44（4）―― 亜鉛栄養治療

特別講演

10 巻 2 号

2020

ゲル電気泳動法を基盤とした生体試料中微量金属イオンおよび金属タンパク質の分離検出法
埼玉大学大学院理工学研究科教授

要齋藤伸吾

約

金属タンパク質に特化した新規ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）を開発した．
この方法は，１）微小体積中の微量金属イオンを検出する「金属 PAGE」，２）汚染金属イオンを抑制し，かつ金属タンパク質から泳動中に金属イオンが解離しない「汚染金属イオンス
ウィーピング - ブルーネイティブ（MICS-BN）PAGE」および３）ホロ型（金属結合型）タンパク質を単離可能な「ホロ／アポ変換二次元（HAC-2D）MICS-BN-PAGE」の 3 種の PAGEで構成されている．金属検出 PAGE では電気泳動場で機能する金属イオン検出用の蛍光プロー
ブ分子を開発することにより，サブ ppb レベルの金属イオン検出を可能とした．MICS-BNPAGE では，平衡論および速度論的に安定なキレート錯体として汚染金属イオンを電気泳動的にスウィープすることで汚染金属イオンのないクリーンな電気泳動場を提供する．HAC-2D
MICS-BN-PAGE は，CBB G-250 分子存在下でホロ型とアポ型金属タンパク質の電気移動度が異なることを利用して，ホロ型金属タンパク質だけをスポットとして単離する対角二次元法である．本論文では，これら手法を解説すると共に，実試料への適用例を紹介する．ヒト血清
試料の MICS-BN-PAGE／金属検出 PAGE では，既報とは異なる Cu イオンの分布を明らかとし，紅色非硫黄光合成細菌試料の HAC-2D MICS-BN-PAGE／金属検出 PAGE ではペリプラズム空間での Cu イオン結合タンパク質を明らかとした．本法は金属タンパク質の総合的な分析法の一つとして有用であると考える．
KEY WORDS

金属タンパク質，微量金属イオン，蛍光プローブ，PAGE，二次元対角法

はじめに態を扱う学問として Haraguchi1） や Szpunar2） らによって“Metallomics”という学問分野が 2004

生体試料中のどの金属イオンがどのタンパク質年に提唱されている．また，日本でも「金属生命に結合しているかを同定することは，多くの生命科学」が提唱され 3），生体中金属イオンおよび金活動を理解するうえで重要である．実に３分の１

属タンパク質の役割に関する研究は近年ますますのタンパク質は金属タンパク質であり生体内の触重要視されている．

媒反応，調節反応，構造化などのプロセスに深くこれまでの金属タンパク質に対する分析法を簡関わっている．このような生体内での金属結合状

単に振り返ると，基本的には分離－検出法が用い

45（5）られている．複雑な試料からタンパク質同士を空間分離し，そのタンパク質分画中の微量金属イオ

１．金属検出 PAGE の開発 4)ンを計測することが合理的だからである．分離法

微小生体試料溶液（あるいは空間分離した分画としてはサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）試料溶液）中の微量金属イオンを高感度検出可能

かポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）

な PAGE を開発した．この手法では，試料溶液の使用が主流である．逆相系やイオン交換系の液に独自の蛍光プローブ 6，7）を添加し，試料中金属体クロマトグラフィー（LC）ではタンパク質がイオンと蛍光プローブを錯形成させる．PAGE変性してしまい，分離中に金属結合型（ホロ型）によって，この金属－プローブ錯体と遊離プロータンパク質から金属イオンが解離してしまう．

ブ分子とを分離することで，金属イオンを蛍光検よって，分子ふるい機能を持つ担体（ゲル）との出する．図１にプローブ分子の設計指針と実際に相互作用がないとされる SEC や PAGE が専ら用合成したプローブ分子群を示す．発光部位は蛍光いられる．検出法としては，その高い感度から誘量子収率の高いフルオレセインとし，配位部位は導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）を用いる

種々の金属イオンと解離不活性錯体（解離速度の例が多い．しかし，筆者はこれら SEC-ICP-MS遅い錯体）を形成する多座ポリアミノカルボン酸

や PAGE-レーザーアブレーション（LA）-ICP-MS骨格とした．プローブ錯体が PAGE 分離中に解法には重大な課題があると考えている．

離してしまうと金属イオンの検出は不可能であ

まず，両者に共通の問題として，分離場における．これら両部位をスペーサーで接続した．一般

る汚染金属イオンへの対策がないことが挙げられに多くの重金属イオンは蛍光団の発光を重原子効る．溶離液や泳動液中あるいは装置にも ppb レ

果や常磁性効果で消光してしまうが，両部位がお4）ベルの様々な汚染金属イオンが存在する ．それよそ 10Å 以上離れると消光を抑制できることがらは分離中に金属タンパク質と結合したり，金属筆者の研究で分かっている 6）．図 1 に示したプロー交換反応によって異なる金属タンパク質を形成しブは金属イオンと錯形成したときに 11Å 以上離たりするため，誤検出や過大評価の原因となる．

れることを計算化学的に予測しており，実際にまた，PAGE-LA-ICP-MS 法ではゲル表面をレー種々の金属イオンと錯生成しても消光を示さなザーで蒸発させるが，ゲルの不均一性による精度い．ただし，遊離プローブ自体も発光するので錯の低下が報告されており 5），また，試料蒸発量が体とプローブの分離が必要である．この分離に微量なため，IPC-MS をもってしても高感度化がPAGE を用いた．例として金属イオン－ L3 錯体困難である．以上のような課題を解決した金属タを PAGE で分離した例を図２に示す．詳細は述

ンパク質分析法はこれまで報告例がない．

べないが，～ 20% の高濃度ゲルで金属間分離が達成されることが判明している（図の例では Fe,

本論文では，筆者がこれまで開発してきた金属Cu, Ni, Co, Cd が検出可能である）．このように大タンパク質に特化した 3 種類の PAGE 手法を紹

きな錯体分子の中心金属の種類が異なるだけで，介する．すなわち，①小体積試料中の超微量金属種々の金属イオンを高分離できることは分離科学イオンの測定を可能とした金属検出 PAGE，②

上も興味深い．検出限界は 78-220pM であり，こ汚染金属を排除した分離場でタンパク質分離を可の感度は ICP-MS より若干劣るものの，ICP- 原能とした汚染金属イオンスウィーピング（MICS）

子発光分光法（AES）より優れている．この方法－ブルーネイティブ（BN）-PAGE，および③ホロ

独自の利点は数µL〜100µL の微小試料中のサブ型金属タンパク質だけを単離可能とした二次元対ppb～数十ppt（絶対感度サブフェムトモル）の角法のホロ／アポ変換二次元（HAC-2D）MICS-

金属イオンをクリーンルーム無しで高感度検出可

BN-PAGE である．

能であり，かつ複数枚のスラブゲルを用いることで 100 以上の試料を同時に計測可能なことであ46（6）―― 亜鉛栄養治療

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図２

L3 を用いる金属検出 PAGE

Royal Society of Chemistry Analyst, 2013, 138, 6097
DOI : 10.1039/c3an01107k Fig. 1

図１

開発したプローブ分子と分子設計指針

る．すなわち，タンパク質を空間分離した分画試の測定を行ったところ，Cu イオンは各分画のほ料の一斉分析などには適した手法である．

ぼ全てから検出された．血清試料中の総 Cu 濃度は 0.95ppm（ICP-AES 測定）であったが，各分２．汚染金属イオンスウィーピング（MICS）ブルーネイティブ（BN）-PAGE の開発4，8）

子量分画中の Cu 濃度の総和である総 Cu 濃度は6.1ppm であり，回収率 642% と明らかに誤った結果となった．この理由はブランク測定（血清試

上記の金属検出 PAGE を，PAGE で分離した料の代わりに超純水を試料として泳動した）の結タンパク質分子量分画に適用した．図３に概要を果から，汚染 Cu イオンが原因ということが分かっ示す．タンパク質の分離には変性剤として CBBた（ブランク測定したときの各分画から Cu イオ

G-250 色 素 分 子 を 添 加 す る ブ ル ー ネ イ テ ィ ブンが検出され，その濃度は一分画当たり 7.5±（BN）-PAGE を用いた（図３a）．BN-PAGE は弱1.7ppb であった）．これらの汚染 Cu は泳動液（0.1い変性力のため，金属タンパク質から金属イオン±0.4ppb），ゲル（5.7±0.5ppb）や装置（電極や4，9）．金属樹脂，ガラス板）等から溶出・混入するものであ

イ オ ン 解 離 が 起 き に く い PAGE と し て は BN-

り，LC を含む既存の分離法では避けがたい汚染が解離しにくいことが報告されている
PAGE 以外に native SDS-PAGE11）

10）

や QPNC-である．なぜなら，図４a に示すように泳動時になどが報告されているが，タンパク質の汚染金属イオンは緩衝剤であるグリシン（上槽泳泳動序列が分子量に従うとされる BN-PAGE を採動液）および Tris（下槽泳動液）とそれぞれ安用した．BN-PAGE でタンパク質分離したゲル定なアニオン性およびカチオン性錯体を形成してレーンを 30 分画にカットしたゲル片から，金属おり，電場印加時に常に分離ゲル中に供給され続イオンを酸抽出で回収し（図３b），その後，蛍けるからである（LC でも溶離液の送液により汚光プローブを添加して二次元目の金属検出 PAGE

染金属イオンが供給され続ける）．この様な汚染を行った（図３c）．このようにして一次元目 BN-金属イオンによって，バックグラウンドとして汚PAGE で分離したタンパク質の分子量分画中の染金属が検出されるだけでなく，分離中に金属非金属イオンを金属検出 PAGE で測定した．

結合型（アポ型）タンパク質と結合し，あたかもPAGE

このBN-PAGE／金属検出PAGEの実証実験として，コントロールヒト血清試料中の Cu イオンホロ型タンパク質として誤検出されてしまう．
そこで，図４b ～ c に示す新しい汚染金属フリー47（7）

図３

MICS-BN-PAGE／金属検出 PAGE の概要

Royal Society of Chemistry Analyst, 2013, 138, 6097
DOI: 10.1039/c3an01107k Electronic Supplementary Information Fig. S-1

図４MICS 法の概略

Royal Society of Chemistry Analyst, 2013, 138, 6097
DOI: 10.1039/c3an01107k Electronic Supplementary Information Fig. S-6

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な MICS-PAGE 法を開発した．MICS 法では，上なった可能性を否定できない．実際，HSA-Cu は槽および下槽泳動液，分離ゲルにそれぞれ熱力学交換活性なCuイオン（Exchangeable Cu；Ex-Cu）的にも速度論的にも安定な錯体を形成する配位子として知られており 13），定量的に HSA-Cu を回収・TPEN，CyDTA お よ び EDTA を 添 加 す る（ 図定量できたという報告は知る限りない．そこで，

４b）．ここで電圧を印加しゲルのコンディショ

MICS-BN-PAGE で HSA-Cu を定量的に回収でき2+ニングを行う．この時，汚染金属 M は上槽で2+2-は [M-tpen] ，下槽では [M-cydta] ，ゲル中では2-るかを，HSA 標準溶液に対する Cu イオンの添加回収実験で検証した．その結果，低温（ゲル 0℃，[M-edta] 錯体を形成しているため，汚染金属は

恒 温 槽 -10 ℃） で の MICS-BN-PAGE で あ れ ばそれぞれの錯体として上下方向に別々に泳動されHSA-Cu を定量的に回収できることが判明した．

る（ゲル中汚染金属は下槽方向へ，上槽泳動液中

これは低温での MICS-BN-PAGE であれば HSA-汚染金属は上槽方向へそれぞれ泳動し，ゲルからCu の自己解離反応をある程度抑制可能であり，汚染金属イオンは除去され，泳動液からゲル中に血清中の Cu イオンの精確な分布を明らかにでき供給されることはない）．そのため，汚染金属イることを示している．

オンが全く存在しない濃縮ゲルが電気泳動的に調そこで，成人健常者（N =10）の血清のタンパ製できる．その後，試料を添加し（図４c），電圧

ク質結合型 Cu の分布を測定したところ，総 Cuを印加する（図４d）と低分子の汚染金属錯体

濃 度 回 収 率 は 99±3% で あ り， そ の 分 布 は，

2-[M-edta] と遊離 EDTA はタンパク質より常に先

Cp-Cu が 99.3±0.3%，HSA-Cu は 0.1±0.5% であっ

行して下槽方向へ泳動されるため，試料中タンパた．詳細は省略するが，従来の報告と異なる分布

ク質は汚染金属イオンに全く接触することなく，が得られた原因を調査した結果，１）従来法ではかつ汚染金属イオンがスウィープされたばかりの汚染金属イオンを考慮に入れていなかったこと，クリーンな分離場を泳動する．このようにして

２）HSA-Cu を精確に回収できていなかったこと，

MICS 法では汚染金属イオンの影響をほぼ完全に

３）血清試料の冷解凍により Cp が変性してしま抑制して泳動できる．MICS 法での汚染金属イオうことを考慮していなかったことの３点が理由でン濃度は理論上 ppq 以下であり，汚染金属をこあることが判明した．近年，我々が得た分布に近のレベルで抑制したタンパク質分離手法は他に報い血清中 Cu イオン分布が報告されている（HSA-

告がない．ここで MICS-BN-PAGE におけるブラCu：0.64%14））．この様に MICS-BN-PAGE ／金属

ンク試料測定を行ったところ，各分子量分画の汚検出 PAGE で精確な Cu イオン分布が初めて得

染 Cu 濃 度 は 金 属 検 出 PAGE の 検 出 限 界 以 下られたものと考えている．

（17ppt 以下）であり，汚染を完全に抑制できていることが分かった．そこで再度，コントロール血清を計測したところ，Cu イオンはセルロプラスミン（Cp）分画のみから検出され，総 Cu 回収

３．ホロ／アポ変換二次元（HAC-2D）
MICS-BN-PAGE15）の開発

率は 96%（1.08ppm）と定量的に回収された．つ続いて，MICS-BN-PAGE／金属検出 PAGE をまり，血清中の Cu イオンは Cp-Cu としてすべて紅色非硫黄性細菌 Rubrivivax gelatinosus （Rg ）存在することになる．しかし，これは従来の定説

細胞試料にも適用している 8）．銅イオン過剰環境とは大きく異なる．既報の多くでは Cp-Cu は 62

下で Rg を培養すると，過剰の Cu イオンは細胞〜 95%， ア ル ブ ミ ン 結 合 型 Cu（HSA-Cu） は 4質からペリプラズム空間へと輸送されるが，ペリ〜 19%，その他低分子量タンパク質結合型 Cu がプラズム空間での Cu 存在化学種（どのタンパク12）．MICS 法の結果は，泳動中に質と結合し無毒化しているか）が不明であったた

HSA などの Cu 結合ホロ型タンパク質から Cu イ

め で あ る 16）．MIC-BN-PAGE ／ 金 属 検 出 PAGE

オンが解離してしまい，定説とは異なる結果との結果，Rg のペリプラズム空間では，Cu イオン

3 ～ 6% である

49（9）

図5HAC-2D MICS-BN-PAGE の概略

Nature Publishing Group Sci Rep, 9（1）, 10566, 2019.
Doi : 10.1038/s41598-019-46955-6 Fig. 2の耐毒性を調節するタンパク質の一つは，CopI

二次元 PAGE 平面の対角線上に並ぶが，ホロ型タンパク質であり，Cu イオンと錯形成しているタンパク質は対角から外れたスポットとして泳動ということが強く示唆されている（CopI 分画かされる（図５Ⅲ）．対角外のスポットから金属タら Cu イオンが検出された）8）．しかし，CopI がンパク質を（質量分析法などで）同定し，金属検泳動される分子量分画には，CopI 以外の他のタ出 PAGE からそのスポットに結合していた金属ンパク質も多量に混在しており，CopI が Cu 結合イオンの種類と濃度が同定できる．このようにしタンパク質であるという決定的な証拠は得られなて，実試料中での金属タンパク質やその結合金属かった．そこで，ホロ型金属タンパク質を選択的種が分析可能な手法である．に単離する新規 PAGE 手法（ホロ／アポ変換二ここで，ホロ型金属タンパク質だけが対角上か次 元（HAC-2D）MICS-BN-PAGE） の 開 発 に 着ら外れたスポットとして現れる機序について説明

手した．HAC-2D MICS-BN-PAGE の概略を図５する．MICS-BN-PAGE ではホロ型とアポ型金属に示す．HAC-2D PAGE 法では一次元目のタンタンパク質で泳動位置が異なることを我々は見出

パク質分離の MICS-BN-PAGE を二つのレーンでしている．例えば，鉄輸送タンパク質のトランス行う（図５Ⅰ中のレーンＡとレーンＢ）．レーン

フェリン（Tf），銅輸送タンパク質セルロプラス

Ｂは通常の MICS-BN-PAGE／金属検出 PAGE にミン（Cp），酸化還元酵素のスーパーオキシドジ供し，どの分子量分画にどの金属イオンが結合しスムターゼ（SOD）などがホロ型とアポ型で大ているかを検出する（図５Ⅱ- ２）．
レーンＡは，キきく泳動位置が異なることを確かめている（Tf

レート剤（EDTA）の入った酸溶液中で段階的にや SOD はホロ型よりもアポ型の泳動速度が速く，pH を変化させることで，ホロ型金属タンパク質

Cp は反対にアポ型よりもホロ型の泳動速度が速をアポ型（金属非結合型）へとゲル内で化学種変い ）． こ の 現 象 は，BN-PAGE で 用 い る CBB換する（これをホロ／アポ変換と呼ぶ，図５Ⅱ-１）．

G-250 分子が，ホロ型とアポ型タンパク質を識別

この後，もう一度，レーンＡを一次元目と全く同して結合していることを示している．実際に Tf

じ MICS-BN-PAGE に 供 す る（ 二 次 元 目 MICS-に対する結合実験（キャピラリー電気泳動法を使BN-PAGE）．そうするとホロ型タンパク質以外は用）とフレキシブルドッキング計算（AutoDock50（10）―― 亜鉛栄養治療

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図６

フレキシブルドッキング計算の結果左）ホロ Tf，右）アポ Tf．図中の赤の原子は Fe3+，黄色は Fe3+ に結合するアミノ酸残基，青色は CBB G-250 分子である．
Nature Publishing Group Sci Rep, 9（1）, 10566, 2019.
Doi : 10.1038/s41598-019-46955-6 Fig. 5（a）

図７ R. gelatinosus 試料の HAC-2D MICS-BN-PAGE ／金属検出 PAGE 結果ａ）二次元 PAGE，ｂ）金属検出 PAGE 泳動図と Cu イオン量，ｃ）ａ）中のアステリスクのスポットから検出された CopI タンパク質の配列（赤字）．
Nature Publishing Group Sci Rep, 9（1）,10566, 2019.
Doi : 10.1038/s41598-019-46955-6 Fig. 3Vina プログラムを使用）によって，CBB 色素分3+パク質）は同じ泳動距離だけ移動するため，対角子はアポ型の Fe が結合する領域をより強く認識線上に並ぶのは自明である．一方，一次元目と二し，ホロ型 Tf よりも多くのCBB G-250分子がア次元目で泳動距離が変わるホロ型金属タンパク質15）

ポ型 Tf に結合することが分かっている（図６） ．

だけが対角線上から外れたスポットとして検出さ先述した HAC-2D PAGE 法では同じ電気泳動をれることとなる．

２回行うので，一次元目と二次元目でほとんどの図５Ⅲには実際に Tf，Cp および SOD 標準試

タンパク質（非金属タンパク質やアポ型金属タン料の混合溶液の HAC-2D MICS-BN-PAGE の結果

51（11）を示している．ホロ型金属タンパク質は対角から金属タンパク質の分析を指向した独自の PAGE

外れたスポットとして検出され，一次元目 MICS-である．著者の知る限り，微量金属イオンを定量

BN-PAGE（ レ ー ン B） に 対 応 す る 金 属 検 出

可能な PAGE，汚染金属イオンや金属解離の影

PAGE で Cu および Fe イオンが検出されている

響を考慮に入れたタンパク質分離用の PAGE，ホことが分かる．このように，標準タンパク質試料ロ型金属タンパク質を選択的に単離可能な PAGEに対してホロ型金属タンパク質を対角外スポットの報告はない．実試料への適用も可能であり，金として検出することに成功したため，続いて Rg

属タンパク質の総合的な分析法としての有用性を試料をこの新規手法に適用した．結果を図７a に示してきた．

示す．一次元目 100kDa，二次元目 29kDa 位置に

ただし，本法は金属タンパク質に対する万能法

スポットが単離され，このスポットをゲル内消化ではないことにも注意する必要がある．例えば，した後，MALDI-TOF MS 法に供してタンパク解離反応速度が非常に速い金属タンパク質には無質を同定した．その結果，スポットのタンパク質力であろう．また，HAC-2D PAGE で単離できは CopI と同定できた（図７c）．また，スポットない金属タンパク質も存在するであろうし，本法試料中に他のタンパク質の配列は検出されなかっでどの程度微量な金属タンパク質を検出できるかたため，このスポットにはホロ型 CopI が単離さも分かっておらず，今後より詳細に調査する必要

れ て い る こ と が 分 か っ た． さ ら に 一 次 元 目がある．

100kDa 位置からは金属検出 PAGE によって多量

上記のような課題点もあるが，本法のような特の Cu イオンが検出された（図７b）．以上の結果長を持ち合わせた他の分析法の報告例がないことを総合して考えると，Rg ペリプラズム空間中のから，本法が将来的に金属タンパク質の分析を行

ほとんどの Cu イオンは CopI タンパク質に強くうときの汎用法の一つとなることを期待している．

結合されて存在していると結論付けられる．このよ う に 実 試 料 に お い て も HAC-2D MICS-BNPAGE／金属検出 PAGE が金属タンパク質の同定に有力な手法であることが実証できた．

謝辞
本研究の一部は文部科学省科学研究費補助金（若手研究 BNo. 18750057；No. 21750072；No.

23750077；No.25410139；基盤研究 B No.19H02740）

おわりにの助成を受けて行われたものであり，一部は株式

以上，ここで紹介した金属検出 PAGE，MICSBN-PAGE お よ び HAC-2D MICS-BN-PAGE は，会社シノテストとの共同研究で行われた．ここに謝意を表する．

◆齋藤伸吾略歴
1996 年		
1998 年		
2001 年		
2001 年		
2007 年		
2010 ～ 2011 年
2017 年		

東北大学工学部卒業
東北大学大学院工学研究科博士前期課程修了
東北大学大学院工学研究科博士後期課程修了
北見工業大学工学部化学システム工学科助手・助教
埼玉大学大学院理工学研究科准教授
Wake Forest University 在外研究員
埼玉大学大学院理工学研究科教授 現在に至る

52（12）―― 亜鉛栄養治療◆文10 巻 2 号

2020

献 ― ――――――――

１）Haraguchi H : Metallomics: the history over thelast decade and a future outlook. Met 9 : 1001-1013,
2017

in proteomic studies by PAGE-LA-ICP-MS, Talanta
81 : 241-247, 201010）Nowakowski AB, Wobig WJ, Petering DH :２）Szpunar J : Metallomics : a newfrontier in

Native SDS-PAGE : high resolution electrophoretic

analytical chemistry, Anal Bioanal Chem 378 : 54-

separation of proteins with retention of native56, 2004

properties including bound metal ions, Met 6 :３）https://bio-metal.org/1068-1078, 2014４）Saito S et al : Separation of metalloproteins using

11）Kastenholz B : New hope for the diagnosis anda novel metal ion contaminant sweeping techniquetherapy of alzheimer's disease, Protein Pept Le 14 :and detection of proteinbound copper by a metal

389-393, 2007

ion probe in polyacrylamide gel electrophoresis:12）Rainsford KD, Milanino R, Sorenson JRJ et al :distribution of copper in human serum, Analyst

Copper and Zinc in Inflammatory and Degenerative

138 : 6097-6105, 2013

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1998

gel electrophoresis conditions for the separation of13）Inagaki K et al : Speciation of protein-binding

metal-tagged proteins with subsequent laser

zinc and copper in human blood serum byablation ICP-MS detection, Electrophoresis 30 :chelating resin pre-treatment and inductively

303-314, 2009

coupled plasma mass spectrometry, Analyst, 125 :６）Saito S et al : Ultrasensitive CE for heavy metal

197-203, 2000

ions using the variations in the chemical structures

14）Ghidoni R, Squitti R, Siotto M et al : Innovative

formed from new octadentate fluorescent probes

Biomarkers for Alzheimer's Disease : Focus on theand cationic polymers, Analyst 136 : 2697-2705,

Hidden Disease Biomarkers, J Alzheimers Dis, 622011（4）: 1507-1518, 2018７）Saito S et al : Direct fluorometric detection of15）Ishikawa J, Maeshima A, Mellinger A et al :paramagnetic and heavy metal ions at sub-amol

Two-dimensional polyacrylamide gellevel using an aromatic polyaminocarboxylate byelectrophoresis for metalloprotein analysis based

CZE : Combination of pre- and on-capillaryon differential chemical structure recognition bycomplexation technique, Electrophoresis 28 : 24482457, 2007

CBB dye, Sci Rep, 9（1）: 10566, 201916）Azzouzi A et al : Coproporphyrin Ⅲ excretion８）Durrand A, Saito S et al : c -Type Cytochrome

identifies the anaerobic coproporphyrinogen Ⅲ

Assembly Is a Key Target of Copper Toxicity

oxidase HemN as a copper target in the Cu +-within the Bacterial Periplasm, mBio 6 : e01007-15,

ATPase mutant copA- of Rubrivivax gelatinosus :2015

Mol Microbiol, 88（2）: 339-351, 2013９）Jiménez MS et al : Metal-protein binding losses53（13）Gel electrophoresis methods orientated towards metalloprotein analysis : isolation of metal-boundproteins and detection of trace protein-bound metal ions
Shingo Saito
Professor, Graduate School of Science and Engineering, Saitama University
Three types of new polyacrylamide gel electrophoresis methods (PAGE) specialized formetalloproteins were developed : 1）"metal detection PAGE" for detection of trace metal ions in small
volume sample solutions, 2）"Metal Ion Contaminant Sweeping-Blue Native (MICS-BN) PAGE" forsuppression of contaminating metal ions without dissociation of metal ions from metalloproteins during
electrophoresis, and 3）"holo/apo conversion two-dimensional (HAC-2D) MICS-BN-PAGE" for selective
isolation of holo(metal ion-binding)-metalloproteins. In the metal detection PAGE, the metal ions on sub
ppb levels were detected in PAGE by developing the fluorescent probe molecule. MICS-BN-PAGE
provides an electrophoretic separation with no contaminated metal ions by electrophoreticallysweeping the contaminated metal ions as thermodynamically and kinetically stable chelate complexes.
HAC-2D MICS-BN-PAGE is a two dimensional diagonal method to isolate only holo-metalloproteins as
spots based on the different electrophoretic mobilities of holo- and apo(non-metal ion-binding)metalloproteins. In this paper, the principles of these methods and applications to real samples aredescribed. MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE was applied to human serum samples, revealed adifferent (and accurate) distribution of Cu ions from those in many previous reports, and HAC-2D
MICS-BN-PAGE/metal detection PAGE was applied to Rubrivivax gelatinosus bacterial samples,
identified a Cu-binding metalloprotein, CopI, in the periplasmic space for the first time. Thus, it wasproven that these PAGE methods are useful for identification and determination of metalloproteins.

Keyword：Metalloproteins, trace metal ions, fluorescent probe, PAGE, two dimensional diagonal
methodAddress for correspondence
255 Shimo-Okubo, Sakura-ku, Saitama 338-8570, Japan6
Phone：048-858-3559
E-mail address
shingo@mail.saitama-u.ac.jp