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J Cardiol 2003 Nov; 42（5）: 213 – 219

マウスの心筋灌流評価における経静脈性心筋コントラストエコー図
法の有用性

Efficacy of Intravenous Myocardial
Contrast Echocardiography forAssessment of Perfusion Area of theHeart in Mice平山秀男

Hideo

石藏

文信

Fuminobu

奥田晃平

平野貴史郎

HIRAYAMA, BS
ISHIKURA, MD, FJCC

Kohei OKUDA, BS
Takashiro

HIRANO, BS

春香

Haruka

KOBAYASHI, BS

別府慎太郎

Shintaro

BEPPU, MD, FJCC

小林Abstract ─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Background and Objectives. Intravenous myocardial contrast echocardiography is used clinically, butuse in small animals has not been evaluated. The conditions for myocardial opacification and the feasibilityof myocardial contrast echocardiography were examined in mice.
Methods. Closed chest mice were examined. The left ventricular short-axis view at the mid papillarymuscle level was recorded before and after NC100100 injection using a SONOS 5500（PHILIPS）. Realtime and intermittent triggering（every 5 beats）myocardial contrast echocardiography was performed with amechanical index of low（0.3）, middle（0.7）, and high（1.5）. Open chest mice were examined after left
anterior descending coronary artery ligation. Myocardial contrast echocardiography was performed using
intermittent triggering imaging（every 5 beats）with high mechanical index（1.5）. The ratio of the non-perfused area to the whole left ventricular wall area was compared with that of the non-stained area by EvansBlue.
Results. The left ventricular myocardium was opacified in any setting. Good opacification was acquired
at middle mechanical index（0.7）in real time myocardial contrast echocardiography and at high mechanicalindex（ 1.5）in intermittent myocardial contrast echocardiography. The opacified and non-opacified
myocardium were clearly identified in all mice with coronary ligation. The non-opacified area ratio showed
a good correlation with the non-stained area ratio（y ＝ 0.93x ＋ 0.51, r ＝ 0.94, p ＜ 0.05）.
Conclusions. Myocardial contrast echocardiography can be used to assess myocardial perfusion anddetermine the ischemic area accurately in situ in the mouse.
─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────J Cardiol 2003 Nov ; 42（5）: 213−219

Key Words
Contrast echocardiography
Echocardiography, transthoracic
Myocardium myocardial perfusion
Experimental medicine

はじめに近年，超音波造影剤の開発や超音波診断装置の発達ている．しかし，その検査対象となる心臓は，ヒトをはじめイヌ，ブタなどのように，そのサイズが比較的大きい動物が主である．

により，心筋コントラストエコー図法に関する基礎研

一方，多くの病態モデルや遺伝子操作モデルとして究が進み，心筋灌流評価法としての有用性が確認され利用されることの多いマウスでは，対象となる心臓が──────────────────────────────────────────────
大阪大学医学部 保健学科 : 〒 565−0871 大阪府吹田市山田丘 1−7
School of Allied Health Sciences, Osaka University, Faculty of Medicine, Osaka
Address for correspondence : BEPPU S, MD, FJCC, School of Allied Health Sciences, Osaka University, Faculty of Medicine,
Yamadaoka 1−7, Suita, Osaka 565−0871
Manuscript received March 6, 2003 ; revised July 8, 2003 ; accepted July 9, 2003
BS ＝ bachelor of science213

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214

平山・石藏・奥田 ほか

非常に小さいため，手技的な困難さや測定精度の問題測定した．超音波造影剤流入後，最も高い輝度値からにより，心室容積や心室壁厚などの基本的計測ですら超音波造影剤流入前の輝度値を引いたものを輝度上昇困難であった．近年開発された高周波探触子を用いる度とした．と，測定精度も向上し再現性のある計測が可能になったが1−3），心筋灌流の評価法についてはマイクロス

各設定条件間の心筋染影度の差の検定は分散分析法による多重比較検定で行った．

フェア法や，死後の病理学的検討に依存しているのが現状である4,5）．そこで本研究の目的は，経静脈性心2筋コントラストエコー図法を用い，in situ の状態でマICR 系雄性マウス 10 匹（8−10 週齢，体重 38−41 g）をウス心臓の心筋灌流評価を行う際の染影条件設定およ対象とした．麻酔・剃毛を前項の方法と同様に行い，び灌流欠損領域の定量的評価の可能性を明らかにする仰臥位に固定した．気管内挿管後レスピレーター（シことである．

ナノ製作所，SN-480-7）に接続し，1 回換気量 1.0−対象と方法
1

心筋灌流評価のための条件設定の検討

心筋灌流欠損領域の定量的評価

1.5 ml，換気回数 80−100 /min で呼吸管理した．超音波
造影剤注入のためのチューブを頸静脈に留置した．傍胸骨開胸により心臓に至り，心外膜を切開して心臓をICR 系雄性マウス 5 匹（8−10 週齢，体重 38−41 g）を露出させ，キシロカイン（10 倍希釈，0.1 ml）を腹腔内対象とした．ネンブタール（1.0 ml/kg）を腹腔内に投与投与したのち，左冠動脈前下行枝を手術用縫合糸し，麻酔下で仰臥位に固定して，頸部および胸部を剃（NESCOSUTURE，6-0）で完全結紮した6）．

毛し，頸動脈には超音波造影剤注入のために，ポリエ超音波装置は，同じく SONOS5500（PHILIPS 製）をチレンチューブ（内径 0.28 mm）を留置した．超音波装使用した．前項の検討で使用したリニア型探触子は周

置は SONOS5500（PHILIPS 製）を，探触子はリニア型

波数は高いが，開胸マウスの心臓に直接探触子を当て高周波ワイドバンド対応の 15-6L 型探触子（周波数 6−ることが不可能であるため，セクタ型高周波ワイドバ15 MHz）を用い，閉胸下で左室短軸像乳頭筋レベルをンド対応の s12 型探触子（周波数 5−12 MHz）を用いた．

ズーム機能を用いて拡大描出した．高周波探触子には探触子の先端に水を満たしたゴム製薄膜（約 2.5 cm）をセカンドハーモニック法は用意されていないので，基装着し，これを探触子と心臓間のスペーサーとして直本波モードのままで frequency fusion ＝ 5 とし，他の設接心臓に当て，ズーム機能を用いて左室短軸像乳頭筋定条件では，送信方法は連続送信法（frame rate 30 Hz），レベルを拡大描出した．

または 5 心拍に 1 回の間欠送信法（収縮末期に心電同心筋コントラストエコー図法のための設定は上記基期）の 2 通りを用い，mechanical index（ MI）を低音圧

礎検討で最良の心筋染影が得られた条件，すなわち（0.3），中音圧（0.7），高音圧（1.5）の 3 段階に設定し

frequency fusion ＝ 5，MI 値 1.5，5 心拍に 1 回の間欠送た．

信法（収縮末期に心電同期）とした．間欠送信のために超音波造影剤は，フルオロカーボンからなる第二世

今回の検討では壁運動の評価は行ってはいない．超音代の造影剤 NC100100（Nycomed Amersham）（5 倍希釈）波造影剤 NC100100（30 倍希釈，0.02 ml）を頸静脈よりを用い，その 0.05 ml をマイクロシリンジを用いて頸注入し，得られた像をビデオテープに記録し，心筋コ動脈より注入し，得られた像をビデオテープに記録しントラストエコー図像より左室壁全面積に対する超音た．頸動脈投与を行った理由は，最適撮像条件の検討

波造影剤の非染影面積の割合を求めた．の際に造影剤の頻回投与においても安定した結果が得られたためである．
心筋コントラストエコー図法により得られた心筋染

心筋コントラストエコ ー図法施行後，3% EvansBlue 水溶液を頸静脈より 1 ml 注入した．Evans Blue 水
溶液は超音波洗浄機（BRANSON 製，BRANSONIC

影性の評価には，日本光電製 Color Cardiology WorkULTRASONIC CLEANER，3510-DTH，100 W，42 kHz）

Station を用いて，グレースケール 256 階調で輝度解析で数分間攪拌したものを用い，シリンジフィルターした．連続送信法，間欠送信法の両者で，収縮末期像（GelmanSciences 製，Sterile Acrodisc 1.2μm）を介してのみを選択し，左室後側壁に関心領域を設定し輝度を注入した．注入経路は極細い注射針やチューブであり，J Cardiol 2003 Nov; 42（5）: 213 – 219

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マウスにおける心筋コントラストエコー図法

215

10μm

BeforeAfterFig. 1 Photomicrographs of Evans Blue solution
Before ultrasonic agitation, the particle size is relatively large and uneven（left）. After agitation, the particle
size is small and even（right）.

心筋灌流欠損領域の定量的評価

撹拌前の状態では粒が不揃いの Evans Blue 粒子（Fig.

21 −左）が経路を塞栓閉塞したが，超音波撹拌しシリンすべてのマウスで良好な心筋染影が得られ，その結ジフィルターを通した粒径は小さくなり（Fig. 1 −右），果，灌流欠損領域は非染影領域として認識された染色も明瞭かつ均一に行えた．

（Fig. 4 −左）．Evans Blue 染色では灌流欠損部は非染摘出した心臓を生理食塩水で洗浄後，10% 中性ホル色領域として明確に確認することができた（Fig. 4 −マリン溶液で固定した．乳頭筋レベルで約 2−3 mm 幅右）．心筋コントラストエコー図法による非染影領域の病理切片を 3 スライス作成し，断層心エコー図像をは，Evans Blue による非染色領域と良好な相関（y ＝参考に，最も形状の近い断面の病理切片を採用した．

0.93x ＋ 0.51，r ＝ 0.94，p ＜ 0.05）を示した（Fig. 5）．まこ の 病 理 切 片 を デ ジ タ ル カ メ ラ（ N i k o n 製 ，た，Bland-Altman 法における評価でも，両者の間にはCOOLPIX950）で撮影し，その画像から，Evans Blue

大きな値のばらつきはなかった（Fig. 6）．の非染色部分面積（非灌流領域）の左室壁全面積に対する割合を Adobe Photoshop 4.0.1J を用いオフラインに考案より求めた．この割合を心筋コントラストエコー図法

今回の実験により心筋コントラストエコー図法によで求めた割合と対比検討した．両者の相関を直線回帰

りマウスの心筋灌流が確認できた．条件的には間欠送し，Bland-Altman 法による評価も行った．

信法と高音圧の組み合わせで最良の心筋染影が得られ

結1

果

心筋灌流評価のための条件設定の検討た．高音圧により高い輝度が得られた理由は微小気泡からなる超音波造影剤のフラッシュ効果によるものと考えられる7）．画像作成手法として，心筋コントラス

各条件での心筋コントラストエコー図像を Fig. 2 に

トエコー図法での心筋染影にはハーモニックイメージ示す．すべての条件において心筋染影を肉眼で確認す

ング法8）が用いられるのが一般的である．今回用いたることができた．連続送信法に比べて，間欠送信法の高周波探触子にはハーモニックイメージングは用意さほうが良好な心筋染影が得られた．MI ＝ 0.3，0.7，れていないものの，周波数範囲は 5−12 MHz であり，1.5 での輝度上昇度は，連続送信法において，それぞ周波数帯域が広いと複数の周波数からの画像構築が可

れ 11.4 ± 5.0，31.8 ± 7.0，24.3 ± 8.7，間欠送信法にお能である．装置では frequency fusion により画像構築周

いてはそれぞれ 14.8 ± 3.0，39.8 ± 8.0，53.1 ± 7.3 で波数が選択可能で，今回は対象が小動物ということかあり（Fig. 3），間欠送信法と高音圧（1.5）の組み合わせら，高周波成分を中心とした画像構築をするモードでで最良の心筋染影が得られた．

ある frequency fusion ＝ 5 を選択した．これによりほぼ10 MHz 付近の周波数を受信するようになる9）．つまり，J Cardiol 2003 Nov; 42（5）: 213 – 219

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平山・石藏・奥田 ほか

Fig. 2 Myocardial contrast echocardiograms in a mouse
Good opacification is noted at MI 0.7 in RTI and at MI 1.5 in ITI.
MI ＝ mechanical index ; RTI ＝ real time imaging ; ITI ＝ intermittent triggering imaging.

RTI＊p<0.033

画像構築には，10 MHz 付近の送信波からの基本波成＊分だけでなく，5−6 MHz 付近の送信波からのセカンモードにもかかわらず，良好な心筋染影が獲得できた大きな原因ではないかと考えられる．
今回の検討で，連続送信法においても心筋染影が得

60
Video intensity

ドハーモニック成分も含まれている．これが基本波

ITINSNS4020られたことは注目される．ただし，最良の心筋染影は中音圧で得られた．低音圧では気泡からの反射信号が少なく，逆に高音圧では気泡が破壊されてしまう．中音圧では，この両者の欠点を補えたために，最も心筋輝度が高かったのであろう（Fig. 3）．もちろん心筋染影輝度自体は，間欠送信法のほうが高く，輝度値だけ

00.3

0.7
Mechanical index

1.5

Fig. 3 Video intensity of myocardial opacification ateach setting
Abbreviations as in Fig. 2.

からみれば間欠送信法が推奨される．
左冠動脈結紮後の心筋コントラストエコー図法で灌流欠損領域は非染影領域として確認でき

10）しかし，彼らの検討では，使用装置の制限から高心拍，Evans数のマウスでの心電図同期ができなかったことから，

Blue 染色により得られた結果と良い相関を示した．

連続送信法による検討となっている．連続送信法にお11）

本実験と同様の試みをした Scherrer-Crosbie ら の実験

いては，MI 値の設定が重要にな ってくるが，でも，両者は良い相関を示したことが報告されている．

Scherrer-Crosbie らの検討では，MI 値に関する設定のJ Cardiol 2003 Nov; 42（5）: 213 – 219

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マウスにおける心筋コントラストエコー図法

Fig. 4 Comparison of myocardial contrast
echocardiographic image（left）
and photograph（right）
of Evans Blue staining
Arrows show the margin between the perfusion
and non-perfusion areas.

（％）
50

送信法においては MI 値を中音圧に設定することで，気泡の崩壊の影響を少なくし，心筋コントラストエコー図法が可能であることを示した．
もちろん，連続送信法では壁運動異常も同時に評価可能であるから有用である．しかし，気泡の崩壊による心筋染影への影響が無視できないこと，正確な欠損

Evans Blue staining

記述がない．この点に関し，今回の実験において連続

4030
y＝0.93x＋0.51
r＝0.94p<0.05

2010

領域の評価には十分な心筋染影を得ることが重要であ0ることを考えると，灌流欠損領域の評価には間欠送信

01020法による検討が適している．さらに同じ心筋染影を得ようとすれば，連続送信法に比べて，間欠送信法のほうが造影剤の投与量は一般に少量で可能である．造影30MCE

4050（％）

Fig. 5 Comparison of the percentage areas of perfusion
defects shown by myocardial contrast echocardiography and Evans Blue staining剤によるマウス心臓への容量負荷を考えても，灌流欠MCE ＝ myocardial contrast echocardiography.

損領域の評価には間欠送信法が適切と考える．
以上のように，今回の検討において，マウスにおけ15る心筋コントラストエコー図法の方法論の確立と同時に，心筋灌流欠損領域の定量的評価が可能であること

10A：MCEが示された．
A−B

本実験の問題点
本実験の対象がマウスという小動物であることからいくつかの制限や問題点が生じる．
第 1 に造影剤の投与方法と投与量の問題がある．今回の実験では超音波造影剤を単回投与したが，超音波造影剤注入用のポリエチレンチ ュ ーブの内径は0.28 mm と非常に小さく，シリンジも細小のものを用いているため，注入時に高い圧力がかかる可能性がある．微小気泡は圧力に脆弱であり，それを避けるためには持続投与のほうが適しているように思われる．しかし一方では，小動物であるマウスの体重を考慮すると，わずかな注入量増加によっても過大な容積負荷がJ Cardiol 2003 Nov; 42（5）: 213 – 219

B：Evans Blue

5：Mean：Mean±SD0：Mean±2SD（Mean，SD＝A−B）−5−1001020304050A＋B2Fig. 6 Comparison of percentage areas of perfusion
defects by the Bland-Altman method
Value A is percentage area of perfusion defects bymyocardial contrast echocardiography. Value B is percentage area of perfusion defects by Evans Blue staining. X axis is（A ＋ B）/2, Y axis is A − B.
Abbreviation as in Fig. 5.

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218

平山・石藏・奥田 ほか生じるため，持続注入は困難であろう．今回，単回投現在，高周波探触子にはハーモニックイメージングの与後フラッシュ用の注入を行わなかったのも，心臓へ設定は存在しないため，今回の実験のような条件の設の容量負荷を避けるためである．マウスの体重を 40 g，定をしたが，今後，高周波探触子においてもハーモ

成人男性の体重を 60 kg と仮定すると，マウスでのニックイメージングが開発されれば，より詳細で良好

0.02 ml 投与は，ヒトでは 30 ml 投与に相当する．現在，な画像が得られると予想される．

レボビストµ（日本シェーリング・田辺製薬）の臨床投
与量が単回投与では数 ml であることを考慮すると，研究の発展性マウスに対しての投与量として減量できる可能性はあ

高周波探触子を用いれば，高度の分解能を有する画る．ただし，単純に体重当たりの投与量を同一にでき像が得られ，マウスにおいても生理学的検討や機能評るかなど，投与量に関しての検討は今後の問題である．

価が可能になる．さらに心筋コントラストエコー図法

注入経路がごく細いことを考慮すると，前述の考察のを用いることで，心筋灌流の評価を経時的に行うことように，注入途中で加圧による機械的気泡の崩壊をきも可能である．今後，心疾患を持った遺伝子操作マウたしている可能性がある．今回の検討での使用量は多スなどへの適応が期待され，より詳細な情報の獲得がいが，実際の気泡密度は低下しているかもしれない．

可能になると考えられる．

厳密に投与量を決定するためには，極細の注入経路に結よる注入速度と，それにかかる圧，注入経路出口にお語ける気泡数が検討されなければならない．もちろん最本実験によりマウスの心筋灌流欠損領域の定量的評初から濃度を希釈して用いれば，気泡密度が低下し，価が心筋コントラストエコー図法で可能であることが十分な超音波反射が得られない可能性は高い．

確認された．現在，商品化されている超音波診断装置

第 2 に，超音波装置の問題がある．左室短軸直径がで，また連続送信法でも心筋染影を得られたことから，約 5 mm のマウスの心臓を描出するには高い空間分解今後の装置の発展が期待でき，マウスにおいても灌流能が要求される．このために高周波帯域を持つ探触子評価と壁運動評価の同時施行が可能であると思われを使用し，その結果，良好なエコー図像が得られた．

る．

要約

背景・目的 : 心筋コントラストエコー図法の心筋灌流評価に対する有用性は確立されたが，小動物への応用は未検討である．そこで今回はマウスを対象とし，本法による心筋灌流評価のための条件設定の確立と，それに基づき本法を施行した際の虚血領域診断の有用性について検討した．
方法 : ICR 系雄性マウスを対象とし，超音波装置は SONOS 5500（PHILIPS 製），超音波造影剤は NC100100 を用い，左室短軸心筋染影像を記録した．条件設定については，閉胸下で 15-6L リニ
ア型探触子を用いて左室短軸像を記録した．映像法を連続送信法または間欠送信法（1 : 5）を用い，音圧を mechanical index（MI）で 0.3，0.7，1.5 の 3 段階での心筋染影度を求めた．虚血領域の評価については，左冠動脈前下行枝を結紮したのち，s12 型探触子を用いて 5 心拍に 1 回の間欠送信法，MI 値 1.5 により左室短軸心筋染影像を記録した．ついで，Evans Blue を注入し病理標本を作成した．
心筋コントラストエコー図法からは左室壁全体に対する非染影部面積の割合を，標本からは左室壁全体に対する非染色部面積の割合を求めた．
結果 : 条件設定については，すべての条件において，心筋染影が確認されたが，連続送信法では MI が 0.7，間欠送信法では 1.5 で最良の心筋染影が得られた．虚血領域の評価については，すべてのマウスで染影領域と非染影領域は明確に認識でき，心筋コントラストの非染影領域は，病理標本の非染色領域と良い相関を示した（y ＝ 0.93x ＋ 0.51，r ＝ 0.94，p ＜ 0.05）．
結語 : 心筋コントラストエコー図法を用いた心筋灌流評価は，マウスのような小動物にも適応が可能であり，心筋虚血領域の正確な定量が可能である．

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マウスにおける心筋コントラストエコー図法

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