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実験を正しく行い 、解釈する。免疫染色・ISHと画像解析の超鉄板テクニック

Contents

◆改訂の序

3

◆初版の序

4

◆動画視聴のご案内

10

序 章

染色をはじめる前に考えること

1 免疫染色と in situ Hybridization

第1章

2 蛍光か発色か？

3 染色をはじめるにあたって，最初に考えること

動物の解剖と固定

1 動物実験をはじめる前に

16

2 切片・固定液の種類と器具の準備

24

1 適切な動物実験を行うための一般原則 2 適正な動物飼育を行うための動物福祉 3 マウス・ラットの試料採取に必要な麻酔薬と安楽死処置 4 人道的エンドポイント 5 最後に

1 切片の種類

2 動物の解剖～切片作製までの流れ

3 固定液の種類と組成

4 解剖，灌流固定に用いる実験器具

3 解剖，灌流固定法の実際
1 灌流固定か，浸漬固定か？

第2章

31

2 灌流固定の方法

組織のサンプリング

1 灌流固定を必要とする組織

1 脳 2 下垂体 3 脊髄 4 後根神経節 5 肝臓 6 腎臓，副腎 7 膵臓 8 脾臓 唾液腺  舌（有郭乳頭）  白色脂肪，褐色脂肪  子宮，卵巣  乳腺

2 灌流固定を必要としない組織

38

9 気管＋甲状腺 ⓾ 胸腺60

1 胃，十二指腸 2 小腸，大腸 3 腸管ロール 4 皮膚 5 眼 6 骨組織①：大腿骨 7 骨組織②：膝関節
8 骨組織③：内耳（蝸牛） 9 骨組織④：歯（下顎） ⓾ 血管  胎仔，新生仔，胎盤  筋肉  精巣，精巣上体
 ゼノグラフト，ヒト・大動物組織など

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3 どちらでもよい組織
1 心臓

2 骨髄843 膀胱4肺4 培養細胞のサンプリング

88

1 調製方法の種類と選び方 2 プロトコール 3 染色例第3章

ブロック作製1 組織の前処理

96

1 パラフィン包埋のための固定後の処理 2 脱脂

3 脱灰

2 パラフィンブロックの作製（包埋）102

3 凍結ブロックの作製

108

1 パラフィン包埋 2 ブロックの成形

1 未固定凍結ブロックの作製

第4章

3 パラフィンブロックの保存

2 既固定凍結ブロックの作製 3 凍結ブロックの保存

薄切

1 パラフィン切片の作製と保存

114

2 凍結切片の作製と保存

123

1 切片の厚み

2 パラフィン切片作製の手順 3 パラフィン切片の保存

1 凍結切片作製時の温度・厚さ

第5章

2 凍結切片作製の手順

免疫組織化学染色

1 抗体を選ぶ

128

2 染色の流れ135

1 抗体の候補を検索 2 候補の絞込 3 Q&A

1 条件検討に用いる切片の準備
4 検出系

2 脱パラフィン～前処理（抗原賦活化，各種ブロッキングなど） 3 一次抗体反応

3 免疫染色の準備

141

4 免疫染色プロトコール（LSAB 法）146

5 染色結果を評価する

152

1 器具

2 試薬（LSAB 法） 3 ABC 法，ポリマー法，mouse on mouseで使用する試薬

1 作業前の準備

2 プロトコール 3 簡易プロトコール

1 免疫染色の条件検討

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2 免疫染色の答え合わせ2023/11/17 11:36

Contents

6 二重染色155

1 二重染色の条件検討 2 二重染色の手順

第6章

蛍光免疫組織化学染色

1 抗体を選ぶ・条件検討

1 一次抗体を選ぶ際の注意点

160

2 蛍光標識の二次抗体 3 条件検討

2 蛍光免疫染色の準備

163

3 蛍光免疫染色プロトコール

165

1 器具

2 試薬

1 作業前の準備

第7章

2 プロトコール 3 染色例

in situ ハイブリダイゼーション（ISH）

1 ISH の原理

170

1 プローブの種類 2 ISH の手順

3 染色のコントロールのとり方

2 プローブの設計

174

3 プローブを作製する

177

4 ISH 染色184

1 設計の注意点

2 設計方法1 設計した遺伝子配列の増幅 2 プローブ領域のクローニング 3 in vitro transcription 反応によるDIG 標識 RNA
合成 4ドットブロット法によるプローブの濃度測定

1 準備

2 染色条件の設定 3 プロトコール 4 染色例

第8章

多重染色，その他の染色1 ISH（発色）＋免疫染色（発色）206

2 HE 染色209

3 TUNEL 染色

211

1 二重染色の条件検討 2 二重染色の手順

1 試薬2 プロトコール

1 TUNEL 染色の原理 2 プロトコール

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4 その他の特殊染色

212

1 シリウスレッド染色 2 マッソントリクローム染色 3 クリューバー・バレラ染色 4トルイジン青染色 5 PAS 染色

第9章

画像解析

1 バーチャルスライドによる染色画像の取得

218

1 ImageJと HALO の比較 2 バーチャルスライドによる染色画像の取得

2 ImageJ を用いた陽性部位の面積測定

3 スキャンした画像の閲覧
222

1 解析画像の準備 2 ソフトのインストール 3 色分解により測定したい色を抽出する
画像の測定の際に単位を合わせたい場合

4 面積を測定する

5 複数

3 HALO を用いた陽性部位の面積測定

227◆索引2311 画像解析の手順

2 解析結果の確認①サンプルや染色方法によって固定液を選ぶ… ……………26⑯最適な ProK 濃度の探し方… ………………………………… 188②大切なシグナルを失わないための灌流固定… ……………36⑰ハイブリチャンバーの気密性と湿度調節… ……………… 191③灌流固定による組織の形態の変化… …………………………48⑱長すぎるハイブリ時間にご用心… …………………………… 193④ PCR 法を用いたマウス胎仔の性判別法……………………79⑲ ISH 発色停止のタイミング… ………………………………… 195⑤溶剤の使い回しはほどほどに… ……………………………… 103⑳カウンターステインの種類とコツ… ………………………… 196⑥ RNase にはどこまで気をつければ良いのか？… …… 116㉑ ISH の検出感度と遺伝子の発現分布… ………………… 198⑦湿度が染色の成否を左右する？！…………………………… 118㉒核酸医薬や遺伝子治療の分野におけるISH…………… 199⑧スライドガラス変われば染色像変わる… ………………… 122㉓その細胞，ヒト由来？マウス由来？………………………… 200⑨使える抗体は Google 先生に聞こう… …………………… 130㉔組織染色で死細胞を判断する新しい指標？…………… 201⑩ DAB の発色を見えやすくする………………………………… 151㉕空間トランスクリプトーム解析用の品質確認…………… 202⑪二重染色ができない組み合わせの抗体について… … 158㉖古代試料 DNA が残っている細胞はどれ？… ………… 203⑫臨床検体での ISH… ……………………………………………… 172㉗細胞数計測？ 面積測定？… …………………………………… 229⑬ ISH のネガコンはセンス鎖のみでよいのか？… ……… 173㉘線 維化の面積測定：マッソントリクロームvsシリウスレッド………………………………………………………… 230⑭プラスミドからの RNA 合成用鋳型調製… ……………… 180⑮プローブのアルカリ処理に要注意… ………………………… 183

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Contents

カバー写真解説A1

A2

A：線維化を可視化するシリウスレッド染色（A1，A3）およびHALO を用いた画像解析の証跡（A2）

B：マウス胎仔矢状断の in situ ハイブリダイゼーション（B1～B4：4 種類のプローブ）
A3
B1

B2

C
C：ヒト結腸癌の蛍光免疫染色（緑：αSMA，赤：CD31，青：DAPI）

B1

D1

B2

E1

E2

D：マウス腸管ロールの in situ ハイブリダイゼーション（D1）および HE 染色（D2）

E：マウス腎臓の免疫染色（E1）および in situ ハイブリダイゼーション（E2）F

D2
F：マウス海馬歯状回の蛍光免疫染色（緑：GFAP，赤：NeuN，青：DAPI）

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