41研究

亜鉛欠乏によって誘導される肝線維化のメカニズム
大阪市立大学大学院生活科学研究科栄養機能科学分野

要湯浅（小島）明子

旨近年，肝硬変患者における血清亜鉛濃度は健常者に比べて低値を示すことが報告されており，亜鉛と肝硬変の病態形成との関連性が示唆されているが，そのメカニズムはいまだ明らかにされていない．そこで，亜鉛欠乏によって誘導される肝線維化のメカニズムについて，in vitro
ならびに in vivo 実験系を用いて検討した．その結果，肝線維化・肝硬変の形成に重要な役割を示す肝星細胞は，亜鉛欠乏によってコラーゲン合成能を亢進させること，またそのメカニズムとして，NADPH oxidase による活性酸素種産生量が上昇することによって細胞内グルタチオン量を一過性に低下させ，このことがトリガーとなってコラーゲン合成能が亢進することが明らかとなった．一方，四塩化炭素（CCl4）投与による薬剤性肝障害モデルラットを用いて亜鉛欠乏食の肝障害に対する感受性について検討したところ，コントロール食を摂食した場合では肝障害が認められない低濃度の CCl4 を投与しても，亜鉛欠乏食の場合では肝線維化を発症したことから，亜鉛欠乏食は肝障害に対する感受性を促進させることが明らかとなった．
これらのことから，亜鉛摂取は肝線維化の予防に重要であることが示唆された．

亜鉛は細胞の生理活性や細胞増殖などにおいてるが，種々の病的刺激によって活性化し，コラー非常に重要な必須微量栄養素であり 1），抗酸化作ゲン線維などの細胞外マトリックスを多量に産生用による免疫調節作用や細胞保護効果，抗炎症作する筋線維芽細胞様に形質変換する 8, 9）．このこ用など重要な役割を示す 2）．とから，肝星細胞の活性化は肝線維化さらには肝近年，肝硬変患者における血清亜鉛濃度は健常硬変の原因となることが知られている（図 1）
．

3, 4）

．

ここでは，亜鉛欠乏によって誘導される肝線維

また，我々は分離肝細胞を亜鉛欠乏状態で培養す化のメカニズムについて，in vitro ならびに in

るとアポトーシス細胞死が誘導されることを明ら

vivo 実験系を用いて検討した結果を紹介する．

者に比べて低値を示すことが報告されている5）かにしている ．一方，四塩化炭素による実験的肝硬変モデルラットに亜鉛を投与すると肝障害や脂質過酸化が抑制されること 6, 7）が報告されている．

1．In vitro 実験系−亜鉛欠乏によって誘導される肝星細胞の活性化メカニズムについて

これらのことから，亜鉛と肝硬変の病態形成と分離肝星細胞は 13-14 週齢の Wister 系雄性ラッの関連性が示唆されているが，そのメカニズムはトの肝臓をプロナーゼ，コラゲナーゼ液で灌流しいまだ明らかにされていない．

た後，Nycodenz 溶液を用いた密度勾配遠心法に肝類洞壁細胞の一つである肝星細胞は，通常ビよって得た 10）．亜鉛のキレート剤として細胞膜タミン A を豊富に含む脂肪滴を有する細胞であ

非透過性の diethylenetriamine penta-acetic acid

42 ―― 亜鉛栄養治療

1巻1号

2010

Normal liver
Quiescenthepatic stellate cell

Hepatocyte

Sinusoidal lumen

Basement membrane - likematrix

図1

Matrix rich ininterstitial collagens I and III

Endothelial cells
lose fenestrae

Activation of hepatic stellate cells+DTPAControl
図2

Activated
hepatic stellate cell

Kupffer cell

Pit cellFenestrated
endothelium

Liver fibrosis+DTPA+ZnEﬀect of zinc deﬁciency on the expression of type I collagen in hepatic stellate cells

Microphotographs of immunohistochemical staining for type I collagen（original magniﬁcation: x200）.

（DTPA）を添加して 24 時間培養したところ，タ2.0

GSH (nmol/7.5 × 105 cells)

イプ I コラーゲン（Co I）合成能はコントロールに比べて有意に亢進したが，亜鉛を再添加するとCo I 合成能はコントロールレベルにまで低下した（図 2）．さらに，亜鉛欠乏によって誘導され**1.0

る肝星細胞の活性化メカニズムについて検討する
ため，細胞の酸化還元を調節する細胞内グルタチオン（GSH）量 11, 12） の挙動を調べたところ，肝星細胞内の GSH 量は，培養開始後 8 時間で亜鉛0.0
Control+DTPA+DTPA+Zn

欠乏群において有意に低下したが，亜鉛を再添加することによってコントロールレベルにまで回復

図3

Eﬀect of zinc deﬁciency on intracellular GSH

Each bar is the mean ± SD of three experiments(**; p ＜ 0.05 with control cells).

した（図 3）．
そこで，亜鉛欠乏による細胞内 GSH 量の低下

43

図4Control+DTPA+DTPA+NAC+DTPA+GEE

Eﬀect of NAC or GEE on zinc deﬁciency-induced expression of type I collagen in hepatic stellate cells
Microphotographs of immunohistochemical staining for type I collagen（original magniﬁcation: x 200）.

が肝星細胞の活性化に関与することを確かめるた

割を示すことから，亜鉛欠乏によって誘導されるめ に，GSH の 前 駆 体 で あ る N-acetylcysteine

細胞内 GSH 量の低下には酸化ストレスが関与し（NAC） ま た は GSH の エ ス テ ル 型 で あ るていることが示唆されるため，H2O2 産生量を測

glutathione ethyl ester（GEE）を DTPA と同時

定 し た と こ ろ， 亜 鉛 欠 乏 に よ っ て 肝 星 細 胞 のに添加することによって DTPA によって低下しH2O2 産生量は時間依存的に顕著に増加した．した細胞内 GSH 量を回復させると，亜鉛欠乏によっかしながら，亜鉛添加群ではコントロールレベルて顕著に亢進した肝星細胞の Co I 合成能は，コを維持したままであった（図 5）．次に，亜鉛欠ントロールレベルにまで抑制された（図 4）．

乏によって産生された H2O2 産生にはどの酸化酵

GSH は活性酸素種（ROS）の消去に重要な役素が関与しているのかを明らかにするために，

H2 O2 release (pmol/hr/7.5 × 10 5 cells)

ROS 産 生 に 関 与 す る 酸 化 酵 素 で あ る NADPH
400**

Control+DTPA+DTPA+Zn300

oxidase，mitochondrial oxidase お よ び xanthineoxidase の阻害剤を用いて H2O2 産生量の変化を**検討したところ，亜鉛欠乏によって過剰に産生さ**れた H2O2 量は NADPH oxidase の阻害剤である

200diphenyl iodonium（DPI）を添加することによって顕著に低下した（表 1）．しかし，mitochondrial

100oxidase の 阻 害 剤 で あ る rotenone や xanthine

00

図534Time (hrs)

56Eﬀect of zinc deﬁciency on H2O2 release

Each bar is the mean ± SD of three experiments(**; p ＜ 0.05 with control cells at the same time point).

oxidase の阻害剤である allopurinol を添加してもH2O2 産生量の抑制効果は認められなかった．また，この時，亜鉛欠乏によって増強した Co I 合成能は，DPI を添加することによって顕著に抑制

44 ―― 亜鉛栄養治療表11巻1号

2010

Eﬀect of inhibitors of oxidases on zincdeﬁciency-induced H2O2 release

H2O2release(pmol/hr/7.5 x 105cells)
86.7±26.8 a
379.7±92.6 b
149.5±26.9 a
484.5±140.1 b
294.6±99.3 b

GroupsControl+DTPA+DTPA+DPI+DTPA+rotenone+DTPA+allopurinol

Values are mean ± SD of three experiments. Data not sharing
common alphabet are signiﬁcantly diﬀerent（p ＜ 0.05）.

2．In vivo 実験系−薬剤性肝障害モデ
ルラットを用いた亜鉛欠乏食の肝障
害に対する感受性について
薬剤性肝障害モデルラットの作製には，Wistar（0.125系雄性ラットに低濃度の四塩化炭素（CCl4）または 0.25mL ／ kg BW）をオリーブオイルと 1：1 の割合で混合して，週 2 回ずつ腹腔内に投与した．飼料には Research Diets 社製のコントロール食（亜鉛含量：30ppm）または亜鉛欠乏食（亜されたが rotenone や allopurinol を添加しても Co鉛含量：0.85ppm）を用いて 3 週間飼育した．肝I 合成能は抑制されなかった．

障 害 の 指 標 で あ る 血 漿 中 の 逸 脱 酵 素（LDH，肝星細胞の活性化メカニズムには多くのサイト
9）

ALT および AST）活性は，食事中亜鉛含量の違カインが関与することが知られている ．その中いによって変化しなかった．しかしながら，低濃でも特に，TGF- βは細胞外マトリックスの産生度の CCl4 を投与したコントロール食群では，逸を促進することから，肝星細胞の活性化に重要な脱酵素の値は CCl4 無投与群と差が認められな役割を示すことがすでに明らかにされていかったのにもかかわらず，低濃度の CCl4 を投与

13, 14）．そこで，培養液中に遊離した TGF- β量した亜鉛欠乏食群では有意に高値を示した（図を経時的に測定したところ，DTPA を添加する7）．同様に，肝臓の組織染色においても，低濃度ことによって TGF- β産生量は経時的有意に増加の CCl4 を投与したコントロール食群では，肝障したが，亜鉛を添加することによってコントロー

害 は ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た が， 低 濃 度 のるルレベルを維持した（図 6）．
8000
60Control+DTPA+DTPA+Zn

40

LDH activity (U/L)

TGF - ß (pg/7.5 × 105 cells)**

503020**c

6000

4000****

10baabbba000468024

Time-dependent eﬀect of zinc deﬁciency on
TGF- β production

Each bar is the mean ± SD of three experiments(**; p ＜ 0.05 with control cells at the same time point).

123(Weeks)Time (hrs)

図6abb2000

図7Eﬀect of diet and CCl4 on plasma LDH
activity

Values represent the mean ± SEM of 5-7 rats. Datapoints not sharing a common letter are significantly
diﬀerent（p < 0.05）.
○；Control diet, □；Control diet+ CCl4（0.125 mL ／ kgBW）,△；Control diet + CCl4（0.25 mL ／ kg BW）,●；Zndeﬁcient diet, ■ ; Zn-deﬁcient diet + CCl4（0.125 mL ／ kgBW）,▲ ; Zn-deﬁcient diet + CCl4（0.25 mL ／ kg BW）.

45

図8adbecf

Eﬀect of diet and CCl4 on morphological changes of the liver

Liver sections were stained by Weigertʼs elastic van Gieson staining.
,（d）; Zn（a）; Control diet,（b）; Control diet+ CCl4（0.125 mL ／ kg BW）,（c）; Control diet+ CCl4（0.25 mL ／ kg BW）（, f）; Zn-deﬁcient diet+ CCl4（0.25 mL ／ kg BW）. Signiﬁcantdeﬁcient diet,（e）; Zn-deﬁcient diet+ CCl4（0.125 mL ／ kg BW）
hepatic necrosis（open arrow）is seen in（e）,and ﬁbrosis（arrow）is seen in（e）and（f）.

CCl4 を投与した亜鉛欠乏食群では，肝線維化をGSH 量が低下することによって，コラーゲン合発症していた（図 8）．

成能の亢進が誘導されたことが示唆された．さらに，in vivo 実験系において，亜鉛欠乏食は，コまとめントロール食を摂食した場合では肝障害が認められない低濃度の CCl4 を投与しても肝線維化が発In vitro 実験系において，亜鉛欠乏による肝星症したことから，肝障害に対する感受性を促進さ細 胞 の 活 性 化 メ カ ニ ズ ム と し て，NADPHせることが示唆された．これらのことから，亜鉛oxidase 活性が亢進することによって ROS の急は肝線維化の予防に重要な役割を果たすことが明

激な産生増加が生じ，それにともなって細胞内らかとなった．

46 ―― 亜鉛栄養治療

◆文

献1巻1号

2010――――――――

1）MacDonald RS : The role of zinc in growth andCaballeria J, Pares A, Joven J, Masana L, Rodes J :cell proliferation. J Nutri 130 : 1500S-1508S, 2000

Relationship between hepatic lipid peroxidation

2）Zalewski PD, Truong-Tran AQ, Grosser D,and fibrogenesis in carbon tetrachloride-treated

Jayaram L, Murgia C, Ruﬃn RE : Zinc metabolism

rats : eﬀect of zinc administration. Clin Sci 83 : 695-in airway epithelium and airway inflammation :basic mechanisms and clinical targets. A review.
Rharmacol Ther 105 : 127-149, 2005
3）Bode JC, Hanisch P, Henning H, Koenig W,Richter FW, Bode C : Hepatic zinc content inpatients with various stages of alcoholic liver700, 19928）Friedman SL : Molecular regulation of hepaticfibrosis, an integrated cellular response to tissue
injury. J Biol Chem 275 : 2247-2250, 2000
9）Friedman SL : Cytokines and ﬁbrogenesis. Semin
Liver Dis 19 : 129-140, 1999

disease and in patients with chronic active and10）Kojima-Yuasa A, Ohkita T, Yukami K, Ichikawa

chronic persistent hepatitis. Hepatology 8 : 1605-H, Takami N, Nakatani T, Kennedy DO, Nishiguchi

1609, 1988

S, Matsui-Yuasa I : Involvement of intracellular4）RodriguezMoreno F, GonzalezReimers E,

glutathione in zinc deﬁciency-induced activation of

SantolariaFernandez F, GalindoMartin L,

hepatic stellate cells. Chemico-Biol Interact 146 :HernandesTorres O, BatistaLopez N, MolinaPerez
M : Zinc, copper, manganese, and iron in chronic
alcoholic liver disease. Alcohol 14 : 39-44, 1997

89-99, 2003
11）Young IS, Woodside JV : Antioxidants in healthand disease. J Clin Pathol 54 : 176-186, 2001

5）Nakatani T, Tawaramoto M, Kennedy DO,

12）Hoshi T, Heinemann S : Regulation of cell

Kojima A, Matsui-Yuasa I : Apoptosis induced byfunction by methionine oxidation and reduction. J

chelation of intracellular zinc is associated withPhysiol 531 : 1-11, 2001

depletion of cellular reduced glutathione level in13）Hellerbrand C, Stefanovic B, Giordano F,rat hepatocytes. Chem-Biol Interact 125 : 151-163,

Burchardt ER, Brenner DA : The role of TGF beta

2000

1 in initiating hepatic stellate cell activation in vivo.

6）Chvapil M, Ryan JN, Elias SL, Peng YM :J Hepatol 30 : 77-87, 1999

Protective effect of zinc on carbon tetrachloride-14）Castilla A, Prieto J, Fausto N : Transforming

induced liver injury in rats. Exp Mol Pathol 19 :growth factor beta 1 and alpha in chronic liver

186-196, 1973

disease : eﬀects of interferon alfa therapy. N Engl J7）Camps J, Bargallo T, Gimenez A, Alie S,

Med 324 : 933-940, 1991