平成10年度 研究親告 大分県産業科学技術センター

酵素の触媒機能の解明およびその食品工業への応用
一青カビの生産するセリンプロテア山ゼに関する研究一山本展久・佐野一成
食品工業部

Cb急ぎaeもerizationofCaもa且yもicFunc也onsofEnzymes
andÅpがkaもion七0七ぬeぎ00鮎王n捜ustries
・SもⅦdyonSey血eProもe血ase缶omき短艇瓜馳闇α恕血胤掛NobuhiさaTAhnMOTO・KazunariSANOFoodScieneea11dTechnologyDiヽ・ision

要 旨
青カビ（j海月プd〟血戊dは玩び戯）からセリンプロテアーゼを精製した．本酵素の至適pHは11．0であり，アルカリプロテアーゼであることが示唆された．食品工業への応用を考慮して中性（pH7．0）とアルカリ性（pHll．0）の両方で検討した．至適温度は，pH7．0では500c，PHILOでは30℃であった凸 しかし，低温域でも酵素活性は，通常の酵素に見られるほどは低下せず，低温性を有していることが観察された，特に，PH7．0では30℃より低温域で活性低下のパターンに変化が見られ，触媒作用の変化が示唆された．pH7．0では0℃から30℃まで酵素活性は100％残存したが，pHll．0
では30℃でほとんど活性が消失し，40℃では完全失活した。至適温度から，自己消化によるものであると考察した。
1，緒 貰

適温度は30℃付近にあるものの，低温領域までその活性食品工業において酵素利用は重要な役割を担っている．

が残存していることが観察された．膏カビは冷蔵庫など酒類やみそ・しょうゆのような発酵食品も微生物が生産の低温域でも繁殖することから青カビの生産する他の酵する酵素を利用しているといえる（1）（2）．酵素の利用は，素についても低温性を有していることが予測される．

その生産物を直接利用する（アルコール発酵やうま味成分発酵など）場合以外にも製造行程の改善（発酵製造中の粘度低下など）や食品の高付加価値化（フレーバー

2．実験方法や2．1セリンプロテアーゼの精製うま味の付与など）といった用途にも使用されている。

プロテアーゼB原抹7gを5mMリン酸緩衝液（pH7．0）に近年の消費者の食に対する意識の向上から，今後も酵素懸濁し，一晩撹絆した．遠心して得られた上浦を同緩衝の利用範囲はさらに拡大するものと考えられる．

液に対して透析した．透析後，再び遠心し，上清をCM−BiogelAおよびCM−Sepbaroseに供した．活性画分

酵素の種類。数は極めて多いが，本研究では，特に低温領域で触媒機能を発揮する酵素について検討した．酵を集め，蒸留水に対して透析し，凍結乾燥して精製酵素

素は通常，至適温度で最大活性を示す．その至適温度はを得た．

酵素固有の温度であり，かなりの高温まで触媒機能を発2．2 活性測定法（7）揮する高温性酵素に関しては多くの例が報告され，高温酵素溶液100〃1に2．5％ミルクカゼイン溶液1mlを加性はその構造的な特徴によるものと考察されている。しえ，30℃で保温した．一定時間後，鴎トリクロロ酢酸2ml

かし，低温領域で活性を維持するような酵素の例はほとを加えて反応を停止させた．濾過し，濾液0．5mlに0．4料宣

んどなくヲ 低温性酵素の機能解明とその食品製造への応Na2CO32．5ml，6倍稀釈のフォリン試薬0．5mlをそれぞれ用が期待されている．

加え，30℃，20分保温後660nmで吸光度を測定した．

青カビ属（廃ぷJd肪び戯属）は菌体外に蛋白質分解酵

2．3 至適pHの測定

素（プロテアーゼ）の一種であるセリンプロテアーゼを50mMNa2B407を緩衝液として，各pHでの2．5％ミルクカ生産する（3）〜（6）。本研究では属誠立通血盟（正銘肌閻の生ゼイン溶液を作成した。活性測定は2．2に準じて行った．

産するセリンプロテアーゼについて検討したところ，至w174−

平成10年度 研究部告 大分県産業科学技術センター

2．4 皇道温度の測定

至適温度の測定には，緩衝液として 50m賊リン酸（pH7・0）および50m随Na2B407（pHll．0）を用いた．それぞれの緩衝液で2．5％ミルクカゼイン溶液を調製し，各温度で酵素活性を2．2に準じて測定した．
2．5 温度安定性の測定
温度安定性の測定には，緩衝液として100感奮リン酸（pH7・0）および100mMNa2B407（pHll．0）を用いた．それぞれの緩衝液に酵素を溶解し，各温度で30分間保温した．

pHll，0の緩衝液で2．5％ミルクカゼイン溶液を調製し，30℃で酵素活性を2．2に準じて測定した▲
789 10 11 12PH3。結果および考察
3．1セリンプロテアーゼの精製

Fig．且普カピセ臣ジンプロテア叫ゼの望遠pH

精製表をでabl￠1に示す．全活性として約10％の回収率で，4。6倍に精製できた。精製過程で1回目の透析の際，透析膜が分解される現象があった．酵素原抹中にはセルラーゼが存在すると予想され，そのために透析膜の分解が進んだものと考察した．透析作業は低温での操作であり，青カビ由来のセルラーゼも低温性を有していることが示唆された．

Tablel書カビセリンプロテアーゼの精製表
Puri蔦cation Total Speci負c Recoveyy Puri鮎ation
Sもep Activity Activity
Crude
Extract（nkat） （nkat）（％）

8，830 0．008

100（・払1d）201406080

温度（℃）

CM−Bioge1 2讐400 0．023
980 0rO37

27．2

2．9

11．1

4．6

ぎig．2骨カピセgノンプ田テア剛ゼの豊適温慶

カリ性での至適温度が30℃となったと考察した。
またタ 本酵素の大きな特徴として，低温域で酵素活性3．2 本酵素に及ぼすpHの影響の残存率が高いことが上げられる。で象ble2 に中性本酵素に対する反応系のpHの影響を観察した．結果を（pH7．0トアルカリ性（pHll。0）それぞれの30℃での酵

yig．且に示す．本酵素はpHll。0で最大活性を示し，アル素活性を100としたときの低温域での各温度の相対活性カリプロテアーゼであることが示唆された．食品工業への応用を考えて，以下の検討は中性（pH7．0）とアルカリ，rable2 低温領域での相対活性性（pHll．0）の両方で行うこととした，

温 度（Oc）

3．3 木酢乗に及ぼす温度の影響
本酵素に対する反応系の温度の影響を観察した．結果PH

5 10 柑 2￠ 25 30

7．0

1911．011 23をFig。2に示す．至適温度は，中性（pH7．0）で50℃，アルカリ性（pHll．0）で300cであった．至適pHである

46

−60

アルカリ性では酵素の活性が非常に高く，30℃を超えた付近から自己消化が始まったと考えられ，そのためアル

−175−

3753

86 100− 100平成10隼度 研究朝告 大分県産業科学技術センターを示す．中性では，5℃という低温でも，酵素活性が30℃4． まとめの約20％も残存していることがわかる．透析時の透析膜

膏カビ（ゐ刀プd払び皿d奴血日用）からアルカリ・セリ分解活性を考え合わせると，青カビは低温域でも活性をンプロテアーゼを精製した．

維持できる酵素群を生産している可能性がある．本来青（1）本酵素に対する反応系のpHの影響を観察したところ，至適pHは11。0であった．

カビは冷蔵などの低温貯蔵中も繁殖するものであり，低温性酵素群の生産は十分納得できるものである．

（2）本酵素に対する反応系の温度の影響を観察したところ，至適温度はpH7．0で50℃，pHll．0で30℃であっさらに特徴的な点は，中性での酵素活性の低下様式である．Fig−2のグラフに見られるように30℃を境に大きた．

く折れ曲がるような挙動を示し，何らかの触媒作用の変（3）本酵素は，pH7．0で30℃まで安定であったが，pHll．0化が示唆された．これは構造的な変化の可能性が大きく，では30℃でほとんど失活し，40℃で完全失活した．

今後30℃前後の温度域での構造の変化をとらえる必要（4）本酵素の酵素活性は，低温域でも通常の酵素に見られがある．

るほどは低下せず，低温性を有していることが観察さ3．4 本酵素の温度安定性れた。特に，PH7．0では30℃を境に活性低下のパター

本酵素の温度に対する安定性を観察した．結果をFig．3

ンに変化が見られ，触媒作用の変化が示唆された一に示す。中性（pH7．0）では，300cまでは酵素活性は100％残存したが，アルカリ性（pHll．0）では300cでほとんど5．参考文献

酵素活性が消失し，40℃では完全失活した．至適pHから

1）林和也，福島男児，茂木孝也：調味科学，17，（1970），

考えると，アルカリ性では酵素活性が非常に高く，至適161−169

温魔の30℃では自己消化が起こり，残存活性が著しく低

2）一島英治：日本醤油研究所雑誌，13，（1987），42−48

下したものと考察した。また，アルカリ性では低温領域

3）T．Xisbida，S．Ybsbimuya：J。Biochem．，55，（1964），95−

でも酵素活性の低下が見られはじめており，この事実も1014）K．Hayasbi：Agric．Biol．Cbem‥31，（1967），642−643

本酵素の低温性を支持するものであると考えた．

5）富山清善，杉森恒武，片桐英郎：醗工誌，38，（1960），
355−359，360−364
6）吉村貞彦：兵庫農大紀要（農芸化学編），5，（1962），︵UnO

97−100O31，（1967），1237−1241n︶
企V︵ぎ︶鯉無夜空7）Ⅹ．Hayasもi，D．yukuさ血ima，K．Mogi：A如c．Biol．Cbem。，

4O
0 10 20 30 40 50 60
2温度（℃）

Fig．3育カビのセリンプロテアーゼの温度安定性−176−