Jpn J Clin Ecol（Vol.24 No.1 2015）

48

原

著

奨励賞受賞発表論文

低用量フタル酸エステル曝露による自己免疫性精巣炎への影響
寺山隼人1）、伊藤正裕2）、平井宗一2）、内藤宗和3）、曲寧2）、倉升三幸2）、小川夕輝2）、
畑山直之2）、林省吾2）、平柳淑恵2）、隅山香織1）、金沢輝久1）、坂部貢1）○

1）東海大学医学部基礎医学系生体構造機能学
2）東京医科大学人体構造学分野
3）愛知医科大学医学部解剖学講座

Effect of low-dose di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)
exposure to testicular autoimmunity in mice
Hayato Terayamaa)*, Masahiro Itohb), Shuichi Hiraib), Munekazu Naitoc),
Ning Qub), Miyuki Kuramasub), Yuki Ogawab), Naoyuki Hatayamab),Shogo Hayashib), Yoshie Hirayanagib), Kaori Suyamaa),
Teruhisa Kanazawaa), and Kou Sakabea)a) Department of Anatomy, Division of Basic Medicine, Tokai University School of Medicineb) Department of Anatomy, Tokyo Medical Universityc) Department of Anatomy, Aichi Medical University

要約

フタル酸エステル（Di-(2-ethylhexyl) phthalate：DEHP）の曝露により誘導される、酸化ストレスやアジュバント効果の影響により、精子形成障害が引き起こされることが報告されている。我々は、精子形成障害が誘導されない低用量の DEHP の曝露であっても、精巣内の免疫環境が変化していることを報告している。成熟精子は免疫系が既に確立された思春期以降に精細管内に出現するため、免疫系から異物として認識される様々な自己抗原を含んでいる。一方で、セルトリ細胞で構成される血液－精巣関門（BloodTestis Barrier：BTB）により、これらの自己抗原は免疫系の攻撃から守られている。以前、我々は、同系のマウスから精巣生殖細胞（Testicular Germ Cell：TGC）の皮下注射を１回するだけでは明らかな精子形成障害が誘導できないが、2回以上皮下注射する事でリンパ球の浸潤と精子形成障害を特徴とする実験的自己免疫性精巣炎（Experimental Autoimmune Orchitis：EAO）が誘導されることを示した。本研
究は、低用量 DEHP 曝露が EAO 発症に及ぼす影響を解析した。

受付：平成27年9月2日 採用：平成27年9月3日
別刷請求宛先：寺山隼人〒259-1193 神奈川県伊勢原市下糟屋143 東海大学医学部基礎医学系生体構造機能学
Reprint Requests to Hayato Terayama, 143 Shimokasuya, Isehara-si, Kanagawa, 259-1193, Japan. Department of Anatomy, Division of Basic
Medicine, Tokai University School of Medicine

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臨床環境医学（第24巻第１号）

実験動物は10週齢 A/J マウスを用いた。実験群は① Control 群：通常の食餌、② DEHP 群：0.01%DEHP
含有食餌、③ TGC 群：通常の食餌＋ TGC の１回皮下注射、④ DEHP ＋ TGC 群：0.01%DEHP 含有食餌
＋ TGC の１回皮下注射、の4群とした。注射から8週間後に安楽死させ、精巣と血清の解析を行った。解析方法は組織化学染色（HE 染色、HRP 染色）、免疫組織化学染色（F4/80、IFN-γ、血清抗体）、Realtime PCR（F4/80、IFN-γ）、ELISA（血清 IgG）を用いた。
TGC 群は、精子形成障害が誘導されないが、精巣内への僅かなリンパ球浸潤、IFN-γ mRNA の上昇、精子・精子細胞に対する自己抗体の出現が認められた。DEHP 群は、TGC 群の障害に加え、HRP の精細管内への侵入やセルトリ細胞の空胞化が観察され、BTB の障害が認められた。さらに、DEHP ＋ TGC 群
は、重度の EAO の誘導、精子・精子細胞に対する自己抗体の出現、HRP の精細管への侵入が観察され、他群と比較して、F4/80 mRNA、IFN-γ mRNA、自己抗体の上昇が認められた。本研究にて、精子形成障
害をきたさない量の DEHP 曝露であっても、BTB が障害され、自己免疫性精巣炎が誘導されやすい状態になっていることが明らかになった。
（臨床環境 24：48－57，2015）《キーワード》フタル酸エステル、低用量曝露、マウス、実験的自己免疫性精巣炎

Abstract
Exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces spermatogenic disturbance (SD) throughoxidative stress, and affects the immune system by acting as an adjuvant. Recently, we reported that a
low dose of DEHP, which does not affect spermatogenesis, was able to alter the testicular immune
microenvironment. Experimental autoimmune orchitis (EAO), an organ-specific autoimmunity of thetestis, can be induced by repeated immunization with testicular antigens, and its pathology is characterized by the appearance of autoantibodies and SD. In the present study, we investigated the effect of
low-dose DEHP on EAO susceptibility. The results showed that exposure to 0.01% DEHP-containing
food caused a little functional damage to the blood-testis barrier with an increase of interferon gamma
and resulted in the appearance of serum autoantibodies targeting haploid cells, but did not affect the
spermatogenic state in mice. While only one immunization with testicular antigens caused very mild
EAO, DEHP exposure after one immunization with testicular antigens induced severe EAO with significant increases in macrophages, interferon gamma, lymphocytic infiltration, and serum autoantibodies,accompanied by severe SD. Therefore, exposure to low-dose DEHP alone does not induce significant SD;
however, it can cause an increase of interferon gamma and a little functional damage of the blood-testis
barrier in the testis with leading to an autoimmune response against haploid cells autoantigens, result( Jpn J Clin Ecol 24 : 48－57, 2015)
ing in increased susceptibility to EAO.
《Key words》di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), Low-dose, mouse, experimental autoimmune
orchitis (EAO)

Ⅰ緒言

おいて免疫原性活性を増強することができ、そのNielsen らは、「環境汚染物質の曝露は免疫系にため、DEHP はアジュバント作用を有する（3 7）。ま影響を与える。」と提唱した1）。合成ポリマープラ

た、DEHP への曝露はマウスおよびラットにおけスチックの可塑剤として広く使用されている

る精子形成障害を惹起し、精巣の萎縮を引き起こ

Di-(2-ethylhexyl) phthalate（DEHP）は、免疫応す（8 13）。いくつかの研究では、DEHP は代謝によ答を促進する生体異物としての性質を有している2）。

り最初 mono-2-ethylhexyl phthalate（MEHP）に

DEHP 自体は免疫原性抗原ではないが、マウスに加水分解され、その後は複雑な代謝過程を経る。

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その代謝過程で酸化的ストレスによる精子形成障。さらに生殖細胞害の誘導が報告されている（8-13）

Ⅱ対象と方法
1, 実験動物の支持細胞であるセルトリ細胞の細胞質に小空胞動物は9週齢 A/J マウスの雄（Charles Riverが 発 生 す る 事 が 報 告 さ れ、 血 液 － 精 巣 関 門

laboratories Japan, Kanagawa, Japan）を購入（Blood Testis Barrier: BTB）のタイトジャンクし、その後1週間東京医科大学の動物実験セン

ションの形態学的変化が生ずる可能性が示唆され

ターにて飼育したものを実験に用いた。マウスは。最近我々は精子形成障害が誘導されな

室温23±1℃、湿度55±5％、12時間ごとの明暗周期

い程度の低濃度 DEHP 曝露マウスにおいて、セルの条件下で飼育し、固形飼料ならびに水を自由摂トリ細胞に小空胞を出現させ、BTB へダメージ取させた。なお、本研究で行う動物実験についてを与え、リンパ球浸潤に伴い、インターフェロン

は動物実験の倫理性と安全性を確保するために、

γ（IFN-γ）の mRNA 発現上昇など精巣の微小環

日本学術会議作成の「動物実験の適正な実施に向

ている

（14）

境が変化する事を報告した。

けたガイドライン」に則り、東京医科大学動物実（15）

精子・精子細胞は免疫系の成熟後に精細管内に出現してくるため、発達段階において新生児免疫験委員会の承認を得て行った。
2, 化学物質

寛容が誘導されず、体細胞と時期的なずれが生じ

気液クロマトグラフィーにて98％の化学純度でている。そのため、宿主にとって異物と認識され、あ る Bis（2－ ethylhexyl）Phthalate（DEHP）

精子・精子細胞抗原に対する自己免疫性炎症が起（Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo,

きやすいと考えられている。一方、通常はセルトJapan）を用いた。マウスに投与する飼料 CLEA

リ細胞同士の連結で構成される BTB により精Rodent Diet CE-2（CLEA Japan, Inc., Tokyo,

子・精子細胞は免疫系から隔絶されていると推察

Japan）を購入し、0.01％ DEHP 含有 CE-2飼料

されている。しかし、精巣マクロファージの分布を 作 製 し た（Oriental Yeast Co., ltd., Tokyo,や管上皮細胞による精子貪食機構などの報告によJapan）。今回使用した0.01％ DEHP 含有 CE-2飼

り、精子・精子細胞は免疫系に認識されている料は0.0113から0.0133mg/g/日の量に当たり、マが、自己拒絶が引き起こらない程度に何らかの免

ウ ス に お け る DEHP の NOAEL（no-observed-。

adverse-effect level）値と同等である（22）。また、疫学的抑制機構が働いている可能性がある（16, 17）

実験的自己免疫性精巣炎（EAO）は、IFN-γ の増以前の我々の実験では、0.01％ DEHP 投与群と対加、BTB の破綻および精子形成障害に伴いマク照群との間の食物および水の摂取量における有意

ロファージやリンパ球が浸潤することで引き起こ

差はなかった（15）。さらに、0.01％ DEHP 投与群とされる自己免疫原性の精巣機能障害である。最近

対照群との間の体重および精巣重量における有意の研究おいて、自己免疫性精巣炎が主な男性不妊差はなかった（15）。

の原因の一つとして提案されている（18 20）。した

3, 精巣生殖細胞（Testicular Germ Cell: TGC）-

がって、EAO は特発性男性不妊症の慢性炎症モの単離。DEHP は男性生殖および免疫微EAO の誘導（n=8）および ELISA（n=6）で必小環境の両方に影響を有するため、比較的低用量

要な TGC を準備するため、10週齢 A/J マウスのの DEHP を投与することで EAO の誘導を促進さ

雄を安楽死後、精巣を摘出し、Hanks' balanced

せ る 可 能 性 が 考 え ら れ る。 本 研 究 の 目 的 は、

salt solution（HBSS）上でステンレスメッシュに

DEHP 曝露が EAO に対する感受性に影響を与えて単離し、遠心（400g・10分間）を行った（23）。

るかどうか調査することである。

4, 実験方法

デルである

（21）

以前、我々はアジュバントを使用せずに1×107
個の TGC のみを2週間おきに2回皮下注射し、高率に EAO を誘導できる事を報告した（19、23）。さら

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臨床環境医学（第24巻第１号）

51に TGC を繰り返し皮下注射すればするほど、よControl 群（n=4）、DEHP 群（n=4）、TGC 群

り確実に EAO を誘導することが出来るが、1回（n=4） お よ び DEHP ＋ TGC 群（n=4） か ら 摘

TGC を皮下注射しただけでは、EAO を誘導でき出した精巣を OCT コンパウンドで包埋後、迅速。したがって、本研究で液体窒素で凍結、厚さ5µm の切片をクリオスタッ

は、低用量 DEHP 曝露が EAO 誘導を促進できるト（HM-550; Microme 社 ） に て 作 製 し た 後、かどうか調べるため、TGC をマウスに1回皮下注

IFN-γの染色には－20℃のアセトンで2分間固定射することを選択した。

し風乾したものを用いた。また、F4/80の染色にる可能性が低くなる（23）

実 験 方 法 と し て、CE-2飼 料 投 与 群 に HBSS

は95％アルコールにて10分間固定し風乾したもの（0.2ml）を1回皮下注射した群（Control 群 : n=8）、を用いた。組織切片は、非特異的染色を防止する

0.01％ DEHP 含有 CE-2飼料投与に HBSS を1回ためにブロックエース（DS Pharma Biomedical

皮下注射した群（DEHP 群 : n=8）、CE-2飼料投与

Co.,Ltd., Osaka, Japan）10分、内因性ペルオキ群に TGC（1×10 個/0.2ml）を1回皮下注射した群

シダーゼ反応の除去に0.3％過酸化水素水 - メタ

（TGC 群 : n=8）、0.01％ DEHP 含有 CE-2飼料投ノ ー ル 溶 液30分、Protain Block, Serum-Free

7

与に TGC を1回皮下注射した群（DEHP ＋ TGC（Dako, Glostrup, Denmark）で20分ブロッキン

群 : n=8）、の4群にマウスを分け、10週齢から18週グしたのち1次抗体および陰性対照には1％ BSA

齢までの8週間自由給餌および水を自由摂取させ

添加 PBS を用い、室温で2時間反応させた。2次た。18週 齢 に て ソ ム ノ ペ ン チ ル（Kyoritsu

抗体としてビオチン化抗 IgG 抗体（Vector Labo-

Seiyaku Corporarion, Tokyo, Japan）による深麻ratories, California, USA）を室温で30分間反応

酔下にて心採血後、開腹処置を行い、精巣を摘出さ せ た。 そ の 後、VECTASTAIN Elite ABC kit

した。

（Vector laboratories, California, USA） を 室 温

5, 組織化学的観察

30分 間 反 応 さ せ、DAB Substrate Kit（Vector

Control 群（n=4）、DEHP 群（n=4）、TGC 群

laboratories, California, USA）を用い室温で5分（n=4）および DEHP ＋ TGC 群（n=4）から摘出

間反応させ発色し、光学顕微鏡で観察した。1次した精巣をブアン液にて3日間固定した。その後、

抗 体 と し て ラ ッ ト 抗 F4/80 抗 体（macrophage

常法通りにエタノールで脱水し、プラスチック包

marker、1:500 dilution, Abcam, Cambridge,

埋（Technovit 7100、Kulzer 社）を行った。5μmUK）、 ラ ッ ト 抗 IFN -γ 抗 体（1:100 dilution,の切片をミクロトーム（HN-360; Microme 社）に

Calbiochem, Darmstaolt, Germany）を用いた。

て作製し、ヘマトキシリンと2% エオジンにて染

ま た2次 抗 体 は ビ オ チ ン 化 抗 ラ ッ ト IgG 抗 体色（HE 染色）を行い光学顕微鏡で観察した。各

（VECTASTAIN Elite ABC kit, Vector laborato-

群の4検体から得られた HE 染色組織切片を観察

ries, California, USA）を用いた。

し計測を行った。精子形成障害の判定にはジョンb）自己抗体ソンスコアを用いた。1検体あたり無作為に選ん10週齢 A/J マウス（n=3）からから摘出しただ精細管100個をスコア1（繊維成分のみで細胞組精巣を OCT コンパウンドで包埋後、迅速液体窒織なし）からスコア10（完全な造精機能や精細胞素で凍結、厚さ5µm の切片をクリオスタットに層が厚く正しく配列し、内腔があり数多くの精子て作製した後、－20℃の95% エタノールで10分。リンパ間固定し風乾した。組織切片は、組織切片は、非球の測定は、1検体あたり無作為に5箇所の精巣間特異的染色を防止するためにブロックエース10

質を選択し、間質1mm あたりに含まれるリンパ分、内因性ペルオキシダーゼ反応の除去に0.3％

球数を数えた（15）。

過 酸 化 水 素 水 - メ タ ノ ー ル 溶 液30分、Protain6, 免疫組織学的観察

Block, Serum-Free で20分ブロッキングしたのちa）F4/80および IFN-γ

1次抗体および陰性対照には1％ BSA 添加 PBSを認める）に分類し、判定を行った
2

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Jpn J Clin Ecol（Vol.24 No.1 2015）

52を用い、室温で2時間反応させた。Horseradish（pH7.4, 4℃）での灌流固定を行い、さらに1% パ

Peroxidase（HRP） 標 識 二 次 抗 体（ 抗 マ ウ ス

ラホルムアルデヒド -0.1M リン酸緩衝液（pH7.4,

IgG 抗 体 ） に 室 温 で30分 間 反 応 後、DAB Sub-4℃）で1時間浸漬固定した。次に、10％スクロー

strate Kit を用い室温で5分間反応させ発色し、ス加 PBS 溶液で１時間、20％スクロース加 PBS

光学顕微鏡で観察した。1次抗体として Control

溶液で１時間、30％スクロース加 PBS 溶液で１群（n=4）、DEHP 群（n=4）、TGC 群（n=4）お時間、固定組織の洗浄を行った。OCT コンパウン

よ び DEHP ＋ TGC 群（n=4） の 血 清（1:50 di-

ド包埋後、迅速液体窒素で凍結、厚さ5μm の切片

lution）を用いた。

を 作 製 し た。 １ 時 間 風 乾 の 後、0.01%H2O2含有

7, Real time RT-PCR

0.1% ジアミノベンチジン -50mM トリス緩衝液

Control 群（n=4）、DEHP 群（n=4）、TGC 群（n=4）および DEHP ＋ TGC 群（n=4）より摘出（pH7.6）で発色し、光学顕微鏡で観察した。
9, ELISAした精巣をそれぞれ RNA 抽出 kit である TRIzol

単離した TGC を carbonate-bicarbonate buffer（Invtrogen, Tokyo, Japan）を用い、手順は同社（Sigma）中でホモジネーションを行い、microti-のマニュアルに従い RNA 抽出を行った。吸光度

ter plate（Nunc 96 micro-well plate; Thermoを測定した後、High Capacity cDNA Archive Kit

Fisher Scientific, Kanagawa, Japan）のウェル（PE Applied Biosystems, California, USA）を用に分注後、37 °C で30分インキュベーションした。

い、手順は同社のマニュアルに従い逆転写を行っ

coating solution を分注後、PBS-Tween 20で3回た。また逆転写反応には iCycler Thermal Cycler

洗浄した。ラビット 抗 GAPDH 抗体（housekeep-（Bio-Rad, California, USA）を使用し、検体は使ing gene; Bethyl Laboratories, Inc., TX, USA;

用時まで -80℃にて保管した。Real-time RT-PCR

1/200 ～1/1000 dilution）に1% ヤギ血清 を添加

解析を用いて、マウスの IFN-γ（3’-tgaacgctaca-

した PBS で血清を連続的に希釈し、GAPDH 抗体

catgcatcttcc-5’, 3’-cgactccttttccgcttcctgag -5’）、

および希釈血清をウェルに200 µL 分注後、2時間

F4/80（3’-ctttggctatgggcttccagtc-5’, 3’-gcaaggag-

室温でインキュベーションした。さらに、PBS-

gacagagtttatcgtg -5’）と内部標準物質である

Tween 20で5回洗浄後、HRP 標識ヤギ抗ラビット

Glyceraldehyde 3-phosphate（GAPDH）（3’IgG 抗体（Cappel, PA, USA; 1:1000）、anti--tgtgtccgtcgtggatctga-5’, 3’-ttgctgttgaagtcgcag-

GAPDH antibody、HRP 標識ヤギ抗マウス IgG

gag-5’） を 測 定 し た。Real-time PCR は SYBR

抗体（Cappel, PA, USA; 1:1000）を20µL 分注し、Premix Ex Taq II（TaKaRa） お よ び Thermal

2時間室温でインキュベーションした。ウェルをCycler Dice Real-Time System TP800（TaKaRa）

PBS-Tween20で5回 洗 浄 し た 後、pNPP 溶 液を使用し、2∆∆ Ct（comparative Ct method）法（Alkaline Phosphatase Yellow）を200μL ずつ各で行った。なお、各遺伝子の発現量は、内部標準

ウェルに添加し、30分室温でインキュベーション（GAPDH）の発現量により補正した後、対照群とした。測定は microtiter plate reader（NJ-2300,

比較し、その発現比を算出した。

Nalge, Tokyo, Japan）を用いて吸光度450 nm に

8, HRPて行った（25）。

BTB の状態を検証するため、トレーサーである

10, 統計horseradish peroxidase（HRP:10mg/mouse、

統計解析は Microsoft Excel（Microsoft 社）を

SIGMA 社 ） を 生 理 食 塩 水0.2ml に 溶 解 し て、用いて行った。各種測定値は平均値 ± 標準偏差Control 群（n=4）、DEHP 群（n=4）、TGC 群で表し、t 検定にて統計学的に解析した。有意水（n=4）および DEHP ＋ TGC 群（n=4）に腹腔内

準は0.05以下とした。

注射した。30分後にソムノペンチル麻酔下で2%Ⅲ結果

パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド -0.1M リ ン 酸 緩 衝 液

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Control 群、DEHP 群、TGC 群および DEHP

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臨床環境医学（第24巻第１号）

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図1. Images of testicular sections stained with hematoxylin and eosin (a, b, c, and d) in the control (a), DEHP (b), TGC (c), and
DEHP+TGC (d) groups. Black arrows indicate vacuoles in the cytoplasm of the Sertoli cells. White arrows indicate infiltrating
lymphocytes. Note the spermatogenic disturbance with many infiltrating lymphocytes in d. 文献42を改変

図2. The grade of spermatogenic disturbance (a) and lymphocytic infiltration (b) in the control, DEHP, TGC, and DEHP+TGC
groups. The number of lymphocytes in 1mm2 testicular interstitium. The mean ± SD of 4 mice per group in shown in each column.
文献42を改変＋ TGC 群の病理組織学的評価は、図1および図2

間質ではなく精巣白膜に若干のリンパ球浸潤をに示す。DEHP 群はいくつかの精細管中に生殖認めたが、残りの3匹は白膜および間質（図1c、図細胞の脱落およびセルトリ細胞の細胞質の小空2b）にリンパ球浸潤は認められなかった。対照的

胞形成を認め（図1b）、精巣間質に少数のリンパに、DEHP+ TGC 群はすべてのマウスに重度の球を認めた（図1b、図2b）。TGC 群の4匹中1匹は精子形成障害と間質にリンパ球浸潤が認められ

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Jpn J Clin Ecol（Vol.24 No.1 2015）

54

た（図1d、図2b）。 DEHP+ TGC 群の精子形成障

けでは EAO を誘導することは難しいが、同時に害とリンパ球浸潤は Control 群、DEHP 群および低用量 DEHP 曝露する事によって、EAO を増悪

TGC 群に比べ優位に高かった（図2）。

させることがわかり、低用量 DEHP 曝露は EAO

F4/80陽 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ は、Control 群、感受性を増加させることが示された。

DEHP 群、TGC 群および DEHP ＋ TGC 群の間

セルトリ細胞同士の連結で構成される BTB に質に認められ、特に DEHP+ TGC 群では、多く

よって自己抗原性の強い TGC は全身の免疫系かの F4/80陽性マクロファージが精子形成障害のあら守られている。そのセルトリ細胞がマウスやる精細管周囲の間質において観察された。 IFN-γ

ラットの実験において、DEHP や MEHP の毒性

は、Control 群、DEHP 群、TGC 群および DEHPの主な標的となっていることが報告されている＋ TGC 群のセルトリ細胞と間質の細胞で検出さ（26、27）

れ、特に DEHP+ TGC 群では、間質中の炎症性子である claudin-11、Cx43、ZO-1などを発現低細胞と関連して広範囲に検出された。

下 さ せ 生 殖 細 胞 の 脱 落 を 誘 導 す る（28）。 ま た、

。DEHP や MEHP は BTB の細胞接着関連分

精巣中の F4/80 mRNA 発現は、Control 群およ

MEHP の曝露は隣接するセルトリ細胞間のタイび DEHP 群と比較して DEHP+ TGC 群で優位にトジャンクションのリモデリングに関係する増加した。また、精巣中 IFN-γ mRNA 発現は、

matrix metalloproteinase 2活性の調節を行ってControl 群と比較して DEHP 群、TGC 群およびいる tissue inhibitor of metalloproteinase-2発現

DEHP ＋ TGC 群 で 有 意 に 増 加 し、 さ ら に、を低下させることも報告されている（29）。一方、

DEHP+ TGC 群では、DEHP 群および TGC 群と

DEHP 自体の免疫原性はないが、アジュバントと比較して顕著に増加した。

して作用することが多く報告されている（3 7）。我々-

ト レ ー サ ー と し て HRP を 用 い た 解 析 で は、は低用量 DEHP 曝露が精子形成に影響を与えな

Control 群および TGC 群の精細管の管腔内に検いことを示したが、BTB の機能的障害や精子・出されなかった。しかし、DEHP 群および DEHP

精子細胞に対する血清抗体の出現を明らかにし＋ TGC 群では、いくつかの精細管の管腔内にた。さらに、リンパ球浸潤や IFN-γ の発現など初HRP が検出され、BTB を超えて精細管の内腔に期 段 階 に お け る EAO の 重 要 な pathological

浸潤していることがわかった。

mediator が DEHP 群で優位に増加した。このこ

Control 群の血清中に精巣細胞に対する自己抗とは BTB から半数体生殖細胞中の自己抗原の漏体の存在は確認出来なかった。しかしながら、出により、精巣の自己免疫反応性が増加したこと

DEHP 群、TGC 群および DEHP ＋ TGC 群血清を示している。

中には、精子細胞および精巣の精子・精子細胞に精巣ホモジネートの皮下注射により抗精子抗対 す る 自 己 抗 体 が 存 在 す る 事 が わ か っ た。

体の産生などの自己免疫反応が生じるのは以前

ELISA 分析において、DEHP 群および TGC 群のより知られていたが、それだけでは精巣の免疫抑TGC に対する抗体価は Control 群に比べて有意制機構を打ち破ることができないため、マウスにに増加した。さらに、DEHP+ TGC 群では、他のおいては、精巣ホモジネートに結核死菌を含んだ3群と比較して TGC に対する抗体価は顕著に増加

complete Freund’s adjuvant（CFA）を混合した。

させ，さらに百日咳死菌（BP）静注の追加などでⅣ考察

免疫増強することにより EAO を誘導するのが従本研究おいて、低用量 DEHP 曝露は精子形成来の方法であった（30 32）。しかし、精巣ホモジネーに影響を与えることはないが、セルトリ細胞の障トと CFA を混合して注射すると精子・精子細胞

害や精子・精子細胞に対する血清自己抗体の増抗原のみならず、精粗細胞、精母細胞、セルトリ

加を示し、BTB の機能障害を引き起こすことが細胞、ライディッヒ細胞や精細管基底膜などに対示された。 さらに、TGC を一回皮下注射するだする自己免疫応答までもが誘導されるので、かな

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臨床環境医学（第24巻第１号）

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り 人 工 的 な 疾 患 モ デ ル と い う 要 素 が あ る（33 36）。

用する環境汚染物質も EAO の感受性を高める可

我々は、マウスにおいて、精巣ホモジネートでな能性がある。今後は、精巣毒性を有する dichloro

く分離したばかりの生きた同系精巣細胞の二回皮diphenyl trichloroethane、pentachlorophenol、

下注射によって、CFA や BP を用いずに精巣へのdieldrin、dinitrobenzene、tert-octylphenol など

炎症細胞浸潤や精子・精子細胞のみに対する抗体の環境毒性物質を用いて、精巣自己免疫反応を促出現などをともなう EAO を高い発症率で誘導さ進するかどうか検討したい。

-

せたことを報告している。また、我々は精巣（21、23）抗原ではなく CFA と BP のみを免疫したマウスにおいてセルトリ細胞や精子・精子細胞に対する抗体が血清中に存在することを報告し（37）、CFA や
BP などのアジュバント（免疫増強剤）自身が自利益相反
本研究の内容に関連して開示すべき利益相反事項はありません。

己免疫性抗原だけでなく、他の精巣細胞に対する
精巣自己免疫反応性を促進することを明らかにした。本研究では、実験群（DEHP 群、TGC 群お謝辞
稿を終えるにあたり、東海大学医学部基礎医学系生体

よび DEHP ＋ TGC 群）すべてにおいて精子・精構造機能学領域の田中理先生、古谷祐生子秘書および東子細胞に対する自己抗体のみが検出された。つま

京医科大学人体構造学講座の小山耕一助手、河田晋一助

り、精子・精子細胞以外の他の精巣細胞に対する抗体が検出されないことから、低用量 DEHP 曝露によるアジュバント効果が自己免疫反応を強く高めることはないことが示唆された。
近年、アレルギー疾患に対して DEHP が影響しているという報告がされ始めている。疫学（7、38-40）

手、桑名慶子書記、阿保亜希子書記のご協力・ご支援に深く謝意を表します。また、本研究内容の一部は科学研
究費・基盤研究 C（26460809、25340050）の助成を受け、
文献42の内容および図表に加筆・修正・改変したものです。第23回日本臨床環境医学会学術集会において奨励賞を頂き、大変光栄に存じます。高野裕久大会長はじめ、学会関係者の先生方に感謝申し上げます。

研究において、Bornehag ら（38）は DEHP 曝露が子供の喘息・喘鳴・鼻炎の有病率の上昇と関係していると報告した。また、チリ中のダニアレルゲ
ンと DEHP 曝露のマウス実験において、高野ら（7）はヤケヒョウヒダニを用いて、アトピー性皮膚炎

文献1) Nielsen GD, Larsen ST, et al. Do indoor chemicals
promote development of airway allergy? Indoor Air
17: 236–255, 2007のような皮膚病変の臨床スコア－は肥満細胞の増2) Thomas JA, Darby TD, et al. A review of the biologi-

加に伴い悪化すると報告した。本研究では、低用

cal effects of di-(2-ethylhexyl) phthalate. Toxicol

量 DEHP 曝露は BTB を超えて半数体生殖細胞中の自己抗原の漏出や BTB の機能的な損傷によって精巣自己免疫反応の感受性の増加に繋がることがわかった。したがって、精巣は他の臓器と比較し、DEHP の自己免疫障害の重要なターゲット臓器の一つであることがわかった。
精巣における環境汚染物質の免疫系への影響を調査するには、自己抗原に対する免疫反応を重要な因子として考慮する必要がある。最近、我々はカドミウム曝露が精巣免疫微小環境を変化させ、EAO 感受性を増加させることを報告した（41）。
それゆえ、DEHP やカドミウム以外の免疫系に作

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