細菌ロドプシン類タンパク質の生物物理学的研究
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言語: English
出版者:
公開日: 2019-06-25
キーワード (Ja):
キーワード (En):作成者: 耿, 兄
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所属:URLhttps://doi.org/10.15118/00009903

氏

名 GENG XIONG

学 位 論 文 題 目

細菌ロドプシン類タンパク質の生物物理学的研究

論 文 審 査 委 員

主査

教授

戎 修二

教授

宮永 滋己

准教授 澤田 研

論文内容の要旨
細菌ロドプシン類タンパク質は 7 本の α-へリックスから構成され、発色団としてビタミン A アルデヒド（レチナール）を持つ光受容膜タンパク質であり、レチナールに吸収された光エネルギーの生体エネルギーへの変換や、外界の光情報の受容に関わっている。細菌ロ
ドプシン類タンパク質は、生体膜中での立体構造が明らかにされた最初の膜タンパク質であり、モデル膜タンパク質として、詳細に研究され、それらの機能について、個々のアミノ酸レベルで、その分子機構が議論されている。本研究では、センサリーロドプシン II（SRII）と、中国内モンゴルの塩湖から我々のグループによって発見された Halorubrum sp. ejinoorの持つアーキロドプシン(HeAR)について、新たなアミノ酸変異体を作成し、その光化学的性質を調べ、これまで分かっていなかったアミノ酸の働きを明らかにした。
SRII は、細菌が青緑光から逃げる負の走光性の光受容体である。本研究では、バクテリオロドプシン（BR）のプロトンポンプ機能に重要なアミノ酸残基であるアスパラギン酸（D）115 に対応する SRII の D103 の変異体を作成した。SRII の D103 をアスパラギン（D103N）やグルタミン酸（D103E）に置換した変異体を作成し、その光反応を調べた。その結果、変異体では、M 中間体の崩壊は速くなるが、光反応サイクル後半の中間体の寿命が長くなること、また、長寿命の副産物の生成が観察され、SRII の D103 は、SRII の光反応サイクルの回転速度の調節に重要な役割を果たすことが分かった。

HeAR は、BR と同様に光駆動外向きプロトンポンプとして働く。AR のアミノ酸配列はBR とよく似ており、これまで、プロトンポンプ機能に必須であることが明らかになっているアミノ酸は全て保存されていた。しかし、AR だけに共通して保存されているアミノ酸があることに注目し、これらのアミノ酸（C 末より 164 番目のトレオニン；T164 と 165 番目のセリン；S165）をアラニン（A）に置換した変異体、T164A、S165A と T164A/S165A を作製し、それらの光化学的性質を調べた。その結果、変異体では、M 中間体の崩壊は速くなるが、光反応サイクル後半の中間体の寿命が長くなり、また、T164 の変異では光反応中間体の数が増加した。発色団レチナールから離れた場所にあるにもかかわらず、HeAR のT164 と S165 は、HeAR の光反応サイクルの回転速度の調節に重要な役割を果たすことが分かった。

また、HeAR の立体構造の熱安定性を X 線小角散乱法（SAXS）によって調べた。脂質に再構成した HeAR と界面活性剤存在下での HeAR の光反応を比較検討し、タンパク質周辺環境の違いの影響についても調べた。

ABSTRACTMicrobial rhodopsins are typical membrane proteins with seven transmembrane alpha-helices(helices A–G). This type of protein has a retinal molecule as the chromophore. The microbial
rhodopsins use the retinal chromophore attached at a conserved lysine residue to absorb photons forlight-energy conversion and light-signal transduction. The molecular mechanisms of microbial
rhodopsins have been discussed at the individual amino acid level. In this study, we have preparedamino acid replaced mutants for sensory rhodopsin II from Halobacterium salinarum (HsSRII), andarchaerhodopsin discovered by our group from salt lake in Inner Mongolia of China (HeAR). Their
photochemical properties were studied by flash photolysis and the function of amino acids which havebeen not reported until now was clarified.
HsSRII is a negative phototaxis receptor, which makes bacterium avoid blue-green light. In thisstudy the amino acid replaced mutants of aspartic acid 103 (D103) of HsSRII were prepared andanalyzed with flash photolysis. Aspartic acid 103 of HsSRII corresponds to D115 of bacteriorhodopsin(BR). This amino acid residue D115 is functionally important in BR. Aspartic acid D103 were replacedwith asparagine (D103N) or glutamic acid (D103E). The work revealed that a substitution of D103
with asparagine (D103N) or glutamic acid (D103E) can resulted in large changes in HsSRII photocycle.
These alterations include acceleration of the decay of the M intermediate, prolonging the lifetime ofintermediates in the later part of photocycle, and appearance of a long-lived shorter-wavelength
photoproduct. Thus, D103 of HsSRII may play an important role in regulation of the photocycle ofHsSRII.
HeAR is a Light-driven outward proton pump like to BR. All key functional amino acid residues
for proton pump of BR are conserved in HeAR. In the present work, we payed an attention to aminoacids which are only conserved in ARs, prepared the mutants T164A, S165A and T164A/S165A(T164 and/or S165 were replaced with an alanine) and analyzed the photocycles of the mutants withflash photolysis. The amino acid replacements caused profound changes to the photocycle of HeAR
including acceleration of the decay of M intermediate, prolonging lifetime of intermediates in the laterpart of photocycle, and appearance of additional two intermediates which were evident in thephotocycles of T164 mutants. These results suggest that although T164 and S165 are located at the far
end of the photoactive center, these two amino acid residues are important for regulation of the HeAR
photocycle.
Moreover, the thermal stability of three-dimensional structure of HeAR and its mutants wereinvestigated by small angle x-ray scattering (SAXS). In addition, the photocycles of HeAR

reconstituted into lipid and HeAR in the presence of detergent were compared and the influence of thedifferent environment on HeAR photocycle was investigated.

論文審査結果の要旨
学 位 申 請 者 ・ 耿 兄 く ん の 博 士 論 文 の 研 究 対 象 で あ る 細 菌 ロ ド プ シ ン 類 は 共 通した立体構造や発色団（ビタミンAアルデヒド、レチナール）を持つ光受容膜タンパク質であり、生体膜中での立体構造が最初に明らかにされたモデル膜タンパク質として詳細に研究され、近年では「光遺伝学」に用いられる光受容体として、応用面でも注目を浴びている。耿兄くんは、細菌ロドプシン類の中のセンサリーロドプシンII（SRII）と、中国内モンゴルの塩湖から室蘭工大のグループによって発見されたHalorubrum sp. ejinoor の持つアーキロドプシン( He AR)について、新たなアミノ酸変異体を作成し、その光化学的性質を調べ、これまで分かっていなかったアミノ酸の働きを明らかにした。
SRII は、細菌が青緑光から逃げる負の走光性の光受容体である。耿兄くんは、バクテリオロドプシン（BR）のプロトンポンプ機能に重要なアスパラギン酸（D）115 に対応する SRII の D103 をアスパラギン（D103N）やグルタミン酸（D103E）に置換した変異体を作成し、その光反応を調べた。その結果、変異体では、M 中間体の崩壊は速くなるが、光反応サイクル後半の中間体の寿命が長くなること、また、長寿命の副産物の生成を見出し、SRII の D103 はその光反応サイクルの回転速度の調節に重要な役割を果たすことを明らかにした。この成果は関連論文１として発表された。

HeAR は、BR と同様に光駆動外向きプロトンポンプとして働き、プロトンポンプ機能に必須のアミノ酸は全て保存されていた。しかし、耿兄くんは AR だけに共通して保存されているアミノ酸があることに注目し、これらのアミノ酸（C 末より164 番目のトレオニン；T164 と 165 番目のセリン；S165）をアラニン（A）に置換した変異体、T164A、S165A と T164A/S165A を作製し、それらの光化学的性質を調べた。その結果、変異体では、M 中間体の崩壊は速くなるが、光反応サイクル後半の中間体の寿命が長くなり、また、T164 の変異では光反応中間体の数が増加することを見出した。T164 と S165 は発色団レチナールから離れた場所にあるにもかかわらず、 HeAR の光反応サイクルの回転速度の調節に重要な役割を果たすことを明らかにした。これらの成果は関連論文 2 として発表された。
耿兄くんの以上の研究成果は細菌ロドプシン類の生物物理学的研究の分野において新規な重要な知見をもたらすものであり、細菌ロドプシン類の生体工学的応用に資するところも大きく、博士（工学）の学位に値するものと判断された。