好熱菌由来Mn型スーパーオキシドディスムターゼのアミノ酸置換による変性剤耐性への影響
メタデータ

言語: Japanese
出版者:
公開日: 2014-06-26
キーワード (Ja):
キーワード (En):作成者: 渡辺, 健太
メールアドレス:
所属:URLhttps://doi.org/10.15118/00005115

氏名

学 位 論 文 題 目

わたなべ

けんた

渡健

辺太

好熱菌由来 Mn 型スーパーオキシドディスムター
ゼのアミノ酸置換による変性剤耐性への影響

論 文 審 査 委 員主査

教授

金教

授

長谷川准教授

安木

居則

明
靖

光

國

論文内容の要旨
生物は呼吸により酸素を体内に取り入れると，活性酸素が副産物として発生する。
活性酸素には，スーパーオキシドアニオンラジカル，過酸化水素，ヒドロキシラジカルなどがあり，スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）は，スーパーオキシドアニオンラジカルを酸素と過酸化水素に不均化させる。この SOD は活性中心に存在する金属の種類によって，Cu/Zn 型，Mn 型，Fe 型などがあり，Mn 型の SOD（ MnSOD） は 真 核 生物 と 原 核 生 物 の 両 方に存 在 し て い る 。 ま た，好 熱 菌 が 生 産 する酵素は，熱や変性剤に対する耐性が高いと知られており，好熱菌から得られるMnSOD は工学的有用利用が期待できる抗酸化酵素である。
本研究では，2 種類の中度好熱菌 Bacillus stearothermophilus （IFO12550 株）
および Bacillus stearothermophilus （C36 株）の MnSOD について，ラウリル硫酸ナトリウム（SDS, sodium lauryl sulfate）に対する耐性を比較した。その結果，後者の耐性が高いことがわかった。これは，C36 株 MnSOD の 102 番目のアミノ酸がグルタミン酸であるのに対して IFO12550 株 MnSOD ではアスパラギン酸，187
番目ではそれぞれのアミノ酸はイソロイシン，バリンであり，いずれの置換も側鎖の炭素数を増加させ，C36 株 MnSOD ではタンパク質内部の疎水性の増大が，構造の安定性を引き起こしたものと考えられた。これを確かめるために，単一アミノ酸を置換した MnSOD を作製し，２つのアミノ酸置換がそれぞれ耐性に関与していることが明らかになった。
また，活性部位付近のアミノ酸を置換することによって，C36 株 MnSOD の SDS耐性ではなく，活性を向上させることにも取り組んだ。その結果，C36 株 MnSOD

の 164 番目のバリンをヒスチジンに置換することによって活性が向上した。これは，Mn 原子を保持しているアミノ酸に隣接した場所において，Mn 原子の保持に働くアミノ酸であるヒスチジンに置換したことにより，Mn 原子が活性部位に取り込まれやすくなったことが原因だと考えられた。
これらのことは，酵素の耐性向上や活性向上において指標を示し，今後の酵素の利用を広げるものである。

ABSTRACT
When the organism takes in oxygen by breathing into the body, the active
oxygen arises as a by-product. Superoxide anion radical, hydrogen peroxide andhydroxyl radical are classified as the active oxygen. Superoxide dismutase(SOD) catalyzes the conversion of the superoxide anion radical to oxygen andhydrogen peroxide. SOD can be separated into three classes based on the metal
cofactors (Cu/Zn type, Mn type and Fe type). There is MnSOD in eukaryote andprokaryotic. The enzyme which thermophilic bacteria produce is known that thetolerance of enzymatic activity for heat and the denaturant is high. Also,MnSOD from thermophilic bacteria is useful antioxidant enzyme for industry.
In this study, activity of MnSOD from thermophilic bacteria was measured
aftertreatmentofSDS(sodiumstearothermophilus

strainC36laurylwassulfate).

stablethanMnSOD

ofBacillus

thatofBacillus

stearothermophilus strain IFO12550. There were only two differences of aminoacid residues between strain C36 and strain IFO12550. Substitution position
with Glu102Asp and Ile187Val were neither essential nor conserved. These
inner amino acid residue changes suggested an approach to obtain more stable
MnSOD.
Amino acids which form the active site are conserved. In this work, an aminoacid of the active site neighborhood was substituted. As a result, activity
improved by substituting 164Val for His in MnSOD. It was thought that Mn
atom in an active site was caught by 163His and 164His. And this wobbling His
residue increased Mn modulation.

論文審査結果の要旨
生物は呼吸により酸素を体内に取り入れると，活性酸素が副産物として発生する。
スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）は，活性酸素のスーパーオキシドアニオンラジカルを酸素と過酸化水素に不均化させる。この SOD は活性中心に Mn を持ち ， SOD（ MnSOD）は 真核 生物 と原 核生 物の 両方 に存 在し てい る。 また ，好 熱 菌が生産する酵素は，熱や変性剤に対する耐性が高いと知られており，好熱菌から得られる MnSOD は工学的有用利用が期待できる抗酸化酵素である。
本研究では，２種類の中度好熱菌 Bacillus stearothermophilus （IFO12550 株）および Bacillus stearothermophilus （C36 株）の MnSOD について，ラウリル硫酸ナトリウム（SDS， sodium lauryl sulfate）に対する耐性を比較した。その結果，後者の耐性が高いことがわかった。これは，C36 株 MnSOD の 102 番目のアミノ酸がグルタミン酸であるのに対して IFO12550 株 MnSOD ではアスパラギン酸，187番目ではそれぞれのアミノ酸はイソロイシン，バリンであり，いずれの置換も側鎖の炭素数を増加させ，C36 株 MnSOD ではタンパク質内部の疎水性の増大が，構造の安定性を引き起こしたものと考えられた。これを確かめるために，個々のアミノ酸を置換した MnSOD を作製し，２つのアミノ酸置換がそれぞれ耐性に相乗的に関与していることが明らかにした。つまり，構造安定化は他のタンパク質の寄与を受けることなく，アミノ酸の疎水性の増加によって引き起こされるものを示した。
また，活性部位付近のアミノ酸を置換することによって，C36 株 MnSOD の SDS耐性ではなく，活性を向上させることにも取り組んだ。その結果，C36 株 MnSODの 164 番目のバリンをヒスチジンに置換することによって活性が向上した。これは，Mn 原子を保持しているアミノ酸に隣接した場所において，Mn 原子の保持に働くアミノ酸であるヒスチジンに置換したことが Mn への活性酸素のアプローチに効果を示したためだと考えられた。
これらのことは，酵素の耐性向上や活性向上において指標を示し，今後の酵素の利用を広げるものである。
以上の酵素の耐性の向上，活性の増大にいずれにおいても，わずか１，２のアミノ酸が寄与することを実験的に証明したことは，プロテインエンジニアリングの有効な発展を生むものである。また，質疑応答も適切であり，内容の理解と伝達力も認められた。よって，本学及び専攻が定める審査基準を満たしており，博士論文に値すると認めた。