2021 年 11 ⽉ 17 ⽇
国⽴⼤学法⼈筑波⼤学
⼤学共同利⽤機関法⼈⾼エネルギー加速器研究機構

C-配糖体の安定な炭素ー炭素結合を切断する酵素の機能と⽴体構造を解明
植物が作るさまざまな化合物の多くは糖と結合しています。これは、細胞内で安定に溶けやすくするためです。これらは⼀般に、酸素原⼦を介して糖と化合物が結合する O-配糖体という形をとります
が、天然には、炭素原⼦に直接糖が結合した C-配糖体も存在します。C-配糖体は、糖の炭素が化合物の炭素と炭素―炭素結合しているため、極めて安定で、O-配糖体と⽐較すると数は少ないですが、葛根湯などの漢⽅薬や⾚⾊⾷⽤⾊素など、⽇常⽣活の中で摂取することもある化合物です。これらの配糖体化合物を体内に摂取すると、腸内細菌によって糖部分が切断されることで活性化、吸収され、薬効を⽰します。この、糖を切断する役割は、腸内細菌のもつ酵素が担っていると考えられていましたが、酵素の詳しい性質は分かっていませんでした。
本研究では、腸内細菌と⼟壌細菌の双⽅から、C-配糖体の炭素ー炭素結合を切断する酵素を発⾒し、その機能を解析しました。このような酵素が⼟壌細菌から⾒つかったのは今回が初めてです。さらに、酵素の結晶構造も明らかにし、これに基づいて、腸内細菌が炭素ー炭素結合切断反応によって⾷物成分を活性化する酵素的メカニズムを世界に先駆けて解明しました。本研究は、ヒトなどの⽣物内と⼟壌などの⾃然環境中での C-配糖体の代謝を初めて捉えたもので、C-配糖体代謝のメカニズムを解き明かすきっかけになると考えられます。

研究代表者
筑波⼤学⽣命環境系
⼩林 達彦 教授
⾼エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所
千⽥ 俊哉 教授!
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研究の背景植物や微⽣物が⽣産する化合物の多くは糖が結合した状態（配糖体注１））として⽣体内に保存されています。その中で C-配糖体は糖を構成する炭素と糖以外の部分（アグリコン）の炭素が直接結合した構造をしており、酸素原⼦を介して糖がアグリコンに結合している O-配糖体と⽐較して極めて強固に結合しています（図１）。C-配糖体は O-配糖体に⽐べて数は少ないですが、漢⽅薬や⾷⽤⾊素など⽣活の中で私たちが摂取する化合物にもみられます。例えば、葛根湯の原料である葛の根に含まれるプエラリンや、かまぼこやお菓⼦の天然⾚⾊⾊素として使われるカルミン酸はいずれも C-配糖体です。これらの配糖体化合物は、体内で腸内細菌によって糖部分が切り離され、活性化されることで多様な⽣理活性を⽰します。
しかしながら、その分解のメカニズムについては、C-配糖体の炭素―炭素結合を切断し、アグリコンと糖に分ける酵素が腸内細菌から⾒つかっていたものの、まだ未知の部分が多く、これらの酵素の⾃然界における⼀般性も明らかになっていませんでした。
研究内容と成果
本研究グループは、糖の炭素―炭素結合切断酵素（C-C 結合切断酵素）についてデータベースを解析した結果、腸内細菌から⼟壌細菌まで幅広い種類の細菌が C-C 結合切断酵素をもっており、腸内だけでなく、⾃然界全体で、C-配糖体が代謝され循環していることを⾒いだしました。⾃然環境中の細菌から CC 結合切断酵素が発⾒されたのは初めてです。どの細菌の C-C 結合切断酵素も、２種類のタンパク質（糖異性化酵素と機能未知酵素）が複合体を形成し、⼀つの酵素として働きます。試験管内での酵素機能の解析から、プエラリン（葛の根に含まれるイソフラボンの⼀種）などの C-配糖体はいずれの細菌においても、まず酸化酵素によって糖の部分が酸化されて 3ʼ-oxo-C-配糖体になってから C-C 結合切断酵素で分解されることが判明しました（図２）。また、本酵素は⾦属イオンを反応に⽤いることも明らかとなりました。
次に、全ての酵素において、さまざまな 3ʼ-oxo-C-配糖体を準備し、基質の選択性注２)を調べたところ、アグリコン部分の構造に対しては寛容である⼀⽅、構造中の糖の結合位置は厳密に認識していることが分かりました。さらに、細菌の C-C 結合切断酵素について、⾼エネルギー加速器研究機構（KEK）物質構造科学研究所（IMSS） 放射光実験施設フォトンファクトリー（PF）注３）での X 線結晶構造解析注 4）と、同じく構造⽣物学研究センターのクライオ電⼦顕微鏡を利⽤した単粒⼦解析注 5）により、この酵素の⽴体構造の解明にも成功しました（図３）。腸内細菌由来の酵素と⼟壌細菌由来の酵素のアミノ酸配列の類似度は 40％程度ですが、全体構造はよく似ており、反応に重要なアミノ酸残基（活性部位）もよく保存されていました。また、それぞれの酵素の構造解析から、活性部位の空間の形が、基質として受け⼊れられる 3ʼ-oxo-C-配糖体の糖の位置を認識していることも⾒いだしました。酵素の⽴体構造が明らかになったことで、２種類のタンパク質がどのように結合しているのか、どのように基質を受け⼊れるのかだけでなく、反応する際の構造変化や、反応に関与するアミノ酸や⾦属も特定され、詳細な反応機構が結晶構造に基づいて初めて提案されました。
今後の展開
C-配糖体は、配糖体の中で唯⼀加⽔分解されない配糖体です。配糖体が体内で⽣理活性を発現するためには、糖が外れて体内に吸収される必要があると⾔われており、本研究は、漢⽅薬や⾷品に含まれる C配糖体の体内における分解・吸収のメカニズムを世界に先駆けて明らかにしました。これらの成果は、新たなプロドラッグ注６）様化合物の創出や酵素の医薬品、⾷品添加などに対する利⽤へとつながり、薬学、2

⾷品化学の発展への貢献が期待されます。さらに、⾃然界における C-配糖体代謝の C-C 結合切断酵素も明らかになったことから、今後、天然における C-配糖体代謝も解明され得ると考えられます。
参考図C-C

HOC-O

HOHO





O

HO
HOC アグリコン

OH



C-O

O- HOOアグリコン

OH





図 1 C-配糖体と O-配糖体の構造
C-配糖体（左図）は糖（各図の左側部分）がアグリコンと C-C 結合している。C-配糖体のピンクの⾊がついている部分が C-C 結合。⼀⽅、よくみられる O-配糖体（右図）は糖とアグリコンが、⽔⾊で⽰した
ように酸素原⼦を介して C-O 結合している。それぞれ、糖とアグリコンの切断箇所を点線で⽰した。

OHOH
C-COOH



HOHOO

OOHHO

3’

HOOH

OOHOO

HOHOOHOOOOOOHOH

OH   図 2 プエラリンの C-C 結合切断反応
プエラリンはまず酸化酵素によって糖の 3ʼの位置が酸化されて 3ʼ-oxo-プエラリンとなり、C-C 切断酵素によって糖とダイゼイン（プエラリンのアグリコン）に分断される。

AgCarC2( 機能未知酵素 )DgpB ( 機能未知酵素 )基質アナログ

DgpC（糖異性化酵素）

AgCarB2（糖異性化酵素）
Mn イオンMn イオン

図３ C-C 結合切断酵素の結晶構造
腸内細菌由来の C-C 結合切断酵素（左）と、⼟壌細菌由来の酵素（右）。基質結合や反応に関わるアミノ酸、⾦属を特定した。Mn イオン：マンガンイオン3

⽤語解説注１）

配糖体

アグリコン（⾮糖部分）に糖が結合した化合物。
注２）基質の選択性
基質は酵素と反応する化合物のことで、酵素ごとに反応する基質が異なることを基質の選択性という。
注３） 放射光実験施設フォトンファクトリー
KEK つくばキャンパスにある放射光施設。電⼦加速器から⽣まれる放射光で、物質・⽣命の構造から機能発現のしくみを明らかにする研究を推進している。PF リング（2.5 GeV）
、PF アドバンストリング（PF-AR, 6.5 GeV）という、特徴ある 2 つの放射光専⽤の光源加速器を有し、KEK で培ってきた放射光技術・加速器技術により世界最先端の研究の場を提供している。
注４） X 線結晶構造解析
酵素は特定の条件で結晶になる。これに X 線をあてて得られた反射像を解析し、⽴体構造を明らかにする。本研究における結晶構造解析に関するデータ収集は、KEK IMSS の PF (ビームライン BL-1A,BL-17A）を⽤いて⾏った。
注５） 単粒⼦解析
透過型電⼦顕微鏡法の⼀種で、酵素試料をグリッド上に配置し、極低温において撮影して得られた透過画像を画像処理することで酵素の⽴体構造を解析する⼿法。本研究におけるクライオ電⼦顕微鏡に関するデータ収集は、KEK IMSS の Talos Arctica G2 を⽤いて⾏った。
注６） プロドラッグ
体内に⼊ってから構造変化して薬効を⽰す薬。
研究資⾦
本研究は、科研費（JP16H06443, JP19K15703, JP19K05784, JP19H05687, JP20H00490, JP20K22700,
JP21K18246）、および国⽴研究開発法⼈⽇本医療研究開発機構（AMED）創薬等ライフサイエンス研究⽀
援基盤事業 創薬等先端技術⽀援基盤プラットフォーム（BINDS）の課題番号 JP20am0101071、国⽴研
究開発法⼈ 新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO：JPNP20011）JST さきがけ（JPMJPR20DA）、公益財団法⼈不⼆たん⽩質研究振興財団のサポートを受けて実施されました。
掲載論⽂【題 名】 C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural
analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes（⾃然界および腸内における C-配糖体代謝：C-C 結合切断酵素の発⾒、機能解析、構造解析および分布）【著者名】 Takahiro Mori1, Takuto Kumano2, Haibing He1, Satomi Watanabe2, Miki Senda3, Toshio
Moriya3, Naruhiko Adachi3, Sanae Hori2, Yuzu Terashita2, Masato Kawasaki3, Yoshiteru
Hashimoto2, Takayoshi Awakawa1, Toshiya Senda2,3, Ikuro Abe1, Michihiko Kobayashi2
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The University of Tokyo; 2University of Tsukuba; 3High Energy Accelerator ResearchOrganization (KEK)【掲載誌】 Nature Communications【掲載⽇】 2021 年 11 ⽉ 2 ⽇【DOI】

10.1038/s41467-021-26585-1
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