平成11年度 研究報告 大分県産業科学技術センター

焼酎酵母のアルコール耐性に関与する遺伝子の解析（第3報）
江藤 勧
食品工業部

AnalysisofReiadonBetweenAlcohol・ToleranCeandSbocbz）YeastGene（3rd．report）
S11SllmllETO
FoodScienceandTechnologyDivision
要旨

焼酎酵母のアルコール耐性に関与する遺伝子を見出しその機構を解明する目的で，清酒酵母や実験室酵母で報告されている種々の遺伝子の発現を増減させた鹿児島焼酎酵母株を作成し，アルコール耐性との関連を検討した．
このうちERG6遺伝子について，アルコール耐性が高くなった株では発現が増加しており，耐性が低くなった採では，発現が減少していたことから，ERG6遺伝子が実際に酵母のアルコール耐性に関与していると推測された。
TablelステップダウンPCRの反応条件

1．はじめに本センターでは，より麦焼酎の醸造に適した大分酵母

変性950C：1，950C：1，95書C：1，950C：1，95EC：1，95らC：1，の開発を目指して，有用酵母の造成の研究を行っており，

アンル700C：2，660C：2，62aC：2，588C：2，541C：2，500C：2，

特に，蒸留柏の減量が期待される，高いアルコール耐性

伸長700C：3，70−C：3，700C：3，700C：3，708C：3，700C：3，を持つ酵母の開発研究をしている．

3Cycles→3Cycles→3Cycles￣＞3Cycles￣＞3Cycles→20Cycles

PCRで増幅したサンプルを1％アガロースゲルで電気前報こ）では，PCR法を応用したSubtractionを行い，アルコール耐性の獲得に関与すると思われるEnoまぉel

泳動し，目的の大きさのバンドを切り出して抽出した後，鱒NOl）及びqtochromeCl（CYl）の遺伝子を検出した．

pcRI王ベクター￠Ⅳitrogen社）につなぎ，且co〟JMlO9

さらに遺伝子組換えにより，これらの発現量を通常の鹿を形質転換させて，CDNAと結合したベクターを増幅

児島焼酎酵母で変化させると遺伝子の増減に伴ってアル後，摘出し，精製した．
2．3の方法で塩基配列を確認した後，制限酵素で切断し，コール耐性の強さが変化したことから，これらの遺伝子が実際に焼酎酵母のアルコール耐性に関与していると推同じ酵素で切断した酵母発現型ベクターpAUR123汀aKa

測されたが，その耐性獲得機構については不明なままで叫成その遺伝子の発現を増やす方向（SenSe）と減らす方あった．本研究で古ま，この獲得機構を明らかにする目的

向（弧tisense）にそれぞれ接続した。これを且coガJMlO9で，清酒酵母や実験室酵母においてアルコール耐性とのを用いて増幅した後，摘出・精製して，それぞれ正しく関与が示唆されている遺伝子2，3）についてタ焼酎酵母で接続されているか塩基配列を確認した．
2．3 塩基配列の決定の発現を増減させることによるアルコール耐性の変化を

pcRIIベクターの場合，Cy5AutoReadSequencing監t

検討するとともにENOlやCYl遺伝子との関連につい（ÅmersbamPhm肛iaBiotech社）申の蛍光プライマーを用て検討した．

いタ pAUR123ベクターの場合は，ÅD‡ilプロモーター

2り 実験方法

またはターミネーターの一部に相補性を持つ巧5標識

2ヶ1プライマーの設計と合成

蛍光プライマーを合成して使用した．「memnosequenase

ぶ．c8将lイgゐeの遺伝子データより，目的とする遺伝子配列を挟むように各々プライマーを設計し，合成を行った

cyc呈esequenci喝kiと（ÅmersねamPhaml∝ia王∋io絶C出社）を用（合成はサワディー・テクノロジー（株）による）・

いて，ALFexpressシーケンサーでベクターと結合した

2．2 目的遺伝子配列の作成

cDNAの塩基配列の決定を行った．
2．4 鹿児島焼酎酵母の形質転換前報⊥）に従い，2」で合成したプライマーを使用して，目的の遺伝子を鹿児島焼酎酵母で増減させるために，

GenomicDNA／ぶ・￠訂e豆如月e（生化学工業）をテンプレート

Au∫eObasidinA（AbA）耐性酵母形質転換システム汀aK狼a）とし，エキスバンドハイファイPCRシステム（BoehringerMannheim社）を用いて下表拝め1eユ）の条件でステップを用いて形質転換を行った．2匹g／m！のÅbÅを含むYpD

ダウンPCRを行い夕 日的の配列を増幅した。

寒天培地状で選抜された株を形質転換体として取得した。

一171・一平成11年度 研究報告 大分県産業科学技術センター

2．5 アルコール耐性試験

10％エタノールを含む培地中での増殖能は，ERG6（＋）

試験株を叫g血1のAbAを含むYPD液体培地中で前培養した後，各濃度のエタノールを1相加1のAbAを含株で増加しており，ERG6（−）株で減少していた。

むYPD液体培地に接種して，振塗培養装置で増殖能をアルコール耐性の検討を行った結果，PDH2（−）とILV測定した．

和一）株で耐性の上昇が認められ，PDH2（＋）とILV2

またMDH2，pD‡i2およびILV2の遺伝子についても2．6 RNÅの調製（＋）抹で耐性が低下した。またMDH2（＋）及びMD‡i2

YPD液体培地で前培養した細胞をさらに6時間培養（一）株では顕著な変化は見られなかった・

して，E・Z・N・A・YeぉtRNAKit（OmegaBiotek）を使用して3．3 ノーザンハイプリダイゼーション

RNAを調製した．

各酵母疎から調製したRNAを用いて，ノーザンハイ

2．7 ノーザンハイプリグイゼーション

プリダイゼーションを行った。前報でアルコール耐性が精製した目的遺伝子を含むpcRIIベクターからD‡G上昇した株でCYl遺伝子が減少しており，耐性が低下

乱NALabeling氾t（馳ehringerMamheim社）を用いてそれした株で遺伝子の増加が認められたことから，本実験でぞれRNAプローブを作成した．

作成した各酵母株についてもCY王道伝子の発現量を検各細胞より調製したRNAをホルムアルデヒド法によ討した鱒ig・2）・

り，1究のアガロースゲル電気泳動にかけた後，ナイロCYlン厳にブロツティングした．この膜に，各RNAプローブを結合きせて，D王G核酸検出キットによりプローブを検出した。
3．実験結果及び考察
3．1 目的遺伝子を増王威させた酵母抹の作成
清酒酵母では，ERG6遺伝子のアルコール耐性への関

pAUR123＋ − ＋ 爛
Cyl Eno与2）や耐性株でMDH2が高発現していることが示唆さ＋ − ＋ −＋ −十 一三喝 Pde nv M助

れており，実験室株ではPDE2やILV2の関連が報告さ
Fjg．2 各棟におけるCYl遺伝子の発現量れている3）．これらの4遺伝子を増減させるための遺伝子配列を前報1）のとおり作成し，pÅUR123ベクターにENOl（＋），（−）及びCYl（＋），（−）各棟については接続して鹿児島酵母への組み込みを行ない，AbA選択前報と同じ結果が得られたが5 3。2でアルコール耐性の増培地により目的の株を得た．
3．2 目的遺伝子を増減させた酵母株のアルコール耐性加が認められたPDH2（−）とILV2（−）株ではCYl遺ERG6の遺伝子をsense配列により増加させた株ERG6

伝子の量に変化は認められず，CYl遺伝子の変化だけ（＋）と弧tisense配列により発現を減少させた株ERG6

ではアルコール耐性の獲得との相関を説明できなかった．

（−）の2株および対照としてpAUR123ベクターのみをまた，pDH之遺伝子と王LV2遺伝子の発現量の変化も検組み込んだ株についてアルコール耐性を検討したげig。1）。

討したが，耐性獲得との相関性は認められなかった．これに対して，ERG6遺伝子の発現量を検討したところア
ルコール耐性の増加しているENOl（−），CYl（−）及びERG6（＋）株で発現量が増加しており，アルコール耐性の低下したENOl（＋），CYl（＋），ERG6（−）株で発現の減少が認められた鱒ig・3）・ERG6はエルゴス
テロール合成系上で働くSteroIc−methyltrans臨で鮎eをコードする遺伝子であり，エルゴステロールは細胞膜脂質の構成成分で，膜の流動性や透過性を調整している．清酒
酵母においては，仕込み末期のもろみ申の酵母においてERG6遺伝子の発現が増加していることなどからも，アルコール耐性との関連が示唆されている3）．
本研究結果より，焼酎酵母でもアルコールに対して耐Fjg．1ERG6の発現調節によるアルコール耐性の変化性を獲得する場合，様々な遺伝子の発現調節の経路を経通常のYPD培地中での増殖は3株とも大差なかったがる可能性があるが，最終的な段階でERG6遺伝子の増加

ー175−平成＝年度 研究報告 大分県産業科学技術センターが必要であると考えられた．今後さらにERG6遺伝子とアルコール耐性の関係を詳細に検討する予定である．
巨寵を：：撞

針㍊．「了二こ卓二3 姜5√，jニ三まJ−言三て弟F19．3 各棟におけるERG6遺伝子の発現量4． まとめ焼酎酵母のアルコール耐性に関与する遺伝子を解明する目的で，通常の鹿児島酵母において種々の遺伝子の発現量を増減させた株を作成し，そのアルコール耐性を検討したところ，次の結果を得た．

（1）・ERG6，MDH2，PDE2及びILV2の遺伝子を酵母発現型ベクターであるpAUR123にsen5e配列あるいはmtisense配列で接続して鹿児島酵母に組み込む事によりそれぞれの遺伝子を増減した酵母株を作成した．
（2）・作成した株の内ERGq−）株，PDE2（＋）株，ILV2（＋）株でアルコール耐性は低下しており，ERG可＋）株，PDE2（一）株，ILV2（−）株では逆に高いアルコール耐性を示した．
（3）．ノーザンハイプリダイゼーションにより，各棟のCYlの遺伝子の発現量を検討したところ，CYl（＋）株，ENOl（＋）株及びCYl（−）株，ENOl（−）株でアルコール耐性との相関が認められたものの，他の株では認められなかった．
（4）。これに対してERG6の遺伝子の発現量とアルコール耐性との間に正の相関が認められたことから焼酎酵母のアルコール耐性の獲得にはERG6遺伝子を介していることが考えられた．

参考文献
1）江藤 勧：大分県産業科学技術センター平成10年度
研究報告，171（1999）
2）井上等：1998年度日本生物工学会要旨集，23（1998）
3）高橋等：1998年度日本農芸化学会要旨集，261−263（1998）

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