平成8年度 研究報告 大分県産業科学技術センター

細胞融合によるアルコール耐性酵母の造成（第2韓）
江藤 勧
食品工業部

BreedまngoぎHigh且yAIcoho旦−Toler狐tYeas官あytheCei且F㍊SionMethod（2富id。rePO瑚Susほmu ETO
Food Sc童enceandTechnologyDivision

要旨
麦焼酎の醸造に適した大分酵母の造成を‖指して，大分酵母として期待される性質の一一一つであるアルコールに高い耐性を持つ酵母を，細胞融合法で音符することを試みた．親株としては，県内で最も多く使用されている鹿児島酵母とアルコドル耐性の強いワイン酵母（OC−2）を選択した。画細胞の栄養要求性変異株をプロトプラスト化し，電気融合法で融合させたところ，鹿児島酵母よりアルコール耐性の強い3株の融合細胞を得た。これらの酵母を用いて麦焼酎を小規模に試醸し，もろみの状態や芳香成分等を測定した。て．緒 言ド（TT〔二）寒天重層染色とっα】ナプチルリン酸とFastbiuesaltBによる，酸性ホスファターゼ（acp）の検出を行った

麦焼酎は大分県の特産品となっているにも関わらず，その醸造には甘藷焼酎f削こ開発された鹿児島酵母や，米2，3 アルコ】ル耐性試験

焼酎もろみより選抜された協会焼酎酵母が用いられてい試験棟をYpD液体培地中で前培養した後9 各濃度のるのが実状である．これらの酵母は，他県の研究機関にエタノールを含むYアD液体培地に接種して，振塗培養おいて開発されており，本センターでも，より麦焼酎の装置で増殖能を測定した
24 栄養要求変異株の作成

醸造に適した大分酵母の開発をぎ‡＝旨している．

また，焼酎業界においては，環境問題の立場から9 焼

エチルメタンスルホン酸（EMS）により変異を引き起酎製造に伴って廃棄物として生じる蒸留粕の適正処理，こした後，Nystaぬ処理を行って選択した・

有効利用の推進，および酒税の引きとげに対員‡二できるよ

2．5 細胞融合

う製造了二程の改善や製品の晶質向ヒなど，解決すべき緊

酵母細胞をZymo！yase−100Tでプロトプラストとした2種類の細胞を混合し，i肋の高周波電圧30Vを10急の課題が多い．これらの問題の解決方法の 一つとして，高濃度のアルコール中でも生育できる酵母を用いて醸造秒印加し。2〜3個のプロトプラスト鎖を形成させた後9を行うことにより，蒸留和白体の減量とそれに伴う製造

直流パルス電圧400Vノヾルス幅60〃秒を印加して融合工程の改善が期待される，このことから，大分酵母の特させた。緩衝液等は既報○、に準じて行った性のひとつとして，アルコ←ルに高い耐惟を持つことも

2 6 パルスフィールドゲル電気泳動（PFG巨）期待される．

165Vで90秒，iO5秒のパルス時間で各iO時間，120

本研究では，細胞融合法により麦焼酎の生膚に適した秒のパルス時間でi2時間電気泳動を行った．
27 麦焼酎の試醸

アルコール耐性の強い酵母を造成する事を巨］的として。
親細胞株の選定を行った後，電気融合を実施した。またサ

1次もろみはナ 予め閻闇培磯で前培養した各酵母を得られた融合酵母を月∃いた麦焼酎の試魔を行い，もろみ麹96g，水96m呈に添加し26℃で6日間経過させた− その状態や芳香成分の分析を行ったので報吉する．の後，総麦300gぅ麺歩合36％，汲水歩合i50％となるように，1次もろみに蒸煮克と水を加えて，メイセル管（硫酸トラッフ）を付けたほ∴三角フラスコに2次もろみと

2．実験方法

して仕込み，28℃恒温器で発酵させ9 経時的にCO三減

2．1使用菌株量を測定した．発酵終、r後，もろみの酸度等を測定し9（財）日本醸造協会および（財）発酵研究所より醸造部を蒸留して芳香成分等を測定した用酵母を中心に購入した。
2．2 染色試験

2．8 もろみ香気成分の分析

常法1に従い、トリフェニルテトラゾリウムクロライ

ヘッドスペース畔S）法により，各もろみから香気成−36−

平成8年度 研究増告 大分県産業科学技術センター
分を合む気体を発生させて，それをキャヒラリ岬ガスグ

34 融合細胞のアルコMル耐性試験

ロマトゲラフ質量分析装置（GC一丸′号S）により分析した．

二三株の融合細胞のアルコール耐性ついて検討した。エ

条件さま，HS温蜜を70℃とし，GC温度は50くニcへ三00

タノールが存在しない条件では，3株とも親株と同等の℃までj二絆させ，M侶温度烏i50′二Cで子J った．

増殖をホしたが，10％のエタノール存在卜では，F3についてはほぼOCEi（Leu▼）と同等の，F2，F5についてはOCEl（Leu）株とKOEl（H主s￣）株との中間的な性質を

3．実験結果及び考察
3．て 栄養要求性変異株の作成
第い酢 では。鹿児島酵偉の※儀増凍刊変異株が得られていなかったので，この変異株の作成を試みた。

EM

Sを変異源として用いたところ．鹿児島酵倖のヒスチジ

ン安東性変異株KOEi（His】）が得られたたれ ワイン帝
位OG蔓由来サにインン要求性愛異株OCEl（Leu￣）と共−くトKOE†：HS）

こ細胞融合の親株とすることとLた。

Ac ＝靖−か・OC∈：（Le］

Acl肌

3．2 細絶融合

一C−F2 い〇10㌔−▲〇−F3AcICl

KOEヱ（His】）とOCE亘（Leu￣）をZき−m叫▼aSe『100Tで処理・トd−F5 AFcIC㌔してブコトブラストとした後ラ 2得難の細胞を混合」．
電気融合法にて融合を行った．最小培地上で生育する株
のれ 増殖の良好であったF21F3っF5の3株を融合細胞
0 6 †2 −8 24 30 36 42 48 54 60 66 72として分離した。この内F5についてはacpは検出され

時間 （h）たが，F2，F3については検出されなかった（Tab王eり．こFig2 融合細胞の増殖に対するiO％エタノールの影響

れは，融合Lたプロトプラストから細胞嘩を再生する過程で何らかの変異を起こしたものと思われる。

3．5 融合細胞を用いた麦焼酎の試療
親株および融合した酵津を恥て，総麦300gの規模
で麦焼酎を仕込んだところ，KOEl（His￣）株は，発酵のTabiei羨掛合細胞の染色仲途中で焼酎臭が観察された。ニの臭いは，元の鹿児島酵母では見られず，変異株に特有のものであったが，最終的には9 臭いが弱くなり，良好な焼酎杏が認められるようになった。真た9 0CEヱ（Leu￣）株，及び融合株では親株のワイン酵母とi甘様に，果実様の香りが認められた。

R：′か，Pニヒンク9 WPイ巨」ほいヒンク，

3．6 菱焼酎もろみの分析

P R：赤っぼいヒンク

試醸したもろみを濾過して桝形物を除去した後，酸度，3．3 パルスブイ山ルドゲプレ電気泳動（PFG巨〉が圭 アルコール分等を測定した（Tabまe2）．酸度9 P田
はき 各もろみごとに若干の差は見られたが，鋲著なもの

ニの3株についてPFGEを子〕った結果，KOEi（His】）とOCEl（Leu【）ゾ〕染色体ハタ岬ンの中間航璃性質を示ではなかった．もろみのアルコー′レ分は，Ko，KOEiし，融合細胞であることが確認された（Figけ（His）株が18％以卓二であったのに対してOC−2，OCEl
勘か1株ではi7％と低く，アルコール耐性試験の結果とは異なる幸）のであった・これはタ OC冊2，OCEi（Leu￣）
株がアルコールには強い性質を縛っているもの♂）タ 麦由
来の糖分をアルコールに変換する能力が低いためと思われる．融合株のむろみのアルコール分はKo株と同等以上で牒り㌢ 特にF5株ではi8′9％と高かった．これより，jOOgの麦から′′喜成できるアルコールの遺を算出すると，

F5抹でほ∴セグ）Ko株と比較して2ml増加しており，本融合酵母株明使月封二よる麦焼酎の増産が期待できる，重た，同量償麦焼酎に対する蒸留柑の毅を算出すると，融合酵持株では5％の減牒となった．

F呈glPFGEによる親で㌻細胞の染色体の解析−37−平成8年度 研究報告 大分県産業科学技術センタ一丁able2 麦焼酎もろみの分析結果
ミニろみ酸隻 lもろみpH 揮発酸度 EtOH（？も） 焼酎p王三 OD275 匡toH（1−−呈）／川Og Pノ′B

KoOC−28．8010。304．i4
4．00

1．331。7018．3
17．i

KOE□19」0

4．19

2．5218。44．68
4．33

0．036
0．iO5

4．24

40．9
38−8

0．93 0．30 0．32
0．93 0．32 0．34

0．030 射．1

い仁F−l 互0．20 4，Oi 1．76 i7．0 4。08 0．246 3さ；．0F29．10 暮 2．52 ≡塁 4．08 0．095
41．1 脚F3F5Bノ′AP′′A

0．63

0．19

0．30

0．85

0．34iO．400．799．60 ● 2．38 18。5 4．22 0．040 ぎ 41。6 1．i3 0．35 0．31

10．40

4．‖

2．27

i8．9

く事0，02942．8

P：互1pProp）′1心cohoI B：Isobu雨ぷcohoiA：三soa王領ViAicohol

ヰ． まとめ3．7 麦焼酎もろみの香気成分濾過したもろみを，HS法によるGC−MSで分析した

麦焼酎の醸造に適した大分酵母の造成を目的として，ところ，主成分のエチルアルコールの他に焼酎の味や香アルコール耐性を指標に親株の選定及び細胞融合を実施

りに影響するといわれているプロピルアルコール，イソした．真た得られた酵母を用いて実際に麦焼酎を試醸しプチルアルコール，イソアミルアルコドルといった高級て，次の結果を得た．

アルコール及び酢酸イソアミルやカブロン酸エチルとい（1）鹿児島酵母Koとワイン酵母OC−2の栄養要求性変異った香気エステル類が検出された（Fig．3）。これらの香株を細胞融合させ9 融合株F2，F3，F5を得た。

気成分について，酵母の違いによる蚊著な差は認められ（2）：う株の細胞は染色体を分析した結果，融合細胞であなかった．しかし，果実様の香りのあるもろみについてることが確認された．

は，酢酸エステルに由来すると思われる酢酸の含有量が（3）アルコールに対する耐性は，3株とも鹿児島酵母よ若干多かった．

りも強く，特にF3株はOC−2に匹敵する耐性を持っていた。

KO∈エ （4〉（4）融合酵母を用いて麦焼酎を小仕込みしたところ，ワイン酵母と同様の，果実様の香りのするもろみが醸造できた．

（5）もろみ中のアルコール分は，F5株では鹿児島酵母よりも高く，計算上5％の蒸留柏の減量が可能と考えられた．

（6）もろみの香気成分をHS法によるGC叩MSで分析したが，酵母の違いによる香気成分の顕著な差は認められなかった。

（7）融合酵母のもろみで認められた果実様の香りは，減圧蒸留して得られる蒸留液では強くなかったが，鹿児島
269 4Z8 560 700 840

エ850

4．2一塁 る．03 7．68 9．3一芸 1⊥，∽

12丘0
⊥3．49

エ470
15．97

⊥680

エe．48

20．94

1e90

酵母と比較して酒質は良好で，麦焼酎の醸造に適してい23．名3

ると判断された。

Fig．3 麦焼酎もろみの香気成分

各々のもろみを50℃，操作圧−660mmHgという，実参考文献

際の製造工程に近い条件で減圧蒸留して，麦焼酎製品にl）西谷尚道‥醸協，77（iO）648（i9§2）近い蒸留液を得た．もろみ醸造時にOCEl（Leu】）抹，及び融合株で認められた果実様の香りは，蒸留憐ではあ2）野間幸太弧 十川好志：島津評論，44，i67（1989）
3）江藤 勧：大分県産業科学技術センター平成7年度

まり観察されなかった．しかし，麦焼酎としての酒質は，研究報告，72（1995）

Ko株より得られたものと比較して，融合株でも遜色なく，本融合陳は麦焼酎の醸造に適しているものと考えられた．

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