4. 生体情報統合技術開発チーム
Technology and Development Team for BioSignal Program

4-2. 細胞運命情報解析技術開発サブチーム
Subteam for Manipulation of Cell Fate

サブチームリーダー

三好浩之

Hiroyuki Miyoshi

幹細胞は、自分自身を複製する能力 ( 自己複製能 ) と体の組織や器官を形成する様々な細胞を作り出す能力 ( 多分化能 ) を持つ未分化な細胞です。近年、この幹細胞を利用した再生医療が非常に期待されていますが、その実現のためにはまず幹細胞の未分化性の維持、増殖、分化といった細胞の運命がどのようなメカニズムによって決定されているのかを明らかにすることが必要です。当チームでは、おもに造血幹細胞を研究対象として、どのような情報によって幹細胞の運命が決定されているのかを解析し、幹細胞の試験管内での人工操作を可能にするような技術開発を試みています。

事業内容

1. 造血幹細胞の体外増幅系樹立のための技術開発
2. 組織幹細胞の可塑性とリプログラミングに関する研究
3. レンチウイルスベクターの開発と幹細胞生物学への応用研究

職員とメンバー構成

サブチームリーダー

三好浩之（平成 15 年 7 月〜）

開発研究員

山口智之（平成 16 年 4 月〜）

形山和史（平成 16 年 4 月〜）

BRC 研究協力員

森川あずさ（平成 14 年 5 月〜）

非常勤職員

真貝裕美（平成 16 年 4 月〜）

研修生

井上真一（平成 14 年 4 月〜）

清水なつみ（平成 14 年 4 月〜）

野田慎一（平成 15 年 4 月〜）

野口和之（平成 16 年 2 月〜平成 16 年 6 月）

伊藤有希（平成 16 年 6 月〜）

Kim Si-Nae（平成 16 年 9 月〜）

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生体情報統合技術開発チームー細胞運命情報解析技術開発サブチーム

2003~2004

Technology and Development Team for BioSignal Program - Subteam forManipulation of Cell Fate

野田、井上、形山清水、伊藤、真貝、山口
三好サブチームリーダー、森川

年次計画と成果

1. 造血幹細胞の体外増幅系樹立のための技術開発
1) 造血幹細胞における遺伝子発現解析
造血幹細胞においてどのような遺伝子が発現してるのかを知ることは、自己複製や多分化能維持のメカニズムを解明するうえで非常に有意義な情報であると思われる。これまでにもマイクロアレイを使用した遺伝子発現解析が行われているが、それらの解析で使用している造血幹細胞の純度は必ずしも高くなかったり、また比較している対象も分化した血液細胞や他の幹細胞であったりと、必ずしも有益な情報とは言い難いものである。そこで、マウス
骨髄より FACS と９種類のモノクローナル抗体を用い

Figure 1. 造血幹細胞の自己複製と未分化維持機構の解明て、長期または短期の骨髄再構築が可能な造血幹細胞を高純度に単離し、これらの造血幹細胞の遺伝子発現プロファイルを比較するため、マイクロアレイ解析を行っている。この解析によって得られた情報をもとに、造血幹細胞の自己複製や多分化能維持などに重要な役割を担っていると予想される遺伝子の cDNA あるいは siRNA をレンチウイルスベクターを用いて造血幹細胞に導入し、その遺伝子の機能解析を in vitro および移植による in vivo で行う予定である。
2) 造血幹細胞の移植後のホーミング能に関する研究
造血幹細胞の増殖と分化は、骨髄中の間質細胞が形成する微小環境によって制御されていると考えられているが、定常状態ではほとんどの造血幹細胞は静止期にあり分裂していない。
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一方、造血幹細胞を致死量放射線照射によって造血を破壊したマウスの尾静脈より移植すると、骨髄へと移動した造血幹細胞は洞様毛細血管外へと遊走し微小環境に生着後（ホーミング）、増殖・分化が誘導され、造血が再構築される。しかしながら、これらの過程の詳細についてはまだよくわかっていない。そこで我々は、マウスの造血幹細胞移植の系において、尾静脈 (intravenous: IV) 移植と骨髄内 (intra-bone marrow: IBM) への直接移植との比較を行い、移植後の造血幹細胞の増殖を継時的に観察しホーミング能を評価した。その結果、移植後２〜３週間では、IBM 移植において、移植した部位の骨髄（左肢の脛骨）における増殖の立ち上がりが他の骨髄の部位や IV 移植したマウスの骨髄よりも早く、造血幹細胞が IBM 移植した部位に速やかに生着したことが示唆された。しかしながら、最終的な生着率では IV 移植と IBM 移植マウスの間に差はみられなかった。また、IBM 移植した細胞は、１０分から１時間後には移植した部位の骨髄に１０％以下しか留まっておらず、大部分は一度血流に乗って全身を循環することがわかった。これらの結果より、造血幹細胞を直接骨髄に注入すると、その一部は速やかに骨髄内微小環境に生着し増殖を開始するが、その他の大部分の細胞は IV 移植と同様に一度血流に乗って全身を循環し、最終的には骨髄造血微小環境へとたどり着くと考えられる。したがって、造血幹細胞は血流に乗って骨髄造血微小環境へとたどり着く能力も、微小環境に生着する能力も非常に高いことが示唆された。

2. 組織幹細胞の可塑性とリプログラミングに関する研究
1) 造血幹細胞の可塑性の検討
組織幹細胞は、生理的なターンオーバーや損傷によって失われた細胞を補充することにより各組織の恒常性を保っており、各組織幹細胞はその組織を構成する細胞への分化能のみを持つと考えられてきた。しかしここ数年、組織幹細胞には組織の枠を越えた分化能、すなわち可塑性が備わっていることを示す結果が次々と報告されている。組織幹細胞の可塑性を利用することにより、再生医療への応用も期待されている。そこで我々は昨年、マウス造血幹細胞の可塑性をクローナルに検討したが、その結果、造血幹細胞には可塑性はないか、あるとしても血球系以外の細胞への分化の頻度は極めて低いと考えられた。今年度は、腎機能不全モデルマウスを用いて、骨髄移植による腎機能再生効果の検討を行っている。
2) 核移植による組織幹細胞のリプログラミングに関する研究
マウスの組織幹細胞を核ドナーとしたクローン胚あるいは個体を作出し、他の体細胞との発生効率の比較を行うことにより、組織幹細胞のクローン核ドナーとしての利用性と再プログラム化能力の評価を行い、リプログラミングのメカニズム解明の手がかりとなる研究を目指している。現在、BRC 遺伝工学基盤技術室との共同研究により、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞を核ドナーとしたクローン作出効率の比較検討を行い、核移植後の遺伝子発現パターンの相違を解析している。

3. レンチウイルスベクターの開発と幹細胞生物学への応用研究
レンチウイルスベクターは、もともと非分裂細胞を標的とした遺伝子治療用のベクターとして開発されたが、遺伝子機能解析のためのベクターとして基礎研究においても非常に有用であると考えられる。そこで昨年度より、レンチウイルスベクターを基礎研究に利用するためにいくつかの改良を加えている。今年度は、宮脇敦史チームリーダー（脳研）との共同研究によ129

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り、GFP の替わりに Venus をベクターに挿入することにより、より蛍光強度の強いマーカー遺伝子発現ベクターを作製した。また、IRES(internal ribosomeentry site) とその下流に Venus を挿入し、IRES 上流の遺伝子の発現を容易にモニターできるようなベクターを作製した。さらに、Gateway テクノロジー (Invitrogen) を利用したベクターを作製し、ベクターから別のベクターへの移し換えを容易にした。
siRNA (small interference RNA) による遺伝子発現抑制の系も確立した。また、渋谷彰チームリーダー（免疫・アレルギー研、現筑波大学）のグループとの共同研究により、これまでレトロウイルスベクターでFigure 2. レンチウイルスベクターの開発と改良+は遺伝子導入が困難であった静止期にある CD4 T+細胞、CD8 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、マクロファージにも、レンチウイルスベクターを用いることにより効率よく遺伝子導入できることを証明し、実際に遺伝子機能の解析にも応用できることを示した。
研究発表（誌上発表）（原著論文）* 印は査読制度のある論文
1. Bai, Y., Soda, Y., Izawa, K., Tanabe, T., Kang, X., Tojo, A., Hoshino, H., Miyoshi, H., Asano, S.,and Tani, K. Effective transduction and stable transgene expression in human blood cells by athird-generation lentiviral vector. Gene Therapy 10, 1446-1457 (2003)*
2. Kuwata, H., Watanabe, Y., Miyoshi, H., Yamamoto, M., Kaisho, T., Takeda, K., and Akira, S.
IL-10-inducible Bcl-3 negatively regulates LPS-induced TNF- α production in macrophages.
Blood 102, 4123-4129 (2003)*
3. Shibuya, K., Shirakawa, J., Kameyama, T., Honda, S., Tahara-Hanaoka, S., Miyamoto, A., Onodera,M., Sumida, T., Nakauchi, H., Miyoshi, H., and Shibuya, A. CD226 (DNAM-1) is involved inlymphocyte function-associated antigen 1 costimulatory signal for naive T cell differentiation andproliferation. J. Exp. Med. 198, 1829-1839 (2003)*
4. Nishitsuji, H., Ikeda, T., Miyoshi, H., Ohashi, T., Kannagi, M., Masuda, T. Expression of small hairpin
RNA by lentivirus-based vector confers efficient and stable gene-suppression of HIV-1 on humancells including primary non-dividing cells. Microbes Infect. 6, 76-85 (2004)*
5. Katayama, K., Wada, K., Miyoshi, H., Ohashi, K., Tachibana, M., Furuki, R., Mizuguchi, H.,Hayakawa, T., Nakajima, A., Kadowaki, T., Tsutsumi, Y., Nakagawa, S., Kamisaki, Y., andMayumi, T. RNA interfering approach for clarifying the PPAR γ pathway using lentiviral vector
expressing short hairpin RNA. FEBS Lett. 560, 178-182 (2004)*
6. Gyobu, H., Tsuji, T., Suzuki, Y., Ohkuri, T., Chamoto, K., Kuroki, M., Miyoshi, H., Kawarada, Y.,
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Katoh, H., Takeshima, T., and Nishimura, T. Generation and targeting of human tumor-specific
Tc1 and Th1 cells transduced with a lentivirus containing a chimeric immunoglobulin T cell
receptor. Cancer Res. 64, 1490-1495 (2004) *7. Miyagishi, M., Sumimoto, H., Miyoshi, H., Kawakami, Y., and Taira, K. Optimization of ansiRNA-expression system with a mutated hairpin and its significant suppressive effects upon HIV
vector-mediated transfer into mammalian cells. J. Gene Med. 6, 715-723 (2004)*
8. Soda, Y., Tani, K., Bai, Y., Saiki, M., Chen, M., Izawa, K., Kobayashi, S., Takahashi, S., Uchimaru,K., Kuwabara, T., Warashina, M., Tanabe, T., Miyoshi, H., Sugita, K., Nakazawa, S., Tojo, A.,Taira, K., and Asano, S. A novel maxizyme vector targeting a bcr-abl fusion gene induced specificcell death in Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Blood 104,356-363 (2004)*
9. Kobayashi, M., Takaori-Kondo, A., Fukunaga, K., Miyoshi, H., and Uchiyama, T. Lentiviral
gp34/OX40L gene transfer into dendritic cells facilitates alloreactive CD4+ T-cell response invitro. Int. J. Hematol. 79, 377-383 (2004)*
10. Ojima, K., Uezumi, A., Miyoshi, H., Masuda, S., Morita, M., Fukase, A., Hattori, A., Nakauchi, H.,
Miyagoe-Suzukia, Y., Takeda, S. Mac-1low early myeloid cells in the bone marrow-derived SP
fraction migrate into injured skeletal muscle and participate in muscle regeneration. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 321, 1050-1061 (2004)*
11. Sumimoto, H., Miyagishi, M., Miyoshi, H., Yamagata, S., Shimizu, A., Taira, K., and Kawakami,
Y. Inhibition of growth and invasive ability of melanoma by inactivation of mutated BRAF withlentivirus-mediated RNA interference. Oncogene 23, 6031-6039 (2004)*
12. Kawano, Y., Yoshida, T., Hieda, K., Aoki, J., Miyoshi, H., and Koyanagi, Y. A lentiviral cDNA
library employing lambda recombination used to clone an inhibitor of human immunodeficiency
virus type 1-induced cell death. J. Virol. 78, 11352-11359 (2004)*
13. Sumimoto, H., Yamagata, S., Shimizu, A., Miyoshi, H., Mizuguchi, H., Hayakawa, T., Miyagishi,M., Taira, K., and Kawakami, Y. Gene therapy for human small-cell lung carcinoma byinactivation of Skp-2 with virally mediated RNA interference. Gene Ther., in press*（総説）
1. 三好浩之、
中内啓光：組織幹細胞の可塑性

実験医学 ( 増刊 )幹細胞研究の最先端（羊土社）

Vol.21 (No.8)( 増刊 ), 130-134 (2003)
2. 渋谷和子、三好浩之、渋谷彰：レンチウイルスベクターを用いた静止期免疫細胞への安定131

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的遺伝子導入法とその応用

細胞工学（秀潤社） Vol.22 (No.11), 1232-1239 (2003)

3. 三好浩之、守田陽平：Flow-FISH 法によるテロメア長の解析 Medical Science Digest Vol.29(No.12), 5-6 (2003)
4. 三好浩之、中内啓光：造血幹細胞の可塑性実験医学（羊土社） Vol.22 (No.1), 6-11 (2004)（著書）
1. Miyoshi, H. Gene delivery to hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Methods in MolecularBiology (HUMANA PRESS) Vol.246: 429-438 (2004)
2. 三好浩之：遺伝子導入法（レンチウイルスベクター） 実験医学 ( 別冊 )免疫学的プロトコール（羊土社）, 127-137 (2004)
研究発表（学会発表）（国際会議）
1. Miyoshi, H., Shimizu, N., Morita, Y., Yuan, X., Ishikawa, F., and Nakauchi, H. Correlation between
telomere length and proliferative capacity of hematopoietic stem cells. The 45th Annual Meetingof The American Society of Hematology, San Diego, USA, Dec. (2003)（国内会議）
1. 井上信一、野田慎一、石川香、守田陽平、中内啓光、三好浩之：“ 造血幹細胞の可塑性の検討 ”
第 26 回日本分子生物学会年会、神戸、12 月 (2003)
2. 清水なつみ、守田陽平、大澤光次郎、石川冬木、中内啓光、三好浩之：“ 造血幹細胞におけるテロメア短小化と骨髄再構築能低下との相関 ” 第 26 回日本分子生物学会年会、神戸、
12 月 (2003)

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