バイオリソース協力研究グループ

5. 石井分子遺伝学研究室
Molecular Genetics Laboratory
グループヘッド石井俊輔

Shunsuke Ishii

生き物の固有の特徴となっているさまざまな形質が，どのように発現し制御されているのかという問題は，生物学における大きな命題となっている。近年の遺伝子操作技術の発達は，遺伝子の発現制御機構に分子レベルで迫る手だてを与えた。特に細胞増殖に関する研究は飛躍的に進み，細胞への増殖・分化のシグナルは膜受容体，シグナル伝達物質により引きつがれ最終的には核内に伝達されると考えられるようになった。しかし，どの遺伝子産物がどの遺伝子をいかなるメカニズムで活性化するのか、それがいかにして細胞シグナル伝達機構とかかわっているのか，さらには，それがいかに細胞の分化・がん化につながるのかと行った問題に関しては今後明かにされるべき点が多い。当研究室では遺伝子発現制御機構を分子レベルで解析する事によって，これらの問題を解明することを目指している。

職員とメンバー構成

主任研究員

石井俊輔（昭和 57 年 4 月〜）

副主任研究員前川利男（昭和 57 年 6 月〜）先任研究員

野村

照明（平成 2 年 11 月〜）

秋丸

裕司（平成 4 年 10 月〜平成 15 年 11 月）

高木豪（平成 9 年 4 月〜）

田中康範（平成 13 年 9 月〜平成 16 年 3 月）

研究員

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2003~2004

年次計画と成果

Molecular Genetics Laboratory

１．遺伝子発現制御因子として機能する核内がん遺伝子産物の研究
動物細胞の多くの遺伝子の機能を明らかにするためには変異マウスの作製・解析は不可欠である。しかし変異マウスが胎性致死となる場合も多く、遺伝子機能の解明のためには、組織特異的な変異マウスの作製・解析が望まれる。しかし ES 細胞での相同組換え及びCRE/loxP システムを用いる方法では、組織特異的変異マウスの作製には通常１年以上の期間と多大な労力を要する。私達は最近 RNA interference を利用して、短期間で組織特異的な knock-down マウスを作製する系を開発した。RNA interference は最初ショウジョウバエ、線虫で見出され、動物細胞でも起こり得ることが分かってきた。
RNA interference のメカニズムの解析の結ショウジョウバエを使って遺伝子の機能を解析する

果、短い二本鎖 RNA が mRNA 分解を誘導することが分かり、短いヘアピンタイプの二本鎖RNA を RNA ポリメラーゼ III プロモーターから発現させ、遺伝子機能を knock-down する系が相次いで報告されている。しかし RNA ポリメラーゼ III プロモーターはすべての組織・細胞で機能するため、組織特異的に二本鎖 RNA を発現できない欠点がある。また RNA ポリメ
ラーゼ II プロモーターを使用できれば、組織特異的な発現が可能となるが、この場合には二本鎖 RNA のサイズが長くなり、インターフェロン応答が起きてしまう。私達は転写開始点のすぐ下流にリボザイム切断部位と、poly(A) 付加配列の代わりに、転写を一時的に停止させる
MAZ 結合サイトを有する二本鎖 RNA 発現ベクター（pDECAP: delete the cap and polyA）を開発した。このベクターから転写されたヘアピンタイプの長い二本鎖 RNA は、5' 末端の cap 構造が速やかに除かれ、また 3' 末端に poly(A) 鎖を持たないため、細胞質に移行せず、核内で短い二本鎖 RNA に分解され、その後細胞質に移行するため、インターフェロン応答が誘導されない。
実際にこのベクターに転写コリプレッサー Ski 遺伝子を挿入し、作製したトランスジェニックマウスは神経管の閉塞異常などの Ski 変異マウスと同様の表現型を呈することを観察した。私達の方法では RNA ポリメラーゼ II のプロモーターを用いるので、種々の組織特異的プロモーターを用いることが可能である。また、この方法はトランスジェニックマウスを作製する方法を利用するので、短期間で変異マウスが作製することができる。この方法がさらに改善・完成されれば、組織特異的変異マウスの作製過程の大幅な時間・労力の削減が可能になり、個々の遺伝子の機能解明は飛躍的に進むことが期待される。

２．細胞外刺激による遺伝子発現誘導の研究
Ski は転写 co-repressor として知られており、TGF βシグナル伝達経路において Smad のnegative regulator として機能する。Ski が機能する際の分子メカニズムを探るため、Ski に結合する因子を Yeast two hybrid screening により探索した。その結果、C184M 蛋白質を同定した。
C184M は、中央部分にロイシンジッパーを含む全長 189 アミノ酸の比較的小さな蛋白質である。GST-pull-down assay および共免疫沈降実験の結果、C184M のロイシンジッパーと Ski の C末端（coiled-coil）領域が相互作用することがわかった。培養細胞内で Ski と C184M を過剰発
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現させると、細胞質において Ski 蛋白質の蓄積が観察された。ここにさらに、Smad2、4 を過剰発現させると、Smad2 の核移行が阻害された。これらの結果より C184M は細胞質の Ski を介して TGF- βシグナルを負に制御することが予想された。実際、C184M を Stable に発現するMv1Lu cell において TGF- βによる増殖抑制がブロックされた。また、3TP-Lux reporter を用いた Luciferase assay においても Smad2,4 による転写活性化が抑制されていた。以上の結果は、C184M が細胞質 Ski による Smad2 の核移行阻害という新たな TGF- βシグナル抑制機構に関与することを示唆している。
また、HIPK2 (Homeodomain Interacting Protein Kinase 2) は、ホメオボックスタンパク質 NKファミリーに結合し、転写リプレッサー NK-1 や NK-3 による転写抑制作用を促進する因子として同定されたタンパク質リン酸化酵素である。また、HIPK2 は Groucho、NK-3、ヒストン脱アセチル化酵素を含む、コリプレッサー複合体を形成することが、知られている。一方、
c-Ski は NcoR・ヒストン脱アセチル化酵素複合体のコンポーネントの１つであり、TGF βシグ
ナリル伝達経路においては、Smad2, 3, 4 による転写活性化能を抑制する negative regulator としての役割をもつことが知られており、ヒストン脱アセチル化酵素を Smad 複合体にリクルートすることも報告されている。しかし、Ski が BMP シグナル伝達経路において Smad にどのように影響するかは報告されていなかった。私達は一連の解析の結果、HIPK2 と c-Ski の複合体が、BMP シグナリングの下流で Smad1,4 による転写活性化を抑制する負の制御因子として働くことを明らかにした。
３．ショウジョウバエを用いた転写制御因子の遺伝学的解析
転写因子 Cubitus interruptus (Ci) は動物細胞の癌遺伝子産物 Glioblastoma (GLI) のホモログであり、Hedgehog シグナル伝達経路上で機能し、形態形成に関与する。Wing disc の A/P 境界上で発現する 155 kD の full-length form の Ci は転写を活性化するのに対し、Anterior 側で発現し、Processing によって産生される 75-kD の短い Ci は転写抑制因子として機能する。Ciの活性制御メカニズムを解析するため、Yeast two-hybrid screening
によって、新規の Ci 結合因子を同定した。この因子は細胞質のMVB（multivesicular body）に局在し、full-length form の Ci のみに結合し、Ci を Lysosome に運搬して分解する機能を有していた。 そ こ で こ の 因 子 を Debra（Determiner of breaking down of Ciactivator）と名付けた。Debra は Ci に Polyubiqutin 鎖を付加することによって、Ci を MVB-lysosome pathway へ運搬することが示された。そして Debra は Wing disc の Anterior 側で帯状に発現し、Hedgehog シグナルが機能する領域を規定する役割を果していた。
突然変異をおこしたショウジョウバエを顕微鏡を用いて解析する

このように Debra は転写因子 Ci の Ubiquitination によって、形態形成を制御するユニークな因子であることが示された。

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研究発表（誌上発表）（原著論文）* 印は査読制度のある論文
1. Dai, P.*, Akimaru, H.* & Ishii, S. (*equally contributed) (2003). A Hedgehog-responsive region in the
Drosophila wing disc is defined by debra-mediated ubiquitination and lysosomal degradation ofCi. Dev. Cell 4, 917-928.*
2. Yoshida, Y., Nakamura, T., Komoda, M., Satoh, H., Suzuki, T., Tsuzuku, J.K., Miyasaka, T., Yoshida,E.H., Umemori, H., Kunisaki, R.K., Tani, K., Ishii, S., Mori, S., Suganuma, M., Noda, T. &Yamamoto, T. (2003) Mice lacking a transcriptional corepressor Tob are predisposed to cancer.
Genes & Dev. 17, 1201-1206.*
3. Shinagawa, T. & Ishii, S. (2003). Generation of Ski-knock down mice by expressing a long
double-strand RNA from an RNA polynerase II promoter. Genes & Dev. 17, 1340-1345.*
4. Kokura, K., Nomura, T., Khan, M. M., Kim, H. & Ishii, S. (2003). The Ski-binding protein C184M
negatively regulate TGF- β signaling by sequestering the Smad proteins to cytoplasm. J. Biol.
Chem. 278, 20133-20139.*
5. Harada, J., Kanei-Ishii, C., Nomura, T., Khan, M. M., Kim, Y. & Ishii, S. (2003). Requirement of theco-repressor HIPK2 for Ski-mediated inhibition of BMP-induced transcriptional activation. J.
Biol. Chem. 278, 38998-39005.*
6. Chen, D., Xu, W., Bales, E., Colmenares, C., Conacci-Sorrell, M., Ishii, S., Stavnezer, E., Campisi, J.,
Fisher, D.E., Ben-Ze'ev, A. & Medrano, E.E. (2003) SKI activates Wnt/beta-catenin signaling inhuman melanoma. Cancer Res. 63, 6626-6634.*
7. Kanei-Ishii, C., Ninomiya-Tsuji, J., Tanikawa, J., Nomura, T., Ishitani, T., Kishida, S., Kokura, K.,
Kurahashi, T., Ichikawa-Iwata, E., Kim, Y., Matsumoto, K. & Ishii, S. (2004). Wnt-1 signal
induces phosphorylation and degradation of c-Myb protein via TAK1, HIPK2, and NLK. Genes &Dev. 18, 816-829.*
8. Alarcon J.M., Malleret, G., Touzani, K., Vronskaya, S., Ishii, S., Kandel, E.R. & Barco, A. (2004).
Chromatin acetylation, memory, and LTP are Impaired in CBP(+/-) Mice; A Model for thecognitive deficit in Rubinstein-Taybi syndrome and its amelioration. Neuron 42, 947-959.*
9. Khan, M. M., Nomura, T., Chiba, T., Tanaka, K., Yoshida, H., Mori, K. & Ishii, S. (2004). The fusion
oncoprotein PML-RAR α induces endoplasmic reticulum-associated degradation of N-CoR andER stress. J. Biol. Chem. 279, 11814-11824.*
10. Nomura, T., Tanikawa, J., Akimaru, H., Kanei-Ishii, C., Ichikawa-Iwata, E., Khan, M. M., Ito, H. &Ishii, S. (2004). Oncogenic activation of c-Myb correlates with a loss of negative regulation by136

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石井分子遺伝学研究室
Molecular Genetics Laboratory

TIF1 β and Ski. J. Biol. Chem. 279, 16715-16726.*
11. Kanei-Ishii, C., Nomura, T., Tanikawa, J., Ichikawa-Iwata, E., & Ishii, S. (2004). Differential
sensitivity of v-Myb and c-Myb to Wnt-1-induced protein degradation. J. Biol. Chem. in press.*

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