生体情報統合技術開発チーム
Technology and Development Team for BioSignal Program

細胞運命情報解析技術開発サブチーム
Subteam for Manipulation of Cell Fate
サブチームリーダー

三好浩之（理博）

Hiroyuki MIYOSHI, Ph.D.

幹細胞は、自分自身を複製する能力（自己複製能）とによって決定されているのかを明らかにすることが必要

体の組織や器官を形成する様々な細胞を作り出す能力である。当チームでは、特に造血幹細胞と多能性幹細胞（多分化能）を持つ未分化な細胞である。近年、この幹を研究対象として、どのような情報によって幹細胞の運細胞を利用した再生医療に大きな期待が寄せられている命が決定されているのかを解析し、幹細胞の試験管内でが、その実現のためにはまず幹細胞の未分化性の維持、の人工操作を可能にするような技術開発を目指してい増殖、分化といった細胞の運命がどのようなメカニズムる。

事業内容
1. 造血幹細胞の体外増幅のための技術開発
2. 組織幹細胞のリプログラミングに関する研究
3. レンチウイルスベクターの開発と幹細胞生物学への応用研究

職員とメンバー構成
サブチームリーダー 三好浩之（平成 15 年 7 月〜）

開発研究員

山口智之（平成 16 年 4 月〜平成 20 年 3 月）

吉田尚美（平成 20 年 7 月〜）

森川あずさ（平成 14 年 5 月〜平成 19 年 12 月）

BRC 研究協力員

栂谷内純恵（平成 20 年 2 月〜）

テクニカルスタッフ 鈴木 ( 大崎 )加奈枝（平成 20 年 3 月〜）

アシスタント三宅久美子（平成 17 年 9 月〜）JRA清水なつみ（平成 14 年 4 月〜平成 20 年 3 月）

野田慎一（平成 15 年 4 月〜）

井上信一（平成 14 年 4 月〜平成 19 年 3 月）

須永裕之（平成 17 年 4 月〜平成 19 年 3 月）

鹿島幸太郎（平成 19 年 4 月〜）

橋爪脩（平成 20 年 4 月〜）

研修生― 148 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

細胞運命情報解析技術開発サブチーム
Subteam for Manipulation of Cell Fate

鈴木 ( 大崎 )、橋爪、鹿島、野田栂谷内、三好サブチームリーダー、三宅年次計画と成果
1. 造血幹細胞の体外増幅時における細胞表面抗原の表現型と幹細胞能力の解析

増殖した細胞の半分量について FACS 解析を行い、残りの半分量を競合細胞と共に致死量放射線照射したマウス

造血幹細胞は、すべての血球細胞に分化する能力（多に移植し骨髄再構築能を解析した。その結果、増殖し分化能）と多分化能を維持したまま分裂する能力（自己た細胞数には個々のクローンでかなりの差があり (4 〜複製能）を持つ細胞である。現在、その能力は造血幹細3846)、細胞数が多いほど未分化性の高い KSL 分画の割胞移植という形で、白血病、再生不良性貧血、重症複合合は少なくなる傾向がみられた。このことは、CD34(-)

免疫不全等の血液疾患に対する効果的な治療法として用KSL 細胞が均一な細胞集団ではないことを示すものでいられている。一方で、ドナーリスクの軽減やドナー細ある。また、KSL 分画の割合が高いクローンほど骨髄胞不足の解消、遺伝子治療への応用、血液製剤の大量生

KSL 分画の割合が低い（< 25%）クロー再構築能が高く、産などの必要性から、造血幹細胞の体外増幅技術の開発

ンでは多くの KSL 細胞が含まれていたとしても骨髄再が課題となっている。特に、in vitro で造血幹細胞の増構築能がみられないことが明らかとなった。さらにいく

殖をサイトカイン等で刺激すると、分化も促進され、そつかの未分化表面抗原マーカーについても解析を行っの多くは幹細胞としての能力を失ってしまうことが問題た結果、幹細胞活性を維持しつつ増殖している細胞はとなっている。本研究では、まず造血幹細胞の体外増幅

CD48(-)KSL 細胞分画に含まれることを見出した（図 1）。

時における細胞表面抗原の表現型と幹細胞能力との関係

また、CD34(-)KSL(quiescent HSCs)、CD48(-)KSL(cyclingを明らかにすることを目的とした。

HSCs)、CD48(+)KSL(cycling non-HSCs) の各細胞のマイマウス造血幹細胞は、細胞表面抗原の発現が CD34 陰

クロアレイ解析を行ったところ、CD48(-)KSL 細胞と性・弱陽性、c-kit 陽性、Sca1 陽性、分化抗原マーカー

CD48(+)KSL 細胞の遺伝子発現の違いは CD34(-)KSL 細陰性（CD34(-)KSL）細胞に濃縮されることが知られて胞と比較してかなり少ないことがわかり、幹細胞活性のいる。この CD34(-)KSL 細胞 1 個を、サイトカイン（SCF,維持に関与する遺伝子はそれほど多くないということがTPO, FGF-1, IGF-2）を含む無血清培地で１週間培養後、示唆された。これらの結果は、造血幹細胞の体外増幅技術開発の基礎となる有用な知見であると考えられる。

― 149 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

細胞運命情報解析技術開発サブチーム
Subteam for Manipulation of Cell Fate期の造血幹細胞でのみ発現の高い遺伝子に着目し、膜タンパク質、分泌タンパク質および転写因子を中心に造血幹細胞の自己複製と多分化能維持に重要であると思われる約 130 の候補遺伝子を選択した。現在、これらの候補遺伝子の cDNA あるいは siRNA(small interfering RNA) をレンチウイルスベクターを用いて造血幹細胞に導入し、その遺伝子の機能解析を in vitro および移植実験によるin vivo で行っており、これまでに、Necdin が細胞分裂を抑制すること、HoxB5 が分化を抑制することなどを見出している。
また、in vitro で造血幹細胞の自己複製能と多分化能を維持することができるストローマ細胞株（OP9, PA6）と PA6 のサブクローンで造血幹細胞を維持することができなくなった細胞株（PA6-S2,S12）に対するマイクロアレイ解析を行った。PA6、OP9 に共に発現が認められた遺伝子 (9951) のうち、PA6-S2、PA6-S12 で２倍以上減
少している遺伝子はわずか 144 であり、それらの大部分は膜タンパクであった。これらの遺伝子のうち、11 遺伝子についてその cDNA をレンチウイルスベクターを用いて PA6-S2 に強制発現させ、造血幹細胞の支持能力に与える影響を in vitro および移植実験による in vivo で

図1

マウス造血幹細胞（CD34(-)KSL 細胞）の in vitro 培養後の表面抗原解析した（図 2）。造血幹細胞を共培養した後、メチルマーカーと幹細胞活性の解析

セルロース培地でのコロニー形成能を解析した結果、7（A）培養後の CD48 の発現は不均一である。

遺 伝 子 (1110007F12Rik, 1200009O22Rik, 2900064A13Rik,（B）CD48(-)KSL 細胞の細胞数は増加するがその割合は培養とともに減少

Ccl9, IL-6, Ppap2b, Cxcl5) で 未 分 化 な 造 血 細 胞 の 支 持する。
（C）各細胞分画の移植実験により、幹細胞活性を維持しつつ増殖してい能 力 の 回 復 が 認 め ら れ た（ 図 3A）。 特 に 機 能 未 知 のる細胞は CD48(-)KSL 細胞分画に含まれることがわかった。

する分子の探索

造血幹細胞の増殖を支持する
ストローマ細胞株（PA6, OP9）

PA6#00-2
PA6#02-1
PA6#02-2
PA6#12-1
PA6#12-2
OP9-1
OP9-2

2. 造血幹細胞の自己複製と多分化能維持に関与

PA6#00-1

マイクロアレイ解析

PA6 サブクローンで発現の低下している候補遺伝子

造血幹細胞においてどのような遺伝子が発現しているレンチウイルス
ベクターを用いてcDNA を PA6 サブクローンに導入のかを知ることは、自己複製や多分化能維持のメカニズムを解明するうえで非常に有意義な情報であると思われる。これまでにもマイクロアレイを使用した遺伝子発現解析が行われているが、それらの解析で使用している造血幹細胞の純度は必ずしも高くなかったり、また比較している対象も分化した血液細胞や他の幹細胞であったり造血幹細胞の増殖を支持できない
PA6 サブクローン
ストローマ細胞株（PA6 S-2, S-12）

造血幹細胞と共培養

in vitro analysisと、必ずしも有益な情報とは言い難いものであった。そin vivo analysis

x 1/16x 1/8x 1/4x 1/2x1x2x4x8x 16

こで、マウス骨髄より、長期または短期の骨髄再構築能を持つ造血幹細胞、前駆細胞、分化した血球細胞（B 細胞、T 細胞、NK 細胞、NKT 細胞、顆粒球、マクロファージ、

図2赤芽球）を FACS により高純度に単離し、マイクロアレ自己複製と多分化能維持に関与する候補遺伝子のスクリーニング

イ解析を行った。得られた情報をもとに、長期または短― 150 ―ストローマ細胞株のマイクロアレイ解析をもとにした造血幹細胞のRIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

細胞運命情報解析技術開発サブチーム
Subteam for Manipulation of Cell Fate

1110007F12Rik(Tmem140) 遺伝子については、長期骨髄現の On、Off 調節が可能なベクターなどを作製し、国再構築能の顕著な上昇も認められた（図 3B）。この遺伝

内外の多数の研究者に提供している。また、宮脇敦史

子は、185 アミノ酸からなるロイシンリッチなタンパクチームリーダー（理研脳科学総合研究センター）のグ質をコードしており、造血幹細胞の多分化能維持に関与ループとの共同研究により、Venus など様々な蛍光タする可能性が高いものと考え、現在さらに詳細な解析をンパク質遺伝子レポーターを発現するベクターも作製進めている。

しており、ごく最近では、細胞周期をモニターすること が で き る mKO2(monomeric Kusabira Orange)-hCdt1、

in vitro colony forming cell assay

AmAG(monomeric Azami Green)-hGeminin などの蛍光タン
パク質融合遺伝子発現ベクターを作製した。

No. of colonies

50

これまでに使用されている遺伝子トラップベクターの

40M
GGMG EMG EM M3020

大多数は、レトロウイルスベクターを利用したものであるが、レトロウイルスベクターは遺伝子の転写開始点近傍あるいは遺伝子の領域外に挿入される頻度が高いため、遺伝子トラップ効率はあまり高くない。一方、レン10

チウイルスベクターは遺伝子内（特に転写されている遺06 -2 ik ik ik l2 l9 -6 53 gf 2b l5 rn
PA 6 S 2R 2R 13R Cc Cc IL Cd
H ap Cxc IL-1
21Pp
PA 07F 9O 64A
0 000
10 00 00
11 12 29

伝子内）にランダムに挿入される頻度が高いことから、効率よく遺伝子トラップできることが期待される。
また、非分裂細胞を含む、より広範囲の細胞種で遺伝子トラップを行うことが可能になる。そこで、遺伝子トラップ用

in vivo competitive repopulation assay

Bのレンチウイルスベクターとレトロウイルスベクターを作製し、HeLa 細胞および ES 細胞に感染させ、挿入部% chimerism

30位を多数解析することにより、遺伝子トラップ効率を比20較検討した。その結果、レンチウイルスベクターは遺伝子領域以外に挿入された偽陽性の頻度がレトロウイルスベクターの約 1/5 と大幅に低かった。またトラップした10遺伝子におけるベクターの挿入部位は、レトロウイルス
0

図36PAikik
ik
2R2R 13R
612A
PA 07F 09O
6400000
01001129
12S-2

l9Cc-6IL

ベクターの場合では 5′UTR およびコーディング領域の52bclap
Cxp
P

5′ 側 10% 以内が約 80% と大きく偏っていたのに対し、レンチウイルスベクターの場合では遺伝子領域全体に均一に分布していた（図 4）。以上の結果より、レンチウ候補遺伝子を強制発現させた PA6-S2 と造血幹細胞を共培養し、支イルスベクターはレトロウイルスベクターよりも効率よ持能力に与える影響を解析した。
（A）コロニー形成能の解析（B）移植実験による長期骨髄再構築能の解析

く遺伝子トラップできることがわかった。
Retroviral vector
Lentiviral vector

3. レンチウイルスベクターの開発と基礎研究への応用
レンチウイルスベクターは、もともと非分裂細胞を標的とした遺伝子治療用のベクターとして開発されたTrapping frequency (%)

60が、遺伝子機能解析のためのベクターとして基礎研究に

50
4030201005’UTR 10%20%

30%

40%も利用できるよう様々な改良を行っている。これまでに、各種プロモーター（CMV, EF-1α, UbC, PolII, CAG）のベクター、Gateway テクノロジー (Invitrogen) を利用

50%

60%

70%

80%

90% 100% 3’UTR

Integration site

図4ES 細胞におけるレンチウイルスベクターとレトロウイルスベクターの遺伝子トラップ挿入部位の解析したベクター、Tet 発現調節機構を利用した siRNA 発― 151 ―RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

細胞運命情報解析技術開発サブチーム
Subteam for Manipulation of Cell Fate

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RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007細胞運命情報解析技術開発サブチーム
Subteam for Manipulation of Cell Fate

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2. 清水 なつみ , 形山 和史 , 野田 慎一 , 市川 仁 , 三好浩之： “ ストローマ細胞株を利用した造血幹細胞の多分化能維持に関与する分子の探索 ”, 日本分子生物学会 2006 フォーラム , 名古屋 , 12 月 (2006).
3. 井上 信一 , 中田 和人 , 三好 浩之 , 林 純一：“ ミトコンドリア呼吸機能低下に起因する巨赤芽球性貧血の― 154 ―