博 士 （ 医 学）

中 沢 大悟学 位 論 文題 名IVIPO‑ANCA関 連 血 管 炎 に お け るNeutrophilExtracellularTrapsの関与
学位論文内 容の要旨
【背景と目的】MPO― ANCA関 連 血 管 炎 (MPO― AAV)は 欧 米 に 比 べて わ が 国 に 多い 血 管 炎 で ある ． 好 中 球 の細 胞 質に 存 在 する ミ エ ロペ ルオ キシダ ーゼ(MPO)に 対する 自己抗 体(MPOーANCA)の 出現 を伴っ て，し ばしば
半月 体形成 性糸 球体腎 炎から 急速進 行性腎 障害 をきた し，重 篤な場 合に は肺出血をきたして死亡する
こ と も ある ， 先 行 研 究に お い て MP
O― ANC
Aの 病 原 性 が確 認 さ れ ている が，な ぜMP
O―ANCAが 産生される かは不 明の ままで ある， そのた め，治 療は 非特異 的かつ 強カな 免疫 抑制治療に頼らざるを得ず，疾患 を制御 する ことが 困難な 上，過剰治療による治療関連死が多いことが問題となっており，本研究で
はM
POーA
N
CAの産生機序を解析する事を目的とした，
Neutrophil Ex
tracellular Traps (NETs)は2004
年 に報告された好中球の細胞死形態のーっで，貪食に引 き 続 き， 細 胞 死 に 至る 好 中 球 が M
PO等 の 細 胞質 内 抗 菌 蛋 白と 核DN
Aを細 胞外に ファ イバー 状に放出す ること によ り形成 され， 細胞死に至った後も微生物を捕捉して殺菌する．しかし，近年このNETsが自 己 免 疫 疾 患と 関 与 す る と報 告 さ れ ， 特 にANCA関連 血 管 炎 患 者の 腎 糸 球 体 半月 体 部 位 や 血 清でNETsが 検出さ れ，病 態の悪 循環 を招い ている 可能性 が指 摘され ている ．一方，バセドウ病の治療薬であ る プ ロピ ル チ オウ ラシ ル(PTU)は，投 与さ れた患 者の30％ にMPO―PANC
A産生 を誘導 する ．P
TUの一部はMPOで 代 謝 され る こ と が 知ら れ て お り ， 本研 究 で は ， PTUがNE
Tsの形成 や代謝 に影響 を与 え，
MPO―ANCAの産生に関与するという仮説を立てた．
【材料と方法】
1． PTUによるNETsの形成異常と分解障害
ヒ ト 末 梢 血 から 好 中 球 を 分離 し ， 20n
Mの PMAで NETsを 誘 導 し ， 同 時に PTU 20ILM
添 加 の 有 無 に分け て 2時 間 培 養 し ， NETs形 態 を 観 察 し た ． NETs誘 導 後 に lU/m
Lの DNaseIを 加 え15分 反 応 させ た
後，PTU添 加 の 有無 に よ る NE
Tsの 分 解 程度 を観察 した ．また ，NETs形 成には ，好中 球の核 が脱 凝縮を起こし，核と細胞質が融合する準備段階が必要であり，これにはヒストンのシ卜ルリン化が関与している，
そこ で，PTU添加 の有 無でPMA刺激した好中球から蛋白を抽出し，Westernblot
法でヒストンのシトルリン化を検討した．
2． PTU添 加 によ り 形成さ れた異 常なNETsがMP
O一AN
CA産 生の原 因とな って いるか を解析 するた め，
二 っ の 動物 モ デ ル を 作成 し た ， ＠ P
TU添 加 N
ETs免 疫 モデ ル ： 8週 齢雄 の WKY
ラ ッ ト に in v
itroでラット好中球から誘導したラットNE
Ts(PTU添加の有無に分けて）を同量の完全型アジュバントと混合し，0
日目と7日 目 に WK
Yラ ッ ト に 免疫 し た ， 14
日 目 と 21日日 に は そ れぞれ のNE
Tsの みを腹 腔内 に投与 した ， ◎ PTU経 口 投 与 に PMA腹 腔 内 投 与 を 併 用 し た モ デ ル ： WKYラ ッ トに PMA(1p g/body)を 0日 日―239−

と7日目に腹腔内 注射し，PTU(lOmg/dayノbody)を30日聞経口投 与した(PTU/PMAラ ット），コントロー ルと して PMA
腹 腔 内注 射の み 行っ たラ ッ ト(PMAラ ッ ト） を解 析 した ，両ラットと も採血，採尿を行い ，MPO− ANCAの 産 生 ， 生 化 学 検 査 を 行 い ， 30日 目 に 解 剖 し 組 織 学 的 に 検 討 し た ．
【 結 果 】 PMAに よ り 刺 激 さ れ た 好 中 球 はMPOとと もに ク ロマ チン フ ァイ バー を 細胞 周囲 に 放出 してNETsを 形 成 し た の に 対 し ， PMAに PTUを添 加 して 作製 し たNETs
は，MPOと D
NAは 混合 され る もの の，クロマチンファイバーは伸展せず，異常な形態を示した． We
sternblot
法でヒストンのシトルリン化を検討したと ころ，PTUの有無によらずシ トルリン化ヒストンが観察された．すなわち，PMAとともにPTUを添加した 好中 球 にお いて も ，NETsは形成 されているが，そ の形態が異常である ことが確認された ．次に，PTU
添 加 の 有 無で 誘 導し たNETsをDNas
eI処 理に より 分 解す る実 験 を行 った と ころ ，PTUを添 加 せず に誘導 し た NETsは 分 解 さ れ る が ， PTUを 添 加 し て 誘 導 し た 異 常 な NETsは DNaseIで 分 解 され ず， DNA，MPOとも 残存 す るこ とが わ かっ た， こ のこ とか ら ，PTUを添 加し て 誘導 され る 異常 な形 態のNE
Ts
は，DNaseIに よる 分 解障 害を き たす こと が 示唆 され ， この 分解 さ れに くい MPO
蛋 白 を内 包す る N
ETsが，
MPOに対 する 免 疫寛 容を 破 綻さ せる と いう 仮説を立 て，invivoの実験を 行った，PT
Uを添加しないNETsを 免 疫 し たラ ッ ト(NETs免 疫ラ ッ ト） では MPO― ANC
Aは 産生 さ れな かっ た が， PTU添 加し た N
ETsを免疫 した ラ ット (PTU/NETs免 疫ラ ット ） では ANCAの 産生 を認 め ，臓 器病変として 肺胞出血と肺毛細血 管炎 が認 め られ た， し かし，腎組織 では糸球体には明 らかな腎炎の所見は 見られなかった． そこで，WKY
ラ ット に PTUを 経口 投与 し ，同 時に PMAを 腹 腔内注射するモデ ル(PTU/PMAラット ）を作成したところ ，MPO― ANCAが産 生さ れ ，臓 器病 変 とし ては 肺 出血 が見 ら れ， 腎臓 の 病理 所見 で は， 糸球 体 に巣 状分節性の 増殖性病変と炎症 細胞浸潤を認めた，【 考察 】 本研 究は ， P
TUに より MP
Oな どの 細 胞内 蛋白 が 異常 なNETsとと もに ， 細胞 外に 長期間存在 する こと が ，MPOに対 する 免 疫寛 容を 破 綻さ せ， MPO− ANCAの 産生 の 関与 する 可 能性 が示 唆した．自 然発 症の 特 発性 MP
O一 AA
Vに おい て も， 感染 症 や遺 伝要 因 ，環 境要 因 など がNETsの制 御異 常を惹起し ，NETs成 分 に 対 す る 免 疫 寛 容 の 破 綻 に よ り MPO‑ANCAが 産 生 さ れ る 可 能 性 が あ る ， 特に NETsを 制御
す る DNaseI活 性 に 異 常 が あ る 患 者 群 が存 在 する 事や ， 感染 症に お いて はDNase
I耐 性菌 の 存在 も知られる ようになり，こう したN
ETs制御異常を 起こしうる要因と MPO−ANCAとの関係を解析することが，本疾患の さらなる病因・病 態を解明する手がか りになると考えられる，現在，本疾患に対する標準治療とされるス テロイドとエンド キサンの併用療法は ，生命予後を大きく改善してきたが，治療開始からの短期間で の死 亡 率は 依然 高 く， その 原 因は 疾患 そ のものよりも治療 関連死，特に過剰 治療による感染症死 が多 いと 報 告さ れて い る． この 事 は， 本疾 患 の病態の本質がわ かっていないため ，非特異的かつ過剰 な
免 疫抑 制 治療 に依 存 しているとい う事態を反映して いる．こうした現状 から，病原性のあ るM
PO―ANC
Aの 産生 機 序を 解明 し ，特 異的 な 治療 を開 発 する こと が 強く 望ま れ る． 本研 究 で示 した MP
O‑AN
CAの産生 にNETsの制 御異 常 が関 与し て いる とい う 概念は，病態に即 した新たな特異的 治療の開発に結びっ く可能性 がある，
【 結 論 】 PTUに よ り 分 解 障 害 を 来 し た NETsは ， MPO― ANCAの 産 生 ， な ら び に MPO‑ANCA関 連 血 管炎の発 症に関与する可能 性がある．

― 240−

学位論文審査の要旨
主査教
授笠原正典
副査准教 授松本美佐 子
授渥達也
副査教
美有
正授
副査教
賀

学 位 論 文 題名

MPO・ ANCA関 連 血 管 炎 に お け る
NeutrophilExtracellularTrapsの関与
MYel
OPeroxidaseーantineutrophilcytoplasmicantibody(MPO一ANCA)
関連血管炎の病態
は、病原性自己抗体であるMP
O−ANC
Aが好中球を活性化し、好中球殺菌蛋白の脱顆粒や、炎症性サイトカインを放出させて小血管に炎症を惹起するとされているが、MPO−ANCAの産生機序は不明であった。本研究では、M
PO―ANCAの産生機序を解明することを目的とし、好中球の殺 菌機構であるneutr
OPhilext
racellulartraps(NETs)に着目した。NETs
は好中球の貪食 に引き続 き、細 胞死に至 る好中球がM
PO等の細胞質内抗菌蛋白と核D
N
Aを細胞外に放 出す る こと に よ り形 成 され 、 自 然免 疫 にお い て 重要 な 役 割を担 っている 。
第一章 の研究ではNE
Tsの制御異常がM
PO−ANCAの産生に関与するという仮説のもと、副作用と して高率にMPO‑ANCAが出現する抗甲状腺薬プロピルチオウラシル(PTU)を用いて、NETs形成へ の影響 を解析し た。In vitro
で は、好 中球をPMAで刺激することによりNE
Tsを誘導 できるが、P
MAにPTUを添加して好中球を刺激したところ、NETsの形成異常とDNase
Iに よる分解 障害が 見られた 。InvivoではラットにPTUを経口投与し、さらにPMAを腹腔内注射したところ、M
PO−A
N
C
A関連血管炎の症状を呈したことから、細胞内蛋白であるMPOがN
E
Tsとともに分解されず細胞外に長期間存在する事で、MPOが自己抗原として認識され、
M
PO一AN
CAの産生にっながる可能性が示唆された。
NETsには凝固因子や血小板と結合することで捕捉した細菌を効率よく閉じ込める役割があるが 、第二章ではM
PO−AN
C
A関連血管炎の合併症である血栓形成機序にNETsが関与することを示した。血栓症を合併した本疾患の剖検検体を用いて、血栓内におけるNE
Ts量を解析したところ、他の原因由来の血栓に比ベ有意にNETsが多く存在し、本疾患の血栓形成に― 241ー

関与している可能性が示唆された。以上、第一章、第二章の研究により、M
PO一AN
CA関連血管 炎 が NETsと い う 自 然 免 疫 機 構 と 密 接 に 関 連 す る と い う 新 し い 概 念 を 提唱 し た。
質疑応答では、＠PT
U添加で誘導されるNETsがなぜ分解障害をおこすのか、また分解障害を示すN
ETsにおいて、なぜMP
Oに対する特異的抗体だけが産生されるのかという質問に対し て、 好中 球の MPOで代謝されるPTU代謝産物がDNAのホスホジエステラーゼ結合部位に接着するため、分解障害が起こる可能性が あること、またP
TU
代謝過程 においてM
PO内のへム蛋白に構造変化が起こる事がわかって おり、構造修飾されたM
POが分解されにくい
N
ETs内に 存続 する 事が M
PO特異的抗体産生 の原因ではないかと考えていると答えた。◎
N
ET
sの異常が関与する疾患についての報告や関連しそうな疾患があるか、という質問に対して、NETsが形成できない疾患としてNA
DPHを欠損している慢性肉芽腫症があり、本症ではN
ETsが誘導されず感染症にかかりやすいこ とを指摘レた。また、逆にNETsの制御異常が関与する疾患としてはSLEを挙げ、本症では抗NETs抗体を有する患者群が存在し、その抗体 とNETsが 結合 する 事で NE
Tsが 分解 され にく くなり、NET
s内DNAがSLEの病態を増悪させるとの報告があると答えた。そして、NETsの関与が推測される疾患として、顆粒球主体の炎症病変を特徴とし、かつ血栓症を合併症とするべーチェット病を挙げた。◎感染以外の原因で生体内にNETsが過剰に起こるような病態は知られているか、という質問に対しては、NETs誘導には、核の脱凝縮・分散とMPO蛋白などの脱顆粒が同時に起こる事が必須とされており、これらを同時に誘導する因子は感染症以外にはまだ知られていないと回答した 。＠ PT
Uと P
MAによ るA
NC
A関連血管炎のモデルでは、MPOに対する免疫寛容の破綻は中枢性か末梢性かという質問に対しては、生 体内に異常なMPOが存続する事による抗体反応であるため、末梢性の免疫寛容の破綻と考 えると回答した。
この論文は、Arthritis and Rheumat
ismとFrontier
sinIrumunologyに掲載され、今後のMPO−ANC
A
関連血管炎の病態解析の進展、ならびに本疾患に対する特異的な新規治療開発に繋がるものと期待される。審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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