66（24）―― 亜鉛栄養治療研究

9巻2号

2019

67（25）

亜鉛投与法の違いによる摂食促進効果をラット脳視床下部
メタボローム解析で明らかにする～ Zinc-ome（ジンクオーム）の観点から～
大分大学・医学部・全学研究推進機構 1） 尚絅学院大学・総合人間科学部・健康栄養学科 2）
東北大学・大学院農学研究科・栄養学分野 3）

酒井久美子 1） 西内美香 2），3） 白川 仁 3） 駒井三千夫 3）

要図1

ヒトにおける機能性亜鉛タンパク質の分類 1），2）

約

臨床現場で経口で食事が摂取できない場合，血清亜鉛値が低下し，それに伴って味覚異常や食欲不振の症状を示す．この状況は経口で亜鉛を投与することで回復することから，周術期の亜鉛栄養の摂取の仕方が注目されている．私たちはこの状況をラットで再現し，亜鉛経口投与による摂食の改善がどのように起こっているのか，そのメカニズムを明らかにするために，メタボロミクスの手法を用いた．非経口で腹腔内に直接亜鉛を投与した場合に比べて，経口投与では，代謝物が大きく増加したものが多く見られた．さらにこれらの有意に増加変動した代謝物群がどのような代謝経路に属するのか，バイオインフォマティクスを用いたパスウェイ解析を行ったところ，亜鉛そのものの関与が見いだされたので報告する．
KEY WORDS

亜鉛栄養，摂食調節，メタボローム，パスウェイ解析，亜鉛酵素
図2

はじめに亜鉛投与後のラット摂食量の時間変化てはこれらの情報を上手く利用することで，研究の範囲が広がり，様々な情報を得ることができる．

クが大きいため，なるべく早く経腸栄養法へ切りの過程で他の 2 価陽イオンである鉄や銅，カルシ

亜鉛は必須微量元素であり，代謝の調節や食欲亜鉛研究においては，亜鉛という多機能の分子を替えることが望ましい．またこの際，血清亜鉛値ウムなどと拮抗する可能性が示唆されている．この維持など多くの生体内機能に関係している重要キーワードにして，実験結果の見直しや研究のさの低下により味覚異常や食欲不振を引き起こすこれらを解明するため，今回，脳の摂食調節領域でな元素である．亜鉛は体内に約 2 ～ 3g 存在するらなる展開を期待できる．今回は投与ルートに関とも知られている．一方で，「亜鉛」を投与するある視床下部の代謝物を解析することで，亜鉛の3）が，その存在形態としては，多くはタンパク質にする亜鉛栄養の研究に，メタボロミクスという方と食欲が回復するという症例があり ，臨床現場

投与ルートの違いがどのような代謝の違いをもた結合しており，ヒトでは約 3,000 種類以上存在し，法を用いて，新たな知見を得ることを試みた．

での亜鉛栄養の摂取の方法が注目されている．こらすかを検討した．

そのうち酵素の約 300 種類以上で補因子として機日本は，総人口に対して 65 歳以上の高齢者人

れまでに共同研究者らは，亜鉛欠乏食を与えた能している．これらは X 線結晶構造解析や既知口の占める割合が平成 29 年 9 月現在で 27.7% とラットに亜鉛溶液を腹腔内投与しても摂食量は上のタンパク質のマルチプルアライメント，DNAなり「超高齢社会」となっている．そのため病院がらないが，経口的に与えると摂食量が急に上昇

配列のアノテーションなどから推定されている構へ入院する患者の高齢化も進み，80 歳代でも侵することを見出している．これは，経口投与によ亜鉛の経口投与による食欲促進効果について，造や機能がほとんどで，これらが登録されている襲の大きな手術の対象となっている．高齢者の場

り消化管を経由することで亜鉛シグナルの中枢へそのメカニズムを解明するため，共同研究者らに種々のデータベースに日々実験的に確証を得た情合，治療・手術後に食欲が回復しない場合は，静の素早い伝達が起きていると推察された．また，

よってラットで次のような実験が行われた 3）（図報が追加されていく．実験，研究を行う者にとっ脈栄養法で栄養管理を行っているが，感染のリス

亜鉛の腸管からの吸収率は約 30％であり，吸収２）．

1．亜鉛経口投与について

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201969（27）投与 3 時間後の亜鉛血漿値は，経口投与，比経口投与で差は見られなかったが，摂食量を見ると，経口投与群で明らかに非経口投与群，生食群に比べて多かった．経口投与群での摂食量の上昇は短時間で起こることから，消化管経由の亜鉛シグナルの脳中枢への伝達が働いたものと考えられる．
またこの結果に基づいて，医療現場において侵襲の大きい手術を受けた高齢患者で，亜鉛を経口で付加した場合の方が食欲の回復が早いという知見も得られた 4）．これらは，亜鉛投与ルートの違いによって，脳の摂食調節領域での代謝が変化していることを示唆しており，本研究では脳視床下部領域のメタボローム解析を行い亜鉛投与ルートの図４違いがもたらす摂食関連の代謝調節について検討を行った．

2．メタボローム解析とは

図3

脳部位の違いによるメタボローム解析（Score Plot）

メタボローム解析の位置づけできる；代謝物は酵素の働きによって作られ，代特 定 の イ オ ン を モ ニ タ ー す る MRM（Multiple

理食塩水を経口投与した群（S-PO 群）を対照とメタボロームとは，ある特定の時刻における，謝物を網羅的に解析するということは，つまりタReaction Monitoring）モードで測定を行った．

した．試験溶液の投与後，再給餌を行い，3 時間

生体中の小分子や代謝産物の総称であり，メタボンパク質の活性を観察することにつながり，よりメタボロームの試料は生体液や組織など，多くの経過後に断頭を行った．氷上にて迅速に脳視床下

ロミクスはそれぞれの代謝の違いを捉え，バイオ直接的に生命現象をとらえることが可能となる．

代謝物や多様な夾雑物が含まれているため，それ部を摘出し，ただちに液体窒素に保存し，試料とインフォマティクスの手法を用いて解析する．メ④動物種特異性がない；マウスとヒトでは遺伝らの成分が重なり合い，同定を難しくしているした．ホモジナイズ後，Brigh & Dyer 法で処理

タボローム解析はオミクス解析の中でも新しい分子やタンパク質が違うが，代謝物であるアミノ酸が，この MRM 法と，469 代謝物成分が登録されし，水溶性画分を誘導体化した．島津製作所トリ野であり，質量分析計を用いて，分子の質量を測や脂肪酸は変わらないため，測定や解析が一律でているデータベースにより，微量成分でも化合物

プル四重極型ガスクロマトグラフ質量分析計

定してどのような代謝物がどのくらい存在してい楽である．の同定が正確かつ容易に行える．通常の代謝成分

GCMS-TQ8040 による MRM 法で 469 個の代謝化るのかを調べる解析方法である．代謝物は，細胞それでは代謝物とは実際にどのようなものか？の分析では 1 試料あたり約 37 分で，データベー合物データベースに対して代謝物の分離同定を行や組織，あるいは個体といった表現型に近い階層生体の代謝反応の過程で生じる中間生産物もしくスに対して測定された質量よりピークの同定を行い，代謝物の情報を得た．に位置しており（図３），代謝物の変動をモニター

は最終生産物で低分子化合物であり，アミノ酸，い，保持時間および面積値を算出したデータ表がすることが，ダイナミックな生体活動の変化を直アミン，核酸類，糖類，脂質，その他の物質が含アウトプットされる 5）．このデータを用いて，多接的に調べることにつながると考えらる．

まれる．それぞれ極性や水溶性などさまざまな物

変量解析を行い，変動した代謝物を抽出する．続性を持っており，代謝物すべてを一度に測定できいて，パスウェイ解析を行って，生物学的・医学る技術は今のところない．今回は質量分析装置に的な意義を考察する．

また，メタボロミクスは他のオミクス解析に比べて次のような大きな特徴がある．

4．多変量解析
質量分析より得られた結果（データベースに対して同定された代謝物名，保持時間，面積値，質量数など）を精査し，SIMCA13（Umetrics 社）①対象とする物質数が少ない；ヒトの場合，ゲ試料を導入する前の分離手段として，ガスクロマ

ノムは 100,000 種類あるのに対してプロテオームトグラフ質量分析計（Gas Chromatograph-Mass

は 25,000 種類あるが，メタボロームは 4,000 種類

Spectrometry：GC-MS）を 用 い た．生 体 内 物 質しかない．この程度の数ならば包括的に解析するの糖・アミノ酸・有機酸は気化しやすいように誘

4 週齢の SD 系雄ラットを 4 日間 F-2 食（固形ことが可能である．

導体化する必要があるが，歴史が古く，データ飼料，船橋農場）で順化後，亜鉛欠乏食を 2 日間②対象とする物質が低分子である；それ故，そベースが充実している．分析は必要なメソッドを与えた．3 日目の朝，2 時間絶食させた後，硫酸ま ず，脳 の 3 部 位 別 の Score Plot を 示 す（図れぞれの代謝物についての知識がこれまでに生化選び試料のバッチファイルを作成し，装置のオー亜鉛溶液（3mg ZnSO4/5mL）を経口投与（Z-PO４）．部位別に明確に 3 群に分けられたが，図の学手法などで蓄積されている．

トサンプラーに並べ，測定を開始する．今回用い群），または腹腔投与（Z-IP 群）した．溶液の投1 点はマウス 1 匹のデータと対応し，この場合，た機器は GC-MS/MS で，2 段階で質量を分離し，与量は体重あたり 5mL/kg とした．同様に，生経 口 投 与（Z-PO）群，腹 腔 内 投 与（Z-IP）群，③生体内での出来事を直接的に観察することが3．研究手法

で多変量解析を行った．多変量解析で，はじめにPCA 法で大まかに群が分けられることを確認した後，OPLS-DA 法でより詳細に群別の情報を解析した．

70（28）―― 亜鉛栄養治療9巻2号

201971（29）図６

図５

亜鉛投与群と生食群との代謝物の比較（S-plot）

脳視床下部の亜鉛投与ルート別メタボローム解析（Score Plot）

生食（S-PO）群ともに部位の群内に示されてい0.8 以上の代謝物に関して，KEGG でパスウェイる．つまり，投与ルートの差違より部位による代解析した結果はすでに報告している 6）．図 7 およ

謝の差が著しいことを示している．このうち，視び表１に示すように，亜鉛を経口投与した群（Z-床下部の投与ルート別の 3 群について，さらに多PO）では，腹腔内投与した群（Z-IP）に比べて，変量解析を行った結果を図５に示す．生食のコン多くの代謝物が大きく変動した．亜鉛経口投与群

トロール群は少し横にばらついたが，経口投与群（Z-PO）ではシチジン，ビオチン，β-アラニンとは明らかに分かれた．また，腹腔内投与群とも（3-Aminopropanoic acid）などの代謝物と共に，群別された．

神経伝達物質や生体アミンであるドーパミン，オ次にどのような代謝物がこれらの群を分ける要

ク ト パ ミ ン，ヒ ポ タ ウ リ ン，ト リ プ タ ミ ン，因となったかを，経口投与（Z-PO）群と腹腔内GABA（4-aminobutanoic acid）な ど も 有 意 に 上投与群で比較し，S-plot を用いて解析した（図昇した．今回は，亜鉛経口投与群において変動代６，７）．この図の 1 点は代謝物 1 個のデータと対謝物一覧の表に載せたすべての代謝物でパスウェ応し，中心をゼロ点とし，上下に優位さ，左右にイ解析を行ったので次に紹介する．

量の変化を示している．まず，経口投与（Z-PO）
群および腹腔内投与（Z-IP）群を生食（S-PO）
群と比較した S-plot 図を図６に示した．いずれも5．パスウェイ解析大きく代謝変動した化合物は少なかった．次に図表１で示した経口投与群の変動代謝物につい７に経口投与（Z-PO）群および腹腔内投与（Z-IP）て，下記の方法を用いて新たに詳細なパスウェイ群を比較した S-plot 図を示した．右側が経口投与

解 析 を 行 っ た の で 報 告 す る．マ ギ ル 大 学 の群，左側が腹腔内投与群である．経口投与群ではJianguo Xia 氏が開発したフリーの代謝物解析用有意差が大きく，かつ量も大きく増えた代謝物がソ フ ト ウ ェ ア MetaboAnalyst（https://www.

多く見られた．逆に腹腔内投与群で優位な代謝物

metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml）を用いて，も見られたが，いずれも量の変化は小さかった．

Functional enrichment analysis を 行 っ た（表 １

この図から得られた変動代謝物一覧を表１に示す．

でグレーで示した代謝物は今回のデータベースでこの中から確実に優位とされる縦軸の絶対値

認 識 さ れ な か っ た も の を 示 し て い る）
．ま ず

図７

亜鉛投与群の投与ルートの違いによる代謝物の比較（S-plot）
表１

亜鉛投与群の投与ルート比較で変動した代謝物一覧

72（30）―― 亜鉛栄養治療

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表２73（31）

MetaboAnalyst による Pathway 解析

図８

MetPA（metabolic pathway analysis）で お お まレッジが含まれており，本研究のように，亜鉛をか な パ ス ウ ェ イ 解 析 を 行 っ た（表 ２ お よ び 図

鍵物質として網羅的に解析しようとする際には，８）．次 に MSEA（metabolite set enrichment

化合物を結ぶ酵素情報が豊富で，亜鉛や代謝物がanalysis）を行った（図９）．MSEA では抽出さ補因子となっているタンパク質が一目瞭然でわかれた有意差のある代謝物の中に，特定の代謝経路り，非常に有効な手段である．ヒトやマウス，の代謝物が多く含まれるとき，その代謝経路を有ラット，大腸菌まで種が選択できる．一例とし意と判定した．て，SMPDB のβ-アラニン代謝パスウェイの一

MetPA および MSEA の両者で有意な代謝経表 2 のグラフ

図９MetaboAnalyst MSEAPathway 解析部を表示する（図 10）．

路として，TCA 回路，β-アラニン代謝，ピリミジン代謝がデータベース中よりピックアップされピリミジン代謝およびβ - アラニン代謝た．これらの代謝経路を SMPDB（Small Molecule

変動代謝物としてシチジン，ジヒドロウラシル，Pathway Database，http://www.smpdb.ca/）でβ-アラニンが属し，ピリミジン代謝経路のシチ検索し，パスウェイごとに有意であった代謝物をジンを出発代謝物として，β-アラニン代謝経路標識した．SMPDB は 350 以上のヒトなどの低分のジヒドロウラシルを経由して，2 段階でβ- ア子パスウェイを含む視覚的なデータベースであラニンが合成される．ここで注目すべきは，シチり，このパスウェイ数は他のデータベースでは見ジンからウリジンへする際の酵素グアニンデアミられない．SMPDB は，メタボロミクスや他のオナーゼ，そしてジヒドロウラシルからβ-アラニミクスにおいて，パスウェイ解明や発見をサポーンが合成される 2 段階で使われる 2 つの酵素ジヒトするために構築されている．全てのパスウェイ

ドロピリミジナーゼ，β-ウレイドプロピオナー

つのルート，カルノシンとアンセリンのジペプチには，詳細な解説や文献情報，化学構造，タンパ

ゼの 3 つの酵素が亜鉛の結合を必要とする（予測ドの分解経路においても，必要とされる酵素βク質補助因子（これが大事！），タンパク質や代される）亜鉛酵素であることだ．さらにβ- アラ-Ala-His- ジペプチダーゼは亜鉛酵素であった．

謝物の局在，その他種々のデータベースにあるナニン代謝経路で，β - アラニンを合成するもう一

図 10

SMPDB のβ-アラニン代謝パスウェイの一部

TCA 回路TCA 回路中ではクエン酸，cis-アコニット酸，α-ケトグルタル酸のサイクルの右側の代謝物が有意に検出されていた．また，量は少ないが，ビ74（32）―― 亜鉛栄養治療

9巻2号

201975（33）また，ビオチンが量は少ないものの高い有意差を持って検出されたが，動物体内では合成されな

図 11

亜鉛経口投与群で起こった代謝のまとめ

今回検出された代謝物のうち，変動した代謝物は青字，検出されなかった代謝物は黒字，測定用データベースに元々ないものはグレー字で示した．

おわりにい．腹腔内投与群に比較して増えたということ

以上，亜鉛を経口で投与した場合の代謝を詳細

は，経口投与で腸管を経由したことで腸内細菌がに検討した．今回，いくつかの亜鉛酵素が働いて刺激され，産出を始めた可能性がある．このビオ代謝経路を動かしたことがわかった．脳内の亜鉛チンは各種カルボキシラーゼの機能に必須で，量は厳密に維持されており，経口投与群でも腹腔TCA 回路ではピルビン酸からオキサロ酢酸へ代内投与群でも大きな差はないと思われる．しかし謝を行うピルビン酸カルボキシラーゼを活性化ながら亜鉛投与後 3 時間での代謝を切り取って測し，ピリミジン産生に繋がったと考えられる．こ定しているため，例えば神経伝達物質による直接のピリミジンは前に述べたピリミジン代謝経路へのシグナル伝達の他に腸管から素早く運ばれた可とはいり，またβ-アラニン産生へと向かう．さ能性もあるのではないか．亜鉛を鍵物質として，らにビオチンはアセチル CoA のアセチル基に亜鉛の機能を網羅的に解析しようという ｢Zinc-CO2 を結合させてマロニル CoA を合成する酵素ome｣ の観点から，今回のようにオミクスデータのアセチル CoA カルボキシラーゼの補酵素としをより情報量の多いデータベースを用いて解析すて働き，脂肪酸合成の律速している．また TCAることで，単なる代謝解析にとどまらず，今まで回路中オキサロ酢酸は続いてクエン酸へと変換さ気づかなかったような知見をも与えてくれる．現

れ，クエン酸の量も増えていることから，ここか在は基礎研究においては材料であったり，手法でらもアセチル CoA を作る方向に動くと思われあったり，限られた範疇での解析となっているこ

る．β-アラニンは補酵素（CoA）を構成するパとが多い．また臨床の場では，マクロな現象からオチンが高い有意差で，経口投与群で検出された

とんどの化合物は検出可能であり，中心代謝の流ントテン酸の一部であり，CoA 合成に重要な分一つ一つ解きほぐす必要があるが，今回のようなが，ビオチンは TCA 回路中でピルビン酸をオキれはカバーできている．さらにアミノ酸や神経伝子であるが，β-アラニンもまた，腸内細菌が産メタボロミクスのアプローチを試みることで，サロ酢酸に変換する酵素のピルビン酸カルボキシ達物質についてはほとんど網羅されている．

生したものを吸収している可能性がある．

DNA やタンパク質よりも生体に近い情報を得る

ラーゼに結合し，活性化に関与する．またビオチ以上から，今回有意にヒットした代謝経路を複一方で，代謝経路には属していないが，表 1 で，ことができ，また，より表現型に近い観点からンはクエン酸からアセチル CoA を合成し，脂肪数合わせ，代謝物を繋いで，まとめた代謝図が図

亜鉛投与群で変動した代謝物一覧には，ドーパミDNA まで一気に迫ることができる．さらに現在酸合成とステロール合成の調節因子であるアセチ11 である．結果でも述べたように，ピリミジンン，オクトパミン，ヒポタウリン，トリプタミン，は特にヒトのデータベースが充実してきており，

ル CoA カルボキシラーゼと結合する．

代謝経路中のシチジンが亜鉛酵素によってウリジGABAなどの神経伝達物質や生体アミンが多く見臨床応用に特に利点があると思われる．

ンとなり，ジヒドロウラシルとなってβ-アラニられた．オクトパミンは昆虫では飢餓シグナル因

ウェイ図を作成し，網羅的に代謝の流れを確認しン代謝経路にはいり，ここでも亜鉛酵素の働きで7）子として摂食を亢進させることがわかっている ．

明できることは，新たな代謝の見方ができ，また，た（図 11）．

β-アラニンを合成したと考えられる．またカル

このオクトパミンが検出されたことから，この生亜鉛の新たな機能の発見にも繋がる可能性があ

ノシン，アンセリンの分解でも亜鉛酵素が働き，体アミン，もしくは今回検出された他の神経伝達る．今後は亜鉛シグナルのスタートがいつで，どβ - アラニンの合成が進み，結果的に量も多く，物質が，直接摂食のシグナル伝達に関与している

こでどの役者が引き金を引くのか，網羅的な観察有意差も高くなった．さらにβ-アラニンはマロ可能性が示唆される．

から検証してみたい．

これらの代謝経路を合わせ，組み合わせたパス

6．考察
まず，本実験で用いた GC-MS/MS によるメタボローム解析では，低分子化合物で機器付属のニル CoA からアセチル CoA，そして TCA 回路に組み込まれる．

データベースに登録されている 469 化合物につい

TCA 回路ではクエン酸からα-ケトグルタル酸てのみ帰属が可能である．したがって，摂食調節まで進み，この先の TCA 回路では代謝物は検出を行っているとされるペプチドホルモンは検出でされなかった．つまり，α-ケトグルタル酸からきない（これは GC に限らず他の分離手段でも今糖新生や GABA の産生に向いた可能性がある．のところ網羅的にはできてない）．さらに，TCAGABA は変動代謝物として多く検出され，神経サイクルにおける CoA 類も検出できない．しか伝達物質として，摂食調節に機能していることがしながら，解糖系から TCA サイクル中の他のほ推察される．

代謝物と亜鉛の関係をパスウェイマップから解76（34）―― 亜鉛栄養治療

◆文

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2019

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献 ― ――――――――

Metabolomics reveals orexigenic mechanisms of oral zinc in the rat hypothalamus from the viewpoint

１）Andreini, C., Bertini, I., & Rosato, A. et al：５）酒井久美子：肥満研究におけるメタボロミクス解

Count- ing the zinc-proteins encoded in the human

析の今−GC-MS/MSのターゲットメタボロミクス

genome. J. Proteome Res., 5：196-201，2006

は組織間の代謝の違いを簡単に明らかにする−「肥２）Andreini, C. & Bertini, I：A bioinformatics viewof zinc enzymes. J. Inorg. Biochem.,：111, 150156，2012
３）Ohinata K, Shirakawa H, Komai M et al：Orallyadministered zinc increases food intake via vagal

満研究」Vol23, No2：149-155，2017

of“zinc-ome”
Kumiko Sakai1），Mika Nishiuchi2,3），Hitoshi Shirakawa3），Michio Komai3）６）Mika Nishiuchi, Kumiko Sakai, Michio Komai et1）Institute for Research Promotion, Faculty of Medicine, Oita University

al：Orexigenic action of oral zinc: metabolomic2）Department of Human Health and Nutrition, Shokei Gakuin University

analysis in the rat hypothalamus. Biosci. Biotech &3）Laboratory of Nutrition, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University

Biochem. 82（12）：2168-2175，2018

stimulation in rats. J. Nutr., 139（3）：611-6，2009７）Suo, S., Culotti, J. G. and Van Tol, H. H. M.：４）西内美香，大谷昌道，紺野亜衣 他：周術期の血Dopamine counteracts octopamine signalling in a清亜 鉛 濃 度 と 栄 養 補 助 食 品 の 有 用 性 に つ い て ．

neural circuit mediating food response in C.

ヒューマンニュートリション No.31,：71，2014

elegans. EMBO J. 28（16）：2437-48，2009

During perioperative period in patients who underwent surgery, serum zinc concentration
decreases and food intake is suppressed. We here investigated the mechanism of the orexigenic
action of zinc using GC-MS/MS-targeted metabolomic analysis in the rat hypothalamus. Four-week-oldSD rats were used, and zinc solution were administered to each rat either orally or intraperitoneally.
Three hours after administration, the rats were sacrificed and the hypothalamus were excised andanalyzed. We found that the oral administration group showed increased concentrations of moremetabolites than that of the intraperitoneal administration group. These differential metabolites wereused for pathway analysis and several pathways were enriched significantly. Some of these pathways
consisted of the beta-alanine metabolism, the TCA cycle, pyrimidine metabolism and biotin
metabolism. In these pathways beta-alanine and biotin were key metabolites and some zinc proteinswere found. With the availability of metabolomics techniques, attractive progress has been made inunderstanding zinc signaling networks called“zinc-ome”.

Keyword：zinc nutrition, orexigenic action, metabolome, pathway analysis, zinc protein

Address for correspondence
Kumiko Sakai
Phone：0975866226
Fax：0975866202
E-mail address
kumi@oita-u.ac.jp◆酒井久美子略歴
1977 年
1990 年
2002 年

日本女子大学理学部化学科卒業
三菱化成生命科学研究所 研究助手
大分医科大学医学部教務員，医学博士取得
大分大学医学部全学研究推進機構，助教