6.3.2 低線量率γ線連続照射マウスにおける悪性リンパ腫等病変発生の早期化の確認 -血清中のタンパク質を指標とした解析Potential Biomarkers in Mice Exposed to Continuous Low-dose-rate Gamma-rays-Analysis of Serum Proteins
杉原 崇, 田中 聡, 田中 イグナシャ, 田中 公夫
生物影響研究部

Takashi SUGIHARA, Satoshi TANAKA, Ignacia TANAKA, Kimio TANAKA
Department of Radiobiology
Abstract
A previous life span study revealed that continuous low-dose-rate (LDR: 21 mGy/ 22hr/ day) gamma
ray exposure in mice induced a shortening of the life span by approximately 120 days due to premature
death from various neoplasms, mainly due to malignant lymphomas (MLs). Moreover, analysis of gene
expressions using a microarray was performed to identify candidate bio-active molecules in sera from
non-irradiated or irradiated mice with MLs. By stimulating mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with serum,
Nr3c1 was considered a candidate as predicted by transcription factor analysis in the IPA software. In 2012,
we measured the quantity of cortisol, which is known to be a Nr3c1 ligand, in mice sera. The amount ofcortisol in LDR-irradiated mice sera was significantly decreased; thus these results suggested cortisol may
have some roles in irradiated mice or mice with developed MLs. Furthermore, the quantity ofalpha-fetoprotein (AFP) was measured, and we confirmed AFP in sera from mice which developed liver
adenoma was increased. Therefore, we considered that the levels of hormones or proteins in mice sera may
be used to analyze tumor developments or effects of LDR-irradiation in mice.
1. 目的

ロアレイ法を用いて、悪性リンパ腫発生あるいは低平成 22 年度に中線量率（400 mGy/22 時間/日）γ

線量率放射線照射が原因でマウス血清中に放出され線を連続照射したマウスの血清を検定用の培養細胞た生理活性物質量を変化させる転写因子を予測した。に添加し、マイクロアレイ法を用いて、血清中の生

本年度は、昨年度 CBA 法にて低線量率γ線連続照

理活性物質による培養細胞への活性を解析する新規射によって変化が生じると予測されたマウス血清中の方法（Cell-based-assay ：CBA 法)を開発した。こに存在する生理活性物質の量的変化を実際に ELISAの方法を用いて、放射線の連続照射によって生体内法等で解析し、昨年度に得られた予測結果を実証すに生じた生理活性物質の量的な変化を検出できるこることを目的とした。とを明らかにし、さらに、その変化を引き起こす原因となる物質の一つを同定した。平成 23 年度の調査

2. 方法

では、低線量率（20 mGy/22 時間/日）γ線長期連続

B6C3F1 メスマウスに低線量率（20 mGy/22 時間/照射したマウスに生じた腫瘍の病理診断結果から悪日）137Cs-γ線を 400 日間連続照射した（集積線量は性リンパ腫と同定されたマウスの血清を用い、遺伝8 Gy）。8Gy 照射後、非照射 SPF 条件下で 100，200，子の発現変化を網羅的に解析する手法であるマイク

300 日間飼育したマウス（すなわち、照射開始から- 52 -

500、600、700 日後のマウス）を病理診断した結果、期連続照射されることで、あるいは悪性リンパ腫を悪性リンパ腫と同定されたマウス（非照射群 5 匹、発生することで変化した可能性を示している。その照射群 7 匹）と、悪性リンパ腫を持たないマウス（非ため、平成 24 年度は平成 23 年度に照射群の血清中照射群 32 匹、照射群 30 匹うち 6 匹は肝腫瘍を持つ）

生理活性物質量の変化によって遺伝子発現が引き起から心採血により血液を採取し、採取した血液からこされたと予測された遺伝子 NR3C1 のリガンドで血清を分離し、ELISA 法による解析を行った。それあるコルチゾールに着目し、血清中のコルチゾールぞれの個体から採取した血清 2.5 μl は 245 μl の量を測定した。また、同時に、昨年度報告した肝細AssayBuffer と混合し、ELISA 法による解析に供した。

胞腺腫と正常肝臓組織の遺伝子発現をマイクロアレELISA 法に用いた抗体は、昨年度に検出されたイで比較し変化が検出されたαフェトプロテイン遺NR3C1（コルチコイドリセプター）のリガンドであ伝子 AFP に着目し、肝細胞腺腫マウスの血清中でるコルチゾールに対する抗体を用いた。さらに、肝AFP 量が変化しているかどうかについても測定を行

アデノーマの血清中 AFP を測定するために、血清をった。

ELISA 解析に供した。

悪性リンパ腫を発生したマウス血清をCell-based-assay(CBA)法とマイクロアレイ法を用い3. 成果の概要て解析した結果、照射群から生じた悪性リンパ腫を平成 23 年度に、低線量率（20 mGy/22 時間/日）持つマウスの血清中には、NR3C1 や THRB 等の核内γ線を連続照射した照射群マウス及びそれらと同日受容体の転写因子の活性化制御に関与する生理活性齢の非照射群マウスから採取した血清を検定用の物質の存在が予測された。今年度は変化が予測され

ICR-MEFs 細胞に添加培養後、RNA を細胞から抽出た物質の一つである、グルココルチコイド受容体し、照射群と非照射群の両群での網羅的な遺伝子発（NR3C1）のリガンドであるコルチゾールに着目し現量の差を比較した。その結果、低線量率γ線連続解析を行った。グルココルチコイドは副腎皮質の束照射により発現変化を示した遺伝子 291 個を抽出し状層で産生される、副腎皮質ホルモンの一つである。

た。有意差が検出された遺伝子群から IPA 解析ソフ

3 種類あるグルココルチコイドの中でコルチゾールトにより発現量差が 1.3 倍以上のものを抽出して、が最も生体内量に多く、グルココルチコイドの 95％

非照射群内で非悪性リンパ腫と悪性リンパ腫間で差はコルチゾールであると言われている。今回、CBAのある遺伝子、照射群内で非リンパ腫と悪性リンパ法で予測されたマウス血清中の活性化物質がコルチ腫間で差のある遺伝子、非悪性リンパ腫群内で照射ゾールであることを明らかにするために、ELISA 法と非照射間で差のある遺伝子、悪性リンパ腫群内でによってコルチゾール量を測定した。その結果、マ照射と非照射間で差のある遺伝子の 4 群についてパウス血清中のコルチゾール量は照射群マウスで有意

スウェイ解析を行った。発現アレイ法で分類されたに減少していた（Fig. 1）。また、悪性リンパ腫を発遺伝子群の中から上流の因子を推測するために、遺生したマウスにおいても、有意に非照射正常群マウ伝子群の発現変化を引き起こすことを文献情報からスよりも減少していた（Fig. 1）。これらの結果から、予測する転写因子スコア（IPA 解析ソフトの一つの低線量率γ線長期連続照射マウスでは血清中コルチプログラムである Transcription Factors 解析を用い、ゾール量が減少すると考えられた。グルココルチコ

その解析によって得られる Regulation Zscore の絶対イド系ステロイドはリンパ球の走化性を抑え炎症を値が 2 以上となる指標）を用い、解析を行った。そ強力に抑制するなど、広く生体環境の恒常作用を有の結果、NR3C1、THRB 等のホルモンに関係した核する。また、グルココルチコイドは悪性リンパ腫の内受容体が抽出された。これらの結果は、上記のホ治療薬として知られている。さらに、古くからマウルモン受容体による転写因子制御を制御する血清中スリンパ腫のアポトーシスをコルチゾールが誘導すホルモンなどの生理活性物質量が、低線量率γ線長ることが報告されている。コルチゾールが照射群で- 53 -減少する知見と、経時的解剖による病理解析の結果血液中に分泌されると考えられるいくつかのタンパで悪性リンパ腫の早期発生が見られなかった結果をク質の遺伝子が検出されている。この結果は、この考慮すると、「低線量率照射によってグルココルチコ方法で血清中の分泌タンパク質と予測されるタンパイドが減少→悪性リンパ腫の増殖抑制能が減少→悪ク質を発がんの解析に用いれば、肝細胞腺腫を同定性化する→マウスの早期死」という仮説が考えられできる可能性を示唆する。今後、AFP 以外の新規のる。

マーカーとなるタンパク質も解析する予定である。

平成 23 年度、肝細胞腺腫（アデノーマ）で発現変

また、今回、低線量率γ線照射によって肝細胞腺腫化の高い遺伝子を抽出したところ、AFP が低線量率を持たないマウスの肝臓に影響を及ぼす遺伝子変化

γ線照射マウス由来の肝細胞腺腫において 288 倍高も検出した。そのため、これらの遺伝子発現に関しい発現を示す遺伝子として検出された。そのため、ても解析を進め、照射によって変化する遺伝子群とAFP タンパク質が、肝細胞腺腫を持つマウスの血清肝細胞腺腫との関係についての解析を行い、低線量中のマーカータンパク質となる可能性を持つと考え率γ線照射によって肝細胞腺腫が発生するメカニズた。そこで、本年度は実際にマウス血液中の AFP をムについても解析する必要があると考える。

調べて、肝細胞腺腫の診断が可能かどうかを検討しこれらの結果から、照射マウスの血清中コルチゾた。低線量率γ線照射群に発生した肝細胞腺腫を持ール量や AFP 量を調べることは、腫瘍や照射によるつマウスの血清中 AFP を ELISA 法によって解析し影響を検出する方法として、利用できる可能性を持たところ、血清中の AFP タンパク質が非照射肝アデつと考えられた。

ノーマを持たない群に比較して、有意に増加することが分かった（Fig. 2）。この結果は、照射群に発生引用文献したマウスの血清中 AFP タンパク質を測定するこ

Tanaka, S. et al. (2003) Radiat. Res.,160,376-379.とで、肝細胞腺腫を持つマウスを診断できる可能性

Tanaka, I.B. III et al. (2007) Radiat. Res.,167,417-437があることを示す。一方、AFP タンパク質以外にもFig. 1 ELISA analysis of cortisol in sera from irradiatedFig. 2 ELISA analysis of alpha-fetoprotein (AFP) in sera

or non-irradiated mice. LDR, Low-dose-ratefrom LDR irradiated mice or non-irradiated mice.

irradiated; C, non-irradiated.

SKC, non-irradiated mice; SKR, LDR irradiatedmice, Liver adenoma, irradiated mice with liveradenoma.

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