牛乳のフラビンの組成に関する研究
一牛乳における 10‑(2'‑hydroxyethyl)flav
inに つ い て ー

宇都宮大学農学部教授

菅野長右エ門Roughead& McCormick[1]は、牛乳に 10~20% の 10四( 2乙hydroxyethyl)flavin、 RFの腸管吸収を阻害するばかりでなく、(HEF) が存在し、しかもこの HEFはflavokinaseを姑抗的に阻害するアンチビタミン効果を持つことを報告している。我々
は、ここ数年間に亘る牛乳の RFについての研究を通じて、 HEFを検出していない。
むしろ HEFは彼等の用いた複雑な方法により引き起こされたアーティファクトの可能性が大きいと推察されるので、彼等の方法を追試し、 HEFの牛乳での存在の有無を確認する必要がある。
昨年度の助成によって牛乳のフラビン (RF、FMN、FAD、その他)を簡易に分離定量する方法を確立したことを報告した。本年度の研究では、 Roughead &McCormickによる方法を追試し、我々の簡易分離定量方[2]と比較し、牛乳における HEFの存在の有無を明確にする。

実験方法
1. K加 noらによる牛乳のフラビンの簡易定量法[2]牛乳1.0g を 3分間煮沸し、水道水で冷却後、ブロナーゼを試料蛋白質の1/50量を加え、 45Cで 1時間インキュベートし、その量を最終的に 2.0gに010mMNaH，PO，(pH5.
5)で調整し、遠心分離(12，000xG、10分)後その上清をろ過し (0.45μm) 、これの 100μ8を高速液体クロマトグラフィー (HPLC、SP‑8逆相カラム (4.
6x250皿、 5μm、CapcellPak、700) に注入し、分離定量した。 C180Cで、 90%メタノール水溶液の 35%から 95%までと資生堂)を用い、溶出は、 4010mMNaH，PO，(pH5.
5) の65%から 5 %までの直線勾配で行った O 流速は 0.
8mlで測定した。
/minで、溶出液の蛍光強度は励起波長462nm、蛍光波長520nm

1442. Roughead& McCormickによる牛乳のフラビンの定量法[1]牛乳25.
0gに 4'Cでトリクロール酢酸 6.
25gを加え(最終濃度 20%、w/w) 、遠心分離 (4"C、3000rpm、20分)し、上清を鴻過後、鴻液を 4 MK，HPO.で中和し(pH6.
8)、 4'Cで60分間インキュベートし、これを再び遠心分離した (4"C、1∞2，0 rpm、20分間)。上清に硫酸アンモニウム粉末を加えて飽和にし、遠心分離した。更にこの上滑に 1/10量の 80% (w/w) フエノールを加え、激しく撹枠後、遠心分離し (4"C、3000rpm、 5分間)、上層のフエノール層を除去した。下層は再び80%フエノールで同様に抽出し、 l回目のブエノール層と合わせた。このフラビンを含むフエノール層の等量の蒸留水を加え、続いて等量のジエチルエーテルで、飽和した冷水で 2回抽出して、下層部を集めた。これをロータリーエパポレータで濃縮し、重量を測定後、その一定量(100μ 引を、 lと同様に、 HPLCに注入し、分別定量した。この場合の HPLCの溶出液は、 A として 50mM酢酸アンモニウム(pH6.
0) 、Bとして 100%メタノールを使用し、 Aの100%を 2分間保持し、その後A79%‑B21%を 6分間保持し、さらに 17分後 A50%‑B50%とし、その 2分後に A30%‑B70%として 2分間保持した。流速は1.5ml/minであった O
3.10‑(2'‑hydroxyethyl)
flavin(HEF)の合成[3]，8‑
dimethyl‑1O‑formylethyl‑
isoalloxazineの合成
3‑
1.74gを褐色フラスコにとり、アイスバス中で 2N H，SO.
30ml
リボフラビン1.1を加え、更に、過ヨウソ酸水溶液 18mlを加え、アイスパス中で撹衿し、更に室温で I時間援持した。これに結晶炭酸ナトリウムを加えて pHを1.5とし、 30分間.8としてから鴻過撹枠後鴻過した O 減液に再び炭酸ナトリウムを加えて pHを3し、残査を冷水(約 100m!
) 、エタノール、ジエチルエーテル(少量)で順次洗浄後乾燥した。

3‑2.10‑(2'‑hydroxyethyl)
flavinの合成
3‑1で得た 7，8‑dimethyl10formylethyl‑isoalloxazine(0.
62g)を十分に冷司

四.1NNaOH(20ml) に溶解し、これに水素化ホウ素ナトリウム (0.
5ml)却した Oを加え、室温で約 2時間撹持した。この溶液をアイスパス中で、酢酸で pHを4.
04.
5に調整した後に鴻過し、残査を蒸留水で十分に洗浄し、低濃度の酢酸、アセ

145‑トンで洗浄し、乾燥し、回収した。 HEFは、展開溶媒としてメタノール蒸留水(1:1、v/v)および固定相として Kise!
ge!
60(Merck)を用いた薄層クロマトグラフィー
で紫外線ランプ下で単一のスポソトを示した。

:::
むにτ。
:::
なにτ。
10・(2・‑hydroxyelhyl)
flavinRibof
1avln・

図 1̲ 'Jポ 7 ラピン及び 10・(2‑hydroxyethyl)
flavln由化学構造結果
本研究では、 1) Kannoらの方法並びに

2) Roughead & McCormickの方法で、牛乳から抽出したフラビンを、 (l)Kannoらの用いた溶出液 Iおよび(Z)Roughead&McCormickが用いた溶出液 Eで HPLCを行い、分析した結果を比較した。さらに、合成した HEFと各抽出物とのコクロマトグラフィーを行うことによって HEFの有無を比較した O

1， Kannoらの方法で抽出した牛乳フラビンの分別定量

1‑(1)， Kannoらの方法によって抽出した牛乳のフラビンの溶出液 Iによる HPLC
パターンは、図 2‑ Aに示されているように、 FAD、FMN及び RFから構成さ，7分に溶出されれている。また HEFの主ピークは、同じ条件下で、保持時間約7た(図 2‑B)。午乳からのブラビン抽出液に HEFを加えてコクロマトグラフィーを行うと、 HEFは RFよりもやや遅れて溶出され、 HEFは各フラビンとは明確に分離されることが明らかである(図 2‑Cl。従って、本方法による抽出物中には日EFは含まれていなかった。
146ーAc

B

FMN

5.
88FMN5.
63RFRF7.
437.
57FAD

FAD

4.
534.
46HEF7.
68~HEF8.
30

図2.Kannoらの方法によって牛乳から抽出したフラピン (A)、10・(2'‑hydroxye出yl)
日av
in(B)
及び両者の混合物 (C)の溶出 i
液Iによる HPLCノ守ターン:10mMNaH2PO.と90%メタノー J
レ、数字は保持時間
溶出液1(分)を示1。

1‑(2). 1ー(1)と同じ試料を溶出液 Eでは、溶出された各フラビンの保持時間は異なるが、 1‑(1)と同様なパターンを示した(図 3‑A)。同条件下で、 HEFは 2つのピークに分離された(図 3‑B)。ピーク Aは RFと同じ保持時間を示した O

図3.Kannoらの方法によって牛乳から抽出したフラピン (A)、10‑(2'‑hydroxyethyl)
flavin(B)及ぴ両者の混合物 (C)の溶出液HによるHPLC
ノてターン:50mM酢酸アンモニウムと 100%メタノール、数字は溶出液n保持時間(分)を示す。

‑147←

この HEFを牛乳抽出フラビンとコクロマトグラフィーを行うと、図 2 でのピー
クAは RFと同じ保持時聞を示した。ピークBは RFよりもやや遅れて溶出され(図 3‑C)、これは HEFであると確認された。
Kannoらの方法によって抽出したフラビン含量は溶出液 IとEによる差異は認められなかった。(表 l‑A)。
2. HEFの牛乳フラピン抽出・分別定量

2‑(1). Roughead& McCormickの方法で牛乳から抽出したフラビンの溶出液 Iによる HPLCパターンを図 4‑ Aに示す。溶出された主ピークは 2つで、それぞれは FADおよび RFと同じ保持時間を示した。 HEFは図 3‑ Bと同様である(図 4‑B)oHEFは牛乳抽出フラビンとのコクロマトグラフィーによって、 RFよりもやや遅れて溶出されることは図 3‑Cの場合と同じである o Roughead &McCormickによって指摘されているように、本抽出法で得られたフラビン抽出物には FMNは検出されなかった。

2ー(2). Roughead&McCormickの方法で牛乳から抽出したフラビンを溶出液 Eによって分析された HPLCパターンを図 5‑Aに示す。主ピークは RFと FAD

AB

17.
48RF

3.
99658
1.

c

￨
7lull:zFAD

4.
08

図 4. Roughead& McConnickの方法によって牛乳から抽出したフラピン(A)、1O‑(2'‑hydroxye出yl)
日avin(B)及び両者の混合物(c)の溶出液 Iによるノてタ}ン
HPLC
溶出液 1:10m MNaI也P04と90%メタノール、数字は保持時間(分)を示す。

必IcB

ARF
14.
25RF
14.
94HEF

HEF

15.
65D8A3Fro・‑ー

16.
06FAD
10.
20

14.
81

図 5. Roughead& McConnickの方法によって牛乳から抽出したフラピA)、10ー(2'‑hydroxye出yl)
日avin(B)及び両者の混合物(c)の溶出液Hによン(るHPLCノてタ}ン

浴出液1I:50mM酢酸アンモニウムと 100%メタノ}ル、数字は保持時間(分)を示す。

つのピーで、その他に 3つのピークが検出された。 HEFは、図 3‑Bと同様に、 2クに分離された(図 5‑B) 0 両者のコクロマトグラフィーでは主ピークの RFよりやや遅れて HEFが溶出された。本研究でも FMNは Roughead &McCormickの結果と同様に検出されなかった。しかし、 Roughead& McCormickによって指摘されている HEFは本実験で検出されなかった。彼らの方法によるフラビン抽出物における RF含量は Kannoらのそれよりも低い値を示した(表 1‑B) 。

表1. 2種の方法で牛乳から抽出したフラピンの含量と組成の比較
溶出液 I
溶出液 Hド.
g/IOOg重 量 % 削oV mol% 阿 lOOg重 量 % nmoV mol%牛乳l E牛乳
牛乳
100g
牛乳
A.K
組 m らによる簡易定量法∞

FAD 12.
022.
14 17.
FMN 8.
56.
0
18.
52.
0 3
RF 1
18.
0 8
13.
54
15.
4
8.
4
98.

12.
66.
9
80.
5

19.
6
18.
3
161.
46.
66.
187.
3B.Roug
head& McCo
聞はによる定量法
30。
目
FAD
24.
957.
1 1
9.
228.
327.
344.
5

1
8目
272.7

200.
781.8

6.
35.
288.
5FMNRF90.
575.
1240.
380.
814975.
5考察

Roughead& McCormick1
立、牛乳には重量%で、 FADが13‑45%、RFが35‑60%、 HEFが11‑19%、その他が含まれており、 FMNは検出されないと報告している。

HEFの存在、 FMNの欠在、 RF比率の減少はこれまでの報告とかなり異なっている O
本実験でも、 Roughead& McCormickの方法では FMNを検出できなかった。またRoughead&McCormickで HEFが検出できなかった。このことは用いた試薬に起因しているのかも知れないので、その点を確認する実験を進めている。
牛乳に HEFの様なアンチビタミン効果を持つ物質は存在しないことが確認された。
アンチビタミン効果をも持つ HEFの存在の有無を確認しておくことは牛乳の真の栄養価の評価と牛乳の普及の観点からも重要である。

参考文献

1)Roughead，Z.K.& D.B.McCormick，J.Nutr.，120，382‑388(1990).，Shirahuji，& T.Hoshi，J. FoodS
ci.，56，678‑681 (1991)
2)Kanno，C.H.& H.G.Petering，J.Am.Chem.Soc.，78，377‑380(1956)
3)Fall，H150