2017 JULY
No. 6042017 年（平成 29 年）7 月号

第 63 巻 第 3 号（通巻 604 号）

挨拶・巻頭言山歩き雑感..................... 真 板 敬 三（ 2 ）発表論文紹介Actinobacillus pleuropneumoniae
血 清 型 2, 3, 4, 6, 8 及 び 15 に お け る
ApxIIA と ApxIIIA の遺伝子的及び抗原性の特徴.................. To Ho（和訳；大嶋 篤）（ 3 ）ヒトアポリポ蛋白（a）遺伝子導入 NIBS
系ミニブタの作出........... 島 津 美 樹（ 9 ）学会参加記
第 48 回 全米養豚開業獣医師協会年次大会. ................................. 林 志佳（13）お知らせ
学会発表演題.................................. （17）平成 29 年度定時評議員会開催........ （18）
研修者･見学者受け入れ状況............ （18）

日生研たより

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山歩き雑感
真板敬三
低山歩きが趣味である。山は春夏秋冬それぞれで素晴らしい姿を見せヒトを感動させてくれるが、登っている最中は周囲の景色を愛でるなどという余裕はなく、もっぱら足元とほんの数メートル先の状況を確認するのが精一杯というのが実情である。かなり若い頃は一刻も早く昼飯の場所に着き缶ビールを飲もうというケシカラヌ心得で歩いていたため、尾根筋に至る植林地はただ暗く陰気な場所で早くそこを抜け明るい雑木帯に入ろうとシャカシャカ先を急いでいた。最近は急ごうにも体が待ったをかけるため自ずと歩くペースは遅くなり植林地の様子に眼が向くようになったが、そこで気になるのは多くの植林地で森林というイメー
ジからすると木々の間隔が狭く太さにバラツキがあり立ち枯れも目立ち、また、如何なる力が働いたのか直径 30 〜 40 cm もの立木が縦に裂け片方がだらりと垂れ下がり、中には両側がなくなりまるで大きな楊枝が地面から突きでた様の無残な光景が随所に見られることである。さらに間伐された木々がそのまま放置され、あるいは 1 m ほどの長さに横挽きされたまま野積されている。聞くところによると植林地での間伐が適切に行われないため木々の成長にムラが出る、また、杉や檜のように垂直に幹が伸びる樹木では枝打ちが定期的に行われないと、春先に降る湿雪の重みに枝葉が耐えかね幹本体が縦に裂けるそうである。原因は安価な輸入材が大量に出回ったため国内林業が立ち行かなくなり、山林作業者の離職や後継者不足から戦後の建材需要が一巡した後に行われた膨大な面積の植林地の維持・管理が困難になったことが大きい。林業の凋落に加え薪炭・蚕糸需要の衰退、ナメコ、シイタケ等キノコ類の工場生産への移行が山村の経済崩壊に拍車をかけたのである。山は標高数百メートルの低山であっても危険はつきものである。尾根筋を離れ急峻な山腹の植林地を抜け勾配が緩やかになるとじきに辺りが開けてくる。そのような場所は以前緩い傾斜地を石組で均した桑畑
か野菜畑だったようで、隅に崩れた作業小屋があり脇には実のなる木を植えてある。春先には真っ青な空に満開の梅が清々しい香りを放ち、その下ではサンシュユが黄色の花をつけ早春に彩りを添えている。ほどなく民家がポツポツ現れ、もう林道は近いとホッとする瞬間であるがそれらは全て廃屋でどこにもヒトはいない。環境維持のため里山保全の大切さが叫ばれて久しいが、それには里山が再びヒトの生活の場になることが最も単純かつ継続性ある方策であり、まずはそこでの生活維持に充分な収入を得る施策を考案・実行すべきであろう。
放棄された田畑での太陽光や風力発電、間伐材チップを用いたバイオマス発電が提案されている。しかし、山間部の気象条件で安定した発電が可能か疑問だしバイオマス発電も採算レベルの技術開発は道半ばの段階であろう。観光産業の誘致はブームの去ったスキー場やゴル
フ場、廃墟と化した民宿の悲惨な状況を見ればとても恒久的施策とは思えない。山村での生活維持には林業経営の安定化が一番であり、それには大きな設備投資なしに経済的にも成り立つ間伐材の利用が手っ取り早いのではなかろうか。欧米の公園に行くと木材チップが散策
路や植え込みに厚く敷かれているが、日本でも最近ガーデニング資材としての利用が増え、ホテルや一部の公園で見られるようになった。これを全国の遊歩道、公園、学校等の公共施設に広めるのはどうだろう。さすれば中国、東南アジアの景気高揚に伴う住宅建材市況の好転と相まって山村経済浮揚のきっかけになるのではないか。でも経常経費が増えてお役人は嫌がるかなあ？

こんなことを山歩きの途中で考えている。
（評議員）

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発表論文紹介Actinobacillus pleuropneumoniae
血清型 2, 3, 4, 6, 8 及び 15 におけるApxIIA と ApxIIIA の遺伝子的及び抗原性の特徴
To Ho（和訳；大嶋篤）

Genetic and antigenic characteristics of ApxIIA and ApxIIIA from Actinobacillus pleuropneumoniae serovars 2,
3, 4, 6, 8 and 15.
To H1, Nagai S1, Iwata A1, Koyama T1, Oshima A1, Tsutsumi N1.
1

Nippon Institute for Biological Science, 9 – 2221 – 1 Shinmachi, Ome, Tokyo 198 – 0024, Japan.

Microbiol Immunol. 2016. 60（7）: 447 – 458.
肺炎を引き起こす。15 個の血清型が知られており、
要約

ApxI、ApxII、ApxIII 及 び ApxIV と 呼 ば れ る RTX

Actinobacillus pleuropneumoniae（App）によって毒素をそれぞれに産生する。App の病原性には様々産生される Apx 毒素は、新世代ワクチンの必須成な要因（RTX 毒素、CPS、LPS 及び鉄輸送システ分である。本研究では、血清型 2、3、4、6、8 及びム）があるが、臨床症状と典型的な豚胸膜肺炎の増15 の apxIIA 及び apxIIIA 遺伝子をクローニングし、悪の第一要因は Apx 毒素である。App のすべての配列を決定した。血清型 2、3、4、6、8 及び 15 の血清型は ApxI と ApxIII の分泌に基づき 2 つの大き

ApxIIA タンパク質のアミノ酸配列は、血清型 1、5、 なグループに分けることができる。1 つは ApxI 及
7、9 及び 11 〜 13 のものとほぼ同一であった。イ

び II を分泌する血清型 1、5a、5b 及び 9 からなる

ムノブロット法において、血清型 2 及び 15 由来のグループ、もう 1 つは ApxII 及び III を分泌する血rApxIIA が、種々の血清型に感染した動物由来の血清型 2、3、4、6、8 及び 15 からなるグループである。

清と強く反応することを示した。アミノ酸配列の解

ApxI は強い溶血性及び細胞毒性、ApxII は弱い溶血

析によって、ApxIIIA タンパク質が血清型 2 の株に性と細胞毒性、ApxIII はブタの好中球及び肺胞マク

1 つ、血清型 3、4、6、8 及び 15 の株に 2 つの変異

ロファージに対する強い細胞毒性を有する。

体を有することを明らかにした。マウスにおける交差

Apx 毒素は、細菌感染に対する防御を付与するワ防御の研究では、rApxIIIA/2 あるいは rApxIIIA/15

クチンの必須要素である。近年、市販されているトの投与は、ApxIII/15 及び ApxIII/2 を発現する血清

キソイドワクチンは App の様々な血清型に対して型 3、4、6、8、15 及び 2 の App 株による攻撃に対強力な防御を付与することが知られている。しかしし て 防 御 効 果 を 与 え る。同 様 に、ウ サ ギ 抗ながら、ApxI、ApxII、ApxIII 及び 42 kDa の外膜タ

rApxIIIA/2 あるいは抗 rApxIIIA/15 血清を投与されンパク質からなるワクチンは血清型 15 の HS143 株

たマウスは、血清型 2 及び 15 による攻撃に対してによる攻撃において、ブタを防御することができな

防御されることが明らかとなった。我々は ApxIIA

かった。

及び ApxIIIA タンパク質間での抗原性及び配列類似

このトキソイドワクチンの失敗は ApxII と ApxIII性を明らかにした。これは、App による疾患に対すの違い及び血清型 15 の特異的な莢膜多糖によるもる有効なワクチンの開発に役立つと考えられる。

のと考えられる。
様々な交差防御の研究が報告されており、初期の研究によると、① 1 つの血清型による鼻腔内接序論
Actinobacillus pleuropneumoniae（App）は豚胸膜

種はホモ及びヘテロの血清型両方の攻撃に対する免疫を付与する、②菌体抗原による防御は血清型

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特異的であり、LPS の抗原性を共有する血清型間チンが、様々な血清型に対する強力な防御を誘導

では交差防御する可能性があると報告されている。

する理由を説明することができる。

たとえば、血清型 2 の不活化ワクチンを投与され抗 Apx 抗体が様々な血清型に対して交差防御をたブタは血清型 1、5、6 あるいは 8 による攻撃に示すかどうかに対する疑問を明らかにすることは、対して防御されず、血清型 4 あるいは 5 のワクチ

効果的なワクチン設計に重要である。この目的のたンでは血清型 2 の攻撃に対し、動物は防御されない。 めに、我々は App 血清型 2、3、4、6、8 及び 15 のしかしながら、血清型 1 から 6 を含むワクチンは

ApxIIA 及び ApxIIIA の遺伝子的ならびに抗原性の血清型 2、3 あるいは 8 での攻撃に対して完全な防解析を行った。

御を付与した。なぜなら、血清型 8 は血清型 3 及
び 6 の両方の LPS の抗原決定基を共有しているた

材料と方法については割愛させて頂きます。

めと考えられる。加えて、ApxI あるいは ApxI 及び ApxII より作られたトキソイドワクチンは血清型 1 による攻撃を完全に防御した。Inzana らの報

結果

告によると、血清型 5 での攻撃に対して、ブタに

apxIIA 及び apxIIIA 遺伝子のシークエンス解析

おいて ApxI を 50μg 含むワクチンの 2 回投与では血清型 2、3、4、6、8 及び 15 の apxIIA の ORFs

防御は認められず、マウスにおいて ApxI を 25μg

は 2868 塩基から成り、956 個のアミノ酸を持つタ含むワクチンの 2 回投与では防御が認められた。

ンパク質をコードしている。血清型 2、3、4、6、8

最 近 で は、マ ウ ス に お い て ApxI の N 末 端 部 を

及び 15 の apxIIA の ORFs の大きさは血清型 1、5、20μg 含むワクチンの 2 回投与において、ホモあ

7、9 及び 11 〜 13 と類似している。ApxIIA の予想

るいはヘテロの血清型に対して交差防御を示すこさ れ る 分 子 量 は 約 103 kDa で あ る。血 清 間 のとが Seah らによって報告されている。ワクチンのApxIIA の ア ミ ノ 酸 配 列 の 類 似 性 は 99.3％か ら違い（不活化、弱毒化及びトキソイドワクチン）、100％であった。

投与経路、1 用量当たりの容量あるいは抗原濃度にシークエンス解析の結果、血清型 2 の推定上の対する免疫応答の差異、動物種の違い（ブタあるapxIIIA の ORFs は 3150 塩 基（あ る い は 基 準 株

いはマウス）及びチャレンジ方法（エアロゾル、

1536 株は 3147 塩基）で 1050 個のアミノ酸がタン

鼻腔内あるいは気管内攻撃）などの各研究におけ

パク質をコードしており、血清型 3、4、6、8 及びる違いが、実験結果の矛盾を生み出していると考15 は 3156 塩基で 1052 個アミノ酸がタンパク質をえられる。App 血清型の構成あるいはワクチンにコードしている。ApxIIIA タンパク質の予想される

おける抗原決定基（血清型における Apx 毒素ある

分子量は約 120 kDa である。これらアミノ酸配列

いは CPS 及び LPS を含むタンパク質）の違いが交の類似性において、ApxIIIA は 2 つのバリアントが差防御試験の結果のばらつきに影響していると考あり、1 つは血清型 2、もう 1 つは血清型 3、4、6、8えられる。CPS あるいは LPS が完璧な防御をもた及び 15 に認められる。ApxIIIA バリアント間のア

らさないことはよく知られているが、ブタでは、

ミノ酸配列の類似性は ApxIIIA/2 では 99.05％からホモ株による攻撃に対して臨床症状、豚胸膜肺炎

100％、ApxIIIA/15 では 99.71％から 100％であり、の増悪及び死亡率を低減させ、強い交差防御を示

こ れ ら 2 つ バ リ ア ン ト 間 の 類 似 性 は 95.32％か らすある種の血清型の集団（例えば、血清型 1、9 及

96.38％であった。アミノ酸配列の相同性において、び 11、3、6、8 及 び 15、4 及 び 7、5a 及 び 5b）がApxIIIA は 2 つの異性体を有し、1 つは血清型 2、交差防御を示すのは、それらの CPS 及び LPS が類

もう一方は血清型 3、4、6、8 及び 15 から成る。

似あるいは同一であることによる。上記の理由と各 ApxIIIA 異 性 体 の ア ミ ノ 酸 配 列 の 相 同 性 は、Apx 毒素の強力な免疫原性によって、3 つの特異的

ApxIIIA/2 で は 99.05％か ら 100％、ApxIIIA/15 でな ApxA 毒 素 を 含 む 市 販 の ト キ ソ イ ド ワ ク チ ン

は 99.71％から 100％であり、これら 2 つの異性体（ApxIA、ApxIIA 及び ApxIIIA）ならびにその地域の間の相同性は 95.32％から 96.38％である。血清

で最も流行している血清型の菌体成分を含むワク型 2 の ApxIIIA は 血 清 型 3、4、6、8 及 び 15 の カ

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ルボキシル末端が異なっている。特に、ノナペプの血清に対する、rApxIIA 及び rApxIIIA タンパクチドリピートとカルボキシ末端の間に位置する、質の反応性について、イムノブロッティング法を107 のアミノ酸残基（878 〜 984）は血清型 2 と血用いて調べた。血清型 2、3、4、6、8 及び 15 に感

清型 3、4、6、8 及び 15 の間で異なっている。こ染したマウス由来の血清は rApxIIA/2（血清型 2 由

れらの結果は、オリジナルと対立遺伝子変異型と来 の 組 み 換 え rApxIIA タ ン パ ク 質）及 び

いう 2 つの異なる ApxIIIA の型があることを示唆

rApxIIA/15（血清型 15 由来）のタンパク質に非常している。

に強く反応し、様々な血清型間の ApxIIA タンパク

各 ApxIIIA のアライメント解析により、2 つの多質と同様の抗原性を示した。同様に、App 血清型 2形領域（878 〜 914 及び 947 〜 970 残基）の間に位ならびに 3、6、8 及び 15（それぞれ ApxIIIA/2 及

置する 922 〜 942 残基間の保存されたアミノ酸配列

び ApxIIIA/15 を発現）に感染したブタ及びマウス（WFKE[G]GNK[S]YNHKIEQIVDKNGR）が明らかの血清は rApxIIIA/2 及び rApxIIIA/15 タンパク質となった。そして、アミノ酸配列の in silico 解析にに強く反応した。これらの結果は、様々な血清型

よると、血清型 2 の ApxIIIA の 878 〜 984 残基の三（ApxIIIA を 発 現 す る）に 感 染 し た 動 物 も 2 つ の次元構造は血清型 3、4、6、8 及び 15 の ApxIIA 配

rApxIIIA タンパク質に反応する抗体を作ることを列と異なっている。アミノ酸領域の疎水性プロファ示している。

イルは 2 つの ApxIIIA 異性体間でも異なっている。
まとめると、これらの結果はアミノ酸配列の一次構造だけでなく ApxIIIA タンパク質の高次構造にも変異があることを示唆している。

能動免疫試験
続いて、我々は rApxIIIA/2 あるいは rApxIIIA/15の投与によって交差防御が可能かについて検討した。
この目的のために、rApxIIIA/2 及び rApxIIIA/15 タ

rApxIIA 及び rApxIIIA の発現と精製

ンパク質をマウスに 2 回投与し、その後 ApxIIIA/2

血清型 2 及び 15 の apxIIAΔCA::Hisx6 で識別されを 発 現 す る App 血 清 型 2 の 885 – 3 株 及 び SHP – 1

た DNA 断片はその大きさが 3043 塩基（172 塩基が株ならびに ApxIIIA/15 を発現する S1421 株（血清apxIIC、2850 塩基が apxIIA、18 塩基が His タグ、3型 3）、M – 62 株（血 清 型 4）
、Femo（血 清 型 6）、

塩基が停止コドン）であることが、増幅した DNA

405 株（血清型 8）及び HS143（血清型 15）を腹腔

断片のシークエンス解析から明らかとなった。その内投与し、攻撃した。

DNA 断片をクローニングベクター pGEM – T Easy

ApxIIIA/2 を 発 現 す る App 血 清 型 2 の 885 – 3 株

内でクローニングし、rApxIIA タンパク質は lacZ プ

及び SHP – 1 株で攻撃後、対照群のマウス 10 頭はロモーターを用いて発現した。精製した rApxIIA タ

元気消失や食欲不振といった臨床症状を示し、3 日

ンパク質は SDS – PAGE において 103 kDa に明瞭な以 内 に 全 頭 死 亡 し、一 方、rApxIIIA/2 及 び

バ ン ド が 認 め ら れ た。血 清 型 2 及 び 15 のrApxIIIA/15 で投与した群のマウスは試験終了日（7apxIIIAΔCA::Hisx6 で識別された DNA 断片はそれ日）まで全頭生残した（表 1）。ApxIIIA/15 を発現

ぞ れ 3234 塩 基（81 塩 基 が apxIIIC、3132 塩 基 がする血清型 15 の HS143 株で攻撃した場合は 3 日

apxIIIA、18 塩基が His タグ、3 塩基が停止コドン）

以内に 9 匹（90％）の対照マウスが死亡したが、及 び 3240 塩 基（81 塩 基 が apxIIIC、3138 塩 基 が

rApxIIIA/2 及び rApxIII/15 を投与したマウスは 10

apxIIIA、18 塩基が His タグ、3 塩基が停止コドン）匹（100％）生 残 し た。rApxIIIA/2 あ る い はであった。前記の方法と同様に精製した rApxIIIA

rApxIII/15 のいずれかを投与したマウスは、ホモ

は SDS – PAGE において約 120 kDa に単一バンドと株だけでなく、ヘテロ株（ApxIIIA/2 を発現する

して認められた。

App 血清型 2 あるいは ApxIIIA/15 を発現する血清型 15 の HS143 株）に よ っ て も 防 御 さ れ た。こ れ

rApxIIA 及び rApxIIIA タンパク質のポリクローナル

らの結果は、rApxIIIA/2 あるいは rApxIII/15 いず

抗体への反応性れ か を 投 与 し た マ ウ ス 及 び 対 照 マ ウ ス に、様々な血清型の App に感染したブタ及びマウス

ApxIIIA/15 を発現する種々の血清型の App 株を投日生研たより

6（34）表1

様々な App 血清型での攻撃後 1 週の rApxIIIA/2 あるいは rApxIIIA/15 投与マウスの生残率

与した場合の結果に類似していた。rApxIIIA/2 あ

抗 rApxIIIA/2 あ る い は 抗 rApxIIIA/15 血 清 で 処 置

るいは rApxIII/15 を投与した群の全てのマウスがしたマウスの 10 匹（100％）が攻撃後 7 日まで生存

生 存 し て い た の に 対 し、非 投 与 対 照 群 の 70％、したが、対照群のマウスは 3 日以内に 9 匹（90％）

90％、60％及 び 70％が App 血 清 型 3、4、6 及 び 8死亡した。これらの結果から、抗 rApxIIIA/2 及びでの攻撃後に死亡した。統計学的解析において、

抗 rApxIIIA/15 血清が、ホモ及びヘテロの血清型

rApxIIIA/2 あるいは rApxIIIA/15 を投与したマウス（ApxIIIA を発現する）株による攻撃に対する防御

群間での生残数に有意な差は認められなかった。しを付与すると考えられた。

か し な が ら、対 照 群 と rApxIIIA/2 あ る い は
rApxIIIA/15 を投与した群との間に統計学的な有意rApxIIIA/2 及び rApxIIIA/15 抗原に対する抗体応答差が認められた。これらの結果は、このマウス攻撃

組換えタンパク質（rApxIIIA/2 及び rApxIIIA/15）

モデルにおいて rApxIIIA がホモあるいはヘテロのを投与したマウス及び血清型 2 の 885 – 3 株及び血ApxIIIA を発現する App による攻撃に対して交差防清型 15 の HS143 株でそれぞれ攻撃したブタにおけ御を付与することを示している。

る体液性の抗体応答について、ヒスチジンタグを付与した ApxIIIA/2 及び ApxIIIA/15 タンパク質なら受動免疫試験

びに Histag – COOH を対照タンパク質としてコー

次 に、抗 rApxIIIA/2 及 び 抗 rApxIIIA/15 血 清 がト し た 抗 原 を 用 い た ELISA で 評 価 し た。

ホモ及びヘテロ血清型の攻撃に対して交差防御を付

rApxIIIA/2 あるいは rApxIIIA/15 の投与または 885

与できるかどうかを調べた。各 10 匹の動物からな– 3 株及び HS143 株での攻撃によって、ホモ及びヘる 群 に、抗 rApxIIIA/2 あ る い は 抗 rApxIIIA/15 血テロの rApxIIIA 抗原に対する抗体は有意に増加し清を 18 時間間隔で 2 回投与し、血清型 2 及び 15 にたが、対照抗原である rSpaC253 に対しては増加し属する株を高濃度あるいは低濃度で攻撃し、臨床症なかった。ホモの抗原を用いて得られた ApxIIIA 特状及び死亡について毎日 7 日間観察した。

異的抗体は、ヘテロの抗原で認められたものとほぼ

血清型 2 及び 15 の高濃度での攻撃において、抗同等であった。

rApxIIIA/2 あるいは抗 rApxIIIA/15 血清で処置した
マウスでは 4 〜 5 匹のみ（40％〜 50％）が 4、5 及
び 6 日目に死亡したのに対し、対照群のマウスは 9

考察〜 10 匹（90％〜 100％）が 3 日以内に死亡した（表最 近 の 研 究 に よ る と、ApxI、ApxII 及 び ApxIII2）。血清型 2 及び 15 の低用量での攻撃において、（ApxI 及び III よりは関与が弱い）が豚胸膜肺炎の

表2

様々な App 血清型での攻撃後 1 週の抗 rApxIIIA/2 血清あるいは抗 rApxIIIA/15 血清投与マウスの生残率63（3）
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臨床的徴候及び特徴的な出血性病変の発症に関与し〜 942 塩基）に存在する。保存されたアミノ酸配列ていることが示唆されている。多くの研究から、が、ロイコトキシンの 840 〜 871 のエピトープある

ApxI 及び II の両方あるいはいずれか一方の毒素にいは HlyA の 914 〜 936 のエピトープの配列と類似

対する抗体は、ApxI 及び II の両方あるいはいずれしており、これらの毒素が白血球のβ2 インテグリ

か一方及び ApxIII を産生する App 血清型 1、2、5ン受容体あるいは赤血球のグリコフォリン受容体に及び 10 のホモ及びヘテロ株による攻撃に対して防結合し、毒性を発現するために非常に重要な部位で御を示すことが明らかとなっている。血清型 2、3、あることは注目すべき点である。

4、6、8 及び 15 由来の ApxIII の防御効果に関する

他の RTX 毒素にもアミノ酸の相同配列があるこ

情報はほとんど報告されていない。さらに、新世代と が 知 ら れ て お り、大 腸 菌 の HlyA、Mnnheimiaのワクチンを用いた近年の研究において、ワクチン

haemolytica のロイコトキシン、Bordetella pertussis 由が HS143 株（血清型 15）の攻撃に対して、有意な来のアデニル酸シクラーゼ毒素及び Aggregatibacter

防御を付与できないことが示された。病気に対する

actinomycetemcomitans 由来のロイコトキシンなどが、より効果的なワクチン開発のための基礎データを得同様の機能で作用することが知られている。

るために、本研究では、血清型 2、3、4、6、8 及び興味深いことに、ApxIA タンパク質は、Apx 毒素

15 からの ApxIIA 及び ApxIIIA の遺伝子的及び抗原の中でも血清型 1、9 及び 11 型と血清型 5 及び 10性の特性を調べた。

型の 2 種類がある。C 末端では、37 個のアミノ酸

apxII 遺伝子はすでに血清型 5 については Changのうち 17 個が 2 つの ApxIA 変異体の間で異なる。

ら、血清型 9 は Smits らによって同定及び特定されC 末端領域の最後の 50 残基は、HlyB/HlyD 型トラて い る。後 に、Jansen ら は、apxIIA 遺 伝 子 が、血ンスロケーターによる ApxIA 及び HlyA の細胞外へ

清型 6 を除いた血清型 1 〜 9、11 及び 12 の参照株の分泌に必要であると考えられている。したがって、に存在し、これらは高度の配列類似性を有している

2 つの ApxIA 変異体は分泌過程に特徴が認められる。

ことを報告した。これらの発見は、ゲノム DNA のApxIA のアミノ酸配列の相違と同様に、ApxIIIA の制限酵素断片の遺伝子解析の結果及び 3.2 kbp の配列の違いは、この領域の二次構造及び疎水パター

apxIICA 遺伝子の PCR 増幅産物の結果に基づいてンの違いに寄与する。よって、この領域が ApxIIIAいる。彼らの結果は、他の研究者によって報告されのタンパク質分泌に関与していると推定される。

た結果と併せて、ApxIIA タンパク質が血清型 1 〜 9、血清型 2 あるいは 15 に由来する 2 つの rApxIIIA

11 〜 13 及び 15 の参照及び野生株の間で高度の配タンパク質が、血清型 2、3、4、6、8 及び 15 の攻列類似性（99.3％〜 100％）を有することを示した。

撃 に 対 す る 交 差 防 御 を 示 す こ と は、Dom ら、さらに、rApxIIA タンパク質（血清型 2 及び 15 のRycroft ら、Macdonald 及 び Rycroft に よ る 以 前 のapxIIA 遺伝子から調製）及び ApxIIA ポリクローナ

報告の結果と一致する。Dom らは、ブタ肺胞マク

ル抗体（血清型 2、3、4、6、8 及び 15 に感染した

ロファージの活性に対する血清型 2 及び 3 の毒性は、マウス由来）のイムノブロット法で認められた強い血清型 2 あるいは 3 の不活化された App 株で吸着

反応は、血清型 2、3、4、6、8 及び 15 の ApxIIA タ

したホモ及びヘテロの回復期のブタ血清によって中ンパク質が他の血清型のものと遺伝子的及び抗原的和されることを報告した。Rycroft らもまた、血清に非常に類似していることを示唆している。

型 2 由来の天然及び組換え ApxIIIA によるブタ肺胞

本 研 究 で 行 わ れ た シ ーク エ ン ス 解 析 に よ り、

マクロファージに対する細胞傷害活性が、血清型 3apxIIIA 遺伝子が、血清型 3、4、6、8 及び 15 と血の感染後の回復期のブタ血清によって中和されるこ

清型 2 のみの 2 つの変異体に分類されると示唆されとを発見した。

た。ノナペプチドリピートとカルボキシル末端の間

精 製 さ れ た rApxIIIA/2 及 び rApxIIIA/15 タ ン パに位置する 2 つの多型領域（アミノ酸残基 878 〜

ク 質 を 投 与 し た マ ウ ス で は、rApxIIIA/2 及 び

914 及び 947 〜 970）における血清型 2、3、4、6、

rApxIIIA/15 タンパク質に対する ELISA において、8 及び 15 の 2 つの ApxIIIA 変異体間の配列に違い

強い体液性免疫応答が認められた。rApxIIIA/2 あが認められた。2 つの多型領域は、保存領域（922

るいは rApxIIIA/15 の投与によって誘導された免疫日生研たより

8（36）

応 答 は、血 清 型 2 及 び ApxIIIA/2 及 び ApxIIIA/15

よって報告された結果とあわせて、血清型 15 特異的をそれぞれ発現する血清型 3、4、6、8 及び 15 の多糖に対する抗体の不在が、市販のトキソイドワク

App による攻撃を十分に防御した。受動免疫試験のチンによる HS143 株（血清型 15）に対する防御効

結果は、能動免疫実験から得られた結果と一致する。 果が限定されたものとなるという結果と一致していこの結果は、ApxIIIA の投与によって誘導される防る。

御が、ホモあるいはヘテロの ApxIIIA を発現する特抗 rApxIIIA/2 抗体あるいは rApxIIIA/15 抗体が定の血清型に限定されないことを明らかにした。こ血清型 2 及び 15 による攻撃に対してマウスを防御の結果とイムノブロット法の結果から、血清型 2、3、するメカニズムは、本研究では明らかにされてい4、6、8 及 び 15 に 感 染 し た マ ウ ス 由 来 の 抗ない。それにもかかわらず、Crujisen、Dom 及び

rApxIIIA/2 あるいは抗 rApxIIIA/15 マウス血清は、Udeze ならびに Kadis らは、抗 Apx 抗体がブタの血清型 2 の代表的な株により産生された rApxIII タ

好中球あるいは単球及び多形核白血球内の細菌のンパク質と強く反応することが明らかとなった。さ取り込み及び死滅を増強することを示している。

らに、それぞれ血清型 2（885 – 3 株）あるいは 15

抗 rApxIIIA 抗体は、毒素の活性部位に近い、生物（HS143 株）に感染したブタの回復期の血清が、イ学的に活性な部位あるいはエピトープに結合し、ムノブロット及び ELISA に利用されていることか

その後、ApxIIIA に対し強固に結合した抗体が毒素

らも明らかな様に、rApxIIIA/2 及び rApxIIIA/15 タの活性を減少あるいは完全に排除し、毒素と好中ンパク質と同等に反応する。同様に、ApxIA タンパ

球あるいは食作用との相互作用を減少させる。毒ク質は 2 つの変異体を有し、apxIA 遺伝子から得ら素に対する中和抗体は細菌による細胞障害を抑制れた組換え N 末端断片（残基 40 〜 380）は、血清すること及び多形核白血球は、抗体による作用が型 1、5 及び 10 の攻撃に対してマウスを防御するとない食細胞より、オプソニン化された細菌を明ら報告されている。ApxIIIA によるマウスの交差防御

かに高い割合で取り込むことはよく知られている。

に関する我々の結果は、Tumamao らの結果と異しかしながら、Apx 毒素に対する抗体とともに莢なっており、市販のトキソイドワクチンを投与した

膜多糖や膜タンパクの表面に露出したエピトープ

ブタは HS143 株（血清型 15）の攻撃に対して、有は、効率的な細胞性の食作用及び App の被包化に意な防御を与えることができないことを示した。

必要である。抗 Apx 抗体は、細菌表面上の Apx タ

Tumamao らの結果と我々の結果との間の相違の理

ンパク質に結合し、食細胞による細菌取り込み及由は明らかではないが、ブタとマウスという実験系

び死滅を増強する。マクロファージ内では、細菌の違いがあり、移行抗体の影響及び ApxIIIA 濃度のへの抗体の結合により、細菌の酸化的破裂が誘発違いの両方あるいはいずれかによるものと考えられされ、細菌の複製も妨げる。

る。同様の結果が ApxIA について報告されている。

十分な抗体が受動免疫された場合、あるいは適当

ApxI の N 末端断片を投与されたマウスは、複数のな量の細菌を感染させた場合、試験動物のほとんど

血清型の攻撃に対して防御が認められる。ApxIA あは生存すると考えられる。過去のいくつかの研究にるいは ApxIA 抗血清を投与されたマウスでは防御より、毒素で能動免疫されたマウスあるいはブタ、が認められるが、ApxIA を投与されたブタでは、ホまたは ApxI 特異的抗体を投与したマウスあるいは

モ株の攻撃に対して防御されなかったと別の研究でブタが、ホモの血清型株による攻撃に対して防御さ報告されている。Tumamao らの最近の報告によるれることが示された。防御における CPS 及び LPSと、市販のトキソイドワクチンを投与したブタは、に対する抗体の役割は、他の研究者によって報告さ

ApxI、ApxIII、42 kDa の外膜タンパク質及び血清れている。興味深いことに、大石らは、CPS に対型 1 特異的多糖に対する有意な抗体を産生したが、する mAb のみ、あるいは ApxI に対する mAb のみ

血清型 15 特異的多糖については十分ではなく、攻をマウスに投与するより、血清型 5 の CPS に対す

撃濃度が高濃度という条件ではあるが、血清型 1 にる mAbs 及び ApxI を組み合わせて投与する方が、対しては防御が認められ、血清型 15 に対しては認血清型 5 で攻撃された場合のマウスの生残率は高められなかった。これらの知見は、他の研究者にかった。さらに、市販のトキソイドワクチンの防御

63（3）
，2017

9（ ）
9（37）

効果を評価した最近の研究により、特定の血清型（CPS 及び LPS を含む）に対する抗体ならびに 3 つ

所感の App 毒素（ApxI、ApxII 及び ApxIII）に対する抗本 研 究 に お い て、App の も つ RTX 毒 素 で あ る

体が、豚胸膜肺炎に重要な役割を果たしていること

Apx 毒素に対する抗体の存在が App の感染に対しが示されている。本研究は、血清型 2、3、4、6、8て重要な役割を示すことが明らかとなった。また、及び 15 の ApxIIA タンパク質が、遺伝子的及び抗App には現在知られている中でも 16 個の血清型が原的に他の血清型の ApxIIA タンパク質と非常に類存在し、その各血清型間での交差防御効果について似していることならびに ApxIIIA タンパク質は抗原

は報告によって様々であことから、App が共通にも的に非常に類似した 2 つの ApxIII 変異体を有するつ Apx 毒素に対するワクチンはその感染制御に重ことを明らかにした。App によって引き起こされる要と考えられる。今回、同じ App の ApxIIIA 間で豚胸膜肺炎に対するより、安全でより効果的なワクも各血清型間において遺伝子的に若干の差異がある

チン開発において、Apx 毒素の抗原の類似性が考慮ことが明らかとなった。その違いがブタへの免疫原されるべきである。

性において、どの程度あるいはどういった違いを生じるのかについては非常に興味深い。

参考文献につきましては割愛させて頂きます。

発表論文紹介ヒトアポリポ蛋白（a）
遺伝子導入 NIBS 系ミニブタの作出
島津美樹
Production of human apolipoprotein（a）transgenic NIBS miniature pigs by somatic cell nuclear transfer.
Shimatsu Y1, Horii W1, Nunoya T1, Iwata A1, Fan J1, Ozawa M1.
1

Nippon Institute for Biological Science, 9 – 2221 – 1 Shinmachi, Ome, Tokyo 198 – 0024, Japan.

Exp. Anim. 2016. 65（1）: 37 – 43
はアテローム性動脈硬化障害に対するプロトロンビ
背景ンの潜在性、コレステロール、脂質および炎症誘発2014 年、世界保健機関は 2000 年から 2012 年ま

性酸化リン脂質との深い関連性を有していると考えでの間の死亡原因上位 10 を公表し、その第 1 位はられている。アポ（a）はヒト、旧世界ザルおよび

虚血性心疾患、第 2 位は脳血管障害が占めた。これ

ハリネズミしか有さない非常に特殊な蛋白であるたら疾患の大部分は動脈硬化が起因となり得る。

め、ヒトアポ（a）遺伝子を導入したウサギが作出

リポ蛋白（a）（リポ（a））は動脈硬化の危険因子

され、動脈硬化症研究に成果をもたらした。

として注目されており、糖蛋白に富んだアポリポ蛋

ブタのコレステロール代謝とリポ蛋白代謝、さら白（a）（アポ（a））と低比重リポ蛋白（LDL）のアに、コレステロールと脂肪に対する生体反応はヒト

ポリポ蛋白（B）（アポ（B））の結合により構築さに類似しており、コレステロール関連疾患の動物モれている。リポ（a）の生理学的機能は不明確な部

デルとして使用されている。雑食性であることも有分が多いが、酸化リン脂質中で選択的に高濃度とな用性が高い。本研究は、動脈硬化症動物モデルとなることが解明された。さらに、選択的にアテローム

り得るヒトアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニブタ性動脈硬化障害を引き起こすことから、アポ（a）

作出を目的に行った。

日生研たより10（38）

図 1 pC-apo（a） HA コンストラクトの構築

核移植
材料及び方法マイクロマニピュレーターを用いて核移植操作を供試動物行った。再構築した胚に対して、直流パルスを用い

1 〜 4 才齢の 9 頭の NIBS 系ミニブタを仮腹動物に供試した。動物のケアと取り扱いは日生研実験

た電気刺激および 6 – ジメチルアミノプリンによる化学物質刺激を施した。

動物福祉並びに動物実験管理に関する規程に従っ胚移植た。

島津らの報告に従い、仮腹ミニブタの発情を人為
ベクターの構築的にコントロールした。開腹下にあるミニブタの片本研究では、図 1 に示すプラスミドベクターを用いた。アポ（a）にはヘマグルチニン（HA）タグを付側の卵管膨大部に少量の培地と共に再構築直後の胚を挿入することで、移植を行った。

け、プライマー配列 ATCCCTCTCTGTGCATCCTCT
お よ び CGAATTATTTCTCATCATTCCCTCAA と テ
ン プ レ ート と し て ア ポ（a）cDNA を 用 い た。T4
DNA ポリメラーゼでブラントエンドさせた後、遺伝子診断得られたすべての子ブタは、既報に従い、ヒトア
ポ（a）遺伝子を解析した。

PCR 産物のクローニングを行った。
血清中リポ（a）および脂質の解析
ドナー細胞とトランスフェクション
生後 1 日齢の雄および 10 日齢の雌の NIBS 系ミ作出された遺伝子導入ミニブタの血清中リポ（a）、
総コレステロールおよび中性脂肪を解析した。

ニブタ 1 頭ずつを由来とする腎由来初代培養細胞へ
アポ（a）を導入し、G418 で遺伝子導入細胞株を選択後、免疫染色でアポ（a）発現株を樹立した。7〜 10 代継代した細胞をドナー細胞として用いた。

精液性状検査性成熟後の遺伝子導入ミニブタ（雄）の精液性状を島津らの報告に従い検査した。

レシピエント卵子
食肉センターから採材したブタ卵巣から卵子を回結果収した後、島津らの報告に従い、卵子の体外成熟培

3 頭の雄のヒトアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミ養、更に、体外成熟卵子の裸化処理を行い、レシピ

ニブタの作出に成功し、その効率は 1.1％を示した

エント卵子を準備した。

（表 1 お よ び 図 2）
。し か し、2 頭（Tg #6 お よ び
表1

ヒトアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニブタの作出効率

a ドナー細胞は生後 1 日齢の雄の子ブタから樹立した。
b ドナー細胞は生後 10 日齢の雌の子ブタから樹立した。
c 平均 ± 標準偏差d 子ブタの娩出時体重は 300、480 および 480 g であった。
e 4 頭の死産と 1 頭の胎子ミイラ変性を含む子ブタの娩出時体重は 309 ± 82.0 g であった。

63（3），2017

11（39）

図 2 ヒトアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニブタに関する PCR 解析#7）は生後 1 〜 2 日齢で仮腹ブタの下敷きとなり圧の数値は加齢に伴う上昇が認められた（図 3）。血死した。雌の遺伝子導入ミニブタは 8 頭得られ効率

清中総コレステロール値はすべてのミニブタで同様

は 0.9％で あ っ た が、正 常 に 生 ま れ た 3 頭 中 1 頭なパターンを示したが、中性脂肪については、Tg（Tg #11）は、出生後間もなく仮腹ブタと分娩房の#1 の数値がほかの遺伝子導入ミニブタおよび対照間に挟まれ圧死した。また、4 頭（Tg #5、#8、 #9個体に比較して高値であった（図 4）。10 ヶ月齢におよび #10）の死産と 1 頭（Tg #4）の胎子ミイラ

達した Tg #3 の精液性状を検査したところ、精液量

変性が含まれた。なお、胎子ミイラ変性の個体の57.5 mL、精子運動性 13.0％および精子濃度 6,600

DNA は精製に至らなかった。

万精子 /mL であった（表 2）。

1 頭（Tg #3）の 雄 お よ び 2 頭（Tg #1 お よ び#2）の雌のヒトアポ（a）遺伝子導入ミニブタの長期間の飼育に成功した（写真 1）。Tg #1 の血清中リ考察

ポ（a）濃度は対照個体と同様に調査したすべての本研究において、動脈硬化症研究に有用なモデル

ポイントにおいて 1 mg/dL 以下を示したのに対し、となり得るヒトアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニ

Tg #2 および #3 では高値で推移した。特に、Tg #3

ブタの作出に成功した。ミニブタの作出効率は以前

写真 1 ヒトアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニブタ 3 頭（左端 : 雄 Tg #3、2 ヶ月齢、6.3 kg、中央 : 雌 Tg #2、3 ヶ月齢、9.8 kg、右端 : 雌 Tg #1、4 ヶ月齢、12.7 kg）

日生研たより

12（40）

 トアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニブタに関ヒ
する血清中リポ（a）濃度の解析

図4 ヒ トアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニブタに関す
る血清中総コレステロール濃度および中性脂肪濃度の解析報告した我々のデータ、さらに、家畜ブタでの報告

ブタの値は 0 であったと考えられた。今回、ヒトアと同様な値であった。ミニブタは家畜ブタと比較しポ（a）遺伝子は山梨大学範教授より提供頂いた。

た場合、サイズおよび扱い易さでアドバンテージが教授らのグループはヒトアポ（a）遺伝子を導入し高い。NIBS 系ミニブタは 1993 年に確立され 、1たウサギの作出に成功し、血中のリポ（a）濃度は歳齢の体重は約 30 kg であり比較的温厚な性格を有

約 3 mg/dL であったことを報告している。また、する。

得られた遺伝子導入ウサギのヒトにおけるアポ（a）

図3

リポ（a）は動脈硬化の危険因子として注目されレベルとしては相対的に低いものと結論付けている。

ており、糖蛋白に富んだアポ（a）と LDL のアポ

ところで、ヒトおよびブタでは肝臓のアポ（B）（B）の結合により構築されている。アポ（a）はヒト、

mRNA 編集酵素 1（APOBEC – 1）の発現が認めら

旧世界ザルおよびハリネズミしか有さない非常に特れず、ウサギにおいては発現が非常に低い。これら

殊な蛋白であることから、我々は核移植技術によりの種では、APOBEC – 1 はカイロミクロンを構成す

ヒトアポ（a）遺伝子を導入した NIBS 系ミニブタ

るアポ（B） – 48 と超低比重リポ蛋白（VLDL）おの作出を立案し、成功した。

よ び LDL を 構 成 す る ア ポ（B） – 100 の う ち ア ポ

本研究では、アポ（a）濃度の指標として血清中（B） – 100 のみを産生するため、ヒトアポ（a）遺リポ（a）の解析を行った。その結果、遺伝子導入

伝子導入ミニブタは、ヒトアポ（a）と APOBEC –ミニブタ 3 頭中 2 頭（雄雌 1 頭ずつ）のリポ（a）

1 によるアポ（B） – 100 の結合に成功したと考えら

濃度が高く、特に雄のブタの数値は加齢に伴い上昇れた。

していた。残り 1 頭（雌）では 1 mg/dL 以下を示

一方、コレステロールエステル転送蛋白（CETP）

した。濃度測定に用いたラテックス凝集比濁法は 1

は、高比重リポ蛋白（HDL）からアポ（B）を含有

mg/dL 以下の正確な数値を測定できなかったため、するリポ蛋白までコレステロールエステルの転送にこの雌のミニブタの血清中リポ（a）濃度は明らか

触媒作用をおよぼし、コレステロール逆輸送経路のではない。一方、通常ブタはリポ（a）を有さないために重要な蛋白であると考えられると共に、アテため、1 mg/dL 以下を示した対照個体となるミニ

ローム性動脈硬化症防御作用に関与する。ブタは

表2

平均 ± 標準偏差

ヒトアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニブタ（Tg #3）の精液性状63（3），201713（41）

CETP 活性を有さない、もしくは、極めて低いこと報告されている。本研究におけるヒトアポ（a）遺が知られており、ヒトアポ（a）遺伝子導入ミニブ

伝子と精液性状の関係は定かではないが、ドナー細タの CETP 活性値を調べることは病態を解析する

胞由来のミニブタの遺伝的背景に関しても調査する上で重要である。

必要があると考えられた。

ヒトアポ（a）遺伝子導入ミニブタの精液性状は、

本研究において、動脈硬化症研究に有用なモデル

ほかの系統ミニブタで報告されているデータと比較となり得るヒトアポ（a）遺伝子導入 NIBS 系ミニ

して差異は認められなかった。しかし、精子の運動

ブタの作出に成功した。今後、同病態ミニブタのコ性および濃度において若干低い傾向が認められ、通ロニーを確立する予定である。

常の人工授精には用いることは困難である。そのため、子宮深部人工授精技術を検討する必要があると参考文献につきましては割愛させて頂きます。

考えられた。
また、一般にブタは精液性状の個体差が大きく、原因として遺伝的要因が大きく関与していることが本 稿 は Exp Anim 2016 ; 65（1）: 37 – 43 に 掲 載 された論文を編集・日本語訳したものである。

学会参加記

第 48 回 全米養豚開業獣医師協会年次大会（48th Annual Meeting of the American Association of
Swine Veterinarians）
場所：アメリカ・コロラド州
期間：2017 年 2 月 25 日～ 28 日
林

志 佳

1,200 人程度が参加しており、3 日間で 2 題の基調
はじめに

講演と 100 題を超える一般口演、60 点のポスター

米国養豚開業獣医師協会 （AASV） は米国の養豚発表があった。企業ブースも 80 を超える出展があ

開業獣医師を中心に、関連産業従事者ならびに研究

り、非常に盛況であった。本学会参加記では、感染者を含め、40 カ国以上に約 1,300 の会員をもつ団体

症に関する演題の中で、筆者が興味深く感じた演題である。今回、私は AASV の第 48 回年次総会に、について報告する。

ポスター発表を行った当所の佐藤研究員と共に参加した。本年の開催地であるコロラド州デンバー市へ
は、日本からの直行便も飛んでおり、機上からだけ興味深かった演題

でなく、市内に移動してからも常に遠景に見える雄

演題：近年の 2 型強毒株 PRRSV に対する、広範な大なロッキー山脈が印象的であった。会場であるハ

中和抗体（Broadly neutralizing antibodies to recent,

イアットリージェンシーホテル（写真 1）のあるダ

virulent type 2 PRRSV isolates）

ウンタウン周辺は、16 番通りを中心に飲食店や土

演者：Michael P. Murtaugh（University of Minnesota）

産物屋が並び、のんびりと落ち着いた雰囲気であっ豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）は、た。総会はホテルの 2 フロアを利用し、同時に最大高頻度に遺伝子変異を起こすウイルスであり、多様4 部屋でセッションが行われた（写真 2）。総会にはな抗原性の野外株が存在する。ウイルスエンベロー

日生研たより

14（42）

写真 1

大会会場のホテル（左）およびホテルからのウェルカムボード（右）写真 2

口頭発表会場（左）およびポスター発表会場（右）プを構成する遺伝子の中で、主要な中和抗体を誘導の強毒株である MW174 株および NC134 株に対すする GP5 糖蛋白質をコードする ORF5 遺伝子領域

る中和抗体価を測定した。

に変異が集中するため、抗原交差性を乏しくさせてワクチン接種を受けている繁殖母豚から採取されいることは、PRRSV の制御を難しいものとする一た血清 20 検体は、全検体がワクチン株 VR2332 株

因と考えられている。演者らは高病原性株の発生しへ の 15 〜 256 倍 の 中 和 抗 体 価 を 示 し た。90％がた農場または繰り返し馴致をされた繁殖母豚群におMN186 株に 4 〜 60 倍、1 型である SDEU 株に対しいて、広範な中和スペクトラムを有する抗体があるても 20％が 4 〜 8 倍の中和抗体価を示した。強毒ことを発見した。

株である MW174 株の流行のあった 2 農場の繁殖母

ワクチン、馴致および自然感染のために複数の豚から採取された 10 検体は、全検体とも VR2332

PRRSV に感染歴のある農場の繁殖雌豚から血清を株、MN184 株、MW174 株 お よ び NC134 株、さ ら採取し、ELISA 法の原理を応用した中和試験法にに 1 型である SDEU 株に対して中和活性を持ってよって、遺伝子型が 1 型の SDEU 株およびレリス

おり、そのうち 22％が 256 倍以上の高い中和抗体

タッド株、2 型の VR2332 株および MN184 株、2 型価を示した。このように複数のウイルス株に感染歴

63（3），2017

15（43）をもつ個体は、多様な抗原性のウイルスに対して高い中和抗体価を有することが示された。

小感染量は、102.5 TCID50/mL であった。
本ウイルスはこれまでに日本での発生報告はない

この現象をワクチンとして再現できれば、多くのが、今後日本に侵入してくる可能性はある。SVA のPRRSV 株に対して交差免疫を誘起することができ、

疾病コントロールのためには、本発表で紹介された

PRRSV の撲滅に有用であると感じた。演者らはこような地道な知見の積み重ねが重要であると感じた。

の多様な免疫応答の元となるメカニズムについては未解明であると論じており、さらなる研究が待たれ

演題：母豚および哺乳子豚における Mycoplasma

る。

hyorhinis および Mycoplasma hyosynoviae の共感
染（Mycoplasma hyorhinis and Mycoplasma

演 題：Senecavirus A に 関 す る 感 染 実 験 の 総 説

hyosynoviae dual colonization of dams and piglets（Senecavirus A: Overview of experimental

prior to weaning）

studies）

演者：Maria Pieters （University of Minnesota）

演 者：Alexandra Buckley （Oak Ridge Institute

Mycoplasma hyorhinis は、哺乳豚に多発性漿膜炎

for Science and Education and National Animal

および関節炎を引き起こし、死亡の重要な一因としDisease Center）て関心を集めるようになっている病原体である。一

Senecavirus A （SVA）は口蹄疫ウイルスと同じ方、Mycoplasma hyosynoviae は、10 週齢以上の豚に

ピ コ ル ナ ウ イ ル ス 科 に 属 し、突 発 性 水 泡 病

重度の関節炎を引き起こす。アイオワ州立大学獣医（Idiopathic Vesicular Disease/ IVD）の 原 因 と し て

診断研究所（ISU – VDL）の調査では、2003 年から知られていた。2015 年夏頃から米国において IVD

2010 年の間に米国中西部で 431 例の跛行を診断しが散見されるようになり、早期病変からの分離ならた。そのうち全体の 17％を Mycoplasma 種によるもびに病態再現のための感染実験によって、その原因の と 診 断 し た。さ ら に、2010 年 に は そ の 頻 度 はが SVA であることが明らかとなった。本発表では37％まで増加し、注目を集めている病原体群である。

これまでに行われた SVA の実験感染について、総本発表では母豚およびその哺乳子豚の同一群の中で括的に報告された。

の両 Mycoplasma の感染動態を調査した。

豚 に 2015 年 に 米 国 で 分 離 さ れ た 株（SVA 15 –破行の既往歴のある農場の母豚 29 頭およびその41901SD）10 TCID50/mL を 5 mL 点 眼 投 与 し、病

子豚 120 頭から、分娩後 1 および 3 週に扁桃スワブ

態の再現性、垂直・水平感染の成立要件、免疫応答を 採 取 し、種 特 異 的 リ ア ル タ イ ム PCR で 両および最小感染量を検討した。

Mycoplasma ゲノムを検出した。

6

接種 3 〜 5 日後頃から蹄冠部に病変が見られ始め、母豚における M. hyorhinis の検出率は、分娩後 1

その 2 〜 3 日後に鼻部に病変が形成され、12 日目

週 お よ び 3 週 で そ れ ぞ れ 72％お よ び 65％、M.

ごろまでに完治した。接種 7 〜 10 日目にはウイル

hyosynoviae はそれぞれ 55％および 48.3％であった。

ス血症が認められ、直腸および口腔スワブには 4 週

両 Mycoplasma の検出された個体に相関は無く、混間後まで SVA が検出された。妊娠豚では、分娩の合感染していない個体も多く認められた。子豚にお10 日以前に感染した母豚の子豚から SVA は検出さける M. hyorhinis の検出率は、分娩後 1 週および 3

れず、垂直感染は成立しなかった。しかし、母乳な週でそれぞれ 8.3％および 50％、M. hyosynoviae は

らびに糞便中に SVA は検出された。群内での水平それぞれ 0％および 0.9％と M. hyorhinis が分娩後 3伝播の動態について検討したところ、感染から 2 週

週で M. hyosynoviae に比べて優位に高い検出率で間以内に豚の鼻同士が接触することによって伝播があったのに対し、M. hyosynoviae はほとんど検出さ成立した。攻撃の 4.5 〜 5 か月前に初めて SVA にれなかった。同一群で飼養されている母豚およびそ暴露されていた候補豚は、256 〜 4,096 倍の中和抗の哺乳子豚においても、これまでの報告にあるとお体価を示し、攻撃後もウイルスは検出されず、病変り、M. hyorhinis は哺乳豚で感染し、M. hyosynoviaeも認められなかったことから、SVA に対する感染防は離乳期以降に感染することが示された。本研究で御免疫を獲得していることが示された。SVA の最は、両 Mycoplasma の検出された個体は必ずしも混日生研たより

16（44）

合感染しておらず、一方の感染がもう一方の感染にのウイルス排泄量は、初回接種後 7 日にピークを迎影響を及ぼしているかは不明のままであり、感染動

えた後、次第に減少し、8 週齢での接種後にはいず

態に関するさらなる研究が求められる。

れの群の検体からもウイルス排泄は認められなかっ

呼吸器症状を引き起こす M. hyopneumoniae に比た。末梢血中の中和抗体価は、3 週齢での接種後 7

べて、関節炎を引き起こす両 Mycoplasma は日本に日に陽転し、14 〜 42 日まで高値を維持した。以上

おいてはあまり関心を集めていないが、米国での診の成績から、8 週齢豚に比べて 3 週齢豚は PDCoV

断数が増加しているとのことで、今後の動向に注目に対する感受性が高いことが示された。

したい。

PDCoV は北米および日本を含むアジアで報告されているため、若齢豚での下痢症の原因として今後注視すべきであると考えている。

ポスター発表
題名：豚デルタコロナウイルス（PDCoV）の 3 週

題名：メタノール酵母によって産生されたキメラタ

齢豚における病原性および免疫応答の検討

ンパク質および免疫賦活剤を用いたワクチン候補の（Evaluation of pathogenesis and antibody

検 討（Evaluation of a vaccine prototype using a

responses of porcine deltacoronavirus in 3–week–chimeric protein and a molecular enhancer

old weaned pigs）

produced by Pichia pastoris fermentation）

発表者：Qi Chen et al.（Iowa State University）

発

豚デルタコロナウイルス（PDCoV）は、2014 年

表者：Aura Villamil et al. （Universidad deConcepción）に米国で初めて報告された比較的新しいウイルスで離乳後多臓器性発育不良症候群（PMWS）は、離ある。一般にその病原性は、豚流行性下痢ウイルス

乳期の豚に発育不良を引き起こすウイルス性疾患で、および豚伝染性腸炎ウイルスに比較すると、弱いと世界各国で多発している。その主な原因である豚されている。本研究では 3 週齢離乳豚に PDCoV を

サーコウイルス 2 型（PCV2）の感染制御のために、実験感染させ、その病原性および免疫応答を検討し4 社からワクチンが市販されている。ワクチン抗原

た。

となる組換えタンパク質の発現系には、細菌、酵母、3 週齢の離乳豚 15 頭ずつを 2 群に分け、一群目

昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いた多様な系が開には 3 および 8 週齢時の 2 回（PDCoV/PDCoV 群）、

発されており、それぞれの発現系は、糖鎖修飾のさ二 群 目 に は 8 週 齢 時 の み（Neg/PDCoV 群）にれ方や大量培養の容易さなどの独自の特色を持つ。

PDCoV USA/IL/2014 株 10 TCID50/pig を経口投与

本研究では Pichia pastoris（メタノール酵母）に、した。初回接種後 7 日に各群 5 頭を安楽殺し、接種

ワクチン抗原としての PCV2 カプシドのキメラタン

後 42 日に全頭を安楽殺した。個体別に血清と直腸

パク質および免疫賦活剤としてのインターフェロン

スワブ、群ごとに糞便と口腔液を採材し、リアルタ

α（IFN – α）を発現させ、これを用いて 3 週齢豚に

イム PCR 法を用いて PDCoV ゲノム RNA を定量化

免疫および攻撃試験を実施した。

5

した。3 週齢時の接種後 7 日目の消化管は、病理学

P. pastoris によって発現させた PCV2 カプシドキ

的検査および PDCoV 特異的免疫染色に供した。血メラタンパク質の投与群、IFN – αとの混合投与群、中抗体価は中和試験によって測定した。

PCV2 カプシドタンパク質を投与した陽性対照群、

PDCoV を接種された 3 週齢の離乳豚は、感染後陰性対照群の 4 群を設定した。アジュバントには

4 〜 21 日にわたって、軽度の下痢を呈した。8 週齢

water – in – oil アジュバント（ISA 15A/ セピック社）

での接種後には、いずれの群も症状を呈さなかった。 を 8 対 2 で混合した。3 週齢時にワクチン抗原を
PDCoV/PDCoV 群の接種後 7 日に安楽殺した豚の2 mL 筋肉内投与し、その 3 週後に同様に追加投与

中・遠位空腸および回腸では、Neg/PDCoV 群に比した。攻撃は追加投与後 2 週に 1 × 104.75 TCID50/

べて腸絨毛の有意な萎縮が認められた。また、免疫mL の PCV2 液を 10 mL 経鼻接種した。攻撃後 4 週

染色では遠位空腸および回腸において、PDCoV 抗間にわたり臨床症状を観察し、血清中の PCV2 ゲノ

原が検出された。直腸スワブ、糞便および口腔液中ム量をリアルタイム PCR 法によって定量した。

63（3），2017

17（45）

攻撃後の試験期間中に臨床症状を発現した個体は観察されなかった。群間で体重に有意な差は認めらおわりにれなかった。初回投与後 1 日に全頭で体温が 40℃

日生研に入所して 1 年目にして、このような海外程度に上昇したが、翌日までに平熱に下がった。キ

の学会に参加する機会を得た。豚のワクチン開発のメラタンパク質投与群および IFN – αとの混合投与

道を駆け出したところであり、自身の勉強不足を感群では、攻撃後の血清中のウイルスゲノム DNA 量

じることもあったが、世界での養豚業界のスケール

が、陽性対照群と同様に、陰性対照群に比較して有の大きさに触れ、論文上の名前でしか知らなかった意に減少し、ウイルス血症を抑制した。しかし、キ先生方の発表を直接聞いたことは、今後もワクチン

メラタンパク質投与群と IFN – αとの混合投与群の分野からの豚病制御という道を邁進する決意をさら

間で成績に有意な差は認められなかったことから、に大きくする原動力となった。

本研究で作出した IFN – αは、免疫賦活剤として機本会の基調講演では、21 世紀にはいり、養豚規

能していないと考えられた。しかしながら、本研究

模の拡大とグローバル化に伴う人とモノの移動の拡で作出した P. pastoris 由来キメラタンパク質は、大、それによる世界規模での感染症の蔓延への懸念

PCV2 ワクチン抗原として有用であることが示されが述べられた。島国の日本といっても、他国で蔓延た。

している感染症が容易に侵入、蔓延し得る状況を実

近年、サブユニットワクチン、ベクターワクチン

感した。今後も起こりうる感染症の同時多発的流行および DNA ワクチンなどの新たな技術を用いたワに対応するためには、臨床の現場と研究開発の現場

クチンの研究開発や新規アジュバントの検討が盛んの間でより緊密に情報を共有し、現状に即した新薬である。新興・再興感染症や既存病原体の遺伝的多や情報をなるべく早く臨床現場に還元することが重様性に素早く対応し、効果が高いだけでなく、製造要であると感じた。そのためには、産官学がよりコストを抑えたワクチン供給のためには、このよういっそう連携し、新技術を積極的に導入した新薬開な新技術が積極的に活用されるとよいと感じた。

発、情報や技術を共有し運用できる環境作りを推し
進め、協力して防疫対策やワクチン開発、薬剤耐性

参考文献につきましては割愛させて頂きます。

菌対策にあたる努力が必要であると感じた。

学会発表演題（2016 年 10 月～ 2017 年 3 月）
●第 4 回 日本先進医工学ブタ研究会
会

期：2016 年 10 月 7 日〜 10 月 8 日

開 催 地：東レ総合研修センター（三島）発表演題：NIBS 系ミニブタにおける薬物代謝および体内動態○斉藤敏樹 1）、北条隆男 2）、藤原哲夫 1）、坂本裕二 1）
日生研、2）（株）
中外医科学研究所

1）●地球環境・食糧・資源のための植物バイオ第 160 委員会
会期：2016 年 10 月 19 日

開 催 地：大阪科学技術センター
発表演題：MucoRice – CTB を応用した豚大腸菌下痢症の経口ワクチン○竹山夏実（日生研）

日生研たより

18（46）● The 48th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians
会期：2017 年 2 月 25 日〜 2 月 28 日

開 催 地：Hyatt Regency Denver, America
発表演題：Adaptation of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） to Vero cells○ Tetsuo Sato, Kazuki Oroku, Aki Nagao, Yoshiaki Furuya, Osamu Taira, Nobuyuki Tsutsumi（Nippon Institute for Biological Science）●第 4 回 獣医病理学専門家協会学術集会スライドフォーラム
会期：2017 年 3 月 30 日〜 3 月 31 日

開 催 地：タワーホール船堀
発表演題：Leucocytozoon caulleryi のメガロシゾント形成による肉芽腫性胸腺炎○近内将記（日生研）

平成 29 年度定時評議員会開催
当研究所の平成 29 年度定時評議員会が、去る平成 29 年 6 月 16 日に開催され、平成 28 年度の事業報告及び決算報告が承認・可決されました。

研修者･見学者受け入れ状況 （平成 28 年 4 月から平成 29 年 3 月）
来所日・期間平成 28 年

平成 29 年

所属機関・人数

研修・見学内容

4 月 28 日

東京農工大学農学部

4名

施設見学

7 月 13 日～ 7 月 14 日

東京都立あきる野学園

1名

現場実習

8 月 15 日～ 8 月 25 日

株式会社ピグレッツ

1名

検査実習

8 月 25 日

麻布大学獣医学部

1名

施設見学

8 月 29 日

全農家畜衛生研究所

5名

施設見学

10 月 17 日～ 10 月 28 日

株式会社日本チャンキー

2名

検査実習

12 月 7 日

東京都立青峰学園

1名

現場実習

2 月 23 日

株式会社食環境衛生研究所

3名

施設見学

2 月 27 日～ 2 月 28 日

東京都立青峰学園

1名

現場実習

日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（年 4 回発行）

（通巻 604 号） 平成 29 年 6 月 25 日印刷
発行所〒 198–0024

生命の「共生・調和」を理念とし、生命体の豊かな明日と、研究の永続性を願う

平成 29 年 7 月 1 日発行（第 63 巻第 3 号）

一般財団法人 日本生物科学研究所
東京都青梅市新町 9 丁目 2221 番地の 1

TEL：0428（33）1520（企画学術部） FAX：0428（33）1036
http://nibs.lin.gr.jp/

気持ちを快いリズムに整え、視覚化したものです。カラーは生命の源、水を表す「青」としています。

編集室

表紙題字は故中村稕治博士の揮毫

印刷所

発行人

草薙公一

委

員／近内将記（委員長）、手島香保、小野浩輝

事務／企画学術部

株式会社 精案社（無断転載を禁ず）