博 士 （ 医 学 ） 村 田 洋 子

学位論文題名Death― associated protein3regulates
cellularsenescencethroughoxidativ
estressresponse(Death―assoclatedprotein3の細胞老化における機能解析）

学位論文内容の要旨【目的 】
DAP3(Death‑associated protein3）は インター フェロ ンァによる細胞死に関与する遺伝子として単離 ・同定 され， Hela細胞株 に強制 発現さ せると 細胞死を 誘導す ること が報告 されてきた．
また 最 近 ， DAP3が ミト コ ン ド リア に 主 に存在 するこ とが明 らかと なり， DAP3のミト コンド リ
ア代謝 におけ る機能 について もその 関与が 示唆さ れてい る．し かし， DAP3による アポトーシス
誘導ヌ カニズ ムもし くはミト コンド リア代謝における機能については不明な点が多い．一方，細胞老化 には種 々のス トレス応 答関連 遺伝子 が重要 な役割 を果た してい ること が明らかとなって
おり ， ア ポ 卜ー シス 関連遺 伝子は ストレ スを受け た後の 細胞の 運命(DeathorSenescence)を
決定づ けるの に重要 な役割を 果たし ていると考えられ，癌化からの逸脱という観点からもその関与が 注 目 さ れて い る ． そこ で ， 我 々は DAP3の 細胞老 化にお ける機 能を探 索する 目的で， 正常細胞 の 継 代 およ び ス ト レス 暴 露 に よる 細 胞老化 における DAP3の発 現変化 を観察 した．さ らにshRNAを 用 いた DAP3夕 ン バ ク の発 現 抑 制 がス 卜 レ ス 感受 性 お よ び細胞 老化に 及ぼす 影響に ついて検 討した ．
【結果 】
DAP3夕 ンバ ク は MRC5(正 常 細 胞） 継 代 に よる 細 胞 老 化で そ の 発 現が経 時的に 減少す ること が明ら か と な った ． ま た YMM/TERT細 胞を 用 い て Stress‑Induced Premature Senescence(SIPS)にお け る DAP3発 現 変化 を 検 討 した と こ ろ，過 酸化水 素刺激 でのみ 減少し ，同等 に細胞老 化を誘 導 す る UVも し く は gamma線 刺 激 で は DAP3は 減 少 し な か っ た ． DAP3は ミ ト コ ン ド リ ア
移 行 シ グ ナ ル を も っ が ， ミ 卜 コ ン ド 1」 ア に 加 え て 細 胞 質 で の 発 現 も 報 告 さ れ て い る，
YMM/TERT細 胞 を 分 画 し て 検 討 し た と こ ろ ， SIPSに お け る DAP3の減 少 は 主 にミ ト コ ン ドリ
ア画 分 で 観 察さ れた ．次に ，shRNAを用 いてDAP3の発現 減少（ノ ックダ ウン） が細胞 老化に 及ぽす影 響を検 討した ．Clonogenicsurvivalassayを用い て酸化ストレスに対する感受性を検討した と こ ろ ，DAP3をノ ッ ク ダ ウン し た NIH3T3細胞 は，酸 化スト レス耐 性カミ増 加して いることが明 らかと なった ．DAP3をノ ックダ ウンし た細胞 は，細胞 内ROS(活 性酸素 ）産生 が低下していた こ と か ら， ミト コンド リアに おける ROS産生を 低下さ せるこ とによル ストレ ス耐性 を増加さ せ た と 考 え ら れ た ． ま た 驚 い た こ と に ， DAP3を ノ ッ ク ダ ウ ン し た Mouse Embryonic
Fibroblastsでは，継代による細胞老化(
replicativesenescence)が誘導されないことが明らかとなった ．
【考察 ・結論 】
これら の結果 から， DAP3は細胞 の酸化 ストレ ス感受 性に関与 し，細 胞老化 の制御 に機能的な役
割を 果 た し てい る こ と が強 く 示 唆 され た ．アポ ト←シス 促進能 に加え てDAP3の 新たな機 能が明らか となっ た．
細胞 老 化 時 にDAP3が減 少 し て いる 事 実 と ，DAP3を ノ ッ ク ダウ ン し た 場合 に 細 胞 老化 が 回 避され る 事 実 は一 見 矛 盾 した 結 果 に 見え る ．細胞 老化時に おける DAP3の減 少はス トレス刺 激の結果 ， 細 胞 の保 護 機 構 とし て 酸 化 スト レ ス抵抗 性増加さ せるた めにDAP3が減少 したもの と考
えられ る．
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学位論文審査の要旨
主査 教授 上出利光
副査 教授 小野江和則
副査 教授 畠山鎮次

学位論文題名Death− associated protein3regulatescellularsen
esc
enceth
rou
ghoxi
dat
ivest
ressresponse(Death―assoclatedprotein3の細胞老化における機能解析）

Death‑assoc
iated protein3(DAP3)はインターフェロンッによる細胞死に関与する遺伝子として単離・同定され，Hela細胞株に強制発現させるとアポトーシスを誘導することが報告さ れてきた。

最近，DAP3が主にミトコンドリアに存在し、ミトコンドリア代謝への関与が 示唆されている。

更に、DAP3タンパク質の発現低下がミトコンドリアにおける呼吸能を低下させると報告された。

一方，細胞老化には種々のストレス応答関連遺伝子が重要な役割を果たしており，アポトーシス関連遺伝子はストレスを受けた後の細胞の運命(
DeathorSenescence)を決定づけるのに重要な役割を果たしていると考えられ，癌化からの逸脱という 観点からもその関与が注目されている。そこで，本研究ではD
AP3の細胞老化における機能 を探索する目的で，正常細胞の継代およびストレス暴躍による細胞老化におけるDA
P3の発 現変化を観察した。さらにDA
P3タンパクの発現抑制がストレス感受性および細胞老化に及ばす影響について検討した。
M
RC5(ヒト胎児肺正常繊維芽細胞）、HE1（ヒト胎児正常繊維芽細胞）及びMEF（マウス胚繊維芽細胞）の継代培養による細胞老化(replicativ
esenescence)
においてDA
P3の発現が減少し ていた。次にYMM/TER
T細胞を用いてSt
ress‑I
nduced P
rematureSenescence (SIPS)におけるDAP
3発現変化を検討したところ，過酸化水素刺激でのみ減少し，同等に細胞老化を誘導 する紫外線もしくはX
線刺激 ではD
AP3は減少しなかった。さらに，過酸化水素刺激後のDAP3 mRNAの 発現 変化 を定 量的 に検討したところ，mR
NAの発現量に変化が 認められなかったことから，DAP3のタンパク発現は翻訳後もしくはタンパク分解によって制御されていると考えられた。DAP3はミ卜コンドリア移行シグナルをもっが，ミトコンドリアに加えて細胞質で の 発現 も報 告さ れて いる 。YMM/TERT
細 胞を 分画 して 検討したところ， SIP
Sに茹ける
DAP3の減少は主にミトコンドリア画分で観察された。次に，DAP
3のノックダウンが細胞老化に及ばす影響を検討した。Clonogenicsu
rviv
ala8s
りを用いて酸化ストレスに対する感受性を 検討したところ，DAP3をノックダウンしたNI
H3T3
細胞は，酸化ストレス耐性が増加して391−

い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 DAP3の ノ ッ クダ ウン に加 え て外 来性 のDAP3を 発 現さ せた 実験
群に おいては酸化ストレス耐性 がコントローノレと同等にもどっていたころから，酸化ストレス耐性 の 増 加 は DAP3の タ ン パ ク 発 現 低 下 に 起 因す るこ とが 強 く示 唆さ れた 。

ま た， DAP3をノック ダウンした細胞は，細胞内 活性酸素産生が低下していた ことから，ミトコンドリアにおける活 性 酸素 産生 を低 下さ せ るこ とに よルストレス耐性を増加さ せたと考えられた。

また， DAP3を ノ ッ ク ダ ウ ンし たMEFで は， 継代 に よる 細胞 老化 が誘 導 され ない こと が明 ら かと なっ た。
発 表 に あ た り 、副 査の 小野 江 教授 から は、 rephcative senescenceとSIPSの 違 いや SIPSを誘導 す る刺 激と して の過 酸 化水 素、 紫外 線お よ ぴX線 の シグナ ルの違い等の質問がなされ、 更に副 査 の畠 山鎮 次教 授か ら は、 DAP3タンパク低下の機序および ヒトとマウスの細胞を使い分 けた理由 等の質問があった。

最後 に主査の上出教授より、細胞 老化の定義等の質問がなされたが、いず れの質問に対しても、申請 者は自己のデータおよび論文 を引用しつつ、適切な回答を行なった。
こ の論 文は 、DAP3が 、 細胞 の酸 化ストレス感受性に関与し ，細胞老化の制御に関与する ことを示 したもので、高く評価され 、今後、細胞内活性酸素が関 与する種々の疾患の予防や治療への応 用 が期 待さ れる 。審 査 員一 同は 、これらの成果を高く評価 し、大学院課程における研鑽 や取得単 位なども併せ申請者が博士 （医学）の学位を受けるのに充分は資格を有するものと判定した。

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