最先端の機器分析化学• 物質エネルギー化学専攻 山本 担当• 本日の講義で紹介すること
バイオと機器分析
・Ab-Ag 抗原ー抗体反応
・ELISA (Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay)
・FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
・SDS-PAGE
・Isoelectric Focusing・Western Blotting
・SPR (Surface Plasmon Resonance)
・DNA Chip
・Single molecule imaging
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• バイオ：絵で理解している人が多い。実験プロトコル
機器分析 keypoint
Blackbox （有機FT-NMR）
分析化学・生化学
物理・物理化学・有機化学・無機化学
電気電子工学・機械工学
要するに総合科学を基礎としている。
バイオと機器分析 ⇒ 学問的にもactive ⇒Spinoff 即ベンチャー2

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BSE [牛海綿状脳症(Bovine Spongiform Encephalopathy)]と機器分析化学

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ＢＳＥ：
全頭検査、見直し 「２０カ月以下、検出不能」−−専門調査会
国内のＢＳＥ（牛海綿状脳症）対策の見直しを検討する国の食品安全委員会プリオン
専門調査会（座長、吉川泰弘東 京大教授）は６日、「生後２０カ月以下では、ＢＳＥ感染牛を検出出来なかった」との報告書案を了承した。これを受け、厚生労働省や農林水産省は現在の全頭 検査を緩和し、生後２０カ月以下の牛を検査対象外にする方針だ。米
国産牛肉の輸入再開を巡る日米協議にも大きな影響を与えそうだ。
ＢＳＥの病原体が蓄積する特定危険部位の除去は、これまで通り全頭で続ける。
調査会は今年４月にＢＳＥ対策の見直しを始めた。７月には、全頭検査について「若い牛を検査対象から外しても、人に感染するリスクは増えない」とする報告書案をまとめたが、若い牛の月齢は示さなかった。
しかし、厚労省、農水省などが「きちんと月齢を明示してほしい」と要望、調査会は報告書案の修正を検討していた。その結果、全頭検査では最も若い感染例が生後２１カ月だったことを重視し、「生後２０カ月以下では検出困難」と結論づけた。
農水省は生後２１カ月の感染例から採取した異常プリオンの感染力を調べる実験中。
調査会は、実験結果がまとまったり、新しい検査法が開発された場合は、今回の線引きが妥当かどうかを改めて検討する。【江口一】毎日新聞 2004年9月6日 東京夕刊

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•

全頭検査によってＢＳＥ感染牛がすべて把握できるかというと、そうではない。
危険部位
一定蓄積濃度以上
今の検査技術では異常プリオンは危険部位に一定以上蓄積されないと検出されな い。専門家によると蓄積するスピードは遅く、感染牛の症状が表れるのは平均六十カ月。発症する六カ月前にならないと異常プリオンは検出されない。検査の結 果、異常プリオンが見つからなくても、ＢＳＥに感染していない保証はない。

•＜ＢＳＥ問題＞末梢神経から異常プリオン検出 動物衛生研
独立行政法人・動物衛生研究所プリオン病研究センターは１日、今年３月に見つかったＢＳＥ（牛海綿状脳症）感染死亡牛の末梢（まっしょう）神経繊維と副 腎から、感染原因物質の異常プリオンを世界で初めて検出したことを明らかにした。これら部位は食肉処理場で除去が義務づけられている特定危険部位ではない が、検出量は極めて微量で、政府は「すぐさま特定危険部位の範囲の見直しにつながるものではない」（農林水産省）としている。
仙台市で開かれた「プリオン病国際シンポジウム」で同センターが発表した。農水省に入った情報などによると、国内１１例目となった感染牛（生後９４カ 月）の各組織について、たんぱく質を電気的に分離して異常プリオンの存在を調べる「ウエスタンブロット法」で検査。
座骨神経や頚骨（けいこつ）神経の末梢 神経繊維などから異常プリオンが見つかったという。
現在、国内の食肉処理場で除去されている特定危険部位は、頭部▽脊髄（せきずい）▽脊柱▽小腸の一部――の４部分で、今回の確認部位は含まれていない。 農水省と厚生労働省は「蓄積量は脊髄などの１００分の１以下程度で、感染性はほとんどないとみている」と説明している。（毎日新聞） ２００４年11月
6プリオンは感染性をもつ？
----------------------------------------------------------正常プリオン蛋白（cellular PrP、PrPｃ）
分子量３３〜３５Ｋda
蛋白分解酵素感受性
αヘリックス(Helix) ４２％ βシート(Sheet)３％↓ 外部からのPrPcjd（PrPsc）の侵入↓ 偶発的変換↓ 遺伝子発現調節の異常
異常プリオン（scrapie PrP、PrPsc、PrPcjd、PrPres）
プロテネースＫによりＮ末端67AAが消化 → ２７〜３０Ｋda
蛋白分解酵素抵抗性
αヘリックス ３０％ βシート ４３％ → アミロイド様性質
一次構造（アミノ酸配列）は違わない
姫路工業大学 環境人間学部 北元先生
糖鎖付加、リン酸基の修飾も変化なし のホームページより
http://www.hept.himeji-tech.ac.jp/~kitamoto/Resources/prion.html↓二次構造（三次構造）が変化
αヘリックス→βシート・・・アミロイド変性↑
プロテアーゼＫ抵抗性↑
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難溶性、凝集性（プリオン・ロッド形成）

１次構造の決定法
タンパク質を配列決定できる長さ（４０〜６０残基）に酵素や試薬を用いて切断する．
一回目とは異なる位置でタンパク質を切断し，各断片のアミノ酸配列を決定する．
切断点の異なる断片の配列を比較し全体の配列を決定する．
タンパク質にフェニルイソチオシアネー
トを反応させると N 末端のアミノ基と結合する．これを酸で分解すると，N 末端のアミノ酸が 2-アニリノ-5-チアゾリノン誘導体として分離される．エドマン分解されたアミノ酸は，電気泳動やガス‐液体クロマトグラフィーにより，同定される．エドマン分解は４０〜６０残基までしか同定できない．それは分解の過程で副反応が起きたり，ペプチド結合が不必要な場所で切れたりするためである．

COOHCOOHCOO
H 89α-helix and β-sheet10正常プリオン（PrPｃ）には生理学機能がある！
-------------------------------------------------------------・PrPcにはなくてはならない生理的役目がある
・脳の学習、記憶・日内周期、睡眠周期の形成
・神経細胞（プルキンエ細胞）の長期生存維持
姫路工業大学 環境人間学部 北元先生のホームページより
http://www.hept.himeji-tech.ac.jp/~kitamoto/Resources/prion.html

11姫路工業大学 環境人間学部 北元先生のホームページより

異常プリオンは強い！
-------------------------------------------------------熱・・・100℃はもちろん120℃２気圧（オートクレイブ、あらゆる生物は死ぬ）でも耐熱性→180℃30分、133℃２気圧20分以上必要＊PrPｃは60〜70℃で変性
乾燥・・・130℃30では死なないホルマリン・・・数年生存
DNase、RNase、紫外線・・・抵抗性
蛋白分解酵素（プロテネースＫ、トリプシン）・・・抵抗性＊PrPｃは感受性・・・この違いは診断の際に利用される
蛋白変性剤(フェノール、尿素、塩酸グアニジン)・・感受性
次亜塩素酸ソーダ・・・１％、２時間 （２％、１時間以上）
次亜塩素酸ソーダ ＋ 苛性ソーダ ＋ 熱 → より効果的
ＳＤＳ・・・１％、10分
ギ酸・・・・80％、２時間

http://www.hept.himeji-tech.ac.jp/~kitamoto/Resources/prion.html

12狂牛病の診断 はどのようにされるの？
---------------------------------------------------------------------------------脳材料→乳剤にし→蛋白分解酵素（あるいはギ酸）で正常プリオンをこわす→（１）一次検査（スクリーニング：ふるい分け）■ＥＬＩＳＡ（エライザ）法（時に２回行う）
プレート上で特異抗体と反応させる→２次抗体を使い→発色剤で色をつける＊短時間に多量の検査可能。感度が 高いが特異性に欠ける（疑わしきはすべて罰する）（２）二次検査（精密検査）■ウエスタンブロッﾄ法 （電気泳動で蛋白を流し、抗体と反応させる。
分子量も分かるため特異的）■免疫組織化学染色法 （脳などの組織切片内のプリオンを抗体を用いて染め分ける）■病理組織学的検査法などの総合判定＊初めから精密検査ができればいいが、手間と時間とお金がかかるため多量の検査には 不向き

姫路工業大学 環境人間学部 北元先生のホームページより
http://www.hept.himeji-tech.ac.jp/~kitamoto/Resources/prion.html

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抗体 (Ab:antibody)

Ref:MBC

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15

EnBioTec Laboratories Co., Ltd16

ELISA （エライザ） （Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay)

触媒

非蛍光性

Jablonski diagram

蛍光性

Ref: Lakowicz, Principles of Fluorescene Spectroscopy

17西川、平木 蛍光・リン光分析法

鏡像、振動構造18

西川、平木 蛍光・リン光分析法

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エネルギー移動
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Donor – Acceptor :dipole-dipole interaction
Measure the D-A distance from 15 to 60 Å
Ref: Lakowicz, Principles of Fluorescene Spectroscopy

20Ref: Lakowicz, Principles of Fluorescene Spectroscopy(Aなし）• D-A distance =24.4 Å

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Ref:MBC

22可視光・色・補色•

Violet: 400 - 420 nm•Indigo: 420 - 440 nm•Blue: 440 - 490 nm•

Green: 490 - 570 nm•

Yellow: 570 - 585 nm•

Orange: 585 - 620 nm•

Red: 620 - 780 nm
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虹の色の覚え方
ROY-G -BIV
Richard ofRed

York gave battle inOrange Yellow Green BluevainIndigo Violet

あ たい き み を あい し
赤 橙 黄 緑 青 藍 紫

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クロロフィルの光吸収スペクトル６６０nm近辺の赤色光は光合成に有効
４５０nm附近の青色光は形態形成や光屈折性に有効

桜の生の葉の吸収スペクトル 25

GFP（Green Fluorescent Protein)
オワンクラゲ 1961 下村氏
９２年 遺伝子組み替えGFP

緑、黄、藍、青、赤26

Ref:MBC
MolecularWeight27

SDS（Sodium dodecyl Sulfate)
OH3COSO-Na+O

MercaptoethanolSHHO

28

Isoelectric focusing

Ref:MBC

Stable pH
gradient
Isoelectric point

29

30

31

pH gradient

Nitrocellulose paper(Blotting)

Antibody + FL dye
Mol weight

WesternBlotting32

SPR（surfaceplasmonresonance)

Ref:MBC33

SPR apparatus

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SPR principles
光による表面プラズモン（電荷密度波）の励起による共鳴

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Binary SAM on Au:
Surface Plasmon Resonance Sensor
DNA-Protein binding

Single strand DNA onAu (5nm thick): Proteins bind here

PEG Thiol on Au:
No Protein Adsorption

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Nelson BP, Frutos AG, Brockman JM, et al. ANALYTICAL CHEMISTRY 71 (18): 3928-3934 SEP 15 1999

SPRの詳細は• http://fm.ehcc.kyoto-u.ac.jp/japanese.htmlのSelf-Study Notes
1. 表面プラズモン共鳴:
Maxwell equations から----->
Electromagnetic Wave at Interface ----->SPR(surface plasmon resonance)
multilayer simulation まで(latex2html or pdf document) 29page37

DNA Chip

Ref:MBC38

柳田敏雄、「生物分子モータ：ゆらぎと生体機能」
岩波物理の世界39

１分子イメージング
エバネッセント波を利用する

柳田敏雄、「生物分子モータ：ゆらぎと生体機能」
岩波物理の世界40柳田敏雄、「生物分子モータ：ゆらぎと生体機能」
岩波物理の世界41

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Total internalreflection

Evanescent wave

100
wavelength

100

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・Ab-Ag・ELISA・FRET・SDS-PAGE
・Isoelectric Focusing・Western Blotting
・SPR
・DNA Chip・Single molecule imaging
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