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総 説

インターフェロンと亜鉛・メタロチオネイン
群馬大学大学院保健学研究科

要長嶺竹明

約

１．Ｃ型慢性肝炎のインタ－フェロン（IFN）治療において，亜鉛併用の有用性を報告してきた．亜鉛はＣ型肝炎ウイルスmRNA，蛋白発現を抑制するとの研究がある．そこで，U937細胞（ヒト白血病細胞）を用いて，IFNα/β受容体発現に及ぼす亜鉛の作用を検討した．その結果，亜鉛はIFN受容体mRNA，蛋白を誘導した．またポラプレジン（亜鉛とＬ-カルノシンの錯体）は，亜鉛単独よりもIFN受容体誘導作用が強かった．
２．亜鉛，IFNはメタロチオネイン（MT）を誘導するが，肝疾患におけるMTの生理的役割は未だ十分に解明されていない． 当教室で開発したMTELISA測定系は臨床検体（血清や尿など）のMT測定に応用可能であり，各種病態における亜鉛欠乏のスクリーニングに有用であろう．
３．大気マイクロPIXE法は単一細胞内微量元素分布が測定可能であり，細胞内における亜鉛動態の解明に有用である．我々はHepG２細胞（肝がん細胞）を用いて，IFNで誘導される亜鉛の細胞内分布をマイクロPIXEで測定した．IFNで細胞内へ取り込まれた亜鉛はブロムと一致する局在を認めることから細胞核内への移行が示唆された．

1．インタ−フェロンの抗ウイルス作用と亜鉛
1．インタ−フェロン（Interferon）とは？
インターフェロン（IFN）は動物体内でウイルスなどの侵入に反応して細胞が分泌する蛋白質でサイトカインの一種に属する．ヒトの IFN の型は３種類Ｉあり，その中で IFN- α，βは抗ウイルス薬（Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎）や抗腫瘍薬（腎癌，骨髄腫，白血病など）として臨床応用されている．

2．亜鉛の抗Ｃ型肝炎ウイルス作用

亜鉛によるＣ型肝炎ウイルス（HCV）増殖抑制については，湯浅らが HCV レプリコン細胞を用いた実験で報告している４）．その研究によると硫酸亜鉛 50μＭ，塩化亜鉛 100μＭ投与によって，
HCV の非構造蛋白（NS ３，NS ５Ｂ）発現および HCVmRNA replication が有意に抑制されている．

3．亜鉛の IFN 受容体誘導作用
我々は塩化亜鉛による IFNα/β受容体蛋白 ,mRNA の誘導実験を行った５）．
方法：Ｕ 937 細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞）
1x104 個を 37℃，5％ CO2 で培養．塩化亜鉛（０，我々は，Ｃ型慢性肝炎症例の IFN 治療におい50，100，200μＭ）添加し，24，48 時間後細胞をて，治療効果を向上させる目的で亜鉛併用療法を回収し遠心．一次抗体（抗 IFNα/β受容体抗体）行った１〜３）．

を 添 加 し，1 時 間 反 応． 遠 心 洗 浄 後，2 次 抗 体

18 ―― 亜鉛栄養治療4巻1号

201319FITC を添加し 1 時間反応．遠心，洗浄後，IFNレジンク（亜鉛換算 ０，50，100，150，200μＭ）

α/β受容体蛋白発現を FACS で測定した．同時を添加，さらに 12，24 時間培養．IFNα/β受容にトータル RNA を抽出し，cDNA を作成し増幅体蛋白発現を FACS で，IFNα/β受容体ｍRNA反応を行った．IFNα/β受容体 mRNA の定量は発現を real time PCR 法で測定した．また L- カreal time PCR 法で測定し，18S リボゾーム RNAルノシン（０，10 ，100，1000μｇ/mL）を添加，に対する比で表した．

24 時間後の IFNα/β受容体蛋白発現を測定した．

成績：①亜鉛投与 24 時間後，IFNα/β受容体蛋

成績：①ポラプレジンク投与 24 時間後，IFNα/白発現が増加することを確認した．亜鉛投与 48

β受容体蛋白は増強し，その発現誘導は塩化亜鉛

時間においても IFNα/β発現は経度増加していによる誘導より顕著であった．ポラプレジンク投た（図１）．

与 12 時間後では IFNα/β受容体蛋白の増加を認②亜鉛投与 24 時間後，IFNα/β受容体 mRNAめなかった（図３）．一方，L- カルノシン単独投はコントロールに比べ，約 1.３倍増加した．48与では IFNα/β受容体蛋白の発現増強を認めな

時間後では IFNα/β受容体 mRNA 発現はむしかった（図４）．

ろ抑制傾向であった（図２）．

ポラプレジンクによるインターフェロンα/β受容体蛋白の誘導

図4

L- カルノシンによるインターフェロンα/β受容体蛋白の誘導

ポラプレジンク投与 24 時間後，Zn 換算 100 ～次に，ポラプレジンク（亜鉛とＬ - カルノシンの錯体）による IFN α / β受容体蛋白 ,

図3mRNAの誘導実験を行った．

200μＭの濃度で IFNα/β受容体 mRNA 発現誘導を認めた．しかし，12 時間後では IFNα/β受容体 mRNA の誘導は明らかでなかった（図 5）．

4

方法：Ｕ 937 細胞 1 × 10 個を一晩培養．ポラプ

図1

塩化亜鉛によるインターフェロンα/β受容体蛋白の誘導

図2

塩化亜鉛によるインターフェロンα/β受容体蛋白の誘導

図5

ポラプレジンクによるインターフェロンα/β受容体 mRNA の誘導

20 ―― 亜鉛栄養治療

4巻1号

2013

21

2．Ｃ型慢性肝炎症例に対する IFN＋亜鉛併用療法

た．なお，ポラプレジンク併用の有無は主治医の判断にゆだねた．
効果判定：治療終了 24 週後に血清中 HCVRNAおよび肝機能検査を測定して，以下の判定基準に

1．難治性Ｃ型慢性肝炎に対するIFN α２ｂ＋ポラプレジンク併用療法の多施設間の検討（1996 年９月～ 1998 年５月）２）
対象：肝生検で診断した，Ｃ型慢性肝炎のうち，基づいた．

2．Ｃ型慢性肝炎に対するプロトコール：＊ IFNα10MU を４週間連日皮下注，その後 20

IFN α 2b ＋リバビリン併用における経口亜鉛製剤の Randomized＊亜鉛群：ポラプレジンク 150 ｍｇ（亜鉛 34 ｍ

HCVRNA（－）/AST，ALT 正常：Complete

対 象； 群 馬 大 学 お よ び 関 連 施 設 に お い てResponder(CR)Genotype １b，かつ HCVRNA100kIU/ml 以上の成績：亜鉛投与による効果は，HCVRNA100 ～HCVRNA（＋）/AST，ALT 正常：Incomplete

Ｃ型慢性肝炎 102 症例を，封筒法で無作為に亜鉛499ｋIU ／ｍｌや，治療開始１～４週後においてResponder (IR)投与の有無を割り付けた．

ウイルス消失率がやや高かったが，有意差は無く，NR，CR 以外：Nonresponder (NR)

亜鉛併用群では非併用群間に比べ女性の比率が成績：CR 率は INF 単独群 11.1％，IFN ＋亜鉛併有意に高率であったが，それ以外は両群間の背景上の 68 症例．IFN 単独群と IFN ＋亜鉛併用群間用群 37.5％となり，両群間で有意差を認めた．ま

因子に差異はなかった（表２）．

で，背景因子に有意差を認めなかった（表１）．

た，CR ＋ IR 率も IFN ＋亜鉛併用群で有意に高方法：IFNα10MU を４週間連続皮下注，その後率 で あ っ た． と り わ け ウ イ ル ス 量 100 ～ 500

24 週まで週３回投与した．ポラプレジンクは 1kcopies/ml の症例で有効であった（図６）．

日 150 ｍｇ（亜鉛 34 ｍｇ）（分２）の経口投与としentryage(y.o)
gendermalefemale
histology
CAH2A
CAH2B
unknownserum ALT level(IU/ml)
serum AST level(IU/ml)
serum zinc level(μg/dl)

Comparison of clinical data in HCV patients

IFN+Zn group3247.7 ± 11.1
1913265
166.4 ± 31.7
65.9 ± 40.3
84.1 ± 19.8

＊リバビリン 600 ～ 800 ｍｇ／日（経口，分２）（2002 年１月～ 2003 年 12 月）３）

Genotype １ｂ，かつ HCVRNA100kcopies/ml 以

表1

週間，週３回皮下注

study

IFN group
3650.1 ± 9.6
261025110
79.0 ± 76.6
76.5 ± 65.9
75.4 ± 21.3

n.sn.sn.s

表2ｇ含有）／日（経口，分２）

全体でも著効率は 33.3％と対照群と同率であった（図７）．
治療前の血中亜鉛濃度が 67μｇ／ｄｌ以上の症例

Comparison of clinical data of chronic hepatitis C in two treatment groups
Zinc group24/26
57 ± 2323.5 ± 3.1
34/15(31%)

Control
38/14
53.8 ± 9.8
23.4 ± 2.1
40/11(22%)

700(100 〜 1490)
95.6 ± 61.1
73.3 ± 20.3

720(110 〜 2310)
97.4 ± 59.869.8 ± 17.2

3/12/23/10/1
26/20/2

1/20/15/13/1
20/24/5

Male/female
AgeBMI(kg/m2)Naïve/Retreatment
Biochemistry
HCV RNA(kcopy/ml)
ALT(U/I)
Serum Zn(μg/dl)
Histology
F 0/1/2/3/4
A 1/2/3

n.s
n.s
n.s
N.S.:not significant

図6

C 型慢性肝炎における亜鉛併用療法の成績

図7

Response rate

22 ―― 亜鉛栄養治療4巻1号

2013

23に限ると亜鉛投与群は有意差をもって著効率が高かった（表３）．

2．IFN よる MT １/ ２誘導と亜鉛

副作用においても亜鉛投与において問題は無ラットを使用した実験で，IFN は亜鉛を肝臓く，むしろ消化器症状の改善も期待できる結果で内に取り込むことによって，MT を誘導することあった．

が報告されている．そこで我々は培養肝細胞を使用して，IFN による MT1/2 誘導における亜鉛の果たす役割について検討した７）．

3．メタロチオネインと亜鉛

方法：TRL1215 細胞（ラット正常肝細胞）を培養．
コンフルエントに達した後，培養液中に亜鉛 100

1．メタロチオネインとはμＭ，IFNα/β100 Ｕ／ｍｌ＋ 亜 鉛 100μＭ添 加，メタロチオネイン（MT）は，熱に安定な低分

24 時間後に MT1/2 発現を免疫染色で検討した．

子量（6000 ～ 7000）タンパク質である．MT はまた細胞を回収し，ホモゲナイズした後，亜鉛濃61 ～ 68 のアミノ酸で構成されており，その約度を原子吸光法で測定した．

30％をシスティンが占め，芳香族アミノ酸を含ま

成績 : 亜鉛単独投与によって，MT 発現は無添加ず，重金属 (Cd，Zn，Cu など ) と高い結合性を群（コントロール）に比べ増強するが，IFN ＋持つ．哺乳類の MT は 4 種類のアイソフォーム

亜鉛では MT 発現は更に顕著であった（図８）．

が報告されているが，MT1 と 2 は主要なアイソ

肝細胞内亜鉛濃度は IFN ＋亜鉛群＞亜鉛群＞フォームであり，さらにいくつかのサブフォームを形成して，殆どすべての臓器中に存在している．
MT3 は主として脳に局在し，他臓器での mRNAの発現は少なく，MT4 は分化型の扁平上皮細胞６）に特異的に存在することが報告されている ．

図8

亜鉛，インターフェロンαによるメタロチオネイン誘導：TRL1215 細胞コントロールの順に高値を示した．

3．各種肝疾患における MT １/2 の代謝
我々は，新たに MT の ELISA 測定系を開発したが，その検出感度は５～ 1000ng/ml と高感度MT の生理活性は，①重金属の解毒作用，②ラであり，臨床検体の MT 濃度測定に応用可能でジカル除去作用，③細胞増殖，分化の制御，④金ある．本測定系の特異性を確認するため，各種亜属（亜鉛，銅など）の代謝，など多岐にわたる．

鉛濃度で飼育したラットの血中 MT 濃度を測定

ＭＴを誘導する物質として，亜鉛，カドミウム，した．その結果，MT 濃度は飼料中亜鉛濃度に従

グルココルチコイド，活性酸素，TNFα，IL６ない上昇を認めたことから，本 MT 測定系の特異どが知られている．

性が確認された（図９）．

図9亜鉛摂取量の違いによるラット血漿 MT1/2 濃度

そこで，各種肝疾患症例の血清中 MT 濃度を測定した（図 10）．
表3

Comparison of clinical data of chronic hepatitis C in two treatment groups(serum Zn ≧ 67)

Male/female
Age
BMI(kg/m2)
HCV RNA(kcopy/ml)
100 〜 199
200 〜 499
500 〜ALT(U/I)
Serum Zn(μg/dl)
Histology
F 0 〜 1/2 〜 4Zinc group10/951(38 〜 66)
24(20 〜 29)
480(100 〜 850)
37974(31 〜 196)
79(67 〜 146)

Control
12/559(40 〜 70)
24(20 〜 30)
740(110 〜 850)
44999(29 〜 331)
78(68 〜 127)

4/14

5/11n.sn.sn.sn.sn.sn.sn.s
N.S.:not significant

図 10

健常人，各種肝疾患症例の血清 MT1/2 値

24 ―― 亜鉛栄養治療

4巻1号

2013

25

Wilson 病は最も高く，次いで自己免疫性肝炎胞（５× 10 ５ 細胞数／ｍｌ）をマイラー膜上で一で高値を呈した．
一方，
Ｃ型慢性肝炎は低値であっ晩培養．BrdU（細胞核のマーカー）100μＭ添加た．Ｃ型慢性肝炎症例の治療効果別に MT 濃度したメデイウムと交換し，24 時間培養．亜鉛 100を判定してみると，IFN で治癒した４例中３例

μＭ，IFN50（又は 100） Ｕ／ｍｌ，亜鉛 100μＭ＋は正常範囲（27 ～ 50ng/ml）であり，未治療症

IFN50（又は 100） Ｕ／ｍｌの入ったメデイウムと例は 44％が正常値以下であり，正常上限を超え交換し，さらに６時間培養．

た症例は 1 例もなかった．
肝臓癌の MT 値は低値から高値までばらばら細胞を洗浄し，凍結乾燥後，ホルダーに固定（図12）し，PIXE 装置で測定．

であり，今後症例数を増やして更なる検討が必要

成績：コントロール（無添加）や IFN 単独投与である．

群では亜鉛のＸ線スペクトルの検出は軽度である

4．亜鉛研究における大気マイクロPIXE の導入
1．大気マイクロ PIXE 分析システムとはが，亜鉛群や IFN ＋亜鉛群では亜鉛のＸ線スペクトルが増強している（図 13）．
細胞内の亜鉛の分布をみるとリン（Ｐ）の分布

大気 microPIXE

試料：HepG2 cellsとほぼ一致しており，核内への取り込みが示唆される（図 14）．次に，亜鉛と Br の細胞内分布をイ オ ン マ イ ク ロ ビ ー ム と Particle-induced示す．亜鉛は Br と一致して局在したり，あるい

X-ray emission（PIXE）法の組み合わせによるは単独でバラバラに細胞内分布する像を認める．

高感度，高空間分解（１μｍ）元素分析システム

IFN で誘導される亜鉛の一部は細胞核内へ移動である．特徴としては，①薄膜を使用し，大気中する可能性が示唆される（図 15）．

での分析が可能である，②単一細胞内微量元素分

以 上 の 成 績 か ら， 我 々 は IFN で 誘 導 さ れ る

布測定ができる，③凍結乾燥法による試料調節がMT 代謝に関する仮説を想定している（図 16）．

可能であることから，生きた状態の細胞を反映す

IFN は肝細胞膜の Zip を誘導し，血清中亜鉛を細るなどである．図 11 に日本原子力研究開発機構

胞内へ取り込み，MT を誘導して，MT のチオー

高崎量子応用研究所の大気マイクロ PIXE 測定装ル残基と結合する．細胞周期がＳ期になると MT置を供覧する．

は 核 内 へ 移 動 し， 遊 離 し た Zn を Zn-Finger

2．IFN による細胞内亜鉛の誘導７）

図 12protein に供給する．また NFκB などの転写因子への関与も想像される．

図 13

X 線スペクトルム：HepG2 細胞

図 14

細胞内元素分布：HepG2 細胞

大気マイクロ PIXE 用試料の作成：HepG2 細

図 11

大気マイクロ PIXE 分析装置−日本原子力研究開発機構

高崎量子応用研究所−

26 ―― 亜鉛栄養治療

4巻1号

201327◆ Abstract
We have reported the beneficial

図 15

IFN50 IU/ml+Zn100μM 投与後の細胞内 Zn，Br の分布

effect of combined

metals, radical scavenger, and modulation of celltherapy with interferon (IFN) and zinc for chronic

proliferation, but the physiological role of MT in liver

hepatitis C patients.

diseases is not clarified yet. We have establishedPreviously, anti-viral effect of zinc for hepatitis C

ELISA method for MT assay; this assay is veryvirus (HCV) was reported, in which zinc suppressedsensitive enough to determine MT levels in clinical

HCV replication and HCV protein. We havesample of serum and urine. Using this assay, we areevaluated zinc effect on IFNα/β receptor

planning to evaluate the latent zinc deficiency inexpression using U937 cells. Our study showed thatvarious diseases.

zinc mildly induced mRNA and protein of IFNα/β

3.

receptor. In addition, polaprezinc ( combined withdistribution of intracellular trace element, and iszinc and L-carnosine) moderately increased IFNα/useful for the research on the intracellular zinc

β receptor levels, whereas IFNα/β receptor waskinetics. We analyzed the zinc distribution within

not induced by L-carnosine alone.

HepG2 cells after IFN dosing using micro PIXE

2. It is well known that metallothionein (MT) is ｒａｐｉｄｄｌｙsystem. Zinc was localized with Br, suggesting that

increased by zinc and IFN. MT exerts manyzinc was moved into nucleus.

In-air micro PIXE method can detect thebiological activities such as detox city for heavy◆長嶺竹明略歴昭和 51 年

群馬大学医学部卒業
群馬大学医学部第一内科入局

図 16
◆文

Possible mechanism underlying interferon-induced metallothionein

献 ― ――――――――
5）Nagamine T, Nakajima K, Takada H, et al:

Preliminary study of combination therapy with

Induction of type 1 interferon receptor by zinc ininterferon-α and zinc in chronic hepatitis CU937 cells. Cytokine 46: 345, 200975: 53, 2000
2）Takagi H, Nagamine T, Abe T, et al: Zinc6）Cherian MG, Jayasurya A, Bay BH: Metallothioneinsin human tumors and potential roles in carcinogenesis.
Mutat Res. 533: 201, 2003

supplementation enhances the response to7）Nagamine T, Kusakabe T, Takada H, et al:interferon therapy in patients with chronic

Interferonβ-induced changes in metallothionein

hepatitis C. J Viral Hepatitis 8: 367, 2001

expression and subsellular distribution of zinc in3）Suzuki H, Sato K, Takagi H, et al: Randomized
controlled trial of consensus interferon with orwithout zinc for chronic hepatitis C patients withgentype 2 World J Gastroenterol 12: 945, 2006
4）Yuasa K, Naganuma A, Sato K, et al: Zinc is anegative regulator of hepatitis C virus RNA
replication. Liver Int. 26: 1111, 2006

群馬大学医学部第一内科助手

平成６年

群馬大学医学部第一内科講師

平成８年

米国 NIH, National Cancer Institute 研究員

平成 10 年

群馬大学医学部保健学科教授

平成 23 年

群馬大学大学院保健学研究科教授〜現在に至る1）Nagamine T, Takagi H, Takayama H, et al:patients with genotype 1b. Biol Trace Element Res

昭和 63 年

HepG2 cells: Cytokine 34: 312, 2006