LIFE2013

OS3-2-2

2013 年 9 月 2 日－4 日 山梨 (山梨大学)

複合低エネルギ生体組織接合に関する研究－加圧熱によるコラーゲンフィブリルの幾何学的形状変化の検討－
Integrated low energy adhesion technique for living tissue- The change of collagens' geometric structures with heating and pressing○諏訪陽祐（茨城大）
南広祐

増澤徹（茨城大)(医科歯科大) 木村剛(医科歯科大) 岸田晶夫

(医科歯科大)Yosuke SUWA, Ibaraki University, 4-12-1 Nakanarusawa, Hitachi, Ibaraki
Toru MASUZAWA, Ibaraki University
Nawangwoo NAM, Tsuyoshi KIMURA, Akio KISHIDA, Tokyo medical and Dental University
Abstract: We have developed a method that allows biological tissues to adhere together with minimal invasion bydelivering integrated low-level energies such as heat, pressure, and vibration. The adhesion mechanism was investigatedby observing collagen fibril's change under the influence of heat by atomic force microscopy. When collagen fibrils weretreated with heat at temperature of 1200 C in dehydrated environment, some collagen fibrils with 1000 nm were imaged.
The results indicated that application of heat leads to aggregate collagen fibrils in dehydrated environment. Whenapplication of pressure of 2.5 MPa was applied on a specimen of a porcine aorta, the mean dewatering ratio was 53.0%.
This results indicated that the environment around the collagen fibers got close to dehydrated condition with theapplication of pressure. So we think that simultaneous application of heat and pressure on biological tissues lead to thecollagen fibers' aggregation and to adhere biological tissues together tenaciously.
Key Words: Integrated low energy adhesion technique, Collagen fibril
1. 緒言
外科手術において、血管の接合や止血は従来、縫合糸、電気メス、超音波メスによって行われてきた。しかし、縫合糸による縫合は習得が難しく、手術時間が外科医の能力に左右される。また、電気メスや超音波メスによる接合は生体組織を炭化させてしまうという問題があった。
そこで我々は電気メスなどエネルギに比べて、低いエネルギである熱、圧力、振動を複合して生体組織に与えることでそれらを低損傷で強固に接合できる複合低エネルギ生体組織接合技術の開発を行っている(図 1)。本技術は生体組織同士の接合だけでなく、脱血管と心臓の接合のような、金属と生体組織の接合にも応用可能である (1。しかし、本接合原理は生体組織の構成タンパク質であるコラーゲンの変性によるものと推定されるだけで、十分に解明されていない。そこで本研究では、接合原理解明のため、熱によるコラーゲンの形態学的変化、加圧前後の生体組織内に含まれる水分の変化を検討したので報告する。
Pressure
HeatCoagulation

Vibration
Collagen fibers

Pressure
Denaturation

Fig.1 Adhesion mechanism

後のコラーゲンフィブリルの形状にどのように影響するのか検討するため、生成したコラーゲンフィブリルをオーブ
ン内で空気中加熱および、ウォータバス内で水中加熱し、加熱後の形状を原子間力顕微鏡を用いて観察した。加熱時間は 30 分、加熱温度は空気中加熱で 370C、450C、630C、800C、1200C、水中加熱で 370C、450C、630C、800C、1000Cとした。
2.2 豚の大動脈の加圧実験
一般にコラーゲン線維は含まれる水分量によって変性温度が異なり、水中では 650C 付近で変性すると報告されている。生体組織内のコラーゲン線維が変性し、完全にゼラチン化すると、強い結合は望めないと考える。しかし本接合技術をもちいて生体組織同士を接合する場合、接合部分に含まれる水分量は加圧により減少すると考える。そこで加圧による生 体組織 の脱水を 脱水 率 R=(M 1-M 2)/(M 1-M 3)×100[%]を計算することで評価した。ここで、M 1 は加圧前の生体組織の質量、M 2 は加圧後の生体組織の質量、M 3 は凍結乾燥後の生体組織の質量である。
試験片には、長さ 4 mm、幅 1 mm、厚さ 0.5 mm に切り分けた豚の大動脈の内皮を用いた。試験片の加圧は図 2 に示す加圧装置を用いて行った。加圧装置はリニアスライダ機構、重り、および試験片と接触する加圧部から構成されており、試験体を垂直に加圧することができる。加圧の大きさは重りで調節し、2.5MPa に設定した。

2. 方法
2.1 コラーゲンフィブリルの熱変性実験
ネイティブコラーゲンをリン酸緩衝生理食塩水に加え、撹拌し、その溶液をセルデスク上に滴下した。その後環境温度を 250C に維持し、ネイティブコラーゲンを再線維化させ、セルデスク上にコーティングした。
コラーゲンフィブリルに含まれる水分量の違いが、加熱

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Linear slider
mechanism
WeightContact area
Specimen

Fig.2 Experimental setup

2013 年 9 月 2 日－4 日 山梨 (山梨大学)

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ンフィブリルの線維構造を確認することができたが、800C以上になるとその構造をを確認することができなかった。
3.2 豚の大動脈の加圧実験
図 6 に、ブタ大動脈内皮の加圧による脱水率を示す。脱水率の最大、最小、平均、標準偏差はそれぞれ、89%、31%、53%、16%であった。

Dewatering ratio[%]

3. 結果
3.1 コラーゲンフィブリルの熱変性実験
図 3 は熱処理前のコラーゲンフィブリルである。一般にコラーゲンフィブリルには軸方向に幅 67 nm から 69 nmの周期的なバンドルが存在し、図 2 においてもそのバンドルを確認することができた。またコラーゲンフィブリルはその直径が大きいほど機械的強度が高いことが知られているが、計測したコラーゲンフィブリルの平均直径は278nm(N=87) であった。

1μm

10090807060504030201001Fig.3 Untreated collagen fibril

2345678910 11Sample numberFig.6 Dewatering ratio of the specimens caused byapplication of pressure

1μm1μm
37℃

1μm
45℃

63℃

4. 考察
4.1 コラーゲンフィブリルの熱変性実験
800C 以上の空気加熱でバンドル構造有したコラーゲンフィブリルの凝集体を確認した。よって本接合技術において、加熱は生体組織間のコラーゲン線維を凝集させ、それらの接合に関与している可能性が示唆された。一方で、800Cのサンプルには凝集した個所が存在したにもかかわらず、450C のサンプルよりも細いコラーゲンフィブリルの割合が高かった。これは生成時のサンプルのばらつきが影響していると考える。今後このばらつきを考慮した新しい評価方法を考案する。
800C 以上の水中加熱でコラーゲンフィブリルは消失した。この現象はコラーゲンフィブリルが完全にゼラチン化し、原子間力顕微鏡で画像化できないほど軟らかくなったため生じたと考える。以上から本接合技術では、生体組織内の水分量を減らすことで、加熱によるコラーゲン線維の凝集が促進され強固に接合できると考える。

1μm

1μm
80℃

120℃

(a) Collagen fibril after heating for 30min
Distribution of collagen
fibril's diameters [%]0～300nm300～600nm

600～900nm

900～1200nm

100908070605040302010037℃

45℃

63℃

80℃

120℃

Heating temperature [0C](b)The distribution of collagen fibril's diameters and thenumber of collagen fibril at heating temperatures
Fig. 4 Collagen fibril heated in dehydrated environment

1μm

1μm
37℃

1μm
45℃

1μm
63℃

80℃

4.2 豚の大動脈の加圧実験
2.5MPa の加圧で生体組織内の水分のおよそ 53%が脱水された。よって本技術を用いて接合する場合、コラーゲン線維は空気中加熱と水中加熱の両方の状態を有していると考える。その中でも空気中加熱時に見られたコラーゲン線維の凝集が本接合原理に寄与している可能性が高い。今後、コラーゲン線維の加圧熱に対する形状変化を評価していく。

1μm
100℃

Fig.5 Collagen fibril heated after heating for 30 min in
hydrated environment
図 4(a)にオーブン中で 30 分間空気中加熱した後のコラーゲンフィブリルを示す。加熱温度が 800C 以上の時、コラーゲンフィブリル同士の凝集を確認した。特に 1200C の時には直径が 1000nm を超えるコラーゲンフィブリルも存在した。また、凝集後のコラーゲンフィブリルにもバンドル構造は存在した。
図 4(b)に加熱温度ごとのコラーゲンフィブリルの直径の分布を示す。コラーゲンフィブリルの直径は、加熱温度が1200C の場合、300nm 以上が約 75%を占めていたのに対し、800C の場合には約 20%であった。また、加熱温度が 450Cと水中での変性温度より低い場合でも、コラーゲンフィブリルの直径は 300nm 以上が約 70%を占めていた。
図 5 にウォータバス中で 30 分間水中加熱した後のコラーゲンフィブリルを示す。加熱温度が 630C 以下ではコラーゲ

5. 結言
本接合技術の接合原理解明のため、生体組織の構成タンパク質であるコラーゲンの熱に対する形態学的変化の観察、および加圧による生体組織の脱水率を評価した。本接合原
理には、加熱によるコラーゲン線維の凝集、および加圧による生体組織内の水分の脱水が関与している可能性があることが分かった。今後は実際の接合時間に近い1分間で、コラーゲンフィブリルの加熱、加圧熱実験を行っていく。
References[1] A Katho, T Masuzawa, K Oseki, A Kishida, T Kimura, andTHigami; "Development of tissue adhesion method using
integrated low-level energies", Medical Engineering &Physics,Vol.32, Issue.4 pp.304-311(2010)

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