12 ―― 亜鉛栄養治療研究

8巻1号

2017

13

亜鉛検出用蛍光プローブの開発とその応用

（a）

Zn2+
Zn2+

長崎大学大学院医歯薬学総合研究科医薬品情報学分野１）長崎大学病院臨床研究センター２）
神戸薬科大学薬品物理化学研究室３）京都大学大学院薬学研究科病態機能分析学分野４）

萩森政頼１）水山奈央子２）小川昂輝１）川上茂１）向高弘３）佐治英郎４）

（b）
Zn2+

要

Zn2+

約

ピリジン‒ピリドン型
蛍光プローブ１亜鉛は重要な生体機能に関与することから，その動態や機能の解明が望まれている．近年，生体内亜鉛イオンの可視化を目的に，様々な亜鉛蛍光プローブが報告されているが，蛍光を発図１

する蛍光団と亜鉛イオンとの反応部位が２つの部分から成ることから分子量が大きくなり，そ低分子量亜鉛蛍光プローブの設計の結果，溶解性や細胞膜透過性が悪くなることが問題となっている．我々は，蛍光団と亜鉛イオンとの反応部位の２つの機能を併せ持つ分子骨格（ピリジン - ピリドン）を見出し，低分子量り，d 軌道が閉殻構造（3d104s0）をとっているため，上で必要な条件である溶解性や細胞膜透過性に影化により，高い細胞膜透過性が期待できる亜鉛蛍光プローブの開発に成功した．また，官能基他の遷移元素のように，色や吸収スペクトルの変響を及ぼすことが考えられる．特に，分子量がを検討することにより，蛍光のオン - オフ機能や亜鉛イオンへの親和性を高める分子設計が可化から亜鉛の反応の追跡，構造予測を行うことは500 以上の化合物は細胞膜透過性が悪くなること能であることを明らかにした．さらに，開発した亜鉛蛍光プローブを用いて，細胞内の遊離亜困難である．そのため，亜鉛と選択的に反応し，が懸念される14）．この点を考慮し，筆者らは，蛍蛍光強度や蛍光波長が変化する蛍光プローブの開光プローブの低分子量化を目指した分子設計を行鉛イオンの検出や組織透明化法への応用を行った．

7,8）

発が活発に行われている ．TSQ は，亜鉛蛍光い，ピリジン環を有する化合物群のスクリーニンプローブとして初めて報告された蛍光プローブでグから15-21），蛍光団と Zn2+反応部位の機能を持つあり，水には難溶性のため，脳や膵ランゲルハンピリジン－ピリドン型蛍光プローブ１を見出し，

ス 島 の 組 織 切 片 の 染 色 に 用 い ら れ て い る9,10）．

分子量の大きな低減化（分子量：324）に成功したの動態や機能に関して不明な部分が多く，それら

Zinquin ethyl ester は，TSQ を改良して細胞膜（図１）22）．の解明が望まれている．生物が生きている状態で透過性を付与した蛍光プローブであり，細胞内亜亜鉛は，生体内において遺伝子発現，酵素触媒生体分子を可視化できるイメージング測定は，対鉛の検出に用いることが可能である11,12）．ZP3 は，作用，免疫システム，神経伝達等に関与すること象を非侵襲的に解析することが可能であり，亜鉛フルオレセインをベースにした蛍光プローブであピリジン－ピリドン型蛍光プローブ１においが示唆されており，その機能に注目が集まっていの動態や機能の解明においても非常に有用な方法

り，海馬における亜鉛の検出に成功している13）．て，Zn2+濃度依存的に，490nmの蛍光強度が増大

る1-3）．細胞内において，亜鉛のほとんどはタンパとなることが期待される6）．本稿では，亜鉛の動

しかし，ZP3 のバックグラウンド蛍光が強く，細し，Zn2+との錯体形成比率は１：１を示したこと

ク質と結合しており，タンパク質の構造の保持，態や機能の視覚的な解析を可能にする亜鉛検出蛍胞膜透過性がやや悪い．これらの亜鉛蛍光プローから，Zn2+に対する結合解離定数（K d ）は 7μM と酵素活性の制御等に関わっている1）．また，亜鉛

光プローブの開発と応用について，我々の研究成

ブは，分子構造において，いずれも蛍光を発する算出された22）．また，適度な水溶性を示し，非常2+蛍光団と亜鉛イオン（Zn ）との錯体を形成する反に大きなストークスシフト（124 nm）を示したこ

応部分がスペーサーによって繋がれた構造をしてとから，励起光の影響を受けにくく，高感度測定

KEY WORDS

蛍光プローブ，イメージング，亜鉛イオン，低分子量，細胞膜透過性

はじめには，非常に低濃度（ピコモルオーダー）であるが遊果を紹介したい．

離状態でも存在しており，中枢神経系においては，哺乳類の海馬におけるグルタミン酸作動性神経終末のシナプス小胞内に局在してセカンドメッセンジャーとして機能する等，生体内において重要な役割を担っている4,5）．このように，生体における亜鉛の役割が報告される一方で，依然として亜鉛

１．亜鉛蛍光プローブの開発
a. 低分子量亜鉛蛍光プローブ
亜鉛は周期表の第 12 族に属する金属元素であ2+b. 精密分子設計による亜鉛蛍光プローブの開発いる．そのため，様々な蛍光団と Zn 反応部位の可能性が期待された．しかしながら，バックグを選択することよって，多様な性質を示す蛍光プラウンド蛍光が比較的高いことから，バックグラローブの開発が可能である．その一方で，蛍光団ウンド蛍光を可能な限り小さくし，Zn2+と結合しと Zn2+反応部位の２つの部分から成ることからたときだけ強い蛍光を発するオン－オフ型蛍光プ

分子量が大きくなるため，生体内亜鉛を検出するローブを開発することにした．

14 ―― 亜鉛栄養治療8巻1号

201715R:No.

3

図２(nm)(nm)(nm)( Zn(II) / free)

図３

ピリドン環の 3 位の官能基の検討				ピリジン－ピリドン骨格への官能基の検討を行っ

Zn2+との錯体形成部位の互変異性化を抑えた亜鉛たところ，ピリドン環の３位での電子密度の変化が蛍光プローブとして，第一級アミンまたは第二級蛍光強度に大きく変化することがわかった23, 24）．特アミンの導入によりビピリジン型とした誘導体をに，トリフルオロメチル基のような強い電子求引設計・合成したところ，溶解性や大きなストーク性の官能基を導入した化合物５においては，蛍光ヒト肺がん由来細胞（A549）におけるアポトーシス誘導後の細胞内遊離 Zn2+の検出

2+スシフト等の性質は保持したままで，Zn に対す		

おいて，ビピリジン型亜鉛蛍光プローブ 7 を用い2+の結果，脳の神経細胞の細胞体では蛍光が見られて内在性の Zn を検出できるか検討を行ったとず，細胞体から伸びた神経終末付近において蛍光発現部位への電子の移動が抑えられるためバックる親和性はnMレベルまでに向上した ．第一級

ころ，過酸化水素処理したがん細胞でのみ蛍光のが観察された．脳内において，Zn2+はグルタミングラウンド蛍光がほぼ消失した．一方，Zn2+添加アミンを導入した化合物７においては，Zn2+との増強が認められた．また，亜鉛キレート剤である酸作動性神経終末の小胞に存在し，そこから放出時においては，蛍光発現部位への電子の移動が回錯体形成後の蛍光波長は 40 nm 程度長波長側にTPEN（N,N,N',N' -tetrakis（ 2-pyridylmethyl）されることが明らかとなっており，本結果はこれシフトし，波長変化型蛍光プローブとしての性質ethylenediamine）の処理によって細胞内の蛍光がと一致するものであった．しかしながら，亜鉛蛍2+消失したことから，開発した蛍光プローブは細胞

光プローブの組織透明化法への応用としては途上2+復することから，Zn 存在／非存在下での蛍光量
子 収 率 の 比（ΦZn(II) ／Φfree）は 23 倍 に 増 強 し た．

25）（a）ビピリジン型プローブ 7 のみを加えた細胞（b）100μM H2O2 を加えて 25 時間インキュベートしてアポトーシスを誘導した後にビピリジン型プローブ 7 を加えた細胞（c）（b）の後に，さらに 100μM TPEN を加えた細胞を示した．波長変化型の蛍光プローブは，Zn2+本分子設計によって，分子量を大きく変えることとの反応に起因する蛍光変化をバックグラウンド

内 Zn を特異的に認識して蛍光を発現しているであり，今後も検討を重ね，最適な条件等を検討なく，蛍光のオン－オフ制御が可能であることがとは異なる波長域での検出が可能になるため高感ことが明らかとなった（図３）．

していく必要がある．

わかった
（図２）
．そこで，水溶性を考慮し，ピリ度の測定が期待できる．筆者らはこの蛍光プロー

亜鉛の動態や機能は，分子レベルから細胞レベドン環の３位に電子求引性のカルボキシル基を導ブを用いてマウスマクロファージ様細胞におけるル，さらには組織レベルからの解明が必要である．

入した化合物を用いて細胞膜透過性について検討

Zn2+のイメージング測定を行い，市販の蛍光プ

従来，組織における亜鉛の動態や機能は，組織のを行ったところ，化合物に由来するバックグラウ

ローブよりも Zn2+を高感度に測定できることを凍結切片やパラフィン切片を用いて行われてお亜鉛の動態や機能の視覚的な解析を可能にする

2+

蛍光プローブの開発を目的に，蛍光団と Zn2+反27-29）．

応部位の２つの機能をもつ分子骨格に着目して低近年，厚みのある組織をそのままの形状で観察で分子量亜鉛蛍光プローブを開発した．低分子量にきる組織透明化技術が開発され，蛍光色素と共焦することにより，高い細胞膜透過性が期待でき，点レーザー顕微鏡とを組み合わせることによって，また，官能基の導入によって蛍光のオン－オフ制

対象を３次元的にイメージングすることが可能に御や Zn2+に対する親和性の向上等が可能であっ2+ンド蛍光は確認されず，Zn 添加時のみ非常に強23）い蛍光が観察された25）

明らかにしている ．

.

り，脳の神経系や膵ランゲルハンス島等に Znが局在していることが明らかとなっている

ピリジン－ピリドン型亜鉛蛍光プローブでは，分子内の電荷移動を制御することによって蛍光のオン－オフ機能を持ち，低分子量であるため良好な細胞膜透過性を示した．しかしながら，溶液中2+２．亜鉛蛍光プローブの応用
蛍光プローブの開発における細胞実験では，細2+胞の外部から Zn を加えることによって，実際

30）

おわりににおいて，Zn との錯体形成に関わるピリドン環に亜鉛蛍光プローブとして機能するか検討してきなり網羅的，空間的な解析が行われている ．筆者

た．さらに，開発した亜鉛蛍光プローブを用いて，がケト－エノール互変異性化することから，Zn2+た． し か し な が ら， 本 研 究 の 目 的 は 内 在 性 のらは，開発した亜鉛蛍光プローブの組織透明化法

細胞内の遊離亜鉛イオンの検出が可能であり，組2+との結合に関与しない異性体の存在により Zn

Zn の可視化である．亜鉛はがん細胞のアポトーへの応用として，脳内の Zn のイメージングを織透明化法への応用の可能性が示された．今後，に対して十分な親和性を得られていないことが推シス制御に密接に関与しており，アポトーシスに行った．透明化試薬としては界面活性剤の濃度の本亜鉛蛍光プローブを用いたイメージング測定に2+察された．細胞内において微量に存在する Zn
2+2+

おいて，細胞内の遊離亜鉛濃度が上昇することが26）

2+31）

低い ScaleS を用い ，波長変化型のビピリジンよる生体内亜鉛の動態や機能の解明を期待するとを検出するには，さらに Zn への親和性の高い報告されている ．そこで，過酸化水素によりア型亜鉛蛍光プローブとともに脳を浸漬したのちともに，蛍光波長の長波長化等を目指した蛍光プ（K d の低い）化合物の開発は必須である．そこで，ポトーシスを誘導したヒト肺がん細胞株 A549 にに，共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した．そローブの開発を進めていく予定である．

16 ―― 亜鉛栄養治療

謝8巻1号

20171712）Rudolf E, et al：Zinc has ambiguous effects on

辞本研究の一部は，平成 25 － 27 年度財団法人サントリー生物有機化学研究所 研究助成（SUMBOR GRNT），平成 28 年度財団法人コニを受けて行いました．

◆萩森政頼略歴
2001 年		
2003 年				
2006 年		
2011 年		
2012 年		
2016 年		

長崎大学薬学部卒業
京都大学大学院薬学研究科 修士課程修了
万有製薬株式会社（現 MSD） 研究員
長崎国際大学薬学部 助手・助教
博士（薬学）京都大学
神戸薬科大学 講師
長崎大学大学院医歯薬学総合研究科 准教授

献 ― ――――――――

pyridone scaffold. Talanta 83：1730, 201113）Chang CJ, et al：Bright fluorescent chemosensor

23）Hagimori M, et al：Fluorescence ON/OFF

platforms for imaging endogenous pools if neuronalswitching Zn2+ sensor based on pyridine–pyridone７）Jiang P, Guo Z：Fluorescent detection of zinc inenzyme to a key element of life. Adv Nutr 4：82,biological systems: recent development on the2013

design of chemosensors and biosensors. Coord２）Prasad AS：Zinc in human health: effect of zincon immune cells. Mol Med 14：353, 2008
３）Hojyo S, Fukada T：Roles of zinc signaling inthe immune system. J Immunol Res 2016：6762343, 2016４）Pochwat B, et al：Relationship between zinc2+(Zn ) and glutamate receptors in the processes
underlying neurodegeneration. Neural Plast 2015：591563, 2015５）Takeda A：Insight into glutamate excitotoxicity
from synaptic zinc homeostasis. Int J Alzheimers
Dis 2011：491597, 2011

Chem Rev 248：205, 2004８）Nolan EM, et al：Synthesis and characterizationof zinc sensors based on a monosubstituted
fluorescein platform. Inorg Chem 43：2624, 2004
９）Reyes JG, et al：A fluorescence method todetermine picomole amounts of Zn(II) in biologicalsystems. Biol Res 27：49, 1994
10）Meeusen JW, et al：TSQ (6-methoxy-8-ptoluenesulfonamido-quinoline), a common
fluorescent sensor for cellular zinc, images zincproteins. Inorg Chem 50：7563, 201111）Coyle, P, et al：Measurement of zinc in６）萩森政頼, 佐治英郎：イメージングによる生体内

hepatocytes by using a fluorescent probe, zinquin:

微量元素の分析. Biol Trace Elem Res 23：221,

relationship to metallothionein and intracellular2012zinc. Biochem J 303：781, 1993

scaffold. Sens Act B 181：823, 201314）Lipinski CA：Drug-like properties and the24）Hagimori M, et al：A low-molecular-weightcauses of poor solubility and poor permeability. Jf l u o r e s c e n t s e n s o r w i t h Z n 2+ d e p e n d e n t

Pharmacol Toxicol Methods 44：235, 2000

bathochromic shift of emission wavelength and its15）Mizuyama N, et al：Synthesis and steady-state

imaging in living cells. Dyes Pigm 103：205, 2015

spectroscopic study of 5-aryl-2,2’-bipyridyls. New25）Hagimori M, et al：A high-affinity fluorescentfluorescent compounds in solid state. Bull Chem

Zn 2+ sensor improved by the suppression ofSoc Jpn 79：602, 2006

pyridine-pyridone tautomerism and its application16）Mizuyama N, et al：Synthesis and fluorescenceof 4-methylsulfanyl-6-pyridyl-2H-pyran-2-ones insolid state. Heterocycles 71：399, 200717）Hagimori M, et al：Novel synthesis of 4H-quinolizine
derivatives using sulfonyl ketene dithioacetals. Eur J
Org Chem 2009：5847, 200918）Hagimori M, et al：Synthesis of fluorescentin living cells. Sens Act B 213：45, 201526）Franklin RB, Costello LC：The important role of
the apoptotic effects of zinc in the development ofcancers. J Cell Biochem 106：750, 200927）Suh SW, et al：Release of synaptic zinc is
substantially depressed by conventional brain slice
preparations. Brain Res 879：7, 2000

pyrrolo[3,4-b]quinolizine derivatives and evaluation

28）Wagner GF, McKeown BA, Popham DJ：The

as a protein-labeling probe. Heterocycles 83：1983,

autoradiographic localization of zinc within the2011

pancreatic islets of the rainbow trout, Salmo
gairdneri. Histochemistry 72：113, 1981

-phenyl-2-oxo-2H-pyran-3-carbonitorile derivatives and their29）Baskin DG：A historical perspective on thefluorescence in solid state and in solutions. Dyes Pigm

identification of cell types in pancreatic islets of92：1069, 2012

langerhans by staining and histochemical20）Shigmitsu Y, et al：Theoretical interpretations

techniques. J Histochem Cytochem 63：543, 2015of electronic and fluorescence spectra of new30）Richardson DS, Lichtman JW：Clarifying tissue2(1H)-pyridone derivatives in solution and solid１）Maret W：Zinc biochemistry: from a single zincbased on pyridine–apoptosis. J Trace Elem Med Biol 18：251, 200519）Hagimori M, et al ：Synthesis of 6-（4-diethylamino）◆文2+fluorescent sensor for Znzinc. Chem Biol 11：203, 2004

カミノルタ画像科学振興財団奨励賞研究費の助成

22）Hagimori M, et al：A novel small molecule

chromium (VI)-induced oxidative stress andstate. Dyes Pigm 99：940, 201321）Hagimori M, et al：2-Pyridone-based fluorophores
containing 4-dialkylamino-phenyl group：Synthesis
and fluorescence properties in solutions and in solidstate. Dyes Pigm 124：196, 2016

clearing. Cell 162：246, 201531）Hama H, et al：ScaleS：an optical clearing
palette for biological imaging. Nat Neurosci, 18：1518, 2015

18 ―― 亜鉛栄養治療

8巻1号

2017

Development and application of fluorescent probes for Zn2+
Masayori Hagimori1）, Naoko Mizuyama2）, Koki Ogawa1）, Shigeru Kawakami1）, Takahiro Mukai3）,
Hideo Saji4）１）Department of Pharmaceutical Informatics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki
University２）Clinical Research Center, Nagasaki University Hospital３）Department of Biophysical Chemistry, Kobe Pharmaceutical University４）Department of Patho-Functional Bioanalysis, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto
University
Zn2+ is known to play important roles in biological processes. To investigate physiological roles ofZn2+, a variety of fluorescent probes has been developed recently. Most of the fluorescent Zn2+ probes
possess a fluorescent core and a separate part for binding to Zn2+ within the molecule, so that themolecules are hydrophobic and the molecular weight is usually large. In this paper, we describednovel low-molecular-weight fluorescent Zn2+ probes based on pyridine-pyridone structure. Modificationof pyridine-pyridone core structure brought about a marked improvement such as aqueous solubility,
affinity toward Zn2+, and fluorescence ON/OFF switching. Fluorescence images of Zn2+ in A549 cells
indicated that novel fluorescent Zn2+ probes could be used to image endogenous Zn2+. We also assessed
the application of fluorescent Zn2+ probes to tissue clearing techniques.

Keyword：Fluorescent probe, Imaging, Zn2+, Low-molecular-weight, Cell permeability

Address for correspondence	M Hagimori, Department of Pharmaceutical Informatics, Graduate School of BiomedicalSciences, Nagasaki University, 1-7-1 Sakamoto, Nagasaki 852-8501, Japan

E-mail address
Masayori Hagimori：hagimori@nagasaki-u.ac.jp

Naoko Mizuyama：

uzty7bg@gmail.com

Koki Ogawa：		

k.ogawa.nagasaki.u@gmail.com

Shigeru Kawakami：

skawakam@nagasaki-u.ac.jp

Takahiro Mukai：

tmukai@kobepharma-u.ac.jp

Hideo Saji：		hsaji@pharm.kyoto-u.ac.jp