GS2-2-4

LIFE2013 2013 年 9 月 2 日－4 日 山梨 (山梨大学)

ラット肝微小循環血流の長期観察法の開発
Long-Term Observation of Rat’s Hepatic Microcirculation○ 澤 田 玲 奈 （芝浦工大）

山田晃世（芝浦工大）

柴田政廣（芝浦工大）

Rena SAWADA, Shibaura Institute of Technology
Kosei YAMADA, Shibaura Institute of Technology
Masahiro SHIBATA, Institute of Technology
Abstract:A novel technique for in vivo long-term observation of hepatic microcirculation was applied to rat experimentalmodel. Abdominal skin chamber, in which consists in transparent acryl tube and microscopic cover glass was surgicallyattached to rat abdominal skin right above the liver surface. The rat hepatic microcirculation was observed using ouroriginal intravital microscope-TV system. Although the artifacts occurred with the movements by respiration could not be
removed from microscopic image, our novel technique could be confirmed which is useful to observe the blood flow inmicrovessels existing the surface of rat liver.
Key Words: hepatic microcirculation, long-term observation, intravital microscopy, Rat

1. はじめに
微小循環動態の観察は基礎・臨床医学分野を問わず，その重要性は高い．しかし，肉眼での観察が出来ず顕微鏡下での拡大観察が必要となるため，観察対象となる組織や器官は自ずと限られてくる．さらに我々の身体の大部分は表皮に覆われており，その表皮下に存在する微小血管を観察するためには，径皮的観察あるいは表皮の切開を伴う侵襲的観察に頼らざるを得ない．このような微小循環研究の現状において，数少ない微小血管血流の長期観察法として表皮への透明窓を装着したモデルが報告されている．本法は一部切除した表皮部分にガラスあるいはアクリル製透明窓を装着し，生体内部を可視化しようとするものである．この 透 明 窓 装 着 モ デ ル と し て は ， 家 兎 の 耳 介 (rabbit earchamber)(1)やラット・マウス背部皮膚(dorsal skin chamber)(2)，さらには家兎・猫の頭蓋(cranial chamber) (3)を対象としたものがあり(Fig.1 参照)，耳介と背部モデルは透過光照明でその直下の筋あるいは皮膚血流を，頭蓋モデルは落射光照明
で大脳表層部微小循環血流の可視化を可能としている．これらの透明窓モデルの共通点として，呼吸や心拍等による体動の影響を比較的受けにくい部位であることが挙げられる．
一方，生体内には微小循環動態の長期観察が待ち望まれている臓器・器官は多々ある．その中でも肝臓は，生理・病態生理学的重要性に併せ，生体肝移植に用いられるように再生能力の高さにおいても特別な器官と言える．このような肝臓の微小循環動態，特に一部切除後あるいは移植後の再生過程における血流変化を径時的に観察できれば，生体肝移植術への貢献に留まらず，再生医療への寄与も期待できる．本研究では，前述の微小循環動態の長期観察法である透明窓モデルを，ラット腹部皮膚に適用し，その直下に存在する肝臓の表層部微小循環血流の長期観察が可能かどうか，その基礎的検討を行った．

Fig.2 にラット肝臓周辺の解剖学的配置図 (4)を示す．本図からわかるようにラットの肝臓は 5 葉に分かれ，その第 3葉(大きさ縦，約 11mm，横，約 8mm:内側右葉)(5)が腹部正中横隔膜下部に位置している．また，表皮から肝表面までの距離は約 5mm で，その間には他臓器はなく直接アプローチできる．本研究では，横隔膜下部位皮膚を切開し透明窓を装着し，その直下に位置する第 3 葉表層部微小循環の観察を試みる．透明窓装着のためのプレパレーションおよび肝微小循環観察時はフローセン吸入麻酔下で行った．

2. 方法
2-1 実験対象
実験には雄の Wistar 系ラット(6-8wks,100-160g b.w)を用いた．全ての実験は芝浦工業大学動物実験倫理委員会の承認を得て行った．

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Fig.1 The transparent chamber technique for long-term
obserbation of microcirculation. (a) rabbit ear chamber,(b) dosal skinchamber, (c) cranial chamber.

Fig.2

Anatomical location of liver in the rat abdomen. The
numbers in the picture show lobe of the liver. Theliver in the rat consists more than five lobes.

LIFE2013 2013 年 9 月 2 日－4 日 山梨 (山梨大学)

2-2 肝微小循環用透明窓
第 3 葉肝組織の解剖学的形状と配置を考慮し Fig.3 に示す形状の透明窓を試作した．内径 6mm のアクリルチューブを利用し，肝組織表面に接する部分に厚さ 0.16mm の顕微鏡用カバーガラスを装着した．透明窓の腹部への固定はアクリルチューブに設けた 8 箇所の穴と皮膚(or 腹直筋)を縫合した．本固定法により，術後 2 日間腹腔内液の漏出がないことを確認した．呼吸による観察視野の動きを抑えるため，アクリルチューブ管壁に 23G 注射針 3 本を挿入して肝表面と観察窓とを固定できるようにした．ただし，穿刺による出血の可能性があるため，動きが大きい時のみ利用した．微小循環観察時にはラットを迎臥位に寝かせ，アクリルチューブを Z 方向微動装置に取り付けたアームで固定し肝組織表面に観察窓(カバーガラス部位)を押し付けることにより体動の影響を少なくした．

固定用注射針をセットし，体動の影響を少なくした観察
例を Fig.5(b)に示す．本例も静止画で示すため分からないが，同図(a)に示した固定用注射針なしの観察例に比べ呼吸性の体動の影響は小さかった．しかし，画面左下に見える黒っぽい部分は穿刺による出血が視野内に入り込んだものであり穿刺の影響がでた．また，(a)と(b)の両観察例とともに，顕微鏡照明を斜め上から落射していることによるカバーガラスでの反射が画像に影響していることが分かる．

100μm(a)100μmFig. 3

Arrangement of rat abdominal skin chamber.

2-3 生体顕微鏡システム
微小循環の観察は従来から用いている生体顕微鏡システ
ムを用いた(Fig.4)．システムの概要を簡単に述べる．顕微鏡には対物レンズから被写体までの作動距離が長い実体顕微鏡(SZH10：オリンパス)を用い，得られた画像は CCD カ
ラーカメラを介し 21 インチモニター上に映写するとともに HDD レコーダーに収録した．21 インチモニター上での観察倍率は x50~x500 で任意の倍率が選択できる．顕微鏡
照明用光源には 100W ハロゲンランプを用い，光ファイバーにより観察窓直近まで誘導し斜め上方向より落射照明で照射した．

Fig. 4 Intravital microscopic system to observe the rat
hepatic microcirculation.
3. 結果と考察
固定用注射針を使用せずラット肝表層部微小循環血流動画を記録した．収録した動画の一部静止画像を Fig.5(a)に示
す．拡大倍率はモニター上で 500 倍とした．本画像では判定できないが，実際の動画上では呼吸性の体動が十分抑えられていなかった．一方，本静止画では，画面中央(矢印部分)を流れる細静脈の合流部が不鮮明であるが，実際の画像上では血流を観察することが可能であった．

Fig.5

(b)
Typical examples of microscopic image in rat
hepatic microcirculation obtain by normal (a) andneedle fixing (b) chamber.

4. 結論
透明窓モデルをラット肝微小循環の長期観察に適用した結果，未だ多くの問題点を残すものの微小血管血流は可視化でき長期観察モデルと成りうることが確認できた．呼吸による体動の影響を除くためには，陰圧を利用したカバーガラスと肝表面の密着などの新規方法を組み込む必要がある．
さらに斜め落射方式照明による反射の影響は，2 方向から落射照明することで解決したい．
参考文献(1) S.Ishioka, M.Shibata, K.Kosaki, Y.Sato, K.Harii, andA.Kamiya : In vivo measurement of morphometrichemodynamic changes in the microcirculation during
angiogenesis under chronic α1-adrenergic blocker
treatment. Microvasc Res55 : 165-174, 1998
(2) Minh TC, Ichioka S, Harii K, Shibata M, Ando J,Nakatsuka T : Dorsal bipedicled island skin flap: a newflap model in mice. Scand J Plast Reconstr Surg Hand
Surg : 262-7,2002(3) Hermes A.Kontos : Cerebral preparations : advantage anddisadvantages. Microcirculatory technology / edited byCarleton H. Baker, William L. Nastuk. :55-64,1986(4) 早川 敏之, 岩城 隆昌：ラットの断面解剖アトラス，アドスリー，2008(5) 野村慎太郎 : 細胞工学別冊マウス解剖イラストレイ
テッド(動画でわかる解剖手技と解剖組織像)，秀潤社，
2002

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