よく用いられる緩衝溶液
山本雅博

February 3, 2010

1

緩衝溶液とは酸、塩基を加えたり、または溶液を薄めても溶液の pH が大きく変化しない溶液を緩衝溶液(Buﬀer solutions) という。化学反応系（特に生体内で）は溶液の pH によっておおきく変化を受けることが多いため、pH の調節は大変重要である。
プロトン濃度を一定にするためには，濃度が減少すればプロトンを供与する酸（弱酸 HA）と濃度が増加すればプロトンを受容する共役塩基（A− ) を水溶液中に生成する塩 (NaA → Na++ A− ）を大量に含む水溶液を調製すればよい。Fig.8 にそのイメージを示した。後に示すように，塩酸や水酸化ナトリウム水溶液も緩衝能をもつ。その緩衝作用の強さは，緩衝能の呼ばれ以下で定義されるが，pH 依存性，イオン強度依存性があるため，緩衝溶液は万能ではないことに注意してほしい。

2

Henderson-Hasselbalch 式

近似式である Henderson-Hasselbalch 式は1 、例えば酢酸-酢酸ナトリウム緩衝溶液の場合、全(分析) 濃度 C(あるいは仕込み濃度）と解離平衡定数 Ka を使って以下のように書かれる。

pH = pKa + log

CNaOAcCHOAc(Henderson − Hasselbalch Eq.)(1)

ここで近似が成立する条件は[HOAc] ≅ CHOAc [OAc− ] ≅ CNaOAc

(2)

である。
Henderson-Hasselbalch 式の導入のための反応式、平衡関係、質量収支、電荷収支を列記す
るとHOAc
NaOAc →

H+ + OAc−
Na+ + OAc−

(3)
(4)

H2 O

(5)

(9)
(10)

Ka=Kw
CNaOAc==H+ + OH−[H+ ][OAc− ][HOAc][H+ ][OH− ][Na+ ]

CHOAc + CNaOAc[Na+ ] + [H+ ]==[OAc− ] + [HOAc][OAc− ] + [OH− ](6)(7)(8)となり、pH はpH∆[OAc− ]
(This is not Henderson − Hasselbalch Eq.!!!)[HOAc]
CNaOAc + ∆= pKa + log
CHOAc − ∆≡ [H+ ] − [OH− ]= pKa + log

(11)
(12)
(13)と与えられる。従って、∆ << CNaOAc , CHOAc であれば Henderson-Hasselbalch 式の近似は成立する。
溶液を希釈 (dilution) しても，濃度比 CNaOAc /CHOAc は変化しないため水溶液の pH は変化しない。
1 Henderson-Hasselbalch 式の Hasselbalch は、ハッセルバルヒと読む方が実際に近い。ハッセルバルクと書いてある本もあるようですが。ちなみに、Gibbs は、ギブズ、と濁るのが正しいことは、最近、広く知られるようになってきました。蛇足ながら。垣内記

1酢酸-酢酸ナトリウム緩衝溶液のイオン強度は,[Na+ ] と [OAc− ] によって決まる。

[Na+ ] = CNaOAc , [OAc− ] ≅ CNaOAc
1 2
1µ =(1) CNaOAc + (−1)2CNaOAc = CNaOAc
223

緩衝能 (Buﬀer Capacity)、緩衝強度 (Buﬀer Strength)

緩衝能 (Buﬀer Capacity) は、1 dm3 (= 1 L ) 溶液の pH を 1 pH 単位だけ変えるのに必要な強塩基のモル数で表される。[Day & Underwood, 定量分析化学での定義。以下に示すように必ずしも緩衝能とは一致しない。]
さらにより明確な定義として緩衝強度 (Buﬀer Strength) がある。ここでは、直感的な定義として、[]−11∂pHβ=(14)
Vsolution dnbase
ここで、Vsolution は緩衝溶液の体積、nbase は加える強塩基のモル数である。β は，pH=pKa で最大となり，その最大値は全濃度 Ctot = CNaOAc + CHOAc に比例する。(Fig.2) 従って，緩衝溶液を希釈するとその緩衝強度は低下する。
HOAc/NaOAc Buffer Solution (Ctot = 0.1 M)
13121110pH

987654300.01

0.02

0.03

0.040.05
NaOH mol

0.06

0.07

0.08

0.090.1

Figure 1: 種々の pH をもつ酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液（1 dm3 , 全濃度 0.1 M) に NaOH(10 M)を入れたときの pH の変化。横軸は NaOH のモル数である。緩衝能の定義と比較せよ。

6x10-20.10 M
0.05 M0.025 M5β432103.54.04.5pH5.0

5.5

6.0

Figure 2: 酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液（全濃度 0.1, 0.05, 0.025 M) の緩衝強度

4よく用いられる緩衝溶液

生化学、生物学、臨床化学等でよく使用する緩衝溶液の例として、リン酸緩衝液、Tris [tris(hydroxymethyl) aminomethane] 、HEPES [2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic2acid] および広 pH 域緩衝溶液を紹介する。試料の精製法、調整（特に乾燥）の具体的な方法については、D. D. Perrin and B. Dempsy「緩衝液の選択と応用」辻啓一訳（講談社）の 8, 9, 10 章に詳しく記述されている。

4.1

リン酸緩衝溶液

生体系にはすでにかなりのリン酸がふくまれているため、この緩衝液は生体系の反応を干渉しない利点がある。リン酸の３段階の解離の pKa は、2.12, 7.21, 12.32 である。従って、分率の図に示すように、pH = 7 近傍では、実際上 H2 PO−4 と HPO2−4 だけが存在すると考えてよい。すなわち、次の解離の平衡関係のみを考えればよい。

H2 PO−4H+ + HPO2−4(15)以下に、イオン強度一定の条件でどのようにリン酸緩衝液を調整したらよいのかを示す。
H2 PO−4 イオンは NaH2 PO4 塩または KH2 PO4 塩から、HPO2−4 イオンは Na2 HPO4 塩から完全解離したものを用いる。
今、NaH2 PO4 の全濃度を C1 、Na2 HPO4 の全濃度を C2 とすると、イオン強度 µ はµ1∑ 2Z Ci2 i i)1( 2=1 [Na+ ] + 12 [H2 PO−4 ] + 22 [HPO2−4 ]21≅[(C1 + 2C2 ) + C1 + 4C2 ]2= C1 + 3C2=(16)
(17)
(18)

Here we approximate
C1≅ [H2 PO−4 ]

(19)
(20)
(21)

C2

≅ [HPO2−4 ](22)Henderson-Hasselbalch 式より

C2(23)
C1となる。具体的な例としてイオン強度 0.100 M で pH 7.4 のリン酸緩衝液を作る場合、HendersonHasselbalch 式より
C2
7.4 = 7.21 + log10(24)C1となりイオン強度より0.100 = C1 + 3C2(25)pH = pKa + log10である。両式より、C1 = 0.0177 M, C2 = 0.0274 M となる。
問題: 実際に，上で得られた C1 , C2 を使って水溶液を 1 dm3 調製したところ pH は 7.25 となった。これは，H2 PO−4 , HPO2−4 イオンの活量を考慮してないためである。イオンの活量係数
γi が√log10 γi = −0.509Zi2 µ(26)で与えられるとして，pH が 7.25 になった理由を示せ。
リン酸は、多くの多価のカチオンと錯形成をしたり、さらには沈殿生成（特にカルシウムと）が見られたりする。また、特定の酵素（例えば、カルボキシペプチターゼ）の活性を抑制することもあるので注意が必要である。

4.2Tris

生理学的緩衝液で最も使われてきたのは Tris H2 NC(CH2 OH)3 (tris (hydroxymethyl) aminomethane)である。緩衝作用に関連した反応は[H3 NC(CH2 OH)3 ]+H+ + H2 NC(CH2 OH)3(27)で、解離の pKa は 8.08 である。pKa より酸性側で使用するため通常は塩酸と組み合わせる。以下に塩酸による pH 調整法と緩衝能の図を示す。
Tris/HCl 緩衝液に対する Henderson-Hasselbalch 式は、塩酸の全濃度を CHCl , Tris の全濃度を CTris , [H+ ] - [OH− ] = ∆ とすればpH = pKa + log10

CTris − CHCl
CTris − CHCl + ∆≅ pKa + log10
CHCl − ∆CHCl(28)となる。
pH7.5 以下で緩衝能が弱くなること、１級アミンと反応すること、有機溶剤に溶ける、時には細胞毒性があることなどの欠点がある。

30.8

noitcarf

0.6

H3PO4
H2PO4(-)
HPO4(- -)PO4(- - -)0.40.20.00246pH8101214Figure 3: リン酸イオンの分率の pH による変化

Figure 4: Tris/HCl 緩衝液（25 ℃) (R. G. Bates and V. E. Bower, Anal. Chem. 28 (1956) 1322.)

4.3

HEPES

Figure 5: HEPES とその zwitterion
pH6 から 8 の間で緩衝能が高く、水溶液に良く溶解し、有機溶剤には溶解度が低く、毒性も低いと考えられている、ほぼ理想に近い緩衝溶液として HEPES がある。
HEPES [2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid] 緩衝液では、水溶液中でスルホン基から解離したプロトンが piperazine 基の４位の窒素にプロトネーションして正負の電荷を同じ分子内にもつ両性イオン (zwitterion)[HEPES-ZW+− ] と脱プロトン化した 2- [4(2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonate [HEPES− ] 間の平衡関係を利用する。
HEPES − ZW+−H+ + HEPES−(29)この場合、スルホン酸の解離の pKa は十分酸性側にあるので考慮しなくてよい。この反応に対する解離の pKa は 7.55 である。イオン強度一定での緩衝溶液を調整するため、水酸化ナトリ
ウムと塩化ナトリウムと HEPES の混合物を用いる。
HEPES/NAOH/NaCl または HEPES/NaOH/NaClO4 緩衝液に対する Henderson-Hasselbalch 式
は、NaOH の全濃度を CNaOH , HEPES の全濃度を CHEPES , [H+ ] - [OH− ] = ∆ とすれば,

Ka=CNaOH + CNaClO4CHEPES==[HEPES− ][H+ ][HEPES− ]pH = pKa + log10+− ,[HEPES − ZW ][HEPES − ZW+− ]+−[Na ], CNaClO4 = [ClO4 ],[HEPES − ZW+− ] + [HEPES− ]
4(30)
(31)
(32)

[H+ ] + [Na+ ] =−[OH− ] + [ClO−4 ] + [HEPES− ]+[HEPES ] = ∆ + [NapH = pKa + log10] − [ClO−4 ] = CNaOH + ∆CNaOH
CNaOH + ∆≅ pKa + log10
CHEPES − CNaOH − ∆CHEPES − CNaOH

(33)
(34)
(35)となり，イオン強度一定の下では,pH は NaClO4 の全濃度には依存しない。イオン強度（ionicstrength)I は，I=)1( +1∑ 2Z ci =[H ] + [Na+ ] + [OH− ] + [ClO−4 ] + [HEPES− ]2 i i2) 1[]1( +[Na ] + [ClO−4 ] + [HEPES− ] ≅(CNaOH + CNaClO4 ) + CNaClO4 + CNaOH
22= CNaOH + CNaClO4≅

(36)
(37)
(38)となる。
問題 上の式を導け。また、イオン強度 0.1 M、pH 7.3 の HEPES/NAOH/NaCl 緩衝液を 1 L作成したい。CHEPES = 0.05 M の時、CNaOH , CNaCl それぞれ何 M 必要か？ 答え：CNaOH = 0.018M,
CNaCl = 0.082M

4.4

広域緩衝溶液pKa が約 2 の間隔で離れた緩衝液を混合することにより、広い pH で均一な緩衝能をもつ広域緩衝溶液が作成できる。例として、クエン酸、リン酸、ジエチルバルビツル酸、ホウ酸のもつ７個の pKa で pH2.6 から 12 までの Britton-Robinson 緩衝液がある。

Figure 6: Britton-Robinson 緩衝液の緩衝能の pH 依存性（姫野・市村「溶液内イオン平衡に基づく分析化学」p.59（化学同人）より）

4.5

塩酸も緩衝溶液になる!?

塩酸も緩衝溶液になる。NaOH による滴定曲線と緩衝能のプロットを Fig.7 に示す。

4.6

緩衝溶液のイメージ，最適 pH緩衝溶液のイメージ，最適 pH に関する図を Fig.8 に示す。

5

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