8.3 がん抑制遺伝子Apcを標的とした新規突然変異解析系の構築
Construction of a Novel Mutation Analysis System Targeting the Cancer Suppressor Gene Apc
山内 一己,
生物影響研究部

Kazumi YAMAUCHI
Department of Radiobiology, Department of Radioecology
Abstract
mice, an animal model for human colorectal cancer, show activated Wnt signaling
Apcand accumulate an excessive amount of intracellular β-catenin protein due to a second-hit mutationin the Apc gene in somatic cells. We extablished a novel mutation monitoring system using a crossbetween Apcmin/+ and TCF/Lef:H2B-GFP transgenic mice. In resulting monitor mice (Tcf-Apcmin/+),
GFP expression is induced by constitutively activated Wnt signaling (β-catenin accumulation) when
the normal Apc gene is lost. To determine whether Apc mutations increase with radiation exposure,these Tcf-Apcmin/+ mice were exposed to 4.2 Gy gamma-rays at a high dose-rate (0.65 Gy/min) at 1
week of age and GFP-reporter expression in cells was evaluated. Results show that GFP-expressionin cells of the large intestine was significantly increased in irradiated mice. This means that GFPreporter expression can be detected in the large intestine of the Tcf-Apcmin/+ mice. This system will
be useful in analyzing oncogenic mutations induced by radiation.
min/+.
1. 目的マ2. 方法
2.1.突然変異検出系マウスの作製とガンマ線照射

ウスでは、正常Apc遺伝子に変異が発生することにTcfマウス（TCF/Lef:H2B GFPトランスジェニックより細胞内のWntシグナル活性化（β-カテニンタン

マウスIMSR_JAX:013752）のオスマウスを、ジャヒト大腸腺腫症のモデルマウスであるApc

パク質の過剰蓄積）を生じる。このApcmin/+min/+マウス と、 クソンラボより購入した。このマウスの精巣上体尾Wntシグナル活性化を緑色蛍光タンパク質（GFP）の部より精子を採取し、超過排卵処理を行った発現により検出することのできるTCF/Lef:H2B-GFP

Apcmin/+メスマウスから採取した卵子と体外受精をトランスジェニックマウス（以下Tcfマウス）とかけ行い、受精卵を作製した。次に受精卵を偽妊娠処理合わせて使用することで、正常Apc遺伝子が欠損すICRメスマウスに移植した。得られた仔マウスはると細胞のWntシグナルが恒常的に活性化し、GFPPCR法により遺伝子型を決定し、野生型ApcのTcfマ蛍光細胞としてマウス組織上で検出のできる新規突然変異解析系のマウスの作製を行う。またこのマウスに放射線照射を行い、放射線照射によるApc遺伝子の突然変異の増加が、GFP蛍光細胞数の増加として組織上に検出されるか明らかとする。

ウス（以下、野生型Tcfマウス）とApcmin/+バックグラウンドのTcfマウス（以下、Tcf-Apcmin/+）を得た。また生後１週齢の野生型TcfマウスとTcfApcmin/+マウスにそれぞれ4.2 Gy（0.65 Gy/分）のガンマ線照射を行った。

2.2.突然変異検出系マウスの解剖と蛍光顕微鏡にられたGFP蛍光細胞は、Apc遺伝子が欠損した細胞よる組織解析であることが示唆された。また生後1週齢のTcfmin/+マウスはそれぞれApcmin/+マウスに4.2 Gyの高線量率（0.65 Gy/分）ガ

イソフルランで麻酔を行い、冷PBSならびに4%パンマ線を照射し、4週齢で解剖を行い大腸と小腸のラホルムアルデヒドで灌流固定を行った後、臓器を蛍光を観察したところ、非照射Tcf-Apcmin/+マウスよさらに４℃の4%パラホルムアルデヒドで24時間固り蛍光を持つ細胞数が顕著に増加したことが明らか定した。また肝臓は、SCALEVIEW-S（富士フイルとなった（Fig. 2B）。このことは、高線量率ガンム和光純薬工業）で透明化を行った。Thunderモデ

マ線照射により正常Apc遺伝子の変異が増加したこ

ル生物蛍光実体顕微鏡（ライカマイクロシステムとを示唆している。また、腫瘍が多く見られる直腸ズ）で臓器組織上のGFPを発する細胞の検出を行っでは蛍光を持つ細胞が多く見られるのに対し、盲腸た。また画像処理はiMac(2019) とAdobe Photoshopから直腸までの腫瘍がほとんど見られなかった領域

CCを用いて行った。

については蛍光を持つ細胞が見られなかったことか

野生型TcfマウスとTcf-Apc

ら、蛍光を持つ細胞と腫瘍の発生パターンには相関3. 成果の概要があることが示唆された。

非照射の野生型Tcfマウスは、小腸や大腸でWnt以上のことから、正常Apc遺伝子を標的とした新シグナルが恒常的に発現していないためGFPタンパ

規突然変異解析系の構築を行うことができたと結論

クを発現している細胞は観察されなかった。一方、される。今後、この蛍光細胞の出現が、照射する放Wntシグナルが恒常的に発現している肝臓や毛嚢で射線の線量により、また被ばく時の週齢によりどのはGFPタンパクを持つ細胞が検出された（Fig.

ような変化を示すか、また蛍光細胞の発生数と肉眼

min/+1）。次にTcf-Apc

マウスの大腸や小腸を解析ししたところ、少数のGFP蛍光細胞が検出された的腫瘍数の相関や、正常Apc遺伝子のDNA変異パターンを調べることを計画している。

（Fig. 2A）。このことから、Tcf-Apcmin/+マウスで見Fig. 1. Fluorescent images of cells in wild-type TCF/Lef:H2B-GFP mice.
(A) Liver: The GFP- reporter expression in zone 3 hepatocytes with activated Wnt/β-catenin signaling near the centralvein.
(B) Hair follicles: The GFP- reporter expression observed in actively proliferating cells.

Fig. 2. Fluorescent images of the large intestine of Tcf- Apcmin/+ mice.
(A) Large intestine from an 8-week-old non-irradiated control mouse.
(B) Large intestine from a 4-week-old mouse, exposed to 4.2 Gy gamma-rays at a high dose-rate (0.65 Gy/min) at 1 weekof age. The increase in the number of GFP-positive cells in the irradiated mouse suggests that high dose-rate gamma
irradiation increases the frequency of mutations in the Apc gene.