2013 MAY
No. 580

2013 年（平成 25 年）5 月号

第 59 巻 第 3 号（通巻 580 号）

挨拶・巻頭言成功体験........................................岩 田晃（ 2 ）

獣医病理学研修会
第 51 回 No. 1031 イヌの甲状腺・副腎....................... 三菱化学メディエンス（ 3 ）第 52 回 No. 1068 ネコの脊髄................... 鳥取大学獣医病理学教室（ 4 ）レビュー
鶏大腸菌症生ワクチン ガルエヌテクト
CBL の開発 ...................永 野 哲 司（ 5 ）論文紹介
マウスモデルにおいて食事性の肥満は 2009年型パンデミック H1N1 ワクチンの効果を劇的に減弱させる ......... 山 下龍（10）一般財団法人 日本生物科学研究所
http://nibs.lin.gr.jp/

2（34）

日生研たより成功体験
岩田晃

1981 年 12 月に京都で AMBO（Asian Molecular Biology Organization）第 1 回シンポジウムが開催されました。ちょうど遺伝子組換え技術が研究レベルで実用化されて分子生物学が誕生した時代であり、大学、バイオ企業の研究所は大規模な構造改革を余儀なくされていました。主催者
は日本にも欧州 EMBO のような研究所を設立すべく、「DNA 研究の未来」というテーマでAMBO 国際学会に国内外の著名な研究者を招待したのです。その後、AMBO 構想は企業の寄付を集められずに挫折しました。
当時、学部学生であった私も教授にプログラム集をもらって会議に潜り込み、教科書でしか知らない先達たちの話を聞きました。DNA の螺旋構造を発見して 1962 年に若くしてノーベル賞を受賞した J. D. ワトソン博士も主催者の一人です。講演に対する質問でヒトゲノム解読は 1 塩基
対 1 セントになればできると答えていました。当時は１メートルの長さのポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、3 日かけて 500 塩基ほどの配列決定をしていたので、夢のような低価格です。
20 年後、ヒトゲノム計画は 2003 年に終了し、約 30 億塩基対であることが判明しました。最新のシステムではヒトゲノム配列も 1000 ドルで決定できるそうで、ウイルスから人間までゲノ
ム全長配列情報はたくさんの生物種で報告されています。大量のゲノムシークエンスデータが報告される原動力は DNA シークエンサの進歩です。蛍光基質を用いた合成反応に電気泳動を組み合わせたサンガー法の代わりに登場したパイロシークエンス法。電気泳動を使わず、マイクロエ
マルジョンと PCR を組み合わせて一気に数百万ベースを読む技術です。昨年は 1 分子の DNA
を読む手のひらサイズの DNA シークエンサが発表され、話題になりました。
ゲノム配列情報に限らず、大量の情報（ビッグデータ）が比較的簡単に生み出される時代になりました。そして、今大切なのは断片的な情報を意味ある情報に組上げる技術です。インター
ネット上の情報を効率的に検索するプログラムを提供したグーグル社は短期間に巨大企業へと成長しました。それでも圧倒的な量の情報から重要な情報を得るのは困難です。現実の問題では考察を合理的に進めたところで最終的な判断ができない結論が残ることが多いものです。
最終的に重要な価値判断は個人の体験ではないでしょうか。判断基準が欲しいために成功者の体験を拝聴する商売が成立しています。実は自然科学に従事する者は慎重に計画して実験するので必ず小さな成功体験を持っています。これこそが膨大な科学情報のなかで研究者が迷うことな
く先端研究を推進できる原動力でしょう。最先端を走る研究者は膨大な情報の中から体験をもとに確かな答えを見つけるのでしょう。
J. D. ワトソン博士は個人の全ゲノム遺伝情報を公開した最初の人物です。国際的な組織であるヒューマン・ゲノム・コンソーシアムで完全解読まで 10 年を要したゲノム解読ですが、この仕事は米バイオ企業 454 Life Sciences が行い、ゲノム解読に 67 日、費用は 100 万ドル（約１億2000 万円）でした。
（常務理事）

59（3）
、2013

3（35）

イヌの甲状腺・副腎
三菱化学メディエンス

第 51 回獣医病理学研修会 No. 1031

動物：イヌ、ビーグル、雄、18 ヵ月齢。

昇を示し、ヒトの橋本病に類似した自己免疫疾患と考え

臨床事項：蒸留水をカテーテルにて 54 週間反復経口投られている。本症例も、血清中の抗イヌサイログロブリ

与後に解剖した。飼育期間中の一般症状観察、解剖時のン自己抗体価が高値（106.2％）を示した。また、副腎血液検査、血液生化学検査では異常は認められなかった。

髄質においても髄質細胞の減少とリンパ球浸潤が認めら

肉眼所見：ホルマリン固定後の副腎割面では、正常個体

れ、これらも自己免疫に起因した病変と考えた。ヒトにの副腎と比較して髄質領域の菲薄化が認められた（図おいて、自己免疫機序により複数の内分泌器官にて炎症

1）。両側の副腎重量が同月齢動物の平均値より低値を示や萎縮性病変などの機能不全を呈する病態は APS に分した（912 mg、平均値：1260 mg）。

類される。イヌでも、グレートピレネー犬に見られた副組織所見：甲状腺では間質および濾胞へのリンパ球浸潤

腎と甲状腺の萎縮を伴う下垂体炎と副腎炎が、ヒトのが認められ（図 3）、リンパ濾胞形成も散見された（図APS に類似した病変として報告されている。しかし、4）。副腎では髄質領域が顕著に減少し（図 2）、髄質細本症例では、副腎髄質に対する自己抗体の存在を証明で胞の減少と共にリンパ球主体の細胞浸潤が認められたきなかったため、診断名に APS を付けることに対して（図 5）。副腎のグリメリウス染色では、萎縮した髄質細慎重論も出た。

胞が散見された（図 6 矢印）。

（友成由紀）

診断：リンパ球性甲状腺炎および副腎髄質の萎縮を伴参考文献：

うリンパ球性副腎髄質炎（Autoimmune polyendocrine

1. Adissu, H. A., Hamel – Jolette, A., Foster, R. A. 2010.

syndrome（APS）を疑う）

Lymphocytic adenohypophysitis and adrenalitis in a dog

考察：イヌのリンパ球性甲状腺炎は、血清中の抗サイロwith adrenal and thyroid atrophy. Vet. Pathol. 47 : 1082 –グロブリンや抗サイロペルオキシターゼ自己抗体価の上1085.

4（36）

日生研たよりネコの脊髄
鳥取大学獣医病理学教室

第 52 回獣医病理学研修会 No. 1068

動物：ネコ、シャム、雌、4 ヵ月齢。
臨床事項：症例は自宅裏口で虚脱状態で発見された。外傷は無かったが、後駆は麻痺し、自力排尿は困難であった。神経学的検査では両後肢深部痛覚、両膝蓋腱反射、肛門反射および尾力が消失していた。
剖検所見：脊髄は第二腰髄から馬尾にかけて（特に腰髄が）腫大していた（図 1）。第一頸髄から第一腰髄に著変は認められなかった。また、椎骨に骨折などの著変は認められなかった。解剖時、骨盤腔内の出血および右腎臓の出血性梗塞巣が認められた。
組織所見：第二腰髄から馬尾にかけて灰白質全域は海綿状を呈し染色性が低下していた（図 2）。海綿状変化は
灰白質と白質の境界部に特に強く認められた（図 2 矢印）。灰白質内の神経細胞は壊死していた（図 3）。灰白
質全域には泡沫状マクロファージ（図 4）および好中球（図 5）が浸潤し、白質にはスフェロイドが少数認められた（図 6）。また、脊髄神経節に神経細胞壊死が認められた（図 7）。Iba – 1 抗体を用いた免疫染色では脊髄
灰白質と白質の境界部に多数の陽性像が認められ（図8）、Iba – 1 陽性細胞はマクロファージ（図 9 矢印）およびミクログリア様の細胞（図 9 矢頭）であった。脊髄に感染症、中毒ならびに代謝異常を示唆する所見は認められなかった。

診断：灰白質と白質の境界部に重度の海綿状変化を伴う
脊髄灰白質壊死（Traumatic feline ischemic myelopathy）
考察：本例は組織学的に脊髄（第二腰髄から馬尾）に広範な壊死が認められ、特に灰白質と白質の境界部の変性が重度であった。本例の病変の質と分布から、原因として第二腰髄以下の脊髄における虚血が考えられた。
本例の臨床症状（突然の後駆麻痺）、肉眼所見（椎骨に著変なし）および組織所見（広範な脊髄の壊死）は、Traumatic feline ischemic myelopathy の 報 告 に 一 致 する。本疾患の発生機序は不明であるが、腹部に強い外力（交通事故など）を受け、腹腔内の動脈に循環障害が生じるためと推定されている。本例においても骨盤腔内の出血ならびに腎臓の出血性梗塞が認められ、腹部に強い
外力が加わったことが疑われた。本会では、組織学的診断における「軟化」という用語の使用の可否について議論され、ヒトの神経病理学の情報をもとに「軟化」という用語を使用しない方が良いという意見があり、上記診断名に変更した。
（櫻井 優・森田剛仁）
参考文献：
1. Summers, B. A., Cummings, J. F., de Lahunta, A. 1995.
Traumatic feline ischemic myelopathy. p. 249. In :Veterinary Neuropathology, Mosby – Year Book, St. Louis.

59（3）
、2013

5（37）

レビュー

鶏大腸菌症生ワクチン

ガルエヌテクト CBL

の開発
永野哲司

ガルエヌテクト CBL は、我が国を初めとして世策が最も求められている疾病の一つである。この疾界的に問題となっている鶏大腸菌症を防除するため病による被害は、農場における斃死率の増加や増体に新たに開発された生ワクチンである。このワクチ重の低減に留まらず、食鳥検査における廃棄率の上

ンは血清型 O78 の鶏大腸菌弱毒株 AESN1331 株を昇などが知られ、算定されるその被害額は莫大なも主成分とした凍結乾燥品で、効能又は効果は「鶏大のとなっている（図 1）。また、発症鶏群を抗菌剤

腸菌症の予防」、用法及び用量は「鶏を対象とし、で治療した場合は、休薬期間の問題や薬剤耐性菌のワクチンを日局の生理食塩液を用いて 1,000 羽分あ出現といった、潜在的な危険性も知られている。こたり 100 〜 300 mL に溶解し、3 〜 4 週間隔で 2 回のような鶏大腸菌症に対し、これまでにも様々な対投与する。初回は噴霧器、第 2 回は噴霧器又は散霧策が講じられてきたが、本症がストレスによる一過器を用いて投与する」となっている。使用している性の免疫力低下等に起因した腸内フローラによる日ワクチン株の特徴や安全性及び有効性については、

和見感染症といった側面をもつため、有効な手立て

これまでに数多くの国内外の学会で紹介しており、がないのが現状である。その中でも、ワクチンによ2012 年には誌上発表した（Nagano T. et al., Micro-

る対策の重要性が認識され、これまで数多くの学術

biology & Immunology, 56 : 605 – 612）
。こ こ で は、論文等で鶏大腸菌症ワクチンに関する研究が発表さ既にそれらで発表した成績の一部を紹介しながら、れてきた。それらの報告の中では、菌体、膜小胞、本ワクチンについて解説する。

線毛、外膜蛋白などを抗原とした不活化ワクチン、
遺伝子組換え弱毒株を用いた幾つかの生ワクチン、大腸菌血清型 O78 の表面抗原遺伝子を組込んだベ
クターワクチンなどがそれぞれ有効であったとされ初めに
鶏大腸菌症は、現時点の養鶏産業においてその対図1ているが、それらのほぼ全てが実用化に至っていな

野外での鶏大腸菌症の被害の実態

6（38）

日生研たよりい。現在、我が国で市販されているワクチンは不活

では、CRP 遺伝子へ挿入されたトランスポゾン遺化ワクチンのみであり、養鶏現場では更なる対策の伝子がしばしば脱落する結果、遺伝的に不安定であ

選択肢を拡大するために、弱毒化生ワクチンの開発

るだけでなく遺伝子組換え体に該当していた。さらを望む声が次第に大きくなっている。

に、食物としての畜産物を考えた場合に、その生産元である畜産動物に対してこのような遺伝子組換えワクチンを使用することについて、一般消費者の理

生ワクチンの開発

解を得ることも非常に困難であると考えられた。

当 研 究 所 の 長 井 ら は、鶏 大 腸 菌 血 清 型 O1 の

我々はこの問題を解決すべく、この遺伝子だけを欠M1000 株にトランスポゾン変異を挿入したところ、損した弱毒株を得る手法について検討を重ねた。そサイクリック AMP レセプタータンパク質（CRP）の結果、自然界でも頻繁に行われている大腸菌同士

遺伝子に変異が入ったクローンでは溶血性状が失わの遺伝子交雑を利用し、コロニーセレクションにれ、さらに鶏への病原性も低下したことを報告した

よって遺伝子組換え体に該当しない遺伝子欠損株を（Nagai S. et al., Veterinary Microbiology, 60 : 227 –選別することに成功した。これが今回報告するワク

238, 1998）。これによって、鶏大腸菌の CRP 遺伝子

チン株 AESN1331 株（図 2）となった。

変異株がワクチン株となる可能性が見出されたことが、鶏大腸菌症生ワクチン開発のきっかけとなった。
しかしながら、この論文で用いた手法で得られた株

AESN1331 株の特徴
ワクチン株である AESN1331 株は、CRP 遺伝子
を部分的に欠損させた遺伝子欠損株である。CRP
遺伝子の機能を失ったことで、幾つかの糖の代謝能とアミノ酸の生合成能を欠失し、様々な蛋白の発現誘導能が著しく減弱するとともに、菌の増殖性も減弱し、また病原性に関連する幾つかの機能も喪失していることが特徴である（表 1）。親株の大腸菌と比べた場合、AESN1331 株では CRP 遺伝子内部において、アミノ酸に変換した場合に読み取り枠にズレが発生しない、いわゆるインフレームで 351 塩基

図 2 AESN1331 株の電子顕微鏡像
やや丸みを帯びた菌体の周囲には線毛（Ⅰ型線毛）が密集している
表1の大きさの欠損が生じている AESN1331 株と親株

AESN1331 株及び親株の性状

59（3）
、2013

7（39）

との違いはこの欠損部位 1 ヶ所だけに留まり、そのさらに、親株では盲腸・ファブリキウス嚢、野外強他の遺伝子については全く同一の配列を示す。さら毒株ではそれに加えて実質臓器等からも菌が検出さに、この欠損部分が比較的大きな領域であり、何られたが、AESN1331 株は呼吸器以外からは全く検出かの偶然によって修復されて元の病原株に戻る確率

されなかった（図 4）。これらのことから、AESN1331

は極めて小さいことから、病原性復帰変異が起こる

株は鶏体内での定着性が減弱し、唯一検出される呼可能性は無視できると考えられる。

吸器からも速やかに消失することが判明した。

AESN1331 株は、親株と同様にアンピシリン、ジ

4 日齢の SPF 白色レグホン鶏及び初生のブロイヒドロストレプトマイシン、オキシテトラサイクリ

ラーコマーシャル鶏に、この AESN1331 株を凍結ンと言った多くの薬剤に対して感受性を示す。近年

乾燥して作製したガルエヌテクト CBL を 4 週間隔分離されてくる鶏大腸菌野外株の多くがこれら複数

で 2 回投与しても臨床的な異常は認められず、安全の薬剤に耐性であり、染色体上やプラスミド上に多であることも確認された。さらに、ガルエヌテクト

様の薬剤耐性遺伝子が存在することが報告されていCBL は初生から投与できる安全性をもつだけでなる。AESN1331 株が薬剤感受性であることは、多剤

く、産卵中の鶏に投与しても臨床的異常を示さず、耐性だけでなくニューキノロン耐性の出現などが問産出卵にも移行しないことから、投与対象の日齢に題となっている養鶏現場において、薬剤耐性遺伝子

は制限がなく、ワクチン成分の残留といった問題も播種の危険性も回避する。さらに、本株は、大腸菌無いことから使用制限期間もない。

に有効な一般的な消毒液などによっても簡単に死滅するだけでなく、自然環境中でも増殖性がなく速やかに死滅する。AESN1331 株を実験的にマウスに噴霧投与した場合、投与後 1 日でも菌は検出されなかった。

ガルエヌテクト CBL の有効性
ガルエヌテクト CBL を SPF 白色レグホン鶏（レイヤー）及びブロイラーコマーシャル鶏（ブロイラー）に 4 週間隔で 2 回投与し、その 2 週後に鶏大
腸菌野外強毒株を静脈内攻撃して、生死を観察することで有効性を調べた。レイヤーでは、非投与対照

ガルエヌテクト CBL の安全性
95 週齢鶏への静脈内攻撃試験では、3 × 10 CFU群が全羽死亡したのに対して、何れのワクチン投与

以上の AESN1331 株を含む培養液を接種しても鶏群でも死亡が抑制されて有意な羽数が生残した。さは死亡せず、50％致死量を算出した結果、親株と比らに、ブロイラーでも非投与対照群が 9 羽死亡した

べて約 10 倍、野外強毒株と比べると約 20 倍以上ものに対して、ワクチン投与群では全羽が生残した

病原性が低下していた（図 3）。また、AESN1331 株（図 5）。免疫持続期間は 2 回投与後少なくとも 10を鶏に噴霧した場合、投与後 1 日の呼吸器からは検週間であることが判明した。有効性評価に用いた静出されたが、投与後 4 日には検出されなくなった。

脈内攻撃試験では、死亡率以外に、臨床症状の軽減、実質臓器での病変形成の軽減並びに菌分離率の低減
といった効果も確認された。
6 万 3 千羽を用いて 4 施設で実施した野外臨床試
験では、初生のブロイラー鶏に噴霧投与して、3 〜

図35 週齢鶏への静脈内攻撃試験での LD50 値

図4

噴霧投与後の臓器ごとの菌検出期間

8（40）

日生研たより図5

試作ワクチン免疫鶏を野外強毒株で攻撃した後の生残羽数

4 週後に再度噴霧投与あるいは散霧投与を行った。

対応できるようにした。

その結果、1 施設では急性敗血症型鶏大腸菌症の発

また、噴霧投与及び散霧投与を選択した最大の理

生を防ぐことができた。亜急性型鶏大腸菌症のみが由として、投与対象鶏を保定する必要がなく、注射認められた別の施設では、農場での増体重や製品化の様に痛みを伴うことがなく、飲水投与の様に投与率といった出荷成績でワクチンの効果が確認された。 前の断水といった措置も必要ないことから、極めてまた、鶏大腸菌症の発生を明瞭に確認できなかった

ストレスフリーで鶏にやさしい投与方法であること

施設においては、一部の鶏を抽出して実施した静脈が挙げられる。

内攻撃試験でその有効性が確認された。
ガルエヌテクト CBL の効能又は効果について
ワクチン投与方法について

ガルエヌテクト CBL を用法及び用量通りに投与研究・開発段階において、ガルエヌテクト CBLされた鶏は、実験室内試験において敗血症型大腸菌の能力を最大限に引き出す様々な投与方法について症を模した静脈内攻撃を耐過することができ、野外検討した結果、省力的でかつ現場での投与が簡単で臨床試験では急性敗血症型鶏大腸菌症の発生からもあり、何よりも鶏にとってストレスフリーな投与方免れることができた。また、野外臨床試験では農場法として、初回は噴霧投与、第 2 回目は噴霧あるいを汚染している多くの血清型の鶏大腸菌株に対しては散霧投与で行うことと設定した。細かい霧状のミも有効性を示す結果が得られたことから、ワクチンストとなった AESN1331 株は呼吸によって吸入さの効能又は効果として「鶏大腸菌症の予防」とする

れ、鼻腔、気管そして肺の上皮細胞において定着し、十分な根拠が得られた。

免疫システムに刺激を与えることで強力な防御能を鶏に付与する。
ガルエヌテクト CBL では、鶏 1 羽当たりの投与

ガルエヌテクト CBL により誘導される免疫についての考察量に 0.1 〜 0.5 mL と幅を持たせた。開発段階にお自然免疫から獲得免疫といった免疫システムの研ける実験室内試験で使用した噴霧器では 1 羽当たり究が進む中で、ウイルス感染及びウイルス生ワクチ

0.3 mL の調整で、鶏への均一な投与が可能であった。

ンによる免疫についてはその詳細が次第に明らかにしかし、実際の現場では様々な噴霧器や散霧器が用されつつある。一方で、細菌感染においても強毒ないられ、種々の噴霧方法や散霧方法が確立されてい病原菌を用いた自然免疫に関する研究が盛んに行わる。従って、投与量を固定した場合、投与鶏群へのれ、その実態が明らかにされ始めたが、生菌ワクチ

均一な噴霧あるいは散霧が不確実になることが危惧

ンによる免疫については未だ詳細が解明されないまされたことから、投与量に幅を持たせることで現場まとなっている。そのため、ガルエヌテクト CBL

59（3）、2013を投与することで、鶏においてどのような自然免疫9（41）に期待しているところである。

が誘導されて、獲得免疫へと移行しているのかを明らかにすることは今後の課題である。しかしながら、現段階でガルエヌテクト CBL を投与した鶏の鼻腔

最後にや肺において軽度な偽好酸球浸潤やリンパ球浸潤がこれまでの細菌ワクチンは不活化菌体抗原が主流観察され、細胞壁成分である O78LPS に対する IgG

であり、近年は細菌が分泌・発現するごく一部の抗産生も確認されている。これらのことからも、ガル原を含有したワクチンへと傾倒していく流れもある。

エヌテクト CBL を投与された鶏の体内では AESN

しかしながら、細菌感染症を不活化菌体抗原や部分

1331 株による刺激で免疫が活性化していることは抗原だけで予防し病原体を農場から排除することが、明らかである。また、生ワクチンであることから細

現実には困難であることが多くの病原体で既に明ら

胞性免疫の誘導、粘膜からの免疫であることからかになっている。例外的には、一部のヒト用ワクチ

IgA の産生も期待できると考えている。これまでにンで感染時に生体内で発現される抗原物質の幾つか論文等で発表されている鶏大腸菌の病原性に関するをコンポーネント化したワクチンが実用化されてい研究報告から AESN1331 株の生体内での動態をイるが、動物用ワクチンでは開発・製造コスト面などメージすると、AESN1331 株は生きた状態で鶏の呼から実現化までにはまだまだ長い時間を要すると思

吸器内に入り込み、Ⅰ型線毛を用いて上皮細胞に接われる。一方で、今回新規に開発されたガルエヌテ

着した後に、その粘膜細胞上であるいは貪食細胞に

クト CBL は生体内で模擬的な感染を起こした後に取り込まれた後に様々な抗原物質を分泌しているも投与鶏の免疫によって速やかに体内から排除されてのと推察される。しかし、免疫システムに補足されいると考えられ、通常の不活化抗原では起こらない

貪食細胞に取り込まれた後は、ワクチン株自体に生高度で強力な免疫の誘導が期待できる。今後は、こ体内での増殖性が無いことから、その後速やかに殺のような生物活性を保有するが増殖活性を持たない菌されるものと予想される。そして生体内で発現し細菌の感染による免疫誘導、そして遺伝子組換え体

た様々な抗原物質は、菌体成分と共に抗原提示され、には該当しない遺伝子欠損株といった 2 つのコンセ

その結果細胞性免疫を強く誘導し、次いで液性免疫

プトに基づいた生細菌ワクチンの開発が加速され、も誘導していると推定している。本ワクチンに対す

鶏にやさしいストレスフリーなワクチンが普及してる宿主応答のメカニズム解明は、今後の研究・解析

いくことが期待される。

10（42）

日生研たより論文紹介

マウスモデルにおいて食事性の肥満は 2009 年型
パンデミック H1N1 ワクチンの効果を劇的に減弱させる
山下龍Diet – induced obesity dramatically reduces the efﬁcacy of a 2009 pandemic H1N1 vaccine in a mouse model.
Kim, Y. H., Kim, J. K., Kim, D. J., Nam, J. H., Shim, S. M., Choi, Y. K., Lee, C. H. and Poo, H.
J. Infect. Dis.（2012）205（2）: 244 – 251.
論文は上記雑誌のホームページより無料で入手可能です。紙面の都合もあり、参考文献は省略し、一部を省略あるいは要約して掲載致します。

要約

背景

様々な疾患を増悪させる危険因子である肥満は、

インフルエンザはインフルエンザウイルスによるワクチンの効果にも悪影響を与えると考えられてい呼吸器疾患で、空気感染により広がり、強い伝染力る。近年、A 型インフルエンザウイルス H1N1 亜型を持つことから、世界的な罹患率および死亡率増加の世界的流行の結果、多くの死者が認められ、よりの原因となる。前世紀だけで 3 度のインフルエンザ

効果的なワクチン戦略の開発が必要となった。本論の世界的大流行（パンデミック）がみられた。すな

文では、パンデミック H1N1 インフルエンザウイル

わち 1918 年のスペインインフルエンザ、1957 年のスに対するワクチンの免疫応答および予防効果におアジアインフルエンザ、そして 1968 年の香港イン

け る 食 事 性 肥 満 の 影 響 を 調 査 し た。4 週 齢 のフルエンザである。それらの中で、1918 年の流行

C57BL/6J マウスを用い、高脂肪食群（肥満マウス）

は最も大きな影響を与え、世界中でおよそ 3000 –および標準食群（対照マウス）を設定し、市販され5000 万人の死者を出した。2009 年には、新型の Aている単味の 2009H1N1 ワクチンによる免疫後、抗型インフルエンザウイルス H1N1 亜型が米国で出原特異抗体反応と中和活性を調べた。また、ワクチ

現し、世界保健機構（WHO）は 21 世紀最初のインン接種後に、インフルエンザ A（H1N1）ウイルス

フルエンザのパンデミックを宣言した。

（A/California/04/2009, CA/04）を 接 種 し、発 症 と肥満は世界的に蔓延しており、WHO は 2015 年

死亡率を調べた。その結果、ワクチンにより誘導さまで現在の傾向が続くと 23 億人の成人が標準体重れた H1N1 特異抗体と中和活性は、肥満マウスにおを 上 回 る こ と に な り（BMI ≥ 25）、7 億 人 が 肥 満

いて著しく減弱した。抗体反応と同様に、ウイルス（BMI ≥ 30）になると予測している。多くの健康問

接種後の肺のウイルス力価は肥満マウスで有意な高題や慢性病が、肥満（たとえば 2 型糖尿病）や脂肪値を示した。加えて肥満マウスでは、肺組織におけ組織の増加に関連するホルモンや代謝の変化と関連る炎症性サイトカインおよびケモカインの著しい増する。また、肥満は感染の危険因子であり、2009

加、重度な肺炎、ならびに対照マウス（14％）に比

年のパンデミック H1N1 ウイルス（2009H1N1）にべ高い死亡率（100％）を示した。これらの結果は、よる死亡例において最も多く確認された基礎疾患で2009H1N1 ワクチンにより誘導される予防的免疫応あった。さらに米国疾病管理予防センターは、肥満

答および防御効果が、食事性の肥満において明らか者は 2009H1N1 に対して罹患や死亡の危険性がよに減弱することを示した。これらの結果は、肥満者

り高いことを示唆した。また、最近の研究において、を含むハイリスクグループのための新たなワクチン

インフルエンザウイルスに感染した肥満動物が、死戦略の必要性を示唆している。

亡率の増加や免疫応答の減弱を起こすことが示唆さ59（3）、2013

11（43）れた。しかしながら、肥満はインフルエンザの症状

る い は 高 脂 肪 食（HFD : high – fat diet）を 15 週 間の増悪に関連するとされるにも関わらず、インフル給餌した。（1）ワクチン未接種標準食（NCD）群

エンザワクチンの効果に対する肥満の影響について（NCD + リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、n = 12）、は、ヒトあるいは動物モデルにおいてまだ研究され（2）ワクチン接種標準食（NCD）群（NCD + ワクていない。

チン、n = 13）、
（3）ワクチン未接種高脂肪食（HFD）

不活性化されたインフルエンザウイルスは、ヒト群（HFD + PBS、n = 12）、（4）ワクチン接種高脂肪

インフルエンザワクチンの主要コンポーネントであ食（HFD）群（HFD + ワクチン、n = 13）。HFD には、り、単味の H1N1 ワクチンはパンデミック H1N1 を31.6％のラードを含む改良 Western diet（D12492 ;制御するために広く使用されてきた。そして、観察

Research Diets, New Brunswick, NJ）を使用した。

研究により、市販されている 2009H1N1 ワクチンはNCD には、標準飼料（2018S ; Harlan Teklad）を使

免疫応答を誘導し、ウイルスに感染したヒトの死亡用した。10 週、12 週および 14 週に、1.6 μ g のパ

リスクを減らすことができることが示された。しかンデミック H1N1 スプリットワクチン抗原（CA/07,

しながら、ワクチン戦略の大部分は健康な人々に向Green Flu – S）あるいは PBS を筋肉内に接種した。

けて開発されている。さらに、ワクチン接種を受け

3 回 目 の 接 種 1 週 間 後 に、50％マ ウ ス 致 死 量

た個人の健康状態がワクチンの効果に影響を及ぼす（MLD50）の 10 倍量の野生型 CA/04 ウイルスを鼻ことがある。たとえば、季節性のインフルエンザワ

腔内に接種した。その後、体重の変化と死亡率をクチンの効果はハイリスクな高齢者で減弱すること

14 日間にわたり観察した。使用した H1N1 抗原はが報告されており、また、B 型肝炎ウイルスワクチ

CA/07（H1N1）ウイルスに由来し、WHO によりンに対する免疫応答の減弱が肥満の感染者で認めらワクチン製造に推薦された株に基づいている。

れている。しかしながら、2009H1N1 インフルエン
ザに関して、健康なグループと健康を害しているグ

血液パラメーターの解析

ループ間でのワクチン接種の効果の差に関する検討

ウイルス接種前にイソフルランによる麻酔下で、はほとんど行われていない。本研究では、高脂肪食

すべての群のマウスの眼窩静脈叢より採血し、血漿（HFD）の給餌により誘発した肥満マウスモデルを中の血糖、インスリンおよびレプチン濃度を測定し用いて、現行のパンデミックワクチンの効果についた。

て調査した。
赤血球凝集抑制試験
血漿をレセプター破壊酵素（RDE ; Denka Seiken,
材料と方法Campbell, CA）で 処 理 し、血 球 球 凝 集 抑 制 試 験ウイルス（HI）を行った。

攻撃に使用されたインフルエンザ A（H1N1）ウイルス（A/California/04/2009, CA/04）は、St. JudeChildrenʼs Research Hospital（Memphis, TN）の Dr

抗体検査
CA/04 ウイルスの抗体価は ELISA により測定しRobert G. Webster より提供された。

た。

動物実験

肺の病理組織学検査

Korea Research Institute of Bioscience andウイルス接種後 8 日に、感染マウス（n = 5 – 6）

Biotechnology（KRIBB）の 4 週齢の雄の C57BL/6J

を安楽殺後、肺を採材し、HE 染色標本を作製した。

マウスを使用した。動物は特定病原体フリーの施設

肺病変の程度は、炎症細胞の相対的な浸潤程度によ（KRIBB）で、自由摂餌（標準飼料；Harlan Teklad,

り半定量的に評価し、以下の 0 から 4 にスコア化しMadison, WI）、12 時間の明暗周期、22 ± 2℃の環た。0：炎症反応なし、1：肺の 1 – 25％に軽度の炎境下で 2 週間馴化した。その後、無作為に以下の 4症細胞浸潤、2：肺の 25 – 50％により重度の炎症、群に分配し、標準食（NCD : normal – chow diet）あ3：肺の 50 – 75％に重度の炎症、4：ほぼすべての肺12（44）

組織に炎症。

日生研たよりおいて違いは認められなかった（図 1）。これらの結 果 か ら、15 週 間 HFD を 給 餌 す る こ と に よ り

定量的リアルタイム PCR

C57BL/6J マウスに食事性肥満（DIO）および肥満ウイルス接種後 0 日、3 日および 8 日に安楽殺したに関連するインスリン抵抗性の両者を誘発できるこマウスの肺組織において monocyte chemoattractantとを確認し、この実験系がヒトの DIO にふさわし

protein – 1（MCP – 1）、regulated on activation,

いモデルであることを示した。

normal T – cell expressed and secreted（RANTES）、
tumor necrosis factor α（TNFα）、interleukin（IL）

2009 パンデミック H1N1 ワクチンの予防効果は肥– 1β、IL – 6 および IL – 10 の定量を SYBR Green 法

満マウスにおいて減弱されるにより行った。データはすべてリボソーム 18S の
cDNA の発現量に対して標準化した。

パンデミック H1N1 インフルエンザワクチンの予防効果に対する DIO の影響を評価するために、3回目のワクチン接種後 1 週に野生型 CA/04 ウイル

統計解析

スを接種した。図 2A に示すように、ワクチン接種

数値データは、平均 ± 標準誤差で示した。群間NCD 群の生存率は、ウイルス接種後 14 日においての比較は、両側の Student t 検定あるいは一元配置も比較的高値（86％）を示した。一方、ワクチン接分散分析を用い、有意水準は 5％とした。

種 HFD 群（肥満マウス）では、ウイルス接種後 12日を超える生存はなく、肥満が防御免疫の誘導を阻害することが示唆された。体重は、ワクチン接種

結果

HFD 群 で は 持 続 的 な 減 少 を 示 し、ワ ク チ ン 接 種

肥満は高脂肪食を与えた C57BL/6J マウスで誘発でNCD 群では 8 日まで体重減少を示したが、その後きる

回復がみられた（図 2B）。一方、ワクチン未接種

ワクチンの効果に対する肥満の影響を評価するた

NCD 群あるいは HFD 群では、ウイルス接種後 8めに、高脂肪食（HFD）を 15 週間にわたり自由摂日あるいは 9 日まで生存したものはおらず、体重は餌させることにより肥満マウスモデルを確立した。

持続的に減少した（図 2）。

図 1A に示すように、体重は標準食（NCD）群に比パンデミック H1N1 インフルエンザウイルスは、

べ高脂肪食（HFD）群で劇的に増加した。さらに

主に呼吸器の細胞に感染し、肺に強い炎症と傷害を

食事性肥満（Diet – induced obesity; DIO）の定量分引き起こし、げっ歯類のモデルでは最終的に死をも析のために、血糖、インシュリンおよびレプチン濃たらす。より高い死亡率を示した肥満マウスが肺組度を測定した。これらすべてのパラメーターは、織に重度な病変を伴っていたかどうかを確認するた

HFD 群で有意に増加した（図 1B – D）
。また、すべめに、ウイルス接種後 8 日の肺の HE 染色標本を検てのパラメーターはワクチン未接種群と接種群間に査した。図 3A に示すように、肺の病理学的スコア

図 1 食事性肥満マウスの体重および血液パラメーターの変化
C57BL/6J マウスに標準食（NCD）あるいは高脂肪食（HFD）を 15 週間給餌し、体重を毎週測定した（A）。15
週における血糖（B）、インシュリン（C）そしてレプチン（D）濃度を測定した。
**P < 0.001, NCD + PBS vs HFD + PBS. ††P < 0.001, NCD + vaccine vs HFD + vaccine.

59（3）、2013

図2

13（45）

パンデミック 2009H1N1 ウイルス接種後の標準食（NCD）給餌マウスと高脂肪食（HFD）給餌マウスの生存率と体重の変化
各群のマウスに H1N1 ウイルスを接種し、生存率（A）と体重（B）の変化をウイルス接種後 14 日間測定した。

は、ワクチン接種 NCD 群に比べワクチン接種 HFD

ス力価は、ワクチン接種 NCD 群（幾何平均抗体価

群で有意に高値を示した。さらに、肺の硬化がワク（GMT）2.4 ± 0.5 log10 EID50/mL）に比べワクチン

チン接種 HFD 群に認められたが、ワクチン接種

接種 HFD 群では（GMT 3.5 ± 0.0 log10 EID50/mL）

NCD 群では稀であった（図 3B）。肥満マウスでは、有意に高値を示した。これらの結果は、DIO がマ

剥離性の細気管支炎、気道上皮細胞のアポトーシス、

ウスモデルにおいてパンデミック 2009H1N1 ワク

実質内のアポトーシス残渣の集積、肺胞出血およびチンの予防効果を明らかに減弱させることを示した。

気管支血管周囲への重度の細胞浸潤を含む化膿性気管支肺炎を示し、これらの症状は NCD 群では軽度2009 パンデミック H1N1 ワクチンに対する液性免であるか、あるいは認められなかった（図 3B）。肥

疫の著しい低下が肥満マウスで認められる

満マウスに認められた高い死亡率とより重度な炎症

インフルエンザウイルスに対する中和抗体が感染に一致して、CA/04 ウイルス接種後の肺のウイル防御に重要な役割を果たし、また、スプリットワク

図 3 2009H1N1 ウイルス接種後の食事性肥満（DIO）マウスの肺の病理（A）肺の組織学的検査は（B）に示す標本でスコア化した。
（B）CA/04 ウイルス接種後 8 日の標準食（NCD）+ vaccine 群および高脂肪食（HFD）+ vaccine 群のマウスの代表的な肺の肉眼および組織（HE 染色）写真。HFD 給餌マウスでは、剥離性細気管支炎（ﬁlled arrowhead）、気
管支上皮細胞のアポトーシス（open arrowhead）、実質内へのアポトーシス残渣の集積（open arrowhead）、肺胞出血（asterisk）および気管支血管周囲への細胞浸潤（ﬁlled arrow）が認められた。BL：細気管支、VL：血管。

14（46）日生研たよりチンは Th2 に偏った液性免疫を引き起こす傾向に接種後 3 日および 8 日では NCD 群に比べ HFD 群

あることから、NCD 群と HFD 群（肥満マウス）

で著しく増加した（図 5A、5B）。

でのワクチンによる抗体誘導について調べた。マウ

ケモカインの発現増加に加え、3 つの炎症性サイ

スに不活化されたスプリット CA/07 ワクチン（1.6

ト カ イ ン（TNFα、IL – 1βお よ び IL – 6）レ ベ ル が

g HA protein）を 3 回接種し、最終接種後 1 週に抗ウイルス接種後 3 日および 8 日の HFD 群で劇的に体産生レベルを確認した。図 4A に示すように、HA

増加しており（図 5C – E）
、この群での肺の病理組に特異的な総 IgG 量は、HFD 群の血清の 400 倍か織スコアの増加とよく一致していた。興味深いこと

ら 25600 倍の間で有意に低下した。産生された抗体に、抗炎症性サイトカインである IL – 10 もまたウの中和活性を調べるために HI 法を実施した。HI 抗イルス接種後 8 日のワクチン接種 HFD 群で有意な体の GMT と HI 陽性血清サンプルはともにワクチ増加を示したことから（図 5F）、増大した炎症反応

ン接種 NCD 群に比べワクチン接種 HFD 群で著しによりネガティブフィードバックが刺激されたことく減少した（図 4B、4C）。これらの結果は、抗原が示唆された。これらのデータは、強い炎症性反応

特異抗体反応の誘導が DIO マウスで減弱すること

が HFD 群のウイルス感染において引き起こされ、を示し、肥満マウスはワクチンを接種してもパンデ

そしてこれらの過剰な免疫応答はワクチンを接種しミック H1N1 の感染に対しより脆弱である可能性ても NCD 群のようには軽減されないことを示しを示唆した。

た。

2009 パンデミック H1N1 ウイルスはワクチンを接種した肥満マウスに過剰な炎症性免疫応答を引き起こす

考察
インフルエンザのパンデミックは、世界経済や世ワ ク チ ン を 接 種 し た HFD 群（肥 満 マ ウ ス）と界的な保健問題と広く密接な関係を持っている。いNCD 群にウイルスを接種し、免疫を調節するサイ

くつかの研究において、2009H1N1 感染者の間で肥トカインとケモカインの発現レベルについて調べた

満が死亡率の増加と関連していることが報告されてところ、ウイルス接種前では 2 つのケモカイン、おり、肥満患者には優先的にワクチンを接種し、感MCP – 1 と RANTES の mRNA レ ベ ル は NCD 群 に染に対しては早急に治療を行うべきであることが示

比べ HFD 群でより低値を示した。しかしながら、された。しかしながら、肥満がヒトあるいは肥満動

MCP – 1 と RANTES の mRNA レベルは、ウイルス物モデルへの 2009 H1N1 ワクチンの効果に影響す

図 4 ワクチンにより誘導される 2009H1N1 ウイルス特異抗体反応（A）H1N1 ウイルス特異血清抗体価は ELISA 法により検出し、450 nm の吸光度を測定した。
（B）、（C）抗体の HI 活性は（B）の HI 価の分布、HI 陽性血清サンプルの GMT（≥ 10）、（C）陽性血清サンプル数を基に決定した。*P < 0.05, **P < 0.001 NCD + vaccine 群と比較した。

59（3）、2013

図515（47）

2009H1N1 ウイルス接種後のワクチン接種標準食（NCD）給餌マウスとワクチン接種高脂肪食（HFD）給餌 DIO マウスの肺におけるケモカインとサイトカインの発現。
*P < 0.05, **P < 0.001 NCD + vaccine 群と比較した。

るか否かを調べた研究は知る限りではない。我々の高脂肪食（HFD）群（肥満マウス）では中和活性

知 る 限 り で は 本 報 告 が、食 事 性 肥 満（DIO）のと抗体産生の著しい抑制が認められた。

C57BL/6J マウスにおいて H1N1 インフルエンザワ

インフルエンザウイルス感染により、サイトカイ

クチンの効果が著しく減弱されることを示す初めて

ンやケモカインが特定のカスケードにより産生されの報告である。

る。最初に抗ウイルス性や炎症性のサイトカインが今回の研究において、我々は高脂肪食（HFD）

誘導され、続いて IL – 6、最後に MCP – 1 や RANTESを 15 週間にわたり給餌したマウスが血糖やインなどのケモカインの誘導が起こる。これらのケモカ

シュリン、レプチン濃度に反映されるインシュリン

インは他の自然免疫や適応免疫細胞の動員、活性化

抵抗性の兆候と食事性肥満（DIO）を引き起こすこを促進し、ウイルス感染に対する効果的な免疫応答とを示した。肥満やインシュリン抵抗性は、インフに関与している。健康体では、これらの抗ウイルス

ルエンザウイルス感染に対する免疫応答を障害し、性の免疫応答はインフルエンザウイルスの複製を制

パンデミック 2009H1N1 感染における致命的な合御するために十分な強さを持つが、障害された免疫併症の潜在的な危険因子となる。さらに、DIO で状態の下では、ウイルスの複製を適切に制御できず、のレプチンの慢性的な上昇は、免疫応答に不都合な

過剰な炎症反応が持続し、最終的には気道の構造的

レプチン抵抗性の状態を引き起こすと考えられる。

な傷害を引き起こす。インフルエンザウイルスに対

このことに一致して、破傷風や B 型肝炎のワクチ

するワクチンは、抗原に特異的な免疫応答を誘導し、ンに対する抗体反応の減弱が、ヒトの肥満においてウイルス感染を防ぐかウイルスの複製を制御するこ報告されている。本研究では、DIO マウスにパンとにより過剰な免疫応答を鎮めることができる。本

デミック H1N1 インフルエンザに対する現行の単研究において、HFD 群では NCD 群に比べウイル

味のヒト CA/07 ワクチンを接種し、液性免疫応答

ス接種後の肺における炎症性サイトカイン（TNFα、について調べた。正常な抗原特異抗体反応はワクチ

IL – 1βおよび IL – 6）の著しい増加を認めた。これ

ン接種標準食（NCD）群において誘導されたが、らのサイトカインの著しい増加に加え、肺での抗炎16（48）日生研たより症性サイトカインである IL – 10 の発現は、炎症性る。樹状細胞の機能については本研究では直接検討

サイトカインを抑制し恒常性の維持に関与し、MCPしていないが、肥満マウスにおける樹状細胞の機能– 1 や RANTES のケモカインと同様に 2009H1N1 接不全がワクチン効果に障害をもたらしたと考えるこ

種後の HFD 群において著しく増加した。

とは妥当である。樹状細胞に加え、肥満マウスでは、病理学的検査では、ワクチン接種 HFD 群は NCD

インフルエンザ感染に対する肥満動物の脆弱性の原群に比べ肺実質への炎症細胞の顕著な増加を伴う重因を裏付けるナチュラルキラー細胞の数の減少ばか

度の気道傷害と肺での高いウイルス力価を認めた。

りか T 細胞群の減少も示されている。とりわけ、

さらに、ワクチン接種 HFD 群は、NCD 群で認めメモリーＴ細胞の応答が肥満マウスのインフルエン

られた体重の回復は示さず、また、CA/04 ウイル

ザ感染後に障害されることが解り、我々の見解を裏ス接種後 12 日まで生き残ったワクチン接種 HFD付けた。

群は認められなかった。一方、NCD 群のウイルス

ま と め る と、ワ ク チ ン 接 種 後 に パ ン デ ミ ック

接種後 14 日の死亡率はわずかに 14％であった。こ2009H1N1 ウイルスを接種した DIO マウスでは、れらの結果は、2009 H1N1 ワクチンにより誘導され免疫応答の障害や過剰な炎症反応を示し、死亡率がる液性免疫応答やウイルスに対する感染防御能は、増加することを示した。これらの結果は、従来のワ

DIO マウスにおいて減弱することを示した。

クチン戦略が増加する肥満人口に対してはそれほど免疫機能の低下は、ヒトと同様に多くの肥満動物

有効ではない可能性を示唆し、そして、このハイリモデルにおいても認められている。高脂肪食を与えスクグループへのインフルエンザワクチンについてたマウスの樹状細胞は機能障害を示し、ワクチン接より効果的で個々に合った戦略の開発の必要性が示

種後の抗 B 型肝炎の表面およびコア抗原に特異的された。

な免疫応答の減弱の原因となることが報告されてい日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（隔月 1 回発行）

（通巻 580 号） 平成 25 年 4 月 25 日印刷
発行所〒 198 0024

生命の「共生・調和」を理念とし、生命体の豊かな明日と、研究の永続性を願う
気持ちを快いリズムに整え、視覚化したものです。カラーは生命の源、水を表す

東京都青梅市新町 9 丁目 2221 番地の 1

TEL：0428（33）1056（企画学術部） FAX：0428（33）1036
発行人
編集室「青」としています。

印刷所
表紙題字は故中村⒥治博士の揮毫

平成 25 年 5 月 1 日発行（第 59 巻第 3 号）

一般財団法人 日本生物科学研究所

岩田

晃

委

員／山下 龍（委員長）、大嶋 篤、堤 信幸

事務／企画学術部

株式会社 精ഛ社（無断転載を禁ず）