R4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書

かごしまのさかな輸出産品品質向上支援事業（抗酸化物質の給餌による養殖ブリの褐変抑制対策）
大山

隼人・竹内

唯・久保

栄一・今岡

慶明・立石
堀内

【目

章二・保

聖子

智矢・外薗

博人

的】

鹿児島県は，養殖ブリの生産量が全国一位であり，近年は海外輸出にも取り組んでいる。
主要な輸出先である米国へは，血合筋の褐変抑制のために国内の加工場にて CO ガス処理された翌日，フィレ加工し－20℃に凍結された状態で流通している。しかし，米国以外の輸出
先は，CO ガス処理が認められておらずチルド状態での流通が主となっている。そこで，市場からは消費期限を延ばすため，凍結処理したノン CO での流通が求められているが，ブリフィレを CO ガス処理せずに冷凍し解凍すると血合筋が著しく褐変するため，輸出先国から敬遠される傾向が強く，輸出に取り組む県内加工場からは冷凍解凍時の血合筋の褐変対策を求める声が多い。
ブリの褐変対策は，これまでに抗酸化物質の給餌や水揚げ時のストレス軽減，加工段階での機能性包装資材の利用，輸送時における-40℃以下の低温輸送等が検討されてきた。なかでも抗酸化物質給餌によるブリフィレの褐変対策は，α-トコフェロールやアスコルビン酸
１），天然由来のオリーブ葉２），セレノネイン３），ユズ４，５），アスタキサンチン・γ-オリザノール６）といった抗酸化物質を含む食物等がブリの血合筋の褐変抑制に効果があるとした報告が多い。
そこで，今回抗酸化作用のあるビタミン C 及びエルゴチオネインが含まれるヒラタケ粉末を飼料に混合してブリに給餌し，血合筋の褐変状況の経時変化やメト化率，生体内の ATP
関連物質及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下，NAD という。
）
・ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下，NADP という。）濃度，硫黄化合物のメタボローム
解析について分析し，抗酸化物質による血合筋の褐変抑制効果や褐変進行と褐変に影響を及ぼす生体内物質との関連性を調べたので報告する。
【材料及び方法】
本試験は，株式会社ヒガシマルに飼育委託したブリ及び鹿児島県水産技術開発センター（以下，水技センターという。
）で飼育したブリを用いて血合筋の褐変抑制効果や褐変進行と褐変に影響を及ぼす生体内物質との関連性について検討した。
１

試験Ⅰ

１）試験区
試験区は，抗酸化物質としてビタミン C を５％エクストルーダー飼料（以下，EP 飼料という。
）に内添したビタミン C 区，ヒラタケ粉末を 10％EP 飼料に内添及び 10％EP

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飼料に外添したエルゴチオネイン区，EP 飼料に両抗酸化物質を添加しない対照区の３区とした。飼料中のビタミン C 及びエルゴチオネイン濃度は，表１に示す。
なお，ヒラタケ粉末には，アミノ酸誘導体の一種であり強力な抗酸化作用があるエ
ルゴチオネインが含まれる。
２）飼料及び抗酸化物質
飼料は，株式会社ヒガシマルで製造された粒径 18mm の EP 飼料を用いた。試験区ごとの抗酸化物質及び添加量は上記のとおりとし，試験区ごとの EP 飼料の組成成分表は表２に示す。
３）供試魚及び飼育尾数
給餌試験開始時における供試魚の平均魚体重は，4.5～4.6kg で，飼育尾数は，対照
区，ビタミン C 区及びエルゴチオネイン区においてそれぞれ 20 尾とした。
４）飼育期間
令和４年７月 15 日から令和４年 10 月 11 日までの 89 日間とした。
５）飼育設備株式会社ヒガシマルが所有する 20ｔ陸上水槽を使用した。
６）給餌及び体長等測定
給餌回数は週３回飽食給餌とした。体長等測定は，令和４年７月 15 日と令和４年
10 月５日の２回行い，期間中の増重量及び増肉係数を算定した。
７）取上及びサンプリング
ブリの取上は，いちき串木野市にある株式会社ヒガシマルの魚類実験棟において令和４年 10 月 11 日に行った。取り上げたブリは，延髄破壊後鰓を切断し氷海水中で脱血した後，発泡スチロール容器に収容し水技センターまで車で輸送した。輸送したブ
リは，三枚におろし，皮を剥いだ後，体側に垂直に厚さ１cm の切り身にした。切り身は，旭化成パックス株式会社製のナイロンポリ袋飛龍 HN-102（150mm×250mm）に入れ真空包装し，一晩－35℃で急速凍結した後，翌日から 41 日間－25℃で凍結保管した。
保管後，流水で解凍したのちサランラップで封をしたアルミトレイに切り身を並べ５℃の低温実験室でサンプリングを行った。
８）分析・解析項目
分析・解析項目は，以下の①～⑦のとおりとし，分析に供するサンプリング時間は，②，③及び④が解凍直後，解凍２時間後，解凍４時間後，解凍６時間後，解凍８時間
後，解凍 10 時間後，解凍 12 時間後及び解凍 24 時間後，⑥及び⑦が解凍前（凍結中），
半解凍時，解凍直後，解凍 30 分後，解凍１時間後，解凍２時間後，解凍４時間後及び解凍６時間後のものとした。
なお，分析・解析は，①が株式会社ヒガシマル，②から⑤までは水技センター，⑥は国立研究開発法人水産研究・教育機構，⑦は国立大学法人筑波大学が行った。
①増肉係数

R4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書：期間中の給餌量から期間中の増重量を除することで算出した。
②切り身の写真撮影：写真撮影は，５℃の低温実験室において上記のサンプリング時間ごとにニコン
社製デジタルカメラ D5200 を用いて行った。
③血合筋のメト化率の測定：メト化率の測定に用いる血合筋は，サンプリング時間ごとに血合筋をハサミで切り取り５ｍL スクリューチューブに入れ液体窒素で凍結後，分析に供するまで－40℃の冷凍庫で保管した。その後，凍結した血合筋に冷却した蒸留水を５倍量加え，15,000rpm でホモジナイズした後，13,000rpm で 10 分間遠心分離
し，上清を 0.22μm のメンブランフィルターで濾過後，分光光度計を用いて548nm 及び 524nm の吸光値を測定した。メト化率の計算は，井ノ原らの方法７）を用いた。すなわち，metMb（％）＝－99.70（A548nm/A524nm）＋164.96。A は吸
光値。
④血合筋のｐH の測定：ｐH の測定に用いる血合筋は，サンプリング時間ごとに血合筋をハサミで切り取り５ｍL スクリューチューブに入れ液体窒素で凍結後，分析に供するまで－
40℃の冷凍庫で保管した。その後，凍結した血合筋に冷却した 20mM モノヨー
ド酢酸ナトリウムを３倍量加え，15,000rpm でホモジナイズ後，ｐH メーター
（HORIBA 社製ｐH METER D-51）で測定した。
⑤血合筋及び切り身の一般成分（水分，粗タンパク，粗脂肪）の測定：一般成分に用いる切り身は，１cm カットした切り身３切れを旭化成パックス
株式会社製のナイロンポリ袋飛龍 HN-102（150mm×250mm）に入れ真空包装し，分析に供するまで－35℃の冷凍庫で保管した。その後，血合筋と切り身それぞれをホモジナイズし分析に供した。水分が乾燥恒量法により，粗脂肪がソック
スレー法により，粗タンパクがケルダール法で定量した全窒素量に 6.25 を乗じて測定した。
⑥血合筋の ATP 関連物質及び NAD，NADH，NADP，NADPH の測定：ATP 関連物質及び NAD，NADH，NADP，NADPH の測定は，対照区，ビタミン C 区
及びエルゴチオネイン区の血合筋から測定時間ごとにサンプリングし，500μL のメタノールを加え，－80℃で保管した。その後，サンプルにクロロホルム
500μL 及び L-MethionineSulfon を１mM になるように加え，振盪した後上澄みを濾過し，キャピラリー電気泳動質量分析計に供して測定した。
⑦血合筋及び普通筋の硫黄化合物のメタボローム解析（サルファーインデックス）：サルファーインデックスは，対照区，ビタミン C 区及びエルゴチオネイン区の血合筋及び普通筋を用いてそれぞれを行った。血合筋及び普通筋それぞれから抽出した硫黄化合物をサルファーインデックスメソッドにより LCMSMS

R4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書

8050（島津製作所製）を用いて分析を行った。検出された硫黄化合物の定量データは，多変量解析を行い，サンプル間の類似度のマッピング解析（R ソフト
vegan パッケージ活用）を行った。
２

試験Ⅱ

１）試験区
試験区は，抗酸化物質としてビタミン C を５％エクストルーダー飼料（以下，EP 飼料という。
）に内添したビタミン C 区，ヒラタケ粉末を 10％EP 飼料に内添及び 10％EP
飼料に外添したエルゴチオネイン区，EP 飼料に抗酸化物質を添加しない対照区の３区とした。飼料中のビタミン C 及びエルゴチオネイン濃度は，表１に示す。
なお，ヒラタケ粉末には，アミノ酸誘導体の一種であり強力な抗酸化作用があるエ
ルゴチオネインが含まれる。
また，エルゴチオネイン区は他の２試験区と比べ摂餌状況が悪かったことから飼育試験開始 36 日後から外添を取りやめてヒラタケ粉末 10％の内添のみの給餌とした。
２）飼料及び抗酸化物質
飼料は，株式会社ヒガシマルで製造された粒径 18mm の EP 飼料を用いた。試験区ごとの抗酸化物質及び添加量は上記のとおりとし，試験区ごとの EP 飼料の組成成分表は表２に示す。
３）供試魚及び飼育尾数
給餌試験開始時における供試魚の平均魚体重は，3.0kg で，飼育尾数は，対照区，
ビタミン C 区及びエルゴチオネイン区においてそれぞれ 18，18 及び 17 尾とした。
４）飼育期間
令和４年 10 月 21 日から令和４年 12 月 19 日及び 20 日までの 60 日及び 61 日間とした。
５）飼育設備
水技センターが所有する FRP 製 12ｔ陸上水槽３基を使用した。
６）給餌及び体長等測定
給餌回数は週３回飽食給餌とした。体長等測定は，令和４年 10 月 20 日，令和４年
11 月 24 日及び令和４年 12 月 19 日，20 日の３回行い，期間中の増重量及び増肉係数
を前述同様に算定した。
７）取上及びサンプリング
切り出した直後の切り身を５℃の低温実験室に搬入し，経時ごとに血合筋をサンプリングした生鮮区と試験Ⅰのサンプリングと同様に約１ヶ月間冷凍保管した後解凍し５℃の低温実験室で経時ごとに血合筋をサンプリングした冷凍解凍区の２区設けた。
ブリの取上は，水技センターにおいて生鮮区が令和４年 12 月 19，冷凍解凍区が令R4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書

和４年 12 月 20 日に行った。取り上げたブリは，約 15℃の海水で 30 分間予冷処理した後，延髄破壊後鰓を切断し，氷海水中で約 30 分間脱血した。その後，三枚におろし，皮を剥いだ後，体側に垂直に厚さ１cm の切り身にした。
生鮮区は，切り出した直後の切り身をタイトボックスに並べ，５℃の低温実験室で経時ごとにサンプリングした。
冷凍解凍区は，切り出した直後の切り身を旭化成パックス株式会社製のナイロンポ
リ袋飛龍 HN-102（150mm×250mm）で真空包装し，一晩－35℃で急速凍結した後，翌日から 34 日間－25℃で凍結保管した。保管後，氷水で解凍したのちタイトボックスに切り身を並べ，５℃の低温実験室で経時ごとにサンプリングした。
８）分析・解析項目⑴生鮮区
分析・解析項目は，以下の①～⑦のとおりとし，分析に供するサンプルの測定時
間は，②，③及び④が低温実験室搬入直後，24 時間後，48 時間後，54 時間後，72
時間後，78 時間後，96 時間後，⑥が低温実験室入庫直後，２時間後，24 時間後，
48 時間後，⑦が低温実験室入庫直後，２時間後，24 時間後とした。
なお，分析・解析は，①から⑤までは水技センター，⑥は国立研究開発法人水産研究・教育機構，⑦は国立大学法人筑波大学が行った。
⑵冷凍解凍区
分析・解析項目は，以下の①～⑤のとおりとし，分析に供するサンプリング時間
は，②，③及び④が解凍直後，解凍２時間後，解凍４時間後，解凍６時間後，解凍８時間後，解凍 10 時間後，解凍 12 時間後及び解凍 24 時間後のものとし，分析・解析は水技センターが行った。
①増肉係数：期間中の給餌量から期間中の増重量を除することで算出した。
②切り身の写真撮影：写真撮影は，生鮮区と冷凍解凍区において５℃の低温実験室で上記のサンプ
リング時間ごとにニコン社製デジタルカメラ D5200 を用いて行った。
③血合筋のメト化率の測定：メト化率の測定に用いる血合筋は，サンプリング時間ごとに血合筋をハサミで切り取り５ｍL スクリューチューブに入れ液体窒素で凍結後，分析に供す
るまで－40℃の冷凍庫で保管した。その後，凍結した血合筋に冷却した蒸留
水を５倍量加え，生鮮区では石英砂と共に乳鉢で擂り潰し，冷凍解凍区では
15,000rpm でホモジナイズした後，13,000rpm で 10 分間遠心分離し，0.22
μm のメンブランフィルターで濾過後，分光光度計を用いて 548nm 及び524nm の吸光値を測定した。メト化率の計算は，井ノ原らの方法７）を用いた。すなわち，metMb（％）＝－99.70（A548nm/A524nm）＋164.96。A は吸光値。

R4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書④血合筋のｐH の測定：ｐH の測定に用いる血合筋は，サンプリング時間ごとに血合筋をハサミで切り取り５ｍL スクリューチューブに入れ液体窒素で凍結後，分析に供するまで－40℃の冷凍庫で保管した。その後，凍結した血合筋に冷却した 20mM モ
ノヨード酢酸ナトリウムを３倍量加え，15,000rpm でホモジナイズ後，ｐHメーター（HORIBA 社製ｐH METER

D-51）で測定した。

⑤血合筋及び切り身の一般成分（水分，粗タンパク，粗脂肪）の測定：一般成分に用いる切り身は，１cmカットした切り身３切れを旭化成パックス株式会
社製のナイロンポリ袋飛龍HN-102（150mm×250mm）に入れ真空包装し，分析に供するまで－35℃の冷凍庫で保管した。その後，血合筋と切り身それぞれをホモジナイ
ズし分析に供した。水分が乾燥恒量法により，粗脂肪がソックスレー法により，粗タンパクがケルダール法で定量した全窒素量に6.25を乗じて測定した。
⑥血合筋の ATP 関連物質及び NAD，NADH，NADP，NADPH の測定：ATP 関連物質及び NAD，NADH，NADP，NADPH の測定は，対照区，ビタミン C 区
及びエルゴチオネイン区の血合筋から測定時間ごとにサンプリングし，500
μL のメタノールを加え，－80℃で保管した。その後，サンプルにクロロホ
ルム 500μL 及び L-MethionineSulfon を１mM になるように加え，振盪した
後上澄みを濾過し，キャピラリー電気泳動質量分析計に供して測定した。
⑦血合筋の硫黄化合物のメタボローム解析（サルファーインデックス）：サルファーインデックスは，対照区，ビタミン C 区及びエルゴチオネイン区の血合筋を用いてそれぞれを行った。血合筋それぞれから抽出した硫黄化合物をサルファーインデックスメソッドにより LC MSMS 8050（島津製作所
製）を用いて分析を行った。検出された硫黄化合物の定量データは，多変量解析を行い，サンプル間の類似度のマッピング解析（R ソフト vegan パッケージ活用）を行った。
【結

果】

１

試験Ⅰ

１）増肉係数飼育試験期間中における給餌量，
魚体重及び増肉係数は，表３－１のとおりであった。
抗酸化物質を添加したビタミン C 区及びエルゴチオネイン区は，給餌試験期間中に魚体重の増加はみられず増肉係数は算出できなかった。
２）切り身の写真撮影及び血合筋のメト化率の測定
冷凍解凍後のサンプリング時間ごとの血合筋の写真撮影及びメト化率は，図１－１
及び図２－１に示した。
対照区の血合筋は，解凍直後から暗赤色を示し時間の経過と共に暗色が増した。メトR4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書

化率は，0 から 12 時間後まで 37.0～45.9％の範囲であったが，24 時間後は，52.6％まで上昇した。
ビタミン C 区は，解凍直後から解凍８時間後まで鮮赤色であり，メト化率は 29.0～
39.7％の範囲であったが，解凍 10 時間後以降わずかに暗赤色に変化したが，メト化率は最大で解凍 10 時間後の 43.0％であった。
エルゴチオネイン区は，解凍直後から暗赤色を示し，時間の経過と共に暗色が増した。
メト化率は，解凍直後 27.6％であったが，解凍 12 及び 24 時間後にはそれぞれ 38.6％
及び 57.6％に上昇した。
また，冷凍解凍区では，生鮮区でみられる血合筋と普通筋の境界から開始する褐変はみられず，血合筋全体が暗赤色に変色する傾向がみられた。
３）血合筋のｐH の測定
冷凍解凍後のサンプリング時間ごとの血合筋のｐH は，図３－１に示した。ｐH は，３区とも解凍 0 時間後から解凍 24 時間後まで 6.0 から 6.3 の範囲内であり，試験区やサンプリング時間ごとの差はほとんど確認されなかった。
４）血合筋及び切り身の一般成分（水分，粗タンパク，粗脂肪）の測定
血合筋及び切り身全体の水分，粗タンパク及び粗脂肪は，表４-１に示した。血合筋における３区の粗タンパク及び粗脂肪の割合は，それぞれ 18.7～19.2％及び 11.0～
13.4％であった。切り身全体における３区の粗タンパク及び粗脂肪の割合は，それぞれ21.4～22.1％及び 6.4～7.5％であった。
食品成分表によると養殖ぶりの皮なし刺身でのタンパク質及び脂質８）は，それぞれ21.0％及び 12.0％と提示されており，本試験に用いたブリ（切り身全体）では，粗タ
ンパクは同程度であったが，粗脂肪は 1/2 程度であった。
５）血合筋の ATP 関連物質
ATP は，生体内のエネルギー通貨と呼ばれ様々な活動に利用されている。また，近年の研究では，魚類の筋肉中に ATP を残存させることでミオグロビンのメト化が抑制されるとの報告９）がある。そこで抗酸化物質給餌と ATP 関連物質との関連を検討した。
血合筋の ATP 関連物質の測定は，ATP，ADP，AMP 及び IMP について行い，図４－１に示した。凍結中の ATP 濃度は，対照区に対してエルゴチオネイン区が有意に低かった。
３区とも解凍１時間後までに ATP 濃度は低下し，解凍２時間後から一時的に ATP 濃度は上昇した。解凍２時間後のエルゴチオネイン区の ATP 濃度は，対照区と比べて有意に高かったが，解凍４時間後には減少し他区と有意な差は認められなかった。ADP 濃度も解凍２時間後にエルゴチオネイン区は，対照区と比べて有意に高かった。エルゴチオネ
イン区の AMP 濃度は，ATP 濃度と同様に凍結中において対照区よりも有意に低く，解凍２時間後に有意に高くなった。また，ビタミン C 区の AMP 濃度は，半解凍時に対照区よりも有意に高くなった。IMP 濃度は，凍結時にエルゴチオネイン区は対照区と比較して有意に低下していた。また，解凍１時間後も対照区と比較して有意に低下していた。

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６）血合筋の NAD，NADH，NADP，NADPH の測定
NAD，NADH，NADP，NADPH は，電子を輸送する補酵素であり酸化還元反応を触媒し，NAD＋及び NADP＋は酸化型，NADH 及び NADPH は還元型を示し，筋肉に NADH あるいは NADPH
を加えるとメトミオグロビンの還元を促進するという報告がある 10），11）。
血合筋の NAD 及び NADH の測定結果は，図５－１に示す。NADP 及び NADPH は，検出されなかった。各時点の NAD 濃度に試験区間の差は認められず，いずれの試験区でも NAD
濃度は経時的に減少した。NADH 濃度は，解凍 0.5 及び４時間後にビタミン C 区は対照
区に比べて有意に高かった。NADH 濃度は，対照区及びビタミン C 区で解凍２時間後に最大となったが，エルゴチオネイン区では解凍４時間後に最大となり，解凍６時間後にはすべての試験区で同程度の濃度まで減少した。
７）血合筋及び普通筋の硫黄化合物のメタボローム解析（サルファーインデックス）⑴血合筋（冷凍解凍時）
血合筋におけるサルファーインデックスの結果，硫黄化合物が３試験区から 46 種
定量された。その定量結果を３試験区のサンプルごとに多変量解析でプロットすると図６-１のとおりとなった。各サンプルが示す特異的な硫黄化合物から相関係数を導き出し，各硫黄化合物の寄与を示すと図７-１となり，本分析からは横軸が酸化還元の度合いを示していることが考えられた。図７-１の横軸で 0.5 以上の寄与率を示したものを抜き出し，酸化還元に高い役割を示す硫黄化合物は表５-１のとおりとなった。また，図６-１の横軸から各試験区の酸化還元の度合いを示すと図８-１のとおりとなり，硫黄化合物の酸化還元の度合いから判断するとビタミン C 区，エルゴチオ
ネイン区，対照区の順に抗酸化作用が強いことが示唆された。
⑵普通筋（冷凍解凍時）
普通筋におけるサルファーインデックスの結果，硫黄化合物が３試験区から 39 種
定量された。その定量結果を３試験区のサンプルごとに多変量解析でプロットすると図６-２のとおりとなった。各サンプルが示す特異的な硫黄化合物から相関係数を導き出し，各硫黄化合物の寄与を示すと図７-２となった。
２

試験Ⅱ

１）増肉係数飼育試験期間中における給餌量，
魚体重及び増肉係数は，表３－２のとおりであった。
対照区の増肉係数が 4.88 であったのに対し，抗酸化物質を添加したビタミン C 区及びエルゴチオネイン区はそれぞれ 5.68 及び 10.22 と対照区に比べ高くなった。
２）切り身の写真撮影及び血合筋のメト化率の測定⑴生鮮区
生鮮時のサンプリング時間ごとの血合筋の写真撮影及びメト化率は，図１－２及び図２－２に示した。

R4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書切り出した直後の血合筋は，３区とも鮮赤色をしており大差なかったが，対照区では 54 時間後，エルゴチオネイン区では 72 時間後，ビタミン C 区では 96 時間後に血合筋と普通筋の境界から褐変が確認された。対照区及びエルゴチオネイン区は，時間の経過とともに褐変が血合筋と普通筋の境界から体表に向けて広がる様子が確認された。メト化率の最大値は，対照区が 96 時間後に 30.8±9.0％，ビタミン C 区が 78
時間後に 25.4±6.9％，エルゴチオネイン区が 78 時間後に 30.6±13.1％であり，ビタミン C 区が最もメト化率を抑えていた。
なお，0 及び 24 時間後のメト化率は，遠心分離や 0.22μm フィルターで濾過してもミオグロビン抽出液に濁りが生じ正確なメト化率が測定できなったため記載していない。
⑵冷凍解凍区
冷凍解凍後のサンプリング時間ごとの血合筋の写真撮影及びメト化率は，図１－
３及び図２－３に示した。
解凍直後の血合筋は，３区とも凍結前に比べ暗赤色であり，時間の経過とともにわ
ずかに暗色が増した。メト化率は，解凍直後において対照区が 35.9％，ビタミン C 区が 40.3％，エルゴチオネイン区が 41.7％ であり，12 時間後までの最大値は対照区
で 10 時間後に 50.2％，ビタミン C 区では８時間後に 45.9％，エルゴチオネイン区
では 10 時間後に 49.5％であった。24 時間経過すると対照区は 65.1％，ビタミン C
区は 55.5％，エルゴチオネイン区は 67.4％であった。冷凍解凍区においても生鮮区と同様に３区のうちビタミン C 区が最もメト化率を抑えていた。
３）血合筋のｐH の測定⑴生鮮区
生鮮区の血合筋のｐH は，図３－２に示した。ｐH は，切り出し直後３区とも 6.4程度であり 24 時間後に減少し，48 時間後以降は，一定若しくは上昇する傾向がみられた。ｐH は，エルゴチオネイン区，ビタミン C 区，対照区の順で高かった。
⑵冷凍解凍区
冷凍解凍区の血合筋のｐH は，図３－３に示した。解凍直後の３区のｐH は，5.9～
6.2 であったが，その後上昇し 10 時間後から減少する傾向がみられた。冷凍解凍区
においても生鮮区と同様に３区のうちエルゴチオネイン区が最も高かった。
４）血合筋及び普通筋の一般成分（水分，粗タンパク，粗脂肪）の測定
血合筋及び切り身全体の水分，粗タンパク及び粗脂肪は，表４-２に示した。血合筋における３区の粗タンパク及び粗脂肪の割合は，それぞれ 17.3～19.8％及び 17.3～
21.8％であった。切り身全体における３区の粗タンパク及び粗脂肪の割合は，それぞれ22.0～23.9％及び 8.3～11.3％であった。血合筋における粗脂肪の割合は，対照区が抗酸化物質を給餌したビタミン C 区及びエルゴチオネイン区に比べ高くなった。
養殖ぶりの皮なし刺身でのタンパク質及び脂質８）は，それぞれ 21.0％及び 12.0％と

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食品成分表で提示されており，本試験に用いたブリ（切り身全体）では，粗タンパクは同程度であったが，粗脂肪は７割から同程度であった。
５）血合筋の ATP 関連物質（生鮮時）
血合筋の ATP 関連物質の測定は，ATP，ADP,AMP 及び IMP について行い，図４－２に示した。ATP 濃度は，０，２，24 及び 48 時間後で試験区ごとの有意な差は認められなか
ったが，０及び２時間後においてエルゴチオネイン区が低い傾向にあった。ADP 濃度は，２時間後にビタミン C 区において対照区と比べて有意に高く，48 時間後ではエルゴチ
オネイン区において対照区と比べて有意に高かった。AMP 濃度は２時間後にビタミン C区，エルゴチオネイン区において対照区と比べて有意に上昇した。IMP 濃度も同様に２時間後にビタミン C 区，エルゴチオネイン区において対照区と比べて有意に上昇した。
６）血合筋の NAD，NADH，NADP，NADPH の測定（生鮮時）
血合筋の NAD 及び NADH の測定結果は，図５－２に示す。NADP 及び NADPH は，検出されなかった。NAD 濃度は，各時点において試験区ごとに有意な差は認められず，３試験
区とも経時的に減少した。NADH 濃度は３試験区とも経時的に減少し，２時間後においてビタミン C 区及びエルゴチオネイン区は対照区と比べ有意に高かった。
７）血合筋及び普通筋の硫黄化合物のメタボローム解析（サルファーインデックス）⑴血合筋（生鮮時）
血合筋におけるサルファーインデックスの結果，硫黄化合物が３試験区から 32 種
定量された。その定量結果を３試験区のサンプルごとに多変量解析でプロットすると図６-３のとおりとなった。各サンプルが示す特異的な硫黄化合物から相関係数を導き出し，各硫黄化合物の寄与を示すと図７-３となり，本分析からは横軸が酸化還元の度合いを示していることが考えられた。図７-３の横軸で 0.5 以上の寄与率を示したものを抜き出し酸化還元に高い役割を示す硫黄化合物は表５-２のとおりとなった。また，図６-３の横軸から各試験区の酸化還元の度合いを示すと図８-２のとおりとなり，硫黄化合物の酸化還元の度合いから判断するとエルゴチオネイン区，ビタ
ミン C 区，対照区の順に抗酸化作用が強いことが示唆された。
【考１

察】
試験区ごとの日間給餌率と増肉係数
試験Ⅰにおける３試験区の日間給餌率及び増肉係数は，対照区がそれぞれ 1.83％及び13.4，ビタミン C 区がそれぞれ 1.91％及び算出不可，エルゴチオネイン区がそれぞれ1.87％及び算出不可であった。
一方，試験Ⅱにおける試験区の日間給餌率及び増肉係数は，対照区がそれぞれ 1.16％
及び 4.88，ビタミン C 区がそれぞれ 1.08％及び 5.68，エルゴチオネイン区がそれぞれ1.05％及び 10.22 であった。
通常 EP 飼料で飼育した４kg 台のブリの日間給餌率及び増肉係数は，それぞれ約２％及R4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書

び２～３であり 12），対照区においても増肉係数が非常に高くなった。この原因は，飼育時期や飼育環境の違いによることが考えられた。また，試験Ⅱにおけるエルゴチオネイン
区においては，他の試験区に比べ増肉係数が倍以上高くなった。これは，ヒラタケ粉末をEP 飼料に対して 20％（飼育試験開始 36 日後から 10％）添加したことによる影響が示唆された。ブリの飼育試験において不稔性アオサ（６％以上の添加で増重低下）やクロレラ
抽出物，コンブ粉末などの藻類の飼料への過剰な添加は，摂餌率の低下により成長が低下すると言われている 13)。このことからヒラタケ粉末についても添加量の検討が必要と思われた。
２

ビタミン C 及びエルゴチオネインによる褐変抑制効果
本試験では，抗酸化物質としてビタミン C 及びエルゴチオネインが含まれるヒラタケ
粉末を飼料に混合し給餌した。メト化率の測定結果では，ビタミン C 添加においてメト化率が対照区に比べ低くなり褐変抑制の効果が確認された。一方，エルゴチオネイン区は，対照区と同等で推移しメト化率の抑制効果がビタミン C に比べ劣っていた。
一般的に生体内でのビタミン C は，ヒドロキシラジカルと脂質が反応してできる脂質
ペルオキシルラジカルを処理し酸化したビタミン E を還元する役割を示す。一方，エルゴ
チオネインは，一重項酸素やヒドロキシラジカルを直接的に作用し消去する。また，ヒド
ロキシラジカルとの反応速度においてもエルゴチオネインのほうがビタミン E よりも速い 14）。このことからエルゴチオネインとビタミン C での抗酸化作用は役割が異なる。
今回エルゴチオネイン区において褐変抑制効果がビタミン C に比べ低かった理由として，①ヒラタケ粉末を直接給餌したことにより魚体内への取り込みが不充分であった点，②ブリに対してエルゴチオネインの褐変抑制効果があまり働かない点，③エルゴチオネ
インの添加濃度が低かった点の３つが考えられた。①においては，飼料中にはヒラタケ粉
末 10％内添では 10.1mg/100g，10％内添及び 10％外添では 24.2mg/100g エルゴチオネインが含まれていた（表１）。また，ブリの筋肉中のエルゴチオネイン濃度は，対照区及びビタミン C 区に比べ６倍近く含まれており（本研究に関する筑波大学のサルファーイン
デックス分析業務報告書），ヒラタケ粉末添加によりブリ体内にエルゴチオネインが取り込まれていたことをわかる。②においては，久保ら 15）によるとリン脂質の酸化とミオグ
ロビンのメト化は相互に作用しながら促進するとのことであり，脂質酸化を防ぎ酸化したビタミン E を還元する役割のあるビタミン C の方が一重項酸素やヒドロキシラジカルに直接的に作用し消去するエルゴチオネインに比べメト化抑制に働いたことが示唆された。③については，本試験の添加濃度が適正であったか検討が必要だと考えられた。

３

生鮮と冷凍解凍による褐変進行の違い
活き締め直後から５℃程度の冷蔵庫で保管したブリの褐変は，普通筋と血合筋の境界から始まり徐々に体表に進行する２）。一方，－25℃程度で一ヶ月間冷凍した後，解凍した

R4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書

ブリは解凍直後から血合筋全体が黒っぽい赤色をしていた（図１-１，３）。このように生鮮状態と冷凍保管後解凍したブリの血合筋の褐変の進行状況は異なっていた。
生鮮時の褐変の進行は，普通筋と血合筋の境界において乳酸が生成されｐH 低下により褐変が開始し，その後血合筋の体表側に向けてリン脂質の酸化とミオグロビンのメト化
は，相互作用により全体に進行するといわれている 15）。一方，冷凍保管後解凍したブリは，冷凍期間中ナイロンポリ袋で真空包装し空気との接触を遮断したにも関わらず，解凍直後から生鮮時とは異なる黒っぽい赤色を示した。水技センターで令和４年度行ったガス置換包装による養殖ブリの褐変抑制対策 16）でもブリの切り身を入れたパック内に酸素の供給を遮断したアルゴン 80％＋二酸化炭素 20％のガスを封入して冷凍保管後解凍したものについても生鮮時に比べると黒っぽい赤色を示した。これらのことから，冷凍期間中
切り身は，外部からの酸素の影響は受けないが，筋肉中に含まれる酸素の影響で冷凍期間中にミオグロビンが酸化されたものと示唆された。そのため，活き締め直前のブリの生体内の酸素濃度を低下させ同様の試験を実施し，筋肉中の酸素濃度の影響についても検討する必要がある。
４

褐変（メト化率）と関連を示す要因の検討
マグロやブリにおける褐変に関する研究は，これまでに数多く行われてきた。その中でATP 関連物質の残存９）や筋小胞体とミトコンドリアの構造崩壊速度 17），Mg2+-ATPase 活性
17），筋肉糖代謝と脂質酸化の関係 15），ｐH15），18）等が褐変やメト化に影響しているとの報告がある。
本試験では，ｐH，ATP 関連物質，NAD・NADH 濃度が褐変（メト化率）に関連しているか検討した。
１）褐変（メト化率）とｐH との関連
久保ら 15）は生鮮時における境界面から始まる褐変はｐH の低下によるもの，また森岡ら 18）はｐH が低いほどメト化の進行が速いと報告がある。本試験においては，図３－１，２で抗酸化物質の添加のない対照区が最もｐH が低くメト化率とも関連性がみられ，これまでの報告と一致した。
２）褐変（メト化率）と ATP 関連物質，NAD・NADH 濃度との関連
試験Ⅱにおける生鮮区の結果から ATP 濃度に試験区間の差は認められなかったが，AMP，
IMP 及び NADH は２時間後にビタミン C 区及びエルゴチオネイン区で有意に上昇した。ADP
濃度はビタミン C 区で２時間後，エルゴチオネイン区で 48 時間後に対照区と比較して有意に上昇した。これは，ADP 及び AMP の分解が緩やかであったと考えられる。一方，IMP
は０時間後の濃度と比較して上昇したことから ATP の分解物として IMP が蓄積したことを示唆している。ATP の分解は，試験区間で差が認められなかったことから対照区では，ATP が IMP に分解された後イノシンやヒポキサンチンまで分解されたと予想され，対照区に比べビタミン C 区及びエルゴチオネイン区は，血合筋のエネルギー消費が緩やかであR4 年度 鹿児島県水産技術開発センター事業報告書ったことが示唆された。また，NADH もビタミン C 区及びエルゴチオネイン区は，冷蔵保存０から２時間後の減少が緩やかになり，エネルギー産生に働く酸化的リン酸化の反応速度が対照区と比較して遅くなったことから NADH の消費が抑制されたと示唆された。
試験Ⅰにおける冷凍解凍試験では，ビタミン C 区は対照区と比較して ATP 関連物質の濃度差は認められなかったが，エルゴチオネイン区は対照区と比較して濃度差が認められた。NADH は，ビタミン C 区において有意な上昇が認められた。以上の結果からエルゴ
チオネインは ATP 関連物質，ビタミン C は NADH に作用して褐変抑制効果を生み出していることが示唆された。
５

メト化率測定による褐変判定の有効性
褐変の進行具合は，分光光度計を用いたメト化率測定や目視，色差計により把握できる。
特にメト化率は，井ノ原らの方法７）により血合筋中のメト化の割合を定量化できることから，本試験においても測定を行ったが，同じ試験区のサンプルでもバラツキが多いことが確認された。これは，サンプルごとの血合肉の表面積，個体や部位ごとのミオグロビンの濃度の違いによるものと考えられた。Chau-Jen Chow ら 19）によるとクロマグロやキハ
ダマグロの筋肉中のミオグロビン濃度は，部位ごとに異なるとの報告がある。これらのことから，サンプルによりミオグロビン含量が異なるため，メト化率についても影響を与えることを考慮する必要があった。
そのため，褐変の進行具合は，メト化率だけでなく，目視や色差計の測定なども加え複合的に判断する必要があると示唆された。

【謝辞】

本 研 究 に お い て ブリ の飼 育 を 担 当 し た 株式 会社 ヒ ガ シ マ ル ，ATP 関連 物 質 及 び
NAD,NADH,NADP，NADPH の分析を担当した国立研究開発法人水産研究・教育機構の世古卓也研究員及び國吉道子研究等支援職員，また，サルファーインデックス分析を担当した国立大学法人筑波大学の大津巌生准教授に感謝を申し上げる。
【参考文献】
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表１

飼料中のビタミン C 及びエルゴチオネイン濃度

ビタミンC濃度（mg/100g) エルゴチオネイン濃度（mg/100g）
ビタミンC3％内添EP

960.1

ー

ヒラタケ粉末10％内添EP

ー

10.1

ヒラタケ粉末10％内添及び10％外添EP

ー

24.2

表２

本試験に用いた EP 飼料の組成成分表
試験区

対照区

ビタミンC区

エルゴチオネイン区

成

予想粗蛋白値

42.6%

38.8%

38.8%

分

予想粗脂肪値

15.6%

14.6%

原材料名

割合

原材料名

割合

原材料名

割合

動物質性飼料

魚粉

50%

魚粉

50%

魚粉

50%

穀類

原
材
料

14.6%

原材料区分

小麦粉

7%

小麦粉

7%

小麦粉

7%

タピオカ澱粉6%

タピオカ澱粉6%

タピオカ澱粉

6%

脱脂大豆粕

10%

脱脂大豆粕

10%

脱脂大豆粕

10%

精製魚油

27%

植物性油かす類
その他

精製魚油

27%

精製魚油

27%

飼料用酵母

飼料用酵母

（内ビタミンC10％）

飼料用酵母（内エルゴチオネイン

第一リン酸カルシウム

第一リン酸カルシウム

第一リン酸カルシウム

10％）

ビタミンプレミックス

ビタミンプレミックス

ビタミンプレミックス

微量元素類

微量元素類

微量元素類
エルゴチオネイン

表３－１

魚体重，増重量，給餌量及び増肉係数（試験Ⅰ）
魚体重（g/尾）増重量（g/尾）

給餌量（g/尾）

増肉係数

4,844

226

3,018

13.4

4,522

4,485

-37

2,911

-

4,547

4,511

-36

2,862

-

増重量（g/尾）

給餌量（g/尾）

増肉係数

7月15日

10月5日

対照区

4,618

ビタミンC区
エルゴチオネイン区

表３－２

魚体重，増重量，給餌量及び増肉係数（試験Ⅱ）
魚体重（g/尾）
10/20

12/19,20

対照区

2,996

3,485

489

2,387

4.88

ビタミンC区

2,975

3,327

352

2,000

5.68

エルゴチオネイン区

3,020

3,215

195

1,992

10.22

表４-１

切り身全体及び血合筋における水分，粗タンパク，粗脂肪（試験Ⅰ）
（％）
水分

粗タンパク

粗脂肪

切り身全体

血合肉

切り身全体

血合肉

切り身全体

血合肉

68.8

67.2

21.7

19.0

7.5

12.3

対照区
ビタミンC区

69.7

65.9

22.1

18.7

6.4

13.4

エルゴチオネイン区

70.6

67.0

21.4

19.2

6.6

11.0

表４-２

切り身全体及び血合筋における水分，粗タンパク，粗脂肪（試験Ⅱ）
（％）
水分
切り身全体

粗タンパク
血合肉

切り身全体

粗脂肪
血合肉

切り身全体

血合肉

対照区

65.3

57.3

22.0

17.3

11.3

21.8

ビタミンC区

65.7

60.6

22.3

19.0

11.2

17.7

エルゴチオネイン区

67.5

61.2

23.9

19.8

8.3

17.3

表５-１

血合筋の冷凍解凍区における酸化還元に高い役割を示す硫黄化合物

還元に寄与の高ホモセリン，メチオニン，O-ホスホセリン，酸化型グルタチオン，アデ

い硫黄化合物ノシン-3’,5’-ビスリン酸，硫化物イオン，チオ硫酸イオン，ニコチンア
ミド

酸化に寄与の高システインテトラスルフィド

い硫黄化合物

表５-２

血合筋の生鮮区における酸化還元に高い役割を示す硫黄化合物
S-アデノシルメチオニン，エルゴチオネイン，トリパノチオン，ホモシ還元に寄与の高ステイン，システインモノスルフィド，５-グルタミルシステイン，グル

い硫黄化合物

タチオンモノスルフィド，チオウロカン酸，亜硫酸イオン，システイン
テトラスルフィド，ドリスルフィド酸化に寄与の高い硫黄化合物

ヒスチジン，メチオニン

解凍 12 時間後

解凍 10 時間後

解凍８時間後解凍６時間後解凍４時間後解凍２時間後解凍直後

対照区
ビタミン C 区
エルゴチオネイン区

72 時間後

54 時間後48 時間後24 時間後（切り出した直後）

0 時間後

図１－１
冷凍解凍後の血合筋の経時変化（試験Ⅰ）
対照区
ビタミン C 区
エルゴチオネイン区

解凍 24 時間後

78 時間後
96 時間後図１－２

生鮮時の血合筋の経時変化（試験Ⅱ）

解凍２時間後

解凍直後

凍結前

対照区

ビタミン C 区

エルゴチオネイン区

図１－３

冷凍解凍後の血合筋の経時変化（試験Ⅱ）

解凍 24 時間後

解凍 12 時間後

解凍 10 時間後

解凍８時間後解凍６時間後解凍４時間後メト化率（％）

100
80
60
40
20
0
０ｈ

２ｈ

対照区

図２－１

４ｈ

６ｈ

８ｈ

ビタミンC区

10ｈ

12ｈ

24ｈ

エルゴチオネイン区

冷凍解凍後の時間ごとのメト化率（試験Ⅰ）

メト化率（％）

100
80
60
40
20
0
０ｈ

24h

対照区

図２－２

48h

54h

ビタミンC区

72h

78h

96h

エルゴチオネイン区

生鮮時の時間ごとのメト化率（試験Ⅱ）

メト化率（％）

100
80
60
40
20
0
０ｈ

２ｈ

対照区

図２－３

４ｈ

６ｈ

ビタミンC区

８ｈ

10ｈ

12ｈ

エルゴチオネイン区

冷凍解凍時の時間ごとのメト化率（試験Ⅱ）

24ｈ

6.5
6.4

pH

6.3
6.2
6.1
6.0
5.9
０ｈ

2h

対照区

図３－１

4h

6h

8h

ビタミンC区

10h

12h

24h

エルゴチオネイン区

冷凍解凍後の時間ごとのｐH（試験Ⅰ）

6.6
6.5

pH

6.4
6.3
6.2
6.1
6
０ｈ

24h

対照区

図３－２

48h

54h

72h

ビタミンC区

78h

96h

エルゴチオネイン区

生鮮時の時間ごとのｐH（試験Ⅱ）

7

pH

6.5
6
5.5
5
０ｈ
対照区

図３－３

2h

4h

6h

ビタミンC区

8h

10h

12h

エルゴチオネイン区

冷凍解凍区の時間ごとのｐH（試験Ⅱ）

24h

0.14

0.08
0.06
0.04

2h

4h

6h

4h

6h

0.00

2h

0.02

1h

0.04

1h

3.00

0.5h

0.06

0.5h

4.00

0h

0.08

0h

0.00

半解凍

0

半解凍

0.02

凍結

0.01

0.10

凍結

0.02

ADP濃度（umol/g）

0.12
0.03

IMP(umol/g）

AMP濃度（umol/g）

ATP濃度（umol/g）

0.04

2.00

1.00

0.00

○対照区 □ビタミン C 区 △エルゴチオネイン区

図４－１

凍結解凍後の ATP,ADP,AMP 及び IMP の経時変化（試験Ⅰ）

0.25

1

0.2

ADP濃度（μmol/g)

ATP濃度（μmol/g)

1.2

0.8
0.6
0.4
0.2

0.15
0.1
0.05
0

0
０ｈ

２ｈ

24ｈ

48ｈ

0.08

０ｈ

２ｈ

24ｈ

48ｈ

０ｈ

２ｈ

24ｈ

48ｈ

3

IMP濃度（μmol/g)

AMP濃度（μmol/g）

2.5
0.06

0.04

0.02

2
1.5
1
0.5
0

0
０ｈ

２ｈ

24ｈ

48ｈ

○対照区 □ビタミン C 区 △エルゴチオネイン区

生鮮時の ATP,ADP,AMP 及び IMP の経時変化（試験Ⅱ）

0.30

0.12

0.25

0.10

○対照区 □ビタミン C 区 △エルゴチオネイン区

図５－１

凍結解凍後の NAD 及び NADH の経時変化（試験Ⅰ）

6h

4h

2h

0.00

凍結

0.00

0.02

1h

0.05

0.04

0.5h

0.10

0.06

0h

0.15

0.08

半解凍

0.20

NADH濃度（umol/g）

NAD濃度（umol/g）

図４－２

0.08

NADH濃度（μmol/g)

NAD濃度（μmol/g)

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05

0.06
0.04
0.02
0

0
０ｈ

２ｈ

24ｈ

48ｈ

０ｈ

２ｈ

24ｈ

48ｈ

○対照区 □ビタミン C 区 △エルゴチオネイン区

図５－２

生鮮時の NAD 及び NADH の経時変化（試験Ⅱ）

図６-１

血合筋における各試験区のプロット（黒：対照区，赤：ビタミン C 区，緑：エルゴチオネイン区）

図７-１

各硫黄化合物の相関関係

元

0.04

還

0.02

⇔

0

化

-0.02

酸

0.06

-0.04
-0.06
control

ビタミンC

エルゴチオネイン

図８-１

３試験区における酸化還元度合い

図６-２

普通筋における各試験区のプロット（黒・灰色：対照区，赤・黄：ビタミン C 区，緑・青：エルゴチオネイン区）

図７-２

各硫黄化合物の相関関係

図６-３

血合筋における各試験区のプロット（黒：対照区，赤：ビタミン C 区，緑：エルゴチオネイン区）

図７-３

各硫黄化合物の相関関係

図８-２

３試験区における酸化還元度合