2012 NOVEMBER
No. 577

2012 年（平成 24 年）11 月号

第 58 巻 第 6 号（通巻 577 号）

挨拶・巻頭言「序破急」........................................小 林 恒 夫（ 2 ）獣医病理学研修会
第 51 回 No.1043 イヌの下腿部筋間腫瘤.................................... 大阪府立大学（ 3 ）第 50 回 No. 1002 イヌの舌下部腫瘤........................................鹿児島大学（ 4 ）第 51 回 No. 1038 ラットの頸腹部腫瘤................................. 残留農薬研究所（ 5 ）論文紹介Avibacterium paragallinarum の
RTX 毒素様遺伝子およびオペロンの同定と性状解析.................今 井 孝 彦（ 6 ）発表論文紹介近年の日本における豚丹毒発症例から分離した Erysipelothrix rhusiopathiae
株の性状について ............ 堤信 幸（14）

一般財団法人 日本生物科学研究所
http://nibs.lin.gr.jp/

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日生研たより「序破急」
小林恒夫
今年の夏，数十年ぶりに能を観賞した。学生の頃，謡を習っていたこともあって，若いころは年に4・5 回は能に接する機会があったように思う。学生の頃といっても高校までの間なので，必ずしも好きで能を見に行っていたわけでもなく，行き掛かり上謡を習い，その延長上で能に接していたとい
うところである。そんなわけで，演目がどうとか，作者や演者がどうとかいうようなことを考えたり，調べたりするというようなこともなく，ただ漫然とその場に居合わせたというような塩梅であった。
それでも，避けようともせず機会があれば能楽堂に座っていたのは，もともと笛，鼓といった和楽器が好きであったことと，一応謡を習っていたので居心地が悪くはなかったためであろう。
能は構成上歌舞劇に分類されるが，オペラやミュージカルと違って使われる楽器は 1 本の笛，太鼓，
大鼓，小鼓の 4 種だけで，極めて簡素な構成である。演目によっては太鼓がない場合もある。その簡素な構成の楽器で奏でられる楽曲というよりお囃子を楽しむということになるが，そのお囃子で物語の情景を想像するための雰囲気が提供される。その雰囲気の中で謡によって物語が語られ，舞われる。
お囃子は概してゆっくりで単調に聞こえる上，物語も世の喜怒哀楽を題材にした比較的単純なものが多い。物語が単純なだけに，頑張って物語を追う必要はなく，また，音楽に耳を集中させる必要もないので，物語から離れて自由気儘に情景を想像することが出来る。それが大変心地よい。数十年ぶりに観賞しても同じような感覚に浸ることが出来た。極めていい加減な観賞の仕方である。昔，舞い手七分に聞き手三分の利があり，楽しみがあるという様なことを聞いたことがある。演じる側には物語を自らの感性で感じ表現する楽しみがあるが，観賞する側は演じられたものから感じることになり，
その分，感動が少ない，あるいは自由に感じることができないというようなことであったと思う。それなら，分の悪い聞き手としては，少々は自由に接してもいいのではないかと勝手に解釈して，いい加減な観賞の仕方の言訳にしている。
謡には観世，金剛，金春，宝生，喜多の 5 流があり，私は京都で育ったこともあって，金剛流の謡を習った。その為，金剛流の能に接する機会が多い。俗に，舞金剛といわれるが，金剛流の舞は華やかであり，優美であるといわれ，謡もそれを反映している。残念ながら能を観賞するというより，雰
囲気に浸りながら夢想する方なので，金剛流の能に優美さとか，華やかさを見出すほどの観賞眼を持たないが，メリハリがはっきりしていて心地よく，物語に入り込み易いという風に感じている。
能では「序破急」という言葉が使われ，1 番の能，1 曲の謡，1 句の中に，さらには 1 音，1 舞の中に「序破急」があり，なければならないといわれる。能は構成上，「序」の物語の導入部，それを受け継ぐ「破」での展開部，「急」での終結部に至る 3 つの部分からなっている。それに合わせて，「序」
ではゆっくり，「破」では少し早く細やかに変化に富んで，「急」ではテンポを速めて短く，躍動的に，メリハリをつけて演じられる。この序破急のメリハリが「序」「破」「急」の中にも，1 句の中にも，一つの足の運びにも表現される。そのリズムを，舞を楽しむのであるが，全般的にテンポはゆっくりしている。
「序」の部分は始まったばかりで集中して観ているが，「破」の場面になると，少しは速くなってはくるものの，猶ゆるやかなので，ついつい物語からそれて余分なことを想ってしまう。派手さはないものの，この「破」の部分は物語の展開部，中枢部分で「急」のクライマックスに向けての準備期間なので，演ずる側にとっても，観賞する側にとっても最も重要な部分であるが，観る側には最もつらい，眠気を催す時間でもある。一見静かに演じられるのであるが，「静中動あり」で変化もあり，クライマックスに導く準備が粛々と進められるのである。ところが，この一番大切な玄人好みの部分で大抵いい加減な観方で余計なことを想っているため，「急」に向かう切り替えの笛に慌てて居住まいを正し，物語に戻ることを繰り返している。
「破」の場面でより深く入り込めれば，能をより深く楽しめるものをと悔やんでいる。
今，我々はバブル崩壊後の新たな秩序の求められている場面にいる。グローバル資本主義が世界経済活性化の切り札のように言われていた時期もあったが，グローバル資本が自由を獲得すればするほ
ど富や所得の格差拡大や地球規模の環境破壊，世界経済の不安定化を招く兆候を示すなど，社会に様々な負の効果をもたらしてきているように見える。先進諸国といわれる国々では不安定な経済情勢に汲々としている一方，新興緒国は着実に豊かになってきている。伝統産業で活性を取り戻した地域
もあれば，誘致企業の海外移転で活性が失われていく地域もある。技術開発で新たな市場開拓をなした企業もあれば，既存技術の応用で新た市場を生み出した企業もある。今，新しい時代に向かって，
世界が，国が，地域が，そして様々な組織が，人が，着地点を模索している。見えてはいないが，すでにあるべき安寧秩序への道筋を歩んでいるのかもしれない。その最も重要な変化の時期，「破」の場面に遭遇しているのではないかと思いながら，先日も国立能楽堂に座っていた。
（理事）

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，2012

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イヌの下腿部筋間腫瘤
大阪府立大学獣医病理学教室

第 51 回獣医病理学研修会 No. 1043

動物：イヌ，雑種，雄，17 歳。
ジマーカー（MSR – A）と PCNA に陽性を示した。サイ
臨床事項：腎不全の治療のため本学を来院。その際，右トケラチンと S – 100 には陰性を示した。
後肢の浮腫が認められた。初診から 7 ヶ月後，元気消失
診断：滑膜粘液腫 Synovial myxoma
および起立不能となり，超音波検査にて左腎に腫瘤が認考察：上記の病理学的所見は，既報のイヌの滑膜粘液腫められた。状態悪化のため，安楽殺が施され，当教室にと一致しており，膝関節原発の滑膜粘液腫と診断した。
て剖検が行われた。
本症例では，大腿部および下腿部の筋間に広く浸潤がみ
剖検所見：右膝関節の大腿脛関節および大腿膝蓋関節のられたものの，明らかな臨床症状（運動障害）を示さず，関節面に，直径 7 mm に至る多結節性灰白色軟性腫瘤が骨浸潤も認められないことから良性腫瘍と考えた。滑膜認められた（図 1）。腫瘤は大腿脛関節から連続して，粘液腫の由来細胞については未だ不明であるが，本症例
近位下腿部の筋間まで伸展していた。同様の腫瘤が大腿では膝関節から離れた下腿部筋間においても，間葉系細部筋間にも認められた。筋間腫瘤の一部は囊胞状を呈し， 胞（B 型滑膜細胞様）に加えて，囊胞を内張りする細胞
その内部に透明なゼリー状物質が貯留していた（図 2）。 （A 型滑膜細胞様）の増殖が認められ，滑膜粘液腫の病
参考所見：左腎に 3 × 3 × 4 cm の白色硬性腫瘤がみら
理組織学的特徴の一つと考えられた。
れ，病理組織学的に腎細胞癌と診断されたが，他臓器へ（井澤武史）の転移は認められなかった。
参考文献：
組織所見：筋間腫瘤は，少数の紡錘形ないし星状の間葉
1. Craig, L. E., Krimer, P. M., Cooley, A. J. 2010. Canine系細胞（図 3；挿入図）と粘液基質（図 4；アルシアン
synovial myxoma : 39 cases. Vet. Pathol. 47 : 931–936.
青染色）からなる多結節性病変であり，囊胞内腔面では2. Craig, L.E., Julian, M.E., Ferracone, J.D. 2002. The
A 型滑膜細胞様細胞の内張りが認められた（図 5）。同
diagnosis and prognosis of synovial tumors in dogs : 35
cases. Vet. Pathol. 39 : 66–73.
様の病変が，膝関節の関節包および大腿骨・脛骨の関節
3. Pool, R. R. and Thompson, K. G. 2002. Tumors of joints.
面でみられたが，骨浸潤は認められなかった（図 6）。
pp. 199–243. In : Tumors in Domestic Animals, 4th ed.
免疫染色では，結節内の間葉系細胞および囊胞の内張り, Iowa State Press, Ames, Iowa.
細胞はビメンチンに強陽性で，その一部はマクロファー （Meuten, D. J. ed.）

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日生研たよりイヌの舌下部腫瘤鹿児島大学組織病理学分野

第 50 回獣医病理学研修会 No. 1002

動物：イヌ，柴犬，雄，7 カ月齢。

空胞状であった。囊胞内腔側および囊胞壁の中心部も同

臨床事項：5 カ月齢頃から歩行時にふらつくようにな様で，腫瘤全体に泡沫細胞が多数浸潤していた。一部にり，徐々に顕著となり，6 カ月齢時に開業動物病院に来は好中球を主体とする細胞浸潤も認められた。泡沫細院した。頭位変換時の外側腹斜視が認められ，血液検査

胞の空胞はアルシアンブルー染色および PAS 染色陰性

ではリンパ球の細胞質に空胞が観察されたため，GM1

で，ズダンⅢ陽性の微細な脂質顆粒が空胞内に認められガングリオシドーシスを疑い，本学に遺伝子検査が依頼

る細胞が小数存在した。免疫染色において，泡沫細胞はされた。検査の結果，柴犬の GM1 ガングリオシドーシ

ビメンチン強陽性サイトケラチン陰性，S – 100 陰性，

スの原因変異（del C1647）のホモ接合体であることがリゾチーム陽性，HLA – DR 陽性，Iba – 1 陽性であり，明らかとなった。本症例は，購入時の 3 カ月齢時にはす腫大したマクロファージであった（図 4）。ホルマリン

でに左右の舌下腺付近に腫瘤が生じており，提出標本

固定後の電顕検索では，泡沫細胞の細胞質にライソゾー

は 7 カ月齢時に摘出された腫瘤である。腫瘤は左 3 × 2

ムと思われる空胞構造はみられるが，明瞭な細胞質内層

cm 大，右 2.5 × 1.5 cm 大（提出標本），両側とも淡赤状構造物はみられなかった。また，厚切り標本において色を呈し，囊胞状で，少量の透明な粘液が貯留し，囊胞

細胞質に大型の脂肪滴は認められなかった。

壁は 1 〜数 mm 大に肥厚していた（図 1）。本症例は，診断：GM1 ガングリオシドーシスの柴犬における泡沫

12 カ月齢時に中枢神経障害が進行性に悪化して自然死

細胞集簇を伴う唾液腺囊胞

したが，剖検は行われなかった。

考察：一般的な犬の唾液腺囊胞においてもマクロファー

組織所見：口腔粘膜の固有層に大型類円形の泡沫細胞がジが多数浸潤するが，本症例のような脂肪芽細胞様に腫多数浸潤し，血管線維組織の増生もみられた（図 2）。

大した泡沫細胞の形態を呈することはなく，GM1 ガン

泡沫細胞の核は類円形で，淡明や空虚な細胞質は単発

グリオシドーシスによるマクロファージの形態変化を伴空胞状あるいは微細網状を呈しており，脂肪芽細胞様でうことが特徴的である。

あった（図 3）。腫瘤のスタンプ塗沫標本でも細胞質は（三好宣彰）

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ラットの頸腹部腫瘤
残留農薬研究所

第 51 回獣医病理学研修会 No. 1038

動物：ラット，Wistar Hannover（BrlHan : WIST@Jcl [GALAS]），
雌，16 週齢。
臨床事項：繁殖毒性試験に用いた動物で，妊娠 20 日目に計画殺，剖検の 12 日前より頸腹部に腫瘤が触知された。
剖検所見：頸腹部皮下に直径約 30 mm の淡褐色腫瘤が観察された。腫瘤の一部に正常の唾液腺が確認された。
腫瘤の横断面は，淡褐色〜白色，充実性で，内部に暗赤色巣が散見された。
組織所見：腫瘍は皮下に存在し，線維性の被膜で被包化され表皮との連続性は見られなかった。腫瘍細胞は類
円形から楕円形の核と好塩基性の比較的乏しい細胞質を有し，充実性に増殖していた。また，腫瘍全体に扁平上
皮化生が散見された（図 1）。腫瘍の辺縁部では線維性結合織に分画され胞巣状に増殖する部位（図 2）が認められ，明瞭ではないものの，一部に腺管状に増殖する像も見られた。高悪性度を示す所見として，核の異型性や分裂像とともに，出血，壊死，被膜への軽度の浸潤像が観察された。腫瘍細胞は PAS 染色陰性，免疫染色ではKeratin（図 3），Vimentin（図 4），GFAP（図 5），p63（図6），Prominin–1（図 7）に陽性であった。
診断：唾液腺にみられた低分化腺癌
考察：腫瘍細胞は中心部では充実性増殖を，辺縁部では胞巣状増殖を示し，Keratin および Vimentin に陽性であった。ラットの唾液腺由来の未分化癌では，腫瘍細胞が Keratin と Vimentin の両方に陽性を示すという報告 1）があり，組織像も今回の症例と類似していたことから，診断の候補に挙げられた。一方，本症例では p63
および GFAP に陽性を示す筋上皮様の細胞が認められたことから，多形腺腫もしくは筋上皮腫（筋上皮癌）も疑われた。しかし軟骨や粘液などの基質の産生を認めな
いこと，および増殖パターンの違いからこれらを除外した。前述の未分化癌では腫瘍細胞が筋上皮への分化を示すという報告はなされていないこと，本症例では一部に腺管状に増殖する部位が見られたことから，本症例を未分化癌ではなく低分化腺癌と診断した。Prominin–
1 は唾液腺の介在導管および腺房の上皮細胞の頂端膜や
stem cell に陽性を示すことが報告されており，腫瘍細胞にも一部，正常な顎下腺，耳下腺に類似する陽性像がみられたことから，本腫瘍の由来は顎下腺もしくは耳下腺であると考えられた。
（嶋田悠子）
参考文献：
1. Nishikawa, S., Sano, F., Takagi, K., Okada, M.,
Sugimoto, J., Takagi, S. 2010. Spontaneous poorly
differentiated carcinoma with cells positive for vimentin ina salivary gland of a young rat. Toxicol. Pathol. 38 : 315–318.

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日生研たより

論文紹介

Avibacterium paragallinarum の
RTX 毒素様遺伝子およびオペロンの同定と性状解析
今井孝彦
Identification and Characterization of an R TX Toxin-Like Gene and Its Operon from Avibacterium
paragallinarum
Avian Diseases 56 : 537–544, 2012
Yen–Chiang Pana, Duen–Huey Tana, Jui–Hung Shienb, Chun–Chi Liuc, Yi–Siang Hea, Pin–Chun Shenb,

and

a,d

Poa–Chun Chang

Graduate Institute of Microbiology and Public Healtha, Department of Veterinary Medicineb, Institute of Henomics and Bioinformaticc, Agricultural Biotechnologyd, National Chung Hsing University, Taichung 402, Taiwan.

要旨

序論

Avibacterium paragallinarum は鶏の重要な呼吸器

Avibacterium（Haemophilus）paragallinarum（A.

疾患，伝染性コリーザの原因菌である。全ゲノム解

paragallinarum）は，鶏に発育不良や産卵率の低下

析 に よ り A. paragallinarum H18 株 は，Pasteurel-をもたらす重大な呼吸器病である伝染性コリーザの

laceae の RTX オペロンと非常によく似た RTX 毒素

原因菌である。全菌体を使った A. paragallinarum

様オペロンを有していることが明らかとなった。こ不活化ワクチンは広く用いられているが，伝染性コの オ ペ ロ ン 中 に は，avxIC，avxIA，avxIB，avxID

リーザの発生は続いており，世界中で多大な経済的と名付けられた 4 つの遺伝子が見つかった。avxIA

損失が生じている。A. paragallinarum は Page らには，分子量 250 kDa と推定される RTX 様毒素（Avx-

よって A，B，C 型の 3 つの血清型に分類され，不IA）をコードしている。AvxIA はペプチダーゼ S8

活化ワクチンはそれぞれの血清型に対してのみ効果

ドメインと前駆タンパク質転換酵素 P ドメインをを示す。A. paragallinarum では，これまでにヘマ持つが，どちらのドメインも他の RTX 毒素では見

グルチニン抗原や莢膜，鉄獲得機能を有するタンパ

つかっていない。大腸菌で発現させた組換え AvxIA

ク 質，リ ポ 多 糖，メ タ ロ プ ロ テ ア ーゼ や putative

は溶血性も細胞毒性も持っていなかった。PCR とtoxin といったいくつかの病原性因子が同定されてシークエンス解析により avxIA は，本研究で調べたいる。これらの因子の研究は，A. paragallinarum

全ての A. paragallinarum 株および野外株がコードの 病 原 性 発 現 機 構 の 解 明 と 新 た な A. paragalli-

していることが明らかになった。A. paragallinarum

narum ワクチンを開発する上で重要である。

を感染させた鶏から採取した血清は AvxIA に強く

RTX 毒 素（Repeats in the structural toxin）は，反応したことから，AvxIA には免疫原性があること

多くの病原性グラム陰性菌によって産生されるポアが示唆された。本研究は，A. paragallinarum にお形成毒素である。RTX オペロンは CABD パターン

いて RTX 毒素様オペロンを同定した最初の報告でをとることが多く，C は活性化タンパク質をコードある。このオペロンの遺伝子産物は疾病の原因に関しており，A は毒素，B と D は I 型に分類される分連している可能性があり，A. paragallinarum の優泌装置をコードしている。多くの RTX 毒素が溶血れたワクチンターゲットとなり得ることが示唆され活性および細胞毒性を有している。近年，RTX 毒た。

素がβ2 – インテグリンのβサブユニット（CD18）

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に結合し，標的細胞のアポトーシスを誘導すること

で あ る ORF を 予 測 し，BLASTP プ ロ グ ラ ムが示された。RTX 毒素はグリシンとアスパラギン（NCBI）を用いて GenBank における相同性を検索

酸に富む反復配列（ヘモリシンのカルシウム結合配した。タンパク質のドメイン構成は Pfam search を列としても知られている）を有しており，RTX 毒用 い て 調 べ た。配 列 の ア ラ イ メ ン ト は LASER-

素はこれらの配列を介して自身の機能に必須である

GENE（DNASTAR Inc., Madison, WI）の MegAlign

Ca イオンに結合する。RTX 毒素は Pasteurellaceae

プログラムを用いて行った。プロモーターと転写終科に属するいくつかの菌で主要な病原性因子である。

結点は BPROM と ARNold を用いて予測した。

2+

Pasteurellaceae 科によって引き起こされる疾患に対するワクチンに RTX 毒素が含まれていることも組換え AvxIA の発現多々ある。これまで A. paragallinarum が RTX 毒素

表 1 に 示 し た プ ラ イ マ ー を 用 い た PCR に よ りをコードする遺伝子を有しているとの報告はなかっ

RTX 毒素様タンパク質をコードする遺伝子を増幅たが，RTX 様タンパク質が存在することは示唆さした。増幅した PCR 産物を適切な制限酵素（EcoRI，

れていた。本論文は，A. paragallinarum の RTX 毒

XhoI，NheI，BamHI または SalI）で切断し，発現

素様遺伝子とそのオペロンの同定と性状解析についベ ク タ ー pET23a（Novagen, Gibbstown, NJ）に 挿て述べている。この RTX 毒素様タンパク質の活性入した。pET23a に挿入された DNA は，シークエ

を，溶血性および細胞毒性試験の観点から調べた。

ンスによって確認した。この組換えプラスミドで大また，異種菌株や野外分離株の RTX 毒素様遺伝子

腸菌 BL21（DE3）を形質転換し，userʼs manual ofの分布を PCR とシークエンス解析によって調べた。

the pET system（Novagen）に従って組換えタンパ
ク質を作製した。この過程を簡単に述べると，組換え プ ラ ス ミ ド を 有 す る 大 腸 菌 BL21（DE3）を 50

材料と方法

mL の Luria – Bertani 培地で OD600 ＝ 0.6 に達する菌株と DNA 抽出まで培養した。そこに isopropylthio –β– d – thioga-

本研究では，221 株と H18 株（それぞれ A. para-lactose を，終濃度 0.4 mM となるように加え，25℃

gallinarum A 型および C 型の参照株）と台湾からでさらに 12 時間培養した。培養後，3,000×g で 20分離された 6 種類の野外株（TW95，TW96，TW07，

分間遠心することにより細胞を沈殿させ，10 mM

TW08，TW09，TW11）を使用した。全ての菌株は，

Tris（pH 7.5），150 mM NaCl，5 mM CaCl2 からな

種特異的な PCR により A. paragallinarum であるこる緩衝液 2 mL に再浮遊した。この懸濁液を超音波とを確認した。台湾で分離された 6 株の血清型は，処理し，12,000×g で 20 分間遠心した。上清と沈

赤血球凝集抑制法によって全て C 型であると同定

殿画分をそれぞれ集め，SDS ポリアクリルアミドした。A. paragallinarum は，5％ウシ血清と 0.01％

ゲル電気泳動（SDS – PAGE）とウェスタンブロッ

NAD を加えたブレインハートインフュージョン寒トによって解析した。上清を組換えタンパク質の可天培地で培養した。平板は，37℃のろうそく瓶培養

溶性画分とした。タンパク質濃度は protein assay

法 で 培 養 し た。細 菌 の DNA は DNeasy Tissue Kit

kit（Bio – Rad, Hercules, CA）を用いて測定した。

（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて分離した。
ウェスタンブロット
全ゲノムシークエンス

Animal Health Research Institute（Council of Ag-

全ゲノムシークエンスを行うため，H18 株のゲノ

riculture, Taiwan）から入手した 20 週齢の SPF 鶏 3

ム DNA を Mission Biotech Inc.（Taipei, Taiwan）

羽から，感染前の血清を採取した。鶏の鼻腔から 5に 送 付 し た。シ ーク エ ン ス 解 析 は，Genome Se-

×109 CFU の A. paragallinarum 台 湾 分 離 株 で あ る

quencer GS Junior System（Roche Diagnostics, Indi-

TW07 を感染させた。感染後，全ての鶏が伝染性コ

anapolis, IN）を用いて行った。平均サイズ 8190 bp，

リーザの臨床症状（鼻汁および顔面浮腫）を示した。

計 296 個のシークエンス配列が得られた。これらの感染 1 週間後に，全ての鶏の眼窩下洞スワブから A.

断片から，GLIMMER ソフトを用いてコード領域

paragallinarum が分離された。感染 1 週間後の血清8（84）

日生研たより

表1

本研究で使用したプライマー

A

制限酵素（EcoRI ，XhoI ，NheI ，BamHI ，SalI ）切断配列を下線で示した。
PCR で増幅される遺伝子の大きさを括弧で示した。
C
H18 株の avxIA の開始コドンを nt 1 とした。
D
F4 は H18，TW95，TW08，TW09，TW11 株，F4 は 221，TW96，TW07 株ゲノム DNA から PCR によって増幅した。
Bを採取し，感染前後の血清をそれぞれウェスタンブ

釈し，10 mL の Histopaque – 1077 溶液（Sigma – Aldrich,

ロット解析用にプールした。動物実験は，Institu-

St. Louis, MO）の上に慎重に重層した。これを 600

tional Animal Care and Use Committee at National×g で 20 分間遠心し，相分離した。中間層から末Chung Hsing University の許可を受けて行った。

梢血単核球（PBMC）を回収し，PBS で一回洗浄しウェスタンブロット解析では，まず組換えタンパた。細 胞 を RPMI – 1640 培 地（Sigma – Aldrich）にク質の可溶性画分と不溶性画分を，Mini – Protean 3

再浮遊し，3 × 105 個の PBMC（200μL の培地中）

system（Bio – Rad）を用いた SDS – PAGE に供した。

を 96 穴プレート各ウェルに撒いた。組換えタンパ

タンパク質を semi – dry transfer system（Bio – Rad）

ク質（5μg/μL）の可溶性画分をフィルター滅菌し，を使ってニトロセルロースメンブレンに転写した。

これを各ウェルに加え 37℃，5％ CO2 の条件下で 3

メンブレンを 3％スキムミルクでブロッキングし，

時 間 培 養 し た。CytoTox96 Non – Radioactive Cyto-

2000 倍に希釈した 6 ×ヒスチジンタグに対するマウ

toxicity Assay Kit（Promega, Madison, WI）を 用 い

ス モ ノ ク ロ ーナ ル 抗 体（Amersham Biosciences,て userʼs manual に従って，細胞毒性を測定した。

Piscataway, NJ）または 500 倍に希釈した感染前も溶血性試験は Kristensen らが述べた方法に従っ

しくは後の血清を作用させた。その後，アルカリて行った。10 mM Tris（pH 7.5），150 mM NaCl，5

フォスファターゼでラベルされた抗マウス IgG 抗

mM CaCl2 からなる緩衝液に，2％となるように鶏体（200 倍 希 釈）ま た は 抗 鶏 IgG 抗 体（5000 倍 希

赤血球を加えた。この赤血球浮遊液（900μL）と釈）（Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithers-

フ ィル タ ー滅 菌 し た 組 換 え タ ン パ ク 質（5μg/burg, MD）を用いて検出した。

μL）の可溶性画分を混合し，37℃で 2 時間培養した。
800× g で 2 分間遠心して溶血していない赤血球を細胞毒性，溶血性およびプロテアーゼ試験

除いた後，上清に放出されたヘモグロビンの量を細胞毒性試験は，Kuhnert らが述べた方法に従っ

540 nm の吸光度により測定した。赤血球を 1％ Tri-て行った。簡単に述べると，鶏から 10 mL の全血

ton X – 100 で溶解したサンプルを，100％の赤血球をヘパリンシリンジを用いて採取した。血液をリンが溶解した基準とした。

酸緩衝生理食塩水（PBS）で 1 : 3 となるように希58（6），2012

9（85）異なる A. paragallinarum 株間における avxIA 遺伝

avxI（Avibacterium RTX toxin I）と名付けられた。

子の PCR による検出

こ の オ ペ ロ ン に は，avxIC，avxIA，avxIB，avxID

F1（＋）/F1（−），F2（＋）/F2（−），F3（＋）/F3と名付けられた 4 つの遺伝子が見つかった（図 1A）。

（−），F4（＋）/F1（−）という 4 組のプライマーを配列から推定されるプロモーターが avxIC の上流に，

avxIA の異なる領域を増幅するために使用した。こ転写終結点シグナルは avxID の下流に見つかった

れらのプライマーの配列は表 1 に示した。PCR 産（図 1A）。推定されるプロモーターと転写終結点の物は QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用い

位置は，他の細菌の RTX 毒素オペロンとよく似てて 精 製 し，Big Dye Terminator Cycle Sequencing

いた。avxI オペロンは，orf1，nhaP という二つのKit（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて遺伝子に挟まれている（図 1A）。orf1 遺伝子は，自動シークエンサー（ABI – 3730XL DNA Analyzer,

GenBank に登録されたどのタンパク質とも相同性

Applied Biosystems）で両方向から配列を決定した。 のない，機能未知なタンパク質をコードしている。
配 列 は LASERGENE package（DNASTAR Inc.）のnhaP 遺伝子は，Na＋/H＋対向輸送体遺伝子と 77％

Seqman プログラムに集めた。本研究で得られた塩の相同性を示すタンパク質をコードしており，この基 配 列 は，GenBank の 登 録 番 号 JQ289154 –タンパク質が RTX 毒素の機能に関連するとの報告

JQ289156 から入手できる。

はない。
avxI オペロンにある 4 つの遺伝子の中で，配列から推定すると avxIA は RTX 様毒素をコードしてお結果

り，約 250 kDa であると推定される。BlastP で検索

A. Paragallinarum における RTX 毒素様オペロンのしたところ，AvxIA は G. anatis（登録番号 AEC17940）

同定の RTX 毒 素 様 溶 血 素 と も っ と も 相 同 性 が 高 い

A. paragallinarum H18 株の全ゲノムシークエン（74％）ことが分かった。Pfam で調べたところ，

スを行い，H18 株が RTX 毒素様オペロンを有してAvxIA は 24 個のヘモリシンカルシウム結合反復配いることが明らかになった。このオペロンは，別の列と 1 個の RTX C 末端ドメインを有していること

細菌の RTX オペロンに類似していたことから，が明らかになった（図 1B）。これらの特徴は，Avx-

図 1（A）A. paragallinarum の avxIA オペロンの遺伝子構成。
矢印は遺伝子の位置と向きを表している。
遺伝子の名前を各矢印の上部に示した。
推定されるプロモーター配列（△）と転写終結シグナル（Ω）を示した。
（B） H18 株の AvxIA のドメイン構成。

10（86）日生研たより図 2 A. paragallinarum AvxIC，E. coli. の HlyC，A. pleuropneumoniae の ApxIC のアミノ酸配列比較。
同一もしくは類似したアミノ酸は太字で示した。全ての株で保存されているアミノ酸は影付きで示した。

IA が RTX 毒素様タンパク質であることを示唆して組換え AvxIA の発現と性状解析いる。Pfam から得られた結果から，AvxIA はペプ

多くの RTX 毒素が細胞毒性および溶血活性を示

チダーゼ S8 ドメインと前駆タンパク質転換酵素 P

す。AvxIA にこれらの活性があるかを調べるために，ドメインを有していることも分かった。これら 2 つavxIA を A. paragallinarum からクローニングし，6のドメインが，AvxIA 中でどのような機能を持つか×ヒスチジンタグを C 末端に持つ AvxIA を大腸菌では明らかになっていない。avxIB と avxID という二組換えタンパク質として発現した。単独でも avxICつの遺伝子が avxIA の下流にある（図 1A）。これらと同時に発現させても，avxIA は発現した。avxIA

二 つ の 遺 伝 子 は，Gallibacterium anatis の HlyB とに 加 え，A. pleuropneumoniae の apxIA も 発 現 さ せ

HlyD（AEC17941，AEC17942）と そ れ ぞ れ 81％おた。この ApxIA は，溶血性と細胞毒性の両方を有よび 88％の相同性を有するタンパク質をコードししていることが知られているため，本研究では陽性ている。HlyB と HlyD は，RTX 毒素の分泌に必須

コントロールとして用いた。avxIA と同様，apxIAの I 型分泌装置を構成している。

も単独または avxIC と同時に発現させた。組換え

avxIC 遺伝子は，avxIA の上流にコードされていAvxIA（r – AvxIA）お よ び ApxIA（r – ApxIA）の 分る。avxIC 遺伝子は，配列から推定するに活性化タ子量は計算上それぞれ約 250 kDa と 110 kDa であンパク質をコードしている。AvxIC は他の細菌のる。r – AvxIA と r – ApxIA を 大 腸 菌 で 発 現 さ せ た

RtxC タンパク質とあまり相同性がないが，AvxIC（図 3A）。r – AvxIA では，250 kDa より小さいタンの配列は二つの代表的な RtxC タンパク質である大

パク質のバンドが多数検出され，これは単独で発現

腸菌の HlyC そして Actinobacillus pleuropneumoniae

しても avxIC と共発現しても同様であった（図 3A）。

の ApxIC と並べてみると，合計 46 個のアミノ酸残これらのタンパク質のバンドは，r – AvxIA が翻訳

基がこれら 3 つのタンパク質間で保存されていたこ

後修飾を受けているもしくは切断されているためにとがわかった（図 2）。このアミノ酸配列の保存性生じるのかもしれない。r – AvxIA とは対照的に，r –は AvxIC が，RTX 毒素の活性化タンパク質である

ApxIA ではこれらのバンドは検出されなかった。r –アシラーゼ HlyC や ApxIC と似た機能を有している

AvxIA および r – ApxIA いずれも，発現したタンパ可能性を示唆している。このことは，AvxIA にはク質の大部分が不溶性画分で検出されたが，いくら15 個ものアシル化されうるリジンがあることから

かは可溶性画分でも検出された。通常，不溶性画分も支持される。

にあるタンパク質は生理活性の無い封入体を形成することから，溶血試験と細胞毒性試験には可溶性のr – AvxIA および r – ApxIA のみを使用した。コント58（6），2012

11（87）

ロ ール と 比 較 し て，r – AvxIA は 単 独 発 現 で も r –/F3（−）という三組のプライマーを用いた。三組

AvxIC と共発現でも溶血活性と細胞毒性のいずれものプライマーは H18 株のシークエンス解析に基づ示さなかった（図 3B）。一方で r – ApxIA は r – Apx-

いて設計した（表 1）。これらのプライマーを用い

IC と共発現したときに強烈な溶血性と細胞毒性をた PCR では F1，F2，F3 という DNA 断片が増幅さ示した（図 3B）
。この結果は，r – AvxIA は溶血素でれるが，これはそれぞれ avxIA の 5ʼ末端，中央部分

も細胞毒素でもないということを示唆している。

そして 3ʼ末端にあたる（図 4A）。F1（＋）/F1（−）
プライマーを用いた PCR では，F1 フラグメント

A. paragallinarum における avxIA 遺伝子の分布（2.8 kb）は H18 株のみから検出された（図 4B）。

異なる領域にアニーリングするプライマーを用いこの結果は F1（＋）もしくは F1（−）プライマーは，た PCR により，A. paragallinarum の異種菌株や台H18 以外の株では F1 フラグメントの増幅に適して湾分離株での avxIA 遺伝子の分布を調べた（図 4A）。

いないことを示している。一方，F2（＋）/F2（−）

はじめに F1（＋）/F1（−），F2（＋）/F2（−），F3（＋）と F3（＋）/F3（−）プライマーを用いた PCR では，

図 3（A）大腸菌で発現した組換え RTX のウェスタンブロット解析。
組換えタンパク質はマウス抗 6 x ヒスチジン抗体で検出した。
S と P はそれぞれ可溶性画分と沈殿物画分を表している。全長の r‑AvxIA と r‑ApxIA に相当するバンドを矢印で示した。
（B）組換え RTX の可溶性画分を用いた溶血性および細胞毒性試験。

図 4（A） avxIA を検出するために使用したプライマーの位置。
大きい矢印は遺伝子の位置と向きを示しており，ATG は avxIA の開始コドンを表している。小さい矢印
は各プライマーの位置を示している。
細い線は PCR によって増幅される DNA のフラグメント（F1‑ F4 と F4 ）を示しており，線の上部には各フラグメントの大きさを表示した。
（B ‑ E） A. paragallinarum ゲノムから PCR で増幅した F1‑ F4 と F4 フラグメントを泳動したアガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した写真。
（E）に示したフラグメント F4 と F4 は，電気泳動前に QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて精製した。

12（88）日生研たより全ての株において F2（2.3 kb）と F3（3.4 kb）フラ

常に多様性が高く，A. paragallinarum はこの可変グメントが検出された（図 4C，D）。株間で F2 と領域の配列に基づき，三つのクラスに分類できるこF3 の配列を比較したところ，99.4 – 100％の相同性とが判明した。グループ 1 は 221 株であり，グルーがあった。H18 以外の株で F1 領域の DNA フラグ

プ 2 は H18，TW08，TW09，TW95，TW11，グルー

メントを PCR で増幅するために，いくつかのプラ

プ 3 は TW07 と TW96 で あ る。同 じ グ ル ープ に 属

イマーを試した。その中で F4（＋）/F1（−）プラする株の配列は高度に保存されていたが，グループ

イマーの組み合わせにより，H18，TW08，TW09，が異なるとわずか 34.9 – 47.9％の相同性しかなかっTW95，TW11 の F4 フラグメント（2.7 kb）が増幅た。グループ 1，2，3 に属する代表的な株のアミノすることを見出した（図 4E）。さらに 221，TW07，

酸 配 列 を 図 5 に 示 す。AvxIA の a.a. 1 – 331（H18TW96 株において，F4（＋）/F1（−）プライマーを株）は非常に変化しやすいが，331 番目以降は高度用いた PCR では F4ʼと名付けられた 3.4 kb のフラに保存されていることがわかる。この AvxIA の a.a.

グメントが検出された（図 4A，E）。F4ʼのシークエ

1 – 331 は血清型と相関していない。たとえば，H18

ンス解析により，F4ʼは avxIC の上流から avxIA の 5ʼと TW07 はどちらも C 型に属するが，この領域の末 端 領 域 で あ る こ と が わ か っ た（図 4A）。

配列は全く異なっている（図 5）。

F4 と F4ʼ のシークエンス解析により，avxIA の 5ʼ末端領域の配列が明らかになった。
株間で F4 と F4ʼのシークエンス配列を比較した
ところ，avxIA の 1 – 993 番目（H18 株）の配列は非

図5

In vivo における AvxIA の発現と抗原性
実験的に A. paragallinarum を感染させた鶏の血

221 株，H18 株，TW07 株の AvxIA N 末端領域のシークエンスアライメント。
同一のアミノ酸残基は太字で，全ての株で保存されているものは影付きで示した。
332 番目 (H18 株）のアミノ酸は▼で示した。

58（6），2012

13（89）清を用いたウェスタンブロット解析により，AvxIAや宿主への侵入に重要な役割を果たす。前駆タンパの抗原性を調べた。その結果，感染鶏の血清は r –ク質転換酵素 P ドメインは，ペプチダーゼ S8 ドメ

AvxIA に強く反応した（図 6）。この感染鶏の血清インの下流でよく見つかり，ペプチダーゼ S8 の折で検出されたバンドは，抗 6 ×ヒスチジンタグ抗体

り畳みに関与している。AvxIA にこれら二つのドメで検出されたバンドとよく似ていることから，これインがあることは，AvxIA はペプチダーゼ S8 ファらのバンドは r – AvxIA あるいはその修飾産物であミリーの一種であることが示唆された。この仮説をると考えられる。感染後わずか 7 日で回収した血清検証するためには，AvxIA のペプチダーゼ S8 活性がこれほどにも r – AvxIA に強く反応するというこを調べる必要性がある。

とから，AvxIA は in vivo でも発現しており，鶏で多くの RTX 毒素が細胞毒性および溶血性を有し高い免疫原性を有していることが示唆された。なお，ており，この標的となる細胞は赤血球を含む広範な

感染前の血清は r – AvxIA に反応しなかった（図 6）。

細胞である。しかしながら RTX 毒素の中には細胞毒性しか示さないものもあり，さらにその毒性は宿主や細胞の種類に依存する。我々が作製した組換え
AvxIA に溶血性あるいは細胞毒性が無かったことに

考察
RTX 毒素は Pasteurellaceae に属するいくつかのついて説明することは困難である。r – AvxIA に溶菌で主要な病原性因子であると考えられている。本

血性がなかったことは，A. paragallinarum 自体に研究で紹介したデータは，A. paragallinarum が他

溶血性がないと知られていることから，驚くべきこの菌の RTX オペロンと同様の遺伝子構成からなるとではない。細胞毒性が無かったのは，大腸菌で発RTX 様オペロンを有していることを示していた。

現した r – AvxIA の不溶性もしくは誤った立体構造

我々の知る限りでは，本研究が A. paragallinarumのためかもしれない。AvxIA の細胞毒性は細胞の種に RTX オペロンが存在するという最初の報告であ類に特異性があり，本研究で用いた PBMC といっる。AvxIA はペプチダーゼ S8 ドメインと前駆タン

た 細 胞 は AvxIA の 細 胞 毒 性 試 験 に は 適 し て い な

パク質転換酵素 P ドメインを持つが，これらは他かったのかもしれない。AvxIA が細胞毒素であるかの RTX 毒素では見つかっていない。ペプチダーゼを調べるためには，マクロファージ，好中球あるい

S8 ド メ イ ン は ト リ プ シ ン と 同 様 の 触 媒 三 残 基はマクロファージ様の細胞株など，他の標的細胞を（Asp/His/Ser）を持つプロテアーゼのグループに用いた試験が必要である。

属する。これらのプロテアーゼは，細菌の栄養摂取

図6

AvxIA のアミノ末端領域 a.a. 1 – 331 の配列は非常

組換え AvxIA の抗原性を表すウェスタンブロット。
組換え AvxIA の可溶性画分を感染前，感染後の鶏血清もしくはマウス抗 6 x ヒスチジン抗体を用いて検出した。
全長の組換え AvxIA あるいはその分解物のバンドを矢印で示した。

14（90）日生研たよりに変化しやすいことが明らかになり，A. paragalli-

AvxIA のアミノ末端領域にあるこの可変配列がこれ

narum はこの領域の配列によって 3 つのグループ

らの機能を有しているかは，まだ不明である。

に分類された。この可変領域は AvxIA のほんの一

RTX 毒素は，Pasteurellaceae が引き起こす疾病に部であることから，この領域内の変異は AvxIA の対するワクチンの重要なコンポーネントにもなって活性には影響しないかもしれない。一方で，過去にいる。本研究では，avxIA 遺伝子が 221 株，H18 株

Mannheimia haemolytica の RTX 毒 素（LktA）の ア

そして台湾分離された全ての野外株に存在すること

ミノ末端領域 a.a. 1 – 167 が標的細胞の特異性に関与を 示 し た。ま た，AvxIA は A. paragallinarum に 感していることを示した報告もある。さらに，ApxIA

染した鶏において免疫原性があることを示した。このアミノ末端領域の a.a. 40 – 380 の組換えタンパク

れらの結果から，今後，組換え AvxIA を基盤とし質は，宿主を A. pleuropneumoniae の致死感染からたワクチンの開発が発展するかもしれない。
（研究員）

防御することも知られている。これらの結果は，
RTX 毒素のアミノ末端領域が標的細胞の特異性や参考文献は割愛いたします。

免疫原性の決定に重要であることを示している。

発表論文紹介近年の日本における豚丹毒発症例から分離した
Erysipelothrix rhusiopathiae 株の性状について
堤信幸

Erysipelothrix rhusiopathiae は グ ラ ム 陽 性 の 小 桿性，亜急性そして慢性型の豚丹毒による経済的損失

菌で，人の皮膚病である類丹毒，豚の豚丹毒，及びは無視できるものではない。近年の調査において，他の動物種における様々な病気の原因菌である。豚

慢性型の豚丹毒から分離された E. rhusiopathiae 株

丹毒は，日本及びアメリカ中西部での養豚におけるのいくつかは生ワクチン株と密接な関係にあると記

臨床的問題として再登場して以来，養豚産業に大き載されたことから，生ワクチン株が日本における慢な経済的損失をもたらす再興感染症とみなされてい性型豚丹毒の増加の原因かもしれないという疑念がる。日本では豚丹毒を防ぐのに，小金井 65 – 0.15 株

生 じ た。Erysipelothrix spp. を 識 別 す る 目 的 で，

（血清型 1a）が生ワクチン製造用種菌として使用さ

RAPD 型別，リボタイピング，制限酵素断片長多型れている。この小金井 65 – 0.15 株は，アクリフラビ（RFLP）解 析，パ ル ス フ ィール ド ゲ ル 電 気 泳 動

ン色素を 0.15％含む寒天平板で 65 代継代すること（PFGE）解析といった分子生物学的手法が試されで弱毒化したものである。その後，生ワクチンを用た結果，ワクチン株と野外株を区別出来る可能性がいた集中的なワクチンプログラムによって，豚丹毒あったのは PFGE 解析だけであった。このことにの発生は大きく減少した。しかしながら，このようより，ワクチン株と野外株を迅速に区別することがな大規模ワクチン接種にもかかわらず，1985 年以降，

でき，正確で信頼性の高い診断法の開発が強く望ま

毎年約 2000 頭の豚が急性又は亜急性の感染を起これている。最近の研究で注目されているのは，菌体し，亜急性又は慢性の豚丹毒として毎年約 2000 頭

表面の防御抗原（surface protective antigen：Spa）の豚が食肉検査所で廃棄されている。このため，急タンパクをコードする遺伝子である spa の型に基づ

58（6），2012

15（91）

いた菌株の識別である。E. rhusiopathiae の Spa タ

時間で発育したコロニーを滅菌蒸留水（DW）に浮

ンパク質は，遺伝学的及びその抗原性から 3 つに分遊させた。生理食塩水で 1 回洗浄した後，DW に再類される。すなわち，SpaA（血清型 1a，1b，2，5，8，

浮 遊 し た。こ の 浮 遊 液 を 121℃で 1 時 間 オ ート ク

9，12，15，16，17，N），SpaB（血 清 型 4，6，11，

レーブにかけた後に，15,000 rpm で 15 分間遠心し

19，21）そして SpaC（血清型 18）の 3 種である。

た。遠 心 上 清 を 回 収 し，DW で 作 製 し た 1％ア ガ

さらに近年，アクリフラビン耐性とマウス病原性試

ロ ース（Sigma – Aldrich Co. Inc.）を 用 い て，E.

験とを組み合わせて，RAPD 型別，リボタイピング

rhusiopathiae の 血 清 型 1a，1b，2a 及 び 2b 型 に 対

及 び PFGE 解 析 の 結 果 を 比 較 す る こ と に よ り，するウサギ抗血清に対してゲル内沈降反応を行なっ

spaA 遺伝子上の 432 bp の高度可変領域の塩基配列た。室温で 16 時間反応させ，沈降線の形成を観察に基づいてワクチン株と野外株を区別する手法が開し，これら 4 つの血清で沈降線を示さない分離株に発された。その研究によれば，生物学的試験と組みついては，残りの抗血清を用いてゲル内沈降反応を合わせた遺伝子型別手法の結果は，spaA 遺伝子の行なった。使用した血清型 1 – 23 型と N 型に特異

配列解析とよく一致し，操作も容易で得られた結果的なウサギ抗血清は著者らの研究所で作製したものも明解であることが示されている。

を用いた。どの抗血清にも沈降線を示さない分離株

今回の研究では，血清型，アクリフラビン耐性，

は判定不能とした。

そしてマウス病原性試験と組み合わせた spaA 遺伝

野 外 株 15 株（血 清 型 1a の 14 株，血 清 型 2 の 1子の塩基配列解析により，2008 年から 2011 年にお株）と参照株 3 株（藤沢株，ATCC 19414T，小金井

ける豚丹毒の発症例から分離された E. rhusiopathi-

65 – 0.15 株）のアクリフラビン耐性試験は，他の論

ae の野外株の同定と識別を行なった。

文での報告に従って実施した。

アクリフラビン耐性試験と spaA 遺伝子の 432 bp

野外株 15 株（急性型の 3 株，亜急性型の 2 株，の高度可変領域の塩基配列解析の参照株には，E.

慢性型の 10 株）と参照株 2 株（藤沢株，小金井 65Trhusiopathiae の 3 株（藤沢株，標準株 ATCC 19414– 0.15 株）のマウスにおける病原性の決定は，他の株，小金井 65 – 0.15 株）を使用した。藤沢株は公知

論文で報告された方法に従った。簡単に述べると，の高病原性攻撃株で，アクリフラビン感受性である。

4 週齢の雌の ddY マウス（日本 SLC）の右鼠径部

小金井 65 – 0.15 株はアクリフラビン耐性の弱毒生ワ

皮下に約 102 CFU の野外株と藤沢株を 0.1 mL ずつ

クチン株である。

10 匹に注射し，無処置の対照群を 5 匹とした。ま

今回の研究には，豚丹毒を発症した豚から分離さた約 107 CFU の生ワクチン株（小金井 65 – 0.15 株）

れた Erysipelothrix sp. 78 株と，急性豚丹毒が発生しも同様に注射した。その後 10 日間臨床症状を観察た養豚場で症状を示した 5 頭の豚の脾臓，腎臓及びした。日本の動物用生物学的製剤基準によると生ワ

心臓から分離された 5 株を使用した。これらの 83

ク チ ン 株 は マ ウ ス を 殺 さ な い が，1 匹 あ た り 107

株は，2008 年から 2011 年にかけて秋田，茨城，群馬，CFU の攻撃で 80％以上のマウスに関節炎を起こす

長野，山口，熊本，宮崎及び鹿児島県での急性（敗とされる。豚丹毒菌の病原性レベルの分類として，血症型），亜急性（蕁麻疹型）及び慢性（関節炎型，3 日以内に 100％のマウスを殺した株は超高病原性，

心内膜炎型及びリンパ節炎型）の豚丹毒罹患豚から

4 – 5 日以内に 80 – 100％のマウスを殺した株は高病分離されたものである。

原性であると考えた。本研究で用いたマウスは，研

菌分離方法は，以前に報告した方法に若干の改変

究機関等における動物実験等の実施に関する基本指を加えた。組織サンプルからの Erysipelothrix spp.

針等に準拠した一般財団法人日本生物科学研究所のの分離には，クリスタルバイオレット（5μg/mL）

動物実験の適正な実施の為の実験動物管理規程にとアジ化ナトリウム（0.03％）の代わりに，カナマ沿って取り扱われた。

イシン（400μg/mL）とゲンタマイシン（25 μ g/

spaA 遺伝子の N 末端側半分の 432 bp の断片を

mL）を添加した BHI 寒天平板とブイヨンを用いた。

PCR で増幅し，過去に報告したように直接配列を分離株の血清型は，以前の報告と同様の方法で決決定した。簡単に説明すると，まず E. rhusiopathi-

定した。簡単に述べると，寒天平板を用い培養 24

ae のゲノム DNA を以前報告したように調製した。

16（92）

日生研たよりプライマーとして用いた Erko – 1F（5ʼ – GTGAAACAC-

Erysipelothrix 属様の特徴を持つコロニーはグラム

CGTATTTTAGTA – 3ʼ）と Erko – 2R（5ʼ – TTCAA-

染色を施して鏡検した。さらに E. rhusiopathiae がGAAGTTCCTGTAGTTT – 3ʼ）はそれぞれ spaA 遺伝

疑 わ れ る コ ロ ニ ー は，spaA 特 異 的 な プ ラ イ マ ー

子の第 502 番目から 522 番目と第 933 番目から 913

Erko – 1F と Erko – 2R を用いた PCR で同定した。

番目の塩基配列部分に位置しており，432 bp の断急性敗血症型豚丹毒の臨床症状を示した 5 頭の豚片が増幅された。PCR 法は他の報告にある通り，

組織サンプルから Erysipelothrix が分離された。血以 下 の 条 件 で 実 施 し た。ま ず 変 性 の ス テ ップ を

清型別と spaA の PCR から 5 株全てが血清型 1a の94℃で 3 分間，その後 94℃で 45 秒間の変性，55℃

E. rhusiopathiae であると同定された。2008 年から

で 1 分間のアニーリング，72℃で 2 分間の伸長のサ2011 年に分離された株は，血清型 1a，2a，型別不イクルを 30 回繰り返し，サイクルの最後に 5 分間

能のいずれかに分類された。菌株と病型の関係を表の伸長を行なった。PCR 産物のシーケンス反応は

1 に示した。83 株全てが E. rhusiopathiae であり，

プ ラ イ マ ー Erko – 1F と Erko – 2R で 行 な っ た。

そのうちの 79 株（95.2％）が血清型 1a，1 株（1.2％）

DNA 配列は以前報告した方法で解析した。

が血清型 2a，3 株（3.6％）が型別不能に分類された。
参照株 2 株（藤沢株，ATCC 19414T）と最近の野分離菌は BHI 寒天平板とブイヨンで継代培養し，
表1

2008 年から 2011 年に発生した豚丹毒より分離された野外 83 株の血清型
各血清型の株数症状
1a2a

判定不能 a)

合計

敗血症

50

50

蕁麻疹

3

リンパ節炎

6

6

心内膜炎

5

5

関節炎

15

1

1

17

合計

79

1

3

83

2

5

a）血清型 1 から 23 と N の抗血清で判定不能。
表2

豚丹毒菌 15 株のマウス病原性とアクリフラビン耐性
マウスに対する病原性を示した株数 c）

由来 a)

グループ b)

アクリフラビン耐性 d)
非常に高い

1

1

2

2

高い
S

敗血症

蕁麻疹

2

2

S

リンパ節炎

2

1

S

心内膜炎

2

1

S

2

7

S

3

1

S

関節炎

a） 亜急性（蕁麻疹型）と慢性（関節炎型）の菌株は屠殺場由来であり、それぞれ 2 株と 4 株であった。
一方、慢性例のリンパ節炎、心内膜炎、関節炎の菌株は養豚場由来であり、それぞれ 1 株、1 株、4 株であった。
b） spaA 配列の高度可変領域の類似性に基づいてグループに分類した。
c） 5 又は 10 匹のマウスに、藤沢株と野外株を 102 CFU の菌量で皮下注射を行った。
非常に高い，攻撃後 3 日以内に全てのマウスが死亡。
；高い，攻撃後 4‑5 日以内に 80 − 100% のマウスが死亡。
d） S，0.01％の濃度のアクリフラビンに感受性。 生ワクチン株は 0.01% アクリフラビンに耐性。

58（6），2012

17（93）

外株 15 株は，0.01％の濃度のアクリフラビンに感1 の株は他のグループの株と比較すると塩基配列が受性であったが，生ワクチン株である小金井 65 –2 箇所異なり，グループ 2 の株とは 584 番目と 609

0.15 株は同じ濃度のアクリフラビンに耐性であった番目，グループ 3 の株とは 583 番目と 584 番目の塩

（表 2）
。

基配列が異なっていた。これらの塩基配列の違いに

藤沢株と急性例由来株を合わせた 3 株は，3 日以より，アミノ酸配列には以下の変異が生じた。すな

内に 100％のマウスを殺した。一方，亜急性例由来わち，ⅰ）グループ 1 では 195 番目 がア ラニ ン，の 2 株と慢性例由来株を合わせた 10 株は，マウス

203 番目がイソロイシンとなり，ⅱ）グループ 2 で

2

1 匹当たり約 10 CFU の攻撃で 4 – 5 日以内に 80 –は 195 番目がアスパラギン酸，203 番目がメチオニ100％のマウスを殺した（表 2）。生ワクチン株であンとなり，ⅲ）グループ 3 では 195 番目がアスパラる小金井 65 – 0.15 株は 100％のマウスに関節炎を起

ギン，203 番目がイソロイシンとなった。さらに，こした。

グループ 1，2，3 の株は藤沢株との間にも 2 箇所の野外株の 83 株と高病原性藤沢株の spaA 遺伝子

塩基配列の違いがあり，それぞれ 584 番目と 769 番

における 432 bp の高度可変領域の塩基配列を，生目，583 番目と 769 番目，609 番目と 769 番目の塩ワクチン株である小金井 65 – 0.15 株と比較し，その基であった。これらの塩基配列の違いによって，違いを表 3 に示した。spaA 遺伝子の塩基配列解析

195 番目，203 番目，257 番目のアミノ酸配列に変に基づき，83 株は 3 つのグループに分類された。

異が生じた。また，グループ 1，2，3 の株は小金井

すなわち，グループ 1 は血清型 1a の 3 株，グルー

65 – 0.15 株との間に 1 箇所の塩基配列の違いがあり，

プ 2 は血清型 1a の 76 株と型別不能の 3 株，そしてそれぞれ 583 番目，584 番目，609 番目であった。

グループ 3 は血清型 2a の 1 株となった。グループ

これらの塩基配列の違いにより，195 番目と 203 番

表3

生ワクチン小金井 65 ‑ 0.15 株と比較した野外 83 株と藤沢株の spaA 遺伝子の 432 bp 高度可変領域における塩基又はアミノ酸置換
塩基置換（アミノ酸の位置）a）, b）
株または
グループ

県

株数

血清型

塩基
塩基
塩基
（アミノ酸 195 番目） （アミノ酸 203 番目） （アミノ酸 257 番目）

小金井 65‒0.15

1a

GAT（Asp）

ATT（Ile）

ATT（Ile）

藤沢

1a

GAT（Asp）

ATT（Ile）

CTT（Leu）

GCT（Ala）

ATT（Ile）

ATT（Ile）

GAT（Asp）

ATG（Met）

ATT（Ile）

AAT（Asn）

ATT（Ile）

ATT（Ile）

熊本

2

1a

山口

1

1a

宮崎

2

1a

鹿児島

3

1a

長野

35

1a

群馬

31

1a

茨城

2

1a

秋田

3

1a

長野

3

判定不能

長野

1

2a

グループ 1

グループ 2

グループ 3a） Asp，アスパラギン酸； Ala，アラニン； Asn，アスパラギン； Ile，イソロイシン； Leu，ロイシン； Met，メチオニン。
b） 下線を施した文字，同じ位置の塩基と置き換わった塩基； 下線を施した文字列，同じ位置のアミノ酸と置き換わったアミノ酸。

18（94）目のアミノ酸配列に変異が引き起こされた。

日生研たより今回の調査では，熊本県と山口県で分離された血清

血清型別は，疾患発生の疫学解明，疾患制御のた型 1a の 3 株において 584 番目の 1 箇所の塩基が置めのワクチン対応，そして汚染農場の血清学的モニ換していたことを除いては，7 つの県（宮崎，鹿児島，

タリングといった目的に有用であることが報告され

長野，群馬，茨城，宮城，秋田県）で分離された血ている。これまでの多くの報告によれば，豚丹毒の清型 1a の 76 株と型別不能の 3 株ではワクチン株で豚から分離された E. rhusiopathiae のほとんどは血ある小金井 65 – 0.15 株と比較して 609 番目の 1 塩基

清 型 1a，1b，2 に 同 定 さ れ て い る。2008 年 か らが置換していた。本研究で明らかになった血清型

2011 年に発生した豚丹毒の分離株に高い割合（83

1a の 79 株の塩基配列は以前の報告とは異なってい

株中の 95.2％）で血清型 1a が存在したという我々た。以前の報告では，3 株で 0 塩基，5 株で 1 塩基，の調査結果は，1999 年から 2001 年のアメリカ中西

2 株で 2 塩基の置換があり，生ワクチン株の小金井部で発生した豚丹毒からの分離株で血清型 1a が 44

65 – 0.15 株と比較すると，1 塩基置換のあった 5 株

株中 79.6％であったとする報告と一致する。しかしで は そ れ ぞ れ 591 番 目，711 番 目，729 番 目，796

ながら，我々の結果はこれまでの多くの報告とは部番目または 911 番目の塩基に置換が起こり，2 塩基

分的に異なっている。それらの報告では血清型 1a

置換のあった 2 株についてはそれぞれ 511 番目とと 2 が高率であったことが示されており，アイオワ

638 番目，または 555 番目と 773 番目の塩基での置州で 2007 年から 2009 年に発生した豚丹毒では 59換であった。本研究の結果から，E. rhusiopathiae

株中 40.7％が血清型 1a，49.2％が血清型 2，日本での 83 株は spaA 遺伝子の塩基配列の類似性により，発生した豚丹毒では 1983 年から 1993 年の調査で3 つのグループに分類されることが示唆された。す1046 株 中 40.4％が 血 清 型 1a，34.3％が 血 清 型 2，

なわち，ⅰ）グループ 1（血清型 1a の 3 株が含ま1992 年から 2002 年の調査で 800 株中 47.6％が血清れる）は 195 番目のアミノ酸がアラニン，203 番目

型 1a，31.8％が血清型 2，1994 年から 2001 年の調がイソロイシンで，熊本県と山口県で急性敗血症型

査で 66 株中 28.8％が血清型 1a，47％が血清型 2 と豚丹毒を引き起こした。ⅱ）グループ 2（血清型 1aされている。今回の結果を，他のグループの調査結の 76 株と型別不能の 3 株が含まれる）は 195 番目

果と合わせて考察すると，血清型 1a は世界中の豚のアミノ酸がアスパラギン酸，203 番目がメチオニ丹毒に罹患豚から高率に分離される血清型であり続ンで，多くの県で急性，亜急性，慢性の症例を引き

け て い る こ と が 強 く 示 唆 さ れ て い る が，今 回 の起こした。ⅲ）グループ 3（血清型 2a の 1 株が含2008 年から 2011 年に発生した豚丹毒における血清

まれる）は 195 番目のアミノ酸がアスパラギン酸，型 1a と 2 の分離率に大きな差異（95％と 1.2％）が203 番目がイソロイシンで，長野県で慢性関節炎の認められたことの説明はつかなかった。

症例を引き起こした。我々の結果からは，血清型

今回の我々の調査で，spaA 遺伝子の 432 bp の高度可変領域における塩基配列とアミノ酸が生ワクチ

1a で SpaA でグループ 2 に分類される型が日本に広く浸潤していることが示された。

ン株である小金井 65 – 0.15 株と異なっていた株がマ

慢性の豚丹毒から分離された株がマウスに高い病

ウスに病原性を示した結果は，Nagai et al. による原性を持つという我々の結果は，過去に報告された

最近の報告と一致している。彼らは，中部地方におデ ータ と 一 致 し て い る。Imada et al. に よ る と，いて 2001 年から 2002 年に慢性型（関節炎）の症例

1992 年から 2002 年において慢性型症例のブタからから分離された 16 株（血清 型 1 の 10 株，血清型分離された血清型 1a の 50 株中 21 株（42％）が，1b の 6 株）の生物学的及び遺伝学的性状を調べ，

104 CFU の攻撃でマウスに高い病原性を示したこと

以下のことを示した。すなわち，ⅰ）生ワクチン株が報告されている。2008 年に，Nagai et al. は，慢の spaA 遺伝子と同じ塩基配列を示した血清型 1a性の関節炎型症例のブタから分離された 16 株中 8の 3 株は，生ワクチン株と密接に関係していると思株（50％）がマウス 1 匹当たり 107 CFU の攻撃菌われた。ⅱ）生ワクチン株と異なる spaA 遺伝子の量で高い病原性を示したことを報告している。近年，塩基配列を示した血清型 1a と 1b の株は，マウスにOzawa et al. により，1994 年から 2001 年に慢性型

対して病原性を示し，野外株であると考えられた。

症例から分離された 55 株中 39 株（70.9％）がマウ

58（6），2012

19（95）

ス 1 匹当たり 108 CFU の攻撃菌量で高い病原性を実施した研究室に関係なく同じ結果が得られ，一度示すことが報告されている。本研究では，慢性例のにより多くのサンプルをスクリーニングできること

ブタから分離された 10 株（血清型 1a の 9 株と血清が報告されている。

型 2a の 1 株が含まれる）は，生ワクチン株と比較

本研究の結果からは以下のことが示された（ⅰ）近して生物学的及び遺伝的特徴が異なっており，マウ年発生した豚丹毒から分離された株のほとんど（832ス 1 匹当たり約 10 CFU の攻撃菌量の高い病原性株 中 の 95.2％）は 血 清 型 1a と 同 定 さ れ た。（ⅱ）

を示すことが示された。他の研究者の報告データとspaA 遺伝子の 432 bp の高度可変領域のアミノ酸配合わせ，これらの結果は，生ワクチン株と関連性の列の類似性に基づいて，83 株は 3 つのグループにない慢性型症例由来株の多くはマウスに高い病原性

分類された。
（ⅲ）これら 83 株は全て野外株であり，を有しているという考えを支持するものである。

ワクチン株は含まれなかった。現在のところ，豚丹本研究で行われた spaA 遺伝子の 432 bp 高度可変

毒発症例における菌株間の関連性をより明確にする

領域の塩基配列解析における最も重要な利点は，そため，PFGE プロファイルに関する研究，現在利用の簡便さと一度により多くのサンプルがスクリーニ

可能なワクチンの近年分離株に対する防御効果につング可能な応用性である。この塩基配列解析は，野いて研究を進めている。

外株から生ワクチン株を識別するためのマウス病原性試験及びアクリフラビン耐性試験の結果に対して参考文献は割愛いたします。

も相関していることが示された。塩基配列解析は実本 稿 は J. Vet. Med. Sci.（2012）74（7）, 949 – 953

施が容易である上に，得られた結果に曖昧さが無く， に掲載された論文を編集・日本語訳したものです。

20（96）日生研たより編集室からの訂正とお詫び
平素は本誌をご愛読頂き，ありがとうございます。
先回に発行いたしました 9 月号の獣医病理学研修会記事につきまして，表紙目次および本誌ページに誤植がございました。関係者の方々ならびに読者の皆様には深くお詫び
申し上げます。
9 月号 5 ページに掲載しました記事のタイトル「第 51 回 No.1045
瘤（摂南大学）」は誤りで，正しくは「第 51 回 No.1043

イヌの卵巣部腫イヌの下腿部筋間腫瘤（大阪府立大学）」でありました。またそれに連動する表紙目次も「第 51 回 No.1043

イヌの下腿部筋間腫瘤（大阪府立大学）」に訂正させて頂きます。当方の不手際により関係者の方々に多大なご迷惑をおかけし，大変申し訳ございませんでした。
このため，本号の研修会記事にはあらためて「第 51 回 No.1043

イヌの下腿部筋間腫瘤（大阪府立大学）」を掲載させて頂いております。
今後はより一層の注意を払い，日生研たよりの編集にあたっていく所存でございますので，引き続きご愛読いただけますようお願い申し上げます。
日生研たより編集室

日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（隔月 1 回発行）

（通巻 577 号） 平成 24 年 10 月 25 日印刷
発行所〒 198 0024

生命の「共生・調和」を理念とし，生命体の豊かな明日と，研究の永続性を願う
気持ちを快いリズムに整え，視覚化したものです。カラーは生命の源，水を表す

東京都青梅市新町 9 丁目 2221 番地の 1

TEL：0428（33）1056（企画学術部） FAX：0428（33）1036
発行人
編集室「青」としています。

印刷所
表紙題字は故中村⒥治博士の揮毫

平成 24 年 11 月 1 日発行（第 58 巻第 6 号）

一般財団法人 日本生物科学研究所

林

志鋒

委

員／堤 信幸（委員長），大嶋 篤，山下 龍

事務／企画学術部

株式会社 精ഛ社（無断転載を禁ず）