様式３

愛媛大学沿岸環境科学研究センター
共同利用・共同研究拠点「化学汚染・沿岸環境研究拠点」
共同研究報告書
平成 30 年 3 月 23 日
化学汚染・沿岸環境研究拠点 拠点長 殿
申請者（研究代表者）
所属機関

帯広畜産大学

職

准教授

氏名

久保田 彰

下記の共同研究について、別紙の通り報告します。
１ 研究課題In vivo および in silico 法による有機リン系難燃剤の生体影響評価と作用機序解明
２ 研究組織氏名

職分担研究課題帯広畜産大学准教授

受精卵を用いた有機リン系難燃剤の影響評価および研究総括

分担者
森田友理

帯広畜産大学

学部生

受精卵を用いた有機リン系難燃剤の影響評価

芳之内結加

愛媛大学

大学院生

エストロゲン受容体と有機リン系難燃剤の in silico 相互作用解析

拠点対応教員

愛媛大学教授

エストロゲン受容体と有機リン系難燃剤の in silico 相互作用解析

代表者
久保田 彰

所属岩田久人

３ 研究内容 （別紙）

研究課題
In vivo および in silico 法による有機リン系難燃剤の生体影響評価と作用機序解明

研究代表者

久保田彰（帯広畜産大学獣医学研究部門）

共同研究者

森田 友理（帯広畜産大学獣医学研究部門）
芳之内結加（愛媛大学沿岸環境科学研究センター）
岩田 久人（愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

研究目的
有機リン系難燃剤 (OPFRs) は、使用規制が進む臭素系難燃剤の代替として世界中で使用が増加している。一方で、OPFRs は揮発性が高く室内空気汚染物質として問題視され、化学物質過敏症との関連も疑われてきた。最近では魚類胚や鳥類胚に対して発生毒性を示すことも報告されている。さらに一部の OPFRs では親化合物よりも代謝物でエストロゲン活性が高いことも in vitro 試験で報告されている。
従って、OPFRs が臭素系難燃剤の代替物質として適しているかどうかは不明な点が多く、化合物を含む OPFRs による発生毒性とその分子機構について詳細に検討する必要がある。そこで本研究では、ゼブラフィッシュをモデルとして、OPFRsおよびその代謝物の発生毒性と分子機構を明らかにすることを試みた。
研究内容
受精後 72 時間 (72 hpf) の胚に triphenyl phosphate (TPP)、tris(1,3-dichloro-2propyl)phosphate (TDCPP) 、 tricresyl phosphate (TCP) 、 tris(2-chloroethyl)phosphate(TCEP) および TPP、TDCPP の代謝物である HO-p-TPP、HO-m-TPP、BDCPP を 24
時間水性曝露し、96 hpf で体幹血流、心臓周囲面積および全長を評価した。また、
96 hpf の曝露胚から全 RNA を抽出し、cDNA 合成を行った後、リアルタイム PCR法で cytochrome P450 19A1b (CYP19A1b)、vascular endothelial growth factor Aa(vegfaa)、growth hormone 1 (gh1)、insulin-like growth factor 1 (igf1) の mRNA 発現量を測定した。また、分子シミュレーションソフト (Molecular Operating Environment)を用いてゼブラフィッシュ核内受容体の 3D ホモロジーモデルを構築し、OPFRs や代謝物との相互作用エネルギーを in silico 解析で算出した。
研究成果
受精後 72 時間のゼブラフィッシュ胚に OPFRs およびその代謝物を曝露したとこ
ろ、TPP および HO-p-TPP が CYP19A1b の発現量を有意に増加させた (Fig. 1)。こFold change(relative to control)

E2

TPP

HO-m-TPP

HO-p-TPP

NANA

Concentration (µM)

Fig. 1. Concentration-response relationships for effects of E2 and OPFRs and their primary metabolites
on CYP19A1b mRNA expression in developing zebrafish. Statistically significant differences in geneexpression between the OPFR-exposed groups and the control group were determined by one way
ANOVA followed by Dunnett’s post hoc test, and are shown by asterisks (**p < 0.01, ***p < 0.001). N=4.
NA denotes no data available due to mortality at the highest concentration tested.

れら化合物による CYP19A1b 誘導の potency (用量効果) および efficacy (最大効力)は E2 と比較してともに低値を示した。また、HO-p-TPP は TPP よりも用量効果が高値を示した。一方、1 µM 以上の TDCPP 曝露により、有意な CYP19A1b 発現量の減少がみられた (data not shown)。BDCPP、HO-m-TPP、TCP、TCEP の曝露では有意な CYP19A1b 発現量の変化はみられなかった (data not shown)。
続いて、TPP とその代謝物である HO-p-TPP で認められた CYP19A1b mRNA 誘導の用量効果の差が各物質のエストロゲン受容体サブタイプ (zfERα/ERβ1/ERβ2) に対する結合性の差に起因するか否かを in silico 解析により検討した。また、各物質と zfERs との結合状態を Fig. 2 に示した。in silico 解析の結果から、代謝物である
HO-p-TPP では E2 同様、zfERs のリガンド結合ドメインに存在するグルタミン酸と水素結合を有し、その相互作用エネルギーも低値を示した。また、OH 基をもたな
い TPP では、グルタミン酸との水素結合はいずれも示唆されず、相互作用エネルギーは相対的に高値を示した。
TDCPP、BDCPP、TPP、OH-p-TPP、OH-m-TPP、TCP は 96 hpf の胚に心臓周囲浮腫や全身血流の低下を誘発した (Fig. 3)。TDCPP および TPP 曝露により体躯の矮zfERα; -37.3 kcal/mol

TPP

zfERβ2; -30.1 kcal/mol
L354

E338

E321

E323
2.89 Å

R379
M389

H509

F372

zfERα; -41.1 kcal/mol

F372

F374

E323

2.26 Å

2.34 Å 3.19 Å

R379
H509

zfERβ2; -49.3 kcal/mol

L372 E338

R362
M389

H494

F389

zfERβ1; -53.4 kcal/mol

E321
3.25 Å 2.34 Å2.83 Å
H492

R364

R362

H492

HO-p-TPP

zfERβ1; -34.5 kcal/mol

F389

R364

H494
F374

Fig. 2. Binding modes TPP and HO-p-TPP in zebrafish estrogen receptors (zfERs).

Not affected

Normal BL w/ edema

500 μmDecreased BL w/ edema

500 μm500 μmFig. 3. Representative pictures of 96 hpf zebrafish larvae exposed to OPFRs.
BL denotes body length.

小が認められたが (Fig. 3)、各代謝物では体躯のサイズに影響はみられなかった。
TPP、TDCPP、TCP の高濃度曝露は vegfaa 発現量を有意に増加させた (data notshown)。TDCPP 曝露は gh1 発現量を顕著に低下させ、TPP、TCP 曝露は igf1 発現量を有意に低下させた。TDCPP と β 受容体遮断薬プロプラノロールとの共処置により、gh1 mRNA 発現量は TDCPP の単独処置と比較して有意な変化はみられなかったが、体躯矮小化の緩和傾向がみられた (Fig. 4)。
TPP よりも HO-p-TPP において CYP19A1b 誘導が顕著であったことから、TPPの代謝はエストロゲン様作用を増強すると考えられた。さらに OPFRs だけでなく一部の代謝物も胚に心血管毒性を誘発することが明らかとなった。また OPFRs の心血管毒性は、vegfaa 発現量が増加したことから血管透過性亢進と関連している可能性が示唆された。一方で、TDCPP でみられた胚の成長阻害は、プロプラノロー
ルとの共処置により緩和されたことから、遺伝子発現以外の過程で化合物の影響を受けた GH/IGF 系のホルモン分泌低下に起因すると推察された。

†‡

Fig. 4. Effect of propranolol (PRO) on TDCPP-induced reduction in body length in developing
zebrafish. A single dagger indicates significant (p < 0.05) difference between DMSO and TDCPP
10 µM, whereas a double dagger denotes significant (p < 0.05) difference between TDCPP 10 µM
and TDCPP + PRO 30 µM.

成果発表
（論文）
1. 川島千帆, 久保田彰 (2018): 十勝の台風被害による飼料用トウモロコシサイレージおよび牧草サイレージのかび毒汚染の実態. 北海道畜産草地学会報 6,29-33.
2. 久保田彰 (2017): 野生鳥類におけるダイオキシン類のエコトキシコロジー. 野生動物医学会誌 22, 63-67.
3. Yin, G., Cao, L., Du, J., Jia, R., Kitazawa, T., Kubota, A., Teraoka, H. (2017):
Dexamethasone-induced hepatomegaly and steatosis in larval zebrafish. The Journal ofToxicological Sciences 42, 455-459.
（学会発表）【国際学会】
1. Kubota, A., Wakayama, Y., Nakamura, M., Kawai, Y., Yoshinouchi, Y., Iwata, H.,Hirano, M., Nakata, H. (2018): In silico prediction and in vivo measurement ofestrogenic activity of bisphenol analogues in zebrafish. Society of Toxicology 2018
annual meeting, San Antonio, USA, March, The Toxicologist: Late-Breaking
Supplement, p. 6.
2. Wakayama, Y., Nakamura, M., Morita, Y., Yoshinouchi, Y., Iwata, H., Hirano, M.,Nakata, H., Kawai, Y., Kubota, A. (2017): In vivo and in silico assessment ofestrogen-like effects of bisphenol analogues in zebrafish. 19th International Symposium
on Pollutant Responses in Marine Organisms, Matsuyama, Japan, July, p. 164.
3. Kawai, K. Y., Ikenaka, Y., Ishizuka, M., Kubota, A. (2017): Evolution of avian UGTfamily genes in relation to feeding habit. 19th International Symposium on Pollutant
Responses in Marine Organisms, Matsuyama, Japan, July, p. 183.
【国内学会】
1. 久保田 彰 、若山 裕己、中村 倫子、川合 佑典、芳之内 結加、岩田 久人、平野 将司、中田 晴彦 (2017): ゼブラフィッシュをモデルとした in silico およびin vivo 解析によるビスフェノール類のエストロゲン様作用の評価. 環境ホルモ
ン学会第 20 回研究発表会, 神戸市, 12 月, プログラム・要旨集, p. 65.
2. 森田友理、若山裕己、芳之内結加、岩田久人、川合佑典、久保田 彰 (2017):
有機リン系難燃剤およびその代謝物による発達期ゼブラフィッシュに対する影響. 第44回日本毒性学会学術年会, 横浜市, 7月, プログラム・要旨集,S271.
3. 中村倫子、若山裕己、芳之内結加、森田友理、岩田久人、川合佑典、久保田 彰 (2017): ゼブラフィッシュをモデルとしたin vivoおよびin silico解析によるビスフェノール類のエストロゲン様作用の評価. 第44回日本毒性学会学術年会, 横浜市, 7月, プログラム・要旨集, S271.
今後の課題
本研究において、OPFRs および代謝物のエストロゲン様作用、心血管毒性、成長阻害といった多様な発生毒性が確認された。これまでの研究で明らかにされてきた毒性学的知見や、ハウスダスト等屋内環境における高濃度汚染、一部の OPFRsの環境残留性や生物濃縮特性を考慮すると、OPFRs は臭素系難燃剤の代替として必ずしも適しているわけではないと考えられた。代替に適している可能性がある物
質としては、分子サイズが大きいために環境中での拡散性や生物に対する毒性が低いと期待される縮合型リン系難燃剤が挙げられる。今後はこうした代替物質の成分について有害性評価を実施する必要があると考えられた。