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放射光第巻第号

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トピックス

筋小胞体カルシウムポンプの構造決定
豊島

近，中迫

雅由，野村

博美，小川

治夫

東京大学分子細胞生物学研究所

Structure Determination of Calcium Pump of Sarcoplasmic Reticulum
Chikashi TOYOSHIMA, Masayoshi NAKASAKO, Hiromi NOMURA and Haruo OGAWA
Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo

Structure of the calcium pump of muscle sarcoplasmic reticulum was determined at 2.6 Å resolution by
X-ray crystallography. This is the ˆrst atomic structure of the cation pumps called P-type ATPases. Because
the crystals were very thin, the use of SPring-8 was vital to this work. The structure of the Ca2＋-pump isoverviewed very brie‰y with emphasis on the X-ray diŠraction experiments.

.

はじめに

イオンポンプは脂質二重膜に埋まった膜蛋白質であり，＋ は細胞

生体はイオンを非常に巧みに使っている。 Na

膜の片側から反対側へ特定のイオンを運ぶ。 Na＋ と K＋

外に多く K＋ は細胞内に多い。その結果として，筋細胞をの濃度差を保つポンプは Na＋K＋-ATPase と呼ばれ，カル

例にとると，細胞の膜電位は内側が外側よりも約 90 mV

シウムを運ぶポンプは Ca2＋-ATPase と呼ばれる。いずれ＋がも運搬するイオンによってスイッチが ON になる ATP 分

外から濃度勾配に従ってチャネル蛋白質を通じて流入し，

解 酵 素 で あ る 。 他 に も 胃 の pH を 維 持 し て い る H＋K＋-

低く保たれている。細胞が興奮するというのは， Na

膜電位が 0 mV 近く（或いはそれ以上）になってしまうこ

ATPase や，銅などの重金属を排出するポンプがあり，総とである。つまり，イオンの流入が神経細胞などの興奮の称して P 型 ATPase （あるいは P 型イオンポンプ）と呼実体である。筋肉が収縮する時には，神経細胞の興奮によばれる。運搬の過程で， ATP の g リン酸によって，酵素ってカルシウムの放出チャネルが開き，貯蔵庫（筋小胞体

それ自体がリン酸化されるのでその名前がある。いずれと呼ばれる袋状のもの）からカルシウムが筋細胞中に放出も，機能しなくなったら細胞は生存不可能となる，重要なされる。そのカルシウムがアクチンフィラメント上のトロ機 能を 持った 蛋白 質群で あり ， Na＋K＋-ATPase の発 見

ポニンに結合し，ミオシンがアクチンと結合できるように（1957年）によって，1997年度のノーベル賞がデンマーク

なって，筋収縮が起こる。さて，このままでは筋肉は収縮の J. C. スコウに授与されたほどのものである。 P 型 AT-

したまま，神経細胞も興奮したままである。もとの状態にPase はまたの名を E1E2 型 ATPase とも呼ばれる。Ca2＋-

イオン環境を戻してやらなければならない。そのためにATPase の場合，細胞内から外部（小胞体内腔）へカルシは，濃度勾配に従って流入してきたものを，もう一度貯蔵

ウムを運ぶわけだが，カルシウムに対して高い親和性を持庫に運び入れなければならないわけで，イオンを濃度勾配

ち，結合部位が細胞内を向いているのが E1 状態であり，に逆らって輸送する（能動輸送と呼ばれる）必要がある。

細胞外を向いて低親和性の状態が E2 状態である。親和性

ATP の持つ化学エネルギーを消費して，この過程を担うの変化と結合部位の向きの変化がリン酸化が行っているこ

ものがイオンポンプと呼ばれる蛋白質である。イオンチャとであり，能動輸送の実体と考えられている。
私達が構造決定に成功し1) Nature の表紙（ SPring-8 のネルは，要するに孔であるが，ポンプははるかに複雑なことをしていると考えられる。

あちこちにも貼ってある）にもなった蛋白質（Fig. 1）は，

1
東京大学分子細胞生物学研究所 〒1130032 東京都文京区弥生 1158418492 FAX: 03
5841
8491 E-mail: ct＠iam.u-tokyo.ac.jp
TEL: 03――(C) 2001 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

放射光第巻第号()

Figure 1. Architecture of the sarcoplasmic reticulum Ca2＋ -ATPase. Two spheres in the membrane domain represent bound Ca2＋
ions. Three cytoplasmic domains are well separated and labelled A,
N and P. TNPAMP (an analogue of AMP), in CPK model, is located on domain N and far distant (＞25 Å) from the phosphorylation site (D351), suggesting that domain N will approach domain P
when phosphorylation occurs (arrows in broken line). The bindingsites for thapsigargin (TG, a potent inhibitor) and phospholamban(PLN, a regulatory protein in cardiac muscle) are also marked.

Figure 2. Crystals of Ca2＋-ATPases in various stages of the
project. a, Electron micrograph of a microcrystal consisting ofstacks of 2D crystals; the two lea‰ets of lipid bilayer are clearly
resolved (black parallel lines). b, Phase-contrast micrograph ofultra-thin 3D crystals induced by sodium propionate. c, Polarisation
micrograph of a plate-like crystal formed with sodium butyrate;some amorphous material sticking to the crystal is also seen. d,Polarisation micrograph of crystals within the dialysis button; thediameter of the hole corresponds to 3 mm.

筋小胞体のカルシウムポンプであり，分子量11万，994個のアミノ酸残基から成る。 P 型 ATPase として初めての.

結晶化とここまでの道のり

筋小胞体 Ca2＋-ATPase はその名の通り， ATP 分解酵

構造決定というだけではなく，輸送するイオンがカルシウ
ムであるところがこの仕事の意義を大きいものにしてい素であり，一個の ATP あたり最高 2 個のカルシウムを運る。なぜなら，カルシウムは生体の機能を制御するために搬できる。一秒間にサイクルは約 30 回（ 37 °C ）回れるの

もっともよく使われているイオンであり，国際カルシウムで，高々 60 個のカルシウムが運搬されることになる。こ学会なるものが（欧州カルシウム学会も）あるほどなのだ。

の速さは，筋収縮時に使われるチャネルのそれ（一千万個

なぜカルシウムなのかというのは面白い問題であるが，教/秒）に比べて圧倒的に遅い。そのため，小胞体膜の膜蛋

 2 価イオンであり，アミノ酸と程々強く結
科書的には◯

白質の半分以上はこのポンプによって占められている。そ 程々の合する（ 1 価では弱すぎ， 3 価では強すぎる），◯のように高い割合で存在するため，可溶化精製しなくて大きさがあるため配位の仕方はかなりゆがんでいても良いも，適当な条件（Ca2＋ 非存在下，デカバナジン酸存在下）（ Mg2＋ などはごく安定な 6 配位になる傾向が著しい）たにすれば，この蛋白質は自然な膜に入ったままで二次元的め，蛋白質の側が選択性を持たすことが出来るからであに並び，チューブ状結晶が得られる。このようなチューブ

る2)。この事についてははあとで少しだけ触れる。

状結晶から電子顕微鏡を用いて三次元構造が 8 Å 分解能

もう一つの生物学的に重要なことは，進化の過程での Pで得られていた4)。この分解能では，膜貫通 a ヘリックス型 ATPase の位置が明らかになったことであろう。 P 型

が密度の高い棒状のものとしてどうにか認識できる程度でATPase のリン酸化部位付近（ Fig. 1 の P ドメイン）のあった。また，精製標品からは高濃度のカルシウム（ 10アミノ酸配列は他の ATPase や GTPase と違っており，

mM ）存在下で三次元微結晶が得られ（Fig. 2a），投影像

進化上の類縁関係は長いこと謎であったが，一昨年になっから，カルシウム無しの状態とは大きな構造変化が起こって，アミノ酸配列からハロ酸脱ハロゲン化酵素との相同性ていることはわかったものの5)，解析の十分な手段が無かが主張された3) 。 Ca2＋-ATPase の三次元構造は，この主った。このような微結晶から出発して X 線結晶解析にか張が正しいことを示しており，P 型 ATPase は ATP とは

かるまでに結晶を成長させることが出来たわけである。

一見何の関係もありそうにない他の酵素をも含む，大きな結晶化条件を捜しているうちに，平面的に大きくすることは文献6)に従ってすぐ出来た。しかし，これは二次元結

ファミリーの一部を形成することが確実になった。

Ca2＋-ATPase の構造に関しては既に何カ所かに解説記

晶が何層か積み重なっただけのごく薄い三次元結晶という事を書いたので，本稿では，実験の実際について多少詳し

どうしようもなく中途半端なものであった（Fig. 2b）。しく書いてみたい。

かし，電子線回折では3.5 Å 分解能を越えるスポットが観
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放射光

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察さ れ たの で ，次 の 3 本 立 てで 研 究を 進 める こ と にし塩が何をやっているかは良くわからない。それとはっきり 薄くして 2 次元結晶を作り，手法とした。すなわち，◯認識できる電子密度がマップの中にあるわけでもない。

 このままては既に確立した電子線結晶解析技術を使う。◯

120 mM KCl で も 電 子 顕 微 鏡 レ ベ ル の 結 晶 は で き る X 線結晶の厚さのものでも解析する技術を開発する。◯（Fig. 2a，格子定数は a＝168.4, b＝56.4, c＝186.8 Å; b＝ に関しては透析時解析にかかるまでに結晶を厚くする。◯）。しかし，分子のパッキングは大きく違っており
83.9 °の温度と蛋白濃度を最適化すれば，3 層程度までは薄くで（ 空 間 群 は と も に C2 ）， 酪 酸 が あ る 場 合 （ Fig. 2c, a ＝きることが判った。実際このような結晶から収集した位相）c 軸方向には40166.01, b＝64.38, c＝147.14 Å; b＝98.00°

 に関し
情報は X 線結晶解析の過程で大変役に立った。◯

Å も短く， b 軸方向には 8 Å 広くなっている（ Fig. 3 ）。

ては電子線回折でも X 線回折で確立しているデータ収集

従って，0.8 M の酪酸ナトリウムによってパッキングが c

技術が使えるはずという考えのもとに，電子線回折用回転

軸方向に密になっていることは明らかである。c 軸方向がカメラを開発し，予備的データが収集解析できるまでに結晶成長のもっとも悪い方向であるから，これによって結なった。

晶性が改善されたことは明らかだが，どのような力によっ の X 線回折にかけら
しかし，結局最も成功したのは◯てそれが起こったかは今のところわからない。

れる迄に結晶を厚くすることであった。すなわち，非常にうまくいった場合には約30 mm（2000層相当）まで厚くす.

実験室での X 線回折実験

ることができた（Fig. 2c）。もっと厚く出来れば分解能は結晶は厚いものでも通常20 mm 程度とごく薄かったし，

より向上すると思うが， SPring-8 のような大型放射光施

結晶化のためにはグリセロール20，高イオン強度（0.8設の進歩によって薄いことによる問題ははるかに小さくな

M 酪酸ナトリウム）を必要としたために，特に凍結防止った。実際には C12E8 で可溶化し，リン脂質と混合した試剤を新たに加えなくても，通常のクライオストリーム（リ料を透析外液（0.8 M 酪酸ナトリウム，2.75 M グリセロー

ガク）による急速凍結で非晶質の氷が得られた。そのたル， 10 mM 塩化カルシウム， 3 mM 塩化マグネシウム，

め，すべての実験はクライオ条件下で行った。急速凍結の2.5 mM アジ化ナトリウム，0.2 mM DTT, 20 mM MES,

ためにはまず，結晶をナイロンループで拾い上げる必要がpH 6.1 ）に対して透析する。結晶成長は 2 ヶ月は続くよある（ Fig. 4 ）。結晶化は透析法によったのであるが，かうである。

なり粘性のあるバックグラウンドがあり，結晶はそれにか

厚みを増やすことが出来た原因には色々のものがある
が，酪酸ナトリウムが鍵であったことは確かである。このらまって得られた（ Fig. 2c, d ）。そのため，結晶をまずdepression glass に移し，ナイロンループでほぐす操作が必要であった。この過程は低温室で行った。また，結晶は薄いが大きかったため，1 q のループでも入らないものもあり，大きいまま無理にすくうより（ループに引っかかっ
たまま凍った場合は確実に駄目である），カミソリで切った方が良い結果が得られた。最も良かった結晶はそのようにして得られたものである。特に 1 q のループを使った場
合，液体窒素中のハンドリングやゴニオヘッドに装着する
ときにループからはずれてしまうことを何度か経験したのFigure 3. Crystal packing of Ca2＋-ATPase in the plate-like crystals. Ca traces with the a-axis horizontal and the b-axis normal to theplane of the paper. Thin lines are used to represent the molecules
oŠset by half unit cell along the b-axis due to the crystal symmetry(C2). Because the crystal is made of stacks of membranes, the lipid
bilayers extend parallel to the ab plane (normal to the plane of thepaper) but may well be distorted around the protein molecules.
Horizontal bars show rough estimates of the positions of the membrane surface from the distribution of hydration water (small
spheres). Three cytoplasmic domains (A, N and P) are identiˆed.
Locations of two Ca2＋ ions are indicated by spheres in the transmembrane domain (M). Those of lanthanide (La3＋ and Tb3＋) in
derivative crystals are marked by circles. The distance between adjacent layers measures 145.7 Å.

Figure 4. A plate-like crystal of Ca2＋ -ATPase mounted in a nylon
loop. The width of the crystals measures ～400 mm; the thickness isapproximately 20 mm. Note that the specimen was examined withlaboratory source and stored in liquid nitrogen for more than one
year prior to the diŠraction experiment at BL41XU and that no severe frosting was observed.

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で， 0.8 q 程度までにとどめておく方が安心である。ま含む比較的狭い範囲のデータを収集すればよいので，時間た，重原子のソーキング実験の時は（脂質の酸化やイオンの節約にもなった。電子顕微鏡の方が試料に関する制限が

環境の変動等を考えて）空気との接触を最小にするためきついが（結晶の厚さは 0.2 mm 以下，グリセリン濃度はループで拾った結晶を100 ml のガラスキャピラリーに詰め，

5 以下であって欲しいとか）， 6 Å 分解能程度までは特

1 時間行った。このように，重原子ソーキングの場合は，に難しいこともないので，板状結晶の場合は試みるに値す1 )結晶を透析ボタン（ Fig. 2d ）から depression glass にると思う。溶媒平滑化がうまく行っているかの検定にも有移す，2 )結晶をきれいにする（付着物を除く），3)大きす用だった。

ぎたら切る， 4 )ループで結晶を拾う， 5 )キャピラリーに重原子として最初は Pt2I2 （通称 PIP ）やリンタングス

詰める，6)キャピラリーから出して再びループですくい，テン酸のような大きなものを試したが， 54 種試したう

7 )急速凍結する，と多くの操作が必要であり，結晶にダ

ち，うまく行ったのは Pt とランタノイド（ La, Tb ）の 5

メージを与える可能性がある。当然，熟練を要するので，種であった。（特に， Tb は膜内のカルシウム結合部位に常に，1)～5)は豊島が，6)～7)は中迫が行った。

高親和性で結合したカルシウムを置換すべく， 90 時間行

急速凍結の際は幾つかの点に注意した。すなわち，ルーったが，置換は起こらなかった。重原子置換体としては有プですくった直後に，ループと接触していないことを顕微用であった。
）水銀系は全滅であり（濃度を下げても駄目），

鏡で確かめた。凍結の際ループの向きは，いつも気流と平Ir 等では結晶が曲がった。結晶のハンドリングの問題が行になるようにした（効率が上がり場所による違いが少なあるため，うまく行かないと確信できるためには数回の試くなる）。また，クライオストリームのノズルの位置は実みが必要であった。その結果，native 結晶も含めると450験期間中動かさなかった。これによって，結晶が薄いせい

個以上の結晶を凍結・露光したことになる。重原子が結合もあったと思うが，結晶間の格子定数の違いは無視できしたアミノ酸残基は，モデル完成後，確認の意味もあってた。試料を拾う際は実体顕微鏡からクライオストリームま確かめたが，Pt の場合はすべてメチオニンであった。

でが物理的に最短になるようにし， depression glass は氷水で冷やしながら行った（実体顕微鏡にも赤外線フィル

. SPring-での X 線回折実験

ターを入れた）。この結晶は高イオン強度で成長している

実験室で評価した試料のみを持ち込んで回折実験を行っ

せいか，イオン環境や温度の変化に比較的強く，急速凍結

たため，SPring-8 (BL44B2, BL41XU) での実験効率は極の操作は室温でできた。現在取り組んでいる Ca2＋-AT-

めて良かった（ Fig. 5 ）。実験室での予備実験の結果とPase の別の生理的状態の結晶は環境変化に弱く，低温室

SPring-8 得られたデータとは非常に良く相関しており，内で凍結する必要がある。

薄いとか小さいとかの理由により，実験室で良い回折パ

さて，放射光での実験を効率よく行うためには，実験室ターンが得られなかったものは，放射光でも S / N 比が悪での予備実験が肝心である。急速凍結した試料はすべて実く役に立たなかった。結局，厚いものほど良い傾向にあっ

験室で露光し，結晶性の良いもののみを回収保存し放射た。

光での実験に用いるようにした。我々が開発したトング7)

BL41XU での実験では2.5 Å 分解能を超える点がイメー（現在リガクから入手可能）を用いれば，この過程での失ジングプレート上でそこそこ見える程度あったが，一応の敗や霜の付 着はほとん どなく，長 期保存も可 能である

データになったのは2.6 Å 分解能までであった。この原因（Fig. 4）。特に，重原子置換体の検索にあたっては実験室でのデータ収集をあらかじめ行い，有効であると確かめられた結晶のみを回収し，放射光実験に用いた。結晶の空間のデータを収集する必要があったた
群は C2 であり，180°
め，当初はフルデータ収集に 2 週間かかった。効率化の為，R-Axis の Yale ミラーを標準の PtNi から PtPt に変更した（ 110 万円かかった）。この結果，強度は約 2 倍
露光時間20分（RIGAKU Ultrax 18,になり，振動角0.6°

45 kV,

90 mA で運転）で1/3.5 Å－1 程度迄のデータを実験室でも収集できた。（振動角を小さくとったのは， c 軸が150 Å 近くと大きいこととバックグラウンドを下げるためである。）
また，重原子の検索においては，結晶が非常に薄いことを利用し， 電子顕微鏡 像から得た 位相が大変 役に立った8) 。（ hk0 ）面一面だけでかつ低分解能（ 6 Å ）ではあったが，最初から差フーリエ法が使えたため，（ hk0 ）面を

Figure 5. X-ray diŠraction pattern from a plate-like crystal of
Ca2＋-ATPase. Recorded on an imaging plate using RIGAKU R
AXIS IV at BL44B2 in early days of this work. Wavelength, 0.990
Å. DiŠuse ring near the edge of this ˆgure is originated from amorphous ice and located at 1/3.7 Å－ 1.

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放射光

第巻第号()の一つは，データ収集を行ったのが， BL41XU に MAR

DM10) に比べて圧倒的に良いマップが得られた。但し，社 CCD 検出器が導入された直後であり，電源ラインから‰ipping factor は色々試して，標準値よりも小さくした。

の雑音がのっていたこと， mosaicity が高く対称性も低か重原子として，精密化には XPLOR12) と CNS13) を用い，ったためか，DPS/MOSFLM 9)による格子定数の決まりが最終的には CNS を使った。結局，大量に存在するはずの悪かったことがあげられよう。イメージングプレートで収リン脂質はまったく同定できなかった。

集した時には，使い慣れた Denzo がビームラインで使えず，露出の最適化ができなかった（とんでもなく過剰の露

.

構造の概略

Nature に発表した論文1) の要点をかいつまんで述べて出をした）。また，ダイナミックレンジをかせぐために使っている 2 個の光電子増倍管間のマッチングの問題もあみよう。

った。結局のところ， BL41XU でイメージングプレート

◯で得たデータは残念ながら merging できなかった。結局，カルシウムが 2 個結合した状態の構造であり，分解能は2.6 Å である（Fig. 1）。

native 結晶の最も良いデータは BL44B2 でイメージング

◯

アミノ酸配列から予想されたとおり膜貫通領域はプレートで得たものであった。これは結晶が良かったこと

10本の a ヘリックス（M1M10）から成る（Fig. 6）。

もあるが露光の条件がダメージとの兼ね合いからも適当で細胞質領域は 3 つの明瞭に分離したドメインよりなあったためと考えられる。 S / N の点からはイメージング

り ， そ の 役 割 か ら A （ actuator 或 い は anchor ）， N

プレートの方が良い可能性が高いので，近い将来 R

(nucleotide binding), P (phosphorylation) ドメインとAXIS でデータ収集をし直したいと考えている。

命 名 し た 。 N ド メ イ ン に は ATP の 類 似 体

また，照射損傷は歴然としており， BL41XU でも 200（TNPAMP）のアデノシン部分が結合する。また，P

mm のコリメータを用いて，単位体積あたりの負荷を減らドメインにはリン酸化部位（ Asp351 ）が存在するすようにした。 200 mm のコリメータを用いたもう一つの（Fig. 1）。

理由は，ゴニオメーターの回転中心とビームの中心が必ず◯

膜貫通領域と P ドメインは M4, M5 ヘリックスで結ばれ，燐酸化部位は M4 の先に位置する。特に M5

しも一致していないことにくわえて，結晶が薄いことと，ループ中の結晶をとりまく溶液（氷）のレンズ効果のためは燐酸化部位の近傍までのびている。また，P ドメイに結晶がどこにあるかよくわからなかったからでもある。

ンの底を走る M6M7 を結ぶループ（L67 ）があり，これも，回折強度を直ちに評価でき，且つ試料の移動をハ

重要な役割を持つらしい。 A ドメインは M1 M3 とッチの外から定量的にできれば原理的には解決可能な問題

結ばれている（Fig. 1）。
◯であるが，実験を行った当時はそのどちらも現実的ではな

2 個のカルシウムは横に並んで膜の中央より細胞質かった。従って，このような薄い結晶に対しては氷からの側に結合している（ Fig. 3 ）。これ迄はイオン通路に余計な散乱を防ぐためにも，スリットでビームを整形してそって縦に並んでいると考えられていた。
◯

至適化したい。また，このように薄くて大きい結晶の場

カルシウムを高い親和性を持って結合するために，合，場所による結晶性の違いは相当あると予想される。

膜貫通ヘリックスのうち 2 本（M4, M6）は結合部位データ収集の最適化という観点からは，まず細いビームで付近でほどけている（ Fig. 7 ）。 2 個のカルシウム結場所による違いを評価し， best の位置と大きさでデータ収集を行いたい。現在， BL41XU の試料の微動機構は大幅に改善され，試料位置の移動は外部からごく簡単にできる。しかし，回折強度の評価の為には，回折パターンを目で見て推測するだけしかないのは残念である。また，これだけ結晶の形が扁平だと，吸収による回折データの異方性が問題になるかもしれない。そう思って，波長 0.8 Å と

1.0 Å で得たデータの比較を行ってみたが，異方性温度因子によって補正できる効果はほとんどなかった。放射損傷の波長や強度，照射時間依存性など定量的実験が必要であることはまだ数多い。

.

解析

解析は CCP410)を用いて，異常分散効果を取り入れた多重同型置換法で行った。初期位相の決定には MLPHAREを用いた。SHARP11)も試みたが，この場合には良いことはなかった 。溶媒平滑化 には SOLOMON10) を用いた。

Figure 6. Arrangement of transmembrane helices of Ca2＋-ATPase. A view roughly normal to the membrane. 10 a-helices are identiˆed. M1M6 and M7M10 are clearly segregated. M7M10 arelacking in bacterial type I P-type ATPases. A solvent ‰attened map,
contoured at 1.2 s (blue net), is shown. Two spheres represent
bound Ca2＋ ions (I and II).

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放射光

第巻第号()

合は協同的であるが，それに対応して 2 個の結合サイトの構造は相当異なっている（Fig. 8）。
◯カルシウム非存在下、デカバナジン酸存在下ではチ
ューブ状結晶が得られるが，その電子顕微鏡による低分解能の三次元像4)と比較した結果， 3 つの細胞質側
回転するという非常に領域，特に A ドメインは～90°
大きなドメイン運動を示した（Fig. 9）。

.

膜貫通領域の構造

ここでは特にカルシウム結合サイトの構造について述べよう。上に述べたように， Ca2＋-ATPase の膜貫通ヘリッ
Figure 7. Two transmembrane a-helices (M4 and M6) that are unwound for e‹cient co-ordination of Ca2＋ (left). Right, backbone of
the two helices. Spheres represent bound Ca2＋ ions.

クスはアミノ酸配列からの予測どおり 10 本（ M1 M10 ）であった。2 つのカルシウム結合サイトは膜貫通領域のほぼ中央に位置し M5, M6, M8 ヘリックスが関与するサイトと，ほとんど M4 ヘリックスの上に出来ているサイトとで構成される（ Fig. 6 ）。 2 つのカルシウム結合部位の構造は相当に異なっている（ Fig. 8 ）。サイトはす
べてアミノ酸残基の側鎖の酸素原子 5 個から成り，水も少なくとも 1 分子が配位している（ Fig. 8 ）。配位する原子の位置は理想的な形からは遠く，原子間距離から計算した価電子数（valence ）も水分子を入れても1.9とやや小さい（理想的には2.0である)14)。サイトの方では主鎖のカルボニル基の酵素原子 3 つが配位しており， Ca2＋ 結合モ
チーフとして有名な EF ハンドの変形と見なすことが出来，

Figure 8. Details of the transmembrane Ca2＋-binding sites. Notethat the two sites have very diŠerent co-ordination geometry. All theco-ordinating oxygen atoms are from side chains (plus water) in site
I; 3 main chain carbonyl oxygen atoms are used in site II, in whichmuch more regular co-ordination geometry is realised. The numbers
show the distances between Ca2＋ ion and the co-ordinating oxygen
atoms (in Å). Valence value calculated from the distances are 1.9(including water) for site I and 2.2 for site II.

Glu309 が上からカルシウムに蓋をするような形になっている（ Fig. 8 ）。配位の形も良く，安定な配位が実現されている。ここのアミノ酸配列は Pro Glu Gly Leu (PEGL)であり，良く保存されている。プロリンがあるから，ヘリックスがほどけていることは十分考えられた。しかし，ほどけているとは言っても， turn 構造が出来ており，ふらふらしているわけではない。いずれにしても，構造予測の際には a ヘリックスが大きくほどけている可能性をも考えなければならないことが明らかになったわけで，その意
義は大きいと思われる。また，M6 もほどけていることがわかったが，2 つのカルシウムに配位する Asp800 の周りに限られている（Fig. 7）。
さて，サイトに関与する残基とサイトに関与する残基は違った性質を持つことが部位特異的変異の結果から得られている。すなわちサイトに加えられた変異はカルシ
ウムの結合を完全に無くしてしまうのに対し，サイトでFigure 9. Fitting the atomic model obtained for the Ca2＋-boundstate (arrows and cylinders) to an 8 Å resolution map (net) obtained from tubular crystals [3] formed in the absence of Ca2＋ andpresence of decavanadate (large sphere in a). Overall orientation of
the molecule in a is the same as in Fig 1. In b, it is viewed from thecytoplasmic side normal to the membrane. The black arrows show
the direction of movements from the Ca2＋-bound to unbound state.

の変異は半分にするに過ぎない。サイトに関与する残基

2 つに同時に変異を導入してもやはり半分であるから，サイトへの結合は保たれるものと考えられる15) 。つまり
サイトへのカルシウムの結合がサイトへの結合を誘導することになる。これはよく知られたカルシウム結合の協同性を説明するものと考えられる。サイトへの結合が，コンフォメーション変化を引き起こし，ATP の加水分解が始まる（それ以外のスイッチは無い）のだが，カルシウ
ムの結合に伴ってドメイン N の運動（熱運動）が誘起さ

――

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

放射光

第巻第号()れるという報告もあり，ATP によるリン酸化が P ドメイ

わっていることが判る。一方， M7 M10 は動かないよう

ンにある Asp351で起こりえるようになる（ドメイン N にである。M5, M6 が M8 に対して動けば，サイトに結合結合した ATP が Asp351 に接近できるようになる）といしていたカルシウムははずれるであろう。そうすると協同

うことがその実態であるらしい。

性からサイトに結合したカルシウムもはずれることになり，カルシウムの運搬が起こることになるのではないか。

.

細胞質側領域の構造変化

細胞質側領域が 3 つの非常に良く分離した領域（ A, N,

.

今後の展望

P と名付けた）から成る（Fig. 1 ）ことは既に述べた。P

イオンポンプの反応サイクルには少なくとも 5 つのス

ドメインにはリン酸化されるアミノ酸残基である Asp351

テップがある。ここに記述したように，今のところ，そのがある。一方， ATP の類似物であり高い親和性を持つうちの一つが詳しく，もう一つがごく大まかに判っただけ

TNPAMP を結合させた結晶の構造を差フーリエ法で調べに過ぎない。当然，他の状態の構造を高分解能で決定したたところ，リン酸化部位とは大きく離れた N ドメインにいわけである。この方向での研究は順調に進んでおり，既結合することが判明した。つまり，リン酸化が起こるために Ca2＋ 無しの 2 つの状態での結晶化に成功し，解析も順には N ドメインは大きく動き， P ドメインに近づかなけ

調に進行している。従って，構造変化のおおよそは近い将ればなければならないはずである。このことは電子顕微鏡

来に理解できるのではないかと考えている。

による解析で得られたチューブ状結晶中の Ca2＋-ATPase

この解析の過程で，膜貫通ヘリックスは大規模な再配置の 8 Å 分解能の密度図4)（厳密にはクーロンポテンシャルを起こすことと膜に垂直な方向にも大きく動いているらしのマップ）と比較することで確かめられた。このチューブ

いことがわかってきた。そうなると，脂質二重膜を見たく状結晶はカルシウム非存在下，デカバナジン酸存在下で形なる。普通の結晶解析では捨てている低分解能領域の位相成されるものである。蛋白質分解酵素による実験結果からを求める必要がある。そのためには手管が必要で，臭素をはリン酸化状態（ E2P と呼ばれる状態）に近い状態にあ結合した脂質をつかうとか，溶媒のコントラスト変調を行ると考えられる。この結果は Fig. 9 に示したとおりであうとかの手段を考えている。当然放射光での実験が必要にほど傾きが変わっており， P ドメイ
り， N ドメインは 20 °なるし，新しいことが出来そうなので大変楽しみにしていンに近くなっている。これでもまだ ATP がリン酸化残基る。なお， SPring-8 での回折実験では理研の足立伸一博に届くまでには足りないのであるが，バナジン酸の 10 量士，神谷信夫博士， JASRI の河本正秀博士の協力を頂い体であるデカバナジン酸（ V10O628－ ， Fig. 9 の赤い球。チた。深く感謝するものである。

ューブ状結晶を作るためにデカバナジン酸が使われる。バ
ナジン酸自体はリン酸の類似体である。）が N ドメインと参考文献

P ドメインの間に挟まった形になって，もっと傾くのを妨1)

害しているように見える。この部分には実際デカバナジン酸と対になる塩基性のアミノ酸残基がちょうど集まってい近くもほぼ水る。驚くべきなのは A ドメインであり，90°
平に回転している。この領域の役割はほとんど判っておらず， TGES という P 型 ATPase の目印の一つである配列があって，ATPase 活性に重要であることが判っていたにすぎない。 M3 との間のループを酵素的に切断すると，E2P 状態に 行く直前 で止まっ てしまう と言う報 告もあり，本質的な役割を持っていることは間違いない。現在，蛍光物質によるラベルを A ドメインに入れようと，色々の人が試みているらしい。
さらに興味深いことは，このように細胞質側の三つの領域をチューブ状結晶の密度図にあわせてみると M4, M5というカルシウム結合サイトを形成している大事な a ヘ
リックスはそのままではマップと合わないこと，M6, M7を結ぶループ（L67）は P ドメインの運動と連動して膜面からの高さが変わっていることである（Fig. 9a）。実際，

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細胞質側領域だけではなく分子全体のモデリング（ PDBに 1FQU として登録）を行ってみると細胞質側ドメイン

15)の運動を M5 M6 ヘリックスの運動に変換する機構が備――C. Toyoshima, M. Nakasako, H. Nomura and H. Ogawa: Nature. 405, 647 (2000).
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