藻類 Jpn.1.Phycol.(Sorui)46:11‑16，
March10，1998

11

昼間術紹介

顕微蛍光測光装置並びにブロモデオキシウリジン及びその抗体を用いた海藻類の細胞周期の解析方法
本村泰三 l・菱沼

佑 2 ・有賀博文 l北海道大学理学部附属海藻研究施設 051・0003室蘭市母恋南町 1・132山形大学理学部生物学科 990‑8560山形市小白川町 1‑4‑12i

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はじめに裂期においては染色体が観察できるようになるため藻類は陸上植物と異なり，それぞれの分類群においに，通常の顕微鏡観察により核分裂期の核は容易に認て多様で複雑な生活環を持つことが培養法の進展と共識できるが，それ以外のステージ，すなわち O.期， Sに明らかになってきた。生活環において減数分裂と受期， O2期の核を通常の光学顕微鏡で判定することは困精がどこで行われるかは，生活環を理解する上できわ難である。これら中間期核における細胞周期の時期をめて重要なことである。ところが，藻類では染色体が判定する方法として，いくつかの手段が考えられるが，大きく 3つの方法が考えられる。まず第 1に DNA

小さく，正確にその数を明らかにすることが難しい種類が多い。さらに多くの紅藻類において染色体の倍数に対する特異的な蛍光色素を用い核を染色し，その蛍化が藻体の生長と共に特殊な細胞群において行われて光光度を計ることにより時期を特定する方法がある。

いることが知られている。また，褐藻類では微小な飼

第 2 に s期 核 に お い て チ ミ ジ ン の 変 わ り に 5・勾体から直立体が発生する際に，体細胞複相化によりbromodeoxyuridine(BrdU)を取り込ませ，その後に抗染色体が倍加したり，単子嚢母細胞において減数分裂

BrdU抗体を用いて検出する方法がある。そして最後にを伴わずに遊定子が形成される場合も知られている。

細胞周期の特定の時期に発現する細胞周期依存性のタ

そのため，藻類学において染色体の単相・複相の問題ンパク質に対する抗体を使用し検出する方法がある(例を含めて広く細胞周期を理解することは重要なことでえば， S期核において特異的に発現するするタンパクある。

質 PCNA(proliferatingcellnuc1earantigen)に対する抗体一般に細胞周期は M 期(核分裂期)， 01期，S期(DNAを使用し検出する方法)。最後の方法は藻類を材料にし合成期)， O2期に分けることができ，それぞれのステーて最近いくつか報告があるが，使用する抗体がすべてジで代謝系が大きく変わることが知られている。核分の種類の PCNAに対して特異性があるとは限らず，ま¥2

本村ら

だまだ普通に使用できる方法とは言いがたい。そこの細胞内構造物がある場合にはデーターにばらつきがで，一般には細胞周期の解析には蛍光色素を用いての生じる。植物細胞の場合には顕微調lt
光により DNA量を顕微蛍光測光，もしくは BrdUを用いた検出が一般的計測するうえで細胞壁と葉緑体が必ずネックになる。

である。本稿では，まず始めに，顕微蛍光測光を行う
際の諸注意についての述べ，その後に BrdU‑抗 BrdU抗体を用いての S期核の検出方法について具体的に報告する。

1・2 染色エタノール:酢酸(3:¥)で固定したサンプルは流水もしくは染色時に使用する緩衝液で洗う。対象とする材料が数ミリの大きさがあり，堅いサンプルの場合に1 顕微蛍光測光による細胞周期の解析

t
光は細胞や組織を固定した後に DNAに顕微蛍光被lは，流水で洗った後に， ¥MのLiC¥溶液に数分浸す事により柔らかくなる。その後に，サンプルはスライド特異的に結合する蛍光色素を用いて核を染色し，顕微ガラスとポリ ‑L‑リジンをコートしたカバーグラスの定量測光装置等(オリンパス社やカールツアイス社な聞にはさみ，細胞が一層になるように押しつぶす。大ど)を装着した落射蛍光顕微鏡を用いて核内 DNAの蛍部分の細胞はポリーしリジンをコートしたカバーグラ

光量を測定して細胞周期の時期を明らかにするものでスの方に付着している。そして，カバーグラスを小型ある。植物，特に海藻類を材料にする場合多くの問題

シャーレ中で適切な緩衝液で数回洗浄した後に蛍光色がある。例えば，ヒパマタ (Fucus)は古くから受精，発素で染色する。

生，極性発現のモデルとして扱われてきた材料である

DNAに特異的に結合する蛍光色素は， Mo¥ecu¥arが未だに受精から接合子の核分裂にいたるまでの細胞

thidiumProbes社などから容易に購入できる(例えば， E周期の時聞は明らかにされていない。実際に顕微蛍光odide(PI)， 4・‑6・
diamido・2・bromide(EB)， Propidiumi

測光によって卵核，精核，そして接合子の核分裂中期

phenylindo¥e(DAPI)， Hoechst33258， Mithramycin，の核内 DNA量を計測してみると，理論的には¥:¥・4とPicogreen， YOYO・¥;など)。これらの蛍光色素が DNAなるはずであるのが，何度行ってもこのようにはならのどの部位に結合するかは，ある程度判明しており，なかった。理由としては， ¥)卵核と精核におけるクロDAPI，Hoechst
33258はdouble‑strandedDNAのA‑T塩基マチンの凝縮度の違い， 2)発生に伴う細胞壁の肥厚，対に， M
ithramycinは double‑strandedDNAの G‑C塩基)発生に伴う細胞内容物の変化などが考えられそして 3対に結合すると考えられる。また EB，PIは DNA全体る。以下，それぞれの作業における諸注意について述の分子構造に対して認識しているものと考えられていてる。

Jる。P
icogreen，YOYO‑Iは 2重鎖の DNAを特異的に染色する。

1・1 固定顕微定量測光には DAPI(stocksol.
:200‑500
陪 ImL

通常，固定はエタノール:酢酸(3:1)，もしくは海水やH20， 冷蔵保存)もしくは M
ithramycin(stocksol.
:¥mg/

浸透圧調整を行った適当な緩衝液に溶かした低濃度

mLH20，冷蔵保存}を用いるのが一般的である (Goff(0.
5・¥%)のグルタールアルデヒドのどちらで行ってもandColeman1990)。緩衝液は， DAPI染色の場合には良いが，顕微定量調J
I
光の場合にはエタノール:酢酸(3:¥)

McIlv
aineの buffer(pH4.
2)，Mithr
amycin染色の場合にの方が良い結果が得られる場合が多い。エタノール:酢は McIlv
aineの buffer(pH7.0+¥5mMMgCI2)を用いる。染3:¥)で数時間あるいは一晩低温(冷蔵庫の中)で行い，酸(色濃度は DAPIの場合は 0.
5・1.0μ，g/mLinMcI
lvainebuffer

使用するまで組織は 70%エタノールに入れ， 4'Cで保n(pH4.2)，Mithramycinの場合には 50‑100μg/mLi存しておく。落射蛍光顕微鏡に装着した顕微蛍光測光

Ilvainebuffer(pH7.0+¥5mMMgCl2 Mithr
amycinのMc装置を用いて核内 DNAを計測する場合，葉緑体のクロ場合には MgCl2を入れていることに注意。 MgCl2がロフィルの自家蛍光が障害となる。核の上に葉緑体が入っていないと染色できない)で冷蔵庫の中で 30分か無い試料ならば何ら問題は無いが，核と葉緑体が重なら2時間程度染色する。染色後，カバーガラスの回りるように混在している場合にはエタノール:酢酸(3:¥)でを透明マニキユアで封じて観察する。

固定した後に， ‑20'Cに冷やしたメタノールに 30分程

DAPIは蛍光輝度も高<，退色も比較的少ないので度浸して完全にクロロフィルを除き，その後に 70%冷

良い蛍光色素であるが，残念ながら材料によっては細エタノールで保存し，試料とするのが良い。しかし，こ胞盛が非特異的に強〈染色され，核の観察が難しい場のような処理をしても対象とする核の上に葉緑体など合がある。このような場合，処理液や染色液に 5mMの細胞周期解析法
CaCl2を添加することにより非特異的蛍光が減少する

132‑
1 細胞への BrdUの取り込みこともある。これに対して ，Mithramycinは DAPIに比マガタマモ，ハネモ，モツレグサを 200μMの BrdU

べれば非特異的な染色が少ない。ただし，退色が早いを含む PES培地中で一定時間培養し BrdUを取り込まので注意が必要である。退色がひどい時には使用するせる。藻体への BrdUの処理時間は 30分以上の取り込対物レンズの倍率を一段下げる。 DAPI染色は U励起みで検出が可能であり，それ以下ではほとんど検出がで青白く， Mithramycin染色は B励起で黄色に光るが，困難である。また，今回用いた BrdUの濃度は，動物細顕微蛍光測光を行う場合適切なバリアーフィルターを0倍ほど高い濃度である。
胞，高等植物の場合と比べ 1装着する (Mithramyc
副染色の場合は日TC
専用のフィル

この濃度は高ければよいというわけではなく，高すぎターで代用できる}。て逆に検出されにくくなる場合もあるので材料によっ同じように固定・染色を行ってもスライドグラスがて培地に添加する濃度を検討する必要がある。また

ちがうと結果が異なる場合があり，また同一スライドB吋 Uが検出されない場合， BrdUが植物細胞内に取り上でも場所によって(中央と端の部分)，値が若干異な込まれていないことも考えられるので，この点も考慮ることもある。このため常にコントロールをとることする必要がある(褐藻類では現在のところ BrdUの取りは重要である。特に対象材料の核分裂中期核，核分裂込みがうまく行かない。チミジンの代謝経路の違いに終期の娘核，さらにはアフイデイコリン処理を行い 01よるのではないかと考えられる)。

期で止めた核などをコントロールとし常に比較検討をしながら進めていくことを強く勧める。

動物細胞ではチミジンの生合成阻害剤である 5・F1uorodeoxyuridine(FdU)を BrdUの 1/10の濃度で同時に添加し BrdUの取り込みを良くする場合があるが，2 ブロモデオキシウリジン (BrdU)，抗 BrdU抗体を用いた DNA合成期核の検出

FdUは多核緑藻では顕著な働きが見られず，それよりは BrdU自体の濃度を上げた方が効果が高い。なお，

S期 (DNA合成期)を認識する方法として古くから用BrdUは 10mMの濃度で純水に溶かし，エツペンドルフ

いられてきたのは，トリチウムラベルしたチミジンをチュープに小分けした後に，・20"Cで保存しておくと便外から細胞に与え，取り込んだ核をオートラジオグラ利である。 BrdUには変異原性があるので取り扱いに注フィーで見つけるという手段である。しかしこの方法意する。

は，1)アイソトープを用いること， 2)判定までに時間がかかること， 3)分解能が低いことなどの幾つかの間

2‑2 細胞の固定

題点がある。トリチウムラベルしたチミジンの代わりBrdUを取り込ませた細胞の固定，さらには抗体処に，チミジンの類似体であるプロモデオキシウリジン

理・蛍光顕微鏡の観察は基本的には前報の細胞骨格の(BrdU:Bromodeoxyuridine)を取り込ませ，それを抗観察法と同様である。固定は 3%のパラホルムアルデ

BrdU抗体を用いて検出する方法がある。この方法は分ヒドと 0.2‑0.5%グルタールアルデヒドを含む PES培

解能も高<，その日のうちに結果を出すことができ，地，あるいは NaClで浸透圧調製した PHEMB
ufferでそしてなによりもアイソトープを用いないために特別な施設を必要としないメリットがある。 B吋 UはチミジOふ 1時間固定する。しかし，材料によっては固定法によって BrdUの検出度に違いが見られるので個々の材ンの類似体であり， DNA合成期にはチミジンと同様に料で検討する必要がある。モツレグサの場合，メタ核に特異的に取り込まれる。抗 BrdUモノクローナル

ノール固定(100%メタノール，室温で 30分)の方がパラ抗体はすでにいくつかの会社から市販されており，前ホルムアルデヒドとグルタールアルデヒドよりも良い回述べた免疫組織化学的方法により容易に検出するこ結果を得ることができた。これは化学固定と有機溶媒とが可能である。以下，主に緑藻類，特に筆者らが材固定による固定能の違いによるためと考えられる。強料にしている多核緑藻のマガタマモ，ハネモ，モツレ

く固定するとそれに伴い後にのべる 2本鎖 DNAの変性

グサを材料に経験的な観点から， BrdUによる S期核のに要する時間は異なる。

検出方法について述べる。固定等の基本操作は，前回固定後.PBSで数回洗い， 5%TritonX‑l00inPBSでの細胞骨格の免疫組織学的方法と同じであり，このた室温 1‑2時間程度処理し，できる限りクロロフィルをめ重複する部分については説明を省略するので，前回取り除く。の方法を適宜参照していただきたい。

J
4

本村ら

1，2.ハネモ。200凶 4の BrdUで 51
時間ラ ベル。2では BrdUを取り込んだ築緑体 DNAがドット 状に検出されてい る。
3."ガタマモ。200μMの BrdUで 11
1寺問パルスラベル。a抗 日rdU抗体で倹出された BrdUを取り込んだ核。b.
20μg/mLの P1で染色。
4.
"ガタマモ。200μMの BrdUで 30分間パルスラベル。30分間パルスラベルでも十分に検出が可能である 。なお，絞戸、}においてBrdUを取り込む部位は sJUJのH寺JVJによって変化する 。a抗日 rdU抗体で検出された BrdUを取り込んだ核。b.20~g/mL の P1 で染色。
5， 6.モツレグサ。 1
00% メタノールで置l定後， 2Nの HC1で DNAを変性 させた。5は 331時間， 6は 4時間 200μMの BrdUで核をラベルし た。 オルガネラ DNAもドッ ト状に検出されている 。

細胞周期解析法

2‑3 DNAの変性

15液で洗浄する。理由は明確では無いが，経験的に 2本BrdUは 2本鎖 DNAの中に取り込まれるが，これを鎖 DNAの変性において塩酸処理を行った場合は FITC

抗 B吋 U抗体を用いて認識するには， DNA中の BrdU分

標識二次抗体， DNaseI処理を行った場合は rhodan由e子を抗体が認識できる様に 2本鎖 DNAを変性させなけ標識二次抗体で好結果が得られる。 BrdUを取り込んだればならない。その方法は大きく 2通りある 0 <1>強酸

核と取り込んでいない核の比較を容易にするため，核本鎖 DNAあるいは強アルカリを用いて 2本鎖 DNAをlは DAPI溶液， EB溶液，あるいは PI溶液(蛍光標識二に変性させる(経験的にアルカリ溶液は酸性溶液よりも次抗体とは異なる励起光に対応する染色液を選択する)

細胞構造に対するダメージが大きいので，酸性溶液をで染色する。 4NHClで l本鎖 DNAに変性させた場合用いることを勧める )0<Il>
Mgt存在下で DNase1
処理には当然 DAPIでは強く核は染色できない。そこで EBを行い， 2本鎖 DNAに randomnickをいれる。 <11>のもしくは PI溶液(50μ.
g/mLinPBS)で室温 10分間染色す

方法はマイルドな方法であるために，他の抗体，例える。 DNase1処理した場合には DAPI溶液(0.
5凶'mLin

ば抗チュープリン抗体との併用が可能である。

PBS)で室温 10分間染色する。

<1>の方法を用いる場合には， 4Nの HClで室温 10分間処理する。 <11>の方法の場合には IOUDNasel/mL

2・
7 プレバレーションおよび観察(5OmMTris‑HC
I，1伽nMMgCI.8%NaCl，pH7.
6))の2，0PBSで数回洗った後に，退色防止剤として 0.2%p‑条件下で室温 30分処理する。最初に実験する場合にはphenylenediamineを含む Mowiol488mountingmedium
司<1>の方法から始めたほうが無難である。塩酸処理のもしくはグリセリン溶液で封入し，落射蛍光顕微鏡で時聞は短すぎても BrdUが検出されないが，長すぎて観察する。 DAPI染色は U励起で，そしてローダミン，も塩酸で細胞自体が分解，褐色化して BrdUの検出がEB， PI染色は G励起で， FITC染色は B励起で観察すできなくなるので注意する必要がある。

る。

いずれの場合も処理後念入りに PBSで洗浄を行い，BrdUを取り込んだ核は強く標識二次抗体で染色さImg/mLの NaBH4で還元処理を施した後，PBSでさられる。この時， BrdUの処理時間また S期の前，中，後に洗浄する。

期によっても染色性は異なるはずである。またハネモやモツレグサでは葉緑体DNAもドット染色される。な2・
4 プロッキング

お，固定， DNA変性処理など本来の抗体のエピトープ

十分洗浄したサンプルはを O.I%BSA含む PBS溶液

構造に変化を与える可能性のある操作が含まれるの・BSA)，もしくはプロッキング液 (2.
5%スキム中 (PBSで，必ずコントロール実験(例えば BrdUを取り込ませ.
1%NaNnPBS)中で 30
ミルク， 5%正常ヤギ血清， 03iていない細胞や BrdUを取り込ませたが一次抗体処理'C， 0.
5・1時間プロッキングを行う。

をしない等)を行い，検出されたのが本当に取り込まれた BrdUであることを確認する必要がある。

2‑5 抗 BrdU抗体処理
PBSで 1β 程度に希釈した抗 BrdUモノクロナール抗

参考文献

5'C， 0.
5‑1時間体(日本ベクトン・デイキンソン社)で 3Goff，L.1. and Coleman，A. W. 1990. DNA:インキュベートする。その後， PBSもしくは PBS‑BSAMicrospectrofluorometricstudies.In"Biologyo
fthered溶液で 3回以上溶液を交換しながら，十分に洗持する。
ところで，抗 BrdUモノクロナール抗体は細胞増殖検出キットとして各社から売り出されているが，すで

a1gae"(Eds.Cole，
K.M.andSheath，
R.G.
)，
Cambridge
ress，
pp.43・71.
Un
iv
ers
ityP

Gr
atzner，
H.G.1
982.Monωlon
a1antibodyt
o5・bromo・ 佃dに DNaseIや制限酵素を含むものもあるので使用に際

5・iododeoxyuridine:anewreagentfordetectionDNAし注意を要する。

replication.Science2
18:474・5.
，H.G.，Leif，R.C.，Ingram，D.J.andCastro，A.
Gratzner

2‑
6 二次抗体処理
PBSもしくは PBS・BSAで 1β0または 1/1∞に希釈し1975. The use of antibody specific forbromodeoxyuridinefortheimmunofluorescentgG(ヤギ)た蛍光標識二次抗体，同TC標識ー抗マウス I

determinationofDNAreplicationi
nsinglecel
1
sandgG(ヤギ)で， 35'C，または rhodamineB標識ー抗マウス Ichromosomes.E
xp.Cel1Res.9
5:
88‑
94.

30分間インキュベートし， PBSもしくは PBS‑BSA溶

B.E.andSammut，
M.1
990.Re創 T
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1‑
7.

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82.

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鈴木健史

1992組織細胞内におけるオルガネラ DNA

合成部位の検出法ーテクノピットー BrdU
抗体蛍光抗体染色法一

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