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研究生化学自動分析装置を用いた亜鉛比色測定法
株式会社シノテスト研究開発部

要

日暮和彦

約

＊我々は，亜鉛欠乏の早期発見，欠乏症のエビデンスにもとづいた治療のため，自動分析装置用亜鉛測定試薬を開発した．
＊開発した試薬は，臨床検査において十分な精度，測定範囲，正確性を有していた．
＊亜鉛測定に際しては注意すべき点もあるが，自動分析装置での測定により，簡易・迅速化，検体の少量化，容易な多検体処理が実現し，測定結果を迅速に臨床医に渡すことが可能とな
り，小児の栄養管理や，診断前検査にも有用と思われる．の反応原理は，いずれも transferrin と結合してはじめにいる Fe3 ＋を酸性下で還元遊離させ，Fe2 ＋として臨床検査における亜鉛測定は，ほとんどが原子

Nitroso-PSAP ま た は Bathophenanthroline の キ

吸光法，一部が用手法の比色法で行われていた．

レート発色剤と錯体を形成させ，その吸光度を測

従来の測定法の問題点として，いずれの方法でも，定し，鉄濃度を求めている．銅は 4-（3,5-Dibromo-検体の前処理を必要とすること，サンプル量が多2-pyridylazo）-N-ethyl-N-（3-sulfopropyl）aniline

く必要なこと，結果報告までにかかる時間が長い（3,5-DiBr-PAESA）法が用いられている 4）．そのことが挙げられる．そこで，特殊な機器や煩雑な反応原理は ceruloplasmin と結合している Cu2 ＋操作を必要とするこれらの方法に替わる，簡便でを酸性下で還元遊離させ，Cu ＋ として 3,5-DiBr-迅速，かつ正確な測定法が求められていた．亜鉛

PAESA と錯体を形成させ，その吸光度を測定し，欠乏の早期発見，欠乏症のエビデンスにもとづい銅濃度を求めている．これらはいずれも，他の生た治療のために，我々は，自動分析装置用亜鉛測

化学項目と同じく自動分析装置に適用されている

1）

定試薬の開発に着手した ．

（図 1）．一方，鉄，銅とほぼ同じ濃度で血清中に存在する亜鉛については，除蛋白操作を含む用手法試薬こそ発売されているが自動分析装置用測定１．亜鉛測定試薬の開発

試薬発売または適用の報告は皆無に近いのが現状

本邦の臨床検査の分野においては，微量元素のである．その理由の主たるものは，蛋白変性剤等

殆どは原子吸光法にて測定されており，比色法がで亜鉛を蛋白質などのリガンドから遊離させた後一般的に用いられているのは，鉄（Fe）と銅（Cu）に，それら遊離リガンド共存下で発色剤を添加しだけに過ぎない．鉄は 2-Nitroso-5-［N-n-propyl-N-た場合，亜鉛と発色剤の錯体形成を 100％にする（3-sulfopropyl）amino］phenol（Nitroso-PSAP）法，条件が見つからなかったためと考えられる．

Bathophenanthroline 法が用いられている

2, 3）

．そ

測定系の構築に当たり，課題は大きく分けて 3

48 ―― 亜鉛栄養治療

1巻1号

2010

点あった．亜鉛と錯体を形成し，亜鉛に対する感割を持つものとして， 中間受容体度・特異性の高いキレート発色剤の選択，サンプ法では，このル中に存在する亜鉛以外の金属，鉄，銅などによ亜鉛の正確な測定を可能にした．

中間受容体と呼ぶ．本を工夫することで，る影響を抑制すること，そしてなにより，水溶液

すなわち，本法では第一反応において，蛋白変と異なり，蛋白質や脂質などさまざまなものの混性剤の作用により亜鉛を蛋白質などのリガンド

ざった血清の中の微量な亜鉛を正確に測定するこ（約 80％が albumin，約 15％がα 2-macroglobulin，とである．

数％がアミノ酸などの低分子物質 6））から遊離さキ レ ー ト 剤 は 亜 鉛 と 高 感 度 に 反 応 す る 2-

せ，同時に，亜鉛以外の金属はキレート剤による（5-Bromo-2-pyridylazo）-5-［N-n-propyl-N-マスキングを行う．続く第二反応で，試料中の亜（3-sulfopropyl）amino］phenol（5-Br-PAPS） を鉛をキレート剤 5-Br-PAPS と錯体を形成させ，5）使用し（図 2） ，鉄や銅などの発色を防ぐためこの錯体の吸収極大近傍の 550nm 付近におけるのマスキング剤として，それらに特異性の高いキ吸光度を測定し，亜鉛濃度を求める（図 3）．本レート剤を加えて処方した．また，このマスキン法は，除蛋白操作を必要としない，本邦初の直接グ剤にはもうひとつ働きがあり，マスキング剤に比色法による自動分析装置用亜鉛測定試薬であ亜鉛が一時的に結合することで，続く 5-Br-PAPSる．との反応を特異的かつ速やかに行う効果があると考えられる．そのため，亜鉛を中間で受け渡す役

Iron ;

denaturationtransferrin - Fe

3+reduction
Fe3+chelation
Fe2+FeFe

Copper ;denaturation
ceruloplasmin - Cu

2+

reduction
Cu

Zinc ;
albumin - Zn
α2 -macroglobulin - Zn 2+- Nitroso-PSAP
or- Bathophenanthroline

chelation
Cu

denaturation2+

図12+2+2+++Cu - 3,5-DiBr-PAESA

chelation
Zn2+Zn2+- 5-Br-PAPS

Determination of iron, copper, zinc concentration in serum, using a colorimetric method

C 3 H7BrNN

N

N

C 3H6SO 3NaHO

図2

Structual formula of 2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol (5-Br-PAPS)

49

図3Reaction principle

2．亜鉛測定試薬の性能
再現性は他の自動分析装置用試薬と同等に良好，測定範囲は 5 〜 500 μg ／ dL であった．標準物質の測定結果も認証値の許容幅の中に得られ，従来の原子吸光法との血清相関も良好であった

表1

Within-run and between-run precisions

Within-run precision. (n=20)
Serum 1
Mean (μg/dL)
61.3
S.D.
0.4
C.V.
0.69％
Range
1.3

Serum 2
76.2
0.8
1.03％
3.1

Serum 3
115.4
0.8
0.71％
2.7

Between-run precision. (n=9)
Serum 1
Mean (μg/dL)
59.8
S.D.
1.0
C.V.
1.73％
Range
2.7

Serum 2
76.2
1.4
1.86％
4.2

Serum 3
115.5
1.6
1.41％
4.9

（表 1，表 2，図 4，図 5，図 6）．
従来の方法と比較し，本試薬は，検体の前処理を必要とせず，サンプル量は微量，結果報告も他の生化学項目と同時に，迅速に行うことが可能である．

表2CRM BCR-637
CRM BCR-638
CRM BCR-639

Assesment of accuracy by certiﬁed reference material

Certiﬁed Value(μg/dL)111±22143±21236±14

Measured Value(μg/dL)
110.6
143.7
232.9

(Measured Value)/(Certiﬁed Value) ratio
99.6%
100.5%
98.7%

50 ―― 亜鉛栄養治療

1巻1号

2010

Limit of detection

Linearity
800
700

15.0600
Zn (μg/dL)

Zn (μg/dL) Mean.±2.6S.D.

20.0

10.0
5.0

500
400
300
2000.0100-5.00/10

5/1000/1010/10

5/10

Dilution ratio

Dilution ratio
Limit of detection and Linearity

90.0

90.0

80.0

80.0

80.0

70.0
60.0
50.0

70.0
60.0
50.0

40.0

40.0

30.0

30.00100Zn (μg/dL)

90.0

Zn (μg/dL)

Zn (μg/dL)

図480.0Zn (μg/dL)

Zn (μg/dL)

90.0

60.0
50.0

20

30.0

70.0
60.0
50.0
30.00250

500

0Hemoglobin (mg/dL)

1500

3000

Chyle (formazin turbidity)
90.0

80.0

80.0

Zn (μg/dL)

90.0
70.0
60.0
50.0

70.0
60.0
50.0
40.0

40.0
30.0

30.00250

0500

Fe (μg/dL)

250500Cu (μg/dL)

図550.001020

Conjugated bilirubin (mg/dL)

40.0

40.0Zn (μg/dL)

10Bilirubin (mg/dL)

80.0

60.0

30.0

Ascorbic acid (mg/dL)
90.0

70.0

40.0020070.0

10/10Eﬀect of interfering substances

51ACCURAS AUTO Zn (μg/dL)

120y = 0.976x - 0.68
r = 0.9956
n = 601008060
40200020406080100

120

Atomic absorption spectrophotometry (μg/dL)

図6

Correlation between the value of serum zinc by atomic absorption spectrophotometryand ACCURAS AUTO Zn

3．亜鉛測定の注意点低下し，夜間において最も低値を示す．
従来の測定ではこれらがおざなりになっていた

亜鉛は，ゴムからの汚染があることが知られてことが，血清または血漿亜鉛の臨床的意義やそのいるので，採血管，注射筒の選択には注意を要す

基準範囲を不明瞭なものにしていたと考えられ

る 7）．検体取り扱い時のグローブの取り扱いも同る．これらに留意した上で，亜鉛測定を行う必要様である．特に採血管については，微量金属測定がある．

用のものでない場合，汚染の無いことを十分に確認して使用することを推奨している．
また，採血後の血清または血漿の遠心分離までの時間経過によって測定値が上昇することが報告
8）

まとめ
本法は，臨床検査において十分な精度，測定範されている ．分離前でも冷蔵保存することで本囲を持ち，共存物質の影響も殆ど認められなかっ現象は抑制されること，血清と血漿で上昇の度合た．標準物質の測定結果ならびに原子吸光法とのいに差がある（血清のほうが上昇する）ことから，相関は良好であり，正確性も満足できる．このよ

高濃度で存在する血球または血小板中の亜鉛が何うな自動分析装置での測定により，簡易・迅速化，らかの機序により解離して血清または血漿中へ出検体の少量化，容易な多検体処理が実現し，測定てくるものと考えられているが，詳細はわかって結果を迅速に臨床医に渡すことが可能となり，小いない．速やかな遠心分離，またはやむをえず分児の栄養管理や，診断前検査にも有用と思われる．

離前に長時間放置する場合は冷蔵保存することを今後も，亜鉛及び亜鉛欠乏症についての研究の更推奨している．

なる発展が望まれる．本法がその一助となれば幸さらに，鉄と同様に，日内変動があることが報8）

告されている ．朝方に高値を示し，日中次第にいである．

52 ―― 亜鉛栄養治療

◆文

献1巻1号

2010――――――――

1）日暮和彦，飯塚直美，芳村一，田中龍彦，野本5）Makino T, Saito M, Horiguchi D, Kina K : A昭三：生化学自動分析装置を用いた亜鉛比色測定

highly sensitive colorimetric determination of法．Biomed Res Trace Elements 18（4）: 380-385,

serum zinc using water-soluble pyridylazo dye.

20072）山田満廣，谷岡房子，岸Clin Chim Acta. 120 : 127-135, 1982
和子，幡中うき，大西6）Foote JW, Delves HT : Albumin bound and alpha

将則：ニトロソーPSAPを用いた血清鉄および不飽

2-macroglobulin bound zinc concentrations in the

和鉄結合能の自動測定法．日本臨床検査自動化学会

sera of healthy adults. J Clin Pathol 37（9）: 1050-

会誌 13（5）: 659-665, 1988

1054, 19843）Beale RN, Bostrom JO, Taylor RF : Improved7）Helman EZ, Wallick DK, Reingold IM : Vacutainerrapid methods for the determination of ironcontamination in trace-elements studies. Clin

content and binding capacity of serum. J ClinPathol 15 : 156-160, 1962

Chem, 17（1）: 61-62, 1971
8）野本昭三，山内一由，中林徹雄：血清亜鉛値によ4）Abe A, Yamashita S, Noma A : Sensitive, direct

る亜鉛欠乏症検出システムの現況 その欠落部へのcolorimetric assay for copper in serum. Clin Chem.

提言．Biomed Res Trace Elements 14（4）: 335-35（4）: 552-554, 1989

337, 2003