学位研究紹介289

学 位 研 究 紹 介

突然変異型組織非特異型アルカリホスファターゼ（V406A）の解析
Analysis of a Tissue-Nonspecific
Alkaline Phosphatase Mutation
Associated with a Lethal
Hypophosphatasia Patientとする低ホスファターゼ症の原因遺伝子が TNSALP 遺伝子であることが明らかとなり，石灰化におけるその重要性が確立した。また，患者や TNSALP ノックアウト
マウスの体液中でホスホエタノールアミン，無機ピロリン酸，ピリドキサ−ルリン酸が著しく増加することが報告され，それらは TNSALP の天然での基質である可能性が高い。３種のリン酸化合物の中でもハイドロキシア
パタイト形成の結晶毒として知られる無機ピロリン酸をTNSALP が分解することで石灰化を促進しているとい新潟大学大学院医歯学総合研究科 口腔生命科学専攻
口腔健康科学講座 小児歯科学分野

沼奈津子

う説が本酵素の生理的な機能として有力になってきている。

Division of Pediatric Dentistry

Ⅱ．目

Department of Oral Health Science

的Niigata University Graduate School of

ヒト TNSALP は名前の通り他の組織特異型アイソザ

Medical and Dental Sciences

Natsuko Numa

イム（小腸型，胎盤型，生殖細胞型）とは異なり，肝臓，骨，腎臓，精巣，線維芽細胞，マクロファージなどの細胞に広く発現しており，別名肝 / 骨 / 腎型酵素とも呼ばれⅠ．背景る。現在まで 184 もの変異が同定されているが，その突然変異の 80％はミスセンス変異であり，その他ナンセ低ホスファターゼ症は硬組織の低石灰化や，血清並びンス変異，フレームシフト変異なども知られている。そに組織中の alkaline phosphatase 活性の低下によって特の中でも 406 番目のバリン（V）がアラニン（A）に置徴付けられる稀な先天性代謝異常疾患である。Rathban

換された突然変異は複合ヘテロ接合体（V406A/A99T）

によって 1948 年に初めて報告され，常染色体劣性遺伝として，2001 年に周産期型症例で報告された症例の変あるいはまれに優性により遺伝し，その原因は組織非特異である。406 番目のアミノ酸は TNSALP 構造のクラ異型アルカリホスファターゼ遺伝子（tissue-nonspeciﬁcウン領域に位置するが，このクラウン領域は哺乳類以

alkaline phosphatase, TNSALP）の変異によることが既外のアルカリホスファターゼには存在しない領域であに知られている。低ホスファターゼ症の重篤度は血清中り，コラーゲンと相互作用する部位であると考えられてのアルカリホスファターゼ活性レベルに密接な関係があいる。また基質小胞から抽出された TNSALP はこのコり，血清中の酵素レベルが低いほど発症時期が早く，しラーゲン分子との結合によって有機性基質に対する親和かも重篤な症状となりしばしば致死性である。発症の時性が増加することも報告されている。従って，本変異

期により周産期型，乳幼児型，小児型，成人型，歯限局は TNSALP 分子構造と機能に何らかの影響を引き起こ型に分類され，歯科学的には乳歯の早期脱落を特徴としすと想定される。本研究では低ホスファターゼ症の分子ており，時折これが主たる現症となっている。本症にお病態機序の解明を目的として，この変異酵素 TNSALP

ける乳歯の早期脱落はかなり高い頻度で発現し，幼児型（V406A）（以下 V406A と略す）に注目し，細胞及び酵の患児の 75％以上にみられるという報告もある。骨疾素レベルでの検討を行った。

患の顕著でないものでは，この歯科的所見が唯一の特徴Ⅲ．方的な症状となるため，歯科医が本疾患を最初に発見する法ことも稀ではない 1。しかし，歯科では一般的に血液検査は行わないので，TNSALP の変異による歯牙に限局野生型酵素の cDNA を鋳型に，変異酵素 V406A を部位特異的突然変異法を用いて作製した 2。始めに COS-1

した症例は見過ごされている可能性がある。
組織非特異型アルカリホスファターゼ（TNSALP）細胞を用いた一過性の過剰発現の実験系において解析をは骨の形成に重要な役割を果たしていることが以前から行い，さらに，より正常に近い発現系である条件発現細推測されていたが，1988 年に骨の石灰化不全を主症状胞株（以下 Tet-On 細胞と略す）を樹立した。方法とし− 81 −

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新潟歯学会誌36（2）：2006て，
p - ニトロフェノールを基質として用いた酵素の定量，サイクリンを添加しないで培養した細胞はどちらの染色アゾ色素法による定性的な組織化学的染色，蛍光抗体染法によっても染まらなかった（図２，右上下）。この樹色，放射性アミノ酸標識 - 免疫沈降法，ウエスタンブロッ

立細胞でのパルス - チェイス実験 /Endo H 処理により，ティング法を用いた。また，野生型と変異酵素を酵素学

新生分子の大半は野生型とほぼ同じ速度で細胞内を移動的に厳密に比較検討する目的で野生型酵素と V406A のすることが判明したが，そのごく一部は小胞体からゴル両酵素を分泌型の酵素として COS-1 細胞に大量に発現ジ装置への移行が野生型に比べて遅延していることが明させた後，精製してその酵素学的な性格付けを行った。

らかになった（図３）。これらの分子はチェイス２時間が経過しても未熟型の分子種として存在することから，Ⅳ．結果と考察

適正な立体構造を保持していないために小胞体からゴルジ装置へ運ばれない可能性があり，アミノ酸の置換がわ

アルカリホスファターゼ活性の定性的な組織化学的染ずかではあるがフォールデイングに影響することを示唆

色により V406A は野生型と同様に細胞膜表面に局在すしている。さらに，アルカリホスファターゼの比活性をることが観察されたが，但し，その染色は野生型に比べ比較したところ，V406A を発現する Tet-On 細胞の比て弱かった（図 1A）。さらに放射性のアミノ酸を用い活性は野生型のそれの約７％にすぎなかった。従って，た生合成実験（免疫沈降 /SDS-PAGE）および PI-PLC（ホ406 番目のバリンからアラニンへの置換が酵素の触媒活

スファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ C）消性に強く影響している可能性が大きいと考えられた。

化実験によって，V406A は 80 kDa の成熟型酵素として細胞表面に GPI（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカーを介して結合していることが明らかになった。一方，p - ニトロフェノールを基質として用いた酵素の定量，ウエスタンブロッティングによる発現される分子種の量比の検討から，野生型を発現する細胞に比べて変異酵素を発現する細胞はアルカリホスファターゼ活性が低いことが明らかになった（図 1B）。

図２

Tet-On 樹立細胞での V406A の発現

図１ 野生型酵素と変異酵素 V406A におけるアルカリホスファターゼ活性

培 地 中 の ド キ シ サ イ ク リ ン に 依 存 し て TNSALP

図３

EndoH 酵素消化実験（V406A）を発現する CHO-K1 細胞を樹立し，ドキシサイクリンの存在，非存在下の条件で培養した際の発現酵素学的な比較検討では，Km 値に大きな差は認めらの比較を蛍光抗体染色及びアルカリホスファターゼ活性れなかったが，Kcat 値は野生型に比べて著しく低い値染色にて行った。ドキシサイクリンを添加した細胞ではをとり，また Kcat/Km 値からも V406A の触媒作用のTNSALP（V406A）は細胞膜表面に局在が認められた（図効率は 10 分の１以下に低下していることが判明した（図２，左上）。同様に，アルカリホスファターゼ活性染色４）。

においても，蛍光抗体染色の結果と一致して，細胞膜表以上のことから，本ミスセンス変異では他の重症例の面に活性が発現していた（図２，左下）。一方，ドキシ

低ホスファターゼ症で報告された変異（R54C, N153D,− 82 −

沼奈津子

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A162T, E218G, D289V）に比較してその生合成への影響は軽微であり，むしろ触媒活性を強く低下させることがⅤ．文献明らかになった。従って，この患者の骨芽細胞や軟骨細胞では細胞の表面に酵素分子は存在するもののその触媒

１．井上 美津子 , 鈴木 駿介 , 中田 稔 : 低ホスファター

活性は著しく低下しているために，ハイドロキシアパタゼ症の 1 症例の歯科的所見 小児歯科学雑誌 1997;

イト形成の阻害物質である無機のピロリン酸を分解でき

15（1）: 62-69.
２．Ishida Y, Komaru K, Ito M, Amaya Y, Kohno S,ずに石灰化が抑制されると推測される。

Oda K.: Tissue-nonspeciﬁc alkaline phosphatasewith an Asp（289） → Val mutation fails
to reach the cell surface and undergoes
proteasome-mediated degradation. J. Biochem.
2003; 134: 67-70.

図４

酵素反応速度の解析− 83 −