博士（医学）伊藤圭

学 位 論 文 題 名ヒ ト VII型 コ ラ ー ゲ ン 発 現 ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス におけ る係留線維形成の解析
学 位論文内容の要旨

背景：表皮水疱症(epidermolysisbullosa；EB)は表皮―真皮境界部を構成する構造蛋白をコードする遺伝子 の変異により，先天的に軽微な外カによって皮膚に水疱を形成する遺伝性皮膚疾患である ，水疱形成部位により大きく3っに分類されるが，その中で基底板直下の 真 皮 最 上 部 に 水 疱 を 形 成 す る EBを 栄 養 障 害 型(dystrophic EB；DEB)と 呼称 す る，
DEBは，遺伝形式により優性栄養障害型と劣 性栄養障害型に分けられ，両者共に基底膜部に存在する係留 線維の構成蛋白であるV
II型 コラーゲン(COL7A1）遺伝子の変異により発症することが明ら かにされている．DEBの原因 となる遺伝子や蛋白分子構造については解明されてきたが， 本症に対する治療は対症療法にとどまり，有効な治療法は開発されていなぃ．
近年，表皮水疱 症患者からの表皮細胞を培養し，潰瘍面に移植する自家培養表皮移植が試みられているが ，患者皮膚からの培養表皮シートは遺伝子的・構造的欠損を補えていな
いため，移植部に W型コラーゲンの発現は無く ，永統的な効果は期待できない．また，遺伝 子導 入を 行う には 限界 に近 い約 9kbと 非常 に大 きいC
OL
7A
1遺伝子を導入し，完全な機能蛋白として発現 させる効果的・効率的な方法についても確立されていぬい．そこで，患者では欠損もしく は減弱している正常C
OL
7A
1遺伝子を自家培養皮膚に導入できたならば，そ の 自 家 培 養 皮 膚 移 植 術 は 永 統 的 根 本 的な 治 療 法 に な り 得る と考 えら れる ．
研究 の目 的： マウ スの表皮角化細胞およ ぴ真皮線維芽細胞に正常ヒトCO
L7A1遺伝子を強制発現させ，導 入された遺伝子が十分な機能を果たし，将来的に効果のある治療法へと結びっくかにっいてトランスジェニックマウスくTgm）を作製・解析することにより検討する．
実験の方法：COL
7A1を表皮に発現させるベクターではヒトケラチン14（K14）プロモーター，真皮に発現 させるベクターではマウスI型コラーゲン（COLlA2）プロモーターとし，共 にそ の下 流に ヒト CO
L7A1cDNA
全 長 を配 置す るべ クタ ーを 作製 し， マイ クロインジェク ショ ン法 にて Tgmを 作製 した ．産 仔マ ウス をPCR法に てス クリ ーニ ング し，かつマウス 皮膚 が抗 ヒト W型コ ラー ゲン N
C． 1domain8peci齔抗体であるL
H7．2抗体にて強陽性を認めたマウスをTgm（Fo冫とした．Tgm（F0）をC57
BL/6マウスと交配し，得られた産仔を前述 同様 にPCRスク リー ニング，免疫組織染色を行い，ヘテロで発現して いるT
gm（F1）をRTPCR， ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト ， 電 子 顕 微 鏡 ， 免 疫 電 子 顕 微 鏡 に て 観 察 ・ 解析 し た．
結果 ：K14プロ モー ターTgm
くK14Tgm）に 関しては，L
H7．2抗体を用いた免疫組織染色で 良 好 な 蛍 光 発 色 を 確 認 で き た Tgm＠ o冫 は 2匹 で あ っ た ． COLlA2プ ロ モ ー タ ーTgm（COLlTgm）で は，良好な螢光発色を確認できたTgm（Fo）は8匹であっ た，C57BI亅/6マウスと交配し， 系統維持されたそれぞれ代表的な1系統のTgm（Fl）についての解析を行った．LH7．2
抗体 を用いた螢光抗体法所見は，K14Tgm（F1）では，基底膜部に線状沈着，および一部の表皮 角化細胞細胞質に顆粒状の沈着を認めた．また，毛包基底膜・毛包上皮内にも沈着を認め た．COLlTgmくF1）では，基底膜部に線状沈着，および真皮全層に広範囲‑ 297ー

に 顆粒 状の 沈着 を認 めた ． Tgm(Fl)皮膚 を表 皮‐ 真皮 間 で剥 離し行ったRTPCR法の結果
は ， K14 Tgm表 皮 側 お よ び COLl Tgm真 皮 側 に 強 い ヒ ト COL7A1 mRNAの 発 現 を 認 めた ． ま た ，K14 Tgm
真 皮側 には 弱 いな がら も， 毛包 由来 と思 われ るmRNAの 発現 がみ られた． COLl Tg
m表皮側には発現は認められなかった．同様に表皮一真皮間剥離皮膚で行っ たウ エス タンブロット法の結果は，K14 Tg
m表皮側：K14 Tg
m真皮側：COLl Tgm
真皮側の ヒト CO
L7A1
蛋 白発 現量 の 比率 は， 2:0.6:1であ った ． いず れもLH
7.
2抗体と反応した
290kDaバ ン ド で あ り ， ヒ ト COL7A1に 由来 する もの であ った ．COLl Tgmの 表皮 側に は発現を認めな かった．透過電子顕微鏡による解析において，いずれの Tgm
においても係留線 維の 形成 を形態学的に確認したが，マウス既 存のものか導入したヒトCOL7A1に由来するものか判別 できなかった． LH7.
2抗体を用いた免疫電子顕微鏡による解析では，K14Tgm
皮膚では，基 底板の係留線維基部に金コロイド粒子の存在を認め，一部は基底板上部の透明層や表皮角 化細胞内にも認めた． C
OLl Tgm
皮膚では，基底板の係留線維基部に金コロイ ド 粒 子 の 存 在 を 認 め ， ま た 真 皮 内 に も 金 コ ロ イ ド 粒 子 の存 在 を 認 め た ．
考察 ： K14 Tgmに おい て は， 表皮 側で 強く m
RNAの発 現が 認め られ，かつ螢光抗体法
で は表 皮角 化細胞での螢光発色陽性となり，ウ エスタンブロット法では290k
DaのCOL7A1蛋 白 が 表 皮内 で認 めら れた こと より ，表 皮で CO
L7A1が 発現 す る系 を反 映す るTgm
を作製することが できた，また，螢光抗体法所見で基底膜部に線状に強い発色がみられ，かつ
免 疫 電 顕 所見 でCOL
7A1のN末端 側 のNC‑
1ド メイ ンを 示す 金コ ロイ ドが 基底 板部 にみ られたことより ，表皮内で作られたヒトC
OL7A1が表皮内細胞膜を通過し細胞外ヘ排出され，基底板上で蛋 白としての機能を果たす係留線維を形成したと考えられた． COLlTgmにおい ては ，真 皮側において強くmRNAの発現が認め られ，螢光抗体法において真皮全層に強い 螢光 発色 が認められたこと，ウエスタンブロ ット法でCOL
7A
1蛋白が真皮側で認められた こ と に より ，真 皮で COL7A
1が 発現 する 系を 反映 する Tg
mを 作製 する こと がで きた ．
また，螢光抗 体法所見で基底膜部に線状に発色がみられたこと，および免疫電顕所見で金コ ロイ ドが 基底板部に認められたことは，真皮 内で作られたヒトCOL
7A
1が基底膜ヘ向かい ， 基 底 板 に NC‑1ド メ イ ン 部 分 を 付 着さ せ， 係留 線維 を形 成し たこ とを 意味 する ．
ウエ スタ ンブロット法による解析でヒトCO
L7A
1蛋白発現量を比較すると，真皮線維芽細胞よりも表 皮角化細胞での発現量が約2倍まさっており，表皮角化細胞のほうが係留線維形成に寄与 するポテンシヤルを高度にもっているものと推測された．一方，皮膚欠損状態など表皮か らの蛋白供給が途絶えるような状況では，真皮全層の線維芽細胞がどの深さで あっ ても そのポテンシャルを発揮し，係留線 維形成を十分行えることが推測された，本研 究で は，表皮角化細胞もしくは真皮の線 維芽細胞，いずれにCOL
7A1を導入しても係留線維の形 成を認めた．このことは将来的に遺伝子治療が行われる際の大きな指標になると考える， すなわち，培養皮膚に導入する際にも，培養表皮であれ培養真皮であれ，より 培養 しや すいものを自由に選択しても係留線 維の形成に支障がなぃことを意味する．
現段 階で は， CO
L7A1
遺 伝 子が 約9kbと非常に 塩基数が大きいため，細胞への導入効率の 問題 が大 きな ハー ドル と なっ てい る， 我々 は， ヒト CO
L7A1 cDNA
全長を 導入したTgmが 成功 した こと を受 け， ヒ トCOL
7A1 cD
NAを部 分的に短くした遺伝子でも同様に係留線維が形成され うるかについても検討を行っている．より短い遺伝子導入でも係留線維形成が行われるな らば，さらに遺伝子治療の実現に向けて大きな前進となりうると思われる．
ま た ， DEBの モ デ ル マ ウ ス で あ る CO
L7A1ノ ック アウ トマ ウ スを 今回 作製 した T
gmを用 いて トラ ンスジェニックレスキューすること も検討している，ヒトC
OL
7A1
遺伝子由来の係留線維の みでのレスキューが成功すれば，そのレスキューマウスを用いて，疾患の再現実験や治療 の研究など様々な方向性で活用できると考えられ，今回 作製したTgmはその大きな足がか りになることが期待できる，
結諭 ：DEBの原 因遺 伝子 であ るヒ トCO
L7A1
遺 伝子をマウスの表皮角化細胞もしくは真皮 線維 芽細 胞に導入したトランスジェニックマ ウスを作製し，マウス皮膚にヒトCO
L7A1遺伝子由来の 係留線維の形成を確認した，今後，さらなる研究を進め ていくことで，DEBに 対 す る 遺 伝子 治療 がより 実現 性を増 して いくも のと 考えら れた ．
‑ 298―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 清 水宏
副 査 教 授 安 田則
副 査 教 授 三 浪 和 男
明

学位論文題名ヒトVII型コラーゲン発現トランスジェニックマウスにおける係留線維形成の解析
栄養 障害 型表 皮水 疱症 は， 先天 的 に皮 膚に 水疱を形成する遺伝性疾患で，表皮一 真皮境界部の接着構築を担う係留線維の構成蛋白である VII型コラーゲン(COL7AI)
遺伝子の変異により発症する．有効た治療法はなく，新規遺伝子治療の開発が待たれる．そこで，マウスの表皮角化細胞
お よ び 真皮 線維 芽細 胞に 正常 ヒト CO
L7A1遺伝 子を 強制 発現 させ ，導 入さ れた 遺伝 子が 十分な機 能を 果た し， 将来 的に 効果 の ある 治療 法へと結ぴっくかについてトランスジ ェニックマウス (Tgmをf匂 製・ 角劇 沂す るこ とに より 検討 を行 った ．そ の 結果 ，抗ヒトCOL7A
1モノクローナ ル抗 体く u酊． 2） を用 いた 螢 光抗 体法 にて，表皮発現Tgm岱14Tgm）では，基 底膜部に線状沈 着お よぴ 一部 の表 皮角 化細 胞 細胞 質に 顆粒状の沈着を認めた．真皮発現Tロ（COLlTgm）
では ，基 底膜 部に 線状 沈着 およ び 真皮 全層 に広 範囲 に顆 粒状 の沈 着を 認めた．Tg
m皮膚を表皮一 真皮 問で 剥離 し行 った RI、−P
CR法の 結果は，K14
隠n表皮側およびC（）L1
1餌1真皮側に強 い ヒ ト COL7A1mRNAの 発 現 を 認 め た ． 同 様 に 表 皮 一 真 皮 問 剥 離皮 膚で 行っ たウ エス タン
ブ ロ ッ ト 法 の 結 果 は ， K14瑠 n表 皮 側 お よ び COLlTgm真 皮 側 に 290kDaの COL7A1蛋 白 の発現 を認 めた ．透 過電 子顕 微鏡 に よる 解析 に韜 いて ，い ずれ の廻 nにおいても係 留線維の形
成 を 形 態学 的に 確認 した が， マウ ス既 存 のも のか 導入 した ヒト C
017Alに 由来 する もの か判
別 で き なか った ．LIロ12抗体 を用 いた 免 疫電 子顕 微鏡 によ る解 析で は， K14Tgm
皮 膚で は，基底板の係留線維基部に金コロイH
竏 の 存荏 を認 め， 一部 は基 底板 上部 の透 明層 や表 皮角化細 胞内 にも 認め た． C（） L1廻 n皮膚 では ，基 底板 の係 留線 維基 部に 金コロイH立子の存庄を 認 め ，ま た真 皮内 にも 金コ ロイ ド粒 子 の存 在を 認め た． 以上 の結 果よ り， K14龜 mに おいて は ， 表皮 側で 強く mm
嶮 の発 現が 認め ら れ， かつ 螢光 抗体 法で は表 皮角 化細 胞で の螢 光発
色陽 性と なり ，ウ エス タン ブロ ッ ト法 では 290kDaの Cく ）L7A1蛋白 が表皮内で認 められたこと よ り ， 表 皮 で COL7A1が 発 現
光抗体法所見す る系 を反 映す るTgmを作 製す るこ とが でき た． また ，螢

で 基 底 膜 部 に 線 状 に強 い発 色が みら れ， かつ 免疫 電 顕所 見で C
OL7A1の N
末端側 のNC‐1ド メイ ンを 示す 金コ ロイ ドが 基底 板部 にみ られ た こと より，表皮内 で作られた
ヒ ト COL
7A1が表 皮内 細胞 膜を 通過 し細 胞 外へ 排出 され ，基 底板 上で 蛋白 とし ての 機能 を果た す 係 留 線 維 を 形 成 し た と 考 え ら れた ．COL1
廻 nにお いて は， 真皮 側に おい て強 くm心 ヾAの発 現が 認め られ ，螢 光抗 体法 に おい て真 皮全層に強い螢光発色が認められたこ と，ウエスタ ン ブ ロ ッ ト 法 で COL7A1蛋 白 が 真 皮 側 で 認 め ら れ た こ と に よ り ， 真 皮 でCOL7
A1が 発現す る系 を 反 映す る Tg
mを 作製す ることが できた ．また， 螢光抗体 法所見 で基底膜 部に線 状に発色が みられ たこと， および免 疫電顕 所見で金 コロイ ドが基底 板部に 認められ たことは ，真皮 内 で 作 ら れ た ヒ ト CO
L7A1が 基 底 膜へ 向 か い， 基 底 板に NC‑1ド メ イ ン部 分 を 付着 さ せ ，係留線維を形成したことを意味する．
本研究 では， 表皮もし くは真皮 のいず れにヒト C
OL
7A
1遺伝子 を導入 しても係 留線維の 形成を認めたことを証明した．このことは，将来的に遺伝子治療が行われる際の重要なevidenceになると考えられ，今後のさらなる研究によって，栄養型表皮水疱症に対する遺伝子治療がより実現陸を増していくものと考えられた．
副査の 三浪明 男教授か らは， COL
7A1遺伝子のヒトとマウスの相同性にっいて，また，遺伝子導入における今後の課題についての質問，副査の安田和則教授からは，マウスにヒト由来の遺伝子が導入されることによる生理的な障害の有無について，およびマウス由来の係留線維の減少な
どみら れるの かにっい て，主査 の清水宏教授からは今回作製し得たトランスジェニックマウスとCO
L
7A
1ノックアウトマウスとのレスキュー実験に関する質問などがあったが，申請者は大概適切な回答をした．
この論 文は， 表皮もし くは真 皮のいずれにヒトC
O
L7A1遺伝子を導入しても係留線維の形成を認めたことを証明し，将来的に遺伝子治療が行われる際の大きな指標になる点が評価された．今後さらに研究を継続することで，遺伝子治療の実現に向けて大きく前進することが期待される．
審査員一同は，これらの点を高く評価し，大学院課程における研鑚や取得単位なども併せ申請
者 が博 士 （医 学 ）の 学 位を 受 ける の に充 分 な資 格 を有 す る もの と判 定した．