博 士（医学）渥美敏也
学 位 論 文 題 名

脂質代謝、糖代謝におけるマ クロ ファ ージ 遊阻止因子の役割
学位論文内容の要旨
1．緒言
現在、日本人の死因の第一位は悪性腫瘍である。第二、三位は脳血管障害と心疾患であり 肥満、高血圧、糖尿病、高脂血症などの成人病がその発症に深く関与している。低比重リ ポ蛋白(low density lipoprotein： LD
Dが動脈内膜に移行すると血管内皮細胞やマクロフ ァ ージ など によ って フリーラジカルが放出されLDLが酸化される。マクロファージ は
TNF‑a、IL‑1などの炎症性サイ トカインを産生し、血管壁を構成する血管内皮細胞や平滑筋 細胞を活性化する。特に酸化LD
Lはこれらの生物活性の高い分子の産生を刺激しマクロ
フ ァ ージ の増 殖も 誘導 する 。ま た動 脈硬 化巣 には 酸化LD
Lのような変性LDLを、特異 的
レ セ プ タ ー を 介 し て 取 込 ん だ マ ク ロ フ ァ ー ジ （ 泡 沫 細 胞 ） が し ぱ し ぱ 存 在 す る。
マクロファージ遊走阻止因子(macrophagemig弧tioninhibit0珂血ctor：MIF）は炎症や 細胞増殖に関与する多機能分子として知られている。最 近MIFが動脈硬化巣で強く発現し ていることが報告され、動脈硬化症におけるMIFの役割が注目されている。本研究では
マ ク ロフ ァー ジに おけ るMIFの 発 現に 対す る酸 化LDLの 影響 お よび 酸化 L
DLの取り込 みと 分解に対するMIFの作用につ いて解析した。
また糖代謝異常も動脈硬化の発症と密接に関与している。MIFの糖代謝における役割を解 明するため、主要な糖利用器官である骨格筋のストレス刺激における糖代謝亢進に対するMIFの役割を検討した。
2．方法細 胞 は マ ウ ス マク ロフ ァー ジ様 細胞 株(RAW 264.
7)を用 いた 。LDLは超 遠心 法で 健康 成人 空腹 時血 漿か ら分 離精 製し た 。酸 化LDLは 得ら れた LD
Lを Cu
S04く5いvDと37゜Cで24時 間反 応さ せ調 整し た。 酸化 LDL (io〜so UgimDでRAW 264.
7を刺激し、MIF mRNA
発 現量 をノ ーザ ンブ ロッ ト法 で解 析 した 。ま たRAW 264.7のMIF分泌 に対する酸化 L
DLの 影響 を検 討す るた め、 培養 上清 中 M
IF濃度 をELISA法 で測 定し た。 さらにMIFの生物学的機能を解析するため、培養液を無血清培地(Cosmedium： C08moBio、東京）に変更後
MIFを 添 加 し 48時 間 37℃ で 培 養 し 、 1251標 識酸 化 L
DLを添 加後 37℃ で4時 間培 養し 放射 活 性 を 測 定 す る こ と に よ り 、 酸 化 LDLの 取 り 込 み 、 分 解 能 を 解 析 し た 。
― 53 ‑

骨格 筋の解糖 系に対 するMIFの役割 を検討す るため、 ラット L6筋芽細胞を筋管細胞に分化させ、MIF
刺激時におけるFructose‑
2，6‑bi8
ph08phate(F2，6BP)量と乳酸産生量を測定した。F
2，6BPは解糖系の強カな刺激因子であり、その濃度の測定は糖代謝を知るうえで非常に有用である。またF2，6BPの合成を触媒する6‑ph08phofirict0・2．bna
艶QFK．2）遺伝子の 発現も同 時に検討した。さらに、TNF．aの解糖系亢進作用とMIFの関連を検討するため、L
6筋管細胞 をT
NF．aで 刺激し培 養上清 中Mm濃度を 測定し た。また T
NF．aによ る解糖系亢進作用に対する抗MIF抗体の影響を検討した。
3．結果
酸 化 LDLは RAW 264.7の MIF mRNAの 発 現 量 を 濃 度 依 存 性 に 増 加 さ せ た 。 し か しnative LDLは MIF mRNA発 現 量 に 変 化 を 与え な か っ た。 ま た 酸化 LDLによるM
IFmR
NAの発現は 時間依存 性に増加し、12時間で最高に達し、その後発現量は減少した。M
IFの培
養上清中への分泌は酸化LDLの濃度依存性（10．50pg′mDに増加し、nati、reL
DLは培養上清 中 MIF濃 度 に 影 響 を 与 え な か っ た 。 さら に 、 M
IFは R
AW264
． 7に おけ る 酸 化LDLの取込み、分解を増加させた。
MIF
は L6筋管 細 胞 にお け る F
2， 6B
P量 を 濃 度依 存 性 （5・ 100nめm）に増 加させた 。
また MIF
は mu闘lePF
K． 2遺伝 子 の 発現 を 増 加 させ た 。 さら に MI
FはL6筋管 細胞に おける乳酸産 生の増加 作用を有することが確認された。またI佑筋管細胞をTNF‐aで刺激すると培 養 上 清中 MIF
濃 度 が 増加 し た 。同 時に 細胞内の MIF量は 減少し 、細胞内 のMIFプールがTN
F．aの 作用で 細胞外に 分泌さ れることが示唆された。またTNF．aはL6筋管細胞のM
IFmR
NAの 発現 を 時 間依 存 性 に増 加 さ せた 。 ま た T
NF． aの 解 糖 系亢進作 用は抗 MIF抗体によって抑制された。
4．考察
動 脈硬化の 初期病 変におい てマク ロファー ジは極め て重要 な役割をしている。M
I
Fは
RAW 264．7におけ る酸化 L
DLの取 込みを 増加させ ること が明らか になった 。酸化 LDLはMIFのオー トクラ イン、パ ラクライ ン作用を通して酸化LD
L自身の取込みを刺激している可 能性があ る。そしてMIFは泡沫細胞の形成を助長し、白色線条の形成、不安定プラークの 形成、ア テローム硬化の進展に寄与すると考えられる。M
IFは炎症反応のみならず、細胞 分化・増 殖にも関与することが知られている。M
IFは血管内皮細胞、動脈中膜平滑筋細胞 にも発現 し、マクロファージに発現するM
IFとともに血管平滑筋の増殖にも関与することが考えられる。
ま た骨格筋 におけ る解糖系 活性化 の機序に MIFが関 与する ことも示唆された。骨格筋は 生体内に おける 糖代謝に 極めて重 要な役割を果たす。M
IFやTN
F‑aによる解糖系活性化機序とインスリン作用の関連を解明することが．、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病などの成人病の新たな治療法の開発にっながる可能性がある。

ー 54−学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 石 橋 輝 雄

学 位 論 文 題 名

脂質代 謝、糖代謝におけるマク ロファ ージ遊走阻止因子の役割
動 脈硬化巣 には酸化 L
DLの ような変 性LDLを、特異 的レセ プターを 介して取 込んだ マクロファージ（泡沫細胞）がしばしば存在する。マク口ファージ遊走阻止因子(macrophagemigr
ationinhibitoryfactor： MIF)
は炎症や細胞増殖に関与する多機能分子として知られてい る。本 研究では マクロ ファージ におけ るM
IFの 発現に対 する酸 化L
DLの 影響お よび
酸化 L
DLの 取り込み と分解 に対する M
IFの 作用につ いて解析 した。 また成人 病と関 連がある糖代謝とMIFの役割についても検討した。
酸 化LDL (10〜50 ygim
Dでマウ スマク 口ファー ジ様細 胞である RAW 264.7を 刺激し、MIF mRNA発 現 量 と 培 養 上 清 中 M
IF濃 度を 測 定 した 。 さ ら にRAW 264.
7に お ける 酸 化
LD
Lの取り 込み、分 解能に 対するMIFの役割についても検討した。また解糖系の強カな活性化因子であるFructose‑2，6‑bisphosphate
くF2，6BP)に関して、ラットL6筋管細胞のMIF
刺 激 時 に お け る F2， 6BP量 と 乳 酸 産 生 量 を 測 定 し 、 F2， 6BPの 合 成 を 触 媒 す る
6‑phosphofructo‑2‑kinase(PFK‑2)遺伝子の発現も同時に検討した。さらに、L6筋管細胞を TNF‑aで 刺激 し 培 養上 清 中MIF濃度を 測定し た。また TNF‑aに よる解糖 系亢進 作用に対する抗MIF抗体の影響を検討した。
酸 化 LDLは RAW 264.7の MIF mRNAの 発 現 量 を濃 度 依 存性 に 増 加さ せ た 。ま た 酸 化
LDLに よ る MI
F mR
NAの 発現 は 時間依存 性に増 加し、12時 間で最 高に達し 、その 後発現量は 減少し た。MI
Fの培養 上清中への分泌は酸化LD
Lの濃度依存性に増加し、nativeLDLは 培 養上 清 中 MI
F濃 度 に影 響 を与えな かった 。さらに 、MIFはRAW 264.7に おける 酸化LDLの取込み、分解を増加させた。
糖代謝との関連では、MI
FはL6筋管細胞におけるF2，6BP量を濃度依存性に増加させた。
またMIFは PF
K‑2遺伝 子 の 発現 を 増 加さ せ た 。さ ら に M
IFは L6筋 管 細 胞に お け る乳 酸産生 の増加 作用を有 するこ とが確認 された 。またL6筋 管細胞をTNF‑aで刺激すると培養
上 清 中MIF濃 度が 増 加 した 。 同 時に 細 胞 内の MIF
量 は 減 少し 、 細 胞 内の MIF
プールがTNF‑aの 作 用で 細 胞 外に 分 泌さ れること が示唆 された。 またTN
F‑aはL6筋管 細胞の M
IF― 55 ‑mRNAの発 現 を 時間 依 存 性に 増 加 させ た 。 TNF‑aの 解 糖系 亢進作用 は抗MIF抗体に よって抑制された。
動脈硬化の初期病変においてマク口ファージは極めて重要な役割をしている。M
IFはRAW 264.7に お け る酸 化 LDLの取込 みを増加 させるこ とが明 らかにな った。 酸化LDLはMIFのオ ートクラ イン、 パラクライン作用を通して酸化LD
L自身の取込みを刺激している可 能性がある。そしてMIFは泡沫細胞の形成を助長し、白色線条の形成、不安定プラークの形成、アテローム硬化の進展に寄与すると考えられる。また骨格筋における解糖系活性化 の機序にMIFが関与することも示唆された。骨格筋は生体内における糖代謝に極めて重要 な役割 を果たす 。MI
FやTNF‑aによる解糖系活性化機序とインスリン作用の関連を解明することが、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病などの成人病の新たな治療法の開発にっながる可能性があることが示唆された。
質 疑 応答 に お いて は 副 査石橋教 授から 、生理的 酸化LDLでの検 討、TNF‑aやMIFの刺激で好気的解糖ではなく嫌気的解糖が促進する理由についての質問があった。次いで副査
浅 香教授から、動脈硬化症におけるMIFの役割に対する炎症反応の関連、動脈硬化症におけ る炎症のメカニズム、MIFの解糖系亢進作用と糖尿病との関連、糖尿病患者において血中MIFが 高い理由 につい ての質問があった。次いで主査小池教授から、RAW264.
7以外の細胞における検討、マク口フ．アージの泡沫化の測定、炎症反応と動脈硬化症に関して慢性
関 節リウ マチなど の炎症 性疾患における動脈硬化との関連、TN
F‑aやMIFの動脈硬化における生理的機能と病因としての役割についての質問があった。最後に副査浅香教授から、TNF‑a抗体 の治療へ の応用 、MIFノックアウトマウスでの検討に関する質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は概ね適切に回答した。
本論分における検討から、今後糖尿病や動脈硬化症におけるMIFの役割を明らかにし、臨床医学への応用が期待される。審査員一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に充 分 な資 格 を有 す るも の と判 定 した 。

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