博士（医学）赤倉伸亮

学位論文題名膵癌におけるHypoxia‑in
ducib
lefa
ctor‑ln(HIF‑1n）
蛋白恒常的発現の意義
学位論文内容の要旨【緒言】
膵癌（その90％はductal adenocarcinoma)は代表的難治癌のーつであり，現在この癌に対する 有効 な治 療は ない ．こ のような難治癌に対する新しい治療アプ口ーチを確立するために は ． 膵 癌の 病 因 ／ 病 態 に 対 す る よ り 詳細 な 分 子 生 物 学 的 理 解 が 必要 で あ る ．
腫瘍細胞が低酸素にさらされると，hypoxiaーinduci
blefactor―la(HIF―la）およびHIF−1ロsubunitで構成される転写因子HIF・1が活性化されることによって，糖輸送蛋白，解糖系酵素，血管拡張因子などの遺伝子の転写が促進され，HIF―laは固形腫瘍の生体内増殖において重要 な 役 割 を 果 た し て いる と 考 えら れて いる ．膵癌 特に ductal adenocarclnomaにお いては，hypova
sculatureであることが顕著な特徴とされている．それゆえに膵癌細胞は，他の血管新生が豊富な固形腫瘍と比較した時，絶えず厳しい低酸素や低栄養にさらされている．膵癌
においてはHIF−la蛋白の発現．および血管新生関連遺伝子以外のHIFー1によって誘導される 遺 伝 子 の 発 現 が 他 の固 形 腫 瘍 細 胞 と 異 な っ て 調 節 さ れ てい る可 能性 が予想 され る，本研究では最初に膵癌細胞株，他の固形腫瘍細胞株における正常酸素分圧下，低酸素分圧下で のHIF・ la mRNA， 蛋白 発現を検討した，っぎに低酸素および低栄養などストレス下での膵癌細胞株の増殖とアポトーシスを検討した．次にin vitro，mvivoでの膵癌細胞株の増殖，アポトーシスに対するHIFー1ば遺伝子導入の影響を検討した．
【方法と結果】
1.HIF― la mRNA． お よび 蛋 白 の発 現： HIF― lamRNAは すべ ての 膵癌 細胞 株およ び他 の固形癌細胞株において正常酸素分圧下で発現していた．HIFーla蛋白は卵巣癌，肺癌，肝癌，および結腸癌細胞株は低酸素条件でのみ発現していたが，膵癌細胞株では20株中15株(75 u/o)が正常 酸素 分圧 下で あっ ても 高い レベ ルの HIF一 la蛋 白を 発現していた．次にHIF−1ば蛋白の安定性を検討するために，cycloheximi
deを加えた条件下で，低酸素から正常酸素分圧へ培養条 件を 変え た後 のHIF‑1a蛋白 発現 を検 討した ．正 常酸 素分圧下でHIF―la蛋白を発現す
る 細 胞 で は HIF― la蛋 白 発 現 が 60分 以 上 持 続 し た が， 正 常 酸素 分圧 下で HIFー la蛋 白を発現しない細胞株では20分以下で消失した．
2．膵癌細胞のapoptosrs抵抗性：膵癌細胞株の低酸素および／または低glucose
下での増殖および生存をtrypan blue dye exclu
siontest
にて検討した．正常酸素分圧下でHIF−la蛋白を発現す る細 胞は ，HIF・ld蛋白 を発 現し ない 膵癌 細胞 とは 異なり低酸素下でも増殖した．低glucoseで72時間培 養し たと ころPCI一10はapoptosisを起したが，PCI−35およびPCI‑43の細胞はapoptosisに抵抗性を示した．FACS解析でも同様に，PCI一10細胞はapoptosisを起したがPCI―35とPCI・43細胞はapoptosisに抵抗性を示した．これらの結果により，低glucoseは低酸素に対しよりcytotoxicであることを示した．
3．低酸素，低glucose下でのHIF−1ば蛋白，Glutlおよびaldo
lase
AmRNAの発現：HIF−la蛋白
はっ PCI‑IO細 胞に おいて は低酸素と低glucose曝露後4時間で出現し，12時間後には減少した．PCI−35細胞では，低酸素と低glucose曝露前からすでにHIF―la蛋白を発現しており、24時間後まで蛋白レベルは増加し続けた， PCI―35
はPC
I・10に比較してGl
utl,およびaldola
seA
mRNAをより高いレベルで発現した，低酸素および低glucose曝露後，Glutlおよびaldola
seAのmRNAの発現はPCI−35においては次第に増加した．
4.HIF―la導入 株の apoptosls抵抗 性： HIF−Ia導入株 はHIF−la蛋白を強発現した．PCI―lO／H2およびPCI・lO／H3細胞は低酸素および低glucose下で増殖したが，PCI・lO／V2細胞は低酸素および低glucose下でapoptosisを起こした，
5．HlF− la導 入株 のGlutlお よび aIdoIaseAmRNAの発 現： vector導 入株 では 低酸素 および低glucose曝露後4時間後にHIF−la蛋白が出現したが，川F−la導入株では曝露前からHIF−la蛋白をすでに発現していた．GIutlおよびaldolasemRNAの発現は，PCI一lO／H2細胞では低酸素および低glucose曝露後に，漸増した．
6．HI
F−la導入株のmレfレ〇での増殖：，PCIーlO／H2細胞ではヌードマウスに川F−1a導入株を皮下 移植 する と腫 瘍を認 めたが，PCI一lO／V2およびPCI一10では腫瘍形成が少なかった．
【考案】
膵癌以外の癌細胞株は低酸素下でのみHIFー1a蛋白を発現したが，20株中15株（75ワ。）の膵癌 細胞 株が 正常 酸素分 圧下でもHIF−la蛋自を発現していた．HlF−la蛋白は正常酸素分圧下でubiquitin／proteasomeシステムを介して分解され，正常酸素分圧下の細胞では検出されな いと 報告 され ており ，正 常酸 素分 圧下 でも HIF― la蛋白を発現している膵癌細胞株においては分解機構の異常が存在する可能性がある．ubiquitin／proteas
omeシステムの膵癌細胞株での欠陥を明らかにするためにはHIF−1a遺伝子，p53癌抑制遺伝子，heats
hockprotein90（HSP―90），vonHippelLindau（VHL）癌抑制遺伝子および阿EN遺伝予など正常酸素分圧で の HIF− la蛋 白 分 解 に 関 係 す る す べ て の 遺 伝 子 を 検 索 す る 必 要 が あ る ．
膵 癌は hypovascularで あることが多く，膵癌細胞は血管新生が豊富な他の固形癌細胞と比較すると，厳しい低酸素および低栄養にさらされると思われる．本研究にて低glucose（血漿の約1／logIucose濃度）はcytotoxicであるが，低酸素（動脈血の1／lO以下の酸素分圧）はcytostaticであり，HIF−laの恒常的発現が膵癌細胞の低酸素および低glucoseでの増殖および生存を増強することを示した．HIF―la蛋白を恒常的に発現している膵癌細胞株においては，HIF−la蛋白を発現していない膵癌細胞株に比較して，低酸素に曝露された際のHIF―ld蛋白発現が高く，その下流において転写活性化されるglucos
etra
nspor
ter遺伝子や解糖系酵素aIdoIaseA遺伝子の発現も高かった．っまりこれらの結果は，H
IF−la蛋白を恒常的に発現して いる 膵癌 細胞 株にお いては低酸素に適応するための道具である嫌気性代謝関連遺伝子を前 もっ て準 備状 態にす ることで低酸素に素早く対処できるが，恒常的に発現していない細胞 株に おい ては 嫌気性 代謝関連遺伝子の転写が遅れるためにアポトーシスしてしまうことを示唆している．低glucoseが低酸素に比較してよりcytotoxicであったという結果は，嫌気性代謝の癌増殖における重要性を示すと共に，膵癌細胞がHIF−la蛋白の恒常的発現を介して 解糖 系酵 素を 前もっ て準備することによって低酸素に適応しているとする本研究の結論を支持するものと思われる，さらにHIF−la蛋白の恒常的発現は膵癌細胞のin vitro
増殖と 同様 m vivo増 殖にお いて も有 利で あっ た． おそらくIn vivoにおいて膵癌細胞は低酸素や 低 glucoseに さ ら さ れ て も HIF一 la蛋白 の 恒 常 的に 発現 して いる 細胞 が， 低酸 素や 低glucoseに よ っ て 誘 導 さ れ る apoptoslsに よ り 抵 抗 性 で あ る と 思 わ れ る ．
以上，HIF−Ia蛋白恒常的発現が膵癌細胞のapoptosis抵抗性など悪性度を現す因子と重要な関わりを有しており，HlF−laの機能を消失させることが膵癌患者の治療に有効である可能性を示唆する結果を得た．
【結語】
HIF・la蛋白を恒常的に発現している膵癌細胞株は20株中15株（75ワ。）に認められ，低酸素および低栄養によって誘導される増殖抑制やapoptoSlsに対して抵抗性を獲得していた．
多 くの 膵癌 細胞 はHIF・la蛋白 を恒 常的 に発 現することによって嫌気性代謝機構をあらかじめ用意することが可能となり，急性の低酸素および低栄養に適応できる事が示唆された．

学位論文審 査の要旨
主査 教授 浅香正博
副査 教授 加藤紘之
副査 教授 細川眞澄男

学位論文題名膵癌におけるHypoxi
a．i
nduciblefac
tor―la（HIF・la）
蛋白恒常的発現の意義
膵癌特にducta．ladenoCarcinomaにおいては、hypovasculatureであることが顕著な特徴とされている 。それゆ えに膵癌 細胞は、他の血管新生が豊富な固形腫瘍と比較した時、絶えず厳しい低酸 素や低栄 養にさら されてい る。膵癌に おいては HIF―la蛋白の発現、および血管新生関連遺 伝子以外 のHIF−1によ って誘導される遺伝子の発現が他の固形腫瘍細胞と異なって調節され ている可 能性が予 想される。申請者は膵癌細胞株、他の固形腫瘍細胞株における正常 酸素 分 圧 下、 低 酸素 分 圧 下で の HIF一 1amRNA、蛋 白 発現 を 検 討し た 。 次に 低 酸素 お よび低栄養 などスト レス下で の膵癌細 胞株の増殖 とアポト ーシスを 検討した 。更にmvf舳 、mvfvDでの膵癌 細胞株の 増殖、ア ポトーシ スに対する 川F−ld遺伝子導入の影響を検討した。
HIF―lamRNAは すべ て の膵 癌 細 胞株 お よび 他 の 固形 癌 細胞 株 に おい て 正 常酸 素 分圧 下 で発現して いた。HIF― la蛋白は卵 巣癌、肺 癌、肝癌お よび結腸 癌細胞株は低酸素条件でのみ発現していたが、膵癌細胞株では20株中15株（75ワ。）が正常酸素分圧下であっても高いレベ
ルの川F− la蛋白を発 現してい た。次に HlF―la蛋白の安 定性を検 討するた めに低酸 素から正常酸素 分圧ヘ培 養条件を 変えた後のHI
F−la蛋白発現を検討した。正常酸素分圧下でHIF・1a蛋 白 を 発現 す る細 胞 で はHIF― la蛋 白 発現 が 60分 ま で持 続 し たが 、 正 常酸 素 分圧 下 でHIF・ld蛋白を 発現しな い細胞株 では20分以 内に消失し た。膵癌細胞株の低酸素および／または低glucoseFで の増殖お よび生存 をtづpanbluedyeexclusiontestとFACS解 析にて検討 した。正常 酸素分圧 下でHIF―1d蛋 白を発現 する細胞は 、HIF・la蛋白 を発現し ない膵癌 細胞とは異な り低酸素 下でも増 殖した。 低glucoseで72時間培 養したところHIFー1ば蛋白を恒常的に発現 しない膵 癌細胞株 はapoptosisを起したが、HIF−ld蛋白を恒常的に発現する細胞株
はapoptosisに抵抗性を示した。H
IF−ld蛋白を恒常的に発現する細胞株は低酸素と低glucose
曝露前か らすでに HIF―ld蛋白を 発現して おり、24時間 後まで蛋白レベルは増加し続けた。

ま た HIF― la蛋 白 を 恒 常 的 に 発 現 す る 細 胞 株 は 発 現 し な い 細 胞 株 に 比 較 し て Glucose
transporterのG
lutl、および解糖系酵素のaldolaseAmRNAをより高いレベルで発現した。HIF−la導 入 株 は HIF― la蛋 白を 強 発現 し た 。HIF− la導 入 株は 低 酸 素お よ び低 glucose下 で増殖 したが、 vector導入株で は低酸素 および低 glucose下でapoptosisを起こした。Glutlおよび aldolaseAmRNAの 発現 はHIFーld導入株 で低酸素 および低 glucose曝露後に 、漸増し た。
ヌ ードマウ スにHIF‑1d導入 株を皮下 移植する と腫瘍を 認めたが、 vector導入株では腫瘍形成 が少なか った。膵 癌はhypova
scularであることが多く、膵癌細胞は血管新生が豊富な他の固 形癌細胞 と比較す ると、厳 しい低酸 素および 低栄養にさらされると思われる。HIF‑1ば蛋
白 を恒常的 に発現す る細胞株 は発現し ない細胞 株に比較し てGlutl、およ びaldol
aseAmRNAを より高い レベルで 発現した事は、嫌気性代謝の癌増殖における重要性を示すと共に、膵癌
細 胞 が HIF・ ld蛋 白 の 恒 常的 発 現 を介 し て その 下 流に お い て転 写 活性 化 さ れる glucose
transporter遺伝子や解糖系酵素を前もって準備することにより低酸素に適応していると考えられた。
公 開発表に 際し、副 査の加藤 教授より 、膵癌が hypovas
culatureである事の妥当性にっき申 請者の意 見が求め られた。申請者は血管造影検査や造影CT等では膵癌は造影されにくく、血 流が乏し いという 見解を述べた。また固形癌一般では血管形成がもろく、不十分なため低酸 素である という報 告を示した。次いでに副査である細川教授、主査の浅香教授もこの件に触 れ論議さ れたが、 膵癌がhypovasculatureで あるかどうかの結論には至らなかった。また
加 藤教授は 、各cell lineの糖 鎖抗原や 解糖系の modify等、おのおの特有の性質の違いによる HIF‑口への影 響を指摘 した。さ らに本研 究の臨床 応用に関し て申請者 の意見が求められた 。申請者 はHIF‑1aの活性 を低下さ せること より腫瘍 造成を抑制 し、癌の 治療に有効である 可能性を 述べた。 続いて細 川教授よ りHIF−laが分解されない理由を求められた。申請者
は、Ubi
qiti
n/proteasome系によるdegradationの異常によりHIF―laの分解が出来ないことによ る と 思わ れ 、 これ ら はp53、 VHL、PTENな ど によ り制御さ れている と報告さ れているので これらの 異常の可 能性があることを示唆した。続いて会場の守内哲也教授から、ここでは示 し て い な い HIF− laの 研 究 に つ い て の 説 明 を 求 め ら れ た 。 申 請 者 は 低 酸 素 に よ る
DNAmicroarayを 用いたHIF− laの下流遺 伝子の検 討、癌の 薬剤耐性 とHIF―laの関係について 研 究 を行 っ た と解 答 した 。 最 後に 浅 香教 授 よ り膵癌の VEGFの発現と 血管が乏し い理由に ついての 質問があ った。申 請者は、 VEGFは発現し ているが何 らかの血 管新生抑制因子が働 いている 可能性を 説明した 。また浅 香教授は 解糖系酵素aldo
rase
Aが膵癌では高率に発現し ているこ とを挙げ 、膵癌で の重要性 とそのHIF― laの関係が興味深いことを示唆した。更に HIF― 1aを 用 い た 治 療 に つ い て 将 来 的 な 展 望 を 申 請 者に 求 めた 。 申 請者 は HIF‑1aのdominant negativeを現在検 討しており 、将来は 遺伝子治 療への応 用の可能 性を述べ た。

本研究 は、HIF―la蛋 白を恒常 的に発現している膵癌細胞株が75%に認められ、HIF―laの発現に より低酸 素および 低栄養で 誘導される増殖抑制やapoptosisに対して膵癌細胞が抵抗性を獲 得するこ とを発見 した点で 高く評価され、今後HIF−laの機能を消失させることにより膵癌 患者の治 療効果の 向上が期 待される 。
審査員 一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や所得単位なども併せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と判 定 し た。