グルタミン酸による膵臓ラ氏島内のインスリン分泌制御機構
Studies on the molecular mechanism of the regulation for insulin secretion by
glutamatergic signal transmission among islet cells.
研究代表者

岡山大学大学院・医歯学総合研究科助手

山田浩司

Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine and Dentistry, Okayama University
和文 アブストラクト
β株化細胞である MIN6 細胞に、AMPA 型グルタミン酸受容体のイソフォームであるGluR2 が発現しており、AMPA 刺激により細胞内にエンドサイトーシスされることを見いだした。このエンドサイトーシスは、細胞外グルコースが低濃度の場合に顕著に起こり、AMPA 型グルタミン酸受容体のアンタゴニストである GYKI52466 により阻害された。さらに、細胞外の Na イオン、Ca イオンを除くことにより阻害された。従って、GluR2 のエンドサイトーシスは、グルタミン酸の受容体への結合と細胞膜の脱分極が必要であることが示唆された。さらに、蛍光ラベルした GluR2 (GFP-GluR2)を MIN6 細胞に強制発現させ、AMPA 刺激で、GluR2 のエンドサイトーシスを反映していると考えられる蛍光スポットの移動が観察できた。現在、GluR2 のエンドサイトーシスの調節機構の詳細を解析中である。
Abstract
In islets of langerhans, beta cell express AMPA receptors.
AMPA receptor is hardly clarified.

However, the physiological functions ofIn this study, we demonstrated that MIN6 cells, pancreatic beta

cell line, expressed GluR2, an isoform of AMPA receptor. And the receptors were endocytosed bystimulation of the cells with AMPA or glutamate.
+The AMPA-induced endocytosis was strongly

2+

inhibited by GYKI52466, depletion of Na or Ca and hypertonic treatment. KCl also stimulatedendocytosis of AMPA receptors, but it did not potentiate the endocytosis by AMPA. These results
indicate that AMPA receptors are internalized by ligand binding and receptor activation. Now
detection of GluR2 movement in living MIN6 cells are in process. Thus, MIN6 cells provide agood mode system to determine AMPA receptor trafficking in the cells.
研究目的の AMPA 型グルタミン酸受容体を介して膵臓ランゲルハンス氏島（ラ氏島）は、情報伝達する可能性を見いだした。本研究

血糖を調節するホルモンを分泌する内分泌では、β細胞における AMPA 型受容体を器官である。ラ氏島β細胞からは、血糖を介するグルタミン酸刺激の受容機構の詳細下降させるインスリンが、α細胞からは血を調べることを目的とした。

糖を上昇させるグルカゴンが分泌されている。我々は、α細胞が、グルカゴンを分泌研究経過する以外にグルタミン酸も分泌し、β細胞

我々は、ラ氏島内のα細胞に、グルタミ-1-ン酸が濃縮されており、分泌されることを受容体のイソフォームをその特異的抗体を見いだした。また、インスリンを分泌する用いたウエスタンブロッティング法及び免β細胞には、グルタミン酸受容体の存在が疫染色法を用い調べた結果、GluR2 の発示唆されていたが、グルタミン酸神経由来現を確認した（図 1A）。GluR2 と 3 は、のグルタミン酸により刺激をうけるものとＣ末は同じ配列をもっており、抗体の反応考えられていた。我々は、α細胞から分泌性からは、GluR3 の発現は確定できなかされたグルタミン酸が、隣接するβ細胞にった。

作用することを見いだした。従って、α細GluR2 が、機能的に発現していること

胞とβ細胞間にはグルタミン酸情報伝達機をグルタミン酸及び AMPA 刺激による細構が存在する。この細胞間情報伝達機構の胞内カルシウム濃度上昇から確認した。続うち、α細胞からのグルタミン酸の分泌機いて、上記細胞における GluR2 の局在を構については、断片的であるがその詳細が調べた。GluR2 は、細胞膜のみならず細明らかになってきている。しかしながら、胞質にもドット状に局在していた（図 1B）。

グルタミン酸情報を受容機構の詳細は、全細胞質における GluR2 は、細胞内に取りく不明であった。

込まれたものと考えられる。

ごく最近、神経において AMPA 受容体は、MIN6 細胞における GluR2 のエンドサイカチオンチャンネルであるのみならず、エトーシス

ンドサイトーシスにより、細胞内に取り込神経細胞では、GluR2 を含む AMPA 型受まれることが報告された。その結果として容体は AMPA、グルタミン酸、インスリングルタミン酸信号の伝達が抑制されること刺激により細胞内にエンドサイトーシスさが明らかになった。膵臓にグルタミン酸受れる。そこで、MIN6 細胞の GluR2 のエン容体のアゴニストである AMPA を還流する

ドサイトーシスを２種類の方法を用いて検と、インスリン分泌が促進される。このイ討した。まず、細胞膜蛋白質の細胞外に露ンスリン分泌に対する増強作用は、グルタ出している部分を NHS-SS-biotin を用いてミン酸刺激後速やかに減衰するため、神経無作為に標識した後、AMPA を加え刺激すと同様な調節機構が存在している可能性がる。その後、細胞膜に残った蛋白質に結合ある。

した NHS-SS-biotin を還元型グルタチオン

本研究では、β細胞における AMPA 型受を加えることにより biotin 部分を除き、エ容体の詳細とそのエンドサイトーシスの可ンドサイトーシスされた NHS-SS-biotin 結能性を調べ、それに関わる蛋白群を同定及合型膜蛋白質をビオチン・アビジンの結合びその機能を確定することにより、AMPAを利用してアビジンビーズで沈降する。ビ型受容体を介するインスリンの分泌調節機ーズと共に沈降した GluR2 をウエスタンブ構の解明を目的とした。

ロッティング法により検出した。この方法

研究成果においても AMPA 刺激による GluR2 のエMIN6 細胞における GluR2 の機能的発現ンドサイトーシスが検出できた (図 2)。まMIN6 細胞に発現しているグルタミン酸

た、GluR2 は、その N 末端部分が細胞外に-2-大きく露出しており、その細胞外部分を特今後の課題と発展異的に認識する抗体を培養した MIN6 細胞

膵臓ラ氏島β細胞の AMPA 型受容体は、グに加え細胞膜上の GluR2 を標識した後、ルタミン酸刺激によりエンドサイトーシスさAMPA を加え刺激した。その後、酸性緩衝れることを実証した。AMPA 刺激による液にて細胞表面に残った抗体を除き、細胞GluR2 のエンドサイトーシスは、観察した時内に GluR2 とともに取り込まれた抗体を免

間経過においては、ほぼ神経細胞のそれと同疫染色法にて検出した。とりこまれた GluR2様であった。神経細胞の GluR2 は、その C 末は 、 ２次 抗 体 に ラベ ル さ れ た 蛍光 色 素に PDZ ドメインを持つ蛋白質（GRIP、PICK1、(Rhodamin) により、赤く観察される。実ABP）及び NSF、AP2 が結合し、そのエンド際にそれらの刺激によりエンドサイトーシサイトーシスを調節している可能性が示唆さスが起こることが確認できた。この AMPAれている。MIN6 細胞のGluR2のC末から100刺激による GluR2 のエンドサイトーシスは、残基をシークエンスしたところ、神経系のそその非競合的アンタゴニストであるれと 100％一致した。

GYKI52466 によって、ほぼ完全に阻害され現在、MIN6 細胞における GluR2 の C 末た (図 2)。従って、β細胞には GluR2 を含に結合する蛋白質を解析中である。さらに、

む AMPA 型受容体が機能的に発現しており、これらの蛋白質の細胞外のグルコース濃度のリガンド依存性にエンドサイトーシスされ変化によりその局在が変化するのかも興味深ることが判明した。

い課題である。米国エール大学 DeCamilli

細胞外に多量のカリウムイオン（30mM 以教授よりエンドサイトーシス関連タンパクの上）を加えると人工的に細胞膜の脱分極を誘ノックアウトマウスの供与を受け、そのマウ発することができる。NHS-SS-biotin で標識スの膵臓の機能を解析する予定である。我々した MIN6 細胞に脱分極刺激を与え、エンドの研究結果並びに、これから得られるであろサイトーシスされた GluR2 を同様に定量した。 う知見は、膵臓のインスリン分泌制御機構の脱分極刺激のみで、GluR2 のエンドサイトー研究のみならず、神経系の AMPA 型受容体シスが起こった。以上より、脱分極刺激のみのエンドサイトーシスの調節機構に関して重でも、GluR2 のエンドサイトーシスが起こる要な知見を与えるものと考えられる。

ことが判明した。

なお、本研究は、岡山大学大学院自然科学

GFP と GluR2 の融合蛋白質を発現する遺伝子を作製し、MIN6 細胞に強制発現させ研究科森山進めた。

た(図 3)。GFP-GluR2 に由来する蛍光は、細胞質及び細胞膜に認められた。この細胞を、発表論文リスト

AMPA で刺激すると、細胞膜から細胞質に移なし。

動する蛍光スポットが観察された。今後、この蛍光スポットの移動がエンドサイトーシスに依るものかどうかを含め、その詳細な解析を進める予定である。
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芳則教授との共同研究として

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