第 22 回環境化学討論会，回環境化学討論会，馬場健史，ポスター
ポスター発表（東京東京；2013 年）

2PE-0707
エストラジオールのオンライン LC--GC 誘導体化分析法の開発○馬場健史
馬場健史 1，山下俊幸
山下俊幸 1，奥野将司 1，内田滋
内田滋 2，佐々野僚一 2，福崎英一郎 1（1 大阪大学
大阪大学，2（株）アイスティサイエンス）（株）アイスティサイエンス【はじめに】
環境試料中における環境試料中におけるエストラジオール
エストラジオールの分析の分析は、夾雑物の除去、は、夾雑物の除去、は、夾雑物の除去、誘導体化が必要になるなど前処理誘導体化が必要になるなど前処理に手間がかかり、に手間がかかり、分析分析作業が煩雑になっ作業が煩雑になっている。演者らは、夾雑物の除去と誘導体化を自動で行うオている。演者らは、夾雑物の除去と誘導体化を自動で行うオンライン LC
LC-GC 誘導体化法の開発を行い、エストラジオールの自動エストラジオールの自動誘導体化分析が可能になったので、分析が可能になったので、その知見と共に報告する。
【方法】
装置

HPLC: Agilent 1100
1100、LC--GC インターフェース
インターフェース: LGI-S110、、大量注入口装置
大量注入口装置: LVI-S200
S200、GC/MS: Agilent 6890
6890N / 5975C
オンライン LC-GC 誘導体化法 逆相系 HPLC で目的物質が溶出される付近（予め標準溶液で目的物質のリテンションタイムを調べておく）を分取しながらその分取液に水を加えて希釈し、そのまま固相カートリッジカートリッジ(C18-1010 mg)へ通水させ、目的物質を吸着へ通水させ、目的物質を吸着 保持）させた(図１))。その後、固相をへ通水させ、目的物質を吸着（保持）させ固相を窒素ガスで乾燥させた後、溶出ガスで乾燥させた後、溶出させなさせながら、スパイラルインサートを備えたスパイラルインサートを備えた GC へ溶出液を溶出液を直接注入直接注入し(図2)、大量注入法を用いて測定
大量注入法を用いて測定大量注入法を用いて測定を行ったを行った。固相からの固相からの溶出は溶出は 5%MSTFA 含有アセトン-ヘキサン含有アセトン ヘキサン(1/3)混合溶液 60 LL で行った。
。インサート中での濃縮およびインサート中での濃縮および誘導体化時間は誘導体化時間は 36 秒、、その温度は 70℃で行った。
℃で行った。
ポンプ

分取用バルブ

HPLC カラム
検出器
UV

ポンプ
（希釈水）

バルブ

ガス

固相カートリッジバルブ

固相カートリッジ

廃液受け

シリンジポンプ（溶出液）

シリンジポンプ
ガス （溶出液）

スパイラル
インサート

スパイラル
インサート
オートサンプラー

HPLC

GC/MS

図 1. HPLC
HPLC-(SPE)-GC/MS
GC/MS システム

エストラジオール
MW: 272

テストステロン
MW: 288

図 2. 溶出と誘導体化注入工程

MSTFA
誘導体化試薬エストラジオールエストラジオール-TMS

図 3. トリメチルシリル
トリメチルシリル誘導体化
誘導体化

テストステロン
テストステロン-TMS

MW: 416

MW: 360

Development of the on
on-line LC-GC
GC automatic deri
derivatization
atization method of estradiol○TakeshiTakeshi BAMBA1, Toshiyuki YAMASHITA1, Masashi Okuno1, Shigeru UCHIDA2, Ryoichi SASANO2, Eiichiro
iichiro FUKUSAKI1
1Osaka University
University, 2-1 Yamada--oka,oka, Suita, Osaka 565-0871,
565 0871, Japan

2

AiSTI SCIENCE co.,co. 120-66 Kuroda, Wakayama 640-8341,
640 8341, Japan

第 22 回環境化学討論会，馬場健史，ポスター発表（東京；2013 年）【結果と考察】１．誘導体化について手作業で誘導体化した 17β-エストラジオー
ル-TMS を GC/MS で測定したものをスタンダードとして、オンライン LC-GC/MS で誘導体

VW D 1 A, W ave len gth= 2 10 nm , TT (2 5 -E T -0 1 .D )N orm .
5040

17β-Estradiol
3020Testosterone

化分析法により得られた回収率は 80%（n=5）。

10であった。また、非誘導体化の 17β-エストラ

00ジオールは検出されなかった。再現性は相対標準偏差（RSD; n=5）が 2%以内と良好な結果が[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ]

8.0E+04を要するが本法は 36 秒と大幅に時間を短縮で6.0E+04きた。誘導体化が効率良く行われた理由として、

4.0E+04

誘導体化試薬 MSTFA を添加したアセトン-ヘ2.0E+04

注入した後、インサート中での濃縮工程において溶媒分子が少なくなることで、エストラジオ

46810m inTIC : 103847 - 01.0E+05得られた。従来の誘導体化は 30 分以上の時間

キサン混合溶液で溶出させながら直接 GC へ2

図 4. HPLC-UV クロマトグラムと分取部分

17β-Estradiol-TMS

0.0E+00
R.T--> 16:00

Testosterone-TMS

16:20

16:40

17:00

17:20

図 5. HPLC-GC/MS トータルイオンクロマトグラム

ール分子と誘導体化試薬分子の衝突率が高まり、さらに注入口の熱が加わることで反応が促進されたことによると考えられた。さらに実用性を考慮し、エストラジオールの近くに溶出するテストステロンを添加した混合標準液を本法により測定した結果、両化合物の分離および検出が可能であった。
２．感度について本法では HPLC に注入した目的物質を固相に保持させて、その全量を GC/MS へ導入しているため、HPLC の注入量を増加させることで容易に感度を向上することができた。
３．環境水への応用について
本法を用いて水試料中のエストラジオール分析への応用を試みた。
前処理の簡易化：
本法により装置の感度を大幅に向上できたことから、試料水の量を従来の 1 L から 100 mL に減らすことができた。そして、前処理の固相の充填量も少量化することができた。また、誘導体化は水分があると不安定になることが多く、通常、濃縮乾固するか、固相を十分に吸引乾燥させて水分を完全に除去する必要がある。本法では最終検液を HPLC に注入するため、最終検液に水分が含まれた状態でも分析可能であることから、乾燥作業工程を省くことができた。これらにより、本法では前処理時間を大幅に短縮することができた。

試料水 100 mL
固相 Smart-SPE HLBi5-10 mg （保持）＊SDB 系コンビネーションカラム

洗浄 水 2 mL
溶出 アセトニトリル/水(1/1) 0.8 mL
定容 1 mL（水で調製）
HPLC-GC/MS システム（100 L 注入）

図 6. 水中エストラジオール分析法

精製水における添加回収試験：
精製水を用いて試料中濃度 1 ng/L での添加回収試験を行った（n=5）。検量線は HPLC-GC/MS で作成した。その結果、17β-エストラジオールの回収率は 101%、再現性は RSD が 5.1%と良好な回収率と再現性を得ることができた。
【まとめ】
オンライン LC-GC 誘導体化分析法により、再現性の良いエストラジオールの自動誘導体化分析が可能となった。また、本法は前処理の簡易化および迅速化、さらには高感度分析が実現できた。
今後、夾雑物の多い試料中の誘導体化を行う分析への応用が期待できる。

2PE-07

エストラジオールのオンラインLC-GC誘導体化分析法の開発○馬場健史1，山下俊幸1，奥野将司1，内田滋2，佐々野僚⼀2，福崎英⼀郎1（1大阪大学大学院工学研究科，2（株）アイスティサイエンス）

1 目的

3 結果と考察

環境試料中におけるエストラジオールの分析は、夾雑物の除去、誘導体化が必要になるなど前処理に⼿間がかかり、分析作業が煩雑になっている。
演者らは、夾雑物の除去と誘導体化を⾃動で⾏うオンラインLC-GC誘導体化法の開発を⾏い、17β-エストラジオールの⾃動誘導体化分析が可能になったので、その知⾒と共に報告する（図1）。

3.1

誘導体化についてオンラインLC-GC/MS誘導体化分析法による17β-エストラジオールのTMS誘導体化率は81%（n=5）であった。また、非TMS誘導体化の17β-エストラジオールは検出されなかった。再現性は相対標準偏差（RSD, n=5）が2%以内と良好な結果が得られた（表2）。
LCにおいて17β-エストラジオールの近くに溶出するテストステロンを添加した混合標準液を測定した結果、両化合物の分離および検出が可能であった（図4, 図5）。
表2 17β-エストラジオールのTMS誘導体化試験結果

GC/MS (pg)

LC-GC/MS(pg)ST-1 ST-212

17β-Estradiol-TMS

1000

500803 815 793 800 817 806

345Ave.

RSD(%)
1.26REC(%)
80.6

Testosterone-TMS

1000500815 827 820 816 821 820

0.58

82.0

[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ] TIC : 103847 - 0分取

Norm.

1.0E+0550

17β-Estradiol

17β-Estradiol-TMS

8.0E+04

Intensity

Intensity

4030

Testosterone

20

Testosterone-TMS

6.0E+04

4.0E+0410

2.0E+04

図1 オンラインHPLC-GC/MSシステム

002

468

10

0.0E+00
R.T--> 16:00

min

Retention Time (min)

図4 HPLC-UV(210 nm) クロマトグラム

2 方法

逆 相 系 HPLC で 目 的 物 質 を 固 相 カ ー ト リ ッ ジ に 分 取 し た 後 、5%MSTFA含有アセトン/ヘキサン(1/3)混合溶液60μLでGCインサー
トへ溶出しながら注⼊した（図2）。
HPLCカラム廃液ポンプ(希釈水)

ニードル

廃液

窒素ガスボンベ② 固相の乾燥

溶出液

固相カートリ ッジ

イ ンジ ェクター

シリンジポンプ

廃液⼝

イ ンジ ェクター

検出器
UV

固相カートリ ッジ

イ ンジ ェクター

廃液⼝① LC分取＆固相に保持

3.2

HPLCカラム
検出器
UV

固相カートリ ッジ

検出器
UV

17:00

17:20

感度について本法ではHPLCに注⼊した目的物質を固相カートリッジに保持させ、その全量をGC/MSに導⼊できる。HPLCの注⼊量を100μLに増加させることにより本システムの検出感度は向上し、50pg/mLの17β-エストラジオールおよびテストステロンを検出できた（図6）。
m/z 416

GC注入⼝

m/z 360

17β-Estradiol-TMS
50 pg/mL③ 固相から溶出＆GCに注入

Testosterone-TMS
50 pg/mL

Intensity

オンラインLC-GC誘導体化注入

HPLCカラム

16:40

Retention Time (min)従来のTMS誘導体化は30分以上の時間を要するが本法では36秒と大幅に時間を短縮できた。
誘導体化が効率良く⾏われた理由として、誘導体化試薬を含有させた溶液で固相カートリッジから目的成分を溶出させながら直接GCへ注⼊した後、インサート中での濃縮工程において溶媒分子が少なくなることで、17β-エストラジオール分子と誘導体化試薬分子の衝突率が⾼まり、さらに注⼊口の熱が加わることで反応が促進されたことが考えられた。

Intensity

2.1

16:20

図5 HPLC-GC/MS トータルイオンクロマトグラム

図2 オンラインLC-GC注入の流れ

固相カートリ ッジ

イ ンジ ェクター

シリンジポンプ

目的物質

夾雑物

誘導体化物

溶出液

インサート

キャピラリカラム

スプリットモード② 濃縮&誘導体化

図6 HPLC-GC/MS

3.3

マスクロマトグラム

前処理の簡易化・迅速化について

⽔試料を固相抽出し、本法により分析した（図7）。
3.2で⽰したように本システムは⾼感度であるため、試料量を従来法の1Lから100mLに減らすことができた。
さらに、最終検液に⽔分が含まれた状態でも分析可能であるため、固相の乾燥工程を省くことができた。これらにより、本法は従来法と⽐較して前処理時間を大幅に短縮することができた。

（5% MSTFA含有
アセトン/ヘキサン(1/3)溶液）① 注入

Retention Time (min)Retention Time (min)スプリットレスモード

スプリットモード③ 導入④ 除去

図3 GC注入⼝における濃縮および誘導体化導入の流れ
表1 LC-GC/MS条件

HPLC (MIDAS;Spark, Agilent 1100)
Injection: 100 µL, Sample loop
Column:3.0 mm i.d. ×100 mm Inertsil ODS-3
Solvents :A: water B: Acetonitrile
flow rate: 0.5 mL/min
Gradient(B%) : 0min(40%)-9min(40%)-12min(90%)-14min(90%)
Detector: UV 210 nm
Interface LC-GC (LGI-S110; AiSTI)
SPE: 2 mm i.d.××10 mm C18Diluting:water 0.5 mL/min
Purge: N2 gas, 3 min
Elution:acetone/Hexane(1/3), 50 µL
Interface Injector (LVI-S200; AiSTI)
Insert: Spiral Insert
Solvent Vent: 0.60min, Purge flow 150 mL/min
Splitless:
4 min
Inj. Temp.: 70ºC(0.6min)-120ºC/min-290ºC(15min)
GC/MS (6890N/5975C; Agilent)
Column:0.25 mm i.d.××30 m, df 0.25μm BPX-5
Oven: 60ºC(4min)-20ºC/min-300ºC(3min)
Carr. gas: He, 1 mL/min
MS:SIM

試料⽔100 mL
固相カートリッジに保持（ Smart-SPE HLBi5, 10 mg )洗浄 ⽔ 2 mL
溶出 アセトニトリル/⽔(1/1) 0.8 mL
最終検液（⽔ 1 mLで定容）オンラインHPLC-GC/MSシステム（100 μL注⼊）

図7 水試料前処理フロー

3.4

精製水における添加回収試験および河川水の分析

17β-エストラジオール濃度が1ng/Lとなるように調製した精製⽔100mLを⽤いて添加回収試
験を⾏った（n=5）。検量線はHPLC-GC/MSで作成し、回収率が101%、再現性がRSD=5.1%と良好な結果が得られた（表3）。
ブランク⽔

表3 精製水における添加回収試験
Recovery (％)
117β-Estradiol

河川⽔2345Ave.

98 1049798 109 101

RSD(%)
5.1

Intensity

GCインサート中での濃縮および誘導体化導⼊は70℃、36秒でおこない（図3）、表1のLC-GC/MS条件で測定した。

17β-エストラジオール添加
河川⽔ 1ng/L17β-エストラジオール

標準液 100ng/L
和歌山市で採取した河川⽔100mLを前処理し分析した(図8)。
(試料⽔濃度として 1ng/L）
その結果、 17β-エストラジオール濃度は0.39ng/L（n=4）、Retention Time (min)
河川⽔における添加回収率は99%であった（1ng/L, n=2）。
図8 河川水分析のマスクロマトグラム

4 まとめオンラインLC-GC誘導体化分析法により、再現性の良い17β-エストラジオールの⾃動誘導体化分析が可能となった。また、本法は前処理の簡易化および迅速化、さらには⾼感度分析が実現できた。精製⽔における添加回収および再現性の試験結果は良好であり、河川⽔の分析も可能であった。今後、夾雑物の多い試料中の誘導体化を⾏う分析への応⽤が期待できる。