メタボローム解析に資する固相誘導体化法を用いたオンラインSPE-GC-MSの開発○佐々野僚一1、古野正浩2、大森一生3, 山本裕一3 , 片上直人3, 下村伊一郎3, 福﨑英一郎2,4（1アイスティサイエンス, 2阪大院・工, 3阪大院・医, 4AMED-CREST）【Abstract】
従来のメタボローム分析は、採取した試料を溶媒抽出、遠心濃縮、凍結乾燥、誘導体化等の前処理工程が煩雑であるため、長時間を要するとともに熟練された技術が必須となる．また、多検体の前処理をバッチ処理した場合、GC-MSでの測定はそれらの検体を順次測定していくため、それらの検体において誘導体化後から測定までの時間が異なってしまう。これらは分析バッチ間の系統誤差の要因となり、多サンプルのメタボローム解析を遂行する上で致命的な短所である．そこで、本研究では、迅速な自動誘導体化とその誘導体化からGCMSへの直接試料導入を目指して、アミノ酸・有機酸の固相誘導体化法を用いたオンラインSPE-GC-MSシステムの開発を行ったので報告する。
【Experimental】■ Online SPE-GC-MS system with automated SPE-based derivatization method■ SPE-based derivatization method
STEP ①

STEP ②

STEP ③

STEP ④

STEP ⑤

試料負荷＆保持洗浄

脱水／１分誘導体化／2分

溶出

アミノ酸と有機酸をイオ
ン交換相互作用により固相に保持

水-ACNで固相に残存している非イオン性化合物を除去

ACNで固相に残存している水分を除去

誘導体化試薬を固相に含侵させて、目的成分を固相中で誘導体化

試料

水-ACN

ACN

アミノ基-SO3 ⊝-SO3 ⊝ ⊕ NH3-R⊕NH3-R-N ⊕-N ⊕カルボキシル基-N⊕ ⊝OOC-R(CH3)3-N ⊕⊝ OOC-R-N⊕(CH3)3(CH3)3(CH3)3-N⊕(CH3)3(CH3)3

非イオン性化合物

The time fromderivatization toinjecting is always
fixed.

-SO3 ⊝

Flash-SPE
AOS-SO3 ⊝

TMS-NH-R-N ⊕⊝ OOC-R

LVI-S250
Spiral Insert-N ⊕-N⊕(CH3)3
TMS-OOC-R(CH3)3-N⊕(CH3)3(CH3)3

GC-MS
SampleLoading

Conditioning

R-NH-TMS
R-COO-TMS

H2O

Washing
Dehydrating

Adding MSTFA
Derivatization

開発したオンライン固相誘導体化SPE-GC-MSシステムを用いて、抽出した試料を固相抽出カートリッジに負荷しアミノ酸・有機酸を固相に保持させた。そして、アセトニトリル水で洗浄後、固相に残存している水をアセトニトリルで除去した。メトキシアミン/ピリジン溶液およびMSTFAを固相カートリッジに適宜直接添加し、固相にそれぞれの誘導体化試薬を浸漬させて、固相上で誘導体化反応させ、アミノ酸および有機酸をTMS化した。
その固相カートリッジにニードルを連結し、注入口へ挿入した。そして、固相から脱離したTMS化誘導体化物をヘキサンで溶出しながら、そのまま胃袋型インサートを備えた大量注入口装置に直接注入し、GC-MSにて測定した。

Automation

血漿： 50µL（50mg）
添加 水 150µL

分取 : 40, 80µL

コンディショニング
水
アセトニトリル

添加 ACN 800µL
Flash-SPE AOS-3mg

振とう （30min）

Sampling

洗浄 水-ACN（1/1）

遠心分離（14000rpm, 5min）Flash-SPE

Injection

1st Stage

Pre-treatment
Unit

含侵 Methoxyamine-Pyridine-MSTFA 8µL

2nd Stage

4th Stage

Concentration

TransferElimination

The injector is kept at
a temperature lower
than the boiling pointof sample solvent.

While the evaporated
sample solvent isexhausted, the sample
is concentrated.

Target compounds aretransferred to thecolumn at an elevatedtemperature.

Matrix compounds areeliminated from theinsert at furtherelevated temperature.

固相誘導体化反応 2min

The spiral shaped insert makes it possible to accept allof the injected eluate(40μL) from the SPE cartridge.

溶出 ヘキサン 40µL

バイアル

3rd Stage

Injection

脱水 ACN

分取：上澄み液■ Large Volume Injection-Split mode

■ Condition of SPE-GC-MS System

Online SPE-GC-MS System

バイアル

Elution &Injection

ヘキサンMSTFA-SO3 ⊝ ⊕ NH3-R

Automated pre-treatment time: 10 min

GC-MS： LVI-Split（1:50）

Pump Unit

Online SPE-GC-MS System【Results】

ヒト血漿による評価

スタンダードによる評価[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ]

TIC:

21417564

2.0E+07-0n-C20[ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ]

TIC:

22146748-0n-C20

14,1552.0E+0728

1.5E+0727
11

1.5E+0721

10

1.0E+07520842224

1.0E+072171372911232625

1916

5.0E+06
129

23

17418

16. Pyroglutamic acid-2TMS
17. Phenylalanine-TMS
18. Ketoglutaric acid-MO-2TMS
19. Ketoglutaric acid-3TMS
20. Glutamic acid-3TMS

11. Threonine-3TMS
12. Aspartic acid-2TMS
13. Malic acid-3TMS
14. Aspartic acid-3TMS
15. Methionine-2TMS

918, 19141211321

1315

2220

16

0.0E+00
R.T-->06:00
07:00
08:00
09:00
10:00
11:00
12:00
13:00
14:00
15:00

26. Tyrosine-2TMS
27. Lysine-4TMS
28. Tyrosine-3TMS
29. Cystine-3TMS

21. Phenylalanine-2TMS
22. Tartaric acid-4TMS
23. Lysine-3TMS-1
24. Citric acid-4TMS
25. Lysine-3TMS-2

7
6 8

0.0E+00
R.T-->
06:00
07:00
08:00
09:00
10:00
11:00
12:00
13:00
14:00
15:00
6. Proline-2TMS
7. Maleic acid-2TMS
8. Glycine-3TMS9. Fumaric acid-2TMS
10. Serine-3TMS

101

5.0E+06

1.Alanine-2TMS
2. Valine-2TMS
3. Serin-2TMS
4. Leucine-2TMS
5. Isoleucine-2TMS

23

6

1.Alanine-2TMS
2. Valine-2TMS
3. Serin-2TMS
4. Leucine-2TMS
5. Phosphate-3TMS

Fig. 1. The SCAN total ion chromatogram of standard solution using SPE-GC-MS system with automated SPE-based derivatization method.
＊Concentration of standard solution is 0.01, 0.02nmol/μL

6. Isoleucine-2TMS
7. Proline-2TMS
8. Glycine-3TMS
9. Serine-3TMS
10. Threonine-3TMS

16. Lysine-3TMS-1
17. Glutamine-3TMS
18. Ornithine-4TMS
19. Citric acid-4TMS
20. Tyrosine-2TMS

11. Methionine-2TMS
12. Pyroglutamic acid-2TMS
13. Glutamic acid-3TMS
14. Phenylalanine-2TMS
15. Asparagine-3TMS

21. Lysine-4TMS
22. Tyrosine-3TMS
23. Uric acid-4TMS

Fig. 2. The SCAN total ion chromatogram of the human plasma using SPE-GC-MS system with automated SPE-based derivatization method.
OO

O

O

Si

NH2O

SiSi

H2NNH
O

Si

SiSi

NHO

Si

O

Si

SiONOOOOSiNHONSiSiSiSiSiSiSi

Asprtic acid-3TMS

Asprtic acid-2TMS

Serine-3TMS

Serine-2TMS

Lysine-3TMS-1

Lysine-3TMS-2

Lysine-4TMS

O

O

OO

O

SiNH

OO

SiSiSiSi

SiNH2SiOOOONO

OSiSi

NH
NH2OO

Pyroglutamic acid-2TMS Glutamic acid-3TMS

SiNH
O

SiSiO

Si

Phenylalanine-TMS

Phenylalanine-2TMS

Tyrosine-2TMS◆ Reproducibility
Table 1. Reproducibility of peak area with the human plasma using SPE-GC-MS system.
No.

NH

OO

NH

O

O

O

Si

NH

O

Si

Si

O

Tyrosine-3TMS【Conclusion】
本システムによる抽出後の前処理時間は10分だった。本システムを用いて、スタン
ダードおよび血漿による再現性を評価したところ、共に良好な結果を得た。開発したオンライン自動固相誘導体化SPE-GC-MSシステムはメタボローム分析に有効であることがわかった。

化合物名

R.T.

123456Ave.

R.S.D. (%)

1

Alanine-2TMS

5.74

8,633,301

8,424,530

8,470,442

8,813,727

9,000,933

8,769,671

8,685,434

2.5

2Valine2TMS

6.95

8,416,9788,354,932

8,527,405

8,622,590

8,842,365

8,580,669

8,557,490

2.0

3Serine-2TMS

7.35

146,333

254,431

241,331247,570

243,287

192,714220,944

19.3

4

Leucine-2TMS

7.50

5,688,755

5,589,834

5,633,904

5,673,684

5,763,540

5,741,602

5,681,887

1.1

5

Phosphate-3TMS

7.54

1,532,993

1,374,189

1,444,839

1,563,735

1,600,848

1,617,307

1,522,319

6.2

6Isoleucine-2TMS

7.72

2,893,660

2,826,312

2,853,509

2,861,420

2,926,974

2,929,822

2,881,950

1.5

7Proline-2TMS

7.77

5,780,501

5,087,064

5,391,122

5,448,195

5,542,415

5,852,003

5,516,883

5.0

8Maleic acid-2TMS

7.77

566,106

468,276

387,623

472,954524,265566,714497,656

13.8

9

Glycine-3TMS

7.87

2,248,062

2,384,697

3,029,933

3,119,386

3,536,835

2,521,247

2,806,693

17.8

10

Fumaric acid-2TMS

8.15

24,42026,85925,862

26,281

22,541

24,20025,027

6.4

11

Serine-3TMS

8.35

1,769,507

1,699,878

1,864,172

1,887,997

1,928,784

1,787,516

1,822,976

4.7

12

Threonine-3TMS

8.61

2,470,842

2,278,645

2,442,888

2,499,770

2,509,920

2,609,086

2,468,525

4.4

13

Malic acid-3TMS

9.48

19,97523,841

22,39523,854

21,07225,43522,7628.8

14Aspartic acid-3TMS

9.75

34,422

48,54447,22948,87750,01540,601

44,948

13.7

15

Methionine-2TMS

9.75

411,457

382,171386,590

383,151394,254392,280

391,651

2.8

16

Pyroglutamic acid-2TMS

9.79

162,195

396,507474,141

442,799

460,530

162,295

349,745

42.2

17

Phenylalanine-TMS

9.99

218,821300,892

279,601

307,866

298,277

251,776

276,206

12.5

18

Ketoglutaric acid-3TMS

10.43

119,904

124,052

109,443

118,173

101,578

111,507

114,110

7.2

19

Glutamic acid-3TMS

10.55

334,862

529,574

564,421517,106

535,416

396,173479,592

19.1

20

Phenylalanine-2TMS

10.65

1,208,420

1,151,445

1,120,208

1,147,962

1,155,375

1,164,611

1,158,004

2.5

21

Asparagine-3TMS

10.97

198,094

144,522

162,130

170,311

173,873

218,463

177,899

14.9

22

Lysine-3TMS-1

11.23

130,569

117,629

113,932

78,295104,046

99,993

107,411

16.6

23

Glutamine-3TMS

11.73

4,990,285

2,520,597

2,608,919

2,391,832

2,649,685

5,422,322

3,430,607

40.4

24

Ornithine-4TMS

12.09

556,511358,171429,547

426,076

473,842

538,421463,761

16.1

25

Citric acid-4TMS

12.11

278,401

237,903

272,095

287,352

279,074

297,215275,340

7.4

26

Lysine-3TMS-2

12.31

545,926

471,612581,221708,622708,732

523,934

590,008

16.7

27

Tyrosine-2TMS

12.54

913,515

1,004,181

1,095,639

1,303,850

1,193,180

929,328

1,073,282

14.4

28

Lysine-4TMS

12.79

857,715

589,052

656,856

623,750

722,892

879,955

721,703

17.0

29

Tyrosine-3TMS

12.92

1,964,130

1,887,541

1,773,845

1,584,446

1,816,129

2,058,909

1,847,500

8.930

Uric acid-4TMS

13.98

2,992,906

2,950,917

2,078,402

1,682,566

2,155,709

2,706,284

2,427,797

22.0

31n-C20（指標）13.20

10,622,488 10,021,339 10,057,308 10,073,109 10,115,937 10,776,483

10,277,777

3.2

Serine-3TMS

Tyrosine-3TMS

Fig. 3. Reproducibility of ion
chromatogram of the human plasmausing SPE-GC-MS system( n = 6 ).