博士（医学）藤倉大輔
学位論文題名新規アポトーシス誘導受容体 、Deathr
eceptor6(DR6)を介した細胞内情報伝達機構の解析
学位論文内容の要旨
アポトーシスは個体の発生，細胞の癌化，免疫応答など様々な生命現象の制御に重要な役割を 担う． 特に 免疫 反応 にお ける アポ トー シス の誘導制御にはアポトーシス誘導受容体ファミリー（Death―receptor−family，DRfamily）分子が重要な役割を持つ事が知られている．
DR family分 子の 中で最も新しく同定された分子であるDR6遺伝子の欠損マウスでは，末梢T細 胞やB細胞 の活 性化 期に おけ るアポ トー シス の減 少及 ぴ過 増殖 を来 す事 が報告された．
こ れらの 報告 は， DR6がアポトーシスの制御を介して，末梢B或いはT細胞の活性化の制御に重 要な役 割を 担う 事を示すが，DR6を介した細胞内情報伝達機構の詳細は明らかにされていな い ． 我 々 は DR6を 介 し た ア ポ ト ーシ ス 制 御 機 構 の 詳 細 を 明 ら か に す る 事 を 目 的 と して ，DR6細胞 内領 域に会合するタンパク質を酵母two hybrid法により探索し，これまでにア
ポ トーシ スと の関 与が 報告 され てい ない タン パク 質， cytoplasmic linker protein―170(CLIP‑170) related protein 59kDa (CLIPR‑59)とDR6細胞内領域との会合を見出した．哺
乳 類細胞 を用 いた 免疫 共沈 降法 によ る解 析か ら，CLIPR一59は哺乳類細胞においてもDR6と会 合し， その 会合 にはDR6においては，第373アミノ酸から428アミノ酸領域が，CLIPR‑59に
お い て は 第 364ア ミ ノ酸 から 第547アミ ノ酸 領域 が必 要で ある 事が 明ら かとな った ，こ れま での報 告か ら， DR6の過剰発現はアポトーシス，及ぴ転写因子・nuclear factor kappa旦(NF−kB)の活 性化 を誘導する事が報告されている．そこで，CLIPR‑59のDR6を介したアポトー シス， 及び NF― kB活性化への関与を検討した．その結果，CLIPR‑59発現はDR6を介したアポトーシスに対しては促進し，NF‑kBの活性化に対しては抑制する事が判明した．更に，NF‑kBの活性化抑制を指標にCLIPR−59の他のシグナルへの関与を検討した所，CLIPR一59発現はDR6と 同 じ DRフ ァ ミ リー に属 する TNF一 Rを 介した NF‑kBの 活性 化に 対し て同様 の効 果を 示したが，他のレセプターファミリーであるIL−1Rを介したNF→kB活性化に対しては影響を与え なかっ た． これ まで のTNF― Rを介 した 解析 から ，DRはり ガンド 刺激 時に Caspaseを介したアポトーシス促進経路，及びNFーkBを介したアポトーシス抑制経路のニっの経路を同時に活性化させ，そのシグナルバランスによルアポトーシスの誘導を制御すると考えられている．
これらの知見及び我々の結果を考慮すると，DR6シグナルにおいて，CLIP
R一59はNF
一kB経路の活性化を抑制することにより，シグナルバランスをアポトーシスヘと傾かせると考えられる．
一 方，CLIPR‑59発 現が DR6及ぴ TNF‑Rを介 した NF一kB活性化に対して選択的に作用した事から，CLIPR一59はDR6及ぴTNF−Rが共有するNF−kB活性化経路に対して作用する事が考えられた ．これ まで の報 告か ら， TNF−Rを 介し たNF‑kBの活性化にはTRAF2/5及ぴその下流に位置

する inhibitor of NF‑kB kinase (IKK)が 重要 な機 能を 有する 事が 報告 され てい る． そこで次 に内 因性 TRAF2，TRAF5及びIKK2の DR6を介 した NF‑kB活性化経路への関与を，それぞれのドミナントネガティブ(DN)変異体発現を用いたレポータージーンアッセイにより検討を行なっ た所 ，TRAF5及 びIKK2の DN発 現は DR6に よる NF− kB活 性化 を抑 制し たの に対 し， TRAF2のDN発現 は影 響を 与え なか った． この 結果 から DR6を介 したNFーkBの活 性化 には TNFーRと同様 TRAF5及び IKK2が関 与す る事 が示 され ，CLIPR‑59が これら いず れか の因 子に 作用 する
こ と が 示 唆 さ れ た ， ま た ， CLIPR‑59は そ の ア ミ ノ 酸 配 列 上 ， Ankyrinー like repeatやcytoskeleton−associated protein glycine‑rich (CAP‑Gly)ドメインなど様々な予測タンパク質会合領域を持つ一方で，酵素活性を予測さ世る領域を持たないことから，CLIPR‑59が他の酵素活性を有するタンパク質を介してDR6−TRAF5ーIKK2‑NF‑kBシグナルに働きかける事が考 え ら れ た ． 近年 ， 皮 膚 の 腫 瘍 の ー つ で あ る cylindromatosisの原 因遺 伝子 であ るCYLDは，TRAFタンパク質に対する脱ユビキチン修飾抑制能により，TNF一Rを介したNF−kB活性化経路を 抑制 し， アポ トー シス を促進することが報告された．そこで，内因性CYLDがDR6を介したNF−kB活性化に関与するか否かを，CYLD特異的ノックダウンを用いたレポータージーンアッセイにより検討したところ，コントロール群と比較して，CYLD特異的ノックダウン処理群
では DR6を 介し たNF―kB活性 化が 顕著 に促 進さ れた ．こ のこと は内 因性 CYLDが， CLIPR‑59と同 様， DR6を 介し たNF―kB活性化に対して抑制的に働く事を示し，CYLDがCLIPR‑59の機能に関 与す る可 能性 を示 唆す る．そこで，CYLDがCLIPR→59の機能に関与する可能性を検討した所 ，免 疫沈 降法 によ りCLIPR一59とCYLDの会合が見出された．また，CLIPR‑59発現によるDR6依 存性 NF― kB活 性化 に対 する抑制効果が，CYLD特異的ノックダウンにより回避されたことか ら， CYLDがCLIPR‑59の NF‑kB活性 化抑 制能 に重 要な 役割を 担う 事が 示唆 され た． 加えて，CLIPR‑59によるNF一kB活性化抑制機構の詳細を明らかにする為に，TRAF5のユビキチン修
飾に 対す るCYLD及 びCLIPR‑59発現 の影 響を 検討 した 所， CYLDと同 様CLIPR− 59発 現も またTRAF5のユ ビキ チン 修飾 を顕 著に 抑制 した こと から ，DR6シグナルにおいて，CLIPR‑59及びCYLDは TRAF5レ ベ ル で NF‑kB活性 化 経 路 に 作 用 す る 事 が 示 唆 さ れ た ． こ れ ま で の 検 討 から，CLIPR―59はDR6刺激により誘導されるアポトーシスに対して促進的に働く事が示唆された． そこ で， 内因 性CYLDの ，CLIPR‑59を介 した アポ トー シス促進効果への関与を検討した
とこ ろ， CLIPR‑59発現 群で 認めら れた DR6依存 性ア ポト ーシス に対 する 促進 効果 はCYLD特異的ノックダウンにより回避された．このことからCYLDはDR6シグナルにおいて，CLIPR一59の アポ ト ー シ ス促 進 効 果に重 要な役 割を担 う事が 明らか とたっ た．
本 研究 の成 果か ら， DR6細 胞内 領域 会合 因子 であ るCLIPR‑59は，TRAF5のユビキチン修飾を，CYLDを介して抑制する事によりNFーkB活性化経路を抑制し，シグナルバランスをアポトーシスに傾けると考えられ，CLIPR一59はDR6を介した細胞内情報伝達饑構を理解する上で，重要なターゲット分子であると結論付けた．

学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 上 出 利 光
副 査 教 授 藤 田 博 美
副 査 教 授 畠 山 鎮 次 ウ

学位論文 題名
新規 アポトー シス誘導 受容体、Dea
threceptor6(DR6)．

を介した細胞内情報伝達機構の解析

ア ポト ー シ スは 個体発 生、癌の形 成、免疫 応答等様 々な生体 制御に重 要な役割を 担 う。 特 に 、免疫 応答におけ るアポト ーシスの 制御には アポトー シス誘導受容体群(DeathReceptorfamily、 DR‑family）が重要な役割を担う。DRIfa
miIyの ー つ で あ る DR6は 、 末 梢 免 疫 細 胞 の活 性 化制 御 に 重要 な 役割 を 担 う事 が 明
らか に され た が 、DR6を 介し た 細 胞内 情 報伝 達 系路の 詳細は明 らかにさ れていない 。 本研 究 は 、DR6を 介し た 細 胞内 情 報伝 達 系路の 詳細を明 らかにす ることを目 的 とし て 、 DR6の 細 胞内 領 域 に会 合 する タ ン パク 質 を 酵母 twohybrid法 により 検 索し た 。 その 結 果、 こ れ まで に アポ ト ー シス や DRシ グ ナル と の 関与 が報告 さ れて い な いタ ン パク 質 で ある CLIPR・ 59と DR6の 会合 を 見出 し た 。哺 乳類細 胞 を用 い た 共免 疫 沈降 の 結 果か ら 、哺 乳 類 細胞 に お いて も DR6は CLlPR‐
59に 対し て 、 会合 性 を有 す る 事が 明 ら かと な った。 更に、CLlPR‐ 59遺伝子発
現 は DR6を 介 し た ア ポ ト ー シ ス を 促 進し 、 NF． 絽 活性 化 を 抑制 す る事 が 明 ら
かと な った 。 DRシ グ ナル に お いて 、 NF‐ 胞 の活 性 化 はア ポ トー シ ス に対 し て抑制 的 に働 く 事 が知 ら れて お り 、CLIPR‐59は少 なくとも NF‐焔の活 性化を抑える 事 によ り 、 アポ ト ーシ ス を 促進 す る事 が 考え られる。 更に、CLIPR‐ 59の機能の詳細 を明らか にするた めに、C凵 PR−59会合因 子の探索 を行ったところ、新 た に DRシ グ ナ ル 関 与 因 子 で あ る CYLD及 び ASK1と CLIPR＿ 59の 会 合 が 見
出 さ れ た 。 CYLDは 自 身 の TRAF夕 ン バ ク 質 に 対 す る 脱 ユ ピ キ チン 修 飾 活性 によ り 、 NFI艪 活 性 化 を 抑 制 す る こ と が報 告 され て い る。 CYLD遺 伝子 特 異 的ノッ ク ダ ウ ン は DR6を 介 し た NF‐ 艪 活 性 化 を 促 進 し CYLDも ま た 、 CLIPR． 59と同 様 、DR6を 介 した NF‐ 艪 活 性化 を 負 に制 御 すること が示唆さ れた。ま た、

CYL
D遺 伝 子特 異的ノ ックダウン は、DR6
シ グナルにお いて、CL
IP
R‑
59発現に よ るNF‑k
B活性 化抑制及び 細胞死促進 効果を抑制 したことか ら、CYL
DはCL
IP
R‑
59の機 能に重要な 役割を担う と考えられ る。一方、AS
K1の種々の変異体のCL
IPR‑
59への会合性を共免疫沈降法により検討したところ、CLIP
R‑
59は AS
K1の C
末 端領 域に会合し 、興味深い 事にこの会 合はA
SK
1の活性 化により 制 御を 受 ける 事が見出さ れた。また 、内因性AS
K1がD
R
6刺激に より活性化 さ れる こ と、 更 に野 生 型ASK1の 発 現は CLI
PR‑59とCYL
Dの会合を 促進する が 、不 活 性型 A
SK1の発現は効 果を示さな い事から、 AS
K1はD
R6シグナ ルにおいて、CLIP
R‑59とCYLDとの会合の調節因子である可能性が示唆された。
本 研 究の 成 果か ら、DR6シ グナルにお いて、ASKl‑CLI
PR‑59‑CYL
D複合体がNF‑k
B活性化を抑制し、アポトーシスを促進する可能性が示唆され、CLI
P
R‑
59はD
R
6シグナ ルの詳細を 解明する上で、重要なターゲット分子であると結論
づ け た。 発 表に あ たり 、 副査 の 藤 田教 授 より C
LI
PR‑59のD
R6とTNF‑Rシグナルにおける機能の違いの可能性や疾患治療を目指した将来的な発展性について等の質問があった。次いで、副査の畠山鎮次教授より細胞膜蛋白可溶化の手技、CLIPR‑59の 他 のユ ピ キ チン 修 飾制 御 への 関与、ASK1
活性 化制御へのCLI
PR‑59の関与、CLIP
R‑59の疾患に対する遺伝学的な考察等についての質問が あった。最 後に主査の 上出教授よ り、正常細 胞におけるDR6とD
R6
会合因子 の結合証明 、DR6を介 するN
F‑kB
経 路とカスペ ース経路のパランス制御における会合分子の役割についての質問があった。いずれの質問に対しても、申請 者は自己の データや、 これまでのDR6やCL
IP
R‑59に関する論文報告を引用し 、適切な回 答を行った 。この論文は、TN
F‑R
ファミリーの最も新しい構成分子であるDR6を介する細胞死の分子機序を明らかにした点で高く評価され、今後免疫疾患や癌の新規治療法の開発への応用が期待される。審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。