学位研究紹介

181

学 位 研 究 紹 介

HIV-1 感染者における唾液中ウイルスの定量的研究
Quantitative study on HIV-1 in oral
fluids of infected individuals
新潟大学医歯学総合研究科

口腔生命科学専攻

顎顔面口腔外科学分野

池野良

Division of Oral and Maxillofacial Surgery, Niigata University
Graduate School of Medical and Dental Sciences

Ryo Ikeno【緒である。
唾液検体としては，安静時の全唾液を被検者が自己採取したものを用いた。実験には唾液５ml 以上を必要とし，採取には平均 13 分（最短４分・最長 40 分・中央値10 分）要した。
方法
唾液中ウイルスの定量法
Ａ．in-house nested PCR とポアソン確率分布法
唾液検体は採取後２時間以内に -40℃にて保存した。
定量前に解凍し，唾液検体にエタノール沈殿を施行し，その後 RNA/DNA 抽出キット QIAamp Ⓡ UltraSensTM
Virus Kit を用いて核酸の抽出を行った。この抽出液を適当に希釈して RT-nested PCR を行った。RT-nested

言】

PCR により得られた結果をポアソン確率分布式に代入し定量（以下，ポアソン法）を行った。ポアソン確率分

HIV は血液だけでなく母乳，精液，膣分泌液，唾液，布式による定量には１検体 15 本の RT-nested PCR の汗などの体液にも存在することが知られている。これら結果を使った。核酸抽出液の希釈比は，RT-nested PCRの体液のうち，血液，母乳，精液，膣分泌液を介しての陽性反応が 15 本中５本以上 10 本以下になるように設HIV 感染が起こることは実証されているが，唾液を介定した。抽出液を希釈しないでそのまま用いても陽性反する感染は，多量の出血を含む場合を除いて，起こらな応が 15 本中５本未満の場合は，その結果をポアソン分いと考えられている。

布式に代入して濃度を計算した。
また，唾液中感染細胞（HIV-1 DNA）量の計算は，唾液による感染が起こりにくい原因として，低ウイル
ス量，唾液中の抗ウイルス因子などがあげられているが，上記の方法から逆転写酵素を省いて同様に行った。

原因はまだ不明である。ウイルス量に関しては，唾液中既知の量の HIV-1 RNA を用いて行った予備実験の結のウイルス濃度が血中よりも高い症例（高分泌型）が存果，RNA/DNA 抽出キットの核酸回収率が 40％であっ在するが，その原因はわかっていない。また，従来の唾たことから，ポアソン分布式により計算された数値の 2.5

液中ウイルスに関する研究はほとんど遊離ウイルスを対倍をポアソン法による唾液中ウイルス定量値とした。

象としており，より感染性の高い感染細胞についてはあ500 μ l の唾液でウイルス量を測定した場合，ポアソンまり注目されてこなかった。

法による定量の検出下限は 5 copies/ml であった。

そこで我々はまず，唾液中の遊離型と細胞内のウイル

Ｂ．リアルタイム PCR 法ス量を正しく測定する独自の方法を開発した。次に，こRoche Molecular Systems Inc.（米国・プレザントン）の方法を用いて HIV 感染者の唾液中ウイルス量を決定で開発されたリアルタイム PCR 法による HIV-1RNAし，血中濃度との相関を評価するとともに，それが口腔定量試薬 COBAS Ⓡ TaqMan Ⓡ HIV-1「オート」（以下コ内の炎症や衛生状態とどのように関連しているかを検討

バス法）にて唾液中 HIV-1RNA/DNA の定量を行った。

した。

採取された検体は，-40℃にて一旦保存した。定量前に本研究で得られた結果は，HIV の口腔内分泌機序や唾検体を解凍し，転倒混和して濃度を均一にした。次に，液の感染性を明らかにするための基礎となるものである。

唾液検体を 400g で遠心し，浮遊物を沈殿させ，沈殿物を吸引しないように採取した上清を用いて定量を行った。

【対象と方法】

コ バ ス 法 の 測 定 範 囲 は 40 copies/ml ～ 1.0 × 107
copies/ml である。結果が測定下限未満となった場合，定量値は得られないが HIV-1 RNA を検出している場合

被験者と検体被験者は，新潟大学医歯学総合病院感染管理部にて加は“＜ 40copies/ml”，また，HIV-1 RNA が検出されな療されている HIV 感染者で，十分な説明により書面でい場合は，“検出されず”と報告される。測定には 3.0ml

同意が得られた 18 名（2008 年４月から 2009 年７月まで）の検体を必要とする。

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新潟歯学会誌

血中ウイルス量の定量法については血清を用い，コバ

40
（2）
：2010
Table：１．
ポ アソン法とコバス法による唾液中ウイルス検出数の比較

ス法にて定量を行った。
口腔内の炎症や衛生状態の評価
口腔内の炎症・衛生状態の評価としては CPI を用いた。
唾液への出血量の指標としてはヘモグロビンを用いた。唾液中ヘモグロビン量は，私が開発した方法により決定した。唾液をヘモグロビン濃度判定用試験紙（サリバスターⓇ；昭和薬品化工株式会社）に滴下し，30 秒後COBAS TaqMan Detectedassay Undetected
total

In-house Poissonquantitation assay
Detected Undetected total
14115181129321244copies/ml）の 75％もあった。に 30％過酸化水素水／エタノール（10：90）に 10 秒間最後に，唾液中ウイルス量に影響を与える因子として浸漬して固定し，デジタルカメラで撮影後，発色の程度口腔内炎症や血中ウイルス量を疑い，重回帰分析にて解を Image J Ⓡ で数値化した。検量線は 0.36 ～ 5.98 mg/析した（表２）。口腔内炎症の指標として，全血中ヘモdl の領域における７点のヘモグロビン濃度をもつ標準グロビン量に対する唾液中ヘモグロビン量の比を採用し唾液によって作成した。この検量線の範囲を越える場合た。解析の結果，唾液中ウイルス量の予測には血中ウイは，試料を標準唾液で適当な比で希釈してから測定した。

ルス量のみが有意で（p<0.01），唾液中出血量とは有意

唾液へのヘモグロビン滲出を評価するにあたり，唾液中な相関がなかった（p ＝ 0.72）。

ヘモグロビン量 / 血中ヘモグロビン量（Oral Hemoglobin【考Index，以下 OHbI）を設定した。

察】

粘膜状態の評価は唾液採取時に，口腔内診査・口腔内写真を撮影し粘膜状態の評価を行った。

唾液中ウイルス量を定量は，ポアソン法の方がコバス

倫理審査法より定量値が高値であった。コバス法では定量前の検本研究は，2007 年 11 月，新潟大学歯学部倫理委員会

体処理で浮遊物の沈下を目的に遠心分離を行っているのに倫理審査申請を行った。2008 年 12 月に承認（承認番に対し，ポアソン法では，唾液検体を攪拌し均一濃度に号 19-R13-07-12）を受け，2008 年４月より研究を開始した。

して後に定量を行う。この前処理の相違が定量値に影響統計解析を与えたものと考えられた。

ポアソン法およびコバス法による唾液中 HIV-1 RNA/唾液中ウイルス量は血中ウイルス量との間には相関がDNA 定量値の比較，および，唾液検体と血清検体との確認された。ポアソン法により定量された唾液中ウイル

関連は単回帰分析で評価した。唾液中ウイルス量と血中ス量では血中ウイルス量の 20％であり，以前の報告でウイルス量・口腔内環境との関連は重回帰分析を用いてあった 10％より高値を示した。その理由としては，以評価した。定量下限以下のデータは定量下限値の 1/2 を前の報告では遊離ウイルスを定量しているのに対し本研代入した。解析ソフトは Statcel - The Usefull Addin

究では遊離ウイルスと感染細胞を同時に定量しているこForms on Excel を用いた。と，以前の報告と定量方法が異なることが考えられた。

【結唾液中ウイルス量に影響を与える因子としては血中ウ果】イルス量が有意で，唾液中出血量とは有意な相関がなかった。この結果は，唾液中のウイルスは，炎症や出血被験者 18 名のうち唾液中ウイルスが検出されたのは，コバス法では７名，ポアソン法では 14 名であった。両などによる血管からの滲出との関連は低く，口腔内に独自に分泌されていることが示唆される。

方法の定量値は強い相関があり（r2 ＝ 0.95），ポアソン

唾液中ウイルス量が 100copies/ml 以上を示した５名法の方が平均して約 4.4 倍高い定量値を与えた（図 1-A，の被験者の感染細胞数を測定した。４名の唾液中ウイル

表１）。ポアソン法とコバス法の二つの方法による唾液

ス量中の感染細胞数の割合は１％以下であり，遊離ウイウイルス値は血中ウイルス量との間に相関が認められたルスが優位であった。ウイルス高分泌型感染者もこの中（図 1-B，図 1-C）
。ポアソン法による唾液中ウイルス量に含まれた。遊離ウイルスは唾液の抗ウイルス作用によは血中ウイルス量の 20％，コバス法では 12％であった。

り感染力が低くなることは，過去の報告で解析されてお次に，唾液中の HIV 感染細胞の割合を調べるため，り，高分泌型感染者においても唾液は低感染性であるこ唾液中ウイルス量が 100 copies/ml 以上であった５名（14とが考えられる。しかし，１名の被験者は唾液中ウイル検体）を対象に，唾液中のプロウイルス DNA 量を測定

スの 75％をプロウイルスが占められており，プロウイした（図２）。これら５名のうち４名はプロウイルス量

ルス量は感染細胞数を反映することから，この症例は感が全ウイルス量の１％以下であったが，１名（被験者染細胞が優位に唾液中に存在している特異な症例と思わNO. ２） は プ ロ ウ イ ル ス 量 が 唾 液 ウ イ ル ス 量（1900れる。さらに，この被験者の唾液中ウイルス量は血中ウ－ 72 －

池野良

183

イルス量より高値を示していた。母乳の有する高感染の進める必要があるが，いずれにしろ医療従事者は，スタ理由は感染細胞が高濃度であることと高濃度ウイルス量ンダードプリコーションを徹底することが二次感染予防であることから，同被験者の唾液も感染性を有する可能に重要であるのは言うまでもない。

性が示唆される。感染性についてはさらなる今後研究をFig：1-A．ポ
 アソン法とコバス法による唾液中ウイルス定量値の比較

Fig：1-B．血中ウイルス量とポアソン法により定量した唾液
ウイルス量との関連

Fig：２．唾 液中ウイルス量，唾液中感染細胞数と血中ウイルス量の比較

Fig：1-C．血 中ウイルス量とコバス法により定量した唾液中ウイルス量との関連

Table：２．
唾液中ウイルス量と全身状態および口腔内との関連

Constant term
Viral load of HIV-1 in serum
OHbI
Salivary secretion rate
CD4

Regression
coefficient－ 1.181.23
12.47－ 0.380.00

Partial correlation
coefficient
0.83
0.03－ 0.20
0.17－ 73 －F
2.17
29.01
0.01
0.57
0.41

P0.16
＜ 0.010.91
0.470.53

学位研

究紹介

185

学 位 研 究 紹 介

義歯着脱補助具の有用性の評価
Evaluation of a denture placement
and removal aid device for thedependent elderly
新潟大学医歯学総合研究科
口腔健康科学講座

表１

The number of people
The number of devices
Sex
AgeWireThe type of clasp
MetalⅠ
Kennedy'sⅡclassification
Ⅲ

口腔生命科学専攻
生体歯科補綴学分野

川崎真依子
Division of Bio-Prosthodontics
Depatment of Oral Health Science
Course for Oral Life Science
Niigata University Graduate School of Medical and Dental

The summary of the subjects
2126
Mele：8
Female：13
75 ± 5.8
0.5 ± 0.762
2.385 ± 0.983
10151を客観的に評価するため，義歯の着脱時の動作をデジタルビデオカメラにて撮影し，その画像を解析した。
撮影による評価対象は非利き手での義歯着脱操作と補Sciences助具を使用した義歯着脱操作の二項目である。画像解析

Maiko Kawasaki

は， 画 像 解 析 ソ フ ト デ ジ モ 社 製 Swallow シ リ ー ズ・Image Hyper Ⅱを用いた。具体的な評価項目は，①義歯着脱に要した時間②手指の運動範囲の面積③手指の運【目動軌跡の長さ④使いやすさなどを聞いたアンケートの４的】項目とした。撮影は，初めて非利き手と補助具を使用しての義歯着脱操作を行った時と，２週間自宅での着脱練超高齢社会の日本において，65 歳以上で，必要であ習をした後の２回行った。ビデオカメラとマーカーの配りながら部分床義歯を使用していない者はその 50％に置は予備実験の結果に基づいて決め，椅子に腰掛けた被及ぶ（平成 21 年度総務省統計局及び歯科疾患実態調査

験者の動作を正面から撮影した。左手中指の第一関節により）1）2）。医療保険診療で提供される義歯の殆どは，クLED ライトを使用したマーカーを装着して，この軌跡ラスプを用いて口腔内に保持されているために，手指感をトレースすることとし，これを容易にするために背景覚，口腔内感覚の低下が顕在化する後期高齢者や，片麻と被験者の胸部には黒い布をかけて撮影した。結果の分痺，リューマチで関節が拘縮した要介護者では，着脱が析には t-test とマクネマー検定を用いた。アンケートは，困難なことが多いのが，その一因であると思われる。ま着脱操作の容易さを，両手を使用した場合を 10 点満点た，介護する側の者においても複雑な設計の義歯を寝たとして，点数で評価した。

きり等の要介護者の口腔内に装着することは容易ではな【結果と考察】い。そこで，本研究では，要介護高齢者が安全かつ容易に義歯を着脱できる装置を考案し，その有用性を明らかにすることを目的として，片麻痺を想定した健常高齢者

アンケートによる非利き手と補助具使用での着脱のしの非利き手での義歯着脱操作について，主観的評価であやすさの主観的評価では，装着，撤去ともに練習後でのるアンケートと，客観的評価である画像解析の両面から評価が高い，すなわち補助具の使用が有効であるという分析評価を行った。

回答が有意に多く，撤去操作においては，補助具の使用は初回から有意に高い評価を得た。（表２）このことは，【対象と方法】

義歯の着脱操作において，撤去の方が難しいと被験者が感じている可能性を示唆しており，慣れるに従い補助具被験者は健常な高齢者で，装着中の義歯に支障がないが使いやすく感じられることがうかがえる。また，被験21 名とし，本研究の趣旨を説明し，研究参加への同意者全体の非利き手のみと補助具を使用し義歯着脱操作を書に署名を頂いた。内訳は男性が８名，女性が 13 名で，行った場合の評価の得点分布に着目したところ，それぞ平均年齢は 74.6 歳である。
（表１）被験者の除外基準とれ７点から８点の間でピークが分かれた。このことから，しては，手指に麻痺，痙縮などがある場合や，認知症な非利き手のみの方が，補助具を使用した時より，高い評

ど意思疎通が困難である場合とした。義歯の着脱の様子価であった群と，補助具を使用したほうが高い評価で－ 75 －

186

新潟歯学会誌

表２
To place the denture
To remove the denture

40（2）
：2010

Subjective evaluations
Only left hand(/10point)
7.12 ± 8.42
7.65 ± 1.13
6.27 ± 1.19
6.81 ± 1.10

First time
Second timeFirst time
Second time

With device(/10point)
7.50 ± 1.14
8.27 ± 0.83
7.73 ± 1.56
8.23 ± 0.95

P-value
NS<0.01*<0.001*<0.001*
T-test

表３First time
To place the denture
Second timeFirst time
To remove the denture
Second time

Objective evaluations
Only left handTime(sec)
12.28 ± 6.13
Area(cm2)
4.94 ± 1.72
Length(cm)19.18 ± 3.10
Time(sec)
10.90 ± 6.86
Area(cm2)
4.33 ± 1.90
Length(cm)18.12 ± 3.24
Time(sec)
10.69 ± 5.60
Area(cm2)
4.24 ± 1.94
Length(cm)17.61 ± 2.52
Time(sec)
10.85 ± 6.64
Area(cm2)
3.59 ± 2.11
Length(cm)18.18 ± 4.23

With device
13.37 ± 4.51
3.74 ± 2.02
17.49 ± 2.50
8.85 ± 3.89
3.13 ± 1.40
16.26 ± 2.00
15.26 ± 7.92
2.97 ± 1.37
16.58 ± 2.85
10.04 ± 5.21
2.68 ± 1.18
16.48 ± 1.68

P-valueNS<0.05*<0.05*
NS<0.01*<0.001*NS<0.01*<0.05*
NS<0.05*<0.05*

あった群とを比較して，撤去時において，補助具を使用

よって手指の運動量が少なく，義歯を着脱しやすいと評したほうが，高い評価の群の人数が有意に多いことが示価されたことから，その有用性が示されたと考えられる。

された。

また，補助具の使用によって義歯の着脱時の怪我や煩わ客観的評価結果では，義歯の装着に要した時間においては初回にも練習後にも有意差は認められなかったが，しさを減少させることができ，義歯の使用率を向上させることができる可能性が示唆された。

操作時の手指の動きの軌跡の面積と外周の長さに関して【参 考 文 献】

は，初回も練習後も補助具を使用したほうが有意に少ない手指の動きで装着していることが明らかになった。義歯の撤去時では，装着時と同様に，手指の動作の面積と１）Maki Y, Enoki T, Sugihara N, et al: A study on

外周の長さにおいて，補助具を使用した方が有意に少なfood acceptance in relation to oral status of the

い運動量で撤去していた。
（表３）このことから，補助elderly with dementia. Rounensigaku: 5: 39-43,

具を使用した方が少ない動きで義歯の装着ができることが示された。

1991. (in Japanese)２）Yoshida M, Wadamoto S, Takahashi A, et al.

【結The Survey on the Use of Removable Denture論】

for the Elderly with Medical Conditions. J
Hiroshima Univ Dent Soc: 28: 342-346,1996. (inこれらの結果より，試作した補助具を使用することに－ 76 －Japanese)