博士 （ 地球 環 境科 学）後藤友 二二

学位論文題名
Abnormal developmen
t of mouse embryos having
an extramaterna
lly inheritedXchromosome：Theim
plicationofim
prlnt
ed
XChromOS
Ome
inaCtiVation（母由来過剰X
染色体を持つマウス胚の発生異常：
刷 り 込 み 型 X染 色 体 不 活 性 化 の 関 わ り ）学位論文内容の要旨
哺乳 類では、常染色体のトリソミ ーは、胚や胎児に流死産や 出産直後の早期の死を引き起 こす重大な影響を 与 える の に対 し、 X染 色体 の増 加の 影 響は それ 程深 刻で は ない 。実 際、 ヒ トで はXXYや XXX個 体 の生 存
カ が低 下 する 事実 はな く、 過 剰X染色 体が両親のいずれに由来し ても違いはない。このような X染色体異数性 の表 現 型に 対す る影 響の 緩 和は 、2倍体 の細 胞に おい て 、1本 を 除く 全て のX染色体を不活 性化するX染色体の 不活性化(xcDに原因がある。 しかしながら、実験用マウスでは、XMXPY(XM:母由来X染色体，冫く二P：
父 由 来 X染 色 体 ） 個 体 の 報 告 は ある が、 XMXMY個 体は これ ま で見 出さ れて い ない 。近 年の 研究 で 、XMを過 剰に 持 つ胚 、っ まり 母由 来 X染色 体 のダ イソ ミ一 （DsXM)は、 胚 体外 組織 の発 育不全に特 徴づけられる
発 生異 常 を示し、着床後に失われるこ とが報告されている。XCIは 、時期、組織特異的に起き る。最初は、受精後 3.5日の栄養外胚葉で、次に 受精後4.5日の原始内胚葉で 、そして最後に受精後5.0‑6.0日目のエピブラ
ス トで 起 きる 。エ ピブ ラス ト では 、2本の X染色 体 のう ちr本がラ ンダムに不活性化されるの に対し、栄養外 胚葉 と 原始 内胚 葉で は、 XP染色 体が 不活 性化 す る。 これらの 事実は、過剰X染色体が両親 のいずれに由来 する か が胚 の生 存に 決定 的 な重要 性を持つことを意味する。当 学位論文では、マウスにお けるDsXM胚の発生異 常に焦点をあて、その原因を 究明した。
第1章で は、 2種 の口 バー ト ソン 型X一常 染色 体転 座Rb(X.2)2Adと Rb(X.9)6Hを へテロに持 つ雌マウスの減 数分 裂 でX染 色体 の 不分 離頻 度が 上 昇す るこ とを 利用 して、DsXM胚を作出した。これらの 胚は、着床前に失わ れることはなく、受精後6.5・7.5日目で胚体外組織に重度の発育遅延や欠損を示した。しかしながら、胚体組 織には影響が比較的少なく、 受精後8.5日目まで発育遅延 以外には異常は認められず 、8.5日胚では、中 胚葉 が 分化しているものも認められ た。更に時期を遡って検討 すると、異常は受精後5.5日 目に初めて観察され た。異常は極栄養外胚葉由来 の組織である外胚葉性胎盤 円錐や胚体外外胚葉に限られ 、他の胚体外組織 であ る 近位 内胚 葉や 遠位 内 胚葉に 異常は認められなかった。こ のため、DsXM胚では、極栄 養外胚葉とそれに起 源を持つ組織の増殖や分化が 抑制されたと考えられる。
DsXM胚 にお いて 、発 生異 常 とXCIの 関係 を調 べる ため 、 次に 、着 床後 のDsXM胚におけるX染色体の不活性 化パ タ ーン を調 べた 。細 胞 遺伝学 的研究では、受精後6.5、7.5日目のXMXMXP胚で、順調に 増殖している― 1317−胚体組織の細胞では、3本のうち2本がランダムに不活性化しているのに対し、発達が停止した胚体外組織の細胞では、父由来のX染色体のみが不活性化していることが見出された。XMX
M
Y胚の胚体組織では、1本のX染色体が不活性化しているのに対し、胚体外組織では、XCIが起きたことを示す兆候は見られなかった。
胚体外組織の欠損がDsX
M胚の発生を異常にしているのであれば、それを補うことで発生を正常の軌道に戻せるはずである。この可能性を検討するために、DsXM
胚と正常胚の凝集キメラ作成を試みた。得られた149のキメラ胚に、DsXM胚と同じ表現型を示すものは認められなかった。細胞遺伝学に18個体のDsX
Mキメラ胚を確認したが、その何れにおいても胚体組織は、DsX
M細胞と正常細胞で構成されていたのに対レ、胚体外組織にDsX
M細胞は認められなかった。これらの結果は、Ds
XM
胚は、胚体外組織を他の正常細胞で補うことで、正常に発生が進むことを示唆している。そこで次に、Ds
X
M胚と4倍体胚のキメラを作成してD
sX
Mマウスの作出を試みた。従来の研究で、2倍体と4倍体のキメラでは、4倍体の細胞は胚体組織に寄与しないことが示されている。DsX
M
胚は毛色遺伝子が野生型（agouti)で、Xー常染色体口バ〜トソン転座を持つため、4倍体胚は、毛色遺伝子がアルビノで核型が正常であるものにした。このためキメラマウスにおける4倍体細胞の割合は、毛色や細胞の染色体構成を調べることで容易に判断できる。90個の胚を仮親に戻し、32頭のマウスが生まれた。30頭は完全な野生型で、2頭は野生型とアルビノのキメラであった。尾を培養す
るこ とに よっ て核 型を 調 ベ、 2頭 が純 粋な Ds
XM個体（1頭はXMXM
XP、もう1頭はXMXMY)であることを確認した。このように、DsX
M
胚は胚体外組織を補ってやることで、個体発生を正常に行い生存可能である
こ と 、 っ ま り XCIが 正 常 に 起 き さ え す れ ば 致 死 と は な ら な い こ と が 示 さ れ た 。
6.
5〜 7.5日目のDs
X
M胚における染色体の観察から、栄養外胚葉系列ではXMが不活性化されないと結論されたが、第2章ではXist
転写産物を検出するR
NAF
ISHとDN
A複製バンド法を用いて、胚盤胞で直接この結論の当否を検討した。DNA複製バンド法による観察からは、XM
X
M
XP胚盤胞の細胞で異周期的複製をおこなうのは父由来X染色体のみであり、X
MXM
Y胚盤胞ではその様な行動をするX染色体は検出されなかった。 不活 性X染 色体 のみ から 特異 的に 発現 し、 不活 性 X
染 色体 を覆 うよ うに局在するX
istR
NAは、
XM
XMXP
胚 盤胞 では 半数 以 上の 細胞 で、 1っ のペイントシグナル として検出された。これに対して、
X
MX
MY
胚盤胞 では、このようなシグナルを持つ細胞は観察されなかった。雌の体細胞では、1つのX
ist
R
NAのペイン トシグナルが不活性X上に検 出されることが確認されている。このため、XM
XM
XP、X
M
X
MY
胚の栄養外胚葉では、父由来X染色体が不活性化し、2本の母由来X染色体は活性化状態にあることは明らかである。この結果から、母由来X染色体が不活性化を免れるようなインプリンティングが、胚体外組織での父由来X染色体の優先的な不活性化を引き起こすという結諭に至った。
第 1章の 4倍 体胚 によるDsXM胚の救助実験で、4細胞期胚の4倍 体胚と2倍体胚を凝集させて 、2匹の2倍体¨4倍体キメラを得た。4細胞期の4倍体胚に8細胞期の2倍体胚を凝集させる標準的な方法ではこのようなキメラマウスは得られていない。このため2倍体¨4倍体のキメラでは、4倍体の細胞は、自身の発生能カの制約あるいは、胚体外組織に優先的に分化することにより、胚体部から排除されると考えられてきた。第3章では4倍体細胞が胎児に寄与するための条件を検討した。厳しい実験上の制約はあるが、凝集実験C
j2倍体 と4倍体の割球の数、大きさ 、発生段階を変えてをおこなった。8細胞期の2倍体胚に、4細胞期の4倍体胚を凝集させる標準的な方法で作成した12.
5日目のキメラ胎児では、これまでの報告と同様に、lacZトランスジーンを持つ4倍体の細胞は胚体組織に全く寄与レなかった。しかし、2倍体胚と4倍体
一 1318 ‑胚を4細胞期で凝集させると、4倍体細胞が、しばしば心臓、肝臓、皮膚、腸などに寄与した。この結果
は、強い細胞選択のもと、4倍体の細胞が桑実胚の内部に位置する機会が滅少することが、標準的な2倍体¨4倍体キメラにおいて4倍体細胞が排除される原因であることを示している。心臓や肝臓には4倍体や多倍体細胞が多い。このような組織にはかろうじて初期発生段階をすり抜けた4倍体の細胞が生き残る素地があるに違いない。4倍体細胞は遺伝的にはバランスが取れているはずであるが、2倍体とのキメラでも組織形成に貢献する能カは極めて低い。こ の原因究明にもキメラは有効に利用出来ると考えられる。

− 1319―

学位論文審査の要旨
主査

教授

高 木 信夫

副査

教授

木 村 正人

副査

教授

吉 田 廸弘副査

教授

渡 辺 智正 （ 大 学 院 獣 医 学 研 究科）

学位論文題名
Abnormal developme
nt of mouse embry
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dXchr
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Chrom
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Cti
Va
tion
（ 母由 来過 剰X染 色体 を持 つマ ウス 胚の 発生 異常：
刷 り 込 み 型 X染 色 体 不 活 性 化 の 関 わ り ）哺 乳類 では 、常 染色 体の トリ ソミ ーは流死産や出産直後の死を引き起こす重大な影響を与 える のに 対し 、X染 色体 の増 加の 影響 はそ れ程 深刻 では ない 。ヒトのXXYやxxx個体の生 存カ は低 下せ ず、 過剰 X染色 体が 両親 のい ずれ に由 来し ても 違いはない。この原因
は 、 2倍 体 く 2n)の細 胞で は1本 を除 いて 全て のX染 色体 が不 活性 化さ れる ため であ る。
し か し 、 マ ウス では XMXPYくXM：母 由来 X染色 体， XP:父由 来X染 色体 ）個 体の 報告 はあるが 、XNtXhtY個 体は見 出さ れて いな い。 近年 、XMを過 剰に 持つ (DsXM)胚は着床後に失わ れ る こ と が 示 さ れ た 。当 論 文 は こ の 不 思 議 な 現 象 の 解 析 を 目 指 し た もの であ る。
X染色 体の 不活 性化(XCI） は時 期お よび 組織 特異 的に 起き る。 最初、受精後3．5日の栄養外胚葉で、次いで4．5日の原始内胚葉で、そして最後に5． 0‑6.O
日目のエピブラストで 起 き る 。 エピ ブラ スト では 、XPまたは XMが ラン ダム に不 活性 化さ れる が、 栄養 外胚葉 と 原 始 内 胚 葉 で は 、 XPの み が 不 活 性 化 す る。 ここ に過 剰X染 色体 の両 親か らの 由来が胚の生存を左右する原因がありそうである。
DsXNI胚 の 研 究は その 発生 頻度 が低 いた め困 難で あっ た。 そこ で、2種の ロバ ート ソン型X‑常染色体転座Rb(X.
2）2A
dとRbくx．9）6Hをへテロに持つ雌マウスでは、減数分裂時のX染 色体 不分 離頻 度が上 昇す るこ とを 利用してDsXcu胚を作出した。これらの胚には、受精後5．5日目より胚体外組織に発育遅延や欠損を認めたが、胚体組織への影響は比較的少な い 。 異 常 は極 栄養 外胚 葉由 来の 外胚葉 性胎 盤円 錐や 胚体 外外 胚葉 に限 られ てい た。
受 精 後 6.5、 7.5日目 のDsXM胚 でX染 色体 の不 活性 化を 細胞 遺伝 学的に 見る と、 XMXM XP

胚の胚体組織では、3本のうち2本がランダムに不活性化し、胚体外組織では、XPのみが不活性化していた。XMXMY胚の胚体組織では、1本のX染色体が不活性化するが、胚体外組織ではXCIが起きていない。RNAFISH法を用いて、胚盤胞で直接XCIの状況を検討した。不活性X染色体から特異的に発現し、不活性X染色体を覆うように局在するXistRNAは、XMXMXP胚では半数以上の細胞で、1つのべイントシグナルとして検出されたが、XMXMY胚ではシグナルを持つ細胞は認められなかった。従って、着床胚でのXCIのバターンは胚盤胞ですでに確立していると結論される。XMにはXCIを免れるような刷り込みがあり、そのため胚体外組織ではXPが優先的に不活性にされると思われる。
胚体外組織の欠損がDsXM胚の発生異常の原因であれば、それを補えば発生は正常に戻ると期待される。そこで、DsXM胚と4n胚のキメラを作成してDsXMマウスの作出を試みた。2n/4nのキメラでは、4n細胞は胚体組織に寄与しないとされている。90個のキメラ胚より、32頭のマウスを得た。30頭は完全な野生型で、通説に反して、2頭は2n/4nのキメラであった。核型より、野生型の1頭は純粋のXMXMXP、もう1頭の野生型マウス
は XMXMYと 判明し た。 また 、胚 体部で はXCIが 正常に起きていることも示された。
上の実 験で 4細 胞期の4n胚と2n胚を凝集して2頭の2n<*4nキメラを得た。4細胞期の4n胚と8細胞期の2n胚を凝集する標準的な方法ではこのようなキメラマウスは得られないので、4n細胞が胎児に寄与するための条件を検討した。標準法で作成した12.5日目のキメラ胎児では、従来の報告通り、4n細胞は胚体組織に全く寄与しない。しかし、2n胚と4n胚を4細胞期で凝集させると、4n細胞が、心臓、肝臓、皮膚、腸などに認められた。この結果は、強い細胞選択の下、4n細胞が桑実胚の内部に位置する機会が減少することが、標準的な2n<+4nキメラにおいて4n細胞が完全に排除される原因であることを示している。心臓や肝臓には元々4nや多倍体細胞が多い。このような組織には初期
発 生 段 階 を か ろ う じ て す り 抜 け た4n細 胞 が 生 き 残 る 素 地 が あ るに 違 い な い 。
以上のように、本論文はマウスのDsXM胚が致死となる原因が胚体外部におけるXCIの異常にあることを疑問の余地無く証明した。また、XMには不活性化を免れさせる刷り込みがあり、エピブラストでiまそれが消えるらしいことも示し、これを基にX染色体不活性化の制御機構の解明が進むものと期待される。DsXMマウスの作成と4n細胞の分化能に 関す る 発 見 も注 目 に 値す るもので 、今後 の発展 を期待 したい 。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や単位取得なども併せ申請者が博士（地球環境科学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判断した。