博 士 （ 医 学 ） 佐藤 和 則
学 位 論 文 題 名SCA12の 遺 伝 子 座 に 連 鎖 す るが ， PPP2R2B遺 伝 子の変異 を 認 めな い 優性 遺 伝 性脊 髄小脳変 性症の1家 系
学位論文内容の要旨
背景と日的Spinocerebellarataxias(SCA)
は，小脳および脊髄に病変の主座をもつ，運動失調を主症 候とする 遺伝性変性疾患の総称であるが，遺伝学的には多様な一群である，疾患遺伝子座 同定には 連鎖解析が有カな方法であるが，マイクロサテライトによる方法では，マーカー 間距離が 長く，核家族などの小家系における連鎖解析での検出カには限界があった．近
年 のDNAマ イクロアレイ技術の進歩は，SNP(SingleNucleotidePolymorphism)のハイスループットジェノタイピングを可能にし，得られた多数のSN
Pによる連鎖解析は，小家系においてもより高い検出カを持っことが期待できる，
我 々は優性遺伝性脊髄小脳変性の1家系っいて，約400のマイクロサテライトマーカーを用 いて連鎖 解析を 行い，第 5染色 体上， D5S436とD
5S2014との間に最大LO
Dスコア2．39を得 たが，マ ーカー密度が十分ではなく，他領域の可能性を除外することは困難であった．
今回，本家系の疾患遺伝子のより正確なマッピングと疾患遺伝子の同定を目的に，DNA
マイク ロアレイ を用い たS
NPジ ェノタイ ピングならびに連鎖解析を行い，候補遺伝子の遺伝子変異の有無を検討した，
対象と方法
DNA収集 と 既 知SCAに関 す る 検討 発 症 者4名 を 含 む本 家 系 10名を対 象とし た．本研 究は北海道大学倫理委員会の承認に基づぃて行われた．末梢血白血球から抽出したゲノムDNAを用 いた．SC
A1，SCA
2，SCA
3，SC
A6，SC
A7，SC
A8，SC
A
10SC
A
12，SC
A
17および歯状核赤核淡蒼 球ルイ体 萎縮症(DRPLA)の各原因遺伝子のC
A
G/CT
Gリピートの異常伸張の有無を評価する
た め，各遺 伝子のトリプレットリピートをはさむ領域のP
C
R増幅をおこない，4％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動を行った後G
ene
ScanA
nalys
isVer.
2．0(PerkinElmer)によルフラグメント解析をおこなった．SC
A
5，SCA
13，SCA
14，SCA
27については，それぞれの原因
遺 伝子にお けるエクソン領域をPC増幅し，これらをテンプレートとしてシークエンス反応を行い，ABIPRISM310geneticanalyzer(AppliedBiosystems)
にて解析を行った．SCA
1
5に 韜けるCN
TN4およびSC
A3
1
だおゲるpuratr
ophin‑l
遺伝子多型の有無については，これらの 部 位 を含 む 領 域を 含 む P
CR産物 を酵素 処理し， 電気泳 動を行い 確認した (RPLP法 ）．
SN
Pジェノ タイピ ングと連 鎖解析16の既知の S
CAを除 外診断 した後，909，622SN
Pを含む
theGenomeーWideHumanSNPArray6.
O(Affymetrix)を用いて，ジェノタイピングを行った．
パラメトリック連鎖解析は，解析ソフトとしてAllegroを用い，LOD
スコアは優性遺伝形式，浸透率100％，性別問での同等の組み換え率，遺伝子頻度O． 001を仮定して計算された，また ， 以下の条 件を満 たすSN
Pを選択し た：Hardy―We
inberg平 衡>
0. 05，call r
ate=l，confidencescore<0.02.さらに，80〜120kbの間で最もマイナーアレル頻度が高いS
NPを選択し解析に用いた(
MinーMax法）．遺伝子座の存在が疑われた染色体では，全SNP
マーカーによりMLINKを用いて解析をおこなった．
DNAシーク エンス 候補遺伝 子である PPP
2R2B(proteinphosphatase2，regulatorysubunit
B，b isoform)のエクソン1の2つのスプライス変異を含む9エクソンおよぴプロモーター領域
一 420−

のDNA塩基配 列の検討を行った．
結果
既 知 の SCAと の 鑑 別 SCA1， SCA2， SCA3， SCA6， SCA7， SCA8， SCA10，SCA17お よび DRPLAの各 疾 患 遺 伝 子 に お け る CAG/CTGリ ピ ート 数 の 異 常伸 張 は 認 めら れ な か った ， ま た ，SCA5，SCA13， SCA14およ び SCA27の各 疾患遺 伝子に おけるORF(OpenReadingFrame)内 の病的 変異は認 め ら れ なか っ た ． さら に ， SCA15お よ び SCA31に お いて 連 鎖 不 平衡 に あ る 遺伝 子 多 型 も認
めら れなか った．
5qへ の 連鎖 多 点 解 析か ら ， 5q31― q33.1に 存 在 する 4． 28Mb領 域 に ， 本家 系 に お ける 理 論 的
最大 値であ る多点 LODスコア 2．408が得 られた ．また ，二点 LODスコア カゝら ，候補 領域の 境界
は ， セ ン トロ メ ア 側 境界 が rs681591と rs10477291と の 間に ， テ ロ メア 側 境 界 がrs741580とrs32582と の 間 に 存在 す る と 考え ら れ た ．こ の 領 域 には SCA12の原 因 遺 伝 子で あ る PPP2R2貴伝子 が含ま れる．
PPP2R2Bの DNAシ ー ク エ ン ス 本 家 系 に お い て は ， SCA12の 病 的 変異 と さ れ るPPP2R2Bの プ ロ
モ ー ター 領 域 に おけ る CAGリ ピー ト の 異 常伸 張 は 認めら れなか った（ 全発症者 におい て16/17
リ ピ ート ） ． ま た， 同 遺 伝 子ORF， 各 エ クソ ン ・ イ ント ロ ン 境 界領 域 お よび プロモ ーター 領
域に おける 点変異 ，欠失 ，挿入 は認めら れなか った，
本 家 系 の 臨 床 像 緩 徐 に 進 行 す る 純 粋 小 脳 性 運 動 失 調 を 特 徴 と す る． 四 肢 体 幹部 の 運 動 失調 ， 構音 障 害 ， 滑動 性 眼 球 運動 障 害 が 認め ら れ るが， 一部に 不随意 運動（ 頭部振 戦）を 認める ， 認知 症 ， パ ーキ ン ソ ニ ズム ， 末 梢 神経 障 害 ， 自律 神 経 障 害を 認 め な い．脳 MRIでは著 明な小 脳萎縮 を認め る，
考察SCA12は PPP2R2Bの プ ロ モ ー タ ー 領 域 の CAGリピ ー ト 異 常伸 張 に 起 因す る （ 変 異ア レ ル 55〜 78リ ピ ー ト， 正 常 7〜 32)が， 本 邦 で の報 告 は な い． 本 家 系 では SCA12の主 症 状 で ある 頭部 振 戦 に て発 症 し た 1例 が ある が ， 緩 徐進 行 性 の 純粋 小 脳 性 運動 失 調 を 呈し ， SCA12で 高 頻
度 に 認 め られ る 認 知 症， 末 梢 神 経障 害 ， 自 律神 経 障 害 ，パ ー キ ン ソニ ズ ム の 存在 は 認 め ら
れ な い ． また ， 脳 MRIで はび ま ん 性 大脳 萎 縮 を 認め る SCA12に 対 し ， 本家 系 で は 小脳 に 限 局
し て い る ， こ の よ う に ， SCA12と 本 家 系で は 異 な った 臨 床 像 を呈 し ， 本 家系 の 発 症 者は ，
PPP2R2Bに お け る CAGリ ピ ー ト の 異 常 伸張 を 持 た ず， 本 家 系 はSCA12と は遺 伝 学 的 に異 な る疾 患 で あ る と 考 え ら れ る が ， SCA12と 本 家 系 は ア レ ル 病 で あ る 可 能 性 も 考 え ら れ る ．
本家 系 に お ける 4． 28Mbの候 補 領 域 には 44の 遺伝 子 が 含 まれ る ． 今 後， PPP2R2Bのイ ント
ロ ン を 含 むよ り 広 範 な検 索 と 候 補領 域 に お ける 他 の 遺 伝子 の 変 異 の有 無 に つ いて の 検 討 が必要 とされ る．
結語
優 性 遺 伝 性背 髄 小 脳 変性 症 の 1家 系 に おい て ， 疾 患遺 伝 子 座 の候 補 領 域 を第 5染 色 体 長 腕上4． 28Mb領 域 に同 定 し た ，同 領 域 に は， SCA12の原 因 遺 伝 子で あ る PPP2R2Bが 含ま れ る が ，同遺 伝子の ORF，プロ モータ ー領域 には病 的変異 を認め なかった ．

― 421ー

学位論文審査の要旨
主 査教 授有 賀正副 査 教 授 笠原正典
副査 教授 佐々木秀直

学 位 論 文 題 名SCA12の 遺 伝 子 座 に 連鎖 す る が ， PPP2R2B遺 伝 子 の変 異 を 認 め ない 優性遺 伝性 脊髄 小脳 変性 症の 1家系
Spinoce
rebellar ataxia(SCA)は，小脳および脊髄に病変の主座をもつ，運動失調を主症候とする遺伝性変性疾患の総称であるが，遺伝学的には 多様な一群である．いまだ疾患遺伝子座が同定されていない優性遺伝性小脳失調症(ADCA)家系も多い．連鎖解析は疾患遺伝子座同定のための有カな方法であるが，従来の方法に比 べDNAマイクロアレイによる 一塩基多 型(SNP)タイ ピン グに より得られた多数のSNPをマーカーとした連鎖解析は，小 家系においてもより高い検出カを持っことが示されている，こうした背景を踏まえて，本論文では，ADCAの1家系にっいて疾患遺伝子座のマッ ピングと疾患遺伝子の同定を目的として，DNAマイクロアレイを用いたSN
P
タイピングならびに連 鎖 解 析 を 行 い ， さ ら に 候 補 遺 伝 子 に お け る 変 異 の 有 無 を検 討 し た ．
対 象は 発症 者4名を 含む 10名か らな る1家系 であ る。 既知のSCAについては以下の ように評価し除外した．すなわち，SCA1，SCA
2，MJ
D/SCA3，SC
A6，SCA
7，SCA
8，SC
A10SCA12，
SCA17および歯状核赤核淡蒼 球ルイ体萎縮症(DRPLA)については、CAG/CTG
リピートの異常伸張の有無をD
NA
フラグメント 解析にて評価した，また，SCA5，SCA
13，SCA
14，SCA
27については，各原因遺伝子のエクソンにおける点変異，欠失の 有無をダイレクトシークエンス法
にて評価した．さらに，SCA16およびSCA
31については， 連鎖不平衡にある遺伝子多型の有無についてP
CR―RFLP法によ り評価した，既知のSCAを除 外診断後，DNA
マイクロアレ イによルタイピングしたSN
Pをマーカーとしてパラメトリック連鎖解析をおこなぃ，5q
3
1―q33.
1上4Mb
領 域に ，本 家系 にお ける理論的最大値であるLO
Dスコア2．408を得た．同領域 にはS
CA12の 疾患 遺伝 子で ある PPP
2R2Bが 含ま れる が， 本家 系おいては，SCA
12の変異で あるP
PP2R
2Bプロモーター領域の C
AGリピート異常伸張を認め ず，また，同遺伝子のエクソンおよびプロモーター領域にも遺伝子変異がないことをダイ レクトシークエンス法により確認した．本家系はS
CA
12と臨床 像を異にし，遺伝学的に異なる疾患であり，あらたなSCAである可能性が示唆され，今後疾患遺伝子同定のため候補領 域の詳細な検討が必要とされる．
公開発表にあたっては，はじめに副査の笠原教授より，SCA
12とアレル病の関係にある可能性とその評価方法について質問があり，申請者は，アレル病の例としてSC
A6の例を挙げ，本家系におけるアレル病の可能性は否定できないが，現 時点では本家系におけるPPP2
R2Bには変異を認めなかったことをスライドおよび文献を引 用しながら回答した．また，イントロンにおける変異の検出法についての質問があり，申 請者はSCA31の例を挙げ，リ ピートの異常伸張などの変異が存在する場合にはサザンブロ ットを用いて健常アレルとの差を検出できる可能性があることを，文献を引用して回答した．また，PPP
2R
2B
や他の候補遺伝子で ある A
DRB2や HT
R4発現 の臓器特異性について質問が あり，申請者は，PPP
2R
2B
は 脳に特異的に発現しているが，他は脳特異的ではないことを，文献を引用し回答した．さらに，‑ 422ー今後の研究の方向性として，脳以外の発現臓器を用いて検討を行うことの重要性にっいてアドバイスがあった．
次いで，主査の有賀教授より，SCA12家系における遺伝子型と表現型の違いについての質問があり，申請者は，CA
Gリピートの異常伸張は共通しているが，インドの家系ではパーキンソニズムが目立たたず，やや異なった表現型を持つことが知られており，その原因につい ては未 解明であ ることを，文献を引用して回答した．また，本家系におけるPPP
2R
2Bの
large deletionの可能 性について質問があり，申請者は，未発表データとしてarrayCG
H
解析結果を示し，候補遺伝子座にはlargedeletionも含めたコピー数多型を認めなかったことを回答した，さらに，今後の研究の方向性として未解析の発症者を加えた上で解析を行うようアドバイスがあった．
最後に，副査の佐々木教授より，今後の疾患遺伝子同定のための方法について質問があり，申請者は，次世代シークエンサーによる候補領域の網羅的な塩基配列の解読が有カな方法のひとっと考えられることを，文献を引用し回答した．
こ の論文 は，あら たなS
CAの存在する可能性を示唆する点で高く評価きれ，今後の疾患遺伝子同定が期待される．審査員一同は，これら成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した．

‑ 423→