Deep Ocean Water Research, 18（1）, 1‒7, 2017

原著論文

UVA照射により誘導される正常ヒト線維芽細胞の石灰化に対する海洋深層水の抑制効果
Suppressive effect of deep seawater on the calcification ofnormal human fibroblasts induced by UVA irradiation
山田勝久 1・柴田雄次 1・野村道康 1・今田千秋 2
Katsuhisa YAMADA1, Yuji SHIBATA1, Michiyasu NOMURA1 and Chiaki IMADA2
Abstract
We have previously reported in this journal that the increase in Ca/Mg ratio and the aging of cells
promote calcification of cultured normal human fibroblasts (NB1 cells). In this report, it is suggested
that A-wave ultraviolet rays (UVA) induces calcification of NB1 cells even if the Ca/Mg ratio inculture medium is well balanced as 2. Furthermore, we have discovered that deep seawater (DSW)
suppresses the calcification induced by UVA irradiation. In addition, suppressive effect of DSW wasmuch higher than that of SSW. From these results, it was suggested that the suppressive effect ofDSW on calcification in NB1 cells was caused by specific components included in DSW.
Key Words: Calcification, Calcium, Deep seawater, Fibroblast, UVA
要旨

我々は正常ヒト由来培養線維芽細胞（以後，NB1細胞）を用いて Ca/Mg比の増加および細胞の老化がNB1 細胞の石灰化を促進することを既に報告した．本研究では，培地中のCa/Mg比が2 という生理的条件でも，長波長紫外線（UVA）の照射により NB1細胞は石灰化することを確認した．さらに海洋深層水（以後，DSW）は，UVA照射により誘導されるNB1細胞の石灰化に対する抑制効果を示し，この効果は表面海水（以後，SSW）よりも高いことがわかった．これらの結果から，DSW が有する顕著な細胞石灰化抑制効果は，DSW に含まれる成分が示す特異的な作用である可能性が示唆された．
キーワード：石灰化，カルシウム，海洋深層水，線維芽細胞，紫外線A 波

1.

緒起源を見ることができると述べている．このことは言

外骨格を持つ無脊椎動物の場合に限った現象と単純生命の進化において体組織の石灰化は，生物の骨に考えることはできない．なぜならば無脊椎動物よ格形成に伴う形態及び生命の維持において重要な意りも進化した脊椎動物でも，未分化の間葉細胞が，味を持っている．後藤（1997）は，無脊椎動物門の血液細胞，血管内皮細胞，骨芽細胞，軟骨細胞，脂棘皮動物の一種であるウニの発生において，原腸腔肪細胞および線維芽細胞等の各種細胞に分化するとをつくる内胚葉の細胞に先立って葉間域に落ち込んいうウニの場合と同じ発生メカニズムを有しておだ間葉細胞により骨針が形成される過程に骨形成のり，骨の中に血液細胞をつくる赤色骨髄が形成され

1

株式会社ディーエイチシー（〒106‒0047

2

東京都港区南麻布2‒8‒21

国立大学法人東京海洋大学大学院（〒108‒8477

南麻布 MIC ビル 7F）

東京都港区港南4‒5‒7）

2

山田勝久・柴田雄次・野村道康・今田千秋

ること，また老化によって身肢骨のそれが脂肪から条件の下で培養することで細胞の石灰化が誘導されなる黄色骨髄に変化することは，血液細胞と骨芽細るかどうかについて調査するとともに，UVA 照射に胞や脂肪細胞が同じ幹細胞由来であることから説明より誘導される細胞の石灰化に対するDSW の抑制がつくと，先の後藤（1997）が併せて述べているか効果についても併せて検討したので報告する．

らである．ヒトの骨格形成における石灰化は，骨格の主体である骨と歯に限定して促される仕組みを獲得している．しかしながら上述の進化的背景からか，骨格や歯以外の生体組織にも石灰化が生じる場

2.

材料と方法

2.1

試薬合がある．これが異所性石灰化や軟部組織石灰化とNaCl（特級，和光純薬），KCl（特級，和光純薬），呼ばれる病状である．この異所性石灰化について

CaCl2（特級，和光純薬），MgCl2･6H2O（特級，和光は，特に動脈など血管系で生じると虚血性心疾患の純 薬）， メ タ ノ ー ル（特 級， 和 光 純 薬），PBS（−）

ように重篤な状態に陥る．この虚血性心疾患の原因（Ca, Mgを含有しない等張リン酸緩衝液，細胞培養については，Karrpanen et al.（1978）による食事中の用，日水製薬），イーグルMEM（細胞培養用，日水カルシウム／マグネシウム摂取比（以後，Ca/Mg 比）製薬），3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2H-と虚血性心疾患の発症リスクに関する報告が著名でtetrazolium bromide（生化学用，ナカライテスク，以ある．Ca/Mg比と虚血性心疾患リスクに関する彼ら

後MTT），トリプシン‒EDTA（2.5 g/L Trypsin: 1 mMの報告に端を発して，今日では数多くの関連報告を

EDTA solution， ナ カ ラ イ テ ス ク）， 牛 胎 仔 血 清みることができる．例えば，血管における異所性石（Biological Industries Ltd.，以後FBS），DSW（伊豆赤灰化を研究している塩井（2010）は，血管において沢， 北 緯34°50′19″， 東 経139°08′11″， 深 度800 m,カルシウム（以後，Ca）の沈着サイトとなるのが血2015年3月30 日取水後4℃で保存），SSW（深度0 m,

管中膜に存在するエラスチンの老化に伴う断片化物

2015年3月30日取水後 4℃で保存），石灰化染色キッであると述べている．このエラスチンは皮膚においト（コスモバイオ），ヘキサデシルピリジニウムクて，コラーゲンとともに物理的機能に大きく関与すロ リ ド 一 水 和 物（特 級， 和 光 純 薬），Triton X-100

る細胞外マトリックス成分として知られており，加（生化学用，シグマ），UVAランプ（FL15BLB，東芝）

齢に伴い質的，量的に低下すると言われている（簱
持，2008）．細胞外マトリックス成分の質的，量的2.2

細胞と培養な劣化は皮膚の物理的機能を低下させる（山羽ら，

NB1細胞（RGB RCB0222，理化学研究所バイオリ2016）．それは皮膚のしわやたるみ，ゴワゴワ感なソースセンター）を1枚の培養シャーレ（ϕ90，日本

ど，外観や感触として誰にでも察知することができジェネティック）に播種し，コンフルエント状態まる老化現象である．また近年，皮膚の老化においてで培養後，トリプシン‒EDTAを用いてNB1細胞を紫外線が大きな影響を与えることがわかってきてお剥離させて新しい培養シャーレ 2 枚に継代し，必要り，皮膚科学の分野でも光老化という用語が汎用さに応じて96穴マイクロプレート（培養細胞用，イワれるようになってきた（Ichihashi et al., 2011）．こうキ）に播種して試験に供した．なお NB1 細胞の培養した状況の下，ヒトの軟部組織の石灰化研究においは全て37℃，5％CO2 の条件で行い，細胞の増殖及て血管に関しての数多くの知見や研究報告は見られび前培養には10％（v/v）FBS含有イーグルMEM培るものの，皮膚の真皮に関する石灰化の知見や研究地を用いた．

はほとんど見られない．そこで本報では真皮細胞外マトリックス成分の生産を担う線維芽細胞に着眼し，真皮にまで到達して光老化の一大因子となるUVAを照射された NB1細胞が，生理的な Ca/Mg 比の2.3

UVA照射が細胞の石灰化および活性に及ぼす影響

NB1細胞を10％（v/v）FBS含有イーグルMEMに懸UVA 照射による線維芽細胞石灰化に対する海洋深層水の抑制効果

3

濁し，96穴マイクロプレート（培養細胞用，イワキ）

デル550，バイオラッド）を用いてOD570‒OD655 の値に2×10 個／200 μL／穴になるように播種して2日間を測定し（n＝8），UVA未照射の細胞活性を100％と前培養した．前培養後，培地を除去して50 μL／穴のして活性残存率を測定した．

4

PBS（−）で2回洗浄した後，新しいPBS（−）50 μL／穴にすべて置換した．これにUVAランプを並列に設置したスタンドから照射エネルギーが0.5 mW/cm

2.4

UVA照射が細胞内アルカリフォスファターゼ（ALP）活性に及ぼす影響

2（UV METER Model UV-340，カスタム）となるよう石灰化との相関性が高いことが知られている細胞に光源から細胞への距離を調整して 0.4から1.2 J/cm

2内ALP活性（山村，1995）について，24穴マイクロの範囲で，0.2 J/cm2 ずつUVA量を変化させて照射しプレートにNB1 細胞を1×105 個／穴播種した以外た．照射後，10％（v/v）FBS含有イーグルMEMをは，2.3節の操作に準じてNB1 細胞を準備し，これ100 μL／穴，20 mM Ca相当の CaCl2 水溶液を 20 μL／に顕著な石灰化が誘導された照射量である0.8 J/cm2

穴，20 mMマグネシウム（以後，Mg）相当のMgCl2・のUVAを照射した後，2.3節と同様の操作で1晩培養

6H2O水溶液を10 μL／穴，PBS（−）を25 μL／穴ずつした細胞内のALP活性を山田ら（2016）の方法に準各々添加し，これに全量200 μL／穴になるように精じて測定した．すなわち培地を除去して 50 μL／穴製水を添加して1晩培養した． 培養後，石灰化染色のPBS（−）でNB1細胞を 2回洗浄した．これらの穴キットを用いる山田ら（2016）の方法に準じて石灰に10％（v/v）Triton X-100含 有PBS（−）を0.1 mL／化度を測定した．すなわち UVA照射後1晩培養した穴ずつ添加して 37℃で1時間インキュベーションをNB1細胞から培地を除去して，新たに 50 μL／穴の行った後，NB1細胞抽出液を試料溶液として市販

PBS（−）を加えて細胞を2回洗浄した後，50 μL/穴キット（ALP活性キット，和光純薬）を用いて測定の冷メタノールを添加し，氷冷下，30分間静置してした（n＝4）．また先の細胞抽出液の蛋白量は，市細胞を固定した．固定後メタノールを除去して，販キット（プロテインアッセイキット，和光純薬）

50 μL／穴の精製水で 2 回，細胞を洗浄した後風乾しを用いて測定し，蛋白量あたりの比活性として補正た．風乾後，石灰化染色キットの操作要領に準じて後，未照射の細胞内ALP比活性を1.0として照射後調製した染色液を50 μL／穴ずつ添加し，室温条件の相対ALP活性の変化を培養時間ごとに調べた．

下で30分間静置して染色した．染色後，染色液を除去してキットに付属している洗浄液を調製後，2.5

DSW添加効果

50 μL／穴ずつ添加して非特異的に染色された色素2.3節と同じ操作で 96穴マイクロプレートに準備を洗浄して除去した．これらの操作で Ca沈着部がしたNB1 細胞について，顕著に細胞の石灰化が観察

特異的に染色された 96穴プレートを室温で十分乾されたUVA量である0.8 J/cm2 を照射後，精製水の代燥させた後，鶴見ら（2009）の方法に準じて10％（v/v）

わりにDSW の終濃度が0‒2.5％（v/v）となるようにヘキサデシルピリジニウムクロリド一水和物水溶液添加し，1 晩培養後に発現する細胞の石灰化度に及を100 μL／穴ずつ添加し，37℃で1時間色素を抽出した後，570 nm における吸光度（以後，OD570）を測定して石灰化度とした（n＝8）．上述の操作で測定したUVA 未照射における細胞の石灰化度を 1.0として，UVA 照射により誘導された石灰化度を相対値で示した（n＝8）．また予め細胞活性残存率の測定用として上述の固定操作を施さず準備しておいた 96
穴プレートのNB1細胞については，MTT還元法（山田ら，2007）によりマイクロプレートリーダー（モTable 1. Concentration of various mineral elements containedin DSW and SSW of Izu-Akazawa. Asterisk indicates a significant difference between DSW vs. SSW(*p＜0.05, Student s t-test).
Mineral element
NaKMg
CaConcentration (mM)
DSW

SSW

441.3±12.9
9.6±1.150.9±0.9*
9.5±0.7

394.6±33.78.5±0.8
45.0±1.5
8.5±0.7

山田勝久・柴田雄次・野村道康・今田千秋

4ぼ す 影 響 を 調 べ た． な お，DSWの 比 較 対 照 に は昇して最高値を示した．その後高い ALP活性は培SSWを添加した（n＝5）．

養6時間後まで持続したが，7時間後には低下し始め，8時間後には未照射の細胞内 ALP活性との差異統計処理

2.6が消失するに至った．

得られたデータは，平均値±標準偏差で表した．
なお，データ間の有意差は，二群間の有意差ではStudentʼs t testを， ま た 多 重 比 較 の 有 意 差 は Steel‒

3.3

DSW添加効果

2.5節の方法で試験を行った DSW 及びSSW の添加が細胞石灰化に及ぼす影響をFig. 5に示す．UVA 照

Dwass testによりそれぞれ検定した．

射後に DSWを添加すると，添加濃度依存的にNB1細胞の石灰化が抑制された．一方，比較対照に用い

3.

結果

3.1

UVA照射が細胞の石灰化および活性に及ぼす影響

NB1細胞にUVAを照射して1晩培養した結果，細胞活性はUVAの照射量に逆相関して低下した（Fig.
1）．一方，UVA未照射条件において細胞はほとんど石灰化しなかったが，0.4‒0.8 J/cm2 の照射量の範囲において照射量依存的に石灰化度の上昇が認められた．しかしながら0.8 J/cm2 以上では，照射量依存的な石灰化度の上昇は見られなかった（Figs. 2, 3）．
3.2

UVA照射が ALP活性に及ぼす影響

2.4 節の方法で試験を行ったNB1細胞について，Fig. 1.

Effect of UVA irradiation on cell viability of NB1cells. Cell viability was measured by MTT assay (n＝UVA未照射および照射後の培養時間ごとの細胞内8, mean±SD). Asterisks indicate a significant differ-

ALP活 性 の 変 化 をFig. 4に 示 す．0.8 J/cm UVA照 射

ence between the following groups: 0.4 J/cm2 UVA vs.
control; 0.6 J/cm2 UVA vs. control (*p＜0.05, Steel‒

2後，2時間培養したNB1細胞はUVA未照射で培養した細胞に比べて細胞内ALP 活性の上昇が認められ，4時間後には細胞内ALP 活性は有意（p＜0.05）に上Fig. 2.

Dwass test, ANOVA); 0.8 J/cm2 UVA vs. control; 1.0 J/
cm2 UVA; 1.2 J/cm2 UVA vs. control (**p＜0.01, Steel‒
Dwass test, ANOVA).

Comparison of microphotographs of NB1 cells with and without UVA irradiation. All NB1 cells were stained by the calcium stain assay kit after overnight incubation. Left is a microphotograph of NB1 cells not irradiated by UVA. Right is a
microphotograph of NB1 cells irradiated by 0.8 J/cm2 UVA. Arrows indicate the calcified nodule.

UVA 照射による線維芽細胞石灰化に対する海洋深層水の抑制効果

Fig. 5.
Fig. 3.

measured by the calcium stain assay kit as describedcells. The expression of calcification was measured

in materials and methods. (n＝8, mean±SD). Asterisks

by the calcium stain assay kit as described in materi-indicate significant differences between DSW andSSW at indicated concentrations (*p＜0.05, Student s

als and methods. (n＝8, mean±SD). Asterisks indicate
a significant difference between the following groups:t test). ● , DSW; ○, SSW.

0.4 J/cm2 UVA vs. control; 0.6 J/cm2 UVA vs. control;

VA).

Supplemental effect of various concentrations ofDSW and SSW. The expression of calcification wasEffect of UVA irradiation on the calcification of NB1

0.8 J/cm2 UVA vs. control; 1.0 J/cm2 UVA; 1.2 J/cm2UVA vs. control (**p＜0.01, Steel‒Dwass test, ANO-5

たSSW にも，濃度依存的に石灰化抑制傾向が見られたが，DSW の抑制効果に比べると低かった．

4.

考察

ヒトの身体にとって海水のミネラル組成は，ヒトの血清成分中のミネラル組成に近似していることが知られており（木村ら，2001），その中でも地球最後の有望資源として注目されている DSWは，ヒトの健康分野への利用が大いに期待されている（高橋，2000）．我々はこれまでNB1 細胞を用いた研究で，培地中の Ca/Mg 比の増加が細胞の石灰化を誘導すること，さらに継代回数の増加（いわゆる細胞の老化）に伴って石灰化が顕著化することを報告した（山田ら，2016）．これまで軟部組織の石灰化についFig. 4.

Comparison of time course of ALP activity in
NB1 cell with and without UVA irradiation. ALPactivity of NB1 cell was measured by the ALP assayては，動脈をはじめとした数多くの既往研究がある．Wallin et al.（2001）は，活性酸素のストレス負

kit as described in materials and methods (n＝4,荷が軟組織石灰化を促進することを動物実験によりmean±SD). Asterisks indicate significant differences確認している．また坂田（2003）は，ヒトの動脈硬between with and without UVA irradiation in the fol-化の原因が酸化ストレスにあることを指摘していlowing groups: after 4 hour vs. control; after 6 hourvs. control (*p＜0.05, Student s t test). ● , UVA irradiated; ○, UVA not irradiated.

る．これらの報告から環境要因が石灰化を誘導する可能性が示唆された．そこで本報ではヒトの真皮に存在する線維芽細胞に対する外的環境刺激として紫6

山田勝久・柴田雄次・野村道康・今田千秋

外線の負荷を想定し，この環境負荷が皮膚細胞の石低下したものと推察される（西野・黒澤，2012）．

灰化を誘導するか否かについての調査を行った．ま塩井（2010）は，血管石灰化においてアポトーシスた，Ca/Mg 比の増加に伴うNB1細胞の石灰化を抑制

が石灰化に関与していることはよく知られているとすることがわかっているDSW（山田ら，2016）につ述べており，UVA 照射に誘導される細胞の石灰化もいて，UVA 照射により誘導される石灰化に対してもアポトーシスとの高い関係が推察される．次に軟部抑制効果があるか否かについても検討した．これま

組織石灰化の研究分野において，石灰化と高い相関

でUVAによる皮膚真皮の構造や機能劣化に関して性を有することが知られている細胞内 ALP活性には池谷ら（1999）の報告をはじめ枚挙に暇がないが，ついて（山村，1995），UVA照射で誘導されるNB1細UVAと真皮の石灰化に関する研究は見当たらない．

胞の石灰化との相関を調べた結果，0.8 J/cm2UVA のこうした背景の下，NB1細胞に種々の照射量の UVA

照射後2時間という比較的短い培養時間で NB1細胞を照射後，培地の Ca/Mg比を生理的バランス（Ca/内ALP活性の上昇が見られ，照射後 4‒6時間は高いMg＝2）に調整した培地で1晩培養したところ，UVA活性を維持したのち，8時間後に活性が急激に低下

未照射ではほとんど発現しなかった細胞の石灰化がした．この結果からNB1 細胞に対するUVA照射のUVA照射により顕著に誘導されることを見出した．

影響は，まず細胞内の ALP活性の上昇を招いて NB1

またこの NB1 細胞の石灰化現象は，0.8 J/cm 以下の細胞の石灰化が誘導されることがわかった．またこ照射量では照射量依存的に石灰化度の上昇は見られの作用が，照射 4‒6時間後まで高く維持されることたが，それ以上照射量を増量しても石灰化度の上昇も判明した．最後にUVA照射で誘導されるNB1細は見られなかった．このことから，生理的条件で培胞の石灰化に対するDSWの添加効果を調査した結養される NB1 細胞でも UVA 負荷により石灰化が誘果，DSW は添加濃度に依存してNB1細胞の石灰化導されることが示唆された．併せて，UVA 照射で誘を抑制することが明らかとなった．さらにその抑制導されるNB1 細胞の石灰化の程度には制限因子が存効果は，比較対照に用いたSSWよりも高かった．

在すると推察された．これまで軟部組織の石灰化にDSW とSSWとの間に見られた石灰化抑制効果の差

おいては，Caおよびリン酸の濃度が関係している異については，DSW は塩類含有量も含めて高い安ことが知られていることから（竹谷，2010），本報定性が知られているが（高橋，2000），SSW は降雨のUVA照射により誘導される NB1 細胞の石灰化にによる変動が考えられるので，部分的には各々の水おいても，これらの成分の濃度が制限因子となってに含まれる Mg含有量の相違が推察される（Tableいる可能性が考えられる．したがってUVA照射後1）．しかしながら，DSW 中にはいまだ検出されての NB1細胞を本報よりも高い濃度の Ca やリン酸をいない有機物を含めた微量成分の種類と濃度に起因含有する培地で培養すると，石灰化度がより上昇すする特異的な相互作用が影響している可能性もあるかもしれない．また並行して調査したUVA照射り，海水中に含まれるMg濃度だけでは説明できなが細胞活性に及ぼす影響については，その照射量にい可能性も推察される．したがって DSW の石灰化逆相関して細胞活性が低下したことから，UVA 照射抑制作用の本質成分の究明については今後の課題とによるNB1細胞の石灰化は細胞活性と逆相関の関係考えられる．またUVA照射で誘導されるNB1細胞にあることがわかる．斉藤・西山（2005）は，細胞の石灰化に対するDSW の抑制作用機序の解明にあの老化に加えてMg不足が重なると細胞内にCaが蓄たり，本報で判明したUVA照射後の早い段階で活積してアポトーシスを引き起こすと報告しており，性が上昇する NB1細胞内 ALP活性に対する DSWの本報のUVA照射による石灰化と細胞活性低下の逆影響について，残念ながら観察する機会を逸した．

相関の関係も，UVA 照射により炎症反応が惹起されこの点については今後検討する必要があると考えらて細胞内への Caの流入が促され，細胞内濃度が上れるが，Ca/Mg比の増加に伴うNB1細胞の石灰化に昇するに伴い，アポトーシスが始まって細胞活性が際して，上昇する細胞内 ALP活性をDSWが抑制す

2

UVA 照射による線維芽細胞石灰化に対する海洋深層水の抑制効果ることをすでに見出していることから（山田ら，2016），UVA照射後に上昇する ALP 活性に対してもDSW が抑制的に作用したことにより，石灰化を抑制した可能性が推察される．最近，組織石灰化の研究は，石灰化細胞の骨芽細胞への分化（山口，1995）やリン酸トランスポーターの発現上昇（齋藤ら，2008）等の分子生物学的アプローチが盛んに行われている．UVA照射で誘導されるNB1細胞におけるDSW の石灰化抑制効果についても，分子生物学的なアプローチにより作用機序を解明し，DSWの石灰化抑制作用機序を詳らかにしたいと考えている．
本研究において，生理的条件のCa/Mg＝2であってもUVA 照射により NB1細胞の石灰化が誘導されること．またその石灰化現象の発現に伴って，細胞活性の指標となるミトコンドリアの機能が低下すること．さらに石灰化に大きく影響することがわかっている ALP活性が，UVA照射後の早い段階で上昇すること．そしてUVA照射で誘導される石灰化をDSW が顕著に抑制する現象を見出した．DSWの石灰化抑制効果は，SSWと比較して顕著に高かったことから，DSWはUVA照射で誘導される細胞石灰化に対する制御因子として活用できる可能性が示唆された．
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（2017年4月14日受付；2017 年6月22日受理）