博士（医学）岸本拓磨
学 fi論 it
題名Defec
ts in str
uctural integrit
yofergosteroland t
heCdc50p‑Drs2p putative phospholipid translocase cause
accumulation of endocytic membranes onto which actin
patches are assembled in yeast（エルゴステロールの構造異常とC
dc50
−Drs2
リン脂質輸送体の欠損は、
酵母 細 胞 内 で エ ンド サ イ ト ー シス 由 来 膜 構 造の 蓄 積 とその上でのアクチン細胞骨格の形成を引き起こす）

学 位 論 文 内 容 の 要旨

緒言
脂質 は生体 膜の構 成成分 や生体 内の栄 養要素としての重要性に加え、細胞増殖、細胞分化、細胞死 、発生 、老化 などの 重要な 生命現象 に機能的に関わっている。そのため、細胞の正常な活動には 、脂質 の生合 成、代 謝、細 胞内輸送 の制御が正しく行われることが必要であり、その破綻は種々 の疾患 を引き 起こす ことが 明らかと なって いる。 そのよ うな疾 患のー っに、 ヒ卜18番常染
色 体 上に 存 在 す るNPC1遺伝子 の欠損 によっ て引き 起こさ れる遺 伝疾患 ニーマ ンピック 病C型が挙げ られる 。この 疾患は 細胞内 で脂質の 細胞内輸送に異常が生じ、コレステロールやスフィンゴミエ リン等 の脂質 群が細 胞内に 蓄積され ることにより、肝臓や脾臓の肥大や、脳神経系が破壊される ことに よる神 経傷害 の症状 を生じる 。また 、アル ツハイ マー病では、アミロイドp蛋白質の脳内 異常凝 集と蓄 積によ って引 き起こさ れることがこの疾患の原因のーっとされるが、この異常凝 集 は神 経 細 胞 膜糖 脂質 のGM1ガン グリオ シドと 結合す ること によっ て開始す る。こ の結合 は細胞 膜のコ レステ ロール 濃度に 大きく依 存していることから、脂質の代謝と細胞内輸送がこの疾患に おいて 重要な 決定因 子であ ることが 予想される。このように疾患における細胞内脂質の関与は明 らかで あり、 そのた め、細 胞レベル や分子レベルで脂質の機能と動態を解明することが、疾患原 因の解 明に必 要不可 欠であ る。
現在 までに 、脂質 が関わ る細胞 内現象 のうち、生理学的意義が完全に解明されていないものとして 細胞膜 におけ るりン 脂質の 非対称分 布が挙げられる。一般に動物細胞では、細胞膜二重層におい てホス ファチ ジルコ リン、 スフイン ゴミエリンが外層に多く分布し、ホスファチジルエタノール アミン やホス フんチ ジルセ リンなど のアミノリン脂質が内層に多く分布している。この現象
は、 外層か ら内層 への脂 質の輸 送と内層 から外層への輸送が、バランスよく制御されることによって 維持さ れてい ると考 えられ ている。 このりン脂質を能動的に輸送する分子のーっとして、リン 脂 質 を 外 層 か ら 内 層 へ 輸 送 す る ア ミ ノ リ ン 脂 質 ト ラ ンス ロ ケ ー スが 同 定 さ れて い る 。
本論 文では 、アミ ノリン 脂質ト ランス ロケースにより制御されたりン脂質膜非対称分布の生理機能 の一端 を解明 するに あたり 、分子遺 伝学的解析が速やかにかつ明確に行うことができる出芽酵母 Saccharomycescerevisiaeをモデ ル生物 として 使用した 。出芽 酵母に は、遺 伝子配 列からアミ ノリン 脂質卜 ランス ロケー スである と推定 される P型ATPaseが5種類(DRS2、DArF1、DAlF2、ー 635―

DNF3およ ぴNE 01)確 認され ている 。本論 文では 、そのう ちDrs2pと そのサ ブユニ ツ卜と して機能 するCdc50pか らなる Drs2p―Cdc50p複合体を 解析対象とし、この複合体が制御するりン脂質膜非 対称性 が示す 生理学的 意義の 解明を 試みた 。
結果
リン 脂質膜 非対称 分布の 生理機 能を解 明する ために 、Drs2pが局 在部位 に輸送されないcdc50欠損 変異と 遺伝学 的相互 作用を 示す遺伝子変異を探索した。ぞの結果、エルゴステロール（ヒト細胞 のコレ ステロ ールに 相当） 後期合 成経路の 遺伝子 変異とcdc50欠損変異が同時に起こることによ って致 死とな ること を明ら かにした。後期段階のエルゴステロール合成酵素欠損変異株は致死に はなら ないが 、構造 が異常 なステロールが蓄積されることが報告されている。しかし、本論
文で 明らか にした ような 遺伝学 的相互作用の報告は現在までになされていない。すなわち、膜を構成 する脂 質本体 （ステ ロール ）と動態（リン脂質膜非対称性）の両者が異常になることが、どのよ うに生 命現象 に関与 するか は明らかにはなっていない。この致死性の原因を解明するため、
エル ゴステ ロール 後期合 成経路 の遺伝子のーつERG3を欠損し、ガラクトースプロモーター発現制
御CDC5ajt!伝子を 持った cdc50 erg3
条件的二重欠損変異株を作製し、細胞学的解析を行った。電子顕 微鏡観 察では 、cdc50 erg3二重欠損変異株の細胞内には通常観察されない大きな膜構造が蓄積していた。この変異株では、細胞膜一初期エンドソームーゴルジ体―細胞膜の経路（エンドサイトーシ ス・リ サイク リング 経路） をサイクルするSnclp（v−SNARE)が細胞内に蓄積していたことから、 電子顕 微鏡観 察で見 られた 異常膜構造がエンドサイトーシス・リサイクリング経路の異常によっ て生じ たもの である 可能性 が考えられた。また、その異常膜には通常細胞膜に多く存在するステ ロール も存在 してい た。こ れらの結果から、リン脂質の非対称性とステロールの構造が同時に異 常にな ること によル エンド サイトーシス・リサイクリング経路が異常になり、細胞内ステロール輸送にも異常が生じていることが確認された。
また 本論文 では、 cdc50げぴ 二重欠 損変異株 が細胞 極性を失い、アクチン細胞骨格が異常局在して いるこ とも見 いだし た。出 芽酵母において脂質の異常がアクチン細胞骨格に影響を及ばしている 例は少 ないこ とから 、この 変異株におけるアクチン細胞骨格の詳細な解析を行った。その結果、cdc50 e．rぴ二重欠損変異株では、通常細胞膜直下にしか存在しなぃアクチン繊維が細胞内に形成 されて いるこ とが確 認され た。この変異株ではアクチン繊維の形成に関わる因子も細胞内アクチ ン繊維 と共局 在して いた。 これらの結果から、細胞内アクチン繊維は単にアクチンの非特異的な 凝集に よって できた もので はなく、細胞内でアクチン繊維を形成する機構が働いて形成されたも のであ ること が示唆 された 。さらに、この細胞内アクチン繊維は、上述の細胞内に蓄積したSnc1と 共局在 を示して いた。 この結果から、細胞内にアクチン繊維が形成される機構について次のよ うな仮 説が立 てられ た。す なわち 、（1） エンドサ イトーシス・リサイクリング経路に異常が生 じ、ス テロー ル輸送 の異常 を引き 起こした 。（2） その結果、ステロールが細胞内の膜構造に蓄 積し、 細胞内 膜構造 の脂質 組成が 細胞膜に 類似し たものに変化した。（3）細胞内内膜構造の脂 質組成 の異常 により 通常で は観察 されない アクチ ン繊維 の細胞 内形成 という異常現象が引き起 こされ た。以 上の結 果から 、リン 脂質の非 対称性 とステ ロール の構造 がエンドサイトーシス・ リサイ クリン グ経路 を制御 することにより、アクチン細胞骨格の形成制御に関与している可能性が明らかとなった。
考察
本 論文に よって 、膜を 構成す る脂質 本体（ス テロール）と動態（リン脂質膜非対称性）とが同 時に異 常1こな ること によって細胞内脂質環境に異常が生じる可能性が示唆された。また、細胞 内脂質 環境の 異常に よって、 生命現 象の異 常（アクチン細胞骨格の異常な形成）が引き起こ
さ れるこ とも示 唆され た。高等 生物に おいて もりン脂質膜非対称性がおそらく同様の機構で機能 し てい ると考 えられ 、本論 文で得 られた 知見は 、今後 ヒトの細 胞にお いて脂 質の細 胞内動態 を 理解 するた めのき っかけ となり うる。 リン脂 質膜非 対称性を 含め脂 質の細 胞内で の動態ー 636ー

や機能を解明することは、種々の疾患のメカニズムを解明するために不可欠な過程であり、本論文で明らかにした知見がそこでも役立っことが期待される。

ー 637―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 野 口 昌 幸
副 査 教 授 渡 辺 雅 彦
副 査 教 授 田 中 一 馬

学位論文題名Defectsinstructuralin
tegri
tyo
fergosterolandtheCdc50p‑Drs2p putative phospholipid translocasecause
accumulation of endocytic membranes onto whichactin
patches are assembled in yeast（エルゴステロールの構造異常とC
dc50―Drs2リン脂質輸送体の欠損は、
酵 母 細 胞内 で エ ン ド サ イト ー シ ス 由 来膜 構 造 の 蓄積とその上でのアクチン細胞骨格の形成を引き起こす）

細 胞膜に 含まれ ている りン脂 質は脂質二重層の外層と内層で非対称に分布している。この現象
は 、リン 脂質輸 送体に よる内 外層の輸送が、正常に制御されることにより維持されている。現在
ま でに、 リン脂 質輸送 体とし てアミノリン脂質（ホスファチジルエタノールアミンやホスファチジ ルセリ ン）を 外層か ら内層 へ輸送するアミノリン脂質トランスロケースが同定されている。しか し、脂 質二重 層間に おける りン脂質輸送の制御機構と生理学的意義はまだ完全には解明されてい ない。
ア ミノリ ン脂質 トラン スロケ ースに より制 御される りン脂 質膜非 対称分 布の生 理機能の一端を 解明す るにあ たり、 分子遺 伝学的解析が速やかにかつ明確に行うことができ、分子細胞生物学
領 域で多 くの研 究室で 用いら れている出芽酵母をモデル生物として使用した。本研究は、出芽酵
母 に お い てア ミ ノ リ ン脂 質 ト ラ ンス ロケ ースで あると 推定さ れるP型 ATPaseのー つ、Drs2pとそ のサブ ュニッ トとし て機能 するCdc50pか らなる Drs2p−Cdc50p複合体を解析対象とし、この複合 体 が 制御 す る りン 脂 質 膜非 対 称 性 が示 す 生 理学 的 意 義の 解 明 を目 的とし ている。
本 研究に おいて 、エル ゴステ ロール（ヒト細胞のコレステロールに相当）後期合成経路の遺伝
子 変 異 erg3と Drs2pが 局 在異 常 を 示 すcdc50欠 損変異 が同時 に起こ ること によっ て致死 となる
こ と を 明 らか にし た。ガ ラクトー スプロ モータ ー発現 制御CDC50遺伝子を 持った erg3欠損 変異株 （cdc5Uerg3二 重欠損 変異株 ）を作 製し、 その表 現型を解析した。CDC50遺伝子発現抑制後、細 胞増殖 停止が 確認さ れる時 間におい て、cdc50erg3二重欠 損変異 株の細 胞内に は通常観察され ない大 きな膜構造の蓄積が見られた。cdc50欠損変異株では、細胞膜―初期エンドソーム―ゴルジ 体一細 胞膜の経路（エンドサイトーシス・リサイクリング経路）の輸送低下が見られる。cdc50― 638ー

erg3二 重 欠 損 変 異 株 では 、エ ンド サイ ト ーシ ス・ リサ イ クリ ング 経路 をサ イ クル する Snclp（ v− SNARE)が 、cdc50欠損 変異株以上に細胞内に蓄積し ていたことから、erg3欠損 変異がcdc50欠損変異 による輸送異常を悪化させて いると考えられた。この結 果から電子顕微鏡観察で見られた異常膜 構造がエンドサイトーシス・ リサイクリング経路の異常 によって生じたものである可能性が考え られた。さらに、異常膜構造 には通常細胞膜に多く存在 するステロールが蓄積していたことを確 認した。
生体膜 に含まれている脂質群はアク チン細胞骨格を制御してい ることが示唆されている。ステロ ール が異 常 膜構 造に 蓄積 する cdc50 erg3二重欠損変 異株では、アクチン構造が異 常局在してい るこ とが 確 認さ れた 。さ らに 共 焦点 レーザー顕微鏡 による詳細な解析によりcdc50 erg3二重欠損変異 株では、通常細胞膜直下にし か存在しなぃアクチン構造 が細胞内に形成されていることが確認さ れた。
アクチ ン構造は、脂質との相互作用 により細胞膜直下に局在している。細胞内アクチン構造は、細 胞内 に蓄 積 した Snclと共 局在 を 示し ていた。このこ とから、cdc50 erg3二重欠損 変異株で見られた細 胞内アクチン構造が、エンド サイトーシス・リサイクリ ング経路の異常により生じた異常ステロ ール膜構造上に形成されたと 考えられた。
本研 究に よ り、リン脂質 膜非対称性を制御していると 推定されるDrs2pーCdc50p複 合体の局在とステロ ールの構造が同時に異常にな ることにより、エンドサイ トーシス・リサイクリング経路の異常と 細胞内ステロール輸送の異常 が生じることが明らかとな った。またこの状況下では、細胞内に異 常な膜構造が蓄積したことか ら、生体膜環境が異常であ る可能性が考えられた。これらの結果よ り、リン脂質膜非対称性の制 御とステロールの構造が生 体膜環境の維持に関与することが示唆さ れた。さらに、細胞内の異常 膜構造上にアクチン構造が 形成されたことが確認された。
し たが って 、生 体膜 環境 がア クチ ン 細胞 骨格 にも 影響 を及 ぼす可能性が示唆された。
口頭発 表において、副査の渡辺教授 よりCdc50−Drs2複合体の輸送活性に関する質問があった。
続いて副 査の田中教授より脂質が及ば す蛋白質の活性制御の可能 性について質問があった。また主査の野 口教授より脂質異常疾患にお ける細胞骨格制御機構に関 連した質問があった。これらに対 し て 申 請 者 は 、 自 己 の 研 究 結 果 と 文 献 的 知 識 を基 に誠 実に 、概 ね 妥当 な回 答を 行 った 。
本研究 は、膜を構成する脂質本体（ ステロール）と動態（リン 脂質膜非対称性）による生体膜環境制御 メカニズムの一端を明らかに したものとして高く評価さ れ、今後、脂質異常による疾患発症メカ ニズムの解明に役立っ可能性 が期待される。
審査員 一同は、これらの成果を高く 評価し、大学院課程におけ る研鑽や取得単位なども併せ申請 者が 博士 （医 学） の学位 を受 ける のに 充分 な資 格を 有す るものと判定した。

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