３ 研究内容

（別紙）

研究課題名
抗生物質によるマダイ幼魚の腸内細菌叢と臓器プロテオームへの影響評価(Effects of antibiotics on gut microbiota and proteome of organs in young
red seabreams ( Pagrus major ))共同研究者名
代表者：飯田緑（九州工業大学大学院）

分担者：前田和勲（九州工業大学

若手研究者フロンティア研究アカデミー）

研究目的
健常成人の腸内細菌叢は安定性が高い。抗菌性薬使用による腸内細菌叢攪乱は、全身の免疫系を過剰に活性化して自己免疫疾患などの炎症を悪化させる。魚養殖場では飼料に抗生物質が添加されているが、抗生物質の魚類腸内細菌叢や免疫系への影響は明らかにされていない。そこで本研究計画では、マダイ幼魚にオキシテトラサイクリンを経口投与し、定量プロテオミクスと腸内細菌叢解析を用いて抗生物質投与時の腸内細菌叢の変動が免疫に関連する臓器に与える影響およびそのメカニズムを明らかにすることを目的とした。

研究内容
本年度は、オキシテトラサイクリン（以下 OTC）を投与したマダイ幼魚を対象に、肝臓タンパク質発現量の変化を調べた。具体的には以下の３点を実施した。

まず、OTC 投与群と非投与群それぞれにおけるマダイ臓器内タンパク質の網羅的な発現量を明らかにするために、iTRAQ ® 試薬を用いてペプチドのＮ末端およびリジン残基に安定同位体標識し、nano-LC と MALDI-TOF/TOF を用いてプロテオーム解析を行った。次に、対照群と比べて OTC 投与によって発現量が変化したタンパク質を同定した。さらに、発現量が変化したタンパク質の機能的な特徴をとら えるために
Gene ontology（GO）解析とパスウェイエンリッチメント解析をおこなった。

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研究成果
iTRAQ を用いた質量分析の結果、229 のタンパク質を同定することに成功した。

まず、どのようなタンパク質が発現変動を示したのかを調べる
ため、同定した 229 のタンパク質を対象に、傾向検定（Jonckheere-Terpstra test）を行った。この結果、オキシテ
トラサイクリンの投与によってマダイ肝臓では、U2 small
nuclear RNA auxiliary factor2a（u2af2a）などの 12 種類のタンパク質がオキシテトラサイクリンの投与濃度依存的に発現変動を示すことが明らかとなった（Table 1 および Fig.1）。

Fig.1 傾 向 検 定 で 有 意 に 発 現 変 動 し た タ ン パ ク 質 の 発 現 量 。 回 帰 直 線が上向きの場合は濃度依存的に発現量が増加したタンパク質、下向きの場合は濃度依存的に発現量が減少したタンパク質を示 す。

Table 1 傾向検定で有意に発現変動したタンパク質
UniportID

SymbolGene Nameprotein phosphatase 2, regulatory subunit A,
alphahydroxyacyl-CoA dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA
thiolase/enoyl-CoA hydratase (trifunctionalprotein), alpha subunit ap -valuep -value(Increase) (Decrease)

log2FC(Low/Cont)

log2FC(High/Cont)

0.03

0.11

0.02

0.99

0.15

0.30

0.02

0.98

A5PMV7

ppp2r1aA7YT47

hadhaaB5DDE8rps8bribosomal protein S8b0.01

-0.03

0.96

0.04

Q4KMI5

u2af2aU2 small nuclear RNA auxiliary factor 2a-0.08

-0.50

0.99

0.01

Q5RG12hsp90aa1.2

heat shock protein 90, alpha (cytosolic), class A
member 1, tandem duplicate 2

0.01

-0.10

0.99

0.01

Q6P5M3rps9

ribosomal protein S9

0.09

0.25

0.02

0.98Q6PC69

rpl10aribosomal protein L10a-0.12-0.170.970.03

Q6PHI7pahphenylalanine hydroxylase

0.08

0.210.020.99

Q6TLG8rps3

ribosomal protein S3(rps3)

0.05

-0.04

0.99

0.02

Q7ZUY9

stt3a

STT3A, subunit of the oligosaccharyltransferase
complex (catalytic)

0.14

0.17

0.04

0.96

Q7ZVG1acaa2acetyl-CoA acyltransferase 2

0.18

0.33

0.02

0.98

got2b

glutamic-oxaloacetic transaminase 2b,
mitochondrial-0.05-0.080.95

0.05

Q7ZWF53 / 5次に、これらの発現変動タンパク質が生体内でどのような機能を持つのかを Geneontology（GO）解析および、パスウェイエンリッチメント解析によって調べた。 GO
解析の結果、タンパク質翻訳に関わる遺伝子が発現変動することが明らかとなった（Table 2）。また、KEGG パスウェイエンリッチメント解析を行った結果、（タンパク質翻訳機構）やリボソームに関わる遺伝子（rps8b, rps3, rps9, rpl10a）が多く発現変動していることが明らかとなった （Table 2 および Fig.2）。

Table 2 エンリッチメント解析の結果
TermCountGenesp -valueq -value

Biological Process (BP)
GO:0006412~translation

4rps8b, rpl10a, rps3, rps9

0.001

0.038

GO:0005840~ribosome

4rps8b, rpl10a, rps3, rps9<0.001

0.003

GO:0030529~intracellular ribonucleoprotein complex

4rps8b, rpl10a, rps3, rps9<0.001

0.003

GO:0022627~cytosolic small ribosomal subunit

3rps8b, rps3, rps9<0.001

0.002

4rps8b, rpl10a, rps3, rps9<0.001

0.01

4rps8b, rpl10a, rps3, rps9

0.002

0.07

Cell Component (CC)

Molecular function (MF)
GO:0003735~structural constituent of ribosome
KEGG Pathway
dre03010:Ribosome

Fig.2 KEGG パ ス ウ ェ イ エ ン リ ッ チ メ ン ト 解 析 に よ っ て 優 位 に 変 動 し て い た リ ボ ソ ー ム パ ス ウ ェ イ に 関 わ る 遺 伝 子 。 左 上 はLarge subunit、 右 上 は Small subunit を 示 し て い る 。 色 付 き の 四 角 は 傾 向 検 定 で 有 意 に 発 現 変 動 し て い た タ ン パ ク 質 を 示 す（ 濃 い 灰 色 は 濃 度 依 存 的 に 発 現 量 が 増 加 し た タ ン パ ク 質 、 薄 い 灰 色 は 濃 度 依 存 的 に 発 現 量 が 減 少 し た タ ン パ ク 質 ）。

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テトラサイクリンは原核生物のアミノアシル -tRNA の結合を阻害することによりタンパク質の翻訳を阻害し、抗生物質として働くことが知られている。本研究によって、真核生物であるマダイ幼魚の肝臓においても、オキシテトラサイクリンがリボソーム関連タンパク質の発現量を変化させることにより、 翻訳機能に影響することが示唆された。

成果発表
これらの成果については、今後、環境毒性学会および環境ホルモン学会等で発表を予定している。

今後の問題点本研究では、タンパク質の網羅的解析を行うことを目的としていたが、同定されたタンパク質は 200 あまりと少なかった。そこで、次期ではゼブラフィッシュ以外の硬骨魚類のリファレンスを用いて同定可能なタンパク質の増加を 試みる。また、今年度実施できなかった腸内細菌叢の解析については、沿岸環境科学研究センター生態系解析部門

鈴木聡教授の研究室で実施され成果発表される予定である。

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