博 士（ 水産科 学） /弋ゲンダカスッジャ

ドミ ニク

学位 論 文 題 名Characterization and applicati
on ofabacteriocin，Pediocin Iz3.13, produced by Pediococcus pe7z
tosaceus
Iz3.1
3i
solat
ed om Japanese seafood（水産食品由来Pediococcuspen
tosa
ceusIz3． 13の産生する
ノヾクテ1JオシンPediocin Iz3.13の特性とその応用）

学位論文 内容の要旨World fisheries production is continuing to grow as seafood consumption booms globally. With

expanding global trade and consumption, the risks and consequences of foodbome disease outbreaks increase

More attention should therefore be given to food safety. Currently, several foodborne disease outbreaks areassociated with consumption of ill‑prepared or ill‑handled seafood. Notable outbreaks include those caused byVibrio spp, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes, histamine (scombroid) poisoning, and Noroviruses(Norwalk viruses). These food pathogens are especially important for Japan where seafood is often consumedraw

As noted above, the culture of eating raw or uncooked seafood has numerous food safety risks. To secure

the safety of seafood one or more of three options can be used; i) prevention of acc
ess ofpatho
gens tothe foods,ii) inactivation of pathogens that access the food, and iii) preventionor sl
owingdown of growt
h of pathoge
ns thatmay not been inactivated. Combination of more than one of the above options to secure safety of a foodproduct isreferred to as &hurdle technology'. Hurdle technology refers to the intelli
gent combina
tion ofbarriers (hurdles) tosecure safety, stabi
lity,sensor
y, nutritiveand ec
onomicaspec
ts of afoodproduct.

Recently hurdle technology applications employing bacteriocin‑producing bacteria have been the focus

of intense research activity. Bacteriocins are antimicrobial proteins produced by members of the domainBacteria.
‑ 948 ‑

Bacteriocin‑producing bacteria possess genetic mechanisms to produce, modify and export bacteriocins as well asgenetic mechanisms to avoid self destruction by the bacteriocins produced. The actual role of bacteriocins innature remains unclear. It is hypothesized that bacteriocin‑producers have competitive advantage over bacteriathat do not produce bacteriocins, but this has not been convincingly demonstrated. Nevertheless food grade

bacteriocin‑producers are curr
ently used inshelf‑lifeextensi
on andfoodsafetyapplications

The aims of this study on Japanese seafood products were to find, characterizeand apply bac
teriocins andthe bacteria that produce them. Bacteria from Japanese seafood were isolated and screened, for antimicrobial

substance (A.M.S) producing strains. Subsequently isolated A.M.Ss produced were analyzed and a strain that

produced a bacteriocin‑like substance was selected. The strain was identified and its bacteriocin characterized.

Furthermore, in an effort to widen its spectrum of application in the food indu
stry,optimu
m bacteriocinprodu
cing

conditions for the strain were sought. With all this information an appropriate hurdle technology system

employing the strain was designed to control a pathogen related toseafood

A total of 19 samples of 4 different types of Japanese seafood products (izushi, shiokara, and surimi)

were analyzed for A.M.S‑producing bacteria. Strain Iz3.13 isolated from izushi was found to produce an A.M.SStrain Iz3.13 was identified as P. pentosaceus by morphological, biochemical characteristics and 16S rDNA

sequence similarity. Its ABS inhibited Listeria and C. botulinum. The ABS was inactivated by a‑chymotrypsin

and proteinase K, but not by catalase, lipase, or a‑amylase, indicating that the ABS was a bacteriocin. Thebacteriocin was stable at lOOoC for 15 min, and pH 2 t0 8. Partial analysis of the purified bac
terioc:in byEdman

degradation showed a 22‑amino acid residue closely related to Pediocin AcH. The ped A operon sequence ofplasmid DNA regulating Pediocin Iz3.13 production was 100% identical to that of P. acidilactici PACl.0 that

produces Pediocin PA‑1. The bacteriocin was therefore named Pediocin h3.13. This is considered to be a firstreport of a bacteriocin‑
producing strain being isolatedfrom i:ushi

Mode of action of the Pediocin Iz3.13 against L. monocytogenes was bactericidal and bacteriolytic949 ‑Production of Pediocin Iz3.13 was enhanced by coinoculation with sensitive strains, water soluble extracts ofbuckwheat, adjusting composition of growth media, and increased viscosity of the growth medium. Furthermore,

inhibitory activity of Pediocin h3.13 was enhanced by exp
osureof ind
icatorstrains t0 2% acet
ic acid l.5%NaCl.

In the presence of traditional antimicrobi
al agents like 2% aceticacid and l.5% NaCl,Pedio
cin Iz3.13 suppressed

re‑growth of L. monocytogenes and germination of C. botulinum spores. Moreover heat resist
ance ofC. botulinu
mspores that were exposed t0 2% acetic acid, 1.5% NaCl, and Pediocin Iz3.13 was reduced. Based on theseproperties a food safety appl
ication using Pediocin h3.13 was sought.

A hurdle technology system, combining Pediocin h3.13, Nisin, pectin andsalt w
as successfully used tocontrol post‑processing contamination of soy‑seasoned salmon roe with L. monocytogenes. The hurdle technology

system was effective even under temp
erature abuse andit didnot si
gnificantlyaffectorgano
lepticaccep
tability ofthe soy‑seasoned salmon roe. According to epidemiological studies on L. monocytogenes in ready‑to‑eat raw

seafood products in Japan, one of the most wlnerable products is fish roe. Moreover in the ca
se of salmonroe,

raw material can only be harvested in autumn and must therefore be refrigerat
ed forextend
ed periods increasing

the risk of post‑processing contamination with psychotropic L. monocytogenes. Furthermore, salmon roe isextremely heat‑labile and so conventional thermal methods ofpasteu
rization cannot beapplie
d without sa
crificingorganoleptic attributes of the fi
nal product.Severa
l unsuccessful attempts have been made to c
ontrolgrowthof L

monocytogenes in temperature‑abused salmon roe using bacteriocin‑mediated methods

In the hurdle technology system developed in this study, pectin played a vital role of creating asurface‑barrier to contamination. Pectin is a gellingagentand astabilizer. In ourstudy,bacter
iocinswerenot

added directly to the food product. Bacteriocins were delivered as part of the pectin‑barrier and therefore

remained at the foodsurfa
ce. S:ince ba
cteriocins w
ere atthe fo
od surface,interaction w
ith the foodmatrix(whichnormall
y leads to b
acteriocin degradation) w
as limited. Furthermore concentratingthe anti‑lis
terialbacter
iocin
sat

the food surface ensured that L. monocytogenes was eliminated as it tried to access the food matrix thus

950 ‑controlling post‑processing contamination. It must be noted that pectin did not significantly affect theorganoleptic acceptability of the roe samples.Thiswas because only athin layer ofthe seasoning wasneededto

prevent L. monocytogenes from accessing the food product. Any off‑odors that would have been created by thepectin were effectively masked by the strong flavor of the soy‑seasoning. Laboratoryprepar
ed roesampl
es werenot as good as a commercial productin ter
ms of texture.and appeara
nce, but thiswas thoughtto berelate
d to raw

material used rather tha
n the seasoning methods

This study is considered to be a first report of a non‑thermal bacteriocin‑mediated solution to L.

monocytogenes post‑processing contamination of soy‑seasoned salmon roe under temperature abuse conditions. It

is hoped that the bacteriocin produced by P. pentosaceus Iz3.13 can be used to secure the safety of ot
her raw

seafo
od delicacies

ー 951―

学位論 文審査の要旨
主 査 教
授 川 合 祐 史
副 査 教
授 吉 永守副 査 准 教 授 山 崎 浩 司

学位論文題名Characterization and application ofabacteriocm，
Pe
diocin Iz3．13，prod
ucedbyPe
diococcuspe
7zt
osacezt
sIz3． 13 isolated from Japanese seafood（ 水 産 食 品 由 来 Pediococcus pentos
aceus Iz
3． 13の産 生す るバ ク テ リ オ シ ン Pediocin Iz3.13の 特 性 と そ の 応 用 ）

低温増殖能と 持つL
isteria monocytogenes
は，水産加工食品に韜いても食中毒発生のりスクが存在 する ため ，極 めて 重要 な制御対象食中毒菌のひとっである。近年， 素材を活かした加工食品の需 要が 高ま り， 可能 な限 り加工処理を行わない食品が求められること から，食品の微生物学的安全 性を 十分 に確 保す るこ とが困難となりつっある。そこで，生物由来 の抗菌物質を利用したバイオプリザベーシ ョンを利用したハードル技術が注目されている。
そこ で本 論文 では ，水 産発酵食品から分離に成功した抗リステリア 活性およぴ抗ポツリヌス活性 を有 する 細菌 株(Iz3.13株） の微 生物 学的 特性 を調べるとともに， 本菌の産生する抗菌性物質の 特 性 を 詳 細 に 調 べ ， 食 品 中 で の 工 ． monocytogenes制 御 へ の 応 用 につ いて 検討 して いる 。
第1章 では ，様 々な 水産 加工 食品 から 抗菌 活性 を有する細菌の分離 を試み，水産発酵食品のひと っで ある ホッ ケい ずし から 抗 リス テリ ア活 性お よび 抗ボ ツリ ヌス 活性 を有 するI
z3.13株の分離 に成 功し てい る。 次に ，Iz3.13株の微生物学的一般性状および16SrDN
A塩基配列の相同性ならぴに系統関係に ついて検討し，本株が乳酸球菌のPe
diococcus pentosaceusであると明確に同定している。さらに ，P pentosaceus Iz3.13株の産生する抗菌性物質の酵素感受性，耐熱性およぴ耐pH性等の特性を調 べ，本物質がタンパク質性のバクテリオシン(PediocinIz3.
13と命名）であることを証明している 。その後，Pediocin Iz
3.
13の精製を試み，その部分アミノ酸配列とマススペクトル
か ら， 既知 のPediocin PA‑1と極めて類似 し，バクテリオシンの分類クラスIIaに属するものであ― 952−ることを明らかにしている。一方 ，Pediocin Iz
3.
13
産生の構 造遺伝子を決定するため，Pediocin
Iz3.13
非産生性変異株(Iz3.13Bac，株）を作成し，構造遺伝子がプラスミド上に存在することを推察し，既知のPe
diocin P
A‑1構造遺伝子から設計されたPC
Rプライマーによって，PediocinIz
3.13構造 遺伝 子 の部 分配 列を 決定 し， Pedioc
in Iz3.13の アミ ノ酸配列がPacidilacticiの産生するP
edioc
in PA‑1と一致することを証明している。
第2章では，P
ediocin Iz
3.
13の ムmonoc
ytogenesに対する抗 菌機作を検討し，本バクテリオシンがP
ediocin PAー1と同様に工．monocytogenesに対して殺菌的かっ溶菌的に作用することを明らかにしている。さらに，ポツリヌス菌芽胞に対しては，ハードル理論に基づき本バクテリオシンと1.
5％NaCIおよ び 2％ 酢酸 によ る酸 ショ ックを複合的に利 用することによって耐熱性を顕著に低下させられることを示している。次に，PpentosaceusIz
3.13
株によるPediocinIz
3.
13の産生条件を検討し， 産生 量が培養液の栄養成分組成に大きく影響を 受けることを示すとともに，培養液の粘度の高い場合に産生量が増えることも 明らかにしている。
第3章では，P
ediocin Iz
3.
13の水産食品への応用について検討し，P
ediocinIz3.
13，NisinAとベクチ ンを 混 合し た粘 性の ある 特殊 な調味液でサケいくらを調味することで，人 為的に接種（105CFU/g)
し た サケ いく ら中 の工 ．monocytog
enesが冷 蔵保存中に検出限界未満（くl02 CFU/g)まで減少 し， その後貯蔵中を通して検出されなぃこと， また官能的にも満足するものが得られることを 示 し ， バ ク テ リ オ シ ン と ぺ ク チ ン を 利 用 し た 新 し い 食 品 微 生 物 制 御 法 を 提案 して い る。
以 上本 論文では，リステリア菌およびボツリヌス 菌に抗菌作用を示す細菌を水産発酵食品から初め て分 離 する こと に成 功し ，本 分離菌株(
Iz3.
13株）が両食中毒細菌に有効なバクテリオシンの産 生菌 であることを明らかにしている。また，こ のバクテリオシンの特性を詳細に調べ，その特性 を利 用 した 水産 食品 にお ける ムmonocytogenesの新しい制御方法を確立している。本研究の成果 は， 食中毒菌制御のための新規なバクテリオシ ン使用法に関する有益な情報を提供するもの
であ り， 今後の食品安全性向上技術の発展に大きく 寄与する点で高く評価できる。よって審査員
一 同 は 申 請 者 が 博 士 （ 水産 科 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 の あ る も の と 判定 した 。

− 953―