ISSN 0073 － 8751

NUMBER

32

INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKARESEARCH
COMMUNICATIONS

2018
公益財団法人

発

酵

研

究

所

RESEARCH COMMUNICATIONS

No.

32

2 0 1 8I N S T I T U T E F O R F E R M E N TAT I O N , O S A K A ( I F O )Published by
INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA
17 — 85, JUSO — HONMACHI 2 — CHOMEYODOGAWA — KU, OSAKA 532 — 8686, JAPAN公益財団法人発酵研究所

理 事 長

中濱

一雄

常務理事

樽井

直樹

理

事

熊谷
冨田
原島
本田

英彦
房男
俊
武司

鈴木
永井
古川

健一朗
和夫
謙介

監

事

下元

高文

藤井

智幸

評 議 員

今田 哲
北本勝ひこ
関 達治
武田 直久
土屋 英子

魚住 武司
下田 親
竹内 昌男
谷 吉樹
吉田 敏臣

目

次

発酵研究所の歴史 （6）～研究助成事業を中心に（ 2003.4 ～ 2017.6 ）～ ……………………………… 中濱一雄

1

第 12 回助成研究報告会の開催 …………………………………………………… 横田明

13

きのこ類培養形質の分類形質としての評価及びそれに基づく担子菌分類系の再検討……………………………………………… 前川二太郎

17

好熱性細菌が放出するウィルス様膜小胞と分泌型プロテアーゼ巨大分子複合体の関連解明そして応用への挑戦………… 渡部邦彦

29

真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明……………………… 高木博史

41

木材腐朽のシステム合成生物学への挑戦………………………………………… 中沢

威人

55

宏康

67

太郎，尾仲

宏康

73

ミコール酸含有細菌に対する放線菌二次代謝応答機構の網羅的転写解析……………………………… 浅水 俊平，尾﨑 太郎，菅井 佳宣，尾仲宏康

87

重イオンビーム変異導入法による Tsukamurella pulmonis への赤色色素非生産応答性 Streptomyces coelicolor 突然変異株の解析……………………………… 浅水 俊平，菅井 佳宣，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

95

複合培養を用いた新規アルカロイドの同定と生合成に関する研究……………………………………………… 尾﨑 太郎，浅水 俊平，尾仲

宏康

105

放線菌複合培養液からの抗生物質-シデロフォア連結化合物の発見……………………………………………… 浅水 俊平，菅井 佳宣，尾仲

宏康

117

ゴードスポリン作用機構の解析……………………………… 尾﨑■ 平成28年度大型研究助成■ 平成24年度寄付講座助成
微生物による「ものづくり」のイノベーション:
微生物の潜在能力発掘・応用のための新手法の開発と実践…………………… 尾仲
ミコール酸含有細菌死菌体は放線菌の二次代謝を誘導しない……………………………………………… 浅水 俊平，尾﨑

佳宜，浅水

俊平，尾仲

宏康

129

In vitro 再構成系を用いたゴードスポリン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計…………… 尾﨑 太郎，菅井 佳宣，浅水

俊平，尾仲

宏康

141

太郎，菅井

ゲノム探索による 32 員環新規チオペプチドラクタゾールの発見……………………………… 林
昌平，尾﨑 太郎，浅水 俊平，尾仲

宏康

155

新規ラビオネン構造の形成に関与するランチペプチド合成酵素の解析……………………………… 菅井 佳宣，尾﨑 太郎，浅水 俊平，尾仲

宏康

167

略号集…………………………………………………………………………………………

178■ 平成28年度 一般研究助成
微細藻類に寄生するクリプト菌門の多様性の解明と培養系の確立…………… 鏡味麻衣子

179

アーバスキュラー菌根菌の in vitro 培養方法の確立と日本産菌株の整備 …… 石田

孝英

179

群体性オオヒゲマワリ目藻類（緑藻綱）に近縁な単細胞性藻類の系統分類学的研究…………………………………………………………………… 仲田

崇志

180

人獣共通感染症原因菌 Escherichia albertii の遺伝子解析および表現型解析による分類……………………………………………………………… 村上

光一

181

東アジア地域における動物関連物質分解に関連する菌類（糞生菌類，アンモニア菌類）の研究 …………………………………………… 吹春

俊光

182

住宅室内真菌叢におけるアレルゲンの多様性に関与する真菌の系統分類学的検討…………………………………………………………………… 渡辺麻衣子

182

ヒト口腔領域における Veillonella 属細菌の系統分類とバイオフィルム形成に関する生態学的研究……………………………………… 眞島いづみ

183

質量分析法を用いたバクテリアのペプチドグリカンアミノ酸
構造決定法の開発…………………………………………………………………… 浜田

盛之

184

原生生物の細胞表面に共生する Treponema 属細菌のシングルセルゲノム解析…………………………………………………………… 雪

真弘

184

ナノアーキアの検出と培養株確立の試み………………………………………… 伊藤隆

185

微生物に見出した新規で多様なアミド結合形成酵素の網羅的解析と利用…… 大利

徹

186

糸状菌テルペノイドのコンビナトリアル生合成………………………………… 一瀬

博文

186

焼酎麹菌のクエン酸高生産機構の鍵となるクエン酸トランスポーターの同定と機能解析……………………………………………………………………… 二神

泰基

187

分裂酵母の細胞寿命制御に学ぶ健康長寿創薬の基盤研究……………………… 饗場

浩文

188

細菌のタンパク質アシル化修飾を標的とした代謝改変に関する研究………… 古園さおり

189

微生物による多様な金属酸化物の合成に関する研究…………………………… 山本

兼由

189

細菌による機能性プラズマローゲン生産の基盤となる酵素の分子機構の解明……………………………………………………………………… 金子淳

190Corynebacterium glutamicum のストレス応答性新奇遺伝子による TCA
回路鍵酵素の制御機構の解明……………………………………………………… 川崎寿191

グリセロール資化性乳酸菌 Enterococcus faecalis が行う
好気性乳酸発酵の発現条件の解明とそれを利用した
廃棄グリセロール再資源化技術の構築…………………………………………… 土肥

裕希

192

乳酸菌の代謝能を利用した有用機能性物質の生産とその応用に関する研究……………………………………………………………… 五十嵐康弘

193

植物病原卵菌 Phytophthora infestans のシスト発芽阻害物質の作用機序解析………………………………………………………………………… 谷

修治

193

禅

194

訓正

195

細胞性粘菌由来の低分子化合物 DIF をリードとした新規抗菌剤の開発 …… 久保原
乳酸菌由来リボソームによる細胞のリプログラミング機構…………………… 太田
絶対寄生性の植物病原糸状菌が分泌する宿主細胞壁分解酵素群の新規発見とセルロース系バイオマス糖化酵素高機能化に向けた基礎的研究…………………………………………………………………………… 八丈野孝

195

シロアリおよび糸状菌由来の植物バイオマス分解酵素の性質解明とそれらを利用したバイオマス分解系構築の試み………………………………… 有岡

学

196

難培養性 Dehalococcoides 属細菌の Sulfurospirillum 属細菌による新規増殖促進メカニズムの解明…………………………………………………… 内野

佳仁

197

カリウム輸送タンパクの人工進化によるセシウム蓄積微生物の創出………… 加藤創一郎

198

好熱菌の未知代謝経路の同定とグリセロールから有用光学活性物質を生産する新たな微生物発酵法の開発……………………………………………… 亀谷

将史

198

新規ポリマー生産のための均一なゴム低分子化システムの構築「ゴム廃棄物の再資源化を目指して」……………………………………………… 笠井

大輔

199

効率的な物質変換を行う低温菌シンプル触媒の構築に関する研究…………… 田島

誉久

200

リグニンからの基幹化合物生産の高効率化に必要なリグニン系フェノール類トランスポーターの解明……………………………… 政井

英司

201

海底下泥炭層からの未培養リグニン開裂微生物の獲得と構造生物学に基づくスーパー酵素創生による C6-C3 芳香族
バイオプラスチックモノマー生産系の開発……………………………………… 秦田

勇二

201

代謝改変赤色酵母を用いる未利用バイオマスからのアスタキサンチン・キシリトールの同時発酵生産プロセスの開発…………… 堀内

淳一

202

放線菌における二次代謝遺伝子を指標とした新たな分類基準の構築に関する研究……………………………………………………… 春成円十朗

205■ 平成27年度若手研究者助成IFO Res.Commun. 32
1-12, 2018

発酵研究所の歴史 （6）～ 研究助成事業を中心に（ 2003.4 ～ 2017.6 ）～
中

濱

一

雄＊

はじめに

した 2003 年 4 月から退任した 2017 年 6 月まで主導・実

財 団 法 人 発 酵 研 究 所（ Institute for Fermentation,

を記録として残しておくため，業務の担当者，会議（開Osaka，略称 IFO ）は，1944 年（昭和 19 年）に当時の催日，場所，出席者）等について，できるだけ詳細に記

内閣技術院と武田薬品工業株式会社との共同出資により載した．

施した研究助成事業を中心に記述する．この期間の事柄

設立され，微生物株の保存機関として国内外の微生物研

微生物株保存事業究を支援してきたが，2002 年 7 月に一般微生物株のコレクションと研究者を独立行政法人製品評価技術基盤機
構バイオテクノロジーセンター（ NBRC ）に移し，微生

一般微生物株（主にカタログに掲載されている株，約物株保存機関としての使命を終えた．2003 年 3 月に開15,000 株）は 2002 年に NBRC に移管していたが 5），危催された評議員会・理事会で，アドホック的に微生物の機管理のため，その 1 セットは引き続き IFO で預かった．

研究を対象とする研究助成事業および微生物に関する出

また，EPO 特許寄託株については，独立行政法人製品版物を刊行する出版事業を実施することが決定・承認さ評価技術基盤機構（NITE ）には特許株寄託機関がなかっれた．

たので，そのまま保管・分譲業務を継続した．一般微生

筆者は 2003 年 4 月に武田薬品創薬研究本部から財団

物株および EPO 特許寄託株の保存管理は吉田正憲事務法人発酵研究所に転職し，常務理事として勤務すること長が担当し，EPO 特許寄託株のデータベースの管理とになった．波多野和德前常務理事から引き継いだ業務は，分譲は佐藤邦子職員が担当した．

微生物株保存事業の継続および研究助成事業と出版事業2009 年 3 月に，これまで危機管理のため IFO で預かっの立ち上げであった．このうち，微生物株保存事業につていた一般微生物株の 1 セットも NBRC に全てを引きいては，2014 年 4 月に EPO 特許寄託株を独立行政法人

渡した．

製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD）

独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託セに移管した．研究助成事業については，2003 年 4 月にンター（ NPMD ）は，2004 年 4 月に国際特許微生物株

開始し，各種助成を実施して現在に至っている．出版事の寄託機関としての指定を受け，国際寄託当局としての業については，2003 年 4 月から開始し，出版委員会に地位を取得して特許微生物株の寄託業務を実施することよる企画，執筆者による執筆ののち 2010 年 12 月に「 IFOになった．そこで，IFO の EPO 特許寄託株を NPMD に

微生物学概論」を発刊した．

移管すべく NPMD と交渉を開始したが，いくつかの問

IFO の常務理事（所長）は，設立当時は中澤亮治，そ題があった．IFO はヨーロッパ特許庁（ EPO ）から認の後，佐藤喜吉，長谷川武治，飯島貞二，長谷川 徹，

定された特許株寄託機関であるが，NPMD はブタペス

竹内昌男，波多野和德の順で，筆者が 8 代目になる．こ

ト条約上の特許寄託当局であるため，移管したい特許寄のうち，長谷川武治 1），飯島貞二 2） ，長谷川 徹 3） ，竹内

託株の取扱が異なるとのことであった．また，IFO のよ昌男 4），波多野和德 5） がそれぞれの常務理事（所長）在うな民間の業務を国が引き受けることを問題視する意見

任中の事業について執筆し，「発酵研究所の歴史 1，2，3，

が NITE にあった．しかし，当時 NBRC の顧問を務めて4 ＆ 5 」 と し て 本 書（ IFO Research Communications ）いた波多野和德前常務理事の NITE との度重なる交渉のに掲載した．本稿では，筆者が IFO の常務理事に就任

結果，2014 年 4 月に EPO 特許寄託株（ 43 株）を国際特許寄託株として NPMD に移管できた．

中濱一雄
1944 年 10 月 7 日生まれ
1969 年 4 月に武田薬品工業株式会社に入社，研究所に配属
2003 年 4 月に武田薬品から財団法人発酵研究所 （IFO） に転職
2003 年 4 月から 2017 年 6 月まで IFO 常務理事
2017 年 6 月から IFO 理事長＊

研究助成事業微生物株保存機関としての使命を終えた IFO が何をなすべきか，関係者の間で熟慮の結果，研究助成が，こ
－1－

中

濱

一

雄

れまで実施してきた微生物株保存事業の精神を生かし，改善して事業を進めた．当事業の立ち上げとその後の運

微生物の研究の進歩発展に寄与できる事業であるとの結用について波多野前常務理事および坂野 勲顧問から多論に達した．2002 年 11 月 7 日に開催された臨時理事・

大な助言を受けた．また，研究助成事業を実施している評議員会で研究助成の概要が決定され ，2003 年 3 月 14

他の財団法人からも多くの助言を得た．IFO の研究助成日に開催された評議員会・理事会でアドホック的に微生を全国の微生物研究者に周知させるため，募集案内の掲物の研究を対象とする研究助成事業を実施することが承載をバイオ関係，微生物関係の学会のホームページおよ認された．そこで，筆者が IFO の常務理事として就任

び学会誌に依頼するとともに募集案内のチラシを関連すした 2003 年 4 月から当事業を開始することになった．

る学会，研究会，講演会で配布した．

5）

平成 15 年度（ 2003 年度）から研究助成を，平成 16

第 1 回目となる平成 15 年度（ 2003 年度）の研究助成

年度（ 2004 年度）から研究者招聘助成を実施し，その後，を募集したところ，研究課題 1 では 45 件の，研究課題 2

特定研究助成および寄付講座助成を追加した．研究助成

では 48 件の応募があり，初めてにしては予想以上の応事業を開始して 5 年を経たとき，当事業の内容について募があった．これは，微生物株保存機関のときの高い知

見直しをする必要が感じられ，後述する検討委員会を設

名度と信用のお蔭であると思った．選考委員会での選考

けて論議していただいた．その検討委員会の見直し案はについて，選考委員長である駒形和男東京大学名誉教授

IFO 理事長の森田 桂へ答申され，それに基づき平成 22および豊島久真男東京大学名誉教授から懇切なご指導を年度（ 2010 年度）から新たに一般研究助成，大型研究いただいた．選考委員会で選考を行い，研究課題 1 では

助成および若手研究者助成を開始した．

5 件，研究課題 2 では 2 件を採択し，採択された 7 件に研究助成事業を開始した 2003 年度から筆者が常務理

助成金を支給した．助成対象者から提出された 1 年目お事を退任した 2017 年度までに，研究助成，研究者招聘（留よび 2 年目の中間報告書を基に早石 修京都大学名誉教学）助成，特定研究助成，一般研究助成，大型研究助成授を委員長とする評価委員会で審査し，研究の進捗状況

および若手研究者助成で合計 367 件を採択した．また，および成果に応じて次年度の助成金の助成の可否および寄付講座助成を開始した 2008 年度から平成 2017 年度ま

助成金額の増減を決定した．
この研究助成は平成 21 年度（ 2009 年度）まで実施し，でに，10 件の寄付講座を採択した．これまでに採択した助成対象者および寄付講座は，IFO のホームページに

合計 51 件を採択した．
なお，2005 年からは，佐藤職員が微生物株保存事業

掲載されている．
各助成の研究成果は，助成研究報告会で発表され，助に加えて研究助成事業の業務にも携わることになった．

成研究報告集 IFO Research Communications に掲載されている．

2 ）研究者招聘助成

1 ）研究助成

生物研究者を支援することは国際協力としてたいへん意

東南アジアは微生物資源の宝庫であり，この地域の微研究助成は，2003 年 3 月 14 日に開催された評議員会・

義深い．2003 年 3 月 14 日に開催された評議員会・理事

理事会で承認されたので，2003 年 4 月から実施するこ会の承認を得て，東南アジアを含む途上国の研究者を支とになった．著者が IFO に着任したとき，引き継ぎ業援するための研究者招聘助成を平成 16 年度（2004 年度）

務として波多野前常務理事から研究助成の募集要項と申から開始した．助成対象は①微生物に関する研究を行う

請書を受け取っていたので，これを基に IFO のホーム目的で来日する外国人研究者，②微生物に関する学会でページで研究助成の募集を行った．本助成の研究課題は，発表する目的で来日する外国人研究者とし，研究課題は研究課題 1「微生物の分離，分類，保存に関する研究」

微生物の分類に関する研究とした．助成金額は，①の場を基本とし，これを活用・発展した形の研究課題 2「健康，合は最高 25 万円／月とし，②の場合は 1 名あたり 20 万環境に関与する微生物の研究」とした．助成金額は，研円を限度とした．受理した応募申請書を選考委員会で審究課題 1 では 1 件当たり年額 300 万円以内，研究課題 2

査し，支給総額が 600 万円以内（平成 23 年度以後は 1,000では 1 件当たり年額 500 万円以内で，助成期間は 3 年以万円以内）になるように採択し，助成金を支給した．後内とし，1 年目および 2 年目に提出される中間報告書を述する検討委員会の答申を基に，平成 22 年度（2010 年度）

基に評価委員会で評価し，次年度における助成の可否おから，本助成に③微生物に関する研究を行う目的で外国よび助成金額の増減を決定することとした．

へ留学する日本人研究者（最高 25 万円／月）を追加し，

IFO は研究助成事業に関してまったく未経験であった

研究者招聘・留学助成とした．

ので，当初は筆者と吉田事務長で試行錯誤しながら研究

平成 16 年度（2004 年度）から平成 29 年度（2017 年度）

助成の募集，選考，採択，助成金交付等を行い，毎年，まで，合計 35 件を採択した．このうち，第 10 回世界微－2－

発酵研究所の歴史（ 6 ） 〜 研究助成事業を中心に（ 2003.4 〜 2017.6 ）〜生物株保存会議（ 2004 年 10 月 10 日 －15 日，つくば市），

波多野和德，坂野 勲）が出席して会議を開催し，寄付

国際微生物連合 2011 年大会（ 2011 年 9 月 6 日－16 日，

講座助成に関する検討を行い，具体案をまとめた．その札幌市），第 64 回日本生物工学会大会（ 2012 年 10 月 23

具体案は 2008 年 3 月 13 日に開催された評議員会・理事

日－26 日，神戸市），第 14 回酵母国際会議（ 2016 年 9会で承認され，平成 20 年度（ 2008 年度）から寄付講座

月 11 日－15 日，淡路市）および第 11 回国際極限環境生助成を実施することになった．

物学会（ 2016 年 9 月 12 日－16 日，京都市）では，10 名

助成金額は 2.5 億円，助成期間は 5 年（その後，5.5 年）

以上の外国人研究者（発表者）に学会を通して助成をおとし，研究課題は特に設定せず，微生物全般とした．全

こなった．

国の国立大学，公立大学，私立大学の部局（研究科，学部，研究所）に向けて公募を行い，応募申請書を基に選3 ）特定研究助成考委員会で選考し，理事会で採択を決定した．採択され前出の研究助成の規模を大きくした助成（特定研究助

た大学に助成金を支給した．

成）を実施するため，委員会を設け，2006 年 7 月 19 日，

平成 20 年度（2008 年度）から平成 29 年度（2017 年度）

波多野和德委員長ほか 3 名の委員（木村 光，中瀬 崇，まで，京都大学（全学），北海道大学（農学研究院），九坂野 勲）で協議し検討を行い，IFO で提案した 2 つの

州大学（農学研究院），大阪大学（工学研究科），東京大

課題に沿った研究を行うグループを募集して助成するこ学（農学生命科学研究科），石川県立大学（生物資源工とにした．その結果，研究課題 1 として「我が国におけ学研究所），北里大学（北里生命科学研究所），首都大学

る微生物の多様性解析とインベントリーデータベースの東京（理工学研究科），東北大学（生命科学研究科）お構築－亜熱帯域と冷温帯域の比較から」を，研究課題 2

よび筑波大学（生命環境系）の合計 10 件を採択した．

として「琵琶湖の水質と環境浄化に関する研究－ヨシ帯

寄付講座設置期間中には，毎年，寄付講座の教員からとそこに生息する微生物が果たす役割の解明」を研究す

中間報告書を提出させ，これを選考当時の選考委員に送るグループが採択され，評議員会・理事会で承認された．

付している．中間報告書について選考委員からいただい

助成金額は年間 2,000 万円，助成期間は 3 年で，1 年目

たご意見・コメントをまとめて寄付講座教員に送付し，および 2 年目の中間報告書を基に評価し，研究の進捗状

当該講座の研究の進展に役立てるようにしている．

況および成果の応じて次年度の助成金の増減を決定し寄付講座を設置した大学では，寄付講座の開設時期おた．本助成は，2007 年度（ 3 年間）の 1 回だけ実施し，よび終了時期に当該寄付講座主催のシンポジウムが開催

次に述べる寄付講座助成に発展していった．

されている．

4 ）寄付講座助成

5 ）検討委員会

近年，大学では微生物の研究と教育を行う講座（研究2003 年 4 月から実施してきた研究助成事業が 5 年目を室）が減少している．例えば，東京大学では応用微生物

迎えたとき，その内容について見直しが必要と考えられ研究所が分子細胞生物学研究所に，大阪大学では工学部

たので，検討委員会を立ち上げ，当事業の内容についての醗酵工学科が応用生物工学科に名称が変更されたこと検討することになった．IFO の理事である別府輝彦東京

からも明らかなように，微生物関連の講座がなくなりつ大学名誉教授に委員長を務めていただき，2008 年 7 月

つあった．このままでは日本の大学で微生物関連の講座

28 日に IFO で検討委員会が開催された．9 名の委員（別がなくなり，微生物の研究が衰退するのではないかと危

府輝彦，木村 光，鈴木健一朗，冨田房男，永井和夫，惧された．IFO の坂野 勲顧問から「研究助成事業の 1

波多野和德，古川謙介，本田武司，中濱一雄）が出席しつとして，大学に寄付講座を設置・運営するための助成て協議・検討し，さらにメールで委員へのアンケートをを行ってはどうか」との提案があり，この件を森田 桂

実施して検討結果をまとめ，見直し案を作成した．この理事長に相談したところ，寄付講座は助成金が多額であ見直し案は 2008 年 12 月 8 日に別府委員長から森田理事

ることもあって「慎重に進めたいので理事・評議員の先長へ答申された．その主な内容は次のとおりである．

生方のご意見を聞いてほしい」とのことであった．評議員であった木村 光京都大学名誉教授に寄付講座につい1 ）これまでの研究助成を廃止して，新たに一般研究助成と大型研究助成を行う．

てご意見を伺ったところ，「たいへん意義深い助成であ2 ）一般研究助成および大型研究助成の研究課題は，る」と大いに賛成された．この旨を森田理事長に伝え，

研究課題 1「微生物の分類に関する研究」，研究課

ゴーサインがでたので，木村 光名誉教授を委員長とす

題 2「微生物の応用に関する研究」，研究課題 3「微る教育・研究育成委員会を設けた．2008 年 1 月 9 日に生物の健康，環境に関する研究」とする．

IFO で木村委員長ほか 4 名の委員（熊谷英彦，冨田房男，

3 ）ポスドクを対象とする若手研究者助成を行う．

－3－

中

濱

4 ）研究者招聘助成に留学のための助成を追加し，研一雄9 ）応募件数および採択件数
平成 29 年度（2017 年度）一般研究助成，大型研究助成，

究者招聘・留学助成とする．
5 ）寄付講座助成については，このまま継続し，時々

若手研究者助成，研究者招聘・留学助成および寄付講座
助成の応募件数および採択件数を表 1 に示す．年度ごと見直しを行う．
6 ）選考委員会の選任に関する新たな規程を設ける．

の応募件数および採択件数は IFO のホームページに掲

本答申の内容は 2009 年 3 月 10 日に開催された評議員

載されている．

会・理事会で承認され，これを基に研究助成事業を実施することになった．

9 ）助成研究報告会

6 ）一般研究助成

助成期間が 2007 年 3 月に終了するので，助成対象者が第 1 回目となる平成 15 年度（ 2003 年度）研究助成の検討委員会の答申を基に，平成 22 年度（ 2010 年度）

研究成果を発表するための助成研究報告会を開催するこから新たに一般研究助成を開始した．助成金額は 1 件あとになり，千里ライフサイエンスセンター（豊中市）でたり 300 万円，助成期間は 2 年．研究課題は，研究課題実施した．

1「微生物の分類に関する研究」，研究課題 2「微生物の第 1 回助成研究報告会は 2007 年 5 月 25 日に開催され応用に関する研究」，研究課題 3「微生物の健康，環境

た．平成 15 年度（ 2003 年度）研究助成対象者 7 名が 3に関する研究」とし，平成 28 年度（ 2016 年度）助成の年間の研究成果を口頭発表した．すなわち研究課題 1「微募集から研究課題 3 を「微生物の環境に関する研究」と生物の分離，分類，保存に関する研究」は 5 題，研究課した．受理した応募申請書を選考委員会で審査してそれ

題 2「健康，環境に関与する微生物の研究」は 2 題が発ぞれの研究課題で約 10 件ずつ採択し，助成金を支給した．

表された．座長には，発表者（助成対象者）が採択され

平成 22 年度（2010 年度）から平成 29 年度（2017 年度）たときの選考委員長であった駒形和男名誉教授（研究課
題 1 ）および豊島久真男名誉教授（研究課題 2 ）が務めまで，合計 239 件を採択した．

られた．第 2 回以後もほぼ同じ形式で実施し，現在に至っ7 ）大型研究助成ている．

検討委員会の答申を基に，一般研究助成よりも大きな

第 1 回助成研究報告会の参加者は 80 名弱であったが，構想をもつ研究を対象とする大型研究助成を平成 22 年

その後，参加者は年々増加して，2017 年 6 月 9 日に開催

度（2010 年度）から開始した．助成金額は 1 件あたり 1,000

された第 11 回助成研究報告会の参加者は 232 名に達し，万円，助成期間は 2 年，研究課題は一般研究助成と同じ

このうち大学院生は 29 名を数えた（図 1 ）．

とした．受理した応募申請書を選考委員会で審査してそ最近の当報告会では，大型研究助成と寄付講座助成のれぞれの研究課題で 1 件ずつ採択し（応募件数が最も多研究成果は口頭発表，一般研究助成と若手研究者助成のい研究課題では 2 件を採択），助成金を支給した．

研究成果はポスター発表としている．いずれの発表でも，

平成 22 年度（2010 年度）から平成 29 年度（2017 年度）

質疑・応答が活発である．
口頭発表，ポスター発表の後には懇親会を開催した．

まで，合計 32 件を採択した．

分類，生態，応用，環境，健康，病原微生物など様々な
8 ）若手研究者助成

領域の微生物研究者が一堂に会し，盛んに歓談がなされ，

ポスドクは大学の研究において重要な役割を果たしているが，その多くは生活が不安定であり，日本の科学研
究の後継者育成に関わる問題点の 1 つとなっている．検討委員会で若手研究者への支援が提案され，その答申を基に平成 22 年度（ 2010 年度）から新たにポスドクを対象とする若手研究者助成を実施することになった．助成

表1

平成 29 年度（2017 年度）助成の応募件数および採択件数
応募件数

採択件数

一般研究助成助

研究課題 1
研究課題 2
研究課題 3

61
137
59

11
13
10

大型研究助成研究課題 1
研究課題 2
研究課題 3

10
15
8

1
2
1

9

1

研究者招聘・留学助成

55

寄付講座助成141

金額は年間 500 万円（生活費 400 万円＋研究費 100 万円）

成

で，助成期間は 3 年，研究課題は主に微生物の分類に関する研究とした．受理した応募申請書を選考委員会で審査して 1 件を採択し，助成金を支給した．
平成 22 年度（2010 年度）から平成 29 年度（2017 年度）まで，合計 8 件を採択した．

－4－

若手研究者助成

発酵研究所の歴史（ 6 ） 〜 研究助成事業を中心に（ 2003.4 〜 2017.6 ）〜

口頭発表

図2

助成研究報告集 IFO Rsearch Communications

び保存に関する研究成果である．2002 年に微生物株保存機関としての研究を終了するのに伴い 20 号（ 1999－

ポスター発表2000 年）を最後に休刊していたが，2007 年から研究助成の助成対象者による助成によって得られた研究成果を掲載する助成研究報告集 IFO Research Communications
として復刊することになった．このため，IFO 評議員である駒形和男名誉教授を委員長とする当機関誌の編集委
員会を設けた．2007 年 7 月 12 日に八重洲富士屋ホテル
で第 1 回会議が，2008 年 8 月 9 日に同ホテルで第 2 回会
議が開催され，駒形委員長ほか 3 名の委員（中瀬 崇，
波多野和德，渡邉 信）が出席して助成研究報告集の投稿要領，投稿原稿の査読等について協議した．その後，懇親会
図1

さらに議論を深めるため，各委員はメールにて協議を続

第 11 回助成研究報告会

行し，編集方針が定まって現在の形になった．
復刊の 21 号は平成 15 年度（ 2003 年度）研究助成の助成対象者 7 名による約 3 年間の研究成果のまとめたものである．その後，大型研究助成，寄付講座助成，一般

異分野研究者間の交流を深める機会を提供している．
この助成研究報告会では，伊藤忠義氏，横田 明氏ほ研究助成，若手研究者助成の研究成果を掲載し，現在に至っている（図 2 ）．

か元 IFO 所員の多大な協力を得た．
なお，毎年の助成研究報告会については次項で述べる

当報告集では助成研究で得られた成果のみならず，

助成研究報告集 IFO Research Communications に掲載さNegative data も 盛 り こ ま れ て い る． 学 術 論 文 で はれている．

Negative data を掲載することはないが，この報告集で10 ）助成研究報告集のあるものは記述するよう執筆者にお願いしている．

は Negative data であっても記録として残しておく価値
IFO は 1961 年に IFO Annual Report という名称で機関

当報告集 IFO Research Communications はレベルの高誌の刊行を開始した．その後，1971 年から IFO Research

い伝統ある機関誌であるので，充実した内容にするため，Communications に改称し，隔年で刊行してきた．その投稿原稿について数名の委員による 3 度の査読（一次査

主な内容は，保存業務に必要な微生物の分離，分類およ読，二次査読，三次査読）を実施し，必要に応じて執筆

－5－

中

濱

一

雄

者に修正を指示している．
当報告集は，毎号約 600 部印刷し，多くの微生物研究者に配布し利用されている．2017 年から，IFO ResearchCommunications の 1 号から最新号までのすべての内容
を PDF ファイルにして IFO のホームページで閲覧できるようにした．

出版事業
2002 年 11 月 7 日に開催された臨時理事・評議員会で，監事の大嶋泰治大阪大学名誉教授から微生物に関する出版物を刊行することが提案され5），2003 年 3 月 14 日の評議員会・理事会で承認された．微生物学の進展のため

図3には先ず大学で微生物に関心をもつ優秀な学生を育てる

IFO 微生物学概論ことが肝要であるが，日本語で書かれた適切な微生物学
入門教科書がないとの声が多かったので，IFO が主体となって要望に応えうる微生物学入門教科書を出版するこページが増え，経費が膨らんだが，売価を学生でも購入とになった．当書を出版するための出版委員会の委員長

可能な値段（本体 4,700 円＋税）に抑えた．本書の目次には大嶋泰治名誉教授が選任された ．

を表 2 に示す．

5）

大嶋委員長と筆者との間で 2003 年 4 月から 6 月まで

本書は内容が充実しているとともに，最新の研究成果の 4 回の会合で出版のスケジュール，出版委員，出版社が盛り込まれ，優れた教育内容になった．また，装丁，について相談し，大嶋委員長が提示された微生物学の入

紙質，図版や写真も美しく仕上がっている．微生物学の門教科書「 IFO 微生物学概論」の構想書を基に出版委員

ほとんど全ての領域を採りあげて懇切な解説がなされて会で協議することになった．出版委員会は 2003 年 7 月

おり，微生物の学徒に極めて有益な参考書になったと自23 日（第 1 回），8 月 28 日（第 2 回），2004 年 4 月 9 日（第負している．出版社によると，本書は 2014 年 3 月まで3 回）に IFO で開催された．この出版委員会には大嶋委に 1,065 部販売され，在庫はほとんどなくなった．

員長ほか 4 名の出版委員（荒井基夫，駒形和男，本田武

公益法人への移行司，宮道慎二）が出席し，執筆要領および目次を作成し，執筆者を決定した．執筆者には微生物研究の各分野の第一人者が選ばれ，大嶋委員長はじめ出版委員がそれぞれ1896 年（明治 29 年）の民法で定められた公益法人制の章の編集を担当することになった．その後，出版委員

度を抜本的に改革するため 2006 年 3 月に公益法人制度として新たに 2 名（杉山純多および中瀬 崇）が参加した．

関連法案が閣議決定され，同年 5 月に国会において法案

本書の出版社は培風館とし，同社の担当者と 2 回にわが成立した．2008 年 12 月から施行されるので財団を存たって協議した．

続するためには，向こう 5 年以内に公益財団法人または2004 年 9 月 19 日に東京駅八重洲北口ルビーホールにて出版企画会議が開催され，大嶋委員長はじめ出版委員

一般財団法人への移行申請し，認可されることが必要になった．

を含む 15 名の執筆者が出席した．大嶋委員長から出版

IFO は，公益法人協会に加入していたので，当協会がに至った経緯および趣旨および執筆要領の説明があり，発刊する月刊誌，主催する説明会等により新制度に関す

執筆の分担が相談，決定された．

る情報を入手していた．その他，国，証券会社が主催す出版企画会議の直後から執筆者に執筆を依頼したが，る説明会にも積極的に参加した．また，製薬企業が設立

執筆は大幅に遅れ，2009 年 7 月にようやく一次原稿がした財団法人（ 25 財団）の生命科学助成財団懇談会に揃い，原稿の編集が行われた．完成稿を 2009 年 9 月 29

おいて，助成財団センターや公益法人協会の講師の講演

日に出版社（培風館）に渡し，
2010 年 12 月 22 日に「 IFO

を聞くことに加えて他の財団との意見交換によって多く

微生物学概論」が発刊された．本書は，財団法人発酵研の情報を得た．

究所監修，大嶋泰治，新井基夫，駒形和男，杉山純多，

公益認定申請には吉田正憲事務長が主担となって定款

中瀬 崇，本田武司，宮道慎二共編，執筆者は 37 名で，等の書類の作成など認定に必要な作業を進め，2011 年 4

5 版 / 543 ページとなった（図 3 ）．内容を重視したため

月 1 日に公益法人へ移行することができた．

－6－

発酵研究所の歴史（ 6 ） 〜 研究助成事業を中心に（ 2003.4 〜 2017.6 ）〜
表 2 「 IFO 微生物学概論」の目次
Ⅰ．基礎編
1 ．序
論
微生物の発見／自然発生説に対する論争／醸造技術／医学と免疫学／薬剤の開発／植物の微生物侵害／地球環境／微生物分類法の変遷／生命科学への展開
2 ．微生物の操作と観察法
微生物培養法／顕微鏡による観察／微生物株の保存
3 ．微生物の多様性
生態系と微生物の活動／地球生態系の創生と微生物／微生物における系統進化と分類法の変遷
4 ．微生物と物質代謝
代謝の熱力学／微生物のエネルギー代謝／光合成／生合成
5 ．微生物の増殖
細胞増殖の数学的表現／閉鎖系内での増殖経過／連続培
養系での増殖経過／増殖の計測／細胞の分裂様式／自然環境が増殖に与える影響／共生Ⅱ．微生物の遺伝現象
6 ．遺伝子とその形質支配
細胞分裂と染色体の動き／核酸と染色体の構造／ DNAの複製／ウイルスとファージにおけるゲノムの複製／遺伝子発現
7 ．微生物の変異と組換え
遺伝子と突然変異／微生物における交雑のメカニズム／
変化し移動する遺伝子
Ⅲ．微生物の系統発生と分類
8 ．原核生物の系統と分類
細菌分類学の歴史／微生物の分類学
9 ．細菌
プロテオバクテリア／ファーミクテス／アクチノバクテ
リア／シアノバクテリア／その他の細菌
10．アーキア
性質と分布／膜脂質／細胞外被／中央代謝系／遺伝情報の複製と発現装置／分類
11．真核微生物の系統と分類
真核微生物の種多様性／真核微生物の大きな系統関係／
命名法と命名規約

12．菌類
菌類とは／ツボカビ門／接合菌門／子嚢菌門／担子菌門／酵母／地衣類／偽菌類
13．真核藻類
灰色植物門／紅色植物門／緑色藻類／クリプト植物門／
ユーグレナ植物門／クロララクニオン植物門／ハプト植物門／不等毛植物門／渦鞭毛植物門
14．原生動物
単細胞真核生物の進化／原生動物の分類体系／原生動物の種類／アルベオラータの分類
15．ウイルスとバクテリオファージ
ウイルスの構造と形態／細菌ウイルス／動物ウイルス／
植物ウイルス／スローウイルス感染症とプリオン／がんウイルス
Ⅳ．生態系における微生物
16．地球環境と微生物
炭素の循環／窒素の循環／硫黄の循環／リンの循環／鉄
その他元素の循環／土壌 ･ 淡水 ･ 海洋および極限環境と微生物
17．植物・動物との共生
植物との共生／動物との共生
Ⅴ．ヒトと微生物18．ヒトへの侵害:病原微生物と感染症
感染症とヒト／感染発症の要因／主な感染症とその原因
微生物／病原微生物の危険性とバイオセーフティ／感染症法
19．ヒトへの感染防御と免疫
物理的障壁／自然免疫系／適応免疫系／免疫異常と病気
Ⅵ．微生物の利用
20．人類の生産活動と環境保全への微生物の応用
酒類と発酵食品の製造／食飼料としての微生物菌体の生産／医薬品製造への微生物の応用／アミノ酸と核酸関連物質の生産／発酵生産と化学工業への微生物の応用／酵
素の生産／地球環境保全への応用／農業における微生物の役割

理事，監事，評議員

移行認定申請の主な経緯は次のとおりである．
・2009 年 3 月 10 日

評議員会・理事会で公益財団法
人への移行決議・2009 年 6 月 4 日

筆者が常務理事を就任した 2003 年度，公益法人に移評議員会・理事会で最初の評議

行した 2011 年度および常務理事を退任した 2017 年度の員選任方法について決議および理事長，常務理事，理事，監事および評議員の名簿は次最初の評議員候補者選定のとおりである．

・2009 年 8 月 21 日

最初の評議員選任委員会開催

・2010 年 3 月 10 日

評議員会・理事会で定款変更の2003 年度

案決議

理事長

森田

評議員会・理事会で役員報酬規

常務理事

中濱一雄

程決議

理事

岡田善雄

岡見吉郎

杉野幸夫

・2010 年 9 月 1 日 移行認定申請

波多野和德

早石

藤野政彦

・2011 年 4 月 1 日 内閣府より公益財団法人の認定

別府輝彦

山田秀明

・2010 年 3 月 10 日

桂

修を受け，「公益財団法人発酵研究

監事

磯野正雄

大嶋泰治

所」に移行

評議員

大村栄之助

木村

－7－

光

駒形和男

中

濱

一

雄

辞を述べられた．

竹内昌男

武田六郎

竹中浩治

椿

冨田房男

豊島久真男

坂野顧問は，IFO の研究者時代に担子菌系酵母の有性

古川謙介

本郷次雄

世代の発見という偉大なる業績をあげられた．1997 年 6

中瀬

啓介
崇

月から 20 年間，IFO の顧問を務められた．前出のヒア

松原 謙一

リング以外にも，月に 2 ～ 3 回，IFO に来訪され，IFOの運営や事業にたいへん有益なご意見とご助言を受け2011 年度
理事長

波多野和德

た．また，助成研究報告会，助成研究報告集等の件でも

常務理事

中濱一雄

ご支援いただいた．2017 年 6 月で顧問を退任されたが，

理事

大嶋泰治

木村

光

武田光子

冨田房男

中瀬

崇

古川謙介

別府輝彦

本田武司

監事

岡田将生

田浦

評議員

今田

哲

魚住武司

北本勝ひこ

下田

親

竹内昌男

谷

土屋英子

松原謙一

吉田敏臣

現在もメール等でご意見をいただいている．

人

清

事

筆者が IFO の常務理事を務めていた 2003 年 4 月から

吉樹

2017 年 6 月までの IFO の人事は次のとおりである．
1 ）理事長2017 年度

筆者が IFO の常務理事として着任した時の理事長は，

理事長

中濱一雄

常務理事

樽井直樹

理事

熊谷英彦

鈴木健一朗

冨田房男

相談役の退職を機に，2005 年 7 月に発酵研究所（武田

永井和夫

中瀬

原島

薬品研究所本館内）に設けた理事長室に移った．森田

古川謙介

本田武司

桂は 2010 年 6 月に理事長を退任し，理事の互選により

監事

下元高文

藤井智幸

波多野和德理事が理事長に就任した．波多野和德は

評議員

今田

哲

魚住武司

北本勝ひこ

2017 年 6 月に理事長を退任し，それまで常務理事を務

下田

親

関

達治

竹内昌男

めていた筆者が理事長に選任され，現在に至っている．

武田直久

谷

吉樹

土屋英子

元武田薬品社長・会長の森田 桂であり，武田薬品相談役として武田薬品本社（御堂筋ビル）に在籍していた．
崇俊2 ）常務理事吉田敏臣

筆者（中濱一雄）は 2003 年 4 月に波多野和德から常IFO の理事会，評議員会の出席率は常に 8 割以上で，務理事を引き継ぎ，2017 年 6 月に常務理事を退任した．

全員が出席されることも多い．また，議案や報告事項に筆者の後任として武田薬品医薬研究本部生物分子研究所

ついて質疑応答は活発で，適切なご指摘，有益なご意見・の所長を勤めていた樽井直樹が常務理事に就任し，現在ご提案をいただいた．理事，評議員が IFO の運営に熱に至っている．

心であることの証であり，感謝している．

顧3 ）事務長問

筆者が IFO の常務理事として着任した時の事務長は吉田正憲であった．吉田正憲事務長の定年退職に伴い，2003 年に筆者が IFO に着任した当時の顧問は，長谷2010 年 9 月から吉田恒明が事務長に就任した．その後，

川武治元発酵研究所所長および坂野 勲元発酵研究所副吉田恒明事務長の定年退職に伴い，武田薬品で経理業務所長であった．2003 年 11 月から 2006 年 1 月まで，毎年，を担当していた児山宗太郎が 2015 年 8 月に事務長に就ヒアリングで両顧問に当年度の進捗状況と次年度の事業

任し，事務全般の管理，経理業務等を担当している．

計画を説明して，ご意見とご助言を得た．
長谷川顧問は，日本の微生物保存事業に多大な貢献を4 ）職員され，1993 年に勲四等瑞宝章を受章された 3）．1997 年 6

筆者が IFO の常務理事として着任した時の職員は佐月から 9 年間，IFO の顧問を務められた．2006 年 5 月に藤邦子であった．その後，佐藤邦子の定年退職に伴い，間質性肺炎を発病され，8 月 6 日に満 91 才の天寿を全う

2015 年 4 月に柘原 静が職員として着任し，研究助成事して永眠された．8 月 8 日に枚方市で告別式が執り行わ業の業務に携わっている．

れ，IFO の評議員である駒形和男東京大学名誉教授が弔－8－

発酵研究所の歴史（ 6 ） 〜 研究助成事業を中心に（ 2003.4 〜 2017.6 ）〜に菌塚の除幕法要が行われ，多くの関係者が参列した．

IFO の収支

その後，曼殊院では毎年 5 月に法要を行っていたが，知名度が低く，参列者は少なかった．

IFO は 2001 年度までは武田薬品から寄付を受けていIFO の武田光子理事のご提案により，理事，監事，評たが，2002 年度以後はこの寄付を打ち切られ，その後議員の先生方に菌塚を参拝し，武田薬品京都薬用植物園の IFO の収入のほとんどは武田薬品の株の配当金となっを見学していただくことを計画し，次のように実施した．

た．2010 年度から現在までの武田薬品株の 1 株当たり

2012 年 3 月 8 日の理事会および 6 月 22 日の評議員会をの配当金は 180 円で，IFO は 245 万株を保有しているの京都市内で開催した後，出席者全員がマイクロバスで曼

で配当収入は 4.41 億円となる．

殊院に異動し，菌塚を参拝した（図 4 ）．この参拝にあ2017 年度の収入は，上記の配当収入とその他の収入

わせて曼殊院を拝観し，武田薬品のご厚意で京都薬用植（利息等）を合わせると 4.74 億であった．このうち 4 億物園を見学した．微生物の研究を支援することを理念と865 万円を研究助成金[一般研究助成 1 億 200 万円（ 34

する IFO の理事，監事，評議員の先生方に菌塚を参拝件），大型研究助成 4,000 万円（ 4 件），若手研究者助成していただくことはおおいに意義があると感じた．
2013 年 5 月に曼殊院の松影崇誓執事長から「久しぶ700 万円（ 3 件），研究者招聘・留学助成 965 万円（ 5 件），りに多くの方に参列していただいて菌塚の法要をしたい

寄付講座助成 2.5 億円（ 1 件）]として支出した．
今後，武田薬品株の配当金が変わると，それに応じてので協力してほしい」との依頼があり，IFO から筆者の他に吉田恒明事務長および佐藤邦子職員が助力すること

研究助成事業の内容を変更する必要がある．

になった．2014 年 5 月 26 日に 33 年ぶりに盛大な法要がその他のできごと執り行われ，雨天にもかかわらず，大学や企業の発酵関係者および京都大学の大学院生・学生を含めて約 100 名

1 ）事務所の移転が参列した．法要の願主は菌塚を建立した笠坊武夫氏のIFO は武田薬品研究所本館が竣工した 1955 年から当ご子息である笠坊俊行氏．法要は当院の藤 光賢門主の研究所本館に賃借所在していたが，武田薬品研究所の湘読経から始まり，参列者の焼香でもって滞りなく終了し南への移転に伴い当研究所本館を解体することになり，た．参列者には，曼殊院を拝観し，武田薬品京都薬用植同じ敷地内（武田薬品大阪工場）にある管理棟の 1 室を物園を見学する機会が得られた．

借受けることになった．当研究所本館では，事務所と常務理事室（ 1 階），理事長室（ 6 階）および微生物株保3 ）震災支援

管庫兼倉庫（地下）の 3 か所に分かれていたが，これら2011 年 3 月 11 日に発生した東日本大震災では地震とを管理棟 6 階の 1 室に移すことになった．吉田恒明事務津波により，多くの尊い命が失われ，家屋や施設が大被長は武田薬品時代に設備関係を担当していたので，この害を受けた．2011 年 6 月 7 日に開催された評議員会で土経験を生かして無事に移転し，使い勝手のよい事務所と屋英子評議員から「東日本大震災で被害を受けた微生物

なった．

株保存機関があったならば，その支援をしてはどうか」

移転後，IFO は武田薬品に賃借料として毎年 436 万 7とのご提案があった．そこで，日本微生物資源学会（鈴木健一朗会長）のカルチャーコレクション委員会を通し千円を支払っている．

て同学会傘下の保存機関（ 23 機関）に IFO からの寄付
2 ）菌塚参拝を要望する機関の募集を行ったところ，石巻専修大学理

京都市の比叡山西麓にある曼殊院の境内に微生物の供

工学部基礎理学科（ ISU ）から応募があった．IFO 理事

養塚「菌塚」がある．今から約 40 年前に，大阪の大和会の承認を得て 2011 年 12 月に ISU に 1,000 万円を寄付

化成株式会社（現在は天野エンザイム株式会社滋賀工場）

した 6,7）．

の取締役社長であった笠坊武夫氏は，社長退任を機に「人北里大学海洋バイオテクノロジー釜石研究所（釜石研）

類のため多大な貢献をし，犠牲となった菌類に感謝し，は，東日本大震災での津波で被災し，フリーザーに保管供養する」ため，供養塚として菌塚を建立することを思していた微生物株が全滅の危機に瀕したので，IFO の平いついた．菌塚の建立について相談を受けた IFO 所長

成 21 年度（ 2009 年度）研究助成対象者（笠井宏明）のの長谷川武治は，IFO の理事で発酵・醸造学の世界的権

3 年目助成金を使って菌株の復元作業を行った．その結威である坂口謹一郎東京大学名誉教授を笠坊氏に紹介し果，71 ％の菌株の生存が確認され，再保存することがた．菌塚は自然石の石碑で坂口謹一郎名誉教授の揮毫にできた 8，9）．釜石研は当フリーザーから救済した石割桜

よる「菌塚」の碑銘が彫られている．1981 年 5 月 16 日の酵母を用いて地元酒造会社と共同で東北復興支援ビー

－9－

中

濱

一

雄

理事会後（ 2012 年 3 月 8 日）

評議員会後（ 2012 年 6 月 22 日）
図4

理事会・評議員会後の菌塚参拝－ 10 －

発酵研究所の歴史（ 6 ） 〜 研究助成事業を中心に（ 2003.4 〜 2017.6 ）〜ル「福香ビール」を開発した 9）．IFO は 2013 年 6 月 7 日

2015 年には大村 智博士がエバーメクチンの発見とそのに開催された第 7 回助成研究報告会のときにこの「福香開発で，2016 年には大隅良典博士が酵母を用いたオービール」を大量購入し，懇親会で参加者に供した 10）．

トファジーの仕組みの解明で，ノーベル生理学・医学賞を受賞され，微生物の研究が再認識されるようになった．

4 ）財団設立当時の理事会議事録に関する投稿

日本はアミノ酸・ヌクレオチドの発酵生産や微生物酵東日本大震災の翌年，元評議員の駒形和男東京大学名素による物質生産で世界をリードしてきた．コレステ

誉教授からお電話があり，「東京大学では，太平洋戦争

ロール合成阻害剤スタチン，免疫抑制剤タクロリムス，

中に坂口謹一郎教授は空襲を避けるため教室の菌株を盛岡農林専門学校と高田農学校に疎開された．その当時，

α -グルコシダーゼ阻害剤ボグリボースは日本の製薬企
業の発酵技術で開発・実用化されており，今後も新規生

IFO は菌株をどこに疎開させたのか」とのご質問をいた

理活性物質の発見と開発に期待したい．最近ではプロバ

だいた．財団設立当時の理事会議事録を調べたところ，

イオティクスを対象とした腸内細菌の研究が盛んで，新菌株を京都薬学専門学校（現 京都薬科大学）に疎開さ

聞やテレビでよく報道されている．また，将来，バイオ

せたことが書かれてあったので，この議事録のコピーをエネルギーの生産に微生物の利用が期待されている．学

駒形和男名誉教授に送付した．当議事録には上記の菌株術的な観点では，単細胞の微生物は生命の基本単位であの疎開のほかにも事業内容，役員など日本の終戦前後のり，生命現象を明らかにするためにはモデル生物として微生物研究の状況を知るうえでたいへん貴重な事柄が記

大腸菌や酵母などの微生物を用いなければ解決できない載されていたので，駒形和男名誉教授から「この時期のことが多い．これまでに自然界から分離培養された微生

理事会議事録は貴重な資料であるので，何らかの形で公物は全体の 1 ％以下で，残りのほとんどは難培養微生物

表してはどうか」とのご提案をいただいた．また，2014と言われている．そこで，難培養微生物を分離培養し，

年 3 月に開催した理事会および同年 6 月に開催した評議

ゲノム解析などを活用することによって微生物の新たな員会で財団設立当時の理事会議事録を紹介したところ，能力を見出すことができれば，微生物の研究と利用が飛理事および評議員から「興味ある内容であるので，学会

躍的に進歩すると思われる．このように微生物学はバイ誌等に投稿するとよい」とのご意見をいただいた．

オサイエンスおよびバイオテクノロジーの基本となる重そこで当財団設立当時の第一回から第四回までの理事
会議事録を紹介することを目的に生物工学会誌の「資料」

要な分野であり，その研究を財政的に支援することは大きな意義があると考える．

．

大学では国からの運営費交付金は年々減少し，それと標題は「微生物株の保存とバックアップ～発酵研究所設ともに研究費も減少しており，外部資金として財団法人

立当時の理事会議事録から～」で，著者は中濱一雄．当等の研究助成金を獲得することが必要となってきた．そ稿は公益社団法人日本生物工学会の許可を得て本書 29のため IFO の各種助成の応募件数は年々増加している．

号に転載した 12）．

IFO は，研究助成事業を開始した 2003 年度から筆者がとして投稿し，2015 年の第 93 巻第 3 号に掲載された

11）

常務理事を退任した 2017 年度までに，研究助成，研究

おわりに者招聘・留学助成，特定研究助成，一般研究助成，大型研究助成および若手研究者助成で合計 367 件を採択し，筆者が常務理事として勤務した 2003 年 4 月から 2017

総額 18.4 億円の助成金を支給した．また，寄付講座助

年 6 月までの約 14 年間の経緯について記述した．IFO

成を開始した 2008 年度から平成 2017 年度までに，10 件

は 1944 年に設立されて以来，微生物株の保存機関としの寄付講座を採択し，総額 25 億円の助成金を支給した．

て国内外の研究を支援し，多大な貢献をしてきたが，これらの助成金は有効に活用され，多くの素晴らしい研2002 年にその使命を終えた．2003 年から新たに微生物究成果がでており，助成を受けた研究者と機関から感謝の研究を対象とする研究助成事業を開始し，現在に至っされている．
IFO は，国がやらない，やれないような特色ある研究ている．
近年，微生物の研究者は少なくなり，微生物の研究で助成事業にしたいと思っている．例えば，微生物の研究は科研費やその他の助成金を獲得しにくい状況にある．

にとって重要であるが，あまり評価されないために科研大学や企業ではバイオ分野の研究には流行がある．1970

費などの競争的資金を獲得しにくい基礎研究，特に分類

年代までは微生物の研究が全盛期であったが，その後，に関する研究に重点的に助成金を支給している．また，

約 15 年ごとに遺伝子工学，ゲノム創薬，再生医学（ iPS

選考委員会には，独創的でチャレンジングな研究はもと細胞）の順で研究が注目されるようになり，それに伴っより，すぐに役に立つ研究よりも 20 年先に重要になるて微生物の研究がやや下火になったようである．しかし，研究を積極的に採択していただくようお願いしている．

－ 11 －

中

濱

何の役に立つかが予測できない研究が採択されてもよいと思う．
今後も，微生物株保存事業で培ってきた精神を生かして研究助成事業を通して微生物の研究の進歩発展に寄与していきたい．その精神とは「微生物をこよなく愛し，大切にすること」である．
筆者が IFO の常務理事として在籍していた 14 年間には，理事，監事，評議員，顧問のほか，選考委員会，評価委員会，検討委員会，編集委員会，出版委員会等の先生方には多大なるご尽力，ご指導，ご支援を賜った．また，助成研究報告会での座長，助成研究報告集への投稿
原稿の査読など，多くの先生方にはたいへんお世話になった．さらに武田薬品の関係者，IFO の事務長，職員，
元所員のお蔭で事業を順調に進めることができた．皆様には，心から感謝を申しあげたい．

参考文献
1） 長谷川武治 1995. 微生物保存事業とIFO. IFO ResearchCommunications 17: 9-18.
2） 飯島貞二2001. 発酵研究所の歴史. IFO ResearchCommunications 20: 15-33.

一雄3） 長谷川 徹 2014. 発酵研究所の歴史～所長当時を回想して(1990～1995)～. IFO Research Communications 28: 1-10.
4） 竹内昌男 2016. 発酵研究所の活動－発酵研究所を継いだ人たち（1995.4－2001.3）－. IFO Research Communications
30: 1-16.
5） 波多野和德 2017. 発酵研究所の歴史（5）微生物株保存事業から研究助成事業への転換－その激動の2年間（2001.4～
2003.3）－. IFO Research Communications 31: 1-12.
6） 鈴木健一朗 2012. 公益財団法人発酵研究所の「震災で被害を受けた微生物株保存機関への支援」に関するご報告.
Microbiol. Cult. Coll. 28: 41.
7） 宮嵜 厚 2013. 東日本大震災で被害を受けた微生物保存機
関への支援を受けて. 生物工学会誌 91: 244-246.
8） 笠井宏明2013. 希少海洋性アクチノバクテリアの系統保存.
IFO Research Communications 26: 49-60.
9） 猪又幸江, 佐藤 航, 笠井宏明 2013. 天然記念物「盛岡石割桜」由来の酵母を使用した東北復興支援「福香（ふくこう）ビール」の開発. 生物工学会誌 91: 238-240.
10） 坂野 勲 2013. 第7回助成研究報告会の開催.IFO ResearchCommunications 27: 1-2.
11） 中濱一雄 2015. 微生物株の保存とバックアップ～発酵研究所設立当時の理事会議事録から～. 生物工学会誌 93: 139-148.
12） 中濱一雄 2015. 微生物株の保存とバックアップ～発酵研究所設立当時の理事会議事録から～. IFO Research Communications
29: 1-9.

－ 12 －

第 12 回助成研究報告会の開催
平成 30 年 6 月 8 日千里ライフサイエンスセンター 5 階サイエンスホールにおいて第 12 回
助成研究報告会を開催し，2 年間の助成を受けた大型研究助成 4 件の研究成果の口頭発表，5年間の助成を受けた寄付講座助成 1 件の研究成果の口頭発表，ならびに 2 年間の助成を受けた一般研究助成 33 件と若手研究者助成 1 件の研究成果のポスターによる発表が行われた．
参加者は，大学，国公立研究所，企業の研究者，大学院生など総数 247 名であった（このう
ち大学院生は 30 名）．
報告会に先立ち，中濱一雄理事長から挨拶があった．報告会では大型研究助成 4 件のうち「きのこ類培養形質の分類形質としての評価及びそれに基づく担子菌分類系の再検討」（前川二太郎）の 1 題は左子

芳彦 京都大学大学院農学研究科教授の座長のもとに，「好熱性細菌が放出するウィルス様膜小胞と分泌型プロテアーゼ巨大分子複合体の関連解明そして応用への挑戦」（渡部木邦彦）および「真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明」（高博史）の 2 題は西山真 東京大学生物生産工学研究センター教授の座長のもとに，「木材腐朽のシステム合成生物学への挑戦」（中沢威人）は福田雅夫

中部大学応用生物学部教授の座長のもとに口頭発表が行われた．また，寄付講座助成の 1 題「微生物による「ものづくり」のイノベーション:微生物の潜在能力発掘・応用のための新手法の開発と実践」（尾仲宏康）は永井和夫 東京工業大学名誉教授の座長のもとに口頭発表が行われた．各研究発表に対して活発な討議がなされ，示唆に富んだ意見も出るなど実りのある発表となった．
発表の内容は全文が本報告集に収録されている．なお，寄付講座助成の報告は総論 1 報と各論 9 報に分けて報告されている．
引き続いて一般研究助成 33 件および若手研究者助成 1 件はポスター展示による発表がなされた．各ポスターの前で参加者と熱心な質疑が交わされた．さらにこの後行われた懇親会の時間にもお酒を片手にポスターの前で討論する姿が見られて，ポスター発表内容について十分に議論されたようであった．一般助成研究および若手研究者助成の研究結果は本報告集ではページ数の関係で要約のみを掲載したが，当財団ホームページ上に詳細を掲載してあります．
懇親会には報告会参加者のほとんどが参加した．先ずは熊谷英彦 理事（石川県立大学学長）の挨拶があり，次いで関達治 評議員（大阪大学名誉教授）のご発声で乾杯を行った．懇親

会では，参加者の間で和やかに歓談が持たれたのに加えて，報告会では十分に出来なかった
質疑応答も行われ，また昨年 9 月で設置期間が終了した東京大学微生物潜在機能探索寄付講座の尾中宏康教授と教員（尾㟢太郎，林昌平，浅水俊平，菅井佳宣の各氏）および本年 10月に開設する東京大学 微生物膜輸送工学寄付講座の川崎寿教授からの挨拶などもあって，異なる分野の研究者の間で賑やかな交換が見られた．今回の報告会および懇親会にも若手の研究者が多数参加され，新旧の研究者の交流の場としても十分役だったものと思われます．
参加された皆様のご協力に心から感謝致します．
来年の第 13 回助成研究報告会は 2019 年 6 月 7 日（金）に同じ会場で開催致します．
以下に報告会，ポスター展示，懇親会の模様の一部を写真で紹介する．
（文）横田－ 13 －明

RESEARCH COMMUNICATIONS

中濱

開会挨拶
一雄 理事長座長

前川二太郎 氏

座長

福田

左子

雅夫 先生

渡部

邦彦 氏

尾仲

宏康 氏

芳彦 先生

座長

座長

和夫 先生

永井

高木

樽井
－ 14 －博史 氏

司会
直樹 常務理事

西山

真 先生

中沢

威人 氏

RESEARCH COMMUNICATIONS

講

演

会

ポスター発表

挨拶

熊谷

英彦 理事

懇

乾杯

親

会

－ 15 －

関

達治 評議員平成 28 年度大型研究助成の研究報告
助成期間:平成 28 年 4 月～平成 30 年 3 月

IFO Res.Commun. 32
17-27, 2018

きのこ類培養形質の分類形質としての評価及びそれに基づく担子菌分類体系の再検討
前

川

二太郎

鳥取大学農学部〒680-8553

鳥取市湖山町南4-101

Evaluation of mycelial characteristics in culture as taxonomic criteria
and their applications to classification of Basidiomycota
Nitaro Maekawa
Faculty of Agriculture, Tottrori University
4-101 Koyama-minami, Tottori 680-8553, JapanThe main purpose of this study was to evaluate as taxonomic criteria anamorphs produced in fungal culture of thesubdivision Agaricomycotina (Basidiomycota). The strains of various species preserved in the Fungus/Mushroom
Resource and Research Center of Tottori University (FMRC) were observed. In addition, the published literatures
on fungal cultures of this subdivision were investigated, and a total of 1,415 species of 442 genera belonging to 81
families of 21 orders were examined for their productivity of anamorphs in culture. Eighty-two species out of 1,415
species examined formed blastoconidia, and the species of Dacr ymycetales formed sympodially proliferatingconidiogenous cells. Spiniger-type anamorph was produced in phylogenetically different genera belonging to
Polyporales and Russulales, and its morphological differences were observed among the genera. In addition,
annellated conidiogenesis was observed in the limited genera of Auriculariales and Agaricales. On the other hand,the formation of arthroconidia was observed in 179 species, and their secession modes were different dependingon the family or genus level, indicating either rhexolytic or schizolytic type. Arthroconidium secession mode of
Ossicaulis species belonging to Lyophyllaceae (Agaricales) was schizolytic type along with other genera of thisfamily. The arthroconidia of Ossicaulis species were significantly different in size from those belonging to othergenera. The two cryptic species of the genus Gloeocystidiellum in which the morphological differences could not
be found between their teleomorphs were different in the productivity of anamorphs in culture. These results
suggest that the productivity of anamorphs in culture, their conidiogenesis and morphology are useful for
discriminating at the level of family, genus or species.
Key words: Agaricomycotina, arthroconidia, blastoconidia, conidium secession mode, molecular phylogeny

緒言

ラタケ亜門（ Agaricomycotina ）に所属する．これらの分類群の生活環において，有性胞子である担子胞子を形きのこは，菌類の中で，主に有性胞子を形成する肉眼成する子実体（担子器果）は肉眼的および顕微鏡的特徴で識別可能な大きさの組織体（子実体），あるいはこのが多様であるため，主に担子器果（テレオモルフ）の形

ような子実体を形成する分類群を指し示す．きのこを形態形質に基づき分類体系が構築され（ Ainsworth et al.,成する多くの分類群は担子菌門（ Basidiomycota ）のハ

1973 ），長年この分類体系による分類が行なわれてきた．
しかし，1990 年代から分子生物学的手法による分子系

E-mail: kin-maek@tottori-u.ac.jp
共同研究者:中桐昭（鳥取大学農学部），
早乙女 梢（鳥取大学農学部），
遠藤 直樹（鳥取大学農学部）

統解析が行なわれるようになり，DNA 塩基配列情報に基づきハラタケ亜門の分類体系も大幅に修正されている（ Hibbett, 2006 ）．ハラタケ亜門に含まれる様々な分類群における分子系統解析の結果，本亜門内の各階層におい－ 17 －

前

川二太郎て，新たな分類群が創設され，とくに属および種におい実験方法ては数多くの新分類群が報告されている．また，従来用
いられている担子器果の形態形質が種間あるいは属間で有意な差異が認められない隠蔽種あるいは隠蔽属の存在

供試菌も示唆されているが，多くの分類群において，それらの鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源研究センター

新種，新属等の分類学的処置はなされていない．また，（ FMRC ）に保存されているカルチャーコレクション

ハラタケ亜門に所属する菌類には，食用きのこ，生理活（ TUFC ）の中から，担子菌門のハラタケ亜門に所属す

性物質や酵素類の生産，植物の生長促進など，遺伝資源

る 956 種 2,500 菌株を供試した．供試菌株は二次菌糸体として有用な分類群も多く含まれているため，遺伝資源

であるが，一部の菌種については一次菌糸体をあわせて株として多くの菌株保存施設で保存されている（日本菌用いた．

学会編，2013；GCOE「持続性社会構築に向けた菌類きのこ資源活用」編集委員会編，2013 ）．しかし，種によっ

培養菌糸体の性状調査ては菌株の品質評価・管理に有用な培養的性状に関する情報が欠如している状況にある．

供試菌株をマルトエキス寒天平板培地（ MA 培地）にて 20－25 ℃下 3－6 週間培養を行なった．菌種によってハラタケ亜門に所属する菌類を培養すると，しばしばは Modified Melin-Norkrans 培地，コーンミール培地等

培養菌糸体に無性世代（アナモルフ）や嚢状体（シスチをあわせて用いた．各供試菌株の培養菌糸体について菌ジア）等の菌糸とは異なる多様な形態を呈する異形細胞

叢形態の肉眼的観察を行なった後，微分干渉顕微鏡下で，が形成される．Kendrick & Watling（ 1979 ）は担子菌門

分生子，異形細胞等の形成の有無を調査するとともに，に所属する分類群が形成するアナモルフを分生子形成様

分生子等の形成が認められた菌株については，その形態

式等に基づき分類した．ハラタケ亜門に含まれるヒダナシ

的特徴を観察した．また，必要に応じて，走査型電子顕タケ類（ aphyllophoraceous fungi ）については，Nobles

微鏡（ SEM ）を用いて，分生子の形成および離脱様式（ 1948, 1965 ），Nakasone（ 1990 ）および Stalpers（ 1978 ）について詳細な観察を行なった．さらに，同亜門に所属らによって，アナモルフ形成の有無を含む種の培養的性状する種の培養性状に関する文献を抽出し，FMRC 保存の記載および培養的特徴に基づく種の検索表が構築され菌種と合わせて，合計 3 綱 21 目 81 科 442 属 1,415 種のた．ハラタケ目（ Agaricales）については，Hohenbuehelia

培養菌糸体の性状調査を行なった．

属（ Thorn & Barron, 1986 ），Pholiota 属（ Jacobsson,
1989 ），Pleurotus 属（ Stalpers et al., 1991 ）などのアナ

走査型電子顕微鏡観察

モルフが断片的に報告されている．また，Walther et

MA 培地で培養した供試菌株の培養菌糸体を，培養基

al.（ 2005 ）は分生子形成様式と担子器果にひだを有する分類群の系統関係との関連性を明らかにし，培養菌糸刃で薄く切り出し，SEM 観察用試料とした．各試料を体に形成されるアナモルフが本目の分類に有用であるこ

2 ％オスミウム酸溶液に一晩浸漬固定した．固定した試とを示唆した．しかし，いずれの報告も限られた分類群

料は，30 ％エタノールで洗浄後，50，70，80，90，95，を対象にしたものであり，培養菌糸体に形成されるアナ

100 ％のエタノールの順に 15 分間毎に置換し，最後に質である MA 培地とともに，およそ 5 mm 角にカミソリ

モルフに関してハラタケ亜門全体を網羅した解析は行な

100 ％エタノールに 2 回置換することによって脱水をわれていない．

行った．脱水した試料は，エタノール:酢酸イソアミル

本研究では，これらの先行研究を基盤として，従来分（ 1:1，v/v ）の混合液に 15 分間浸漬した後，100 ％酢

類形質としてあまり重要視されてこなかった担子器果以酸イソアミルに 15 分間 2 回置換することによって，エ外のステージ，とくに無性世代（アナモルフ）に焦点を

タノールを除去した . 酢酸イソアミルに置換した試料は当て，ハラタケ亜門に所属する分類群のアナモルフの形

試料表面の酢酸イソアミルを除去後，臨界点乾燥装置

成の有無，形成様式等について網羅的に解析を行うとと（ JCPD-5, JEOL ）を用いて臨界点乾燥を行った．乾燥しもに，これと並行して保有菌株の分子系統解析を行い，た各試料は SEM 観察用試料台に菌叢面を上にして SEM

培養形質と系統群との関係性を解析することによって，

用 カ ー ボ ン 両 面 テ ー プ で 貼 付 け，Magnetron Sputter

ハラタケ亜門に所属するきのこ類培養菌糸体に形成され（ MSP-1S，アルバック機工株式会社）を用いて白金にるアナモルフ等の分類形質としての評価を行なった．

よりコーティングを行った．コーティングした試料は，
走 査 型 電 子 顕 微 鏡（ S-3400N，HITACHI ） を 用 い て，
高真空低加速電圧（ 5 kV ）モードで観察を行った．

－ 18 －

きのこ類培養形質の分類形質としての評価及びそれに基づく担子菌分類体系の再検討

各培養菌糸体からの DNA 抽出，PCR およびシーケンス反応

れらの中で，もっとも多くのアナモルフ形成が認められ各供試菌株を MA 培地等で培養して得られた菌糸体かた目はハラタケ目（ Agaricales ）であり，調査した 432

ら，改変 CTAB 法によりゲノム DNA 抽出を行った．得種のうち 124 種が分節型分生子を，15 種が出芽型分生られたゲノム DNA を鋳型とし，核リボソーム RNA 遺伝

子を形成し，本目供試種全体の 32 ％において分生子形子の ITS 領域をポリメラーゼ連鎖反応（ PCR ）により成が認められた．また，もっとも多くの供試種が所属す増幅した．プライマーには ITS1F／ITS4 を用いた．PCR

るタマチョレイタケ目（ Polyporales ）においても分節型の反応条件は，初期熱変性を 95 ℃で 2 分間行なった後，分生子を形成する種と出芽型分生子を形成する種が混在

変性 95 ℃で 45 秒間，アニーリング 50 ℃で 45 秒間，伸することが明らかとなった．しかし，イグチ目（Boletales）

長 70 ℃で 1 分間を 35 サイクル行ない，最終伸長反応をは調査した 39 種のうち 1 種において，またキカイガラ

72 ℃で 10 分間行なった．PCR 増幅産物は，エチジウム

タケ目（ Gloeophyllales ）は 13 種のうち 6 種において分

ブロマイドを含む 1 ％アガロースゲル電気泳動により増節型分生子の形成が認められたが，両目の供試種におい幅を確認後，ExoSAP-IT（ USB ）を用いて精製した．精て出芽型分生子を形成する種は認められなかった（Table

製 後 の 産 物 は BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit

1）．一方，アカキクラゲ目（ Dacrymycetales ）は調査し

v.3.1（ Applied Biosystems ）を用いてダイレクトシーケ

た 23 種のうち 15 種において，キクラゲ目（Auriculariales）

ンスを行った．シーケンス反応は PCR 反応と同様のプ

は 17 種 の う ち 6 種 に お い て， ま た シ ロ キ ク ラ ゲ 目

ライマーを用い，初期熱変性を 96 ℃で 1 分間行い，変（ Tremellales ）は 8 種のうち 7 種においてアナモルフの性 96 ℃で 10 秒間，アニーリング 50 ℃で 5 秒間，伸長形成が認められ，これら 3 目においてはいずれの種も出60 ℃で 4 分間を 25 サイクル行なった．反応生成物はエ

芽型分生子を形成した（ Table 1 ）．以上の 6 目においてタ ノ ー ル 沈 殿 に よ り 精 製 し た 後，ABI 3130 Genetic

は，目内で同一の分生子形成様式を示したことから，分Analyzer（ Applied Biosystems ）を用いてシークエンス

生子形成様式が目レベルの判別形質となり得ることが示を行なった．

唆された．また，キクラゲ目の出芽型分生子の形成において，分生子形成細胞の頂部に環紋が観察されたことか

分子系統解析

ら（ Fig. 1C ），アネロ型の分生子形成様式であることが分子系統解析には，本研究で得た塩基配列に加え，明らかとなり，本目の判別形質となり得ると考えられる．

FMRC お よ び GenBank の デ ー タ ベ ー ス か ら 入 手 し た

なお，アカキクラゲ目の 1 種においては，出芽型分生子

Hyphoderma 属種の塩基配列から ITS（ ITS1–5.8S–ITS2 ）領 域 を 用 い た． 塩 基 配 列 は MEGA7（ Kumar et al.,に加えて，分節型分生子の形成が観察され，本種アナモ
ルフは多型性であることが明らかとなった．

2016 ）を用いてデータセットを作成し，MAFFT Ver. 7
Online version を用いてアライメントを行った．その後，

ハラタケ目におけるアナモルフ形成種の分布最尤法（ ML 法）に基づき MEGA7 を用いて系統樹を作

ハラタケ亜門において，アナモル形成種がもっとも多成した．ギャップは missing data として扱い，各枝の信く認められたハラタケ目について，科別にアナモルフ形

頼性は 1,000 回反復のブートストラップ値検定により算成種の分布および分節型分生子と出芽型分生子の形成種出した．ブートストラップ値（ BP 値）は 70 ％以上の枝数 を 調 査 し た（ Table 2 ）． そ の 結 果， ハ ラ タ ケ 科を 信 頼 性 の 高 い 枝 と し た． ア ウ ト グ ル ー プ と し て，（ Agaricaceae ），オキナタケ科（ Bolbitaceae ）およびキHypochnicium bombycinum (Sommerf.) J. Erikss. および

シメジ科（ Tricholomataceae ）においては，分節型分生
子 を 形 成 す る 種 の み が 認 め ら れ， ま た シ メ ジ 科

Hypochnicium wakefieldiae (Bres.) J. Erikss. を用いた．

（ Lyophyllaceae ），ナヨタケ科（ Psathyrellaceae ）およ

結果および考察びモエギタケ科（ Strophariaceae ）においては，それぞれ 1 種を除き，すべてが分節型分生子を形成する種でハラタケ亜門におけるアナモルフ形成種の分布あった．これに対して，ガマホタケ科（ Typhulaceae ）供試した 1,415 種の培養菌糸体におけるアナモルフ形

においては，調査した 4 種はすべて出芽型（アネロ型）

成の有無を調査した結果，179 種において分節型分生子

分生子を形成する種であった．これらの科においては，（ arthroconidia ）の形成が認められ，82 種において出芽培養菌糸体に形成されるアナモルフの形成様式が科の判型分生子（ blastoconidia ）の形成が認められた．残りの別形質として有用であることを示唆する．

1,154 種においてはこれらアナモルフの形成は認められなかった．また，同亜門に所属する各目の分節型分生子および出芽型分生子の形成種数を Table 1 に示した．こ－ 19 －

前
Table 1

川二太郎

Distribution of conidium producing species in Agaricomycotina.

分節型分生子の分類形質としての評価
分節型分生子は，多くの種において，直線状に伸長した菌糸の先端細胞に形成されるが（ Figs. 1A, 2C ），しば
しば円状あるいはコイル状に伸長した菌糸先端細胞に形成される．円状あるいはコイル状の分節型分生子形
成 菌糸はモエギタケ科（ Strophariaceae ）に所属する
Hypholoma 属種で認められた（ Fig. 1B ）．また，分節型
分生子が短く分岐した分生子形成細胞あるいはジグザク状に分岐した分生子形成細胞に形成されるシンポジオ型の形成様式は同科の Pholiota 属種において認められた（ Fig. 1D ）．このような形成様式においては，分生子の離脱部に脱落痕が観察された（ Fig. 1D ）．また，シンポ
ジオ型の分生子形成様式はオキナタケ科（ Bolbitiaceae ） namorphs of Agaricomycotina produced in mycelia. A
Fig. 1 A
and B, Arthroconidia of Hypholoma subviride (arrowheads: rehxolytic secession). C, Annellated conidiogenous cell apex (arrowhead) forming C-shaped conidiumof Exidia glandulosa. D, Conidia (arrowheads) producedon sympodially proliferating conidiogenous cell of
Pholiota aurivella. Scale bars: A, D = 5 µm; B, C = 2 µm.

およびナヨタケ科（ Psathyrellaceae ）において，円状あるいはコイル状の分節型分生子形成菌糸はオキナタケ科（ Bolbitiaceae ）においても報告されている（ Walther etal., 2005 ）．しかし，これら 3 科以外のハラタケ亜門の科においてはシンポジオ型の分生子形成様式あるいはコ
イル状の分生子形成菌糸は観察されなかった．これらの－ 20 －

きのこ類培養形質の分類形質としての評価及びそれに基づく担子菌分類体系の再検討
Table 2Distribution of anamorph producing species in Agaricales.

－ 21 －

前川

結果は分節型分生子の形成菌糸の形状および形成様式がハラタケ亜門の科レベルの分類形質となり得ることを示
唆する．

二太郎

H. ulmarius (Bull.) Redhead は形成しないとされている（ 長 澤・ 有 田，1988 ）． し か し， 本 研 究 で 供 試 し た H.

分 節 型 分 生 子 が 菌 糸 か ら 離 脱 す る 様 式 は， 破 裂型

ulmarius の二次菌糸体株では旺盛な分節型分生子の形成が観察された．一方，Lyophyllum 属および Leucocybe 属（ rhexolytic secession ）と開裂型（ schizolytic secession ）では供試したいずれの種においても培養菌糸体に分生子の離脱様式に大別される（ Cole & Samson, 1979; Waltherの形成は認められなかった．なお，H. ulmarius の 1 菌

et al., 2005 ）．そこで，ハラタケ目に所属する科の中で，分節型分生子を形成する供試種が 5 種以上含まれる 7株においては，分節型分生子に加えて，出芽型分生子の科について，分生子の離脱様式について調査した．その 結 果， ハ ラ タ ケ 科（ Agaricaceae ）， オ キ ナ タ ケ 科

Ossicaulis 属に所属する種の分節型分生子の Q 値（長O. lachnopus (Fr.) Contu が 5.4 および 6.5，O.
さ／幅）は，（ Bolbitiaceae ），ヒメノガステル科（ Hymenogastraceae ）lignatilis (Pers.) Redhead & Ginns が 6.5 であり，シメジ形成が観察された．

およびシメジ科（ Lyophyllaceae ）においては供試種のすべてが開裂型の離脱様式（ Figs. 2A, B ）を持つのに対 し， ナ ヨ タ ケ 科（ Psathyrellaceae ）， モ エ ギ タ ケ 科（Strophariaceae ）およびキシメジ科（Tricholomataceae ）においては供試したすべての種は破裂型の離脱様式（ Fig. 2D ）を示した（ Table 3 ）．これらの結果は，分節型分生子の離脱様式もまた科レベルの分類形質として有用であることを示している．なお，シメジ科に所属する
Gerhardtia sp. においては開裂型であるが，破裂型の離脱様式も観察された（ Fig. 2C ）．
シメジ科における分節型分生子等の分類形質としての評価
Gerhardtia 属，Hypsizygus 属 お よ び Ossicaulis 属 に おいて，分節型分生子はいずれの種も直線状菌糸に形成され， 開 裂 型 の 離 脱 様 式 を 示 し た． 本 研 究 で 供 試した
Asterophora lycoperdoides (Bull.) Ditmar（ TUFC 31130 ）は，分節型分生子の形成が観察されなかったが，本種および A. parasitica (Bull.) Singer が分節型分生子を培養菌

Fig. 2

糸 体 に 形 成 す る こ と が Clémençon（ 2004 ） お よ び
Durand & Nicot（ 1968 ）によって報告されている．また，
Hypsizygus 属種の培養二次菌糸体において，H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow は分節型分生子を形成するが，Table 3

Secession modes of arthroconidia in Agaricomycotina
produced in mycelia. A, Hyphsizygus marmoreus (arrowheads: schizolytic secession). B, Sistotremastrum niveocremeum (ar rowheads: schizolytic secession). C,
Gerhardtia sp. (arrowheads: rhexolytic secession). D,
Pholiota adiposa (arrowheads: rhexolytic secession).
Scale bars: A–D = 5µm.

Secession modes of arthroconidia in families of Agaricales.

－ 22 －

きのこ類培養形質の分類形質としての評価及びそれに基づく担子菌分類体系の再検討

科の Hypsizygus marmoreus（ Q 値:2.6 ），H. ulmarius（ Q
値:3.0 ），Gerhardtia sp.（ Q 値:2.1，2.2 ）と比較して明らかに大きく，また分節型分生子は有意に長い値を示した（ Fig. 3 ）．さらに，モエギタケ科（ Strophariaceae ）に所属する Hypholoma lateritium (Schaeff.) P. Kumm.（Q
値:2.4 ），H. subviride (Berk. & M.A. Curtis) Dennis（ Q
値:2.1，2.4，2.4 ），Pholiota adiposa (Batsch) P. Kumm.
（ Q 値:2.7 ），P. aurivella (Batsch) P. Kumm.（ Q 値:2.6 ），コウヤクタケ科に所属する Punctularia atropurpurascens(Berk. & Broome) Petch（ Q 値:1.9 ）， フ サ タ ケ 科（ Pterulaceae ）に所属する Deflexula fascicularis (Bres.
& Pat.) Corner（ Q 値:2.7 ）， お よ び ヒ ド ノ ド ン 科（ Hydnodontaceae ）に所属する Sistotremastrum niveocremeum (Höhn. & Litsch.) J. Erikss.（ Q 値:3.0 ） の い ず
れの分節型分生子よりも Ossicaulis 種の Q 値は大きく，
本属種の分節型分生子は有意に長いことが明らかになっ

Fig. 3た（ Fig. 3 ）．したがって，Ossicaulis 属においては培養
菌糸体に形成される分節型分生子の長さが他属との判別形質になり得ると考えられる．また，本属の分節型分生
子 形 成 能 を 調 査 し た 結 果，O. lachnopus お よ び O.
lignatilis ともに供試したすべての一次菌糸体において分節型分生子の形成が認められた（ Table 4 ）．一方，二次Size of ar throconidia produced by agaricomycetous
fungi produced in culture. Each plot represents following
species: 1, Deflexula fasicularis; 2, Hypholoma lateritium;
3–6, Hypholoma subviride; 7, Hypsizygus marmoreus; 8,Hypsizygus ulmarius; 9 and 10, Ossicaulis lachnopus; 11,
Ossicaulis lignatilis; 12, Pholiota adiposa; 13, Pholiota
aurivella; 14, Punctularia atropurpurascens; 15, Sistotremastrum niveocremeum; and 16 and 17, Gerhardtia sp.

菌糸体においては，両種ともに一部の菌株においてのみ，Table 4

Production of arthroconidia in monokaryotic and dikaryotic mycelia of Osscicaulis spp.

－ 23 －

前

川二太郎

分節型分生子が観察された（ Table 4 ）．これら 2 種におGloeocystidiellum sp.（ TUMH61421 ）は，Gloeoystidiellum

いては，一次菌糸体では安定的に分生子が形成されるが，二次菌糸体では分生子形成能が低下することが示唆されporosum–clavuligerum complex（ Larsson & Hallenberg,
2001; Larsson, 2002 ）に所属し，類似種の G. clavuligerum

た．そこで，O. lachnopus の和合性が認められている一(Höhn. & Litsch.) Nakasone 等とは形態的特徴において

次菌糸体 2 菌株の分節型分生子の形成量とそれらの交配

判別が困難な隠蔽種である．しかし，Gloeocystidiellum

によって得られた二次菌糸体（交配株）の分節型分生子

sp.（ TUMH61421 ）の培養菌糸体の菌叢は紛状を呈し，の形成量とを比較した．その結果，O. lachnopus の二次倒卵形で小型の出芽型分生子と棍棒形で大形の出芽型分菌糸体（交配株）の分生子形成量は，それらの親株であ生子を旺盛に形成する特徴を有する．一方，G. porosum–

る一次菌糸体の形成量に比べて明らかに減少した（ Fig. 4 ）．これらの結果は，Ossicaulis 属種の培養菌糸体

clavuligerum complex に所属する他の種の培養菌糸体は
いずれも綿毛状であり，培養菌糸体に出芽型分生子の形

における分節型分生子の形成能が二次菌糸体において低成は認められなかった．これらの結果は，テレオモルフ

下することを示すものであり，本属種の分生子形成能のの特徴では類似種との種判別が困難な本種において，培評価においては一次菌糸体を用いるのが妥当である．ま養菌糸体に形成される菌叢形態およびアナモルフ形成のた，このような現象が他の分類群でも生じるのかについ有無が有用な種の判別形質になり得ることを示している．

ては，今後より多くの分類群について一次菌糸体と二次Spiniger 型アナモルフは，分生子形成細胞の頂部が球形あるいは不定形に肥大し，肥大部表面に多数の小突起

菌糸体との分生子形成能の比較調査が必要である．
Asterophora lycoperdoides は培養菌糸体に無色から淡褐
色を呈し，表面が明瞭な突起によって被われた厚壁細胞が生じ，出芽型分生子はこれら小突起の先端に各 1 個形

（chlamydospores ）を形成する（Fig. 5A ）．これに対して，

このような Spiniger 型アナモルフを培養菌糸体に形成す

A. parasitica は平滑な厚壁胞子を形成することが報告さ
れ て い る（ Thompson，1936 ）．A. lycoperdoides に 見 らる種はハラタケ亜門のタマチョレイタケ目（Polyporales）
およびベニタケ目（ Russulales ）のみに認められた．タ

れる特徴ある厚壁胞子は，他の分類群の培養菌糸体ではマチョレイタケ目においては，Hyphoderma 属に所属す成されることによって特徴付けられる（ Figs. 5B, C ）．

報告されていないため，本種の判別形質として有用である．しかし，A. mirabilis (T.W. May) Redhead & Seifert
は A. lycoperdoides と同形の厚壁細胞を担子器果上に形成 す る こ と が 報 告 さ れ て い る た め（ May & Fuhrer，1995; Blanco-Dios，2011 ），A. mirabilis の培養菌糸体における本厚壁胞子の産生の有無について，今後調査する必要がある．
出芽型アナモルフの分類形質としての評価
ベニタケ目，ウロコタケ科（ Stereaceae ）に所属する

Fig. 5
Fig. 4

Productivity of ar throconidia of monokar yotic anddikar yotic mycelia in Ossicaulis lachnopus. OL1-S1×
OL1-S4 represents a dikaryotic strain arised from mating
between OL1-S1 and OL1-S4.

－ 24 －

Chlamydospores and Spiniger-type anamorphs producedin cultural mycelia. A, Chlamydospores of Asterophora
lycoperdoides. B, Spiniger-type anamorph of Hyphoderma
microcystidium. C, Spiniger-type anamorph of Heterobasidion irregulare. Scale bars: A, B = 10µm; C = 5µm.

きのこ類培養形質の分類形質としての評価及びそれに基づく担子菌分類体系の再検討

る H. heterocystidia (Burt) Donk ，H. mutatum (Peck)

ド を 形 成 し た（ Fig. 6 ）． ま た，Parmasto（ 1968 ） はDonk，H. populneum (Peck) Donk および Hyphoderma

Hyphoderma 属内に 3 つの節を設け，そのうちの 1 つをsp.（ TUFC 34078 ）で形成され，いずれの種も分生子形
成細胞の頂部は不定形であった（ Fig. 5B ）．これら 4 種

Mutatoderma 節とした．Mutatoderma 節は子実体中に結晶を被る隔壁を形成しないシスチジアを有することによ以外に供試した Hyphoderma 属 19 種の培養菌糸体に，り 特 徴 付 け ら れ る． そ の 後，Gómez & Loewenbaum

Spiniger 型アナモルフの形成は観察されなかった．さらに，ITS 領域を用いた最尤法による系統樹において，こ（ 1976 ） は， 本 節 を Mutatoderma 属 と し，H. heterocys-

れら 4 種は高いブートストラップ値（ 96 ％）でクレーFig. 6

tidia，H. mutatum および H. populneum を Mutatoderma
属に転属した．しかし，分子系統解析の結果（ Fig. 6 ），Maximum likelihood tree based on ITS rDNA of Hyphoderma species. Bootstrap values(>70％) from Maximum Likelihood (ML, BS) are indicated at nodes.

－ 25 －

前川二太郎

Mutatoderma 属 は Hyphoderma 属 に 内 包 さ れ た こ と から，Hyphoderma 属が多系統であり，本属の属レベルの統解析により，系統的位置を決定した．また，FMRC

分割の必要性が示唆された．Hyphoderma 属の再分類に情報を入手し，ハラタケ亜門に所属する 3 綱 21 目 81 科

保有種以外の種についても，文献調査により，培養特性

おいては，培養菌糸体における Spiniger 型アナモルフの442 属 1,415 種の培養菌糸体性状に基づき，アナモルフ形成の有無が属の重要な判別形質になり得ると考える．

等の形成能について解析を行った．その結果，アナモル

一方，ベニタケ目では，Bondarzewia 属，Heterobasidion

フ形成能の調査に供試した 1,415 種のうち 82 種が出芽属および Laurilia 属種において，Spiniger 型アナモルフ

型分生子を形成し，アカキクラゲ目においては供試したの形成が認められた．Spiniger 型アナモルフを形成する

す べ て の 属 種 が シ ン ポ ジ オ 型 の 形 成 様 式 を 示 し た．

4 属は，分子系統解析において，それぞれ系統的に異なる単系統群として認められた．これら 4 属は供試した

Spiniger 型分生子は系統的に異なるベニタケ目およびタマチョレイタケ目の特定の属で形成され，加えて形態的

MA 培地，コーンミール培地およびキャロット培地のい差異が属間において認められた．また，アネロ型分生子

ずれにおいても Spiniger 型アナモルフを形成し，各々のも系統的に異なる特定の属で観察された．一方，分節型属が形成する Spiniger 型アナモルフは培地間での形態的

分生子の形成は 179 種において観察され，分生子離脱様

差異が無く，形態的特徴に変異は認められなかった．さ

式は科あるいは属によって異なり，破裂型あるいは開裂

らに，4 属が形成する Spiniger 型アナモルフを比較検討

型のいずれかを示した．ハラタケ目のシメジ科に所属すしたところ，分生子の形状と表面構造の違いおよび分生る Ossicaulis 属種は同科の他属とともに離脱様式は開裂

子形成細胞の形状によって，4 属の判別は可能であるこ型であるが，本属分生子の大きさは他属種のそれらとはとが明らかとなった．したがって，ベニタケ目に所属す

有意に異なっていた．また，テレオモルフにおいて形態る Bondarzewia 属，Heterobasidion 属，Laurilia 属 お よ的差異が見出せないベニタケ目のウロコタケ科に所属すびタマチョレイタケ目に所属する Hyphoderma 属が培養

る Gloeoystidiellum porosum–clavuligerum complex に お

菌糸体に形成する Spiniger 型アナモルフは，これら 4 属

いて，培養菌糸体における分生子形成の有無によって，の判別形質となり得ることが示唆された．

判別可能な種があることが明らかとなった．これらの結本研究において，ハラタケ亜門の分類形質として従来

果は，培養菌糸体におけるアナモルフの形成の有無，形あまり重要視されてなかった培養菌糸体に形成されるア

成様式，形態等が科，属あるいは種の判別に有用である

ナモルフに焦点を当て判別形質としての評価を行った結ことを示唆する．

果，培養菌糸体におけるアナモルフの形成の有無，形成

本助成で得られた研究成果の報告

様式および形態が，分類群によっては，科，属あるいは種の判別に有用であることが示唆された．今後，さらに多くの属・種の培養菌糸体におけるアナモルフ形成の有無，アナモルフ形態，分生子形成様式を調査し，どの分類階級（ランク）における何れの分類群において，これらの形質が分類形質として有用であるかを評価する必要がある．分類形質としての有用性の評価に際しは，対象とする分類形質について，分類形質としての安定性および適用できる分類階級・分類群を分子系統解析により検証することが不可欠である．

要

約

本研究では担子菌門ハラタケ亜門に所属するきのこ類
培養菌糸体に形成される無性世代（アナモルフ）等に焦点を当て，培養形質と分類群との関係性を解析することにより，培養菌糸体に見られるアナモルフ等の分類形質としての評価を行なうことを主要な目的とした．鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源研究センター（FMRC）
保存菌株の培養菌糸体を供試して，菌糸体の培養特性を調査するとともに，分離源標本の形態観察および分子系

口頭発表
1) 小 林 崇 人 ， 早 乙 女 梢 ， 中 桐 昭 ， 前 川 二 太 郎 ． 2 0 1 6 ．
Gloeocystidiellum porosum様子実体を形成する担子菌の分類学的検討．日本菌学会第60回大会．9月16–18日，京都．
2) 志野遼太郎，早乙女梢，遠藤直樹，前川二太郎，中桐昭．2017．Spiniger型アナモルフを持つ担子菌の系統位置と分生子形成の分類学的及び生態学的意義．第2回環境微生物系学会合同大会．8月29–31日，仙台．
3) Shino, R., Sotome, K., Endo, N., Maekawa, N. & Nakagiri, A.
2017. Systematic position of basidiomycetes forming
Spiniger-type anamorph and taxonomic and ecologicalsignificance of the conidial formation. The 14th
International Joint Symposium between Korea and Japan.
8–9 November, Fukuoka, Japan.
4) 前川二太郎，奥田雄大，遠藤直樹，早乙女梢，中桐昭．
2018．シメジ科菌類の培養菌糸体が形成する分節型分生子の分類形質としての評価．日本菌学会第62回大会．5月
25–27日，長野．
5) 砂川直徹，遠藤直樹，早乙女梢，前川二太郎，中桐昭．
2018．異担子菌類のアナモルフの多様性とその分類学
的・生態学的意義．日本菌学会第62回大会．5月25–27日，長野．
6) 志野遼太郎，早乙女梢，前川二太郎，遠藤直樹，中桐－ 26 －

きのこ類培養形質の分類形質としての評価及びそれに基づく担子菌分類体系の再検討
昭．2018．水辺の材上に分生子柄束様構造を形成する担子菌の構造と生態．日本菌学会第62回大会．5月25–27日，長野．
7) 志野遼太郎，早乙女梢，遠藤直樹，前川二太郎，中桐昭．2018．担子菌培養株で形成されるアナモルフの分類形質としての意義，― Spiniger型アナモルフを持つ担子菌について ―．日本微生物資源学会第25回大会．6月13–15
日，函館．

謝

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源研究センターの上田祥子技術補佐員ならびに学生諸氏に感謝の意を表します．

文

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－ 27 －

IFO Res.Commun. 32
29-39, 2018

好熱性細菌が放出するウイルス様膜小胞と分泌型プロテアーゼ巨大分子複合体の関連解明そして応用への挑戦
渡

部

邦

彦

京都府立大学大学院生命環境科学研究科〒606-8522

京都市左京区下鴨半木町1-5

Elucidation of the relation between membrane vesicles exfoliatedby a thermophilic bacterium and secretory protease complex assemblies,
and challenge for their application
Kunihiko Watanabe
Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University,
Kyoto 606-8522, Japan
This project focuses on “membrane vesicles” exfoliated from the outer membrane of Meiothermus ruber H328. This
strain was screened from Arima Hot Spring, Kobe, Japan, and has been found to produce protease complex
assemblies that degrade keratin, one of the major proteins in feathers. Two methods preparing for the assemblies
and membrane vesicles were developed; Method 1 mainly consisted of ultrafiltration with a membrane filter for
higher-weight molecules and a size-exclusion chromatography with Sephacryl S-1000, followed by sucrose density
gradient (0 - 60 ％) ultracentrifugation. Two keratinolytic active fractions were separated by the method; one
fraction containing membrane vesicles produced by the strain H328 and associated with keratinolytic activity (SUAF in Peak 1 fraction), and the other fraction containing the assemblies of keratinolytic protease complex (Peak 2
fraction). Membrane vesicles most likely included the assemblies in the bilayer of the membrane and thosestructures were confirmed by electron microscopy (TEM) analysis. Furthermore, one serine peptidase (Protein B,
MrH_874) responsible for keratinolytic activity and its accessor y protein (Protein A, MrH_873) were
simultaneously identified in MALDI-TOF/MS/MS analysis by use of the information on the whole genome of thestrain H328. Their localization in membrane vesicles and the assemblies of keratinolytic protease complex was
shown by immunoelectron microscopy analysis. Method 2 was developed for quantitative analysis of membrane
vesicles, utilizing a fluorescent dye DiI. To enhance the productivity of membrane vesicles in the strain H328, aheat shock protein degP gene was selected from the genome and knocked out in the strain H328. The methodclarified that the deletion of degP gene in the strain H328 caused four to five-fold increase in their productivity at
60 ℃ as compared at 55 ℃. Candidates for scaffold proteins in membrane vesicles of M. ruber H328 were searched
and three proteins were finally selected.
Key words: membrane vesicle, protease, Gram-negative bacterium, keratin, assembly緒

言究の中で，重要なキーワードは「膜小胞」である．当初
は，グラム陰性細菌の外膜から膜小胞が放出されること

細菌が，酵母の出芽のように細胞表層から放出する小から外膜小胞（ outer membrane vesicle (OMV) ）と称

胞を “ membrane vesicle” と呼び，これを和訳したものされることが多かった．ところが昨今の総説では（ Kulp

を「膜小胞」と言う（渡部，2014；渡部，2015 ）．この研& Kuehn, 2010 ; Brown et al., 2015 ），グラム陽性細菌にも膜小胞が存在することが報告されて以来（ Dorward

E-mail: kwatanab@kpu.ac.jp
共同研究者:増村威宏（京都府立大学大学院生命環境科学研究科），
川崎一則（産業技術総合研究所健康科学部門）& Garon, 1990 ）， 外 膜 由 来 に 限 定 せ ず 広 く 呼 ば れ，“ extracellular vesicle” と称されることもある．歴史的には 半 世 紀 以 上 前 か ら， 似 た 報 告 が あ っ た（ Bladen &－ 29 －

渡部

Waters, 1963 ; Knox et al., 1966 ）．しかし実際に細菌細胞より小さい膜小胞に出会って初めてこれらの研究を知るに至ったというのが筆者の場合で，その存在を教えてく

邦彦

CaCO3 も 添 加 し た． 培 養 は，2 L 三 角 フ ラ ス コ 中，
200 ml の培地を含み，55 または 60 ℃で好気的にロータリーシェーカーで振とう（ 180 rpm ）させて行った．

れたのは，神戸市北部の有馬温泉泉源からスクリーニン
グされた好熱性細菌 H328 株である．単離された当初は，

ケラチン分解性プロテアーゼを含む膜小胞の調製の検討

ここまで貴重な研究材料になるとは思っていなかった意

基本的には，以前の論文（ Kataoka et al., 2014 ）の方外な菌株であり，異分野の技術を持つ研究者との共同研究

法に従って調製した．即ち H328 株を，トリ羽毛を添加の重要性を，改めて印象付けてくれた菌株でもある．

した培地で 60 ℃，2 ないしは 3 日間培養した後，遠心で

当初 H328 株は，エラスチンという不溶性タンパク質

細菌細胞とトリ羽毛分解残渣を取り除いて得られた上清を強力に分解することでスクリーニングされて来た．長を，限外ろ過濃縮機（ Tangential Flow Filtration (TFF)

桿 菌 で， 赤 い 色 素 を 出 す コ ロ ニ ー 形 態， そ し て 16S

System, 排除限界ポアサイズ 0.03 μm(500 kDa に相当),

rRNA 遺伝子配列から，Meiothermus ruber と同定した．

ミリポア社）で約 1/30 にまで濃縮した．得られた濃縮

好 熱 性 細 菌 と し て は， 至 適 生 育 温 度 が 50－60 ℃ で，液 を， 巨 大 分 子 量 用 ゲ ル ろ 過 ク ラ マ ト グ ラ フ ィ ーThermus 属 細 菌 が 軒 並 み 70 ℃ 以 上（ Brock & Freeze
1969 ）であることと比べると見劣りがする．そのため（ Sephacryl S-1000, 排除限界分子量 1 x 108 Da ）にかけ，分子量の異なる 2 つの画分（高分子側，Peak 1 画分；低

この属は，当初は Thermus 属で報告・提案されたものの，分子側，Peak 2 画分）に分けた．高分子側 Peak 1 画分を，「劣る」という意味の接頭語 Meio をつけた Meiothermus

ショ糖密度勾配（ 0－60 ％(w/v)）の超遠心（ 4 ℃, 4 h,属が新たに設定されている（ Nobre et al., 1996 ）．微生

116,000 x g ）にかけ，その後 0.5 ml ずつ回収し，活性，物分解が難しい不溶性タンパク質を分解するなら，産業タンパク質量，電子顕微鏡解析を行った（ Fig. 1, Method

廃棄物のトリ羽毛も分解するかも知れないという単純な

1）．超遠心は，日立工機 himac CP65 β，同社スイングロー

着想から，培養に工夫を加えてトリ羽毛を分解すること

ター P28S2 を用いて行った．

を示し，本研究につながっている（ Matsui et al., 2009 ）．
引き続く研究の常套ステップとして，トリ羽毛の主成分

透過型およびフリーズフラクチャーレプリカ法による電であるケラチンタンパク質を分解する強力なプロテアー

子顕微鏡（電顕）解析

ゼの研究へと進んで行ったわけであるが，「膜小胞」との出会いはそこからスタートする．

上記の方法に従って調製された Peak 1 画分と Peak 2
画分に含まれる構造体（膜小胞）の外形の様子を調べる

本研究では，最初に H328 株が産生するケラチン分解ために，試料を常法によって 1％酢酸ウラニルでネガティ性プロテアーゼを含む膜小胞の調製の検討とフリーズフ

ブ 染 色し， 透 過 電子 顕 微 鏡（ FEI 社，Tecnai G2 F20）

ラクチャーレプリカ法による電子顕微鏡（電顕）解析，による観察を行った．

次いで蛍光色素を用いた膜小胞の簡便な定量法の検討，
そして膜小胞産生の量的コントロールとして degP 遺伝
子破壊による効果を，質的コントロールとして膜小胞表
面提示のための足場タンパク質の検討を報告する．

実験方法
細菌株と培養本研究では，神戸市北部の有馬温泉泉源から単離した
Meiothermus ruber H328 株を用いた（Matsui et al., 2009 ）．
16S rRNA 遺伝子の塩基配列（ 1,412 bp ）が，同種の基準株 DSM 1279T と 99.9 ％という高い相同性を有する他，
生育温度帯，赤い色素産生能，糖資化性などの共通点を有する．本菌株は，エラスチンなどの不要性タンパク質を強力に分解する特徴を持つことでスクリーニングされFig. 1てきた．本研究で用いた基本培地として，YS 培地（0.5 ％(w/v) 酵母エキス，0.5 ％(w/v) ショ糖 (pH 8.0) ）およ
びこれにトリ羽毛（ 3 ％(w/v)）を加える場合には，
0.5 ％－ 30 －

Preparation methods for the keratinolytic protease fraction
containing membrane vesicles from M. ruber H328.
Method 1, basic method that was employed in our previous
report (Kataoka et al., 2014); Method 2, simple methodfor quantitative analysis by use of a fluorescent dye, DiI.

好熱性細菌が放出するウイルス様膜小胞と分泌型プロテアーゼ巨大分子複合体の関連解明そして応用への挑戦

さらに Peak 1 画分，ショ糖密度勾配超遠心後のケラ

ギ抗体，Protein B 抗体に対しては，15 nm 金コロイドでチン分解活性のある画分（ショ糖密度 35－50 ％，以降「超標識した抗マウス IgG ヤギ抗体を用いた．ネガティブ染

遠心活性画分」(SU-AF)）と活性のない画分（ショ糖密色は，酢酸ウラニル（ 2 ％(w/v)）を用いた．

度 10 ％未満，以降「 10 ％未満画分」(10LF)）に対して，
フリーズフラクチャーレプリカ法を実施した．液体ヘリ

蛍光色素を用いた膜小胞の簡便な定量法

ウムによる急速冷凍後，凍結試料をフリーズフラク

膜小胞の産生能を培養上清に対して簡便に定量するたチャー装置（ BAF400D, Balzers 社）の真空チャンバー

め，上記の調製法ではなく，次に示す方法で行った内の冷却試料台に設置して，－110 ℃で試料をナイフで（ Fig. 1, Method 2 ）．トリ羽毛を添加した培地で 60 ℃，2,割断した．試料を回転させながら，露出した割断面に白4, 6 日間培養した後，各 25 ml 抽出し遠心（ 5,800 x g, 10

金を蒸着（約 6.5 mm 厚）してレプリカ膜を作製し，補分を 2 回）で除菌とトリ羽毛分解残渣を取り除いて上清

強のためカーボンを蒸着（約 25 mm 厚）させた．フリーを得た．これを，0.45 μm のフィルターにかけ，得られズフラクチャー装置から取り出した試料を，塩素系漂白

たろ液を超遠心（ 110,000 x g, 2 時間）にかけ，沈殿を剤そして希硫酸による付着物の除去を行った後，コロジ

50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) 500 μl に再縣濁し，膜小オンを張った電顕用グリッド（銅，150 mesh ）の上に胞サンプルとした．これに，蛍光色素 DiI (1,1' - dioctadecyl-

レプリカ膜を回収した．そのグリッドを透過型電子顕微

3, 3, 3', 3' - tetramethylindocarbocyanine perchlorate) を 最鏡を用いて加速電圧 200 kV にて観察した．

終濃度 5 μM になるように加え，37 ℃で 1 時間反応後，H328 株菌体に対する電顕解析（ TEM ）は，以前に示

励起波長 550 nm，測定波長 570 nm で蛍光測定を行った．

した方法に準拠して実施した（ Yamaoka et al., 2014 ）．
膜小胞に含まれるケラチン分解性プロテアーゼの同定と膜小胞産生の量的コントロール− degP 遺伝子破壊による効果

局在性の検討H328 株における degP 遺伝子の検索は，H328 株ゲノ

ケラチン分解性プロテアーゼを含む膜小胞の調製によム情報を基に，大腸菌 degP 遺伝子との相同性（ BLASTP

り分画された 2 つ（ Peak 2 画分と超遠心活性画分）に検索），局在性，転写プロモーターの存在について最上

対し，SDS - PAGE 電気泳動を行い，クマジーブリリアン

位 の も の を 選 択 し た．degP 遺 伝 子 破 壊 株 の 作 成 は，トグリーンで染色，脱色後，解析したいバンドを切り出

Thermus thermophiles の相同組換えの方法（ Hashimoto

し，抽出したタンパク質に対し，還元，アルキル化を行った．その後，トリプシンまたはリジルエンドペプチダー

et al., 2001 ）に準じて行い，遺伝子破壊を目指す遺伝子の 5’ 上流，3’ 上流，それぞれ約 1 kb を PCR で断片作製後，ゼによる消化酵素処理を行い，Mono Tip miniC18 を用

カナマイシン耐性遺伝子を両断片の間に挟み込んでプラ

いて脱塩，トリフルオロ酢酸（ TFA, 0.1 ％(w/v)），アセ

スミドを構築し，H328 株ゲノムとの間で相同組換えをトニトリル（60 ％(w/v)）による溶解の後，MALDI-TOF/

行わせた．それをカナマイシン耐性でスクリーニングし，MS/MS 解析にかけた（ AXIMA Performance, 島津製作

最終的には候補株のゲノムに対して PCR で遺伝子破壊所）．得られたデータと H328 株の全ゲノム情報（ Inadaを確認した．

& Watanabe, 2013 ）を照合することで，ケラチン分解性
膜小胞表面提示のための足場タンパク質の検索

プロテアーゼの同定を行った．

これまで別途膜小胞を調製する過程のサンプルについ

同 定 さ れ た Protein A （MrH_873) お よ び Protein B（MrH_874) の局在性の確認は，Peak 1 画分，Peak 2 画分，て MALDI-TOF/MS/MS 解析を行い，H328 株のゲノム

超遠心活性画分，そして 10 ％未満画分の 4 つの画分に情報（ Inada & Watanabe, 2013 ）と照合してきた．この対して，直接グリッド（ニッケル，100 mesh ）に各サ

照合作業により選択されてきたタンパク質を中心に，膜ンプルを載せ，グルタルアルデヒド（ 1 ％(w/v)）で固タンパク質探索ソフトウエア TMHMM（ http://www.

定後，免疫電子顕微鏡解析により行った．基本的な方法

cbs.dtu.dk /services/TMHMM - 2.0/ ）およびグラム陰性は，以前の報告に従って行った（ Saito et al., 2012 ; Sasou

細菌タンパク質に特化した PSORTb（ http://www.psort.

et al., 2016 ）．用いた 1 次抗体は ，Protein A および Protein
B の組換え体タンパク質を，大腸菌 BL21（DE3) と発現

org/psortb/ ）により，候補タンパク質を検索した．

結プラスミド pET11a を利用して大量発現後精製し，これを抗原にして Protein A 抗体はウサギから，Protein B 抗

果体はマウスから調製した．2 次抗体は，Protein A 抗体に

当初は M. ruber H328 株が産生する細胞外のケラチン

対しては，5 nm 金コロイドで標識した抗ウサギ IgG ヤ

分解性プロテアーゼを研究するため，これまでの生化学－ 31 －

渡

部

邦

彦

的手法を駆使して，常套的な精製手段を施してみた．とPeak 2 画分，そして Peak 1 画分をもとにショ糖密度勾

ころがいずれの方法も顕著な効果がなく，研究が立ち往配超遠心で得られた活性を示した画分（超遠心活性画分）

生した状態であった．このプロテアーゼが 105 Da をはと活性のない画分（ 10 ％未満画分）の 3 つについて中

るかに超える巨大分子量を取り，まるでプロテアソーム

心的に以後の調査を行った．

様の挙動が認められていたので，排除限界分子量が大きく，大量の培養上清の限外ろ過を可能にする装置 TFF

透過型およびフリーズフラクチャーレプリカ法による電system と，ウイルスやプラスミド精製用のゲルろ過ク

顕解析
上で得られた 3 つの画分について（ Peak 2 画分，超ロマトグラフィー（ Sephacryl S-1000）の採用が，進展

遠心活性画分，そして 10 ％未満画分），電顕解析（ TEM ）を後押ししてくれた．

を行った（ Fig. 3 ）．Peak 2 画分では，直径 10 nm 程のケラチン分解性プロテアーゼを含む膜小胞の調製の検討

小さな顆粒状の粒子が沢山見られるのに対し，Peak 1

限外ろ過濃縮（ TFF system ）後のゲルろ過クロマト

画分由来の超遠心活性画分と 10 ％未満画分には，直径グラフィー（ Sephacryl S-1000）で 2 つの画分（ Peak 1

100 nm 程の球形の構造物が見られた．これをさらにフ画分と Peak 2 画分）に分かれた（ Fig. 2 ）．この結果はリーズフラクチャーレプリカ法を行うと，超遠心活性画以前若干異なる調製法で行われた時と類似のものであっ分の凍結割断面では，直径が 100 nm 程度の凸面（ convex

た（ Kataoka et al., 2014 ）．得られた 2 つの画分のうち，face ）と直径が 100 nm 程度の凹面（ concave face ）の 2

前者が高分子側，後者が低分子側であるが，限外ろ過を種類の像が観察された．生体膜が存在する場合のフリー

分画分子量 500 kDa で実施しており，Peak 2 画分でも相ズフラクチャーでは，膜の脂質二分子層が疎水性界面で当の分子量を有すると考えられた．このうち高分子側の劈開されることによって，相補的な凸面と凹面の 2 種類

Peak 1 画分については，ショ糖密度勾配（0－60 ％(w/v)）の割断面が観察される．今回得られた結果はこの膜の割の超遠心をかけ，その後 0.5 ml ずつ分画して回収し，ショ断の一般則に一致する．すなわち，ショ糖密度 35－50 ％

糖濃度に応じたケラチン分解活性とタンパク質量を調べの活性画分で観察される 100 nm 程度の構造体には膜小た．その結果，ケラチン分解活性は，ショ糖密度 35－胞が含まれていることを示していた．加えて，超遠心活50 ％にあり，ショ糖密度 10 ％以下の画分には活性が見性画分については，Peak 2 画分で観察される粒子状のられないもののタンパク質の存在が確認された．このこ

ものがこの 2 つの面にも見られ，Peak 2 画分の 10 nm 大とから，ゲルろ過クロマトグラフィーにより得られたの顆粒状粒子は，ケラチン分解性プロテアーゼを含む複合体で，それが超遠心活性画分で，二重膜の間に局在する可能性があることを示唆した．同様に，10 ％未満画分でも凸面（ convex face ）と凹面（ concave face ）の 2種類の像が観察されたため，脂質二分子層を有する構造物であることが確認できた．しかし，ケラチン分解性プ
ロテアーゼを含む複合体の存在は確認できず，これはケラチン分解活性がない画分であることと合致していた．
別途，H328 株細胞そのものについても，フリーズフラ
クチャーレプリカ法を用いた観察を行ったが，外膜と内膜構造が同時に確認され，これらの観察結果とは異なるものであった．以上のことから，Peak 1 画分由来の超遠心活性画分と 10 ％未満画分では，直径 100 nm 程の膜を持つ小胞を有すること，そして超遠心活性画分ではケラチン分解性プロテアーゼを含む顆粒状粒子を持ち，ショ糖密度で重い画分（ 35－50 ％）となって活性を示すのに対し，軽い画分（ 10 ％未満）では顆粒状粒子はFig. 2Elution pattern of the keratinolytic protease fraction
containing membrane vesicles from M. ruber H328 on
Gel filtration chromatography Sephacryl S-1000.
- ● -, keratinolytic activity (U/ml-eluate)- □ -, protein concentration (A 280)

観察されず活性を示さないことが判った．この結果を基に，直径 100 nm 程の膜を持つ小胞は「膜小胞」である
ことが強く示唆され，H328 株細胞表層からこれが放出される電顕写真（ Fig. 4 ）も踏まえて「膜小胞」であると判断された．

－ 32 －

好熱性細菌が放出するウイルス様膜小胞と分泌型プロテアーゼ巨大分子複合体の関連解明そして応用への挑戦

Fig. 3

Electron microscopy (TEM) images and the freeze-fractured-replica method.
The samples (Peak 1 and Peak 2 fractions) were derived from the previous step for the preparation method, Method 1.
From Peak 1 fraction, two fractions were obtained by sucrose density gradient ultracentrifugation; keratinolytic active
fraction (SU-AF) and lower than 10 ％ sucrose fraction (10LF). The method for the ultracentrifugation was described in
the text. Closed arrows indicate membrane vesicles (MVs) and open arrows indicate granular particles in 10 nm. The
freeze-fractured-replica method was done following the explanation described in the text. TEM preparation are shown in
our previous report (Yamaoka et al., 2014). Scale bars represent 100 nm

Fig. 4

Electron microscopy (TEM) images of Meiothermus ruber H328. The incubation of the strain with chicken feathers andtheir preparations for the electron microscopy analysis were done as in the previous report (Yamaoka et al., 2014).
Arrows indicated membrane vesicles.

－ 33 －

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部

邦

彦

膜小胞に含まれるケラチン分解性プロテアーゼの同定と遺 伝 子 (2,094 bp, 697a.a.)）， このプ ロテアー ゼ（ 以 後

局在性の検討Protein B）が，ケラチン分解性プロテアーゼとして Peak 1

MALDI-TOF/MS/MS 解析と H328 株のゲノム情報を画分と Peak 2 画分に含まれる巨大分子複合体にあること照合させた結果，Peak 2 画分から 25 タンパク質が，超を突き止めた．加えて，大変興味深いことに，この遺伝子

遠心活性画分からは 16 タンパク質が同定され候補としの 5’上流側 4 bp のところにある機能未知の MrH_873 遺て上がってきた．他方でゲノム情報からは，プロテアー

伝 子（ 以後 Protein A ，2,025 bp, 674 a.a.））の産物が，ゼ遺伝子が全 78 個見つかり，分泌型シグナル，転写プ

プロテオーム解析でいずれの画分でも Protein B と同時に

ロモーター，局在性予測などから，26 遺伝子に絞り込検出された．この 2 つの遺伝子は，別途 mRNA の発現解んだ．さらに，予備実験として，培養上清中のケラチン

析においてもオペロンとして機能することが明らかになり，

分解性プロテアーゼ活性に対する阻害剤の検討から，セProtein A が Protein B のアクセサリー的あるいはシャペロ

リンプロテアーゼ阻害剤（フェニルメチルスルフォニル

ン的な機能を有するなど，タンパク質のレベルでも何らか

フルオリド (PMSF)）とジイソプロピルフルオロリン酸の機能的相互作用を持つことが強く示唆された．

（ DFP ）が，ほぼすべての活性を阻害することが判り，同定された Protein A と Protein B について，Peak 1 画

セリンプロテアーゼに着目することにした．絞り込んだ

分，Peak 2 画分，超遠心活性画分，そして 10 ％未満画

26 候補遺伝子のうち，セリンプロテアーゼは 18 あるこ

分の 4 つの画分に対して，局在性の調査を，2 つのタンとが分かった．この 18 候補遺伝子を MALDI-TOF/MS/

パク質に対するポリクローナル抗体を用いた免疫電顕解

MS 解析で確認・同定されたタンパク質と照合したとこ

析を行って調査した．Protein A と Protein B に対する一ろ，超遠心活性画分と Peak 2 画分で共に同定されるセリ次抗体は，二次抗体で識別できるように異なる動物（マンプロテアーゼは 1 つだけゲノムに存在しており（ MrH_874

ウスとウサギ）から調製した．その結果，Fig. 5 に示す

Fig. 5

Immunoelectron microscopy analysis for localization of Protein A and Protein B. The preparation of antibodies toProtein A and Protein B was done according to the method described in the text by use of mouse and rabbit, respectively. The secondary antibodies conjugated with different size of colloidal gold particles (5 nm for Protein A and 15 nm
for Protein B) were employed for the detection of two proteins.
□:>100 nm membrane vesicle▲:5 nm gold-colloid (Protein A)△:15 nm gold-colloid (Protein B)
white bars:size marker 100 nm－ 34 －

好熱性細菌が放出するウイルス様膜小胞と分泌型プロテアーゼ巨大分子複合体の関連解明そして応用への挑戦

よ う に，Peak 1 画 分 と 超 遠 心 活 性 画 分 か ら 得 ら れ た
100 nm 程の膜小胞には，Protein A および Protein B の存
在を示す大小のシグナルが見えるのに対し，10 ％未満
画分ではシグナルが検出されなかった．さらに，Peak 2
画分の顆粒状粒子に対して，両タンパク質のシグナルが検出されたことから，Peak 2 画分の 10 nm 大の粒子は，両タンパク質を含むことが判明した．このことから，
Protein A および Protein B は，Peak 2 画分に見られる顆
粒状粒子に含まれる形で，膜小胞にも局在する可能性が示唆された．
膜小胞産生の量的コントロール− degP 遺伝子破壊によFig. 6る効果
膜小胞産生が，同じグラム陰性細菌である大腸菌において，熱ショックタンパク質かつ翻訳されたタンパク質
移送後の分解を担うとされている degP 遺伝子の欠損が膜小胞産生能増加に関与することが報告されていた（ Schwechheimer & Kuehn, 2013 ）．そこで本菌株でもまず degP 遺伝子の検索を行った結果，HtrA2 peptidase とアノテーションされる遺伝子（ MrH_331, 413 a.a., 推定分
子量 44.5 kDa ）が最上位に選択されてきた．他にも 2 つの遺伝子が候補として選択されてきたが，特に相同性でFluorescence intensity for quantitative analysis ofmembrane vesicles produced by the wild type H328
strain and the mutant ΔdegP. Two strains were incubatedat 55 or 60 ℃ in YS medium. Each sample was preparedfrom the corresponding culture in the indicated culture
time (2, 4, or 6 days). After the procedure explained in
the text, each sample was incubated with DiI at 5 μM for
1 h at 37 ℃ and then the fluorescence intensity wasmeasured.
: wild type at 55 ℃
: wild type at 60 ℃
: mutant ΔdegP at 55 ℃
: mutant ΔdegP at 60 ℃

MrH_331 が最も高い（ 36 ％）ものであった．引き続き
MrH_331 について，この遺伝子破壊を相同組換えにより実施し，カナマイシン耐性で選択後，PCR でもこのに散見されるのに対し，degP 遺伝子破壊株の方では，遺伝子の欠損を確認した．

55 ℃培養時に対し，著しく膜小胞と見られる小胞が増H328 株の変異株である degP 遺伝子破壊株の細胞特性加していることが分かった．しかし，これらの現象は，を知るため，培養温度 55 ℃と 60 ℃における生育と細胞

トリ羽毛のない YS 培地で観察されるに留まっており，

形態を調べた．その結果，野生型 H328 株は，両方の温培 地 に ト リ 羽 毛 が 存 在 す る 時 に は， 羽 毛 分 解 物 が度で良好な生育（ OD660 が 1.5 超）を示したが，degP 遺

Method 2 の方法では重篤な夾雑物となり蛍光強度の増伝子破壊株は，55 ℃では野生型と同じだったのに対し加に支障となることから，トリ羽毛が存在する培地でのて，60 ℃では 6 日間の培養でも生育を示す OD660 が 1 程検討に適した調製方法の検討が必要である．

ることが判った．この後，培養上清から簡便に調製し膜小胞表面提示のための足場タンパク質の検索

度までしか上昇せず，細胞形態も異常に長い細胞になたサンプル（ Fig. 1, Method 2 ）に対し，膜小胞産生量

膜小胞の量的コントロールに続き質的コントロールとを調べるため，蛍光色素 DiI（ 1,1' - dioctadecyl - 3, 3, 3', 3' -して，膜小胞表層へターゲットするタンパク質分子の提tetramethylindocarbocyanine perchlorate ）を用いて，蛍示は，新しい膜小胞の応用として重要な課題である．そ

光量の変化を見た．その結果，Fig. 6 に示すように，4こで，膜小胞表層に局在するタンパク質を，膜小胞での日目から 55 ℃培養時と比べ 60 ℃培養時には，培養上清

足場タンパク質として応用できないか検討した．実際にml あたり 4－5 倍程度の蛍光強度の上昇が見られ膜小胞は，この足場タンパク質に有用タンパク質を遺伝子融合

産生量が増加していることが示唆された．この現象は，させて膜小胞表層に発現させることが目的である．膜小6 日目でも同様な増加が継続して確認されていた．次に，胞の応用の一つとして，ワクチン生産のためのツール開同法により調製した膜小胞画分を，電子顕微鏡（ TEM ）発があり，表層提示できるタンパク質を抗原にして，抗解析を行った．Fig. 7 は，野生型株と degP 遺伝子破壊株

原タンパク質の精製や免疫賦活性アジュバントを必要との，55 および 60 ℃での膜小胞画分の TEM 画像である．

しない簡便な方法の開発が望まれている．加えて，膜小

その結果，野生型株の場合は，両温度においていずれの胞を酵素のキャリヤーにした系を構築し，新しいナノリ

場合も直径 100 nm 程の膜小胞と若干の夾雑物が同程度

アクターともいえる装置になればと考えている．

－ 35 －

渡

Fig. 7

部邦

彦

Electron microscopy (TEM) images of membrane vesicles produced in the wild type (WT) and ΔdegP mutant.

（ Fig. 8 ）．まず膜タンパク質探索ソフトウエア TMHMM（ http://www.cbs.dtu.dk /services/TMHMM-2.0/）に
H328 株の全ゲノム遺伝子情報をかけ，207 個のタンパク質遺伝子を候補として選択することができた．引き続
き， グ ラ ム 陰 性 細 菌 タ ン パ ク 質 に 特 化 し た PSORT b（ http://www.psort.org/psortb/ ） を か け る と， 上 記 のS-layer タンパク質を含む 4 個（ MrH_466, α-galactosidase ;MrH_1507, outer membrane efflux protein ; MrH_2213,
basic lipoproteins ）が選択されてきた．S-layer タンパク質については上記理由で除外することとし，MALDI-TOF/
Fig. 8Search process for candidates of scaffold proteins inmembrane vesicles of M. ruber H328.

MS/MS 解析で検出された 3 タンパク質候補について，
現在検討を進めており，膜小胞表面提示の可能性を引き続き検討していく計画である．

考

当初は，MALDI-TOF/MS/MS 解析と H328 株のゲノム情報（ Inada & Watanabe, 2013 ）と照合する過程で確察認され，常に主要なタンパク質候補として上がってきた

M. ruber H328 株が産業廃棄物であるトリ羽毛を強力に分解することからスタートし，その研究を進めていく

S-layer タンパク質（ MrH_2961 ）に焦点を絞り，抗体中で膜小胞を産生することを突き止めた．当初は，ケラのある Protein A を融合させて検出する方策で検討してチン分解性プロテアーゼを含むプロテアソーム様の巨大いた．しかし，この遺伝子が H328 株にとって必須遺伝

分子複合体という解釈で研究を進めたが，これに電子顕子である可能性が高く，遺伝子破壊株そのものを取得す

微鏡解析を実施したことで，膜小胞に遭遇した．

ることができないことが判った．そのため，S-layer タ

ケラチン分解性プロテアーゼおよび膜小胞の調製は，ンパク質に代わるタンパク質候補を検索することにした

Fig. 1 に示す 2 つの方法で行った．Method 1 は，( i ) ケ－ 36 －

好熱性細菌が放出するウイルス様膜小胞と分泌型プロテアーゼ巨大分子複合体の関連解明そして応用への挑戦

ラチン分解性プロテアーゼ活性が，巨大分子複合体と察されることから，グラム陰性細菌では共通する現象となって少なくとも 2 つの形態（膜小胞と密接に関与する考えられる．H328 株では，この研究で開発した Method

場合（ Peak 1 画分）とそうでない場合（ Peak 2 画分））

2（ Fig. 1 ）による簡便な定量法での結果であるが，トがあること，そして （ii) 膜小胞の存在（ Peak 1 画分）

リ羽毛を含む培地ではこの方法が適用できないため，膜を示すために有効な手段となった．各画分に対して小胞産生の増加現象を別の方法で確認することが次の課

MALDI-TOF/MS/MS 解析を行うといずれも複数のタン題となる．

パク質を含んでいることから，ケラチン分解性プロテ

膜小胞産生における質的検討として，膜小胞で表面提アーゼが精製されたのではなく，それらと共に巨大分子示するための足場タンパク質の開発を検討した．既に大複合体として存在することが判った．しかしゲノム情報

腸菌では，OmpA タンパク質が外膜にアンカーされていと 照 合 さ せ る こ と で，MrH_874 遺 伝 子（ Protein B,

る足場タンパク質として研究が進められているが，それ2,094 bp, 697 a.a. ）がケラチン分解活性を示す中心であとは異なるタンパク質として最初は MALDI-TOF/MS/ることを示した．加えて，MrH_873 遺伝子（ Protein A,

MS 解析でも確認された S-layer タンパク質で検討した．

2,025 bp, 674 a.a. ）を同時に見出し，この遺伝子がゲノ

しかしこの遺伝子の欠損変異株を作製することが不可でム上で隣接し，かつオペロンとして発現するものの，あったことから，必須遺伝子である可能性が示唆された．

Protein B に対してどのような機能を発揮するのか今後

そこで，他のタンパク質に目を向け（ Fig. 8 ），現在異明らかにしていくことが必要である．これら 2 つのタン

なる 3 タンパク質候補に対して同様のアプローチを行っ

パク質（ Protein A と Protein B ）は，存在が明らかになっているところである．

た膜小胞と密接に関与する場合（ Peak 1 画分）とそう

ケラチン分解性プロテアーゼとトリ羽毛分解の関係にでない場合（ Peak 2 画分）いずれでも共存しているこ

ついて調べるため，この研究から明らかになった Proteinとが示され，ケラチン分解活性の本体である Protein B

B の遺伝子欠損株を作製し，トリ羽毛分解を調べた．ケ

に対するシャペロン機能が Protein A に予想されている．

ラチン分解活性は減少しトリ羽毛分解もやや弱くなるもProtein A には，既存のシャペロンやプロテアーゼとはのの分解は進行することが判明した（未発表データ）．

相同領域が確認されておらず，これまでとは異なる手法

加えて Protein B の遺伝子破壊が行われても，別のプロで新たな相互作用を明らかにすることが課題である．

テアーゼがトリ羽毛分解のために発現・機能しているこ

電子顕微鏡解析等により膜小胞の存在が明らかになっとが推察され，そのプロテアーゼの同定を進めている．

たことは，全く意外な発見であったが，直径 100 nm 程

またプロテアーゼ以外の他の因子もトリ羽毛分解に大きのサイズはこれまで他の細菌で報告されている膜小胞とく影響しており，その因子の一つとしてケラチンタンパ

同程度のサイズで，細菌細胞とは異なることを示してい

ク質にも多く含まれるシステインの SH 残基の酸化・還る（ Kulp & Kuehn, 2010 ）．膜小胞の機能として，病原元が重要であることが判ってきている．その反応を触媒

性物質やクオラムセンシングなどの細胞間コミュニケー

する protein disulfide oxidoreductase（ PDO ）の遺伝子発ションシグナル物質の輸送が示されているが，H328 株

現を強化すると，確実にトリ羽毛の分解が強化されるこの場合は，細胞外にある栄養物質のタンパク質を分解すとが判り，タンパク質のジスルフィド結合開裂もトリ羽る酵素タンパク質の輸送という役割を担っていると考え

毛分解に重要な因子であることが明らかになりつつある．

られる．さらに膜小胞の存在で，ケラチン分解性プロテ

H328 株の場合だけでなく膜小胞を産生する細菌株全

アーゼは，強力なタンパク質変性剤（ SDS やほとんどの有

般に当てはまることだが，膜小胞の産生量が依然として機溶媒）に対して極めて強い耐性を示し，熱安定性も膜少ないことが，膜小胞をまだ応用につなげられていない

小胞により強化されることが判っている（ Kataoka et al.,原因の一つである．膜小胞への放出が，積極的あるいは2014 ）．これらの事実は，膜小胞を安定な酵素キャリヤー

受動的な細胞生理学上の現象か明確にし，膜小胞放出のとして応用することの提案に強力な例示になっている．

制御に応用することが今後の課題の一つである．その他，

膜小胞産生において，degP 遺伝子の欠損が量的増加

活性汚泥などを含むバイオフィルムや細胞間相互作用ををもたらすことがこの研究で示された．この現象は，熱解明していくと，膜小胞を大量に生産する細菌が見つかショックを与えると degP 遺伝子産物を用いて変性タン

ることが期待され，膜小胞のより実用的な応用の道が示

パク質を分泌する機構が働くはずのものが，degP 遺伝

されるであろう．トリ羽毛のような産業廃棄物の処理の子欠損でその機構が働かず，緩和策としてストレス軽減

観点からも大きな可能性を秘めている (Shigeri et al.,のため膜小胞の産生増加に繋がったと説明づけられる．

2009)．微生物の応用を志す者にとって，スクリーニン

この現象は大腸菌で確認されている（ Schwechheimer

グは極めて重要な研究ステップであり，スクリーニング& Kuehn, 2013 ）が，好熱性細菌である H328 株でも観の末に自分のオリジナルな菌株を持って新たな可能性を－ 37 －

渡

部

邦

彦

とが判った．フリーズフラクチャーレプリカ法を含む電追究する研究を推進して欲しい．
最後に，膜小胞の発生 (biogenesis) について，現在ま顕 解 析 の 結 果， 超 遠 心 活 性 画 分 に つ い て は， 直 径

でに主に 2 つが議論されている．一つは，オーソドックス

100 nm 程の脂質二重膜構造を有する膜小胞が明らかにな細胞表層から出芽のように放出される手段，そしてもなり，Peak 2 画分については直径 10 nm 程の顆粒状粒子

う一つは細胞破裂が元で出来たリン脂質が筏状に断片化構造が検出された．超遠心活性画分と Peak 2 画分に含後，球になって膜小胞を作るという手段である（Turnbull

まれるケラチン分解性プロテアーゼのタンパク質の同定

et al., 2016 ）．内膜・外膜構造を有さないグラム陽性細菌での膜小胞は，おそらく後者によるものと推察される．

を，MALDI-TOF/MS/MS 解析で確認・同定されたタン

今後，細胞の生育期と膜小胞の産生の関係がより詳細に

リンプロテアーゼ MrH_874 遺伝子であることを突き止

明らかになることや，膜小胞の構造がウイルスやファーめた．加えて，MrH_874 遺伝子とゲノム上でオペロン

ジに似ていることから，バクテリオファージ関連遺伝子を構成する MrH_873 遺伝子も同定されてきたが，このとの密接な関係が解明されて行けば，応用だけでなく進タンパク質に関しての機能は不明のままである．

パク質と H328 株のゲノム情報を照合させることで，セ化的な視点からも面白い議論が展開されていくことが期

ケラチン分解性プロテアーゼを含む膜小胞の調製法と待される（ Toyofuku et al., 2017 ）．H328 株においても，して開発した Method 2 は，蛍光色素 DiI を使った膜小Protein B のプロテアーゼあるいはこれらの巨大分子複胞の定量化を可能にした簡便法である．膜小胞の応用を

合体の局在性を，細胞外のみならず細胞内膜および外膜めざす上で必要となる膜小胞産生の量的コントロールのについてより詳細に調査することにより，膜小胞へタンため，熱ショックタンパク質である degP 遺伝子破壊に

パク質分子がリクルートされる生理学的な意味の解明とよる膜小胞産生への効果を調べた．その結果，55 ℃培

共に，膜小胞発生の手がかりがつかめる可能性がある．

養時に比べ 60 ℃培養時に 4－5 倍程度の蛍光量の上昇が日本農芸化学会 2015 年度大会（岡山大学）で，「膜小見られ，この結果は電顕解析でも著しい膜小胞様構造の胞（ membrane vesicle ）を知っていますか？」という増加を確認することが出来た．続いて，膜小胞の質的コ

キャッチーな題名で，シンポジウムを筑波大学の野村暢

ントロールとして，膜小胞上で足場タンパク質として機彦先生と世話役として開催した．当時は，細菌における能する候補タンパク質の検索を行った．MALDI-TOF/

膜小胞の存在アピールのための啓蒙活動と捉えていたもMS/MS 解析でも確実に確認できた S-layer タンパク質のの，膜小胞にかかる研究者も少なく演者を探すのに困

は，遺伝子破壊株を取得できないことから，足場タンパるほどであった．それが現在では，多数の研究者が膜小ク質としての使用が難しいと判断され，膜タンパク質検

胞関連の研究に携わって推進に貢献していることを知索ツールなどを用いて，現在 3 つの候補タンパク質を選り，喜ぶと共に，自分の研究の進展の遅さに危機感を覚び，検討を行っている．

えるほどになってきている．

要本助成で得られた研究成果の報告

約

この研究では，有馬温泉から単離された好熱性細菌 M.
ruber H328 株によるトリ羽毛の分解機構を研究する過程
で見つけられた膜小胞の解析を中心に行った．トリ羽毛の主成分であるケラチンタンパク質を分解する強力なプ
ロテアーゼを研究するうちケラチン分解性プロテアーゼ
が巨大分子複合体を形成することが判った．まずケラチ
ン分解性プロテアーゼを含む膜小胞の調製の検討を行い，2 つの方法を使ってこれらを調製した．1 つ目のMethod 1 では，最終的に巨大高分子用ゲルろ過クロマ
トグラフィーとそれに引き続くショ糖密度勾配超遠心分離による調製を行い，その後で電顕解析（ TEM ）を実施した．ケラチン分解性プロテアーゼの局在性について
は，他のタンパク質と共に巨大な複合体として存在する
場合（ Peak 2 画分）と細菌細胞から出芽形式で放出される膜小胞に含まれる場合（超遠心活性画分）があるこ

原著論文
Watanabe, K. 2016. Bacterial membrane vesicles (MVs):
Novel tools as nature- and nano-carriers for immunogenic
antigen, enzyme suppor t, and dr ug deliver y. Appl.
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口頭発表1) 武田梨花，西海斗，渡部邦彦. 2018. Meiothermus ruber
H328株由来protein disulfide oxidoreductase (PDO) 発現量増強株の羽毛分解への影響. 日本農芸化学会2018年度大会，3月，名古屋．
2) 渡部邦彦. 2017. 細菌の高次機能開拓:細菌が産生する膜小胞の可能性～トリ羽毛分解から出発して～．平成28年度
バイオインダストリー協会3研究会合同講演会，3月，東京．
3) 武田梨花，西 海斗，清水 歩，渡部邦彦. 2017. Meiothermus
ruber H328株由来protein disulfide oxidoreductase (PDO)の発現量増加による羽毛分解の促進について. 日本農芸化学会関西支部例会，5月，京都．
4) 渡部邦彦，大西愛航，清水 歩，西 海斗，川崎一則.
2017. 好熱性細菌 Meiothermus ruber H328 株のdegP遺伝子－ 38 －

好熱性細菌が放出するウイルス様膜小胞と分泌型プロテアーゼ巨大分子複合体の関連解明そして応用への挑戦
破壊株を用いた膜小胞産生に関する研究. 日本農芸化学会
2017年度大会，3月，京都．
5) 清水 歩，西 海斗，俣野明日香，森川拓磨，増村威
宏，佐生 愛，川崎一則，茂里 康，渡部邦彦．2016. 膜小胞を産生する Meiothermus ruber H328 株によるトリ羽
毛分解に関する研究 ～ケラチン分解性プロテアーゼ遺伝
子破壊株の作成とトリ羽毛分解の検討～日本農芸化学会
2016年度大会，3月，札幌.
その他
渡部 邦彦．2016. 細菌が放出する膜小胞（membrane
vesicle）の機能と生合成機構そして応用に向けた研究動向」化学と生物 54: 720-725.

謝辞本研究の遂行にあたり，助成いただきました公益財団
法人発酵研究所に深く感謝いたします．いつもトリ羽毛を供与頂いている川中公平様（ http://www.jidori.net ）にも感謝申し上げます．また，プロテオーム解析などでお世話になった京都市産業技術研究所山本佳宏様，泊直宏様にも御礼申し上げます．

文

献Bladen, H.A. & Waters, J.F. 1963. Electron microscopic study ofsome strains of Bacteroides. J. Bacteriol. 86: 1339-1344.
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Shimoni, R., Omasits, U., Ito, S., Yap, X., Monahan, L.G.,
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－ 39 －

IFO Res.Commun. 32
41-53, 2018

真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明
高

木

博

史

奈良先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科〒630-0192

奈良県生駒市高山町8916-5

The synthetic mechanisms and the physiological roles of nitric oxide in fungi
Hiroshi Takagi
Graduate School of Science and Technology Nara Institute of Science and Technology
8916-5 Takayama, Ikoma, Nara 630-0192, Japan
Nitric oxide (NO) is a ubiquitous signaling molecule involved in the regulation of many biological processes inhigher eukar yotes and microorganisms. In mammalian cells, NO is produced by NO synthase (NOS) thatcatalyzes the two-step oxidation of arginine. The molecular function of NO in unicellular eukaryotic yeast is poorly
understood due to the lack of mammalian NOS orthologues in the genome. Recently, we reported that theflavoprotein Tah18, which was previously shown to transfer electrons to the Fe-S cluster protein Dre2, is involvedin the NOS activity in response to elevated temperature and that NO produced from arginine through the Tah18dependent activity confers high-temperature stress tolerance on Saccharomyces cerevisiae cells. We also proposed anovel regulatory mechanism of NO synthesis mediated by the Tah18-Dre2 complex. In this study, we further
analysed the synthetic mechanism and the physiological role of NO in yeasts and fungi.
Our findings raised the possibility that Tah18 acts as a reductase to transfer electrons from NADPH to an
unidentified oxygenase protein that oxidizes arginine to citrulline and NO. As results of the experiments using the
Yeast Knockout Collection and the specific inhibitor, we individually found candidate genes encoding theoxygenase-like protein among the heme-dependent oxidases and encoding an enzyme involved in NADPH
synthesis, both of which are required for the NOS reaction. We also showed that an NADPH-dependent diflavinoxidoreductase 1 (NDOR1) and its interaction partner protein CIAPIN1, which are homologous to Tah18 andDre2, respectively, are involved in the NOS activity in a manner similar to Tah18-Dre2, suggesting that the Tah18dependent NO synthesis and its regulatory system are conserved in eukaryotic cells from yeasts to mammals. On
the other hand, a high level of H2O2 was shown to induce cell death caused by the Tah18-dependent NOS activity.
The dual functions (cell survival vs. cell death) of NO found in higher eukaryotic organisms also occur in yeast.
NO contributes to physiological events in yeast in a manner dependent on its intracellular level, as well as on theenvironmental conditions. In mammals, NO is known to act mainly through soluble guanylate cyclase/cGMPmediated signaling pathways and protein S-nitrosylation, which are involved in the regulation of gene expression
and protein functions. To identify S-nitrosylated proteins in yeast, we developed the biotin switch method
combined with LC-MS. Using cell extract treated with a NO donor S-nitrosoglutathione, we identified many
S-nitrosylated proteins, including enzymes involved in glycolysis and TCA cycle.
In terms of industrial application, the disruption of genes encoding NO detoxification enzymes was supposed toenhance the fermentation ability of yeast, which may be related to intracellular NO level. In research of pathogenic
yeasts and fungi, we found that some of multidrug-resistant strains of Candida species and clinical strains ofAspergillus fumigatus had lower levels of NO or less sensitivity to NO than those of other strains, suggesting that
NO is related to pathogenicity.
Key words: nitric oxide, nitric oxide synthesis, nitric oxide signaling, yeasts, fungi
E-mail: hiro@bs.naist.jp
共同研究者:渡辺大輔（奈良先端科学技術大学院大学先端科学
技術研究科），
那須野亮（奈良先端科学技術大学院大学先端科学
技術研究科），－ 41 －

川本 進（千葉大学真菌医学研究センター），
知花博治（千葉大学真菌医学研究センター）

高

緒

木

言

博

史

度の NO はその高い反応性のために細胞毒性を示すた
め，細胞は NO に対する解毒系や防御系も備えている．

一酸化窒素（ NO ）は大気汚染の原因となる窒素酸化

一方，高等生物のモデルとして，また発酵産業におい物の一種であるが，様々な生物種の細胞内ではシグナルて重要な酵母 Saccharomyces cerevisiae では，NO とスト分子として多様な生命現象に関与しており，哺乳類におレス応答との関連性が示唆されているが（ Domitrovic et

いては，血圧調節，神経伝達，免疫応答などに寄与している（ Francis et al., 2010 ; Wink et al., 2011 ）．また，植al., 2003 ），ゲノム上に哺乳類 NOS の相同遺伝子（オルソログ）が存在しないため，NO の合成機構や生理的役物では形態形成，気孔開閉，感染防御などのシグナルと割については不明な点が多い．一般に，製パンや酒類，して機能している（ Takahashi & Yamasaki, 2002 ; Siddiqui

バイオエタノールの製造に用いられる産業酵母は種々のet al., 2011 ）．細菌においても，運動性，病原性，バイ
オフィルム形成，抗生物質耐性などへの関与が報告され発酵生産環境（エタノール，高温，冷凍，乾燥，浸透圧ている（ Shatalin et al., 2008 ; Patel et al., 2009 ）．NO はする酸化ストレスに曝され，有用機能（エタノール，炭哺乳類では主にアルギニンから NO 合成酵素（ NOS ）酸ガス，味・風味成分などの生成）が制限されるため，によってシトルリンとともに生成される（ Förstermann

発酵力の向上には酸化ストレス耐性の強化が必要であ& Sessa, 2012 ）．NO の作用機序としては，可溶性グア

る．また，真菌感染症の主要な原因菌である病原真菌

ニル酸シクラーゼ（ sGC ）を活性化することで，サイ（ Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Aspergillus

クリック GMP（ cGMP ）の合成を介して，様々な生理反応を調節している（ Francis et al., 2010 ）．また，NO

fumigatus など）は，ヒトに感染する際，種々のストレス（温度，酸素濃度，栄養など）に対する耐性を獲得し，はタンパク質のシステイン残基と反応し，S-ニトロソ

感染・病原性を示すことから，NO がこれらの現象に関（ SNO ）化修飾を行うことでタンパク質の局所的構造を与する可能性が考えられる（ Li et al., 2016 ）．

など）において，細胞内に活性酸素種（ ROS ）が蓄積変化させ，その活性や機能を制御している（ Heinrich et

我々は酵母の新規なストレス耐性機構を解析し，産業

al., 2013 ）．NO が生理機能を発揮するためには，その濃度や局在を適切にかつ厳密に制御する必要がある．高濃

酵母の育種への応用に取り組んでいる．これまでに，細Fig. 1

胞内の ROS レベルが上昇する高温ストレス下において，Metabolic pathway of proline and arginine in S. cerevisiae. Protein names: Pro1, γ-glutamyl kinase; Pro2, γ-glutamyl
phosphate reductase; Pro3, Δ1 -pyrroline-5-carboxylate (P5C) reductase; Put1, proline oxidase; Put2, P5C dehydrogenase; Arg1, arginosuccinate synthetase; Arg2, N-acetyl-glutamate synthase; Arg3, ornithine carbamoyltransferase; Arg4,
arginosuccinate lyase; Arg5, N-acetyl-glutamyl-5-phospate reductase; Arg6, N-acetyl-glutamate kinase; Arg7, N-acetylornithine acetyltransferase; and Arg8, N-acetyl-ornithine aminotransferase. (Reproduced from Astuti et al., 2016a)－ 42 －

真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明

N-アセチルトランスフェラーゼ Mpr1 依存的なプロリン
からのアルギニン合成が亢進されること（ Nishimura etal., 2010 ），アルギニンからフラボタンパク質 Tah18 依
存的に NO が生成し，細胞の高温ストレス耐性に寄与す
る こ と を 見 出 し た（ Nishimura et al., 2013 ）（ Fig. 1 ）．
Tah18 には NOS 活性に必要なオキシゲナーゼドメインが存在しておらず，複合体を形成する Dre2 タンパク質の鉄硫
黄クラスターに FAD と FMN を介して電子を転移するが（ Netz et al., 2010），NO 合成への関与は初めての知見である．また，我々は「通常，Tah18 と Dre2 は複合体を形成し，細胞質の鉄硫黄タンパク質生成に関与しているが，酸化ストレスに応答して Tah18-Dre2 複合体が解離することで，遊離した Tah18 に依存的な NO 合成が起こる．」という新規な NO 合成の制御モデルを提唱している（ Yoshikawa et al., 2016 ）（ Fig. 2 ）．NO の生理機能としては，NO が銅代謝に関与する転写因子 Mac1 を活性化

Fig. 2することで，細胞内の銅含量が増加し，銅依存型スーパー
オキシドジスムターゼ Sod1 の活性上昇を介して細胞が高温ストレス耐性を獲得することが示された（ Nasuno et al.,2014 ）（ Fig. 3A ）． ま た， 分 裂 酵 母 Schizosaccharomyces
pombe では，NO の合成系や解毒酵素の同定，酸化ストレス応答の解析を行い，NO を介したシグナル伝達系の存在を見出した（ Astuti et al., 2016b ）（ Fig. 3B ）．

Fig. 3

A proposed model for regulator y mechanism of NO
synthesis in S. cerevisiae. Under non-stress conditions,
Tah18 binds to Dre2 for the early step of electrontransfer in cytosolic Fe-S protein biogenesis. In this state,
Tah18 cannot use electrons from NADPH for its
NOS-like activity. In contrast, oxidative stress, such as
high temperature and H 2 O 2 treatment, induces the
Tah18-Dre2 complex dissociation, and Tah18 released
from Dre2 exerts its NOS-like activity using these electrons from NADPH, leading to generation of NO.

Proposed models for NO-mediated oxidative stress responses in yeast. (A) When S. cerevisiae cells are exposed tohigh-temperature stress, NO is produced from arginine by an NOS-like activity. NO-mediated Mac1 is activated bypost-translational modification, then upregulates the expression of CTR1, which encodes a copper transporter. Proteinnames: Fre1, cupric reductase; Ctr1, copper ion transporter; Sod1, Cu,Zn-superoxide dismutase; Mac1, transcription
factor responsible for copper metabolism. (B) In S. pombe, NO is mainly generated by the activities of an unidentified
NOS and the mitochondrial respiratory chain (MRC) complex III during log phase growth and is detoxified by H2O2detoxifying enzymes in stationary phase. NO triggers at least three antioxidant mechanisms: (i) inhibition of the conversion of Fe3+ into Fe2+ (ii) upregulation of the genes encoding H2O2 -detoxifying enzymes, and (iii) downregulation of the
MRC genes. (Reproduced from Astuti et al., 2016a)－ 43 －

高木

酵母における NO 研究は，哺乳類や植物に比べてまだ博史子を破壊して，それぞれ構築した．タンパク質相互作用

活発ではないが，酵母のモデル生物，また有用微生物との解析に用いた CIAPIN1 過剰発現株，NDOR1 過剰発現

しての重要性を考えた場合，その科学的意義は極めて大株および CIAPIN1/NDOR1 共過剰発現株は，L5685 株にきいと考えられる．特に，NOS 様活性の責任分子であpAG414GPD-3HA-CIAPIN1 ま た は pAG416GPD-EGFP-

るオキシゲナーゼはいまだ同定できておらず，酵母におNDOR1，もしくはその両方を導入して，それぞれ構築

ける NO 研究を加速する上で，新規分子を同定することした．

は緊急の課題である．また，酸化ストレス耐性との関連各菌株が有する栄養要求性の相補には，pRS416 およ

では，NO 依存的な抗酸化機構を応用した産業酵母の育び pRS414 を 用 い た．pAG414GPD-TAH18，pAG414G-

種が期待される．実際に，NO 合成系を強化した実用パ

PD-6HisTAH18，pAG414GPD-3HA-CIAPIN1， お よ び

ン酵母を作製したところ（ γ -グルタミルキナーゼ Pro1

pAG416GPD-EGFP-NDOR1 は，Tah18，N 末 端 に 6Hisと Mpr1 の高機能型変異体の共発現），親株に比べて製タグを融合した Tah18，N 末端に 3HA タグを融合した

パン過程でのストレス（乾燥，冷凍）に対する耐性が向CIAPIN1，および N 末端に EGFP タグを融合した NDOR1

上し，細胞内 NO レベルや発酵力が増加したことから，をそれぞれ恒常的に発現するプラスミドであり，Gateway

産業酵母における NO の有用性を実証できた（ Sasanotechnology（ Invitrogen 社）の BP 反応および LR 反応を

et al., 2012 ）．
一方，病原真菌（C. glabrata, C. neoformans, A. fumigatus ）用いて構築した．pRS414-CIAPIN1 は，DRE2 遺伝子のプロモーター，ターミネーターとともに，CIAPIN1 遺においても，S. cerevisiae の NO 合成関連遺伝子に着目

伝子をクローニングして，pRS415-NDOR1 は，TAH18

し，機能解析を行った．その結果，C. glabrata の Tah18

遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー， タ ー ミ ネ ー タ ー と と も に，発現抑制株は野生型株より毒性が低下すること（カイコ

NDOR1 遺伝子をクローニングして，それぞれ構築した．

感染実験），C. neoformans の Mpr1 破壊株は野生型株よ酵母の培養には，栄養培地の YPD（2 ％グルコース，1 ％り熱ショック感受性を示すこと，C. neoformans および A.

酵母エキス，2 ％ポリペプトン），最少培地の SD（ 2 ％fumigatus では過酸化水素処理やアルギニン添加により細胞内で NO が検出されるなど，NO と増殖，感染，病Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium

原性との関連を示唆する知見が蓄積されてきた．

Sulfate ）などを用いた．

グ ル コ ー ス，0.5 ％ 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム，0.16 ％ Yeast

このように，NO の合成機構と生理的役割を解明でき
れば，産業酵母における発酵力の強化，病原真菌の生理

フローサイトメトリー（ FCM ）による細胞内 NO の定量
酵母の培養液（OD600＝1.0 ）を NO 特異的な蛍光プロー

特性（増殖，感染，病原性）制御などに繋がることが期待される．そこで本研究では，S. cerevisiae に見出した

ブ Diaminofluorescein-FM diacetate（ DAF-FM DA ） でNO の合成制御機構の解明を目指すとともに，NO 産生

15 μM，30 分間処理し，2 mM 過酸化水素処理後，経時が酵母や病原真菌の生理特性に及ぼす効果，影響につい的 に BD Accuri C6 Flow Cytometer（ Becton Dickinsonて解析を行った．

Bioscience 社）に供し，平均蛍光強度を測定した．

実験方法

Tah18 と相互作用するタンパク質の同定
SD 培地で対数増殖期まで培養した酵母を，2 mM 過酸

菌株，プラスミド，および培地

化水素で 30 分間処理した後，集菌・洗浄し，細胞抽出

本研究では，酵母 S. cerevisiae の S288C 系統株（BY4741

液を Buffer A:TNETG buffer（10 mM Tris-HCl (pH 7.4),

株）およびΣ1278b 系統株（ L5685 株）を用いた．また，

2.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10 ％ (v/v) glycerol, 0.5 ％非必須遺伝子の破壊株コレクションである Yeast MATa(v/v) Triton X-100 ）で平衡化した Ni Sepharose 6 Fast

Collection（ Dharmacon 社）を適宜用いた．Tah18 の過Flow（ GE ヘルスケア社）と混合した．50 mM imidazole

剰 発 現 株（ TAH18-OE ） お よ び His タ グ 融 合 型 Tah18

を含む Buffer A で洗浄した後，結合タンパク質を Bufferの 過 剰 発 現 株（ 6His -TA H18 -OE ） は，L5685 株 にB（ 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 2.5 mM EDTA, 150 mM

pAG414GPD-TAH18 も し く は pAG414GPD-6HisTAH18

NaCl, 10 ％ (v/v) glycerol, 0.5 ％ (v/v) Triton X-100 ，を導入後，ゲノム上の TAH18 遺伝子を破壊して，それ500 mM imidazole ）で溶出した．溶出液を SDS-ポリア

ぞ れ 構 築 し た．TAH18 遺 伝 子 を NDOR1 遺 伝 子 に，ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動（ SDS - PAGE ） に 供 し，

DRE2 遺伝子を CIAPIN1 遺伝子にそれぞれ置換した株（ NC ）は，L5685 株に pRS414-CIAPIN1，pRS415-NDOR1

ゲルからペプチドを回収し，液体クロマトグラフィーを導入後，ゲノム上の TAH18 遺伝子および DRE2 遺伝行った．

－質量分析（ LC-MS ）に供してタンパク質の同定を－ 44 －

真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明

タンパク質相互作用の解析

で画像を取得した．RNA-sequencing 解析については，

SD 培地で対数増殖期まで培養した酵母から抽出した

CD 培地で 37 ℃，24 時間振とう培養後，SNAP（最終濃タンパク質溶液を，TNETG buffer（ 10 mM Tris-HCl

度 100 μg/ml ） を 添 加 し，1 時 間 後 に 菌 体 を 回 収 し て(pH 7.4), 2.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10 ％ (v/v) glycerol,

RNA 抽出を行った．その後，Miseq システム（ Illumina

0.5 ％ (v/v) Triton X-100 ） で 平 衡 化 し た 10 μl の anti-

社 ） に よ り RNA-sequencing を 行 い，CLC Genomics

GFP magnetic beads（ Medical ＆ Biological Laboratories

Workbench（ CLC 社）にてデータ解析を行った．二次社 ） と 混 合 し，15 分 間 室 温 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た．

代謝遺伝子クラスターの発現解析については，Brilliant

TNETG buffer で 3 回 洗 浄 し た 後，SDS -PAGE sample

Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix（ Roche 社）を

buffer（ 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10 ％ (w/v) glycerol,

用いて，リアルタイム PCR（ CFX Connect, BioRad 社）

2 ％ (w/v) sodium dodecyl sulfate, 0,1 ％ bromophenolにより行った．また，臨床から分離した A. fumigatus 株

blue, 5 ％ 2-mercaptoethanol ）で溶出し，SDS -PAGE おについては，千葉大学真菌医学研究センターに分与してよびウェスタンブロットに供した．

いただき，各菌株の NO 感受性を検討した．

結果および考察SNO 化タンパク質の探索と同定
対数増殖期まで SD 培地で培養した酵母から抽出したタンパク質溶液を NO ドナーとして作用する 2 mM S -ニNO の合成制御機構：ヘム依存的酸化酵素が NO 産生にトロソグルタチオン（GSNO ）で 3 時間処理したものに，及ぼす影響

1.8 ％ SDS，0.15 ％ N-methylmaleimide を加えて 50 ℃で哺乳類 NOS において，基質であるアルギニンはオキ

20 分間インキュベートした（ブロッキング処理）．アセ

シゲナーゼドメインのヘムを含んだ活性中心において酸ト ン 沈 殿 で 得 た タ ン パ ク 質 を HENS buffer（ 100 mM化され，NO が合成される（ Förstermann & Sessa, 2012 ）．

HEPES, 1 mM EDTA, 0.1 mM Neocuproine ，2 ％ SDS

我々はこれまでに，酵母の NOS 様活性に関わる分子と(pH 8.0) ） に 懸 濁 し，0.082 mM CuCl2 ，0.41 mg/ml

してフラボタンパク質 Tah18 を同定したが（ Nishimura

間処理した．再度，アセトン沈殿を行い，タンパク質をet al., 2013 ; Yoshikawa et al., 2016 ），Tah18 はレダクター
ゼ様タンパク質であり，オキシゲナーゼドメインと相同

1/10 HENS buf fer（ 10 mM HEPES, 0.1 mM EDTA,

なアミノ酸配列を有していない（ Fig. 4 ）．そこで，ヘBiotin-HPDP，47.9 mM アスコルビン酸を加えて，3 時

0.01 mM Neocuproine，2 ％ SDS (pH 8.0) ）250 μl に溶解

ム依存的な酸化酵素が NO 産生に及ぼす影響を解析しし，Neutralization buf fer（ 25 mM HEPES, 100 mM

た．まず，ヘム結合および酸化酵素であると報告されてNaCl, 1 mM EDTA, 0.5 ％ TritonX-100 (pH 7.5)）750 μl をいる酵素，または推測される酵素をコードする遺伝子を加えてビオチン化サンプルとした．

リストアップし，Yeast MATa Collection の当該遺伝子

続いて，ビオチン化サンプルを 1/10 HENS buffer とNeutralization buffer の混合溶液（ 1:5 ）で平衡化した
Neutravidin-agarose beads 50 μl と混合し，4 ℃で 18 時間

破壊株を YPD 培地で OD600＝1.0 まで培養し，過酸化水

素処理下での NO 産生を評価した．その結果，野生型株
においては過酸化水素処理時間に伴って蛍光強度が上昇

インキュベートした．600 mM NaCl を含む Neutralizationbuffer でビーズを洗浄後，DT T を含んだ 1/10 HEN buffer（ 10 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, 0.01 mM Neocuproine(pH 8.0) ）により，結合したビオチン化タンパク質を溶出した．溶出液を SDS -PAGE に供した後，ゲルからペプチドを回収し，LC-MS に供してタンパク質の同定を行った．
A. fumigatus における NO シグナルの検出
A. fumigatus の胞子を Czapek-Dox（ CD ）培地に 2×
106 個/ml となるように植菌し，37 ℃で 24 時間振とう培

Fig. 4養を行った．その後，DAF-FM DA を最終濃度 15 μM となるように添加し，20 分後に 48 ℃の恒温槽に移動，または過酸化水素（最終濃度 0.3 ％）を添加，1 時間後に水洗し，Axio observer 蛍光顕微鏡システム（ Zeiss 社）－ 45 －

Structure of mammalian nitric oxide synthase and Tah18.
Primary structures of mammalian NOS (mNOS), bacterial NOS (bNOS), and Tah18 were shown. Arrows show
electron flow. H4B and H4F indicate tetrahydrobiopterin
and tetrahydrofolate, respectively. Tah18 is homologous
only to the reductase domain of mNOS.

高

木

博

史

したが，ある遺伝子（ X ）の破壊株では蛍光強度がほとNO の合成制御機構：Tah18-Dre2 複合体による NO 合

んど上昇しなかった（ Fig. 5A ）．続いて，その遺伝子産成制御機構の生物間保存性物の阻害剤を酵母の培養液に加え，NO 産生に及ぼす影

我々はこれまでに，Tah18 依存的な NO 合成が，Tah18

響を解析したところ，阻害剤未処理条件下では過酸化水と Dre2 の相互作用によって負に制御されることを報告

素処理時間に伴って蛍光強度が上昇したが，阻害剤処理している（ Yoshikawa et al., 2016 ）．哺乳類は主に NOS

条 件 下 で は， 蛍 光 強 度 の 上 昇 は 完 全 に 阻 害 さ れ たにより NO を合成しているが，Tah18 のオルソログとし（ Fig. 5B ）．以上のことから，ある種のヘム依存的酸化て NADPH 依存性ジフラビンオキシドレダクターゼ 1

酵素が，NOS 活性が発現する際にオキシゲナーゼ様の（ NDOR1 ）を，Dre2 のオルソログとしてサイトカイン

機能を果たしている可能性が考えられた．今後，この遺誘導性アポトーシスインヒビター 1（ CIAPIN1 ）をそれぞ

伝子産物が Tah18 活性に依存した NO 合成機構にどのよれ有している（ Banci et al., 2013）．そこで，NDOR1 おように関与するかについて，詳細な解析を行う予定である．

び CIAPIN1 を酵母で発現させて，その機能を解析することで，Tah18-Dre2 複合体による NO 合成制御機構が，酵NO の合成制御機構：Tah18 と相互作用するタンパク質

母以外の生物においても存在しているかどうか検証した．

の同定と NO 産生に及ぼす影響

まず，TAH18 遺伝子を NDOR1 遺伝子に，DRE2 遺伝

Tah18 の過剰発現株（ TAH18-OE ）および His タグ融子を CIAPIN1 遺伝子にそれぞれ置換した株（ NC ）を作

合型 Tah18 の過剰発現株（ 6His-TAH18-OE ）を，それ製し，過酸化水素処理条件下での NO 産生を評価した．

ぞれ過酸化水素処理し，過酸化水素処理条件下で特異的

その結果，NC 株は野生型株と同様に，過酸化水素処理に Tah18 と相互作用するタンパク質を網羅的に同定し時間に伴って NO を産生した（ Fig. 7A ）．次に，この条た（ Fig. 6A ）．次に，同定したタンパク質をコードする

件下での NDOR1 および CIAPIN1 の挙動を解析するた遺伝子の破壊株を Yeast MATa Collection より選出し，め，免疫共沈降法を用いて両者の相互作用について評価

過酸化水素処理条件下での NO 産生について評価した．

した．その結果，過酸化水素処理に伴い，NDOR1 によ

その結果，ある遺伝子（ Y ）の破壊株においては，過酸

る免疫沈降画分中，および細胞抽出液中の CIAPIN1 タ

化 水 素 に 応 答 し た NO 産 生 が ほ ぼ 完 全 に 阻 害 さ れ た

ンパク質量が低下した（ Fig. 7B ）．これらのことから，（ Fig. 6B ）．その遺伝子産物は NADPH の代謝に関連す

NDOR1 と CIAPIN1 は過酸化水素処理に伴って解離し，る酵素であり，ある種の NADPH 代謝関連酵素が NOS

また CIAPIN1 は同時に分解されることが明らかになっ

活性の発現に重要である可能性が考えられた（論文準備

た． こ の 結 果 は，NDOR1-CIAPIN1 が Tah18-Dre2 と 同中）．今後，この遺伝子産物が Tah18-Dre2 複合体によ様の機構で，既知の NOS とは異なる NO 合成に寄与す

る NO 合成制御機構にどのように関与するかについて，ることを示唆している．また，Tah18-Dre2 複合体に依存

詳細な解析を行う予定である．

的な NO 合成とその制御機構が，哺乳類を含む高等生物にも広く保存されている可能性が示された（論文投稿中）．

Fig. 5

Effect of the heme-dependent oxygenase-like enzyme on NO production in yeast. The intracellular NO production was measured
by FCM. The relative fluorescence intensity was calculated with the average fluorescence at 0 h as 1. (A) WT and ΔX indicate thewild-type and the X gene-disrupted strains, respectively. (B) The relative fluorescence intensity of the X gene-disrupted strain. NT
and INH indicate non-treatment and treatment conditions with the inhibitors of the X gene product, respectively.

－ 46 －

真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明

Fig. 6 Effect of proteins interacting with Tah18 on NO production in yeast. (A) Identification of the proteins, which interact with Tah18 under
H2O2 treatment. Interaction proteins of Tah18 were subjected to SDS-PAGE, followed by identification with LC-MS analysis. (B) Disruptantsof the genes encoding the proteins, which were identified as a protein interacting with Tah18, were cultured in SD medium and then
their NO production under H2O2 treatment was measured with FCM. The Y gene encodes the protein involved in NADPH metabolism.

－ 47 －

高

Fig. 7

木博

史

Effect of NDOR1 and CIAPIN1 on NO production. (A) NO production of WT, NC, and tah18-5I5 strains was measured
with FCM. (B) Interaction of NDOR1 with CIAPIN1 under H2O2 treatment. Cell extract was subjected to co-immunoprecipitation followed by western blotting. IP means co-immunoprecipitation using anti-GFP antibody conjugated beads.

NO の生理的役割：NO により S-ニトロソ化されるタン

し，SNO 化タンパク質を同定したところ，複数のタン

パク質の探索と同定

パク質が同定された（ Fig. 8B ）．同定されたタンパク質

NO が生理機能を発現する作用機序としては，sGC/には，TCA 回路や解糖系の酵素が多く含まれていたこ

cGMP 経路によるものやタンパク質の SNO 化によるもとから，SNO 化修飾により炭素代謝の中央経路が制御のがある．酵母ゲノム上には sGC のオルソログが保存を受ける可能性が考えられた．

されていないことから，酵母においてはタンパク質のSNO 化が特に重要であると考えられる．そこで，ビオ

NO の生理的役割：正負二面性（細胞保護・細胞死誘導）チンスイッチ法（ Forrester et al., 2009 ）を用いた SNO
化タンパク質のスクリーニング系を確立することを試み

S. cerevisiae では，過酸化水素処理に応答した Tah18
依存的な細胞死誘導が報告されている（ Vernis et al.,

た．酵母抽出液を 2 mM GSNO で 3 時間処理したものを2009 ）．そこで，Tah18 の発現抑制株および Tah18-Dre2

ビオチンスイッチ法に供し，抗ビオチン抗体によるウェ融合株を高濃度（ 2 mM ）の過酸化水素で処理し，細胞

スタンブロットを行った．その結果，GSNO の濃度依存生存率を測定したところ，いずれも野生型株と比較して的にビオチン化されたタンパク質が検出された（ Fig. 8A ）．

顕 著 に 細 胞 死 の 割 合 が 低 下 し た（ Yoshikawa et al.,さらに，Neutravidin-agarose beads を用いたプルダウン

2016 ）．この結果は，高濃度の過酸化水素処理に伴いアッセイにより回収したタンパク質を LC-MS 解析に供

Tah18 依存的に合成される NO が細胞死を誘導すること－ 48 －

真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明

Fig. 8

Identification of S-nitrosylated protein in yeast. (A) Development of the biotin switch method using protein extract
treated with GSNO. (B) List of identified gene products as S-nitrosylated proteins.

－ 49 －

高

木

博

史

を示しており，NO は細胞保護だけでなく，細胞毒性にわる遺伝子の破壊株（実験室酵母）を用い，培養中に発も関与することが明らかになった（ Astuti et al., 2016a;

生する炭酸ガス量をファーモグラフ（ ATTO 社製）で測2018 ）（ Fig. 9 ）．これまでの研究から，酵母における NO

定することで，発酵力を評価した．その結果，反応性のの機能には哺乳類と同様に（ Pacher et al., 2007 ），正負

高い NO の解毒に関与する NO ジオキシゲナーゼ Yhb1

二面性がある点は注目すべきである．高温に対する細胞および GSNO レダクターゼ Sfa1 の遺伝子を同時に破壊保 護（ Nishimura et al., 2013; Nasuno et al., 2014; Liu et

した株では，炭酸ガスの発生速度および総発生量が野生al., 2015 ）と過酸化水素処理時の細胞死誘導（ Almeida型株に比べて有意に増加しており，発酵力が向上する傾et al., 2007; Yoshikawa et al., 2016 ）は一見すると矛盾しており，NO は Tah18 依存的に合成されるにも関わらず，向が見られた（ data not shown ）．今後，各菌株が生成

相反する機能（細胞保護，細胞死誘導）を有している．

析する．また，Yhb1 および Sfa1 の遺伝子を破壊・過剰する NO 量を測定し，NO と発酵力との関連を詳細に解おそらく，細胞内 NO 濃度の違い（高温処理では，過酸発現させた産業酵母（パン酵母，清酒酵母，バイオエタ

化水素処理に比べて NO レベルが低い），NO が生理機

ノール酵母など）を作製し，発酵特性への影響を調べる

能を発現する環境の違い（高温処理と過酸化水素処理に予定である．

おける ROS レベルの違い）などが二面性を引き出す要因になっている可能性がある．

病原真菌における NO の合成機構と生理的役割

NO 代謝が酵母の発酵特性に及ぼす影響

新たな予防法や治療法の開発が求められている．NO は近年，Candida 属酵母の薬剤耐性が問題になっており，
NO が酵母の発酵生産性に及ぼす影響を解析する目的

貪食細胞や血管内皮細胞から分泌されており，感染防御

で，NO の合成（制御）や耐性，シグナル下流経路に関やアポトーシスにも作用を示すことが知られている．そこ で， 酵 母 S. cerevisiae（ S288C 株 ） に 加 え，Candida
albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis,
C. auris の日本，韓国，インド，米国の株について NO
寛容性や NO 産生量の解析を行った．その結果，過酸化
水素処理に伴う NO 産生は，S. cerevisiae では誘導が，C.
albicans では抑制が，C. krusei および C. tropicalis では促進がそれぞれ見られたことから，Candida 属酵母ではNO の多様な産生誘導経路の存在が示唆された（論文投稿中）．また，NO に高い感受性を示す Candida 属酵母も存在しており，今後は NO を用いた真菌感染症の治療について検討する予定である．
Cryptococcus neoformans においては，NO の生成機構
や生理機能を理解する目的で，生化学的手法により NOの検出を試みたが，明瞭かつ再現性のある結果は得られていない．しかしながら，その過程で C. neoformans とNO の相互作用が示唆される結果を得た．YNB/10 mM
KPB（ pH 7.4 ） 培 地 に NO ド ナ ー の Sodium nitroprus-

Fig. 9The Tah18-Dre2 complex regulates cell protection andcell death through its NO-generating ability. Tah18 transfers electrons from NADPH to Dre2 for Fe-S cluster
biogenesis under normal conditions. Oxidative stressinduces the dissociation of Tah18 from Dre2, leading to afunctional change of Tah18. Tah18 uses electrons from
NADPH, which might be synthesized by the Y geneproduct, and exhibits the NOS-like activity that is dependent on the availability of NADPH. NO production
derived from the Tah18-dependent NOS-like activity
required for the X gene product as oxygenase is involvedin cell protection or cell death. (Modified from Astuti etal., 2016a)side（ SNP ）を添加後，インキュベートすると（ 30 ℃，
24 時間），培地中に NO の産生が認められた．一方，同
じ培地に C. neoformans の菌体を共存させると，NO は全く検出されなかった（data not shown ）．この結果から，
C. neoformans が NO の分解酵素やスカベンジャーを培
地に分泌，または NO を細胞内に取り込み，分解するなどの可能性が考えられる．NO は宿主によって産生され，免疫システムとして機能するが，C. neoformans は一種のスカベンジャー機能を有しており，感染時に宿主の免疫機構（ NO を介した感染防御など）から逃れることが可能なのかも知れない．今後は C. neoformans における－ 50 －

真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明

Fig. 10Detection of fluorescent signal using DAF-FM DA in A. fumigatus upon stress treatments. The conidia of A. fumigatus
were inoculated in liquid CD medium and cultured at 37 ℃, for 24 h. DAF-FM DA was added in the medium (final
concentration, 15 μM). After 20 min the mycelia were cultured at 48 ℃ for 1 h or upon H2O2 treatment (final concentration, 0.3％) for 1 h. The mycelia were harvested and washed with distilled water, and then observed under fluorescent
microscope.

NO の機能を詳細に解析する予定である．

も活性化された．現在，これらの二次代謝クラスターに

Aspergillus fumigatus においては，ストレスが NO 産生を誘導するか検討した．その結果，高温または過酸化より生合成される化合物の産生量が，NO に応答して変水素処理によって，DAF-FM DA 由来の蛍光シグナルが化するか解析中である．また，臨床から分離した A.

検 出 さ れ， 菌 糸 内 で NO が 発 生 す る こ と が 示 さ れ た

fumigatus 株（ 16 株）を対象に，NO ドナーに対する感受性を検討したところ，超感受性を示す株を 1 株見出し

（ Fig. 10 ）．糸状菌の NO 産生機構は不明であるため，S.

た（ Hagiwara et al., in press ）．今後，超感受性機構を

cerevisiae の Mpr1 および Tah18 のオルソログの関与について検討した．Mpr1，Tah18 のアミノ酸配列をもとに，得られるものと期待される．

解明することで，糸状菌の NO 応答機構に関する知見がMprA（ Afu2g0585 ），AfTah18（ Afu5g07290 ）をオルソ

要

ログ候補としてそれぞれ見出し，遺伝子破壊株の作製を試みた．その結果，MprA の遺伝子破壊株（ ΔmprA ）を約取得できたが，AfTah18 の遺伝子破壊株は得られなかっ本研究では，酵母における NO の合成機構と生理的役た．次に，ΔmprA 株を用いて，高温や過酸化水素処理

割の解明を目指すとともに，NO が酵母の発酵力や病原による NO 産生を観察したところ，野生型株と同様の表

真菌の表現型に及ぼす影響について解析を行った．その現型を示したことから，MprA はこれらの条件での NO

結果，通常，Tah18 依存的な NOS 活性は Dre2 タンパク産生に重要でないことが示された．

質との結合により抑制されているが，過酸化水素，高温

また，NO に対する A. fumigatus の応答を解析するたなど酸化的条件下では Dre2 から遊離した Tah18 がアルめ，NO ドナーの S-nitroso-N-acetylpenicillamine（SNAP ）ギニン酸化に関与するタンパク質に電子を伝達し，NOSを 添 加 1 時 間 後 に 菌 体 か ら RNA を 抽 出 し，RNA-活性が発現するという新規な NO 合成機構を提唱するこsequencing 解析を行った．その結果，has および fsq のとができた．アルギニン酸化に関わるタンパク質につい

二次代謝遺伝子クラスターの発現が誘導されることが明ては，ヘム依存性酸化酵素の中から発現抑制や阻害剤添らかになった（ data not shown ）．これらのクラスター

加の実験により候補を絞り込んだ．また，NOS 活性に遺伝子は，NOC18 や SNP など他の NO ドナーによって必要な NADPH の生成に関わる酵素を初めて同定し，詳－ 51 －

高木博

史
大会，12月6－9日，神戸
11) Hagiwara, D., Kowalski, C. H., Cramer, R. A., Takahashi, H.,
Takagi, H., Watanabe, A. & Kamei, K. 2018. Diversity ofAspergillus fumigatus clinical strains in the potential pathogenicity-related proper ties. The 8 th Advances Against
Aspergillosis, 1-3 February, Lisbon, Portugal
12) 吉川雄樹，那須野 亮，高木博史．2018．酵母に見出した
フラボタンパク質Tah18依存的な一酸化窒素合成の制御機
構と細胞死誘導．日本農芸化学会2018年度大会，3月15－18日，名古屋13) 吉川雄樹，那須野 亮，高木博史．2018．酵母に見出した
フラボタンパク質Tah18依存的な一酸化窒素の合成制御機
構の解析．第18回日本NO学会学術集会，5月17－18日，
京都14) 示野誠也，吉川雄樹，那須野 亮，高木博史．2018．酵母
におけるS-ニトロソ化タンパク質の同定．第18回日本NO
学会学術集会，5月17－18日，京都
15) 示野誠也，吉川雄樹，那須野 亮，高木博史．2018．酵母
におけるS -ニトロソ化タンパク質の探索・同定・機能解析．第65回日本生化学会近畿支部例会，5月26日，西宮

細な解析を進めている．さらに，Tah18 の哺乳類オルソ
ログ NDOR1 が酵母の NO 合成に関与することを見出し，新規な NO 合成機構が真核生物に広く保存されている可能性を示した．一方，高濃度の過酸化水素処理に伴いTah18 依存的な NO 合成が細胞死を誘導することから，
NO の二面性（細胞保護・細胞毒性）も明らかになった．
また，ビオチンスイッチ法を確立し，NO により特異的に S-ニトロソ化されるタンパク質を多数同定した．応用面では，NO 耐性に寄与する遺伝子の破壊により発酵力が増加する傾向にあり，NO 量との関連が注目された．
病 原 真 菌 で は，Candida 属 の 多 剤 耐 性 株 や Aspergillus
fumigatus の臨床株の中に，NO 量または NO 耐性の低いものが存在していることから，NO と病原性との関連が強く示唆された．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 吉川雄樹，那須野 亮, 渡辺大輔, 高木博史．2016．酵母に見出したフラボタンパク質Tah18依存的な一酸化窒素合成の制御機構．酵母遺伝学フォーラム第49回研究報告会, 9
月9－11日，神戸
2) Yoshikawa, Y., Nasuno, R., Watanabe, D. & Takagi, H. 2016.
Regulatory mechanism of the flavoprotein Tah18-dependent
nitric oxide synthesis and cell death in yeast. The 14th
International Congress on Yeasts, 11-15 September, Hyogo,Japan3) Takagi, H. 2017. Synthetic Mechanism and PhysiologicalRole of Nitric Oxide in Yeast. Gordon Research Conference“Nitric Oxide”, 19-24 February, Ventura, CA, USA
4) 吉川雄樹，那須野 亮，渡辺大輔，高木博史．2017．酵母に見出したフラボタンパク質Tah18依存的な一酸化窒素の合成制御機構と生理機能解析．日本農芸化学会2017年度
大会，3月17－20日，京都
5) Takagi, H. 2017. Nitric oxide in yeast: a double-edged sword“cell protection vs. cell death”. The 12 th International
Meeting on Yeast Apoptosis, 14-18 May, Bari, Italy6) 吉川雄樹，那須野 亮，渡辺大輔，高木博史．2017．酵母に見出したフラボタンパク質Tah18依存的な一酸化窒素の合成制御機構と細胞死誘導機構．第17回日本NO学会学術集会，5月19－20日，徳島
7) 吉川雄樹，那須野 亮，高木博史．2017．酵母に見出した一酸化窒素の合成制御機構と細胞死誘導メカニズムの解析．酵母遺伝学フォーラム第50回研究報告会，9月11－13日，東京8) 示野誠也，高木博史．2017．一酸化窒素によりS -ニトロ
ソ化されるタンパク質の同定．第35回イーストワーク
ショップ，11月24－25日，高松
9) 多和田健人，高木博史．2017．Tah18依存的な一酸化窒素
合成に関与する因子の探索．第35回イーストワーク
ショップ，11月24－25日，高松
10) 吉川雄樹，那須野 亮，高木博史．2017．酵母に見出した
フラボタンパク質Tah18依存的な一酸化窒素合成の制御機
構と細胞死誘導機構．2017年度生命科学系学会合同年次

原著論文
1) Hagiwara, D., Takahashi, H., Takagi, H., Watanabe, A. &Kamei, K. 2018. Heterogeneity in pathogenicity-related
properties and stress tolerance in Aspergillus fumigatus clinical isolates. Med. Mycol. J. in press.
その他（総説・書籍）
1) Astuti, R. I., Nasuno, R. & Takagi, H. 2016. Nitric oxidesignaling in yeast. Appl. Microbiol. Biotech. 100: 9483–9497.
2) 高木博史．2017．酵母における一酸化窒素の分子機能と応用．バイオサイエンスとインダストリー 75: 214–218.
3) 那須野 亮，吉川雄樹，高木博史．2017．酵母に見出した一酸化窒素（NO）の合成制御機構と生理機能．化学と生物 55: 617–623.
4) Astuti, R. I., Nasuno, R. & Takagi, H. 2018. Nitric oxidesignalling in yeast. Adv. Microb. Physiol. 72: 29–63.
5) 那須野 亮，吉川雄樹，高木博史．2018．酵母における一酸化窒素シグナルを介したストレス応答機構．生化学，印刷中．

保存機関に寄託した菌株
なし

謝

辞

本研究を行うにあたり，多大なる助成をいただきました公益財団法人発酵研究所に深く感謝申し上げます．また，Aspergillus fumigatus に関する解析を行っていただ
いた千葉大学・真菌医学研究センターの萩原大祐特任助教（現・筑波大学生命環境系准教授）に厚くお礼申し上
げます．

－ 52 －

真菌における一酸化窒素の合成機構・生理的役割の解明

文

献

Almeida, B., Buttner, S., Ohlmeier, S., Silva, A., Mesquita, A.,
Sampaio-Marques, B., Osorio, N. S., Kollau, A., Mayer, B.,Leão, C., Laranjinha, J., Rodrigues, F., Madeo, F. & Ludovico, P.
2007. NO-mediated apoptosis in yeast. J. Cell Sci. 120: 3279–
3288.
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－ 53 －

IFO Res.Commun. 32
55-66, 2018

木材腐朽のシステム合成生物学への挑戦
中

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人

京都大学大学院農学研究科〒606-8502

京都府京都市左京区北白川追分町

Molecular genetics studies of wood lignin degradationby the white-rot Agaricomycete Pleurotus ostreatus:
Towards systems synthetic biology
Takehito Nakazawa
Graduate School of Agriculture, Kyoto University
Oiwake-cho, Kita-shirakawa, Sakyo-ku, Kyoto 606-8502, Japan
In nature, white-rot fungi ef ficiently degrade lignin contained in wood biomass. Elucidation of molecularmechanisms underlying wood lignin biodegradation by white-rot fungi would contribute to the development ofefficient and ecofriendly methods of producing valuable chemical products from wood biomass. In this study, we
conducted molecular genetics studies to identify factors that play important roles in wood lignin degradation by
the white-rot Agaricomycete Pleurotus ostreatus, which will lead us to establish heterologous degradation of woodby non-white-rot fungi in future. We first created double-gene disruptants for vp2 and vp3 transcripts of which wereshown to predominantly accumulate when P. ostreatus PC9 is grown on the beech sawdust medium in this study.
However, it was suggested that these genes are dispensable for wood lignin degradation. Based on this result, wethen performed comparative RNA-seq analyses among P. ostreatus strains that are defective in wood lignin
degradation, which suggested the possibility of involvement of some extracellular enzyme genes in wood lignin
degradation. We then created single- and double-gene disruptants for these genes. Furthermore, considering thatlignin and hemicellulose are linked by covalent bonds in wood biomass, we also created single-gene disruptantsfor putative xylanase genes. However, we found only one gene, xyn11b, the disruption of which significantly
decreased the ability to degrade wood lignin contained in the beech sawdust medium. Considering that the
number of each of the aforementioned genes that is present in the genome of P. ostreatus as well as many otherwhite-rot fungi are large, there remains the possibility that the paralogous genes of the disrupted gene(s) are
involved in lignin degradation. In future, it appears to be necessar y to create more multi-gene disruptants to
identify factors that are important in lignin degradation.
Key words: lignin, white-rot fungi, wood biomass, molecular genetics

緒

言いる（ Kolpak & Blackwell, 1976 ）．ヘミセルロースは，
アルカリで抽出される多糖の総称（この場合，結晶性セ

木質は主に，多糖であるセルロース，ヘミセルロース

ルロースは，ほとんど抽出されない）を表し，樹木の種および芳香族高分子リグニンという主要三大成分と呼ば類によって異なる．一般的には，広葉樹ではグルクロノれる高分子から構成される．セルロースは，β-1, 4 -グル

キシランが，針葉樹ではガラクトグルコマンナンがそれ

カンが水素結合によって同じ向きに集合して形成されたぞれ主要なヘミセルロースであると報告されている

繊維状構造（結晶性セルロース）の形状で主に存在して（ Gírio et al., 2010 ）．一方でリグニンは，基本的にはフェニルプロパン（C6 - C3 ユニット）骨格のリグニンモノマー

E-mail: tnakazaw@kais.kyoto-u.ac.jp
共同研究者:井鷺裕司（京都大学大学院農学研究科）

が，結合および重合することで生合成される（ Boerjan
et al., 2003 ）．主なリグニンモノマーとして 3 種類（近－ 55 －

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年では 4 種類）知られており，樹木の種類によっても異ンを除去することが求められる．リグニン除去方法としなるが，一般には広葉樹は G 核（ Guaiacyl unit ）と S 核て，現時点では高温高圧処理に加えて強烈な薬品を用い（ Syringyl unit ），針葉樹は G 核のみから成るとされていた化学処理による方法が行われている．現行の方法では，る．このリグニンは，セルロースを被覆する形で存在しエネルギー消費および環境負荷が大きいため，より省エており，さらにヘミセルロースの構成成分であるいくつ

ネルギー・低環境負荷な形でのリグニンの効率的除去がかの糖との間で共有結合が報告されている（ Watanabe

求められる．また，多糖を利用する際の“邪魔者”扱い

and Koshijima, 1988; Watanabe et al., 1989; Nishimura etだったリグニンも，近年では化成品への利用が注目され

al., 2018 ）．また，一部のヘミセルロースは，セルロー
ス繊維中の水酸基と水素結合を介して会合することで，始 め， 最 近 で は SIP-Lignin（ http://lignin.ffpri.affrc.

セルロース繊維間をつなぐ役割を果たしていると考えらている．

go.jp）をはじめとする大型国家プロジェクトも進行しれている（ Zhang et al., 2011; 2015 ）．このように，木質

樹木の主要三大成分に関して，その構造の一部分を模はセルロース，ヘミセルロース，リグニンが相互に会合

倣した分子（および，木質中に含まれる成分を変性ならしあって強固な構造を形成している．

びに低分子化して可溶化させたもの）を分解する微生物

自然界において，上述のように強固な木質は，多くの由来酵素について，豊富な研究知見がある（ Rytioja et“きのこ”が含まれる真正担子菌の一部である“木材腐朽菌”によって主に分解される．木材腐朽菌は，木材のal., 2014; Pollegioni et al., 2015 ）．例えば，特定の多糖を分解する酵素（グルカナーゼ，キシラナーゼ，マンナー

腐朽パターンから，原則的には褐色腐朽菌と白色腐朽菌

ゼなど）が単離され，酵素特性が調査されてきた．リグに分類される．褐色腐朽菌は，木質中の結晶性セルロー

ニン分解酵素に関しても，モデル化合物（リグニン中のスを積極的に分解（低分子化）し，結果的に木はリグニ構造の一部を合成した低分子化合物）を利用して，特定ンの色である褐色に腐朽される．この場合，リグニンはのリグニンモノマー間の結合を切断する活性を示す酵修飾された形で残存する（ Arantes & Goodell, 2014; Jin

素，および芳香環を修飾ならびに開裂する活性を示す酵

et al., 1990 ）．この褐色腐朽菌によるセルロース分解は，
いわゆるセルラーゼ（ β-1, 4-グルカナーゼ）による分解素に関する研究知見が豊富に存在する（ Pollegioni et al.,ではなく，フェントン反応などによって生成する菌体外処理と併用することで，効率的なリグニン由来の芳香族

ラジカルを介した，酵素によらない機構によるものだと分子の除去および有用物質への変換などに寄与することされている．木質中の一部の多糖成分に関しては，分解が期待されている．しかし木質構造は，多糖とリグニン可能な微生物が，木材腐朽菌以外にも報告されている．

が相互に会合しあった複雑かつ強固なものであることを軟腐朽菌と呼ばれる，子のう菌である Chaetomium およ

踏まえると，微生物由来の酵素反応だけで木質バイオマ

び Trichoderma 属などは，上述の木材腐朽菌が腐朽しにスを処理し，効率的なリグニン除去および変換を達成す

くい，水分を多く含む木材中の多糖を分解可能であるとることは困難である．

2015 ）．これらの酵素の研究は，木質バイオマスの化学されている（ Levy, 1966 ）．これらの菌類による腐朽は，環境負荷が少なく，かつ効率的な木質バイオマス中のいわゆるセルラーゼによる酵素分解であると考えられてリグニン除去および変換方法への応用を目指して，白色いる．一方で白色腐朽菌は，木質中の多糖も分解可能だ

腐朽菌によるリグニン分解の分子機構の解明を目指したが，リグニンを優先的に分解し，結果的に木は多糖成分研究が行われてきた．白色腐朽菌の間でも，生産されるの色である白色に腐朽される．木質中のリグニンを単独分泌酵素のパターンなどに違いが報告されているで効率的に分解可能な生物は，現時点では白色腐朽菌の（ Fernandez-Fueyo et al., 2012; Hori et al., 2014 ）が，現みとされている．

時点では白色腐朽菌のみが分泌生産するとされている，

近年，石油や石炭などの化石燃料に替わる持続可能エ

いわゆるリグニン分解酵素と呼ばれるリグニンペルオキ

ネルギーとして，地球上に膨大な量が存在する木質バイ

シダーゼ（ LiP ），マンガンペルオキシダーゼ（ MnP ），オマスの活用が注目されている．木質中に含まれる多糖

多 機 能 型 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ（ VP ） が 知 ら れ て い るは，今までも主に紙パルプなどの原材料となっていたが，（ Pollegioni et al., 2015 ）．その他に，ラッカーゼ（ Lacc ）サトウキビやトウモロコシなどの食糧と競合しないバイや Dye Peroxidase（ DyP ）も，しばしばリグニン分解

オエタノール原料として期待されている．しかし，木質

酵素とみなされるが，これらの酵素は，褐色腐朽菌なら中におけるリグニンと多糖の強固な結合は，植物バイオ

びに他の微生物なども生産することが報告されているマス中の多糖類を利用する上で大きな障害となる．紙パ（ Ahmad et al., 2011; Kersten & Cellen, 2014 ）．しかし，ルプをはじめとして，効率的な多糖類の工業的利用と高各白色腐朽菌のゲノム上に存在する，これらのリグニン

品質化成品の製造のためには，“不純物”となるリグニ

分解酵素遺伝子のコピー数も様々であり，白色腐朽菌と－ 56 －

木材腐朽のシステム合成生物学への挑戦

されている Schizophyllum commune（スエヒロタケ）なでの機能の冗長性を示唆する報告も存在する（ Salame

ど一部の白色腐朽菌では，上述のリグニン分解酵素をコードする遺伝子が存在しない場合もある（ Kersten &et al., 2013 ）．このことから，遺伝子ターゲティングが可能になったとしても，遺伝子の単独破壊だけでは木材

Cullen, 2014 ）．

腐朽（今回の場合は，白色腐朽菌によるリグニン分解）

白色腐朽菌によるリグニンの効率的な分解機構は，いの研究への適応が難しいことが示唆されていた．しかし，わゆるリグニン分解酵素の存在だけによって説明できる

Salame et al.(2012 ）の報告に続いて，ヒラタケではマー

単純なものではないことも，同時に知られている．いく

カーリサイクル法による多重遺伝子破壊（ Nakazawa et

つかの白色腐朽菌においては，リグニン分解酵素が関与

al., 2016 ）および新規薬剤選択マーカー（ Matsunaga et

しないラジカル発生機構，メディエーターの存在，低分子化したリグニン断片を細胞内に取り込み代謝する機構なal., 2017 ）も利用可能となり，本菌によるリグニン分解
機構を分子遺伝学から研究することが可能な基盤が整備

どが，同様に重要であるとも考えられている（ Hernández-

された．また一方で，古典的な遺伝学技術と近年の次世

Ortega et al., 2012; Kersten & Cullen, 2014 ）． 例 え ば，代シーケンサー解析技術を組み合わせることで，ヒラタ

Cupper radical oxidase（ CRO ）の一部に分類されるグケにおける効率的な順遺伝学研究が可能になった．現在

リオキサル酸オキシダーゼ（ GLX ）をコードする遺伝までに真正担子菌で高く保存されている Zn finger モチー

子は，現時点では白色腐朽菌ゲノム上にのみ分布していフを有する真正担子菌に特徴的な推定上の DNA 結合性

ることが知られている．この酵素は，リグニン分解酵素

転写因子をコードする wtr1，推定上のクロマチン構造が活性を示すために必要な菌体外 H2O2 の生成に関与し変換因子をコードする chd1，ペルオキシソーム形成にていると考えられている（ Kersten et al., 2014 ）．その他

必須なタンパク質をコードする pex1 の遺伝子変異が，の CRO をコードする遺伝子は，褐色腐朽菌も保有してアントラキノン系色素 Remazol Brilliant Blue R（ RBBR ）いるが，それらのタンパク質および遺伝子の機能と役割

ならびにアゾ系色素 Orange II の脱色能力に欠陥を生じは不明である．木質中におけるキシランとリグニンとのることが示された．これらの遺伝子変異および破壊株で間の共有結合の存在を踏まえると，キシラナーゼがリグ

は，ブナ木粉培地中のリグニン分解活性も実際に低下しニン分解にも影響する可能性も考えられる．また，そもていた（ Nakazawa et al., 2017a; Nakazawa et al., 2017b ）．

そも上述のリグニン分解酵素は，リグニン誘導体および近年，ゲノム科学および微生物および植物を用いた物

モデル化合物などに対する反応性は報告されてきたが，質生産関連の研究では，合成生物学という言葉がしばし実際の木質中のリグニンを分解していることを支持するば用いられるようになった．この言葉は主に，「微生物証拠は乏しい．

ゲノムを，一から合成的につくる」「生合成遺伝子群を

以上のように，白色腐朽菌による木質中のリグニン分

異種発現させることで，有用成分を異種生産する」研究

解に関して，過去から現在に至るまで，生化学，細胞生に用いられている．リグニン化学の分野でも，植物細胞物学，ゲノム科学など多岐に渡る研究報告があるにも関壁中のリグニン生合成に関与する遺伝子を遺伝子組換えわらず，実際のリグニン分解に不可欠な因子の同定までによって操作し，人為的に構造変化させる研究が行われは行われてこなかった．この主要な原因は，木材腐朽菌はじめた．このような研究が，しばしば合成生物学とし（担子菌）を用いた分子遺伝学研究の難しさにある．特に，て記述される（ Eudes et al., 2014 ）．白色腐朽菌によるリ狙った遺伝子を破壊することが難しかった．このため，グニン分解機構に不可欠な因子を遺伝学研究によって特先行研究において木質中のリグニン分解に重要だと“考定し，より取り扱いが容易な非木材腐朽性担子菌およびえられる”因子が発見されたとしても，その機構（遺伝

軟腐朽菌に該当する一部の子のう菌でリグニンの“異種子）だけが特異的に変異および喪失した場合に，実際の分解系”を構築することができれば，より効率的な木質

木質中のリグニン分解能力が低下するかを明確に示すこ

処理につながると考えられる．本研究では，リグニンのとが難しかった．しかし，Salame et al.（ 2012 ）によって，異種分解系構築（リグニン分解の合成生物学）へと繋げ

リグニン分解酵素遺伝子をゲノム中に多コピー保有するて行くことを最終目的として，分子遺伝学研究が可能に典型的な白色腐朽菌の一種であるヒラタケ（ Pleurotus

なった白色腐朽菌ヒラタケにおけるリグニン分解機構を

ostreatus ）において，効率的な遺伝子ターゲティング実
験が可能になった．しかし，ヒラタケを含む大部分の白成立させている重要な因子を明らかとする研究を行った．

実験方法

色腐朽菌ゲノム上には，リグニンを含む木質成分の分解に関与しそうな酵素（例えば，前述のリグニン分解酵素
やトランスポーターなど）をコードする遺伝子が複数コ

菌株，培養条件および遺伝学実験法

ピー存在する場合が多い．実際に，MnP および VP の間－ 57 －

ヒラタケ野生型株 PC9（ Larraya et al., 2000 ）由来プ

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ロトプラストへの UV 照射による RBBR の脱色不全突然に従ってゲノム DNA を抽出し，次世代シーケンサー

変異体の取得は，Nakazawa et al.(2017b)に従って行っ（ HiSeq2500 ）を用いてゲノムリシーケンスを行った．

た．この RBBR 脱色能力は，ヒラタケにおいてリグニン

得 ら れ た デ ー タ は，Bowtie2（ Langmead & Salzberg,

分解能力とある程度相関する指標として，しばしば用い

2012 ）を用いて，PC9 ゲノム配列上にアライメントさられている（ Vyas et al., 1995; Salame et al., 2010 ）．得せた．これから得られた SAM ファイルは，Samtools(Li,られた変異体の遺伝分析のため，野生型株 PC15（ Larraya

2011 ）を用いて BAM ファイルに変換し，ソートした．

et al., 1999 ）と交配させて F1 子孫を得た．この F1 子孫集団を用いて，色素脱色不全の表現型と連鎖する遺伝

こ れ に よ っ て 得 ら れ た デ ー タ を，Integrative genome

マーカー（ Nakazawa et al., 2017b ）の同定を行った．

PC15 間から得た F1 子孫を用いた遺伝分析の結果に基づヒラタケにおける相同組換えによる遺伝子破壊は，PC9viewer（ IGV ）上で可視化した．PC9 由来の変異体とき，原因変異遺伝子が存在すると考えられるゲノム領域

由来の ku80 破壊株である 20b 株（ Salame et al., 2012 ）周辺を調査し，原因変異遺伝子候補となる遺伝子を同定を用いて行った．20b 株由来の vp2 破壊株は，Salame et

した．

al.(2014 ）で作成されたものを用いた．各遺伝子の破壊
カセット作成は，Nakazawa & Honda(2015 ）に従って

菌体外酵素活性の測定行った．遺伝子破壊の際は，形質転換マーカーとしてハヒラタケ PC9 株のゲノム上には，MnP および VP を

イグロマイシン耐性遺伝子（ Salame et al., 2012 ）およびコードする遺伝子を合計 9 種類あり，LiP は存在しない

ビアラフォス耐性遺伝子（ Matsunaga et al., 2017 ）を用ことがわかっている（ Knop et al., 2015 ）．従って，本菌いた．形質転換体を得た後，ハイグロマイシン含有培地における主要なリグニン分解酵素の活性は，Mn2+ 依存

上で二次選抜を行なった後，得られた株からゲノム DNA

性ペルオキシダーゼ活性で評価できると考えられていを抽出し，PCR によって遺伝子破壊の確認を行なった．

る．いずれも親株である 20b と同等の菌体外 Mn2+ 依存

本 研 究 で は， 先 行 研 究（ Nakazawa et al., 2017a;

性ペルオキシダーゼ活性素を示した．予め脱脂したブナ

Nakazawa et al., 2017b ）で作成された 20b 株由来の wtr1

木粉培地上で，各ヒラタケ株を 13 および 20 日間培養し遺伝子破壊株である wtr1d#1 株，PC9 由来の chd1-1 変異

た．培養後，菌体を含む木粉培地を 0.1 M 乳酸バッファー

体 で あ る UVJ3-3 株，20b/1 株（ Nakazawa et al., 2016 ）（ pH 4.5 ）に懸濁し，遠心して得られた上澄み液を用い由来の pex1 破壊株である D14d#1 を，RNA-seq 解析のたて酵素活性測定を行なった．基質として，2-メトキシフェ

めに用いた．

ノールを用いた．1 分間で 465 nm の吸光度を 1 上昇させ

上記で得られた変異体および遺伝子破壊株をブナ木粉る酵素活性を，本研究では 1 U と定義した．Mn2+ 依存培地上で培養した際の菌体外酵素活性および木質中のリ性ペルオキシダーゼ活性測定の手順は，Kamitsuji et al.

グニン分解能力について，野生型株もしくは親株（ PC9(2004）に従って行った．酵素活性は，木粉プレート 1

もしくは 20b 株）と比較解析を行った．この場合，各ヒ枚あたりの酵素活性で計算した．

ラタケ株は，直径 4 cm ガラスシャーレに，6 ％（木粉重量比）の小麦ふすまを添加したブナ木粉培地上で 18 も腐朽ブナ木粉培地に含まれる残存リグニンの定量

しくは 28 日間静置培養した（プレート 1 枚あたり，4.4 g

ブナ木粉培地上で，各ヒラタケ菌株を 28 日間培養しの木粉培地と 10.8 ml の水を加えた）．酵素活性測定を行た．培養後の木粉培地に含まれる残存リグニン量の定量

う場合は，予めトルエン・エタノール処理を 80 ℃にて 1

は，Klason 法にて行った．培養終了後，まずトルエン・

時間 4 回行って脱脂した，6 ％（木粉重量比）の小麦ふ

エタノール（ 2:1 v/v ）を用いて脱脂処理を行った（室すまを添加したブナ木粉培地を用いた（プレート 1 枚あ

温にてスターラー攪拌を 1 時間 2 回）
．乾燥後，残存木

たり，2 g の脱脂木粉培地と 6 ml の水を加えた）．リグニ

粉培地の重量（菌体も含む）を正確に測定した．この一ン分解量を定量する場合は，30 - 55 メッシュのブナ木粉部（約 0.5 g ）を測りとり，74 ％（w/w）硫酸を 7.5 ml 加

（脱脂処理は行っていない）を用いて木粉培地を作成しえて室温で 2 時間膨潤させた．その後，250 ml の水を加た．酵素活性測定を行う場合は，木粉の粒径は揃えてい

えて，2 時間 120 ℃オートクレーブをかけた．沈殿物をない（おおよそ直径 2 mm 以下）．本研究では，培養は吸引ろ過で回収し，24 時間以上 50 ℃で乾燥させた酸不暗黒下 28 ℃で行った．

溶性リグニン（Klason リグニン）重量を正確に測定した．
以上の測定値をもとに，木粉培地 1 プレートあたりの変異体ゲノムのリシーケンス解析およびバイオインフォ
マティクス処理

Klason リグニン量を計算した．ヒラタケ株を植菌していないプレートと比較した場合の Klason リグニン減少

各ヒラタケ突然変異体から，Nakazawa et al.(2017b ）量を計算することで，各ヒラタケ株による木質中のリグ－ 58 －

木材腐朽のシステム合成生物学への挑戦に導入した．遺伝子組換え体の培養およびメタノールにニン分解量を評価した．

よる酵素の分泌発現誘導は，EasySelect Pichia Expression
全 RNA の抽出および RNA-seq 解析と定量 RT-PCR 解析

Kit（ Invitrogen, CA, USA ）に従って行った．発現させ予め脱脂したブナ木粉培地上で，各ヒラタケ株を 13た酵素を含む培養液上清をマイクロチューブにとって遠日間培養したサンプルから全 RNA を抽出した．木粉と心し，上澄み 100 µL と 100 µL の 0.1 M 乳酸バッファー

菌糸を一緒に回収し，RNeasy Plant Mini Kit（ Qiagen,（ pH 4.5 ）に溶解させた市販の基質（ブナ由来キシラン）

Germany ）を用いて全 RNA を抽出した後，DNase 処理

2 mg とを混合し 37 ℃ 1 時間反応後，2 倍量の DNS 試薬

を 行 っ た． 得 ら れ た RNA の 品 質 チ ェ ッ ク の 後，（還元末端量を定量する試薬）と 95 ℃で 5 分間反応させ，RNA-seq 解析および定量 RT-PCR 解析を行った．PC9 お

535 nm の吸光度変化からキシラン分解活性（還元末端

よび 20b 株については，同じ木粉培地上で 6，20 および生成量）を評価した．この際，発現ベクターを導入して

28 日間培養したプレートの菌体からも全 RNA を抽出し，いない株（ X33 株）を培養した培養液を用いて，同様の定量 RT-PCR 解析（ Paffl, 2001 ）に用いた．

操作を行ったサンプルの吸光度を 0 とした．なお，本研

RNA-seq 解析は，次世代シーケンサー（ HiSeq2000 ）究におけるキシラン分解酵素活性は，上述の反応条件にを用いて得たデータをトリミング処理後，PC9 のゲノム

おいて 1 mol の還元末端を生成する酵素活性を 1 U と定

お よ び 遺 伝 子 ア ノ テ ー シ ョ ン 情 報 を 利 用 し，Tophat

義した．本研究では，既知濃度のキシロース溶液の希釈（ Langmead et al., 2009 ）を用いてアライメントを行なっ

系列を用いて検量線を作成することで，各反応サンプル

た．得られた BAM ファイルは，featureCount（ Liao etに含まれる還元末端量を決定した．

al., 2014 ）を用いて，遺伝子毎のリードカウント数を計算し，FPKM 値（ Fragments Per Kilobase of exon per

結Million mapped fragments ）を算出した．この値は，各果

ま た， 各 遺 伝 子 の 発 現 解 析 の た め， リ ア ル タ イ ム

vp2，vp3 の二重破壊が，ブナ木粉培地中のリグニン分
解能力に与える影響

PCR を用いた比較定量も行なった．各遺伝子に特異的

ヒラタケ PC9 株，20b 株，ならびに 20b/1 株を，ブナ株における転写量を比較する際の指標となる．

なプライマーを用いた場合の cDNA 増幅効率を計算し木粉培地で 13 日間（これらの株では，リグニン分解進行

た上で，Paffl et al.(2001）に従って，転写産物の量につと相関する木粉培地の白化が十分に観察される培養期間）

いて比較定量を行なった．本研究では，β-tubulin 遺伝

培養した場合の全 RNA サンプルを用いて RNA-seq 解析子を用いて，各遺伝子の転写量を標準化した．

を行った．この結果，当該培養条件では推定リグニン分解酵素[3 種の VP，6 種の MnP，10 種のラッカーゼ（Lac），

Pichia pastorias を用いた酵素の分泌生産およびキシラ
ナーゼ活性測定

4 種のダイペルオキシダーゼ(DyP)]をコードする遺伝

分泌発現プラスミドを作成し，Pichia pastorias X33 株

体の約 85％程度を占めることが明らかとなった（ Fig. 1 ）．

Fig. 1子の全転写量（ FPKM 値で計算）のうち，vp2 と vp3 が全Transcript accumulation of putative ligninolytic enzyme genes. P. ostreatus PC9 was grown on sawdust medium for 13 days. FPKM
value for each ligninolytic gene was calculated based on RNA-seq data (n = 1). “vp”, “mnp”, “lacc”, and “dyp” indicate versatile
peroxidases, manganese peroxidases, laccases, and dye peroxidases, respectively.

－ 59 －

中

沢

威

人

以上を踏まえて，vp3 遺伝子の単独および vp2，vp3行うことで，原因変異遺伝子が存在する領域を推定した．

の二重破壊株を作成し，ブナ木粉培地中のリグニン分解

なお，UVRM22 に関しては，優性的に子実体発生不全能力を調査した．その結果，上記の重破壊株を木粉培地であったため，F1 分析を行うことができなかった．そで 18 日間および 28 日間培養した場合，親株である 20bの後，変異体のゲノム・リシーケンス解析を行った．上株と比較して，顕著な木質中のリグニン分解能力の量的記の実験を通して推定された領域に存在する遺伝子変異な減少は確認されなかった（ Fig. 2 ）．また，vp2 単独破（この時点では，推定原因変異遺伝子）を特定した後，壊株および vp2，vp3 二重遺伝子破壊株では，2 -メトキ

それら遺伝子の破壊株を作成した．遺伝子破壊株の表現

シフェノールを基質とした場合の Mn2+ 依存性ペルオキ型を観察した結果，現時点までに新たに 2 種類のリグニ

シダーゼ活性（ MnP および VP の活性だと考えられる）ン 分 解 能 力 に 影 響 を 与 え る 遺 伝 子 が 同 定 さ れ た．

がほとんど消失していた．また，vp3 単独破壊株においUVRM22 由来の変異遺伝子（優性的だと考えられる）ても減少していた（ Fig. 3 ）．

を野生株に導入した場合，RBBR 脱色不全および子実体
発生不全になることが示された（ data not shown ）こと

RBBR 脱色不全をきたす突然変異体の原因変異遺伝子のから，原因変異遺伝子と特定された．この原因変異遺伝

同定

子は，真正担子菌において高く保存されている推定状のヒラタケ PC9 株に対して，致死率が約 90 ％になるよ

Zn finger モチーフを有する DNA 結合性転写因子をコー

うに UV 照射を行なった．この場合，およそ 100 からドしており，スエヒロタケ（ Schizophyllum commune ）200 株につき 1 株の割合で，RBBR 脱色不全をきたす突において，子実体形態形成関連遺伝子 gat1 と命名された

然変異体が得られた．リグニン分解能力に不全をきたすものに相当する（ Ohm et al., 2011 ）．UVRM28 の推定原

突 然 変 異 体 UVRM5，UVRM22，UMRM25，UVRM28

因変異遺伝子は，出芽酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）を得た．これらの変異体と PC15 を交配した二核菌糸（ダにおいて，HIR 複合体に含まれる因子である HIRA（ヒイカリオン）より子実体を発生させることで胞子を得て，ストンシャペロンだと考えられている）のホモログをF1 子孫を取得した．また，それぞれの変異体と PC15 株

コードする遺伝子であった（ Gal et al., 2015 ）．

UVRM22 の変異表現型は優性形質であり，それ以外のリグニン分解不全株間の比較 RNA-seq 解析を交配させて得た二核菌糸の表現型を観察した結果，ブナ木粉培地上で 13 日間培養した UVJ3-3 変異体およ突然変異体は劣性形質であることが示唆された．それぞれの F1 子孫のうち，顕著な RBBR 脱色能力不全をきた

びその野生型株である PC9，wtr1 および pex1 破壊株とす株ならびに，野生型株である PC9 と同等の脱色能力

それらの親株由来の RNA を用いて，比較 RNA-seq 解析を示す株を選び出し，簡易マーカーを用いた連鎖解析をを行った．本研究では，変異体および破壊株において，Fig. 3Fig. 2

Effects of vp2/vp3 double-gene disruption on the ligninolytic activity. The degradation of wood lignin was determined after the growth in sawdust medium for 18 days(A) and 28 days (B) (n = 1). Lignin loss indicates decreasein the weight of Klason lignin per plate compared with theplate without inoculation of P. ostreatus strain (0.8310 g/
plate).

－ 60 －

Extracellular Mn2+-dependent peroxidase activity when
20b and each vp2 and/or vp3 disruptant was grown on
sawdust medium for 13 days (n = 1). One unit (1 U) ofactivity for guaiacol oxidation was defined as the amountof enzyme that increased the absorbance at 465 nm by 1.0
per min in this study. MnP activity indicates Mn2+-dependent peroxidase activity, which was calculated bysubtracting the activity determined in the absence fromthat in the presence of 0.2 mM Mn2+.

木材腐朽のシステム合成生物学への挑戦

それぞれの野生型株と比較して FPKM 値（ RNA-seq 比

朽菌と褐色腐朽菌の両方において木質バイオマスの分解

較解析時の転写発現量の指標となる値）が 1/10 以下とに関与する可能性が示唆されていた（ Alfaro et al., 2016;

なった遺伝子を転写発現が顕著に減少した遺伝子，発現Gaskell et al., 2016 ）．Hemopexin は MnP，VP，LiP のが 10 倍以上になっていた遺伝子を顕著に転写発現が増ようなペルオキシダーゼの活性に必要なヘム輸送に関わ加した遺伝子とした．リグニン分解不全で共通して転写る可能性が考えられることから，これらの遺伝子も破壊発現が著しく減少している遺伝子の中に，これらの 3 株対象とした（ Table 1 ）．
本研究で破壊対象とした上述の遺伝子の転写発現量がリグニン分解不全の原因となった遺伝子が存在する可は，上記の RNA-seq 解析（ n = 1 ）以外にも，複数サン

能性を考えた．
GLX を含む，2 種類の CRO をコードすると推定され

プルを用いた定量 RT-PCR によって再現性を確認した．

る遺伝子が，リグニン分解不全株で共通して転写減少し

また，本研究で新たに同定した 2 種類のリグニン分解不ていることが明らかとなった．また，別のもう一つの全変異株（および遺伝子破壊株）においても，同様に転CRO 遺伝子が，UVJ3-3 と pex1 破壊株において共通して写量が顕著に減少していることが明らかとなった（ data

転写減少していた．以上を踏まえて，これらの CRO 遺

not shown ）．

伝 子 を 破 壊 候 補 と し た（ Table 1 ）． ま た，2 種 類 のJacalin-like lectin domain を有する機能未知タンパク質を各遺伝子破壊株が木質中のリグニン分解能力に与える影響

コードする遺伝子が，共通して転写減少していた．この前項で破壊対象とした遺伝子の単独および二重破壊株

レクチンドメインは，Mannose-binding lectin domain だを作成した．まず，本研究で得た破壊株を脱脂木粉培地とアノテーションされているが，現時点で実際の機能は上で 13 日間培養し，2-メトキシフェノールを基質とし不明である．しかし，木質バイオマス中には，リグニンた際の菌体外 Mn2+ 依存性ペルオキシダーゼ活性を測定

間と共有結合が報告されているヘミセルロースが存在すした（ Fig. 4 ）．次に，木粉培地中に含まれるリグニン

ること，ならびに白色腐朽菌では，多くの多糖分解酵素

分解能力の比較解析を行った．各遺伝子の単独および二に多糖結合モジュールを有していることを踏まえると，

重破壊株ならびに親株である 20b 株を，28 および 18 日

このようなドメインを持つタンパク質の機能不全がリグ

間木粉培地上で培養し，プレートあたりのリグニン減少

ニン分解不全に関与しているかもしれない．以上より，量を計算した（ Figs. 5 and 6 ）．これらの結果からは，これらの 2 つの遺伝子も破壊対象とした（ Table 1 ）．ま本研究で調査した全ての単独および二重遺伝子破壊株にた，Cupredoxin をコードすると推定される遺伝子およ

おいて，20b 株と比較した場合の木質中のリグニンの分

び Hemopexin をコードすると推定される遺伝子も，リ解能力が顕著に低下しないことが明らかとなった．

グニン分解不全株 3 株で共通して転写減少していた．
Cupredoxin は，銅を活性中心に持つ酸化還元酵素であり，いくつかのオミックス解析の文献において，白色腐

Table 1

Genes disrupted in this study.

Fig. 4－ 61 －

Extracellular Mn2+-dependent peroxidase activity wheneach strain was grown on sawdust medium for 13 days(n = 1). One unit (1 U) of activity for guaiacol oxidation
was defined as the amount of enzyme that increased theabsorbance at 465 nm by 1.0 per min in this study. MnPactivity indicates Mn2+-dependent peroxidase activity,
which was calculated by subtracting the activity determined in the absence from that in the presence of 0.2 mM
Mn2+. Mutants are indicated by the Protein IDs (Table 1).

中Fig. 5

Fig. 6

沢威人

Fig. 7

Transcript accumulation of GH10 and GH11 genes whenP. ostreatusPC9 was grown on sawdust medium for 13
days. FPKM value for each gene was calculated based on
RNA-seq data (n = 1).

Fig. 8

Effects of each xyn10 and xyn11 single-gene disruption
on the ligninolytic activity. Each bar indicates wood-lignin
degradation ability of a disruptant grown for 28 days insawdust medium (n = 1). Lignin loss indicates decrease in
the weight of Klason lignin per plate compared with theplate without inoculation of P. ostreatus strain (0.8310 g/
plate).

Effects of each single- and double-gene disruption on theligninolytic activity (28 days). Graph showing the abilityof each strain to degrade wood lignin contained insawdust medium when grown on sawdust medium for 28
days (n = 1). Lignin loss indicates decrease in the weightof Klason lignin per plate compared with the plate
without inoculation of P. ostreatus strain (0.8310 g/plate).
Mutants are indicated by the Protein IDs (Table 1).

Effects of each double-gene disruption on the ligninolytic
activity (18 days). Graph showing the ability of each strai
to degrade wood lignin contained in sawdust medium
when grown on sawdust medium for 18 days (n = 1).
Lignin loss indicates decrease in the weight of Klason
lignin per plate compared with the plate without inoculation of P. ostreatus strain (0.8310 g/plate). Mutants areindicated by the Protein IDs (Table 1).

ドする遺伝子が合計 5 種類（ xyn10a，xyn10b，xyn10c，
xyn11a，xyn11b ）存在する．RNA-seq 解析の結果からは，
この 5 種類の遺伝子のうち，PC9 株をブナ木粉培地上で13 日間培養した場合，xyn10a，xyn10b，xyn11a の転写産物が主に蓄積していることが示された（Fig. 7 ）．また，
JGI のゲノムデータベース上で推定されているタンパク質の一次構造を見ると，Xyn10a ，Xyn10c ，Xyn11a は多糖結合モ
ジュール（CBM ）を有することが示されていた．ここで，我々が行った RNA-seq 解析から推定した各遺伝子の ORF か

キシラナーゼ（ GH10 および GH11 ）をコードする各遺ら推定すると，新たに Xyn11b（ JGI のアノテーションでは，

伝子の単独および多重破壊が，リグニン分解に与える影響

CBM を有さない）の C 末側に CBM を有することが明らか

木質中において，リグニンとヘミセルロースの間に共となった．RNA-seq 解析による ORF の修正を踏まえて，

有結合が報告されていることを踏まえて，ヘミセルロー

まず上記 5 種類の推定キシラナーゼのうち xyn10c 以外のス分解酵素遺伝子の単独および多重破壊が，ヒラタケに4 種類の酵素を P. pastoris を用いて分泌生産させた．そのよる木質中のリグニン分解能力に与える影響の解析を行

結果，確かにキシラン分 解活性を有することを確認したなった．本研究で用いたブナ木粉の構成糖分析を行い，（data not shown ）．この結果は，本研究で破壊対象としセルロース由来のグルコースに次いで，キシロースが主要た遺伝子がコードするタンパク質が，確かにキシラン分解

な構成糖成分であることを確認した（ data not shown ）．

活性を有するタンパク質であることを示している．

JGI のゲノムデータベースに基づくと，ヒラタケ PC9

次に，20bf3 株（ Nakazawa et al., 2016 ）から各キシラ株のゲノム上には，推定上の GH10 および GH11 をコー

ナーゼ遺伝子の単独破壊株を作成し，ブナ木粉培地上で－ 62 －

木材腐朽のシステム合成生物学への挑戦

培養した際の，木質中のリグニン分解能力に与える影響

た．リグニン分解不全をきたすヒラタケの遺伝子破壊なを調査した（ Fig. 8 ）．この結果，上述の RNA-seq デー

らびに変異体の間で比較 RNA-seq 解析を行い，共通しタからは，転写量が多かった xyn10a，xyn10b，xyn11aて転写減少している遺伝子を（なるべく菌体外酵素を遺伝子の単独破壊株においては，リグニン分解能力はコードすると推定される遺伝子を中心に）を絞り込んだ

20bf3 株と変わりなかった．一方，転写量が低かった（ Table 1 ）．その後，遺伝子破壊を行い，木質中のリグ

xyn11b 単独破壊株においては，リグニン分解能力の低下が示された．この xyn11b 単独破壊株は，親株である

ニン分解能力に与える影響を調査した．しかし，本研究

20bf3 株と比較して，YMG（麦芽，酵母エキス，グルコー

たす遺伝子破壊株を見いだすことはできなかった．CROス）寒天培地上における生長速度が若干遅かった（ data

や Cupredoxin はゲノム上にコピー数が多く，これらのnot shown ）．

中の他の酵素がリグニン分解に関与する可能性も残され考場合，上述の酵素が木質中のリグニン分解に重要かどうで行なった限りでは，木質中のリグニン分解に不全をきている．（ Kersten et al., 2014; Alfaro et al., 2016 ）．この
察
本研究では，近年分子遺伝学研究が可能になった白色かを明らかにするためには，さらなる多重遺伝子破壊株

腐朽菌ヒラタケを用いた研究によって，木質中のリグニの作成が必要であると考えられる．しかし，相同組換え

ン分解機構に重要な因子を明らかとすることを試みた．

を通した多重遺伝子破壊は，多大な労力と時間がかかる

将来の異種リグニン分解系構築という“合成生物学”をため現実的ではない．今後は，より効率的な多重破壊株

志向した基礎研究を行った．

を作成するため，最近担子菌で達成された担子菌類にお本研究では，ブナ木粉培地上でヒラタケを培養した際に，主要に転写発現している vp2，vp3（ Fig. 1 ）の二重けるゲノム編集（ Sugano et al., 2017 ）を用いる必要がある．
また本研究では，先行研究で得られていたリグニン分

遺伝子破壊株について，木質中のリグニンの化学構造および分子量に与える影響までは調査していないが，少な解不全株 3 株を用いた RNA-seq 解析から，これらの不くとも量的な木質中のリグニン分解能力は，野生株と同全株に共通して顕著に転写減少する遺伝子グループに含等であることが示された（ Fig. 2 ）．このことについて，

まれる遺伝子に対象を絞って遺伝子破壊を行った．この考えられる可能性が三つある．一つ目は，VP2，VP3 は，3 株の中で，pex1 破壊株は，ブナ木粉培地に含まれるリ

少なくとも本研究で用いたブナ木粉培地上でのリグニン

グニンの分解能力をほとんど失っていた（ Nakazawa et

分解に重要ではないという可能性である．この場合，いal., 2017a ）一方で，chd1-1 変異体である UVJ3-3 並びに

わゆるリグニン分解酵素以外によるラジカル生成などのwtr1 破壊株では，培養 28 日目時点で野生型株の半分程
度リグニンを分解する能力を有していた（ Nakazawa et

方が，本研究における木質中のリグニン分解に対する寄与が大きいかもしれない．二つ目は，主要なリグニン分
解酵素 VP2，VP3 の機能喪失が，他のリグニン分解酵素

al., 2017b ）．このため，これらの 3 株間で共通して転写減少する遺伝子の中から，顕著なリグニン分解能力低下

遺伝子（ラッカーゼなども含む）を活性化させ，リグニをもたらす遺伝子（破壊対象）を選ぶことが不適当だっ

ン分解能力を相補したという可能性である．MnP の一たと考えられる．本研究で取得した新たなリグニン分解

部には，転写レベルでの制御だけでなく，分泌レベルで不全株（ UVRM22 およびその原因変異遺伝子の破壊株）の制御を示唆する知見（ Mancilla et al., 2004 ）も存在す

では，pex1 と同様にリグニン分解能力がほとんど失っる．しかし，仮に活性化があったとしても，VP2 およびていたものが存在していた．これらのリグニン分解能力

VP3 の機能喪失を補うほどの菌体外酵素活性には結びつがほとんど失われていた株を用いた比較 RNA-seq 解析

いていない（ Fig. 3 ）ことから，後者の可能性は低いとを再度行うことで，破壊対象となる遺伝子（複数ある可考えられるが，今後も注意深く解析することが必要であ能性もある）の絞り込みを，より効率的に行うことがでる．三つ目として，今回破壊対象としなかった，vp2，

きると考えられる．
本研究では，木質中でのリグニンとヘミセルロース間

vp3 と比較すると転写発現が高くない他の mnp，vp 遺伝
子のみでも，本研究で用いたブナ木粉培地に含まれるリの共有結合の存在に関する知見を踏まえて，GH10 およ

グニンを十分に分解できる能力がある可能性も考えられび GH11 遺伝子の単独および二重遺伝子破壊が，ヒラタる．この可能性を検証するためには，さらなる多重遺伝

ケによるリグニン分解能力に与える影響を調査した．そ子破壊株を作成し，リグニン分解能力への影響を調査すの結果，GH11 の一つである xyn11b 遺伝子を破壊した場る必要がある．

合に，本研究で用いたブナ木粉培地中の木質リグニン分

上記の結果を踏まえて本研究では，リグニン分解酵素

解能力がある程度減少することが判明した（ Fig. 8 ）．し以外に木質中のリグニン分解に重要な因子の同定を試みかし一方で，RNA-seq 解析の結果，他の xyn10 および－ 63 －

中

沢

威

人

xyn11 遺伝子と比較して，木粉培地上で培養した際の補とした上述の遺伝子は，ヒラタケおよび他の白色腐朽

xyn11b の発現は，少なくとも転写レベルでは高くない
ことが示された（ Fig. 7 ）．生長速度がリグニン分解に菌ゲノム上に多コピー存在する．このことは，単独およ影響している可能性も考えられる．以上のことも踏まえ

子コピーが分解に関与する可能性も残されている．以上

ながら，リグニン分解におけるキシラナーゼの役割（おのことから，それぞれの因子が，ヒラタケによる木質中

よび，キシラナーゼ遺伝子欠損の影響）を合理的に説明のリグニン分解に重要かを調査するためには，今後さらすることが，今後の課題である．

なる多重遺伝子破壊株を作成し，表現型を調査する必要以上のように，本研究では白色腐朽菌によるリグニン

び二重遺伝子破壊では，破壊した遺伝子以外の他の遺伝性が考えられた．

分解能力を他の菌に移植することを最終目標とし，ヒラ本助成で得られた研究成果の報告

タケによる木質中のリグニン分解に重要な菌体外酵素を同定すべく，分子遺伝学アプローチから研究を行った．
今後は，冗長性の問題を克服すべく，CRISPR/Cas9 系
を用いたさらなる遺伝子の多重破壊などを行うことで，白色腐朽菌ヒラタケによる木質中のリグニン分解能力に重要な因子の同定を行う予定である．
要

約
担子菌の一部である白色腐朽菌は，自然界において，木質バイオマスに含まれるリグニンを効率よく分解可能な生物である．白色腐朽菌によるリグニン分解の分子機構を解明することは，木質バイオマスを高付加価値な化成品などへと変換するために役に立つ可能性がある．本
研究では，ヒラタケを用いた分子遺伝学研究を通して，
白色腐朽菌ヒラタケが，木質中のリグニンを効率よく分解するために重要な役割を果たしている因子を同定し，将来的には，非木材腐朽性担子菌などにリグニン分解能
力を移植する「木材腐朽の合成生物学」を目指した研究を行なった．ブナ木粉培地上でヒラタケ株を培養した際に，リグニン分解酵素遺伝子の中で転写量の大部分を占めていた vp2，vp3 の二重破壊株を作成し，野生型株とリグニン分解能力を比較した．しかし，これらの 2 つのリグニン分解酵素は，ブナ木粉培地中のリグニン分解に重要ではないことが示唆された．この結果を踏まえて，リグニン分解酵素以外で，木質中のリグニン分解に重要だと考えられる遺伝子を，リグニン分解不全株を用いた
比較 RNA-seq 解析の結果から絞り込んだ．これらの遺伝子の単独および二重破壊株を作成し，リグニン分解能
力の比較解析を行なった．しかし，リグニン分解能力を不全化する遺伝子を特定するには至っていない．リグニ
ンとのヘミセルロース間の共有結合を踏まえて，褐色腐朽菌と比較した場合に，白色腐朽菌で発達しているキシラナーゼ遺伝子群（ GH10 および GH11 ）の単独および二重破壊株を作成した．本研究の培養条件において，転写量が多くなかった一つの GH11 の単独破壊株において，リグニン分解能力の減少が示されたが，他の転写量が多い他の GH10，GH11 遺伝子の破壊株については，
リグニン分解能力の減少は示されなかった．今回破壊候

口頭発表
1) 中沢威人, 小寺里奈, 西村裕志, 坂本正弘, 渡辺隆司, 本田与一. 2016. 順遺伝学アプローチを起点とした，リグニン生分解に重要な新たな因子の探索. 第61回リグニン討論会,
10月27–28日, 京都2) 小寺里奈,中沢威人, 西村裕志, 渡辺隆司, 坂本正弘, 本田与一. 2016. 白色腐朽菌ヒラタケにおけるwtr1遺伝子変異がリグニン分解システムに与える影響. 第16回糸状菌分子生物学コンファレンス, 11月17–18日, 京都3) 中沢威人, 村口元, 本田与一. 2016. 担子菌キノコの順遺伝学研究から示唆されてきた，リグニン生分解と子実体形成の関連性. 第16回糸状菌分子生物学コンファレンス, 11
月17–18日, 京都4) 中沢威人, 伊津野彩子, 井鷺裕司, 粟野達也, 高部圭司, 宮崎
安将, 村口元, 西村裕志, 渡辺隆司, 本田与一. 2017. 白色腐朽菌ヒラタケにおけるpex1遺伝子の機能喪失が，木質生分
解および子実体発生に与える影響. 第67回日本木材学会大会, 3月17–19日, 福岡5) 湯村直樹, 中沢威人, 大沼広宜, 泉津弘佑, 入江俊一, 福田泰久, 白坂憲章, 坂本正弘, 本田与一. 2017. 白色腐朽菌ヒラタ
ケにおけるGH10・GH11の機能喪失がリグニン分解に及ぼす影響について. 第62回リグニン討論会, 10月26–27日,
名古屋6) 中沢威人, 堀井雅人, 森本亮太, 辻祥子, 西村裕志, 小寺里奈,
坂本正弘, 渡辺隆司, 本田与一. 2017.キノコによる木質リグ
ニン分解と有性形態形成との間に，関係性はあるのか？.
第62回リグニン討論会, 10月26–27日, 名古屋
7) Honda, Y. & Nakazawa, T. 2018. Recent progress in molecular genetic approaches for mushroom science. Satellite
workshop on Basidiomycetes in European Conference on
Fungal Genetics 14, Feb. 25–28, Haifa, Israel8) Nakazawa, T. & Honda, Y. 2018. Efficient forward genetics
studies to identify mutations that cause defects in the ligninolytic activity in the white-rot Agaricomycete Pleurotus
ostreatus. Satellite workshop on Basidiomycetes in European
Conference on Fungal Genetics 14, Feb. 25–28, Haifa, Israel9) 中沢威人, 伊津野彩子, 森本亮太, 井鷺裕司, 坂本正弘, 本田
与一. 2018. 新旧実験法の融合による，白色腐朽菌ヒラタ
ケにおける効率的な順遺伝学実験系の確立. 第12回日本ゲノム微生物学会年会, 3月5–7日, 京都10) 中沢威人, 小寺里奈, 竹中敦紀, 森本亮太, 坂本正弘, 本田与一. 2018. ヒラタケにおけるリグニン分解不全変異が，多糖分解酵素関連遺伝子群の転写に与える影響の解析. 第68回日本木材学会大会, 3月14–16日, 京都－ 64 －

木材腐朽のシステム合成生物学への挑戦
原著論文
1) Nakazawa, T., Tsuzuki, M., Irie, T., Sakamoto, M. & Honda,
Y. 2016. Marker recycling via 5-fluoroorotic acid and 5-fluorocytosine counter-selection in the white-rot agaricomycete
Pleurotus ostreatus. Fungal Biol. 120: 1146–1155.
2) Nakazawa, T., Izuno, A., Kodera, R., Miyazaki, Y., Sakamoto,M., Isagi, Y. & Honda, Y. 2017. Identification of two mutations that cause defects in the ligninolytic system throughan efficient forward genetics in the white-rot agaricomycete
Pleurotus ostreatus. Environ. Microbiol. 19: 261–272.
3) Nakazawa, T., Izuno, A., Horii, M., Kodera, R., Nishimura, H.,
Hirayama, Y., Tsunematsu, Y., Miyazaki, Y., Awano, T.,
Muraguchi, H., Watanabe, K., Sakamoto, M., Takabe, K.,
Watanabe, T., Isagi Y. & Honda Y. 2017. Effects of pex1
disruption on wood lignin biodegradation, fruiting development and the assimilation of carbon sources in the white-rot
Agaricomycete Pleurotus ostreatus and non-wood decaying
Coprinopsis cinerea. Fungal Genet. Biol. 109: 7–15.

保存期間に寄託した菌株
該当なし

謝

辞

本研究に対して大型研究助成のご支援を賜りました，
公益財団法人発酵研究所の関係者の皆様に深く感謝致します．本研究実施に尽力して頂いた，京都大学大学院農学研究科・森林生化学分野の学生の皆様（都築雅美，小寺里奈，竹中敦紀，森本亮太，湯村直樹，呉紅麗，坂知奈美，井上智香子）に深くお礼申し上げます．また，本研究を進める上で，様々なご助言およびご助力頂いた，
井鷺裕司博士（京都大学大学院農学研究科），伊津野彩子
博士（同上 現・森林総合研究所），渡辺隆司博士（京都大学大生存圏研究所），西村裕志博士（同上），辻祥子博
士（同上），山田美紗登博士（同上），ならびに京都大学
大学院農学研究科・森林生化学分野の本田与一博士，坂本正弘博士に深く感謝申し上げます．本研究で使用した
Δvp2 株を分与頂いた，Hebrew University of Jerusalemの Yitzhak Hadar 教授に深く感謝申し上げます．

文

献

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平成 24 年度寄付講座助成の研究報告
助成期間:平成 24 年 10 月～平成 30 年 3 月

IFO Res.Commun. 32
67-72, 2018

微生物による「ものづくり」のイノベーション：
微生物の潜在能力発掘・応用のための新手法の開発と実践
尾

仲

宏

康

東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在機能探索寄付講座〒113-8657

東京都文京区弥生1-1-1

Innovating microorganism metabolite production:
Development and practice of new methods for using the microbial metabolic potential
Hiroyasu Onaka
Laboratory of Microbial Metabolic Potential
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo,
1-1-1 Yayoi, Bunkyo, Tokyo 113-8657, Japan
With the progress of genome analysis technology, the potential of microorganisms is drawing increasing attention.
Actinomycetes are soil microorganisms that produce various secondary metabolites with different physiologicalactivities, such as antibacterial activity. These metabolites are often used in pharmaceuticals and have made a great
contribution to human medicine. To explore the potential practical use of the secondar y metabolism ofactinomycetes, we started ＂ The Laboratory of Microbial Metabolic Potential (Onaka lab)＂ at the University ofTokyo in 2012. In our lab, we focus on the activation mechanism of secondary metabolism in combined-culture,
which is one of the co-culture methods for secondar y metabolism induction. We also study the biosynthetic
machiner y of Ribosomally synthesized and Post-translationally modified Peptides (RiPPs), and apply it to
combinatorial biosynthesis. Here, our summar y report is divided into ten sections as follows: (1) Innovating
microorganism metabolite production: Development and practice of new methods for using the microbial
metabolic potential, (2) Requirement of live mycolic acid-containing bacteria for induction of antibiotic production
by Streptomyces in combined-culture, (3) RNA sequencing analysis of contact-dependent secondary metabolism
responses by Streptomyces coelicolor, (4) Analysis of response deficient mutants of Streptomyces coelicolor generated
by heavy ion beam induced mutagenesis to contact-dependent stimuli by Tsukamurella pulmonis, (5) Studies on
the biosynthesis of novel alkaloids derived from the combined-culture of Streptomyces nigrescens HEK616 andTsukamurella pulmonis, (6) A new sideromycin-like antibiotic from combined-culture of Streptomyces sp. HOK021
and Tsukamurella pulmonis, (7) Goadsporin, a specific inhibitor of actinomycetal signal recognition particle, (8)Dissection of goadsporin biosynthetic machiner y by in vitro reconstitution leading to in vivo production ofdesigner analogues, (9) Genome mining to reveal a minimum gene set for the biosynthesis of 32-memberedmacrocyclic thiopeptides lactazoles, (10) Analysis of lanthipeptide biosynthetic enzymes responsible for formationof novel goadionin structure.

第一章

はじめに

謝産物は生育に必須な化合物を総称したものであり，アミノ酸，糖，核酸，脂質などが挙げられる．一方，二次生物の産生する低分子化合物は一次代謝産物と二次代代謝産物は，生育自体には必ずしも必須ではない化合物

謝産物の二つにおおまかに分けられる．そのうち一次代群を指し，抗生物質やシデロフォア，アルカロイド化合

E-mail: aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
教員:浅水俊平:（現 東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在酵素寄付講座），
尾﨑太郎:（現 北海道大学理学研究院），
菅井佳宣:（現 京都大学学術研究支援室）

物などが含まれる．現在までに，何らかの生理活性を有する天然物は 22,500 種類ほどであると報告されている(Berdy, 2005)．土壌微生物である放線菌は，微生物の中でも特に多様な二次代謝産物を生産することが知られている．1943 年に抗結核薬であるストレプトマイシン－ 67 －

尾

仲

宏

康

が米国のワクスマン博士により Streptomyces griseus の産中での生育環境の違いが考えられる．自然環境中では，生する二次代謝産物から発見されて以来，現在に至るま

放線菌は様々な微生物と同じ土壌中で生育しており，周で 10,100 種類以上の二次代謝産物が放線菌から発見さ囲の微生物の影響を受けながら生育していると考えられれ，そのうち Streptomyces 属放線菌からは実に 7,630 種

る．それに対して，実験室環境は純粋培養であり，他の類が発見されている(Berdy, 2005)．これら生理活性物

微生物の影響を全く受けずに生育する．二次代謝産物の質のいくつかは抗生物質のみならず抗がん剤，免疫抑制

いくつかは抗生物質活性を有することを考えると，放線剤，抗真菌剤，抗寄生虫薬，生活習慣病治療薬などとし菌の二次代謝が周囲の微生物に影響を受けている可能性て多数実用化され，人類の健康に大きく貢献してきた．

が考えられる．そこで我々は微生物間相互作用が二次代ゲノム解読技術の進展は，微生物の有する潜在能力が謝に与える影響に着目し，放線菌 Streptomyces lividans

我々の想像を超えて高いことを明らかにした．例えば放の赤色色素生産誘導を指標に，二次代謝を活性化する微線菌においては，これまでに明らかになっている二次代生物の探索を行い．約 400 株のスクリーニングの結果か

謝産物の数に比べはるかに多い二次代謝生合成遺伝子群

ら Tsukamurella pulmonis を発見した．T. pulmonis はミが，ゲノム内に存在していることが明らかとなった．一コール酸を細胞表層に有する微生物（ MACB:Mycolic

例として，エバーメクチン生産菌である Streptomyces

Acid-Containing Bacteria ） で あ り，T. pulmonis 以 外 のavermitilis のゲノム内には 38 種類の二次代謝生合成遺伝子クラスターが存在していることが明らかにされた

MACB も赤色色素生産誘導が観察されたことからミコール酸が誘導活性に関与していることが強く示唆され(Nett et al., 2009)．しかしながら，実際に化合物が同定た．また，S. lividans 以外の放線菌 109 株においても二されているものは 13 種類にとどまり，残りの 25 種類，

次代謝誘導が引き起こされるかを調査したところ，その実に 6 割以上の二次代謝産物が未同定である．このこと

うちの 86 株，9 割近くの放線菌において二次代謝パター

は，放線菌の二次代謝潜在能力は，従来考えられているンに変化がおこることが明らかとなった．この発見から，以上に高いことを端的に示しているとともに，潜在的二MACB は広く放線菌の二次代謝を活性化することが明

次代謝産物を効率的に発見する手法の開発が必要である

らかとなったため，MACB と放線菌の共培養法を複合ことを示している．

培養（ combined-culture ）と命名することとした(Onaka

そこで，微生物潜在機能探索寄付講座では，このような微生物に隠された能力を発掘して「ものづくり」に応

et al., 2011)．本誘導活性は MACB 培養抽出物では引き起こされないことから，ケミカルコミュニケーションで用するための新しい手法の開発を目指し，新しい概念にはないことが示唆された．その後の研究から S. lividans

基づく微生物培養を出発点としたスクリーニングによっと MACB との直接接触が本誘導活性には必要であるこて，新規化合物を取得するとともに，新たに見出した新とが明らかとなった．複合培養現象は目も耳も持たない

規生合成酵素群をコンビナトリアル生合成に応用する研

微生物が自分の周りの他者を認識し，接触応答反応とし究を 2012 年 10 月より開始した．本研究は 1，複合培養:て二次代謝活性化をしていると捉えることができる．こ微生物相互作用を利用した放線菌二次代謝活性化，2，複のような微生物による接触応答による他者認識機構はこ合培養による新規二次代謝産物の発見，3，ゴードスポリ

れまでに全く報告されていない現象であり，極めて興味

ンの作用機構；新規作用機構を有する抗生物質の開発に深い．本寄付講座ではこの接触応答機構に関しての知見向けて，4，Ribosomally synthesized and Post-translationallyを集め，最終的には分子レベルで本作用機構を明らかに

modified Peptides(RiPPs) 生合成:中分子創薬へ向けたすることを目指した．

新規 RiPPs アナログの効率的な合成システムの確立の 4部から構成されている．

第二章
1.

液体培養にて複合培養を行った際に，その様子を走査型電子顕微鏡（ SEM ）撮影すると MACB が放線菌の菌
糸にびっしりと付着している状態が観察された．当初，

研究概要

この付着状態は MACB が外層に持つミコール酸の疎水的な形質がもたらした物理的吸着なのではでないかと予複合培養：微生物相互作用を利用した放線菌二次代想されたため，細胞表層がミコール酸に覆われた状態で

謝活性化

あれば，MACB の生死に関係なく，放線菌は接触応答

Streptomyces 属放線菌は 1 株あたり 40 個前後の二次代
謝生合成遺伝子群を有することがゲノム解析より明らか

するのではないかと考えた．そこで，細胞構造を維持しとなったが，それに対して実際に生産が確認される二次菌法により調製して接触試験を行った(Asamizu et al.,

代謝産物は数個程度とその数には大きな乖離がある．そ2015)．この結果に関しては本報告書各論内の「ミコーの理由の一つとして，自然環境中と実験室での純粋培養

ル酸含有細菌死菌体は放線菌の二次代謝を誘導しない」

た状態の MACB をホルマリン固定法およびガンマ線滅－ 68 －

微生物による「ものづくり」のイノベーション：微生物の潜在能力発掘・応用のための新手法の開発と実践にまとめた．しかし，死菌体では二次代謝が誘導されなは抗真菌活性を有する 8 種類のアルキル側鎖の異なるかったことから，放線菌においては生死を判別する機構

5-alkyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline類(5aTHQs)(Sugiyamaが存在することが強く示唆され，基礎生物学的にも興味深い結果が得られた．そこで次に，複合培養時にどのよ

et al., 2015) 及 び 抗 菌 活 性 を 有 す る streptoaminal A-C(Sugiyama et al., 2016)，Streptomyces sp. HOK021 と のうな遺伝子が作用することによって接触応答機構が働い複合培養では抗 MRSA 抗生物質 harundmycin を発見しているかを明らかにするために，RNA-seq 解析による遺た．これら発見された化合物の生物活性や化学構造は多伝子発現量比較を純粋培養と複合培養の間で行った．本岐にわたり，多様な潜在的二次代謝の活性化が複合培養結果については「ミコール酸含有細菌に対する放線菌二を用いることにより可能になることを示した．本報告書

次 代 謝 応 答 機 構 の 網 羅 的 転 写 解 析 」 に ま と め た．

においては S. nigrescens HEK616 における 5aTHQs 及びRNA-seq 解析によると純粋培養と比較して，複合培養に

streptoaminal の生合成経路に関して「複合培養を用いおいては，接触 7 時間半後には全遺伝子の約 5 ％が変動

た新規アルカロイドの同定と生合成に関する研究」及び，することが明らかとなり，複合培養は予想以上に多くの遺伝子の発現に影響を与えていることが明らかとなっ

Streptomyces sp. HOK021 由来抗 MRSA 抗生物質 harundmycin の単離同定について「放線菌複合培養液からの抗た．また，RNA-seq 解析では接触応答制御に関わる遺伝

生物質 - シデロフォア縮合体化合物の発見」として以下

子の同定までは至らなかったため，重イオンビーム法での各論においてまとめた．

S. lividans 変異株を 152,000 株作製し，接触応答欠損変異株，すなわち T. pulmonis との接触においても赤色色

3.

ゴードスポリンの作用機構；新規作用機構を有する
抗生物質の開発に向けて素生産を誘導しない 118 株を取得した．それら変異株か
ら 16 株を選抜し 9 箇所の変異点を同定した．本結果にゴ ー ド ス ポ リ ン（ GS ） は 放 線 菌 Streptomyces sp.

ついては「重イオンビーム変異導入法による T. pulmonis

TP-A0584 の生産する二次代謝産物であり，1 µM 以下のへの赤色色素非生産応答性 Streptomyces coelicolor 突然変低濃度では放線菌に広く二次代謝と形態分化を誘導し，異株の解析」にまとめた．変異株解析は現時点ではまだ1 µM 以 上 で は 生 育 阻 害 を 引 き 起 こ す(Onaka et al.,

完了していないが，機能未知遺伝子，膜タンパク質遺伝2001)．著者らは以前より行っていた GS 生合成研究に

子，一次代謝や翻訳に必要な遺伝子など，変異箇所が多おいて，GS 生産菌における GS 自己耐性遺伝子が Signal

岐にわたっていることから，接触応答は二次代謝特異的

Recognition Particle(SRP)をコードする ffh 遺伝子であな活性化機構ではなく，細胞の代謝全体に影響を与える，ることを明らかにしていた(Onaka et al., 2005)．このこ

一種のストレス応答であることが示唆された．

とは，GS が SRP の阻害剤であることを強く示唆するため，本研究において GS と SRP との結合を実験的に証明

2.

複合培養による新規二次代謝産物の発見することとした．SRP は翻訳中のタンパク質の N 末に

前述の通り，T. pulmonis との複合培養により約 9 割の存在するシグナル配列を認識して結合し，膜に存在する

放線菌において二次代謝が変化することが明らかとなっ

SRP 受容体まで運ぶことによって，膜タンパクや分泌タた．そこで，複合培養法を自然環境から分離した放線菌

ンパク質の局在化を担っている重要な分子である．SRPに適用することにより，純粋培養では生産しない二次代を介する機構は全ての生物が有する重要な仕組みであ

謝産物の探索を行い，現在までに 8 種類の放線菌からり，SRP が機能しなくなると生物は生育できない．本研

23 種類の新規二次代謝産物を発見した．Streptomyces

究の詳細は各論の「ゴードスポリン作用機構の解析」にendus S522 と T. pulmonis と の 複 合 培 養 に お い て は，まとめた．GS は SRP に直接結合することが証明された

Micrococcus luteus に対して 0.06 μg/mL の極低濃度で抗菌活性を示す alchivemycin A, B を発見した(Igarashi et

世界で初めての化合物であり，新規作用機序を有する抗al., 2010)． 同 様 に T. pulmonis と Streptomyces cinnamo-

れる．また，SRP は生物種ごとに構成タンパク質のアミ

neus NBRC 13823 との複合培養からは，殺細胞活性を有するインドロカルバゾール化合物 arcyriaflavin E(Hoshinoノ酸配列が異なっており，ゴードスポリンは放線菌のet al., 2015c)，Streptomyces sp. CJ-5 との複合培養では，殺 細 胞 活 性 を 有 す る chojalactone A-C(Hoshino et al.,

ように SRP は生物に必須であるにもかかわらず，生物

生物質の開発におけるリード化合物になることが期待さ

SRP にしか作用しないことが明らかとなっている．この
種ごとに少しずつ構成タンパク質の構造が異なるため，

2015b)，Micromonospora wenchangensis HEK-797 との複病原菌 SRP に選択的に結合する化合物が発見できれば，合培養においては，doracolactam A, B，Streptomyces sp.

新規作用機序を有する抗生物質のリード化合物となりう

NZ-6 と の 複 合 培 養 で は niizalactam A-C(Hoshino et al.,る．今回，実際に放線菌 SRP にのみ特異的に結合し，2015a)，Streptomyces nigrescens HEK616 との複合培養で生育阻害を引き起こす GS が発見できたことから，同じ－ 69 －

尾

仲

宏

康

ような仕組みで病原菌に対して特異的に結合して生育阻

その結果，多様なアナログ体を創出することができる．

害を引き起こす新規作用機構を有する抗生物質の創製が本寄付講座では，直鎖アゾール環含有ペプチドに分類さ期待される．

れるゴードスポリン（ GS ），同じく GS 生産菌が生産していた新規架橋構造を有するランチペプチド・ゴードペ

4.

RiPPs 生合成：中分子創薬へ向けた新規 RiPP アナロ

プチン，Streptomyces lactacystinaeus OM-6519 ゲノム中

グの効率的な合成システムの確立に存在していた潜在的二次代謝生合成遺伝子群により産

天然物創薬においてペプチド系化合物は重要な地位を占めており，それらペプチド骨格の生合成には，リボゾー

生される新規チオペプチド・ラクタゾールの 3 種類のRiPPs を研究対象とした．

ム翻訳系を使うものと非リボゾーム翻訳系で合成される

まず，GS 生合成をモデル系として用いて，試験管内も の の 二 種 類 が あ る． 前 者 は 総 称 し てにテンプレート DNA を入れるだけで形質転換等の煩雑

RiPPs(Ribosomally synthesized and Post-translationally

な操作無しに，天然ペプチド抗生物質である GS を合成

modified Peptides) と呼ばれ，天然物中で大きなウエイできるシステムを確立した（ Fig. 1 ）．本システムは，in

トを占めている(Arnison et al., 2013)．RiPPs 生合成においては，リボゾーム翻訳系によって鋳型 DNA より合vitro 無細胞翻訳系によって前駆体ペプチドを翻訳合成
後，GS 生合成に必要な 6 個の翻訳後修飾酵素が関わる成されたペプチド骨格のアミノ酸が様々な修飾反応を受4 段階の生合成反応（アゾール環形成，デヒドロアラニ

けることによって，活性を持つ化合物へと変換される．

ン形成，リーダペプチド切断，N 末アセチル化）を順次

RiPPs はその前駆体ペプチドが遺伝子情報として存在す行う事で実現した(Ozaki et al., 2017)．本システムでは，るために，その構造遺伝子配列の塩基置換によって容易投入する DNA の塩基配列を変えるとそれに応じた GSに前駆体ペプチドのアミノ酸配列を変えることができ，

アナログが簡便に合成できる．さらには今回の in vitro

Fig. 1

Outline of RiPPs biosynthesis by in vitro reconstitution system coupled with cell-free translational system. This scheme is an
example of reconstitution of goadsporin biosynthesis. To input a template DNA corresponding to RiPPs structure gene into thereconstitution system resulted in goadsporin production by sequential enzymatic reactions.

－ 70 －

微生物による「ものづくり」のイノベーション：微生物の潜在能力発掘・応用のための新手法の開発と実践反応の結果に基づき，有望な候補ペプチドを放線菌を方的に他微生物に影響を与えるだけでなく，他微生物か使って in vivo 系で大量調製できることも実証した．本らも影響を受ける相互作用の様式であることが明らかと研究に関しては「 In vitro 再構成系を用いたゴードスポなった（ Fig. 2 ）．

リン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計」として各

放線菌由来二次代謝産物の中には，人類にとって有用論にまとめた．更に，S. lactacystinaeus OM-6519 ゲノム

な活性を有する化合物の存在が少なくないことから，そ中に存在する，休眠状態にある潜在的チオペプチド生合

れらの生理活性は決して偶然に備わったものではなく，

成遺伝子群を同定し，S. lividans TK23 を用いた異種発生産する放線菌自身においても，その生存のために有効

現によりラクタゾール A，B，C を同定した(Hayashi etに利用されているのではないかという仮説を唱える研究

al., 2014)．本研究に関しては各論の「ゲノム探索による 32 員環新規チオペプチド・ラクタゾールの発見」に者も多く存在する．しかしながら，実際にそれを証明す

その詳細を記した．最後にゴードペプチン生合成に関しどは定かではないのが現状である．今回明らかとなったては「新規ラビオネン構造の形成に関与するランチペプ

放線菌二次代謝に介在する微生物間相互作用は，上記のチド合成酵素の解析」にまとめた．ラクタゾール，ゴーような仮説を裏付けるものの一つである．今後も本研究

ドペプチンにおいても GS 同様に試験管内にテンプレーで得られた接触応答機構現象を切り口に，自然環境におト DNA を入れるだけで形質転換等の煩雑な操作無しに，ける放線菌二次代謝の役割を明らかにできればと考えて産物を合成できるシステムの構築に既に成功している．

いる．

るような直接的な実験的証拠は未だ存在せず，真偽のほ以上のことから，in vitro 合成系を用いた類縁体生産性

謝の迅速な評価と，in vivo 生産系を組み合わせることで，
RiPPs 系天然ペプチドをベースにした創薬開発の加速が期待できる．

第3章

辞本研究は，公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成によって開設された微生物潜在機能探索寄付講座において終わりになされたものであります．本助成を賜った発酵研究所に対して，ここに篤く御礼申し上げます．また，本寄付講

本寄付講座で行われた複合培養の研究は，当初は潜在座世話人である東京大学大学院農学生命科学研究科応用的二次代謝の活性化機構という産業利用に向けた実用研

生命工学専攻・大西康夫教授のご支援とご協力に感謝の究の側面が強かったが，共凝集状態の観察より接触応答

意を表します．最後に，本寄付講座の浅水俊平特任助教，機構の存在を示唆する結果を得たことから，微生物相互尾崎太郎特任助教，菅井佳宣特任助教，林昌平特任研究

作用に関する基礎的な研究へと展開した．すなわち，放員，並びに，大学院生，学部生の皆様に深く感謝申し上

線菌は他微生物に対して抗生物質を生産する「抗生」作

げます．

用により，他者に対して影響を与えているだけでなく，

文

MACB からの接触刺激を受けることにより抗生物質をはじめとした二次代謝生産の誘導を受けているということが本研究によって明らかになり，放線菌二次代謝は一Fig. 2Bacterial communication between Streptomyces andMycolic acid containing bacteria (MACB). Antibiosis is
not unilateral action but a mutual interaction.

献

Arnison, P.G., Bibb, M.J., Bierbaum, G., Bowers, A.A., Bugni, T.S.,
Bulaj, G., Camarero, J.A., Campopiano, D.J., Challis, G.L.,
Clardy, J., Cotter, P.D., Craik, D.J., Dawson, M., Dittmann, E.,
Donadio, S., Dorrestein, P.C., Entian, K.D., Fischbach, M.A.,
Garavelli, J.S., Goransson, U., Gr uber, C.W., Haft, D.H.,
Hemscheidt, T.K., Her tweck, C., Hill, C., Horswill, A.R.,
Jaspars, M., Kelly, W.L., Klinman, J.P., Kuipers, O.P., Link, A.J.,
Liu, W., Marahiel, M.A., Mitchell, D.A., Moll, G.N., Moore,
B.S., Muller, R., Nair, S.K., Nes, I.F., Norris, G.E., Olivera,
B.M., Onaka, H., Patchett, M.L., Piel, J., Reaney, M.J., Rebuffat,
S., Ross, R.P., Sahl, H.G., Schmidt, E.W., Selsted, M.E.,
Severinov, K., Shen, B., Sivonen, K., Smith, L., Stein, T.,
Sussmuth, R.D., Tagg, J.R., Tang, G.L., Truman, A.W., Vederas,
J.C., Walsh, C.T., Walton, J.D., Wenzel, S.C., Willey, J.M. & vander Donk, W.A. 2013. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: over view andrecommendations for a universal nomenclature. Nat. Prod.
Rep. 30: 108-160.

－ 71 －

尾仲Asamizu, S., Ozaki, T., Teramoto, K., Satoh, K. & Onaka, H. 2015.
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antibiotic production by Streptomyces in combined-culture.
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combined-culture of Streptomyces nigrescens and Tsukamurella
pulmonis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 55: 10278-10282.

－ 72 －

IFO Res.Commun. 32
73-86, 2018

ミコール酸含有細菌死菌体は放線菌の二次代謝を誘導しない
浅水

俊平，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在機能探索寄付講座〒113-8657

東京都文京区弥生1-1-1

Requirement of live mycolic acid-containing bacteria for induction of antibiotic production
by Streptomyces in combined-culture
Shumpei Asamizu, Taro Ozaki, Hiroyasu Onaka
Laboratory of Microbial Metabolic Potential,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
Yayoi 1-1-1, Bunkyo, Tokyo, 113-8657, Japan
Streptomyces co-culture with mycolic acid-containing bacteria (MACB), which we termed ＂combined-culture,＂
alters the secondar y metabolism in Streptomyces and has been useful for the discover y of bioactive natural
products. Our investigation to identify the inducing factor(s) of MACB had shown that production of pigments in
Streptomyces lividans was not induced by small molecules, including mycolic acids. Although dynamic changes inculture conditions were caused by co-culture with MACB, the activation of pigment production by S. lividans wasobser ved in a limited area where colonies of both species were in direct contact. This suggested that direct
attachment of cells is a requirement and that components of the MACB cell membrane may play an important rolein inducing the response of S. lividans. Here we examined whether this response was influenced by dead MACB
that possess intact mycolic acids. Formaldehyde fixation and γ - irradiation were used to prepare dead cells thatretain their shape and mycolic acids using three MACB species: Tsukamurella pulmonis, Rhodococcus erythropolis,
and Rhodococcus opacus. Both solid and liquid culture tests verified that S. lividans did not respond to the intact
dead cells of three MACB. Observation of combined-culture by scanning electron microscopy (SEM) indicatedthat adhesion of live MACB to S. lividans mycelia was a significant interaction that resulted in co-aggregation. In
contrast, dead cells were not observed to adhere to S. lividans mycelia. Therefore, direct attachment by live MACB
cells is proposed as one of the possible factors that causes Streptomyces to alter its secondar y metabolism in
combined-culture.
Key words: Streptomyces, mycolic acid containing bacteria, 60Co γ- irradiation, co-aggregation

緒

言る．Streptomyces 属を主とする放線菌由来の天然物は創薬において重要な役割を果たしている(Berdy, 2005)．
また最近のゲノム解析から，Streptomyces 属放線菌単一Streptomyces 属放線菌は，通常，土壌に生息し，菌糸状に生育するグラム陽性細菌であり，臨床的に重要な生株につき 20－40 個もの潜在的な二次代謝産物生合成遺物活性二次代謝産物の生産者としてもよく知られてい伝子クラスターが存在することが示唆されており，多数の二次代謝産物のほんの一部しか実際には発見していな

E-mail: 浅水俊平（ asamizu@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp ）尾﨑太郎（ ozaki@sci.hokudai.ac.jp ）尾仲宏康（ aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp ）共同研究者:佐藤勝也（国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構高崎量子応用研究所），
寺本華奈江（日本電子株式会社，現 株式会社島津製作所）

いことが示唆されている(Nett et al., 2009)．
二次代謝の活性化機構に関しては，環境ストレスまたは
低分子化合物による機構が存在することが知られている(Liu et al., 2013)．γ -ブ チロラクトン系 低 分 子 化 合 物（ A-factor など）は，Streptomyces 属の形態分化および二次代謝制御に関与しており，微生物ホルモン物質として知－ 73 －

浅水

俊平，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

られて いる(Horinouchi & Beppu, 2007)．Streptomyces

ナルが生成し，どのように最終的に二次代謝の活性化に

coelicolor A3(2) に お けるウンデシルプ ロディギオシン
（ RED）またはアクチノロージン（ ACT ）をコードする遺伝達されるかは未だ不明である．

伝子クラスターの活性化につながる他の因子についても，

ター活性化による新規天然物の発見を目的とした，共培

過去にいくつか研究例が存在する．例えば，培地中のリン養法に関する研究を行っている．微生物間相互作用によ酸を制限することでいくつかの抗生物質生産は活性化される放線菌潜在的二次代謝産物生合成遺伝子クラスターのる例がある(Martin, 2004)．またペプチドグリカン構成成発現の覚醒・活性化を目的とした本方法論は，複雑な微分である N -アセチルグルコサミンは最少培地条件下で S.

生物群からなる自然生育環境を模倣することに着想を得

coelicolor A3(2) における RED および ACT の産生を活性化する(Rigali et al., 2008)．PI 因子(Recio et al., 2004)，とミコール酸含有細菌 Tsukamurella pulmonis TP-B0596

我々は，放線菌の潜在的二次代謝産物遺伝子クラスている．これまで，放線菌 Streptomyces lividans TK23 株

goadsporin(Onaka et al., 2001)，hormaomycin(Andres

株の異属細菌間の相互作用が S. lividans による二次代謝

et al., 1990)，およびいくつかの合成化合物(Ahmed et

産物の産生に強く影響を与えることを見いだしていた

al., 2013) なども低分子化合物として Streptomyces の二次代謝に影響を及ぼすことが見出されている．

(Onaka et al., 2011)．
2 種類の色素性抗生物質（ RED および ACT ）の生合

微生物間相互作用における二次代謝産物の役割につい成遺伝子をゲノム中に有するが普段は発現していない S.

ての研究も報告されており，細菌 - 細菌または細菌 - 真菌間の相互作用における二次代謝産物の役割が注目されlividans を二次代謝誘導細菌株スクリーニングのための指標株として使用した．そのスクリーニングの過程で，ている(Bertrand et al., 2014 ; Marmann et al., 2014)．

土壌から分離されたミコール酸含有細菌（以下 MACB ）Bacillus subtilis は，S. coelicolor A3(2) の気中菌糸形成を阻害する界面活性剤様の低分子サーファクチンを分泌しである T. pulmonis TP-B0596 は，S. lividans による色素(Straight et al., 2006 ; Willey et al., 2006)，Streptomycesに，この効果は多様な属種の MACB によって誘導されsp. Mg1 株はこのサーファクチンを特異的に分解する酵

たが，例えば，枯草菌 Bacillus subtilis，黄色ブドウ球菌

素 を 分 泌 し， 対 抗 し て い る(Hoefler et al., 2012)．B.

Staphylococcus aureus，酵母 Saccharomyces cerevisiae，
真菌 Candida albicans は誘発効果を示さなかった(Onaka

subtilis との相互作用に対して S. coelicolor A3(2)（または S. lividans ）は RED を生産するが，B. subtilis がバシ生産を強く誘導することが見いだされた．興味深いこと

ラ エ ン を 生 産 す る と， そ の RED 生 産 は 阻 害 さ れ る

et al., 2011)．潜在的二次代謝の活性化における放線菌と MACB の 共 培 養 の 効 果， こ の 方 法 を「 複 合 培 養(Vargas-Bautista et al., 2014)．S. coelicolor A3(2) と他の（ combined-culture ）」と称した．

放線菌間の相互作用ではまた，シデロフォアとして利用

その後の実験で，更に T. pulmonis は広範囲の放線菌されているデスフェリオキサミン誘導体の産生などによにおける純粋培養では生産されない「潜在的」抗生物質

る環境中の Fe3+ の競合なども知られている(Traxler etの生産を活性化することが明らかになり，新規天然物とal., 2013)．
潜在的二次代謝産物の活性化の試みについての多くのして，alchivemycin A(Igarashi et al., 2010)，arcyriaflavin

報告があるが，微生物における二次代謝の活性化に関与する直接的相互作用を提唱する報告は依然として数が少al., 2015b)，niizalactam A- C(Hoshino et al., 2015a)，dracolactam A- B(Hoshino et al., 2017)，umezawamide

な い．Brakhage ら の 研 究 グ ル ー プ は，Streptomyces

A- B(Hoshino et al., 2018)，5-alkyl-1,2,3,4-tetrahydro-

rapamycinicus が Aspergillus nidulans によるポリケチド
抗生物質生合成の活性化の間に A. nidulans 菌糸に直接(Sugiyama et al., 2016) などが単離された．また最近で付 着 し て い る SEM 画 像 を 示 し た(Schroeckh et al.,は本方法に着想を得て，放線菌とミコール酸含有細菌の2009)．この A. nidulans ポリケチド抗生物質生合成遺伝

組み合わせから，Bachmann らの研究グループは ciro-子の発現活性化は，ゲノムのヒストン修飾に関わる主要

micin 類を発見し(Derewacz et al., 2015)，Bugni らの研E(Hoshino et al., 2015c)，chojalactone A- C(Hoshino etquinoline 類(Sugiyama et al., 2015)，streptoaminal 類

なヒストンアセチルトランスフェラーゼ複合体である

究 グ ル ー プ は keyicin を 発 見 し て い る(Adnani et al.,Saga / Ada complex を 介 し て 起 こ る こ と が 示 さ れ た

2017)．

(Nutzmann et al., 2011)．これらの結果は，ケミカルコ

MACB はコリネバクテリウム亜目に属し，病原菌であミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン(Straight & Kolter, 2009) 以 外 に も，る Mycobacterium tuberculosis(Smith, 2003)，工業的グル

直接的な物理的相互作用が微生物間のコミュニケーショ

タ ミ ン 酸 生 産 株 Corynebacterium glutamicum(Kimura,

ン手段として普遍的に存在していることを暗示してい2003)，および有機汚染物質分解者である Rhodococcus

る．しかしながら，物理的付着によってどのようなシグ属(Martinkova et al., 2009) を含むグラム陽性桿菌の一－ 74 －

ミコール酸含有細菌死菌体は放線菌の二次代謝を誘導しない群である．MACB の細胞膜外膜は，脂質に富む構造を実験方法有する(Marrakchi et al., 2014)．例えば，Mycobacteriumの外膜は，グリコペプチドリピッド，トリアシルグリセ
ロール，ジアシルグリセロール，トレハロース 6,6' - ジ

使用した培地及び菌株

ミコレート，およびミコール酸を主成分とする(Bansal-

S. lividans TK23 を 2 種の色素（ RED および ACT ）生
産 の 指 標 株 と し て 使 用 し た．3 つ の MACB 株，T.

Mutalik & Nikaido, 2014)．これらの外膜脂質のうち，ミコール酸は MACB に特異的に保存された成分である．
尾仲ら（ 2011 ）は，MACB による放線菌に対する二pulmonis TP-B0596 ，R. erythropolis PR4 ，R. opacus B4を誘導株として用いた．TSB 培地（ Trypto-Soya Broth ）

次代謝誘導因子を同定する試みとして，T. pulmonis のを種培養に用いた．S. lividans による色素の生産培養お

ミコール酸を含む脂質抽出物の添加実験を行ったが，ミ

よび SEM による細胞間相互作用の観察には，A3M またコール酸のみでは放線菌の二次代謝は誘導されなかっは YGGS 培地を用いた．A3M 培地は，0.5 ％グルコース，

た．また，T. pulmonis によって産生された拡散性の低

2 ％デンプン，2 ％グリセロール，1.5 ％ファーマメディ

分子化合物による活性化を検証するために，T. pulmonis

ア，0.3 ％酵母エキス，1 ％ HP-20 を含み，pH 7.2 に調整の培養液ブタノール抽出物およびフィルターろ過した培

した．A3M 寒天培地では，1.8 ％寒天を添加し，HP-20

養上清の添加実験を行ったが，これらも誘導活性を示さを添加しなかった．YGGS 培地は，0.5 ％グルコース，2 ％なかった．さらに，T. pulmonis および S. lividans の 2 つデンプン，2 ％グリセロール，0.3 ％酵母エキス，pH 7.2の培養層を透析膜やメンブレンフィルターで分離するこに調整した．YGGS 寒天培地は 1.8 ％寒天を添加した．

と が で き る 二 層 式 フ ラ ス コ を 用 い た 実 験 で は，T.
pulmonis の生育による培地状態の変化（主要栄養では炭素源，窒素源，リン酸，や pH など）の増減の影響を

ホルムアルデヒド固定化 MACB の作製法検証したが，S. lividans はこの場合においても色素生産

T. pulmonis，R. erythropolis， お よ び R. opacus を，
TSB 培地 100 ml を含む K-1 フラスコ中，30 ℃，200 rpm

をしなかった．また，C. glutamicum の細胞膜ミコール

で 3 日間，完全に増殖するまで培養した．菌体を遠心分酸層を欠損した変異株（ pks13 :: Km r ）がその誘導能を離で回収し，オートクレーブした透析膜に充填し，中和

消失していることも明らかになっていた．この結果は，ホルムアルデヒド（ 1 ％ 最終濃度）を添加した TSB 培

外膜に存在するミコール酸成分が S. lividans による色素

地（ 1 L ）を用いて 3 時間処理し，ホルムアルデヒドを誘導において重要な役割を果たすことを示唆した．

TSB 培地（ 1 L ）で 9 回透析することにより除去した．

れまで知られている放線菌二次代謝活性化因子とは異な固定された細胞の死滅は，TSB 寒天プレート上に 2 ml
培養物（ > 10 8 cfu ）由来の固定細胞を接種し，増殖が観る機構を有していることが考えられた．本研究では，誘察されないことによって確認した．

以上の結果，S. lividans の色素生産活性化現象は，こ導因子を明らかにすることを目的として，ミコール酸成分を含有する MACB 細胞のミコール酸外膜層との物理

ホルムアルデヒド固定化 MACB における走査型電子顕的な接触が S. lividans の二次代謝をもたらすことを予測

微鏡試料の作製法

し，検証を行った．S. lividans が MACB のミコール酸含SEM 分析のための試料調製は，同じ培養バッチから有細胞外膜層との直接的相互作用に対して二次代謝応答の固定細胞および非固定生細胞を水寒天上にスポットするかどうかを試験するために，ホルムアルデヒド固定

し，さらに 2 ％ OsO4 を用いて一晩処理し蒸気固定を行っ

および Co 線源を用いた γ 線照射により MACB 死細胞
60

た．固定細胞を Pt / Pd イオンスパッタ装置を用いてコーを調製した．Rhodococcus erythropolis PR4，Rhodococcus

ティングし，走査型電子顕微鏡（ S-4000，日立）で観察

opacus B4，および T. pulmonis の 3 種の MACB を実験に使用した．死細胞の細胞形状およびミコール酸成分の保した．非ホルムアルデヒド処理した細胞を対照として用いて，細胞の形状を比較した．

存を確認した後，MACB 無傷死細胞による放線菌色素生産誘導を，生育細胞と比較した．複合培養液中における放線菌と，MACB 生育細胞または死細胞との相互作
用様式について走査型電子顕微鏡（ SEM ）を用いて観察した．

γ 線照射 MACB 死菌体試料の作製法
T. pulmonis，R. opacus および R. erythropolis を完全に増殖するまで 30 ℃，200 rpm で 3 日間，100 ml の YGGS培地を含む K-1 フラスコ中で培養した．遠心分離により800 ml の培養液から細胞を回収し，新鮮な YGGS 培地
で 2 回洗浄した．回収した菌体を 60 ml の新鮮な YGGS
培地に懸濁し，6 つの 15 ml コニカルチューブに分けた．

－ 75 －

浅水

俊平，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

日本原子力研究開発機構食品放射線施設（群馬県）にお（ Polymer Laboratories，UK ）．各試料の 3 つの質量スペ

いて 60Co を用いた γ 線照射を行った．照射線量は，γ 線

クトルを収集し，質量スペクトルデータを Polymerix ソ

源からの試料の距離を変えることによって調節し，5，

フトウェア（ Sierra Analytics，USA ）で解析した．

10，20，30 または 40 kGy の照射を行った．γ 照射した細胞の死滅は，2 ml の培養物（ > 10 8 cfu ）由来の固定細ホルムアルデヒド固定化 MACB を用いた誘導試験（対胞を TSB 寒天プレートに接種し，増殖が観察されない

峙培養）ことによって確認した．

S. lividans の胞子（約 10 8 cfu ）を A3M 寒天培地（約 3
×0.3 cm ）に塗布した．固定 MACB 死菌体（ 10 ml の培

γ 線照射 MACB 死菌体試料における走査型電子顕微鏡試料の作製法

養液分）を寒天培地にスポットし半乾燥させた．対照とγ 線照射によって細胞に損傷がないことを確認するた
めに，同じ培養バッチからの γ 線照射細胞および対照生

保存していた MACB 生菌 2 μl を使用した．寒天プレー

存細胞を水寒天上にスポットし，さらに 2 ％ OsO4 を用を 3 回繰り返し，10 日以上培養し，経時変化を観察した．

でスパッタコーティングし，走査型電子顕微鏡（ S-4000，

γ 線照射 MACB 死菌体を用いた誘導試験（対峙培養）

して，固定細胞調製のために同じ培養バッチから 4 ℃でトを 30 ℃でインキュベートし適時観察を行った．実験

いて一晩処理し蒸気固定を行った．固定細胞を Pt / Pd日立）で観察した．非照射細胞を対照として用いて，細胞の形状を比較した．

S. lividans の胞子（約 10 8 cfu ）を YGGS 寒天上に 2 μl
スポットした．MACB の 2 ml 培養液分の γ 線照射死菌体を寒天培地にスポットし半乾燥させた．対照として，死菌体試料からミコール酸の抽出と分析方法
T. pulmonis，R. opacus，および R. erythropolis からの総脂質を，同じ培養由来の生菌体，ホルムアルデヒド固定死菌体および γ 線照射死菌体を加水分解し，エステル

γ 線照射細胞調製用の同じ培養バッチから 4 ℃で保存して い た MACB 生 菌 2 μl を 使 用 し た． 寒 天 プ レ ー ト を
30 ℃でインキュベートし適時観察を行った．実験を 2 回繰り返し，10 日以上培養し，経時変化を観察した．

化し，抽出した．メタノール中 10 ％ KOH 2 ml を凍結乾燥細胞に添加し，100 ℃で 2 時間加熱した．6 N HCl（終ホルムアルデヒド固定化 MACB を用いた誘導試験（混濃度 0.6 N ）を加えて酸加水分解を行い，ミコール酸を合培養）

含む脂質を 2 ml のヘキサンで 2 回抽出した．ヘキサン層を乾固し，2 ml の BMS 溶液（ベンゼン:メタノール:

S. lividans を TSB 培地で 3 日間培養し，1 ml の種培養液を用いて 100 ml フラスコ中の 20 ml の A3M 培地に接

硫酸＝10:20:1 ）を脂質抽出物に加え，100 ℃で 2 時間

種した．MACB のホルムアルデヒド固定細胞（ 40 mL の加熱した．1 ml の水を溶液に加え，脂肪酸メチルエステ

TSB 培養物由来）を A3M 培地に加えた．対照として，ルを 2 ml のヘキサンで 2 回抽出した．メチルエステル

30 ℃，180 rpm で 2 日間，試験管中で 10 ml の TSB で培化脂肪酸を 300 μl の CM（クロロホルム:メタノール＝養した MACB の生菌 200 μl を A3M 培地に同時に添加し

2:1 ）に溶解し，2 μl を TLC にスポットした．HE 溶媒（ヘた．フラスコを 30 ℃，180 rpm で 7 日間振盪した．

キサン:酢酸エチル＝19:1，2 回）により TLC を展開し，
CAM（セリウム - アンモニウム - モリブデン酸塩）で処
理し，ミコール酸メチルエステルを青色スポットとして呈色させた．

γ 線照射 MACB 死菌体を用いた誘導試験（混合培養）
S. lividans を TSB 培地で 3 日間培養し，1 ml の種培養液を用いて試験管中の 10 ml の YGGS 培地を植菌した．
MACB の γ 線照射死菌体（ 20 mL の YGGS 培養物由来）

死菌体試料からのミコール酸の質量分析

を YGGS 培地に添加した．対照として，30 ℃，180 rpm

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型

で 2 日間，試験管中で 10 ml の TSB で培養した MACB

（MALDI TOF ）マススペクトルを測定した（JMS-S3000，の生菌 100 μl を同時に YGGS 培地に添加した．試験管をJEOL ）．高質量分解能を達成するために 349 nm の Nd:

30 ℃，180 rpm で 7 日間振盪した．

YLF レーザーの照射によって生成されたイオンは，螺旋軌道（ 8 サイクル）の間に 20 kV で加速された．遅延時

色素性二次代謝産物の定量

間とグリッド電圧の設定は，m/z 400 -1300 の範囲にわRED および ACT の定量を行った．アクチノロージン

たって半値全幅で ΔM＝0.02 - 0.03 Da を維持するように（ ACT ）を定量するために，0.4 ml の 2 N KOH を 0.4 ml

最適化された．質量分析は，ポリ（メチルメタクリレーの培養液に添加した．遠心分離（ 3000×g，5 分）後，ト），Mp＝625 または Mp＝1310 ）を基準として行った

上清の吸光度（ A640 ）を分光光度計で測定し，ACT の－ 76 －

ミコール酸含有細菌死菌体は放線菌の二次代謝を誘導しない

結モル吸光係数（ ε640＝25320 ）を用いて定量した．ウン
デシルプロディジオシン（ RED ）を定量するために，

果

0.4 ml の培養物からの細胞を遠心分離（ 10000×g，5 分）

ホルムアルデヒド固定死菌体は細胞形状とミコール酸組によって回収した．減圧下で細胞を乾燥させた後，0.4 ml成が維持されていたの MeOH を添加した．1 時間振盪した後，MeOH 抽出

細胞形状とミコール酸成分が完全に維持された死菌体物に 0.4 ml の 1 N HCl を添加し，遠心分離した（3000×g，を作製するために，最初にホルムアルデヒド固定を試み

5 分）．上清の吸光度（ A530 ）を測定し，RED のモル吸た．ホルムアルデヒド固定は，細胞生物学の研究のため

光係数（ ε530＝100500 ）を用いて定量した．

の一般的な細胞固定法であり，官能基を架橋することによってタンパク質 / ペプチドを修飾し，細胞形状を維持

複合培養菌体の走査型電子顕微鏡試料の作製法

させる．そのため，死滅時に溶菌を起こさずに細胞構造

生菌，固定死菌体，または γ 線照射死菌体を含む培養を維持した状態であると考えられる．そこで，R. eryth-

物を SEM（ S-4000，日立製作所）によって観察した．
100 μl の 培 養 液 を 水 寒 天（ 2 ％） に ス ポ ッ ト し，2 ％ropolis，R. opacus，および T. pulmonis を中和ホルムア
ルデヒドで処理して細胞を固定することとした．ホルム

OsO4 を用いて一晩（ 14 ～ 16 時間）蒸気固定処理を行っアルデヒドで処理した細菌は寒天培地上で増殖しないこ

た．OsO4 固定試料を Pt / Pd イオンスパッタ装置（E-1030，とから殺菌固定化されたことを確認した．ホルムアルデ

日立製作所）を用いてコーティングした．独立した複数

ヒド固定細胞と生細胞を SEM で観察し，細胞形状を比の培養系列を用いて SEM イメージングを実施した

較したところ，ホルムアルデヒド固定細胞の細胞形状は保持されていることが示された（ Fig. 1A ）．

Fig. 1Conservation of cell shape and mycolic acids by formaldehyde-fixation.
(A) SEM images of formaldehyde-fixed MACB. (B) MALDI mass spectra of mycolic acid methylesters from formaldehyde-fixed cells and non-fixed cells. Numbers on arrows represent (0) A-1 MA, (1) A-2 MA, (2) A-3 MA, (3) A-4
MA, (4) A-5 MA, and (5) A-6 MA (MA : mycolic acid). Abbreviations ; Tp : Tsukamurella pulmonis TP-B0596, Ro :Rhodococcus opacus B4, Re : Rhodococcus erythropolis PR4.

－ 77 －

浅水

俊平，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

観察されなかった（ Fig. 3A, 3B ）．対照として MACB 生

R. erythropolis，R. opacus および T. pulmonis の固定細胞および非固定細胞の総脂質を加水分解，メチルエステ細胞を添加した培養では，RED および ACT の産生が向ル化し抽出した．メチルエステル化全脂質を最初に上することは確認されている（ Fig. 3A, 3B ）．

TLC により分析した．TLC 分析において，ミコール酸を含む脂質画分のスポットは，ほとんど同一のパターンを示したことから，固定化前後での細胞壁中のミコール

γ 線照射 MACB 死菌体は細胞形状とミコール酸組成が維持されていた酸層が保存されていることが示された．抽出したミコー

MACB 死菌体では S. lividans の色素生産誘導活性が消ル酸メチルエステルを，MALDI-TOF-MS により分析し失することを確認するために，別の滅菌方法を用いて試た(Teramoto et al., 2015 ; Teramoto et al., 2013)．ミコー

験 す る こ と と し た．γ 線 照 射 は 細 胞 中 に 活 性 酸 素 種

ル酸画分のマススペクトルは，ホルムアルデヒド固定細（ ROS ）を生成し，ゲノム DNA や生体分子を破壊する

胞と非固定細胞との間で同一のパターンを示したことか滅菌方法であり，細胞構造を維持した状態で死菌体を調ら，ホルムアルデヒド固定細胞においてもミコール酸が製することが出来る(Krisko & Radman, 2010 ; Min et al.,

分解していないことが確認された（ Fig. 1B ）．

2003)．YGGS 培地を用いて培養した R. erythropolis，R.

実験に用いた MACB のミコール酸組成

opacus，および T. pulmonis を用意し，このサンプルに異なる線量率（ 1, 2, 4, 6 または 8 kGy/ 時間）になるよ

MACB は，多様な炭素鎖長および異なる飽和型のミ

うに 60Co 照射を 5 時間行った．5 kGy 照射を行ったサンコール酸を生合成する．一般的に知られているミコール

プルからは，生存細胞が観察された．しかし，10 kGy

酸 の 炭 素 鎖 長 は，Corynebacterium で は C20 ～ C38，を超える照射を行ったサンプルでは生存細胞が確認でき

Rhodococcus で は C34 ～ C52，Tsukamurella で は C64 ～C78，Mycobacterium で は C60 ～ C90 で あ る(Butler &なかった．この結果を踏まえ，以後の実験には，MACBを完全殺菌するための最小線量である 10 kGy 照射サン

Guthertz, 2001)．今回の MALDI-TOF-MS を用いた測定

プルを用いた．γ 線照射（ 10 kGy ）および非照射生細胞により，R. erythropolis PR4 は，C32 - C44 の炭素鎖長をを SEM で比較観察したところ，細胞形状に 10 kGy の γ

有 す る ミ コ ー ル 酸 を 含 有 す る こ と を 確 認 し た．T.

線照射において明確な損傷は認められず，細胞は構造を

pulmonis TP-B0596 は，C72 - C76 の炭素鎖長を有するミコール酸を含有していた．興味深いことに R. opacus B4（ Fig. 4A ）．

は，C50 - C56 の炭素鎖長を有するミコール酸を含んでいた．R. opacus のミコール酸は，これまでに報告され維持した状態で死滅していることが明らかとなった
R. erythropolis，R. opacus，および T. pulmonis の γ 線
照射死細胞および非照射生細胞のメチルエステル化した

た Rhodococcus 種のものよりも比較的長い鎖長を有していた．以上の結果から，異なる炭素鎖及び修飾パターンのミコール酸を有する固定化 MACB 細胞をミコール酸の効果を試験するために得ることができた．
ホルムアルデヒド固定 MACB 死菌体は放線菌の色素生産を誘導しなかった
まず，死菌体による誘導効果を寒天培地で試験した．
2 ml 培養液分の固定死細胞を A3M 寒天培地にスポットし，S. lividans を 側 方 に 増 殖 さ せ た． 対 照 と し て，
MACB 生菌をスポットした．生細胞は 2 ～ 3 日で広がり，2 種類の細菌は直接相互作用し始めた．コロニーが互いに接触してから約 1 日後に，S. lividans による色素生成が，相互作用するコロニーの界面で観察された（ Fig. 2 ）．
しかしながら，予想外なことに，S. lividans は固定死細胞との接触界面で色素を生産しなかった（ Fig. 2 ）．
死細胞による誘導効果は液体培地でも試験した．S.
lividans および 20 ml 培養液分の固定死細胞を同じ A3M培地に接種し培養した．その結果，固定化された死細胞

Fig. 2の添加による培養では RED および ACT の生産活性化は－ 78 －

Pigments inducing effect by formaldehyde-fixed MACB.
(A) Induction activity of formaldehydefixed MACB wastested on solid medium. Both bacteria were inoculated
on A3M agar and incubated for 5 days at 30 ℃.

ミコール酸含有細菌死菌体は放線菌の二次代謝を誘導しない

Fig. 3

Induction activity of formaldehyde fixed MACB tested in liquid medium culture.
(A) Flask of mixed-culture and SEM images of mixed-culture of S. lividans and live T. pulmonis (left) or fixed T.
pulmonis (right). The boxed image (left bottom) indicates the rod-shaped MACB. (B) Flask of mixed-culture andSEM images of mixed-culture of S. lividans and live R. opacus (left) or fixed R. opacus (right). Bacteria were
cultured in A3M medium for 5 days at 160 rpm, 30 ℃.

－ 79 －

浅水

Fig. 4

俊平，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

Conservation of cell shape and mycolic acids by γ-irradiation.
(A) SEM images of γ-irradiated MACB. non-irradiated cells of R. erythropolis, R. opacus, T. pulmonis on top (left to right).
γ-irradiated (5 kGy) cells of R. erythropolis, R. opacus, T. pulmonis on bottom (left to right). (D) MALDI mass spectra ofmycolic acid methylesters from γ-irradiated MACB and live cells. Numbers on arrows represent (0) A-1 MA, (1) A-2 MA,(2) A-3 MA, (3) A-4MA, (4) A-5 MA, and (5) A-6 MA (MA : mycolic acid).

総脂質画分を TLC で分析した．ミコール酸を含む総脂

MACB 生細胞を用いた培養も行った．MACB 生細胞で質画分は，TLC 分析においてほぼ同一のパターンを示

は，2 種類の細菌コロニー同士が直接接触した翌日に両し，細胞壁におけるミコール酸層が両者において保存さコロニーが接触する領域で S. lividans による色素生成がれていることが確認された．抽出したミコール酸メチル

観察された（ Fig. 5 ）．一方，対照的に γ 線照射された細エステルをスパイラル型 MALDI-TOF-MS で分析し，γ胞と S. lividans のコロニーが接する領域では，色素生成

線照射死細胞由来のミコール酸のマススペクトルが非照は全く観察されなかった（ Fig. 5 ）．

射生細胞のものと同一のパターンを示すことを確認した

液体培養における赤色色素誘導活性を調べるために，（ Fig. 4B ）．

S. lividans お よ び γ 線 照 射 細 胞（ 20 mL 培 養 液 分 ） を
YGGS 培地に接種し，液体培養した．赤色色素の増強生

γ 線照射 MACB 死菌体は放線菌の色素生産を誘導しなかった

産は，MACB 生菌を加えた複合培養によって観察され2 ml 培養液分の γ 線照射死細胞を YGGS 寒天培地にス

天培地上の結果と同様に赤色色素の生成は全く観察され

ポ ッ ト し，S. lividans と 対 峙 培 養 し た． 対 照 と し て，た（ Fig. 6A - C ）．一方，γ 線照射死細胞の添加では，寒なかった（ Fig. 6A - C ）．

－ 80 －

ミコール酸含有細菌死菌体は放線菌の二次代謝を誘導しない

MACB 生菌は放線菌菌糸に付着し共凝集した培養液中でのホルムアルデヒド固定死菌体および生菌と の 細 胞 間 相 互 作 用 を，SEM に よ っ て 比 較 し た．S.
lividans と固定 T. pulmonis 死菌または固定 R. opacus 死菌との混合培養物を SEM で観察した．コントロールとして，S. lividans と T. pulmonis または R. opacus の生菌同士の複合培養液も SEM で観察した．S. lividans は菌糸状に，MACB は桿菌として観察された．S. lividans と T.
pulmonis 生菌または R. opacus 生菌との複合培養では，MACB は S. lividans 菌糸に対して接着する様子が観察された（ Fig. 3A, 3B ）．対照的に，ホルムアルデヒド固定
死菌体の添加培養では，MACB 生菌との複合培養で観Fig. 5

Pigments inducing effect by γ-irradiated MACB.
Induction activity of γ-irradiated MACB was tested onsolid medium culture. Both bacteria were inoculated on
YGGS agar and incubated for 5 days at 30 ℃.

Fig. 6

察された MACB 生菌の接着は観察されなかった（Fig. 3A,
3B ）．続いて，S. lividans と γ 線照射死菌体の添加培養
液と生菌との複合培養液を YGGS 培地を用いて比較観察した．ホルムアルデヒド固定死菌体を用いた場合の観Induction activity of γ-irradiated MACB tested in liquid medium.
(A-C) SEM images were obtained from mixed-cultures in YGGS medium (5 days at 180 rpm, 30 ℃) : (A) S.
lividans with live R. erythropolis (left) or γ-irradiated R. erythropolis (right). (B) S. lividans with live R. opacus (left)or γ-irradiated R. opacus (right). (C) S. lividans with live T. pulmonis (left) or γ-irradiated T. pulmonis (right).

－ 81 －

浅水

俊平，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

察と同様に，γ 線照射死菌体と混合した場合，MACB 生（ Fig. 6A - C ）．S. lividans によって形成された菌糸ペレッ菌との複合培養で観察された共凝集は観察されなかった

トに MACB 生菌が付着する全体の様子を観察するため（ Fig. 6A - C ）．対照的に，S. lividans と MACB との複合に，低倍率で SEM 画像を撮影した．その結果，MACB は，培養において，MACB は，S. lividans の菌糸体に対してS. lividans により形成されたペレット全体に付着し，共凝集形態を形成している様子が観察された（ Fig. 7A, 7B ）．

接着する様子が観察され，共凝集する様子も観察されたFig. 7

Co-aggregation of S. lividans and MACB observed using SEM.
(A) Co-aggregation of S. lividans and live R. erythropolis. Adhesion of rod-shaped cells of R. erythropolis wasobserved entirely on pellets of S. lividans formed in liquid culture. (B) Co-aggregaton of S. lividans and live R.
opacus. Adhesion of rod-shaped cells of R. opacus were observed entirely on pellets of S. lividans formed in liquid
culture. Bacteria were cultured in YGGS medium for 5 days at 180 rpm, 30 ℃.

－ 82 －

ミコール酸含有細菌死菌体は放線菌の二次代謝を誘導しないにおいては，MACB 死菌体量を増殖定常期と同等以上

考察となるように十分な量を添加したにも関わらず，死菌
MACB の S. lividans ペレットへの付着は観察されなかっ細胞外膜にミコール酸が存在する MACB の細胞構造た．これは，MACB の接着特性はミコール酸を有するが，S. lividans の 潜 在 的 二 次 代 謝 産 物（ ACT お よ び

他に生菌のみが有する特有な性質が関与していることをRED ）生産の誘導をできるかどうかを明らかにするた

示唆している．

めに，細胞構造に損傷のない MACB 死菌をホルムアル

複数の微生物によって形成される共バイオフィルム構

デヒド固定および 60Co を用いた γ 線照射によって調製し造には，分離状態，層状態，または共存（ミックス）状

た．MACB 死菌体の細胞形状を SEM を用いて確認した態の 3 つの異なる様式が観察されている(Elias & Banin,

ところ，ホルムアルデヒド固定または γ 線照射によって2012)．本研究において，複合培養では 2 つの遺伝的に調製された死菌細胞に明確な損傷は見出されなかった．

異なる属の細菌が共凝集体を形成することを示した．こ次 い で， 死 菌 体 中 の ミ コ ー ル 酸 成 分 を，TLC お よ びのような異属細菌間の共凝集は，口腔内バイオフィルム

MALDI-TOF-MS によって分析した．死菌および生菌細においても観察され，複数種が関与するバイオフィルム

胞から抽出した総脂質を，TLC を用いて比較した分析

内では，特異な膜タンパク質が属種間の共凝集の関係性

では，生菌または死菌の両試料中のミコール酸成分に変に影響することが報告されている(Kolenbrander et al.,化がなかった．さらに，ミコール酸の MALDI-TOF-MS

2010)．Streptomyces と MACB の両方が鞭毛をもたないを，死菌と生菌との間で比較したところ，死菌体におい非運動性細菌であるため，物理化学的特性(Bendingerても生菌と同一のミコール酸成分が観察された．マスス

et al., 1993)，線毛または特異的膜タンパク質(Antunes

ペクトル結果と TLC 分析から，定性・定量的にミコール酸は死菌調製の処理前後で分解しておらず，ホルムア

et al., 2015) などのいくつかの因子が S. lividans と MACBとの間の細胞接着を媒介すると予測される．ミコール酸

ルデヒド固定および γ 線照射処理によってミコール酸成層は疎水性であることから，様々な物質の表面への接着分の有意な変化は生じなかったことが明らかになった．

にミコール酸が関与することが推定されている(Zhang

これらの無傷の死滅細胞を使用することにより，S.

et al., 2010)． し か し， 脂 質 に 富 む 外 膜 が 保 存 さ れ た
MACB 死菌体は，混合培養において S. lividans の菌糸体

lividans による RED および ACT の誘導能を試験した．
その結果，ホルムアルデヒド固定または 60Co - γ 線照射に付着することが観察されなかったことから，ミコール

によって生成された死菌体は，両者ともに S. lividans に酸が有する物理化学的な性質だけでは Streptomyces 属細よる色素生成を誘導しなかった．誘導活性試験の結果は，菌の細胞表面への接着には不十分であることが明らかに固体培地および液体培地の両方において，死滅細胞ではなった．生物の有する接着分子としてアドヘシンタンパ

S. lividans の色素生産応答には不十分であることを示
し，MACB 生菌のみが有するミコール酸以外の他の何ク質が知られており，これは細菌間接着を促進する最もらかの因子が誘導に必要であることを強く示唆した．
MACB 死菌体は色素産生を誘導できなかったことか

et al., 2010)．Streptomyces 属放線菌においては接着タン
パク質は報告されていないが，今回の結果から未知のア

ら，S. lividans と生菌 MACB との相互作用をさらに調べ

ドヘシン様膜タンパク質が，S. lividans と MACB の接着るために，液体培養中の S. lividans と MACB の生菌まに関与している可能性も考えられる．

一般的な細胞成分であると言われている(Kolenbrander

たは死菌との相互作用を SEM を用いて観察した．複合

本研究において，ホルムアルデヒド固定および γ 線照

培養における S. lividans 菌糸体に対する MACB 生菌の射によって損傷のないミコール酸含有 MACB 死菌体を接着する様子を観察した．興味深いことに，2 種類の効率的に調製することに成功した．このようにして調製

MACB 細菌 T. pulmonis 及び R. erythropolis は，S. lividans

した MACB 死菌体は S. lividans の二次代謝を誘導できと共凝集を形成していた．S. lividans は，通常，液体培

ないことが明らかになった．この結果は予想外であり，養においてペレットを形成し増殖することから，培養中

MACB 死菌体が有するミコール酸を含む細胞表層構造に MACB は S. lividans 菌糸体の表面に付着した可能性だけが S. lividans の色素生産応答の直接的な誘導因子でが高い．Streptomyces 種と他の細菌との間のこれらの接はないことを示している．また，色素生産誘導時の複合

着相互作用は，単一種のバイオフィルムと比較して，混培養状態を SEM 観察すると S. lividans と MACB 生菌が合バイオフィルム構造を形成する場合に，フィムブリエ

共凝集していることが観察された．しかしながら，色素様構造の広範なネットワークを有することが Streptomyces

産生が誘導されなかった MACB 死菌体では共凝集形成

griseus および Bacillus amyloliquefaciens において示されている(Winn et al., 2014)．一方，死菌体との混合培養

る色素産生の活性化には未だ多くの可能性が考えられるは観察されなかった．MACB が誘導する S. lividans によ－ 83 －

浅水

俊平，尾﨑

太郎，尾仲

4) 浅水俊平，尾崎太郎，佐藤勝也，尾仲宏康．2015．複合培養における放線菌二次代謝の誘導要因の探索．2015年
度日本農芸化学会大会．3月26-29日，岡山．
5) 浅水俊平，尾崎太郎，寺本華奈江，佐藤勝也，尾仲宏
康．2015．複合培養における放線菌とミコール酸含有菌の生死で異なる相互作用．第30 回日本放線菌学会大会．9
月7-8日，富山．
6) Shumpei Asamizu, Taro Ozaki, Kanae Teramoto, Katsuya
Satoh, Hiroyasu Onaka. 2015. Adhesion of alive mycolic
acid-containing bacteria is an important factor to induce
secondar y metabolisms in Streptomyces. Pacifichem2015.
Dec 15-20, HI, USA.

が，S. lividans 菌糸体に対する MACB の物理的接触が S.
lividans の二次代謝生産を変化させる引き金となる可能性が示唆された．

要

約「 複 合 培 養 」 は ミ コ ー ル 酸 含 有 細 菌（ MACB ） とStreptomyces 属放線菌との共培養法であり，Streptomyces
属放線菌の二次代謝を変化させ，新規天然産物の発見に有用な方法である．これまでに MACB が有する誘導因子を同定するため，様々な実験を行ったが，Streptomyces
lividans による色素性二次代謝産物の生産は，ミコール
酸やその他の低分子化合物によっては誘導されなかった．MACB を共培養することによって培養条件は動的に変化するが，S. lividans による色素生産の活性化は，

原著論文
1) Asamizu S, Ozaki T, Teramoto K, Satoh K, Onaka H. 2015.
Killing of mycolic acid-containing bacteria aborted inductionof antibiotic production by Streptomyces in combined-culture. PLoS One 10: e0142372.

両菌のコロニーが直接接触する限られた領域でのみ観察謝された．このことから，S. lividans による色素生産には
MACB の直接的な接触が必須であり，MACB 細胞膜上の成分が S. lividans による応答において重要な役割を果

宏康

辞たすことを示唆した．本研究では S. lividans による応答

γ 線照射による死菌体作製実験は国立研究開発法人 量子科学技術研究開発機構 高崎量子応用研究所の佐藤勝が，損傷のない MACB 死菌体によって引き起こされる也博士との共同研究である．ミコール酸成分の質量分析

かどうかを調べた．ホルムアルデヒド固定または γ 線照は日本電子株式会社（当時）の寺本華奈江博士との共同射を用いて，Tsukamurella pulmonis，Rhodococcus eryth-研究である．

ropolis お よ び Rhodococcus opacus の 細 胞 形 状 お よ び ミ
コール酸が保持された死菌体を調製した．固体培養また成 24 年 10 月 ～ 29 年 9 月）により行われた．また本研は液体培養への添加実験を行ったが，S. lividans はイン

究の一部は科研費基盤研究 B（尾仲宏康 25292046 ），科

本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成金（平タクトな MACB 死菌体に対して応答しないことが確認

研費若手研究 B（浅水俊平 26850044 ）による研究助成された．走査型電子顕微鏡（ SEM ）により複合培養中により行われた．

の 両 菌 の 形 態 観 察 を 行 っ た と こ ろ，MACB 生 菌 の S.
lividans 菌糸体への接着が観察され，両菌による共凝集の 形 成 が 観 察 さ れ た． 対 照 的 に，MACB 死 菌 体 が S.
lividans 菌糸体に接着することは観察されなかった．したがって，S. lividans の二次代謝を活性化させる要因の一つとして，MACB 生菌の菌糸体への直接的な付着が必須である可能性が示唆された．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 浅水俊平，尾仲宏康．2014．異属細菌による放線菌二次代謝産物の誘導．日本農芸化学会関東支部例会．5月24日，東京．
2) 浅水俊平，尾崎太郎，尾仲宏康．2014．死細胞は放線菌の二次代謝を複合培養において誘導しない．2014年度日
本放線菌学会大会．6月19-20日，つくば．
3) Shumpei Asamizu, Taro Ozaki, Hiroyasu Onaka. 2015.
Secondary metabolites induction by mycolic acid-containing
bacteria in Streptomyces. Natural Product Discover y andDevelopment in the Post Genomic Era. Jan 11-14, CA, USA.

文

献

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－ 86 －

IFO Res.Commun. 32
87-94, 2018

ミコール酸含有細菌に対する放線菌二次代謝応答機構の網羅的転写解析
浅水

俊平，尾﨑

太郎，菅井

佳宣，尾仲

宏康

東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在機能探索寄付講座〒113-8657

東京都文京区弥生1-1-1

RNA sequencing analysis of contact-dependent secondary metabolism responses
by Streptomyces coelicolor
Shumpei Asamizu, Taro Ozaki, Yoshinori Sugai, Hiroyasu Onaka
Laboratory of Microbial Metabolic Potential,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
Yayoi 1-1-1, Bunkyo, Tokyo, 113-8657, Japan
Streptomyces species respond to mycolic acid-containing bacteria e.g. Tsukamurella pulmonis by production of
secondar y metabolites in a contact-dependent manner. Here we investigated the gene(s) responsible for theactivation of secondary metabolism such as red pigmented antibiotic undecylprodigiosin (RED), to explore themolecular basis of the response mechanism of Streptomyces species. Using Streptomyces coelicolor JCM4020 as a
response model actinomycetes, we examined the gene expression variation caused by T. pulmonis or Bacillus
subtilis by employing an RNA-sequencing technique. We found that 20.0 ％ of all whole genes from S. coelicolor
showed more than 2-fold expression variation, whether up or down, at a 7.5 h time point. A comparison of thenumber of differentially expressed genes in co-culture with B. subtilis indicated that T. pulmonis can affect thegene expression of S. coelicolor more strongly. At a 2-hour earlier time point, we identified the activation of genes
which are under the regulation of PhoP, a response regulator in the PhoR-PhoP two component system. These
contained pstSCAB, a phosphate transporter, and a SCO4877 homolog, possibly involved in teichulosonic acidbiosynthesis under phosphate starvation conditions. Interestingly, B. subtilis did not affect the PHO regulons. The
RNA-seq experiments may have revealed how S. coelicolor adapted to the environment under combined-culture
condition, however, alternative experimental approaches will be necessary to investigate how S. coelicolor responds
to the contact by T. pulmonis.
Key words: Streptomyces, mycolic acid-containing bacteria (MACB), transcriptomic analysis, PHO regulon,
Tsukamurella緒言り，医・農薬として使用される重要な生物活性を有する
二次代謝産物の生産者として知られている．また最近のStreptomyces 属に代表される放線菌は，土壌など様々な環境に生息し，菌糸状に生育するグラム陽性細菌であ

ゲノム解析から，Streptomyces 属放線菌には，一株につき 20－40 個もの「潜在的」二次代謝産物生合成遺伝子
クラスターが存在することが示唆されている(Nett etE-mail: 浅水俊平（ asamizu@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp ）尾﨑太郎（ ozaki@sci.hokudai.ac.jp ）菅井佳宣（ yoshinorisugai2158@gmail.com ）尾仲宏康（ aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp ）共同研究者:佐々木槇子（慶応大学理工学部生命情報学科）
吉田昭介（慶応大学理工学部生命情報学科，
現 京都大学白眉センター）
宮本憲二（慶応大学理工学部生命情報学科）

al., 2009)．この事実は，これまでに実験室環境下で発見されてきた天然物は，実はほんの一部であり，自然界
ではこれまでに知られていない多種多数の二次代謝産物が存在し，機能していることを強く示唆している．このような実験室環境下において発現が困難な放線菌二次代謝を活性化することを目的とし，これまでに世界中の多くの研究者が様々な方法を用いて挑戦している．
－ 87 －

浅水

俊平，尾﨑

太郎，菅井

佳宣，尾仲

宏康

モデル放線菌 Streptomyces coelicolor A3(2) による赤色

る．また VI 型分泌装置（ T6SS ）は，グラム陰性細菌に

色素ウンデシルプロディギオシン（ RED ）または青色保存されるトキシン分泌装置であり，異属細菌にトキシ

色素アクチノロージン（ ACT ）の生合成遺伝子クラス

ン蛋白質を注入し近隣に生育する異属細菌との競合のたターの活性化機構に関しては，無機リン酸を制限するこめに用いられることが明らかになっている．放線菌やミとにより活性化されることや(Martin, 2004)，ペプチド

コール酸含有細菌に CDI 機構や VI 型分泌装置，またはグリカン構成成分である N -アセチルグルコサミンを最類似する機構が存在することはこれまでに知られていない．

少培地に添加すると生産が活性化することが知られてい本研究では放線菌 S. coelicolor JCM 4020 株を用いて，る(Rigali et al., 2008)．その他，放線菌二次代謝のエリシ

純粋培養，T. pulmonis TP-B0596 株との複合培養，またター様低分子化合物として，PI 因子(Recio et al., 2004)，

は B. subtilis 168 株との共培養の 3 種類の条件における S.

goadsporin(Onaka et al., 2001)，hormaomycin(Andres

coelicolor の網羅的遺伝子発現量を RNA シーケンスにより解析し，S. coelicolor の転写変動遺伝子の機能から接et al., 1990) なども知られている．これらは環境中の栄養素に対する応答機構，自己溶菌や他の細菌の細胞構成

触応答に関与する分子機構を推定し，特に T. pulmonis

成分分解物に対する応答機構，そして細胞外に物質を排の接触刺激に対する S. coelicolor の特異的な転写応答機

出，拡散させてシグナルを伝達させる機構などの存在を構（接触依存的な応答機構）を明らかにすることを目指

示し，物質を介した多様な微生物間の相互作用の仕組みした．

を垣間見せている．

実験方法

一方で，直接的相互作用が微生物における二次代謝の活性化に関与する例はこれまでにほとんど知られていない．
Brakhage ら の グ ル ー プ は，Streptomyces rapamycinicus

網羅的転写解析に使用した菌株及び培地

が Aspergillus nidulans によるポリケチド抗生物質生合成の活性化の間に A. nidulans 菌糸に直接付着する SEM 画

S. coelicolor JCM 4020 株による赤色色素（ RED ）生産
を放線菌二次代謝活性化の指標として使用した．mycolic

像を示した (Schroeckh et al., 2009)．この A. nidulans ポ

acid-containing bacteria(MACB) として T. pulmonis TP-

リケチド抗生物質生合成遺伝子の発現活性化は，ゲノム

B0596 株を放線菌二次代謝産物生産の誘導株として用いのヒストン修飾に関わる主要なヒストンアセチルトラン

た．B. subtilis 168 株を S. coelicolor JCM 4020 株の共培養

スフェラーゼ複合体である Saga /Ada complex を介してに対する転写応答の比較解析のために用いた．YGGS 培

起こることが示された (Nutzmann et al., 2011)．この結

地 を 種 培 養 に 用 い た．S. coelicolor，T. pulmonis，B.

果は，ケミカルコミュニケーション(Straight & Kolter,2009) 以外にも，直接的な物理的相互作用が微生物間のsubtilis 生産培養には YGGS 培地を用いた．YGGS 培地は，0.3 ％酵母エキス，0.5 ％グルコース，2 ％グリセロール，

コミュニケーション手段として普遍的に存在しているこ

2 ％デンプンを含み，pH 7.2 に調整した．YGGS 寒天培とを暗示している．しかしながら，物理的刺激の実体や，地は 1.8 ％寒天を添加した．

どのようなシグナルとして受け取られ，そしてどのような伝達経路を介し最終的に二次代謝の活性化を引き起こ

網羅的転写解析のための複合培養

すかは未解明である．

前培養のため 100 ml の YGGS 培地が入った K-1 型フ

尾仲らは放線菌 Streptomyces lividans TK23 株とミコーラスコに植菌し，S. coelicolor を 3 日間，T. pulmonis（まル酸含有細菌 Tsukamurella pulmonis TP-B0596 株の異属

たは B. subtilis ）を 2 日間，200 rpm，30 ℃で回転振盪培

細菌間の相互作用が S. lividans による二次代謝産物の生養を行った．前培養液からの代謝産物の持ち込みを除く産に強く影響を与えることを見いだした(Onaka et al.,

ために，集菌し，培地による菌体の洗浄を行った．S.

2011)．そして興味深いことに S. lividans の色素生産活性化現象は，物質が関与する機構では説明ができず，物

coelicolor 及 び T. pulmonis（ ま た は B. subtilis ） を 50 mlのコニカルチューブに移し，等量の YGGS 培地を用い

理的な刺激を介した相互作用に起因することが示唆されて 3 度洗浄した．集菌操作は遠心分離（2,000 g，
10 分，
4 ℃）

ている．物理的な接触を介した微生物間の相互作用としにより行った．本培養は 100 ml 三角フラスコに 12 ml のて は， こ れ ま で に 大 腸 菌 の CDI（ contact-dependent

YGGS 培地を入れ，200 rpm，30 ℃で回転振盪培養を行っgrowth inhibition ）機構，同種粘液細菌間の外膜交換にた．複合培養には湿重量 0.6 g の S. coelicolor 菌体と湿重よる運動性の補完，グラム陰性細菌に保存される VI 型

量 0.02 g の T. pulmonis 菌体（または B. subtilis 菌体）を分泌装置（ T6SS ）などが知られている(Stubbendieck

植菌し，純粋培養には湿重量 0.6 g の S. coelicolor 菌体を& Straight, 2016)．大腸菌の CDI 機構は近縁種のみに有植菌した．

効なトキシン蛋白質を接触依存的に供与する機構であ－ 88 －

ミコール酸含有細菌に対する放線菌二次代謝応答機構の網羅的転写解析

トータル RNA の抽出

および純度を測定した．

1.5 ml チューブに 0.8 ml の RNAprotect ® Bacteria Reagent（キアゲン）を分注し，そこに 0.4 ml の培養液を添加し，PacBio による Streptomyces coelicolor JCM 4020 株ゲノム

10 秒間ボルテックスで攪拌し，RNA の分解を抑制した．

配列の決定

5 分間静置し，遠心分離（ 5,000 g，10 分，4 ℃）により菌体を回収した．菌体を TE 緩衝液に懸濁し，リゾチー

Streptomyces coelicolor JCM 4020 株 の ゲ ノ ム 配 列 を
PacBio RS II 一分子シーケンス（ BGI 受託シーケンス）

ム（ 終 濃 度 20 mg/ml ） と プ ロ テ イ ナ ー ゼ K（ 終 濃 度を行い，平均 20 kb 断片のシーケンスを取得した（それ

2 mg/ml ）を加え，10 分おきに攪拌しながら 30 分間室

ぞれ約 0.3 及び 0.9 Gb ）．得られたデータを Canu/Celera

温で静置した．トータル RNA の抽出は RNeasy Mini Kit

Genome Assembler を用いてアッセンブリ解析に供した（キアゲン）を用いた．1 ％の 2 -メルカプトエタノール

結果，一本のコンティグを得ることに成功した．得られを 含 む キ ッ ト 添 付 の RLT 溶 液（ Lysis buffer，0.7 ml ）た ゲ ノ ム DNA 塩 基 配 列 を RAST（ http://rast.nmpdr.

を菌体懸濁液に添加し，0.2 ml 容積のジルコニアビーズ

org/ ）を用いて推定遺伝子機能の自動アノテーション（直径 0.5 mm ）が入った 2 ml の O リングチューブに移を行った．

した．ビーズビーター（ 3,750 rpm，10 秒，6 回）を用

S. coelicolor JCM 4020 株はゲノムサイズ 8,620,775 bp，
GC 含 量 72.2 mol％，coding sequence（ CDS ） 数 7786

いて細胞を破砕し，以後キアゲンの製品プロトコールに従いトータル RNA の精製を行った．2 時間後，4 時間後，個であった．同定された S. coelicolor JCM4020 株遺伝子

7.5 時間後にサンプリングを行い，サンプリング後，直配列（及び翻訳産物のアミノ酸配列）は，すでに完全ゲ

ちにトータル RNA を抽出した．トータル RNA 濃度をノ ム が 報 告 さ れ て い る Streptomyces coelicolor A3(2)NanoDrop2000 により測定し，Agilent Bioanalyzer 2100

M145 株とほぼ一致していた（ゲノムサイズ 8,667,507 bp，（ RNA 6000 Nano キット）を用いてトータル RNA 精製

GC 含量 72.1 mol％，coding sequence（CDS ）数 7877 個）．

純度，及び分解度を測定した．各サンプルに対して n＝

そこで本論文では，便宜的に S. coelicolor A3(2)M145 株

4 でトータル RNA を抽出し，最もクオリティーが高かっに用いられている遺伝子番号（ SCO ナンバー）を遺伝たロットについて，n＝2 で以後の実験に用いた．

子名として表記した．

rRNA の除去，cDNA 合成

MiSeq による RNA シーケンスとシーケンスリード解析

DNase I によりトータル RNA サンプルを処理し，混構築した cDNA ライブラリーを MiSeq（イルミナ）

入したゲノム DNA を分解し，定法に従いトータル RNA

を用いてシーケンスを行った．MiSeq Reagent Kit v3（ペを精製した．リボソーム RNA（ rRNA ）は総 RNA の約

アエンド，75×2 サイクル）を用いた．得られた FASTQ

95 ％を占めるため，次世代シーケンスによって得られデータを CLC ゲノミクスワークベンチ（キアゲン）をるデータの多くを占めてしまうことから，rRNA の除去用いて，ショートリードのテンプレートゲノム配列へのを行った．トータル RNA サンプル（ 2 μg ）から Ribo-

マッピングを行い，それぞれの遺伝子転写量を RPKM

Zero rRNA removal Kit（イルミナ）により，23S，16S，

値（正規化されたリード数）への変換により算出した．

5S rRNA を除去した．Agencourt RNAclean® XP(Beckman

RPKM 値を基にサンプル間の遺伝子発現量の差を EDGE

Coulter) を用いて rRNA を除去した残りの RNA（ mRNA

法により算出した．有意な発現量の差として p 値が 0.01

及び tRNA 等）を精製した．Agilent Bioanalyzer 2100（ RNA

以下に設定し，p 値が 0.01 以下の遺伝子の fold change

6000 Nano キット）を用いて精製 RNA サンプルを測定し，値（発現比）の値を基に，以後の転写変動解析を行った．

rRNA が除去されていることを確認した．

結果及び考察cDNA 合成と次世代シーケンスライブラリー合成のた
めに NEBNext ® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit
for Illumina® を用いた．mRNA を約 200 bp 程度にフラグ複合培養における転写変動遺伝子数の経時的変化

メ ン ト 化 し，NEB 社 の 製 品 プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て，

転 写 量 が 増 加 し た 遺 伝 子 の 数 を 抽 出 し た（ 閾 値:

cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を 合 成 し た．Agencourt AMPure
XP(Beckman Coulter) を 用 い て cDNA を 精 製 し た．

p < 0.01，複合培養時の RPKM 値 > 20，複合培養時のリー
ド数 > 5 ）．その結果，T. pulmonis との複合培養においてNEBNext ® Multiplex Oligos for Illumina®(Index Primers

2 倍以上に転写活性化された（ EGDE テストを基にした

Set 1 and 2, NEB #E7335, #E7500) をインデックスプラ

発現比が 2 倍）遺伝子の数は，2 時間で 148 個，4 時間

イ マ ー と し て 用 い た．Agilent Bioanalyzer 2100（ Highで 432 個，8 時間で 719 個に及んだ（ Fig. 1A ）．次に転写量が減少した遺伝子の数を抽出した（閾値:p < 0.01，

Sensitivity DNA キット）を用いて cDNA の断片サイズ－ 89 －

浅水

俊平，尾﨑

太郎，菅井

佳宣，尾仲

Fig. 2

Fig. 1

Number of variation genes in combined-culture with T.
pulmonis.
(A) Number of genes up-regulated (fold change > 2) incombined-culture with T. pulmonis (in the front row) andB. subtilis (in the back row). (B) Number of genes
down-regulated (fold change > 2) in combined-culture
with T. pulmonis and B. subtilis. (C) Number of genes
up-regulated (fold change > 10) in combined-culture with
T. pulmonis and B. subtilis. (D) Number of genes
down-regulated (fold change > 10) in combined-culture
with T. pulmonis and B. subtilis.

宏康

Venn diagram for number of commonly variation genes.
(A) Venn diagram for number of genes commonly up-regulated (fold change > 2) in combined-culture with T.
pulmonis (as indicated in the circle) and B. subtilis (asalso indicated in the circle). (B) Venn diagram for
number of genes commonly down-regulated (fold change< 1/2) in combined-culture with T. pulmonis and B.
subtilis.

による応答機構に関与する特異的因子を見出すことを極めて困難にした．
枯草菌共培養との比較解析
一方 B. subtilis との共培養では，2 倍以上転写活性化
さ れ た 遺 伝 子 の 数（ 閾 値:p < 0.01， 複 合 培 養 時 の
RPKM 値 > 20，複合培養時のリード数 > 5 ）は，2 時間で350 個，4 時間で 213 個，8 時間で 146 個であった（Fig. 1A）．
ま た 1/2 以 下 の 転 写 抑 制 さ れ た 遺 伝 子 の 数（ 閾 値:
p < 0.01，純粋培養時の RPKM 値 > 20，純粋培養時のリー
ド数 > 5 ）は，2 時間で 229 個，4 時間で 123 個，8 時間
で 108 個であった（ Fig. 1B ）．意外なことに，B. subtilis

純 粋 培 養 時 の RPKM 値 > 20， 純 粋 培 養 時 の リ ー ド 数> 5 ）． そ の 結 果， 半 分 以 下 に 転 写 抑 制 さ れ た 遺 伝 子との共培養では，T. pulmonis との複合培養と異なり，活（ EGDE テストを基にした発現比が 1/2 倍）の数は，2や多くなるが，経時的に共に減少する傾向が観察された．

時間で 78 個，4 時間で 696 個，8 時間で 837 個に及んだ（ Fig. 1B ）．T. pulmonis との複合培養において活性化・

T. pulmonis または B. subtilis との共培養によっていず
れかの時点で，少なくとも一度 2 倍以上発現が活性化し抑制される遺伝子の数は，共に経時的に増加する傾向がている遺伝子（ T. pulmonis では 912 個，B. subtilis では観察された．S. colelicolor JCM 4020 の全推定遺伝子の数

474 個）について，共通して発現が活性化された遺伝子

は 7,786 個であることから，7.5 時間の時点で 9.2 ％の遺を抽出すると，その数は 58 個（ 6.4 ％）しか存在しなかっ伝子発現が活性化され，10.8 ％の遺伝子発現が抑制された（ Fig. 2A ）．また同様に，T. pulmonis または B. subtilis

たことになる．つまり，驚くべきことに本実験においてとの共培養によっていずれかの時点で，少なくとも一度

全遺伝子の 20 ％におよぶ発現が T. pulmonis との複合培

1 / 2 以下に発現が抑制されている遺伝子（ T. pulmonis

性化・抑制される遺伝子の数は，初期に変動遺伝子がや養によって有意に影響を受けたことが示された．この結では 1035 個，B. subtilis では 387 個）について，共通し果は一方で，T. pulmonis との接触依存的な S. coelicolorて発現が抑制されている遺伝子を抽出すると，その数は－ 90 －

ミコール酸含有細菌に対する放線菌二次代謝応答機構の網羅的転写解析

74 個（ 7.1 ％）のみであった（ Fig. 2B ）．これらの結果

純粋培養時の RPKM 値 > 20，純粋培養時のリード数 > 20

か ら，S. coelicolor JCM 4020 株 は T. pulminis TP-B0596という設定で行った．転写量が 1/2 以下に減少した遺伝株に対して，B. subtilis 168 株とは全く異なる応答，適子は合計 70 個存在し，その内訳は，推定転写制御因子（ 9個），酵素（ 27 個，内 EC ナンバーが付与された蛋白質

応機構を発現することが強く示唆された．

17 個），トランスポーター（ 9 個），推定膜蛋白質（ 5 個），
遺伝子発現比が 5 倍を超える遺伝子の数

機能未知推定蛋白質（ 15 個），その他（ 5 個）であった

特に強く影響を受けた遺伝子の数に注目すると，T.

（ Fig. 3B ）．活性化された遺伝子の数と比較し，転写制

pulmonis との複合培養において 10 倍以上転写活性化した遺伝子の数は 2 時間で 4 個，4 時間で 27 個，7.5 時間

御に関わると推定される蛋白質（ 9 個，12.9 ％）の割合

で 90 個見いだされた（ Fig. 1C ）．また 1/10 以下の転写の遺伝子や，酵素遺伝子の発現の転写の抑制も目立った．

がやや多く，トランスポーターなどの取り込み・排出系抑制された遺伝子の数は，2 時間で 5 個，4 時間で 42 個，
7.5 時間で 113 個見いだされた（ Fig. 1D ）．一方 B. subtilis

大幅に転写活性化された変動遺伝子の推定機能との共培養では 10 倍以上転写活性化した遺伝子の数は前述の枯草菌との共培養では，転写量の変動が 10 倍

2 時 間 で 0 個，4 時 間 で 2 個，7.5 時 間 で 2 個 で あ っ た以上に増加，または 1/10 以下に減少する遺伝子が極め（ Fig. 1C ）．また 1/10 以下の転写抑制された遺伝子の数て少なかったため，T. pulmonis との複合培養によっては，2 時間で 8 個，4 時間で 0 個，7.5 時間で 0 個であっ特に大きく変動した遺伝子に注目した．2 時間の時点で，た（ Fig. 1D ）．以上の結果は，S. coelicolor は，B. subtilis

転写量が 5 倍以上に増加した遺伝子は 6 個存在したよりも T. pulmonis に対して，より強く転写レベルでの（ Table 1 ）．その内 4 個は pstS（ SCO4142，7.7 倍）及びオペロンを構成する pstCBA（SCO4141-4139，
5.3～5.7 倍）応答機構が発現することを示している．

であった（ Table 1 ）．PstABCS は，環境中からの無機
転写活性化された変動遺伝子の機能的内訳

リン酸の取り込みに関わる ABC トランスポーターを構培養開始後，二時間の時点で転写が活性化されていた成する因子であると言われている(Martin et al., 2017)．

遺伝子について以下に記載する．変動値（ fold change ）の信頼性をできるだけ担保するために，閾値を p < 0.01，

pstSCBA 遺 伝 子 は 二 成 分 制 御 系（ Two component
system, TCS ）である PhoR-PhoP の応答制御因子 PhoP

複合培養時の RPKM 値 > 20，複合培養時のリード数 > 20のリン酸化により転写活性化される PHO レギュロンのという設定で解析を行った．環境応答に関わる ECF シ

下流に存在する遺伝子オペロンであることがわかっていグマ因子や，蛋白質のリン酸化を介した制御に関わる二成分制御系下流に存在するレギュロンなどの転写応答は2 時間以内に十分起こると考えられることから，共培養
後，2 時間の時点で大きく転写変動する遺伝子に注目した．転写量が 2 倍以上に増加した遺伝子は合計 122 個存在し，その内訳は，翻訳因子（ 5 個），推定転写制御因子（ 5 個），酵素（ 37 個，内 EC ナンバーが付与された
蛋白質 32 個），トランスポーター（ 23 個，内 TC ナンバーが付与された蛋白質 9 個），推定膜蛋白質（ 14 個），機
能未知推定蛋白質（ 32 個），その他（ 6 個）であった（ Fig. 3A ）．意外なことに，抽出された遺伝子の中に予想された ECF シグマ因子などはなく，また転写制御に関わると推定される蛋白質（ 5 個）も予想外に少なかった．一方で，トランスポーターなどの取り込み・排出系の遺伝子や，酵素遺伝子の発現の転写が活性化したことが観察された．

Fig. 3

転写抑制された変動遺伝子の機能的内訳
培養開始後二時間の時点で転写が抑制されていた遺伝子について選抜した．これも変動値（ fold change ）の信頼性をできるだけ担保するために，閾値を p < 0.01，－ 91 －

Pie chart of functional categor y for up- or down-regulated genes.
(A) Pie chart of functional categor y for up-regulated
genes (fold change > 2) in combined-culture with T.
pulmonis at 2 hr. (B) Pie chart of functional category for
down-regulated genes (fold change < 1/2) in combinedculture with T. pulmonis at 2 hr.

浅水Table 1

俊平，尾﨑

太郎，菅井

佳宣，尾仲

宏康

List of up- or down-regulated gens in the combined-culture with T. pulmonis.
The column SCO homolog indicate homologous gene for Streptomyces coelicolor A3(2) strain M145 and the identities.

る(Martin et al., 2017)．
PhoRP 系はリン酸飢餓に応答し，特に大きく転写抑制された変動遺伝子の推定機能

無機リン酸の細胞内での利用や取り込みなどに関与する転写量が 1/5 以下に減少した遺伝子は 8 個存在した因子を制御することがこれまでに言われてきている（ Table 1 ）．その内 3 個は MarR タイプの転写制御因子(Martin et al., 2017)．しかしながら，B. subtilis との共（ SCO4032，1/23.9 倍）とオペロンを構成する MSF タ

培養では PhoRP 制御下にある遺伝子の有意な活性化は確

イプのトランスポーター（ SCO4031，1/10.1 倍），機能認できず，T. pulmonis との複合培養により S. coelicolor

未知蛋白質（ SCO4030，1/6.7 倍）であった（ Table 1 ）．

のリン酸飢餓応答制御系の攪乱が起こる原因は不明であ

これらの遺伝子産物に機能についてこれまでに調べられることから，今後の更なる解析が必要である．一方，本た例はなく，発現抑制を受けた原因は不明である．興味実験では 2 時間の時点で TCS（ PhoRP ）制御下の有意深いことに，その他に MSF タイプトランスポーター二な遺伝子発現が十分に確認できたことから，転写制御応

種類（ SCO5957，1/10.7 倍，及び SCO2310，1/10.1 倍）

答の下流における発現変動が既に観察できていることがの転写が抑制されていた（Table 1 ）．MSF（メジャーファ

確認できた．

シリテータースーパーファミリー）トランスポーターは，それ以外に機能未知蛋白質（ SCO4877，6.3 倍）の転

一般的にプロトン勾配を駆動力として物質の運搬を担う

写活性化も観察され（ Table 1 ），これは機能未知糖転移輸送体である(Quistgaard et al., 2016)．しかしながら，酵素（ SCO4878 ）とオペロンを組む蛋白質であった．

転写が抑制された MSF タイプトランスポーターの特異推定機能ドメインとして LIC13510 family の中の surface

的機能は明らかになっておらず，現時点ではどのようなcarbohydrate biosynthesis protein が検出され，細胞膜中物質の排出または輸送機構に影響を及ぼすかなど多くはの糖鎖生合成に関与することが示唆された．逆向きにオ不明である．その他に，全くの機能未知蛋白質（ SCO5484，

ペロンを形成する SCO4879-4881 はタイクロン酸生合成

1/19.6 倍，及び SCO5485，1/7.2 倍）や，一次代謝酵素に関与することが示されている(Ostash et al., 2014)．こ

コハク酸デヒドロゲナーゼ（ SCO0923，1/5.3 倍）など

れらの遺伝子も PHO レギュロンであることが示されてが転写抑制されていた（ Table 1 ）．

いる(Martin et al., 2017)．リン酸飢餓では一般的に細胞結果のまとめと今後の展望

膜中の糖鎖を構成するリン酸を多く含むタイコ酸から，
タイクロン酸に変換されることが知られているが，応答機構との関連は不明である．

RNA-seq を利用した複合培養時の S. coelicolor の網羅

また他に，機能未知トランスポーター蛋白質（ SCO7536 ，的転写解析から，2 時間の時点で一次代謝酵素遺伝子を6.3 倍）の転写活性化も観察された（ Table 1 ）．機能ド含めて，大きく活性化，または抑制の制御を受けている

メインとして RND superfamily に分類される排出系トラことが示された．この事実から 2 時間の時点で既に T.

ンスポーターが推定されたが，これらの遺伝子産物に機能についてこれまでに実験的に調べられた例はなく，こpulmonis による未知シグナル対する応答反応を適合反応に変換し始めており，その結果を観察していることがれも活性化された原因は不明である．

考えられた．一方で，このことから，T. pulmonis に対－ 92 －

ミコール酸含有細菌に対する放線菌二次代謝応答機構の網羅的転写解析
2) 浅水俊平，佐々木槇子，尾崎太郎，菅井佳宣，宮本憲二，
尾仲宏康．2016．複合培養における Streptomyces coelicolor
A3(2) の経時的トランスクリプトーム解析．第31回日本放線菌学会大会．9月8-9日，東京．
3) 浅水俊平，菅井佳宣，尾仲宏康．2017．ミコール酸含有細菌に対する放線菌の網羅的転写応答解析．2017年度日
本農芸化学会大会．3月17-20日，京都．
4) S. Asamizu, Y. Sugai, H. Onaka. 2017. Trascriptomic
responses of Streptomyces coelicolor A3(2) in combined-culture
environment with Tsukamurella pulmonis TP-B0596. 18th
International Symposium on the Biology of Actinomycetes.
May 23-27, Jeju, Korea.

する応答機構では，シグナルはより速やかな反応を介して伝達されることも示唆された．例えば二成分制御系は蛋白質のリン酸化を介し，速やかに制御下の遺伝子（レギュロン）の遺伝子発現に正または負の影響をもたらすと考えられる．事実，PhoR-PhoP のレギュロンである
pst 遺伝子オペロンの活性化が 2 時間ですでに観察された．一方で，この事実から，RNA-seq を利用した複合培
養時の網羅的転写解析から S. coelicolor による適合反応
機構を経時的に解析することは可能であるが，未知シグ
ナルに対する応答反応機構を解析することは困難である
ことが強く示唆された．そこで後述する順（古典）遺伝学的手法を用いた解析と組み合わせることで，放線菌の応答反応機構に関わる制御系の解明を目指すこととした．

要

原著論文
Asamizu S, Sasaki M, Ozaki T, Sugai Y, Miyamoto K, Onaka
H. (Manuscript in preparation)

約

謝

本研究では特に S. coelicolor の転写変動遺伝子の機能

辞から応答に関与する分子機構（シグナルカスケード）をRNA シーケンス解析は慶応大学理工学部生命情報学

推定し，T. pulmonis に対する特異的な転写応答機構（接科宮本憲二教授，吉田昭介博士（現京都大学白眉センター

触依存的な応答機構）を明らかにすることを目指した．

特定准教授），佐々木槇子氏（ 2013.4 ～ 2016.3 修士学生）

Streptomyces coelicolor JCM 4020 を応答モデル放線菌とし て 用 い，RNA-seq 解 析 に よ り，T. pulmonis ま た はとの共同研究により行った．MiSEQ を用いた次世代シー

Bacillus subtilis によって引き起こされる遺伝子発現変動を調べた．S. coelicolor 全遺伝子の 20 ％が，7.5 時間の時変動解析では，東京大学大学院農学生命科学科の大西康

点で上方または下方にかかわらず，2 倍以上の発現変動の場をお借りし深く感謝いたします．

ケンスや，CLC ゲノミクスワークベンチを用いた転写
夫教授，手塚武揚助教に多大なご指導をいただいた．こを示したことを見出した．枯草菌 B. subtilis との共培養

本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成金（平における変動遺伝子の数を比較すると，T. pulmonis が B.

成 24 年 10 月 ～ 29 年 9 月）により行われた．また本研

subtilis よりも S. coelicolor の遺伝子発現にさらに強く影響を与えることが示された．2 時間前の時点で，PhoR-

究の一部は科研費基盤研究 B（尾仲宏康 25292046 ），科PhoP 二成分制御系のレスポンスレギュレーターである研究助成により行われた．

研費若手研究 B（浅水俊平 26850044, 16K18673 ）による

PhoP の制御下にある遺伝子の活性化を見出した．これ

文らは，リン酸飢餓条件下でリン酸トランスポーターを構成する pstSCAB や，恐らくタイクロン酸生合成に関与する SCO4877 を含んでいた．興味深いことに，枯草菌
は PHO レギュロンに影響を与えなかった．RNA-seq 実
験は，S. coelicolor が複合培養条件下での環境に適合する様子を明らかにした．しかしながら，S. coelicolor が T.
pulmonis の接触に対してどのように応答するかを調べるためには別の実験的アプローチの必要性が明らかになった．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 佐々木槇子，浅水俊平，尾崎太郎，宮本憲二，尾仲宏
康．2016．RNA-seq によるミコール酸含有細菌に対するStreptomyces coelicolor A3(2)の応答解析．2016 年度日本農芸化学会大会．3月27-30日，札幌．

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浅水

俊平，尾﨑

太郎，菅井

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IFO Res.Commun. 32
95-104, 2018

重イオンビーム変異導入法による Tsukamurella pulmonis への赤色色素非生産応答性 Streptomyces coelicolor 突然変異株の解析
浅水

俊平，菅井

佳宣，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在機能探索寄付講座〒113-8657

東京都文京区弥生1-1-1

Analysis of response deficient mutants of Streptomyces coelicolor generated
by heavy ion beam induced mutagenesis to contact-dependent stimuli
by Tsukamurella pulmonis
Shumpei Asamizu, Yoshinori Sugai, Taro Ozaki, Hiroyasu Onaka
Laboratory of Microbial Metabolic Potential,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
Yayoi 1-1-1, Bunkyo, Tokyo, 113-8657, Japan
Streptomyces species respond to MACB, for example Tsukamurella pulmonis, by production of secondar ymetabolism in a contact-dependent manner. Here we investigated the gene(s) responsible for the activation of
secondary metabolism induced by T. pulmonis, to explore the molecular basis of the response mechanism ofStreptomyces species. Using Streptomyces coelicolor JCM4020 as a model strain, we first employed heavy ion beaminduced mutagenesis to generate spore mutant library of S. coelicolor. Then we screened the RED productiondeficient mutants of S. coelicolor by mixing them with T. pulmonis on agar plates using red/white phenotype of thecolonies as indication. Through this process, we obtained 118 mutants from around 152,000 tested spores. We
further tested the phenotype of the 118 mutants by growth on minimum medium and formation of aerial mycelia,
and finally obtained 59 mutants which were deficient in RED production but were not deficient in growth anddevelopment. Until now, we have re-sequenced the genome of 16 mutants and identified 51 mutation points. We
confirmed some of the mutated genes by gene complementation and found that glutamate synthase ( gltB) andelongation factor G ( fusA) were responsible for the RED deficient phenotypes in respective mutants. We are now
investigating the involvement of the other 10 hypothetical proteins which may be responsible for the phenotype of
3 mutants found in this study. Also, further re-sequencing of the genome for the 35 remaining mutants will lead tothe identification of the additional mutation points responsible for the response of Streptomyces species.
Key words: Streptomyces, mycolic acid-containing bacteria, heavy ion beam, mutagenesis

緒

言な環境に生息し，菌糸状に生育するグラム陽性細菌であり，医・農薬として使用される重要な生物活性を有する

Streptomyces 属に代表される放線菌は，土壌など様々

二次代謝産物の生産者として知られている．最近のゲノム解析から，Streptomyces 属放線菌には，一株につき 20

E-mail: 浅水俊平（ asamizu@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp ）菅井佳宣（ yoshinorisugai2158@gmail.com ）尾﨑太郎（ ozaki@sci.hokudai.ac.jp ）尾仲宏康（ aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp ）共同研究者:佐藤勝也（国立研究開発法人量子科学技術研究開
発機構 高崎量子応用研究所），
大野 豊（国立研究開発法人量子科学技術研究開
発機構 高崎量子応用研究所）－40 個もの「潜在的」二次代謝産物生合成遺伝子クラスターが存在することが示唆され(Nett et al., 2009)，休眠遺伝子の革新的な覚醒方法が求められている．放線菌
Streptomyces lividans TK23 株 と ミ コ ー ル 酸 含 有 細 菌
Tsukamurella pulmonis TP-B0596 株の異属細菌間の相互作用により S. lividans に眠る二次代謝産物の生産を強く活性化することを見いだしていた(Onaka et al., 2011)．

－ 95 －

浅水

俊平，菅井

佳宣，尾﨑

そして興味深いことに S. lividans の二次代謝生産活性化

太郎，尾仲

宏康

量子科学技術研究開発機構 高崎量子応用研究所にある現象は，物質が関与する機構では説明ができず，物理的イオン照射研究施設（ TIARA ）の AVF サイクロトロンな刺激を介した相互作用に起因することが示唆されてイオン加速器を用いて，12 C 5+ をイオン核として重イオいる．

ン ビ ー ム を 照 射 し た（ エ ネ ル ギ ー:220 MeV，LET:

本研究では，放線菌がミコール酸含有細菌の物理的な相互作用に対して，どのようにシグナルを受け取り，そ121.5 keV/µm，フルエンス:1.25×108 ion/cm 2/sec ，線
量率:24.4 Gy/sec ）．

してどのような伝達経路を介し，最終的に二次代謝産物

本研究に使用したサンプルは二度に分けて調製した．

生合成の活性化を引き起こすかを明らかにするために，一度目の重イオンビームの照射は 2016 年 7 月 8 日に行

古典遺伝学の手法，つまり放線菌突然変異株ライブラ

い，S. coelicolor に対し線量:100 Gy，500 Gy，1,000 Gy

リーから二次代謝非応答性変異株をスクリーニングし，の 3 照射条件をそれぞれ n＝3 で行った．二度目は 2016

その変異遺伝子をゲノムリシーケンスにより同定するこ

年 10 月 12 日 に 行 い， 線 量:10 Gy，50 Gy，100 Gy，とを目指した．重イオンビームを用いた変異導入は，植200 Gy の 4 照射条件をそれぞれ n＝3 で行った．

物や微生物などの育種分野において利用される変異導入

重イオンビーム照射した胞子サンプルの回収は以下の法である(Hu et al., 2017)．導入される変異に関して，ように行った．20 ％グリセロール 500 µl をメンブレン上Arabidopsis thaliana（アブラナ科植物）などにおいてはゲノムレベルでの解析が行われ，DNA 領域の大規模なに滴下し，ピペットでメンブレン表面をこするようにして 胞 子 を 懸 濁 さ せ， 胞 子 懸 濁 液 を 1.5 ml の マ イ ク ロ

欠損などを引き起こすことなどが示されている(Hirano

チューブに移した．同じ操作を 4 回繰り返し，遠心分離

et al., 2015)．しかしながら，例えば炭素イオン(12C 5+）をイオン源とし，細菌に対して照射した場合，ゲノムレ（ 3,000 rpm, 5 min, 4 ℃）により上清を除去し，1 ml の胞

ベルでどのような変異が導入されるかについて知見はま存した．

子懸濁液とし，クライオチューブに移し，－80 ℃で保だない(Hu et al., 2017)．重イオンの照射では，DNA 二
本鎖切断が起こり，その修復過程で変異が誘発される．

生存率と気中菌糸形成率
重イオンビームを照射した各放線菌の変異株ライブラ

近年，放線菌においても DNA 二本鎖切断の際に，Ku 蛋
白 質（ Streptomyces coelicolor A3(2) 株 で は SCO5309 ）リーを適宜希釈して 100 µl ずつ TSB 寒天培地上に移し，を介した DNA 末端同士を連結させる非相同末端結合

コンラージ棒を用いて塗布した．30 ℃で 3 日間培養し，（ NHEJ ）機構が存在することが示唆されているが(Hoff

生じたコロニーをカウントし，重イオンビーム照射後回

et al., 2018)，放線菌変異株の効果的な取得法として重イオンビーム照射が有効であるかはわかっていない．本様の操作を行った重イオンビーム非照射（ 0 Gy ）株を収した胞子液 100 µl あたりの生存胞子数を算出した．同研究では，放線菌 S. coeliocolor JCM 4020 株を対象に突基準として，生存率をコロニーフォーミングユニット

然変異を誘発するために，重イオンビームを変異源とし（ CFU ）として算出した．

て用いた突然変異株ライブラリーを作製し，ミコール酸

重イオンビームを照射した S. coelicolor 胞子サンプル

含有細菌 T. pulmonis TP-B0596 株への赤色色素生産によを胞子数約 100 個 /100 µl となるように希釈し，きなこる応答性が欠損した変異株を選抜し，次世代シーケンス

寒天培地上に 100 µl 移し，コンラージ棒を用いて塗布しにより変異遺伝子を同定したので以下に述べる．

た．30 ℃で約 7 日培養することでコロニーの形成と気中菌糸の形成を確認し，全コロニー数と気中菌糸を形成し実験方法ているコロニー数をそれぞれカウントし，気中菌糸形成率を算出した．

重イオンビーム照射放線菌胞子の調製と照射試料の回収
S. coelicolor JCM 4020 をスクリーニング対象放線菌株として使用した．－80 ℃保存したグリセロールストッ

非応答性変異株の一次スクリーニング
一次スクリーニングでは 2 種類の方法で行った．一つクから胞子数が約 1×10 となるように 1.5 ml チューブ目の方法では，A3M-P 寒天培地上に T. pulmonis グリセに移し，20 ％グリセロールが入った 0.5×PBS 溶液を

ロールストックを滅菌水で希釈し，100 µl を滴下し，同900 µl 加えた．遠心分離（ 3,000 rpm, 3 min, 4 ℃）後，胞じプレートに重イオンビーム照射をした S. coelicolor 胞子

子 ペ レ ッ ト に 0.1×PBS を 1 ml 加 え， 懸 濁 し た 後，

ストックを胞子数が約 100 個となるよう塗布した．30 ℃

500 µl をシャーレ上の mixed cellulose ester メンブレン

で 4 ～ 7 日間培養し，ローン状に生育した T. pulmonis の8（ 0.2 µm ）に吸着させ，風乾した．シャーレをカプトン

中で赤色色素生産が確認できない S. coelicolor コロニー

膜で覆い，パラフィルムで密封した．国立研究開発法人

を釣菌した．釣菌した S. coelicolor 菌体は T. pulmonis と－ 96 －

重イオンビーム変異導入法によるTsukamurella pulmonis への赤色色素非生産応答性 Streptomyces coelicolor 突然変異株の解析

混 ざ っ て い る こ と か ら， 混 合 菌 体 を mixed cellulose

PacBio による Streptomyces coelicolor JCM 4020 株ゲノム

ester メンブレン（ 0.45 µm ）を用いて放線菌を分離した．

配列の決定

30 ℃で 3 ～ 7 日間培養した後にメンブレンを除去し，更に 2 ～ 7 日間 30 ℃で培養を継続した．メンブレンを通S. coelicolor JCM 4020 株のゲノム配列を PacBio RS II
一分子シーケンス（ BGI 受託シーケンス）を行い，平過し，形成した S. coelicolor コロニーを，新しい A3M-P

均 20 kb 断片の PacBio シーケンスを取得した（それぞ培地に植え継ぎ，30 ℃で 3 ～ 5 日間培養した後，培地にれ約 0.3 及び 0.9 Gb ）．得られたデータを Canu/Celera

20 ％グリセロールを 1.5 ml 加えて白金耳で菌体をかきGenome Assembler を用いてアッセンブリ解析に供した取り，クライオチューブに移して－80 ℃で保存した．

結果，一本のコンティグを得ることに成功した．得られ二 つ 目 の 方 法 で は， 重 イ オ ン ビ ー ム 照 射 を し た S.

た ゲ ノ ム DNA 塩 基 配 列 を RAST（ http://rast.nmpdr.

coelicolor 胞子ストックを胞子数が約 60 個となるように
A3M-P 培地に塗布し，30 ℃で 3 日培養した．また別のorg/ ）を用いて推定遺伝子機能の自動アノテーション

A3M-P 培 地 に T. pulmonis グ リ セ ロ ー ル ス ト ッ ク を
100 µl 塗布し，培養した．綿ビロード布を被せた円筒を T.

S. coelicolor JCM 4020 株はゲノムサイズ 8,620,775 bp，
GC 含 量 72.2 mol％，coding sequence（CDS ）数 7,786 個

pulmonis がローン状に生育したプレートに押しつけた
後，S. coelicolor のコロニーが形成しているプレートに列（及び翻訳産物のアミノ酸配列）は，すでに完全ゲを行った．

であった．同定された S. coelicolor JCM 4020 株遺伝子配スタンプ植菌した．30 ℃で 3 ～ 5 日間培養した後，ローノムが報告されている S. coelicolor A3(2)M145 株とほン状に生育した T. pulmonis の中で赤色色素生産が確認

ぼ一致していた（ゲノムサイズ 8,667,507 bp，GC 含量

できない S. coelicolor コロニーを釣菌した．その後は上

72.1 mol％，coding sequence（CDS ）数 7,877 個 ）． そ こ記と同様に，変異株をメンブレンにより分離し，－80 ℃

で本論文では，便宜的に S. coelicolor A3(2)M145 株に用で保存した．

いられている遺伝子番号（ SCO ナンバー）を遺伝子名として表記した．

A3M-P 寒天培地での対峙培養による非応答性再試験，
最少寒天培地での生育能，気中菌糸形成能，及び浸透圧

次世代シーケンスサンプルの調製

ショックによる RED 生産性確認

ゲノム DNA の調製は定法に従い行った．NEBNext ®

A3M-P 培地を用いた対峙培養により，一次スクリー

dsDNA Fragmentase® を用いて精製したゲノム DNA をニングにより得られた変異株形質の確認を行った．プ

約 300 bp 程 度 に 断 片 化 し た．Agencourt AMPure XP

レート培地中央に T. pulmonis グリセロールストック 2 µl

(Beckman Coulter) を用いて DNA 断片を精製し，Highを点植菌し，約 1 cm 離れた点とその上下に 1 cm 離れた

Sensitivity DNA キットを用いた Agilent Bioanalyzer 2100

点に変異株ストック 2 µl を点植菌した．親株の形質をポにて断片化した DNA サイズが適当であるかを確認した．

ジティブコントロールとして用い，30 ℃で培養を継続

適切に断片化した DNA について，NEBNext ® Ultra™ II

し，菌体間接触による変異株の RED 生産性の有無を確

DNA Library Prep Kit for Illumina® を用いて DNA ライブ

認した．非応答性再試験において RED の生産が確認さ

ラ リ ー を 作 製 し た．NEBNext ® Multiplex Oligos for

れなかった変異株を最少培地に植菌し，最少培地におけ

Illumina ®(Index Primers Set 1 and 2, NEB #E7335,

る生育能を確認した．変異株グリセロールストック 2 µl

#E7500) をインデックスプライマーとして用いた．最後

を最少培地に点植菌し，30 ℃で培養した．最少培地でにライブラリーの純度を High Sensitivity DNA キットをの生育が確認できた変異株について，Bennett＇s maltose

用いて Agilent Bioanalyzer 2100 にて確認した．

培地及びきなこ寒天培地を用いて気中菌糸形成能を確認した．変異株グリセロールストックを寒天培地上に点植

MiSeq による DNA シーケンスとシーケンスリード解析

菌し，30 ℃で培養した．コロニーの色が白くなる形質構築した DNA ライブラリーを MiSeq（イルミナ）をを基準として，気中菌糸形成能を確認した．気中菌糸の用いてシーケンスを行った．MiSeq Reagent Kit v3（ペ形成が確認できた変異株について，Bennett＇s maltose に

アエンド，75×2 サイクル）を用いた．得られた FASTQ

1 ％ NaCl を加えた寒天培地に変異株グリセロールス

データについて，CLC ゲノミクスワークベンチ解析ソ

トックを点植菌し，30 ℃で培養した．親株の形質（ RED

フト（キアゲン）を用いて，リードのマッピング，多型生産によりコロニーが赤くなる）を基準として，高浸透（ SNP と InDel ）の検出，変異遺伝子の抽出を行った．

圧下における変異株の RED 生産能を確認した．

－ 97 －

浅水

俊平，菅井

佳宣，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

いるが(McCormick & Flardh, 2012)，この場合も生育に結果及び考察影響する因子を原因とした二次代謝応答性の低下を排除するため，気中菌糸形成能を失った変異株は除くことと重イオンビーム照射による放線菌胞子の照射量依存的なした．また 59 変異株の内，5 株において高浸透圧下に生存率と気中菌糸形成率

おける RED 生産が野生株同様に観察された（ Fig. 1 ）．

変異株スクリーニング用の重イオンビーム照射サンプ

この 5 株については RED 生合成遺伝子に変異があることで生産応答性が欠損していないことが確認された．

ルは二回に分けて調製した．
一回目は S. coelicolor JCM 4020 に対して 12 C 5+ イオン
を 100 Gy，500 Gy，1,000 Gy の線量で照射した．その照重イオンビームにより導入された多型の数と種類

射サンプルでの生存率は非照射サンプルを 100 ％として，これまでに 59 変異株の中から 16 変異株について染色100 Gy:68.8±25.1 ％，500 Gy:7.4±0.68 ％，1,000 Gy:

体 DNA を調製し，次世代シーケンサ（MiSeq）によりシー

0.52±0.10 ％であった．また気中菌糸形成率は，0 Gy:

ケンスリードを取得した．得られた変異株のゲノム DNA

99.9±0.065 ％，100 Gy:93.6±1.2 ％，500 Gy:63.3±

配列と親株ゲノム DNA 配列とを比較解析し，16 変異株から 58 カ所の多型を同定した（ Table 1 ）．このうち 6

4.0 ％，1,000 Gy:40.4±16.2 ％であった．
二 回 目 は 10 Gy，50 Gy，100 Gy，200 Gy の 線 量 で 照

変 異 株（ 202001，202004，202007，205011，208014，

射した．その照射サンプルでの生存率は，10 Gy:55.0±

209008 ）では，ゲノム領域上の位置 4,038,304 に C の A

3.5 ％，50 Gy:36.1±8.6 ％，100 Gy:36±5.5 ％，200 Gy:への置換，4,066,523 に G の挿入が見いだされた（ Table

13.0±4.1 ％であった．また気中菌糸形成率は，0 Gy:

1 ）．また 2 変異株（ 209010，203013 ）では，ゲノム領

99.9±0.065 ％，10 Gy:99.3±0.35 ％，50 Gy:99.3±0.43 ％，

域上の位置 4,067,411 に C の挿入が見いだされた（ Table

100 Gy では 98.4±1.1 ％，200 Gy では 90.6±2.3 ％であっ1 ）．このことからこの 14 カ所変異は重イオンビームにた．照射量に依存した生存率及び気中菌糸形成能の低下

よって導入されたものではなく，胞子ストック調製中にが確認できた．照射時期によって照射率に対して生存率生じた自然変異に由来することが考えられた．そのことにばらつきが生じた原因は，加速された重イオンビーム

から 44 カ所が重イオンビームによって導入された多型

は透過性が低いため一端生体分子に衝突するとそこで止であることが示唆された．100 Gy の照射では 1 変異株当まることから，胞子が重なった内側の試料には効果的にり平均 2.0 個（7 変異株から 14 カ所），200 Gy の照射では，照射できなかったことが原因であると考えられた．

1 変異株当り平均 3.3 個（ 9 変異株から 30 カ所）の多型

非応答性変異株のスクリーニング
一回目と二回目の照射実験において照射線量 100 Gy
及び 200 Gy の重イオンビーム照射した胞子ライブラ
リーを用いて以後の実験を行った．約 15,2000 個の胞子から，118 株（ 0.078 ％）の非応答性変異株を取得した（ Fig. 1 ）．変異株取得率の低さ（ 0.078 ％）の要因としては，一般的に UV 変異などで用いる生存率（ 1－0.1 ％）と比較し，生存率が 13－69 ％程度のサンプルを用いたことが原因であると考えられる．ゲノムに誘発された突然変異の数が多数に及んだ場合，原因となる変異点を同定することが困難になるため，変異点の数を極力少なくするために高い生存率のサンプルを用いた．いずれにせよ，得られた 118 株のうち最少培地における生育能や，気中菌糸形成能が維持されている非応答性変異株が 59株存在した（ Fig. 1 ）．最少培地において生育できない
変異株は主要な一次代謝系が欠損していることが考えられた．増殖能の低下に起因する二次代謝応答性の低下を原因とした変異を排除するために，最少培地で生育できなかった変異株は除くこととした．また放線菌の形態分化（気中菌糸形成）に関与する遺伝子はよく研究されて－ 98 －

Fig. 1

Screening process to obtain RED deficient mutants.

重イオンビーム変異導入法によるTsukamurella pulmonis への赤色色素非生産応答性 Streptomyces coelicolor 突然変異株の解析
Table 1

List of RED deficient mutants and their mutation points.

(*) and (**) indicate the respective mutants that contain mutation in sarA gene. (a), (b), and (c) indicate the identical mutation
points found in the respective mutants. Abbreviations used in this table : ins : insertion, del : deletion, FS : flameshift, M :missense mutation, F : flameshift mutation, N : nonsense mutation, S : silent mutation, D : deletion mutation, I : insertion mutation. The column SCO gene homolog indicate homologous gene for Streptomyces coelicolor A3(2) strain M145.

－ 99 －

浅水

俊平，菅井

佳宣，尾﨑

が存在し，照射量に依存し多型の数が増加する傾向が確

太郎，尾仲

宏康

認された．多型の種類は，塩基置換が最も多く 30 カ所，

sarA 遺伝子の不活化によって，T. pulmonis への二次代謝応答機能が欠損したことが示唆された．しかし，SarA

挿入変異が 6 カ所，欠損変異は 8 カ所であった（Table 1）．

蛋白質が RED 及び ACT 生産に対してどのような機能を予想に反して，誘発された変異の種類は，塩基置換が多果たしているかは全く解析されていない．そもそも数を占めた（ 68.2 ％）．放線菌における NHEJ の効率が低いために，主に起こるとされる 2 本鎖切断を受けたゲ

sarA 遺伝子の欠損によって RED 及び ACT の生産が消失することから，本遺伝子がミコール酸含有細菌に対す

ノム DNA 鎖がうまく修復されず，致死となってしまっる応答機構に関与する因子であるかは不明であるが，た可能性も考えられた(Su et al., 2016)．一方物理的なDNA 鎖の切断による変異導入であることから，予想通sarA 遺伝子の欠損によって T. pulmonis による生産誘導に対しても RED 生産応答ができなくなることから，接り，変異カ所の分布はゲノム全体に及び，特異なホット

触応答機構は SarA が介在する制御系と綿密に関連するスポットを生じていないことが明らかになった（ Table

ことが示唆された．

1 ）．一般的に用いられる変異導入法，例えば汎用され残りの 27 カ所の内，RED 生合成遺伝子群に属する

る物理的な UV 照射ではシトシン塩基のデアミノ化により誘発される複製エラーを引き起こし，または化学的なred 遺 伝 子（ redH と redP ）(Williamson et al., 2006) に変異点が存在する変異株が 2 株（ 106003，201001 ）存

ニトロソグアニジン（ NTG ）などではグアニンのメチ在し，生合成酵素の欠損による RED 生産欠損株であるル化により誘発される複製エラーを引き起こし，主にことが明らかになった（ Table 1 ）．sarA 遺伝子及び red

GC が AT に置換される変異を誘発するため，塩基配列遺伝子に変異のない変異株は 6 株になり，その中の 14に依存する傾向などがある(Lucchesi et al., 1986 ; Miller,

個の変異遺伝子がミコール酸含有細菌に対する放線菌二1985)．またトランスポゾン変異導入法では，トランス

次代謝応答に関与する可能性が考えられた．

ポゾンの挿入頻度や挿入箇所の偏りなどの問題点がある(Xu et al., 2017)．放線菌胞子に対する重イオンビーム

遺伝子相補による形質の回復照射による多型は，多様かつ広くゲノム中に存在したこ

変異点解析を行った 16 変異株の内，3 株は良好に気とから，従来の方法と比較し，重イオンビーム照射によ中菌糸を形成し（ Fig. 3A, middle ），Bennet＇s maltose にる変異導入法は極めて有効であることを示した（Fig. 2 ）．

1 ％ NaCl を添加した培地において親株同様に RED を生産した（ Fig. 3A, bottom ）．変異株 108013 はグルタミン

変異遺伝子の同定

酸合成酵素（ GltB，SCO2026 ホモログ），変異株 203010

同定された多型をもとに蛋白質をコードすると推定さはリボソーム伸長因子 G（ EF-G ）（ FasA，SCO4661 ホ

れる配列（ CDS ）に起こる変異点を同定した．16 変異

モ ロ グ ）， 変 異 株 107004 は リ ボ ソ ー ム 蛋 白 質（ Rpl4，

株の sarA 変異を除くと CDS にはイオンビームにより導SCO4703 ホモログ）などに変異点が存在した．これら入された 44 カ所の変異点（内サイレント変異が 17 カ所）のうち，変異株 108013 と，変異株 203010 について遺伝が存在した．ミスセンス変異（ 13 カ所），ナンセンス変子相補実験を行った．変異株 108013 では，gltB 遺伝子

異（ 2 カ所），フレームシフト変異（ 9 カ所），アミノ酸の 597 番目の C が欠損し，GltB 酵素のフレームシフト

挿入変異（ 1 カ所），アミノ酸欠損変異（ 2 カ所）など

変異を誘発していた（ Table 1 ）．グルタミン酸合成酵素が存在した（ Table 1 ）．上述の sarA 遺伝子ホモログの 8遺伝子（ gltB ）の周辺領域を含めてクローニングしたプ

カ所は一塩基挿入によるフレームシフト変異であった

ラスミド（ pTYM19-gltB ）を作製し，変異株 108013 ゲ（ Table 1 ）．S. coelicolor A3(2) に お い て sarA 遺 伝 子

ノムに導入，gltB 遺伝子の相補実験を行った．得られた（ SCO4069，膜蛋白質とアノテーションされる機能未知

gltB 相補株（ 108013_pTYM19-gltB ）は，ベクターのみの コ ン ト ロ ー ル 株（ 108013_pTYM19 ） と 比 較 し，T.

蛋白質）を欠損させると，純粋培養において RED 及び
ACT の生産が起こらなくなることがすでに報告されてい る(Ou et al., 2008)． こ の こ と か ら，16 株 中 8 株 はFig. 2

pulmonis に対する RED 生産応答機構が回復していることが確認された（ Fig. 3B, bottom ）．変異株 203010 では，Distribution of mutation points in the genome induced by heavy ion beam mutagenesis in Streptomyces coelicolor JCM 4020.
Black circle indicate the nucleotide mutation points.

－ 100 －

重イオンビーム変異導入法によるTsukamurella pulmonis への赤色色素非生産応答性 Streptomyces coelicolor 突然変異株の解析

Fig. 3

Phenotypes of the RED deficient mutants ; 203010 and 108013.
(A) Phenotype of two mutants 203010 and 108013 obtained from the screening. Both mutants showed RED production deficientphenotype against T. pulmonis interaction (upper image). They showed aerial mycelium formation (middle image) and produced
RED under osmotic stress (bottom image). (B) Gene complementation experiment of the mutants 203010 and 108013. The wildtype phenotype, production of RED, was restored by fusA or gltB genes in the respective mutants.

－ 101 －

浅水

俊平，菅井

佳宣，尾﨑

太郎，尾仲

宏康

fasA 遺伝子の 147 番目の C が欠損し，fasA 蛋白質のフレームシフト変異を誘発していた（ Table 1 ）．リボソー

連性のある蛋白質であることが示唆された．今後の遺伝

ム伸長因子 G 遺伝子（ fasA ）の周辺領域を含めてクロー

原因を明らかにしていきたい．

子機能の詳細な解析により，二次代謝生産がなくなった

ニングしたプラスミド（ pTYM19-fasA ）を作製し，変異株 203010 ゲノムに導入，fasA 遺伝子の相補実験を

二次代謝応答機構に関与し得るその他の機能未知蛋白質行った．得られた fasA 相補株（203010_pTYM19-fasA）は，得られた 16 株変異株のうち，RED 生合成遺伝子に変ベクターのみのコントロール株（ 203010_pTYM19 ）と異が存在した 2 株，sarA 遺伝子に変異が存在した 8 株，

比較し，T. pulmonis に対する RED 生産応答機構が回復

上述した gltB 変異株，fasA 変異株，sco4877 変異株を除していることが確認された（ Fig. 3B, upper ）．

くと，残りは 3 株であった．変異株 107004 にはリボソー

GltB は広く生物種に保存されるグルタミン酸合成酵

ム 50S を構成する rpl4 遺伝子のみに変異が存在したこ素であり，グルタミンと 2 -オキソグルタル酸からグルとから，fasA 同様に細胞内の翻訳過程が滞ったために，

タミン二分子を合成する．グルタミンはプロリンやセリ

RED 生産応答に至らない形質を生じたと考えられた．

ンの前駆体となり，RED 生合成における直接的な前駆

ま た 変 異 株 204003 に は 4 つ の 変 異 蛋 白 質 が 存 在 し た

体基質となる．このことから変異株 108013 の形質は，（ Table 1 ）．SCO6192 は Winged helix DNA-binding

RED 生合成による基質供給が滞ったために，生産でき

domain を有する蛋白質であり，DNA 結合ドメインを有なくなり生じたと考えられた．また EF-G は広く生物種することから転写制御などに関与する可能性がある．

に保存されるリボソーム翻訳における重要な伸長因子でSCO0281 と SCO0308 は既知ドメインとの相同性がない

ある．S. coelicolor はオルソログである fasB 遺伝子を有機能未知蛋白質であった．SCO2503 は Glycosyl hydro-

することから，その機能補完により，生存が可能であっlase family 18 のキチナーゼドメインを有する蛋白質であたことが考えられた．また変異株 203010 の形質は，本り，おそらく無関係な変異であると考えられた．

来の EF-G の欠損により細胞内の翻訳過程が滞ったため

また変異株 204030 にも 4 つの変異蛋白質が存在したに，RED 生産応答に至らない形質を生じたと考えられ（ Table 1 ）．SCO1647 は proteasome accessor y factor

た．以上の変異株 108013 や変異株 203010 に見い出され

PafA2 ドメインを有し，蛋白質の分解に関与すると考えた遺伝学的形質は，T. pulmonis に対する応答制御因子

られた．SCO4177 は既知ドメインとの相同性がない機が関与する機構が欠損することにより生じた形質ではな

能未知蛋白質であった．SCO5064 は SNF2 family DNAく，翻訳機能や基質供給の低下によって現れた非特異的or RNA helicase ドメインを有するヘリカーゼ様の蛋白な形質であることが考えられた．

質であった．SCO5397 は N terminus of SMC(structural
maintenance of chromosomes)superfamily proteins ドメ

網羅的転写解析において活性化された遺伝子と共通したインを有し，DNA 複製などに関与する蛋白質であるこ変異遺伝子，SCO4877とが考えられた．

変異株 209020 において，機能未知蛋白質（ SCO4877 ）

まとめ及び今後の展望をコードする遺伝子の 1038 番目の C が欠損し，SCO4877
蛋白質のフレームシフト変異を誘発していた（Table 1 ）．
この遺伝子は RNA-seq 解析により，T. pulmonis との複本研究は，放線菌胞子に対して重イオン（12 C 5+）を変合培養によって 2 時間で 6.3 倍，4 時間で 7.9 倍，7.5 時

異原として使用し，その影響をゲノムレベルで解析した間で 166.4 倍の転写活性化が観察された．これは機能未初めての例であった．本研究において明らかにした重イ知糖転移酵素（ SCO4878 ）とオペロンを組む蛋白質でオンにより導入された多型は，多様でゲノム全体に分布あった．推定機能ドメインとして LIC13510 family の中していた．このことから，今後の重イオンを変異源としの surface carbohydrate biosynthesis protein が検出され，た細菌の順遺伝学的研究，または放線菌育種において，

細胞膜中の糖鎖生合成に関与することが示唆された．逆非常に有効であることが考えられた．また二次代謝非応

向きにオペロンを形成する SCO4879-4881 はタイクロン

答性変異株を取得するために今回構築したスクリーニン

酸生合成に関与することが示されている(Ostash et al.,グ法では，確かに非応答性の多様な変異株を複数取得す2014)．これらの遺伝子も PHO レギュロンであることがることに成功した．しかしながら，本スクリーニングに示されている(Martin et al., 2017)．複合培養により活性おいて得られた変異株中に同定された変異遺伝子には，化された遺伝子の欠損により S. coelicolor の二次代謝応予想したシグナル伝達に関与するようなレギュレーター

答がなくなったことから，S. coelicolor による RED 生産

系の蛋白質が見いだされなかったため，現在のところ，につながる応答機構または適合機構に対して何らかの関目的とした応答機構に関わる制御因子の同定には至って－ 102 －

重イオンビーム変異導入法によるTsukamurella pulmonis への赤色色素非生産応答性 Streptomyces coelicolor 突然変異株の解析ない．そこで引き続き得られている変異株の遺伝的形質

本助成で得られた研究成果の報告を詳細に解析する．またスクリーニングの過程において気中菌糸を形成しない変異株を除いてしまったが，放線菌の形態分化と二次代謝の制御系は深くクロスリンクしていることが知られており，今後は気中菌糸形成能を欠損した変異株についても解析を広げる必要があると考えられた．また，変異株 209020 に存在した SCO4877 は，
網羅的転写解析において活性化されたことから，接触応答機構に深い関連性が示唆された．本遺伝子の今後の詳細な解析により，異属細菌間相互作用に起因する新しい二次代謝生産制御機構の発見につながる可能性がある．
本研究は，これまでに全くわかっていない接触に依存した異属細菌間相互作用における遺伝子を解明できることが期待でき，これは新しい微生物の関わり合いの仕組
みの解明につながる．また，異属細菌間相互作用に起因した放線菌二次代謝産物生産の活性化機構の解明により，放線菌に広く存在する休眠二次代謝の新たな活性化法に関する分子基盤を確立することを目指したい．

要

約

本研究では Streptomyces 属細菌の T. pulmonis に対する接触に依存した応答機構の分子基盤を明らかにするた

口頭発表1) 栁澤昌臣，浅水俊平，菅井佳宣，佐藤勝也，尾仲宏康．
2016．重イオンビーム遺伝子変異導入法を用いた複合培養による放線菌の二次代謝活性化に関与する遺伝子の探索．第31回日本放線菌学会大会．9月8-9日，東京．（ポスター賞）
2) 栁澤昌臣，浅水俊平，菅井佳宣，佐藤勝也，尾仲宏康．
2017．複合培養における放線菌の二次代謝活性化に関与する遺伝子のイオンビームを用いた順遺伝学的解析．
2017年度日本農芸化学会大会．3月17-20日，京都．
3) 栁澤昌臣，浅水俊平，佐藤勝也，大野豊，尾仲宏康．
2017．重イオンビーム照射変異株を用いた異属細菌刺激による放線菌二次代謝活性化機構の解析．QST高崎サイ
エンスフェスタ2017．12月12-13日，高崎．
4) 浅水俊平，尾仲宏康．2018．異属細菌間の相互作用がもたらす放線菌特殊代謝．2018年度日本農芸化学会大会．3
月15-18日，名古屋．
原著論文1) Asamizu S, Yanagisawa M, Satoh K, Sugai Y, Ohno Y, Onaka
H (Manuscript in preparation)
その他
1) M. Yanagisawa, S. Asamizu, Y. Sugai, K. Satoh, Y. Ohno, H.
Onaka. 2018. Screeninig of mutants generated by heavy ion
beam for identification of genes involved in bacterial interaction. QST Takasaki Annual Report 2016, 97.

めに，T. pulmonis の接触により誘導される二次代謝の活性化に関与する遺伝子を調査した．S. coelicolor JCM

謝4020 をモデル株として使用し，重イオンビーム突然変
異誘発法を用いて S. coelicolor の胞子変異体ライブラ

辞リーを作製した．次に，寒天培地上で T. pulmonis と S.

本研究において主要な実験（非応答性放線菌変異株ス

coelicolor を混合培養し，S. coelicolor コロニーの赤/白表
現型を指標としてウンデシルプロディジオシン（ RED ）クリーニング及び多型・変異点解析）は東京大学大学院

生産欠損突然変異体をスクリーニングした．このスク月まで修士学生）により行われた．重イオンビーム照射

リーニングにより，試験した約 152,000 個の胞子から実験は国立研究開発法人 量子科学技術研究開発機構 量

118 株の突然変異体を得た．118 個の突然変異体の表現

子ビーム科学研究部門 高崎量子応用研究所の佐藤勝也

型について，最少培地上での増殖能，および気菌糸形成

博士，同 大野豊博士との共同研究により行った．MiSeq

能を試験し，その結果 RED 生産能が失われているが，を用いた次世代シーケンスや，CLC ゲノミクスワーク

生育や形態分化能が維持されている 59 株の突然変異体

ベンチを用いた多型解析では，東京大学大学院農学生命を得た．現在まで，16 株の突然変異体のゲノムをリシー

科学科の大西康夫教授，手塚武揚助教に多大なご指導をケンスし，58 個の変異点を同定した．遺伝子相補実験いただいた．この場をお借りし深く感謝いたします．

農学生命科学科の栁澤昌臣氏（ 2016 年 4 月～ 2018 年 3によって変異遺伝子の一部を確認し，グルタミン酸合成

本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成金（平酵素（ gltB ）または，翻訳伸長因子 G（ fusA ）が RED

成 24 年 10 月～ 29 年 9 月）により行われた．また本研生産の欠損表現型の原因であることを見出した．今後，究の一部は科研費基盤研究 B（尾仲宏康 25292046 ），科

16 株のリシーケンスから見出された 3 株の突然変異体

研費若手研究 B（浅水俊平 26850044, 16K18673 ）によるの表現型に関与し得る他の 9 個の機能未知蛋白質の関与

研究助成により行われた．

を調べ，また，残りの 35 株の突然変異体についてのゲ
ノムリシーケンスを行い，Streptomyces 種放線菌によるミコール酸含有細菌への接触依存的な応答の原因となる変異点の同定を行いたい．
－ 103 －

浅水

文

俊平，菅井

佳宣，尾﨑

献

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太郎，尾仲

宏康

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－ 104 －

IFO Res.Commun. 32
105-115, 2018

複合培養を用いた新規アルカロイドの同定と生合成に関する研究尾﨑太郎1)，浅水俊平，尾仲宏康

東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在機能探索寄付講座〒113-8657

東京都文京区弥生1-1-1

Studies on the biosynthesis of novel alkaloids derived from the combined-culture ofStreptomyces nigrescens HEK616 and Tsukamurella pulmonis
Taro Ozaki 1), Shumpei Asamizu, Hiroyasu Onaka
Laboratory of Microbial Metabolic Potential,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
1-1-1 Yayoi, Bunkyo, Tokyo 113-8657, Japan
Co-culture of Streptomyces and mycolic acid-containing bacteria (MACB), which we termed combined-culture,
dramatically changes the metabolic profile of Streptomyces and provides a promising strategy for the discovery ofnovel natural products that are not produced in conventional culture conditions. In this study, we applied the
combined-culture method to screen antifungal natural products that specifically interact with the cell membrane offission yeast. As a result, a series of novel metabolites with 5-alkyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoline (5aTHQ) skeletonswere identified. In the same culture broth, streptoaminals, which possess unique [5,5]-spirohemiaminal skeletons,
were also discovered. Although the cyclization mode and oxidation state of 5aTHQs and streptoaminals weredifferent, both compounds share the same carbon skeleton, implying the biosynthetic relationship of thesemetabolites. To obtain insights into the biosynthesis of 5aTHQs and streptoaminals, draft genome sequencing of
the HEK616 strain was performed and a candidate gene cluster, comprising a unique type II PKS system, wasreadily identified. The function of this gene cluster was confirmed by heterologous expression and subsequentgene deletion analysis.
Key words: Combined-culture, tetrahydroquinolines, spiro-hemiaminals, type II PKS緒

言et al., 2015 ; Hoshino et al., 2017 ; Hoshino et al., 2018 ;Hoshino et al., 2018 ; Onaka et al., 2011 ）．

ミコール酸を細胞表層に有する細菌（ Mycolic acid-

本研究では，複合培養を利用して真核生物の膜脂質に

containing bacteria, MACB ）を放線菌と同一のフラスコ作用する化合物のスクリーニングを行った．膜脂質は細で培養すると，放線菌の代謝プロファイルが変化するこ

胞膜の主要な構成因子であり，膜蛋白質との相互作用をとが知られている．著者らはこの培養法を複合培養と命介して，シグナル伝達や細胞の極性の決定などの生体プ

名し，生物活性物質の探索に利用してきた（ Onaka et

ロセスに関与する．しかし，それらのプロセスにおけるal., 2011 ）．これまでに，インドロカルバゾールやブチ
ロラクトン，ポリエンマクロラクタムなど様々な化合物

膜脂質の機能の解析は進んでいない．これは，膜脂質がが複合培養によって発見されてきた（ Derewacz et al.,に起因する．わずかではあるが膜脂質と相互作用する低2015 ; Hoshino et al., 2015 ; Hoshino et al., 2015 ; Hoshino

分子化合物が膜脂質の局在やそれが関与する生体プロセ

現北海道大学理学研究院
E-mail: 尾﨑太郎:ozaki@sci.hokudai.ac.jp
尾仲宏康:aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
共同研究者:杉山龍介，西村慎一，掛谷秀昭(京都大学大学院薬学研究科)
1)

構造多様性に富んでおり，適切な解析ツールがないこと

スの解析に使われている（Nishimura et al., 2010 ; Sugiyama
et al., 2014 ; Hannich et al., 2011 ）．この種の化合物は，抗真菌剤や抗生物質のリードとしても期待される．
酵母のエルゴステロール生合成欠損株が，膜脂質を標的とした抗真菌剤に耐性を示すことが知られている．このこ－ 105 －

尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

宏康

とを利用して分裂酵母野生型株と変異株に対して異なる活

し，90 ％メタノールと n - ヘキサンを用いて分画した．

性を示す化合物をスクリーニングし，放線菌 Streptomyces

90 ％メタノール層を回収し，ODS カラムクロマトグラ

nigrescens HEK616 の複合培養時特異的に生産される新規テトラヒドロキノリンアルカロイドを発見した．また，同フィー（移動相:水・メタノール），シリカゲルクロマ

じ培養液からは同一の生合成起源を有すると予想されるス

用いて分画した．また，n - ヘキサン層をシリカゲルク

ピロヘミアミナール骨格を持つ化合物群も見出した．更に

ロマトグラフィー（移動相:n - ヘキサン・酢酸エチル，

これらの骨格情報に基づいて，HEK616 株のドラフトゲノ

およびクロロホルム・メタノール）に供し，分画した．

ムシーケンスからその生合成遺伝子群を見出した．

ストレプトアミナール（ Streptoaminal ）を含有する画トグラフィー（移動相:クロロホルム・メタノール）を分を NH-シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相:実験方法

n - ヘキサン・酢酸エチル）に供し，ストレプトアミナー
ルの側鎖の異なる混合物を合わせて 86.5 mg 得た．この5aTHQs の単離と構造決定

う ち，41.6 mg を 逆 相 HPLC（ カ ラ ム:COSMOSIL

分裂酵母のエルゴステロール生合成欠損株（ erg2Δ お

5C8-MS, 溶媒:67 ％メタノール・33 ％水・0.1 ％ TFA ）よび erg31Δerg32Δ ）を用いて，酵母の膜脂質に作用すを用いて精製し，2.4 mg のストレプトアミナール- 9n,る低分子化合物のスクリーニングを行った（ Nishimura

3.0 mg のストレプトアミナール- 9i，2.1 mg のストレプ

et al., 2010 ）．YE5S（ 0.5 ％ Yeast extract, 3 ％ D- glucose,
225 µg/m l of 5S(adenine, histidine, leucine, uracil,

トアミナール- 8n をそれぞれ TFA 塩として得た．

lysine ）培地で培養を行った対数増殖中期の培養液を標識化合物を用いた生合成経路の解析

OD595 が 0.033 と な る よ う に 希 釈 し， 培 養 抽 出 物 のS. nigrescens HEK616 と T. pulmonis を V-22 培 地 に 接種し，30 ℃で 2 日間培養を行った．この培養液を種培養

DMSO 溶液を終濃度 1 ％ (v/v) となるように添加した．
その後，30 ℃で 24 時間培養を行い，
OD595 をプレートリーとし，100 ml の A-3M 培地に対してそれぞれ 3 ml，およダー（ EnVision-2103, PerkinElmer ）を用いて測定した．

び 1 ml 接種した．この培養液を 30 ℃で培養し，培養開スクリーニングサンプルは石川県舳倉島から採集した土始 72 時間後まで 24 時間ごとに [1-13C] 酢酸ナトリウム，

壌より分離した放線菌約 1000 株を T. pulmonis と複合培あるいは [1, 2 -13C2] 酢酸ナトリウムを 50 mg ずつ計 200 mg

養した培養液のブタノール抽出物を用いた．その結果，S.

添加した．5 日間の培養終了後，5aTHQ 類を精製し，nigrescens HEK616 の培養抽出物に活性が見出された．

13

S. nigrescens HEK616 株 と T. pulmonis TP-B0596 の 複合培養液 800 ml から菌体を回収し，クロロホルム:メ
タノール（ 1:1 ）を用いて 菌体成分を抽出した．抽出

C NMR に供し，酢酸の取り込みパターンを観測した．

生合成遺伝子の探索

液を濃縮後，90 ％メタノールと n - ヘキサンを用いて分S. nigrescens HEK616 株のドラフトゲノム解析を行った．
イルミナ社の Genome Analyzer GAIIx を用いて解析した．

画した．n - ヘキサン層を回収し，シリカゲルクロマト得られたリードは，Edena および Velvet を用いてアッセ

グラフィーで分画した（ n - ヘキサン:酢酸エチル）．目

ンブルした．なお，以上のライブラリー作製，配列解析，的化合物を含む画分を ODS カラムクロマトグラフィー
でさらに精製した（メタノール:水）．5aTHQ を含む画

de novo アッセンブリーはタカラバイオ社に委託した．
得 ら れ た デ ー タ を も と に デ ー タ ベ ー ス を 構 築 し，分を逆相 HPLC（一次精製カラム:COSMOSIL 5C8-MS，

BLAST を用いて標的遺伝子を探索した．BLAST は，機溶媒:84 ％メタノール； 二次精製カラム:COSMOSIL

能解析済みのポリケチド合成酵素の KS ドメイン，およCholester，溶媒:89 ％メタノール）で分画し，精製化

び窒素原子の導入に関与すると推測したアミノ基転移酵合物を得た．各化合物の構造は 1 次元および 2 次元の素のアミノ酸配列をクエリとして行った．

NMR，質量分析を行って決定した．また，5aTHQ-10a

同定した遺伝子クラスターを PCR 反応により増幅しの絶対配置は化合物と合成標品をそれぞれ大類－赤坂エた後，大腸菌－放線菌シャトルベクター pTYM19gt にステルへと導いて，それぞれの 1H NMR スペクトルをクローニングした（ Hayashi et al., 2014）．構築したプラ

比較することで決定した．

スミド pTYM19gt-stm を大腸菌 Escherichia coli S17-1 株に導入した後，放線菌 Streptomyces lividans TK23 に接合

ストレプトアミナールの単離と構造決定

伝 達 を 利 用 し て 導 入 し た． 得 ら れ た 形 質 転 換 体を T.

S. nigrescens HEK616 株 と T. pulmonis TP-B0596 の 複合培養液 1 L から菌糸を回収し , クロロホルム:メタノー

pulmonis と同時に A-3M 培地に接種し，30 ℃で 10 日間培養を行った．培養終了後，代謝産物をクロロホルム:ル（ 1:1 ）を用いて菌体成分を抽出した．抽出液を濃縮

メタノール（ 1:1 ）で抽出し，LC-MS 分析に供した．

－ 106 －

複合培養を用いた新規アルカロイドの同定と生合成に関する研究

遺伝子破壊

ラフィーにより分画し，8 種の関連化合物を見出した．

λRED 相同組換え法を用いて，pTYM19gt-stm ベクター
上 で 各 stm 生 合 成 遺 伝 子 へ 欠 失 変 異 を 導 入 し た．

NMR および質量分析を用いて構造決定を行った結果，

pTYM19gt-stm ベクターと，PCR により増幅したアプ有しており，5 位に鎖長・分岐様式の異なるアルキル基

ラマイシン耐性遺伝子 aac(3)IV をエレクトロポレーを有していることが明らかになった．各化合物は側鎖のいずれの化合物も 1,2,3,4-tetrahydroquinoline の骨格をション法により大腸菌 E. coli BW25141 株へ導入し，相鎖長と分岐様式に従って命名した（ 5aTHQ）(Fig. 1)．側

同組換えにより stmB, stmD, stmF, stmG, stmH 遺伝子領

鎖の 7’ 位にメチル基を有する 5aTHQ-10a については，域を耐性遺伝子カセットで置換した．各形質転換体から天然物および合成標品を大類－赤坂エステルへと導い

定法に従いプラスミドを抽出した後，XbaI で消化するて，それぞれの 1H NMR を比較することで絶対配置をことで耐性遺伝子カセットを切り出し，セルフライゲー（ 7’S ）であると決定した．これは大類－赤坂法をキラションすることで欠失変異を導入した．各プラスミドを

ルアミンの立体化学の決定に応用した初めての例である．

上述の方法と同様に S. lividans TK23 へ導入し，形質転換体の代謝産物を分析した．遺伝子破壊による極性効果

ストレプトアミナールの単離と構造決定がないことを確認するため，各破壊遺伝子の相補株を作製し，代謝産物の分析を行った．

側鎖構造の異なる 8 種の類縁体が得られる 5aTHQ 類
が質量分析において，分子量の差が 14 ごとに検出されるイオンピークのクラスタが検出されることに着目し，結果および考察同様のイオンピークのクラスタを探索することで新規の化合物群を容易に取得できると期待し，研究を行った．

5aTHQ の単離と構造決定

5aTHQ が単離された S. nigrescens HEK616 と T. pulmonis

分裂酵母野生型株およびエルゴステロール生合成欠損

TP-B0596 の複合培養液を精査したところ，分子量差 14株に対する生育阻害活性を比較し，前者に選択的に活性の新たなイオンピーククラスタ（ m/z 270, 284, 298, 312,を示す化合物をスクリーニングした．分裂酵母のエルゴス

326 ）が見出された．これらの化合物をカラムクロマト

テロール生合成欠損株（以下欠損株）は，アムホテリシン

グラフィーにより精製し，3 種の化合物を得ることがで

B やシリンゴマイシン E のように脂質を標的とする抗生物質

きた．NMR と質量分析による構造解析を行った結果，に対して耐性を示すことが知られており（ Hampsey, et al.

いずれも [5,5]-スピロヘミアミナール構造を有する新規1997 ; Iwaki et al., 2008 ; Nishimura et al., 2010 ; Sugiyama

化合物であることが明らかになった（ Fig. 2 ）．9 位のア

et al., 2014 ），同様に分裂酵母野生型株に特異的に活性を示す化合物は分裂酵母の生体膜に作用する化合物であるルキル基の鎖長と分岐様式が異なる構造であったため，ことが期待される．放線菌純粋培養液および複合培養液か-8n と命名した．また，合成標品との比較から絶対配置

ら目的 の 活 性を探 索したところ， 放 線 菌 S. nigrescens

を(5R, 7S, 9S) と決定した．

5aTHQ と同様にそれぞれストレプトアミナール -9n, -9i,

HEK616 と T. pulmonis TP-B0596 の複合培養抽出物に活

5aTHQ とストレプトアミナールの構造を比較したと性を見出すことができた．活性画分をカラムクロマトグ

ころ，環化様式と酸化度は異なるものの同一の炭素骨格から構成されていることが推定された．このことから，
これらの化合物の生合成経路には関連があることが示唆

Fig. 1

Structures of 5aTHQs. The numbers indicate the lengthof alkyl chains. i : iso- ; n : normal- ; a : anteiso-.

－ 107 －

Fig. 2

Structures of streptoaminals.

尾﨑

太郎，浅水

Fig. 3

13

俊平，尾仲

宏康

C labeling pattern of 5aTHQs.

される．次節以降ではその生合成解析を行った．
標識化合物を用いた生合成経路の解析
5aTHQ の生合成解析にあたり，その化学構造からポリケチド合成酵素によって生合成されると予想した．そこでポリケチド化合物の基質となる酢酸の取り込み実験を行った．S. nigrescens HEK616 と T. pulmonis TP-B0596の複合培養に [1-13C] 酢酸ナトリウムおよび [1, 2-13C2] 酢

酸ナトリウムを添加し，5aTHQ の標識パターンを試験した．標識化合物の 13C NMR 解析の結果，5aTHQ のテトラヒドロキノリン骨格のすべての炭素に 13C の取り込みが確認された．この際，酢酸の 1 位の炭素は THQ の 2，
4，5，7，8a 位に，2 位の炭素は 3, 6, 8, 4a 位に選択的に取り込まれることが分かった（ Fig. 3 ）．また，側鎖アルキル基にも酢酸が連続的に取り込まれることが明らか

Fig. 4

Proposed biosynthetic pathway of 5aTHQs predicted byfeeding experiments.

Fig. 5The stm gene cluster of Streptomyces nigrescens HEK616.

になった．これらの結果から，5aTHQ 類の生合成には，
予想通り，酢酸単位の連続的な縮合反応を触媒するポリケチド合成酵素が関与することが示唆された．
C 標識酢酸の取り込みパターンから，5aTHQ の生合

13成経路を以下のように推測した（ Fig. 4 ）．5aTHQ には側鎖の鎖長や分岐の様式が異なる複数の類縁体が存在することから，5aTHQ 類を生合成するポリケチド合成酵
素は酢酸単位以外にもイソ酪酸やプロピオン酸に由来す
る様々な開始基質を利用することができると推測される．炭素鎖はアセチル CoA を単一基質として取り込んで伸長した後，チオエステルの還元的な開裂によってア

による塩基配列の解読，および Edena を用いた de novo

ルデヒドとして放出される．生じたアルデヒドがアミノ基転アセンブリによって総塩基長約 9.3 Mb のドラフトシーケンス移酵素の作用によってアミノ基へと変換された後，環化反データを得ることができた．標識実 験の結果をもとに，応が進行することで 5aTHQ の骨格が合成されると考えら

BLAST のアルゴリズムを用いてポリケチド生合成遺伝子をれる．この環化反応が自発的に進行するか酵素の作用に探索したところ，15 遺伝子からなる遺伝子クラスターを同よるものかは，この段階で結論することはできなかった．

定することができた（ Fig. 5）．後述する異種発現によって生合成遺伝子の同定・遺伝子破壊

stmA-I がストレプトアミナールの生合成遺伝子であることが確かめられたため，本遺伝子クラスターを stm 遺伝子群

S. nigrescens HEK616 染色体 DNA の次世代シーケンサと命 名した．本遺伝 子クラスターは，ACP(acyl carrier－ 108 －

複合培養を用いた新規アルカロイドの同定と生合成に関する研究

protein, StmA)，KS(ketosynthase, StmB-E)，amino-

出された．stmA の上流に存在する 6 つの ORF（ orf1- 6 ）transferase-reductase(StmF)，KR(ketoreductase, StmG

は他の Streptomyces の遺伝子クラスターには保存されて& StmH)，type II TE(thioesterase, StmI) を コ ー ド す る

いたが，グラム陰性菌由来の遺伝子クラスターには存在遺伝子を含んでいた（ Table 1 ）．相同性を示す遺伝子クしなかった．この orf1- 6 オペロンは P450 や転写制御因

ラスターは，グラム陽性およびグラム陰性のバクテリア子などから構成されていた（ Table 1 ）．

にも存在し，Streptomyces albulus，Pseudomonas putida，

4 つの KS は既知 KS の分子進化系統樹において II 型

Photobacterium gaetbulicola，Vibrio gazogenes などにも見

PKS の KS, お よ び CLF(chain length factor) と 近 い ク

Table 1

Deduced function of ORFs in stm gene cluster.

－ 109 －

尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

宏康

レードに分類されることが分かった（ Fig. 6 ）．StmB とラニンで置換されており，CLF として機能すると考え

StmD は，KS における活性残基として知られるシステられた．これらの遺伝子の並び方を考慮すると，StmB

イン残基が保存されていることから，分子進化系統樹かと StmC，StmD と StmE がそれぞれ一対の KS-CLF としら示唆されたように，KS として機能すると考えられる．

て機能すると推測される．これらの KS/CLF は芳香族

一方で StmC と StmE ではシステイン残基がセリンやアポリケチドを合成する既存の II 型 PKS とは異なるク

Fig. 6Phylogenetic tree for StmB, StmC, StmD, StmE, and selected PKSs and FASs. StmB and StmD belong to a phylogenetic clade
different to the KSs of type II PKSs and FASs. StmC and StmE belong to a phylogenetic clade different to the CLFs of typical type
II PKSs. Black dots indicate the position of StmB, StmC, StmD, and StmE. The phylogenetic tree was generated using the Geneious tree builder exploiting the neighbor-joining method. Distances were obtained from the global alignment of all sequence pairs
using BLOSUM62. StmB, StmC, StmD, StmE resemble KSs and CLFs of type II PKS system but are classified into the new clades.

－ 110 －

複合培養を用いた新規アルカロイドの同定と生合成に関する研究

レードに分岐することから，新たなファミリーの II 型

両化合物が同一のポリケチド合成酵素によって生合成されることが確かめられた．KR と考えられる stmG およ

PKS であることが示唆される．
興味深いことに，StmF の N 末端領域はアミノ基転移

び stmH を欠失させたプラスミドを S. lividans TK23 に酵素と，C 末端領域はグルタミル tRNA 還元酵素と相同導入したところ，同様に 5aTHQ の生産が失われた．興

性を示し，本タンパク質が二機能性酵素であることが示

味深いことに，stmH 欠損株ではストレプトアミナール

唆された．各ドメインの相同タンパク質の機能から考えると，StmF は C 末端領域においてチオエステル結合の還元的開裂を触媒してポリケチド鎖をアルデヒドとして切り出し，続いて N 末端領域においてアミノ基転移反応を行い，炭素鎖の末端に 1 級アミンを生成すると考えられる．
StmG と StmH はどちらも 3 -オキソアシル ACP 還元酵
素と相同性を示した．その為，これらはそれぞれポリケ
チド鎖の伸長過程でケト基の還元を触媒する KR であると考えられる．また，StmI は type II TE と相同性を示す
ことから，炭素鎖伸長過程で生じる誤ったアシル鎖をACP から切り出す校正酵素であると考えられる（Kotowska,
M. & Pawlik, 2014 ）．
stm 遺伝子クラスターの異種発現
前述の各遺伝子の機能予測の結果から，stmA-I がスト
レプトアミナールと 5aTHQ の基本骨格の生合成に関与すると考えられた．そこでこれらの遺伝子をクローニン
グし，S. lividans TK23 を宿主として異種発現を行った．
異種発現の際には，stmA-I をゴードスポリン前駆体遺伝
子 godA プロモーターの下流にクローニングした．
形質転換体の代謝産物を LC-MS で分析した結果，ス
トレプトアミナール -9n，-9i を生産していることが標品との比較によって明らかになった（ Fig. 7A ）．その他の類縁体についても生産が確認された．しかしながら，形質転換体の純粋培養液からは 5aTHQ の生産は確認されなかった．そこで，godA プロモーターが複合培養時に活性化されることから，形質転換体を T. pulmonis との複合培養に供した．同時に T. pulmonis による放線菌の代謝応答の可能性も考慮し，S. lividans TK23 に対してHEK616 と同様の応答を示すことも期待した．複合培養
液を LC-MS に供したところ，5aTHQ-9i, -9n, -10a が生産されたことが標品との比較から明らかになった（ Fig. 7B ）．本結果から，5aTHQ とストレプトアミナー

Fig. 7ルが同一の PKS によって生合成されることが明らかになった．
THQ とストレプトアミナールの生合成についてさらに知見を得るために，遺伝子破壊実験を行った．2 種のKS 遺伝子 stmB と stmD，アミノ基転移酵素・還元酵素
stmF を欠失させたプラスミドを作製し S. lividans TK23に導入したところ，いずれの形質転換体でも THQ とス
トレプトアミナールの生産が失われた．このことから，－ 111 －

Heterologous expression of stmA-I in Streptomyces
lividans TK23. A. The transformant produced streptoaminal-9i and -9n both in the presence and in the absenceof Tsukamurella pulmonis. Chromatograms are extracted
at m/z 298 that is corresponding to streptoaminals-9i and-9n. B. The transformant produced 5aTHQs only in thepresence of T. pulmonis. Chromatograms are extracted
at m/z 260 and m/z 274 that are cor responding to
5aTHQ-9n and -9i, and 5aTHQ-10a. Asterisks indicate
unidentified metabolite specifically produced by thetransformants.

尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

宏康

の生産も失われたが，一方で stmG 欠損株では生産量がる（ Du et al., 2018 ）．生合成後半の環化反応ではケト基減少するものの，ストレプトアミナールが生産されていが必要となるため，2 段階目の伸長の際のケト還元はス

た（ Fig. 8 ）．

キップされると考えられる．また，3 段階目の伸長の際は，ケト基の還元によって生じた水酸基はさらに脱水とストレプトアミナールと 5aTHQ の推定生合成経路

エノイル還元を受けると考えられる．stm 遺伝子クラス

バイオインフォマティクスによる機能推定，異種発現，

ターにはこれらの反応を担う酵素遺伝子が存在しないたおよび遺伝子破壊実験の結果から，ストレプトアミナー

め，代わりに脂肪酸合成系の酵素がこの反応を触媒する

ル と 5aTHQ の 生 合 成 経 路 を 以 下 の よ う に 推 測 し たと 推 測 さ れ る． ポ リ ケ チ ド 鎖 の 伸 長 が 終 了 す る と，（ Fig. 9 ）．両者の基本骨格は II 型 PKS による鎖伸長，還StmF の C 末端ドメインによる還元的切り出しによって

元的切り出しとアミノ化によって生合成される．生合成

アルデヒドが生成した後，N 末端ドメインによってアミされるポリケチド鎖の酸化度の違いによって，異なる環ノ基へと変換される．生じたアミノ基が分子内のケト基化様式のストレプトアミナールと 5aTHQ が生成するとへと求核攻撃することで，環状イミンが生成する．この考えられる．

環状イミンが速やかにストレプトアミナールへと互変異

鎖長と分子様式の異なる様々な類縁体が存在すること性化することが合成標品を用いて確かめられているから，生合成は脂肪酸合成経路由来の β -ヒドロキシア（ Sugiyama et al., 2016 ）．5aTHQ は上記の過程で生成すシル - ACP とマロニル - ACP の縮合によって開始される．

る中間体 1 あるいは 2 が酸化されることで生成する中間

KS-CLF である StmB/C あるいは StmD/E のどちらかが体 3 を経由して生合成されると考えられる．興味深いここの反応を担うと考えられる．続く鎖伸長段階では，β -とに，2 種存在する KS/CLF がどちらも生合成に必要でケトアシル ACP は StmG と StmH によって，β -ヒドロキ

あることから，これらはポリケチドの伸長過程において

シアシル ACP へと変換される．非酵素的な環化反応にそれぞれ異なる鎖長の中間体を認識して伸長反応を触媒

よって ACP から切り出された副生物が生産されないこすると考えられる．

とから，ケト基の還元は伸長のサイクルごとに行われると考えられる．同様の事例はイシガミドの生合成においstmG 欠損株においては 5aTHQ の生産が失われる一方
で，ストレプトアミナールの生産が完全には失われないてポリエンを合成する特異な II 型 PKS でも知られていことが分かっている．このことを考慮すると，上記の 1

Fig. 8Gene deletion analysis. stmB, stmD, stmF, stmG, and stmH were deleted using λREDrecombination. A. All the transformants, except ΔstmG strain, abolished productionof streptoaminals. Chromatograms are extracted at m/z 298. B. All the transformants abolished production of 5aTHQs. Chromatograms are extracted at m/z 260.

－ 112 －

複合培養を用いた新規アルカロイドの同定と生合成に関する研究

Fig. 9Proposed biosynthetic pathway for streptoaminals and 5aTHQs. StmB and StmC, and StmD and StmE likely form distinct KS-CLF
pairs. Either of them (indicated as KS&CLF1) might be responsible for the first two steps of chain extension, and the other(KS&CLF2) for the last step. Two KRs, StmG and StmH, would catalyze ketoreduction at different step of chain elongation. Afterthe chain elongation, reductive cleavage and transamination are catalyzed by StmF. Subsequent cyclization and tautomerization
yielded streptoaminals. For the biosynthesis of 5aTHQs, oxidation of one hydroxy group would be necessary, which might becatalyzed by StmG or other unidentified oxidase.

－ 113 －

尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

ヒドロキノリン類の生合成遺伝子の同定と解析．第10回
生合成勉強会（「生合成マシナリー」第6回若手シンポジウム）．8月，東京．
5) R yosuke Sugiyama, Shinichi Nishimura, Taro Ozaki,
Hiroyasu Onaka & Hideaki Kakeya. 2015. 5-Alkyl-1,2,3,4tetrahydroquinolines, membrane-interacting lipophilic
metabolites, found in combined-culture of Streptomyces sp.
HEK616 and Tsukamurella pulmonis. Natural ProductDiscover y and Development in the Post Genomic Era.
January, San Diego, U.S.A.
6) 杉山龍介，西村慎一，尾﨑太郎，浅水俊平，尾仲宏康，
掛谷秀昭．2016．脂質結合性天然物の活用―放線菌複合培養液より見出した新規アルカロイド群に関する研究．
日本薬学会第136年会．3月，横浜．
7) 下村杜人，尾﨑太郎，杉山龍介，西村慎一，浅水俊平，
掛谷秀昭，尾仲宏康．2016．複合培養特異的に生産されるテトラヒトロキノリン生合成遺伝子の解析．日本農芸化学会2016年度大会．3月，札幌．
8) 西村慎一，杉山龍介，仲谷崇宏，尾﨑太郎，浅水俊平，
尾仲宏康，掛谷秀昭．2016．微生物の複合培養で得られる5aTHQとstreptoaminalの構造と構造．第21回天然薬物の開発と応用シンポジウム．10月，千葉．
9) 下村杜人，尾﨑太郎，杉山龍介，西村慎一，浅水俊平，
掛谷秀昭，尾仲宏康．2017．複合培養によって生産されるテトラヒドロキノリン化合物の解析．第32回日本放線菌学会．9月，長野．

あるいは 2 の脱水素反応を StmG が担う可能性が考えられる．異なる可能性として，T. pulmonis との複合培養において特異的に活性化される未知の酸化酵素がこの反応に関与することも考えられる．後者の場合，生産菌である S. nigrescens HEK616 と異種発現の宿主である S.
lividans TK23 の両者で 5aTHQ が複合培養特異的に生産されることから，両者に共通した酸化酵素の存在が示唆される．現在，純粋培養時及び複合培養時の比較転写解析を進めており，複合培養時の遺伝子発現変化について知見が得られつつある．今後の解析によって，複合培養による放線菌の代謝変化の分子機構が明らかになると期
待される．

要

約

複合培養は，放線菌に数多く潜在する二次代謝経路を活性化する有用な手法の一つである．本研究では，複合培養を出芽酵母の生体膜に作用する化合物のスクリーニ
ングに応用し，新規アルカロイドである 5aTHQ の同定に成功した．同時に 5aTHQ と共通する炭素骨格を有し，酸化度・環化様式が異なるストレプトアミナールも見出すことができた．生産菌のゲノム解析と異種発現によって生合成遺伝子を同定し，両化合物群がどちらも新規の
II 型 PKS によって生合成されることを明らかにした．
複合培養によって放線菌の二次代謝経路が活性化されるメカニズムは明らかにされていないが，今回複合培養時
特異的に生産される 5aTHQ の生合成遺伝子および生産菌のゲノム配列が明らかになったことで，複合培養時の転写プロファイルの変化を解析することが可能になった．今後，複合培養による二次代謝活性化機構が分子レベルで明らかになることで，未利用の放線菌遺伝子資源

原著論文
1) Sugiyama, R., Nishimura, S., Ozaki, T., Asamizu, S., Onaka,
H., Kakeya, H. 2015 5-Alkyl-1,2,3,4-tetrahydroquinolines,
new membrane-interacting lipophilic metabolites producedby combined culture of Streptomyces nigrescens andTsukamurella pulmonis. Org. Lett. 17: 1918-1921
2) Sugiyama, R., Nishimura, S., Ozaki, T., Asamizu, S., Onaka,
H., Kakeya, H. 2016 Discovery and total synthesis of streptoaminals: Antimicrobial [5,5]-spirohemiaminals from the
combined-culture of Streptomyces nigrescens and Tsukamurella
pulmonis. Angew. Chem.Int. Ed. 55: 10278-10282をより効率的に利用できるようになると期待される．

謝

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 杉山龍介，西村慎一，尾﨑太郎，尾仲宏康，掛谷秀昭．
2014．テトラヒドロキノリン骨格を有する新規放線菌代謝物の構造多様性と生物活性．日本薬学会134年会．3
月，熊本．
2) 尾﨑太郎，森夕希子，杉山龍介，西村慎一，浅水俊平，
掛谷秀昭，尾仲宏康．2014．放線菌の複合培養法による新規テトラヒドロキノリン類の単離とその生合成．日本
農芸化学会2014年度大会．3月，東京．
3) 尾﨑太郎，杉山龍介，西村慎一，浅水俊平，掛谷秀昭，
尾仲宏康．2014．複合培養を利用した新規テトラヒドロ
キノリン類の単離とその生合成に関する研究．2014年度（第29回）日本放線菌学会大会．6月，茨城．
4) 尾﨑太郎，杉山龍介，西村慎一，浅水俊平，掛谷秀昭，
尾仲宏康．2014．複合培養により見出された新規テトラ宏康

辞本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成によって開設された微生物潜在機能探索寄付講座においてなされたものである．本助成を賜った発酵研究所に対して，ここに厚く御礼申し上げます．本寄付講座世話人である東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専
攻・大西康夫教授のご支援とご協力に感謝の意を表します．5aTHQ およびストレプトアミナールの単離と構造解析，生物活性試験は京都大学大学院・薬学研究科シス
テムケモセラピー・制御分子学分野（掛谷研究室）で行われたものである．同掛谷秀昭教授，西村慎一助教，杉山龍介氏に厚く御礼申し上げます．生合成研究でご助言を賜りました東京大学大学委員農学生命科学研究科応用
生命工学専攻・勝山陽平准教授に感謝の意を表します．

－ 114 －

複合培養を用いた新規アルカロイドの同定と生合成に関する研究

文

献

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Du, D., Katsuyama, Y., Onaka, H., Fujie, M., Satoh, N., Shin-Ya, K.
& Ohnishi, Y. 2016. Production of a Novel amide-containing
polyene by activating a cr yptic biosynthetic gene cluster in
Streptomyces sp. MSC090213JE08. ChemBioChem 17: 14641471.
Du, D., Katsuyama, Y., Shin-Ya, K. & Ohnishi, Y. 2018.
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－ 115 －

IFO Res.Commun. 32
117-127, 2018

放線菌複合培養液からの抗生物質-シデロフォア連結化合物の発見
浅水

俊平，菅井

佳宣，尾仲

宏康

東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在機能探索寄付講座〒113-8657

東京都文京区弥生1-1-1

A new sideromycin-like antibiotic from combined-cultureof Streptomyces hygroscopicus HOK021 and Tsukamurella pulmonis.
Shumpei Asamizu, Yoshinori Sugai, Hiroyasu Onaka
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
Yayoi 1-1-1, Bunkyo, Tokyo, 113-8657, JapanA new sideromycin-like antibiotic was identified in a combined-culture of Streptomyces hygroscopicus HOK021 andTsukamurella pulmonis TP-B0596. The planar structure and two absolute stereo-chemistries were assigned basedon a spectroscopic analysis and modified Marfey＇s method. The identified compound was a conjugant of FabF
inhibitor platensimycin and siderophore enterobactin dimer connected by a C-S bond. The isolated antibiotic,
named harundomycin (HDM), showed ferric iron (Fe 3+) chelating activity. HDM had moderate minimum
inhibitor y concentration (MIC) against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin
resistant enterococci (VRE). The MIC of HDM was compared with platensimycin under an iron depleted condition.
Intriguingly, while the PTM reduced bioactivity, HDM retained growth inhibition activity, which implied that thecatechol unit binds Fe3+ and mimics a siderophore to support the active transport of the HDM into the cell and thereleased PTM acts as the growth inhibitor. The HDM was likely produced by activation of more than two gene lociincluding ptm and ent biosynthetic gene clusters in HOK021, and a subsequent uncharacterized reaction was
involved that formed thioester linkage between two independent natural products. These results show that bacteria
may have evolved to use offensive delivery systems during competitive interaction and suggest that even known
secondary metabolites could be validated in an ecological system involving the complex soil microbiome.
Key words: Streptomyces, mycolic acid-containing bacteria, sideromycin, anti-MRSA, anti-VRE

緒

言

望な方法となると考えられる．
放線菌は，時には生態学的ニッチにおける環境変化，放線菌は臨床的に重要な薬剤を含む二次代謝産物

外的ストレスに対応する生存戦略（環境適合）のために（ SM ）を生産する菌糸状に生育するグラム陽性細菌で多様な特殊代謝（＝SM ）を進化させたと考えられる(vanある．近年の放線菌ゲノム解析により，放線菌は 20－

der Meij et al., 2017)．これらの SM の生態学的機能を理40 個の潜在的 SM 生合成遺伝子クラスター（ BGC ）を解することは，実験室の培養条件下では発現されない多有することが明らかになったが，実験室における培養条

数のいわゆる「潜在性」BGC の発現やその機能を解析

件下では限られた SM- BGC のみしか発現されない．しするために必要であることが考えられる．中でも最近注たがって，残りの休眠状態または十分な発現のない目されているように，「潜在性」SM- BGC の一部では，

BGC の活性化は，新規な天然産物を発見するために有他の微生物の活動を感知して発現されている可能性が示

E-mail: 浅水俊平（ asamizu@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp ）菅井佳宣（ yoshinorisugai2158@gmail.com ）尾仲宏康（ aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp ）共同研究者:河合盛進（トヨタ紡織株式会社基礎研究所），
荒川宜親（名古屋大学大学院医学系研究科）

唆されている．他の微生物の増殖などの活動を感知し，二次代謝の発現パターンを変化させる方法としては，複数の細菌によって引き起こされる必須栄養素（炭素源となる糖や脂質，窒素源となるアミノ酸，無機リン酸など）の動的変化，特定の化学物質，また場合によっては他の－ 117 －

浅水

俊平，菅井

佳宣，尾仲

宏康

細菌との物理的な相互作用が考えられる(Urem et al.,

そこで，本研究では複合培養時に特異的に生産される抗2016)．

菌性二次代謝産物を探索した．

細菌における環境適合の例として，シデロフォアをスクリーニングの過程で，森林土壌由来 Streptomyces

用いて鉄の取り込みを他の細菌と競合することが知られている(Johnstone & Nolan, 2015)．Streptomyces 属放hygroscopicus HOK021 は，シデロフォアであるエンテロ
バクチン(ENT)，脱水 ENT 二量体(DED)，また FabF

線菌は，広く一般的に hydroxamate 型シデロフォアで阻害剤 Platensimycin(PTM)，PTM と DED との縮合体

あ る desferrioxamine を 生 産 す る こ と が 知 ら れ る が，である新規シデロマイシン様抗生物質（ Harundomycin，Streptomyces coeliocolor A3(2) は Amycolatopsis sp. AA4 との 競 合 に お い て， 特 異 的 に 鎖 長 の 異 な る ア シ ル 化

HDM ）を生産することを発見した．これらの化合物のdesferrioxamine 類 を 生 産 す る こ と が 報 告 さ れ て い る

異的に生産された．本研究では，
HDM の単離，構造決定，(Traxler et al., 2013)．大腸菌やサルモネラ菌などのグ

シデロフォア活性及び生物活性を報告する．

生産は，HOK021 を TP-B0596 と複合培養した場合に特ラム陰性細菌は一般的にカテコール型シデロフォアであ実験方法

る enterobactin を 生 産 す る こ と が 知 ら れ(Reitz et al.,2017)，最近ではいくつかの Streptomyces 属放線菌もカテコール型シデロフォアである enterobactin を生産する

複合培養を用いた抗生物質のスクリーニング

ことが報告されている(Fiedler et al., 2001)．

2014 年に北海道富良野市の東京大学北海道演習林で天然には，このシデロフォアによる鉄の取り込み機構

集めた森林土壌から，ISP4 寒天培地を用いたフェノーを巧みに利用し，他の微生物との生存競争に打ち勝とう

ル希釈法により，59 種の放線菌を単離した．各放線菌と す る 戦 略 を 獲 得 し た 仕 組 み が 存 在 す る(Klahn &お よ び T. pulmonis を，100 ml の V-22 種 培 地 を 含 む

Bronstrup, 2017)．シデロマイシン類として知られる抗500 ml の K-1 フラスコ中でそれぞれ培養した．フラスコ

生物質の一群は，抗生物質「弾頭」にシデロフォアが連を回転振盪機（ 200 rpm，30 ℃）で振盪し，放線菌を 3結する構造を有する．このため細菌が有するシデロフォ

日間，T. pulmonis を 2 日間培養した．放線菌培養液 3 ml

アの特異的 / 非特異的トランスポーターを介してシデロ

および T. pulmonis 培養液 1 ml を同時に 100 ml の A-3M

マイシン類は細胞内へ輸送されることが示されている．

生産培地を含む 500 ml K-1 フラスコに移し，回転振盪機

シデロフォアに擬態して，抗生物質を相手の細胞内に取（ 200 rpm，30 ℃，8 日間）にて培養した．等量の n -ブタ

り込ませるため，「トロイの木馬」型抗生物質ともいわ

ノールで全培養液を抽出し，抽出物を Bacillus subtilis にれる．天然の「トロイの木馬」機構に着想を得た最近の対してペーパーディスク法による抗菌試験を行った．

いくつかの有機合成研究では，シデロフォア「輸送体」を連結することによって，抗生物質「弾頭」の抗菌活性

HOK021 株培養抽出物の分析

を 増 強 す る 効 果 を 明 ら か に し て い る(Johnstone &HOK021 純粋培養，T. pulmonis 純粋培養，それらのNolan, 2015)．したがって，これら抗生物質‐シデロフォ複合培養液からの抽出物を超高性能液体クロマトグラ

ア結合体は，抗生物質の菌体内輸送機構を強化するため

フィー / エレクトロスプレーイオン化 / 四重極飛行時間に有望な戦略であると考えられている．

/ 質量分析法（UPLC-ESI-QTOF-MS ）を用いて分析した．

Tsukamurella pulmonis TP-B0596 を含むミコール酸含有細菌（ MACB ）は広範囲の放線菌に対して効果的に（ Agilent iFunnel 6550 ）を代謝産物解析及び化合物同定

SM 生産を誘導することが示されており，この方法を「複に用いた．化合物の粗精製は，ODS 充填剤（ COSMOSIL合培養」と呼称している(Onaka et al., 2011)．MACB に

75C18-PREP，ナカライ）を用いたオープンカラムによよる抗生物質生産の誘導機構は，物理的な相互作用を始り行った．化合物の精製は，
COSMOSIL AR-II（ナカライ）

UPLC 装 置（ Agilent 1290 ） 及 び ESI-QTOF-MS 装 置

めとして様々な要因を伴った複雑な機構であると考えら

及 び XTerra（ Wates ） カ ラ ム を 用 い た HPLC 装 置

れるが，この複合培養法を用いて広範囲の放線菌に対し（ Agilent1260 ）により行った．化合物の構造決定には，て二次代謝産物生産誘導スクリーニングを行ったとき，

核磁気共鳴装置 500 MHz NMR（ JEOL ）及び 600 MHz

複合培養法時特異的な物質生産（つまり潜在的二次代謝

NMR（ JEOL ） を 用 い，1H，13C NMR 及 び 各 種 2 次 元

物生産を活性化する現象）が観察され，新規化合物の発NMR を測定し，行った．

見に成功している(Onaka, 2017)．複合培養法から新規
SM の発見は効果的であることが示されたが，生態学的最少生育阻害濃度な側面における微生物間相互作用の競合的場面を表すよ

グラム陽性細菌として，Bacillus subtilis ATCC 6051，

うな「抗生物質」の探索・発見はこれまで限られていた．

Enterococcus faecalis ATCC 2921 ，E. faecium ATCC

－ 118 －

放線菌複合培養液からの抗生物質-シデロフォア連結化合物の発見

35667，E. faecium ATCC 51299（ VRE 株），Staphylococcus（ 1463/1469 ）を示したことから，Streptomyces hygroscop-

aureus ATCC 29213，S. aureus ATCC 4330（ MRSA 株 ）を用いた．グラム陰性細菌として，Acinetobacter baumannii

icus HOK021 と命名した．

ATCC 17978 ，Escherichia coli ATCC 25922 ，Klebsiella

複合培養における PTM と ENT の同定

pneumoniae ATCC 49472 ，Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 を用いた．

結HOK021 純粋培養，T. pulmonis 純粋培養，それらの複合培養液からの抽出物を UPLC-ESI-QTOF-MS を用いて分析し，クロマトグラムを比較すると，複合培養液の果抽出物中に多数のピークが出現することが観察された（ Fig. 1B ）．まず抽出物中の既知化合物を検索したとこ

抗生物質生産菌の同定

ろ，m/z 670.15 [M+H]+ を示すイオンを同定した．推定

スクリーニングを行った株の中で，HOK021 株は，複分子式は，シデロフォア・エンテロバクチン（ ENT ）合培養において特異的に抗生物質の生産を示した．した（ Fig. 1A, 2 ）と同一の分子式 C30H28N3O15 を示した．m/z

がって，HOK021 と T. pulmonis との複合培養物におい670.15 [M+H]+ の衝突誘起開裂（ CID ）では，2 つの主て生産された抗生物質を探索した．HOK021 の部分 16S

なフラグメントイオンピーク，m/z 447.10 および 224.05

rDNA は，Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosusをもたらし，これは ENT において報告された値と一致（ AB184479 ） の 基 準 株 と 最 も 高 い 類 似 性 99.6 ％した．ENT の化学構造は，精製化合物の 1H NMR によっ

Fig. 1

Chemical structures and HPLC traces of isolated compounds.
(A) Chemical structures of dehydrated enterobactin dimer (DED, 1), enterobactin (ENT, 2), platensimycin (PTM,3), harundomycin (HDM, 4). (B) HPLC traces of HOK021 and T. pulmonis combined-culture (top), HOK021
mono-culture (middle), and T. pulmonis mono-culture (bottom). Number (1-4) indicated the respective compounds.

－ 119 －

浅水

俊平，菅井

ても確認し，ピーク 2 は ENT であると同定した（Fig. 1B）．

佳宣，尾仲

宏康

DED の構造解明

抽出物は抗菌活性を示したことから，抽出物を更に解析

DED を 白 色 粉 末 と し て 単 離 し た．HR-ESIMS（ m/z

したところ，m/z 442.18 [M+H]+ を示すイオンピークを

447.1032 [M+H]+ ，C20H19N2O10+ の計算値:447.1034 ）に見出した．推定された分子式は，FabF 阻害剤として知ら れ る 抗 生 物 質 PTM（ Fig. 1A, 3 ） と 同 一 の 分 子 式
C24H27NO7 で あ っ た．m/z 442.18 [M+H]+ の MS/MS 分

よ り 分 子 式 は C20H18N2O10 と 推 定 さ れ た．DED は
DMSO- d6 溶媒に溶解し，平面構造は，1H NMR（500 MHz,JEOL ），13C NMR（ 125 MHz, JEOL ）， 及 び HH-COSY，

析では典型的なフラグメントイオンピーク m/z 273.15

Rotating frame overhauser effect spectroscopy（ ROESY ），が 存 在 し，PTM に お い て 報 告 さ れ た 値 と 一 致 し た．

Heteronuclear multiple quantum coherence（ HMQC ），PTM の化学構造は，精製化合物の H NMR によってもHeteronuclear multiple bond coherence（ HMBC ） を 含

確認し，ピーク 3 は PTM であると同定した（ Fig. 1B ）．

む一連の 2D NMR 分析によって決定した（ Fig. 2B, C ）．

1

DED の 13C および 1H NMR データを Table 1 に示した．
複合培養液中の PTM と ENT の未知誘導体

H NMR には，α-メチンプロトン（ δH 4.88 ）
，エキソメ

1

GNPS（ Global Natural Products Social ）Molecular
Networking 分析(Wang et al., 2016) を利用し，3 種類の培養液抽出物に由来する化合物イオンを比較した．培地
及び T. pulmonis 純粋培養からの抽出物をブランクとし，
HOK021 および HOK021 と T. pulmonis 複合培養を対照として実施した．

チレンプロトン（ δH 6.55，5.80 ），メチレンプロトン（ δH

4.64, 4.59 ），2 つの NH プロトン（ δ H 10.81，9.21 ），6 つの 芳 香 族 メ チ ン（ δ H 7.37 - 6.70 ） が 推 定 さ れ た．13C
NMR には 18 個の共鳴ピークが観察され，そのうちの 2つ（ δC 148.73，118.85 ） に つ い て は，HMQC お よ び

HMBC 分析から 2 つの 13C 化学シフトの重複が確認されMolecular Networking 解析の結果，PTM の質量イオた．その結果，DED 予想分子式と一致する 20 個の共鳴

ン m/z 442.18 [M+H]+ が，多数の誘導体（質量イオンがピークが同定された．13C NMR には，4 つのカルボニル

274 から 1127 までの合計 20 個）と共にクレードを形成炭素（ δC 170.23 - 163.15 ）の存在が示唆され，Distortionless

していることが示された．分子ネットワークによって同

Enhancement by Polarization Transfer（ DEPT ）135 NMR定された親イオンを表す各値について抽出イオンクロマ

から 2 つの二級炭素（ δ C 109.27, 64.42 ）の存在が示唆さトグラム（ EIC ）を描画したところ，m/z 904.26 [M+H]+

が最も高い強度を示し，また PTM 誘導体としての報告れた．また Fig. 2 に示した ROESY 及び HMBC 相関から
DED の平面構造を決定した．

例はなかった（ Fig. 1B, 4 ）．そこで，このイオンピークを示す分子について，後述するように精製し，構造決定

改良 Marfey 法を用いた DED の絶対立体化学の決定を 行 っ た． ま た Molecular Networking 解 析 の 結 果，

DED の平面構造には 1 つの不斉中心が存在した．精ENT の質量イオン m/z 670.15 [M+H] も，独立したクラ製した DED を 6N HCl を用いて 100 ℃で 14 時間，酸加

スターを形成していることも見出した．分子ネットワー

水分解を行い，酸加水分解試料を L-FDLA で処理し，クによって同定された親イオンを表す各値について EIC

LC-QTOF-MS で分析した．L-FDLA 誘導体化 L- セリンを描画したところ，m/z 447.10 [M+H]+ が最も強い強度

および D- セリンを基準として比較すると，加水分解生を示し，天然由来の ENT 誘導体としての報告例はなかっ

成物中の L-FDLA 誘導体化セリンは L -セリンと同一のた（ Fig. 1B, 1 ）．そこで，このイオンピークを示す分子

保持時間を示した．この結果から，DED の絶対立体化について，後述するように精製し，構造決定を行った．

学は (S) - 立体配位であると決定された（ Fig. 1A, 1 ）．

HDM と DED の精製

HDM の構造解明+

新規 PTM 誘導体（ Fig. 1B, 4 ）および新規 ENT 誘導体

HDM の HRQTOFMS 分析から，分子式 C44H45N3O16S（ Fig. 1B, 1 ）を単離するために，HOK021 と T. pulmonis（観測値:m/z 904.2616 [M+H]+；計算値:m/z 904.2593の複合培養液を 10.8 L 調製した．培養液を等量の酢酸エ[M+H]+ ）が推定され，HDM は硫黄原子を含むことを示

チル（ EtOAc）で 2 回抽出し，EtOAc 層を真空下で乾燥さ

唆 し た．HDM を pyridine-d6 溶 媒 に 溶 解 し，1H NMR

せて合計 8.7g の粗抽出物を得た．EtOAc 抽出物を低圧（ 500 MHz, JEOL ），13C NMR（ 125 MHz, JEOL ）及び HH-

ODS カラムクロマトグラフィーで分離した．得られた画分

COSY，ROESY，HMQC，HMBC を含む 2D NMR 分析について，更にフェニルエチルカラム（ Cosmosil PE-MS，によって決定した（Fig. 2E, F）．HDM の 13C および 1H NMRナカライ）および C18 カラム（Cosmosil AR-II，ナカライ）

データを Table 2 に示した．

を 用 い た セ ミ 分 取 逆 相 HPLC に 供 し た． 最 終 的 に，PTM 部位に関して，化学シフトを PTM の報告値とHDM（ 16.7 mg ）および DED（ 8.6 mg ）を精製した．

比較した結果，HDM の部分構造に PTM に保存された－ 120 －

放線菌複合培養液からの抗生物質-シデロフォア連結化合物の発見

Fig. 2

2D NMR correlation of DED and HDM.
(A) Atom numbering for DED. (B) HH-COSY (thick bond) and ROESY (arrow) correlation of DED. (C) HMBC
correlation (arrow) of DED. (D) Atom numbering for HDM. (E) HH-COSY (thick bond) and ROESY (arrow)correlation of HDM. (C) HMBC correlation (arrow) of HDM.

Table 1

H and 13C NMR assignment for DED

1

See figure 2 for atom position numbering. CH3 : primary carbon, CH2 : secondary carbon, CH :tertiary carbon, Co : quaternary carbon. # : exchangeable positions.

－ 121 －

浅水
Table 2

俊平，菅井

佳宣，尾仲

宏康

H and 13C NMR assignment for HDM

1

See figure 2 for atom position numbering. CH3 : primar y carbon, CH2 : secondar y carbon,
CH : tertiar y carbon, Co : quaternar y carbon. (*) assigned based on HSQC or HMBC since
overlapped carbon chemical shifts were observed.

－ 122 －

放線菌複合培養液からの抗生物質-シデロフォア連結化合物の発見

化学シフトが観察された．1H NMR には，2 つのメチル（δH

造を支持した．

レフィンメチン（ δ H 6.37, 5.94 ），2 つの芳香族メチン（ δ H

改良 Marfey 法を用いた HDM の絶対立体化学の決定

10.39 ）などが存在した．また 13C NMR には，10 個の四る分析を行った．HDM を 6 N HCl 中で，100 ℃（14 時間）

級炭素が存在し，ケトン（ δ C 203.6 ），酸素と結合したで酸加水分解を行い，酸加水分解した試料を L-FDLA で

sp3 四級炭素（ δC 87.2 ），酸素と結合したオレフィン炭素（ δ C 160.3，156.8 ），2 つ の カ ル ボ ニ ル 炭 素（ δ C 174.5，

L-FDLA 誘導体をコントロールとしたところ，HDM に

194.9）などが存在した．最も重要な化学シフトの変化は，存在するセリン残基部位は，L-Serと同一の保持時間を

3 -アミノ- 2,4 -ジヒドロキシ安息香酸（ ADHBA ）部位の示した．このことから C2''' の絶対立体配置は (S) であ

1.13，1.40 ），5 つのメチレン（ δ H 1.48 - 2.75 ），2 つのオ

7.50, 6.66 ），オキシメチン（ δH 4.46 ），NH プロトン（ δH

カルボニル炭素（ PTM:δ C 175.2 から HDM:δC 194.8 ）

改良 Marfey 法を用いて HDM の絶対立体化学に関す

処 理 し，LC-QTOF-MS で 分 析 し た．L-Ser と D-Ser のると決定した．一方，FDLA 誘導体化システインは観察の 13C NMR で観察された．この低磁場への化学シフトされなかった．システインは酸加水分解により酸化シスの変化は，フェノール性カルボン酸がフェノール性チオ

テインを形成することが知られており，このことが原因

エステルに変換されたことを示唆した．HH-COSY は，であると考えられた．そこで加水分解したサンプルを

2 つ の メ チ レ ン 相 関（ C2 - C3 ），cis -オ レ フ ィ ン 相 関

H2O2/HCO2H（ 100 μL，9:1 ）で，3 時間氷上で処理し，（ C6 - C7 ），C9 - C13 およびオルトカップリング芳香族

安定なシステイン酸にシステインを変換し，HCO2H を（ C6' - C7' ） 相 関 の，4 カ 所 の 連 結 部 分 構 造 を 示 し た

添加後，真空中で乾燥させた．サンプルを L-FDLA で処（ Fig. 2E ）．NH の C1 カルボニルへの HMBC 相関は観察

理 し，L-Cys と D-Cys に 由 来 す る シ ス テ イ ン 酸 のされなかったが，NH の C2 メチレンへの ROESY 相関が

L-FDLA 誘 導 体 を コ ン ト ロ ー ル と し， 保 持 時 間 を観察され，2 つの部分構造のアミド結合を介する連結がLC-QTOF-MS で比較分析した．HDM のシステイン部支持された．これは，PTM に対するアミド結合の切断

位は，L-Cys と D-Cys に由来するシステイン酸と同一保により生じる，ESI-MS におけるフラグメントイオン（ m/z

持時間の両方にピークが存在し，ピーク面積値から算出

273 ）の検出によっても支持された．C1' カルボニルのした結果，ほぼ (S):(R)＝1:1 の混合物であることが化学シフトに違いはあるが，アミド結合を介した五環式

明らかになった（ Fig. 1A, 4 ）．

ケトライド（ Fig. 1A, 4 化学構造右上）および 3 -アミノ2,4 -ジヒドロキシ安息香酸（ ADHBA，Fig. 1A, 4 化学構

HDM および DED の鉄鉄キレート化活性造中央上）単位からなる PTM 部位の存在が確認された．

エンテロバクチン（ ENT ）は，グラム陰性細菌にしENT 二量体部位に関して，推定された HDM の分子

ばしば観られるシデロフォアである．HDM と DED の式（ C44H45N3O16S ） は，24 度（ 1 + 44 - 45/2 + 3/2 ） の 不

化学構造には，第二鉄イオン（ Fe3+ ）との錯体形成が知飽和を示した．推定された分子式と一致して， C NMRられているカテコール単位が存在した．そこで，単離精

13は 44 個の共鳴を示し，DEPT135 NMR は 7 個の二級炭製した DED および HDM，また対照としての ENT を用

素を含む 24 個の化学シフトを示した．PTM 部分は 5 ついて，鉄イオン（ Fe3+ ）キレート活性について試験したの二級炭素を含んでいたため，未知の部分構造には 2 つ（ Fig. 3 ）．ENT，DED，または HDM を FeCl3 溶液にイの二級炭素を含むことが示唆された． H NMR では，2
1

つのメチレン（ δH 3.87 と 4.11 及び，5.08 と 5.22 ），6 つンキュベートした．ENT を FeCl3 溶液中にインキュベー
ションした結果，m/z 670.1534 [M+H]+ から 723.0642 への芳香族メチン（ δ H 6.79，6.86，7.25，7.30，7.89，7.95 ），の 52.91 Da のマスシフトをもたらした．これは予想通り，

れた． C NMR では，4 つの酸素と結合した四級炭素（δCし，DED または HDM と FeCl3 とのインキュベーション

炭素（ δC 170.1，170.6，171.3，172.9 ）を含む 10 個の非904.2620 [M+H]+ か ら 971.1515，DED に つ い て は m/z

二量体の連結に関する相関については，C1' カルボニル

して反応し，カテコール部位を酸化（酸素原子添加）し炭素には，H7' の芳香族メチン，そして H3'' メチレンかたためであることが考えられた．そこで，FeSO（第一鉄，4および 2 つの非遮蔽 α -メチン（ δ H 5.60，5.42 ）が観察さ
13148.4，148.5，150.5，150.9 ），および 4 つのカルボニル

プロトン化炭素が観察された（ Table 2 ）．PTM と ENTらの HMBC 相関が観察され，各部位の結合が確立され

ENT - 第二鉄錯体 [M-3H+Fe3++H]+ の形成を示した．しかで は 予 想 外 に 66.89 Da シ フ ト を 生 じ た（ HDM；m/z

447.1044 [M+H]+ から 513.9956 ）．これは FeCl3 が触媒とFe2+ ）とのインキュベーションによる錯体形成を調べた．

た．また推定化学構造に対して，HDM は矛盾のない

この実験では，化合物 - 第二鉄錯体 [M-3H+Fe3++H]+ の形

MS/MS フラグメンテーションパターン；m/z 663，m/z

成を示す 52.91 Da のマスシフトが HDM 及び DED にお424，及び m/z 273 を示し，決定した HDM 平面化学構

いて観察され，第二鉄錯体を形成することが出来ること－ 123 －

浅水

俊平，菅井

が示された．次いで，キレート活性の強度を Chrome

佳宣，尾仲

宏康

ENT 二量体が連結した構造を有していた．これまでのAzurol S（ CAS ）比色アッセイを用いて調べた．比較す構造活性相関研究では，PTM の ADHBA 部位のカルボ

る コ ン ト ロ ー ル と し て，ENT お よ び Deferoxamine

ン酸部位が活性に必須であることが示されていた(Rudolf

mesylate を 用 い た．HDM と DED は Deferoxamine
mesylate よりも高い鉄キレート効果を示した．以上の結et al., 2017)．一方 HDM では，このカルボン酸部位にはENT 二量体が連結し，これまでの知見では FabH に対果から，HDM と DED は第二鉄イオン（ Fe3+ ）と錯体する阻害活性，その結果起こる抗菌活性は発揮できないを形成し，キレート活性を有するシデロフォアであること考えられた．メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA ）とが示された（ Fig. 3 ）．

およびバンコマイシン耐性エンテロコッカス（ VRE ）に対する HDM の最小生育阻害濃度（ MIC ）を測定し，T. pulmonis または C. glutamicum は HOK021 の HDM 産生を誘導した

受性エンテロコッカス（ MIC 16 μM ）および VRE（ MIC

HDM，PTM，ENT，及び DED の真の生産菌を調べ

16 μM ）， メ チ シ リ ン 感 受 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌（ MICるために，HOK021 を他のミコール酸含有細菌との複合

32 μM ） お よ び MRSA（ MIC 16 μM ） に 対 す る MIC を

PTM の MIC と比較した（ Table 3 ）．バンコマイシン感培養を行った．C. glutamicum ATCC 13032 株，R. opacus

比較したところ，HDM は PTM よりも高い MIC を示し

B4 株，R. erythropolis PR4 株を試験した．興味深いことに，た．つまり，HDM の生育阻害活性は PYM より低くなっENT および DED がミコール酸含有細菌との複合培養にているが，予想外に，失われず維持されていることが明

おいて生産されたが，PTM および HDM は，T. pulmonis

らかになった．一方，鉄欠乏培地（ ID-CAMHB ）を用または C. glutamicum との複合培養においてのみ生産され

いて MIC を測定したところ，PTM の MIC は 4 ～ 16 倍た．antiSMASH などのバイオインフォマティクスツールを用上昇した（ Table 3 ）．しかしながら，HDM の MIC の上

いてC. glutamicum（NC_003450），R. opucus（ AP011115），

昇率は総じて PTM ほどではなく（ 2 倍程度），MRSA に

R. erythropolis（ NC_012490 ）の全ゲノム配列を検索したが，既知の ptm と ent の BCG は同定できず，PTM とHeLa 細胞を用いた細胞傷害活性を調べたところ，測定ENT の生産者が HOK021 株であることを支持した．

した濃度において，殺細胞活性は示さなかった．

つ い て は そ の 抗 菌 活 性 は 2 倍 程 度 増 加 し た． ま た，考

HDM と PTM の最小生育阻害濃度（ MIC ）PTM は，Streptomyces platensis MA7327 株から単離さ
れ，MRSA および VRE に対する抗菌活性を示し，またFabF 阻 害 剤 と し て 知 ら れ て い る．HDM は，PTM に察

S. hygroscopicus HOK021 と T. pulmonis TP-B0596 との複 合 培 養 に お い て， 新 規 な sideromycin 様 抗 生 物 質
HDM の産生が，その前駆体である PTM，DED，ENTの生産と共に発見された．
細菌競合により誘導される HOK021 に存在する可能性のある「トロイの木馬」戦略
HDM 化学構造は，PTM 骨格の 3 -アミノ- 2,4 -ジヒド
ロキシ安息香酸（ ADHBA ）部位のカルボン酸部位に修飾を受けていた．構造活性相関（ SAR ）研究では，カルボキシレートの改変が黄色ブドウ球菌に対する PTMの増殖阻害活性を減少させることを示していた(Rudolf
et al., 2017)．これは，PTM カルボキシレートが大腸菌
由 来 の 脂 肪 酸 生 合 成 に 関 与 す る 分 子 標 的 FabF のHis340，His303 および触媒 Cys163 残基と直接的に相互作用するためである(Rudolf et al., 2017)．本研究では予Fig. 3Chrome Azurol S Assay for HDM and DED.
Fe3+ chelating activity of HDM (black line), ENT (black
dot line), DED (wide gap gray dot line), and deferoxamine
mesylate (gray dot line) were compared. Decrease ofabsorption (OD630 ) indicate the chelating of ferric iron by therespective test compounds. Experiments were done in n = 3.

想外に，CS 結合により嵩高い ENT 二量体修飾された
HDM が MRSA および VRE を含む試験した細菌に対する 増 殖 阻 害 活 性 を 保 持 す る こ と を 示 し た． し か し，PTM 母核自身の活性を比較すると，試験したすべての細菌でほぼ 2 ～ 16 倍活性が減少した．

－ 124 －

放線菌複合培養液からの抗生物質-シデロフォア連結化合物の発見
Table 3

MIC for HDM and PTM in ID-CAMHB

MIC were compared based on mole concentration of HDM and PTM (μM). CAMHB :Mueller Hinton Broth (Cation-Adjusted), ID-CAMHB : Iron Depleted-CAMHB.

シデロマイシン類の抗生物質としては，グラム陽性の療する利点をもたらす可能性がある．また，抗菌スペク

Streptomyces 属放線菌種から，アルボマイシン，サルマイシンおよびフェリマイシン，グラム陰性の Klebsiella 属細トルに関し，PTM のものと，HDM のものが良く一致

菌から MccE492 が単離されている(Klahn & Bronstrup,が示唆された．一方，HDM の細胞内への取り込み後，したことから，PTM が抗菌活性を担う分子であること

2017)．シデロマイシンに共通する構造的特徴は，シデ

チオエステル結合がどのように切断され，PTM が解離

ロフォアと抗生物質が共有結合した分子であることであするかについて，酵素的または非酵素的メカニズムを含る．シデロフォア部分の連結は，特異的トランスポーター

めて不明であり，今後の解析が必要である．

を介して細胞内に能動的に化合物を輸入することにつながる．アルボマイシンでは，ABC 型トランスポーター

デヒドロアラニンを含有する天然産物（ FhuCGBG ）を介して細胞内に輸入した後，細胞内でデヒドロアラニンを含むデヒドロアミノ酸構造は，リプロテイナーゼ N 酵素が，ヌクレオシド系抗生物質

ボソーム合成され翻訳後修飾を受けるペプチド系化合物

SB -217452 と シ デ ロ フ ォ ア 部 位 を 加 水 分 解 し，

（ RiPP ）などの微生物二次代謝産物で良く見出されていSB -217452 は標的分子であるセリル- tRNA 合成酵素に結る構造である．デヒドロアラニンを酵素的に生成する機合して抗菌活性を発揮する(Pramanik & Braun, 2006)．

構は，ナイシン生合成における NisB（デヒドラターゼ）

したがって，HDM が同様の作用機構を有した場合，などおいてよく研究されている(Ortega et al., 2015)．ま鉄制限下において生育阻害活性が増加すると予測した．

た，非リボソームペプチド（ NRP ）にもデヒドロアミ

Staphylococcus aureus は，ENT などのカテコール型シデロフォアを生産しないが，SstABCD 遺伝子産物（ ABC

ノ酸構造は存在するが，デヒドロアミノ酸形成に関する型トランスポーター）は S. aureus による ENT を含む

アではほとんど見られず，Halomonas sp. LOB-5 由来の知見はない．さらに，デヒドロアミノ酸は細菌シデロフォ

カテコール型シデロフォアを取り込む機能があること

Loihichelin に存在するデヒドロアラニン(Homann et al.,が 示 さ れ て い る(Beasley et al., 2011)． 鉄 欠 乏 培 地

2009) や，Teredinibacter turnerae T7901.52 由 来 の turn-（ ID - CAMHB）(Hackel et al., 2017) を用いて，HDM のerbactin に存在するデヒドロブチリン(Han et al., 2013)

MIC を試験し，PTM の MIC と比較した．鉄欠乏培地でのみである．よって DED におけるデヒドロアラニン構

は，PTM の MIC が予想外に増加した（8 ～ 16 倍）．一方，造の形成機構は不明であるが，恐らく ENT の二量体がHDM の MIC は，わずかに増加した（ 2 倍）のみであっ前駆体となり，セリン残基から変換されると推定される．

た．PTM 活性の低下は，PTM が静菌的抗生物質である
ことから，その増殖能が低下したことにより，抗生物質

HDM 生合成におけるチオエステル結合の形成に対する感受性が低下したことが考えられた．この結果

PTM および ENT の生合成遺伝子は明らかになっておは，IDM-CAMHB 培地では HDM の方が PTM よりも S.

り，その生合成機構も推定されている(Reitz et al., 2017 ;

aureus 細胞内に輸送された可能性を示唆している．病原体の宿主細胞は高度に鉄分制限された状態であることがRudolf et al., 2017)．HDM を生成するためには，PTMと DED または ENT 二量体との間にチオエステル結合を知られている．この結果は，鉄分制限された環境で増殖形成する必要がある．PTM と ENT 二量体が結合した精している病原体をシデロフォア結合体である HDM で治製 HDM 中のシステイン残基の α - 炭素の立体化学は，－ 125 －

浅水

俊平，菅井

佳宣，尾仲

宏康

S - および R -立体配置がほぼ 1:1 の比で存在していた．
しかし，HDM のジアステレオマーは試験したカラム条連結された化合物であった．ハランドマイシン（HDM ）件下で分離できないため，細胞内で変換されたか，抽出

また HDM は，メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ MRSA ）/ 精製プロセス中に生成されたアーティファクトであるか，立体異性が起こる原因は不明である．Platensimycin

およびバンコマイシン耐性腸球菌（ VRE ）に対して中と命名した本抗生物質は，Fe3+ キレート活性を示した．

程度の最小阻害濃度（MIC ）を示した．興味深いことに，

チオカルボン酸類縁体は，Streptomyces platensis の培養

鉄 欠 乏 培 地 で の PTM と HDM の MIC を 比 較 す る と，物から既に見出されていた(Dong et al., 2016)．チオカ

PTM は生物活性を低下させたが，HDM は増殖阻害活

ルボン酸を含む天然物は，ほとんど発見されていない．

性をほぼ維持した．このことから HDM はシデロフォア

Psuedomonas sp. 由 来 の Pyridine - 2,6 - bis(thiocarboxylicacid)，および Psuedomonas fluorescens ATCC17400 由来

を模倣し，細胞内にて切り離された PTM が増殖阻害剤
として作用する可能性が示唆された．HDM は，HOK021の thio-quinolobactin のみであるが，それはチオカルボ

株ゲノムに存在する PTM（ ptm）と ENT（ ent ）生合ン酸が不安定で容易に加水分解されるためであると考え

成遺伝子クラスターを含む 2 つ以上の遺伝子座の活性化

られる(Dunbar et al., 2017)．有機合成反応において，によって産生された可能性があり，その後の未同定の連

α , β - 不飽和カルボニル炭素へのチオ酢酸またはチオカ
ルボン酸類を求核基とした 1,4 -付加反応は，温和な条件結機構を介し，2 つの独立した天然物をチオエステル結でも反応が起こる(Hintermann & Turockin, 2012)．そて細菌は競合的に相互作用する中で，抗生物質の輸送機のことから，HDM の合成では，PTM チオカルボン酸

構を発達させるために進化した可能性があり，複合培養を DED 上の α , β - 不飽和カルボニルに 1,4 -付加（マイケを用いることで既知の二次代謝産物にも，機能的付加価ル付加）することにより，チオエステル結合が形成され値を加えることが可能であることが示唆された．

合で連結したと考えられた．土壌マイクロビームにおいる可能性が示唆された．

本助成で得られた研究成果の報告

結果のまとめ及び今後の展望
S. hygroscopicus sp. HOK021 と T. pulmonis TP-B0596
を複合培養し，特徴的チオエステル結合によって PTM とDED が連結された新規シデロマイシン様抗生物質 HDMを発見した．HDM において PTM と DED を連結する生合成機構や，HDM が抗菌活性を発現する作用機構に関して未解明であり，今後の詳細な解析が必要である．
複合培養法により，微生物間の相互作用は，重要な抗菌活性を有する前例のない SM を得るための方法論となり得る大きな可能性を示した．また，これまでに例のない変換反応により新規な複合天然産物を生産できる可能性が示唆された．Streptomyces 属細菌は，細菌間の競合的な相互作用において，抗生物質をシデロフォアによって偽装するトリックを使用し，土壌マイクロビオームにおいて生存を有利にする仕組みを獲得していることを改めて示した．

要口頭発表1) A. A. C. Pramana, S. Asamizu, Y. Sugai, H. Onaka. 2017.
Analysis of intergeneric bacteria induced specialized metabolites with antibiosis from soil isolated actinomycetes. The
2nd A3 Foresight Symposium on ＂Chemical & Synthetic
Biology of Natural Products＂, May 24th, Jeju, Korea.
2) A. A. C. Pramana, S. Asamizu, Y. Sugai, H. Onaka. 2017.
Analysis of combined-culture induced specialized metabolites with antibiosis from Streptomyces sp. HOK021. 第32回
日本放線菌学会大会．9月7-8日，長野．
3) A. A. C. Pramana, S. Kawai, M. Kato, S. Asamizu, Y. Sugai, H.
Suzuki, Y. Arakawa, H. Onaka. 2018. Discover y of a new
antibiotic-siderophore hybrid compound from combined-culture of Streptomyces sp. HOK021 and Tsukamurella pulmonis.
2018年度日本農芸化学会大会．3月15-18日，名古屋．
4) 浅水俊平，尾仲宏康．2018．異属細菌間の相互作用がもたらす放線菌特殊代謝．2018年度日本農芸化学会大会．3
月15 - 18日，名古屋．
原著論文
1) S. Asamizu, A. A. C. Pramana, S. Kawai, Y. Sugai, Y.
Arakawa, H. Onaka. (Manuscript in preparation)

約

謝Streptomyces hygroscopicus HOK021 と Tsukamurella

辞pulmonis TP-B0596 の複合培養物から，新規なシデロマ
イシン様抗生物質が同定された．平面構造および 2 つの本研究において主要な実験（活性物質スクリーニング，

絶対立体化学は，各種機器分析および改良 Marfey 法に大量培養及び化合物精製）は東京大学大学院農学生命科

基づいて決定した．同定された化合物は，FabF 阻害剤・学研究科のアブロリアグスチャヤプラマナ氏（ 2016 年 4

PTM とシデロフォア・ENT ダイマーが C-S 結合により月～ 2018 年 3 月まで修士学生）により行われた．薬剤－ 126 －

放線菌複合培養液からの抗生物質-シデロフォア連結化合物の発見

耐性菌の最小生育阻害濃度に関する実験はトヨタ紡織株
式会社 基礎研究所の河合盛進氏及び名古屋大学医学研究科の荒川宜親教授との共同研究により行った．この場をお借りし深く感謝いたします．
本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成金（平成 24 年 10 月～ 29 年 9 月）により行われた．また本研究の一部は科研費基盤研究 B（尾仲宏康 25292046 ），科研
費若手研究 B（浅水俊平 16K18673 ）による研究助成により行われた．

文

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Klitgaard, A., Larson, C.B., P, C.A.B., Torres-Mendoza, D.,
Gonzalez, D.J., Silva, D.B., Marques, L.M., Demarque, D.P.,
Pociute, E., O'Neill, E.C., Briand, E., Helfrich, E.J.N., Granatosky,
E.A., Glukhov, E., Ryf fel, F., Houson, H., Mohimani, H.,
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Social Molecular Networking. Nat. Biotechnol. 34: 828-837.

－ 127 －

IFO Res.Commun. 32
129-139, 2018

ゴードスポリン作用機構の解析尾﨑太郎1)，菅井佳宜，浅水東京大学大学院農学生命科学研究科〒113-8657

俊平，尾仲

宏康

微生物潜在機能探索寄付講座

東京都文京区弥生1-1-1

Goadsporin, a specific inhibitor of actinomycetal signal recognition particle.
Taro Ozaki 1), Yoshinori Sugai, Shumpei Asamizu, Hiroyasu Onaka
Laboratory of Microbial Metabolic Potential, Department of Biotechnology,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
1-1-1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
Goadsporin (GS) is a secondary metabolite produced by Streptomyces sp. TP-A0584. This compound activates
secondar y metabolism and induces sporulation of various actinomycetes. At higher concentrations, GS also
exhibits growth inhibition activity. GS is active only against actinomycetes and does not exhibit these activities
against other bacteria. Despite these unique characteristics, the molecular target of GS had not previously been
identified. In the present study, we identified that GS interacted with Ffh, a proteinaceous component of thebacterial signal recognition particle (SRP). GS inhibited the recognition of signal peptide, resulting in a disturbanceof protein secretion. We also revealed that GS interacted with Ffhs derived from pathogenic actinomycetes,suggesting that GS potentially inhibited the growth of these bacteria. To the best of our knowledge, GS is the firstsmall molecule that inhibits the function of SRP. GS would be an attractive scaffold for future development of novel
biologically active peptides.
Key words: goadsporin, signal recognition particle, antibiotics, protein secretion, signal peptide緒言

もそれらのごく一部に由来する代謝産物しか同定されな
い．それ以外の遺伝子クラスターは休眠状態にあると考

ゴードスポリン（ goadsporin ; GS ）は Streptomyces sp.

えられるが，生物活性を有する低分子化合物が数多く潜

TP-0584 の 二 次 代 謝 産 物 で あ り，Streptomyces lividans

在する有用な遺伝子資源だと考えられる．そのため，

TK23 の色素生産・形態分化の誘導を指標に単離された

RNA ポリメラーゼやリボソームタンパク質の変異株の化合物である（ Onaka et al., 2001 ）GS は 19 残基の直鎖利用（ Hosaka et al., 2009 ）や，汎用宿主を利用した異ペプチドであり，構造中に含窒素芳香環であるアゾール

種発現（ Komatsu et al., 2010 ）などが広く試みられていや，デヒドロアラニンを複数含む特徴的な構造を有してる．GS のように広い作用スペクトルを示す化合物によっい る（ Fig. 1A ; Igarashi et al., 2001 ）． 本 化 合 物 は，S.

て潜在的な二次代謝を活性化することができれば，新規

lividans 以 外 に も 様 々 な 放 線 菌 に 対 し て 活 性 を 示 し，
1 µM 程度の低濃度では色素などの二次代謝産物の生産

天然物の探索において有用な手法になりうると期待されや放線菌の形態分化を誘導する．Streptomyces 属放線菌ことも知られており，抗生物質としての利用も期待される．また，GS は，高濃度では放線菌の生育を阻害するのゲノム上には通常 30 個以上の二次代謝産物生合成遺る．しかしながら，GS の分子標的は明らかにされてお伝子クラスターが存在するが（ Bentley et al., 2002 ; Ikeda

らず，作用機構に関する研究は進展してこなかった．
GS の生合成遺伝子クラスターのクローニングによっ

et al., 2003 ; Ohnishi et al., 2008 ），実際に培養を行ってて，10 遺 伝 子 か ら な る god 遺 伝 子 群 が 同 定 さ れ た
現北海道大学理学研究院
E-mail: 尾﨑太郎:ozaki@sci.hokudai.ac.jp
尾仲宏康:aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
1)（ Fig. 1B, Onaka et al., 2005 ）．その一つである godI 遺伝
子は，遺伝子破壊と異種発現実験から，生合成酵素をコードするのではなく，生産菌における自己耐性遺伝子であ－ 129 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宜，浅水

俊平，尾仲

宏康

Fig. 1 Properties of goadsporin (GS). A. Structure of goadsporin. B. Biosynthetic gene cluster of GS. C. Analysis of GS sensitivity of
producing strain and its deletion mutants. Producing strain (TP-A0584), ΔgodA, and ΔgodB strains can grow on the Bennett＇s agar
plate containing GS (7 µg ml -1). ΔgodA ΔgodI strain are sensitive to GS and cannot grow on the same plate. D. Analysis of GS
sensitivity of Streptomyces lividans and its transformant harboring pGODI and pGSB14K. pGODI is a plasmid that contains godI
under the ermE* promoter. pGSB14K is a cosmid that contains the genetic regions from godA to godR. Only the transformant
harboring pGODI shows GS resistance on the same plate in Fig. 1C.

ることが明らかにされた．TP-A0584 株において godI 遺質である Ffh をコードしている．SRP はタンパク質の分伝子を欠失させると，本菌株は GS に感受性を示すよう

泌・細胞内局在化に関与するタンパク質・RNA 複合体になる（ Fig. 1C ）．また，GS 感受性の S. lividans TK23であり，生物に普遍的に保存されている（ Saraogi et al.,を宿主として godI 遺伝子を異種発現すると，本菌株は2011 ）．分泌タンパク質の翻訳過程で，シグナルペプチ

GS 耐性を獲得する（ Fig. 1D ）．godI はシグナル認識粒

ドがリボソームから出現してくると SRP はこれを結合子（ Signal Recognition Particle:SRP ）の構成タンパク

し，SRP 受容体との相互作用を介して新生タンパク質－－ 130 －

ゴードスポリン作用機構の解析

Fig. 2 Schematic representation of bacterial signal recognition particle (SRP). A. Bacterial SRP consists of 4.5S RNA and Ffh,
which has N, G, and M domains. M domain is responsible for the interaction with 4.5S RNA and signal peptide (SP). B. The roleof SRP during co-translational protein targeting. (i) SRP interacts with SPs when it appears during translation. (ii) SRP-ribosome
nascent chain (RNC) complex are then targeted to cell membrane via interaction between SRP and SRP receptor. (iii) SP isreleased from SRP and transferred to SecYEG. SRP dissociates from its receptor that is triggered by the hydrolysis of GTP.

リボソーム複合体を小胞体膜や細胞膜上へと誘導する

グである Ffh（ fifty four homolog ）を主要な構成要素と（ Fig. 2 ）．真核生物の SRP においては，複数のタンパクする．Ffh は 3 つのドメインから構成されることが知ら

質が RNA と複合体を作ることが知られているが，このれており，それぞれ N ドメイン，G ドメイン，M ドメ

うち SRP54 がシグナルペプチドの結合タンパク質であインと呼ばれている．N・G ドメインは細胞膜上に存在

り，機能の中枢を担う．原核生物の SRP はより単純なする SRP 受容体と相互作用する領域であり，M ドメイ

構成であることが知られており，RNA と SRP54 ホモロンはシグナルペプチドの認識ドメインである．放線菌に－ 131 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宜，浅水

俊平，尾仲

宏康

おいても，S. lividans の SRP が，同定されている(Palacín

ドになるまで精製した．

et al., 2003)．Ffh と通常放線菌は ffh 遺伝子を 1 コピー
しか持たないが，TP-A0584 株は godI 以外にも ffh 遺伝

アミンカップリング法を用いて固定化した．Biacore

子を 1 コピー有していた．このことから，GS が Ffh を

T-200（ GE ヘルスケア）を用いて GS との相互作用を解標的として作用することが示唆されていた．これまでに析した．相互作用解析は，HBS-P バッファー（＋2.5 ％Ffh を標的とする薬剤は知られていない．そのため，GS

DMSO ）を流速 30 µl min-1 で用いて 25 ℃で行った．タの作用機序を明らかにすることで，将来的には SRP を

ンパク質を固定化していないフローセルを対照として分標的とした新規抗生物質の開発が可能になると期待され析を行った．この際，GS の終濃度が，0.8, 4, 8, 20, 40,

る．そこで本研究では，GS 作用機構の解明を目的とし100, 200, 1000 nM となるようにアナライト溶液（ HBS-Pて研究を行った．

バッファー（＋2.5 ％ DMSO ））を調製した．GsFfh を得られた組換えタンパク質をセンサーチップ CM-5 に用いた際は，10 mM Gly-HCl(pH 1.0)を 1 分間送液して，実験方法

セ ン サ ー チ ッ プ 表 面 を 再 生 し た． 解 析 終 了 後，BIA
evaluation software を用いて 1:1 結合モデルにセンサー

ビアコアを用いた表面プラズモン共鳴の観測による相互作用の解析
大腸菌発現用に最適化した遺伝子配列を設計，合成し

グラムをフィッティングし，K D 値を算出した．
ドメインスワッピングによる相互作用部位の解析

た．godI および ffh 遺伝子を PCR で増幅後（それぞれプGsFfh と GodI のキメラタンパク質遺伝子をギブソン

ラ イ マ ー No. 1 と 2 及 び No. 3 と 4 を 使 用．Table 1 ），アセンブリー法により構築した．GsFfh の NG ドメイン

pET26b(＋)ベクターにクローニングし，大腸菌 BL21(DE3)（ 1—888 塩基，M1—R296，プライマー No. 7 及び No. 8 ）株を宿主として，定法に従いヒスチジンタグ付き組換え

GodI の M ドメイン領域（ 889—1557 塩基，I297—L519，

タンパク質を調製した．この際，各遺伝子のコドンの使プライマー No.5 及び No. 6 ）及び pUC19（プライマー

用頻度を大腸菌に最適化した合成遺伝子（GENEWIZ 社）

No. 9 及び No. 10 ）をそれぞれ PCR により増幅した．増を用いた．各タンパク質は Ni-NTA カラム，陽イオン交換

幅した DNA 断片をアッセンブリー反応に供した．反応

カ ラ ム（ SP Sepharose High Performance, 16 x 180 mm,

産物を用いて E. coli DH5α を形質転換し，形質転換体か

GE ヘルスケア）を用いて，SDS-PAGE 上で単一のバン

ら 目 的 プ ラ ス ミ ド を 調 製 し た． 配 列 を 確 認 し た 後，

Table 1

Oligonucleotides used in this study.

－ 132 －

ゴードスポリン作用機構の解析

pTYM1ep ベクター（ Onaka et al., 2005 ）にサブクローを用いた．各アナライト溶液を送液する前に，異なる濃ニングし，接合法を用いて S. lividans TK23 に導入した．

度の GS と混合し，4 ℃で 3 分間インキュベートした．

また，ffh 遺伝子への部位特異的変異は，アジレント・

各サイクルの終了後に，10 mM Gly-HCl(pH 1.0)を 1 分

テクノロジー社の QuickChange Lightning Site-Directed

間送液して，センサーチップ表面を再生した．分析およMutagenesis Kit を用いて定法に従って行った．A142T

びデータの解析は，前述の方法に従った．

変異の導入にはプライマー No.11 と No. 12 を，LPG 欠
病原性放線菌由来 SRP との相互作用解析

損変異にはプライマー No. 13 と No. 14 を用いた．
目的のプラスミドを構築後，接合法を用いて各遺伝子

結核菌 Mycobacterium tuberculosis H37Rv，およびジフ

を S. lividans TK23 に導入した．得られた形質転換体をテリア菌 Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129 の培養し，胞子懸濁液として回収した後，1 スポット当たFf h [MtFf h(accession No. NP_217432) および CdFf h

り約 1,000 細胞となるよう希釈し，Fig. 2B のようにベ(accession No. CAE50059)] を，大腸菌発現用に塩基配ネット寒天培地に植菌した．30 ℃で 4 日間培養したのち，列の最適化を行い，合成 DNA を調製した．なお，合成

各形質転換体の生育を確認した．

DNA の設計と調製は，GENEWIZ 社に依頼した．各遺伝子断片を pET26b(＋) にサブクローニングし，大腸菌

GS による蛋白質の菌体外分泌阻害試験

BL21 株を宿主として組換タンパク質を調製した．上記

S. lividans TK23 株 を SL-glycerol 培 地（ Berka et al.,1996 ）に接種し，30 ℃で 2 日間培養した．この際，GS算出した．

と同様の方法で表面プラズモン共鳴を測定し，K D 値をを終濃度 0, 0.3, 3 µg ml -1 となるように添加した．培養終結果および考察了後，培養上清を回収し，トリクロロ酢酸で処理し，得られた沈殿画分を SDS-PAGE で分析した．

表面プラズモン共鳴を用いた GS と Ffh の相互作用解析
ビアコアによる Sti1 シグナルペプチド，Ffh の相互作用解析と GS による阻害試験

ビアコア T-200 を用いて SPR シグナルを観測し，GsFfh
および GodI と GS の相互作用を解析した．GsFfh をリ

Sti1 シグナルペプチド（MRNTARWA ATLGLTATAVC

ガンドとしてセンサーチップに固定化し，GS をアナラ

GPLAGASLA ）を固相合成により，調製した（ライフイトとして分析を行った．GS を 0.8 nM から 1,000 nM のテイン社）
．シグナルペプチドをアミンカップリング法

範囲で調製してフローセルに送液し，相互作用を解析しを用いてセンサーチップ CM5 に固定化した．未処理のた．その結果，GS 濃度の上昇に応じて，レスポンス値

フローセルに blank immobilization を行い，対照としてが上昇することが分かった（ Fig. 3A ）．一方，GS 耐性

用いた．アナライト溶液は 100 nM GsFfh あるいは GodI

タンパク質である GodI をセンサーチップに固定化した

Fig. 3 Surface plasmon resonance (SPR) analysis showing the interaction between GS and either of GsFfh
or GodI. A. Biacore sensorgrams showing the interaction between GsFfh and GS. B. Biacore sensorgrams
analyzing the interaction between GodI and GS. Up to 1,000 nM of GS, GodI did not show detectable interaction.

－ 133 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宜，浅水

俊平，尾仲

宏康

場合，GS 濃度を 1,000 nM まで上昇させてもセンサーグ推測した．そこで，S. lividans TK23 株培養液に GS を添

ラムの上昇は観測されなかった（ Fig. 3B ）．このことか

加して培養したのち，培養上清に存在するタンパク質をら，GS は GsFfh と特異的に相互作用することが明らか

SDS-PAGE を 用 い て 分 析 し た． そ の 結 果， 分 子 量 約になった．GsFfh と GS が 1:1 のモル比で結合すること

9 kDa のタンパク質が GS 存在下で消失することが明らを仮定してフィッティングを行い，GsFfh に対する GSかとなった（ Fig. 6 ）．タンパク質を PVDF 膜に転写後，の K D 値を 7 nM と算出した．センサーグラムの形状か

プロテインシーケンサで N 末端のアミノ酸配列を解析

らも GS が緩やかに解離していることがわかり，GsFfh

した結果，本タンパク質が Sti1 であることが明らかとと GS の相互作用が強固なものであることが示唆された．

なった．Sti1 はプロテアーゼとして知られるサブチリシンの阻害剤であり，このタンパク質が S. lividans の培養

ドメインスワッピングによる相互作用部位の解析

上清に検出されることが既に報告されている（ Strickler

一般的に，Ffh は N 末端側から N ドメイン，G ドメイ
ン，M ドメインの 3 種のドメインから構成されることがet al., 1992 ）．また，本タンパク質の分泌は SRP に依存したものであると考えられている（ Schaerlaekens et al.,

知られている．このうち，最も C 末端側に位置する M

2001 ; Keersmaeker et al., 2006 ）．そこで，本タンパク質ドメインがシグナルペプチドの認識ドメインであることの N 末端に存在するシグナルペプチドと GsFfh，GodIが 知 ら れ て い る(Saraogi et al., 2013)．GsFfh，GodI，の相互作用を解析することとした．

および放線菌由来 Ffh のアミノ酸配列を比較したとこ

Sti1 のシグナルペプチドと Ffh の相互作用，およびろ，GodI に特異的な残基として M ドメイン中に存在す

GS による阻害効果を検証した．Sti1 シグナルペプチド

る 426 番 目 の ス レ オ ニ ン 残 基 を 見 出 す こ と が で き たを化学合成し，センサーチップ CM-5 に固定化した．

（ Fig. 4 ）．他の放線菌由来の Ffh においてはこの残基はFfh および GodI をアナライトとして分析したところ，

アラニンとして保存されている．また，他の多くの原核

どちらのタンパク質も濃度依存的にセンサーグラムが上生物由来の Ffh において，この位置はメチオニン残基と昇することが分かった（ Fig. 7AB ）．それぞれの Sti1 シ

して保存されている．シグナルペプチドとの複合体結晶

グナルペプチドに対する K D 値を算出したところ，GsFfh

構 造 が 報 告 さ れ て い る Sulfolobus solfataricus 由 来 の
SRP54 の結晶構造において，このメチオニン残基はシグナルペプチドの結合部位を構成する残基の一つとして知の K D 値が 11 nM，GodI の K D 値が 18 nM と同程度の値が算出された . このことから，両タンパク質がどちらもFfh として機能していることが強く示唆された．

られている（ Janda et al. 2010 ）．これらのことから，GS

次に GS による阻害効果を検証した．アナライト溶液

が M ドメインを標的として作用すること，および GodI

（ GsFfh あるいは GodI ）にあらかじめ GS を添加してイにおいて M ドメインのアミノ酸残基の変異が GS 耐性化

ンキュベートした後，同様にフローセルに送液し，SPRに重要であると仮説を立て，検証することとした．

を測定した．その結果，GsFfh と Sti1 の相互作用は GS

初めに，GsFfh の M ドメインを GodI の M ドメイン存在下で濃度依存的に減少し，100 nM の濃度で完全にに置換したキメラタンパク質 Ffh(NG)- GodI(M) をコー阻害されることが分かった（ Fig. 7C ）．このことから，ドした変異遺伝子を構築し，S. lividans TK23 へ導入しGS がシグナルペプチドの結合を阻害していることが示た．得られた形質転換体の GS 感受性を試験したところ，唆された．一方で，GodI には阻害が見られないことか

godI 導入株と同程度の GS 耐性を示すことが分かった（ Fig.5, lane 6 ）．このことから，GodI の M ドメインがら（ Fig. 7D ），GS 存在下でも GodI はシグナルペプチドを結合できることが示唆された．そのため，GS 存在下

GS 耐性化に寄与することが明らかとなった．次に，Ffh

で GodI が Ffh の代わりに機能することで耐性が発揮さにおいて A426T 変異を導入したところ，わずかに GS 耐れると考えられる．

性を示すようになった（ Fig. 5, lane 4 ）．このことから，
アラニン残基がスレオニンへと置換することが GS 耐性

病原菌由来 Ffh と GS の相互作用化に寄与することが分かった．ただし，GodI 導入株とGS は放線菌に対して特異的に活性を示す薬剤である．

比較すると耐性が弱いため，この変異のみで耐性化を全

これは，放線菌由来の Ffh と他の生物種（原核微生物）て説明することはできず，他の残基の変異による寄与もの Ffh の構造の違いに起因すると考えた．既に述べたよあると考えられる．

うに，放線菌の Ffh においてはシグナルペプチドに近接する残基がアラニンとして保存されており，メチオニン

GS は SRP によるシグナルペプチドの結合を阻害する残基が保存されている他の原核生物由来の Ffh とは配列

GS が Ffh の M ドメインを標的とすることが示唆されが異なる．GodI ではこの残基がスレオニンに置換されたため，本化合物がタンパク質の分泌を阻害しているとることが耐性に重要であった．このことから，同じ部位－ 134 －

ゴードスポリン作用機構の解析

Fig. 4 Amino acid sequence alignment GodI and Ffhs of actinomycetes. The regions coding N, G, M domains
predicted by Pfam are shown by arrows. The position of 425T of GodI are shown by black rectangle. KsFfh :Kitasatospora setae KM-6054 ; SlFfh : Streptomyces lividans TK24 ; ScFfh : Streptomyces coelicolor A3(2) ; SaFfh :Streptomyces avermitilis NBRC 14893 ; SgFfh : Streptomyces griseus NBRC13350.

－ 135 －

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太郎，菅井

佳宜，浅水

俊平，尾仲

宏康

がアラニン残基となっている Ffh であれば GS によって阻害されると考えられる．公開データベースに登録されている Ffh の配列を精査した結果，Streptomyces 属や近縁の放線菌以外に，広義の放線菌（ actinobacteria ）に含まれる微生物の Ffh においてもこの部位がアラニンとして保存されていることを見出した．そこで，GS がそれらの Ffh も標的として活性を示すと考え，結核菌 M.
tuberculosis，およびジフテリア菌 C. diphtheriae の Ffh（ MtFfh，および CdFfh ）に対する相互作用を検証した．
各 ffh 遺伝子を大腸菌配列用に最適化した合成 DNA
として設計し，大腸菌 E. coli BL21(DE3)株を宿主として組換えタンパク質を調製した．Biacore T-200 を用いて 前 述 と 同 様 の 方 法 で 相 互 作 用 を 解 析 し た と こ ろ，
MtFfh に対する GS の K D 値が 31 nM，CdFfh に対する

K D 値が 372 nM であることが分かった（ Fig. 8 ）．このことから，GS がこれらの病原菌に対しても活性を有する

可 能 性 が 示 さ れ た． た だ し，K D 値 が 高 い こ と か ら
Fig. 5 Growth test of the transformants harboring Ff hvariants on the GS-containing plates. S. lividans
TK23 harboring Gsff h, godI, or GsFf h mutants weregrown on the plates containing various concentrations ofGS ( 0 to 30 µg m l -1 ). The transformant harboring
pTYM1ep (empty vector) was used as a control strain.
The results showed that M domain of GodI is sufficientfor the GS resistance. Site directed mutagenesis of
A426T and deletion of LPG contributed to GS resistance,but other mutation would also be required because thetransformant still could not grow on the plates containing
GS at the concentrations above 7.5 µg ml -1.

Fig. 6

GsFfh に対する相互作用よりも弱いと考えられる．センサーグラムの形状が箱型であることから GS の結合速度と解離速度が速いことがわかり，GsFfh に対する相互作
用よりも弱いことが考えられる．

SDS-PAGE analysis of the secreted proteins of S. lividans TK23 in the presence of GS.
Secretion of Sti1 was inhibited by GS. Amino acid sequence of Sti1 is shown in the right panel. SP
predicted by SignalP 4.1 is shown by bold letters.

－ 136 －

ゴードスポリン作用機構の解析

Fig. 7 Recognition of Sti1 signal peptide by GsFfh and GodI, and Biacore sensorgrams showing interference by
GS for interaction between GSFfh and signal peptide. A. Biacore sensorgrams showing the interaction between
GsFfh and Sti1 signal peptide. B. Biacore sensorgrams showing the interaction between GodI and Sti1 signal peptide.
C. GS inhibited the interaction between GsFfh and Sti1 signal peptide. GsFfh (100 nM) and GS are pre-mixed before
analysis. The interaction was completely lost at the GS concentrations above 100 nM. D. GS did not inhibit the interaction between GodI and Sti1. GodI (100 nM) and GS are pre-mixed before analysis. GodI still interacts with Sti1 even in
the presence of 1000 nM of GS.

Fig. 8 SPR analysis showing the interaction between GS and Ffhs of pathogenic actinomycetes. A. Biacore sensorgrams showing the interaction between MtFfh and GS. B. Biacore sensorgrams showing the interaction between
CdFfh and GS. MtFfh : Mycobacterium tubuerculosis H37Rv ; CdFfh : Corynebacterium diphtheriae NCTC13129.

－ 137 －

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太郎，菅井

佳宜，浅水

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宏康

型 Ffh である GodI が，Ffh の機能を代替することで耐まとめ及び今後の展望

性が発揮されると結論した．これまでに，Ffh を標的とする薬剤は知られておらず，GS はその初めての例であ2015 年に WHO が公開した資料（ Antibacterial Agents

る．結核菌などの病原性放線菌が有する Ffh と GS の間

in Clinical Development ）によると，現在，早急に対に in vitro で相互作用が検出されたことから，本研究で処 す べ き 病 原 菌 と し て 結 核 菌， カ ル バ ペ ネ ム 耐 性得られた知見をもとに新規の抗生物質の開発が可能にな

Pseudomomas aeruginosa， 同 Acinetobacter baumannii，
同 Enterobacteriaceae が指摘されている．さらに，現時ると期待される．

本助成で得られた研究成果の報告

点での抗生物質開発のパイプラインは既存抗生物質の改良によるものがほとんどであるが，このような開発では短期的な解決法にしからならず，多剤耐性菌による感染症を根本的に解決することはできない．将来におけるパンデミックな病原菌の蔓延が危惧されており，既存の抗生物質とは作用点が重ならず，耐性機構が異なる革新的な抗生物質の開発が待ち望まれている．本研究によって，GS の作用点が SRP であることが明らかとなった．今後，本知見を基に SRP を分子標的とした抗生物質が開発されることが期待できる．別項で述べるように GS 生合成
酵素は基質特異性が寛容であり，GS の骨格改変による新たな薬剤の創製が期待される．また，GS は SRP に結合する初めての薬剤であり，タンパク質の分泌・細胞内局在に関する研究に適用可能な生化学試薬としての利用も期待される．

要

約

放線菌 Streptomyces sp. TP-A0584 株が生産する二次代謝産物である GS は，様々な放線菌に対して二次代謝の誘導 , 形態分化の促進，生育の阻害など特徴的な生物活性を示すが，その分子標的は明らかにされておらず，作用機構に関する研究は進んでいなかった．本研究では ,表面プラズモン共鳴を用いて GS が SRP の構成タンパク質である Ffh と相互作用することを示した．GS 生産菌が有する Ffh ホモログである GodI は同様の条件で GSと相互作用しないこともわかり，GS 耐性型の Ffh であることが示唆された．続いて，Ffh と GodI のドメイン
スワッピングにより，標的部位がシグナルペプチドの認識を担う M ドメインであることが明らかになった．さら に， こ の 知 見 を も と に GS を 添 加 し て 放 線 菌 S.
lividans の液体培養を行ったところ，SRP 依存的である
ことが知られている Sti1 の分泌が阻害されることが分かった．化学合成した Sti1 シグナルペプチドと Ffh の間には相互作用が観測されたが，GS 存在下でこの相互作用は阻害された．同様の相互作用は GodI と Sti1 の間にも観測されたため，GodI は Ffh として機能しうると考えられる．また，GS 存在下でも GodI と Sti1 の結合は

口頭発表
1) 尾﨑太郎，浅水俊平，尾仲宏康．2013．二次代謝誘導物
質ゴードスポリン耐性化機構の解析．2013年度（第28回）日本放線菌学会大会．9月5-6日，広島．
2) Ozaki, T., Asamizu, S. & Onaka, H. 2015. Characterization of
the mechanism for the goadsporin self-resistance. Natural
Product Discovery and Development in the Post Genomic
Era. 11-14 January, San Diego, U.S.A.
3) 尾﨑太郎，浅水俊平，尾仲宏康．2015．二次代謝誘導物
質ゴードスポリンの作用機構の解析．日本農芸化学会
2015年度大会．3月27日，岡山．
4) 尾﨑太郎，浅水俊平，尾仲宏康．2015．二次代謝誘導物
質ゴードスポリンの作用に関する研究．第6回醗酵学フォーラム．9月6日，富山．
5) 尾﨑太郎，浅水俊平，尾仲宏康．2015．二次代謝誘導物
質ゴードスポリン作用機構の解析．第30回日本放線菌学会．9月7-8日，富山．
6) 尾﨑太郎，浅水俊平，尾仲宏康．2016．二次代謝誘導物
質ゴードスポリン作用機構の解析．日本農芸化学会2016
年度大会．3月28日，札幌．
7) Sugai, Y. 2016. Mode of action by goadsporin, the inducer of
secondary metabolism and morphogenesis in actinomycetes.
The 1st A3 Foresight Symposium on ＂Chemical & Synthetic
Biology of Natural Products＂. 23 August, Shanghai, China.
8) 金田彬，尾﨑太郎，菅井佳宣，浅水俊平，千田俊哉，尾仲宏康．2017．薬剤ターゲットをFfhとするゴードスポリンの新規作用機構解析．日本農芸化学会2017年度大会．3
月18日，京都．
9) Kanada, A., Ozaki, T., Sugai, Y., Asamizu, S., Senda, T. &Onaka, H. 2017. Analysis of interaction between secondary
metabolisms inducing peptide goadsporin and Ff h. A3
Foresight Network on Natural Products. 23 May, Jeju,
Korea.
10) Kanada, A., Ozaki, T., Sugai, Y., Asamizu, S., Senda, T. &Onaka, H. 2017. Analysis of interaction between secondary
metabolisms inducing peptide goadsporin and Ffh. 18th
International Symposium on the Biology of Actinomycetes.
24 May, Jeju, Korea.
11) 金田彬，菅井佳宣，浅水 俊平，千田 俊哉，尾仲 宏康．
2017．Goadsporin とそのターゲットタンパク質 Ffh の相互作用の解析．第32回日本放線菌学会．9月7-8日，長野．
12) 金田彬，尾﨑太郎，菅井佳宣，浅水俊平，千田俊哉，尾仲宏康．2018．二次代謝誘導ペプチドgoadsporinの作用解析．日本農芸化学会2018年度大会．3月15-18日，名古屋．

妨げられないことから，GS 生産菌においては GS 耐性－ 138 －

ゴードスポリン作用機構の解析

謝

辞本研究は公益財団法人発酵研究所の平成 24(2012) 年度寄付講座助成で行われたもので , ここに感謝の意を表します．また，Biacore T-200 を用いた相互作用解析でお力を賜りました高エネルギー加速器研究機構の千田俊
哉教授に感謝の意を表します．

文

献Batey, R.T., Rambo, R.P., Lucast, L., Rha, B. & Doudna, J.A. 2000.
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Thomson, N.R., James, K.D., Harris, D.E., Quail, M.A., Kieser,
H., Harper, D., Bateman, A., Brown, S., Chandra, G., Chen,
C.W., Collins, M., Cronin, A., Fraser, A., Goble, A., Hidalgo, J.,
Hornsby, T., Howarth, S., Huang, C.H., Kieser, T., Larke, L.,
Murphy, L., Oliver,. K, O'Neil, S., Rabbinowitsch, E.,
Rajandream, M.A., Ruther ford, K., Rutter, S., Seeger, K.,
Saunders, D., Sharp, S., Squares, R., Squares, S., Taylor, K.,
War ren, T., Wietzor rek, A., Woodward, J., Bar rell B.G.,
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cloning, and expression. J. Biol. Chem. 267: 3236-3241.

－ 139 －

IFO Res.Commun. 32
141-154, 2018

In vitro 再構成系を用いたゴードスポリン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計尾﨑太郎1)，菅井

佳宣，浅水

俊平，尾仲

東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻

宏康

微生物潜在機能探索寄付講座〒113-8657 東京都文京区弥生1-1-1

Dissection of goadsporin biosynthetic machinery by in vitro reconstitution leading
to in vivo production of designer analogues
Taro Ozaki1), Yoshinori Sugai, Shumpei Asamizu, Hiroyasu Onaka
Laboratory of Microbial Metabolic Potential,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
1-1-1 Yayoi, Bunkyo, Tokyo 113-8657, Japan
Goadsporin (GS) is a member of a growing family of natural products called RiPPs (Ribosomally synthesized andPost-translationally modified Peptides). GS has a unique linear structure containing an N-terminal acetyl moiety,six azoles, and two dehydroalanines in the peptidic main chain. Although the enzymes involved in GS biosynthesis
have already been identified, substrate tolerance and recognition determinants of the respective enzymes have yet
to be elucidated. In the present study, we report a one-pot synthesis of GS using a flexible in vitro translation
system (FIT system) integrated with recombinant enzymes. The FIT system allows us to readily prepare not only
the precursor peptide GodA from its synthetic DNA template, but also 52 mutants, enabling us to analyze substratetolerance of each modification enzyme and the modification determinants of the GodA sequence. The knowledge
obtained from in vitro experiments has also led us to rationally design and produce GS analogues in vivo. The
methodology demonstrated in this study can also be applied to other RiPP biosynthetic machinery, enabling rapid
investigation of post-translational modifications that confer structural diversity and biological activity.
Key words: goadsporin, biosynthesis, RiPPs, in vitro translation緒

scabies JCM 7914 の よ う な 病 原 菌 も 含 ま れ る． ま た，
1 µM 程度の低濃度において GS は放線菌の形態分化や二言

次代謝を誘導することも知られている．さらに GS はタ

ゴードスポリン（goadsporin, GS ）は放線菌 Streptomyces

ンパク質の分泌・局在に関わるシグナル認識粒子（Signal

sp. TP-A0584 が生産する二次代謝産物である（ Onaka etrecognition particle ; SRP ）を標的とする，報告例のない

al., 2001 ）．19 残基の直鎖ペプチドの骨格が，複素環やデヒドロアラニン，アセチル基で高度に修飾された特異作用機序を有することが示唆されている．これらのことな構造を有している（ Igarashi et al., 2001 ）．GS は放線する化学ツール開発のための魅力的な骨格を有している菌に対して，顕著な抗菌活性を示す．標的とする放線菌といえる．

から，GS は新規の抗生物質や潜在的二次代謝を活性化

GS の生合成遺伝子クラスターは 10 の遺伝子から構成には，ジャガイモそうか病の原因菌である Streptomyces

さ れ る（ godA - I，godR ）（ Onaka et al., 2005 ）． こ の う
現北海道大学理学研究院
E-mail: 尾﨑太郎:ozaki@sci.hokudai.ac.jp
尾仲宏康:aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
共同研究者:後藤佑樹（東京大学大学院理学系研究科），
菅 裕明（東京大学大学院理学系研究科），
池田治生（北里大学北里生命科学研究所）
1)

ち godA 遺伝子は 150 bp の短い遺伝子であり，49 残基のペプチド GodA をコードしている．GodA の C 末端側 19
残基は GS の構造に対応した配列であり，この部分が生合成酵素による翻訳後修飾を受けることで GS が生合成される．このような特徴を有するペプチド系天然物を－ 141 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宣，浅水

俊平，尾仲

宏康

RiPPs（ Ribosomally-synthesized and Post-translationally

ボ ザ イ ム を 組 み 合 わ せ る こ と で FIT（ flexible in vitro

modified Peptides ）と総称することが提唱されている

translation ）システムを開発した．本システムでは，鋳（ Arnison et al., 2013 ）．RiPPs には顕著な生物活性を有型となる DNA を添加することで，天然・非天然アミノする分子が多いことから，近年注目されている化合物群

酸を構成単位とする様々なペプチドを簡便に合成するこの一つである．また，RiPPs の翻訳後修飾酵素には寛容とが可能である．後藤ら(2014)はさらに，FIT システムな基質特異性を示すものが多く知られており，生合成工を用いて脱水環化酵素 PatD の基質特異性を詳細に調査

学による経路の改変・新規類縁体の創製などの点からもし，本酵素が広範な基質を in vitro で修飾可能であるこ有望な一群である．

とを示した．本論文では，FIT システムを用いて GodA

GS の生合成においては，初めに GodA が godA 遺伝子を調製し，翻訳後修飾酵素による反応に供することで，の転写と翻訳により合成される．GodA の N 末端側 30

ワンポットで GS を合成することに成功した（ Fig. 1 ）．

残基はリーダーペプチド（ LP ）と呼ばれ，修飾酵素にさらに，様々な基質類縁体を調製し翻訳後修飾酵素の基よる基質認識部位だと考えられている．これに対して，

質特異性を網羅的に検証した．得られた知見を応用する

C 末端側 19 残基はコアペプチド（ CP ）と呼ばれ，前述

ことで新たな GS 類縁体を論理的に設計することが可能のようにこの領域が修飾を受けることで GS が生合成さとなり，in vitro だけでなく in vivo の生産系にも適用でれる．CP に存在するセリン・スレオニン ･ システイン

きることを示した．

残基は，YcaO ドメインを有する脱水環化酵素（ Li et al.,

実験方法

1996 ; Dunbar et al., 2012 ; Dunbar et al., 2014 ; Koehnke,
et al., 2013 ; Schmidt et al., 2005 ）である GodD とニトロ
リダクダーゼドメインを有する脱水素酵素（ Li et al.,

前駆体ペプチド GodA* およびそのアナログ体合成のた1996 ; Melby et al., 2014 ; Milne, et al. 1999 ）GodE によりめの鋳型 DNA の調製

アゾリンを経て複素芳香環であるアゾールへと変換されGodA およびそのアナログ体の配列をコードした合成

る．また，一部のセリン残基は O -グルタミル化とグル

DNA をプライマー伸長と PCR により調製した．各反応

タミン酸の脱離によって，デヒドロアラニンへと変換さには KOD-Plus-Ver. 2（東洋紡）を利用した（プライマーれる．これらの反応はランチペプチド脱水酵素 LanBの詳細は Ozaki et al.(2017)の Supplementary Table 5 及（Garg et al., 2013 ; Ortega et al., 2015）の N 末端ドメイン，

び 6 を参照のこと）．プライマー伸長は 100 µl のスケー

C 末端ドメインとそれぞれ相同性を示す GodF と GodG

ルで行い，95 ℃で 1 分間インキュベートした後，各プラによって触媒される（Ozaki et al., 2015）．N 末端の LP は，

イマーを終濃度 1 µM で使用した．50 ℃で 1 分間のアニー

GodB によって消化されると考えられる．LP の消化にリングと 68 ℃で 1 分間の伸長を 5 サイクル行った．反よって生じたアミノ基が，GNAT ドメイン（ Vetting et

応液のうち 5 µl を PCR の鋳型として用いた．1 段階目のal., 2005 ; Reyna-González et al., 2016 ）を有するアセチル基転移酵素 GodH によってアセチル化されることで GS

PCR は，100 µl の反応溶液でプライマー濃度 0.5 µM で行った．95 ℃で 40 秒，50 ℃で 40 秒，68 ℃で 40 秒のサが生成する．

イクルを 5 回行った．この反応液から 0.5 µl を以降のRiPPs 生合成における翻訳後修飾酵素は，しばしば寛PCR の鋳型とした．最終段階の PCR は同様の反応を 14

容な基質特異性を示す．そのため，前駆体遺伝子に変異

サイクル行った．アガロースゲル電気泳動で増幅を確認を導入することで生合成経路に前駆体アナログを供給した後，FastGene Gel/PCR Extraction（ニッポンジーン）

し，類縁体を創製する試みがなされてきた（ Zhang &を用いて目的断片を精製した．

Kelly, 2012 ; Zhang & Liu, 2013 ; Deane et al., 2013 ;Tianero et al., 2012 ）．しかし，各修飾酵素の基質特異性

生合成遺伝子のクローニングと組換えタンパク質の調製を検証するには，基質となるペプチドを化学合成や組換

GS 生合成酵素は，大腸菌 BL21(DE3)を宿主としたえタンパク質として調製する必要があり，それらの作業

組換えタンパク質として調製した．godD の塩基配列は，には多大な労力が必要とされる．GS 生合成に関しては，大腸菌を宿主とした発現系に合わせてコドンの使用頻度

既にいくつかの類縁体創製が可能であることは示されてを最適化した．合成 DNA を鋳型として PCR により目的いたが（ Onaka et al., 2005 ），各修飾酵素の基質認識に配列を増幅した後，
pET16b の NdeI-XhoI サイトにクローついて系統的な検証は行われていなかった．

ニングした．godE，godF，godH は，TP-A0584 株のゲノ本研究では，無細胞翻訳系を用いて前駆体ペプチドを

ム DNA を 鋳 型 と し た PCR に よ り 増 幅 し， そ れ ぞ れ

合成し，GS 生合成酵素の基質特異性を調査することと

pET26b(＋) の NdeI-HindIII サイト，pET15b の NdeI-XhoI

した．後藤ら(2011)は，再構成無細胞翻訳系と人工リサイトにクローニングした．lazF は，コスミド pKU465-－ 142 －

In vitro 再構成系を用いたゴードスポリン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計

Fig. 1 Schematic representation of FIT-GS system. After DNA templates are prepared by primer extension and PCR,
precursor peptides can be synthesized by in vitro transcription and translation. Post-translational modification of synthesized peptide yielded goadsporin (GS).

－ 143 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宣，浅水

ltc18-6C（ Hayashi et al., 2014 ）を鋳型とした PCR によ

俊平，尾仲

宏康

り増幅し，pET26b(＋) の NdeI-XhoI サイトにクローニン

ΔgodA/pGODR を宿主として，GS アナログを生産した．
各形質転換体を 7 日間培養した後，n -ブタノールで抽出

グした．

し，LC-MS（ ACQUITY UFLC, Xevo G2-S Tof, Waters ）構 築 し た プ ラ ス ミ ド pET16-godD，pET26-godE ，を用いて分析した．

pET15-godF，pET15-godH ，pET26-lazF を そ れ ぞ れBL21(DE3) に導入した．GodD の発現の際は，シャペ

GS-10SA11 の精製

ロンプラスミド pGro7(タカラバイオ株式会社)も導入

Streptomyces sp. TP-A0584 ΔgodA に pTYM-10SA11 お
よび pGODR を導入した．形質転換体を V-22 培地（Onaka

し，シャペロンタンパク質 GroEL，GroES との共発現を 行 っ た． 得 ら れ た 形 質 転 換 体 を カ ル ベ ニ シ リ ン（ 50 µg/ml ），クロラムフェニコール（ 20 µg/ml ），アラ

et al., 2001 ）に接種し，30 ℃で 3 日間培養した．この培
養 液 を 種 培 養 と し，3 ml を 100 ml の GS 培 地（ 6.0 ％ビノース（ 0.5 µg/ml ）を含む LB 培地に植菌し，30 ℃

maltose，4.0 ％ pharmamedia，1.0 ％ yeast extract，1.0 ％で 2 時間培養した．その後，培養温度を 18 ℃に下げ，

diaion HP20，pH 7.0 ）に植え継いだ．培地は 500 ml 容

さらに 20 時間培養した．そのほかのタンパク質についK-1 フラスコに調製し，30 ℃で 7 日間培養した．

ては，形質転換体を ZYM-5052 培地に植菌し，18 ℃で2.8 l の培養液を調製し，等量の n -ブタノールを用いて

20 時間培養した．培養終了後，菌体を 4,720 g で 10 分間抽出した．有機層を回収し，ロータリーエバポレーター

遠心し，菌体を回収した．

を用いて乾固することで 11 g の粗抽出物を得た．この

各 菌 体 を 緩 衝 液（ 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM

乾固物を 500 ml の水に懸濁し，n - ヘキサンによる洗浄

NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0 ）に懸濁し，菌体を破砕を 2 回行った．水層を回収し，等量の酢酸エチルで 2 回した．10,300 g で 30 分間遠心し，未破砕の細胞と不溶性抽出した．酢酸エチル層を回収し，乾固することで 1.2 g

画分を除いた．可溶性画分を Ni -アフィニティークロマ

の抽出物を得た．この抽出物をクロロホルム:メタノー

トグラフィーに供し，目的タンパク質を精製した．

ル（ 10:1 ）に溶解し，LH-20 カラムクロマトグラフィーに供した．クロロホルム:メタノール（ 10:1 ）を用い酵素反応条件てカラムを展開し，GS-10SA11 を含む画分を集めて乾固

翻訳因子，酵素，リボソーム等を論文に記載の方法でした．得られた 0.3 g の粗精製サンプルを HPLC
（カラム:

調製した（ Goto et al., 2011 ）（各酵素，化合物の終濃度

Protein-R（ 5 µm, φ4.6 x 250 mm, ナカライテスク），溶媒:などの詳細は Ozaki et al.(2017) を参照のこと）．翻訳反

アセトニトリル，水，TFA（ 10 ％アセトニトリル 0 - 2 min，

応は 0.25 µl の鋳型 DNA を含む 2.5 µl の反応溶液で行い，10 - 95 ％アセトニトリル 2 - 25 min，95 ％アセトニトリ

37 ℃で 30 分間反応を行った．翻訳終了後，反応溶液に

ル 25 - 30 min, 0.1 ％ TFA を 添 加 ）， 流 速:1.5 ml min-1 ，

修 飾 酵 素 を 終 濃 度 各 1 µM で 添 加 し，10 mM MgCl 2 ，

温度:40 ℃）を用いて精製した．約 2.5 mg の精製品を

5 mM ATP，1 mM DTT の存在下，15 µl の溶液中で反応得られるまで HPLC による精製を繰り返した．

を行った．25 ℃で 24 時間反応を行った後，C-Tip C18 カ
ラ ム（ 日 京 テ ク ノ ス ） を 用 い て サ ン プ ル を 脱 塩 し，GS-tandem の生産
GS-tandem の配列をコードした合成 DNA（ Genewiz

MALDI-TOF-MS（ ultrafleXtreme, ブルカーダルトニク社）を，pTYM1gk の NdeI-HindIII サイトに挿入した．

ス）により分析した．
GS 酵素合成の際は，翻訳反応を 7.5 µl のスケールでこのプラスミドを Streptomyces sp. TP-A0584 ΔgodA に導行った．この反応産物を上記と同様の修飾反応に供した．

入し，得られた形質転換体を GS-10SA11 と同様の方法

反応の進行を確認した後，30 µl の反応液に 1 µg の GluCで培養した．

エンドペプチダーゼ（ロシュ）を添加し，37 ℃で 1 時間

2.9 l の培養液を調製し，クロロホルム:メタノール

反応を行った．消化反応後，GodH を終濃度 6 µM とな（ 1:1 ）を用いて抽出した．有機層を回収し，ロータリー

るように添加し，30 ℃で 1 時間反応を行った．反応溶液

エバポレーターを用いて乾固した．その乾固物を 90 ％を凍結乾燥した後，100 µl の DMSO に溶解し，LC-MS

メタノールに懸濁し，n - ヘキサンで洗浄した．90 ％メタ（amaZon-SL，ブルカーダルトニクス）を用いて分析した．

ノール層を回収・乾固し，2.2 g の粗抽出物を得た．この抽出物を 60 ％メタノールに溶解し，ジクロロメタンを

in vivo での GS アナログの生産

用いて抽出した．ジクロロメタン層を回収・乾固し，0.7 g

godA への部位特異的変異の導入と類縁体の生産は，既存の方法に従った（ Onaka et al., 2005 ）．Streptomycesの抽出物を得た．この抽出物をクロロホルム:メタノー

sp. TP-A0584 ΔgodA および Streptomyces sp. TP-A0584

フィーに供した．クロロホルム:メタノール（ 5:1 ）でル（ 5:1 ）に溶解し，シリカゲルカラムクロマトグラ－ 144 －

In vitro 再構成系を用いたゴードスポリン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計

カラムを展開し，GS-tandem を含む画分を回収・乾固しての機能を有することが支持された．

した．得られた部分精製品をクロロホルム:メタノール（ 10:1 ）に溶解し，LH-20 カラムクロマトグラフィーに

FIT-GS システムの構築供した．クロロホルム:メタノール（ 10:1 ）でカラム

初めに，GodD を用いた GodA* へのアゾリンの導入を展開し，22 mg の粗精製品を得た．このサンプルをHPLC

修飾を試みた．反応後，MALDI-TOF-MS を用いて分析（カラム:Protein-R（ 5 µm, φ10 x 250 mm, ナカライテス

したところ，m/z 5,448，5,430，5,412，5,394 を示すシク）
，溶媒:アセトニトリル，水，TFA（ 59 ％アセトニト

グナルが観測された（ Fig. 2B ）．これらはそれぞれ 2，3，

リル，0.05 ％ TFA を 添 加 ）， 流 速:3.0 ml min-1 ， 温 度:

4，5 か所にアゾリンが導入された分子量と一致してい40 ℃）を用いて精製した．2.1 mg の GS-tandem を得た．

結る．この反応系に GodE を添加して同時に反応を行った
ところ，m/z 5,364 を示すシグナルがただ一つ主要な生果

成物として観測された（ Fig. 2C ）．これは，GodA* に 6
つのアゾールが導入されたものと一致するシグナルであ前駆体ペプチド GodA* の調製り，GodD と GodE によって GodA* が期待通りの修飾を前駆体ペプチド GodA を再構成無細胞翻訳系 FIT シス

受けたことが示唆された．

テムを用いて調製した．この際，MALDI-TOF-MS で分

次にデヒドロアラニンの導入を試みた．著者らはこれ析する際のイオン化効率を向上させるために，開始メチ

までにデヒドロアラニン残基が GodF によって触媒されオニンの直後に連続したリジン残基を三つ挿入した．まるセリン残基の O -グルタミル化と GodG によるグルタ

た，LP の消化を担うと考えられた GodB は膜結合ドメ

ミン酸の脱離によって導入されることを，著者らによるインを有し，可溶性タンパク質として調製することがで遺伝子破壊実験およびナイシン生合成酵素 NisB についき な か っ た． そ のた め， 市 販 の エ ン ド プ ロ テ ア ーゼて Ortega ら(2015)が報告した知見を基に提唱している

GluC で消化できるよう，CP の直前にグルタミン酸残基（ Ozaki et al., 2016 ）．GodF を GodD，GodE と と も にを挿入した．この改変 GodA を GodA* と呼称する．FIT

GodA* と反応させたところ，m/z 5493 を示すシグナルシステムを用いて GodA* を翻訳合成した後，MALDI-が新たに観測された（ Fig. 2D ）．これは GodA* に 6 個

TOF-MS を用いて分析した結果，m/z 5,482 を示すシグのアゾールと 1 個のグルタミル基が導入された分子量とナルが検出された（ Fig. 2A ）．これは GodA* に存在す

一 致 す る．FIT シ ス テ ム に は 大 腸 菌 由 来 の tRNAGlu とる 2 残基のシステイン間でジスルフィド結合を形成した

GluRS が含まれているため，これらが GodF の補基質とものと一致する．そのため，以降の修飾反応では終濃度して利用されたと考えられる．一方で，GodF のみを

1 mM の DTT を添加して実験を行った．

GodA* と反応させてもグルタミル化活性は検出されな修飾酵素の調製の導入が GodF による基質認識に必須であることが示唆かった．このことから，GodD，GodE によるアゾール
GS の生合成酵素は，大腸菌を宿主とした組換えタンされた．

パク質として調製した．GodD，GodE，GodF，GodH

さらに，LazF を GodD，GodE，GodF とともに GodA*は 可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て 発 現・ 精 製 が で き た が，と反応させると，m/z 5,328 を示すシグナルが観測されGodG については活性タンパク質を得ることができな

た（ Fig. 2E ）．これは 6 つのアゾールと 2 つのデヒドロかった．そのため，ラクタゾール生合成経路における相アラニンが導入された GodA* と一致する値であり，期

同 タ ン パ ク 質 LazF を 代 わ り に 利 用 す る こ と に し た

待通りの修飾がすべて行われたことが示唆された．この（ Hayashi et al., 2014 ）．LazF は GodG に相同性を示す Nことから，GodA* の LP とラクタゾール前駆体ペプチド

末端ドメインとともに，C 末端領域にはアゾリンをアの LP の配列は大きく異なるものの，その違いは LazF

ゾールへと酸化する脱水素酵素ドメインを有する二機能によるグルタミン酸の脱離反応には影響がないことが示性酵素であり，可溶性タンパク質として発現・精製する

唆された．

ことができた．精製した GodE と LazF は黄色を呈して最 後 に， 上 記 の 修 飾 反 応 を 行 っ た 後， 反 応 溶 液 におり，補酵素としてフラビンが結合していると考えられ

GluC および GodH を順次添加して，LP の消化，およびた．メタノールで処理して酵素を失活させた後，その上アセチル化反応を行った．反応産物を LC-MS で分析し清を LC-MS で分析したところフラビンモノヌクレオチたところ，標品の GS と溶出時間，MS3 における開裂様

ド（ FMN ）が検出され，上記の推測が裏付けられた．

式が一致するシグナルが検出された（ Fig. 2FGH ）．以

また，同様の分析により，GodH がアセチル CoA と共上の結果から，試験管内反応によって GS が合成された

精製されたことも明らかになり，アセチル基転移酵素とことが示された．

－ 145 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宣，浅水

俊平，尾仲

宏康

Fig. 2 MALDI-TOF-MS and LC-MS spectra of GS and GS intermediate. A-E. MALDI-TOF-MS spectra of GodA* (A), reaction
products of GodD reaction (B), GodDE reaction (C), GodDEF reaction (D), and GodDEF and LazF reaction (E). F. Chromatgrams showing total ion current (TIC) of LC-MS3 analysis of enzymatically synthesized GS and authentic one. G. MS3 spectra of
enzymatically synthesized GS and authentic one. H. Observed MS3 fragmentation of GS.

GodA への変異導入によるアゾール形成反応の解析は修飾されなかった．このことは，これら 2 種のペプチ

鋳型 DNA の調製に用いるオリゴ DNA の配列を変える

ドには基質認識に重要な因子が欠けていることを示唆しことで，godA* の塩基配列へ迅速に変異を導入することている．GodA*1- 9 と GodA*1- 6 の配列には本来のアゾーができる．この点を利用して，アゾール形成酵素群 GodD，

ル形成部位である T2 ，T5，C8 以外に，S4，S9 も修飾

GodE の基質受容能を検証した．初めに，CP 領域を部

個所の候補として存在した．そのため，GodA*1- 9 -T2A/

分 的 に 欠 損 さ せ た GodA*1- 9，GodA*1- 6，GodA*1- 3，

T5A/C8A および GodA*1- 6 -T2A/T5A を調製し，同様に

GodA*1- 2，GodA*2 - 3 を調製した（ Fig. 3A, entry 2 - 6 ）．

GodD，GodE によるアゾールの導入を試みた．反応溶液

これらに GodD，GodE を作用させたところ，期待通りを分析したところ，アゾール形成は確認されず，基質ペGodA*1- 9，GodA*1- 6，GodA*1- 3 に そ れ ぞ れ 3，2，1 つ

プチドのシグナルが観測された．同様に GodA*1- 3 -T2Aのアゾールが導入された．一方で，GodA*1- 2，GodA*2 - 3

も修飾を受けなかった（Fig. 3A, entry 7- 9 ）．これらから，－ 146 －

In vitro 再構成系を用いたゴードスポリン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計

Fig. 3 GS analogs constructed by FIT-GS system. A. Summary of azole formation catalyzed by GodD and GodE. The aminoacid sequences of core peptides of synthesized GodA* derivatives are shown. B. Summary of dehydroalanine formation
by GodF and LazF. GodD and GodE are also included in the reaction mixture. The amino acid sequences of core peptidesof synthesized GodA* derivatives are shown. C. Summary of the LP truncation analyses in the reaction with GodD,
GodE, GodF, and LazF. D. Summary of azole installation into the designer GodA* derivatives by GodD and GodE.

－ 147 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宣，浅水

俊平，尾仲

宏康

上記の変異体においても従来の位置（ T2 ，T5，C8）にド ロ ア ラ ニ ン は 形 成 さ れ な か っ た（ Fig. 3B, entry

アゾールが導入されていると結論した．

40 - 43 ）．このことは，CP 全長が GodF と LazF の反応に

次に，アゾールに隣接する残基が修飾に影響するか調必要であることを示唆している．そこで，次に 2 種の変べるために，GodA*1- 8 および GodA*2 - 9 を調製し，試

異 体 GodA*T5A と GodA*S15A を 調 製 し た．T5 と T15

験した．これらの変異体には GodA*1- 9 と同様に 3 か所

はデヒドロアラニンに隣接したアゾール形成部位であのアゾール形成部位が存在するが，2 個のアゾールしかり，これらのアゾールがデヒドロアラニンの形成に重要

形成されなかった．同様に GodA*1- 6 に欠失変異を導入か検証することができる．欠損変異体の結果と同様，どした GodA*1- 5 および GodA*1- 6 には 1 つのアゾールしちらの変異体も GodF，LazF による修飾を受けなかっか導入されなかった（ Fig. 3A, entry 10 -13 ）．既に述べた（Fig. 3B, entry 44, 45）．このことから，これらのアゾーたように GodA*1- 2 と GodA*2 - 3 が修飾を受けないこと

ルの形成がデヒドロアラニンの形成に必須であると結論も合わせて考えると，X1 -(S/T/C)- X2 という 3 残基のモした．
次に，デヒドロアラニンの形成残基をアラニンに置換

チーフがアゾールの形成に必要であるという仮説を導くした GodA*S4A と GodA*S14A を調製した．上流側の S4ことができた．
この仮説を検証するために，GodA*1- 3 に 2 か所の変を置換した場合，S14 はデヒドロアラニンへと変換され異を導入した 6 種の変異体を調製した（ Fig. 3A, entry

なかった．一方で，下流側の S14 を置換した場合，S4

14 -19 ）．これらの変異体においてはアゾール導入されるがデヒドロアラニンへと変換されることが分かった

S/T/C の位置が入れ替わって (S/T/C) - X1 - X2，あるい（ Fig. 3B, entry 46, 47 ）． こ れ ら の 結 果 を 考 慮 す る と，は X1- X2 -(S/T/C) となっている．予想通りこれらの変GodF，LazF によるデヒドロアラニン形成においては異体は GodD，GodE による修飾を受けなかった．同様

T5 と T15 位のアゾール形成の認識が必要であり，更にの変異を GodA*1- 9 と GodA*1- 6 に導入したところ，そ両酵素は S4 を先にデヒドロアラニンへと変換すること

れらの変異体においても，変異箇所のアゾールが形成さが明らかになった．

れないことが分かった（ Fig. 3A, entry 20 - 25 ）．ただし，例外的に GodA*1- 9 - L7C/C8L についてはアゾリン形成

LP 領域の欠損
RiPPs の生合成において前駆体ペプチドの N 末端領域まで反応が進行した．
次に，GodD，GodE が修飾を受ける S/T/C の位置をに存在する LP が，翻訳後修飾酵素の基質認識に重要で厳密に認識している可能性を検証した．GodA*1- 9 にあることが，一般的に知られている．そのため，GS のAla 挿入変異を導入した 3 種の変異体を調製したが，こ生合成においても GodA の LP が同様の機能を有するこ

れらの変異体には 3 つのアゾールが導入された（Fig. 3A,とが期待される．しかしながら，LP 全長が必要となる

entry 26 - 28 ）．この結果から，X1 -(S/T/C)- X2 が基質認かどうかはこれまでに明らかにされていない．
そこで，LP 領域を N 末端側から欠損させた 5 種の変異識を決定するモチーフであると結論した．
次に，X 1 -(S/T/C)- X 2 に対して変異を導入し，GodD，体を調製した（Fig. 3C, entry 49 - 53 ）．GodA*LP(- 25)-( -1)

GodE の基質受容能を調査した．この際，最小単位であ

お よ び GodA*LP( - 20)-( -1) は，GodD，GodE，GodF，る GodA*1-3 を基本骨格として変異を導入した．T2 を C

LazF によってすべての修飾を受けることが分かった．

および S に置換したところ，どちらも修飾を受けた．次

一方で，GodA*LP( -15)-( -1) の場合は，アゾールが 5 つに A1 を E，R，Y，W に置換したところ，いずれの変導入されたペプチドを主生成物として，いくつかの修飾

異体も修飾を受けなかった．一方，V3 にも同様の変異産物が検出された．さらに LP を切り縮めた GodA*LPを導入したところ，V3E 以外の変異体はいずれも修飾さ( -10)-( -1) や GodA*LP( - 6)-( -1) は全く修飾されないこれた（ Fig. 3A, entry 29 - 38 ）．以上のことから，X1 残基とが明らかになった．これらの結果から，LP 領域のう置換できることが示唆された．

とが示唆された．鎖長のより短いペプチドのほうが扱いの変異は許容されず，X2 残基は酸性アミノ酸以外には

ち C 末端側の 20 残基が修飾酵素の認識に重要であるこが容易であるため，これらの知見はさらなる類縁体創製

GodA への変異導入によるデヒドロアラニン形成反応のを容易にすることが期待される．

解析
アゾール形成反応と同様に，GodF，LazF によるデヒ

論理的に設計した GS アナログの試験管内生合成

ドロアラニン形成反応を検証した．初めに，4 種の欠損

以上の知見に基づいて，新たな前駆体ペプチド GodA*-

変 異 体 GodA*1-16，GodA*1-13，GodA*1- 9，GodA*1- 6

10SA11 を設計した．この変異体は，CP の G10 と C11を調製した．驚くべきことに，いずれの変異体にもデヒの間にセリンとアラニンが挿入された配列を有してい－ 148 －

In vitro 再構成系を用いたゴードスポリン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計る．これにより，CP 中央に新たな X 1 -(S/T/C)- X 2 モチーの酵素が用いられており，得られた結果の解釈には注意

フ（ GSA ）ができるため，この部位にアゾールが導入を払わなくてはならない．In vitro で得られた知見が inされることを期待した．この前駆体を GodD，GodE による反応に供したところ，期待通り 7 つのアゾールが導vivo での物質生産にも応用可能であるか精査するために，GodA 類縁体の生産を in vivo で検証することとした．

入されたことが明らかになった（ Fig. 3D, entry 54 ）．

初めに，in vitro での結果からアゾールの形成を受け次に，更に鎖長の長いペプチドにアゾールを導入するないと予測される部位へ変異を導入した 10 種の類縁体ことができるか検証するために，GodA*-tandem を調製（ A1S ，V3S ，I6S ，L7S ，G10S ，G11S ，L13S ，A16S ，した．この変異体は，GodA の CP 配列が 2 回繰り返し

G17S，V19S ）を発現した（ Fig. 4, entry 2-12 ）．生産さた 38 残基の CP を有している．同様に GodD，GodE 反れた GS 類縁体を LC-MS により分析した．主生成物の応に供したところ，12 個のアゾールが導入された．以MS フラグメンテーションのパターンを解析したとこ

上のことから，一連の変異体の解析から得られた知見がろ，本来修飾されるべき位置にはアゾールが導入されて新たな GS 誘導体の創製に応用可能であることが示されいる一方で，変異により新たに導入したセリン残基は変た（ Fig. 3D, entry 55 ）．

換されていないことが分かった．例外的に，L7S 変異体の場合には，この部位がデヒドロアラニンへと変換されIn vivo での GS 類縁体の生産
著 者 ら は こ れ ま で に GS 生 産 菌 Streptomyces sp.
TP-A0584 ΔgodA を宿主として godA 変異体を発現することで，GS 類縁体の生産が可能であることを示してきたた化合物がわずかに生産された．以上のように新たに導入したセリン残基がアゾールへと変換されなかったことから，in vivo においても X1 -(S/T/C)- X 2 がアゾールの形成に必要であることが示唆された．

（ Onaka et al., 2005 ）．また，生合成遺伝子クラスター中に存在する転写活性化因子 godR の過剰発現によって，次に，in vitro では X 1 -(S/T/C)- X 2 のうち，X2 は変異が許容されたことから，I6Y と V19Y の 2 種類の変異体

生産量が増加することも見出している（ Haginaka et al.,産生を試みた（ Fig. 4, entry 13, 14 ）．変異 godA を宿主

2014 ）．再構成無細胞翻訳系の利用により，修飾酵素群へ導入し，形質転換体を培養したところ，どちらの類縁の基質受容能を迅速に評価することが可能になったが，体も生産されることが分かった．本実験から，これらのそれらの試験管内反応では基質と同等あるいは過剰な量類縁体が GS でみられるすべての修飾を受けていたこと

Fig. 4

Summar y of GS analogues produced by in vivo expression of GodA derivatives.

－ 149 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宣，浅水

が示され，X 1 -(S/T/C)- X 2 のうち X 2 について in vitro で試験したものと同様の変異を in vivo でも導入可能であることが強く示唆された．

俊平，尾仲

宏康

本研究によって，アゾール形成酵素群 GodD，GodEの基質認識に X 1 -(S/T/C)- X 2 モチーフが重要であることを見出した．これによって 3 残基から 38 残基までのア

さらに，GodA-10SA11 についても，in vivo で発現をゾール含有ペプチドが本生合成系によって合成可能であ試みた（ Fig. 4, entry 15 ; Fig. 5 ABCD ）．形質転換体をることを示した．著者らの知る限りでは，3 残基のよう培養した結果，7 箇所のアゾールと 2 残基のデヒドロアに短いペプチドは，アゾールを含有する RiPPs では知ら

ラニン，N 末端のアセチル基が導入された GS-10SA11

れていない．しかしながら，in vitro での調製に成功しが確かに生産された．得られた化合物の構造は，1 次元たことから，in vivo での生産の可能性が示されただけ

および 2 次元の NMR，MS フラグメンテーション，高でなく，得られる産物の生物活性の検証も可能になると分解能質量分析によって行った．GodA-tandem につい期待される．さらに，in vitro，in vivo どちらにおいてても同様に 12 個のアゾール，4 残基のデヒドロアラニン，

も X 1 -(S/T/C)- X 2 モチーフのうち X2 に変異を導入した

N 末端のアセチル基が導入された化合物の生産が確認さ類縁体の生産に成功した．さらに新たにアゾール形成部

れた（ Fig. 4, entry 16 ; Fig. 5 EFGH ）．本生産物に関し位を創出することにも成功した．これらのことから，ては，MS フラグメンテーションと高分解能質量分析に

GS 生合成系は基質受容能が高く，類縁体生産へ応用可

よって構造解析を行った．

能であるといえる．

考GodD，GodE により触媒される X 1 -(S/T/C)- X 2 モチー

察

フへのアゾール導入は，既知のアゾール・アゾリン導入
酵素とは異なるユニークなものである．例えば，パテラ

再構成無細胞翻訳系 FIT システムと生合成酵素群を組

ミドの生合成においては，PatD，PatG によって 2 残基

み合わせることで，鋳型 DNA を開始基質として GS を

ご と に ア ゾ ー ル・ ア ゾ リ ン が 導 入 さ れ る． 近 年，in

酵素を用いて人工的に合成することに成功した．この試
験管内合成系は，あたかも生体内における RiPPs 生合成

vitro においては PatD が連続した S/T/C 残基に対してもアゾリンを導入可能であることも示された（ Goto et al.,を連想させるものであり，鋳型 DNA の転写と翻訳，62014 ）．連続した残基へのアゾール導入は，天然の生合

つの修飾酵素によるアゾールとデヒドロアラニンの形

成系においても知られており，プランタゾリシン生合成

成，LP の消化，アセチル化により，基質や中間体を精酵素 BamB，BamC，BamD やチオムラシン生合成にお製することなく，ワンポットで GS を合成できる．コス

ける TbtE，TbtF，TbtG などが例として挙げられる．そトを考えると，この in vitro 合成系はあくまで小スケーの た め，GodD，GodE に よ る X 1 -(S/T/C)- X 2 モ チ ー フルでの定性的な解析に適したものであり，定量的な解析へのアゾールの導入は，ユニークなモチーフ認識によるには向いていない．しかしながら，本反応系を確立した

アゾール導入酵素例である．しかしながら，将来同様のことで，望みの配列を有する鋳型 DNA を調製するのみ

酵素は天然からさらに発見され得ると考えられる．

で，広範な基質アナログを in vitro で検証，さらには設今回構築した試験管内反応系では，デヒドロアラニン

計することが可能となった．これによって，化学合成や形成に必要な二つの要素を，生産菌内での本来の生合成

in vivo での前駆体ペプチドの調製に掛かる労力を大幅に低減することができる．

系とは異なるものに置き換えている．一つ目は GodG の本研究では 50 を超える変異 GodA を調製することで，GodG の相同性はわずか 23 ％と低いものの，驚くべき

代 わ り に 用 い た LazF で あ る．LazF の N 末 端 領 域 とアゾールやデヒドロアラニンの形成，LP の認識配列にことに LazF は GodG の機能を代替してグルタミン酸のついて知見を得ることができた．反応を完全に進行させ脱離を触媒することができた．このことから，LazF はるために比較的高濃度の酵素を反応に用いていることか

LP との相互作用を必要とせず，O -グルタミル化されたら，in vitro で得られた知見が in vivo へ適用可能である

セリン・スレオニンからグルタミン酸の脱離を触媒し，か，という点は懸念された．そのため，著者らが過去にデヒドロアラニンを形成するために広く応用可能である

構築した発現系を利用して in vivo でも 15 種の GS 類縁

こ と が 示 唆 さ れ た．2 つ 目 の 要 素 は， 大 腸 菌 由 来 の体の生産を試みた．in vitro と in vivo で一貫した結果がGlu-tRNAGlu である．GodF はグルタミル化ドメインか得られたことから，以下の方法論が有効であることが確

ら 構 成 さ れ る 酵 素 で あ る が， 同 様 の 大 腸 菌 由 来 の認された．すなわち，in vitro 合成系が GS 修飾酵素の基

Glu-tRNAGlu への許容性はグルタミル化と脱離の両方を質許容性の検証に有効なシステムであり，それによって触媒する乳酸菌由来の二機能性酵素 NisB においても知in vivo で生産が可能な新規類縁体のデザインが容易になる，といえる．

られている（ Ortega et al., 2015 ）．一方で，放線菌由来の相同酵素 TbtB（Hudson et al., 2015 ）や MibB（Ortega－ 150 －

In vitro 再構成系を用いたゴードスポリン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計

Fig. 5 In vivo production of designer GS analogues, GS-10SA11 and GS-tandem. A. Structure of GS-10SA11.
B. Chromatogram extracted at 254 nm shows the production of GS-10SA11. C. MS 2 spectrum of GS-10SA11. D.
Fragmentation pattern of GS-10SA11. E. Structure of GS-tandem. F. Chromatogram extracted at 254 nm shows
the production of GS-tandem. G. MS 2 spectrum of GS-tandem. H. Fragmentation pattern of GS-tandem.

－ 151 －

尾﨑

太郎，菅井

佳宣，浅水

et al., 2016 ）は，放線菌由来の Glu-tRNAGlu のみを利用し，大腸菌由来の Glu-tRNAGlu は利用できないことが知られている．さらなる解析によって，本酵素ファミリーのGlu-tRNAGlu の許容性が明らかになると期待される．
本研究で確立した試験管内 GS 合成系（ FIT-GS シス
テム）によって，GS 生合成における修飾酵素の認識モ
チーフに関する知見が容易に得られるようになった．また，in vitro で得られた知見は in vivo で検証可能であり，GS 類縁体を in vitro，in vivo どちらでも合成することができる．そのため，GS は擬天然物の創出のための魅力的な骨格であるといえる（ Asai et al., 2015 ; Maini et al.,2016. ）．最も重要な点は，FIT システムと翻訳後修飾酵
素の組み合わせは，他の RiPPs 生合成系にも適用可能であるということである．それによって，天然物そのものだけでなく自在に設計した分子の生産も容易になることが期待できる．

要約

ゴードスポリン（ GS ）は遺伝子の転写と翻訳による前駆体ペプチドの合成と，生合成酵素群による翻訳後修
飾反応により生合成される天然ペプチド RiPPs の一種である．RiPPs の生合成酵素には寛容な基質特異性を示すものが多く，また前駆体遺伝子への変異導入によって生合成経路に基質アナログを容易に供給できることから，生合成経路の改変による物質生産に適している．RiPPsの中でも，GS は特徴的な生物活性と，既存の薬剤には知られていない新たな作用機序を有していることから，魅力的な研究対象であるといえる．本研究では，再構成
無細胞翻訳系を用いて基質ペプチドを合成し，それを組換えタンパク質を用いた酵素反応に供することで，試験管内で GS 合成することに成功した．さらに，再構成無細胞翻訳系を用いて基質ペプチド類縁体を簡便かつ迅速に合成できる点を生かして，50 種以上の基質アナログを調製し，修飾酵素群の基質受容能を解析し，アゾール形成に必要な配列モチーフ，デヒドロアラニンの形成順
序，基質認識に重要な LP 領域等を明らかにした．さらに，
アゾール形成に関して得られた知見が，過去に構築した
in vivo 発現系にも応用可能であることを示し，放線菌を宿主として非天然型 GS を生産することにも成功した．同様の方法論は GS のみならず，他の RiPPs 生合成
系にも応用可能であり，本成果を応用して今後様々な生物活性ペプチドを自在に創製することが可能になると期
待される．

俊平，尾仲

宏康

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 岡本悠志，尾﨑太郎，浅水俊平，尾仲宏康．2015．goadsporin生合成機構を利用したgoadsporin倍加ペプチドの生
産．日本農芸化学会2015年度大会．3月27日，岡山．
2) 山下湖奈，尾﨑太郎，浅水俊平，後藤佑樹，菅裕明，尾仲宏康．2015．Streptomyces sp. TP-A0584株由来ゴードス
ポリン生合成のin vitro再構成．日本農芸化学会2015年度
大会．3月27日，岡山．
3) 山下湖奈，尾﨑太郎，浅水俊平，後藤佑樹，菅裕明，尾仲宏康．2015．ゴードスポリン生合成のin vitro再構成．
第11回生合成勉強会（生合成マシナリー第7回若手シンポジウム）．6月20日，東京．
4) 山下湖奈，尾﨑太郎，浅水俊平，後藤佑樹，菅裕明，尾仲宏康．2015．ゴードスポリン生合成の試験管内再構
成．第6回醗酵学フォーラム．9月6日，富山．
5) 山下湖奈，尾﨑太郎，浅水俊平，後藤佑樹，菅裕明，尾仲宏康．2015．Streptomyces sp. TP-A0584由来ゴードスポ
リン生合成の試験管内再構成系の確立．第30回日本放線菌学会．9月7-8日，富山．
6) Onaka, H. 2015. In vitro reconstitution of goadsporin biosynt h e s i s . 1 8 t h Ja p a n e s e - G e r ma n Wo rk s h o p E nz yme
Technology. 13-15 September, Kyoto, Japan.
7) 山下湖奈，尾﨑太郎，浅水俊平，後藤佑樹，菅裕明，尾仲宏康．2016．ゴードスポリンの酵素的全合成．日本農芸化学会2016年度大会．3月28日，札幌．
8) Ozaki, T., Yamashita, K., Hayashi, S., Goto, Y., Suga, H.,
Asamizu, S. & Onaka, H. 2016. In vivo and In vitro reconstitution of dehydroalanine biosynthesis in goadsporin, a linear
azole containing RiPP. SIMB Annual Meeting. 24-28 July,New Orleans, U.S.A.
9) 尾﨑太郎，山下湖奈，下村杜人，後藤佑樹，菅井佳宣，
浅水俊平，菅裕明，尾仲宏康．2016．無細胞翻訳系を利用したゴードスポリン生合成経路の再構成と新規アナロ
グの創製．第31回日本放線菌学会．9月8日，東京．
10) 尾仲宏康．2016．多段階酵素反応によるリボゾーム翻訳系抗生物質の完全合成．第18回生体触媒化学シンポジウ
ムin東京（日野）．12月21日，東京．
11) 尾仲宏康，尾﨑太郎，山下湖奈，後藤佑樹，下村杜人，
林昌平，浅水俊平，菅井佳宣，菅裕明．2017．試験管内
完全合成系によるゴードスポリン生合成経路の解析とデザイナーアナログ創製．日本農芸化学会2017年度大会．3
月18日，京都．
12) Onaka, H. 2017. Dissection of goadsporin biosynthesis by invitro reconstitution leading to designer analogs expressedin vivo. 18th International Symposium on the Biology ofActinomycetes Workshop 1-1: A3 Foresight Network on
Natural Product. 24 May, Korea.
13) Onaka, H. 2017. In vitro reconstitution of RiPPs biosynthesisby translational-coupled post-translational modification. 9th
US-JAPAN Seminar on the Biosynthesis of Natural
Products. 30 May, U.S.A.
14) 尾仲宏康（菅井佳宣代理発表）．2017．多段階連続酵素反応によるペプチド系抗生物質の試験管内完全合成と翻訳後修飾酵素群の基質認識の解明．第18回酵素応用シン
ポジウム研究奨励賞受賞講演．6月2日，愛知．

－ 152 －

In vitro 再構成系を用いたゴードスポリン生合成酵素の解析と合理的な類縁体設計
15) 尾仲宏康．2017．天然ペプチド生合成系を利用した新規ペプチド薬剤の開発．低・中分子創薬推進プラット
フォーム特別講演．6月22日，東京．
16) Onaka, H. 2017. In vitro reconstitution of RiPPs biosynthesisby translational-coupled post-translational modification. ASP
meeting. 31 June, Portland, U.S.A.
原著論文
1) Ozaki, T., Kurokawa, Y., Hayashi, S., Oku, N., Asamizu, S.,
Igarashi, Y. & Onaka, H. 2015. Insights into the biosynthesisof dehydroalanines in goadsporin. ChemBioChem 17:
218-223.
2) Ozaki, T., Yamashita, K., Goto, Y., Shimomura, M., Hayashi,S., Asamizu, S., Sugai, Y., Ikeda, H., Suga, H. & Onaka, H.
2017. Dissection of goadsporin biosynthesis by in vitro
reconstitution leading to designer analogues expressed invivo. Nat. Commun. 8: 14207.

謝辞

本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成によって開設された微生物潜在機能探索寄付講座においてなされたものである．本助成を賜った発酵研究所に対して，ここに厚く御礼申し上げます．
再構成無細胞翻訳系を用いた実験については，東京大学大学大学院理学系研究科菅裕明教授，同後藤佑樹准教
授との共同研究により行われたものである．ここに記し，両先生に深く感謝いたします．放線菌生産物の質量分析にご協力いただいた北里大学北里生命科学研究所池田治
生教授に感謝の意を表します．

文

献Arnison, P.G., Bibb, M.J., Bierbaum, G., Bowers, A.A., Bugni, T.S.,
Bulaj, G., Camarero, J.A., Campopiano, D.J., Challis, G.L.,
Clardy, J., Cotter, P.D., Craik, D.J., Dawson, M., Dittmann, E.,
Donadio, S., Dorrestein, P.C., Entian, K.D., Fischbach, M.A.,
Garavelli, J.S., Göransson, U., Gr uber, C.W., Haft, D.H.,
Hemscheidt, T.K., Her tweck, C., Hill, C., Horswill, A.R.,
Jaspars, M., Kelly, W.L., Klinman, J.P., Kuipers, O.P., Link, A.J.,
Liu, W., Marahiel, M.A., Mitchell, D.A., Moll, G.N., Moore,
B.S., Müller, R., Nair, S.K., Nes, I.F., Norris, G.E., Olivera,
B.M., Onaka, H., Patchett, M.L., Piel, J., Reaney, M.J., Rebuffat,
S., Ross, R.P., Sahl, H.G., Schmidt, E.W., Selsted, M.E.,
Severinov, K., Shen, B., Sivonen, K., Smith, L., Stein, T.,
Süssmuth, R.D., Tagg, J.R., Tang, G.L., Truman, A.W., Vederas,
J.C., Walsh, C.T., Walton, J.D., Wenzel, S.C., Willey, J.M. & vander Donk, W.A. 2013. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: over view andrecommendations for a universal nomenclature. Nat. Prod.
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尾﨑

太郎，菅井

佳宣，浅水

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Ozaki, T., Yamashita, K., Goto, Y., Shimomura, M., Hayashi, S.,

俊平，尾仲

宏康

Asamizu, S., Sugai, Y., Ikeda, H., Suga, H. & Onaka, H. 2017.
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IFO Res.Commun. 32
155-166, 2018

ゲノム探索による 32 員環新規チオペプチドラクタゾールの発見
林昌平1)，尾﨑太郎2)，浅水東京大学大学院農学生命科学研究科〒113-8657

俊平，尾仲

宏康

微生物潜在機能探索寄付講座

東京都文京区弥生1-1-1

Genome mining reveals a minimum gene set for the biosynthesis of
32-membered macrocyclic thiopeptides lactazoles.
Shohei Hayashi 1), Taro Ozaki 2), Shumpei Asamizu, Hiroyasu Onaka
Laboratory of Microbial Metabolic Potential,
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo.
Yayoi 1-1-1, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
Although more than 100 thiopeptides have been discovered, the number of characterized gene clusters involved intheir biosynthesis is lagging. We use genome mining approach to discover a silent thiopeptide biosynthetic genecluster responsible for biosynthesis of lactazoles. Lactazoles are structurally unique thiopeptides with a 32-memberedmacrocycle and a 2-oxazolyl-6-thiazolyl pyridine core. We demonstrate that lactazoles originate from the simplest
cluster, containing only six unidirectional genes (lazA to lazF). By gene disruption experiment, we show that lazC is
involved in the macrocyclization process, leading to central pyridine moiety formation. Substitution of the endogenous
promoter with a strong promoter results in an approximately 30-fold increase in lactazole A production andmutagenesis of lazA precursor gene in production of two analogs. Lactazoles do not exhibit antimicrobial activity but
may modulate signaling cascades triggered by bone morphogenetic protein. Our report demonstrates that genome
mining is a powerful strategy that can be applied to uncover biosynthetic pathways for natural drug products.
Key words: biosynthesis, RiPPs, Streptomyces, heterologous expression, macrocyclization

緒言Dha ）/ デ ヒ ド ロ ブ チ リ ン（ dehydrobutyrines，Dhb ）やアゾール・アゾリンが形成される．その後，2 つのチオペプチドは主に放線菌によって生産される含窒素

Dha が [4 + 2] 環化付加反応により含窒素六員環が形成さ六員環（ピリジンもしくはピペリジン）を要としたマクれると予想されている(Bycroft & Gowland, 1978)．多く

ロ 環 と 硫 黄 を 多 く 含 む 高 度 に 修 飾 さ れ た RiPPsのチオペプチドはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌やバン（ Ribosomally-synthesized and Post-translationally modi-

コマイシン耐性腸球菌を含むグラム陽性細菌の生育を阻

fied Peptides ）の一種である．生合成の過程でゴードス害するため，医薬のリード化合物として期待されている．

ポリン（ GS, goadsporin ）と同様に前駆体ペプチドが修

これまでに 100 種類以上のチオペプチド化合物が報告さ

飾反応を受けてデヒドロアラニン（ dehydroalanines，

れており，いくつかの生合成遺伝子クラスターも同定されている(Bagley et al., 2005 ; Li & Kelly, 2010)．近年ゲノム解現 島根大学生物資源科学研究科
2)
現 北海道大学理学研究院
E-mail: 林 昌平:shohaya@life.shimane-u.ac.jp
尾仲宏康:aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
共同研究者:大村智（北里大学・北里生命科学研究所），
供田洋（北里大学・薬学研究科），
池田 治生（北里大学・北里生命科学研究所），
奥直也（富山県立大学工学部），
五十嵐康弘（富山県立大学工学部）
1)

析技術が向上し，ゲノム解読株が増えるに従い，幅広い
微生物の中で休眠状態下にあるチオペプチド生合成遺伝
子クラスターが 数 多く同 定されて いる(Li et al., 2012 ;Wieland Brown et al., 2009)．また，Streptomyces 属放線菌が生産する RiPPs の報告は多く，我々も Streptomyces
sp. TP-A0584 から GS 生合成遺伝子クラスターをクローニングしている(Onaka et al., 2005)．Streptomyces 属放線菌を用いた異種発現の宿主ベクター系の開発が進み，休眠遺－ 155 －

林

昌平，尾﨑

太郎，浅水

伝子クラスターの異種発現による代謝産物の同定が可能に

俊平，尾仲

宏康

ラクタゾールと ΔlazC 株代謝産物の精製なってきている．
しかしながら，
休眠遺伝子クラスターによっ

3 L の培養液を 8,000 rpm で 10 min 遠心し，沈殿したて生産されるチオペプチドはこれまで報告されていない．

菌体を 3 L のメタノールで 3 回抽出した．回収したメタ

本研究では，ゲノム情報からチオペプチド生合成遺伝

ノール画分の溶媒を留去し，水で再溶解後，60 ％メタ

子クラスターを探索し，ラクタシスチン生産菌である

ノール - ジクロロメタンで分配した．60 ％メタノール画

Streptomyces lactacystinaeus OM-6519 ゲノム中に存在す
る，休眠状態にあるチオペプチド生合成遺伝子クラス分を回収し n -ブタノールで再抽出し，溶媒を留去後，1.6 g

ターを同定し，Streptomyces lividans TK23 を用いた異種LH-20 ゲルろ過カラムで分画後，目的化合物が含まれる発現によりラクタゾール A，B，C を同定した．

画分を HPLC で確認した．目的化合物が含まれる画分をの 粗 抽 出 物 を 取 得 し た．DMSO で 再 溶 解 し Sephadex

回収し，逆相 ODS カラム（ 75 µm，Cosmosil 75 C18 -PREP，

実験方法

ナカライテスク；Japan ）を用いて精製を行なった．目

的化合物を回収後，1200 シリーズ（ Agilent，CA，USA ）ゲノムマイニングと laz クラスターのクローニングの HPLC と Cosmosil 5PE-MS（ 5 µm，10×250 mm，ナ

S. lactacystinaeus OM-6519 のドラフトゲノムは Illumina
GA-II（ Illumina，CA，USA ）を用いて解析した．チオ

カライテスク）を用いて分取を行なった．その結果，ラクタ

ペプチド遺伝子クラスターは godF，godD，godG の配列

産物をそれぞれ 6.7 mg，2.7 mg，0.7 mg，2.5 mg 取得した．

ゾール A ，ラクタゾール B，ラクタゾール C，ΔlazC 株代謝

を ク エ リ ー に BLAST 検 索 を 行 う こ と で 探 索 し た．
FramePlot 4.0 beta(http://nocardia.nih.go.jp/fp4/) を用

ラクタゾールの構造解析
NMR スペクトルは DMSO-d6 溶媒中で Bruker AVANCE

いて ORF の推定を行い，それらを BLAST 検索し既知のタンパク質と比較することで機能を推定した．

500（ Bruker ）もしくは JEOL ECA-600（ JEOL，Japan ）S. lactacystinaeus OM-6519 のコスミドライブラリーを
構 築 す る た め に， ゲ ノ ム DNA を Sau3AI で 消 化 しを用いて取得した．精密質量は Time-of-Flight MS（Xevo

pKU465cos の BamHI サ イ ト に ラ イ ゲ ー シ ョ ン し た

測定した．

G2-S；Waters，UK ）を用いてポジティブ ESI モードで(Komatsu et al., 2010)．λ-packaging mixutre を 用 い てた．laz クラスターを含むコスミド pKU465-ltc18-6C は

laz 遺伝子の破壊実験
各 laz 遺伝子の破壊は二重交差破壊で行なった．大腸

パッケージングと大腸菌 DH5α への形質転換を行なっ
2 種類のプライマーを用いた PCR によりスクリーニング

菌 - 放線菌シャトルベクターである pTYM19 のφC31int

し た．pKU465-ltc18-6C を S. lividans TK23 に 形 質 転 換

領域を削除して作製した pTYM19Xint をベースに各遺伝することで S. lividans ltc18-6C 株を取得した．

子（ lazA ，lazB ，lazC ，lazD ，lazE ，lazF ，ltc74 ，ltc66 ）破壊用プラスミドを作製した(Onaka et al., 2003)．各遺HPLC 分析用サンプル調製

伝 子 の 上 流， 下 流 2.0 kb を PCR で ク ロ ー ニ ン グ し，各株を 10 mL の V-22 培地に植菌し 30 ℃，2 日間振盪pTYM19Xint のマルチクローニングサイトに導入した．

培養することで前培養を行なった．その後 100 mL のS. lividans ltc18-6C に対してこれら遺伝子破壊用プラス
ミドを形質転換し，各遺伝子破壊株を取得した．

A-3M 培地もしくは GS 培地に 3 mL の前培養液を添加し，30 ℃，5 日間振盪培養した(Onaka et al., 2001)．4 mL の培養液を 5 mL の n -ブタノールで抽出し，溶媒を留去しラクタゾールの生理活性試験

た後ジメチルスルホキシド（ DMSO ）に再溶解した．

ラクタゾールの抗菌活性は 8 種の指示菌（Staphylococcus

HPLC 分析は HP1100（ Hewlett-Packard，CA，USA ）シaureus FDA209P JC-1 ，Bacillus subtilis ATCC 6633,

ステムと C18 Rainin Microsorb カラム（ 3 µm，4.6×100，

Streptomyces lividans TK23 ，Micrococcus luteus ATCC
9341，Escherichia coli NIHJ JC-2，Saccharomyces cerevisiae

Rainin Instrument，MA，USA ）を用いた．移動相には
ア セ ト ニ ト リ ル と 0.15 ％ KH 2PO4（ pH 3.5 ） を 用 い，S100，Candida albicans A9540，Penicillium chrysogenum

1.2 mL/min の流速で 22 分間かけてアセトニトリル濃度

NBRC 6223 ）を用いて評価した．5 mm 径のペーパーディ

を 15 ％から 85 ％に直線的に上げることで溶出させた．

ス ク に 0.04 mg の ラ ク タ ゾ ー ル を 染 み 込 ま せ，Luria

ラクタゾールは保持時間と 254 nm の UV 吸収を指標に

broth glucose 寒天培地上で 30 ℃，3 日間培養した．

検出した．質量分析はイオントラップ型質量分析計
amaZon（ Bruker Daltonics，MA，USA ）を用いた．

造骨細胞 C2C12（ R206H ）のアルカリホスファター
ゼ阻害活性は造骨細胞の分化阻害活性にて評価した(Fukuda et al., 2012)．

－ 156 －

ゲノム探索による 32 員環新規チオペプチドラクタゾールの発見

ラクタゾール高生産株の作製
高発現プロモーターである godA プロモーターを利用

S. lividans ltc 18-6C の代謝産物を解析したところ，コン
トロールでは見られない代謝産物が確認された（ Fig. 2a ）．

するために，φK38-1 インテグラーゼ，アプラマイシン
耐性遺伝子，godA プロモーター領域を持つ放線菌 - 大腸

ラクタゾールの単離同定
上記代謝産物を同定するために，異種発現株を大量培

菌シャトルベクター pTYM3ga を作製した．3 断片に分割した laz クラスターと pTYM3ga ベクターをそれぞれ養し，抽出物から単離精製を行なった．3 L 培養から回PCR で増幅し，ギブソンアセンブリー法により pTYM3ga-

収した菌体をメタノールで抽出し，各種クロマトグラ

lazAF を調製した(Gibson et al., 2009)．これを S. lividans

フィーにより代謝産物を単離し，最終的にラクタゾール

TK23 に形質転換することで godA プロモーターによってA（ 6.7 mg ），ラクタゾール B（ 2.7 mg ），ラクタゾール

laz クラスターが高発現する変異株を作製した．

C（ 0.7 mg ）をそれぞれ取得した．

ラクタゾールアナログの生産によりラクタゾール類の構造を決定した（ Fig. 3a ）．生

lazA の 配 列 を 置 換 す る た め に，QuickChange sitedirected mutagenesis kit（ Stratagene，CA，USA ）を用産量が最も多かったラクタゾール A は高分解能質量分

いて pTYM1ga-lazA 上の lazA 遺伝子に塩基置換を導入しは C 61H64N18O16 S 3 と予想された．一次元 NMR 解析から，高分解能質量分析計，各種一次元，二次元 NMR 測定

析において m/z 1401.3975 [M+H]+ を示し，その化学式た．これにより 2 番目の Trp を Ser に置換した pTYM1ga-

ペプチド化合物であることが示唆され，各種二次元

lazA W2S と 11 番目の Ser を Cys に置換した pTYM1ga-

NMR 解析から構成するアミノ酸残基やアミノ酸どうしlazA S11C を作製した．また，godA プロモーター下流にのつながりが観察された．特に，メチン由来シグナル

lazB から lazF の領域を結合させた異種発現用プラスミ
ド pTYM19 gt-lazBF を作製し，S. lividans TK23 に形質（ δ 8.34 - 8.71 ） か ら 4 級 炭 素（ δ 139.72 -173.24 ） へ の
HMBC 相関から 4 つのアゾール環の存在が示された．

転換した．この S. lividans lazBF 株に変異 lazA 遺伝子をさらに，2 つのメチン由来シグナル（ δ 8.11，7.37 ）か

含むプラスミドを導入し，S. lividans W2S と S. lividans

ら 4 級炭素（δ 131.80 - 167.31 ）とカルボニル炭素（δ 166.74 ）S11C を作製した．

への HMBC 相関から 3 置換ピリジン環が示され，そのう結

ちの一つは Trp 残基であることが示された．NMR 解析か

果ら示されたラクタゾール A の構造と前駆体ペプチドの C 末
端の配列が一致したことからも，構造解析結果が支持さ休眠状態にあるチオペプチド遺伝子クラスターのゲノムれた（ Fig. 4 ）．以上の結果から，ラクタゾール A は 11 残

マイニングと異種発現

基のアミノ酸からなるマクロ環，一つのオキサゾール環と 3

チオペプチドの構造中に見られる Dha/Dhb はランチ

つのチアゾール環，2 つの Dha ，2 ，3，6 位が置換されたペプチドの生合成過程においても生成することから，生

ピリジン環を持つペプチドであることが示された．ピリジ

合成酵素は類似していることが予想された．そこで GS

ン環の 2 ，3，6 位にはそれぞれオキサゾール，トリプトファ生合成に関与する class I ランチペプチド脱水酵素遺伝子

ン，チアゾールが結合している．質量分析計による MS/

godF の配列をクエリーに S. lactacystinaeus OM-6519 のドラフトゲノムを探索したところ，チオペプチド生合成

MS フラグメントパターンも構造解析結果と一致していた．

に関与すると予想される遺伝子クラスターを見出した．

タゾール C に関しても解析を行なった．これら化合物

このクラスター内にはアゾール環の形成に関与すると予は UV スペクトルが類似しており，構造類縁体と予想さ想される cyclodehydratase，nitroreductase，SpaB ホモ

れた．高分解能質量分析結果から，ラクタゾール B はログを含んでおり，さらに前駆体ペプチドと予想される

ラクタゾール A の C 末端に Gln 残基が付加したもので，構造遺伝子も見出された（ Fig. 1 ）．FlamePlot 解析から，ラクタゾール C はラクタゾール A の C 末端の Gln と Pro

このクラスターは 6 つの ORF からなる事が示され，そ残基が欠除したものであることが示された．ラクタゾー

マイナー生産物として精製したラクタゾール B，ラク

れぞれ lazA，lazB，lazC，lazD，lazE，lazF と名付けた．

ル A，B，C はいずれも Chemical Abstracts Service デー

S. lactacystinaeus OM-6519 の代謝産物からチオペプチ
ド系化合物は見出されていなかったため，この laz クラ

タベースに登録されておらず，新規化合物だった．

スターを S. lividans TK23 株に導入し異種発現を試みた．

ラクタゾール生合成遺伝子クラスターの同定

まず S. lactacystinaeus OM-6519 のゲノムからコスミドラ

ラクタゾール生合成に必須の遺伝子セットを同定する

イブラリーを構築し，そこから laz クラスターを含む

ためにサブクローニングと遺伝子破壊実験を行った．

pKU465-ltc18-6C を単離した．このコスミドを導入した

laz クラスターの上流，下流に隣接する遺伝子 ltc74 と－ 157 －

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昌平，尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

宏康

Fig. 1 Gene organizations of the laz cluster and other thiopeptide biosynthetic gene clusters
Lactazole (laz), TP-1161 (tpa) (Nocardiopsis sp. TFS65-07), GE37468 (get) (Streptomyces sp. ATCC 55365), GE2270A (tpd_GE)(Planobispora rosea), thiostrepton (tsr) (Streptomyces laurentii ATCC 31255), cyclothiazomycin (clt) (Streptomyces hygroscopicus
10-22), thiomuracins (tpd_TM) (Nonomuraea species), thiocillin (tcl) (Bacillus cereus ATCC 14579), siomycin (sio) (Streptomyces
sioyaensis ATCC 13989), berninamycin (ber) (Streptomyces bernensis UC 5144), nosiheptide (nos) (Streptomyces actuosus ATCC
25421), nocathiacin (noc) (Nocardia sp. ATCC202099), and goadsporin (god) (Streptomyces sp. TP-A0584). The deduced functions
are labeled in pattern.

Fig. 2 HPLC analysis of lactazoles and the expression of related compounds in heterologous hosts(a) S. lividans ltc18-6C containing whole laz cluster. The arrow indicate the lactazole A (11.0 min).
(b) S. lividans KU465 harboring pKU465 as a negative control.
(c) S. lividans ΔlazA (the lazA disruptant).
(d) S. lividans ΔlazC (the lazC disruptant). The arrow indicate a compound accumulated in ΔlazC (11.3 min).
(e) S. lividans S11C produces the Ser11Cys analog (14.7 min).
(f) S. lividans W2S produces the Trp2Ser analog (13.1 min).
(g) S. lividans pTYM1ga containing pTYM1ga as a negative control.

－ 158 －

ゲノム探索による 32 員環新規チオペプチドラクタゾールの発見

Fig. 3Chemical structures of the lactazoles and the related compounds(a) Lactazole A, B, and C.
(b) A compound that accumulates in the ΔlazC strain.
(c) Lactazole analog S11C. Cys11 is posttranslationally modified.
(d) Lactazole analog W2S.

－ 159 －

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昌平，尾﨑

太郎，浅水

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宏康

ltc66 をそれぞれ破壊した異種発現株においてもラクタ
ゾールの生産が確認されたことから，これら遺伝子はラクタゾール生合成に必須ではないことが示された．必須な遺伝子を同定するために lazA - lazF の領域を PCR によりクローニングし，S. lividans で発現させた．その結果，ラクタゾールの生産が確認されたことから，生合成には
これら 6 つの遺伝子で十分であることが示された．
lazA がコードする 57 アミノ酸残基からなる前駆体ペプチドはこれまでに報告されているチオペプチド前駆体
Fig. 4 DQF-COSY and HMBC correlations for a compound
accumulated in ΔlazC mutant.

ペプチドとは相同性を示さなかった(Fig. 5)．LazB は
GS の生合成に関与しランチペプチドの脱水反応を触媒

Fig. 5 Phylogenetic analysis of the core peptide amino acid sequences and comparison with other thiopetides and goadsporin.
aAlignment of the core peptide amino acid sequences is shown. Amino acid residues that participate in the formation of the main
ring containing the central N-containing heterocyclic domain are underlined. The C-terminal cleavage sites in lactazole, GE37468,
thiomuracin, and GE2270A are indicated by hyphens. The core peptides in goadsporin (GodA) (Streptomyces sp. TP-A0584) and in
thiopeptide precursors, lactazole (LazA), GE2270A (TpdA_GE) (P. rosea), GE37468 (GetA) (Streptomyces sp. ATCC 55365),
thiomuracins (TpdA_TM) (Nonomuraea species), TP-1161 (TpaA) (Nocardiopsis sp. TFS65-07), berninamycin (BerA) (S. bernensis
UC 5144), cyclothiazomycin (CltA) (S. hygroscopicus 10-22), thiocillin (TclE-H) (B. cereus ATCC 14579), siomycin (SioH) (S. sioyaensis ATCC 13989), thiostrepton (TsrH) (S. laurentii ATCC 31255), nosiheptide (NosM) (S. actuosus ATCC 25421), and nocathiacin (NocM) (Nocardia sp. ATCC202099), are shown.
b
The number of macrocycles in thiopeptides is shown, with the number of amino acid residues that form the macrocycle given inparentheses (submacrocycles bridged by sulfide, quinaldic acid, and indole are indicated by s, q, and i, respectively).
cSer, Thr, and Cys (SCT) ratios in the core peptides are shown. The ratios except for C-terminal cleavage amino acids in lactazole
A, GE37468, thiomuracin, and GE2270A are given in parentheses.
dPutative precursor sequences proposed from the chemical structures－ 160 －

ゲノム探索による 32 員環新規チオペプチドラクタゾールの発見

す る GodF と 相 同 性 を 示 し た（ identity 23.5 ％）．LazEると予想された（ Table 1 ）．

は GodD と 22.1 ％の identity を示し，アゾリン形成に関これら生合成酵素の機能を解析するために各生合成遺与する YcaO ドメインの C 末端を含んでいた．LazF は伝子を破壊し，その代謝産物を解析したが，lazA，lazB，

N 末端側のランチビオティック酵素ドメインと C 末端のフラビン依存脱水素酵素ドメインからなるタンパク質

lazD，lazE，lazF の破壊株培養液からは lactazole 関連化
合物は見出されなかった(Fig. 2c)．対象的に lazC 破壊株

で，N 末端側は GodG と，C 末端側は GodE とそれぞれ（ S. lividans ΔlazC ）の培養抽出物中からは新たなピーク

相同性を示した．これらの配列情報から，LazF は Dhaが観察された．質量分析の結果，m/z 1,437.4150 [M+H]+

形成と azoline の脱水素反応を触媒する二機能性酵素でのピークが観察され（ Fig. 2d ），化学式が C 61H68N18O18 S 3あることが予想された．LazC と LazD は相同性検索か（理論値 1,437.4199 [M+H]+ ）であることが予想された．

らは機能を推定することができなかった．マクロ環化反応以外の翻訳後修飾酵素は LazB，E，F と予想できるこ

lazC 破壊株代謝産物の構造解析とから，LazC と LazD はマクロ環化反応に関与していTable 1

S. lividans ΔlazC 培養抽出物中に観察された化合物のDeduced genes and their proposed functions in laz cluster and the surrounding region－ 161 －

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昌平，尾﨑

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宏康

構造を決定するために精製を行なった．2.4 L の培養液現が制御されていることが示唆された．このクラスターから回収した菌体をメタノールで抽出した後，ラクタによって生産されるラクタゾールの生産性は 12.9 mg/L

ゾール類と同様の精製行程を経て，2.5 mg の精製品を得だが，godA プロモーターの制御により生産される GS のた．NMR と質量分析結果から，この化合物はラクタゾー

生産量は 342.7 mg/L であると報告されている(Haginaka

ル A と同じ 15 残基のアミノ酸からなり，マクロ環化以
外の修飾反応を完全に受けた直鎖状の化合物であること

et al., 2014)．そのため，lazA プロモーターを godA プロ
モーターに置換することでラクタゾール生産性が向上すが示された（ Fig. 3b ）．

ると予想した．プロモーターを置換した異種発現株は予

この化合物はピリジン環に由来する 2 つのプロトンシ

想通りラクタゾールを高生産し，その生産量は GS 培地

グナル（ δ 8.11，7.37 ）が消失していたことから，マクを使用した際に最大で 383.8 mg/L に達した（ Fig. 6 ）．

ロ環化反応を受けず直鎖状態を維持していたと考えられた．325 nm の UV 吸収が消失していたこともこの推測をアミノ酸置換によるラクタゾール A アナログの創製

裏付けていた．同様の結果がチオペプチドの一種である

翻訳後修飾酵素がアナログ基質に対しても認識するこ

チオシリン生合成研究でも観察されている(Bowers etとができるかどうかを評価するために lazA に対して部位

al., 2010)．本化合物はピリジン環に由来するシグナルが消失した一方で，ピリジン環形成の土台となる Dha

特異的変異を導入した．アナログを生産するために，前駆体ペプチド（ lazA ）過剰発現用プラスミド pTYM1gp

残 基 に 由 来 す る シ グ ナ ル が H-NMR か ら 観 察 さ れ た+ lazA と翻訳後修飾酵素（lazB から lazF までのオペロン）（ δ 6 . 2 4 , 5 . 7 5:D ha 6 ， δ 5 . 9 0 , 5 . 8 5:D ha 1 0 ，δ 6.18,

過剰発現用プラスミド pTYM19gp + lazBF を構築した．

5.75:Dha12 ）．HMQC と HMBC スペクトルからも Dha

両プラスミドを S. lividans の染色体に導入し，godA プの存在が確認された．

ロモーターにより発現されるようにした．また，lazA

1

Dha のシグナルに加えて特徴的なメチルプロトンのシに対して部位特異的変異導入を行い 2 つのアナログ

グナルがシングレットで観察された（ δ 2.20 ）．このシ（ Ser11Cys，Trp2Ser ）が発現される株をそれぞれ作製

グナルがカルボニル炭素と相関していたことから，N 末した（ Fig. 2e, f ）．Ser11Cys を発現させた S. lividans の端にメチルケトン構造が存在することが示唆された．こ培養液から m/z 1417.3788 [M+H]+ を示す化合物が検出

れは N 末端の Dha 残基が互変異性と加水分解を受けてされた．この化合物はラクタゾール A よりも 16.0 Da 大形成されたと予想された．そのため，lazC 破壊株で蓄きかったことから，酸素原子が硫黄原子に置き換わった

積した化合物は Ser1，Ser6，Ser10，Ser12 が Dha へとことが示された．MS/MS 解析から，ピリジンの 2 位に変換されたことが示唆された．

結合している残基がオキサゾールからチアゾールへと変化していたことが確かめられた（ Fig. 3c ）．Trp2Ser を

ラクタゾールの生理活性発現させた株からは m/z 1302.3478 [M+H]+ を示す化合

ラクタゾールは試験した菌（ S. aureus FDA209P JC-1，
B. subtilis ATCC 6633，S. lividans TK23，M. luteus ATCC
9341，E. coli NIHJ JC-2，S. cerevisiae S100，C. albicans
A9540，P. chrysogenum NBRC 6223 ）に対して抗菌活性を示さなかった．しかしながら進行性骨化性線維異形成症に対するスクリーニングにおいて，ラクタゾールが造骨細胞 C2C12（ R206H ）のアルカリホスファターゼ活性を阻害することを発見した．その 50 ％阻害濃度はラ
クタゾール A，B，C でそれぞれ 101，116，93.5 µM であり，200 µg/mL 以下の濃度では細胞毒性は観察されなかった．このことから，ラクタゾールは骨誘導因子によって誘起されるシグナルカスケードを分子標的としていることが示唆された．

Fig. 6

遺伝子工学によるラクタゾール高生産化
laz ク ラ ス タ ー は 9.8 kb か ら な り， 全 て の 遺 伝 子 がギャップなく同じ向きで並んでいる（ Fig. 1 ）．このことから，laz クラスターは lazA プロモーターによって発－ 162 －

Lactazole production by promoter substitution oflaz cluster in GS and A-3M MediaS. lividans Ltc6C07 : laz cluster expressed under original
promoter. S. lividans gp-lazAF : laz cluster expressed
under godA promoter. Seven day culture broth wasanalyzed. Each value shows the mean±SD of triplicate
values from a representative experiment.

ゲノム探索による 32 員環新規チオペプチドラクタゾールの発見物が検出された．MS/MS フラグメント解析から，大きく性質の異なるアミノ酸の置換にも関わらず Trp2Ser ア

lazE はオペロンを形成しており，lazA - lazB と lazE - lazFの遺伝子間領域はそれぞれ 221，80 bp である．lazA プ

ナログもマクロ環化反応を受けたことが示唆された

ロモーターを，高発現であることが確認されている(Fig. 3d)．

godA プロモーターに置換することでラクタゾールの高生産化を試みたところ，異種発現株において置換前と比考察

較して 29.8 倍の生産性の向上が確認された．
プロモーターの置換による高生産化に加えて，アナロ

本研究ではゲノムマイニング手法を用いて S. lactacys-

グの生産も試みた．修飾酵素の基質寛容性を検証するた

tinaeus OM-6519 から休眠状態にあるチオペプチド生合
成遺伝子クラスターを同定した．LazA の系統樹解析をめに，ピリジン環周辺のアミノ酸残基の置換を行なった．

したところ，LazA が既知のチオペプチド前駆体ペプチ

S11C の生産物を解析したところアミノ酸の置換に伴い

そ の 結 果，S11C と W2S ア ナ ロ グ の 生 産 に 成 功 し た．

ドのクレードに属さなかったことから，lazA が他の既Ser に由来するオキサゾールが Cys に由来するチアゾー

知のチオペプチド前駆体遺伝子とは独立して進化してきルに変化したことが確認され，修飾反応を受けたことがたことが示唆された（ Fig. 5 ）．実際に翻訳後修飾を受示された．一方で，W2S アナログではオキサゾールへける LazA の Ser，Thr，Cys 残基の割合は 56 ％と既知の変換は観察されなかった．このことから，アゾール環のチオペプチドファミリーの中で最も低い．さらに形成反応は部位特異的であることが示唆された．

LazA コアペプチドには Trp と Gln 残基が含まれるが，チオペプチド生合成経路におけるマクロ環化反応を生

他のチオペプチド前駆体にはこれら残基は含まれていな

化学的に再現することは難しく，付随する反応も未解明

い．このようなユニークな特徴に着目し解析に取り組んである．lazC を破壊したところ直鎖状の化合物を生産だが，実際にこのクラスターを異種発現し代謝産物を解したことから，ピリジン環形成に必須であることが示さ析したところ，非常にユニークなチオペプチドの生産にれた．同様の直鎖状ペプチドはチオペプチドの一種チオ

関与していた．

シリンの生合成遺伝子クラスターを破壊した際に観察さ既知のチオペプチドは 9，10 もしくは 12 残基のアミれている．ピリジン環形成機構に関する考察はチオシリノ酸からなるマクロ環を有しているが，予想外なことにン 生 合 成 遺 伝 子 tclM の 破 壊 実 験 か ら 得 ら れ て い る

ラクタゾールは 11 残基からなるマクロ環を有していた．

(Bowers et al., 2010)．TlcM は Diels-Alderase と 予 想 さ

したがって，ラクタゾールのマクロ環は天然に存在する

れており，マクロ環を持つチオペプチドの遺伝子クラス

マクロ環骨格に新たな多様性を付加するものと考えられ

ターで保存されている一方で，直鎖状ペプチドである

る．また，これまでに 2,3,6-trithiazolylpyridine を持つ

GS の遺伝子クラスターには存在しない．tclM の破壊に

チオペプチドは報告されていたが，3 位が嵩高い Trp により直鎖状のペプチドが蓄積することから，TclM が置換されている 2-oxazolyl-6-thiazolylpyridine 骨格はラ[4+2] 環化付加反応を触媒すると予想されている．LazC

クタゾールの構造中で特徴的である．さらに C 末端のは TclM と低い類似性しか示さないが，破壊によって蓄

アミノ酸残基が異なるラクタゾール B，C も発見した．

積する直鎖状ペプチドは類似している．同様の直鎖状ペこのような C 末端のバリエーションは他のチオペプチ

プチドは Planobispora rosea から GE2270 の生合成中間ドでは報告されておらず，これは異種宿主に存在するペ体誘導体として報告されている(Tocchetti et al., 2013)．

プチダーゼの働きによって生じたものと予想している．

この報告で筆者らは C 末端側の修飾反応が完全に進まな

多くのチオペプチドはグラム陽性細菌に対する生育抑かったためにマクロ環化反応が完了しなかったと結論し制活性を持っているが(Bagley et al., 2005)，ラクタゾーているが，lazC 破壊実験ではマクロ環化反応以外の修飾

ルは今回試験した菌に対してそのような活性は示さな反応が完全に進行した化合物が蓄積していた．この結果かった．しかしながら造骨細胞 C2C12（ R206H ）のアから，我々は LazC がラクタゾール生合成経路の最後に

ルカリホスファターゼ活性を阻害することを発見した．

TclM と同様 Diels-Alder 縮合を触媒すると結論づけた．

今後，ラクタゾールの分子標的を同定することができれ

チオペプチド生合成に関する先行論文(Ding et al.,ば，この新規チオペプチドファミリーの抗生物質として2010 ; Liao et al., 2009) と同様に，laz 遺伝子の破壊によの潜在能力が注目されると考えられる．

りラクタゾール生産は完全に消失した．バイオインフォ

ラクタゾール生合成クラスターは全長 9.8 kb と非常にマティクス解析から，LazB，LazE，LazF は Dha とチア

小さいため遺伝学的改変に向いていると考えられる．事ゾール/オキサゾールの形成に関与することが予想され

実，わずか 1 回の PCR 操作でクラスター全体を増幅可た．一方で既知の酵素との相同性を示さなかった LazD能であった．6 つの遺伝子のうち，lazB，lazC，lazD，は機能を推定することができなかった（ Table 1 ）．

－ 163 －

林

昌平，尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

宏康

ラクタゾールの化学構造と遺伝子のアノテーション，

Trp と結合したチオペプチドも初めての発見だった．本

そして遺伝子破壊実験からラクタゾール生合成経路を推研究からゲノムマイニング手法は天然由来新規薬剤候補定した（ Fig. 7 ）．まず初めに lazA が転写され，リボソー

化合物の生合成経路発見のための強力な戦略であること

ムにより前駆体ペプチドが翻訳される．次の Dha とアが示された．現在ラクタゾールのコンパクトな遺伝子ク

ゾールの形成の順序は不明だが，LazB の触媒する脱水

ラスターのエンジニアリングによるチオペプチド化合物

反応により Ser1，Ser6，Ser10，Ser12 が Dha へと変換のアナログを創製することで天然物ベースの医薬探索にされ，LazE（環化脱水酵素）と LazF（脱水素酵素）に先鞭を着けることができると期待し，研究を進めている．

よ り Cys5，Cys7，Cys13 が チ ア ゾ ー ル へ，Ser11 が オ

要キサゾールへとそれぞれ変換される．その後 LazC によって 触 媒 さ れ る hetero-Diels-Alder 縮 合 に よ り Dha1 とDha12 間でピリジン環が形成され，マクロ環が生じると予想される．

約

放線菌は多様な抗生物質を生産することが知られているため，新規医薬品の礎となる新しい化学構造を有する

本研究で単離したラクタゾールは特徴的な構造を有し化合物の探索源となっている．本研究ではゲノム探索とている．1948 年の最初の発見以来 100 種類以上のチオ

異種発現手法を用いて，これまでに知られていたものとペプチドが発見されているが，それらのマクロ環のサイは化学構造が大きく異なる RiPPs 化合物を発見した．ラズは全て 26，29 もしくは 35 員環だった．一方でラクタ

クタゾールと命名した本化合物は，環構造やアミノ酸組

ゾールはこれまで報告が無かった 32 員環のマクロ環を成などの点において，これまでに知られているチオペプ

持っていた．さらにピリジン環の 3 位がアミド結合でチドと類似性が低いことが明らかになった．さらに生合Fig. 7 P roposed lactazole biosynthetic pathway
Line indicates the biosynthesis steps of azole ring formation (solid line), dehydroalanine production (dashedline), and pyridine formation (bold gray). LP, leader peptide.

－ 164 －

ゲノム探索による 32 員環新規チオペプチドラクタゾールの発見

成に関与する遺伝子がわずか 6 個で，チオペプチド生合

われたものである．同大村智特別栄誉教授，供田洋教授

成遺伝子クラスターとして最小だった．また，この化合に厚く御礼申し上げます．化合物の構造解析は富山県立

物は抗菌活性は示さなかったが，骨形成に関与する遺伝

大学工学部・微生物工学講座で行われたものである．同子の発現を阻害する活性が認められた．RiPPs は比較的

五十嵐康弘教授，奥直也講師に厚く御礼申し上げます．

容易に類縁化合物が作製できることに加え，ラクタゾー

生合成研究でご助言を賜りました東京大学大学院農学生

ル生合成遺伝子は数が少なく遺伝子の改変が容易である

命科学研究科応用生命工学専攻・勝山陽平准教授に感謝ことから，今回の研究成果を基盤としラクタゾールを基の意を表します．

にした新規抗生物質の開発を進めている．

引用文献

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 林昌平，池田治生，大村智，奥直也，五十嵐康弘，尾仲宏康．2012．Streptomyces lactacystinaeus OM-6519のリボ
ソーム合成型新規チオペプチドlactazole Aの生合成遺伝子の解析．日本農芸化学会中部支部第166回例会．11月2日，福井．
2) 林昌平，池田治生，大村智，奥直也，五十嵐康弘，尾仲宏康．2013．異種発現，プロモーター置換，複合培養によるLactazole A生産の増加．2013年度日本農芸化学会大会．3月24-27日，仙台．
3) 林昌平，尾﨑太郎，浅水俊平，尾仲宏康．2014．ゲノム探索が明らかにした新規32員環チオペプチド，ラクタ
ゾールの構造と生合成．第56回天然有機化合物討論会．
10月15日，高知．
4) Shohei Hayashi, Taro Ozaki, Shumpei Asamizu, Hiroyasu
Onaka. 2015. Genome mining reveals a minimum gene set
for the biosynthesis of lactazoles, novel 32-memberedmacrocyclic thiopeptides. Natural Product Discovery andDevelopment in the Post Genomic Era. Jan. 11-14,
SanDiego.
5) 尾仲宏康．2015．新規RiPPs抗生物質生合成系のゲノム探索と生合成マシナリー解析．「生合成マシナリー」成果
報告シンポジウム．6月21日，東京．
原著論文
1) Hayashi, S., Ozaki, T., Asamizu, S., Ikeda, H., Ōmura, S.,
Oku, N., Igarashi, Y., Tomoda, H., Onaka, H. 2014. Genome
mining reveals a minimum gene set for the biosynthesis of
32-membered macrocyclic thiopeptides lactazoles. Chem.
Biol. 21, 679-688.

謝辞

本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成によって開設された微生物潜在機能探索寄付講座においてなされたものである．本助成を賜った発酵研究所に対して，ここに厚く御礼申し上げます．本寄付講座世話人である東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専
攻・大西康夫教授のご支援とご協力に感謝の意を表します．S. lactacystinaeus OM-6519 の供与，バイオアッセイ
及び LC-MS 分析は北里大学・北里生命科学研究所で行Bagley, M.C., Dale, J.W., Mer ritt, E.A. & Xiong, X. 2005.
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林

昌平，尾﨑

太郎，浅水

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俊平，尾仲

宏康

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－ 166 －

IFO Res.Commun. 32
167-177, 2018

新規ラビオネン構造の形成に関与するランチペプチド合成酵素の解析
菅井佳宣1)，尾﨑太郎2)，浅水東京大学大学院農学生命科学研究科〒113-8657

俊平，尾仲

宏康

微生物潜在機能探索寄付講座

東京都文京区弥生1-1-1

Analysis of lanthipeptide biosynthetic enzymes responsible
for formation of novel goadionin structure.
Yoshinori Sugai 1), Taro Ozaki 2), Shumpein Asamizu, Hiroyasu Onaka
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo.
Yayoi 1-1-1, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
Lanthipeptides are an important class of ribosomally synthesizes and post-translationally modified peptides. In
Streptomyces sp. TP-A0584 genome, we found a gene cluster containing both a class III lanthipeptide synthetase(GopKC) and a flavin-dependent Cys decarboxylase (GopD). Heterologous expression of the cluster led to
discovery and characterization of new class III lanthipepitde named as goadpeptin which has a unique structure
consisting of a central quarternary carbon atom with a thioether bridge and a methylene bridge. This moiety
shares structural feature with labionin, but the C-terminal amino acid residue is processed by oxidative
decarboxylation. To uncover the biosynthetic mechanisms of the unique structure, we reconstituted thebiosynthetic pathway of goadpeptin in vitro. Although single GopKC reaction afforded lanthionin ring, tandem
reaction of GopD and GopKC accomplished the formation of the labionin-like structure. This is the first report thatthe ring formation reaction catalyzed by class III lanthipeptide synthetase was switched from lanthionin mode tolabionin mode by preceding modification reaction. Our results provide additional insights into determinants oflanthipeptide ring topology produced by lanthipeptide synthetases.
Key words: biosynthesis, RiPPs, Streptomyces, in vitro reconstitution, enzymes緒言の性質から RiPPs は遺伝子操作によってエンジニアリン
グしやすい化合物とされている．また，PTM によってリボソーム翻訳系翻訳後修飾ペプチド(RiPPs) はその導入される構造が生成物の安定性や生理活性発現に重要

構造多様性とユニークな生理活性から医薬の探索源としであるため，新規 PTM の発見は創薬につながることがて注目されている(Arnison et al., 2013 ; Ortega & van der

期待される．

Donk, 2016)．この構造の多様性は翻訳後修飾酵素

ランチペプチドはチオエーテル架橋でつながった 2 ア(PTMs) によって生み出されている．PTMs では前駆体

ミノ酸からなるランチオニン（ lanthionine，Lan ）と呼ペプチドの N 末端に存在するリーダーペプチドを認識ばれる構造を持つ RiPPs の一種であり，最も盛んに研究して C 末端側のコアペプチド領域のアミノ酸残基を修されている化合物群である(Repka et al., 2017)．ランチ

飾することが知られている(Arnison et al., 2013)．また，

ペプチドの中にはナイシンに代表される抗バクテリア活

RiPPs の前駆体ペプチドが構造遺伝子にコードされてい性を持つものが多く含まれるが，他にも抗真菌，抗ウィるため，コアペプチド領域に変異を入れやすい．これら

ルス，抗侵害受容活性など様々な生理活性を示す化合物

現 京都大学学術研究支援室
2)
現 北海道大学理学研究院
E-mail: 尾仲宏康:aonaka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
共同研究者:菅 裕明（東京大学大学院理学研究科），
後藤佑樹（東京大学大学院理学研究科）
1)

が多く含まれている(Arnison et al., 2013)．それらは生合成酵素（ランチペプチド合成酵素）の種類からクラス
I - IV の 4 つに分けられている．これらは反応機構は異なるが，Ser もしくは Thr 側鎖を脱水し，デヒドロアラニン(dehydroalanine, Dha) も し く は デ ヒ ド ロ ブ チ リ ン－ 167 －

菅井

佳宣，尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

宏康

（ dehydrobutyrine，Dhb ）を形成後，Cys 残基のチオー

出 し た． さ ら に GS 生 合 成 研 究 で 利 用 し た flexible in

ルから Dha/Dhb のメチレンへのマイケル付加反応を触

vitro translation（ FIT ）システムを利用し(Ozaki et al.,

媒することが共通している．多くのランチペプチド合成2017)，この遺伝子クラスターにコードされている 2 種

酵素は，その際生じたエノラートアニオンをプロトン化類の PTMs の機能解析を行なった．

することで Lan 構造を形成する．一方でクラス III ラン

実験方法

チペプチド合成酵素の中にはエノラートアニオンからさらなるマイケル付加反応を触媒することで二環性のラビ
オニン構造（ labionine，Lab ）（ Fig. 1 ）を形成させるも目的遺伝子クラスターを含むコスミドの単離のがある．また，クラス III ランチペプチド合成酵素はkinase ドメインと cyclase ドメインからなることから

Streptomyces sp. TP-A0584 のコスミドライブラリーは既に構築したものを使用した(Onaka et al., 2005)．クラLanKC と呼ばれている．

ス IV ランチペプチド合成酵素の一種 venL の配列をクエ

このような Lan/Lab 構造に加え，さらに修飾された

リーに Streptomyces sp. TP-A0584 のドラフトゲノムを検構造をもつランチペプチドも報告されている．例えば，

索した(Goto et al., 2010)，見出された lanKC ホモログ

エピデルミンは Lan 構造の C 末端側 Cys のカルボキシルの配列をもとにプライマーセットを設計し，PCR によりコス基が酸化，脱炭酸された S-[(Z)-2-aminovinyl]- D -cystein

ミドライブラリーから目的遺伝子クラスターを持つコスミド（ AviCys ）（ Fig. 1 ）と呼ばれる構造を有している．C 末（ pTOYAMAcos/15-8D）を単離した．制限酵素処理と末端のカルボキシル基が消失しているため，エピデルミン

端塩基配列の解析によりゲノム上の位置を同定した．

はカルボキシペプチダーゼによる消化を受けず，細胞内で安定に存在できることが示唆されている(Maffioli etal., 2015)．AviCys 構造の生合成における Cys の酸化，脱炭酸を触媒するフラビン依存酵素は LanD と総称されている(Kupke et al., 1992 ; Sit et al., 2011)．
ゴ ー ド ス ポ リ ン（ Goadsporin，GS ） 生 産 菌 で あ る

gop クラスターの異種発現
pTOYAMAcos/15-8D を 大 腸 菌 S17-1 株 を 経 由 し てStreptomyces albus J1074 に 接 合 伝 達 に よ り 導 入 し，S.
albus 15 -8D を 取 得 し た． こ の 株 を 10 mL の YMP 培 地（ 0.2 ％酵母エキス，0.2 ％麦芽エキス，0.4 ％ペプトン，

Streptomyces sp. TP-A0584 の ゲ ノ ム を 探 索 し た と こ ろ(Igarashi et al., 2001 ; Onaka et al., 2001)，GS 生合成遺0.5 ％塩化ナトリウム，0.2 ％硫酸マグネシウム，1 ％グ

伝子クラスター（ god クラスター）とは別の RiPPs 生合

新しい 100 mL の YMP 培地に前培養液を 1 mL 添加し，成遺伝子クラスター（ gop クラスター）が見出された．

さらに 30 ℃で 3 日間振盪培養した．培養後，400 µL の本研究では gop クラスターの異種発現により代謝産物を培養液を 400 µL の n -ブタノールで抽出した．n -ブタノー

同定し，新規化合物ゴードペプチン（ goadpeptin ）を見

ル層を回収し溶媒を留去した後，40 µL のジメチルスル

ルコース，pH 7.2 ）に植菌し，30 ℃で 1 日振盪培養した．

Fig. 1 Chemical structures of labionin, aminovinyl-D-cysteine, and goadionin.
Aminovinyl- D -cysteine is biosynthesized from cysteine via aminoenethiol intermediate that is generated by oxidative
decarboxylation of cysteine. Labyrinthopeptin is one of the representative compounds of labionin containing compound.

－ 168 －

新規ラビオネン構造の形成に関与するランチペプチド合成酵素の解析

ホキシドで再溶解し，LC-MS 解析に供した．LC-MS 解

で 消 化 し， そ れ ぞ れ pColdII（ Takara Bio，Japan ） と析 に は 1200 series ultra-performance liquid chromatog-

pET26b（ Novagen，WI，USA ）のマルチクローニング

raphy（ UPLC ）システム（ Agilent Technology，Japan ）サイトに挿入した．得られた pColdII-gopD と pET26b-

を 組 合 せ た 四 重 極 time-of-flight（ TOF ）6550（ Agilent

gopKC はシークエンス解析により配列を確認した．

Technology ）を用いた．分析には AQUITY UPLC BEH
C18 カラム（ 1.7 µm，2.1×100 mm ; Waters ）を使用した．

組換えタンパク質の調製

Goadpeptin の大量生産と単離精製

ク 質 は pET26b-gopKC と pGro7（ Takara Bio ） を 形 質

GopD タンパク質は pColdII-gopD を，GopKC タンパ
3 L の YMP 培地で S. albus 15-8D を 3 日間培養後，培転換した大腸菌 BL21（ DE3 ）を用いて調製した．発現

養 液 に 60 g の XAD 樹 脂（ Sigma-Aldrich，MO，USA ）誘導した大腸菌株を遠心分離により回収し，Lys Bufferを添加し 1 時間インキュベートすることで化合物を吸着（ 50 mM Tris-HCl（ pH 8.0 ），300 mM NaCl，10 mM imid-させた．不織布を用いて回収した XAD 樹脂をカラムに

azole ）で洗浄した．その後，超音波破砕したサンプル

充填し，水 - メタノール（ 20，40，60，80 ％）を用いを 10,300×g で 30 min 遠心し，上清を可溶性画分としてて段階的に溶出させた．各フラクションを LC-MS によ回収した．Profinia（ BioRad，CA，USA ）を用いて可り分析し，ゴードペプチンが含まれたフラクションを回

溶性画分から目的タンパク質を Ni アフィニティー精製

収した．溶媒を留去後ジメチルスルホキシドで溶解し，し，ゲルろ過カラムを用いてバッファーを交換した

LH20 を用いたゲルろ過クロマトグラフィーに供した．

（ 20 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl ）．

50 ％メタノールを移動相として使用し，分画した各フ
ラクション LC-MS で分析した．ゴードペプチンを含む

ゴードペプチン生合成経路の in vitro 再構成

フラクションを回収後，再度ジメチルスルホキシドに溶DNA テンプレートの調製と前駆体ペプチドの転写，

解 し， 逆 相 ODS（ 48×200 mm，Cosmosil 75C18 -PREP ;翻訳反応はペプチドのアミノ酸配列以外は GS 生合成研

Nacalai Tesque，Japan ）による精製を行なった．サン

究 と 同 様 に 行 な っ た． 翻 訳 し た ペ プ チ ド と，5 µM

プルはアセトニトリル - 0.1 ％ギ酸（ 8:2 ）で溶出した．

GopD，2 µM GopKC，10 mM 塩化マグネシウム，5 mM回収したサンプルは 5C18-AR-II カラム（ Nacalai Tesque ）ATP，50 mM トリス - 塩酸（pH 8.0 ）を混合し 45 µL スケーを用いた分取 HPLC により精製した．精製したゴード

ルで反応を行なった．30 ℃で 3 時間インキュベート後，
1 µg の GluC（ Roche Diagnostics，Switzerland ）を添加

ペプチンは LC-MS 解析により精製度を確認した．

し 37 ℃で 1 時間インキュベートした．その後，サンプ
ゴードペプチンの構造解析

ルを凍結乾燥させ 50 µl のジメチルスルホキシドで再溶

ゴードペプチンのアミノ酸解析は精製した 20 µg の解したものを LC-MS で解析した．環化状態を解析する

ゴードペプチン B を用いて行なった．500 µL の 6 M 塩酸

際は β -メルカプトエタノールを 100 mM になるよう添加に溶解した後，100 ℃で 1 h インキュベートした．溶媒

し，50 ℃で 30 分インキュベートした．酵素反応産物はを減圧濃縮した後，20 µL の水で溶かし，10 µL ずつ分注

MALDI-TOF-MS(ultrafleXtreme, Br uker Daltonics ，した．4 µL の 1 M 炭酸水素ナトリウムを各サンプルに添

MA，USA ）のネガティブイオンモードで分析した．

加後，0.1 ％アセトンに溶かした L - もしくは D - FDLA を

結

20 µL 添加し，40 ℃で 1 時間インキュベートした．1 M
塩 酸 を 4 µL 添 加 す る こ と で 誘 導 体 化 反 応 を 停 止 し，
162 µL のアセトニトリルで希釈後，LC-MS 解析に供した．
一次元，二次元 NMR スペクトルはジメチルスルホキ
シド- d6 に溶かしたゴードペプチン B を用いて解析し，

果

Strepromyces sp. TP-A0584 の RiPPs 生合成遺伝子クラス
ターのゲノムマイニング
GS 生産菌である Streptomyces sp. TP-A0584 のゲノム

溶媒シグナルを化学シフト値の基準とした．ECA-600

データベース上で RiPPs 生合成遺伝子クラスターを探索（JEOL，Japan ）を用いて 600 MHz（ 1H ）と 150 MHz（ 13C ）したところ，クラス IV ランチペプチド合成酵素遺伝子のスペクトルを取得した．

venL と 相 同 性 を 示 す 遺 伝 子（ gopKC ） が 見 出 さ れ た（ Fig. 2a ）．しかしながら gopKC の配列を精査したとこ

遺伝子のクローニング

ろクラス IV ランチペプチド合成酵素の特徴である亜鉛

gopD，gopKC 遺伝子は pTOYAMAcos/15-8D をテンプレートとして PCR により増幅した．増幅した遺伝子は制限

結合ドメインが無いことから，ほぼ同一のドメイン構成

酵 素（ gopD:NdeI と BamHI，gopKC:NdeI と HindIII ）が判明した．また，その近傍には LanD グループに属すを持つクラス III ランチペプチド合成酵素に属すること－ 169 －

菅井

佳宣，尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

宏康

Fig. 2 B iosynthetic gene cluster of goadpeptin.
The gene organization of gop cluster (a). The amino acidsequences of the precursor peptides. Recognition motif
required for post-translational modification were underlined. Residues undergoing post-translational modifications were highlighted in gray (b).

る酵素をコードする遺伝子（gopD ）も見出された．また，クラスター内に 2 コピー存在した構造遺伝子（ gopA1，
gopA2 ）にコードされる前駆体ペプチドの配列にはこれ
ら修飾酵素の反応を受けると予想される Ser，Ser，Cys
モチーフが存在した（ Fig. 2b ）(Müller et al., 2010)．これまでに LanKC と LanD が協働して生合成されるラン

Fig. 3チペプチドの報告例は無く，このクラスターによって生合成されるペプチドに興味が持たれた．
gop クラスターのクローニングと異種発現
gopKC の配列情報を基に設計したプライマーセットを
用 い て Streptomyces sp. TP-A0584 の コ ス ミ ド ラ イ ブ ラ

Heterologous expression of gop cluster.
(a) LC-MS analysis of metabolites extracted from S. albus
harboring empty vector (i and iii) and pTOYAMAcas/
15-8D (ii and iv). The chromatograms show extracted
ion chromatograms at m/z 695.3 (i and ii) and at m/z
723.3 (iii and iv). (b) The elucidated structure of goadpeptin B (left). Simplified structure is drawn to the right.
Amino acid residues that were under went posttranslational modification are highlighted in gray.

リーから PCR によりスクリーニングを行なった．得られたコスミド（ pTOYAMAcos/15-8D）のシークエンス解
析から gop クラスターを全て含んでいることが確認され分取 HPLC による精製を経て 2 を単離した．アミノ酸分析

た．このコスミドを異種放線菌である Streptomyces albus

から L - Ala，L - Ile，L - Glx，L - Asx が検出され，GopA2 のに形質転換し，その代謝産物を LC-MS で解析したところ，

コ ア ペ プ チ ド ア ミ ノ 酸 配 列（ Ala-Ser-Thr-Ile-Ser-Gln-

ネガティブコントロールでは見られないピークが観察さ

Asn-Cys）と一致していた．検出されなかった Ser，Thr，れた（ Fig. 3a ）．高分解能質量分析から，化合物 1 の分子

Cys は翻訳後修飾酵素の反応を受けたことが示唆された．

式が C28H42N10O9S（測定値:695.2918 [M+H] ，理論値:

また，NMR 解析を行なったところ，HMBC スペクトルか

定値:723.3246 [M+H] ，理論値:723.3243 [M+H] ）での環状構造が Ser5 に由来する残基を中心に構築されてい+695.2930 [M+H]+ ），化合物 2 の分子式が C30H46N10O9S（測++ら 4 級炭素（ δ 64.1 ）を中心とした相関が観察され，2 つあることが示された．これら化合物の分子量の差は 2 コ

ることが示された(Iorio et al., 2014)．さらにビニル基にピー存在する前駆体ペプチド（ GopA1，GopA2 ）の分由来するプロトン（ δ 5.38 ，7.15）が観察され，C -末端の子量の差と一致することから，化合物 1，2 がそれぞれCys が酸化，脱炭酸され S-[(Z)-2-aminovinyl]- D -cystein

GopA1，GopA2 に由来する化合物であることが強く示(AviCys) 構造へと変換されていることが示された．ま唆された．

た，二次元 NMR の相関から上記 2 環性の構造中に Cysに 由 来 す る ビ ニ ル 基 が 存 在 す る こ と か ら，LanKC と化合物 2 の構造解析

LanD が協働してこの構造を構築していることが示唆さ

gop クラスターによって生合成される化合物の構造を決定するために，2 に注目し精製，単離を行なった．

れた．本部分構造はこれまでに生合成研究の報告が無く

XAD 樹脂による固相抽出後，LH-20 を用いたゲルろ過精

ディオニン（ goadionin，Goa ）と命名し，化合物 2 をゴー

製，オープン ODS カラムによる逆相クロマトグラフィー，

ドペプチン B(goadpeptin B) と命名した（ Fig. 3b ）．

新規な構造であったことから(Aszodi et al., 2017)，ゴー－ 170 －

新規ラビオネン構造の形成に関与するランチペプチド合成酵素の解析

ゴードペプチン B 生合成経路の再構成

加え 3 時間反応させることで酸化的な脱炭酸反応が進行

ゴードペプチンの生合成経路を解明するために，試験するか確かめた．その結果，MALDI -TOF-MS 解析にお管内で生合成経路の再構成を行なった（ Fig. 4 ）．GopKC

いて，水素分子と二酸化炭素の脱離と一致する 46 Da のと GopD は大腸菌を用いた組換え酵素として発現させ，ニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製したものを使用した．GopKC はシャペロンタンパク質の GroELと GroES との共発現により可溶性タンパク質として調製可能だった．また，精製した GopD を含む溶液が黄色を呈色し，LC-MS で解析したところ FAD が検出されたことから，FAD と結合した状態で調製されたことが示された．
RiPPs の N 末端に存在するリーダーペプチドの消化には特異的なプロテアーゼが関与することが知られているが，gop クラスター内にはプロテアーゼと相同性を示す
酵素遺伝子は存在しなかったことから，gop クラスター
外にコードされるプロテアーゼによって切断されると予想 さ れ た(Kodani et al., 2004 ; Krawczyk et al., 2012 ;Meindl et al., 2010)．そこでコアペプチド領域の N 末端
上流（ -1 ）にグルタミン酸残基を挿入し，市販のプロテ
アーゼ GluC によって切断できるようにした前駆体ペプチド（ GopA2* ）を設計した．無細胞翻訳系（ Fit シス
テム）を用いて GopA2* を調製したところ，理論値と一致する化合物（m/z 3,313 [M-H]- ）の生産が MALDI-TOFMS 解析により確認された（ Fig. 5a ）．これに GopD を

Fig. 4The over view of an in vitro reconstitutionof goadpeptin biosynthetic pathway by the
FIT-Gop system.

Fig. 5 MS analysis of the enzymatic reactions.
MALDI TOF-MS spectra of GopA2* expressed in the FIT system (a), FIT-GopD system (b), and FIT-GopD/KC system (c) are
shown. Byproduct (m/z 3210.15, 103 Da less than GopA2*) indicated by asterisk was supposed to be the peptide GopA-(Met-21-Asn7)(missing the last Cys residue; -103 Da) or the peptide GopA-(Met-21-Asn7)-amide (-104 Da). When the product of FIT-Gop/KC
system was derivatized by β-mercaptoethanol, addition of only one molecule of β-mercaptoethanol was observed (d).

－ 171 －

菅井

佳宣，尾﨑

太郎，浅水

分子量の減少が観察され（ m/z 3,267 [M-H]- ），アミノ

俊平，尾仲

宏康

エンチオールが形成されたことが強く示唆された

al., 2012 ; Völler et al., 2012 ; Wang & van der Donk,
2012)，GopKC はアミノエンチオールを基質としている．

（ Fig. 5b ）．次に，ここに GopKC を加え反応を行なった．

GopKC が他の class III ランチペプチド合成酵素と同様，

3 時間のインキュベーション後に MALDI -TOF-MS で解チオールを基質として認識できるかを再構成系を用いて析したところ，3 箇所の脱水反応と一致する分子量の変検証した．環化反応の進行は β -メルカプトエタノール化が観察され，コアペプチド中の 3 つの残基（ Ser2，による誘導体化により観察した．誘導体化の際，Ser 由

Thr3，Ser5 ）が脱水されたことが示唆された（ Fig. 5c ）．

来の Dha より Thr 由来の Dhb の反応性が低いことから，

C 末端のアミノエンチオールから脱水により形成された前駆体ペプチドの Thr3 を Ser に置換した GopA2_T3S を二重結合へマイケル付加反応がおき，環化していること

設計し，誘導体化の検出感度を高めた変異前駆体ペプチが期待されたが，この反応には分子量の変化が伴わない

ド GopA2_T3S を設計して，実験に用いた．無細胞翻訳

ため MALDI -TOF-MS では観察することができなかっ系を用いて調製した GopA2_T3S を基質に GopKC を反た．そこで脱水によって形成された二重結合に対して応させたところ，予想通り 3 分子の水分子の脱離が観察

β -メルカプトエタノールを反応させ，誘導体化すること
で，環化されずに残った二重結合の数を測定した．そのされた（ Fig. 7ab ）．興味深いことに，その後の誘導体

結果，一分子の β -メルカプトエタノールの付加（ +78 Da ）たことから，2 ヶ所が二重結合であることが確認された化反応では，2 ヶ所に β -メルカプトエタノールが付加しが観察され，2 つの Ser もしくは Thr 残基が環化し二環性（ Fig. 7b ）．すなわち，GopKC によって，1 ヶ所の Dhaの構造に変換されていることが示された(Fig. 5d)．最後に残基のみ環化した一環性の構造（ランチオニン）へと変

GluC を添加することでリーダーペプチドの切断を行い，換されたことが示された（ Lan モード）．一方，GopD

ゴードペプチン B の合成を行なった．生成物を LC-MS でと GopKC をステップワイズに反応させると二重結合は解析したところ，標品のゴードペプチン B と保持時間と精1 ヶ所しか観察されず（ Fig. 7c ），二環性のラビオニン

密質量が完全に一致したことから（Fig. 6），
試験管内でゴー様構造が形成されることから（ Lab モード），GopKC がドペプチン B の生合成経路を再構成することに成功した．

触媒する環化反応は基質の C 末端の構造に依存することが示された．このような C 末端の構造の違いにより酵素反応の詳細な解析

環化様式が変化する例はこれまで報告されておらず，

これまで報告されているクラス III ランチペプチド合

GopKC が初めてである．
環化機構に関してさらなる知見を得るために GopKC

成酵素は Cys 残基側鎖のチオールを用いてマイケル付加反応を行っているが(Jungmann et al., 2016 ; Krawczyk etFig. 7
Fig. 6 LC-MS analysis of the reaction product of the
FIT-GopD/KC and the authentic goadpeptin B.
Goadpeptin B was detected at 3.2 min. Authentic sample(a) and Full reaction (c). Goadpeptin B was not detectedfrom the reaction sample without GopKC and GopD (b).

－ 172 －

Analysis of ring topology produced by GopKC.
MALDI-TOF-MS spectra of GopA2_T3S expressed in the
FIT system (a), reaction products of FIT-GopKC system(b, black), and FIT-GopD/KC system (c, black) are
shown. Spectra obtained from the derivatized samples byβ-ME are shown in gray (b and c).

新規ラビオネン構造の形成に関与するランチペプチド合成酵素の解析

によって形成される化合物の環構造を詳細に解析した．

ン構造（ Dha2-Cys8 と Dha5-Cys8 ）を形成できること

まずランチオニン構造を形成すると予想された Ser 残基が示された．次に，Ser を置換していない前駆体ペプチを Ala に置換した変異前駆体ペプチドを調製し，GopKC

ドを基質とした際に GopKC は大小どちらの環構造を形と反応させた．その結果，二番目の Ser(S2A) もしくは

成 す る か を 確 か め た．2 種 類 の 環 構 造 を 区 別 で き る

5 番目の Ser を Ala に置換した前駆体ペプチド(S5A) は

UPLC の測定条件を最適化し，GopKC 生成物を分析しいずれも脱水，環化されたことが質量分析により示された．その結果，UPLC 解析から生成物は一種類であるこ

た．このことから，GopKC は大小 2 種類のランチオニとが示され（ Fig. 8a ），さらに MS/MS フラグメンテー

Fig. 8 LC-MS/MS analysis of reaction product synthesized by FIT-GopD/KC and FIT-GopKC systems.
Extracted ion chromatograms of each reaction product are shown (a). FIT-GopD/KC product from Pre2 was detected at 2.8 min(1543.686 [M+2H]2+). FIT-GopKC product from Pre2 was detected at 6.1 min (1566.687 [M+2H]2+). FIT-GopKC product from
Pre2_S2A was detected at 6.7 min (1567.693 [M+2H]2+). FIT-GopKC products from Pre2_S5A was detected at 3.9 min (1567.685[M+2H]2+) and at 6.9 min (1567.694 [M+2H]2+). The analytical conditions were as follows : ACQUITY UPLC BEH Shield RP18
1.7 µm column (2.1×100 mm; Waters); column temperature, 40 ℃; a linear gradient program (from 33 ％ to 34 ％ acetonitrile, in thepresence of 10 mM formic acid) over 8 min with a flow rate of 0.3 mL/min. Different retention times between S2A and S5A suggested
that this analytical condition could distinguish the processed peptides containing different ring size. MS/MS spectrum of the
precursor ion representing m/z 1566.687 [M+2H]2+ (b). Fragment ions y4 - y6 indicate that the compound has small lanthionine ring.

－ 173 －

菅井

佳宣，尾﨑

太郎，浅水

俊平，尾仲

宏康

ションパターンから小さい環構造（ Dha5-Cys8 ）を持

ラビオニン環を持つ化合物は分子内にタンデムに並んだつ分子であることが示された（ Fig. 8b ）．この結果から，

ラビオニン環形成モチーフ（ Ser - Ser - Cys ）を持ってい

GopKC は 2 種類の環構造を生成する能力を持っているるが（ Fig. 1 ），GopA は一つしかモチーフを持っていなが，野生型の前駆体ペプチドからは小さい環を持つランい（ Ser2 - Ser5 - Cys8 ）．そこで GopA2 の 8 残基のコアペ

チオニンのみを生成することが示された．

プチド配列を C 末端に追加し，モチーフが 2 つ並ぶ変異
前駆体ペプチド（ GopA2_tandem ）を設計した．再構築

GopD，GopKC の基質認識に関する解析系を用いて GopD と GopKC の酵素反応を行なったとこ

これまでに報告されている RiPPs 生合成酵素の多くはろ，GopD による修飾反応は進行しなかった（ Fig. 9d ）前駆体ペプチドの N 末端に存在するリーダーペプチド

一方で，GopKC を反応させたところ 3 分子の水の脱離を認識し酵素反応を触媒している．GopD と GopKC もが観察された．6 分子の水の脱離は観察されなかったこ

同様にこの領域を認識しているかを検証するために，とから，GopKC は GopA2_tandem を基質として認識すリーダーペプチド領域を削除した前駆体ペプチドを設計ることは出来るが，完全に反応をさせることはできない

し，再構成系を用いて酵素反応を行なった．その結果，ことが示された（ Fig. 9e ）．以上の結果から，GopD と酸化的脱炭酸反応も脱水反応も観察されず，GopD とGopKC は前駆体ペプチドのリーダーペプチド領域を認GopKC がリーダーペプチド領域を認識していることが識し，一つのラビオニンモチーフを修飾する酵素である

示された（ Fig. 9ab ）．また，これまでに知られている

ことが明らかとなった．

Fig. 9 MALDI - TOF-MS analysis of reaction mixture using leader-less precursor peptide and GopA2_tandem as
substrate.
Reaction mixtures containing no enzymes (a) and GopD and GopKC (b) were analyzed by MALDI -TOF-MS. No
obvious conversion of precursor peptide (980 [M-H]-) were observed. Reaction mixtures containing no enzymes (c),GopD (d), and GopKC (e) were analyzed by MALDI -TOF-MS. No obvious conversion of precursor peptide (m/z3987.5 [M-H]-) were observed when the precursor peptide was incubated with GopD (d). Three times dehydration(-54 Da, m/z 3933.5 [M-H]-) was observed when the precursor peptide was incubated with GopKC (e).

－ 174 －

新規ラビオネン構造の形成に関与するランチペプチド合成酵素の解析

ドペプチン B はラビオニン構造の C 末端が脱炭酸され考察た新規な goadionin 構造を持つことが示された．無細胞
翻訳系と組換え翻訳後修飾酵素を組み合わせた再構築系

ランチペプチド合成酵素の系統樹解析から，生成物のを構築し，修飾酵素の機能を解析したところ，上記新規環構造は合成酵素の機能によって一義的に決まるわけで構造は GopD と GopKC の協働により形成されることがはなく，前駆体ペプチドのアミノ酸配列も影響を与えて示された（ Fig. 11 ）．GopD と GopKC はリーダーペプチ

いることが示唆されており，特にクラス III ランチペプ

ドを認識して修飾反応を触媒し，コアペプチド配列を厳

チド合成酵素のうちランチオニンを形成する酵素とラビ密に認識していないことから，本研究において示した

オニンを形成する酵素は系統樹解析から区別することはgoadionin 形成反応はコアペプチドを変化させた変異

できないことが示されている(Zhang et al., 2012)．クラ

RiPPs の創製に利用でき，将来的には新規薬剤の開発へ

ス III ランチペプチド合成酵素の中にはランチオニンと活用されることが期待される．

ラビオニンの両方を合成する酵素が知られている(Völler
et al., 2012)．これは環形成反応において基質ペプチドが二環性のラビオニンを形成するための適切な位置取り

要旨をすることができず，一環性のランチオニンが形成されランチペプチドは強力な抗菌活性やユニークな生理活たと推測している．GopKC においては GopD により前性から医薬の探索源として注目されている．本研究では

駆体ペプチドの C 末端 Cys 残基が修飾されアミノエンチ

放線菌 Streptomyces sp. TP-A0584 のゲノムから見出されオールが形成されたときのみラビオニンが形成されるこたランチペプチドの生合成酵素遺伝子クラスターを解析とから，この修飾により基質ペプチドが GopKC の基質

し，異種発現によりラビオニンと AvyCys が融合した新ポケット内でラビオニンを形成するために適した構造を

規構造を有する goadpeptin を発見した．さらに無細胞とることが出来るようになると考えられる．また，チオー

翻訳系と組換え酵素を組み合わせた生合成経路の再構成

ルよりもアミノエンチオールのほうが共役系による電子により，goadpeptin の試験管内合成に成功した．この再の非局在化のため反応性が高くなることから，この反応構成系を用いて生合成酵素の詳細な機能を解析したとこ性の高さがラビオニン形成に寄与している可能性もある

ろ，生合成前駆体が酸化的脱炭酸酵素 GopD による修飾(Kupke & Götz, 1997)．データベースを探索すると GopKC

反応を受けることで，続くクラス III ランチペプチド合

ホモログと GopD ホモログが同一の遺伝子クラスターに

成酵素 GopKC の環化反応生成物が単環性から二環性へコードされている生物が複数見出される（ Fig. 10 ）．こと変化することが見出された．これら修飾酵素の基質特のことから，GopD と GopKC の協働による goadionin 形

異性を解明し，類縁体を創製することでランチペプチド成機構はバクテリアに分布している機構と考えられる．

のケミカルライブラリーを拡張すると共に新規薬剤の開今回，放線菌 Streptomyces sp. TP-A0584 株が持つ RiPPs

発につながることが期待される．

生合成遺伝子を見出し，異種発現株からその生成物を同定しゴードペプチン B と命名した．構造解析から，ゴーFig. 10 Gene organizations of the gop cluster andother gene clusters contatining gopD and
gopKC homologs.
The deduced functions are labeled in pattern.

Fig. 11－ 175 －

Ring formation reaction switched from lanthioninmode to labionin mode by preceding modification
reaction

菅井

佳宣，尾﨑

太郎，浅水

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 菅井佳宣，小野拓人，浅水俊平，尾仲宏康．2016．新規
ポリケタイド- RiPPs ハイブリッド化合物の生合成研究．
第31回日本放線菌学会大会．9月8日，東京
2) 菅井佳宣，浅水俊平，尾仲宏康．2017．新規RiPPs-ポリケ
タイドハイブリッド化合物の生合成経路解析．日本農芸化学会2017年度大会．3月18日，京都
3) Yoshinori Sugai, Shumpei Asamizu, Hiroyasu Onaka. 2017.
Biosynthetic studies on the class III lanthipeptide synthetase found in the goadsporin producing strain Streptomyces
sp. TP-A0584. 18th International Symposium on the Biology
of Actinomycetes. May 24, Jeju, Koria
4) 菅井佳宣，千田美紀，小野拓人，浅水俊平，千田俊哉，
尾仲宏康．RiPP-polyketideハイブリッド化合物の生合成に関与するGNAT型アシル基転移酵素の解析．第32回日本放線菌学会大会．9月7日，長野
5) 菅井佳宣，江畑一真，浅水俊平，後藤佑樹，菅裕明，尾仲宏康．新規decarboxydehydrolabionin構造の形成に関与するlanthipeptide合成酵素の解析．2018年度日本農芸化学会大会．3月15-18日，名古屋

謝

辞本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成によって開設された微生物潜在機能探索寄付講座においてなされたものである．本助成を賜った発酵研究所に対して，ここに厚く御礼申し上げます．本寄付講座世話人である東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専
攻・大西康夫教授のご支援とご協力に感謝の意を表します．無細胞翻訳系を用いた実験は東京大学大学院理学研
究科化学専攻・生物有機化学研究室で行われたものである．菅裕明教授ならびに後藤佑樹准教授に厚く御礼申し上げます．生合成研究でご助言を賜りました東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻・勝山陽平准教授に感謝の意を表します．

文

献Arnison, P.G., Bibb, M.J., Bierbaum, G., Bowers, A.A., Bugni, T.S.,
Bulaj, G., Camarero, J.A., Campopiano, D.J., Challis, G.L.,
Clardy, J., Cotter, P.D., Craik, D.J., Dawson, M., Dittmann, E.,
Donadio, S., Dorrestein, P.C., Entian, K.D., Fischbach, M.A.,
Garavelli, J.S., Göransson, U., Gr uber, C.W., Haft, D.H.,
Hemscheidt, T.K., Her tweck, C., Hill, C., Horswill, A.R.,
Jaspars, M., Kelly, W.L., Klinman, J.P., Kuipers, O.P., Link, A.J.,
Liu, W., Marahiel, M.A., Mitchell, D.A., Moll, G.N., Moore,
B.S., Müller, R., Nair, S.K., Nes, I.F., Norris, G.E., Olivera,
B.M., Onaka, H., Patchett, M.L., Piel, J., Reaney, M.J., Rebuffat,
S., Ross, R.P., Sahl, H.G., Schmidt, E.W., Selsted, M.E.,
Severinov, K., Shen, B., Sivonen, K., Smith, L., Stein, T.,

俊平，尾仲

宏康

Süssmuth, R.D., Tagg, J.R., Tang, G.L., Truman, A.W., Vederas,
J.C., Walsh, C.T., Walton, J.D., Wenzel, S.C., Willey, J.M. & vander Donk, W.A. 2013. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: over view andrecommendations for a universal nomenclature. Nat. Prod.
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－ 176 －

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－ 177 －

略

号

集

ACT

アクチノロージン

HOK021 Streptomyces nigrescens HOK021

A-factor

Autoregulatory factor，nM オーダーで作用す

ID-CAMHBる微生物ホルモン

Lanthipeptide リボソームで合成され翻訳後に修飾を受

鉄欠乏培地
けるペプチド5aTHQ

5-alkyl-l,2,3,4-tetrahydroquinolin

BCG

Biosynthetic Gene ClusterLP

リーダーペプチド

CDI

Contact-Dependent growth Inhibition

MACB

Mycolic Acid Containing Bacteria ミコール酸

CDS

Coding Sequence

CFU

コロニーフォーミングユニット

Combined-culture

を細胞表層に有する微生物

複合培養

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

MRSA

methicillin-resistant Staphylococcus aureus

CPCore Peptide

NRP

非リボゾームペプチド

DET

脱水 ENT 二量体

PTM

FabF 阻害剤 Platensimycin

DEPT

Distor tionless Enhansment by Polarization

PTMs

翻訳後修飾酵素
ウンデシルプロディギオシン

TransferRED

Dhadehydroalanines デヒドロアラニン

RiPPs

Dhb

dehydrobutyrines デヒドロブチリン

ENT

エンテロバクチン

ROS

活性酸素種

Ffh

Fifty four homologue

ROSEY

Rotating frame overhauser effect spectroscopy

FIT

Flexible In vitro Translation

SEM

走査型電子顕微鏡

GNPS

Global Natural Products Social

SM

二次代謝産物

GodA*

市販のエンドプロテアーゼ GluC で消化でき

SRP

Signal Recognition Particle

るように CP の直前にグルタミン酸残基を挿UPLC-ESI-QTOF-MS

Ribosomally synthesized and Posttranslationally modified Peptide

入した改変 GodA

超高性能液体クロマトグラフィー／エレクト

GSgoadsporin

ロスプレーイオン化／四重極飛行時間／質量HDM

harundomycin

HMBC

Heteronuclear multiple bond coherence

HMQC

Heteronuclear multiple quantum conference

分析法
VRE

－ 178 －

vancomycm resistant enterococci平成 28 年度一般研究助成の研究報告
助成期間:平成 28 年 4 月～平成 30 年 3 月

IFO Res.Commun. 32
2018を用いて解析した結果，寄生性ツボカビに加えクリプト

微細藻類に寄生するクリプト菌門の多様性の解明と培養系の確立
鏡

味菌も検出された．検出されたクリプト菌はロゼラ属(Rozella)に近縁であった．ロゼラ属(Rozella)には菌類に麻衣子

寄生する種類が含まれており，今回検出された菌類も藻類自体よりは藻類に寄生するツボカビに寄生していた可

東邦大学理学部，
現 横浜国立大学大学院環境情報研究院
mycoloop@gmail.com

能性が高い．藻類を餌として菌類の単離培養を試みた結果，ツボカビについては複数種，単離培養が成功した．

目的:クリプト菌門(Cryptomycota)は 2011 年に提唱さしかし，クリプト菌の培養はうまくいかなかった．クリ

れた新しい分類群で，菌類の進化を探る上でも重要な系

プト菌が藻類ではなくツボカビに寄生しているのであれ

統群である．DNA 解析では多くの湖沼や海洋などにおば，藻類とツボカビとクリプト菌の 3 者培養系を確立す

いて普遍的に検出されものの，その多くは観察や単離培る必要がある．

養はされておらず，存在形態や生態は殆ど明らかになっていない．本研究ではクリプト菌類の中でも微細藻類にアーバスキュラー菌根菌の in vitro
培養方法の確立と日本産菌株の整備寄生する種類に焦点をあて，微細藻類に寄生している状態の菌体の DNA を解析する方法（ Single Spore PCR 法）

石により多様性を解明することを目的とした．
方法:千葉県印旛沼およびドイツの Stechlin 湖において，

田

孝

英

製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター，
現 国立環境研究所・生態系環境センター
ishida.ta@gmail.com

春から夏にかけて週 2 回から月 2 回の頻度で表層水を採取した．湖水を数 ml チャンバーに取り，菌類を特異的に染色する Calcofluor White を滴下し，蛍光顕微鏡下で目的:アーバスキュラー菌根(AM)菌はおよそ 8 割の陸観察した．菌類の付着した藻類（珪藻，緑藻，藍藻など）上植物の根に感染し，植物から光合成産物をもらう代わを見つけた折には，菌類が付着した状態で藻類を 1 細胞

りに，土壌の養水分を植物へと供給するという共生関係

あるいは 1 コロニーピックアップした．藻類ごと DNAにある．AM 菌は宿主植物なしに培養することが出来なを抽出し，菌類に特異的プライマーを用いて SSU，ITS，

いため，現在ではポット栽培での植物との共培養が行わ

LSU 領域の rRNA 遺伝子を増幅し，サンガー法により塩れている．しかし，ポット栽培ではクロスコンタミネー

基配列を解析した．一部の試料については，別途，ユニションの危険が高く，バクテリアや腐生菌の混入も不可

バーサルプライマーを用いて，細菌類を含む全生物の避である．さらには，継代作業の手間，広い培養面積，

SSU rRNA 遺伝子を増幅し，次世代シークエンサーを用

植物育成のための光源など，菌株の維持 ･ 管理には多くいて解析した．同時に，宿主となる藻類を複数種もちいの苦労を抱えている．

て寄生菌類の単離培養を試みた．

近年発展した in vitro での AM 菌培養法は，毛状根を結 果・ 考 察: サ ン ガ ー 法 で 解 析 し た 結 果， 印 旛 沼 や

宿主に用いるため，ポット栽培の欠点を克服し，in vitro

Stechlin 湖には多様な寄生性菌類が存在することが明らか

培養の利点を備えている．本研究では，毛状根培養方法となった．検出された多くはツボカビであり，新規系統を発展させ，多種の菌株を維持管理出来るような培養方の種を含む多様な系統が見つかった．印旛沼の試料につ法 ･ 長期保存方法を開発すること，そして，カルチャー

いては，珪藻 Aulacoseira 2 種からクリプト菌や Aphelida

コレクションから分譲可能な国産株を整備することの 2も検出された．Stechlin 湖からはツボカビのみが検出さ点を目的とした．

れたが，珪藻 Fragilaria について次世代シークエンサー

方法:国内 17 カ所から 92 の土壌を採取し，新しい胞子－ 179 －

IFO Res.Commun. 32
2018の増殖を目的として室内でのソルガム/クローバーなど

群体性オオヒゲマワリ目藻類（緑藻綱）に近縁な単細胞性藻類の系統分類学的研究

をポット栽培した後，このポット土壌からの胞子の採集を行った．また東京大学と千葉大学から，すでにポット

仲

栽培で分離された AM 菌株の栽培土壌からも胞子を採集

田

崇

志

慶應義塾大学大学院政策・メディア研究科
naktak@ttck.keio.ac.jp

した．AM 菌の胞子は土壌懸濁液から顕微鏡下のピペッ
ト操作で採取したほか，懸濁液を Ludox とともに遠心分離することによっても回収した．また，野外から AM

目的:オオヒゲマワリ属（ Volvox ）を含む群体性藻類の菌の胞子果を採取した．これらの胞子を表面殺菌した後系統（ TGV 系統群）は，多細胞生物の起源を探る手がに培地で発芽させることにより in vitro 化を試みた．

かりとして注目されている．群体性の進化的な起源を明

結果・考察:ポット栽培した土壌の内，22 試料から胞らかにするためには，単細胞性姉妹群との比較研究も必子の採取を試みた．そのうち 6 試料からは胞子が見つか要であるが，TGV 系統群に近縁な単細胞藻類の分類学らなかった．発芽した胞子でもバクテリアや糸状菌のコ的整理は進んでおらず，TGV 系統群の姉妹群も特定さンタミにより廃棄したものも多かったが，2 株の AM 菌

れていない．そこで本研究では複数遺伝子系統解析によは毛状根に感染したようであった．しかし，その後成長り群体性系統の単細胞性姉妹群を特定し，光学および透が非常に遅いかほとんど止ってしまった．ポット栽培分

過型電子顕微鏡観察に基づき群体性に関わる形質進化の離株 13 株からは胞子数百粒を平板培地に静置したとこ

解明をめざした．

ろ，少なくとも 4 株で発芽が見られたが，これらを毛状

方 法:TGV 系 統 群 に 近 縁 な Chlamydomonas 属 お よ び

根に接種するなどして継代したところ，最終的に千葉大Vitreochlamys 属の既知株，および新たに分離した類似学の分離株 S -20 から in vitro の継代培養が可能な菌株を株について，光学顕微鏡観察および断片的な 18S rRNA

得た．野外から採取した胞子塊はピンセット等で胞子を遺伝子情報から対象株を絞り込んだ．18S rRNA 遺伝子

ばらした後に表面殺菌しても，コンタミネーションが非系統樹上で強く支持された単系統群について，それぞれの常に多く，分離源としては不向きだった．

代表株を選択し，葉緑体 5 遺伝子（ atpB，rbcL ，psaA ，土壌からの胞子の洗い出し自体は比較的簡便である

psaB，psbC）を加えた 6 遺伝子系統解析を行った．複が，発芽に至る胞子はわずかであり，発芽しても毛状根数遺伝子系統解析に際しては，遺伝子ごと，コドン位置に感染させることも困難であった．また，ベルギーにあごと，対象株ごとの塩基組成などの偏りを検討するため，

る GINCO (Glomeromycota In vitro Collection) から現在

任意の遺伝子，偏りが疑われるコドン位置・株をそれぞ

利 用 で き る in vitro 株 は す べ て Rhizophagus 属 で あ り，

れ除いた系統解析も行った．これら複数遺伝子系統解析

今回 in vitro 培養化できた S-20 株も Rhizophagus 属であっの結果に基づき，TGV 系統群に近縁な代表株 6 株につた．一部の土壌試料からは Gigaspora 属と思われる胞子

いて透過型電子顕微鏡観察を行った．

がよく発芽したが，最終的には菌糸伸長が見られなく

結果・考察:18S rRNA 遺伝子系統からは TGV 系統群になったこともあり，毛状根培養が適用可能な分類群が狭近縁な 32 の単細胞系統群（単細胞系統群 1 ～ 32，うちい可能性が考えられた．

13 系統は新規）が認められたため，そのうち培養株が入手できた 29 系統について複数遺伝子系統解析を行った．29 系統群はさらに 6 系統群（メタ系統群 A ～ E，および単細胞系統群 19 ）に整理され，Chlamydomonas
pila を含むメタ系統群 A が TGV 系統群の姉妹群である
ことが弱いながら示唆された．一部データを除外した解－ 180 －

IFO Res.Commun. 32
2018

析でも，大きく異なる結果は得られなかった．光学およにし，生物型 3 を含めた本菌全体の簡便な検出・同定方

び透過型電子顕微鏡観察の結果からは，特殊化した細胞法を提唱し，細菌学，公衆衛生学の発展に寄与する．

壁を持ち二分裂による無性生殖を行うメタ系統群 B を方法:本菌 417 株を収集し，パルスフィールド・ゲル電

除き，形態学的に明瞭な識別形質は見いだされなかった．

気泳動による遺伝子型別にて独自のプロファイルを示す

また遊走子嚢を形成する全ての系統群で遊走子嚢中の遊107 菌株，さらに基準株（ LMG 20976 T ），および標準株

走子数に個体差（ 2 体または 4 体）があった．

（ ATCC 12032 など計 3 株）（合計 111 株）を用いて菌株

今回，未知の 18S 系統群を多数見いだすと共に，TGVの生化学性状（計 77 性状）を確認した（試験管法，API系統群に近縁な単細胞性藻類の系統学的整理を大きく進50CH，および API XYM キット）．試験は 2 度繰り返しめることに成功した．これまでは多数の単細胞系統からて行ったが，必要に応じて 3，4 回繰り返し試験したも恣意的に選ばれた種が比較研究に用いられてきたが，今の も あ る． そ の ほ か 病 原 性 関 連 遺 伝 子 保 有 の 有 無，回の成果により系統学的に妥当な代表種（株）の選択がMultilocus sequence typing( MLST )を実施した．更に，可能になった．またメタ系統群間の形態差が乏しかった

40 菌 株 を 選 び next-generation sequencing( NGS) を 用

ことは，分類学的整理の困難さを浮き彫りにしつつ，系

いて型別を行った．

統分化が進化的に短期間に進んだ可能性も示唆してい結果・考察:111 菌株は，生化学性状により 81 の型に分る．特に単細胞藻類で遊走子嚢中の遊走子数が定まって類された．Biogroup 1 に含まれる菌株は基準菌株と標準いなかったことは，その制御が群体性進化の直前または菌株( LMG 20972 および 20973 )のみであった．同様に

ごく初期に生じたことを示唆している．

Biogroup 2 に含まれる菌株は標準菌株( ATCC 12032 )のみであった．他の野生株 107 株は全て Biogroup 1 お
よび 2 に属さない性状を示した（リジン脱炭酸試験陽性

人獣共通感染症原因菌 Escherichia albertii の遺伝子解析および表現型解析による分類
村上光

かつインドール陽性）( Biogroup 3 とする)．MLST の結果からも Biogroup 1，2 および 3 におけるハウスキーピ

一

ング遺伝子の大きな類似度の差異は認められなかった．

国立感染症研究所感染症疫学センター
kmuraka@nih.go.jp

NGS による解析により過去の報告で Escherichia albertiiは系統的に G1-G5 の 5 つのグループに分けられているが，目的:人獣共通感染症原因菌 Escherichia albertii（エシェ

本研究で解析した株は G1-G4 に含まれ，多くは G1 のグ

リキア・アルベルティイ）は，2003 年，‘ Hafnia-like’

ループに分類された( 35/40 株)．以上の結果から，臨下痢原性株に提唱された新菌種である．鳩等の野鳥が保床および公衆衛生上の検査において混乱を避けるために菌し，ヒトに下痢等の消化器症状を惹起する．国内ではも，本菌における Biogroup 3(リジン脱炭酸陽性かつイ複数の集団感染事例が報告されていて，中には患者数

ンドール陽性)という新たなグループの存在を提唱する．

100 名を超す事例もある．本菌は，現在 2 つの生物型の存在が明らかとなっている．我々は，新たに第三の生物型を発見した．この第三の生物型は，通常の検査では大腸菌と誤同定されることが多発している．これは，この生物型 3 が，公知のものであるとは言えない状況だからである．本研究では，Escherichia albertii の生物型 3 を確立し，大腸菌との誤同定を減らすよう情報提供することを目的とする．それに加え，本菌全体の系統を明らか－ 181 －

IFO Res.Commun. 32
2018

モニア菌類:ヒメシバフタケ属（ Panaeolina ）未記載

東アジア地域における動物関連物質
分解に関連する菌類（糞生菌類，
アンモニア菌類）の研究
吹春

俊

種の発生が期待された北海道において，目的の菌種についての多数の標本と菌株及び分子系統の情報を得ることができ，新種“ Panaeolina jezoensis ”として記載をすす光めている．今回得られた，新産・未記載の糞生菌類とア

千葉県立中央博物館生態環境部
fukiharu@chiba-muse.or.jp

ンモニア菌類について，現在，論文化をすすめており，収集した菌株についても可能なものは NBRC への寄託

目的:陸上に植物と菌類の共生系としての森林が誕生し，を予定している．

その後，陸生動物群も登場し森林の中で排泄・死亡するなかで，動物関連物質の分解に関与する菌類，すなわち住宅室内真菌叢におけるアレルゲンの多様性に関与する真菌の系統分類学的検討

糞生菌類（動物糞上に発生）やアンモニア菌類（動物死
体や糞尿分解跡に発生）が誕生した．人類も含め動物の渡暮らしに深く関与し，森林生態系にとっても重要なこれ

辺麻衣子

国立医薬品食品衛生研究所衛生微生物部
mwatanabe@nihs.go.jp

らの菌類についての基本情報は少ない．今回は日本を中心に東アジアの該当菌類の種類相について調査した．
方法:糞生菌類:国内では千葉県，京都府，沖縄県で採目的:住宅室内の真菌数が異常増加した場合に，吸入曝集したニホンジカ，キョン，ニホンイノシシ，イリオモ

露による喘息等アレルギー疾患が発生する可能性があ

テヤマネコ，リュウキュウイノシシの糞，国外ではベトる．一方で，医療機関では，商業ベースで実施される菌ナムで採集した野生アジアゾウ糞を，湿室培養し，発生

種特異的抗原を用いた血清学的検査で陽性判定が出た場

する糞生の菌類相（ヒトヨタケ類[担子菌類:ハラタケ

合にも，示唆される病原菌種と臨床試験の結果が必ずし科，ナヨタケ科]，チャワンタケ類[子嚢菌類:チャワも一致しないケースや，患者宅から病原菌種が検出されンタケ科]）を調査した．アンモニア菌類:北海道九州

ない等により病因の特定に至らないケースがあることが大学足寄演習林に発生区を設置し（カシワとミズナラ林，問題となっている．これらが生じる原因のひとつとして，

1 × 2 m × 4 か所，2016 年 6 月 13 日設置），調査した（現真菌アレルゲンタンパクの多様性についての知見が乏し地調査は 5 回:2016 年 7 月 14 日，8 月 22 日，9 月下旬，

いことが挙げられるが，これまで真菌アレルゲンについ

10 月上旬，10 月 17 日）．

て行われた詳細な解析は少ない．そこで本研究では，真結果・考察:糞生菌類:従来日本産ヒトヨタケ類約 40

菌の中でもアレルゲン性の高い Aspergillus 属菌の複数菌種のうち，糞生として 11 種が知られていたが，今回の調種について，アレルゲン遺伝子の多様性に関する分子分

査で合計 7 種が分離され，うち 1 種 Coprinellus pusillulus

類学的検討を行った．

は日本新産のヒトヨタケ類であった．またイリオモテヤ

方法:東北および九州地方に建設された築年数 1 ～ 50

マネコ・リュウキュウイノシシの糞から日本新産のチャ

年の木造一戸建て計 20 戸を対象として，室内のハウス

ワ ン タ ケ 類 3 種 Ascobolus crenulatus，A. lineolatus，A.

ダストおよび空気の真菌叢解析を行った．続いて，多様fushanus が採集された．ベトナムからは 28 種のヒトヨな真菌種においてアレルゲン遺伝子として発現しているタケ類が報告されており，うち 6 種が糞生として知られと考えられる Alt_a_6 および Asp_v_13 のアミノ酸配列ていた．今回の調査で“ Coprinopsis yokdonensis ”（現在について，公共 DB からのダウンロードおよび本研究に記載中）を含む未記載の 3 種，ベトナム新産 3 種を含む，おける分離株から実験的に配列決定することによって収合計 8 種のヒトヨタケ類を分離することができた．アン

集し，配列の相同領域の比較を行った．続いて，アミノ－ 182 －

IFO Res.Commun. 32
2018

酸配列ごとに既存のエピトープ（ epitope ）配列との類かった．
我々はこれまで，ヒト口腔内から多数の未同定株を分似性と立体構造の予測を行い，各菌種のアレルゲン性の強さについて予測評価を行った．

離後，その一部を新菌種 V. tobetsuensis として登録し，結果・考察:築年数が古い住宅では総真菌数が比較的高本菌がヒト口腔内で優勢であることを明らかにした .

く，かつ Cladosporium 属菌の占める割合が高いこと，築本研究では上記未同定株の系統分類を進めると同浅の住宅では Aspergillus 属菌および Eurotium 属菌の割時 に，V. tobetsuensis が 産 生 す る 細 菌 間 情 報 伝 達 物 質

合が高い傾向にあることが示された．また，Aspergillus（ Autoinducer: AI ）の口腔バイオフィルム初期形成過程

属菌種の検出傾向を比較したところ，築年数に関わりなにおける生態学的役割を明らかにすることを目的とした．

く，最もアレルギー性の高い真菌である A. fumigatus は

方法:多数の未同定株の 16S rRNA，rpoB，dnaK 遺伝

ほとんど検出されず，Aspergillus Section Restricti および子の塩基配列を網羅的に解析し，そのデータから系統樹

Eurotium 属菌が優占的に検出される住宅の頻度が高かっ

及 び 類 似 性 解 析 を 行 い， 小 児 口 腔 か ら 分 離 さ れ た

た．そこで，これら A. fumigatus および高検出菌種のVeillonella sp. T11011-4 株を新菌種候補とした．近縁菌

Alt_a_6 および Asp_v_13 のアミノ酸配列の比較解析を種との Average Nucleotide Identity(ANI)の算出，各種行った．その結果，Alt_a_6 では配列共通性は高く，A.

生化学的性状を解析し，GC-MS にて終末代謝産物の測fumigatus 以 外 の 多 様 な Aspergillus 属 菌 も 高 い ア レ ル

定を行った．

ギー性を有する可能性が示唆された．一方で，Asp_v_13

一方，V. tobetsuensis の培養上清中の AI-2 活性を測定

では，Alt_a_6 と比較するとアミノ酸配列の菌種間の変後，最大活性を示した培養上清から，Sep-Pak C18 カラ

異が蓄積しており．アレルゲン性が菌種によって異なる

ム(Waters)を用いて AI-2 を部分精製した．次いで，口可能性が考えられた．さらに，両遺伝子ともに特異的な腔バイオフィルム形成開始菌である Streptococcus gordonii

アミノ酸変異が epitope 領域に存在することを確認した．

の，バイオフィルム形成に及ぼす AI-2 部分精製物の影

これらのことから，Aspergillus 属菌の中でのアレルゲン性響を解析した .

の違いに考慮し，真菌アレルギー患者の診断や治療方法

結果・考察:T11011- 4 株は，既報の Veillonella 属細菌とについて検討する必要があると考えられた．

同等の生化学的性状を示し，本属細菌に特徴的な，酢酸とプロピオン酸を終末代謝産物とする乳酸代謝が確認された．また，16S rRNA 遺伝子は既報菌種と 98.8 ％の高い

ヒト口腔領域における Veillonella 属細菌の系統分類とバイオフィルム形成に関する生態学的研究
眞島

類似性を示したが，rpoB 及び dnaK 遺伝子とはいずれも95.9％以下の低い類似性を示し，さらに ANI は全て 91.8 ％以下であったことから，本株を Veillonella infantium といづみ命名し( JCM 31738 T, TSD-88 T )，新菌種として確立した．

北海道医療大学歯学部
i.mashima106@gmail.com

V. tobetsuensis 由来 AI-2 部分精製物は，経時的，濃度依存的に S. gordonii のバイオフィルム形成を抑制した

目的:Veillonella 属細菌は，ヒト口腔等から高頻度に分が，その浮遊状態の細胞の増殖抑制は認められなかった．

離される偏性嫌気性グラム陰性球菌である．歯科の二大

本研究成果から，V. tobetsuensis 由来 AI-2 がう蝕や歯疾患であるう蝕と歯周病の原因は口腔バイオフィルムで周病の新規的予防及び治療法の確立に応用できる可能性あり，その初期形成期に Veillonella 属細菌が重要な役割が示唆された．また，Veillonella 属細菌の系統分類が進を担うことが示唆されてきたが，培養や菌種の判別が困

み，今後口腔バイオフィルムの形成機序の解明に寄与す難である等の理由から，その詳細な研究が進んでいなることが期待される．

－ 183 －

IFO Res.Commun. 32
2018

リペプチドの状態でアミノ酸が多く残存する部分加水分

質量分析法を用いたバクテリアのペプチドグリカンアミノ酸構造決定法の開発
浜田盛

解条件について検討を行った．様々な温度（ 60 ～ 100 ℃）と時間（ 30 分～ 3 時間）を組み合わせて加水分解を行っ之て比較したところ，4N HCl で 100 ℃ 45 分間加水分解し製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター
hamada-moriyuki@nite.go.jp

た際に最も良好な結果が得られることが明らかとなった．

目的:ペプチドグリカンはグラム陽性細菌の細胞壁の主プチドグリカンを分析したところ，完全加水分解サンプ

要構成成分であり，そのアミノ酸構造によって定義されルからは検出されなかったジペプチド（ NBRC 3775 T:るペプチドグリカンタイプは，分子系統による分類と高Asp-Ala, Ala-Glu, Glu-Or n, Or n-Asp; NBRC 15015 T :い相関性を示すことから，グラム陽性細菌，特に放線菌

Ala-Glu, Thr-Asp, Lys-Thr） と ト リ ペ プ チ ド（ NBRC

における属レベルの指標として広く用いられている．現3775 T : Or n - A sp - A la ; NBRC 15015 T : Lys -T h r - A sp,

在多くの分類学者は新規分類群の提唱に際し，ペプチド

Glu-Lys-Thr）が検出された．今回得られた結果は，両グリカンの加水分解物を TLC や HPLC を用いて分析し，株のペプチドグリカン構造が既報に一致することを強く含まれるアミノ酸の種類や量比からペプチドグリカンタ

示唆していた．以上のとおり，本研究で開発した手法はイプを推定しているが，新規もしくは複雑な構造になる

簡便かつ迅速に分析可能で，従来の定量分析および異性と，豊富な経験を持つ特定のグループしか構造決定でき

体分析の結果と組み合わせることで詳細なアミノ酸構造ないのが現状である．本研究では，液体クロマトグラフを推定もしくは決定することができるため，今後広く普質量分析装置（ LC-MS ）を用いることで，正確かつ客及することが期待される．

この加水分解条件と APDS 誘導体化法を組み合わせてペ観的なデータに基づく，簡便で信頼性の高いペプチドグ
リカンアミノ酸構造決定法を開発することを目的とした．

原生生物の細胞表面に共生する
Treponema 属細菌のシングルセルゲノム解析

方法:詳細なアミノ酸構造が既に決定されている放線菌
Cellulomonas flavigena NBRC 3775 T と Oerskovia turbata

雪

NBRC 15015 T を分析対象とした．定法により抽出・精真弘

理化学研究所環境資源科学研究センター
masahiro.yuki@riken.jp

製した細胞壁サンプル 1 mg を 4N HCl で 100 ℃ 45 分間
加水分解した後，3 -アミノピリジル- N -ヒドロキシスク
シンイミジルカルバメート（ APDS ）で誘導体化したも目的:シロアリ腸内には，十数種の原生生物と数百種ののを，逆相系カラムを使用した LC-MS を用いて分離し，細菌が共生している．さらに原生生物の細胞内，細胞表

各アミノ酸およびペプチドの分子量から同定を行った．

面にも細菌が共生し，多重共生系を構築していることが結果・考察:まず，LC-MS によるアミノ酸の検出手法

分かっている．しかし，多くの共生細菌は難培養性であについて検討を行った．市販の複数の誘導体化試薬を用るため，分子生物学的解析が進んでおらず，共生系においてアミノ酸の標準試料の分析を行ったところ，APDSける役割が分かっていなかった．本研究では，シロアリによる誘導体化法が高感度かつ安定的に検出可能だった．

腸内の原生生物 Pyrsonympha の細胞表面に共生する 3 種

この方法で C. flavigena NBRC 3775 T と O. turbata NBRCの Treponema 属細菌 (Cluster I, Cluster IIA, IIB) のゲノ

15015 のペプチドグリカン完全加水分解物（ 4N HCl

ム配列をシングルセルゲノム解析により解読し，共生系

100 ℃ 16 時間）を分析したところ，報告されている全における各細菌の役割を解明することを目的とした．

構成アミノ酸を検出可能なことが確認された．次にペプ方法:マイクロマニピュレーターを用いて，腸内微生物

チドグリカン構造を推定する上で重要なジペプチドやト叢から Pyrsonympha を 20 細胞集め，破砕し，TreponemaT－ 184 －

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2018

属細胞表面共生細菌を含んだ溶液を調製した．この溶液

ナノアーキアの検出と培養株確立の試み

から，セルソーターを用いて細菌を 1 細胞毎に分離した．
分離した細菌を溶菌し，Phi29 DNA ポリメラーゼによ伊り全ゲノム増幅を行い，3 種の Treponema 属細菌の全ゲ

藤隆

理化学研究所バイオリソース研究センター
titoh_jcm@riken.jp

ノム増幅産物を取得した．得られた全ゲノム増幅産物からライブラリーを作製し，MiSeq でシーケンスを行った．
さらに長鎖配列を得るため PacBio を用いたシーケンス

目的:近年，他のアーキアに寄生または共生しているとも行った．SPAdes を用いて，アセンブルを行い，ドラ思われるゲノムサイズの小さい微小アーキア（本研究でフトゲノム配列を取得した．このドラフトゲノム配列かはナノアーキアと称する）が，温泉・鉱山排水・塩田・らゲノム完全性を求め，Prokka と RAST を用いてアノ海底堆積物など様々な環境から発見されてきている．こテーション解析を行った．ゲノム完全性が低かったのうち Nanoarchaeota 門アーキアは，海底熱水孔や陸上Cluster IIB のドラフトゲノム配列に関しては，原生生物

温泉から頻繁に検出されており，またこれまでに 2 株が1 細胞をその共生細菌と一緒に丸ごとミニメタゲノム解培養化に成功している．しかしながら，その生態学的実析し，ビニング (binning) 解析によりゲノム完全性が高態や宿主範囲，共生（寄生）のメカニズムはよく分かって

い Cluster IIB 配列の取得を行った．

いない．本研究では陸上温泉に存在する Nanoarchaeota

結果・考察:Cluster I 3.8 Mb，Cluster IIA 2.6 Mb，Cluster

を中心にその生態学的分布を解明し，またそれらの培養

IIB 1.3 Mb のシングルセルゲノム配列を得ることに成功

株の確立を目指すことを目的とした．

し，ゲノム完全性はそれぞれ 92.8 ％，85.6 ％，42.4 ％で

方法:秋田県及び栃木県の火山性酸性温泉から温泉水をあった．Cluster IIB に関しては，ミニメタゲノム解析か

採取し，その 1 リットルを孔径 0.2 µm メンブレンフィ

ら，ゲノム完全性が 90 ％以上の配列を取得できた．ア

ルターに通して細胞を捕集し，これより DNA 抽出を行っノテーション結果から，Cluster I は還元的酢酸生成関連

た．さらに Nanoarchaeota を含めたアーキア及びバクテ遺伝子を有しており，二酸化炭素と水素から酢酸を生成

リアをカバーする 16S rRNA 遺伝子プライマーを設計し，し，シロアリにエネルギー源として供給している可能性

3 温泉試料について次世代シークエンサーによる菌叢解析が示唆された．Cluster IIA は，多種多様な糖質加水分解を行った．一方，これら温泉試料について温度（ 85，70，

酵素遺伝子を有していることから，原生生物と協調した45 ℃），pH（ 2.5 ，5.0）， 気 相（ air，80％H 2 - 20％CO2 ），木材分解系を構築していることが示唆された．Cluster I，

添加物（硫黄またはチオ硫酸）の有無を変えて様々な培

Cluster IIB は糖質加水分解酵素遺伝子が少ないことから，養条件下で集積培養を行い，生育が認められた場合にはこの木材分解系から生じた遊離糖を取り込んで利用してDNA 抽出を行い，アーキアあるいは Nanoarchaeota 16Sいる可能性が示された．これらの結果から，原生生物

rRNA 遺伝子特異的プライマーを用いてそれぞれの検出

Pyrsonympha の細胞表面に共生している 3 種の Treponemaを行った．必要に応じてその遺伝子配列を決定し系統学

属細菌が，それぞれ異なった役割を担い共生しているこ

的解析を行った．

とが示唆された．

結果・考察:野外で採取した温泉水 2 試料（秋田県後生掛温泉及び蒸ノ湯温泉）には全リード中 17 ～ 36 ％の，
屋内浴槽中温泉水（栃木県奥塩原温泉）には 1.4 ％の比率で Nanoarchaeota が検出できた．一方，集積培養物か
ら の 検 出 で は， 浴 槽 中 温 泉 水 試 料 に お い て 70 ℃・
pH 2.5・好気条件下，硫黄添加または無添加の集積培養－ 185 －

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物からは一次 PCR で Nanoarchaeota を検出することがチドを求核剤に用いてアミド形成することを見出した．

可能であった．しかし，この培養物の継代培養を繰り返

本酵素の遺伝子の相同遺伝子（オーソログ）は放線菌をすと次第に一次 PCR による Nanoarchaeota 検出は困難

中心に多種多様な微生物に分布していることから網羅的となった．さらに，凍結保存してあった本温泉水試料を機能解析を試みた．

段階的に希釈・分配した多検体について同培養条件（硫方法:Streptomyces avellaneus NBRC 13451，Kitasatospora

黄存在下）で培養したところ，1,200 倍希釈した培養物

aureofaciens NBRC 12843 ，Streptomyces varsoviensis

は培養管 50 本中 12 本で生育が認められ，これらからは

NBRC 13093 ，Streptomyces catenulae NBRC 12848 ，

いずれもアーキア（系統解析によって 2 種の Acidianus

Actinokineospora inagensis NBRC 15663，Bradyrhizobium

spp. と同定），Nanoarchaeota を検出することができた．

lablabi NBRC 108826 ，Pseudomonas syringae MAFF

しかしながら，Nanoarchaeota の PCR 増幅産物は収量が301538 ，Catelliglobosispora koreensis NBRC 105861 ，少なく，その存在量はきわめて低いものと思われた．

Nocardiopsis baichengensis NBRC 104399 のゲノム配列に今後，Nanoarchaeota の存在量を定量化したうえでそ

見出した ATP-grasp ligase 相同遺伝子を含む推定生合成の消長をより詳細に調べていくことによって，培養株の遺伝子を PCR で増幅あるいはシャトルコスミドにクロー確立を図っていきたい．

ニング後，異種宿主である Streptomyces lividans に導入し，特異的に生産される代謝産物の検出を試みた．
結果・考察:予想に反し殆どの株で特異的化合物の生産

微生物に見出した新規で多様なアミド結合形成酵素の網羅的解析と利用
大利は認められなかった．おそらく，用いた殆どのクラスターが休眠状態にあり，クラスター内に存在する転写因子の活性徹化などが必要であると考えられた．唯一，N. baichengensis

北海道大学大学院工学研究院
dairi@eng.hokudai.ac.jp

NBRC 104399 由来のクラスターを発現させた場合，クラスターの一部の遺伝子が機能したと推定される N -ア

目的:自然界で見出されるペプチド化合物のアミド形成

セチルクロロチラミンの生産が認められた．また，本研機構として最も良く知られているのが，タンパク質の合究の過程で，微生物のペプチドグリカンの生合成に関与

成と同様にリボソーム関与の機構である．リボソームがする ATP-grasp ligase である新規酵素 UDP-MurNAc-L -関与しないペプチドの生合成として，非リボソームペプ

Ala-L -Glu synthetase (MurD2) を見出した．

チド合成の英語名 non-ribosomal peptide synthesis の頭文字を取って NRPS と総称される機構による生合成も知ら

糸状菌テルペノイドのコンビナトリアル生合成れている．さらに，アミノ酸を ATP を用いてリン酸化により活性化した後，もう 1 つのアミノ酸のアミノ基との一間でアミド結合を形成する ATP-grasp-ligase が存在する．

瀬

博

文

九州大学大学院農学研究院
ichinose@agr.kyushu-u.ac.jp

本酵素については，求核剤として使えるのはアミノ酸のみであり，ペプチドや求核性の化合物を利用できる酵素は知られていなかった．しかし筆者は放線菌が生産する

目的:テルペノイドはイソプレンユニットの倍数体を基ペプチド系抗生物質フェガノマイシン（ pheganomycin ）本骨格とする天然化合物である．中でも 3 つのイソプレの生合成研究を通して，ATP-grasp モチーフを持つ新規ンユニットからなるセスキテルペノイドは化学構造の多ペプチドリガーゼが，ATP を用いて多様な化合物のカ様性に富み，優れた生物活性を示す化合物も多く，創薬

ルボン酸をリン酸化し，種々の配列や長さからなるペプシード化合物の探索資源として期待される．その生合成－ 186 －

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2018

過程では，骨格化合物の産出を担うセスキテルペン合成

たれた．本研究の結果は，糸状菌 P450 を利用すること

酵素（ STS）と，骨格化合物への酸化修飾を施すシト

でテルペノイドのコンビナトリアル生合成を可能性にしクロム P450（ P450 ）が連鎖的に機能して構造多様性にた例であり，本例を起爆剤として様々な有用天然物の高富む化合物群が産生される．我々は，木材腐朽担子菌お効率生産が進展すると期待している．

よび麹菌に由来する 425 種の糸状菌 P450 を獲得し，酵母を用いた P450 異種発現技術を開発してきた．本研究

焼酎麹菌のクエン酸高生産機構の鍵となるクエン酸トランスポーターの同定と機能解析では，担子菌に由来する様々な STS を 425 種の P450 と網羅的に共役させ，多種多様なセスキテルペノイドの産生を試みた．

二

方法:白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium および褐

神

泰

基

鹿児島大学農学部
futagami@chem.agri.kagoshima-u.ac.jp

色腐朽菌 Postia placenta のゲノム配列を精査して STS
候補遺伝子を探索し，RT-PCR により cDNA を増幅した．
得 ら れ た cDNA を Saccharomyces cerevisiae に 形 質 転 換

目的:焼酎製造に用いられる白麹菌（ Aspergillus luchuensis

して異種発現させた．形質転換酵母が産生する代謝物をmut. kawachii ）は，クエン酸を高分泌生産する能力をGC-MS 分析に供することで STS の酵素機能を同定した．

もち，醪の pH を下げて雑菌汚染を防ぐ重要な役割があ

さらに，STS と P450 を共発現する酵母を作出し，代謝る．本研究は，白麹菌のクエン酸高分泌生産機構の解明

物を網羅的に分析してセスキテルペン骨格化合物を水酸を目的として，比較ゲノムにより見出した推定ミトコン

化する糸状菌 P450 を同定した．

ドリア局在型クエン酸輸送体（ CtpA と YhmA ）を解析

結果・考察:P. chrysosporium および P. placenta に 36 種した．なお，yhmA 遺伝子は糸状菌のゲノムにおいてクの STS 候補遺伝子が見出され，このうち 26 種の STS をエン酸合成酵素遺伝子（ citA ）の下流に高度に保存され完全長 cDNA として獲得することに成功した．S. cerevisiaeているため，クエン酸生産機構と密接に関連しているこを宿主として担子菌 STS を異種発現させたところ，少とを予測して，解析対象とした．

なくとも 35 種の化合物が検出され，多様性に富むセス

方法:白麹菌から CtpA と YhmA を精製してリポソーム

キテルペン骨格化合物を産出することが可能となった．

に再構成し，[14 C] クエン酸を用いてクエン酸輸送活性

中でも，ビサボレン合成酵素およびプロトイルデン合成を測定した．また，ctpA 遺伝子破壊株，yhmA 遺伝子破酵素が産出する骨格化合物は，生物活性セスキテルペノ

壊株，yhmA 遺伝子破壊株における ctpA 遺伝子のコン

イドの有望な前駆体として期待された．

ディショナル発現株，各相補株，GFP 融合タンパク質

つづいて，STS と 425 種の糸状菌 P450 を共発現させ発現株を構築した．これらの株の表現型，有機酸生産，て多種多様なセスキテルペノイドの産生を試みた．一連

細胞内のアミノ酸濃度を解析した．

の検討によりビサボレン変換活性を示す 5 種の P450 が結果・考察:まず，CtpA と YhmA のクエン酸輸送活性同定され，少なくとも 7 種のビサボレン水酸化体を得るを測定した結果，いずれも交換輸送体であることが示唆ことに成功した．また，プロトイルデン合成酵素と P450された．CtpA はリンゴ酸と cis -アコニット酸を対向基を共発現させたところ，3 種の糸状菌 P450 がプロトイ

質としてクエン酸輸送活性を示し，一方，YhmA はリ

ルデンに対する水酸化活性を示し，5 種のプロトイルデ

ンゴ酸，cis -アコニット酸，オキソグルタル酸，オキサン水酸化体を得ることに成功した．ビサボレンおよびプ

ロ酢酸，コハク酸といった幅広い対向基質でクエン酸輸

ロトイルデン誘導体の生物活性は広く注目されており，送活性を示した．次に，ctpA と yhmA を単独破壊すると，本研究で得た様々な水酸化体の有用性について興味がも

クエン酸生産量が減少した．また，yhmA 破壊株におい－ 187 －

IFO Res.Commun. 32
2018て Tet-On システムによる ctpA のコンディショナル発現

分裂酵母の野生株を SD 液体培地に接種し，長期間培養株を構築した．同株の観察により，ctpA と yhmA の二重を繰り返すことで生き残る細胞を濃縮した．この中から破壊が最少培地で合成致死となることが明らかになっ

長寿命変異株をスクリーニングし，変異株のゲノム情報

た．次に，CtpA と YhmA に GFP を付加して蛍光顕微鏡を解析した．

により観察した結果，CtpA と YhmA が少なくともミト「高発現することで分裂酵母の細胞寿命を延ばす因子のコンドリアに局在することが示唆された．さらに，リア

解析」についてルタイム RT-PCR の結果から，クエン酸を高生産する培当研究室で取得した「長生き因子:Ecl1 」は高発現す養条件で ctpA と yhmA の転写が誘導されることが明らることにより分裂酵母の経時寿命を延ばす．そこで，まかになった．また，ctpA と yhmA の二重破壊が合成致死

ず Ecl1 の発現時期，発現誘導シグナル，発現に関わるとなったことから，クエン酸輸送には重要な生理的意義

転写因子を同定し，その上で，発現誘導シグナルが細胞があると考えて，有機酸を起点とするアミノ酸合成に着寿命に与える影響を解析した．

目した．各破壊株の細胞内のアミノ酸濃度を分析した結結果・考察:「分裂酵母の寿命延長変異株の解析」につ果，共通してリジンが減少していた．そこで，最少培地

いて大規模に長寿命変異株をスクリーニングし，独立ににリジンを添加すると ctpA と yhmA の二重破壊条件で98 株の変異株を取得した．この中から先行して原因遺も生育できることを見出した．
以上の結果から，CtpA と YhmA がクエン酸高分泌生

伝子の特定を行った結果，新規な必須キナーゼ Nnk1 に産に必要なクエン酸輸送体であり，ミトコンドリアから変異（ nnk1-35 ）が生じることで経時寿命が延びること

細胞質へのクエン酸輸送はリジン合成にも関与することを発見した．nnk1-35 変異株では，主要なグルコースト

が明らかになった．白麹菌の細胞質では，クエン酸の一ランスポーターである Ght5 の発現が低下すると共に，部が 2 -オキソグルタル酸へと変換され，α -アミノアジピ

局在にも異常が見られた．これによってグルコースの利ン酸経路によるリジン合成に使われていると考察し，現用が正常に行われず，細胞がカロリー制限様の生理状態

在その詳細を解析している．

になることで経時寿命が延長したと考えた．この成果は，グルコースの取り込み異常に起因する疾病に関して基礎的知見を与えるものと考えている．今後，Nnk1 キナー

分裂酵母の細胞寿命制御に学ぶ
健康長寿創薬の基盤研究饗

場浩

ゼを制御するシグナル，ならびにリン酸化する基質の同定を進める予定である．

文「高発現することで分裂酵母の細胞寿命を延ばす因子の名古屋大学大学院創薬科学研究科
aiba@ps.nagoya-u.ac.jp

解析」について長生き因子 Ecl1 は，転写レベルで硫黄源の枯渇に応目的:生物の寿命がどのようにして決まるのかを理解す

答して転写因子 Zip1 により発現誘導されることを発見

ることは，現代生物学が取り組むべき挑戦的課題の一つ

した．硫黄の枯渇は，Ecl1 とそのパラログ（ Ecl2, Ecl3:

であり，本助成研究では分裂酵母をモデルとしてこれに総称して Ecl1 ファミリー）に依存して新しい寿命延長挑戦した．得られた知見は，ヒトの健康長寿社会の構築

シグナルとして作用することを見出した．既知の寿命延に資する創薬・食品開発等の基盤知識となることが期待

長シグナルであるカロリー制限（酵母ではグルコース制

される．具体的には，以下にまとめた 2 つの研究を遂行

限）と硫黄枯渇とに共通して生じる細胞内変化を RNAし，成果を得た．

Sequence 法により探索したところ，リボソームの低下

方法:「分裂酵母の寿命延長変異株の解析」についてが起こることを見出した．さらに，変異や薬剤処理によ－ 188 －

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り人為的にリボソームを低下させると寿命が延びること

結果・考察:オキサロ酢酸供給の補充経路酵素であるホを証明した．これらの結果から，リボソーム低下が寿命

スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ PEPC）に延長の鍵であると考え，これを「寿命制御におけるリボ

ついて，アセチル化部位である 653 番目のリジン残基

ソーム仮説」として提唱した．今後は，この仮説につい（ K653 ）はグルタミン酸生産に必須であることを見出して普遍性を確認し，それに基づく寿命制御法を開発する

た．模倣変異を用いた解析から，K653 アセチル化は酵ことが課題である．これらの解析と並行して，Ecl1 タ

素活性およびグルタミン酸生産を阻害することが示唆さ

ンパク質の機能—構造相関に関しても解析を行い，Ecl1

れた．653 部位特異的にアセチルリジンを導入した PEPC

は亜鉛結合タンパク質であることを示した．

タンパク質を調製し，K653 アセチル化は PEPC 活性を阻害するのに必要十分であることを明らかにした．また，サーチュインホモログである NCgl0616 は，K653 脱ア

細菌のタンパク質アシル化修飾を標的とした代謝改変に関する研究
古園

セチル化活性を示した．NCgl0616 による PEPC-K653 脱アセチル化は，グルタミン酸生産に重要な PEPC フラッ

さおり

クスの維持に関わることが示唆された．2 -オキソグルタ

東京大学生物生産工学研究センター
uskos@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

ル酸デヒドロゲナーゼ（ ODH ）の制御因子 OdhI は，リン酸化に依存して分子フォールディングが変化し，非目的:タンパク質のリジン残基に起こるアシル化修飾は，リン酸化型 OdhI が ODH の E1 サブユニット（ OdhA ）細菌からヒトまで広く存在する翻訳後修飾として知られに結合して ODH 活性を阻害する．OdhI の 132 番目のリている．筆者は，グルタミン酸発酵生産菌として知られジン残基（ K132 ）のスクシニル化は，OdhA との相互る Corynebacterium glutamicum において，代表的なアシ作用を阻害することにより ODH 活性を維持し，グルタ

ル化修飾であるアセチル化とスクシニル化がグルタミン

ミン酸生産に負の効果をもたらすことを明らかにした．

酸生産誘導刺激によって顕著に変化することを見出し

本研究により，アシル化修飾が PEPC や ODH などグルた．グルタミン酸生産条件ではグルコースからグルタミ

タミン酸生産に重要な代謝酵素の活性調節に関わること

ン酸生成に至る代謝酵素反応のフラックスが上昇するを明らかにすることができ，アシル化修飾を標的としたが，それを担う代謝酵素の発現量は上昇しておらず，翻代謝改変の可能性が示唆された．

訳後制御の存在が示唆される．本研究では，グルタミン
酸生産に特徴的な代謝フラックス変化を誘発するメカニ

微生物による多様な金属酸化物の合成に関する研究ズムとしてアシル化修飾という新しい可能性に注目し，グルタミン酸生産に重要な代謝酵素についてアシル化修

山

飾の機能解析を行った．

本

兼

由

法政大学生命科学部
kanyamam@hosei.ac.jp

方法:リジンアシル化の機能の推定には，グルタミン置換（アセチル化模倣），グルタミン酸置換（スクシニル化模倣），アルギニン置換（非アシル化模倣）変異を用いた．

目的:Mn(II) を酸化して Mn(IV) 酸化物を合成する真菌部位特異的なアセチルリジン導入には，Methanosarcinaや細菌が報告されている．Actinobacteria 門，Firmicutes 門，

mazei 由来の改変ピロリジル tRNA 及び PyrRS による遺Proteobacteria 門を含む様々な細菌が Mn 酸化能をもつ

伝暗号を拡張した in vitro 翻訳系を用いた．アシル化のことが推測されている．本研究では，微生物の金属酸化検出には，修飾特異的抗体を用いたウェスタンブロット

システムを再構成させ，金属酸化物の効率的な発酵合成

または MS 解析により行った．

と多様な金属酸化物合成デザインの制御を目指し，Mn－ 189 －

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酸化物を合成する Pseudomonas putida から逆遺伝学的に培地中の Mn(II) の存在で呈色するコロニーを形成した．

Mn 酸化物合成酵素遺伝子を単離同定することを行った．

また，銅(II) と亜鉛(II) でも呈色コロニーを確認した．

方法:P. putida KT2440 株を，金属を含む M9 グリセロー

これらの呈色した成分は細胞外に分泌されており，培養

ル寒天培地に 30 ℃で画線培養し，コロニーの呈色を確液の上清に存在することが明らかとなった．KT2440 を認した．また，KT2440 株のシングルコロニーを，金属

親 株 とし た lapA ，cumA ，copA2 ，mopA ，mcoA ，mnxG，を含む M9 グリセロール液体培地に 30 ℃で終夜培養し，

copA1 の 欠 失 株 は， 親 株 と 比 較 し て， 寒 天 培 地 上 の培養液および培養上清の呈色を確認した．P. putida GB-1

Mn(II) 添加による呈色コロニー形成に顕著な違いを確

株で推定される全 7 種類の Mn 酸化遺伝子のすべてを認できなかった．また，銅(II) と亜鉛(II) 添加による呈KT2440 で 確 認 し た．KT2440 株 の lapA（ PP_0168 ），色コロニーでも同様に違いを確認できなかった．これら

cumA（ PP_1034 ），copA2（ PP_2205 ），mopA（ PP_2561 ），の結果より，KT2440 株の金属酸化能は複数の遺伝的要

mcoA（ PP_3184 ），mnxG（ PP_3490 ），copA1（ PP_5380 ）因で行われることが示唆された．

のそれぞれの遺伝子上流側 300 bp と下流側 300 bp を，一方の末端にベクターの挿入領域との相同配列をもつよ細菌による機能性プラズマローゲン生産の基盤となる酵素の分子機構の解明

うに設計したプライマー対を用い，KT2440 ゲノムを鋳型として PCR で増幅し，精製した．つぎに，ゲンタマ

金

イシン耐性遺伝子カセットを，増幅した遺伝子の上流領

子淳

東北大学大学院農学研究科
jun.kaneko.b6@tohoku.ac.jp

域の一部と相同な配列を一方の末端に，増幅した遺伝子の下流領域の一部と相同な配列を他方の末端にもつように設計したプライマー対を用い，pPS856 プラスミドを鋳目的:グリセロール骨格の 1 位に尾部がビニルエーテル型として，PCR で増幅し，精製した．これら 3 つの DNA結合したリン脂質であるプラズマローゲンは，近年アル

断片と Sal I と Pst I を用いて線状化した pK19mobsacB を

ツハイマー症の発症予防や進行抑制の期待からサプリメ

混合し，試験管内組換え酵素によって，全てが連結したントとしての需要が高まっている．我々は嫌気性ルーメ

組換え遺伝子をもつプラスミドを大腸菌 DH5α への形質ン細菌 Selenomonas ruminantium のエタノールアミン型

転換によって，PP_5380，PP_0168，PP_1034，PP_2205，

プラズマローゲンを豊富に含む膜脂質画分が，アミロイ

PP_2561，PP_3490，PP_3184 のそれぞれがゲンタマイ

ド β 産生に関わる膜酵素である γ セクレターゼの活性を

シン耐性遺伝子カセットで破壊された組換え遺伝子プラ

用量依存的に抑制することを発見し，細菌による機能性

スミドを構築した．ゲンタマイシン耐性遺伝子カセット

プラズマローゲン生産の可能性を発想した．本研究では，で破壊された組換え遺伝子プラスミドは，大腸菌 S17-1

その基礎となる細菌酵素によるビニルエーテル結合形成

λpir へ導入し，大腸菌形質転換体と KT2440 株と混合し，の分子機構の解明を目指した．

接合反応後，クロラムフェニコールとゲンタマイシンへ方法:S. ruminantium のゲノム解析情報からビニルエーの耐性によって，まずシングルクロスオーバー組換えに

テル結合形成に関与していると予想したグラム陽性型リより目的組換え遺伝子が KT2440 ゲノム上に導入された

ン脂質生合成酵素 PlsX ，PlsY の遺伝子を大腸菌に導入

形質転換体を選抜した．その後，ダブルクロスオーバー

して様々な条件で培養し，リン脂質画分を調製して組換えにより目的遺伝子がゲンタマイシン耐性遺伝子カ

DNP 法によりプラズマローゲン生産を確認した．一方，セットで破壊された形質転換体を，スクロース耐性株と本菌における形質転換系の確立をめざし，ゲノム解析にした．

より発見したプラスミドを活用して大腸菌とのシャトル

結 果・ 考 察:P. putida KT2440 株 は GB-1 株 と 同 様 に，

ベクターを構築するとともに，S. ruminantium へのエ－ 190 －

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2018

レクトロポレーションによる導入条件を検討した．

ン酸過剰生産誘導性ストレスに応答して転写量が増加す

結果・考察:細胞質酵素である PlsX の遺伝子を pTrc99aる遺伝子を本菌に 7 つ見出している．これらはいずれも

発 現 ベ ク タ ー に 組 み 込 み， 大 腸 菌 JM109 に 導 入 し て

短い ORF で機能が未知である．本稿ではこれらを uk1

PlsX 発現株を得た．一方，膜酵素である PlsY の遺伝子

(unknown1) ～ uk7 とする．遺伝子破壊株の解析から本を pTrc99a の発現スイッチ部の下流に繋いで低コピー

研究では uk2 と uk3 に注目し，機能解明を目指した．

pMW219 をベースとしたプラスミドを構築し，JM109

方法:uk2 および uk3 をそれぞれインフレームで破壊しでの PlsY 発現株を得た．さらに plsX と plsY を共に導入た Δuk2 株と Δuk3 株を構築し，グルコース消費量あた

した株も構築し，これらの発現条件及び培養条件によるりのグルタミン酸生産量（本稿ではグルタミン酸生産性

プラズマローゲン生産性を検討した．その結果，plsX ととする）を調べた．両遺伝子破壊株の相補株，両遺伝子

plsY の両方をもつ株を IPTG を終濃度 0.001 mM で添加増幅株のグルタミン酸生産性も調べた．uk2 に関する解して 37 ℃で 12 時間培養後，24 時間静置培養を行った時

析では，uk2 のフレームシフト変異型，サイレント変異にプラズマローゲンのスポットが検出された．スポット型発現プラスミドを Δuk2 株に導入し，それらの表現型の MS 分析で C16:1 の脂肪アルデヒドのヒドラゾン誘導を調べた．また，uk2 の機能に関連があると考えられた体と確認された．一方，TYL（乳酸）培地で培養液を通

pyruvate dehydrogenase complex（ PDHc ） と oxogluta-

常の環境で遠心集菌して，コンピテント化処理した S.

rate dehydrogenase complex（ ODHc ）の酵素活性につruminantium 菌体にパルスを当て，嫌気ボックス（ 80 ％いて，uk2 組換え株の細胞抽出液を用いて NADH アナ

N2 ，10 ％ CO2 ，10 ％ H2 ）内で TYG（グルコース）寒天ログである APADH の増加を指標に評価した．uk3 に関培地に塗布することでシングルコロニー形成を確認した．

する解析では，His-tag 融合型 UK3 発現プラスミドも用

また，S. ruminantium TAM6421 株が有する最も小さい

いた．

plasmid 9 と大腸菌クローニングベクター pMD20 を組み結果・考察:Δuk2 株は，野生型株と比べてグルタミン

合わせたプラスミドを構築し，Bacillus subtilis の形質転酸生産性が低下していた．そこで培養液中のアミノ酸お換を確認した．現在，これらを用い S. ruminantium のよび有機酸の分析をしたところ，酢酸が蓄積していた．

形質転換を試みている．本成果はビニルエーテル結合をまた，酢酸代謝およびグルタミン酸代謝にそれぞれ関連導入する酵素の分子機構の解明，ならびに細菌による機する PDHc および ODHc の活性が Δuk2 株では低下して能性プラズマローゲンの生産の技術開拓研究の基盤とないた．相補株では，グルタミン酸生産性が回復し，酢酸ると期待される．

蓄積量は減少した．PDHc および ODHc の酵素活性も回復した．続いてフレームシフト変異型，サイレント変異型 uk2 発現株の表現型を調べると，両株ともにグルタミ

Corynebacterium glutamicum のストレス応答性新奇遺伝子による
TCA 回路鍵酵素の制御機構の解明
川崎

ン酸生産性が回復し，酢酸の蓄積は減少していた．これらのことから，uk2 がコードする機能因子は糖代謝の制御因子であり TCA 回路鍵酵素の活性調節に関与するこ寿と，それがタンパク質ではなく non-coding RNA である

東京電機大学工学部
kawasaki@cck.dendai.ac.jp

ことが示唆された．non-coding RNA のターゲット分子が何か興味深く，今後の課題である．一方，uk3 は 3 回

目的:Corynebacterium glutamicum（コリネ型細菌）は，膜貫通型タンパク質をコードしていると予測される．こ特定のストレスに応答してグルタミン酸を過剰に生産すの点を確かめるために超遠心分画を調べたところ，膜画る．このメカニズムを解析する過程で，我々はグルタミ

分 を 含 む 沈 殿 中 に His-tag 融 合 型 UK3 が 検 出 さ れ た．

－ 191 －

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2018

Δuk3 株は，野生株と比べてグルタミン酸生産性が低下

結果・考察:グルコースあるいは低濃度のグリセロール

していた．相補株では，グルタミン酸生産性が回復してを好気代謝している W11 株と比較して，高濃度（ > 1.0 M）

いた．増幅株では，グルタミン酸生産性が上昇しており，のグリセロールを好気代謝している W11 株ではピルビ

生育量あたりのグルコース消費量も増加していた．これ

ン酸の好気代謝経路であるアセトインおよび酢酸の生産

らのことから，uk3 がコードする機能因子は膜タンパクを担う酵素遺伝子の発現がいずれも強く抑制されてい質であり，UK3 は糖代謝を正に制御する因子であるとた．その細胞内 NADH/全NAD 比は極めて高い値を示考えられる．近年のデータベース情報の増加に伴って，し た こ と か ら， グ リ セ ロ ー ル 代 謝 で 生 じ た 過 剰 な

UK3 は真正細菌に広く分布する普遍的な因子であるこ

NADH による還元ストレスがそれらの遺伝子発現を抑とが分かってきている．しかし，UK3 の機能解析は他制したことが示唆された．一方，その還元ストレスは嫌に例がないのが現状である．糖代謝制御に関わる新機構

気的な NADH 酸化経路であるアルコール発酵を担う酵の発見を期待して，さらに解析を進めたい．

素遺伝子の発現を上昇させたが，培地にエタノールの生産は認められなかった．これは，アルコール発酵を担う
酵素が酸素に対して非常に脆弱であることから，発現しグリセロール資化性乳酸菌
Enterococcus faecalis が行う
好気性乳酸発酵の発現条件の解明とそれを利用した廃棄グリセロール再資源化技術の構築
土肥裕

た酵素タンパク質が酸素によって失活したためと考えられる．これらに対して，ピルビン酸から L - 乳酸の生産
すなわち乳酸発酵を担う L - 乳酸脱水素酵素の遺伝子発現と活性はあらゆる培養環境下で認められた．これらの希結果から，E. faecalis の好気性乳酸発酵は乳酸発酵以外

岡山理科大学工学部
yuki.doi.doct@gmail.comのピルビン酸代謝経路の抑制および機能不全に起因することが示された．

目的:高濃度のグリセロールを炭素源に用いて好気培養

E. faecalis のこの代謝を利用することで，1.5 M のグリされた乳酸菌 Enterococcus faecalis は，その代謝産物とセロールおよび 1.4 M の廃棄グリセロールから 120 時間以してアセトイン，酢酸，エタノールなどをほとんど産生

内にそれぞれ約 1.4 M（ 126 g/L ）および 1.15 M（ 104 g/L ）せず，L - 乳酸のみを盛んに産生する．本課題では，この L - 乳酸の発酵生産に成功した．これらの生産量は既の好気性乳酸発酵が発現するメカニズムを解明すると共報を大きく上回る．しかしながら，生産物（ L - 乳酸）に，それを用いてバイオディーゼル燃料の製造過程で副による代謝阻害などのため，その生産量をさらに向上さ生される廃棄グリセロールから L - 乳酸を高生産する系

せることはできなかった．回分培養系において L - 乳酸の構築を目的とした．

の生産量をさらに向上させるためには，乳酸（塩）など

方法:E. faecalis W11 株の培養はジャーファーメンターへの耐性を向上させた変異株を作製・使用する必要があを用いて行われた．培養液には W11 株の酸素要求量以ると考えられる．

上の酸素が供給され，培養液の pH は pH コントローラー
を用いて 7.5 に自動調整された．遺伝子の発現解析は逆
転写 - PCR 法を用いて行なわれ，培養液中の糖・有機酸・アルコールはバイオセンサ BF-7（王子計測）および Fキット（ロッシュ）を，細胞内のニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（ NAD ）は NAD/NADH Quantitation
Kit（バイオビジョン）を用いて定量された．
－ 192 －

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2018

疎水性成分が検出された．以上をまとめると，薬草粉末

乳酸菌の代謝能を利用した有用機能性物質の生産とその応用に関する研究
五十嵐康を滅菌せずに豆乳発酵すれば，グルコシダーゼ阻害活性が安定して得られることが確認されたことより，酵素阻

弘

害成分の生産には乳酸菌ではなく，薬草に付着している

富山県立大学工学部
yas@pu-toyama.ac.jp

微生物の関与が強く示唆された．現在は，関与する微生物の同定と，豆乳発酵液中に生産される α -グルコシダー

目的:我々は，乳酸菌発酵物から美容や健康に有用な天ゼ阻害物質の同定を進めている．

然成分を探索する過程で，薬草粉末を添加した豆乳を乳酸菌発酵すると，未発酵の薬草入り豆乳発酵液には見ら植物病原卵菌 Phytophthora infestans のシスト発芽阻害物質の作用機序解析れない様々な生理活性が出現する現象を見出した．本研
究は，その活性本体を明らかにし，その発酵物を食品へ谷

応用することを目的として行われた．

修治

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科
shuji@biochem.osakafu-u.ac.jp

方法:薬草粉末（クミスクチン，沖縄ウコン，春ウコン，
ギムネマシルベスタ，キダチアロエ，黒ニンジン，レモ
ングラス，長命草）は，沖縄長生薬草本社より入手した．

目的:卵菌 Phytophthora infestans は，低温に応答して遊

無調整豆乳はマルサンアイ社製を使用した．乳酸菌は，走子を放出後，シスト形成，シスト発芽，付着器形成へ

Lactobacillus delbrueckii KM-2 株（沖縄・久米島の海草と至る形態分化を経て宿主植物に感染する．この形態分から分離）を用いた．アミラーゼ，キサンチンオキシダー化を特異的に制御する分子機構を解明することを目指し

ゼ，チロシナーゼは和光純薬より購入し，比色法によるて，本研究では，シスト発芽を特異的に阻害する化合物

阻害活性試験に用いた．

を同定し，取得した化合物を用いた化学遺伝学により，結果・考察:薬草（ 3 g/L ）を加えた豆乳をオートクレー

形態分化を制御する分子機構を解明することを目的とした．

ブ滅菌後に，乳酸菌 KM-2 株を接種し発酵したもの（サ方法:土壌より単離した放線菌の二次代謝産物をター

ンプル A ），薬草を加えた豆乳を滅菌せずに乳酸菌を接ゲットとして，P. infestans シスト発芽を特異的に阻害す

種し発酵したもの（サンプル B ），豆乳に薬草を加え，る化合物を探索した．放線菌抽出サンプルから各種クロ滅菌せずに発酵したもの（サンプル C ），豆乳に乳酸菌

マトグラフィーにより阻害物質を精製し，取得した化合を加えて発酵したもの ( サンプル D，対照区 1 ），薬草物を ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR スペクトル解析によりのみを熱水抽出したもの（サンプル E，対照区 2 ），合計同定した．同定したシスト発芽阻害物質が，P. infestans

5 サンプルについて，α -グルコシダーゼに対する阻害活の形態分化に与える影響，および 25 ℃の比較的温暖な性を比較した．遠心分離により発酵物から固形分を除去

条件下で生育する Pythium aphanidermatum の形態分化

し，上清を活性試験に供した．その結果，α -グルコシダーに与える影響を定量的に評価した．また，シスト発芽阻

ゼ阻害率は，サンプル A が 5 ％，B が 85 ％，C が 45 ％，

害物質存在下で発現量が変動する遺伝子を同定し，そのD が 12 ％，E が 8 ％であった．このとき糖尿病治療薬ア

機能を遺伝学的に解析した．

カルボースは 1 mg/mL で 20 ％の阻害率を示した．

結果・考察:土壌から単離した放線菌を培養して調製しさらに，上記のサンプル A ～ E の内容物を HPLC にた約 700 のアセトン抽出サンプルから，シスト発芽を阻より分析した．D には，イソフラボン配糖体であるゲニ

害する活性を有すサンプルを一つ見出した．シスト発芽

スチンとダイジンが主成分として検出されたが，最も活阻害物質生産菌の 76.4 L の培養液から各種カラムクロマ

性の強い B には，それら配糖体は検出されず，新たなトグラフィーによりシスト発芽阻害物質を精製し，2.9 mg－ 193 －

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2018の精製標品を得た．各種スペクトル解析により精製した低分子化合物だが，近年我々は，DIF-1 とその誘導体がシスト発芽阻害物質を β -ルブロマイシンと同定した．β -in vitro で強力な抗菌活性を有することを発見した．

ルブロマイシンは，10 ℃での P. infestans 形態分化にお本研究の目的は，D. discoideum 由来の DIF-1 をリード

けるシスト発芽を特異的に阻害し，シスト発芽を 50 ％阻化合物とした新規抗菌薬の開発とその作用機序解析を進害する β -ルブロマイシン濃度（ IC50 ）は 37 nM であった．

めることにある．とりわけ，既存薬剤耐性菌に対してもP. infestans において，β -ルブロマイシン存在下で発現量

有効な抗菌薬の開発を目指すこととした．

が変動する遺伝子を RNA-seq 解析および定量 RT-PCR

方法:Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌:薬剤感法を用いて探索した結果，キナーゼ様タンパク質の発現受性株）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA ），量が劇的に変動していることを見出し，この遺伝子の機Enterococcus faecalis（腸球菌:薬剤感受性株），バンコ

能を遺伝学的に解析している段階である．

マイシン耐性腸球菌（ VRE ），Escherichia coli（大腸菌）

更に，β-ルブロマイシンは，P. infestans の 25 ℃で起きる遊を用いて，各種 DIF 誘導体の抗菌活性を検討した:抗走子嚢からの菌糸伸長を阻害すること，P. aphanidermatum

菌活性は，発育阻止円観察（ disc-diffusion 法）と最小のシスト発芽（ IC50 = 226 nM ）と卵胞子からの菌糸伸長

発育阻止濃度（ Minimum inhibitory concentration: MIC ）の胞子発芽を阻害（ IC50 = 516 nM ）する事を明らかにし結果・考察:約 30 種類の DIF 誘導体を用いて，黄色ブ（IC50 = 60 nM）を阻害する事，真菌 Colletotrichum orbiculare

によって判定した．

た．β -ルブロマイシンは，ヒトテロメラーゼの構成成分

ドウ球菌に対する抗菌活性を disc-diffusion 法で検討し（ TS-A ）に結合し（ K i = 0.74 μM)，テロメアの伸長を阻た．その結果，多くの DIF 誘導体が黄色ブドウ球菌お害する事が報告されている．一方卵菌においては，β -ル

よび MRSA の発育を強力に阻害することが明らかとブロマイシンが P. infestans の寒天培地上での生育を阻害なった．我々の用いた MRSA 株は，ペニシリン以外にしなかったこと，P. infestans のゲノムデータベース上にもストレプトマイシン，イミペネム，レボフロキサシン，

ヒトのテロメラーゼ構成成分と相同性の高い因子が見出

クリンダマイシン等の抗菌薬に対する多剤耐性を示した

されなかったことなどから，今回見出された β -ルブロマ

ことから，それら既存薬と DIF の作用機序は少なくとイシンのシスト発芽阻害活性は，新たな作用機序によるも一部異なると考えられる．

ものであると推測された．また，β -ルブロマイシンは，

黄色ブドウ球菌，MRSA，腸球菌，VRE に対する DIF

卵菌だけでなく真菌の菌糸伸長も阻害したことから，分誘導体の MIC 値を検討した結果，いくつかの DIF 誘導

類学的に異なる卵菌と真菌において保存された形態分化

体がそれら細菌株の発育を強力に阻害することが明らか

機構の解明に繋がるものと期待される．

となった．それらの DIF 誘導体は，我々が調べた全てのグラム陽性細菌の発育を強力に阻害したが，大腸菌（グラム陰性細菌）の発育を阻害しなかった．

細胞性粘菌由来の低分子化合物 DIF をリードとした新規抗菌剤の開発
久保原

DIF の作用機序を解明するため，トランスポゾンを利用して黄色ブドウ球菌遺伝子に変異を入れ DIF 存在下

禅で生育する菌の単離を試みているが，現段階では DIF

順天堂大学大学院スポーツ健康科学研究科
ykuboha@juntendo.ac.jp

耐性株を得ていない．さらに我々は，透過型電子顕微鏡を用いて，DIF 存在下での黄色ブドウ球菌の形態変化を

目 的:DIF-1（ differentiation-inducing factor-1 ） は， 細観察した．その結果，DIF 誘導体存在下においては，多胞性粘菌の一種「キイロタマホコリカビ（ Dictyostelium

くの菌細胞内に細胞壁/膜の特異な多層構造が形成されdiscoideum ）」の分化誘導因子として単離・同定されたることが判明した．この構造体の形成と DIF の抗菌作

－ 194 －

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2018

用の因果関係は不明だが，今後，その関連を明らかにすだけが細胞塊形成を促進するのかを解明したい．次に，ると同時に，DIF をリード化合物とした新規抗菌薬の開トリプシン処理直後の細胞へのビーズの取り込みを調べ発を目指したい．

たところ，培養細胞に直接添加した場合と比べ，トリプ
シン処理直後の細胞は蛍光ビーズを劇的に細胞内に取り込むことが明らかになった．リボソームの直径は 20 nm

乳酸菌由来リボソームによる細胞のリプログラミング機構
太田訓であることから，リボソームの細胞内への取り込みは，
エンドサイトシスと細胞膜に傷や穴を開けて取り込みを正促すトリプシン処理の相乗効果であることが明らかに

熊本大学大学院生命科学研究部
ohta9203@gpo.kumamoto-u.ac.jp

なった．
His タグが付いているリボソームを取り込んで形成さ目的:我々は，細胞が乳酸菌を取り込むと多能性を獲得れた細胞塊の凍結切片を作成し，抗 His タグ抗体を用いすることを報告し，その後の本研究助成により，乳酸菌て免疫染色法を行ったところ，ドット状のシグナルが細のリプログラミング物質がリボソームであることを発見

胞質だけでなく核内にも観察された．3 次元的解析では，した．本研究では，リボソームが細胞内に取り込まれる

取り込まれたリボソームは核内にも存在していることが際の分子機構の解明と細胞内におけるリボソームの局在示された．リボソームが核膜孔を通って核内に運ばれて場所の同定を目的とした．

いる可能性が考えられる．

方 法: ヒ ト 皮 膚 細 胞（ Human Dermal Fibroblast cells,
Cell Applications, Inc. Cat No.106-05a ）を用いて，細胞外

絶対寄生性の植物病原糸状菌が分泌する
宿主細胞壁分解酵素群の新規発見とセルロース系バイオマス糖化酵素
高機能化に向けた基礎的研究

からリボソームを添加して細胞塊を形成させた．9 種類のエンドサイトシス阻害剤の存在下で細胞塊形成実験を行い，その効果を比較検討した．エンドサイトシス阻害剤は，
filipin ，nystatin ，genistein ，cytochalasin B ，bafilomysin

八丈野

A1，concanamysin A，5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride，孝

愛媛大学農学部
yaeno@agr.ehime-u.ac.jp

chlorpromazine，methyl-β-cyclodextrin を用いた．また，我々の細胞塊形成実験では，トリプシン処理が必須であることから，リボソーム取り込みに対するトリプシンの目的:植物病原糸状菌は宿主植物の細胞壁という物理的効果を直径 50 nm の蛍光ビーズを用いて検討した．

障壁を乗り越えなければ感染できない．絶対寄生性の子大腸菌（ Escherichia coli JE28 ）由来のリボソーム（大嚢菌であるオオムギうどんこ病菌（ Blumeria graminis f.

サブユニットを構成する L12 タンパク質に His タグが付

sp. hordei ）は，分生子の発芽後に形成した付着器の先いている）を用いて細胞塊を形成し，抗 His タグ抗体を端から宿主細胞壁を分解して侵入し，感染すると考えら用いた免疫染色法を行い，細胞内におけるリボソームのれている．付着器形成から貫穿まではほんの数時間であ局在を調べた．

ることから，細胞壁分解酵素群は非常に高い活性を持つ

結果・考察:8 種類のエンドサイトシス阻害剤は細胞塊と予想される．しかしながら，全ゲノム配列が解読され形成を抑制したが，methyl-β-cyclodextrin の存在下ではたにもかかわらず細胞壁分解酵素遺伝子は見つかってい細胞塊形成が促進された．これらの結果から，リボソーム

ない．また，細胞壁の貫穿後に宿主の抵抗性反応を抑制

による細胞塊形成には，エンドサイトシスが関与しているする病原性タンパク質についてもほとんどわかっていなことが示唆された．今後は，何故，methyl-β-cyclodextrin

い．そこで本研究では，細胞壁分解や抵抗性抑制に関わ－ 195 －

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2018

るタンパク質を同定することを目的として，付着器発芽

シロアリおよび糸状菌由来の植物バイオマス分解酵素の性質解明とそれらを利用したバイオマス分解系構築の試み

管に含まれるタンパク質を網羅的に解析し，候補タンパ
ク質について研究を行った．
方法:分生子をセルロース膜上で発芽させ，付着器を形有成したタイミングでオオムギ表皮細胞に移植するとその

岡

学

東京大学大学院農学生命科学研究科
arioka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

まま侵入できることを確認した．したがって，付着器発芽管の内部には，侵入のための細胞壁分解酵素群や抵抗性抑制のための病原性タンパク質がすでに存在すること

目的:木質バイオマスを原料として生産されるバイオエが示唆された．そこで，セルロース膜上で半同調的に分タノールは，石油や天然ガスに代わる新たなエネルギー

生子が発芽する条件を見出して付着器発芽管を大量に収源として期待されている．しかし，木質バイオマスはセ集し，付着器発芽管が破裂しやすいバッファーに懸濁しルロース，ヘミセルロース，リグニンが組み合わさったて遠心分離することにより分生子本体を排除して付着器

複雑な構造を持つため分解が困難である．シロアリは高発芽管に含まれるタンパク質のみを回収した．2010 年

効率で木材を分解・資化することができるが，これにはに解読されていた全ゲノム配列情報が不完全であること

腸内の共生微生物の持つ分解酵素が寄与している．それが判明したため，新たに全ゲノム配列を解読し，抽出しらは従来の酵素にない優れた性質を持つ可能性がある

たタンパク質を質量分析に供してゲノム情報を参照してが，知見に乏しく，その利用には至っていない．そこで網羅的にタンパク質を同定した．

本研究ではそれらの異種生産を行って機能解析を試み

結果・考察:プロテオーム解析の結果，幾つかのタンパ

た．また，併せて糸状菌由来のバイオマス分解酵素の解ク質が細胞壁分解酵素の候補として新規に見つかった．

析も行った．

その中のひとつを APEC5（ appressorial effector candidate

方法:EuCBH は麹菌で，また NtSymX11 は大腸菌で生5 ）と名付け，立体構造モデルを作製して類似するタン産した．AfGE は麹菌と酵母を用いて生産した．いずれ

パク質を立体構造データベースにて検索したところ，糞のタンパク質も Ni2+カラムを用いて精製し，その酵素学

生菌の Podospora anserina の Gluc131A の触媒ドメイン的性質を解析した．

に 酷 似 す る こ と が 明 ら か と な っ た． し か し な が ら，

結果・考察:結晶性セルロースの分解において中心的な

APEC5 には PaGluc131A が持つような糖質結合モジュー役割を果たすセロビオヒドロラーゼの一つであるシロア

ル（ CBM ）が存在しない．そのためまず，APEC5 がむ

リ腸内共生原生生物由来の EuCBH の麹菌を用いた生産しろ病原性タンパク質であるという可能性を調査するたを試みた．Aspergillus aculeatus 由来の β -グルコシダー

め，オオムギ表皮細胞およびシロイヌナズナにおいて

ゼをコードする Aabgl1 と共発現させたところ，培養上APEC5 遺伝子を過剰発現させたところ，宿主の抵抗性清への分泌生産が認められた．しかし，キャリアであるを抑制するような機能は持たないことが示唆された．こ

α -アミラーゼが融合されたままのバンドも検出された．

のことから，今後は CBM を持たないがグルカナーゼとそこでキャリアを用いずに発現したところ，より多量のして細胞壁成分を分解する可能性を検証するとともに，

EuCBH が生産された．これらのサンプルについて活性APEC5 に PaGluc131A の CBM を結合させた人工型の分測 定 を 行 っ た が， 明 確 な 活 性 を 示 さ ず， 生 産 し た

解酵素を作製し，高機能化に向けて引き続き研究を行う

EuCBH が正しくフォールディングしていない可能性が予定である．

考えられた．
次にシロアリ腸内共生細菌由来のキシラナーゼ
NtSymX11 の生産および機能解析を行った．NtSymX11－ 196 －

IFO Res.Commun. 32
2018

は触媒ドメイン以外に糖質結合モジュール CBM36 を 2

増殖促進因子が生体分子であるかどうか確認するため，個持つ．様々なコンストラクトを作製して大腸菌で生産①両株を親水性 PVDF 膜で隔てた隔離培養，②滅菌されしたところ，キシラン特異的な分解活性が認められた．

た培養物を添加する培養，③両株で感受性の異なる薬剤

比活性や安定性の解析から，同じドメイン構造を持つ既を添加する培養により UCH007 株の増殖（脱塩素化反応）

知酵素に比べて 20 倍高い触媒効率を示すこと，CBM36が促進されるかの確認を行った．つぎに，増殖促進が起は酵素の安定性を低下させるが，触媒効率を上昇させる

きている時の両株の位置関係を確認するため，混合培養

ことがわかった．

物の SEM 観察（ポリ- L -リジンコーティングディッシュ

併行して A. fumigatus 由来のグルクロン酸エステラー

上に試料を吸着させ前処理を行った）及び FISH 法によゼ AfGE の生産も行った．AfGE はキシランとリグニンる観察を行った．さらに，混合培養時に特異的に発現変間の結合を切断し，セルラーゼ類の働きを補強する機能

動する遺伝子を選抜するため，UCH001 株の単独培養物を持つと予想される．酵素学的性質を解析した結果，熱又は両株の混合培養物から抽出した RNA について新型

安定性や触媒能に優れた酵素であることがわかった．

シーケンサーを用いて解析し全ゲノム配列にマッピング

以上，本研究では 3 種類のバイオマス分解酵素の生産

する RNA-seq 解析を行った．最後に，カナマイシン耐と性状解析を行った．EuCBH については，麹菌での異性カセットを含む遺伝子破壊コンストラクトを作製し，種タンパク質生産においてキャリアを用いない方が生産

UCH001 株の増殖促進関連遺伝子の破壊法を検討した．

量が高い場合があるとの知見が得られた．NtSymX11 と結果・考察:両株を隔離した状態，UCH001 株の増殖活

AfGE についてはどちらも既知酵素に比べ高い触媒能を性が失われた状態では UCH007 株の増殖が促進されない持つことがわかった．今後はこれらの酵素を他の酵素とことが明らかとなり，「増殖促進因子」は膜を通過できず，

組み合わせ，バイオマスの高効率分解系を構築すること

UCH001 株が生きている状態でなければ伝達できないもを計画している．

のであることが示唆された．また，UCH007 株の細胞のサイズが小さいため FISH 法による顕微鏡観察は困難であったが，電子顕微鏡（ SEM ）観察により UCH007 株

難培養性 Dehalococcoides 属細菌のSulfurospirillum 属細菌による新規増殖促進メカニズムの解明
内野佳と UCH001 株が直接結合している状態が多く観察され，2 つの異なる株が接触することにより UCH007 株が増殖促進している可能性が示唆された．RNA-seq 解析の結仁果では，混合培養時に，UCH001 株の呼吸や電子の移動製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター
uchino-yoshihito@nite.go.jp

を伴う反応に関係するチトクロム類，酸化酵素，還元酵
素等をコードする遺伝子の発現量が上昇することが明ら

目的:これまでの培養実験から，難培養性 Dehalococcoides

かとなった．今回の結果やこれまでの培養実験の結果を属細菌の Sulfurospirillum 属細菌による増殖促進は，両併せて考察すると，Dehalococcoides 属細菌の増殖促進は，細菌間での「細胞外電子伝達」による可能性が示唆されDehalococcoides - Sulfurospirillum 属細菌間で，微生物どているが，詳細は明らかではない．本研究では，培養実うしが接触し，電子を介して起きている可能性が考えら

験に加えて遺伝子レベルの解析を行うことで，増殖促進れる．

メカニズムの解明を行うことを目的とする．

我々は，UCH001 株の遺伝子破壊株の作製を試みたが，方法:供試菌株として，我々が分離し既に全ゲノムを残念ながら成功しなかった．促進メカニズムの解明には，

決 定 し て い る Dehalococcoides 属 細 菌 UCH007 株 及 び

遺伝子破壊株は必要であり，今後の課題であると考える．

Sulfurospirillum 属 細 菌 UCH001 株 を 使 用 し た． ま ず，－ 197 －

IFO Res.Commun. 32
2018

塩酸酸性条件で煮沸し，得られた上清を原子吸光光度計

カリウム輸送タンパクの人工進化によるセシウム蓄積微生物の創出
加藤で測定することで定量した．
結果・考察:細胞内への Cs の取り込みが K 欠乏条件に

創一郎

おいて大腸菌の生育を促進するという知見に基づき，K産業技術総合研究所生物プロセス研究部門
s.katou@aist.go.jp

欠乏（ 10 µM ）・Cs 存在下（ 100 µM ）で Cs 取り込み能

目的:セシウム（ Cs ）の放射性同位体は核廃棄物等に系を構築した．約 3 万株の異なる変異型 Kup を発現す由来する放射能汚染の主要な原因物質である．生物をる大腸菌株ライブラリをスクリーニング系で集積し，最使った Cs 回収は低コスト・低環境負荷という観点から

終的に K 欠乏・Cs 存在下で有意に増殖が改善する C1 株，

注目されている．実際にある種の植物や微生物に Cs 取

C2 株 を 得 る こ と が で き た． こ の う ち C1 株 は KCl

り込み・蓄積能が確認されているが，これらの生物は10 µM，CsCl 10 µM 添加条件で，大腸菌野生型株と比較

Cs と性質が類似するカリウム（ K ）の輸送系を介してして最大で 46 倍の Cs 取り込み活性を示した．導入され非特異的に Cs を取り込んでいるに過ぎない．そのためた 変 異 型 kup の 塩 基 配 列 解 析 の 結 果，C1 に は E80G，

K が Cs よりも多い環境では Cs の取り込みは格段に低下

C2 には D283，T374A および T512A のアミノ酸置換がし て し ま う． 大 腸 菌 は 3 種 の K 輸 送 系（ Kup，Kdp，

確認された．2 菌株共に酸性アミノ酸に変異が入っていTrk ）を持ち，そのうち Kup にのみ非特異的な Cs 輸送

ることから，陽イオンの認識に関与することが知られて活性が確認されている．しかし Kup の Cs 輸送活性・親いる酸性アミノ酸が Cs に対する親和性・特異性にも寄和性は K に対するものの 1/10 以下にすぎない．本研究与していることが示唆された．

が高い大腸菌株を集積可能なポジティブスクリーニング

では大腸菌の Kup タンパクを人為的に進化させ，高いCs 輸送活性・親和性を持つ変異型 Kup を作製・選抜し，好熱菌の未知代謝経路の同定とグリセロールから有用光学活性物質を生産する新たな微生物発酵法の開発

大腸菌に高い Cs 取り込み能を付与させることを目的とした．
方法:校正機能を持たない rTaq ポリメラーゼを使用し亀たエラープローン PCR 法により，大腸菌 kup 遺伝子にビノース誘導プロモーター下流に組み込み，大腸菌 kup
大腸菌株を約 3 万株回収し，変異株ライブラリを作製した．大腸菌野生型株および Kup 誘導発現株を異なる K，
Cs 濃度条件下で培養し生育を測定することで，Cs 取り
込み能が向上した変異株のポジティブスクリーニング条
件を検討した．変異型 Kup ライブラリをスクリーニン
グ条件で計 20 回継代培養し，集積された株から計 100株の候補株を得た．候補株をスクリーニング条件で培養し，野生型 Kup 誘導発現株より生育が有意に向上した株を選別し，アミノ酸変異箇所の同定，Cs 取り込み活性の測定に供した．大腸菌の細胞内 Cs 濃度は，菌体を将史

東京工業大学地球生命研究所，
現 東京大学大学院農学生命科学研究科
akameya@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

ランダム変異を導入した．増幅断片を pBadGiiiA のアラ
欠損株に形質転換した．異なる変異型 Kup を発現する

谷

目的:光学活性な D -乳酸は機能性ポリマーの材料として有用であり，その安価な生産法の開発が望まれている．
既存の D -乳酸発酵法の多くは，大腸菌など本来 D -乳酸
生産能のない宿主に D -乳酸合成遺伝子を導入したものであり，宿主本来の代謝による副産物生成や収率低下が課題となっている．また，グリセロールは燃料製造などの工業過程で副生成物として大量に発生し，有用物質生産のための安価なバイオマスとしてのみならず，産業廃棄物としても有効利用が望まれている．本研究では，高効率な D -乳酸生産系の構築を目的に，グリセロールを－ 198 －

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2018

単一炭素源とした培地で D -乳酸を選択的に蓄積する特新規ポリマー生産のための均一なゴム低分子化システムの構築「ゴム廃棄物の再資源化を目指して」

異な好熱菌を見出し，その代謝系の解明を行った．
方法:D -乳酸蓄積能を示した微生物サンプルから菌の単離を行い，16S rRNA および遺伝子間領域配列解析か

笠

ら菌の同定を行った．菌株保存機関から取り寄せた類縁

井

大

輔

長岡技術科学大学技学研究院
dkasai1@vos.nagaokaut.ac.jp

菌を本研究で用いた条件で培養し，各株の D -乳酸生成
能および生育能を比較した．また，D -乳酸生成代謝を同定するため，単離株のゲノム解析および酵素活性測定

目的:ポリイソプレンゴムは工業的に幅広く利用されてを行った．

いるが，その廃棄物は燃焼や埋立てにより処理されてい結果・考察:各種培養により，D -乳酸を選択的に蓄積るため，温室効果ガス増加等の環境負荷が懸念されていする好熱性微生物を単離に成功した．16S rRNA およびる．そこで，ゴム廃棄物の削減と処理プロセスの革新を

遺伝子間領域配列解析から，本単離株は Geobacillus 属

目指して，微生物の酵素系を利用したゴム変換系の開発に属する菌と推定された．グリセロールから D -乳酸をが望まれている．本研究では，Nocardia sp. NBRC 15532

選択的に生成する本単離株のような性質は，これまで

株のゴム分解能を用いたゴム廃棄物からの有価物変換系

Geobacillus 属細菌において報告されていない．菌株保存の構築を目指して，ゴム分解機構の全容を明らかにする機関から取り寄せた類縁菌 7 株（ G. stearothermophilus

ことを目的とした．

から 2 株，G. kaustophilus ，G. thermocatenulatus ，G.

方法:Nocardia sp. NBRC 15532 株のゴム代謝時に誘導

thermodenitrificans，G. thermoglucosidasius，G. thermo-

される遺伝子の特定にはマイクロアレイ解析を用い，誘

leovorans から 1 株ずつ）を同条件で培養した際には，単導条件下で 2 倍以上の転写量の増大が認められる遺伝子

離株のような旺盛な生育や D -乳酸蓄積は見られなかっを候補とした．遺伝子破壊には，CRISPR- Cas9 を含む

た．単離菌のグリセロール依存的な生育および D -乳酸

pCRISPomyces -2 ベクターを使用した．遺伝子破壊株の生成能は，Geobacillus 属類縁菌の中でも特異な性質であ

ゴム分解能は，反応時間毎の基質（ポリイソプレン）のることが示唆された．また興味深いことに，60 ℃では分子量をゲル浸透クロマトグラフィー (GPC) 分析によ単離菌もグリセロール添加無機培地での生育が阻害さり測定することで評価した．lcp 遺伝子産物 (Lcp) を得れ，本菌のグリセロール資化に 70 ℃という高温環境がるために，ヒスチジンタグを付加した lcp を Escherichia

寄与している可能性も示唆された．乳酸菌などの D -乳coli( 大腸菌)BL21(DE3)株で発現させた．ヒスチジン酸生成菌は解糖系を生合成経路とするのに対し，本菌は融合 Lcp(Lcp-His) の精製には Ni -アフィニティカラム

メチルグリオキサールを経た経路でグリセロールからを用いた．ゴム分解産物（イソプレンオリゴマー）の特D -乳酸を生成することがゲノム解析および生化学的解定には HPLC -MS 分析を用いた．

析から示唆された．こうした代謝は毒性の高いメチルグ

結果・考察:ゴム分解に関わる遺伝子を同定するために，リオキサールの解毒経路として知られているが，野生型

マイクロアレイ解析を行なった結果，ゴム代謝時に特異生物での炭素資化に寄与していることを示した例は知ら的に発現上昇する 121 の遺伝子が限定された．その中にれていない．本経路中酵素の発現増強や D -乳酸資化経路

は，推定の細胞外オキシゲナーゼ遺伝子 (lcp) やイソプの破壊を行うことで，さらなる生産性向上が期待される．

レンオリゴマー分解に関わると考えられる 7 つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ (ALDH) 遺伝子，低分子化されたイソプレンの代謝に関わると考えられる β 酸化系遺伝子群が含まれていた．ゴム分解に真に関わる遺伝子を明－ 199 －

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らかにするために，CRISPR- Cas9 を用いたゲノム編集

1,3 -プ ロ パ ン ジ オ ー ル に 変 換 す る 反 応 系 を Klebsiella

技術により lcp の内部領域を欠失させた lcp 欠失株を得

pneumoniae 由来の 1,3 -プロパンジオール生成酵素 DhaB

た．lcp 欠失株のゴム分解能を評価するために，野生型

および DhaT，さらに補酵素 NADH 再生酵素としてギ株と欠失株の培養菌体とポリイソプレンを 37 ℃で反応

酸デヒドロゲナーゼを低温性 Shewanella 属細菌に発現させた．その結果，野生型株は反応 20 日でポリイソプ

させ，熱処理を行うことでシンプル酵素触媒を調製した．

レンを分解したのに対して，欠失株はその分解能を完全

低温菌の探索には北海道道東沖にて北海道大学調査船おに失っていた．以上の結果から，lcp が本株のゴム分解

しょろ丸によるハイドレート調査（北見工業大学）に同に必須であることが示された．

行し，海底泥水を採取した．これをマリンブロス (Difco)

Lcp によるゴムの分解で生じるイソプレンオリゴマー

にて反復回分培養を 3 週間継続し，その後形成されたコを特定するために，精製 Lcp-His とポリイソプレンの反ロニーを 18 ℃と 37 ℃で培養した．18 ℃でのみ生育した応産物を HPLC-MS で分析した．その結果，反応産物にコロニーを低温菌として，16S rRNA 配列解析および培

は 3 ～ 9 量体に相当する分子量のイソプレンオリゴマー

養試験を行った．

が含まれていることが示された．今後は，特定の分子量結果・考察:構築した低温菌株を 45 ℃で熱処理してシのイソプレンオリゴマーを生産することを目指して，トンプル酵素触媒を調製し，グリセロールを基質とした変ランスクリプトーム解析で特定した ALDH 遺伝子や β

換反応を行った．DhaB と DhaT を発現させた株では補酸化系遺伝子の破壊を行う予定である．

酵素の添加量増加に伴い 1,3 -プロパンジオールの生成量が増加した．また，さらにギ酸デヒドロゲナーゼを発現さ せ た 株 で は，NADH を 添 加 す る こ と な く 高 収 率

効率的な物質変換を行う
低温菌シンプル触媒の構築に関する研究田島誉(98.5 ％) での変換が可能であった．以上より低温菌を用いたシンプル酵素触媒が有用物質生産に適用可能であ久ることが示された．次に低温菌の培養条件を検討したと

広島大学大学院先端物質科学研究科
ttajima@hiroshima-u.ac.jp

ころ，通気やスレオニンの添加により Shewanella 属細菌において菌体収量を 8 倍に向上させることができた．

目的:低温菌シンプル酵素触媒とは，物質変換系酵素をまた，北海道道東沖にて取得した海底泥を接種した反復宿主（低温菌）代謝系とは異なる温度域で機能させるよ回分培養液より低温菌を単離した．それらは 16S rRNA

うにした細胞を構築し，中温の熱処理により異種発現さ解析により，Pseudoalteromonas 属，Vibrio 属であった．

せた中温性酵素のみで効率的な物質変換を行う触媒であ

そのうち，Pseudoalteromonas sp. AK17 株は比増殖速度

る．本触媒は酵素を精製することなく，宿主代謝酵素にが最も高く(μ = 0.80 h-1)，Shewanella 属細菌の約 2 倍でよる副産物のカットと基質の膜透過性を向上させることあった．以上より酵素触媒の宿主の候補となる新たな低が可能である．そこで本研究では効率的な物質変換触媒

温菌を単離することに成功した．今後，変換酵素発現ののモデルとしてグリセロールを基質とした 1,3 -プロパンための遺伝子導入について検討を進めていきたい．

ジオールを生成するシンプル酵素触媒の構築を行った．
また，宿主である低温菌は，一般に増殖が遅く，菌体収量が低いことが課題である．そこで，その問題点を解決するために，培養時間の短縮と菌体収量の向上を目的として新規低温菌の単離と培養条件の検討を行った．
方法:物質変換触媒の構築については，グリセロールを－ 200 －

IFO Res.Commun. 32
2018

能と PDC 生産能を向上させることが示された．

リグニンからの基幹化合物生産の高効率化に必要なリグニン系フェノール類
トランスポーターの解明
政井英

pcaK を 含 む 8 個 の MFS に 属 す る 芳 香 族 酸/H＋シ ン
ポーター (AAHS) ファミリー遺伝子の多重破壊株を作製
して VA 取り込み能を評価するとともに，各遺伝子を司

UT26S 株で発現させて VA 取り込み能を調べた．その結

長岡技術科学大学大学院工学研究科
emasai@vos.nagaokaut.ac.jp

果，SYK-6 株の VA 取り込みに pcaK を含む複数の AAHS
遺伝子が関与することが示唆された．

目的:リグニン系フェノール類からの有価物生産におい

SLG_07710 (ddvK) 破壊株は DDVA での生育能を欠損て，トランスポーターを付加したバイオプロセスの構築

し，ddvK 発現 UT26S 株は DDVA 取り込み能を獲得しが望まれる．本研究では，Sphingobium sp. SYK-6 株のリたことから，DdvK は DDVA トランスポーターであるこ

グニン系フェノール類のトランスポーター遺伝子を明らとが明らかとなった．アミノ酸配列相同性から，DdvK

かにし，有価物生産の高効率化を図ることを目的とした．

は MFS に属する新規トランスポーターであることが示

方法:遺伝子破壊は相同組換えにより行い，遺伝子発現された．DDVA から PDC への変換実験から，トランスは Sphingobium japonicum UT26S 株を宿主に用いて行っポーター遺伝子の発現強化が物質生産速度の向上に寄与た．プロトカテク酸 (PCA) とバニリン酸 (VA) の取り込することが明らかとなった．

み能測定には 14C 標識化合物を用いた．5,5´-デヒドロジ
バニリン酸 (DDVA) の取り込み能は，DDVA 存在下で海底下泥炭層からの未培養リグニン
開裂微生物の獲得と構造生物学に基づく
スーパー酵素創生による C6-C3 芳香族
バイオプラスチックモノマー生産系の開発

特異的に転写が誘導される転写制御系を利用したプロ
モーター解析ベクターを作製して評価した．ddvK を付加した本ベクターを導入した UT26S 株の DDVA 培養時

秦におけるプロモーター活性をレポーター遺伝子の発現量で評価した．PCA と DDVA からのポリマー原料化合

田

勇

二

海洋研究開発機構海洋生命理工学研究開発センター，
現 埼玉工業大学工学部
hatada@sit.ac.jp

物 2 -ピロン- 4,6 -ジカルボン酸 (PDC) の生産能評価は，
SYK-6 株の PDC ヒドロラーゼ遺伝子破壊株に pcaK 又はddvK を導入した株を用いて行った．化合物の分析には

目的:リグニンは地球温暖化や石油枯渇リスクを背景に，

高速液体クロマトグラフィーを用いた．

その有効利用技術の開発が期待されている．リグニンは数

結果・考察:SYK-6 株の PCA，VA，DDVA の取り込み

種の芳香族モノマーが重合した物質であり，リグニン内主にプロトン駆動力が必要であることから，major facilitator

要結合である β -O -4 結合を特異的に切断する酵素の開発はsuperfamily (MFS) の関与を予想した．SYK-6 株の 67 遺リグニン有効利用への鍵となる．これまでに我々は，β -O -4

伝 子 を 破 壊 し， 生 育 能 を 調 査 し た 結 果，SLG_12880

結合を選択的に還元開裂する海洋性 Novosphingobium 属(pcaK) 破壊株の PCA での生育能の低下が観察された．

細菌（ Sphingomonadaceae 科）を深海沈木より発見し，また，pcaK 破壊株の PCA 取り込み能は顕著に低下し，本細菌が有する 5 つの酵素から成るカスケード反応を利若干の VA 取り込み能の低下が見られた．さらに pcaK

用し C6 - C3 構造を骨格とする芳香族モノマーの One -Pot

発現 UT26S 株が両基質の取り込み能を獲得したことか生産に成功した．本課題では，同様の機能を有する，よら，PcaK は SYK-6 株において PCA の主要な取り込みと，り優れた酵素の獲得を目指して，リグニンの特異的変換

VA の部分的な取り込みを担うことが示唆された．PCA能を有する微生物種を海底下泥炭層から新規に単離するから PDC への変換において，pcaK の導入は PCA 変換

ことを第一の目的とした．併せて，既に保有している酵－ 201 －

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2018

素の改良指針を得ることも試みた．

を統合することにより，より実用的なリグニンバイオ変方法:微生物の環境依存的な分布に着目し，環境との相換技術の開発が期待される．

関解析を主軸とする統計数理学的な手法により，目的とする微生物の分離条件を検討した．まず，環境 RNA（16S

代謝改変赤色酵母を用いる
未利用バイオマスからのアスタキサンチン・
キシリトールの同時発酵生産プロセスの開発

rRNA 遺伝子 V3 -V4 領域）に基づく微生物菌叢データより，各環境における存在密度を数値化する［データ処理]，
次に，算出値と塩基配列（ 4 -mer unit でクラスタリング）

堀の重相関解析を行う［数理計算]，そして，相関の見出せ

内

淳

一

京都工芸繊維大学大学院工芸科学研究科
horiuchi@kit.ac.jp

た環境サンプル（海洋堆積物，海水）を抽出，さらに多次元尺度法にて近傍プロットに配置されたサンプルを絞り込み，対応する［実環境データ抽出]，さらに，それら目的:地球温暖化の抑制や循環型社会構築の観点から，を因子分析等の因子抽出法により成分分解し［多変量解

リグノセルロース系バイオマス等の再生可能資源を原料

析]，最後に，導出された成分を基に培地を構築し，環としたバイオプロセスによる有用物質生産の研究が活発

境微生物の単離を試行［検証試験］の 5 ステップで実施し化している．リグノセルロース系バイオマスの生物的利た．得られた情報に基づき，対象とする微生物群の生育

用では，バイオマスから得られるグルコース及びキシに好適な条件を設定し，海底下コアサンプルから新規微ロースをともに利用し，高付加価値の生産物を得ること

生物の単離を試みた．

が重要である．本申請では，多様な糖資化能を有する赤

結果・考察:α - proteobacteria を解析対象とした多次元

色酵母 Xanthophyllomyces dendrorhous を用い，リグノセ

尺度法解析の結果，リグニン特異的変換に関連する酵素

ルロース系バイオマスを原料とし，キシリトールを培養

遺伝子と相同性の高い構造遺伝子を有する

液中に，アスタキサンチンを細胞内に蓄積させ同時生産

Sphingomonadaceae 科既知株が非常に近い位置にプロッするバイオプロセスを開発することを目的とした．

トされた．本情報に基づき，対象とする微生物群の生育

方 法:5 株 の X. dendrorhous(JCM 9680 ～JCM 9684 ，

2＋に好適な塩類濃度（K , Na , Mg , NH , Ca , Fe , Mn ,JCM 19184) を用いて，グルコース及びキシロースを炭Co , Zn , SO4 ）を設定した．これらの塩類組成を基素源とする合成培地を用い pH 5.0，通気量 1 vvm，温度に固体培地を作成し，海底下コアサンプルから新規と考22 ℃，撹拌速度 500 ～ 700 rpm に制御したジャーファー

えられる微生物を単離した．現在これらの株の詳細な系

メンター培養により培養特性を比較した．次に，バイオ

統学的分析を進めている．

マス原料として，食糧供給と競合せず世界的規模で生産

＋

2＋

2＋

＋

2＋

＋
4

2＋

2＋

2-

short chain dehydrogenase-reductase (SDR) は多様な量が多く，セルロース・ヘミセルロース含有率が高いト

アルコールの酸化 / 還元を触媒する巨大な酵素スーパー

ウモロコシの芯（コーンコブ）を用いることとし，酸加ファミリーであるが，その構造と機能の相関はまだ未解

水分解及び酵素糖化により 100 g/L のコーンコブからキ明な部分が多い．前述の反応カスケードの第一段階を担

シロース約 25 g/L，グルコース約 28 g/L 含有するコー

う SDR (SDR3) について構造予測プログラムによりモデンコブ加水分解液を得て培養実験に供した．

ルを構築したところ，Rossmann-fold モチーフを持つ予結果・考察:X. dendrorhous の各菌株を用いてグルコー

測構造モデルが得られ，補酵素および基質結合部位が推ス・キシロースをそれぞれ 25 g/L 含有する合成培地に定できた．今後，β -O-4 結合の特異的開裂酵素に関わるより回分培養を行ったところ，いずれの菌株でもキシ酵素群の更に詳細な速度論的解析や構造解析精密化から

ロース・グルコースを炭素源として速やかに資化するこ得られる知見と新規単離株から得られる新規酵素の知見とが明らかになった．一方アスタキサンチン及びキシリ－ 202 －

IFO Res.Commun. 32
2018

トールの生産特性は菌株により大きく異なったが，最大でアスタキサンチン約 9 mg/L，キシリトール約 16 g/Lが生産された．その内アスタキサンチン及びキシリトー
ル両方の生産が認められた JCM 9680 及び JCM 9683 を用いて合成培地による回分培養を行ったところアスタキ
サンチンとキシリトールの同時生産が可能なことが明らかになった．次にコーンコブを酸加水分解及び酵素糖化して得られるキシロース・グルコース混合加水分解液を用いて同様の回分培養を行ったところ，合成培地を用いた場合に比べ菌体増殖が促進され 3 - 4 mg/L のアスタキ
サンチン生産が可能なことが明らかとなった．一方キシリトールは一時的に生産されたもののその後資化され消失した．その原因を明らかにするためバイオマス加水分
解液の成分を検討したところ，加水分解液に含有されるコーンコブ由来の高濃度ミネラル成分がキシロース代謝を促進していると考えられた．更に温度条件を検討した
ところ，比較的低温（ 22 ℃）でキシリトール生産が促進され，一方高温条件下（ 28 ℃）でキシリトール代謝が抑制される現象が見いだされたことから，温度シフトを行う回分培養を検討し，アスタキサンチン生産を大幅に向上させたが，キシリトールの分解抑制まだ不十分であった．今後更に培養工学的検討を進め，バイオマス原料を用いたアスタキサンチン・キシリトールの同時生産プロセスの開発を進める予定である．

－ 203 －

平成 27 年度若手研究者助成の研究報告
助成期間:平成 27 年 4 月～平成 30 年 3 月

IFO Res.Commun. 32
2018の小牧博士らと解析した．これまでに，当研究 室で放線菌における二次代謝遺伝子を指標とした新たな分類基準の構築に
関する研究
春

成

Streptomyces 属放線菌から発見したヒアルロマイシン（ルブロマイシン＋ C5N ユニット），キナマイシン，ラキサ
イジン，アルキベマイシン，ブチロラクトールの 4 化合

円十朗

物についての分布傾向を得た．ルブロマイシン，C5N ユ

富山県立大学工学部
enjuro@pu-toyama.ac.jp

ニット，キナマイシン，ラキサイジンの生合成遺伝子クラスターはそれぞれ 3 科 5 属，2 科 3 属，3 科 5 属，3 科

目的:Salinispora 属などいくつかの放線菌では属や種に5 属の放線菌に分布しているのに対し，アルキベマイシン

特異的な二次代謝遺伝子を有している．このことから，は Streptomyces 属の小さなクラスターにのみ存在してお多種多様な二次代謝産物を生産する放線菌の場合，進化り，ヒアルロマイシンやブチロラクトールは存在しない

情報は二次代謝遺伝子にも強く保存されていると推定ことが判明した．これらの結果は二次代謝遺伝子の分布

し，次の 2 点を仮定した．まず，二次代謝遺伝子によるに系統樹とは異なる傾向があることを示唆しており，二分類が可能である．次に，新奇性の高い化合物の生産菌

次代謝遺伝子による分類の可能性を支持するものである．

は新規分類群である．以上の仮定を検証するため，本研
究では新規骨格化合物を放線菌より探索し，生産菌の同定および二次代謝遺伝子の解析を計画した．
方法:放線菌の分離源には，海洋島として高度に隔離され，植物をはじめ多くの固有種を有する小笠原諸島を選定した．特異的な環境 2 点から分離した 194 株を 3 種類の培地で培養し，ブタノール抽出物に含まれる化合物は，UV スペクトルを指標とした物理化学的スクリニーング
により，新規性の判定を行った．
結果・考察:判定の結果，7 株に新規と推定される化合物の生産が確認されたため，これらを各種クロマトグラ
フィーによって単離・精製し，MS・NMR による構造解析を行った．解析の結果，7 株が生産する化合物は，いずれも陸上放線菌の生産物として報告されている化合物，もしくはその類縁体であると決定・推定された．本探索によって得られた新規化合物の生産候補株は全体の約 3.7 ％と低いことや，既知化合物を生産している可能性が高いことから，当初計画していた「新規骨格化合物
生産菌の取得および二次代謝遺伝子の解析」を遂行することは困難であると判断し，本計画を中止した．
次に遺伝子配列データベースを用いて，二次代謝遺伝
子を指標とした分類の可能性を検証するため，放線菌に特異的な化合物の二次代謝遺伝子が 16S rRNA に基づいた系統樹においてどのように分布しているのかを NBRC
－ 205 －

発酵研究所助成研究報告第 32 号【非売品】

平成 30 年 12 月 10 日 印刷
平成 30 年 12 月 20 日 発行
編集委員長
編集委員
発行人
発行所

印刷所

横田 明
金子嘉信，左子芳彦，永井和夫
西山 真，福田雅夫
樽井直樹
公益財団法人発酵研究所
大阪市淀川区十三本町 2 丁目 17 番 85 号
TEL. 06 － 6300 － 6555
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