月例卓話

烏龍茶の香りに，魅せられて茶の香気生成の分子基盤を探る
坂
１．はじめに田完

三*て飲ませてもらい，その花のような香りに驚いチャ樹（ツバキ科 Camelliasinensis）の新た．この香りがその茶の製造工程で生まれると鮮葉を様々に加工することで，種々の茶が製造聞きますますこの茶に興味を覚え，その香気生され，世界中で楽しまれている．緑茶，紅茶，成機構の分子基盤を明らかにすべく研究に取り烏龍茶など一般に良く知られているもの以外に組んだ．その結果，烏龍茶の香気生成はチャ樹もその製造方法の違いにより，様々な茶がつくのストレス応答を最大限に利用したものである

られている［1］．その中で良く知られている緑ことが明らかとなった．緑茶は日本料理の極意

茶，烏龍茶，紅茶の製造法を図１に示す．これのように，チャ葉のもつ新鮮な緑の香りと色をらの茶はチャ葉（チャ樹の葉）の加工法を変え最大限製品に著すよう工夫されたもので，摘採ればつくることができる．緑茶はチャ葉中の酵後速やかに加熱することで酵素活性を止めてつ素の働きを利用しない「不発酵茶」であり，摘くられる．その対極にある紅茶の場合はチャ葉採後すぐに蒸すか釜炒りすることで内生酵素をを強く揉捻して組織を破壊し，チャ葉に含まれ失活させてつくる．烏龍茶と紅茶はチャ葉の内る酵素と基質との反応を促進し，あの華やかな生酵素を利用する「発酵茶」であり，酵素作用色と特有の香りをもつ茶となる．烏龍茶では紅を最大限に利用する紅茶は発酵茶，軽度の利用茶の様に早い段階で組織を破壊してしまうことによる「烏龍茶」は半発酵茶とよばれている．

なく，つまるところ，チャ葉を虐め続けて，乾発酵とは本来微生物の酵素による物質代謝であ

燥や傷害などの外部ストレス対するチャ葉の応るが，上記発酵茶の製造工程時にはほとんど微答を見事に利用して，あの香気を生み出してい生物は関与しておらず，この用語は誤ったものることが明らかとなった．その過程を以下に紹であるが，茶の世界では慣習としてそのまま使介する．

われている．茶にも微生物発酵を積極的に利用し た プ ア ー ル 茶や 阿 波 晩 （ 番 ） 茶 な ど が あ

２．茶の製法による香気の違い

り［1,2］，これらは後発酵茶と呼ばれてきたが，山西らは烏龍茶の香気を詳細に調べ，我々はむしろ微生物発酵茶とよぶことを提唱しgeraniol,linalool,benz
ylalcohol,2phenyl-ている．

ethanolなどのアルコール系香気を多量に含ん茶の香はその品質を決める最も重要な因子とでいて，これらの香気成分がこの茶の新鮮な花言われ，それぞれのお茶は特有の香気を有して香に寄与していることを明らかにしている［3］．

いる．前任地の静岡大学勤務当時，中国から留そしてこれらの香気成分は，烏龍茶の製造工程学してきた烏龍茶の研究者に高級烏龍茶を初めで多量に生成することが竹尾により示され，茶*京都大学名誉教授
第194回京都化学者クラブ例会（平成18年８月５日）講演
90

海洋化学研究第20巻第２号

平成19年11月

の製法の違いにより香気の生成に大きな違いが緩衝液（pH6.
0）に可溶化後，硫安沈殿（20－あることがすでに示されていた［4］．

80％）の後，CMToyope
arl650M［20mM ク
エン酸緩衝液（pH6.
0）；NaCl濃度勾配溶出］

３．茶のアルコール系香気の生成機構

により分画し，二糖配糖体加水分解活性を示す

31． Ger
aniol等の香気前駆体酵素画分を精製した．そして，チャ葉中には香烏龍茶用品種（水仙種と毛蟹種）のチャ葉を気前駆体 ・－プリメベロシドを特異的に加水分

摘採後直ちに釜炒り法により加熱し，酵素活性解する新規なグリコシダーゼである ・－プリメを停止させた後，乾燥したものの熱水抽出液をベロシダーゼが存在していることが明らかになっ各種クロマトグラフィーにより分画し，各画分た［6］．

を新鮮チャ葉より調製した粗酵素で処理して生成する香気成分をＧＣ分析により検出し，各香33． ・－プリメベロシダーゼの酵素化学的性

気成分の香気前駆体を追跡した結果，烏龍茶や質紅茶の花様の香りに寄与するアルコール系香・－プリメベロシダーゼの精製標品は SDS-

気 成 分 の ほ と ん ど は ， 二 糖 配 糖 体 ・－ プ リ

PAGE電気泳動で分析すると61kDaに単一バメ ベ ロ シ ド （6O-・Dxyl
opyr
anosyl-・D-

ン ド を 示 し ， ゲ ル ろ 過 お よ び MOALDI-gluc
opyranoside）（図２） としてチャ葉中にTOFMSの結果，分子量61,000であることから，蓄積されていることが明らかとなった［5］．

・－プリメベロシダーゼは単量体として存在することが明らかになった．一方，精製標品はＰ32． 香気生成酵素 ・－プリメベロシダーゼのＡＳ染色で陽性を示し，またグリコペプチダー

精製

ゼＦで処理すると61kDaから56kDaへ減少すまず予備検討として，緑茶用品種やぶきた種ることから，本酵素はＮ型糖タンパク質であるを用いて，これらの配糖体からの香気生成にかことも明らかになった．・－プリメベロシダー

かわる酵素の精製を行なった．常法により新鮮

ゼの基質特異性について詳細に解析した結果，葉から得たアセトンパウダーを0.
1M クエン酸

本酵素は単糖配糖体（・－グルコシドや ・－キ

図１．緑茶，烏龍茶，紅茶の製造法の概略

Tr
ans
acti
onsofTheResearchI
nstitut
eofOceanoc
hemistryVol.20,No.2,Nov.
,200791シロシド）をほとんど加水分解しないのに対しアルギニン残基が糖鎖修飾残基として推定されて，特に天然基質である ・－プリメベロシドにることから，本酵素はＮ－グリコシド糖鎖修飾対してきわめて高い基質特異性を示し，・1,6されたのち，細胞外へ分泌されると推定された．

結合を有する天然由来の二糖配糖体にも弱いな

実際，本酵素をバキュロウイルス－昆虫細胞系がら活性を示すことが明らかとなった［7］．まで大量発現させたところ，組換え酵素は糖鎖修た，・－プリメベロシドとの反応生成物のＴＬ飾され培地中に分泌された［8］．

ＣおよびＭＳ分析の結果から，単糖は生成せず二糖のプリメベロースだけが生成していること

35． ・－プリメベロシダーゼによる香気生成から，本酵素は ・－プリメベロシドの二糖とア機構とチャ葉中での役割グリコンの間の ・－グリコシド結合を特異的にやぶきた種の新芽（一葉，二葉，三葉，四葉，加水分解するジグリコシダーゼであることが分っ茎）の ・－プリメベロシダーゼを分析した結果，た．さらに，NMR管中で本酵素と ・－プリメ一葉から四葉へと葉の成熟度が上がるにつれてNMRで追跡したとベロシドを反応させて H-減少し，茎にも相当量の ・－プリメベロシダー

ころ，先ずプリメベロースの ・H（H1a）に帰ゼが存在することが分かった［8,9］．同様に，属できるシグナルが ・4.
43付近に観察され，次チャ葉中の全香気前駆体量も一葉で最も多く，いで ・H（H1e） に帰属できるシグナルが ・成熟するにつれて減少する［9］．茶の製造には5.
03付近に現れたことから，本酵素は立体保持三葉までの新芽が使われ，本酵素と茶の香気生型の機構で加水分解することが明らかとなっ成機構の関わりを示唆するものである．次に，た［7］．

・－プリメベロシダーゼの細胞レベルでの存在

1部位を免疫組織染色により解析したところ，細34． チャ葉 ・－プリメベロシダーゼのクロー胞間隙とその周囲の細胞の外側に反応が見られニングた．本酵素の推定アミノ酸配列から細胞外輸送

精製標品から決定された部分アミノ酸配列をシグナルペプチドを持つと推測されるので本酵利用して，やぶきた種チャ葉の cDNA ライブ

素は細胞外（細胞壁）に局在すると考えられる．

ラリーから ・－プリメベロシダーゼ cDNA を一方，基質である ・－プリメベロシドは細胞内クローニングした［8］．c
DNA配列から推定さ（液胞など）に存在するので，両者は通常隔離れるアミノ酸配列を Bl
astホモロジー検索したされて存在し，傷害などのストレスにより組織結果，青酸配糖体を加水分解する ・－グルコシが破壊されたときにのみ遭遇して反応すると考ダーゼや多くの植物由来 ・－グルコシダーゼとえられる． 遊離される香気成分の多くが抗菌50％程度の相同性を示し，ファミリー１グリコ性［10］などの生理活性を示すことから，本来，シダーゼに分類された．また，28残基目までは本酵素はチャ樹において生体防御機構に関わるシグナルペプチド（細胞外輸送シグナル）で，重要な酵素であると考えられる．

28残基目と29残基目の間で翻訳後切断されると推定された．予想される成熟タンパク質の分子４．ジグリコシダーゼ（二糖配糖体特異的グリ量は54,324であるのに対し精製酵素の分子量はコシダーゼ）の本来の役割約61,000であり，アミノ酸配列中には５カ所の茶の香気生成酵素として見いだされたβプ

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海洋化学研究第20巻第２号

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リメベロシダーゼは二糖部分を高い特異性をもっ41． その他の植物ジグリコシダーゼ遺伝子のて認識して，相当する二糖と香気成分のアグリクローニング

コンに加水分解することが明らかにされたが，ムシカリの葉から新規にフルカチンヒドロラー

天然には香気成分だけではなく，フラボノイドゼ（ＦＨ）の cDNAを単離した結果，その推やキサントンなどの色素や種々の二次代謝産物

定アミノ酸配列は ・－プリメベロシダーゼと最が二糖（・16）配糖体として蓄積する植物がも高い相同性（64％）を示し，多くの植物由来あり，そのうち数種の植物からは，その二糖配のファミリー１ ・－グルコシダーゼとも高い糖体を特異的に加水分解するジグリコシダーゼ相同性（50％前後）を示した．大腸菌で発現さ［ムシカリ （Viburnum furcatum） のフルカせた組換えＦＨは，p－アリルフェノールと二チン （pallylphenyl・acuminoside） 加水分

糖の間の ・－グリコシド結合を特異的に加水分解酵素，ソバのイソフラボン配糖体加水分解酵解した［13］．またＦＨのＮ末シグナル配列とＧ素，カラスノエンドウの青酸配糖体であるビシＦＰの融合酵素を植物で発現させた結果，ＦＨアニン（・visianoside）加水分解酵素など（図は葉緑体に局在することがわかった．

２）］の存在が古くから知られているが［11,12］，さらに，カラスノエンドウ未熟種子からビシ驚いたことにこれらの酵素については精製標品アニンヒドロラーゼ（ＶＨ）を精製し cDNAの酵素学的性質もほとんど明らかにされておらをクローニングした．そのＮ－末端には分泌タず，遺伝子まで明らかにされたのは ・－プリメ

ンパク質であることを示すシグナル配列があり，ベロシダーゼ（ＰＤ）が最初のものである［11］． 成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は，精製酵素から決定した配列と完全に一致した．またＶＨの推定アミノ酸配列はファミリー１グルコ(b) Furcatin hydrolase in Viburnum furcatum(a) -Primeverosidase in tea leaves
HOHOO

OOH
HOHOO
OH

O
O
OH HOHOOH OHO(S)-Linalyl -primeverosideOH
HO(d) Rutin hydrolase in Fagopyrum tataricum

OOOH
HOHOO
OHOHCOOHFurcatin ( p-Allylphenyl -acuminoside)(6-O--D-apiofuranosyl--D-glucopyranoside)(6-O--D-xylopyranosyl--D-glucopyranoside)(c) Vicianin hydrolase in Vicia angustifolia

OOHONHOOHOHOHOOOOHOOHOOHHOOH

Vicianin [(R)-Mandelonitrile -vicianoside]

Rutin (Quercetin -rutinoside)(6-O--L-arabinopyranosyl--D-glucopyranoside)(6-O--L-rhamnopyranosyl--D-glucopyranoside)

図２．主な植物由来のジグリコシダーゼとその基質

Tr
ansactionsofTheRe
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eofOceanoc
hemistryVol.20,No.2,Nov.
,200793

シダーゼと50％以上の相同性を示し，ＶＨがファ42． ＰＤ，ＦＨおよびＶＨの基質特異性

ミリー１に分類されることが確認された［14］．

これら３種の基質特異性を解析した

RTPCRを行った結果，種子にＶＨが多量に（表１）［14,15］．各ジグリコシダーは対応する発現しており，また，花にも発現が確認された

天然基質以外の二糖配糖体もある程度加水分解が，葉，茎，根においては，発現していないこできることが分かった．一方，ゲンチオビオシとが確認された．全長の VH c
DNA を昆虫細ドを基質とした場合，三種の酵素はほとんど加胞において発現させ，組換え酵素を作製した．

水分解しなかった．ゲンチオビオシドでは二糖ＶＨもＦＨと同様にチャ葉のＰＤに対する抗体目がグルコースでありペントースに比べ C5・と反応することが確認された．種子精製ＶＨと位にヒドロキシメチル基が余分に突き出ている

組換えＶＨの二糖配糖体に対する加水分解様式ため，ジグリコシダーゼの活性部位に納まるこをＴＬＣ分析で調べた．その結果，両ＶＨともとができなくなると考えられる．興味深いこと

ビシアニンを二糖のビシアノースとマンデロニに，ジグリコシダーゼは ・－グルコシダーゼとトリルに加水分解したことから，ＶＨも二糖配高い相同性を示すが，それぞれのジグリコシダー糖体を特異的に加水分解するジグリコシダーゼ

ゼに対応する天然基質と同じアグリコンを持っであることが確認された．ている単糖配糖体はある程度加水分解するのに対し，それ以外の単糖配糖体をほとんど加水分解できない．ジグリコシダーゼの基質認識ポケッ
表１．ＰＤ，ＦＨ，ＶＨの基質特異性

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トは二糖グリコンを認識する subs
ite－１，－２が，図３に示すように，各植物でそれぞれに進とアグリコンを認識する subs
ite＋１の３つの化した ・－グルコシダーゼが植物の防御機構に

subs
iteから構成されると予想される．このモ組み込まれるという特別の役割を担うことで，デルをもとにジグリコシダーゼの基質特異性は6・-位が修飾された ・－グルコシドを基質とで以下のように説明できる．ジグリコシダーゼはきるジグリコシダーゼにさらに平行進化したも

subs
ite－２と subs
ite－１により二糖のペントーのと理解できる［15］．

スとグルコースをそれぞれ認識することにより基質を捉え，加水分解する．ＦＨおよびＶＨの６．・－プリメベロシダーゼ（ＰＤ）のＸ線結

場合，天然基質と同じアグリコンを持つ単糖配晶構造解析

糖体は subs
ite－１と subs
ite＋１により認識

上記のことを確認するため，独自に開発したされるため，ある程度加水分解される．一方，基質アナログ阻害剤である ・－プリメベロシル

各ジグリコシダーゼに対応する天然基質と異なアミジン（表２）をリガンドとして用いたアフィるグリコンを有する非天然型 ・－グルコシドは
subs
ite－１のみでしか認識されず，しっかり固定できないため加水分解されないと理解でき
94.1

る．また，アグリコン特異性の広いＰＤの場合も，単糖配糖体は subsite－１のみで認識されるため，加水分解されない．以上のように，ジグリコシダーゼの二糖認識に関わるタンパク質構造がどのように ・－グルコシダーゼから進化したのか興味深い［15］．
５．植物のファミリー１ ・－グリコシダーゼ

Arabidopsis thaliana
Sinapis Alba "/
Arabidopsis thaliana
Medicago truncatula+" '
Vicia angustifolia ).Arabidopsis thaliana
Polygonum tinctorium.
Fagopyrum tataricumManihot esculenta&
Hevea brasiliensis#Viburnum furcatum#*Camellia sinensis&Rubia tinctorum (
Oryza sativa$Oryza sativa
Oryza sativaの分子進化の解析
我々が明らかにしたジグリコシダーゼ（チャ樹，ムシカリ，カラスノエンドウ）および最近明らかにされたジグリコシダーゼ（ダッタンソ
バとセイヨウアカネ）のアミノ酸配列をもとに作製した，ファミリー１グリコシダーゼの進化系統樹を図３に示した．・－プリメベロシダー
ゼ（ＰＤ：チャ樹）に続いてフルカチンヒドロ

Prunus serotina-+*Prunus serotina
Trifolium repens,$ ラーゼ（ＦＨ：ムシカリ）のジグリコシダーゼのアミノ酸配列を明らかにし進化系統樹を作製

Oryza sativa
Dalbergia cochinchinensis

すると，それらは隣に位置したことから，ジグ

0.1 amino acid substitutions / site

リコシダーゼはファミリー１の中でサブファミ

.
NJ tree

図３．ファミリー１グリコシダーゼの進化系統樹
解析

リーを形成しているのではないかと考えていた

TransactionsofTheRese
archI
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eofOceanochemistr
yVol.20,No.2,Nov.
,2007

Secale cereale  )#Zea mays %, 
Sorghum bicolor  %, 
100.0
Avena sativa  )#Arabidopsis thaliana
Cucurbita pepo
!&Hordeum vulgare
#Pinus contorta  "Rauvolfia serpentina
.&!
Rauvolfia serpentina
Catharanthus roseusOlea europaea
 */
Digitalis lanata   *
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana
Costus speciosus .

95

ニティークロマトグラフィーでチャ葉 ・－プリノ酸残基 Phe198，Trp378，Phe466が存在する

メベロシダーゼ（ＰＤ）を精製した［16］．これが，ＰＤでは Gly210，Ala387，Leu472に置換を用いてＸ線結晶構造解析を行った．

されていた（図４）．その結果，開口部の幅は1・－プリメベロシルアミジンを取り込んだＰ

E1FよりもＰＤの方が約３Å広くなっていた．

Ｄとファミリー１に属するトウモロコシ由来の

この大きな開口部によって，ＰＤは単糖配糖体

・－ グ ル コ シ ダ ー ゼ （1E1F； 阻 害 剤 の p-よりも大きな二糖配糖体を結合することができ

Nitr
ophenyl・Dthiogl
uc
opyr
anosi
deを 取ると考えられる［15］．

り込んでいる）の基質ポケット開口部の構造を次に，ジグリコシダーゼが，なぜ単糖配糖体

図４に示す．活性残基付近の構造はほとんど同を加水分解できないのか，得られた構造から考じであるが，ポケットの開口部に大きな違いが察した．ＰＤと 1E1Fのグルコース認識残基と見られた．1E1Fの開口部には，かさ高いアミ活性残基は，側鎖の立体配座までほとんど一致している．つまり，ＰＤが単糖配糖体の ・－グ
ルコシドをほとんど加水分解しないのは，グル

表２．・－グリコシルアミジンの構造とＰＤに対する阻害活性Inhibitor
HO1HOHOO

コース部分の認識が問題ではなく，他に何らかの原因があると考えられた．1E1Fの Phe
198，

Ki (mM)

HN

ND

OH Cl- NH +Tr
p378，Phe466はアグリコンの認識に関わる重要なアミノ酸である．ファミリー１の ・－グ

22aHOHOOOOHHOHOOHN

0.14

ルコシダーゼは subsite－１でのグルコースとの水素結合以外に，subsite＋１でのアグリコOH Cl- NH +2HO
HO2bOOOHHO
HOン部分によっても単糖配糖体を認識している．

OOHN

OH Cl- NH +2N

S0.026

特に1E1Fの Trp378は， アグリコンの芳香環Oとsubsite＋１で ・・・スタッキングするアミ

ND: no inhibitory activity was detected.

ノ酸であることが報告されている． この Trp

図４．ＰＤおよび1E1Fの基質ポケット開口部の構造

96

海洋化学研究第20巻第２号

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はファミリー１ ・－グルコシダーゼに強く保当広く植物界に分布していることが予想され，存されており，・・・スタッキングが単糖配糖

これらが今後明らかにされることにより，新し体を安定に結合するために必要であると考えい視点からの栽培作物の虫害や病害からの防御られる． しかし前述したように， ＰＤでは法の開発に繋がることも期待される．

Trp378が Ala387に置換されており，その置換烏龍茶の香気生成機構の研究から始まった研が原因で subs
ite＋１でのアグリコンの認識が究が，新しいグリコシダーゼの機能の発見へと弱く，グルコース部分の水素結合だけでは単糖発展した．そして，烏龍茶のあの素晴らしい花配糖体を安定に結合できないため，その結果と香を生み出す伝統技術は，実はチャ樹がその進して単糖配糖体に対する活性が低いと考えられ化の過程で備えた自己防衛機能をフルに活用しる．こうして，ジグリコシダーゼの基質特異性たものであったことを実証できた．しかし，茶実験から推測された基質認識機構がＸ線結晶構の世界はまだまだ奥が深く，虫害を受けたチャ造解析により確かめられた．

葉をわざわざ用いてつくる茶がある．これぞチャ樹のストレス応答を利用した香気生成技術の極

７. おわりにみと言うべきものである．我々は数年前から台我々が茶の香気生成の鍵酵素として見出した湾（東方美人茶）やインド（ダージリンセカン

・－プリメベロシダーゼ （EC 3.
2.
2.
149） はそ

ドフラッシュ）の茶の研究者と共同研究を始め，のアミノ酸配列にもとづく進化系統樹解析によこの仮説の証明に取り組み，興味ある成果を挙り，植物 ・－グルコシダーゼが属するファミリーげつつあるがその紹介は誌面の都合により割愛

１に属することが明らかとなった．しかしながさせていただいた．

ら，チャ樹 ・－プリメベロシダーゼは詳細な基
質特異性解析により，二糖配糖体特異的酵素

謝辞：本研究は大変多くの方々のご支援を賜（ジグリコシダーゼ）で，・－グルコシダーゼ

り，静岡大学農学部応用生物化学科食品・天然活性はほとんど有していなかった．

物化学研究グループおよび京都大学化学研究所

この特異な基質特異性に興味を抱き，今まで生体触媒化学研究分野の関係教官および学生諸ほとんど研究がされていなかったジグリコシダー

君がなし遂げてくれたものであり，皆様のご支ゼに着目し，天然物化学，有機合成化学，生化援とご尽力に深甚の謝意を表します．

学，分子生物学，構造生物学の研究手法を総合して，チャ樹の ・－プリメベロシダーゼを初め引用文献とするジグリコシダーゼを詳細に研究した結果，

１）伊奈和夫，坂田完三，南条文雄，鈴木壮幸：

上記のようにこれらジグリコシダーゼはファミ

新版

リー１の数種の ・－グルコシダーゼが植物の自アイ・ケイコーポレーション，2007.

己防御などの特別の役割を担うことにより新し

２）呂毅，坂田完三，駱少君，郭ぶん飛：中国

い機能（6・-位に修飾を受けた ・－グルコシド

黒茶のすべて，幸書房，2003．

を加水分解できる）を持つように平行進化した

３）山西貞：FFIジャーナル，Ｎo.168，2334

一群のグリコシダーゼと定義できることを明ら（1996）．

かにすることができた．ジグリコシダーゼは相Tr
ansacti
onsofTheRese
archI
nstitut
eofOceanochemistr
yVol.20,No.2,Nov.
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緑茶・紅茶・烏龍茶の化学と機能，４）TakeoT.
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