演題 GC/MS 基盤メタボローム分析に資する固相誘導体化法の応用
佐々野僚一 1* 大﨑秀介 2 松本明弘 2 馬場健史 3 山下俊幸 4 福﨑英一郎 4
1. (株)アイスティサイエンス 2.和歌山県工技セ 3.九大・生医研セッション／計測技術・融合領域[緒言]

4.阪大・工口頭発表

一般的なGC/MS基盤メタボローム分析では、GC/MS注入に先立ち、溶媒抽出、遠心濃縮、凍結乾燥、誘導体化等の多段階の前処理が必要であり、長時間にわたる煩雑な操作を伴うため、時として除去不能の系統誤差が含まれる。また、試料によっては高濃度の糖類がアミノ酸や有機酸の分析を困難にすることがある。そこで当該問題解決のため、我々は固相カートリッジ中の充填剤に検体を濃縮・保持した状態で行う誘導体化反応を検討し、従来のメタボローム分析における煩雑な操作を必要としないGC/MS分析を開発した。本発表では固相抽出の技術を応用し、糖類を多く含む検体中のアミノ酸と有機酸の迅速な分析を目的として、糖類を固相に保持せずにアミノ酸と有機酸を固相に保持させた状態で誘導体化を試み、有用な結果を得たので報告する。
[実験]

測定装置として、大量注入口装置（LVI-S200, (株)アイスティサイエンス製）を備えたGC-MS/MS（GC: 7890B, MS: 7000C, Agilent製）を用いた。測定試料はアミノ酸と有機酸と糖類を水-アセトニトリル混合溶液に調製した。固相カートリッジには、(株)アイスティサイエンス製の強イオン交換作用の固相抽出カートリッジ(CXi／AXi) を用いた。前処理の手順は、固相カートリッジをコンディショニングした後に、試料溶液を通液し、水-アセトニトリル混合溶媒で糖類を洗浄し、脱水のためにアセトニトリルを流した。その後、誘導体化試薬MSTFAを固相上に直接添加することで誘導体化を行い、ヘキサンで溶出し測定溶液とした。
[結果]

アミノ酸を保持させる陽イオン交換樹脂（CXi）と有機酸を保持させる陰イオン交換樹脂（AXi）を積層にした固相カートリッジを開発した。この固相カートリッジにおいて、糖類は固相に保持せずアミノ酸と有機酸を固相に保持させるための通液時の水-アセトニトリル比率の最適化を図った。その結果、糖類を多く含む検体においてもその影響を受けずアミノ酸と有機酸のトリメチルシリル(TMS)化されたピークが再現性良く検出された。また、誘導体化に要する時間の大幅な短縮が可能となった。

GC/MS基盤メタボローム分析に資する固相誘導体化法の応用
佐々野僚一1* 大崎秀介2 松本明弘2 馬場健史3 山下俊幸4 福崎英一郎4
1.(株)アイスティサイエンス 2.和歌山県工技セ 3.九大・生医研 4.阪大・工第9回メタボロームシンポジウム
2015年10月01-02日, 三島市

はじめに
【経緯】
これまでに、従来のメタボローム分析における長時間にわたる操作を必要としない迅速な前処理法を目的として、固相に目的成分を濃縮・保持した状態で誘導体化する固相誘導体化法を開発した。
【本研究の課題】
一般的なGC-MS基盤メタボローム分析において、試料によっては高濃度の糖類が測定および解析時にアミノ酸や有機酸の分析を困難にすることがある。
【目的】
先の固相抽出の技術を応用し、糖類は固相に保持させず、アミノ酸と有機酸を固相に保持させた状態で誘導体化するアミノ酸と有機酸の迅速分析法の開発

従来の誘導体化前処理法と課題
減圧濃縮遠心分離（1600rcf, 4℃, 3min）
凍結：液体窒素

凍結乾燥（一晩：16時間）
誘導体化試薬添加
メトキシアミン/ピリジン溶液 20mg/mL 100uL

誘導体化
前処理時間

9〜19時間水分除去操作と誘導体化反応に長時間を有している。

インキュベーション（30℃, 90min）：誘導体化反応

誘導体化試薬添加：MSTFA 50uL
インキュベーション（37℃, 30min）：誘導体化反応
遠心分離（16000 rcf, 4℃, 3min）
分取：上澄み 100µL → バイアル瓶

測定：GC/MS：注入1µL（スプリット 25:1)

固抽相出技術を用いて水分除去と誘導体化反応を行うことで前処理の迅速化を試みた。

アミノ酸のCX固相を用いた誘導体化Step1

Step２

Step３

Step４

負荷・保持

脱水

誘導体化

溶出

試料抽出液

R- C – COO⊖
アミノ酸–

⊕NH

CX

洗浄液
アセトニトリル

誘導体化試薬 [含浸]
MSTFA

溶出液
ヘキサン

3R-C–COO⊖－SO3⊖ ⊕NH3CX

R-C-COO-TMS－SO3⊖
TMS-NH

固相誘導体化－SO3⊖

R-C-COO-TMS–

アセトニトリルで水分を除去

CX–

アミノ酸をイオン交換相互作用により固相に保持。

R-C–COO⊖––－SO3⊖ ⊕NH3

CX

TMS-NH

有機酸・糖類のAX固相を用いた誘導体化
Step1

Step２

Step３

Step４

Step5

負荷・保持

脱水

メトキシム化

TMS化

溶出

試料抽出液

有機酸

糖類

洗浄液
アセトニトリル

誘導体化試薬[含浸]メトキシアミン－COO⊖ －OH

AX

AX－OH－Ｎ⊕ －COO⊖(CH3)3－OH－Ｎ⊕ －COO⊖(CH3)3

有機酸をイオン交換相互作用により固相に保持。
糖類を極性相互作用により固相に保持。

アセトニトリルで水分を除去

AX－OH－Ｎ⊕ －COO⊖(CH3)3固相誘導体化

誘導体化試薬 [含浸]MSTFAAX－O-TMS－Ｎ⊕ －COO-TMS(CH3)3固相誘導体化

溶出液
ヘキサン

AX－Ｎ⊕
(CH3)3－O-TMS－COO-TMS

試料負荷時の水濃度と固相への保持について【アミノ酸とCX固相】【糖とAX固相】【有機酸とAX固相】

20%水-アセトニトリル溶液では糖類を除去して、アミノ酸と有機酸を保持することが可能。

糖類を除去する固相誘導体化前処理法の工程
Step1

Step2

Step3

Step4

Step5

試料負荷保持脱水

誘導体化

溶出

試料抽出液
20%水-ACN

洗浄液
20%水-ACN

洗浄液
アセトニトリル

アミノ酸CX- –NH3+

CX-

AX+ 有機酸

AX+ 有機酸

AX+ 有機酸

糖類 -OH

残存糖類 -OH

残存水–COO-

アミノ酸
–NH3+

–COO-

アミノ酸をと有機酸を固相に保持。
糖類はスルーさせ、除去。

CX-

アミノ酸
–NH3+
–COO-

アセトニトリル
で水分を除去誘導体化試薬 [含浸]
MSTFA

CX-

アミノ酸
–NH-TMSAX+ 有機酸–COO-TMS

固相誘導体化

溶出液
ヘキサン

CX-AX+

アミノ酸–NH-TMS
有機酸–COO-TMS検討および評価項目
A．固相誘導体化前処理法の最適条件の検討
１．洗浄液量について
２．誘導体化反応時間について
B．実試料を用いた本法の評価

１．糖類の除去効果
２．抽出後の固相誘導体化前処理法の再現性

実験に用いた試料
試料：市販のフルーツジュース（果汁100%）
品名：果実ミックス飲料

栄養成分表示タンパク質0.8g

脂質0g

糖質23.2g

原材料：

食物繊維果実（リンゴ、オレンジ、バナナ、パイ
ナップル、うんしゅうみかん、キウイフ
ルーツ、ぶどう、パッションフルーツ、アサイー、マンゴー、もも、レモン、プ
ルーン、アセロラ、etc.）

ナトリウム2mg

カリウム320mg

ビタミンC110mg

ビタミンK

0-6µg

葉酸

5-40µg

香料、クエン酸、ビタミンC

0.1-1.0g

ブドウ糖

5.2g

クエン酸

820mg

（1本/200mL当たり)

固相誘導体化前処理法（アミノ酸と有機酸）抽出後の固相誘導体化前処理時間
試料 50µL
添加：水 150µL

添加：ACN 800µL

試料抽出液分取

AiSTI-SPE ACX-3mg

インキュベーション（37℃, 30min）

洗浄：20%水-ACN 50µL（糖類を洗浄）
洗浄：ACN 100µL（脱水効果）

遠心分離（14000rpm, 5min）
試料抽出液（20%水-アセトニトリル）

6分50µL

誘導体化試薬を含浸

MSTFA 25µL

固相誘導体化反応
溶出：ヘキサン 100µL

添加：ヘキサン 400µL検液

GC/MS：大量注入10µL

GC/MS条件
PTV Injector
Injectoin Temp.
Solvent Purge Time
Injection VolumeGC
Pre-column

LVI-S200(AiSTI Science) : Spiral Insert

70℃(0.1min)-120℃/min-240℃(0.5min)-50℃/min-280℃(15min)
0.1min10μL
Agilent 7890B
Deactivated silica capillary tube 0.25mm×0.3m

ColumnColumn Oven Temp.

BPX5, 0.25mm i.d.× 30m, df0.25μm (SGE)

Splitpurge Flow
Splitless Time

150mL/min(0.10min)-0mL/min(3.9min)-50mL/min(6min)-20mL/min

60℃(4min)-20℃/min-290℃(4min)
4min

MS
Detector Temp.

Agilent 7000CMS Method

SCAN : 50-4５0

280℃

洗浄液量と糖類の除去効果
糖類

糖類

洗浄無洗浄液量：25µL

洗浄液量：50µL

SCANトータルイオンクロマトグラム比較
20%水-アセトニトリル50µLで洗浄することで固相に残存している糖類を十分に除去できることが分かった。

20%水-アセトニトリル洗浄液量について【有機酸】

相対ピーク面積比

相対ピーク面積比【アミノ酸】

20%水-アセトニトリル洗浄液量（µL）

20%水-アセトニトリル洗浄液量（µL）

固相誘導体化反応時間について【アミノ酸】

相対ピーク面積比

相対ピーク面積比【有機酸】

固相誘導体化反応時間（秒）固相誘導体化反応時間（秒）固相上で誘導体化することで速やかにTMS化反応していることが考えられ、誘導体化試薬を固相に含浸する時間は15秒で十分であった。

フルーツジュースの本法によるSCANトータルイオンクロマトグラム④⑧②⑤③⑥ ⑦①①Alanine-2TMS②Proline-2TMS③Serine-2TMS④Maric acid-3TMS⑤Asparatic acid-3TMS⑥Glutamic acid-3TMS⑦Asparagin-3TMS⑧Citric acid-4TMS⑪⑨⑩⑬⑫⑨Valine-2TMS⑩Isoleucine-2TMS⑪Threonine-3TMS⑫Ketoglutaric acid-3TMS⑬Tartaric acid-3TMS

固相抽出技術による糖類の除去効果
糖類
アミノ酸、有機酸

ー黒線：
試料抽出液量：10uL
2%水-アセトニトリル
ー赤線：
試料抽出液量：50uL
20%水-アセトニトリル

SCANトータルイオンクロマトグラム重ね描き20%水-アセトニトリルで固相に負荷して、洗浄することで糖類をほとんど除去できた。

フルーツジュースの固相誘導体化法の再現性
No.

CompoundPeak Area
123456Ave.

101 Alanine-2TMS

922,366

896,338

900,613924,316

893,251

907,292

907,363

102 Valine-2TMS

2,280,757

2,199,247

2,175,089

2,249,300

2,179,606

2,188,250

2,212,042

103 Leucine-2TMS

8,238,086

7,993,113

7,807,302

8,156,037

7,842,769

8,070,694

8,018,000

104 Isoleucine-2TMS

3,152,605

2,931,310

2,878,507

3,061,404

2,924,058

3,027,144

2,995,838

105 Proline-2TMS

7,153,058

6,916,459

7,114,867

7,343,125

6,908,478

7,208,605

7,107,432

106 Serine-3TMS

1,630,455

1,578,066

1,539,055

1,604,529

1,547,032

1,574,444

1,578,930

107 Threonine-3TMS

223,434

214,033

204,897

206,024

204,772

212,917

211,013108 Aspartic acid-3TMS

1,440,509

1,416,698

1,390,517

1,410,988

1,407,988

1,403,984

1,411,781

109 Methione-2TMS

72,91973,207

67,574

72,11871,73773,063

71,770110 Glutamic acid-3TMS

379,603359,315366,787352,375

366,416353,280

362,963

111 Phenylalanine-2TMS

1,623,907

1,607,477

1,546,167

1,633,851

1,590,592

1,625,657

1,604,609

180,343

168,369

154,763

172,856

165,834

169,786

168,658

393,542355,299

303,190396,236

369,866

377,538

365,945

31,836,205

31,114,777

27,480,877

33,665,359

31,651,902

32,598,864

31,391,331

203 Ketoglutaric acid-3TMS

485,776545,080

445,816

477,290461,074

479,614482,441

204 Tartaric acid-4TMS

202,387

196,159

178,516

202,680

194,985

204,069

196,466

118,149,126

116,573,721

109,788,429

119,169,130

117,325,701

RSD
(%)

Amino group

112 Tyrosine-2TMS

1.5
1.9
2.1
3.4
2.4
2.2
3.5
1.2
3.0
2.8
2.0
5.0

Organo acid group
201 Fumaric acid-2TMS
202 Malic acid-3TMS

205 Citric acid-4TMS117,454,095 116,410,034

9.4
6.7
7.0
4.92.9まとめ

アミノ酸を保持させる陽イオン交換樹脂（CXi）と有機酸を保持させる陰イオン交換樹脂（AXi）を積層にした固相カートリッジを開発した。

糖類は固相に保持せずアミノ酸と有機酸を固相に保持させるための通液時の水-アセトニトリル比率の最適化を行い、アミノ酸と有機酸の迅速な分析法を開発した。



糖類を多く含む検体においてもその影響を受けずアミノ酸と有機酸のトリメチルシリル(TMS)化されたピークが再現性良く検出された。



固相誘導体化法を用いることで誘導体化前処理に要する時間の大幅な短縮が可能となった。

高濃度の糖類が分析に及ぼす影響【測定機器について】
・注入口が汚れる・フィラメントが切れやすくなる
・感度低下
・メンテナンス頻度が高い
・GCへの注入量を増やせない。
【解析について】
・定量イオンが限定される。
・ピーク形状が崩れる。
・低濃度の目的成分が分析できない。
・解析に時間が掛かる。
・リテンションタイムが重なると解析できなくなる。
・リテンションタイムが重なる物質は測定対象から除外する。
・リテンションタイムがずれる。

糖類を除いた「アミノ酸」と「有機酸」の分析測定機器を安定に保ち、メンテナンス頻度を下げられ、短時間分析が可能となる。
解析の時間短縮が図れ、精度の高い分析が可能となる。
低濃度のアミノ酸や有機酸が測定できるようになり、アミノ酸や有機酸の網羅的な分析枠が広がる可能性がある。

固相抽出技術による糖類の除去効果
糖類

試料抽出液量：10uL
2%水-アセトニトリル
測定機器を安定に保ち、メンテナンス頻度を下げられ、短時間分析が可能となる。

アミノ酸、有機酸

試料抽出液量：50uL
20%水-アセトニトリル

解析の時間短縮が図れ、精度の高い解析が可能となる。
低濃度のアミノ酸や有機酸が測定できるようになり、アミノ酸や有機酸の網羅的な分析枠が広がる可能性がある。

SCANトータルイオンクロマトグラム比較