［研究報告］

糖化タンパク質生成抑制能の測定法の構築と機能性に優れた県産食品素材の検索＊
山口佑子＊＊、岸敦＊＊、小浜恵子＊＊

多試料の糖尿病予防効果を評価するため、糖尿病合併症の原因の一つである糖化タンパク質（AGE:Advanced Glycation End Products）の生成抑制効果を測定する ELISA 法を開発した。この測定法を用いて、約 250 種類の県産農産物の AGE 生成抑制能を評価した。また、ラジカル消去能についても DPPH ラジカル消去活性、oxygen radical absorbance capacity (ORAC)を用いて同様に評価した。その結果、高い AGE 生成抑制能やラジカル消去能を持つ農産物が見つかった。
キーワード：ラジカル消去活性、糖化変性、糖尿病

Relative Estimation of Food Functionality of Agricultural Products
Harvested in Iwate Prefecture : Application of Novel Assay for
Glycosylation Process Inhibit Activity.
YAMAGUCHI Yuko, KISHI Atsushi and KOHAMA Keiko
Advanced glycation end products (AGEs) have been implicated in various disease statesin diabetes ,and to inhibit protein glycation lead to decrease AGEs is expected to beimportant for prevention of diabete development. To measure physiological functional
activities which work on AGEs generation inhibitory, we developed new procedure (ELISAsystem) which is more simple but sensitive and reliable. In this study, about 250 agricultural
products were measured by using this method. And radical scavenging activities of thesesamples were estimated by two methods: DPPH radical scavenging activities and oxygen
radical absorbance capacity (ORAC). As a result, some agricultural products showed strong
food functionality.
key words : radical scavenging activity, glycation, diabetes
１ 緒

料としてラジカル消去活性の評価法を検討した。

言

昨今の食品における消費者のニーズは「健康・安全・安心」

また、生活習慣病の一つである糖尿病は国民病といわれるに集約されており、今後もこの傾向は高まっていくと考えらほど発症率が高く、糖尿病に関連した機能性食品が開発されれている。一方で、県内食品企業では健康機能性に優れた食ている。糖尿病は発症初期段階において血液中の高濃度の糖品や、地域色が強い特産品（地域ブランド）の開発に関心がが生体タンパク質と非酵素的に反応し糖化タンパク質を生成高まっている。

する（非酵素的糖付加反応）。これらはその後の反応過程を食品の持つ健康機能性の中でも、過度の酸化ストレスが生経て、非酵素的糖付加反応－後期反応生成物（AGE:Advanced

活習慣病や老化の原因であることから、抗酸化能（ラジカルGlycation End Products）となり、生体内で種々の糖尿病の病態消去活性）に対する期待は高く、既報１）ではヤマブドウを試（腎臓障害、視力障害、etc）を引き起こす原因となる 2～3）。

＊ 県産素材を利用した機能性食品開発＊＊食品技術部

第１報

15

岩手県工業技術センター研究報告第１１号（２００４）

これら一連の反応では、ラジカルが発生して、AGE 生成を加蛍光プレートリーダー（Fluostar、tecan 製）によりラジカ速すると言われており、ラジカル消去能を有するビタミン Eルによる蛍光退色の防止作用（Ex:530nm,検出フィルタやポリフェノール類摂取による AGE の生成抑制が報告されー:570nm）を測定した。0.1mM Trolox の退色速度を被検液とている。
岩手県内の農林水産物の中から AGE 抑制能をもつ食比較することにより、相対的な抗酸化活性を算出した。

品素材を見出せば新たな機能性食品としての活用も可能であ２－５ 糖化タンパク
糖化タンパク質生成抑制能
タンパク質生成抑制能の質生成抑制能の測定る。

糖化タンパク質生成抑制能は次のように測定した。

そこで、本報告では、岩手県内の農林水産物中から高いラBSA-Fructose 溶液（2 ％BSA 、500 ｍM

Fructose 、15ppm

ジカル消去活性を有するものを検索し、既報１）で構築した測puroclin-200、200mMP-K buffer（pH7.4））990μｌに各抽出定法を用いて約２５０種類の食品素材を評価した。また、深液 10μｌを加え、37℃で 3 日間インキュベートした。対照と刻な糖尿病合併症の原因であるタンパク質の非酵素的糖化反しては水溶性の G-Rutin（東洋精糖）を用いた。Control と応の抑制効果の測定法を新規に構築し、同様に評価したのでBlank には 200m MP-K buffer を加え、後者は直ちに-20℃保報告する。

存した。反応終了した各液を非酵素的糖付加反応－後期反応生成物（AGE:Advanced Glycation End Products）液とした。

２ 実験方法

AGE 固定済マイクロプレート（AGE のプレートへの固定には

２－１ 分析試料

ZeptoMetrix 社 IMMUNO TEK ELISA construction system を使

今回測定に用いた試料は以下の通りである。試料は、岩手用） に抗 AGE モノクローナル抗体－peroxidase（0.1μg/ml)

県農業研究センター、岩手県林業技術センターなどを通じてを 50μl と各 AGE 液の 100 倍希釈液を 50μl 加え、室温で 3県内より収集した。農産物の種類は大きく６つ（果実類、野時間放置後、0.05%Tween20 を含む PBS で 3 回洗浄した。発色

菜類、キノコ類、穀類、海産物、その他）に分類した。種類

基質（KPL 社 TMB Microwell Peroxidase Substrate System

別の試料数は以下の通り。

50-76-00)を 100μl 加え約 3 分間発色させた。
1M H3PO4 を 100①果実類（103 種類）、②野菜類（60 種類）、③キノコ類（24μl 加え反応を停止させ直ちにマイクロプレートリーダーで種類）、④穀類（17 種類）、⑤海産物（5 種類）

450nm における吸光度を測定し、10mMG-Rutin の生成抑制率と２－２ 試料抽出液試料抽出液の調製比較することにより、相対的な生成抑制能を算出した。

試料は可食部を凍結乾燥後、粉砕し、10 倍量（w/v）の 100％エタノールで１時間抽出、または純水で熱水抽出した。この３ 結果および結果および考察および考察抽出液を濾過し、試料抽出液とした。

３－１ 試料中の試料中の総ポリフェノール含量
ポリフェノール含量

２－３ 総ポリフェノール含量
ポリフェノール含量の含量の測定

図１に、各試料中の総ポリフェノール含量の分布を示した。

キノコ類を除いた各試料の総ポリフェノール量は既報１）にほとんどの試料で、エタノール抽出よりも熱水抽出の方が高従って測定し、没食子酸相当量として算出した。

いポリフェノール抽出率を示していた。熱水抽出物ではピペ

２－４ ラジカル消去活性
ラジカル消去活性の消去活性の測定

リカム、アロニア、西洋カンボク、カリン、ガマズミ、フサ

ラジカル消去活性は原理の異なる以下の方法で測定した。

スグリ、カシスなどに多く含まれていた。エタノール抽出物

有色ラジカルである DPPH の消去活性は、既報１）に従ってでも、ほぼ同様の結果であった。既報１）で試料として用いた測定し、没食子酸相当量として算出した。

ヤマブドウを含むベリー類には、含量の高いものが多かった。

Oxygen radical absorbance capacity (ORAC)を指標とした野菜類、穀類では少なかった。

４）ラジカル消去活性は Cao らの方法

３－２ 各測定法による各測定法によるラジカルによるラジカル消去活性
ラジカル消去活性の消去活性の比較に準じて測定した。20nMのβ-phycoerythrin(75mM リン酸緩衝液 pH7.0)を 170μl、96図２に、各試料の DPPH ラジカル消去活性の分布を示した。

穴プレートに分注し、各抽出液を 100 倍に希釈して 10μl 添

全体的に、熱水抽出物の方がエタノール抽出物よりも活性が加した。対照として、0.1mM の Trolox を添加した。37℃にて高いが、これは総ポリフェノール含量が高いためと考えられ30 分間静置後、0.3M AAPH を 20μl 加え、2 分置きに 80 分間る。約２５０点のサンプルを測定したが、その中で活性の低16

糖化タンパク質生成抑制能の測定法の構築と機能性に優れた県産食品素材の検索
いサンプル（1mg 没食子酸相当量/g 以下）は熱水抽出物で３0.1mMTroloxを1としたときの抗酸化力割、エタノール抽出物で５割を占めており、活性の特に高い（10mg 没食子酸相当量/g 以上）サンプルは、抽出法によらず全体の１割に満たなかった。熱水抽出物では、ピペリカム、アロニア、西洋カンボク、ガマズミ、フサスグリ、カシス、カリン、青シソ、クロカワ、ナメコなどで高い活性を示した。
エタノール抽出物では、これらに加えてブルーベリー（ラビ2.52.01.51.00.50.00ットアイ）が高い活性を示した。ベリー類については高い活50100150200250

試料数性を示すものが多く見られた。ベリー類は総ポリフェノール

熱水抽出

エタノール抽出量も総じて高く、これが高いラジカル消去活性に寄与していると考えられる。

図３ ORAC 分布

図３に、各試料の ORAC を指標としたラジカル消去活性の分G-Rutin10mMを１としたときのグリケーション抑制能布を示した。既報１）では蛍光イメージアナライザーを用いたが、今回は蛍光プレートリーダーを用いて定量測定した。DPPH
ラジカル消去活性の高い試料は、ORAC でも高い値を示す傾向が見られた。上記以外の試料で高い活性を示したものは、ナ
ラタケ、バイアム、スピニチ、みず、あまちゃづる等であった。

3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.50.0

galic acid相当量(mg/g)

050

100150熱水抽出8060250

エタノール抽出図４ 糖化タンパク質（AGE）生成抑制能分布4020

表１ DPPH ラジカル消去活性の高い試料の AGE 生成抑制能

00

100

200

（熱水抽出物）300

試料数
熱水抽出 エタノール抽出

作物名

ＤＰＰＨラジカル消去活性（galic acid 相当量）

AGE 生成抑制能（G-Rutin10mM を１とした時のAGE 生成抑制率）

ピペリカム
アロニア
西洋カンボク
ガマズミ
フサスグリ
カシス
青シソ
カリン
ナメコ
イチゴ（女峰）リンゴ（さんさ）

26.0
21.2
17.7
16.3
13.7
13.2
12.8
12.7
11.7
6.6
5.0

2.91
0.91
1.01
1.56
0.18
2.410.42.840.00.380.81

図１ 総ポリフェノール含量分布35galic acid相当量(mg/ｇ）

200

試料数

100302520151050050100150200250

試料数
熱水抽出

３－３ 糖化タンパク
糖化タンパク質生成抑制活性タンパク質生成抑制活性エタノール抽出

糖化タンパク質（AGE）生成抑制活性は、既報１）では蛍光
図２ DPPH ラジカル消去活性分布（没食子酸相当）

強度測定法を用いて評価したが、今回は競合的 ELISA 法を用17

岩手県工業技術センター研究報告第１１号（２００４）いた。この方法では、試料が蛍光性を有する場合や逆に蛍光ルは AGE 生成抑制に有効な成分を明らかにするという点からを阻害する効果を有する場合でも測定結果に影響が出ないたも非常に興味深く、今後さらに検討をすすめる予定である。

め、蛍光強度測定法よりも優れた手法といえる。また、多試料を同時に測定可能なため、不特定多数の試料からのランダ

４ 結言

ムスクリーニングや、糖化抑制効果を有する試料（植物など）

岩手県内の農林水産物の有効利用のため、約 250 種の食品からの有効成分の精製に伴う分画サンプルの効果測定などに素材の機能性を評価した。１次スクリーニングとして、DPPH極めて有効であると考えられる。

ラジカル消去活性、oxygen radical absorbance capacity

図４に、各試料の糖化タンパク質生成抑制能の分布を示し(ORAC)、糖化タンパク質生成抑制能について評価し、どの評た。ラジカル消去活性の結果とは異なり、抽出法による分布価法でも高い活性を持つ食品素材が見つかった。今後は、培の差は見られなかった。また、データは示していないが、総養細胞を利用した評価系を用いて２次スクリーニングを行い、ポリフェノール量と AGE 生成抑制能に相関は認められなかっ機能性に優れた食品の開発を進める予定である。

た。以上の事より AGE 生成抑制効果を持つ成分には、ポリフまた、本研究の成果の一部をＨ１６年３月末に行われた盛ェノール類以外の物も含まれていると推測される。

岡地方特産小果樹検討会において報告した。

対照として用いた抗酸化性を有するＧ－ルチンは糖尿病の本研究を行うにあたり試料を提供していただいた、林業技病態として体内に蓄積する糖化タンパク質の生成を in vivo

術センター、農業研究センター、県北農業研究所、（株）長根5)で抑制すると報告されている 。10mM Ｇ－ルチンよりも高い商店の皆様に感謝いたします。

抑制活性を示した試料は、熱水抽出物ではピペリカム、カリ文ン、カシス、ガマズミ、西洋カンボク、エタノール抽出物で1)はカシス、カリン、アロニア、ブルーベリー（ラビットアイ）、献

小浜恵子、岸敦、米倉裕一、大澤純也、澤井秀幸、長澤

グーズベリーなどであった。

孝志：岩手県工業技術センター研究報告, 10, 77-80

AGE 生成過程の一部では、ラジカル消去により生成反応を阻(2003)
2)害すると言われている。そのため、ラジカル消去活性の高い

Takeda,M.,Ku,Y.,Suzuki,Y.and Kuroda,Y :Hepato-Gastroenterology 49.928-931(2002)

サンプルは高い AGE 生成抑制能が期待できる。表１に DPPH
3)

ラジカル消去活性の比較的高いサンプルの AGE 生成抑制能を

McLennan,S.V.,Martell,S.K.Y.and Yue,D.K:
DIABETES 51,2612-2618(2002)示した。AGE 生成抑制能の高い試料は、ラジカル消去活性も4)高い傾向にあった。しかし、フサスグリやナメコのようにそCao, G., Verdon, C. P., Wu, A. H. B., Wang,H.:
Clin. Chem., 41, 1738(1995)の逆は当てはまらないものもあった。また、リンゴ（さんさ）
5)のように、ラジカル消去活性は別段高いわけではないが、高い AGE 生成抑制能を示すものも見られた。このようなサンプ

Nagasawa,T., Tabata,N., Ito,Y., Aiba, Y., Nishizawa,
N. and Kitts,D.D: Mol. Cell. Biochem., 252, 141-147(2003)

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