最近のトピックス

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最 近 の ト ピ ッ ク ス【方法】

破骨細胞性骨吸収と血管内皮増殖因子
Osteoclastic Bone Resorption and
Vascular Endothelial Growth Factor

成熟破骨細胞による骨吸収活性は，まず7日齢の日本
白色ウサギの長管骨より未分画全骨細胞を調整し，コラー
ゲ ン ゲ ル 上 に 播 き ， 各 種 酵 素 処 理 （ pronase E,collagenaseなど）によって破骨細胞のみの細胞浮遊液

新潟大学歯学部歯科矯正学教室１
明海大学歯学部口腔解剖学第一講座２（純度95％以上）を調整した後，単離破骨細胞を象牙片

中川麻里１，羽毛田慈之２，久米川正好２，花田晃治１

上に播種し，VEGF165を添加した。そして任意時間培養

Department of Orthodontics,した後に形成された吸収窩の面積より算定した10）。また，

Faculty of Dentistry,Niigata University 1
First Department of Oral Anatomy,
Meikai University School of Dentistry2

Mari Nakagawa１，Yoshiyuki Hakeda２
Masayoshi Kumegawa２，Kooji Hanada１

この象牙片上の細胞を酒石酸耐性酸フォスファターゼ（TRAP）にて染色し，任意時間培養後の破骨細胞の生存を検討した。次に，成熟破骨細胞におけるVEGF受容体（Flt-1,KDR/Flk-1）の発現をRT-PCR分析，免疫染色およびwestern blot分析にて検討した。最後にVEGFの作用と破骨細胞内のチロシンキナーゼの活性化との関連【はじめに】性を抗フォスフォチロシン抗体を用いたwestern blot分
析およびチロシンキナーゼ阻害剤であるherbimycin A

骨組織のモデリング・リモデリングの過程において，を用いて検討した。

血管新生と骨・軟骨組織の吸収は欠くことが出来ない1）。
これまでに，組織学的に血管の侵入と破軟骨細胞及び破【結果】

骨細胞の出現が同時期に認められることより，これらは時を同じくして密接に関連していることが知られていVEGF165は直接成熟破骨細胞による骨吸収活性を促進る。さらに，この2つの事象は生理的な骨形態形成過程することが示され，この促進効果は濃度，及び処理時間のみならず，慢性関節リュウマチや癌の骨転移などの病に依存して有意に現れた。また，象牙片上の破骨細胞は態でも同様に認められる2,3）。そこで，血管新生と破軟骨

VEGF165を作用させることによって生存が高められるこ細胞及び破骨細胞による軟骨・骨組織の吸収活性を同時とが示された。（Fig.1.）成熟破骨細胞におけるVEGF受に促進する因子の存在が考えられる。

容体（Flt-1,KDR/Flk-1）の発現が遺伝子，及びタンパ血管内皮増殖因子（VEGF）は強力な血管新生因子の4）クレベルにて認められた。（Fig.2.3）最後にVEGF165を成ひとつである 。これまでに骨芽細胞や肥大化軟骨細胞

熟破骨細胞に作用させると破骨細胞内のチロシンキナーなどからも産生されることが知られており5,6），VEGFがゼ活性が促進することが示され，この促進効果はチロシ血管新生促進作用ばかりでなく，骨モデリング・リモデンキナーゼ阻害剤を作用させることによって，コントロリングにも関与している可能性が考えられる。また，ールと同等のレベルにまで抑制された。

VEGFは血管内皮細胞ばかりでなく，造血系幹細胞にも作用することが知られており，単球の走化作用があるこ【以上の結果より】

7,8）とが知られている 。更に最近になって，免疫組織学的手法により破軟骨細胞にVEGF受容体の発現が認められ血管新生促進因子であるVEGFが破骨細胞による骨吸ること，破骨細胞分化因子（ODF）とともに破骨細胞収活性を促進することが明らかになり，この促進効果に6,9）の分化を促進すること ，などが報告されている。しかは破骨細胞自身の生存が関与していることが示唆されし，成熟破骨細胞の機能に対するVEGFの作用は未だ不た。また，成熟破骨細胞には2つのVEGF受容体の発現明な点が多い。

が認められ，VEGFによる破骨細胞の骨吸収活性促進効

そこで，成熟破骨細胞に対するVEGFの直接的な作用

果はVEGF受容体（Flt-1もしくはKDR/Flk-1）を介したと成熟破骨細胞におけるVEGF受容体の発現についてin直接的な作用であり，破骨細胞内のチロシンキナーゼのvitroから検討したのでここに紹介する。

活性化によってもたらされることが示された。

−59−

232

新潟歯学会誌

30（2）
：2000

今回の検討において，成熟破骨細胞の単離は破骨細胞自身の強力な接着力を利用し，各種酵素処理にて破骨細inducedbyinsulin-likegrowthfactorI.Endocrinology, 137:2262-8, 1996.

胞以外の除去することで行った。得られた成熟破骨細胞６）Gerber HP, Vu TH, Ryan AM, Kowalski J, Werb

は骨髄間質細胞などの介在を必要とせずに，象牙片上でZ, Ferrara N.: VEGF couples hypertrophicの骨吸収活性が認められた。このように，成熟破骨細胞

cartilageのみを象牙片上で培養することによって，VEGFの破骨angiogenesis during endochondral bone細胞に対する直接的な作用，すなわち骨吸収活性促進作

remodeling,ossificationandformation.Nat.Med. ,5:623-8,1999.

用を示すことが可能になった。この破骨細胞の単離法お７）Hidaka M, Stanford WL, Bernstein A.:

よび骨吸収活性分析法はこれまでに不明な点が多かった

Conditional requirement for the Flk-1 receptor

破骨細胞の機能に及ぼす各種因子の直接的な作用を解明

in the in vitro generation of early hematopoieticcells.Proc. Natl .Acad. Sci. U S A. ,96:7370-5,1999.

する有効な分析法であることが示された。

８）Mitola S, Sozzani S, Luini W, Primo L, Borsatti A,
これまでに，in vivoにおける研究で，op/opマウスにWeich H, Bussolino F.: Tat-human immunodeficiency

おいてVEGFがFlt-1を介して破骨細胞の形成を促し，

virus-1 induces human monocyte chemotaxis by9）

VEGFがM-CSFの代替因子として作用する ，という報

activation of vascular endothelial growth factor

告や長管骨の成長板にFlt-1キメラタンパクを作用させreceptor-1.Blood,90:1365-72,1997.

ると石灰化軟骨組織への血管侵入が妨げられ，肥大化軟９）Niida S, Kaku M, Amano H, Yoshida H, Kataoka

骨組織は吸収されず一次海綿骨への置換が行われない6），

H, Nishikawa S, Tanne K, Maeda N, Nishikawaという報告がある。また，骨芽細胞や肥大化軟骨細胞がS, Kodama H.: Vascular endothelial growth

VEGFを産生することがこれまでにも知られており，骨factor can substitute for macrophage colony-芽細胞に関しては，骨吸収促進因子である活性型ビタミ

stimulating factor in the support of osteoclastic

ンD 3やプロスタグランジンE2を作用させると VEGFのbone resorption.J. Exp. Med. ,190:293-8,1999.

産生が促進することも知られている11,12）。これらの報告

10）Kakudo,S., Miyazawa,K., Kameda,T., Mano,H.,

からVEGFが骨形態形成において血管新生作用ばかりでMori,Y., Yuasa,T., Nakamaru,Y., Shiokawa,M.,なく，軟骨・骨組織吸収作用にも関与していることが示

Nagahira,K.,

唆されてきたが，今回のin vitroにおける研究において

Kumegawa, M.Isolation of haighly enriched

もVEGFが血管新生作用ばかりでなく，骨吸収活性促進rabbit osteoclasts from collagen gels:a new作用も合わせ持つことが示めされた。

assay system for bone-resorbing activity ofTokunaga,S.,

Hakeda,Y.andmature osteoclasts. J.Bone Miner. Metab.,14:129-

参考文献136,1996.
11）Wang DS, Miura M, Demura H, Sato K.

１）Baron, R.E.: Primer on the Metabolic Bone:Anabolic effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3 onDiseases and Disorders of Mineral Metabolism,osteoblasts

3rd edition.（Favus, M.J., Ed.）p.3-10, Lippincott-endothelial growth factor produced byRaven, New York, NY.,1996.

osteoblasts and by growth factors produced by２）Woodhouse, E.C., Chuaqui, R.F. and Liotta, L.A. :areenhanced

byvascularendothelial cells. Endocrinology. ,138:295362,1997.

Cancer 80（8 Suppl）, p.1529-1537,1997.
３）Paleolog E.M. :Angiogenesis: a critical process in12）Harada S, Nagy JA, Sullivan KA, Thomas KA,

the pathogenesis of RA--a role for VEGF?Br .J.

Endo N, Rodan GA, Rodan SB.:Induction ofRheumatol. ,35:917-9,1996.

vascular endothelial growth factor expression４）Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, Goeddel
DV, Ferrara N.: Vascular endothelial growthby prostaglandin E2 and E1 in osteoblasts.J.
Clin. Invest.,93:2490-6,1994.

factor is a secreted angiogenic mitogen.

【Figure legends】

Science,246:1306-9,1989.
５）Goad DL, Rubin J, Wang H, Tashjian AH Jr,
Patterson C.: Enhanced expression of vascularFig. 1. Dose- and time-dependent effect of VEGF on

endothelial growth factor in human SaOS-2

bone resorption byosteoblast-like cells and murine osteoblasts

mature osteoclasts（200 cells）were incubated with−60−

mature osteoclasts.

Isolated最近のトピックス

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various concentrations of VEGF for 24 h（A）, orKDR/flk-1 primers. The PCR products for Flt-1 andincubated without（open circle）or with VEGF（100KDR/flk-1 were 971 bp and 398 bp, respectively.

ng/ml, closed circle）for the indicated times（ B）

Fig. 3.

Then, the area of pits excavated by the isolated

mature osteoclasts. Rabbit unfractionated bone cells

osteoclasts were measured. The number of TRAP-

were immunostained with polyclonal rabbit anti-Flt-

positive osteoclasts on the dentine slices were1 IgG（A）, monoclonal mouse anti-KDR/flk-1 IgG（C）

counted, and the percentage to the number ofantibody, non-immune rabbit IgG（B）, or non-initially-seeded osteoclasts was indicated as survival

immune mouse IgG（D） Note that multinucleate

rate.

osteoclasts（arrows）were positively immunoreactive

The experiments were performed four times,

Expression of VEGF receptor proteins inand the values are means + SD for 5 cultures in afor two distinct receptors of VEGF.

representative experiment.

photograph indicates 100 μ m.（ E）, Western*P <0.01 vs. untreated

Bar in eachcells.

blotting analysis for VEGF receptors expressed onFig. 2. RT-PCR analysis for the expression of VEGF

mature osteoclasts.

receptors in mature osteoclasts.（A）, Equal amounts

extracted from HUVEC cells（lanes 1, 3）and isolated

Membrane proteins wereof total RNA from endothelial HUVEC cells, rabbit

mature osteoclasts（lanes 2, 4）, and used for Western（Rab.）
aorta, and isolated rabbit osteoclasts（Rab. OC）

blotting analysis of KDR/flk-1（lanes 1, 2）and Flt-1

were reverse-transcribed（RT , +）, or not（RT, −）,（lanes 3, 4） Arrows indicates immunoreactive

and then the samples were amplified with Flt-1 orbands for KDR/flk-1 and Flt-1, respectively.

Fig.1
＊＊，＊

p＜0.01＊p＜0.01

＊＊

＊＊
＊＊

100

＊

200

＊

＊

50
100

0001 10 25 50 100
VEGF（ng／ml）

Pit area（number of mesh／dentin slice）

300
Survival of osteoclasts（％）

Pit area（number of mesh／dentin slice）

300

VEGF（100ng／ml）

200

100

control

0024

48Time（h）

Fig.2

Fig.3−61−72