酵母 Cryptococcus humicola UJ1 由来 D‑アスパラギン酸酸化酵素の基質結合部位の解析
環境生物化学研究室
指導教官

丸山和大

山田 良平 , 解良 芳夫 , 高橋 祥司

１．背景と目的D-アスパラギン酸酸化酵素( D-aspartateoxidase 以下 DDO ) は、酸性 D-アミノ酸の① アライメント解析によってウシ腎 DDO酸化的脱アミノ反応を触媒し、対応するα-ケの R216 に対応する ChDDO の R230 のト酸とアンモニアに変換するフラビン酵素で残基が推定された( Fig. 1 )。

ある。DDO とは別に D-アミノ酸の酸化的脱アミノ反応を触媒する酵素に D-アミノ酸酸化
R230

酵素 ( D-amino acid oxidase 以下 DAO ) が

C.humicola
C.humicola DDOある。DAO は主に中性アミノ酸を基質とする。 Bovine DDO
現 在 DAO で は 、 Rhodotorula gracilis
DAO( 以下 RgDAO ) において結晶構造解析や、様々な変位導入実験が行われ、中性、塩基性 D-アミノ酸に対する基質特異性に関与

Human DDO‑
DDO‑1
Pig DAO
R.gracilis
R.gracilis DAO

221‑
221‑ APWMRAGFTRAPWMRAGFTRQVGSLGGGEGGTRQVGSLGGGEGGTRTYIIPRCNG ‑252
208‑
208‑ APWVKHFIRAPWVKHFIRDS‑‑‑‑‑‑‑‑‑
DS‑‑‑‑‑‑‑‑‑SGLT‑‑‑‑‑‑‑‑‑SGLTY
SGLTYIYPG‑IYPG‑VS ‑229
208‑
208‑ APWVEHFIRAPWVEHFIRDG‑‑‑‑‑‑‑‑‑
DG‑‑‑‑‑‑‑‑‑SGLT‑‑‑‑‑‑‑‑‑SGLTY
SGLTYIYPG‑IYPG‑TS ‑229
209‑
209‑ APWLKNFIITHDLERGI‑‑‑APWLKNFIITHDLERGI‑‑‑Y‑‑‑YNSPYNSPYIIPG‑IIPG‑LQ ‑236
206‑
206‑ SPCKRC‑‑‑‑‑‑‑SPCKRC‑‑‑‑‑‑‑T‑‑‑‑‑‑‑TMDSSDPASPAYDSSDPASPAYIIPRPGG ‑230

Fig. 1 ChDDO と他種 DAO , DDO との配列比較する残基は明らかにされつつある。それに対し、DDO では未だに結晶構造解析が行われておらず、さらに、変異導入による解析も行われていない。
本研究は Cryptococcus humicola UJ1 由来② 立体構造モデル上において、RgDAO のM213 に対応する ChDDO の R243 残基が推定された( Fig. 2 )。の DDO ( 以下 ChDDO )における基質特異性に関わる残基を特定しその役割を解析する。
Met260R243

２．基質特異性に関わる残基の推定
DAO と DDO は触媒残基の構造が類似してTyr245いると考えられ、さらに RgDAO については、基質特異性に M213 が関与しているとわかっArg306ている。また、RgDAO の結晶構造解析のデGly344ータから、ウシ腎 DDO の立体構造モデルが推定され、ウシ腎 DDO においては R216 が基質特異性に関与していると推定された。
これらの報告から、以下の方法によって
ChDDO 上の２つの残基が基質特異性に関与する残基の候補として推定された。

Fig. 2Gln348ChDDO の三次元モデル

３．R230A
R230A , R243A の作成
３．
Table 1

これらの推定から、ChDDO は塩基性アミ発現条件ノ酸である Arg 側鎖を使用し、酸性の D-アミ・ Medium : TBノ酸に対する特異性を発揮していると考えら

・ Temperature : 30°Cれる。そこで、推定した Arg を Site-directed

・ Induction time : 6 hmutagenesis により、中性アミノ酸である Ala・ Host strain : E. coli Rosetta (DE3)に置換することで、DDO 活性の消失や様々な性質変化が期待できる。それらを解析することで、推定された残基の役割を考察する。
Fig. 3 の様に R230 を Ala に置換した酵素を

５．R230A
５．R230A , R243A の精製

R230A、R243 を Ala に置換した酵素を R243A

誘導発現させた酵素を以下の方法で精製をとした。Wild-type と示すものはアミノ酸の行い、SDS-PAGE 上でほぼ単一に精製された置換を行っていない元々の酵素のことである。

ことが確認できた ( Fig.6 )

R243

R230

Wild-type 216‑‑ VVVVRAPWMRAGFTRVVVVRAPWMRAGFT R QVGSLGGGEGGTRQVGSLGGGEGGT R T YIIPRC‥‥‥YIIPRC ‥‥‥R230A 216‑‑ VVVVRAPWMRAGFTAVVVVRAPWMRAGFT A QVGS‥‥‥QVGS ‥‥‥

E. coli cell paste

SDS-PAGE of Purified Enzymes
MWildR230A

R243A

kDaSonication

97

R243A 216‑‑ VVVVRAPWMRAGFTRVVVVRAPWMRAGFT R QVGSLGGGEGGTAQVGSLGGGEGGT A TYIIPRC‥‥‥TYIIPRC ‥‥‥Fig. 3ChDDO の変異酵素の作成

Centrifugation

66

Metal Chelate Affinity
Chromatography

42

Gel Filtration
Chromatography

30

kDa
4443
kDa

M : Marker proteins

４．ChDDO
４．ChDDO , R230A , R243A の発現
前項で得た R230A , R243A の酵素は、Fig.6 ChDDO , R230A , R243A の精製方法とSDS-PAGE による確認

Fig. 4 に示すような発現用プラスミドとして構築され、Table 1 に示した条件によって発現された。

６．精製酵素の比活性の比較

Ⅲ
His-tag HindⅢ
AmproripECD25bpECDR230A
pECDR243A

ChDDO
geneNdeIT7 promoter

各精製酵素の比活性の比較を行った。
R230A は Wild-type 酵素の約 13 % の比活性を示し、R243A では比活性がかなり低かった。
( Fig. 7 ) 。

lacI

Fig. 4 発現用プラスミド→比活性の比較では、基質の結合では R243の残基が基質の結合に関わっていると言える。

DDO Specific activity
Specific( U/mg( U/mgactivityof protein) )120② 可視スペクトルの変化 ( Fig. 8 )

101.4

100

ChDDO はフラビン酵素であり、360 , 450

80nm のピークを持つ可視スペクトルを持つ。

60

Wild-type の場合、D-Asp を添加すると、触媒40

反応の進行と共に、そのピークは消失する。

2013.8

また、ChDDO に対する競合阻害剤であるマ0.050

R243A

ロン酸を添加すると、そのピークは長波長側各精製酵素の比活性の比較にシフトする ( Red-shift )。これらの傾向はWild

Fig. 7

R230A

R230A には見えたが、R243A においては、D-Asp の添加を行った後、ピークの消失にか７．特徴付けなりの時間を要した。また、R243A にマロン

① D-Asp に対する Km 値の比較 ( Table 2 )酸を添加した場合、Red-shift はほとんど起こ

D-Asp に対する親和性をあらわす Km 値は、らなかった。

Wild-type 酵素より、R230A、R243A では増→R243A においては、D-Asp は結合するが、加していた。さらに、R230A、R243A では正しく配位していないと考えられる。さらKm 値はほぼ同じ値であった。に、R243A はマロン酸には結合しない。

→Km 値の比較では、D-Asp の結合に対する親和性は R230A、R243A の双方ともに変わらない。

Table 2

D-Asp に対する酵素学的諸特性の比較

11k catk cat/K m-1( s ・M )Km( mM )V max( U /mg )2.9 ± 0.23

123.9 ± 3.00

82.6

28300

2.5 ± 0.26

104.0 ± 3.14

74.5

29922

R230A

13.4 ± 3.13

21.8 ± 3.08

15.61165

R243A

14.4 ± 3.55

0.1 ± 0.01

0.1

5Amino acid

(s )

-1-1

D-AspartateChDDO 2
Wild-type1

Means ± SE

2

E. coli Rosseta (DE3)/pECD5 より精製 Hisタグ非融合
タグ非融合 ChDDO
R243A については D-Glu、、 NMDA の値は活性が低かったため計測していない。

3D-Asp 添加時
W ild

0.120 m in
9 m in2 m in
25 m in

30 m in

60 m in

0.12

0.1
0.1

0.08

A bAbsorbances orb an ce

AbsorbanceA b s orb an ce

0.1

0.06
0.05

0.04

R 230A

0.08
0.06
0.05

0.04
0.02

0.020030030000
350350400400450450550000

35
3500

0 .1
0.1

0.08

Ab
s o rb a n c eAbsorbanceAbsorbanceA b s o rb a n c e

45 04505 00
5000.06
0 .0 50.040.02

335050400400450450300300350350

5500000 .10.10.06
0 .0 50.04

0 .0 50.04

335050400400450450550000

55505000
3300003350
50400400残基が基質の結合に関わっていると言える。
・可視スペクトル変化から、R230A に比べ、R243A は D-Asp の触媒に時間がかかることがわかる。さらに、マロン酸添加によるRed-shift が起こらないことから、R243Aはマロン酸が結合していない。
→D-アミノ酸に対する基質特異性に関与する残基は R243 の方である ( Fig. 9 )。

HOTyr245

・The function of Met260 is unknown.

CNH
Arg306

H3COO-HN

450450W Wavelengtha v elen g th ((nm)
nm )・比活性の比較では、基質の結合で R243 のH3+CNH
25550
500.06

８．まとめ

H2N550000

0.08

W Wavelengtha v elen g th ((nm)
nm )CH35550
50

R 243A

Fig. 8 各変位酵素の可視スペクトルの経時変化の比較

CH2 S

5500000.0200330000W Wavelengtha v elen g th ((nm)
nm )Met2604504500.12

R 230A

0.08

5550
50

400400

Wavele n gth ((nm)
nm )Wavelength

0.0200330000

0.05

0.04

5 50
5500.122 m in
6 0 m in

0 m in3 0 m in

40 0400

Abs o rb a n c eAbsorbance

W ild

0.06

WWavelengtha vele n gth (nm)( nm )

マ ロン酸 添 加時

0 .1
0.1

0.080030 03005550
50

R 243A

0.02

WWavelengtha vele n gth ((nm)
nm )

0.12

0.1
0.1

A bAbsorbances orb an ce

0.12

Arg243
R243

FAD

HN
NH OCCC CH2 CN
N
O++NH2O
O
H
N
NH
2CH23
H?
OO
H
NH2OCC
Gly344Gln348Fig. 9 D-Asp と ChDDO の結合モデル
R230は基質結合ポケッ
は基質結合ポケットの形成に間接的に関与か？