博士（ 医学）渡邊亜美
学 位 論 文 題 名/ヾ ー キ ッ ト リ ン パ 腫 細 胞 の 増 殖 、 生 存 に お け る
EBVの 役 割 に 関 す る 研 究
学 位 論 文 内 容 の 要旨

【背 景と 目的 】Epstein‑Barrvirus (EBV)はヘ ルペ スウ イル ス科 に属 する 2本鎖 DNAウイルスである。殆どの健常成人に無症候性に感染している普遍的なウイルスであるが、バーキ ットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、上 咽頭癌、胃癌、T/NKリンパ腫など様々な癌の発 症 に 関 与 す る と 考 え ら れ てい る。 EBV陽性 バー キ ット リン パ腫 (BL)はEBVの 潜 伏感染様式からニ種類のタイプに分けられる。ひとっはlatencyIと呼ばれるタイプで、BamHI
Qプ ロ モ ー タ ー よ り EBNA1タ ン パ ク 質 を 発 現 す る 。 も う ー っ は Wpプ ロ モ ー タ ー か ら
EBNA1、 EBNA3A， 3B， 3C、 欠損 型EBNA‑LP、BHR
F1を 発現 する W
p‑restri
cted latencyと呼 ばれ るタ イプ であ る。 両方 のタ イプ に共 通し て 発現 しているE
BNA1は、EBV
ゲノムの維 持に 必須 のウ イル スタ ンパ ク質である。近年、BL細胞の増殖や生 存にEBVが重要な役割を果たすことが報告されたが、その詳細なメカニズムについては未だ不明の点が少なくない。特に最近になってから同定されたWp‑restricted latencyを呈するB
Lについては不明 の点 が多 い。 本研 究は 、Wp‑restr
icte
d型 B
L細 胞の 生存において EBVがどのような役割を果たしているかを解明することを目的として行われた。ウイルスゲノム維持に必須の EBNA1の 機 能 を 抑 制 す る とい う方 法を 用い て、 Wp‑restrict
ed型BL細胞 株の P3HR‑1からEBV
ゲノムを脱落させ 、細胞の増殖や生存にどのような変化が起こるか解析した。さらに 、どの ウイ ルス 遺伝 子が 重要 な役 割を 果た すか につ いても検討を行った。
【 材 料 と 方 法 】 Wp‑restricted型 BL細 胞 株 P3HR‑1に お いて 、ド ミナ ント ネガ テ ィブEBNA1（ 以 下 dnEBNA1） を テ ト ラ サ イ ク リ ン 制 御 下 で コ ン デ ィ シ ョ ナ ル に 発 現 す る
P3HR‑1安 定 細 胞 株 (P3‑dnEBNA1） を 作 製 し た 。 dnEBNA1は 野 生 型 EBNA1機 能 を 阻 害する こと が報 告さ れて おり 、EBNA
1は E
BVゲノ ムの 維 持に 必須のタンパクであるため、dnEBNA1を発現 させることによってE
BVゲノ ムを細胞から脱落させることが可能となる。
P3‑dnEBNA1細 胞 に 、 Bcl― 2、 BHRF1を そ れ ぞ れ 外 来 性 に 強 制 発 現 さ せ た 細 胞 株
P3‑dnEBNAl‑Bc12、 P3― dnEBNAl‑BHRF1を 作 製 し た 。 ノ ック ダウ ン実 験は 、BHRF
1に対す るshR
NAとEGFPを 発 現す るOri
Pベ クタ ーを 細胞 に遺 伝子 導入 する こと によ り 行った。
【 結 果 】 P3‑dnEBNA1細 胞 を Dox存 在 下 で 培 養 す る と dnEBNA1の 発 現 は 認 め ら れ な かっ た が 、 Dox非 存 在 下 で 培 養 す る と dnEBNA1の 発 現 が 強 く誘 導さ れた 。dnE
BNA1発現によ って P
3HR―1細胞 内 のEBVゲ ノム 量は 進行 性に 減 少し た。 それ に伴 い、 E
BV遺 伝子― 488−

産 物の 発現 量 も著 明に 減少した。したがって、dnEBNA1を発現させることによって、期待通り にE
BVゲノムが脱落し、ウイ ルス遺伝子産物の発現も失われることが明らかになった 。次 に、 EBV
ゲ ノム の減少が細 胞にもたらす影響を検討するために、P3‑dnE
BN
A1細胞を Dox存 在 下 (dnEBNA1非 発 現 下 ） あ る い は Dox非 存 在 下 (dnEBNA1発 現 下 ） で 培 養
し て生 細胞 数 を計 測し た。dnE
BNA1を発現していない細胞では生細胞数は指数関数的に増 殖し たの に 対し 、dnE
BN
A1を発 現した細胞では生細胞数の増加が著しく抑制された。
さ らに 、dnEBN
A1発現 細胞 では アポ トー シ スが 誘導されてい た。すなわち、E
BV
ゲノム脱落に 伴って、P3H
R‑1細胞の増殖抑制およびアポトーシスが惹 起されることが明らかになった 。次に、E
BV
ゲノム脱落細胞 にみられる増殖抑制の主たる要因がアポトーシスによる もの であ る か検 討す るた めに 、dnE
BNA1をDox
制 御下で発現し、かつBclー2を強制発現させ た細胞株P3―dnE
BNA‑Bc12を 作製した。Bcl‑2の強制発現 でアポトーシスを阻止する こと によ っ て細 胞増 殖抑 制を 回避 させ られ るか 検討した。P3‑dnE
BNA‑Bc12においてdnEB
NA1を発 現さ せて EB
Vゲ ノム は脱 落さ せた とこ ろ、アポトーシス阻止とともに増殖抑制も ほぼ完全に回避された。したがってEBV，ゲノム脱落に伴う細胞増殖抑制の主因はアポトー シスであると考えられた。この結果を受けて、EBVがコードするBcト2ホモログであ る BHRF1に 着 目 し た 。 BHRF1を 外 来 性 に 過 剰 発 現 さ せ た P3‑dnEBNA‑BHRF1細 胞 株
を 作製 し、 dnE
BNA1を 発現させて E
BV
ゲノムを脱落させた。そ の結果、P3‑dnEBNA‑Bcl‑2と 同 様 に 、 P3‑dnEBNA‑B
HRF1に お いて もEBVゲ ノム 脱落 に伴 う アポ 卜ー シス と細 胞増
殖 抑 制 は ほ ぼ 完 全 に 阻 止さ れて いた 。さ らに 、BHRF
1に 対す るshRN
Aを 用い てP3H
R‑1
細 胞に おい て 内在 性に 発現 して いる B
HRF1をノ ック ダウ ンし た結 果、 P3HR‑1細胞に細胞 死が 誘導 さ れた 。以 上の結果から、P3HR‑1細胞の生存にお いてEBVが必須の役割を果た し て い る こ と 、 BHRF1が 生 存 因 子 と し て 機 能 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た 。
【 考 察 】 本 研 究 に よ り 、Wp‑restr
icted型 B
L細 胞株 P
3HR‑
1の 生存 にウ イル スBcl‑
2ホモ ログ BH
RF1が必 須で ある こと が判 明し た 。BHR
F1が外来性のアポトーシス誘導刺激に対する アポトーシス抵抗性を賦与することはこれまでにも報告されていたが、外来のアポト ーシ ス刺 激 のな ぃ至 適培養条件下においてBL細胞の生存に BHRF1が必須の役割を果たしてい ることを示したのは本研究が初めての報告である。BL細 胞ではc‑myc/l
g染色体転座によ るc‑myc
発現活性化によってアポトーシス感受性が亢進していると考えられている。
Bclー2とc‑myc
は 協調 して りン パ腫 発生 を 促進 することが知 られており、BHRFもc‑mycと 協調 的に 働 くこ とに よってW
p‑restricte
d型B
Lの発生に貢献しているものと考えられる 。本 研究 に より 、EBVゲ ノム を脱 落さ せ るこ とがWp‑restricted型BLの有効な治療法に なり うる こ とも 明ら かになった。今後、より実用的なEBNA1阻害分子が同定されて治療に応 用されることが期待される。
【 結 論 】 EBVは Wp‑restr
icted型 BL
細 胞株 P3
HR‑1の 生存 に必 須 であ るこ と、 さら に、EBVのコ ード する Bc
l‑2ホモ ログ B
HRF1が 生 存因 子と して 機能 して いる こと が明らかになった 。本研究結果から、BHRF1は アポトーシスを抑制することによってWp‑restricted型 BLの 発生 を 促進 する ことが示唆された。さらに本研究によ り、EBVゲノムを細胞から脱 落 さ せ る こ と が Wp‑restricted型 BLの 有 効 な 治 療法 にな り うる こと が示 され た。

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学位論文審査の要旨
主査 教授 志 田壽利
副査 教授 高 田賢藏
副 査 准教 授 演田 淳一
副査 教授 畠 山鎮次
副査 准教授 松本美佐子

学 位 論 文 題 名バー キット リンパ腫細胞の増殖、生存におけるEBVの 役 割 に 関 す る 研 究

Epstein―Barrvirus (EBV)はへルペスウイルス科に属する2本鎖DNAウイルスで、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌、胃癌、T/NKリンパ腫など様々な癌の発症に関与すると 考 え られ て い る 。EBV陽性 バ ー キッ ト リ ンパ 腫 (BL)は E
BVの 潜伏感染 様式から latencyIと
Wp―restricted latencyの二種類のタイプに分けられる。近年、BL細胞の増殖や生存にEBVが重要な役割を果たすことが報告されたが、その詳細なメカニズムにっいては未だ不明の点が多い。
本 研究は 、wp−restricted型B
L細胞の生存においてEBVがどのような役割を果たしているかを解明 するこ とを目的 として行われた。w
p一restricted型BL細胞株P
3H
R―1において、ドミナントネ
ガティブE
BNA1（以下dnEBNAl)をテトラサイクリン制御下でコンディショナルに発現するP3HR一1
安 定細胞 株(P3ーdnEBNAl)を作製 した。 dnEBNAlは野 生型EB
NA1機能を 阻害することが報告されて おり、 EBNA1はEBVゲノムの維持に必須のタンパクであるため、dnE
BNAlを発現させることによっ てEBVゲノムを 細胞から脱落させることが可能となる。まずdnEB
NAl発現によってP
3H
R―1細胞
内 のEB
Vゲノム量 が進行 性に減少 し、それ に伴い、EBV遺伝子産物の発現量も著明に減少することを確認した。次に、EBV
グノムの減少が細胞にもたらす影響を検討するために、P3―dnE
BNAl
細胞 をdnEB
NAl非発現下 あるい はdnE
BNAl発現下で 培養して 生細胞 数を計測 した。dnE
BNAlを発現し ていな い細胞で は生細胞数は指数関数的に増殖したのに対し、dnE
BNAlを発現した細胞では生細 胞数の 増加が著 しく抑制された。さらに、dnE
BNAl発現細胞ではアポトーシスが誘導されていた。すなわち、EBV
ゲノム脱落に伴って、P3HRー1細胞の増殖抑制およぴアポトーシスが惹起される ことが 明らかに なった。次に、EB
V
ゲノム脱落細胞にみられる増殖抑制の主たる要因がアポトー シスに よるもの である か検討す るために 、dn
E
BNAlをDox制御下で発現し、かつ抗アポトーシスタンパクBcl−2を強制発現させた細胞株P3−dnE
BNA−Bc12を作製した。P3―dnE
B
NA―Bc12においてdnEBNAlを 発現させ てEB
Vゲノムは 脱落さ せたところ、アポトーシス阻止とともに増殖抑制も‑490―

ほば完全に回 避された。したがってEBV
ゲ ノム脱落に伴う細胞増殖抑制の主因はアポ卜ーシスであると考えら れた。この結果を受けて、EBVがコードするBclー2ホモログであるBH
RF1に着目した。BH
RF1を外来性に過剰発現させたP3−dnE
BNA−B
HR
F1細胞株を作製し、dnE
B
NAlを発現させてEBV
ゲノムを脱落させた。その結果、P3ーdnE
B
N
A〜Bcl‑2と同様に、P3−dnE
B
N
A―B
H
R
F
1においてもE
B
V
ゲノム脱落に 伴うアポトーシスと細胞増殖抑制はほば完全に阻止されていた・。さらに、BH
R
F1に対するshRN
Aを用いてP3H
R―1細胞において内在性に発現しているBH
R
F1をノックダウンした結果、P3HR―1細胞に細胞死が誘導された。以上の結果から、P3HR
ー1細胞の生存においてEBVが必須の役割を果たして いること、BHR
F1が生存因子 として機能していることが明らかになった。本研究により、wp一restricted型BL細胞株P3H
R−1の生存にウイルスB
cl一2ホモログBHRF1が必須であることが判明した。
発表 後、 志田 壽利 教授 よ りEBV
陰 性BL細胞 と、今 回の実験に用いたE
BV
陽性BL細胞の生存におけるEBVの重要性の違いについての質問 があった。また、畠山鎮次教授よりBH
RF1がアポトーシスを阻害す るメカニズムについて質問があった。また演田淳一准教授より不死化B細胞とBL細胞の生存メカ ニズムの違いに関する質問があり、松本美佐子准教授よりB
H
R
F1の溶解感染時の役割に関する質 問があった。また高田賢藏教授よりB
Lの病因を解明するうえでの今後の展望についての質問があ った。申請者は質問に対し現在までに得られている実験結果をふまえ自身の考えと今後の展望を述べた。質疑に対する応答は概ね妥当だった。
この 論文 はwp型BL細胞 の 生存 にお ける E
BVの重要 性を初めて示し、BLの病因においてEBVが非常に重要で あることを強く示唆した点が高く評価される。今後B
Lの病因にっいての詳細が明らかにされること、またdn
EB
NAlを応用した治療法の開発が期待される。
審査員一 同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充分 な 資 格 を 有 す る も の と判 定し た。

― 491―