博 士 （水 産科 学）吉田夏子

学位論文題名
環境水中におけるコイヘルベスウイルス(KHV)の生 存性 お よ び抗 KHV物質産生 細菌を用 いた
魚類飼育排水の浄化に関する研究
学位論文内容の要旨
コイヘルペスウイルス(koiherpesvirus:KHV)
病は，コイCyprinuscarpioの稚魚から成魚にまで大量 死 を もた ら すウイ ルス感 染症であ る。日 本では2003
年 に茨城 県霞ケ浦 の養殖 コイにお いて本病が初め て発生 し，霞ケ 浦におけ るコイ 養殖は壊 減的な 打撃を受けた。一般に，感染症による大きな被 害 が 生じ る の は孵 化 場 ，種 苗 生 産施 設 ある いは養殖 場であ ることが 多いが， KHV病 は養殖魚のみ な ら ず天 然 魚 にも 猛 威 をふ る い ，甚 大 な被 害をもた らした 。K
HV
病 は現在わ が国に おいて持続的養殖 生産確 保法の特 定疾病に 指定さ れ，国内 防疫を 目的とした蔓延防止措置が取られている。
しか し な がら こ れ はKHV病発 生 後 もし く は 発 生が 疑 わ れた 場 合 にお い てのみ ，KHVを含む可 能性のあ る 飼 育水 の 流 出を 規 制 する に 過 ぎず ， 病気 の発生に 備え， 自然環境 中へのKHVの流 出を防ぐ
取り 組 み は未 だ 検 討さ れ て いな い 。 K
HV病 が養 殖環境の みなら ず自然環 境まで拡 大して いった背景として ，養殖 場からの 排水を通 してウ イルスが コイ生 息環境中に流出したことが疑われ，魚類飼育排 水 中 のウ イ ルスを 不活化 すること は本病 の拡大を 防ぐ上で 重要な 手段にな り得る ものと考 える。一般 に淡水 中の病原 体の感染 性を失 わせる方 法とし て紫外線やオゾンによる殺菌法が知られている が ， いず れ も コス ト の 面か ら 飼 育排 水 への 応用は困 難とさ れ，新た なK
HV
病 の防除 法の確立
が重 要 な 課題 と 言える 。そこ で本研究 ではI河川水 および湖 水中に おけるKH
Vの生 存性に着 目し，新 た な KHVの 防 除 法 に つ い て 検 討 を 行 い， 抗 KHV
物 質 産 生細 菌 を 用い た 魚 類飼 育 排 水処 理 モ デルを作製 し，そ のウイル ス不活化 能カに っいて検 討した 。
第 1章で は ， 環境 水 中 にお け る KHVの 生 存性 に つ いて 培 養 細胞 お よ びコイ を用い て検討し た。
培養 細 胞 を用 い た 検討 の 結 果， KHV
は 未 処 理の 環境水中 におい て不安定 で，1〜3日で不活 化し，検出 限 界 以下 と な った の に 対し ， 濾 過除 菌 処理 および高 圧滅菌 処理を施 した環境 水中で はK
HVは―1096―

比較的安定であることが示された。またコイを用いた検討において，KHV添加直後の環境水を用いて浸漬攻撃を行った区ではKHV病が発生したのに対しIKHV添加後3日間保持した環境水を用いて浸漬攻撃を行った区では病気は発生せず，死亡は見られなかった。以上の結果から，KHVは環境水中において1〜3日で感染性を失い，この現象には環境水中に存在している微生物が関与していることが示唆された。KHVが環境水中においてIt‑‑3日で不活化する現象を捉えたことはK
HV病の防除対策を進める上で大きな前進であり，環境水中でのウイルスの挙動を考慮に入れた防除対策の構築が期待される。すなわち，KHV病が発生した場合，その池からコイを全て取り除き3日以上放置した後に，KHVに感染履歴のないコイや，親魚選別およぴ卵消毒により作出されたKHVフリーの稚ゴイを新たに導入することで，その池をIくHVフリーにすることが可能と考える。この手法は，有機物により影響を受けることはなく，また消毒薬の使用時に懸念される自然環境への負
荷 も な く ， 消毒 薬の 使用 が困難 な池 など にお ける 防除 対策 とし て有 効で ある と考 える。
次いで第2章では第1章で用いた五稜郭公園の堀の水から抗KHV物質産生細菌の探索を行い，五稜郭公園の堀の水由来細菌132株から2株の抗KHV物質産生細菌を見出した。また，コイの腸内容物由来細菌374株中19株およびコイ飼育水由来細菌207株中5株においても抗KHV活性が見られた。これらの結果から，前章において示された，五稜郭公園の堀の水中でKHVが速やかに不活化された現象の裏付けが得られたものと考える。また，これらの抗KHV物質産生細菌が本研究の目的とする魚類飼育排水中のウイルスの不活化に有効活用できるのではないかと考えた。
そこで第3章では，抗KHV物質産生細菌を有効活用したカラム式の魚類飼育排水処理モデルを実験室レベルで作製し，そのウイルス不活化能カについて検討した。抗ウイルス物質産生細菌を固定化するためのろ材として，現在水産廃棄物として問題となっているヒトデの骨片を有効活用したろ材に着目した。ヒトデの骨片は多孔質の構造をとることが知られており，細菌付着性のろ材として応用出来ると考えた。ヒトデ骨片ろ材の細菌付着性について検討した結果，l09CFU/g程度の細菌が付着し，市販のろ材と同程度の能カを有していることが明らかになった。またヒトデ骨片ろ材
は，モデルを8日間連続的に運転した後もl08CFU/g程度の抗KHV物質産生細菌を保持していた。
次いで，抗KHV物質産生細菌を用いた試験区モデルと，細菌を用いていない対照区モデルを作製し，これらのモデルのウイルス不活化能カにっいて2つの条件下で検討した。設定条件2の対照区ではKHV病による死亡が発生し，累積死亡率は80％に及んだのに対し，試験区では死亡を抑制することができ，KHVがカラム中の抗KHV物質産生細菌によって不活化されることが示された。
しかしたがら，設定条件1の試験区では対照区と比較し，供試魚の死亡率の低下が見られたもののー1097−

死亡を完全に防ぐことはできず，このような条件下ではKHVが十分に不活化されない可能性が考えられた。そのため，本モデルの運転条件の詳細にっいては検討を重ねる必要があるが，本研究において見出された抗KHV物質産生細菌ならぴに本研究において作製した魚類飼育排水処理モデルは，ウイルスの不活化に有効であると考える。現在，ニシキゴイの養殖場では水質浄化を目的としたろ過装置が設置されており，本モデルをスケールアップし実際に養殖場に導入する際には，既設のろ過装置を応用できるのではないかと考える。本研究では無菌条件下でモデルを運転し，単一の抗KHV物質産生細菌によるウイルス不活化効果を検討しているため，養殖場のろ過装置に抗KHV物質産生細菌を導入した際の，他の細菌との競合やその時のウイルス不活化能カなどについて検討する必要があると考える。
以上、本研究では環境水中におけるKHVの生存性を明らかにし，抗KHV物質産生細菌を用いた魚類飼育排水処理モデルを作製してその有用性を示した。本研究で確立した，抗KHV物質産生細菌を応用した魚類飼育排水処理モデルには，運転条件の詳細設定やスケールアップ後の検討など解消しなければならない課題も残されているが，効果的な魚類飼育排水中のウイルス不活化法が限られる中，抗KHV物質産生細菌は新たなウイルス病の防除対策として有効な手段となり得るものと考える。今後，コイのように天然水域にも広く生息する魚種の増養殖において，魚類飼育排水中のウイルスの不活化の重要性が広く認識され，本研究において確立した手法が既知の魚類感染症の防除・防疫対策と共にKHV病の防除にっながることを確信する。

ー 1098ー学位論文審査の要旨
主副副副査
査
査
査

教
教
教助

授
授
授
教

吉都澤笠水守木彰
辺 靖 雄井 智 会
久

学 位 論文題名

環境水中におけるコイヘルベスウイルス(KHV)の生 存 性 およ び 抗KHV物質 産生細菌 を用いた魚類飼育排水の浄化に関する研究
コ イヘルペ スウイ ルス(koiherpesvirus:KHV)
病は，コイCy
prinu
scarpioの稚魚から成魚にまで大 量 死 をも たらすウ イルス 感染症で ある。 本病は1998
年 にアメ リカ合衆 国およ ぴイスラ エルで 観賞 用のニシ キゴイ に初めて 発生し ，以降， ヨーロッ パや東南アジアを中心にまたたく間に世界中に伝 播 し ，各 地に甚大 な産業 被害をも たらし た。日本 では2003
年 に茨城県 霞ケ浦 の養殖コ イにお いて 本病が初 めて発 生し，霞 ケ浦に おけるコ イ養殖は 壊減的な打撃を受けた。一般に，感染症により
大 き な 被害 が 生 じる の は 孵化 場 ， 種苗 生産施 設あるい は養殖 場である ことが 多いが， KHV
病は 養殖 魚のみな らず天 然魚にも 猛威を ふるい， 甚大な被 害をもたらした。この背景として，養殖場からの 排水を通 してウ イルスが コイ生 息環境中 に流出し たことが疑われており，魚類飼育排水中のウイル スを不活 化する ことは本 病の拡 大を防ぐ 上で重要 な手段になり得るものと考えられる。しかし，
現 在 の とこ ろ ， KHV病 の発 生 が 疑わ れ た場合 において のみ， ウイルス が含ま れている 可能性の ある 飼 育 水を 環境中に 排出し ないよう にする 指導が全 国のコ イ養殖場 およびコ イ飼育 者に対し て行
わ れ て いる に 過 ぎな く ， 病気 が 発 生し た際に 備え，周 辺水域 へのKH
Vの流出 を防ぐよ うな取り 組
み はなされ ていな ぃ。一般 に淡水 中の病原 体の感染 性を失わせる方法として，紫外線やオゾンによる 殺菌法が 知られ ているが ，いず れもコス トの面か ら飼育 排水への 応用は 困難とされ，新たなKHV
病 の防除法 の確立 が重要な 課題と 言える。
本 研究 で は ，河 川 水 およ び 湖 水中 に お け るKHVの生 存 性 に着 目し ，KHVの不活化 に細菌が 関与‑1099―し てい たことから，これら細菌のKHV防除への応用について検討を行い，抗KHV物質産生細菌を用いた魚類飼育排水処理モデルを作製し，そのウイルス不活化能カについて検討した。本研究の審査要旨は以下の通りである。
1．培養細胞を評価系として用い，KHVが未処理の環境水中において不安定で，1〜3日で検出限界以下となるのに対し，濾過除菌処理および高圧滅菌処理した環境水中では比較的安定であることを示した。また，コイを評価系として用いた場合でも，KHV添加直後の環境水に暴露したコイにはKHV病が発生するのに対し，KHV添加後3日間保持した環境水に暴露したコイには病気は発生しなぃことを示した。以上から，KHVは環境水中において1‑‑3日で感染性を失い，これに環境水中に存在している微生物，中でも細菌が大きく関与することを明らかにした。また，この結果を考慮に入れた防除対策として，汚染地域と非汚染地域のゾーニングを行い，上流からの浄化法を提言した。
2．供試細菌の菌体外産生物質，即ち，培養ろ過液を対象としたスクリーニングを行い，自然環境水由来細菌132株から2株，コイの腸内容物由来細菌374株から19株およびコイ飼育水由来細菌207株から5株の抗KHV物質産生細菌を見出した。さらに，供試細菌について属レベルの同定を行い，抗KHV物質産生細菌は淡水魚の腸内およぴ河川・湖沼の主要な細菌叢を構成することが知られているAeromo
nas属船よびP
seudomonas属の細菌から多く見出され，魚類生息環境水中や腸内に広く存在する可能性があることを示した。
3．抗KHV物質産生細菌を用いたカラム式の魚類飼育排水処理モデルを作製した。細菌を固定化するための細菌付着用ろ材として，現在水産廃棄物として問題となっているヒトデの骨片に着目し，ヒトデ骨片が市販の細菌付着用ろ材と同程度の性能を有し，モデル中においても細菌をよく保持することから，モデルヘ応用できることを示した。さらに，抗KHV物質産生細菌を用いた試験区モデルと，細菌を用いていない対照区モデルを作製し，これらのモデルのウイルス不活化能カについて検討を行い，コイを用いた評価系において試験区モデルに発症・死亡が認められなかったことから，カラム式の魚類飼育排水処理モデルによりKHVを不活化することができた。
養鯉場の飼育水浄化装置や排水処理装置に，抗KHV物質産生細菌を導入した際の，他の細菌との競合やウイルス不活化能カなどについて検討する必要があるものの、抗KHV物質産生細菌が飼育排水中のKHVの不活化に応用できることを示した。
以上、本研究の成果は，環境水中のKHVの生存性を明らかにし，効果的な手法が限られている魚類飼育排水中のウイルスの不活化に，抗ウイルス活性を有する細菌の利用が可能であることを示―1100−

した もので あり，本 法は環 境に優し い水処理 方法としてその応用が期待される。これらの成果は水産科 学に寄 与すると ころ大 と考え、 審査員一 同は申請者が博士（水産科学）の学位を授与される資格の あるも のと判定 した。

― 1101―