博士（医学）横尾英樹
学位論文題名Proteomic Signature Corresponding toAlpha Fetoprotein Expre
ss10ninLi
VerCanCerCe11S(AFP産生 肝癌細胞株 に特徴的なタンパク質プロフんイルの解析）

学位論文内容の要旨【 緒 言 】a‑フ ェト プ ロ テイ ン （ 以 下AFP)
は 195
6年 Be
rg8t
randに よ ル ヒ ト胎児の 血清
中 に見いだ された 分子量67kDaの糖タン パクで 後に肝細胞癌において再生産されることが発見されて以来、肝細胞癌の腫瘍マーカーとして広く普及している。一方、こうした診断学的マーカー以外に腫瘍径、分化度、門脈侵襲の有無など肝細胞癌の悪性度とも関連する ことが報 告され ている。従ってA
FPが産生されることで変化が起きるタンパク質に着目す ることで これら の事象を 説明す ることが できる 可能性があると考えられることから、
AFP産生肝 癌細胞 株からタ ンパク 質を抽出 、2次 元電気泳動法に展開し統計学的手法を用い てAFPと 連動す る特徴的 なタン パク質ス ポット の同定を 試みた。 その結 果、11個のタンパク質スポットが同定でき、それらは質量分析器にて全て特定可能であった。機能別にはアポトーシス、細胞骨格、翻訳、糖代謝に関連するものに分けられ従来より悪性度との関係が示唆されているものも含まれていることが判明した。【材料および方法】（材料）◎衄 ｜ P産 生 肝 癌 細 胞 株(JHH‑5， H
uH‑1， PLC/PRIJ
5， He
p3B，HT17， JHH‑7， H
uHー 7，HepG
2，Li‑7，KIM‑1，KYN‑2)◎A
FP
非 産生肝 癌細胞株 (HLE，JHH‑
6，Sk‑Hep‑l，JH
H‑4，HLFRBE，SSP‑25，KY
N‑
3，PH5‑
CH，PH5‑T)（方法） ＠肝癌 細胞株の w
e8tern blotting：
肝 癌 細 胞 株 の AFP発 現 を 確 認 す る た め 、 30pgの 抽 出 タ ン パ ク を AFP抗 体 を 用 い て
we8t
ernblottingを施行 ◎抽出タ ンパクの 螢光色 素ラベリング：肝癌細胞株から抽出しImgImの 濃 度 に 調 整 し た s
ampl
eを cy
5の 蛍 光色 素 で ラ ベリ ン グ 、全 8am
pleをmixtu珊
し1mg′1mに濃度調整したものをcy3の蛍光色素でラベリングした。◎二次元電気泳動法：
一 次元日の タンパ ク分離と して固 定化pH
勾配 等電点 電気泳動 （24c血pIrange3‐10）を行 っ た 。そ れ を SDSPA（迥を用 いて17W15時間の 条件で二 次元に 展開しタ ンパク 分離を行 った。二 次元電 気泳動後 、スキ ャナで各 スポッ トを読み取りcy5をcy3で補正した。＠
機械学習法と多変量解析：80％以上再現性のある1334スポットを解析対象とした。機械学
習 法の統計 学的手 法を用い 、16細胞 株をAFP産生群 と非産生 群に分 けること のできる特徴的なタンパクスポットの同定を試みた。さらに選び出されたタンパクスポットで階層的
ク ラスタリ ング、 主成分分析を行った。残り5細胞株を使ってタンパクスポットを評価した 。◎質量 分析に よるタンパク質の同定：各肝癌細胞株から抽出したタンパクを500pgにー 262ー

調 整し 二次元電気泳動 に展開しSYPRO Rubyで染色。スキャン後スポットランキ ングで選ぱ れ た ス ポ ッ ト を 切 り 出 し ゲ ル 内 消 化 で ペ プ チ ド に 分 解 、 MALDI‑TOF‑MASS法 とSw
嵒8．Prot
データベースを用い てタンパク質を同定した。【結果】＠肝癌細胞株のAFP
発
現 ：21種 類の 肝癌 細胞 株の うち n
種 類 がAFP
産 生肝 癌細 胞株 であることが判明 した。◎
二 次元 電 気泳 動： 約2000の タン パクスポットが得 られ、げ3イメージで80％以 上再現性の ある 133
4ス ポッ トを 解析 対象 とした。これらの 中にはAFPのスポットは認め られなかっ た。 ◎ 多変 量解 析に よる A
FP産生 群に特徴的なタンパクスポットの同定：1334のタンパ クス ポットの濃度を 数値化し、機械学習法による多変量解析を行うと100％AFP産生群と非 産生群に分けられることがわかった。また、2群を分けることが出来る特徴的なタンパ
ク スポ ッ トは n個 であ った 。こ のn個 のタ ンパ クス ポッ トの 情報を用いて階層 的クラス
タリ ング、主成分分析を行うとやはり2群のグループに分けることが出来た。さらに分類の 構 築に 用 いな かっ た5細胞 株は n個の タン パク スポ ット で正 しく 分 類で きた 。＠ n
個のタ ンパクスポットの同定：質量分析器にて全て同定でき、機能別には糖代謝に関わるもの が4、 アポトーシスに関わるものが4、細胞骨格に関わるもの2、翻訳に関わるもの1であっ た。【考察】AFPは診断的腫瘍マーカー以外に腫瘍径、分化度、門脈侵襲の有無など肝細胞 癌の悪性度とも関連することが報告されている。しかしながらその機序は十分に解明さ れて い なぃ 。今 回、 AFPと連 動す る タン パク 質が n個 であ ることが判明し、 その中で糖 代謝 に関わるものが 4個あったが1個を除いて虹甲産生群で発現が高かった。 低分化癌
では AFPが産生されているものが 多いが、糖代謝が亢進しているとの報告がありこれらを反映 しているものと考えられた。アポトーシス関連ではAFP産生群において高発現しているも のと低発現しているものがあり、一定した傾向は見られなかった。悪性度の高い腫瘍では 抗アポトーシス作用の傾向が強いとの報告が多いが、AFPを産生しているもので悪性度の 低いものも存在することからアポトーシス関連タンパクの発現の差があっても矛盾しな い結 果と思われた。 また、今回アポトーシス促進と細胞分化に関わるタンパ クである
Galect血1がAFP産生肝 癌細胞株において低発現している結果が得られた。今ま でに肝癌との 関わりでの報告はなぃが、悪性度の高いものや低分化癌 でAFPが産生されているものが多 いことを考えると興味深い。AF
Pに関連するタンパクを同定出来たことで悪性度との関連 を説明することが出来たばかりでなくさらにそのタンパクの機能を追究することによっ て 新 し い 肝 癌 の bi010釘 の 発 見 に っ な が る 可 能 性 が あ る と 考 え ら れ た 。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 藤 堂
省

学位論文題名Proteomic Si
gnat
ureCor
res
pond
ingto
Alpha Fetoprotein Express10ninLiVerCanCerCe11S（AFP産生肝癌細胞株に特徴的なタンパク質プロフんイルの解析）

a‑フ ェ ト プロ テ イ ン（ 以 下 AFP)は1956年Bergstrandに よルヒト 胎児の 血清中に 見いだ された分 子量67 k
Daの 糖夕ンバ クで後 に肝細胞 癌にお いて再生 産されることが発見されて以来、肝細胞癌の腫瘍マーカーとして広く普及している。一方、こうした診断学的マーカー以外に腫瘍径、分化度、門脈侵襲の有無など肝細胞癌の悪性度とも関連することが報告
さ れている 。しか し、AFPと悪性度 との関 係は十分 解明さ れていな い。AF
Pと関連するタンパク質の存在について未だ報告はなく、関連夕ンバクを調べることで悪性度と関係する候補夕ンパク質を同定出来る可能性がある。
肝 癌細胞株 のAF
P発現を確 認する ため、AFP抗体を用いてw
esternblottingを施行。A
FP産 生 肝 癌細 胞 株 (JHH‑5， Hu
H‑l，PLC/PRI
丿5，Hep3B，HT‑17，JHH‑7，HuH‑7，HepG2，Li‑7，KIM‑1，KYN‑2)、AFP
非 産生肝 癌細胞株 (HLE，JHH‑6，Sk‑H
ep‑l，JHH‑4，HLFRBE，SSP‑25， K
YN‑3， PH5‑CH，PH5‑T)に 分 類できた 。肝癌 細胞株か ら抽出し たsampleをcy5の 螢光色素 でラベ リング、全sampleをmixture
したものをcy3の螢光色素でラベリングし、両者混合したものを二次元電気泳動に展開した。二次元電気泳動後、スキャナで各スポットを 読み取り cy5をcy3で補 正した。 80％以上 再現性の ある1334ス ポット を解析対象とし、機 械学習法 の統計 学的手法 を用い、 16細胞株 をAFP産生群と非産生群に分けることのできる特徴的なタンパクスポットの同定を試みた。機械学習法による多変量解析を行うと100％
AFP産生群 と非産 生群に分けられることがわかった。また、2群を分けることが出来る特徴的 なタンパ クスポ ットは11個であった。この11個のタンバクスポットの情報を用いて階層的クラスタリング、主成分分析を行うとやはり2群のグループに分けることが出来た。さらに 分類の構 築に用 いなかっ た5細 胞株は 11個のタンバクスポットで正しく分類できた。これ らの11個の タンバ ク質は質量分析器にて全て同定でき、機能別には糖代謝に関わるもの
が4、ア ポトーシ スに関 わるもの が4、細胞骨 格に関わ るもの 2、翻 訳に関わるもの1であっ た。夕ン パクレ ベルでの 網羅的解 析方法 を示したばかりでなくAFPに関連するタンバクを同定出来たことでそのタンパクの機能を追究することによって新しい肝癌のbiologyの発見にっながる可能性がある。
公開発表後、副査の畠山教授より1）同定したタンバク質のwesternblot
での確認、2）同定さ れたタン パクが A
FPの変動で変化が起きるかについての質問があった。それに対して1）
発 現量をwestern
では 確認して いない が、二次 元上で 確認して いること 。2）RN
Aiなどの― 264 ‑手法を用いないと確認できない、などの回答があった。また、主査の浅香教授から1）胎児抗原な の で 胎 児で も 同 じよ う な 結果 が 得 られ る か 2） 予 後 に影 響 するのは A
FPか、 AFP
関連夕ン パクか3）アル ブミン 産生との 関係に ついての 質問が あった。それに対して1）同じよう な結果が 得られ る可能性 2）こ の実験 系からは 判断不 能3） アルブミンのスポット発現量 との比較 検討必要、との回答があった。藤堂教授からは1）複数のAFP
抗体での確認の有無 、2)AFPmR
NA陰性症例 の存在の 理由、 ついての 質問が あった。それに対して、1）
単一の A
FP
抗体 のみ使 用2） 転写因子 、並び にプロモ ーター 領域の変異により発現しなくなった可能性、との回答がなされた。
この論 文はAF
P産生肝 癌細胞株 と非産生 細胞株とを分ける特徴的なタンパク質が存在することを二次元電気泳動法で初めて示した論文であり、この方法論で臨床検体への応用も期待される。
審査員 一同は、 これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

− 265ー