Ciconia (福井県自然保護センター研究報告)

11:47−51 (2006)

トノサマガエル(Rana nigromaculata)とダルマガエル(Rana porosa brevipoda)水晶体に発現する構造タンパク質：クリスタリンの比較−γ27による両種の識別法−
藤井豊1,2,3

木元久4

川内一憲1,5

長谷川

巌1,2,6

はじめにnigromaculata)である. トノサマガエルはダルマガ

眼は外界からくる可視光を検出する器官である.

エル(Rana porosa brevipoda)とともにアカガエル科

ヒトのような動物の眼では, 光は角膜, 前房をとお(Ranidae) に分類されている (前田・松井 1989).

り, レンズである水晶体に達する. その後硝子体をこれらのカエルには種特異的クリスタリンとしてρ-通過して網膜で結像し視覚として認知される. 光のクリスタリンが多量に発現しており, 水晶体タンパ屈折の大部分は角膜が担当するが, 水晶体は映像がク質の約20%を占めている (Fujii et al. 1990). ト

網膜にうまく結像するよう微調整の役割を果たしてノサマガエルは, 明るい背中線を有し, 背中の黒色いる. 網膜に到達する光量が減衰しないよう, 角膜,斑紋は融合しているが, 腹部は白く黒色斑紋はない｡

水晶体および硝子体は無色透明でなければならない.

他方, ダルマガエルは, 背中線を持たず､ 背中の黒水晶体は, 60%が水で, 残りの40%がごく限られた

色斑文は独立して大きく､ 腹部には雲状あるいは点種類のタンパク質でできている非常に特殊な組織で状の黒色斑紋がある｡ 典型的な場合には, 両種を識ある.

別することはさほど難しくはない. しかし, 川内ら

水晶体のタンパク質は構造タンパク質として知らの報告にあるように, 福井県では両者の中間的な形れクリスタリンと呼ばれている. 脊椎動物では, α-質をもつ個体：高田型トノサマガエルがかなり生息

クリスタリン, β-クリスタリンおよびγ-クリスタ

している (藤井ら 2004, 川内ら 2003, 2006). こリンが共通のクリスタリン (α-, β-, γ-ファミリー)の中間種の同定には, ミトコンドリア遺伝子の解析として多量に発現している. 脊椎動物での共通のクが決定的な検証法となるが, この方法は高価であり,リスタリンの他に, 脊椎および無脊椎動物では種にまた, 時間もかかる (藤井ら 2004). 今回, γ-ク特異的なクリスタリンとして, アヒルのε-クリスリスタリンファミリの構成タンパク質を比較するとタリン, ニワトリのδ-クリスタリン, カメのτ-クいう迅速で安価な方法が両種の識別に有効であるこ

リスタリンおよびイカのＳ-クリスタリンなどが知とを発見したので報告する.

られ, これらを種特異的クリスタリンと呼んでいる調査地と方法(Wistow and Piatigorsky 1988). このことから,Fujiiらは, 種特異的クリスタリンによって, 生物種

１) カエルの捕獲地点と計測 (川内ら 2006)の分類が可能になると提唱している (Fujii et al.

トノサマガエルは, 三方町黒田(K1:♀, 体長83㎜,2001). また, 共通のクリスタリンであっても, そ体重59.3g)および三方町中山(N1:♂, 体長56㎜, 体のファミリーの構成タンパク質を詳しく同定すれば,

重16.9g), (N2:♂, 体長59㎜, 体重18.8g), (N3:♂,

さらに詳細な分類が可能になるものと考えられてい体長48㎜, 体重11.2g), (N6:♂, 体長41㎜, 体重5.9る.

g)の5個体, 高田型トノサマガエルは, 織田町細野

日本を代表するカエルはトノサマガエル(Rana
1.福井爬虫両生類研究会(A1: ♀, 体長58㎜, 体重14.2g), 福井市田ノ頭(C2:2.福井陸水生物研究会

3.福井大学医学部生命情報医科学講座分子生命化学領域 (吉田郡永平寺町松岡下合月23-3)
4.福井県立大学生物資源学部生物資料学科応用微生物学研究室 (吉田郡永平寺町松岡兼定島4-1-1)
5.あわら市御簾尾7-17

6.越前市葛岡町2-6― 47 ―♂, 体長63㎜, 体重24.6g),

江市中野(D1:♀, 体方法を用いた. この方法では, 試料タンパク質は,長40㎜, 体重5.3g)の3個体, ダルマガエルは, 三方通常それを構成している複数のサブユニットに解離

町黒田(K2:♂, 体長55㎜, 体重16.2g), (K3:♀, 体変性した状態で分析される. ゲル濃度は12.5%アク長63㎜, 体重23.9g), (K24:♂, 体長49㎜, 体重8.7g),リルアミド:ビスアクリルアミド(29.2:0.8)とした.

(K25:♀, 体長44㎜, 体重7.8g), (K26:♂, 体長410.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)存在下, 12.5%㎜, 体重6.0g), (K29:♂, 体長41㎜, 体重5.7g)およポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分び三方町田井(T13:♂, 体長42㎜, 体重6.0g)の7個離泳動されたゲル中のタンパク質は, Coomassie体をそれぞれ捕獲した.

Brilliant Blue R-250 (ナカライテスク社)で染色され た . 分 子 量 ス タ ン ダ ー ド は , Low Molecular２) 水晶体の摘出とクリスタリン溶液の調製

Weight Calibration Kit (phosphorylase b (97kDa),

水晶体レンズは, 角膜をメスで切開し眼球を軽くalbumin(66kDa),ovalbumin(45kDa),

carbonic圧迫すると飛び出してくる. 水晶体をピンセットで

anhydrase (30kDa), trypsin inhibitor (20.1kDa), α-摘出し重量を測定した. 摘出された水晶体は, そのlactalbumin (14.4kDa), Amersham社)を用い, 目的20倍量の20mMリン酸ナトリウム緩衝液, pH7.4, 含のタンパク質の分子量の算定に供した.

0.01%アジ化ナトリウムを用いて, 超音波ソニケー
ション処理されホモゲナイズされた. 12,000gで10６) アミノ酸配列分析

分間遠心してクリスタリンが溶けた上清を粗抽出画

試料タンパク質を12.5%ゲルSDS-PAGEにより分分として回収した. このときのタンパク質濃度は約離した後, ゲル中のタンパク質をPVDF膜(BioRad10mg/mlである.

社 ) に 電 気 的 に 転 写 し た . PVDF 膜 を Coomassie
Brilliant Blue R-250で染めた後, 目的のタンパク質３) ゲル濾過によるα-,β-,ρ-およびγ-クリスタリンファミリーの分離バンドを切り出し, プロテインシーケンサー(Procise, アプライドバイオシステムズ社)で分析しゲル濾過はBioAssist G3SWXLカラム (東ソー社)た.

を用い, 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液, pH7.4, 含結果と考察

0.01%アジ化ナトリウムを展開緩衝溶液として, 流速 0.5ml/min の 条 件 で 行 っ た . 粗 抽 出 画 分 (10mg

トノサマガエル, 高田型トノサマガエルおよびダをカラムに導入し, フラクションはルマガエル水晶体粗抽出画分のSDS-PAGEによる結20秒 (0.17ml) ずつ集めた. タンパク質の溶出パター

果を図1に示した. 36kDaの染色バンドは種特異的

ンは280nmの紫外線の吸収をモニターして求めた.

ρ-クリスタリンである. 20-30kDaの範囲にある染protein/ml)40

４) タンパク質濃度の測定
試料中のタンパク質濃度は色素結合法により求めた. 50

試料に250色素溶液(Coomassie Protein Assay Reagent, Pierce社)を加え, 室温で10分放置後, 630nmの可視光の吸収を, 405nmの吸収をサブトラ
クションレファレンスとして, マイクロプ
レートリーダーを用いて測定した. 牛血清
アルブミン10mg/ml溶液(Pierce社)を標準溶液として検量線を作成し, 試料のクリスタリンタンパク質濃度を算出した.
５) 変性タンパク質の電気泳動解析
試料タンパク質の電気泳動はレムリーの図1. 水晶体粗抽出画分の電気泳動とタンパク質染色― 48 ―色バンドは, 共通のクリスタリン:α-, β-, γ-クリ(藤井ら 2004) による結果と一致する.

スタリンファミリーのタンパク質バンド帯である.

上述の27kDaクリスタリンの同定を行うため, トトノサマガエルと高田型トノサマガエルの染色パターノサマガエル(K1)とダルマガエル(K3)の水晶体粗ンはほとんど同じである. しかし, ダルマガエルの抽出画分をゲル濾過により分析した. その結果を図

染色パターンをみると, 27kDaの付近にはバンドが2に示した. ゲル濾過では, 分子ふるいの効果によみられない. 即ち, トノサマガエルおよび高田型トり, 分子量の大きいものほど早くカラムから流出しノサマガエルには分子量27kDaのクリスタリンが発てくる. ゲル濾過による流出順位は, α-クリスタ現しているが, ダルマガエルではこのクリスタリンリンが最も早く, 次いでβ-クリスタリン, ρ-クリは発現していないことを示している. 従って, 27スタリンそして最後にγ-クリスタリンの順となる.

kDaのクリスタリンを発現しているカエルがトノサ

α-クリスタリンは, SDS-PAGEでみると分子量20マガエルであり, 発現していないのがダルマガエル

kDa前後の小さいサブユニットタンパク質に解離しと判定される. このことから, 高田型はトノサマガているが, 多数のサブユニット分子が複合体を形成エルと同種であると結論された. この判定は, 我々し巨大な会合体の形態をとるためゲル濾過では一番がすでに報告しているミトコンドリア遺伝子解析早く流出してくることになる. β-クリスタリンも会合体を形成している. 他方, ρ-クリスタリンとγ-クリスタリンはそのような会合体を形成することはなく, それ自身一つのサブユニット即ち単量体としてふるまっているため, 分子量がα-, βクリスタリン会合体よりも小さくなり流出は遅れてくる. 図2のトノサマガエル(K1)の結果を見ると, 27kDaクリスタリ
ンはγ-クリスタリン画分に検出された.
ダルマガエル(K3)ではこの位置にバンドは検出されていない. そこで, この27
kDaクリスタリンをPVDF膜に転写して,そのアミノ基末端からのアミノ酸配列をプロテインシーケンサーで分析した. その結果は, 1残基目:グリシン(Gly, G), 2残基目:リジン(Lys, K), 3残基目:イソロ
イシン(Ile, I), 4残基目: イソロイシン(Ile, I), 5残基目:フェニルアラニン(Phe,F), 6残基目:チロシン(Tyr, Y), 7残基目:グルタミン酸(Glu, E), 8残基目:アスパ
ラ ギ ン 酸 (Asp, D), 9 残 基 目 : リ ジ ン(Lys, K), 10残基目:アスパラギン(Asn,N), 11残基目: フェニルアラニン(Phe,F)と決定された. この11残基よりなる
ア ミ ノ 酸 配 列 G-K-I-I-F-Y-E-D-K-N-F を基に相同性検索を実施したところ, 魚類のγ-クリスタリンと高い相同性が確認された. そこで, この27kDaタンパク質

図2. BioAssist G3SWXLカラムによる水晶体粗抽出画分のゲル濾過とSDS-PAGEによるタンパク質染色― 49 ―をγ27と命名することにした.
以上より, γ27はトノサマガエルとダルマガエルの識別に有効な指標となることが立証さ

ル(Rana porosa brevipoda)のミトコンドリア・れた. SDS-PAGEにより迅速で安価な判定方法が確

シトクロムcオキシダーゼ・サブユニットI(COI)立された. 今後は, γ27の抗体を調製し, 抗原抗体遺伝子の比較. 福井陸水生物会報

反応を利用したより精度の高い判定法の開発が可能

川内一憲, 藤井豊, 木元久, 長谷川巌. 2003. 福井と思われる. 日本に生息する無尾両生類は, 現在５県にみられるトノサマガエル種族の多様性. 福科８属３４種５亜種に分類されている (前田・松井井大学医学部研究雑誌 4：81-85.

1989). 面白いことに, アマガエル科(Hylidae)のニ

川内一憲, 藤井豊, 木元久, 長谷川巌. 2006. 福井

ホンアマガエル(Hyla japonica)では, ρ-クリスタ

県における高田型トノサマガエルの出現頻度.

リンの代わりにζ-クリスタリンが発現している

Ciconia (福井県自然保護センター研究紀要)(Fujii et al. 2001). さらに, 硬骨魚類では新しいin press.

種特異的クリスタリン (藤井ら, 未発表) が発見さ

前田憲男, 松井正文. 1989. 日本カエル図鑑, 8-れている. このように, 今後も種を特定する新しい

9pp., 84-87pp., 92-95pp. 文一総合出版, 東京.

クリスタリンの発見が予想される, クリスタリンにG.J.

andPiatigorsky,

よる生物種の同定法は, これからの新しい生物分類

Crystallin:

theevolution

学の一つの手法として確立される可能性を持っていproteins for a highly specialized tissue.

る.

Rev. Biochem. 57:479-504.
要Wistow,

旨and1988.

Lens

expressionofAnnu.

キーワード

トノサマガエル水晶体には27kDa-γ-クリスタリ
ンタンパク質 (γ27) が発現している. γ27はダル

γ27, クリスタリン, 水晶体, ダルマガエル, トノサマガエル

マガエル水晶体には発現していない. ダルマガエルの形質の特徴をもつ高田型トノサマガエルの水晶体には, γ27のみならず他のクリスタリンもトノサマガエルと同じレベルで発現していた. このことから,高田型トノサマガエルはトノサマガエルと同種と結論された.
謝J..

辞原稿の校正を担当して頂いた福井大学の岡本先生に感謝致します｡
引用文献
Fujii, Y., Watanabe, K., Hayashi, H., Urade, Y.,
Kuramitsu, S., Kagamiyama, H. and Hayaishi,O.. 1990. Purification and Characterization of γCrystallin from Japanese Co㎜on Bullfrog Lens.
J. Biol. Chem. 265, 9914-23.
Fujii, Y., Kimoto, H., Ishikawa, K., Watanabe, K.,
Yokota, Y., Nakai, N. and Taketo, A.. 2001.
Taxon-specific ζ -Crystallin in Japanese Tree
Frog (Hyla Japonica) Lens. J. Biol. Chem. 276,28134-39.
藤井豊, 木元久, 川内一憲, 長谷川巌. 2004. トノ
サマガエル(Rana nigromaculata)とダルマガエ― 50 ―

Comparisation of Crystallin form Black-spotted pond frog (Rana nigromaculata)
and Daruma pond frog Rana porosa brevipoda.
Yutaka FUJII1,2,3 Hisashi KIMOTO4 Kazunori KAWAUCHI1,5 Iwao HASEGAWA1,2,6The 27kDa- γ -crystallin protein ( γ 27) was observed in crystallin lens of Black-spotted pond frog (Rananigromaculata), but not in Daruma pond frog (Rana porosa brevipoda). In the crystallin lens of Takada (tb) type
(R. nigromaculata) having the morphological character which closely resembled R. porosa brevipoda, not only
γ 27 but also other crystallin was observed as the same level as R. nigromaculata. From these results, weconcluded that the Takada (tb) type is classified into the same species as R. nigromaculata.

1. Fukui Reptiles and Amphibians Research Academy
2. Fukui Rikusui-Biology. Research Academy
3. University of Fukui Faculty of Medical Sciences, 23-3 Shimoaizuki, Matsuoka,eiheiji-cho, Yoshida-gun, Fukui 910-1193 JAPAN4. Fukui Prefectural University Faculty of Biotechnology, 4-1-1 Kenjojima,Matsuoka, eiheiji-cho, Yoshida-gun, Fukui 910-1195 JAPAN5. Misnoo7-17, Awara city, Fukui 919-0747
6. Kuzuoka-cho 2-6, Etizen city, Fukui 915-0041― 51 ―