表面科学 Vol. 31, No. 1, pp. 41-47, 2010

研究紹介

原子間力顕微鏡を用いた動的分子間力分光法―Biotin-Streptavidin 結合ポテンシャルの分離測定―
谷中

淳 1, 2・武内修 1, 2・重川秀実 1, 2

1

筑波大学大学院数理物質科学研究科 〠 305-8573
2
CREST JST 〠 305-8573

茨城県つくば市天王台 1-1-1
茨城県つくば市天王台 1-1-1（2009 年 7 月 8 日受理）

Site-selective Analysis of Biotin-Streptavidin Interactions
using Dynamic Force Spectroscopy
Atsushi TANINAKA 1, 2, Osamu TAKEUCHI 1, 2 and Hidemi SHIGEKAWA 1, 2
1Institute of Applied Physics, University of Tsukuba, 1-1-1 Tsukuba, Ibaraki 305-8573
2
CREST-JST, University of Tsukuba, 1-1-1 Tsukuba, Ibaraki 305-8573(Received July 8, 2009)

Probing the step-by-step bonding processes induced by the individual interactions in a molecular complex and theirvariation with the surrounding conditions is a key factor for enabling further advances in biophysics and chemistry andtheir applications. Here, we demonstrate a methodology that realizes the site-selective anatomy of molecular interactions
at the single-molecule level. With the combination of cross-linkers and the atomic force microscopy (AFM) that wedeveloped to enable a precise analysis by dynamic force spectroscopy (DFS), direct and bridged interactions at eachreaction site in a typical ligand-receptor system, streptavidin-biotin complex, were clearly distinguished and individually
analyzed for the first time, providing a greater understanding of step-by-step progress of the bonding process. Thismethodology will provide a foundation for further advances in biophysics and chemistry and their applications, such as
designing and controlling the mechanism of chemical reactions between functional molecules.
KEYWORDS : dynamic force spectroscopy, atomic force microscopy, molecular recognition, energy landscape,ligand-receptor

1．は

じ

め

性や限定性は，局所的な機能分子の性質や反応過程によにり決定されるため，これまでの巨視的な反応の描写でDNA や抗原抗体などの機能性分子を利用して分子デバイス構築などへの応用を目指す場合

1, 2)，相互認識により特異的な結合を形成する 2 分子間の相互作用を，溶は，機能性分子の局所的な相互作用を解明することは極めて困難で，単分子レベルでの解析が必要不可欠といえる。

液や温度など環境の変化に対して正しく理解することがこうした問題を解決する方法として動的分子間力分光

非常に重要である。しかし，一般に，相互作用ポテンシ法（Dynamic Force Spectroscopy : DFS）がある 3∼15)。DFS

ャルを記述するための実験手段としては熱力学的解析がは結合している分子に直接動的に力を印加して結合を破用いられてきた。熱力学は，物質の反応を律するエネル

断させ，そのときの破断力と力の印加速度（Loading

ギーや反応速度を巨視的に記述する場合，極めて有効でrate）の関係から分子間相互作用ポテンシャルを求める

あるが，機能性分子の複雑な構造から生じる反応の多様手法である。DFS は特定の 2 分子間相互作用ポテンシ
ャル曲線および 2 分子間結合寿命を導出可能である点が特に優れている。

42

表面科学

第 31 巻しかし，バイオメンブランフォースプローブを用いた

第1号(2010)から測った障壁位置，t 0 は結合寿命である。

4)

従来の DFS 測定 では，フォースプローブのバネ定数を

破断は確率的に起こるので，個々の障壁に対しては，

0.1-3.0 pN/nm と小さくできる点で優れている反面，サ以下のように破断の過程を統計的に扱うことにより破断

ンプリングレートが 1 kHz 程度と低いため，高速に分子の確率分布を得ることができる。時刻 t において分子がを引っ張るところでは正確な破断力を見積ることができ結合状態にある確率を S(t)とする。t＝0 において分子ない。また，装置が特殊で，温度変化や溶媒効果の測定

は結合状態にあるので，S(0)＝1 と表される。単位時間には不向きであるため，環境変化に伴うポテンシャル曲

あたりの S の減少を表すと，線の精密な測定・評価には不十分である。そこで，我々dS(t)＝−k →(f(t))S(t)dt

は，ま ず，原 子 間 力 顕 微 鏡（AFM）を 用 い て 精 密 に
DFS 測定を行うことが可能なシステムを開発した 3, 9)。

となる。式（ 2 ）を力のスケールに変更して

AFM は原子あるいは分子というスケールの空間分解能

d2 S
df 2

を持ち，印加する力を高精度で制御可能という利点があり 5∼9)，サンプリングレートも 100 kHz まで高めること

* ＝0
f＝f *

（3）

として積分すると，
f *＝k B T/x b(ln(r f)＋ln[` ln(k →)/`f−` ln(r f)/`f] f＝f *)ができる。また，温度変化や溶媒効果などの環境変化に（4）

よる局所的な相互作用変化を観察することも可能である。同システムの構築により，機能性分子の局所的な相（2）*

f は最頻破断力である。

互作用を評価することが可能になり，複数のポテンシャ

ここで，r f が一定の場合，` ln(k →)/`f＝1，` ln(r f)/`f＝0

ルを持つ分子を対象として詳細な解析が可能となった。

なので，最頻破断力 f * は式（ 5 ）に示すように力の印

本稿では，この装置を用いて，抗原抗体反応や分子マー

加速度（r 0＝df/dt）の対数と直線関係になる 9)。

カーとして有名な Streptavidin-Biotin 相互作用の DSF 解

f *＝k B T/x b{ln(r 0)＋ln(t 0 x b/k B T)}（5）

析を行い，Streptavidin と表面との化学結合の状態を操式（ 5 ）において，傾きはポテンシャル障壁の位置

作する新しい手法と組み合わせることで，複数のポテン

x b に依存しているので，力の印加速度 r 0 を変えて最頻

3)

シャルを分離して解析することを可能にした研究 につ破断力を求め，r 0 の対数に対してプロットすると，直線

いて紹介する。

の傾きからポテンシャル障壁の位置が求まることにな

2．実

る。

験

また，r 0 が一定の場合，式（ 2 ）は，AFM と DFS を組み合わせたシステムを構築するにあたり，DFS の理論を見直してみる 3, 4, 9∼15)。2 分子間の結合ポテンシャルは，機能性分子の複雑な立体構造に起因

dS(f)＝P(f)dt＝C exp{(f−f *)x b/k BT}exp[1−exp{(f−f *)x b/k BT}]したファンデルワールス力や静電気力，溶媒和の影響を（6）

強く受けることになるが，これらの影響を簡略化して，である。ここで，P (f)，f，f *，x b，k B，T および C はそれ

一次元の反応経路に，結合を破断させるのに必要な破断

ぞれ，破断頻度，破断力，最頻破断力，ポテンシャル障エネルギー障壁を一つ持つポテンシャルを考える。

壁位置，ボルツマン定数，温度および定数である。ポテ

結合した分子をそれぞれの側から引っ張り力を印加する。この時，外力によるポテンシャルの変化が主にエネ

ンシャル障壁を越えて起こる破断は，式（ 6 ）のように
最頻破断力 f * を中心とする確率分布で表される 9)。

ルギー障壁の高さを変化させ，ポテンシャル形状変化へ

AFM を用いて DFS 測定を行う場合，カンチレバーにの影響が小さいと仮定すると，印加した力のポテンシャ

分子鎖を修飾し，その分子鎖の先に測定対象とする機能

ルとの和によって分子間のポテンシャル曲線が変化する性分子を固定する必要がある。これは，タンパク質など（Fig. 1）。印加する力の増加速度（Loading Rate）が大きの分子では，カンチレバー先に直接分子を付けた場合，

くなるほど大きな力で破断が生じることになる。このと立体障害やカンチレバー先の質量などが問題になるから

き，破断する方向の反応速度は，である。しかし，分子鎖をカンチレバー先に修飾した場

1
exp(−E b(f)/k B T)
t0

合，分子を引っ張る際に分子鎖が伸びるため，力の印加

k →(f)＝＝

1exp(−(E b(0)−fx b)/k B T)
t0

速度 r 0 を一定に保つことが難しくなる 9∼15)。カンチレバ（1）

ここで，f は外力であり，x b は反応経路上で最安定位置

ーを分子から離す速度が一定では必ずしも r 0 一定を保証しないからである。式（ 5 ）および式（ 6 ）は，r 0 が一定であることを前提として導かれるため，印加する力

谷中

淳・武内

を制御して条件を満たす必要がある 3, 9)。我々は，AFM修・重川秀実43

トは 100 kHz が可能である。

にデジタル信号処理装置（DSP）を組み合わせ，計測さ試料は分子標識などに用いられ，ligant-receptor ではれた力をフィードバックし，力の印加速度 r 0 を高精度代表的な Streptavidin-Biotin 18, 19)を用いた。Streptavidin はに制御するよう装置を改良した 3, 9)。サンプリングレー

筒状の構造で，Streptavidin と Biotin は（ 1 ）アミノ酸
残基 ASP128 や TYR43 との水素結合で形成される一番内側にある結合サイト，（ 2 ）SER45 や THR90 との水素結合で形成される中間の結合サイト，および（ 3 ）ASN49 や SER88 との水素結合で形成する一番外側の結合サイトで結合している。内側にあるアミノ酸残基のASP128 から外側の SER88 までの距離はおよそ 1 nm である。結合ポテンシャルはこれら（ 1 ），（ 2 ）および（ 3 ）のアミノ酸残基との結合によって形成されており，極めて強固な結合を有している。
過去の DFS では，Streptavidin-Biotin のポテンシャル
障 壁を二 つ（0.12 nm お よ び 0.5 nm）観 察し て お り，
MD 計算に基づいて，二つの障壁は，内側のアミノ酸残Fig. 1. Schematic diagram of the mechanism of Dynamic
Force Spectroscopy.

基との直接結合で生じる障壁とアミノ酸残基と水分子が架橋して生じた障壁であると報告されている 4)。しかFig. 2. Schematic illustrations of site-selective analysis using two types ofcross-linker : (a) streptavidin is fixed to a SAM of 1, 10-decanedithiol/
1-octanethiol (1/100 ratio) mixed solution on a Au-coated substrate via
a streptavidin-maleimide structure, (b) streptavidin is fixed to a selfassembled monolayer (SAM) of 8-amino, 1-octanethiol molecules on a
Au-coated substrate via a biotin-PEG-COO-NHS molecule. Two
different forms of typical force curves obtained under the condition ofFig. 2 (a) as functions of (c) distance and (d) time. (e) Typical force
curve obtained under the condition of Fig. 2 (b).

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表面科学

第 31 巻

第1号(2010)

Fig. 3. (a) Typical histogram of rupture forces obtained forthe condition of Fig. 2 (a) at the loading rate of
2.95×10 2 pN/s. Solid green line represents thetheoretical fitting curve obtained using eq. 5 based on
the method of analysis proposed in ref. 9. (b) and (c)indicate the relationship between the most frequent
rupture force and the logarithm of the loading rate
obtained in a 0.01 M phosphate (pH 7.4) solution
with the conditions represented by Fig. 2 (a) and 2(b), respectively. The barrier positions obtained fromthese using the least-squares fitting are estimated tobe (b) 0.68:0.05 nm and (c) 0.63:0.09 and0.13:0.01 nm.

し，これまでの手法では，力の印加速度 r 0 が大きいところではサンプリングレートが十分ではないため，また，r 0 が小さいところでは r 0 の値を一定に保つことが難しく，それぞれ，正確な破断力を得ることが困難で，障壁の詳細を議論するには十分ではなかった。実際，過Fig. 4. Schematic illustrations of bond structures between
biotin and streptavidin molecules discussed in thisstudy : (a) and (b) under the conditions of Fig. 2 (b)and 2 (a) in a phosphate buffer solution, respectively.
(c) under the condition of Fig. 2 (a) in a phthalate ora sodium carbonate buffer.

去の論文を比較してみると，ある印加速度における破断力の値は文献の間で一致しておらず，障壁位置や結合寿命もまちまちである3∼9)。

AFM を用いて DFS 解析を行う場合，Streptavidin を観察表面に固定し，カンチレバーの先に分子鎖と Biotin

また，ポテンシャル障壁の数は議論しているものの，を固定する必要がある。結合サイトを選択的に解析する

どの反応サイトのアミノ酸残基から生じる障壁であるのことを目的として二つの条件で試料を製作した。Fig. 2

か，どのアミノ酸残基と架橋して生じた障壁であるのか(a)および(b)に概念図を示すように，一方は，maleimideという，機能性分子の特長を決定する局所的な結合ポテ

で Streptavidin を基板の近傍に固定，他方は，Biotin-

ンシャルの明確な解析は行われていない。本研究では，

PEG を用い，Streptavidin を固定した。後者は，前者に（ 1 ）新しく開発した AFM を用いることで，従来行わ比べ自由な動きも期待される。カンチレバーは Olympus

れていなかった，力の印加速度一定での精密な DFS 解

社製 Bio-Lever 0.006 N/m，0.030 N/m と AC-Lever 0.020

析を行うことを可能にし，（ 2 ）Streptavidin を表面に固N/m の 3 つを使用した。

定する際，Biotin-PEG 分子を用いて固定する方法とDFS 測定は液中，室温で行い，水溶液は pH7.4 0.01 M

maleimide 基を用いて直接固定する方法で，Streptavidin-

リン酸緩衝溶液である。実験はこれら反応させた表面おBiotin の相互作用ポテンシャルとの結合の深さを変更

よびカンチレバーを組み合わせて実験を行った。異なる

し，内側のポテンシャル障壁と外側のポテンシャル障壁

それぞれの印加速度 r 0 に対しフォースカーブを 5000-を個々に観察することを試みた。

10000 回測定して破断力を見積もり，ヒストグラムを作

谷中

淳・武内

修・重川秀実45

三 角 形），カ ン チ レ バ ー 先 端 の 物 質（Au coat お よ び

成した。

Non-coat 窒 化 ケ イ 素）お よ び バ ネ 定 数（0.006 N/m，

3．結果および考察

0.020 N/m および 0.030 N/m）によって影響を受けない

Fig. 2（c）に，Fig. 2（a）の 固 定 方 法 で，pH7.4 0.01

ことを示している。

M リン酸緩衝溶液で測定した場合の，Biotin と Sreptavi-

Fig. 3（b）の傾きから，式（ 5 ）を用いて障壁位置を

din の破断力を測定したフォース曲線を示す。Fig. 2（c）

見積もった結果，0.68 nm となった。この値は，先のヒにおいて，表面から離したカンチレバーの距離に対するストグラムに式（ 6 ）をフィッティングした結果から得印加された力の増加量は一定ではないが，Fig. 2（d）にられた障壁位置によく一致しており，測定の正しさと，

おいて，時間に対する力の増加量は一定になっている。

力の印加速度一定を精密に実現し DFS 測定を行えば一

すなわち，DSP を用いたフォースフィードバックは力つのヒストグラムの幅からポテンシャル障壁位置を得るの印加速度一定を十分実現している。

ことは十分可能であることを示している 3, 9)。

Fig. 2（e）に，Fig. 2（b）で固定したときのカンチレ

Fig. 3（c）では，力の印加速度が 2×10 3 pN/s 以上のバーの距離に対するフォース曲線を示す。Fig. 2（c）のところで急激に傾きが変化した。傾きから求めたポテン

場合，破断が起こるまでの距離はおよそ 30 nm で，こシャル障壁位置は 0.13 nm と 0.63 nm となった。これはれはカンチレバー先端の Biotin-PEG-COO-NHS の長さが過去に報告されているポテンシャル障壁位置である 0.1230 nm 程度であることを示しており，分子量 3400 のnm および 0.50 nm に一致している 4)。また，0.63 nm はPEG 分子の長さに一致している。一方，Fig. 2（e）の場

Streptavidin-maleimide を用いた Fig. 3（b）の障壁位置

合 は，お よ そ 60 nm で 破 断 が 起 こ っ て い る。こ れ は

0.68 nm に一致している。0.13 nm の障壁位置は，Strep-

PEG 分子の長さの 2 倍に相当し，このことから，Strep-

tavidin の奥の反応サイトにあるポテンシャル障壁で，tavidin が Fig. 2（b）に示す通り，表面に PEG 分子を介0.63 nm はそれよりも浅い位置にあるポテンシャル障壁

して固定されていることがわかる。測定を 100 kHz の帯であると考えられる。

域で行っているため，市販の AFM では均されているカ

表面と Streptavidin の間に PEG 分子がある場合は障壁

ンチレバーの揺らぎが観られ，カンチレバーが表面からが二つ観察され，表面との間に PEG 分子がない場合に離れると振幅が増す様子が確認される 9)。測定したフォは障壁が一つ観察される結果になった。Fig. 3（b）ではースカーブは，自動解析のプログラムを用い，カンチレ

Streptavidin が maleimide によって固定されているため，バーに力がかかっていない点を力 0 の点として破断点の自由度が制限されることや，基板上の Streptavidin が表値を決定する。複数破断がある場合は，そのフォースカ

面からの疎水的な影響を強く受けることで，深い位置にーブは除去される。

ある障壁による結合が阻害され，浅い位置にある障壁のFig. 3（a）に力の印加速度一定で測定した破断力のヒみを観察できると考えている。

ストグラムを示す。縦軸が破断頻度，横軸が破断力であ以上の結果を基に，どの反応サイトのアミノ酸残基かる。最頻破断力は，力の印加速度が 2.95×10 2 pN/s におら生じる障壁であるのかを考察する。0.13 nm の障壁位

いて，31.0 pN となった。式（ 6 ）を用いると，破断力

置は，Streptavidin の奥の反応サイトにあるポテンシャのヒストグラムの幅からポテンシャル障壁位置 x b を求ル障壁で，ASP128 や ASN23 などの深い位置にあるア9)

めることができて，0.69 nm と見積もられた 。

ミノ酸残基との直接結合から生じたポテンシャル障壁でFig. 3（b）および（c）に力の印加速度 r 0 の対数に対あると考えられる（Fig. 4（a）を参照）。実際，過去のする最頻破断力をプロットした結果を示す。Fig. 3（b）

報告からも同様のことが言われており 4)，また，Molec-

および（c）の結果は，それぞれ Fig. 2（a）および（b）

ular Dynamics（MD）による計算 16, 17) からも，破断距離の方法で作成した構造の試料を用いて得られたものであが 0.2 nm より短いものは ASP128 や TYR43 などの，奥る。

にあるアミノ酸残基との直接結合だと報告されている。

Fig. 3（b）において，各カンチレバーのバネ定数は0.68 nm および 0.63 nm の位置にある障壁については，

0.030 N/m（Bio-Lever），0.006 N/m（Bio-Lever）およびよ り詳 細 に検 討す る た め，緩 衝 溶 液 の種 類を変 更 し

0.020 N/m（AC-Lever）である。形状は Bio-Lever が長DFS を行った。過去の報告 4) から言われているように

方形，AC-Lever が三角形である。バネ定数および形状

0.68 nm および 0.63 nm の位置にある障壁が Streptavidin

は 3 つのカンチレバーで異なっているが，3 つのカンチのアミノ酸残基と Biotin の反応サイトとの間を架橋す

レバーはすべて同じ直線となった。これは，AFM を用る水分子から生じるのであれば，緩衝溶液を変更してもいた DFS 測定が，カンチレバーの形状（長方形および障壁位置には変化が現れないと予想されるが，塩分子か

46

表面科学

pH
pH 7.4pH 4
pH 10
pH 7.4pH 6.8

Fix type
Maleimide
Maleimide
Maleimide
PEG-PEGR. Merkel et al. 4)
Bonding type

Amino acid residue
Barrier positions by MD 17)
Reaction area

第 31 巻

第1号(2010)

Table 1. Results obtained in this study.
Buffer solution
Potential barrier position(x b)
Phosphate――
0.68 nmPhthalate―
0.29 nm―
Carbonate―0.24 nm―Phosphate
0.13 nm―0.63 nmPhosphate
0.12 nm―0.50 nmDirect bondDirect bondSalt bridge
ASP128,
SER27,
SER27,TYR43,
SER45
SER45
ASN23
―
0.10 nm0.26 nm―
inner
middleら生じたものであるならば，緩衝溶液の分子を変更すれば障壁位置に変化が現れるはずである。

―
4.0 nm
1.4 nm――――――

置にある SER45 と Biotin の結合で生じる障壁を変化させ，0.6-0.7 nm 付近の障壁になると考えられる（Fig. 4緩衝溶液をリン酸からフタル酸および炭酸へ変更した（b））
。フタル酸や炭酸の緩衝溶液を用いた場合で観察さ場合，0.2-0.3 nm 付近に障壁位置を確認できたが，0.6-

れた 0.2-0.3 nm 付近の障壁がリン酸塩では観察されず，

0.7 nm 付近の障壁は観察されなかった。リン酸緩衝溶

リン酸塩で観察された 0.6-0.7 nm 付近の障壁が，フタ液では反応系や pH によらず 0.6-0.7 nm 付近の障壁を観

ル酸や炭酸では観察されなかった結果は，このことを示察できたが 0.2-0.3 nm 付近の障壁位置は確認できなか唆している。観察された障壁位置を Table 1 にまとめった。これらの結果から，0.6-0.7 nm 付近の障壁は Bio-た。

tin と Streptavidin のアミノ酸残基がリン酸イオンと架橋

こうして，個々のサイトでの結合の様子を詳細に解析したために生じた障壁（Fig. 4（b）を参照），0.2-0.3 nm

することが可能になったことで，分子間相互作用の反応付近の障壁はアミノ酸残基との直接結合から生じた障壁

機構を，単一分子レベルで段階的に理解することも可能であると考えられる（Fig. 4(c)を参照）。2-iminobiotinになるが，詳細は文献を参考にされたい 3)。

と Streptavidin の系では，硫酸イオンが SER27 と SER45に架橋しているという報告があり 18)，硫酸イオンと同様

4．ま

と

め

の過程がリン酸イオンでも生じていると思われる。緩衝精密な DFS 測定を可能にする AFM のシステムを開溶液がフタル酸および炭酸の場合，0.2-0.3 nm 付近の障発 し，分 子 の 固 定 法 と 組 み 合 わ せ る こ と で，壁以外に 4.0 nm および 1.4 nm に障壁が現れた。内側のStreptavidin-Biotin 分子間相互作用ポテンシャルの詳細を

アミノ酸残基である ASP128 と外側のアミノ酸残基であ解析した。Streptavidin を表面に直接固定した場合，浅る SER88 の距離がおよそ 1 nm であることを考慮する

い位置にあるポテンシャル障壁のみが観察され，その位と，これらの障壁は対象とするサイト以外の結合である

置は 0.68 nm で架橋による結合であることが示された。

と考えられる。詳細は現在検討中である。

一方，Streptavidin を，PEG 分子を介して表面に固定し17)

この結果を MD と比較してみる 。まず，0.2-0.3 nm
17)た場合，浅いサイトに加えて深い位置にあるポテンシャ

付近の障壁を比べてみると，MD 計算 では，0.26 nm

ル障壁も観察され，その位置は 0.13 nm と，深いサイトに SER45 と Biotin の結合で生じる障壁が存在する。こでの結合が直接結合であることが明らかになった。まのことからも，0.2-0.3 nm 付近の障壁はアミノ酸残基とた，AFM では，溶媒の種類を変えることも可能で，この直接結合から生じた障壁であると考えられる（Fig. 4

れまで水分子により架橋されていると考えられてきた浅17)

いサイトの結合が，リン酸分子の架橋によることが明ら（b））。一方，0.6 nm 付近の障壁については，MD 計算

では 0.4 nm 以上の距離には結合ポテンシャルが現れてかになった。

いないが，これは緩衝液の分子が計算に入れられていな

個々のサイトでの結合の様子を詳細に解析することがいため，アミノ酸残基と緩衝溶液中の分子が架橋すると可能になったことにより，分子間相互作用の反応機構をきに生じる障壁を考慮されていないからである。したが単一分子レベルで段階的に理解するなど，今後，新たなって，SER45 とリン酸塩の架橋によって，0.26 nm の位展開が期待される。

谷中

淳・武内

本研究は科研費（若手研究 B）19710109 の助成を受けたものである。

文

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修・重川秀実47

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