Technical Review

CHROMATOGRAPHY, Vol.33 No.2 (2012)

Technical Review

環境分析における LC−MS/MS と固相抽出カラムの利用
佐々木俊哉

The use of LC−MS/MS and solid phase extraction column
for the environmental analysis
Shunya Sasaki
Nihon Waters K.K., No. 5 Koike Bldg.
1−3−12 Kita−Shinagawa, Shinagawa−ku, Tokyo 140−0001, Japan

Abstract
Over the last decade, the combination of high−performance liquid chromatography and mass spectrometry has become the most important
tool in many fields, especially when a determination of specific analytes in a complex matrix needs to be performed such as measurement ofresidual contaminants in the environment. The reason for this widespread acceptance is the high selectivity and high sensitivity of MS techniques that permit the detection of very low levels of target analytes in the presence of a complex matrix background. However, experiencehas taught that, while detection is no longer an obstacle, quantitative determination of the species of interest may be problematic. Steps must
be taken prior to analysis to minimize or eliminate matrix effects via sample clean−up techniques such as solid phase extraction. The use ofLC−MS/MS and solid phase extraction(SPE) column for the environmental analysis are explained in this paper.
Keywords: liquid chromatography mass spectrometry, solid−phase extraction, matrix effect, ion suppression

た。

１．はじめに
環境分析の特徴のひとつに環境中の複雑かつ大量のマト

特に LC−MS 及び LC−MS/MS は、不揮発性化合物や熱にリックス成分の存在がある。それに対して測定するべき成分不安定な化合物及び高極性化合物に対しても誘導体化などのは ppb（µg/kg）オーダーもしくはそれ以下と微量で、高分化学処理をしないで測定することができ、また過去１０年間に離および高選択性な分析技術が必要とされる。

装置性能が向上したことにより、環境分析の分野でも幅広くガスクロマトグラフ質量分析計や高速液体クロマトグラフ使用されるようになっている。しかしながら LC−MS、LC−

質量分析計（LC−MS, LC−MS/MS）は、複雑な混合物から目MS/MS を使用する場合でも測定対象成分が大量のサンプル的の化合物を分離するため、極性などの個々の物質の性質でマトリックス成分と未分離で共溶出するとそのイオン化が影分離を行うクロマトグラフィーと質量の違いで分離を行う質響を受け、正確な定量が困難となることが知られており、固量分析計を組み合わせた分析機器であり、環境中に残留する相抽出などのサンプル前処理技術によりマトリックス成分の農薬類など微量有機物質の分析に大きな役割を果たしてき除去をすることが効果的である。ここでは環境分析の LC/MS

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CHROMATOGRAPHY, Vol.33 No.2 (2012)に的を絞り、LC/MS の機器構成、各種イオン化法の特徴、源の汚れに対する耐久性とメンテナンスのし易さは重要なポ試料中の夾雑成分（マトリックス）の影響および試料の前処イントである。
マスアナライザーには四重極型、飛行時間型、イオント理に関して解説する。

ラップ型もしくはこれらのハイブリッド型がある。
環境分析においてターゲットが定まっている場合の定量分

２．LC/MS システム構成
Figure１に代表的な LC/MS システムの構成を示す。

析に最も多く使用されるのは四重極型マスアナライザーで、HPLC の溶出液がイオン源に入り、後述の方法でイオン化これを一つ持つシングル四重極型質量分析計と、複数持つタされる。イオン源では移動相溶媒等の不用な液相が除去さンデム四重極型質量分析計（Figure２）がある。タンデム四れ、イオンとなった成分がマスアナライザーへ導入される。

重極型質量分析計は二つの四重極型マスアナライザーの間にイオン源では溶媒除去と併せて、サンプル溶液中の塩や汚れコリジョンセル（六重極など）を持つが、初期のコリジョンをマスアナライザーへ入れないためにスプレーの向きを変えセルは四重極だったため、トリプル四重極の名前が使われるる等の工夫が施されているものもある。環境分析において場合もある。またシングル四重極質量分析計を使用したもの

は、比較的汚いサンプルを分析することが多いため、イオンを LC−MS、タンデム四重極質量分析計を使用したものを LC

Figure 1. A typical LC/MS system configuration.

Figure 2. A structure of tandem quadrupole mass spectrometer.

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Shunya Sasaki−MS/MS と表記することが多い。

ク ト ロ ス プ レ ー イ オ ン 化（ESI）や 大 気 圧 化 学 イ オ ン 化（APCI）、大気圧光イオン化（APPI）などがあるが、環境分

タンデム四重極型質量分析計ではコリジョンセルでアルゴンなどのコリジョンガスと衝突させることによりイオンを解析において汎用的に使用されている ESI および APCI の原理離（衝突誘起解離）させ、プロダクトイオンを生成させるこを以下に解説する。とにより構造情報が得られると共に、シングル四重極質量分
３―１ エレクトロスプレーイオン化（ESI）

析計と比べより高い選択性が得られる。
タンデム四重極型質量分析計で定量分析を行う場合に使用

HPLC からの溶出液は導電されたステンレスキャピラリかされる MRM（Multiple Reaction Monitoring）は MS１で特定ら噴霧されることにより帯電液滴を生成し、窒素ガスによるのイオンを選択し、さらにコリジョンセルで衝突誘起解離霧化で小さな液滴を生じさせる。この液滴は、さらに溶媒部

後、MS２で特徴的なフラグメントイオンを選択することに分を蒸発させることにより、イオンが液相から気相へと飛びより、バックグラウンドノイズを大幅に減らすことができ、出す方法である（Figure４）。

S/N 比が向上する。

中〜高極性及びイオン性の化合物や、低〜高分子（タンパターゲット化合物とまったく同じ分子量を持つ妨害物質がク質では１５０kDa 程度まで）の幅広い化合物を効率よくイオ共存すると選択的検出ができなくなるシングル四重極型質量ン化でき、また生体高分子、ポリマーでは多価イオンを生成分析計と比べ、環境分析などマトリックス成分の多いサンプする。熱に不安定な化合物や非共有結合複合体もイオン化でルの場合、高感度化が可能となる（Figure３）。

きる。LC/MS で使用されるイオン化手法の中で最も高感度であり、汎用性も広いため環境分析において最も多用されているイオン化である。ただし、低極性化合物においては ESI

３．LC/MS のイオン化法
質量分析計は、まず試料を気相イオンにし、真空中でイオが困難なものもあり、その場合は APCI が使用される。また

ンを質量／電荷比（m/z）に従って分離した相対イオンの電移動相の pH、有機溶媒種と混合比、バッファーおよび添加流値を記録する。HPLC から導入される試料は液体である剤の種類と濃度、マトリックス成分の共存などによってイオ為、これを気相にしイオン化するインターフェース部分が重ン化効率が変動するため、高感度かつ頑健な分析メソッド開要な役割を果たす。

発のためにはこれらのファクターの最適化が重要である。

LC/MS インターフェースとして近年最もポピュラーなのものは HPLC で分離した試料溶液を静電噴霧あるいは加熱

３―２ 大気圧化学イオン化（APCI）
HPLC からの溶出液は、高温ヒーターとネブライザーガス噴霧により、微細な液滴にし大気圧下で気相イオンを生成する大気圧イオン化（API）インターフェースである。

（霧化ガス）の働きによって、キャピラリーの出口で気化される。溶媒と溶質試料の蒸気が、コロナ放電による EI で生本インターフェースで使用されるイオン化方法には、エレ

Figure 3. Comparison examples between LC−MS and LC−MS/MS
analyte: nicosulfuron.

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Figure 4. Electrospray ionization (ESI).

Figure 5. Atmospheric pressure chemical ionization (APCI).
成した N２＋や H２O＋及び O２−といった初期イオンと溶媒の反応目的に対応して最近は ESI＋／−、APCI＋／−を高速スイッで H３O＋[H２O]n 及び O２−[H２O]n などの試薬イオンが生成する。

チングして同時取り込みができる装置も開発されている。
Figure６に 代 表 的 な LC/MS イ オ ン 化 法 の 適 用 範 囲 を 示

この試薬イオンと溶質試料間のプロトンあるいは電荷の移動す。

によりイオン化する（Figure５）。APCI では一般的に一価のイオンが生成する。ESI でイオン化しにくい低極性化合物もイオン化する場合が多いが、熱に非常に不安定な化合物の場

４．環境分析におけるサンプル前処理の必要性

合は、熱分解の可能性もある。

前述のように環境分析においては多量に存在するサンプルマトリックス中の ppb（µg/kg）オーダーもしくはそれ以下

前述のように化合物の性質により ESI が適している場合もの微量成分を測定することがある。分析効率を上げるためにあれば APCI が適している場合もある。またイオン化においは、試料をそのまま直接分析することが理想であるが、実際てかける電荷の極性により正電荷イオンが得られるポジティには試料中の妨害物質除去を必要とする場合や対象成分の濃ブイオン化モードと負電荷イオンが得られるネガティブイオ縮を必要とする場合にサンプル前処理が必要となる。

ン化モードがありこれも化合物の性質により選択される。既LC−MS/MS においては、妨害物質除去のための前処理は知化合物において予め充分な情報がある場合は特定のイオン必要ないと考えがちであるが、正確なマススペクトルを得る化法とポジティブまたはネガティブのイオン化モードを選ぶためや、サンプルマトリックスのイオン化効率への影響「マことができるが、既存情報が少ない場合はこの中から最適なトリックス効果」を排除するために前処理を必要とすること組み合わせを検討する必要がある。また、環境分析のようにが多い。以下にマトリックス効果について説明する。

幅広い特性の化合物を一斉分析する場合は、ひとつの分析でESI、APCI のイオン化法それぞれのポジティブ、ネガティ

４―１ マトリックス効果について特に ESI によるイオン化において、液滴内に測定対象成分ブイオン化モード全部が必要となることも多い。このような―８８―

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Figure 6. Applicable scope of ionization methods.

Figure 7. An example of matrix effect.
以外の成分が多量に共存していると、対象成分のイオン化効呼ぶ。マトリックス効果によるイオンサプレッションが強い率に影響を与えることがある。イオン化効率が減少する場

場合、たとえ選択性の良いタンデム四重極型質量分析計を使合、イオンサプレッション、増加する場合はイオンエンハン用していても初めのイオン化が十分に起こっていないことかスメントと呼ばれる。

ら必要な感度が得られない場合がある。更に重要なのは、定量分析においてマトリックス効果により正確な定量値が得ら

サンプルマトリックス成分が分析対象成分と未分離で共溶れなくなることである（Figure７）。

出しイオン化効率に影響を与えることをマトリックス効果と―８９―

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Figure 8. Quantitative assessment of matrix effects.
問題なのは、例えば LC−MS/MS MRM においては前述のて説明する。

ように特定イオンのみを高選択にモニターできるため、マト５．固相抽出

リックス効果が起こっていてもそれを察知できないことが多液体クロマトグラフィーの固定相（固相）を小さな樹脂製いということである。そのため、マトリックス効果が起こる

し、精可能性が高い環境分析においては、予めどのぐらいのマト（一部ガラス製製品も使用されている）カラムに充リックス効果が起こっているか定量的に評価する必要があ製および濃縮を行う方法で、少ない有機溶媒で迅速かつ簡便る。評価方法としては無添加サンプルを所定の方法で前処理にサンプル前処理を行うことができる（Figure９）。

した溶液に後から測定対象成分を添加して調製した標準溶液

固相抽出カラムの基本的な使用方法としては、目的成分まと、マトリックスを全く含まない対象成分のみの標準溶液のたは妨害成分を固相に保持させてから、適当な溶媒にて脱離レスポンスの比を使用する方法がある（Figure８）。

抽出する方法（Figure１０）と、反対に目的成分は保持させず素通りで回収し、マトリックス成分など妨害成分を固相に保持させて除く方法がある（Figure１１）。

４―２ マトリックス効果の対策

的確な固相により最適化された固相抽出法は、精製効果がマトリックス効果の影響を削減する方法としては以下があ高く、回収率、精度共に良好、簡便・迅速であり、作業者にる。

よる差も出にくい。

―測定対象成分を完全単離する

また、有機溶媒消費量も少なく、自動化も可能と、理想に―安定同位体を内部標準として使用する―マトリックスを含む標準溶液で検量線を作成し補正する

近い方法のひとつである。が、固相の選択もしくは使用方法―サンプル前処理でマトリックス成分を除去するを誤ると、良い結果は得られない。以下に固相抽出に焦点を理想的には全ての測定対象成分の安定同位体を内部標準とあて、その選択方法とトラブルシューティングについて解説する。

して使用することだが、必ずしも安定同位体が入手可能で無い事もあり、また入手できても高価で使用できない場合もあ

５―１ 固相の種類と選択方法

る。マトリックス成分を含む標準溶液で検量線を作成する方法は原則として測定サンプルセットにおいてマトリックス成

固相抽出法には、HPLC で使用される固相のほとんどが利分の組成と濃度が同一の場合にのみ正確な補正が可能であ用可能である。Figure１２に現在使用されている代表的な固相る。

について紹介する。

サンプル前処理はマトリックス効果を削減するために非常利用可能な固相の種類が多いということは最適な固相の選に効果的な対策であり環境分析でも多く使用されている。次択が必要ということでもある。固相の選択方法には種々ある

項に環境分析において多く使用されている固相抽出法についが、Figure１３にサンプル溶液のタイプによる選択ガイドライ―９０―

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Figure 9. Solid−Phase Extraction (SPE).

Figure 10. SPE Retention−Cleanup−Elution method.

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Figure 11. SPE Pass−Through Cleanup method.

Figure 12. SPE sorbents.

ンを紹介する。分析試料が水系試料である場合は逆相固相にされ逆相固相に保持しない高極性化合物は活性炭固相に濃縮よる抽出が最適である。水環境中の汚染物質などの前処理にされる。本手法を使用することにより高極性化合物から疎水は逆相固相抽出法が多く使用されている。疎水性が弱く、高性化合物まで同時に抽出が可能になる（Figure１４）。本手法

極性の化合物は逆相固相への保持が弱いことがあり、活性炭の水道水質中の１，４―ジオキサン検査方法への応用例を Figureが使用される。逆相固相と活性炭固相を接続し、逆相固相側１５に紹介する。

からサンプルをロードすると疎水性化合物は逆相固相に濃縮

分析対象成分がイオン性である場合は、イオン交換固相、―９２―

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Figure 13. SPE mode selection guide.

Figure 14. A tandem SPE method.
イオン交換―逆相ミックスモード固相（Figure１６）が使用されないなどのトラブルが発生した場合は、分析対象成分を既れる場合もある。逆相固相が幅広い化合物の一斉抽出に適し知濃度で添加した試料を用いて回収試験をおこない、対象成ているのに対して、イオン交換及びイオン交換―逆相ミック分がどの画分にどのぐらい存在しているかを定量的に把握

スモード固相はイオン性化合物の選択的抽出に適している。

し、トラブルの原因がどこにあるかを確定する必要がある。

また、逆相固相は水系試料の前処理には適しているが、有機原因がどこにあるかが確定すると、それに応じた対策を実施

溶媒溶解試料の前処理には適していない（有機溶媒を除去ますることが可能になる。

たは混合比を下げる必要がある）ことに対して、イオン交換以下に、逆相固相抽出法において対象成分を固相に保持さ及びイオン交換―逆相ミックスモード固相は有機溶媒中のイせてから、洗浄し脱離をする方法について、４つのステップ

オン性化合物を抽出することも可能である。に分けて、各ステップにおけるトラブルとその改善方法について解説する。

５―２ 固相抽出トラブルシューティング
固相抽出において低回収率や再現性低下、精製効果が得ら―９３―

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Figure 15. JPMHLW DWQS method for1,4−dioxan.

―マスオーバーロード

５―２―１ ステップ１：試料調製【改善方法】

固相抽出を実施する前の試料調製時に起こる可能性のあるトラブルとその改善方法について下記に紹介する。

―固相にあった適切なコンディショニングを実施【想定されるトラブル】―シリカベース C１８の場合、乾燥させないこと―試験管への吸着―脱離力の弱い溶媒で希釈する―試料中の固形物への吸着―保持の強い固相を使用する―不安定成分―大きなカートリッジを使用する―一定の pH 及びイオン強度にバッファライズする【改善方法】―ロード容量を小さくする―シリル化した試験管あるいはプラスチック製試験管を使用

５―２―３ ステップ３：洗浄―更に完全にホモジネートする―温度、照度のコントロール、溶媒選択

試料ロードに続いて、洗浄を行い、妨害成分をクリーンアップする。本ステップにおける溶出液を分析し、そこへ対

５―２―２ ステップ２：試料ロード

象成分が溶出している場合に想定されるトラブルとその改善

試料調製に続いて固相のコンディショニング＆平衡化を行方法について記述する。

い、試料をロードする。本ステップにおける素通り液を分析【想定されるトラブル】

し、そこへ対象成分が溶出している場合に想定されるトラブ―対象成分の保持が弱い

ルとその改善方法について記述する。

―試料マトリックスの変動【改善方法】【想定されるトラブル】―不適切なコンディショニング―保持の強い固相を使用する―対象成分の保持が弱い―大きなカートリッジを使用する―試料マトリックスの変動―脱離力の弱い洗浄液を使用する―ボリュームオーバーロード―洗浄液の容量を減らす―９４―

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Figure 16. An example of ion exchange−reversed phase mixed mode SPE sorbents.

Figure 17. Back−Flush elution method.

―９５―CHROMATOGRAPHY, Vol.33 No.2 (2012)―一定の pH 及びイオン強度にバッファライズする保持が強い成分は固相カラムの入り口に濃縮されるため、試料ロード方向と反対側から脱離溶媒を送液する方法（バックフラッシュ法）によって、脱離効率を改善することができ

５―２―４ ステップ４：脱離る（Figure１７）。

５―２―２、５―２―３のどちらの分画にも対象成分が溶出せず、それでも回収率が悪い場合、５―２―１対象成分の分解や容器への６．おわりに吸着以外に固相への保持が強く固相にまだ残存していること

以上簡単に環境分析で利用されている LC−MS/MS と固相が想定される。その場合、下記について検討する。
【想定されるトラブル】

抽出カラムについて解説した。ここ１０年間の高速液体クロマ―保持が強すぎる

トグラフ質量分析計の技術革新と普及率増加は目覚しい。今後も更なる発展が予測されるが、性能が向上すればするほど【改善方法】―脱離溶媒の容量を増やす

高感度かつ高精度な分析が可能になり、LC 部分の分離およ―脱離力の強い溶媒を使用

び前処理の重要性は間違い無く増加し、その使いこなしが環―脱離流速を遅くする

境分析の品質向上の鍵となると考えられる。

―バックフラッシュ―固相を保持の弱いものへ変更―９６―