Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)

Focusing Review

Focusing Review

親水性保持係数による HILIC 保持挙動の解析
吉田達成*

Study of HILIC retention behavior using Hydrophilic retention coefficients
Tatsunari Yoshida *Analytical Applications Department, Shimadzu Corporation, 380−1, Horiyamashita,
Hadano−city, Kanagawa, 259−1304, Japan
Received for review July 8, 2008. Accepted September 4, 2008.

Abstract
Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) is able to retain and separate hydrophilic peptides that are not retained on an octadecyl silica
column in reversed−phase liquid chromatography (RPLC). It has been reported that separation selectivities in HILIC and RPLC methods differed significantly. In order to clarify the differences of selectivities, a set of “hydrophilicity retention coefficients” in HILIC of peptide is presented. The contribution of each amino acid residue to retention on HILIC column was calculated by linear multiple regression analysis using
121peptide retention times. A set of the hydrophilicity retention coefficients on each column successfully explained the contribution degree ofretention. In this review, recent developments in the separation of peptides by HILIC using polar sorbents and less polar eluents, and the discussion of retention selectivities using hydrophilicity retention coefficients, have been summarized.
Keywords: hydrophilicity retention coefficients, selectivity, hydrophilicity parameters, HILIC, peptide separation

ロ酢酸（TFA）などを添加した揮発性移動相とオクタデシル

はじめに
逆相液体クロマトグラフィー（RPLC, Reversed Phase Liquid

シリカ（ODS）カラムを用いる RPLC が，よく用いられていChromatography）は現在 HPLC（High Performance Liquid Chro-る［２］。何故ならば３点の利点に加え更に，分離後に，ペmatography）分析において，約８０％の割合で使用されている

プチドシーケンサーによる配列解析や生理的活性を測定すると言われている。その理由として， RPLC は高分解能であ移動相に緩衝溶液などと有機溶媒の混合溶液を用いるため，試料が溶解しやすい，HPLC 操作上の観点からために，凍結乾燥などで容易に純度の高いペプチドそのもの

ること，が得られるからである。しかし，この RPLC を持ってして取り扱いが容易である，の３点が挙げられる［１］。特に，なかったり，回収率が著しく低下するなどの問題があり，万解析を目的とするペプチドの HPLC においては，水−アセ能では無い。その場合には，イオン交換クロマトグラフィー

トニトリル（ACN）混合溶液にイオン対であるトリフルオ（IEX, Ion Exchange Chromatography）やサイズ排除クロマト

も，親水性の高いペプチドに対しては，保持されず分析でき㈱島津製作所分析計測事業部応用技術部アプリケーション開発センター
神奈川県秦野市堀山下３８０―１
電話：０４６３―８８―８６６０
FAX：０４６３―８８―８６７０
Email :yoshidat@shimadzu.co.jp―７―Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)

グラフィーが用いられるが，これらの方法は分離条件に多量と の 関 係 解 明 に も 利 用 さ れ て い る［１４］。し か し な が らの塩を用いるため，ペプチドを単離する際には，脱塩操作を

HILIC においては，このような親水性保持係数を用い，保持施さなければならない煩雑さがある［３］。RPLC の利点を挙動を解析する試みは少ない［９，１０，１７］。本レビューで持ちながら，RPLC に保持のないペプチドを含む様々な親水は，先ず，シリカゲル基材を用いている HILIC カラムのペ性化合物を如何にカラムに保持させ，分離するかに関心が集

プチドの分離応用例を紹介し，次に主題である HILIC の親

まっている。

水性保持係数を紹介，そして RPLC での疎水性保持係数と対RPLC に保持のない親水性化合物をよく保持し分離するHPLC モードとして，近年，HILIC（Hydrophilic

比しながら，その選択性の違いについて定量的な考察を紹介

Interaction

することとする。

Chromatography）［４，５］が注目されるようになってきた。
これは，有機溶媒（主に ACN）濃度７０％以上で水や緩衝溶

１．HILIC によるペプチド分離の応用例

液を含む移動相と，シリカゲルそのものやアミノ基など極性

HILIC としての最古の論文は１９５２年の Samuelson らの報告基を有する固定相を用いる分離モードで，固定相の極性が移［１８］と考えられている。彼らは固定相にイオン交換樹脂，

動相のそれよりも高いことが特徴である。HILIC が将来的に移動相にエタノールを用いて糖類の分離に成功している。

有望であると期待されるのは，RPLC に無い選択性を持ちな

１９７５年には，アミノカラム・シリカカラムを用いた水系順相

がら，且つ RPLC と同様の揮発性移動相が使用できることか

法による糖類の分析［５］が始まり，現在では食品分野の汎ら，容易に ESI（ElectroSpray Ionization）−MS（Mass Spectro

用的な分析法にまで成熟している。１９９０年代入ると Alpert-meter）への接続ができる点にある。HILIC と言う HPLC 用の報告に始まり，ペプチド，タンパク質消化物，アミノ酸，

語は，１９９０年，Alpert によって命名された［４］。彼は論文核酸といった生体関連物質の分析の報告が主流 となったの中で，アスパラギン酸誘導体を官能基に持つ固定相と緩衝［４，８］。１９９０年後半からは，医薬品分野の分析へと応用さ

溶液−ACN 系移動相で過塩素酸の濃度を上げてゆく塩グラれ，更に HPLC−ESI−MS での安定した測定が可能になってジエントにより，アミノ酸，ペプチド，タンパク質，核酸なきたのを機に，さまざまな低分子化合物へ応用されるようにど生体由来の親水性化合物を分離したと報告している。まなる。今世紀に入ると，様々な種類の官能基を持つ HILIC

た，彼は HILIC の分離カテゴリーを，variant NPLC（Normal

カラムが開発され，多種の親水性化合物の分離に適用される

Phase Liquid Chromatography）と説明している。HILIC と言ようになった［１９，２０］。最近では，環境分野にも応用され，う用語が提案される以前の１９７５年には，水−ACN 系移動相

農薬の分析にも応用されている。これら HILIC の応用例そとシリカカラムを用いて糖類を分離している手法が，順相液して詳細な保持機構の考察は，Hemstron らのレビューにま体クロマトグラフィー（NPLC, Normal Phase Liquid Chroma-

とめられている［２１］。ここでは，シリカゲルを基材とする

tography）として報告されているが［６］，これも HILIC にHILIC カラムを用いたペプチド分離例を紹介することとし属するものと考えられ，最近では HILIC として紹介されて［２２］，これを表１に示した。
HILIC において，分離に関与する溶質と固定相に働く相互いる［７］。
こ の よ う に HILIC は 広 義 の NPLC と 考 え ら れ て い る

作用は，主に水素結合であると考察されているが［８］，他［４，８］。したがって，HILIC での溶質の溶出順序は RPLCにも双極子相互作用，静電相互作用が関与していることも説の逆になるものと予想される。ペプチドに関して言えば，

明されている［５，２３］。また，HILIC の保持機構は，疎水

RPLC に保持されない親水性のペプチドは HILIC に保持さ的な有機溶媒のバルク移動相と固定相上の吸着された水層とれ，逆に RPLC に強く保持される疎水性ペプチドは，HILICの間の液−液分配であると一般的に理解されている［４］。

には弱く保持される［８］。この選択性の違いは，ペプチド医薬品を代表する低分子極性化合物の HILIC 分析には，を構成する各アミノ酸残基の固定相に対する保持の強さが，未修飾のシリカゲルを固定相とするシリカカラムがよく使用

各カラムによって異なるために生じたものと考えられる。

されるのに対し［２４−２６］，ペプチドの HILIC 分離において

HILIC における各のアミノ酸の保持の貢献度は， 親水性保は，様々な官能基を有するカラムが使用されている。シリカ

持係数 （Hydrophilicity retention coefficients）と表現され，カラムは，基材上のシラノール基と溶質との間に働く水素結

これは保持の貢献度の定量化に成功し，保持挙動の解明に有合・静電相互作用によって，HILIC 分離されるものと考えら用であることが報告されている［９，１０］。RPLC においてれている［２７］。官能基を修飾したカラムにおいては，主にも，ペプチドを構成する各アミノ酸の保持の貢献度は，疎水官能基と溶質との間に働く相互作用によって HILIC 分離さ性保持係数（Hydrophobicity retention coefficients）として表現れるが，更に，基材上のシラノール基によるイオン交換相互さ れ，同 様 な 考 え 方 で１９８０年 代 に 算 出 さ れ て い る［１１−

作用も HILIC 分離に多大に関与してくることを留意する必

１５］。この疎水性保持係数は，LogP 値や Rekker の疎水性フ要がある。
PolySulfoethyl

ラグメント定数（Hydrophobic fragmental constant）［１６］と相A［４，５，２８−３０］や NH2， Polyamine［３９］，DEAE，CM［２０］カラムのようにイオン交換基を有関があることも報告されており，RPLC の保持挙動と疎水性―８―

Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)

吉田達成

Table 1 HILIC column for peptide separation
Brand name

PolyHydroxyethyl A

PolySulfoethyl A

Functionality

Mobile phase

PeptidesSalt gradient in TEAP buffer with ACN

SubstanceP and small peptides [4−5], synthetic model peptides [31],tyrosine protein kinase [32], major tyrosine protein kinase[33]ACN gradient, 0.2%H3PO4 with ACN

synthetic model peptides [28], polyphenolic protein [34],hydroxyproline−rich glycoprotein [35],Isocratic, TEAP buffer with ACN

small peptides [4,5,36], Antistasin (ATS) and recombinant−ATS[37], ovalbumin and GKEGLRFMKGA [38], atosiban1−(3−mercaptopropanoic acid)−2−(O− ethyl D− tyrosine)−4−Lthreonine−8−
L−ornithine−oxytocine [39]ACN gradient, TEAP buffer with ACN

low molecular weight autocrine growth factor [39],vector−mediated peptide [40], diuretic peptides [41]Salt gradient, TEAP buffer with ACN

SubstanceP and small peptides [4−5],synthetic model peptides [28−30]

ACN gradient, TEAP buffer with ACN

synthetic model peptides [28],ACN gradient, 0.1%TFA with ACN

standard and digest peptides [8], digest and synthetic peptides [8,27]

ACN gradient, ammonium acetate with
ACN

taste−active peptides [42], dipeptide [43], small peptides [20]Hydroxyethyl
aspartamide

Sulfoethyl
aspartamide

TSKgel Amide−80

Amide

ZIC−HILIC

sulfoalkylbetaine

ACN gradient, ammonium formate with
ACN

digest peptides [44−46]

Altantis

Underivatized

ACN gradient, ammonium formate withACN

glycine betaine [47]Spherisorb NH2

Amino

PolyamineⅡ

Polyamine

SynChropak CM300

Isocratic, TEAP buffer with ACN

atosiban1−(3−mercaptopropanoic acid)−2−(O−ethyl D−tyrosine)−
4−Lthreonine−8−L−ornithine−oxytocine [39]Isocratic, ammonium acetate with ACN

atosiban1−(3−mercaptopropanoic acid)−2−(O−ethyl D−tyrosine)−
4−Lthreonine−8−L−ornithine−oxytocine [39]

Carboxyl

Salt gradient, TEAP buffer with ACN

acetylated core histones [48],

PolyCAT A

Aaspartic

Salt gradient, TEAP buffer with ACN

phosphorylated H1histones [49]TSKgel DEAE−2SW
TSKgel CM−2SW

Diethylamino,
Carboxyl

ACN gradient, ammonium acetate withACN

small peptides [20]TSKgel OH−120
TSKgel Silica−60

Hydroxylic

ACN gradient, 0.2%TFA+0.2%TEA with
ACN

digest and synthetic peptides [27]Lichrosorb Diol

Hydroxylic

ACN gradient, 0.1% TFA with ACN

PeptideT [50]するような固定相を用いる場合，溶質との間にイオン交換的

材上のシラノール基とのイオン交換相互作用が強すぎ，ピーな相互作用の関与が大きくなると考えられ，さらに違った選クがテーリングすることがある。このような場合には，前述

択 性 が 得 ら れ る。こ の よ う な 分 離 モ ー ド は，HILIC−IEXのように移動相のイオン強度を上げる他に，TFA などの強mixed mode［５，２８−３０］として報告されている。但し，イい酸を用いると改善されることがあるが［８］，これは ESI−

オン交換相互作用の関与が大きくなると，RPLC でもよく観MS には適さない。

察されるように，ピーク形状が著しく悪くなったり，或い
３．親水性保持係数による HILIC 保持挙動の考察

は，溶質が溶出しなくなる問題が生じる。その場合には，移動相のイオン強度を上げるか，緩衝能力の大きなリン酸系移

標準ペプチド１０種類を HILIC と RPLC で分離したクロマ動相を使用するかの対策をとることになる［２８］。電荷的にトグラムを図１に示した。AGSE（Peak No. 6）は，RPLC でニュートラルであると考えられているアミドカラムや ZIC−

ある ODS カラム（Fig. 1 (A)）において，ボイドボリューム

HILIC カラムは，イオン交換的な相互作用が少ないと考えら付近に溶出し保持されないが，HILIC では，いずれのカラムれるため，揮発性で低濃度な緩衝溶液と ACN とを組み合わにおいてもよく保持されている（Fig. 1 (B−D)）。RPLC におせた緩和な溶離条件が使用できる。これは ESI−MS への接続

いてあまり強く保持されていない ASTTTNYT（Peak No. 9）を一層容易にしている。しかし，溶質の種類によっては，基のような親水性ペプチドも，HILIC においては強く保持され―９―Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)

Figure 1
Comparison of chromatograms of peptides separated on (A) TSK
gel ODS−80Ts, (B) TSKgel Amide−80 (amide column), (C)TSKgel OH−120 (diol column) and (D) TSKgel Silica−60 (silica
column). The peptide mixture was separated with (A) 83.3min linear gradients of acetonitorile from 5 to 55% in 0.1% TFA and (B−D) 70min linear gradients of water from 3 to 45% in 0.2% TFA+
0.2% TEA.
Peak identification: 1, FY; 2, FGGF; 3, FLEEI; 4, DYMGWMDP−
NH2; 5, NFTYGGF; 6, AGSE; 7, WAGGDASGE; 8,YGGFMTSQKSQTPLVT; 9, ASTTTNYT; 10,
VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEM*; M*: homoserine
This figure is taken from Ref [27].

Figure 2
Relationship between observed retention times of peptides andpredicted retention times on the silica column based on thehydrophilic retention coefficients by linear regression analysis. The
correlation coefficient is 0.98. The each number in Figure is the
peptide used as a probe. This figure is taken from Ref [51].
ここで T obs は実測の保持時間，n i j は i ペプチド中の j ア
ミノ酸残基の数，Dj は j アミノ酸残基の親水性保持係数，terminus は i ペプチドの末端係数。
図２は，計算された親水性保持係数を用いて，シリカカラ
ムにおけるペプチドの保持時間を予測し，実測値に対しプている。一方，RPLC では強く保持される FLEEI（Peak No.

ロットしたものである［５１］。図中の数字はペプチドを示し

3）や DYMGWMDP−NH2（Peak No. 4）のような疎水性ペプている。ペプチドの配列，保持時間については，文献５１を参

チドは，HILIC では中程度に保持された。アミドカラムにお照されたい。これから明らかなように，シリカカラムに関し

いて，YGGFMTSQKSQTPLVT（Peak No. 8），ASTTTNYT は，ては，予測値と実測値との間に，良好な直線関係がある。一

この順に溶出したが，ジオールカラム・シリカカラムでは逆方，アミド及びジオールカラムについては，式転しており，更に FGGF，FLEEI はアミドカラムでは，この式で計算した予測値と実測値との関係が上に凸型のカーブし順に溶出したが，シリカカラムでは逆転している［２７］。このた関係になったと報告されている［９］。このカーブした関

ように HILIC の各カラム間においても，選択性に若干の差係を考慮して，アミド及びジオールカラムに関しては，以下がある。このような現象は，ペプチドを構成するアミノ酸側に示すような対数型のモデル式にデータをフィティングさせ鎖の保持の貢献度が，カラムによって異なっているために生ている［５１］。

に示す線形

 log（１＋n i j × D’j ＋terminus）＋B

じるものと考えられる［９−１０］。シリカ，アミドカラム，
ジオールカラムにおけるそれぞれの親水性保持係数を算出

T obs ＝A ×j

し，定量的な選択性の違いを考察する試みがとられた。



RPLC においては，保持時間は構成されるアミノ酸残基の各保持係数の和であることが確認されている［１１−１５］。こ

ここで T obs は実測の保持時間，n i j は i ペプチド中の j アの考え方に基づいて，アミノ酸配列が分かっている１２１種類

ミノ酸残基の数，A，B は係数，D’j は j アミノ酸の親水性保のペプチドをそれぞれの HILIC カラムで分離し，得られた持係数，terminus は i ペプチドの末端係数。

に示す線形式にフィットさせ，各アミ実測の保持時間を式計算された親水性保持係数を用いて，アミド及びジオール

ノ酸残基の親水性保持係数を算出している［５１］。

 n i j × D ＋terminus
T obs =jj

カラムにおけるペプチドの保持時間を予測し，実測値に対してプロットしたものを図３，４に示している［５１］。得られたシリカ，アミド及びジオールカラムの親水性保持係数は，
表２に示している。更に，各カラムの親水性保持係数を比較―１０―

Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)

吉田達成

Table２Hydrophilicity and hydrophobicity retention coefficients
Amino acidThree−letter code(One−letter code)

Silica

Amide

Diol

ODS

Ala(A)CMC(C)
Asp(D)
Glu(E)
Phe(F)
Gly(G)
His(H)
Ieu(I)
Lys(K)
Leu(L)
Met(M)
Asn(N)
Pro(P)Gln(Q)
Arg(R)

0.41
1.19
0.08
0.10
−1.27
0.60
3.07
−0.59
2.56
−0.84
−0.41
1.49
1.91
2.69
2.20

0.21
0.39
1.79
1.76
−2.24
0.30
3.65
−1.55
3.15
−2.11
−0.85
2.24
0.67
3.08
3.59

0.06
−0.35
1.15
0.67
−0.91
0.29
2.59
−0.55
3.04
−1.26
−1.11
1.93
0.34
2.58
2.15

0.13
1.57
0.10
0.27
1.71
0.22
0.34
1.38
0.05
1.34
0.85
−0.45
0.48
0.36
0.26

Ser(S)
Thr(T)
Val(V)
Trp(W)
Tyr(Y)
b value

1.22
0.87
−0.90
−1.80
−1.80
14.65

2.04
1.23
−1.46
−1.73
−1.04
8.00

2.28
0.39
−0.81
−0.36
−0.90
6.61

0.18
0.12
0.38
2.34
1.23

Hydrophilicity retention coefficient

Figure 3
Relationship between observed retention times of peptides and predicted retention timeson the amide column based on the hydrophilic retention coefficients by non−linear regression analysis.
Constants are A=24.15 and B=−52.36. The correlation coefficientis 0.96. The each number in Figure is the peptide used as a probe.
This figure is taken from Ref [51].

Hydrophobicity retention coefficient

Figure 4
Relationship between observed retention times of peptides and predicted retention times on the diol column based on the hydrophilicretention coefficients by non−linear regression analysis. Constants
are A=15.33 and B=−26.38. The correlation coefficient is 0.96.
The each number in Figure is the peptide used as a probe. This figure is taken from Ref [51].

―１１―Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)

するために，各カラムにおける親水性保持係数で最も大きな相への保持に貢献するものと考えられる。また，ヒドロキシ

値をとるものに＋１０を，最も小さな正の値を取るものを０

基の自由度の大きい Ser のほうが Thr よりも保持に貢献しやに，そして負の値を取るものに−１０を割り当て，その間は比すいと予測されている。

例させ，規格化を行った比較図を図５に示している［５１］。

Pro は疎水的な性質を持つため，本順相法においては保持

図５から，塩基性アミノ酸，アミド基を有するアミノ酸，に貢献しないものと推測されたが，これに反して，すべての酸性アミノ酸が保持に大きく貢献しているのが確認できる。

カラムにおいて正の貢献があった。同様に Gly，Ala も弱い

その貢献度は，塩基性アミノ酸が一番大きく，次にアミド基ながら疎水性を持っているが，この HILIC 分析結果においを有するアミノ酸，次に酸性アミノ酸及びヒドロキシ基を有ては，すべてのカラムにおいて正の貢献を与えている。

するアミノ酸の順であった。Arg，His，Lys の塩基性残基のTrp，Phe，Val，Leu，Ile，Met の疎水性の大きいアミノ酸

親水性保持係数は，３種類のカラムにおいてすべて大きな値

は，すべてのカラムにおいて保持に負の貢献を示した。これを示している。使用された溶離条件下で，塩基性アミノ酸

ら疎水性アミノ酸は，極性固定相へは保持されにくいと推測

は，正の電荷を帯びていると推測され，電荷を帯びたアミノできる。また Tyr は，親水性を示すヒドロキシ基と疎水性を酸は非常に親水性が高いため，HILIC の極性固定相に対して示すベンゼン環の両方を持つが，HILIC に対しては疎水的貢よく保持されるものと考えられる。また，ペプチドはこの正献が大きいとの結果であった。

に電荷を通して固定相に保持されているのではなく，塩基性

このように，各 HILIC カラム間において，若干の選択性

側鎖の持つ親水性によって保持されているものとの報告があの違いが観察されていることは興味深い。親水性保持係数

る［４］。これら塩基性アミノ酸の中でも，HILIC カラムには，それぞれの HILIC 固定相における保持の貢献の度合い

よってその貢献度は異なっている。アミド（３．
６５）及びシリを定量的に考察でき，保持挙動の解明に役立つことが分か

カカラム（３．
０７）においては His，ジオールカラム（３．
０４）

る。ここで紹介した親水性保持係数以外の係数に，Parker らにおいては Lys の保持の貢献度が最も大きい。

の報告がある［１７］。しかしながら，Parker らの親水性保持
係数は RPLC から算出されているもので，HILIC の実質的なアミド基を側鎖に持つ Asn，Gln の親水性保持係数も，各HILIC カラムにおいて大きな値を示している。これはアミド

保持係数を算出しているとは言いがたい。彼らのパラメー

基の双極子モーメントが大きいことによる，すなわち，極性ターによると，酸性アミノ酸である Asp，Glu の保持係数のの大きさに起因するものと推測できる。

値がもっとも大きく，次にアミド型の Asn，Gln，次にヒド

次に，酸性アミノ酸である Asp，Glu が大きな値を示してロキシ基を有する Ser，Thr，次に Arg，His，Lys の塩基性アいる。使用された溶離条件下（酸性）では，これらアミノ酸

ミノ酸の順であった。Trp，Phe，Val，Leu，Ile，Met の疎水のカルボキシ基はプロトネートしている。カルボキシ基と固性アミノ酸については負の値を取り，保持に貢献していない

定相との水素結合が保持の推進力と考えられる。
ヒドロキシ基を有する Thr，Ser は，水への溶解度も高く，親水性が高い。これらアミノ酸は，水素結合を通して各固定

Figure 6
Relative order of elution of amino acids from various column. Tie
lines connect the same amino acid. Polyhydroxyehtyl A and Polysulphoethyl A: Columns, 200×4.6 mm; mobile phase (isocratic), 10
mM TEAP (pH 2.8) containing 80%v/v ACN. RPC; Linear AB
gradient from water to ACN (0.1% TFA in each). SCX; Step gradient of increasing salt and pH. This figure is taken from ref [4].

Figure 5Comparison of the present hydrophilic retention coefficients oneach column □ : silica column ; ○ : amide column, △ : diol column
This figure is taken from Ref [51].

―１２―Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)

吉田達成

結果となっている。また，定量的な親水性保持係数は算出さを理解することができる。また，図１のクロマトグラムに示れていないものの，Alpert は，PolyHydroxyehyl A カラムとしたように，これら図７−９の結果から，HILIC での保持とPolySulfoethyl

A カラムで得られた１６種類のアミノ酸の溶出

RPLC のそれとが，ただ逆転するだけの関係で無いことを，順序を報告している［４］。これを図６に示した。この結果

親水性保持係数と疎水性保持係数の大きさの違いから理解す

からは Arg，His，Lys の塩基性アミノ酸に関するデータは無ることができる。

いが，アミド型の Asn やヒドロキシ基を有する Ser，Thr，

このような手法で計算された疎水性及び親水性保持係数

酸性アミノ酸である Asp，Glu の保持が大きく，Trp，Phe，は，測定された分析条件において成立し，ユニバーサルなも

Val，Leu，Ile，Met の疎水性アミノ酸の保持は小さいことが分かる。Parker ら，Alpert の報告はいずれも，保持の貢献の大きいアミノ酸の順序は異なるものの，親水性の大きいアミノ酸はよく保持され，疎水性アミノ酸はあまり保持されないと言う結果は共通している。
４．親水性保持係数と疎水性保持係数との比較
HILIC と RPLC との選択性の違いを視覚的に考察するために，親水性保持係数（X 軸）に対して Sasagawa らが報告している疎水性保持係数（Y 軸）［１４］をプロットした。図７にシリカカラムの場合を，図８にアミドカラムの場合を，図９にジオールカラムの場合を示している。疎水性保持係数においては，Trp，Phe，Val，Leu，Ile と言った疎水性アミノ酸は大きな値を示し，Arg，His，Lys，Asn，Gln，Asp，Gluと言った親水性アミノ酸は小さな値を取るが，これは親水性
保持係数と逆の関係にある。このように親水性保持係数は，逆相法の疎水性保持係数と概ね逆の関係になっているが，直線的な比例関係があるわけではなく，散らばっている様子が違いがあることを前述したが，この図７−９は視覚的にそれ

Figure 8
Correlation of the present hydrophilic retention coefficient on theamide column with hydrophobic retention coefficient on ODS.
One letter codes are shown in Table 2.

Figure 7
Correlation of the present hydrophilic retention coefficient on thesilica column with hydrophobic retention coefficient on ODS.
One letter codes are shown in Table 2.

Figure 9
Correlation of the present hydrophilic retention coefficient on the
diol column with hydrophobic retention coefficient on ODS.
One letter codes are shown in Table 2.

分かる。図５，表２から各 HILIC カラムの間でも選択性の―１
３―

Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)のではない。しかしながら「はじめに」に記したように，[13] M. J. O’Hare, E. C. Nice, J. Chromatogr., 171, (1979) 209.

RPLC において算出された疎水性保持係数については，物理[14] T. Sasagawa, T. Okuyama, D. C. Teller, J. Chromatogr.,
240, (1980) 329.

化学的なパラメーターである LogP 値との相関についても考[15] C. Chabanet, M.J. Yvon, J. Chromatogr. A, 599, (1992)

察されており，RPLC の保持挙動と疎水性との関係解明にも211.

利用されている［１４］。親水性保持係数についても，他方で[16] R. F. Rekker: “The Hydrophobic Fragment Constant”, p 301

得られた物理化学的なパラメーターと比較・検討され，さら(1977), (Elsevier, Amsterdam).

なるその考察が期待される。

[17] Parker, J. M. R.; Guo, D.; Hodges, R. S. Biochemistry, 25(1986), 5425−5432.

５．今後の HILIC の展望[18] O. Samuelson, E. Sjostrom, Sevn. Kem. Tidskr., 64 (1952)

HILIC と RPLC の溶出順序は概ね逆になると推測できる

305−314が，その保持の貢献度を算出し比較することで，定量的にその違いが説明できることを紹介した。これにより選択性の点[19] M. A. Strege, J. Chromatogr. B, 725 (1999) 67−78.

で，HILIC が RPLC を補完する関係にあることが理解でき[20] M. A. Strege, S.Stevenson and S. M. Lawrence, Anal.Chem.,
72 (2000) 4629−4633

た。現在，様々な官能基を修飾した HILIC カラムが開発され，その改良も進んでいるが，実際分析してみると，試料の[21] P. Hemstrom, K. Irgum, J. Sep. Sci. 29 (2006) 1784−1821.

溶解性や保持時間再現性，ピーク形状の歪み，カラムの安定[22] T. Yoshida, J. Biochemical and Biophysical Methods, Review, 60 (2004) 265−280.

性などの問題に直面することが多い。更に今日，報告されて[23] J. Yu and Z. E. Rassi, Journal of High Resolution Chromato-

いる HILIC カラムは，RPLC カラムの保持力と比較して，全graphy, 17 (1994) 773−777

体的に強くない。更なる HILIC カラムの改良・開発が期待されている。近年の HILIC カラムの開発の方向は，RPLC が[24] S. Grumbach, D. M. Wagrowski−Diehl, J. R. Mazzeo, B.

辿ったように，充てん剤の微粒子化［５２］やモノリス化［５３Alden, P. C. Iraneta, LC GC North America, 22 (2004) 1010
−1023.

−５４］，超高速・高分離化［５４，５５−５７］へと進んでいる。

[25] Y. Iwasaki, K.Inoue, R. Ito, Y. Yoshimura., et al., Bunseki

そして，今後期待される多次元 HPLC においては，それをKagaku, 54 (2005) 135−142.

構成する一つのモードとして HILIC が重要な役割を果たす[26] H. L. Coh, E. A. J. Lau, E. C. Y. Chan, Rapid Commun.

ものと期待されている。様々なところで報告されているよう

Mass Spectrom., 19 (2005) 1237−1244.

に，HILIC モードは HPLC 分離において益々重要な分離モー[27] T. Yoshida and T. Okada, J. Chromatogr. A., 840 (1999) 1−

ドになってゆくとものと思われる。

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