ISSN 0073 － 8751

NUMBER

37

INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKARESEARCH
COMMUNICATIONS

2023
公益財団法人

発

酵

研

究

所

RESEARCH COMMUNICATIONS

No.

37

2 0 2 3I N S T I T U T E F O R F E R M E N TAT I O N , O S A K A ( I F O )Published by
INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA
17 — 85, JUSO — HONMACHI 2 — CHOMEYODOGAWA — KU, OSAKA 532 — 8686, JAPAN公益財団法人発酵研究所

理 事 長

中濱

一雄

常務理事

樽井

直樹

理

事

左子 芳彦
鈴木健一朗
原山 重明
松下 一信

清水
原島
古川
横田

昌
俊
謙介
篤

監

事

下元

藤井

智幸

評 議 員

高文

五十嵐泰夫
太田 寛行
笹川 千尋
園元 謙二
土屋 英子

大島 敏久
北本 勝ひこ
関 達治
武田 京子
中山 浩次

目

次
謙介

1

始原的呼吸経路を繋ぐ一酸化炭素酸化菌コレクションの構築とその応用基盤………………………………………………………………… 吉田天士

3

タイムラプス・シングルセル発現解析の開発による
分裂酵母胞子の休眠と発芽の分子機構…………………………………………… 佐藤政充

19

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された
Host-jump 現象の分子基盤の解明 ……………………………………………… 田淵光昭

25

遺伝子組換え大腸菌が生産する新規な膜小胞の解析と有用物質分泌生産への応用………………………………………………………… 尾島由紘

43

新規分析法によるセリンラセマーゼ生産菌の網羅的探索とこのラセマーゼによる D-セリン高効率生産の研究 …………………………… 金内誠

55

生物間相互作用解析を基軸にした糸状菌の潜在機能の開拓と利用……… 萩原大祐

67

糸状菌に感染するマイコウイルスの多様性解析…………… 浦山

俊一，萩原

大祐

75

マイコウイルスが宿主糸状菌にもたらす作用の網羅解析… 浦山

俊一，萩原

大祐

87

マイコウイルスによる糸状菌二次代謝の誘導……………… 浦山

俊一，萩原

大祐

101

糸状菌間相互作用による抗生物質ジフェニル
エーテル類の産生誘導………………………………………… 浦山

俊一，萩原

大祐

111

巻頭言………………………………………………………………………………… 古川■ 2021年度大型研究助成■ 2017年度寄付講座助成
生物間相互作用解析を基軸にした糸状菌の潜在機能の開拓と利用

■ 2021年度一般研究助成
健史

125

深海底に沈む木材等をニッチとした深海生菌類の多様性解明………………… 長野由梨子

126

土壌に特異的に優占する難培養細菌門アシドバクテリアのバイオリソース拡充………………………………………………………………… 伊藤

英臣

127

各種胆汁酸分子の発芽誘導能を用いた難培養性腸内細菌の分離と日本人腸内細菌叢カクテルの創製………………………………………………… 中山

二郎

128

地衣類チャシブゴケ属の新しい分類体系構築に向けた試み…………………… 橋本

陽

129

土壌微生物が産生する揮発性有機化合物( VOCs )の網羅的解析による土壌の微生物性評価法の開発………………………………… 池永

誠

130

ワイン発酵におけるプロリン資化抑制機構の理解とその応用展開…………… 西村明

131

病原細菌のインフラマソーム活性化因子の同定と応用………………………… 原

英樹

132

幅広い単細胞生物のイオンチャネルの構造と機能から根源的な情報伝達手段であるイオン透過の成り立ちに迫る…………………… 入江

克雅

133

真核微生物の細胞表層糖鎖マーカーとしての酸性糖鎖の選別機構と生理的役割の解明………………………………………… 竹川薫

134

スピルリナ強光培養時に確認されたアルカリバチルスの出現メカニズムの解析……………………………………………………………… 渡辺

智

135

ビフィズス菌のヒト腸管共生・相互作用因子の構造生物学的解析…………… 伏信

進矢

136

環境メタゲノムから発見した新規な遺伝子発現調節機構の解明と生理学的意義………………………………………………………………………… 末永光

137

ストレス検知の場としてのオルガネラ膜：
細胞内膜の相分離を利用した細胞成長調節システムの分子基盤……………… 松浦彰

138

多細胞システムの機械受容シグナル伝達機構に関わる複数イオンの解明…… 森本

雄祐

139

出芽酵母可視化スクリーニングによる活性化ステロール
分布領域制御因子の特定と制御機構の解明……………………………………… 岸本

拓磨

140

グラム陽性菌における翻訳の品質管理機構の解明……………………………… 千葉

志信

141

土壌中での環境適応を標的とした防除技術開発を指向した，
青枯病菌のシデロフォア産生機構の解明………………………………………… 曵地

康史

142

酵母の細胞質局在型センサーによる新奇高浸透圧感知機構の解明…………… 舘林

和夫

143

Gallionellaceae 科微好気性鉄酸化細菌の分離と特性の解明 …………………… 渡邉

ビタミン B6 の生体内恒常性維持機構の解明 …………………………………… 伊藤

智和

144

トリコテセン系かび毒生合成制御の分子機構…………………………………… 木村

真

145

細菌の宿主定着能獲得や病原性獲得への進化のメカニズムの解明…………… 坂本啓

146

分岐鎖アルコール認識機構とその生理的意義の解明…………………………… 黒田

浩一

147

祖先型硫黄酸化経路の鍵となる未知酵素の同定………………………………… 渡邉

友浩

148

ビスフェノール S 分解微生物系の人工構築と生物処理への応用 …………… 武尾

正弘

149

ATP-grasp リガーゼにより修飾される新規ペプチドの異宿主生産 ………… 小谷

真也

150

プラスチック廃棄物の微生物分解の効率化を目指した
生化学・工学的アプローチ………………………………………………………… 渡邊

崇人

151

病原微生物の侵襲進化の解明と新規天然物の探索……………………………… 荒井

緑152

ヒト病原性真菌の内在性ストレス応答機構を活用した神経変性疾患治療薬開発のための新規戦略……………………………………… 小菅

康弘

153

細菌性血管新生因子 BafA の社会実装を目指した
高活性オルソログ探索ならびに活性部位の特定………………………………… 塚本健太郎

154

黄麹菌における光遺伝学的手法を用いたメンブレンレスオルガネラ形成による有用物質生産…………………………………………………………… 樋口裕次郎

155

嫌気性ベンゼン分解菌の分解力を引き出す：「本当に現場で分解する」菌を目指して ………………………………………… 水口

千穂

156

ニトリルゴムのバイオリサイクル法の開発……………………………………… 杉森

大助

157

ポリエチレンテレフタレート分解微生物・酵素の探索………………………… 飯塚怜

158

水環境中の多様な捕食性細菌による捕食特性の解明とその持続的なウキクサバイオマス高効率生産への応用………………………… 井上

大介

159

Aureobasidium pullulans の細胞壁構造から超高分子 β -グルカンの分泌機構を学ぶ……………………………………………………………………… 東

雅之

160

α -アミノ酸の二量化による有用芳香族複素環化合物の創製…………………… 桝尾

俊介

161

腸内細菌が産生する芳香族アミノ酸による腸管病原菌の感染制御…………… 西山

啓太

162

日本人の腸内に特有な酢酸生成菌の多様性解析および新規分離株の取得…… 山田

千早

163

国内における外生菌根性担子菌類 Tomentella 属の分類学的研究と分離培養法の確立による菌株拡充………………………………………………… 早乙女梢164細菌のセカンダリータンパク質分泌モーター SecDF の活性化状態構造の基盤……………………………………………………………… 塚崎

智也

165

出芽酵母におけるリボソーム品質管理の分子機構……………………………… 北畠真

166

植物病原細菌が感染植物組織中に形成するバイオフィルム高次構造と植物病原性との相関解析…………………………………………………………… 別役

重之

167

氷河微生物の地球規模での地域比較と寒冷適応戦略の解明…………………… 瀬川

高弘

168

適応育種的変異を利用した酢酸菌セルロース合成酵素変異体の作成とそのセルロース合成能の解析……………………………………………… 松谷峰之介

169■ 2021年度若手研究者助成
医療施設で分離される P. putida グループ新菌種の分類とサブグループ形成関連因子の検索………………………………………………… 遠矢

真理

171

同型配偶子生殖を行う単細胞性緑藻クラミドモナスを用いた
葉緑体母性遺伝の分子機構の解析………………………………………………… 小林

優介

172

遊離脂肪酸を介した細菌間コミュニケーションによる環境応答機構の解明………………………………………………………………… 神保

晴彦

173

地衣化菌が共生藻を認識する仕組みに関する研究……………………………… 升本

宙174

盗葉緑体生物群から探る葉緑体獲得進化の共通原理の解明…………………… 大沼亮

175

植物病原細菌の感染プロセスに重要なホスファチジルコリン
生合成機構の構造基盤解明………………………………………………………… 渡邊

康紀

176

マウス腸内細菌におけるゲノム進化速度の解明………………………………… 高安

伶奈

177

日本微生物資源学会における微生物分類学に関する支援活動………………… 大熊

盛也

179

公益社団法人 日本生物工学会 未培養微生物(微生物ダークマター)
資源工学研究部会の研究推進活動について……………………………………… 青柳

秀紀

183

■ 2021年度学会・研究部会助成

巻

巻

頭

言

頭

言
古

川

謙

介＊

発酵研究所( IFO )は 1944 年，12 月，武田薬品㈱の付属機関として設立されました．来年で 80 周年を迎えます( IFO の歴史，活動内容は中濱理事長により生物工学会誌( 2015 年
3 号)に記述されています)．IFO Research Communication は，本号で 37 巻になります．
助成研究が始まったのが 2003 年，微生物の最先端の研究が多く掲載されるようになりました．助成研究報告会はコロナ禍でこの数年中止を余儀なくされ，また，オンラインでの開催となりましたが，本年は 4 年ぶりの対面開催となりました．この巻頭言の場をお借りして
2 つの提案をしたいと思います．一つは微生物を一般の人々，特に子供たちに正しく知ってもらうこと，もう一つは微生物の専門家がこれからの微生物学を大胆に展望することです．
一般の人々にとって微生物はペスト菌，コレラ菌，結核菌，チフス菌，O157 大腸菌，エイズウィルス，インフルエンザウィルス，そして新型コロナウィルスなどの病気を起こす悪し き“ い き も の ” を 連 想 す る よ う で す．2019 年 12 月 年 発 生 し た 新 型 コ ロ ナ ウ ィ ル ス( COVID-19 )による感染症は瞬く間に世界中に広まり，人口の 10 % 近くが感染，七百万人以上の死者が出たと言われています．つまり微生物はバイ菌との認識であり，除菌，抗菌グッ
ズも多く出回っています．
専門家の皆様には釈迦に説法でありますが，微生物が演じている「ものづくり」と「環境浄化・保全」を世間にもっと PR する必要を感じます．特に小中学生，高校生を対象とした微生物教育が必要であろうと思います．クワガタ虫やカブト虫など昆虫の好きな子供は(大人も)沢山いますが，微生物をバイ菌として捉えている子供が大半でしょう．微生物を正しく理解するための絵本，漫画，アニメはあるのでしょうか．グーグルで調べてみると微生物図鑑など数冊は出版されているようです．記憶に残るのは 20 年ほど前に漫画「もやしもん」(石川雅之作)でしょう．これは肉眼で菌をみることのできる主人公を中心に菌・ウィルスに関わる農業大学の学園ドラマを描いたものです．発行部数は 800 万部を超えた人気漫画でした．久しぶりに本棚から引っ張り出して斜め読みをしました．日本酒製造などに関わる細菌，酵母，カビなどが全編を通して出てきますが，微生物が主役ではありません．漫画(アニメ)家と微生物専門家が共同して面白くてためになる子供向けの漫画，アニメを制作したら如何でしょうか．
一方で微生物を専門とする研究者は，自身の取り扱っている微生物についてはその形態，
機能を詳細に明らかにすべく奮闘されています．しかし，自分の専門以外の微生物について＊

古川謙介
別府大学客員教授・九州大学名誉教授，公益財団法人発酵研究所理事

－1－

古

川

謙

介

は余り関心がないように思われます．1970 年，日本万国博覧会(大阪)の一環として開催されたタイムカプセル EXPO '70 事業をご存じの方も多いかと思います．特殊ステンレス鋼を材料にした球状のカプセル容器(内径 1 m )に，2,098 点の物品と記録が収納されました．
その中には大腸菌，サルモネラ菌，枯草菌，アミノ酸発酵菌，抗生物質生産菌などの細菌，
麹カビ，青カビ，椎茸の胞子，土壌中の雑菌など，そしてファージ，DNA，RNA が納められましたが，IFO もこの事業に関与しました．二つのカプセルが 1971 年，大阪城公園本丸跡の地下 15 m に埋設されました．一つ目のカプセルは 2000 年に開封されましたが，その後100 年ごとに開封される予定です．二つ目のカプセルは 5000 年後の西暦 6970 年に開封される予定です．5000 年後に人類が存在している保証はありませんが，夢多き事業だと思います．
このタイムカプセル Expo '70 にあやかって，5000 年はともかく，これからの 80 年間の微生
物学の発展を予想してみませんか．そして，それを書き留めて IFO に保管し，80 年後に開示し，検証しては如何でしょうか．
恥ずかしながら，浅学非才な筆者の微生物への妄想・希望を思いつくまま記しておきます．
○微生物を主体とした食品がでまわる○病害菌の毒性を無くした有用菌が開発される○自然環境を模した培養系ができる○高性能光合成シアノバクテリアが開発される○微生物ゲノム上のほとんどの遺伝子機能がわかる○超好熱菌の好熱性のからくりが解明される○貧栄養細菌の貧栄養性のからくりが解明される○生物界の第 4 のドメインができる，あるいは生物界はシームレスとなる○化学合成により自立増殖できるバクテリアができる？これは神の領域としてできない方が良いかもしれません．
80 年後，予想した人の何人の方が生存しているか？？ですが，記録は残り，21 世紀の微生物学がどのように展開されたか，検証されることでしょう．

－2－2021 年度大型研究助成の研究報告
助成期間:2021 年 4 月～ 2023 年 3 月

IFO Res.Commun. 37
3-18, 2023

始原的呼吸経路を繋ぐ一酸化炭素酸化菌コレクションの構築とその応用基盤
吉

田

天

士

京都大学農学研究科〒606-8502

京都府京都市左京区北白川追分町

Construction of culture collection and application base of carbon monoxide-oxidizing
bacteria that have inherited primitive respiratory pathways
Takashi Yoshida
Graduate School of Agriculture, Kyoto University
Kitashirakawa-Oiwake, Sakyo, Kyoto 606-8502
Hydrogenogenic carbon monoxide (CO)-oxidizing bacteria (hereafter referred to as CO-oxidizing bacteria)
conser ve energy using an anaerobic CO dehydrogenase containing Ni (Ni - CODH) and hydrogen-producing
hydrogenase (ECH). In this study, we promoted the exploration and isolation of undescribed microbial species byusing the established enrichment culture method in which the gas phase is replaced by CO to expand the culture
strain collection as a genetic resource. Parageobacillus sp. strain G301 was successfully isolated from the sedimentof Unagi-ike Lake in Kagoshima Prefecture, Japan, and closely related to Parageobacillus toebii, which lacks
CODH/ECH. Furthermore, the genome of strain G301 encoded a gene cluster for aerobic CODH containing Mo(Mo-CODH). Culture experiments demonstrated that the strain enabled both hydrogenic anaerobic and aerobic
CO oxidation, which had not been previously reported. We also obtained a CO oxidizing bacterial isolate ofThermolongibacillus altinsuensis which has not been reported to be capable of CO oxidation, from a sediment
sample from the bottom of Lake Biwa. A comprehensive search in public metagenomes showed that Ni-CODH
was distributed in a wide range of prokaryotes spanning 55 bacterial and 11 archaeal phyla. Although Ni-CODH isa universal enzyme that exists in a wide variety of microbiome, including aquatic environments such as oceans,
artificial environments, and mammalian microflora including humans, Ni-CODH responsible for hydrogenogenic
CO oxidation was rarely found in the metagenomic data, suggesting the importance of the isolation and cultivation.
We also found an acetyl CoA production pathway, in which Ni-CODH is a key enzyme, in heterotrophic, humangut-derived enterobacteria, and expanded the genomic database of potential aerobic marine CO-oxidizing bacteria
in the ocean. These results in this study could expand our knowledge on Ni- CODH and CO oxidizers and are
expected to provide a basis not only for utilization as a genetic resource, but also for elucidating unpreceded
metabolisms of CO-oxidizing bacteria and their ecological functions on the surrounding environment.
Key words: hydrogenogenic carbon monoxide-oxidizing bacteria, carbon monoxide dehydrogenase,Parageobacillus, enrichment culture, metagenome緒

言は，年間 2000 ～ 3000 Tg に達し，その半分は人為起源である( Khalil & Rasmussen, 1990 )．残りの半分は，火一酸化炭素( CO)は，人間や微生物を含むさまざま

山，淡水，海洋，陸域での自然の化学プロセス(例:有な生物にとって有毒なガスである．大気中における CO

機物の光化学的および熱化学的分解)および生物学的プ

濃度は 0.06 ～ 0.15 ppm と微量であるが，その総排出量

ロセス(例:微生物，葉，根，動物による生成)による

E-mail: yoshida.takashi.7a@kyoto-u.ac.jp
共同研究者:神川龍馬(京都大学農学研究科)
井上真男(立命館大学立命館グローバル・イノベーション研究機構)( Fukuyama et al., 2020 )．一方，CO/CO2 間の酸化還元
反応は，生物圏で利用可能な無機化合物の反応の中で最も酸化還元電位が低い反応の 1 つである( E 0’＝520 mV，
CO + H 2O ⇔ CO2 + 2H+ + 2e- )．そのため CO 酸化は，フェ

－3－

吉

田

天

士

レドキシンのような電子伝達体を含むさまざまな電子受

KKC1 株)( Yoneda et al., 2013 )を，鹿児島県鰻温泉よ容体の還元と共役できる( CO 代謝)．1991 年にロシア

り新種 Carboxydothermus pertinax Ug1 株(以下 Ug1 株)のグループにより，CO を酸化し水素を生産する好熱性( Yoneda et al., 2012 )を分離することに成功した．これ

偏性嫌気性菌(以下 CO 酸化菌とする)が初めて分離さらの環境における密度は低く，CO 酸化菌が中温環境でれ，以来 37 株( 5 門，20 属，32 種)が記載されている活動するかどうかは不明のままである．一方，以前の研( Fukuyama et al., 2020 )．CO は有毒ガスであり，水素究 で 示 さ れ て い る よ う に CO 酸 化 菌 分 離 株 の 多 く はは無酸素環境における多くの微生物にとって重要なエネ

Bacilliota に属し，内生胞子形成能が本門細菌の広範な分ルギー源であるため，環境中の CO 酸化菌は重要な「 CO

布に寄与している可能性が指摘されている( Fukuyama

スカベンジャー」であるとともに一次生産者であると考えられている( Fukuyama et al., 2020 )．その CO 代謝に

et al., 2020 )．事実，申請者らは鹿児島県錦江湾底泥より
通性嫌気性，CO 酸化菌 Parageobacills thermoglucosidasius

おいて，鍵酵素であるニッケル含有 CO デヒドロゲナー

TG4(以下 TG4 株)を分離することに成功した( Inoue

ゼ( Ni-CODH )が中心的な役割を担っており，Ni-CODH
はその種類によって呼吸や炭酸固定と多岐に渡る代謝に

et al., 2019b )．このように CO 酸化菌の分布は，これまで考えられていたよりも広い可能性がある．さらに重要寄与する．多くの場合，CO 酸化菌は複数の Ni-CODH

なことは，ほとんどの原核生物分離株では CO 酸化能力

遺伝子を保有し，その一つと同一遺伝子クラスター上にが検査されておらず，CO 酸化菌の多様性は過小評価さコードされるヒドロゲナーゼ(ECH )が複合体を形成し，れている可能性があり，CO 酸化菌の多様性と進化を理CO 酸化と水素生成を共役させることでエネルギー獲得

解するにはさらなる分離の取り組みが必要である．本研を 行 う．Ni-CODH/ECH 複 合 体 は，NAD(P)H を 電 子

究では，世界的に先行する CO 集積培養法によって未記伝達体として利用せず，最終電子受容体として水さえあ

載種の分離探索を推進し，オミックス解析によって新規ればよいため，そのエネルギー保存様式は電子伝達系のCO 代謝を解明することで，遺伝子資源としての培養株

ような他のエネルギー保存メカニズムと比較して非常にコレクションを拡充することを目的とした．さらに，

単純で始原的である( Fukuyama et al., 2020 )．

Ni-CODH 大量発現系および通性嫌気性 CO 酸化菌にお

水素は石油や天然ガスと比べてエネルギー効率が高く，ける Ni-CODH ノックアウト技術を用いた水素生産微生

次世代エネルギーとして期待されている．現在，水素は物触媒の開発に向け，メタゲノムデータベース上の未利天然ガスやバイオマス等を希少金属触媒下で約 900 ℃で

用 Ni-CODH 遺伝子の多様性解析を行った．

ガス化することで生じる CO を含む合成ガスから生産さ実験方法

れるが( Ragauskas et al., 2006 )，CO により金属触媒が劣化する問題点を有する．CO 酸化菌が有する Ni-CODH
は熱安定性が高く( ～ 70 ℃)，CO 酸化反応の速度定数
kcat は～ 40,000 s−1 と非常に大きく，kcat/Km も～ 10 9 M−1s−1と拡散律速に近い．そのため CO 酸化菌は CO を除去しサンプリング
淡水堆積物試料は，静岡県慈雲寺温泉( 34°38′54″N,
138°52′00″E)にて 2015 年 1 月に，鹿児島県鰻温泉( 31°

高効率に水素を生成する微生物触媒となりうる．一方，

13′41″N, 130°36′47″E)にて 2012 年 12 月に，琵琶湖調CO はエネルギーとして利用可能なメタノールやメタン

査 定 点 Ie-1( 35°12′58″N, 135°59′55″E) に て 2021 年 10といった C1 化合物を合成するための重要な前駆物質で月に採取した．特に，琵琶湖では水深約 70 m におけるもある( Ragauskas et al., 2006 )．現在，CO2 の還元による CO 生産手法として CO2 + 2e- + 2H+ ⇔ CO + H 2O の可湖底堆積物を琵琶湖調査船「はす」から不攪乱柱状採泥器にて採取した．

逆反応を行なう Ni-CODH が新規触媒として注目されている．Ni-CODH が触媒する CO2 還元反応は熱力学的な集積培養障壁があるため，Ni-CODH を酸化チタン等で光触媒化

CO 酸化菌の集積培養を目指し，以下の通り行った．

することで光エネルギーを利用して CO2 を還元するモ

培 養 に は 180 mm×18 mm ス ク リ ュ ー キ ャ ッ プ 試 験 管

デル研究が行われてきた( Parkin et al., 2007; Woolerton( IWAKI )を用い，液相を 5 mL ，気相を 26 mL とした．

et al., 2010 )．
このような背景のもと，申請者らは気相を CO に置換

慈恩寺温泉堆積物および間隙水試料を 10％ CO 90％ N2した独立栄養培地を用いて海洋熱水環境試料を集積培養

琶湖堆積物試料は，B 培地( Yoneda et al., 2012 )，20％

することにより複数の CO 酸化菌を探索してきた．そのCO 80％ N2 雰囲気下にて，65℃で静置した．静置培養

雰囲気下にて 65 ℃で静置した．鰻温泉堆積物試料と琵

結果，トカラ列島鬼界カルデラの海底コアサンプルより後の気相は熱伝導度型検出器付ガスクロマトグラフ

新属新種の Calderihabitans maritimus KKC1 株(以下，( GC-2014 gas chromatograph, 島 津 製 作 所 , 京 都 )，－4－

始原的呼吸経路を繋ぐ一酸化炭素酸化菌コレクションの構築とその応用基盤

ShinCarbon ST packed column(信和化工 , 京都)を用

v. 0.13( Murphy et al., 2015 )を用いた．アノテーション

いて検査し，CO の減少と水素生成が検出されるまで集には DFAST v. 1.2.6( Tanizawa et al., 2018 )を用いた．

積培養を継続した．

muscle v.3.8.31( Edgar, 2004 ) お よ び trimAl v. 1.4.1( Capella-Gutiérrez et al., 2009 )をもちいて，アラインメ

分離

ントデータを作成し，分子系統解析は IQTREE v. 1.6.12

鰻温泉堆積物集積培養後の試料は，ポリペプトン，酵( Nguyen et al., 2015 )にて行った．PATRIC( Wattam et

母エキスおよび硫酸マグネシウム 7 水和物を主成分とした NBRC 802 寒 天 プ レ ー ト 培 地( Hachisuka et al.,al., 2017 )を用いて代謝を予測し，Orthofinder( Emms
& Kelly, 2019 )を用いて同属細菌とゲノム中の遺伝子組

2022 )にて塗抹培養に供し，好気的に 65 ℃で一晩静置成を比較した．

培養した．形成された単一コロニーの分離により分離株

B1-1 株のゲノム DNA 抽出は G301 株と同様に行った．

G301 を得て，気相分析により CO 酸化能を確認した．

200 bp 長 ペ ア エ ン ド リ ー ド は DNBSEQ-G400( MGI

16S rRNA 遺伝子の部分配列を標的とした BLASTn 検索

Tech Co., Ltd. )によるゲノムシーケンスにより得た．

により種を推定した．琵琶湖堆積物集積培養後の試料は，リードのアダプター除去とクオリティーフィルタリン

TGP 寒天プレート培地( Cripps et al., 2009 )にて行い，

グは Trimmomatic v0.39( Bolger et al., 2014 )にて行っ

他の条件および作業内容は G301 株と同様とした．

た．アッセンブルとアノテーションはそれぞれ SPAdes

メタゲノム解析( Tanizawa et al., 2018 )を用いて行った．近縁ゲノムとv3.15.4( Bankevich et al., 2012 )と DFAST server v1.2.18
慈恩寺温泉集積培養試料からの DNA 抽出は，Extrap
Soil DNA Kit Plus V 2(新日鐵住金 , 東京)を用いて行っの平均ゲノム相同性は JSpeciesWS( Richter et al., 2016 )を用いて算出した．

た．300 bp 長のペアエンドリードは MiSeq を用いたゲ
ノムシーケンスにより得た．リードのアダプター除去と分離株の増殖生理実験

クオリティーフィルタリングは fastp V 0.20.1( Chen et

酸素および硝酸が存在しない条件下(プロトン以外に

al., 2018 )を用いた．アッセンブルは MEGAHIT V 1.2.9( Li et al., 2016 ) を 用 い た．Burrows-Wheeler Aligner

電子受容体が存在しない)における，G301 株の CO の

(BWA)V 0.7.17( Li & Durbin, 2010 )を用いてリードを( Yoneda et al., 2012 )を用い，N2:CO(80:20)の雰囲気

アッセンブル配列にマップし，ビニングとその評価には下にて 65℃で培養した．また，硝酸存在下で同様に嫌酸化能を調べるため，G301 株を硝酸非存在下の B 培地

MetaBAT2 V 2.12.1(Kang et al., 2019 )と CheckM V 1.13

気的に培養し，CO の酸化能を調べた．加えて，空気:CO( Parks et al., 2015 ) を 用 い た． ア ノ テ ー シ ョ ン に は(80:20)雰囲気下にて同様に培養することで好気的な

DFAST v. 1.2.6( Tanizawa et al., 2018 )を用いた．近縁

CO の酸化能を調べた．いずれの場合も，コントロール

ゲノムとの平均ゲノム相同性は pyani V 0.2.10(Pritchard

として CO を N2 で置換した条件でも培養した．細胞収et al., 2015 )を用いて算出した．16S rRNA 遺伝子またはゲノムを用いた分子系統解析には MEGA-X: Molecular

量および増殖速度の比較は Welch t 検定にて行った．硝Evolutionary Genetics Analysis version 10( Sudhir et al.,を推定するため，Ni-CODH のみを有する Parageobacilus

2018 )と GTDB-tk V1.7.0( Chaumeil et al., 2020 )をそれぞれ用いた．

thermoglucosidasius NBRC 107763 株を上記と同様に培養
し，CO の酸化能を調べた．

分離株のゲノム解析

メタゲノムデータベース解析

酸存在下における嫌気的な CO の酸化に関わる CODH

G301 株のゲノム DNA は DNeasy blood and tissue kit

相同性検索によって，MGnify メタゲノム由来タンパ( Qiagen, Valencia, CA, USA )を用いて抽出した後，解ク質データベース( Richardson et al., 2023 )および NCBI

析 に 供 し た．300 bp 長 の メ イ ト ペ ア エ ン ド リ ー ド は

データベース( Sayers et al., 2022 )から Ni-CODH 様配

MiSeq を用いたゲノムシーケンスにより得た．リード列を収集した．MGnify データベースには，約 175,000のアダプター除去とクオリティーフィルタリングはのサンプルを含む 3,500 以上のプロジェクトの解析デー

Trimmomatic v. 0.3.6( Bolger et al., 2014 )と NxTrim

タが含まれている( Richardson et al., 2023 )．90 ％のア

v. 0.4.1( O'Connell et al., 2015 )を用いた．アッセンブル

ミノ酸配列相同性でクラスタリングを行い，分子系統解とその評価は SPAdes v. 3.13.0( Bankevich et al., 2012 )，析を行った．これらの配列クラスターについて，MGnify

Burrows-Wheeler Aligner(BWA)v. 0.7.17( Li & Durbin,から生物圏情報，ゲノムアセンブリから Ni-CODH の周2010 )，SAMtools v. 0.1.19( Li et al., 2009 )，NxRepair

辺遺伝子情報，さらに GTDB( Parks et al., 2022 )から

－5－

吉

田

天

士

ゲノム情報に基づく分類群のアノテーションを行い，分告であるが一部の種から CO 酸化能が報告されている

子系統樹にこれら全ての情報を統合した．

Thermolithobacter 属真正細菌であることが，両 MAG の
16S rRNA 遺伝子を用いた分子系統解析によって明ら

ヒト腸内 CO 酸化菌の詳細な解析については，原核生物ゲノムデータベース HumGut より，上記と同様の手

か に な っ た． 別 の 2 つ の CO 酸 化 菌 候 補 MAG の 16S

法で CODH 様配列を保持するゲノムを収集した．これ

rRNA 遺伝子は，炭酸固定に関わる Ni-CODH を有する

らゲノムの宿主細菌の系統的特徴およびその CO 代謝経

ことが知られる古細菌 Geoglobus acetivorans SBH6 と相路を予測するために，GTDB-tk v2.1.1 および Mashtree

同性 98.9 ％であったため，本種に近縁であると考えら

v1.2.0( Katz et al., 2019 )を用いた系統解析，eggNOG-れた．一方で，これら 2 つの MAG と本種ゲノムとのmapper v2.1.5( Cantalapiedra et al., 2021 ) に よ る 遺 伝

ANI 値(ゲノム間の相同性を示す)は，76 から 78 ％と子アノテーション，および METABOLIC v4.0( Zhou et

種の閾値 95 ％よりも低く，G. acetivorans SBH6 と近縁

al., 2022 )を用いた代謝解析を行った．
好気的 CO 酸化菌の探索については，Ni-CODH と異化菌候補 MAG には 16S rRNA 遺伝子が含まれていななる系統に属し，酸素，硝酸，過塩素酸と共役した CO

かったものの，CO 酸化能が報告されている真正細菌

酸化に用いられる Mo-CODH( King & Weber, 2007 )を，NCBI RefSeq および海洋原核生物ゲノム( the OceanDNA

Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115 と ANI 値 が96 ％以上と種の閾値よりも高かったため，本種由来

MAG Catalog )( Nishimura & Yoshizawa, 2022 )から相MAG と考えられた．

な新規 CO 酸化菌であると考えられた．5 つ目の CO 酸

同性検索により収集し，アミノ酸配列相同性 90 ％でク

特に，2 つの Thermolithobacter 属由来 MAG に含まれラスタリングした．CO 酸化菌をゲノム相同性 95 ％でクる Ni-CODH 遺伝子はそれぞれ 4 つの遺伝子クラスター

ラスタリングし，GTDB-tk v2.1.1 を用いて系統を予測を形成していた( Fig. 1 )．遺伝子クラスターの一つはした．

Ni-CODH の成熟因子遺伝子やヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでおり，CO 酸化能を有すると考えられた．別の遺結果および考察伝子クラスターは，アセチル CoA 合成酵素遺伝子を含んでいたため，炭酸固定に関与すると考えられた．その集積培養における新規 CO 酸化菌のゲノム解析

他 2 つの遺伝子クラスターにはそれぞれ，フェレドキシ

新規な CO 酸化菌の探索を目的とし，環境試料に CO

ン様タンパク質遺伝子と NAD(P)H -亜硝酸還元酵素大を添加した集積培養とそれらに対するメタゲノム解析をサブユニット遺伝子，そしてシステイン合成酵素遺伝子行った．静岡県慈雲寺温泉から採取された堆積物試料にとタウリン輸送 ATPase 遺伝子が含まれていたが，これ10 ％ CO を封入し，65℃で 5 日間静置培養した試料かららの生理学的機能は不明であった．他の MAG には，CO

抽 出 し た DNA を メ タ ゲ ノ ム シ ー ケ ン ス に 供 し た 後，

酸化に関わる遺伝子クラスターが検出されなかった．
本研究により，CO 雰囲気下での集積培養により極め

metagenome assembled genomes( MAGs )を構築した
結果，32 のクオリティーの高い MAG が得られた．そのてクオリティーが高い CO 酸化菌 MAG の構築に成功しうち 5 つの MAG から Ni-CODH 遺伝子が検出され，こた．すなわち本集積系は CO 酸化菌の選択培養に非常にれらには CO 酸化菌に由来する MAG が含まれている可

効果的であり，分離培養株の確立に至らなくとも MAG

能性が考えられた( Table 1 )．これら 5 つの CO 酸化菌を構築することでその系統や性状を明らかにすることが候補 MAG のうち，2 つの MAG は，ゲノム配列が未報可能な基盤技術として極めて有用であることが示された．

Table 1 The obtained MAGs containing Ni-CODH genes
No.

Completeness*1

Contamination*1# of Ni-CODH

Taxonomic assignments*2

1

88.6 ％

6.1 ％3

Desulfotomaculum kuznetsovii

2

91.5 ％

0.0 ％2

Geoglobus sp.

3

99.4 ％

1.1 ％5

Thermolithobacter sp.

4

95.4 ％

1.3 ％2Geoglobus sp.

5

100 ％

0.8 ％

4

Thermolithobacter sp.

*1: estimated by checkM, *2: inferred from rRNA-based or genome-based phylogenetic analyses－6－

始原的呼吸経路を繋ぐ一酸化炭素酸化菌コレクションの構築とその応用基盤

Fig.1

Ni-CODH gene clusters in Thermolithobacter-derived MAGs.
Arrows show coding regions and their directions. (A) Gene clusters of the MAG no. 3. (B) Gene clustersof the MAG no. 5. See Table 1 for MAG numbers.

鰻池からの新規 CO 酸化菌の分離と性状解析した( cyd–cox 領域)( Fig. 2A )．ここから，G301 株は水新規 CO 酸化菌の培養株を得るため嫌気的な CO 雰囲

素生成および酸素の還元と CO の酸化を共役する可能性

気下での集積培養に供した鰻池の堆積物サンプルにおいが示唆された．G301 株は好気呼吸鎖の他に，硝酸レダて，CO 消費と水素生成がガスクロマトグラフィーにクターゼ遺伝子( nar )( Stolz & Basu, 2002 )を有し，硝よって検出された．そこで集積培養液を好気的なプレー

酸還元も CO の酸化と共役すると考えられた( Fig. 2B)．

ト培養に供したところ，コロニー形成が観察され，そのcoo–ech 遺伝子クラスターは G301 株および全ての P.

うちの 1 コロニーを単離することで培養株 G301 を確立した．本培養株を集積培養と同様の手法で培養したとこ

thermoglucosidasius に，cyd–cox 領 域 は Parageobacillus
genomosp. 1 NUB3621 ，Saccharococcus thermophilus

ろ，CO 消費と水素生成が検出されたことから，G301 株

DSM 4749 ，P. toebii DSM 14590 ，Geobacillus sp. 44C ，が CO 酸化菌の培養株であることが確認された．コア遺伝子に基づく系統樹において，G301 株は Parageobacillus

Geobacillus sp. NFOSA3，および P. galactosidasius DSM
18751 に 存 在 し た( Fig. 2B)．NCBI RefSeq/GenBanktoebii ，Parageobacillus yumthangensis ，Parageobacillus( Sayers et al., 2022 )に登録されている原核生物の中で，galactosidasius および 5 株の未分類 Geobacillus 属細菌と単系統群を形成した．これらの株との間の ANI 値は種株のみであった．

の閾値である 95 ％( Jain et al., 2018 )を上回った．G301
株は Ni-CODH とそのアクセサリー遺伝子，およびヒドロゲナーゼ遺伝子からなる遺伝子クラスター( coo–ech

Ni-CODH と Mo-CODH の両方を有した分離株は G301
codh の在・不在と対応するゲノムの違いがあるか調べるために，Parageobacillus 属細菌のゲノムを比較した．
まず，高い ANI 値( > 95 ％)を示したが，codh の在・遺伝子クラスター)を有した( Fig. 2A )．Ni-CODH に

不在が異なった G301 株，P. toebii DSM 14590，および

加えて，CO デヒドロゲナーゼ( CODH )にはモリブデ
ン含有 CODH( Mo-CODH )がある．Mo-CODH は，モ

Geobacillus sp. WCH70 のゲノムを比較した．その結果，ゲノム全体のシンテニーは保存されていた．codh を持リブデンと銅からなる活性中心を持ち( Dobbek et al.,つゲノムと持たないゲノムの間で codh の周辺領域を比1999 )，酸素，硝酸塩，過塩素酸塩といった末端電子受

較した．その結果，coo–ech 遺伝子クラスター，cyd–cox

容 体 を CO 酸 化 と 共 役 さ せ る( King & Weber, 2007;

領域いずれについても遺伝子クラスター内のシンテニー

Myers & King, 2017)．Ni-CODHとは異なり，Mo-CODH

および周辺の遺伝子領域は保存されており，両ゲノム領を持つ菌は好気性菌に偏在する( King & Weber, 2007 )．

域は周囲のゲノム領域の変化を伴わずに挿入または欠失

本 菌 は，Ni-CODH に 加 え て Mo-CODH を コ ー ド す る

していると示唆された．codh を持つゲノムと持たない

cox 遺伝子群も有した．cox およびその成熟因子は遺伝子クラスターを形成し，cox の上流にはシトクローム bd オ

ゲノムの間で遺伝子の在・不在を比較した．その結果，キシダーゼ遺伝子( cyd )( Winstedt et al., 1998 )が存在

coo–ech 遺伝子クラスターを有するゲノムのみに存在した遺伝子は 13 個存在した．このうち 12 遺伝子が coo–ech

－7－

吉

Fig. 2田天

士Comparison of the G301 genome with those of its close relatives.
(A) The organization of the coo–ech gene cluster and the cyd–cox region of G301. Arrows show coding regions and directions.
The coo and cox gene clusters are colored in black, while the ech and cyd gene clusters are colored in grey. (B) Summary of thepresence and absence of codh and genes for respirations that can be coupled with CO oxidation in Parageobacillus genomes.
Top panel: presence and absence of coo, ech, cox, cyd, and nar genes. Bottom panel: presence and absence of respiratorycomplex genes other than cyd. Detected and undetected genes are shown as dark grey and open boxes, respectively.

－8－

始原的呼吸経路を繋ぐ一酸化炭素酸化菌コレクションの構築とその応用基盤

遺伝子クラスターに含まれた．1 遺伝子は細胞壁合成にことを示唆しており，系統樹において属レベルの単系統関与するアンデカプニルジホスファターゼ( El Ghachi

群であっても，CO 酸化菌が点状分布を形成する要因とet al., 2004 )をコードした．cyd–cox 領域保有ゲノムのみに存在する遺伝子は 3 個あり，全て cyd–cox 領域に含なっていることを示している．

まれた．codh の獲得，欠失はゲノムおよび CO 酸化以外

琵琶湖湖底からの新規 CO 酸化菌の分離と性状解析
さらに分離培養株を得るため，水深 70 m の琵琶湖湖の細胞機能にほとんど影響しないと示唆された．
G301 株の CO 酸化能を培養実験によって調べた結果，底堆積物サンプルを嫌気的 CO 雰囲気下で集積培養したCO が存在する全ての培養条件で CO の酸化が生じた

結果，CO 消費と水素生成が検出された．そこで本集積( Fig. 3A ，3D，3G)．酸素も硝酸も存在しない培養では，培養液を好気的にプレート培養し，形成されたコロニー

対数増殖後期以降に CO の酸化が観察され( Fig. 3A ，の単離により培養株を確立した．本培養株 B1-1 株は3C)，CO 消費量，H 2 生成量および気相への CO2 放出量

CO 酸化能と水素生成能が検出された．16S rRNA 遺伝のモル比は 1.00:1.03:0.47 であった．細胞収量は CO 存

子部分配列相同性に基づくと，本培養株は CO 酸化能の在 下 の 培 養 で CO 非 存 在 下 よ り も 3.07 倍 大 き か っ た

報告がない Thermolongibacillus altinsuensis と相同性が( Fig. 3C)．酸素存在下および硝酸存在下では，定常期99 ％以上であった．本属は好気性，好熱性，内生胞子に CO の酸化が生じた( Fig. 3D，3F，3G，3I )．酸素存形成能を有する桿菌である．本培養株から抽出した

在下では，CO 消費量，酸素消費量および気相への CO2

DNA を用いてゲノム解読を行った結果，352 配列のス

放出量のモル比は 1.00:0.95:0.60 であった．酸素消費量

キャフォールドから成る全長 2.9 Mbp のゲノムが得ら

および気相への CO2 放出量は，CO 存在下で CO 非存在

れ，T. altinsuensis DSM24979( GCA_004341205.1 )との下の 1.46 倍と 2.80 倍であった．硝酸存在下では，CO 消

ANI 値は 99 ％以上であった．そのため B1-1 株は本種と費量，硝酸消費量，気相への CO2 放出量および亜硝酸

同定された．B1-1 株のゲノムの GC 含量は 41.3 ％であり，生成量のモル比は 1.00:1.79:0.60:1.63 であった．硝酸消CDS 数は 2,933 であった．B1-1 株は，Ni-CODH 遺伝子

費量，気相への CO2 放出量および亜硝酸生成量は，CO群を含む coo-ech 遺伝子クラスターを 1 組のみ有してい存在下で CO 非存在下の 1.85 倍，3.20 倍，および 1.67

たため( Fig. 4 )，本遺伝子群が B1-1 株の CO 酸化能に倍であった．酸素存在下，硝酸存在下いずれも CO 存在寄与すると考えられた．

下と非存在下の間で細胞収量と増殖速度に有意な差は確以上の結果は，既報の非 CO 酸化菌と同種であったと認されなかった( Fig. 3F，3I )．硝酸存在下で CO の酸

しても，その中には CO 酸化能を有する個体群が存在す化に寄与する CODH を調べるために，G301 株とアミノる可能性があることを示している．本研究により，これま

酸配列相同性 70 ％以上の Ni-CODH を持ち，Mo-CODH

で見落とされてきた CO 酸化菌の多様性が現在も環境試を持たない P. thermoglucosidasius NBRC 107763 株を同料中やデータベース中に埋没している可能性が示唆され様の条件下で培養した．その結果，P. thermoglucosidasiusている．本培養株以外にも京都大学理学部植物園内の淡は硝酸存在下で CO の酸化を行わなかったため，G301

水池堆積物からも CO 酸化能を有する新属候補培養株が，株は硝酸存在下では Mo-CODH を用いた CO の酸化をそして琵琶湖湖底堆積物試料より P. thermoglucosidasius

行うと推察された．

の分離株が得られており，現在それらのゲノム性状と生微生物による CO 酸化は，多くの生物にとって有毒な理性状解析を進めている．

CO の除去剤として機能することに加えて地球規模の炭素循環に寄与するため，CO 酸化菌は生態において重要

嫌気的 CO 酸化の鍵酵素 Ni-CODH の細菌分類群・環境な微生物群と認識されてきた．真正細菌と古細菌のいずにおける分布れにおいても，CO 酸化菌は属レベルの単系統グループ

CO は大気中に微量ガスとして存在するが，嫌気的環であっても非 CO 酸化菌と姉妹関係を示す．本研究では，境下における CO の発生源については謎が多く，火山性

新規分離株である Parageobacillus sp. G301 株が，これま熱水環境における著者らの研究例( Omae et al., 2021,

で報告されていなかった嫌気的(水素生成型)および好2019; Yoneda et al., 2015 )を除き，環境における分布を気的な CO の酸化のいずれも可能であることを実証しはじめとする嫌気性 CO 酸化菌の生態は未解明であった．CO 代謝において多機能性を有する新規分離株の発た．そこで，公共メタゲノムにおける Ni-CODH の網羅

見は，多様な CO 代謝を有する CO 酸化菌の研究を加速的探索を介して，Ni-CODH 系統( Inoue et al., 2019a )させ，微生物の多様性についての理解を広げることになとゲノム分類群，生物圏分布などの多次元情報を統合し，ると期待される．比較ゲノム解析では，Parageobacillus

大規模かつ高深度なバイオインフォマティクス解析を属において CO 酸化遺伝子がアクセサリー遺伝子である

行った．

－9－

吉

Fig. 3田天

士

Cultivation of G301 and Parageobacillus thermoglucosidasius
The presence and absence of CO, O2 , and nitrate under the initial conditions are shown in parentheses in each panel.
Plus (+) and minus (−) symbols indicate presence and absence of the indicated substrates, respectively. (A) Amountof H 2 , CO, and CO2 in the culture with CO but without O2 and nitrate for CO oxidation. (B) Amount of H 2 , CO, andCO2 in the culture without CO, O2 , and nitrate as the control for (A). (C) Growth of G301 under the conditions
described in (A) and (B). (D) Amount of O2 , CO, and CO2 in the culture with CO and O2 but without nitrate forcoupling of reduction of O2 and oxidation of CO. (E) Amount of O2 , CO, and CO2 in the culture with O2 but without
CO and nitrate for the control of (D). (F) Growth of G301 under the conditions described in (D) and (E). (G) Amountof CO, CO2 , nitrate, and nitrite in the culture with CO and nitrate but without O2 for coupling of reduction of nitrate
and oxidation of CO. (H) Amount of CO, CO2 , nitrate, and nitrite in the culture with nitrate but without CO and O2 forthe control of (G). (I) Growth of G301 under the conditions described in (H) and (I). Plots represent the means of
three biological replicates. Thin vertical lines represent standard deviations.

－ 10 －

始原的呼吸経路を繋ぐ一酸化炭素酸化菌コレクションの構築とその応用基盤

Fig. 4Comparison of Ni-CODH gene clusters and their flanking regions in Thermolongibacillus altinsuensis
and other bacteria.
Arrows show coding regions and their directions. Vertical blocks between given two genomes represent genomic
regions with nucleotide identity higher than 70 ％ . M. th, P. th, and T. al represent Moorella thermoacetica Hama-1,
Parageobacillus thermoglucosidasius DSM2542, and T. altinsuensis DSM24979, respectively.

MGnify タンパク質データベースと NCBI データベー

Ni-CODH 系統は代謝経路ではなく微生物叢の組成にスを用いて Ni-CODH 様配列を収集し，90 ％のアミノ酸よって決定されることを示唆した．ごく最近，様々な土

配列相同性にて配列クラスタリングを行った．得られた

壌環境中において嫌気的な CO の酸化活性が検出される

2,462 個の Ni-CODH 配列クラスターは，分子系統解析

ことが報告され( DePoy & King, 2023 )，著者らの大規によって 1 つの新たな系統群を含む 8 つのサブグループ

模解析が示す Ni-CODH 遺伝子の遍在性が他の環境におに分類することができた(Fig. 5A )．これらのうち 1,653

いても実験的に確認されつつある．

個の Ni-CODH 配列クラスターはゲノム情報に紐付けら

以上の研究成果は，Ni-CODH に関する情報資源を大れ，バクテリア 55 門・アーキア 11 門( GTDB による分幅に拡張し，遺伝子資源として活用していくための基盤類群)に渡る幅広い原核生物に由来した．さらに，1,424と な る と 期 待 さ れ る． 本 成 果 を ま と め た 論 文 は，

個の Ni-CODH 配列クラスターには約 27,000 ものメタゲ

MGnify データベース論文( Richardson et al., 2023 )内ノム由来配列が含まれており，全クラスターの 60 ％がにおいて，メタゲノム情報を利用した立体構造予測 AI

メタゲノムアセンブリに見出された．これらの配列はいである AlphaFold2( Jumper et al., 2021 )やメタゲノム

ずれも海洋などの水圏環境，バイオリアクタなどの人工由来 PET 分解酵素( Eiamthong et al., 2022 )とともに環境，ヒトを含む哺乳動物の微生物叢由来のものであり，紹介されるなど国際的に高い評価を受けている．

CO を利用した代謝経路が火山性環境などの CO 発生源

一方，本解析を通して，CO 酸化菌のマーカーとなるの存在に関わらず普遍的に存在することを示唆した．水

ヒドロゲナーゼと共起する Ni-CODH はメタゲノムデー

圏環境及び人工環境中では幅広い Ni-CODH 系統が見出

タ中にはほとんど見つからなかった．このことは熱水環されたが，ヒト微生物叢では特定の系統に限定されてい境における著者らの過去の研究例( Omae et al., 2019,た( Fig. 5B)．ヒト微生物叢における Ni-CODH 所有微2021 )とも一致しており，多くの環境で CO 酸化菌が生物の 70 ％が Firmicutes_A 門( GTDB による分類群)“rare biosphere”として存在することを示唆する．ビッであり，水圏環境および人工環境に比べて分類群の多様グデータが示すこれらの事実は，奇しくも本研究課題の性が低かった( Fig. 5C)．一方で，Ni-CODH 遺伝子近核である独自の技術による CO 酸化菌の分離・培養の重傍のゲノムコンテクストから予測される関連代謝経路の要性を浮き彫りにし，上述した新奇 CO 酸化菌分離株コ

分布は生物圏に関わらず類似していた．これらの結果は，レクションの構築や集積培養系を利用したゲノム再構築

Ni-CODH が多様な微生物叢に存在する普遍的な酵素でが極めてオリジナリティの高い研究成果であることを裏

あ る が， そ の 系 統 は 生 物 圏 に よ っ て 偏 っ て お り，付けるものであった．

－ 11 －

吉

Fig. 5田天

士

Biome-specific distribution of Ni-CODH and its owner.
(A) A phylogenetic tree of Ni-CODH clusters mapped along the two circles showing the presence of MGnify (outer)and NCBI RefSeq/GenBank (inner) sequences in each cluster. An unrooted phylogenetic tree was constructedusing an alignment of centroid sequences from the 2,462 Ni-CODH clusters on 90 ％ amino acid sequence identity.
The major clades A to H are designated. The black circles on the branches separating the major clades or subclades
indicate their bootstrap value of > 0.95 support). (B) Clade compositions of Ni-CODH clusters in the three major
biome categories: "engineered", "environmental (aquatic)", and "host-associated". (C) Compositions of phylum-leveltaxonomies in three major biome categories annotated by co-occurrence of biome and genome information.

ヒト腸内および海洋表層マイクロビオームにおける CO

CO を恒常的に生産するが( Ryter & Choi, 2009 )
，ヒト

酸化菌

体内における CO 消費能は十分に調べられていない．こ上述の通りさまざまな生物圏微生物叢において

こでは，ヒト腸内細菌叢において CO を利用する菌( CO

Ni-CODH の普遍性が明らかとなったが，環境や宿主生菌)の存在有無を確かめるため，ヒト腸内原核生物ゲノ物における CO 酸化菌とその CO 代謝の機能理解は限定

ムデータベース HumGut( Hiseni et al., 2021 )において的である．ヒトはヘム分解の副産物として自身に有毒なNi-CODH 保有菌の多様性と予測される代謝を調査した．

－ 12 －

始原的呼吸経路を繋ぐ一酸化炭素酸化菌コレクションの構築とその応用基盤

その結果，30,609 の代表ゲノムのうち 1,302 ゲノムがNi-CODH 遺伝子近傍のゲノムコンテクストを保有する

Ni-CODH を 1 個以上保持し，それらゲノムは腸内特異細菌系統が存在し，CO の利用経路について培養株を用

的 な 細 菌 系 統 で あ る Firmicutes 門 Oscillospirales 目

いた生理学的研究が必要である．総じて，ヒト腸内細菌( 31.6 ％)，Lachnospirales 目( 29.1 ％)，および腸内や口叢の CO 利用菌は腸内において有毒な CO の蓄積を防ぐ腔で見られる Veillonellales 目( 26.3 ％)等に属することと共に，独自の CO 代謝経路を発達させた可能性がある．

が明らかとなった( Fig. 6A )．これは，一部の腸内細菌

CO 菌の理解が我々の身近な健康への理解に繋がることが CO 利用能を保持し，ヒト体内の CO 消費に寄与してが期待される．

い る こ と を 示 唆 す る． さ ら に， 代 謝 解 析 に よ っ て

海洋表層では藻類への光照射および有機物の分解にNi-CODH 保有腸内細菌がユニークな CO 代謝経路を保よって CO が生成し，その量は年間 30 Tg C とも試算さ持する可能性が示された．例えば，667/1,302 のゲノムれる( Conte et al., 2019 )．海洋表層では，Mo-CODH を

は Ni-CODH を反応の鍵酵素とする炭素固定経路(WLP,

保有する好気性微生物群によって CO が利用されている

Wood Ljungdahl Pathway )を保存したが，このうち 635と考えられる．海洋から 5 種の分離株において，CO のゲノムは，CO2 の還元によりギ酸を生成するギ酸脱水素

酸化能が知られている．一方，近年のメタゲノム解析の酵素を欠損しており，本酵素は WLP におけるメチル基発展により，海洋より 8 門 98 属 166 種のメタゲノム由来

合成に重要である．しかし，例えば，Lachnospirales 目

ゲノム( MAG )に Mo-CODH 遺伝子が見いだされていWLP 保有ゲノムはギ酸脱水素酵素を欠損しているが，る．ただし，探索された MAG 数は十分でない．加えて，

本ギ酸生成経路の代替としてピルビン酸からギ酸を生成

Mo-CODH 遺伝子の類似遺伝子の扱いなどの課題も残さするピルビン酸:ギ酸リアーゼを保存し，解糖系を通じれ( Lappan et al., 2022 )，海洋の CO 菌の多様性が正確て生成したピルビン酸を利用していると考えられた．こに判断されていなかった．そこで，海洋 CO 菌の多様性

れは，本来独立栄養経路である WLP が，一部の腸内細を明らかにするため，50,000 個以上の高品質 MAG が登菌において従属栄養におけるアセチル CoA 生成経路と録された the OceanDNA MAG Catalog( Ocean_MAGs )して利用されていることを示唆する( Fig. 6B)．また，

から CO 菌を探索した．CO 菌の探索に用いるマーカー

Veillonella 目 等 に お い て， 既 知 の も の と は 異 な る

遺伝子を精査するために，RefSeq に登録された CoxL のFig. 6

Distribution of Ni-CODH gene and a Ni-CODH-mediated divergent metabolism in the human gut
microbial MAGs.
(A) The total numbers of MAGs and Ni-CODH-encoded MAGs. The number of MAGs were shown for all theorders from which Ni-CODH-encoded MAGs were derived. (B) A divergent Wood Ljungdahl Pathway (WLP)
estimated from human gut MAGs. The MAGs lack the gene for Formate dehydrogenase, which contributes tothe conversion of CO2 to formate for the methyl branch formation in WLP. Instead, the MAGs carry the genes
for Pyruvate formate lyase (Pfl), which supplies formate converted from the end product of glycolysis, pyruvate.

－ 13 －

吉田系統と活性中心を調べた．相同性検索により，1,796 の天士

細菌，クレード 5 は Pseudomonadota 門細菌のゲノムにCoxL が検出され，これらは 291 のクラスターに分かれ存在した．既報の CoxL 活性中心モチーフ( AYXCSFR )た．CoxL は大きく 5 群に分かれたため，これらをクレー( King & Weber, 2007 )の類似モチーフを探索した結果，

ド 1 – 5 とした( Fig. 7 )．各クラスターの代表配列につ7 種類の活性中心が確認された．活性中心も CoxL の系

いて，代表配列のクレードと代表配列を有したゲノムの統ごとにまとまる傾向が見られた( Fig. 7 )．そこで，系統は対応しており( Fig. 7 )，これは先行研究の報告

Ocean_MAGs から，7 種類の活性中心いずれかを含むと矛盾しない( Cordero et al., 2019 )．クレード 1 CoxL

form I CoxL を持つ CO 菌ゲノムを探索した．その結果，は Halobacteriota 門古細菌，クレード 2 は Actinomycetota

52,325 ゲノムのうち 1,792 ゲノムが CO 菌であった．こ門 細 菌， ク レ ー ド 3 は Actinomycetota 門 細 菌 お よ び

れ ら の 海 洋 由 来 CoxL の 活 性 中 心 グ ル ー プ は 3 種 類

Myxococcota 門細菌，クレード 4 は 9 門の細菌および古( AYRCSFR ，AYACSFR ，SYRCSFR )のみ確認された．

Fig.7

Phylogenetic relationships of Mo-CODHs found from NCBI RefSeq. The midpoint-rooted tree is constructedusing an alignment of 887 centroids of proteins which are homologous to Mo-CODH. The clades 1 through 5 of
Mo-CODH are highlighted in grey. The inner circle is colored according to the phylum classification of the
genome which encodes the centroids. Phyla containing less than 10 genomes are shown as "Other bacteria andarchaea". The number of genomes in each phylum is shown in parentheses. The outer circle is colored according
to the active site motifs of the centroids. The number of centroids with each active site is shown in parentheses.
The clades of the proteins without sequence motifs similar to the active site motifs of Mo-CODHs are collapsed.

－ 14 －

始原的呼吸経路を繋ぐ一酸化炭素酸化菌コレクションの構築とその応用基盤

Ocean_MAGs から検出された CO 菌と既知海洋 CO 菌

しくも本研究課題の核である独自の技術による CO 酸化

ゲノム(以下，非 Ocean_MAGs )は，397 種に分かれた．

菌の分離・培養の重要性を浮き彫りにした．また腸内細231 種は Ocean_MAGs にのみ，122 種は非 Ocean_MAGs

菌における Ni-CODH を反応の鍵酵素とする従属栄養にに の み，44 種 は Ocean_MAGs と 非 Ocean_MAGs の 両

おけるアセチル CoA 生成経路を見出し，海洋における方に含まれた．CO 菌は 10 門 185 属 397 種に分かれ，本好気的な潜在的海洋 CO 菌のデータベースを拡張した．

研究により新たに 2 門，87 属，231 種の潜在的海洋 CO

以上の研究成果は，Ni-CODH に関する情報資源を大幅

酸化菌のデータベースを拡張した．これにより海洋におに拡張し，遺伝子資源として活用するだけでなく，COける CO 酸化菌の系統や分布が明らかとなり，ゲノム情

酸化菌の代謝と周囲に及ぼす生態学的機能の解明に向け

報から CO 酸化菌の代謝と周囲に及ぼす生態学的機能のた基礎となると期待される．

解明に向けた基礎となる．

要本助成で得られた研究結果の報告

約

CO 酸化菌は，Ni-CODH と ECH を用いてエネルギー保存を行う．そのため CO 酸化菌は CO を除去し高効率に水素を生成する微生物触媒としての利用が期待されている．本研究では，確立した気相を CO に置換した集積培養法を用い，未記載種の分離探索を推進し，遺伝子資源としての培養株コレクションを拡充することを目的とし た． さ ら に， メ タ ゲ ノ ム デ ー タ ベ ー ス 上 の 未利用
CODH 遺伝子の多様性解析を行った．まず，CO 雰囲気
下での集積培養により高品質な CO 酸化菌 MAG の構築に成功した．すなわち本培養系により CO 酸化菌が効果的に集積され，分離培養株の確立に至らなくとも，遺伝情報をえてその系統や性状を明らかにすることが可能な基盤技術として極めて有用であることが示された．鹿児島県鰻池湖底堆積物より水素生成型 CO 酸化能を有する
Parageobacillus 属細菌 G301 株の分離に成功した．G301
株は Parageobacillus toebii と同種と判断されたが，G301
株のみが CODH/ECH を有した．さらに G301 株ゲノムには好気型 CODH の遺伝子群がコードされており，嫌気型および好気型 CODH の両方を有した．培養実験により，これまで報告されていなかった嫌気的(水素生成型)および好気的な CO の酸化のいずれも可能であることを実証した．また，水深 70 m の琵琶湖湖底堆積物サ
ンプルより CO 酸化能の報告がない Thermolongibacillus
altinsuensis とゲノム相同性が 99 ％以上で，CO 酸化能を有する分離株を得た．本株は，Ni-CODH 遺伝子群を含む coo–ech 遺伝子クラスターを保有し，CO 酸化菌が含まれる細菌分類群を拡張した．
一 方， 公 共 メ タ ゲ ノ ム に お け る 網 羅 的 探 索 により
Ni-CODH がバクテリア 55 門・アーキア 11 門に渡る幅広い原核生物に分布した．海洋などの水圏環境，バイオ
リアクタなどの人工環境，ヒトを含む哺乳動物の微生物叢など多様な微生物叢に存在する普遍的な酵素であるが，水素生成型 Ni-CODH はメタゲノムデータ中にはほとんど見つからなかった．CO 酸化菌は極めて少なく奇口頭発表1) 今浦由就，足立夕花，岡元俊輔，日野太貴，井上真男，
神川龍馬，左子芳彦，吉田天士．2021．一酸化炭素利用能を持つ新規 Parageobacillus 属細菌分離株の生理・ゲノム
性状解析．日本微生物生態学会第34回大会(2021年10月
30日–11月2日，オンライン)
2) 井上真男，大前公保，神川龍馬，吉田天士，左子芳彦．
2021．CO デヒドロゲナーゼは生物圏によって異なる系統
分布を示す．第22回極限環境生物学会年会(2021年11月
20日，オンライン)
3) 今浦由就，足立夕花，岡元俊輔，日野太貴，井上真男，
神川龍馬，左子芳彦，吉田天士．2021．常温湖底堆積物より分離された好熱性 Parageobacillus 属細菌の一酸化炭
素利用能分析．令和3年度 日本水産学会近畿支部例会(2021年12月5日，オンライン)
4) 今浦由就，西門航平，藤原健太郎，山本圭吾，神川龍馬，吉田天士．2022．海洋表層の炭素，エネルギー循環を駆動する好気的一酸化炭素酸化菌の探索．日本微生物生態学会第35回大会.(2022年10月31日–11月3日，札幌
市)5) 今浦由就，神川龍馬，吉田天士．2023．
“一酸化炭素を食べる”海洋原核生物の系統および分布．令和5年度 日本水産学会大会春季大会.(2023年3月28日–3月31日，品川区)
原著論文
1) Inoue, M., Omae, K., Nakamoto, I., Kamikawa, R., Yoshida,T., Sako, Y. 2022. Biome-specific distribution of Ni-containing
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－ 15 －吉田その他
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(2022年10月31日–11月3日，札幌市)
2) 西田志穂, 大前公保, 井上真男, 左子芳彦, 今髙里莉, 神川龍馬, 吉田天士. 2022. 水圏環境中に潜在する水素生成型一酸
化炭素酸化菌の探索とゲノム特性の解明. 日本微生物生態学会第35回大会.(2022年10月31日–11月3日，札幌市)
3) 鈴木晟太, 今浦由就, 今高里莉, 西田志穂, 神川龍馬, 吉田天士. 2022. 淡水低湿環境からの水素(H 2)生成型一酸化炭素(CO)酸化菌の分離及び性状解析. 日本微生物生態学会第35回大会.(2022年10月31日–11月3日，札幌市)
4) Yuka Adachi Katayama, Ryoma Kamikawa, Takashi Yoshida.
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Microbiome Consortium Congress 2022.(2022年11月9日,
神戸市)

謝

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心から御礼申し上げます．また，
京都大学海洋分子微生物学研究室の学生諸子に感謝の意を表します．

文

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High-throughput profiling of microbial genomes for functional
traits, metabolism, biogeochemistr y, and community-scale
functional networks. Microbiome 10:33.

－ 18 －

IFO Res.Commun. 37
19-24, 2023

タイムラプス・シングルセル発現解析の開発による
分裂酵母胞子の休眠と発芽の分子機構
佐

藤

政

充

早稲田大学理工学術院(先進理工学部生命医科学科)〒162-0056

東京都新宿区若松町2-2

早稲田大学先端生命医科学センター

Dormancy breaking of fission yeast spores revealed by establishment oftimelapse single cell RNA-seq analyses
Masamitsu Sato
Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University
2-2 Wakamatsucho, Shinjuku-ku, Tokyo 162-0056
How cells wake up from dormancy remains enigmatic, although it has long been known that Schizosaccharomyces
pombe spores break dormancy in response to glucose uptake from their environment. Expression profiling upondormancy breaking must be a clue for the question. As RNA-seq profiles made from bulk spores may not display
sufficient temporal resolution, we established a system to perform single cell RNA-seq (scRNA-seq) to capture
the transcriptional landscape of a single spore upon dormancy breaking. scRNA-seq was performed over 64 single
spores in dormancy or germination, and each single-cell transcriptome was mutually compared to predict howtranscriptomes changed over time upon dormancy breaking. Thus, each transcriptome was aligned along the'Virtual Timeline' and a histone H3 gene was highlighted as a differentially expressed gene upon dormancy
breaking. The data highlighted a possibility that chromatin dramatically change in accordance with progression ofgermination.
Key words: fission yeast, dormancy, germination, single-cell RNA-seq, histone

打破して，体細胞分裂周期に突入する．この休眠打破の緒言

ステップを発芽と呼ぶ．これまで多くの基礎研究は細胞の増殖過程や性分化の過程に焦点を当てて解析がなさ

真核細胞は周囲の環境における栄養源などを認識して，休眠と増殖を適宜選択する生存戦略をとっている．

れ，その結果，多くの分子機構が働いていることが明確にされてきた．

分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe は通常一倍体で生また，性分化からの脱却にあたる，胞子の発芽に関す

育し，栄養源が豊富な環境下では体細胞分裂周期によっる形態学的な観察は以前よりおこなわれている．分裂酵て増殖を行うが，培地中の栄養源が枯渇すると，増殖を母の胞子は明視野顕微鏡下で輝度の高い球形の形態を示停止して性分化を開始する．性分化の過程では増殖を停すが，顕微鏡下で視認できる最初の発芽の兆候は，細胞止した 2 個の細胞が接合して二倍体を形成した後，減数の輝度が落ち暗化することであり，次に胞子サイズの増分裂を経て，一倍体の胞子を形成する．胞子は栄養源が大，その後，特徴的な「芽」すなわち発芽突起の形成に枯渇した状況で休眠した状態で存在し，生存を維持する．

よってそれまでの完全な球形から対称性を失った形状へ

ふたたび環境中に栄養源が与えられると，胞子は休眠をと変化する( Padilla et al., 1975; Johnke & Padilla, 1979;
Hatanaka & Shimoda, 2001 )( Fig. 1 )．また，栄養源をE-mail: masasato@waesda.jp
共同研究者:露崎 隼，正垣佑樹(早稲田大学大学院先進理工学研究科)，
角井康貢(早稲田大学高等研究所)

与えて発芽を誘導すると，やがて RNA やタンパク質の量が増加することが生化学的に示されている( Nurse &Thuriaux, 1977 )．

－ 19 －

このような形態変化は以前より知られているものの，

佐

Fig.1

藤

政

充

From dormancy breaking of fission yeast to germination, which leads to entry into mitotic cycles
When dormant spores break dormancy, they accompany several morphological changes, although there arealmost no changes at the initial stage of germination. In early stages of germination, spores get darkened inappearance, followed by an increase of the cell size. In late stages of germination, germination projection isformed to break the morphological symmetry and eventually enter mitotic cell cycles.

細胞の内部でどのような現象が起きているのか，発芽は理を実施した．基準を満たしたものに対して NGS 解析

どのような分子の働きで起きるのか，発芽を促す分子機すなわち scRNA-seq を実施した．発芽誘導前・誘導後

構については知見が大きく不足している．分子機構につあわせて 64 個の胞子を 1 細胞ごとに単離した．

いて先行する知見が不足している現状において，これを解明するためには，休眠から発芽し始めた時期の細胞をタイムラプス・シングルセル発現解析法

集めてトランスクリプトームなどの遺伝子発現プロファ

本解析は，産総研オープン・イノベーション・ラボラ

イルを作成することが一つの突破口となると思われる．

トリーとの共同研究として実施した．詳細な実験手法は

しかし，培地に栄養源を与えることで胞子の発芽を人為Tsuyuzaki et al., 2020 に記載した．簡潔にまとめると，的に誘導しても発芽のタイミングは個々の細胞で異なる

64 個それぞれからトランスクリプトームを作成し，次個体差があるため，質の良いトランスクリプトームを作

元削減解析( Monocle 解析)( Trapnell et al., 2014 )に成するためには多数の細胞を同調的に発芽させるというかけ，これらの 1 細胞トランスクリプトームを 2 次元平困難な問題に直面した．そこで本研究では 1 細胞単位で面上にプロットした．

の RNA シーケンシング(以下，scRNA-seq; single-cell
RNA-seq )を実施した．そこから得られた実験結果を

ヒストン H3 遺伝子の遺伝子破壊・GFP による可視化

もとに，さらに，休眠および発芽期の胞子におけるクロ分裂酵母が有するヒストン H3 遺伝子 hht1, hht2, hht3

マチン状態を可視化するための ATAC-seq( Assay forの 3 種類をそれぞれ破壊した hht1∆, hht2∆, hht3∆ 株を作

Transposase-Accessible Chromatin-sequencing )解析手製した．遺伝子破壊株の作製は一般的な方法に準拠した法を確立し，発芽の分子機構に迫ることを目指した．

( Bähler et al., 1998 )．G418 耐 性 遺 伝 子 kanR を hht1 な
ど各遺伝子のコード領域に相同組換えを利用して挿入す

実験方法

る形で置き換えた．Hht1 タンパク質の細胞内局在の可視 化 の た め に は，hht1 コ ー ド 領 域 の 3′ 末 端 領 域 に

分裂酵母胞子の単離と scRNA-seq 手法の確立

GFP-kanR を挿入する遺伝子ノックインを実施した．

細川正人博士・竹山春子博士との共同研究をおこない実施した．詳細な実験手法は Tsuyuzaki et al.( 2020 )にクロマチン状態の可視化
分裂酵母のヌクレオソーム状態を可視化するために，記載した．簡潔にまとめると，分裂酵母( 972, 975 由来株)における胞子壁の合成酵素である β グルカンシンター

ATAC-seq 法を実施した．休眠胞子，発芽誘導後の胞子ゼ Bgs2( Liu et al., 2000 )の変異体を作製し(Pnmt41-bgs2( 1 時間・3 時間)，増殖期の細胞を準備し，先行研究の株)，これを野生型のかわりに使用した．シングルセル

方 法 に 従 っ て 実 験 を 行 っ た( Buenrostro et al., 2015;の単離は，顕微鏡下で視認しながらマイクロニードルでSchep et al., 2015; Lei et al., 2020 )． 細 胞 に 対 し て Tn5

吸い取り，直後にマイクロチューブ内に移し，細胞破砕

transposase を作用させ，断片化された DNA を PCR 増に続いて RNA 採取へと進んだ．RNA 採取後に，オリゴ

幅して NGS 解析を行い，そのリード配列を分裂酵母ゲ

dT 配列を利用した RT-PCR 反応をおこなった．この増ノムにマッピングし，カバー率( read coverage )を測

幅の様子をキャピラリー型電気泳動装置によって確認

定した．

し，増幅が一定量認められるかどうかで判断して品質管－ 20 －

タイムラプス・シングルセル発現解析の開発による分裂酵母胞子の休眠と発芽の分子機構

結果と考察
仮想的時間軸の設定
本研究では発芽の最初期に発現する遺伝子を検索し，その中から発芽を誘導するために必須の遺伝子や，発芽の進行に連動した発現を示す遺伝子を発見することを目指した．したがって，休眠を打破した直後，発芽の最初期の細胞を狙って単離して，その scRNA-seq をおこな
うことが望まれた．しかし，実際にシングルセルの単離に使用するような低倍率で広視野な顕微鏡下では，発芽の初期に見られるような胞子細胞の輝度の暗化を見いだ
すことは出来なかった．仮にそれが見られたとしても，それに先立つような発芽の最初期の胞子を見つけ出すための指標としては確立していないため，これらのように胞子の見た目で発芽のステージを判断してそのシングル

Fig. 2セルを単離するのは合理的ではない．
そ こ で， 本 研 究 の 基 盤 と な っ た 我 々 の 先 行 研 究( Tsuyuzaki et al., 2020; 2021; 露崎ら，2021 )では，顕微
鏡下で胞子細胞の発芽のステージを判定してからシング
ルセルを単離するのではなく，まずはステージの如何に関わらず多数のシングルセルを単離したうえで，それらのトランスクリプトームを作成して比較したうえで，どれが発芽の最初期の細胞に由来するトランスクリプトー
ムであるのかを推定した．64 個の scRNA-seq に基づく
トランスクリプトームのデータを得たうえで，Monocle
解析による次元削減をおこなった．これにより，約 7,000の遺伝情報をもつ，すなわち 7,000 次元からなる 1 細胞

Prediction of temporal changes of gene
expression profiles via single-cell-based
RNA-seq
Single-cell-based R NA-seq (scRNA-seq) was
performed over ~ 60 single spores in dormancy
or germination to make transcriptomes derived
from each single cell. Those were plotted in a
two-dimensional field after reducing dimensions
by the bioinformatics toolkit Monocle. Each plotcorresponds to each transcriptome of a single
cell and is coloured in gradation along thevirtual timeline. The far-right bottom cluster atthe edge of the virtual timeline corresponds tothe initial stage of germination, whereas the
far-left bottom to the end of germination.

のトランスクリプトームのデータを 2 次元の情報に次元削減し，2 次元平面上にこれらのデータをプロットした．

るような発現変動遺伝子を統計解析によって選び出し

その結果，約 60 個のトランスクリプトームのプロットはた．すなわち，発芽の最初期と推定される時期の細胞に

平面上に一列に並ぶ形で配置された( Fig. 2 ; Tsuyuzaki

おいて，発現量が有意に変動する遺伝子を抽出すれば，

et al., 2020 )．類似した位置にあるトランスクリプトー
ムは発現状態が近いといえるため，この一列の配置は，その中に発芽を引き起こすための遺伝子が含まれる可能性があると考えた．

時間とともに細胞内の遺伝子発現が徐々に変動していく

その結果，上位にヒストン H3 遺伝子のひとつである

ことを示唆していると判断した．このようなインフォマ
ティクス解析の結果として見られた仮想的な時間軸のこ

hht1 が見られた．分裂酵母のヒストン H3 遺伝子は 3 コ
ピー存在しており，hht1, hht2 および hht3 遺伝子と命名とをバーチャル・タイムラインと呼ぶことにした(Fig. 2 ;されている( Takayama & Takahashi, 2007 )．しかしな

Tsuyuzaki et al., 2020 ; 2021; 露崎ら，2021 )．

がら，3 種類のヒストン H3 遺伝子がどのように細胞内で使い分けられているのかは不明であった．各遺伝子の発芽の最初期に発現変動した遺伝子の探索とヒストン
H3 遺伝子

破壊株を作製してその表現型を調べたところ，hht2 遺伝子破壊株のみ高温での生育阻害が見られた(Tsuyuzaki

Monocle 解析の結果，約 60 個の scRNA-seq は平面上
では一列に並ぶ形で配置された．この一列の始点にあた

et al., 2020 )．この結果から，体細胞分裂周期において最も主要なヒストン H3 は hht2 遺伝子によって供給される位置にクラスター的に存在しているのが発芽の最初期ると判断した．

の細胞のトランスクリプトームであると想定して次に hht1∆, hht2∆, hht3∆ の 3 つのヒストン H3 遺伝子( Fig. 2 )，そのクラスター内の細胞が示すトランスクリ

破壊株についてそれぞれ胞子を作製し，発芽を誘導してプトームにおいて，発現量に有意( p < 0.05 )な差があ

発芽の効率をモニターした．その結果，hht1∆ と hht2∆－ 21 －

佐

藤

政

充

の胞子は発芽が起きないあるいは遅延する細胞の割合がされないため，その後の PCR でも増幅されない．した高いのに対して，hht3∆ は発芽に異常を示さないことががって，Tn5 による消化後に増幅された配列を次世代分かった( Tsuyuzaki et al., 2020 )．hht2 は増殖過程でもシーケンサーによって解読すれば，クロマチンがオープ発芽でも常に必要となる恒常的なヒストン H3 遺伝子でンである領域の配列が得られ，ゲノム全域においてオープ

あり，hht1 は増殖過程には不要であるが発芽の過程でンおよびクローズ領域の位置を判定できる( Buenrostro

は重要な意味をもつヒストン H3 遺伝子であることが分

et al., 2015 )．今回は，休眠胞子，発芽中の胞子，および対照群として増殖期の細胞について，それぞれの細胞

かった．

集団を回収して Tn5 を作用させて，ATAC-seq を実施し細胞の目覚めにともなうクロマチンの変化と大規模な遺た．なお，分裂酵母 S. pombe の増殖期の細胞集団につ伝子発現の開始

いての ATAC-seq については前例がある( Schep et al.,

Monocle 解析から推定された仮想的な時間軸に沿ってヒストン H3 遺伝子の発現変動を見たところ，hht1 遺伝

2015; Lei et al., 2020 )が，胞子についての ATAC-seq は前例がない．
その結果を Fig. 3B に示す．まず，ATAC-seq で得ら子は発芽の最初期に発現を低下させ，その後上昇させる
ことが分かった．これに対して，hht2 および hht3 遺伝れた配列リードをゲノム全域にマッピングしてカバー率

子は発芽の仮想的時間軸のなかで発現量を大きく変化さ( read coverage )を調べたところ，休眠期の胞子( Spore

せなかった．これらは仮想的時間軸における mRNA 量

0 h，Fig. 3B)から得た配列のカバー率は，増殖期の細の変動を推定したものに過ぎないため，実際の時間軸に胞( Veg**，Fig. 3B)から得た配列のカバー率に比較的おいて，またヒストン H3 のタンパク質としての発現量

類似していることを示す相関係数を得た．したがって，がどのように変動するのかを改めて確認した．その結果，カバー率で比較する限り，休眠状態のクロマチンのヌク

実際の時間軸においても，細胞内のヒストン H3 量が調レオソーム状態は増殖細胞のそれに近いといえる．事前

節されることが分かった．

の予想では，休眠胞子におけるクロマチン状態は増殖細hht1 遺伝子自体が体細胞分裂周期において重要な働きをもたないため，hht1 遺伝子の発現変動によるヒストン

胞のそれとは大きく異なると想定していたため，本実験

量の調節は，発芽のみで見られる現象と結びついた調節

いため，本研究は分裂酵母のクロマチン状態と細胞分化機構だと捉えられる．発芽に際しては細胞の目覚めを促の関係を探るうえで良きレファレンスとなるであろう．

結果は予想外の発見であった．類似の実験の先行例がな進するためにゲノム規模での遺伝子発現の促進が起きる

Fig. 3C には，ATAC-seq で得られた配列が遺伝子配列と考えられ，ヒストン量の一時的な低下は，このようなのどの領域に由来するのかを分類した結果を示す．増殖

転写の一時的増加に連動した現象であると推測される．

中の細胞では ATAC-seq リード配列の約 7 割，また休眠

これらの仮想的時間軸に沿った解析結果から得た推測

胞子ではその約 5 割が，遺伝子のプロモーター領域に由が正しいかを検証するために，クロマチン上にヒストン来することが分かった．一般的にプロモーター領域はヌが形成するヌクレオソーム状態を調べた．まず，マイク

クレオソーム量が減少してオープン・クロマチンになる

ロコッカルヌクレアーゼ( MNase )による染色体 DNAことが知られる( Lieleg et al., 2015 )ため，今回の結果の消化実験をおこなった．その結果，発芽初期の細胞ではそれを忠実に再現するデータとなった．これに対して，は染色体 DNA は切断されやすいが，発芽の後期では染休眠胞子ではコード領域( CDS)に由来する配列の割

色体 DNA が切断されにくいことが分かった．この予備合がやや増加し，プロモーター領域に由来する配列の割的な実験結果を得たうえで，染色体全域のヌクレオソー

合はやや減少した．発芽誘導後 1 時間後と 3 時間後の胞ムが休眠から発芽する際にどれだけ変動するかを調べ

子ではプロモーター領域に由来する配列の割合はさらにる，ATAC-seq を実行した．なお，当該実験および解析

減少して，かわりにコード領域に由来する配列の割合がは研究室の正垣佑樹・角井康貢が主体となり共同で実施

さらに増加した．これらの結果は，休眠胞子のクロマチしたものである．

ンは発芽中の胞子のそれと比較しても，増殖期の細胞にATAC-seq 法の原理の概要を Fig. 3A に示す．DNA 消

比較的近いクロマチン状態にあることを示しており，カ化酵素 Tn5( transposase )は，染色体上のヌクレオソー

バー率で見た結果( Fig. 3B)に合致するといえる．さ

ムが粗である(＝クロマチンがオープンである)領域のらに重要なことに，休眠状態から目覚めて発芽を始める

DNA を選択的に切断する．次に PCR 反応を行うことで，に伴い，コード領域のヌクレオソーム状態がオープン・

その断片化された領域が特異的に増幅される．これに対クロマチンに変化してきたことを示している．

して，ヌクレオソームが密に形成されている(クロマチFig. 3D に本研究の結果に基づくモデルを示す．休眠

ンがクローズである)領域の DNA は Tn5 によって消化期にはヒストンの存在量は比較的多く，ヒストンが－ 22 －

タイムラプス・シングルセル発現解析の開発による分裂酵母胞子の休眠と発芽の分子機構

DNA に巻き付いたヌクレオソーム構造が形成され，ク状態に戻っていくのだろうと想像される．これをさらにロマチン構造としては比較的閉じた状態にあると思われ実証するためには，より解像度の高いクロマチン状態のる．これに対して，発芽が誘導されるとヒストンが減少

可視化が必要であり，多数の細胞により平均化された細するが，これはそこに位置する遺伝子からの mRNA の胞集団を用いた ATAC-seq よりも，シングルセル単位で転写を意味すると考えられる．やがて発芽の後期になるの ATAC-seq が求められるため，現在は引き続きそのたと，このような開き気味のクロマチンが再びもとの定常めの技術開発を進めている．

Fig. 3

Analyses for the chromatin state upon dormancy breaking(A) A schematic for ATAC-seq analyses. Open chromatin can be digested by the transposase Tn5, whereas closed one
cannot. The digested fragments are amplified by PCR and detected as ATAC-seq reads. Open and closed regions are thenmapped along the entire genome sequence by peaks of the reads. (B) Comparison of read coverage among this study (vegetative cells [veg**] and spore cells [0, 1 and 3 h after induction of germination]) and previous studies: veg* is ATAC-seq dataof vegetative cells from Schep et al. (2015), whereas veg*** is from Lei et al. (2021). Values shown in the plot and theheatmap are Spearman's rank correlation coefficients calculated from the ATAC-seq reads distributed into 1 kb bins on thefission yeast reference genome. (C) Peak analysis of the ATAC-seq reads. All the reads from vegetative cells (Veg) andspores (0 – 3 h) were categorised into the promoter region, 5́- and 3́- UTRs, coding sequences (CDS), and others, and theirpercentages are shown without any other normalisation. (D) A model for the relationship between the chromatin reorganisationand gene expression at dormancy breaking. Dormant spores may show the regular nucleosome pattern by histone octamers,
which is partly open/closed. This study demonstrated that the amount of histone is dramatically reduced at the initial stageof germination. This may be correlated with a boost of global transcription required for dormancy breaking.

－ 23 －

佐

要

藤

充

約

文

本研究では，分裂酵母における胞子の休眠状態と，そこからの目覚めにおける遺伝子発現状態をモニターする
た め に シ ン グ ル セ ル 単 位 で の RNA シ ー ケ ン シ ン グ(scRNA-seq )を実施した．その結果，ヒストン H3 をコードする hht1 遺伝子の mRNA が発芽の最初期に減少することが分かった．ヒストンが DNA に巻き付いて形成するヌクレオソーム状態を精査したところ，発芽の初期にはヌクレオソームが減少して，遺伝子配列の中でも特にコード領域においてクロマチン状態がオープン化することが示された．このように，細胞の目覚めにおいては，通常の増殖過程では見られないゲノム全体での大規模な遺伝子発現の活性化が起きていることが示唆された．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 佐藤政充．2022. 配偶子を作るための細胞分裂 — 減数分裂による染色体分配のメカニズム 第27回日本臨床エン
ブリオロジスト学会(2022年1月9日，横浜)
2) 佐藤政充．2022. 酵母胞子の休眠からの目覚め ～ シング
ルセル発現解析でそのメカニズムに迫る 酵母研究会 第91回講演会(2022年8月9日，大阪)
3) 佐藤政充．2022. 1細胞RNA-seqプロファイルの経時変化から見えてきた休眠胞子の目覚めシステム第202回 酵母細胞研究会例会(2022年12月9日，東京)
原著論文なし
その他(総説・書籍・特許など)
1) Sato M., Kakui Y. & Toya M. 2021. Tell the dif ference
between mitosis and meiosis: interplay between chromosomes, cytoskeleton and cell cycle regulation. Front. Cell
Dev. Biol. 660322.

謝

政

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．シングルセル RNA-seq の方法論と実践，ならびにバイオイ
ンフォマティクスについて共同研究を展開してくださっ
た早大，依田卓也先生・細川正人先生・竹山春子先生な
らびに産総研オープン・イノベーション・ラボラトリーの有川浩司先生に感謝いたします．また，本研究の最初期に試行錯誤を繰り返しながら本研究の基礎を築いた岡献

Bähler, J., Wu, J., L ongtine, M. S., Shah, N. G., III, A . M.,
Steever, A. B., Wach, A., Philippsen, P., & Pringle, J. R. 1998.
Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based
gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast, 14, 943–951.
Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., & Greenleaf, W. J. 2015.
ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility
Genome - Wide. Current Protocols in Molecular Biology, 109,21.29.1-21.29.9.
Hatanaka, M., & Shimoda, C. 2001. The cyclic AMP/PK A signal
pathway is required for initiation of spore germination in
Schizosaccharomyces pombe. Yeast, 18, 207–217.
Johnke, R., & Padilla, G. M. 1979. Germination and Outgrowth of
Schizosaccharomyces pombe Spores Isolated by a Simple Batch
Centrifugation Technique. Microbiology, 115, 255–258.
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Lieleg, C., Krietenstein, N., Walker, M., & Korber, P. 2015.
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a 1,3-β-glucan synthase subunit, is essential for maturation ofascospore wall in Schizosaccharomyces pombe. FEBS Letters,
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Germination of Schizosaccharomyces pombe spores separated
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Schep, A. N., Buenrostro, J. D., Denny, S. K., Schwartz, K.,
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fingerprints enable high-resolution mapping of chromatinarchitecture within regulatory regions. Genome Research, 25,
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Takayama, Y., & Takahashi, K. 2007. Differential regulation of
repeated histone genes during the fission yeast cell cycle.
Nucleic Acids Research, 35, 3223–3237.
Trapnell, C., Cacchiarelli, D., Grimsby, J., Pokharel, P., Li, S.,
Morse, M., Lennon, N. J., Livak, K. J., Mikkelsen, T. S., &Rinn, J. L. 2014. Pseudo-temporal ordering of individual cells
reveals dynamics and regulators of cell fate decisions. Nature
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Tsuyuzaki, H., Hosokawa, M., A rikawa, K., Yoda, T., Okada,N., Takeyama, H., & Sato, M. 2020. Time-lapse single-celltranscriptomics reveals modulation of histone H3 for dormancy
breaking in fission yeast. Nature Communications, 11, 1265.
露崎隼, 細川正人, 竹山春子, 佐藤政充. 2020. シングルセル
RNA-seq解析から明らかになった分裂酵母の目覚め機構 バ
イオサイエンスとインダストリー( B&I )78:507-509

田直幸先生に感謝いたします．

－ 24 －

IFO Res.Commun. 37
25-41, 2023

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された
Host-jump 現象の分子基盤の解明
田

淵

光

昭

香川大学農学部応用生物科学科〒761-0795

香川県木田郡三木町大字池戸2393

Studies on the molecular basis of virulence factors of the causal agent forolive bacterial wilt disease by comparative genomic analysis
Mitsuaki Tabuchi
Faculty of Agriculture, Kagawa University
2393 Ikenobe, Miki-cho, Kagawa 761-0795
Olive bacterial wilt was first reported in Kagawa prefecture in Japan in 2017. Ralstonia pseudosolanacearum, the causal
agent of bacterial wilt disease in Solanaceae plants, was identified as the causal agent of olive bacterial wilt disease. In
this study, we aimed to identify specific virulence factors for R. pseudosolanacearum isolated from olive bacterial wilt
and to elucidate the mechanism of infection of olives. To search for specific virulence factors of the pathogen, 26
strains isolated from 6 prefectures in Japan were classified based on phylotype, sequevar, and biovar. T he
characterization of the strains showed that 20 out of 26 strains were classified as phylotype I, sequevar 14, and biovar 3.
These results suggest that R. pseudosolanacearum strains with specific genetic backgrounds infect olives and cause
olive bacterial wilt. Whole genome sequence analyses of eight olive bacterial wilt strains were performed by nextgeneration sequencing (NGS), and comparative genomic analyses were conducted. Especially, the type III secretion
effectors (T3Es) repertoires of each strain were compared with bacterial wilt strains isolated from tomato, andeggplant, and identified three effectors, RipBE, RipBK, or RipBQ specific to the genome of olive bacterial wilt strains.
To investigate the molecular functions of the effectors from olive bacterial wilt strains, 72 T3Es from the olive bacterial
wilt strain, YPPS1660, were systematically expressed in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Among them, wefound that expression of RipBK, which is specifically harbored by some olive bacterial wilt strains, strongly inhibited
yeast growth and that this growth inhibition was dependent on the Toll/Interleukin-1 receptor (TIR) domain in the＋
RipBK molecule. The TIR domain has recently been shown to possess NA Dase activity that degrades NA D .
Therefore, we measured the NADase activity of recombinant RipBK protein expressed in Escherichia coli and foundthat it showed only a very low activity. Interestingly, the addition of yeast lysate to the recombinant RipBK proteinincreased NADase activity in a concentration-dependent manner. This suggests that NADase activity of RipBK isstimulated by a substance(s) derived from host eukaryotes.
Key words: Ralstonia pseudosolanacearum, olive bacterial wilt disease, Saccharomyces cerevisiae, genome, host jumping緒

言幹の導管部周辺の変色，葉枯，急速な萎凋枯死を示す（氏家，2021 ）．オリーブ立枯病に罹病したオリーブから分

オリーブ立枯病は，2017 年 8 月小豆島（香川県）に離された原因菌は，解析の結果，Ralstonia solanacearum

おいて国内ではじめて確認された．症状としては，枝やと呼ばれる一般的に青枯病菌としてナスやトマト，ピーマンなどの野菜類の病原菌として知られていた菌である

E-mail: tabuchi.mitsuaki@kagawa-u.ac.jp
共同研究者:市村 和也（香川大学農学部），
秋光 和也（香川大学農学部），生咲巖（香川県農業試験場府中果樹研究所），
氏家 章雄（香川県農業試験場病害虫防除所），
松本 英治（香川県農業試験場・オリーブ研究所）．

ことが判明した（ Fig. 1A ）．R. solanaceaarum によるオリーブへの感染は，国内で 6 県（ Fig. 1B），ブラジル（ Tebaldi et al., 2014 ）や中国（ Jiang et al., 2017 ）など
でも確認されているが，感染経路や病原因子については不明である．

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Fig.1 Characterization of Ralstonia pseudosolanacearum isolated from the olive tree with olive bacterial wilt disease inJapan. (A) Colonies of the olive bacterial wilt strain, U-1-1, on rich B agar medium. (B) The locations where theolive bacterial wilt bacteria were isolated. Olive bacterial wilt occurs in olive groves in western Japan, including
Kagawa, Kagoshima, Hiroshima, Miyazaki, Shizuoka, and Mie prefectures. (C) The phylotypes and sequevarsof R. pseudosolanacearum from the olive bacterial wilt. The phylotype and sequevar were determined based on
the DNA sequences of the egl gene encoding an endoglucanase. The major class of the olive bacterial wilt strains
was classified as phylotype I, sequevar 14 and biovar 3.

－ 26 －

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された Host-jump 現象の分子基盤の解明

青枯病菌には宿主範囲，地理的分布，病原性，疫学子（ avirulence gene, AVR ）と呼ばれる．遺伝子対遺伝的特徴および生理・生化学的性質等の異なる系統の存子説に基づいた R タンパク質を持つ植物に病原菌が感染

在が広く知られている．Safni ら（ 2014 ）によって青すると AVR として認識され，ETI が誘導されることで枯病菌と類縁細菌が分類学的に詳細に解析された結果，病原菌は病気を引き起こせない．よって ETI 誘発に関

これらを種のレベルで R. solanacearum（ phylotype Ⅱ），

わるエフェクターの標的の解析は，その病原菌の感染拡R. pseudosolanacearum（ phylotype Ⅰ, Ⅲ），R. syzygii（ phylotype Ⅳ）の三つのグループに類別することが提大 の 制 御 法 の 考 案 に 役 立 つ と 考 え ら れ る（ Block &案されている．また，分子生物学的手法を用いた解析がエフェクターは宿主との共進化の過程で病原菌ごとにAlfano, 2011 ）．

進み，青枯病菌は単一種というよりむしろ複数種の複合

独自に獲得した様々な機能を持つタンパク質であり，1 種

体（ Ralstonia solanacearum species complex, RSSC）と類の病原菌でも数十種類の異なった生理的な作用を持つ

定義する方が適切であると考えられている（ Fegan &エフェクターを有する．そのため従来の解析方法ではPrior, 2005 ）．RSSC は，その病原性，広い宿主範囲，広エフェクターの機能解明が困難である．近年，エフェク

範な地理的分布，土壌中での長期の残留性から，最も破ターの機能解析法の 1 つとして出芽酵母 Saccharomyces

壊的な植物病原菌のひとつに数えられている（Mansfield

cerevisiae を利用した方法が報告されている（ Valdivia,
2004; Sigger & Lesser, 2008; Popa et al., 2016a ）．酵母細et al., 2012 ）．RSSC は，感染を成立させるために，細胞外多糖（ EPS）や植物ホルモンの産生，細胞壁分解酵

胞内で発現させると増殖阻害を引き起こすエフェクター

素の分泌，運動性など，様々な病原性決定因子を利用しが複数同定されている．我々は，出芽酵母が高等真核生ている（ Genin & Denny, 2012 ）．しかし，RSSC の主要物の生物学的プロセスを高度に保存していることや，全な病原性決定因子は，Ⅲ型分泌系（ T3SS）と呼ばれるゲノム配列が解析された非常に扱いやすいモデル生物で注射針状の構造物とそれによって宿主細胞内に注入されあることに注目し，酵母発現系を用いたエフェクターのる病原因子エフェクターである（ Landry et al., 2020 ）．

機能解析を行っている．

RSSC は 70 種類以上もの多様なエフェクターを有し，多くのエフェクターは，ホスホリパーゼ，プロテアー

この多様性が宿主域の広さと関連付けられている

ゼ，プロテインキナーゼ，トランスフェラーゼなどの酵（ Peeters et al., 2013 ）．

素活性が予測される触媒ドメインをその一次配列上に含植物は病原体感知の方法が異なる 2 つの自然免疫機構

み，それらのいくつかは，真核生物のカウンタパートにを有している．1 つは病原体が共通して持つ細菌の鞭毛勝る高い活性を有する（ Levin et al., 2010 ）．しかし，全や分泌タンパク質などの病原体関連分子パターンてのエフェクターが大腸菌などの細菌内で発現させたと（ PAMPs : pathogen-associated molecular patterns ） を，きに酵素活性を示すわけでなく，活性化にはさらなる真細胞膜または細胞質に存在するパターン認識受容体

核 生 物 因 子 と の 相 互 作 用 が 必 要 で あ る（ Popa et al.,（ PRRs : pattern recognition receptors ） で 感 知 す る

2016b ）． 例 え ば， 我 々 は， グ ル タ チ オ ン を 分 解 す る

PAMPs 誘 導 免 疫（ PTI : PAMPs-triggered immunity ）γ-Glutamyl cyclotransferase（ GGCT ） 活 性 を 持 つ R.

で あ る（ Halim et al., 2009; McCann & Guttman, 2008;
Deslandes & Rivas, 20012 ）．これに対し，植物病原菌側

pseudosolanacearum のエフェクター RipAY が，宿主内チオレドキシンと相互作用することで，GGCT 活性をは植物細胞に T3SS を介して，エフェクターを分泌する

爆発的に増強させることを明らかにしている（ Fujiwara

こ と に よ り PTI を 抑 制 し 感 染， 増 殖 す る（ Jones &et al., 2016; Fujiwara et al., 2020 ）．
本研究では，青枯病菌としてナスやトマトなどの草本

Dangl, 2006 ）．しかし，宿主以外の植物では，病原菌との共進化の過程で獲得した抵抗性タンパク質（ R タンパ類に感染する R. peudosonalacearum が，どのようにしてク質）によりエフェクタータンパク質が特異的に認識さ宿主域を拡大し，樹木であるオリーブに感染できるようれることにより，強力な免疫反応である過敏感反応（ HRになったのかを明らかにすることを目的として研究を: Hypersensitive response ）と呼ばれるプログラム細胞行った．まず，日本各地で分離されたオリーブ立枯病菌

死が引き起こされる．これをエフェクター誘導免疫8 菌株の全ゲノム配列を解析し，ナスやトマトに感染す（ ETI : Effector-triggered immunity ） と 呼 ぶ（ Jones &る青枯病菌との比較ゲノム解析によりオリーブ立枯病菌

Dangl, 2006 ）．ETI は HR により感染部位を自発的に壊が特異的に保有するエフェクターを同定した．さらに，死させることで感染を防止し，その後，全身獲得抵抗性

オリーブ立枯病菌株が保有するエフェクターを網羅的に（ SAR : systemic acquired resistance ）により感染を受け酵母において発現させ，各種ストレス条件下における増ていない周辺の組織においても抵抗性を誘導する．また，殖阻害活性を指標とするエフェクターの網羅的機能解析

R タンパク質に認識されるエフェクターは非病原力遺伝を行った．その結果，本研究で調べた 72 個のエフェク－ 27 －

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ターのうち，23 個のエフェクターが酵母に増殖阻害をブに移し，14,000 rpm，1 分間遠心し，上清をアスピレー

引き起こすことを見出した．オリーブ立枯病菌が特異的ターで吸い取り菌体を回収した．
菌 体 に 300 µL の TE buffer に 懸 濁 し，15 µL の 0.5 Mに保有するエフェクターの一つである RipBK は，分子内にある TIR ドメインが持つ NADase 活性依存的に酵

EDTA pH 8.0，15 µL の 10％ SDS ，3 µL のプロテイナー

母に強い増殖阻害を引き起こした．大腸菌で発現させたゼ K を添加し，56˚C で 1 時間インキュベートした．

RipBK 組換えタンパク質は低い NADase 活性しか示さ

プロテイナーゼ K 処理後の菌体懸濁液に 300 µL の TEなかったが，RipBK 組換えタンパク質に酵母抽出液を飽和フェノールを添加後，転倒混和し，さらに 300 µL の添加することで NADase 活性が上昇し，RipBK は宿主真クロロホルムを添加後，5 分間転倒混和し，14,000 rpm，

核生物由来因子依存的に活性化することが考えられた．

10 分間遠心した．
上 層 液 を 新 し い エ ッ ペ ン ド ル フ チ ュ ー ブ に 移 し，

今後さらにオリーブ立枯病菌のエフェクターの機能解析が進むことで，本菌のオリーブへの宿主拡大のメカニ

200 µL の TE 飽和フェノール，200 µL のクロロホルムを

ズムの理解，並びにオリーブ立枯病菌の感染拡大防止や添加後，5 分間転倒混和し，14,000 rpm，10 分間遠心した．
上 層 液 を 新 し い エ ッ ペ ン ド ル フ チ ュ ー ブ に 移 し，被害の縮小に大きく貢献することが期待される．

400 µL の ク ロ ロ ホ ル ム を 添 加 後，5 分 間 転 倒 混 和 し，

実験方法

14,000 rpm，10 分間遠心した．
上層液を新しいエッペンドルフチューブに移し，3 µL

供試菌と培養条件の RNase A（ 10 mg/mL ）を添加後，37˚C で 1 時間イン

出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4743（Brachmann

キュベートした．
RNase A 処理後の溶液に 200 µL の TE 飽和フェノー

et al., 1998 ） の 栄 養 培 地 と し て YPD 培 地（ 1％ Bacto
Yeast Extract, 2％ Bacto Peptone, 2％ Glucose ），選択培

ル，200 µL のクロロホルムを添加後 5 分転倒混 和し，地 SD 寒天培地（ 0.67％ Bacto Yeast Nitrogen Base, 2％

14,000 rpm，10 分間遠心後，上層を 400 µL 新しいエッペ

Glucose, 2％ Bacto Agar ），SD 液体培地（ 0.67％ Bacto

ンドルフチューブに移した．この操作を 4 回繰り返した．

Yeast Nitrogen Base, 2％ Glucose ）を使用した．また，4 回の TE 飽和フェノール/クロロホルム抽出後の上槽

発 現 誘 導 培 地 と し て，SGal 液 体 培 地（ 0.67％ Bacto

液 に 40 µL の 3 M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム（ pH 5.2 ），1 mL のYeast Nitrogen Base, 2％ Galactose ）および SGal 寒天培

95％ EtOH を添加後，14,000 rpm，10 分間遠心し，上清地（ 0.67％ Bacto Yeast Nitrogen Base, 2％ Galactose, 2％をアスピレーターで吸い取った．

Bacto Agar ）を使用した．SD 培地および SGal 培地には，500 µL の 冷 却 し た 70％ EtOH を 加 え，14,000 rpm，

必 要 に 応 じ て L -ヒ ス チ ジ ン（ 4 mg/mL ），L -ロ イ シ ン

10 分間遠心し，アスピレーターで上清を吸い取り，遠（ 6 mg/mL ），L -リジン（ 4 mg/mL ），L -トリプトファン

心乾燥機で完全に乾燥させた．
最終的に得られたゲノム DNA に 50 µL の TE を加え，

（ 4 mg/mL ）， L - メチオニン（ 4 mg/mL ），ウラシル（ 4 mg/mL ）， ア デ ニ ン（ 4 mg/mL ） を 加 え た．E. coli

ボルテックスで完全に溶解させた．OD260 を測定，DNADH5α（ Takara Bio. ） の 培 養 に は LB 培 地（ 1％ Bacto

濃度を算出し，-25˚C で保存した．

Tryptone, 0.5％ Bacto Yeast Extract, 0.5％ NaCl ），SOC
培 地（ 2％ Bacto Tr yptone, 0.5％ Bacto Yeast Extract,

phylotype の決定
オリーブ立枯病菌の egl の塩基配列を決定するために，鋳10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4,
20 mM Glucose ），MMI 培地（1.3％ Bacto Tryptone, 2.5％型に R. pseudosolanacearum 各菌株のゲノムDNAを用いて，Bacto Yeast Extract, 0.4％ Glycerol, 20 mM Tris-HCl,

Forward primer（5'-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3'）

pH 7.2, 0.85％ NaCl ）を使用し，必要に応じてアンピとReverse primer（5'-GCGTTGCCCGGCACG AACACC-3'）

シ リ ン（ 50 μg/mL ）， カ ナ マ イ シ ン（ 25 μg/mL ） をで PCR 反応を行った（堀田・土屋，2012 ）．反応条件は，

加 え た．S. cerevisiae は 26 ℃ ま た は 30 ℃，E. coli は

96 ℃ 1 min 後，96 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，68 ℃ 1 min を

37 ℃，R. pseudosolanacearum は 28 ℃で培養した．

30 cycle 後，68 ℃ 7 min で行った．得られた PCR 産物をオリーブ立枯病菌ゲノム DNA 抽出

Mini Kit を用いて目的の増幅断片を回収し，Forward

電 気 泳 動 後，FAVORGEN 社 製 の GEL/PCR Purification
5 mL の rich B 液体培地（ 1％ Bacto Peptone, 0.1％ Bacto

primer でシーケンス反応を行い，塩基配列を決定した．

Yeast Extract, 0.1％ Bacto Casamino Acids, 100 μg/mL

遺伝子の塩基配列をもとに，MEGA11（ Tamura et al.,Polymyxin B） に R. pseudosolanacearum 株 を 植 菌 し，2021; https://www.megasoftware.net/ ） を 用 い て 系 統

30˚C で一晩培養した．培養液をエッペンドルフチュー

樹を作製し，それを基に Phylotype を決定した．

－ 28 －

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された Host-jump 現象の分子基盤の解明

sequevar の決定を作製した．得られたエフェクター酵母発現プラスミド

目的のオリーブ立枯病菌の egl 配列と既に sequevar がは，酵母 BY4173 株にそれぞれ形質転換し，得られた形分かっている菌の egl 配列を比較して，塩基配列が一致

質転換体を滅菌水に懸濁して OD600nm=1.0 に調整した菌する，または 99％以上の相同性を示す場合は，同じ液を 10 倍，102 倍，10 3 倍希釈した段階希釈液を調製した．

sequevar であると判定した（堀田・土屋 ，2012 ）．

ガラクトースを炭素源とする誘導培地およびグルコースを炭素源とする非誘導培地に，段階希釈液をスポットし，

biovar の決定

26 ℃，3 日間培養した．菌の増殖を Image J により定量し，

オートクレーブによって滅菌した基礎培地（ NH4H 2PO4

エフェクターによる増殖阻害を評価した．

500 mg, KCl 100 mg, MgSO 4・7H 2O 100 mg, peptone
500 mg, 8 mg/mL Bromothymol blue / 0.1 N NaOH 5 mL,

組換タンパク質の作製・精製法

agar 1.5 mg, water 500 mL ）を 50 ℃まで冷まし，滅菌済

RipBK を pCold Pros2 プラスミドに組み込み，N 末端

みの試験管 7 本に培地を 3 mL ずつ加えた．それぞれのに His6 -tag とタンパク質可溶化タグである ProS2 タグを試験官に最終濃度 1％になるように 10％炭素源（マル

融合した RipBK WTと活性中心変異体 E286Q 組換えタン

トース，ラクトース，セロビオース，マンニトール，ソ

パク質を大腸菌 Rosetta-gami B（DE3 ）pLysS（Novagen ）ルビトール，ダルシトール）を加えて，よく混合した．

で発現させ His Trap HP カラム（ Cytiva ）で精製した．

対象として，滅菌水を加えた培地を準備した．菌体を固形培地からかき取って滅菌水に懸濁し，OD600=0.01（約NADase 活性測定
エ ッ ペ ン ド ル フ チ ュ ー ブ に 大 腸 菌 で 発 現 さ せ，

107 cfu/mL ）に調整した．菌液をパスツールピペットで
2 ～ 3 滴ずつ試験管に添加し，28 ℃で 1 週間から 3 週間

His6 -tag により精製した RipBK 組換えタンパク質 2.5 μg

培養し，炭素源資化に伴う培地の pH 変化を培地の色のを加え，0.6 mM NAD＋ 溶液 40 μL 添加して全量を 500 μL

変化として観察した．資化された炭素源の違いによってとし，37 ℃で 1 時間インキュベートした後，-80 ℃で凍biovar を決定した（堀田・土屋，2012 ）．

らせることで反応停止させた．これをサンプルとして，
Cytiva 社

全ゲノムシーケンス解析の Resource™ Q（ Cytiva 17-1177-01, pack of

1 mL, expiry 2019-08 ）を用いた HPLC により解析した．

全ゲノムシーケンス解析は，Illumina 社 MiSeq によ

溶出は，水:0.7 M 重炭酸アンモニウム=100:0（ 0 min ），る シ ョ ー ト リ ー ド シ ー ケ ン ス と Oxford Nanopore

95:5（ 5 min ），90:10（ 10 min ），75:25（ 15 min ），0:100

Technologies 社 GridoION によるロングリードシーケン（ 17 min ），0:100（ 19 min ），100:0（ 20 min ）の条件でスにより得られた配列情報の de novo ハイブリッドアセ

グラジエントをかけ，流量 1.0 mL/min で行った．

ンブリにより完全長ゲノムシーケンスを取得した．ライ
ブラリーの構築，データの取得・解析は，ゲノムリード

酵母抽出液添加による RipBK の活性化株式会社（高松市）に委託した．

RipBK WT, E286Q タ ン パ ク 質 の C 末 端 に Protein
A-tag を付加させた融合遺伝子発現プラスミドを形質転

エフェクター遺伝子のクローニングと酵母発現系による機能解析換した大腸菌を，アンピシリン（ 50 μg/mL ），クロラム
フェニコール（ 25 μg/mL ）を含む 100 mL LB 液体培地

エ フ ェ ク タ ー 遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ に は Gatewayに植菌し，37 ℃で対数増殖期まで培養後，IPTG を 0.2 mM

cloning 法を使用した（Thermo Fisher Scientific ）．attB1になるように添加してタンパク質の発現を誘導した．誘配列および attB2 配列をそれぞれ 5'-末端に付加したエ

導後，遠心分離により得られた菌体にプロテアーゼイン

フェクター遺伝子 ORF 領域特異的なフォワードプライ

ヒビターを含む IPP150 buffer（ 10 mM Tris-HCl, pH 8.0,

マーおよびリバースプライマーを用いて，オリーブ立枯

150 mM NaCl, 0.1％ NP-40 ）を 5 mL 加え，懸濁後，超病菌 YPPS1660 株ゲノム DNA を鋳型として PCR 法によ

音波破砕により菌体を破砕した．大腸菌破砕液の遠心分

りエフェクター遺伝子を増幅した．得られた PCR 産物

離により得られた上清 1 mL に予め IPP150 buffer で平衡を BP 反応によりドナーベクター pDONR207 にクロー化 し た IgG-beads（ Thermo Fisher Scientific ） を 25 μL

ニングし，エフェクターカセットドナーライブラリーを加え，IgG-beads に RipBK-Protein A 融合タンパク質を作製した．ドナークローンは更に LR 反応により GAL1

固定した．

プロモーターの制御下で目的遺伝子の発現が可能な

RipBK WT-Protein A ま た は 活 性 中 心 変 異 体 RipBK

pMT751 酵母発現ベクター（ Fujiwara et al., 2016 ）に組

E286Q-Protein A を固定化した IgG-beads に酵母抽出液 ,み込み，エフェクター酵母発現プラスミドライブラリー

オリーブ立枯病菌抽出液（400 μg/mL ）またはコントロー－ 29 －

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ルとして IPP150 buffer を 1 mL 添加し，4 ℃で 1 時間イ

株は，香川県小豆島町内の異なる 3 地域で分離された株

ンキュベートした．その後，IgG-beads を IPP150 bufferが 12 菌株，広島県江田島で分離された株が 6 菌株，香で 3 回洗浄し，洗浄後の IgG-beads を用いて NADase 活

川県高松市と同県多度津町で分離された株がそれぞれ性を測定した．

1 菌株あり，異なる地域で同一の遺伝子型を持つ菌株がオリーブ立枯病菌として分離されていた．また，中国で結果および考察オ リ ー ブ か ら 分 離 さ れ た R. pseudosolanacearum は，
sequevar 14 と sequevar 44 との報告がある（ Jiang et al.,オリーブ立枯病菌は特定の遺伝子型に類別された

2017 ）． 以 上 の 結 果 か ら 特 定 の 遺 伝 的 背 景 を 持 つ R.

R. solanacearum を internal transcribed spacer 領域，
endoglucanase 遺伝子（ egl ）および hrpB 遺伝子の塩基

pseudosolanacearum 菌株がオリーブに感染し，オリーブ
立枯病を引き起こしていることが考えられた．

配 列 を 基 に 分 類 す る phylotype は 4 つ の 主 な clade（ phylotype Ⅰ～Ⅳ）に区別することができる（曳地，オリーブ立枯病菌のゲノム解析

2009 ）．各 phylotype は複数の sequevar から構成され，sequevar，biovar の違いおよび分離地の違いをもとに

この sequevar は egl 遺伝子の保存領域の塩基配列の違い選抜した菌株について全ゲノム配列を決定し，これらのに基づき決定される（堀田・土屋，2012 ）．また，炭素ゲノムを比較することでオリーブに対する病原性に関与

源資化の違いに基づいて分類する biovar も世界的に頻する共通因子の同定が可能であると考えられたため，用されている．この 3 つの分類法を用いて日本国内 6 県

8 種 類 の オ リ ー ブ 立 枯 病 菌（ YPPS1660, U-1-1, OO-1,

で発生したオリーブ立枯病から分離された 26 菌株の遺Tadotsu, Nishi2-4-1, Hiroshima 1, SB20-1, Mie2 ）を次世

伝子型，生物型を調べた．その結果，26 菌株中すべて

代シーケンサー（ NGS）により全ゲノム配列を決定したの菌株が phylotype Ⅰに分類された（ Fig. 1C，Table 1 ）．

（ Fig. 2 ）．ショートリードシーケンスおよびロングリー

そのうち 20 菌株は sequevar 14，biovar 3 に，4 菌株はドシーケンスで得られたリード配列を用いてハイブリッ

sequevar 15，biovar 4 に，2 菌株は sequevar 44，biovar

ドアセンブリを行い，完全長のゲノム配列を取得した．

3 に分類され，特定の遺伝子型を持った菌株がオリーブ取得したゲノム配列を DFAST（ https://dfast.ddbj.nig.

立枯病菌として分離されていた（ Fig. 1C，Table 1 ）．特

ac.jp）を用いてアノテーションした．ほとんどの菌株は，に phylotype Ⅰ，sequevar 14，biovar 3 に分類された菌約 3.9 Mb の染色体と 2 Mb のメガプラスミドから構成さTable 1 Genetic characterization of 21 olive bacterial wilt strains－ 30 －

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された Host-jump 現象の分子基盤の解明

Fig. 2 Flowchart for obtaining the full-length genome sequences of R. pseudosolanacarum isolated from olive treewith olive bacterial wilt disease in Japan. Genomic DNAs were analyzed by two next-generation sequencers,
a long-read system, and a short-read system, and hybrid assembly was performed to obtain full-length
genome sequences. The acquired genome information was annotated by DFAST.

Table 2 The genome sequence information of 8 olive bacterial wilt strains

れており，それぞれ約 5,000 個の CDS ，12 個の rRNA ，

エフェクターレパートリーに焦点を当てた比較ゲノム解析

67 個の tRNA が同定された．しかし，Hiroshima 1 株は植物病原細菌が有する病原性関連因子としては，植物

メガプラスミドと染色体が融合したと考えられる 1 つの毒素，植物ホルモン，植物組織破壊酵素，菌体外多糖，

環状染色体ゲノムを有していた．Mie2 株はメガプラスミ

Ⅲ型分泌系エフェクター等が考えられる（露無ら，2003 ）．

ドに加えて，2,184 bp の小さなプラスミドを有しており，

特に R. solanacearums species complex, RSSC は，他の菌株によりゲノムの構成に違いが見られた（ Table 2 ）．

植物病原細菌よりも多様なエフェクター（ 70 種類以上）

当初，香川県から苗木などを介して，他県のオリーブ農を有しており，その多様性が宿主域の広さとも関連付け

園に感染が拡大したことが懸念されていたが，ゲノム解られている．そこで，エフェクターに焦点を当てて更に析の結果から特定のクローンが本病害の拡大に関係して比 較 ゲ ノ ム 解 析 を 行 っ た． オ リ ー ブ 立 枯 病 菌 8 菌 株

いないことが証明された．

（ YPPS1660, U-1-1, Tadotsu, OO1, SB20-1, Hiroshima 1,－ 31 －

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Nishi2-4-1, Mie 2 ）が保有するエフェクターレパート

ターは R. pseudosolanacearum 菌株間で共通の病原性にリーを比較するため，RSSC エフェクター予測サイト

機能するコアエフェクターであると考えられる．青枯

Ralsto T3E（ https://iant.toulouse.inra.fr）を使用し，各病菌が保有しておらず，SB20-1 以外のオリーブ立枯病

菌株が保有するエフェクターを予測した．その結果，そ菌 が 保 有 す る エ フ ェ ク タ ー と し て RipBE が，U-1-1，

れぞれの菌株が 59 ～ 85 個前後のエフェクターをゲノム

NISHI2-4-1，Mie 2 以外のオリーブ立枯病菌が保有する

上に保有していることが明らかとなった（ Tables 3，4 ）．

エフェクターとして RipBQ と RS_T3E_Hyp18 が，U-1-1，

さらに，青枯病菌（ OE1-1，GMI1000 ）とオリーブ立

SB20-1，Hiroshima 1，Mie 2 以外のオリーブ立枯病菌

枯病菌 8 菌株について，全てのエフェクターレパート

保有するエフェクターとして RipBK が見出された．一リ ー を 比 較 し た（ Table 4 ）． そ の 結 果， す べ て の R.

方，RipBO は，OE1-1 と GMI1000 は保有するが，今回pseudosolanacearu 菌株が保有するエフェクターとして36 個のエフェクターが見出された．これらのエフェク

調べたすべてのオリーブ立枯病菌 8 菌株のゲノム上には見出されなかった．

Table 3 Comparison of the number of effectors possessed by each bacterial wilt strain.

Table 4 T3E repertoires of bacterial wilt strains isolated from olive tree and Solanaceae plants.

Continued on the next page.

－ 32 －

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された Host-jump 現象の分子基盤の解明
Table 4 continued－ 33 －

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次に RipBE ，RipBK ，RipBQ について，本研究で使ブラリーを作製した．ドナーベクターを，ガラクトース

用したオリーブ立枯病菌全 26 菌株での保有状況を各遺誘導性 GAL1 プロモーターを有する酵母発現ベクターに伝子に特異的なプライマーを用いた PCR 法により調べ

LR 反応を用いてクローニングし，72 個のエフェクター

た（Fig. 3 ）．RS_T3E_Hyp18 は，解析当初，エフェクター

について増殖阻害を調べた．多くのエフェクターは，宿として同定されていなかったため，解析対象から外して主植物の MAP キナーゼ経路などの免疫応答シグナル伝

いる．PCR の結果，sequevar 14，biovar 3 に分類された達経路を阻害する活性を有しており，酵母においてはス

ほとんどの菌株が RipBE ，RipBK ，RipBQ の 3 つすべ

トレス応答にかかわるシグナル伝達経路がそのカウンてを保有していた．また，sequevar 15，biovar 4 である

ターパートとして機能することから 37 ℃（高温ストレU-1-1，U-1-2，Mie1，Mie2 は RipBE のみ保有していた．

ス応答），高食塩（高浸透圧ストレス応答），Myriocin（膜Sequevar 44，biovar 3 である Miyazaki，SB20-1 は RipBQ

ストレス応答），SDS（細胞膜，細胞壁ストレス応答）のみを保有していた（ Fig. 3 ）．これらの結果からオリー

等のストレス条件におけるエフェクター発現による酵母

ブ立枯病菌は，通常ナスやトマトに感染する青枯病菌がの 生 育 阻 害 を 評 価 し た（ Fig. 4 ）． そ の 結 果，RipAE ，持たないエフェクターを有し，これらのエフェクターのR ipBK ，R ipAY ，R ipM ，R ipBM ，R ipA 5 ，R ipA N ，獲得がオリーブへの宿主域の拡大と関連する可能性が考RipR は，すべてのストレス条件において増殖阻害を示えられた．

し た． ま た，RipI ，RipS6，RipAC-2，RipA1，RipA2，
RipA3 は，ほとんどすべてのストレス条件において増殖

酵母発現系を用いたオリーブ立枯病菌エフェクターの網阻害を示したが，37 ℃において増殖阻害が見られなかっ羅的機能解析

た．一方，NaCl において特異的に増殖阻害を引き起こ

多くのエフェクターは出芽酵母で発現させた場合，そすエフェクターとして，RipAF1，RipJ，RipQ が見出さのエフェクターが有する活性に依存して酵母に増殖阻害れた．また，RipA4，RipAC，RipAV，RipD，RipV1-2，を引き起こすことから，酵母を用いてエフェクターの機

RipZ は，SDS に特異的に増殖阻害を示した．このよう能解析が可能であることが明らかにされているにエフェクターによっては，特異的なストレス条件で増（ Valdivia, 2004; Sigger & L esser, 2008; Popa et al.,

殖阻害を示すものが見られ，これらのエフェクターはこ2016a ）．そこで，オリーブ立枯病が保有するエフェク

れらストレス応答経路を特異的に標的とする活性を有す

ターについて酵母発現系を用いて網羅的な機能解析をる可能性が示唆された．

行った．オリーブ立枯病 YPPS1660 菌株が保有する 85

さらに，酵母で発現させたエフェクターについて GFP個のエフェクター遺伝子を Gateway cloning 法を用いて蛍光を指標に観察し，各エフェクターの細胞内局在を調ドナーベクターに組み込み，これまでに 72 個のエフェ

べた．その結果，発現が認められたエフェクターの多く

クター遺伝子についてエフェクターカセットドナーライが細胞質に局在したが，一部のエフェクターは細胞膜Fig. 3 Results of PCR of 26 strains of R. pseudosolanacearum isolated from olive trees using specific primers for RipBE,
RipBK, RipBQ. Eighteen strains out of 20 sequevar 14, biovar 3 strains possessed all RipBE, RipBK, RipBQ andsome strains (sequevar 15, biovar 4 strains; U-1-1, U-1-2, Mie 1, Mie 2, and sequevar 44, biovar 3 strains; Miyazaki
3, SB20-1) possessed either RipBE or RipKQ.

－ 34 －

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された Host-jump 現象の分子基盤の解明

Fig. 4 Comprehensive functional analysis of 72 effectors from the olive bacterial wilt strain, YPPS1660, using a yeast expression system. (A) Yeast cells carrying effector expression plasmids whose expression is controlled under the GAL1
promoter were spotted with a serial dilution on SD (-Ura) plates, the suppressed condition, and SGal (-Ura), the induced
condition, plus various stresses. The cells were incubated for 3-4 days at the indicated temperatures. Representative
results of growth inhibition, when the nine effectors are expressed in yeast, are shown. The empty vector was used as acontrol with no growth inhibition, and HopAI1 from Pseudomonas syringae pv. actinidiae was used as a control for effectors
showing growth inhibition. (B) Each plate was photographed, and the cell growth was quantified using Image J software.
The relative growth defects were normalized to the growth of yeast cells carrying the empty vector and presented
graphically as a gray-scale map (100％ = yeast growth of cells carrying the empty vector, 0％ = no growth).

－ 35 －

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昭

（ PM ），核，ミトコンドリア，小胞体（ ER ），ゴルジ体の一つである RipBK は，酵母において発現させると強など細胞内の様々なオルガネラに局在した（ Fig. 5 ）．

い増殖阻害が観察された（ Fig. 4 ）．そこで，タンパク質

エフェクターは，細胞内において様々なオルガネラに局

ドメイン予測サイト Pfam（ http://pfam.xfam.org ）を用在することでその機能を発現することが知られており，

いて RipBK の機能ドメインの推定を行った．その結果，

これらのエフェクターも宿主である植物においては特定

アミノ酸残基 241 ～ 334 a.a. の領域に Toll/Interleukin-1のオルガネラに局在することで機能を発現し，病原性を受容体（ TIR ）ドメインを持つことが明らかになった．

発揮していることが考えられた．

RipBK 分子内のどの部分が酵母増殖阻害活性に重要であるかを調べるため，N 末端および C 末端から段階的に

オリーブ立枯病菌エフェクター RipBK による強い酵母欠失させた各種 RipBK 欠損変異体を作製した．その結増殖阻害は TIR ドメインに依存する

果，RipBK の酵母増殖阻害には，TIR ドメインとその周オリーブ立枯病菌株が特異的に保有するエフェクター

辺アミノ酸残基が重要であることがわかった（Fig. 6A ）．

Fig. 5 Subcellular tropism of effector proteins of the olive bacterial wilt strain, YPPS1660 in eukaryotic organelles.
(A) Association of R. pseudosolanacearum YPPS1660 effector proteins with distinct subcellular structures.
Yeast strains carr ying each effector expression plasmid were induced overnight in SGal (-Ura) liquidmedium and live-imaged by fluorescent microscopy. Effectors were categorized according to the localizationof GFP-tagged effector proteins: cytosol, plasma membrane (PM), nucleus, mitochondria, endoplasmic
reticulum (ER), Golgi, other/unclassified, and not detected. (B) Examples of cytosol, plasma membrane,
nucleus, mitochondria, Golgi, and endoplasmic reticulum. Scale bar = 5 μm.

－ 36 －

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された Host-jump 現象の分子基盤の解明

Fig. 6 Expression of the olive bacterial wilt strain specific effector, RipBK exhibits sever growth inhibition depending on its
TIR domain. (A) Deletion mutant analysis of RipBK using yeast expression system revealed that the TIR domain is
responsible for its growth inhibitor y activity. (B) TIR domains from different species produce different cADPR
isotypes. Animal types produce cADPR, plant types produce v-cADPR (2' cADPR), and bacterial types produce
v2-cADPR (3' cADPR). (C) The predicted domain structures and alignment of amino acid sequences of TIR domainsof Pseudomonas syringae effector, HopAM1, and R. pseudosolanacearum effector, RipBK. The putative catalytic residuesof NADase in TIR domains are highlighted. (D) Yeast cells carrying empty vector or plasmids expressing RipBK wildtype or catalytic residue mutant, E286Q were spotted with serial dilution on, an SD (-Ura) plate, repressed condition(OFF), or an SGal (-Ura) plate, induced condition (ON) and incubated at 26 ℃ for 3-4 days.

－ 37 －

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TIR ドメインは，生体内の酸化還元反応を制御する必HPLC に よ っ て NADase 活 性 の 測 定 を 行 っ た． 精 製

須の電子伝達体，補酵素として機能するニコチンアミド

RipBK WT はリテンションタイム 16 分に小さなピーク

アデニンジヌクレオチド（ NAD＋）を特異的に分解し，が現れたが，推定活性中心変異体 E286Q ではこのピー

ニコチンアミド（ NAM ）とアデノシン二リン酸リボー

クが現れなかった（ Fig. 7A ）．このピークは RipBK のス（ ADPR ）を経由して環状 ADPR（ cADPR ）を産生

NADase 活性により NAD＋から生成した v2-cADPR であする活性を有することが最近明らかになっている

ると考えられたが，その活性は極めて低かった．

（ Essuman et al., 2017; Essuman et al., 2018 ）．各種生物

以前我々は，γ -Glutamyl cyclotransferase（ GGCT ）活種由来の TIR ドメインは NADase 活性により NAD＋ を性を持つエフェクター RipAY は，宿主細胞内に存在す

分解するという共通性を有するが，生物種によって異なるチオレドキシン（ Trx ）と反応することで GGCT 活

る 環 状 ADPR（ cADPR ） を 産 生 す る（ Manik et al.,性が爆発的に上昇することを報告した（ Fujiwara et al.,2022; Locci et al., 2023 ）（ Fig. 6B）．動物では，TIR ドメ

2016; Fujiwara et al., 2020 ）．活性化した RipAY は，宿主

イ ン を 持 つ タ ン パ ク 質 SARM1（ sterile alpha and TIR

内在性の GGCT と比較して 100 倍近く高い触媒反応効

motif containing 1 ）は神経軸索の損傷に伴って活性化し，率を有しており，これにより宿主細胞質グルタチオンを

NAD を分解して cADPR を産生し，プログラム軸索細青枯病菌感染後に急速に低下させることができると考え胞死を実行する（Essuman et al., 2018）．植物においては，られている（ Fujiwara et al., 2016 ）．大腸菌で発現させ＋

TIR ドメインを持つ免疫受容体である Nucleotide binding

た RipBK 組換えタンパク質の NADase 活性は極めて低Leucine-rich Repeat（ NLR ）タンパク質が病原菌の感く，その強い酵母増殖阻害から考えて RipAY 同様に何染に伴って NADase 活性が上昇し，NAD＋ を分解してらかの真核生物由来の因子により活性化されるという仮

cADPR（ v-cADPR ）を産生し，病原菌に対する防御応説を立てた．そこで，RipBK が酵母の内在性因子によっ答である過敏感反応を伴う細胞死を誘発する（ Wan etて活性化されるかを検証した．大腸菌で発現させた

al.，2019 ）．Bacillus cereus においては最近，Thoeris と呼ばれる抗ファージ防御システムにおいて TIR ドメイン質を固定化した IgG-beads を酵母抽出液とインキュベー

タンパク質 ThsB がファージ感染に伴って細菌型 cADPR

ト後，IPP150 buffer で洗浄し，RipBK 固定化 IgG-beads（ v2-cADPR ）を産生し，これが下流の ThsA の活性化の NADase 活性を測定した（ Fig. 7B）．この時，酵母抽の 引 き 金 を 引 く こ と で NAD＋ の 枯 渇 を 引 き 起 こ し，

出液の代わりに IPP150 buffer を加えたサンプルをコン

ファージ感染細胞の細胞死を誘導することが明らかにさトロールとし，また，R. pseudosolanacearum の抽出液にれた（ Ofir et al., 2021 ）．また，最近，植物病原性細菌

R. pseudosolanacearum
ついても同様に調べた．その結果，で あ る Pseudomonas syringae の エ フ ェ ク タ ー HopAM1の抽出液を添加しても RipBK の活性はコントロールとは NAD を v2-cADPR に分解する NADase 活性を有す

変化しなかった．しかし，酵母抽出液を添加すると，ることが報告された（ Eastman et al., 2022 ）．

NAD＋ のピークが大幅に減少し，v2-cADPR のピークが＋Protein A-tag 融合 RipBK WT と E286Q 組換えタンパク

BL A S T を用いたホモロジー検索により R ipBK は，大きく上昇した（ Fig. 7C）．v2-cADPR ピーク面積を比P. syringae のエフェクター HopAM1 のオルソログであり，53.8％の相同性があることが分かった（ Fig. 6C）．

較したところ，約 4.5 倍に増加していることが分かった（ Fig. 7D）．さらにこの活性化について詳細に解析するた

HopAM1 とのアライメントの結果，RipBK の 286 番目

め，酵母抽出液濃度依存性について調べた．IgG-beadsのグルタミン酸（ E286 ）が触媒残基であることが予測によって精製した Protein A-tag を融合させた RipBK WT

された（ Fig. 6C）．そこで，RipBK の推定活性中心変異と E286Q に酵母粗抽出液をタンパク質濃度 0，0.2，1.0，

体（ E286Q ） を 作 製 し， 酵 母 で 発 現 さ せ た と こ ろ，

2.0，10，20，100 µg/mL になるように添加し，活性をRipBK WT で見られた酵母に対する増殖阻害は完全に測定した．その結果，酵母抽出液添加濃度依存的にキャンセルされた（ Fig. 6D）．以上の結果から，RipBK

NADase 活性が上昇し，20 µg/mL で活性がほぼ最大には TIR ドメインが有する NADase 活性依存的に酵母になった（ Fig. 7E）．一方，この NADase 活性の上昇は，増殖阻害を引き起こしていることが推測された．

E286Q では見られなかった．以上の結果から，原核生物には存在せず，酵母などの真核生物が有する因子に

RipBK は NADase 活性を持ち，酵母抽出液によって顕よって RipBK は NADase 活性を上昇させることが示唆

著に活性が上昇する

された．

次に RipBK が NADase 活性を持ち，NAD＋ を分解し，

我々は，
以前，
幅広い宿主域を有するR. pseudosolanacarum

v2-cADPR を生成するのかを確かめるため，精製した組由来エフェクター RipAY は，幅広い宿主由来抽出液によ

換 え タ ン パ ク 質 を 使 用 し て，NAD＋ と 反 応 を 行 い，

りその GGCT 活性が活性化されるが，宿主域が限られ－ 38 －

比較ゲノム解析によるオリーブ立枯病菌で見出された Host-jump 現象の分子基盤の解明

Fig.7 RipBK acts as a NADase to degrade NAD＋ to v2-cADPR. (A) A peak of v2-cADPR was detected when a recombinant
WT RipBK protein expressed in E. coli reacted with NAD＋ as a substrate. On the other hand, no peak was detectedin the putative catalytic site mutant E286Q. (B) NADase activity was measured by the addition of yeast lysate or
R. pseudosolanacearum lysate to E. coli expressed-recombinant RipBK-Protein A -immobilized IgG beads. As acontrol, an IPP150 buffer was added. (C) Effect of yeast lysate on NAD＋ activity of RipBK. (D) The addition of yeast
lysate to RipBK stimulated NADase activity by 4.5 times compared to the control. (E) Stimulation of NADase activityof RipBK by the addition of yeast lysate was in a concentration-dependent manner. Stimulation of NADase activity
was not observed in the catalytic site mutant (E286Q) of RipBK.

－ 39 －

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昭

本助成で得られた研究成果の報告

たスイカ果実汚斑細菌病を引き起こす Acidovorax citrulli
由来の RipAY オルソログであるエフェクター Aave_4606
は，スイカなど極限られた植物由来の抽出液によってのみ活性化されることを見出している（ Fujiwara et al.,2023 ）．このように一部のエフェクターは，宿主特異的な因子に依存して活性化することでその活性を獲得することで病原性を発現することが考えられており，エフェ
クターが持つ活性が宿主域を限定する事例がある．RipBKについてもオリーブ由来の因子がその活性化に重要であるかを今後解析する必要がある．また，RipBK 以外の酵
母に増殖阻害を引き起こしたエフェクターについては，
今後さらなる分子機能の解析をおこなうことで本菌の宿主域拡大の原因を分子レベルで明らかにすることが期待
できる．

要

約

本研究では，オリーブに感染し立枯病を引き起こす口頭発表
1) 兔子尾真菜, 藤原祥子, 生咲巌, 氏家章雄, 松本英治, 増中章,
市村和也, 田淵光昭. 2022. 比較ゲノム解析によるオリーブ
立枯病菌の特異的因子の解明, 支部創立20周年記念 日本農芸化学会中四国支部会第61回講演会（例会）（1月22日, オ
ンライン）2) 兔子尾真菜, 和氣由尚, 藤原祥子, 田淵光昭. 2022. 酵母発現系を用いたオリーブ立枯病菌特異的病原因子エフェク
ターの機能解析, 酵母遺伝学フォーラム第55回研究報告会（9月7日- 9日, 沖縄）3) 兔子尾真菜, 和氣由尚, 藤原祥子, 木村義雄, 田中直孝, 田淵光昭. 2022. TIRドメイン含有エフェクターRipBKのNADase
活性化メカニズムの解明, 第39回 Y EAS T WOR KSHOP（11月10日, -11日, 高知）
4) Toshio, M., Wake, Y., Fujiwara, S., Kimura, Y., Tanaka, N. &Tabuchi, M. 2023. Eukaryotic factor-dependent activation
mechanism of RipBK, a TIR domain-containing pathogen
effector protein from Ralstonia solanacearum, 国際シンポジウム 環境・資源ゲノムとライフサイエンス（2023年1月
30日, 高松）

Ralstonia pseudosolanacearum 菌株についてナスやトマトに感染し青枯病を引き起こす R. pesudosolanacarum との謝

比較ゲノム解析によりオリーブ立枯病菌特異的な病原因子を明らかにすることを目的として解析を行った．

辞日本各地で分離されたオリーブ立枯病から分離された

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公R. pseudosolanacaerum 26 菌株について遺伝子型・生理型を解析したところ，特定の遺伝的背景を持った菌株が益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，

オリーブ立枯病を引き起こしていることが明らかとなっ所・病害虫防除所の大住太良氏（オリーブ立枯病菌株のた．そこで，更にこれらの菌株のうち 8 菌株の全ゲノム分与），三重県農業技術研究所・病害虫防除所の辻 明子

配列を決定し，比較ゲノム解析を行った．特に病原性に氏（オリーブ立枯病菌株の分与），農研機構西日本農業

関与することが知られているⅢ型分泌系エフェクターに研究センター・生産環境研究領域・病害 G（現・名城大

ついて各菌株ゲノム中のレパートリーを比較したとこ

学農学部付属農場）の増中 章氏（オリーブ立枯病菌株

ろ，これらの菌株は RipBE ，RipBK ，RipBQ のいずれの分与，病原性解析），香川大学農学部・木村義雄氏並かのエフェクターを保有していることが明らかとなっびに応用分子細胞生物学研究室の学生諸氏に感謝の意をた．エフェクターの分子機能の解明のためにオリーブ立

表します．

本研究の遂行に協力いただきました静岡県農業技術研究

枯病菌 YPP1660 株由来の 72 個のエフェクター遺伝子を文

酵母発現系により網羅的に解析したところ，23 個のエフェクターが酵母に増殖阻害を示した．特にオリーブ立枯病菌特異的エフェクターの一つである RipBK は，その分子内に存在する TIR（ Toll/Interleukin 受容体）ドメインが有する NADase 活性に依存して，酵母に強い増殖阻害を示すことが明らかとなった．大腸菌で発現させた RipBK は，極めて低い NADase 活性を示したが，酵母抽出液を添加することにより強い NADase 活性を示すようになった．多くのエフェクターにおいて宿主内因子依存的に活性化することが知られており，RipBKについても宿主由来因子に依存して NADase 活性を獲得し，宿主細胞内 NAD＋を分解することで病原性を発現することが予測された．

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堀田光生, 土屋健一, 2012. 微生物遺伝資利用マニュアル（12）改訂第2版 p.1-32, 独立行政法人 農業生物資源研究所.

－ 41 －

IFO Res.Commun. 37
43-53, 2023

遺伝子組換え大腸菌が生産する新規な膜小胞の解析と有用物質分泌生産への応用
尾

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由

紘

大阪公立大学大学院工学研究科〒558-8585

大阪市住吉区杉本3-3-138

Analysis of novel membrane vesicles produced by genetically modified
Escherichia coli and their application to secretory production of useful compounds
Yoshihiro Ojima
Department of Chemistry and Bioengineering, Osaka Metropolitan University
3-3-138, Sugimoto, Sumiyoshi-ku, Osaka 558-8585
Escherichia coli produces extracellular vesicles called outer membrane vesicles (OMVs) by releasing part of its
outer membrane. We previously reported that the combined deletion of nlpI and mlaE, related to envelope
structure and phospholipid accumulation in the outer leaflet of the outer membrane, respectively, resulted in thesynergistic increase of OMV production. In this study, the analysis of ΔmlaEΔnlpI cells using quick-freeze, deepetch electron microscopy (QFDE-EM) revealed that plasmolysis occurred at the tip of the long axis in cells andthat OMVs formed from this tip. Furthermore, intracellular vesicles and multilamellar OMV were observed in the
ΔmlaEΔnlpI cells. QFDE-EM analysis also revealed that ΔmlaEΔnlpI sacculi contained many holes noticeably
larger than the mean radius of the peptidoglycan pores in wild-type E. coli. These results suggest that in ΔmlaEΔnlpI
cells, cytoplasmic membrane materials protrude into the periplasmic space through the peptidoglycan holes andare released as outer-inner membrane vesicles (OIMVs). Meanwhile, the secretion of recombinant GFP expressedin the cytosol of the ΔmlaEΔnlpI cells was about 2 mg/L which was more than 100 times higher than that of WT,
suggesting that OMV phenomenon is able to be applied for the secretory protein expression system of E. coli.
Next, secretory production of fatty acid via OMVs was also examined using the multiple gene knockout mutant
strain. However, it was failed due to the sever suppression of cell growth and fatty acid production. Expression
suppression of mlaE and nlpI using Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats Interference (CRISPRi)
achieved the increase of OMV production while maintaining cell activity. In the future, we will optimize theexpression levels of each gene for secrete production of useful compounds via OMVs.
Key words: Escherichia coli, outer membrane vesicle (OMV), plasmolysis, peptidoglycan, secretory production,
CRISPRi緒

言OMVs 内には，DNA, RNA などの核酸やペリプラズム
タンパク質が存在する．長い間，OMVs は細胞から不要

外膜小胞(OMVs)とは，グラム陰性細菌の外膜から物を排出する機構と考えられてきたが，近年になって排遊離した直径 20 ～ 250 nm の細胞外小胞であり，外膜タ出された OMVs が周囲の細胞に融合することで様々なンパク質やリポ多糖類・リン脂質によって構成される物質の運搬を行い，遺伝子水平伝搬や細胞間コミュニ(Schwechheimer & Kuehn 2015; Toyofuku et al., 2019)．

ケーションなど，微生物間相互作用に重要な役割を担っていることが明らかとなり，注目を集めている．OMVs

E-mail: ojima@omu.ac.jp
共同研究者:澤邊 朋美（大阪公立大学大学院工学研究科）．
中川 真緒（大阪市立大学大学院工学研究科）．
熊添 優希（大阪公立大学大学院工学研究科）．

の応用研究としては，ワクチン開発やドラッグデリバ
リーシステムなどへの寄与が期待されている．原核微生物が分泌する OMVs に関しては，酸化ストレス，熱ス
トレス，浸透圧ストレスや抗生物質ストレスによる損傷－ 43 －

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で，外膜がたわむことによって OMVs が形成されるこにした．さらに，大腸菌を宿主とした物質生産におけるとが提唱されている(Schwechheimer & Kuehn 2015)．

細胞外への分泌ツールとして OMV を応用するため，組

一方，Toyofuku らはライブセルイメージングを用いて換えタンパク質や脂肪酸の OMV を介した分泌生産を試

膜小胞の形成と細胞外への放出を観察し，細胞膜が一旦みた．

断片化したのちに再結合して MV が作られること報告し

実験方法ている( Toyofuku et al., 2019)．
これまで大腸菌においていくつかの遺伝子欠損により
OMVs 生産が促進するとの報告がある．NlpI は，外膜使用菌株と培養方法と内膜の間を結ぶペプチドグリカン(PG)の架橋を加水

大腸菌 K-12 株由来の BW25113 と単独遺伝子欠損株

分解する酵素である Meps の機能を抑制するリポタンパ

ΔnlpI, ΔmlaE, ΔfadE は，ナショナルバイオリソースプ
ロジェクト(NBRP, 国立遺伝学研究所)から入手した．

ク質である．nlpI 遺伝子を欠損することで，Meps による PG の分解が促進され，PG と外膜の結合が緩む．こ二重遺伝子欠損株 ΔmlaEΔnlpI は，P1kc ファージを使の結果，外膜が隆起しやすくなり，OMVs の生産が促進用 し た P1 形 質 導 入 法 に よ っ て 構 築 し た(Ojima et al.,

されると考えられている(Schwechheimer et al., 2015)．

2020)．タンパク質生産に関しては，各株にプラスミド

一方，DegP はペリプラズム内の不活性なタンパク質を

pCA24N-gfp を 形 質 転 換 し， 細 胞 質 内 で His タ グ 付 き

分解するプロテアーゼである．欠損によりペリプラズム

GFP をモデルタンパク質として発現させた．

内に不活性タンパク質が蓄積することが物理的な膜スト

各大腸菌株を LB 培地（ 1％Bacto トリプトン，0.5％

レスを誘導し，不活性タンパク質を細胞外に排出するた酵母エキス，1％NaCl ）で培養した．pCA24N-gfp を保

めに OMVs 生産量が増えるとされる(Schwechheimer,

持する株の培地には，50 mg/L のクロラムフェニコール

& Kuehn 2013)．MlaE は，Yrb-ATP 結合カセット(ABCおよび 1 mM の IPTG を添加した．前培養は，LB 培地

トランスポーター)の膜輸送体で，YrbE とも称される．

で 37 ℃で 18 時間行い，本培養は 500 mL バッフル付き三外膜のリン脂質の輸送に関わっており，内膜へのリン脂

角フラスコに入った 100 mL の LB 培地に，OD660=0.01

質の逆輸送により外膜と内膜のリン脂質の比を一定に保となるように植菌した．ロータリーシェーカー(NR-30,

つ役割を果たしている．mlaE 遺伝子の欠損により，外Taitec)上で，37 ℃, 140 rpm で旋回培養した．細胞増殖

膜の外葉からリン脂質が戻ることが出来なくなり，外膜は OD660 を測定し評価した．

の外葉に脂質が蓄積する．その結果，外膜上で余剰となった脂質が放出されやすくなり，OMVs 生産が促進するとナノ粒子マルチアナライザーによる細胞体積測定

されている(Roier et al., 2016)．MlaA は VacJとも称され，

培 養 3 時 間 後 お よ び 24 時 間 後 に， 各 菌 株 の 細 胞 をMlaE と同じ Yrb-ATP 結合カセットのリポタンパク質と10,000×g, 4 ℃で 10 分間遠心分離し回収した．細胞をして，外膜の外葉と内葉のリン脂質の比を一定に保つたPBS で洗浄し，最終的に PBS に再懸濁した．細胞体積は，めに働く．mlaA 遺伝子を欠損することで，外膜の外葉

Nanopore NP-1000 を備えたナノ粒子マルチアナライと内葉の脂質バランスが崩れ，OMV 生産の引き金となザー(qNano, IZON Science Ltd.)により測定した．

る．mlaA および mlaE の遺伝子欠損による OMVs の生
産 促 進 の 効 果 は， グ ラ ム 陰 性 菌 で あ る Haemophilus

急速凍結レプリカ電子顕微鏡法による大腸菌細胞の観察

influenzae(インフルエンザ菌)および Vibrio cholerae(コレラ菌)で報告された(Roier et al., 2016)．大腸菌におい上記と同様に PBS に再懸濁した菌体を 4 ℃，10,000×g，
10 分間遠心分離して上清を捨て，0.85％ NaCl が含まれても網羅的な遺伝子欠損株の解析により mlaA およびる 5 mM HEPES 溶液または 15％グリセロール溶液にてmlaE の欠損により，OMVs の生産が促進することが確認されている(Kulp et al., 2015)．

再懸濁した．ここで，HEPES 溶液はエッチングした細我々の以前の研究では，これらの遺伝子欠損を重ね合観察する際に用いた．得られた菌体に対して急速凍結レ

胞表面を観察する際に，グリセロール溶液は細胞断面をわせることで OMV 生産に与える影響を確認したとこ

プリカ電子顕微鏡法により標本を作製し観察したろ，二重遺伝子欠損株 ΔmlaEΔnlpI が最も高い OMV 生(Tahara & Miyata 2023)．具体的には，試料をマイカフ

産を示すことを明らかにした（ Ojima et al., 2020 ）．本

レークと混合しウサギ肺皮膚片に載せ，液体ヘリウムに研 究 で は， 単 独 遺 伝 子 欠 損 株 ΔmlaE お よ び ΔnlpI とより急速凍結した．凍結試料作製装置（ JFDV，JEOL ）ΔmlaEΔnlpI の各株の細胞や生産する OMV に関して，
急速凍結レプリカ電子顕微鏡法を用いた観察を中心に詳により，-180 ℃のチャンバー内に保管したサンプルの細な解析を行い，OMV 生産の促進メカニズムを明らか-104 ℃で 15 分間凍結エッチングした．ここで 15％グリ

温度を -120 ℃まで上昇させた後，ナイフで凍結割断し，－ 44 －

遺伝子組換え大腸菌が生産する新規な膜小胞の解析と有用物質分泌生産への応用

セロールを溶媒として使用した場合，細胞断面を観察す

Kuehn 2013)．脂質膜量基準では，蛍光色素 FM4-64 をるため凍結エッチングのステップは省略した．その後，使用して定量化した(McBroom et al., 2006; Manning &試料に炭素と白金膜を蒸着してから，強酸によって試料

Kuehn 2011)． 単 離 さ れ た OMV を 5 μg/mL の FM4-64を溶かし，水と漂白剤にて洗浄した．作製したレプリカ（ Molecular Probes/Thermo Fisher ）が溶けた PBS で 20標本をグリッドに載せ，透過型電子顕微鏡( JEM-1010,

分間インキュベートし，分光蛍光光度計(INFINITE200PRO,

JEOL)にて観察した．

TECAN)を使用して，558 nm の励起波長と 734 nm の蛍光波長で測定した．

OMV の回収と TEM 観察ならびに動的光散乱法(DLS)
によるサイズ分布測定

pCA24N-gfp を形質転換し His タグ付き GFP を発現させて培養した際の OMV サンプルに含まれる組換え GFPOMV の回収は，以前に報告されている手法にいくつ

量は，抗 His タグ一次抗体を用いたウエスタンブロッ

かの修正を加えて行った(Gujrati et al., 2014)．24 時間培

ティングによって分析した．組換え GFP の量は，バン

養した後，100 mL の培養液を 10,000×g，4 ℃で 10 分間

ド強度を ImageJ により画像解析することで定量化し遠心分離し細胞を除去した．次に，上清を 0.45 μm のフィた．各大腸菌細胞内に蓄積された GFP も同様にウェス

ルターに通した．硫酸アンモニウムを終濃度 400 g/L で

タンブロッティングによって分析した．細胞の場合，添加し，室温で 1 時間インキュベートして培養液成分を

OD660=0.3 のサンプル 10 μL をゲルの各ウェルにロード沈殿させた．11,000×g，4 ℃で 30 分間遠心分離し沈殿

し，細胞量を合わせて比較した．

物を回収し，500 μL の 15％グリセロールに溶解し，超遠心分離機(CS100FNX ，日立工機)を使用して 109,000×g

OMV を介した脂肪酸分泌生産の評価

で 1 時間超遠心分離した．得られたペレットを 100 μL の脂肪酸分解に関わる fadE 遺伝子の欠損株 ΔfadE にプ15％グリセロールに懸濁したものを，元の培養液から

ラ ス ミ ド pA5c-tesA-vhb50-8fadR(addgene ID86601)を1000 倍濃縮された OMV サンプルとした．

形質転換し，必要遺伝子を発現させることで細胞質内に得られた OMV サンプルをグリッド上に置き，酢酸ウ

脂肪酸を生産する株 ΔfadE/tesA を作製した(Liu et al.,

ランでネガティブ染色してから TEM( JEM-2100, JEOL )2017)．さらに同時に OMV を高生産する株として三重により観察した．また同時に OMV サンプルを滅菌水で遺伝子欠損株 ΔfadEΔmlaEΔnlpI を作製し，プラスミド

希釈し，0.45 μm のフィルターにかけて不純物を除去しを形質転換した(ΔfadEΔmlaEΔnlpI/tesA)．各大腸菌株た後，動的光散乱法(Zetasizer Nano, Malvern)によりを 8％グルコースを含む M9 最小培地で，140 rpm, 37 ℃

OMV の粒子径分布を測定した．

で 72 時間培養し脂肪酸を生産した．菌体を含む培養液
全体と，遠心して菌体を除去した培養上清から，それぞ大腸菌細胞のペプチドグリカン(PG)の調製と急速凍結れ酢酸エチルを用いて脂肪酸を抽出し，メチルエステル

レプリカ電子顕微鏡法による観察

化後にガスクロマトグラフィー(GC-2025, Shimazu)に

24 時間培養した大腸菌細胞を 10,000×g，4 ℃で 10 分より測定した．

間遠心分離して回収した後に PBS で一度洗浄し，10％
SDS(w/v)に再懸濁し 95 ℃で 12 時間インキュベートしClustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats

た．200,000×g，20 ℃で 40 分間超遠心分離して PG をInterference(CRISPRi)による発現抑制株の作製と OMV

回収し，Milli-Q 水で 3 回洗浄した後に TEM もしくは急生産量の評価速凍結レプリカ電子顕微鏡法により観察した．

欠損による OMVs 生産の促進が報告されている 2 つの遺伝子 mlaE と nlpI について，gRNA を設計したプラ

OMV の生産量と OMV を介したタンパク質分泌生産量

ス ミ ド pgRNA-bacteria(addgene ID44251)と dCas9 発の評価

現 プ ラ ス ミ ド pdCas9-bacteria(addgene ID44249)を そOMV 生産量は，先行研究の手法にいくつかの修正をれぞれ野生株に形質転換した．各大腸菌株を LB 培地

加えてタンパク質量基準と脂質膜量基準の 2 つの手法で37 ℃で培養し，8 時間後の増殖期に mRNA を抽出し，定量化した．タンパク質量基準では，OMV サンプルを

qRT-PCR により遺伝子発現量を測定した．また 24 時間

SDS-PAGE および CBB 染色により分析した．OMV 量は，後に OD660 を測定すると同時に，前述の方法で OMVs

Image J ソフトウェア(National Institutes of Health)を使を回収し，タンパク質量基準で回収量を評価した．

用して，SDS-PAGE 上に現れる外膜タンパク質 OmpA, C,
F 由来の約 37 kDa のバンド強度を数値化することにより，野生株に対する相対値として示した(Schwechheimer &－ 45 －

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由

結果および考察紘株と変わらなかった．一方，培養 24 時間後では，野生株で約 0.52 fL となり 3 時間後より大幅に低下したが，大腸菌の遺伝子欠損株の細胞と生産された OMVs の特徴

この結果は過去の報告で培地中の成分が少なくなると細培養終了時の各大腸菌株の増殖や細胞サイズ，OMV

胞体積が小さくなるという結果と一致した(Kubitschek
1990)．欠損株は，全て約 0.4 fL となり野生株と比較し生産量などを Table 1 に示す．
野生株の OD660 は 5.1 であったのに対して，単独遺伝子て小さかった．以上より，OMV 粒子や細胞体積の結果欠損株では ΔnlpI が 4.1 であり少し減少したが，ΔmlaE

から，OMV を高生産する欠損株では細胞の表現型にもでは 5.2 であり増殖に影響を与えなかった．一方で，二大きな変化が生じている可能性が示唆された．

重遺伝子欠損株 ΔmlaEΔnlpI では，OD660 は 2.9 であり増殖抑制が顕著であった．OMV 生産を向上する遺伝子欠

大腸菌の遺伝子欠損株の細胞と生産された OMVs の特徴

損は重ね合わせることで増殖を阻害することがわかった．

OMV を高生産する欠損株の細胞について詳しく解析す

続いて，タンパク質基準での OMV 生産量を比較したとるため，急速凍結レプリカ電子顕微鏡法により，細胞のころ，野生株と比較して ΔnlpI と ΔmlaE は，それぞれ約

微細構造の観察を行った．まずは前処理を終え，急速凍7 倍と 5 倍に増加し，さらに ΔmlaEΔnlpI では，約 30 倍結を行う直前の細胞を位相差顕微鏡で観察したが，野生に増加していた．脂質膜基準でも OMV 生産量を確認し株と ΔmlaEΔnlpI ともに生きた状態の細胞を光学顕微鏡でたところ，野生株と比較して ΔnlpI と ΔmlaE では，約観察した際と大きさや形状が一致し，前処理による人為6 倍と 9 倍に増加し，さらに ΔmlaEΔnlpI では，約 14 倍

的な変化は起きていないことが確認された(Fig. 1A, D)．

に増加していた．このようにタンパク質基準と脂質膜基続いて，エッチング処理を施したレプリカ標本を TEM

準において数字に違いがある要因としては，OMV の高で観察した結果，ΔmlaEΔnlpI の細胞は野生株よりも全生産株では OMV 中のタンパク質と脂質の比率が変化し体的に細長く伸びている様子が確認された(Fig. 1B, E)．

ている可能性が考えられる．ただし，いずれの評価方法

さらに，ΔmlaEΔnlpI の細胞では，長軸の先端から OMVにおいても遺伝子欠損を重ね合わせることで更に OMVを形成している様子が観察された(Fig. 1F)．観察された生産が向上することを確認できた．次に，DLS により

OMV の直径は約 400 nm であり，OMV の中では最も大OMV の平均粒径を測定したところ，野生株と ΔnlpI できな部類である．続いて，エッチング処理を行わず細胞は約 80 nm であるのに対して，ΔmlaE では約 65 nm とな

断面を観察した結果を Fig. 2 に示す．

り，小さくなる傾向が見られた．一方で，ΔmlaEΔnlpI

まず野生株に関しては，Fig. 1 に類似した細胞形状が観では約 100 nm となり欠損を重ね合わせることでサイズ察され(Fig. 2A)，より高倍率で観察しても細胞の外膜とが大きくなることがわかった．続いて，qNANO により

内膜はほとんど一層に見え，ペリプラズムの幅が数 nm

各株の細胞体積を評価した．まずは培養 3 時間時点で測であることを考えると観察倍率からは妥当な結果となっ定したところ，野生株が約 1 fL であるのに対して，ΔnlpIた(Fig. 2B)．一方で，ΔmlaEΔnlpI の細胞は細長い傾向

では約 0.85 fL と少し小さく，それ以外の欠損株は野生が観察され(Fig. 2C)，さらに矢印で示されるような長軸Table 1 Summary of cell growth, relative OMV production, OMV size, and cell volume of each E. coli strain
Culture time [h]

WT

ΔnlpI

ΔmlaE

ΔmlaEΔnlpI

OD660 [-]

24

5.1 ± 0.6

4.1 ± 0.7

5.2 ± 0.3

2.9 ± 0.2

Relative OMV production(SDS-PAGE) [-]241

7.0 ± 1.2

5.3 ± 1.5

29.4 ± 5.6

Relative OMV production(FM4-64) [-]241

5.8 ± 1.0

8.7 ± 0.7

13.8 ± 3.9

Average OMV size [nm]24

83.9 ± 0.3

81.7 ± 0.3

65.9 ± 0.6

100.4 ± 0.5

Cell volume [fL]3

1.08 ± 0.27

0.85 ± 0.26

1.04 ± 0.27

1.08 ± 0.28

24

0.52 ± 0.18

0.39 ± 0.15

0.41 ± 0.14

0.39 ± 0.20

The data were obtained from three independent experiments (n = 3).

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遺伝子組換え大腸菌が生産する新規な膜小胞の解析と有用物質分泌生産への応用

Fig.1 Surface structure of the wild-type (WT) E. coli BW25113 and ΔmlaEΔnlpI cells visualized via quickfreeze, deep-etch electron microscopy (QFDE-EM). (A, D) Phase-contrast optical microscopy image ofthe WT (A) and ΔmlaEΔnlpI cells (D). (B) Field image of the WT cells. (C) Magnified image of thesurface of WT cells. (E) Field image of the ΔmlaEΔnlpI cells. (F) Magnified image of the surface ofΔmlaEΔnlpI cell.

Fig. 2 Cross-section of various fractured E. coli cells visualized by QFDE-EM. (A) Field image of cells. (B)Magnified image of the structure of the WT cells. (C) Field image of the ΔmlaEΔnlpI cells. OM, outermembrane; IM, inner membrane; CP, cytoplasm. (D) Magnified image of the structure of the ΔmlaEΔnlpI
cells. The arrowheads indicate the plasmolysis. (E) Magnified image of the structure of the ΔnlpI cells.
(F) Magnified image of the structure of the ΔmlaE cell.

の先端部に外膜と内膜のペリプラズム空間が拡張した原形質分離が生じていることが明らかとなった(Fig. 2D)．
ΔmlaEΔnlpI の全細胞のおよそ 50％以上の頻度ではっきりとした原形質分離が観察された．また原形質分離は，

ΔnlpI と ΔmlaE の単独遺伝子欠損株においても観察され(Fig. 2E, F)，OMV 高生産株に共通の表現型であることも確認された．

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さらに観察を続けると，ΔmlaEΔnlpI において原形質

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分離が起こった長軸先端部の外膜が括れて，小胞を形成

で，超遠心分離により回収した OMV を酢酸ウラニルにしている様子が確認された(Fig. 3A, B)．

よるネガティブ染色で観察したところ(Fig. 4)，野生株

この現象は他の細胞においても高い頻度で観察されたで は 多 重 膜 の OMV は 観 察 さ れ な い の に 対 し て，ため(Fig. 3C)，ΔmlaEΔnlpI における主な OMV 形成経

ΔmlaEΔnlpI では数％の頻度で多重膜小胞が観察された．
この多重膜小胞は，ΔnlpI ではさらに低頻度で観察され，路であると考えられる．さらに興味深いことに，ペリプ
ラズム空間に細胞内小胞のようなものや(Fig. 3D)，多重膜と考えられる小胞も観察された(Fig. 3E, F)．そこΔmlaE では観察されなかったことから，nlpI の欠損がきっかけとなり生じる表現型であることが示唆された．

Fig. 3 Cross-section of plasmolyzed ΔmlaEΔnlpI cells. (A–D) Magnified image of the structure of the plasmolyzed
cells. The arrowheads indicate the blebbing from the outer membrane. (E) The multilamellar vesicle
generated from the ΔmlaEΔnlpI cells.

Fig. 4 Transmission electron microscopy images of the OMVs isolated from E. coli. (A) WT. (B) ΔmlaEΔnlpI.
(C) ΔnlpI. (D) ΔmlaE strains. The OMVs were stained with uranyl acetate.

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遺伝子組換え大腸菌が生産する新規な膜小胞の解析と有用物質分泌生産への応用

大腸菌細胞からの PG の調製と急速凍結レプリカ電子顕微鏡法による観察

構造が脆弱化していることが示唆された．他の研究グ
ループにより，シェワネラ属細菌では PG の穴から細胞NlpI は PG 層の架橋を加水分解する酵素である Meps

内膜や細胞内成分がペリプラズムに流出し，その成分をの機能を制御するリポタンパク質として報告され，nlpI

内 包 し た 外 内 膜 小 胞(outer-inner membrane vesicles,を欠損することで Meps による PG 層の加水分解が促進

OIMVs)が報告されており(Pérez-Cruz et al., 2013)，こされ，PG 層と外膜の結合が緩み，外膜が隆起しやすくの結果を受け ΔmlaEΔnlpI では OIMV が生産されているなることで OMVs の生産が促進されると考えられる．

可能性が考えられた．

本研究において，細胞内で原形質分離が生じていること

以上の結果から，予想される大腸菌株 ΔmlaEΔnlpI のもその推察を裏付けるものである．そこで，ΔmlaEΔnlpIOMV 生産機構を Fig. 6 にまとめる．ΔmlaEΔnlpI は通常の PG を調製し，同様に急速凍結レプリカ電子顕微鏡法の OMV と多重 膜 小 胞である OIMV を 生 産 し て お り，により観察した．まずは，酸化タングステンでネガティ

OMV の 生 産 促 進 に 関 し て は，ΔmlaEΔnlpI に お い てブ染色した PG を TEM で観察したところ，野生株とLpp-PG 架橋の機能不全により，細胞の長軸先端部位でΔmlaEΔnlpI で PG が形状を保ったまま調製できていることが確認された(Fig. 5A, E)．

原形質分離が高頻度で生じ，余分な外膜が括れ取られる

続いて，急速凍結レプリカ電子顕微鏡法で表面状態を観の生産に関しては，一段階目として，内膜や細胞質膜物ことで，生産が促進することが明らかとなった．OIMV

察したところ，野生株の PG は細胞を観察した際と類似質が PG の穴を通ってペリプラズム空間に漏出し，細胞した形状をしており(Fig. 5B)，さらに高倍率で撮影す

内小胞が形成される．二段階目として，細胞内小胞が外ると滑らかな表面構造をとっていることが観察された膜とともに細胞外へ放出され，多重層小胞である OIMV

(Fig. 5C, D)．一方で，ΔmlaEΔnlpI では長細い形状をしが生産されると考えられた．以上の様に，本研究では電た PG が多く，細胞と同じような傾向が見られた．さら子顕微鏡を用いたアプローチによって，大腸菌の多重遺に高倍率で観察すると，図中の矢印で示すように長軸先伝子欠損株の新規な膜小胞形成過程を明らかにした．ま

端部に穴が開いている様子が複数観察され，大きなもの

たこの過程において，細胞膜の断片化や再結合による膜では直径 50 nm を超えていた(Fig. 5G, H)．一般に大腸小胞の形成が生じているかどうかに関しては現時点では菌の PG 構造上に存在する隙間は 2 nm 程度であり，野明らかとなっておらず，ライブセルイメージング等を用

生株には確認されなかったため，ΔmlaEΔnlpI では PG

いた観察による確認が必要である．

Fig. 5 Surface structure of PG of the WT and ΔmlaEΔnlpI E. coli cells. (A, E) The TEM image of the PG
stained with uranyl acetate of WT and ΔmlaEΔnlpI. (B) Field image of the WT cells. (C–D) Magnified
image of the surface of the WT PG. (F) Field image of the ΔmlaEΔnlpI PG. (G–H) Magnified image ofthe surface of the ΔmlaEΔnlpI PG.

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Fig. 6 Possible models of the mechanism underlying vesicle formation by ΔmlaEΔnlpI cells. Left side: model for mechanismin the promoted unilamellar OMV production. Right side: model for mechanism in OIMV production.

Fig.7 Green fluorescent protein (GFP) secretion in the OMV fraction isolated from each E. coli strain. (A) Relative
OMV production by each E. coli strain normalized to that by the WT strain. (B) Western blot analysis of secreted
GFP using an anti-His-tag primary antibody. (C) Quantitative evaluation of GFP secretion in the OMV fractions ofcorresponding E. coli strains. (D) Western blot analysis of the GFP produced in each E. coli cell. Loading samples
were prepared on an OD 660 basis to include the same quantity of cells. The data are expressed as the mean ofthree independent experiments (n = 3) and standard deviation (vertical bar).

OMV 高生産株を用いた大腸菌のタンパク質分泌生産

増殖に関しては，ΔnlpI および ΔmlaE の OD660 値はそれこれまでの結果から，OMV 高生産株である ΔmlaEΔnlpI

ぞ れ 4.6 お よ び 4.5 で あ り， 野 生 株 の 6.0 よ り も 低 く，

では OIMV と考えられる多重膜小胞が確認され，PG にも穴が存在することが明らかとなったことから，この株

ΔmlaEΔnlpI は 2.7 で最も低かった(データ省略)．タン
パ ク 質 基 準 で OMV 生 産 量 を 相 対 比 較 し た と こ ろを用いることで組換えタンパク質の分泌生産を試みた．

(Fig. 7A)，ΔnlpI および ΔmlaE による OMV 量はそれぞ

モデルタンパク質として GFP を細胞質内に発現させ，れ野生株の 5.7 倍および 5.1 倍であったが，ΔmlaEΔnlpIOMV 画分を回収して GFP の分泌量を評価した．まずは 55.8 倍となった．

－ 50 －

遺伝子組換え大腸菌が生産する新規な膜小胞の解析と有用物質分泌生産への応用

これらの結果は，pCA24N-gfp プラスミドを導入してもローチ以外に遺伝子の発現量を制御可能な技術である

高い OMV 生産量は維持されることを示唆している．続CRISPRi を応用し，最適な発現抑制状態を探索すること

いて，OMV 画分に含まれる GFP をウエスタンブロッ

で，細胞の活性を保ったまま OMV の高生産を試みた．結ティングにより評価した(Fig. 7B)．野生株では検出感果として，複数設計した gRNA の内，mlaE では mlaE ― 1，

度以下でありバンドが検出されなかったが，各欠損株では検出され，特に ΔmlaEΔnlpI では非常にバンド強度がmlaE ―2，mlaE ― 3 の 3 つ(Fig. 8A)，nlpI では nlpI ―4 の
1 つの gRNA が有意に対象遺伝子の mRNA 発現を抑制強かった．濃度既知の GFP のバンド強度から培養液中した(Fig. 8B)．

の分泌濃度を算出したところ(Fig. 7C)，ΔnlpI と ΔmlaE

一般的に，対象遺伝子の N 末端に近い領域に gRNA をではそれぞれ 14.3 μg/L と 36.5 μg/L であった．一方で，設計したほうが抑制効率が高いとされるが，今回の結果

ΔmlaEΔnlpI では約 2 mg/L と他の株と比較して非常に高い分泌濃度を示した．この原因として，分泌効率の向上

か ら そ の 傾 向 は 見 ら れ な か っ た．mlaE で は，3 つ のgRNA をそれぞれ導入することで，野生株の 3, 10, 32％

ではなく細胞内での発現量そのものが増加したことが考の発現量に抑制された(Fig. 8A)．ここで，増殖を示すえられたため，細胞量を合わせてウエスタンブロッティ

OD660 は野生株と mlaE 欠損株の間の値となり回復傾向

ングを行い細胞内の GFP 量を比較したところ，Fig. 7Dが確認された(Fig. 8C)．さらに，OMV 生産量は遺伝子に示すように株間でほとんど差がないことがわかった．

の発現抑制度合いに応じて，野生株と欠損株の間の値とまた OMV 生産量の増加倍率以上に分泌量が向上していなった(Fig. 8A)．nlpI に関しては，gRNA の導入によりる理由については，細胞質内に発現した GFP が PG の13％の発現量に抑制され(Fig. 8B)，増殖は野生株と欠損穴を通してペリプラズムに漏出し，OMV への内包効率

株の間の値となった(Fig. 8D)．興味深いことに，OMVが増加したことが考えられた．以上の結果から，OMV

生産量は，欠損株よりも 40％ほど増加した(Fig. 8B)．

を介した組換えタンパク質の分泌生産の有効性が実証さ以上の結果から，CRISPRi を用いて発現抑制株を作製れた．今後は，密度勾配超遠心法などにより，全 OMVすることで，欠損株よりも高い増殖を保ちながら，OMV画分に占める OIMV の割合を評価することで，分泌へ生産量を向上できることがわかった．今後は，mlaE との寄与度を評価できると考えている．

nlpI の発現抑制を組み合わせる，もしくは mlaE 欠損株の nlpI 発現を抑制するなどの最適化を行うことで，細OMV 高生産株を用いた大腸菌の脂肪酸分泌生産

胞負荷の高い有用物質生産に向けた OMV 高生産株を作

OMV を介したタンパク質の分泌生産が実証されたた製する予定である．

め，続いて疎水性が高くタンパク質より分泌が難しい有要用物質として脂肪酸の分泌生産を試みた．脂肪酸は，分解に関与する fadE 遺伝子を欠損し，生産の促進に関与す

約

るチオエステラーゼ遺伝子(tesA)を細胞質内で過剰発現

外膜小胞(Outer Membrane Vesicles; OMVs)は，グラさせることで，細胞内に蓄積することが報告されている

ム陰性細菌の外膜から遊離した直径 20 ～ 250 nm の細胞(Liu et al., 2017)．今回は，この脂肪酸生産菌 Δ fadE/tesA

外小胞である．本研究では，大腸菌のペプチドグリカンの mlaE と nlpI を欠損させた ΔfadΔmlaEΔnlpI/tesA を作(PG)構造維持に関与する nlpI 遺伝子と，外膜外層への製し，培地中への脂肪酸の分泌量をガスクロマトグラ

リン脂質バランスを維持する mlaE 遺伝子の欠損を重ねフィーによって測定した．結果として，ΔfadE/tesA では，た 2 重欠損株 ΔmlaEΔnlpI が，野生株の約 30 倍の OMVs

約 300 mg/L の濃度で脂肪酸を生産したが，大腸菌細胞を生産することを明らかにした．さらに急速凍結レプリ

内に蓄積した状態であり培養上清からはほとんど検出さカ電子顕微鏡法により，ΔmlaEΔnlpI の細胞ではペリプれなかった．一方で，Δ fadΔmlaEΔnlpI/tesA では，増殖

ラズム空間が広がる原形質分離と細胞内小胞が生じ，多が抑制され脂肪酸の生産量が 10％以下に減少し，さら重膜小胞も生産することを確認した．さらに急速凍結レに培養上清への分泌は確認できなかった．この結果は，プリカ電子顕微鏡法による PG の観察では，2 重欠損株

細胞のエネルギー消費が大きい脂肪酸生産株に対して，

では野生株には見られないサイズの穴が多数観察された細胞を脆弱化させる OMV 生産促進用の遺伝子欠損を重ことから，PG の穴を介して内膜がペリプラズムに漏出ね合わせたことで，細胞の負荷が大きくなり過ぎたことし，更に外膜に包まれた外内膜小胞が生産されているとが原因であると考えられた．

考えられた．この結果より，細胞質内で生産される組換
えタンパク質や脂肪酸の細胞外分泌を目的とし，組換え

CRISPRi による発現抑制株の作製と OMV 生産量の評価

タンパク質として GFP を細胞質内発現させたところ，2

OMV を高生産させる手法として，遺伝子欠損のアプ重欠損株では 2 mg/L 程度の濃度で OMV 画分に分泌さ－ 51 －

尾

島

由

紘

Fig. 8 Expression suppression of mlaE and nlpI using Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats Interference(CRISPRi). (A) Relative gene expression and OMV production of mlaE-repressed strain. (B) Relative gene expression
and OMV production of nlpI-repressed strain. (C) OD660 of mlaE-repressed strain. (D) OD660 of nlpI-repressed strain.
The data are expressed as the mean of three independent experiments (n = 3) and standard deviation (vertical bar).
Significant difference (p < 0.05) is marked with asterisks.

れ，タンパク質分泌生産ツールとして有効であることを

for Biotechnology and International Conference (TSB2022)(November 24-25, Bangkok, Thailand) Invited talk3) Ojima, Y., Sawabe, T., Nakagawa, M., Tahara, YO., Miyata,M., & A zuma, M. 2021. Aberrant membrane structuresin hyper vesiculating Escherichia coli strain ΔmlaEΔnlpI
visualized by quick-freeze deep-etch electron microscopy.
EMBO Biologists Workshop Bacterial membrane vesicles:
Biogenesis, functions and medical applications (November
23-26, Tsukuba (Hybrid), Japan)
4) 尾島由紘，澤邊朋美，中川真緒，田原悠平，宮田真人，
東雅之．2021．電子顕微鏡により可視化された大腸菌の外膜小胞高生産株ΔmlaEΔnlpIの異常な膜構造．第73回日
本生物工学会大会（10月27–29日，オンライン）
5) 中川真緒，尾島由紘，澤邊朋美，田原悠平，宮田真人，
東雅之．2021．大腸菌Nissle1917株の外膜小胞高生産株の特性解析．第73回日本生物工学会大会（10月27–29日，オ
ンライン）確認した．続いて，遺伝子の欠損と過剰発現により作製された脂肪酸生産大腸菌に，さらに ΔmlaE と ΔnlpI の 2
重欠損を重ねて脂肪酸の分泌生産を試みたところ，増殖と脂肪酸生産量自体の著しい低下が確認され，細胞への負荷が大きすぎることが明らかとなった．そこで，遺伝子を欠損するのではなく CRISPRi 技術を用いて発現抑制を行ったところ，増殖低下を抑えつつ OMVs 生産を向上させることに成功した．今後は，発現抑制状態を最適化することで脂肪酸などの細胞負荷の大きな有用物質の分泌生産を目指す予定である．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 熊添優希，澤邊朋美，尾島由紘，東雅之．2022．大腸菌の外膜小胞を介した有用物質分泌生産の検討．化学工学
会 岡山大会2022（12月19日，岡山）
2) Ojima, Y., Sawabe, T., & Azuma, M. 2022. Outer membrane
vesicles of Escherichia coli and its application to the biotechnology field. The 34th Annual Meeting of the Thai Society

原著論文
1) Ojima, Y., Sawabe ,T., Nakagawa, M., Tahara, YO., Miyata,M., & A zuma, M. 2021. Aberrant membrane structuresin hyper vesiculating Escherichia coli strain ΔmlaEΔnlpI
visualized by electron microscopy. Front. Microbiol. 12:706525－ 52 －

遺伝子組換え大腸菌が生産する新規な膜小胞の解析と有用物質分泌生産への応用
その他（総説・書籍・特許など）
1) 尾島 由紘，東 雅之．2022. バイオプロセスを用いた有用性物質生産技術～大腸菌を用いたタンパク質分泌生産～.
情報技術協会. pp.477-487(第7章分担執筆)
2) 尾島 由紘，東 雅之．2021. 大腸菌の外膜小胞高生産株の作製とタンパク質分泌生産等への利用．酵素工学ニュース. 86, pp.32-35

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，急速凍結レプリカ電子顕微鏡観察において，本研究の遂行にご協力いただいた大阪公立大学大学院理学研究科の宮田真人氏ならびに田原悠平氏に感謝の意を表します．

文

献Gujrati, V., Kim, S., Kim, S-H., Min, J.J., Choy, H.E., Kim, S.C.,& Jon, S. 2014. Bioengineered bacterial outer membrane
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－ 53 －

IFO Res.Commun. 37
55-66, 2023

新規分析法によるセリンラセマーゼ生産菌の網羅的探索とこのラセマーゼによる D-セリン高効率生産の研究
金内誠

宮城大学食産業学群〒982-0215

宮城県仙台市太白区旗立2-2-1

Studies of screening D-serine producing bacteria using enzymic assay method
and enhanced production of D-serine using bacteria
Makoto Kanauchi
School of Food Industrial Sciences, Miyagi University
2-1, Hatatate 2-chome, Taihaku-ku, Sendai, Miyagi 982-8686
Among the many D- amino acids which have healthy functions, D- serine reportedly prevents cognitive impairmentof the human brain. After lactic acid bacteria capable of producing D- serine were selected, we investigated thebacteria cultivation conditions for production of D- serine. Many microorganisms that have serine racemase
produce D- serine from L - serine. For this study, D- serine was assayed using colorimetr y, for which peroxide
produced by amino acid oxidase reacting with D- serine was colored using methyl benzothiazolinonehydrazone(MBTH) and dimethylaniline (DMA). Lactic acid bacteria (129 strains) were cultivated in media containing
L - serine. After cultivation, the bacteria-converted D- serine was assayed. Results demonstrated high D- serine
conversion potential for the H74 strain, which was identified as Lactococcus lactis ssp. lactis according to its
morphological, physiological, and molecular biological characteristics. The H74 strain converted efficiently
L - serine to D- serine in a medium containing 1.0％ L - serine. The strain converted efficiently L - serine to D- serine at
15 ℃, and the conversion rate at 15 ℃ was found to be four times higher than that found at 30 ℃. The highconversion rate at 15 ℃ continued for 8 days.
Serine racemase activity in the strain was found in the cell membrane and cytoplasm fractions. These findings
suggest that serine racemase is a membrane-binding cytoplasmic enzyme. From these findings, we infer that thestrain has high potential for the production of D- serine and foods that contain D- serine as supplements supporting
health.
Key words: D- serine, D- serine producing bacteria, lactic acid bacteria, racemase緒

言

養学的だけでなく生化学的にも重要な物質である．アミノ酸の特徴の一つとして，光学活性を持ち，鏡像異性体

アミノ酸は，タンパク質の構成成分であり，生物の代である L 体と D 体が存在し，通常のタンパク質を構成

謝や構造・組織の維持等，各種生命活動に関わる重要なしているものは，L 型のアミノ酸のみである（胸組 ,物質である．また，グルタミン酸からは γ アミノ酪酸

1998 ）．そのためこれまでは，D 型のアミノ酸の研究が（ GABA ），チロシンからはドーパミン，トリプトファ

極めて少なかった．

ンからはセロトニンなど脳内の伝達物質の形成にも関与

本来 D 型のアミノ酸（ D -アミノ酸）は，微生物の細する（ Rhintamäki & Partonen, 2011 ）．さらに脂質の代胞表層の構成成分として生産される（ Lam et al., 2009;

謝にはリジンやメチオニンから代謝変換されるカルニチ

宮 本，2019 ）． こ れ ま で Enterococcus gallinarum は， 生ンが関与する（ Flanagan et al. 2010 ）．そのために，栄産する D -アミノ酸について詳細な検討がなされ，抗生物質であるバンコマイシン耐性を獲得するためにセリンラ

E-mail: kanauchi@myu.ac.jp

セマーゼ遺伝子(vanT )を発現して D -セリンを合成し，－ 55 －

金

内

誠細胞表層に蓄積すると報告されている（ Billot-Klein et

岡田，1992 ）．分離源となる試料 4.0 g に MRS（ De Man,

al., 1994; Arias et al., 1999 ）．この報告のように D -アミノ酸は，細菌の外部からのストレス耐性に対し，重要な役

Rogosa, Sharpe ; Oxoid, Thermo Scientific 社 ）5.0 mL を割を果たすと考えられる．また，発酵微生物も D -アミノ

その後，この培養液を PBS 溶液（リン酸緩衝生理食塩水）

酸を変換する（ Kato et al., 2011 ）が，その多くは菌体外にて，1.0×10 5 倍まで 10 倍ずつ段階希釈した．分離寒に漏出し，その結果として D -アミノ酸は発酵食品中に含天培地には，MRS - 白亜寒天培地（ 0.5％ 炭酸カルシウ有することとなる（大森・大島，2012; 井上ら，2014 ）．

ムを含む MRS 培地）（ Kondo et al., 2016 ）に，希釈し特に，乳酸菌類は，D -アミノ酸を生産するアミノ酸ラセ

た前培養液を塗抹後，アナエロパック（三菱ガス）を用

マーゼが強いことが知られるが，その特徴の一つとして，いて，嫌気下で 30 ℃，72 時間培養し，クリアーゾーン

その活性の強さや酵素学的な特性は菌株間で大きく異なをつくったコロニーは釣菌した．釣菌したコロニーは

添 加 し，30 ℃ で，48 ～ 72 時 間 培 養 し た（ 集 積 培 養 ）．

GYP 液体培地（ 1.0％ グルコース，1.0％ 酵母エキス，る（牟田口ら，2015 ）．
さらに近年では，分析機器の発達により D -アミノ酸を0.5％ ポリペプトン，1.0％ ツイーン 80 溶液，0.5％ ミネ

測定可能な分析機器が開発され，生体の代謝における生ラル溶液 pH 6.5 ）（内村・岡田，1992 ）に接種し，培養後，理機能も明らかとなった．D -アミノ酸はエネルギー変換

グリセロールと混合し，グリセロール・ストック溶液とに関わるだけでなく，食品に好ましい香味を付与する効

して -80 ℃で冷凍保存した．ただし，ツイーン 80 溶液

果（呈味性）や，疲労回復，肌のうるおいの保持，免疫は 50 mg/mL ，ミネラル溶液は 1.0 mL 中に 硫酸マグネ力の向上等の効果（大森・大島，2012 ）を有することがシウム・七水和物 ; 40 mg，硫酸マンガン・四水和物 ;報告されている．また，Avellar et al.,（2016 ）は，高齢

2 mg，硫酸鉄（II）・七水和物 ; 2 mg，塩化ナトリウム ;健常者において D -セリンが空間記憶能力，問題解決能2 mg となるようにした．

力，学習能力を促進することを報告した．また，D -セリンは，統合失調症やアルツハイマー症，脳卒中等，脳内培地中の L -セリンから D -セリンへの高変換菌株のスクの神経伝達に関わる疾患に関与し，症状を改善する（丸リーニング

山ら，2011 ）．このような D -セリンが持つ脳疾患改善に供試菌株として分離菌株および研究室保存株（合計つながる効果は，高齢者の健康維持に大きく貢献するこ

129 株）は 30 mL の MRS 液体培地に接種し，30 ℃，24とが期待できる．

時間，静置にて前培養した．培養後，遠心分離（ 6,000

このように機能性にすぐれた D -アミノ酸を作り出す乳×g，10 min，4 ℃）を行い集菌した．菌体は PBS 溶液

酸菌を選抜して，発酵食品に応用することができれば，で洗浄し，再び遠心分離（ 6000×g，10 min，4 ℃）を

医薬品に頼らないで，日常の食生活による健康増進が可行い集菌した．菌体の洗浄は 3 回行い，PBS 溶液に再能となる．特に高齢社会を迎えた日本においては，老齢懸濁した．次に 1.0％ L -セリンを含む GYP 液体培地に者の健康維持に貢献できると考えられる．

PBS 懸濁菌体を終濃度 1.0×107 cells/mL となるように

そこで，本研究ではまず，機能性に優れた D -セリン

接種し，30 ℃で 48 時間静置培養した．培養液 10 mL をの生産に着目し，高セリンラセマーゼ活性を持つ乳酸菌

15 mL 容 チ ュ ー ブ に 採 取 し， 遠 心 分 離（ 6,000×g，を自然界や食品から分離スクリーニングした．スクリー

10 min，4 ℃）を行った．上清部分を採取し，試料溶液

ニング後に得られた高変換株は培養日数，培地組成などとした．

の D -セリン変換最適培養条件や，細胞分画によるセリ
ンラセマーゼの酵素局在を検討し，D -セリンを効率的に培地中の L -セリンからの D -セリンへの変換率の測定製造し，新規機能性食品への開発につなげることを目指した．

試 料 溶 液 中 の D -セ リ ン 濃 度 の 定 量 は， 松 本・ 金 内（ 2021 ）および Kanauchi（ 2019 ）の方法を一部改変して行った．各培養液（ 50 μL ）と 150 μL の検出試薬溶液

実験方法［ 6.0 U/mL D -ア ミ ノ 酸 オ キ シ ダ ー ゼ（ ブ タ 肝 臓 由 来，

乳酸菌の分離源

わさび由来，和光純薬株式会社），0.11 mM メチルベン

Sigma-Ardrich 社），2.0 mg/mL ペルオキシダーゼ（西洋乳酸菌の分離源として，ナチュラルチーズ，なれずし，

ゾチアゾリノン ヒドラゾン 塩酸塩（ MBTH ），0.79 mM
ジメチルアニリン（ DMA ），10 mM エチレンジアミン

ホヤやサバの水産物加工物，植物試料なども用いた．

四酢酸（ EDTA ）を 50 mM リン酸緩衝液（ pH 6.0 ）に乳酸菌の分離溶解］を 96 穴ウェルマイクロプレートに分注した．こ

各試料の分離は，成書を一部改変して行った（内村・れらを 37 ℃，30 分間反応させた．反応後，プレートリー－ 56 －

新規分析法によるセリンラセマーゼ生産菌の網羅的探索とこのラセマーゼによる D -セリン高効率生産の研究

ダー Multiskan GO アドバンス（ Thermo Fisher Scientific

し，15 ～ 60 ℃まで検討した．

社）で 590 nm の吸光度を測定した．検量線には，0 ～50 mM の D -セリン溶液を使用した．コントロールは，分子生物学的特性

L -セリンを含む GYP 培地の菌体未接種培地を用いた．

16S リボソーム RNA をコードする DNA のホモロジー

培地中の L -セリンからの D -セリンへの変換率は，下記

解析は，成書に従った（鈴木ら，2001 ）．プライマーは，の計算式より算出した．

Forward primer 27f（ 5'-AGA GT T TGA TCC TGG CTC
AG-3' ）および Reverse primer 1525r（ 5'-A A A GGA GGTGAT CCA GCC-3' ）を用いた．増幅後，DNA シークエンサー（ 3130 sequencer，アプライド バイオサイエン
ス製）とシークエンス反応キット（ ABI Prism Big Dye

アミノ酸分析計による D -セリンの分析

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit， ア プ

D -セ リ ン を 含 む D -ア ミ ノ 酸 は Kuranaga & Kakeya

ライド バイオサイエンス製）を用いて解析した．また，(2022)の方法を一部改変して，測定した．すなわち，

塩 基 配 列 の 相 同 性 は，NCBI（ Basic Local Alignment

サ ン プ ル 溶 液 に N(5- -Fluoro-2,4 -dinitrophenyl)- L -Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ） に て 解 析alaninamide（ L-FDLA ）を加え，塩基性条件下で反応した．

させ，L -アミノ酸を誘導化させた．中和後，0.02 N 塩酸で希釈し，高速アミノ酸分析計 LA8080（日立ハイテク）

炭素源（糖源）の種類と濃度の違いによる培地中の L -セにて測定した．

リンからの D -セリンの変換率

生理学的・形態学的特性

0.5％ ポリペプトン，1.0％ ツイーン 80 溶液，0.5％ ミネ

1.0％ L -セリンを含む YP 基本培地［ 1.0％ 酵母エキス，
被検菌は，MRS 液体培地にて，30 ℃，24 時間，静置

ラル溶液］に，各種糖を 1.0％となるように添加した．

で前培養し，遠心分離（ 6,000×g，10 min，4 ℃）を行炭素源として，生理学的試験にて生育が確認できた D -ア

い集菌した．菌体は，PBS 溶液で洗浄し，再び遠心分

ラビノース，L -アラビノース，フルクトース，ガラクトー

離（ 6,000×g，10 min，4 ℃）により集菌した．菌体は，ス，グルコース，ラクトース，マルトース，マンニトー

PBS 溶液にて 3 回行ったものを試験に使用した．被検菌

ル，マンノース，ラフィノース，サリシン，デンプン，のグラム染色試験は，フェイバー G（日水製薬株式会社）D -ソルビトール，スクロース，トレハロース，キシロー

によって染色し，油浸レンズを用いて光学顕微鏡を用いスの 16 種類を用いた．スクリーニング株は，あらかじて 形 態 観 察 し た． カ タ ラ ー ゼ 活 性 試 験 は 内 村・岡田

め静置培養にて前培養し，1.0×107 cells/mL となるよう（ 1992 ）に従った．すなわち，菌体に 3.0％ 過酸化水素に各炭素源を含む培地に接種し，30 ℃，48 時間静置培溶液を 500 μL 添加し，3 分後，気泡の確認によりカタラー養した．培養液を遠心分離（ 6,000×g，10 min，4 ℃）し，ゼ活性の有無を判断した．被検菌の被検糖および被検炭

上清の D -アミノ酸を上記方法によって測定した．

素源類の資化性試験は，YP 基本培地（ 1.0％ 酵母エキス，
0.5％ ポリペプトン，1.0％ ツイーン 80 溶液，0.5％ ミネ

窒素源の添加量の違いによる培地中の L -セリンからのラル溶液）に，被験糖および被検炭素源を 1.0％となる

D -セリン変換

ように添加した（内村・岡田 1992 ）．被験糖および被検

1.0％ D -アラビノース基本培地［1.0％ D -アラビノース，

炭素源として，D -アラビノース，L -アラビノース，フル

1.0％ 酵母エキス，1.0％ L -セリン，1.0％ ツイーン 80 溶

クトース，ガラクトース，グルコース，ラクトース，マ液（ 50 mg/mL ），0.5％ ミネラル溶液］に，0.5％ ポリペ

ルトース，マンニトール，マンノース，D -メレチトース，

プトン，1％ポリペプトン量を加えた培地に，あらかじL -ラムノース，ラフィノース，サリシン，デンプン，D -ソ

め前培養したスクリーニング株を 1.0×107 cells/mL とな

ルビトール，スクロース，トレハロース，キシロース，

るように接種し，30 ℃，48 時間静置培養した．さらにグルコン酸ナトリウムの 19 種類を用いた．対照としてペプトン無添加の 1.0％ D -アラビノース基本培地でも同

被験糖および被検炭素源を添加しない基礎培地を用いた．

様に検討した．上記同様，培養液を遠心分離し，上清のあらかじめ前培養した被験菌を終濃度 1.0×105 cells/mL

D -アミノ酸を測定した．

となるように菌を各培地に接種し，30 ℃，48 時間で静置培養後，菌の増殖を観察した．また，被験菌の生育温

ビタミン類の添加の違いによる培地中の L -セリンからの度の検討は，1.0％ グルコースを含む YP 基本培地を用D -セリン変換

い，被験菌を終濃度 1.0×10 5 cells/mL となるように接種－ 57 －

1.0％ D -アラビノース基本培地に，ビオチン，ピリドキ

金内サール塩酸塩を，それぞれ 1.0 μg/L ，3.0 μg/L ，9.0 μg/L

誠

細胞の分画

添加し，あらかじめ前培養したスクリーニング株をあらかじめ培養したスクリーニング株は，50 mL の

1.0×107 cells/mL となるように接種し，上記同様に培養

D -セリン高変換培地に培養菌株に 1.0×10 cells/mL とな
7

して D -セリン変換率を測定した．また，ビタミン無添るように接種した．これを 15 ℃，4 日間培養後に遠心分

加の 1.0％ D -アラビノース基本培地に，上記同様にスク離にて集菌した．上清は ① 菌体外画分とした．沈殿しリーニング株を接種後，培養，遠心分離し，上清の D -ア

た菌体は PBS 溶液で 2 回洗浄後，プロトプラスト緩衝液（ 50 mM トリス-塩酸緩衝液，5.0 mM EDTA ，5.0 mM

ミノ酸を測定した．

塩化ナトリウム，25％スクロース，pH 7.5 ）に懸濁後，リ培養温度の違いによる培地中の L -セリンからの D -セリン

ゾチームを終濃度 1.0 mg/ml になるように添加し，37 ℃，

変換

16 時 間 反 応 さ せ た． 反 応 後， 遠 心 分 離（ 13,000×g，

上記から D -セリン高変換のために決定した D -セリン

10 min，4 ℃）を行った．得られた上清を ② 細胞壁消化

高変換培地［ 1.0％ D -アラビノース，1.0％ 酵母エキス，画分とした．沈殿に 50 mM リン酸緩衝液（ pH 7.2 ）を加1.0％ L -セリン，1.0％ ツイーン 80 溶液，0.5％ ミネラル

え，菌体をバーストさせた．これを遠心分離（13,000×g，

溶液，ピリドキサール塩酸塩（ 3.0 μg/L ），pH 6.5 ］に上

10 min，4 ℃）し，得られた上清を ③ 細胞質画分とした．

記同様にあらかじめ培養したスクリーニング株を接種

沈殿は 50 mM リン酸緩衝液（ pH 7.2 ）5.0 mL に懸濁し，後，15 ～ 37 ℃，48 時間培養し，D -セリン変換率を測定④ 細胞膜画分とした．各画分は凍結乾燥後，50 mM リ

した．

ン酸緩衝液（ pH 7.2 ）5.0 mL 各画分のセリンラセマーゼ
活性を測定した．なお，分画方法は，Fig. 1 に示した．

培養時間の違いによる培地中の L -セリンからの D -セリン
分画した細胞のセリンラセマーゼ活性変換
上記から D -セリン高変換のために決定した D -セリン細胞の分画溶液（ 20 μL ）に 50 μL の L -セリン基質溶

高変換培地に，あらかじめ培養したスクリーニング株を液（ 1.0 mM L -セリン，50 mM ピリドキサールリン酸塩

接種後，15 ℃で培養して，最大 8 日間培養し，経時的にを 50 mM トリス-塩酸 緩衝液 ; pH 7.5 に溶解）を加え，サンプリングして，D -セリン変換率を測定した．

37 ℃，30 分反応させた．生成した D -アミノ酸は，上記

Fig.1 Method of finding H74 strain fractions. H74 strain bacteria were fractionated to localize D- serine racemase in
the H74 strain organelles. The cultivated H74 strain was fractionated to four fractions, as the extracellular
fraction, the cell membrane fraction, cell wall fraction, and cytoplasm fraction.

－ 58 －

新規分析法によるセリンラセマーゼ生産菌の網羅的探索とこのラセマーゼによる D -セリン高効率生産の研究

方法によって測定した．ネガティブコントロールは，による D -セリン量の精度は，L-FDLA 処理後にアミノ酸

50 mM リン酸緩衝液（ pH 7.2 ）と各種 L -アミノ酸を反応分析装置によって測定し，確認した．L-FDLA は，L -アさせた．測定は，3 回以上繰り返し行った．

ミノ酸のみを誘導化（ Kuranaga & Kakeya 2022; Marfey,
1984 ）し，通常のアミノ酸分析装置では分離されない．

結果及び考察一方，L-FDLA によって誘導化されない D -アミノ酸は，アミノ酸分析装置によって分離，測定できる．そこで，培地中の L -セリンを D -セリンへ変換する乳酸菌のスクL - ，D -セリン混合溶液を D -アミノ酸オキシダーゼ - ペル

リーニング

オキシダーゼ法と L-FDLA 処理後にアミノ酸分析装置

アミノ酸ラセマーゼによって酵素生産された D -アミノ

による D -アミノ酸の測定を比較した．その結果，酵素法

酸の機能性は，数多く報告されている（大森・大島，は精度よく測定できることが確認できた（データ未提2012 ）．特に D -セリンは，統合失調症やアルツハイマー

示）．本実験での培地中のアミノ酸は，添加した 1.0％病，脳卒中等，脳内の神経伝達など治療法が確立していL -セリン以外，ほとんどがペプトンに由来し，L 型のアない疾患の治療に関与すると考えられる（ Hashimoto et

ミノ酸でその総量は 20 mg/100 g（データ未提示）と，

al., 2004 ）．そこで，本研究では，機能性に富む D -セリンに着目し，培地中の L -セリンを D -セリンに変換するセ

添加したセリンに比べ圧倒的に少なく，培地中で多くを占める 1.0％セリンが他のアミノ酸の D - 型へ変換する影

リンラセマーゼ活性が強い乳酸菌を選抜することとした．

響は少ない．そこで，D -アミノ酸オキシダーゼ - ペルオ

まず，初めに D - 型セリンの測定原理は Fig. 2A に示し

キシダーゼを用いた測定系にて，D -セリン変換乳酸菌をた．サンプル中に含まれる D 型のアミノ酸に D -アミノ

測定することとした．

酸オキシダーゼを作用させることで，アミノ酸の酸化的ナチュラルチーズやなれずし，水産物加工物，植物試

脱アミノ化反応が引き起こされる．このときに生成する料などより細菌を 60 株分離した．これらから，強い乳過酸化水素は，ペルオキシダーゼの触媒により，試薬中酸生産性があり，グラム陰性で，乳酸菌と考えられる特の MBTH 及び DMA と反応することで，紫色の呈色反徴の菌株は 25 株であった．また，グラム陽性でカタラー

応が引き起こされる．これを吸光度測定すること測定でゼ陰性の研究室保有菌株は 104 株で，合計 129 株の中かきる．そこで濃度系列を調製した D -セリン溶液で測定

ら，培地中の L -セリンから D -セリンへ変換する菌株のした結果を Fig. 2B に示した．その結果，濃度と吸光度

スクリーニングを行った．

に相関があり，R は 0.9980 であった．これによって十培地中の L -セリンから D -セリンへ 3.0％以上変換した

2分に測定できることが確認できた．

ものは 6 株，D -セリンへの変換率が 2.0 ～ 3.0％未満のも

また，D -アミノ酸オキシダーゼ - ペルオキシダーゼ法のは 6 株，D -セリンへの変換率が 1.0 ～ 2.0％未満のもの

Fig. 2 Mechanisms of assaying D- serine and standard curves of D- serine.
Panel A portrays mechanisms of assaying D- serine using the D- amino acid oxidase system. Panel B shows
the standard curve for the assay of D- serine using the D- amino acid oxidase system.

－ 59 －

金

内は 16 株，D -セリンへの変換率が 0.5 ～ 1.0％未満のもの

誠

かったが，乳酸生産は少ないと考えられた．

は 13 株，D -セリンへの変換率が 0.5％未満のものは 88

アラビノースは自然界では，主に L 体として存在する株であった．培地中の L -セリンから D -セリンへの変換

糖であり，植物細胞壁の構成成分の 1 つで，米や小麦な率が 3.0％以上の値を示した 6 株の中で H74 株が一番高

どの穀類の細胞壁を構成するヘミセルロースである（檜く，変換率は約 6.0 ～ 7.0％であった．また，他 5 株の作，1999 ）．また，アラビノースは，多くの動物の腸内D -セリンへの変換率は 3.0 ～ 4.2％
（データ未提示）であっ細菌が利用することが明らかになっている．Schutte et

た．H74 株は，伝統的な発酵食品である「へしこ」から

al.（ 1992 ）は，L -アラビノースを含んだ餌をブタに与えることで，揮発性脂肪酸及び乳酸の増加や消化率の増加

分離したものであった．

を報告し，これは腸内の乳酸菌等が L -アラビノースを資培地中の L -セリンから D -セリンへ高変換する乳酸菌 74

化・発酵するためであった．

株の同定

また，BLAST のデータベースとの相同性の結果，16S

スクリーニングされた H74 株の形態学的・生理学的

rDNA シ ー ク エ ン ス 解 析 で は H74 株 は，Enterococcus

特徴，分子生物学的特徴を検討した．H74 株の各特性をTable 1 に示した．H74 株は，グラム染色の結果はグラ

faecium（ CP115812.1 ）及び Lactococcus lactis subsp. lactis（ CP064339.1 ）とで 99.73％であった．次に生育温度をム陽性で，顕微鏡観察の結果，二連～四連球菌であった．

検討した結果，H74 株の生育範囲は 15 ～ 40 ℃で，15 ℃

カタラーゼ活性試験では発泡が確認できず，カタラーゼ

以 下，50 ℃ 以 上 で は 生 育 で き な か っ た．Enterococcus

を持たなかった．また，H74 株は，発酵中に二酸化炭素を生成せず，ホモ型発酵形式を持つことから，ホモ乳酸

faecium は，10 ℃でも生育するとされている（内村・岡田，
1992 ）．また，Lactobacillus 属は，50 ℃以上では生育で発酵連鎖球菌であることが明らかになった（内村・岡田 ,きないと報告されている（Ahmed et al. 2006. ）．よって，1992 ）．また，H74 株の被験糖および被検炭素源の資化

一連の同定試験より，H74 株は Lactococcus lactis subsp.

性は，被験糖および被検炭素源無添加を対照とした．

lactis であると同定した．

H74 株は，ラムノース，メレジトース，グルコン酸ナト
リウム以外の糖は資化した．特に L -アラビノースは資化Lactococcus 属 は Streptococcus 属 か ら，Enterococcus
属も Streptococcus 属から独立した属で，非常に近縁で性が強かった．また，この時，滴定によって乳酸の生成あると考えられている（ Scheifer & Kilpper-Balz, 1984;

量を求め，乳酸換算にて示した．48 時間でグルコース

Schleifer et al., 1985 ）．また，Billot-Klein et al.（1994 ）は，からの乳酸生産は 0.5 ～ 0.6 g/100 mL であった．L -アラ
ビノースからの乳酸の生成は 0.3 g/100 mL 程度，D -アラEnterococcus gallinarum BM4174 株が，D -セリンの生合成に関わるセリンラセマーゼ遺伝子（ vanT ）を有する

ビノースでも同程度であり，ペントースでは生育はよことを報告した．従って Lactococcus 属も Enterococcus

Table 1 Physiological, morphological, and molecular biological characteristics of H74－ 60 －

新規分析法によるセリンラセマーゼ生産菌の網羅的探索とこのラセマーゼによる D -セリン高効率生産の研究

Fig. 3 Optimum carbon sources and optimum concentrations in the medium for D- serine conversion. The
highest condition was calculated as having 100％ as the relative ratio of D- serine conversion. Panel A
shows the optimum sugars to achieve high conversion of D- serine by the H74 strain bacteria in themedium condition. Panel B shows the optimum D- arabinose concentration to achieve high D- serine
conversion by the strain bacteria in the medium condition. After assaying D- serine conversion, they calculated Tukey's test for post-hoc analysis, p < 0.05, in panels A and B.

属と同様に，セリンラセマーゼ遺伝子を有する菌株であラセマーゼに結合し，GAPDH が産生する NADH を利る．今後は本株のセリンラセマーゼ遺伝子の塩基配列な用して D -セリンの合成を阻害する（鈴木，2015）．よって，

どの詳細について明らかにする必要があると考えられた．

解糖系での糖の代謝が低い条件で生産されるのではないかと推察された．

H74 株の L -セリンから D -セリンへ変換する最適条件

次に D -セリン高変換のための培地中のポリペプトン

H74 株における D -セリン高変換のための培養条件を濃度を調べた．その結果を Fig. 4A に示した．ペプトン

検討した．まず，炭素源の種類による D -セリン変換率

を無添加の培地で H74 株を培養したものが D -セリン変を示した（ Fig. 3A ）．炭素源として D -アラビノースを用

換率が高かった．ポリペプトンは，タンパク質を酵素でいて培養したところ，グルコースで培養するより 10 倍消化したものの総称で（駒ら，2011 ）である．本実験で以上 D -セリン変換率が高かった．一方，生育を示さな用いたポリペプトンは，ミルクカゼインをパンクレアチ

いラムノース，メレジトース，グルコン酸ナトリウムをで消化させたもので，アミノ態窒素が 2.1％以上含まれて炭素源とした培地のほか，マンノース，L -アラビノース，

いる．ポリペプトン中の遊離アミノ酸として，ロイシン

キシロース，トレハロースを含む培地で培養した H74

やリシン，フェニルアラニンであった．一方，ポリペプ

でも D -セリンは検出されなかった．D -アラビノースは，

トン中のセリン含有量はペプトン 1.0 g 中に 3.7 mg であ米や米糠などの穀類の細胞壁を構成するヘミセルロース

り，培地の L -セリンと D -セリン濃度は低く，さらに，本である（檜作，1999 ）．本株は，米糠漬けの「へしこ」

測定には影響はないと考えられた．さらに，H74 株は，窒より分離し，米糠に多く存在する D -アラビノースを資化

素源が欠乏状態になることで，菌体増殖に必要なアミノしやすいのではないかと考えられた．

酸変換のためにも，ラセマーゼが上昇すると考えられた．

H74 株は，0.1 ～ 1.0％ D -アラビノースを含む培養で，酵母エキスの濃度による D -セリン変換について検討

D -セリン変換条件が最大となった（ Fig. 3B）．10％ D -ア

した．結果は，Fig. 4B に示した．酵母エキスの濃度は，ラビノースを含む培地での D -セリン変換率は 0.43％と0.1％を添加した培地での D -セリン変換率より，1.0％を低下し，豊富な栄養条件では変換しなかった．

培地に添加した培地での D -セリン変換効率が高くなっ

解 糖 系 が 活 性 化 す る と 解 糖 系 酵 素 GAPDH（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）がセリン

た．酵母エキスはビタミンを含むことから，ビタミンが補酵素としてラセマーゼ変換に関わると考えられた．

－ 61 －

金内

誠Fig. 4 Optimum polypeptone concentration as a nitrogen source and yeast extract in the medium. The highest
condition was calculated as having 100％ as the relative ratio of D- serine conversion. Panel A shows the
optimum polypeptone concentration to achieve high conversion of D- serine by H74 strain bacteria in themedium condition. After assaying D- serine conversion, they calculated Tukey's test for post-hoc analysis,p < 0.05. Panel B shows the optimum yeast extract concentration to achieve high conversion of D- serine by
the strain bacteria in medium condition. After assaying D- serine conversion, a T-test was applied to infersignificance of the findings: p < 0.05. Asterisk (*) indicates p value smaller than 0.05 (p < 0.05).

Fig. 5 Optimum concentration of vitamins in the medium.
H74 strain bacteria were cultivated the medium containing 1.0％ D- arabinose, 0.5％ peptone, 1.0％ yeast
extract, and vitamin as biotin (1–9 μg/L) or pyridoxal (1–9 μg/L) at 30 ℃ for 48 hr to achieve high conversion of D- serine of H74 strain in the medium condition. After assaying D- serine conversion, Tukey's test
was applied for post-hoc analysis. Significance was inferred for p < 0.05. The highest condition was calculated as having 100％ as the relative ratio of D- serine conversion.

そこで，次に D -セリン高変換のための培地中の各種1 種で，生体内反応の補酵素として，重要な役割を担っビタミン（ビオチンとピリドキサール塩酸塩）の添加濃ていることが知られている（ Hayashi, 1995 ）．細菌類の度について検討した（ Fig. 5 ）．

ペプチドグリカンに含まれる D -アラニンは，PLP（ピリ

いずれのデータ間でも有意差が認められなかった．しドキサール）リン酸依存型のアラニンラセマーゼにより

かし，H74 株はピリドキサール塩酸塩 3.0 μg/L を添加す変換される（宮本，2019 ）．また，セリンラセマーゼにると D -セリン変換率が高くなった．

おいても PLP 依存性のものが報告されている．カイコ

ピリドキサールはビタミン B6 活性を有する化合物のの蛹（ Uo et al. 1998 ）や，ラットの脳（ Wolosker et al.

－ 62 －

新規分析法によるセリンラセマーゼ生産菌の網羅的探索とこのラセマーゼによる D -セリン高効率生産の研究

Fig. 6 Optimum temperature for D- serine conversion. H74 strain bacteria were cultivated in medium
containing 1.0％ D - arabinose, 0.5％ peptone, 1.0％ yeast extract, and 3.0 μg/mL of pyridoxal
between 15 ℃ and 37 ℃ for 48 hr to elucidate high conversion conditions of D- serine by H74 bacteria
under temperature conditions. A fter assaying D - serine conversion, Tukey's test was used forpost-hoc analysis. Significance was inferred for p < 0.05. The highest condition was calculated ashaving 100％ as the relative ratio of D- serine conversion.

Fig.7 Optimum cultivation period for D- serine conversion. H74 strain bacteria were cultivated in medium
containing 1.0％ D- arabinose, 0.5％ peptone, 1.0％ yeast extract, and 3.0 μg/mL of pyridoxal at 15 ℃ for
2–8 days to ascertain high D- serine conversion conditions of the H74 strain. The highest condition was
calculated as having 100％ as the relative ratio of D- serine conversion.

1999 ）が，PLP 依存性セリンラセマーゼをもつと報告

本来，酵素変換の D 型と L 型の平衡は 1：1 である．

されている．これらの酵素はセリンに対する特異性が高

しかし，本実験では，菌体による変換のほか菌体の接種

く，D -セリンの生合成や生理的機能と密接に関連すると量（初期菌体量）が多く，細胞壁に蓄積した D -セリン

考えられている（三浦，1999 ）．

が徐々に培地へ遊離し，変換量が上昇したと考えられた．

D -セリン高変換のための培養温度の検討を Fig. 6 に示した．その結果，最も高い変換率を示した培養条件は 15 ℃

今後は，菌体が生産するペプチダーゼなどについても検討予定である．

であり，統計的にも有意に高いことが明らかとなった．

以上の結果より，D -セリンデヒドラターゼを用いず，次に，至適培養期間を検討した（ Fig. 7 ）．その結果，

D -アミノ酸オキシダーゼ - ペルオキシダーゼで測定が可

1 ～ 2 日間で，D -セリンの変換率は 33 ～ 34％，5 日間で能であり，H74 株の D -セリン変換の培地条件は，1.0％

は 41％であった．また，8 日間培養後の D -セリン変換率

D -ア ラ ビ ノ ー ス，1.0％ L - セ リ ン，1.0％ 酵 母 エ キ ス，

は高く，約 60％であった．さらに，D -セリン変換率を3.0 μg/mL ピリドキサール塩酸塩，1.0％ ツイーン 80 溶

L-FDLA による誘導化後にアミノ酸分析を行ったとこ

液，0.5％ ミネラル溶液を含む培地で，培養温度 15 ℃，ろ，同様に約 60％程度であった．

8 日間であると考えられた．
－ 63 －

金内

誠Fig. 8 Location of D- serine racemase in cell organization. H74 strain bacteria were fractionated to evaluate thelocalization of D- serine racemase in organelles of H74 strain bacteria. The cultivation medium of H74
strain was the extracellular fraction. After digestion by lysozyme of H74 strain, the supernatant of centrifugation was the cell wall fraction. Finally, after bursting the protoplast cells of the H74 strain bacteria, theprecipitate obtained by centrifugation was the cell membrane fraction; the supernatant of centrifugation
was the cytoplasm fraction. The highest activity of serine racemase was calculated as having 100％ as therelative activity.

H74 株のセリンラセマーゼの局在固定化酵素として利用が可能であると考えられる．現在

H74 株のセリンラセマーゼ局在を検討するために，乳酸菌の細胞を菌体外画分，細胞壁消化画分，細胞質画分，は，酵素学的特徴や分子生物学的な特徴についても検討している．

細胞膜画分に分画し，それぞれセリンラセマーゼ活性を要測定した．その結果を Fig. 8 に示した．一番高いセリン
ラセマーゼ活性を示したものは細胞質であった．細胞質

約のセリンラセマーゼ活性，61 mU/min を 100％とした相D -セリンを含む発酵食品や飲料などの食品の生産を目対活性で示した．次いで，細胞膜で相対活性 67％であっ

指し，D -セリン生産乳酸菌をスクリーニングし，さらにた．細胞外画分としての菌体溶液は相対活性 60％と菌D -セリンの最適生産条件を明らかにした．D -アミノ酸は，体内の活性と比べ菌体外の活性は低く，酵素を分泌しな食品に好ましい香味を付与する効果（呈味性が高い）だ

いないと考えられた．一般的に微生物酵素は，細胞内にけでなく，様々な機能性を有し，特に D -セリンは統合保持される菌体内酵素と，細胞外に分泌される菌体外酵

失調症やアルツハイマー病，脳卒中等，脳内の神経伝達素（ 分 泌 型 酵 素 ） の 2 種 類 に 大 別 さ れ る（ Chibata,など治療法が確立していない疾患の治療に関与すると考1974. ）．さらに，菌体内酵素は，細胞溶解等によって放えられる．

出される酵素と，細胞膜や細胞膜内膜系に結合している

まず，D -セリン量の測定は，高価な機器を用いないで酵素に分類される．細菌のセリンラセマーゼは，セリン測定するため，D -アミノ酸オキシダーゼを作用させて生ラセマーゼ遺伝子（ vanT ）解析から膜結合型であると成する過酸化水素を呈色反応させることで測定した．そ報告されている（ Billot-Klein et al., 1994 ）．

の結果，L -セリンの影響を受けず，D -セリン濃度を測定

本酵素は，細胞膜画分と細胞質画分に活性が見られる

することが可能であった．また，いくつかの乳酸菌類は，ことから，膜結合型の酵素であると考えられた．また，そのアミノ酸ラセマーゼにより，L -セリンを D -セリンへ本酵素は，細胞質で旺盛に発現・生成され，細胞膜へ運変換した．そこで，発酵食品などから分離した乳酸菌株

ばれる酵素で，本株が死滅などによって菌体外（培地中）

129 株を被験菌として，培地に L -セリンを添加し，乳酸に，漏出したのではないかと推察した．

菌を培養後に生成する D -セリン量を D -セリンデヒドラ

また，本酵素は 60 ℃でも活性がある耐熱性酵素であり，一方，菌体は 60 ℃でほとんど死滅する（データ未

ターゼを用いず，D -アミノ酸オキシダーゼを利用して測定した．その結果，H74 株が最高値を示した．

提示）．このような性質から，細胞を死滅後に，菌体を－ 64 －

H74 株は，形態学的，生理学的，分子生物学的特徴か新規分析法によるセリンラセマーゼ生産菌の網羅的探索とこのラセマーゼによる D -セリン高効率生産の研究

ら Lactococcus lactis subsp. lactis であると同定した．
また，
H74 株の D -セリン変換率条件を検討した結果，炭素源を 1.0％ D -アラビノース，1.0％ L -セリン，1.0％ 酵母エ
キス，3.0 μg/mL ピリドキサール塩酸塩を含む培地で，
L -セリンから D -セリン変換率が最大となった．D -セリン

高変換のための培養温度を検討した結果，最も高い変換率を示した培養条件は 15 ℃であり，30 ℃での培養と比較して，約 2.4 倍高い D -セリン変換率を示すことが明らかになった．
培養 8 日目では，L -セリンから D -セリンへの変換率は約 60％と高い値となった．さらに，H74 株のセリンラ
セマーゼ活性は細胞膜と細胞質画分に局在することか
ら，膜結合型の酵素であると考えられた．
以上の結果 H74 を用いて，D -セリン製品や D -セリン
高含有食品の生産のポテンシャルを持つことが明らかとなった．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 加藤陽菜子・庄子真樹・金内誠；「Enterococcus faecium
H74株が有するセリンラセマーゼについて」2023年 日本
農芸化学大会
その他（特許）1) 金内誠 加藤陽菜子；D -セリンの製造方法，特願2023-094516

謝

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．

文

献Ahmed T., Kanwal R. & Ayub N. 2006. Influence of Temperature
on Growth Pattern of Lactococcus lactis, Streptococcus cremorisand Lactobacillus acidophilus Isolated from Camel Milk.
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－ 66 －

2017 年度寄付講座助成の研究報告
助成期間：2017 年 10 月～ 2023 年 3 月

IFO Res.Commun. 37
67-73, 2023

生物間相互作用解析を基軸にした糸状菌の潜在機能の開拓と利用
萩

原

大

祐

筑波大学生命環境系糸状菌相互応答講座〒305-8577

茨城県つくば市天王台1-1-1

Exploitation and utilization of potential functions of filamentous fungi basedon biological interaction analysis
Daisuke Hagiwara
Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
1-1-1, Tennodai, Tsukuba, Ibaraki 305-8577
Filamentous fungi, which inhabit diverse environments on earth, are ecologically important as they contribute tomaterial cycles based on biomass decomposition, and they also have a strong influence on human society throughtheir effects on animal, plant, and human diseases and their application in the fermentation industr y. In theenvironment, they interact with microorganisms with different growth mechanisms, such as viruses, bacteria, andfungi, and a detailed and comprehensive understanding of these interactions is important for understanding thetrue ecology of filamentous fungi. Therefore, our laboratory has focused on 1) viruses in filamentous fungi cells,2) co-cultures between filamentous fungi, and 3) interactions with microbial community, and has been analyzingthese interactions. In particular, we have explored filamentous fungal viruses (mycoviruses) on a large scale,
which have not been given much importance, and have contributed to our understanding of the diversity of
mycoviruses and the mechanisms by which they express their functions in the host. Co-culture experiments withother fungi and filamentous fungi have also revealed the molecular basis of the mutual response that induces the
production of secondary metabolites. We believe that this detailed and bird's-eye understanding of the interactions
between organisms based on filamentous fungi will establish a new field of filamentous fungi research in the future.
Key words: Aspergillus, Mycovirus, Secondary metabolism, Co-culture

第一章

はじめに

出している．裏を返せば，生物量としても大きな割合を占める糸状菌が関わる生物間相互作用により，地球上の糸状菌は菌糸生育により増殖し環境中に広く分布している菌群である．その種数は 220 万種以上と推測されて多くの環境生態系が構成され，恒常性が維持されているとも言える．

おり，既知種は 12 万種ほどである( Hawksworth and L

一方，単独の生物としての糸状菌は，ペニシリンには

Lücking, 2017 ）．これらの分離菌株に限っても，形態やじまる化合物や多様な産業用酵素の生産宿主としての有機能，生態は実に多様であり，多くの糸状菌は主に植物用性を見出されて研究が大きく進展してきた．細胞生物

バイオマスを分解する腐朽菌として生息し，地球上の炭学や分子生物学的な解析により，有用物質の生産機構や，素循環のキープレーヤーとして分解酵素分泌系の進化を形態形成，代謝，環境応答機構などの理解が深まり，近遂げている．植物に感染する病原性戦略を持つ種や，陸年では遺伝子レベルで多くの因子が明らかにされてい上植物と栄養交換による相利共生関係を築く種も存在す

る．このように，ゲノム配列の決定を契機に，単独の生る．植物のみならず，動物や両生類，昆虫に感染性を示物として糸状菌はより深く広く研究されている．同じ頃，す種もあり，生態系における多様な生物間相互作用を創

糸状菌の機能の発現に，糸状菌と他者との相互作用が大きく寄与することが報告されるようになった．たとえば，

E-mail: hagiwara.daisuke.gb@u.tsukuba.ac.jp
教員：浦山 俊一(筑波大学生命環境系）．

実験室環境で単独の生育では発現せずに休眠している二次代謝は他の微生物との共培養により覚醒し，新たな代－ 67 －

萩

原

大

祐

謝 物 が 産 生 す る 例 が 多 く 報 告 さ れ て い る( Xu et al.,とは困難である．しかし我々は，従来のウイルス探索法

2023 ）．また，糸状菌内に感染するマイコウイルスが，の欠点を克服した，ウイルス配列を高感度で高精度に検生育や病原性などの宿主機能に大きく影響を及ぼすこと出する技術を有しており，その技術を活用した網羅的なも報告されている( Kotta-Loizou & Coutts, 2017; Hough

マイコウイルス探索を実施した．糸状菌に潜むマイコウ

et al., 2023 ）．このように，糸状菌と他者との相互作用が異なる様式で確認されているが，現状ではこれらの現イルスの実態とその多様性の理解を目指し，多数の糸状象を支える分子機構に関してほとんど知見が得られてい2021b ）．

菌種を対象に探索した( Chiba et al., 2021a; Chiba et al.,ない．さらに，無数の微生物が共存する複合環境においヒト病原菌の Aspergillus fumigatus を含むアスペルギて，糸状菌がどのような生存戦略をとっているのか，す

ルス属菌 175 株を対象に，マイコウイルスを構成する核

なわち，糸状菌が微生物群集とどのような相互作用を持酸種である dsRNA を精製し，電気泳動，および次世代

ち，どう応答するかについても，ほとんど解析例がない

シ ー ケ ン サ ー を 駆 使 し た Fragmented and loop primer

ため理解が及んでいない．今後，糸状菌の潜在的な能力

ligated dsRNA sequencing( FLDS）法により，ウイル

を引き出し活用する上でも，糸状菌の複合環境におけるスの検出およびウイルス配列情報を獲得した．対象株の生存戦略を解明する上でも，集団から細胞，分子のレベ

うち 23 株がウイルスを保有しており，その中から 17 種

ルまで踏み込んだ糸状菌の相互作用・相互応答研究は不のウイルスで完全長ゲノムを決定した．その結果，14 種

可欠である．

がこれまでに報告のない新規 RNA ウイルスと考えられ

そこで本寄附講座では，1）糸状菌細胞に潜むマイコ

た．マイコウイルスには，複数のセグメントから RNA

ウイルス，2）糸状菌同士の共培養，3）微生物集団に対ゲノムが構成されるものが含まれており，本研究で用いする相互作用等に着目し( Fig. 1 ），糸状菌を基軸とした FLDS 法は，それらのセグメントを同一ウイルスに帰た生物間相互作用の詳細かつ俯瞰的な理解を得ること

属することが判定可能な技術であり，既存の検出手法にで，糸状菌の真の生態理解に迫ることを目的とした．

比べて優位性を示す．したがって，今回得られたウイル

第二章

スゲノムは読み逃しのない真の完全長ウイルスゲノムで研究成果の概要あると言える．
本解析では，検出されたウイルス配列の中に一見して不可解な配列を持つものが存在した．Aspergillus fumigatus

1．糸状菌に感染するマイコウイルスの多様性解析
真菌に感染するマイコウイルスは，宿主の“病気”か

narnavirus2( AfuNV2） の RNA 依 存 RNA 合 成 酵 素ら発見された経緯がある．しかし今では，感染しても無( RNA-dependent RNA polymerase : RdRp ）と予想され症状の潜在的な感染因子も多く存在すると認識されている ORF には，本来の酵素機能発現に必要となる 5 つのる．宿主の症状から感染を判別できないため，地球上のモチーフのうち 3 つ( F, A, B）しか含まれておらず，不糸状菌類にどの程度感染が広がっているのか把握するこ

完全な RdRp タンパク質であると推測された．同ウイル

Fig.1 The aim of this study is to gain a detailed and bird’s eye view of the interactions between organisms
based on filamentous fungi.
Mycoviruses are present inside fungal cells. The objective is to determine what viruses are present and what effects
they have on the host filamentous fungi. The study of fungal interactions will reveal the molecular mechanisms of
secondary metabolism induced by co-culture. Interaction and mutual responses of filamentous fungi to indigenous
microbial communities (microbiota) in the soil and environmental biomass are the target of the study.

－ 68 －

生物間相互作用解析を基軸にした糸状菌の潜在機能の開拓と利用

スには他のセグメントが存在し，そこに含まれる ORF

を与えることができるか，あるいは，ある宿主株に同種を調べると，先の RdRp で欠落していた 2 つのモチーフ

異株のウイルスが感染すると同等の影響を与えるのか，( C, D）を含むタンパク質をコードする配列を持っていといった体系的な実験を組む必要がある．我々は，このた．すなわち，本来は一つのタンパク質として存在するような体系的な理解を得ることを目的として，ウイルス

RdRp が，必要なモチーフを 2 つの異なるタンパク質の脱離および導入法を確立し，複数の同種糸状菌株―ウ( RNA1, RNA2）に分割して保持していることが示唆さ

イルスセットに対して網羅的な機能解析を実施した．

れた．ホモロジーモデリングによる検証では，これらのまず初めに，効果的なウイルス脱離法を確立するため

2 つのタンパク質が水素結合やファンデルワールス力にに，抗ウイルス活性のある核酸アナログ試薬の効果を比より相互作用し，RdRp の活性部位を形成することが示較検証した(Ikeda et al., 2022 ）．4 種の試薬，リバビリン，

唆されており，複合体を形成して RdRp 活性を示すこと

7d2CM A( 7-Deaza-2'- C -Methyladenosine ），2CM Aが予想された．本解析では，別のアスペルギルス属菌か( 2'-C-Methyladenosine ），2CMC( 2'-C-Methylcytidine ）らも RdRp が分割したナルナウイルス配列が見つかってを用いて，A. fumigatus の複数のウイルス保有株を対象

おり，興味深いことにこちらでは違う箇所での分割型をに試験した結果，7d2CMA と 2CMA が dsRNA ウイルス示していた(前者を Type I ，後者を Type II と命名した）．

を対象に幅広く高い脱離率を示した．このように，マイ

2 種類の異なる分割タイプのナルナウイルスを発見した

コウイルスの脱離頻度は，ウイルス種と核酸アナログ種

ことから，既存のナルナウイルス配列と比較系統解析をの組合せに依存することが示され，マイコウイルス研究行なったところ，Type I と Type II のウイルス配列は異に重要な指針を示すことができた．
実際に取得したウイルス脱離株と親株となるウイルス

なるクレードに良く別れたことから，独立に発生したも保有株とを対象に，様々な条件下で各種の生育性状を比のと考えられた．
以上から，従来の手法と比べて優位性のある検出技術

較した．その結果，調べた多くのウイルス感染株は，脱を適用したことにより，これまで見逃されてきたウイル離株と比べた時にコロニー生育に影響を及ぼすことが示ス を 多 数 同 定 する こ と が で き た． 中 に は， 分 割型のされた．ただし，温度や使用した培地の種類に強く依存

RdRp を有するウイルスが含まれており，RNA ウイルスすることも示されており，培養条件により機能がダイナの分子マーカーとも言える RdRp が分割されうることをミックに変化しうることが明らかになった．

初めて示した例となった．このような極めてユニークな

アフラトキシン生産菌として知られる Aspergillus flavus

ウイルスや多様なウイルスが糸状菌から見つかることのウイルス感染株を対象として，胞子形成能へのウイル

は，マイコウイルスの実態解明に向けた探索の余地が多スの影響を調べた．この中で，2 種のウイルスに重複感く残されていることを示しているとも考えられる．

染している株( IFM 63847 ）では，単独ウイルスの感染では影響が出ないのに対して，二重感染することで胞子2．マイコウイルスが宿主糸状菌にもたらす作用の網羅形成が約 1/10 に低下する表現型を示した．この結果か

解析

ら，糸状菌に複数のウイルスが感染することで機能が発ウイルス探索の技術革新により，マイコウイルスの配現するという相互作用の可能性が示唆された．そのほか，

列情報は急速に蓄積され始めており，ウイルス機能の検複数のウイルス感染株／脱離株のセットを対象として，証は単発的に報告されるものの( García-Pedrajas et al.,

抗真菌薬感受性や二次代謝化合物生産への影響を比較

2019; Li et al., 2019; Nuss, 2005; Milgroom & Cortesi,

し，いずれも表現型として優位な影響を与えるウイルス

2004; Heiniger & Rigling, 1994 ），現状として全く追いつを明らかにすることができた( Kuroki et al., 2023 ）．

いていない．また機能を検証する上で，糸状菌宿主に対する影響を外観だけで捉えてしまうと，表現型を見せな

A. flavus の感染株／脱離株のすべてのセットを対象にトランスクリプトーム比較解析を実施し，ウイルスに対

いことも多くあるため，潜在的な感染と判定されてしまする宿主の細胞応答を解析した．発現パターン解析から，

う．実際には，目に見える表現型を示さない場合でも，ウイルス感染の有無で生じるバリエーションは，遺伝的ウイルス感染により遺伝子発現や二次代謝生産が影響を背景の異なる株間の発現パターンを超えるほどの影響を受ける例も報告されており( Zhang et al., 2022; Lee et示すものではないことが示された．このことは，目に見al., 2014 ），マイコウイルスと宿主糸状菌における相互作用について注意深く観察する必要がある．またウイルスえる表現型が無くても，遺伝子発現レベルでは，ウイル

機能をより正確に理解するには，ある一つのウイルス種

いると言える．感染の有無で一定程度以上の発現変動をス感染による宿主の応答反応が生じていることを示してに対しても多面的に評価し一般性を担保するデータが必示した遺伝子を抽出すると，前述の IFM 63847 株にお要となる．すなわち，異なる宿主株に対して同等の機能

いて，ウイルスの二重感染により単独感染よりも発現変－ 69 －

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動遺伝子数が増加していた．ここでも，複数のウイルス

ルスの再感染株を作製し原因となるウイルスの特定をの共存により宿主の応答反応が増大したと考えられる．

行った結果，直接の原因となるのはトティウイルスの感

また，同属のウイルスが感染するセット間で比較すると，染であることが判明した．さらに，トティウイルスの感発現変動遺伝子のほとんどが共通しないことから，宿主染の有無によって，テヌアゾン酸生合成因子の遺伝子

菌株やウイルス株に特有の宿主応答が生じることが示唆された( Kuroki et al., 2023 ）．以上の結果から，1）表現

TAS1，TAS2 の発現を解析すると，テヌアゾン酸の産生の増減と相関して，三重感染株で高い発現レベルを示し

型を示さない潜在的なマイコウイルスであっても，遺伝た．つまり，転写制御因子である TAS2 を正に制御する

子発現レベルでは大きな影響を与えること，2）マイコ

ことで，テヌアゾン酸生合成遺伝子発現が上昇し，結果，ウイルス感染細胞では菌株に特異的で多様な応答が起き

テヌアゾン酸産生が誘導されたと示された．

ており，3）糸状菌宿主の表現型が表出するためには，

以上の結果は，マイコウイルスが遺伝子レベルで影響条件が限定されることが明らかになった．マイコウイルを与え糸状菌の二次代謝を制御することを初めて示したスを利用することで，宿主糸状菌の遺伝子発現パターンことになる( Ninomiya et al., 2020 ）．これまでにもウイや表現型を制御する可能性に関して，その基盤となる知ルス感染による二次代謝への影響は単発的に報告があっ見を得ることができた．

たものの，本成果により，マイコウイルスが糸状菌細胞の内部でその応答機構にまでアクセスして二次代謝を作動している実態が明らかになった．糸状菌には多様な二3．マイコウイルスによる糸状菌二次代謝の誘導
マイコウイルスによる糸状菌二次代謝への影響はい

次代謝産物の生合成遺伝子クラスターが存在している．

く つ か の 報 告 が あ る． 特 に カ ビ 毒 生 産 に 関 し て は，

しかしその多くが，研究室の培養条件において発現が確

Fusarium graminearum によるトリコテセン産生はマイコウイルス感染により負の影響をもたらす( Chu et al.,

認できていない．このような休眠状態にある二次代謝を2002 ）．また，Alternaria alternata のクライソウイルス

待されている．ウイルス感染による二次代謝の活性化に

AaCV1 は宿主菌の生育不良を引き起こすものの，宿主菌おける作動原理の理解が進み，糸状菌細胞へのウイルス

は AK トキシンの産生量が増大し，植物に対する高い病導入技術が発達することで，糸状菌二次代謝を活性化す原性を示した(Okada et al., 2018 ）．Aspergillus ochraceus

るための革新的技術につながると期待される．

覚醒することにより，新規物質を得ることができると期

では，パルティティウイルスの感染によりオクラトキシンの産生が促進されることが示されたが，本現象の遺伝4．糸状菌間相互作用による抗生物質ジフェニルエーテ

子レベルでの確認は取れていない( Nerva et al., 2019 ）．

ル類の産生誘導

このように，ウイルスによる糸状菌二次代謝への影響

休眠状態にある二次代謝は新たな有用物質の探索源とは，現象としての報告がなされているものの，その制御して有望である．これらの活用を目指して，糸状菌を対メカニズムについてはほとんど理解されていない状況で象とした手法開発が進められており，培養条件の検討ある． こ の よ う な 背 景 か ら， 我 々 は イ ネ い も ち病菌( OSMAC 法），DNA メチル基転移酵素やヒストンアセ

Magnaporthe oryzae を対象として，ウイルス感染による二次代謝制御のメカニズムに関する知見の取得を目指した．

チル化阻害剤などを使用したエピジェネティック処理，
標的生合成遺伝子の異種発現，などが検討されてきた解析の対象は，3 種のマイコウイルス(トティウイル( Bode et al., 2002; Williams et al., 2008; Kennedy et al.,ス，クライソウイルス，パルティティウイルス）が重複

1999; Heneghan et al., 2010; Itoh et al., 2010 ）．これらの感染する株と，このうちパルティティウイルスのみが単

他に簡易的な手法として微生物共培養があり，注目を集

独感染する同じ遺伝系統の株を用いて，様々な培養条件

め数々実践されている．しかしこれまでの共培養研究で下で代謝物解析を実施した．その結果，ある条件においは，化合物の取得に成功しても，培養したどちらの菌のて 3 種の重複感染株が，カビ毒として知られるテヌアゾ

産物かも不明のままであることも多く，ましてや関与す

ン酸を産生誘導していることが明らかになった．テヌアる遺伝子の同定までは大抵の研究では実施されていな

ゾン酸は過去に，Alternaria 属菌や Magnaporthe 属菌かい．したがって，共培養により二次代謝が活性化するそらの産生が報告されており( Rosett et al., 1957 ），特定の分子的な理解は追いついていないのが現状である．例の条件下で産生しうることが示されている．また，テヌ

外的に，Brakhage らのグループが先駆的な研究により，

ア ゾ ン 酸 の 生 合 成 遺 伝 子 TAS1 と そ の 転 写 制 御 因 子
TAS2 についてもイネいもち病菌で同定されており(YunA. nidulans が放線菌 Streptomyces rapamycinicus との共培養でオルセリン酸生合成遺伝子クラスターを発現し，et al., 2015; Yun et al., 2017 ），この情報を参考にウイルスによる影響の分子メカニズムを検証する．まず，ウイ( Schroeckh et al., 2009 ）．その後の解析により，共培養

複数の化合物を産生誘導することが明らかにされている－ 70 －

生物間相互作用解析を基軸にした糸状菌の潜在機能の開拓と利用による化合物産生誘導にヒストンアセチル化が関与する

本研究では，モデル糸状菌 A. fumigatus と A. nidulans

こと( Nützmann et al., 2011 ），BasR という転写因子がからなる糸状菌間の共培養系を確立し，当該共培養がオ関与すること( Fischer et al., 2018 ），当該放線菌が A.

ルセリン酸生合成遺伝子クラスターの転写を活性化し，

fumigatus の二次代謝も誘導することが明らかにされている( König et al., 2013; Stroe et al., 2020 ）．このモデル

抗菌性ジフェニルエーテルの産生を誘導することを明らかにした．多様な構造を生み出す糸状菌のジフェニル

ケースでは，放線菌と糸状菌による相互作用を観察してエーテル生合成の理解を深めるとともに，A. nidulans

おり，糸状菌同士の共培養ではない．そこで本研究では，が 放 線 菌 S. rapamycinicus と A. fumigatus に 応 答 し て，糸状菌同士のモデル共培養系を確立し，共培養に伴う二異なる種類のポリケチドを産生する機構の一端を明らか

次代謝の制御を解析した．

にした．このような知見は，糸状菌を取り巻く微生物と

複数のモデル糸状菌(A. nidulans, A. niger, A. fumigatus,
and A. oryzae ）を使用して共培養により代謝物の産生誘の複雑なコミュニケーションに対する二次代謝の応答の理解に大きく貢献する．

導の検討をした結果，A. fumigatus と A. nidulans の組み

第三章

合わせで共培養した場合に，単独培養ではほとんど検出されない 3 つの主要な化合物の産生を認めた(Ninomiya

おわりに本寄附講座は，糸状菌が環境で遭遇する様々な次元のet al., 2022 ）．これらの産物は，質量分析および NMR 解析により，ビオラセオール I ，II ，およびジオルシノー

相互作用を想定し，その作用の及ぶ範囲や詳細な分子基

ルと同定された．これらの化合物は共通してジフェニル

盤を明らかにした．糸状菌に潜在的に感染するマイコウ

エーテル骨格を有しており，いずれも抗微生物活性が報

イルスの探索と網羅機能解析からは，これまでのウイル

告されている( Yamazaki & Maebayashi, 1982; Itabashi

ス学の常識を覆す新奇な遺伝子構造を持つウイルスの発

et al., 1993 ）．培養菌体を対象にトランスクリプトーム
解析を実施し，単独培養に比べて共培養時に発現上昇す

見や，表現型として表出しない深部の細胞応答を捉える

る二次代謝遺伝子クラスターを探索した．その結果，A.

張することができた．さらに我々は，子嚢菌，担子菌，

fumigatus ではシデロフォア生合成に関する遺伝子が誘導されており，共培養時は細胞外環境の鉄の争奪が起接合菌と広範な菌種を対象に合計 1000 を超える株を対象にマイコウイルスを探索し，自然界のほとんどの菌種

こっている可能性が示唆された．また，A. nidulans でにウイルス感染が及ぶことを明らかにしている．ここではシコリン生合成遺伝子クラスター( cic クラスター），

新たに得られた多数のウイルス感染株と精細なウイルス

およびオルセリン酸生合成遺伝子クラスター( ors クラ

配列ライブラリーは世界でも類を見ないユニークなリスター）の発現誘導が見られた( Sanchez et al., 2012;

ソースであり，今後，マイコウイルスの biosphere の多Schroeckh et al., 2009）．orsクラスターは，上述のように，様性と糸状菌―ウイルス間相互作用の分子機構の解明に放線菌との共培養時にも活性化し，オルセリン酸，その貢献すると期待される．

ことに成功し，糸状菌とウイルスの相互作用の理解を拡

二量体のレカノール酸などの生合成に寄与している．そマイコウイルスや共培養により糸状菌の二次代謝が活

こで，ors クラスターの骨格形成遺伝子である orsA の破性化する例を見出し，それらが遺伝子レベルで制御され壊株作製，および各因子を麹菌 A. oryzae に異種発現すている実態をトランスクリプトーム解析により明らかにることで，ors クラスターがジフェニルエーテル産生にした．特に共培養では，培養される両菌株において二次関与するか検証した．作出した菌株の代謝物の解析から，代謝が活性化することを明らかにし，共培養法が二次代

orsA がジフェニルエーテル生合成に必須であること，

謝研究において重要な解析手法であることが改めて証明

orsA の単独の発現でオルセリン酸，レカノール酸，ジフェニルエーテルである diorcinolic acid が産生されるこされた．取り上げた事例の他にも，Aspergillus 属菌同士とが示された．その他の因子である orsB および orsF をり，当該化合物の生合成遺伝子の同定に成功している．

orsA に併せて A. oryzae に異種発現させると，ジオルシ
ノールを産生した．続いて，チロシナーゼドメインを有当該遺伝子クラスターは他の菌種にも存在し，それらのする OrsC の関与を予想し，orsA, B, F に併せて orsC を産生するものがあり，化合物クラスターの応答性は菌株

異種発現させると，ジオルシノールにヒドロキシ基が導に依存することが明らかになった．さらなる共培養の事入されたビオラセオールが産生された．以上の結果から，

例の積み重ねと，詳細な分子機構解析により，二次代謝

幅広い生物活性を示すジフェニルエーテルであるビオラ

活性化の作動原理の解明につなげる必要がある．

の共培養による特異的な色素化合物の産生を確認してお菌では，共培養に応答する場合としない場合，構成的に微生物集団に対する糸状菌の相互作用・相互応答につセ オ ー ル I と II の 生 合 成 遺 伝 子 を 明 ら か に し た( Ninomiya et al., 2022 ）．

いては，本寄附講座における挑戦であり一つの目標で－ 71 －

萩原

あった．そのためにマイクロコズム培養による実験系を確立し解析を進めており，実際に，集団内での糸状菌の挙動を，生育量や発現応答，機能発現などの視点で分析することが可能になった．プレート上や液体培地とは大きく異なる振る舞いも見出され，本手法が糸状菌の新たな生態の発見に大きく寄与するものと確信する．本手法を駆使した相互作用研究をさらに発展させ，今後の糸状菌研究の新たな領域を確立し，真の生態に迫る研究を展
開したい．

謝

辞

本研究は公益財団法人発酵研究所の平成 29 年度寄付講座助成で行われたもので，ここに感謝の意を表します．
そして，寄付講座研究員(二宮章洋，老木紗予子，趙彦杰，黒木美沙，Wasiatus Sa'diyah ），寄付講座技術補佐員(水越浩子，大畑由紀子，中澤善美，畑林秀美），筑波大学糸状菌相互応答講座の学生・構成員諸氏の協力のもとに，研究を真剣に楽しく抜かりなく実施してまいりました．誰一人取り残すことなく，関わったメンバーがみな前向きに次に進むことができたことに，感謝の意を表します．また，筑波大学生命環境系，高谷直樹教授，
竹下典男准教授，野村暢彦教授には多大なるご支援と，的確なタイミングで効果的なアドバイスを投げかけてい
ただいたことに感謝いたします．

文

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－ 73 －

IFO Res.Commun. 37
75-85, 2023

糸状菌に感染するマイコウイルスの多様性解析
浦山

俊一，萩原

大祐

筑波大学生命環境系糸状菌相互応答講座〒305-8577

茨城県つくば市天王台1-1-1

RNA virus diversity in filamentous fungi
Syun-ichi Urayama, Daisuke Hagiwara
Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
1-1-1 Tennodai, Tsukuba, Ibaraki 305-8577
In recent years, virus surveillance in filamentous fungi have revealed the existence of numerous novel viruses,
which revolutionized our understanding of viral diversity on earth. In this study, we applied a novel virus discovery
method to filamentous fungi, which has enhanced sensitivity and various advantages compared to conventional
approaches. This enabled us to identify a large number of viruses that had been overlooked until now. In thepresent study, we discovered a divided RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), which is an essential RNA viral
replication enzyme and empirically considered to be encoded by a single gene. Due to such diversity of viralstructure and untapped fungal resources, filamentous fungi currently are a promising model host organism for the
research of RNA viruses.
Key words: Aspergillus, Mycovirus, RNA virus, RdRp

緒言

イルスの多様性の理解が進んでいる生物群となっている( Charon et al., 2022 ）.
現在知られているマイコウイルスの大部分は RNA を真菌に感染するウイルス(マイコウイルス）の存在は
1960 年頃に初めて明らかになり，ウイルスの発見からゲノムとする RNA ウイルスに属する．RNA マイコウイ

は約 70 年後のことである( Hollings., 1962 ）．マイコウ

ルスは一般に細胞外感染経路を持たないため，宿主真菌イルス発見のきっかけは，マッシュルーム栽培におけるを殺すことなく，その細胞内に持続的に存在する．概し子実体の形成不良であり，その病原体を探索する過程でて，ゲノムサイズは数 -20 kb 程度で，1-複数本の RNA

真菌にも RNA ウイルスが感染していることがわかった．

に少数の遺伝子をコードしている．また，自身の RNA

その後，パン酵母や種々の植物病原菌からも RNA ウイ

ゲノムを複製するのに必要不可欠な RNA 依存 RNA 合ルスが見出され，今では真菌一般に RNA ウイルスが存成酵素( RNA-dependent RNA polymerase，以下 RdRp ）在することが知られている(Ghabrial et al., 2015）．現在，を有している．
真菌における RNA ウイルス探索は当初，長鎖 2 本鎖真菌は動物と植物に次いでそこに感染している RNA ウ

RNA(以下 dsRNA ）を生物試料から精製し，電気泳動
E-mail: hagiwara.daisuke.gb@u.tsukuba.ac.jp
共同研究者：千葉 悠斗(筑波大学特別研究員 DC2，現 明治大学農学部）．
老木紗予子(筑波大学生命環境系，現 京都大学
農学研究科）．
長野由梨子(海洋研究開発機構）．
趙
彦杰(筑波大学生命環境系）．
黒木 美沙(筑波大学生命環境系，現 東京大学
農学生命科学研究科）．
矢口 貴志(千葉大学真菌医学研究センター）．

で 検 出 す る こ と で 行 わ れ た( Kotta-Loizou & Coutts,
2017 ）．dsRNA は RNA ウイルスのゲノムや複製中間体などに由来する核酸種であり，RNA ウイルスのいない細胞試料からは検出されない．dsRNA 電気泳動はこの原理を応用した RNA ウイルス検出法で，1970 年代に確立して以降，現在に至るまで使用されている．一方，シー
ケンシング能力の向上に伴い，近年では RNA-seq を利用した RNA マイコウイルスの探索も広く行われるようになった( Kondo et al., 2022 ）．さらに，ウイルスの探－ 75 －

浦山

俊一，萩原

大祐

索ではなく真菌のトランスクリプトーム解析を目的に取れはすなわち，RNA-seq で得られる配列ベースでウイ得され，公共データベースにデポジットされているルス情報を拡張することの限界と言える．
著者らはこれら RNA ウイルス探索手法の欠点を克服

RNA-seq データからも，RNA マイコウイルスの探索がしつつ，極めて効率的に高品質な RNA ウイルスゲノムを決行われている．
dsRNA 電気泳動と RNA-seq テクノロジーは，マイコ定する手法を過去に確立している( Urayama et. al., 2018;

ウイルスに限らず RNA ウイルス多様性研究に大きな進Hirai et. al., 2021 ）( Fig. 1 ）． 当 該 手 法 は Fragmented

展をもたらした技術であるが，いずれの技術にも無視でand primer-Ligated DsRNA Sequencing 法( FLDS） ときない限界がある．まず，dsRNA 電気泳動には，検出命名し，dsRNA の完全長配列を解読可能な技術である．

感度以下の量の dsRNA しか存在しないものは見逃してFLDS ではまず，dsRNA をハイスループットシーケン

しまうという限界がある．感度の高い染色剤を用いたとサーによりシーケンシングすることで，電気泳動よりもしても ng オーダーの dsRNA が必要であり，特に RNA

高感度に RNA ウイルスゲノムを解読( RNA ウイルスをウイルスの中でも一本鎖 RNA ウイルスは 2 本鎖 RNA 蓄検出）する．さらに，dsRNA 分子の完全長配列を網羅

積 量 が 少 な く 検 出 し に く い と さ れ て い る． 後 者 の的に決定することで，既知 RNA ウイルスとの配列類似

RNA-seq では，十分なシーケンシングデプスが得られ性に依存することなく RNA ウイルスゲノムを同定可能

る場合は dsRNA 電気泳動よりも高い感度が得られる．

となっている( Fig. 1 ）．本研究では FLDS を適用し，糸しかし，得られた配列情報から RNA ウイルスに由来す状菌に感染する RNA マイコウイルス(以下単にマイコるすべての配列情報を正確に取り出すことが可能なわけ

ウイルスと表記）の完全かつ最高品質のリスト構築を目ではない．RNA 試料にはウイルス由来の RNA だけでは指した．これにより，糸状菌に潜むウイルスの実態とそなく，宿主由来の RNA などの非ウイルス由来 RNA も含の多様性の理解につながることとなる．

まれてしまうため，一般に，得られた配列が何に由来す

実験方法

るかを判定するために「既知配列との類似性」が用いられる．既知 RNA ウイルス配列と“有意”に当該配列が似ていれば，この配列は RNA ウイルスに由来すると判菌株と培養方法

定するというものである．そのため，RNA ウイルス配

本実験で使用した菌株を Table 1 に示した．Aspergillus

列としてリストアップされていない未知の RNA ウイル

fumigatus およびその近縁種 A. lentulus, A. udagawae, A.

ス配列については，原理的に捉えることができない．こpseudoviridinutans, Neoartrya fischeri は千葉大学真菌医

Fig.1 Differences in FLDS and conventional method (RNA-seq). RNA viruses with a multi-segmented genome haveconserved terminal sequences among their own genomic segments. FLDS allows us to obtain full-length RNA
sequences containing the terminal sequences, which are difficult to obtain with RNA-seq, and to reconstruct
RNA viral genomes based on the terminal sequences. RNA-seq has difficulty in obtaining the terminal sequence.
The only sequences with similarity to reported RNA viral sequences can be extracted as RNA virus sequences.
Highly novel RNA virus sequences which show no significant similarity to the reported RNA virus sequences
may be overlooked in RNA-seq.

－ 76 －

糸状菌に感染するマイコウイルスの多様性解析
Table 1 Over view of mycovirus surveillance from Aspergillus

学研究センターが保有する株を使用した．A. creber, A.

Bio ）によりコンティグ配列を作成した．カバレッジの

amoenus, A. sydowii, A. protuberus, A. tennesseensis, A.

高いコンティグについてはマッピング状況を確認しながjensenii は，海洋研究開発機構が保有する深海に分離源を 持 つ 株 を 使 用 し た． 全 て の 菌 株 は 適 温 に て potato

らコンティグの伸長を行った．最終的に得られたコン

dextrose broth 培地で振蕩培養した( 120 rpm ）．液体培

分子の末端まで到達しているかどうかを判断し，両端が地からミラクロスやフィルター等を使用して菌体を回収末端と判定されたコンティグを完全長配列とした．

ティグ配列のマッピング状況から，各コンティグが dsRNAし，ペーパータオル等で水分を除去後，使用するまで-80 ℃にて保存した．

系統解析

dsRNA 精製と電気泳動による RNA ウイルス検出

ドメイン検索を実施した( Finn et al. 2016 ）．系統解析

ORF 予測は ORFfinder によって行い，Pfam を用いた菌体は，液体窒素存在下で乳鉢，またはビーズ式細胞を行うために，NCBI nr データベースから取得したアミ破砕装置( MP Biomedicals Inc ）を用いて破砕した．破ノ酸配列を加え，MEGA6( Tamura et al., 2013 ）内の砕 後 の 菌 体 約 0.1 g か ら sodium dodecyl sulfate–phenol

MUSCLE( Edgar, 2004 ）を用いてアライメントを作成

法を用いて全核酸を抽出した．全核酸溶液から cellulose

した．アライメントの不明瞭な位置は，trimAl( Capella-resin chromatography 法( Morris & Dodds, 1979; Okada

Gutiérrez et al. 2009 ） を 用 い て 削 除 し た．RAxML

et al., 2015 ） に よ り dsRNA を 精 製 し た． 精 製 し た
dsRNA をエタノール沈殿により濃縮し，1％アガロース( Stamatakis, 2006 ）を使用して最尤推定法に基づく系統

ゲ ル 電 気 泳 動 に 供 し た． 検 出 に は GelRed( Biotium ）た．アミノ酸置換モデルは Aminosan( Tanabe, 2011 ）を用いた．

を用いて選択した．系統樹は MEGA6 を用いて描画した．

FLDS と RNA ウイルスゲノム配列決定

ホモロジーモデリング解析を実施し，1,000 回のブートストラップテストを行っ

Urayama et al.( 2018 ）および Hirai et al.( 2021 ）に

ホ モ ロ ジ ー モ デ リ ン グ は SWISS-MODEL program

倣 い，RNA ウ イ ル ス ゲ ノ ム の 塩 基 配 列 を 決 定 し た．

( Waterhouse et al., 2018 ）を用いて行った．AfuNV2 ，Cellulose resin chromatography 法 に よ り 1 度 精 製 し た

AtenNV1 のテンプレートには，それぞれ Escherichia virus

dsRNA を再度同様に精製し，Illumina シーケンシング

Qbeta viral RdRp protein complexed with translational

ライブラリーを調製した．得られたライブラリーは

elongation factors EF-Tu and EF-Ts of Escherichia coli

Illumina platform でシーケンシングを行った．得られた(PDB ID: 3MMP, 3AGP）を用いた．解析結果は，PyMOL

リ ー ド 配 列 か ら 余 分 な 配 列 を 除 去 し た 後，de novo

software( DeLano, 2002 ）を用いて描画した．

assembly(CLC Genomics Workbench Version 11 ）(CLC
－ 77 －

浦山

俊一，萩原結果および考察大祐

い ssRNA ウイルスが見逃されている可能性が指摘されていたが( Nerva et al., 2016 ），本研究によりこれが確

dsRNA 電気泳動法と FLDS 法を用いたマイコウイルス

か め ら れ た． 近 年，FLDS 以 外 に も RNA-seq な ど の探索の比較

dsRNA 電気泳動よりも高感度かつ網羅的なマイコウイ

アスペルギルス関連菌株におけるマイコウイルスのリ

ルス探索技術が広く使われるようになり，ssRNA タイ

ス ト を 構 築 す る た め， 計 174 株 の 単 離 株 に つ い てプのマイコウイルスが多数見出されている．その結果，dsRNA の電気泳動を実施した．その結果，dsRNA 電気

20 年ほど前まではマイコウイルスの多くは dsRNA タイ

泳 動 に よ り 16 株 か ら マ イ コ ウ イ ル ス が 検 出 さ れ た

プだと考えられていたが，現在では ssRNA ウイルスも(Fig. 2 ）．続いて，電気泳動でウイルスが検出されなかっ同等数報告されている．

た株を中心に 146 株を対象として，より好感度な FLDS
による探索を実施し，8 株から新たにマイコウイルスが同定したマイコウイルスの完全長ゲノムと分類検出された．合計すると 23 株からウイルスが検出され，マイコウイルスが検出された 23 株から，FLDS によ

いくつかの株はウイルスが重複感染していたため，計り 17 種のマイコウイルス完全長ゲノムを既知 RNA ウイ

31 株のウイルス配列が得られた( Table 1 ）．以上より，

ルスとの配列類似性に依存せずに決定し( Table 2 ），そ

1）今回対象とした菌株セットのウイルス保有率は 13.2％の代表例となるゲノム構造を示した( Fig. 3 ）．RdRp 配( 23/174 ）と，感度の高い技術を使用したものの，一般

列のアミノ酸配列の類似性などから，検出したウイルス

的に報告されるマイコウイルス感染率( 10 - 50％）には 17 種中 14 種がこれまでに報告のない新規 RNA ウイ

比 べ て 少 し 低 い 結 果 と な っ た( Ghabrial et al., 2015;

ルスであることが示唆された．

Kotta-Loizou & Coutts, 2017 ），2）dsRNA 電気泳動で検検出されたウイルスの中には，Aspergillus fumigatus

出できないマイコウイルスが 29％( 9/31 株）存在した．

polymycovirus 1( AfuPmV1 ） や Aspergillus fumigatus

FLDS でのみ検出されたマイコウイルスの多くは一本鎖

chrysovirus( AfuCV ）といった，完全長ゲノムがこれRNA( ssRNA ） を ゲ ノ ム と す る タ イ プ で あ っ たまでに決定されている既知の RNA ウイルスも含まれて( Table 1 ）．マイコウイルスは概してゲノム核酸種によいた(Kotta-Loizou & Coutts, 2017 ）．これらに関しては，

り dsRNA タイプと ssRNA タイプに分類され，前者の方

FLDS 法を用いた本研究においても同様のゲノム構造をが細胞内での dsRNA の蓄積量が高い傾向にあることが示しており，このことは，本手法が既存の RNA ウイル

知られている．そのため，以前より dsRNA 蓄積量の低

スゲノムの決定方法と少なくとも同程度の正確性を有しFig. 2 Screening of mycovirus infected strains by the dsR NA agarose gel electrophoresis. The dsR NA wasextracted from mycelia and examined in agarose gel electrophoresis. The gels contained GelRed to visualize
dsRNA. A. fumigatus: IFM 62632, 63147, 63431, 64916; A. lentulus: IFM 62627, 64004, 64003, 63547, 65052;
A. tennesseensis: #1383_1_1; A. creber: B2_5_3_SC9, SC-f7 F59, SC-f4 F57, NT10-19-SO2-15, NTC-f5975_1-7;
A. protuberus: LIMA-18-5_MYP.

－ 78 －

糸状菌に感染するマイコウイルスの多様性解析
Table 2 Mycoviruses indentified in this studyていることを示唆している．
また，新規なマイコウイルスであっても，近縁なウイ
ルスグループの完全長ゲノムが明らかな場合は，従来の配列類似性に基づいた手法で，その完全長ゲノムを同定できる可能性がある．そのような例として，Aspergillus
creber partitivirus 1( AcrePV1 ）が挙げられる( Fig. 3 ）．
AcrePV1 は本研究で発見した Partitiviridae(科）に属する
新規のマイコウイルスであり，FLDS 法により各分節の末端配列の類似性を指標に完全長ゲノムを同定したとこ
ろ，そのゲノムは 2 分節の RNA 分子から構成されていた．Fig. 3 中にボックスで示されているのが推定 ORF
であり，それらの推定アミノ酸配列を用いた配列相同性検索の結果，RNA1 には RdRp が，RNA2 にはウイルス粒子の殻を形成する外被タンパク質( coat protein: CP）
がそれぞれコードされていた．AcrePV1 のゲノム構造はPartitiviridae(科）ウイルスの典型的なゲノム構造であり，Fig. 3 Organization of representative RNA viral genomes.
Straight lines indicate RNA segments. Boxes show
predicted OR Fs. Genes predicted by homology
search are shown in boxes.

各タンパクは既知の Partitiviridae(科）に属するウイルスと十分な配列類似性を示していた．このような典型的なウイルスであれば FLDS を用いなくても，配列類似性か
らその完全長ゲノムを推定・同定することは可能である．
－ 79 －

浦山

俊一，萩原

大祐

一方で，従来の配列類似性に基づいた手法では，既知

る別の RNA ウイルスということになるが，詳細な解析のウイルス遺伝子と配列類似性を示さない遠縁なウイルを進めていくと，RNA2 も AfuNV2 に由来するというこ

ス遺伝子は検出できないが，FLDS ではそのような遺伝とが明らかになった．RdRp には A-G の機能モチーフが子も検出可能である．その例として，Aspergillus creber

存在しており，その中でも特に A-C は RdRp の活性中心

narnavirus 1( AcreNV1 ）が挙げられる．AcreNV1 は本に位置し，RdRp が活性を発揮する上で重要であると考研究で発見した，Narnaviridae(科）に属する新規のマ

えられている( Venkataraman et al., 2018 ）．RNA1, 2 上

イコウイルスであり，解析の結果，4 分節の RNA 分子にコードされている RdRp それぞれにおいてこのモチーからゲノムが構成されていた．典型的な Narnaviridae

フを探索すると，RNA1 ではモチーフ C が，RNA2 では(科）の RNA ウイルスは 1 本の RNA のみで構成され，モチーフ A と B が欠けており( Fig. 4A ），RNA1，RNA2

そこには RdRp がコードされている．推定アミノ酸配列

は共に完全な RdRp をコードしておらず，一方で欠損しを用いた類似性検索では AcreNV1 の RNA1 には RdRpているモチーフがもう一方のセグメント上に存在するこがコードされており，配列類似性による従来の解析基準
では RNA1 のみでも全長配列を取得すれば，“ AcreNV1とが明らかになった．この結果から，AfuNV2 は RdRpのモチーフ A + B を RNA1 に，モチーフ C を RNA2 に分の完全長ゲノム”として報告しても異論は生じないと予割してコードしており( Fig. 4B, Type I ），これら 2 種類

想される．これに対し，FLDS を用いることで，RNA1のたんぱく質が複合体を形成して RdRp 活性を示すといの 5' 末端，3' 末端の配列と共通配列を有する RNA2, 3, 4

うことが示唆された．加えて，ホモロジーモデリングにが見出された．当該配列は既知配列と有意な配列類似性

よる構造予測からも( Fig. 5A ），これら 2 種類のたんぱを示さず，非 FLDS 解析の大部分で見落とされてしまう

く質が水素結合やファンデルワールス力により相互作用

ものである．このことは，当該手法を用いることで従来し，RdRp の活性部位を形成していることが示唆されたよりも格段に高品質な完全長ゲノム配列を取得可能であ( Fig. 5B）．既知の RNA ウイルスは全て単一の RNA 分
節上の ORF に RdRp をコードしており，本研究では，別々ることを示している．

の分節上の別の ORF 上に RdRp を分割してコードする
RdRp が分割コードされている RNA ウイルスの発見

RNA ウイルスの存在を初めて明らかにした．

Aspergillus fumigatus narnavirus 2( AfuNV2）は，以本研究で見出した Aspergillus tennesseensis narnavirus

前に別の研究グループによって報告されたウイルスであ1( AtenNV1 ）も，AfuNV2 同様に RdRp を分割コード

り( Zoll et al., 2018 ），今回の研究では 3 つの異なる A.

する RNA ウイルスであることが示唆された(Figs. 4, 5 ）．

fumigatus 分離株( IFM 63147，IFM 63431，IFM 62629 ）で同定された．既報の AfuNV2 ゲノムは 1 本の RNA の

しかし，アライメントに基づくモチーフ同定の結果，みで構成されるとされていたが，FLDS を用いた本研究

AtenNV1 は RNA1 にモチーフ A を，RNA2 にモチーフ
B + C をコードしており，先の AfuNV2 とは RdRp の分割では，末端配列の類似性から，AfuNV2 が RNA1( RdRp ）場所が異なっていた( Fig. 4A ）．このことから，分割型に加えて，RNA2 と RNA3 の 2 本のセグメントを有して

RdRp には AfuNV2 のようにモチーフ B と C の間で切れいることを明らかにした( Fig. 3 ）．RNA2 および RNA3ているタイプ( Type I ）と AtenNV1 のようにモチーフには複数の ORF が推定され，RNA2 上の ORF2 は既知

A と B の間で切れているタイプ( Type II ）の 2 タイプ

Narnaviridae(科）の RdRp とトップヒットした．RNA3 上のが存在することが明らかになった( Fig. 4B）．

ORF は全て既知配列との有意な配列類似性を示さなかった．

公共データベース上の RNA-seq データや別の探索で

AfuNV2 の RNA1 と RNA2 それぞれが RdRp をコード検出したマイコウイルス，同時期に報告された分割型

していることが示唆されたが，従来の RNA ウイルス学

RdRp を有する別のマイコウイルス( Sutela et al., 2020;に基づくとこの状況には何らかの問題が存在していると

Ruiz-Padilla et al., 2021; Jia et al., 2021 ）などのデータを考えられた．RdRp は RNA ウイルスにおいて転写・複用いて，AfuNV2 や AtenNV1 のような分割型 RdRp を製を担う必須酵素であり，既知の(マイコウイルスに限有する RNA ウイルスの分布や系統学的位置を調査した

らず人類が知る全ての）RNA ウイルスは皆，ゲノム中( Fig. 6 ）．まず，一連の解析で見出された分割型 RdRpにコードされている RdRp 遺伝子数は 1 ウイルスにつきはすべて Narnaviridae(科）に由来するものであり，分

1 コピーである．そのため，従来の RNA ウイルス研究

割型 RdRp は Type I(モチーフ B と C の間で分割）とにおいては 1 種類の RdRp が 1 種類の RNA ウイルスにType II(モチーフ A と B の間で分割）の 2 つの分割タ相当するものとして扱われてきた．これに基づくと，

イプごとに，2 つのクレードに分かれて存在していた

AfuNV2 で 新 た に 見 出 さ れ た RdRp と 類 似 性 を 示 す( Fig. 6 ）．Type I ，Type II はそれぞれ非分割型 RdRp をRNA2 は AfuNV2( RNA1 ）とは末端配列が類似してい有するクレードと共に別々に分 岐しており，Narnaviridae－ 80 －

糸状菌に感染するマイコウイルスの多様性解析

Fig. 4 Positions of the conserved motifs in normal RdRps and divided RdRps. (A) Multiple alignments of the deduced
amino acid sequences of the RdRp motifs for the family Narnaviridae. The amino acid positions with 100 per centmatches and > 50 percent matches are depicted by dark gray and light gray shading, respectively. The numbers in
the alignment indicate the number of amino acids not shown in the alignment. (B) Schematic overview of motif
positions on viral ORF(s) encoding RdRp. This figure was adapted from Chiba et al. (2020).

(科）において少なくとも 2 度の独立した RdRp の分割の分節 RNA に分割されてコードされうるという発見は，が生じたことが示唆された．

100 年以上続く RNA ウイルス研究で不変とされた経験

実際にこれら分割型 RdRp が RdRp 活性を示すのかは則を打ち破るものと言える．このような基礎科学におけ明らかになっておらず，分離株を用いた解析などで明らる重大な発見が，ヒトを含む動物や植物の病原性 RNA

かにしていく必要がある．また，これまでに見出された

ウイルス研究分野からではなくマイコウイルス研究に

分割型 RdRp はすべて Narnaviridae(科）に属するマイ

よってもたらされたことは特筆に値する．近年，シーケ

コウイルスであり，少なくとも子嚢菌には広く分布してンシング技術の発展により数万単位の新規 RNA ウイル

いることが示唆されているが，他の宿主やウイルス科にスが毎年報告されるようになっており( Edgar et al,.

も類似のものが存在するのかは明らかになっていない．

2022; Neri et al., 2022; Zayed et al., 2022 ），2000 年 ご ろ

一般的な RNA ウイルス探索に用いられる非 FLDS 解析に人類が認知していた RNA ウイルスが数千種であるこではこのようなタイプの RNA ウイルスを同定することとを考えると文字通り爆発的な増加を示している．しかは困難であることから，FLDS のより広範な適用によりし，これら RNA ウイルスの大部分は技術的な制約から明らかにしていく必要がある．

“ RdRp の部分配列”しか明らかになっておらず，完全RNAウイルスのマーカー遺伝子とされる RdRp が別々長ゲノムは勿論，その宿主や形状，機能についてほとん－ 81 －

浦山

俊一，萩原

大祐

Fig. 5 3D structure prediction model of the two proteins that compose divided RdRp. (A) Overall structure and of
AfuNV2 and AtenNV1 model. AfuNV2 ORF1, green; AfuNV2 ORF2, blue. AtenNV1 ORF1, pink; AtenNV1
ORF2, orange. Although the position of motif B is different between AfuNV2 and AtenNV1 (AfuNV2: ORF1,
AtenNV1: ORF2), the structures of motif B are conserved between the two viral RdRp. (B) Hydrogen bonds andvan der Waals contacts between ORF1 and ORF2. In AfuNV2, green and blue ball models show ORF1 and ORF2
residues, respectively. Stick models show amino acid residues of ORF1 and ORF2 that interact with each other byhydrogen bonding. Pink dashed lines indicate hydrogen bond between amino acid residues of ORF1 and ORF2.
In AtenNV1, pink and orange ball models indicate ORF1 and ORF2, respectively. Stick models show amino acidresidues of ORF1 and ORF2 that interact with each other. Cyan and blue dashed lines refer to hydrogen bonds
and van der Waals contacts, respectively. This figure was adapted from Chiba et al. (2020) and Chiba et al. (2021).

－ 82 －

糸状菌に感染するマイコウイルスの多様性解析

Fig. 6 Phylogenetic tree based on the RdRps from the family Narnaviridae. For viruses with divided RdRp, the twoamino acid sequences of the first and second halves were merged. Then, the merged sequences aligned withother viruses that have normal RdRp. The numbers at the nodes are the percentage bootstrap support from
1,000 R AxML bootstrap replicates. The best-fitting amino acid substitution model was [BLOSUM62+ F+ G].
This figure was adapted from Chiba et al. (2021).

－ 83 －

浦山俊一，萩原10) 萩原大祐．2021．Virus world of fungal world．第23回酵母合同シンポジウム．(9月2 – 3日，オンライン）
11) 浦山俊一．2021．ウイルスは細胞外にデポジットされた細胞制御“自己複製子”．生命情報科学若手の会第13回
研究会．(10月23日，オンライン）
12) 浦山俊一．2021．糸状菌は何のためにR NAウイルスを育むのか？．糸状菌分子生物学研究会若手の会第9回ワークショップ．(11月10日，オンライン）
13) 千葉悠斗，高橋弘喜，楠屋陽子，渡邉哲，浦山俊一，萩原大祐．2021．Aspergillus fumigatusと感染ウイルスのdual-genomicsによる進化的な関係性の解析．糸状菌分子生物学コンファレンス．(11月11 – 12日，オンライン）
14) 浦山俊一，池田彩乃，千葉悠斗，黒木美沙，趙彦杰，萩原大祐．2021．R NAウイルスと真核微生物の共生的関係を俯瞰する．日本共生生物学会第5回大会．(11月27 – 28日，オンライン）15) Hagiwara, D. 2022. Virus infection among a fungal world.
The 19th young Scientist Seminar. (November 26-27，
Online）.
16) 浦山俊一．2023．真菌を操るウイルスのポテンシャルを俯瞰する．日本マイコトキシン学会第88回学術講演会．
(1月6日，茨城）
17) 浦山俊一．2023．生物を変身させる秘密道具としてのウ
イルス．微生物コンソーシアムG3定例会(大隅基礎科学
創成財団）．(2月15日，オンライン）

ど何も明らかになっていない．しかしマイコウイルス研
究では，系統的にも多様な宿主糸状菌の分離株を対象に解析できる．そして，FLDS の技術により RdRp およびゲノムの完全長の取得が可能になり，上記の限界を打ち破り，地球上にどのような RNA ウイルスが存在しているのか，その解明を牽引していく可能性が高い．

要

約

糸状菌を対象としたウイルス研究は近年，それまで認知されてこなかった未開のウイルスが多数存在することを明らかにし，ウイルス多様性の解明を牽引している．
本研究では，従来手法と比べて感度が高く，様々なアドバンテージを有する独自のウイルス探索手法を糸状菌に適用することで，これまでに見逃されてきたウイルスを多数同定した．特に，分割型の RdRp を有するウイルスが含まれており，100 年以上にわたる RNA ウイルス研
究史上一貫して保たれていた経験則を打ち破る発見に至った . マイコウイルスを対象とした探索研究によりウイルス学が一段と拡張された．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 浦山俊一．2018．病気を起こさず宿主と共存するウイル
ス～生物相互作用の理解にウイルスの視点を～．環境バ
イオテクノロジー学会2018年度大会．(6月26日，茨城）
2) 千 葉 悠 斗 ， 浦 山 俊 一 ， 矢 口 貴 志 ， 萩 原 大 祐 ． 2 0 1 9 ．
Aspergillus fumigatusとその近縁種に潜伏するRNAウイル
スの網羅的な探索．第13回ゲノム微生物学会．(3月6 – 8日，東京）3) 千葉悠斗，浦山俊一，矢口貴志，萩原大祐．2019．糸状菌を用いたR NAウイルス多様性の再検証．日本微生物生態学会 第33回大会．(9月10 – 13日，山梨）
4) Chiba, Y., Yaguchi, T., Urayama, S., Hagiwara, D. 2019.
R NA virus diversity in Aspergillus species revealed by
FLDS, a comprehensive non-retro RNA virus surveillancemethod. Asian Mycological Congress. (October 1-4，
Mie）.
5) 浦山俊一．2019．生態系構成要素としてのウイルスを考える― 糸状菌に潜むマイコウイルスを例に―．糸状菌相
互応答学シンポジウム．(11月27日，宮城）6) 浦山俊一．2020．環境ウイルス生態学―自然界の生物に潜むウイルスのはなし―．第19回みちのくウイルス塾．
(7月24日，宮城）7) 浦山俊一，布浦拓郎．2020．二本鎖R NAシーケンシング
によるR N Aウイルス研究の新展開．第22回日本進化学会．(9月4日，オンライン）
8) 千葉悠斗，老木紗代子，矢口貴志，浦山俊一，萩原大祐．
2020．菌類RNAウイルスの持つゲノム構造多様性の探索．
ウイルス学若手研究集会．
(12月19日，オンライン）
9) 浦山俊一．2021．真菌細胞内で“家畜化”されたウイル
ス．第94回日本細菌学会総会．(3月23日，オンライン）

大祐

原著論文
1) Takahashi-Nakaguchi, A., Shishido, E., Yahara, M., Urayama,S., Sakai, K., Chibana, H., Kamei, K., Moriyama, H., Gonoi,
T. 2020. Analysis of an intrinsic mycovirus associated with
reduced vir ulence of the human pathogenic fungus
Aspergillus fumigatus. Front. Microbiol. 10: 3045.
2) Takahashi-Nakaguchi, A ., Shishido, E ., Yahara, M.,
Urayama, S., Ninomiya, A., Chiba, Y., Sakai, K., Hagiwara,
D., Chibana, H., Moriyama, H., Gonoi, T. 2020. Phenotypicand molecular biological analysis of polymycovir us
A fuPmV-1M from Aspergillus fumigatus: Reduced fungal
virulence in a mouse infection model. Front. Microbiol. 11:607795.
3) Chiba, Y., Oiki, S., Yaguchi, T., Urayama, S*., Hagiwara, D*.
2020. Discovery of divided RdRp sequences and a hitherto
unknown genomic complexity in fungal viruses. Virus Evol.
7: veaa101.
4) Chiba, Y., Oiki, S., Zhao, Y. J., Nagano, Y., Urayama, S.,
Hagiwara, D. 2021. Splitting of RNA-dependent RNA polymerase is common in Narnaviridae: Identification of a type
II Divided-RdRp from Deep -Sea Fungal Isolates. Virus
Evol. 7: veab095.
5) Ikeda, A., Chiba, Y., Kuroki, M., Urayama, S., Hagiwara,
D. 2022. Ef f icient elimination of R NA mycovir uses inAspergillus species using RdRp -inhibitors ribavirin and2'-C-methylribonucleoside derivatives. Front. Microbiol. 13:1024933.
6) Chiba, Y., Yabuki, A., Takaki, Y., Nunoura, T., Urayama, S.,
Hagiwara, D. 2023. The first identification of a narnavirus in
Bigyra, a marine-protist. Microb. Environ. 38: ME22077.
7) Zhao, Y. J., Shirouzu, T., Chiba, Y., Hosaka, K., Moriyama,
H., Urayama, S., Hagiwara, D. 2023. Identification of novel
RNA mycoviruses from wild mushroom isolates in Japan.
Virus Research. 325: 199045.

－ 84 －

糸状菌に感染するマイコウイルスの多様性解析
その他(総説・書籍・特許など）
1) 浦山俊一，千葉悠斗，高木善弘，萩原大祐，布浦拓郎．
2019．再構築された“ウイルス生態像”．バイオテクノロ
ジー学会．19 : 5-122) Urayama, S., Takaki, Y., Chiba, Y., Zhao, Y., Kuroki, M.,
Hagiwara, D., Nunoura, T. 2022. Eukaryotic microbial RNA
viruses — Acute or persistent? Insights into their function in
the aquatic ecosystem. Microb. Environ. 37: ME22034

謝

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた筑波大学糸状菌相互応
答講座の学生・構成員諸氏に感謝の意を表します．また，
JSPS 科研費，挑戦的研究(開拓）(萩原大祐 20K20377），
新学術領域研究(研究領域提案型）(浦山俊一 20H05579,
22H04879 ），特別研究員奨励費(千葉悠斗 21J10873 ）の支援にも感謝いたします．

文

献Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, J. M., & Gabaldón, T. 2009.
trimAl: a tool for automated alignment trimming in large-scale
phylogenetic analyses. Bioinformatics, 25: 1972-1973.
Charon, J., Buchmann, J. P., Sadiq, S., & Holmes, E. C. 2022. A
bioinformatic resource to identify and annotate divergent RNA
viruses in metagenomic sequence data. Virus Evol. 8: veac082.
Chiba, Y., Oiki, S., Yaguchi, T., Urayama, S., & Hagiwara, D.
2020. Discover y of divided RdRp sequences and a hitherto
unknown genomic complexity in fungal viruses. Virus Evol. 7:
veaa101.
Chiba, Y., Oiki, S., Zhao, Y., Nagano, Y., Urayama, S., & Hagiwara,
D. 2021. Splitting of R NA-dependent R NA polymerase iscommon in Narnaviridae: Identification of a type II divided
RdRp from deep-sea fungal isolates. Virus Evol. 7: veab095.
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－ 85 －

IFO Res.Commun. 37
87-99, 2023

マイコウイルスが宿主糸状菌にもたらす作用の網羅解析
浦山

俊一，萩原

大祐

筑波大学生命環境系糸状菌相互応答学講座〒305-8577

茨城県つくば市天王台1-1-1

Comprehensive analysis of the impact of mycoviruses on their host filamentous fungi
Syun-ichi Urayama, Daisuke Hagiwara
Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
1-1-1 Tennodai, Tsukuba, Ibaraki 305-8577
Several mycoviruses that have a significant impact on fungal pathogenicity have been extensively studied over theyears. However, researchers have also noticed that a number of mycoviruses that do not exhibit any noticeable
effect on host phenotypes exist. This empirical fact suggests that the previously analyzed effects of mycoviruses
represent exceptional cases and only provide a partial view of their function. Therefore, it is necessary to study thecomprehensive effects of mycoviruses regardless of visible changes in the host phenotype. Firstly, to facilitate thestudy of a wide range of mycoviruses, we developed an efficient virus elimination system. In this regard, we
conducted comparative analyses of virus elimination rates using various nucleoside analogs and observed that theefficacy of elimination depends on the specific combination of the analog and the viral genome type. Secondly, we
also obtained virus-free strains from multiple virus-harboring fungal strains/species. Based on the comparative
analyses, it was revealed that most mycoviruses induced host-phenotype change but it was limited to the specificconditions. Our data suggested that mycoviruses are not destructive but mild parasites of filamentous fungi,
possibly to expand fungal phenotypic diversity without genetic change.
Key words: Mycovirus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Secondary metabolism, Transcriptome

緒

言在性のマイコウイルスについても捉えて統合的に理解することが，マイコウイルスと宿主糸状菌の関係性の解明

初期のマイコウイルス研究は，ヒトや植物のウイルスに 必 要 で あ る(Larios et al., 2023; Komatsu et al., 2019;

研究と同様に，宿主に対する病原性などの表現型をもとWang et al., 2018)．実際，目に見える表現型を与えないに選抜したものを対象としてきた．しかし次第に，マイ組み合わせであっても宿主の遺伝子発現や二次代謝生産

コウイルスの多くは“病気”を引き起こさず潜在的な存が変わることが報告されている(Zhang et al., 2022; Lee

在である可能性が指摘されるようになってきた．例えば，
明確な“表現型”を示していない真菌のメタトランスク

et al., 2014)．また，これまでの多くの研究では，ウイルスが確認された株における表現型の観察のみから機能リプトームデータから多数のマイコウイルスが検出されが評価されてきたが，近年になり，異なる菌種や菌株へることからも(Starr et al., 2019; Sutela et al., 2019; Hillaryの 導 入 に よ る 評 価 も 進 め ら れ て い る(Cordoba et al.,

et al., 2022)，宿主の表現型に影響を与えないウイルスの存在が示唆された．したがって，強烈な表現型の変化

2022; Ning et al., 2022; Nuskern et al., 2021; Kashif et al.,2019)
．これらの情報を蓄積していくことで，より俯瞰を与えるマイコウイルスが存在する一方で，その他の潜的かつ高解像度なマイコウイルスの機能解明が期待でき
るが，まだこのような視点を持った研究事例は少ないの

E-mail: hagiwara.daisuke.gb@u.tsukuba.ac.jp
共同研究者：黒木 美沙(筑波大学生命環境系，現 東京大学
農学生命科学研究科）．
矢口 貴志(千葉大学真菌医学研究センター）．

が現状である．
実際，各論的なマイコウイルスの機能に関する報告は枚挙にいとまがない．代表的な例としては，宿主菌の植物に対する病原性が大きく変化するクリ胴枯病菌やフザ－ 87 －

浦山

俊一，萩原

大祐

リウム属菌とマイコウイルスの関係については古くから影響を観察するためにはウイルスに感染した株からウイ研究が進められており，マイコウイルス感染による影響

ルスを脱離して同じ遺伝的背景でウイルスの有無のみがとしてコロニー性状をはじめ菌糸生長，分生子形成，病異なる株同士を比較するということが行われてきた．ウ

原性，二次代謝生産などの変化について多くのレビュー

イルスの脱離方法についても，長期培養やプロトプラス

がまとめられている(García-Pedrajas, 2019; Li et al., 2019;

ト化，菌糸先端の切断などの手法が考案され実施されて

Nuss, 2005; Milgroom & Cortesi, 2004; Heiniger & Rigling,

きたが，いずれも効率が低いことが課題であった(鈴木，1994)．近年ではそれら以外にも，Alternaria alternata2014)．近年になり，ヒトのウイルス治療薬として使用の毒素生産促進や Aspergillus ochraceus でのオクラトキ

されるタンパク合成阻害剤や核酸アナログが，マイコウ

シンの生産促進，Magnaporthe oryzae でのテヌアゾン酸

イルスにも適用できることが示され利用が進んできた生産促進，Stemphylium lycopersici での Altersolanol A 生( Applen Clancey, 2020; Herrero & Zabalgogeazcoa, 2011;

産抑制など，マイコウイルスによって二次代謝産物の生

Niu et al., 2018 ）．しかし，論文ごとに条件や対象ウイル

産量が変化する例が多く報告されている(Okada et al.,

ス種が異なるため，これらの薬剤の有効性の比較は困難

2018; Liu et al., 2022; Ninomiya et al., 2020; Nerva et al.,である．

2019)．また，担子菌の Pleurotus ostreatus では Pleurotus

さらに，多くの研究はマイコウイルスの明確な影響を

ostreatus virus1 の感染で各種酵素の生産が抑制されて探すことに重点を置かれがちであり，ミクロなレベルのおり，結果として子実体が矮小化する現象が報告されて影響や，そもそも影響が見られないという点などが軽視いる(Song et al., 2020)．ヒト病原菌におけるマイコウ

されてきた．そのため，マイコウイルス保持株とその治

イルスについても研究が進んできている．Aspergillus や癒株の間で差異が見られた表現型については上記の通り

Rhizopus，Cladosporium など 27 属の臨床分離株を対象に網羅的なマイコウイルス探索が行われた結果 11 種のウイ

多数の事例を見つけることができるが，差異が見られなルスが検出され，マイコウイルスが普遍的に存在していい．また，多くの研究は異なる場所，手技，菌株，ウイることが明らかになった( Kinsella et al., 2022)．研究がルス種にて行われており，文献で報告されている結果同進んでいる Aspergillus fumigatus では，宿主の病原性を低士を並べて比較することは事実上できない．このような下させるウイルスが複数報告されている一方で，病原性状況は，マイコウイルスという存在が真菌に何をもたらを変化させないウイルスやむしろ病原性を増加させるウ

しているのかという俯瞰的な機能解明を困難にしている．

い組み合わせや条件を文献情報から多数得ることは難し

イルスの存在も報告されている( Takahashi-Nakaguchi

そこで，本研究では先ず研究材料の取得を加速する目

et al., 2020a; Takahashi-Nakaguchi et al., 2020b; Ozkan &Coutts, 2015)．宿主のストレス耐性に影響を与えるウイ的で，マイコウイルス除去技術の確立を行った．具体的ルスもいる．ストレス耐性の変化は結果的に病原性発露マイコウイルスに処理し，体系的にウイルス脱離への効の程度にも影響を与えることが多く，近年注目が集まっ果を評価した．さらに，マイコウイルスが宿主菌にもたている．A. fumigatus では低酸素ストレスや酸化ストレらす影響についてより俯瞰的なデータを得る目的で，特ス，浸透圧ストレスへの耐性が低下している Aspergillus

定菌種の多数の株を用いて様々なウイルス保持・非保持

fumigatus Chrysovirus 41362 感染株においてマウスへののセットを確立し，その影響を網羅解析した．本研究は，病原性低下が確認されている( Takahashi-Nakaguchi et

表現型の有無によらず公平な視点でマイコウイルスの影

al., 2020b)．Colletotrichum 属では浸透圧ストレス耐性や植物病原性に影響を与えるウイルスが複数報告されてい響を観察するための研究基盤を構築し，マイコウイルスる(Guo et al., 2022; Olive & Campo, 2021)．Penicillium

な報告になると期待される．

には，抗ウイルス薬を含む複数の核酸アナログを複数のが一般にどんな存在であるのかを解明する初の“俯瞰的”属菌では複数の菌株とウイルスの組み合わせで同様に

実験方法

prochloraz への耐性が低下することが明らかになっており，この効果が Penicillium 属菌に共通したものであることが示唆されている(Wang et al., 2019; Niu et al., 2018)．

菌株と培地

このように多数の報告はあるものの，俯瞰的かつ高解本研究で使用した菌株および RNA ウイルスは Table 1

像度な研究事例が少ない一因として，研究材料の取得がに示した．菌株名が IFM から始まる菌株群はナショナ

難しいという点があげられる．マイコウイルスは細胞外ルバイオリソースプロジェクト( https://nbrp.jp）を通からの感染経路をもたないため，任意の宿主に感染させして千葉大学真菌医学研究センターから提供された．

てウイルスの影響を評価するということが難しいことがPenicillium chrysogenum JCM2056 株は国立研究開発法
人理化学研究所バイオリソース研究センター微生物材料

障壁になっていた(Nuss, 2005)．そのため，ウイルスの－ 88 －

マイコウイルスが宿主糸状菌にもたらす作用の網羅解析

Table 1 Fungal strains and mycoviruses used in this study.

開発室( https://jcm.brc.riken.jp/en/ ）から提供された．

[Super-Script III One-Step RT-PCR System with Platinum

各種菌株はポテトデキストロース寒天培地( PDA; BD,

Taq( Invitrogen ）]でウイルス配列を増幅し，電気泳動Franklin Lakes, NJ, United States ）上で 37 ℃( A. fumigatus,に よ り ウ イ ル ス の 有 無 を 判 定 し た． ワ ン ス テ ッ プ

A. lentulus ）あるいは 25 ℃( A. flavus, P. chrysogenum ）で培養し，0.05％ Tween20 溶液で胞子を回収した．

RT-PCR 反 応 は 以 下 の 条 件 で 行 っ た： 逆 転 写( 55 ℃，
20 min;60 ℃，10 min ）;PCR 反応 94 ℃，2 min;( 94 ℃，
15 s;55 ℃，30 s;68 ℃，1 min ）x40;68 ℃，5 min．

ウイルス脱離法
ウイルス脱離法の概要を Fig. 1 に示した．各種核酸ア

生育，胞子形成，気中菌糸

ナログ試薬，リバビリン( Cayman Chemical, Ann Arbor,

コロニー生育は，PDA 培地，MM 培地( 70 mM 硝酸

MI, United States ）は終濃度 0.1 mg/mL ，7-Deaza-2'-C-ナトリウム，1％ グルコース，0.052％ 塩化カリウム，

Methyladenosine( 7d2CMA; Carbosynth Ltd., United

0.052％ 硫酸マグネシウム七水和物，0.152％ リン酸水素

Kingdom ），2'-C-Methyladenosine( 2CMA; Carbosynth ，二カリウム，0.0022％ 硫酸亜鉛七水和物，0.0011％ ホウ

2'-C-Methylcytidine( 2CMC; Carbosynth ） は 終 濃 度

酸，0.0005％ 塩化マンガン四水和物，0.0005％ 硫酸鉄七0.2 mg/mL になるよう PDA に含め，胞子液を点植菌し水和物，0.00016％ 塩化コバルト五水和物，0.00016％ 硫

コロニー生育させた．溶媒コントロールには，使用量と酸銅五水和物，0.00011％ モリブデン(VI)酸アンモニウ

同量のジメチルスルホキシド( DMSO）を用いた．核ム四水和物，0.005％ エチレンジアミン四酢酸，pH 6.5)，酸アナログ試薬添加培地での培養後，胞子を回収し適宜

YPDA 培地のプレートの中心に，1×104 ～ 105 個の胞子希釈し，YPDA( 1％乾燥酵母エキス，2％ペプトン，2％を点植菌し，25 ℃，37 ℃，45 ℃で培養した．いずれのグルコース，1.5％寒天）培地上で単胞子分離した．単培地でも，37 ℃は 3 日間，45 ℃は 4 日間培養後にコロ胞子由来のコロニーに対して，ワンステップ RT-PCR

ニー直径を計測した．25 ℃培養について，PDA と YPDA

－ 89 －

浦山

俊一，萩原

大祐

Fig.1 Schematic workflow of method for virus eliminating and virus detection
Fungi were cultured on nucleoside analog-containing plate media, then spores were spread on YPD plate media
to form single colonies. Using toothpicks as described previously (Urayama et al., 2014), viral RNA was amplified
by one-step RT-PCR. PCR products were detected by electrophoresis. (Modified from Ikeda et al., 2022)

培地では 4 日間，MM 培地では 6 日間培養しコロニーの子(終濃度 1×10⁴ 個/mL ）を混合し，50 mL チューブに直 径 を 計 測 し た． 培 養 は 3 連 で 行 い， サ ン プ ル 間 で垂直に培地を入れ固化後に 37 ℃で 5 日間培養した．培Student の t 検定を行い有意差判定した．

養は 3 連で行った．チューブに 5 mL の 0.05％ Tween20

初期生育の評価は，レサズリンによる細胞活性の測定と 0.5 mm ガラスビーズを加え 30 秒混合した後 40 µm セにより行った．レサズリンは成長細胞の還元力によりレ

ルストレーナー(Falcon ）を通過させて胞子を回収した．

ゾルフィンに還元され，溶液は青からピンク色に変化す取り残した胞子を回収するため同じ作業を繰り返し，計る．この原理を利用し初期生育(発芽から菌糸伸長まで）

10 mL の胞子懸濁液を作製し胞子数をカウントした．A.

における細胞活性を測定した．1×10 個/mL の胞子懸濁flavus の胞子形成数は，約 10 3 個の胞子を PDA 上に全面塗 布 し，25 ℃ で 4 日 間 培 養 し た． 培 地 上 に 0.05 ％8

液 2 μL ，レサズリンナトリウム( Wako Pure Chemical ）2 μL( 10 μM ）と培地 196 μL を 96 ウェルプレートに添

Tween20 を 3 mL 添加し，コンラージ棒で全面から胞子加し，プレートリーダーで培養と計測を行った．培養条を回収した．適宜希釈したのち，血球計算盤で計数し，件はコロニー直径計測試験，二次代謝解析に使用した条胞子懸濁液原液の濃度を算出した．ウイルス脱離株は件と，「 37 ℃ MM 培地」をベースとしたストレス条件

3 つの生物学的反復それぞれにつき 3 回の技術的反復でを設けた．その際，培地由来の色味が強いため，Potato

実施した．

Dextrose Broth(PDB)培地は 10 倍希釈，YPD( 1％乾燥酵母エキス，2％ペプトン，2％グルコース）培地と

A. flavus の気中菌糸の観察では，PDA 上に胞子を点植菌し 25 ℃で 4 日間培養した．スパーテルで培地ごとSS( 5％ 醤油，5％ 砂糖）培地は 40 倍希釈して使用した．

菌体を切り出し，スライドガラス上に横たえたサンプル

生育進行度の比較は，培養前と培養後のレサズリンナト

を実体顕微鏡で観察した．気中菌糸の観察は 3 つの生物

リウム(波長 600 nm ）の吸光度を計測し，その差分で学的反復それぞれにつき 3 回技術的反復サンプルを用意評価した．

し，代表的な写真を示した．

A. fumigatus の胞子形成数は，15 mL の PDA 培地に胞
－ 90 －

マイコウイルスが宿主糸状菌にもたらす作用の網羅解析

薬剤感受性試験結果および考察

薬剤感受性試験には 7 種類の薬剤を用いた．1×10⁸
個/mL の胞子懸濁液を薬剤含有 PDA 培地の中心に 1 μL

核酸アナログ処理によるウイルス脱離率の比較

点植菌し，アムホテリシン B のみ 72 時間培養し，それ

マイコウイルスの影響解析では，遺伝的背景の同一な以外の薬剤については 48 時間培養後コロニーの直径をウイルス保有株およびフリー株のセットを用意する必要計測した．その際，コントロールとして，薬剤を溶かしがある．そのためには，効率的なウイルス除去の手法がた溶媒である DMSO のみを添加した培地でも同様に培必要となるため，ウイルス感染が認められた複数の A.

養した．得られたコントロールのコロニーの大きさを100％としたときの薬剤含有培地で培養したコロニーのfumigatus 株を対象に，近年ウイルス脱離例が報告されている複数の核酸アナログ試薬の効果を比較検証した．

大きさ(％）を比較した．

まず，抗ウイルス薬として最もよく利用されているリバ
ビリンによるウイルスの脱離率を評価した( Fig. 1 ）．

化合物解析

Aspergillus fumigatus RNA virus 1( AfuRV1 ）が宿主で5 mL の YESA 培地[ 2％ 乾燥酵母エキス，15％ 砂糖

ある IFM 63439 株から脱離する頻度は，リバビリン添(日新製糖），1.5％ 寒天]上に A. flavus の 10 個の胞子を加時は DMSO 処理(コントロール）に対して 6 倍高かっ

全面植菌し，25 ℃で 7 日間培養した．培地ごと凍結乾燥た( Fig. 2A ）．また，IFM 62632 株において Aspergillus

したのち，10 mL のアセトンを添加し 10 分間超音波破fumigatus polymycovirus 1( AfuPmV1 ）は DMSO 処理

砕した．そのうち 5 mL を用いて，遠心エバポレーター

では全く脱離しなかったのに対し，リバビリン処理ではでアセトンを揮発させ，1 mL のメタノールに再溶解し脱 離 が 確 認 さ れ た． そ の 他 の ウ イ ル ス に 対 し て は，

た．C18 カラムを通過させ夾雑物を除去し，遠心エバポ

DMSO 処理とリバビリン処理とは同程度の効果であっレーションで濃縮したのち 100 µL の DMSO に溶解した．

た． 続 い て，2CMC を 用 い て 同 様 の 実 験 を 行 っ た

抽 出 産 物 は Poroshell 120 EC-C18 column( ϕ 3.0 mm×( Fig. 2B）．2CMC 処理では AfuRV1 および AfuPmV1 に

3

100 mm，particle size 2.7 μm ; Agilent Technologies，Inc. ）加えて IFM 62355 株の Aspergillus fumigatus mitovirus 1を用いて 1260 Infinity LC system(Agilent Technologies，( AfuMV1 ），IFM 63147 株の Aspergillus fumigatus

Inc., ）で解析した．HPLC の分析は，流速 0.8 mL/min，

chrysovirus 1( AfuCV ）もコントロールと比較してウ

0.5％ 酢酸含有アセトニトリルが 18 分間で 5 – 100％にな

イルスの脱離の頻度が高かった．その他のウイルスに対るようグラジエント条件で行った．それぞれ 3 つの生物

しては 2CMC 処理による効果は認められなかった．同

学的反復に対して 3 回の技術的反復で解析を行った．

様 に，7d2CMA お よ び 2CMA に つ い て 検 証 す る と，
AfuRV1，AfuPmV1，AfuCV においてコントロールよ遺伝子発現解析り高頻度でウイルスの脱離が起きた( Fig. 2C）．特に，化合物分析と同条件で培養し，回収した菌体を液体窒dsRNA をゲノムとする AfuPmV1 と AfuCV において脱素を用いて凍結破砕したのち，TRIzol( Invitrogen ）によ

離 率 が 高 か っ た こ と か ら，7d2CMA お よ び 2CMA はり RNAを抽出した．Pure Link RNA mini kit(Invitrogen）

dsRNA に対して特異的な効果を示す脱離薬である可能

で 精 製 後，DNase I 処 理 を 行 い，ZYMO RNA clean &性を考えた．そこで，同様に dsRNA ウイルスである

concentrator 5( ZYMO RESEARCH ） で 精 製 濃 縮 し，

Penicillium chr ysogenum virus( PcV ），Aspergillus

Total RNA を取得した．この Total RNA を用いて NEBNext

lentulus partitivirus 1( AlePV1 ）， お よ び Af293 株 のpoly(A)mRNA Magnetic Isolation Module( New England

AfuPmV1，IFM 61469 株 の AfuPV1 に 対 す る 7d2CMA

Biolabs ），NEBNext Ultra II Directional RNA Librar y

および 2CMA の効果を検証した( Fig. 2C）．その結果，Prep Kit for Illumina( New England Biolabs ），NEBNext

コントロールと比較してどのウイルスも高い脱離率を示

Multiplex Oligos for Illumina(Index Primer Set 1 ）(Newし，7d2CMA および 2CMA が dsRNA ウイルスに対してEngland Biolabs ）でシーケンスライブラリーを調製した．

幅広く高い脱離効果を示すことが確認できた．これらのライブラリーの品質及び濃度は Agilent 2100 バイオアナ

比較解析の結果から，ウイルスの脱離の頻度はそのウイライザーで測定し，ペアエンド NGS 解析は Novogene

ルス種と核酸アナログ試薬の組合せに依存していることに委託した．リードデータは CLC genomics workbenchが明らかになった(Ikeda et al., 2022)．今後のマイコウ( QIAGEN ）にてトリミング・マッピングを行い，発現イルス研究では，ウイルス脱離の際に複数の核酸アナロ

量 は TPM で 評 価 し た．1 つ の 生 物 学 的 反 復 に 対 してグ試薬処理を検討することでウイルス脱離株の取得がよ

2 回の技術的反復で RNA 抽出を行い，等量の Total RNA

り容易になることが期待できる．

を混合してライブラリーを作製した．
－ 91 －

浦山

俊一，萩原

大祐

Fig. 2 Ratios of virus-free colonies after treatment by nucleoside analogues
The treatments were performed by using ribavirin(A), 2CMC(B), 7d2CMA or 2CMA (C). Error bars represent
SD and were calculated from three biological replicates. Asterisks indicate significant differences (p < 0.05;
Student's t test). (Modified from Ikeda et al., 2022)

多様な培養条件における宿主生育に対するウイルスの影響

昇 し た が，YPDA 培 地 で は 生 育 が 遅 延 し た． ま た

前項の実験から取得したウイルス脱離株と，その親株

AfuNV2 感染株は，MM 培地で 25 ℃および 45 ℃培養すとなるウイルス感染株を対象に，コロニー生育を比較す

ると生育速度は上昇したが，37 ℃で PDA 培地にて培養ることでマイコウイルスが宿主に与える影響を評価した

した場合に生育が遅延した．これらの結果から，マイコ( Fig. 3 ）．AfuRV1 感 染 株 は，37 ℃ お よ び 25 ℃ の MMウイルスが宿主の生育に対して正負両面の影響を与える

培 地 に お い て， 脱 離 株 に 比 べ て 早 い 生 育 を 示 し た．

場合があり，これらは培養条件に依存してダイナミック

Aspergillus fumigatus botourmiavirus 1( AfuBOV1 ） 感に変化しうることが明らかになった．

染株は，25 ℃の YPDA 培養において生育が遅延した．
培地や温度条件が変わることで真逆の影響を示す例も観

胞子形成へのウイルスの影響察された．AfuPmV1 感染株は，PDA および MM 培地

Aspergillus fumigatus negative-strand R NA virus 1

で 37 ℃で培養した場合，脱離株に比べて生育速度が上( AfuNSRV1 ）の感染株は脱離株に比べて，宿主の胞子－ 92 －

マイコウイルスが宿主糸状菌にもたらす作用の網羅解析

Fig. 3 Comparing the growth rate of virus-free or -infected isolates in various condition
The PDA, MM, and YPD agar media were used. Spore suspension was inoculated in the center of the media witha 1 μL spot. The cultures were incubated at 25, 37 or 45 ℃. The colony diameter was measured at 4 days for PDA
and YPD media, and at 6 days for MM media. The cultures were performed in triplicate. Error bars indicate SD
and were calculated from three biological replicates. Asterisks indicate significant differences (*: p < 0.05;**: p < 0.01; ***: p < 0.001; Student's t test).

形成数が上昇した( Fig. 4A ）．ここから，マイコウイル

薬剤感受性へのウイルスの影響

ス感染が認められた 8 株の A. flavus に対象を広げて解アゾール系抗真菌薬 4 種類，キャンディン系抗真菌薬

析した( Table 1 ）(未発表）．Aspergillus flavus virga-like

1 種類，ポリエン系抗真菌薬 2 種類の計 7 種類の抗真菌

virus 1( AfVLV1 ）感染株( IFM 49866 ）は，25 ℃培養

薬とグルタルイミド系抗生物質のシクロヘキシミドを用時の胞子形成数が脱離株に比べて 1.3 倍に上昇したがいて，A. fumigatus のウイルス感染株を対象に薬剤感受( Fig. 4B），その一方で 30 ℃培養では約 2/3 に減少した性 試 験 を 実 施 し た( Table 2 ）．AfuNV2 感 染 し た A.

( data not shown ）．IFM 63847 株では，Aspergillus flavus
partitivirus 1( AfPV1）と Aspergillus flavus polymycovirus

fumigatus は脱離株に比べて，全てのアゾール系抗真菌薬に対して高い感受性を示した．また，AfuRV1 および( AfPmV1 ）はそれぞれ単独感染では胞子形成に影響をAfuBOV1 はそれぞれ 3 剤，2 剤に対する高感受性を誘導与えないにもかかわらず，同一宿主に二重感染した場合した．逆に，AfuPmV1 はイトラコナゾールに対する耐に胞子形成は約 1/10 まで減少した(Fig. 4B）．また IFM性を誘導した．一部のウイルスでは，ミカファンギンや

63847 株では，AfPV1 と AfPmV1 の二重感染株で気中菌

アンフォテリシン B に対する感受性にも影響を及ぼした．

糸が極端に増加し，胞子形成数の低下と関係があると考えられた( Fig. 4C）．この結果から，宿主に対するマイA. fumigatus のアゾール系抗真菌薬に対する耐性機序は，薬剤標的分子である Cyp51A のタンパク質内の薬剤

コウイルスの影響が，培養環境だけでなく，複数のウイ結合部位周辺のアミノ酸置換や cyp51A 遺伝子の過剰発

ルスによる相互作用によって生じる可能性が示唆された．

現などが報告されている( Hagiwara et al., 2016 ）．本研
究では，AfuRV1 保持によりボリコナゾールを除いた 3－ 93 －

浦山

俊一，萩原

大祐

Fig. 4 Conidial formation in virus infected or eliminated isolates(A) In A. fumigatus, number of conidia number per tube was counted after 5 days culture. (B) In A. flavus,
number of conidia number per plate was counted using 4 day-old-colonies. Error bars indicate SD and were
calculated from three biological replicates. Asterisks indicate significant differences (*: p < 0.05; **: p < 0.01;
Student's t test). P: partitivirus 1, DF: deltaflexivirus 1, Pm: polymycovirus 1, N: narnavirus 1, V: vivivirus 1,
and VL: virga-like virus 1. (C) Gross morphology under stereomicroscopy was investigated using 4-day-old
colonies. The representative data was shown. (Modified from Kuroki et al., 2023)

Table 2 Alterations in the drug susceptibility of filamentous fungi as a consequence of mycovirus infection.

－ 94 －

マイコウイルスが宿主糸状菌にもたらす作用の網羅解析

種類の薬剤に対して耐性を示す結果が得られ，AfuNV2

くのカビ毒を生産することが知られており，それらの生と AfuBOV1 は宿主菌にアゾール系薬剤への感受性を与産に対するウイルス感染の影響を解析した．しかし，今えた．これらはいずれも，標的分子である Cyp51A タン

回解析対象とした A. flavus 菌株において，カビ毒生産

パク質の変異による影響ではなく，ウイルス感染によっに対するウイルスの影響はみられなかった．一方で，て発現レベルが変動した可能性が挙げられる．また別の

HPLC チャート上には，ウイルスの影響を受ける代謝物

可能性として，ウイルス感染により真菌の細胞膜の構造のピークが多数見られた(Fig. 5 ）．たとえば Aspergillusが変化し，薬剤の透過や排出能に影響を及ぼしているか

flavus delaflexivirus 1( AfdFV1 ）感染株( IFM 64473 ）もしれない．今回の結果から，公衆衛生上重要な病原真では RT: 8.1 min のピークが上昇する一方で，脱離株に菌の薬剤耐性に影響を及ぼすマイコウイルスの存在が明比べて，RT: 8.8 min のピークは低下した．AfVV1 感染

らかになった．これまでに臨床的に分離された耐性菌株株( IFM 61879 ）では複数のピークが同様に増大しておの中にも，AfuRV1 のようなウイルスが関与して薬剤耐り，全体的に二次代謝の活性が上昇していると考えられ性を示す株が含まれている可能性は十分に考えられる．

た．IFM 63847 株では，AfPV1 と AfPmV1 それぞれの単独感染株では HPLC チャートに大きな変化は見られな二次代謝化合物へのマイコウイルスの影響

いが，二重感染株では RT: 1.0 min および RT: 6.1 min のA. flavus はアフラトキシンやシクロピアゾン酸など多ピークが低下した．

Fig. 5 Secondary metabolite profiles of virus-infected and -free isolates
Culture extracts of virus-infected and -free isolates of three A. f lavus strains; IFM 64473, IFM 63847, and IFM 61879 wereanalyzed by HPLC. Arrow heads indicate the peak showing increased (black) or decreased (white) metabolite production
between virus-infected and -free isolates. Metabolite production was detected at 214 nm. The representative data was shown.
(Modified from Kuroki et al., 2023)－ 95 －

浦山

俊一，萩原

大祐

AfPV1 と AfPmV1 の二重感染株は前述のように目視主の応答反応を解析した．各遺伝子の発現レベルの類似で観察できる表現型を与えていたが，AfdFV1 や AfVV1性から系統樹を作成すると，各ウイルス脱離株はその親は宿主に対する外観的な影響は見られなかった．すなわ

株である感染株と最も近い発現パターンを示した

ち，生育や形態への影響がない場合でも，代謝物生産へ( Fig. 6A ）．同種内の異なる株間では，遺伝的背景の違の影響を示すことが明らかになった．したがって，今後，いから異なる遺伝子発現パターンを示すが，ウイルス感

ウイルス感染を利用して新規二次代謝物の探索を行う場

染の有無によりさらに細かいバリエーションを生み出し合，外観的な性状にとらわれずに，代謝物を直接検証すていることが示唆された．

る必要性がある．

ウイルス感染株／非感染株の間で，発現が 2.5 倍以上に上昇あるいは減少した遺伝子( DEGs ）を抽出した．

遺伝子発現へのマイコウイルスの影響

その数は株によって異なり，100 ～ 1000 遺伝子が発現

A. flavus のウイルス感染株／非感染株を用いたトランスクリプトームの比較解析により，ウイルスに対する宿変動していた( Fig. 6B）．例外として，IFM 63847 株において，AfPV1 および AfPmV1 単独感染時の DEGs はFig. 6 Comparative transcriptome analysis between virus-infected and -free isolates in A. flavus(A) Heat map of gene expression levels in virus-infected strains and the corresponding virus-free isolates. The heat map was
generated according to TPM data for the whole genome. The color bar shows the range of log2 (TPM) for each gene. A phylogenetic tree presented above the heat map shows the relationships in expression patterns among samples. (B) Number of differentially expressed genes (DEGs) affected by virus infection in each strain. Genes in which TPM was up- or down-regulated > 2.5
times by virus infection were regarded as DEGs. (Modified from Kuroki et al., 2023)－ 96 －

マイコウイルスが宿主糸状菌にもたらす作用の網羅解析

本助成で得られた研究成果の報告それぞれ 422 個と 192 個であったが，二重感染株とウイ
ルス脱離株の間では 1507 個の DEGs が検出された．前述の性状解析や二次代謝産物解析において観察された二重感染株での大規模な表現型変化はこれらの遺伝子発現変動を反映したものと推測できる．つまり，ウイルスの種類や宿主菌株の種類だけでなく，複数のウイルス種が共存することによっても宿主の応答反応が大きく変化すると考えられる．同様のウイルス属をもつ株間で DEGsを比較しても 75％以上の DEGs は共通しておらず，それぞれの菌株に特有の宿主応答であることが示された( data not shown ）．以上の結果から，マイコウイルスに対する宿主の応答の多くは宿主とウイルスの組合せ特異的に起こったと考えられ，同種ウイルスでも異なる株であれば，宿主に異なる影響を与えることが示唆された．
本研究では二次代謝産物の解析を行った条件と同様の条件でのみ遺伝子発現解析を行っており，性状解析を行っていた条件とは培地条件・生育日数ともに異なっている．
そのため本遺伝子発現データは性状解析時の状況を反映した結果とは言えないが，それぞれの性状解析と同様の条件での遺伝子発現を解析することで表現型と遺伝子発現情報の関連を紐づけることができると考えられる．

要約

マイコウイルス研究は宿主の表現型が大きく変わる例に限定されて解析が進められてきた歴史があり，それ以外の潜在的なウイルスについての報告例はほとんどなかった．近年になりウイルス検出技術が発展したことから，それ以外のウイルス感染例にも目が向けられるようになってきた．本研究はマイコウイルスを体系的に評価するべく，生育性状のような目に見える表現型に限らず，
より広範にかつ高解像度にウイルスの影響を見ることが狙いにある．今回の結果から，見た目に影響をほとんど与えない潜在的なウイルスであっても，遺伝子発現としては大きな影響を与えていることがわかった．ウイルス
感染細胞では多様な応答が起きており，限定的な条件において宿主の表現型が表出する例を示したことが本研究の大きな収穫である．そして，宿主糸状菌の遺伝子発現
バリエーションを生み出す存在として，マイコウイルスの新たな価値を見出す足がかりになった．現在，産業利用される糸状菌の機能は，培養条件や薬剤添加などで制御されているが，マイコウイルスを利用することで，新たな遺伝子発現パターンや形質を宿主菌に与える可能性がある．宿主糸状菌の機能強化や制御技術の確立につながることを期待する．

口頭発表1) 浦山俊一．2018．病気を起こさず宿主と共存するウイル
ス～生物相互作用の理解にウイルスの視点を～．環境バ
イオテクノロジー学会2018年度大会．(6月26日，茨城）
2) 萩原大祐．2019．Exploring fungal potential to produce
novel compounds toward drug discovery．第63回日本医真菌学会学術集会．(10月11 – 12日，千葉）
3) 二宮章洋，浦山俊一，周防玲，藤晋一，森山裕充，萩原大祐．2020．トティウイルスによるイネいもち病菌のカ
ビ毒テヌアゾン酸産生誘導．2020年度日本農芸化学会大会．(3月26日，要旨集での発表）
4) 二宮章洋，浦山俊一，周防玲，藤晋一，森山裕充，萩原大祐．2021．菌類ウイルスがイネいもち病菌の二次代謝に与える影響の解析．日本農芸化学大会2021年度仙台大会．(3月18 – 21日，オンライン）
5) 浦山俊一．2021．真菌細胞内で“家畜化”されたウイル
ス．第94回日本細菌学会総会．
(3月23日，オンライン）
6) 萩原大祐．2021．Virus world of fungal world．第23回酵母合同シンポジウム．(9月2 – 3日，オンライン）
7) 池田彩乃，千葉悠斗，浦山俊一，萩原大祐．2021．糸状菌における菌類ウイルスの多面的な影響評価．日本微生物生態学会．(10月30日– 11月2日，オンライン）
8) 浦山俊一．2021．糸状菌は何のためにR NAウイルスを育むのか？．糸状菌分子生物学研究会若手の会第9回ワークショップ．(11月10日，オンライン）9) 黒木美沙，浦山俊一，矢口貴志，萩原大祐．2021．マイコウイルスがAspergillus flavusの表現型に与える影響の普遍性を解明する．糸状菌分子生物学コンファレンス．(11月11 – 12日，オンライン）
10) 浦山俊一，池田彩乃，千葉悠斗，黒木美沙，趙彦杰，萩原大祐．2021．R NAウイルスと真核微生物の共生的関係を俯瞰する．日本共生生物学会第5回大会．(11月27 – 28日，オンライン）11) 黒木美沙，浦山俊一，矢口貴志，萩原大祐．2022．A .
flavusのアフラトキシン生産を促進するマイコウイルスの発見．日本マイコトキシン学会第 87 回学術講演会．(1月7日，オンライン）12) Kuroki, M., Urayama, S., Yaguchi, T., Hagiwara, D. 2022.
Comparing fungal response to mycovirus infection between
some strain of Aspergillus flavus. V International Mycovirus
Symposium.(May 30- June 2, Italy）
13) Hagiwara, D. 2022. Virus infection among a fungal world.
The 19 th young Scientist Seminar.(November 26-27，
Online）
14) 浦山俊一．2023．真菌を操るウイルスのポテンシャルを俯瞰する．日本マイコトキシン学会第88回学術講演会．
(1月6日，茨城）
15) 浦山俊一．2023．生物を変身させる秘密道具としてのウ
イルス．微生物コンソーシアムG3定例会(大隅基礎科学
創成財団）．(2月15日，オンライン）
原著論文
1) Ninomiya, A, Urayama, S, Suo, R, Itoi, S, Fuji, S, Moriyama,
H, & Hagiwara, D. 2020. Mycovirus-induced tenuazonicacid production in a rice blast fungus Magnaporthe oryzae.
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－ 97 －

浦山俊一，萩原2) Ikeda, A., Chiba, Y., Kuroki, M., Urayama, S. & Hagiwara, D.
2022. Efficient elimination of RNA mycoviruses in aspergillus species using R dR p-inhibitors ribavirin and2'-C-methylribonucleoside derivatives. Front. Microbiol. 13:
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3) Kuroki, M., Yaguchi, T., Urayama, S. & Hagiwara, D. 2023.
Experimental verification of strain-dependent relationshipbetween mycovirus and its fungal host. iScience. 8: 107337.
その他(総説・書籍・特許など）
1) 浦山俊一．2020．天然のウイルスを使った微生物の“調和的”な活性化．生物工学会誌．98: 680．
2) Urayama, S., Takaki, Y., Chiba, Y., Zhao, Y., Kuroki, M.,
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3) 浦山俊一，黒木美沙，二宮章洋，萩原大祐．2023 ．真菌を操るマイコウイルスのポテンシャル －二次代謝を中心に－．マイコトキシン．73, 25-28．

謝辞本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた筑波大学糸状菌相互応答講座の学生・構成員諸氏に感謝の意を表します．
また，JSPS 科研費スタート支援(黒木美沙 21K20567 ），挑戦的研究(開拓）(萩原大祐 20K20377 ），新学術領域
研究(研究領域提案型）(浦山俊一 20H05579, 22H04879 ）の支援にも感謝いたします．

文

献Applen Clancey, S., Ruchti, F., LeibundGut-Landmann, S., Heitman,
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略語一覧
AfdFV1: Aspergillus flavus deltaflexivirus1
AfNV1: Aspergillus flavus narnavirus1
AfPmV1: Aspergillus flavus polymycovirus1
AfPV1: Aspergillus flavus partitivirus1
AfuBOV1: Aspergillus fumigatus botourmiavirus 1
AfuCV: Aspergillus fumigatus chrysovirus
AfuMV1: Aspergillus fumigatus mitovirus 1
AfuNSRV1: Aspergillus fumigatus negative-stranded RNA virus 1
AfuNV2: Aspergillus fumigatus narnavirus 2
AfuPmV1: Aspergillus fumigatus polymycovirus 1
AfuPV1: Aspergillus fumigatus partitivirus 1
AfuRV1: Aspergillus fumigatus RNA virus 1
AfVLV1: Aspergillus flavus virga-like virus
AfVV1: Aspergillus flavus vivivirus1
AlPV1: Aspergillus lentulus partitivirus 1
AmpB: Amphotericin B
2CMA: 2'-C-Methyladenosine
2CMC: 2'-C-Methylcytidine
7d2CMA: 7-Deaza-2'-C-Methyladenosine
DEGs: Differentially expressed genes
HPLC: high performance liquid chromatography
ICZ: itraconazole
MCFG: micafungin
MM: minimal medium
NGS: next generation sequencing
PcV: Penicillium chrysogenum virus
PDA: potato dextrose agar medium
RT: retention time
RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction
TCZ: tebuconazole
TPM: transcripts per million
VCZ: voriconazole
YESA: yeast extract sucrose agar medium－ 99 －

IFO Res.Commun. 37
101-109, 2023

マイコウイルスによる糸状菌二次代謝の誘導
浦山

俊一，萩原

大祐

筑波大学生命環境系糸状菌相互応答講座〒305-8577

茨城県つくば市天王台1-1-1

Mycovirus-induced fungal secondary metabolism
Syun-ichi Urayama, Daisuke Hagiwara
Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
1-1-1 Tennodai, Tsukuba, Ibaraki 305-8577
Fungi produce various secondary metabolites, and thus are exploited as a source of useful compounds. Studies offungal genomes have revealed that fungi have the potential to produce more secondary metabolites than expected,
as they have a large number of genes for secondary metabolism. To date, some knowledge on control of fungal
secondary metabolite production by mycoviruses has accumulated. In this study, we evaluated the influence of
mycoviruses on fungal secondary metabolism using a rice blast fungus Magnaporthe oryzae that is infected withthree types of mycoviruses: a totivirus, a chr ysovirus, and a partitivirus. As a result, it was revealed that a
mycotoxin tenuazonic acid was produced in a manner dependent on the totivirus infection. Transcriptome analysis
revealed the regulator y mechanism under viral induction of tenuazonic acid: the totivirus activates thetranscription factor gene TAS2 that upregulates the tenuazonic acid biosynthetic gene TAS1. To the best of ourknowledge, this is the first report that confirmed mycovirus-associated regulation of secondary metabolism at atranscriptional level. Our finding highlights the potential of mycoviruses as a epigenomic factor activating fungal
secondary metabolism.
Key words: secondary metabolism, mycovirus, rice blast fungus

緒

言培養等，休眠遺伝子を覚醒させる様々な手法が考案されてきた．しかしながら，あらゆる休眠遺伝子に適用可能

糸状菌は多様な生物活性物質を産生することから，長な手法は存在しないため，新たな手法を拡充することが年にわたって新規有用物質の探索源として利用されてき望まれる．また，糸状菌が産生する有用物質を我々が利た．近年，糸状菌のゲノム中には，既知の二次代謝産物用する一方で，糸状菌の二次代謝産物は我々に害を与えの数を遥かに越える二次代謝産物の生合成遺伝子クラス

得る．例えば，アスペルギルス属( Aspergillus ）糸状菌

ターが含まれるが，その多くは研究室の培養条件では発が産生するアフラトキシンやオクラトキシンは穀物を毒現しないことが明らかになった．このように休眠状態に化させ，肺アスペルギルス症の原因菌である Aspergillus

ある遺伝子(休眠遺伝子）を発現させることができれば新規物質を得ることができると期待されるため，培養条

fumigatus が産生するグリオトキシンは感染に深く関与する．従って，「有用な二次代謝の促進」と「有害な二件の最適化，薬剤の添加，遺伝子の異種発現，および共次代謝の抑制」を目的とした，糸状菌二次代謝の制御技術が，我々の健康増進のために必要であると言える．

E-mail: hagiwara.daisuke.gb@u.tsukuba.ac.jp
共同研究者：二宮 章洋(筑波大学生命環境系，現 東京大学
農学部）．
周防玲(日本大学生物資源科学部）．
糸井 史朗(日本大学生物資源科学部）．
藤晋一(秋田県立大学生物生産科学科）
森山 裕充(東京農工大学大学院農学研究院）

糸状菌にはマイコウイルスと呼ばれるウイルスが感染する．マイコウイルスは植物病原糸状菌の病原力を低下させ得ることから生物防除剤として期待されており，このような背景から，特に植物病原菌に感染するマイコウ
イルスの機能解析が進んでいる．マイコウイルスは宿主の有性生殖，菌糸の成長，およびコロニーの形態等，様々－ 101 －

浦山

俊一，萩原

大祐

な形質に影響を与え得ることが明らかになっている．マに 3 種のウイルス，APU10-199A_P 株にパルティティウ

イコウイルスが糸状菌二次代謝に与える影響は，特にマイルスが感染していることは，先行研究において逆転写

イコトキシン産生に関していくつかの報告がある．初期

PCR に よ っ て 確 認 し た( Higashiura et al., 2019 ）．M.

の研究では，Aspergillus flavus のアフラトキシン産生がマイコウイルスによって抑制されるとの報告があり

oryzae は ポ テ ト デ キ ス ト ロ ー ス 寒 天 培 地( PDA; BD,
Franklin Lakes, NJ, United States ）上で生育させ，菌糸( Schmidt et al., 1986 ），Fusarium graminearum に よ るを寒天培地ごと切り出して液体培地に植菌した．液体培

トリコテセン産生が RNA ウイルスによって抑制される

養にはポテトデキストロース培地( PDB; BD, Franklinという報告がこれに続いた( Chu et al., 2002 ）．これにLakes, NJ, United States ），醤油白砂糖培地( SS; 5％醤

対して，クライソウイルスによる Alternaria alternata の油と 5％スクロースを水道水に溶解）( Nukina, 1999 ），毒素産生促進( Okada et al., 2018 ），パルティティウイル

または IPN 培地(20％野菜ジュース;野菜一日これ一本，スによる Aspergillus ochraceus のオクラトキシン産生促

カゴメ，愛知，日本;0.3％炭酸カルシウム）を用いた．

進( Nerva et al., 2019 ）など，マイコウイルスが物質産生を促進する例もある．このオクラトキシン産生促進の二次代謝プロファイルの分析

例では，Nerva et al.( 2019 ）はどういうわけかオクラト

いもち病菌を PDB，SS ，および IPN 培地を用いて，キシンの生合成遺伝子が用いた株のゲノム中に見つから40 rpm で振盪しながら 25 ℃で 2 週間，もしくは 150 rpm

なかったと報告しており，従って，ウイルスによる物質で 振 盪 し な が ら 25 ℃ で 5 日 間 培 養 し た． ミ ラ ク ロ ス

産生制御のメカニズムは不明である．これまでのところ，( Merck Millipore, Burlington, MA, United States ）を用

ウイルスが物質産生に影響を与えるとの報告は散見されいて培養液を濾過した後，濾液を等量の酢酸エチルで抽るが，その制御メカニズムはほとんど理解されていない．

出し，抽出液の溶媒を留去した．抽出物をジメチルスル

このような背景をもとに，本研究では，ウイルスによホキシド( DMSO）に溶解し，1260 Infinity LC system

る二次代謝制御のメカニズムについて知見を得ることを( Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, United

目的とした．本研究ではイネいもち病菌 Magnaporthe

States ）と Poroshell 120 EC-C18 カラム( ϕ 3.0 mm×

oryzae APU10-199A 株を研究対象として用いた．当該株はトティウイルス，クライソウイルス，パルティティウ

100 mm, particle size 2.7 μm ; Agilent ）を用いた逆相高速

イルスという 3 種類のウイルスに感染した株である移動相の初期条件は 0.5％酢酸を含む 5％アセトニトリ

液体クロマトグラフィー( HPLC）によって分析した．

( Higashiura et al., 2019 ）．これら 3 種のウイルスは糸状

ルで，18 分かけてアセトニトリルの濃度を 100％まで上菌に広く分布するが，宿主の二次代謝に与える影響は，昇させるグラジエント溶出をおこなった．

先述の例を除いて理解が進んでいない．本研究で我々は，
トティウイルスがイネいもち病菌のマイコトキシン，テテヌアゾン酸の単離

ヌアゾン産の産生を促進することを明らかにした．さらトティウイルスに感染した M. oryzae を 1.2 L の SS 培に，トティウイルスがテヌアゾン酸の生合成遺伝子を調地を用いて 150 rpm で振盪しながら 25 ℃で 5 - 7 日間培節することを示す結果を得たので，併せて報告する．本養した．培養上清を酢酸エチルで抽出した後．ODS フ

研究は，ウイルスが宿主の二次代謝を転写レベルで制御

ラッシュクロマトグラフィーによって抽出物を分画し，することを世界で初めて示すものであり，マイコウイル

0，20，40，60，および 100％メタノール画分を得た．

スを糸状菌の二次代謝を制御する因子として利用できる

この 20％と 40％メタノール画分を，先述した HPLC シ

ことを示唆している．

ス テ ム と COSMOSIL 5C18-AR-II カ ラ ム( ϕ 10 mm×
250 mm; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan ）を用いて精製し，実験方法

6.0 mg のテヌアゾン酸を得た．移動相は 0.5％の酢酸を含む 32％アセトニトリルであった．

微生物株と培養条件
M. oryzae APU10 -199A 株は，先行研究で秋田県にて「あきたこまち」の病斑から分離されたものを用いた核磁気共鳴と高分解能質量分析( Higashiura et al., 2019 ）．当該株はトティウイルス，クNMR spectrometer( JEOL Ltd., Tokyo, Japan ）を用いて

ライソウイルス，およびパルティティウイルスに感染し測定した．1H と 13C の化学シフトは CD3OD の溶媒ピーている．これら 3 種のウイルスのうちトティウイルスとク(それぞれ δH 3.30 と δC 49.0 ）を基準とした．高分解

クライソウイルスを欠いた株を単分生子分離によって単能エレクトロスプレーイオン化質量分析( HRESIMS）

離した(以下 APU10-199A_P と呼ぶ）．APU10-199A 株

は UPLC-SYNAP T G2 HDMS( Waters, Milford, MA,

核磁気共鳴( NMR ）スペクトルは 500-MHz ECA500－ 102 －

マイコウイルスによる糸状菌二次代謝の誘導ると言われているため，M. oryzae を 3 種の培地( SS ，

United States ）を用いた．

PDB，IPN ）で，2 つの異なる速度で振盪培養( 40 rpm
定量的逆転写 PCRと 150 rpm）した．各条件について三重感染株とパルティ

M. oryzae APU10-199A と APU10-199A_P を SS 培地を用いて 150 rpm で振盪しながら 25 ℃で 7 日間培養した．

ティ感染株の二次代謝プロファイルを比較した結果，40 rpm の振盪速度で培養した時に，パルティティ感染

乳鉢と乳棒を用いて菌糸を破砕し，TRIzol( Thermo

株は産生するが三重感染株はほとんど産生しない化合物

Fisher Scientific, Waltham, MA, United States ）を用いて( Fig. 1 中の矢印）を認めた．一方，SS 培地を用いて振RNA を抽出した後，PureLink RNA Mini Kit( Thermo盪速度 150 rpm で培養した時，パルティティ感染株は産Fisher ）を用いて精製した．得られた RNA を DNase I

生しないが三重感染株は著量産生する化合物（1）を発見( Thermo Fisher ）で処理した後，さらに RNA Clean

した．マイコウイルスが化合物 1 の産生に影響を与える& Concentrator( Zymo Research, Ir vine, CA, United

ことが示唆されたため，化合物 1 に着目することとした．

States ）を用いて精製した．そして，Brilliant III Ultra-

化 合 物 1 を 同 定 す る た め，APU10-199A 株 を 1.2 L のFast SYBR Green QPCR Master Mix( Agilent ） を 用 いSS 培地で培養し，培養上清から 6.0 mg の化合物 1 を得て定量的逆転写 PCR( qRT-PCR ）をおこなった．遺伝

た．化合物 1 の分子式を HRESIMS によって C10H15NO3子の発現量は β -チューブリン遺伝子の発現量に対すると決定し，NMR データを基に，テヌアゾン酸と同定し相対値として算出した．

た( Fig. 2A ）．化合物 1 の NMR スペクトルはテヌアゾ

マイコウイルス再感染

物 1 とテヌアゾン標品の逆相 HPLC における保持時間はン酸のものとよい一致を示し( Nolte et al., 1980 ），化合
マイコウイルスの感染実験はウイルスのドナーとして一致した( Fig. 2B）．テヌアゾン酸は過去にアルタナリア

APU10-199A ，レシピエントとして APU10-199A_P を用属( Alternaria ）やマグナポルテ属( Magnaporthe ）の糸い，先行研究にならって( Yaegashi et al., 2011 ）菌糸融状菌から報告されているマイコトキシンである( Rosett

合により実施した．先行研究にならって( Higashiura etet al., 1957 ）．テヌアゾン酸は哺乳類細胞においてペプ
チド結合形成を阻害することでタンパク質合成を阻害す

al., 2019 ）APU10-199A_P 株にハイグロマイシン耐性遺伝子( hph ）を導入した．ドナーとレシピエント株をることが報告されている( Carrasco & Vazquez, 1973 ）．

PDA 上に互いに 1 cm 離して植菌し，25 ℃で 14 日間培養した．そして，2 つのコロニーが接する部分から菌糸マイコウイルスがテヌアゾン酸生合成遺伝子とその調節を切り出し，ハイグロマイシン B( 200 μg/mL ）を含む遺伝子に与える影響

PDA に植菌した．さらに 3 回，ハイグロマイシン含有

テヌアゾン酸は，非リボソームペプチド合成酵素培地にコロニーを植え継いだ．得られたハイグロマイシ( NRPS）とポリケチド合成酵素( PKS）のハイブリッン耐性株について，逆転写 PCR( RT-PCR ）によってウド酵素であるテヌアゾン酸合成酵素 TAS1 によって生合イルス感染の有無を確認した．

成 さ れ る( Yun et al., 2015 ）．TAS1 遺 伝 子 の 発 現 はRNA-シーケンシング解析

される( Yun et al., 2017 ）．マイコウイルスが TAS1 とM. oryzae の各株を SS 培地を用いて 150 rpm で振盪しながら 25 ℃で 5 日間培養した．先述の方法で RNA を抽

TAS2 の転写に与える影響を調べるために，三重感染株
APU10-199A とパルティティ感染株 APU10-199A_P にお出し，精製した．Novogene( Beijing, China ）にライブ

けるこれらの遺伝子の発現量を qRT-PCR によって定量

Zn(II)
2 - Cys 6 型転写因子である TAS2 によって正に制御

ラリ調製とシーケンシングを委託した．CLC Genomics

した．その結果，TAS2 の発現量はパルティティ感染株

Workbench( QIAGEN, Hilden, Germany ）を用いてリーよりも三重感染株において 2 倍以上の高い値を示し，

ドを M. oryzae 70-15 のゲノム配列( GCA_000002495.2 ）にTAS1 は 100 倍以上の高い発現量であった( Fig. 3 ）．このデータは，マイコウイルスが転写因子 TAS2 を正に制マッピングし，transcripts per million( TPM ）を算出した．

結

御することによって TAS1 の発現量を増幅し，テヌアゾ

果

ン酸産生を誘導することを示唆するものである．Yun etal.( 2015 ）は M. oryzae の培地に 1％ DMSO を添加する
ことによってテヌアゾン酸産生を誘導したと報告していマイコウイルスがテヌアゾン酸産生に与える影響
まず，三重感染株 APU10-199A とパルティティ感染株

るが，我々の培養条件では，DMSO 添加はテヌアゾン

APU10-199A_P の二次代謝プロファイルを比較した．一酸の産生を誘導せず，また，TAS1 あるいは TAS2 を活

般的に糸状菌の二次代謝は培養条件によって影響を受け性化することもなかった( Fig. 3 ）．

－ 103 －

浦山

俊一，萩原

大祐

Fig.1 Secondary metabolite profiles of APU10-199A and APU10-199A_P
The strains were cultured in soy sauce-sucrose medium (SS), potato dextrose broth (PDB), and IPN medium.
The culture extracts were analyzed by HPLC. This data shows a representative profile from three independentcultures. This figure is adapted from Ninomiya et al. 2020.

－ 104 －

マイコウイルスによる糸状菌二次代謝の誘導

Fig. 2 Chemical structure and production of tenuazonic acid(A) Chemical structure of tenuazonic acid (TeA). (B) HPLC chart of the extract of TeA producing strain and TeA
standard. This figure is adapted from Ninomiya et al. 2020.

Fig. 3 Expression levels of TAS1 and TAS2 in APU10-199A and APU10-199A_P
The strains were cultured in soy sauce-sucrose medium, and the expression levels of (A) TAS1 and (B) TAS2
were determined by quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR). This experiment was performed on three
independent biological replicates each containing three technical replicates. Error bars represent the standard
deviation. This figure is adapted from Ninomiya et al. 2020.

－ 105 －

浦山

俊一，萩原

テヌアゾン酸産生を誘導するマイコウイルスの同定

大祐子と呼ぶ）を探索した．その結果，7 つのテルペン合成

パルティティ感染株 APU10-199A_P は，三重感染株

酵素，16 の NRPS ，21 の PKS ，および 7 つの PKS-NRPS

APU10-199A と比べてトティウイルスとクライソウイル

ハイブリッドがコードされていることがわかった．次に，スを欠いている．テヌアゾン酸産生に影響を与えるのがRNA シーケンシング解析によって遺伝子の発現量を決

どのウイルスであるのかを明らかにするために，我々は定した．三重感染株 APU10-199A とパルティティ感染株

以下に示す再感染実験をおこなった．パルティティ感染株に選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子をAPU10-199A_P について，51 のコア遺伝子の発現量を比較し，発現量の比が > 10 あるいは < 0.1 であり，なお導入し，得られたハイグロマイシン耐性パルティティ感

かついずれかにおいて TPM 値が全遺伝子の TPM 平均

染株と三重感染株の菌糸融合によってパルティティ感染

値の 1/10 を超えるものを探索した．その結果，三重感株にウイルスを再感染させた．その結果，6 つの再感染

染株とパルティティ感染株で 3 つのコア遺伝子( TAS1，

株( RI 株 ），RI-1-60 ，RI-4-49 ，RI-4-51 ，RI-4-53 ，RI-4-59 ，および RI-4-61 を得た．RI 株のウイルス感染プロファイ

MGG_10671，MGG_14767 ）の発現量に差があることを明らかにした( Table 1 ）．テヌアゾン酸生合成遺伝子

ル は RT-PCR( Fig. 4 ） と ウ イ ル ス 由 来 二 本 鎖 RNA

TAS1 は三重感染株で，発現量が高かった．また，再感( dsRNA ） の 電 気 泳 動 に よ っ て 確 認 し た．RI-4-49 とRI-4-53 は 3 つのウイルスに感染しており，テヌアゾン
酸を産生したことから，ハイグロマイシン耐性遺伝子と再感染の操作はテヌアゾン酸産生に影響を与えないことが示された．RI-4-51 と RI-4-59 はトティウイルスとパルティティウイルスに感染しており，テヌアゾン酸を産生したことから，クライソウイルスもテヌアゾン酸産生に影響を与えないことが示唆された．RI-4-61 株はクラ
イソウイルスとパルティティウイルスに感染しており，
テヌアゾン酸を産生しなかったことから，テヌアゾン酸
産生はトティウイルス依存的であると結論付けた．
マイコウイルスが二次代謝産物の生合成遺伝子の発現に与える影響
マイコウイルスが M. oryzae の二次代謝に与える影響を包括的に理解するため，三重感染株 APU10-199A ，パルティティ感染株 APU10-199A_P，再感染株 RI-4-49，
および RI-4-51 について，RNA シーケンシング解析をおこなった．RI-4-49 はトティウイルスとクライソウイル
スに再感染しており(パルティティウィルスと合わせて三重感染となる），RI-4-51 はトティウイルスのみに再感染(同様に二重感染となる）している．まず，antiSMASH( Blin et al., 2019 ）を用いて，M. oryzae のゲノム配列から二次代謝産物の骨格形成を担う遺伝子(以下コア遺伝

Fig. 4 Virus infection profiles and tenuazonic acidproduction of the strains obtained by virus
reinfection experiments.
Through anastomosis experiment, several candidatestrains were segregated. For the colonies, presenceof viruses ( Toti, Chr yso, and Partiti) was directly
confirmed by reverse transcription PCR (RT-PCR)
with primer set specific to each virus. TeA represents
tenuazonic acid production. This figure is adaptedfrom Ninomiya et al. 2020.

Table 1 Expression levels (TPM) of core genes for secondary metabolism determined by RNA-sequencing analysis.

－ 106 －

マイコウイルスによる糸状菌二次代謝の誘導

染株 RI-4-49 と RI-4-51 においても三重感染株と同様に告されているが( Kang et al., 2017 ），これまでのところ，

TAS1 の発現量は高かった．また，転写因子 TAS2 の発現量はパルティティ感染株よりも三重感染株と再感染株

M. oryzae のイネへの感染にテヌアゾン酸が関わるかど
うかは明らかになっていない．Yun et al.( 2015 ）は M.

で高かった．以上の結果から，トティウイルスがテヌア
ゾン酸生合成遺伝子の転写を正に制御することでテヌア

oryzae のテヌアゾン酸生合成遺伝子を同定し，2 つのテヌアゾン酸産生誘導条件( 1％ DMSO 添加と浸透圧応

ゾン酸産生を促進すると結論付けた．

答性 MAP キナーゼ遺伝子 OSM1 の破壊）を発見した．

考

本研究では初めて，薬剤添加や遺伝子操作等の人為的な察条件に依らず，内在性のウイルスによってテヌアゾン酸の産生が誘導されることを明らかにした．本研究は，ウ

近年，マイコウイルスが糸状菌の物質産生に影響を与

イルスによって機能未知の休眠遺伝子を内在性の遺伝因

えるとの報告が僅かながらも挙がっている．マイコウイ

子によって活性化できる可能性を示すものである．マイ

ルスがマイコトキシン産生を促進する( Okada et al.,

コウイルスの中には，菌糸融合，プロトプラスト融合

2018 ; Nerva et al., 2019 ）例もあれば，抑制する(Schmidt( Lee et al., 2011 ），やエレクトロポレーション( Moleleki

et al., 1986 ; Chu et al., 2002 ）例もある．しかしながら，これらの知見は，ウイルス感染株とウイルス治癒株の表et al., 2003 ）等によって容易に感染可能なものがあり，二次代謝を活性化する因子としての利用が期待される．

現型を比較することのみによって得られている．本研究

要では，ウイルスが宿主の二次代謝に与える影響を，ウイルス感染株と治癒株の比較によって推定した後，ウイル

約ス再感染株を作製することによって確認している．さら

本研究では，マイコウイルスが糸状菌の二次代謝に与に，本研究は世界で初めて，マイコウイルスによる糸状える影響を理解することを目的として，3 種のウイルス

菌二次代謝の転写レベルでの調節を明らかにした．本研(トティウイルス，クライソウイルス，パルティティウ

究は，有用な二次代謝産物の探索研究にマイコウイルスイルス）に感染したイネいもち病菌 Magnaporthe oryzaeを応用できる可能性を示している．

APU10-199A 株と，当該株からトティウイルスとクライ

トティウイルスは長さ 5.2 kb の dsRNA セグメントをソウイルスを除いた株 APU10-199A_P 株の物質産生をゲノムとして有し，当該セグメントにはコートタンパク

比較した．その結果，M. oryzae がウイルス依存的にテ質と RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ( RdRp ）がコード

ヌアゾン酸というマイコトキシンを産生することが示唆されている．詳細な分子メカニズムは明らかではないが，された．テヌアゾン酸産生を誘導するウイルスを同定す

これら 2 つのオープンリーディングフレーム( ORF ）るため，ウイルス再感染によって様々な感染プロファイのうちいずれか，あるいは両方がテヌアゾン酸産生誘導

ルを示す株を取得し，それらの株の物質産生を比較するに関わる可能性がある．ゲノム中のどの因子がテヌアゾことによって，トティウイルスがテヌアゾン酸産生を誘

ン酸産生を誘導するか，および，TAS2 の活性化に至る導することを明らかにした．さらに，RNA-シーケンシ

シグナル伝達経路を明らかにするためには，更なる研究

ング解析によって，トティウイルスがテヌアゾン酸の生が必要となる．また，テヌアゾン酸以外にも，いくつか合成遺伝子 TAS1 の発現を正に制御する転写因子 TAS2の化合物の産生がトティウイルスあるいはクライソウイを活性化することによってテヌアゾン酸産生を誘導す

ルスの影響を受けることが示唆された( Fig. 1 ）．ウイる，という機構が示唆された．本研究は，ウイルスによ

ルスが二次代謝に与える影響は，培地の種類と振盪速度る糸状菌の二次代謝制御を転写レベルで捉えた初の研究の違いによる影響を受けた．本研究ではトティウイルス

であり，二次代謝の活性化因子としてマイコウイルスをのみに感染した株が得られなかったため，トティウイル

利用できる可能性を示す．

スとパルティティウイルス，あるいはトティウイルスと本助成で得られた研究成果の報告

クライソウイルスの組合わせがテヌアゾン酸産生誘導に必要である可能性は排除できていない．この可能性を検証するためには，更なる研究が必要である．
テヌアゾン酸は古くから知られているマイコトキシン
であり，抗菌，抗ウイルス，植物毒性など，多様な生物活性が報告されている( Miller et al., 1963 ; Gitterman,
1965 ; Chen et al., 2010 ）．アルタナリア属糸状菌ではテ
ヌアゾン酸が病原性因子として感染に関わることが報

口頭発表
1) 二宮章洋，浦山俊一，藤晋一，森山裕充，萩原大祐．
2019．ウイルスがイネいもち病菌の物質産生に与える影響の解析．日本農芸化学会関東支部2019年度支部大会(9月7日，茨城）2) 萩原大祐．2019．Exploring fungal potential to produce
novel compounds toward drug discovery．第63回日本医真菌学会学術集会．
(10月11 – 12日，千葉）－ 107 －

浦山

俊一，萩原

3) 二宮章洋，浦山俊一，周防玲，藤晋一，森山裕充，萩原大祐．2020．トティウイルスによるイネいもち病菌のカ
ビ毒テヌアゾン酸産生誘導．日本農芸化学会2020年度大会(3月25 – 28日，福岡）
4) 二宮章洋，浦山俊一，周防玲，藤晋一，森山裕充，萩原大祐．2021．菌類ウイルスがイネいもち病菌の二次代謝に与える影響．日本農芸化学会2021年度大会(3月18 – 21日，宮城）5) 浦山俊一，二宮章洋，千葉悠斗，池田彩乃，趙 彦杰，老木 紗予子，萩原 大祐．2021．真菌細胞内で“家畜化”されたウイルス．第94回日本細菌学会総会(3月23 – 25日，
オンライン）
6) 二宮章洋．2021．ウイルスゲノムを利用した糸状菌の二次代謝機能開発．ACT-X「環境とバイオテクノロジー」領域－新学術領域「ポストコッホ生態」合同シンポジウム(9月1日，オンライン）
7) 萩原大祐．2021．Virus world of fungal world．第23回酵母合同シンポジウム(9月2 – 3日, オンライン）
8) 萩原大祐．2021．生態システム理解を目指した糸状菌相互作用研究．第20回糸状菌分子生物学コンファレンス，(11月11-12日，オンライン）
9) Hagiwara, D. 2022. Virus infection among a fungal world.
The 19th young Scientist Seminar,(26-27 Nov. Online）
原著論文
1) Ninomiya, A ., Urayama, S., Suo, R ., Itoi, S., Fuji, S.,
Moriyama, H. & Hagiwara, D. 2020. Mycovirus-induced
tenuazonic acid pr oduction in a rice blast fungus
Magnaporthe oryzae. Front. Microbiol. 11: 1641.
その他(総説・書籍・特許など）
1) 浦山俊一，黒木美沙，二宮章洋，萩原大祐．2023．真菌を操るマイコウイルスのポテンシャル．マイコトキシン
73：25–28．

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた筑波大学糸状菌
相互応答講座の学生・構成員諸氏に感謝の意を表します．JSPS 科研費スタート支援(二宮章洋 18H05999），
特別研究員奨励費(二宮章洋 21J00311 ），挑戦的研究(開拓）(萩原大祐 20K20377 ），JST ACT-X(二宮章洋
JPMJAX20BF ）の支援にも感謝いたします．

文

献Blin, K., Shaw, S., Steinke, K., Villebro, R., Ziemart, N., Lee, S.
Y., Medema, M. H. & Weber, T. 2019. antiSMASH 5.0: updates
to the secondary metabolite genome mining pipeline. Nucleic
Acids Res. 47: W81-W87.
Carrasco, L ., & Vazquez, D. 1973. Differences in eukar yotic
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大祐

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Yaegashi, H., Sawahata, T., Ito, T., & Kanematsu, K. 2011. A－ 108 －

マイコウイルスによる糸状菌二次代謝の誘導
novel colony-print immunoassay reveals differential patterns of
distribution and horizontal transmission of four unrelated
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略語一覧
DMSO
HPLC
HRESIMS
NMR
NRPS
ORF
PDA
PDB
PKS
qRT-PCR
RdRp
RT-PCRSS
TPM－ 109 －

ジメチルスルホキシド
高速液体クロマトグラフィー
高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析
核磁気共鳴
非リボソームペプチド合成酵素
オープンリーディングフレーム
ポテトデキストロース寒天
ポテトデキストロース培地
ポリケチド合成酵素
定量的逆転写PCR
RNA依存性RNA複製酵素
定量的逆転写PCR
醤油白砂糖培地
Transcripts per million

IFO Res.Commun. 37
111-124, 2023

糸状菌間相互作用による抗生物質ジフェニルエーテル類の産生誘導
浦山

俊一，萩原

大祐

筑波大学生命環境系糸状菌相互応答講座〒305-8577

茨城県つくば市天王台1-1-1

Antibacterial diphenyl ether production induced by fungal-fungal interaction
Syun-ichi Urayama, Daisuke Hagiwara
Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
1-1-1, Tennodai, Tsukuba, Ibaraki 305-8577
Fungi have the potential to produce various biologically active secondary metabolites. Fungal genomes contain far
more genes for secondary metabolites than the number of metabolites that have been identified. In several studies,novel fungal metabolites were discovered on co-culturing fungus with another microorganism. Therefore, the coculturing method has attracted much attention in this field. However, study of the molecular mechanisms
underlying this effect is in its infancy. In this research, we used strains of the fungal genus Aspergillus in co-culture
to enhance secondary metabolites production. Aspergillus nidulans showed enhanced production of antibacterial
compounds called diphenyl ethers when it was co-cultured with Aspergillus fumigatus. We identified a gene cluster(the ors cluster) that are involved in production of these metabolites. Notably, this cluster was previously
demonstrated to be responsible for production of a different compound, orsellinic acid, when Aspergillus nidulans
was co-cultured with the bacterium Streptomyces rapamycinicus. To gain insight into the differences in metabolite
biosynthesis during fungal–bacterial and fungal–fungal interaction, the biosynthetic pathway of co-culture-induced
metabolites were analyzed and reconstructed in Aspergillus oryzae. Our model co-culture system serves as afoundation for understanding fungal secondary metabolic response to fungal–fungal interaction.
Key words: Co-culture, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Secondary metabolism, Diphenyl ether緒

言ル基転移酵素の阻害剤を加える方法( Williams et al.,2008 ），および，生合成遺伝子の異種発現( Kennedy et

糸状菌は，フレミングらによる世界初の抗生物質ペニ
シリンの発見以降，有用物質の探索供給源として利用さ

al., 1999 ; Heneghan et al., 2010 ; Itoh et al., 2010 ）等が挙げられる．中でも最も簡便な方法のひとつが共培養法でれてきた．近年，糸状菌のゲノム中には膨大な数の未知ある( Arora et al., 2020 ; Chen et al., 2020 ; Liu & Kakeya,

化合物の生合成遺伝子が存在することが明らかになった

2020 ; Kim et al., 2021 ）．初期の研究では，海洋天然物化

が( Khaldi et al., 2010 ; Sanchez et al.. 2012a ），そのうち学者である Fenical らのグループが，海洋由来の糸状菌研究室条件で発現するものは一部に過ぎない(Brakhageと細菌との共培養が糸状菌の物質産生を促進することを& Schroeckh, 2011 ）．休眠状態にある二次代謝産物の生報告している( Cueto et al., 2001 ; Oh et al., 2005, 2007 ）．

合成遺伝子は新たな有用物質の探索源として有望視され

Cueto et al.( 2001 ）は海洋由来の真菌 Pestalotia sp. とており，休眠遺伝子を活性化する手法がいくつも考案さ未同定細菌 CNJ-328 を共培養し，新規ベンゾフェノンれてきた．例えば，培養条件の検討( OSMAC 法;Bode

化合物ペスタロンを発見した．ペスタロンは真菌を単独

et al., 2002 ），DNA メチル基転移酵素やヒストンアセチ

培養しても産生せず，共培養でのみ産生が確認された．
細菌の培養上清や抽出物を真菌に与えても化合物の産生

E-mail: hagiwara.daisuke.gb@u.tsukuba.ac.jp
共同研究者：二宮 章洋(筑波大学生命環境系，現 東京大学
農学部）．

が誘導されなかったことから，化合物産生は化学物質によって制御されているのではないと考えられた．当該研究に続いて，Oh et al.( 2005, 2007 ）は，海洋由来真菌－ 111 －

浦山

俊一，萩原

大祐

Libertella sp. と CNJ-328 の共培養から新規ジテルペン
libertellenones を，海洋由来真菌 Emericella sp. と海洋スターである( Schroeckh et al., 2009 ）．興味深いことに，放線菌 Salinispora arenicola の共培養から新規抗菌物質

nidulans 共培養はいずれも ors クラスターを活性化するが，生成する代謝産物は異なっていた．また，我々は，

emericellamides を単離した．以上の先駆的な研究によって細菌との競争が糸状菌の二次代謝を刺激することが示唆され，これが契機となって共培養による糸状菌からのA. fumigatus -A. nidulans 共 培 養 と S. rapamycinicus -A.

S. rapamycinicus によって誘導されるポリケチドはポリケチド合成酵素のみによって生合成されるが，それに対新規化合物の報告が多数後に続いている( Arora et al.,

して，A. fumigatus によって誘導されるポリケチドの産2020 ; Chen et al., 2020 ）．

生にはポリケチド合成酵素に加えて最大 3 つの修飾酵素

共培養における糸状菌二次代謝の制御機構を明らかにが必要であることを明らかにした．A. nidulans が細菌することは，人為的に二次代謝を活性化する技術を開発と真菌に応答して，2 つの異なる種類のポリケチドを作するために不可欠であるが，そのような分子機構に関しり分ける機構を明らかにした本研究は，糸状菌の微生物ては理解が進んでいない．先行研究のほとんどは新規物に対する代謝応答の理解を深めるものである．

質の獲得を目的としており，そのため非モデル生物を研実験方法究対象としている．この制限が，二次代謝活性化の分子機構の解析を難しくしている．例外は Brakhage の研究グループによる糸状菌と細菌の相互作用に関する先駆的

モデル糸状菌の寒天培地を用いた共培養と代謝物分析な研究である．Schroeckh et al.( 2009 ）はモデル糸状菌

二次代謝産物の産生を促進する糸状菌間相互作用を探Aspergillus nidulans と放線菌 Streptomyces rapamycinicusとの共培養が，A. nidulans のオルセリン酸生合成遺伝

索するため，4 種のモデル糸状菌( A. fumigatus Af293，

子クラスター( ors クラスター）の発現を促し，いくつAspergillus niger CBS 513.88，A. nidulans FGSC A4，かのポリケチド化合物の産生を誘導することを報告しAspergillus oryzae RIB40 ）を用いた．共培養の場合，それぞれの糸状菌の分生子をポテトデキストロース寒天

た．透析実験と顕微鏡観察の結果，糸状菌と放線菌の物( PDA;BD, Franklin Lakes, NJ, USA ）に 5.0×10 3 個/mL

理的相互作用が二次代謝活性化に必要であることが示唆の割合で加え，30 ℃で 3 日間培養した．単独培養の場合，さ れ た．Nützmann et al.( 2011 ） は，S. rapamycinicus

1.0×10 4 J/mL の割合で分生子を培地に加えた．培養後が引き起こすヒストンアセチル化が二次代謝の誘導に必の寒天プレートを凍結融解し，酢酸エチルで抽出した．

要であることを，Fischer et al.( 2018 ）は，BasR とい抽出物を乾固した後，ジメチルスルホキシド( DMSO）

う転写因子が S. rapamycinicus による二次代謝誘導に深に溶解し，高速液体クロマトグラフィー( HPLC ）分

く関わることを明らかにした．さらに，S. rapamycinicus

析に供した．HPLC 分析には 1260 Infinity LC system

は A. nidulans の み な ら ず， 同 属 他 種 の モ デ ル 糸 状 菌( Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA ）とAspergillus fumigatus の二次代謝も誘導することが明らかになっている( König et al., 2013 ; Stroe et al., 2020 ）．

Poroshell 120 EC-C18 カラム( ϕ 3.0 mm×100 mm, particle
size 2.7 μm ; Agilent）を用いた．HPLC の初期条件は 0.5％

産生が誘導された化合物 fumigermin は S. rapamycinicus

酢酸を含む 5％アセトニトリルで，18 分かけてアセトニの発芽を抑制することから，放線菌からの防御物質と考トリル濃度を 100％まで高めるグラジエント溶出をおこえられている( Stroe et al., 2020 ）．糸状菌と細菌の相互なった．化合物は 214 nm の UV の吸収で検出した．

作用については，先述した A. nidulans–S. rapamycinicusと A. fumigatus–S. rapamycinicus の系をモデルとして解析が進んでいるが，それに対して，糸状菌同士の相互作用によって二次代謝が活性化する分子メカニズムについA. fumigatus と A. nidulans の液体培地における共培養と代謝物分析ては一部の例外を除いて理解が進んでいない( Liu et al.,A. fumigatus( 1.0×10 5/mL），A. nidulans( 1.0×10 5/mL），
または A. fumigatus -A. nidulans(それぞれ 1.0×10 5/mL ）2022 ）．

をポテトデキストロース培地( BD）に植菌し，30 ℃，

本研究で我々は，糸状菌同士のモデル共培養系( A.

120 rpm の振盪速度で 3 日間培養した．培養液をミラク

fumigatus -A. nidulans ）を確立し，共培養に伴う二次代謝の制御を解析した．その結果，A. fumigatus -A. nidulans

ロス(Merck Millipore, Burlington, MA, USA ）で濾過し，濾液を酢酸エチルで抽出した．抽出物を乾固した後，共培養によって，A. nidulans の ors クラスターが活性化

DMSO に溶解して，先述の HPLC システムと Poroshell

し，抗菌性ジフェニルエーテル類の産生が誘導されるこ

120 EC-C18 カラムを用いた HPLC 分析に供した．

とが明らかになった．当該クラスターは A. nidulans と放線菌 S. rapamycinicus の共培養によっても活性化するクラ－ 112 －

糸状菌間相互作用による抗生物質ジフェニルエーテル類の産生誘導

ビオラセオール，ジオルシノール，およびコルジオール
C の単離

et al., 2002 ）から PCR によって増幅した．Cas9 タンパ
ク質( 20 μg ; Takara ）と gRNA( 4 μg ）に滅菌水を加えて 全 量 を 18.4 μL と し， 室 温 で 5 分 反 応 さ せ た．Cas9-

A. fumigatus - A. nidulans 共培養の培養液をミラクロ
スで濾過し，濾液を酢酸エチルで抽出した．抽出物をgRNA 溶液，インサート DNA( 4 μL ），および 15 μL の乾固した後，DMSO に溶解し，先述の HPLC システム

solution II( 40％( w/v ）PEG4000, 50 mM CaCl2, 50 mMと COSMOSIL 5C18-AR-II カ ラ ム( ϕ 10 mm×250 mm ;Tris-HCl( pH 8.0 ））を，50 μL のプロトプラスト懸濁液

Nacalai Tesque, Kyoto, Japan ） を 用 い た 逆 相 HPLC にに加え，混合液を 20 分間氷上に置いた．プロトプラスト

よって分画し，ビオラセオール I と II ，ジオルシノール，

を，ピリチアミン( 0.1 μg/mL ），0.8 M NaCl，0.5％寒およびコルジオール C を得た．HPLC の条件は，0.5％

天を含む最小培地(MM ; Barratt et al., 1965）に植菌した．

酢酸を含む 24％アセトニトリルを用いた 35 分間のアイ
ソクラティック溶出(ビオラセオール類），または 0.5％

異種発現のためのベクター作製

酢酸を含む 36％アセトニトリルを用いた 25 分間のアイ

pAdeANPCR に よ っ て pUARA2( Tagami et al., 2014 ） か ら

ソクラティック溶出(ジオルシノールとコルジオール C）とした．

PamyB -TamyA カセット(0.9 kb ）を増幅した．In-Fusion
HD Cloning Kit(Takara）を用いて，PamyB -TamyA カセッ
ト を pAdeA( 4.9 kb ）( Jin et al., 2004a ） の EcoRI サ イ

RNA-シーケンシング解析
乳鉢と乳棒を用いて，液体培養(独立した培養×2 ）から得た菌糸を破砕した．TRIzol reagent( Thermo Fisher

トに挿入し，pAdeAN( 5.8 kb ）を得た．

Scientific, Waltham, MA, USA ）を用いて RNA を抽出し，

pUSAN
PCR に よ っ て pUARA2 か ら PamyB -TamyB -PamyB -PureLink RNA Mini Kit( Thermo Fisher ）を用いて精TamyA カセット( 1.9 kb ）を増幅した．PCR によって製 し た． 得 ら れ た RNA を DNase I( Thermo Fisher ）pUSA( Yamada et al., 2003 ）から ATP スルフリラーゼ

処 理 し，RNA Clean & Concentrator( Zymo Research,

遺伝子 sC を含む長さ 6.4 kb の領域を増幅した．PamyB -Irvine, CA, USA ）で精製した．2 つの独立した培養由来

TamyB -PamyB -TamyA カセットと 6.4 kb のフラグメントの RNA を等量ずつ混合し，RNA-シーケンシング解析にを In-Fusion システムによって連結し，pUSAN( 8.3 kb ）供した．ライブラリ調製，シーケンシング，および一部を得た．

のデータ解析は Novogene(Beijing, China ）に委託した．

pUARA2-orsA

リードを A. fumigatus Af293 と A. nidulans FGSC A4 のリファレンスゲノム配列(それぞれ GCA_000002655.1

A. nidulans FGSC A4 のゲノム DNA から，イントロン
を含む orsA 遺伝子( 6.5 kb ）を増幅した．In-Fusion シと GCA_000149205.2 ）に マッピングし，CLC Genomics

ステムを用いて orsA 遺伝子を pUARA2(8.0 kb ）の KpnI

Workbench( Qiagen, Hilden, Germany ） を 用 い て遺伝サイトと ClaI サイトに導入し，pUARA2-orsA( 13.7 kb ）子の発現量を transcripts per million(TPM ）で算出した．

を得た．

遺伝子破壊

pAdeAN-orsF
PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara）

醤油白砂糖培地( SS ; 5％醤油と 5％白砂糖を水道水を用いて，共培養の菌体由来 RNA から orsF 遺伝子のに溶解）を用いて A. nidulans を一晩 37 ℃で培養した．

cDNA( 0.6 kb ）を合成した．PCR で cDNA から増幅しミラクロスを用いて菌糸を回収し，プロトプラスト化溶た orsF 遺伝子を In-Fusion システムを用いて pAdeAN

液((10 mM リン酸ナトリウムバッファー(pH 6.0 ），0.8 Mの NheI サイトに導入し，pAdeAN-orsF( 6.5 kb ）を得た．

NaCl，5 mg/mL Yatalase( Takara Bio Inc., Shiga, Japan ），pUSAN-orsB

5 mg/mL lysing enzyme( L1412, Sigma-Aldrich, St. Louis,

orsB 遺 伝 子 の cDNA( 1.0 kb ） を 合 成 し，PCR で
cDNA から増幅した orsB 遺伝子を In-Fusion システムを

MO, USA ））に加えて 30 ℃で 3 時間反応させた．セルストレーナー( 40 μm ）で濾過し，菌糸塊を取り除いた．

用 い て pUSAN の KpnI サ イ ト に 導 入 し，pUSAN-orsB

プロトプラストを遠心分離(1000×g，5 分）で集め，0.8 M( 6.5 kb ）を得た．

NaCl で 2 回 洗 浄 し，200 μL の solution I( 0.8 M NaCl，

pUSAN-orsBC

10 mM CaCl2 ，10 mM Tris-HCl( pH 8.0 ））に再懸濁した．
ガ イ ド R NA( gR NA ） は Guideit sgR NA In Vitro

orsC 遺伝子の cDNA(1.2 kb ）を合成し，PCR で cDNAから orsC 遺伝子を増幅した．In-Fusion システムを用いTranscription Kit( Takara ）を用いて作製した．ピリチて orsB と orsC をそれぞれ pUSAN の KpnI サイトと ClaI

アミン耐性遺伝子(ptrA ）カセットは pPTRI(Kubodera

サイトに導入し，pUSAN-orsBC( 10.5 kb ）を得た．

－ 113 －

浦山

俊一，萩原

大祐

A. oryzae の形質転換

G2 HDMS( Waters, Milford, MA, USA ）を用いた．

A. oryzae NSAR 1 株を，2％グルコース，0.05％硫酸
アンモニウム，0.02％アルギニン，0.01％アデニン，おビオラセオール生合成遺伝子を有する菌類の探索

よ び 0.15 ％ メ チ オ ニ ン を 含 む MM を 用 い て，30 ℃ でBlastP を用いて OrsA に相同性を示すタンパク質を検3 日間培養した．菌糸からプロトプラストを作製し，索した．以下，互いに > 55％の同一性を示すタンパク質200 μL の solution I に懸濁した．懸濁液 200 μL に対してを推定上のホモログとして扱う．orsA のオルソログを

40 μL の solution II を加えた．この懸濁液 200 μL に，20 μL有する真菌のゲノム配列について，antiSMASH を用いの solution I に懸濁したプラスミド(70 – 100 μg ）を加え，て二次代謝産物の生合成遺伝子クラスターを検索した．

氷上に 30 分静置した．懸濁液に 1 mL の solution II を加そ の 結 果，orsA ，orsB，orsC，orsD，orsE ，お よ び orsF

え，さらに室温で 15 分静置した．Solution I を 8.5 mL 加のオルソログを含むクラスターを発見した．

え，プロトプラストを遠心分離( 1000×g，5 分）によっ

結て集めた後，100 μL の solution I に懸濁した．プロトプ
ラ ス ト 懸 濁 液 を，2 ％ グ ル コ ー ス，0.5 ％ 寒 天，0.8 M
NaCl，および適切な栄養素を含む MM に混和し，30 ℃

果

二次代謝産物産生を促進する糸状菌間相互作用の探索

で 5 - 7 日間培養した．

糸状菌間相互作用を理解するためのモデル共培養系を構築するために，二次代謝産物産生を促進する糸状菌同A. oryzae 形質転換体の代謝物分析士の組合わせを探索した．スクリーニングには 4 つのモ

A. oryzae 形質転換体は，2％マルトースと適切な栄養素を含む MM を用いて，30 ℃で 5 日間，120 rpm で振盪

デル糸状菌( A. fumigatus Af293，A. niger CBS 513.88，

培養した．菌糸を回収し，超音波処理によって代謝産物

A. nidulans FGSC A4，A. oryzae RIB40 ）を用いた．これら 4 種の糸状菌は二次代謝に関してよく研究が進んでを抽出した．抽出物を乾燥させ，DMSO に溶解した後，おり，従って多くの二次代謝産物の生合成遺伝子クラス

先述の HPLC システムと Poroshell 120 EC-C18 カラムをターの産物が同定されている．さらに，これらの菌には用いた逆相 HPLC 分析に供した．形質転換体が産生した

様々な遺伝学的分子ツールが適用可能である( Son &オルセリン酸とレカノール酸の同定は，HPLC 分析におPark, 2021 ）．PDA を用いて先述の 4 株のうちそれぞれ

ける保持時間を標品と比較することによっておこなった．

1 組を共培養した．培養 3 日目の寒天プレートを回収し，単独培養と共培養の二次代謝プロファイルを比較した．

Diorcinolic acid と C10-deoxy gerfelin の単離

その結果，A. fumigatus と A. nidulans の共培養サンプル

orsA 遺 伝 子 を 導 入 し た A. oryzae( A. oryzae-orsA ），お よ び，orsA と orsF を 導 入 し た A. oryzae( A. oryzae-

で，いずれの株の単独培養でもほとんど検出されない化

orsAF ）を，2％マルトースと適切な栄養素を含む MMでそれぞれ合計 1 L ずつ培養した．菌糸をアセトンで抽と A. nidulans の相互作用が二次代謝産物の産生を促したことを示唆する．これ以外の菌の組合わせでは，共培

出 し， 抽 出 物 を 上 述 の HPLC シ ス テ ム と COSMOSIL

養特異的な二次代謝産物の産生は見られなかった．

合物の産生を認めた( Fig. 1 ）．この結果は，A. fumigatus

5C18-AR-II カ ラ ム を 用 い て 分 画 し た 結 果，diorcinolicacid( 6.3 mg ）と C10-deoxy gerfelin( 18.1 mg ）を得た．

共培養によるジフェニルエーテル産生の促進

HPLC の条件は，0.5％酢酸を含む 24％アセトニトリルを次に，A. fumigatus -A. nidulans 相互作用が液体培養に20 分流すアイソクラティック溶出( C10-deoxy gerfelin ），おける二次代謝産物産生に与える影響を解析した．そのまたは 0.5％酢酸を含む 36％アセトニトリルを 27 分流

結果，単独培養ではほとんど検出されない 3 つの主要なすアイソクラティック溶出(C10-deoxy gerfelin ）とした．

産 物( Fig. 2A の 1，2，3 ） を 発 見 し た．HRESIMS とNMR 解析を基に，化合物 1，2，および 3 をそれぞれ，

核磁気共鳴と質量分析

ビオラセオール II ，I ，およびジオルシノール( Fig. 2B）

核 磁 気 共 鳴( NMR ） ス ペ ク ト ル は JNM-ECS-400と同定した．また，化合物 1-3 に加えて産生量が比較的

NMR Spectrometer( JEOL Ltd., Tokyo, Japan ），あるい少ない化合物コルジオール C( 4 ; Fig. 2B）を認めた．

は AVANCE-500 または -600 NMR Spectrometer( Bruker,

化合物 1- 4 は共通してジフェニルエーテル骨格を有してBillerica, MA, USA ）を用いて測定した． H と C の化

いる．ビオラセオールは Emericella violacea から報告さ学シフトは DMSO-d6 の溶媒ピーク(それぞれ δH 2.49 とれた化合物であり，マウスに対する毒性と抗微生物活性δC 39.5 ）を基準とした．高分解能エレクトロスプレーイ
オン化質量分析( HRESIMS）分析は UPLC-SYNAPTが報告されている( Yamazaki & Maebayashi, 1982 ）．ジ

1

13

オルシノールは Emericella falconensis から単離された，－ 114 －

糸状菌間相互作用による抗生物質ジフェニルエーテル類の産生誘導

Fig.1 Secondary metabolite profiles of monoculture, and co-culture in PDA.
Af and Anid indicate A. fumigatus and A. nidulans, respectively. The compounds marked by arrowheads wereobserved in the co-culture, but hardly detectable in monoculture. This figure is adapted from Ninomiya et al., 2022.

Fig. 2 Secondary metabolite profiles and the compounds produced.
(A) Secondary metabolite profiles of Af monoculture, Af/Anid co-culture, and Anid monoculture in potato-dextrose
broth. Compounds 1 and 3 were observed in the co-culture, but were hardly detectable in monoculture. Compound
2 was detected at lower amount in the mono-culture. Two independent cultures were performed. (B) Structures ofviolaceols II (1) and I (2), diorcinol (3), and cordyol C (4). This figure is adapted from Ninomiya et al., 2022.

－ 115 －

浦山

俊一，萩原

抗微生物活性を示すジフェニルエーテルである(Itabashi
et al., 1993）．コルジオール C は昆虫病原糸状菌 Cordyceps
sp. から発見された化合物で，抗マイコバクテリア活性

大祐

sidI は共培養で発現量が高かった．SidI は NRPS のアデ
ニル化ドメインに相同性を示し，メバロン酸をメバロニ
ル CoA に変換するアシル CoAリガーゼである．この反を示す(Bunyapaiboonsri et al., 2007 ）．我々の知る限り，

応はシデロフォアであるフザリニン C( FSC）の生合成

A. fumigatus -A. nidulans 相互作用はジフェニルエーテル産生を誘導する初の糸状菌間相互作用である．

経路の一部である( Yasmin et al., 2012 ）．トリアセチル

共培養による A. fumigatus のシデロフォア生合成遺伝子

係する sidI 以外の遺伝子( sidA ，sidD，sidF，sidG，おフザリニン C( TAFC）は FSC から生合成され，シデロフォアとして機能する．FSC と TAFC の生合成に関

活性化

よび sidH ）もまた共培養で発現量が高かった(Table 1 ）．

A. fumigatus -A. nidulans 共培養が A. fumigatus の二次代謝に与える影響を理解するため，単独培養と共培養のこの結果は，共培養によってシデロフォアである FSC

比較トランスクリプトーム解析を実施した．antiSMASHAFUA_3G13700 は単独培養で発現量が高く，これは共version 5.2.0( Blin et al., 2019 ）を用いて，A. fumigatus

培養によって発現が抑制されたことを示唆するが，当該

Af293 のゲノム配列に含まれる，二次代謝産物の骨格形

遺伝子の機能は未知である．

と TAFC の 生 合 成 が 促 進 さ れ た こ と を 示 唆 す る．

成を担う遺伝子(以下コア遺伝子と呼ぶ）を探索した．
その結果，7 つのポリケチド合成酵素( PKS），16 の非リ共培養が A. nidulans の二次代謝産物の生合成遺伝子のボソームペプチド合成酵素( NRPS），1 つの PKS-NRPS

発現に与える影響

ハイブリッド，8 のテルペン合成酵素( TS）を発見した．

A. fumigatus と同様にして，共培養が A. nidulans のコ
ア遺伝子の発現に与える影響を調べた．antiSMASH に

これら 32 のコア遺伝子の単独培養と共培養における発現量を RNA-シーケンシングによって決定した．そして，単独培養と共培養の TPM の比 > 5 または < 0.2 であり，なよる解析の結果，A. nidulans FGSC A4 のゲノム中に，

おかついずれかの TPM > 全遺伝子の TPM の平均( > 10 ）ド，および 9 の TS がコードされていることがわかった．

である遺伝子を探索した．その結果，2 つの NRPS 遺伝

これら 51 のコア遺伝子の，単独培養と共培養における子，AFUA_1G17190( sidI ）と AFUA_3G13700 が， 単 独

発現量を RNA-シーケンシング解析によって決定した．

培養と共培養で発現量が異なることが明らかになった．

A. fumigatus の場合と同様にして，発現量が単独培養と25 の PKS ，16 の NRPS ，1 つの PKS-NRPS ハイブリッ

Table 1 Expression levels of the biosynthetic genes induced by co-culture－ 116 －

糸状菌間相互作用による抗生物質ジフェニルエーテル類の産生誘導共培養で異なる遺伝子を探索した結果，2 つの PKS ，と考えられる F-9775A ，および F-9775B の生合成に必要

AN6448( cicF ）と AN7909( orsA ）が共培養で高く発な遺伝子として同定された( Schroeckh et al., 2009 ）．

現していた( Table 1 ）．

その後，ors クラスターが 1，2，および 3 を含むジフェ

cicF はシコリン生合成遺伝子クラスター( cic クラス
ター）に含まれ( Fig. 3A ），当該クラスターには他にトニルエーテルの生合成に関わることが，遺伝子破壊実験

ランスポーター( cicA ），転写活性化因子( cicD），およal., 2011 ）．近年，Feng et al.( 2019 ）は Saccharomyces

び修飾酵素( cicB，cicC，cicE，および cicH ）がコードされている( Sanchez et al., 2012b ）．これら 7 つの遺伝

cerevisiae を異種発現の宿主として用いて，orsA ，orsB，および orsF の機能を明らかにした．PKS である OrsA

子がシコリン生合成に必要である．cic クラスターは共のみによって 5，6，およびジフェニルエーテルである

培養で協調的に発現量が上がっており( Table 1 ），共培

diorcinolic acid（7 ; Fig. 3C）が 生 合 成 さ れ る．OrsF とにより示唆されている( Sanchez et al., 2010 ; Nielsen et

養によってシコリン生合成が誘導されたことを示唆する．

OrsB が 順 次 脱 炭 酸 反 応 を 触 媒 し，7 か ら 3 が 生 じ る

orsA はオルセリン酸生合成遺伝子クラスター( ors ク
ラスター）に含まれ( Fig. 3B），当該クラスターは他に( Fig. 3C）．我々は，orsA が A. fumigatus -A. nidulans 共

5 つの遺伝子 orsB，orsC，orsD，orsE ，および orsF を含3 の産生に関与していると予想した．

培養系においても，ジフェニルエーテル 1，2，およびみ，いずれも共培養により発現が誘導された( Table 1 ）．
orsA は オ ル セ リ ン 酸（5）の 生 合 成 遺 伝 子 で あ り，A.

PKS 遺伝子 orsA が共培養におけるジフェニルエーテル

nidulans と S. rapamycinicus との共培養によって産生が誘導されるオルセリン酸，オルセリン酸の二量体である産生に必要である

レカノール酸（6），構造的にオルセリン酸から派生する

テ ル 産 生 に 関 与 す る と い う 仮 説 を 検 証 す る た め に，

我々の共培養系で ors クラスターがジフェニルエー

Fig. 3 Schematic biosynthetic gene cluster and proposed pathway of diorcinol biosynthesis.
Biosynthetic gene cluster for (A) cichorine and (B) orsellinic acid. The black genes show polyketide
synthase (PKS) genes. See Table 3 for the function of each gene in the clusters. (C) Biosynthesis
pathway of diorcinol proposed by Feng et al. (2019). This figure is adapted from Ninomiya et al., 2022.

－ 117 －

浦山

俊一，萩原

大祐

CRISPR/Cas9 シ ス テ ム を 用 い て A. nidulans の PKS 遺

ケチドを産生する分子機構に着目した．ors クラスター

伝 子 orsA を 破 壊 し た． 独 立 し て 3 つ の orsA 変 異 株によるポリケチド生合成機構を明らかにするため，当該( ΔorsA-1，-2，および -3 ）を得た．寒天培地での生育のクラスターに含まれる遺伝子を A. oryzae に導入し，そ様子は野生株と変異株に差は見られなかった．野生株との機能を解析した．

変異株をそれぞれ A. fumigatus と液体培地中で共培養し，まず，PKS 遺伝子 orsA を，四重栄養要求性の A. oryzae

二次代謝プロファイルを HPLC で分析した( Fig. 4 ）．

NSAR1( Jin et al., 2004b ）に導入した．orsA 遺伝子をその結果，ジフェニルエーテル 1，2，3，および 4 の産導入した A. oryzae( A. oryzae-orsA ）は細菌誘導ポリケ

生は A. nidulans ΔorsA と A. fumigatus の共培養ではまっチドである 5 と 6，そしてそれに加えてジフェニルエー

たく確認できなかったため，我々の共培養系において，

テルである diorcinolic acid（ 7 ; Fig. 5 ）を産生した．続いorsA がジフェニルエーテル産生に必要であることが明らかになった．

て，脱炭酸酵素をコードする orsF を A. oryzae-orsA に
導 入 し，A. oryzae-orsAF を 得 た．A. oryzae-orsAF は
C10 -deoxy gerfelin（ 8 ; Fig. 5 ）を産生した．そして，もチロシナーゼ OrsC がビオラセオール産生に必要である

う 一 方 の 脱 炭 酸 酵 素 を コ ー ド す る 遺 伝 子 orsB を A.

細菌-糸状菌相互作用( Scroeckh et al., 2009 ）と糸状

oryzae-orsAF に 導 入 し，A. oryzae-orsABF を 得 た．A.

菌間相互作用(本研究）がいずれも ors クラスターを活性化する．細菌-糸状菌共培養の主産物はオルセリン酸

oryzae-orsABF はジオルシノールを産生した（ 3 ; Fig. 5 ）．
以上の結果は，( I ）OrsA がオルセリン酸（5），レカノー（5）とレカノール酸（6）(細菌誘導ポリケチド）であるが，ル酸（6），およびジフェニルエーテルである diorcinolic

一方，糸状菌同士の共培養の主産物はジフェニルエーテ

acid（7）の 生 合 成 を 担 う こ と， お よ び，( II ）OrsB とルであるビオラセオール II（1），I（2），およびジオルシ

OrsF が位置選択的な脱炭酸酵素であることを示唆する．

ノール(糸状菌誘導ポリケチド）である．我々は，A.

化学構造の比較から，ビオラセオール（1 と 2 ）の生

nidulans が細菌と糸状菌に応答して，異なる種類のポリ合成はジオルシノール（3）の生合成と関連があると予想

Fig. 4 Secondary metabolite profiles of orsA mutant strains.
The production of diphenyl ethers was abolished in co-culture of the mutant strains and A. fumigatus.
This figure is adapted from Ninomiya et al., 2022.

－ 118 －

糸状菌間相互作用による抗生物質ジフェニルエーテル類の産生誘導されたが，ビオラセオール生合成機構は不明だった．我々

ビオラセオール，ジオルシノール，およびコルジオール

は，1 と 2 の生合成の過程で，何らかの酵素が 2 つのヒ

C の抗菌活性ドロキシ基を導入すると考えた．ors クラスターに含ま抗菌試験の結果，我々の糸状菌同士の共培養の産物れる遺伝子のうち，orsC，orsD，および orsE の機能が

( 1，2，3，および 4 ）は Bacillus subtilis PCI 219 に対し未知であった．このうち OrsC がチロシナーゼドメインて抗菌活性を示した．化合物 1，2，3，4，およびクロを含んでいたことから，OrsC がヒドロキシ基導入を担

ラムフェニコールの MIC 値( μg/mL ）は，それぞれうと予想した．OrsC の機能を明らかにするため，orsB

50，13，100，100，6.3 μg/mL だった．ビオラセオールと orsC を Ao-orsAF に導入し，orsA ，orsB，orsC，および( 1 と 2 ）の B. subtilis に対する抗菌活性はジオルシノー

orsF を発現する A. oryzae を得た( A. oryzae-orsABCF ）．

ルとコルジオール Cよりも高かった．また，ビオラセオー

A. oryzae-orsABCF が 3 に加えて 1，2，および 4 を産生したことから，OrsC がビオラセオール生合成においてル I ，II ，およびクロラムフェニコールの Escherichia

ヒドロキシ基導入を担うことが示された．

coli ATCC25922 に対する MIC 値( μg/mL ）は，それぞれ > 200，> 200，6.3 μg/mL だった．

Fig. 5 Secondary metabolite profiles of A. oryzae expressing some genes in A. nidulans
ors gene cluster.
The strains were cultured in maltose minimal medium supplemented with appropriate nutrientsfor 5 days at 30 ℃ before extraction. orsAF indicates A. oryzae expressing orsA and orsF.
Accordingly, orsABF and orsABCF indicate the host expressing the corresponding genes. Two
independent cultures were performed. This figure is adapted from Ninomiya et al., 2022.

－ 119 －

浦山

俊一，萩原

ビオラセオール生合成遺伝子を有する真菌

大祐

考BLAST 検索と antiSMASH による解析を組合わせ，ビ察

オラセオール生合成に必要な遺伝子( orsA ，orsB，orsC，

本研究で我々は，A. fumigatus と A. nidulans からなるおよび orsF ）を有する真菌を探索した( Fig. 6 ）．その結糸状菌-糸状菌共培養のモデル系を確立した．当該系を

果，ors クラスターに含まれる 6 つの遺伝子のオルソログ

用 い て，A. fumigatus -A. nidulans 共 培 養 が A. nidulans

が，Aspergillus section Versicolores に属する 3 種の糸状菌のオルセリン酸生合成遺伝子クラスター( ors クラス( Aspergillus versicolor，Aspergillus puulaauensis，および

ター）の転写を活性化し，抗菌性ジフェニルエーテルのAspergillus sydowii ）のゲノム中に見つかった．実際に，ビオラセオール類は海洋由来の A. versicolor( Fremlin et

産生を誘導することを明らかにした．本研究は，複雑なal., 2009 ; Salendra et al., 2019 ; Yang et al., 2020 ），および答の理解に寄与する．

A. sydowii( Liu et al., 2017 ; Hamed et al., 2019 ）から報告されている．また，ビオラセオール生合成遺伝子のオル

糸状菌同士のコミュニケーションに対する二次代謝の応RNA シーケンシング解析の結果，共培養において A.

ソログは，クロイボタケ綱( Dothideomycetes ）に属する

nidulans と A. fumigatus はいずれも二次代謝産物の生合成遺伝子を活性化することが明らかになった．A. fumigatus

4 つ の 子 嚢 菌( Melanomma pulvis-pyrius，Lentitheciumのシデロフォア FSC と TAFC の生合成に関わる 6 つのfluviatile，Pseudogymnoascus sp.， お よ び Clohesyomyces

遺伝子の発現量が共培養によって上昇していた．これら

aquaticus ）のゲノム中に見出された．これは，ビオラ
セオール生合成遺伝子が子嚢菌に広く分布していることのシデロフォアは鉄が乏しい条件下で分泌され，細胞外を示唆する．

MirB を 介 し て 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ る( Raymond-の鉄に結合する．TAFC - 鉄複合体はトランスポーター

Fig. 6 ors cluster in other fungi.
Solid arrows indicate genes that are orthologous to orsA, orsB, orsC, orsD, orsE, and orsF. The
numbers below genes indicate percentage identity of the corresponding protein to the ortholog
in A. nidulans FGSC A4. This figure is adapted from Ninomiya et al., 2022.

－ 120 －

糸状菌間相互作用による抗生物質ジフェニルエーテル類の産生誘導

Bouchard et al., 2012 ）．サイトゾルにおいてエステラー

カノール酸( Schroeckh et al., 2009 ）が生合成されるこゼ( EstB）が TAFC を加水分解し，遊離した鉄は代謝とを示した．また，我々は A. fumigatus-A. nidulans 共培に使われるか，あるいは細胞内に貯蔵される( Kragl et

養の主な産物であるビオラセオールの生合成には，修飾al., 2007 ）．この鉄取込みシステムが鉄欠乏条件での糸状菌の生存を助ける．興味深いことに，MirB と EstB はい酵素である OrsB，OrsC，および OrsF が必要であるこ

ずれも A. fumigatus の単独培養と比べて共培養で高く発と共培養した時と A. fumigatus と共培養した時で，A.

現しており( Table 1 ），これは共培養が鉄の取込みを促

nidulans の酵素活性が異なる調節を受けることを示唆している．

進することを示唆する．Moree et al.( 2012 ）は FSC ととを明らかにした．これらの結果は，S. rapamycinicus

TAFC の生合成が A. fumigatus と Pseudomonas aeruginosa

本 研 究 で は，2 つ の モ デ ル 糸 状 菌 A. fumigatus との共培養においてフェナジンによって誘導されることを報告している．この知見と今回得られた結果を併せて考A. nidulans からなる糸状菌同士のモデル共培養系を確立し，当該共培養がジフェニルエーテル産生を誘導する

えると，A. fumigatus は他の微生物との共培養において，こ と を 明 ら か に し た． さ ら に，A. nidulans が 放 線 菌

鉄をめぐる競争の中で生き残るためにシデロフォアを産

S. rapamycinicus と A. fumigatus に応答して，異なる種類のポリケチドを産生する機構の一端を明らかにした．

生することが示された．
ビオラセオール( Yamazaki & Maebayashi, 1982 ），ジ
オルシノール( Itabashi et al., 1993 ; Zhao et al., 2014 ），これは，糸状菌の微生物に対する二次代謝応答の理解を深める手掛かりとなるものである．

コ ル ジ オ ー ル( Bunyapaiboonsri et al., 2007 ）， お よ び

要pestheic acid( Shimada et al., 2001 ）等，糸状菌からは多様なジフェニルエーテルが報告されている．糸状約菌が産生するジフェニルエーテルは植物の成長促進活

糸状菌は二次代謝産物の生合成遺伝子を多数ゲノム中性( pestheic acid ; Shimada et al., 2001 ），抗単純ヘルに有するが，実験室の環境下で発現するものは少数に過ペ ス ウイルス 1 型活性と細胞毒性(コルジオール C ;ぎない．糸状菌の潜在的な物質産生能を活性化する最も

Bunyapaiboonsri et al., 2007 ），アクチン阻害活性(ビオ

簡便な方法のひとつが共培養である．共培養によって新

ラセオール I と II ; Asami et al., 2012 ），アミロイド β42 凝規化合物を得たとの報告は多数挙がっているが，先行研集抑制活性(ビオラセオール I と II ; Zhao et al., 2014 ），究の多くは新規物質の獲得を目的としており，物質産生および抗卵菌活性(ジオルシノール，ビオラセオール I

促進の分子メカニズムについては理解が進んでいない．

および II ; Takahashi et al., 2018 ）等，幅広い生物活性を

我々はそのような分子メカニズムについて理解を深める示す．従って真菌ジフェニルエーテルは創薬シード化合ため，モデル糸状菌 A. fumigatus と A. nidulans からなる物として有用であると言える．本研究で我々は，特に幅モデル共培養系を確立した．当該共培養は，A. nidulans

広い生物活性を示すジフェニルエーテルであるビオラセのオルセリン酸生合成遺伝子クラスター( ors クラス

オール I と II の生合成遺伝子を明らかにした．また，異ター）を活性化することによって，抗菌性ジフェニルエー

種発現により，チロシナーゼ OrsC が芳香環にヒドロキテルの産生を誘導することを明らかにした．興味深いこ

シ基を導入することが示された．ヒドロキシ化はジフェとに，放線菌 S. rapamycinicus も A. nidulans の ors クラ

ニルエーテルの構造と生物活性を多様化させる．従って，スターを活性化するが，主な産物はオルセリン酸とレカ

本研究は多様な構造を生み出す糸状菌のジフェニルエー

ノール酸であることが報告されている．すなわち，糸状テル生合成の理解を深めるものである．我々はまた，4菌-糸状菌共培養と放線菌-糸状菌共培養とで，ors クラ

つのヒドロキシ基を有するジフェニルエーテル(ビオラ

スターの生合成産物が異なる．我々は，A. oryzae 異種

セオール I と II ）が，2 つまたは 3 つのヒドロキシ基を発現系を用いて，2 つの共培養が異なる産物を生じるメ

有するジフェニルエーテル(それぞれジオルシノールとカニズムを検討した．その結果，放線菌-糸状菌共培養

コルジオール C）よりも，B. subtilis に対して高い抗菌の主産物はポリケチド合成酵素のみによって生合成され活性を示すことを明らかにした．これは，OrsC が糸状

るが，糸状菌-糸状菌共培養の主産物の生合成にはそれ菌のジフェニルエーテルの抗菌活性を高めることを示唆に加えて最大 3 つの酵素が必要であることを示した．本する．

研究は，糸状菌の微生物に対する複雑な二次代謝応答を

S. cerevisiae を 用 い た 異 種 発 現( Feng et al., 2019 ）と A. oryzae を用いた異種発現(本研究）は，ポリケ

理解する手掛かりとなるものである．

チ ド 合 成 酵 素 OrsA の み に よ っ て，S. rapamycinicus A. nidulans 共培養の主な産物であるオルセリン酸とレ－ 121 －

浦山

俊一，萩原

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 二宮章洋，浦山俊一，萩原大祐．2018．二次代謝を活性化する糸状菌間相互作用の探索．第18回糸状菌分子生物学コンファレンス(11月15–16日，新潟）
2) 二宮章洋，浦山俊一，萩原大祐．2019．糸状菌間相互作用による二次代謝活性化の機構解明を目指したモデル共培養系の確立．日本農芸化学会2019年度大会(3月24–27日，東京）3) 萩原大祐．2019．糸状菌の未利用遺伝子資源にアクセスする複雑系培養の研究．第65回日本放線菌学会学術講演会．(5月24日，山梨）4) 萩原大祐．2019．生物間相互作用研究から糸状菌の真の生態に迫る．微生物ウィーク2019.(7月25日，東京）
5) 萩原大祐．2019．Exploring fungal potential to produce
novel compounds toward drug discovery．第63回日本医真菌学会学術集会．(10月11–12日，千葉）
6) 二宮章洋，浦山俊一，萩原大祐．2020．糸状菌Aspergillus
nidulansとAspergillus fumigatusの共培養が抗生物質産生を促進する機構の解析．日本農芸化学会関東支部2020年度
支部大会(11月28日，オンライン）
7) 萩原大祐．2021．生態システム理解を目指した糸状菌相互作用研究．第20回糸状菌分子生物学コンファレンス，(11月11-12日，オンライン）
原著論文
1) Ninomiya, A., Urayama, S. & Hagiwara, D. 2022. Antibacterial
diphenyl ether production induced by co-culture of Aspergillus
nidulans and Aspergillus fumigatus. Appl. Microbiol. Biotechnol.
106: 4169-4185.
その他(総説・書籍・特許など）
1) 萩原大祐．2018. 糸状菌ゲノムから紐解く二次代謝の多様性．JSM Mycotoxins, 68: 89-92.
2) 萩原大祐．2020．微生物，非純粋培養のすすめ. 生物工学
会誌，98: 192.

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた筑波大学糸状菌相互応答講座の学生・構成員諸氏に感謝の意を表します．
筑波大学研究基盤支援プログラム( A タイプ）の支援にも感謝いたします．

文

献Arora, D., Gupta, P., Jaglan, S., Roullier, C., Grovel, O. & Bertrand, S.
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大祐

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浦山

俊一，萩原

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大祐

略語一覧
DMSO
FSC
HPLC
HRESIMS
MM
NMR
NRPS
PDA
PKS
SS
TAFC
TPM
TS

－ 124 －

ジメチルスルホキシド
フザリニンC
高速液体クロマトグラフィー
高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析
最小培地
核磁気共鳴
非リボソームペプチド合成酵素
ポテトデキストロース寒天
ポリケチド合成酵素
醤油白砂糖培地
トリアセチルフザリニンCTranscripts per million
テルペン合成酵素2021 年度一般研究助成の研究報告
助成期間:2021 年 4 月～ 2023 年 3 月

IFO Res.Commun. 37
2023

Gallionellaceae 科微好気性鉄酸化細菌の分離と特性の解明
渡【目的】鉄の酸化反応は地球化学的物質循環において重

邉

健

史

要な反応の一つであり，多様な微生物が反応に関与する．

emersonii MIZ01T に 最 も 近 縁 で あり， そ の 相 同 性 は95.8％，96.7％であった．また，BFL2-1 株と BRTS 株のストークと呼ばれる捻れた紐状の鉄酸化物を形成する間の相同性も 96.4％であり，分離した 4 株は 3 種の新種とGallionella ferruginea は，中性淡水環境に生息する典型
的な微好気性鉄酸化細菌の一種である．しかし，これまして分類される可能性が示された．分離菌株は全て 2 価鉄

でに正式に記載された種は少ない．筆者は，以前に愛知

BRTS 株はイオウ酸化能も有することが示された．細胞形をエネルギー源として生育する無機栄養細菌であり，唯一，

県内の水田土壌より Ferrigenium kumadai An22 を分離

態は BRTS 株を除 いて曲がった桿 状 細 胞であったが，した．本研究では，Gallionellaceae 科鉄酸化細菌の多様

BRTS 株は他に比べて全長がやや長く，捻れた形態を示し性とその特性を明らかにするために，水田環境より新たた．全て運動性を有し，鞭毛も観察された．現在までにに菌株を分離・同定することを目指した．また，鉄酸化NRt1 株と NRt3 株の生育特性を解析した結果，NRt1 株は細菌ゲノム解析のための基盤的データを得ることを目的

12～37 ℃，pH 5.4～7.4，NaCl 25 mM 以下，NRt3 株は 12

Tとして，F. kumadai An22 のゲノム配列を解読した．

～37 ℃，pH 5.4～ 6.8，NaCl 75 mM 以下の範囲で生育し，【方法】多様な鉄酸化細菌を得るために，複数の試料（名古系統的に近い両菌株の特性はやや異なることが示された．

屋大学内の水田圃場より得た水稲根と，別の調査目的で訪NRt1 株と NRt3 株は，樹枝状のストークをところどれた西アフリカ，ブルキナファソのイネ鉄過剰障害発生水ころ形成した（図 2 ）．蛍光標識レクチンによる観察の結田より採取した水稲根と田面水）を分離源として用いた．試果，NRt1 株のストークには α-マンノースとガラクトー

験管の底に硫化鉄を沈めた低濃度アガロース無機塩培地

スが含まれると推定された．これまでに α-マンノースをに接種し，鉄酸化細菌と増殖とともに形成した鉄酸化物の混含むストークは観察されているが，ガラクトースは検出

合物を限界希釈法で純化した．大学内の水稲根よりNRt1 株

されていないため，NRt1 株は，既知のストークとは異なとNRt3 株，ブルキナファソ水田の田面水よりBFL2-1 株，水る糖組成のストークを形成している可能性が考えられた．

T

稲根よりBRTS 株を得た．16S rRNA 遺伝子を解読するとともに，細胞形態や運動性等の特性を調べた．この内，NRt1
株については，形成したストークを SEM および蛍光標識
レクチンで観察した．また，
An22 T 株のゲノム解析を行った．
【結果・考察】NRt1 株，NRt3 株は F. kumadai An22T に最も近縁で，16S rRNA 遺伝子の相同性は共に 96.4％であった（ 図 1 ）．BFL2-1 株 と BRTS 株 は Sideroxyarcus
図2

NRt1 株が形成した樹枝状ストーク

F. kumadai An22T の ゲ ノ ム 解 析 の 結 果，An22T は2.57 Mb のゲノムを有し，鉄酸化に関わる酵素として
Cyc2 をコードする遺伝子を有することが示された．一方，ほかの分離菌株についても DNA 抽出を繰り返し試
みたが，十分な量のゲノム DNA は得られなかった．今後，
DNA の精製方法をさらに検討する必要がある．
以上，本研究により新たに新種の可能性を含む 4 菌株の Gallionellaceae 科微好気性鉄酸化細菌が分離され，その特徴の一部が明らかにされた．今後，さらに解析を進
図1

所属

Gallionellaceae 科鉄酸化細菌 16S rRNA 遺伝子の系統
樹．太字は分離菌株を，‘ ’は未承認の属種名を示す．
名古屋大学大学院生命農学研究科

めることで，環境中の Gallionellaceae 科微好気性鉄酸化
細菌の多様性，生態，機能の解明に繋がると期待される．

E-mail: watanabe@agr.nagoya-u.ac.jp－ 125 －

IFO Res.Commun. 37
2023

深海底に沈む木材等をニッチとした深海生菌類の多様性解明
長

野

由梨子

【目的】深海底には，陸上より流出し沈んだ多種多様な

水深約 5700 m の房総半島沖深海平原より回収した植物片が点在している．陸上において植物の主要な分解

1 試料（スモモ）においては菌類の子実体が確認され，者は真菌類であるが，深海環境においても沈木に子実体

深海生菌類の一つ Oceanitis scuticella であることが明らを形成する深海生菌類が存在している．しかしながら，かとなった．（図 2 ）偏性深海生菌類は世界でもわずか 6 種が報告されているのみで，その多様性や分布，生態についてはほとんど研究が進んでいない．そこで，深海底に沈む木材等をニッチとした深海生菌類の多様性や分布を網羅的に明らかにするために，深海底より植物片を回収し，ITS rRNA 遺伝子を対象とした真菌アンプリコン解析を行なった．
【方法】相模湾や東京湾三崎沖，房総半島沖の深海平原など，水深約 750 m ～ 5700 m の深海底から有人潜水船

図2「しんかい 6500 」を用いて植物片 19 試料，海藻 1 試料

Oceanitis scuticella の子実体が観察された沈木を回収した．また浅海から植物片 1 試料を回収した．一

他試料では子実体の確認はできなかったものの，アンプ部の試料については枝，葉，果球部分などに分け，計

リコン解析の結果，異なる水深や海域から回収した 8 試

24 試料より DNA を抽出し，真菌類に特異的なプライ料中（スギ，ヒノキ，アマモ，イチイガシ，スモモ，3

マー ITS1-F_KYO1/ITS2_KYO2 を用いて真菌多様性解

種未同定）で O. scuticella と 100％もしくは高い相同性析を行った．植物や海藻試料については葉緑体遺伝子を示す配列が検出された．このことから O. scuticella は

rbcL を対象に PCR を行い，簡易同定を行った．
【結果・考察】アンプリコン解析の結果，23 試料から合広範囲に渡る水深約 700 ～ 6000 m の深海環境中の様々な計 543 の真菌 Amplicon Sequence Variants（ ASVs ）が検た．また水深 5 m の浅海（ JAMSTEC 岸壁，東京湾）より出された．アマモ 1 試料からは真菌類と同定される配列

回収したイチョウからは海生菌類である Ceriosporopsisは検出されなかった．最も多くの ASVs が検出されたのはイチイガシの葉（147ASVs），次いでスギの葉（131ASVs），

halima と高い相同性を示す配列が優占して検出されたが，深海由来 5 試料（コナラ，クスノキ，3 種未同定）

コナラの葉（ 58ASVs ）であり，枝や幹よりも葉で多様からは，C. halima と近縁だが別種と推定される配列（相な菌類が存在していることが示唆された．カシヤマツに

同性約 86％）が優占種として検出された．このことか

樹種の植物基質に高頻度で存在することが明らかとなっ

おいて枝，葉，果球部分に分けて解析した結果は，枝部ら C. halima と近縁な深海種が存在することが示唆され分が最も菌類の多様性が高いという結果であった．検出た．この配列は相模湾から回収した試料からのみ検出さされた ASVs は，綱レベルでは Dothideomycetes が最もれた．また先行研究で南西諸島沖より発見されていた深多く，次いで Sordariomycetes，Eurotiomycetes が多かっ海生菌類 Alisea longicolla は，本研究で解析した試料かた．存在量（配列リード数）としては，Sordariomycetes

らは検出されなかった．
本研究により，深海底に沈む植物基質中に深海生菌類は（ 76 ％） が 圧 倒 的 に 多 く， そ の う ち か な り の 割 合 をHalosphaeriaceae 科が占めていた（図 1 ）．

予想以上に高頻度で存在していること，Halosphaeriaceae
科が優占していること，これまでに発見されていない種も存在していること，樹種特異性はあまりみられないこと，海域により分布の違いがありそうなことなどが明らかとなった．深海環境中における植物由来有機物の分解には，Oceanitis 属や Ceriosporopsis 属をはじめとした深海生菌類が大きく貢献していることも予想され，今後はメタゲノム解析やゲノム解析による分解プロセスの解明

図1
所属検出された ASVs の内訳（A），リード数（B）

海洋研究開発機構地球環境部門

も含めさらに研究を進めていきたい．

E-mail: y.nagano@jamstec.go.jp－ 126 －

IFO Res.Commun. 372023

土壌に特異的に優占する難培養細菌門アシドバクテリアのバイオリソース拡充
伊

藤

英

臣

【目的】環境中の核酸ベースの解析から，アシドバクテ

たところ，これまでにアシドバクテリアではほとんど前リア門細菌は海水や河川水といった水圏ではほとんど検例のなかった，土壌環境の恒常性や物質循環に関わる重出されない一方，土壌圏では普遍的かつ高頻度に検出さ要な機能遺伝子が複数株のゲノム上で発見された．現在，れる，いわば「土壌ならではの細菌群」であることが知このアシドバクテリアの新規な生態機能について検証実られている．それにも関わらず，他門と比べてアシドバ

験・分析を進めている．

クテリア門細菌の単離培養例は極めて少なく，基準株も門全体で 27 属 60 種しかない（ 2021 年 4 月時点）．これまでに申請者は土壌そのものを培地として用いた集積培養により新系統の嫌気性微生物を発見してきたが，その中でアシドバクテリア門細菌も多数単離できた．そこで
本研究では，考案した培養法を用いて様々な土壌からア
シドバクテリアを集中的に単離培養することを試みた．
【方法】風乾した土壌と蒸留水をバイアル瓶に入れてオートクレーブしたものを集積培地として用いた．そこに微生物接種源として生土試料を添加し，気相を無酸素ガス（ N2:CO2 = 4:1, v/v ）で置換して 30℃で静置培養した．2 週間ごとに培養した土壌スラリーを新しい集積培
地に植継いだ．継代培養したスラリーをフマル酸を添加した R2A 寒天培地に塗布して，30℃で嫌気培養した．
生えてきたコロニーの 16S rRNA 遺伝子を解読するとともに，一部の株に関してはコンプリートまたはドラフト
ゲノムを解読した．代表株を単離した集積培地の土壌と接種源の土壌の組合せは図 1 に記載した．
【結果・考察】農耕地土壌，河川の底泥，森林土壌等から基準株との 16S rRNA 遺伝子配列の相同性が 92.6 ～
99.2％を示すアシドバクテリア門細菌 466 株が得られた．
配列の相同性が 98.65％以上の条件でクラスタリングしたところ，466 株から 21 の系統群が構成されたが，基準株と同系統と推定されたものはわずか 1 つであり，残りの 20 は新規な系統群であることが判明した．各 20 系
統群の代表株の配列の相同性および系統樹から，本研究から少なくとも 1 新科 7 新属 20 新種のアシドバクテリ
ア 門 細 菌 を 単 離 培 養 で き た こ と が わ か っ た（ 図 1 ）．
2023 年 3 月時点のアシドバクテリアの基準株は 63 種であり，直近 2 年間でわずか 3 種しか増えていないことを踏まえると，本研究によりアシドバクテリアのバイオリ
ソースをかつてないスピードで拡充できたと考えられる．また，本研究では R2A 寒天培地をベースとした分離培地しか試していなかったことから，分離培地の検討次第だけでもさらに多くの新系統を見出せる可能性が高い．さらに興味深いことに，代表株のゲノム解析を行っ
所属

産業技術総合研究所生物プロセス研究部門

図1

16S rRNA 遺伝子配列に基づくアシドバクテリア門細菌の系統樹．2023 年 3 月時点では基準株は 63 種であったが，本研究から 20 の新系統（灰色網掛け．
少なくとも 1 新科 7 新属 20 新種）が単離できた．引
用符は現在投稿中の論文で提唱中の系統名．括弧内は各新系統の代表株を単離した土壌を示す（集積培
地の土壌／接種源（単離源）の土壌）．

E-mail: hideomi-itou@aist.go.jp－ 127 －

IFO Res.Commun. 372023

各種胆汁酸分子の発芽誘導能を用いた難培養性腸内細菌の分離と日本人腸内細菌叢カクテルの創製
中【目的】近年，数百種類からなる腸内フローラの構造を遺伝子レベルで俯瞰的に解析する研究スタイルが定着しつつある一方，腸内フローラを細胞や分子レベルでボトムアップに解析する研究は，腸内細菌の分離と培養に高いハードルがあり一筋縄では進行しない．そのような背景のもと，
我々は，腸内細菌叢中にて高い占有率を占め，難培養性細菌が多い有胞子桿菌の Clostridia 綱細菌の胞子が，グリシン抱合型胆汁酸において高効率に発芽誘導されることを見出し，胆汁酸用いた難培養性 Clostridia の高効率培養法を確立した．そして，その方法を用いて得られた菌種を含めて，日本人の腸内細菌叢をモデル化した人工細菌叢を調製し，食や薬物，そしてプレ・プロバイオティクスの腸内細菌叢に与える影響と腸内細菌叢を介した機能性をインビトロで評価できる系の確立を目的として，以下の研究を展開した（図 1 ）．

図1

本研究のワークフロー【方法】
1）胆汁酸とアミノ酸を用いた難培養性腸内細菌の分離培養法の確立:新鮮便を終濃度 35％のエタノールで処理し，栄養細胞を死滅させ，抱合型胆汁酸 5 種混合物
(GDCA は終濃度 0.02％，それ以外は 0.1％)および終濃
度 30 mM の各種アミノ酸を添加し，インキュベートした後，
GAM 寒天培地で 72 時間嫌気培養し，寒天培地上に生育したコロニーの 16S rRNA 解析し，菌種解析を行った．
2）人工腸内細菌叢モデルの構築と評価:1)の分離株を含む日本人の主要腸内細菌 16 菌種を液体培地中で前培養したものを，各菌の存在比が均一になるよう，各種炭素源を含む AF 培地に接種し，37℃，嫌気条件下で回分培養を行った．炭素源として，スターチ，ペクチン，ア
ラビノキシラン，ムチンをそれぞれ加えた．培養後 48 時
間まで経時的に培養液を回収し，OD600 ，pH ，16S rRNA
アンプリコン配列，各種短鎖脂肪酸濃度を測定した．
【結果・考察】所属

九州大学大学院農学研究院

山

二

郎

1）胆汁酸とアミノ酸を用いた難培養性腸内細菌の分離培養法の確立:各種胆汁酸の発芽誘導能を検証した結果，
特にグリシン抱合型胆汁酸において，コントロールと比較して10 倍から1000 倍のコロニー数の増加が観察された．計 642
株を単離培養し，系統解析した結果，Lachnospiraceae 科に属する 9 種と Clostridiaceae 科に属する 2 種の新規候補種を含む計 98 種が得られた．また，ほぼすべての健常日
本人に優先的に存在し，有益代謝物である短鎖脂肪酸の高い発酵能を有する等有益菌として注目されているが，難培養性である Blautia 属細菌 2 種も分離培養に成功した．
次に，グリシンが胆汁酸と協調的に胞子発芽能を示すことが一部の細菌で知られているので，我々は他のアミノ酸と胆汁酸の協調作用も調べることにした．結果，アルギニンにて胆汁酸との有意な協調的発芽誘導能が見られた（ Onizuka et al., Microogranisms, 2021, 9, 1651 ）．
2）人工腸内細菌叢モデルの構築と評価:日本人の主要腸内細菌 16 菌種（上記にて培養分離された 2 種の Blautia
属を含む）で構成される人工腸内細菌叢カクテルの混合培養系にて，腸内環境に存在する代表的な多糖類をそれぞれ添加し，各細菌種の増殖挙動と培地の pH 変化，短鎖脂肪酸の生産量をモニタリングした．菌叢の主成分分析においては，4 つの糖源のもとに異なる菌叢パターンに変化することが示された（図 2）．特に，スターチにおいて全菌の増殖量が顕著に多く，中でも Bifidobacterium，
Faecalibacterium，Blautia の増殖が顕著で，酢酸と酪酸の生産が多く見られた．一方，アラビノキシランにおいては Bacteroides の増殖が顕著で，プロピオン酸が多く生産されていた．以上より，多糖特異的な代謝を反映する「人工腸内細菌叢モデル」が構築できたことが示唆され，今後，様々な食品成分の腸内複合菌叢における代謝の解析に有効的に利用できると期待される．

E-mail: nakayama@agr.kyushu-u.ac.jp－ 128 －

図2

人工腸内細菌叢モデルにおける各種多糖類存在下での菌叢変化の主成分分析と短鎖脂肪酸の生産傾向

IFO Res.Commun. 37
2023

地衣類チャシブゴケ属の新しい分類体系構築に向けた試み
橋本

陽【目的】子のう菌類と藻類の共生体である地衣類は極地から街中などの身近に存在する．地衣類の最大のグループの一つであるチャシブゴケ（ Lecanora ）属は抗がん作用のあるアトラノリンなどの地衣成分を生産することで注目されているが，分類学的な複雑性により研究が遅れていること，培養菌株の確立が難しく利用に結びつかない問題があった．チャシブゴケ属を微生物資源として有効利用するためにはその基盤整備が必要である．そこで本研究では，チャシブゴケ属の分類学的再整理の新た

図1

な指針と菌株確立による微生物リソースとしての利用可

Lecanora symmicta 様菌の子実体形成様式の比較

能性の向上を目的に設定した．

較した．結果として，いずれの領域においても 2OTUs が【方法】本研究では主に培養と標本観察を試みた．

認められ，OTU 間では胞子サイズに大きな違いが見られ培養実験:この手法では，チャシブゴケ属の純粋培養

た．即ち，L. yasudae には少なくとも国内に 2 系統が分布株を試みた．素寒天培地上で発芽させた子のう胞子の純することが示唆され，形態的に区別できる本 2 系統はこの粋性を顕微鏡下で確認し，発芽から 2 週間後に酵母エキ

同一ハビタットに混在することが明らかとなった．2OTUs にス麦芽培地（ Yeast Extract Agar ）でこれを移植し，培ついて子実体形成様式に注目した場合に明瞭な違いは見ら養を試みた．なお，一部の菌種は寒天培地上で原因不明

れなかったが，これは 2 種間における共通派生形質と捉えの細胞破裂が起こるため，菌糸体での分離を試した．培ることができると考えられた．今後，広義 Lecanora 属の解

養 3 ～ 6 ヶ月後に目視で確認できたコロニーの一部から体の際の属の特徴付けに有用である可能性が考えられた．

DNA 配列決定と凍結保存を行い，標本との DNA 配列

以上の研究で分離された菌株は理化学研究所バイオリの一致（ 99％以内の相同性で判断）と凍結保存可能性

ソース研究センター（ Riken BRC-JCM ）に寄託されたを確かめた時点で分離株を確立したと判断した．

（表 1 ）．以上の研究から，子実体形成様式が分類学上一分子系統解析:採集直後の子実体から DNA を抽出し，定の情報をもたらすこと，これまでわずかであった地衣ミトコンドリア SSU（ mtSSU ）および ITS 領域の配列類を構成する地衣化菌の分離培養株の確立に成功した．

を決定し，前述した培養物との配列同一性を確認した．

菌株については今後，培養株に基づく二次代謝産物の研発生学的比較:成熟に至るまでの発生過程の比較によ

究や培養下での地衣体誘導など，さらなる研究の発展に寄与できることが期待される．

り器官のでき方の解明を試みた．
【結果・考察】本研究では 2 つの研究成果が得られた．

なお，本研究の菌糸分離の中で複数の地衣生菌が副次

Lecanora symmicta の事例:国内から採集された 46
サンプの L. symmicta 様菌を ITS/mtSSU 領域に基づき的に分離された．当初はコンタミネーションとして実験

genotyping を行い，大きく複数のサブクレードを含む

および属レベルで未知系統であることが判明した．未知2 系 統（ 広 義 L. symmicta お よ び 広 義 L. strobilinoides ）系統の菌種ゆえ，新規生理活性物質の探索源の点からもを 認 識 し た． な お， 前 者 に は 国 内 に 新 た に Lecanora

興味深い材料として期待される．

遂行上の問題点と考えられていたが，いずれの菌株も科

parasymmicta の分布が確認され，後者は L. pulverulentaが属することが判明した．この 2 系統の子実体構造の比表1寄託菌株と菌種名

較から，いずれの関連種も菌糸組織が子実下層から求頂

菌株番号

学名

的に扇形で発達する共通性を認識した（図 1 ）．

JCM:39433

Lecanora pulverulenta

Lecanora sibirica の 事 例:Lecanora sibirica(syn. L.

JCM:39434

Lecanora pseudargentata

yasudae)様菌 25 標本から標本抽出した DNA および確立
した 2 菌株の DNA 抽出物を GenBank に登録された近縁

JCM:39435

Lecanora pseudargentata

JCM:39436

Lecanora sibirica

JCM:39437

Lecanora sibirica

種について ITS-LSU 領域および mtSSSU 領域の配列を比所属

理化学研究所バイオリソース研究センター

E-mail: akira.hashimoto@riken.jp / cool.meron.223@gmail.com－ 129 －

IFO Res.Commun. 372023

土壌微生物が産生する揮発性有機化合物（ VOCs）の網羅的解析による土壌の微生物性評価法の開発
池【目的】土壌に生息する微生物間には様々な相互作用が永誠【結果・考察】LVSH 法では，複合的に分析条件を検討し存在しており，環境条件によって常に影響を受けている．

たものの，VOCs ピークはブランクの夾雑ピークと類似して

これら微生物間の相互作用を理解し，状況を的確に判断おり，十分に微生物 VOCs を検出できていなかった．比

できれば，土壌の微生物性評価に繋がることが期待され

較的検出感度が優れていた条件は，土壌 30 g，100 mL×

る．近年，微生物が産生する揮発性有機化合物（ Volatile

5 回 吸 引， カラムへ の 吸 着 温 度 は 20 ℃， 脱 着 温 度 はOrganic Compounds ; VOCs ）の多くは，微生物－微生

180℃であった．この条件で分析した結果，土壌の種類や物間（さらに微生物－植物間にも）に様々な作用を及ぼ有機物資材添加の有無で，VOCs パターンに違いが認めらす「情報化学物質」であるという知見が蓄積されてきてれた．例えば，畑土壌では 2,3 -ブタンジオールが検出されいる． 即 ち， 土 壌 中 で は 微 生 物 － 微 生 物 間 に お いてたが，裸地土壌では検出されなかった．また，有機物資

VOCs を情報化学物質とした相互作用が形成されている材を添加した土壌では，無添加に比べ，多くの VOCs ピーと考えられる．しかし，従来の微生物 VOCs に関する研クを検出した．しかし，夾雑ピークの影響が依然大きく，

究は分離菌を対象としており，微生物集団が産生する

LVSH 法による土壌の微生物性評価は困難と判断した．

VOCs を網羅的に解析した研究は殆ど報告されてこな

次にモノトラップ捕集法を検討した．結果，比較土でかった．本研究では土壌微生物が産生する VOCs を網羅

は，VOCs ピークが殆ど検出されなかった．これは土壌的に解析する方法を検討し，土壌の微生物性評価法に資に微生物が資化する有機物等を加えない限りは，微生物することを目的とした．

の活動が殆ど生じていないことを意味する．一方，有機【方法】土壌における微生物 VOCs の網羅的解析法とし物資材を土壌に添加すると新たな VOCs ピークが検出さて， 本 研 究 で は ① 大 容 量 ヘ ッ ド ス ペ ー ス（ Large

れ，特に SF 土と RB 土で顕著であった．また，いずれ

Volume Static Headspace ; LVSH ）法と，②モノトラッの処理区からも 2 -メチルイソボルネオール（ 2-MIB）

プ捕集法を検討した．① LVSH 法は土壌を専用の容器にが検出された．2-MIB は有機物資材そのものから検出

入れ，容器中の大容量ヘッドスペースガスを吸引・低温

されず，土壌中では主に放線菌が産生することから，有濃縮した後，GC-MS に導入し，土壌そのままの状態で機物資材の添加によって土壌中の放線菌が応答したと推微量な VOCs を測定する方法である．分析条件を最適化測した．事実，土壌細菌の菌叢解析では，放線菌であるするため，土壌の使用量・種類，吸引量・回数，土壌のインキュベーション時間，有機物資材添加の有無，カラKitasatospora 属と Arthrobacter 属の存在比が増加しており，比較対象の土壌で 0.4％及び 2.4％であった構成比が，ムへの VOCs の吸着・脱着温度を検討した．検討した条SF 土では 4.9％及び 6.8％に，RB 土では 13.9％及び 5.4％

件で，畑土壌と裸地土壌，有機物資材（鶏糞と焼酎廃液に増加していた．他方，各土壌の VOCs パターンと細菌を混合・堆肥化した資材（ KS））を添加・培養した土壌

叢（科レベル）を見ると（図 1 ），両者に関係性が認めと，無添加の土壌を分析した．②モノトラップ捕集法はられたものの，SF 土と RB 土では異同の程度が異なっ土壌が入った容器のヘッドスペースに，モノトラップをていた．これは，施用資材によって土壌細菌の応答が異一定時間設置して，土壌から出てきた VOCs を捕集したなることを示しており，微生物性の実態を反映した結果

後，モノトラップから VOCs を加熱解離させ，GC-MSと推測される．以上より，モノトラップ捕集法は土壌のに導入して微量な VOCs を測定する方法である．モノト

微生物性評価法の一つとして有効な手法と考えられた．

ラップ捕集法では，3 種の有機物資材（ KS ，米ぬかに焼酎廃液を染み込ませ乾燥した資材（SF ），米ぬか（RB））
を個別に添加した土壌と，比較対象として土壌のみ（比較土）を用いた．各土壌 500 g を容器に入れ，モノトラッ
プをヘッドスペース中に設置して 1 週間 30℃で静置してから分析に供した．併行して各処理区の土壌細菌の菌叢解析を次世代シークエンスで行った．
所属

鹿児島大学学術研究院農水産獣医学域農学系

図1

ウォード法による VOCs と細菌叢のクラスター解析

E-mail: ikenaga@agri.kagoshima-u.ac.jp－ 130 －

IFO Res.Commun. 37
2023

ワイン発酵におけるプロリン資化抑制機構の理解とその応用展開
西村明【目的】酵母 Saccharomyces cerevisiae は酒類醸造に用い

Ala379Ile ）を見出した．また，これらの Can1 変異体をられ，酵母による原料の資化（細胞内への取込みと代謝）解析した結果，Arg トランスポーター活性は，Pro 資化

は多様な味・風味を生み出す．プロリン（ Pro ）はブド抑制の制御と無関係であることが明らかになった．以上

ウや麦汁などの原料に最も多く含まれるアミノ酸であるより，Can1 は Arg 取込み以外の機能を有することが示

が，酵母は Pro をほとんど資化できない．そのため，発唆された．

酵後も最終製品中に多量に残存し，酒質を低下させるこ

近年，トランスポーターの中で輸送活性以外に外部環とがある．さらに，発酵中の窒素源枯渇を防ぐために，境因子の受容体活性を持つタンパク質が報告されてい人工窒素源（アンモニウム塩など）の添加が必要となる．

る．このような受容体様の機能を併せ持つトランスポー

この添加物は，ワインの品質に影響を与えるだけでなく，

ターは「トランスセプター」と呼ばれ，炭素源応答の主製造コストの増加要因にもなっている．このため，いか要制御系である Protein kinase A（ PK A ）シグナルをにしてプロリンを資化できるかという試みが 30 年以上

cyclic AMP（ cAMP）非依存的に活性化する．そこで，前からなされてきた．我々はこれまでに，外部環境に存Can1 もトランスセプターである可能性を考え，Arg 添

在するアルギニン（ Arg ）が Pro 資化抑制因子として働加時の PK A シグナルの活性化レベルを検討した．そのくことを見出した．さらに，Arg はユビキチンリガーゼ

結果，Arg 添加によって Can1 依存的に PK A シグナルがRsp5 とそのアダプター Art3 を活性化し，ユビキチン化

活性化することが判明した．さらに，PK A の触媒サブを介して Pro の主要な取込み系トランスポーター Put4

ユニットである Tpk1/2/3 は通常時 Can1 の TK モチーフのエンドサイトーシス分解を誘導することを見出した．

に直接結合しているが，塩基性アミノ酸存在下では

しかし，Arg による Put4 エンドサイトーシスのシグナ

Can1 から解離することがわかった．以上のことから，

ル伝達経路は解明されていない．本研究では，Pro 資化

Arg は Can1 依存的に PK A を活性化させ，Pro 資化抑制

抑制に関わる遺伝子群の同定とそれら役割を解析するこの制御を行っていることが強く示唆された（図 1 ）．

とで，シグナル伝達経路の全容解明を目指した．
【方法】本研究では，Saccharomyces cerevisiae の X2180-1A
株を使用した．プロリン資化抑制活性はプロリン要求性株（ pro1Δcar2Δ ）の生育と Put4 のエンドサイトーシスから検討した．さらに，Arg 存在条件でも生育可能なプ
ロリン要求性株の全ゲノム DNA シークエンス解析からプロリン資化を制御する遺伝子を同定した．また，細胞内外の Arg や Pro 含量はアミノ酸アナライザーによって，測定した．加えて，
PK A 活性は PK A
（触媒サブユニットは Tpk1/2/3 ）によって直接制御されている中性トレ
ハラーゼ活性を指標に検討した．

図1【結果・考察】まず，Arg 以外の塩基性アミノ酸が Pro 資

Arg によるプロリン資化抑制機構（仮説）

化能に及ぼす影響を検討したところ，オルニチンやリジ本研究で得られた知見を実用ワイン酵母に応用するこンも Put4 のエンドサイトーシスを誘導することで，Proとで，プロリン含量が低下し，苦みを抑えたすっきりと資化抑制因子として働くことが分かった．次に，約 108した味わいのワインの醸造が可能となり，ワインの高品

個のプロリン要求性株を Arg が添加されたプロリン単質化に資すると考えている．また，酵母が利用可能な窒一窒素源培地に播種した結果，塩基性アミノ酸存在下で素源が増えることで香味性の強化，人工添加物の添加なもプロリン資化が可能な変異株を 4 株分離した．これら

しのオーガニックなワインが製造可能となり，ワインの4 株の全ゲノム DNA 配列を決定したところ，全ての株で高付加価値化に繋がると考えている．

Arg トランスポーター Can1 をコードする遺伝子にアミノ酸置換を伴う変異（ Gly434Cys, Leu161Pro, Gly224Cys,所属

奈良先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科

E-mail: nishimura@bs.naist.jp－ 131 －

IFO Res.Commun. 37
2023

病原細菌のインフラマソーム活性化因子の同定と応用
原【目的】 微 生 物 は 様 々 な pathogen-associated molecular

英樹

LLO が spleen tyrosine kinase などのリン酸化酵素を活

patterns（ PAMPs ）を発現しており，宿主受容体を介性化することで ASC のリン酸化を促し，インフラマソー

して認識されることで多様な炎症応答を惹起する．一般

ム応答を亢進していることを見出した．世界規模で病原的な炎症応答は感染防御に寄与するが，近年の研究から細菌の薬剤耐性化が進行しており，国内では特に黄色ブ一部の炎症応答は感染病態を悪化させることがわかっ

ドウ球菌臨床株の 70％以上が薬剤耐性を獲得しているてきた．我々は Listeria monocytogenes や Staphylococcusと言われている．そこで，リステリアと同じグラム陽性

aureus などの病原菌が自然免疫機構であるインフラマ
ソーム炎症を積極的に誘導することで生体内増殖を加速菌に属する黄色ブドウ球菌がどのような機序でインフラし，感染病態を増悪させていることを見出した．インフ黄色ブドウ球菌は c-Jun N-terminal kinase（ JNK ）など

ラマソームは細胞内受容体，アダプター分子 apoptosis-のリン酸化酵素を活性化することでインフラマソーム応

associated speck-like protein containing a CARD（ ASC），

答を亢進していることが判明した．そこで，薬剤耐性黄タンパク質分解酵素カスパーゼ 1 で構成されるタンパク

色ブドウ球菌をマウスに感染させたのちに JNK 阻害剤

質複合体であり，炎症性サイトカインである interleukin-1βを投与し臓器内菌数と生存率を観察した．その結果，興（ IL-1β ）や IL-18 の産生を誘導する．これまでにケミカ

味深いことに，JNK 阻害剤投与群では血清中の IL-1β がルリガンドで刺激した際のインフラマソーム構成因子は低下しており，肝臓における菌数もコントロール群と比明らかにされてきたが，感染病態におけるインフラマ

較して減少していた（図 1 ）．

マソームを活性化しているのか検討を行った．その結果，ソーム活性化機序は不明な点が多い．そこで本研究では，グラム陽性菌感染症におけるインフラマソームの活性化機序を解析した．
【方法】マウス腹腔マクロファージもしくは骨髄細胞から分化誘導したマクロファージに Listeria monocytogenes
EGD（ リ ス テ リ ア ） も し く は Staphylococcus aureus
NUMR101（黄色ブドウ球菌）を感染させた．インフ

図1

ラマソーム応答の指標として，培養上清中の IL -1β お黄色ブドウ球菌感染における JNK 阻害効果

よ び IL-18 濃 度 を enzyme-linked immunosorbent assay

また ASC 欠損マウスに黄色ブドウ球菌を感染させると（ ELISA ）で測定した．また，細胞懸濁液および上清中

野生型マウスと比較して臓器内菌数が減少し感染抵抗性の活性型カスパーゼ 1p20 をウエスタンブロット法で検を示すことが判明した（図 2 ）．

出した．感染により活性化したリン酸化酵素はリン酸化
タンパク質を特異的に検出する抗体を用いてウエスタン
ブロット法で特定し，該当するリン酸化酵素に特異的な阻害剤で細胞を処理することでリン酸化の影響を調べた．感染症モデルとして，C57BL/6 マウスにリステリアもしくは黄色ブドウ球菌を経静脈感染させマウスの生存をモニターした．血清中のサイトカイン濃度を ELISA

図2で測定し，感染臓器をホモジナイズし寒天培地に塗布す

黄色ブドウ球菌感染におけるインフラマソーム応答の影響ることで臓器内菌数をカウントした．阻害剤は感染後に以上の結果から，薬剤耐性黄色ブドウ球菌を含むグラ

腹腔内に投与した．
【結果・考察】マクロファージにリステリアを感染させ

ム陽性病原菌の治療標的として新たにインフラマソーム

ると病原因子 listeriolysin O（ LLO）依存的にインフラ経路の阻害が有効であることが明らかとなった．今後，マソームが活性化したことから，菌の病原性とインフラ

インフラマソーム阻害薬の開発と感染症治療への応用がマソーム応答に相関性があることが判明した．また，期待される．

所属

慶應義塾大学医学部，現 旭川医科大学医学部

E-mail: hhara@asahikawa-med.ac.jp－ 132 －

IFO Res.Commun. 37
2023

幅広い単細胞生物のイオンチャネルの構造と機能から根源的な情報伝達手段であるイオン透過の成り立ちに迫る
入【目的】イオンの透過による電気刺激は生命の最もシンプルで根源的な情報伝達手段である．原核生物においても Nav（ BacNav ）は，外部刺激に応答し細菌の遊走方向を調節する．我々が同定した Nav と Cav の共通祖先の特徴を有するチャネル群である AnclNav（ Ancestor
like BacNav ）と，単細胞真核生物である珪藻などから同 定 さ れ た EukCat（ Eukaryotic single domain Cation
channel ）というホモ四量体型のチャネル群は，イオン
チ ャ ネ ル の 進 化 に お い て AnclNav は 太 古，EukCat と
BacNav はそれぞれ真核生物と原核生物の現在の起点と捉えることができる（図 1 ）．そこで，これらのチャネ
ルの変異体も含めた構造と機能を解析し，普遍的なイオンの選択性の構造基盤の成り立ちの解明を目指す．

図1

イオンチャネルの進化系統樹
AnclNav はイオン選択性チャネルらの分岐点にあり様々なチャネルの特徴を取り入れることができる．

【方法】イオン選択性の解析には水和イオンの水和水の配置をチャネルの透過経路内に再現できるかを評価することが重要である．この解析には 2 フェムト秒ごとに分
子のふるまいを記述する分子動力学計算が適する．そして，この計算のためにはチャネルの構造を知る必要がある．そこで，電子顕微鏡や大型放射光施設を用いた構造解析・スーパーコンピュータを利用した分子動力学計算によるイオン透過過程の解析・電気生理実験による活性測定，といった手法を駆使してイオンチャネルの立体構
造とチャネル内のイオンの動態を解析し各イオンの選択性の分子基盤とその成り立ちを明らかにする．まず，これらのホモログの一次配列の解析を行い，特徴的な配列を持つものを優先的に機能解析する．さらに，電気生理実験による機能解析により，イオンチャネルの進化の過程に繋がる機能変化を明らかにし，構造基盤を解明する．
【結果・考察】アミノ酸配列の解析から EukCat の中に
CatSper と相同性が高いホモログが見つかった．CatSper所属

和歌山県立医科大学薬学部薬品物理化学研究室

江

克

雅

は精子に特異的に発現するカルシウムチャネルであり，精子の遊走性に関わるチャネルである．CatSper は四量体型のチャンネルであるがそれぞれのサブユニットのアミノ酸配列は異なる．CatSper の四つのサブユニットのそれぞれに高い相同性をもつ EukCat が存在することを見出
し，CatSper のサブユニット I に相同性の高い Allomyces
macrogynus（ JGI 4951 ）及び Schizochytrium aggregatum（ CAMPEP 0191604132 ）由来の EukCat，サブユニット
II に相同性の高い Gloeochaete wittrockiana（ CA MPEP
0194025564 ）及び Gonapodya prolifera（A0A139A5W7 ）由 来， サ ブ ユ ニ ッ ト III に 相 同 性 の 高 い Cyanophoraparadoxa（ Contig39524 ）由来，サブユニット IV に相同性の高い Rhizoclosmatium globosum（ JGI 852918 ）及びThecamonas trahens（ XP 013753028.1 ） 由 来 の EukCatの遺伝子を合成し機能解析を進めている．
また，AnclNav の一種である NavPp が Ca イオンによる活性阻害を受けることを見出しており，機能解析によって同様の阻害を受ける NavAb 変異体を作成した（図 2 ）．二価カチオンによる活性阻害はイオンチャネル型受容体である NMDA 受容体の Mg イオンによる活性阻害が有名であるが，詳細な分子機構はいまだ不明である．イオンチャネル型受容体の特徴を導入できたことか
ら原核生物チャネルへの機能創出の有用性が示された．
さらに，NavAb 変異体で Ca イオンによる強い阻害を受ける L176Q 変異体と弱い阻害を受ける L176G 変異体

図 2 NavPp と NavAb 変異体による内向き電流野生型で Ca イオンによる阻害を受ける NavPp の特徴を
点変異の導入により NavAb に移植することに成功した．

の結晶構造解析を行った．この構造から阻害を受ける変異体ではチャネル内腔への入り口の Ca イオンの滞在が観測され，これが電流阻害の原因になっていると考えられた．阻害が起こる変異は親水性に富む残基や嵩の低い残基であったため，チャネル内腔の親水性の向上が Ca
イオンの内腔での安定化に寄与すると考えられた．

E-mail: kirie@wakayama-med.ac.jp－ 133 －

IFO Res.Commun. 37
2023

真核微生物の細胞表層糖鎖マーカーとしての酸性糖鎖の選別機構と生理的役割の解明
竹川薫【目的】真核生物の細胞表層糖鎖は，細胞間認識の「バー結合の Gal 転移反応の分子メカニズムは不明であり，糖コード」の機能を果たしている．通常は糖鎖の末端部分転移酵素も未同定であった．先行研究によって分裂酵母に酸性基(高等動物ではシアル酸など)が付加して細胞の糖鎖中に β1,3-Gal が付加されない変異株が取得され，表面を負電荷にしている．出芽酵母は糖鎖中にリン酸基を酸性糖鎖として持つが，その機能については不明な点

β1,3-Gal 転移反応に関与する機能未知タンパク質 Pvg2，
3，5 が同定された．そこで，PANTHER や CAZy なども多い．分裂酵母は，糖鎖の非還元末端にガラクトースのデータベースを用いて各タンパク質のドメインを検索（ Gal ）が付加する．糖鎖末端の Gal 付加はゴルジ体にしたところ，3 つのタンパクは全て一回膜貫通ドメイン

局在する Gal 転移酵素が関与するが，さらに Gal へ酸性を有する典型的なⅡ型膜貫通タンパク質でゴルジ体に局基のピルビン酸が付加する（ PvGal ）．しかし，その詳在することがわかった．さらに，Pvg3 のみが糖転移酵

細な生合成経路や機能は未解明であった．そこで，本申素に保存されている GT31 ドメインを有しているため，請研究では糖鎖への PvGal 付加を担う Gal 転移酵素とピPvg3 が Gal 転 移 酵 素 で あ る と 予 想 さ れ た． そ こ で，ルビン酸転移酵素の解析を行い，PvGal の生合成機構とGalT 活 性 に 重 要 と 考 え ら れ る ア ミ ノ 酸 の 点 変 異 体

生理的役割について解析を行なった．

（ D212，D282 ）を作製して pvg3Δ に対する機能相補試【方法・結果・考察】分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe験を行った結果，これらの変異体は正常にゴルジ体に局糖鎖中の α1,2 - および α1,3 - 結合の Gal を付加する推定在したが，細胞表層のピルビン酸を欠失していた．以上

α - Gal 転移酵素（ GalT ）は，分裂酵母ゲノム上に計 10
遺伝子が存在する．申請者らが取得した GalT の 10 重遺の結果から，Pvg3 が β1,3-Gal 転移酵素であり，D212 お伝子破壊株（ Δ10GalT ）に各 GalT 遺伝子を単独で導入

次に Yeast Two-hybrid 法を用いて Pvg2，Pvg3，Pvg5

した株を作成し，それらの株の糖鎖構造を比較解析する

各タンパク質の相互作用を調べた結果，Pvg3 と Pvg2 はことにより各 GalT の基質特異性の解明を目指した．そPvg5 とのタンパク質相互作用が観察されたため，Pvg5

よび D282 残基が活性に重要であることがわかった．

の 結 果，Gma12，Gmh1，Gmh2，Gmh3，Gmh6，Otg2，を中心とした Pvg3-Pvg5-Pvg2 ヘテロ複合体の形成が示

Otg3 が単独で Gal 転移活性を示すことが明らかになっ唆された．さらに β - 結合 Gal へピルビン酸付加を担う

た． ま た Gma12 と Gmh6 は O－結 合 型 糖 鎖 へ， ま た

Pvg1/ピルビン酸転移酵素と Pvg5 が相互作用すること

Gmh1-3 は N- 結合型糖鎖へ Gal を付加することがわかっが明らかになった（図 1)．以上の結果から，PvGal の合た．さらに Otg2，Otg3 は O－結合型糖鎖のマンノース

成が Pvg5 を中心としたヘテロ複合体の形成を介して連2 糖に対して活性を示した．しかし α1,3-GalT の Otg2，

続的に起こることが示唆された．

Otg3 と高い相同性を持つ Otg1 は，GalT 活性を示さなか っ た． そ こ で，Otg1 と α1,2-GalT（ Gma12，Gmh1，
Gmh2，Gmh3，Gmh6 ）を同時に導入した株を作成し，それらの株の糖鎖構造を比較した．その結果，Otg1 はGmh6 と共発現することによって，Gal 転移活性を示した．以上の結果から，分裂酵母における Gal 鎖には各糖転移酵素の基質特異性に基づく一定の合成経路が存在することが明らかになった．
分裂酵母糖鎖中の β1,3 - 結合 Gal 残基は N- 結合型糖鎖のみに存在する．また，非性的な凝集反応の抑制に重要なピルビン酸が付加されるのは β1,3 - 結合の Gal のみであり，野生株において全ての β1,3-Gal がピルビン酸の付加を受ける．以上のことから，β1,3 - 結合の Gal は糖鎖のピルビン酸化に重要な分子である．これまで，β1,3 所属

九州大学大学院農学研究院生命機能科学部門

図1

Pvg5 を中心とした分裂酵母 Gal 転移酵素複合体とPvGal 生合成機構

E-mail: takegawa@agr.kyushu-u.ac.jp－ 134 －

IFO Res.Commun. 37
2023

スピルリナ強光培養時に確認されたアルカリバチルスの出現メカニズムの解析
渡【目的】糸状性藍藻スピルリナ( Arthrospira platensis)はタンパク質をはじめとする栄養素や色素を豊富に含む糸状性の可食藍藻類である．高塩，高アルカリ環境を好むという特徴を利用し開放系大規模培養が行われているが，スピルリナ生産の現場ではスピルリナの細胞凝集と，それに伴う品質低下が問題となっている．
これまでの我々の研究から，スピルリナ Arthrospiraplatensis NIES-39 株を強光ストレスに曝すことにより凝集体形成が促進されること（図 1 ），さらに凝集体には好アルカ
リ性のバチルス菌（以後，アルカリバチルス）が出現することが明らかになった（図 2）．本研究ではなぜ，どのようにしてアルカリバチルスが出現したのか，スピルリナの凝集体
出現メカニズムを解明することを目的として研究を実施した．

スピルリナの培養の様子（上）とそれぞれの培養菌体の走査型電子顕微鏡（ SEM ）画像（下）図1

図2

強光ストレスによるスピルリナ凝集体形成

スピルリナ凝集体に観察されたアルカリバチルスのSEM 画像【方法】スピルリナ Arthrospira platensis NIES -39 の培養には SOT 培地を用い，全て滅菌処理した試薬，培地を 用 い て 実 験 を 実 施 し た． 強 光 ス ト レ ス は 通 常 光
所属

東京農業大学生命科学部

辺

智(60 μmolm−2 s−1)，2％CO2 バブリング条件で一週間培養した培養液を強光条件(600 μmolm−2 s−1)に移して付与した．強光ストレス時のアルカリバチルスの出現時期について 16S rRNA の v1v2 領域および v3v4 領域をターゲッ
トとしたアンプリコンシーケンスにより解析した．また
PacBio シーケンサーを用いてスピルリナ凝集体から単離されたアルカリバチルスの全ゲノム配列を決定した．
アルカリバチルスの出現メカニズムを明らかにするため，スピルリナ細胞内の代謝産物量をメタボローム解析
により比較した．また凝集体に含まれる成分を熱水抽出し NMR により分析した．アンプリコンシーケンスは生物技研に，メタボローム解析は HMT に委託した．
【結果・考察】ゲノム解析の結果，アルカリバチルス二種のドラフトゲノム情報を取得した．当該細菌はアルカリ塩湖で見つかった Alkalihalobacillus krulwichiae およびAlkalihalobacillus pseudofirmus と同種であることがわかった．これら二種を A. krulwichiae TUA1，A. pseudofirmus
TUA1 として以後の実験に用いた．強光ストレス時のア
ルカリバチルスの出現時期を調べると，ストレス処理前の培地では全く検出されなかったのに対し，強光ストレス条件に移して約一週間後，高アルカリ化（ pH 11 ）した培養液から突如としてバチルス属細菌群が検出された．
スピルリナ細胞内の代謝産物量を比較した結果，強光ストレスに曝した細胞では解糖系や TCA 回路など，中央代謝系の代謝産物量が顕著に減少することがわかった．これに対し，凝集体からはグリコーゲン主成分をした多糖が多く検出された．
スピルリナ培地である SOT 培地を用いて A. krulwichiae
TUA1 および A. pseudofirmus TUA1 の増殖試験を実施した．グルコース，グリコーゲンの資化能を比較した結果，
A. krulwichiae TUA1 はグルコースの添加依存的な増殖を示したのに対し，A. pseudofirmus TUA1 はグルコース
よりもグリコーゲンを添加した際に良好な生育を示した．つまり，両者はグルコースとグリコーゲン資化能に明確な違いがあることが示された．
上記の結果より，アルカリバチルスはストレスにより損傷したスピルリナ細胞より漏出したグリコーゲンおよびグルコースを栄養源として出現すると考えられた．
現在，アルカリバチルスの胞子に着目して研究を進めており，今後，発芽誘導のメカニズムを明らかにすることでアルカリバチルスの出現に関わる原因をさらに絞り込むことができると考えられる．

E-mail: s3watana@nodai.ac.jp－ 135 －

IFO Res.Commun. 37
2023

ビフィズス菌のヒト腸管共生・相互作用因子の構造生物学的解析
伏【目的】ビフィズス菌はヒトの健康に資する善玉菌として有名だが，その中でも Bifidobacterium bifidum は，菌体外に数多くの糖質分解酵素を持ち，それらが多糖を分解するだけでなく，ヒト腸管の糖タンパク質であるムチンに結合して腸管の定着に寄与している．さらに，菌体外酵素の分解物を他のビフィズス菌に分け与えて増殖を助ける「クロスフィード」を行うことが知られている．
本研究では，複数の構造生物学的手法を併用して，B.
bifidum の菌体外糖質分解酵素のマルチドメイン構造を明らかにすることを目的とした．
【方法】B. bifidum JCM1254 株のシアリダーゼ（ SiaBb1,
SiaBb2, SiaBb3 ），スルホグリコシダーゼ（ BbhII ），B
型抗原特異的 α -ガラクトシダーゼ（ AgaBb ）の遺伝子を共同研究者（片山高嶺教授，芦田久教授）より提供していただいた．これらのマルチドメイン酵素の全長および部分的なドメイン構造の発現プラスミドを作成し，大腸菌で発現，精製したタンパク質を X 線結晶構造解析，
クライオ電子顕微鏡解析，X 線小角散乱（ SAXS）解析に用いた．
【結果・考察】3 種 の シ ア リ ダ ー ゼ の う ち，SiaBb3 はGH33 シアリダーゼドメインと GH123 N-アセチルガラ
クトサミニダーゼドメインを含む二機能性酵素である．
SiaBb3 の GH123 ドメインと反応産物 GlcNAc の複合体
構造を高分解能で決定した（図 1A ）．さらに，クライオ
電顕により，GH123 と β -サンドイッチドメインの構造も決定できた（図 1B）．GH33 シアリダーゼドメインとその他のドメインについては現在構造解析を進めている．残りの 2 種のシアリダーゼでは，SAXS により溶液中のマルチドメイン構造を推定した（図 1C）．
SiaBb1 は GH33 ド メ イ ン と そ れ に つ づ く 2 つ のSGNH（エステラーゼ）ドメインと LamG の合計 4 ドメ

図1所属

SiaBb1, SiaBb2, SiaBb3 シアリダーゼの構造東京大学大学院農学生命科学研究科

信

進

矢

インの立体的な配置が確認できた．SiaBb2 は GH33 ド
メインとそれに続く付加ドメインが観察された．
新規に発見されたスルホグリコシダーゼである BbhII
においても，結晶構造解析に成功した（図 2A ）．GH20
触媒ドメインには GlcNAc-6S が結合しており，基質認
識と触媒機構が明らかになった．それに加えて N 末端
側の CBM32 ドメインにも GlcNAc-6S の結合が確認され，これが新規な糖質結合ドメインであり，ムチンの硫
酸化 GlcNAc に結合して腸管定着に寄与していることが示された．また，ヒトの B 型の血液型抗原に特異的な
α -ガラクトシダーゼである AgaBb も構造解析に成功した． 結 晶 構 造 で は GH110 の コ ア ド メ イ ン に 加 え て，
2 つの β -サンドイッチドメインが明らかになった．ゲル
濾過解析により，その C 末端側の構造未決定のドメイ
ンが AgaBb を二量体化させることが分かったため，全長の AgaBb のクライオ電顕を行ったところ，二量体と見られるマップが観察された（図 2B）

図2

BbhII と AgaBb の構造

このように，B. bifidum の巨大な菌体外マルチドメイ
ン酵素についてクライオ電顕，結晶構造解析，SAXS を組み合わせることにより，その立体的な構造と，ヒト腸管の糖タンパク質への結合・認識機構を部分的に明らかにすることに成功した．
本研究は高橋宏大氏，鹿島騰真博士らと共同で行った．
構造生物学的解析は KEK 物構研で AMED-BINDS の支援を得て行った（課題番号 2114, 3073, 3181, 4450 ）．デー
タ 測 定 は KEK-PF お よ び SPring-8 で 行 っ た．SAXS 解析は清水伸隆教授，クライオ電顕解析は廖増威氏，池田聡人博士，稲葉理美博士，守屋俊夫特任准教授，安達成
彦特任准教授，川崎政人准教授，千田俊哉教授が行った．

E-mail: asfushi@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp－ 136 －

IFO Res.Commun. 37
2023

環境メタゲノムから発見した新規な遺伝子発現調節機構の解明と生理学的意義
末永光【目的】真核生物，特にヒトを含む進化した動植物のゲ

真核生物の Saccharomyces cerevisiae YPH500 株においてノム上には，同一配列が繰り返す「反復配列」が存在すも，また C23O 以外の遺伝子においても同様の現象が確認ることが知られているが，そのほとんどが未だに機能不されたことより，本配列は，生物において汎用的に機能す明である．反復配列は，微生物ゲノム配列中においても，る遺伝子発現調節システムであることが示唆された．次に遺伝子内領域・遺伝子間領域を問わずあらゆる部位で定量 RT-PCR により，大腸菌内における C23O mRNA 量

発見されてきており，それはメタゲノム配列においてを解析した結果，MTRn の繰り返しの数によって，菌体内も例外ではない．我々はこれまでに，芳香環を多量にリボヌクレアーゼによる C23O mRNA の分解速度に差異が含む環境に棲息する微生物集団のメタゲノム解析を行生じることが示された．したがって，MTRn は mRNA の構

い，芳香環変換酵素の網羅的な取得を行ってきた．そ造の安定性に影響を与えることによって，下流に存在する遺の過程において，芳香環開裂酵素であるカテコール 2,3 -伝子の発現量をコントロールしていることが明らかになった．

ジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ(C23O)遺 伝 子 の 上 流 に 存 在 す る，
5’
-T(G/A)ACATG(A/C)T-3’からなる連続した 9 塩基ユニットの縦列反復配列（ Metagenomic Tandem Repeat:
MTRn とよぶことにする）と，その繰り返しの多型（n = 3,
4, 5 ）を偶然に発見した（図 1 ）．ここで我々は，MTRnのくり返しは偶発的に生じたものではなく，生命にとって何か意味があるものであろうと推測した．そこで本研究においては，MTRn の機能を解明し，その生物学的

図2

な意義・役割を推測することを目的とした．

C23O の酵素反応

それでは，本反復配列の生物学的な意義・役割は何であろうか？本配列は，芳香環を多量に含む環境のメタゲノ
ム配列中において，C23O 遺伝子の上流に存在し，その遺伝子発現量をコントロールしていることより，芳香環中間代謝産物のなかでも比較的毒性の強いカテコール化合物
図1の分解を促進するために機能していることが示唆される．

メタゲノムから発見した MTRn 配列

つまり反復配列は，生物にとっては毒と成り得る化合物が【方法】C23O 遺伝子の上流に，様々なくり返し数（ n = 1

豊富に存在している，宿主にとってはある種の極限的な環～ 7 ）の MTR 配列を付加した DNA 断片を合成し，pUC

境において発動している環境適応機構のひとつであると考ベクターに連結し，大腸菌 JM109 株を形質転換した．

えられる．微生物の環境適応機構については，プラスミド

IPTG で発現誘導後に，培養した菌体を破砕し，一定のやトランスポゾンなどの可動性遺伝因子が良く知られていタンパク量の基で C23O 酵素活性を測定した．基質である．微生物は過酷な環境で生存するために，これらに加えるカテコールは，C23O 酵素の働きによって黄色を呈すて二重，三重にその対応策を講じていることが推察される．

る環開裂化合物に変換されるため，容易に酵素活性が測

今回発見した MTRn は，由来生物種が不明ながらも，定可能である（図 2A ）．さらに，本現象のメカニズムに

原核生物および真核生物における遺伝子発現システム上ついて解明するために，SDS-PAGE および定量 RT-PCR

で，遺伝子発現をコントロールする機能を発揮した．こを行い，翻訳・転写レベルでの解析を行った．

のことは，MTRn は微生物にとどまらず，動物や植物【結果・考察】C23O 酵素活性の解 析の結果，MTRn のなど幅広い宿主生物においても同様の現象をもたらす可繰り返し数の違いによって，カテコール分解産物の生成量能性が高いことを強く示唆している．つまり，タンパクが異なることが明らかとなった（図 2B）．SDS-PAGE 解析

質の大量発現や遺伝子発現のファインチューニングのたを行い，C23O 酵素の活性とタンパク質の発現量の相関関めの，新規な合成生物学的装置となる可能性をも秘めて

Pseudomonas putida KT2440 株や，係を確認した．さらに，おり，バイオテクノロジーへの転用も期待できる．

所属

産業技術総合研究所 細胞分子工学研究部門

E-mail: suenaga-hikaru@aist.go.jp－ 137 －

IFO Res.Commun. 37
2023

ストレス検知の場としてのオルガネラ膜：
細胞内膜の相分離を利用した細胞成長調節システムの分子基盤
松【目的】種々のストレスに直面した細胞は，成長速度を一時的に低下させ適応後に再び成長を回復する．この制御はタンパク質合成速度の調節を介してなされるが，ストレスの違いによらずタンパク質合成速度を制御する共通の仕組みは未解明である．真核生物においてタンパク質合成ひいては 細 胞 成 長 を 制 御 する TORC1( Target of Rapanycin
Complex 1 )経路の活性は，リソソームや液胞の膜上で活性化され，種々のストレス時に一時的に抑制される．我々は出芽酵母 TORC1 のストレス時の機能解析の過程で，プロテインキナーゼである TORC1 とその主要標的である
Sch9（哺乳類 S6K ホモログ）がストレス後に大きく細胞内局在を変化させ，それに伴ってタンパク質合成活性の切り替えが生じていることを見出した．さらに我々は，この様な膜上のタンパク質局在変化がオルガネラ膜脂質の相分離による偏在と関連していることを発見した（図 1 ）．これらの知見から，「オルガネラ膜脂質分布変化は細胞内生理状態の鋭敏なセンサーであり，生物はそれを利用して自身の生合成活性を最適化している」という仮説に至った．

図1

出芽酵母において高浸透圧処理後に形成される
液胞膜ドメインの蛍光顕微鏡画像

千葉大学大学院理学研究院

彰

ムを発現する株においてゲノムの FAB1 コード領域の終止コ
ドン直前に mAID（ mini AID）タグ配列を挿入し，オーキ
シンアナログ 5-Ph-IA A を添加することで行なった．細胞質 pH の人為的調節は，細胞外液を任意の pH に調整した緩衝液に置換し，その後 H＋に対するイオノフォア 2,4 -ジニ
トロフェノール（ DNP）を添加することにより行なった．
【結果・考察】まず，Fab1 阻害剤の添加もしくはオーキ
シンデグロンにより Fab1 を除去した条件における Sch9の動態を観察した．その結果，上記条件でもストレス応
答過程で Sch9 が存在する膜ドメインが通常通り観察されること，またその過程で Sch9 の活性が正常に調節されていたことから，PI(3, 5)P 2 の新規合成自体は正常なストレス応答に必須ではないことが明らかになった．
そこで，すでに存在している PI(3, 5)P 2 自体がストレス状態のセンサーとなっている可能性について検討した．
細胞がストレスに曝露された場合に，細胞質の pH が一過的に低下することが知られている．DNP を用いて細胞質 pH を人工的に低下させたところ，Sch9 の液胞膜局在が減少し，TORC1-Sch9 経路の活性が抑制された（図 2 ）．
本研究の開始当初は，膜脂質分布の偏在自体がストレスシグナルの需要もしくは伝達に関わっていると想定していたが，本研究の結果から，実際には膜上のリン脂質の荷電状態変化がその過程に関わっていることが示唆された．すなわち，細胞に対するストレスが細胞質の pH
低下へと情報変換され，オルガネラ膜に存在するイノシ
トールリン脂質の荷電状態がそのセンサーとなって細胞成長を調節するプロテインキナーゼの活性が調整されるという，オルガネラ膜を受容体とする新奇情報伝達経路が存在していることが示された．

液胞膜リン脂質 PI(3, 5)P 2 の合成に関わる Fab1 の欠損株では，Sch9 の膜局在が抑制されることがミシガン大
学の Weisman らにより明らかにされている．そこで本研
究では，高浸透圧応答時の TORC1 下流経路の活性制御における PI(3, 5)P 2 の機能を探るための実験を行った．
【方法】Sch9 の細胞内局在性およびリン酸化状態の検出には，それぞれ GFP（ green fluorescent protein ）タグ，
HA（ hemagglutinin ）タグを有する Sch9 を発現する株を用いた．オーキシンデグロンによる Fab1 タンパク質の発現抑制は，AID2（ Auxin-induced degron 2）システ
所属

浦E-mail: amatsuur@faculty.chiba-u.jp－ 138 －

図 2 細胞質酸性化後の Sch9 液胞膜局在性の蛍光顕微鏡
画像．DNP 処理により細胞質 pH は外液 pH と平衡になる．FM-4-64 は液胞膜を特異的に染色する．

IFO Res.Commun. 37
2023

多細胞システムの機械受容シグナル伝達機構に関わる複数イオンの解明
森

本

雄

祐

【目的】われわれヒトを含むほとんどの生物は，メカノ
センシングと呼ばれる，外環境からの機械的な刺激に応答するための様々な機構を持っている．生物個体が危険を察知するために重要な機構であるだけでなく，組織，細胞，細胞内小器官，分子のそれぞれのステージにおいてメカノセンシング機構が保持されており，細胞運動，
細胞分化，分子活性などに広く働いている．メカノセン
シングにおいて Ca2＋がセカンドメッセンジャーとして働いていることは，培養細胞や組織レベルでよく知られ

図2

細胞性粘菌多細胞体の機械刺激応答ているが，そのシグナル伝達機構の詳細は十分に理解されていない．土壌生物である細胞性粘菌は，通常はアメー

細胞性粘菌の多細胞体は，前方部を振りながら，周りをバ状の単細胞生物として分裂増殖しているが，飢餓状態

探索するように動いているため，前方部に効率的な応答により多細胞体形成を容易に誘導できる．本研究課題で機構があるものと考えられる．また，機械刺激に伴うは，細胞性粘菌を用いて，多細胞システムのメカノセン

Ca2＋の流入経路を特定するために，小胞体に存在する

シングにおいて，どのようなイオンが働いているか，各IP3（イノシトール三リン酸）受容体ホモログ IplA 欠損

イオンの役割を明らかにすることを目的とした．

株，ヒト細胞にも保存されている機械受容チャネル【方法】カルシウムセンサーとして働く蛍光プローブタンパ

Piezo 欠損株をそれぞれ用いて計測を進めたところ，多ク 質 GCaMP6s を 細 胞 性 粘 菌 Dictyostelium discoideum

細胞体において，IplA チャネルは部分的に機械刺激に寄の AX2 株に発現させ，栄養培地から寒天上に移すこと与しており，Piezo チャネルはほとんど寄与していないによって多細胞体を構築させた．蛍光顕微鏡上で，多細ことが明らかとなった．これは，単細胞期での機械刺激

胞体を機械刺激し，刺激前後の細胞質 Ca2＋濃度変化を応答に Piezo が大きく寄与しているとする過去の報告とモニターした（図 1 ）．計測データは，多細胞体の前方異なっている．このことは，細胞性粘菌が単細胞から多及び後方に分けて解析を行った．

細胞システムへと分化することによって機械刺激応答シ
グナル伝達経路が変化するが，どちらの状態においてもCa2＋シグナルを共通して利用していることを示している．この結果は，単細胞と多細胞でのシステムの違いを理解するために重要な知見となると考えられる．
多細胞体の機械刺激応答時に，Ca2＋移動とともに変動することが知られている H＋に注目し，pH 感受性蛍光タンパク質 SEpHluorin を用いて細胞質 pH をモニターした．しかし，機械刺激に応じて Ca2＋のような変動は pH
では見られなかった．この結果は，機械刺激に応じて変動するのは Ca2＋特異的なものであり，イオン流として

図1

よりセカンドメッセンジャーとしての役割が大きいこと

細胞性粘菌の機械刺激応答計測が示唆された．今後は，前方部と後方部においてどのよ【結果・考察】蛍光プローブ GCaMP6s を用いたイメー

うにして機能の違いを作っているのか，メカノセンシン

ジングにより，外部から機械刺激を与えることで，細胞グと通常の細胞集団運動において Ca2＋シグナルをどの性粘菌の多細胞体を構成する各細胞の細胞質 Ca 濃度がように使い分けているのか，またはシグナルを併用して一過的に上昇することが明らかになった．多細胞体の前いるのかといった疑問を明らかにすることにより，多細方部と後方部に分けて解析したところ，前方部がより効

胞システムの細胞集団運動におけるシグナル分子機構を率的に強く応答していることが明らかとなった（図 2 ）．

解明していく必要がある．

2＋所属

九州工業大学大学院情報工学研究院

E-mail: yvm001@phys.kyutech.ac.jp－ 139 －

IFO Res.Commun. 37
2023

出芽酵母可視化スクリーニングによる活性化ステロール
分布領域制御因子の特定と制御機構の解明
岸【目的】真核生物のステロール分子は，主に細胞膜に内包され，膜外物質との接触が制限されているが，膜環境の変化により二重膜表面に露出する活性化ステロールという物理状態を示す（図 1）．活性化ステロールは，細胞質分子や細胞外分子との相互作用の確率を高めるため，様々な生命現象に影響を与える可能性があり，その機構の解明は重要な
Saccharomyces cerevisiae(出芽酵母)課題である．我々は，のエルゴステロール（ Erg ）の活性化状態を顕微鏡下で可視化する蛍光タンパク質プローブ GFPen-D4H を開発し，効率的な検出方法を確立した．本課題では，GFPen-D4Hを用いて Erg 活性化に関わる遺伝子を探索し，その遺伝
子解析によりステロール活性化機構の解明を目指した．

図1

GFPen-D4H を利用した活性化ステロール関連遺伝
子スクリーニング【方法】出芽酵母の野生株では，GFPen-D4H は細胞極性部位（出芽部位や細胞分裂面）に分布する（図 1 ）．この分布の変化を指標に活性化機構に関わる遺伝子を探索するため，GFPen-D4H 発現ベクターを遺伝子欠損変異株（ KO）ライブラリーに導入し，顕微鏡下で分布解析を実施した．得られた分布情報をもとに，既知の情報と統合し，解析対象遺伝子を決定した．そして，活性化関連遺伝子の機能解析として，遺伝学的アプローチ（高発現実験，多重変異株実験）を行う遺伝学的相互作用の解析を行った．filipin 染色（活性化に関係なく全ステロールを染色）や生化学定量実験を利用して Erg 量を評価した．
また，蛍光タンパク質融合タンパク質と活性化 Erg 分布との局在相関について細胞生物学的解析を行った．これらの実験から得られた結果から，制御機構の解明を進めた．
【結果・考察】Erg の活性化状態を制御する細胞膜や細胞膜近傍小胞体 Cortical endoplasmic reticulum（ cER ）に分布するタンパク質を単離するため，遺伝子欠損ライブ
ラリーから約 500 株の関連遺伝子欠損株を選択し，ステ所属

北海道大学遺伝子病制御研究所

本

拓

磨

ロール関連薬剤に対する感受性試験と GFPen-D4H 分布を指標にした顕微鏡観察による一次スクリーニング，得られた遺伝子の戻し交配を経て，最終的に 12 遺伝子を同定した（図 1）．これら遺伝子を足がかりに更なる探索を進め，同様の表現型を示す複数の遺伝子変異も同定している．
スクリーニングで得られた関連遺伝子変異株について，
現在，遺伝子機能の解析を進めている．その一つはLam タンパク質（StARt like domain タンパク質）である．
Lam タンパク質は，cER に分布する膜タンパク質であり，細胞膜からステロールを抽出する．このタンパク質 群 の LAM1/2/3/4 の 4 遺伝子の単独欠損変異では，
GFPen-D4H が母細胞側に分布し，野生株での極性分布とは逆の分布を示した．また，Lam タンパク質は母細胞側 cER に局在することから，母細胞側特異的にステロールの分布を制御していると推測される．さらに，遺伝学的相互作用の解析を進め，phosphatidylserine（ PS）
合成酵素 cho1 欠損との組み合わせで合成致死性を示す
ことが明らかとなった（図 2A ）．PS はステロールと相互作用するため，cho1 欠損では GFPen-D4H 分布が細胞膜全体に広がるという変化が以前から観察されていた．この合成致死性の原因を探ることで，活性化ステロールの機能が明らかになることを期待し，条件致死変異株を構築して表現型解析を進めた．その結果，ステロール量が異常蓄積（ 369％±80 vs 野生株）とそれに伴い細胞膜の異常陥入が確認された（図 2B）．致死性はステロール合成を阻害
すると回復するため（図 2A ），全く異なる 2 つのメカニズムによる協調的な制御が，活性化を介してステロールのホメオスタシスを維持する可能性が示唆された．現在より詳細に解析を進めている．また，機能未知の細胞膜タンパク
質 Pmp3 の解析も開始し，LAM 遺伝子欠損と同様な母細胞側での活性化ステロール分布が判明した．この遺伝子は解析の初期であり，今後の研究の発展が期待される．

図2

E-mail: kishitaku@igm.hokudai.ac.jp－ 140 －

活性化ステロールに関わる cho1 lam 遺伝子多重変異株が示す合成致死性（ A ）と細胞膜の陥入（ B ，矢印）．
ステロール合成阻害剤 Fluconazole の添加で回復する．

IFO Res.Commun. 37
2023

グラム陽性菌における翻訳の品質管理機構の解明
千【目的】 リ ボ ソ ー ム は， 終 止 コ ド ン を 欠 い た 異 常 な

葉

志

信

mRNA（ non-stop mRNA ）を翻訳すると，翻訳終結を

in vitro でのリボソームレスキュー活性を測定した．解析 に は， 大 腸 菌 由 来 の 精 製 再 構 成 翻 訳 系（ PURE行うことができずに mRNA 上で停滞する．細胞は，そsystem ）に含まれる大腸菌リボソームの代わりに枯草のような停滞リボソームを解放する機構（リボソームレ

菌リボソームを導入した Bs hybrid PURE system を用い

スキュー機構）を持つ．真正細菌においては，広く保存

た． こ の 系 で， 終 止 コ ド ン を 欠 い た GFP を 合 成 し，さ れ た tmRNA（ SsrA ） に よ る trans-translation が， 主BrfA および RF2 存在下で，ペプチジル tRNA が切断さ要なリボソームレスキュー機構として知られている．一

れるか否かを検討したところ，これらの変異体は，いず方，我々は，以前，枯草菌の第 2 のリボソームレスキュー

れもペプチジル tRNA の切断活性が低下していた．特に，因子として BrfA を同定した．BrfA は，翻訳終結因子

R25A ，F31A ，R36A 変異は BrfA の活性を著しく低下さ

RF2 を停滞したリボソームにリクルートすることで，終せることが示唆された．以前明らかにされた構造データ

止コドンがないにもかかわらず翻訳終結を促進する．本と合わせると，R25 はリボソーム RNA と，また，F31

研究では，（1）BrfA のレスキュー機構をさらに理解する

および R36 は，RF2 との相互作用に重要な役割を果たことを目的とし，BrfA の詳細な変異解析を行った．また，すことが示唆された（図 1 ）．

枯草菌のリボソーム品質管理機構の全貌を理解することを目指し，（2）SsrA ，BrfA 以外のレスキュー因子のさらなる探索を行った．
【方法】BrfA のリボソームレスキュー機構をさらに詳細に理解するために，BrfA 分子の重要領域を，網羅的な変異解析により明らかにすることを目指した．そのために，枯草菌（ Bacillus subtilis PY79 株）由来の各種部分欠失変異株や，1 アミノ酸置換変異株を作製した．brfA遺伝子と ssrA 遺伝子の二重欠失株は低温で生育欠損を示す．このことを利用し，生育を指標に BrfA の変異の効果を調べた．また，in vitro 精製再構成翻訳系を用い，各種 BrfA 変異体のリボソームレスキュー活性を評価した．
加えて，ssrA，brfA 以外の第三の枯草菌リボソームレ

図1

ス キ ュ ー 因 子 を 探 索 す る た め，ssrA 単 独 欠 失 変 異 やBrfA の重要残基

ssrA/brfA 二重欠失変異と組み合わせることで合成生育阻害を示す欠失変異を，TnSeq 法を用い探索した．

次に，SsrA ，BrfA に次ぐ第三のレスキュー因子探索【結果・考察】BrfA の C 末端領域を様々な長さで欠失しのため，ssrA 単独欠失株および ssrA/brfA 二重欠失株をた各種部分欠失変異を作製した．これらが活性を保持し用いた合成生育阻害スクリーニングを行った．その結果，ているか否かを，brfA を欠失し，かつ，ssrA を CRIPSRi
でノックダウンできる株を用いて検討した．その結果，

ssrA 単独欠失変異と合成生育阻害を示すものとして，近年他のグループから報告されたリボソーム品質管理因子

BrfA の N 末端から 50 アミノ酸残基があれば，野生型並である rqcH や rqcP をはじめ，いくつかの遺伝子がヒッに生育を相補することが示された．次に，BrfA のアラ

トした．また，ssrA/brfA 二重欠失株を用いたスクリー

ニンスキャニング変異解析を行い，重要残基の同定を試ニングからも，機能未知の遺伝子を含む，複数の遺伝子み た． そ の 結 果， ま ず，BrfA の S4A ，R15A ，D20A ，が得られた．今後，これらの遺伝子のリボソーム品質管

R25A ，F31A ，G35A ，R36A の 7 つの変異株は生育阻害

理への関与を検討する必要がある．

を示した．うち，G35A 変異体以外の変異体タンパク質は細胞内での蓄積が見られたため，それらは機能喪失変異であることが示唆された．そこで，これらについて，所属

京都産業大学生命科学部

E-mail: schiba@cc.kyoto-su.ac.jp－ 141 －

IFO Res.Commun. 372023

土壌中での環境適応を標的とした防除技術開発を指向した，
青枯病菌のシデロフォア産生機構の解明
曵【目的】持続性ある防除技術がなく，土壌生息性グラム陰性細菌 Ralstonia solanacearum species complex（青枯病菌）は，250 種以上の作物に甚大な被害を与えている．
その病原性には，細菌密度感知系クオラムセンシング（ QS）により活性化された LysR 型転写因子 PhcA による遺伝子発現制御を必要とする．土壌に生息する青枯病
菌の環境適応の阻害は，QS 阻害とともに，持続性ある
青枯病防除をもたらすと考えられる．土壌での青枯病菌の環境適応には，土壌中に存在する三価鉄と結合能を有す る シ デ ロ フ ォ ア（ Sd ） で あ る Micacocidin(Mic)とStaphyloferrin B(StB)を介した二価鉄(Fe2＋)の細胞内への獲得が肝要である．本研究では，青枯病菌の Sd 産生機構とともに Sd の病原性への関与について解明した．
【方法】青枯病菌 OE1-1 株ゲノム情報を基に作出した Sd
産生候補遺伝子の欠損株の三価鉄キレート活性能(Sd 活性)を測定し，Sd 産生遺伝子を同定した．それら Sd 産生
遺伝子欠損株と OE1-1 株の培養ろ液の LC/MS 解析から，
Sd 画分を分画し，NMR と MS によって Mic と StB の構造を決定した．そして，Mic と StB それぞれの産生遺伝子を同定した．種々の条件で培養した青枯病菌のトランスク
リプトームを RNA-seq により解析した．また，青枯病菌
菌株のトマト植物の根における挙動を in vitro pathosystem
で解析するとともに，トマト植物に対する病原性とともに，青枯病菌菌株の QS 依存形質を解析した．
【結果・考察】Sd 活性低下株と OE1-1 株それぞれの培養
ろ液の NMR と MS を用いた解析から，Mic と StB の構造を決定した(図 1)．そして，Mic と StB それぞれの産
生に，RSc1804 遺伝子 - RSc1813 遺伝子(Mic 遺伝子群)と RSp0413 遺伝子 - RSp0424 遺伝子(StB 遺伝子群)が関
わ り，RSc1806 遺 伝 子(RSc1806)と RSp0424 遺 伝 子(RSp0424)が中核となることを明らかにした．さらに，培地に Fe2＋が含まれないときに，Sd 活性が顕著に高まる
ことを見出し，Fe2＋有あるいは Fe2＋無で培養した OE1-1
株の RNA-seq によるトランスクリプトーム解析から，
Fe2＋と結合した転写制御因子 Ferric uptake regulator である Fur1 によって，Mic 遺伝子群と StB 遺伝子群の発現が抑制されることを見出した．さらに，QS 能喪失変
異株の RNA-seq によるトランスクリプトーム解析から，
PhcA により，StB 遺伝子群の発現が抑制されることを見出した．そして，三価鉄をキレート結合した Sd の細胞内への取り込みに，RSc1807 遺伝子と RSp0416 遺伝所属

高知大学農林海洋科学部

地

康

史

子がコードする外膜受容体が関与することを明らかにした．さらに，RSp0100 遺伝子と RSp0414 遺伝子がコードする外膜受容体が，三価鉄をキレート結合した Sd の細胞内への取り込みに拮抗的に作用することを見出した．StB 産生能喪失株である RSp0424 欠損株はトマト
植物に対する病原性を保持したが，Mic 産生能喪失株である RSc1806 欠損株はトマト植物に対する病原性を喪失した．そこで，青枯病菌のトマト根での挙動を解析したところ，表皮表面に固着した OE1-1 株は，表皮と皮層の細胞間隙で増殖して QS を起動し，細胞壁を分解して皮層細胞内に感染しマッシュルーム型バイオフィルム(mBF)を形成した．mBF から離脱した OE1-1 株は皮層と内皮の細胞間隙を動き，内鞘，そして導管へ感染した．
一方，RSc1806 欠損株は，QS 能喪失株と同様に，表皮と皮層の細胞間隙で増殖したが皮層細胞へ感染できず，道管への感染も観察されなかった．そこで，RSc1806 欠
損株のトランスクリプトームを RNA-seq により解析したところ，病原性関連遺伝子を含む PhcA により発現が制御される遺伝子の 80％以上の遺伝子の QS 依存性が，RSc1806 欠損により崩壊した．RSc1806 欠損株の QS 依
存形質であるバイオフィルム形成能，主要な菌体外多糖
EPS I 産生能およびべん毛回転による運動能が，QS 能喪失株と同様に，変化した．すなわち，土壌環境下で，Mic は，青枯病菌の病原性に不可欠な QS に依存した遺伝子発現制御に関わり，StB 産生とともに青枯病菌の病原性の制御に関わると考えられた．

E-mail: yhikichi@kochi-u.ac.jp－ 142 －

図1

青枯病菌における Sd 産生と Fe2＋獲得の制御およびMic による QS 依存遺伝子の制御に関する推定図

IFO Res.Commun. 37
2023

酵母の細胞質局在型センサーによる新奇高浸透圧感知機構の解明
舘

林

和

夫

【目的】出芽酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）で高浸透

果，図 1 に示すように Ptc1，Ptc2，Ptc3，Ptc4 という 4 種

圧適応の中心的な役割を担っている Hog1 MAP キナーの 2C 型セリン・スレオニンホスファターゼが Pbs2 のゼ（ MAPK ）経路では，上流の膜局在型センサーが高脱リン酸化に働くことがわかった．例えば PTC1 遺伝子

浸透圧を感知すると，各支経路の MAP3K（ Ssk2/22,

破壊株では Pbs2 T518 のリン酸化が高浸透圧刺激の有無

Ste11 ）， 共 通 の MAP2K（ Pbs2），MAPK（ Hog1 ） がによらず野生株に比べて亢進しており（図 2 ），T518 脱順次リン酸化・活性化され，活性化した Hog1 がさまざ

リン酸化には主として Ptc1 が単独で働いていることがまな高浸透圧適応反応の誘導に働く．我々は上流高浸透わかった．一方，S514 の脱リン酸化には 4 種のホスファ

圧センサーとして複数の膜タンパク質を，経路下流の細ターゼ（Ptc1-Ptc4 ）が重複した機能を有していた．また，

胞質局在型高浸透圧センサーとして Hog1 を見出していPtc1 による Pbs2 の脱リン酸化には，アダプタータンパ

る．上・下流のセンサーが高浸透圧に同時に応答した場ク質である Nbp2 が Ptc1 を Pbs2 にリクルートする必要

合のみ Hog1 が活性化するため厳密な高浸透圧特異性ががあることも明らかになった．これまで Hog1 経路の負保障される．本研究では，細胞質局在型センサーによるの活性制御には，Hog1 を脱リン酸化するホスファター

高浸透圧感知機構の理解に向けて，Pbs2 の脱リン酸化

ゼの関与のみが示されていたが，本研究で新たに Pbs2制御機構を中心に解析した．

の脱リン酸化を介した Hog1 経路の制御機構が明らかに【方法】 出 芽 酵 母（ Saccharomyces cerevisiae ） の Hog1

なった．Pbs2 の脱リン酸化反応が高浸透圧によって制御経路を構成するキナーゼやシグナル因子をコードする遺されているのかについては，今後検証すべき課題である．

伝子の破壊株，各種ホスファターゼの破壊株に，C 末端に hemagglutinin（HA ）タグを付加した Pbs2（ Pbs2-HA ）の発現プラスミドを導入し，高浸透圧条件下などにおける Pbs2 の S514, T518 のリン酸化状態を検討した．具体的には，調製した酵母細胞抽出液から HA 抗体で免疫沈降した Pbs2-HA について，Phos-tag PAGE 法によるバ
ンドシフトアッセイにより S514 リン酸化を，リン酸化
T518 特異的抗体を用いたウエスタンブロット法によりT518 リン酸化を検出，定量した．
【結果・考察】Hog1 経路における高浸透圧作用点として，上流の膜局在型センサーと，Pbs2 によりリン酸化される細胞質の Hog1 が知られていた．本研究では，活性化 Ssk2 が Pbs2 をリン酸化する過程も高浸透圧によ

図1

2C 型ホスファターゼによる Hog1 経路の負の制御

図2

Ptc1 による Pbs2 T518 の脱リン酸化＋
高浸透圧刺激後の ptc1Δ 株と野生株（ PTC ）における Pbs2-T518 の経時的リン酸化．ウエスタンブロッ
ト に は T518-P:T518 リ ン 酸 化 抗 体，Pbs2-HA:HA
抗 体 を 使 用． 最 下 段 の Pbs2 T518-P は Pbs2-HA
T518/Pbs2-HA の相対値を示す．

るリン酸化増強作用を受けることを遺伝学的解析により示した．
続いて，高浸透圧による細胞質内リン酸化増強作用点に共通して存在する Pbs2 について，その活性化ループ内のリン酸化制御機構を解析した．活性化ループ内には 2 つのリン酸化部位(S514,T518)が存在し，MAP3K(Ssk2/22,
Ste11)がこれらをリン酸化することで Pbs2 を活性化す
る．一方，S514, T518 を脱リン酸化し Pbs2 を不活化す
るホスファターゼについては不明であった．そこで最近確立した Pbs2 の S514, T518 のリン酸化検出系を用いて，様々なホスファターゼ変異の Pbs2 リン酸化に対する影響を調べ，Pbs2 の脱リン酸化機構を検討した．その結所属

東京大学医科学研究所

E-mail: tategone@ims.u-tokyo.ac.jp－ 143 －

IFO Res.Commun. 372023

ビタミン B6 の生体内恒常性維持機構の解明
伊【目的】ビタミン B6 の補酵素型であるピリドキサールリ
ン酸(PLP)は，多くのアミノ酸代謝酵素の補酵素として機能し，生体代謝に必須の役割を果たす．一方，PLP やこの前駆体であるピリドキシンリン酸（ PNP）は，アルデヒド毒性や代謝撹乱作用を示す．生体内の各ビタマー
レベルは必要十分量に厳密に制御される必要があるが，この恒常性維持機構には不明な点が多く残されている．
各ビタマーの相互変換・リサイクル経路，輸送システ
ムは，ビタミン B6 恒常性に重要な役割を果たすと予想される．図 1 に Escherichia coli のビタミン B6 代謝酵素・経路に関する現在の知見をまとめたが，PLP の合成・分解に直接関与する代謝酵素（図 1 中に実線で示した）以外のビタミン B6 恒常性因子はほとんど知られていな
い．この状況は E. coli 以外の大部分の微生物においても同様である．本研究では，ビタミン B6 ホメオスタシスの
分子基盤の解明を目的とした．本稿では，E. coli の PNP
レベルの制御機構に関する研究成果について記述する．

図1

E. coli のビタミン B 6 代謝酵素・経路【方法】E. coli 野生株および yigL 欠損株の菌体内や，酵素反応溶液中の各ビタミン B6 ビタマーは，除タンパク処理の後，ODS カラム・HPLC を用いて分離，蛍光検出した．リコンビナントタンパク質は，各遺伝子をクロー
ニ ン グ し た pCA24N ベ ク タ ー で 形 質 転 換 し た E. coli
AG1 株を用いて発現し，His タグを利用して精製した．
PNP ホスファターゼのスクリーニングには，E. coli の一遺伝子発現ベクター（ ASK A クローン）約 100 クロー
ンずつを含むプラスミドプール（～ 50 セット)を調製し，これを用いてE. coli serA pdxH 株（serA:phosphoglycerate
dehydrogenase, pdxH:PNP oxidase ） を 形 質 転 換 し た．
グリシンおよびピリドキサール（ PL ）を含む合成選択培地において生育したコロニーよりプラスミドを抽出
所属

名古屋大学大学院生命農学研究科

藤

智

和

し，インサート配列を同定した．
【結果・考察】E. coli の細胞破砕液と PNP をインキュベー
トし，その反応産物を分析したところ，PLP に加えピリド
キシン（ PN ）の生成を認め，PNP ホスファターゼが関与する脱リン酸化経路の存在が明らかとなった．PNP 依存
的な条件的致死性を示す E. coli serA pdxH 株を用いたマ
ルチコピーサプレッサースクリーニングによって，同株のPNP 毒性緩和に寄与する 6 種類の遺伝子を同定した．このうち yigL は，唯一ホスファターゼをコードし，この発現によりE. coli 粗酵素液中の PNP ホスファターゼ活性は 40倍上昇した．精製 YigL タンパク質は，PNP に対して高い
ホスファターゼ活性を有し（ Km;0.8 mM kcat;1.8 S -1 ），また，PLP に対してもほぼ同等の（ Km; 0.2 mM kcat; 2.4 S -1 ）
反応性を示した．
このPLP に対する活性値は，
PLP ホスファ
ターゼである YbhA と同等であった．
yigL 欠損株では PNP レベルが野生株と比べ有意に高値を示し，この際，粗酵素液中の PNP ホスファターゼ
活性は野生株と比べ 40％ほど低下していた．さらに，
yigL 欠損株は PNP 毒性に対し，野生株と比べ高感受性を示した．E. coli の PNP レベルの 新 規 制 御 因 子としてPNP ホスファターゼ:YigL の存在が明らかとなった（図 2）．
yigL/ybhA 二重欠損株の PLP ホスファターゼ活性は，野生株と比べ 80％低下しており，両 酵素が E. coli の主要な
PLP ホスファターゼである可能性が示された（図 2）．
既知の PNP レベルの制御因子として，PNP オキシダー
ゼ(PdxH/PNPO)および，PLPBP タンパク質が知られてきた．plpbp 欠損株は，PNP に対する反応性を示さないにも関わらず，pdxH 欠損株と同様に，菌体内に PNP
が高濃度蓄積する．興味深いことに，plpbp 欠損株における pdxH の過剰発現は，同株の PNP の蓄積を解消できな
かった．PLPBPと PNPO との直接的な相互作用は期待できない．このため，PLPBP は何らかの間接的な作用によって PNPO の酵素活性制御に関与する可能性が予想された．

E-mail: ito-t@agr.nagoya-u.ac.jp－ 144 －

図 2 E. coli の新たなビタミン B 6 代謝酵素・因子

IFO Res.Commun. 37
2023

トリコテセン系かび毒生合成制御の分子機構
木村真【目的】 ム ギ 類 赤 か び 病 を 引 き 起 こ す Fusarium
graminearum はトリコテセン系かび毒（以下，毒素）を大量に外観健全粒に蓄積させる．毒素生合成遺伝子（Tri遺伝子）の転写には，遺伝子クラスター中の Cys2 - His2
転 写 因 子 Tri6p と そ の 調 節 因 子 Tri10p が 必 須 で あ る．
Tri6 を高発現させてもスクロースのような誘導糖が存在しないと経路酵素遺伝子（ Tri5 や Tri4 ）の転写は起こらない．Tri6 や Tri10 は遺伝子クラスターのコア領域に位置するが，相同組換えによるベクター挿入によってコ
ア領域の遺伝子間距離が変わると，毒素非生産条件下でも Tri6 の転写が活性化する．その結果，経路酵素 Tri 遺伝子が脱抑制されて毒素を産生するようになる．以上のことから，遺伝子クラスターのコア領域は本来，強固なヘテロクロマチン構造をとり，毒素を誘導する培養条件にならないとコア領域の遺伝子が転写されないが，ベクター
挿入によって構造が変化すると転写活性化が引き起こされると推測された．そこで本研究では，酵母の二形成に関わるWOR1 の F. graminearum のホモログである Fgp1 の毒素産生への関与を検証する．また，スクロースが Tri6p

図1を転写因子として機能化させるメカニズムを解析し，毒素産生制御に役立つ科学的知見を得ることを目指す．
【方法】F. graminearum JCM 9873 株（ WT ）を親株に，

Fgp1 の遺伝子操作株の各種培養条件下における解析．（ A ）トリコテセンの TLC 解析（ B）培養液のpH プロファイル

ハイグロマイシン耐性遺伝子およびチミジンキナーゼ遺を弛緩さることで Tri6 と Tri10 を発現させると考えられた．

伝子をそれぞれ正，負の選択マーカー遺伝子として用い

次に Tri6 高発現株の培養液にスクロースを添加した．

たセルフクローニングによって，Fgp1 の座位での相補15 分でまず Tri10 mRNA が検出され，その後，経路酵株（ C），Gpd プロモーターを Fgp1 コード領域の上流に素遺伝子 Tri5 の発現が活性化された．このことからス挿入した高発現株（ O/E），リン酸化部位 Thr-67 を Ala

クロースはまず Tri10 の転写を誘導し，生成した Tri10pに置換した被リン酸化部位置換株（ T67A ）を作成した．

タンパク質が Tri6p タンパク質を転写因子として機能化

また，スクロース非存在下で毒素産生する物質としてフすることで経路 Tri 遺伝子の転写が活性化することが示

ルオレノンの誘導体を見出した．Tri6 を高発現させたされた（図 2 ）．

株にスクロースやフルオレノンの誘導体を添加し，Tri
遺伝子発現の転写レベルを経時的に解析する．
【結果・考察】O/E 株は pH 4.0 の培地で培養すると大きな pH 変動を示したため，全ての株で同じ pH を示す pH
2.5 の 培 地 を 用 い て Fgp1 の 影 響 を 評 価 し た（ 図 1 ）．
O/E 株は WT 株より毒素生産のレベルが高く，WT 株
では毒素産生のほとんど見られないグルコースを糖源にし た 場 合 で も 顕 著 な 毒 素 産 生 が 認 め ら れ た． 一 方，
T67A 株では毒素が検出されなかったことから，Thr-67 のリン酸化が必須であることが示された．以上より，Fgp1 はリン酸化を受けて活性化し，恐らくヘテロクロマチン構造
所属

名古屋大学大学院生命農学研究科

図 2 トリコテセン遺伝子クラスターのコア領域と Tri 遺伝子の発現制御モデル

E-mail: mkimura@nagoya-u.ac.jp－ 145 －

IFO Res.Commun. 37
2023

細菌の宿主定着能獲得や病原性獲得への進化のメカニズムの解明
坂本【目的】Escherichia coli（大腸菌），Klebsiella pneumoniae

表1（肺炎桿菌等）の腸内細菌目の細菌は院内感染の原因と

遺伝子

高病原株

低病原株

rmpA

4( 23％)

0( 0％)magA

0( 0％)

0( 0％)

らの多くは口腔内や腸管内の常在細菌叢の構成種であK20( 0％)

0( 0％)り，免疫抑制状態の患者に対してでさえ大抵は感染症を

Kfu

1( 0.8％)12( 43％)

引き起こさない．また，環境中から検出された菌株と同

ybtS

8( 61％)

8( 31％)uge

13( 100％)

25( 89％)iroN

6( 46％)

0( 0％)iroB

6( 46％)

0( 0％)

して重要である．しかし，検出された菌株全てが感染症の原因菌（＝病原性を有する）という訳ではない．これ系統の株がヒトから検出される例があるが，そもそも全ての環境細菌がヒトへの定着能をもつ訳では無い．環境中の細菌が宿主への定着能を獲得し，やがて宿主に対し啓実験で使用した株の遺伝子保有状況て病原性を発揮するようになるメカニズムは解明されていない．
本研究は環境細菌や宿主の常在菌としてありふれた細菌が，宿主中に侵入あるいは定着し，やがて病原性を発揮するようになる進化のメカニズムを解明する．
【方法】2017 年 9 月～ 2018 年 8 月に長崎大学病院の入院患者（ 20 名）から肺炎球菌計 41 株（血液 13 株，喀痰12 株，尿 16 株）を収集した．これらの菌株は，日常的な臨床処置の一環として収集され，同定されたものである．実験は各実験内で週齢と性別を一致させた野生型の雄マウスと雌マウスの両方で行った（ C57BL6 系統）．
41 株を 1.0 X 108 CFU 静脈内投与し，24，48，72，96
時間後に生存率を集計してスコア化し，高病原性の群と

図1

低病原性の群とに分けた．

鉄制限アッセイで検出されたコロニー数

使用した菌株は全て全ゲノム解析を行った．
また，各菌株を使用して鉄制限アッセイ等を行った．

培地中に加えるキレートを漸増させて細菌が生存でき【結果・考察】使用した菌株 41 株のうち，13 株が高病る限界濃度を評価した（図 1 ）．その結果，高病原性の株

原性株であった．それらについて，既報で頻出する高病は低病原性の株に比べて高濃度の鉄存在下で生存できる原性と関連付けられた遺伝子の有無を調べた（表 1 ）．

ことが判明した．しかし，高病原性株どうしを比較した

既報で高病原性と関連する遺伝子として頻出する rmpA ，場合，iroN 遺伝子の有無による差は確認できなかった．

magA ，莢膜型 K2 serotype 遺伝子について，rmpA は 4 株，

また，好中球貪食アッセイを行ったが，高病原株と低magA は 0 株，莢膜型 K2 serotype 遺伝子保有株も 0 株

病原株の間では好中球の貪食について差は認めなかった．

であった．このことから，本研究で扱った株ではそれらの遺伝子とは別の遺伝子が高病原性と関連することが考

今後，iroN が病原性に果たす役割を追求しつつ，iroN
陰性の高病原性を規定する因子についても探求する．

えられた．また，kfu 遺伝子は高病原性株のうち 1 株検出された一方で，低病原性株からは 12 株検出された．
更に，ybtS 遺伝子や uge 遺伝子のように，病原性に関わらず同様の頻度で検出される遺伝子も認められた．一方で，iroN や iroB のように，高病原性株で高頻度に検出され，低病原性株からは検出されなかった遺伝子を認めたため，これらの遺伝子について解析を進めた．
所属

山口大学大学院医学系研究科ゲノム・機能分子解析学講座

E-mail: sakamotk@yamaguchi-u.ac.jp－ 146 －

IFO Res.Commun. 372023

分岐鎖アルコール認識機構とその生理的意義の解明
黒

田

浩

一

【目的】生物は生存を維持するために，栄養飢餓やスト【結果・考察】6 種のイソブタノール耐性酵母について，レス環境を感知して細胞の活動を調節する．例えばイソ様 々 な ア ル コ ー ル 存 在 下 で 生 育 を 比 較 し た と こ ろ，

ブタノールなどの分岐鎖アルコールは，酵母の窒素飢餓時に誘導されるアミノ酸異化反応の副産物として作られgln3Δ（ glutamine metabolism ）株が分岐鎖アルコール
特異的に高い耐性を示したほか，gcn3Δ（ general control

る一方，バイオ燃料として有用である．そのため，酵母

nonderepressible ）株が炭素数 5 以上のアルコールに対は分岐鎖アルコール生産のホストとして期待されるもの

して構造を問わず gln3Δ 株よりも高い耐性を示した．

の，分岐鎖アルコールの細胞毒性が大きな課題であった．

野生株の両アルコールに対する発現変動解析と GO 解

私たちは分岐鎖アルコール特異的に耐性が向上した出芽析を行ったところ，アルコールが無い条件と比較して転酵母を初めて同定し，イソブタノールによる細胞生育阻

写レベルが増大した遺伝子群に差は見られなかった．一

害の新たなメカニズム（図 1 ）などを見出してきた．そ方で，1 - ペンタノール存在下では主に TCA 回路などのの独自の知見から，① 細胞には分岐鎖構造を認識する

炭素固定系，イソペンタノールでは主に呼吸鎖に関連す分子機構が存在し，② 分岐鎖アルコールには重要な生る遺伝子の発現レベルが低下しており，直鎖と分岐鎖で理的意義があると考えた．そこで，本研究ではこれらには異なるアルコール認識・応答機構が働くことで細胞毒ついて解明することを目的とした．

性が引き起こされていることが示唆された（図 2 ）．

図1

分岐鎖アルコールによる酵母の生育阻害機構【方法】私たちの以前の研究において，イソブタノールに高い耐性を示す酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4741

(A)

(B)

図2

野生株において 1 - ペンタノール（A），イソペンタ
ノール（B）存在下で有意に発現レベルが低下した
遺伝子群の GO 解析

株として同定された 6 種の 1 遺伝子破壊株を様々なアル

次に，イソペンタノールに高い耐性を示す gln3Δ 株，

コールを含む SC 培地にて培養し，30℃，24 時間後の生育を比較した．アルコールの構造（直鎖または分岐鎖）

gcn3Δ 株について，両者で耐性の度合いが異なる直鎖の1 - ペンタノール存在下で培養した際の転写レベルをに応じて特徴的な耐性プロファイルを示す株を同定し，RNA-seq により比較した．その結果，発現変動遺伝子

これらの耐性株が各種アルコールに対してどのような細として 39 個の遺伝子群が検出され，これらの遺伝子が胞応答を示すのか網羅的に解析した．野生株および耐性

直鎖アルコール（ 1 - ペンタノール）に対する耐性・感株を直鎖アルコール（ 1 - ペンタノール），分岐鎖アルコー受性に関与する遺伝子であることが示唆された．

ル（イソペンタノール）を含む SC 培地にて 30℃，12 時

本研究により，構造の異なるアルコールが酵母に及ぼ間培養した後，細胞から RNA を抽出し，サンプル調製

す機構について複数の新たな知見が得られた．これらのを経て RNA-seq により転写レベルを網羅的に比較した知見をもとに，アルコール耐性の詳細な機構，ひいては（比較トランスクリプトーム解析）．その結果をもとに両生物の生存戦略の根本的理解を深めるだけでなく，様々

アルコールに対してどのような発現挙動の違いが見られなアルコール類のバイオプロダクションにおける新たなるのかを調べるため，発現変動解析と GO 解析を行った．

技術革新にもつながることが期待される．

所属

E-mail: kuroda@kit.ac.jp

京都大学大学院農学研究科，現 京都工芸繊維大学分子化学系－ 147 －

IFO Res.Commun. 37
2023

祖先型硫黄酸化経路の鍵となる未知酵素の同定
渡

邉

友

浩

【目的】初期の地球生命は，そのエネルギー代謝に亜硫酸（ SO32- ）を用いていたと考えられている．このため，亜硫酸エネルギー代謝を推進するシロヘム含有酵素は，
生命進化の指標として重要である．ところが近年，シロヘム含有酵素とは全く異なる酵素が亜硫酸エネルギー代謝に関わることが提案された．提案されている代謝経路
は現存する一部の硫黄酸化菌に保存されており，ヘテロ
ジスルフィド還元酵素様の複合体（以下，sHdr と呼ぶ）と未知の酵素の共役反応が亜硫酸を合成すると考えられ

Gro7 株から予想されたテトラチオン酸酸化機構

図1ている．しかし，sHdr と未知酵素による亜硫酸合成反応は検証されていない．本研究では，未知酵素を比較ゲノムと比較トランスクリプトームで探索した．

株のトランスクリプトームにおいても同様であった．一【方法】当研究室の分離培養実験によって新設した硫黄酸方で，比較ゲノムおよび比較トランスクリプトーム解析化菌のみから構成される分類群 Sulfuricellaceae 科の基準からは，sHdr と共役して亜硫酸を合成する可能性のあ株ゲノム（ 4 属 8 種）を比較した．そのうち，Sulfuriferula

る酵素遺伝子は見つからなかった．

plumbophilus Gro7 株，Sulfuriferula multivorans T TN 株，
Sulfuriferula thiophila mst6 株，Sulfuriferula nivalis
SGTM 株，Sulfurirhabdus autotrophica BiS0 株の培養条件を最適化し，トランスクリプトーム解析に用いた．培養過程の硫黄化学種はイオンクロマトグラフィーと比色法で定量した．Gro7 株は電子供与体として水素ガス，
チオ硫酸，テトラチオン酸で培養し，対数増殖期および定常期の細胞を集菌した．その他の株はテトラチオン酸で培養し，対数増殖期に細胞を回収した．DNBSEQ によるシーケンス解析は生物技研に依託した．Gro7 株の各培養条件のトランスクリプトームは DESeq2 で比較解析した．
【結果・考察】Gro7 株の培養上清の分析結果より，本菌

図2はチオ硫酸（ S2O32- ）およびテトラチオン酸（ S 4O62- ）を硫酸（ SO42- ）に酸化することが分かった．比較トラ

テトラチオン酸および水素ガスで培養した Gro7 株
トランスクリプトームの発現変動遺伝子

ンスクリプトーム解析の結果より，硫黄酸化エネルギー以上の結果を総合すると，亜硫酸の合成反応は sHdr

代謝経路を予想した（図 1 ）．チオ硫酸またはテトラチ単独で推進されると考えられる．チオール基（ R–SH ）オン酸は，硫黄リレータンパク質に結合したチオール基を酸化して亜硫酸（ SO32- ）を合成するには 3 分子の水

（ R–SH ）として細胞内に輸送される可能性がある．そ（ H 2O）が必要であり，この反応を推進する生体触媒はして，R–SH は亜硫酸を経由して硫酸に酸化されると考シロヘムである．sHdr の活性中心はシロヘムではなくえられる．

鉄硫黄クラスターだと考えられるが，鉄硫黄クラスターの構

水素ガス培養を対象とする DESeq2 解析より，Gro7

造はシロヘムの構造（血液中のヘムと似て複雑な構造をし株では複数の硫黄リレータンパク質と sHdr 遺伝子群のた有機物の中心に鉄が結合）と比べて圧倒的に単純であ発現量が有意に増加し（図 2 ），これらの発現量は他のる．単純な構造を持つ鉄硫黄クラスターが 3 分子の水と反硫黄酸化関連遺伝子の発現量と比べて顕著に高かった．

応して亜硫酸を合成するという反応仮説は，エネルギー代

そして，この結果は T TN 株，mst6 株，SGTM 株，BiS0

謝の進化において重要であり，今後の検証が必要である．

所属

北海道大学低温科学研究所

E-mail: watanabe1986@lowtem.hokudai.ac.jp－ 148 －

IFO Res.Commun. 37
2023

ビスフェノール S 分解微生物系の人工構築と生物処理への応用
武

尾

正

弘

【目的】ビスフェノール S（ BPS）は，ポリエーテルスとなるように BPS を加え，振盪培養（ 150 rpm, 25℃）

ルホン等の耐熱性エンジニアリングプラスチックの原材

による BPS の分解を行ったところ，7 h 程度でほぼ完全料として，近年その使用量が増加している化学物質であに BPS は分解された．この際，代謝物である HQ は分る．しかし，本物質は環境ホルモン作用を有し，またビ

解され，PS 並びに HQS は培地中に残留した．次に，こスフェノール類の中でも特に生分解性が悪いことが知らの 培 養 上 清 に，PS 分 解 菌 PSY7 株 及 び HQS 分 解 菌れており，生態や環境への負荷が憂慮されている．BPS

HQS1 株の細胞懸濁液を加えて，最終濁度 OD600 = 1.0（各分解菌の報告もわずかに存在するが，それらの特徴付け

菌株の濁度は 0.5 ）に調製後，同様に振盪培養による分すら進んでいない．BPS やその誘導体の生産は，国内解を試みた．その結果，期待通りにこれらの中間体は完生産が世界シェアの大部分を占めるため，BPS 含有廃

全に消失した．以上により，3 つの分解菌と nmoA を組

水の安価で安全な処理法の確立も望まれている．そこで，み合わせることにより，ほぼ完全に BPS を分解できる

本研究では，単一微生物では完全無機化できない BPS にことが示唆された．

対して，BPS を部分分解できる既存の微生物を組み合わ

一方，上記研究と並行して，下水処理場の汚泥からせ，人工的に迅速に BPS を無機化できる分解系を構築す

BPS の集積培養を実施したところ，1 ヶ月程度の培養後る．また，この BPS 分解系を実処理に適用できるように，に突如 BPS が分解されるようになり，その培養液から固定化法を用いた BPS 生物処理法の基礎検討も行う．

1 株 の 真 菌 を 分 離 す る こ と が で き（ 図 2 ），BPS1 株【方法】環境ホルモンとして知られるノニルフェノール（ NBRC115858 ）と命名した．この菌株は，その形態や（ NP）の微生物分解の研究の過程で，Sphingomonas sp.
NP5 株の保有する NP 酸化酵素が幅広くビスフェノール類を分解することが明らかとなっている．また，その酵素反応により，BPS は 3 つの単環化合物・ハイドロキノン（ HQ ），フェノールスルホン酸（ PS），ハイドロキ

図2

BPS1 株の走査型電子顕微鏡像

28S rRNA 遺伝子領域及び ITS 領域の解析から，黒色酵
図1

母として知られる Exophiala xenobiotica に属する菌株で人工複合微生物系による BPS 分解の戦略あることがわかった．本菌株を 120 mg/L の BPS を含む

ノンスルホン酸（ HQS）に分解されることもわかって

無機塩培地に少量植菌し，振盪培養したところ，良好にいる（図 1 ）．そこで，BPS の人工分解微生物系の構築

増殖し，2 週間でほぼ完全に BPS を分解した．この際，を 目 指 し， 図 1 に 示 す 通 り，HQ 分 解 菌 Pseudomonas

理論量の 73％の溶存炭素量の減少と 55％の硫酸イオン

putida TSN1 株に NP 酸化酵素の遺伝子（ nmoA ）を導入して BPS を分解させ，さらに生じた HQ をこの菌株の生成が観察された．また，HPLC 分析では，PS, HQ,に資化させた後，同時に生成した PS 並びに HQS をそ本菌株は BPS を資化したと考えられる．単一菌株としれ ぞ れ PS 資 化 菌 Cupriavidus basilensis PSY7 株 及 びて 500 mg/L までの BPS の分解が可能であり，また，ア

HQS 資化菌 Delftia lacustris HQS1 株に分解・資化させルギン酸固定化物では 800 mg/L の BPS を 48 h で分解でることを試みた．

き，繰り返しの分解も可能であった．このような高濃度【結果・考察】無機塩培地で P. putida TSN1（ nmoA ）株の細胞懸濁液（OD600 = 2.0）を調製後，0.4 mM（100 mg/L）の BPS の分解菌の報告はなく，世界で初めての例と考所属

兵庫県立大学大学院工学研究科

HQS 等の顕著な中間体は検出されなかった．従って，えられる．（ 2023 年 2 月特許出願済）

E-mail: takeo@eng.u-hyogo.ac.jp－ 149 －

IFO Res.Commun. 37
2023

ATP-grasp リガーゼにより修飾される新規ペプチドの異宿主生産
小【目的】リボソームにおける合成後の翻訳後修飾ペプチ

谷

真

也

チド配列は，隣接するアミノ酸の α -プロトンとアミド

ド（ RiPP）には，20 を超えるサブクラスが含まれる．

プロトンの間の NOESY 相関によって決定された（図 1）．

ゲノムマイニングにより，新しいクラスの RiPP である

Thr4 の β -プロトンから Asp14 の β -カルボニル炭素へのω エステル含有ペプチドである graspetide の生合成遺伝
子クラスターがバクテリアのゲノムに広範囲に見出されHMBC 相関が観察され，Thr4 と Asp14 の側鎖間のエス
テル結合が示唆された．Lys5 の ε-NH と Glu13 の γ -プロている．このクラスの RiPP は，生合成システムに環状トンの間に NOESY 相関が観察され，Lys5 と Glu13 の側ペプチドの生産に不可欠な ATP-grasp リガーゼが含まれ鎖間のイソペプチド結合が示された．Lys6 と Glu10 でている．これまで，前駆体ペプチドのアミノ酸配列の相も同様の NOESY 相関が観察されたため，Lys6 と Glu10

同性に基づいて，合計約 1500 の候補 graspetide が示さの側鎖間のイソペプチド結合が示された．また，精密質

れ，12 のグループに分類された．この中には未報告の量分析の測定の結果も図 1 の構造を支持する結果が得ら結合を形成する新規性の高い遺伝子クラスターも含まれれた．以上の結果より，新規ペプチド marinomonasin

る．このような背景の下，新しい graspetide を得ることの構造を図 1 のように決定した．

が本研究の目的であり，ゲノムマイニングおよび異宿主生産を試みた．
【方法】海洋プロテオバクテリアMarinomonas fungiaeJCM
18476 のゲノムに Graspetide の生合成遺伝子クラスターを見出した．生合成遺伝子クラスターには，前駆体ペプチド（ marA ）と ATP-grasp リガーゼ（ marB）をコー
ドする 2 つの遺伝子が含まれていた．前駆体ペプチド
コード遺伝子は，バクテリアのゲノムに分布しており，
特に C 末端のアミノ酸配列が非常によく保存されていた．機能不明タンパク質コード遺伝子とキノールモノオ
キシゲナーゼコード遺伝子を含む他の 2 つの遺伝子は，
marA および marB の近くに並んで存在しているが，生合成に関与するかどうかは不明であった．そこで，この4 つの遺伝子を含む領域の分子クローニングを行った．
テンプレートとしてゲノム DNA とプライマーを用いた
PCR により，4 つの遺伝子を含む遺伝子断片を増幅した．
増幅された DNA 断片を制限酵素で切断した後，切断した pET41a プラスミドとライゲーションして，発現ベク

図1

ターを構築した．さらに大腸菌に形質転換を行い，遺伝子発現を行った．

NMR による marinomonasin の構造決定

今回，組み込んだ遺伝子クラスターには ATP-grasp リ【結果・考察】発現ベクターを保有する形質転換体大腸

ガーゼコード遺伝子 marB が一つ含まれているのみであ菌を，栄養寒天培地を使用して発現誘導を行い培養した．

る．前駆体ペプチド MarA に対して作用し，3 つの分子細胞は，寒天培地から直接収穫し，メタノールで抽出し内結合を形成する．そのことから，ATP-grasp リガーゼ

た．メタノール抽出物を繰り返し HPLC による精製にMarB は分子内にイソペプチド結合 2 つ，エステル結合

供して，マリノモナシンを得た．架橋パターンを含む化

1 つを形成する能力を有する新しい二機能性酵素である

学構造を決定するために，DMSO-d6 に溶解したマリノ

ことが示された．今後，X 線結晶解析および酵素学的ア

モナシンの NMR スペクトルを分析した．マリノモナシ

プローチにより，ATP-grasp リガーゼ MarB における

ンの 18 アミノ酸すべてが，二次元 NMR スペクトルデー

marinomonasin の結合形成メカニズムに関して解明が期

タを用いて同定することが出来た．18 アミノ酸のペプ

待される．

所属

静岡大学学術院農学領域

E-mail: kodani.shinya@shizuoka.ac.jp－ 150 －

IFO Res.Commun. 37
2023

プラスチック廃棄物の微生物分解の効率化を目指した生化学・工学的アプローチ
渡【目的】プラスチック廃棄物の環境汚染やマイクロプラ
スチックのヒトを含めた生体への悪影響（健康被害）が指摘されている．これらの問題の原因の一つは，環境中に廃棄されたプラスチック類が生分解されにくいことにある．最近，プラスチック類を分解する細菌や分解酵素の報告があり，機能改変や分子育種等の試みがなされている．本研究では，そのような分解細菌や分解酵素の「分解する側」からの遺伝・生化学的なアプローチだけではなく，生分解されるプラスチック類にも焦点を当てる．
すなわち，プラスチックという「分解される側」に工学的（物理化学的）なアプローチを加え，さらに，環境中に普遍的に存在する微生物でもプラスチック類を効率的に分解できるかについて把握することを目的とした．
【方法】これまで我々が研究対象としてきたビフェニル/PCB 分解細菌十数株のゲノム情報よりプラスチック類の分解・代謝を担う候補となる遺伝子を BLAST 解析等で検索した．検索された候補遺伝子については，クロー
ニング後，Rhodococcus 属細菌の宿主ベクター系で異種発現を行い，精製後，活性測定を行った．さらに，これらビフェニル/PCB 分解細菌を用いて様々なプラスチッ
ク類やその構成成分であるモノマーの化合物を炭素源として生育するかどうか資化性試験を行った．一方，様々なプラスチック素材を裁断・破砕し，これらのプラスチッ
ク片に対し，マイクロ波加熱やプラズマ放電処理を行い（図 1 ），処理したプラスチック片を唯一の炭素源としてビフェニル/PCB 分解細菌を用いて資化性試験を行った．

図 1 裁断したペットボトルのプラズマ放電処理
A. 5 mm 以下に裁断したペットボトル片（ PET 片）
B. アーク放電による PET 片の処理の様子【結果・考察】ビフェニル/PCB 分解細菌のゲノムを精査した結果，例えば，石油由来生分解性プラスチック
所属

京都大学生存圏研究所

邊

崇

人

Poly Butylene Adipate-co-Terephthalate（ PBAT ）等の分解に関与する芳香族エステラーゼ系酵素，ペットボトルの成分である PET（ポリエチレンテレフタレート）分
解細菌 Ideonella sakaiensis 201-F6 株由来の PETase，さらに，生分解性が乏しいポリウレタンのオリゴマーやモノマーを分解する酵素と相同性を有する酵素遺伝子を有し て い た． そ の 内，Cupriavidus basilensis KF708 株 のPETase 様 の 酵 素 遺 伝 子 等 を 異 種 発 現 さ せ， 精 製 後（図 2 ），高いエステラーゼ活性を確認した．

図 2 KF708 株の PETase 様酵素(Cb-PETase)の発現
A. 発現ベクターの構造 B. 精製後の SDS-PAGE 解析

一方，資化性試験の結果，特に PET 片を炭素源として生育できた菌は，我々が解析対象としている12 株のビフェ
ニ ル/PCB 分 解 細 菌 の 内，Rhodococcus wratislaviensis
T301 株のみだった．しかしながら，T301 株においては，
今回実施した 5 種類のプラズマ処理の内，アーク放電処
理した PET 片を用いた際，放電処理した時間に依存するものの未処理の PET 片よりも約 1 ヶ月間の培養でOD600 の値が 1.8 倍から 2.9 倍高くなり，生育が良くなった．なお，現在，T301 株以外の菌株でもプラズマ処理
した PET 片を資化できるか確認中である．また，T301
株の PET 片の分解には，エステラーゼ系酵素だけではな
く，色素脱色型ペルオキシダーゼ等のリグニン分解系の酸化型酵素の関与もあると考え，合わせて解析中である．
今回，プラズマ処理した PET 片では，生育の向上が確認されたことから，プラスチック類の物性変化が微生
物分解を加速させたと示唆される．物性変化については，
今後，表面の粗さ，親水性，接触角，ヤング率等を前処理の最適化のための指標としたい．一方，今回良好な結果が得られなかったマイクロ波による前処理について
は，マイクロ波加熱による特にガラス転移点を持つプラ
スチック類の物性変化の条件を探っていきたい．

E-mail: takahito@rish.kyoto-u.ac.jp－ 151 －

IFO Res.Commun. 37
2023

病原微生物の侵襲進化の解明と新規天然物の探索
荒【目的】放線菌や真菌から得られる天然物は多くの有用

井緑で確認しながら，カラムクロマトグラフィーおよび分取な医薬となって人類に貢献してきたが，近年，新規天然

HPLC で単離・精製し，各種 NMR で構造決定を行った．

物が得られない壁が立ちはだかっている．しかしながら，【結果・考察】病原真菌 A. fumigatus は真菌感染症であ

放線菌や真菌には多くの休眠遺伝子が存在しており，そるアスペルギローシスの主な原因菌として知られていれらを活性化して新規天然物を得ようと世界で試みられる．A. fumigatus とマクロファージ様細胞株 RAW264 をている．そのような中，我々は病原微生物が受ける一つ共培養したところ，共培養特異的化合物が HPLC にてのストレスに気がついた．それは，病原微生物が生体内検出された．大量培養を行い，特異的化合物を単離したに侵入した際に受ける免疫排除のストレスである．そこところ，fumigatinolactone(1)が得られた（図 2 ）．化合で，疑似感染状態を作り出すべく，病原微生物とマクロ

物 1 の構造は各種 NMR および計算科学にて決定した．

ファージ細胞との共培養を行ったところ，共培養特異的化合物 1 の構造中にフマリルアラニンが含まれることにに出現するあるいは生産が増強する化合物を見いだすこ

着 目 し た．A. fumigatus を マ ウ ス に 感 染 さ せ る と，A.

とに成功した（図 1 ）．本手法は新規天然物を得るための世界で初めての新規手法である．本研究では，微生物

fumigatus のフマリルアラニン生合成クラスター SidE が発現上昇することが報告されている．そこで共培養後にと動物細胞の共培養法により得られる天然物を単離・構RNA-seq を行ったところ，共培養のみでも SidE の発現造決定すること，また，その休眠遺伝子活性化のメカニ上昇が見られた．A. fumigatus は，RAW264 と出会うこズムに迫ることを目的とした．

とによってストレスがかかり，フマリルアラニンを多く生成し，fumigatinolactone(1)が得られたと考えている．
また，病原真菌 A. terreus と急性単球性白血病細胞
THP-1 を 2 週 間 共 培 養 し た と こ ろ， ブ チ ロ ラ ク ト ン
Ia(2)が共培養時の増強ピークとして得られた．興味深いことに，2 は，マクロファージの自然免疫反応で放出される一酸化窒素（ NO）の産生を濃度依存的に抑制した（ IC50 18 μM ）．さらに，NO の合成酵素 iNOS の発現も抑制した．さらにマクロファージから放出されるサイ

図1

トカインの一つ，インターロイキン 1 β の発現も転写レ

微生物と動物細胞の共培養による天然物生産

ベルで濃度依存的に抑制した．この結果は，病原微生物
がマクロファージからのストレスを受け，休眠遺伝子を【方法】千葉大学真菌医学研究センターが保有する，臨活性化し，生き残ろうと免疫抑制化合物を産生したと考

床検体から分離された病原真菌 Aspergillus fumigatus おえることができる．

よび Aspergillus terreus に着目した．これらを動物細胞（マクロファージ様細胞株 RAW264 または急性単球性白血病細胞 THP-1 ）とプラスチック製フラスコ内で共培養を行った．細胞を 80 - 90％コンフルエントの状態に培養し，培地を CD(Czapek-Dox)培地等に変更し，別途前培養した A. fumigatus または A. terreus を加えた．大量培養は 175 cm2 フラスコを用い，A. fumigatus は 28 ℃

図2

にて 1 週間，A. terreus は 2 週間静置培養した．遠心に微生物と動物細胞の共培養で生成する天然物て上清と沈殿物にわけ，沈殿物はメタノールを加えて菌以上のように，微生物と動物細胞の共培養によって休体を破砕した後遠心し，上清をエバポレーターで乾固し眠遺伝子が活性化し，興味深い天然物を単離することがた後，始めの上清と合わせ，酢酸エチルで抽出した．共できた．現在，本方法を，病原菌に限らず，麹カビや耐培養で特異的に現れるあるいは増強する化合物を HPLC

熱真菌にも応用している．

所属

慶應義塾大学理工学部生命情報学科

E-mail: midori_arai@bio.keio.ac.jp－ 152 －

IFO Res.Commun. 372023

ヒト病原性真菌の内在性ストレス応答機構を活用した神経変性疾患治療薬開発のための新規戦略
小

菅

康

弘

【目的】酵母のような真核生物から哺乳類まで保存され

2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide ）法にて測定した．

ているオルガネラである小胞体は，タンパク質の合成や【結果・考察】日本大学薬学部病原微生物学研究室で保修飾を行うだけでなく，細胞内 Ca2＋ストアとして，ま有する Aspergillus 属 82 菌株の他に，新たな真菌試料をた脂質代謝の場として機能するなど多様な生命機能に関獲得するため，青森県八甲田山および岩手県五葉山にお与する．この細胞・個体の機能維持に重要な役割を演じ

いて土壌や植物根を採集した．ベイト法や表面殺菌法にている小胞体の機能不全により生じる小胞体ストレスより分離培養を試みたところ，それぞれ 206 株，129 株

が，脳梗塞，ハンチントン病，筋萎縮性側索硬化症，パーを得た．これらの菌体を PD もしくは DG18 での培養にキンソン病やアルツハイマー病などで認められる神経細加えて，イトラコナゾール添加 PD もしくは DG18，TM

胞死に関与することが報告されている．近年，小胞体ス

添加 PD もしくは DG18 で培養した抽出液を作製した．

トレスは糖尿病，炎症や癌などにも密接に関係すること

次に，HT22 細胞によりそれらの細胞活性を評価したとが明らかにされ，この小胞体ストレスを制御する化合物

ころ，僅かな細胞死毒性を示した Mariannaea imbricataの開発が国内外の研究者により行われている．「微生物，NUH319 の代謝産物において，有意な TM 誘発細胞死抑

植物，動物などの天然資源から採取したサンプルに生物制効果が認められた．一方，その近縁種である Mariannaea

活性を見いだし，その活性成分を製品化する」という二

sp. Y868 の代謝産物には，細胞保護効果や細胞毒性を示

次代謝産物の研究は，創薬に限らず関連他分野の学問のすものは認めらなかった．そこで，Mariannaea imbricata

発展にも大きく貢献してきたが，現代では頭打ち感を出

NUH319 の成分探索を行った結果，5 種の新規化合物としつつある．本研究では，難治性の神経変性疾患の治療

6 種既知化合物を単離した．さらに，これらの新規化合薬創製を最終目標とし，真菌に潜在するストレス応答機

物のひとつに細胞死毒性を示さずに細胞保護効果を示す構を利用することで，神経保護薬の探索を高効率化する化合物を見出した（図 2 ）．
以上より，本研究で作製した二次代謝産物ライブラリ

ための二次代謝産物ライブラリの構築を行った．
【方法】前培養後の菌株は，ポテトデキストロース培地

は，有用な生物活性を持つ新規化合物を含有することか（ PD）もしくはジクロラン・グリセロール培地（ DG18 ）ら，小胞体ストレスが関与する神経変性疾患の新たな治

で 1 週間もしくは 2 週間振盪培養した培養液を酢酸エチ

療薬開発ツールとなることが期待される．

ル 抽 出 し， 乾 固 し た も の を ジ メ チ ル ス ル ホ キ シ ド（ DMSO）に溶解して，アッセイ用試料を得た（図 1 ）．
マウス海馬神経細胞由来の株化細胞である HT22 細胞は，ダルベッコ改変イーグル培地に，4000 個/well で播種
し，37 ℃, 10％ CO2 の環境下で一晩培養したものを用いた．小胞体ストレス依存的な細胞死の誘導には，糖鎖修飾阻害剤であるツニカマイシン（ TM ）50 ng/mL を用い，処置 24 時間後の生存率を MT T（ 3[4,5-dimethylthiazol-

図1所属

図 2 Mariannaea imbricate NUH319 含有化合物が TM 誘発細胞死に及ぼす影響
グラフは，4 例の平均値±標準誤差で示した．
##
P< 0.01, #### P< 0.0001 vs. TM alone

糸状菌由来二次代謝産物試料の作製法

日本大学薬学部

E-mail: kosuge.yasuhiro@nihon-u.ac.jp－ 153 －

IFO Res.Commun. 37
2023

細菌性血管新生因子 BafAの社会実装を目指した
高活性オルソログ探索ならびに活性部位の特定
塚【目的】バルトネラ属細菌は人に感染すると血管新生を本健太郎【結果・考察】バルトネラ属 28 菌種に由来する各 BafA

惹起し，血管増殖性病変を形成する．我々は最近，このの HUVEC に対する増殖促進活性は，菌種によって様々病態形成の責任因子として菌から分泌されるオートトラ

な違いがあることがわかった（図 2 ）．

ンスポータータンパク質 BafA を発見した．BafA はヒトの 血 管 内 皮 増 殖 因 子（ VEGF ） 受 容 体 の 一 つ で あ る
VEGFR2 に作用し細胞増殖シグナルを活性化させる細菌由来の血管新生因子といえる（図 1 ）．血管新生因子
は血管研究をはじめ，創傷治癒・心筋梗塞など虚血性疾患への適用，再生医療での臓器構築等様々な用途で用いられる．本研究では，BafA のこうした分野での実用化・
社会実装に向け，より高活性な BafA オルソログの探索と活性に必須な最小領域の特定を目的とした．

図 2 種々のバルトネラ属菌種に由来する BafA の細胞増殖促進活性

次に，菌種番号 6 の BafA の N 末端領域約 360 残基に，菌種番号 4 の C 末端約 90 残基を繋げたキメラ型 BafA を図1作出した結果，VEGF の 1/5 の低濃度でも細胞増殖活性

バルトネラ属細菌が産生する血管新生因子 BafAを示す高活性な BafA 変異体を作出することに成功した．

【方法】データベースからゲノム配列情報が得られたバ

さらにこの BafA 変異体は，HUVEC の管腔構造形成やルトネラ属細菌の 28 菌種について，BafA オルソログを

VEGFR2 シグナルの活性化を VEGFよりも低濃度で惹コードする遺伝子を各菌株から PCR で増幅もしくは人起した．一方，活性に必要な領域の特定を試みた結果，

工遺伝子合成で得た後，大腸菌発現系で各 BafA の組換BafA の N 末端については 54 残基の欠失で VEGFR2 とのえタンパク質を作製した．これらをヒト臍帯静脈内皮細結合が低下し，91 残基の欠失で結合が完全に消失した．

胞（ HUVEC）の培養液に添加し，HUVEC に対する細また，C 末端領域については，427 番目より C 末端側を胞増殖促進活性を調べた．また，その中から活性の高かっ欠失させても結合性は低下しなかったが，408 番目からたものとタンパク質収量が多かったものを選択し，それ17 残基を欠失させると結合が失われた．これらの結果

らのキメラ型タンパク質を作製した．キメラ型タンパク

から，BafA の VEGFR2 への結合には N 末端と C 末端領

質の生物活性は HUVEC に対する細胞増殖促進活性，域の両方が関与していることが示唆された．さらに，こ管腔構造形成活性，および VEGF 受容体シグナルの活れら変異体の細胞増殖促進活性を調べた結果，VEGFR2性化によって評価し，VEGF と比較した．活性領域の特に結合するにもかかわらず，活性を示さないものが存在

定には，比較的収量の高かった Bartonella koehlerae 由した．このことは BafA が細胞増殖活性を示すためには，

来 BafA の N 末端および C 末端領域を様々な長さで欠失

VEGFR2 への結合に加えて他にも必要な要素があるこ

させ，VEGFR2 に対する結合活性と HUVEC に対するとを示唆している．今後はこれらの結果を基に，高活性細胞増殖促進活性を調べた．

型 BafA の実用化に向けた改良を進めていきたい．

所属

藤田医科大学医学部

E-mail: tsuka-k@fujita-hu.ac.jp－ 154 －

IFO Res.Commun. 372023

黄麹菌における光遺伝学的手法を用いたメンブレンレスオルガネラ形成による有用物質生産
樋【目的】微生物を用いた有用物質生産においては，目的物質を生産するために必要な酵素群を細胞内で高発現させる戦略がこれまでに多く用いられてきた．しかし，複数段階の酵素反応により目的物質が生成される場合には，中間代謝物が次反応の酵素と空間的に効率良く反応できず，
結果的に目的産物の収量が多く得られないケースが考えられる．そこで本研究では，黄麹菌 Aspergillus oryzae における有用物質の効率的生産を目指し，各酵素群を相分離して形成されるメンブレンレスオルガネラによって空間的に近接させるための光遺伝学の導入を目的とした．
【方法】まず，黄麹菌における有用物質生産の対象物質としては，希少含流アミノ酸の一種であり，高い抗酸化活性を有するエルゴチオネイン（ ergothioneine, EGT ）を選定した．過剰発現用の Aotef1 プロモーター下で黄麹菌における推定 EGT 合成酵素である AoEgtA/B/C のN 末端および C 末端に改変型緑色蛍光タンパク質 EGFPを融合発現する黄麹菌株をそれぞれ作製した．それらの菌株に対し，蛍光顕微鏡（ Nikon Ti2-A ）による各酵素の局在解析および HPLC による EGT 生産量解析を行った．
【結果・考察】黄麹菌における EGT の生合成は下記のよ
うに考えられる．まず，His と S -アデノシルメチオニン（ SAM ）から AoEgtA によってヘルシニン（ HER ）が生成され，そしてヘルシニルシステインスルホキシド（Cys-HER ）が作られる．さらに AoEgtB と AoEgtC によって EGT が生成される．実際の EGFP 融合タンパク質の局在解析により，AoEgtA は細胞質に，AoEgtB と AoEgtCは細胞質にドット様構造としても観察された（図 1 ）．

図1

所属

裕次郎

このことから，AoEgtA の作用により His から HER を
経て Cys-HER が生成され，それらの反応は細胞質で行われていることが示唆された．また，AoEgtB 及び AoEgtCによって EGT が作られると考えられることから，EGT
はドット様構造で生成されている可能性が示唆された．
実際に EGT 生産量を解析した結果，AoEgtB と AoEgtCの過剰発現株では対照株と比して生産量の増加は見られなかった．一方で，AoEgtA においては EGFP-AoEgtA
過剰発現株において最も生産量の増加が見られた．この結果から，EGFP-AoEgtA が EGFP の作用で細胞内で集合して EGT の生産性を増加させた可能性が考えられた．
次に，黄麹菌細胞における光遺伝学の導入を行った．
光遺伝学的手法の一つとして，Cry2-CIBN システムが存在し，青色光照射によって Cry2 と CIBN の二つのタンパク質が特異的に結合する性質により，任意のタンパ
ク質同士を細胞内で共局在させることに利用できる．まず，黄麹菌細胞内において実際に，Cry2-CIBN システ
ムが作動するかの確認を行った．そこで，赤色蛍光タン
パク質 mCherry を融合した Cry2 を細胞質に，EGFP を融合した CIBN を細胞膜マーカーである AoSso1 とともに融合発現させた．そして，青色光照射によって Cry2と CIBN が結合することにより，Cry2-mCherry の一部
を細胞質から細胞膜に局在変化させることに成功し，
Cry2-CIBN シ ス テ ム に よ る 青 色 光 応 答 が 確 認 で き た（図 2 ）．本システムを用いて，青色光照射によって特定のタンパク質を任意に局在制御することが可能と考えられ，今後は黄麹菌細胞を用いて RNA 相分離を含めたメ
ンブレンレスオルガネラ形成によって有用物質生産のさらなる向上を目指した研究の展開が期待される．

エルゴチオネイン生合成酵素の細胞内局在の蛍光顕微鏡画像．菌糸先端を黒矢印で，酵素のドット様局
在を白矢頭で示す．
スケールバーは 10 μm．
九州大学大学院農学研究院

口

図 2 Cry2-CIBN システムの青色光応答性．上段の矢印部
位における Cry2-mCherry の蛍光強度を中段に示す．また，下段は対応する模式図．

E-mail: y.higuchi@agr.kyushu-u.ac.jp－ 155 －

IFO Res.Commun. 37
2023

嫌気性ベンゼン分解菌の分解力を引き出す：「本当に現場で分解する」菌を目指して
水

口

千

穂

【目的】ベンゼンは各種有機化合物の合成原料や溶媒とイアルを密閉後にオートクレーブで滅菌した後，嫌気して広く利用されているが，発がん性が高く，しばしばチャンバー内でベンゼンを終濃度 15 μM となるように添

地下水汚染が問題になる．低濃度の汚染が広範囲に見ら加して DN11 株を植菌した．バイアル中に残存するベン

れるような場合には，ベンゼン分解菌の利用が浄化の有ゼンの定量や生成物の同定には GC-MS を使用した．ま力な手段となる．Azoarcus sp. DN11 株は好気・嫌気のた，同様の実験系を用いて，培地に添加する還元剤（シ両環境下でベンゼンを分解する通性嫌気性細菌であり，ステイン塩酸塩）の濃度を変化させた時の DN11 株のベ

環境省と経済産業省が定める「微生物によるバイオレメ

ンゼン分解力も評価した．

ディエーション利用指針」適合株に認定されている．し【結果・考察】培地に 18O 標識亜硝酸塩を添加したとこ

かし，汚染現場での分解力が安定せず使いにくいとの声

ろ，ベンゼンの分解は確認できたものの，18O 標識フェがあがっていた．

ノールの生成は確認できなかった．このことから，脱窒

これまでの研究では DN11 株の嫌気条件でのベンゼン

過程で酸素は生じていないと考えられた．培地に添加す

分解経路に着目してきた．過去に実施したベンゼン分解

るシステイン塩酸塩の濃度を変化させた際には，終濃度時のトランスクリプトーム解析でフェノールの嫌気性代が 0.5 mM，1 mM の時に，無添加の場合と比べてベンゼ謝に関与する遺伝子の発現が確認されたこと，また代謝

ン分解速度が低下する傾向が見られた（図 2 ）．また，産物としてフェノールの生成が確認されたことから，培養 14 日目以降にベンゼン分解速度が低下したことか

DN11 株はベンゼンをフェノールに変換し，フェノール

ら，DN11 株は培地に残存する酸素を分解に使用しておの嫌気性代謝経路により分解を進めることが示唆されて

り，酸素が不足すると分解が進まなくなると考えられた．

いた．一方，嫌気条件で実施したはずのトランスクリプ

なお，システイン塩酸塩の濃度が 4 mM 以上の場合には，トーム解析では好気条件で機能する芳香環水酸化酵素遺DN11 株によるベンゼンの分解は確認できなかった．

伝子の発現も確認された．また O 標識水を用いた代謝18

産物解析では 18O 標識フェノールの生成は確認できなかった．以上の背景から，ベンゼンからフェノールへの変換には酸素が関与する可能性が考えられた（図 1 ）．本
研究ではこの可能性を検証し，DN11 株のベンゼン分解
力を引き出すための培養条件を見出すことを目的とした．

図2

図1

培地中のシステイン塩酸塩の濃度が DN11 株のベン
ゼン分解力に及ぼす影響

以上の結果より，DN11 株は培地に残存する酸素を用

DN11 株の推定ベンゼン分解経路

いてベンゼンをフェノールに変換し，その後フェノールの嫌気性代謝経路により分解が進むことが示唆された．

【方法】ベンゼンからフェノールへの変換には，培地か

今 後 は 培 養 系 内 の 酸 素 量 を 定 量・ 制 御 す る こ と で，ら除ききれなかった溶存酸素が使用される可能性のほ

DN11 株のベンゼン分解力と酸素量の関係について検証

か，DN11 株の培養でも使用している硝酸還元条件におする必要がある．実際の汚染現場のことを考えれば，好いて，脱窒過程で生じた一酸化窒素から酸素が生じる可気条件で DN11 株を培養し嫌気環境下へ接種することで能性が考えられた．18O 標識硝酸塩の入手は困難であっ前 培 養 液 中 に 残 存 す る 酸 素 量 を 増 や し て お く こ と，たため，本研究では硝酸塩の代わりに 18O 標識亜硝酸塩

DN11 株 の 接 種 前 後 に 短 時 間 の 曝 気 を 行 う こ と が，を添加した培地を使用し， O 標識フェノールが生成す

DN11 株によるベンゼン分解を促進するために有用であるか検証した．無機培地を窒素ガスでバブリングし，バると考えられる．

18

所属

東京大学大学院農学生命科学研究科

E-mail: csmina@g.ecc.u-tokyo.ac.jp－ 156 －

IFO Res.Commun. 37
2023

ニトリルゴムのバイオリサイクル法の開発
杉【目的】ニトリルゴム（ NBR ）は，オイルシールや使い捨てグローブなど世界中で広く利用されている．NBR
製品製造時の端材および使用済み NBR の多くが焼却処分されているため，有効なリサイクル方法の開発が望まれている．本研究では，NBR のバイオリサイクル法の開発を目指し，NBR 分解菌の探索および NBR 分解代謝経路，分解に関与する酵素について明らかにすることを目的とした．
【方法】NBR を C，N 源とした無機培地を用いて土壌等から NBR 分解菌を探索した．NBR 分解活性は NBR シート（ 1 cm 角×1 mm 厚）の分解前後の乾燥重量変化により評価した．NBR 分解菌の分類学上の同定は 16S rDNA
解析により行った．NBR 分解の代謝経路と分解に関与する酵素を明らかにするため NBR 分解酵素の局在性試
験，精製条件検討，分解生成物分析を行った．酵素活性は上述と同様に酵素反応前後の NBR シートの乾燥重量変化により評価した．酵素反応後の気相，水相，沈殿物について IR ，NMR ，MALDI-TOFMS 等を用いて分解生成物の同定を試みた．さらに，ゲノム解析，RNA 変動解析
によりNBR 分解に関与する酵素遺伝子の推定を試みた．

図1

NBR 分解菌による NBR 分解の様子【結果・考察】37℃，1 週間培養で NBR を 6.5％分解した放線菌 A 株を取得した．培養条件検討により，本菌株はNBR を最大で 11％分解した．分解後の NBR シート表面
を SEM，AFM 観察した結果，シート表面に直径 5 - 10 μm
×深さ 1 - 3 μm 程度の分解孔が多数観察された（図 1 ）．
NBR 分解酵素の局在性試験の結果，NBR 主鎖分解酵素
は細胞表層に局在していることがわかった．細胞膜画分を界面活性剤で可溶化後，2 種類のカラムクロマトグラ
フィーにより目的酵素を精製し，NBR の酵素分解試験を行った．その結果，pH 8，37℃，24 h で NBR を 1.5％
分解した．また，酵素反応にともない O2 消費とアルデヒド生成が認められた．IR 分析の結果，シート表面に存在していた -C =O 基の消失と -CN 基の減少が認められた．この結果は，酵素反応によって NBR 中のアクリ所属

福島大学共生システム理工学類

森

大

助

ロニトリル（ AN ）ユニットが 39 wt％から 34 wt％に減
少し，-C =O 基は検出されなかったという 13C-NMR の分析結果と良く一致した．これらの結果から，NBR 主
鎖中のブタジエンユニットと AN ユニット間の C-C 結合が優先的に切断され AN ユニットが遊離，その際に生じたラジカルが再結合することによって AN 含量が減少したものと考えられる．FE-EPMA 分析の結果，C 原子が 37％減少，N 原子が 7.4％減少，O 原子が 2.4 倍増加
することがわかった．以上の結果から，顕著に増加した
O 原子は NBR の酸化によって生じたものではなく，NBRに充填材として混練されたシリカが露出したものと考えられる．酵素反応後の気相を GC-MS 分析した結果，シアノ基を含む芳香族化合物が検出された．同化合物は NBRの熱分解生成物として報告例があることから，酵素反応においても NBR 熱分解と同様の反応が起こっている可能性が考えられた．さらに，酵素反応によって NBR 中に含まれるカーボンブラックと思われる黒色微粒子と，分解生成物と考えられる乳白色物質の沈殿が生成した．乳白色沈殿を IR 分析した結果，-C = O，-C = CH の存在を示唆するピークが検出されたことから，水に不溶性の分解生
成物は -C = O を含む NBR 酸化物と推定した．酵素反応後の水相を MALDI-TOFMS 分析した結果，1，2 個の O 原子を含む分子量約 750 ～ 2500 程度の NBR オリゴマー（繰り返し単位 6 ～20 程度）と予想される物質が検出された．
A 株のゲノム解析，mRNA 変動解析の結果，少なくとも 2 種類の酸化酵素 OX1, 2 が NBR 分解に関与する可能性が高いと考えられた．NBR 添加培養時に mRNA 転
写量が約 7 倍向上した OX1 を大腸菌組換え生産した結果，微弱ながら NBR 分解活性が認められた．OX1 のアミノ酸（ aa ）配列は，既知天然ゴム酸化酵素の aa 配列と類似性が極めて低かったことから，新奇なゴム分解酵素の取得に成功したと考えられる．

E-mail: sugimori@sss.fukushima-u.ac.jp－ 157 －

図2

NBR 分解菌 A 株による NBR 分解様式

IFO Res.Commun. 37
2023

ポリエチレンテレフタレート分解微生物・酵素の探索
飯【目的】2016 年にポリエチレンテレフタレート（ PET ）を資化する細菌が発見されたことが契機となり，微生物や酵素を利用した PET 分解に高い関心が寄せられるようになった．また最近，PET 分解能を有する酵素は環境中に広く存在することが示され，新たな PET 分解微生物・酵素の発見が期待されている．しかし，その効果的な探索法は確立されていない．そこで本研究では，新たな PET 分解微生物・酵素探索法を開発することを目的とした．また本研究では，当初の計画に加え，メタゲ
ノム法による PET 分解酵素の探索も並行して進めた．
【方法】粉体化 PET を用いた PET 分解微生物の探索法の開発 PET フィルム，ボトルやパッケージなどの使用済み PET 製品をマイクロメートルサイズに粉体化した．
粉体化前後の PET に好熱性放線菌 Saccharomonospora
viridis 由来 PET 分解酵素（ Cut190 ）を作用させ，その分解度を比較した．
メタゲノム解析 高温発酵堆肥よりメタゲノムを抽出し，ショットガンシーケンス解析を行った．得られたコ
ンティグに対し，Leaf-branch compost cutinase をクエリにした Local BLAST 検索を行い，PET 分解酵素遺伝子を探索した．またメタゲノムを鋳型に，PET 分解酵素遺伝子に対するユニバーサルプライマーを用いて PCR を行った．増幅産物をクローニングし，シーケンスを決定した．
得られた遺伝子の末端に His タグ配列を挿入し，大腸菌で組換え発現させた．その可溶性画分あるいは精製タンパ
ク質を用いて，ポリエステル・PET 分解活性を調べた．
【結果・考察】粉体化 PET を用いた PET 分解微生物の探索法の開発 PET を粉体化すれば，比表面積が増大
し，酵素による分解が迅速に進行するため，PET 分解
微生物・酵素の探索が容易になると考えた．そこでその原理実証を，Cut190 を用いて行った．その結果，粉体化 PET は同重量の PET フィルムに比べ，2 倍以上分解された．使用済み PET 製品も，粉体化することで分解性が向上した．また，粉体化 PET と油中水滴を用いた PET
分解微生物の探索法として「光散乱を利用した探索法」，「油中水滴の変形能を利用した探索法」，「増殖を指標にした探索法」を考案し，その要素技術の確立に成功した．
メタゲノム解析 高い PET 分解能を示す酵素の多くは，堆肥由来の好熱性放線菌のクチナーゼである．そこで，高温発酵堆肥より抽出したメタゲノムのショットガン
シーケンス解析を行った．その結果，PET 分解酵素をコードすると思しき遺伝子を 5 種類見出した．このうち
所属

東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻

塚怜

の 1 つは C 末端領域を欠いた読み枠であったが，その遺伝子産物のアミノ酸配列は Thermoanaerobacterales 目細菌の α/β hydrolase と 100％一致した．この α/β hydrolase
を大腸菌で発現させ，精製した．精製酵素を PET フィ
ルムと混合したところ，溶液が白濁し（図 1 上），フィルムの重量が減少した（図 1 下）．また反応溶液中に，分解産物であるテレフタル酸およびモノヒドロキシエチ
ルテレフタル酸の存在が確認された．これらの結果から，
PET 分解能を有することが示された．この研究を進めている間に，他の研究グループより，筆者らが見出した
α/β hydrolase とほぼ同一の配列の酵素が高い PET 分解活性を示すことが報告された．Sonnendecker らは，PET
分解酵素遺伝子に対するユニバーサルプライマーを設計し，堆肥メタゲノムより PET 分解酵素を得た．そこで同じプライマーを用い，新たな PET 分解酵素の取得を目指した．高温発酵堆肥より抽出したメタゲノムを鋳型にして PCR を行い，得られた増幅産物をクローニングした．その結果，32 種類の候補遺伝子を得ることができた．
いずれの遺伝子産物も，好熱性放線菌（ Thermobifida 属
細菌，Actinomadura 属細菌，Thermoanaerobacterales 目細菌）のクチナーゼ，エステラーゼなどと高い相同性（ ≥ 84％）を示した．またその 2/3 は，先行研究で得られた PET 分解酵素（ PHL1, 2, 3, 7 ）と類似していた．各
遺伝子を大腸菌で組換え発現させ，26 種類のタンパク質
を可溶性画分に発現させることに成功した．このうちの多くはポリエステル・PET 分解活性を示し，その活性は近縁酵素に類似する傾向にあった．以上の結果から，このユニバーサルプライマーを用いた探索は PET 分解酵
素のバリエーションを増やす方法として有用であるが，新規性の高い酵素を得ることは難しいと考えられた．

E-mail: ryo.iizuka@bs.s.u-tokyo.ac.jp－ 158 －

図1

精製酵素の PET 分解能

IFO Res.Commun. 372023

水環境中の多様な捕食性細菌による捕食特性の解明とその持続的なウキクサバイオマス高効率生産への応用
井【目的】ウキクサ科植物は水質浄化とバイオマス生産の両面で有望な水生植物として知られている．他方，ウキ
クサ表面には多種多様な細菌が生息し，ウキクサの成長や生理状態に重大な影響を及ぼしている．そのため，細菌群集を適切に制御することにより，ウキクサの水質浄化能及びバイオマス生産能を向上させることが可能になると考えられる．そこで本研究では，他の細菌を溶解し細胞成分を栄養源として生育する捕食性細菌を活用した
細菌群集制御による持続的かつ効率的なウキクサバイオ
マス生産を構想し，基礎研究に取り組んだ．具体的には，
水環境中に生息する捕食性細菌を取得し，それらの溶菌・捕食特性，ならびにウキクサ表層に生息する細菌群集の改変効果を明らかにすることを目的とした．
【方法】Escherichia coli HB101 ，Acidovorax sp. DW036 ，Methylophilus sp. DW102 を餌細菌として添加した重層寒天培地を用い，池水及び汚泥試料を微生物源として，捕食性細菌を探索した．純粋分離された捕食性細菌の中から選抜した代表株を対象として，溶菌・捕食特性を調査した．さらに，コウキクサ（ Lemna minor ）と細菌群集との共生系を用い，捕食性細菌のコウキクサ表面への定着と細菌群集改変効果について検討した．
【結果・考察】複数の微生物源から捕食性細菌を探索した 結 果， 偏 性 捕 食 性 の Bdellovibrio and like organisms（BALOs）に含まれるBdellovibrio属の3 株及び Bacteriovorax
属の 1 株，通性捕食性細菌である Myxococcus 属の 3 株及びArenimonas 属の 1 株，Myxococcota 門に属する未同定の 1
株の計 9 株の捕食性細菌を分離することができた．図 1 には，微小細胞をもつことが知られる BALOs の代表として，Bacteriovorax sp. HI3 の電子顕微鏡画像を示している．
分離菌株のうち，偏性捕食性の Bacteriovorax sp. HI3と通性捕食性の Myxococcus sp. MH1 を対象として，53株の細菌（グラム陰性菌 45 株，グラム陽性菌 8 株）に

図1

所属

大

介

対 す る 溶 菌 の 可 否 を 調 べ た と こ ろ，Bacteriovorax sp.
HI3 はグラム陰性菌 26 株を溶菌可能であるが，グラム陽性菌は溶菌しないこと，Myxococcus sp. MH1 は 53 株
すべてを溶菌できることが明らかとなった．また，E. coli
HB101 を餌細菌として添加したバッファー（pH 7.4 ）を用い，両菌株が旺盛に捕食する 28℃で捕食挙動を詳細に解析した結果，溶菌の速度及び強度は Bacteriovorax sp. HI3 が優れるものの，同株により一旦減少した餌細菌は再び増加することが観察され（図 2），捕食性細菌の種類により，溶菌・捕食特性が顕著に異なることが明らかとなった．
次に，コウキクサ表面の優占系統 6 種を用いたシンプ
ルなコウキクサ－細菌群集共生系，及び池水微生物群を用いて構築した複雑なコウキクサ－細菌群集共生系に対して Bacteriovorax sp. HI3 を植種し，コウキクサ表面への定着と元々生息する細菌群集の改変効果について検討した．特異的プライマーを用いた qPCR による定量の結果，Bacteriovorax sp. HI3 は無菌コウキクサ（次亜塩素酸
ナトリウム水溶液で無菌化）には定着しなかったが，細菌群集が存在するコウキクサ表面では生残したことから，
コウキクサ表面の細菌群を捕食して定着し得ることが明らかとなった．また，Bacteriovorax sp. HI3 の定着量は，
土着の捕食性細菌に影響されることも示唆された．他方，
Bacteriovorax sp. HI3 の植種により，Pseudomonadaceae
科が顕著に減少するなど，コウキクサ表面の細菌群集が元とは異なる構造に変化し安定することが観察され，捕食性細菌をウキクサ表面の細菌群集の制御に活用可能であることが示された．本研究では細菌群集改変に伴うコ
ウキクサの成長促進は確認できなかったが，適切な捕食性細菌を選択することにより，持続的・効率的なウキク
サバイオマス生産にも応用可能であると期待される．

E. coli との共培養時の Bacteriovorax sp. HI3 の走査型電子顕微鏡画像
大阪大学大学院工学研究科

上

図 2 Bacteriovorax sp. HI3 及び Myxococcus sp. MH1 による E. coli HB101 の捕食挙動

E-mail: d.inoue@see.eng.osaka-u.ac.jp－ 159 －

IFO Res.Commun. 37
2023

Aureobasidium pullulans の細胞壁構造から超高分子 β -グルカンの分泌機構を学ぶ
東【目的】Saccharomyces cerevisiae の細胞壁主成分である
β-1,3-グルカンは，UDP -グルコースを基質として細胞膜酵素 FKS1 によって合成されるが，細胞外には分泌できない．食品に利用される S. cerevisiae が自然免疫を活性化する β -グルカンを分泌できれば，発酵食品への新たな機能付与に繋がりその意義は大きい．一方，FKS1 と相同な酵素による β -グルカン合成が予想される二形性
酵母 Aureobasidium pullulans は，β -グルカンを大量に分泌生産する．本研究では，A. pullulans の β -グルカン分
泌機構の理解から，S. cerevisiae における β -グルカン分
泌株の構築に繋がる情報を得ることを目的とした．具体的 に は，A. pullulans の 細 胞 壁 を 生 化 学 的 に 解 析 し S.
cerevisiae と比較した．また，細胞壁を構成するグルカンと分泌されたグルカンの構造を比較した．さらに，細胞壁形成への関与が予想される遺伝子の発現量を解析した．
【方法】グルカン分泌量の測定
β -グルカン高分泌株 A. pullulans TS1 株を使用した．菌
糸形態の誘導には PDB 培地，酵母形態の誘導には Czapek
培地を使用し，50 mL の培養液を含むフラスコで，27℃で72 時間旋回培養した．培養上清のエタノール沈殿物を硫酸加水分解し HPLC を用いグルコース量を測定した．
TS1 株と S. cerevisiae の細胞壁成分の解析
各形態に誘導した TS1 株と S. cerevisiae BY4741 株の細胞壁主要高分子の成分量を測定した．菌体をビーズ破砕処理した後に細胞壁画分を回収した．グルカンとマン
ナンの量は細胞壁画分を硫酸加水分解し HPLC を用い定量した．キチン量は酵素で N -アセチルグルコサミンに分解し，DMAB 試薬で呈色後に 585 nm 吸光度から測定した . 細胞壁タンパク質量は BCA 法により測定した．
細胞壁グルカンと分泌グルカンの解析
分泌 β -グルカン（培養上清のエタノール沈殿物）と細胞
壁 β -グルカン（所定の方法で取得）の構造を 1H-NMR で解析した．β -グルカンに関しては，β-1,3-グルカン分解酵素
処理と透析を行い，透析で外液に抜けた糖量を β-1,3-グル
カン量，内液に残った糖量を長鎖の β-1,6-グルカンとした．
qRT-PCR による遺伝子発現量の測定
各形態に誘導した細胞について，細胞壁形成への関与が予想される遺伝子の発現量を測定した．mRNA を抽出し，逆転写酵素を用いて cDNA を合成した．RT-PCR
により FKS1，GAS1，AGS1 などの発現量を測定した．
【結果・考察】グルカン分泌量の測定
菌体当たりのグルカン分泌量は，酵母形態に誘導した所属

大阪公立大学大学院工学研究科

雅之

方が菌糸形態に誘導したものより約 4 倍多く分泌した．
TS1 株と S. cerevisiae の細胞壁成分の解析
細胞壁の高分子組成の分析結果を表 1 に示す．TS1 株の酵母と菌糸の形態間で組成に大きな違いはなかった．
TS1 株と BY4741 株の比較では，TS1 株はグルカン量が多く，マンナン量が少ないことが分かった．この違いが
β -グルカンの分泌に影響する可能性が考えられる．
表1

細胞壁を構成する高分子の割合（％）
グルカン

マンナン

キチン

タンパク質

S. cerevisiae BY4741

45

35

1

5

A. pullulans TS1 酵母

63

9

1

4

A. pullulans TS1 菌糸

60

6

1

5

細胞壁グルカンと分泌グルカンの構造解析
1
H-NMR の解析から，細胞壁グルカンと分泌グルカン
は共に α -グルカンは検出されず，β -グルカンで構成されていることを確認した．また，長鎖の β-1,6-グルカンは細胞壁グルカンのみに存在していたが，β-1,3-とβ-1,6- の比は分泌グルカンが約 1:1 に対し，細胞壁グルカンは菌糸形態で 3:2 ，酵母形態で 5:2 となり β-1,6- の割合は分泌グ
ルカンが多かった．長鎖の β-1,6-グルカンが β-1,3-グルカンが細胞壁に留まることに影響する可能性が考えられる．
qRT-PCR による遺伝子発現量の測定
FKS1 は β -グルカン分泌量が多い酵母形態で発現量が菌
糸形態より高かった（図 1 ）．β-1,3-グルカンの細胞壁固定への関与が予想された GAS1 では顕著な違いは見られなかった．また，α -グルカン合成への関与が予想された AGS1 は発現量が極めて低く，α -グルカンを合成しないことが示唆された．

図1

菌糸及び酵母形態での遺伝子発現量の比較

その他
S. cerevisiae で は GAS1 遺 伝 子 欠 損 株 で ご く 微 量 の
β -グルカンが分泌されることが分かっていたが，GAS1との欠損の組み合わせにより分泌量が上がる細胞壁関連
遺伝子 CCW12 を見い出し，それらに FKS1 の過剰発現を加えた株についても分泌グルカン量の解析を進めている．

E-mail: azuma@omu.ac.jp－ 160 －

IFO Res.Commun. 37
2023

α -アミノ酸の二量化による有用芳香族複素環化合物の創製
桝
【目的】ピラジンをはじめとした含窒素複素環化合物は香料，医薬品，色素原料などとして広く利用されている．近年，
我々は Pseudomonas fluorescens のピラジン生合成遺伝子
papABCDEF を発見した（図 1 ）．本経路の α -オキソアミン
合成酵素 PapD は α -アミノ酸の 4 -アミノフェニルアラニン(4APhe)から，ピラジン前駆体のアミノケトンを生成する．
本研究では，α -アミノ酸を原料とした多様なピラジン生産系の構築を目指し，PapD の基質特異性の改変に取り組んだ．

尾

俊

介

べてのアミノ酸に対して活性を示さなかった．一方，
L258F はフェニルアラニンに対する比活性は野生型と同様であったが，4APhe およびチロシンに対する比活性が野生型に比べ 1.5 倍程度高かった．これらのアミノ酸残基が基質の認識に関与することが示唆された．WT お
よび L258F の酵素反応液を LC-MS 分析に供したところ，
チロシンおよびフェニルアラニンから当該ピラジンが生成していることが示された．

図2

PapD と PLP-4APhe のドッキングモデル【方法】PapD の立体構造および基質とのドッキングモ
デルは，Alphafold2 および CB-Dock2 を用いて作製した．
PapD 発現用プラスミドを鋳型とした PCR により papDに変異を導入し，HisTrap カラムを用いて精製酵素を取得した．エルマン試薬を用いて酵素反応により生じる遊離の CoA を定量することで PapD の比活性を求めた．
SU-8 および PDMS 樹脂を用いてドロップレット作製用のマイクロデバイスを作製した．
【結果・考察】PapD と基質のドッキングモデルを基に，基質認識に関わるアミノ酸残基を予測した．その結果，
PapD の 200 番目のセリン残基（ S200 ）と 4APhe のベン
ゼン環のアミノ基とが近い位置にあり，その酸素原子と窒素原子の距離は約 2.2 Å であることが示された（図 2 ）．
当該残基，およびピリドキサールリン酸（ PLP）が結合する 260 番目のリジン残基近傍のロイシン残基（ L258 ）に着目し，これらをそれぞれアラニンおよびフェニルア
ラニンに置換した変異酵素 S200A および L258F を調製した．4APhe を含む種々の α -アミノ酸に対する野生型
PapD（ WT ），S200A ，L258F の比活性を測定したところ，
WT は本来の基質である 4APhe の他に，チロシン，フェニルアラニンに対して弱い活性を示したが，S200A はす

S200 および L258 をターゲットとし，前後のアミノ酸残基も含めた領域にランダム変異を導入した発現株ライ
ブラリーをそれぞれ作製した．96 ウェルプレートを用いたアッセイ系を用いて変異株の各アミノ酸に対する活性を測定したものの，目的酵素は得られなかった．よりハ
イスループットなスクリーニングを実施するため，waterin oil in water(W/O/W)ドロップレットの作製法を開発した．独自に設計したマイクロデバイスを用いて，平均内径13 μm，直径 20 μm の W/O/W ドロップレットを 667 Hzの頻度で安定的に作製することに成功した．OD600 が0.1 の大腸菌液を用いてドロップレットを作製すると，全体の 26％のドロップレットに 1 菌体が封入されることが示された．これを回収し，37℃で 18 時間インキュベートしたところ，ドロップレット内で大腸菌が増殖した．CoA-SH 標準液と検出用蛍光試薬を含むドロップ
レットを作製し蛍光顕微鏡観察を行ったが，蛍光が弱く，
CoA-SH の遊離を指標に PapD のスクリーニングを行うには，より高感度の検出系が必要であることが示された．
本研究により PapD の基質認識に関わると予想されるアミノ酸残基が特定された．チロシンとフェニルアラニ
ンから新たなピラジンを生産することにも成功した．また，ドロップレットを用いたスクリーニング系の基礎を構築することができた．

所属

E-mail: masuo.shunsuke.fp@u.tsukuba.ac.jp

図1

P. fluorescens SBW25 の新規ピラジン生合成経路

筑波大学生命環境系，微生物サステイナビリティ研究センター－ 161 －

IFO Res.Commun. 37
2023

腸内細菌が産生する芳香族アミノ酸による腸管病原菌の感染制御
西

山

啓

太

【目的】腸管病原菌の多剤耐性化は脅威であり，腸管感

PPA 濃度と比較し，生理的なレベルとは言えなかった．

染症の制御は重要な課題である．多剤耐性菌の対応策のそこで，腸内での主要な有機酸である酢酸を 10 mM 添

一つに健常者の便移植療法の有効性が知られる．これは，加したところ，1.25 mM PPA でも十分な抗菌活性を示

腸内細菌叢がもつ外来細菌への抵抗性を利用し，多剤耐し（図 1 ），とりわけ S. Typhimurium，Escherichia coli，性菌の腸管定着を排除するものである．このように，多様な細菌から構成される腸内細菌叢は，その均衡性を維

Klebsiella pneumoniae など複数のグラム陰性細菌に対して増殖阻害活性が認められた．さらに多剤耐性大腸菌に持するための共生機構を持つ．これまでに，ヒト便を用対しても同様の効果を示した．一方，グラム陽性細菌やい た 共 培 養 実 験 か ら， 腸 内 細 菌 由 来 の 代 謝 産 物 がBacteroides に対しては，本濃度での増殖阻害活性は確認できなかった．

Bifidobacterium の腸管接着因子である線毛の発現を誘導し，腸内定着を促進することを見出した．さらに，分離・精製技術を駆使し，特定の Clostridium が産生する芳香族化合物の一種 Phenylpropionic acid(PPA)を責任物質として同定した．すなわち腸内には，異種細菌の共生関係を司るシグナル物質が存在することを意味している．
一方，PPA はいくつかの細菌に対して抗菌活性を示す
ことが知られており，Clostridium sporogenes が産生する
PPA の異なる 2 つの性質に着目し，特に PPA が腸管病
原菌の増殖や感染に及ぼす影響を理解し，感染予防に応用することを目的とした．

図1【方法】C. sporogenes の 培 養 上 清 の Salmonella

Salmonella Typhimurium の増殖評価（各濃度の PPA と10 mM 酢酸が増殖に及ぼす影響を濁度にて評価した）

Typhimurium に対する抗菌活性を agar well diffusion 法
により確認した．次に，PPA の特性を評価するため，複PPA が S. Typhimurium の 膜 透 過 性 に 及 ぼ す 影 響 を

数の腸内細菌に対する増殖阻害活性を継時的な濁度測定

SYTOX 取り組み試験により評価したところ，PPA 存在に よ り 評 価 し た． ま た，S. Typhimurium の 蛍 光 色 素

下で細胞内への取り込みの顕著な上昇が確認された．さSYTOX の取り込み試験から膜の透過性変化を確認し，さらに GFP を発現した S. Typhimurium を用いて細胞内らに緑色蛍光タンパク質を発現した S. Typhimurium のpH を測定したところ，PPA や酢酸のみでは生理的な細細胞内 pH を測定することで，PPA による抗菌活性の作

胞内 pH を維持していたが，PPA と酢酸が同時に存在す

用機序について調べた．In vivo 試験として，無菌マウス

ると細胞内 pH が顕著に低下した．すなわち，PPA によに C. sporogenes と Bifidobacterium longum を定着させたる細胞膜の透過性変化と酢酸による細胞内 pH の低下

ノトバイオートマウスを用い，そこに S. Typhimurium をが，PPA による増殖阻害活性のメカニズムと考えられた．

経口感染させた際の感染率を生菌数測定により評価した．

以上の結果を受け，C. sporogenes と B. longum を無菌【結果・考察】S. Typhimurium を播種した寒天培地に C.

マウスに定着させたノトバイオートマウスをモデルに，

sporogenes の培養上清をスポットし阻止円の形成を確認したところ，C. sporogenes 野生株の培養上清は増殖阻害活

S. Typhimurium を経口感染させた．S. Typhimurium 単独
感染群では全個体の最大生存日数は感染後 5 日であるの性が認められたが，C. sporogenes PPA 非産生株の培養上に対し，C. sporogenes と B. longum を前投与した群は感染

清では活性は顕著に低下した．したがって，C. sporogenes

後 10 日目でも 8 割以上の個体が生存した．C. sporogenesの培養上清に含まれる PPA が重要な物質であることが

PPA 非産生株ではこのような効果は認められなかった．

示唆された．次に，PPA が複数の腸内細菌（約 30 菌種）

これらより C. sporogenes が産生する PPA がグラム陰の増殖に及ぼす影響を評価した．PPA は 10 mM でグラ性病原菌の増殖や感染において密接に寄与すること，さム陽性・陰性細菌に対して広く増殖阻害活性を示したがらに本菌種やその代謝産物を腸管病原菌の感染制御に利（ MIC 90 ），C. sporogenes の培養上清や腸内で検出される用できる可能性が考えられた．

所属

東北大学大学院農学研究科

E-mail: keita.nishiyama.a6@tohoku.ac.jp－ 162 －

IFO Res.Commun. 372023

日本人の腸内に特有な酢酸生成菌の多様性解析および新規分離株の取得
山

田

千

早

【目的】腸内フローラとヒトの健康との関連性が注目を添加し，鉄の腐食作用によって発生する水素を培養槽の浴びているが，その形成機構には不明な点が多い．腸内気相に供給する低水素供給培養システムを利用し，よりにおいて糖などの発酵により発生する水素は主に酢酸生

実環境に近い条件下で酢酸生成菌の集積を試みた．糞便

成菌・メタン生成菌により消費されるが，そのどちらがサンプルを微生物源とし低水素供給培養システムで集積優占するのかには個人差がある．特に日本人では酢酸生培養を行い，水素消費および酢酸生成をモニターし酢酸成菌が優占する傾向にあり，その健康・長寿との関連が生成菌の増殖を確認した．また，メタン生成菌の生育を期待されている（図 1 ）．

抑えるために阻害剤（ 10 mM 2 -ブロモエタンスルホン

しかしこれまでにヒト腸内酢酸生成菌として分離され酸）を集積培地に添加した．

詳細に研究されているのはモデル微生物である Blautia【結果・考察】属細菌のみであり，腸内における酢酸生成菌の多様性，

・日本人糞便サンプルを対象とした 16S rRNA 遺伝子解

生理生態，ヒト健康への影響は不明な点が多い．そこで

析および機能遺伝子解析による酢酸生成菌の多様性解析

本研究では，日本人の糞便サンプルを対象とした酢酸生

大人糞便サンプル 5 つと子供糞便サンプル 3 つから成菌の機能遺伝子解析，集積・分離培養により，腸内にDNA を抽出し，16S rRNA 遺伝子解析，Wood-Ljungdahl

おける酢酸生成菌の多様性を解明し新規分離株を取得す経路を担う遺伝子である acsB と fthfs 遺伝子の増幅と解ることを目的とする．

析を行った．子供の糞便( 0 歳児，1 歳児，4 歳児)からは Blautia 属細菌が検出されていなかったのに対して大人の糞便では 10％程度占めていた（図 2 ）．ascB と fthfsの増幅を行ったため多様性解析を行うところである．
・腸内酢酸生成菌の集積培養
低水素供給培養条件および高水素培養条件で集積培養を行った結果，高水素培養条件（ 100 kPa, 20％H 2 80％
CO2 ）で水素の消費が見られたが，酢酸量の増加は見られなかった．酢酸を消費する細菌も同時に集積されてい図1る可能性があり，集積培養を引き続き行なっている．

水素をめぐって競合するメタン生成菌と酢酸生成菌【方法】

Blautia 属細菌が検出されなかった子供の集積サンプルにおいて，水素消費が見られていたため，引き続き集積・機能遺伝子解析による酢酸生成菌の多様性解析

培養を行っており，他の糞便サンプルについても集積培

サンプル:日本人の糞便サンプル（子供および大人）養を開始するところである．

糞便サンプル・集積培養液から核酸を抽出し特異的プラ
イマーを用いた PCR ，塩基配列解析を行った . 一般的な系統分類の指標となる 16S rRNA 遺伝子に加え，酢酸生
成菌の中心代謝系（還元的アセチル CoA 経路）に特徴的な機能遺伝子（ acs，fthfs）を対象に解析し，日本人の腸内にどのような種類の酢酸生成菌がどのくらい存在しているのかを明らかにした．
・腸内酢酸生成菌の集積培養
酢酸生成菌の培養時には基質として 2 気圧（ 200 kPa ）程度の水素を供給するのが一般的である．しかしこれは実環境の水素濃度（ 1 ～ 100 Pa ）とはかけ離れており，
それが腸内酢酸生成菌の分離培養例が少ない要因の一つであると考える．本研究では，0 価の鉄粉を培地溶液に所属

東京大学大学院農学生命科学研究科，現 明治大学農学部農芸化学科－ 163 －

図2

日本人糞便サンプルと集積培養液の 16S rRNA
遺伝子解析

E-mail: chihaya@meiji.ac.jp

IFO Res.Commun. 37
2023

国内における外生菌根性担子菌類 Tomentella 属の
分類学的研究と分離培養法の確立による菌株拡充
早乙女梢

【目的】広義 Tomentella 属（担子菌門イボタケ目）は，域については，13 属 59 配列を用いて分子系統解析を行子実体が背着生，子実層托が平滑～針状，子実層表面がい，結果，各領域の系統樹間に矛盾がないことを確認し赤褐色～黄褐色～黒色で，菌糸の隔壁にクランプを有し，た．次に，分子系統関係，形態的特徴，文献情報を併せ担子胞子が球形～多角形，担子胞子表面に不規則で微小て分類学的に各標本を検討し，結果，得られた 55 標本な突起があることによって特徴づけられる．本属は，枯のうち，9 標本は日本既報告種 2 種（ Thelephora ellisii（ = Tom. ellisii ）および Th. terrestris ）と日本新産種 4 種（T.

死木上や土壌表面に薄膜状（コウヤクタケ型）の子実体を形成し，外生菌根性樹種に加え，ツツジ科やラン科，
葉緑体を欠くギンリョウソウを含むシャクジョウソウ科

papuae，T. pilosa，T. tedersooi および T. viridula ）と同定した（図 1，2 ）．残りの 46 標本は子実層托の形状や色，など多様な植物と共生関係を持ち，冷温帯域～熱帯域に
汎世界的に分布する．
NCBI データベースには，本分類群の DNA 配列が約9,000 も登録されるが（ 2023 年 3 月），その大半は環境
DNA や菌根由来で，子実体の特徴に基づき種が同定されたものはごく少数である．Index fungorum によると
約 200 種 が 本 属 種 と し て 掲 載 さ れ て い る が（ 2021 年
3 月），国内既知種は 3 種のみであり，日本産本属菌の図1

日本新産種の子実体．

分類学的研究は未着手である．そこで，本研究では，国内に分布する広義 Tomentella 属の種構成を明らかにすることを目指し，各地で子実体（標本）を収集し，分類学的検討を行った．また，難培養性であるため，国内外の菌株保存機関には提供可能な本属種の菌株は限られている．本研究では，多胞子分離法を用い，類似種と本属種の菌株拡充も試みた．
【方法】新型コロナウイルスの蔓延防止のため，県外移動は厳しく規制されていたが，それでも 2019 年～ 2022

図2

年に 8 道県（岡山県，鹿児島県，静岡県，鳥取県，兵庫

日本新産種の担子胞子（側面）．

県，長野県，北海道，山口県）にて子実体を収集し，こ菌糸表面への結晶付着の有無，菌糸束の形成および担子れらの一部を多胞子分離に供試した．DNA 抽出は，実胞子の色や特徴に既知種と差異のある多数の未同定種で態顕微鏡下で僅かに掻き取った担子胞子および菌糸より構成されることを明らかにした．本研究により，国内に行った．ITS 領域および nrLSU 領域の部分配列を TA ク

は菌根や環境 DNA としても検出されていない未記載種

ローニング法またはダイレクトシークエンス法で決定が多数存在することが明らかとなった．本研究で検出さし，最尤法およびベイズ法で分子系統樹を構築した．子

れた未同定種のうち，鳥取県のスダジイ林で複数の標本

実体の肉眼的形態的特徴に加え，顕微鏡的な特徴を光学（ 7 標本）が採集された菌種やラン菌根に由来する登録

顕微鏡で観察し，種の分類形質として重要な担子胞子表配列と同一の単系統群を形成する菌種（ 2 標本）につい面の微細構造については走査型電子顕微鏡で観察した．

て，新種の可能性を含めた検討を進めている．

【結果・考察】 国 内 各 地 で の 採 集 調 査 の 結 果， 広 義

本研究により，広義 Tomentella 属に加え，近縁な属

Tomentella 属として 55 標本を得た．NCBI データベースに登録される DNA 配列のうち，タイプ標本由来や分類である Pseudotomentella 属 1 種を含む合計 5 菌株を確立することに成功した．これらは，鳥取大学農学部附属菌学的研究により同定されているものを加え，類似種 3 属

類きのこ遺伝資源研究センターに寄託し，DNA 配列とを含む 110 配列による分子系統樹を作成した．nrLSU 領

菌株情報を付与して公開する予定である．

所属

鳥取大学農学部

E-mail: ksotome@tottori-u.ac.jp－ 164 －

IFO Res.Commun. 37
2023

細菌のセカンダリータンパク質分泌モーター SecDF の活性化状態構造の基盤
塚

崎

智

也

【目的】細菌は，ペットボトルを分解する酵素やベロ毒質との共結晶化法である LCP 法を用いて結晶を得た．

素など様々なタンパク質を細胞外へと分泌する．この分

SecDF と基質との相互作用を検出するために，基質断片

泌過程は Sec タンパク質群が担っている．SecYEG 複合を用いて，バイオレイヤー干渉法で相互作用を測定した．

体がタンパク質膜透過チャネルを形成し，2 つのモー

SecDF をナノディスクに再構成し，電子顕微鏡によるタータンパク質が関与する．一つは細胞質に存在する単粒子解析の準備を進めた．

SecA ATPase であり，ATP の加水分解のエネルギーを【結果・考察】SecDFとSecYEG の結晶を用いた SPring-8

利用してタンパク質の輸送を促進する．もう一つが膜タ

BL32XU での X 線回折実験の結果，約 6Å分解能のデー

ン パ ク 質 SecDF（ プ ロ ト ン 駆 動 の モ ー タ ー） で あ る

タセットを得た．空間群は P41212 であり，分子置換法（図 1 ）．分泌される前のタンパク質はシグナル配列があにより，位相が決定できた（図 2 ）．詳細構造を決定す

り，この情報をもとに Sec 複合体に運ばれたのち，アンるには分解能が低かったため，さらなる高分解能構造のフォールドのまま膜を超えて細胞質外へと輸送されてい決定を目指す．Sec 複合体は，分泌するタンパク質のほく．最終的に基質タンパク質はフォールディングして成とんどが基質となるため，SecDF と基質との複合体を解熟体となる．この過程において，SecDF は SecYEG と析するには，その中でも親和性の高い基質が必要である

相互作用することではじめてモータータンパク質としてと考えた．そこで，マニュアルで 10 アミノ酸からなる機能するとされているが，その詳細は SecDF と SecYEG

基 質 ペ プ チ ド を 5 つ 選 別 し， 合 成 に よ り 準 備 し た．

の複合体の構造報告がないため不明である．本研究ではSecDF とこれらのペプチドとの相互作用をバイオレイ

SecDF と SecYEG の構造決定により相互作用の詳細を

ヤー干渉法で確認した結果，1 つのペプチドが強く相互明らかにする．さらに，未だ不明の SecDF の基質認識作用をすることを示した．次に SecDF とペプチドとの機構も構造生物学的に明らかとし，タンパク質分泌過程

共結晶化を進める．また，複合体の構造解析はクライオを理解することを目指した．

電子顕微鏡による単粒子解析も並行して進めるため，予
備的に SecDF 含有ナノディスクを用いて，測定を行ったところ SecDF の構造解析が可能となる像を得た．今後，基質との複合体の解析を進めていく．
どの複合体についても，今後更なる条件検討が必要であるが，SecDF の構造を報告した我々が，Sec システムの詳細を明らかとすべく，SecDF を含む複合体の解析を進めることが，当該分野に大きく貢献すると考えている．次の段階として SecDF が基質タンパク質を輸送中に，どのように分子内構造変化を起こすのかについて，
さまざまな方法を用いて明らかとしていきたい．

図1

タンパク質の分泌SecYEG 複合体を通るタンパク質の膜透過を SecA,SecDF が駆動する．

【方法】Thermus thermophilus（ 高 度 好 熱 菌 ） ま た はDeinococcus radiodurans（ 放 射 線 抵 抗 性 細 菌 ） 由 来 のSec タンパク質を大腸菌に発現させて，その膜画分からタンパク質の抽出・精製を行なった．SecDF と SecYEGの結晶化では，SecDF と SecYEG を 1：1 で混合し，脂所属

奈良先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科

図2

SecDF-SecYEG 複合体の構造解析（左）SecDF-SecYEG 複合体の結晶（右）SecDF-SecYEG 複合体の結晶のパッキング

E-mail: ttsukaza@bs.naist.jp－ 165 －

IFO Res.Commun. 37
2023

出芽酵母におけるリボソーム品質管理の分子機構
北畠真【目的】真核生物のリボソームは 4 本の RNA と約 80 個て結合した RNA 断片の配列を解析することで，RNA 結のたんぱく質から形成される，高度に保存された巨大複合タンパク質が結合する RNA 領域を特定する手法）を合体である．主な活性は RNA 成分に担われており，重導入した．

要塩基に一塩基置換が導入されるだけでリボソームの機【結果・考察】X にタグ配列を融合させて発現させ，タ能は失われてしまう．われわれは，このような異常リボグを標的にした抗体を用いて，X が結合したリボソーム

ソームを検出して分解する「品質管理機構」が出芽酵母の精製に成功した．しかし予想外の結果として，天然のに存在することを発見し，研究を続けてきた．これまで

X の場合と比較してタグの融合により機能不全リボソーに，機能不全となったリボソームを選択的にユビキチン

ムの分解効率が大幅に低下することが明らかになった．

化する E3 リガーゼを見出すなど，その概要を明らかに沈降したリボソーム複合体にも，品質管理機構の補助としつつある．しかし細胞がどのようにして分解すべき異なるような分子は存在しておらず（ほとんどが大量のリ

常リボソームを見出しているか，もっとも重要な「識別」

ボソームタンパク質であった）X と共に働く因子の結合の原理についてはいまだ分かっていない．最近になって，をタグが阻害している可能性が考えられた．この問題をわれわれは E3 リガーゼとリボソームを物理的に結びつ解決するために X を認識する抗体を受託で作成したが，ける因子 X を同定することに成功した（図 1 ）．この因得られたポリクローナル抗体は結合力が非常に低く，免子 X と相互作用する因子を網羅的に探索し，分解に導か

疫沈降に使用できないものであった．
他の因子の同定が行き詰まった一方で，CLIP 法を用れるリボソームの上でのそれぞれの結合位置を明らかにすることで，「細胞がどのようにしてリボソームの機能をいて X のリボソーム上での結合部位の解明は明快な結果検査しているのか」を解明するのが本研究の目的である．

が得られた．具体的にはユビキチン化されるリボソーム
タンパク質の近傍の，リボソーム表面の RPL22 に隣接した 25S rRNA 配列が多数読み出されてきた．結果をリボ
ソーム RNA の二次構造にマッピングしたのが図 2 である．

図1

ユビキチン化に必要な因子
X はリボソームと E3 の両方に結合するが(左)，ユビキチン化にはそれ以外の因子も必要である(右).

【方法】Saccharomyces cerevisiae BY4741 株を用いて X により免疫沈降したリボソームの生化学的分析を行い，X

図2と直接・間接的に結合する因子の網羅的解明を目指した．
得られた因子の遺伝子破壊を行い，機能不全 rRNA の分解への影響を確認することを予定していた．この目的で因子 X のリボソーム結合部位（黒い太線部分）
60S の表面の隣接した 2 つのドメインに集中している．X は 40S との接触面の近傍に結合するようだ

X にタグ標識を行い，そのタグを認識する抗体を用いてこの結果から品質管理において 60S と 40S の接触の重目的のリボソームを精製する手法を開発した．X を含め要性が示唆されている．今後立体構造の解析をすすめ，関連因子のリボソーム上での位置が，メカニズムの解明

全容の解明に迫りたいと考えている．そのため E3 複合に重要である．これらを解明する目的で，CLIP 法（紫体を大量培養する系の構築や，X が結合したリボソーム

外線照射することでタンパク質と RNA を共有結合で架を大量調製する系の構築を行い，それぞれ効率のよいも橋した後，RNA を部分分解してから目的産物を精製しのが得られている．

所属

京都大学医生物学研究所

E-mail: kitabatake.makoto.5m@kyoto-u.jp－ 166 －

IFO Res.Commun. 372023

植物病原細菌が感染植物組織中に形成するバイオフィルム高次構造と植物病原性との相関解析
別

役

重

之

【目的】植物病害防除は食糧生産における古くからの重要課題である．そのうち，細菌性病害に関しては有効な薬剤も少ないが，その大きな原因としては感染過程の生態学的理解が遅れていることが挙げられる．そこで我々は，蛍光タンパク質を用いた植物病原細菌感染過程のイ
メージング解析系を立ち上げたところ，細菌が植物細胞間隙においてバイオフィルム（ BF ）様構造体を形成することを見出した．一般に BF 形成した細菌は BF 内部での機能分化を介して環境耐性を獲得することなどが知られており，植物病原細菌においてもその病原性に大きく寄与している可能性が高い．そこで本研究では，植物病原細菌の毒素合成遺伝子活性に着目し，このバイオフィル

図1

ム様構造と病原力の相関を解析することで植物病原細菌

接種法で異なる宿主植物葉内での Pst 増殖防除法開発につながる新規知見を得ることを目的とした．

成に関係する遺伝子 cmaD のプロモーターレポーター株【方法】 本 研 究 に お い て は， シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 野 生 型を構築し，植物細胞間隙での Pst コロニー内での活性を（ Col-0 ）植物と Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000調査した．その結果，注入接種ではまず，コロニーごとに株（Pst）を用いた．Pst 株は psbA プロモーター( psbApro)

活性の強弱や有無に違いがあり，コロニー内でも活性細胞制御下で構成的に tdTomato を発現するプラスミドを持が偏在していることが明らかとなった．一方，スプレー接たせた株を用いた．また，本菌が生産する植物毒素コロ

種では全体として強い cmaDpro 活性は見られず，孔辺細ナチンの合成経路遺伝子 cmaD 遺伝子のプロモーター胞に囲まれた一群の菌体でのみ活性が見られた（図 2 ）．

（ cmaDpro）制御下で GFPuv を発現するプラスミドも保有する株を用いた（両株は筑波大学・石賀康博博士との共同研究）．Pst 接種実験においてはポット栽培した植物の葉に接種を行い，接種葉は非切断状態で共焦点顕微
鏡 Leica TCS SP8x を用いて定点経時観察を行った．
【結果・考察】各種条件検討を行い，植物葉組織内における Pst（ tdTomato 発現株）の増殖を経時的に定点観察できる系を構築した．一般に，Pst の病原性解析等のための感染実験はより安定な結果が得やすい注入接種法が用いられるが，Pst を含む細菌病原体の主要な感染経路
としては気孔を介した侵入が知られている．そこで，まずこの観察系を用いて両接種法での増殖様式に違いがあるのかを検討した．その結果，注入接種では球状のコロ

図2

ニーがそのまま拡大していく一方，スプレー接種では植BF 内部での毒素合成遺伝子活性化細胞局在

物細胞間隙を抜けて非感染部へとより早く広がるように以上のことは，これら Pst コロニーがその内部で機能分増殖し，接種方法によって異なる増殖様式をとり，最終化した BF であること，そしてその形態や形成・発達過程，

的にコロニー形態も異なることが見出された（図 1 ）．

そして病原性因子の活性化状況が接種法によって大きく異

この形態の違いが植物に対する Pst の病原性においてなることを示唆しており，植物病原細菌の病原力発揮機構

どのような意義があるのかを調べるために，Pst の重要と BF 形成に関しての興味深い関連を見出すモデルとなるな病原力因子として知られている毒素コロナチンの生合可能性がある．今後，更なる詳細な研究を進めていきたい．

所属

筑波大学生命環境系/微生物サステイナビリティ研究センター，現 龍谷大学農学部－ 167 －

E-mail: betsu@agr.ryukoku.ac.jp

IFO Res.Commun. 372023

氷河微生物の地球規模での地域比較と寒冷適応戦略の解明
瀬【目的】極地や高山に分布する氷河には，寒冷環境に適

川

高

弘

応したシアノバクテリアや藻類などの光合成微生物，従P. priestleyi は，光合成に主に赤色光を利用していたが，アジアのクリオコナイトには赤色光に加えて緑色光も利属栄養細菌，無脊椎動物などが生息している．中でも「ク用するシアノバクテリアや，赤色光と緑色光を光環境変

リオコナイト」と呼ばれる雪氷微生物と鉱物が凝集した化に応じて使い分ける能力を有するシアノバクテリアが粒状の集合体は，氷河上の生化学反応が集中するホット多く存在していた（図 1 ）．アジアのクリオコナイトでスポットであり，氷河生態系の物質循環を駆動する中心

脱窒遺伝子が豊富に検出され，また複数のシアノバクテ的存在である．クリオコナイトの微生物の活動は，氷河

リア種が共存していた背景として，降着物による比較的

のみならず周囲の土壌・海洋を含めた物質循環に影響を豊富な栄養供給があると推察された．加えて，利用する与えている．さらに近年の気候変動と連動した微生物繁

光波長の選択肢を種間で広げることも，複数シアノバク

殖域の拡大は氷河縮小の大きな要因となっている．しかテリア種の共存につながっているものと考えられる．

し，こうした氷河微生物の生理機能や地域多様性，さらに進化過程に関する知見はほとんど知られていないのが現状である．そこで本研究では，氷河微生物のメタゲノ
ム情報を元に，クリオコナイト細菌の代謝能や雪氷微生
物種の進化過程を解析した．
【方法】グリーンランド北西部やスバールバル諸島，南極半島のキングジョージ島などの極域氷河に加え，ネ
パール・ヒマラヤ山脈や中国・天山山脈，キルギス共和国・天山山脈などのアジア山岳域の氷河表面から広くク
リ オ コ ナ イ ト 試 料 を 収 集 し，DNA 抽 出 を お こ な い，
ショットガンメタゲノムシークエンシングをおこなっ

図1た．また微生物種の分子進化解析では，上記試料に加えメタゲノム解析から推測された極域とアジアのクリ
オコナイトの違いてキルギス共和国のグレゴリア氷河の山頂から掘削された 8000 年前のアイスコア試料からも DNA を抽出し，雪氷微生物種の分子進化解析では，極地と中緯度の両ITS2 領域のアンプリコンシークエンシングを行った．

方に分布し，幅広い年代のアイスコア層からも検出さ【結果・考察】メタゲノム解析の結果，クリオコナイト

れる Raphidonema 属（ Trebouxiophyceae ）の雪氷藻類にに含まれる細菌の種類とそれらが保有する様々な遺伝子着目した．これまでの研究で，雪氷藻類は，特定の地を群集総体レベルで把握することに成功し，各々の細菌域にのみ分布する固有種と全球的に分布する汎存種ががどのようにして栄養やエネルギーを獲得しているのか

存在し，両者が同所的に混在して生息していることがを解析した．さらに，極域とアジア山岳域の間でクリオ明らかとなっている．アイスコアの試料年代と絡めたコナイトを構成する細菌の種類や有する代謝能が大きく異なることを初めて明らかにした（図 1 ）．顕著な例とRaphidonema 属の分子進化解析の結果，汎存種の系統は最終氷期以前から存在していること，さらに各地域固有

して，脱窒遺伝子はアジアのクリオコナイトから豊富にの系統は，汎存種の系統から派生したものであることが検出されたが，極域からはほとんど検出されなかった．

判明した．この結果から，汎存種が世界中に分散した後，また，シアノバクテリアにも大きな地域差が認められた．

各地域で独立した微小進化が進行して特定の地域にのみ

極 域 で は 単 一 の シ ア ノ バ ク テ リ ア 種（ Phormidesmis

分布する固有種が生じ，現在の雪氷藻類の地域多様性がpriestleyi ）がクリオコナイトの形成に関与しているのに対し，アジアではそれとは全く別の複数のシアノバクテ創出されたことが示唆された．本研究により，自然環境

リア種が生息していることが判明した．さらに，シアノ河生態系構造の実態解明を進める上での重要な知見が得バクテリアの光エネルギーの捕集に関する地域差が遺伝られた．

下における微小進化による微生物群集形成の理解や，氷子情報から明らかとなった．極域のシアノバクテリア所属

山梨大学総合分析実験センター

E-mail: tsegawa@yamanashi.ac.jp－ 168 －

IFO Res.Commun. 37
2023

適応育種的変異を利用した酢酸菌セルロース合成酵素変異体の作成とそのセルロース合成能の解析
松【目的】酢酸菌が生成するバクテリアセルロース（ BC）
は微細なナノファイバーであり，ナノセルロース素材として化粧品などに利用されている．酢酸菌の BC 生成能
は，ゲノム不安定性に起因するセルロース生合成（ bcs）
オペロンへの変異により消失し，アミノ酸置換を伴い復帰することを見出している（図 1 ）．酢酸菌においては菌膜生成能を有する R（ Rough ）株と生成能を失った S（ Smooth ）株が見いだされている．R 株で振盪培養を繰
り返すと，菌膜形成能を失った S 株が出現し，S 株で静置培養を繰り返すと，再び菌膜形成能を有する復帰変異株（ R’株）が現れる．この性質を利用し，Komagataeibacter
oboediens MSKU3 株（ R 株）から S 株 E3 を取得したが，この株から静置培養によって，4 種のアミノ酸置換を伴なうR’株が得られ，親株の数倍の BC 生産能や微細繊維の BC を有する株を獲得して報告した（ Taweecheep et al.,2019 ）．しかしながら，これらの復帰変異は単一の破壊変
異からの復帰であるため，今回この手法を拡張して，様々な変異パターンを有する多数の S 株を取得することで BCの増産や物性改変を可能にする多数の BC 生産変異株を育種し，その原因について明らかにすることを目的とした．

セルロースオペロンの 3 次構造モデル（A）と 1 塩基挿入変異株から得られた 4 種の復帰変異パターン（B）【方法】MSK U3R 株 は Y PD 培 地（ Yeast extract:
Hipolypeptone:D- glucose = 1％:1％:3％）を用いて培養した．また，YPD 培地は 5 ml を L 字試験管に調製し，30℃，121 rpm で 2 日間振とう培養を行い，培養 2 日目に別に調製した YPD 培地に植継ぐことで複数系統での継代培養を行った．通気条件を変えるために，バッフル
所属

東京農業大学生物資源ゲノム解析センター

峰之介

付き三角フラスコを用いた継代培養も実施した．200 ml
バッフル付き三角フラスコに調製した YPD 培地 100 mlに白金耳接種し，28℃, 121 rpm の円形回転の振とうにより2 日間培養した．培養 2 日目に別に調製した YPD 培地に植継ぐことで同様に複数系統からなる連続継代培養を行った．BC 生産が見られなくなった株について，コロニーを単離し，Illumina シークエンサを用いたゲノムリシークエンスを実施した．公開済みの MSKU3R 株のゲノム配列（RefSeq
assembly acc. no.:GCA_014905215.1 ）をリファレンスとしてゲノムマッピング解析をすることで変異箇所を同定した．得られた BC 非生産株を用いて三角フラスコで静置培養することで復帰変異株の取得についても検討した．

図2

図1

谷

非生産株に生じたセルロース生合成オペロンへの変異（一部抜粋）【結果・考察】L 字試験管またはバッフル付き三角フラスコを用いた連続振盪培養により，それぞれ 9 系統 28株および 8 系統 12 株からなる計 40 株の BC 非生産株を取得した．ゲノムリシークエンスにより bcs オペロンに対する変異を調べて同一系統の重複変異を除いた結果，
12 系統から 15 種のアミノ酸置換またはストップコドン
挿入を伴う塩基置換，6 系統から 7 種の 1 塩基挿入・欠失および 8 系統から 8 種の IS 挿入変異が見られた（図 2）．
このうち，8 系統から検出された IS は全て bcsC 遺伝子の同一箇所（ Leu1261Tn ）に挿入されている．塩基置換や 1 塩基挿入・欠失についても別系統で同一変異がい
くつか得られており，これらは変異が集中するホットス
ポットであることが示唆された．40 株の非生産変異株から三角フラスコを用いた連続静置培養を実施した結果，それぞれ 1 アミノ酸置換体から 1 株，ストップコド
ン変異株から 1 株，フレームシフト変異株から 3 株の R’
株が得られており，現在解析を進めている（図 2 ）．

E-mail: mm207299@nodai.ac.jp－ 169 －

2021 年度若手研究者助成の研究報告
助成期間:2021 年 4 月～ 2023 年 3 月

IFO Res.Commun. 37
2023

医療施設で分離される P. putida グループ新菌種の分類とサブグループ形成関連因子の検索
遠【目的】近年の遺伝子解析技術の発展と細菌学への導入
は，細菌の分類学を大きく変えており，菌株の全ゲノム
情 報 を 基 に し た average nucleotide identity（ ANI ） や
digital DNA-DNA hybridization（ dDDH ）などの in slico
解析ツールを用いることで精確に菌種判定ができるようになった．Pseudomonas 属菌は，系統分類学的に 13 のグループに分類される．これらのグループには P. aeruginosa グループや P. putida グループ等がある．P. putida
グループは，ヒトを含む動物から分離される菌種と主に植物や環境から分離される菌種が含まれている．
Pseudomonas 属菌は近縁な菌種の場合，菌種間の 16S
rRNA 遺伝子配列の相同性が 99％を超える場合があり，正確な菌種同定が難しい属であるため，誤同定が起こりや
すい．当研究室で保存され，過去に全ゲノム情報を取得していた P. putida 臨床分離菌株を調査したところ，細菌同定機器で P. putida として同定された菌株の半数以上は全ゲノム情報を基にした解析では異なる菌種であった．そこで本研究では，緑膿菌以外の Pseudomonas 属菌の菌種の再同定を行い，どの様な菌種が医療施設で伝播拡大しているのか，さらに新菌種が含まれているのかも明らかにする．
【方法】日本の医療施設で分離され，P. putida もしくは P.
fluorescens として同定された 42 菌株を用いた．これらの菌株の全ゲノム情報は MiSeq を用いて決定し，ANI
及び dDDH 解析を実施した．臨床分離株と type strain（基準株）の全ゲノム情報を比較し，ANI 値:> 95％またはdDDH 値:> 70％を示す type strain の菌種をその臨床分離株の菌種とした．また各菌株の薬剤感受性（最小発育阻止濃度:MIC）を 2 倍段階希釈法によって決定した．
薬 剤 は amikacin，aztreonam，ceftazidime，colistin，
gentamicin，imipenem，levofloxacin，meropenem 及 びtobramycin を使用した．全ゲノム情報を基に再同定された菌株を，マトリックス支援レーザー脱離イオン化質
量分析（ MALDI-TOFMS）方法で解析し，菌種特異的
タンパク質の発現パターンを決定した．
【結果・考察】全ゲノム情報を用いた in slico 解析によって，42 菌株のうち 30 菌株（ 71.4％）は既存菌種であったが，残りの 12 菌株（ 18.6％）は既存菌種には同定されなかった．既存菌種に分類された 30 株は，14 菌種に再同定され，更に P. putia と再同定された株は 1 株のみであった．既存菌種に分類できなかった 12 菌株同士をANI 及び dDDH 解析を行ったところ，9 つの菌種に分か
所属

順天堂大学大学院医学研究科微生物学

矢

真

理

れていることが明らかとなり，これら 9 菌種を新菌種として提唱を行った．全ゲノム情報を基にした菌種再同定の結果は，P. putida 臨床分離株には未分類の菌種やその他の菌種が多く含まれていること，Pseudomonas 属菌株の菌種同定は，ANI や dDDH が望ましいことが示唆された．
薬剤感受性試験では，aztreonam 以外には今回供試した 42 株は感受性を示した．一方で既存菌種である P.
protegens，P. carnis 及 び P. lactis と 同 定 さ れ た 菌 種 は
colistin に耐性を示した（表 1 ）．さらに type strain についても colistin の MIC を測定したところ，臨床分離株と同 様 に 耐 性 が 認 め ら れ た（ 表 1 ）． こ の 成 績 は，
Pseudomonas 属の中には colistin に対して生来耐性である菌種が存在していることを示唆している．
表1

colistin に対する薬剤感受性菌株

菌種

MIC（ μg/mL ）Colistin highly resistant isolates
BML-PP019
BML-PP025
P. protegens type strain

P. protegens
P. protegens
P. protegens

4096
1024
512

Colistin resistant isolates
BML-PP010
BML-PP012
BML-PP016
BML-PP035
BML-PP038
P. carnis type strain
BML-PP040

P. carnis
P. carnis
P. carnis
P. carnis
P. carnis
P. carnis
P. lactis

64
32
32
32
32
64
8

分離菌株の質量分析を近縁な菌種ごと（サブグループ）
で比較したところ，それぞれのサブグループの中において菌種間で共通性の高いまたは低いリボソームタンパク
質がそれぞれ存在することが明らかになった．つまり，医療施設で行われている菌種同定装置は質量分析を基にしているので，質量分析のデータベースに全ゲノム情報を基にした菌種同定結果を加えることで精確な同定結果が得られるようになることを示唆している．
本研究から，緑膿菌以外の Pseudomonas 属の菌種分類は不完全であり，これまで P. putida や P. fluorescens と同定されていた菌株の疫学を見直す必要があること，更に菌種特異的に薬剤耐性を示す菌種が存在することが明らかとなった．以上から Pseudomonas 属菌株の全ゲノム情報を基にした更なる疫学調査が必要であることが示唆された．

E-mail: ma-toya@juntendo.ac.jp－ 171 －

IFO Res.Commun. 372023

同型配偶子生殖を行う単細胞性緑藻クラミドモナスを用いた葉緑体母性遺伝の分子機構の解析
小【目的】地球上の多くの生命を光合成で支える葉緑体は，

林

優

介

細胞内共生によって誕生した．その名残として，葉緑体

aadA が次世代に遺伝するかどうかで調べた．
【結果・考察】栄養細胞においてリコンビナーゼ RECAには独自のゲノム DNA が存在する．興味深いことに，は葉緑体 DNA の相同組換え・ゲノムの安定性に関わる．

葉緑体はメンデルの遺伝の法則から逸脱し，多くの生物

接合子において RECA の発現は亢進するが，その意義で片親からのみ子孫に伝わる（母性遺伝）．母性遺伝は，は不明であった．そこで RECA と，葉緑体ゲノムの維雌雄で配偶子のサイズが同じである同型配偶子による生持に関わることが考えられる MOC1，Whirly，MutS2

殖においても観察されることから，父性オルガネラゲノとの多重変異体において母性遺伝が攪乱されるか調べ

ムを受精卵から排除し，母性オルガネラゲノムを選択的た．変異体同士で交配をすると，スぺクチノマイシンにに複製する分子機構が存在すると考えられている．本研耐性を持つ子孫が高頻度で現れた．しかし，PCR 解析の究は，同型配偶子で生殖を行う単細胞性緑藻クラミドモ

結果，薬剤耐性をもつ株からは aadA 遺伝子は検出されナ ス（ Chlamydomonas reinhardtii ） を 材 料 に， 母 性 遺なかった．バクテリアでは，リボソーム遺伝子に変異が伝の分子機構に迫ることにした（図 1 ）．

蓄積すると，翻訳を阻害するスぺクチノマイシンに耐性

一般的に，一つの葉緑体には約 80 コピーの相同な葉を獲得することが知られている．つまり，スぺクチノマ

緑体 DNA が存在する．葉緑体 DNA は裸で存在するのイシンに耐性を示すクラミドモナスの子孫株は，aadA

ではなく，様々なタンパク質が葉緑体 DNA に相互作用

を父性遺伝で獲得したのではなく，葉緑体 DNA のリボすることで核様体という葉緑体 DNA -タンパク質複合体

ソーム遺伝子に変異が蓄積することで誕生したと考えら

として存在する．クラミドモナスでは，接合後約 60 分

れる．この結果は，有性生殖過程では，栄養細胞に比べてで雄由来の葉緑体 DNA が選択的に分解されることが報

葉緑体ゲノムが変異を蓄積させやすいことを示している．

告されていた．本研究の目的は，雄の葉緑体 DNA の分

次に，既知のドメインを持たない EZY1 の解析を行っ解を担うヌクレアーゼや雌の葉緑体 DNA をヌクレアー

た．EZY1 には 3 つのパラログが存在し，雌雄それぞれ

ゼから保護する因子を同定することである．

にコードされている．また，それらは，mating locus と呼ばれる雌雄間で組換えが起きない領域にコードされていることから，交雑で多重変異体を作成することは不可能である．そこで，ゲノム編集を行うことで多重変異体の作成を試みた．Cas9 タンパク質と gRNA をエレクト
ロポレーションによって細胞に導入し，PCR によって当該遺伝子がすべて破壊された株を探索した．雌雄それ
ぞれ 500 株以上をスクリーニングした結果，複数の多重変異体を作成することができた．そのうち，接合効率がよい雌雄 1 株を単離することに成功した．これらの株を

図1

交雑すると，雄の葉緑体 DNA に導入した aadA が次世

クラミドモナスの有性生殖過程の概要．雌雄で等量の葉緑体 DNA が接合子に持ち込まれるが，母系の葉緑体 DNA のみが次世代に遺伝する．

代に高頻度で父性遺伝することがわかった．大腸菌を用いて EZY1 タンパク質を作成し，生化学解析を行ったところ，このタンパク質は DNA に強い結合性を示したが，【方法】本研究では，接合子特異的に葉緑体核様体に局

様々な 2 価の金属イオンを添加してもヌクレアーゼ活性

在する RECA, Whirly, EZY1 タンパク質の逆遺伝学的解は示さなかった．そこで我々は，このタンパク質が葉緑析を行うことにした．各遺伝子の破壊株はクラミドモナ

体 DNA に結合し，母性遺伝の鍵因子をリクルートする

スリソースセンターから取り寄せたり，CRISPR/Cas9

足場として機能するのではないかという新たな作業仮説

によるゲノム編集技術によって作成した．変異体で父性を立てるに至った．当該タンパク質に対する特異性の高遺伝が起きるかどうかは，雄の葉緑体 DNA に aadA（スい抗体を作成することに成功しており，共免疫沈降実験

ぺクチノマイシン耐性）遺伝子を導入し，交配を行い，によって母性遺伝に関与する因子を探索する予定である．

所属

茨城大学大学院理工学研究科理学野

E-mail: yusuke.kobayashi.botany@vc.ibaraki.ac.jp－ 172 －

IFO Res.Commun. 372023

遊離脂肪酸を介した細菌間コミュニケーションによる環境応答機構の解明
神【目的】生体膜は，すべての細胞の基本原理の一つであり，リンや糖を極性基としたグリセロ脂質で主に構成されている．膜脂質は，膜の構造的な役割だけでなく，代謝回転によって組成を動的に変化させ，細胞の生理活性を制御している．膜脂質の代謝回転においては，脂質分解酵素であるリパーゼが，グリセロ脂質から脂肪酸を切り出し，リゾ脂質と遊離脂肪酸（ FFA ）を生成する．
光合成生物であるシアノバクテリアや，大腸菌，黄色ブドウ球菌など多くのバクテリアは，FFA を細胞外に放出したり，細胞外の FFA を膜脂質に取り込むことがわかっている．シアノバクテリアの一種である Synechocystis sp.
PCC 6803（ 6803 株）は，特に強光ストレス下で FFA を細胞外に放出する．オレイン酸（ 18:1 ）などの不飽和脂肪酸は，グラム陽性菌に対して抗菌作用を示すことがわ
かっており，細胞外 FFA が異種細菌との競争に働く可能性もある．本研究では，6803 株を用いて，細胞内外の FFA
における生理学的な意義を明らかにすることを目的とした．
【方法】本研究では，まず FFA の生成機序を明らかにするため，6803 株ゲノムにコードされたリパーゼ様遺伝子の同定を行った．6803 株のゲノムにおいてリパーゼ
ドメインを持つタンパク質をコードする遺伝子は 3 つ存在する．それぞれのリコンビナントタンパク質を無細胞
翻訳系や大腸菌の誘導発現系によって合成・タグ精製し，
基質特異性を解析した．また，強光下におけるリパーゼの活性化について，光合成活性との関連を解析した．さらに，強光下における細胞外 FFA 量を GC-MS で定量した．また，FFA による細胞への影響を明らかにするために，異なる分子種の脂肪酸をシアノバクテリア培地に添加した時の光合成活性を測定した．
【結果・考察】6803 株における 3 つのリパーゼ遺伝子のうち，リン脂質の sn-2 位に結合した脂肪酸を遊離する
ホスホリパーゼ A2（ Pla2 ），及びガラクト糖脂質の sn-1位に結合した脂肪酸やトリアシルグリセロール（ TAG）に結合した脂肪酸を遊離する TAG／ガラクトリパーゼ
A1（ LipA ）を同定した（図 1 ）．6803 株の膜脂質には，
sn-2 に C16 脂肪酸，sn-1 に C18 不飽和脂肪酸がそれぞれ結合している（図 1 ）．不飽和脂肪酸は抗菌作用を持つ
ことから，不飽和脂肪酸を生成する lipA の遺伝子欠損
変異株を作製した．強光下において lipA 株では，不活性化した光合成複合体の分解が遅延し，光合成活性が低下した．これらの結果から，LipA が強光ストレスによって活性化することが示唆された．野生株および lipA 株所属

東京大学大学院総合文化研究科

保

晴

彦

図 1 （a）リパーゼのドメイン構造（b）遺伝子の保存性を
Gclust（ http://gclust.c.u-tokyo.ac.jp/ ）を用いて解析した（c）S6803 株のホスファチジルグリセロールの分子構造において，細胞外 FFA は，パルミチン酸（ 16:0 ）が主
要な遊離脂肪酸であったが，野生株では強光照射後にパルミトレイン酸（ 16:1 ）やリノール酸（ 18:2 ），リノレン酸（ 18:3 ）の量が増加していた．この増加は lipA 株において見られなくなったことから，強光下での LipA の活性化が，細胞外への不飽和脂肪酸の放出に必要であることが明らかとなった．次に，FFA 分子種による光合成への影響を解析したところ，18:2 や 18:3 は，光合成複合体を不安定化させ，光合成を不活性化した．したがって，細胞外 FFA の分子種による，細胞の生育制御が示唆された．
強光は，細胞集団にほぼ一様に照射されるが，ストレスに応答するまでの時間は，細胞毎に異なる．環境変化に素早く応答してリパーゼを活性化し，光合成の代謝回転を促進できた細胞は，不飽和脂肪酸を細胞外に放出し，集団内のまだストレスに応答できていない細胞に対して，生育を抑制することで，集団としての環境応答を促進すると考えられる（図 2 ）．今後は，1 細胞解析などにより強光下での光合成活性の変化とリパーゼ遺伝子の活性化，細胞の生育について明らかにする必要がある．

E-mail: hjimbo@bio.c.u-tokyo.ac.jp－ 173 －

図 2 FFA を介した細胞集団の環境応答

IFO Res.Commun. 37
2023

地衣化菌が共生藻を認識する仕組みに関する研究升本

宙【目的】約 2 万種の菌類は緑藻やシアノバクテリアを主を形成し，正常な地衣共生の誘導が確認された（図 1 ）．

とした“共生藻”と地衣共生を営んでおり，これらは“地実験 2 ）では地衣体形成が部分的に観察されたものの，菌衣化菌”と呼ばれている．地衣共生は一般に「財の提供」

糸が絡みついていない藻類細胞も多数見られ，地衣共生と「サービスの提供」からなる相利共生の関係にあるとの誘導は不完全であった．実験 3 ）では菌糸が藻類に絡むされている．すなわち，共生藻は地衣化菌に光合成産物

様子は観察されず，地衣共生の誘導は確認されなかった．

を提供し（財の提供），地衣化菌は地衣体という特殊な構造体を形成して内部に共生藻を住まわせることで乾燥や紫外線等の環境ストレスから保護する（サービスの提供），という関係性である．しかし，地衣化菌と共生藻が互いをどのように認識しているのか，また，地衣共生時に物質やシグナル等の相互のやり取りが存在するのかど
うかについては未だ解明が進んでいない．本研究では地衣化菌と共生藻の相互認識の機構を解明するためのアプ
ローチの一つとして，地衣化菌 Multiclavula mucida（担子菌門アンズタケ目カノシタ科）と共生藻 Elliptochloris
subsphaerica（緑藻植物門トレボウクシア藻綱）の地衣
共生系を材料とした地衣共生の誘導実験を行った．そし図1

実験 1 ）の共培養で形成された粒状の地衣体て，M. mucida の遺伝子発現を地衣共生成立時と単独培養時で比較することにより，地衣共生の成立や共生藻の実験 1 ）の場合に単独培養比で高発現した遺伝子とし認識に関わる可能性が高い遺伝子の抽出を試みた．

て，GPR1/FUN34/YaaH や MF S general substrate【方法】地衣化菌 M. mucida NBRC 114396 株を用いて，

transporter，ABC transporter などの（推定）輸送体タ

実験 1 ）本来の共生藻である E. subsphaerica NIES-4525

ンパク質，C2H 2 型や Zn(2)- Cys(6)型の転写因子，炭素株との共培養（ Mm+Esub ），実験 2 ）本来の共生藻と同代謝に関わる炭酸脱水酵素やリパーゼ，推定分泌型低分属 別 種 の Elliptochloris sp. NIES-4523 株 と の 共 培 養

子量タンパク質をコードする遺伝子などが見出され（表（ Mm+Esp1 ）， 実 験 3 ）本 来 の 共 生 藻 の 姉 妹 属 の1 ），これらは地衣共生の成立と維持に関わっている可

Coccomyxa sp. S-203-PL-004 株との共培養（Mm+Cocc ），実験 4 ）M. mucida のみの単独培養（ Mm ），以上の 4 つ

能性が高いと考えられる．特に，実験 1 ）の場合でのみの培養実験を行った．各培養実験はコーンミール寒天平

過程において関与している可能性が考えられ，その機能

板培地上に設置した滅菌済みのバルサ材（ 3 cm 角，厚について今後詳細に解析すべき対象であるといえる．

高発現した遺伝子に関しては，本来の共生藻を認識する

さ 2 mm ）上で行い，20℃の培養器内で 16 h/8 h の明暗周期を実施した．そして，培養 100 日後に各培養系での

表 1 地衣共生成立時に高発現した遺伝子

地衣共生の有無を光学顕微鏡により観察するとともに，菌体を回収して RNA-seq で遺伝子発現を解析した．転写 産 物 の 発 現 の 定 量 に お い て は，HISAT2 を 用 い て
M. mucida NBRC 114396 株のゲノムへのマッピングを行い，StringTie を用いて遺伝子ごとの発現量（ TPM ）を算出し，「 E. subsphaerica との共培養時／M. mucida の単独培養時」の発現量の比が 5 倍以上となった場合において，共生時特異的に高発現した遺伝子として抽出した．
【結果・考察】 培 養 100 日 後 の 観 察 に お い て， 実 験 1 ）では菌糸が藻類細胞に絡みついて粒状の構造体（地衣体）
所属

筑波大学山岳科学センター，現 京都大学大学院地球環境学堂

E-mail: masumoto.fungi@gmail.com－ 174 －

IFO Res.Commun. 372023

盗葉緑体生物群から探る葉緑体獲得進化の共通原理の解明
大沼亮【目的】藻類は捕食栄養性だった祖先種と取り込んだ光藻を除いた条件では増殖することができず，明所でクリ

合成性生物との細胞内共生によって誕生したとされる．

プト藻添加したときのみに増殖が確認された．これらのしかし，捕食栄養性から細胞内共生を経て藻類化する進ことから，N. poecilochroum では盗葉緑体への栄養塩輸化過程には不明な点が多い．盗葉緑体現象は，もともと送を行っておらず，光合成，および葉緑体での無機栄養

葉緑体を持っていない生物が光合成性生物を捕食し，そ塩の同化に依存しているというよりは，捕食によって得の葉緑体を一時的に維持して光合成に用いる現象で，葉られる物質に依存していると考えられる．真の葉緑体に緑体獲得への進化の中間的段階であると解釈される．盗近い現象を示す N. aeruginosum では NRT，NR ，AMT の葉緑体性渦鞭毛藻類 Nusuttodinium 属には比較的捕食に遺伝子群が明期で発現上昇することがわかった（図 1 ）．

近い盗葉緑体現象を見せる種（ N. poecilochroum ）から

また , 硝酸還元酵素の系統解析から，渦鞭毛藻が持ってオルガネラに近い現象を示す種（ N. aeruginosum ）までいる NR はクリプト藻からの水平転移によって獲得されバリエーションが存在するため，葉緑体獲得の研究には格たものであることが明らかとなった．異なる窒素源に応

好の材料である．本研究は Nusuttodinium spp. を主な対じたトランスクリプトーム解析の結果，宿主渦鞭毛藻の象とし，盗葉緑体現象の種間比較を行うことで葉緑体をNRT，NR は硝酸を与えたときに発現上昇し，藻類や植一時的に維持する機構を解明することを目的とした．また，物に共通する発現パータンを示すことがわかった．N.

Nusuttodinium 属に見られる盗葉緑体現象を盗葉緑体性
ユーグレナ Rapaza viridis と比較することにより，葉緑体

aeruginosum はクリプト藻を除去し，それぞれアンモニ
ウム，亜硝酸，硝酸イオンを唯一の窒素源とした培地で増獲得進化に関する共通原理を解明することを目的とした．

殖することが可能であるため，これらのイオンを積極的に【方法】本研究では，以前より研究室で維持している細胞外から取り込み，共生体に輸送していることが示唆さ

Nusuttodinium aeruginosum と N. poecilochroum の培養株を用いた．各渦鞭毛藻株には餌生物としてそれぞれクリれた．特に，硝酸単体でも増殖可能であることから，宿主

プト藻 Chroomonas sp. Dc01 株とChroomonas sp. Ak01 株

だ硝酸を還元して共生体に与えている可能性も示唆された．

渦鞭毛藻はクリプト藻から獲得した NR を使って取り込んを与えて培養した．明暗に応じたトランスクリプトーム

盗葉緑体性ユーグレナ Rapaza viridis でも，遺伝子のの変動解析の培養条件として，餌のクリプト藻を取り除由来は不明であるが，NR 遺伝子を水平転移によって獲いた後，暗期で 24 時間培養したものを基準とし（0 時間），得しており，この NR を用いて硝酸を還元し，盗葉緑体

明期に移して 1，6，12 時間後，再度暗期に移して 1 時に輸送していることが示唆された．これらから，現生の間後（ 13 時間）とし，明期と暗期のトランスクリプトー藻類が持つ硝酸同化能は，盗葉緑体性の生物でも獲得しムの変動を比較した．N. aeruginosum における異なる窒うることが示唆され，葉緑体獲得への進化では光合成に素源に応じたトランスクリプトームの変動解析の培養条関する遺伝子群の水平転移による光合成の制御機構獲得件として，餌のクリプト藻を取り除いた後，硝酸のみ，

よりも先に，無機栄養塩輸送・同化の機構を獲得する進亜硝酸のみ，アンモニウムのみ，窒素源なしの 4 条件で化が起こる可能性があることが考えられる．

5 日間の連続明期培養（明暗による影響を避けるため）を行い，トランスクリプトームを比較した．盗葉緑体性
ユーグレナ Rapaza viridis でもトランスクリプトーム解
析によって窒素同化に関する遺伝子群の探索を行った．
【結果・考察】明暗に応じたトランスクリプトーム解析の結果，捕食に近い盗葉緑体現象を示すN. poecilochroum
は硝酸輸送体（ NRT ），硝酸還元酵素（ NR ）の遺伝子が発現しておらず，その他栄養塩の輸送に関わると考えられる遺伝子群（アンモニウム輸送体，AMT ）は明暗の切り替えで発現が変動しないことが明らかとなった（図 1 ）．培養実験の結果，N. poecilochroum はクリプト
所属

神戸大学内海域環境教育研究センター

図1

N. poecilochroum と N. aeruginosum の明暗に応じた
窒素同化に関する遺伝子群（ NRT，NR ，AMT ）の発現変動

E-mail: ryoonuma@harbor.kobe-u.ac.jp－ 175 －

IFO Res.Commun. 372023

植物病原細菌の感染プロセスに重要なホスファチジルコリン生合成機構の構造基盤解明
渡

邊

康

紀

【目的】ホスファチジルコリン（ PC）は真核生物特異的か っ た．AtPmtAΔN25 は SAH 結 合 に 伴 っ て 強 固 な

リン脂質であるが，Agrobacterium tumefaciens 等，植物

フォールドを形成することが示唆された．

へ感染し，宿主の腫瘍形成を導く一部の細菌は生体膜中に PC を含んでおり，真核生物のリン脂質組成と似ている．PC を生合成できない A. tumefaciens は，植物への感染能を失うことが報告されており，PC が植物への感染プロセスに重要な役割を担うことを示唆している．
PC はリン脂質 N メチル基転移酵素（ PmtA ）が触媒する S -アデノシルメチオニン（ SAM ）をメチル基供与体としたホスファチジルエタノールアミン（ PE）の三段
階のメチル化反応によって生合成される．本研究では，
構造生物学的アプローチを主軸に PmtA による PC 生合成機構の解明をめざした．

図1【方法】A. tumefaciens 由来 PmtA（ AtPmtA ）および大豆
根粒菌 Bradyrhizobium japonicum 由来 PmtA（ BjPmtA ）AtPmtAΔN25-SAH 複合体の結晶構造．全体構造（左）と SAH 結合領域の拡大図（右）を示す．

について，大腸菌の発現系を用いて調製した．結晶化はAtPmtA は PE の三段階のメチル化反応全て触媒する

蒸気拡散法を用いて行った．得られた結晶を用いてことで PC の生合成を担うが，BjPmtA は PE の最初の二SPring-8 の BL32XU に て 回 折 実 験 を 行 っ た． 位 相 は段階のメチル化反応しか触媒しない．AtPmtA の SAH

AlphaFold 2 による AtPmtA の予測構造を利用した分子結合部位から示唆された PE の認識ポケットを構成する置換法により決定した．NMR 測定用 13C, 15N ラベル化

アミノ酸のうち，Ile159 が BjPmtA では Phe161 になっ

AtPmtA は，13C, 15N ラベル化 M9 培地で培養した大腸菌ていた（図 2AB）．各種 PmtA 発現大腸菌膜のリン脂質の系を用いて調製した．NMR の測定は，北海道大学次を 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 法 に よ り 調 べ た と こ ろ，

世 代 物 質 生 命 科 学 研 究 セ ン タ ー の 800 MHz も し く は

AtPmtA の I159F 変異体は PE の三段回目のメチル化反600 MHz NMR 装置を用いて行った．

応の触媒活性が低下し，BjPmtA の F161I 変異体は PE【結果・考察】結晶化には AtPmtA の N 末端 25 残基を欠の三段階のメチル化反応を全て触媒した（図 2C）．以上損させたコンストラクト（ AtPmtAΔN25）を用いた．

のことから AtPmtA の Ile159（ BjPmtA の Phe161 ）が基

SAM からメチル基が解離した S -アデノシルホモシステ

質特異性の決定に関与していることが示唆された．

イン（ SAH ）を AtPmtAΔN25 と混合することで結晶を得ることに成功した．SPring-8 の BL32XU にて回折デー
タ を 収 集 し，2.0 Å 分 解 能 で 結 晶 構 造 を 決 定 し た．
AtPmtA はロスマンフォールドを形成しており，そのフォールド中の溝に SAH が結合していた（図 1 ）．13C,
N ラベル化した AtPmtAΔN25 を用いて，SAH を添加

15

前および添加後のサンプルについて各種三次元 NMR を測定し，主鎖帰属を行った．SAH の添加に伴って，いくつかの NMR シグナルについて化学シフト変化が見られ，新たに出現した NMR シグナルも観測された．化学
シフト変化が見られたアミノ酸残基および新たに NMR
シグナルが観測されたアミノ酸残基を結晶構造上にマッピングしたところ，主に SAH 分子近傍に位置している
アミノ酸残基の NMR シグナルが変化していることがわ
所属

山形大学理学部理学科

E-mail: yasunori@sci.kj.yamagata-u.ac.jp－ 176 －

図2

A. SAH 近傍に位置する Ile159 残基．B. AtPmtA と
BjPmtA の配列アラインメント．C. AtPmtA 変異体
および BjPmtA 変異体の PC 合成活性．

IFO Res.Commun. 372023

マウス腸内細菌におけるゲノム進化速度の解明
高

安

伶

奈

【目的】ヒト一人あたりが保持しているバクテリアの細まず，腸内細菌の長期観測サンプルから，一生の各時期

胞数，ゲノムサイズ，複製回数と，大腸菌ゲノムで起こ

における腸内細菌の成長率の変化を推定したところ，大るゲノム変異(SNP)の in silico での速度試算からは，一きな変化が観測された．Erysipelotrichacea 科の一種で日に腸内で起こりうるゲノム変異は実に 10 の 9 乗～ 12
乗とも試算されている．腸内細菌は今も宿主とともに共Dubosiella 属に属する細菌ゲノムでは，生後 400 日程度までの若年期の長期にわたり，非常に活発にゲノム複製

進化していると考えられているが，腸内細菌が実際に腸を行っていた一方，後半生ではゲノム複製はかなり抑制内で進化している様子を時系列で追った研究はまだ非常されていた可能性が示された（図 1 ）．

に少ない．本研究では，マウスの一生にわたる腸内細菌の観測に基づく，細菌ゲノムの変化の解明を目的とした．
【方法】本研究では，8 匹の同腹の SPF マウスの糞便を長期にわたりサンプリングし，酵素法を用いて DNA 抽
出した後，ロングリード（ PacBio Sequel II ）と，ショートリード（ Illumina Novaseq 6000 system ）のシークエンス技術で得られる両データを組み合わせ，細菌ゲノムの再構築と一塩基多型（ SNP）の推定，iRep（ C. Brown
et al., Nature Biotechnology, 2016 ）を用いたゲノム複製
速度の推定を行った．また，ショートリードのデータか
らメタゲノミックアセンブルゲノムを構築し，マウスの

図2

生涯を通じて発生した水平遺伝子伝播（ HGT ）イベン
トの推定も行った．

L. intestinallis ゲノムにマップしたリード 1 つあたりのゲノム変異数の一生にわたる変遷【結果・考察】今回，ロングリード（PacBio Sequel II ）と，
ショートリード（ Illumina Novaseq 6000 system ）のシー
クエンス技術を組み合わせた最新のメタゲノム解析によLactobacillus intestinallis のゲノムでは，特に生まれた直後に非常に高い率でのゲノム複製が観測された一方，離り，Lactobacillus，Alistipes，Dubosiella 属等を含む計 15

乳後は安定した挙動を見せた（図 1 ）．ただし，観測さの完全長細菌ゲノムが再構築され，それらのゲノム比較

れた突然変異は生まれた直後に偏るわけではなく，特にを行った．これらの解析の中で，一生にわたる複雑な腸生後 50 日程度，400 日程度のタイミングで急激なゲノ

内細菌のダイナミクス変化の裏に潜む細菌群の成長速度

ム変異の増加を確認した（図 2 ）．また，個々の塩基変の変化に加え，細菌のゲノムが一生の中で進化していく

異について相対存在量をショートリードメタゲノムデー

様子を捉えることに成功した．

タから推定し，似た時系列ダイナミクスの変異をクラス
タリングすることで，株レベルのダイナミクスの推定を行った．生後すぐは 5 株程度が存在したと推定される．
また，当初独占状態にあった株と，一生の中盤以降に多数を占めた株は異なっていた．ゲノム上に観測された変異をマップすると，13 箇所の変異のホットスポットが
存在した．

図1

所属

細菌ゲノムの複製速度の一生にわたる変遷例

東京大学医学系研究科

E-mail: lena.takayasu@humeco.m.u-tokyo.ac.jp－ 177 －

2021 年度学会・研究部会助成の研究報告
助成期間：2021 年 4 月～ 2023 年 3 月

IFO Res.Commun. 37
179-181, 2023

日本微生物資源学会における微生物分類学に関する支援活動
大

熊

盛

也

【活動内容および成果】

表1

日本微生物資源学会は，微生物多様性の理解とその保全及び持続的利用に資するため，微生物資源に関する科
学技術や微生物系統分類学の発展を促進することなどを目的としている．2015 年日本微生物系統分類研究会の当学会への合流を機に「微生物系統分類部会」を設置し，微生物分類学に関する当学会の学術活動の方策や将来計画についての議論等を行ってきた．公益財団法人発酵研究所 2021 年度学会・研究部会助成に基づき，微生物系
統分類部会を中心に，微生物分類学を志す若手研究者および関連研究者の支援と人材育成，および，微生物分類
学分野の活性化をめざした活動を実施した．

学会参加への支援

氏名(所属)

発表学会

森 雄吾(千葉大真菌医セ)

Asian Mycological Congress 2021,
Bangkok, Thailand

谷道琢朗(千葉大真菌医セ)

Asian Mycological Congress 2021,
Bangkok, Thailand

日高仁晴(千葉大真菌医セ)

Asian Mycological Congress 2021,
Bangkok, Thailand青木敬太(東農大総合研)

36th International Specialized
Symposium of Yeasts, Vancouver,
Canada阿部晃大(茨城大理)

日本微生物生態学会第 35 回大会
札幌

丸岡直弥(東工大生命理工)日本微生物生態学会第 35 回大会
札幌

1．学会参加，論文発表への支援
学会やシンポジウム等における「分離・分類・保存」
に関する研究発表に対し，渡航費や参加費等の支援を表2行った．コロナ禍の影響で学会発表がオンラインとなる

論文発表への支援場合が多く，論文投稿に対する掲載費・オープンアクセ

氏名(所属)

発表論文

ス費等の支援も合わせて行うこととした．支援の対象は，

酒井博之(創価大理工)Microbiol. Resour. Announc.,
10 (38): e0058221 （2021）

鈴木重勝(国立環境研)Mol. Bio. Evol.,39 (2): msac001 (2021)

加藤真悟(理研 JCM )Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,
72 (8): 005489 (2022)

鈴木重勝(国立環境研)DNA Res.,29 (6): dsac037 (2022)

当学会の大会・シンポジウム等で発表実績のある成果，
または，今後成果発表をすることを条件とし，会員・非会員は問わないこととした．当学会ホームページやメール配信にて広く案内し，申請に対して系統分類部会メン
バー等による審議を経て支援対象とした．
学会発表については，国際学会 4 件，国内学会 2 件，
計 6 件の学会発表を，5 名の学生と 1 名のポスドク研究員に支援した(表 1 )．また，4 件の論文発表について，若手研究者に支援することができた(表 2 )．
これらの支援者には，後述の 2023 年 3 月の公開シンポジウムで，講演またはビデオでのショートトークで支援対象の研究成果を紹介いただいた．このうち千葉大の3 名の学生は，いずれも初めての国際学会への参加で(図 1 )，緊張の連続の中での貴重な体験について，日本
微生物資源学会誌に学会見聞録を寄稿いただいた( 39
巻 1 号に掲載)．3 名のうち 1 名は，この国際学会への参図1E-mail: mohkuma@riken.jp
役職：日本微生物資源学会 2019 - 2022 年度会長

－ 179 －

参加した国際会議( Asian Mycological Congress2021 )での支援者らと海外研究者

大熊加を一つの契機として博士課程へ進学し，糸状菌の分類

盛也

3．シンポジウムの開催支援
コロナ禍で現地参集でのシンポジウムの開催が困難なの研究に取り組むとのことである．

状況であったことから，2021 年度は第 27 回大会に合わ
2．技術研修への支援，微生物保存機関紹介動画の作成

せ，オンデマンド配信の形式でシンポジウムを開催した．

当学会は，微生物株コレクションの保存管理・提供の開催主催者側にもまだ Web での配信のノウハウがなく，事業を実施する機関会員を有することを特徴としてい本助成によって実現させることができた．シンポジウム

る．機関会員には分類や保存の技術に長けた研究・技術

は「環境負荷低減に向けた農業・食品関連微生物の分類者がおり，関連の技術を広く普及させることを目的に，とその応用」と題し，大会を主催する農研機構に関連し技術研修への支援を実施した．2023 年 3 月 7 - 8 日開催

た農業・食品分野に焦点をあてたものとしたが，国内外の理化学研究所 JCM によるオンラインでの「真菌類のから 1 名ずつ，微生物リソース情報，ゲノム情報を基盤

分子系統解析に関する技術研修」に支援を行った．同機とした分類学への取り組みについても話題提供をいただ

関での毎年の技術研修には数名の参加者があるとのことき，計 6 つの講演があった(図 3 )．

であるが，このオンライン研修には 23 名もの聴講者が2022 年度 7 月には，第 28 回大会の前日に「持続可能参加し，大変好評であった．研修後のアンケートでは回な微生物の利用と分類」と題した公開のシンポジウムを

答者全員が内容等に満足とのことであった(図 2 上)．

現地開催(東京理科大)とオンライン配信のハイブリッ

一方で，コロナ禍の影響で多くの機関では技術研修のドで開催した．持続可能な開発目標である SDGs 達成に開催を見合わせることが多く，技術研修への申請は限定貢献する微生物と，それら微生物の研究のよりどころと的であった．そこで，機関会員の微生物株保存等の活動

なる持続可能な分類学という趣旨で，海外からの講演者と保存されている微生物株について，一般への啓発を目

1 名(オンライン講演)を含む 8 名に話題提供をいただ

的として，紹介動画を作成することとした．国立環境研

いた．オンライン接続だけでも 220 名もの聴講があった

NIES，理研 JCM，千葉大 IFM，東京農大 NRIC，鳥取(図 4 上)．

大 FMRC， 大 阪 大 RIMD， 製 品 評 価 技 術 基 盤 機 構

2023 年 3 月には，「新たな時代を拓く微生物分類学：

NBRC，石巻専修大 ISU の 7 つの機関会員から賛同が得

現状と展望」と題した公開のシンポジウムを，都内でのられた．作成した紹介動画は YouTube により一般に配現地開催とオンライン配信のハイブリッドで開催した．

信し，当学会のホームページの機関会員のページから
YouTube へのリンクを貼ることとした(図 2 下)．

図2

オンライン技術研修での集合写真(上)と機関紹介の YouTube 動画(下)図3－ 180 －

2021 年度のシンポジウム講演のオンデマンド配信

日本微生物資源学会における微生物分類学に関する支援活動

このシンポジウムは，2022 年 9 月に逝去なされ，微生物
分類学に多大なる功績を残された駒形和男先生の追悼の意を込めたものとした．6 名の講演者に話題提供をいた
だき，駒形先生の活躍された時代から現在までを振り返りつつ，培養を介さないゲノム情報による微生物の同定・分類の現状と将来についても熱い議論がなされた．聴講
参加申し込み者数は 307 名までになった(図 4 中，下)．
それぞれのシンポジウムの詳細については，以下のよ
うに当学会誌にて報告を行った．
・石田達也，乙黒美彩，高島昌子，佐藤衛．2021 年

シンポジウム「環境負荷低減に向けた農業・食品関連
微生物の分類とその応用」Microb. Resour. Syst. 37:
72-75(2021).
・河地正伸，飯野隆夫，石田達也，乙黒美彩，鈴木誠，

高島昌子，矢口貴志．2022 年シンポジウム「持続可能な微生物の利用と分類」Microb. Resour. Syst. 38:
90-94(2022).
・田中尚人，飯野隆夫，石田達也，伊藤河地正伸，鈴木隆，乙黒美彩，誠，高島昌子． 駒形和男先生追悼

公開シンポジウム「新たな時代を拓く微生物分類学：
現状と展望」Microb. Resour. Syst. 39: 41-45(2023).
公益財団法人発酵研究所 2021 年度学会・研究部会助成をいただき，当学会の系統分類部会を中心とした微生物分類学に関する研究発表の支援と若手人材の育成，技術研修の支援，保存機関活動の啓発，微生物分類学分野の活性化を目的としたシンポジウム等に活発な活動を行うことができた．コロナ禍の状況で，申請時の計画どお図42022 年度 7 月(上)と 2023 年 3 月のシンポジウムの様子(中，下)りには活動が実施できなかったところもあるが，オンラ
イン・オンデマンド配信など不慣れなことにも本助成がいただけたおかげで柔軟に対応することができた．心より感謝申し上げます．

－ 181 －

IFO Res.Commun. 37
183-185, 2023

公益社団法人 日本生物工学会 未培養微生物（微生物ダークマター）
資源工学研究部会の研究推進活動について
青

柳

秀

紀

【はじめに】

面の利活用が期待され，網羅的なゲノム解析などが活発

生物工学は，微生物をはじめ，動物・植物細胞などのらない微生物の機能解明や利用を考えた場合，生物工学

生物の機能を活用し，食糧，医療，環境，エネルギーな的視点から，ダークマター微生物の解析，探索，分離・ど，私達の生活を取り巻く，種々の問題の解決に挑戦す

単離，培養，評価，保存，利用に関連する新規技術開発る学問領域である(基礎から応用まで，様々な研究分野

や，ビッグデータとの連携が必須である．この様な現状を含んでいる)．公益社団法人日本生物工学会は生物工を踏まえ本研究部会が設立され，未培養微生物(微生物学に関する学理及びその応用の研究についての発表およダークマター)に関連する研究，基盤技術開発，利用のび連絡，知識の交換，情報の提供などを行う場となるこ活性化を目指し活動をしている中で，2021 年度 公益財とにより，生物工学に関する研究の進歩普及を図り，もっ団法人 発酵研究所 学会・研究部会助成に申請・採択され，てわが国の学術の発展に寄与することを目的としている

下記の活動を行った．

に行われている．しかしながら，塩基配列だけでは分か(生物をより深く理解し，その機能を生かして豊かで安全な生活と持続可能な社会の実現に貢献する)．本学会には多様な研究部会が活発に活動しており，未培養微生物(微生物ダークマター)資源工学研究部会(図 1 )【活動内容および成果】
1.

( https://www.sbj.or.jp/division/division_mdarkmatter.
html )もその中の一つである．

研究部会支援型の公募制度の確立と研究助成
日本生物工学会ではじめて，研究部会支援型の公募制度を確立し，「微生物の分離・培養・分類・保存などに従来の微生物培養法では自然界の微生物の 1％程度し関する研究で，生物工学分野におけるダークマター微生か培養ができていない．残された 99％の未培養微生物物の課題を解決する新たな方法論や基盤技術の確立を目( Microbial dark matter )資源は，国内外で学術，産業指した研究を推進し，未培養微生物(微生物ダークマ
ター)資源工学研究部会の活動推進に貢献する提案(異分野・融合領域，産官学連携のシーズとなる研究も含む)」

未培養微生物（微生物ダークマター）資源工学研究部会

を生物工学会の正会員から公募し，審査を行った．その膨大で多様な微生物ダークマター（未知微生物資源）が残されている
膨大で多様な未培養微生物（微生物ダークマター）資源が残されている

結果，下記 3 名の若手研究者に研究助成を行い，研究部

従来法で培養可能な微生物（学術研究や産業［有用物質生産、環境浄化など］に利用）
0.1～1%

微生物
微生物
ダークマター
ダークマター99%
99%

ダークマター微生物の探索
分離、分類、培養化、保存、復元、生理特性解析、利用に関する基盤技術開発
微生物
微生物
ダーク
ダーク
マター
マター

ゲノム解析
オミックス解析自動化
ビッグデーター、AIれた．下記に実施した助成課題の概要を紹介する．
1)坂元 仁(大阪公立大学 研究推進機構)：生存している新規な微生物・
遺伝子資源の開拓・獲得
新規な微生物・が発芽不能状態の芽胞を標的とした未培養微生物の発芽および培養法の開発

遺伝子資源の開拓・獲得〈研究成果の概要〉 栄養源飢餓などを感知して栄養細胞とは異なる耐久性細胞である芽胞に分化する芽胞形成細新たな学術研究・産業応用の拡大:イノベーション菌が存在する．芽胞はその耐熱性や化学薬剤耐性から滅https://www.sbj.or.jp/division/division_mdarkmatter.html

図1

会と連携して研究を推進することで，一定の成果が得ら

菌評価の指標としても用いられてきた．何らかの原因で発芽不全の場合，増殖できない．そこで VBNC( Viable

研究部会のコンセプトの概念図

but non-culturable )とは異なる概念として VBNG(Viable
E-mail: aoyagi.hideki.ge@iu.tsukuba.ac.jp
役職：日本生物工学会 副会長 未培養微生物(微生物ダークマ
ター)資源工学研究部会代表

but non-germinatable )を想定した．VBNG には人為的な殺菌処理による損傷芽胞，環境中での長期間の劣化の蓄積による損傷芽胞，戦略的に発芽しない進化の選択な－ 183 －

青

柳

秀

紀

ども予想される．そこで身近な例として最初に好熱菌

辺のスカルブスネス露岩域から分離した担子菌酵母のGeobacillus stearothermophilus の芽胞を選択した．好熱菌
芽胞は滅菌のバイオロジカルインディケーターとして使用さMrakia gelida MGH － 2 株について次世代シーケンサー
PacBio Sequel を利用し全ゲノム配列解析と遺伝子配列れるが発芽の詳細は未解明のままであった．この芽胞はの予測を行った．その結果，C. tubakii のゲノムサイズ

CFU 法と顕微鏡による直接計数との比較では全芽胞中のは 21.5 Mb，GC 含量は 50.1％，予測されたタンパク質コー

1/100 程度しかコロニーを形成せず，発芽できないのか戦ド遺伝子の数は 7,213 であった．また M.gelida のゲノム

略的な発芽抑制芽胞なのかは定かではない．これを天然

サイズは 34.9 Mb，GC 含量は 55.7％，予測されたタン

VBGN と想定し，発芽誘起物質を調査した結果，この好パク質コード遺伝子の数は 11,524 であった．

熱菌の 4 種類の発芽誘起物質( L- Aspartic acid, L- Glutamic② 南極産菌類の低温性酵素の探索：南極産菌類 33 株にacid, D- Aspartic acid, D- Glutamic acid)を新たに特定した．

ついて 4℃～ 15℃の温度条件下で β -ガラクトシダーゼのだがこれらは 10 mM で増殖阻害を引き起こした．以上

活性を測定した．その結果，4℃では Vishniacozyma 属の成果は，書籍 1 件，学会発表 4 件として公表した．

が 1 株と Mrakia 属が 3 株，β -ガラクトシダーゼの高い活

2)高橋 将人(筑波大学 生命環境系)：気相環境に着目性を示した．以上から，南極産菌類は低温性酵素の新たした新規培養法による微生物ダークマター資源の探索な探索源として有用であることが示せた．以上の成果は，〈研究成果の概要〉 微生物資源を利用するために培養技原著論文 2 件，書籍 1 件，学会発表 3 件として公表した．

術は重要である．未培養微生物(微生物ダークマター)を利活用するためには，「未培養の微生物」と「未生産2．シンポジウム「未培養微生物（微生物ダークマター）
資源の新展開」の開催の代謝産物」の両方にアクセスする必要がある．しかし，培養化できる微生物は僅か 1％程度であり，培養は従来

https://w w w.sbj.or.jp/event/division_dark _matter_のノウハウに依存している．このような背景の中，振盪

20230329.html

フラスコ培養法による環境試料を用いた放線菌の集積培

上述の研究助成を受けた 3 名の若手研究者の成果発表

養中に，フラスコ気相部への間欠的な通気によって従来も含めた，シンポジウム「未培養微生物(微生物ダークとは異なる放線菌の群集構造を形成する現象を見出しマター)資源の新展開」を主催・開催した( 2023 年 3た．この現象に基づき，『新奇なガス環境』の創出を目

月 29 日，御茶ノ水 ソラシティカンファレンスセンター指した．微生物資源としての真価を引き出すことができ

完全対面開催，82 名参加)．本シンポジウムでは，新規る新たな基盤技術の確立を目指し，簡便に多検体を並列な培養デバイス iChip を開発，活用することでダークマ実施できるガス制御機構として，Non-electric Bellows

ター微生物を培養化し，新規抗生物質( teixobactin )のPump( NeBP )を独自に開発した．NeBP は，既存の発見，生産につなげた Prof. Kim Lewis( Northeastern振盪基盤上のフラスコ間のデッドスペースに設置でき，

University ) の 基 調 講 演( 図 2 )，Lewis 研 究 室 の Dr.

振盪条件に応じて，培養器内外のガスを無菌的かつ迅速

Sangkeun Son の招待講演も実施した．

に置換できる換気エンハンサーである．振盪機能を有す

また，上述の 3 名の研究助成採択者が協力して企画しるガスインキュベーターと併用することで，微生物の液た講演会(ミニシンポジウム)を開催した．演者と演題

内振盪培養中のガス制御も容易に実施可能となった．バを下記に記載する．

イオプロセス開発上流における好気的な液内振盪培養のPlenar y Lecture: Discovering New Antibiotics from

ガス制御は，未開拓な培養環境であり，培養を介した微Unlikely Sources(Northeastern University)Kim Lewis

生物ダークマター資源の探索に直結する重要な知見となることが期待される．以上の成果は，原著論文 2 件，書籍 1 件，学会発表 2 件として公表した．
3)辻 雅晴(旭川工業高等専門学校)：南極産菌類を利用した新たな研究分野の開拓への挑戦〈研究成果の概要〉 ① 南極・昭和基地周辺産菌類の全ゲノム解析と遺伝子予測，② 南極産菌類の低温化で活性のある酵素の探索を通じて，南極産菌類を利用した新
たな研究分野の開拓を目指し，下記の成果を得た．
① 南極産菌類の全ゲノム解析と遺伝子予測：辻が南極・昭和基地周辺の東オングル島から分離した担子菌酵母のCystobasidium tubakii 9A-1 株と，同じく辻が昭和基地周－ 184 －

図2

Prof. Kim Lewis による基調講演の様子

公益社団法人 日本生物工学会 未培養微生物（微生物ダークマター）資源工学研究部会の研究推進活動について

Invited Lecture: New Peptide Compounds of Photorhabdus

講演 6：松井 求(東京大学)：未培養微生物研究におけ

temperata Identified by the Screening Approach That
Monitors the Outer-Membrane Stress in E. coli

るバイオインフォマティクスの役割(Northeastern University)Sangkeun Son, Kim Lewis

や，データを取得するときに気を付けていること」など

2021 学会・研究部会助成 成果発表

現場の研究者ならではの議論から，バイオインフォマ

高橋 将人(筑波大学)，辻 雅晴(旭川工業高等専門学校)，

ティクスに対する期待，ダークマター微生物関連研究に

坂元 仁(大阪公立大学／関西大学)

おける，実験自動化，ビッグデータや AI の活用など，様々

ミニシンポジウムな議論が交わされ，講師と参加者間の情報交換や交流の講演 1：小山 純弘(エイブル株式会社)：ITO 電極を利機会を提供できた．

講演後に行われた情報交換会では，「困っていること用した微生物スクリーニング
講演 2：橋本 陽(理化学研究所バイオリソース研究セン

4．第 74 回日本生物工学会大会(創立 100 周年記念大会)ター)：3 つの未知：未発見・未培養の未利用真菌を環

シンポジウム「生物工学が拓く未培養微生物（微生

境中から引き摺り出す！

物ダークマター）の未来」の開催

講演 3：井上 浩章(アクアス株式会社)：アメーバ共培

https://www.sbj.or.jp/2022/symposium/program_4c07.

養法による難培養性レジオネラ属菌の検出

html

本シンポジウムには，産官学の研究者や学生が参加し，上述のシンポジウム「大規模データとインフォマティ

対面開催ならではの活発なディスカッションと新たな人クスが拓く未培養微生物研究」の討論内容も踏まえ，第的ネットワークの形成ができた．

74 回日本生物工学会大会(創立 100 周年記念大会)でシ
ンポジウム「生物工学が拓く未培養微生物(微生物ダー

3．シンポジウム「大規模データとインフォマティクス
が拓く未培養微生物研究」の開催

クマター)の未来」( 2022 年 10 月 20 日，オンライン，
150 名参加)を開催し，最先端の研究成果の紹介と討論

https://www.sbj.or.jp/event/division_bioinfo_20220307.

を行った．演者と演題を下記に記載する．

html

講演 1：鈴木 志野(宇宙航空研究開発機構 宇宙科学研究

本学会の研究部会であるバイオインフォマティクス相所)：複合的極限環境に生きる微生物の生存戦略から紐談部会( https://www.sbj.or.jp/division/division_bioinfo.

解く極限微生物の遺伝資源の潜在性

html )と連携し，未培養微生物分野において，大規模計

講演 2：東樹 宏和(京都大学・生態研)：生物種間ネッ

測技術(オミクス解析や大規模イメージング解析)，実トワークと微生物叢動態分析で難培養生物に挑む験自動化，ならびにそこから得られた大規模データを読

講演 3：玉木 秀幸(産業技術総合研究所・生物プロセス)：

み解くためのインフォマティクスを駆使して研究を進め

未知の微生物を“培養”して新たな生物機能を探る - 未ている研究者を講師として学会内外から招聘し，最新の利用微生物遺伝子資源開拓と利活用に向けて -研究成果，Wet 技術と Dry 解析をどのように組み合わせ

今井 優 1,2( 1信州大学・先鋭領域融合研究群バイオメディ

たり，異分野間で連携しているのかに関する事例，研究

カル研究所，2ノースイースタン大学・抗生物質発見セ

現場ならではの“生の声”を聞く，若手研究者を中心としたンター)：有用抗生物質探索源としての線虫マイクロバ

シンポジウム「大規模データとインフォマティクスが拓く未イオームの利用

培養 微 生物 研 究 」( 2022 年 3 月 7 日， オンライン開 催，

講演後に開かれたパネルディスカッションでは，キー100 名参加)を開催した．演者と演題を下記に記載する．

テクノロジーを駆使した未培養微生物の開拓に関わる様々

講演 1：高橋 将人(筑波大学)：これまで気づかなかっ

な分野の研究者が，オミクス計測や実験自動化などによたフラスコスケールの振盪培養法の実態る大規模データの取得，AI やデータサイエンスによる

講演 2：小西 正朗(北見工業大学)：その培地，最適で活用など，将来の展望についての討論が活発に行われた．

すか？培地 AI で読みとく微生物培地

また，両研究部会は連携をさらに発展させ，自動化に

講演 3：野尻 秀昭(東京大学)：新しい技術で環境汚染関する研究(アームロボットを用いた未培養微生物の実

物質分解微生物群集を探索する

験自動化システムの開発に関する調査研究)を進め，プ

講演 4：西川 洋平(早稲田大学)：1 細胞・1 粒子レベル

ロトタイプのシステムを試作することができた．

のゲノム情報から読み解く，環境細菌とファージの相互作用

以上の様に，2021 年度 学会・研究部会助成により，

講演 5：黒岩 恵(東京農工大学)：代謝ポテンシャル解

当該分野の活性化，認知度向上，研究・技術開発の推進，析を用いた anammox 細菌－共在細菌群間の相互作用の人的ネットワークの拡大，若手研究者育成など，次に繋推定がる成果を出すことができた．
－ 185 －

発酵研究所助成研究報告集
2023 年 12 月 10 日
2023 年 12 月 20 日
編集委員長
編集委員
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第 37 号【非売品】
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左子芳彦
太田寛行，林 哲也，遠藤銀朗，
古川謙介
樽井直樹
公益財団法人発酵研究所
大阪市淀川区十三本町 2 丁目 17 番 85 号
TEL. 06 － 6300 － 6555
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