Technical Review

CHROMATOGRAPHY, Vol.32 No.3 (2011)

Technical Review

超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）の有効的な使い方
堀川愛晃

Good use of Supercritical Fluid Chromatography
Yoshiteru Horikawa
JASCO Corporation
2967-5 Ishikawa-machi, Hachioji-shi, Tokyo 192-8537, Japan

Abstract
Supercritical Fluid Chromatography (SFC) offers high speed analysis due to high diffusivity of solutes in the low-viscosity supercritical mobile phase. Generally, the separation mode in SFC is regarded as normal phase with a combination of non-polar CO2 mobile phase and polar
stationary phase. Therefore, separation of water-soluble polar compounds is considered to be difficult to separate by using SFC. However, theelution and peak shapes of polar compounds can be improved by adding a small amount of acid, base, volatile salt and ion pair reagent to themodifier solvent such as alcohol.
In chiral preparative SFC, samples are often over-loaded and it is difficult to determine when to start and end fractionation from Ultra Violet(UV) chromatographic data. A Circular dichroism (CD) detector can differentiates enantiomers and generate positive/negative chromatographic peaks. In addition, CD detector can simultaneously generate CD, UV and g-factor signals. The g-factor is a signal defined as CD/
UV whose level is independent of the peak concentration but dependent only on enantiopurity. Therefore, enantiopurity of g-factor triggered
fractions is very high.
Keywords: Supercritical fluid chromatography, Polar compound, Chiral separation, Circular dichroism, Fractionation

ルオイルなどの揮発性の高い物質も含め、多種類の成分の分

１．緒言
超臨界流体クロマトグラフィー（Supercritical Fluid Chroma-

離例が報告されている[1,2]。特に、近年では光学異性体の分tography, SFC）とは、超臨界流体（主に二酸化炭素）を移動

離・分析、分取精製について多くの研究がある[3]。より詳相として使用するクロマトグラフィーである。充填カラムを細な内容については、総説、解説を参照して頂きたい[2-11]。

用いた SFC は、HPLC から発展した装置の扱いやすさと分

このような分離分析、分取精製法は、海外では環境保全の観離技術の拡張性により、種々の試料の分析に利用され、応用点からも注目されて、LC から SFC に切り換えている企業が分野が拡大している。医薬品やその光学異性体、脂溶性ビタ多く、最近ではアキラル物質の分取にも活用されている。こミン、高分子添加物、オリゴマー、多環芳香族炭化水素、石の論文では SFC の基礎や分析、分取の応用例を記述する。

油製品、脂質、環境汚染物質、農薬、さらに、エッセンシャ
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２．超臨界流体クロマトグラフィー

いう特長を有する。Figure２にフラバノンの光学分離を行っ

２．
１ 超臨界流体クロマトグラフィーシステム

た時の HPLC と SFC を比較した H-u 曲線を示す。ここでのFigure１は充填カラムを使用した SFC に使用される典型的

Peak１は最初に溶出したピークで、Peak２は二番目に溶出しな装置構成例である。移動相は、ポンプにより加圧された流たピークである。HPLC の場合、線流速 u を速くすると、理体が液体状態で送液され、オーブン内で予備加熱後にイン論段高さ H は、高くなり、カラム効率が悪くなることが分ジェクタを通過しカラム、検出器に入る。SFC では、セルかる。一方、SFC では線流速を速くしても、理論段高さはの出口側に背圧をかけるため、光学検出器に使用するセルあまり変化しない。従って、HPLC よりも短時間・高速分離は、高い耐圧性能が必要となる。流路の最後には、超臨界状が実現できる分離技術としての能力を備えている。また、超態を保つために、圧力制御弁または抵抗管が接続される。検臨界流体は、密度を気体から液体に近い高い状態まで、圧力出時に大気圧、または、それ以下の減圧状態にする必要があを操作して連続的に変化させることができる。すなわち、分る水素炎イオン化検出器（FID）、質量検出器（MS）、蒸発離の操作パラメータの一つに、カラム内の圧力を利用するこ

光散乱検出器（ELSD）、荷電化粒検出器（CAD）などは、とが可能である。さらに補助溶媒（エントレーナー、モディ

スプリッタを用いる方法によって、溶出成分の一部を検出器ファイヤー、コソルベントとも呼ばれる）として使用する有に導入する。検出器の種類によっては、スプリットした後機溶媒と混合して、保持時間や分離の調整にも利用できる。に、検出器の感度の向上、配管内の試料の析出による閉塞を補助溶媒として使用する各種有機溶媒との混合は、移動相溶防止するためにカラムの出口よりも下流で溶媒を足すことが媒の極性の調節が可能となるため、分析対象成分を広げるこある。その溶媒をメイクアップ溶媒と呼ぶ。分取の場合は、とができる。このような特性から、GC よりも温和な測定条回収率の向上のために、メイクアップ溶媒を使用する。メイ

件下で、GC では分離不可能な不揮発性成分や熱的に不安定クアップ溶媒を送液するためのポンプは目的によって流路へな成分などの分離にも適用できる。の接続の場所が変わる。例えば、分取物の回収率の向上の場

２．
３ 二酸化炭素を使用した SFC の特徴
SFC の移動相として、二酸化炭素を利用することは、比合は、検出器と圧力制御弁の間に接続する。
SFC-MS は、GC-MS、LC-MS と同様に分離した成分の定較的扱いやすい臨界温度（３１．
３℃）と臨界圧力（７．
３８MPa）性情報を得ることができる強力な検出器となる。分離した成で超臨界状態となり、アルコールなどの種々の有機溶媒と混分や移動相条件によって、インターフェースおよび、イオン合できる物質であること、毒性がほとんど無く、化学的に不化法を選択する必要がある。基本的には、SFC では、LC-MS活性であり、高純度なものが、安価に市販されているなどの用のインターフェースがほとんど利用できるが、イオン化を多くの利点を有するためである。さらに、二酸化炭素は、液促進させるためにメイクアップ溶媒を送液することが、必要体または超臨界流体となっている加圧下から大気圧へ減圧すな場合がある。

るだけで、気体となってしまう。この特性は、分離成分の分２．
２ 分離特性と能力取精製時の後処理工程を短縮化できる特長となっている。

SFC の移動相溶媒として超臨界流体を用いた場合は、物超臨界二酸化炭素は、極性がヘキサンと同等レベルのた性値が、液体よりも低粘度、高拡散係数であるため、カラムめ、親油性物質の分離には向いている。シリカカラムを使用

内の移動相の流速を速くしても高い分離効率を維持できるとすると、順相クロマトグラフィーとしての保持挙動を示すこ

1. CO 2 Cylinder
2. Modifier Solvent

9113. CO 2 Pump

74. Modifier Pump
1063816171151218Waste

641452613Figure 1Hydraulic diagram of Typical SFC System.

―１５４―

5. Switching Valve
6. Stop Valve
7. Safety Valve
8. Accumulator
9. Auto Sampler (Injector)
10. Column
11. Column Oven
12. Detector (UV, PDA, CD)
13. Make up Solvent
14. Make up Solvent Pump
15. Splitter
16. Detector (ELSD, CAD, MS)
17. Back Pressure Regulator
18. Fraction Collector

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Yoshiteru Horikawa

Figure 2 H-u curve for SFC and HPLC.
SFC conditions are: column: CHIRALCEL AD-H (5 µm, 4.6 mm ID×150 mmL), mobile
phase: HPLC; n-Hexane/EtOH (90/10), SFC; CO2/EtOH (90/10), total flow rate: HPLC; 2.5,2.0, 1.5, 1.0, 0.75, 0.5, 0.3, 0.1 mL/min, SFC; 3.6, 3.2, 2.6, 2.0, 1.4, 0.8 mL/min, column
temperature: 40°
C, pressure: 20 MPa, wavelength: 250 nm, sample: 1 mg/mL Flavanone in
MeOH, injection volume: 5 µL.とが知られている。極性が高い物質の場合は、モディファイ

グラジエント溶出法を用いて、分離の改善を行うこともできヤー溶媒の割合を増やす必要もある。そのため、一般的に使る。温度と圧力は超臨界 CO２の密度に影響する。低温高圧に用されている条件（４０℃、１０〜２０MPa、モディファイヤーのすることで、移動相の流体の密度が高まり、溶出力を増加す

割合１０〜５０％）は亜臨界の状態で分離を行っている場合が多ることができる。ただし、超臨界 CO２の極性は低いので、一い。総称として超臨界流体クロマトグラフィーと呼んでいる

般的な SFC の条件にはモディファイヤーを加えている。SFCが、実際は液化二酸化炭素を主溶媒とするカラム背圧制御型で使用できるモディファイヤーと添加試薬を Table１に示高速流体クロマトグラフィーと呼んだ方が適切だと思われす。モディファイヤーの選択には以下の２つの点を注意する。

る。１つは超臨界 CO２に対して、相溶性があることが必要で

２．
４ SFC のカラムと分離パラメータある。相溶性がない水をモディファイヤーとして加えると、

２．
４．
１ カラム

相の状態が液体と超臨界相の二相になり、検出ノイズの増大

SFC で使用できるカラムはシリカゲル、シリカゲルベーや溶媒時間の再現性の低下などを引き起こすことがある。もスの化学結合型充填剤（C１８、C８、C４、C１、フェニル、C３０）、う１つは目的成分を溶解する溶媒であること、CO２だけではシアノプロピル（CN）、アミノプロピル（NH２）、ジオール溶解しない成分でもモディファイヤーの割合を上げることに（DIOL）、２―エチルピリジン、４―エチルピリジン、光学異性より、溶解させ、測定可能になる。

体分離カラム等がある。ポリマー系のカラムは超臨界 CO２に極性成分の分離は、モディファイヤーの使い方やカラムのより、膨潤・収縮を起こし、性能を低下する可能性があるの選択によって可能になる。アルコールなどのモディファイで、注意が必要である。Figure３に４種類のカラムによる７

ヤー溶媒に少量の酸、または塩基、揮発性の塩やイオンペア種類の極性物質の分離挙動の違いを示す。CN カラムの保持試薬（Table１を参照）を加えることで極性物質の分離、ピー能力が一番低く、次に DIOL、シリカカラムとなっている。

ク形状の改善もできる。しかし、添加試薬を使用した場合

一方、NH２カラムは他のカラムと保持挙動が異なり、塩基性は、カラムへの添加試薬の履歴による影響に注意が必要であ物質の保持が短く、酸性物質の保持が強くなる、従って、試る。充填剤に対しての平衡化に時間が必要であり、条件検討料の酸性度、塩基性度に保持挙動が依存する。

時に再現性の確認を的確に行うことである。添加試薬入りの２．
４．
２ 分離パラメータ

モディファイヤー溶媒を事前に流すことにより、平衡化の時間を短縮することができる。

分離するパラメータには、圧力、温度、モディファイヤーの種類と量がある。なお、これらのパラメータを変化させる―１５５―

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Figure 3 Chromatograms of 6 polar compounds in silica and silica based columns.
1. Flurbiprofen, 2. Acetylsalicylic acid, 3. Caffeine, 4. Sulfamethoxazole, 5. Adenine, 6. Amitriptyline.
SFC conditions are: columns, Silica (SFCpak SIL-5), Silica-DIOL (SFCpak SIL DIOL-5), Silica-NH2(SFCpak SIL NH2-5), Silica-CN (SFCpak SIL CN-5) 4.6 mm ID×250 mmL, 5 µm, CO2 Flow Rate: 3.0mL/min, MeOH Flow Rate: 0.5 mL/min, temperature: 40°
C, pressure: 20 MPa, wavelength: 220 nm, concentration: 0.1 mg/mL, injection volume: 5 µL.
Table 1 Using modifier solvents and additives for Supercriticalfluid chromatography.

２．
５ SFC の分離条件の探索方法
SFC の分離条件を探索する場合、始めにカラムを選択し、モディファイヤー溶媒添加試薬

モディファイヤーの割合を１０〜５０％まで溶媒グラジエントを

メタノール
エタノール
イソプロピルアルコールn-ヘキサン
イソオクタン
酢酸エチル
アセトン
アセトニトリル
ジクロロメタン
クロロホルム

ギ酸
酢酸
トリフロロ酢酸
ジエチルアミン
ジイソプロピルアミン
トリメチルアミン
トリエチルアミン
アンモニア
酢酸アンモニウムMS 用イオンペアー試薬
ジ（2-エチルヘキシル）
スルホこはく酸ナトリウム

行い、溶出することを確認する。溶出しない場合は、違うカテトラヒドロフラン

ラムを選択し、溶出挙動を確認する。ピークが多数で、分離しない場合は温度、圧力を変化させる。極性が高い試料の場
合は添加試薬をモディファイヤーに入れて、ピーク形状の改善や溶出促進を促す。ただし、分離だけではなく、分取を行う場合は後処理のことも考えて、添加試薬を選択することが必要である。
３．分析 SFC の応用例
SFC は、HPLC に比べて、短時間分離、有機溶媒量の低減が期待でき、ランニングコストが低く、効率の高い分離分析

1,4-ジオキサン
ジエチルエーテル
ジイソプロピルエーテルジメチルホルムアミド
ジメチルスルホキシドを実現できる。医薬品分野では、SFC の適用性が認められている。分離例として、Figure４に医薬品成分の１１種類を分離したクロマトグラム、Table２に分離条件のモディファイ
ヤー溶媒のグラジエント条件を示す。極性物質でも SFC で―１５６―

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Yoshiteru Horikawa

Figure 4 Chromatogram of 11 polar compounds.
SFC conditions are: column: Silica (4.6 mm ID×250 mmL, SFCpak SIL-5), mobile phase: carbon dioxide and modifier;
20 mM ammonium acetate in Methanol, CO2 Flow rate: 3.0 mL/min, modifier Flow rate is Table 2, column temperature: 40°
C, pressure: 25.0 MPa, splitter: 50 µmI.D.×50.5 cmL, concentration: each 0.1 mg/mL in Methanol (Atropin:0.5 mg/mL), injection volume: 10 µL, ELSD: Evaporator temperature ; 40°
C, Nebulizer temperature ; 40°
C, N2 gas;1.60 SLM.

Table 2 Modifier solvent gradient condition for Figure 4.
Gradient condition
min
0.00
2.5
8.0
12.0
16.5 16.55

することができる。それに加えて、CD 検出器は同時に CD、mL/minる。従って、g-ファクターでモニターする方法は、光学純度

0.30.30.8

2.02.0

UV、g-ファクターの信号が得られる。g-ファクターは CD/UVの値で定義され、濃度に依存せず、光学純度だけに依存す

0.3によるフラクションの適切な分画位置を正確に制御できるため、高純度な光学異性体成分を効率的に回収することでき分離検出することができる。次にそれらの極性物質が含まれる。また、g-ファクターは、CD/UV の比を表し、レシオクている市販の下痢止め薬４種類と風邪薬のクロマトグラムをロマトグラムと同様に一定の比の値で出力されるため、台形Figure５に示す。分離条件は Figure４と同じ分離条件で行っの形状となる。UV 信号と g-ファクター信号で分取時のクロた。下 痢 止 め 薬 に は、フ ォ ト ダ イ オ ー ド ア レ イ 検 出 器

マトグラムを Figure６に示す。UV 信号のクロマトグラムで（PDA）で、Acrinol と Berberine の２成分が、Stearic acid、分取した場合、Fraction１、２の光学純度は９８．
１％、９２．
１％

Ursodeoxycholic acid、Acrinol、Berberine の４成分が ELSD でと純度が低い。一方、g-ファクターの信号を用いた時の分取検出できた。風邪薬では、Caffeine と Acetaminophen の２成では、Fraction１、３の２つのフラクションの光学純度はど分が両方の検出器で検出できた。SFC も HPLC と同等のレちらも９９．
９％以上になり、Fraction２をリクロマトすることベルで分離分析に適用することが可能である。

により、回収率も９０％以上と良好な結果となった。

４．分取 SFC の応用例

５．まとめ

SFC を用いたキラル分離は、２．
２章に記述したように超臨多くの利点を有し、分析から分取まで幅広く利用できる

界流体は、移動相流体の高拡散係数、低粘度という特性から

SFC は、環境に優しいクロマトグラフィーとして、応用がHPLC よりも短時間で、高効率で分離できること、価格の高広まっている。有機溶媒の規制が厳しくなっていく中で SFC

い有機溶媒の使用量の削減、分取後の溶媒除去の後処理が容の優位性が高まり、高圧ガスの規制緩和が進み、国内でもよ易などの利点からキラル物質の分取精製に多く利用されていり多く利用されることを期待している。

る。ここでは、円二色性検出器を用いた分取 SFC システムによるフラバノンの光学分割と効率的分取精製法を紹介す

文献

る。円二色性検出器（CD）はクロマトグラムのピークの極[1]Harris, C. M. Anal. Chem. 2002, 74, 87A-91A.

性からプラスとマイナスの応答が発生し、光学異性体を識別[2]

Guiochon, G.; Tarafder, A. J. of Chromatography A, 2011,―１５７―

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Figure 5

Chromatogram of 4 antidiarrheics and cold medicine.
Elution conditions are identical to those given in Figure 4 caption.

Figure 6 Chromatograms of UV-triggered and g-factor-triggered fractionation.
Elution conditions are: column, CHIRALPAK IA (20 mm ID×250 mmL), CO2 flow rate: 21.5 mL/min, Modifier, methanol
flow rate: 3.5 mL/min, column temperture: 40°
C, pressure: 20 MPa, wavelength: 310 nm, sample, 30 mg of flavanone.

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CHROMATOGRAPHY, Vol.32 No.3 (2011)

[3]
[4]
[5]

Yoshiteru Horikawa

1218, 1037-1114.

[7]

Henry, M. C.; Yonker, C. R. Anal. Chem. 2006, 78, 3909.

坊之 下 雅 夫，堀 川 愛 晃， ぶ ん せ き ，2009，12，669-[8]

Randall, L. G. Sep. Sci. Technol. 1982, 17, 1.

677．

[9]Saito, M.; Yamauchi, Y.; Okuyama, T. Fractionation byPacked-Column SFC and SFE; VCH Publishers, Inc. 1994.

Taylor, L. T. Anal. Chem. 2008, 80, 4285.

[10] Smith R. M. 超臨界流体クロマトグラフィー

Chester, T. L.; Pinkston, J. D.; Raynie, D. E. Anal. Chem.

[6]

化学と生

物実験ライン，47；廣川書店，2001．

1996, 68, 487R.

[11] Anton, K.; Berger, C.; Supercritical Fluid Chromatography

Chester, T. L.; Pinkston, J. D.; Raynie, D. E. Anal. Chem.

with Packed Columns, Marcel Dekker, Inc., 1997.

2004, 76, 4606.

―１５９―