学位研究紹介

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学 位 研 究 紹 介
mM CaCl2 をベースとし，切断初速度測定には基質濃度組換ヒト副甲状腺ホルモンの効率的生産法の開発
Efficient production of recombinanthuman parathyroid hormoneを0.5mMとした。酵素学的パラメーター測定時の切断率は15%以下とし，尿素によるKex2失活の影響は別途求めた失活速度から補正した。
3）

PTH（1-34）精製方法

菌体を破砕し，融合蛋白質を含む不溶性顆粒を回収し，サントリー医薬開発研究所

可溶化・Kex2切断反応後希釈して1.5 M urea, pH6.3と鈴木雄司

し，保護蛋白等を沈殿させ，圧搾濾過し，濾過液にSuntory Institute for Medicinal

PTH（1-34）を回収した（酸性沈殿法）。本上清を陽イ

Research and Development

オン交換クロマト（Poros50HS・NaCl濃度勾配），逆相Yuji Suzuki

HPLC（TSK ODS 80Ts アセトニトリル濃度勾配）にて精製後，凍結乾燥した。

緒言

保護蛋白PTH（1-34）はヒト副甲状腺ホルモン（1-84）の活性nP４ P ３ P ２ P １ ↑ン生産を促し破骨細胞形成から骨吸収を亢進する一方，量を間歇投与すると骨量増加が見られ，骨折や骨粗鬆症PTH (1-34)-Pro-（His-His-His-His-Pro-Gly-9）-Gly-Arg-Pro-Ser-Val-Lys-Lys-Arg -1-Ser 1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln+6

本体と考えられており，骨芽細胞に作用してサイトカイIGF・TGF-β等の産生を促し骨形成作用をも示す。適リンカー

図１．融合蛋白質模式図とその切断部位のアミノ酸配列。nはオリゴヒスチジン繰返し数，P3, P4 はアミノ酸置換部位，↑はKex2切断部位を示す。

治療薬としての期待されたため，遺伝子組換え法によるPTH（1-34）の効率的生産法開発を試みた。

方１）

法

結 果 と 考 察

融合蛋白質の設計と発現

１） 融合蛋白質生産性の改善

ベクターにはpBR322の一部を，プロモーターには大Kex2切断配列のみをﾘﾝｶｰにすると，融合蛋白質生産

腸菌lactose オペロン（図１lac P/O）を，宿主には大腸性は低かったが（図2 lanes 1, 6, 13），オリゴヒスチジン菌W3001 [ompT-] 株を用いた。保護蛋白には大腸菌β-を挿入することで改善され，保護蛋白をβG-117S，オリgalactosidaseアミノ酸番号1-97（βG-97S), 1-117（βG-

ゴヒスチジンを1個挿入した場合に生産性が最大となり117S），1-139（βG-139S）の3種（CysはSerに置換）を（図2，lane 7），Kex2反応溶液中の溶解度も0.65mM以上用い，リンカーを介してPTH（1-34）と融合させた。リを示した。

ンカーC末端にはKex2切断配列としてPTH前駆体由来の5アミノ酸（図1下線部）を配し，N末端にはオリゴヒスチジン（His-His-His-His-Pro-Gly）を適宜挿入した（図１）。P3, P4のアミノ酸置換は合成primerを用いてPCR法により行った。融合蛋白質のGly -9 からGln +6 を別途合成・精製し，合成ペプチド基質とした。融合蛋白質は形質転換菌体を37℃で培養し，OD660=1.0 の時点でIPTGを1mMとなるように添加して発現を誘導，さらに4時間培
n= 0 1 2 3 - 0 1 2 3 4養して生産された。

5 - 0 2 - 3

保護蛋白 βG-97S → ← βG-117S→ ← βG-139S２）Kex2反応初速度および速度パラメーター

図２．SDS-PAGE 電気泳動による融合蛋白質の発現量比較。

反応溶液は3.0M urea, 50mM Tris, 50mM NaCl, 2.0−43−ｎはオリゴヒスチジン繰返し数を示す。

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新潟歯学会誌

31（1）
：2001

３）PTH（1-34）の精製

２）切断部位の至適化
切断部位をKex2により切断され易くするために， P3,融合蛋白質F-IIIは不溶性顆粒として蓄積され，そのP4部位のｱﾐﾉ酸置換を施した（表１）。P3 Lys 置換体の初生産性は約10g/L-cultureと高く，Kex2反応液の融合蛋

期切断速度はPhe, Hisで約1.4倍となった。 P4 Val置換体の白質純度は80%以上であった（図2A）。切断後，高分子初期切断速度は正電荷を持つArgで1.8倍に増加したが，量不純物は酸性沈殿法により大半が沈殿除去され（図負荷電を持つAspまたはGluでは切断されなくなった。

2C），PTH（1-34）は清澄な上清に回収された。融合蛋
白質設計は，生産性向上同様，精製も考慮して行う必要

表１．アミノ酸置換による融合蛋白質切断速度の変化
Substitution at P3
P4−P3
RelativeVal-Xaaactivity（%）
CiyAiaVal
IleLeuPheProTrp

1009213079128
1410126

Ser
Thr
AsnGlnTyrHisLvs
Arg
AspGku92
110
98102121143
1001283889がある。 微量混在するPTH（1-34）誘導体や保護蛋白

Substitution at P4
P4−P3
Relative
Xaa-Hisactivity（%）
6
Ciy45
Aia
100
Val51
Ile16Leu
108
Phe
36
Pro58
Trp
95
Met
9Cys
31
Ser30
Thr88
Asn
74
Gln85
Tyr131
His
128
Lvs
179
Arg
0Asp0Gku

分解物は，陽ｲｵﾝ交換ｸﾛﾏﾄ（図2D）・逆相HPLC（図2E）によって除去され，純度 99.5%以上のPTH（1-34）を得ることができた。精製工程の回収率は約40%と高く，培養液１Lあたり0.8gの精製PTH（1-34）が得られる事が示された。

置換前の融合蛋白質切断活性を100％とした（下線）。

P4-P3のｱﾐﾉ酸配列がVal-Lys, Val-His, Arg-Hisである融合蛋白質 F-I, F-II, F-IIIと，切断部位を模倣した合成ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ基質 P-I, P-II, P-III, P-IV（P4-P3＝Asp-His）を用いて酵素学的ﾊﾟﾗﾒｰﾀｰを求めた（表2）。 両基質ともValLys→Arg-His置換によりk catが約２倍に増加した。P 4Val→Asp置換の影響はP-IVを基質とし尿素非存在下で求められた。kcatの低下は約1/2であったがKmが約80倍に増加しており，P 4の電荷がKex2の基質認識に大きく影

図２．精製各工程でのPTH (1-34) の逆相HPLC分析響していることがわかった。ペプチドホルモンは前駆体

A: 可溶化後，B: Kex2反応後，C: 酸性沈殿上清が塩基性ｱﾐﾉ酸連続部位でプロホルン変換酵素により切

D: 陽イオン交換クロマト後，E: 逆相HPLC後
1: PTH (1-34) ，2: 保護蛋白-リンカー，3: 融合蛋白質

断されて生じる。複数のそのような部位から特定個所だ
けが切断される現象には，各部位の立体構造に加え，近傍のｱﾐﾉ酸側鎖も関与すると思われる。kcatが最大を示し

参考発表論文たF-IIIを基質としてKex2反応条件の至適化を行った結果，0.5mM 融合蛋白質, 2.7M urea, 50mM TrisHCl pH
7.8, 2.5mM CaCl2, 5.0 μg/ml Kex2 が適切であった。

１）Suzuki, Y., Yabuta, M. and Ohsuye, K.（1998）
High-level production of recombinant human表２．Kex2によるアミノ酸置換体切断の酵素学的パラメーター
基質P4-P3アミノ酸配列

F-ⅠF-Ⅱ
F-Ⅲ
P-Ⅰ
P-Ⅱ
P-Ⅲ
P-Ⅳ

Val-Lys
Val-HisArg-His
Val-Lys
Val-HisArg-HisAsp-HisKm（mM）urea（M） 3.0
120
170
190
6.3
47
6.5
25
1354
500

Kcat
（sec-1）
0
3.0
28
45
61
93
110
72
98
180
240
45

Kcat／Km（mM-1sec-1）
0
3.0
0.23
0.26
0.32
2.0
17
2.9
15
3.3
18
0.09

−44−

parathyroid hormone 1-34.

Appl. Environ.

Microbiol. 64, 526-529
２）Suzuki, Y., Ikeda, N., Kataoka, E. and Ohsuye K.
（2000）Effect of amino acid substitution at theP3 and P4 subsites of fusion proteins on Kex2
protease activity. Biotechnol. Appl. Biochem. 32,53-60