Original

Chromatography, Vol.28 No.1 (2007)

Original

薄層クロマトグラフィーを活用した医薬品成分を含有する健康食品の分析

熊坂謙一＊、松阪綾子、麻生順子、宮澤眞紀、土井佳代、小島尚

Practical Use of a Thin−layer Chromatography as a Screening analysis
for Active Drug Ingredients in Dietary Supplements
Kenichi Kumasaka*, Ayako Matsuzaka, Yoriko Aso, Maki Miyazawa, Kayo Doi, and Takashi Kojima
Kanagawa Prefectural Institute of Public Health, 1−3−1 Shimomachiya, Chigasaki, Kanagawa 253−0087, Japan
Received for review December 28, 2006. Accepted February 5, 2007

Abstract
Active drug ingredients for erectile dysfunction (ED) treatment in dietary supplements for sexual enhancement were determined. Ingredientsin the products were extracted by methanol for preparation of the test solutions. The solutions were analyzed with an HPTLC plate to screen
and narrow down the candidate active drug ingredients. A reversed phase HPLC equipped photodiode array detector analysis was then performed to ascertain the retention time and UV spectrum of the detected peaks from the test solutions and the tested drug ingredients. An LC/MS/MS analysis was used for final identification of drug ingredients in the test solutions. These results suggested that the examined threeproducts contained tadalafil. In addition, one of these products also contained vardenafil. Moreover, quantitative analysis of the drug ingredients was also performed by an HPLC analysis. Our consecutive analyses showed that screening analysis with a TLC analysis had some advantages to make the analyses efficient.
Keywords : dietary supplement, tadalafil, vardenafil, electile dysfunctionが添加されている場合があり、服用による健康被害も発生し

緒言
健康への意識の高まりとともに、様々な「いわゆる健康食ている。その事例は、厚生労働省のホームページ「健康被害品」がインターネットなどで流通している。しかし、その中情報・無承認無許可医薬品情報」に詳細に報告されているの一部の製品では、標榜した作用を強めるために医薬品成分[1]。最近の事例では、N―ニトロソ―フェンフルラミン、乾燥神奈川県衛生研究所理化学部〒２５３―００８７ 茅ヶ崎市下町屋１―３―１
TEL：０４６７―８３―４４００
FAX：０４６７―８３―４４５７
E−mail : kumasaka.z3aa@pref.kanagawa.jp*To whom correspondence should be addressed : Chemistry
Division, Kanagawa Prefectural Institute of Public Health, Shimomachiya 1−3−1, Chigasaki, Kanagawa 253−0087, Japan
Tel : +81−467−83−4400
Fax : +81−467−83−4457
E−mail : kumasaka.z3aa@pref.kanagawa.jp―３７―

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甲状腺等が添加されたダイエット用健康食品により、重篤な調製した。その濃度は、TLC法で は１．
０mg/mL、HPLC法で健康被害が発生して大きな社会問題となった[1,2]。また、血は０．
０１mg/mL、ま た、LC/MS/MS法 で は１．
０µg/mLと し た。

糖降下を謳った製品からグリベンクラミドが検出された事例

なお、定量に使用した標準溶液は別に調製した。

[3]、強壮強精作用を謳った製品よりバイアグラの有効成分

３．試料溶液の調製であるシルデナフィルが検出された事例[4]などがある。こ

分析を行った３製品A、B、Cのうち、A、Cはカプセルでれらの製品は「食品」として流通しており、有効性、安全性あり、Bは錠剤であった。そのため、カプセル製品からは内の審査を踏まえて承認・許可を受けた「医薬品」ではない。

容物を取り出し、また、錠剤は乳鉢で粉末とした。それぞれ

また、外装、成分表示などには医薬品成分の含有については１カプセルまたは錠剤相当量の各粉末を遠沈管に量り、メタ表示されておらず、外観からは医薬品成分の添加の有無を判

ノール３０mLを加えて３０分間振とうした後、遠心分離する。

断することはできない。そのため、消費者の健康被害を防止

これらの上澄液を回収し、残渣にはさらにメタノールを１８するためには、市場に流通するいわゆる健康食品について医mL加えて１０分間振とうした後、遠心分離し上澄液を得る。

薬品成分添加の有無を検査することが重要となる。

上澄液は全て合わせてメタノールでそれぞれ正確に５０mLと我々もこの様な製品について試験検査を実施しているが、し、よく混和した後、その５ mLをHPLC用およびLC/MS/MS製品に添加される医薬品成分は製品ごとによって異なってい用試料溶液とした。また、残りの４５mLは乾固したのち、メるという実情がある。そのため、様々な医薬品成分の添加のタノール４ mLに再溶解してTLC用試料溶液とした。

可能性を想定しながら手探りで分析することになるが、根拠

４．TLC法なく多種多様な医薬品成分を対象に分析することは、試験検試料溶液には、「２．試料溶液の調製」にて作成したTLC査の効率性が問題となる。また、特定の成分を対象にした分用試料溶液を用いた。薄層板は蛍光剤入りHPTLC pre−coated析法では、対象外の成分を見落とす可能性があり、試験検査

silica gel 60 F254（メルク株式会社、東京）を使用した。また、の信頼性が問題となる場合がある。このような問題点を解決

展開溶媒にはクロロホルム／メタノール混液（９：１）を用するためには、まず、効率的に医薬品成分の有無を確認する

いて、標準溶液および試料溶液とも各２ µL（バルデナフィスクリーニング試験を行うことが重要である。さらに、何ら

ル標準溶液のみ１ µL）を薄層板原点にのせ、展開溶媒を満かの成分が検出された場合には、既存医薬品成分との類似たしたチャンバー内で充分に飽和させた後に、展開を開始し性、化学構造などに関する情報を得て、効率的に検出成分をた。約６ cm展開した後に薄層板を風乾し、成分スポットの推定し、最終的な同定手段である質量分析法などに結びつけ検出は以下の①〜③の条件で行った。検出条件①：紫外線照る必要がある。

射（主波長２５４nm）、検出条件②：薄層版に５０％硫酸を噴霧

そこで本稿では、勃起不全（ED）治療薬成分が検出されし、１０５℃で５分間加熱して可視光下で確認する、検出条件

た強壮強精用の健康食品の分析事例において、高速液体クロ③：②に加えてさらに紫外線（主波長３６６nm）を照射する、マトグラフ（HPLC）法、液体クロマトグラフ−質量分析（LCとした。

/MS/MS）法による確認・同定分析に先立ち、添加医薬品成５．HPLC法

分のスクリーニング法として薄層クロマトグラフ（TLC）法

試料溶液には「２．試料溶液の調製」にて調製した液をメを活用した事例報告する。本事例においてTLC法を活用したタノールで希釈して使用した。分析には、フォトダイオード

結果、HPLC法およびLC/MS/MS法分析における対象成分をアレイ（PDA）検出器を接続したHPLC（アライアンス２６９５絞り込む際に有効であると考えられた。

―PDA検出器２９９６、日本ウォーターズ株式会社、東京）を使用した。PDA検出器の波長範囲は２００―４００nmとし、モニター実験波長は２２０nmとした。カラムにはODSカラム（Unison US C―１８、１．試薬

４．
６mmID×１５０mm、粒径５ µm、インタクト株式会社、京タダラフィルおよびバルデナフィル標準品として、厚生労都）を使用し、移動相にはリン酸２水素ナトリウム二水和物

働省より分与されたタダラフィルおよびバルデナフィル塩酸

７．
７５gを水約９５０mLに溶解し、薄めたリン酸でpH３．
０に調整塩３水和物標準品を使用した。シルデナフィル標準品はファし、水で１０００mLとした液（A）およびアセトニトリル（B）をイザー株式会社より分与されたクエン酸シルデナフィル標準用いて、A/B＝７５/２５混液を、直線勾配でアセトニトリルの濃品を使用した。メチルテストステロンおよび塩酸ヨヒンビン

度を増加させ、３０分後にA/B＝５０/５０とするグラジェント送液は和光純薬製を標準品として使用した。また、アセトニトリを行った。なお、カラム温度は４０℃、流量は１．０mL/分とし、ルはHPLC用アセトニトリル（和光純薬、大阪）を用い、そ注入量は２０µLとした。の他の試薬、試液は和光純薬製の特級を使用した。

６．LC/MS/MS法

２．標準溶液の調製

試料溶液は、「２．試料溶液の調製」にて作製した液をメTLC法、HPLC法、およびLC/MS/MS法による分析のため、タノールで希釈して使用した。分析にはアジレント製１１００シ

各標準品を試験法に応じてメタノールに溶解して標準溶液をリーズHPLC（バイナリーポンプ）を接続した液体クロマト―３８―Chromatography, Vol.28 No.1 (2007)

熊坂謙一＊、松阪綾子、麻生順子、宮澤眞紀、土井佳代、小島尚

グラフ−ハイブリッド型リニアイオントラップ質量分析計（Qtrap LC/MS/MSシステム、アプライドバイオシステムズ
ジャパン、東京）を使用した。なお、HPLCによる分離は逆相系分離条件で行った。カラムにはODSカラム（Cadenza CD−C１８、２．
０mm ID×１５０mm、粒径３ µm、インタクト）を使用し、移動相には０．
１％ぎ酸水溶液（A）及び０．
１％ぎ酸アセトニトリル溶液（B）を使用し、そのA/B＝７０/３０混液を５分間保持した後、０．
１％ぎ酸アセトニトリル溶液を直線勾配で１５分間増加してA/B＝４０/６０とし、さらに５分間保持するグラジェント送液を行った。なお、カラム温度は４０℃、流量は０．
２mL／分とし、注入量は５ µLとした。イオンソースはESIとし、スキャンモードはEPI、極性はポジティブとした。また、タダラフィルのプリカーサーイオンはm/z：３９０、Q３の測定範
囲はm/z：１００―４５０、バルデナフィルのプリカーサーイオンはm/z：４８９、Q３の測定範囲はm/z：１００―５５０、また、CE電圧は３０V（スプレッド１５V）とした。
７．定量
定量は以下のHPLC条件により実施した。タダラフィルおよびバルデナフィル標準溶液はメタノールに溶解し、タダラ

Figure 1. Thin−layer Chromatograms of Tested Drug Ingredientsand Products
These spots were detected by UV irradiation at 254 nm.
Spot No.1 : sildenafil, No.2 : vardenafil, No.3 :tadalafil, No.4 : methyltestosterone, No.5 : yohimbine,
No.6 : product A, No.7 : product B, No.8 : product C.

フィルは２―２０µg/mL、バルデナフィルは０．
５―２ µg/mLの範囲で希釈列を調製した。試料溶液は、製品A、Bでは１カプセル内容物または１錠の１０分の１‐２０量の各粉末を精密に量り、Cは１個相当量の粉末を遠沈管にとり、「３．試料溶液の調製」の項に準じて調製し、メタノールで希釈して測定した。HPLC分析条件は「５．HPLC法」に記載した条件を準Table 1用し、移動相をA/B＝７０/３０混液のアイソクラティック条件でEach Rf value and Color of Detected Spots by the TLC
Analysis

送液した。

detection
drug ingredientsRf

結果
sildenafil
vardenafil
tadalafilmethyltestosterone
yohimbine

１．TLC法による探索的スクリーニング
本法は、同時に展開した標準溶液と試料溶液中の成分について、スポットのRf値、呈色反応などから、その類似性を一度に視覚的に確認することができる優れたスクリーニング法である。そこで、本分析においても第一スクリーニング法として使用した。なお、分析対象物質は、製品に含有する可能

０．
５００．
５２０．
６３０．
６５０．
２７

①②③○
○
○
○
○

nd.
nd.
violetyellownd.

bluend.
○yellow-green
blue

The HPTLC silica gel plate containing fluorescent indicator at 254 nm wasdeveloped by a mixture of chloroform and methanol (9 : 1). Detection ① :UV irradiation at 254 nm, ② : spraying 50% sulfuric acid following heatedat 105℃, ③ : spraying 50% sulfuric acid following heated at 105℃ andUV irradiation at 366 nm.[○] : spot detected(black or pale black spot),[nd.] : not detected. Colors in the table showed the color of the detected
spot.

性がある医薬品成分を事前に特定することができないことから、ED治療薬成分であり、検出事例が多いシルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィルのほか、メチルテストステロン、ヨヒンビンを対照とし、各標準溶液を調製した。
各標準溶液および試料溶液について分析したクロマトグラ

光を呈することがあり、検出の選択性を高めることが可能でムを、Figure 1に示す。また、各標準溶液における検出条件①〜③での検出状況をTable 1に示す。なお、検出条件①はあった[3]。試料溶液では、検出条件①により製品AではRf値構造に共役系を有する成分の検出を目的としており、蛍光剤０．
６３にスポットを検出し、このスポットは、各検出条件にお入りの薄層板を使用することにより、選択性は弱いが多くのいてタダラフィルのスポットと同様の呈色を示した。製品B

医薬品成分をスクリーニング的に検出することが可能であでは、検出条件①によりRf値０．
６３および０．
５１にスポットを検る。また、検出条件②、③は主にステロイド系の医薬品成出した。このうち、Rf値０．
６３のスポットはタダラフィルのス分、およびUV吸収が無い有機化合物の検出を目的としていポットと、また、Rf値０．
５１のスポットはバルデナフィルのスるが、過去の経験では医薬品成分によって特異的な色調、蛍ポットと、各検出条件においてそれぞれ同様の呈色を示し―３９―

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た。製品Cでは検出条件①によりRf値０．
６３にスポットを検出し、このスポットはタダラフィルと同様の呈色を示した。以上の結果は、製品A、B、Cにはタダラフィルを含有し、製品Bでは併せてバルデナフィルを含有する可能性を示唆しており、試料溶液中の医薬品成分を効率的に推定するために有効であった。
２．HPLC法による確認
TLC法により含有が推定されたタダラフィル、バルデナフィル、および検出事例が多いシルデナフィルを対象に、成分のピークの保持時間およびそのUVスペクトルを確認した。UVスペクトルは質量分析に比べ特異性が弱いが、成分の構造に由来するものであり、検出された成分の確認手段の一つとして有効である。Figure （2 A）に示すとおり、標準溶液では、バルデナフィル、タダラフィルおよびシルデナフィルのピークは、それぞれ保持時間８．
５分、１６．
１分、９．
５分に検出された。また、各成分ピークのUVスペクトルは、バルデナフィルは２１５nm付近に、タダラフィルでは２８４nm付近に、シルデナフィルでは２２４nmおよび２９５nm付近に極大を持つ特徴的なUVスペクトルであった。一方、Figure （2 B）に示す
とおり、製品Aにおいては、保持時間１６．
０分にピークを検出し、そのUVスペクトルはタダラフィルに一致した。製品B
では保持時間８．
５分にごく小さなピークを、また、１６．
０分にピークを検出した。各ピークのUVスペクトルは、それぞれバルデナフィル、タダラフィルに一致した。また、製品Cでは保持時間１６．
０分にピークを検出し、そのUVスペクトルはタダラフィルと一致した。以上の結果は、製品Aではタダラフィルを、製品Bではバルデナフィルおよびタダラフィル

Figure 2. UV Chromatograms (left) and UV spectra (right) oftested Drug Ingredients (A) and Products (B)を、製品Cではタダラフィルをそれぞれ含有する可能性を示唆しており、TLC法を用いたスクリーニング試験の分析結果

４．検出成分の定量の妥当性を示すものと考えられる。

各製品につき３回試料溶液を調製して測定した結果、製品

３．LC/MS/MS法による同定

Aのタダラフィル含有量は３５mg／カプセル、製品BのバルデTLC法およびHPLC法により、製品への添加が推定された
タダラフィルおよびバルデナフィルの標準溶液について、ナフィル、タダラフィル含有量はそれぞれ０．
３６mg／錠、９．
３EPIスキャンにより分析した。標準溶液ではタダラフィルのmg／錠、製品Cのタダラフィル含有量は７．
０mg／カプセルでピークは保持時間１６．
５分に検出され、バルデナフィルのピーあった。なお、タダラフィルは国内未承認薬であるが、１回クは保持時間４．
６分に検出され、それぞれ特徴的なマススペ量が１０―２０mgとされている。そのため、これら全ての製品クトルを示した。一方、製品A、B、Cではプリカーサーイにおいて相当量のタダラフィルが添加されており、服用にオンm/z：３９０において保持時間１６．
５〜１６．
６分付近にピークがよって医薬品的な効果が発現する危険性がある。また、服用検出され、その保持時間およびマススペクトルはタダラフィに伴う様々な副作用、他の医薬品との飲み合わせによる健康ルと一致した。また、製品Bでは、プリカーサーイオンm/z：被害が発生する恐れもある。また、バルデナフィルの医薬品

４８９において保持時間４．
６分にピークが検出され、その保持時としての薬用量は、国内で承認されているレビトラ錠の添付間およびマススペクトルはバルデナフィルと一致した（Fig-文書によると１回量が５―１０mgとされている[5]。製品Bより

ure 3）。

検出されたバルデナフィルは薬用量と比較して含量が少ない

以上の質量分析による結果は、TLC法、HPLC法により推ことから、薬効を期待して添加されたものではなく、他製品定された結果と一致していた。即ち、製品A、B、Cには、EDの製造によるコンタミネーションが発生した可能性が考えら治療薬として使用されている医薬品成分であるタダラフィルれる。

が添加されており、また、製品Bではバルデナフィルも添加されていることが判明した。

―４０―

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熊坂謙一＊、松阪綾子、麻生順子、宮澤眞紀、土井佳代、小島尚Figure 3. Total Ion Chromatograms of Each Tested Product (left) and the Mass Spectra of the Peaks detected fromthe products (right)
りスポットの特異的な呈色が見られたことから、その存在を考察
本分析事例では、HPLC法、LC/MS/MS法に先立ち、添加容易に推定することが可能であった。また、製品Bでは、された医薬品成分のスクリーニング法としてTLC法による分HPLCクロマトグラムではタダラフィルのピークと比較して析を実施した。製品より検出された成分の同定のためには、バルデナフィルのピークがきわめて小さく、抽出された成分HPLC法によるUVスペクトルの確認、LC/MS等によるマススの概要をTLC法によって把握していなければ、ごく微量のバペクトルの確認などの特異性が高い手法が必要となる。しかルデナフィルの含有は見落としていた可能性も考えられる。

し、このような製品では、添加医薬品成分の有無、また、そまた、HPLC法のみをスクリーニング法として使用した場合の成分が事前に特定されているわけではないことから、第一は、カラムに保持しない成分、および溶出しない成分につい段階として効率的にスクリーニング分析を行うことが重要とては検出が困難となるが、TLC法では、原点から展開先端まなる。TLC法は検出の感度、特異性、分離、定量性の面ではでの成分を確認することができる。以上のことから、TLC法他の手法に劣るが、試料溶液から検出された未知成分の挙の活用が、いわゆる健康食品に添加された医薬品成分を分析動、および対照とした標準溶液との類似性について、１枚のする上で、その試験検査の効率性を確保し、信頼性を高めるTLC上で視覚的に捕らえること可能であり、効率的に分析対ために重要であると考えられた。

象成分を推定することが可能であった。また、HPLCのようまた、強壮強精を目的としたいわゆる健康食品では、最に接続した検出器によって検出法を縛られることはなく、近、既存のED治療薬成分の構造を若干修飾した類似成分の様々な検出試薬を使用することが可能である。今回の分析事検出事例が相次いでいる[6−8]。そのため、検出成分の最終例では、製品中のタダラフィルの含有について、TLC法によ的な同定のためには、質量分析計等の同定能力が高い分析が―４１―

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不可欠である。しかし、このような類似成分では、骨格とS. ; Minowa, K. ; Kamimura, H. ; Yasuda, I. Ann. Rep. To-

なった医薬品成分とは疎水性が大きく変化している可能性がkyo Metr. Inst. P. H. 2003, 54, 69−73

懸念される。そのため、原点から展開溶媒先端まで一度に観[3]察が可能であるTLC法を活用することは、その化学的性質のKumasaka, K. ;Kijima, T. ;Doi, K. ;Satoh, S.

YAKUGAKU ZASSHI 2003, 123, 1049−1054

的確な推定につながるものと考えられる。

[4]

市場に流通するいわゆる健康食品の製品数は膨大であり、Moriyasu, T. ; Shigeoka, S. ; Kishimoto, K. ; Ishikawa,F. ; Nakajima, J. ; Kamimura, H. ; Yasuda, I. YAKUGAKU

添加された医薬品成分による健康被害を防止するためには、

ZASSHI 2001, 121, 765−769より効率的な試験検査の実施が重要である。今後の試験検査[5]

勃起不全治療剤「レビトラ錠５ mg、１０mg」添付文書[6]

Shin, M.−H. ; Hong, M.−K. ; Kim, W.−S. ; Lee, Y.−J. ;バイエル薬品株式会社

において、効率化のためにはTLC法の活用が有効になると考えられた。

Jeoung, Y.−C. Food Additives & Contaminants 2003, 20,
謝辞

793−796

クエン酸シルデナフィルをご提供いただいた、ファイザー[7]

株式会社に深謝いたします。

Blok−Tip, L. ; Zomer, B. ; Bakker, F. ; Hartog, K. D. ;Hamzink, M. ; ten Hove, J. ; Vredenbregt, M. ; de Kaste
D. Food Additives & Contaminants 2004, 21, 737−748

文献
[1]

[8]
健康被害情報・無承認無許可医薬品情報

厚生労働省

77

http : //www.mhlw.go.jp/kinkyu/diet.html[2]

Moriyasu, T. ; Shigeoka, S. ; Minowa, K. ; Kishimoto, K. ;Yasuda, I. Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P. H. 2004, 55, 73−Moriyasu, T. ; Kishimoto, K. ; Nakajima, J. ; Shigeoka,―４２―