最 近 の ト ピ ッ ク ス

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最 近 の ト ピ ッ ク ス

新たな骨形成不全症モデルマウスに見られた選択的スプライシング-Seal における GT-AG ルールの例外 A novel mutation generated a raresplice site in Osteogenesis imperfecta
model mice
- an exception to the GT-AG rule in
Seal 新潟大学超域研究機構

多部田康一，高橋直紀，前川知樹，山崎和久
Center for Transdisciplinary Research, Niigata University

Koichi Tabeta, Naoki Takahashi, Tomoki Maekawa,Kazuhisa Yamazaki

変異による影響を受けるかで症状の強さが異なる。症状としては，脆弱な骨形成による易骨折性，骨の変形を主とし，青色強膜，難聴，成長障害，歯科と関連して象牙質形成不全が認められる。幼児期より骨折を繰り返すため特に成長期の小児に大きな負担となり，のちに障害を残すこともある。小児慢性特定疾患に指定さる疾患であり，多様な症状に対して治療法は十分に確立されていな
い。疾患の解析，治療法の開発などに有用なツールとして，これまでいくつかの疾患動物モデルとなる Type Iコラーゲンのミュータントマウスが作られてきたが，コラーゲン分子の生体における重要性がゆえに，胎生致死もしくは誕生後すぐに死亡してしまうため，疾患モデルとして利用できるものは限られている。Seal マウス はミューテーションによる影響が非常に小さく，ミューテーションがホモ接合子となった場合のみ易骨折性を示す劣性遺伝形質である。骨折させない限りは正常に生育する。ヒト OI のモデルとして極めて貴重なモデルマウ
スであると考えられる。

【Seal : 新しい骨形成不全症モデルマウス】【Type I コラーゲン遺伝子に変異がない？】

現在，私たちは骨形成不全症モデルマウスにおける疾マウス Type I コラーゲン（α1 鎖）は約 4000bp（塩基）患発症メカニズムについての解析を行っている。このマにコードされる大きな遺伝子である。約 40 のエクソン

ウスは ENU（N-ethyl-nitrosourea）というアルキル化より構成され，ゲノム上 15000bp の範囲にわたってコー剤の一種を投与することによりゲノム遺伝子上にランダドされている。真核細胞の遺伝子は pre-mRNA 転写後ムに点突然変異（ポイントミューテーション）を導入しの選択的スプライシングにより mRNA が形成され，さたマウスの子孫において発見された 。体を掴まれた直らにアミノ酸に翻訳されることにより機能する。Seal

後にアザラシ（Seal ）が陸をはうように歩くフェノタイ

マウスの明らかなフェノタイプから，この Type I コラープ（表現系）から Seal マウスと命名された。当初はヒゲン遺伝子の mRNA 配列上に遺伝子の変異があるもの

トに掴まれた恐怖のあまり？神経症状により後ろ足に麻と予測されたため，この点について検索した。しかし実痺がでるものかと考えられていたが，その後詳細に検討際には mRNA 上には変異は存在しなかった。結果としすると，体幹をつかむと逃げようともがくことにより自て変異はイントロン上の５' 末端にある選択的スプライ分自身の力で脊椎を骨折しているらしく，麻痺は脊椎のシングにおけるイントロン認識部位に存在していた。と損傷によるものであることがわかった。約 2000 頭のころが信じられないことにスプライシング産物は正常でSeal マウスの交配と遺伝子マッピングによる実験結果から，第 11 染色体の Type I コラーゲンの遺伝子付近に発生した遺伝子変異によりこのフェノタイプが発生していることが予測された。従ってこのマウスはヒト骨形成不全症（OI：Osteogenesis Imperfecta）の新たな疾患モデルマウスであると考えられた。
ヒトにおける OI は遺伝性疾患であり約２万人に１人の割合で発症する。最も高頻度なケースは Type I コラーゲンの遺伝子変異が原因であり，その変異の位置により産生される Type I コラーゲンたんぱく質がどのようにあり，正常なたんぱく質が翻訳されていることも解った。

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常識的には考えられないことである。
選択的スプライシングは真核細胞の遺伝子発現における中心的なメカニズムであり，これにより一般には直接的にアミノ酸をコードするエクソンの間に複数介在するたんぱく質としての情報をもたないイントロンの除去が行われる。ヒトの遺伝子のうち約 70％の遺伝子はこの選択的スプライシングを受ける。長さの異なるスプライシング産物であるスプライシングアイソフォームが転写されることから，高等動物においてコードされるたんぱ－ 79 －

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新潟歯学会誌

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（1）
：2010

く質の機能により多様性を与える仕組みの一つであると考えられている。この切り取られるイントロンの５' 末端と３' 末端は GT と AG の塩基対でコードされている。
教科書的には選択的スプライシングにおける GT-AGルールとして知られている。また，わずかであるがその他の例外的なスプライシングのメカニズムが存在することも知られている。
選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ は Uracil rich small nuclear
RNA（U-snRNA） と そ れ に 結 合 す る Small nuclear
ribonucleoproteins（snRNPs）の複合体で形成されるスプライソゾームによって２つのステップにより行われる。①イントロンの 5' splice site（SS）の塩基配列 GTと３' SS の AG さらにその間に位置する Branch pointの A（アデノシン）を認識する。②投げ縄構造にイン
ト ロ ン を 切 り 捨 て る。 こ の 過 程 に お い て U2 snRNPdependent のスプライシング（図 1a）が大部分をしめるが，ごくわずかに U12 snRNP-dependent にスプライシングを受けるイントロン（約 0.3％）の存在も知られている 2（図 1b）。ヒトのゲノムシークエンスがほぼ解読され，この U12 Type のなかには GT-AG 以外のスプライシングによるものが約 30％存在すると最近報告さ

図１. 選択的スプライシング
A: U2 snRNP-dependent ス プ ラ イ シ ン グ，B: U12 snRNPdependent スプライシングれた。全スプライシングの約 99.7％を占める U2 タイプ

Seal マウスは骨の組織学的所見において非常に薄いではその 99％以上が通常に GT-AG によりスプライシン皮質骨と骨梁を有し，電顕レベルにおいても明らかに希グを受けるため，GT-AG 以外でのスプライシングは本薄なコラーゲン線維束が観察される（図２，図３）。遺当にレアなものである 3。

伝子の発現レベルはわずかに減少しているのみだが，実際 GT-AG 以外のスプライシングが行われる遺伝子

Type I コラーゲン量が恒常的に減少することが脆弱な骨はクラスターを形成してゲノム上にコードされているこのフェノタイプを生じさせていると考えられる。ヒト OIとが報告される。つまりスプライシングのメカニズムとにおいても同様に Type I コラーゲンの低産生が原因として安定したシステムが進化の中で淘汰に耐えて残ってなっているタイプが多い。そのような点でこの Seal マウきたものであると考えられる。この SS に塩基の置換がスは OI の治療法の開発などに非常に貴重なモデルとな起きれば，正常なスプライシングが阻害されることでエクソンの skipping 等を生じ，正常たんぱく質として機能しなくなるために SS に生じた一塩基の変異の個体生存へのリスクは非常に大きい。ヒトの遺伝疾患の約 15％がスプライシング異常によるものであるとされている。

【Seal マウスが貴重な理由】
これまで Seal マウスに認められる５'SS ミューテー

図２. 脛骨骨端軟骨部の H-E 染色像（a: Wild-type, b: Seal ）Seal において Wild-type に比べて著しく骨梁構造（矢頭）が減少している。

ションのタイプで正常なスプライシングが起きる例は知られていない。しかし昨年 U1-snRNP 非依存性（イントロンの 5'SS を認識する snRNP に依存しない）スプライシングが細胞レベルでも起きることが報告された 4。
現在のところ生体レベルでこの現象が起きていることは報告されていないが，私たちが Seal マウスに見ている現象は U1-snRNP 非依存性経路と同一または類似した新たなスプライシングメカニズムが生体において機能することを示す。

図３. 電顕像（x5000），（a: Wild-type, b: Seal マウス）
Seal において Wild-type に比べて疎なコラーゲン線維の走行を認める。

－ 80 －多部田

康一

りうると考えられる。現在さらなる解析を進めている。

ほか

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proteins in innate and adaptive immuneresponses. Microbes Infect, 6:1374-1381, 2004.
２）Reed R: Mechanisms of fidelity in pre-mrna（共同研究者）

splicing. Curr Opin Cell Biol, 12:340-345, 2000.

The Scripps Research Institute３）Sheth N, Roca X, Hastings ML, Roeder T,

Bruce Beutler

Krainer AR, Sachidanandam R: Comprehensive北海道大学大学院歯学研究科

splice-site analysis using comparative genomics.

網塚憲生（前新潟大学超域研究機構教授

Nucleic Acids Res, 34:3955-3967, 2006.

教授）

４）Fukumura K, Taniguchi I, Sakamoto H, Ohno M,【参 考 文 献】

Inoue K: U1-independent pre-mrna splicing
contributes to the regulation of alternative

１）Beutler B, Hoebe K, Georgel P, Tabeta K, Du X:
Genetic analysis of innate immunity. Tir adapter－ 81 －splicing. Nucleic Acids Res, 37:1907-1914, 2009.