基質多様性を有するアデニル化酵素の探索とD-アミノ酸ジペプチド生産法の開発

P-16

木野 邦器
早稲田大学 先進理工学部 応用化学科

Kino Laboratory

目的 ジペプチドは構成するアミノ酸単体には見られない生理活性や物理化学的特性を有し、医薬品や健康食品素材、化成品などその用途は拡大している。一方、発酵・醸造食品中の遊離D-アミノ酸の存在と呈味性などが報告され、D-アミノ酸を含むジペプチドにも新たな機能や特性が期待できる。本研究では、我々が見出した非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメインを利用するユニークなアミド結合形成反応1)を応用して、D-アミノ酸含有ジペプチドの新規生産法を開発した。

Adenylation
domain+

Mg2+
D-Amino acid
(D-Xaa)D-Amino acid
(D-Yaa)ATPAMP
PPiDipeptide(D-Xaa-D-Yaa)

方法・結果 1.アデニル化ドメインを利用したジペプチド合成
N末端側アミノ酸(制限有り)
Aドメインの基質となるアミノ酸

A domain
Mg2+ATPPPiAMP➢ D-アミノ酸を基質とするAドメインを利用→多様なキラリティを有するジペプチドが合成可能と推察＋ アミノ基による求核置換反応

アミノ酸のアデニル化反応

2. D-アミノ酸を基質とするAドメインの探索■作業仮説の構築
NRPSによるペプチド合成におけるキラリティ制御
1. Aドメイン：アデニル化する基質アミノ酸
2. Eドメイン：L-アミノ酸→D-アミノ酸の立体反転
3. Cドメイン：厳密なキラリティ認識を伴うアミノ酸同士の縮合■候補AドメインのD-アミノ酸に対する基質特異性評価
タンパク質構成性アミノ酸およびOrnのD-体を対象として評価
ヒドロキシルアミン比色分析(Fig. 2)5)を利用+➢ Eドメインを有するモジュールのAドメイン→D-アミノ酸を基質としても生合成に不都合がない= D-アミノ酸を基質とする可能性が高い

Mg2+

FeCl3
AMP
PPi

λmax=490 nm

Fig. 2. Hydroxamate-based colorimetric assay5).
TycA-Awith A domain

Tyrocidine synthetase from Brevibacillus parabrevis IAM 10312)

BacB2-A

TycC

TycB

module 1

module 2

module 3

module 4

Phe T

C Pro T

C Phe T

C Phe T

EA domain
ATP■候補Aドメインの選定
TycA

C末端側アミノ酸(制限無し)
全てのアミノ酸E

module 5

module 6

module 7

module 8

module 9

module 10

C Asn TC Gln T

C Tyr T

C Val T

C Orn T

C Leu T

without A domain
E

BacC4-A

TycA-A

Bacitracin synthetase from Bacillus licheniformis NBRC 121993)
BacB

BacA
module 1 module 2

module 3

module 4

C Cys T

C Leu T

C Glu T

IleTE

module 5

module 6

CC Lys TIleTPbtA1-A

BacC

module 7
EC Orn T

module 8module 9

TC Phe T

CIle

module 10
E

C His T

BacB2-A

module 11

C Asp TE

module 12

C Lys T

BacC4-A

PbtB2-A

Paenibacterine synthetase from Paenibacillus alvei NBRC 3343
(homolog of paenibacterine synthetase from Paenibacillus thiaminolyticus OSY-SE4)
PbtA
module 1
C Orn TE

module 2

module 3

C Val T

C Thr T

module 5

module 4
C Orn TE

C Ser T

module 6
C Val T

PbtA1-A

module 7
C Lys T

module 9 module 10module 8

E

C Ser TPbtB3-APbtCPbtB

ECT

Ile

C Pro T

module 13

module 11 module 12
CVal T

C Lys TCIle

T Te

PbtB2-A PbtB3-A

Fig. 1. Location of six candidate A domains in the NRPS modules.

Fig. 3. Colorimetric assay for substrate specificity of A domains.

➢ 候補として6つのAドメインを選定
TycA-A, BacB2-A, BacC4-A, PbtA1-A, PbtB2-A, PbtB3-A➢ TycA-AがD-Ala, D-Leu, D-Met, D-Phe, D-Tyr, D-Trp、BacB2-A, PbtA1-A, PbtB2-AがD-Lysを基質とすることが判明

3. D-アミノ酸含有ジペプチドの合成■TycA-A、BacB2-Aを用いたジペプチド合成
N末端側:Xaa■菌体反応によるD-Trp-D-Pro合成

C末端側:Yaa

TycA-A

BacB2-A

L-Ala, L-Leu, L-Met, L-Phe, L-Tyr, L-Trp
D-Ala, D-Leu, D-Met, D-Phe, D-Tyr, D-Trp

L-Lys
D-Lys

TycA-A

BacB2-A

D-Trp

D-Lys

L-Pro
D-Pro

D-Yaa

37ºC
24hr
反応

HPLC分析
MS分析
MS/MS分析➢ L-Xaa-L-Pro, L-Xaa-D-Pro, D-Xaa-L-Pro, D-Xaa-D-Proが生成→ 基質のキラリティを反映したジペプチドの作り分けが可能➢ D-Trp-D-Yaa, D-Lys-D-Yaaが生成→ 求核剤として任意のD-Yaaが利用可能➢ 最大4.67 mMの
D-Trp-D-Proが生成
pH： 8.0
Mg2+： 10 mM
Fig. 4. D-Trp-D-Pro synthesis by whole cell reaction.

まとめ 1. NRPSによるペプチド合成機構を踏まえて“Eドメインを有するモジュールのAドメインはD-アミノ酸も基質とする”という作業仮説を立て、それに基づいて探索を行った結果、D-アミノ酸を基質とする目的のAドメインを４つ(TycA-A, BacB2-A, PbtA1-A, PbtB2-A)見出した。
2. TycA-A及びBacB2-Aを用いた場合、基質Xaaと求核剤Proを作用させると、L-Xaa-L-Pro、L-Xaa-D-Pro、D-Xaa-L-Pro、D-Xaa-D-Proが、D-TrpあるいはD-Lysを基質として求核剤D-Yaaを作用させると、それぞれ、D-Trp-D-Yaa と D-Lys-D-Yaa が生成した。
3. D-Trpを基質とするTycA-Aを発現させた組換え大腸菌による菌体反応では、10 mMのD-Trpから最大4.67 mMのD-Trp-D-Proを生産した。

文献

1) Hara, R., et al., Sci. Rep., 8:2950 (2018)2) Marahiel, MA., et al., Mol. Gen. Genet, 201, 231-236 (1985)

4) Huang, E., et al., Res. Microbiol., 165, 243-251 (2014)

5) Hara, R., et al., Anal. Biochem., 477, 89-91 (2015)

3) Konz, D., et al., Chem. Biol., 4, 927-937 (1997)