Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

Tanaka, Anal. Chem., 68(1996)3498.

Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

Original

72(2000)1275.

50）C. Fujimoto, Analusis, 26(1998)M49.

53）N. Tanaka, H. Nagayama, H. Kobayashi, T. Ikegami, K.

51）C. Fujimoto, J. High Resol. Chromatogr., 23(2000)89.

Hosoya, N. Ishizuka, H. Minakuchi, K. Nakanishi, K.

52）N. Ishizuka, H. Minakuchi, K. Nakanishi, N. Soga, H.

Cabrera and D. Lubda, J. High Resol. Chromatogr.,

Nagayama, K. Hosoya and N. Tanaka, Anal. Chem.,

Original

23(2000)111.

イオン交換樹脂を利用した人蔘サポニン分離法の開発
成鍾煥1，蔡煕政2，金義†ソウル市立大学校化学工学科，１㈱一和中央研究所，２湖西大学校食品加工工学科

Development of Separation Method of Ginseng Saponins
using Ion Exchange Resin
Jong-Hwan Sung1, Hee Jeong Chae2 and Eui Yong Kim†
Department of Chemical Engineering, University of Seoul, Seoul 130-743,Korea
1

Central Research Institute, IL-HWA Co.,Ltd., 471-030, Korea

2

Department of Food Technology, Hoseo University, Asan 336-795, Korea

Received, November 8, 1999.

Accepted, March 13 , 2000.

Abstract
A new method to prepare saponin fractions from Ginseng whole extracts was developed. A separation procedure was establisherd using HP-20, a porous adsorption resin. After adsorption, fellowed byelution with water and methanol, high yield and high content of Ginseng Total saponins (GTS) wereobtained. The recovery yields of GTS prepared by conventional methods such as n-butanol (BuOH)
method and sep-pak C18 cartridge method were compared with that by HP based method. Ginsenosidecontent in GTS prepared by HP method was significantly higher than that by BuOH-method. In
addition, when HP method was used, GTS was separated completely into protopanaxadiol (PPD)- andprotopanaxatriol (PPT)-type saponins with high rapidity. Consequently HP-20 method was found to besuperior to BuOH method in the preparation of GTS, PPD and PPT fractions from Ginseng whole
extracts.
Key words : Ginseng total saponins(GTS), HP resin, Protopsnaxadiol(PPD), Protopanaxztriol(PPT),
Recovery yield.

はじめにが薬理活性を持つ物質として確認された（１）。サポニンとは人蔘（Panax ginseng C. A. Mayer, Araliaceae）は、韓國並

スペイン語の泡に由来し、持続的に泡があり、水やアルコー

びに中東北部の山岳地帶に自生している多年生草本である。

ルによく溶ける物質を意味する。Fig.1に表わすように、GTS数千年前から神秘の霊薬として珍重された薬草で、中国本草はtriterpene骨格のR1、R2、R3の位置に糖類が結合した構造学の原典である 農神本草経 に上薬として収載されている。

を持つ。1966年、柴田らは人蔘に含有される配糖体を、薄層ク

現在は、そのほとんどが栽培品として、健胃消化剤、整腸剤、ロマトグラフでのRF値の順でginsenoside-Ra(Ra)、-Rb1、

鎭痛剤、滋養強壯剤などの多くの漢方処方で使用されている。

-Rb2、-Rc、-Rd、-Re、-RF、-RG、-RH等と命名した（２）。

人蔘成分の中でサポニン（ginseng total saponins、GTS）-protopanaxadiol（PPD、doil系、Rb1、Ginsenosideは、20（S ）†Corresponding author

−202−

−203−

Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

Rb2、Rc、Rdなど）と20（S ）-protopanaxa-triol（PPT、triol系、Jong-Hwan Sung, Hee Jeong Chae and Eui Yong Kim

溶媒で展開し、発色のために10％-H2SO4を噴射して、120℃た後、減圧濃縮してGTSを得た。

という短所を持っている。

Re、Rf、Rgなど）に分けることができる。

Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

にて５分間加温した。HPLCはWaters Millennium systemを

この研究は、より速く効率的にGTSを分離、回收のために、GTSの生体内代謝に関する研究が最近活発に進み、GTSの吸着型樹脂を利用する新しい分離法を開発し、同法による新代謝中間物質から発癌制御及び癌轉移抑制作用が有ることがしいPPTとPPDの分離法を確立し、簡便で速やかなサポニン

確認され、GTSから抗癌剤を開発しようとする研究が進行し分離法を開発しようとする。

ている（3−7）。また、抗糖尿、抗血小板作用、免疫増強作用

ブタノール法によるPPT、PPDの分離

利用し､AcCn：H2O溶媒を移動相として使用し分析した。は

GTS 2000mgを５％ NaOH 60mlに溶解し、水飽和ブタノー

じめの30分まではAcCN：H2O（18：82）とし、33分まで30：ルで３回抽出した。ブタノール層を水で洗淨した後、ろ過し、70に調節した後、以後同じ濃度で維持した。檢出器はUV-

減圧濃縮してPPTを得た。一方、水層に10％HCIを加え中和

203nm、カラムはLiChrospher RP-8（5μm）を使用し、流量した後、水飽和エタノールで３回抽出し、水で３回洗淨したは1.5ml/minにした。カラム温度は40℃に調節した。その結反する薬理作用があることも知られている（８）。この樣に人

材料及び方法後、ろ過し、減圧濃縮してPPDを得た。GTSからアルカリ條

果をFig.２及びFig.３に表わす。

蔘の主な薬理活性成分であるGTSは多方面に用いられる重要

実験材料

件で分離されたPPTは680mgであり、中和した後得られたと共に、PPTは血圧を上昇させ、PPDは血圧を降下させる相PPDは760mgであった。

Sep-Pak法による試料のHPLC定量分析

HP法によるGTSの分離分析に汎用されている（13）。Sep-Pak C18 cartridgeは小さなな物質で、人蔘からGTSを分離、回收する技術の開発は大変

人蔘は、韓国の金山で栽培された水分含有量が約７−10％

重要だと言える。今までは、人蔘をエタノールで抽出した後、である６年根乾蔘を購入し、実験に使用した。人蔘濃縮液は、さらに水飽和ブタノール（BuOH）で再抽出することによっ人蔘200gを細断後、50％エタノール1200mlで６時間、４回還てGTSを回收する方法が使用されていた（２,９,10）。しかし、流抽出し、そのろ液を減圧濃縮して調製した。標準品としてイオン交換樹脂DIAION HP-20は多孔性吸着樹脂である。

前処理用完成品で、機器分析の微量成分分析用前処理に使わこの方法ではエタノールに加えて沸点の高いブタノールを使使用したRb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rglは既存の方法で吸着力が強くて、特に糖分の吸着分離が容易で、糖分離に多れるので、HP法やブタノール法のように大量分離には利用用するために、濃縮するの時間がかかり、大量生産が難しい單離した（11）。

く使用されている。この研究では配糖体であるGTSの効率的できない。從ってこの実験で使用したHP法により分離した

な分離のためにGHP-20を利用した。先ずHP-20をメタノール

GTSの分離能をSep-Pak法と比較した。ブタノール法、HP法、機器及び試薬

Sep-Pak C18 cartridgeは、人蔘濃縮液中のginsenoside定量に一晩浸した後、蒸留水で洗淨して使用した。正確に計り取並びにSep-Pak C18 cartridge法によるGTSの分離能をHPLCを

HPLCはWaters Millennium systemを、TLCはsilica gel 60

ったHP-20（10ml、v/v）を、底部を脱脂綿で栓をしたガラス用いて分析した。人蔘濃縮液20mgを量り取り、少量の水にF254（Merck）を使用した。GTS分離に、DIAION HP-20担体

カラム（10mm×300mm）に充填した。試料及び容媒を入れる

溶かした後、予めメタノール２mlと水５mlに浸潤させたSep-（三菱化成、日本）を使用した。Sep-Pak C 18 cartridgeは

ときHPが盛り上がっていることを防止するために、上部をPak C18 cartridgeに注入した。水と30％メタノールで先淨後、Waters社製を、アセトニトリル（AcCN）
はHPLC用を使用した。

脱脂綿で止めた。HPの吸着能を計るために人蔘濃縮液をメタノールで溶出した。溶出液は減壓濃縮後、HPLC用移動300mg、500mg、800mg、1200mg、1700mg、2200mgを各各相に溶かして分析試料とした。ブタノール法とHP法で分離

量り、水0.5mlに溶かして、カラム上部からゆっくり注入し、したGTSも同じ濃度になるよう分析試料を調製した。

ブタノール法によるGTSの分離
人蔘濃縮物2000mgを水60mlに溶解し、分液ロートに入れ、約2ml/minの流速で担体に吸着させた。吸着後はHPの3倍量

同量のエーテルで３回抽出した。水層は水飽和ブタノールでの水で糖画分を溶出し、３倍量の50％メタノールで非糖画分結果及び考察３回抽出し、ブタノール層を集め、水で3回洗淨し、ろ過しを溶出した後、最後にメタノールでGTS画分を溶出した。吸HP法の吸着及び回收限界
人蔘濃縮物300mgから2,200mgを用いてHP 10mlに対する着されなかったGTSを定量するために、水溶出液を別のHP

Fig. 1

カラムに吸着させ、同じ方法で糖部と非糖部を除去して、メ

吸着量を調べた。

Name

R

R

R

Ginsenoside-Ra1-O-Glc2-Glc-H-Glc6-Ara(p)4-Xyl

タノール溶出液を得た。溶出速度による影響を試驗するため

Table１に示すように、吸着させた濃縮液の量の増加にとGinsenoside-Ra2-O-Glc -Glc

-H

-Glc -Ara(f) -Xylに同法0.5ml/minから2.5ml/minまで溶出速度を変えて実験しもなってGTSの量も増加した。しかし、濃縮液の量が800mg

Ginsenoside-Ra3-O-Glc2-Glc-H-Glc6-Glc3-Xylた。以上の方法で確立した実験法は、繰り返し實驗を通してを境として、GTSの回收量（％）が量依存的に減少した。これ

Ginsenoside-Rb1-O-Glc -Glc

-H

-Glc -Glc

その再現性を確認した。

は、10mlのHPに対する人蔘濃縮液の限界吸着量が500mgでGinsenoside-Rb2-O-Glc2-Glc-H-Glc6-Ara(p)Ginsenoside-Rb3-O-Glc -Glc

-H

-Glc -Xyl

Ginsenoside-Rc-O-Glc2-Glc-H-Glc6-Ara(f)Ginsenoside-Rd-O-Glc -Glc

-H

Ginsenoside-Re-OH-O-Glc2-Rha

Ginsenoside-Rf-OH

Ginsenoside-Rg1

1

2

2

2

2

3

6

4

6

6

あることを示唆している。さらに、HPに吸着されずに溶出HP法によるPPT、PPDの分離

したGTSを定量した結果、500mgの人蔘濃縮液を吸着した場

人蔘濃縮液500mgを水0.5mlに溶かしてHPカラムに吸着さ合、GTSは檢出されなかったが、800mgから約１％が檢出さ-Glc

せた後、水及び50％メタノールで糖部及び非糖分を溶出した。

れ、以後檢出量が量依存的に増加し、2200mgの場合、3.7％-Glc

さらに、55％メタノールから85％メタノールまで５％間隔でが檢出された。また、GTSの吸着量と非吸着量を比較した場-O-Glc -Glc

-H

メタノール濃度を変えながら溶出した。各溶出液をTLCで確合、吸着量は濃縮液の量が800mgまでは14.4〜14.8％と一定し-OH-O-Glc-Glc

認した後、減圧濃縮して各各の画分を得た。

ているが、1200mg以後からは徐々に減少していることが分

Ginsenoside-Rg2-OH-O-Glc -Rha

-H

Ginsenoside-Rg3-O-Glc2-Glc

-H

-H

2

2

2

かる。これは水で先淨するときは殘留しているが、不安定な吸TLC及びHPLCによるGTS、PPT、PPDのパターン分析

着状態であるためにね、
50％メタノールで非糖部を先淨する時、

Ginsenoside-Rh1-OH-O-Glc-H

各実験の過程で得たGTS、PPT及びPPD画分は、一定量をGinsenoside-Rh2-O-Glc-H-H

各各メタノール及びHPLC用移動相に溶かし、TLC及び基準として人蔘濃縮液からGTSを吸着分離する場合、500mg

HPLCで分析した（12）。TLC分析はsilica gel 60 F254（Merck）の人蔘濃縮液を吸着されるのが好ましいことが分かった。

Chemical structuers of ginseng saponins
Glc; β-D-glucopyranosyl, Xyl; β-D-xylopyranosyl, Ara(p); α-L-arabino-pyranosyl, Ara(f): α-L-arabinofuranosyl, Rha; α-L-rhamnopyranosyl−204−

溶出させたと思われる。以上の結果から見ると、HP 10mlをを使用し、CHCl3：MeOH：H2O（65：35：10, lower phase）−205−

次に、先淨液の溶出速度がGTSの吸着分離に与える影響をChromatography, Vol.21 No.3(2000)

Rb2、Rc、Rdなど）と20（S ）-protopanaxa-triol（PPT、triol系、Jong-Hwan Sung, Hee Jeong Chae and Eui Yong Kim

溶媒で展開し、発色のために10％-H2SO4を噴射して、120℃た後、減圧濃縮してGTSを得た。

という短所を持っている。

Re、Rf、Rgなど）に分けることができる。

Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

にて５分間加温した。HPLCはWaters Millennium systemを

この研究は、より速く効率的にGTSを分離、回收のために、GTSの生体内代謝に関する研究が最近活発に進み、GTSの吸着型樹脂を利用する新しい分離法を開発し、同法による新代謝中間物質から発癌制御及び癌轉移抑制作用が有ることがしいPPTとPPDの分離法を確立し、簡便で速やかなサポニン

確認され、GTSから抗癌剤を開発しようとする研究が進行し分離法を開発しようとする。

ている（3−7）。また、抗糖尿、抗血小板作用、免疫増強作用

ブタノール法によるPPT、PPDの分離

利用し､AcCn：H2O溶媒を移動相として使用し分析した。は

GTS 2000mgを５％ NaOH 60mlに溶解し、水飽和ブタノー

じめの30分まではAcCN：H2O（18：82）とし、33分まで30：ルで３回抽出した。ブタノール層を水で洗淨した後、ろ過し、70に調節した後、以後同じ濃度で維持した。檢出器はUV-

減圧濃縮してPPTを得た。一方、水層に10％HCIを加え中和

203nm、カラムはLiChrospher RP-8（5μm）を使用し、流量した後、水飽和エタノールで３回抽出し、水で３回洗淨したは1.5ml/minにした。カラム温度は40℃に調節した。その結反する薬理作用があることも知られている（８）。この樣に人

材料及び方法後、ろ過し、減圧濃縮してPPDを得た。GTSからアルカリ條

果をFig.２及びFig.３に表わす。

蔘の主な薬理活性成分であるGTSは多方面に用いられる重要

実験材料

件で分離されたPPTは680mgであり、中和した後得られたと共に、PPTは血圧を上昇させ、PPDは血圧を降下させる相PPDは760mgであった。

Sep-Pak法による試料のHPLC定量分析

HP法によるGTSの分離分析に汎用されている（13）。Sep-Pak C18 cartridgeは小さなな物質で、人蔘からGTSを分離、回收する技術の開発は大変

人蔘は、韓国の金山で栽培された水分含有量が約７−10％

重要だと言える。今までは、人蔘をエタノールで抽出した後、である６年根乾蔘を購入し、実験に使用した。人蔘濃縮液は、さらに水飽和ブタノール（BuOH）で再抽出することによっ人蔘200gを細断後、50％エタノール1200mlで６時間、４回還てGTSを回收する方法が使用されていた（２,９,10）。しかし、流抽出し、そのろ液を減圧濃縮して調製した。標準品としてイオン交換樹脂DIAION HP-20は多孔性吸着樹脂である。

前処理用完成品で、機器分析の微量成分分析用前処理に使わこの方法ではエタノールに加えて沸点の高いブタノールを使使用したRb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rglは既存の方法で吸着力が強くて、特に糖分の吸着分離が容易で、糖分離に多れるので、HP法やブタノール法のように大量分離には利用用するために、濃縮するの時間がかかり、大量生産が難しい單離した（11）。

く使用されている。この研究では配糖体であるGTSの効率的できない。從ってこの実験で使用したHP法により分離した

な分離のためにGHP-20を利用した。先ずHP-20をメタノール

GTSの分離能をSep-Pak法と比較した。ブタノール法、HP法、機器及び試薬

Sep-Pak C18 cartridgeは、人蔘濃縮液中のginsenoside定量に一晩浸した後、蒸留水で洗淨して使用した。正確に計り取並びにSep-Pak C18 cartridge法によるGTSの分離能をHPLCを

HPLCはWaters Millennium systemを、TLCはsilica gel 60

ったHP-20（10ml、v/v）を、底部を脱脂綿で栓をしたガラス用いて分析した。人蔘濃縮液20mgを量り取り、少量の水にF254（Merck）を使用した。GTS分離に、DIAION HP-20担体

カラム（10mm×300mm）に充填した。試料及び容媒を入れる

溶かした後、予めメタノール２mlと水５mlに浸潤させたSep-（三菱化成、日本）を使用した。Sep-Pak C 18 cartridgeは

ときHPが盛り上がっていることを防止するために、上部をPak C18 cartridgeに注入した。水と30％メタノールで先淨後、Waters社製を、アセトニトリル（AcCN）
はHPLC用を使用した。

脱脂綿で止めた。HPの吸着能を計るために人蔘濃縮液をメタノールで溶出した。溶出液は減壓濃縮後、HPLC用移動300mg、500mg、800mg、1200mg、1700mg、2200mgを各各相に溶かして分析試料とした。ブタノール法とHP法で分離

量り、水0.5mlに溶かして、カラム上部からゆっくり注入し、したGTSも同じ濃度になるよう分析試料を調製した。

ブタノール法によるGTSの分離
人蔘濃縮物2000mgを水60mlに溶解し、分液ロートに入れ、約2ml/minの流速で担体に吸着させた。吸着後はHPの3倍量

同量のエーテルで３回抽出した。水層は水飽和ブタノールでの水で糖画分を溶出し、３倍量の50％メタノールで非糖画分結果及び考察３回抽出し、ブタノール層を集め、水で3回洗淨し、ろ過しを溶出した後、最後にメタノールでGTS画分を溶出した。吸HP法の吸着及び回收限界
人蔘濃縮物300mgから2,200mgを用いてHP 10mlに対する着されなかったGTSを定量するために、水溶出液を別のHP

Fig. 1

カラムに吸着させ、同じ方法で糖部と非糖部を除去して、メ

吸着量を調べた。

Name

R

R

R

Ginsenoside-Ra1-O-Glc2-Glc-H-Glc6-Ara(p)4-Xyl

タノール溶出液を得た。溶出速度による影響を試驗するため

Table１に示すように、吸着させた濃縮液の量の増加にとGinsenoside-Ra2-O-Glc -Glc

-H

-Glc -Ara(f) -Xylに同法0.5ml/minから2.5ml/minまで溶出速度を変えて実験しもなってGTSの量も増加した。しかし、濃縮液の量が800mg

Ginsenoside-Ra3-O-Glc2-Glc-H-Glc6-Glc3-Xylた。以上の方法で確立した実験法は、繰り返し實驗を通してを境として、GTSの回收量（％）が量依存的に減少した。これ

Ginsenoside-Rb1-O-Glc -Glc

-H

-Glc -Glc

その再現性を確認した。

は、10mlのHPに対する人蔘濃縮液の限界吸着量が500mgでGinsenoside-Rb2-O-Glc2-Glc-H-Glc6-Ara(p)Ginsenoside-Rb3-O-Glc -Glc

-H

-Glc -Xyl

Ginsenoside-Rc-O-Glc2-Glc-H-Glc6-Ara(f)Ginsenoside-Rd-O-Glc -Glc

-H

Ginsenoside-Re-OH-O-Glc2-Rha

Ginsenoside-Rf-OH

Ginsenoside-Rg1

1

2

2

2

2

3

6

4

6

6

あることを示唆している。さらに、HPに吸着されずに溶出HP法によるPPT、PPDの分離

したGTSを定量した結果、500mgの人蔘濃縮液を吸着した場

人蔘濃縮液500mgを水0.5mlに溶かしてHPカラムに吸着さ合、GTSは檢出されなかったが、800mgから約１％が檢出さ-Glc

せた後、水及び50％メタノールで糖部及び非糖分を溶出した。

れ、以後檢出量が量依存的に増加し、2200mgの場合、3.7％-Glc

さらに、55％メタノールから85％メタノールまで５％間隔でが檢出された。また、GTSの吸着量と非吸着量を比較した場-O-Glc -Glc

-H

メタノール濃度を変えながら溶出した。各溶出液をTLCで確合、吸着量は濃縮液の量が800mgまでは14.4〜14.8％と一定し-OH-O-Glc-Glc

認した後、減圧濃縮して各各の画分を得た。

ているが、1200mg以後からは徐々に減少していることが分

Ginsenoside-Rg2-OH-O-Glc -Rha

-H

Ginsenoside-Rg3-O-Glc2-Glc

-H

-H

2

2

2

かる。これは水で先淨するときは殘留しているが、不安定な吸TLC及びHPLCによるGTS、PPT、PPDのパターン分析

着状態であるためにね、
50％メタノールで非糖部を先淨する時、

Ginsenoside-Rh1-OH-O-Glc-H

各実験の過程で得たGTS、PPT及びPPD画分は、一定量をGinsenoside-Rh2-O-Glc-H-H

各各メタノール及びHPLC用移動相に溶かし、TLC及び基準として人蔘濃縮液からGTSを吸着分離する場合、500mg

HPLCで分析した（12）。TLC分析はsilica gel 60 F254（Merck）の人蔘濃縮液を吸着されるのが好ましいことが分かった。

Chemical structuers of ginseng saponins
Glc; β-D-glucopyranosyl, Xyl; β-D-xylopyranosyl, Ara(p); α-L-arabino-pyranosyl, Ara(f): α-L-arabinofuranosyl, Rha; α-L-rhamnopyranosyl−204−

溶出させたと思われる。以上の結果から見ると、HP 10mlをを使用し、CHCl3：MeOH：H2O（65：35：10, lower phase）−205−

次に、先淨液の溶出速度がGTSの吸着分離に与える影響をChromatography, Vol.21 No.3(2000)

Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

Jong-Hwan Sung, Hee Jeong Chae and Eui Yong Kim

遊離糖が殘存することによりサポニン含量が高くなったと推察される。Fig.３の結果を見ると、二つの方法により分離したGTSのHPLCのパターンには大きな差は見られなかった。
ブタノール法とHP法によるPPTとPPDパターンをTLC（Fig.２）とHPLCで分析した。その結果、ブタノール法で分離したPPTからはPPD成分であるRb1、Rb2、Rc、Rdなどが檢出され、PPDからもPPT成分であるReが檢出され、完全に分離されないことが分かった。しかし、HP法から分離した
PPTやPPDからは各々の成分だけが檢出され、HP法による
PPTとPPDの分離がブタノール法よりも選択性において優れていることが分かった。さらに、HP法はブタノール法とは違って、人蔘濃縮液をHPカラムに吸着させた後、溶出液媒であるメタノール含量を変えることによってPPT、PPD、GTSを選択的に分離できる長所がある。
Fig. 4Comparison of the recovery yields of ginsenosides obtained by
BuOH, HP and Sep-Pak Method

Ginsenosideの定量分析
各分離方法における６種の主要ginsenoside成分に対する
HPLC分析を行った結果をFig. 4に表わす。HP法並びにSep-

Fig. 2

TLC spots of GTS, PPT and PPD obtained by BuOH and HP
methodFig. 3Comparison of HPLC profile of GTS obtained by BuOH method(a)and HP method(b)Table 1. Capability of HP resin to separate GTS from ginseng extract

調べた結果をTable２に表わす。HPカラムの最大自然溶出速Pak法によるGTS含量は、ほとんど同量であったが、ブタノ度である2.5ml/minまでは、溶出速度が増加してもGTS含量ール法によるGTS含量は著しく低い。また、Sep-Pak法に対に影響を与えることなく、平均14.2％の一定値が得られるこする回收率を比較すると、ブタノール法は86.5〜88.7％（平均とが分かった。

86％）であるのに比べ、HP法では88.8〜106.5％（平均99.8％以HP法によるPPT、PPDの分離上）の高い回收率が得られた。從って、HPを用いたGTSの分

HPカラムに吸着された濃縮液中のPPTとPPDを分離する

離法は、既存のブタノール法による低回收率、低分離能、並ために、GTS分離法と同樣に水と50％メタノールで糖部と非びに操作の煩雑さを解決するものであって、迅速、簡便で、Weight of

GTS weight

GTS weight

Total weight ofRecovery yield of

糖部を除去した後、55％メタノールから80％メタノールまで

高選択的に分離でき、大量生産にも耐えうる分離方法である

GTS obtained (mg)

GTS (%)

５％間隔でメタノール濃度を変えながら溶出した。55〜65％と考えられる。

ginsengobtained in MeOH

obtained in H2O

extract (mg)phase (mg)phase (mg)

300

44.4

−

44.4

14.8

に70％メタノール以上での溶出画分にはPPD成分だけが檢出

500

72.1

−

72.1

14.4

された。各々の溶出液を減圧濃縮して、人蔘濃縮液508.1mg

ブタノール法の最も大きな短所は溶媒分離が惡くて時間が

メタノールからの溶出画分にはPPT成分だけが檢出され、次HP法の特性

800

106.9

8.1

115.0

13.4

から、65％以下のメタノール溶出液から21.3mgのPPT、70％

たんさくかかり、刺戟的な有機溶媒を使用するという点であ

1200

146.2

16.9

163.1

12.2

以上のメタノール溶出液から48.6mgのPPDを得た。從って、る。実際、本実験でもブタノール法でGTSを分離するのに濃

1700

184.4

40.7

225.1

10.8

人蔘濃縮液をHPカラムに吸着先淨後、メタノール濃度を縮、乾燥まで含めて48時間以上所要した。これに比べてHP

2200

199.7

81.1

280.8

9.1

70％以下と以上に区別して溶出すれば、PPTとPPDを分離で法はわずか４−５時間あればすべての實驗が終了できた。まきることが分かった。

たHP法はメタノールと水だけを使うので実験環境も多く改善されており、沸点が比較的に低いメタノール層を濃縮する

ブタノール法とHP法の比較

Table 2. Effect of elution rate on the isolation yield of GTS in HP method

Elution rate (ml/min)

Total weight of GTS

Recovery yield of GTS (%)

obtained (mg)ので低温でも速やかな濃縮が可能で、カラムを裝着できる小人蔘濃縮液からGTSを分離してその含量を比較した結果、さなスペースでも実験が可能で比較的少量の溶媒で結果が得ブタノール法は14.8％、HP法は14.2％でブタノール法のGTSられる。從って、スケールアップによる大量生産が容易で、

0.5

70.7

14.1

含量が少し高かった。これはブタノール法の場合、ブタノー

時間的な面からも、コスト的な面からもブタノール法により

1.0

71.5

14.3

ル抽出物を水で先淨するとき、遊離の糖が殘存するのに対し、

良い新規な方法が確立できた。

1.5

70.4

14.1

HP法では完全に糖が除去されることに起因すると思われる。

2.0

72.3

14.5

このことは、Fig.２に示すように、ブタノール法の場合、

2.5

70.6

14.1

TLC下端に黄色いバンドの発現が遊離糖成分の存在を示して結いることからも裏付けられる。ブタノール法で分離した場合、

−206−

−207−

論

高麗人蔘の成分中で最も重要な薬理活性を持つGTSを分離Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

Jong-Hwan Sung, Hee Jeong Chae and Eui Yong Kim

遊離糖が殘存することによりサポニン含量が高くなったと推察される。Fig.３の結果を見ると、二つの方法により分離したGTSのHPLCのパターンには大きな差は見られなかった。
ブタノール法とHP法によるPPTとPPDパターンをTLC（Fig.２）とHPLCで分析した。その結果、ブタノール法で分離したPPTからはPPD成分であるRb1、Rb2、Rc、Rdなどが檢出され、PPDからもPPT成分であるReが檢出され、完全に分離されないことが分かった。しかし、HP法から分離した
PPTやPPDからは各々の成分だけが檢出され、HP法による
PPTとPPDの分離がブタノール法よりも選択性において優れていることが分かった。さらに、HP法はブタノール法とは違って、人蔘濃縮液をHPカラムに吸着させた後、溶出液媒であるメタノール含量を変えることによってPPT、PPD、GTSを選択的に分離できる長所がある。
Fig. 4Comparison of the recovery yields of ginsenosides obtained by
BuOH, HP and Sep-Pak Method

Ginsenosideの定量分析
各分離方法における６種の主要ginsenoside成分に対する
HPLC分析を行った結果をFig. 4に表わす。HP法並びにSep-

Fig. 2

TLC spots of GTS, PPT and PPD obtained by BuOH and HP
methodFig. 3Comparison of HPLC profile of GTS obtained by BuOH method(a)and HP method(b)Table 1. Capability of HP resin to separate GTS from ginseng extract

調べた結果をTable２に表わす。HPカラムの最大自然溶出速Pak法によるGTS含量は、ほとんど同量であったが、ブタノ度である2.5ml/minまでは、溶出速度が増加してもGTS含量ール法によるGTS含量は著しく低い。また、Sep-Pak法に対に影響を与えることなく、平均14.2％の一定値が得られるこする回收率を比較すると、ブタノール法は86.5〜88.7％（平均とが分かった。

86％）であるのに比べ、HP法では88.8〜106.5％（平均99.8％以HP法によるPPT、PPDの分離上）の高い回收率が得られた。從って、HPを用いたGTSの分

HPカラムに吸着された濃縮液中のPPTとPPDを分離する

離法は、既存のブタノール法による低回收率、低分離能、並ために、GTS分離法と同樣に水と50％メタノールで糖部と非びに操作の煩雑さを解決するものであって、迅速、簡便で、Weight of

GTS weight

GTS weight

Total weight ofRecovery yield of

糖部を除去した後、55％メタノールから80％メタノールまで

高選択的に分離でき、大量生産にも耐えうる分離方法である

GTS obtained (mg)

GTS (%)

５％間隔でメタノール濃度を変えながら溶出した。55〜65％と考えられる。

ginsengobtained in MeOH

obtained in H2O

extract (mg)phase (mg)phase (mg)

300

44.4

−

44.4

14.8

に70％メタノール以上での溶出画分にはPPD成分だけが檢出

500

72.1

−

72.1

14.4

された。各々の溶出液を減圧濃縮して、人蔘濃縮液508.1mg

ブタノール法の最も大きな短所は溶媒分離が惡くて時間が

メタノールからの溶出画分にはPPT成分だけが檢出され、次HP法の特性

800

106.9

8.1

115.0

13.4

から、65％以下のメタノール溶出液から21.3mgのPPT、70％

たんさくかかり、刺戟的な有機溶媒を使用するという点であ

1200

146.2

16.9

163.1

12.2

以上のメタノール溶出液から48.6mgのPPDを得た。從って、る。実際、本実験でもブタノール法でGTSを分離するのに濃

1700

184.4

40.7

225.1

10.8

人蔘濃縮液をHPカラムに吸着先淨後、メタノール濃度を縮、乾燥まで含めて48時間以上所要した。これに比べてHP

2200

199.7

81.1

280.8

9.1

70％以下と以上に区別して溶出すれば、PPTとPPDを分離で法はわずか４−５時間あればすべての實驗が終了できた。まきることが分かった。

たHP法はメタノールと水だけを使うので実験環境も多く改善されており、沸点が比較的に低いメタノール層を濃縮する

ブタノール法とHP法の比較

Table 2. Effect of elution rate on the isolation yield of GTS in HP method

Elution rate (ml/min)

Total weight of GTS

Recovery yield of GTS (%)

obtained (mg)ので低温でも速やかな濃縮が可能で、カラムを裝着できる小人蔘濃縮液からGTSを分離してその含量を比較した結果、さなスペースでも実験が可能で比較的少量の溶媒で結果が得ブタノール法は14.8％、HP法は14.2％でブタノール法のGTSられる。從って、スケールアップによる大量生産が容易で、

0.5

70.7

14.1

含量が少し高かった。これはブタノール法の場合、ブタノー

時間的な面からも、コスト的な面からもブタノール法により

1.0

71.5

14.3

ル抽出物を水で先淨するとき、遊離の糖が殘存するのに対し、

良い新規な方法が確立できた。

1.5

70.4

14.1

HP法では完全に糖が除去されることに起因すると思われる。

2.0

72.3

14.5

このことは、Fig.２に示すように、ブタノール法の場合、

2.5

70.6

14.1

TLC下端に黄色いバンドの発現が遊離糖成分の存在を示して結いることからも裏付けられる。ブタノール法で分離した場合、

−206−

−207−

論

高麗人蔘の成分中で最も重要な薬理活性を持つGTSを分離Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

するために、既存のブタノール抽出法の短所を解決し、これ

２）S. Shibata, O. Tanaka, T. Ando, M. Sado, S. Tsushimaに変わる新しい分離方法を確立した。多孔性イオン交換吸着and T. Osawa, Chem. Rharm. Bull., 17 (1966) 595-600

樹脂であるDIAION HP-20をガラスカラムに充填した後、高３）成鍾煥, 長谷川秀夫, 松宮智之, 内山雅守, 河周永, 李文淳,

麗人蔘濃縮液を吸着させ、水と50％メタノールで順次溶出し、最終的にメタノールで溶出してGTSを得ることができた。こOriginal

４）成鍾煥, 長谷川秀夫, 河周永, 朴世浩, 松宮智之, 内山雅守,
許才斗, 生薬学会誌, 28 (1997) 35-41
５）H. Hasegawa, J. H. Sung, S. Matsumiya, and M.

ル抽出法で得たものと比べ、サポニン含量が高く、吸着分離

Uchiyama, Planta Medica, 62 (1996) 453-457

能に優れていた。さらに、65％以下のメタノール溶出液から

６）B. H. Lee, S. J. Lee, J. H. Hui, S. Y. Lee, J. H. Sung,J. D.

PPTを、70％メタノール以上のメタノール溶出液からはPPD

Huh and C. K. Moon, Planta Medica, 64 (1998) 500-503

を、それぞれ特異的に回收できた。從って、高麗人蔘濃縮液

７）H. Hasegawa, J. H. Sung and J. D. Huh, Arch. Pharm.

をHPカムラに吸着させ、溶出溶媒のメタノール含量を変えることによってGTS、並びにPPT、PPDを選択的に分離する

Original

許才斗, 生薬学会誌, 26 (1995) 360-367の方法では10ml容量のHPを用いた場合、500mgの人蔘濃縮
物を分離することができた。得られたGTSは既存のブタノー

Chromatography, Vol.21 No.3(2000)

Res., 20 (1997) 539-544
８）T. Kaku, T. Miyata, T. Uruno, I. Saco and A. Kinoshita,

ことが可能となった。本研究を通して開発されたイオン交換

Arzneim. Forsch., 25 (1978) 539-547

樹脂法による人蔘サポニンの簡便な分離精製法が確立でき

９）安藤利夫, 田中 治, 柴田承二, 生薬学雑誌, 25 (1971) 28-32て、これにより人蔘サポニンに対する新しい研究の展開が期

10）藤田路一, 糸川秀治, 柴田承二, 薬学雑誌, 82 (1962) 1634-

待される。

1638
11）H. Hasegawa, S. Mastumiya, M. Murakami, T.

Preparation of Packing Materials for TemperatureResponsive Chromatography. Modification of Silica
Surface with Poly (N-isopropylacrylamide)
Kazuo Yamamoto1), Hideko Kanazawa1)*, Yoshikazu Matsushima1),
Nobuharu Takai2), Akihiko Kikuchi3) and Teruo Okano3)
1)

Kyoritsu College of Pharmacy, 1-5-30 Shibakoen, Minato-ku, Tokyo 105-8512, Japan

2)

Faculty of Science and Engineering, Tokyo Denki University, Saitama 350-0394, Japan

3)

Institute of Biomedical Engineering, Tokyo Women's Medical University3), 8-1 Kawadacho,
Shinju-ku, Tokyo 162-8666, Japan.

Kurokawa, R. Kasai, S. Ishibashi and K. Yamasaki, Planta
参考文献

Medica, 60 (1994) 153-156

１）S. Shibata, O. Tanaka, J. Shoji and H. Saito, Economic12）田中and Medicinal Plant Research, Academic Press, London
1985 pp 217

治, 笠井良次, 松浦廣道, 山口啓之, Pharm. Tech.

Japan, 2 (1986) 475-481
13）H. Kanazawa, Y, Nagata, Y. Mastushima, M. Tomoda
and N. Takai, Chromatographia, 24 (1987) 517-519

Received, June 22, 2000.

Accepted, July 26 , 2000.

Abstract
Poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) with a carboxyl terminal was coupled with aminopropylsilica for preparation of packing materials of temperature-responsive chromatography. Several coupling
methods were examined. The best results were obtained by the method, in which an active ester of theterminal carboxyl with succinimide was coupled in 1,4-dioxane. Scanning electron micrographs showedsimilar external appearances for both PIPAAm modified and unmodified silica, indicating the particle
and pore sizes were essentially the same. With the packing material, five steroids and benzene were well
separated with water as a sole mobile phase at a column temperature of 50˚C, while they were poorly
separated at 15˚C, which is lower than the lower critical solution temperature of PIPAAm (32˚C).
Key words : Poly (N-isopropylacrylamide); temperature-responsive chromatography; packing material.

Introduction
Poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) exhibits thermallysurface of the packing materials.

reversible soluble-insoluble changes in aqueous solution in response

methods on material surfaces. However they are not satisfactory for

to temperature changes across a lower critical solution temperature

preparation of the packing materials for HPLC columns, because of(LCST) at 32˚C. The polymer chains show an expanded conforma-

low polymer density on the surfaces. In an effort to obtain packing

tion in water below the LCST due to strong hydration and change tomaterials for temperature-responsive chromatography, we triedcompact forms above the LCST by dehydration.

various methods to immobilize the polymer on silica surface. Most

There have been many reports on polymer-immobilization

PIPAAm hydrogel has been utilized for drug delivery systems

successful method obtained to date is to prepare PIPAAm with a(1-3), and cell culture substrate (4-6). PIPAAm has also been utilized

carboxyl group on one terminal and to couple it with the surface ofin thermoresponsive bioconjugates (7-12), which can be applied inaminopropylsilica. However, some materials obtained by the method

reversible bioreactor systems. We have recently developed a new

showed poor temperature-responsive properties. We assumed that thechromatography system based on PIPAAm (13) grafted on theproperties may be dependent on the conditions of coupling reaction*Corresponding author
−208−

−209−