ISSN 0073 − 8751

NUMBER

31

INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKARESEARCH
COMMUNICATIONS

2017
公益財団法人

発

酵

研

究

所

RESEARCH COMMUNICATIONS

No.

31

2 0 1 7I N S T I T U T E F O R F E R M E N TAT I O N , O S A K A ( I F O )Published by
INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA
17 — 85, JUSO — HONMACHI 2 — CHOMEYODOGAWA — KU, OSAKA 532 — 8686, JAPAN公益財団法人発酵研究所

理 事 長

中濱

一雄

常務理事

樽井

直樹

理

事

熊谷
冨田
中瀬
古川

英彦
房男
崇
謙介

鈴木健一朗
永井 和夫
原島 俊
本田 武司

監

事

下元

高文

藤井

評 議 員

今田 哲
北本勝ひこ
関 達治
武田 直久
土屋 英子

智幸

魚住 武司
下田 親
竹内 昌男
谷 吉樹
吉田 敏臣

目

次

発酵研究所の歴史( 5 )微生物株保存事業から研究助成事業への転換－その激動の 2 年間( 2001.4 ~ 2003.3 )－ …………………………………… 波多野和徳

1

第 11 回助成研究報告会の開催 …………………………………………………… 横田明

13

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属の決定
ならびに生活環進化の解明のための情報基盤構築……………………………… 山岡裕一

17レブリン酸を基幹化合物とする新規バイオ生産技術の開発~化学触媒変換とバイオコンバージョンの融合による木質バイオマスの高効率転換~…………………………………………………… 羽部浩

37

有害化合物汚染土壌の微生物集団による分解・浄化に向けた基盤研究 :分解菌と共存する非分解菌の役割の解明………………………………………… 津田雅孝

47

窒素循環研究のパラダイムシフトを目指した未培養性硝化細菌の網羅的高速ハンティング…………………………………………………………… 常田

聡

57

BioCentury を先導する次世代酵母リソース中核拠点の形成 ………………… 金子

嘉信

67

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha におけるtRNA-sgRNA 融合を用いた CRISPR/Cas9 によるゲノム編集ツールの開発……………………………………………………… 金子

嘉信

75

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha では 2 つの接合型遺伝子座間領域の染色体逆位により接合型が転換する…………… 前川裕美

87

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha の接合型変換に関わる
転写制御………………………………………………………………………… 前川裕美

99

リン酸シグナル伝達経路の主要調節因子はメタノール資化酵母
Ogataea polymorpha で保存されている ……………………………………… 金子

嘉信

107

■ 平成27年度大型研究助成■ 平成23年度寄付講座助成

■ 平成27年度一般研究助成
混合栄養生物としての能力を持つ放線菌の系統的分布範囲と生理特性の解明,
および独立栄養に着目した新規な放線菌系統群の探索………………………… 菅野

学

121

コメツキモドキ－酵母栽培共生系の進化と酵母の拮抗菌抵抗性の関係……… 土岐和多瑠

121

ヒト腸内からの難培養性微生物の単離とその分類およびバイオリソース整備………………………………………………………………… 坂本

光央

122

植物工場に発生する植物病原性 Plectosphaerella 属菌の分類学的および植物病理学的研究…………………………………………………………… 宇佐見俊行

123

水田土壌の微好気性鉄酸化細菌の特性および生態に関する研究……………… 渡邉

健史

124

プロファージによる細菌細胞分化における遺伝子再構築機構の獲得と進化…………………………………………………… 佐藤勉

125

浅海性無脊椎動物の体液に棲みつく新奇ヘリコバクターの分類学的・生態学的性状の解明…………………………………………………… 中川聡

125

担子菌アンズタケ類の生物学的特性解明：
特に,種分類,生態的分化ならびに菌根構造について………………………… 山田

明義

126

珪藻 DNA メタバーコーディング解析による河川湖沼水質評価法の開発 …… 佐藤

晋也

127

有害元素代謝機構の多様性解析から解き明かす
微生物エネルギー代謝の進化……………………………………………………… 濱村奈津子

128

アルミニウム耐性とアルカロイド産生能から読み解く
植物根内共生菌の多様性と共生関係の生態学的意義…………………………… 広瀬大128

MqsR-YgiT toxin-antitoxin system によるバイオフィルム制御機構およびバイオフィルム薬剤耐性機構の解明……………………………………………… 山口

良弘

129

非天然マクロラクタム化合物の微生物発酵生産………………………………… 宮永

顕正

130

大腸菌の菌外膜ベシクル生産促進機構の解明…………………………………… 尾島

由紘

131

酢酸菌の酸化発酵に関わる中央炭素代謝制御に関する研究…………………… 新井

博之

131

二倍体で,育種が比較的容易である上面ビール酵母に,ビール醸造に適した凝集性を付与した菌株を造成し,
小規模多品種生産する地ビールへの貢献をめざす……………………………… 尾形

智夫

132

放線菌生体内代謝の超高感度リアルタイム観測手法の開発と応用……… Ulanova Dana133

微生物機能を利用したバイオベースポリマー生産系の構築…………………… 岩木

134

宏明

ゲノム解析結果を利用した清酒酵母の減数分裂における染色体組換えに関する研究………………………………………………………… 下飯

仁

134

免疫活性化能と乳化作用を併せ持つパン酵母の細胞表層構造解析…………… 東

雅之

135

出芽酵母のリン酸飢餓応答におけるオートファジーの役割とその誘導機構に関する研究………………………………………………………… 新谷

尚弘

136

植物病原菌が病原性タンパク質を植物・微生物間インターフェースに局在させるメカニズム……………………………………………………………… 高野

義孝

137

省リン型農業実現のための土壌微生物難溶性リン酸塩資化スペクトルの体系的分析とその資化機構の解明………………………………………………… 岡野

憲司

137

エピジェネティックス制御の人為的再制御による微生物生産機能の活性化…………………………………………………………… 渡辺

賢二

138

緑藻クラミドモナスを用いた繊毛運動制御機構の解明………………………… 小田

賢幸

139

結核菌の表面に存在する酸素結合蛋白質を介した感染メカニズムの解明…… 若杉

桂輔

140

ビフィズス菌がヒト腸内に定着するために重要なスルファターゼ遺伝子の役割の解析……………………………………………… 加藤

紀彦

140

限定的発現遺伝子の機能解析による新たな両賭戦略システムの解明………… 森川

一也

141

外来遺伝子の発現を抑制する CRISPR-Cas エフェクター複合体の機能構造解析………………………………………………………………………… 沼田

倫征

142

微生物の中枢神経系への侵入経路およびその分子機構の解明………………… 村上

正晃

143

バクテリアの光環境応答学の開拓………………………………………………… 笠原

賢洋

143

IFO Res.Commun. 31
1-12, 2017

発酵研究所の歴史 （5）微生物株保存事業から研究助成事業への転換−その激動の 2 年間（ 2001.4 〜 2003.3 ）−
波多野

和

徳

及ぼし始めたのは発効後 5 年ほど経ってからであろう．

はじめに財団法人発酵研究所( IFO )では,1995 年頃からその影響を受け始めていた．

財団法人発酵研究所( IFO )は 2011 年 4 月 1 日から

最 初 は, 保 存 菌 株 の 交 換 に お け る ATCC(American

公益財団法人発酵研究所として正式に研究助成を主とす

Type Culture Collection) の対応であった．これまで IFO

る事業の道を歩み始めた．思いおこせば 2002 年 7 月にと ATCC とは何の問題もなくお互いの保存菌株の交換

60 年近くかけて収集・保存してきた約 15,000 株の一般を行っていたが,1995 年頃から菌株交換に関する応答

微生物株と 8 名の研究者を国が新たに設立した「生物遺が無くなった．一方,イギリスやヨーロッパなどにある

伝資源保存センタ－( NITE Biological Resources Center

CC からは特段の変化が認められなかったことから,(NBRC))へ移管し,抜け殻となった財団法人は生き残ATCC の対応は不審なことであった．1997 年頃になっりをかけアドホック的に「微生物研究者への研究助成」て ATCC の 部 門 担 当 者 か ら「 ATCC は CBD( 米 国 はを中心にした事業へと方向転換した．それから 8 年後のCBD 非批准国)に対応すべく菌株分譲に関する所内規2011 年にようやくこの事業活動が正式に認められ今日

則の整備を行った．これからは所内規則に従って対応すに至った．これもひとえに当時の理事・評議員の方々のる」との知らせが届いた．当時,IFO においては CBD

適切なるご指導,ご提言,ならびに国内の微生物研究者

に関する認識は殆ど無く見過ごされていた．

の方々からのご理解と協力ならびにご支援の賜と思ってつづいて,1997 年の秋頃,バイオインダストリー協

いる．改めて,この紙面をお借りしてお世話になった方々会( JBA )から筆者へ「微生物資源に関する意見交換会へ御礼申し上げる．

を行いたいので IFO からも出席して欲しい」という要

これまで,当財団の歴史については,歴代の各研究所請があった．最初の会合で集まったメンバーは日本微生長(長谷川武治( 3 代目) ,飯島貞二( 4 代目) ,長谷

物資源学会( JSCC )に所属する数名の顔見知りの研究3)4)
川徹( 5 代目)
,竹内昌男( 6 代目))が,それぞれの者に加えて見知らぬ通産省の関係者数名が含まれてい所長時代における研究成果や苦労話しを記してきた．そた．しかし,日本の代表的な CC である理化学研究所微こには,設立以来 60 年近くにおよぶ研究を主体にした生物系統保存施設( JCM )からは誰も出席していなかっ微生物株保存事業を遂行して,世界有数のカルチャーコ

た．この席で初めて CBD の発効により各国,特に開発

レクション( CC )を確立し,さらには世界的に優れた途上国は,自国内から産出される微生物に対して権利意研究成果を挙げてきた努力の道のりが記されている．そ

識を持ち始め,｢採取した微生物などを含む試料を勝手の世界に誇る CC が何故に,如何にして短時日のうちにに国外に持ち出すことを禁じた｣ いわゆる微生物の囲い

微生物株保存事業から研究助成事業へと転換しなければ込みが始まり,CBD が単なる生物多様性の保全を謳っならなかったのか,その激動の経緯について明らかにした条約だけではなく,微生物によってもたらされる利益ていきたい．

の配分にも影響を及ぼす経済闘争の元になり始めたこと

1)

予

2)

を知った．また,ATCC が菌株交換における不可解な行兆動を理解することもできた．この会合は,CBD の下で
日本の微生物産業を護り発展させていく施策の検討に加生 物 多 様 性 条 約（ Convention on Biological Diversity;

えて,微生物を用いた諸産業の下支えをしている日本に

CBD ）の発効とカルチャーコレクション（ CC ）へ及ぼある CC の存在意義と将来における役割について話し合した影響：

う目的で開かれたようであった．数回の会合の後,討論

1993 年 12 月 29 日に発効した CBD が日本国内に於い内容は次第に CC の将来像に移っていった．

て微生物株保存事業を実施している各 CC へ直接影響を－1－

波 多 野新 BRC 設立における通商産業省(通産省)
の戦略

和

徳

られる．その施設は,千葉県木更津市かずさアカデミア
パーク内に人員規模は 50 名,床面積 6000㎡の建屋を建設する．新 BRC 設立に要する総予算として 60 億円を計上した．そして,NITE からは「新 BRC の設立」に関わOECD Workshop, Tokyo 1999 の 開 催 と 新 Biological

る具体的な機器の選定などについて IFO に相談しにやっResources Center（ BRC ）構想：てきた．

日本経済の振興を担っている通商産業省(通産省：現在の経済産業省)の一部局では「生物多様性条約(CBD )「カルチャーコレクションの未来像」に関する国内でのは,発酵工業を得意とするわが国の産業に大きな影響を議論：与えるに違いない．特に,発酵工業の根幹をなす微生物

東京で開催された CC に関する国際シンポジウムとなどの収集・保全・利用において受ける影響は大きいだ

ワークショップと前後して,日本国内でも JBA またはろう．その対策として日本にある微生物株保存機関(CC)JBA-JSCC が主催する「 CC の未来像」に関する討論会の整備をする必要がある」と考えた．通産省の外郭団体が開かれた．ここで,日本微生物資源学会( JSCC )のの一つである「バイオインダストリー協会」( JBA )を会長から「日本でも IFO を中核にして国内にある主要通じて IFO に対し「カルチャーコレクション( CC )にな CC を統合して ATCC に匹敵するような大きな CC を関する意見」を求められたのは 1998 年の初頭であった．

創るべき」との提言があった．当時,IFO の一研究員だっその年の 2 月にはフランス・パリにある経済協力開発機

た筆者は,「 IFO が微生物株保存機関としての規模と質構( OECD )の部会への出席を求められた．この会議が高く評価されている」ことを認識しただけであった．

で日本の通産省は「 CBD に則った新しいコンセプトの財団法人発酵研究所(IFO)を取り巻く諸情勢

CC すなわち New Biological Resource Center 構想」を披
瀝し,これを具現化するためのワークショップを東京で開催することを提案した．この国際会議は,1999 年 2

IFO の財政状況：

月東京において世界中の主な CC の代表者を集め,まずIFO の財政に関しては,財団の設立者である武田薬品「 WFCC-WDCM Symposium, Tokyo 」を開き,ここで工業株式会社(武田薬品)社長六代目武田長兵衛とその「CC の現状と問題点,21 世紀における CC のあるべき姿」

一族である小西新兵衛が理事長を務めている間はなんのについて討論した．翌日,日本政府主催で産業界,政府問題も生じなかった．お二人は,「 IFO の役割は,微生関係者,学術界,保存機関の代表者らによる「 OECD

物による発酵工業界や微生物の学術界などの発展を下支Workshop, Tokyo 1999 」が開催された．ここで,将来あえするのに重要である」というメセナ的な考えで財団のるべき CC の理想像を政府サイド,産業界サイド,なら運営に携わっていた．しかし,六代目武田長兵衛が亡く

びに学術界サイドから要望と支援策などが論議された．

なり,小西新兵衛が退任したあとは,IFO への寄附金は( ：World Federation for Culture Collections Committee

武田薬品の経営幹部が裁量することになった．

＊＊

筆者が入所した当時( 1993 年)の IFO の財政は,武on the World DATA Centre for Microorganisms )田薬品からの寄付金に加えて預貯金などの高金利に支え
通産省からの働きかけ（ 1999 年）：

られ豊かであった．当時の長谷川徹所長は,豊かな資金

東京ワークショップ終了後の 3 月に通産省の担当課長をもとに研究を充実させるため研究者を増やし,所員数

補佐は IFO の研究所を訪れ「通産省が計画する新 BRC 」

27 名を数えるほどになった．また,研究内容も質・量に関する青写真を示し意見を求めた．また,同年 5 月にともに充実していた．しかし,この頃から景気の後退がJBA が開催する「日本の BRC を考える」に出席する竹進み,金利の低下とそれに伴う収入減に陥り,1995 年

内所長は藤野副社長に会い,「新 BRC に構想について」

度にはかなりの金額の赤字を計上せざるを得なくなり,

武田薬品側の考えを聞いたところ,既に通産省の堅尾課

武田薬品から緊急に寄付金の追加を仰ぐことになった．

長が藤野副社長に会い,「通産省が計画する新 BRC に

これを契機に武田薬品から「 IFO の組織をスリム化してIFO が参画するよう」武田薬品側に打診し,武田薬品側

寄附金の範囲内で運営するよう」求められ,やむなく 7は賛同の意向を示していたとのことであった．

名の研究者を出向元である武田薬品に引き取って貰わざるを得なくなった．この財政危機に陥る前までの IFO は,通産省が設立を計画している新 BRC の規模と組織：

本来の業務である保存菌株の分譲収入や安全寄託株や特通産省が設立を計画している新 BRC は,独立行政法

許株の寄託収入に加えて武田薬品からの受託研究などに

人製品評価技術基盤機構( NITE )の一組織として設けよる収入で健全な財政状況を保っていた．しかし,赤字－2－

発酵研究所の歴史（ 5 ） 微生物株保存事業から研究助成事業への転換−その激動の 2 年間（ 2001.4 〜 2003.3 ）−を補填するための寄附金の追加を求めたことにより武田に対し新 BRC への参画要請の働きかけを一層強くして薬品経営陣は IFO の運営に対して厳しい目を向け始め

きた．

た．それと同時に,1993 年から武田薬品の社長を継いだ武田國男は事業の中心を医薬品関係におき,また,コ

第 2 回目の参画要請：

ストパフォーマンスを重視する施策を実行し,社会的貢2001 年 2 月 7 日に通産省製造産業局生物化学産業課

献度は高いが寄附金に見合った利益をもたらさない IFO(以下,経産省と略す)塚本課長と渡辺班長が森田理事長を訪れ,IFO に対し新 BRC への参画を正式に申し入に対し「寄附金なしで運営すること」を求めてきた．

れた．この時の会談内容は,森田理事長によって「 IFO
寄附金の減額と研究施設からの退去要請：

関連面談要旨」5)としてまとめられた．その概略は2000 年 4 月に IFO は武田薬品の IFO 担当部門の部課

1. BRC とは,独立行政法人製品評価技術基盤機構長から「 2001 年度から寄付金を毎年 5,000 万円ずつ減額(註)( NITE )の生物情報解析部(仮称)の中に生物する．ただし,3 年後に残っている 2,500 万円を減額す

遺伝資源施設を作り,それと新財団( IFO が母体)

るかは未決定である」旨が口頭で通知された．さらに 9とが一体になった組織を称する．

月には当時在住していた研究棟が 3 年後に建て替えする

2. BRC の当面の人員は施設職員 5 名,技術情報担当

予定であることを理由に「 2002 年度末までに今の場所

者 5 名以上を明け渡すよう」通達された．城攻め,兵糧攻めに遭っ

3. BRC の予算は平成 12 年度 2.24 億円確保,平成 13

た IFO はその年の 11 月 24 日に臨時理事会・評議員会を

年度は 4.1 億円確保

開いた．この会の冒頭,理事長から「 IFO は,現時点に

4. その他,新財団設立などのタイムスケジュールがおいて武田薬品から寄付金の減額と現在居住している施

示されていた．

設からの退去が要請されている」ことが披瀝された．こ5. また,理事長の要望としての臨時理事会・評議員会終了後,出席した理事・評議員① 運営費の継続的な確保の全員で「通産省が設立を進めている新 BRC への移転

② IFO 事業が国の支援によって国際的に見て相応について」自由討論が行われたが,その内容は明らかにしい位置づけで業績を挙げ得る体制に整備されされていない．

ることは望ましい事であると考えている③ 武田薬品の株式の保全については武田薬品との通産省からの新 BRC への参画要請

長年の信頼関係の上からも万全を期すつもりである．

最初の参画要請：：後のバイオテクノロジーセンター(註)

1999 年 11 月に開かれた 5 省庁会議において,通産省上述したように,ここでは通産省が構想している新は「 IFO を主体にして生物資源保存機関を創る」ことを

BRC の規模と予算の大枠が示され,それに対する森田

明らかにし,12 月に通産省の堅尾課長は森田理事長を理事長の考えが明らかにされている．この会談内容は,訪れ,「新 BRC 設立における IFO の協力と参入」を正式

武田薬品経営陣にも伝えられた．また,後日,森田理事に申し入れた．この時の理事長は,新 BRC 設立への協長から「通産省の新 BRC への IFO の参画のあり方」に力は約束したが,参入に関しては態度を保留した．このついて具体的な考えが示され,竹内所長を通じて全所員

ことは竹内所長を通じて IFO の全所員に対して「通産に知らされた．

省が千葉県木更津市かずさアカデミアパーク内に新しい2001 年 3 月 9 日武田薬品から武田國男社長名で森田理

生物資源保存施設を創る．その中核として IFO がその事長あてに「貴財団に対する当社の要望について」の書候補に挙げられている」ことが明らかにされた．2000

類が届く６）(資料：武田薬品からの要望)．

年 3 月に理事会が開催され,その会の終了後,「通産省それによれば,が設立を計画している新 BRC へ IFO が参画を求められ

1. IFO が経産省プロジェクトに「新財団」として参加ていること」に関して意見交換を行った．これについてする場合,「新財団」は IFO を母体とした衣替えではは,竹内元所長が[発酵研究所の活動－発酵研究所を継いだ人たち( 1995.4 ~ 2001.3 )]において詳述されていなく,別途「新財団」を設立すること．
2. 発酵菌株は「新財団」に寄附すると共に研究担当者

るので割愛するが,どの出席者からも新 BRC に移行した後も IFO が実施してきた微生物に関する研究活動がは異動し,経産省に協力する．
3. IFO は存続するものの,寄附行為に掲げた目的範囲

継続する事ができるか懸念される意見が出された．

を遵守し,スリムな態勢による事業運営を図る．当新 BRC の設立を進めたい通産省は,2001 年から IFO－3－社の資金支援を受けることなく事業運営をはかる．

波 多 野和② 生物資源センター(仮称)(2002 年 4 月 1 日完成予定 ) は,機構の一部門として総工費 60 億円で建設中です．
③ 同センター完成時に現 IFO 研究者を中核とする研究者ならびにカルチャーコレクションを迎え入れる構想で作業が進められています．
④「機構」に所属する生物資源センター(専従人員は

5 名程度)と独立財団法人たる「新財団」(現 IFO の研究者が管理および研究実務を担当する)とを一括して BRC と称す．
⑤「 BRC の予算規模は約 3 ~ 4 億円／ H13 年度でその大半は新財団への委託費に充当する．
⑥ 菌株分譲に伴う収入は「機構」に入る．
⑦ 知的所有権は原則として新財団に帰属する．
⑧ 2002 年度から,新財団は微生物系統保存・提供のほかに,
もう一つの分野である ｢技術開発研究｣ を立ち上げる．
このための予算と人員は別枠で考える．
⑨ 新財団の研究所長は未定．IFO 理事長案として,波多野
現 IFO 所長を推薦する意向を表明した．
⑩ 新財団の運営については独立性が損なわれないことが肝要である旨を指摘した．特に,微生物系統保存・提供が百年を越えて継続される長期研究であるのに対し,技術開発研究はせいぜい 10 ~ 20 年のスパンで浮沈する性質の研究である点を指摘し,研究および研究者の評価に際して基礎研究者が犠牲にならないような配慮が肝要であることを述べた．
⑪ 新財団の運営は原則的に独立組織として行われるが,技術開発研究を推進するため必要な研究者の雇用と併せて理事・評議員に若干の変更があり得る．
⑫ 新財団の本拠地(登記場所)は,BRC 近隣が望ましい．
⑬ 現状では,IFO の組織全体がそのまま新財団になる可能性が高いと思われる．
以 上

4. 経産省プロジェクトに参画することなく,IFO が独自の事業活動を図る場合,国から要望があれば発酵菌株を提供し,研究担当者の一部を異動させることも視野に入れておく．
5. この場合も,当社からの資金支援を受けることなく事業活動を図るためのスリムな態勢を整えることを要望する．
6. 2001 年度の寄附金は 1 億円とする．次年度からの寄附金は情勢に応じて判断するが,いずれにしても当社からの資金支援を受けずに運営体制を整えることを要望する．
この様な要望書が武田薬品から提出されてきたにも拘わらず,2001 年 3 月 14 日に開かれた理事会・評議員会では何ら討議された形跡は伺えない．
第 3 回目の参画要請：
2001 年 3 月 27 日に経産省の塚本課長,渡辺課長補佐
は,前回の訪問時(2 月 7 日)よりさらに具体化した案「経産省が進める新 BRC 構想への IFO の関わり方」を持って森田理事長を訪れ,IFO にたいして新 BRC への参画を要請した．これを受けて,森田理事長は理事・評議員・監事の方々に対して,「これからの IFO がとるべき進路」
について下記に示すような見解を表明した．その全文を下記に示す．

─────────────────────────
Ｈ 13 年 3 月 28 日
理事・評議員・監事 各位殿
経過報告－(財)発酵研究所の進路について－
理事長 森田 桂
1. 経過の概要
先人の高い志によって創設され,多くの研究者が心血を注いで今日の姿に育てあげた IFO に対して,今回 国の援助の下でより長期的かつ国際的視点に立って IFO をセンター・オブ・エク
セレンスとして発展させたいという提案が寄せられております．
財団を預かる者としては,この提案に示される「新財団」のゆるぎなき姿が見通せる段階に至るまで,自らの責任で誤りのない舵取りを行いたく存じます．当然のことながら,関西を離れて千葉のかずさ研究所に移られる現 IFO 所属の研究者にとって,新財団が希望に充ちた受け皿であるべきことは言を待ちません．
本件につきまして理事,評議員各位のご忌憚のない御意見と倍旧のご支援をお願いいたします．
2. 経済産業省からの説明と提案( H13.3.27 付)① 独立行政法人「製品評価技術基盤機構」(以下「機構」と呼ぶ)
2001 年 4 月 1 日発足予定,417 名徳─────────────────────────

この「経過報告」は,森田理事長が実質上「 IFO を母体とした新財団を設立し,新財団ごと新 BRC へ参画する」ことへの表明であった．
新 BRC 構想に対する武田薬品の見解：
森田理事長への訪問後,経産省の二人は武田薬品を訪問し「経産省 BRC 構想に対する IFO の関わり方」について説明した．
この席で示した武田薬品側の考えは,先の 3 月 9 日にIFO に対して示した社長からの ｢要望書｣ の内容と殆ど同じであった．

－4－1）経産省が推進する国家プロジェクト「 BRC 構想」に協力する．発酵菌株,研究担当者の移管には全面的に協力する．研究担当者の「新財団」への移動をスムーズに行うため当社からの出向とすることでの協力を検討する．

発酵研究所の歴史（ 5 ） 微生物株保存事業から研究助成事業への転換−その激動の 2 年間（ 2001.4 〜 2003.3 ）−IFO の収支予測(ケース別)

2）ただし,IFO の基本財産のうち当社株式については何らかの形で当社の影響下におくことが出来る

収ことが必須条件である．
3）IFO を基にした新財団の設立ではなく,独自の新財団を設立して IFO 本体は残しておく．これによって当社株式の散逸などの恐れがなくなる．
4）それが不可能なら,IFO にたいして「 BRC 構想」には参画せず,独自の財団法人として事業活動を請されれば発酵菌株の提供,研究担当者の異動については協力しても良い．
などを主張したようである．
1）独自の新財団の設立は不可能に近いこと,
2）武田薬品側の株式の保全に対する考えは理解したが,現時点では良い解決策はない．結局,IFO を「経

ケース2

ケース3

(百万円)

(百万円)

基本財産からの配当金,
預金利子

120

120

120

45

15

0

菌株保管収入(特許株,
安全寄託株)

15

15

0

寄附金

100

0

0

収入合計

280

150

120

出

所員15名 所員13名

所員6名

人件費(給与など：1人当たり1100万円)

165

143

運営費(業務費,
光熱費,
不動産借用料等)

115

77

54

支出合計

280

220

120

0

-70

0

過不足額

この武田薬品側の主張に対して,経産省側は,

ケース1
(百万円)

事業収入(菌株分譲)

支継続する要請をする．この場合でも経産省から要入66

ケース 1：現況( 2001 年度)：所長,事務長,事務員 2 名,研究者
11 名,その他パートタイマー 3 名,業務委託 2 名
ケース 2：所長,事務長,事務員,研究者 10 名
ケース 3：所長,事務長,研究者 4 名

産省プロジェクト」に参画させるという武田薬品
側と経産省との話し合いは,武田薬品が「 IFO がケース 1：現況( 2001 年度の IFO の活動)(所員 15 名)保有する武田薬品の株式の保全」を主張すること新たな分析機器などの購入は控えるが,微生物株保で暗礁に乗り上げ,話し合いは不調に終わった．

存事業(菌株の収集・保存・分譲,安全寄託株なら

筆者は 2001 年 4 月 1 日に竹内所長から所長／常務理

びに EPO 特許株の適正な保存・管理)を実施する．

事を引き継いだ．この時すでに武田薬品から今年度の寄一般菌株の分譲や契約株,特許株の保管などから上附金が１億円に減額され,さらに 2002 年度の寄附金ががる収益は従来通りとする．

どうなるか見通せない状況であった．就任後すぐに,森

総収入は 1 億 8 千万円,総支出は 2 億 8 千万円で 1

田理事長から「これからの IFO を運営するための基本億円の赤字になるが,今年度の寄附金 1 億円で相殺

理念を箇条書きにして示すこと．また,今後 5 年間に起される．しかし,次年度以降は寄附金が望めないの

こる諸情勢を考慮にいれて IFO の収支についてシミュでこのケースでは 2002 年度以降 1 億円の赤字になる．

レーションしておくように」と指示があった．また,「 IFO

ケース 2：最低限レベルにおける微生物株保存事業活動は独立した組織なのだから武田薬品の思惑に左右されず,(所員 13 名)

IFO が創立されたときの理念を守る独自の考えで物事を一般微生物株は新 BRC へ移管する．IFO の保存事進めるべきだ」というような趣旨の助言をいただいた．

業は[寄附行為]から逸脱しないよう最低限のレベルで実施する．菌株の分譲や契約株などからの収入

微生物株保存機関としての生き残りをかけて（2001.4 〜 7 ）：は減少する．

武田薬品は,経産省との会談後,IFO が保有する武田

総収入は 1 億 5 千万円,総支出は 2 億 2 千万円で 7

薬品株の散逸を確実に防ぐ為には IFO にこれまで通りの業務を遂行させるのが良策と考えたようで,4 月下旬,

千万円の赤字になる．
ケース 3：寄附金なしでの活動(所員 6 名)

武田薬品は IFO の担当部門である本社総務人事部を通一般微生物株は新 BRC へ移管する．研究者は各部じて「 2001 年以降における IFO の運営内容とそれにか門(カビ,酵母,細菌,放線菌)1 名とし,菌株のかる費用額の試算」を至急検討するように要請してきた．

保存・分譲のみ行う．保管している特許株,契約株

この時が「 IFO が CC として生き残っていく」唯一の好は近い将来新 BRC または適当な保存機関へ移管す機であった．まず,IFO の ｢寄附行為｣ を逸脱しない運ることを模索する．ヨーロッパ特許庁( EPO )へ営が出来ることを前提に,IFO が予めシミュレーション

国際寄託機関としての地位を返上する申出を行う必してあった収支予測をたたき台にして,総務人事部の担要がでてくる．

当者と種々検討し,最終的に下の表に示す 3 通りのケー

総収入および総支出は 1 億 2 千万円．

スにまとめた．

このケースでは,財団としての「寄附行為」がほとんど実施できなくなり,財団は解散への道を辿るこ
とになる．
－5－

波 多 野和徳

ケース 2 であれば IFO の[寄附行為]に則った微生物［案 1 ］IFO はタイプカルチャーコレクション( TCC )株保存事業と EPO 国際寄託機関の地位を一定レベルでを担当し,基本財産運営収入の 2 倍を超えな保てる．しかし,これには武田薬品から 7 千万円の寄付

い範囲( 1.5 ~ 2 億円)で委託を行う．

金が必要であった．森田理事長の了解を得て上の 3 案を・IFO への委託の内容は TCC の維持・管理・充実とする．

武田薬品の総務人事センターを通じて経営企画部へ挙げ,社長も出席する「経営企画会議」に上程し,「ケー・微生物多様性コレクション＊ は NITE の仕事とし

ス 2 」を認めて貰えるよう決済を受けることにした．結て行う．したがって,その責任者は NITE で採用論から言うとこの案は,企画部長ならびに副社長までのする．

了解は得られたが,武田國男社長の「 IFO の運営は寄付

・この案１では,公益法人制度改革で拠出金の制限

金なしで行う．保存菌株や研究者は国の要請があれば移を受ける限り,TCC 部門への拠出金額に不安がす．ただし武田の株券は武田薬品の管轄化に置く」との残る．

考えを忖度し,上程されず社長の目には触れることはな［案 2 ］IFO が全てのコレクションの維持・管理・充かった．IFO の微生物株保存機関としての生き残りをか実を担当し,NITE はインテリジェントサービ

けた武田薬品との交渉も不調に終わり,さらに両組織のスなどの仕事を担当する．

トップである森田理事長と武田國男社長との話し合いも・IFO への委託の内容は TCC の維持・管理・充実

実現せず,また IFO の事業内容やそれによって生じるとする．

社会,学術界における役割と貢献度を説明するからとの・IFO と NITE はそれぞれ全く異なる仕事を分担す波多野からの申し出も無視され,武田薬品との話し合いることから,相互に補完するという関係が構築さは暗礁に乗り上げたままになってしまった．

れ,相互依存の強力な協力関係が構築できる．

7 月に入り,経産省から新たな提案が IFO に示された．

・｢案１｣ と同様 NITE からの拠出金の制限を受けるため,TCC 部門への資金に不安が残る．

第４回目の参画要請：［案 3 ］IFO の職員を NITE で採用し,完全に吸収する．

経産省からの新たな提案

この場合,IFO は引き続き大阪に残り,NITE

2001 年 7 月 18 日に経産省から「 IFO が BRC へ参加すとの継続的な関係はない．

ることについて」の新たな提案が示された．この会談に・IFO はカルチャーコレクション研究への助成機関出席した経産省の塚本課長と渡辺課長補佐,(独）製品評として仕事の内容を衣替えする．

価技術基盤機構（NITE )・バイオテクノロジーセンター

・この場合,IFO はカルチャーコレクション事業か菊池所長,IFO の森田理事長ならびに波多野の 5 人が本ら撤退することとなり,IFO の理事会・評議会の音をぶつけ合い,突っ込んだ討論をした．

賛同が得られない可能性が高い．

経産省側が用意した提案は,・NITE における IFO 研究者への人件費の確保は可

1. IFO が BRC へ参加する為に受け入れ側が考慮すべき能と考えられるが,給与が下がる可能性がある．

事項として・この案が認められれば,TCC 部門に安定した資１） IFO の独立性が確保されていることが必要である．
それが担保されるためには IFO の独自財源が必要

金が投与できる．
［案 4 ］IFO 職員が NITE に出向する,又は,IFO がかである．

ずさに分室を設置する．

２） 公益法人制度改革との関係から,国から IFO へ委・IFO のポテンシャルをそのまま維持することが容託できる総資金は,IFO の独自財源の 2 倍以下に易である．

ならざるを得ない．

・NITE に出向する,または分室を設置するという

2. 受け入れる NITE の方針

場合,NITE と IFO の仕事の切り分けが不明確に

１） NITE は BRC の職員を将来的には 50 名程度に拡充なる．仮に,TCC を IFO が所有したまま担当すする用意がある．

るとした場合,NITE に出向する,又は分室を作２） NITE には,直ちに 10 名程度を BRC の職員として採用または配置換えすることが可能である．

る必要性が存在しない．
＊：産業応用微生物,遺伝子,DNA などで細胞株は含NITE と IFO は,IFO の自己資金と総額とのかねあい

まない．将来,病原菌も考慮に入れる．微生物ので,仕事の分担を設定することが必要である．これら能力を十分に生かした利用が出来るようにする．

を考慮して以下の 4 案を提案した．

－6－

発酵研究所の歴史（ 5 ） 微生物株保存事業から研究助成事業への転換

森田理事長の見解
1. 組織における責任の所在をはっきりさせるには,「案1 」より「案 3 」が望ましい．
2. IFO 本体は,CC 研究助成財団として残す．
3. IFO の保有する菌株には,IFO No. を付することを続ける．
4. NITE 内 に Type Culture Collections と Diversity Collections の二本柱を建て,それぞれ独立運営とする．
経産省が示した新たな提案に対する森田理事長の見解
は,これまで理事長が「経過報告」で明らかにしていた「新 BRC へは IFO を母体とした新財団として参加し,
NITE とは連携するものの独立した組織として CC を運営する．武田薬品の IFO に対する思惑とは一線を画し,
IFO は最良と思われる独自路線を選択する」とした参画
方針を変更し,武田薬品が経産省へ示した見解と殆ど同じになった．話し合いの中で,「案 1 」は,｢経過報告｣で示した見解を受け入れた案であったが,この案では新BRC における命令系統が一本化されないあやふやな状態になる恐れがあり組織運営上好ましくないと判断され,最終的に「案 3 」を採択する事になった．この案を進めるための最大の関門は,「案 3 」にたいして理事・評議員から同意が得られるかであったが,理事長は理事・評議員の説得に対して強い意志と自信を示した．

−その激動の 2 年間（ 2001.4 〜 2003.3 ）−2. IFO はこの趣旨を理解し NITE に協力する．NITE はこれま
での IFO の歴史と実績のあるタイプカルチャーコレクション
を維持・継続・発展させることを前提とし,BRC を整備する．
3. IFO が所有する保存菌株(特許菌株を除く)は NITE に無償で譲渡し,NITE の所有とする．NITE は譲渡を受けたコレクションを IFO 番号で管理し,引き続き維持・発展させる．
特許菌株については別途協議する．
4. NITE は,IFO 所員を NITE 職員として採用し,この職員を中心としたタイプカルチャーコレクション事業を立ち上げ
る．NITE はこの事業の継続性を確保する．
5. IFO から譲渡された菌株の維持・管理・充実はタイプカル
チャーコレクション事業の部署で実施する．
6. NITE は,タイプカルチャーコレクション事業とは別に,従来のカルチャーコレクションが取り扱っていた微生物資源
より幅の広い微生物および遺伝子資源を対象とした事業を立ち上げ,幅広く産業応用をめざす．両事業はお互いに協力し合い,BRC の発展に寄与する．
7. NITE が IFO のタイプカルチャーコレクション事業を内部化することに伴い,IFO は主たる事業を研究助成事業等に変更する．その本体は大阪に置く．
8. IFO は,平成 14 年夏までに研究リソース(保存株・所員・研究資材など)を大阪にある研究所施設内から NITE 生物資源保存供給施設内に移転する．
9. NITE と IFO は,タイプカルチャーコレクション事業を IFO
から NITE に移転するための具体的な課題やその対応策などの詳細を検討するためのタスクフォースを共同で設置し,平成 13 年 8 月 31 日までに検討結果を取りまとめる．

この会談の結果は,最終的に以下のような会談議事録

四者会談

としてまとめられた．

平成 13 年 7 月 18 日に合意した「会談議事録」を基に

会談議事録「 IFO が BRC へ参加すること」についての合意を確かな

日 時：平成 13 年 7 月 18 日（水) 10：00 ~ 11：30
場 所：武田薬品工業（株) 大阪本社 9 階応接室
出席者：経済産業省・製造産業局・生物化学産業課 塚本課長,
渡辺課長補佐(独）製品評価技術基盤機構・バイオテクノロジーセン
ター 菊池所長(財）発酵研究所 森田理事長,波多野所長

ものにするため,平成 13 年 8 月 22 日に武田薬品工業（株）(独）製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源センターの整備と(財）発酵研究所の協力について以下の事項について話し合いがあり,歩み寄りがあった．

談メモ」７）として文書化されている)．なお,この会談に

1. 独立行政法人製品評価技術基盤機構(以下,「 NITE 」という)は OECD レポートにも謳われている定義に基づくわが国の中核的生物遺伝資源機関(以下,「 BRC 」という)を「かずさ」に整備する．BRC を整備するにあたり,タイプカルチャー
コレクションとして実績のある財団法人発酵研究所(以下,「 IFO 」という)に参画を求め,これを基盤として BRC を発展させるとともに,活動の幅を学術および産業応用まで広げることとする．

大阪本社において「四者会談」が持たれた．(財)発酵研究所からは森田理事長,（独）製品評価技術基盤機構からは斉藤理事長,武田薬品工業（株）からは藤野会長,経済産業省製造産業局からは増田次長が出席した．この四者会談で「（独）製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源センターの整備について」の覚書を最終的に確認した(「会おける現認者として,IFO からは波多野が,NITE からは菊池所長が,経産省製造産業局からは生物化学産業課の塚本課長,渡辺課長補佐が,産業技術環境局からは知的基盤課の小谷課長が同席した．この会談は当初午前中に本社で開催される予定であったが,折からの台風 22号の影響で新幹線の到着が遅れ,急遽,午後から開催されることになり,また場所を[クラブ関西]へ移すという波乱含みの会談であったが,「会談議事録」の中身についてはそれぞれの組織に不満はなく,すんなりと各事
項について確認・承認した．

－7－

波 多 野和徳ことで終了した．後日談として,平成 15 年 4 月に中濱文部科学省(文科省)への経過説明

新常務理事と共に文科省研究振興局学術機関課を訪問し,「今年度からアドホック的に研究助成事業を開始し四者会談が終了した後,平成 13 年 8 月 24 日文科省へた」ことを告げ,了解をもとめた．これに関して,「主赴き「財団法人発酵研究所( IFO )の研究資源を独立行

事業の内容が研究助成であることは明らかに寄附行為の政法人製品評価技術基盤機構( NITE )に移転するにあ違反である．この見解は曲げられないが,この事業はア

たってその経緯の説明ならびにその後の IFO の事業形

ドホック的に始めた研究委託であると考えている」と態態に関する意見交換」という事案にたいして詳細な説明

度を軟化させていた．さらに,「この事業を正式に実施をおこなった(文科省との会談メモ) ．文科省は IFOするためには平成 18 年度から発効する「公益法人制度からのこの突然の申し出に,驚愕と困惑,微生物株保存改革」に従って対応するように」との助言を貰った．

８）

事業関係への危機感,さらには,この重要な案件にたい

臨時理事会・評議員会の開催

して主務官庁の一つである文科省へ一言の相談もなかった事に対して憤りを感じたことだろう．その証拠に,この会合には担当部局である研究振興局学術機関課から主任以下 3 名が出席したのみならず,ライフサイエンス課

平成 13 年 9 月 7 日に「臨時理事会・評議員会」を開催し,下記の 2 議案について審議した．

から 2 名,研究助成課から 2 名,その他数名の職員が出

１） (財）発酵研究所の研究リソースを NITE 生物資源席していたことからも明らかである．

保存供給施設( NBRC )に移転することについて

IFO からは,まず研究資源を NITE に移転しなければ

2） 研究助成事業を行うことについて

ならなくなった経緯とその後の IFO は微生物株保存事

１） の NBRC への移転に関する議案については,二人業を細々と続けるものの,それに加えて研究助成事業をの理事から反対する意見が出され脚註),移転の話を進め行うということについて説明した．

たい理事長と真っ向から対立し激論が交わされたが,最文科省側からの質問は,終的に双方が少しずつ譲歩し,「移転するという原則に①これまで IFO は大学の研究機関に年間どれほどの立って交渉をすすめる」で落ち着いた．

菌株を分譲していたのか,これらが NITE の保存機関

２） の議案については,そのままの字句では IFO の寄( NBRC )に移されたら大学の研究機関に分譲されなく付行為から逸脱する恐れがあると指摘され,「研究助成なるのではないかであった．この質問は,CC の本質を事業を行うことを加える」と修正して承認された．

まったく理解していない質問であったが,「 IFO は大学の研究機関に対して年間 1,300 ~ 1,400 株分譲している．
NBRC が CC を標榜する限りは,菌株の分譲に関しては所属機関による分譲制限をするようなことはしない．
CC の使命は保存菌株を学術的または産業的に利用しようとする研究者に対し平等に分譲する事である」と説明した．
② IFO が研究助成を行う事に関しては,「これは明らかに[寄付行為]の内容の変更にあたり[寄付行為の違反]になる,研究助成を主事業にするなら財団を解散し,新財団を設立して研究助成事業をするべきだ」と厳しく指摘された．
これに対して,IFO からは,「研究資源の大半はなくなるが,特許株の受託・保存・分譲ならびに安全寄託株の保存,さらには危険分散のため移管する一般微生物株の一セットは大阪に保存することなどから,IFO は規模を縮小して従来の業務を遂行している．その中からでてきた資金の一部を研究助成に回すのだ」と説明した．また,「研究助成は寄付行為の中にある研究委託に相当する」と説明したが,この会談では文科省からの了解は得られず,今後とも連絡を密に取り合い話し合いを続ける

IFO の研究資源を新 BRC へ移すことに対する反対意見は,
2 人の理事から出された．まず,
１） 新 BRC において IFO がこれまで実施してきた微生物に関する幅広い研究が継続してできるような運営がなされるかど
うかの疑念であった．この理事を含めて学術界を背負ってきた理事・評議員の方々は,これまでの経験で通産省が行ってきた微生物に関する諸施策への対応に不信感を持っている方が多くおられた．もう一つの反対意見は,
2） 先に理事長が「経過報告」で述べたように IFO を母体とした新財団ごと新 BRC に移動すると説明していたのに,一般保存菌株を含む研究機材と研究者のみが新 BRC に移動することになったという変更であった．それに加えて,
3） 一般保存菌株を無償譲渡することであった．IFO から新BRC へ無償譲渡された場合,譲渡される全菌株の所有権がIFO にあるのかどうか明確にしておくべきで,「これらが明らかにならないうちは軽々にことを進めるべきではない」と主張した．
ただ,多くの理事・評議員の方々は IFO の本体が大阪に残ることについて安堵し,移転を容認する態度であった．
脚註)

－8－

発酵研究所の歴史（ 5 ） 微生物株保存事業から研究助成事業への転換

IFO の微生物株保存事業を NITE へ移管するためのタスクフォース−その激動の 2 年間（ 2001.4 〜 2003.3 ）−を強く意識し,現役時代にはその実現に向けて指導的役割を果たし,また,退任した後も当財団の行く末を案じてくれていた．筆者の心の支えであった飯島貞二氏が2002 年 3 月 3 日にご逝去された．前年の 10 月に飯島さ

IFO の微生物株保存事業を NITE に移管することにつんのご自宅に伺い,これからの IFO の運営や NBRC にいて IFO では未だ正式に決定されていなかったが,移おける事業の進め方など多岐にわたりご相談申し上げた管を進めるという前提で「 IFO-NITE タスクフォース」

ときは,些か辛そうではあったが財団と NBRC の運営が動き出した．IFO からは,微生物株保存事業( CC )に関する基本的理念について熱く語っていたのにと思うとについてあまり知識をもっていない NITE にたいして,飯島さんの訃報に接したときは,一種の虚脱感に襲われた．

CC の意義ならびに役割についてその基本的な事柄につ微生物株保存事業の移管

いて解説することから始まった．NITE からは CC における組織や保存する菌群ごとに必要な研究者の数ならびに実験補助者数などの相談を受けた．実務的なことは簡平成 14 年 3 月 8 日,第 114 回理事会ならびに評議会９）

単に処理できたが,一番の難問題は何名の IFO 研究者

において IFO が所有する一般微生物株約 15,000 株,研が NITE 生物資源保存供給施設( NBRC )に移動してく究資材を NBRC へ移管する事と研究者の移動を正式にれるかであった．NITE 側は,異動を希望する IFO 所員

決定し,ここに 60 年近く続けられてきた IFO の微生物は全員受け入れる用意をしていた．しかし,大阪におい株保存事業は正式に幕が下ろされた．残った財団は,危て研究生活を送っていた IFO 所員にとって,全く見知

機管理のために残した微生物株の 1 セットと契約株,特らぬ土地である千葉県に生活拠点を移すと言うことは大許株の保管を行うとともに研究委託を主体にした研究助

変な事で,解決すべき数多くの問題が立ちはだかった．

成事業を始めることになった．

また,IFO の殆どの所員は武田薬品からの出向社員であ

平成 14 年 7 月 4 日：IFO が保存していた一般微生物

るため,どのような身分と処遇で NITE へ異動するかは

株と研究資材ならびに研究者は,武田薬品大阪工場地区

IFO では決められず,結局,NITE 企画管理部と武田薬から千葉県木更津市かずさにある生物遺伝資源センター

品人事部との話し合いに委ねられた．異動の対象となっ( NBRC )へ移転した．IFO には常務理事,事務長,事た所員の身分・処遇については揉めに揉めて翌年のはじ

務員の 3 名が残り,菌株などの保管と事務処理を行う．

めまで決着がつかなかった．そのため,IFO 所員の多く

IFO の研究活動( 2000.3 ~ 2002.6 )が NBRC へ異動するかどうか決めかねていた．ただ,IFO の実務責任者としては,研究者全員が NBRC へ移
動 し て く れ る よ う 説 得 す る の み で あ っ た． そ れ は,

さて,経産省が IFO に対して「新 BRC 設立への協力

NBRC へ移された IFO の保存菌株の維持,管理,分譲と参入」を申し入れてから NBRC へ微生物株保存事業

といった CC の主要な部分を経験のある研究所員が担当を移管するまでの 2 年余り( 2000.3 - 2002.6 )の間におし,NBRC の微生物株保存事業の立ち上げに協力し発展

ける IFO の保存事業と研究活動はどうであったのであさせて貰いたかった．それに加えて,所員達が持っていろうか．2001 年度における保存事業の実績は下記に示る微生物研究における諸キャリアーを無駄にして欲しくすように前年度と比べて全く遜色ない．2002 年は,6 月なかった．出向元の武田薬品に帰る途もあったが彼らのに菌株の分譲業務を終了したため分譲数は減少した．一

キャリアーを生かせる道は殆ど閉ざされていた．

方,各所員の保存菌株の品質管理に関する研究や菌株収最終的に,移動を了承した IFO 所員は,武田薬品からの出向者としてではなく,IFO へ出向したまま勤務地

集の意欲は衰えず,彼らの研究意欲と努力の成果が学術発表数に現れている．

変更という状態で NBRC へ移動し,それぞれのキャリ
アーに基づいて NBRC で格付けされ,天上がりの非常

保存株数と分譲株数の推移

勤 研 究 職 員 と し て 処 遇 さ れ る こ と に な っ た． 勿 論,

2000年＊NITE 側は,彼らが一日も早く NITE 職員となって業務に携わってくれることを切に願っていた．

2003年

＊＊

16,442

16,373

1,255

1,118

分譲株数

8,501

8,819

2,040＊＊＊

13：既出(竹内昌男４）)：2002 年度の保存数＊＊＊：2002 年 6 月 ま で の 分 譲 数． 一 般 微 生 物 株 は 同 年 7 月 に
NBRC へ移管した．
＊＊

微生物の保存事業について,その重要性と社会的貢献

2002年

保存株数
＊

元常務理事飯島貞二氏のご逝去

2001年

－9－

波 多 野

和

学術発表
誌上発表

口頭発表

徳

法案が決まったらすぐに対応できるよう準備してお講

義くようにとの助言を貰った．

執筆
（共著）

国

内

17

15

2

2

海

外

14

3

0

0

合

計

31

18

2

2

これで新 IFO の今後の運営方向が決まった．
平成 15 年 3 月の理事会・評議員会において波多野は常務理事を退任し,中濱一雄が新しい常務理事に就任することが承認された．

この中には,見方洪三郎が「酵母の系統保存法に関す

平成 15 年 4 月 1 日から,森田理事長,中濱常務理事

る技術開発」の功績で日本微生物資源学会「技術賞」を主導の下でアドホック的に研究委託の一環として研究助受賞した受賞講演と報告論文,岡根泉が「植物内生菌の成事業を開始した．

分類および生態に関する研究」で日本菌学会奨励賞受賞

そ の 後

講演が含まれている．
彼らの活力は新しい NBRC の職場に於いても十分に生物遺伝資源センター（ NITE Biological Resource Center :発揮された．

NBRC ）の誕生

新 IFO の新運営方針

NBRC は,NITE の 1 部門であるバイオテクノロジー
センターの BRC センターとして 2002 年 5 月 23 日に開IFO が NBRC に研究資源を移した後,財団の新しい所式を迎え正式に発足したが,菌株の分譲業務を始めと運営方針を決めるため平成 14 年 11 月 7 日に臨時理事・する全ての業務は IFO からの研究資材が到着するまで評議員会を開催した．(参考資料：H14 年臨時理事会・準備状態にあった．諸々の業務が本格的に動き始めた頃

評議員会議事録)10）．

の NBRC の体制は,系統保存課( CC 担当)には,9 名

議題は,の IFO 研究者に加えて,NITE が雇用した微生物研究を1. 平成 15 年度から 5 年間における財団の具体的運営
2. 寄 付行為変更について－主務官庁への働きかけとを含め総勢 17 名が,資源開発課には,任期付き研究職
員を含め 30 名が,管理課(事務担当)には 11 名が配属

その経過報告され,これに 17 名の派遣社員が加わり総勢 75 名の大所

出席者は,
理

専門とする任期付研究者ならびに NBRC の研究職員として教育とトレーニングを受けた４名の NITE 若手職員について帯から成っていた．

事：岡田,岡見,波多野,早石,藤野,森田

2002 年 7 月に IFO からの研究資材が到着し,7 月 10

評議員：大村,木村,駒形,竹内,竹中,武田,豊島監

日から NBRC において一般菌株の分譲業務を開始した．

事：大嶋である．討議は多岐にわたり含蓄の多い内容であったが,これには IFO から移動してきた研究者と IFO が開発しここにはその要約を記す．

た分譲システムが多大な貢献をした．IFO から NBRC

１） 微生物に関する出版物を刊行する．内容は微生物のに移動した研究者は,カビ担当 3 名(伊藤忠義,中桐昭,「実験提要」のようなものにして研究者の指標となる

岡根泉),細菌担当 2 名(中川恭好,内野佳仁),放線菌

ようなレベルとし,有料とする．

担当 1 名(田村朋彦),情報担当 1 名(末永格：翌年 3大島泰治監事が出版事業委員長として指名された．

月退職),IFO 所員の統括責任者である筆者の 8 名であ2） 研究助成は国が実施している助成とは重ならないよ

る．さらに,強力な助っ人として元 IFO 所員であった

うに配慮する．

細菌のスペシャリストである坂根健と酵母のスペシャリ

選考委員長

ストである見方洪三郎の 2 名が加わり総勢 10 名となっⅠ. 駒形和男評議員：微生物・分類・保存関係

た．この 10 名が中心となって NBRC における微生物のⅡ. 豊島久真男評議員：微生物に関し全体を網羅し保存と分譲業務を動かした．特筆すべきは,系統保存課

た研究,後に健康と環境に関する研究と具体化の責任者として坂根健が課長に就任し,保存菌株の品質された．

管理から研究指導まで幅広く貢献したこと,また,見方
洪三郎と伊藤忠義は NBRC に雇用された初心者である

3） 助成した研究成果の評価をする
評価委員長：早石修理事,副委員長：岡見吉郎理事

派遣社員の人々にたいして菌株保存方法の一つで IFO

4） 寄附行為の変更については具体的な文案が出されたが開発した L - 乾燥法の技術と微生物研究では基本中のが,評議員の一人から,国は「公益法人制度改革」

基本である培地調整の実施指導を行い,IFO で培われたについて審議を始めているので,その情報を収集し,技法の実施教育と普及に努めた．また,菌株の分譲シス－ 10 －

発酵研究所の歴史（ 5 ） 微生物株保存事業から研究助成事業への転換−その激動の 2 年間（ 2001.4 〜 2003.3 ）−テムは,IFO が開発したシステムをそのまま踏襲し,移業に置き,しかもコストパフォーマンスを重視する施策

管後わずか 1 週間で分譲開始をする事ができた．このシをとり始め,目に見える経済的利益を生み出しにくい当

ステムはその後,NBRC が IFO のシステムをベースに財団は,リストラの対象部門の一つとして考えられたの開発したシステムが動き出すまで用いられた．

ではないだろうか．さらに,それを推し進めたのは,武IFO から移動した研究者のその後を追ってみよう．

田薬品の社長を始め経営上層部は,IFO を自社の研究所

2004 年 3 月末に NITE から懸命な慰留要請があった坂根の 1 部門程度の認識しかなく,社会的貢献度は高いが直健が,同年 9 月末には伊藤忠義が,同年 12 月末には見接的な経済効果を出さない IFO に対する評価は極めて

方洪三郎が退職した．この 3 名は IFO に於いても菌株の低かったと考えられる．

保存管理のスペシャリストでその力を NBRC においてもうひとつは,通産省が国の新 BRC を設立しようとも遺憾なく発揮し,NBRC における微生物株保存事業の考え,その基盤となる保存機関として民間運営の IFO

基礎を築いたと言っても過言ではない．坂根,伊藤,見に目をつけたのではないかと考えられる．1994 年およ方の 3 名は,IFO が実施していた微生物株保存事業がび 1997 年に新 BRC 設立を推進した通産省基礎産業局生NBRC へ移された後,この事業がきちんと継承・実施さ

物化学産業課の職員と課長が,IFO の研究所を訪問してれる事を見届けたら退職する心づもりで NBRC へ来た

いる( IFO 芳名録より)．武田薬品の思惑と通産省の思ようであった．残りの５名は,2008 年に正式に NITE 職

惑が相俟って,両者で IFO の研究資源を新 BRC へ移す

員として雇用された．IFO から移動した所員の行く末に算段をしたのではないかと推察される．

一段落つけた波多野は 2009 年 3 月に NITE を退職した．

これらに加えて,IFO は運営資金の大半を 1 カ所から

東日本大震災後,中桐昭は鳥取大学へ,岡根泉は筑波大のみの寄附金に頼っていたことにも遠因があったのでは学へと転出した．現在( 2017 年)NBRC に残っているないだろうか．当財団が設立された経緯から考えると,のは中川恭好(系統保存関係の課長),田村朋彦(特許IFO の運営が武田薬品からのみの寄付金に委ねられたこ株担当)と内野佳仁(開発関係を担当)の 3 名となった．

とは致し方ないことと考える一方,運営資金の調達に関彼らはそれぞれの部門においてその重責を担い,NBRC

してもう一工夫があれば事業転換をせざるを得なくなるを支え,旧 IFO が実施してきた微生物株保存事業を継承・というリスクから多少なりとも逃れられたかもしれな

発展させている．

い．例えば,財団の事業に賛同する多方面の団体や人々から寄附金の公募などをして運営資金の獲得を試みる必おわりに要もあった．このことは今の公益財団法人発酵研究所の運営にも考慮すべきことで,常にそのことを念頭に入れ

財団法人発酵研究所( IFO )は,設立当初( 1944 年)て運営していく必要があるだろう．

から有用微生物の収集・保存・分譲を行うと共に,集め最後に一言書き加えておきたいことは,会社が財団法た微生物の基礎ならびに応用研究などを実施してきた．

人などに寄附をするという行為は会社の経済活動ではな

応用研究部門を切り離した 1964 年からは,微生物の収く会社の社会貢献の一つであり,それをする事によって集・保存・配布とこれらの基礎研究をする所謂カルチャー

会社は社会的敬意を受けるということを,会社幹部が充コレクション( CC )に専念し,保存菌株の数ならびに分に認識していなかったことである．特に IFO の微生

それらの質の高さ,さらに保存菌株を用いた基礎研究の物株保存事業は学術界,発酵工業界などへの貢献度が高

質の高さにおいて日本はもとより世界に誇る組織となっく,武田薬品が IFO の運営に対して資金援助をして多た．これはひとえにこの財団の社会的重要性を認めその大な社会貢献をしていると,社会から高い敬意を受けて設立に尽力し,常に経済的支援をし続けていただいた武きていた．これを忘れ,単なる経済性だけで IFO の事

田薬品工業株式会社社長・故六代目武田長兵衛氏とその業を判断している愚かしさを認識していなかったことはご一族ならびに同社経営陣におけるご理解の賜物である．

誠に残念である．ただ,皮肉なことに,IFO の研究資源

それならば何故,IFO が CC から研究助成へと事業転を NBRC に移管した後,武田薬品は株の配当金額を上換をせざるを得ない事態に陥ったのか？

筆者なりの推げ始めたため,今日,その恩恵に浴し IFO は潤沢な資金を得ることができ,研究助成事業を順調に進めることが察をしてみよう．
その遠因として,1995 年に当財団が赤字を出し,そできた．この事業は,国内の微生物関係の研究者から大の補填の為に武田薬品から寄附金の追加要請をしたこと

いに評価され感謝されている．これも,武田薬品が株のが考えられる．これを切っ掛けに,武田薬品側は IFO

配当金額を高く維持してくれているお陰と感謝している．

への資金支援をする事への是非論が出てきたのではない
か．また,この頃から武田薬品は経営の中心を医薬品事－ 11 －

この発酵研究所の歴史 （5） は,筆者が手に入れた諸文

波 多 野和

徳て」2001 年 3 月 9 日
７） ｢会談メモ｣．2001 年 8 月 22 日
８） 波多野和徳．文部科学省との会談メモ．2001 年 8 月 24 日
９） 波多野和徳,吉田正憲．第 114 回理事会・評議員会議事録．
2002 年 3 月 8 日．
10） 波多野和徳(文責者)平成 14 年度臨時理事会・評議員会
議事録．2002 年 11 月 7 日．

書や見聞きした事を下敷きにして書かれている．別の立場の人から見ると納得できない部分もあるであろう．また,筆者の判断で,契約書,要望書,他部門が作成した議事録は,一部を除いてそのまま全文を掲載することを控えた．了解願いたい．

参考資料
１） 長谷川武治．「微生物保存事業と IFO 」1995. IFO ResearchCommunications. 17: 9-18．
２） 飯島貞二．A History of Institute for Fermentation, Osaka.
2001. IFO Research Communications. 20:15-33．
３) 長谷川徹．発酵研究所の歴史．2014. IFO Research Communications. 28:1-10．
４） 竹内昌男．発酵研究所の活動－発酵研究所を継いだ人たち( 1995.4 ~ 2001.3 )－．2016. IFO Research Communications. 30: 1-16
５） 森田桂．「 IFO 関連面談要旨」．2001 年 2 月 8 日．
６） 武田薬品からの要望．「貴財団に対する当社の要望につい

略

歴

波多野和徳
1941 年生まれ
1964 年 4 月：武田薬品工業株式会社入社,研究所配属
1993 年 10 月：武田薬品から財団法人発酵研究所へ出向
2001 年から 2003 年：IFO 所長／常務理事
2010 年から 2017 年：IFO 理事長
2017 年 6 月理事長退任－ 12 －

第 11 回助成研究報告会の開催
平成 29 年 6 月 9 日千里ライフサイエンスセンター５階ホールにおいて第 11 回助成研究報
告会を開催し,2 年間の助成を受けた大型研究助成 4 件の研究成果の口頭発表,5.5 年間の助成を受けた寄付講座助成 1 件の研究成果の口頭発表,ならびに 2 年間の助成を受けた一般研
究助成 31 件の研究成果のポスターによる発表が行われた．参加者は,大学,国公立研究所,
企業の研究者,大学院生など総数 232 名であった(このうち大学院生は 29 名)．
報告会に先立ち,中濱一雄理事長から挨拶があった．報告会では大型研究助成 4 件のうち「不完全さび菌および内生型さび菌の系統分類学的所属の決定ならびに生活環進化の解明のための情報基盤構築」(山岡裕一)の 1 題は徳増征二 元筑波大学教授の座長のもとに,「レブリン酸を基幹化合物とする新規バイオ生産技術の開発~化学触媒変換とバイオコンバージョンの融合による木質バイオマスの高効率転換~」(羽部 浩)は阪井康能 京都大学大学院農学研究科教授の座長のもとに,「有害化合物汚染土壌の微生物集団による分解 ･ 浄化に向けた基盤研
究：分解菌と共存する非分解菌の役割の解明」(津田雅孝)および「窒素循環研究のパラダ
イムシフトを目指した未培養性硝化細菌の網羅的・高速ハンティング」(常田 聡)の 2 題は
熊谷英彦 石川県立大学学長の座長のもとに口頭発表が行われた．また,寄付講座助成の 1 題「 BioCentury を先導する次世代酵母リソース中核拠点の形成」(金子嘉信)は熊谷英彦 石川
県立大学学長の座長のもとに口頭発表が行われた．各研究発表に対して活発な討議がなされ,示唆に富んだ意見も出るなど実りのある発表となった．発表の内容は全文が本報告集に収録されている．なお,寄付講座助成の報告は総論 1 報と各論 4 報に分けて報告されている．
引き続いて一般研究助成 31 件はポスター展示による発表がなされた．各ポスターの前で参加者と熱心な質疑が交わされた．さらにこの後行われた懇親会の時間にもお酒を片手にポスターの前で討論する姿が見られて,ポスター発表内容について十分に議論されたようであった．一般助成研究の研究結果は本報告集ではページ数の関係で要約のみを掲載した．
懇親会には報告会参加者のほとんどが参加した．先ずは下田 親 評議員(大阪市立大学名
誉教授)の挨拶があり,次いで土屋英子 評議員(広島大学名誉教授)のご発声で乾杯を行った．懇親会では,参加者の間で和やかに歓談が持たれたのに加えて,報告会では十分に出来なかった質疑応答も行われ,また本年 3 月で設置期間が終了した大阪大学寄付講座の教員および本年 10 月に開設する筑波大学寄付講座の教員からの挨拶などもあって,異なる分野の研究者の間で賑やかな交換が見られた．今回の報告会および懇親会にも若手の研究者が多数参加され,新旧の研究者の交流の場としても十分役だったものと思われます．参加研究者の間で共同研究の話がまとまった,などの声も聞かれました．参加された皆様のご協力に心から感謝致します．
来年の第 12 回助成研究報告会は平成 30 年 6 月 8 日（金）に同じ会場で開催致します．
以下に報告会,ポスター展示,懇親会の模様の一部を写真で紹介する．
(文)横田－ 13 －明

RESEARCH COMMUNICATIONS

中濱

開会挨拶
一雄 理事長

山岡

裕一 氏

座長

徳増

征二 先生

羽部

浩 氏

金子

嘉信 氏

座長

阪井

津田

樽井

講

演

会

－ 14 －

康能 先生

雅孝 氏

司会
直樹 常務理事

座長

熊谷

英彦 先生

常田

聡 氏

RESEARCH COMMUNICATIONS

ポスター発表

挨拶

下田

親 評議員

乾杯

土屋

英子 評議員懇－ 15 －

親会

平成27年度大型研究助成の研究報告
助成期間：平成27年 4 月〜平成29年 3 月

IFO Res.Commun. 31
17-35, 2017

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属の決定
ならびに生活環進化の解明のための情報基盤構築
山

岡

裕

一

筑波大学生命環境系〒305-8572

つくば市天王台1-1-1

Taxonomic Determination of Anamorphic and Endocyclic Species of Rust Fungi
and Construction of Foundations for Solving the Evolution of Life Cycles
Yuichi Yamaoka
Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba
1-1-1 Tennodai, Tsukuba 305-8572, Japan
Molecular phylogenetic analysis of the nuclear small subunit (SSU), the nuclear large subunit (LSU) and the internaltranscribed spacer 2 (ITS2) region of rDNA were conducted to determine the taxonomic treatments of anamorphic
species and endocyclic species of rust fungi (Pucciniales). Furthermore, these molecular data were catalogued for
future studies on life cycles and evolution of rust fungi. Among the anamorphic and endocyclic species, twelve
species of Aecidium, four species of Uredo and two species of Endophyllum were included in Pucciniaceae s.l. These
species may need to be transferred to Puccinia or other related genera. Caeoma tsukubaense, Uredo daphnicola andU. fagarae were contained in the same clade as Chrysomyxa, Melampsora and Coleosporium, respectively. On theother hand, three species of Aecidium, four species of Uredo and Monosporidium machili were included neither in
Pucciniaceae s.l. nor in the same clades with a particular genus. Within Pucciniaceae s.l., macrocyclic heteroecious
rust species parasitizing Cyperaceae as uredinial and telial hosts created a well-supported clade, while the ones
parasitizing Poaceae were included in other clades. This is useful information to explore alternate host plants ofrust fungi with unknown or incomplete life cycles. Two species of Endophyllum examined in the present study
appear to be related to the different macrocyclic species of Puccinia. Species of Endophyllum appear to be derived
from Puccinia or allied genera.
Key words: Aecidium, Endophyllum, molecular phylogeny, Pucciniales, Uredo緒言

カゲノカズラ植物・シダ植物),裸子植物,被子植物に寄生し,コムギ,トウモロコシ,ダイズ,ナシ,リンゴ,

サビキンは担子菌類サビキン目( Pucciniales )に属する植物の絶対寄生菌で,世界で 14 科 166 属約 7,798 種

キク,マツ,ユーカリなどの作物や樹木に寄生し経済的に深刻な被害を引起こすものもある．

が存在するとされている(Kirk et al., 2008 )．シダ類(ヒサビキンは,1 種が最大で 4 つの形態的,機能的に異なる胞子世代と5 種類の胞子(精子,さび胞子,夏胞子,冬胞子,E-mail: yamaoka.yuichi.gp@u.tsukuba.ac.jp
共同研究者：岡根泉(筑波大学生命環境系),
小野 義隆(茨城大学教育学部),
細矢
剛(国立科学博物館),
升屋 勇人(森林総合研究所東北支所),
安藤 裕萌(筑波大学生命環境科学研究科,
現 森林総合研究所東北支所),
藤森 祥平(筑波大学生命環境科学研究科),
鈴木 浩之(筑波大学生命環境科学研究科),
糸澤 千尋(筑波大学生命環境科学研究科)

担子胞子)を形成する多型性の菌類である．また生活環を全うするのに系統的に関係の遠い 2 種類の植物(精子・さび胞
子世代宿主と夏胞子・冬胞子世代宿主)を必要とする異種
寄生種と1 種の植物で全うできる同種寄生種が存在するなど,
その生活環は複雑で生活環が不明な種も多数存在する．
サビキンは有性生殖形態(テレオモルフ)の冬胞子世代の形態に重点を置いて分類されているが,精子・さび胞子世代,あるいは夏胞子世代しか発見されていない種－ 17 －

山

岡

裕

一

は無性生殖形態(アナモルフ)種の不完全サビキンとしてたサビキンや植物が対象になる場合には,継続的な野外扱われている．Cummins & Hiratsuka(2003)は,胞子観察を通して不完全サビキンが生じていた植物の周辺を堆構造と胞子形態で特徴付けられるアナモルフ属として 13

探索し,夏胞子・冬胞子世代だけを形成している植物を属をあげている．例えば,Aecidium 属は,護膜が発達し見出し,その健全な植物にさび胞子を接種することにな

たカップ型の胞子堆を形成し,疣状突起で覆われた胞子をる．あるいは逆に,夏胞子・冬胞子世代だけを形成して介在細胞とともに鎖生する．一方,Caeoma 属は,胞子堆いた植物から得た冬胞子を発芽させて(多くの場合越冬の境界部に護膜等の構造を持たず,疣状突起で覆われた後)得た担子胞子を精子・さび胞子世代を形成していた胞子を介在細胞とともに鎖生する．Uredo 属は,胞子堆の健全植物に接種することになる．それぞれの実験的接種

境界部に護膜等の構造を持たず(胞子堆内に糸状体を伴う試験で,被接種植物に胞子堆が形成されれば異種寄生性ことはある),刺状の突起で覆われた胞子を柄生する．たが証明されたことになる．異種寄生性解明のための宿主だし,機能的には夏胞子世代であるために,胞子の機能

探しは,専門家の経験と根気に頼る必要があるが,それを重視する観点から,形態的には Caeoma 型の胞子堆をでも候補が見つからない場合も多い．

形成する種が Uredo 属菌として記載されていることもある．

しかし,近年,分子系統解析法をサビキン研究に容易,

これらの不完全サビキンは,異種寄生性のテレオモル

迅速かつ安価に適用できるようになった．そのため,不フ種の精子・さび胞子世代であることが多く,それが証

完全サビキンのみならず精子・さび胞子世代が不明なテ

明されると適切なテレオモルフ種の名前が与えられてきレオモルフ・サビキン種の DNA 塩基配列情報をデータた． 例 え ば,Aecidium 属 菌 は,Puccinia 属 と Uromyces

ベース化し比較研究に提供することよって,多くのサビ属の精子・さび胞子世代であることが多いが,Ochrop-

キンのテレオモルフ－アナモルフ関係を推定できるよう

sora 属や Tranzschelia 属であることもある．一方,不完になった．この分子系統研究による推定に基づくことに

全サビキンの中には,有性生殖を放棄してさび胞子世代

よって,実験的交互接種試験による異種寄生性生活環のあるいは夏胞子世代のみで生活していると考えられる種実証が効率的かつ正確に実行できることが期待される．

も存在する．この様に,サビキンの複雑で多様な生活環

生活環を短縮し,冬胞子世代のみを有する短世代型サと異なる胞子世代の生活環上の連続を証明することの難

ビキンのうち,冬胞子世代の胞子形態が長世代種のさび胞しさから,同一サビキン種を胞子世代ごとに命名すると子と同様の種を内生型サビキン(内生種)と呼ぶ．内生種は,いう複数命名法が長年にわたり正当な方法として行われ形態的特徴や宿主植物,病徴などから,その種の由来とてきた．しかし,同一種が同時に複数の正式名を持つとなった祖先テレオモルフ種が 推定されていた．しかし,いうことの問題が指摘され,2011 年にメルボルンで開2011 年のメルボルン規約制定以前は,系統関係の有無に催された国際植物会議において“一菌種一名( One fun-

かかわらずテレオモルフの形態に重点を置いて分類していgus, one name )”の考え方に基づいて新たな国際藻類・たため,これまでは別の属に,例えば,Puccinia 種由来の

菌類・植物命名規約が導入された(岡田, 2011 )．この

さび胞子様冬胞子を形成するサビキンは Endophyllum に

命名規約に従うと,アナモルフ種の系統関係を明らかに分類され,Cronartium 種由来のさび胞子様冬胞子を形成し,正式な所属を決定することが必要になる．一方,不するサビキンは Endocronartium に分類されることが普通

完全サビキン属は系統的に多様な集団であることは明白であった( Cummins & Hiratsuka, 2003)．
“一菌種一名であり,形態的特徴と分子系統情報に基づいてそれぞれ( One fungus, one name)”は必然的に生活環の類縁性の不完全サビキン属に分類されている種を系統分類学的だけではなく系統的類縁性をも考慮に入れることを要請すに整理することが喫緊の課題である．

るので,内生種の分類も系統関係から研究する必要がある．

精子・さび胞子世代のみで命名された不完全サビキン

サビキンの 分 子 系 統 解 析 に 関しては,Maier et al.

のほとんどは,異種寄生種の精子・さび胞子世代である（2003）,Wingfield et al.（2004）,Aime （2006）,McTag-

ことが予想される．そのため,異種寄生性生活環を証明

gart et al.（2015),Beenken（2017） 等により,18S およびし冬胞子世代を見つけ出すために,野外観察と実験的接28S rDNA ,ITS 領域,β - チューブリン遺伝子などを用い種試験が行われてきた(例えば,Ono, 1983; Okane et

た研究が行われ,サビキンの科や属・種の系統的位置関al., 2013 )．異なる胞子世代の生活環上の連続性は従前係が次第に明らかになってきた．例えば,Aime（2006） は,の研究成果に基づいて推定し,異なる 2 種類の植物上に

18S および 28S rDNA を用い,広範囲にわたるサビキン属形成されたさび胞子と冬胞子から生じた担子胞子を交互の分子系統解析を行った．その結果,Cummins & Hirat-

接種して確かめることになる(被接種植物や接種胞子のsuka（2003） が“ Illustrated genera of rust fungi ”第 3 版

状態によっては一方向の接種で済ませなければならないの中で示した 13 科のうち 8 科は系統群として支持されたこともある)．一方,それまで研究がなされていなかっものの,残りの科についてはそれまで考えられていた系統－ 18 －

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属関係とは異なることを明らかにした．その後,Aime はデーDNA 抽出，PCR 増幅およびシーケンシング

タを 追 加して 解 析 を 進 め (https://www.plantmanage-

標本上の胞子堆を火炎滅菌したメスを用いて掻き取

mentnetwork.org/infocenter/topic/soybeanrust/2009/

り,50 μl の DNA extraction buffer[ 10 mM Tris-HCl pH.

presentations/Aime.pdf ,2017 年 5 月 26 日 現 在),Puc-

8.3 ,1.5 mM MgCl 2 ,50 mM KCl ,0.01 % sodium do-ciniaceae,Phakopsoraceae,Raveneliaceae,Pileolari-decyl sulfate ,0.01 % Proteinase K ]( Uzuhashi et al.,aceae ,Phragmidiaceae ,Coleosporiaceae ,Cronartia-

2008 )に懸濁した．懸濁した胞子堆は,ホモジナイザー

ceae,Melampsoraceae,Mikronegeriaceae の 9 科を認

ペッスルで磨り潰し,37 ℃で 1 時間,95 ℃で 10 分間イ

めている．また,Gymnosporangium,Phakopsora のようにンキュベートし,高速遠心分離( 15,000 × g で 2 分間)

これまで所属していた科から大きく離れた属や,分割されたを行った後,上清を回収することで DNA 抽出物を得た．

属などの存在も明らかにされた．Beenken（2017） は,同様

18S rDNA( SSU ),ITS 領域,ITS2－D1/D2,およびに 18S および 28S rDNA を用いた解析を行い,Pucciniace-

28S rDNA( LSU )の部分塩基配列を既存のプライマー

ae から Sphaerophragmiaceae を分けることを提案した．

および本研究で新たに設計したサビキン特異的プライ

この様にサビキン目の系統関係について,次々に新たな知マー(Table 1 )を用いて polymerase chain reaction( PCR )見が加えられているが,未だ系統関係が不明確な菌群も残によって増幅させた．PCR 反応は,初期熱変性を 95 ℃

されており,さらにデータを収集し解析を進める必要がある．

で 5 分行い,94 ℃で 30 秒,各プライマーセットの最適

日本では約 800 種のサビキンが報告されているが,そのアニーリング温度( Table 1 )で 30 秒,72 ℃で 60 秒をうち,不完全サビキンが約 120 種,生活環が不明な種が約40 サイクル繰り返し,最終伸長反応を 72 ℃で 8 分行っ

200 種存在する( Hiratsuka et al., 1992)．この様に日本国

た．PCR 産物は,エチジウムブロマイドを含めた 1 %ア

内だけでも対応すべき種が多く存在する．そこで本研究は,ガロースゲル電気泳動によって増幅を確認し,illustra

日本産の不完全サビキンおよび内生型サビキンを中心に分

ExoProStar( GE Healthcare, Little Chalfont, Bucking-

子系統解析を行い,その系統分類学的所属を決定すること

hamshire, UK )をマニュアルに従って使用して PCR 産を目的とした．また,これらの分子情報をカタログ化し,物の精製を行った．シーケンシングは,BigDye Termi-

今後の異種寄生種の生活環解明,生活環の進化に関するnator Cycle Sequencing Kit v.3.1( Applied Biosystems )研究の情報ソースを構築することも目的として研究を進めた．

をマニュアルに従って使用し,ABI 3500xL Genetic Analyzer( Applied Biosystems )によって塩基配列を解読し実験方法

た．得られた塩基配列データは,BioEdit ver.7.1.9( Hall,
1999 )でアセンブルを行った．

供試材料

分子系統解析

筑波大学植物寄生菌学研究室,茨城大学教育学部,国立科学博物館等が所蔵するサビキンの標本,ならびに採集調査で得た標本の中から,不完全サビキン( Aecidium,

塩基配列が決定できた不完全サビキン 3 属 35 種の標Caeoma, Uredo 属菌)および内生型サビキン( Endophyl-

本 に 加 え,Cummins & Hiratsuka( 2003 ) の 提 唱 す る

lum, Endocronartium, Monosporidium 属菌),サビキン目

13 科のうち 12 科 30 属 118 種の標本から得られたシーケの各科を代表する菌群,ならびに Pucciniaceae を中心にンスデータを分子系統解析に供試した(Table 2 )．また,

精子・さび胞子世代が不明な種や異種寄生種に加え,様々GenBank に登録されている塩基配列を取得し(Table 3),な生活環を有する種の標本,計 925 標本を供試した．

合わせて各データセットを作成した．各データセットは,Table 1

Primers and optimised anneling temperature for each primer set－ 19 －

山
Table 2

岡裕

一Specimens from which DNA sequence data were obtained in this study

Continued on the next page.

－ 20 －

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属
Table 2

continued
Continued.

Continued on the next page.

－ 21 －

山

岡Table 2

裕一continued
Continued.

オ ン ラ イ ン 上 の MAFFT 7( http://mafft.cbrc.jp/align-

いて最尤法[塩基置換モデルとして General Time Re-

ment/server/ )( Katoh & Standly, 2013 )で Q-INS-i オプ

versible model + Gamma distribution + Proportion of in-

ションによってアライメントを行った．アライメント後

variable sites ( GTR + G + I ) を設定]により行い,各系統のデータセットは,BioEdit ver. 7.1.9( Hall, 1999 )で 5’枝の再現性はブートストラップ法( 1,000 回反復)によ

末端と 3’ 末端を揃え,ギャップを含むサイトを削除しり評価した．Outgroup として,Pucciniomycetes の Puc-

たデータセットを作成し,分子系統解析に用いた．

ciniales 以外の目に属する Eocronartium muscicola（Pers.)

系統解析は,アライメントデータからギャップ挿入サ

Fitzp.（Platygloeales) ,Herpobasidium filicinum (Rostr.)

イトを除いたデータセットについて,raxmlGUI ver.1.2

Lind.（Platygloeales） ,Helicobasidium purpureum (Tul.)( Silvestro & Michalak, 2012；RAxML ver.8 を実装)を用

Pat.（Helicobasidiales) を用いた．

－ 22 －

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属
Table 3

Sequence data obtained from GenBank used in this study

2,248 サイト( SSU: 1470; LSU: 778 )について最尤法で結果および考察

系統解析した．その結果に基づき構築した系統樹を Fig.
1 に示す．

18S (SSU) および 28S rDNA (LSU) 解析結果

本解析では,Aime （2006) や Beenken （2017) が使用し供試したサビキン 12 科 30 属 118 種および不完全サビ

た SSU および LSU を用いた．これまでに確認されていキン 3 属 35 種の標本のうち,SSU および LSU の配列解

た Mikronegeriaceae ,Cronartiaceae, Coleosporiaceae ,読に成功したサビキン 123 標本と Outgroup として H.

Melampsoraceae ,Phragmidiaceae ,Pucciniaceae s.l. ,filicinum( IBA-10957 )に由来するシーケンスデータ,

Sphaerophragmiaceae は,明確なクレードを形成した．

および Genbank より取得した Outgroup の 2 データを含

従来,Phakopsoraceae,Chaconiaceae,Uropyxidaceae,

む 51 シーケンスデータ,合計 174 シーケンスデータを

Pileolariaceae,Raveneliaceae に含まれていた菌群はそ

アライメントし,ギャップ挿入サイトを除いて得られた

れぞれ複数のグループに分かれ,系統的に異なる集団が－ 23 －

Fig. 1 Maximum likelihood tree based on SSU and LSU rDNA of rust fungi.
Maximum likelihood bootstrap (ML BS) more than 50 % were shown as the support values for nodes. Upper (a), middle (b) andlower part (c) of the tree. Black and white arrows indicated anamorphic and endocyclic species, respectively, mentioned in the text.

Continued on the next page.

山岡裕－ 24 －

一

Fig. 1

continued
Continued on the next page.

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属－ 25 －

Fig. 1

continued

山岡裕－ 26 －

一

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属

含まれていたことが分かった．また,Phakopsoraceae,に分類されていた．Zanthoxylum 属のサンショウ,カラ

Uropyxidaceae,Chaconiaceae の一部の菌群については,ス ザ ン シ ョ ウ に は Coleosporium xanthoxyli Dietel & P.

それぞれ高いブートストラップ値で支持されたクレード

Syd. が寄生し,この夏胞子世代と形態的に類似するこを形成した．Pucciniastraceae については,クレードはとから,本菌も Coleosporium 属菌の夏胞子世代である形成されたが,ブートストラップ値は低かった( 35 %)．

と予測されていた．本研究の SSU と LSU を用いた系統

系統的位置づけが不明確な菌群については,今後さらに解析の結果,本菌が Coleosporium に属し,C. xanthoxyli

試料を加え,また異なる遺伝子による解析を行い,検討と極めて近縁であることが示された．
上記 3 種については,それぞれ適切な属に転属する必する必要がある．

要があると考える
特定のクレードに含まれた不完全サビキン
今回 SSU と LSU を用いて解析することができた不完

Pucciniaceae s.l. クレードに含まれた不完全サビキン

全サビキン Aecidium 14 種,Caeoma 1 種,Uredo 12 種,

Pucciniaceae s.l. クレードに含まれることがわかった

および内生型サビキン Endophyllum 2 種,Monosporidi-

Aecidium 属菌,Uredo 属菌については,さらに Puccinia,

um 1 種のうち,Aecidium epimedii Henn. & Shirai 他 Ae-

Uromyces, Stereostratum, Endophyllum の既知種とともにcidium 属 11 種,Uredo caricis-incisae (Syd. & P. Syd.) S.

rDNA の ITS2 領域,LSU の D1/D2 領域を用いた分子系

Ito 他 Uredo 属菌 3 種,および Endophyllum 2 種は,Puc-

統解析を行い,夏胞子・冬胞子世代の探索ならびに系統

ciniaceae s.l. クレードに含まれた( Fig. 1a )．これらの関係の解析を行った．なお,Endophyllum 属菌は,進化

Aecidium 属菌は,同種寄生種の可能性もあるが,Puc-の過程で,近縁の長世代種から分化したと考えられていcinia,Uromyces または近縁属に属する異種寄生種の精るので,近縁と考えられる種との系統関係を明らかにす子・さび胞子世代である可能性が高いと考えられる．

るため,本分子系統解析に加えた．本解析では,85 標

一方,SSU と LSU の解析結果より,Caeoma tsukubaense

本に由来するシーケンスデータ[ outgroup として Nys-

P.E. Crane et al.,Uredo daphnicola Dietel,および Uredo

sopsora cedrelae( TSH-R11239 ),Gymnosporangium asi-fagarae Syd. & P. Syd. は,それぞれ,高いブートストラッ

aticum( TSH-R7842 )],および GenBank より取得した

プ 値 で 支 持 さ れ た Chrysomyxa 属,Melampsora 属,

4 シーケンスデータ,合計 89 シーケンスデータをアライ

Coleosporium 属のクレードに含まれた( Fig. 1c )．

メントし,ギャップ挿入サイトを除いて得られた 658 サ

Caeoma tsukubaense は,Crane et al.( 2005 ) に よ り

イト( ITS: 173; D1D2: 485 )について最尤法で系統解析

筑波山のヤマツツジ上で発見され記載された種である．

した．その結果に基づき構築した系統樹を Fig. 2 に示す．

胞子堆に護膜がなく,表面に疣状突起を有し鎖生する胞解析の結果,チャンチンモドキ( Choerospondias axil-

子を形成することから Caeoma 属に分類された．この形

laris (Roxb.) B.L.Burtt & A.W.Hill ) に 寄 生 す る Aecidi-

態的特徴と宿主植物がツツジ科であること,ならびにum sp. 1,ヨツバムグラ( Galium trachyspermum A.Gray )D1/D2 領域による解析結果から,本菌は Chrysomyxa 属に 寄 生 す る Aecidium sp. 3, ヨ モ ギ( Artemisia indicaに属すると予測されていたが( Crane et al. 2005 ),これWilld. var. maximowiczii (Nakai) H.Hara ) に 寄 生 す るまで冬胞子世代は確認されていない．本研究の成果でもAecidium sp. 4,キツネアザミ( Hemistepta lyrata Bunge )に 寄 生 す る Aecidium saussureae-affinis Dietel に つ い て

本菌は Chrysomyxa 属に属することが確認できた．
Uredo daphnicola は, ジ ン チ ョ ウ ゲ 科 の オ ニ シ バリ
( Daphne pseudomezereum A. Grey )に寄生し,表面が刺は,塩基配列がほぼ一致する夏胞子・冬胞子世代を見つけることができた．

状突起で覆われた胞子を柄生し,多数の頭状の糸状体を

Van Der Merwe et al. （2007, 2008） は,TEF-1α 遺伝子,

混在する胞子堆を形成する．この特徴は Melampsora 属

β - チューブリン遺伝子を用いて Puccinia, Uromyces 属菌

菌の夏胞子堆に見られる特徴であり,Melampsora daph-の系統解析を行った結果,Puccinia, Uromyces 属は大きnicola (Dietel) Jørst. とされていたこともあるが,これく二つのサブクレードに分かれることを報告した．すなまで冬胞子世代が発見されていなかったため,Uredo 属

わち,イネ科に寄生する異種寄生種とスゲ類などカヤツ菌として扱われてきた．本研究の解析結果では,本菌がリグサ科に寄生する異種寄生種は,それぞれ異なるク

Melampsora 属に属することが確認できた．

レードに含まれた．その傾向は,本研究の SSU+LSU,

Uredo fagarae はテリハザンショウ( Zanthoxylum niti-

ITS2-D1/D2 領域を用いた系統解析の結果でも確認する

dum Bunge )に寄生し,胞子堆に護膜がなく,表面にことができ,特に,カヤツリグサ科に寄生する異種寄生疣状突起を有し鎖生する胞子を形成する Caeoma 型の胞種を含むクレードは,他の集団と明確に分かれることが子堆を形成するが,夏胞子世代であることから Uredo 属

分かった( Fig. 2a )．

－ 27 －

Fig. 2a Maximum likelihood tree based on ITS2 and D1/D2 regions of rDNA of Pucciniaceae s.l.
Maximum likelihood bootstrap (ML BS) more than 50 % were shown as the support values for nodes. Upper (a) and lower (b) part of the tree.
Life cycle: Ae, Autoecious; He, Heteroecious; Mi, Microcyclic; En, Endocyclic; 0, I, Spermogonial and aecial states only; II, III, Uredinial and telial states only; II, Uredinial state only.
Host Families: Ado, Adoxaceae; All, Alliaceae; Anc, Anacardiaceae; Api, Apiaceae; Ast, Asteraceae; Bal, Balsaminaceae; Ber, Berberidaceae; Col, Colchicaceae; Com, Commelinaceae; Cyp, Cyperaceae; Ela, Elaeagnaceae; Eup, Euphorbiaceae; Ger, Geraniaceae; Hyd, Hydrangeaceae; Jun, Juncaceae; Lam, Lamiaceae; Lar, Lardizabalaceae; Lil, Liliaceae; Mal,
Malvaceae; Myr, Myrsinaceae; Pla, Plantaginaceae; Poa, Poaceae; Poa (Bam), Bambusoideae; Pol, Polygonaceae; Ran, Ranunculaceae; Rub, Rubiaceae; Rus, Ruscaceae; Urt,
Urticaceae; Vio, Violaceae.

山岡裕－ 28 －

一

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属

供試した標本のうち,タニタデ( Circaea erubescens

cis-stipatae Y. Harada( Harada, 1986 ),ハマアオスゲ( C.

Franch. & Sav. )に寄生する A. circaeae Ces.,ムカゴイ

breviculmis R. Br. subsp. fibrillosa (Franch. & Savat.) T.

ラクサ( Laportea bulbifera (Siebold & Zucc.) Wedd. )に

Koyama ) と す る P. dioicae Magnus var. micropuncta Y.

寄生する A. laporteae Henn.,クロトウヒレン( Saussurea

Ono （Ono, 1983）,コウボウムギ( C. kobomugi Ohwi ),sessiliflora (Koidz.) Kadota )に寄生する Aecidium sp. 9,

コウボウシバ( C. pumila Thunb. )とする P. caricis-mac-

ス ミ レ 類( Viola sp. ) に 寄 生 す る Aecidium sp. 6( P.

rocephalae Dietel( Hiratsuka, 1936 ) が 知 ら れ て い る．

pulchella Y. Ono & Kakish. の精子・さび胞子世代と推測

著者と共同研究者は,茨城県内のサビキン菌類相調査をされる),ヤハズヒゴタイ( Saussurea triptera Maxim. )

実施する中で,ヤガミスゲ( C. maackii Maxim. ),アサに寄生する Aecidium sp. 8( P. ohsawaensis Kakish. の精

マスゲ( C. lithophila Turcz. )およびクロカワズスゲ( C.

子・さび胞子世代と推測される),はカヤツリグサ科のarenicola F.Schmidt )上にヨモギを精子・さび胞子世代

クレードに含まれた(Fig. 2a )．イカリソウ(Epimedium宿主とする Puccinia 属菌が存在することを明らかにしgrandiflorum C. Morren )に寄生する A. epimedii,ゴマキ

た(未発表)．ITS2 と D1/D2 を用いた系統解析結果に( Viburnum sieboldii Miq. )に寄生する A. viburni Henn.

より,これらのヨモギ属とスゲ属を異種寄生する菌群は& Shirai, サ ク ラ タ デ( Persicaria macrantha (Meisn.)

互いに近縁であることが示された( Fig. 2a )．ヨモギ上Haraldson subsp. conspicua (Nakai) Yonek. )に寄生するの Aecidium sp. 4 もこのクレード内に含まれたが,分類

Aecidium sp. 2,ボタンヅル( Clematis apiifolia DC. )に学的位置づけは今後検討が必要と考えられた．また,こ寄生する Aecidium sp. 5,ミツバアケビ( Akebia trifolia-

れらの集団とキクやヨモギに同種寄生する長世代種 Puc-ta (Thunb.) Koidz. )に寄生する Aecidium sp. 7(Puccinia

cinia tanaceti DC. var. tanaceti,短世代種の P. artemisi-

cymbiformis F. He & Kakish. ま た は P. nigroconoidea I.

ae-keiskeanae Miura と P. ferruginosa P. Syd. & Syd.

Hino & Katum. の精子・さび胞子世代と推測される)は,( TSH-R3092 )( Puccinia cnici-oleracei Pers. の シ ノ ニ ム

イネ科植物に異種寄生する種とともにその他のクレードとする意見もある)も近縁であることが示された( Fig.

入った( Fig. 2b )．これらのサビキンの夏胞子・冬胞子2a )．一方,キクに寄生する短世代種の P. horiana Henn.

世代を特定することはできなかったが,今後,異種寄生とヨモギに寄生する P. cnici-oleracei( TSH-R25604 )はの相手を,イネ科かカヤツリグサ科に絞り込んで探索す

カヤツリグサ科を夏胞子・冬胞子世代とする集団から大ることができる．

きく外れ,イネ科を夏胞子・冬胞子世代とする集団内にイネ科またはカヤツリグサ科植物に寄生するテレオモ

含まれた( Fig. 2b )．これらの情報は,今後生活環の進

ルフ・サビキン種のほとんどは Puccinia または Uromy-

化を考察する上で重要な情報となると考える．また,P.

ces に属することが知られている．カワラスゲ( Carex

ferruginosa と同定されていたヨモギ上に寄生する短世代

incisa Boott )に寄生する Uredo caricis-incisae (Syd. & P.

種は多系統であることが,Engkhaninun et al. （2005) にSyd.) S. Ito は,これまで冬胞子世代が発見されておらず,

よっても報告されており,分類学的な再検討が必要である．

不完全サビキンとして扱われてきた．本研究の分子系統

ボタンヅル( Clematis apiifolia DC. )に寄生する Aeci-

解析の結果,Pucciniaceae s.l. のカヤツリグサ科を宿主

dium sp. 5 は,Puccinia agropyri-ciliaris F.L. Tai & C.T.

とする集団内に含まれた( Fig. 2a )．ウマスゲ( Carex

Wei と近縁であることが示された( Fig. 2b )．本種は,idzuroei Franch. & Sav. )およびアオコウガイゼキショ

カ モ ジ グ サ( TSH-R7999 ) や ミ ゾ イ チ ゴ ツ ナ ギウ( Juncus papillosus Franch. & Sav. )に寄生するサビキ( TSH-R11230 )上に夏胞子・冬胞子世代を形成し,冬ンの報告はこれまでにない．夏胞子世代しか発見されて胞子は越冬せずに発芽するが,精子・さび胞子世代宿主

いないが,これらも Pucciniaceae s.l. のカヤツリグサ科は不明である．このクレードの周辺にはボタンヅルと同を宿主とする集団内に含まれた( Fig. 2a )．これらの種

じキンポウゲ科植物を精子・さび胞子世代宿主とする P.

は冬胞子世代を有する可能性は十分あり,今後探索する

recondita Roberge ex Desm. や P. triticina Erikss. が位置必要がある．

しており,キンポウゲ科とイネ科植物を異種寄生する集Pucciniaceae s.l. の中では,系統解析の結果近縁と考団が近縁である可能性が示唆された．Aecidium sp. 5 や P.

えられる種は,系統的に近縁の宿主植物を利用している

agropyri-ciliaris 異種寄生の相手を探索する上で参考とな傾向が見られた．例えば,ヨモギ属( Artemisia )植物る情報と考える．また,この集団とは別にヨシを夏胞子・に寄生する種は,近縁であることが示唆された( Fig.

冬胞子世代,キンポウゲ科植物を精子・さび胞子世代と2a )．ヨモギ属植物を精子・さび胞子世代宿主とする種

する 2 種の Puccinia magnusiana Körn. と Puccinia okata-として,日本では夏胞子・冬胞子世代宿主をオオカワズ

maensis S. Ito が 姉 妹 群 を 形 成 す る こ と も 確 認 で き たス ゲ( Carex stipata Muhlenb. ) と す る Puccinia cari-( Fig. 2b )．

－ 29 －

岡裕

一Fig. 2b山－ 30 －

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属

今回初めて発見されたサクラタデに寄生する Aecidium sp. 2 は,タデ科植物を精子・さび胞子世代宿主,夏より報告されていたが,その他の世代については不明であった．

胞子・冬胞子世代をヨシに寄生する異種寄生種の Puc-

そこで,つくば市で採取したメダケ上の S. corticioides

cinia phragmitis (Schumach.) Tul. と同一のクレードに冬胞子を接種源とし,発芽させて得た担子胞子をチャン含まれた( Fig. 2b )．また,そのクレード内にはダンチ

チンモドキ苗に接種した結果,接種 6 ~ 7 日後には精子ク( Arundo donax L. )を夏胞子・冬胞子世代宿主とす器が形成され,その後約 1 ヶ月後にはさび胞子堆が形成

る Puccinia arundinis-donacis T. Hirats. が含まれた．今後,された．以上の結果から,チャンチンモドキ上の Aecid-

Aecidium sp. 2 および P. arundinis-donacis の異種寄生のium sp. 1 は,S. corticioides の精子・さび胞子世代であ相手を探索する上で参考となる情報と考える．一方,タることが確認され,本菌が,タケ類とチャンチンモドキ

デ 科 植 物 を 夏 胞 子・ 冬 胞 子 世 代 宿 主 と す る Pucciniaに異種寄生することが明らかになった．

polygoni-amphibii Pers. と Puccinia acetosae (Schumach.)

Stereostratum 属は,本種のみからなる属で,Magnus

Körn. は姉妹群を形成することが示された( Fig. 2a )．

（1899） により,大型で革質状の冬胞子堆を形成し,冬これらの情報は,異種寄生種であることが予想される

胞子の 1 細胞につき 3 個の発芽孔が存在するなどの特徴

不完全サビキンやテレオモルフ・サビキンの生活環解明

から新属として設立された．SSU と LSU, ITS2-D1/D2のために,接種試験の対象とする宿主植物やサビキン種による解析の結果 Pucciniaceae s.l. のタケ亜科( Bambu-の候補を絞り込むことに活用できるとともに,サビキン

soideae )を夏胞子・冬胞子世代宿主とする Puccinia 属の種分化,生活環の進化を考察する上で有益な情報とな菌と同じクレードに含まれた( Figs. 1a, 2b )．本菌の冬る．小野（2008） は,生活環・宿主特異性研究の成果に胞子は,2 細胞で柄を有する点で Puccinia 属の冬胞子の基づきサビキンの種分化の過程について仮説を提唱して形態的特徴とも一致する．また,チャンチンモドキ上でいる．今回得られた情報を精査し,不足している情報を形成された精子器の形態もタイプ 4 であったことも,本追加して解析を進めることにより,この仮説を検証して菌が,Puccinia-Uromyces 属と同系統であることを支持いくことができると考える．

する．従って本属は,Puccinia 属のシノニムとする必要

今回の解析で夏胞子・冬胞子世代宿主の候補が見つがあると考える．

かったのは 4 種( Aecidium sp.1,Aecidium sp. 3,Aecidium sp. 4,A. saussureae-affinis )であり,そのうち,接【ヨツバムグラに寄生する Aecidium sp. 3 】
今回の調査中に,ヨツバムグラに全身感染する Aecid-

種試験により異種寄生性が確認できた 2 種について以下

ium sp. 3 を発見した．感染はシュート単位で確認することに解説する．

ができ,そのシュートでは輪生する葉のほぼすべてでさび胞子堆が形成される．SSU と LSU, ITS2-D1/D2 の塩【チャンチンモドキに寄生する Aecidium sp. 1 】
チャンチンモドキは,ウルシ科の落葉広葉樹で,中国

基配列比較の結果,本菌はマスクサに寄生する Puccinia

西・南部,東南アジア北部,ヒマラヤに分布するが,日

caricis-gibbae Dietel( TSH-R )と一致することが明らか

本では,鹿児島と熊本の限られた地域に自生するのみでになった( Figs. 1a, 2b )．ヨツバムグラと同属のヤエム(山崎, 1989 ),絶滅危惧 IB 類(EN )に分類されている(環グラ( G. spurium L. var. echinospermon (Wallr.) Hayek )境省絶滅危惧種検索 https://ikilog.biodic.go.jp/rdbdata/には,ヤガミスゲ( Carex maackii Maxim. )上に夏胞子・

files/envpdf/ 植物Ⅰ _248.pdf )．2014 年に鹿児島県にて,

冬胞子世代を形成する P. galiiuniversa Okane & Yamaoka

チャンチンモドキの苗を育苗中に,さび病が発生した．小が全身感染し,Aecidium 型の精子・さび胞子世代を形

葉上あるいは部分的に肥大した若い茎や葉柄上に Aecidium

成することが知られている( Okane et al., 2013 )．この型のさび胞子堆が形成された．チャンチンモドキのさび

2 種の Puccinia 属菌の冬胞子は,どちらも越冬すること

病は,2001 年に福岡県で報告があるが(小河, 2001),分類なく発芽することができ,分子系統解析の結果でも,姉学的検討はされていなかった．今回の DNA( SSU と LSU,

妹関係であることが示された．

ITS2-D1/D2 )解析の結果,Aecidium sp. 1( TSH-R27003,

そこで,P. caricis-gibbae がマスクサとヨツバムグラ間

TSH-R25644 )は,メダケ上の Stereostratum corticioides

を異種寄生するか確認するため,マスクサ上で形成され(Berk. & Broome) H. Magn.( TSH-R9960 )と一致する

た P. caricis-gibbae の冬胞子を用いヨツバムグラ,ヒメヨ

ことが分かった( Fig. 2b )．本菌は,タケ・ササ類上でツバムグラ( Galium gracilens (A.Gray) Makino ),ヤエ

夏胞子・冬胞子世代を経過し,赤衣病を引きおこすこと

ムグラに対する接種試験を行った．接種方法は,Okane

が知られている(日本植物病理学会, 2000 )．この種のet al. （2013) に従った．その結果,接種 1 週間でヨツバ

タケ・ササ類上での生活環については,何ら（1990）に

ムグラの葉が萎縮したりやや厚くなる等の奇形がシュー－ 31 －

山

岡

裕

一

ト単位で生じた．接種１~ 2 ヶ月後には,奇形になった

Dietel & P. Sydow,Phakopsora meliosmae S. Kusano )とシュートから新たに展開した葉の裏面にさび胞子堆が形近縁であるとの結果になったが,明確な系統学的位置づ成された．このさび胞子をマスクサに接種したところ,

け は 不 明 で あ っ た．Uredo iyoensis は Uredo alpestris J.

接種約 1 ヶ月後に夏胞子堆が形成され,本菌の異種寄生

Schröt. とともに 2 形性夏胞子を有することが知られて性を証明することができた．接種されたヤエムグラでもいるが,形態の異なる夏胞子は,それぞれ異なる種のも葉やシュートの奇形は生じたが,接種 3 ヶ月後でもさびのではないかとの見解もあり( Ono, 1980 ),分類学的

胞子堆の形成には至っていない．

再検討が求められている．

所属が未確定な不完全サビキン類

内生種の系統と分類

Aecidium mori Barclay ,Aecidium raphiolepidis Syd. ,5 種類の胞子世代のうちさび胞子世代と夏胞子世代をAecidium paeoniae Kom.,Uredo pipturi (Syd.) Hirats. f. 他

失った短世代種のうち,冬胞子世代の形態が,その種とUredo 属 3 種は Pucciniaceae s.l. クレードには属さない

関連性があると考えられている長世代種のさび胞子世代ことは明らかであるが( Fig. 1b ),その所属を特定すると同様の種を内生種と呼ぶ．長世代種との関連性は,胞ことはできなかった．

子世代の形態的特徴や宿主植物,病徴などから推定されAecidium mori と A. rhaphiolepidis は,護膜を有し,表ていたが,冬胞子の形態が,起源と考えられる長世代種

面に疣状突起を有する胞子が鎖生することから Aecidi-とは明らかに異なることから,内生種として別属として

um 型の胞子堆を形成するが,胞子は繰り返し宿主植物扱うか,起源と考えられる長世代種と同属とするか,不に 感 染 し, 無 性 的 に 増 殖 す る こ と が で き る( Hiura,

完全サビキンとして扱うか意見が分かれていた( e.g.

1931; Sato, 1975; Sato & Sato, 1981 )．すなわち,機能的Hiratsuka, 1969, 1975; Laundon, 1967; Buriticá & Hennnen,には夏胞子世代となる．Aecidium mori はクワ,ヤマグワ,

1980 )．Scholler & Aime（2006） は,Acacia 属 に 寄 生 す

シマグワなどの Morus 属植物に,A. rhaphiolepidis はシャる Endoraecium acacia Hedges & D. E. Gardner(内生種,

リンバイ,ホソバシャリンバイなどの Rhophiolepis 属植タイプ種),E. hawaiiense Hedges & D. E. Gardner(内物に寄生する．系統解析の結果,両種は近縁であり,生種)と Racospermyces koae (Arthur) J. Walker(長世代Gymnosporangium 属と比較的近縁であることが分かっ種)Racospermyces digitatus (G. Winter) J. Walker(長世たが,明確な系統学的位置づけは不明であった．

代種,タイプ種)の分子系統解析を行い,これらが同属

Uredo pipturi はイラクサ科のヌノマオ( Pipturus arbo-に属することを明らかにした．そして,生活環の違いでrescens C. B. Clarke )に寄生し,表面に刺状突起を有す属を分ける必要は無いという立場から,両属菌を Endo-る胞子が柄生するが胞子堆周辺に護膜を有する Milesia

raecium 属に統一した．この関係性は,参照データを利型の胞子堆を形成する．この形態的特徴から Puccinias-

用した今回の解析結果でも確認することができた( Fig.

trum 属菌の夏胞子世代であると予測され,はじめ Puc-1b )．また,マツ類のこぶ病を引きおこす内生種の En-

ciniastrum pipturi Syd. として記載・命名された( Sydow

docronartium 属菌は,さび胞子世代が同様の特徴を有す& Petrak, 1931 )．しかし,本研究の分子系統解析の結果

る Cronartium 属菌と関連性を有すると考えられていたから Phakopsora 属またはその近縁な属であることが示( Hiratsuka et al., 1966 )．今回の rDNA の SSU と LSU をされた．Phakopsora 属菌は,胞子堆の周辺が内側に湾用いた分子系統解析で,参照データとして使用した内生

曲した厚壁の糸状体で囲まれた Calidion 型,胞子他の周種 の Endocronartium harknessii (J.P. Moore) Y. Hirats.

辺を取り囲む糸状体の基部が融合した Malupa 型,またCFB22250:( AY665785 + AY700193 ) は, 他 の Cronari-

は Milesia 型 の 胞 子 堆 を 有 す る こ と が 知 ら れ て い る

tum 属(長世代種)と同一のクレードに入ることが確認( Cummins & Hiratsuka, 2003 )．

できた( Fig. 1c )．この結果から Endocronartium 属は

Phakopsora 属菌は,SSU と LSU を用いた系統解析のCronaritum 属に統合することが妥当と考える．

結 果, 大 き く 2 つ に 分 か れ る こ と が 報 告 さ れ て お りMonosporidium machili (Henni.) T. Sato は,タブノキ( Aime, (https://www.plantmanagementnetwork.org/in-( Machilus thunbergii Siebold & Zucc. )に寄生し,形態

focenter/topic/soybeanrust/2009/presentations/Aime.

的には Aecidium 型の胞子堆を形成するが,胞子は発芽pdf),本研究でも確認することができた．Uredo iyoensis

すると担子器様の発芽管を形成する内生種である．はじ

Hirats. f. & Yoshin. はスミレ属植物に寄生し,表面に微め Hennings （1902) に よ り,Aecidium machili Henn. と細な突起を有する夏胞子を柄生する．SSU と LSU を用して記載されたが,Stevens （1932) は,胞子発芽様式のいた系統解析の結果,本菌は,上記の Phakopsora 属菌

観察結果より,本菌の胞子はさび胞子ではなく冬胞子でとは別の Phakopsora 属菌集団( Phakopsora ampelopsidis

あ る と 結 論 し,Endophyllum に 移 さ れ た( E. machili－ 32 －

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属(Henn.) F. Stevens )．その後日本産の系統に関しても,数の Aecidium 型の胞子堆が形成されていた．Hydrangea

Hiratsuka & Kaneko （1977) が,発芽に伴う核の行動を属 植 物 で は, コ ア ジ サ イ( Hydrangea hirta Sieb. &明らかにし,本菌のさび胞子様の胞子が冬胞子であるこ

Zucc. ),ナガバアジサイ( H. longifolia Hayata ),アマチャとを確認した．Endophyllum 属は Aecidium 型の胞子堆( H. macrophylla DC. var. thunbergii Mak. )に精子・さびを形成する内生種であり,その形態的特徴から Puccinia

胞子世代,スズタケ( Sasamorpha borealis (Hack.) Na-属 や Uromyces 属 と 関 係 性 が あ る と 推 測 さ れ て い た

kai var. borealis )上で夏胞子・冬胞子世代を経過する( Laundon, 1967; Buriticá & Hennnen, 1980 )． し か し,

Puccinia suzutake Kakishi. & S. Sato,およびノリウツギ

佐藤 （1992) は,本種の精子器の形態がタイプ 5 である( H. paniculata Sieb. )に精子・さび胞子世代,ミヤマド

ことから,精子器のタイプ 4 を有する Puccinia や Uro-

ジョウツナギ( Glyceria alnasteretum Kom. ),ドジョウ

myces 属とは異なる長世代種と系統関係を有すると考ツナギ( G. ischyroneura Steud. ),ヒロハノドジョウツ

え,本種を Monosporidium 属に移した．精子器の形態的ナギ( G. leptolepis Ohwi )上で夏胞子・冬胞子世代を経特徴から Phakopsora 属に近縁と予想されていたが,本過する Puccinia glyceriae S. Ito が知られる．また,原田・研究の SSU と LSU を用いた系統解析の結果では,本菌藤田（1998）は,青森県のエゾアジサイ (Hydrangea mac-

は Gymnosporangium 属と最も近縁であることが示されrophylla var. megacarpa) の新梢で Aecidium sp. が発生し

( Fig. 1b ),多くの Endophyllum 属菌を派生したと推定

たことを報告している．後に李（2004）は,本菌の発芽される Puccinia や Uromyces 属とは系統的に異なること

管が担子器様構造になることを確認し本菌を内生型サビが明らかになった．

キン( Endophyllum sp. )であると結論した．今回岩手

前述の通り,Endophyllum 属は Aecidium 型の胞子堆

県で発生したサビキンは,発芽試験において担子器様のを形成する内生種であり,その形態的特徴から Puccinia

発芽管を形成することが確認され,この Endophyllum

属 や Uromyces 属 と 関 係 性 が あ る と 推 測 さ れ て い た

sp. と同一種であると同定した．本研究の DNA( SSU と( Laundon, 1967; Buriticá & Hennnen, 1980 )． し か し,

LSU, ITS2-D1/D2 )解析の結果,本菌は,タケ,ササ類

精子器が確認されていない種もあり,また Monosporidi-に寄生する Puccinia 属菌のクレードに含まれ( Figs. 1a,um は Endophyllum のシノニムとする考え方もあるため

2b ),本菌は,P. suzutake またはその近縁種(精子・さ( Cummins & Hiratsuka, 2003 ),Endophyllum 属 内 に はび胞子世代宿主をアジサイ科植物とする)との系統的関

複数の異なる系統が混在している可能性がある．本研究連性があることが示唆された．

で は,2 種 の Endophyllum 属 菌 を 供 試 し た．rDNA の

今回供試した Endophyllum 属菌 2 種は,ともにイネ科

SSU と LSU を用いた分子系統解析結果では,ヘクソカ

植物を夏胞子・冬胞子世代宿主とする Puccinia 属の長

ズラ( Paederia scandens (Lour.) Merr. )に寄生する内世代種と近縁であることが分かった．また,これら 2 種

生種の E. paederiae (Dietel) Stevens & Mendiola とアジは進化の過程でそれぞれ異なる長世代種から分化したとサイに寄生する Endophyllum sp. はともに,Pucciniaceae

推測された．南アフリカのキク科植物に寄生する Endo-s.l. クレード内に含まれた( Fig. 1a )．そのため,ITS2

phyllum 属菌 3 種のように,系統的に近縁な内生種が存領域,LSU の D1/D2 領域を用いて,Pucciniaceae s.l. ク

在 す る 例 も あ る が( Wood & Crous, 2005 ),Endophyl-

レードに含まれるさらに多くの種を用いた分子系統解析

lum 属を独立した系統群と扱うことは困難であると考えを行った．

る．今後より多くの種について解析が必要ではあるが,ヘクソカズラ( Paederia scandens (Lour.) Merr. )上には内生種の E. paederiae (Dietel) F. Stevens & Mendio-

系統関係を重要視するならばこれら 2 種は Puccinia 属等の適切な属に転属させる必要があると考える．

la が寄生すると同時に,シバ類( Zoysia 属)で夏胞子・本研究で分子系統解析に使用した DNA 抽出物および冬胞子世代を形成する異種寄生種の Puccinia zoysiae Di-

DNA シークエンス情報は,原著論文の投稿作業に伴い,etel が精子・さび胞子世代を形成することが知られていそれぞれ国立科学博物館分子生物多様性研究資料センる( Hiratsuka et al., 1966 )．ヘクソカズラ上の両種の胞ターや GenBank を通じて,標本データは地球規模生物

子世代の形態は極めて類似しており系統的な関連性があ

多様性情報機構( GBIF )を通じて公開する予定である．

ると予測されていたが,今回の系統解析の結果でも両者

要が近縁であることが示された( Fig. 2b )．

約

今回解析に供試したアジサイ上の Endophyllum sp. は,2016 年 6 月に,岩手県一関市のアジサイ園において,
ヒメアジサイ系統の新梢に発生が確認された(升屋本研究では,日本産の不完全サビキンおよび内生型サ

未

ビキンの系統分類学的所属を決定するとともに,今後の発表データ)．葉上だけではなく茎やシュート全体に多異種寄生種の生活環解明,生活環の進化に関する研究の－ 33 －

山

岡

情報ソースを構築することを目的とし,不完全サビキン,
内生型サビキンおよび関連するテレオモルフ・サビキン
種の 18S rDNA( SSU ),28S rDNA( LSU )および ITS
領域を用いた分子系統解析を行った．SSU と LSU を使用した分子系統解析の結果,Aecidium 属 12 種,Uredo
属 4 種および Endophyllum 属 2 種は,Pucciniaceae s.l. ク
レードに含まれた．これらの菌群については,Puccinia
属またはより適した属に転属する必要がある．一方,
Aecidium 属 3 種,Caeoma tsukubaense,Uredo 属 8 種,
Monosporidium machili は Pucciniaceae s.l. 以外のクレードに属した．このうち,C. tsukubaense,U. daphnicola,U.

裕一  3) 安 藤裕萌,岡根 泉,久保慎也,秋庭満輝,山岡裕一．
2017．チャンチンモドキに寄生する Aecidium 属さび菌の生活環．(ポスター発表)第 128 回日本森林学会大会( 3
月 26−29 日,鹿児島)  4) 山 岡裕一,岡根 泉,小野義隆,升屋勇人,細矢 剛,
安藤裕萌,藤森祥平,鈴木浩之,糸澤千尋．2017．内生型生活環を有するさび菌 3 種の系統分類学的所属の検討．
(ポスター発表)第 2 回環境微生物系学会合同大会 2017(8月 29−31 日,仙台)  5) 糸澤千尋,加藤 彩,山岡裕一．2017．スゲ属およびヨモギ属を宿主とするさび菌の分類学的検討．
(ポスター発表)
第 2 回環境微生物系学会合同大会 2017( 8 月 29−31 日,
仙台)

fagarae は既存の属内に含まれ,それぞれ転属の必要が謝あると考えた．しかし,その他の種は既存の属内には含辞

まれず,今後より広範囲の属を含めた系統解析を行い,所属を決定する必要がある．Pucciniaceae s.l. クレード

本研究に対し,研究助成を頂いた公益財団法人発酵研に属した菌群については,さらに ITS2 領域と LSU の究所に深く感謝いたします．また,試料の採取にご協力

D1/D2 領域を用いた解析を行った．その結果,Aecidi-

いただいた森林総合研究所の秋庭満輝氏,鹿児島県森林

um sp.1 ,Aecidium sp. 3 ,Aecidium sp. 4 ,A. saussure-

技術総合センターの久保慎也氏と新原修一氏,大阪市立

ae-affinis の 4 種についてテレオモルフ・サビキン種の候

大学理学部附属植物園,ミュージアムパーク茨城県自然補が見つかり,Aecidium sp.1 と Aecidium sp. 3 について

博物館,北海道大学北方生物圏フィールド科学センター

は,接種試験により異種寄生性を証明した．また,Puc-

植物園,標本をお貸し頂いた弘前大学農学生命科学部のciniaceae s.l. は,カヤツリグサ科に寄生する種を含むサ

田中和明氏,神奈川県立生命の星・地球博物館に対し,ブクレードとその他のクレード(イネ科に寄生する種を心からお礼申し上げます．

含む)に分かれた．その中で系統的に近縁なサビキンは

文

近縁の宿主植物を利用している傾向が示された．これらの情報は,異種寄生種であることが予想される不完全サ
ビキンやテレオモルフ・サビキンの生活環解明のために,接種試験を行う際,供試植物やサビキン種の候補を絞り込むことに活用できるとともに,サビキンの種分化,生活環の進化を考察する上で有益な情報となる．今回供試した Endophyllum 属菌 2 種は,ともにイネ科植物を夏胞子・冬胞子世代宿主とする Puccinia 属のそれぞれ異なる長世代種から分化したと推測された．従って,Endophyllum 属を独立した系統群と扱うことは困難であると考える．今後より多くの種について解析が必要ではあるが,系統関係を重要視するならばこれら 2 種は Puccinia
属等の適切な属に転属させる必要があると考える．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表  1) 栗 田招子,岡根 泉,山岡裕一,小野義隆．2016．ヤマ
ブドウに寄生するさび菌 2 種の発生生態について．(ポス
ター発表)日本菌学会 60 周年記念大会( 9 月 16−19 日,
京都)  2) 岡 根 泉,安藤裕萌,栗田招子,山岡裕一,小野義隆．
2016．北アメリカ南部と南アメリカ北部に分布するブド
ウ葉さび病菌の分子系統学的検討．(ポスター発表)日本菌学会 60 周年記念大会( 9 月 16−19 日,京都)

献

Aime, M. C. 2006. Toward resolving family-level relationships inrust fungi (Uredinales). Mycoscience 47: 112-122.
Beenken, L. 2017. Austropuccinia: a new genus name for the myrtle rust Puccinia psidii placed within the redefined family
Sphaerophragmiaceae (Pucciniales). Phytotaxon 297: 53-61.
Buritica, P. & Hennen, J. F. 1980. Pucciniosireae (Uredinales, Pucciniaceae). Flora Neotropica Monograph 24: 1-50
Crane, P. E., Yamaoka, Y., Engkhaninun, J. & Kakishima, M.
2005. Caeoma tsukubaense n. sp., a rhododendron rust fungusof Japan and southern Asia, and its relationship to Chrysomyxa
rhododendri. Mycoscience 46: 143-147.
Cummins, G. B. & Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated Genera of Rust
Fungi, third edition. APS Press, St. Paul.
Engkhaninun, J., Ono, Y. & Kakishima, M. 2005. Phylogenetic relationships of four Puccinia species parasitic on Artemisia inJapan. Mycoscience 46: 61-65.
Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: 95-98.
Harada, Y. 1986. Four new species of heteroecious Puccinia (Uredinales) on Carex from Japan. Tran. Mycol. Soc. Japan. 27:
357-370.
原田幸雄,藤田美夏 1998．エゾアジサイ新梢さび病(新称)およびエンレイソウ春さび病(新称)について．日植病報 64:611．
何 方,柿島 真,佐藤昭二 1990.筑波地域における赤衣病－ 34 －

不完全サビキンおよび内生型サビキンの系統分類学的所属
菌,Stereostratum corticioides のメダケ上での周年変化.菌蕈研報 28: 243-249.
Hennings, P. 1902. Einige neue japanische Uredineen III. Hedwigia 41: 18-21.
Hiratsuka, N. 1936. Inoculation experiments with heteroecious
species of the Japanese rust fungi. III. Bot. Mag., Tokyo 50:
213-216, 239.
Hiratsuka, N. & Kaneko, S. 1977．Life cycles of three rust species. Rept. Tottori Mycol. Inst. 15: 6-12．
Hiratsuka, N., Kaneko, S. & Kudo, A. 1966. Two species of Uredinales from Japan. Trans. Mycol. Soc. Japan 7: 33-35.
Hiratsuka, N., Sato, S., Katsuya, K., Kakishima, M., Hiratsuka, Y.,
Kaneko, S., Ono, Y., Sato, T., Harada, Y., Hiratsuka, T. & Nakayama, K. 1992. The Rust Flora of Japan. Tsukuba Shuppankai, Tsukuba.
Hiratsuka, Y. 1969. Endocronartium, a new genus for autoecious
pine stem rusts. Can. J. Bot. 47: 1493-1495.
Hiratsuka, Y. 1975. Recent controversies on the terminology ofrust fungi. Rept. Tottori Mycol. Inst. 12: 99-104.
Hiura, M. 1931. Observations and experiments on the mulberryrust caused by Aecidium mori Barclay. Jap. J. Bot. 5: 252-272.
Katoh, K. & Standly, D. M. 2013. MAFFT multiple sequencealignment software version 7: improvements in performanceand usability. Mol. Biol. Evol. 30: 772-780.
Kirk, P. M., Cannon, P. F., Minter, D. W. & Stalpers, J. A. 2008.
Ainsworth & Bisby's Dictionar y of the Fungi, tenth edition.
CAB International, Wallingford.
小河誠司 2001.チャンチンモドキのさび病．森林防疫 50: 188.
Laundon, G. F. 1967. Terminology in the rust fungi. Trans. Br.
Mycol. Soc. 50: 189-194.
李 壮 2004.さび菌の生活環および分類学に関する研究.岩手大学大学院連合農学研究科生物環境科学専攻(弘前大学)
博士論文．
Magnus, P. 1899. Ueber die bei verwandten Arten auftretenden
Modificationen der Charaktere von Uredineen-Gattungen. Ber.
Deutsch. Bot. Ges. 17: 178-184.
Maier, W., Begerow, D., Weiß, M. & Oberwinkler, F. 2003. Phylogeny of the rust fungi: an approach using nuclear large subunit ribosomal DNA sequences1. Can. J. Bot. 81: 12-23.
McTaggart, A. R., Shivas, R. G., van der Nest, M. A., Roux, J.,
Wingfield, B. D. & Wingfield, M. J. 2016. Host jumps shaped
the diversity of extant rust fungi (Pucciniales). New Phytol.
209: 1149-1158.
日本植物病理学会（編）2000.日本植物病名目録．（社）日本植物防疫協会，東京．
O’Donnell, K. 1993. Fusarium and its near relatives. In Reynolds,
D. R. & Taylor, J. W. (eds), The fungal holomorph: mitotic,
meitotic and pleomorphic speciation in fungal systematics, p.
225-233, CABI, Wallingford,.
岡田 元 2011．第 18 回国際植物学会議（IBC2011, Melbourne）
で採択されたアナモルフ菌類および多型的生活環をもつ菌類の統一命名法．日菌報 52: 82-97.
Okane, I., Yamaoka, Y., Kakishima, M., Abe, J. P. & Obata, K.
2013. Puccinia galiiuniversa, a new caricicolous rust fungus

systemically inhabiting Galium aparine in its spermogonialeaecial stage. Mycoscience 55: 89-97.
Ono, Y. 1980. Is Uredo iyoensis dimorphic ? Mycologia 72: 11951199.
Ono, Y. 1983. Aecial stage of Puccinia dioicae var. micropuncta,
var. nov. occurs on Artemisia in Japan. Trans. Mycol. Soc. Japan 24: 1-6.
小野 義隆 2008.なぜ生活環研究なのか：サビキン分類学での意義.日菌報 49: 1-28.
Sato, S. 1975. Life cycle and spore appendage of a rust fungus,
Aecidium rhaphiolepidis H. Sydow on Rhaphiolepis umbellata
Makino. Trans. Mycol. Soc. Japan 16: 86-89.
佐藤豊三 1992.Monosporidium.小林享夫，勝本 謙，我孫子和雄，阿部恭久，柿島 真（編)植物病原菌類図説,p.585-586,
全国農村教育協会，東京．
Sato, T. & Sato, S. 1981. Aecidium rhaphiolepidis and A. pourthiaeae: two imperfect rust fungi with aecidioid uredinia. Trans.
Mycol. Soc. Japan 22: 173-179.
Scholler, M. & Aime, M. C. 2006. On some rust fungi (Uredinales) collected in an Acacia koa-Metrosideros polymorpha woodland, Mauna Loa Road, Big Island, Hawaii. Mycoscience 47:
159-165.
Silvestro, D & Michalak, I. 2012. raxmlGUI: a graphical front-end
for RAxML. Org. divers. evol. 12: 335-337.
Stevens, F. L., 1932. Additional Philippine Uredineae. Univ Philippines Nat and Appl. Sci. Bull. 2: 441-447.
Sydow H. & Petrak, F. 1931. Micromycetes philippinenses. Series
secunda. Ann. Mycol. 29: 145-279.
Uzuhashi, S., Tojo. M., Kobayashi, S., Tokura, K. & Kakishima,M., 2008. First records of Pythium aquatile and P. macrosporum
isolated from soils in Japan. Mycoscience 49: 276-979.
Van Der Mer we, M. M., Ericson, L., Walker, J., Thrall, P. J. &Burdon, J. J. 2007. Evolutionary relationships among speciesof Puccinia and Uromyces (Pucciniaceae, Uredinales) inferredfrom partial protein coding gene phylogenies. Mycol. Res. 111:
163-175.
Van Der Merwe, M. M., Walker, J., Ericson, L. & Burdon, J. J.
2008. Coevolution with higher taxonomic host groups within
the Puccinia/Uromyces rust lineage obscured by host jumps.
Mycol. Res. 112: 1387-1408.
White, T. J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J. 1990. Amplification anddirect sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In Innis, M. A., Gelfand, D. H., Shinsky, J. J. & White, T.
J. (eds), PCR protocols: a guide to methods and applications, p.
315-322, Academic Press, San Diego.
Wingfield, B. D., Ericson, L., Szaro, T. & Burdon, J. J. 2004. Phylogenetic patterns in the Uredinales. Australas. Plant Pathol.
33: 327-335.
Wood, A.R. & Crous, P.W. 2005. Morphological and molecularcharacterization of Endophyllum species on perennial asteraceous plants in South Africa. Mycol. Res. 109: 387-400.
山崎 敬 1989.ウルシ科 Anacardiaceae.佐竹義輔,原 寬,
亘理俊次,冨成忠夫（編）,日本の野生植物 木本 II,p.4-6,
平凡社,東京.

－ 35 －

IFO Res.Commun. 31
37-46, 2017

レブリン酸を基幹化合物とする新規バイオ生産技術の開発～化学触媒変換とバイオコンバージョンの融合による木質バイオマスの高効率転換～
羽部

浩

産業技術総合研究所機能化学研究部門,現 環境管理研究部門〒305-8569

つくば市小野川16-1

Development of a process for microbial production using levulinic acid as a substrate
Efficient conversion of woody biomass into chemicals
with combination of chemical and biotechnological processes
Hiroshi Habe
Environmental Management Research Institute,
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST),
16-1 Onogawa, Tsukuba, Ibaraki 305-8569, Japan
Levulinic acid is a platform chemical catalytically synthesized from lignocellulose, the most abundant and nonedible biomass resource, and the expansion of levulinic acid use as a feedstock is important for production of biobased chemicals. Up to now, few reports have focused on the microbial conversion of levulinic acid into valueadded chemicals, because such short-chain organic acids are reported to inhibit microbial growth at moderateconcentrations. Here, we isolated and analyzed seventy levulinic acid-utilizing bacteria to develop a process for
microbial production using levulinic acid as a substrate. Some bacteria belonging to the phyla of Actinobacteria,
Firmicutes, or Proteobacteria possessed the ability to use high concentrations of levulinic acid (greater than 70 g/L)
with the addition of organic nutrient into media, and Brevibacterium epidermidis LA39-2 utilized 100 g/L of levulinicacid. As for metabolites from levulinic acid, several organic acids and trehalose were detected. Pseudomonas sp.
LA18T accumulated acetic acid, propionic acid and α-ketoglutaric acid during the growth, and Burkholderia stabilis
LA20W did trehalose. We also carried out comparative transcriptome analyses of levulinic acid-utilizing bacteria,
Rhodococcus equi PS1b and Pseudomonas sp. LA18T, under growth on levulinic acid or pyruvic acid. It was revealed
by RNA-seq that several genes were commonly up-regulated in the two species despite their phylogenetic
difference. The enzymes including acyl-CoA ligase, phosphoglycerate mutase, acyl-CoA dehydrogenase were
thought to participate in microbial levulinic acid metabolism.
Key words: biorefinery, woody biomass, microbial production, levulinic acid緒

言

業は非常に重要な役割を果たしてきた．一方近年では,化学品製造分野においても,発酵技術を組み入れた化学

我が国独自の微生物工業として勃興したアミノ酸発酵品製造プロセスの開発が行われている．現在,国内全石

以降,食品,医薬品,化粧品分野において微生物発酵工

油消費量の約 23 %,CO2 総排出量の約 5 %を化学品製造分野で占めていることから,原料を循環型資源である

E-mail: hiroshi.habe@aist.go.jp
共同研究者：桐村光太郎(早稲田大学理工学術院先進理工学部),
小池 英明(産業技術総合研究所生物プロセス研
究部門),
菅野
学(産業技術総合研究所生物プロセス研
究部門),
佐藤 由也(産業技術総合研究所環境管理研究部門)

バイオマス等へと転換し,石油消費量および CO2 排出量を削減していくことは重要な課題である．例えば,味の素株式会社と東レ株式会社との間では,植物原料から発酵技術により製造したリジンを原料とするバイオベー
スナイロンの事業化に向け,2012 年から共同研究が開始されている．

－ 37 －

羽部

浩

特にバイオマスからの化学品製造においては,賦存量可能とした( Nemoto et al., 2015 )．このように木質系バが多く,かつ食糧と競合しない木質系バイオマスの主成

イオマスから基幹化学品であるレブリン酸を一段階で効分であるリグノセルロースを効率的に利用することが重率よく合成することは化学触媒反応でのみ成しうる技術要である．従来の利用法としては,リグノセルロースをである．この産総研方式以外にも,他の酸系触媒を使っセルラーゼにより酵素糖化した後,発酵によりエタノーた方法( Pileidis & Titirici, 2016 )や,マイクロ波とイル,アミノ酸,あるいは有機酸を製造し,さらに化学触

オン液体を使ってセルロースからレブリン酸を製造する媒等により各種基礎化学品あるいは機能性化学品へと変技術も報告され( Ren et al., 2013 ),基幹化学品として換する．しかしながらセルラーゼによる酵素糖化には,のレブリン酸は注目されている．その結果,化学触媒反未だ技術的な課題も多く,①セルロースが結晶構造をと応でレブリン酸から芳香族化合物や C4 化合物といったるため適切な前処理技術の開発が必要,②セルラーゼが基礎化学品,さらには機能性化学品を製造する研究も報大量に必要であるが酵素自身のコストが高い,③リグニ

告されている( Pileidis & Titirici, 2016 )．実際バイオマ

ン等の夾雑物によりセルラーゼ活性が阻害される,④糖

ス由来のレブリン酸は,GFBiochemicals 社により商用

化液中の夾雑物により発酵が阻害される,⑤バイオマス

スケールで生産され,2017 年までにイタリアで年産

原料から化学製品までの各工程間での最適化が必要,と10,000 トン規模までスケールアップされている．
リグノセルロース由来基幹物質としての糖とレブリン

いった課題も多い( Olson et al., 2011; Hasunuma et al.,酸を比較すると,糖は蒸留で精製できないがレブリン酸

2013 )．
近年,産業技術総合研究所・触媒化学融合研究センター

は可能であるため,バイオマス由来の夾雑物を除去するにおいて,木質バイオマスをレブリン酸( Fig. 1 )へとことも容易である．発酵で C6 糖(グルコース)をエタノー

1 段階で変換可能な Lewis 酸と Brønsted 酸のハイブリッ

ルまで変換した場合,C6 糖 1 モルから 2 モルの CO2 がド酸触媒が開発された( Tominaga et al., 2011 )．この発生することになるため,炭素の利用効率が悪い上,CO2

In(OTf)3 と p-toluenesulfonic acid から成るハイブリッド

排出にも繋がる．一方,C6 糖を C5 のレブリン酸に変換

酸触媒により,メタノールの存在下で,対セルロース収した場合は炭素利用効率が良く,かつ残りの C1 もギ酸率 75 %以上でメチルレブリン酸を合成することに成功であるため,こちらも化学品原料として利用可能である．

している．また実際のバイオマスを用い,杉木粉から 3

今後レブリン酸の価格が下がり,大量に提供できる可成分(セルロース／ヘミセルロース／リグニン)を分離能性が示されれば,糖以外のリグノセルロース由来基幹

せずに直接レブリン酸を合成可能であることも示された物質として,レブリン酸も注目されるであろう．もしレ( Nemoto et al., 2014 )．さらに AlCl3·6H2O と H3PO4 からブリン酸を基質としたバイオ変換により,従来の糖プ成る水系でも利用可能なハイブリッド酸触媒を開発し,ラットフォームやレブリン酸の化学触媒反応では製造が杉木粉から対セルロース収率 86 %でレブリン酸を合成

難しい化学品が製造可能となれば,リグノセルロース利Fig. 1

Summarized concept of lignocellulosic biomass utilization. (A) Sugar platform biorefinery; (B) Levulinic acid platform biorefinery
by a combination of chemical and biotechnological conversion; (C) Levulinic acid platform biorefinery by catalytic conversion.

－ 38 －

レブリン酸を基幹化合物とする新規バイオ生産技術の開発

用法の多様性が拡充され,バイオマスをより効率的に利2 g/L, (NH4)2 SO4 5 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L,B 培地の用することが可能となる( Fig. 1 )．このようにバイオ

組成は,NaNO3 1.5 g/L, NH4Cl 1 g/L, Basal salt solution

マス由来化学品の製造においては,化学技術とバイオテ

5 mL/L, Phosphate solution 5 mL/L, Vitamin solution

クノロジーの融合が今後ますます重要となる．

1 mL/L ,C 培 地 の 組 成 は,K 2 HPO 4 0.5 g/L, KH 2PO 4レブリン酸のバイオ変換に関する研究報告は少ないも2.5 g/L, (NH 4)2 SO 4 1 g/L, NaNO 3 1 g/L, MgSO 4·7H 2Oのの,その歴史は古い．レブリン酸の酵素変換について

1 g/L ,Metal solution 2 mL/L, Vitamin solution 1 mL/L

は,1925 年にカルボキシラーゼによるレブリン酸の酵である．Vitamin solution の組成は,Calcium pantothen-

素 分 解 に 関 す る 報 告 が あ る( 黒 野 ら,1925 )． 一 方,

ate 0.5 g/L, Inositol 2 g/L, Niacin 0.5 g/L, Pyridoxine hy-

1969 年から 1970 年にかけて当時のキッコーマン醤油関

drochloride 0.5 g/L, p-Aminobenzoic acid 0.5 g/L, Cyano-

西工場の研究者らによって,レブリン酸の微生物分解に

cobalamin 0.02 g/L, Thiamine 1 g/L, Biotin 0.2 g/L ,関する研究が行われている(原田ら,1969 )．各種調味Metal solution の 組 成 は,FeCl 3 ·4H 2 O 1.5 g/L, CoCl 3料の製造において,炭水化物を含む原料を酸によって加水分解して得られる酸分解液を使用する際に,炭水化物の過分解によって分解液中に多量のレブリン酸とギ酸等が生成し,酵母の発酵を阻害するとともに香味に悪影響·6H 2 O 0.19 g/L, MnCl 2·4H 2O 0.1 g/L, ZnCl 2 0.07 g/L,
H3BO3 0.062 g/L, Na2MoO4·2H2O 0.036 g/L, NiCl2·6H2O
0.024 g/L, CuCl2·2H2O 0.017 g/L である．Basal salt solution および Phosphate solution の組成は,既報( Hanada

を与えるという問題があった．そこで調味料の品質改良

et al., 1997 )に従い調製した．スクリーニングは,産総を目的とし,酸分解液からレブリン酸を除去するため,

研つくばセンター内の土壌を中心とした 200 箇所以上のレブリン酸の微生物分解を検討している．このようにレ

環境サンプルを分離源とした．上記 A, B, C 培地のいず

ブリン酸をはじめ,フルフラール類やギ酸など糖の過分

れか 5 mL が入った試験管を用いて好気的に 30 ℃で一週

解物は,一般に微生物の発酵阻害を引き起こすことが知間程度培養を行った後,これを試験管で複数回継代するられていることから,微生物を用いた物質生産においてことで集積し,寒天培地にて単離を行った．単離した菌

レブリン酸を原料に用いる研究例は非常に少ない．これ

株は,再度スクリーニング用の培地を用いて,レブリンまでは濃度が高くても 20 g/L 程度のレブリン酸を資化

酸資化能を確認した．

する微生物しか知られていなかったことに加え,レブリ

有機栄養源の存在下でレブリン酸を利用可能な微生物

ン酸を資化した際にどのような代謝中間体が培地中に蓄をスクリーニングする際は,主に 2 種類の培地( D, E

積するかなどについては,ほとんど知見がなかった(相培 地 と 呼 ぶ ) に, レ ブ リ ン 酸 が 終 濃 度 20 g/L か ら

田ら,1970; 奥山ら,1995 )．近年では,生分解性ポリマー

100 g/L となるよう加えた培地( NaOH にて pH を 7.0 にであるポリヒドロキシアルカン酸( PHA )生産の基質と調整)を用いた．レブリン酸を除く D 培地の組成は,してレブリン酸を利用する研究も行われている(Jaremko

ポリペプトン（日本製薬）5 g/L,酵母エキス（Difco）5 g/L,

& Jian, 2011 )．

MgSO4·7H2O 1 g/L,E 培 地 の 組 成 は,K2HPO4 2 g/L,

本研究では,将来的なバイオプロセスによるレブリン(NH4)2 SO4 5 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L, 酵 母 エ キ ス酸からの物質生産を見据え,100 g/L 程度の高濃度レブ（Difco）5 g/L である．スクリーニングは,産総研つく

リン酸を利用可能な微生物の取得を試みた．またレブリばセンター内の土壌を中心とした 200 箇所以上の環境サン酸のバイオ変換で製造可能な化学品に関する情報を得

ンプルを分離源とした．上記 D, E 培地のいずれか 5 mLるため,レブリン酸資化菌の代謝産物を調べるとともに,が入った試験管を用いて好気的に 30 ℃で一週間程度培

ゲノム情報に基づいた代謝系の解析から,今後の化学品養を行った後,これを試験管で複数回継代することで集への展開において有用な代謝中間体が存在しないか調べ

積し,寒天培地にて単離を行った．単離した菌株は,再ることとした．

度スクリーニング用の培地を用いて培養した後,液体ク
ロマトグラフ( HPLC )にて培地中のレブリン酸濃度の実験方法

減少を確認した．
単離した細菌株の同定は定法に従い,16S rRNA 遺伝

微生物菌株の探索，単離，同定

子配列の全領域(一部の菌株については,16S rRNA 遺

レブリン酸を唯一の炭素源として生育可能な微生物を

伝子の上流領域約 500 bp) の塩基配列を決定,もしくはスクリーニングする際は,主に 3 種類の培地( A, B, C

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量培地と呼ぶ)に,レブリン酸が終濃度 20 g/L から 50 g/L

分析計( MALDI-TOF/MS )によりリボゾームタンパクとなるよう加えた培地( NaOH にて pH を 7.0 に調整)

質のマススペクトルを取得し,データベースと照合するを用いた．レブリン酸を除く A 培地の組成は,K2HPO4ことで細菌種を同定した．

－ 39 －

羽部

電気透析によるバイオマス由来レブリン酸からの夾雑物の除去

浩

ルシリル化剤にて誘導体化した後,キャピラリーカラム
HP-5MS を装着したガスクロマトグラフ質量分析計(GC-

実バイオマス(杉木粉)由来レブリン酸溶液は,産総MS )システム( Agilent Technologies )で分析を行った．

研・触媒化学融合研究センターにて既報( Nemoto et

カラムは 50 ℃で 5 分間保持した後,毎分 3 ℃ずつ昇温

al., 2015 )に従い調製した．杉木粉由来レブリン酸は,して 250 ℃とし,10 分間温度を保持した．

pH 2 であるため,NaOH にて pH 6 に調整した．レブリ
ン酸溶液からの夾雑物除去は,陰イオン回収用の膜カー

レブリン酸誘導性遺伝子の発現解析

トリッジ AC-122-10(有効膜面積 10 cm2 ,サンアクティス)

微生物におけるレブリン酸代謝系を解明するため,レを装着した電気透析装置マイクロアシライザー S1(アブリン酸生育時に高発現する遺伝子の特定を試みた．最ストム)を用いた．電極液には,0.5 M NaNO3 溶液を用

初に各菌株の遺伝情報を取得するため,ドラフトゲノム

いた．電気透析開始時は 4.7 V の定電圧で運転し,電流解析を行った．定法に従い菌株から total DNA を抽出し,値が 0.4 A より低くなった時点で 4.6 V の定電圧に切り替キットを用いてペアエンド法およびメイトペア法にてわる,同様に電流値が 0.1 A より低くなった時点で 4.2 V,

DNA ラ イ ブ ラ リ ー を 調 製 し た 後,MiSeq あ る い は

さらに 0.04 A より低くなった時点で 3.6 V に切り替わるよHiSeq(イルミナ)を用いてシークエンスを行った．

う自動運転を行った(電極電圧は 3.5 V )．溶液の電気伝

ALLPATHS-LG ver.46449 等を用いてゲノムシークエン

導度が 500 μS/cm(約 1 g/L のレブリン酸イオンに相当)

スのアッセンブルを,Glimmer 3.02 等を用いてタンパクになった時点で運転が自動的に止まるように設定した．

質 を コ ー ド す る 遺 伝 子 を 予 測 し,NCBI-BLAST-

電気透析にて濃縮した 0.5 M のレブリン酸溶液 1 mL

2.2.29(BLASTP) 等を用いてアノテーションを行った．

に, 飽 和 塩 化 カ ル シ ウ ム 溶 液( 6.7 M ) を 1 mL か ら

これらゲノム情報に基づき,RNA-seq 法による比較トラ

2 mL 加えて混合し,10 mL のエタノールを添加すること

ンスクリプトーム解析を行った．各菌株をレブリン酸おでレブリン酸カルシウムを晶析した．エタノールを濾別

よびピルビン酸を基質とした培地で培養し,対数増殖中して結晶を乾燥させたのち,水に再溶解して HPLC で純期の菌体からフェノール／クロロホルム法等により度を確認した．

RNA を抽出した後,DNase( RQ1 RNase-Free DNase,

レブリン酸およびレブリン酸代謝物の分析法( QIAGEN )を用いて RNA を精製した．続いて,キット

Promega )により残存 DNA を除去し,RNeasy Mini Kit
レブリン酸を含む培地で培養した菌体を遠心分離によ( NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit ,New England

り除去した後,上清液を HPLC にて解析し,標品化合物

Biolabs ) を 用 い cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を 調 製 し た 後,と保持時間およびピーク面積を比較することで濃度を測

MiSeq あるいは HiSeq(イルミナ)を用いてシークエン

定した．レブリン酸およびその代謝物である酢酸,プロスを行った．発現量の解析は,低クオリティのシークエ

ピオン酸,2 -オキソグルタル酸等は,Aminex® HPX-87H

ンスを Trimmomatic v0.30 等によって除去した後,各細カラム( 300 x 7.8 mm, BIO-RAD )を装着した HPLC シ

菌のドラフトゲノム配列を対象に Bowtie2 によってマッステムを用い,移動相は 5 mM H2SO4 ,流速は 1 mL/分,

ピングし,BEDTools 等により発現強度を正規化するこ

カラム温度は 60 ℃として示差屈折計( RI 検出器)で分とで行った．

析を行った．また同様に,異なるカラムと検出器を用い結果および考察ても HPLC 解析を行った．TSK-GEL ODS-100V カラム( 150 x 4.6 mm, TOSOH )を装着した HPLC システムを用い,移動相は 74 mM H3PO4 ,流速は 1 mL/分,カラム

レブリン酸を唯一の炭素源として生育する微生物の探索

温度は 30 ℃として紫外検出器(UV 検出器)で分析を行っレブリン酸を唯一の炭素源とする A, B または C 培地

た．さらに必要に応じてコクロマトグラフィーに供した．

を用いて,微生物の生育を指標としたスクリーニングを

ト レ ハ ロ ー ス は, 培 養 液 上 清 を 陰 イ オ ン 交 換樹脂

行った結果,30 株の細菌の単離に成功した．これら 30

Dowex に通すことで残存するレブリン酸イオンを除去

菌株を同定した結果,Bacillus 属など Firmicutes に属す

し精製した．分子量は,Synergy® 4-μm Fusion RP カラる菌が 21 株,Rhodococcus 属など Actinobacteria に属す

ム( 150 x 2 mm, 島津製作所)を装着した液体クロマトる 菌 が 4 株,Pseudomonas 属 な ど Gammaproteobacteria

グ ラ フ ィ ー 質 量 分 析( LC-MS ) シ ス テ ム( LC/MSに 属 す る 菌 が 3 株, そ の 他 は,Betaproteobacteria と2020, 島津製作所)を用い,移動相は 0.1 %ギ酸/アセト

Alphaproteobacteria が 1 株ずつであった( Fig. 2 )．

ニ ト リ ル( 95:5 ), 流 速 は 0.2 mL/分, カ ラ ム 温 度 は

例 え ば Rhodococcus sp. WU-1501 株 は,20 g/L の レ ブ

40 ℃として測定を行った．同定はサンプルをトリメチ

リン酸を含む C 培地で良好に生育し,120 時間で OD 値

－ 40 －

レブリン酸を基幹化合物とする新規バイオ生産技術の開発

が 20 程度まで増殖した．一方,炭素源をレブリン酸か

cus 属など Actinobacteria に属する菌が 22 株,Burkholde-

らグルコースに変更すると,グルコースはほとんど消費

ria 属など Betaproteobacteria に属する菌が 8 株,Pseudo-

されなかった．同じ Rhodococcus 属細菌である R. equimonas 属 な ど Gammaproteobacteria に 属 す る 菌 が 5 株,

PS1b 株を,3 g/L から 20 g/L のレブリン酸を含む B 培

Bacillus 属など Firmicutes に属する菌が 4 株,その他は,地で生育させたところ,10 g/L までのレブリン酸であれAlphaproteobacteria が 1 株であった( Table 1 )．これら

ば 24 時間後に菌の増殖が始まり,48 時間で OD 値が 340 菌株の門／綱レベルでの分類を,レブリン酸を唯一程度まで増殖した．レブリン酸濃度が 15 g/L になると,の炭素源として単離した 30 菌株の分類と比較したとこ

72 時間後に菌が増殖し始め,120 時間後では OD 値が 4

ろ,割合は異なるものの類似の細菌が単離されており,に達する．一方,レブリン酸濃度が 20 g/L になると,いずれも門レベルでは Actinobacteria か Firmicutes,も菌の生育は確認されなかった．

しくは Proteobacteria に属していた( Fig. 2 )．

こ の よ う に 単 離 し た 多 く の 菌 が, レ ブ リ ン 酸濃度
20 g/L 前後を境に生育が悪くなり,現在までに,液体培

高濃度レブリン酸の代謝試験

養で 40 g/L 以上のレブリン酸を唯一の炭素源として生

有機栄養源の存在下でレブリン酸を利用可能な細菌

育可能な微生物は取得できていない．20 g/L のレブリン

40 株について,実際に 80 g/L 以上の高濃度レブリン酸

酸を用いて物質生産を行ったとしても,生産量はせいぜを代謝可能であるか検証した．20 g/L のレブリン酸を含い 20 g/L 程度である．バイオプロセスを工業化する目む D 培地 100 mL で菌株を 2 日間 30 ℃で培養し,生育し安の一つと言われる,1 バッチ当たり 100 g/L の生産量た菌体を集菌して上清を除去した後,80 g/L のレブリンを目指すためには,100 g/L 程度のレブリン酸を変換可

酸 を 含 む D 培 地 20 mL に 再 懸 濁 し( OD 値 は 約 20 ),能な微生物の取得が望まれた．

30 ℃で 10 日間培養した．その結果,Cellulosimicrobium
cellulans LA14-2 株,
Brevibacterium epidermidis LA39-2 株,

有機栄養源存在下でレブリン酸を利用可能な微生物の探索
高濃度レブリン酸を利用可能な微生物を取得するため,レブリン酸を唯一の炭素源としたスクリーニング方

Table 1

法を変えることとした．40 g/L から 100 g/L のレブリン酸を含む D 培地で集積して得られた単離菌株を用いて,培養液上清のレブリン酸濃度の減少を確認することでス
クリーニングを行った．その結果,40 株の細菌の単離に成功した．これら 40 菌株を同定した結果,Rhodococ-

Fig. 2The phylum/class-level phylogenetic classification of
levulinic acid-utilizing bacteria isolated based on screening methods using the media containing levulinic acid asa sole carbon source (A) and the media containing organic nutrients besides levulinic acid (B). The numberson the graphs represent the number of isolated bacterial
strains.

－ 41 －

Identification of levulinic acid-utilizing bacteria isolated
from the environment using the media containing organic nutrients besides levulinic acid羽部

Rhodococcus erythropolis LA73-1 株の 3 株において,80 g/L

浩

杉木粉由来レブリン酸に含まれる微生物阻害物質の除去

レブリン酸の経時的な減少が確認された．LA14-1 株お

これまでレブリン酸資化菌のスクリーニングおよびレ

よび LA73-1 株においては,4 日目で残存レブリン酸濃

ブリン酸の代謝実験は,市販の試薬レブリン酸を用いた度が 50 g/L となったが,それ以降レブリン酸濃度は変実験であったが,実際のバイオマス由来レブリン酸でもわらなかった．一方,B. epidermidis LA39-2 株においては,微生物が利用可能であることを示す必要がある．杉木粉

4 日目以降もレブリン酸濃度は経時的に減少し,10 日間

由来レブリン酸は黒褐色であるが( Fig. 4, 写真),NMR

で約 90 %のレブリン酸が代謝された( Fig. 3 )．LA39-2

解析ではレブリン酸以外のスペクトルは確認されておら

株 に つ い て は, さ ら に レ ブ リ ン 酸 初 発 濃 度 を 上 げ,ず,極めて微量な不純物により着色しているものと考え

90 g/L および 100 g/L のレブリン酸を含む D 培地に菌体られている( Nemoto et al., 2015 )．そこで杉木粉由来レを 懸 濁 し( OD 値 は 約 20 ),30 ℃ で 10 日 間 培 養 し た．

ブリン酸が,微生物の生育およびレブリン酸の代謝に及そ の 結 果, 初 発 濃 度 90 g/L で は 10 日 間 で 約 80 %,ぼす影響について調べた( Fig. 4 )．20 g/L の杉木粉由

100 g/L においても 10 日間で約 50 %のレブリン酸が代来および試薬のレブリン酸を含む D 培地で,Pseudomo-

謝されることが明らかとなった( Fig. 3 )．

nas sp. LA18T 株を 5 日間 30 ℃で培養した結果,試薬レ

このように高濃度レブリン酸の存在下でも耐性を示

ブリン酸を用いた場合は 2 日目に約 50 %,3 日目に約し,基質として利用可能な微生物が単離されたことから,

90 %のレブリン酸が代謝された．一方,杉木粉由来レ

例えば B. epidermidis LA39-2 株を宿主とした組換え体をブリン酸を用いた場合は,2 日目ではまだほとんど代謝

創製することにより,高濃度レブリン酸を効率的に変換されておらず,4 日目で約 80 %のレブリン酸が代謝されして化学品を生産することも可能となる．これまでにレるなど,杉木粉由来レブリン酸は利用可能ではあるもの

ブリン酸の酵素変換に関する研究も報告されており,の,試薬レブリン酸に比べ微生物利用の速度が遅いこと

Clostridium acetobutylicum 由来のアセト酢酸脱炭酸酵素が示された( Fig. 4 )．

は,レブリン酸をメチルエチルケトンへと変換する(Minそこで,この阻害を引き起こす微量夾雑物を,電気透et al., 2013 )．また,Alcaligenes faecalis 由来の 3-ヒドロ

析装置を用いて除去することとした．予備検討として,キシ酪酸脱水素酵素をベースとした改変酵素が,レブリ

各種濃度および pH 範囲でのレブリン酸溶液を調製し,ン酸を 4-ヒドロキシ吉草酸へと変換可能であることも報

電気透析装置を用いたレブリン酸の濃縮が可能であるこ

告されている( Yeon et al., 2013 )．精製酵素を利用するとを確認した後,初発濃度 80 g/L から 90 g/L の杉木粉とコストが高くなるが,これらの酵素をコードする遺伝由来レブリン酸を用いて夾雑物の除去を試みた．電気透子を B. epidermidis LA39-2 株などの宿主に導入すること

析により,杉木粉由来レブリン酸は 115 g/L から 125 g/L

により,メチルエチルケトンや 4- ヒドロキシ吉草酸といった化学品も安定的に生産できるであろう．

Fig. 4

Fig. 3Time course of levulinic acid consumption by Brevibacterium epidermidis LA39-2. Symbols: diamonds, 80 g/Lof initial levulinic acid concentration; squares, 90 g/L;
circles, 100 g/L. Data represent the means of three independent experiments.

－ 42 －

Effect of cedar-derived levulinic acid on growth as wellas levulinic acid consumption of Pseudomonas sp. LA18T.
Symbols: white circle, reagent levulinic acid; black circle, cedar-derived levulinic acid. The vertical bar shows
the standard deviation of the mean of three independent
experiments. The picture represents the catalyticallysynthesized levulinic acid solution from cedar powder(cedar-derived levulinic acid).

レブリン酸を基幹化合物とする新規バイオ生産技術の開発の範囲で濃縮され,若干色は残っているものの,陰イオに伴い,酢酸およびプロピオン酸が培養液中に蓄積され,ン交換膜により着色物質が除去された．電気透析で濃縮

4 日目でそれぞれ最大 13.2 g/L および 3.2 g/L の蓄積がした杉木粉由来レブリン酸( 20 g/L )が,レブリン酸の確認された( Fig. 6 )．この結果から,C5 のレブリン酸

代謝に及ぼす影響について調べたところ,試薬レブリン酸

が C2 のアセチル CoA と C3 のプロピオニル CoA に分かを使用した場合と同等の速度でレブリン酸が消費された．

れて代謝されることが示唆された．また,5 日目からのまた電気透析により得られた杉木粉由来レブリン酸溶

酢酸濃度の減少に伴い,2-オキソグルタル酸が検出され液を,長期間安定的に保存するため,レブリン酸カルシ

たことから,酢酸がアセチル CoA として TCA 回路に入ウムとして回収する方法を検討した．0.5 M レブリン酸

ることで,2-オキソグルタル酸が生成したと考えられる．

溶液と,飽和した塩化カルシウム溶液を混合後,適当量同様に,レブリン酸の消費に伴う酢酸とプロピオン酸ののエタノールを添加した．その結果,白色のレブリン酸

生成は,Rhodococcus hoagie LA6W 株においても確認さカルシウムが析出し( Fig. 5,写真左),十分量の塩化れた．一方少量ではあるが,他の有機酸を培養液中に蓄カルシウムを添加することで,95 %以上のレブリン酸

積する菌株も存在し,例えば Ochrobactrum WU-1502 株

がカルシウム塩として回収可能であることが示されたにおいては,7 日間の培養で 0.63 g/L の 2-オキソグルタ( Fig. 5 )．このように電気透析による杉木粉由来レブリ

ル酸に加え,0.1 g/L のシュウ酸も検出されている．

ン酸溶液の精製と濃縮が可能になったこと,またカルシ

Burkholderia stabilis LA20W 株を,40 g/L のレブリンウム塩として長期間安定に保存できるようになったこと

酸を含む D 培地で培養し,HPLC にて培養液中の代謝物から,ラボにおいて杉木粉由来レブリン酸を用いた各種を解析したところ,これまで検出された有機酸とは異な実験を行うことが可能となった．

る保持時間に未知のピークが検出された．培養液上清から残存レブリン酸を除去し,LC-MS で分析したところ,

レブリン酸代謝産物の解析

分子量が 342 g/mol となり二糖類であることが示唆され高濃度レブリン酸を利用可能な微生物が単離され,バた．サンプルをトリメチルシリル化剤にて誘導体化したイオマス由来レブリン酸も利用可能となったことから,

後,GC-MS にて各種二糖類の標品と比較したところ,

次に微生物がレブリン酸の代謝産物としてどのような化

トレハロースと保持時間( 74.8 分)およびマススペク

合物を培養液中に蓄積するのか調べることとした．

トル(主要なフラグメントイオン：m/z 361, 271, 191,

Pseudomonas sp. LA18T 株を,20 g/L のレブリン酸を

147, 73 )が完全に一致した．レブリン酸の代わりにグ含む D 培地 100 mL で 2 日間 30 ℃で培養し,生育した菌

ルコースを用いた D 培地では,トレハロースは検出さ体を集菌して上清を除去した後,70 g/L のレブリン酸をれず,レブリン酸誘導的に生産されていることが示され含む D 培地 20 mL に再懸濁し( OD 値は約 25 ),30 ℃で
7 日間培養した．その結果,レブリン酸の経時的な消費Fig. 6
Fig. 5

Effect of calcium chloride addition on crystallization of
levulinic acid calcium salt dihydrate. The initial concentration of levulinate solution is 58 g/L. The vertical bar
shows the standard deviation of the mean of three independent experiments.

－ 43 －

Time course of levulinic acid consumption and metabolic intermediate accumulation by Pseudomonas sp. LA18T.
Symbols: black squares, levulinic acid concentration(initial 70 g/L); white squares, acetic acid concentration;
white circles, propionic acid concentration. Representative results out of at least two independent experiments
are shown.

羽

部

浩

た．トレハロースは微生物細胞内に蓄積され,細胞外に菌 Burkholderia stabilis LA20W 株の 3 菌株を対象としたはトレハロースリピッドのような形で排出されることが( Table 2 )．このうち B. stabilis LA20W 株のドラフトゲ

多い．現在までに本菌株におけるトレハロース蓄積のメノム配列については,DDBJ/EMBL/GenBank に登録を

カニズムは不明であるが,LA20W 株の培養条件では,行った(コンティグ: BDCP01000001－BDCP01000023;

菌の生育に伴って培養液の pH が上昇しアルカリ性にな

スキャホールド:DF978417－DF978420 )．残りの 2 菌株

るため,このことが何かしらの影響を及ぼしている可能について,得られたゲノム情報に基づき,RNA-seq 法を性が考えられる．

用いた比較トランスクリプトーム解析を行った．

上記菌株以外にも,バイオ界面活性剤等を生産していR. equi PS1b 株において,ピルビン酸生育時と比較し,る菌が検出されているが,いずれも生産量は数 g/L 程

レブリン酸生育時に発現量が 100 倍以上になる遺伝子を度と少なく,現在までにレブリン酸から量産可能な化合含む 2 つのゲノム領域が取得された．1 つのゲノム領域

物は見つかっていない．引き続き,嫌気条件下など多様には,輸送タンパクとアシル CoA リガーゼと相同性のな条件でレブリン酸資化菌の探索を継続し,代謝物の分ある遺伝子がクラスターを成して存在しており,それぞ析を行っていく必要がある．

れ 71 倍,289 倍の発現量増加(対ピルビン酸生育時)を示した．もう一方のゲノム領域には,ホスホグリセリ

レブリン酸代謝系の解析

ン酸ムターゼ,短鎖型脱水素酵素,アシル CoA 脱水素

レブリン酸の代謝経路を解明し,その中間体に化学品

酵素等と相同性のある遺伝子がクラスターを成して存在へと展開可能な有用物質があれば,各種遺伝子工学的なしており,120 から 370 倍の発現量増加(対ピルビン酸

手法により,レブリン酸からその化合物を蓄積するよう生育時)を示した．

な菌株を創製することも可能となる．そこでこれまでほPseudomonas sp. LA18T 株においては,ピルビン酸生

とんど知見のない,微生物におけるレブリン酸の代謝系

育時と比較し,レブリン酸生育時に発現量が 5 倍以上にを解析することとした．

なる遺伝子を含むゲノム領域が取得された．このゲノム

最初にレブリン酸を利用可能な各タイプの菌株につい領域にも PS1b 株と同様,輸送タンパクとアシル CoA リて遺伝情報を得るため,ドラフトゲノム解析を行った．

ガーゼと相同性のある遺伝子がクラスターを成して存在

レブリン酸を唯一炭素源として利用可能なグラム陽性細しており,それぞれ 5 倍,7 倍の発現量増加(対ピルビ菌 Rhodococcus equi PS1b 株,有機栄養源の存在下でレン酸生育時)を示した．さらに,ホスホグリセリン酸ム

ブリン酸を利用可能なグラム陰性細菌 Pseudomonas sp.

ターゼ,短鎖型脱水素酵素,アシル CoA 脱水素酵素等

LA18T 株,培地中にトレハロースを生産するグラム陰性細と相同性のある遺伝子群もクラスターを成して存在して
おり,5 から 10 倍の発現量増加(対ピルビン酸生育時)を示した．

Table 2 S ummary of draft genomes of three levulinic acid-utilizing bacteria isolated in this study

このように系統学的位置と培養方法も異なる 2 種類の細菌において,類似の遺伝子群が高発現していたことから,レブリン酸代謝系の酵素遺伝子である可能性が高いと考えられる．得られた酵素遺伝子から推定されるレブリン酸の代謝経路としては,レブリン酸もしくはレブリ
ン酸の 4 位のケト基が還元され 4-ヒドロキシ吉草酸になった後,補酵素 A がカルボキシル基末端に付加して代謝が進む経路である( Fig. 7 )．代謝物解析の結果から最終的にアセチル CoA とプロピオニル CoA に分かれることを考えると,4-ヒドロキシバレリル CoA が 3-ヒドロ
キシバレリル CoA へと変換される必要があり( Fig. 7 ),Fig. 7

Proposed metabolic pathway of levulinic acid in Rhodococcus spp. and Pseudomonas spp.

－ 44 －

レブリン酸を基幹化合物とする新規バイオ生産技術の開発

現在これら代謝経路の解析に取り組んでいる．

from a cellulose-derived building-block, levulinic acid, by
Burkholderia stabilis. The Society for Industrial Microbiology and Biotechnology (SIMB) Annual Meeting and Exhibition. July 24-28, 2016, New Orleans, Louisiana, USA.

レブリン酸を基質としたバイオ変換において,従来の糖プラットフォームやレブリン酸の化学触媒反応では生産が難しい化学品をターゲットにするという観点に立てば,化学品展開の可能性がある代謝中間体として,4-ヒ
ドロキシ吉草酸や 3-ヒドロキシ吉草酸といった C5 の光
学活性ヒドロキシカルボン酸が有望であろう．光学活性化合物は医薬品原料として利用可能であり,また C5 のヒドロキシカルボン酸は新たな樹脂のモノマー原料としての利用可能性もある．今後はより詳細なレブリン酸代
謝系の解析だけでなく,C5 ヒドロキシカルボン酸の用
途開拓も重要な研究課題となる．

要約

木質バイオマス利用法の多様性を拡充するため,リグノセルロースの直接化学変換により得られる基幹化合物「レブリン酸」を原料としたバイオ生産技術開発を目標とし,各種基盤研究を行った．具体的には,1）微生物発酵の阻害物質としても知られるレブリン酸を化学品製造の原料とするため,100 g/L 程度の高濃度レブリン酸

原著論文
1) Habe, H., Sato, S., Morita, T., Fukuoka, T., Kirimura, K. &Kitamoto, D. 2015. Bacterial production of short-chain organic acids and trehalose from levulinic acid: a potential ofcellulose-derived building block as a feedstock for microbial
production. Bioresour. Technol. 177: 381-386.
2) Habe, H., Sato, S., Morita, T., Fukuoka, T., Kirimura, K. &Kitamoto, D. 2015. Isolation and characterization of bacterial
strains with the ability to utilize high concentrations oflevulinic acid, a platform chemical from inedible biomass.
Biosci. Biotechnol. Biochem. 79: 1552-1555.
3) Sato, Y., Koike, H., Kondo, S., Hori, T., Kanno, M., Kimura,N., Morita, T., Kirimura, K. & Habe, H. 2016. Draft genome
sequence of Burkholderia stabilis LA20W, a producer of trehalose that uses levulinic acid as a substrate. Genome Announc. 4(4): e00795-16, doi:10.1128/genomeA.e00795-16.
4) Habe, H., Kondo, S., Sato, Y., Hori, T., Kanno, M., Kimura, N.,
Koike, H. & Kirimura, K. 2017. Electrodialytic separation of
levulinic acid catalytically synthesized from woody biomass
for use in microbial conversion. Biotechnol. Prog. 33: 448453.

を変換可能な微生物の探索を行った．2）微生物が実バ
イオマス由来レブリン酸を利用可能であるか検討した．

保存機関に寄託した菌株

3）ターゲットとする化学品に関する情報を得るため,
レブリン酸の微生物代謝産物を分析するとともに,レブ
リン酸の代謝経路の解明を試みた．

Burkholderia stabilis LA20W = NBRC 112421

その結果として,以下に示す成果が得られた．

謝1）レ ブ リ ン 酸 を 唯 一 の 炭 素 源 と し た 培 養 条 件 で は,辞

40 g/L 以上のレブリン酸で生育する微生物は取得できな
かった．一方,有機栄養源存在下でレブリン酸を利用可

本研究を行うにあたり,助成をいただきました公益財

能 な 微 生 物 を 探 索 し た と こ ろ,Brevibacterium epider-

団法人発酵研究所に深く感謝いたします．また,杉木粉

midis など 100 g/L のレブリン酸も代謝可能な細菌の取由来のレブリン酸溶液を調製,供与いただきました富永

得に成功した．

健一博士と根本耕司博士(ともに産業技術総合研究所触2）黒褐色の杉木粉由来レブリン酸を基質にすると,レ媒化学融合研究センター)に深謝いたします．

ブリン酸の利用速度が遅くなるが,電気透析で夾雑物を文除去することにより,試薬レブリン酸と同程度の利用速度に向上した．
3）レブリン酸代謝物を解析した結果,酢酸,プロピオン酸,2-オキソグルタル酸等の有機酸やトレハロースが検出された．また Rhodococcus 属や Pseudomonas 属細菌を用いて比較トランスクリプトーム解析を行い,発現量の高い酵素遺伝子群から代謝経路を推定した．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) Habe, H., Fukuoka, T., & Morita, T. Production of trehalose献

相田徳二郎,山口和夫．1970. レブリン酸資化性酵母に関する研究(第 2 報)生菌懸濁液によるレブリン酸の代謝について．
農化．44: 476-483.
Hanada, S., Kawase, Y., Hiraishi, A., Takaichi, S., Matsuura, K.,
Shimada, K. & Nagashima, K. V. P. 1997. Porphyrobacter tepidarius sp. nov., a moderately thermophilic aerobic photosynthetic bacterium isolated from a hot spring. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 47: 408-413.
原田倫夫,重田敞右,上野喬宏．1969. 微生物によるレブリン酸の代謝(第 1 報)レブリン酸資化性細菌の検索．農化．43:
739-746.
Hasunuma, T., Okazaki, F., Okai, N., Hara, K. Y., Ishii, J. & Kon-

－ 45 －

羽部

do, A. 2013. A review of enzymes and microbes for lignocellulosic biorefinery and the possibility of their application to consolidated bioprocessing technology. Bioresour. Technol. 135:
513-522.
黒野勘六,深井冬史,舘野正淳．1925.「カルボキシラーゼ」の作用に就て(第一報)(レビュリン酸の酵素的分解)．農化．
1: 281-291.
Jaremko, M. & Jian, Y. 2011. The initial metabolic conversion of
levulinic acid in Cupriavidus necator. J. Biotechnol. 155: 293-298.
Nemoto, K., Tominaga, K. & Sato, K. 2014. Straightforward synthesis of levulinic acid ester from lignocellulosic biomass resources. Chem. Lett. 43: 1327-1329.
Nemoto, K., Tominaga, K. & Sato, K. 2015. Facile and efficienttransformation of lignocellulose into levulinic acid using an
AlCl3·6H2O/H3PO4 hybrid acid catalyst. Bull. Chem. Soc. Jpn.
88: 1752-1754.
Min, K., Kim, S., Yum, T., Kim, Y., Sang, B. -I. & Um, Y. 2013.
Conversion of levulinic acid to 2-butanone by acetoacetate decarboxylase from Clostridium acetobutylicum. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 97: 5627-5634.

浩
奥 山 潔, 篠 山 浩 文, 藤 井 貴 明．1995. 紅 色 非 硫 黄 細 菌 Rhodopseudomonas sp. No.7 の休止細胞によるレブリン酸の分解．
千葉大園学報．49: 29-35.
Olson, D. G., McBride, J. E., Shaw, A. W. & Lynd, L. R. 2011. Recent progress in consolidated bioprocessing. Curr. Opin. Biotechnol. 23: 1-10.
Pileidis, F. D. & Titirici, M. M. 2016. Levulinic acid biorefineries:
New challenges for efficient utilization of biomass. ChemSusChem. 129: 616-619.
Ren, H., Zhou, Y. & Liu, L. 2013. Selective conversion of cellulose
to levulinic acid via microwave-assisted synthesis in ionic liquids. Bioresour. Technol. 9: 562-582.
Tominaga, K., Mori, A., Fukushima, Y., Shimada, S. & Sato, K.
2011. Mixed-acid systems for the catalytic synthesis of methyl
levulinate from cellulose. Green Chem. 13: 810-812.
Yeon, Y. J., Park, H. -Y. & Yoo, J. Y. 2013. Enzymatic reduction oflevilinic acid by engineering the substrate specificity of
3-hydroxybutyrate dehydrogenase. Bioresour. Technol. 134:
377-380.

－ 46 －

IFO Res.Commun. 31
47-56, 2017

有害化合物汚染土壌の微生物集団による分解・浄化に向けた基盤研究 :分解菌と共存する非分解菌の役割の解明
津

田

雅

孝

東北大学大学院生命科学研究科〒980-8577

仙台市青葉区片平2-1-1

Toward establishment of microbial community-based degradation and remediation ofchemically polluted soil: enhancement of degrader growth by co-residing non-degraders
Masataka Tsuda
Graduate School of Life Sciences, Tohoku University
2-1-1 Katahira, Aoba-ku, Sendai 980-8577, Japan
Using a phenanthrene (Phn)-degrading bacterial consortium (MixEPa4) that consisted of several genera, we havepreviously isolated two strains; one is Mycobacterium sp. EPa45 able to completely degrade three toxic polycyclicaromatic hydrocarbons (PAHs), Phn, naphthalene, and biphenyl, and the other is Burkholderia sp. Bcrs1W unable
to degrade the three PAHs. We have further found that the growth of EPa45 is significantly inhibited in thepresence of Phn and that such inhibition is suppressed by the co-cultivation with Bcrs1W. These two phenomena
were designated growth inhibition (GI) and suppression of GI (SGI), respectively. In this study, we further
analyzed these phenomena in more detail, and dissemination of such phenomena in microbial world wasinvestigated. Addition of Phn to the culture medium led to the death of EPa45 cells, and such death might havebeen induced by reactive oxygen species (ROS) that were formed abundantly in the presence of Phn or its
metabolite(s). The SGI effect of Bcrs1W to EPa45 was obser ved only when the viable Bcrs1W cells directly
contacted the EPa45 cells, strongly suggesting no involvement of small and/or diffusible molecules in the SGI.
Various and taxonomically divergent bacterial strains, including Burkholderia multivorans ATCC 17616, exhibited
the SGI effect to EPa45, and strain-dependent difference in the intensities of the SGI effect was observed. Such
difference among the strains was apparently correlated with their growth abilities on Phn-containing solid medium.
Co-cultivation of EPa45 with ATCC 17616 in the presence of Phn specifically induced an EPa45 gene putatively
involved in the removal of ROS, suggesting that such induction is mediated by ATCC 17616 with (an) unknown
mechanism(s). The three PAHs exerted the GI effect to EPa45 and another mycobacterial strain, and such GI
effect to the two strains were suppressed by Bcrs1W and ATCC 17616, suggesting wide dissemination of the two
phenomena in various PAH-degrading mycobacterial strains.
Key words: microbial community, Mycobacterium, Burkholderia, phenanthrene degradation, growth inhibition緒

言る実汚染土壌では,実験室系で分解活性が低い細菌株や汚染土壌細菌叢で優占化しない「予想外の」細菌株や細各種の有害化合物で汚染された土壌の浄化には,当該菌集団の汚染化合物分解への関与や異種細菌株での協調

環境棲息微生物 (特に細菌) が極めて重要な役割を果た的な分解が示唆されている (加藤ら,2015; Nojiri et al.,

し,有害化合物完全分解可能な数多くの細菌株の実験室2015) が,これら現象の詳細な実体とそれらを司る機構

系解析で学術的に重要で新規性のある数々の知見が提示は不明である．従って,細菌やその集団による汚染土壌されてきた (Nojiri et al., 2015)．一方,複合生物系であの効率的浄化技術の確立をめざすためには,集団内での分解細菌の分解機能発現と共存する非分解細菌の汚染化

E-mail: mtsuda@ige.tohoku.ac.jp
共同研究者：吉川博文(東京農業大学応用生物科学部)

合物分解への役割とその機構の根源的解明が必要である．
汚染土壌での汚染化合物の微生物分解に関する従来の－ 47 －

津

田

雅

孝

研究は生物的・非生物的な多数環境因子が多面的かつ不には棲息細菌集団内で常時 1%以下だった Mycobacterium

確定的に大幅変動する開放系環境で実施されたため,再現属細菌がとりわけ分解前半段階に関与するが,集団内で最性の高い研究成果取得が難しい．これに対して我々は,有大 20%程度までに優占化した Burkholderia 属細菌が何ら

害化合物汚染土壌棲息細菌集団の中で如何なる細菌 (群)かの協調的な形で前者株によるフェナントレン分解を促進しが如何に当該化合物の分解に関与するかを外的環境因子たと強く推定された．一方,本汚染土壌からフェナントレン

変動のない状態で解析してきた．特定農地土壌を物理的を唯一炭素源とする最小寒天培地で生育可能なコロニーを環境要因の制御が可能な閉鎖系にした後に代表的な環境

多数取得した．多くのコロニーは各々が 1 種の細菌株で構汚染化合物で多環芳香族炭化水素 (polycyclic aromatic

成されず,フェナントレン完全分解菌株と数種の非分解菌株

hydrocarbon; PAH)(本報独自の略号は Table 1 にまとめから構成されるフェナントレン分解コンソーシアムであった．

た ) であるフェナントレンを含む 4 種の芳香族系有害化合

そのうちのひとつ MixEPa4 ではフェナントレン完全分 解

物を同時添加し,当該土壌の細菌叢 (16S rRNA 遺伝子配Mycobacterium 属菌株と Burkholderia 属菌株を含む数種

列を指標 )と機能遺伝子プールの経時的変動に関する大規の非分解菌株が共存していた．MixEPa4 の菌叢組成は最模メタゲノム解析を行った (Mori et al., 2014; Kato et al.,

小液体培地でのフェナントレン分解過程でも安定で,Myco-2015a)．その結果,当該土壌でのフェナントレン完全分解

bacterium 属細菌は少数派のままで優占化せず (Fig. 1),

Table 1

Fig. 1.

Abbreviations used in this study

Degradation of phenanthrene by consortium MixEPa4 and its changes in community compositions. (A) Degradation of phenanthrene (Phn) in M9 Phn minimal liquid medium (square) and cell proliferation (circle). Copy numbers of 16S rRNA genes in theculture were determined by quantitative PCR analysis according to the protocols by Kato et al. (2015a). (B) Change in community compositions during the Phn degradation in M9 Phn minimal liquid medium. 16S rRNA genes in the culture were PCR-amplified and sequenced using the Illumina MiSeq system according to the protocols by Mori et al. (2014). Boxes from the bottom are
the following bacteria: family Alcaligenaceae (check) – genus Dyella (wave) – genus Burkholderia (black) – genus Mycobacterium(white) – genus Pseudolabrys (grey) –genus Paenibacillus (dot). Similar results were obtained in two independent experiments,
and panel B shows one representative result.

－ 48 －

多環芳香族化合物分解細菌の基質による生育阻害と共存異種細菌による阻害緩和

MixEPa4 での効率的フェナントレン分解には Mycobacte-

et al., 2014; Nishiyama et al., 2010; Sato et al., 2017) がrium 属株と非分解菌株との共存が重要と示唆された (加EPa45 株に対して,Bcrs1W 株と同様の SGI 効果を示す

藤ら , 2015)．そこで,上記メタゲノム解析での示唆もが,ADN 現象は示さないという予備的成果を得ていた．

踏まえ,MixEPa4 からフェナントレン完全分解 Myco-

本研究では,上記のメタゲノム解析の成果と EPa45

bacterium 属 EPa45 株 (Kato et al.. 2015b) と非分解 Burk-

株の GI 現象と Bcrs1W 株による SGI 現象の知見をもとholderia 属 Bcrs1W 株 (Ohtsubo et al., 2016) を単離した．

に,両現象の更なる解析,そして,両現象に関して,ゲ各株の単独並びに共培養系を用いた解析の結果,(1)ノムレベルの遺伝子発現の観点からの検討と細菌界におEPa45 株はフェナントレン存在時に生育阻害を受ける

ける広範な存在性の検討を実施した．

Growth Inhibition (GI) 現象[フェナントレン最小寒天培

実験方法

地でのコロニー形成単位 (cfu) が栄養寒天培地の場合に比べて 10 倍減少]を示すが,共存 Bcrs1W 株が本 GI 現
3

象を緩和する Suppression of Growth Inhibition (SGI) 現

使用菌株と培養条件

象[EPa45 株のフェナントレン含有最小寒天培地での cfu

本研究で使用したほとんどの細菌株は研究室保存菌株

は EPa45 株単独時に比べて Bcrs1W 株共存時に 10 倍増である．大腸菌は K12 株由来の野生型 BW25113 株並び加](Fig. 2),そして,(2) EPa45 株のフェナントレン分にその誘導体である (Baba et al., 2006)．菌株は 30℃の

解 能 が Bcrs1W 株 共 存 時 に 増 強 さ れ る Acceleration of

好気条件で培養した．完全液体培地としては 1/3LB 培

Degradation by Non-degrader (ADN) 現 象[フェナント

地 (Nagata et al., 2014) を用い,最小液体培地としては

レン最小液体培地での EPa45 株によるフェナントレン

M9 培地 (Komatsu et al., 2003) で炭素・エネルギー源と消失は EPa45 株単独時に比べて Bcrs1W 共存時に早い]

してフェナントレン,ナフタレン,ビフェニル,またはカルバ(Fig. 3),を見出した ( 加藤ら,2015)．また,米国土

ゾールを 2.5 mM の濃度で用いた．なおフェナントレンは溶壌由来で我々が様々な研究に用いてきた Burkholderia

解度がたいへん低いためジメチルスルホキシドを溶媒に用

multivorans ATCC 17616 株 (Kishida et al., 2017; Nagata

いて溶かした．液体培地に最終濃度 1.5%になるように精3製寒天末 (ナカライ)を加えることで固体培地を調製した．
培養液でのフェナントレン量測定
フェナントレンを添加した細菌培養液に当量の酢酸エチルを添加し,ボルテックスで良く撹拌後に遠心し,回収した酢酸エチル画分を GC/MS 装置 (GP2010, Shimadzu)

Fig. 2. Colony formation of Mycobacterium EPa45 with and without Burkholderia Bcrs1W on Phn-containing and non-containing M9 minimal agar plates. (A) Colony formation on
M9 minimal agar plates. (B) Colony formation on M9 Phn
minimal agar plates. Dilution rates of the EPa45 cell suspension are shown below each panel. “None” means no inoculation of EPa45 cells. “+” at the left of each panel indicates the co-cultivation with Bcrs1W cells. See Materials
and Methods for details. The photographs were taken using transmitted light, and only the EPa45 colonies werevisible. Note that very minute colonies of Bcrs1W werevisible and invisible on the photographs when the reflected
and transmitted light conditions, respectively, were used.

Fig. 3.

－ 49 －

Enhanced degradation of Phn by Mycobacterium EPa45
in the presence of Burkholderia Bcrs1W. Degradation of
Phn was monitored using GC-MS. only E, cultivation of
EPa45; only B, cultivation of Bcrs1W; E+B, co-cultivation of both strains; and none, no inoculation of bacterial strains. Three independent experiments were performed.

津

田

雅

孝

で分析した (Nagayama et al., 2015)．

非分解菌の生育能強度と SGI 効果強度の検討

DNAとRNAの調製，ならびに定量的逆転写PCR (qRT-PCR)

Index) 」は,OD660 値を 1.0 に調整した当該株の 10 倍毎

これらは常法に従った (Kato et al., 2015a; Sato et al.,の希釈液 5 μL をフェナントレン添加 M9 寒天培地の接種

本研究における非分解菌株の「生育能強度 (Growth

し,10 日後の培養時に微小コロニー形成可能な最大希2017)．

釈率として定義した．一方,SGI 効果は生育能強度算出
ゲノム配列の決定と RNA-seq 解析に用いた非分解菌株の 10 倍毎の希釈液と OD660 値を 1.0

配列決定にはイルミナ社の MiSeq あるいはロシュ社のに調整した EPa45 株細胞懸濁液の 104 倍希釈液とを混合

454 GS FLX Titanium との併用により実施した．ゲノム

後に 5 μL をフェナントレン添加 M9 寒天培地の接種し,DNA から mate-pair と paired-end のライブラリーを構築

10 日後の培養時に EPa45 株のコロニー形成能を検討し後に塩基配列を解読し,GenoFinisher と AceFileViewer

た．そして,本コロニー形成能を賦与可能な非分解菌株の 両 ソ フ ト ウ ェ ア (http://www.ige.tohoku.ac.jp/joho/の最大希釈倍率を SGI 効果強度 (SGI Index) と定義した．

gmProject/gmhomeJP.html) を用いてフィニッシングを

両強度はそれぞれ 3 回の独立した実験で検討した．なお,した．アノテーションは NCBI Microbial Genome Anno-

寒天培地上でのコロニー形成能のデジタル画像化には,

tation Pipeline (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/

分解菌株に関しては反射光を,非分解菌株に関しては透

annotation_prok/) を用いて行った．また,液体または過光を用いて実施した．

固体培地で培養した菌株から調製した RNA を用い,東結果および考察京農業大学生物資源ゲノム解析センターにおいてイルミ
ナ 社 HiSeq 2500 に よ る paired-end シ ー ケ ン シ ン グ でMycobacterium 属 EPa45 株 と Burkholderia 属 Bcrs1W 株

RNA-seq 解析を行った．

のゲノム情報GI 現象と SGI 現象の検討

EPa45 株は 6.2 Mb の環状染色体を有し,約 5,600 のタ

PAH 完全分解 Mycobacterium 属細菌株の GI 現象検出

ンパク質をコードすると推定され,また,16S rRNA 遺に際しては,1/3LB 寒天培地全面で培養した菌株を M9

伝子の配列解析では M. gilvum に分類された (Kato et al.,培地で 2 回洗浄後,OD660 値を 1.0 に調整した細胞懸濁

2015b)．そして,本株はフェナントレンを 7 つの酵素で液を得た．本懸濁液を 10 倍ずつ希釈した系列を作製し,o - フタル酸に,続いて 2 つの酵素によりプロトカテク酸,

各 5 μL をそれぞれ PAH 添加ならびに非添加の M9 寒天

そして多数酵素により β - ケトアジピン酸経由で TCA 回培地に接種後,10 日培養した後のコロニー形成能を観路にまで代謝すると推定された．また,本株ではゲノム察した．前者培地でのコロニー形成能が後者培地に比べサイズが似ている他細菌に比べると毒性が強烈な活性酸て著しく減少した場合に GI 現象が認められたとした．

素種 (reactive oxygen species; ROS) 除去に関連すると

一方,GI 現象発現株に対する共存異種細菌株による想定される酵素遺伝子の数が数個のみという特徴があっ

SGI 現象の検討は,M9 培地で OD660 値を 1.0 に調整した

た．一方,ゲノムサイズが 9.3 Mb であった Bcrs1W 株

後者株懸濁液を 103 倍希釈した後に Mycobacterium 属細は他の多くの Burkholderia 属株に見られるように 3 本の菌懸濁液と混合した．そして,混合液と Mycobacterium

環状染色体から構成されていた (Ohtsubo et al., 2016)．

属細菌のみの懸濁液の各 5 μL をそれぞれ PAH 添加 M916S rRNA 遺伝子の配列解析では B. caribensis に分類さ寒天培地に接種後 10 日培養した．Mycobacterium 属細菌

れ,約 8,000 のタンパク質をコードすると推定され,フェのコロニー形成能がその単独培養時に比べて混合培養時

ナントレン分解の初期段階に必要な酵素遺伝子は見いだに著しく回復した場合に SGI 現象が認められたとした．

せなかった．

SGI 効果消失変異株の探索

EPa45 株のフェナントレンによる GI 現象とゲノム情報発現

OD660 値を 1.0 に調整した EPa45 株細胞懸濁液と SGI

対数増殖期まで増殖させた EPa45 株の液体培養液に効果検証株細胞懸濁液をそれぞれ 104 倍と 103 倍希釈しフェナントレンを添加すると,フェナントレンが消失すた．各希釈液を混合後,5 μL をフェナントレン添加 M9るまでの 12 時間では OD660 値の増加が認められず,そ寒天培地に接種し,10 日後の培地での EPa45 株のコロの 後 OD660 値 が 上 昇 し た (Fig. 4A)． 培 養 液 細 胞 のニー形成能を検討した．このような条件でコロニー形成

LIVE/DEAD 染色 (タカラバイオ) では,フェナントレ

能を EPa45 株に賦与しない変異株を SGI 効果消失変異

ン添加後 5 時間めで死細胞の割合が上昇し,8 時間めで株とした．

はその割合が約 80%に達し,12 時間めには死細胞の割－ 50 －

多環芳香族化合物分解細菌の基質による生育阻害と共存異種細菌による阻害緩和

合が急激に減少していた．従って,フェナントレンその遺伝子の約 2 割はフェナントレン分解に直接関与する酵

ものか,その分解過程で生じた中間産物或いは副産物が素遺伝子群で 50 - 100 倍ほどの増大率であり,このよう細胞毒性を示したと示唆された．ビフェニル分解細菌株

な増大は qRT-PCR 解析でも確認できた．一般に様々なで は ビ フ ェ ニ ル 分 解 過 程 で ROS が 生 成 さ れ る こ と

PAH 分解細菌株において,PAH 存在時にのみ分解酵素(Ponce et al., 2011) から,EPa45 株でもフェナントレン

遺伝子群が転写される (Nojiri et al., 2015) が,このよう分解に伴い ROS が生成され,その結果として細胞死にな機構は EPa45 株にも該当した．また,細胞外に放出至った可能性があった．この可能性は本株で ROS 除去

されて Fe3+ イオンを捕捉するシデロフォアの合成酵素

関連酵素遺伝子が少ないことと整合性がある．EPa45 株

遺伝子や Fe3+ - シデロフォア複合体の細胞内取り込み系,のフェナントレンによる GI 現象への ROS の関与を検討

そして鉄硫黄クラスター合成系などの鉄代謝遺伝子の転するために,フェナントレン添加培養液に過酸化水素除

写も 10 - 44 倍ほど増大しており,さらには,ROS 分解去に関わるカタラーゼや強力な還元能のあるアスコルビに関与する酵素系の一部遺伝子の転写も増大していた．

ン酸を加えたが,両者とも GI 現象を緩和しなかった．

ダイオキシン代替化合物として微生物分解研究に使用さ

ただ,これらの予備的結果では,ROS でも最も細胞毒れるカルバゾールの好気分解が可能な Pseudomonas 属性が強いヒドロキシラジカルの関与は否定できない．

細菌 CA10 株では,そのトランスクリプトーム解析でカ

上記 EPa45 株液体培養でフェナントレン添加後の 8 時

ルバゾール分解時に上記のような鉄の獲得・取り込み系

間目での RNA-seq 解析を行い,フェナントレン非添加

遺伝子の転写増大がおきる (Shintani et al., 2010)．カルのコントロールの当該解析と比較した (Fig. 4B)．そのバゾール分解を司る多くの酵素は鉄硫黄タンパク質であ結果,フェナントレン添加で 5 倍以上の転写が増大・減り,当該酵素の大量発現と機能発揮に際して細胞内の鉄少した遺伝子をそれぞれ 123 と 66 見出した．増大したイオンが酵素に捕捉される結果として細胞内の鉄が減少

Fig. 4.

Transcriptionally up- and down-regulated genes of Mycobacterium EPa45 in the presence of Phn. Three independent experiments
were performed. (A) Phn degradation and growth of EPa45 in 1/3LB medium after the addition of Phn at time point 52 h. Squareand circle: OD660 values with and without the addition of Phn, respectively. Triangle: residual ratio of Phn. Note that cultivation of
EPa45 in 1/3LB started at time point 0 h. (B) RNA-seq analysis-based scattered plots of genes affected by the presence of Phn.
This analysis was carried out using the cells that were recovered at time point 60 h. The genes whose transcription were up- anddown-regulated by more than 5-fold in the presence of Phn are positioned over the upper slash mark and below the lower one,respectively.

－ 51 －

津

田

雅

孝

し,このため細胞が鉄を外部環境から取り入れる機能が系や協調代謝系がよく知られているが,このような類の高まったと考えられている．EPa45 株の転写が増大した

拡散性化合物の異種細菌間交換による SGI 現象発揮の可フェナントレン分解酵素遺伝子群もその産物が鉄硫黄タ能性は低いと強く示唆された．

ンパク質と示唆され,EPa45 株でもフェナントレン分解に伴い細胞内の鉄濃度が著しく低下したのであろう．一

SGI 現象を示す細菌株の探索方,好気呼吸の酸化的リン酸化に関与する NADH デヒ

MixEPa4 の構成細菌株でフェナントレン分解能を有ドロゲナーゼ遺伝子群の顕著な転写量減少が認められたさない 3 株 (Dyella 属 EPa41 株と Pseudolabrys 属 Me6 株,

が,この転写量減少はフェナントレンによる細胞死とのアルカリゲネス科の Bordetella 属 EPa43 株) について,関連性が高いと示唆された．

各株の EPa45 株に対する SGI 現象発揮を検討したところ,効果強度は違うものの,いずれも SGI 現象を示した

SGI 現象発揮に必要な条件(Fig. 5)．MixEPa4 構 成 4 株 中 で Burkholderia 属 の上述のように,Mycobacterium 属 EPa45 株はフェナン

Bcrs1W 株 が 最 も 大 き な SGI 効 果 強 度 を 示 し た た め,

ト レ ン 含 有 培 地 で GI 現 象 を 示 し,Burkholderia 属

MixEPa4 非由来のフェナントレン非分解 Burkholderia

Bcrs1W 株共存により緩和される SGI 現象が認められた属 5 株を用いて検討した結果,いずれも SGI 効果を示しが,本 SGI 現象発現に必要な Bcrs1W 株由来画分等を検た．一方,フェナントレン非分解の Pseudomonas 属細討した．その結果,本株の培養液上清や粗細胞抽出液,

菌 4 株 は い ず れ も SGI 効 果 を 示 さ な か っ た． こ れ ら

オートクレーブ処理した死細胞は SGI 効果を発揮しな

Pseudomonas 株の共存で EPa45 株コロニーが小型化した

かった．また,固体培地上で両株を物理的に離して接種ことから,Pseudomonas 属細菌株が M9 固体培地の寒天した場合には SGI 現象が認められなかった．以上のこと

末にわずかに含まれた炭素源を EPa45 株との競争で奪か ら,Bcrs1W 株 の SGI 現 象 発 揮 に は そ の 生 細 胞 とい 取 っ た と 示 唆 さ れ た． ま た, 大 腸 菌 K-12 株 由 来EPa45 株との直接的接触が必要と判明した．ホモセリン

BW25113 株 (Baba et al., 2006) も強力な SGI 効果を発揮

ラクトンやフェロモン等の固体培地でも物理的拡散が可した (Fig. 5)．

能な低分子性化合物による異種細菌細胞間での情報伝達

Fig. 5.

SGI index of non-Phn-degrader and its growth index using M9 Phn minimal agar plate. Definition of SGI and growth indices (blackand grey bars, respectively) is described in Materials and Methods; the larger indices indicate stronger SGI effect and growthability, respectively, on M9 Phn minimal agar plate. Three independent experiments were carried out for each strain to obtain the
average value with its standard deviation. The first four strains were the members in MixEPa4. E. coli and B. cenocepacia J2315
were derived from humans, and the other strains from various soils.

－ 52 －

多環芳香族化合物分解細菌の基質による生育阻害と共存異種細菌による阻害緩和

Mycobacterium 属細菌の PAH による GI 現象と共存細菌

SGI 現象消失突然変異体の選抜と解析株による SGI 現象

大腸菌では野生型 BW25113 株を親株として破壊可能

本研究過程で EPa45 株が,フェナントレンのみならな遺伝子を各々欠失させて 3,884 株からなる Keio collec-

ずナフタレンやビフェニルの完全分解能を有するが,カtion が得られている (Baba et al., 2006)．そこで本 col-ルバゾールの分解能はないことを見出した．ナフタレン

lection を用いて,EPa45 株で見られた GI 現象に対してとビフェニルは EPa45 株に GI 現象を発揮し,本 GI 現

SGI 現象を示さない大腸菌変異株のスクリーニングを行

象は Bcrs1W 株や ATCC 17616 株の共存下で緩和された．

い,SGI 効果消失変異株を 100 程取得した．その 9 割弱

一方,カルバゾールは GI 現象を示さなかった．

はアミノ酸・核酸塩基・ビタミンなどの生合成系遺伝子

EPa45 株の PAH による GI 現象と共存異種細菌株によの欠失,そして,その発現制御に関与する遺伝子の欠失,る SGI 現象が他の Mycobacterium 属細菌株でも該当する

残りは金属イオン取り込み系や DNA の複製・組換え・かを,フェナントレンとナフタレン,ビフェニルの完全修復系の遺伝子の欠失であり,いずれも SGI 現象発揮に分解能を有する米国土壌由来 M. vanbaalenii PYR-1 株

特異的に関わると容易に想定できる遺伝子の変異は見い(Kim et al., 2008) を用いて検討した．その結果,PYR-1

だせなかった．ただ,Keio collection には大腸菌の生育

株は 3 種 PAH に GI 現象を示すとともに,Bcrs1W 株やに必須な遺伝子の欠失変異体は存在せず,このような必ATCC 17616 株が PYR-1 株に対して SGI 現象を示した．

須遺伝子群に SGI 効果を発揮するものが含まれている可以上の結果から,少なくとも PAH 完全分解能を有す能性がある．また,大腸菌ゲノムには同じ機能を支配す

る上記 Mycobacterium 属 2 株では,(1) 毒性のある PAH

る遺伝子が 2 つ以上存在する場合もあり,SGI 効果発揮

自体やその分解産物によって PAH 含有培地でのコロに関与する 1 つの遺伝子を欠失させても別遺伝子の機能

ニー形成能が大きく低下するとともに,(2) これら My-

により SGI 効果が発揮された可能性もあった．

cobacterium 株のコロニー形成能は共存 Burkholderia 属

野生型大腸菌株はフェナントレン含有 M9 寒天培地で細菌株によって大幅に緩和される,というおそらく普遍

微小コロニーを形成したが,SGI 効果消失変異株の微小性のある微生物現象の存在が強く示唆できた．なお前述

コロニー形成能は様々な割合で著しく減少していたの人工的汚染化土壌からフェナントレン完全分解能のあ(Fig. 6A)．そして,変異株での微小コロニー形成能のる Burkholderia HB-1 株 (Ohtsubo et al., 2015) を単離し度合い (生育能強度) は EPa45 株に対する SGI 効果発揮ていたが,本株はフェナントレンによる GI 現象を示さの 度 合 い (SGI 効 果 強 度) と 正 の 相 関 を 示 し た (Fig.

なかった．

6B)．このような大腸菌で観察された現象は,B. multi-

Fig. 6.

Colony formation of SGI-defective mutants of E. coli on M9 Phn minimal agar plate and SGI effect of the E. coli mutants on thecolony-forming ability of Mycobacterium EPa45. (A) Inoculation of only E. coli mutant. (B) Co-inoculation of EPa45 with E. coli
mutant. Dilution rates of E. coli cell suspension are depicted to the left of each panel. Box indicates the place where the E. coli
mutant or EPa45 colonies were formed at the highest dilution rate of E. coli suspension. The photographs were taken under thereflected and transmitted light conditions so as to observe the minute colonies of E. coli (in panel A) and only the EPa45 colonies(in panel B), respectively.

－ 53 －

津

田

雅

孝

vorans ATCC 17616 株 と そ の 栄 養 要 求 性 突 然 変 異 株(1)Epa45 株単独の場合には,上記液体培地で取得した(Komatsu et al., 2003) を 用 い た 場 合 で も 認 め ら れ た

場合と同様の結果を得た．

(Fig. 7)．さらに,他の SGI 効果を示した広範な前述細(2)ATCC 17616 株単独の場合には,フェナントレン添

菌株においても,フェナントレン添加 M9 寒天培地での加により転写が 5 倍以上増大した遺伝子は 20 に満たな

生 育 能 強 度 と SGI 効 果 強 度 の 間 に 正 の 相 関 が あ っ た

かったが,この中には複数抗生物質の細胞外排出に関与(Fig. 5)．フェナントレン含有 M9 寒天培地を用いて検する薬剤排出トランスポーターを支配する遺伝子群が存討した各種細菌株の SGI 効果発揮には EPa45 株との直在した．複数抗生物質の細胞外排出に関わる当該トラン接的接触が必要であったが,各種細菌株の細胞表層にス ポ ー タ ー の 存 在 が Burkholderia 属 で 知 ら れ て い る

フェナントレンが吸着されることが SGI 現象に繋がって(Schweizer, 2012) が,このような系が PAH 排出にも関いるのかもしれない．この可能性の妥当性を各種細菌株

与する可能性を本研究で初めて示した．数種の抗生物質

表層へのフェナントレン吸着の定量化で検討するとともが PAH と化学構造に類似性を示すことを踏まえると,に,該当時には吸着に関与する細胞機能を明らかにしてこの可能性は妥当といえるかもしれない．

いきたい．ただ,自然環境には栄養要求性細菌がほとん(3) 単独株時にフェナントレン存在下で認められ各株のど存在しないことを踏まえると,生育能と SGI 効果の強転写増大遺伝子の転写は,両株共存時でフェナントレン

度間での相関性提示はたぶんに実験室系に限定されたも存在条件においても増大していた．

のであり,自然界での現象にそのまま該当させるには隔(4) 両株共存でフェナントレン存在時に特異的に転写増たりが大きいといえよう．従って,細胞表層へのフェナ

大していた遺伝子が見出された．Epa45 株では,ロダニー

ントレン吸着以外の機構による SGI 効果発揮を念頭におゼスーパーファミリーに属するタンパク質 RdhA の遺伝

いた別の視点からの解析が必要である．

子が該当した．本スーパーファミリータンパク質は細胞の酸素ストレスに耐性を賦与する (Cereda et al., 2007)

固体培地での共培養時におけるゲノム情報発現とされ,共存していた ATCC 17616 株が何らかの未知機

Epa45 株 の フ ェ ナ ン ト レ ン に よ る GI 現 象 に 対 する

構で EPa45 株の ROS による酸素ストレスを誘導した可ATCC 17616 株の SGI 現象に関して,両株のゲノムレベ能性が推定された．一方,ATCC 17616 株では,フタルルでの遺伝子転写変動を検討した．このために,フェナ酸をプロトカテク酸経由で分解するための遺伝子群が該

ントレン添加と非添加の M9 寒天培地で各株単独または当した．ちなみに本遺伝子群はフタル酸により転写誘導

両株共存で培養したときの RNA-seq 解析をおこなった．

さ れ る こ と が 判 明 し て い る (Nishiyama et al., 2010)．

そのデータの初歩的解析で以下の点が判明した．

EPa45 株のフェナントレン分解過程で中間産物としての
フタル酸蓄積を予備的実験で見出しており,本産物が共存 ATCC 17616 株のフタル酸分解系遺伝子群の転写誘導に関与したと推定された．ただ,EPa45 株のフェナント
レン分解は ATCC 17616 株共存で促進されない知見 (上述) を踏まえると,EPa45 株フェナントレン分解経路で分解が順調に進行しないために細胞内に蓄積したフタル酸以前の中間産物の毒性を ATCC 17616 株が何らかの機構で除去し,その結果としての ATCC 17616 株 SGI 効果発揮に至った可能性がある．
以上のような転写量が顕著に増加する遺伝子に関する予備的な成果は qRT-PCR 等で詳細に検証する必要があり,また,転写量が顕著に減少する遺伝子の提示・検証とその解析が今後必要である．また,EPa45 株のフェナ
ントレン分解能消失株やフェナントレン耐性株,そしてFig. 7.

SGI index of SGI-defective non-Phn-degrader and its
growth index using M9 Phn minimal agar plate. SGI
and growth indices are depicted as black and grey bars,
respectively. See Komatsu et al. (2003) for the transposon-inserted auxotrophic mutants of B. multivorans
ATCC 17616.

ROS 除去系の欠損・過剰株の単離・解析,さらには,ATCC 17616 を含む Burkholderia 株の SGI 効果特異的消失株の単離・解析を実施することで,GI 現象とこれに対応する SGI 現象をそれぞれ支配する分子機構の詳細な提示をめざす予定である．

－ 54 －

多環芳香族化合物分解細菌の基質による生育阻害と共存異種細菌による阻害緩和

要2) 守屋梓,小川なつみ,加藤広海,大坪嘉行,永田裕二,
津田雅孝．2016. フェナントレン分解細菌 Burkholderia sp.
HB-1 株のゲノムと芳香属分解遺伝子の解析．
(ポスター発表)第 10 回日本ゲノム微生物学会年会(3 月 4 - 5 日,東京)
3) 小川なつみ,加藤広海,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝．
2016．遺伝学的解析を用いた芳香族化合物分解コンソー
シアムにおける分解菌と非分解菌の共在機構の解明．
(ポスター発表)第 10 回日本ゲノム微生物学会年会( 3 月 4-5日,東京)4) 大坪嘉行,加藤広海,永田裕二,津田雅孝．土壌細菌叢
変動とレジームシフト．2016.第 89 回日本細菌学会総会(3月 22-25,大阪)
5) 小川なつみ,加藤広海,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝．
2016. フェナントレン分解コンソーシアムに存在する非分解菌の分解菌に対する効果．(ポスター発表)日本農芸化学会 2016 年度大会( 3 月 27-30 日,札幌)
6) 守屋梓,小川なつみ,加藤広海,大坪嘉行,永田裕二,
津田雅孝．2016. フェナントレン分解コンソーシアム MixEPa4 における構成細菌間の相互作用．(ポスター発表)日
本農芸化学会 2016 年度大会( 3 月 27-30 日,札幌)
7) 小川なつみ,石毛太一郎,加藤広海,大坪嘉行,永田裕二,
吉川博文,津田雅孝．2017. フェナントレン分解細菌 Mycobacterium sp. EPa45 株のフェナントレンに対する転写応答．(ポスター発表)第 11 回日本ゲノム微生物学会年会(3月 2-4 日,藤沢)
8) 池内倫子,小川なつみ,加藤広海,大坪嘉行,永田裕二,
津田雅孝．2017.フェナントレン分解細菌の基質耐性突然変異株の取得と解析．(ポスター発表)第 11 回日本ゲノム微生物学会年会( 3 月 2-4 日,藤沢)
9) 小川なつみ,加藤広海,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝．
2017. フェナントレン分解細菌の生育阻害の緩和に対する
非分解細菌の生細胞の重要性．日本農芸化学会 2017 年度
大会( 3 月 17-20 日,京都)

約

芳香族系化合物による人工的汚染化土壌由来のフェナ
ントレン分解コンソーシアム MixEPa4 を構成していたフェナントレン完全分解 Mycobacterium 属 EPa45 株はフェナントレンによる生育阻害 (GI) 現象を示し,本現
象 は MixEPa4 由 来 の 非 分 解 Burkholderia 属 Bcrs1W 株
共存で緩和される SGI 効果を見出していた．本研究では,両現象の更なる詳細な解析とともに,両現象の普遍的存在の有無の検討を実施した．EPa45 株のゲノム解析で本株のフェナントレン分解経路と分解酵素・遺伝子を推定し,RNA-seq 解析で本推定の妥当性を示した．本株のフェナントレンによる GI 現象時には菌の細胞死がおきていた．この細胞死を惹起するひとつの可能性として,毒性のあるフェナントレン自体あるいはその分解中間産物でフタル酸以前の未同定毒性産物によって上昇した活性酸
素種 (ROS) の関与が示唆された．一方,Bcrs1W 株のSGI 効果発揮には,その生細胞の EPa45 株との物理的接触が必要であった．また,B. multivorans ATCC 17616
株を含む分類学的に広範な細菌株が生育阻害緩和 (SGI)
効果発揮能を備えていたが,各株の SGI 効果強度はこれを検定するために用いた培地での各株の生育能強度と正の相関性を示した．他方,EPa45 株と ATCC 17616 株の共存時にフェナントレンが存在すると,前者株での酸素ストレス除去系発現の上昇が RNA-seq データの初歩的解析で示唆され,本除去系発現上昇に後者株が何らかの機構で寄与していると推定された．以上の研究で示唆・推定された点に関して EPa45 株のフェナントレン非分解や耐性の変異株の取得・解析などで今後検討する必要がある．本研究ではさらに,EPa45 株はフェナントレン
以外に完全分解可能な他 2 種の多環芳香族炭水化物(PAH) に対しでも GI 現象を示すとともに,本現象を上記 2 種の Burkholderia 株が緩和できること,そして,3種 PAH の完全分解可能な別の Mycobacterium 属細菌株
もいずれの PAH に対する GI 現象とこれら GI 現象に対する 2 種 Burkholderia 株の SGI 効果発揮を示した．このように,PAH による GI 現象とこれに対応する SGI 現象
に関しては,少なくとも研究対象にした 2 種 Mycobacterium 属細菌株で該当する知見を得た．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 加藤広海,小川なつみ,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝．
2015. メタゲノム情報を基盤とした汚染土壌の細菌コン
ソーシアムの研究．(ポスター発表)第 30 回日本微生物生態学会年次大会( 10 月 17-20 日,土浦)

原著論文
1) Kato, H., Ogawa, N., Ohtsubo, Y., Oshima, K., Toyoda,A., Mori, H., Nagata, Y., Kurokawa, K., Hattori, M., Fujiyama,
A. & Tsuda, M. 2015. Complete genome sequence of aphenanthrene degrader, Mycobacterium sp. strain EPa45(NBRC 110737), isolated from a phenanthrene-degrading
consortium. Genome Announc. 3: e00782-15.
2) Kato, H., Mori, H., Maruyama, F., Toyoda, A., Oshima, K.,
Endo, R., Fuchu, G., Miyakoshi, M., Dozono, A., Ohtsubo,Y., Nagata, Y., Hattori, M., Fujiyama, A., Kurokawa, K. &Tsuda, M. 2015. Time-series metagenomic analysis reveals
robustness of soil microbiome against chemical disturbance.
DNA Res. 22: 413-424.
3) Ohtsubo, Y., Moriya, A., Kato, H., Ogawa, N., Nagata, Y.
& Tsuda, M. 2015. Complete genome sequence of aphenanthrene degrader, Burkholderia sp. HB-1 (NBRC
110738). Genome Announc. 3: e01283-15.
4) Ohtsubo, Y., Nonoyama, S., Ogawa, N., Kato, H., Nagata,Y. & Tsuda, M. 2016. Complete genome sequence of
Burkholderia caribensis Bcrs1W (NBRC110739), a strain
co-residing with phenanthrene degrader Mycobacterium sp.
EPa45. J. Biotechnol. 228: 67-68.

－ 55 －津田

その他
1) 加藤広海,小川なつみ,津田雅孝．2015. メタゲノム情報を基盤とした土壌細菌コミュニティの解析.日本微生物
生態学会誌 30: 57-64.
2) 加藤広海,津田雅孝．2017．土壌細菌叢メタゲノムの時間的変動．生体の科学 68: 160-164.
3) 加藤広海,津田雅孝．2017．土壌細菌叢の化学的撹乱に対するロバスト性．化学と生物 55: 466-467.

保存機関に寄託した菌株
Mycobacterium sp. EPa45 (NBRC 110737) と Burkholderia sp. HB-1 (NBRC 110738) ,Burkholderia sp. Bcrs1W(NBRC 110739) を (独) 製品評価基盤機構 Biological Resource Center に寄託した．

謝辞

本研究実施に当たりまして研究助成をして頂きました
公益財団法人発酵研究所に深く御礼申し上げます．また,本研究実施に大きく尽力して頂いた小川なつみ氏と加藤
広海氏,大坪嘉行氏を始めとする東北大学大学院生命科
学研究科の研究に携わって頂いた関係者の皆様に感謝い
たします．

文

献

Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M.,
Datsenko, K. A., Tomita, M., Wanner, B. L. & Mori, H. 2006.
Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene
knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2:
2006.0008.
Cereda, A., Carpen, A., Picariello, G., Iriti, M., Faoro, F., Ferranti,
P. & Pagani S. 2007. Effects of the deficiency of the rhodaneselike protein RhdA in Azotobacter vinelandii. FEBS Lett. 581:
1625-1630.
Kato, H., Mori, H., Maruyama, F., Toyoda, A., Oshima, K., Endo,R., Fuchu, G., Miyakoshi, M., Dozono, A., Ohtsubo, Y., Nagata,Y., Hattori, M., Fujiyama, A., Kurokawa, K. & Tsuda, M. 2015a.
Time-series metagenomic analysis reveals robustness of soil
microbiome against chemical disturbance. DNA Res. 22: 413-424.
Kato, H., Ogawa, N., Ohtsubo, Y., Oshima, K., Toyoda, A., Mori,
H., Nagata, Y., Kurokawa, K., Hattori, M., Fujiyama, A. & Tsuda,
M. 2015b. Complete genome sequence of a phenanthrene
degrader, Mycobacterium sp. strain EPa45 (NBRC 110737),
isolated from a phenanthrene-degrading consortium. Genome
Announc. 3: e00782-15.
加藤広海,小川なつみ,津田雅孝．2015.メタゲノム情報を基盤とした土壌細菌コミュニティの解析.日本微生物生態学会
誌 30: 57-64.
Kim, S. J., Kweon, O., Jones, R. C., Edmondson, R. D. & Cerniglia
C. E. 2008. Genomic analysis of polycyclic aromatic hydrocarbon
degradation in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. Biodegradation

雅孝
19: 859-881.
Kishida K., Inoue, K., Ohtsubo, Y., Nagata, Y. & Tsuda, M. 2017. Host
range of the conjugative transfer system of IncP-9 naphthalenecatabolic plasmid NAH7 and characterization of its oriT region
and relaxase. Appl. Environ. Microbiol. 83: e02359-16.
Komatsu, H., Imura, Y., Ohori, A., Nagata, Y. & Tsuda, M. 2003.
Distribution and organization of auxotrophic genes on themultichromosomal genome of Burkholderia multivorans ATCC
17616. J. Bacteriol. 185: 3333-3343.
Mori, H., Maruyama, F., Kato, H., Toyoda, A., Dozono, A., Ohtsubo,Y., Nagata, Y., Fujiyama, A., Tsuda, M. & Kurokawa, K. 2014.
Design and experimental application of a novel non-degenerate
universal primer set that amplifies prokar yotic 16S rRNA
genes with a low possibility to amplify eukaryotic rRNA genes.
DNA Res. 21: 217-227.
Nagata, Y., Senbongi, J., Ishibashi, Y., Sudo, R., Miyakoshi, M.,
Ohtsubo, Y. & Tsuda, M. 2014. Identification of Burkholderia
multivorans ATCC 17616 genetic determinants for fitness insoil by using signature-tagged mutagenesis. Microbiology 160:
883-891.
Nagayama, H., Sugawara, T., Endo, R., Ono, A., Kato, H., Ohtsubo,Y., Nagata, Y. & Tsuda, M. 2015. Isolation of oxygenase
genes for indigo-forming activity from an artificially polluted
soil metagenome by functional screening using Pseudomonas
putida strains as hosts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99: 44534470.
Nishiyama, E., Ohtsubo, Y., Nagata Y. & Tsuda, M. 2010.
Identification of Burkholderia multivorans ATCC 17616 genes
induced in soil environment by in vivo expression technology.
Environ. Microbiol. 12: 2539-2558.
Nojiri, H., Tsuda, M., Fukuda, M. & Kamagata, Y. (ed.) 2015. Biodegradative Bacteria: How Bacteria Degrade, Survive, Adapt,and Evolve. Springer-Verlag, Tokyo.
Ohtsubo, Y., Moriya, A., Kato, H., Ogawa, N., Nagata, Y. & Tsuda,
M. 2015. Complete genome sequence of a phenanthrene
degrader, Burkholderia sp. HB-1 (NBRC 110738). Genome Announc. 3: e01283-15.
Ohtsubo, Y., Nonoyama, S., Ogawa, N., Kato, H., Nagata, Y. &Tsuda, M. 2016. Complete genome sequence of Burkholderia
caribensis Bcrs1W (NBRC110739), a strain co-residing withphenanthrene degrader Mycobacterium sp. EPa45. J. Biotechnol. 228: 67-68.
Ponce, B. L., Latorre, V. K., Gonzalez, M. & Seeger, M. 2011. Antioxidant compounds improved PCB-degradation by Burkholderia
xenovorans strain LB400. Enzyme Microb. Technol. 49: 509516.
Sato, T., Nonoyama S., Kimura, A., Nagata, Y., Ohtsubo, Y. & Tsuda,
M. 2017. The small protein, HemP, is a transcriptional activator
for the hemin uptake operon in Burkholderia multivorans ATCC
17616. Appl. Environ. Microbiol. 83: e00479-17
Schweizer, H. P. 2012. Mechanisms of antibiotic resistancein Burkholderia pseudomallei: implications for treatment of
melioidosis. Future Microbiol. 7: 1389-1399.
Shintani, M., Takahashi, Y., Tokumaru, H., Kadota, K., Hara, H.,
Miyakoshi, M., Naito, K., Yamane, H., Nishida, H. & Nojiri,
H. 2010. Response of the Pseudomonas host chromosomaltranscriptome to carriage of the IncP-7 plasmid pCAR1. Environ.
Microbiol. 12: 1413-1426.

－ 56 －

IFO Res.Commun. 31
57-66, 2017

窒素循環研究のパラダイムシフトを目指した未培養性硝化細菌の網羅的高速ハンティング常田聡

早稲田大学先進理工学部生命医科学科〒162-8480

東京都新宿区若松町2-2

早稲田大学先端生命医科学センター

Comprehensive and High-Throughput Hunting of Uncultured Nitrifiers
for Paradigm Shift in Nitrogen Cycle Research
Satoshi Tsuneda
Department of Life Science and Medical Bioscience,
School of Advanced Science and Engineering, Waseda University
2-2 Wakamatsu-cho, Shinjuku-ku, Tokyo 162-8480, Japan
Nitrification is an important reaction in the biological nitrogen removal process in wastewater treatment plants(WWTPs). As ammonia-oxidizing microbes are slow-growing and sensitive to environmental factors such as freeammonia, pure strains are hard to obtain, preventing our understanding of their physiological characteristics. To
conquer this hurdle, we report a high-throughput isolation technique based on scattering signatures, which
exploits the tendency of many ammonia-oxidizing bacteria (AOB) to form microcolonies in activated sludge. The
AOB microcolonies were directly sorted from the activated sludge without long incubation and enrichment bias,
and were sequentially inoculated into 96-well microtiter plates containing growth medium. Phylogenetic analysis of
the pure strains isolated in this study revealed a deeply branching and unrecognized lineage and diversity within
the genus Nitrosomonas, beyond our expectation.
Key words: activated sludge, isolation, microcolony, nitrification, Nitrosomonas緒

ア酸化は排水処理施設の窒素除去において律速段階であ言ると認識されている( Wagner et al., 1995 )．排水処理施設に流れ込むアンモニアは,自然環境中のアンモニアよ硝化反応は,排水処理施設の生物学的窒素除去プロセ

りも低濃度であることから( Wells et al., 2009 ),排水処

スにおいて重要な反応である．硝化反応は,アンモニア

理施設では AOA よりも AOB が優占していることが多い

酸化古細菌(AOA )とアンモニア酸化細菌(AOB )によっ

( Mußmann et al., 2011 )．したがって,水処理効率を向てアンモニアを亜硝酸に変換するアンモニア酸化反応,

上させるためには排水処理施設に棲息する AOB の生理

亜硝酸酸化細菌( NOB )によって亜硝酸を硝酸に変換

生態学的性質を理解することが重要である．また,新規する亜硝酸酸化反応の 2 つのステップで構成されていに発見された Comammox 細菌については知見が乏しる．近年,一種の細菌がアンモニア酸化と亜硝酸酸化のく,排水処理施設においてどの程度優占しているのか不両方を行うことができる Comammox 細菌が発見され明であるため,今後の研究が期待される．

( Daims et al., 2015; van Kessel et al., 2015 ),窒素循環に

近年,16S rRNA 遺伝子や amoA 遺伝子に基づいた分関わる微生物生態の研究は大きな変革期を迎えている．

子生物学的なアプローチや in situ 生理解析によって,一般的に,AOB は増殖速度が遅く,アンモニアのよう

活性汚泥中の AOB の種の多様性が明らかになってきた．

な様々な環境因子に対して感受性が高いため,アンモニ

しかし,遺伝子ベースで明らかにされる多様性に比べ,純粋分離された分離株の種類は極めて少ない( Suwa etE-mail: stsuneda@waseda.jp
共同研究者：藤谷拓嗣(早稲田大学ナノ・ライフ創新研究機構)

al., 1994; Koops & Harms, 1985 )．排水処理施設における窒素除去の安定性は,AOB の種の多様性によって維－ 57 －

常田

持されているにも関わらず,分離株の不足が個々の聡り,活性汚泥サンプル 100 mL を 2014 年 4 月,2014 年 7 月,

AOB を対象にした生理学的性質の理解を妨げる大きな2014 年 10 月,2015 年 1 月に採取した．以後,これらの要 因 と な っ て い る( Suwa et al., 1997; Koops & Pom-

サ ン プ ル は Apr-AS,Jul-AS,Oct-AS,Jan-AS と 呼 ぶ．

merening-Röser, 2001; Kowalchuk & Stephen, 2001 )．従

全てのサンプルは採取後,分離培養のために速やかに培来,平板プレートや限界希釈法などの古典的な培養法に地を含んだマイクロタイタープレートにマイクロコロ

よって AOB 分離株は獲得されてきたが,新しい分離培

ニーを播種した．培地組成は,「 AOB スクリーニングと養手法の開発が新規な AOB の獲得を可能にするかもし継代培養」の項目で記載した．その後,DNA 抽出のたれない．

めに,活性汚泥サンプル 10 mL を -80 ℃の冷凍庫で保存

私たちの研究グループでは,セルソーターの散乱光をし,残りの活性汚泥サンプル 10 mL は FISH 解析による用いてマイクロコロニーを分取する新しい分離培養手法

顕微鏡観察のため,4 %のパラホルムアルデヒドによっを開発してきた．排水処理施設の活性汚泥から集積したて固定し,-4 ℃で保存した( Amann et al., 1990 )．

NOB の Nitrospira( Ushiki et al., 2013; Fujitani et al.,2014 ),および微生物固定化担体として有効な硝化グラ

DNA 抽出ニュールから AOB の Nitrosomonas mobilis の分離株の獲ISOIL extraction kit(ニッポンジーン)を用い,付属得に成功した( Fujitani et al., 2015 )．本手法は,これまのプロトコルに準拠し,Apr-AS,Jul-AS,Oct-AS,Jan-で培養の難しい硝化細菌を単離する上で,きわめて有効AS から DNA を抽出した．DNA 濃度は NanoDrop 分光

なアプローチであった．しかしながら,マイクロコロニー

光度計(Nanodrop Technologies Inc. )を用いて計測した．

を分取するまでに数年間という長期間の集積培養を経ており,集積培養によるバイアスでごく一部の細菌しか獲アンプリコンシーケンスと系統解析得することができなかった．こうした障壁を乗り越える

16S rRNA 遺伝子の V1-2 領域をターゲットとした For-

ために,私たちは活性汚泥に棲息する多くの硝化細菌がward プ ラ イ マ ー 及 び Reverse プ ラ イ マ ー を 用 い て,

マイクロコロニーを形成していることに着目した(Okabe

DNA 抽出物を増幅させた．増幅産物を対象に,次世代

et al., 1999; Coskuner et al., 2005; Maixner et al., 2006;

シーケンサー( Ion Torrent; Life Technologies, Carlsbad,

Gruber-Dorninger et al., 2015 )．もし,活性汚泥サンプ

CA, USA )によって塩基配列を決定した．続いて,同一ルを直接セルソーターに供試しマイクコロニーを分取す

菌種のシーケンスを 1 つの Operational Taxonomic Unit

ることができれば,未培養な硝化細菌を分離培養する効( OTU )とみなし,macQIIME を用いて UCLUST 解析率が高まるのではないか,と着想した．実際に,嫌気 /アルゴリズムに従い相同性 97%以上のシーケンスを 1

無酸素 / 好気循環型処理( A2O )プロセスで運転され

つ の OTU に ま と め た． 活 性 汚 泥 に 棲 息 す る Nitroso-ている活性汚泥をサンプルソースとして,集積培養を介monas 属の系統樹を作成するために,Nitrosomonas 属のさず直接マイクロコロニーの分取を試みたところ,Ac-

シーケンスのみを抽出した．抽出したシーケンスから,

cumulibacter や Nitrospira が形成するマイクロコロニー

DNA Data Bank of Japan (DDBJ) にて BLAST 検索するを散乱光で選択的に分取することが可能であった( Irie

ことで,近縁種,並びに近縁のクローンを探索した．つet al., 2016 )．

づいて,MEGA6( Tamura et al., 2013 )を用いて,マル本研究では,活性汚泥サンプルから AOB マイクロコ

チプルアライメントを行った．遺伝的距離の計算にロニーを直接分取する技術を報告する．さらに,本技術

p-distance モデルを使用し,塩基配列に基づいた系統樹を用いて獲得した AOB の系統学的な解析を行ったとこ

作成に近接結合( NJ )法を用いた．Bootstrap number

ろ,Betaproteobacteria 綱に属し,今まで同定されなかっは 500 とした．

た新規な AOB を 3 種発見することに成功した．本研究で分離培養された新規な AOB は,特徴的な生理学的性

蛍光プローブの設計作成した系統樹に基づいて,Nitrosomonas 属をクラス

質を保持している可能性が示唆された．これらの新しい種の存在が,複雑極める排水処理施設での窒素除去プロ

ター分類し,クラスター毎に Nitrosomonas 属を特異的

セスの安定性に貢献しているのかもしれない．

に染色できるように蛍光プローブを設計した( Abe etal., 2017 )．設計したプローブは,5’ 末端及び 3’ 末端を実験方法

Cy-3 で 標 識 し た．Tm 値 と ホ ル ム ア ミ ド 濃 度 は Oligo
Calculator( http://www.ngrl.co.jp/tools/0217oligocalc.

サンプリング，サンプル調製htm )を使用し,算出した．また,汚泥中の全ての微生硝化反応が確認されている東京都の排水処理施設よ

物を染めるために,真正細菌を網羅的に検出することが－ 58 －

窒素循環研究のパラダイムシフトを目指した未培養性硝化細菌の網羅的高速ハンティング

可能なプローブである EUB mix を使用した( Daims et2al., 1999 )．EUB mix は 5’ 末端を FITC で標識した．

Jul-AS サンプルにおける培地中のアンモニアの終濃度はMoO4 (24 mg/L）, and H3BO3 (62 mg/L) とした．Apr-AS,

10 mg-N L-1 と し,Oct-AS, Jan-AS は 10 ま た は 50 mg-N
Fluorescence in situ Hybridization（ FISH ）法を用いたL-1 の 2 種類の培地を使用した．培養条件は 23 ℃,暗所,

顕微鏡観察

静置とし,培養期間は 3 ヶ月間とした．

Amann ら( 1990 )に準拠し,蛍光プローブをハイブリ

培養中,アンモニア酸化による亜硝酸生成の有無を確

ダイズし,細胞を染色した．染色したサンプルは蛍光顕

認 す る た め に Griess 試 薬 を 使 用 し た( Shinn, 1941 )．

微鏡または,共焦点顕微鏡を用いて,観察した．FISH

AOB の増殖は FISH 解析によって確認した．純粋培養さにより,特異的に染色された AOB を検出し,画像を保れた AOB が確認された場合,5 mL の培地を含有した

存した．全微生物数に占める AOB の割合を求める際は,25 mL チューブにスケールアップさせ,同条件で培養し最低 10 枚の顕微鏡画像から平均の細胞数を算出するこた．その後,20 mL の培地を含有した 100 mL チューブ,とを三回繰り返した．

500 mL の培地を含有した 2 L 三角フラスコに順次スケー
ルアップさせた．

活性汚泥からのマイクロコロニーの分取
活性汚泥を 1.5 mL チューブに 1.0 mL 分注し,超音波分離株の PCR と系統解析

破砕機を用いて１分間穏やかに分散させた．その後,継代培養に成功したサンプルから加熱処理( 95 ℃,

35 μm ポ ア サ イ ズ の フ ィ ル タ ー (Falcon, Co., Ltd., Na-

10 min )によって DNA を抽出した．16S rRNA 遺伝子配goya, Japan) を用いて大きな凝集体や活性汚泥に含まれ列を 27F/1492R プライマーセットで PCR 法により増幅る堆積物を取り除き,懸濁液を調製した．続いて懸濁液させた．また,amoA 遺伝子配列を amoA-1F/amoA-2R

を セ ル ソ ー タ ー (FACS Aria, BD, Franklin Lakes, NJ,

プライマーセットで増幅させた( Rotthauwe et al., 1997 )．

USA) に供試した．ドットプロットは凝集体の大きさをPCR 産物を精製した後,27F/1492R プライマーセット

表す前方散乱光( Forward Scatter; FSC )と凝集体の内または amoA-1F/amoA-2R プライマーセットを用い,シー部構造の複雑さを表す側方散乱光( Side Scatter; SSC )ケンス解析した．微生物菌叢の同定と近縁種の配列情報の 2 つのパラメーターに基づいて展開させた．この際,は日本 DNA データバンク( DDBJ )を利用した．遺伝ドットプロットは最低でも 10,000 イベントを解析した的距離の計算に p-distance モデルを使用し,塩基配列に結果を表示させた．各エリアに含まれるドットの数が基づいた系統樹作成に NJ 法を用いた．Bootstrap num-

100 イベント以上になるようにドットプロット上に複数

ber は 500 とした．

のエリアを設定した．設定したそれぞれのエリアからス結

ライドガラスにサンプルを播種し,FISH 解析によって果

マイクロコロニーの存在を確認した．分取したマイクロコロニーの割合はダイレクトカウントによって算出し,活性汚泥に棲息する AOB の同定と菌叢解析

最も多くのマイクロコロニーが含まれているエリアを特

活性汚泥サンプルを対象にした菌叢解析では,いずれ定した．最後に,特定したエリアから 96 ウェルプレー

のサンプルにおいても,Proteobacteria 門と Bacteroidetes

トにマイクロコロニーを一つずつ分注し,以下の条件で門が優占的に検出された．既存の AOB として知られて培養を行った．

いる Nitrosomonas 属に分類されたリードは 0.34 - 2.3 %を占めた．一方で,Nitrosococcus 属と Nitrosospira 属は

AOB のスクリーニングと継代培養

今回の解析では検出されなかった．

純粋培養に用いた培地の組成は以下の通りである．まず,

本研究で得られた 57クローンのうち,30クローン( WWTPs

NH4Cl (0.0038 - 0.304 g/L）, NaCl (0.116 g/L） ,MgSO4

clone 1-30 )が Cluster 6a に分類された( Fig. 1 )．Clus-·7H2O （0.04 g/L）, CaCl2·2H2O (0.073 g/L）, KCl（0.038 g/L）,

ter 6a に は, 既 存 株 Nitrosomonas sp. Is79A3 と Nitroso-

KH2PO4 （0.034 g/L) を含む無機培地に,超純水 1 Lで混合

monas sp. AL212 が含まれている．残りの 27 クローン

し,オートクレーブで滅菌した．一方,超純水 1 L に Trace( WWTPs clone 31-57 )は既存株 Nitrosomonas sp. Nm84,

element(1 mL/L) を 添 加し,NaHCO3 (21 g/L) を加 え,

Nitrosomonas sp. JL21 ,Nitrosomonas communis strain

pH を 7.8 - 8.5 の間に調整し,オートクレーブで滅菌した．

Nm2 に対して低い相同性であり,これまでの分離株をTrace element の 組 成 は,FeCl2·6H2O (2 mg/L）, MnCl2

含まない新規なクラスターに位置した( Fig. 1 )．した

·4H 2O （100 mg/L）, CoCl 2·6H 2O (24 mg/L）, NiCl 2·6H2O

がって,WWTPs clone 31-55 は,Unclassified Cluster 1 と(24 mg/L）, CuCl2·2H2O (17 mg/L）, ZnCl2 (68 mg/L）, Na-

して定義し,WWTPs clone 56-57 は,Unclassified Clus-－ 59 －

常Fig. 1

田聡

Phylogenetic tree of the Nitrosomonas OTUs based on 16S rRNA gene sequencing. OTUs containing identical sequences weregrouped as WWTPs clones (bold types). Filled circles on the branch nodes indicate the percentage bootstrap supports for theclades, based on 500 bootstrap resamplings ( > 70%). Numbers in brackets are the GenBank accession numbers of the strains in
the DNA Data Bank of Japan (DDBJ). Asterisks (*, **, ***, and ****) indicate the target organisms of probes Cluster6a_192,
Nmo218, Nsm196, and Nsm153, respectively. Percent indicates the population of trimmed sequences, obtained by dividing the Nitrosomonas reads by the total trimmed sequencesin each month. Brackets indicate the Nitrosomonas clusters defined by Purkhold
et al. (2000). Clones excluded from previous clusters were newly clustered as Unclassified Cluster 1 and Unclassified Cluster 2.
The bar represents 0.02-estimated change per nucleotide.

－ 60 －

窒素循環研究のパラダイムシフトを目指した未培養性硝化細菌の網羅的高速ハンティング

ter 2 として定義した．Cluster 6a と Unclassified Cluster

100 イベント(ドットプロット上で表示される 1 イベン

1 に含まれるクローンは,すべての汚泥サンプルで検出

トは,１つのマイクロコロニー,または１つのシングルされたが,Unclassified Cluster 2 に含まれるクローンは,セルを示す)ずつ分取し,FISH 解析によって Nitroso-

Oct-AS,Jan-AS の み 検 出 さ れ た． ど の ク ロ ー ン も,

monas のマイクロコロニーの割合を算出した．Apr-AS,

Cluster 6b( Nitrosomonas marina ),Cluster 7( Nitroso-

Jul-AS, Oct-AS, Jan-AS のマイクロコロニーの割合はそれmonas europaea ),Cluster 8( Nitrosomonas communis )ぞれ 26.6 %,21.5 %,24.9 %,13.5 %であった．

には属さなかった( Fig. 1 )．
培養サンプルのスクリーニングと純粋培養
活性汚泥に棲息する Nitrosomonas の形態解析

3 ヶ月間培養を行った後,アンモニア酸化反応が生じ活性汚泥から直接マイクロコロニーを分取するために,ているウェルを特定するため,Griess 試薬を用いて全て活性汚泥において Nitrosomonas がマイクロコロニーをのウェルをスクリーニングした．調査した 3800 ウェル

形成しているかどうかを FISH 解析によって確認した．

のうち,Apr-AS 由来のサンプルは 9 ウェル,Jul-AS 由来

Nitrosomonas oligotropha 系統( WWTPs_clone 1-15 )ののサンプルは 4 ウェル,Oct-AS 由来のサンプルは 262細胞を選択的に染色する Cluster 6a_192 プローブ( 5′ウェル,Jan-AS 由来のサンプルは 5 ウェル,合計 280 ウェ-CTT TCG ATC CCC TAC TTT CC-3′ )では,マイクロコ

ルにおいてアンモニア酸化反応が確認された．そこで,ロニーはほとんど確認されず,マイクロコロニーよりも

これらの 280 ウェルから 20 μL ずつサンプルをスライド

他の微生物との凝集体が多く確認された．Nitrosomonas

ガラスに載せ,FISH 解析を用いた顕微鏡観察によってoligotropha 系 統( WWTPs_clone 1-30 ) と Unclassified

AOB が増殖しているかどうか確認した．アンモニア酸

Cluster 1( WWTPs_clone 31-55 )を選択的に染色する化反応が確認された 280 ウェルのうち,249 ウェルにおNmo218 プローブ( 5′-CGG CCG CTC CAA AAG CAT-3′ )いては他の細菌と共存し複数種の微生物が増殖していでは,いずれの汚泥からも複数種で構成する凝集体が頻た．一方で,31 ウェルにおいて純粋な Nitrosomonas 属

繁に確認された．また,Apr-AS, Jul-AS, Oct-AS において,の細菌の増殖が観察された．

直径 2 - 4 μm のマイクロコロニーも検出された．Nitrosomonas oligotropha 系 統( WWTPs_clone 20-30 ) と Un-

分離株の同定純粋培養を確認した 31 ウェルについて 16S rRNA 遺伝

classified Cluster 1( WWTPs_clone 31-55 )を選択的に染色する Nsm196 プローブ( 5′-CGA TCC CCT ACT TTT

子配列に基づいたシーケンス解析を行ったところ,3 種類

C-3′ )では,Apr-AS, Jul-AS, Oct-AS から Nitrosomonas 属の新規な種として同定されることが期待された( Tableのマイクロコロニーが頻繁に検出された．Unclassified

1, Fig. 2 )．それぞれの種の代表株を,Nitrosomonas sp.

Cluster 2( WWTPs_clone 56-57 )を選択的に染色する

NP1( Jul-AS から培養された 4 株のうちの一つ),Nitro-

Nsm153 プローブ( 5′-GGA GTA TTA GCA CAC C-3′ )でsomonas sp. PY1( Apr-AS か ら 培 養 さ れ た 5 株 と Oct-は,マイクロコロニーの数が検出限界を下回っており,

AS から培養された 19 株のうちの一つ),Nitrosomonas

FISH 解析による顕微鏡観察では確認することが出来な

sp. SN1( Oct-AS から培養された 3 株のうちの一つ)とかった．

し て 定 義 し た． 特 に,PY1 株 は 暫 定 的 に,Candidatus

Nitrosomonas 属マイクロコロニーの分取

Nitrosomonas 属の分離株を獲得できなかった．また,

Nitrosomonas yedoensis と 命 名 し た．Jan-AS か ら は
活性汚泥に存在するマイクロコロニーを選択的に分取

Nirosomonas 属以外には,Mycobacterium, Sphingomonas,

するため,超音波破砕機を用いて活性汚泥サンプルを分Actinobacteria などが全ての汚泥サンプルから獲得され散処理し,セルソーターに供試し,ドットプロットを展た．3 つの分離株は,近縁種との相同性が 95%となり,開させた．展開させたドットプロット上で FSC と SSC

Unclassified Cluster 1 に分類された．分離株間の相同性の値が異なる 6 つのエリアを設定した．それぞれのエリは 94.8 - 96.1%であった( Table 1,Fig. 2 )．

アからサンプルを分取した後,顕微鏡観察を行ったとこ

続いて,分離株の amoA 遺伝子配列を決定して解析しろ,浮遊する単一細胞は FSC の値が小さいエリアに集た( Table 1, Fig. 3 )．3 つの分離株は,近縁種との相まることが分かった．また,SSC の値が小さいエリアに同性が 88%であり,分離株間の相同性は 81.0 - 90.1%では Nitrosomonas のマイクロコロニーが多く含まれていあった(Table 1)．また,活性汚泥から獲得されたクロー

た．一方で,FSC,SSC の値が大きいエリアには複数種

ンだけでなく,河川,淡水などの貧栄養環境から獲得さで構成される凝集体が含まれていた．続いて,Nitroso-

れたクローンと高い相同性( 97%)を示していた．NP1

monas のマイクロコロニーが多く含まれるエリアから,

株は貧栄養環境のクローンが形成するグループに,PY1－ 61 －

常Table 1

Fig. 2

田聡

Similarities of pure strains based on 16S rRNA genes and amoA genes

Phylogenetic tree of pure strains within the genus Nitrosomonas based on 16S rRNA genes. Clones and pure strains obtained inthis study are indicated by bold. Numbers in brackets are the GenBank accession numbers of the strains in the DNA Data Bankof Japan (DDBJ). Circular frames indicate the Nitrosomonas clusters based on 16S rRNA gene classification by Purkhold et al.
(2000). The bar represents 0.01-estimated change per nucleotide.

－ 62 －

窒素循環研究のパラダイムシフトを目指した未培養性硝化細菌の網羅的高速ハンティング

Fig. 3Phylogenetic tree of the genus Nitrosomonas based on amoA gene sequencing. Filled circles on the branch nodes indicate thepercentage bootstrap supports for the clades, based on 500 bootstrap resamplings ( > 70%). Numbers in brackets are the GenBank accession numbers of the strains in the DNA Data Bank of Japan (DDBJ). The bar represents 0.1-estimated change per nucleotide.

考察株と SN1 株は活性汚泥由来のクローンが形成するグ
ループに属していた( Fig. 3 )．したがって,獲得した本手法の優位性

分離株の amoA 遺伝子は既存の系統ではなく,新規な系
統に区分されることが明らかになった．

本研究では,次世代シーケンサーによる微生物群集構造解析と FISH 法による顕微鏡観察に基づいて,マイクロコロニーを形成する AOB を選別した．さらに,セル－ 63 －

常田

ソーターによってマイクロコロニーを直接分取すること

聡

様々な Nitrosomonas 属の形態を観察することができた．

で系統学的に新規な AOB の獲得に成功した．一般的に,

つまり,Cluster 6a_192 プローブで検出される細胞は,

AOB は増殖速度が遅く,実験室での培養が困難である．

複数種の凝集体を形成し,Nsm196 プローブで検出され集積培養は標的細菌の細胞数を増大させるのに効果的でる細胞は,マイクロコロニーを形成した．Unclassified

あるが,集積化するのに膨大な時間を要し,集積条件のCluster 1 に属するすべての細胞が対数増殖期にあったバイアスもかかってしまう( Kamagata, 2015 )．また,とは考えにくいことから,マイクロコロニーを形成する

AOB が産生する有機物が従属栄養細菌の炭素源かつエ

能力は,系統学的に保存されているのかもしれない．まネ ル ギ ー 源 に な る こ と か ら( Rittmann et al., 1994;

た,この研究で獲得した分離株は,それぞれ独特な形態

Kindaichi et al., 2004; Okabe et al., 2005; Matsumoto et

的特徴を持っていた．NP1 株は直径 1 μm 以下の小さなal., 2010 ),従属栄養細菌と AOB は共存しやすく,AOB

細胞が planktonic 状態で存在していた．活性汚泥中のマを純化することも困難である．

イクロコロニーを分取して単離していることを鑑みると,本手法は,平板プレートや限界希釈法などの従来の培NP1 株は環境中ではマイクロコロニーを形成していた養方法と比べ,2 つの優位性を持っている．一つは,培が,純粋分離の状態になると浮遊状態に移行したと考え

養開始の段階で,他の細菌やコンタミの存在を排除できられる．一方で,PY1 株と SN1 株は EPS を過剰に産生る点である．一度,96 ウェルプレートの個々のウェルし緩やかに凝集したマイクロコロニーを形成していた．

にマイクロコロニーが分注されれば,他の細菌との競合獲得した 3 種の純粋分離された株については,継代培もなく,標的の細菌を培養することができる．もう一つ

養を繰り返し行い,大量培養することを目指している．

は,寒天などのゲル化剤による毒性を避けることができ大量培養できた株から,随時生理学的な特徴とゲノム特る点である．ゲル化剤はある種の細菌にとって,増殖を性を明らかにしていく予定である．このように,環境サ抑制させるはたらきを持っており( Tamaki et al., 2009;

ンプルから新規な硝化細菌を獲得し,特徴づけを行ってHara et al., 2012 ),特定の細菌ばかり培養されてしまう

いくことは,窒素循環に関わる微生物生態学の重要な研といった偏り(バイアス)が生じやすい．AOB につい

究課題である．

ても同一の培地組成で調製した固体培地では増殖できな

要

いが,液体培地では増殖できることが確認されている

約( Fujitani et al., 2015 )．本研究で獲得された AOB についても,今のところ固体培地での増殖は確認できていない．

本研究では,排水処理施設の活性汚泥を対象に,微生物

興味深いことに,アンモニアの消費が確認できた 262が形成するマイクロコロニーを直接分取することが可能

ウェルのうち,249 ウェルで AOB と一緒に共存する他なハイスループット分離培養技術を開発した．本手法にの細菌を確認した．他の細菌と共存することで,AOB

よって,これまで存在が明らかにされてこなかった,未のアンモニア酸化が促進されていた可能性がある．実際,

培養な AOB を獲得することができた．以下に具体的な

NP1 株と SN1 株は継代過程でアンモニア酸化活性が低要点を挙げる．

下している．分離株自身が産生する亜硝酸や代謝物の蓄

1)包 括 的 な 系 統 解 析 と FISH 観 察 に よ っ て,Nitroso-

積によって,アンモニア酸化活性が低下しているのであmonas 属の細菌を形態的な特徴に基づいて分類した．

れば,NOB や従属栄養細菌との共培養がアンモニア酸

特に,本研究で設計した Nsm196 プローブによって,化活性を高める上で重要なのかもしれない．

活性汚泥中に棲息する Nitrosomonas 属のマイクロコ
ロニーが豊富に検出された．

Nitrosomonas 属の形態的特徴

2)2 種類の散乱光( FSC と SSC )によって,活性汚泥

硝化細菌の形態は,個々の株における増殖過程や環中の微生物群集から,Nitrosomonas 属のマイクロコ

境条件に依存して変化する．Nitrosomonas europaea やロニーを分取することができた．この発見は,蛍光Nitrosospira は対数増殖期にマイクロコロニーを形成し,標識を用いず,環境サンプルからマイクロコロニー

定常期から飢餓状態に入ると分散してしまう(Hesselsøeを形成する未培養な細菌を直接的に分取し,分離培& Sørensen, 1999 )． ま た, 富 栄 養 環 境 で は Nitroso-

養できることを意味している．

monas europaea は浮遊細胞として存在しているのに対

3)本研究で分離培養された株を,16S rRNA 遺伝子とし,Nitrosomonas oligotropha は細胞外高分子物質の産生

amoA 遺伝子に基づき系統解析したところ,既存のが盛んであり,マイクロコロニーの形成が確認されていクラスターに属さない Nitrosomonas 属の細菌であるる(Stehr et al., 1995; Suwa et al., 1994)．驚くべきことに,ことが明らかになった．

本研究において異なる FISH プローブを用いることで,－ 64 －

窒素循環研究のパラダイムシフトを目指した未培養性硝化細菌の網羅的高速ハンティング

本助成で得られた研究成果の報告

謝口頭発表
1) 牛木章友,藤谷拓嗣,諸星知広,常田 聡. 2017. Nitrospira の亜硝酸酸化活性を制御する Quorum-sensing 機構の発見,第 11 回日本ゲノム微生物学会年会,3 月 2-4 日,藤沢
2) Fujitani, H., Abe, T., Ushiki, N. & Tsuneda, S. 2016. Direct
isolation of microcolonies from activated sludge opens thewindow of unrecognized genus Nitrosomonas as ammonia
oxidizers, 16th International society for microbial ecology,
21-26 August, Montreal, Canada
3) Ushiki, N., Fujitani, H., Sekiguchi, Y. & Tsuneda, S. 2016.
Comparative genomic analysis of phylogenetically distinct
two Nitrospira strains isolated from a wastewater treatment
plant, 16th International society for microbial ecology, 21-26
August, Montreal, Canada
4) 藤谷拓嗣,牛木章友,神野 大,安部拓磨,常田 聡.
2016. 新規な分離培養技術によって獲得された硝化細菌の生理・ゲノム特性,環境バイオテクノロジー学会,6 月
13-14 日,広島
5) 牛木章友,藤谷拓嗣,関口勇地,常田 聡 . 2015. 比較ゲ
ノム解析が明らかにする亜硝酸酸化細菌 Nitrospira の生態学的ニッチ,31th Japanese Society Microbial Ecology Annual Meeting and 7th Japan-Taiwan-Korea Symposium on
Microbial Ecology, 17-20 October, Tsuchiura, Japan6) 安部拓磨,牛木章友,藤谷拓嗣,常田 聡 . 2015. 新規分離培養手法を用いたハイスループットなアンモニア酸化細菌の獲得,2015 年度環境バイオテクノロジー学会,6 月
29-30 日,東京
原著論文
1) Ishii, K., Fujitani, H., Nakagawa, T., Takahashi, R. & Tsuneda, S. 2017. Enrichment and physiological characterizationof a cold-adapted nitrite oxidizer Nitrotoga sp. from an eelgrass sediment, Appl. Environ. Microbiol. (in press) doi:
10.1128/AEM.00549-17
2) Ushiki, N., Jinno, M., Fujitani, H., Suenaga, T., Terada, A. &Tsuneda, S. 2017. Nitrite oxidation kinetics of two Nitrospirastrains: the quest for competition and ecological niche differentiation, J. Biosci. Bioeng. 123: 581-589.
3) Abe, T., Ushiki, N., Fujitani, H. & Tsuneda, S. 2017. A rapid
collection of yet unknown ammonia oxidizers in pure culture from activated sludge, Water Res. 108: 169-178.
4) Thandar, S. M., Ushiki, N., Fujitani, H., Sekiguchi, Y. & Tsuneda, S. 2016. Ecophysiology and comparative genomics ofNitrosomonas mobilis Ms1 isolated from autotrophic nitrifying granules of wastewater treatment bioreactor, Front. Microbiol. 7: 1869.

保存機関に寄託した菌株
Nitrosomonas mobilis Ms1 = NBRC 112761

辞本研究の遂行にあたり,多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に深く感謝いたします．また,国立研究開発法人産業技術総合研究所の関口勇地博士には,硝化細菌のゲノム解析において多大なるご尽力を賜りました．さらに,東京農工大学工学部化学システム工学科の寺田昭彦准教授には,高感度微小電極の使用や貴重なご助言をいただきました．ここに記して,深く感謝いたします．

文

献Abe, T., Ushiki, N., Fujitani, H. & Tsuneda, S. 2017. A rapid collection of yet unknown ammonia oxidizers in pure culture from
activated sludge, Water Res. 108: 169-178.
Amann, R., Krumholz, L. & Stahl, D. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic,
and environmental-studies in microbiology. J. Bacteriol. 172:762-770.
Coskuner, G., Ballinger, S., Davenport, R., Pickering, R., Solera,
R., Head, I. & Curtis, T. 2005. Agreement between theory andmeasurement in quantification of ammonia-oxidizing bacteria.
Appl. Environ. Microbiol. 71: 6325-6334.
Daims, H., Bruhl, A., Amann, R., Schleifer, K. & Wagner, M. 1999.
The domain-specific probe EUB338 is insufficient for the detection of all Bacteria: Development and evaluation of a morecomprehensive probe set. Syst. Appl. Microbiol. 22: 434-444.
Daims, H., Lebedeva, E., Pjevac, P., Han, P., Herbold, C., Albertsen, M., Jehmlich, N., Palatinszky, M., Vierheilig, J., Bulaev, A.,
Kirkegaard, R., von Bergen, M., Rattei, T., Bendinger, B., Nielsen, P. & Wagner, M. 2015. Complete nitrification by Nitrospirabacteria. Nature 528: 504-509.
Fujitani, H., Ushiki, N., Tsuneda, S. & Aoi, Y. 2014. Isolation ofsublineage I Nitrospira by a novel cultivation strategy. Environ.
Microbiol. 16: 3030-3040.
Fujitani, H., Kumagai, A., Ushiki, N., Momiuchi, K. & Tsuneda, S.
2015. Selective isolation of ammonia-oxidizing bacteria fromautotrophic nitrifying granules by applying cell-sorting andsub-culturing of microcolonies. Front. Microbiol. 6:1159.
Gruber-Dorninger, C., Pester, M., Kitzinger, K., Savio, D., Loy, A.,
Rattei, T., Wagner, M. & Daims, H. 2015. Functionally relevant
diversity of closely related Nitrospira in activated sludge. ISME
J. 9: 643-655.
Hara, S., Isoda, R., Tahvanainen, T. & Hashidoko, Y. 2012. Traceamounts of furan-2-carboxylic acids determine the quality ofsolid agar plates for bacterial culture. PLoS ONE 7: e41142.
Hesselsøe, M. & Sørensen, J. 1999. Microcolony formation as a viability index for ammonia-oxidizing bacteria: Nitrosomonas europaea and Nitrosospira sp. FEMS Microbiol. Ecol. 28: 383-391.
Irie, K., Fujitani, H. & Tsuneda, S. 2016. Physical enrichment of
uncultured Accumulibacter and Nitrospira from activatedsludge by unlabeled cell sorting technique. J. Biosci. Bioeng.
122: 475-481.

－ 65 －

常田Kamagata, Y. 2015. Keys to cultivating uncultured microbes: elaborate enrichment strategies and resuscitation of dormant cells.
Microbes Environ. 30: 289-290.
Kindaichi, T., Ito, T. & Okabe, S. 2004. Ecophysiological interaction between nitrifying bacteria and heterotrophic bacteria in
autotrophic nitrifying biofilms as determined by microautoradiography-fluorescence in situ hybridization. Appl. Environ.
Microbiol. 70: 1641-1650.
Koops, H. & Harms, H. 1985. Deoxyribonucleic-acid homologies
among 96 strains of ammonia-oxidizing bacteria. Arch. Microbiol. 141: 214-218.
Koops, H. & Pommerening-Roser, A. 2001. Distribution and ecophysiology of the nitrifying bacteria emphasizing cultured species. FEMS Microbiol. Ecol. 37: 1-9.
Kowalchuk, G. & Stephen, J. 2001. Ammonia-oxidizing bacteria: amodel for molecular microbial ecology. Ann. Rev. Microbiol.
55: 485-529.
Maixner, F., Noguera, D., Anneser, B., Stoecker, K., Wegl, G.,
Wagner, M. & Daims, H. 2006. Nitrite concentration influences
the population structure of Nitrospira-like bacteria. Environ.
Microbiol. 8: 1487-1495.
Matsumoto, S., Katoku, M., Saeki, G., Terada, A., Aoi, Y., Tsuneda, S., Picioreanu, C. & van Loosdrecht, M. 2010. Microbialcommunity structure in autotrophic nitrifying granules characterized by experimental and simulation analyses. Environ. Microbiol. 12: 192-206.
Mußmann, M., Brito, I., Pitcher, A., Damste, J., Hatzenpichler, R.,
Richter, A., Nielsen, J., Nielsen, P., Muller, A., Daims, H., Wagner, M. & Head, I. 2011. Thaumarchaeotes abundant in refinery nitrifying sludges express amoA but are not obligate autotrophic ammonia oxidizers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108:
16771-16776.
Okabe, S., Satoh, H. & Watanabe, Y. 1999. In situ analysis of nitrifying biofilms as determined by in situ hybridization and theuse of microelectrodes. Appl. Environ. Microbiol. 65: 31823191.
Okabe, S., Kindaichi, T. & Ito, T. 2005. Fate of C-14-labeled microbial products derived from nitrifying bacteria in autotrophic nitrifying biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71: 3987-3994.
Purkhold, U., Pommerening-Röser, A., Juretschko, S., Schmid,M., Koops, H. & Wagner, M. 2000. Phylogeny of all recognizedspecies of ammonia oxidizers based on comparative 16S rRNA

聡
and amoA sequence analysis: Implications for molecular diversity surveys. Appl. Environ. Microbiol. 66: 5368-5382.
Rittmann, B., Regan, J. & Stahl, D. 1994. Nitrification as a sourceof soluble organic substrate in biological treatment. Water Sci.
Technol. 30: 1-8.
Rotthauwe, J., Witzel, K. & Liesack, W. 1997. The ammonia
monooxygenase structural gene amoA as a functional marker:
Molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing
populations. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4704-4712.
Shinn, M. 1941. Colorimetric method for determination of nitrite.
Ind. Eng. Chem. 13: 0033-0035.
Stehr, G., Zorner, S., Bottcher, B. & Koops, H. 1995. Exopolymers- an ecological characteristic of a floc-attached, ammonia-oxidizing bacterium. Microb. Ecol. 30: 115-126.
Suwa, Y., Imamura, Y., Suzuki, T., Tashiro, T. & Urushigawa, Y.
1994. Ammonia-oxidizing bacteria with different sensitivities to(NH4 )2 SO4 in activated sludges. Water Res. 28: 1523-1532.
Suwa, Y., Sumino, T. & Noto, K. 1997. Phylogenetic relationshipsof activated sludge isolates of ammonia oxidizers with different
sensitivities to ammonium sulfate. J. Gen. Appl. Microbiol. 43:
373-379.
Tamaki, H., Hanada, S., Sekiguchi, Y., Tanaka, Y. & Kamagata, Y.
2009. Effect of gelling agent on colony formation in solid cultivation of microbial community in lake sediment. Environ. Microbiol. 11: 1827-1834.
Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. & Kumar, S.
2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30: 2725-2729.
Ushiki, N., Fujitani, H., Aoi, Y. & Tsuneda, S. 2013. Isolation of
Nitrospira belonging to sublineage II from a wastewater treatment plant. Microbes Environ. 28: 346-353.
van Kessel, M., Speth, D., Albertsen, M., Nielsen, P., Op denCamp, H., Kartal, B. Jetten, M. & Lücker, S., 2015. Complete
nitrification by a single microorganism. Nature 528: 555-559.
Wagner, M., Rath, G., Amann, R., Koops, H. & Schleifer, K. 1995.
In situ identification of ammonia-oxidizing bacteria. Syst. Appl.
Microbiol. 18: 251-264.
Wells, G., Park, H., Yeung, C., Eggleston, B., Francis, C. & Criddle, C. 2009. Ammonia-oxidizing communities in a highly aerated full-scale activated sludge bioreactor: betaproteobacterial
dynamics and low relative abundance of Crenarchaea. Environ.
Microbiol. 11: 2310-2328.

－ 66 －

平成23年度寄付講座助成の研究報告
助成期間：平成23年10月〜平成29年 3 月

IFO Res.Commun. 31
67-74, 2017

BioCentury を先導する次世代酵母リソース中核拠点の形成
金

子

嘉

信

大阪大学大学院工学研究科酵母リソース工学寄附講座〒565-0871

大阪府吹田市山田丘2-1

Establishment of a foothold for the leading yeast resource in the era of life science
Yoshinobu Kaneko
Yeast Genomic Resources Laboratory, Graduate School of Engineering, Osaka University
Yamadaoka 2-1, Suita, Osaka 565-0871, JapanThe methylotrophic yeast Ogataea polymorpha (syn. Hansenula polymorpha) is an attractive industrial nonconventional yeast showing high thermo-tolerance (up to 50 ℃) and xylose assimilation. To facilitate genetic
manipulation in O. polymorpha, we developed a CRISPR/Cas9 system, in which both of single guide RNA (sgRNA)and endonuclease Cas9 were expressed by a single autonomously-replicable plasmid and the sgRNA portion was
easily changed using PCR technique. Moreover, we employed tRNACUG gene for the sgRNA expression. The
editing efficiency of our system was 17 to 71 % of the transformants in several target genes tested. Next, we
unveiled a mating-type switching mechanism in O. polymorpha. Two MAT loci, MATa and MATα, are ~18 kb apartnear centromere on the same chromosome. One MAT locus distal to the centromere was transcriptionally active,
while the other proximal to the centromere was repressed. An inversion of the MAT inter vening region was
induced by nutrient limitation, resulting in the swapping of the chromosomal locations of two MAT loci, and henceswitching of mating type identity. This chromosomal inversion-based mechanism represents a novel form ofmating-type switching. We also found that co-presence of MATa1 and MATα2 was sufficient to prevent mating-type
switching, suggesting that ploidy information resides solely in the mating type locus. Additionally, RME1 deletion
resulted in a reduced rate of switching, and ectopic expression of O. polymorpha RME1 overrode the requirement
for starvation to induce MAT inversion. These results suggested that mating-type switching in O. polymorpha is
likely regulated by two distinct transcriptional programs linked to the ploidy and transmission of the starvation
signal. Lastly, we characterized the phosphate signal transduction (PHO) pathway of O. polymorpha in order to get
more information for the diversity and evolution of the PHO pathway in yeasts. Several pho gene-deficient mutants
were constructed by using the information of annotated draft genome of O. polymorpha BY4329. Except for thepho2-deficient mutant, these mutants exhibited the same phenotype of repressible acid phosphatase (APase)
production as their Saccharomyces cerevisiae counterparts. We also screened for UV-irradiated mutants that
expressed APase constitutively and obtained four classes of mutants. Genetic analysis showed that one class ofrecessive constitutive mutations was allelic to PHO80 and a group of dominant mutations occurred in the PHO81
gene. Epistasis analysis between pho81 and the other two classes of recessive constitutive mutations suggested
that the corresponding new genes, named PHO51 and PHO53, function upstream of PHO81 in the PHO pathway.
Taking these findings together, we conclude that the main components of the PHO pathway identified in S.
cerevisiae are conserved in the methylotrophic yeast O. polymorpha, even though these organisms were separated
from each other before duplication of the whole genome.

第1章

はじめに

の Ogata et al.( 1969 )が自然界から Kloeckera sp.(後に Candida boidinii に再同定 ; Kato et al., 1976 )を分離,

C1 化合物であるメタノールを単一炭素源として利用できるメタノール資化酵母は,世界に先駆けて京都大学

報告して以来,1970 年代には微生物タンパク質供給源
として,1990 年前半には異種タンパク質発現系が整備されて,異種タンパク生産宿主として利用が進められて

E-mail: kaneko@bio.eng.osaka-u.ac.jp
教員：前川裕美(現 九州大学大学院農学研究院)

きた( Faber et al., 1995 )．また,メタノールや硝酸塩の資化代謝経路の生化学的・生理学的研究やペルオキシ－ 67 －

金

子

嘉

信

ソーム形成の分子細胞学的研究などの基礎生物学的研究

いて CUG ロイシンコドンをセリンコドンとして使用し材 料 と し て も 使 用 さ れ て き た( Gleeson & Sudbery,ている Candida albicans や Debaryomyces hansenii などの1988a )．既知の約 1500 の酵母種のうち,メタノール資グループが分岐したと考えられる．そして,メタノール

化酵母は Ogataea 属に分類されているものが多く,Oga-

資化酵母は全ゲノム重複が起こった S. cerevisiae を含む

taea 属 30 種と,現在は rRNA 配列の違いで Komagataell-

グループとは約 1 億年前の全ゲノム重複の以前に分岐しla pastoris, K. phaffii, K. pseudopastoris の 3 種に再分類さている．Ogataea 酵母は系統進化的に比較的まとまりがれ て い る Pichia pastoris( Kurtzman, 2011 ), お よ び

あり,C. boidinii とも近いが,K. pastoris とは遠い関係に

Candida boidinii などが知られている( Kurtzman et al.,ある．研究材料として選んだ O. polymorpha は系統進化

2011 )． 中 で も Ogataea polymorpha( syn. Hansenula

的に S. cerevisiae と Sch. pombe の間に位置していること

polymorpha )は古典遺伝学的あるいは分子遺伝学的手法から,接合型変換やリン酸シグナル伝達の機構に関するが適用でき( Gleeson & Sudbery, 1988a, b; Saraya et al.,

知見は子嚢菌における系統進化的観点からも興味深い．

2012 ),生育上限温度が 50℃と他の酵母より高く( Péter

真核モデル生物である S. cerevisiae と Sch. pombe では

et al., 2007; Shin et al., 2001; Suh & Zhou, 2010 ),産業利

その詳細な生活環や接合型変換機構が明らかにされてい用の観点からは有利な点がある．

る(田仲 & 山本,2007; 原島,2007 )．両酵母では,接合

O. polymorpha では,メタノール誘導性の高発現系や型変換を起こして接合型の異なる一倍体細胞間で接合

高密度培養法などが開発されているため,異種タンパク

し,二倍体形成,減数分裂と胞子形成という有性世代を質生産のための宿主として利用されおり,ヒル由来の血

回すホモタリック系統と接合型変換を起こさずに接合型

液凝固ペプチドは臨床レベルまで進み,B 型肝炎ワクチの異なる細胞間で接合し,有性世代を回すヘテロタリッ

ンは韓国やアルゼンチンで製品として市販されている

ク系統が知られている．Fig. 2 にはホモタリック系統の( Gellissen, 2000 )．また,微生物酵素として,Aspergil-

生活環を示した．S. cerevisiae のホモタリック系統では,lus 由来のフィターゼの生産は 13.5 g/L の分泌生産が可a 型あるいは α 型の一倍体細胞は栄養増殖中に接合型変能である( Mayer et al., 1999 )．さらに,タンパク質生

換を起こし,反対の接合型細胞が生じる．つまり,a 細

産だけでなく,ペルオキシソームへの代謝経路酵素の導胞でスタートしても増殖中に α 細胞が生じ,その α 細胞入発現によるペニシリン G の生産も報告されているは接合変換していない a 細胞と接合して a/α 二倍体細胞( Gidijala et al., 2009 )．したがって,生理活性物質や汎となり,増殖を継続する．そして,栄養飢餓状態になる

用化 学物 質の 生産 にも利 用で きる 可能 性が ある．O.
polymorpha は最高 50℃までの高温で生育可能で,グルコース,キシロースおよびセロビオースを含む様々な炭素源を資化できるため( Ryvoba et al., 2003 ),Saccharomyces cerevisiae などと並んでバイオエネルギー分野にも貢献できる魅力的な産業用酵母でもある．しかし,その基礎生物学的知見は S. cerevisiae と比べてまだまだ乏し
く,効率のよい育種や安定な性質・能力維持のためには生活環や遺伝子発現調節機構などの基礎生物学的な知見の蓄積がこれから 21 世紀を担う産業酵母として望まれる．
そこで,本寄附講座ではこの O. polymorpha を研究材料とし,その接合型変換機構やリン酸シグナル伝達機構の解明およびゲノム編集ツールの開発を行うことにした．
Kurtzman et al.( 2011 )による最新の酵母分類体系は複数の遺伝子配列の相同性に基づく系統進化関係を反映させたものとなっている．担子菌酵母 Filobasidiella neoformans をアウトグループとした子嚢菌酵母の系統進化

Fig. 1関係( Kurtzman & Robnett, 2013 )をメタノール資化酵
母に注目して簡略した系統図を Fig. 1 に示した．担子菌と分岐した子嚢菌では,Schizosaccharomyces pombe が最も古く先に分岐し,子嚢菌系糸状菌( Pezizomycotina )がさらに分岐した後に Yarrowia lipolytica が分岐し,続－ 68 －

Phylogenetic relationships among ascomycetous yeasts.
This figure was prepared by modifying Fig. 1 in the paper of Kurtzman & Robnett (2013). The concatenatedgene sequences for LSU rRNA, SSU rRNA, EF-1α, RPB1
and RPB2 were analyzed by the maximum likelihood
program. Filobasidiella neoformans was the designatedoutgroup species in the analysis.

次世代酵母リソース中核拠点の形成と二倍体細胞は減数分裂,胞子形成を経て,4 つの一倍

( MAT 座,mat1 座)に遺伝子変換されることによって体の子嚢胞子を形成する．子嚢胞子は栄養状態がよい条起こることがわかっている．S. cerevisiae では MAT 座特

件で発芽して,一倍体の栄養細胞へともどる．一方,異的な HO エンドヌクレアーゼによって二重鎖切断が生Sch. pombe のホモタリック系統でも栄養増殖中に接合型じることで接合型変換がおこるが,Sch. pombe では HO

変換が起こり,h+ 細胞からは h- 細胞が,h- からは h+ がエンドヌクレアーゼに相当する酵素が存在せず,mat1

生じる．しかし,栄養豊富な条件では接合は起こらず,座近傍の DNA 複製の一時停止に起因する組換え反応に異なる接合型細胞の混合状態で増殖を継続する．そして,よる接合型変換モデルが提案されている．モデル生物で栄養飢餓状態になることで,異なる接合型細胞どうしである両酵母と比べて,系統進化的に両者の中間にある O.

接合を起こし,二倍体細胞となり,そのまま減数分裂,

polymorpha では,ホモタリックであるということは知

胞子形成が進行する．なお,形成された二倍体細胞を栄られており,Fig. 2 に示すような Sch. pombe に近い生活

養豊富な条件に戻すと,二倍体細胞として栄養増殖させ環が提案されていた( Gleeson & Sudbery, 1988a )．しることが可能である．しかし,栄養増殖中に染色体喪失

かし,栄養飢餓により接合,減数分裂,胞子形成が誘導による一倍体化が起こりやすいと言われている．接合型されることはわかっていたが,接合型遺伝子座はいくつ遺伝子として,S. cerevisiae で 3 つの遺伝子座( MAT 座,

あるのか,いつ接合型変換は起こるのかなどについての

HML 座,HMR 座)が,また Sch. pombe でも 3 つの遺伝情報は全くなかった．この研究により,O. polymorpha

子座( mat1 座,mat2 座,mat3 座)が存在しているが,の接合型変換についてのいくつかの重要な知見を得るこ

接合型決定のために発現しているのは 1 つの遺伝子座のとができた．

みであり,それぞれ MAT 座と mat1 座である．残りの 2

O. polymorpha では 1986 年に形質転換が報告され,染つの遺伝子座は発現が抑制されているサイレント遺伝子

色体組込型ベクターや自立複製起点( ARS )を利用し座である．つまり,MAT 座が MATa 遺伝子の時には a

た自立複製型ベクターの遺伝子操作ツールが開発され細胞,MATα の時には α 細胞になり,mat1 座が mat1-Pて き た( Gleeson et al., 1986; Roggenkamp et al., 1986;

遺伝子の時には h+ 細胞,mat1-M の時には h- 細胞にな

Tikhomirova et al., 1986 )．S. cerevisiae で実施されているわけである．そして,接合型変換は,どちらの酵母でる遺伝子改変手法はほぼ同様に O. polymorpha においてもサイレント遺伝子座の遺伝子情報が発現遺伝子座も実施可能で,PCR を利用した遺伝子破壊も行われてFig. 2

Homothallic life cycles of three yeasts.

－ 69 －

金

子

嘉

信

いる( González et al., 1999 )．しかし,実際には非相同れるか,外来の相同部分をもつ供与 DNA がある場合に組換えが相同組換え( HR )より頻度高く起こり,O.

は相同組換えにより供与 DNA が標的部位に組み込まれpolymorpha の遺伝子操作は少し煩雑で手間がかかり,て修復される．つまり,NHEJ 修復の場合は標的遺伝子

効率的な標的部位への組み込みには,500 bp 以上の隣接座に欠失または挿入突然変異が起こる．また, 外来する相同 DNA 断片が必要である．また,ランダムな染DNA 断片を同時に導入した場合は DNA 断片の相同配列色体への組み込み頻度も高く,遺伝子によっては標的改を利用した相同組換え修復によって標的遺伝子座に外来変が著しく困難な場合がある．この弱点を克服するため,

DNA 断片を組み込むことができる．動物細胞での CRIS-

非 相 同 末 端 結 合( NHEJ ) に よ る 二 本 鎖 切 断( DSB )PR/Cas9 によるゲノム編集効率は数 10 %であると言わ修復に必要な遺伝子 YKU80 を欠失させ,O. polymorpha

れているので,O. polymorpha でも効率のよい標的遺伝における HR 効率を相対的に増加させる工夫も報告され

子改変が可能になると期待できた．

ている( Saraya et al., 2012 )．しかし,YKU80 はテロメ

遺伝子発現調節機構の知見は,代謝経路の改変や異種ア長の維持にも必要であり,その機能欠損はしばしばタンパク発現などを行う上で重要な情報となる．PHO

DNA 損傷に対する感受性を増加させる．したがって,

経路として知られる S. cerevisiae のリン酸シグナル伝達

しばしば yku80Δ 変異を回復させるさらなる操作が必要

経路は真核生物におけるリン酸恒常性を維持する遺伝子となる．そこで,標的遺伝子改変効率が高いゲノム編集

発現調節機構として詳細に研究されてきた( Ljungdahl

技術の一つである CRISPR/Cas9( clustered regularly in-& Daignan-Fornier, 2012; Oshima, 1997; Yadav et al.,terspaced short palindromic repeats/ CRISPR associated2016 )．S. cerevisiae の PHO 経路において,高リン酸条

protein 9 )システム( Terns & Terns, 2014 )が酵母に件下ではサイクリン - サイクリン依存性キナーゼ(サイ

おいても適用可能であることが示されたので( DiCarlo

クリン - CDK )複合体 Pho80-Pho85 によってリン酸化さ

et al., 2013 ),O. polymorpha で の CRISPR/Cas9 ゲ ノ ム

れた転写活性化因子 Pho4 はエクスポーチン Msn5 に編集ツールの開発を試み,遺伝子改変効率の検討を行っ

よって核から細胞質に排出される．その結果,酸性ホス

た．CRISPR/Cas9 システムでは,Fig. 3 に示すようにファターゼ( APase )PHO5 遺伝子およびリン酸輸送体

20 ヌクレオチドの標的配列を含むガイド RNA(sgRNA )PHO84 遺伝子のようなリン酸抑制遺伝子は発現されなとエンドヌクレアーゼ Cas9 の複合体が標的遺伝子にい．反対にリン酸濃度が十分に低い場合,Vip1 により合DSB を入れ,その修復を誘導する．DSB が入る場所は,成されるイノシトール 7 リン酸( inositol heptakisphos-

プロトスペーサー隣接モチーフ( PAM )と呼ばれる 5 ' -phate, IP7 )によって活性化される CDK 阻害因子(CKI )NGG-3 '( N は任意の塩基)配列の 3 bp 上流の標的配列

Pho81 が Pho80-Pho85 複合体の活性を阻害し,リン酸化内である．sgRNA-Cas9 複合体によって生じた標的配列

されない Pho4 が核内にとどまり,Pho2 との協働でリン内の DSB は,誤りを生じやすい NHEJ によって修復さ

酸抑制遺伝子を脱抑制する( Kaffman et al., 1994, 1998a,b; Lee et al., 2007; Ogawa et al., 1995; Schneider et al.,1994 )．PHO 経路を構成する多くの因子についての詳細はかなり明らかにされているが,リン酸シグナル自体がどのように感知されるかについては不明なままである．
近年,いくつかの酵母でこの PHO 経路についての研究がなされてきた．Fig. 4 に S. cerevisiae,Sch. pombe,そして日和見病原性酵母 Candida glabrata の PHO 経路の遺伝子構成をまとめた．C. glabrata では PHO 経路の多くの調節因子が保存されているが,PHO2 はリン酸飢餓
応 答 遺 伝 子 の 発 現 に は 必 要 な い( Kerwin & Wykoff,
2009 )． ま た,C. glabrata は S. cerevisiae の APase 遺 伝
子 PHO5 の相同遺伝子を持たず,その代わりに機能的に置き換わる別のタイプのリン酸飢餓応答酸性ホスファ
ターゼ PMU2 が存在する( Orkwis et al., 2010 )．一方,
Sch. pombe の PHO 経 路 に は,PHO81,PHO2 お よ び
PHO4 に対する相同遺伝子はなく,PHO80 と PHO85 のFig. 3

Schematic diagram of the genome editing by CRISPR/
Cas9 system

相 同 遺 伝 子 は PHO 経 路 に 関 与 し て い な い． さ ら に,APase 遺伝子( pho1 )の転写活性化因子 Pho7 は,転写－ 70 －

次世代酵母リソース中核拠点の形成

Fig. 4

Genetic models of the PHO pathway in four yeasts.
The arrows indicate positive function and the marks of ⊥ indicate negative fuction.

活性化因子 Pho4 のヘリックス - ループ - ヘリックス型とPCR および In-Fusion クローニング技術を用いて sgRNAは異なる亜鉛フィンガー型転写活性化因子である(Henry部 分 を 容 易 に 交 換 で き る よ う に し て い る． さ ら に

et al., 2011 )．また,この Sch. pombe PHO 経路では CDK

sgRNA 発現には tRNACUG 遺伝子を融合させたカセット

活性化キナーゼ遺伝子 csk1 が pho7 を負に調節しているを用いた．このシステムの編集効率は試験したいくつか( Estill et al., 2015 )．最近では,子嚢菌とは違う担子菌の標的遺伝子( ADE12, PHO1, PHO11, PHO84 )におけ系の日和見病原性酵母 Cryptococcus neoformans の PHO4,

る形質転換体の 17 - 71%であった．したがって,このPHO80,PHO85 および PHO81 が実際に PHO 経路の調

CRISPR/Cas9 シ ス テ ム を 用 い る こ と に よ り,O. poly-節遺伝子であり,S. cerevisiae の対応する遺伝子と同じ

morpha の遺伝子操作がより簡便になり,加速されるこ調節作用があると報告されている( Toh-e et al., 2015 )．

とが期待される．

一方,O. polymorpha ではすでに S. cerevisiae APase 遺伝
子 PHO5 の 相 同 遺 伝 子 PHO1 は 同 定 さ れ て い た が

2)メタノール資化酵母 O. polymorpha の逆位による接( Phongdara et al., 1998 ),発現調節遺伝子を含む PHO

合型変換機構の発見

経路に関する研究は全くなされていなかった．そこで,O. polymorpha を細胞増殖及び有性生殖のモデル系と遺伝子発現調節システムの進化という観点からも含めして確立するためには実験に有利なヘテロタリック株のて,O. polymorpha の PHO 経路の構成遺伝子の解明に挑取得が必須であると考え,O. polymorpha の生殖サイク戦した．

ルの解明に挑戦した．O. polymorpha のドラフトゲノム

第2章

配列を解析したところ,S. cerevisiae とは異なる接合型

研究成果の概要

遺伝子構成をしていることが明らかになった．α 型の接合型遺伝子( MATα )近傍の配列が,同じ染色体上の異

1)メタノール資化酵母 O. polymorpha におけるゲノムなる位置に重複しており,さらに重複領域に隣接して a

編集ツールの開発

型の接合型遺伝子(MATa )が存在していた(A タイプ)．

O. polymorpha では S. cerevisiae とは対照的に,相同組さらに,菌株によっては MATα - MATa を両端とする染換え効率が低いため,O. polymorpha の遺伝子操作はし

色体領域が逆向きになった構造を取っていた( I タイ

ばしば煩雑で時間がかかる．この弱点を克服するために,プ)．いずれの株でも 2 つの MAT 配列の一つのみが転写

O. polymorpha に強力なゲノム編集ツールとして CRIS-

発現しており,染色体上の位置に依存して A タイプでPR/Cas9 システムを適用した．我々のシステムでは,は α 型,I タイプでは a 型細胞の形質を示していた．A/I

ガイド RNA( sgRNA )とエンドヌクレアーゼ Cas9 のタイプ間での変換が起こるかを検討した結果,栄養増殖

両方を単一の自律複製可能なプラスミドで発現させ,中は A/I タイプは安定的に保持されるが,栄養飢餓条件－ 71 －

金子にすると A/I タイプの変換によって接合型が変換した細嘉信作製した．pho2 欠損突然変異体を除いて,これらの突胞が混在するようになることがわかった．つまり,両然 変 異 体 は 対 応 す る S. cerevisiae 突 然 変 異 体 と 同 じ

MAT 遺伝子座の外側に隣接する逆向き反復配列( IR )APase 生産性を示した．次に,pho80 および pho85 突然

間での組換えによる染色体逆位によって接合型変換が起変異体が pho81 突然変異の抑圧変異体として単離でき,こったと考えられる．IR を欠失させた変異体では逆位

さらに pho4 変異体が pho80 および pho85 突然変異の抑が起こらなくなり,ホモタリズムを示さなくなったこと

圧変異体として得られた．O. polymorpha の PHO 経路のから,O. polymorpha の接合型変換は染色体逆位によるより完全な構成因子を網羅するために,UV 照射処理に新しい機構であることが明らかになった．この機構は,よって APase を構成的に発現する突然変異体を分離し,2 つの MAT 座をもつ点と逆位による接合型変換という遺伝解析を行った．その結果,3 種類の劣性構成的変異

点で S. cerevisiae や Sch. pombe の機構とは異なっており,

および 1 つの優性構成的変異が得られた．そして,劣性

子嚢菌酵母の接合型の進化過程をたどる上で重要な知見

構成的突然変異の 1 つは PHO80 の対立遺伝子であり,となった．

優性突然変異が PHO81 の対立遺伝子であることがわ
か っ た．pho81 変 異 と 2 つ の 未 知 の 劣 性 構 成 的 変 異3)メタノール資化酵母 O. polymorpha の接合型変換に( pho51 と pho53 と 命 名 ) と の 間 の 上 位 下 位 試 験 は,関わる転写因子

PHO51( IPK1 と 判 明 ) と PHO53 が PHO 経 路 の Op-

栄養飢餓条件でのみ誘導される接合型変換がどのよう

PHO81 の上流で機能することを示唆した．これらの結に制御されているかについて検討を試みた．接合して減果をまとめると,S. cerevisiae とは全ゲノム重複が生じ

数分裂・胞子形成へと進行するには一倍体であることとる前に分岐した O. polymorpha においても PHO 経路の

栄養飢餓状態であることが必要である．そこで,S. cere-

主要調節遺伝子は保存されており,S. cerevisiae や C.

visiae などの知見からこれらの条件下で重要であること

glabrata と同じサイクリン - CDK - CKI 複合体による転写が予想される転写因子について,接合型変換への関与を活性化因子 Pho4 の核局在制御様式による遺伝子発現調調べた．まず,a 型および α 型接合型遺伝子が同一細胞節機構をもつことがわかった( Fig. 4 参照)．しかし,内に共存する時( a/α 二倍体)にのみ生じる a1-α2 複合

イノシトールポリリン酸生合成経路遺伝子である IPK1

体の影響を調べた．その結果,予想通り接合型変換はや KCS1 の欠損変異体では S. cerevisiae と AP 表現型の

a1-α2 により抑制されることがわかった．次に Kluyvero-

違いが見られ,S. cerevisiae とは異なるイノシトールポ

myces lactis における接合型変換の鍵となる Rme1 転写因

リリン酸種が Pho81CKI 活性調節に働く可能性が示唆さ

子の相同遺伝子について解析したところ,RME1 遺伝子れた．この知見は酵母における PHO 経路の進化の研究

欠失変異体では接合型変換頻度が野生型の半分程度に低に有用な情報となる．

下した．一方,RME1 を構成的に発現させると栄養増殖

第3章

中にも接合型変換が起こった．RME1 は栄養増殖細胞中おわりにでも発現しているが,栄養源飢餓により転写量の増加が観察され,タンパク質量も数倍に上昇することがわかっ寄附講座では,これからのバイオテクノロジーを支えた．これらの結果から,栄養飢餓シグナルは Rme1 転写る酵母の 1 つとしてメタノール資化酵母 O. polymorpha

因子を介して接合型変換に関与する遺伝子(群)の発現をを研究材料として取り上げ,CRISPR/Cas9 システムを調節していることが示唆された．また,RME1 は接合に利用したゲノム編集ツールの開発,染色体逆位による接も必須であることから,O. polymorpha は接合型変換と合型変換機構の解明,リン酸飢餓応答システムである接合に関与する遺伝子(群)の発現を Rme1 転写因子の下PHO 経路の解明を行った．ゲノム編集ツール開発では,流に位置づけることにより,接合型変換と接合が同じ条

sgRNA を tRNA と融合した形で発現させることにより,

件・タイミングで引き起されることを保証していると考実用に耐えうるゲノム編集プラスミドを構築できた．今えられる．

後はプラスミドの選択マーカーを薬剤耐性マーカーなどに 換 え て, ゲ ノ ム 編 集 で き る 株 の 制 限 を 広 げ た り,4)メタノール資化酵母 O. polymorpha のリン酸シグナ

sgRNA カセットを複数導入して複数箇所の同時ゲノム

ル伝達経路の解明

編集を可能にしたりすることによって,O. polymorpha

酵母における PHO 経路の多様性および進化について

での遺伝子改変の効率化が期待される．さらに産業利用の情報を得るために,O. polymorpha の PHO 経路を調べが検討されている O. polymorpha 近縁のメタノール資化

た．O. polymorpha BY4329 の注釈付きドラフトゲノム情酵母( O. minuta や O. thermomethanolica )でのゲノム報を利用して,いくつかの pho 遺伝子欠損突然変異体を編集の道も拓いたと言えよう．今まで不明であった O.

－ 72 －

次世代酵母リソース中核拠点の形成

polymorpha の接合型変換機構が 2 つの接合型遺伝子座

う活動基盤が事業推進に非常に貢献した．また,引き続間の逆位によって起こるという発見は,S. cerevisiae とき第 4 期事業継続が可能になったのも寄附講座での活動

Sch. pombe で知られていた機構とは異なる第 3 の新しいが貢献したと思われる．

タイプの発見であり,子嚢菌での接合型システム進化の謝観点から興味が広がっている( Hanson & Wolfe, 2017 ).

辞

一 方,O. polymorpha の PHO 経 路 で S. cerevisiae や C.
glabrata と同じサイクリン - CDK - CKI 複合体による転写

本研究は公益財団法人発酵研究所の平成 23(2011) 年

活性化因子の核局在制御様式が保存されていたことは,度寄付講座助成で行われたもので,ここに感謝の意を表

この制御様式が基本的な遺伝子発現調節システムである

します．そして,寄附講座特任研究員(周ということを示唆している．Sch. pombe の PHO 経路は香,

今のところ特殊な構成をしており,系統的に Sch. pombe

補佐員(長沢奈央子),寄附講座事務補助員(角田洋子,との間に位置すると考えられる酵母 , 例えば D. hansenii三浦準子)の協力のもとに実施しました．また,大阪大学

や Y. lipolytica の PHO 経路の構成に興味がもたれる．

大学院工学研究科生命先端工学専攻生物工学講座の原島

沼本

瑩,名城千

穂,山田菜美子,山本勝良),寄附講座技術

最後にもう 1 つの活動についても触れておきたい．寄俊教授(現,崇城大学教授)と村中正俊教授のご支援と附講座は文科省ナショナルバイオリソースプロジェクト

ご協力,生物工学講座ゲノム機能工学研究室に在籍した( NBRP; http://www.nbrp.jp)の受皿となって大阪市立大学院生の皆さんの協力の賜物です．あわせて感謝します．

大学理学研究科の代表機関と共に NBRP 酵母リソース

文

事業(http://yeast.lab.nig.ac.jp/yeast/ )を推進してきた．
寄附講座活動 5.5 年間で酵母株 2,760 と DNA クローン
2,067 の酵母リソースの増加があり,リソース保有数は
酵母株 27,170 と DNA クローン 6,081 となった．特に,リボソーム生合成の研究分野で著名であった米国カル
フォルニア大学アーバイン校の故・野村真康教授コレクション(菌株とプラスミドあわせて約 1,600 )を収集できたことは意義深い．Fig. 5 に示すようにリソース提供
数は 5.5 年間で菌株 1,993,DNA クローン 2,162 であり,海外への提供はのべ 36 カ国で提供総数の 43 %を占めた．
したがって,国際的にも貢献できたと考えている．そして,第 3 期 NBRP に採択された 29 生物種の中でもマウス,
ショウジョウバエ,線虫,シロイヌナズナなどのモデル
生物種とともに 13 の「優れた成果をあげた」生物種の1 つとしてプロジェクト事後評価を受け,寄附講座といFig. 5

献

DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J. & Church,
G. M. 2013. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae
using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41: 4336-4343.
Estill, M., Kerwin-Iosue, C.L. & Wykoff, D.D. 2015. Dissection of
the PHO pathway in Schizosaccharomyces pombe using epistasis
and the alternate repressor adenine. Curr. Genet. 61: 175-183.
Faber, K.N., Harder, W., Ab, G. & Veenhuis, M. 1995. Review:
Methylotrophic yeasts as factories for the production of foreign proteins. Yeast 11: 1331-1344.
Gellissen, G. 2000. Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 741-750.
Gidijala, L., Kiel, J.A., Douma, R.D., Seifar, R.M., van Gulik, W.M.,
Bovenberg, R.A., Veenhuis, M. & van del Klei, I.J. 2009. An engineered yeast efficiently secreting penicillin. PLos ONE 4:
e8317.
Gleeson, M.A., Ortori, G.S. & Sudbery, P.E. 1986. Transformaton

Distribution activity of NBRP-Yeast during 5. 5 years.

－ 73 －

金子

of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465.
Gleeson, M.A. & Sudbery, P.E. 1988a. The methylotrophic yeasts.
Yeast 4: 1-15.
Gleeson, M.A. & Sudber y, P.E. 1988b. Genetic analysis in the
methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Yeast 4: 293-303.
González, C., Perdomo, G., Tejera, P., Brito, N. & Siverio, J.M.
1999. One-step, PCR-mediated, gene disruption in the yeast
Hansenula polymorpha. Yeast 15: 1323-1329.
Hanson, S.J. & Wolfe K.H. 2017. An evolutionary perspective on
yeast mating-type switching. Genetics 206: 9-32.
原島 俊 2007．9.3 出芽酵母,分裂酵母の接合型変換,大隅良典・
下田 親（編),酵母のすべて－系統,細胞から分子まで－,p.
285-292,シュプリンガー・ジャパン,東京．
Henry, T.C., Power, J.E., Kerwin, C.L., Mohammed, A., Weissman,
J.S., Cameron, D.M. & Wykoff, D.D. 2011. Systematic screenof Schizosaccharomyces pombe deletion collection uncovers parallel evolution of the phosphate signal transduction pathway inyeasts. Eukaryot. Cell 10: 198-206.
Kaffman, A., Herskowitz, I., Robert, T. & O’Shea, E.K. 1994.
Phosphor ylation of the transcription factor Pho4 by a cyclin-CDK complex, Pho80-Pho85. Science 263: 1153-1156.
Kaffman, A., Rank, N.M., O’Neill, E.M., Huang, L.S. & O’Shea,
E.K. 1998a. The receptor Msn5 exports the phosphorylatedtranscription factor Pho4 out of the nucleus. Nature 396: 482486.
Kaffman, A., Rank, N.M. & O’Shea, E.K. 1998b. Phosphorylation
regulates association of the transcription factor Pho4 with its
import receptor Pse1/Kap121. Genes Dev. 12: 2673-2683.
Kato, N., Omori, Y., Tani, Y. & Ogata, K. 1976. Alcohol oxidase of
Kloeckera sp. No.2201 and Hansenula polymorpha. Catalytic
properties and subunit structure. Eur. J. Biochem. 64: 341-350.
Ker win, C.L. & Wykoff, D.D. 2009. Candida glabrata PHO4 isnecessary and sufficient for Pho2-independent transcription ofphosphate starvation genes. Genetics 182: 471-479.
Kurtzman, C.P. 2011. Chapter 37 Komagataella Y. Yamada, Matsuda,
Maeda & Mikata (1995), In Kurtzman, C.P., Fell, J.W. & Boekhout, T. (eds.), The yeasts, a taxonomic study, 5th ed., p. 491495, Elsevier, Amsterdam.
Kurtzman, C.P., Fell, J.W. & Boekhout, T. (eds.) 2011. The yeasts,
a taxonomic study, 5th edition, Elsevier, Amsterdam.
Kurtzman, C.P. & Robnett, C.J. 2013. Relationships among generaof the Saccharomycotina (Ascomycota) from multigene phylogenetic analysis of the species. FEMS Yeast Res. 13: 23-33.
Lee, Y.S., Mulugu, S., York, J.D. & O’Shea, E.K. 2007. Regulationof a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science 316: 109-112.
Ljungdahl, P.O. & Daignan-Fornier, B. 2012. Regulation of aminoacid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces
cerevisiae. Genetics 190: 885-929.
Mayer, A.F., Hellmuth, K., Schlieker, H., Lopez-Ulibarri, R., Oertel,S., Dahlems, U., Strasser, A.W.M. & van Loon, A.P.G.M. 1999.
An expression system matures: a highly efficient and cost-effective process for phytase production by recombinat strains ofHansenula polymorpha. Biotechnol. Bioeng. 63: 373-381.
Ogata, K., Nishikawa, H. & Ohsugi, M. 1969. A yeast capable of嘉信utilizing methanol. Agric. Biol. Chem. 33: 1519-1520.
Ogawa, N., Noguchi, K., Sawai, H., Yamashita, Y., Yompakdee, C.
& Oshima, Y. 1995. Functional domain of Pho81p, an inhibitorof Pho85p protein kinase, in the transduction pathway of Pi signal in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 15: 997-1004.
Orkwis, B.R., Davies, D.L., Kerwin, C.L., Sanglard, D. & Wykoff,
D.D. 2010. Novel acid phosphatase in Candida glabrata suggests selective pressure and niche specialization in the phosphate signal transduction pathway. Genetics 186: 885-895.
Oshima, Y. 1997. The phosphatase system in Saccharomyces cerevisiae. Genes Genet. Syst. 72: 323-334.
Péter, G., Tornai-Lehoczki, J., Shin, K.S. & Dlauchy, D. 2007.
Ogataea thermophila sp. nov., the teleomorph of Candida thermophila. FEMS Yeast Res. 7: 494-496.
Phongdara, A., Merckelbach, A., Keup, P., Gellissen, G. &Hollenberg, C.P. 1998. Cloning and characterization of thegene encoding a repressible acid phosphatase (PHO1) fromthe methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 77-84.
Roggenkamp, R., Hansen, H., Eckart, M., Janowicz, Z. & Hollenberg,
C.P. 1986. Transforamation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration
vectors. Mol. Gen. Genet. 202: 302-308.
Rybova, O. B., Chmil, O. M. & Sibirny, A. A. 2003. Xylose and cellobiose fermentation to ethanol by the thermotolerant methylotrophic yeast. FEMS Yeast Res. 4: 157-164.
Saraya, R., Krikken, A. M., Kiel, J. A. K. W., Baerends, R. J. S.,
Veenhuis, M. & van der Klei, I. J. 2012. Novel genetic tools for
Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Res. 12: 271-278.
Schneider, K.R., Smith, R.L. & O’Shea, E.K. 1994. Phosphate-Regulated inactivation of the kinase Pho80-Pho85 by the CDK inhibitor Pho81. Science 266: 122-126.
Shin, K.-S., Shin, Y.K., Yoon, J.-H. & Park, Y.-H. 2001. Candida
thermophila sp. nov., a novel thermophilic yeast isolated fromsoil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 2167-2170.
Suh, S.-O. & Zhou, J.J. 2010. Methylotrophic yeasts near Ogataea(Hansenula) polymorpha: a proposal of Ogataea angusta comb.
nov. and Candida parapolymorpha sp. nov. FEMS Yeast Res.
10: 631-638.
田仲加代子 & 山本正幸．2007．9.1 生活環における細胞分化シグ
ナル,大隅良典・下田 親(編),酵母のすべて－系統,細胞から分子まで－,p. 269-278 ,シュプリンガー・ジャパン,東京．
Terns, R.M. & Terns M.P. 2014. CRISPR-based technologies: prokaryotic defense weapons repurposed. Trends Genet. 30: 111118.
Tikhomirova, L.P., Ikonomova, R.N. & Kuznetsova, E.N. 1986.
Evidence for autonomous replication and stabilization of recombinant plasmids in the transformants of yeast Hansenula
polymorpha. Curr. Genet. 10: 741-747.
Toh-e, A., Ohkusu, M., Li, H.M., Shimizu, K., Takahashi-Nakaguchi, A., Gonoi, T., Kawamoto, S., Kanesaki, Y., Yoshikawa, H. &Nishizawa, M. 2015. Identification of genes involved in thephosphate metabolism in Cryptococcus neoformans. Fungal
Genet. Biol. 80: 19-30.
Yadav, K.K., Singh, N. & Rajasekharan, R. 2016. Responses tophosphate deprivation in yeast cells. Curr. Genet. 62: 301-307.

－ 74 －

IFO Res.Commun. 31
75-86, 2017

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha における tRNA-sgRNA 融合を用いた
CRISPR/Cas9 によるゲノム編集ツールの開発
金

子

嘉

信

大阪大学大学院工学研究科酵母リソース工学寄附講座〒565-0871

大阪府吹田市山田丘2-1

Development of a genome editing tool by CRISPR/Cas9
with a tRNA-sgRNA fusion in the methylotrophic yeast Ogataea polymorpha
Yoshinobu Kaneko
Yeast Genomic Resources Laboratory, Graduate School of Engineering, Osaka University
Yamadaoka 2-1, Suita, Osaka 565-0871, JapanThe methylotrophic yeast Ogataea polymorpha (syn. Hansenula polymorpha) is an attractive industrial non-conventional
yeast showing high thermo-tolerance (up to 50 ℃) and xylose assimilation. However, genetic manipulation of O.
polymorpha is often laborious and time-consuming because of less homologous recombination efficiency in contrast to
Saccharomyces cerevisiae. To overcome this weakness, we have applied the CRISPR/Cas9 system as a powerfulgenome editing tool in O. polymorpha. In our system, both of single guide RNA (sgRNA) and endonuclease Cas9 wereexpressed by a single autonomously-replicable plasmid and the sgRNA portion was easily changed using PCR and InFusion cloning techniques. Moreover, we employed tRNACUG gene for the sgRNA expression. The editing efficiency of
our system was 17 to 71 % of the transformants in several target genes tested. Therefore, it is expected that genetic
manipulation of O. polymorpha will be more convenient and accelerated by using this CRISPR/Cas9 system.
Key words: Genome editing, CRISPR/Cas9, tRNA-processing, Ogataea polymorpha緒

言的部位と隣接する 40 塩基対の配列を用いることにより,
DNA 断片の標的部位への組み込みを効率的に行うこと

Ogataea polymorpha( syn. Hansenula polymorpha,Pi-ができる．しかし,O. polymorpha における効率的な標

chia angusta nom. nud. )は,炭素源およびエネルギー的部位への組み込みには,500 bp 以上の隣接する相同源としてメタノールを利用できるメタノール資化酵母

DNA 断片が必要である( González et al., 1999 )．非相同で,メタノール代謝の生化学および生理学を研究するた

末端結合による二本鎖切断修復に必要な遺伝子 YKU80めのモデル生物としてだけでなく,異種タンパク質産生を欠失させると O. polymorpha における相同組換え効率のための宿主としても利用されている( Gellissen, 2000;

が 相 対 的 に 増 加 す る( Saraya et al., 2012 )． し か し,Stochmann et al., 2009; van der Klei et al., 1991)．さらに,YKU80 はテロメア長の維持にも必要であり,その機能

O. polymorpha は,最高 50 ℃までの高温で生育可能であ

欠損はしばしば DNA 損傷に対する感受性を増加させる．

り,グルコース,キシロースおよびセロビオース(Ryvoba

したがって,しばしば yku80Δ 変異を回復させるさらなet al., 2003 )を含む様々な炭素源を資化することができる操作が必要となる．
最近,ゲノム編集のための CRISPR/Cas9( clustered

るため,バイオエタノール生産のための魅力的な産業用酵母でもある．

regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR

O. polymorpha 細胞では相同組換えより非相同組換え

associated protein 9 )システムが細菌から高等真核生物が頻度高く起こり,O. polymorpha の遺伝子操作は少しに至る多くの生物で確立されている( Jinek et al., 2012;

煩雑で手間がかかる．Saccharomyces cerevisiae では,標Li et al., 2013; Kimura et al., 2014; Yu et al., 2013; Friedland et al., 2013; Jiang et al., 2013 )．この技術では 20 ヌ

E-mail: kaneko@bio.eng.osaka-u.ac.jp

クレオチドの標的配列を含むガイド RNA( sgRNA )と－ 75 －

金

子

嘉

信

エンドヌクレアーゼ Cas9 の複合体が重要な役割を果た

実験材料と実験方法

す．sgRNA の標的配列によって Cas9 は標的遺伝子座に誘導されて,プロトスペーサー隣接モチーフ( PAM )配列( 5 ' - NGG - 3 ',N は任意の塩基)の 3bp 上流の標的菌株と培地配列内に二重鎖切断を生じさせる．そして,誤りを生じ

O. polymorpha BY4330( ura3-1)は NBRP-YGRC(http://

やすい非相同末端結合による二重鎖切断の修復によってyeast.lab.ac.jp/yast/ )から入手した．酵母の培養には標的遺伝子座に欠失または挿入突然変異が起こる．つま

0.2 g/L ア デ ニ ン を 追 加 し た Difco YPD broth [50 g/L;

り,マーカー遺伝子を必要としない遺伝子ノックアウト

Becton, Dickinson and Company (BD), USA] の完全培地が可能である．また,外来 DNA 断片を同時に導入すると,( YPDA )または合成デキストロース培地( SD )を使用

DNA 断片の相同配列を利用した相同組換えによって標して,37 ℃で増殖させた．SD は 6.7 g/L Difco Yeast Ni-

的遺伝子座に外来 DNA 断片を組み込むことができる．

trogen Base w/o amino acids( BD ) と 20 g/L Glucose

S. cerevisiae ,Schizosaccharomyces pombe ,Kluyvero-を含む培地である．平板培地には 2%の寒天を加えた．

myces lactis,Yarrowia lipolytica および Pichia pastoris な

ハイグロマイシン耐性( HygR )酵母形質転換体の選択

どの酵母においてはすでに CRISPR/Cas9 システムを用にはハイグロマイシン B( 200 μg/mL; ナカライテスク,Ja-

いたゲノム編集が実施されている( DiCarlo et al., 2013;pan )を追加した YPDA を使用した．アデニン栄養要求性

Jacobs et al., 2014; Horwitz et al., 2015; Schwartz et al.,株の赤色コロニーアッセイには,アデニン( 10 μg/mL )を2016; Weninger et al., 2016 )． そ こ で 本 研 究 で は,O.

SD 平板培地に追加した．組換えプラスミド DNA 調製に

polymorpha における CRISPR/Cas9 システムの有効性をは ECOS™ Competent E. coli DH5α(ニッポンジーン,Ja-

検討した．sgRNA の発現に tRNA 遺伝子を用いた改良pan )を宿主として 37 ℃,100 μg/mL のアンピシリンを追

CRISPR/Cas9 システムを用いると,試したいくつかの加した LB 培地( Miller)(関東化学,Japan )で培養した．

標的遺伝子( ADE12,PHO1,PHO11,および PHO84 )で効率的に突然変異体が得られた．したがって,本研究

プラスミドの作製と DNA 操作で開発した改良 CRISPR/Cas9 システムは O. polymorphaのゲノム編集の有用なツールとなると期待される．

使用したすべてのプラスミドおよびプライマーをTable 1 と Table 2 にそれぞれ示した．PCR には PrimeSTAR Max DNA ポリメラーゼ(タカラバイオ,Japan )Table 1

Plasmids used in this study－ 76 －

メタノール資化酵母のゲノム編集ツール開発
Table 2

Primers used in this study－ 77 －

金

子

嘉

信

を用いた．Cas9 と sgRNA を発現させるプラスミドはた．次に,得られた 2 つの増幅断片を In-Fusion クロー

YCp 型プラスミドベクター pSC6cen-14a を元に作製しニングで連結した．

た．pSC6cen-14a に Cas9 遺 伝 子 を 組 み 込 ん だ pHP-

sgRNA 発現カセットの調製のために,pUC-HpSNR6a

Cas901( Fig. 1A ) は 以 下 の よ う に し て 構 築 し た：および pHP-gRNA を最初に構築した．300 bp 上流およ

ScTEF1 プロモーターと ScCYC1 ターミネーターを含む

び 259 bp の下流領域を含む OpSNR6 遺伝子を,BY4330

Homo sapiens コ ド ン 最 適 化 Cas9 DNA 断 片 を p414-のゲノム DNA を鋳型として,プライマー HpSnR6-F とTEF1p-Cas9-CYC1t(＃ 43802; Addgene, USA; DiCarlo et

HpSnR6-R を用いて増幅した．SNR52 プロモーターおよびal., 2013 )を鋳型に,Cas9-F1 と Cas9-R1 をプライマー

SUP4 ターミネーターを含む sgRNA 断片は p426-SNR52p-にして PCR 増幅した．得られた PCR 断片を In-Fusion

gRNA.CAN1.Y-SUP4t(＃ 43803; Addgene; DiCarlo et al.,クローニングキット(タカラバイオ)を用いて KpnI-XhoI2013 )を鋳型とし,SNR52p_gRNA-F1 と SNR52p_gRNA-で切断した pSC6cen-14a に連結した．pMN27( Fig. 1B )R1 をプライマーとして増幅した．これらの増幅断片を

は 次 の よ う に し て 構 築 し た：pHP-901 を 鋳 型 と し て

Mighty Cloning Reagent (Blunt End)( タ カ ラ バ イ オ )Cas9-ORF-F1 と Cas9-SV40-R1 のプライマーで Cas9 断片を用いて pUC118 の HincII 部位に挿入し,得られたプラを増幅した．また,pSC6cen-TDH3p-PHO1 を鋳型としスミドをそれぞれ pUC-HpSNR6a および pHP-gRNA と命て OpTDH3 プロモーターを含むベクター部分を Cas9-

名した．pUC-gRNA(ADE12) を構築するために,pHP-gR-

TDH3t-F1 と TDH3p-Cas9-R1 をプライマーとして増幅しNA を 鋳 型 に,ADE12_gRNA-F と ADE12_gRNA-R を プ

Fig. 1

Construction of plasmids for the CRISPR/Cas9 system in O. polymorpha. The promoter fragment and the sgRNA-terminator fragment were amplified by using primers containing the target sequence. The two resulting PCR amplicons were ligated and inserted into NotI-digested pHP-Cas901 (Cas9 expressed by the ScTEF1 promoter) or pMN27 (Cas9 expressed by the OpTDH3 promoter) by using In-Fusion cloning. The sgRNA was transcribed with the OpSNR6 promoter (A) or with the tRNACUG promoter
containing the tRNA coding region (B).

－ 78 －

メタノール資化酵母のゲノム編集ツール開発

ライマーとして用いて OpADE12 遺伝子を標的とする

酸性ホスファターゼ活性のコロニー染色検出法
以 前 に 報 告 し た コ ロ ニ ー 活 性 染 色 法( Zhou et al.,sgRNA 発現カセットを増幅し,次にプライマー HP-SNR6v-F2 と Hp-SNR6v-R を用いて pUC-HpSNR6a から増幅2016 )によって酸性ホスファターゼ活性を検出した．

したベクター部分と増幅 sgRNA 発現カセットを In-Fusion

結クローニングで連結した．OpADE12 遺伝子座をゲノム果編集するためのプラスミド pCRIC_ADE12 を構築するため,鋳型として pUC-gRNA(ADE12) を,そしてプライマー

ゲノム編集のための CRISPR/Cas9 システムの実施

SNR6gRNA_xxx-1F1 と SNR6gRNA_xxx-2R1 を用いて増CRISPR/Cas9 システムが O. polymorpha で有効に働く

幅 し た PCR 断 片 を,Not I で 切 断 し た pHP-Cas901 にかどうか調べるため,まず Cas9 と sgRNA の両方を 1 つIn-Fusion ク ロ ー ニ ン グ し た( Fig. 1A )．pMN67 とのプラスミドで発現させる CRISPR/Cas9 プラスミドを

pMN70 の構築は,以下のように行った( Fig. 1B )：プ

構築した．Cas9 のゲノム標的部位は sgRNA 中の 20 ヌ

ライマー Leu(CUG)-F1 と Leu(CUG)-sgADE12-R を用い

クレオチド標的配列を置換することによって変更できて BY4330 ゲノム DNA から tRNACUG 遺伝子を増幅した．

る．標的配列を含むプライマーを用いて増幅された

OpADE12 遺伝子を標的とする sgRNA 発現カセットを,sgRNA の PCR 断片を In-Fusion クローニングによって

pUC-gRNA(ADE12) を鋳型として,プライマー ADE12_

Cas9 ベクターに挿入した( Fig. 1 )．CRISPR/Cas9 プラ

gRNA-F と SNR6gRNA_xxx-2R1 を用いて増幅した．次に,スミドの有効性を試験するために,最初に ScADE2 のオ

この PCR 増幅断片を In-Fusion クローニングによってルソログである OpADE12 遺伝子( Gleeson & Sudbery,

NotI で切断した pHP-Cas901 または pMN27 に挿入した．

1988 )を標的とした．この遺伝子の欠損は限定量のア

pMN67 ,pMN74 ,pMN77 ,pMN80 ,pMN84 ,pMN87 ,デニンしか含まない培地上で赤色コロニーを形成する表

pMN91,pMN93 および pMN96 は以下のようにして構現型でモニターすることができるので,OpADE12 遺伝

築した：各標的部位に対応する sgRNA カセットの 2 つ子を CRISPR/Cas9 活性の評価のための最初の標的としの DNA 断 片 を 鋳 型 と し て pMN67 を 用 い て 増 幅 し,て使用することにした．プラスミド pCRIC_ADE12 はIn-Fusion クローニングを用いて Not I 切断した pMN27

URA3 選択マーカー,Cas9 および OpADE12 遺伝子を標的とする sgRNA を含んでいる( Fig. 1A )．sgRNA は真核に挿入した (Fig. 1B 参照 )．
変異遺伝子座を解析するために,Kaneka Easy DNA

生物の CRISPR/Cas9 システムで一般的に使用されている

Extraction Kit version 2(カネカ,Japan )を用いて単一OpSNR6( O. polymorpha の U6 small noncoding RNA )コロニーからゲノム DNA を抽出し,PCR 増幅のための遺伝子のプロモーターによって発現されるようにした

鋳型 DNA として使用した．PCR 断片を QIAquick PCR( Mali et al., 2013; Cong et al., 2013 )．BY4330( ura3-1 )精製キット( QIAGEN,Germany )で精製し,BigDye

へ pCRIC_ADE12 を導入すると,得られた Ura+ 形質転Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit( Applied Biosyste-

換体の中にアデニン要求性( Ade- )を示すクローンがms,USA )および ABI PRISM 310 Genetic Analyzer( Ap-

10-3 の頻度で出現した( Table 3 )．2 つの Ade- クローンplied Biosystems )を用いて塩基配列解析を行った．遺を任意に選んで OpADE12 遺伝子座の塩基配列を分析す

伝子ノックアウトのために,OpADE12 座に対して 60 bp

ると,Ade- 変異体は OpADE12 遺伝子座内の CRISPR/の相同領域を有するまたは有さない HygR カセットを

Cas9 システムでの推定切断部位に 1 塩基挿入あるいは 2

pKS133( Janke et al., 2004 ) を 鋳 型 に し て 増 幅 し た．

塩基欠失の変異を生じていることがわかった．

Hyg カ セ ッ ト( hphNT1, 1.7kb ) は,Ashbya gossypii

次 に, 他 の 2 つ の 標 的 遺 伝 子,OpADE8 お よ び Op-

TEF プロモーター,ハイグロマイシン B ホスホトラン

PHO85 に つ い て も ゲ ノ ム 編 集 を 試 み た．OpADE8 はスフェラーゼをコードする大腸菌プラスミド由来 hph 遺BY4329 のドラフトゲノム配列( Zhou et al., 2016 )から伝子および S. cerevisiae CYC1 ターミネーターから構成

ScADE8 のホモログとして同定され,ade8 欠損突然変異される．

体は Ade- 表現型が期待される．OpPHO85 はリン酸シグR

ナル伝達( PHO )経路に関与するサイクリン依存性タ
酵母形質転換ンパク質キナーゼをコードする ScPHO85 のオルソログ

O. polymorpha の形質転換は Frozen-EZ Yeast transfor-として以前に同定されており,その突然変異は抑制性酸

mation II Kit( Zymo Research, USA )を用いて行った．

性ホスファターゼ( APase )の構成的産生を示す( Zhou

約 0.2 μg の環状プラスミド DNA または 2 μg の線状 DNA

et al., 2016 )．CRISPR/Cas9 プラスミドを細胞に導入し断片を形質転換に用いた．

て培養をしばらく継続してゲノム編集候補株をスクリーニングすると,CRISP/Cas9 システムの効率がしばしば－ 79 －

金

子

嘉

信

Table 3

Mutagenesis efficiency of OpADE12 using the CRISPR/Cas9 system

Table 4

Targeting efficiency of donor DNA using the CRISPR/Cas9 system

上昇することが報告されているので( Schwartz et al.,ていることを確認できた(Fig. 2A & B )．しかしながら,2016 ),Ura+ 形質転換体を液体 SD 培地で一晩増殖させ興味深いことに,PCR 増幅断片の DNA 塩基配列分析はた．その結果,ade8 および pho85 変異体の両方を得たが,様々なパターンを示した．相同領域がない供与 DNA の変異効率はそれぞれわずか 0.36%および 0.08%であり,

場合,10 個の Ade- 形質転換体のうち 9 個は OpADE12効率の顕著な増加は見られなかった．

転写と反対方向に供与 DNA が組み込まれており,そのうち 6 個は組み込みの接合部で 1 ~ 23 塩基の欠失が生

CRISPR/Cas9 システムによる供与 DNA の染色体組み込みじていた( Fig. 2B & D )．一方,相同領域をもつ供与

CRISPR/Cas9 システムによる供与 DNA の標的化されDNA の場合,OpADAE12 と同じ転写方向に hphNT1 がた組み込みを調べるために,60 bp 相同領域をもつある挿入された Ade- 形質転換体 8 個と反対方向に hphNT1

いはもたない HygR カセット( hphNT1 )DNA を用いたが 挿 入 さ れ た Ade- 形 質 転 換 体 が 2 個 で あ っ た( Fig.

OpADE12 遺伝子の破壊を試みた．プラスミド pCRIC_

2B )．同じ方向に挿入された 8 個の形質転換体のうちのADE12 をもつ細胞を hphNT1 DNA で形質転換し,得ら6 個では,hphNT1 DNA は標的部位にそのまま組み込まれた Hyg 形質転換体の Ade 表現型を調べた．Table 4

れていた．しかし,残りの 2 個では 5 ' - 側相同領域にそに示すように,hphNT1 DNA を相同領域なしで導入しのまままたは 2 塩基欠失で連結されていた．反対方向にた場合は Hyg 形質転換体の 12%が,相同領域がある場挿入された 2 つの Ade- 形質転換体では 5 ' 末端に 1 つか合は 47%が Ade 表現型を示した．対照的に,Cas9 酵素

2 つの塩基欠失を有し,3 ' 末端に欠失なしか 1 塩基欠失のみを発現するプラスミド pHP-Cas9 による形質転換でが見られた (Fig. 2D )．

R

R

-

は,Ade コ ロ ニ ー が 得 ら れ な か っ た． こ の こ と か ら-

CRISP/Cas9 システムによって誘導された二重鎖切断がtRNA-sgRNA 融合による遺伝子編集効率の向上
細胞内の sgRNA 量が CRISPR/Cas9 システムの編集効

標的ゲノム部位に供与 DNA の組込みを促進すると考え率にとって重要であることがいくつか報告されている

られた．
相同領域あるなしの供与 DNA のそれぞれで,無作為( Cong et al., 2013; Ryan et al., 2014; Schwartz et al., 2016;に 10 個の Ade Hyg 形質転換体を選択し,OpADE12 標

Xie et al., 2015 )．そこで,ゲノム編集での突然変異効率

的遺伝子座について PCR 増幅と DNA 塩基配列決定によを高めるために sgRNA 発現カセットを再設計すること

り分析を行った( Fig. 2 )．PCR 増幅分析から調べたすにした．通常,sgRNA は 5 ' 末端キャッピングや 3 ' 末端

べての形質転換体で標的部位に供与 hphNT1 が挿入されポリ A 付加などの転写物の末端修飾を避けるために,-R－ 80 －

メタノール資化酵母のゲノム編集ツール開発

Fig. 2Integration of donor DNAs into the target site in various patterns. A. Principle of PCR analysis of donor DNA integration. To
examine whether the donor DNA was integrated into the ADE12 target site, PCR amplification was performed with four pairsof primers: (1) ADE12 seqF1 and Hyg C R1; (2) ADE12 seqR1 and Hyg C F1; (3) ADE12 seqF1 and Hyg C F1; and (4) ADE12
seqR1 and Hyg C R1. If the donor DNA was integrated at the ADE12 site in the direction of transcription (forward), fragments
1 and 2 would be amplified. If integration occurred in the opposite direction, fragments 3 and 4 would be amplified. If the donor
DNA was integrated elsewhere, no amplicon would be obtained with any primer pair. B. Summary of integration patterns of
the donor DNA at the ADE12 target site. Ten ade12 mutants obtained with each donor DNA with or without homologous arms
were analyzed by PCR, and the insertion direction of the donor DNA was assessed. The junction sequences of integration werethen confirmed by sequencing each amplified fragment (see panel D). In four mutants with donor DNA without homologous
arms (M2, M4, M5, and M7), the donor DNA was simply inserted at the target site in the reverse direction. The other six mutants contained a small deletion at one or both sides of the inserted donor DNA. Of the ten ade12 mutants with the donor DNA
with 60-bp homologous arms, only two (H3 and H5) showed the reverse pattern of insertion; among the mutants with forward
insertion, fragment 1 amplicons from mutants H8 and H9 were slightly larger than the other fragment 1 amplicons. C. Primer
sequences used for PCR amplification of the donor DNAs. The 60-bp homologous sequences to the ADE12 target site areshown in bold. D. Junction sequences of the integrated donor DNAs without (M clones) and with (H clones) homologous
arms in the ade12 mutants. PCR products (fragments 1-4 in panel A) were used as templates for sequence analysis. The CRISPR/Cas9 target sequence is underlined; the PAM sequence is indicated in italics. Red and blue letters indicate the sequencesof, respectively, the forward- and reverse-integrated cassette (see also panel B). In the M1 mutant, the donor DNA was inserted with a deletion at both sides in addition to a 16-bp deletion of the PAM side of targeted ade12 locus. Sequence analysis offragments 1 and 2 amplified from H1 suggested that ideal insertion of the donor DNA occurred by homologous recombinationin the major class of mutants.
Continued on the next page.

－ 81 －

金子

Fig. 2

嘉信

continued

5S RNA,tRNA および snRNA を転写する RNA ポリメラー

parapolymorpha DL-1 ゲ ノ ム 解 析 の 結 果 と 一 致 し た

ゼ III( Pol III ) で 転 写 発 現 さ せ る． し か し, 最 近(Ravin et al., 2013 )．DL-1 は最近まで H. polymorpha(O.

sgRNA 発現のために内在性 tRNA プロセシングシステム

polymorpha の異名)として同定されていた( Kurtzman,を利用した効率的な CRISPR/Cas9 システムがイネにお2011 )．高いコドン使用頻度の tRNA 遺伝子は細胞内でいて開発された( Xie et al., 2015 )．tRNA 前駆体の 5 ' お

高発現されると考え,最も頻繁に使用されるコドンとしよび 3 ' 末端はそれぞれ RNase P および tRNase Z によって,O. polymorpha( Pichia angusta nom. nud. ) の コ ドて切断されるため,tRNA-sgRNA 融合遺伝子の一次転写

ン使用データベース中の上位 5 つのコドンを選んだ．次産物はこの内在性 tRNA プロセシングシステムによってに,一部の tRNA 遺伝子では重複した遺伝子座が存在し細胞内で成熟 sgRNA 分子に変換され,成熟 sgRNA はているため,tRNA 遺伝子あたりのコドン使用率を計算

Cas9 と複合体を形成し,標的遺伝子座に結合すると期した．Table 5 に示すように,CUG コドンは O. polymor-

待される．さらに,tRNA 遺伝子はコーディング配列内

pha 中の tRNA 遺伝子あたり最も高いコドン使用頻度でに Pol III のための内部プロモーターエレメント( A お

あると計算された．したがって,CUG コドンに対応す

よび B ボックス)をもち,tRNA 遺伝子が Pol III の転写

る tRNACUG 遺伝子が最も高く発現されると推定し,そエンハンサーとしても働くことも期待できる．これらのれを sgRNA の高発現のための改変 CRISPR/Cas9 プラス

特 徴 を 考 慮 し て,tRNA 遺 伝 子 を O. polymorpha で もミドに使用した( Fig. 1B )．

sgRNA 高発現に適用可能であると考えた．まず,tRNA-

OpADE12 を標的とした改変 CRISPR/Cas9 プラスミド

scan-SE プログラム( Lowe & Eddy, 1997 )を用いて,O.

( pMN67 )を構築し,これを用いて BY4330( ura3-1 )polymorpha BY4329 のゲノム中の 80 の潜在的 tRNA 遺伝

を 形 質 転 換 し た．ScTEF1 プ ロ モ ー タ ー の 代 わ り に子を同定した．この予測された遺伝子数は,Ogataea

OpTDH3 プロモーターを使用した第 2 の改変プラスミド－ 82 －

メタノール資化酵母のゲノム編集ツール開発
Table 5

Table 6Predicted top five codons used most frequently in O. polymorpha

Mutagenesis of OpPHO1 and OpPHO11 using the CRISPR/Cas9 plasmid( pMN70 )も,pMN67 と比べて Cas9 のより高い発現を

ら OpPHO1,OpPHO11 お よ び OpPHO84 を 選 択 し た．

期待して形質転換に使用した．Table 3 に示すように,

OpPHO1 および OpPHO11 はそれぞれ,S. cerevisiae 酸

こ れ ら 2 つ の CRISPR/Cas9 プ ラ ス ミ ド( pMN67 と性ホスファターゼ( APase )をコードする ScPHO5 とア

pMN70 )では同程度の高い効率( 38%と 45%)で Ade-

ミノ酸配列で 35%および 33%同一である．また,Op-

変 異 体 が 得 ら れ た．pMN67 で 形 質 転 換 さ れ た 5 つ のPHO84 は BY4329 のドラフトゲノム解析( Maekawa &Ade コロニーの塩基配列解析から 1 塩基あるいは 2 塩基

Kaneko, 2014 )の注釈情報から S. cerevisiae 高親和性リの 欠 失 が 生 じ てい る こ と が わ か っ た． つ ま り,改変

ン酸トランスポーターをコードする ScPHO84 のホモロ

CRISPR/Cas9 システムでの突然変異効率が最初のシスグと考えられる．

-

OpPHO1 遺伝子座と OpPHO11 遺伝子座にそれぞれ 4

テムの突然変異効率の 100 倍であることが示された．

つおよび 3 つの標的部位を設計した( Table 6 )．4 - 10
改良 CRISPR/Cas9 システムによる PHO 経路遺伝子のゲ

個の無作為に選択した Ura+ 形質転換体クローンの塩基

ノム編集

配列解析により,PHO1S18,PHO1S30,PHO11S2 およ改善された CRISPR/Cas9 システムの有効性を他の遺び PHO11S17 の標的部位で 17 - 71%の変異効率で Op-

伝子でも検証するため,PHO 経路を構成する遺伝子かPHO1 および OpPHO11 の挿入 / 欠失( indel )突然変異－ 83 －

金

子

嘉

信

が起こっていた．しかし,残りの 3 つの標的部位(すなかの酵母種を含む多くの生物での適用例が報告されていわ ち,PHO1S13,PHO1S40 お よ び PHO11S1 ) に つ いる( Jinek et al., 2012; Li et al., 2013; Kimura et al., 2014;ては,調べた 7 - 9 個の Ura+ 形質転換体中に突然変異体

Yu et al., 2013; Friedland et al., 2013; Jiang et al., 2013;

は観察されなかった( Table 6 )．

DiCarlo et al., 2013; Jacobs et al., 2014; Hor witz et al.,S. cerevisiae において,PHO84 遺伝子の欠損変異は高2015; Schwartz et al., 2016; Mali et al., 2013; Cong et al.,

リン酸条件下での構成的 APase 産生を示す( Bun-Ya et al.,2013; Ryan et al., 2014; Xie et al., 2015 )．本研究では,メ1991 )．改良 CRISPR/Cas9 システムによる OpPHO84 のタノール資化耐熱性酵母 O. polymorpha におけるゲノム

突然変異誘発を試験するために,遺伝子コーディング内

編集ツールとしての CRISPR/Cas9 システムの実用性をの 2 つの部位,すなわち ATG 開始コドンから 844 - 863 bp

検討した．OpSNR6 プロモーターで sgRNA を発現するに位置する PHO84S49( pMN77 )および 1381 - 1400 bp

最初の CRISPR/Cas9 システムでは実用的な O. polymor-に位置する PHO84S80( pMN87 )を選んだ( Fig. 3A )．

pha の ゲ ノ ム 編 集 に は 至 ら な か っ た． し か し,tR-

調べた 12 個の Ura+ 形質転換体の中で,APase 活性の構NA-sgRNA 融合遺伝子として発現させる改変システムは

成性表現型を示す変異体が高効率( 67%)で得られた

OpADE12 の突然変異効率を約 100 倍増加させ,40 %前( Fig. 3B )．PHO84S49 および PHO84S80 構成変異体の後まで高めた( Table 3 )．同様に,改良 CRISPR/Cas9

それぞれ 2 クローンの塩基配列解析の結果,indel 変異システムで他の遺伝子の変異体( OpPHO1,OpPHO11

が期待どおり両方の標的部位で生じていることがわかっ

および OpPHO84 )も 17 - 71%と高い効率で得られたた( Fig. 3C )．

( Fig. 3C と Table 6 )．したがって,改善された CRISPR/

以上の結果から,標的部位によっては高効率に働かな

Cas9 システムは O. polymorpha における実用的な遺伝子い場合もあるが,他の生物での場合と同じく O. polymor-

操 作 ツ ー ル と な り う る． し か し, 現 時 点 で は, 改 良

pha でも改良 CRISPR/Cas9 システムによって実用的な

CRISPR/Cas9 システムでもみられた標的部位の違いに高い効率でゲノム編集が可能であることを確認できた．

よる編集効率の大きなばらつきの理由をうまく説明する

考ことはできない．最近,Hinz et al.( 2015 )は in vitro察

で組換えヌクレオソームを基質として Cas9 活性を測定
し,PAM がヌクレオソーム内に位置する場合には Cas9

ゲノム編集のための CRISPR/Cas9 システムはいくつ

Fig. 3活性が強く阻害されるが,リンカー DNA 内に位置する

Mutation of OpPHO84 by the CRISPR/Cas9 system. A. Target positions (S49 and S80) for genome editing of the OpPHO84 gene.
The target region is indicated by nucleotide number from the start codon of OpPHO84 (A is +1). B. Phenotype of acid phosphatase production. Acid phosphatase activity was determined by a colony-staining assay on YPDA plates as described previously(Zhou et al., 2016). Colony color turns red if cells produce the enzyme. Red color is expressed as dark color in this photo. WT,
PHO84S49, and PHO84S80 indicate BY4330 transformants containing pMN27, pMN77, and pMN87, respectively. C. Sequence
analysis of the target region in four of the APase-constitutive clones shown in B. The target sequence of S49 and S80 is underlined; the PAM sequence is shown in italics.

－ 84 －

メタノール資化酵母のゲノム編集ツール開発

PAM の場合には阻害されないことを見出した．したがっえ効率が低いため,O. polymorpha の遺伝子操作はしばて,ヌクレオソーム中の PAM の位置が in vivo で効率的しば面倒で時間がかかる．
この弱点を克服するために,O.

なゲノム編集の重要なポイントになる可能性も考えられる．

polymorpha に強力なゲノム編集ツールとして CRISPR/

CRISPR/Cas9 システムにより,Hyg マーカーをゲノ

Cas9 システムを適用した．我々のシステムでは,ガイムの特定の標的部位に効率的に組み込むことができ(Ta-ド RNA( sgRNA )とエンドヌクレアーゼ Cas9 の両方R

ble 4 ),相同領域をもたない Hyg マーカーでも比較的を単一の自律複製可能なプラスミドで発現させ,PCR

高い頻度( 12%)で OpADE12 座に組み込まれた．したおよび In-Fusion クローニング技術を用いて sgRNA 部分

がって,遺伝子破壊の表現型が予測できる場合にはを容易に交換できるようにしている．さらに sgRNA 発

CRISPR/Cas9 システムは選択マーカーのみの導入で遺

現には tRNACUG 遺伝子を融合させたカセットを用いた．

伝子破壊変異体が取得できる．また,60 塩基の相同領

このシステムの編集効率は試したいくつかの標的遺伝子

R域を両端にもたせた Hyg マーカーでは,より長い相同において得られた形質転換体の 17 - 71%であった．した

領域断片を必要とする従来の遺伝子破壊法( González

がって,この CRISPR/Cas9 システムを用いることによet al., 1999 )よりも効率的に遺伝子破壊変異体を得られり,O. polymorpha の遺伝子操作がより便利になり,加た．CRISPR/Cas9 システムによって導入 DNA を標的部速されることが期待される．

R

位に組み込む方法は O. polymorpha ゲノムの特定部位に本助成で得られた研究成果の報告

点突然変異またはタグ断片を導入するなどの他の状況においても有用と思われる．しかし,Fig. 2D に示したよ
うにゲノム標的部位への組み込みは様々なパターンで起こるため,導入 DNA がインフレームに挿入されていることを確認する作業が必要である．導入 DNA が様々なパターンで組み込まれたのは,O. polymorpha 細胞で相同組換えよりもエラーが起こりやすい非相同末端結合の方がより強い活性を示すためかもしれない．
sgRNA に tRNA 遺伝子を融合して発現させると,細胞内 sgRNA 量が増加し,酵母( Schwartz et al., 2016;
Ryan et al., 2014 )および植物( Xie et al., 2015 )におけるゲノム編集の効率が高い．実際,tRNA-sgRNA 融合発
現 シ ス テ ム は O. polymorpha に お い て も CRISPR/Cas9
編集の標的突然変異効率を有意に高くした( Table 3 )．
さらに Xie et al.( 2015 )は 8 個の sgRNA を含むタンデ
ム配列の tRNA-sgRNA カセットを使用してイネの多重
ゲノム編集が可能であることも示した．tRNA-sgRNA 融合システムは O. polymorpha において良好に機能するので,タンデム tRNA-sgRNA アレイを用いた多重ゲノム

口頭発表1) 金子嘉信,周 瑩,前川裕美．2014．メタノール資化酵母
Hansenula polymorpha の新しい高安定性プラスミドベク
ター,第 66 回日本生物工学会大会,9 月,札幌 .
2) 沼本 穂,前川裕美,金子嘉信．2015．メタノール資化
酵母 Hansenula polymorpha における CRISPR/Cas9 によるゲノム編集,第 67 回日本生物工学会大会,10 月,鹿児島 .
3) 沼本 穂,前川裕美,金子嘉信．2016．メタノール資化
酵母 Hansenula polymorpha の改良 CRISPR/Cas9 によるゲノム編集,第 68 回日本生物工学会大会,9 月,富山 .
4) Numamoto, M., Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2016. P-246 Genome editing in Hansenula polymorpha using CRISPR/Cas9
system, 14th International Congress on Yeasts, September,
Awaji city, Hyogo, Japan.
原著論文
1) Numamoto, M., Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2017. Efficientgenome editing by CRISPR/Cas9 with a tRNA-sgRNA fusionin the methylotrophic yeast Ogataea polymorpha. J. Biosci.
Bioeng. 124: 487-492 (http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.
2017.06.001).

編集も O. polymorpha において適用できると考えられる．

保存機関に寄託した微生物株

結論として,本研究で開発した改変 CRISPR/Cas9 シ
ステムは O. polymorpha の遺伝子操作をより便利にし,O.
polymorpha 株の育種を促進し,分子生物学および合成

CRISPR/Cas9 シ ス テ ム の ゲ ノ ム 編 集 で 得 ら れ た O.

生物学および代謝工学を含む様々な分野で利用されるこ

polymorpha の ade12 突 然 変 異 体 (BY28911, BY28912) ととが期待される．

pho 突然変異体( BY28926 ~ BY28943 )及び Table 1 に要記載したプラスミド( BYP9596 ~ BY9615 )は NBRP 酵

約

母遺伝資源センター(分担機関；大阪大学工学研究科生
命先端工学専攻)に寄託した．

メタノール資化酵母である Ogataea polymorpha( syn.
Hansenula polymorpha ) は, 高 い 耐 熱 性( 50 ℃ ま で )謝

辞とキシロース資化性も示す魅力的な産業酵母である．しかし,Saccharomyces cerevisiae とは対照的に,相同組換－ 85 －

本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成に

金

子

よって行われたもので,ここに感謝の意を表します．そして,本研究は当寄附講座博士研究員の沼本穂さんの協 力 の も と に 実 施 し ま し た． ま た,S. cerevisiae 用 の
CRISPR/Cas9 プラスミド( #43802, #43803 )を提供してくれた Addgene (Cambridge, MA, USA) にも感謝します．

文

献Bun-Ya, M., Nishimura, M., Harashima, S. & Oshima, Y. 1991.
The PHO84 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes aninorganic phosphate transporter. Mol. Cell. Biol., 11: 3229-3238.
Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu,
P. D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L. A. & Zhang, F. 2013. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339: 819-823.
DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J. & Church,
G. M. 2013. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae
using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41: 4336-4343.
Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church,
G. M. & Calarco, J. A. 2013. Heritable genome editing in C.
elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat. Methods 10: 741-743.
Gellissen, G. 2000. Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 741-750.
Gleeson, M. A. & Sudber y, P. E. 1988. Genetic analysis in the
methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Yeast 4: 293-303.
González, C., Perdomo, G., Tejera, P., Brito, N. & Siverio, J.M.
1999. One-step, PCR-mediated, gene disruption in the yeast
Hansenula polymorpha. Yeast 15: 1323-1329.
Hinz, J. M., Laughery, M. F. & Wyrick, J. J. 2015. Nucleosomes
inhibit Cas9 endonuclease activity in vitro. Biochemistry 54:
7063-7066.
Hor witz, A. A., Walter, J. M., Schuber t, M. G., Kung, S. H.,
Hawkins, K., Platt, D. M., Hernday, A. D., Mahatdejkul-Meadows, T., Szeto, W., Chandran, S. S. & Newman J. D. 2015. Efficient multiplexed integration of synergistic alleles and metabolic
pathways in yeasts via CRISPR-Cas. Cell Syst. 1: 88-96.
Jacobs, J. Z., Ciccaglione, K. M., Tournier, V. & Zaratiegui, M.
2014. Implementation of the CRISPR-Cas9 system in fission
yeast. Nat. Commun. 5: 5334.
Janke, C., Magiera, M.M., Rathfelder, N., Taxis, C., Reber, S.,
Maekawa, H., Moreno-Borchart, A., Doenges, G., Schwob, E.,
Schiebel, E. & Knop, M. 2004. A versatile toolbox for PCRbased tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, moremarkers and promoter substitution cassettes. Yeast 21: 947-962.
Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L. A. 2013.
RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas
systems. Nat. Biotechnol. 31: 233-239.
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A. &Charpentier, E. 2012. A programmable dual-RNA-guided DNA
endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337: 816821.
Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A. & Higashijima, S. 2014. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carr yingreporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome
engineering. Sci. Rep. 4: 1-7.
Kurtzman, C.P. 2011. A new methanol assimilating yeast, Ogataea

嘉信parapolymorpha, the ascosporic state of Candida parapolymorpha.
Antonie van Leeuwenhoek 100: 455-462.
Li, J. F., Nor ville, J. E., Aach, J., McCormack, M., Zhang, D.,Bush, J., Church, G. M. & Sheen, J. 2013. Multiplex andhomologous recombination-mediated genome editing in
Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA andCas9. Nat. Biotechnol. 31: 688-691.
Lowe, T. M. & Eddy, S. R. 1997. tRNAscan-SE: A program for
improved detection of transfer RNA genes in genomic
sequence. Nucleic Acids Res. 25: 955-964.
Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2014. Inversion of the chromosomal
region between two mating type loci switches the mating typein Hansenula polymorpha. PLoS Genet. 10: e1004796.
Mali, P., Yang, L., Esvelt, K. M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J. E.,
Norville, J. E. & Church, G. M. 2013. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339: 823-826.
Ravin, N. V., Eldarov, M. A., Kadnikov, V. V., Beletsky, A. V.,
Schneider, J., Mardanova, E. S., Smekalova, E. M., Zvereva, M.
I., Dontsova, O. A., Mardanov, A. V. & Skryabin, K. G. 2013.
Genome sequence and analysis of methylotrophic yeast
Hansenula polymorpha DL1. BMC Genomics 14: 837.
Ryan, O. W., Skerker, J. M., Maurer, M. J., Li, X., Tsai, J. C., Poddar, S., Lee, M. E., DeLoache, W., Dueber, J. E., Arkin, A. P. &Cate, J. H. D. 2014. Selection of chromosomal DNA libraries
using a multiplex CRISPR system. eLife 3: e03703.
Rybova, O. B., Chmil, O. M. & Sibirny, A. A. 2003. Xylose andcellobiose fermentation to ethanol by the thermotolerant
methylotrophic yeast. FEMS Yeast Res. 4: 157-164.
Saraya, R., Krikken, A. M., Kiel, J. A. K. W., Baerends, R. J. S.,
Veenhuis, M. & van der Klei, I. J. 2012. Novel genetic tools for
Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Res. 12: 271-278.
Schwartz, C. M., Hussain, M. S., Blenner, M. & Wheeldon, I.
2016. Synthetic RNA polymerase III promoters facilitate
high-ef ficiency CRISPR-Cas9-mediated genome editing in
Yarrowia lipolytica. ACS Synth. Biol. 5: 356-359.
Stockmann, C., Scheidle, M., Dittrich, B., Merckelbach, A.,
Hehmann, G., Melmer, G., Klee, D., Buchs, J., Kang, H. A.
& Gellissen, G. 2009. Process development in Hansenula
polymorpha and Arxula adeninivorans, a re-assessment. Microb.
Cell Fact. 8: 1-10.
van der Klei, I. J., Harder, W. & Veenhuis, M. 1991. Methanol metabolism in a peroxisome-deficient mutant of Hansenula
polymorpha: a physiological study. Arch. Microbiol. 156: 15-23.
Weninger, A., Hatzl, A. M., Schmid, C., Vogl, T. & Glieder, A.
2016. Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9 expression
enables precision genome engineering in the methylotrophic
yeast Pichia pastoris. J. Biotech. 235: 139-149.
Xie, K., Minkenberg, B. & Yang, Y. 2015. Boosting CRISPR/Cas9
multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112: 3570-3575.
Yu, Z., Ren, M., Wang, Z., Zhang, B., Rong, Y. S., Jiao, R. & Gao,
G. 2013. Highly efficient genome modifications mediated by
CRISPR/Cas9 in Drosophila. Genetics 195: 289-291.
Zhou, Y., Yuikawa, N., Nakatsuka, H., Maekawa, H., Harashima,S., Nakanishi, Y. & Kaneko, Y. 2016. Core regulatory componentsof the PHO pathway are conserved in the methylotrophic yeast
Hansenula polymorpha. Curr. Genet. 62: 595-605.

－ 86 －

IFO Res.Commun. 31
87-97, 2017

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha では
2 つの接合型遺伝子座間領域の染色体逆位により接合型が転換する
前

川

裕

美 1)

大阪大学大学院工学研究科酵母リソース工学寄附講座〒565-0871

大阪府吹田市山田丘2-1

Inversion of the chromosomal region between two mating type loci switches
the mating type in the methylotrophic yeast Ogataea polymorpha
Hiromi Maekawa1)
Yeast Genetic Resources Laboratory, Graduate School of Engineering, Osaka University
Yamadaoka 2-1, Suita, Osaka 565-0871, Japan
Yeast mating type is determined by the genotype at the mating type locus (MAT ). In homothallic (self-fertile)
Saccharomycotina such as Saccharomyces cerevisiae and Kluveromyces lactis, high-efficiency switching between aand α mating types enables mating. Two silent mating type cassettes, in addition to an active MAT locus, areessential components of the mating type switching mechanism. We investigated the structure and functions ofmating type genes in Ogataea polymorpha. The O. polymorpha genome was found to harbour two MAT loci, MAT1
and MAT2, that are ~18 kb apart on the same chromosome. MAT1-encoded α1 and MAT2-encoded a2 specifies αcell and a cell identity, respectively. MAT1-encoded α2 and MAT2-encoded a1 were, however, essential for meiosis.
When present in the location next to SLA2 and SUI1 genes, MAT1 or MAT2 was transcriptionally active, while theother was repressed. An inversion of the MAT intervening region was induced by nutrient limitation, resulting inthe swapping of the chromosomal locations of two MAT loci, and hence switching of mating type identity.
Inversion-deficient mutants exhibited severe defects only in mating with each other, suggesting that this inversion
is the mechanism of mating type switching and homothallism. This chromosomal inversion-based mechanism
represents a novel form of mating type switching that requires only two MAT loci.
Key words: homothallism, mating type switching, methylotrophic yeast, chromosomal inversion, nutritional
starvation

緒言

写制御を介して細胞の接合型アイデンティティーを決めている．子嚢菌ではほとんどの種が接合型を 2 つだけも酵母種の多くは細胞分裂による無性生殖に加えて有性

つことが知られている．

生殖サイクルを持つ．酵母の性サイクルは接合相手とな

Saccharomyces cerevisiae では a 型または α 型の一倍体る細胞の認識と細胞融合,それに続く核融合により二倍細胞は接合能をもつが,a/α の二倍体細胞は接合能を持体を形成する．二倍体は減数分裂を経て一倍体の胞子をたない．S. cervisiae の 2 つの MAT アレル MATa,MATα形成する．子嚢菌酵母では細胞間認識は異なる接合型細はそれぞれ a1,α1 と α2 の転写因子をコードしている．

胞間でのみ起こる．酵母の接合型は接合型遺伝子座

α1 は α 特異的遺伝子群の転写を活性化するのに対して,( MAT )と呼ばれる単一の遺伝子座により決定される．

α2 は a 特異的な遺伝子を抑制する．これに対して,a 特

MAT 遺伝子座は複数のアレルを持っているが,いずれ異的な遺伝子の転写は MAT 遺伝子に依存しておらず,も転写制御因子をコードしており,下流の遺伝子群の転α2 が発現していない限りは a 特異的遺伝子の転写が認められる (Haber, 2012)．a 特異的遺伝子のデフォルト

E-mail: hmaekawa@agr.kyushu-u.ac.jpp
1)
現 九州大学大学院農学研究院

での転写発現は S. cervisiae に特徴的であるが,これは他の Saccharomycotina 酵母種のゲノム中には存在する－ 87 －

前

川

裕

美

a2 遺伝子が S. cerevisiae では欠失しているためである．

polymorpha の性システムは,他の子嚢菌酵母と同様にCandida albicans 及 び Candida lusitaniae で は a2 は a 特

接合型は二極性であると考えられたが,四極性であると異的遺伝子群の転写を活性化する因子として機能するの 記 載 も あ っ た (Hansen & Hollenberg, 1996)． ま た,

(Reedy et al., 2009)．S. cerevisiae の二倍体細胞において不完全ではあるもののドラフトゲノム配列が明らかにさは,α2 は a1 と複合体を形成し,一倍体特異的遺伝子群

れており,MATa と MATα が融合した構成を持つ特徴の転写を抑制しており,これにより接合能の喪失と,減的な MAT 遺伝子座を持っていること,HO 遺伝子が見

数分裂能の獲得を保証している．

られないことが報告されていた (Butler et al., 2004)．本有性生殖システムには,相互に認識可能な異なる接合研究では O. polymorpha を新たな酵母モデル系として確型株間でのみ接合可能なヘテロタリックと単一細胞由来

立するために,接合型の分子機構とホモタリズム機構をの集団内で接合することができるホモタリックがある．

明らかにすることを目指した．

酵母のホモタリズムの中で最も研究が進んでいるのは S.

実験方法

cerevisiae である (Haber, 2012)．転写活性があり機能しているのは接合型遺伝子座( MAT )のみであるが,染色体上の別の位置にサイレントな「カセット」と称され

酵母菌株

る MATa,MATα 配列のコピー( HMLα と HMRa )がO. polymorpha NCYC495 又は CBS4732 由来の研究室存在している．接合型変換は栄養増殖期にある細胞で起株を用いた (Lu et al., 2000)．遺伝子欠失やタグ付加なこるため,隣接する細胞との間で接合が可能となり,S.

どのゲノム配列操作,酵母の培養,ゲノム DNA の精製

cerevisiae では栄養培地で接合して二倍体になるので,は S. cerevisiae で標準的な用いられる方法により行なっ

培養中の殆どの細胞は二倍体である．接合型変換はた (Janke et al., 2004; Saraya et al., 2012; Sherman, 1991)．

MAT 遺 伝 子 座 の DNA 配 列 を 除 去 し,HMLα 又 は

富栄養条件としてはロイシン,ウラシル,アデニンを添

HMRa を鋳型とする遺伝子変換反応であり,HO エンド

加した酵母完全培地(ロイシン,ウラシル,アデニンをヌクレアーゼによる DNA 二重鎖切断が引き金となり開各 200 mg/l 含有する 1 %イーストエクストラクト,2 %始する．S. cerevisiae 近縁の Candida glabrata, Saccharo-

ペプトン,2 %グルコース培地),接合誘導培地としてmyces castellii, Zygosaccharomyces rouxii はサイレントな 2

MEMA 培地( 2.5 %マルトース,0.5 %モルトエクスト

つのカセットと HO エンドヌクレアーゼを持っているラクト培地)を用いた．培養は 30 ℃で行なった．

が,進化的に離れた C. albicans や Yarrowia lipolytica は
機能的な MAT を一つだけ持つヘテロタリックであり,サイレントなカセットを持たない．S. cerevisiae 近縁種の一つである Kluveromyces lactis は 2 つのカセットを持つものの,HO エンドヌクレアーゼを持たない．しかし,S. cerevisiae と同様の遺伝子変換反応により接合型を変換することが分かっている (Butler et al., 2004)．ゲノム
中に HO エンドヌクレアーゼ遺伝子が存在した痕跡と考えられる DNA 領域があることから,進化の過程で遺伝子変換反応の引き金となる DNA 損傷を引き起す独自の機構を獲得し,HO エンドヌクレアーゼ遺伝子が退化したものと考えられている (Barsoum et al., 2010; Herman& Roman, 1966)(Fig. 1)．
Ogataea polymorpha は S. cervisiae とは進化的に離れた酵母であり,メタノール資化性をもつ等,様々な産業
利用に有利な形質をもつが,細胞増殖制御や有性生殖などの分子制御機構についての理解は進んでいない．O.
polymorpha は二倍体として増殖することは可能である

Fig. 1が, 通 常 は 一 倍 体 で あ る (Hansen and Hollenberg,
1996)．ホモタリックな有性生殖サイクルを持っており,
栄養飢餓条件に置かれると同一株由来の細胞間で接合
し,減数分裂を経て胞子形成を行なう．研究開始当時,O.
－ 88 －

Schematic of phylogenetic relationships among yeast
species and conservation of silent mating type cassettes
and the HO gene.
Information on silent cassettes and the HO gene is basedon ref. 13. The tree is not drawn to scale. Adopted from
Maekawa et al. (2014).

新規接合型変換機構によるメタノール資化酵母のホモタリズム

RNA の抽出と解析

ドラフトゲノム配列解析
野生型 O. polymorpha 株 BY4329 のゲノム DNA を調整

O. polymorpha の 全 RNA は van Zutphen et al. (2010)

し,ロッシュ社の Genome Sequencer FLX System 及びに記載された手法で抽出した後,DNaseI 処理と RNeasy

イルミナ社の Genome Analyzer GAIIx を用いて解析しPlus Kit を 用 い て 更 に 精 製 し た (van Zutphen et al.,

た．ペアエンド・ライブラリー及びゲノムライブラリー

2010)．1 μg RNA を 用 い て SuperScriptIII に よ り cDNA

は 各 々 Paired-End Library Preparation Method Manualを合成した．定量解析には QuantStudio 3D Digital PCR

220 kb and 8 kb Span キット(ロッシュ社),TruSeq DNA

system を用いた．

Sample Preparation v2 キット(イルミナ社)を用いて作結製した．なお,ライブラリー作製及び配列解析はタカラ

果バイオ社に委託した．
O. polymorpha は 2 つの接合型遺伝子座を持つ
A(α) 型と I(a) 型の PCR による検出

ドラフトゲノム配列から O. polymorpha の接合型遺伝

ゲノム DNA 10 ng を鋳型とし,PRIME STAR Max(タ子座として α2,α1,a1 遺伝子がこの順番に同じ向きに

カラバイオ社)を用いて PCR 反応を行なった．プライマー

配 置 さ れ た 遺 伝 子 座 が 報 告 さ れ て い た (Butler et al.,として,Primer A( 5’-ATAAGTACTCACAATCGAGGC-3’,

2004)．この遺伝子座に加えて,我々の全ゲノム配列解5’-AGGAACAGGTTCAGTACTGG-3’ ) ま た は Primer D

析から a1,a2 遺伝子をコードする配列が同一染色体上( 5’-ATAAGTACTCACAATCGAGGC-3’, 5’-GATGGTAATの約 19 kb 離れた位置にあることが明らかになった (Fig.

GACTCTGTAGC-3’ )を用いた．PCR 反応は 21-23 サイ

2)(Hanson et al., 2014; Maekawa & Kaneko, 2014)．このクル行なった．PCR 産物は 0.8%アガロース電気泳動で第二の接合型遺伝子座には SLA2 遺伝子の C 末側領域が解析した．

隣接しており,第一の接合型遺伝子座に隣接する完全長

半定量的接合アッセイ

形成している．2 つの a1 様蛋白質のアミノ酸配列は Nの SLA2 遺伝子領域との間に約 2 kb の逆向き反復配列を
leu1-1 又は ura3-1 の遺伝型を持つ酵母菌株は,YPDS

末の 24 アミノ酸を除いて同一であり,S. cerevisiae の a1培地を用いて 30 ℃で培養した．PBS で洗浄後,同量の蛋白質の類似性は共通領域に限られている．同様のゲノ菌体を MEMA プレート上に置いたニトロセルロース膜

ム構造は近縁の Ogataea parapolymorpha DL-1 でも報告上で混合し,30 ℃で 24 時間培養した．ニトロセルロー

されている (Ravin et al., 2013)．本稿では既に報告のあス膜上の細胞を PBS に懸濁し,適当な倍率で希釈した

る接合型遺伝子座と新たに見いだされた遺伝子座をそれものをロイシンを添加した合成培地( SD + Leu ),ウラ

ぞれ MAT1,MAT2 と名付け,2 つの a1 様遺伝子の内,シルを添加した合成培地( SD + Ura ),合成培地( SD )MAT1 中の遺伝子を a1*,MAT2 中の遺伝子を a1 と表プレートに蒔き 37 ℃で 2 日間培養した．コロニー数を記する (Maekawa & Kaneko, 2014)．

カウントし,次の計算式の値を接合率とした．
接合過程でのパートナーの認識はフェロモン受容体に依(接合率）=｛( SD プレートのコロニー数）x 希釈倍率｝/

存している｛( SD + Leu と SD + Ura プ レ ー ト の コ ロ ニ ー

O. polymorpha のホモタリズムの分子機構を明らかに

数のいずれか小さい方）x 希釈倍率｝x 100

するために,接合型遺伝子の有性生殖での機能の解析を試みた．その為に,先ずヘテロタリックな a 型または αFig. 2

Two mating type loci in O. polymorpha.
Schematic of the chromosomal region surrounding MAT1 and MAT2. The chromosome is represented by a thick grey line; α2,
α1, a1* and a1 genes are indicated by grey arrows. MAT loci are indicated by light grey. Predicted ORFs are indicated by arrows
above the chromosome. Position of centrosome is based on Hanson et al. (2014).

－ 89 －

前

川

裕

美

型細胞として挙動する株の構築を行なった．酵母の接合二倍体での減数分裂能は回復しなかったことから,a1では,接合フェロモンによる細胞間コミュニケーション

遺伝子と a1* 遺伝子は異なる機能を持つと考えられるが重要な役割を果たすことが知られており,フェロモン(Fig. 3E)．a1* 遺伝子は有性生殖には必須でないことか

シグナル伝達経路は真菌類に広く保存されている．O.

ら,MAT1,MAT2 は其々 MATα,MATa として機能すpolymorpha のゲノム中に S. cerevisiae の a ファクター受るといえる．

容体遺伝子 STE3,α 型ファクター受容体遺伝子 STE2 の相同遺伝子が見いだされた (Burkholder & Hartwell, 1985;

MAT 間領域の逆位は接合型遺伝子の発現パターンを変Hagen et al., 1986)．ste2 遺伝子欠失株,ste3 遺伝子欠失化させる株は接合において各々ヘテロタリック α,a 細胞と同様

MAT1 上流と MAT2 下流は 2049 bp の逆向き反復配列の挙動をすることが期待される．即ち,Self-fertility はとなっている( IR1,IR2 と称する)(Fig. 4A)．IR1 又持たないが,適合する接合型細胞との接合は可能である．

は IR2 を挟む PCR がしばしば不明瞭な結果を生じたこ

接合能を評価するために半定量的接合アッセイ系を構築とから,ゲノム DNA を用いたサザン解析により接合型した．O. polymorpha の接合は栄養飢餓条件により誘導

遺伝子周辺のゲノム配列の解析を行った (Fig. 4B)．2 つされるが,接合により生じる二倍体細胞は速やかに減数の研究室株 BY4330,HPH22 からゲノム DNA を調製し,分裂・胞子形成過程へ移行することが知られている．しMAT1,MAT2 近傍の DNA 領域をプローブとして用い

かし,二倍体形成後,減数分裂開始前に栄養条件が好転

た．BY4330 と HPH22 の結果は異なっており,BY4330

すると二倍体細胞として増殖を再開する．この性質を利が我々のドラフトゲノム配列から予想される結果と一致

用し,二倍体コロニー形成数を指標とした接合能の評価した．一方,IR1 と IR2 の間の領域の逆位を想定するとが可能かどうかを検証した．ste2Δ x ste2Δ,ste3Δ x ste3Δ

HPH22 の結果と一致することから,この領域の向きがの交配では二倍体は形成されなかったが,ste2Δ 又は2 つの株間で異なっているかを PCR 法により検証した．

ste3Δ x 野生型,ste2Δ x ste3Δ では同等の二倍体コロニー

其々の向きに特異的な PCR プライマーを用いた PCR 解形成が観察された (Fig. 3A)．この結果は,O. polymor-

析の結果は上記の予想と完全に合致しており,BY4330

pha の接合型が 2 極性であり,接合アッセイにおいて

株と HPH22 株では染色体の MAT 領域が逆位の関係に

ste2Δ と ste3Δ は其々ヘテロタリック α 型,a 型細胞とみあることが明らかになった (Fig. 4C)．出芽酵母の MATなすことができることを示している．

遺伝子座近傍の遺伝子配置は進化的に保存されているこ

a2 と α1 は接合に，a1 と α2 は減数分裂・胞子形成に必が MAT 遺伝子座に隣接している (Fig. 2)(Butler et al.,

須である2004)．この遺伝子配列に相当するのが BY4330 型の染とが知られており,一般に DIC1 遺伝子と SUI1 遺伝子

接合型遺伝子座にコードされる a1,a2,a1*,α1,色体であるので,BY4330 株の MAT の配置を Ancient 型

α2 遺伝子の欠失変異株を作製し,有性生殖での表現型( A 型 ),HPH22 株 を Inverted 型( I 型 ) と 名 付 け, 以を解析した．接合能は半定量的接合アッセイで評価し,降は遺伝型表記として A(α) 及び I(a) を用いる．BY4330

減数分裂・胞子形成については顕微鏡観察を行った．O.

株と HPH22 株のいずれも PCR サイクル数を増やすと両polymorpha の研究室株の接合率は一般に低く,野生型

方の向きを示す PCR 産物が検出できるようになる．までも 2%程度であるが,a2Δ,α1Δ 株では同じ遺伝型を持た,HPH22 株の複数のシングルコロニーを調べたとこ

つ株との間では二倍体コロニーを形成することができず

ろ,多くは I 型を保持していたが,少数のコロニーでは( a2Δx a2Δ,α1Δx α1Δ; Fig. 3B & 3C ),顕微鏡観察におA 型に変換していた( HPH22i 株)．更に HPH22i 株のシ

いても接合子や接合時の細胞形態変化などは観察されなングルコロニーのほとんどは A 型であった．これらのかった．一方,a1Δ,a1*Δ,α2Δ 株では同じ遺伝型を持結果から,A 型・I 型間の変換は起こり得るが,栄養増

つ株との交配で野生型と同程度の接合子が形成された殖中は比較的安定に維持されることを示唆している．

( a1Δx a1Δ,a1*Δx a1*Δ,α2Δx α2Δ; Fig. 3B & 3C )．こ

ゲノム中に MATα,MATa が共存しているにもかかれらの結果から,a 型及び α 型のアイデンティティーはわらず,接合能をもつことから,2 つの接合型遺伝子の其々 a2,α1 が規定することが明らかになった．a1 及び転写が異なった制御を受けており,一方のみが発現してα2 は接合には必須でないが,a1Δ/a1Δ 及び α2Δ/α2Δ 二いる可能性を考えた．栄養増殖中の HPH22 株から RNA倍体では減数分裂・胞子形成は観察されなかった．一方,を抽出し,RT-PCR 解析を行ったところ,MAT2 にコー

a1*Δ/a1*Δ 二倍体は野生型と同様に高い効率で減数分ドされる遺伝子は発現しているが,MAT1 上の遺伝子は裂・胞子形成を行なった (Fig. 3D)．更に,a1* 遺伝子発現が見られなかった (Fig. 4D)．これに対して BY4330

を TEF1 プロモーターを用いて高発現しても a1Δ/a1Δ

株では MAT1 にコードされる遺伝子は発現しているが,－ 90 －

新規接合型変換機構によるメタノール資化酵母のホモタリズム

Fig. 3Functions of mating type genes in sexual development.
(A) Two mating pheromone receptors are required for mating. Wild-type, ste2Δ and ste3Δ O. polymorpha strains of ura3-1 andleu1-1 genotypes were combined on MEMA mating medium and incubated at 30 ℃. After 24 h, cells were spread on SD plates toselect for Leu+Ura+ diploids. Colony number was counted after 2 days at 37 ℃. Shown is the average of three independent matings. Error bars indicate SD. (B) Mating assay of wild-type, α1Δ, α2Δ, a1*Δ, and a1Δ strains. Wild-type , α1Δ, α2Δ, a1*Δ , and a1Δstrains were treated as described in (A). Shown is the average of three independent matings. Error bars indicate SD. (C) Mating
assays of wild-type, α1Δ , α2Δ , a1*Δ, a1Δ and a2Δ strains with ste2Δ and ste3Δ strains. Cells were treated as described in (A).
Shown is the average of three independent matings. Note that ste2Δ and ste3Δ strains behave as heterothallic α or a strains, respectively. Error bars indicate SD. (D) Functions of a1 and α2 are essential for meiosis and sporulation. Shown are mergedbrightfield and DAPI epifluorescence images. White arrows indicate spores. Bar, 5 μm. (E) a1* and a1 are functionally distinct.
Logarithmically growing wild-type diploid and a1Δ homozygous diploid (a1Δ/a1Δ) cells carrying the indicated plasmid werespotted on MEMA plates and incubated at 30 ℃ for 24 hrs. Plasmids used were vector plasmid, plasmids that carry PTEF1-a1* orPTEF1-a1. Shown are merged brightfield and DAPI epifluorescence images. White arrows indicate spores. Bar, 2 μm. Adopted from
Maekawa & Kaneko (2014).

－ 91 －

前

Fig. 4

川裕

美Inversion of the MAT intervening region alters the expression status of mating type genes.
(A) Schematics of the chromosomal region surrounding MAT1 and MAT2. α1, α2, a1*, and a1 genes are indicated by pink, red,and light and dark blue arrows, respectively. IR regions are shown as thick orange arrows. DNA fragments used as probes forSouthern blot analysis in (B) are shown as dark grey (probe A) or light grey (probe C) bars. The upper schematic shows the draft
genome sequence. The lower schematic shows the predicted DNA sequences after the inversion between IR regions. Upper andlower panels show restriction enzyme sites deduced from the DNA sequences and the size of the DNA fragment hybridized byeach probe. X, XhoI; P, PstI; E, EcoRI; B, BamHI. (B) Two types of chromosome configuration in different wild-type strains. Genomic DNA of two strains (indicated as 1 and 2) were prepared from logarithmically growing cells in YPDS medium and analyzed
by Southern blotting using probes A and C (upper panel). The lower panel shows the results predicted from Upper (U) and Lower (L) schematics in (A). (C) PCR amplification of the I- or A-type MAT1 locus (reaction I with Primer_I/Primer_D or reaction A
with Primer_A/Primer_D). The presence of the I product and absence of the A product for HPH22 indicates that the chromosome is in the I-type orientation. HPH22i and BY4330 have an A-type chromosome. (D) Mating type genes are transcriptionallyactive at position 1 and repressed at position 2. The expression of α1, α2, a1*, and a1 genes was examined by RT-PCR. RNA samples were prepared from logarithmically growing wild-type cells in YPDS medium at 30 ℃ (HPH22, HPH22i, and BY4330).
HPH22i is a clone isolated from HPH22 (Fig. S4B; see text). Adopted from Maekawa & Kaneko (2014).

－ 92 －

新規接合型変換機構によるメタノール資化酵母のホモタリズム

MAT2 上 の 遺 伝 子 は 発 現 し て い な か っ た (Fig. 4D)．

型は MAT 領域の染色体構造( A 型,I 型)によって決HPH22i 株は BY4330 株と同じ発現パターンを示したこ

まることから,A(α) 株と I(a) 株の交配の方が接合率がとから,接合型遺伝子発現パターンの違いは菌株間の遺高い可能性を考えた．しかし,A(α) 型と I(a) 型の組み伝的背景の違いではなく,MAT 領域の染色体上の向き

合わせの違いは接合率には影響しなかった (Fig. 5A)．

( A 型,I 型)に依存していることが示唆される．即ち,

このことから,接合誘導条件下では接合型変換が誘導さ

ORF フリー領域近傍の MAT は転写抑制されていると考れる可能性が考えられる．そこで,BY4330 株を用いてえられる．Hanson et al.(2014) は,この ORF フリー領

栄養源飢餓条件下での接合型遺伝子の発現を解析したと域及び隣接する MAT 領域はセントロメアクロマチン構ころ,栄養増殖中に発現している MAT1 上の遺伝子(α1 )造をとっていること示しており,MAT の転写抑制はこに加えて,接合培地( MEMA )で 10 時間培養するとのクロマチン構造の影響であると考えられる．

MAT2 上の遺伝子である a1 の発現が検出された (Fig.

接合型変換は栄養飢餓により誘導される遺伝子の発現上昇が確認された (Fig. 5B & 5C)．つまり,5B & 5C)．同様に,HPH22 株では MEMA 培地での α1
O. polymorpha はホモタリックであるが,細胞の接合

Fig. 5接合誘導条件での培養では全ての接合型遺伝子が発現しInversion of the MAT intervening region is induced during mating.
(A) Mating assay between I- and A -type strains. Cells were treated as described in Fig. 3A. Shown is the average of three independent matings. Error bars indicate SD. (B) RT-PCR analysis of α1 and a1 genes. RNA samples were prepared from I - or A-typewild-type cells incubated on MEMA medium for the indicated times. (C) Quantitative digital PCR analysis of α1 and a1 genes.
RNA samples in (B) were subjected to digital PCR analysis. α1 and a1 RNA levels were normalized to that of ACT1 RNA. Shownare the averages of two independent PCR reactions. Error bars indicate SD. (D) PCR amplification of the I- or A-type MAT1 locus.
PCR reactions are as described in Fig. 4C. Genomic DNA samples were prepared from three wild-type strains after incubation on
MEMA for the indicated times. The appearance of the I product in the reaction with BY4330 (A-type) after 9 and 24 hrs indicatesa switch to the I-type in a subset of the population. Adopted from Maekawa & Kaneko (2014).

－ 93 －

前

川

裕

美

ており,self-mating が全ての株で観察されることと整合いることを確かめるために,接合子由来の二倍体細胞をしている．

複数単離し,MAT 領域の向きを調べた．146 株の二倍体

発現抑制されていた MAT の転写が栄養飢餓により活株は全て A(α) 型染色体と I(a) 型染色体を一本ずつ保持性化される機構として,転写制御が変化する可能性,染していた．この結果はセントロメアに隣接する MAT は色体逆位により転写活性のある染色体の位置にある

栄養源飢餓下でも転写抑制されていることを示唆している．

MAT 配列が変化する可能性が考えられる．後者を検証するために,BY4330 株,HPH22 株,HPH22i 株を接合

O. polymorpha のホモタリズムは MAT 間領域の逆位に培地中で培養し,MAT 周辺の染色体の向きを PCR 法をよってのみ引き起される用いて解析した (Fig. 5D)．3 つ全ての株で接合培地中

O. polymorpha においては MAT 間領域の逆位が接合型

で染色体の向きの変換が見られた．HPH22 株に比べて変換の唯一の機構であることを確かめるために,A(α)

BY4330 株の方が逆位の頻度がやや高いが,BY4330 株で型野生型において IR2 配列を欠失させた変異株( IR2Δ )の飢餓下での a1 の発現誘導が HPH22 株での α1 発現誘を作製したところ,栄養源飢餓下でも逆位が全く起こら

導より強いことと一致している．これらの結果から,なくなった (Fig. 6A & 6B)．この株の接合能を調べたと

MAT 間領域の逆位によって接合型遺伝子の転写誘導がころ,ヘテロタリック a 型細胞様株( ste3Δ )との交配引き起されることが示唆された．

では接合子が形成されたが,ヘテロタリック α 型細胞様

接合型変換の際には必ず MAT 領域間逆位が起こってFig. 6株( ste2Δ ) と は 接 合 で き な か っ た (Fig. 6C)． ま た,

Inversion of the MAT intervening region is essential for homothallism.
(A) Schematic of the strategy for IR2 deletion on the A-type chromosome.
(B) IR2 Δ cells are defective for the inversion. Logarithmically growing wild-type (HPH22i) and IR2 Δ (HPH833) cells in YPDS medium (+N, nutrient plus) were transferred to YPDS (+N → +N) or MEMA (+N → -N, nutrient minus) and incubated for 20 hrs.
Genomic DNA samples were prepared and inversion was detected by two PCR reactions, A and Ai, using the primer sets Primer_
D/Primer_A and Primer_E/Primer_A, respectively. (C) Cells of the A-type strain carrying the IR2 Δ allele are incapable of matingwith each other and with ste2Δ. Wild-type , ste2Δ , ste3Δ and IR2 Δ cells were treated as described in Fig. 3A. Shown is the averageof three independent matings. Error bars indicate SD. (D) Model of homothallism in O. polymorpha. Adopted from Maekawa &Kaneko (2014).

－ 94 －

新規接合型変換機構によるメタノール資化酵母のホモタリズム

IR2Δx IR2Δ でも接合子は形成されなかった (Fig. 6C)．

matin Protein 1 )もない (Haber & George, 1979; Lorentz

これらの結果から O. polymorpha の接合型変換は MAT

et al., 1994; Rine & Herskowitz, 1987; Rine et al., 1979) ．

間領域の逆位によってのみ引き起されることが明らかに

これらのことから,S. cerevisiae とは異なる分子機構により MAT の転写が抑制されていると考えられた．Wolfe

なった (Fig. 6D)．

考らのグループは MAT に隣接した ORF フリー領域がセン察

トロメア特異的ヒストン(CENP-A )を含むヌクレオソー
ム構造を取っており,セントロメア構造が MAT のサイ

O. polymorpha の接合型遺伝子

レンス化を担っていると提唱している (Hanson et al.,

欠失変異株の表現型の解析から,4 つの遺伝子( a1,2014)．

a2,α1,α2 )が有性生殖で必須の役割を果たしている
ことが明らかになった．a2,α1 は各々 a 型,α 型細胞

O. polymorpha のホモタリズム機構の接合に必須であり,a1 及び α2 は減数分裂・胞子形成

これまでに知られている子嚢菌酵母のホモタリズムはに必須である (Fig. 7A)．a 型遺伝子特異的な遺伝子発現

接合型変換に依存している．「カセットモデル」としては接合型遺伝子の制御を受けず,デフォルトが ‘ON’ で広く知られる S. cerevisiae や S. pombe 接合型変換機構はある S. cerevisiae とは異なっており,C. albicans と似た最も解析が進んでおり,分子機構は合計 3 つの接合型遺接合型遺伝子の機能を持っていると言える．各々の接合伝子配列によって構成されている．興味深いことに,S.

型遺伝子による転写制御の標的遺伝子については今後明

cerevisiae と S. pombe の共通祖先はヘテロタリックであらかにしていく予定である．

り,接合型遺伝子座を一つだけ持っていたと考えられている．系統関係を考慮すると,現象や分子機構の構成はMAT の転写抑制機構

よく似ているものの,2 つの酵母の接合型変換機構は進2 つの MAT 遺伝子座のうち,ORF フリー領域近傍に化的には各々独立に生じたものであることが分かる．O.

位置している遺伝子座の転写は厳密に抑制されている．

polymorpha の ゲ ノ ム 中 に は MAT 配 列 が 2 つ あ り,S.

S. cerevisiae のサイレントな接合型遺伝子座は Sir 蛋白質

cerevisiae 及びその近縁種に見られる 3 つの MAT を持つによるヘテロクロマチン化により転写抑制されることがゲノム構成の進化過程の過渡的な状態を保持していると知られているが,O. polymorpha には Sir2 ホモログは存考えられる (Fig. 7B)．今後は,O. polymorpha における

在するものの,Sir1,Sir3,Sir4 ホモログは見つからず,

IR 間の DNA 組換えの分子機構とその分子制御機構の解ヘテロクロマチン結合蛋白質である HP1( Heterochro-

明を目指す．

Fig. 7

Model of mating type regulation in O. polymorpha.
(A) Function of mating type genes in establishing mating type identity. (B)Evolution of the mating type switching system in yeast.

－ 95 －

前

要

川

約

子嚢菌酵母の共通祖先は接合型遺伝子( MAT )座を一つだけ持つヘテロタリックであったと考えられる．一

裕

美
原著論文
1) Maekawa, H., & Kaneko, Y. 2014. Inversion of the chromosomal region between two mating type loci switches themating type in Hansenula polymorpha. PLoS Genet 10:
e1004796.

方,S. cerevisiae 及びその近縁種は 3 つの MAT と HO エ謝

ンドヌクレアーゼをコアとする接合型変換機構によるホ辞

モタリズムを進化させてきた．S. cerevisiae とは進化的に離れており,ホモタリックであるメタノール資化酵母

本研究は,公益財団法人発酵研究所の寄附講座助成を受

O. polymorpha の全ゲノム配列解析を行なったところ,S.

けて行なわれたものであり,ここに感謝の意を表します．

cerevisiae に見られる接合型変換機構を構成するゲノム

本研究への大阪大学大学院工学研究科原島峻教授(現：構成を持っていなかった．O. polymorpha は 2 つの MAT

崇城大学)並びに村中俊哉教授のご支援とご協力に深く

遺伝子座を同じ染色体上に持つが,転写発現は一方のみ感謝いたします．さらに,当寄附講座に在籍した皆さんに限定されている．転写制御は染色体上の位置に依存しに感謝します．

ており．両 MAT を含む染色体領域の逆位に依存して発文現する MAT を変換するという新規の接合型変換機構をもつことが明らかになった．2 つの MAT 遺伝子をもつ
ゲノム構成は,3 つの MAT 遺伝子による接合型変換機
構が進化する過渡的な状態を反映していると考えられる．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 前川裕美,金子嘉信．2015. メタノール資化酵母 Hansenula polymorpha の新規な接合型変換機構．第 38 回日本分子生物学会年会・第 88 回日本生化学会大会 合同大会,12 月,
神戸 .
2) 前川裕美．メタノール資化酵母における新規な接合型変換機構．第 80 回酵母研究会・第 3 回 NBRP 酵母シンホ゜シ゛
ウム合同講演会,9 月,奈良 .
3) 前川裕美,金子嘉信．2015. メタノール資化酵母 Hansenula polymorpha の接合型変換機構．酵母遺伝学フォーラム
第 48 回研究報告会,9 月,広島 .
4) Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2015. Chromosomal inversionbased mechanism of mating type switching in Hansenula
polymorpha. 28th Fungal Genetics Conference, PacificGrove CA, USA.
5) 前川裕美,金子嘉信．2014. メタノール資化酵母 Hansenula polymorpha の性決定と接合型変換機構．第 37 回日本分子生物学会年会,11 月,横浜 .
6) Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2014. Inversion of the chromosomal region between two mating type loci switches themating type in Hansenula polymorpha, Experimental Approaches to Evolution and Ecology using Yeast & other
Model Systems, EMBO Conference Series, EMBL Heidelberg, Germany (poster presentation).
7) 前川裕美,金子嘉信．2014. メタノール資化酵母 Hansenula polymorpha の性決定とホモタリズムの機構．酵母遺伝学フォーラム第 47 回研究報告会,9 月,東京 .
8) 前川裕美,金子嘉信．2014. メタノール資化酵母の接合型
遺伝子座の構造と転写解析．第 8 回ゲノム微生物学会年会,
3 月,東京 .

献

Barsoum, E., Martinez, P. & Astrom, S.U. 2010. Alpha3, a transposable element that promotes host sexual reproduction.
Genes Dev. 24: 33-44.
Burkholder, A.C., & Hartwell, L.H. 1985. The yeast a-factor receptor: structural properties deduced from the sequence of the
STE2 gene. Nucleic Acids Res. 13: 8463-8475.
Butler, G., Kenny, C., Fagan, A., Kurischko, C., Gaillardin, C. &Wolfe, K.H. 2004. Evolution of the MAT locus and its Ho endonuclease in yeast species. Proceedings of the National Academy of Sciences 101: 1632-1637.
Haber, J.E. 2012. Mating-type genes & MAT switching in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 191: 33-64.
Haber, J.E. & George, J.P. 1979. A mutation that permits the expression of normally silent copies of mating-type informationin Saccharomyces cerevisiae. Genetics 93: 13-35.
Hagen, D.C., McCaffrey, G. & Sprague, G.J. 1986. Evidence theyeast STE3 gene encodes a receptor for the peptide pheromone a factor: Gene sequence and implicationsfor the structure of the presumed receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:
1418-1422.
Hansen, H. & Hollenberg, C.P. 1996. Hansenula polymorpha (Pichia angusta). In K. Wolf, ed. Nonconventional Yeasts in Biotechnology (Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg),
pp. 293-311.
Hanson, S.J., Byrne, K.P. & Wolfe, K.H. 2014. Mating-type switching by chromosomal inversion in methylotrophic yeasts suggests an origin for the three-locus Saccharomyces cerevisiae
system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111: E4851-E4858.
Herman, A. & Roman, H. 1966. Allele specific determinants of homothallism in Saccharomyces lactis. Genetics 53: 727-740.
Janke, C., Magiera, M.M., Rathfelder, N., Taxis, C., Reber, S.,
Maekawa, H., Moreno-Borchart, A., Doenges, G., Schwob, E.,
Schiebel, E. et al. 2004. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers
and promoter substitution cassettes. Yeast 21: 947-962.
Lorentz, A., Ostermann, K., Fleck, O. & Schmidt, H. 1994. Switching gene swi6, involved in repression of silent mating-type loci

－ 96 －

新規接合型変換機構によるメタノール資化酵母のホモタリズム
in fission yeast, encodes a homologue of chromatin-associatedproteins from. Gene 143: 139-143.
Lu, S.F., Tolstorukov, I.I., Anamnart, S., Kaneko, Y. & Harashima,
S. 2000. Cloning, sequencing, and functional analysis of
H-OLE1 gene encoding delta9-fatty acid desaturase in Hansenula polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 499-509.
Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2014. Inversion of the chromosomal
region between two mating type loci switches the mating typein Hansenula polymorpha. PLoS Genet 10: e1004796.
Poggeler, S. 2007. MAT and its role in the homothallic Ascomycete Sordaria macrospora. In J. Heitman, J. Kronstad, J. Taylor,
and L. Casselton, eds. Sex in Fungi (American Society of Microbiology), p. 171-188.
Ravin, N.V., Eldarov, M.A., Kadnikov, V.V., Beletsky, A.V.,
Schneider, J., Mardanova, E.S., Smekalova, E.M., Zvereva, M.I.,
Dontsova, O.A., Mardanov, A.V. et al. 2013. Genome sequence
and analysis of methylotrophic yeast Hansenula polymorphaDL1. BMC Genomics 14: 837.
Reedy, J.L., Floyd, A.M. & Heitman, J. 2009. Mechanistic plastici-

ty of sexual reproduction and meiosis in the Candida pathogenic species complex. Curr. Biol. 19: 891-899.
Rine, J., & Herskowitz, I. 1987. Four Genes Responsible for a position effect on expressio from HML and HMR in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 116: 9-22.
Rine, J., Strathern, J.N., Hicks, J.B. & Herskowitz, I. 1979. A suppressor of mating-type locus mutations in Saccharomyces cerevisiae: evidence for and identification of cryptic mating-type
loci. Genetics 93, 877-901.
Saraya, R., Krikken, A.M., Kiel, J.A., Baerends, R.J.S., Veenhuis,
M. & van der Klei, I.J. 2012. Novel genetic tools for Hansenula
polymorpha. FEMS Yeast Research 12: 271-278.
Sherman, F. 1991. Getting started with yeast. Method. Enzymol.
194: 3-21.
van Zutphen, T., Baerends, R.J., Susanna, K.A., de Jong, A.,
Kuipers, O.P., Veenhuis, M. & van der Klei, I.J. 2010. Adaptation of Hansenula polymorpha to methanol: a transcriptome
analysis. BMC Genomics 11: 1.

－ 97 －

IFO Res.Commun. 31
99-106, 2017

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha の接合型変換に関わる転写制御
前

川

裕

美 1)

大阪大学大学院工学研究科酵母リソース工学寄附講座〒565-0871

大阪府吹田市山田丘2-1

Transcriptional regulation of the mating type switchingin the methylotrophic yeast Ogataea polymorpha
Hiromi Maekawa1)
Yeast Genetic Resources Laboratory, Graduate School of Engineering, Osaka University
Yamadaoka 2-1, Suita, Osaka 565-0871, Japan
Saccharomyces cerevisiae and its closely related yeasts undergo mating type switching by replacing DNA sequencesat the active mating type locus (MAT ) with one of two silent mating type cassettes. Recently, a novel mode ofmating type switching was reported in methylotrophic yeast, including Ogataea polymorpha, which utilizes
chromosomal recombination between inverted-repeat sequences flanking two MAT loci. The inversion is highly
regulated and occurs only when two requirements are met: haploidy and nutritional starvation. However, the links
between information on ploidy and nutritional condition and the mechanism associated with mating type switching
are not understood. Here we investigated the roles of transcription factors involved in yeast sexual development,such as mating type genes and the conserved zinc finger protein Rme1. We found that co-presence of MATa1 andMATα2 was sufficient to prevent mating type switching, suggesting that ploidy information resides solely in themating type locus. Additionally, RME1 deletion resulted in a reduced rate of switching, and ectopic expression of O.
polymorpha RME1 overrode the requirement for starvation to induce MAT inversion. These results suggested thatmating type switching in O. polymorpha is likely regulated by two distinct transcriptional programs linked to theploidy and transmission of the starvation signal.
Key words: mating type switching, methylotrophic yeast, chromosomal inversion, RME1, nutritional starvation

緒言(Hanson et al., 2014; Maekawa & Kaneko, 2014)．カセッ
トモデルとして知られる Sacchromyces cerevisiae の接合

他の生物と同様に,酵母は外界の栄養状態などの変化型変換機構では,転写活性のある接合型遺伝子座 MATを感知し,菌糸形成や有性生殖などの環境適応プログラに 加 え て, サ イ レ ン ト な 2 つ の MAT 配 列( HMLa,

ムを持っている．多くの酵母種では生存が脅かされるよ

HMRα )を必要とする (Haber, 2012)．これに対して O.

うな厳しい環境条件に置かれると,接合・減数分裂を経

polymorpha は a 型( MAT2 )と α 型( MAT1 )の接合型て,様々なストレスに強い耐性を示す胞子を形成する．

遺伝子配列を各々一つ持っており,同一染色体上の両遺ホモタリック( Self-fertile )な有性生殖サイクルを持つ

伝子座を両端とする染色体領域の逆位により接合型が変種は,同種かつ接合型の異なる細胞と出会うことなく胞換される (Hanson et al., 2014; Maekawa & Kaneko, 2014)．

子を形成することができる有利さを持つと考えられる．

S. cerevisiae と O. polymorpha での接合型変換は制御機構

これまでに,我々はメタノール資化酵母 Ogataea poly-も異なると考えられ,O. polymorpha では栄養飢餓条件

morpha の新規接合型変換機構を明らかにし,報告した下でのみ起こるのが特徴的である．また,減数分裂には
MATa, MATα が共存する必要があるため,二倍体細胞

E-mail: hmaekawa@agr.kyushu-u.ac.jp
1)
現 九州大学大学院農学研究院
共同研究者：山本勝良(大阪大学大学院工学研究科)

では接合型変換は抑制されていると予想される．これらのことから,一倍体細胞が栄養源飢餓下におかれたときに特異的に発現する遺伝子の中に,接合型変換を引き起－ 99 －

前

川

裕

美

す重要な因子が含まれる可能性を考え,遺伝子発現プロの細胞は洗浄した後,MEMA 培地で 10 時間培養した(-N

ファイルを変化させる転写因子に注目した．

サンプル)．得られた菌体からホットフェノール法により RNA 得 た． 更 に genomic DNA eliminator column 及実験方法

び RNeasy columns (Qiagen) を用いてゲノム DNA を除去し,total RNA とした (Maekawa & Kaneko, 2014)．

酵母菌株及び培養
O. polymorpha NCYC495 又は CBS4732 由来の研究室

RNA-seq 解析

株を用いた (Lu et al., 2000)．遺伝子欠失やタグ付加な

TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit(イルミナ社)

どのゲノム配列操作,酵母の培養,ゲノム DNA の精製を用いて cDNA ライブラリーを作製し,HiSeq 2500(イは S. cerevisiae で標準的な用いられる方法により行なっ

ルミナ社)を用いて 100 base 両末端解析を行ない,約 4

た (Janke et al., 2004; Saraya et al., 2012; Sherman, 1991)．

億リードを得た．得られたリード配列を用いて,100 万

富栄養条件としてはロイシン,ウラシル,アデニンを添マッピングフラグメント当たりの,エキソン 1 kbp あた

加した酵母完全培地(ロイシン,ウラシル,アデニンをりのリード数(FPKM )を算出した．cDNA ライブラリー

各 200 mg/l 含有する 1 %イーストエクストラクト,2 %作製,シークエンス及びデータ解析はタカラバイオ株式

ペプトン,2 %グルコース培地),接合誘導培地として会社に委託した．

MEMA 培地( 2.5 %マルトース,0.5 %モルトエクスト

結果と考察

ラクト培地)を用いた．培養は 30 ℃で行なった．
MAT 逆位の PCR による検出

接合型遺伝子は MAT 逆位には必須ではない

ゲノム DNA 10 ng を鋳型とし,PRIME STAR Max(タまず,接合型変換の誘導に接合型遺伝子が関与していカラバイオ社)を用いて PCR 反応を行なった．プライマー

るかを調べた．MATa,MATα は a1 と a2,α1 と α2 の各々として,Primer A( 5’- ATAAGTACTCACAATCGAGGC - 3’,

2 つの遺伝子をコードしている．a1Δ, a2Δ, α1Δ, α2Δ 株

5’- AGGAACAGGTTCAGTACTGG - 3’ )または Primer Dを作製し栄養飢餓培地で培養したところ,全ての株で野( 5’- ATAAGTACTCACAATCGAGGC - 3’, 5’- GATGGTAAT

生型と同程度の MAT 逆位が起こっていた (Fig 1)．こGACTCTGTAGC - 3’ )を用いた．21 - 23 サイクルの PCRのことから,接合型遺伝子の機能は接合型変換に必須で反応の後,0.8 %アガロース電気泳動で解析した．

はないことが分かった．

接合率アッセイ

二倍体細胞では接合型変換は抑制される

leu1-1 又は ura3-1 の遺伝型を持つ酵母菌株は,YPDS

であることが明らかになっている (Maekawa & Kaneko,

培地を用いて 30 ℃で培養した．PBS で洗浄後,同量の2014)．a/α 二倍体細胞で接合型変換が起こると減数分

菌体を MEMA プレート上に置いたニトロセルロース膜

裂不能になる可能性があることから,二倍体細胞では上で混合し,30 ℃で 24 時間培養した．ニトロセルロー

MAT 逆位は抑制されている可能性が考えられる．二倍

ス膜上の細胞を PBS に懸濁し,適当な倍率で希釈した体細胞中の 2 本の MAT 遺伝子座を持つ染色体のうち,ものをロイシンを添加した合成培地( SD+Leu ),ウラ一本の IR 配列を欠失させて MAT 逆位不能にした細胞をシルを添加した合成培地( SD+Ura ),無添加の合成培用いて二倍体細胞の接合型変換能を調べたところ MAT

地( SD )プレートに蒔き 37 ℃で 2 日間培養した．コロ

逆位が起こらなくなっていた (Fig 2A)．

減数分裂・胞子形成の進行には a1 と α2 の機能が必要

次に,A(α) 型一倍体細胞の URA3 遺伝子座に MATa

ニー数をカウントし,次の計算式の値を接合率としたを挿入し,a 型と α 型遺伝子が共発現している一倍体細胞(Maekawa & Kaneko, 2014)．

を作製した．この細胞は,栄養飢餓下で培養しても MAT(接合率）=｛( SD プレートのコロニー数）x 希釈倍率｝/

逆位は起こらなかった (Fig 2B)．I(a) 型一 倍 体 細 胞に｛( SD+Leu と SD+Ura プレートのコロニー数

MATα を挿入した細胞でも同じ結果であった (Fig 2C)．更のいずれか小さい方）x 希釈倍率｝x 100に,各遺伝子の効果を調べたところ,a1 と α2 が同一細胞内で発現すると MAT 逆位が抑制された (Fig 2B & 2C)．

RNA 精製

このことから,二倍体における接合型変換抑制には,ゲノO. polymorpha 株を 30 ℃で YPDS 培地中で対数増殖後期まで培養し,一部を集菌し + N サンプルとした．残り

ム DNA 量ではなく MATα と MATa が共に発現することが倍数性の情報として働いていることが分かった．

－ 100 －

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha の接合型変換に関わる転写制御

接合型変換は栄養源飢餓下での細胞分裂を終える時期に誘導される接合型変換は栄養源が枯渇した後,どのようなタイミ
ングで誘導されるだろうか？この点を明らかにするために野生型細胞を栄養飢餓条件下で培養し,経時的に細胞数の変化,分裂期細胞の割合,MAT 逆位の有無を測定した (Fig 3)．出芽した細胞の割合は飢餓後 2.5 時間までは高く維持され,その後ゆっくりと低下した (Fig3A)．細胞数の増加が止まる 6 時間後に初めて MAT 逆位が検出された (Fig 3B)．その後,24 時間まで培養を続けても MAT 逆位頻度の顕著な上昇は見られなかった．
さらに,飢餓条件に移すと同時にノコダゾールを添加して 分 裂 中 期 で 細 胞 周 期 の 進 行 を 停 止 さ せ た と こ ろ,
MAT 逆位の誘導が遅れることが分かった (Fig 3C)．こ
れらのことから,栄養飢餓下で細胞周期を停止するまでの間の細胞分裂過程の進行が MAT 逆位に重要な役割を果たす可能性が示唆された．
接合の誘導に必須の役割を果たす転写因子 Rme1 は接合型変換にも重要である
他の出芽酵母における研究から,栄養飢餓下での接合
Fig. 1

Fig. 2Mating type genes are not required for the MAT inversion.
(A) Schematic of the primer designs for PCR reactions
specific to I(a)- or A(α)-type chromosomes (MAT PCR
analysis). (B) I(a)- or A(α)-type of MAT1 chromosome
was determined by PCR reactions described in (A). PCR
reactions to detect I(a)- or A(α)-type chromosomes aredesignated as a and α, respectively. Genomic DNA samples were prepared from the wild-type strain and deletion mutants for MAT a1, MATa2, or MATα before (+N)
and after incubation on MEMA (-N).

の誘導に関与する転写因子の候補として Zinc フィン
ガ ー 蛋 白 質 Rme1 が 挙 げ ら れ る (Barsoum et al., 2010;2011; Booth et al., 2010)．O. polymorpha の RME1 遺伝子を欠失させたところ,完全な不捻ではないものの,野生型と比べて接合率が著しく低くなることが分かった(Fig 4A)．また,rme1Δ 細胞での接合型変換をしらべた
ところ,MAT 逆位の頻度が野生型の 1/3 - 1/2 程度に低下していた (Fig 4B)．
Rme1 蛋白質が MAT 逆位の誘導に直接的に関与する

a1- α2 inhibits the MAT inversion.
(A) MATα haploid cells and MATα/MATa(IR2Δ) diploid cells were grown in YPD medium (+N) and transferred to MEMA medium (-N). Genomic DNA samples were prepared and digested with EcoRI and subjected to Southern blot analysis using a probe
specific for MATα sequence. (B) Genomic DNA was prepared from strains with the indicated genotype, and the mating type wasdetermined by MAT PCR analysis as shown in Fig. 1A. Left panel of B: Schematic of haploid cells expressing both MATa and
MATα. +N: cells grown in YPD medium, -N: cells incubated in MEMA medium for 16 hrs.

－ 101 －

前

Fig. 3

川裕

美Mating type switching occurs after cessation of cell division under starvation condition.
(A) CBS4329 cells were grown in YPDS medium and transferred to NaKG medium. Samples were collected at different intervals
and cell density was measured using a hematocytometer. The remaining of samples were fixed and stained with DAPI to determine anaphase cells and budding index. (B) Genomic DNA was prepared from samples collected in (A) and subjected to MAT
PCR analysis as shown in Fig. 1A. CDC28-specific primers were added to PCR reactions as controls for the amount of input DNA.
(C) I(a)- or A(α)-type of CBS4329 cells grown in YPDS medium were incubated in NaKG medium containing either dimethyl sulfoxide or nocodazole for 8 hrs. Genomic DNA was prepared and subjected to MAT PCR analysis as shown in Fig. 1A.

かを調べるために,野生型細胞中で RME1 遺伝子を高発現させたところ,栄養増殖中でも MAT 逆位が起こっていることが分かった (Fig 5A)．RME1 高発現株では,野生型細胞では有性生殖が誘導されない YPDS 培地上でも接合管と似た細胞の変形や胞子様の構造体が観察された (Fig 5B)．これらの結果から,O. polymorpha では接合と接合型変換は協調的に制御されており,Rme1 が重要な役割を果たすことが示唆された．
Rme1 蛋白質は DNA 結合能があると予想されることから,染色体の MAT 周辺領域に直接結合することにより DNA 組換えを促進する可能性と下流の遺伝子の転写を誘導させる可能性が考えられる．栄養飢餓下での蛋白質発現にはオートファジーが重要である．オートファ
ジーに必須の Atg1 のホモログが O. polymorpha のゲノム中にも存在していることから,atg1Δ 株を作製したとこ
ろ,MAT 逆位は不能であった (Fig 6A)．しかし,RME1
高発現細胞で見られる栄養増殖中の MAT 逆位は正常でFig. 4

Rme1 is required for mating and MAT inversion.
(A) Mating is severely reduced in rme1Δ cells. Wild-type
and rme1Δ strains of ura3-1 and leu1-1 genotypes werecombined on MEMA mating medium and incubated at
30 ℃. After 24 hrs, cells were spread on SD plates to select for Leu+Ura+ diploids. Colony number was counted
after a 2 days incubation at 37 ℃. The average of three independent matings is shown. Error bars indicate SD. (B)MAT inversion was reduced in rme1Δ. Genomic DNA
was prepared from strains with the indicated genotype
and the mating type was determined by MAT PCR analysis as shown in Fig. 1A. -N: incubated in MEMA medium
for 16 hrs. CDC28-specific primers was added to all PCR
reactions as controls for the amount of input DNA.

あった (Fig 6B)．このことから,Rme1 は接合型変換の誘導に転写因子として働いていると考えられる．
以 上,Rme1 が MAT 逆 位 を 促 進 す る の に 対 し て,
a1- α2 が抑制することを示した．a1- α2 の機能として,
RME1 の発現を抑制している可能性が考えられる．しかし,一倍体細胞と同様に,MATα と MATa を共発現している疑似二倍体細胞( α + a 型)でも,栄養飢餓により RME1 遺伝子の転写は誘導されていた (Fig 7A)．このことから,二倍体での MAT 逆位の抑制は Rme1 機能の下流で起こると考えられる．現在の Rme1 及び a1- α2による MAT 逆位制御のモデルを Fig 7B に示す．栄養飢
餓 下 で Rme1 に よ り 転 写 誘 導 さ れ る 標 的 遺 伝 子 及 び－ 102 －

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha の接合型変換に関わる転写制御

Fig. 5 RME1 overexpression induces the MAT inversion in mitotically growing cells.
(A) RME1 was expressed in I(a)- and A(α)-type wild-type strains using a strong constitutive TEF1 promoter. Cells were grown in
SD medium supplemented with adenine, leucine, and uracil, and genomic DNA was subjected to MAT PCR analysis as shown in
Fig. 1A. (B) Wild-type cells carrying PMET3 -RME1 were grown on SD plate supplemented with adenine, leucine, and uracil for 3
days at 30 ℃. Cells were fixed with ethanol and stained with DAPI. Mating projection-like morphology and spores were evident
only in cells carrying PMET3 -RME1.

Fig. 6

MAT inversion is autophagy dependent.
(A) Autophagy mutants are MAT inversion deficient. Wild-type, atg1Δ, and atg13Δ cells were grown in YPDS medium (+N), transferred to MEMA medium and incubated for 20 hrs (-N). Genomic DNA was subjected to MAT PCR analysis as shown in Fig. 1A.
(B) Atg1 is dispensable for REM1-induced MAT inversion. Wild-type and atg1Δ cells carrying PTEF1-RME1 were grown in YPDS
medium (+N), transferred to MEMA medium and incubated for 20 hrs (-N). Genomic DNA was subjected to MAT PCR analysis
as shown in Fig. 1A. CDC28-specific primers were included in the reaction as control for input DNA.

A

Fig. 7B

a1-α2 functions independently of RME1 expression.
(A) a1-α2 does not repress RME1 mRNA levels. A(α)-type haploid cells and I(a)-type haploid cells in the presence or absence of
MATα the exogenous URA3 locus were grown in YPDS (+N), then shifted to MEMA medium and incubated for 16 hrs (-N). RNA
was prepared and subjected to RNA-seq analysis. Relative amount of RME1 RNA is shown. (B) Model of the regulation of the mating type switching and mating in O. polymorpha.

－ 103 －

前

川

裕

美

a1- α2 による転写抑制の標的となる遺伝子の中には,細胞の倍数性ではなく MAT 遺伝子座の heterozygosity

MAT 逆位の促進に働く遺伝子と接合過程に必要とされが接合型変換能の有無を規定することが分かった．また,る遺伝子が含まれると考えられる．Rme1 と a1- α2 が同

栄養飢餓シグナルによる制御として,様々な出芽酵母でじ標的遺伝子(群)の転写を制御するかどうかは現在不進化的に保存された転写因子 Rme1 が関与することを見明であり,今後の解析により明らかにしていきたい．

いだした．O. polymorpha において Rme1 は接合に必須であるが,接合型変換においても重要な役割を果たして一倍体特異的遺伝子を同定する試み

おり,特に RME1 遺伝子の高発現細胞では富栄養条件

接合型変換に重要な遺伝子のいくつかは,接合型変換

でも MAT 逆位が起こることから,Rme1 は接合型変換が起こる一倍体細胞では栄養源飢餓により遺伝子発現が機構を栄養状態と結びつけていること考えられる．これ上昇するが,接合型変換が抑制されている二倍体では顕らの結果から,O. polymorpha は接合型変換と接合を共著な発現上昇が見られないことが予想される．そこで,に Rme1 の制御下におくことにより,接合に至る可能性

a 型,α 型一倍体細胞,疑似二倍体である α + a 型細胞ののある時のみ接合型変換を行うシステムを構築している+N 及び -N 条件下での全遺伝子発現を RNA-seq 法を用ことが明らかになった．

いて解析した．

本助成で得られた研究成果の報告

α + a 細 胞 に お い て は, ゲ ノ ム 配 列 か ら 推 定 さ れ る
5174 遺伝子のうち 1920 遺伝子については,栄養源飢餓による転写量の増減が 1.4 倍以下あった．この 1920 遺伝子のうち,α 細胞と a 細胞のいずれにおいても栄養飢
餓条件下で転写量が 2 倍以上に増加するのは 16 遺伝子のみであった．これらは一倍体特異的に栄養源飢餓により転写誘導される遺伝子であり,CMY1 - CMY16（Candidate Molecule Yamamoto) と名付けて解析を進めた (Fig
8A)．CMY 遺伝子を破壊した株を作製し,接合型変換が起こるかどかを PCR 法により調べた．CMY2,CMY5,
CMY6,CMY8,CMY11,CMY12 遺伝子を破壊した株
では接合型変換の低下は見られなかった (Fig 8B)．他の CMY 遺伝子についても同様の解析を行なう予定である．更に,栄養源飢餓条件下での一倍体における転写量が疑似二倍体の 2 倍以上である遺伝子群を解析した．こ
こでは,栄養源飢餓による転写量の変化の有無は問わないものとした．この絞り込みにより 107 遺伝子を得た．
機能未知の候補遺伝子のうち,違いの大きい 3 つの遺伝
子を CMY13,CMY14,CMY15 遺伝子とした (Fig 8C)．

口頭発表
1) Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2015. Chromosomal inversion-based mechanism of mating type switching in Hansenula polymorpha. 28th Fungal Genetics Conference, PacificGrove CA, USA.
2) 前川裕美,金子嘉信．2015．メタノール資化酵母 Hansenula polymorpha の接合型変換機構 , 酵母遺伝学フォーラ
ム第 48 回研究報告会,9 月 , 広島 .
3) 山本勝良,金子嘉信,前川裕美．2016．メタノール資化
酵母 Hansenula polymorpha における接合型変換の制御 , 酵
母遺伝学フォーラム第 49 回研究報告会 , 9 月,兵庫 .
4) Yamamoto, K., Kaneko, Y., & Maekawa, H ．2016. Regulation of mating-type switching in the methylotrophic yeast
Hansenula polymorpha, 14th International Congress on
Yeasts,Awaji, Japan.
原著論文
1) Yamamoto, K., Tran, T.N.M., Takegawa, K., Kaneko, Y. &Maekawa, H. 2017. Regulation of mating type switching by
the mating type genes and RME1 in Ogataea polymorpha.
Sci Rep. 7(1)16318

これらの候補遺伝子の遺伝子破壊株の解析を行なった

謝が,栄養飢餓条件下で誘導される接合型変換の著しい低辞

下は見られなかった (Fig 8D)．今後は,他の候補遺伝子についても同様の解析を進めていく予定である．

要本研究は,公益財団法人発酵研究所の寄附講座助成を受けて行なわれたものであり,ここに感謝の意を表します．

約

本研究への大阪大学大学院工学研究科原島峻教授(現：崇城大学),村中俊哉教授のご支援とご協力に深く感謝

O. polymorpha における接合型変換,即ち 2 つの MATいたします．さらに,当寄附講座に在籍した博士研究員,

遺伝子座間での染色体逆位は栄養飢餓条件により誘導さ技術補佐員,事務職員の皆さんに感謝します．特に,山れるが,これは接合可能な一倍体細胞に限られており,

本勝良博士研究員には実験の遂行と本稿執筆補助,Fig

二倍体細胞では抑制されている．一倍体でも a1 と α2 遺8 の作成を行なって頂いたことを記して感謝の意を表し

伝子が共に発現する細胞では MAT 逆位は誘導されず,

ます．

－ 104 －

メタノール資化酵母 Ogataea polymorpha の接合型変換に関わる転写制御

Fig. 8RNA-seq analysis.
(A) The mRMA levels of the CMY genes in haploid α, a, or a+α cell in the RNA-seq analysis. Fragments per kilo base of exon model per million mapped reads (FPKM) was calculated and presented as mRNA level. α, haploid α cell; a, haploid a cell, a+α, haploida+α cell; +N, cell grown in YPDS; -N: incubated in MEMA medium for 10 hrs. (B) MAT inversion was unaffected in cmy5Δ,
cmy8Δ, cmy11Δ, and cmy12Δ cells. Genomic DNA was prepared from strains with the indicated genotype and the mating type wasdetermined by MAT PCR analysis as shown in Fig. 1A. +N: cells grown in YPDS medium, -N: incubated in MEMA medium for 16
hrs. CDC28-specific primers was added to all PCR reactions as controls for the amount of input DNA. (C) The mRNA levels of the
haploid specific genes in the RNA-seq analysis. FPKM was presented as mRNA level. α, haploid α cell; a, haploid a cell, a+α, haploid a+α cell; +N, cell grown in YPDS; -N: incubated in MEMA medium for 10 hrs. (D) MAT inversion was unaffected in cmy13Δ,
cmy14Δ, and cmy15Δ cells. Genomic DNA was prepared from strains with the indicated genotype and the mating type was determined by MAT PCR analysis as shown in Fig. 1A. +N: cells grown in YPDS medium, -N: incubated in MEMA medium for 16 hrs.
CDC28-specific primers was added to all PCR reactions as controls for the amount of input DNA.

－ 105 －

前

文

川

献

Barsoum, E., Martinez, P. & Astrom, S.U. 2010. Alpha3, a transposable element that promotes host sexual reproduction.
Genes Dev. 24: 33-44.
Barsoum, E., Rajaei, N., & Astrom, S.U. 2011. RAS/cyclic AMP
and transcription factor Msn2 regulate mating and mating-type
switching in the yeast Kluyveromyces lactis. Eukaryot. Cell 10:1545-1552.
Booth, L.N., Tuch, B.B. & Johnson, A.D. 2010. Intercalation of a
new tier of transcription regulation into an ancient circuit. Nature 468: 959-963.
Haber, J.E. 2012. Mating-type genes and MAT switching in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 191: 33-64.
Hanson, S.J., Byrne, K.P. & Wolfe, K.H. 2014. Mating-type switching by chromosomal inversion in methylotrophic yeasts suggests an origin for the three-locus Saccharomyces cerevisiae

裕美system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111: E4851-E4858.
Janke, C., Magiera, M.M., Rathfelder, N., Taxis, C., Reber, S.,
Maekawa, H., Moreno-Borchart, A., Doenges, G., Schwob, E.,
Schiebel, E., et al. 2004. A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers
and promoter substitution cassettes. Yeast 21: 947-962.
Lu, S.F., Tolstorukov, I.I., Anamnart, S., Kaneko, Y. & Harashima,
S. 2000. Cloning, sequencing, and functional analysis of
H-OLE1 gene encoding delta9-fatty acid desaturase in Hansenula polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 499-509.
Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2014. Inversion of the chromosomal
region between two mating type loci switches the mating typein Hansenula polymorpha. PLoS Genet 10: e1004796.
Saraya, R., Krikken, A.M., Kiel, J.A., Baerends, R.J.S., Veenhuis,
M. & van der Klei, I.J. 2012. Novel genetic tools for Hansenula
polymorpha. FEMS Yeast Research 12: 271-278.
Sherman, F. 1991. Getting started with yeast. Method. Enzymol.
194: 3-21.

－ 106 －

IFO Res.Commun. 31
107-119, 2017

リン酸シグナル伝達経路の主要調節因子はメタノール資化酵母 Ogataea polymorpha で保存されている
金

子

嘉

信

大阪大学大学院工学研究科酵母リソース工学寄附講座〒565-0871

大阪府吹田市山田丘2-1

Main regulatory components of the phosphate signal transduction pathway
are conserved in the methylotrophic yeast Ogataea polymorpha
Yoshinobu Kaneko
Yeast Genomic Resources Laboratory, Graduate School of Engineering, Osaka University
Yamadaoka 2-1, Suita, Osaka 565-0871, JapanTo gain better understanding of the diversity and evolution of the gene regulation system in eukaryotes, thephosphate signal transduction (PHO) pathway in non-conventional yeasts has been studied in recent years. Herewe characterized the PHO pathway of Ogataea polymorpha, which is genetically tractable and distantly related to
Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe, in order to get more information for the diversity andevolution of the PHO pathway in yeasts. We generated several pho gene-deficient mutants based on the annotateddraft genome of O. polymorpha BY4329. Except for the Oppho2-deficient mutant, these mutants exhibited the same
phenotype of repressible acid phosphatase (APase) production as their S. cerevisiae counterparts. Subsequently,
Oppho80 and Oppho85 mutants were isolated as suppressors of the Oppho81 mutation and Oppho4 was isolated
from Oppho80 and Oppho85 mutants as the sole suppressor of the Oppho80 and Oppho85 mutations. To gain more
complete delineation of the PHO pathway in O. polymorpha, we screened for UV-irradiated mutants that expressed
APase constitutively. As a result, three classes of recessive constitutive mutations and one dominant constitutive
mutation were isolated. Genetic analysis showed that one group of recessive constitutive mutations was allelic to
OpPHO80 and that the dominant mutation occurred in the OpPHO81 gene. Epistasis analysis between Oppho81
and the other two classes of recessive constitutive mutations suggested that the corresponding new genes, named
PHO51 and PHO53, function upstream of OpPHO81 in the PHO pathway. Taking these findings together, weconclude that the main components of the PHO pathway identified in S. cerevisiae are conser ved in the
methylotrophic yeast O. polymorpha, even though these organisms were separated from each other before
duplication of the whole genome. This finding is useful information for the study of evolution of the PHO
regulatory system in yeasts.
Key words: PHO pathway, O. polymorpha, regulatory gene, phosphate homeostasis, diversity緒言

酸恒常性を維持する遺伝子発現調節系として詳細に研究されてきた( Ljungdahl & Daignan-Fornier, 2012; Oshima,

環境変化に適応し,様々な条件で生存するために,微1997; Yadav et al., 2016 )．無機リン酸( Pi )はすべての生物はシグナル伝達の複雑な経路を進化させてきた．

生物に不可欠な栄養素であるため,PHO 経路は他の真PHO 経路として知られるパン酵母 Saccharomyces cerevi-

核生物でも程度の差はあれ共通に保存されていると考え

siae のリン酸シグナル伝達経路は真核生物におけるリンられ,遺伝子発現調節系の多様性と進化を研究するための良いモデルとなると思われる．S. cerevisiae の PHO 経

E-mail: kaneko@bio.eng.osaka-u.ac.jp
共同研究者：原島 俊(崇城大学生物生命学部),
中西洋一(名古屋大学大学院生命農学研究科)

路において,高リン酸条件下ではサイクリン - サイクリ
ン依存性キナーゼ(サイクリン- CDK )複合体 Pho80Pho85 によってリン酸化された転写活性化因子 Pho4 は－ 107 －

金

子

嘉

信

エクスポーチン Msn5 によって核から細胞質に排出されPHO80,CnPHO85 お よ び CnPHO81 は PHO 調 節 遺 伝る．その結果,酸性ホスファターゼ( APase )遺伝子子であることが報告されている( Toh-e et al., 2015 )．しPHO5 や高親和性 Piトランスポーター遺伝子 PHO84 のた が っ て,S. cerevisiae か ら 系 統 的 に 離 れ た 真 菌 で もようなリン酸抑制性遺伝子は発現されない．反対にリン

PHO 経路自体は保存されているが,PHO 経路の主要調酸濃度が十分に低い場合,Vip1 により合成される inositol

節因子であるサイクリン- CDK - CKI 複合体は常に保存さheptakisphosphate(イノシトール 7 リン酸 , IP7 )によっ

れているわけではなさそうである．

て活性化される CDK 阻害因子( CKI )Pho81 が Pho80-

メタノール資化酵母 O. polymorpha は系統関係的には

Pho85 複合体の活性を阻害し,リン酸化されない Pho4

S. cerevisiae と分裂酵母あるいは糸状菌との間に位置しが核内にとどまり,もう 1 つの転写活性化因子 Pho2 とており( Dujon, 2010; Dujon et al., 2004 ),約 10 億年前の協働でリン酸抑制性遺伝子を発現させる( Kaffman etには S. cerevisiae との共通の祖先から分岐したと考えら

al., 1994, 1998a, b; Lee et al., 2007; Ogawa et al., 1995;

れている．S. cerevisiae のゲノム中には複数の遺伝子でSchneider et al., 1994 )． 最 近,YTH ドメ イン を 含 む構成される相同領域対が 55 カ所も存在することから,

Pho92 が,PHO4 mRNA の安定性を調節して,リン酸およ

およそ 1 億年前に S. cerevisiae 祖先種で全ゲノム重複がびグルコース代謝に関与することも報告されている( Kang

生じ,その後のゲノムの再編成とサイズ削減によって S.

et al., 2014 )．PHO 経路を構成する多くの因子についての詳

cerevisiae と C. glabrata を含むその近縁種が進化してき細はかなり明らかにされているが,リン酸シグナル自体がたと考えられている( Wolfe & Shields, 1997 )．O. poly-

どのように感知されるかについては不明なままである．

morpha はこの全ゲノム重複以前に S. cerevisiae や C. gla-

最近,真核生物における遺伝子発現調節系の多様性とbrata と系統的に分岐したと考えられる．O. polymorpha

進化についての知見を得るために,いくつかの酵母でではすでに APase 遺伝子として OpPHO1 が同定されてPHO 経路が研究されている．例えば,Candida glabrataいるが( Phongdara et al., 1998 ),PHO 経路に関する研では PHO 経路の多くの調節因子が保存されているが,究はなされていない．本研究では,O. polymorpha にお

CgPHO2 は リ ン 酸 抑 制 性 遺 伝 子 の 発 現 に は 必 要 な い

ける PHO 経路の解明を行った．比較ゲノム解析と古典( Kerwin & Wykoff, 2009 )．また,C. glabrata は S. cere-

遺伝学的手法の組み合わせで,PHO 経路の OpPHO81,

visiae の APase 遺伝子 PHO5 の相同遺伝子を持たず,そOpPHO80,OpPHO85 および OpPHO4 遺伝子を同定しの代わりに機能的に置き換わる別のタイプのリン酸抑制

た．さらに,構成的 APase 生産性( PhoC 表現型)を示性酸性ホスファターゼ CgPMU2 が存在する( Orkwis et

す突然変異体を分離し,3 つの劣性突然変異群および 1

al., 2010 )． 一 方, 分 裂 酵 母 Schizosaccharomyces pombe

つの優性突然変異群に分類できた．3 つの劣性 PhoC 変の PHO 経 路 に は,ScPHO81,ScPHO2 お よ び ScPHO4

異の 1 つは OpPHO80 の対立遺伝子で,優性変異は Op-に対する相同遺伝子はなく,ScPHO80 と ScPHO85 の相PHO81 の対立遺伝子であった．Oppho81 突然変異と残同 遺 伝 子 は PHO 経 路 に 関 与 し て い な い． さ ら に,りの 2 つの劣性変異の上位下位試験の結果,両方の遺伝

APase 遺伝子( Sppho1 )の転写活性化因子 SpPho7 は,子とも PHO 経路の OpPHO81 の上流で機能することが

ScPho4 転写活性化因子のヘリックス - ループ - ヘリックわかった．つまり,PHO 経路におけるこれらの調節遺ス型とは異なる亜鉛フィンガー型転写活性化因子である伝子の遺伝学的役割は,S. cerevisiae の対応する遺伝子( Henry et al., 2011 )．さらに,この分裂酵母 PHO 経路と同じであった．O. polymorpha は系統的には全ゲノム

では SpPho7 を介したリン酸とアデニンの両方からの発重複以前に S. cerevisiae から分岐しているが,PHO 経路

現調節が見られる( Estill et al., 2015 )．

の主要調節因子は O. polymorpha において保存されていPHO 経路は,1960 年代から糸状菌 Neurospora crassa

ることが明らかとなった．

および Aspergillus nidulans においても研究されている．

実験材料と実験方法

N. crassa の PHO 経 路 で は,ScPHO4,ScPHO80,
ScPHO85 および ScPHO81 にそれぞれ対応する遺伝子
nuc-1,preg,pgov および nuc-2 が同定されている( Kang

菌株，プラスミド及び培地& Metzenberg, 1990; Littlewood et al., 1975; Toh-e & Ishi-

使用した酵母菌株およびプラスミドを Table 1 に示す．

kawa, 1971 )．一方,A. nidulans では,ScPHO80 およびBY4329 を APase 変異体分離のための野生型株として使ScPHO4 に 相 同 な 遺 伝 子 は PHO 経 路 に 関 与 す る が,用 し た．Oppho81 突 然 変 異 の 抑 圧 変 異 体 の 分 離 に は

ScPHO81 と ScPHO85 に相同な遺伝子は関与しない(WuNY-1 を用いた．O. polymorpha 遺伝子破壊体は,ゼオシ

et al., 2004 )． 担 子 菌 酵 母 Cryptococcus neoformans のン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子またはPHO 経 路 に 関 す る 最 近 の 研 究 で は,CnPHO4,Cn-

OpURA3 遺 伝 子 を 用 い て 構 築 し た． 遺 伝 子 の 破 壊 は－ 108 －

メタノール資化酵母におけるリン酸シグナル伝達経路
Table 1

Strains and plasmids used in this study

PCR によって確認した．プラスミド YZ3 および YZ6 を高リン酸および低リン酸合成培地で増殖させた( Sherman,

構築するために,PCR 増幅した OpPHO81 ORF および

1991; Toh-e et al., 1973)．O. polymorpha の交雑および胞ScPHO81 ORF をそれぞれ BamHI と HindIII で切断した

子 形 成 は 30 ℃ で 0.5% 麦 芽 エ キス- 2.5% マ ルト ース

プラスミド BYP7151 に In-Fusion Cloning キット(タカ(MEMA )平板培地上で誘導した．
薬剤耐性選択のために,

ラバイオ,Japan )を用いて連結した．プラスミド YZ14

平板培地にハイグロマイシン B( 150 μg/ml,和光純薬)

は OpPHO4 ORF + 500 bp 上流および 300 bp 下流配列をまたはゼオシン( Zeocin 100 μg/ml,Invitrogen,USA )PCR により増幅し,pFL26 の SmaI 切断部位に挿入してを添加した．大腸菌 DH5α はプラスミド保持を選択する薬作製した．OpPHO80- と OpPHO85- 発現プラスミド( YZ77

剤入り LB ブロス( Miller, 1972)中で培養し,プラスミドと YZ78 )も同様に構築した．OpPHO81C 遺伝子の配列

DNA 調製に使用した．平板培地には 2 %寒天を添加した．

解析のために,各 OpPHO81 遺伝子を PCR で増幅し,別段の記載がない限り,酵母と細菌の培養は 37 ℃で行った．

C

pUC19 の BamHI-HindIII ギャップにクローニングした．
酵母菌株は,200 mg/L のアデニンを含む 50 g/L の Difco

遺伝解析と形質転換

YPD broth [Becton, Dickinson and Company (BD), USA]

二倍体細胞は,MEMA 平板培地上で互いに相補的な培地 (YPAD),最少合成培地 [SD; 組成は 6.7 g/L Difco

栄養要求性突然変異を有する株を交雑することによってYeast Nitrogen Base w/o Amino acids (BD), 20 g/L Glu-

作製した．30 ℃で 1 日間交雑培養した後,SD 平板培地

cose],または必要に応じて適切なアミノ酸を追加したに移し,二倍体細胞のみを原栄養体として選択した．胞－ 109 －

金

子

子形成のために,得られた二倍体細胞を新しい MEMA嘉信

定量 RT-PCR 解析

平 板 上 で 30 ℃,2 日 間 培 養 し た． 形 成 し た 四 分 子 を

全 RNA を van Zutphen et al. (2010) の方法に従って単SporePlay マ イ ク ロ マ ニ ピ ュ レ ー タ ー( Singer Instru-

離 し,DNase I 処 理 後, さら に RNeasy Mini Plus Kit

ments,UK )で解剖した．酵母形質転換は Frozen-EZ(Qiagen,Germany)を用いて精製した．試薬会社のプロ

Yeast Transformation II キット( Zymo Research,USA )トコールに従い,1 μg の全 RNA から SuperScript III 逆転

を 用 い て 行 っ た． 大 腸 菌 形 質 転 換 の た め に,ECOS

写酵素( Invitorogen )を用いて cDNA を合成し,1 μl のCompetent E. coli DH5α(ニッポンジーン,Japan )を

cDNA 反応混合物を定量 PCR 反応に使用した．PCR 産指定の方法に従って使用した．

物は TaqMan MGB 遺伝子発現キット( Applied Biosystems, USA )を用いて StepOnePlus リアルタイム PCR シ

ドラフトゲノム解析と遺伝子注釈

ステム( Applied Biosystems, USA )で測定した．アクBY4329 のドラフトゲノム配列を決定し,日本 DNA

チン遺伝子 OpACT1 の発現に対して相対値を算出した．

データバンクに BioProject ID が PRJDB3035 として登録結した( Maekawa & Kaneko,2014 )．ドラフト配列の予果

測コーディング配列( CDS )データは In silico Molecular Cloning( IMC )バージョン 5.1(インシリコバイオ

メタノール資化酵母での PHO 経路構成遺伝子の保存性

ロジー,Japan )と 3 つの酵母アミノ酸データベース( S.

BY4329 の注釈付きドラフトゲノム配列( Maekawa &cerevisiae,O. parapolymorpha および S. pombe )由来のKaneko, 2014 )に基づいて,O. polymorpha における S.

クエリーアミノ酸配列を用いて調べた．遺伝子アノテー

cerevisiae PHO 経路の調節因子と相同な遺伝子を調べションは,予測 CDS データをクエリとして NCBI nr デー

た．相同遺伝子間のアミノ酸同一性を推定するためにタベース内の BLASTX プログラムで使用して行った．PHO

BLASTP 解析をさらに行った．その結果,Table 2 に示経路の構成因子と注釈された候補遺伝子について,Sac-

すように ScPHO 経路構成遺伝子に対応する O. polymor-

charomyces Genome Database (http://www.yeastge-pha のオルソログと考えられる APase( OpPHO1 ),CKI

nome.org/) の BLASTP 解析プログラムを使用して,対応( OpPHO81 ),サイクリン( OpPHO80 ),CDK( Op-する S. cerevisiae 遺伝子との配列類似性を再確認した．

PHO85 )
, 転 写 活 性 化 因 子( OpPHO2 と OpPHO4 ),イ ノ シ ト ー ル ピ ロ リ ン 酸 合 成 経 路 酵 素( OpPLC1,

酸性ホスファターゼ突然変異体の分離

OpARG82, OpIPK1, OpKCS1, OpVIP1 )の各遺伝子を抽一晩培養した培養液を滅菌水で 10,000 倍に希釈し,出できた．したがって,O. polymorpha は S. cerevisiae と0.1 ml を YPAD 平板培地に広げた．Spectrolinker(トミー同様な PHO 経路を持つと考えられた．なお,BY4329 の精工 , Japan )を用いて,平板培地上の細胞に紫外線( 20

Pho1 は, 以 前 に 報 告 さ れ た O. polymorpha の Pho1

または 25 J/m2 )を照射した．28 ℃で 2 日間培養した後,( ATCC34438; Phongdara et al., 1998 )と 95 %の同一性出現したコロニーをコロニー活性染色法( Toh-e et al.,であった．E 値から判定すると,転写活性化因子 Op-

1973 )により APase 生産を調べた．線状 DNA 断片のラPho4 が最も ScPho4 と相同性が低かったが,アミノ酸

ンダムな組込み法( van Dijk et al., 2001 )も O. polymor-

長が ScPho4 より長い CgPho4 と同様に C 末端 DNA 結

pha の APase 変異体を得るために使用した．具体的には,合ドメインが最も保存されている( Fig. 1 )．Kerwin &プ ラ ス ミ ド pREMI-Z( 阪 井 康 能 博 士 か ら の 分 与 ) をWykoff （2009） は,CgPho4 が CgPho2 を 必 要 と せ ず,

BamHI で線状化し,O. polymorpha 細胞に導入した．得単独で APase 遺伝子を活性化できる原因として ScPho4られたゼオシン耐性形質転換体の APase 表現型をコロよりアミノ酸長が長く,サイズが大きくなっていること

ニ ー 活 性 染 色 法 に よ り 調 べ て 変 異 体 を 分 離 し た．

が重要であると考えている．したがって,ScPho4 より

pREMI-Z 挿入の座位は,各形質転換体から回収されたサイズが大きい OpPho4 も単独で PHO プロモーターのプラスミドを配列解析することによって決定した．

発現を活性化できる可能性がある．

酸性ホスファターゼ活性測定

PHO80,PHO81 および PHO85 によってコードされた 4

PHO 経路の中心的な発現調節システムは,PHO4,
APase 活性は Toh-e et al. (1973) の方法に従って,細つの調節因子から構成されている( Ljungdahl & Daig-

胞懸濁液を酵素液として用いて測定した．1 単位の酵素

nan-Fornier, 2012 )．そこで,以下の研究ではこれら O.

活性は,35 ℃で 1 分間に 1 μmol の p - ニトロフェノール

polymorpha の 4 つの遺伝子が S. cerevisiae 遺伝子と同じを遊離させる酵素の量として定義した．

役割を PHO 経路で果たすかどうかを調べた．

－ 110 －

メタノール資化酵母におけるリン酸シグナル伝達経路
Table 2

Fig. 1

Sequence similarity of components of the PHO pathway between O. polymorpha and S. cerevisiae

Amino acid sequence alignment of Pho4 proteins in three yeast species.
The amino acid sequences of the Pho4 protein in S. cerevisiae (Sc_Pho4), C. glabrata (Cg_Pho4) and O. polymorpha (Op_Pho4)
were aligned by Clustal Omega. The known phosphorylation sites of ScPho4 are indicated by boxes.

－ 111 －

金

子

嘉

信

OpPHO80 と OpPHO85 は酸性ホスファターゼ発現制御

OpPHO81 は CDK 阻害因子である
まず,OpPHO81 を OpURA3 断片の挿入により破壊しに関与している

た．得られた遺伝子破壊株は低リン酸条件下でも APase

OpPHO80 と OpPHO85 の欠失変異は,S. cerevisiae で生産能を示さず,PHO1 転写物も増加しなかった( Tableの遺伝子欠失変異と同じ表現型である PhoC 表現型を示

3 )．これは Scpho81 破壊と同じ表現型である．したがっし た( Table 3 )．S. cerevisiae で は pho80 お よ び pho85て,OpPHO81 は O. polymorpha の PHO 経路の転写レベ

変異は pho81 変異に対して上位の変異であることが知ら

ルでの正の調節因子であると考えられる．OpPHO81 機

れているので( Toh-e et al., 1973; Ueda et al., 1975 ),UV

能が ScPHO81 機能と互換性があるかどうかを調べるた

突然変異誘発によって Oppho81Δ 株からの抑圧突然変異

めに,S. cerevisiae での OpPHO81 発現プラスミド( YZ3 )体の分離を試みた．約 23,000 コロニーを,高リン酸おを作製して S. cerevisiae BY22357( Scpho81Δ )を形質転よび低リン酸平板培地の両方で APase 活性についてス

換した．得られた形質転換体を高リン酸培地で前培養し,ク リ ー ニ ン グ し,PhoC 表 現 型 を 示 す 3 つ の ク ロ ー ン

初期 OD660 が 0.1 になるように高リン酸および低リン酸( M1,M8 および M11 )を得た( Fig. 2A )．それぞれの培地に植菌し,培養 23 時間後に APase 活性を測定した．

クローンを H76-1B( Oppho81Δ )と交雑し,得られたTable 4 に示すように,OpPHO81 遺伝子は Scpho81Δ 突

交雑二倍体の APase 表現型を調べたところ,いずれの然変異体の APase 非生産性表現型を ScPHO81 遺伝子と交雑二倍体も APase 活性を示さなかった．すなわちす

同 程 度 の レ ベ ル に 回 復 さ せ た こ と か ら,OpPho81 がべて Pho- 表現型を有していた．これは分離株の抑圧変CDK 阻害因子であることが支持された．さらにサイク異が劣性であることを示している．次に,各交雑二倍体

リン- CDK 複合体が O. polymorpha の PHO 経路においてを胞子形成させ,子嚢解剖した．それぞれ調べた 9 ~ 16も機能していることも示唆された．

個の四分子はほぼすべてが 2 PhoC：2 Pho- 分離を示し,

Table 3

Table 4APase production of pho mutants in high- and low-phosphate media

Expression of the OpPHO81 gene complements the pho81 mutation in S. cerevisiae－ 112 －

メタノール資化酵母におけるリン酸シグナル伝達経路

抑圧変異がそれぞれ単一の核性遺伝子に生じていること

Oppho80 と Oppho85 変異の抑圧変異遺伝子 Oppho4 のが わ か っ た．3 つ の 分 離 株 と PhoC 表 現 型 を 示 す Op-

取得

pho80 および Oppho85 突然変異体の間で相補性試験を次に,Oppho4Δ および Oppho2Δ 変異体を作製した．

行った．その結果,M1 と M11 の突然変異は Oppho80

予想どおり,Oppho4Δ 変異体は低リン酸条件下で Pho-

変異と相補せず,M8 の突然変異は Oppho85 変異と相補表現型を示した( Table 3 )．しかし,Opho2Δ の APase

しなかった．さらに,M1 および M8 の抑圧変異は,そ生産は Cgpho2Δ の場合( Kerwin & Wykoff, 2009 )と同

れ ぞ れ OpPHO80( YZ77 ) お よ び OpPHO85( YZ78 )様に野生型と同じであった( Table 3 )．

発 現 プ ラ ス ミ ド に よ っ て 相 補 さ れ た( Fig. 2B )．M1

S. cerevisiae の場合,pho4 変異は pho80 構成性変異の( pho81Δ pho80-101 )および M8( pho81Δ pho85-8 )突抑圧変異となり,PHO 経路では PHO4 は PHO80 の下流

然変異体は,各遺伝子の欠失突然変異体と同レベルので働いている．そこで,OpPHO80 の下流で働く遺伝子

APase 生産能を示した( Table 3 )．したがって,O. poly-を確認するため,Oppho80 突然変異体( AP2; Oppho80-2

morpha においてもサイクリン- CDK-CKI 複合体が,S.

leu1 )の抑圧変異をプラスミド pREMI-Z のランダム組

cerevisiae と同様の様式で APase 発現を調節する可能性

込み変異法( van Dijk et al., 2001 )によってスクリーニが高いと考えられる．

ングした．しかし,理由は不明であるが,この方法はAP2 ではうまく機能せず,形質転換後に多くの偽陽性ゼ

Fig. 2

Colony staining assay of APase production in O. polymorpha mutants.
APase activity was determined by a colony-staining assay in high-Pi and low-Pi media. A, Strains M1, M8, and M11 were isolatedby screening mutants obtained after UV mutagenesis of NY-1 (pho81Δ). B, Suppressor mutants KYC1385 and KYC1388 were derived from the original suppressor mutants M1 and M8, respectively, and both carried the pho81Δ mutation. They were transformed with either the control plasmid (pFL26), or the OpPHO80 (YZ77) or OpPHO85 (YZ78) expression plasmid. C, Strains R1
and R2 were isolated by screening mutants obtained after random integration of pREMI-Z into AP2 (pho80). D, Suppressor mutant YZS28 was derived from the original suppressor mutant R1, and carried the PHO80+ gene and the inserted pREMI-Z fragment. YZS28 was subsequently transformed with pFL21 (control) or YZ14 (OpPHO4) plasmid.

－ 113 －

金

子

嘉

信

オシン耐性コロニーが得られた．そこで,APase 活性をを示す突然変異体のスクリーニングを実施した．野生型株

試験する前に,200 μg/ml のゼオシンを追加した新鮮な

BY4329 を UV 照射処理して,YPAD 平板培地に出現した

YPAD 平板培地上に最初の形質転換体をコロニーレプリ

コロニーを高リン酸平板培地に移し,37 ℃で 1 日培養したカ法で複写して,ゼオシン耐性( Zeo )株を再選択した．

後,コロニー活性染色法によりAPase 生産を調べた．約

調べた約 9,100 のゼオシン耐性形質転換体の中から,2

25,000 コロニー中,明瞭に PhoC 表現型を示す 38 の構成

つの Pho- 抑圧突然変異体( R1 および R2 )を単離した性突然変異体が得られた．次に,得られた 38 個の PhoC

( Fig. 2C )．この抑圧突然変異体の各々と KYC1389( Op-

突然変異体を野生型株 BY4330 と交配し,得られた交雑

pho80-2 ade11 )との交雑二倍体は,PhoC 表現型を示し,

二倍体を高リン酸平板培地で培養し,コロニー染色によりR

2 株の抑圧突然変異が劣性であるがわかった．さらに,APase 活性を調べた．38 の突然変異体のうち 4 つは優性

各二倍体の 25 個の四分子は,2 PhoC ZeoS：2 Pho- ZeoR

構成性変異であり,他のものは劣性の構成性変異であった．

の分離を示し,また,2 つの抑圧突然変異は互いに相補劣性構成性変異体について,先に述べた優性劣性試験

せず,核性の同一遺伝子の変異であることがわかった．
抑圧変異体 R1 の EcoRI 消化ゲノム DNA から回収したで作製した雑種二倍体を無作為に選び,胞子形成させ,
子嚢解剖した．YPAD 平板培地で 2 +：2 - の APase 生産

ゼ オ シ ン 耐 性 プ ラ ス ミ ド DNA の 塩 基 配 列 分 析 か ら,

能の分離を示す四分子の中で,適当な PhoC 表現型胞子

pREMI-Z 断片が OpPHO4 のプロモーター( ATG 開始コ

クローンを選択し,他の劣性構成性変異体との相補性試

ドンの 52 bp 上流)に挿入されていることが明らかになっ験を行った．その結果,劣性構成性変異体は 3 つの相補た．野生型 OpPHO4 遺伝子が R1 の抑圧変異を相補する性グループに分けられ,そのうちの 1 つは OpPHO80 のかどうかを調べるために,R1 の抑圧変異を有する株

変異であった( 11 株)．残りの 2 つの相補性グループは( YZS28 )を OpPHO4 発現プラスミド( YZ14 )で形質新しい遺伝子変異であり,pho51 および pho53 と命名し転換した．得られた形質転換体は Fig. 2D に示すようにた．3 つの相補性グループのうち,pho51 突然変異体が野生型の Pho 表現型を示した．したがって,分離した

最も多く分離された( 21 株)．

Oppho80 変異の 2 つの抑圧変異遺伝子は Oppho4 変異遺伝子であると結論した．

4 つの優性構成性変異体( AP4,AP5,C12,C51 と命名)についても,野生型株 BY4330 と交雑した後,四分

KYC1390( Oppho85-8 ura3 )の UV 突然変異処理によって Oppho85 突 然 変 異 の 抑 圧 変 異 体 の 単 離 を 試 み, 約子分析を行った．その結果,高リン酸平板培地での四分
子の Pho 表現型は 2 +：2 - 分離し,4 つの優性変異はすべ

18,000 の生存コロニーから 6 つの抑圧変異体( YZS66,て単一遺伝子の変異であることがわかった．S. cerevisiae

YZS69,YZS72,YZS73,YZS77 および YZS85 )を得た．

の場合,ScPHO81C 変異が優性構成性変異として報告さ各抑圧変異体と KYC1404( Oppho85-8 leu1 )との交雑れている( Creasy et al., 1993; Ogawa et al., 1995 )．した

二倍体はすべて Pho 表現型を示し,抑圧変異はすべてが っ て,4 つ の 優 性 構 成 性 変 異 体 の い ず れ か は Op-

劣性変異であった．YZS73 または YZS72 と KYC1404 とPHO81C 変異の可能性があると考えた．それぞれの優性Cの交雑二倍体からの 20 または 30 個の四分子の Pho 表現

構成性変異体と NY-1( Oppho81Δ )との交雑二倍体を作

型は 2 PhoC：2 Pho- のパターンで分離していた．さらに,製し,四分子分析を行った．各交雑二倍体について調べ

6 つの抑圧変異体の間の相補性試験の結果,すべての抑圧変異は同一遺伝子の突然変異であることが明らかにた 8 - 12 個の四分子の Pho 表現型は,高リン酸および低リン酸平板培地の両方で 2 +：2 - 分離パターンを示し,な っ た．YZS73 を 野 生 型 株 BY4330 に 戻 し 交 配 し て,

すべて両親型の四分子で,野生型組換え体を含む四分子

Oppho85 突然変異をもたない Pho クローン( YZS135 )は観察されなかった．この結果から 4 つの優性構成性変を 作 製 し た．YZS135 は,YZS28( Oppho4 :: pREMI-Z )異体はすべて OpPHO81C 変異体であると結論した．

-の Pho 表現型を相補することができず,抑圧変異遺伝

ScPHO81C の 4 種類の対立遺伝子は Pho81 タンパク質

子が OpPHO4 遺伝子の変異遺伝子であることが確認での N 末端領域に変異をもつと報告されている( Creasy et

きた．変異解析と抑圧変異体分離の結果から,低リン酸

al., 1993; Ogawa et al., 1995)．今回得られた OpPHO81C

条件下で APase 遺伝子( PHO1 )の発現に必要な転写活

遺伝子の変異点を同定するために,4 種の突然変異体の性化因子を OpPHO4 がコードし,OpPho80 と OpPho85

PHO81C 遺伝子領域を PCR 増幅してクローニングし,が OpPho4 の機能を負に調節すると考えられた．

それらの塩基配列を決定した．注目すべきことに,各-OpPHO81C 対立遺伝子の突然変異点はすべて異なり,N
酸性ホスファターゼ構成性突然変異体の分離末端( AP4 の S144F )だけでなく,最小ドメイン( C12

O. polymorpha の PHO 経路,特に OpPHO81 の上流で働いている遺伝子をさらに探索するために,PhoC 表現型の Y614 N,C51 の F618L ) や C 末 端( AP5 の N968T )にも変異点が存在していた( Fig. 3 )．

－ 114 －

メタノール資化酵母におけるリン酸シグナル伝達経路

Fig. 3

Amino acid sequence alignment of Pho81 proteins in three yeast species.
The amino acid sequences of the Pho81 protein in S. cerevisiae (Sc_Pho81), C. glabrata (Cg_Pho81) and O. polymorpha (Op_
Pho81) were aligned by Clustal Omega. The minimum domain of ScPho81 is denoted by a box. The mutation point in each OpPHO81C mutant is indicated by an asterisk.

－ 115 －

金

子

嘉

信

PHO51 と PHO53 は PHO 経路での PHO81 の上流で働く

PHO81 遺伝子は S. cerevisiae の pho81 変異を相補し,S.

PHO 経路における PHO51 および PHO53 遺伝子の位

cerevisiae と同様の優性の構成性 OpPHO81C 変異が単離置を決定するために,Oppho81 変異と pho51 変異あるいさ れ た．Oppho81 変 異 と Oppho80 変 異 あ る い は Op-

は pho53 変異との上位下位の関係を調べた．pho51 変異

pho85 変異との上位下位関係も O. polymorpha の PHO 経が Oppho81 変 異 に 対 し て 上 位 で あ る 場 合,pho51 Op-

路において保存されていた．さらに,Oppho4 変異は

pho81 二重変異体は Pho 表現型を示す．逆の場合,すOppho80 変異と Oppho85 変異の両方に対して上位であっなわち,Oppho81 変異が pho51 変異に対して上位である

た．そして,各調節遺伝子の突然変異体における高リン

場合,二重変異体は低リン酸条件下でも Pho- 表現型を酸 条 件 お よ び 低 リ ン 酸 条 件 の 両 方 で APase 遺 伝 子

C

示すはずである．そこで,NY-1( Oppho81 )および C5(PHO1) の発現を定量的リアルタイム PCR で調べた結( pho51 )を交雑して四分子分析を行った．Table 5 に示果,O. polymorpha の APase 生産も PHO 経路によって転す よ う に, 四 分 子 は 低 リ ン 酸 条 件 下 で APase 生 産 の2 +：2 - 分離パターンのみを示したが,高リン酸条件で

写レベルで調節されていることを確認できた(Table 3 )．

1 +：3 -(テトラ型)や 0 +：4 -(非両親型)が観察され,複以前に S. cerevisiae と分岐したにもかかわらず,PHO

Oppho81 変異が pho51 変異に対して上位であることがわ

経路の主要な調節因子は O. polymorpha においても保存

かった．pho53 変異( AP3 )でも,Oppho81 変異体とのされていることが明らかになった．

したがって,子嚢菌酵母の進化過程における全ゲノム重交雑二倍体の四分子分析は pho51 変異と同様の Pho 表

O. polymorpha の PHO 経路を明らかにしたことで,リ

現型分離パターンを示した．したがって,Oppho81 変異

ン酸飢餓応答システムの進化的過程を推論することがでとの上位下位試験の結果は,PHO 経路において PHO51

きる．PHO 経路の主要コア部分は,子嚢菌門のいくつと PHO53 の両方が OpPHO81 の上流で作用することをかの種において保存されているか,または部分的に保存示唆している．

されている．例えば,Kerwin & Wykoff （2009） によれば,

考

サイクリン- CDK-CKI( Pho80-Pho85-Pho81 )複合体は S.

察

cerevisiae とゲノム重複以降に分岐した系統的に近い C.
glabrata において保存されている．また,アカパンカビ N.

S. cerevisiae では PHO 経路における調節遺伝子機能に

crassa のリン酸飢餓応答でも,PHO4,PHO80,PHO85

ついて多くの情報が数十年にわたり蓄積されており,

お よ び PHO81 に 対 応 す る 4 つ の 調 節 遺 伝 子 nuc-1,

PHO 経路は遺伝子発現調節ネットワークを研究するた

preg,pgov および nuc-2 が働いている( Kang & Metzen-

めの最良のモデル系の 1 つである．本研究では,1 億年

berg, 1990; Littlewood et al., 1975; Toh-e & Ishikawa,

以上前に S. cerevisiae から分岐したメタノール資化酵母

1971 )．S. cerevisiae の経路と同様に,NUC-2 タンパクO. polymorpha( Dujon et al., 2004 )に焦点をあて,その質は PREG-PGOV 複合体の機能を阻害し,それによりPHO 経路を遺伝学的に解明した．比較ゲノム解析およPi 欠乏条件下で NUC-1 の核内への移行を促進する(Gras

び突然変異体分析によって,O. polymorpha の PHO 経路

et al., 2009 )．一方,コウジカビの一種 A. nidulans では,に は 4 つ の 遺 伝 子( OpPHO81,OpPHO80,OpPHO85

AnPho80 と AnPho4 はそれぞれ PHO 経路において期待

および OpPHO4 )が関与していることを確認した．Op-

さ れ る 負 の 役 割 お よ び 正 の 役 割 を 果 た し て い る が,Table 5

Epistasis analysis between the Oppho81 mutation and the pho51 or pho53 mutation－ 116 －

メタノール資化酵母におけるリン酸シグナル伝達経路

Pho81 と Pho85 の最も可能性のあるホモログは PHO 経

1995; Schneider et al., 1994 )．ScPho81 CKI は ScPho80-

路に関与していない( Wu et al., 2004 )．S. cerevisiae とScPho85 と常に会合している( Schneider et al., 1994 )．

は最も古く進化的に分岐している分裂酵母 S. pombe は小分子リガンド IP7 は,この ScPho80-ScPho85-ScPho81

PHO81 のホモログを持たず,PHO80 と PHO85 のホモ複合体と非共有結合的に相互作用し,基質となる転写活

ログは APase 生産の調節に関与していないようである

性化因子 ScPho4 が ScPho85 キナーゼの活性部位へ接近( Henry et al., 2011 )．さらにもっと古い時代に分岐したすることを妨げる(Lee et al., 2007, 2008)．ScPho81 の「最系統的に遠い関係にある担子菌門の日和見病原性酵母

小 ド メ イ ン 」( Fig. 3 参 照 ) と 呼 ば れ る ド メ イ ン は,

Cryptococcus neoformans では PHO 経路の主要コア調節

ScPho4 標的への ScPho80-ScPho85 のキナーゼ活性およ

因子が保存されていることがわかっている( Toh-e et

び IP7 との相互作用の両方を阻害するために必要であal., 2015 )．したがって,真菌の共通祖先には PHO 経路る( Ogawa et al., 1995; Lee et al., 2008 )．ScPho80 にはの主要コア調節因子サイクリン- CDK-CKI 複合体と転写

ScPho4 および ScPho81 に結合するための 2 つの領域が活性化因子が存在していた可能性が高いと思われる．しある( Huang et al., 2007 )．ScPho81 と OpPho81 のアミ

かし,いくつかの種は進化の過程でこれらの構成要素をノ酸配列の整列結果は,最小ドメインが両 Pho81 タン

他のタイプのシステムに変更したと考えられる．

パク質でよく保存されていることを示している( Fig.

pho51 および pho53 変異体の PhoC 表現型は OpPHO81

3 )． し た が っ て,OpPho81 は ScPho81 と 同 様 に Op-

遺伝子機能に依存するため,PHO 経路での PHO51 およPho80-OpPho85 複合体に結合でき,IP7 によって活性化

び PHO53 の作用位置は OpPHO81 の上流に位置するとされる可能性がある．実際,OpPHO81 遺伝子は Table 4

推測される．現在,PHO51 は O. polymorpha YCp 型ベクに示すように,S. cerevisiae pho81Δ 細胞において CKI とターを利用した O. polymorpha ゲノム DNA ライブラリー

して機能することができる．一方,OpPHO81C 対立遺伝のスクリーニングおよび Iida et al. （2014） が報告した全子の突然変異点は N 末端に位置するだけでなく最小ドゲノム配列のバイオインフォマティクス分析によってイ

メインおよび C 末端にも存在する．変異型 Pho81C は野ノシトール 1,3,4,5,6 - ペンタキスリン酸 2 - キナーゼ遺伝

生型 Pho81 より Pho80-Pho85 キナーゼとの強い結合を子 IPK1 であることがわかっている（未発表）が,PHO53

もたらし,野生型 Pho81 と競合して高リン酸条件下で遺伝子の機能は不明のままである．S. cerevisiae で報告

も Pho80-Pho85 キナーゼ活性を阻害すると考えられる．

されている劣性構成性変異となる PHO81 の上流に位置

今後のタンパク質構造データおよび詳細な生化学分析をする遺伝子には次のような遺伝子がある：リン酸輸送系

用いた,IP7 および Pho81 による Pho80-Pho85 キナーゼの 機 能 に 必 要 と さ れ る PHO84,PHO86 お よ び PMA1

調節の詳細なメカニズムの解明が期待される．

( Ueda et al., 1975; Lau et al., 1998 )；イノシトールピロ

以上をまとめると,S. cerevisiae で同定された PHO 経

リン酸の合成に関与する PLC1,ARG82 および KCS1；路の主要調節因子は進化の過程で全ゲノム重複が生じる

アデニル酸キナーゼをコードする ADK1( Auesukaree

前に分岐したメタノール資化酵母 O. polymorpha でも保et al., 2005 )．したがって,PHO53 はリン酸輸送または存されていた．さらに,CKI -サイクリン- CDK 調節シス

イノシトールポリリン酸合成に関与するタンパク質をテムは,酵母の PHO 経路の基本的なタイプであるよう

コードしている可能性が高い．さらに,アセチル- CoAである．

カルボキシラーゼをコードする ACC1 または Rpd3L ヒ

要

ストン脱アセチル化酵素複合体の成分をコードする

約

PHO23 のいずれかの破壊も構成的 APase 活性を示し,
PHO81 依存性であることが報告されている( Lau et al.,

真核生物における遺伝子発現調節系の多様性および進1998 )．したがって,PHO53 は,同様の細胞機能に関与化のより良い理解を得るために,近年複数の酵母でリンす る タ ン パ ク 質 の 遺 伝 子 か も し れ な い． こ れ ら酸シグナル伝達( PHO )経路が研究されている．本研

PHO51(IPK1) と PHO53 の 詳 細 な 分 析 は,O. polymor-

究では,酵母における PHO 経路の多様性および進化に

pha だけでなく,他の酵母においても PHO 経路のよりついての情報を得るために,Saccharomyces cerevisiae お

深 い 理 解 に つ な が る だ ろ う． さ ら に,S. cerevisiae の

よび Schizosaccharomyces pombe からは系統的に離れてPHO 経路のイノシトールピロリン酸にまつわる未解決

いて遺伝学的に扱いやすい Ogataea polymorpha の PHOの問題に手がかりを与えるかもしれない．

経路を調べた．O. polymorpha BY4329 の注釈付きドラフ

す で に 紹 介 し た よ う に S. cerevisiae で は,ScPho81

トゲノム情報を利用して,いくつかの pho 遺伝子欠損突CKI によってリン酸濃度に応じた ScPho80-ScPho85 複然変異体を作製した．Oppho2 欠損突然変異体を除いて,合体のキナーゼ活性の調節が行われる( Ogawa et al.,

これらの突然変異体は対応する S. cerevisiae 突然変異体－ 117 －

金

子

嘉

信

と同じ抑制性酸性ホスファターゼ( APase )生産性を示

NY-1( BY19539),H76-1B(BY19540),YZS216( BY19541),

した．次に,Oppho80 および Oppho85 突然変異体が Op-

YZS28( BY19542 ),YZS135( BY19543 ) を NBRP 酵 母

pho81 突然変異の抑圧変異体として単離でき,さらに遺伝資源センター(分担機関；大阪大学工学研究科生命Oppho4 変異体が Oppho80 および Oppho85 突然変異の抑先端工学専攻)に寄託した．

制変異体として得られた．O. polymorpha の PHO 経路の謝より完全な構成因子を網羅するために,UV 照射処理に辞

よって APase を構成的に発現する突然変異体を分離し,遺伝解析を行った．その結果,3 種類の劣性構成的変異

本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成で行および 1 つの優性構成的変異が得られた．そして,劣性われたもので,ここに感謝の意を表します．そして,本

構成的突然変異の 1 つは OpPHO80 の対立遺伝子であり,研究は博士研究員の周瑩さん,大学院博士前期課程の優性突然変異が OpPHO81 の対立遺伝子であることがわ

中塚比呂記さんと結川直哉さんの協力のもとに実施しまかった．Oppho81 変異と 2 つの未知の劣性構成的変異した．また,プラスミド pREMI-Z は阪井康能京都大学( pho51 と pho53 と 命 名 ) と の 間 の 上 位 下 位 試 験 は,教授から,一部の菌株とプラスミドは National BioRe-

PHO51 と PHO53 が PHO 経路の OpPHO81 の上流で機

source Project Japan( YGRC / NBRP )から分与しても能することを示唆した．これらの結果をまとめると,S.

らいました．あらためて感謝します．

cerevisiae で同定された PHO 経路の 4 つの主要構成因子

文は,全ゲノム重複が生じる前に分岐したメタノール資化
酵母 O. polymorpha においても保存されていると結論できる．この知見は酵母における PHO 経路の進化の研究に有用な情報となる．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 金子嘉信．2012．酵母におけるリン酸シグナル応答機構の進化－メタノール資化酵母の場合,シンポジウム酵母の生存戦略から学ぶ－環境応答機構と産業利用－,第 65回日本生物工学会大会,9 月,広島．
2) 結川直哉,中塚比呂記,周 瑩,中西洋一,前川裕美,金子嘉信,原島 俊．2012．Genetic identification of the component genes in the phosphate signal transduction pathway
in Hansenula polymorpha,第 35 回日本分子生物学会年会,
12 月,福岡．
3) Zhou, Y., Yuikawa, N., Nakatsuka, H., Maekawa, H.,
Harashima, S. & Kaneko, Y. 2013. PS11-11 Genetic identification of the component genes in the phosphate signaltransduction pathway of Hansenula polymorpha. 26th International Conference of Yeast Genetics and Molecular Biology, August, Frankfurt, Germany.
原著論文
1) Zhou, Y., Yuikawa, N., Nakatsuka, H., Maekawa, H.,
Harashima, S., Nakanishi, Y. & Kaneko, Y. 2016. Core regulatory components of the PHO pathway are conserved in
the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Curr. Genet. 62: 595-605.

保存機関に寄託した微生物株
Ogataea polymorpha

KYC638( BY19512 ),KYC1389(BY19536 ),KYC1390(BY19537 ),KYC1404(BY19538 ),献

Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y. &Harashima, S. 2005. Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential forphosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280: 25127-25133.
Creasy, C.L., Madden, S.L. & Bergman, L.W. 1993. Molecularanalysis of the PHO81 gene of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 21: 1975-1982.
Dujon, B. 2010. Yeast evolutionary genomics. Nat. Rev. Genet. 11:
512-524.
Dujon, B., Sherman, D., Fischer, G. et al. 2004. Genome evolution
in yeasts. Nature 430: 35-44.
Estill, M., Kerwin-Iosue, C.L. & Wykoff, D.D. 2015. Dissection of
the PHO pathway in Schizosaccharomyces pombe using epistasis
and the alternate repressor adenine. Curr. Genet. 61: 175-183.
Gras, D.E., Silveira, H.C., Peres, N.T., Sanches, P.R., Mar tinez-Rossi, N.M. & Rossi, A. 2009. Transcriptional changes in
the nuc-2A mutant strain of Neurospora crassa cultivated underconditions of phosphate shortage. Microbiol. Res. 164: 658664.
Henry, T.C., Power, J.E., Kerwin, C.L., Mohammed, A., Weissman,
J.S., Cameron, D.M. & Wykoff, D.D. 2011. Systematic screenof Schizosaccharomyces pombe deletion collection uncovers parallel evolution of the phosphate signal transduction pathway inyeasts. Eukaryot. Cell 10: 198-206.
Huang, K., Ferrin-O’Connell, I., Zhang, W., Leonard, G.A.,O’Shea, E.K. & Quiocho, F.A. 2007. Structure of the Pho85Pho80 CDK-cyclin complex of the phosphate-responsive signaltransduction pathway. Mol. Cell 28: 614-623.
Iida, N., Yamao, F., Nakamura, Y. & Iida, T. 2014. Mudi, a web
tool for identifying mutations by bioinformatics analysis ofwhole-genome sequence. Genes Cells 19: 517-527.
Kaffman, A., Herskowitz, I., Robert, T. & O’Shea, E.K. 1994.
Phosphor ylation of the transcription factor Pho4 by a cyclin-CDK complex, Pho80-Pho85. Science 263: 1153-1156.
Kaffman, A., Rank, N.M., O’Neill, E.M., Huang, L.S. & O’Shea,－ 118 －

メタノール資化酵母におけるリン酸シグナル伝達経路
E.K. 1998a. The receptor Msn5 exports the phosphorylatedtranscription factor Pho4 out of the nucleus. Nature 396: 482486.
Kaffman, A., Rank, N.M. & O’Shea, E.K. 1998b. Phosphorylation
regulates association of the transcription factor Pho4 with its
import receptor Pse1/Kap121. Genes Dev. 12: 2673-2683.
Kang, H.-J., Chang, M., Kang, C.-M., Park, Y.-S., Yoon, B.-J., Kim,
T.-H. & Yun, C.-W. 2014. The expression of PHO92 is regulatedby Gcr1, and Pho92 is involved in glucose metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 60: 247-253.
Kang, S. & Metzenberg, R.L. 1990. Molecular analysis of nuc-1+,
a gene controlling phosphorus acquisition in Neurospora crassa. Mol. Cell. Biol. 10: 5839-5848.
Ker win, C.L. & Wykoff, D.D. 2009. Candida glabrata PHO4 isnecessary and sufficient for Pho2-independent transcription ofphosphate starvation genes. Genetics 182: 471-479.
Lau, W.-T. W., Schneider, K.R. & O’Shea, E.K. 1998. A genetic
study of signaling processes for repression of PHO5 transcription in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 150: 1349-1359.
Lee, Y.S., Huang, K., Quiocho, F.A. & O’Shea, E.K. 2008. Molecular basis of cyclin-CDK-CKI regulation by reversible binding of
an inositol pyrophosphate. Nat. Chem. Biol. 4: 25-32.
Lee, Y.S., Mulugu, S., York, J.D. & O’Shea, E.K. 2007. Regulationof a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science 316: 109-112.
Littlewood, B.S., Chia, W. & Metzenberg, R.L. 1975. Genetic control of phosphate-metabolizing enzymes in Neurospora crassa:
relationships among regulatory mutations. Genetics 79: 419434.
Ljungdahl, P.O. & Daignan-Fornier, B. 2012. Regulation of aminoacid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces
cerevisiae. Genetics 190: 885-929.
Maekawa, H. & Kaneko, Y. 2014. Inversion of the chromosomal
region between two mating type loci switches the mating typein Hansenula polymorpha. PLOS Genet. 10: e1004796.
Miller, J.H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Ogawa, N., Noguchi, K., Sawai, H., Yamashita, Y., Yompakdee, C.
& Oshima, Y. 1995. Functional domain of Pho81p, an inhibitorof Pho85p protein kinase, in the transduction pathway of Pi
signal in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 15: 9971004.
Orkwis, B.R., Davies, D.L., Kerwin, C.L., Sanglard, D. & Wykoff,
D.D. 2010. Novel acid phosphatase in Candida glabrata suggests selective pressure and niche specialization in the phosphate signal transduction pathway. Genetics 186: 885-895.
Oshima, Y. 1997. The phosphatase system in Saccharomyces cere-visiae. Genes Genet. Syst. 72: 323-334.
Partow, S., Siewers, V., Bjorn, S., Nielsen, J. & Maury, J. 2010.
Characterization of different promoters for designing a new
expression vector in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 27: 955964.
Phongdara, A., Merckelbach, A., Keup, P., Gellissen, G. &Hollenberg, C.P. 1998. Cloning and characterization of thegene encoding a repressible acid phosphatase (PHO1) fromthe methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 77-84.
Schneider, K.R., Smith, R.L. & O’Shea, E.K. 1994. Phosphate-Regulated inactivation of the kinase Pho80-Pho85 by the CDK inhibitor Pho81. Science 266: 122-126.
Sherman, F. 1991. Getting started with yeast. Meth. Enzymol.
194: 3-21.
Toh-e, A. & Ishikawa, T. 1971. Genetic control of the synthesis ofrepressible phosphatases in Neurospora crassa. Genetics 69:
339-351.
Toh-e, A., Ohkusu, M., Li, H.M., Shimizu, K., TakahashiNakaguchi, A., Gonoi, T., Kawamoto, S., Kanesaki, Y., Yoshikawa, H. & Nishizawa, M. 2015. Identification of genes involvedin the phosphate metabolism in Cryptococcus neoformans. Fungal Genet. Biol. 80: 19-30.
Toh-e, A., Ueda, Y., Kakimoto, S. & Oshima, Y. 1973. Isolationand characterization of acid phosphatase mutants in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 113: 727-738.
Ueda, Y., Toh-e, A. & Oshima, Y. 1975. Isolation and characterization of recessive, constitutive mutations for repressible acidphosphatase synthesis in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 122: 911-922.
van Dijk, R., Faber, K.N., Hammond, A.T., Glick, B.S., Veenhuis,
M. & Kiel, J.A. 2001. Tagging Hansenula polymorpha genes byrandom integration of linear DNA fragments (RALF). Mol.
Genet. Genomics 266: 646-656.
van Zutphen, T., Baerends, R.J., Susanna, K.A., de Jong, A.,
Kuipers, O.P., Veenhuis, M. & van der Klei, I.J. 2010. Adaptation of Hansenula polymorpha to methanol: a transcriptome
analysis. BMC Genomics 11: 1.
Wolfe, K.H. & Shields, D.C. 1997. Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome. Nature 387: 708713.
Wu, D., Dou, X., Hashmi, S.B. & Osmani, S.A. 2004. The Pho80like cyclin of Aspergillus nidulans regulates development independently of its role in phosphate acquisition. J. Biol. Chem.
279: 37693-37703.
Yadav, K.K., Singh, N. & Rajasekharan, R. 2016. Responses tophosphate deprivation in yeast cells. Curr. Genet. 62: 301-307.

－ 119 －

平成27年度一般研究助成の研究報告
助成期間：平成27年 4 月〜平成29年 3 月

IFO Res.Commun. 31
2017を含む約 20 以上の属で炭酸固定遺伝子が検出された．

混合栄養生物としての能力を持つ放線菌の系統的分布範囲と生理特性の解明，および独立栄養に着目した新規な放線菌系統群の探索
菅野

cbbL,coxL,hhyL の 全 遺 伝 子 を 持 つ Streptomyces thermocarboxydovorans において,一酸化炭素や大気水素の消費と,有機物の無い環境での二酸化炭素濃度に応じた菌体増殖を確認した．また,Streptomyces 属では,栄養学に乏しい環境で胞子の状態で存在するときに高親和性水産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門
manabu-kanno@aist.go.jp

素酸化活性が確認され,これら菌株は有機物以外の大気成分からも炭素源やエネルギー源を獲得する機構を持つ

目的：近年の膨大なゲノム情報の探索結果から,一酸化可能性が示唆された．無機ガスの馴養処理によって,採炭素および水素の好気的酸化に関わる遺伝子を持つ微生取時の試料や通常大気下での馴養試料とは異なる微生物物株の多くが放線菌に属することが明らかとなった．放叢への集積は見られたものの,独立栄養の希少系統群を線菌の多くは,異なる環境に適応するために従属栄養性

効率的に獲得するには至らず,平板培養の条件にさらなと独立栄養性の両方の基礎代謝様式を備えた混合栄養生

る工夫が必要と考えられた．

物の可能性がある．本研究は,混合栄養生物としての能

主に人工培地上での従属栄養のふるまいを中心に発展力を持つ放線菌の系統的分布範囲や生理特性を明らかとしたこれまでの放線菌研究に対して,本取組みは混合栄

し,さらに環境中から新規な放線菌系統群を分離するこ養生物として放線菌を捉えなおす研究の端緒と位置づけとを目的とした．

られ,環境中の放線菌の素顔を解き明かすべく今後の進方法：まず,公共データベースの登録ゲノム情報から,展が期待される．

放線菌の炭酸固定および一酸化炭素酸化,水素酸化に関わる各遺伝子(リブロース 1,5 -ビスリン酸カルボキシ

コメツキモドキ−酵母栽培共生系の進化と酵母の拮抗菌抵抗性の関係

ラーゼの大サブユニットの遺伝子 cbbL,一酸化炭素デ
ヒドロゲナーゼの大サブユニットの遺伝子 coxL,高親土

和性水素酸化酵素の大サブユニットの遺伝子 hhyL )の保有情報を系統的に万遍なく調査した．属レベルでゲノ岐和多瑠

京都大学生態学研究センター,
現 名古屋大学大学院生命農学研究科
tokiw@agr.nagoya-u.ac.jp

ムが未解読の放線菌系統に関しては,国内菌株保存機関
から各属の基準種の基準株の抽出 DNA から縮重プライ
マーを用いて PCR 試験を行った．次に,複数の Strepto-

目的：宿主が共生生物を育てて食べる栽培共生は多くのmyces 株のゲノム解読と,ガス消費能の試験,独立栄養生物で見られる．中でも社会性昆虫と菌の栽培共生は最条件での生育試験を行った．さらに,気相に二酸化炭素,も発達しており,農耕と称され,多くの研究がなされて一酸化炭素,水素を充填して無機栄養のみを添加した集きた．一方,非社会性昆虫と菌の栽培共生は例が少なく,

積ボトル中で土壌試料を 60 日間馴養して集積株の分離共生の実態解明や進化プロセスを扱った研究はごくわずと分子生態解析を行った．

かにとどまる．

結果・考察：2016 年秋の時点で Actinomycetales 目に属す

ニホンホホビロコメツキモドキ Doubledaya bucculenta

る 310 属のうち,ゲノム配列が既に解読されている 212(鞘翅目オオキノコムシ科コメツキモドキ亜科)(以下ホ属とゲノム未解読の 54 属を調べた結果,系統的に偏りホビロ)のメス成虫は,枯れた竹に孔を開け,空洞内になく,Streptomyces 属,Mycobacterium 属,Rhodococcus 属,

産卵すると同時に酵母 Wickerhamomyces anomalus を接Pseudonocardia 属,Amycolatopsis 属,Actinoplanes 属等

種する．孵化した幼虫は,酵母を空洞全体に広げて農園－ 121 －

IFO Res.Commun. 31
2017を作り,酵母を食べて成長し,空洞内で羽化する．農園であった．D. ustulata 共生酵母は W. anomalus に近縁で,には,幼虫の成長や酵母の増殖に負の影響を及ぼす非共

D. ruficollis 共 生 酵 母 は Metschnikowia 属 酵 母 に 近 縁 で生菌がしばしば侵入する．そのため,その増殖を抑えるあった．これらのことは,Doubledaya 属の複数の系統

ことは非常に重要である．面白いことに,酵母は抗菌活で W. anomalus あるいはそのごく近縁な種が共生生物と性を示し,幼虫が空洞全体に酵母を広げることで非共生して採用されており,これは拮抗菌抵抗性の強さとコメ菌の蔓延を防ぐ．

ツキモドキ－酵母栽培共生系の進化が密接に関係するこ本研究は,コメツキモドキ－酵母栽培共生系の進化ととを示唆する．

酵母の拮抗菌抵抗性の関係を明らかにすることを目的とし,ホホビロ－酵母栽培共生系において,( 1 )農園で酵

ヒト腸内からの難培養性微生物の単離とその分類およびバイオリソース整備

母のモノカルチャーが成立しているか,( 2 )酵母の拮抗
菌抵抗性は共生系の維持に必須かを調べた．さらに,ホ坂

ホビロとその近縁種において,( 3 )共生酵母の拮抗菌抵

本

光

央

理化学研究所バイオリソースセンター
sakamoto@riken.jp

抗性の強さが異なるかを調べた．
方法：( 1 )2016 年 6 月および 9 月に,宮崎県川南町にて
ホホビロ個体の存在するメダケ節間を採取し,空洞より目的：近年のメタゲノム的アプローチにより検出された菌の分離培養およびメタゲノム解析を行った．( 2 )ホホ

ヒト腸内の微生物のその多くがこれまでに未培養あるいビロの農園由来の非共生菌 4 種( Arthrinium 属菌 1 種,

は未同定の微生物(難培養微生物)である．本研究では,

Fusarium 属菌 2 種,未同定糸状菌 1 種)と酵母 2 種( W.

ヒト腸内から難培養性の微生物を単離し,その分類学的anomalus,パン酵母)を PDA 培地上で対峙培養し,非研究を行うとともに,微生物資源の確保およびその利用

共生菌の増殖の程度を調べた．同町産のホホビロ卵を無の観点からバイオリソースの整備を行うことを目的とした．

菌化して,孵化幼虫を得,前述の非共生菌と W. anoma-

方法：健常成人 5 名( 30 代男性・女性 各 1 名,40 代男

lus を与えて飼育した．( 3 )ホホビロと同系統の D. rufi-

性 1 名・女性 2 名)から糞便を提供してもらい実験を実

collis および別系統に属する D. ustulata の共生酵母を用施した．菌株を分離するために,種々の血液寒天培地ない,上記 Arthrinium 属菌と対峙培養して拮抗菌抵抗性どを使用し,嫌気条件下で培養した．また,メンブランを調べた．

フィルター法の適用も試みた．分離された菌株の 16S

結果・考察：( 1 )いずれの調査時期,実験方法においてrRNA 遺伝子の部分塩基配列( 5’ 末端側：約 500 bp )をも W. anomalus が圧倒的に優占しており,モノカルチャー

決定し,その配列の比較から既知種あるいは新菌種であがほぼ達成されていることが強く示唆された．
( 2 )W.

るかを判定した．

anomalus は,パン酵母と比べて,いずれの非共生菌に結果・考察：5 名から 1,691 株(サンプル 1：322 株,サ

対しても強い拮抗菌抵抗性を示した．孵化幼虫に非共生

ンプル 2：360 株,サンプル 3：212 株,サンプル 4：368

菌と W. anomalus を与えて飼育したところ,非共生菌の株,サンプル 5：429 株)を分離した．Bacteroides 属や増殖が抑えられた．Fusarium 属菌を単独で餌として与Bifidobacterium 属に属する菌種も数多く分離されたが,えた場合と比較し,W. anomalus とともに与えた場合は近年,宿主との健康の関連性について注目されている

生存率が著しく増加した．これらのことから,酵母のAkkermansia muciniphila のような既知種ではあるがユ拮抗菌抵抗性は,本共生系の維持に極めて重要である

ニークな菌種も分離された．分離株は総合で 61 種の分ことが強く示唆された．( 3 )拮抗菌抵抗性の強さは,W.

類群に分けられ,一人当たり 26 種( 19 種から 33 種)

anomalus > D. ustulata 共生酵母> D. ruficollis 共生酵母が検出された．該当菌株は理化学研究所バイオリソース－ 122 －

IFO Res.Commun. 31
2017

センター微生物材料開発室( JCM )に寄託し,バイオることで,植物病害の発生を防ぐことができるとも言わリソースの整備を行った．また,16S rRNA 遺伝子配列れている．ところが 2011 年に,日本国内の閉鎖型植物の類似度の比較から新菌種であると考えられる 36 菌株

工場(湛液型水耕栽培)で栽培されているレタスに,茎も分離された．健常成人 1 名の糞便から中心がくぼんだの基部が黒く変色して腐敗する病害が発生した．本病害

特徴的なコロニー形態を示す菌株 2 株が分離された．分

は世界で初めて確認されたもので,その病原菌が Plecto-

離株 2 株はいずれも,偏性嫌気性,無芽胞のグラム陽性

sphaerella pauciseptata とされたことから,プレクトス

球桿菌であり,16S rRNA 遺伝子配列による解析から,フェレラ腐敗病と命名された．その後,国内の異なる 3

Lachnospiraceae 科 内 に 既 存 の 属 と は 独 立 し た ク ラ ス

県にある太陽光利用型植物工場においても本病害が発生

ターを形成した．最も近縁な菌種は Eubacterium contor-

した．本病害は,植物工場という新たな栽培環境に発生

tum JCM 6483 であった(塩基配列の類似度が 95%)．

する新しい植物病害と考えられる．しかし,本病害を引

この結果は hsp60 遺伝子配列の解析からも支持された．

き起こす病原菌に関する知見は極めて限られている．そ分離株 2 株と E. contortum JCM 6483 の主要な菌体脂肪こで,本病害を引き起こす Plectosphaerella 属菌の系統

酸(> 10%)は C18:1 ω9c,C16:0 および C18:1 ω9c dimethyl

的範囲や生理的性質を明らかにし,防除のための基盤情

acetal( DMA )であったが,分離株 2 株の菌体脂肪酸組報を得るために研究を行った．

成中の割合では C18:1 ω9c が一番多いのに対して E. con-

方法：国内 3 県の太陽光利用型植物工場における罹病レTT

tortum JCM 6483T は C18:1 ω9c DMA が一番多かった．まタスおよびその水耕液から,病原菌を分離した．そして,た,分離株 2 株は E. contortum JCM 6483 と比較して硫分離された病原菌の形態的特徴を観察するとともに,化水素を産生し,エスクリンを加水分解する点などで異PCR により rDNA-ITS 領域を増幅して塩基配列を決定しなっていた．分離株はグルコースからの代謝産物としてた．また,国内で分離された Plectosphaerella 属の様々酢酸を産生した．分離株 2 株はその特徴的なコロニー形

な分離株(レタス以外からの分離株を含む)を,レタス

態,16S rRNA 遺 伝 子,hsp60 遺 伝 子 配 列 の 解 析 結 果,の一品種であるサンチュの葉に接種して病原性を調査し主要な菌体脂肪酸などから既知種とは異なっていると考た．同様に,P. pauciseptata の 1 菌株を様々なレタス品えられた．以上の結果より,この 2 分離株を新属・新菌種に接種し,病原性を調査した．さらに,pH を 4 - 8 に

種 Faecalimonas umbilicata(基準株 EGH7=JCM 30896 )

調整した PSA 平板培地に各菌株を植菌して培養し,コとして命名提案した．現在,その他の新種候補株に対しロニー直径を計測した．

ても詳細な検討を行っている．

結果 ･ 考察：国内 3 県に発生した罹病レタスおよびそのT水耕液からは,フィアライド上に単胞もしくは 2 胞の紡錘形の分生子を擬頭状に形成する Plectosphaerella 属菌

植物工場に発生する植物病原性
Plectosphaerella 属菌の分類学的および植物病理学的研究
宇佐見俊と思われる糸状菌が高率に分離された．これらを形態および遺伝的特徴より同定したところ,当初病原菌として報告されていた P. pauciseptata のほか,Plectosphaerella

行

cucumerina および Plectosphaerella plurivora が含まれる

千葉大学大学院園芸学研究科
usami@faculty.chiba-u.jp

ことが明らかとなった．水耕液から分離された糸状菌は,
そのほとんどが Plectosphaerella 属菌と,同じくレタス

目的：植物工場では,植物の生育に影響を与える様々なに 腐 敗 性 病 害 を 引 き 起 こ す Gibellulopsis nigrescens で因子を制御できるため,季節にかかわらず高品質の農産あった．このように,植物工場の水耕栽培では,栽培植物を安定生産できる．また,栽培環境を衛生的に管理す物を加害して増殖する植物病原菌が優占的に増殖する傾－ 123 －

IFO Res.Commun. 31
2017

向にあった．これは,衛生的に管理される植物工場では,条件を作り出し,土壌表面に鉄酸化物を沈着した細菌コ

病原菌の増殖を抑える競合的微生物が少ないためと思わ

ロニーを形成させた．そのコロニーを接種源として,試れる．一方,Plectosphaerella 属の様々な菌株をレタスに

験管の底に沈めた硫化鉄により酸素と二価鉄の対称濃度接種した結果,P. pauciseptata,P. cucumerina,P. pluriv-

勾配を形成させた軟寒天無機塩培地で培養し,至適部位

ora のほか,Plectosphaerella delsorboi や,新種の可能性

にて鉄酸化物の形成とともに増殖した菌を純化してのあるカラー斑点病菌などの幅広い系統がレタスに病原An22 株を得た．群集構造解析には,湛水前,湛水後,性を示した．さらに,レタスの様々な品種に対する接種

中干し中,再湛水後および落水後に採取した土壌を供試試験では,いずれの品種も等しく感受性を示した．以上

した．還元状態の指標として土壌中の活性二価鉄量を測の結果より,Plectosphaerella 属の幅広い菌が様々なレタ

定するとともに土壌より DNA を抽出し,Gallionellaceae

ス品種を加害する可能性が明らかとなった．また,P.

科微好気性鉄酸化細菌の 16S rRNA 遺伝子を対象とした

pauciseptata,P. cucumerina,P. plurivora の 菌 株 は pH

qPCR,PCR-DGGE 解析を行った．

が低くなるにつれて PSA 平板上のコロニー直径が小さ

結果・考察：An22 株は還元鉄を酸化して生育する湾曲

くなる傾向が認められ,特に pH 4 では生育が顕著に抑した桿状のグラム陰性細菌であり,ルビスコ活性を持つ

制された．従って,水耕液の pH を調整することで本病

独立栄養細菌であった．12 - 37℃,pH 5.2 - 6.8 の範囲で害を防除できる可能性が示された．

生育し,水田環境での生育に適していると考えられた．
主な菌体脂肪酸組成は C16:0 ,C16:1 ,C18:1 ,キノン種は Q-10と Q-8 であった．16S rRNA 遺伝子は Gallionellaceae 科

水田土壌の微好気性鉄酸化細菌の特性および生態に関する研究渡邉

健の微好気性鉄酸化細菌に最も近縁であったが,既知菌株との相同性の低さ(< 95%)やその他の特性を考慮する

史と,An22 株は新規分類群に属すると考えられた．培地

名古屋大学大学院生命農学研究科
watanabe@agr.nagoya-u.ac.jp

中では溶存酸素濃度が 4 μM 以下の部位でバンド状に生育したことから,水田土壌中でも酸化還元境界層で働く

目的：水田土壌の鉄酸化反応は非生物的反応が主反応とことが示唆された．

考えられ,生物的鉄酸化反応はこれまでほとんど考慮さ群集構造解析の結果,土壌 1 g 当たり 106 ~ 108 コピー

れてこなかった．本研究では,水田土壌より初めて分離の 16S rRNA 遺伝子が検出され,水稲栽培期と非栽培期した微好気性鉄酸化細菌の特性を解明するとともに,水を区別すると,一部圃場を除いて土壌中の活性二価鉄量

田土壌中の微好気性鉄酸化細菌の群集構造を解析し,生とコピー数の間に有意な負の相関関係が見られた．また物的鉄酸化反応の理解に向けた知見を得ることを目的と

DGGE 解析により,微好気性鉄酸化細菌である Gallio-

した．

nella や“ Sideroxydans ”,An22 株に近縁な菌を含む多様

方法：愛知県農業総合試験場の水田（安城）より採取したな菌が生息することが示唆され,その群集構成は湛水や土壌より分離した微好気性鉄酸化細菌 An22 株の生理的中干しに伴い大きく変化した．以上より,水田土壌中の性質を解析した．また,安城および東北農業研究センター

鉄酸化反応には多様な Gallionellaceae 科の微好気性鉄酸

大仙研究拠点内の水田の土壌中の微好気性鉄酸化細菌の化細菌が関与し,土壌の酸化還元状態の変化に伴い反応群集構造を解析した．最初に湛水条件で鉄が十分に還元に関与する菌の群集構造が変化することが示唆された．

するまで前培養した土壌をガラスチューブに移し,窒素雰囲気下,暗所で静置培養した．その際,わずかに酸素透過性を示す合成ゴム栓で密閉することで徐々に微好気－ 124 －

IFO Res.Commun. 31
2017

伝子を持たない介在配列 gin によって分断されているこ

プロファージによる細菌細胞分化における遺伝子再構築機構の獲得と進化
佐藤とが示された．また,gin 上の遺伝子がコードする GirC
( 487 aa )が胞子形成期の gerE 再編成に関与する LSR で勉あること,この部位特異的組換えの補助因子として法政大学生命科学部
t-sato@hosei.ac.jp

BCE_4620( 42 aa )が必要であることを明らかにした．

目的：溶原性ファージは自らの DNA を宿主ゲノムに組えを用いている点では共通性を持つが,菌種によって対み込むタイプのファージである．このファージが宿主ゲ

象遺伝子と介在配列が異なることが示された．一方,異ノムの遺伝子をコードする領域に組み込まれるとその遺なる溶原性ファージが同じ標的部位を認識する可能性も伝子が破壊され,機能が失われる．我々は,枯草菌の示唆された．このため環境中から特定の標的部位に溶原SPβ プロファージ及び欠損プロファージにより分断され化するファージのスクリーニング系( Pxyl-attB-mazF )ている spsM 遺伝子及び sigK 遺伝子が,細胞が分化するを用いて,環境中から新規 SPβ 様ファージを得た．さ

胞子形成期にそれぞれ異なるセリン型の部位特異的組換らに,SPβ を attB を持たない宿主に溶原化させ,胞子え酵素( LSR )により再構築されることを見出した．本

形成関連遺伝子である htrC,yhfN を含む計 18 ヶ所の部

研究は,このようなプロファージによる遺伝子再構築機

位への挿入を確認した．これらの溶原化株は正確な構の獲得過程の解明を目指した．

ファージの切り出しと遺伝子再構築ができないが,今後

方法：プロファージなどの介在因子によって遺伝子が分実験室進化系を組むことにより,正確な遺伝子再構築を断されたゲノムを持つ細菌を公共ゲノムデータベースを行うまでの進化過程を追うことが可能となった．

従って有胞子細菌の遺伝子再編成は LSR が介する組換用いて調べ,その遺伝子と介在配列の特徴を解析した．
特に転写調節因子をコードする胞子形成遺伝子 gerE の浅海性無脊椎動物の体液に棲みつく
新奇ヘリコバクターの分類学的・生態学的性状の解明

再 構 築 を 行 う Bacillus cereus の gin( gerE intervening )element 上の部位特異的組換え遺伝子ユニットに着目し,表現型,転写,精製酵素による in vitro 組換え実験

中を行なった．また,遺伝子内の標的部位( attB )に溶

川聡

京都大学大学院農学研究科
nsatoshi@kais.kyoto-u.ac.jp

原化するファージの特徴を調べるために,枯草菌を用いた特定の標的部位に溶原化するファージスクリーニング系( Pxyl-attB-mazF )を構築し,ファージの探索を行なっ

目的：浅海性無脊椎動物の体内を満たす体液(血リンパ)た．ファージが溶原化した細胞は細胞毒素 MazF によるは,貪食能を有する体腔細胞や様々な抗菌物質の宝庫で致死を回避できることから選択が可能である．さらに,あることから,当然のように無菌的であると考えられて従来の標的部位とは異なる遺伝子内の部位に挿入したプ

きた．しかし,我々は様々な浅海性無脊椎動物の体液をロファージによる当該遺伝子の再構築を調べるため,調査し,特異な種類の微生物が普遍的に検出されること

SPβ ファージを用い attBSPβ を持たない宿主に SPβ を溶を見出してきた．本研究では,特にヒトデ類の体液中に原化させ,新たに獲得した secondary attB site の位置を発見したヘリコバクター近縁微生物に注目し,培養法とシークエンシングにより解析した．

分子生物学的手法を用いて,その分類学的,生理生態学

結果・考察：有胞子細菌の様々な胞子形成遺伝子が可動的,進化学的性状を解析した．

性因子により分断されていることが示された．このうち

方法：ヒトデ類の血リンパ中における培養可能な微生物の 1 つ B. cereus の gerE は,約 28 kb のファージ関連遺の密度・多様性を解析するため,ヘリコバクター選択培－ 125 －

IFO Res.Commun. 31
2017

地(海水ベースあるいは血リンパそのものをベースに用

担子菌アンズタケ類の生物学的特性解明：
特に，種分類，生態的分化ならびに菌根構造についていた)をはじめとする数種類の寒天培地を用いて,アネ
ロパックによる微好気条件下かつ複数の温度で培養を行った．形成されたコロニーを純化後,分離株の 16S

山rRNA 遺伝子の塩基配列に基づく系統解析を行った．さ

田

明

義

信州大学農学部
akiyosh@shinshu-u.ac.jp

らに,試料から培養を経ずに直接抽出した DNA を用いて,次世代シーケンサーによる 16S rRNA 遺伝子のアン
プリコン解析やメタゲノム解析を行った．加えて,これ目的：アンズタケ類は,アンズタケ目カノシタ科に所属

らの結果に基づき,特徴的な微生物について定量 PCRするアンズタケ属( Cantharellus )とクロラッパタケ属

や FISH 法,電子顕微鏡観察,宿主の飼育実験によって,( Craterellus )で構成され,以前はアンズタケ科とされそれらの存在量・局在性・形態等を解析した．

ていた．このうちアンズタケ属は,2016 年時点で約 130

結果・考察：まず培養法を用いた解析では,合計 250 株

種が有効種とされている．アンズタケ類は,外生菌根性

以上の微生物株を取得し,分離株の 16S rRNA 遺伝子ので汎世界的であり,食用きのことしてはシャントレルと塩基配列に基づく系統解析を行ったが,残念ながら分離も呼ばれる．日本産アンズタケ類の有効種は 13 種と考株の中にヘリコバクター近縁微生物は含まれていなかっ

えられるが,分類学的研究は過去 30 年あまり殆ど進展た．しかし系統学的に特徴的な複数の新規微生物株(少がなく,菌根に関する研究も殆ど知られていない．本研

なくとも新種もしくは新属)を取得することに成功する

究は,日本国内のアンズタケ類に関する種分類と生態解など,本培養実験により,多様かつ培養可能な微生物群

明を目的とした．また,アンズタケ属の基準種であるが浅海性無脊椎動物の体液中に棲息していることが明ら

Cantharellus cibarius Fr. が日本産アンズタケに対してかとなった．次に次世代シーケンサーを用いた解析を実1908 年以来一貫して充てられている点について,分子施し,ヒトデ類の体液中に棲息する微生物の群集構造を系統学的観点から精査することも本研究の目的とした．

解析した．微生物群集構造は,試料の採取地点やヒトデ方法：日本各地よりアンズタケ属とクロラッパタケ属のの種類,さらには個体差の影響を受け,大きく変化する

300 点を超える子実体を収集し rDNA ITS2 領域の分子系

ことが明らかとなった．試料のなかから,注目してきた

統解析を行った．また,子実体直下の菌根を採取し形態

ヘリコバクター近縁微生物を多く含むものを選択し観察と分離操作を行った．

(リードの割合で最大 97%以上がヘリコバクター近縁種

結果・考察：アンズタケ属で 15 クレード,クロラッパとなる試料を見出し,定量 PCR でも確認した),蛍光 in

タケ属で 9 クレードを識別した．これは,日本産アンズ

situ ハイブリダイゼーション( FISH )法および電子顕タケ属既知種の約 2 倍,クロラッパタケ属では約 1.5 倍

微鏡観察により,当該微生物がらせん状の形態を有するに相当する．このうちアンズタケ( Cantharellus cibari-

ことを見出した．さらにメタゲノム解析を実施した結果,

us s.l. )と同定されてきた子実体標本を精査した結果,標的としていたヘリコバクター近縁微生物のゲノム情報

それらは 4 種を含む複合種と判断され,アンズタケが最をある程度取得することに成功した．本微生物は,“人初に記載された長野県内の標本を基準に Cantharellus

類に最も蔓延した胃癌原因菌”として活発に研究されて

anzutake として新種記載した(論文投稿中)．この Can-きたヘリコバクターの進化に関する新しい知見を提供しtharellus anzutake は,北海道渡島半島から沖縄県久米島

うる存在であることから,データを詳細に解析しているまで分布していた．また,近年の研究から欧州固有種とところである．

考えられてきた Cantharellus cibarius s.s. が,北海道の北部と東部にも分布することを明らかにした．日本産ク－ 126 －

IFO Res.Commun. 31
2017

ロラッパタケ属のクロラッパタケには,これまで Cra-

究ではまずリファレンスデータベースの作成を試みた．

terellus cornucopioides が充てられてきたが,今回収集しまた実際に次世代シーケンサーにより大規模データを取たクロラッパタケ標本には胞子サイズのやや異なる 3 つ得し,網羅的な珪藻種同定法の確立へ向けた方法やそのの分子クレードが存在し,いずれも北米の Craterellus

問題点の検討を行った．

flallux に近縁な種であると考えられた．また,アクイロ

方法：福井県の北川,南川,中池見湿地を調査区とし,ウスタケにも 3 クレードが存在し,そのいずれもが,従それぞれ複数地点からサンプル採集を行った．サンプル

来アクイロウスタケに充てられてきた Cantharellus ci-

中に含まれる珪藻類を顕微鏡下でキャピラリーピペット

nereus との相同性が低かっ た．これまでに確認したアを用いて一細胞ずつ単離し,それらの培養,DNA 抽出,

ンズタケ類の外生菌根は,黄土~橙色系のやや明るい色

rbcL 遺伝子の全長配列決定を行い独自のリファレンス

彩の菌鞘を形成することが多く,菌糸には多数の油滴がデータベースを作成した．次にサンプル中の全 DNA(環確認された．特に Cantharellus anzutake では,菌根から境 DNA )の rbcL 3’ 末端領域をバーコード配列とし,次純粋培養株を得ることが比較的容易であった．得られた世代シーケンサーにより環境 DNA に含まれるバーコー

菌株の一部については,菌根合成法によりアカマツとのド配列を網羅的に決定する DNA メタバーコーディング

外生菌根形成を確認した．他の菌種では子実体と菌根の法により種組成を調べた．また各サンプルについて顕微

双方で分離培養に成功しなかったが,クロラッパタケと鏡下で計数を行い,配列情報との比較も行った．

トキイロラッパタケでは,外生菌根チップを接種源として結果・考察：本研究で作成した単離培養株のうち半数程

マツ実生根系に外生菌根を再形成させることに成功した．

度のみ種名を決定することができた．また遺伝的に異なるが形態的には区別のできない「隠蔽種」の存在が複数の 種 で 検 出 さ れ た． 特 に Gomphonema parvulum や

珪藻 DNA メタバーコーディング解析による河川湖沼水質評価法の開発
佐藤晋

Achnanthidium minutissimum などの形態種からはこれまでも隠蔽種の存在が報告されていたが,本研究により也

更に新奇の隠蔽種が見つかった．次世代シーケンサーに

福井県立大学海洋生物資源学部
ssato@fpu.ac.jp

よる網羅的配列解析と顕微鏡による種組成計数との結果を比較した結果,必ずしも両者の結果は一致しなかった．

目的：河川や湖沼の水質評価法には,物理化学的方法と例えば多くのサンプルにおいて Achnanthidium 属は顕微生物学的な方法がある．前者が季節や日変動に左右され

鏡計数では大量に出現するにも関わらず次世代シーケンるのに対し,後者は調査水域の水質の平均的な情報を得サー解析では極端に少なく見積もられた．一方 Eolimna

ることができるという利点がある．珪藻は水質指標生物

属由来の配列は次世代シーケンサーでは多くみられるもとしてその有用性が確かめられており,その出現の有無のの,顕微鏡による計数では過少評価されがちであった．

や頻度にもとづき水質が評価されてきた．しかしその種

これは種により DNA 抽出効率の違いや PCR 増幅効率等

同定には分類学的知識や経験といった専門性が要求さが異なり,また顕微鏡観察においてサイズが極めて小され,また作業者の習熟度により得られる結果が変動する

い細胞は見落とされやすいためと考えられた．今後種組という欠点もある．本研究では次世代シーケンサーの使成が既知の集団を用い,DNA 抽出および顕微鏡観察の用によりこうした問題を回避し,誰にでも迅速かつ正確

条件を検討する必要性がある．

な同定が行える方法を開発することを目的とする．ただし,現段階では本邦産珪藻の種名と塩基配列情報が正しく整備された情報が極端に不足していることから,本研－ 127 －

IFO Res.Commun. 31
2017

示された．本コンソーシアの構成細菌群を 16S rDNA 配

有害元素代謝機構の多様性解析から解き明かす微生物エネルギー代謝の進化
濱村

列により同定したところ,ヒ素やその他金属の還元菌と系統的類似度の高い Firmicutes 門とともに,アンチモン

奈津子

酸化および還元菌として知られている Sinorhizobium に

九州大学大学院理学研究院
nhamascb@kyushu-u.org

近縁な配列が検出された．さらに,その他の代謝機構と目的：周期表第 15 族のヒ素とアンチモンは地殻の構成成功した．この新規アンチモン酸化菌は,同族元素であ元素であり,原始地球から現在にいたるまで自然界に広るヒ素の酸化は行わないことから,これまでに報告のあく存在している有害元素である．あらゆる生物種の中でるヒ素およびアンチモン酸化細菌とは異なる代謝機構を

唯一微生物はこれら有害元素への耐性のみならず,エネ

有すると考えられる．以上より,本研究では世界的にもルギー源として利用するより積極的な代謝機構も発達さ

数株の報告例のみである嫌気的アンチモン酸化および還せてきた．特に微生物のヒ素代謝機構は多系統群に共有

元細菌群の培養に成功し,アンチモン代謝機構は系統的・されており,嫌気的な原始の地球でドメインに分化する

生理的に多様な細菌群に分布していることを明らかにし以前に起源するエネルギー代謝ではないか,との仮説がた．また本成果は,有害元素の生物利用に関する新しい提唱されている．しかし,これまでヒ素以外の有害元素知見を提供するとともに,アンチモン生物変換を利用しの生物利用に関する知見は限られており,ヒ素と同族元たバイオメタル生成や浄化技術への応用も期待できる．

して,嫌気下でアンチモン酸化を司る細菌の分離培養に素であるアンチモンの微生物利用についても未解明な部分が多い．そこで本研究では,原始の地球で生命体のエ

アルミニウム耐性とアルカロイド産生能から読み解く植物根内共生菌の多様性と共生関係の生態学的意義

ネルギー源となり得るアンチモンに着目し,微生物進化に関わる有害元素の影響に関する基礎的知見を得るために,新規アンチモン代謝菌群の分離培養による同定に取広り組み,有害元素代謝機構の多様性分布を明らかにする

瀬大

日本大学薬学部
hirose.dai@nihon-u.ac.jp

ことを目的とした．
方法：本課題では多様なアンチモン代謝菌群を探るため,高濃度アンチモンで汚染した鉱山土壌を接種源とし,目的：菌類と植物根の共生関係は陸上生態系において普酸素条件や炭素源等の異なる集積培養を実施した．アン

遍的にみられるが,本研究ではコアツツジ科植物をモデ

チモン変換活性を示すコンソーシアを取得後,直接プル系とした調査・実験を行った．コアツツジ科植物はレート法や希釈混合培養法を用いて分離培養した．得ら

hair root と呼ばれる細かい根を発達させることにより,れた新規アンチモン代謝細菌群については分子系統学的その根圏でエリコイド菌根菌や根内生菌(以下,両者をに同定するとともに,アンチモンおよびヒ素の酸化還元

合わせて根内共生菌とよぶ)と共生関係を築いている．

代謝活性を誘導結合プラズマ発光分光分析法により測定

次世代シークエンサーの普及により根内生菌の多様性のした．

実態は解明されつつあるが,根内共生菌の多様性パター

結果・考察：集積培養の結果,嫌気下で 5 価アンチモン

ンと共生関係の機能との関連性に関しては殆ど分かってを 3 価へと還元するコンソーシアを取得した．アンチモいない．本研究では,根内共生菌のアルミニウム( Al )ン還元の際に 5 価アンチモンの減少にともなって生成す

毒性に対する耐性能と産生する二次代謝産物(特にアルる 3 価アンチモンが溶液中からは検出されず,還元されカロイド)に着目し,生理生態学的特性と多様性パター

たアンチモンは三酸化アンチモンとして析出することがンの関連性を探ることを最終的な目的とした．

－ 128 －

IFO Res.Commun. 31
2017

方法：日本国内全域を網羅する 47 地点でコアツツジ科化合物の産生の有無を評価し,根内共生菌の多様性パ

植物の根を採取,根内共生菌の分離を行った．各分離菌

ターンとの関連性を議論する予定である．

株は形態観察と 28S rRNA 遺伝子の部分塩基配列から種同定を行った．また各採取地土壌の pH と水溶性 Al 濃度

MqsR-YgiT toxin-antitoxin system によるバイオフィルム制御機構およびバイオフィルム薬剤耐性機構の解明の測定を行い,土壌環境の多様性を評価した．
根内共生菌の Al 毒性に対する耐性能は,分離培養した 2048 株のうち 228 株を用い,pH 3,Al3+ 濃度 100 mM

山に調整した栄養培地上での生育状態により評価した．さ

口

良

弘

大阪市立大学複合先端研究機構
yamaguchi@ocarina.osaka-cu.ac.jp

らに 248 菌株については二次代謝産物に関する化学分析を行った．PDB 培地で液体培養後,酢酸エチルで抽出し,
UPLC により二次代謝産物のプロファイリングを行うと目的：近年,原核生物において細胞死を制御する Toxin-

共に,ドラーゲンドルフ呈色反応によるアルカロイド産

antitoxin（TA）system の存在が明らかとなってきた．MqsR

生能を評価した．

は大腸菌のバイオフィルム形成促進因子として同定され結果・考察：Al 毒性に対する耐性能に関する実験の結果,

た MqsR-YgiT TA system の toxin である．予備実験にお各地で優占するズキンタケ綱において供試した株の 29%

いて,MqsR-YgiT TA system によるバイオフィルム制御

で Al 存在下でも良好な成長がみられることが明らかに機構の存在が示唆された．本研究では,YgiT によるバなった．また Rhizoscyphus ericae,Phialocephala fortinii,

イオフィルム形成促進機構,MqsR によるバイオフィル

Oidiodendron maius に関しては同種内の株間で耐性能に

ム内細胞死誘導機構さらに MqsR-YgiT TA system によ

相違があることも明らかになった．土壌分析の結果,鹿るバイオフィルムの薬剤耐性機構を解明し,バイオフィ

児島県野間岳で低 pH(平均 3.76 )かつ高い Al 濃度(平ルム形成及び細胞死に係る TA system の役割を明らかに

均 137 mg/100 g d.w. )を示したが,この採取地で分離さすることを目指した．

れた菌株の中には Al 耐性のあるものが多数見られた．
ツツジ科植物の多くは Al 集積植物でないことが知られ

方法：Escherichia coli( 大腸菌)MG1655 ∆araBAD/mqs-ており,Al 耐性のある根内共生菌による Al 毒性の緩和を用いて,バイオフィルムはクリスタルバイオレット溶が行われている可能性がある．これらの事は,土壌中の液で染色し測定した．Curli 線毛の発現は,コンゴーレッ

Al 濃度が根内共生菌の多様性パターンに影響を及ぼし

ド寒天培地で培養後のコロニーの色から定性的に評価していることを示唆している．

た．MqsR による RNA 分解は合成 RNA を基質とし質量

ドラーゲンドルフ呈色反応が陽性となった株は 43 菌

RygiT（∆2)を作製し実験に用いた．運動性は軟寒天培地

分析計で解析した．

株となり,分類群としては根内で優占することの少ない

結果・考察：MqsR,YgiT および MqsR-YgiT による大フンタマカビ綱で頻度が高かった．しかし,陽性株の系

腸菌の遊泳運動への影響を調べた．その結果,YgiT お

統的な偏りは比較的低く,同一属内であっても陽性株とよび MqsR-YgiT の発現は遊泳運動を増加させた．次に陰性株が混在する傾向がみられた．これら陽性株のうちYgiT および MqsR-YgiT のバイオフィルム形成への影響

特に明瞭な呈色がみられた 3 株に関して化合物の同定をを解析した結果,YgiT および MqsR-YgiT はバイオフィ

試みた．しかし,分子サイズが大きいことから現在のとルム形成を促進した．ここで,バイオフィルム形成促進

ころ未だ同定に至っておらず,分析は現在も進めている．

に関与する遊泳運動以外の因子として curli 線毛に着目

今後それらの化合物の同定が終わり次第,既に完了してし解析した．その結果,YgiT および MqsR-YgiT の発現

いる UPLC プロファイルを利用して各菌株における対象は大腸菌の curli 線毛量を減少させることが示唆された．

－ 129 －

IFO Res.Commun. 31
2017

そこで,curli 線毛発現制御因子である csgD 欠損株を用型のマクロラクタム化合物を生産することを目的とした．

いて YgiT 誘導後のバイオフィルム形成を解析した結果,

方法：インセドニンとヒタチマイシンとビセニスタチン

YgiT によるバイオフィルム形成促進は消失した．よっ

生産菌の β - アミノ酸生成酵素遺伝子の破壊株に対して,て,YgiT は csgD の発現を抑制することで運動性およびそれぞれ非天然型の β - アミノ酸を投与して培養を行っバイオフィルム形成を促進することが明らかとなった．

た．培養抽出物を解析することにより,目的の非天然型

現在,YgiT による csgD 発現抑制機構について実験を進化合物が生産されているかを調べた．

めている．

結果・考察：インセドニン生産菌に関しては,生合成遺MqsR によるバイオフィルム内細胞死を解明するため

伝子クラスター中のグルタミン酸 2,3 -アミノムターゼ遺に,MqsR の配列特異性について合成 RNA を用いて in

伝子 idnL4 の破壊株を作製し,アデニル化酵素 IdnL1 がvitro で解析した．その結果,MqsR は RNA の GCU 配列

認識できる 3 -アミノ脂肪酸を投与して培養した．そののみならず GCC および GCA 配列も GCU と同程度に認結果,3 -アミノペンタン酸を取り込んだインセドニン類

識・切断した．MqsR 切断配列を持たない遺伝子は大腸縁体を生産させることに成功した．ヒタチマイシン生産菌では 2 つしか存在しないことから,MqsR は細胞死を菌に関しても,同様にフェニルアラニンアミノムターゼ

引き起こすことが示唆された．質量分析により MqsR に遺伝子 hitA の破壊株に,アデニル化酵素 HitB が認識でよる RNA 切断部位は 5’- OH および 3’-リン酸基を生じる

きる β -フェニルアラニン類縁体を投与して培養を行っことを見出した．さらに MqsR は一本鎖 RNA を特異的た．その結果,フェニル基のオルト位,メタ位,パラ位に分解し,二本鎖 RNA および tRNA は分解しないことをそれぞれフッ素に置換した化合物を投与した際に,こも見出した．

れらを取り込んだヒタチマイシン類縁体を生産した．また,メタ位がメチル基,あるいはブロモ基に置換された
β - フェニルアラニン類縁体を投与した際にもヒタチマ

非天然マクロラクタム化合物の微生物発酵生産宮

永顕

イシン類縁体の生産が確認された．また,ビセニスタチ
ン生産菌に関しては,グルタミン酸ムターゼ遺伝子の破正壊株にインセドニン生合成に関わるアデニル化酵素遺伝

東京工業大学大学院理工学研究科
miyanaga.a.aa@m.titech.ac.jp

子 idnL1 を導入し,インセドニンの開始基質である 3 -ア
ミノブタン酸を投与して培養を行った．その結果,3 -ア

目的：マクロラクタム抗生物質は,放線菌によって生産

ミノブタン酸を開始基質部位に含むビセニスタチン類縁される環状アミド構造を有するポリケタイド化合物であ体を生産することが明らかになった．本研究の結果から,り抗菌性や抗腫瘍性を有する化合物が多数知られていマクロラクタム抗生物質の β - アミノ酸開始基質部位はる．その生合成においては,アデニル化酵素により各化

入れ替え可能であることが分かった．今後はさらなる非合物に特有の β - アミノ酸開始基質が選択され,ポリケ

天然マクロラクタム化合物生産を試みる予定である．

タイド骨格に組み込まれる．例えば,Streptomyces sp.
ML694-90F3 が生産するインセドニンは 3 - アミノブタン
酸部位を,Streptomyces scabrisporus JCM11712 が生産するヒタチマイシンは β -フェニルアラニン部位を,Streptomyces halstedii HC34 が生産するビセニスタチンは 3 -ア
ミノイソブタン酸部位を有している．本研究では,このβ - アミノ酸部位を別の β - アミノ酸に入れ替えた非天然－ 130 －

IFO Res.Commun. 31
2017の少ない内膜貫通タンパク質である BcsB を過剰発現し大腸菌の菌外膜ベシクル生産促進機構の解明
尾島由

たことにより,膜ストレス応答が誘因され,それに伴っ紘てベシクル生産が促進されたと考察した．
一方で,bcsB 過剰発現によるベシクル生産の促進に付

大阪大学大学院基礎工学研究科,
現 大阪市立大学大学院工学研究科
ojima@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

随して,フロックと呼ばれる数 mm 程度の自己凝集体が形成されることを明らかにした．フロックはプロテアー

目的：菌外膜ベシクルは,主にグラム陰性菌の外膜からゼ感受性であることから主構成成分はタンパク質である遊離した直径 20 ~ 250 nm 程度の細胞外小胞で,毒性因と考えられ,フロックに含まれるタンパク質を質量分析

子やシグナル物質の運搬または不要物質の排出などに関に より解 析したところ, 細 胞 外 膜タンパク質 OmpA と与するとされている．近年,ベシクルのドラッグデリバ

OmpC が高い割合で検出され,ベシクル生産促進との関リーシステムへの応用などが報告されており,ベシクル

連性が示唆された．大腸菌のベシクル生産が促進または生産機構の解明や過剰生産株の構築は重要である．先行研究において,大腸菌にセルロース生合成関連遺伝子で抑制されると報告のある欠損株(それぞれ,ΔdegP, Δds-

ある bcsB を過剰発現すると,ベシクル生産量が促進さ

ク形成の間に正の相関が確認され,過剰に生産された菌れることを明らかにしており,本研究ではその促進機構

外膜ベシクルは,フロック形成を引き起こすことを見出の解明を目的として検討を行った．

した．

bA )を用いて試験したところ,ベシクル生産量とフロッ

方法：大腸菌野生株と bcsB 過剰発現株をグルコース含
む LB 培地を用いて,37 ℃で 24 時間培養することでベ酢酸菌の酸化発酵に関わる
中央炭素代謝制御に関する研究

シクルを生産させ,超遠心分離により回収した．得られたサンプルはポリアクリルアミド電気泳動を行い,細胞新

外膜タンパク質 OmpA, OmpC の量を基準としてベシク

井

博

之

東京大学大学院農学生命科学研究科
aharai@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

ル生産量を評価した．また透過型電子顕微鏡を用いた観察により,得られたベシクルの写真から見かけの平均粒径分布を算出した．さらに DNA マイクロアレイ解析に目的：酢酸菌はエタノールを不完全酸化することによりより,野生株と bcsB 過剰発現株の網羅的な遺伝子発現の一時的に酢酸として培地中に蓄積する性質を持ち,古く比較を行い,ベシクル生産の促進機構について考察した．

から食酢醸造に利用されてきた．蓄積した酢酸はエタ

結果・考察：bcsB 過剰発現株では,ベシクル生産量は約

ノールの枯渇後に炭素源およびエネルギー源として利用

3 倍に増加した．ベシクル平均粒径は,野生株が 130 nm,

される．Acetobacter aceti NBRC 14818 等の酢酸菌野生株

bcsB 過剰発現株では 56 nm となり,bcsB を発現させるでは TCA 回路の補充経路であるグリオキシル酸経路をことで小さくなる傾向が確認された．さらに DNA マイ

持つのに対し,食酢醸造に使用されている Acetobacter

クロアレイ解析から,膜ストレス応答性である Cpx 関

pasteurianus NBRC 3283 等の菌株ではこの経路を欠失し連遺伝子( cpxA, cpxP )やペリプラズムプロテアーゼており,このような中央炭素代謝経路の違いが酢酸生産( degP )などの発現量が,bcsB 過剰発現株において大幅性に影響を及ぼすことが示唆されている．NBRC 14818に増加していることがわかった．他の研究グループによのグリオキシル酸経路遺伝子欠損株では,エタノールとり,膜ストレス負荷が微生物のベシクル生産を誘引する

グルコースが共存する条件で著しい生育阻害が起こるのとの報告があるため,bcsB 過剰発現によってベシクル

に対し,NBRC 3283 では生育阻害を起こさず酢酸を蓄生産が促進した理由として,本来大腸菌細胞内で発現量積するため,食酢醸造株には特有の代謝特性があると考－ 131 －

IFO Res.Commun. 31
2017

えられる．本研究では酢酸菌が共通して持つ不完全酸化二倍体で，育種が比較的容易である上面ビール
酵母に，ビール醸造に適した凝集性を付与した菌株を造成し，小規模多品種生産する
地ビールへの貢献をめざすを起こすための中央炭素代謝制御機構と,食酢醸造株に特異的な代謝特性を明らかにすることを目的とした．
方法：A. aceti NBRC 14818 の野生株とグリオキシル酸経路欠損株,および,A. pasteurianus NBRC 3283 を用い,

尾

様々な培養条件におけるトランスクリプトームと代謝物

形

智

夫

前橋工科大学工学部
tomoo.ogata@maebashi-it.ac.jpの解析から,各菌株に共通または特異的な炭素代謝経路の推定を行った．
結果・考察：解析したすべての菌株において,エタノー

目的：我が国の人口減少,高齢化に伴い,酒類消費量がルの存在時に TCA 回路関連遺伝子の発現が抑制された．

減少傾向にある．この中で,地ビールの消費量は,増加

特に酢酸からアセチル CoA を経てクエン酸に変換する傾向にある．地ビールの特徴は,少量多品種生産にある．

succinyl-CoA:acetate CoA-transferase（aarC）と citrate

このことに貢献する手段として,酵母株が多種類ある上

synthase（aarA）の遺伝子発現がより強く抑制され,これ面ビール酵母株の利用が考えられる．しかし,上面ビー

により TCA 回路への代謝フローが減少することで不完

ル酵母株には,ビール醸造に適した NewFlo タイプ凝集

全酸化が起こることが示された．NBRC 14818 ではピル性(マンノース,グルコース添加で凝集が抑制される凝ビン酸をアセトアルデヒドに変換する pyruvate decar-集性)を示す酵母株がほとんどない．そこで,上面ビー

boxylase 遺伝子 pdc の発現がエタノールとグルコース共

ル酵母株にビール醸造に適した凝集性を付与する酵母株

存時に顕著に上昇していたため,グルコースを解糖系かの造成を試みた．

らアセトアルデヒドを経由して酢酸に変換するオーバー

方法：凝集性を示さない上面ビール酵母 Saccharomyces

フロー代謝が働いていると考えられた．グリオキシル酸

cerevisiae Y6 株を胞子形成させ,胞子を分離し,凝集性経路欠損株では pdc の転写量がさらに増大しており,細を調べた．NewFlo タイプ凝集性を示す胞子分離体 Y6-a5

胞内に蓄積するアセトアルデヒドの毒性により生育阻害株(接合型 a )を分離した．この酵母株と,麦汁発酵性が起こると考えられた．NBRC 3283 では逆に,pdc の発
現はエタノールとグルコース共存時に顕著に低下した．

が良好な酵母株 S. cerevisiae MAFF 113369(接合型 α )NBRC 3283 のゲノムには NBRC 14818 が持っていない

酵母 S. cerevisiae Y6 株のゲノム DNA 配列を,次世代シー

acetate kinase（Ack)- phosphotransacetylase(Pta)経路等,

クエンサー HiSeq2500 で解読し,アセンブリソフトウエ

アセトアルデヒドを経由せずにピルビン酸を酢酸に変換

ア Platanus でアセンブリさせた scaffold を解析し,凝集するバイパス経路の遺伝子があり,代謝によりアセトア性に関与する遺伝子を解析した．

ルデヒドを生成しないために生育阻害が起こらないと予結果・考察：NewFlo タイプ凝集性を示す上面ビール酵母

想 さ れ た． 以 上 の 結 果 か ら, 酢 酸 菌 の 不 完 全 酸化は

胞子分離体 S. cerevisiae Y6-a5 株と,麦汁発酵性が良好な

aarC と aarA の遺伝子発現抑制によって起こり,菌株間

酵母株 S. cerevisiae MAFF 113369 の接合株 S. cerevisiae

におけるグリオキシル酸経路の有無,および,グルコー

Y6-a5/113369 は,良好な麦汁発酵性を示し,NewFlo タ

スからのオーバーフロー代謝経路の違いが,酢酸生産性

イプ凝集性を示した．従って,ビール醸造に適した凝集の違いの原因となることが示された．

性を示す 2 倍体の上面ビール酵母を造成することができを接合させ,2 倍体酵母を造成した．また,上面ビール

た．次世代シークエンサーによる,上面ビール酵母 S.
cerevisiae Y6 株のゲノム DNA 配列解読の結果,第 I 染色体の右腕末端,左腕末端,第 VIII 染色体右腕末端に,－ 132 －

IFO Res.Commun. 31
2017

凝集性に関与すると予想される遺伝子の存在が確認され害剤を最小発育阻止濃度より低濃度で添加した . 培養後,た．現在,第 VIII 染色体右腕末端に存在する遺伝子( Y7-

条件の細菌増殖の速さ及びバイオマス・色素合成を測定

FLO5 )が,NewFlo タイプ凝集性に関与していると推した．続いて,土壌及び海洋由来放線菌 Streptomyces

察している．

avermitilis NBRC 14893, Saccharopolyspora erythraea

DNA 塩基配列から推定されるアミノ酸配列から,Y7-

NBRC 13426, Amycolatopsis orientalis NBRC 12806, Salin-

FLO5 遺 伝 子 で は, 実 験 室 酵 母 S. cerevisiae S288C のispora arenicola NBRC 105043, Salinispora tropica NBRC

FLO5 遺伝子(マンノース添加で特異的に凝集性が阻害

105044 のトリクロサンの最小発育阻止濃度を検討し,される FLO1 タイプ凝集性を示す)と比較すると,アミ各株の対数増殖期に最小発育阻止濃度より低濃度でトリノ酸配列の一致率が 78%で,マンノース認識に関与す

クロサンを添加した．培養後,バイオマス測定及び生理ると推察されている Q98, Q117 は,全て保存されていた．

活性アッセイを行った . 二次代謝産物を抽出し , 混合物

一方,糖質リガンド結合に関与すると考えられている

1のまま,
H NMR 及び HSQC 法により代謝分析を行った．

Flo subdomain(D84 – N110)では,一致率が相当低下し結果・考察：放線菌 S. violaceoruber の液体培養実験のており(一致率 59%),特に C 末端領域では,全く一致

結果,阻害剤添加により赤色色素の産生量は 2 倍に増加

しないことより,このアミノ酸残基の差異が,酵母凝集することが確認できた．興味深いことに,培養期に応じ性の差異に関連していると推察された．

て,阻害剤の添加は増殖及び代謝産物に異なる影響を与えることも明らかにした．トリクロサンを対数増殖期に添加すると,培養開始時に比べ,色素の合成は 58%増

放線菌生体内代謝の超高感度
リアルタイム観測手法の開発と応用加した．
解 析 し た 他 の 放 線 菌 に お い て,Saccharopolyspora

Ulanova Danaerythraea, Amycolatopsis orientalis, Salinispora arenicola

高知大学教育研究部
ulanova@kochi-u.ac.jpの生理活性物質の生産は,今回の実験条件下においてト
リクロサンの影響を受けなかった．一方,Salinispora

目的：放線菌由来二次代謝産物の基質は主に一次代謝産

tropica の場合は,阻害剤を添加した培地でのみ,生理物であり,一次代謝経路と代謝フラックスの制御の理解

活性物質を生産した．又,Salinispora tropica 及び Strep-

が,二次代謝研究の進展に必要である．我々は,核磁気tomyces avermitilis の NMR 解析の結果,トリクロサン添

共鳴分光法( NMR )による,微生物代謝の超高感度リア

加有無の培養に,メチル基と酸素官能基を持つ化合物のルタイム観測手法の開発を目的としている．本研究では,違いを確認した．現在,トリクロサンの添加により,ど放線菌二次代謝の混合物の NMR 解析に適した培養条件のような代謝産物の合成を改変するかを調べている．

の検討に注目した．脂肪酸合成を阻害するトリクロサン

結論として,開発した阻害剤添加アッセイと NMR 解析

により,放線菌二次代謝研究のモデル株 Streptomyces

により二次代謝産物改変の観察ができた．今後は,本手

coelicolor における一次代謝を改変し,二次代謝色素産法を生体内代謝の超高感度リアルタイム観察に応用する物の合成が固体培養で増加することについて報告があことが期待される．

る．この阻害剤を用いて,放線菌の液体培養条件及びNMR 解析条件を検討した．
方法：Streptomyces violaceoruber NBRC 15732( Streptomyces coelicolor A3(2))を培養し,培養開始,対数増殖期,
定常期のそれぞれのフェーズで一次代謝産物の生合成阻－ 133 －

IFO Res.Commun. 31
2017

クタノン 1,2 - モノオキシゲナーゼ遺伝子取得の供試菌に

微生物機能を利用したバイオベース
ポリマー生産系の構築
岩木宏

決定した．これら菌株の codB 遺伝子の塩基配列を決定し,推定アミノ酸配列を機能既知の Baeyer-Villiger モノ

明

オキシゲナーゼのものと比較したところ,両菌株の関西大学化学生命工学部
iwaki@kansai-u.ac.jp

CodB は 共 に Xanthobacter flavus ZL5 株 お よ び Acineto-

目的：植物油由来のポリマー生産系構築に資する遺伝子

キシゲナーゼと最も高い類似性を示した(それぞれを獲得することを目的とした．具体的には,オレイン酸

78%および 61%のアミノ酸一致率)．なお,KU5D5 株からシクロオクタノン,8 - オクタノリドを経由し,ポリと KU2B3a 株の CodB は 96%のアミノ酸一致率を有し( 8 - オクタノリド)を合成する系に資するシクロオクタていた．両菌株の codB 異種発現大腸菌を構築し,CodB

ノン 1,2 - モノオキシゲナーゼ遺伝子,オレイン酸からシの機能を確認した結果,両菌株の CodB ともにシクロオ

クロヘキサンカルボン酸を経て 4 -ヒドロキシシクロヘ

クタノン 1,2 - モノオキシゲナーゼ活性を有していたこ

キサンカルボン酸,4 -ヒドロキシ安息香酸,プロトカテとから,標的遺伝子の取得に成功したものと判断した．

キュ酸,2 -ピロン - 4,6 - ジカルボン酸を合成する系に資

シクロヘキサンカルボン酸分解系遺伝子群の配列を取するシクロヘキサンカルボン酸分解系(芳香族化経路)得するため,約 12-kb の領域の塩基配列を決定した．こ遺伝子群の取得を試みた．

の領域には,chcC 遺伝子だけでなく,シクロヘキサン

方法：シクロオクタノン 1,2 - モノオキシゲナーゼ遺伝子

カルボン酸から 4 -ヒドロキシ安息香酸への変換に関与( codB )は,Baeyer-Villiger 型モノオキシゲナーゼの保すると推定される酵素遺伝子群,制御遺伝子,トランス

存配列をもとに設計した縮重プライマーを用いて部分配ポーター遺伝子が存在した．chcC 異種発現大腸菌を構

列 を 増 幅 後, イ ン バ ー ス PCR 法 で 全 域 を 取 得 し た．

築し,無細胞抽出液の活性を解析した結果,ChcC は 4 -codB の大腸菌異種発現には pET システムを用いた．

ケトシクロヘキサンカルボン酸から 4 -ヒドロキシ安息

bacter sp. NCIMB9871 株のシクロヘキサノン 1,2 - モノオ

シクロヘキサンカルボン酸分解系遺伝子の取得において は,Corynebacterium cyclohexanicum MU 株 を 供 試 菌

香酸への芳香族化を触媒することが明らかとなり,標的遺伝子の取得に成功したものと判断した．

株とした．まず,本菌株のシクロヘキサンカルボン酸分
解経路上の 4 -ケトシクロヘキサンカルボン酸から 4 -ヒ

ゲノム解析結果を利用した清酒酵母の減数分裂における染色体組換えに関する研究

ドロキシ安息香酸への芳香族化を触媒する酵素(芳香族化酵素)の N 末端アミノ酸配列を決定し,その配列をもとに縮重プライマーを設計した．設計したプライマー

下と TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit を用いて,芳香族飯仁

岩手大学農学部
simoi@iwate-u.ac.jp

化酵素遺伝子( chcC )の部分配列を増幅した．chcC 全域および周辺域の取得はインバース PCR 法で行った．
chcC の大腸菌異種発現には,pET システムを用いた．

目的：清酒醸造に用いられている清酒酵母は減数分裂に結果・考察：シクロオクタノン資化性菌からシクロオク

よる胞子形成率が低く,胞子が得られた場合でも発芽率

タノン 1,2 - モノオキシゲナーゼ活性の強い菌株を選択が非常に低いことが知られている．このため,清酒酵母

し,Lutimaribacter litoralis KU5D5 株(シクロヘキシル

では一倍体の作成による交配育種がきわめて困難であ

酢酸分解菌として単離)および Phaeobacter sp. KU2B3aる．しかし,清酒酵母の減数分裂過程のどの部分に欠陥株(シクロヘキサノン資化性菌として単離)をシクロオがあるのかについては不明な点が多く,その解明が待た－ 134 －

IFO Res.Commun. 31
2017

れている．清酒酵母きょうかい 7 号( K7 )で胞子形成

can1 )では胞子形成率が極めて低いため,胞子形成後の転写因子 Ime1 を高発現させると,胞子形成能はかな

65 ℃,20 分間の熱処理を行い,その後カナバニン培地

り回復するが,発芽率はあまり回復しないこと,K7 でで増殖可能で一倍体特有のフェロモン生産能を示す株をまれに得られる一倍体は異数体が多いことから,清酒酵一倍体とした．その結果,異なる 2 種類の親株から得ら

母は減数分裂時の染色体組換えに欠陥があり,その結果れた 15 株及び 18 株の一倍体は,それぞれ同一の遺伝子の染色体不分離によって胞子形成率や発芽率が低下して型( K7-1 株由来の株は ura3 can1,K7-2 株由来の株はいる可能性が考えられた．本研究では,K7 の一倍体 4

URA3 can1 )を示し,組換え型は観察されなかった．

株を次世代シーケンサーを用いてリシーケンスし,ゲノ
ムワイドな染色体組換えを観察した．また,二倍体実験

免疫活性化能と乳化作用を併せ持つ
パン酵母の細胞表層構造解析

室酵母 X2180 及び K7 の同一染色体上に 2 種類のヘテロザイガスな遺伝子マーカーを導入した菌株を作製し,胞東子形成後の組換えの有無を検証した．

雅之

大阪市立大学大学院工学研究科
azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

方法：一倍体のリシーケンスにはイルミナ社の HiSeq2500
を 用 い た． 得 ら れ た リ ー ド を DDBJ Read Annotation
Pipeline を用いて K7 ゲノムにマッピングし,K7 ゲノム

目的：これまでに免疫力を高めることができる新たな機でヘテロザイゴシティーを示す部分の塩基を抽出した．

能性パン酵母の開発を目指し,免疫担当細胞であるマク

また,5 番染色体右腕にある URA3 及び CAN1 の遺伝子

ロファージとの接触により細胞を強く活性化する遺伝子

破壊は clonNAT 耐性遺伝子及び G418 耐性遺伝子をマー

欠損株を取得し,それらの性状解析を進めてきた．強いカーとした相同組換えによって行った．ura3 及び can1活性を示す株の共通の性状として,細胞壁マンナンの減

は 5 -フルオロオロチン酸耐性及びカナバニン耐性によっ

少の他に,酵母と油を混合すると油が乳化する現象が見て調べた．

られ,乳化活性は免疫活性が高い酵母ほど強い傾向を示

結果・考察：K7 一倍体の全ゲノム解析では,染色体組した．マクロファージの活性化と乳化作用の間に相関が換えが正常である場合は親株のヘテロザイゴシティーに示され,乳化は酵母を油と混合するだけで簡便に評価で由来する塩基のハプロタイプが 4 株ですべて異なるが,きることから,実験室酵母の遺伝子ノックアウト株(約染色体組換えが異常の場合は親株と同じハプロタイプが5000 株)のセットを用い,乳化作用を有する酵母のス

2 種類観察されるはずである．解析の結果,二倍体親株

クリーニングを行い,さらに選抜株のマクロファージ活の各染色体に由来すると考えられる 2 種類または 1 種類

性化能を評価してきた . 本研究では,継続してスクリーのハプロタイプしか観察されず,組換え型と考えられる

ニングを行い,さらにこれら選抜株と既存の活性化株をハプロタイプは観察されなかった．この結果は,K7 の用いて,酵母により乳化が生じるメカニズムの解明を進

減数分裂時にはいずれの染色体においても組換えが生じめた．

ていないことを示している．

方法：スクリーニングには,Saccharomyces cerevisiae

ヘテロザイガスな遺伝子マーカーを導入した実験でBY4741(接合型 a の一倍体株)をもとに各 ORF を遺伝

は,まず実験室酵母 X2180( URA3/ura3, CAN1/can1 )子破壊した遺伝子欠損株を使用した．乳化は,試験水溶を胞子形成後,50 個の子嚢について四分子解析を行っ

液にケロシンを添加しボルテックスにより撹拌した後のた．その結果,予想通り約 38%の頻度で組換え型が観様子から目視で判断した．マクロファージ活性化能は,察され,この方法が染色体組換えの検証に有効であるこマウス由来の細胞株 RAW264.7 株を用い,酵母細胞と 6と が 確 認 で き た． 清 酒 酵 母 K7( URA3/ura3, CAN1/

時間接触した後の TNF- α の分泌量を ELIZA によって測－ 135 －

IFO Res.Commun. 31
2017

定しその値から評価した．

誘導されることが示されていたが,リン酸飢餓でオート結果・考察：菌体と油を混合した時に乳化活性を示す遺ファジーが誘導されるかは明らかでなかった．そこで,伝子欠損株をスクリーニングした結果,その候補株とし私たちは出芽酵母を用い,リン酸飢餓で誘導されるオーて 22 株(接合型 a )が選抜された．接合型 α の同遺伝

トファジーの役割とその誘導機構について解析を行うこ子の欠損株の乳化活性,菌体懸濁液( PBS )の遠心上とを目的とした．

清の乳化活性を評価し,最終的に既存の高い乳化を示す

方法：本研究では,遺伝子破壊株ライブラリーの親株とし酵母と同程度の活性を持つ酵母を 5 株選抜した．酵母細て広く用いられている Saccharomyces cerevisiae BY4742

胞自身のマクロファージ活性化能を評価した結果,選抜

株のロイシン,ヒスチジン,リシン要求性を原栄養性にした 5 株中 4 株で野生株より高い活性が見られた．乳化変換した YHY36 株を用いた．各種アッセイに用いるレ現象がマクロファージ活性化株を選ぶ一つの指標となる

ポータータンパク質は URA3 を選択マーカーとするプラ

ことが確認された．4 株中 2 株の欠損遺伝子は,G タン

スミドを導入することにより発現させた(これにより,パク質のサブユニットもしくはそれに関わる因子である

原栄養株となる)．遺伝子破壊には,薬剤耐性遺伝子をと報告されていたが,細胞表層との関わりについての情用いた．酵母株を最小培地( SD 培地)で栄養増殖させ報はなかった．他の 2 株の欠損遺伝子は機能未知であった後,窒素源(硫酸アンモニウム)あるいはリン酸源(リた．今後,これら遺伝子と細胞表層の関わりについてのン酸カリウム)を含まない SD 培地(それぞれ,SD − N,

解析が必要となる．とくに機能未知であった YBL094C

SD − P )で培養することにより,飢餓処理を行った．

欠損株は細胞サイズが大きいことからも細胞表層との関SD − P には差し引いたリン酸カリウムと当量の塩化カリわりが示唆されたため,細胞壁成分マンナン,グルカン,

ウムを加えた．

キチン量を常法に従い測定したが野生株との顕著な違い

結果・考察：リン酸飢餓下で誘導されるオートファジーは観察されなかった．これまでの活性株ではマンナン量(以下,PSiA と省略する)は窒素飢餓で誘導されるオーの減少が共通した特性であったが,YBL094C 欠損株はトファジー(NSiA )と比べて,誘導レベルは著しく低かっ

異なる傾向を持つのかもしれない．また,菌体を PBSた．液胞に貯蔵されたリン酸を細胞質に再分配できないに懸濁するだけで容易に遊離してくる乳化物質の精製を

pho91∆株で PSiA のみが促進されたことから,細胞質の進めたが,同定には至らなかった．そのため,別途乳化

リン酸濃度を感知してオートファジーを誘導することが物質を培養液中に分泌する変異株を用いて培養液中から示唆された．PSiA の誘導には,低リン酸条件に応答しの精製を進めた．

て細胞外ホスファターゼや高親和性リン酸輸送体の転写を活性化する PHO シグナリング経路は関与せず,targetof rapamycin complex 1( TORC1 )シグナリング経路が出芽酵母のリン酸飢餓応答におけるオートファジーの役割とその誘導機構に関する研究
新谷尚

関わっていることが明らかとなった．窒素源飢餓下では,ア ミ ノ 飢 餓 に 伴 う TORC1 の 迅 速 な 不 活 性 化 に よ る
Atg13 の脱リン酸化が,オートファジーの誘導に寄与し弘て い る こ と が 知 ら れ て い る． リ ン 酸 飢 餓 に 伴 っ て,

東北大学大学院農学研究科
takahiro.shintani.d7@tohoku.ac.jp

Atg13 の脱リン酸化が起こることが観察されたが,そのキネティックスは窒素飢餓時より著しく遅かった．この目的：真核細胞は,栄養飢餓に曝されるとオートファ

結果は,リン酸飢餓下でのオートファジーレベルが低い

ジーを利用して細胞成分のリモデリングを行う．出芽酵ことと一致する．一方,PSiA には,これまで非選択的オー

母では窒素源,炭素源,硫黄の飢餓でオートファジーがトファジーには必要でないと報告されていた Atg11 が必－ 136 －

IFO Res.Commun. 31
2017

要であった．Atg11 は選択的オートファジーにおける積た．さらに,感染時に病原菌より分泌されたエフェクター

荷タンパク質と Atg1 や Atg9 を始めとしたオートファゴが宿主細胞内に移行する可能性について検討を加えた．

ソーム形成因子との橋渡しに必要な因子である．積荷結結果・考察：分泌小胞と細胞膜の融合などに関わる合部位を欠いた Atg11 でも PSiA を誘導できることから,

SNARE 分子である SSO1 のオルソログをコードする遺Atg11 は積荷の認識だけでなく,オートファゴソームの伝子をウリ類炭疽病菌において同定し,その標的破壊株形成にも関与することが示唆された．リン酸飢餓下では,を作出した．本破壊株は宿主キュウリへの病原性につい脱リン酸化が不十分な Atg13 の機能を Atg11 が補っていて有意な低下を示した．続いて,エフェクター DN3 とることが考えられた．

mCherry の融合タンパク質を発現するレポーター株に対し,SSO1 遺伝子の破壊をおこなった．SSO1 破壊株の胞子においては,エフェクター分泌の明確な低下が観植物病原菌が病原性タンパク質を植物・微生物間インターフェースに局在させるメカニズム高野

義

察され,本因子が胞子からのエフェクター DN3 の分泌に関わることが示唆された．一方で本レポーター株をキュウリに接種し,侵入菌糸基部周辺のインターフェー

孝ス領域へのエフェクター局在について観察した結果,野京都大学大学院農学研究科
ytakano@kais.kyoto-u.ac.jp

生型株と比較して,SSO1 破壊株においては明確な変化は見られなかった．他の因子についても同様な結果が得目的：多くの植物病原菌は「エフェクター」と呼ばれるられており,これらの結果は,インターフェースへのエ

分泌型の病原性タンパク質を用い,本来発揮されるべきフェクター分泌に特化した機構の存在を示唆した．また,宿主植物の防御反応を抑制している．しかし,このエフェ

DN3：mCherry タンパク質を発現するレポーター株のクターを病原菌がどのように分泌し植物に作用させるの感染部位について共焦点レーザー顕微鏡を用いた詳細なかは不明な点が多い．近年,ウリ類炭疽病菌( Colle-

蛍光観察を実施した結果,インターフェースへの局在を

totrichum orbiculare )を対象とした研究により,付着器

示すリング状の蛍光シグナルに加えて,侵入された植物が形成する侵入菌糸の基部周辺に生じる「病原菌・宿主細胞において mCherry シグナルが検出された．このこ間に形成されるリング状インターフェース領域」にエとは,病原菌から分泌されたエフェクター DN3 の宿主

フェクターが局在・蓄積することが明らかとなっている．

移行についての可視化の可能性を示しており,今後さらさらにインターフェースへのエフェクター局在が低下しに解析を継続していく予定である．

た場合,本病原糸状菌の病原性が顕著に低下することが示され,エフェクターを介した宿主感染戦略におけるイ

省リン型農業実現のための土壌微生物
難溶性リン酸塩資化スペクトルの体系的分析とその資化機構の解明

ンターフェースへの局在の重要性が示唆されている．本
研究では,このインターフェースにおけるエフェクター
局在について研究を実施した．

岡

方法：エフェクター動態がモニターできるウリ類炭疽病

野

憲

司

大阪大学大学院工学研究科
okano@bio.eng.osaka-u.ac.jp

菌のレポーターラインを背景に,分泌経路に関わると推定される候補遺伝子について相同性組換えを利用した標的破壊解析を行い,その破壊株と宿主とのインター

目的：畑地土壌において,肥料として供給されたリンのフェース領域へのエフェクター局在,および破壊株の胞

大半は鉄やアルミニウムなどと結合し,作物が利用でき子細胞からのエフェクター分泌について調査をおこなっない形態で固定される．一方,環境中には難溶性リン酸－ 137 －

IFO Res.Commun. 31
2017

塩を可溶化する微生物の存在が知られる．そこで本研究物の増殖が確認された．従って,本株はグルコースをでは,土壌より難溶性リン酸塩資化微生物を単離し,そAlPO4 の溶解に利用し,ペントースを菌体の増殖に用いの資化機構を解明することで,土壌のリン利用効率向上

ることが明らかとなった．以上のように,土壌微生物のに向けた知見を得ることを目的とした．

有機酸産生には酸素供給や複数の炭素源の供給が重要で方法：大阪大学構内で得た土壌より Ca(PO
(OH)
,
5
4)
3

あることが示唆された．従って,多孔性の土壌改質剤に

FePO4 ,AlPO4 のいずれかの化合物を単一リン源としてよる通気性の向上や,稲わら等炭素を含む有機物の鋤き

含む MOPS 培地で生育可能な株を複数単離した．得らこみにより,難溶性リン酸塩の効率的な利用が可能となれた株を培養し,培養上清の pH,遊離リン酸濃度,有ると考えられる．

機酸濃度の測定を行った．リン溶解能の高い株については 16S rDNA 塩基配列に基づき微生物同定を行った．

エピジェネティックス制御の人為的再制御による微生物生産機能の活性化

結果・考察：リン酸カルシウム溶解株 200 株について培養を行った結果,17 株について pH の顕著な低下が見ら

渡れ,リン溶出量が高い株が多数得られた．pH とリンの

辺

賢

二

静岡県立大学薬学部
kenji55@u-shizuoka-ken.ac.jp

溶出量には負の相関が認められ,最も溶解量の高い株で6.7 mM の Ca(PO(OH) から 15.9 mM のリンの溶出が54)3確認された．いずれの株においても乳酸や酢酸,グルコ

目的：次世代シーケンサーによる DNA 配列解読技術のン酸,酒石酸などの有機酸の生成が認められ,リン酸カ革新により,現在では様々な微生物のゲノム配列を短時

ルシウムは有機酸の生成に伴う pH の低下によって溶解間,低コストにて解読可能になった．その結果,たったすることが示された．FePO4 溶解株についても,リンの一種の糸状菌のゲノム中に数十種類もの天然物生合成遺

溶出量が高い株は pH を低下させる傾向にあったが,有伝子が含まれていることが明らかにされた．ところが,機酸の種類はグルコン酸と 2 - ケトグルコン酸と限定的

実験室内における一般的な培養条件において,実際に代であった．従って,キレート効果のある有機酸が FePO4

謝産物として単離,同定される天然物の数はそれよりもの溶解に重要な役割を果たしていると考えらえる．最も遥かに少数である．近年のトランスクリプトーム解析に溶解量の高かった株( Enterobacter aerogenes と同定)でより,これら天然物生合成遺伝子の多くが不活性化状態,

は,2 mM の FePO4 から約 0.6 mM のリンの溶出が確認

すなわち休眠状態であることが示された．つまり,我々された．本株の有機酸生産は培地中の遊離リン酸や鉄濃は微生物のもつ天然物生産能力のうち,氷山の一角のみ

度には影響を受けず,酸素濃度によって影響を受けるこを利用していたに過ぎないのかも知れない．一方で,ことが明らかとなった．一方,AlPO4 溶解株においてもグのような生合成遺伝子を人為的に制御し,発現させるこ

ルコン酸と 2 - ケトグルコン酸の産生が確認され,FePO4 ととができれば,これまでに発見されてこなかった天然物

同様 pH の低下とキレート効果により溶解していることの獲得が期待できる．そこで我々は,糸状菌の休眠型遺が示唆された．最も溶解量の高い株で 2 mM の AlPO4 よ伝子を人為的に覚醒させることで新規化合物を含む多く

り約 0.8 mM のリンの遊離が確認され,Acinetobacter cal-の二次代謝産物の創製を目的として研究に着手した．

coaceticus と同定された．本株はグルコースを単一炭素方法：Aspergillus niger は工業的に有機酸の製造に用い源として用いた場合にグルコン酸を生成し AlPO4 を溶解られている麹菌の一種であり,既にそのゲノム解読が完するが,微生物の増殖は殆ど見られなかった．一方,キ了している．そのゲノム中には 33 個のポリケタイド合

シロースやアラビノースといったペントースを炭素源と成酵素,15 個の非リボゾーム性ペプチド合成酵素およして用いた場合,グルコン酸の生成は確認されず,微生

び 9 つのポリケタイド – ペプチドハイブリッド型酵素遺－ 138 －

IFO Res.Commun. 31
2017

伝子を有する．我々は,コンピューター上にてこれら天造は単細胞生物から哺乳類に至るまで保存されており,

然物生合成遺伝子クラスターを詳細に解析し,新規天然中でも緑藻の一種 Chlamydomonas reinhardtii は鞭毛を物生合成を担う遺伝子クラスターを推測した．続いて選持つモデル生物として広く用いられている．繊毛の運動

抜した数十種の生合成遺伝子クラスターについて,様々は,モータータンパク質であるダイニンにより駆動されな培養条件にて得た mRNA をもとに,半定量 RT-PCRているが,繊毛の複雑な非対称波を作り出すためには,法によりその転写量の解析を行った．その結果,いくつ

ダイニンの活性を精緻に制御する必要がある．私は過去かの生合成遺伝子クラスターを,いずれの培養条件におに繊毛内での分子間衝突が繊毛運動制御に関わっている

いても転写不活性である,休眠型遺伝子として特定することを示したが,衝突が生じる箇所はダイニンから離れことに成功した．

ていたため,メカノシグナルがどのようにダイニンに伝

結果：選び出した休眠型遺伝子クラスターに含まれる転達されるか不明だった．本研究では,繊毛ダイニンの 1

写因子遺伝子をマルトース存在下にて強制発現可能なグつである外腕ダイニン( Outer Dynein Arm, ODA )と,ルコアミラーゼをコードする glaA 遺伝子のプロモー

ダイニン制御複合体( Nexin-Dynein Regulatory Complex,

ター領域の機能部位の下流へと配置したプラスミドを作

N-DRC )との間に生じると予想される相互作用と,繊製し,A. niger A1179 株へと導入した．PCR 法にて遺伝

毛運動制御の関係を検証した．

子導入を確認した形質転換体について,スターチを含有方法：C. reinhardtii の ODA 中間鎖欠損株 oda6とN-DRC

した培地にて振盪培養を行い,その代謝産物を LC–MS

サブユニット欠損株 ida6 を,それぞれ対応するタンパ

にて解析したところ,コントロール株には認められない,

ク質 IC2,DRC2 にビオチン化タグを付加して表現型回

新たな化合物の産生が確認された．得られた化合物の化復を行った．それらの回復株から鞭毛を単離し,ストレ学構造を解析したところ 5 種の新規化合物 pyranonigrin

プトアビジンで鞭毛内の目的のタンパク質を構造ラベル

F, G, H, I, J および F1 を得た．

した．ラベルした鞭毛の構造をクライオ電子トモグラ

考察：以上のように,我々は糸状菌の 1 種を用いて休眠フィー法により三次元再構成すると,目的のタンパク質型遺伝子を人為的に覚醒させることで新規化合物を含むの場所を同定することが出来た．これらの構造情報に基多くの二次代謝産物の創製に成功した．微生物ゲノムをき,IC2 と DRC2 の近接ドメインに FKBP および FRB タ

読み解くことで,迅速で簡便に新規化合物の探索が可能

グを導入し,ラパマイシンによる化学的二量体誘導でとなることが期待される．

IC2 － DRC2 間の相互作用を人為的に操作可能にした．
結果：三次元再構成により IC2 のアミノ末端と DRC2 の中央ドメインが近接していることが明らかになった．そ緑藻クラミドモナスを用いた繊毛運動制御機構の解明
小田賢

こで IC2 のアミノ末端に FRB タグ,DRC2 の中央ドメイ
ンに FKBP タグを挿入し,ラパマイシンによる IC2 と幸

DRC2 の架橋を試みた．ODA は 600 mM の塩化カリウム
で鞭毛から溶出されるが,ラパマイシンを付加すると東京大学大学院医学系研究科,
現 山梨大学大学院総合研究部医学域
toda@yamanashi.ac.jp

ODA は溶出されなかったことから,ODA と N-DRC が架橋されていることが確かめられた．遊泳状態の C.

目的：繊毛・鞭毛は哺乳類において,左右差の決定,気reinhardtii に対しラパマイシンを与え運動性を測定する

道の異物除去,精子の運動能,卵管内における卵子の移と,IC2-FRB と DRC2-FKBP を発現している細胞は,ラ動,脳室内での脳脊髄液還流など高度な生理現象に関わパマイシン依存的に遊泳速度と鞭毛打頻度が低下した．

る重要な運動性細胞小器官である．繊毛・鞭毛の基本構

考察：私は前研究において,鞭毛軸糸の中心にある微小－ 139 －

IFO Res.Commun. 31
2017

管から伸びる突起が,外側円周上にある微小管上の突起

結核菌 HbN に細胞膜透過能があることが明らかになった．

に衝突することで,モーター活性が制御されることを示

次に,N 末端 11 アミノ酸残基を欠損させた truncated

した．本研究の結果により,上記のメカノシグナルが

HbN を蛍光標識し顕微鏡観察した結果,truncated HbN

N-DRC を介して ODA に伝達されることが明らかになった．

は細胞内にほとんど取り込まれないことがわかった．このことから,結核菌 HbN の細胞膜透過能には N 末端領域が重要であることが明らかになった．また,結核菌

結核菌の表面に存在する酸素結合蛋白質を介した感染メカニズムの解明
若杉桂

HbN と GAG の一種のヘパリンとの相互作用を検討するために,ヘパリンセファロース結合アッセイを行った．

輔

その結果,HbN はヘパリンを固定化したゲルに結合し東京大学大学院総合文化研究科
wakasugi@bio.c.u-tokyo.ac.jp

たが,truncated HbN は結合しなかった．この結果は,細胞膜透過能に GAG の存在が重要であることを示唆し目的：我々は,以前,魚類ニューログロビン( Ngb )に,ており,魚類 Ngb と類似の機構によって細胞質内に導

細胞外から細胞質内に自ら移行する働き「細胞膜透過能」

入されるものと考えられる． さらに,結核菌 HbN の部があることを初めて発見した．また,魚類 Ngb の細胞位特異的アミノ酸置換体を作製し細胞膜透過能に重要な

膜透過能には N 末端領域の 4 つの正電荷を帯びたリジ残基を探索した結果,N 末端領域に存在する 4 つの塩基ン残基が重要であること,さらに,魚類 Ngb は細胞表性アミノ酸 Arg6, Arg8, Lys9, Arg10 が細胞膜透過能に必面に存在する負電荷を帯びたグリコサミノグリカン

須であることが明らかになった．結核菌 HbN は糖鎖修

( GAG )と静電的に相互作用し細胞膜透過することも明飾を受け結核菌の表面に存在することが報告されておらかにした．この魚類 Ngb は細胞膜透過能を持つこと

り,本研究で明らかになった結核菌 HbN の細胞膜透過が明らかになった最初の酸素結合蛋白質である．我々は,能は,結核菌の感染に関与している可能性がある．

さらに,N 末端に塩基性アミノ酸に富む配列を持つ他のグロビン蛋白質を検索したところ,Mycobacterium tuber-

ビフィズス菌がヒト腸内に定着するために重要なスルファターゼ遺伝子の役割の解析

culosis(結核菌)由来のヘモグロビン N( HbN )にそのような配列があることを見い出した．そこで,本研究で加は,結核菌 HbN に細胞膜透過能があるかどうか検証し,その膜透過機構を解明することを目指した．

藤

紀

彦

石川県立大学生物資源工学研究所,
現 京都大学大学院生命科学研究科
tkatoh@lif.kyoto-u.ac.jp

方法：まず,結核菌 HbN 遺伝子を pET-20b に導入し大腸菌発現ベクターを作製した．大腸菌を用いて大量発現させた HbN および truncated HbN 蛋白質を精製した後,目的：ビフィズス菌のヒト腸内への定着・共生には,ヒ脱エンドトキシン処理を行った．HeLa 細胞をガラスボ

トミルクオリゴ糖や食物繊維,あるいは腸管より分泌さトムディッシュに播種し,24 時間後,FITC 標識した蛋

れるムチン糖タンパク質等の糖質源の資化代謝が重要で白質を導入した．その後,緩衝液で 2 回洗浄して生細胞ある．これまで,これら糖質に対して作用する多様な糖のまま蛍光顕微鏡で観察した．

質分解酵素が本菌より単離されているが,ムチンに普遍

結果・考察：まず,結核菌 HbN を大腸菌を用いて大量的に含まれる硫酸化糖鎖に作用する酵素ついては解析さ調製する手法を構築し,次に,蛍光標識した結核菌 HbN

れておらず,また硫酸化糖鎖が資化代謝の対象となるのを HeLa 細胞の培地に添加し,蛍光顕微鏡で観察を行っかについても明らかではない．そこで,本研究においてた．その結果,結核菌 HbN も細胞質内に取り込まれ,ビフィズス菌のムチン硫酸化糖鎖の分解資化能とそれに－ 140 －

IFO Res.Commun. 31
2017

関わると推定されるスルファターゼ関連遺伝子の解析を

限定的発現遺伝子の機能解析による新たな両賭戦略システムの解明目的とした．
方法：保有する 14 種のビフィズス菌株について,ブタ

森

胃由来ムチンの資化能および p - ニトロフェニル β - 6 位

川

一

也

筑波大学医学医療系
morikawa.kazuya.ga@u.tsukuba.ac.jp

硫 酸 化 N - ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン( pNP-β-GlcNAc-6S )の分解様式について検討した．さらに Bifidobacteriumbifidum JCM 7004 株のゲノムについて PacBio RSII 法に

目的：細菌が多様な環境を生き抜いていく際,各々の細よる解読を行った．また,B. bifidum JCM 7004 由来の胞が全て生き残る必要はない．一部の細胞が自然形質転bbhII 遺伝子について,大腸菌にてヒスタグ融合タンパ

換能を発揮して外来遺伝子を獲得したり,発現させる鞭ク質として発現させ,組換え酵素 BbhII の酵素学的諸性

毛タイプを確率的に切り換えて宿主免疫を回避したりす

質について調べた．さらにムチン存在下における本遺伝

る．細胞集団の一部の適応・進化を前提として種の存続

子の発現誘導についても検討を行った．

を図るこのような生存戦略は,「両賭戦略」,「保険仮説」,

結果・考察：ムチン培地における生育試験の結果,B.

「分業」などの概念で理解されている．ここでは,通常

bifidum および B. animalis subsp. lactis にムチンを炭素発現していない遺伝子が一部の細胞で発現する(限定的源としての生育能が観察された．さらに菌体を pNP-β-発現)ことが重要であり,そのメカニズムには Phase

GlcNAc-6S と混合したところ,B. bifidum の 2 菌株におvariation や bi-stability が知られている．

いて 6 位硫酸化 N - アセチルグルコサミン遊離活性を見トランスクリプトーム解析やプロテオーム解析データ

出 し た．B. bifidum JCM 7004 株 の ゲ ノ ム を 解 読 し,

(計 64 条件)によると,これまで黄色ブドウ球菌で発現

BLAST 検索によって 6 位硫酸化 N - アセチルグルコサミが検出されていない遺伝子は 128 個( 88 個の外来遺伝

ン遊離活性の責任遺伝子を探索したところ,bbhII が子と 40 個の黄色ブドウ球菌遺伝子)存在する．我々はPrevotella 由来スルフォグリコシダーゼ遺伝子 sgl と 28%

外来遺伝子を除く 40 個のうちから 20 種類の限定的発現のアミノ酸相同性を示した．そこで組換え酵素 BbhII に遺伝子を見出している．このうちの一つ comGC( DNA

ついて基質特異性を調べたところ,pNP-β-GlcNAc と比取り込み装置遺伝子)については限定的に発現するメカ

べ pNP-β-GlcNAc-6S に 対 し て 400 倍 以 上 の kcat/Km 値をニズムを明らかにして少数の細胞が自然形質転換能を示示したことから BbhII は硫酸化された N - アセチルグル

すことを初めて証明したが,残り 19 種類の限定的発現

コサミンを加水分解するスルフォグリコシダーゼである遺伝子が担う生物学的役割は不明である．本研究ではこことが示された．また BbhII はムチンからも 6 位硫酸化

れら限定的発現遺伝子 esp( espression in minor subpop-

N - アセチルグルコサミンを直接遊離した．さらに bbhII

ulation )の機能を解明することによって,新規な両賭戦はブタ胃由来ムチン存在下において 2 倍程度の発現誘導

略・保険戦略システムを明らかにすることを目的とした．

が観察された．

方法：強度の異なるプロモーター配列を用いることで発以上のことから,ビフィズス菌 B. bifidum は硫酸化糖

現レベルの異なる強制発現用ベクターを 2 種類(高発現用鎖に対して,スルファターゼによる反応よりもむしろ,と低発現用)作製した．各限定発現遺伝子を 2 種類の強スルフォグリコシダーゼによる反応による硫酸化糖の遊制発現プラスミドに組み込み,黄色ブドウ球菌( Staphylo-

離によって,硫酸化糖鎖の分解を促進することが示唆さ

coccus aureus )RN4220 株 お よ び N315 株 に 導 入 し た．

れた．

これらの強制発現株,特に強発現用プラスミド株について,コロニー形態,寒天培地上でのコロニー拡散,各種
薬剤感受性,糖の利用などの各種細菌生化学的特徴,ポ－ 141 －

IFO Res.Commun. 31
2017

リスチレン表面への接着,乾燥耐性度などを調べた．

原理を解明するために,その結晶構造を決定し,立体構

結果・考察：esp17 強制発現が RN4220 の乾燥耐性を上造に基づいた機能解析を行った．

昇させることを見出した．RN4220 株はストレス応答に方法：アーキア由来の Cmr タンパク質を大腸菌内で合重要なシグマ因子 SigB のレギュレーターを欠損してお成し精製した．crRNA およびそのガイド配列と相補的り比較的乾燥に弱い．一方,esp17 を N315 で強制発現な RNA または DNA は市販品を購入した．Cmr 複合体

させても乾燥耐性化は見られなかった．N315 は通常のを再構成し,crRNA 依存的な RNA 分解活性を測定した．

乾燥耐性度を示す株である．このことから,本菌は複数再構成した Cmr 複合体を結晶化し,Photon Factory にの乾燥耐性メカニズムを補完的に備えており,esp17 はおいて回折データを得た．MR-SAD 法により,結晶の位ひとつのバックアップシステムを担う可能性が考えられ相を決定し,Cmr 複合体の原子構造モデルを構築した．

る．乾燥耐性は本菌がヒト表層環境で生存し,またヒト

このモデルに基づいて生化学的実験を行った．

からヒトに伝播するためにも重要な特質であるが,実は結果：再構成実験の結果,5 つの Cas タンパク質( Cmr2

そ の メ カ ニ ズ ム は ほ と ん ど 明 ら か に な っ て い な い．

~ Cmr6 ) と crRNA か ら な る 複 合 体( Cmr1-deficient

esp17 による新たな乾燥耐性メカニズムについて今後明Cmr 複合体：CmrΔ1 複合体)が,crRNA のガイド配列

らかにしていきたい．

と相補的な標的 RNA を切断することが判明した．次に,
標的アナログ(標的 RNA と同じ配列をもった一本鎖DNA )と結合した CmrΔ1 複合体の結晶構造を解析した．

外来遺伝子の発現を抑制する CRISPR-Cas
エフェクター複合体の機能構造解析
沼田倫

CmrΔ1 複 合 体 は,Cmr4 を 3 分 子,Cmr5 を 2 分 子, それ以外のサブユニットを 1 分子ずつ含んでいた．crRNA

征のタグ配列は Cmr3 により特異的に認識されていた．ま産業技術総合研究所
t-numata@aist.go.jp

た,標的アナログは crRNA のガイド配列と 2 本鎖を形成していたが,Cmr4 が 6 塩基周期で 2 本鎖の間に入り

目的：CRISPR-Cas 系は原核生物における獲得免疫系と込んでいた．このため,Cmr 複合体は,crRNA の 5’ 側

して機能する．ウイルスに感染すると,原核生物はウイから数えて一定距離( 14, 20, 26 番目)にある塩基対合

ルス核酸の一部をゲノム上の CRISPR 遺伝子座に組み込の形成を周期的に阻害し,標的 RNA の形を 3 ヶ所で不み,ウイルスの感染をゲノムに記録する．同じウイルス

安定化させることが分かった．生化学的な解析の結果,に再感染すると,この遺伝子座から crRNA が合成され,Cmr 複合体はこれら 3 ヶ所のリン酸結合を周期的に切断

Cas タンパク質と会合してエフェクター複合体を形成することが明らかとなった．

し,ウイルス核酸を分解する．エフェクター複合体は,考察：構造解析の結果,Cmr 複合体が I 型エフェクター

Cas タンパク質の種類により 3 つの型に分類される．III

複合体の立体構造と類似することも判明した．I 型エフェ型エフェクター複合体である Cmr 複合体は,6 種類のクター複合体は DNA を標的とするが,それ自身に DNA

Cas タンパク質( Cmr1 ~ Cmr6 )と crRNA から構成さ分解活性は無く,リクルートされた Cas3 が二本鎖 DNAれている．crRNA は 5’ 側に 8 塩基のタグ配列( crRNAを切断する．このように,I 型および III 型エフェクターに固有の配列),続いて 31 もしくは 37 塩基のガイド配複合体は,類似した仕組みで標的を認識するが,全く異列(ウイルス核酸に由来する配列)をもち,Cmr 複合なる機構で標的を分解する．したがって,両者は共通の体はガイド配列と相補的な外来 RNA を切断する．しか祖先型複合体から派生し独自の進化を遂げてきたと示唆しながら,Cmr 複合体が標的 RNA を捕えて分解する仕された．

組みは不明であった．本研究では,Cmr 複合体の作動－ 142 －

IFO Res.Commun. 31
2017

から RNA を単離し,DNA マイクロアレイを行った．

微生物の中枢神経系への侵入経路
およびその分子機構の解明
村上正

結果・考察：L. monocytogenes を腹腔内投与後,CNS 各
部位でのリステリアの存在量を定量的 PCR にて解析し晃

た．その結果,大脳皮質,中脳,小脳や脊髄 L1 部位に北海道大学遺伝子病制御研究所
murakami@igm.hokudai.ac.jp

比較して,L5 部位に有意に高いリステリアの存在を認

目的：微生物には中枢神経系( CNS )へ感染し,脳髄L. monocytogenes の場合のような L5 選択性を示さなかっ膜炎を発症させるものがある．しかし CNS は血液脳関

た．L5 血管の特殊性を分子レベルで明らかにするため

門によって保護されており,物質の出入りは厳密に制御に,正常マウスから L1 および L5 背側血管を単離し,されている．それにもかかわらず,どのように微生物がDNA マイクロアレイを行った．リステリアの組織への

CNS へと侵入するのかは不明である．我々は,慢性炎

侵入は,肝細胞増殖因子受容体 c-Met と E カドヘリンに症性疾患の発症機構の解明を研究する過程で,第 5 腰髄

主に依存している．c-Met は炎症回路の標的遺伝子であ( L5 )の背側血管において,免疫細胞を引き寄せるケモ

り,DNA マイクロアレイの結果からも実際に L5 背側血カインが,他の脊髄部分に比べて非常に多量に存在する管で発現増強していた．阻害薬にて c-Met 機能を阻害すことを報告している．この L5 でのケモカイン発現の誘ると L5 部位への L. monocytogenes の存在が変化するこ

導は,重力からの感覚神経の活性化が交感神経の活性化とが判った．これらの結果は,L. monocytogenes が CNSを招き,L5 背側血管でノルアドレナリンが放出するこ

侵入に重力ゲートウェイ反射という宿主生体応答を利用とによって L5 血管内皮細胞が NF-kB および STAT3 依

していることを示しており,c-Met 阻害剤が L. monocy-

存的に活性化すること(炎症回路)が原因であることを

togenes の CNS 重症感染を防ぐ手段となる可能性を示唆見出している．このような局所神経刺激による特異的血している．

めた．一方で,N. meningitidis,S. pneumoniae,HSV2 は,管機能の変化を「ゲートウェイ反射」,とくに重力による L5 背側血管の機能変化を重力ゲートウェイ反射と呼び,研究を進めている．この L5 背側血管の特殊性が微バクテリアの光環境応答学の開拓

生物の CNS への侵入にも関与するか否かをリステリア

笠菌( Listeria monocytogenes )を用いて検討したところ,

原

賢

洋

立命館大学生命科学部
kasa@sk.ritsumei.ac.jp

リステリア菌全身感染後の CNS では L5 にのみ菌が検出された．このことは,微生物の CNS 侵入に宿主生体応答が利用されていることを示唆している．本研究では,

目的：ゲノム解析の急速な進行により,多くのバクテリ

微生物の CNS 侵入経路を明らかにし,その分子機構のアが光受容体を持つことが明らかになってきた．特に,解明を目的とした．この研究により,微生物による健康

光合成せずに増殖する多くのバクテリアも光受容体を持被害を抑制する神経系を介した新たな方法の開発へと繋

ち,光環境が増殖に影響を及ぼすと考えられ興味深いが,がることが期待される．

実際にどのような生理現象に光が関与するのかはほとん

方法：C57BL/6 マウスに L. monocytogenes ,Neisseria

ど分かっていない．バクテリアの光環境応答の全容を明

meningitidis,Streptococcus pneumoniae,herpes simplex

らかにしていくことを目指し,Novosphingobium aromat-

vius（HSV)
2 を全身感染させ,その後,脳や脊髄の各部

icivorans が持つ光受容体 LOV − ヘリックス - ターン - ヘ位を単離し,qPCR によって感染させた微生物のゲノムリックス( LOV-HTH )の生理機能を明らかにすること

DNA を検出した．正常マウスの L1 および L5 背側血管を目的とした．

－ 143 －

IFO Res.Commun. 31
2017

方法：生化学的解析で決定した N. aromaticivorans LOVHTH の DNA 結合配列モチーフをゲノム DNA 配列から検索し,相同性の高い配列をプロモーター領域に持つ遺伝子を抽出した．青色光照射した細胞から RNA を調製して逆転写後,候補遺伝子の mRNA 量をリアルタイム
PCR で定量し,青色光で mRNA 量が増加する遺伝子を探索した．
結 果・ 考 察：123 遺 伝 子 を 調 べ た と こ ろ,Saro1759,
Saro1229,Saro1230,Saro3053 の 4 遺伝子の mRNA 量
が青色光照射で顕著に増加した．Saro1759 は紫外線でDNA に形成されるピリミジン二量体を修復する光回復酵素遺伝子,Saro1230 は光回復酵素に結合するアンテ
ナ色素の合成経路の GTP シクロヒドロラーゼ遺伝子であった．Saro1229 は機能未知の酸化還元酵素遺伝子であるが,Saro1230 のすぐ下流に位置し,オペロンを組むと予想されたため,アンテナ色素合成に関わると考えられた．LOV-HTH を介する光回復酵素生合成の光調節機構の存在が明らかとなった．植物や菌類でも光回復酵
素遺伝子の発現が光で調節され,植物ではクリプトクロ
ム,菌類では WC-1 が光受容体であることが分かっている．異なる光受容体が関与することから,光回復酵素遺伝子発現の光調節機構は,それぞれの生物種が収斂的に獲得した光環境応答機構であると考えられる．これは,光回復酵素遺伝子発現の光調節機構が,N. aromaticivorans のみならず多くの生物が,地球環境で生きるための重要なしくみであることを示しており,他のバクテリ
アも同様の調節機構を持つと予想できる．Saro3053 はfasciclin をコードし,N 末端のシグナル配列からペリプ
ラズムに局在することが予想された．Fasciclin は細胞間接着や光酸化ストレス応答など多様な働きが報告されている．N. aromaticivorans で fasciclin の機能や光で発現調節される生理的意義は不明であるが,短時間の青色光照射が N. aromaticivorans の増殖を阻害することが分かり,この現象との関連などを検討し,fasciclin が関与す
るバクテリアの光環境応答機構を明らかにしていきたい．

－ 144 －

発酵研究所助成研究報告第 31 号【非売品】

平成 29 年 12 月 10 日 印刷
平成 29 年 12 月 20 日 発行
編集委員長
編集委員

発行人
発行所

印刷所

中瀬 崇
伊藤忠義,熊谷 英彦,阪井康能
左子芳彦,下田 親,徳増征二
坂野 勲,横田 明
樽井直樹
公益財団法人発酵研究所
大阪市淀川区十三本町 2 丁目 17 番 85 号
TEL. 06 － 6300 － 6555
FAX. 06 － 6300 － 6814
日本印刷出版株式会社
大阪市福島区吉野 1 丁目 2 番 7 号