topics

CHROMATOGRAPHY, Vol.33 No.2 (2012)

Topics

生体試料中薬物濃度分析（バイオアナリシス）の歴史と国内情勢
富樫一天

The history of regulated bioanalysis and circumstances in Japan
Kazutaka Togashi
Pharmaceutical Business Division, Pharmaceutical Analysis Osaka Laboratory, Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.
1−135, 3−chome, Kasugade−naka, Konohana−ku, Osaka 554−0022, Japan

Abstract
This is a topical report for the Bioanalytical Method Validation (BMV) on a quantification of drugs in biological matrices such as plasma,urine, or tissue. Bioanalysis is performed in pharmacokinetic, toxicokinetics and bioequivalence studies and the results are used for the criticalpharmacokinetic information. The purpose of this report is to represent the world history of the bioanalysis for the small molecules and, as recent topics, the global harmonization on regulated bioanalysis by Global Bioanalysis Consortium and the draft guideline on BMV in Japan
prepared by Japan Bioanalysis Forum.
Keywords: regulated bioanalysis, bioanalytical method validation (BMV), Global Bioanalysis Consortium (GBC), Japan Bioanalysis Forum(JBF), LC/MS/MS

た今、国際調和という新たな変革期を迎えている。本稿ではじめには、バイオアナリシスについて簡単な解説をするとともに、生体試料中薬物濃度測定（バイオアナリシス）に関する議

日本を取り巻く国内外の状況について紹介したい。

論の元年はいつかと問われたなら、バイオアナリストであれば、それは１９９０年アメリカで開催されたクリスタルシティーⅠ会議だと答えるに違いない。９０年代当初と比べて IT の恩１．生体試料分析（バイオ ア ナ リ シ ス）バ リ デ ー シ ョ ン

恵を受けた今の世の中は格段に便利になった。バイオアナリ（Bioanalytical method validation, BMV）

シスの世界においても、科学の進歩は分析技術の発展に寄与

バイオアナリシスとは、医薬品開発における非臨床（動物し、高度な分析技術は医薬品開発の推進に大きく貢献した。

等）および臨床試験（ヒト）から得られる血漿、尿および組Regulated bioanalysis（規制下バイオアナリシス）という言葉

織片等の生体試料を対象とした生体試料中薬物濃度測定のこがある。バイオアナリシスの規制ガイドラインに関わる議論とである。これらの薬物濃度測定は、開発医薬品の体内挙動における大きな変化は、ほぼ１０年単位で訪れ、２０１０年を過ぎ（吸収、分布、代謝、排泄）を知る上でたいへん重要であり、株式会社住化分析センター医薬事業本部ファーマ大阪事業所〒５５４―００２２ 大阪府大阪市此花区春日出中三丁目１―１３５
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薬物動態（Pharmacokinetic, PK）試験、トキシコキネティク

医薬品開発に関する規制の歴史は、１
９６０年代以降、薬害とTK）試験および生物学的同等性（Bio-ともに始まったと言って過言ではない。世界各国で起きたサequivalence, BE）試験等、化合物スクリーニングから開発スリドマイドやスモンといった深刻な薬害事件を背景に、１９７０

テージおよび医薬品承認後の市販後調査まであらゆる段階に年代後半から Good laboratory practice（GLP）が非臨床試験おいて必要とされる。各種試験から得られる実試料測定（検（動物試験等、とくに安全性試験）のデータの信頼性を確保

体測定）の実施前には、濃度測定法の開発が必要であり、開するための実施基準として導入されるようになり、１９８０年以発された濃度測定法の妥当性を実証するためにバリデーショ降からバイオアナリシスの品質管理方法等についても次第にンの実施が必要となる。バリデーションにおいては、測定値確立されていった。バイオアナリシスの測定に用いられる機（定量値）の再現性データや実試料の取り扱いに関する安定器は、１９８０年代では、LC に紫外吸光度検出器（Ultraviolet,性データを取得し、得られた結果をあらかじめ設定された判UV）、蛍光検出器（Fluorescence, FL）を組み合わせたものや定基準に照らし合わせることにより、その濃度測定法の妥当ガスクロマトグラフ（Gas chromatograph, GC）に質量分析計性を保証する。

を組み合わせた GC/MS 等が主流であったが、１９９０年代以ス（Toxicokinetics,

バリデーションにおいては、通常、測定対象物質（未変化

降、LC/MS および LC/MS/MS の台頭によりバイオアナリシ

体および代謝物等）を溶媒に溶解した標準溶液を調製し、そス技術は急激な躍進を迎えることとなる。とりわけタンデムれを生体試料（マトリックス）に添加する、いわゆる添加試

トリプル四重極型質量分析計は、プリカーサーイオンとプロ料を用いて、添加検量線および品質管理（Quality

ダクトイオンの二つのマスフィルターによる Selectedcontrol,reac-QC）試料の測定を実施することで分析法妥当性を担保できtion monitoring（SRM）検出の選択性の高さから、従来の測るようなデータを取得する。一般的には、添加検量線は調製定法と比べ、生体試料中の夾雑物ピークと測定成分との分離直後のフレッシュな試料を用い、各種安定性等の確認操作をに長い分析時間を必要としないため、格段なハイスループッ実施した QC 試料について、除タンパク法、液―液抽出およト化につながり、低分子のバイオアナリシスといえば、LC/び固相抽出法といった前処理を施した試料を用いて測定値のMS/MS による定量がもはや定番となった。しかしながら、確認を行い、調製既知濃度（理論値）と乖離がないことを一方で、選択性の高さゆえクロマトグラム上には現れない夾もって安定性や再現性の確認を行うものである。なお、バリ雑物の影響等により測定結果に疑義を生ずるような現象が確

デーション時において使用されるマトリックスは特別な理由認される等、新たな議論を巻き起こしてきたことも無視できがない場合は、正常コントロール（いわゆる健常人等）としない。
１９９０年代以降、欧米ではバイオアナリシスに関する公式なて採取された試料を用いることがほとんどであり、測定対象場においての議論が盛んに行われるようになった。１９９０年１２

物質が含まれていないマトリックスを用いる。
一般的に実施されるバリデーション項目とその実施内容に月にアメリカ合衆国クリスタルシティーで American Associa-ついてまとめたものを表１に示す。これら以外にも目的に応

tion of Pharmaceutical Scientists / Food and Drug Administration

じて、血液中の安定性や溶血血漿の影響確認等を追加項目と（AAPS/FDA）の会議（通称クリスタルシティーⅠ）が開かしてバリデーションを実施する場合があり、その実施方法やれ、その会議の内容をまとめた Shah の論文[2]がバイオアナ確認の要否についての議論が業界内で現在も進行中である。

リシス規制のベースとなった。それから２０００年１月のクリス

２．バイオアナリシスの歴史[1]れたガイダンス[3]により、BMV に関する主要項目は確立さ

タルシティーⅡ会議を経て、２００１年に米国 FDA から発表され、バイオアナリシスの世界標準として、PK、TK、BE 試

バイオアナリシスの対象は、低分子と高分子に大別され、験等の申請データに用いられるようになった[4]。

低分子測定には液体クロマトグラフ・トリプル四重極質量分
析計（Liquid chromatograph−triple quadrupole mass spectrome-

その後、２００６年５月のクリスタルシティーⅢ会議を経て発ter、LC−MS/MS）等のクロマトグラフィー技術が、高分子表された White paper[5]では、Incurred sample reanalysis（ISR）

測定には Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay（ELISA）やという新たな概念が盛り込まれ、バイオアナリシス業界に大Electrochemiluminescence immunoassay（ECL）といった免疫きな衝撃が走ったことは記憶に新しい。ISR とは、実試料を学的測定法、いわゆるバインディングアッセイ技術が用いら（別の日に）繰り返し分析することで分析法の堅牢性を検証れる。BMV に関する議論については、低分子測定に関してする方法である。バリデーションはあくまで標準溶液をマトはすべての議論項目に対して、かなり議論が進んではいるリックスに添加した QC 試料による擬似サンプルによる確認が、いまだ合意が得られていない項目も多い。今後はさらににすぎない。一方、実試料には前述のように、代謝物等の存高分子測定やバイオマーカーといった分野への議論の展開が在が考えられる他、疾病患者の場合、明らかに正常コント見込まれる。なお、本稿においては、以下 LC/MS/MS を用ロールとはマトリックスの性状も異なることも多い。食生活

いた低分子測定のバイオアナリシスについてのみ言及するこ

習慣の違いによっては、マトリックスに人種差が影響することとしたい。とも考えられる。このため、実試料を用いて分析法の堅牢性―１０８―

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表１

Kazutaka Togashi

バリデーション実施項目と実施方法並びに判定基準

バリデーション項目および内容

実施方法および判定基準

選択性（Selectivity）：各分析対象物質及び内標準物質の定量に対する妨害作用がないことを確認少なくとも６個体から得られた個別のブランク試料（分析対象物質や内標準物質を添加せずに前処理するマトリックス試料）を用いて評価。
ブランク試料において妨害物質に由来するレスポンスが認められないか、若しくは妨害物質に由来するレスポンスが、定量下限における分析対象物質のレスポンスの２０％以下および内標準物質の５％以下。

定量下限（Lower Limit of Quan- 定量下限における分析対象物質のレスポンスが、ブランク試料のレスポンスの５倍以上であtification, LLOQ）：分析対象物 ること。定量下限における平均の真度は理論値の±２０％以内、精度は２０％以下。
質を定量することができる最も低い濃度検量線（Calibration curve）：分 マトリックスに既知濃度の分析対象物質を添加して作成され、ブランク試料、ゼロ試料（内析対象物質の濃度とレスポンス 標準物質を添加したブランク試料）及び６濃度以上で構成される。
検量線の各濃度の真度が、定量下限において理論値の±２０％以内、他濃度において理論値のの関係±１５％以内であり、全ポイントの７５％以上かつ、定量下限及び検量線の最高濃度を含む少な
くとも６濃度が判定基準にあること。
精 度（Precision）：繰 り 返 し 分 QC 試料を分析することによって評価。検量線の定量範囲内で、最低４濃度（定量下限，低析によって得られる定量値間の 濃度，中濃度及び高濃度）の QC 試料で評価。各濃度あたり少なくとも５回の繰り返し分析をすることによって評価。分析単位間の精度は、少なくとも３回の分析単位を繰り返し分析一致の程度することによって評価。
各濃度における定量値の精度が、定量下限で２０％以下、他の濃度で１５％以下。
真 度（Accuracy）：測 定 対 象 物 評価方法については精度と同様。
質の測定値と真の値の差各濃度における平均の真度が、理論値の定量下限で±２０％以内、他濃度で±１５％以内。
マトリックス効果（Matrix Effect）：分析対象物質のレスポンスが試料中のマトリックス由来成分によって影響を受けることマトリックス存在下での分析対象物質のレスポンスを、マトリックス非存在下でのレスポンスと比較することによってマトリックスファクター（MF）を算出。MF の算出には、少な
くとも６個体から得られた個別のマトリックスを用いる。
MF の精度が、個体間で１５％以下。

回 収 率（Recovery）：生 体 試 料 分析対象物質を生体試料に添加して前処理したときのレスポンスと、ブランクの生体試料をの前処理過程における分析対象 前処理した後に分析対象物質を添加したときのレスポンスを比較。最低３濃度（低濃度，中濃度及び高濃度）において少なくとも３回の繰り返し分析をすることより評価。
物質の回収効率
とくに判定基準を設けないことが多いが、各濃度において再現性があることが望ましい。
キャリーオーバー（Carry Over） 最高濃度の検量線用標準試料を測定した後にブランク試料を測定することにより評価。
：分析装置に残留した分析対象 最高濃度の検量線用標準試料を測定した後のブランク試料のレスポンスが、定量下限におけ物質が次注入の定量値に影響を る分析対象物質のレスポンスの２０％以下及び内標準物質のレスポンスの５％以下。
与えること希 釈 妥 当 性（Dilution integ- 試料中における分析対象物質の濃度を検量線の定量範囲内となるようにブランクマトリックrity）：希釈による分析対象物質 スで希釈し、希釈倍率あたり少なくとも５回の繰り返し分析をすることによって評価。
希釈された試料の平均の真度が理論値の±１５％以内、精度が１５％以下。の定量値への影響確認
安定性（Stability）：試料を採取してから分析するまでの各過程において分析対象物質の安定性が分析対象物質の定量値に影響を及ぼさないことへの保証

溶媒又はマトリックス中の安定性を確認。凍結融解安定性、短期保存安定性（室温，氷冷又は冷蔵等）、長期保存安定性、前処理後試料中安定性を評価。
マトリックス中の安定性は、低濃度及び高濃度の QC 試料で評価。各濃度あたり少なくとも３回の繰り返し分析を、QC 試料を保存する前後に行うことで安定性を評価。各濃度における平均の真度が、原則として理論値の±１５％以内。
標準溶液中の安定性は、最高濃度及び最低濃度付近の溶液で評価。各濃度あたり少なくとも３回の繰り返し分析を行う。

を検証することの必要性が求められたわけである。ISR の議かりしている日本人バイオアナリストにとって ISR は必要論が湧き上がった当初、日本国内の反応はやや冷ややかでないとする意見が圧倒的多数を占めていた。しかし、FDAあった。実試料の測定値の妥当性をその実試料でしか検証で申請の際には ISR は必須であるといったオフィシャルな見きないとする考え方はたしかに正論には違いないが、欧米の解まで聞かれるようになると、国内バイオアナリストたちもISR 失敗事例の多くがヒューマンエラーに起因したことに加考えを改めざるを得なかった経緯があり、現在では国内でもえ、世界水準から見て手先が器用で、しかも品質管理もしっISR の実施はごく一般的となった。昨今、Incurred sample sta-―１０９―

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bility（実試料による安定性の確認）や Incurred sample accu-

３．バイオアナリシスフォーラム（JBF）の誕生と国内バイracy（実試料による測定値の真値確認）といった概念も議論

オアナリシス情勢[8,9,10]
JBF 誕生の背景として特筆すべきは、２０１１年１月に上海でされ始めており、今後の行方から目が離せない状況だ。
paper 以降、米国のみならず欧州やアジア、世界各行われた The 1st Conference in Asia Pacific on Recent Issues in

国で湧き起こった ISR を中心とした議論は、Global Bioanaly-

GLP Regulated Bioanalysis（以下、本稿では、上海バイオア

sisConsortium（GBC）[6]で国際的な議論をするという新たナリシス・アジアンワークショップと略す）の開催であるな潮流につながった。GBC は２０１２年９月までにバイオアナ[11]。アジア初のワークショップが日本ではなく、中国で開リシスに関する国際調和文書の作成を目標とした民間国際団催されたこともショックであったが、そこで紹介されたWhite体である。北米、南米、欧州、アジアの製薬会社および受託

GBC の活動について日本のバイオアナリストたちがほとん機関（Contract research organization, CRO）のバイオアナリス

ど認識していなかったという衝撃は、そのまま日本のバイオトたちが各 Harmonization team（HT）に分かれて議論を進めアナリシス業界の危機であるとして、上海から帰国したワーている。各 HT のテーマ内容を表２に示す。A は、All mole-クショップ参加者たちによって伝えられた。このままでは日cules の略であり、低分子のクロマトグラフィー測定と高分本のバイオアナリシスが世界から取り残されてしまうだけで子のバインディングアッセイ測定の両方を対象としている。

なく、中国やインドといったアジア諸国にも遅れをとってしL は、Large molecules の略であり、高分子のバインディングまいかねない。昨今、日本国内から外資系製薬企業の研究所アッセイ測定を対象としている。S は、Small molecules の略が次々と閉鎖していき、国内製薬メーカーの臨床試験もそのであり、低分子のクロマトグラフィー測定を対象としていほとんどが海外での実施であり、血漿等の薬物濃度測定も海る。２０チームからなる各 HT では、それぞれ１０名前後のバイ外受託機関で実施されるケースが非常に多い。LC/MS/MS 等

オアナリストが各国から集まり、電話会議やメールによる議の新しい分析技術の登場は、バイオアナリシス業界に大きな論を繰り広げている。このような世界の議論の流れに日本が革命と標準化をもたらした一方で、先進国と発展途上国の分乗り遅れてはならないとする危機感の中、バイオアナリシス析技術の差を大きく縮める結果に繋がったともいえる。

フォーラム（Japan Bioanalysis Forum, JBF）[7]は誕生した。
表２

バイオアナリシスのみならず医薬品開発に係わる分析や製Global Bioanalysis Consortium（GBC）における Harmonization Team（HT）のテーマ

Harmonization teams focusing on topics which apply for both chromatography based assays and ligand binding assays (All molecules)
A1

Scope and regulations

A2

Tiered approaches to method validation

A3

Method transfer, partial and cross validation

A4

Reference standards and reagents

A5

Sample management

A6

Stability

A7

Repeat analysis and ISR

A8Documentation

A9

Analytical instrument qualification

A10

New frontiers

A11

Biomarkers

Harmonization teams focusing on topics which apply for chromatography based assays (Small molecules)
S1

Small molecule − Specific run acceptance

S2

Small molecule specific assay operation

S3

Chromatographic run quality assessment

Harmonization teams focusing on topics which apply for ligand binding assays (Large molecules)
L1Run acceptance

L2

Large molecule specific assay operation

L3

Assay formats

L4Reagents and their stability−Link with tiered approach

L5Automation practices in LM bioanalysis

L6Anti−drug antibody (ADA) Interference of PK assessments―１１０―

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Kazutaka Togashi

造は、かつては製薬メーカーの研究所や工場内でそのすべてられた。BMV 研究班の目的は、BMV の国内における現状を担ってきたが、構造再編による効率化等が進められていく分析と関連する海外規制文書の比較検討であったが、その最中、外部委託という流れが１９９０年代後半より顕著となった。

終目標には日本版 BMV ガイドラインの制定が掲げられた。

とりわけバイオアナリシスにおいては、まさに LC/MS/MS

２０１１年１１月に研究班から指針の作成依頼が提出されるや、技術躍進とともに CRO 事業は拡大したといってよい。国内

JBF 内で結成されたガイドラインタスクフォースは異例の速でも動物試験施設や臨床試験施設といった医薬品開発支援業さで素案を作成し、２０１２年２月にこれを研究班へ提出した。

界のみならず、広範囲に及ぶ分野の受託機関が LC/MS/MS

今後、この JBF 案[13]を、日本製薬工業協会、日本ジェネリッを導入し、バイオアナリシス受託事業に参入したのもこの時

ク製薬協会および安全性受託研究機関協議会等、バイオアナ期であった。そして外部委託が進むにつれ製薬メーカー研究リシス業界に関与する各種団体でレビューを進めると同時に所内にあったバイオアナリシスという仕事もその技術とともBMV 研究班での議論を反映した指針ドラフト版を発表するに CRO へとアウトソースされていったのである。医薬品開予定である。

発費における外部委託費が嵩み始めると、それを節約しようおわりにと考える国内製薬メーカーは、次第に海外施設への委託を検討するようになった。それでも２０００年当初は、言語の壁や時世界的な議論からやや遅れを取っていた日本のバイオアナ差の問題もあり、日本の受託機関に対する技術や品質においリシス業界が、JBF 設立や GBC への参加により、ようやくて、国内製薬メーカーからの信頼もまだ根強かった。しか世界に追いつつある。技術面において、必ずしも世界に立ちし、２０１０年前後より海外受託機関の利用が急速に伸び始め遅れてはいない日本のバイオアナリシス技術が、世界市場かた。それには海外受託機関が国内のそれと比べ半値以下といら取り残されないためにもこうした世界の議論へ積極的に参う低コストに加え、海外受託機関において前処理ロボット導加していくことこそが重要であることはいうまでもない。莫入による自動化やラボラトリー情報管理システム（Labora-

大な医薬品研究開発費や期間を節約するために、海外で臨床

tory information management system, LIMS）導入によるデータ試験を行い、そのまま濃度測定も海外で実施されるケースは処理等の IT 化により品質が大きく向上したことも一因と考近年急激に増えつつある。着実に技術力をつけ、自動化や ITえられる。

化の進んだ海外受託機関とのコスト競争は、国内受託機関の上海バイオアナリシス・アジアンワークショップが開催さ存在を脅かしている。こうした状況下で、日本のバイオアナれた２０１１年１月当時、日本にはまだバイオアナリシスを議論

リシス業界が目指すべき活路は、アジアにおける日本、世界する公式な場はなかった。それが GBC への参加に乗り遅れにおける日本として何を発信していけるかに懸かっている。

た原因であったことに危機感を募らせた発起人たちは、２０１１

今後、JBF の活動の場が、世界に大きく発展していくことを年３月 JBF 設立に向けて本格的な検討を開始した。JBF 設立強く願っている。の準備と同時に日本バイオアナリストたちによる GBC へのアプローチが急速に進められた。慶応義塾大学薬学部の黒川引用文献

達 夫 教 授 が JBF 代 表 と し て 日 本 唯 一 の GBC−SC（Steering[1]

Global Bioanalysis Consortium Members（翻訳：工藤忍），Pharm Tech Japan 2012, vol. 28, No. 3, 9(489)−19committee）に加わり、GBC の２０チーム全ての HT に各一名(499).

ずつの日本人が HT メンバーとして採用されるにいたった。
[2]

これは、GBC のようなグローバルな活動に日本人がコミッ

Shah, V. P.; Midha, K. K.; Dighe, S.; McGilveray, I. J.;

トしなければならないという JBF 立ち上げ当初の悲願を見

Skelly, J. P.; Yacobi, A.; Layloff, T.; Viswanathan, C. T.;

事に達成した瞬間であった。その後、JBF は２０１１年８月東京

Cook, C. E.; McDowall, R. D. Eur. J. Drug Metab Pharmacokinet 1991, 16, 249−255.

にて第１回シンポジウムを開催し、２００名もの参加者を迎[3]

え、設立を宣言した[12]。JBF 運営委員会は、産官学のバイ

Bioanalytical Method Validation: Guidance for Industry.

オアナリシス関係者により構成され、低分子および高分子のFDA (May, 2001): http://www.fda.gov/downloads/Drugs/

規制下バイオアナリシス全般を対象としたシンポジウムの開GuidanceComplianceRegulatoryinformation / Guidances /催、国内 BMV に関する議論の活発化、BMV 国際調和の日

UCM070107.pdf[4]

本窓口、国内 BMV 指針案の作成等を活動目的として掲げて井上則子．国内のバイオアナリシスディスカッションの歩み，第一回 JBF シンポジウム発表資料．

いる。
[5]

JBF は第１回シンポジウム終了後、すぐに第２回シンポジ

Viswanathan, C. T.; Bansal, S.; Booth, B.; DeStefano, A. J.;
Rose, M. J.; Sailstad, J.; Shah, V. P.; Skelly, J. P.; Swann, P.

ウムの準備に取り掛った。その間、GBC 日本人 SC が黒川

G.; Weiner, R. The AAPS Journal 2007, 9 (1) Article 4.

教授から株式会社島津テクノリサーチ工藤忍氏へ交代となっ[6]

た他、厚生労働科学研究の一環として BMV 研究班（研究代Global Bioanalysis Consortium (GBC): http://www.globalbioanalysisconsortium.org/

表者：国立医薬品食品衛生研究所大野泰雄所長）が立ち上げ

―１
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[7]
[8]
[9]

25(505)−27(507).

バイオアナリシスフォーラム（Japan Bioanalysis Forum,JBF）: http://www.bioanalysisforum.jp/[11] Dumont, I.; Garofolo, F. Bioanalysis 2011, 3 (7) , 723−731.

Tatsuo Kurokawa. Pharm Tech Japan 2012, vol. 28, No. 3,[12] 大津善明． ぶんせき ，2012, 1, 52.

7(487).

[13] 米山智城；井上則子；立木秀尚；富樫一 天；中 山

Noriko Katori. Pharm Tech Japan 2012, vol. 28, No. 3, 21

聡；工 藤(501)−23(503).

and Medical Device Regulatory Science, “in press”.

[10] Hidehisa Tachiki. Pharm Tech Japan 2012, vol. 28, No. 3,―１
１２―喬；清 水 久 夫；香 取 典 子．Pharmaceutical