Technical Review

Chromatography, Vol.28 No.2 (2007)

Technical Review

超高速液体クロマトグラフィーシステム

TM（Extreme Liquid Chromatography System）の特長とアミノ酸分析への応用
坊之下雅夫，佐藤泰世，宮路敏彦，岩谷敬仁，山口高歩，東館栄，齋藤宗雄

Feature of Extreme Liquid Chromatography System

TM

and Application to Ultra High−Speed Separation of Amino Acids
Masao Bounoshita, Yasuyo Sato, Toshihiko Miyaji, Keijin Iwaya,
Higashidate Sakae, Takayuki Yamaguchi and Muneo Saito
JASCO Corporation, 2967−5 Ishikawa−cho, Hachioji−shi, Tokyo, 192−8537 Japan

Abstract
Ultra high−speed liquid chromatography has become increasingly popular in HPLC. In general, conventional HPLC separation has been performed on columns packed with 5 µm particles. However, conventional HPLC requires a long analysis time and a large amounts of solvents.
In case of ultra high−speed liquid chromatography, shorter columns typically 50 − 100 mm in length and 2 mm I.D. packed with ultra micro−
particles, of which particle size is less than 2 µm, are used. X−LC (extreme liquid chromatograph) offers higher efficiency and sensitivity, andreduction of organic solvents without sacrificing separation efficiency. We outline the new generation HPLC equipment X−LC that can beused for ultra high−speed liquid chromatographic separation. We also discuss the analysis of amino acids using the X−LC system, utilizing a
combination of precolumn derivatization with OPA (orthophthalic aldehyde) and separation on a 2−µm dia C18 column with fluorescence detection.
Keywords: Ultra high−speed liquid chromatography, X−LC, Extreme liquid chromatography, Amino acids, precolumn derivatization, OPA,
preheat−coil, High−Throughput

術的進歩を遂げて現在に至っている．特に１
９６９年にJ.J.Kirk-

１．緒言
液体クロマトグラフィーは，M.S.Tswettがクロロフィルを

landらが開発，発表した表面多孔性充填剤は，当時として分離してから約１
００年経過し，その間にいくつかの重要な技は，高い分離能力を有していた．その後，全多孔性充填剤がJASCO Corporation, 2967−5 Ishikawa−cho, Hachioji−shi, Tokyo, 192−8537 Japan
Tel：0426−46−4109
Fax：0426−60−7513
E−mail: masao.bounoshita@jasco.co.jp―８９―

Chromatography, Vol.28 No.2 (2007)

TMを開発され，高圧送液ポンプや高感度検出器などの高速液体ク

では，弊社超高速液体クロマトグラフィーシステム

ロマトグラフの高性能化とともに，１０µmから年々粒子径が例として紹介する．

小さくなり，現在は３ µm，５ µmが主流となっている．こ２．１ カラム外効果によるピークの拡がりを抑えたシステムのように分離カラムと装置が共に発展しながら，分離分析機

流路の設計器として，医薬，生化学，バイオ，環境，高分子，合成など

超高速液体クロマトグラフィーで得られるピーク容量は，

化学のほとんどの分野を網羅する広い分野で利用され，高速使用するカラムのサイズが内径２ mm，長さ５０mm程度，２液体クロマトグラフィーとして，飛躍的に普及してきた．こµm前後の充填剤粒子径の場合は，数µL〜数十µL程度と少なのような進歩の源は，高速液体クロマトグラフィーが，分離

い．そのため，ピークが通過するカラム管内以外の流路によ性能の向上と分離時間の短縮化，そして，分離した成分の高るバンドブロードニングの発生を抑える必要がある．例えい検出能力（高感度検出，選択的検出，高い同定能力など）ば，インジェクターや検出器のセル，インジェクターからカが常に求められていたためと考えられる．

ラム入口までの配管やカラム出口から検出器までの配管など

近年，２ µm前後の超微小粒子充填カラムとこれらを使用である．超高速液体クロマトグラフィーシステム

TMでできる性能を備えた装置システムが開発，市販され，超高速は，流路の配管は，内径０．
１mmのステンレス配管（高い耐液体クロマトグラフィーとして利用され始めている．

圧性が必要な部分）または，内径０．
０６５mmのPEEK樹脂配管

この超高速液体クロマトグラフィーは，高い線速度領域の（耐圧性が必要ない部分）を使用している．インジェクター

移動相流量でも，高い分離効率を維持したまま，高感度，短から検出器までのボリューム（カラムを除く）は，トータル

時間測定が実現できる手法であり，van Deemterの式から充２０µL以下と少ない．UV検出器のセル容量も２．
０µLと小さ填剤粒子径を小さくすることにより，その可能性は示されてく，高感度検出とピークの拡がりへの対応に適切に設計されいた［１］．しかし，超高圧ポンプ，カラム外効果を最小とている．また，これらの配管の接続部は，小さなデッドボする検出器，バルブ，配管，高速データ処理などを必要とす

リュームも生じないように配管の切断面（接触面）をダイアるため，最近まで商品としては実現していなかった．

モンドカッターにより正確に垂直にカットし，断面を鏡面に本稿では，我々が開発した超高速液体クロマトグラフィー

仕上げている．これらの配管は，配管キットとして弊社からとして，高い能力を活用，実現できるシステムである弊社Extreme Liquid Chromatography System “

供給されている．

TM”の特長と応用例

２．２ 幅の狭いピークを正確に検出できる高速データ出力機
能を備えた検出器を紹介する．

超高速液体クロマトグラフィーでは，溶出するピークは，
ピーク幅１〜５秒程度で溶出する．このような幅の狭いピー

２．超高速液体クロマトグラフィーを実現できるシステム
２ µm以下の微小粒子充填カラムを使用した超高速液体ク

クを正確に検出する必要がある．通常，ピークは，検出器のロマトグラフィーは，５ µm粒子充填カラムと比較して，同応答速度により，その形状に影響を受けることは，すでに知じ分離度を示すクロマトグラムを約１／５〜１／１０，場合にられている．そのため，超高速液体クロマトグラフィーに使

よっては，１／２０程度の短時間で得ることができる．また，用される検出器は，５０から１００ポイント／秒程度の高速サン

カラムの内径を小さくしたセミミクロカラムを用いることにプリングが必要となってくる．Figure 1は，検出器のレスポより，内径４．
６mmのコンベンショナルHPLCで使用するカラ

ンスを変化させたときのピーク形状の変化を示しているデー

ムと同数の検体を測定するときに消費する溶液量と比較する

タである．レスポンスが遅いときは，ピーク形状がゆがみ，と移動相溶液の使用量も１／１０〜１／２０に削減することができカラムがシャープなピークとして分離してもその性能を生かる．さらに，測定に使用する試料注入量も約１／１０程度で同等の感度を得る測定が実現できる能力を備えている．
このような能力を十分に引き出し，実現することができる
超高速液体クロマトグラフは，次のような性能を有する設計が施されていることが必要となる．
１）非常に幅の狭いピーク（ピーク容量が小さい）に対応できる設計，すなわち，カラム外効果によるピークの拡がりを抑えたシステム流路
２）ピークが短時間に溶出するため，これを適確に検出できる高速データ出力機能を備えた検出器
３）微小粒子充填カラムを高い線流速で測定するために必要な高耐圧性能を備えた送液ポンプと試料注入機構と流路
Figure 1. 検出器のResponseの違いによるピーク形状の変化

設計

―９
０―

Chromatography, Vol.28 No.2 (2007)

Masao Bounoshita, Yasuyo Sato, Toshihiko Miyaji, Keijin Iwaya,
Higashidate Sakae, Takayuki Yamaguchi and Muneo Saito（測定条件）
流
量：０．
１，０．
２，０．
４，０．
６，０．
８，１．
０，１．
２mL/min
移 動 相：水／アセトニトリル＝５０／５０
カラム温度：２
５℃
検 出 波 長：２５４nm（X−LCmode，FAST）
実験に使用したカラム：Silica−ODS
粒子径（１．
８，
２．
０，
３．
０，
５．
０µm）
，内径（２．
０または，
２．
１mm）
，
長さ（５
０mm）
サ ン プ ル：Urasil，Benzyl Alcohol，Benzene，Toluene，Ethyl Benzene
混合試料を１ µL injection

Figure 3. 適切な理論段高(H)を維持する流量範囲（１．
８µm充
填剤カラム）

Figure 2−1. H−u曲線作成の測定条件と実測データ例

Figure 4. 充填剤粒子径別カラム圧力と流量の関係
が，どの程度であるかを実測した．Figure 2−1，2−2は，平均
粒子径１．
８，２．
０，３．
０，５．
０µmの充填剤（カラムサイズは，
I.D.２．
１mmφまたはI.D.２．
０mmφ，カ ラ ム 長 さ は５０mm，充填剤のメーカーは異なる．表示したクロマトグラムは，１．
８Figure 2−2. 充填剤粒子径別市販カラムのVan Deemter Plots（実測例）µm充填剤カラム，２５℃の例）にアセトニトリ ル／水（５０／５０）を移動相とする溶離液を送液して，各カラムのH−u曲線

すことができない．従って，データ処理装置にも，同等の高を作成したデータである．このデータから１．
８µmの充填剤

速データ取り込み速度が必要となる．

カラムについて，移動相流量と理論段高さの関係をプロットTMに使用してしたグラフをFigure 3に示す．この結果から，理論段高の最いる検出器は，UV検出器では，１００ポイント／秒，蛍光検出

小値とその２０％程度低下までの流量範囲は，０．
５２〜１．
１mL/

超高速液体クロマトグラフィーシステム

器では，５０ポイント／秒の高速出力に対応し，シャープな

minの流量であることがわかる．Figure 4は，今回実験に使用

ピークに対応することができる．

した各種粒子径の充填剤カラムの流量とカラム圧力を示した

２．３ 微小充填剤カラムを高い線流速で測定するために必要グラフである．Figure 3により示された適切と思われる流量範囲での１．
８µm充填剤カラムの圧力は，４５〜８８MPa程度にな高耐圧設計充填剤粒子径の異なるカラムの分析時の圧力は，その粒子なることがわかった．また，２．
０µmのカラムでも適切な圧径や溶離液の種類，温度などによって異なる．一般的には，

力範囲が３
１〜５２MPa程度になる．今回の実験の溶離液は，カラムの圧力は，流量とカラムの長さに比例し，充填剤の粒

アセトニトリル／水系を使用したが，粘度が高くなるメタ

径の二乗に反比例する．そのため，小さな粒子径の充填剤を

ノール／水系などの場合は，カラム圧力もさらに高くなるこ

充填したカラムは，カラム圧力が高くなる．超高速液体クロとが予想される．
従来から使用している通常のHPLCシステムのポンプは，

マトグラフィーに使用できる２ µm前後の市販の充填剤カラ

５０MPa程度の耐圧性能を有しているが，オートサンプラな

ムは，耐圧性能に優れている．

どのバルブの耐圧性能は，一般的には，３５MPaから４０MPa

これらのカラムの性能を生かすために必要な常用の圧力―９１―

Chromatography, Vol.28 No.2 (2007)程度である．すなわち，従来システムでは，２．
０µmのカラアミノ酸の組成分析は，食品，医薬品分析，タンパク質科

ムでも理論段高さが最小値である適切な流量での使用が，耐学からメタボローム研究など多くの分野で高速液体クロマト

圧性能の限界に近いところでシステムを使用することとなっグラフィーを使用して測定されている．その分析方法としててしまう．これは，ポンプのプランジャーシールの耐久性な利用されている分離，検出法は，プレカラム誘導体化（オルども含めかなり厳しい使用条件となる．このような理由か

トフタルアルデヒド，ダブシルクロライド，ダンシルクロラ

TMの送イド，NBD−Fほか）後，逆相系カラムによる分離，または，液ポンプとオートサンプラは，１００MPaの耐圧性能を有し，イオン交換カラムによる分離後，ポストカラム誘導体化（オ

よく使用される３０〜６０MPaの圧力範囲でも，このような高ルトフタルアルデヒド，ニンヒドリン）による蛍光検出や可性能カラムの性能を余裕をもって引き出せる設計となってい視紫外分光検出など種々の方法が実施されている．

ら，弊社超高速液体クロマトグラフィーシステム

ここで紹介する応用例は，高感度検出が容易にできるオル

る．

トフタルアルデヒド（OPA）によるプレカラム誘導体化法を

２．４ 超高速液体クロマトグラフィーシステムとして便利な採用し，蛍光検出器付の超高速液体クロマトグラフィーによ装備
超高速液体クロマトグラフィーで使用されるグラジェント

るアミノ酸１７成分の高速分離である［３］．分離は，２ µm

溶出法は，高圧混合グラジェントシステムが採用されていの超微粒子を充填したC18カラム（２．
０mm×５０mmL）を用る．この理由は，短い分析時間の中でのグラジェント溶出をいたグラジェント溶出法を行うことによるアミノ酸１７成分の行うため高い追従性が必要とされると同時に迅速な溶媒の切高速分離を検討した．その結果，約７ minで分離することが換時の置換性も高速分離においては，重要な影響を与えるた

でき，従来の５ µm粒子充填カラムでの分析時間３８min（当めである．しかしながら，混合しにくい溶媒やUV吸収が大社比）と比較して，約１／５の分析時間の短縮化を実現し，きく異なる溶媒の混合などが必要な場合もあり，高性能なミさらに溶媒の消費量をグラジェントの再生時間も含めて，約キシングと溶媒置換性能の高いグラジェントミキサが必要となる．超高速液体クロマトグラフィーシステム

１／１０に削減することができた．ここで用いるOPAを使用しTMは，２たプレカラム誘導体化は，オートサンプラ（JASCO

TM

ポンプまたは，３ポンプの高圧混合グラジェントシステムを

3059 AS）の自動プレカラム誘導体化機能を利用している．

組むことができ，ダイナミック方式による高い効率のミキ〔実験〕

サーが接続されている．このダイナミックミキサーは，ミキシステムは，日本分光製

超高速液体ク ロ マ ト グ ラ フ

TM ; Extreme Liquid Chromatograph）を使用した．蛍光シングチャンバーを容易に交換することができ，５
０µLから

（

８００µLまでの各種チャンバーを選択することができるように検出器は，５０data points/secの高速データ出力に対応し，ピー設計されている．

クの拡散を抑えたXLCセルを装備した

3120 FPを接続しそのほか，溶離液の温度をすばやくカラム温度と同じにすた．測定は，和光純薬工業㈱から購入したアミノ酸混合標準

るプレヒートコイル，カラムの耐久性を向上させるためのイ

液Ｈ型と０．
０１mol/Lの塩酸水溶液に溶解したシステイン酸とンラインフィルターなどが用意され，種々の試料および，測トリプトファンを添加し，各アミノ酸が２０pmol/µL濃度に調定条件において便利に利用できる周辺装置が準備されてい製した標準試料を用いて行った．プレカラム誘導体化は，１

る．

%OPA溶液，０．
４Mホウ酸緩衝液（pH９．
０），２−メルカプト
エタノールを０．
５：１：０．
０１に混合した反応試薬溶液２０µLと上３．超高速液体クロマトグラフィーによるアミノ酸分析への記方法にて調製したアミノ酸標準試料１００µLを約３
０秒間混合

応用例

して行った．この誘導体化した標準溶液を

超高速液体クロマトグラフィーを用いて各種試料を測定しシステムに１µL注入し，グラジェント溶出法により分離を行った．分離

た応用例は，多く報告されている．我々は，本誌Technical Re-

および検出条件を以下に示す．

view（２００６年）にて，米国薬局方（USP 27 (2004), Page 1654）〈測定条件〉に掲載されている抗結核薬Isoniazid, Rifampin, RyrazinamideのEluent A: 1.0 M citrate buffer (pH 5.8) 3.5 mL in 1 L of H2O

グラジェント溶出法による短時間測定を報告した［２］．結Eluent B: 1.0 M citrate buffer (pH 5.8) 3.5 mL in 1 L of CH3CN/

果として，従来法による測定時間約９分に対して，１．
４分で

C2H5OH/H2O (30/30/40)の測定が可能となり，約１／７の短時間測定ができ，さらに，

Gradient condition : 1 cycle 10 min

USPに定められている規定値として指定されている分離度R

A:B = 90:10
90:10
72:28
72:28
42:58
0.2 min
2.2 min
2.5 min
4.6 min＞４（Not less than 4）に対して，IsoniazidとPyrazinamide間

42:58
23:77
0:100
0:100
90:10
5.0 min
6.1 min6.15 min
7.0 min7.05 min

でR＝４．
２，PyrazinamideとRifampin間 でR＝３７．
２を 得 ら れ，
規定値を越えることができた．

Flow rate: 0.6 mL/min

今回は，オルトフタルアルデヒドを用いた自動プレカラム

Column: X−PressPak V−C18 (2−µm dia., 2.0 mm I.D. × 50 mm)

誘導体化アミノ酸の高速分離について紹介する．

―９２―

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Masao Bounoshita, Yasuyo Sato, Toshihiko Miyaji, Keijin Iwaya,
Higashidate Sakae, Takayuki Yamaguchi and Muneo Saito

Table 1. Detection limit for 18 amino acid derivatives

Column temperature: 40℃
Detection: Fluorescence; Ex 345 nm, Em 455 nm; Gain × 100

Amino acidCys−SO3
Asp
Glu
Ser
His
Arg
Gly
Thr
Ala

S/N=3
fmol/µL
48.7
40.9
37.3
30.5
37.1
27.2
27.3
30.4
23.7

S/N=3
Amino acidfmol/µL
Tyr
NH3
Met
Val
Trp
Phe
Ile
Leu
Lys

20.9
434.4
23.6
25.7
27.1
24.4
23.5
23.4
21.6

Highly sensitive detection was realized by the use of the fluorescence detector; the detection limit (S/N=3) was between 21 and 49
fmol/µL.

Figure 5. Analysis of standard mixture of 17 amino acids (20pmol/µL each)This analysis was performed under the optimized conditions. Broken line indicates gradient profile (B%).

Figure 7. Analysis of amino acids in red wine
This wine is a cooking wine.

Figure 6. Linear dynamic ranges for 7 amino acid derivatives
This figure indicates linear dynamic range for arbitrary
chosen amino acid derivatives. Correlation coefficients(r) were also calculated for 7 amino acid derivatives
ranging from 0.2 to 20 pmol. Excellent linearity was
obtained.

のアミノ酸誘導体化物の分析結果から算出し，０．
２−２０pmolの間で良好な結果が得られた．蛍光検出器を用いたことで，高感度な検出が可能になり，検出限界値（Ｓ／Ｎ＝３）は２１−
４９fmol/µLと良好な値が得られた（Table 1）．実際の食品に適用した実試料の応用データをFigure 7（赤ワイン），Figure 8〔結果と考察〕TMを用いて標準試料を測定して得られた（アミノ酸を添加した清涼飲料水），γ−アミノ酪酸（GABA）

クロマトグラムである．１７成分のアミノ酸が７分以内に分離などの標準試料を加えた２０種類のアミノ酸の測定例をFigure

でき，５ µm充填剤による従来のHPLCを用いた測定が３８分9に示す．超高速液体クロマトグラフィーに蛍光検出器の利であることから，測定時間を約１／５に短縮することが可能

用が可能であり，逆相系カラムを用いた多成分の短時間高速となった．さらに，溶媒の消費量は，グラジェントの再生時分離に適用できることが確認できた．

Figure 5は，間も含めた１試料の測定あたり，６０mLから６ mLと約１／１０
４．結言に削減することができた．

TMは，つぎの保持時間とピーク面積の再現性は，１７成分のアミノ酸（各

超高速液体クロマトグラフィーシステム

２０pmol）について１０回の連続分析の結果から算出した．そようなコンセプトを基に開発した装置である．

の結果，良好な再現性が得られ，保持時間における相対標準１）超高速・高分離クロマトグラフィーに対応できるシステ

偏差は０．
０４８−０．
４２９%，ピーク面積における相対標準偏差

ム

は０．
５４６−１．
９０%だった．アミノ 酸 誘 導 体 化 物 の 直 線性を

２）多くの分析対象成分の測定に対応できるシステム

Figure 6，検出限界をTable 1に示す．相関係数（r）は７成分

３）コンベンショナルHPLCと同様の使い勝手（高いメンテ―９３―Chromatography, Vol.28 No.2 (2007)

Figure 10. 各種モジュールを組合せて構築したX−LCのシス
テム例
Figure 8. Analysis of amino acids in functional beverage
This beverage contained 9 essential amino acids, i,e.,His, Thr, Met, Val, Trp, Phe, Ile Leu and Lys.

離を行うモノリスカラムについても，カラムの内径を小さくしたセミミクロタイプへの対応が行われ，このようなカラムを用いて得られるシャープなピークの高速分離にも，本システムを適用することができる．
また，超高速液体クロマトグラフィーが，多くの分析対象
成分の測定に対応できるためには，分離においては，各種カラムが開発されることはもちろんである．さらに，検出においては，各種試料の検出や現在実施しているコンベンショナ
ルHPLCで使用している検出器が使用できるようになること
が，その一つの条件となる．紫外可視検出器をはじめとして，蛍光検出器，そして４波長同時検出ができる４−λ紫外可視検出器，さらに光学活性物質の選択的検出ができる円二色性検出器などを利用した例も近いうちに報告できるように

Figure 9. Analysis of standard mixture of 20 amino acids containing GABA (20 pmoL/µL each)
GABA (γ−aminobutyric acid) is an important inhibitory
neurotransmitter in the central nervous system and essential for brain metabolism and function. Asparagine
and glutamine are contained in this standard sample besides GABA. The analysis conditions are the same asshown in Fig. 5.

なる．また，ポンプ（３台），検出器などのモジュールを組み合わせたシステムを構築できるため，３ポンプ高圧混合グ
ラジェントシステムや１ポンプ定組成送液システムなど分析目的に適したシステムを構築し，入手しやすい価格の構成シ
ステムを使用して実験することができる．
今後も種々の超高速液体クロマトグラフィー用カラムの性能を利用できるシステムとして，進化させていくと同時に，
各種アプリケーションの紹介を行い，次世代のHPLCシステ
ムとして，ご利用していただけるよう発展させていきたいと

ナンス性，各種オプションパーツなど）

考えている．

４）コンベンショナルHPLCとしても使用できる．
５）高いコストパフォーマンス

References

このようなコンセプトから，本システムは，つぎのような目的でも使用することができる．通常の分析時間と同じでも[1]

Jorgenson, J.W.; Anal. Chem., 1997, 69, 983

高い理論段数のカラムを使用する測定，すなわち，sub３．
０[2]

Bounoshita, M.; Miyaji, T.; Iwaya, K.; Higashidate,S.; Yamaguchi, T.; Saito, M.; Chromatography 2006, 27, 3, 131µmの粒子径のカラムでも１５０mmや２５０mmという長いカラム[3]を使用する分析などである．この場合，カラム圧力が４０MPa

Sato,Y.; Silverman, C.;, Bounoshita, M.; Miyaji, T.; Oka-

以上と高くなっても本システムにとっては，問題なく使用すmura,K.; Iwaya, K.; Yamaguchi, T.; and Saito, M.;ることができる．また，カラム圧力は，低いままで，高速分

PITTCON 2006 Abstract.

―９４―