Niigata Dent. J. 30（2）：173−182,

2000

173

−総説−
メカニカルストレスにより誘導される骨芽細胞の分化と骨形成
川

島

博

行

新潟大学歯学部歯科薬理学講座／教授

Mechanical stress-induced osteoblast differentiation and osteogenesis
Hiroyuki Kawashima
Department of Dental Pharmacology
Faculty of Dentistry Niigata University
平成12年11月6日受付

11月6日受理キーワード：メカニカルストレス，骨芽細胞分化，骨形成，遺伝子発現，BMP-4

レスに曝された場合には骨形成が増加して高い骨量レベ

１．はじめにルで定常状態に達する，というふうにメカニカルストレ

生物は地上にある限り，1Gという重力に曝されていスによる歪みを感じるセンサーが骨に存在するというのる。この重力が効果を最大に発揮するのは，地上で生物である。骨吸収と骨形成はカップルしているので新しいが行動する場合であり，水中では約1/6程度に減少する。

平衡状態に移行し得るわけである。この場合どちらの方

また，睡眠や休息状態にあるときは，さらに重力の効果

向に移行するにもある閾値を越えることが必要であるは減少し，寝たきり状態やギブスによる固定など，いわ10）ゆる，不動化状態が続く場合には，筋肉や骨格など運動

定以上の運動負荷をかけないと無効である，という具合にかかわる組織の主要部分に対する重力の効果は実質的である。メカニカルストレスによる骨形成の刺激は，骨にゼロに近くなる。すなわち，無重力に近い状況が作り芽細胞の分化および活性化をともなうが，その機構につ出されていることになる。このような状態では，筋肉・いては不明である。本稿では，メカニカルストレスの受骨ともに萎縮するが，このことは，volunteerを用いて

容とその伝達について概観し，その後我々のデータを中

bed rest の状態を強制的に続ける実験によっても確認

心に骨芽細胞分化のメカニズムについて述べてみたい。

。たとえば，運動によって骨形成を刺激するには，一1）されている 。宇宙飛行士の骨量が宇宙滞在中に減少し，帰還一定期間後にはほぼ回復することもよく知られてい２．メカニカルストレスに対する細胞の応答

2,3）る 。骨量は，骨吸収（骨破壊）と骨形成のバランスに

メカニカルストレスに応答する組織は運動骨格系に限より維持されているが，メカニカルストレスの減少によらず生体内に広く分布し，循環器系とくに血管や内皮細る骨萎縮（骨量減少）の原因は主として骨形成の抑制で胞については多くの研究がある。これらの細胞がメカニあることが明らかにされている4,5）。一方，地上においてカルストレスに応答する機序には普遍性があると考えらも，メカニカルストレスを負荷すると骨量が増加するこれるが，どの組織についてもその詳細は想像の域を出なとが良く知られており6-8），この場合にも骨形成が刺激さい。表-１はメカニカルストレスの受容から効果が発揮れることが確認されている。このように，メカニカルス

されるまでの過程を大きく3段階に分けて示したものでトレスの持続的負荷が一定期間内に繰り返されることが，ある。その第一はメカニカルストレスの受容である。

骨の構造と機能の維持に必要であるが，このメカニズムを説明する仮説としてメカノスタット説（mechanostat
9）

theory） なるものが提出されている。これを詳しく述べる余裕はないが，要は，生理的なメカニカルストレスの幅（physiological window）というものがあり，この範囲より低いメカニカルストレスに曝される場合には骨形成が相対的に減少してメカニカルストレスに見合ったところで定常状態に達し，逆に，より高いメカニカルスト

表-１

メカニカルストレスの受容とその細胞機能への変換（1） メカニカルストレスの受容：①細胞外基質−インテグリン-細胞骨格系の変化②細胞膜イオンチャネルの開閉（2）細胞内シグナルへの変換：シグナル伝達分子（表-２参照）（3） 骨形成細胞へのシグナル伝達①骨 細 胞 → 骨芽細胞活性化／骨芽細胞のリクルート②骨芽細胞 → 自身の活性化／新たな骨芽細胞のリクルート

−１−

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変動する分子の種類は，負荷するメカニカルストレスの種類により異なるが，in vivoの実験とin vitroの実験

２-１．メカニカルストレスの受容機構
メカニカルストレスという物理的刺激を受容するため

でほぼ対応する結果が得られている。これらの変化がメには，細胞はstrain（ひずみの応力）あるいはshear
stress（ずり応力），音波（聴覚の場合）等を感知しな

カニカルストレス負荷後比較的短時間（数分から数時間以内）で起こるのに対し， in vivoにおいて骨芽細胞がければならない。刺激が感知されるためには，細胞自身

分化し細胞外マトリックスを分泌するのは3日〜5日後でが感知機構を備えていなければならない。その感知機構

ある17-19）。従って，これらの分子はメカニカルストレスを構成するものは細胞の構造であり，構造を維持するのの受容後のシグナル伝達にかかわっていると考えられてに必要な細胞骨格とこれに密接に相互作用をしている分いる。NOがメカニカルストレスの骨形成作用に密接に子であるはずである。実際，細胞は浮遊状態では球形でかかわっていることは，NO合成阻害剤を用いた実験であるが，細胞外基質に結合すると構造が変化する。これ明らかにされている20,21）。一方，iNOSノックアウトマウ

は細胞自体が内力を持っているからである。その内力をスでは骨の異常は認められないが22），eNOSノックアウ

生み出すのは細胞骨格であり，tensegrityという概念でトマウスでは10％に四肢の末端欠損が認められておりも説明されている11,12）。細胞の基本骨格を作るactin分子

23）はvinculinやtalin，tensin，α-actinin等の分子を介してintegrinと結合するが13），細胞自身の内力により細胞外成作用の有無が興味深い。また，メカニカルストレス負荷による in vivoの骨形成がインドメタシンにより大幅

基質に応力を加えることになる。従って細胞外基質と結に抑制される 24）ことから，プロスタグランジンの関与

合した細胞にメカニカルストレスを感じさせるためにするシグナル伝達系の役割も否定できない。プロスタグ

は，この応力に抗する力，すなわち，細胞骨格の変化あランジンの増加はPLAの活性化の結果であり，PLAのるいは細胞の変位を惹起するような刺激でなければなら活性化はやはり細胞骨格の変化によりもたらされる。培ない。そのような刺激に対応して細胞膜表面の変化ある

養細胞を用いた検討では，骨芽細胞に伸展刺激を与える

いは細胞骨格の変化が最初に起こると考えられる。実際，と細胞内カルシウムの著明な上昇が認められる25,26）。ここのような刺激に対しては，アクチン分子の再重合や配のカルシウムの上昇は，SA channelを介した細胞外の列変化が起こることが知られている

14,15），これらのマウスにおけるメカニカルストレスの骨形。細胞の接着状カルシウム流入やPLCの活性化により産生されたIP 3が態により骨芽細胞の分化や活性化状態に違いが生じるこ小胞体からのカルシウム放出を活性化する機序が考えらとも良く知られている14）。一方，細胞膜の変形や電位変れる。前者は細胞膜の変位あるいは電位変化に続いて起化が膜のチャネルの開閉に影響を与え，これがメカニカこる現象としてとらえることができるし，後者は細胞骨

16）ルストレスの受容機構として作用する可能性もある 。

格の変化の結果と考えることができる。また，cAMPの増加がどのように骨形成にかかわるかは不明であるが，２-２．受容された刺激の化学的シグナルへの変換

メカニカルストレスの負荷により細胞内のcAMPが上昇受容されたメカニカルストレスが細胞の機能に影響をすることが知られており27,28），また，細胞骨格が破壊さ与えるためには，それが化学的なシグナルに変換されなれるとcAMPが増加することが知られている 29,30）。骨芽ければならない。この過程にかかわるのが，いわゆるシ細胞においてIGF-IIを増加させる因子としては，従来

グナル伝達分子である。メカニカルストレス負荷によりBMP-231）やBMP-732）が知られていたが，IGF-IIもメカニ

骨芽細胞において発現量の変化する分子について表-2にカルストレスのシグナル伝達にかかわっている可能性がまとめた。これを見ると，メカニカルストレスによって高い 33）。一方IGF-Iは，骨芽細胞では誘導されないが，変動するシグナル伝達分子あるいはサイトカインは，い骨細胞ではメカニカルストレス負荷後数時間で誘導されわゆるホルモンやサイトカインに応答する分子と基本的る34）。この場合，骨表面における細胞外基質の分泌は48に同じであることが明らかである。

時間後に起こるので 34），骨細胞で産生されたIGF-Iが何らかの機序で骨芽細胞を刺激した可能性は十分考えられ

表-2 メカニカルストレスにより骨芽細胞で変動するシグナル伝達分子
In vivo 実験
c-fos54,55），

TGFβ ，NO
20,21）

iNOS

，

器官培養

c-AMP27,28），
c-fos58），
egr-159），NO47，60），

PGE268），iNOS61），
PGE247，62），
PGI262，63），
PGF2α62），

IGF-I55,56），
55）

培養細胞

20,21）

62）

2+25，26）， COX-2 ，Ca

，IP

64）

，

28）

は，その殆どが他の組織においても共通に認められる現象であり，決して骨芽細胞に特異的なシグナルではない。
従ってこれらは，メカニカルストレスを受容しその信号をシグナル伝達に変換する共通のメカニズムを示してい

27，
64）
3

SA channel ，
PKC ，
PLA2 ，PLCγ ，65）

る。しかし，メカニカルストレスに対するこれらの反応64）ると考えるべきであろう。

PGE224），GLAST57） TGFβ63），PDGF66），IGF-II63），
osteopontin59，67）

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報告している41）。三つ目の例はPTH（副甲状腺ホルモン）

２-３．シグナルから効果への変換である。メカニカルストレスの骨形成作用にかかわる

さて細胞内シグナル伝達系に伝わった情報が効果としPTHの効果に関する報告はないが，不動化による骨量て現れるためには，情報が細胞の機能へと変換されなけ減少が副甲状腺摘除によって抑制されることが報告されればならない。骨の場合には骨形成の刺激である。このている42）。骨細胞やbone lining cellに及ぼすメカニカル

場合，①メカニカルストレスを受容した受容細胞自身がストレスおよびPTHの効果の類似性43），また，骨芽細胞

骨形成に直接かかわるのか，あるいは，②その情報をそのmechanosensitive channelの活性化とそのkineticsにのまま伝える，もしくは，転写等により別なシグナルにおよぼす両者の類似性なども報告されている44,45）。

変換して伝える，ことで骨形成に直接かかわる細胞を活性化し，その結果骨形成が刺激されるのか，という二つ

これらは非常に興味深い問題であるが，いずれも今後に残された課題である。

の可能性が考えられる。前者は骨芽細胞自身がメカニカする場合である。骨細胞および骨芽細胞の休止型細胞と３．メカニカルストレスの骨形成作用に関する従来の研究されるbone lining cellを併せると骨形成系細胞の95％をメカニカルストレスの骨形成作用にかかわる研究は，

ルストレスを受容する場合であり，後者は骨細胞が受容35）占めること ，
ネットワークを形成する骨細胞がfluid flow

動物個体を用いる研究，培養細胞を用いる研究，および，によるshear stressを検知するのに適していること36），な器官培養を用いる研究に分けられる（表-３）。個体を用どの理由から一般的に，メカニカルストレスを受容するいる研究では，ヒトを含めて，静水圧では骨形成は刺激のは骨細胞であると信じられているが，メカニカルスト

されず，反復刺激が必要であることが確認されている。

レス負荷後，どちらの細胞にも同じようなシグナル分子

しかしながら，モデル実験においては，静水圧を加えるの変化が起こることが知られており，骨芽細胞自身が受方法も含めてどの方法によっても骨形成が促進される，

容細胞として働く可能性も十分にある。また，ヒトの骨あるいは，骨芽細胞の活性が増加する方向にパラメータにおいては骨表面を覆っている骨芽細胞はわずか5％でーが変化することが知られている。ただ，詳細に比較すあり94％はbone lining cell，1％は破骨細胞に覆われてると，メカニカルストレスの種類により変化するシグナ

35）

いる 。従って仮に骨細胞がメカニカルストレスを受容

ル分子が異なるようである。たとえば，骨芽細胞によるし，シグナルを伝達したとしてもその後の骨形成を説明

osteopontin46）やNO47），PGE247）の産生に関しては，fluid

するためにはさらに多くの骨芽細胞がリクルートされな

flowのような shear stressの方が歪みの応力に比べて，ければならない。その機構のひとつとして，bone lining

変化が大きい，という報告がある。通常の運動時におい37）cellの活性化が報告されているが ，間葉系細胞からのて，shear stressが重要であるのか，あるいは，変形を分化も十分に考えられる。

ともなう応力が重要であるのか，は不明である。どちらの応力が主に働くにしても，細胞がこれを感じるために

２-５．メカニカルストレスの骨形成作用を左右する生理的条件
内分泌機能その他正常の生理的条件が維持されている
限り，メカニカルストレスはもっとも強力な骨形成因子であり得るが，生理的異常があればその効果は減少ある

表-３

メカニカルストレスの骨形成作用に関する研究法（1） in vivo
① Stainless steel pinを骨に挿入しこれに周期的な圧迫刺いは消失する。メカニカルストレスの骨形成作用が加齢激を加える方法にともなって減少する38,39）のは，その例のひとつである。

（ i ）七面鳥の前肢に刺激を加える方法36）

二つ目の例はエストロジェンである。エストロジェン欠（ii）ラットの尾椎に刺激を加える方法69）

乏によって起こる骨量減少と不動化によって惹起される② Strain gaugeを用いて非侵襲的に圧迫刺激を加える方法69）

骨量減少とが，時間経過や形態学的変化についてよく似③ 4点曲げによりたわみ刺激を加える方法55）ていること 40）から，エストロジェンのレベルやエスト（2） in vitro

ロジェン受容体の機能がメカニカルストレスの骨形成作
用 に 影 響 す る 可 能 性 が 提 唱 さ れ て い る 9 ）。 実 際
Chambersのグループは，ラットの尾堆骨に圧迫刺激を① 細胞培養（ i ）静水圧を加える方法70）（ii）Fluid flow （shear stress） を加える方法15,46,59,60）（iii）培養基質を伸縮させる方法27,71）

加えるin vivoモデルにおいて，骨形成がまだ進行しな（iv）細胞を直接刺激する方法65,66）

いうちにエストロジェンを投与するとメカニカルストレ② 器官培養スの骨形成作用は抑制されるが，骨形成が進行中にエス（ i ）静水圧を加える方法68）

トロジェンを投与した場合には骨形成が亢進することを（ii）伸展刺激を加える方法49,72）

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は，細胞の表面や骨格を構成する分子が変形に曝されは張力負荷方向に扁平化するとともに細胞数が次第に増なければならないはずであり，その場合には，上で述

加し，縫合部は時間の経過とともに伸張した49）。伸長にべたように，セカンドメッセンジャーの変化をともなともなって，アルカリフォスファターゼ（ALP）陽性

う複数の機構によりメカニカルストレスのシグナルがの細胞層も縫合部中心に向かって伸び出したが，6時間相互作用しながら伝達される可能性が高い15）。その意味

後においては，これらの細胞はオステオカルシン

では，細胞自身はどちらの応力についても応答可能で（OCN）やオステオポンチン（OPN）陰性であることかあり，従って，メカニカルストレスの負荷方法にはそら，前骨芽細胞と考えられた。24時間後には，類骨れほどこだわる必要はないかも知れない。それよりも，（osteoid）の形成も認められるようになり，このようなそれぞれの実験系の特徴を生かしてその過程を詳細に調べ，それぞれの結果を総合して in vivo における現象

一連の変化は縫合部中心に向けて継続的に進行し，48時を解析する努力をすべきではなかろうか？いずれのシ（図-２）49）。新しく石灰化した類骨の表面の細胞はALP

グナル伝達経路も骨形成にいたる途中のある特定の過陽性でOPNやOCNを発現しており，成熟した骨芽細胞

程以降では共通のものになると考えられる。この過程と考えられた。72時間後にはこのような変化はさらに顕つまり骨形成に特異的な過程を特定することが，医療著になった。石灰化が進行中の部位ではマトリックス小胞が出現し， in vivoで認められるものと同様の変化がへの応用面から考えると最も重要である。また，従来の研究においては，in vitroにおいて骨芽細胞を活性化

間後には新しく形成された類骨の一部は石灰化したするに必要な歪み応力は，in vivo のそれに比してきわ

起こっていることが電顕的に観察された（未発表データ）。従って，本実験モデルにおいては，in vivoで通常めて高く，非生理的であるという指摘があった48）。しか観察されるものと同様の骨形成が極めて短時間に再現さし，生理的範囲の歪み応力を負荷した最近の研究においても骨芽細胞の増殖や分化が確認されている。 Inれていると考えられた。

vivoの実験系に比べて，培養細胞を用いる実験系の最大の問題点は，骨芽細胞あるいは骨細胞いずれを用いる
場合でも，骨芽細胞へと分化する細胞が存在しないということである。このことを解決するために我々は，器官培養系を選んだ。

４．マウス頭蓋冠縫合部を用いた研究
器官培養系は表に示したように静水圧をかける方法と伸展刺激をかける方法とがある。前者には，特別の装置が必要である，また，骨形成が刺激されるまでに時間を要する，などのが難点があるので，われわれは後者を採用した。このモデルの利点として，48時間以内に石灰化も含めた骨形成を観察することができる，
間葉系の多くの細胞も含んでおり骨芽細胞の前駆細胞を決めるのに適している，個体レベルの研究に比べて全身性に作用する物質の関与を除くことができる，顕微鏡による観察が容易なので細胞の形態変化と遺伝子発現の変化とを対応させて細胞分化を観察できる，内軟骨性骨化を含まず膜性骨化のみを見ることができる
単純な系である，などが挙げられる。この実験系を用

図−1

マウス頭蓋冠縫合部培養系

いて我々はこれまでに以下のことを明らかにした。

A：歯科矯正用ワイヤーで作成したバネ，および，縫合部への装着の模式図

４-１．張力負荷による骨芽細胞の分化と骨形成

B：24穴プレートに装着した状態を上から撮影したもの

生後4日令のマウス頭蓋冠縫合部を無菌的に切り出し，歯科矯正用のワイヤーを用いて作成したバネにより張力を連続的に負荷しながら培養した。対照群においてはバネの長さを糸で固定することにより張力をゼロにした（図-１）。張力負荷により頭蓋冠縫合部の細胞
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り細胞レベルの発現状況を調べた。その結果，張力負荷
開始3hr後には，前骨芽細胞のBMP-4遺伝子発現が増加
し，新たにALP陽性となった前骨芽細胞および間葉系の線維芽細胞様細胞の一部にBMP-4遺伝子が発現するようになった（図-４）49）。このような変化が順次縫合部中心に向かって移動するとともに，あらたに分化したと思われるALP陽性の前骨芽細胞は，骨芽細胞特異的転写因子であるCbfa1遺伝子を発現するようになった（図-4，
5）。
そして，典型的な骨芽細胞へと分化すると，順次type I
collagenやosteopontin，osteocalcinなどを分泌してosteoidを形成しながら，自身のBMP-4遺伝子発現は低下する。時間の経過とともに，類骨では，matrix
vesicleの形成を経て石灰化に至る，という一連のプロセスを観察した（図-6）。これは生体内で見られる骨形成過程と同一のものと考えることができる。このように，
BMP-4はautocrine/paracrine factorとして骨芽細胞の分化に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。尚，
本実験系ではBMP-2の変動は認められなかった。

４-３．メカニカルストレスにより変動する遺伝子の網羅的検出
上述のように，マウス頭蓋冠縫合部培養系を用いるこ
図−2 張力刺激による縫合部の骨形成（アルカリフォスフとにより，従来の研究では得られなかった，比較的骨形

ァターゼおよびvon Kossa染色）
a：0時間，立方状でALP陽性の骨芽細胞が骨（B）および成に特異的な遺伝子変化が検出された。張力刺激によりosteoid（＊）を覆っている。また，前骨芽細胞を斜めの矢印で示してある。b：1時間，縫合部の細胞はいずれもdifferential display（DD）法およびRAP-PCRを用いる

扁平化し長さを増している。OsteoidならびにALP陽性

よび未知遺伝子を同定した50）。これらの遺伝子の発現がの前骨芽細胞（斜め矢印）層も縫合部中央（垂直矢印）に向けて伸びだしている。c：6時間，扁平化したALP陽性の発現レベルが変動する遺伝子をさらに検出するために，その変法により検索した結果，いくつかの既知遺伝子お骨芽細胞の分化とともに増加することを確認している

細胞層（斜め矢印）はさらに縫合部中央に向かって伸長し，
osteoidも若干増加している。d：24時間，osteoidおよび前骨芽細胞（斜め矢印）層はさらに伸長している。e：48
時間，osteoidは長さおよび厚みを増し，一部には石灰化（矢頭）も認められる。
6４-２．骨芽細胞の分化とBMP-4の発現

50.2g／0g

上述の骨芽細胞分化とそれに続く骨形成にかかわる因子を明らかにするため，同じ実験系で遺伝子発現を調べ3た。メカニカルストレスにより発現状況が変動する骨芽2細胞特異的遺伝子を見出すための手始めとして，骨芽細1胞の分化マーカーのうち比較的初期に現れる遺伝子の発0

現状況をRT-PCRで調べた。その結果，BMP-4遺伝子の発現が増加し，6時間後には有意な変化として検出され

＊

4

3

6

24

Culture hour

図−3

張力刺激によるBMP-4遺伝子発現の誘導

た（図-３） 。これらの変化がどの細胞に起こっている

Total RNAを頭蓋冠縫合部から抽出した後RT-PCRによかを明らかにすることができれば，骨芽細胞へ分化する

りBMP-4遺伝子の発現を調べた。上のパネルはそのパターンを，下のパネルには数値化して結果を示した。*は5％49）細胞の起源やメカニズムを明らかにする契機となる可能性がある。そこで，in situ hybridization（ISH）法によ−５−の危険率で対照群との間に有意差があることを示す。

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Cbfa1

Positive cell ％

30

BMP-4

0g

0g

0.2g

0.2g

＊＊

20

10

0
0

3

6

0

3

6

Culture hour

図−5 張力刺激によるBMP-4およびCbfa1遺伝子発現細胞数の経時変化
図 − 4に 模 式 的 に 示 し た original data（ in situ
hybridization）をcomputer画面上で解析し，BMP-4陽性
およびCbfa1陽性の細胞数を計測した。図4の説明と一致してBMP-4陽性細胞がまず増加し，ついでCbfa1陽性細胞が増加していることがわかる。*は5％の危険率で対照群との間に有意差があることを示す。

図−4 張力刺激下に培養した頭蓋冠縫合部における骨芽細胞の分化と骨形成（模式図）
図はin situ hybridization法により検出した遺伝子発現の変化を模式的に示したものである。上から順に，張力
刺激開始後0時間，3時間，6時間，24〜48時間における変化を示す。0時間では，osteoid（類骨，図ではBoneと示してある）に接している球形の骨芽細胞（OB）とこ
れに隣接する前骨芽細胞（POB）がBMP-4およびCbfa1
陽性で，間葉系の線維芽細胞様細胞（FB）の中にも
BMP-4弱陽性のものが散見される。3時間以降では，張力負荷方向に沿って細胞が扁平となるとともに，細胞数の増加，osteoidの伸長，そしてosteoidの一部の石灰化（骨化）という順で骨形成が起こっていることがわかる。
3時間後ではOBおよび一部のFBにおいてBMP-4遺伝子発現が増加する。6時間後になると，これらの変化はさらに増加し，3時間後でBMP-4陽性となったFBはCbfa1
陽性となってPOBへと分化し，さらに新しくBMP-4陽性のFBが出現する。一方で新しく分化したOBは細胞外基質を分泌してosteoidの伸長に寄与する。24時間以降になると，伸長したosteoidの一部は石灰化し骨化する（図では白抜き文字でBoneと示してある部分）が，間葉

図−6 張力刺激によって惹起される骨芽細胞の分化と骨形成（模式図）

系のFBがPOBついでOBに分化する先端部ではこれまでと同様の変化が繰り返されて骨形成が進行する。図では明確に示されてはいないが，骨化した部分の表面に接す
るOBのBMP-4発現は次第に消失する。また，図には示していないが，osteoid表面に接するOBはbonesialoprotein陽性またその一部はosteopontin陽性，骨化した部分の表面に存在するOBはosteopontinおよびosteocalcin陽性になることも確認している。（データの詳細は文献49を参照）。

−６−

骨芽細胞の分化，細胞当りの遺伝子発現量，および，骨形成をそれぞれ経時的に示した。BMP-4遺伝子の発現状
況と骨芽細胞の分化に関するデータは我々の研究が最初のものであるが，骨芽細胞に分化し骨基質を分泌し終えるとその発現が低下することが注目される（図-4の説明参照）。これらのデータからBMP-4はautocrine/paracrine
factorとして骨芽細胞の分化にかかわる可能性が示唆される。図に示したその他の因子の発現については，発現の順序，発現量とも従来の報告とほぼ一致する。

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が，より詳細な機能を解析中である。しかしながら，容文

易に予想されるように，DD法は遺伝子の網羅的検出に献適しているとは言い難い。張力刺激により変動する遺伝子をさらに網羅的に検索し，メカニカルストレスの骨形

１）Lebranc AD, Schneider VS, Evans HJ,

成作用のキーとなる遺伝子を特定するため，張力刺激負Engelbreston DA and Krebs JM: J Bone Miner

荷組織および非負荷組織からRNAを抽出し，マイクロRes 5: 843-850, 1990.
２）Mack PB and Vogt FB: Roentgenographic boneアレイ（GeneChipシステム）により検討している。

density changes during representative Apollo

４-４．今後の検討事項

space flight. Am J Roentgenol 113: 621-623, 1971

BMP-4遺伝子をはじめ，特定された遺伝子が骨形成に

３）Vose GP: Review of roentogenographic bone

必須であるか否かを決定するためには，張力負荷組織に

demineralization studies of the Gemini space

おいて当該遺伝子の発現を阻止して骨芽細胞の分化や骨flight. Amer J Roent 121: 1-5, 1974

形成が抑制されること，また，張力非負荷組織に当該遺

４）Morey ER and Baylink DJ: Inhibition of bone

伝子を過剰発現させて骨芽細胞の分化や骨形成が刺激さ

formation during space flight. Science 201: 1138-

れること，等を確認しなければならない。これを実現す

1141,1978

るため，アデノウイルスベクターを用いる発現系を構築

５）Yagodovsky VS, Trifaranidi LA and Goroklova

し検討中である。また，BMP-4遺伝子の転写調節領域に

GP: Space flight effects on skeletal bones of rats.

はshear stressに応答する部位（SSRE）が存在する51）。

Aviat Space Environ Med 47: 734-738, 1984

この領域に結合する因子はまだ同定されていないが，張６）Bassey EJ and Ramsdale SJ: Increase in femoral

力刺激により誘導される骨形成にこの部位がかかわってbone density in young women following high-いる可能性もあり，この因子の同定が重要になるかも知

impact exercise. Osteoporosis Int 4: 72-75, 1994
７）Smith EL, Gilligan C: Exercise and bone mass.

れない。これらの点についても現在検討中である。

In: Deluca HF, Mazess R（ eds）Osteoporosis:

おわりにPhysiological Basis, Assesment and Treatment.

以上のように，我々の用いている頭蓋冠縫合部の培養

Elsevier Science, New York pp285-293, 1990

系には，短時間で骨形成に至り，しかも骨芽細胞の分化

８）Eisman JA, Kelly PJ, Sambrook PN et al: Physicalをも調べることが可能である，という特徴がある。本実

activity and bone mass. In: Deluca HF, Mazess

験系で用いているメカニカルストレスは，大きな一方向R（eds）
Osteoporosis: Physiological Basis, Assesmentの張力刺激を組織に連続的に加えるという，非生理的なand Treatment. Elsevier Science, New York刺激であるが，これと良く似たdistraction osteogenesis

pp277-283, 1990という治療法がある。長管骨を長軸と垂直方向に切断した後長軸方向に連続的に張力を負荷しながら骨形成を促

９）Frost HM: Bone mass and the mechanostat a
proposal. Anat Rec 219: 1-9, 1987

し，結果的に骨を伸長させる（1日あたり1ミクロン程度

10）Turner CH, Forwood MR, Rho J and Yoshikawaの伸長）方法である。最終的に10㎝程度までなら伸長可

T: Mechanical loading thresholds for lamellar能であるという。ラットを用いた同様のモデル実験で張and woven bone formation. J Bone Miner Res 9:

力刺激によりBMP-2やBMP-4の遺伝子発現が著明に増加

87-97, 1994

52）

することが最近報告された 。この場合，骨折治癒過程

11）Ingber DE: Cellular tensegrity: defining new

で認められるBMP-4発現の増加に比べて，その発現量がrules of biological design that govern the

はるかに高値である

52,53）

点が，我々の上記の結果と併せて注目される。我々の実験系で得られる情報がそのまま
in vivoの骨形成過程を正確に表しているとは考えていcytoskeleton. J Cell Sci 104: 613-627, 1993.
12）WangNandIngber

DE:

Probingtransmembrane mechanical coupling andないが，このような非生理的条件が通常のin vivoの実

cytomechanics using magnetic twisting

験系では検出できないような小さな変化を検出可能にしcytometry. Biochem Cell Biol 73: 327-335, 1995ているのではないかと考えている。
いずれにしても最終的にはin vivoの系に持ち込んで13）Pavalko FM, Otey CA, Simon KO and Burridge
K: α-Actinin: a direct link between actin and

結論を出すことが必要なのであり，最初の段階でこのよ

integrins. Biochem Soc Trans 19: 1065-1069, 1991

うな極端な条件を選ぶのもstrategyとして十分成り立つ

14）MJ, Banes AJ, Levin LG, Sumpio BE, Sato M,
Jordan R, Gilbert J, Link GW and Tran Son Tayと考えている。
−７−180

新潟歯学会誌

30（2）
：2000

R: Osteoblasts increase their rate of division and26）McDonald F, Somasundaram B, McCann TJ,

align in response to cyclic, mechanical tension.

Mason WT and Meikle MC: Calcium waves in

Bone Miner 4: 225-236, 1988

fluid flow stimulated osteoblasts are G protein

15）Pavalko FM, Chen NX, Turner CH, Burr DB,
Atkinson S, Hsieh Y-F, Qie J and Duncan RL:

mediated. Arch Biochem Biophys 326: 31-38,
1996

Fluid shear-induced mechanical signaling in27）Sandy JR, Meghji S, Farndale RW and Meikle

MC3T3-E1 osteoblasts requires cytoskeleton-

MC: Dual evaluation of cyclic AMP and inositol

integrin interactions. Am J Physiol 275: C1591-

phosphates

C1601, 1998

deformation of murine osteoblasts. Biochim16）Chakkalakal DA: Mechanoelectric transductionin

responsetomechanical

Biophys Acta 1010: 265-269, 1989
28）Binderman I, Zor U, Kaye AM, Shimshoni Z,

in bone. J Mater Res 4: 1034-1046, 198917）Pead MJ, Suswillo R, Skerry TM, Vedi S and
3

Harell A and Somjen D: The transduction of

Lanyon LE: Increased H-uridine levels inmechanical force into biochemical events inosteocytes following a single short period of

bone

cells

may

involve

activationofdynamic bone loading in vivo. Calcif Tissue Int

phospholipase A2. Calcif Tissue Int 42: 261-266,

43: 92-96, 1988

1988.

18）Dodds RA, Ali N, Pead MJ and Lanyon LE:29）Kennedy MS and Insel PA: Inhibitors of

Early loading-related changes in the activity of

microtubule assembly enhance beta-adrenergic

glucose 6-phosphate dehydrogenase and alkaline

andphosphatase in osteocytes and periosteal

accumulation in S49 lymphoma cells. Mol.

osteoblasts in rat fibulae in vivo. J Bone Miner

Pharmacol. 16: 215-223, 1979.

Res 8: 261-267, 1993

prostaglandin

E 1 -stimulatedcAMP30）Insel PA and Koachman AM: Cytochalasin B

19）Goodship AE, Lanyon LE and McFie H:

enhances hormone and cholera toxin-induced

Functional adaptation of bone to increased

cyclic AMP accumulation in S49 lymphoma

stress. J Bone Joint Surg 61A: 539-546, 1979

cells. J Biol Chem 257: 9717-9723, 1982.

20）Turner CH, Takano Y, Owan I and Murrell31）Canalis E and Gabbitas B: Bone morphogenetic

GAC: Nitric oxide inhibitor L-NAME suppresses

protein 2 increases insulin-like growth factor I

mechanically induced bone formation in rats.

and II transcripts and polypeptide levels in bone

Am J Physiol 270: E634-E639, 1996

cell culture. J Bone Moner Res 9: 1999-2005, 1994

21）Fox SW, Chambers TJ and Chow JWM: Nitric32）Knutsen R, Honda Y, Strong DD, Sampath TK,

oxide is an early mediator of the increase in

Baylink DJ and Mohan S: Regulation of insulin-bone formation by mechanical stimulation. Am J

like growth factor system components by

Physiol 270: E955-E960, 1996

osteogenic protein-1 in human bone cells.

22）Mashimo H and Goyal RK: Lessons fromgenetically engineered animal models IV. Nitric

Endocrinology 136: 857-865, 1995
33）Chen MZ, Zaman G and Rawlinson SC:

oxide synthase gene knockout mice. Am J

MechanicalPhysiol 277: G745-G750, 1999

proliferation through IGF-II and estrogen23）Gregg AR, Schauer A and Shi O: Limb
reduction defects in endothelial nitric oxide
synthase-deficient mice. Am J Physiol 275:
H2319-H2324, 1998

strainstimulates

ROS

cell

through IGF-I. J Bone Miner Res 14: 1742-1750,
199934）Lean JM, Jagger CJ and Chambers TJ:
Increased insulin-like growth factor I mRNA

24）Chow JWM and Chambers TJ: Indomethacin

expression in rat osteocytes in response tohas distinct early and late actions on bonemechanical stimulation. Am J Physiol 268: E318-

formation induced by mechanical stimulation.
Am J Physiol 267:E287-E292, 1994

E327, 1995
35）Parfitt AM: The Physiologic and clinical25）Xia SL and Ferrier J: Propagation of a calcium

significance of bone histomorphometric data. In:

pulse between osteoblastic cells. Biochem

Recker RR（ed）Bone Histomorphometry, techniques

Biophys Res Commun 186: 1212-1219, 1992
−８−

川島

博行

and interpretation. CRC Press, Boca Raton, FL,
Y-Q,

McLeodChambers TJ:Induction of NO and prostaglandin
E2 in osteoblasts by wall-shear stress but not

pp143-223, 1983
36）Sun

181

KJ

and

Rubin

CT:

Mechanically induced periosteal bone formation

mechanical strain. Am J Physiol 273: E751-E758,
1997

is paralleled by the upregulation of collagen48）Duncan RL and Turner CH: Mechanotransduction

type one mRNA in osteocytes as measured byand the functional response of bone to mechanicalin situ reverse transcript-polymerase chain

strain. Calcif. Tissue Int 57: 344-358, 1995
49）Ikegame M, Ishibashi O, Yoshizawa T,

reaction. Calcif. Tissue Int 57: 456-462, 1995
37）Chow JW, Wilson AJ and Chambers TJ:

Shimomura J, Komori T, Ozawa H and

Mechanical loading stimulates bone formation

Kawashima H: Tensile stress induces boneby reactivation of bone lining cell in 13-week-old

morphogenetic protein 4 in preosteoblastic andrats. J Bone Miner Res 13: 1760-1767, 1998

fibroblastic cells, which later differentiate into38）Turner CH, Takano Y and Owan I: Agingosteoblasts leading to osteogenesis in the mousechanges mechanical loading thresholds for bone

calvariae in organ culture. J Bone Miner Res 16:

formation in rats. J Bone Miner Res 10: 15441549, 1995

24-32, 200150）Shimomura J, Ishibashi O, Ikegame M, Noda T39）Rubin CT, Bain SD, McLeod KJ: Suppression ofand Kawashima H: Tensile stress markedly

the osteogenic response in the aging skeleton.

increased tetranectin gene expression in cranial

Calcif Tissue Int 50: 306-313, 1992.

sutures of mouse calvariae. J Bone Miner Res 1440）Turner CH: Homeostatic control of bone
structure: an application of feedback theory.
Bone 12: 203-217, 1991.

（suppl 1）:S194, 1999
51）Feng JQ, Chen D, Cooney AJ, Tsai MJ, Harris
MA, Tsai SY, Feng M, Mundy GR and Harris41）Jagger CJ, Chow JWM, Chambers TJ: Estrogen

SE: The mouse bone morphogenetic protein-4

suppresses activation but enhances formation

gene. Analysis of promotor utilization in fetal

phase of osteogenic response to mechanical

rat calvarial osteoblasts and regulation bystimulation in rat bone. J Clin Invest 98: 2351-

COUP-TFI orphan receptor. J Biol Chem 270:

2357, 1996.

28364-28373, 199542）Burkhart JM, Jowsey J: Parathyroid and thyroid

52）Sato M, Ochi T, Nakse T, Hirota S, Kitamura Y,

hormones in the development of immobilization

Nomura S and Yasui N: Mechanical tension-

osteoporosis. Endocrinology 81: 1053-1062, 1967.

stress induces expression of bone morphogenetic

43）EL Haj AJ, Minter SL, Rawlinson SCF, Suswillo

protein（BMP）-2 and BMP-4, but not BMP-6,

R, Lanyon LE: Cellular responses to mechanical

BMP-7, and GDF-5 mRNA, during distraction

loading in vitro. J Bone Miner Res 5: 923-932,

osteogenesis. J Bone Miner Res 14: 1084-1095,

1990.

1999

44）Duncan RL, Hruska KA: Chronic, intermittent53）Nakase T, Nomura S, Yoshikawa H, Hashimoto

loading alters mechanosensitive channel

J, Hirota S, Kitamura Y, Oikawa S, Ono K andcharacteristics in osteoblast-like cells. Am J

Takaoka K: Transient and localized expression

Physiol 267: F909-F916, 1994.

of bone morphogenetic protein 4 messenger45）Duncan RL, Hruska KA, Misler S: Parathyroid
hormone activation of stretch-activated cation
channels in osteosarcoma cells（UMR-106.01）
FEBS Lett 307: 219-223, 1992.

RNA during fracture healing. J Bone Miner Res
9: 651-659, 1994
54）Lean JM, Mackay AG, Chow JW and Chambers
TJ: Osteocytic expression of mRNA for c-fos

46）Owan I, Burr DB, Turner CH, Qiu J, Tu Y,

and IGF-I: an immediate early gene response to

Onyia JE and Duncan RL: Mechanotransduction

an osteogenic stimulus. Am J Physiol 270: E-937-

in bone: osteoblasts are more responsive to fluid

E945, 1996

forces than mechanical strain. Am J Physiol 273:
C810-C815, 1997.

55）Raab-Cullen DM, Thiede MA, Petersen DN,
Kimmel DB and Recker RR: Mechanical loading47）Smalt R, Mitchell FT, Howard RL and−９−stimulates rapid changes in periosteal gene

182

新潟歯学会誌

30（2）
：2000

Acad Sci USA 93: 1864-1869, 1996

expression. Calcif. Tissue Int 55: 344-358, 1995
56）Ochoa JA, Sanders AP, Heck DA and Hillberry66）Wang W, Zhuang H, Levitz CL, Fan H, Seldes

BM: Stiffening of the femoral head due to

RM, Tahernia AD and Brighton CT: Theintertrabecular fluid and intraosseous pressure.

increased level of PDGF-A contributes to the

J. Biomech Eng 113: 259-262, 1991

increased proliferation induced by mechanical57）Mason DJ, Suva LJ and Rubin CT: Mechanicallyregulated expression of a neural glutamate

stimulation in osteoblastic cells. Biochem Mol
Biol Int 43: 339-346, 1997

transporter in bone: a role for excitatory amino67）Klein-Nulend J, Roflofsen J, Semeins CM,

acids as osteotropic agents? Bone 20: 199-205,

Bronckers ALJJ and Burger EH: Mechanical1996

stimulation of osteopontin mRNA expression58）Glanstching H, Varga F, Rumpler M andKlaushofer K: Prostacyclin（PGI2）: A potential

and synthesis in bone cell culture. J Cell Physiol
170: 174-181, 1997

mediator of c-fos expression induced by68）Rawlinson SCF, El-Haj AJ, Minter SL, Tavareshydrostatic pressure in osteoblastic cells. Eur J

IA, Bennett A and Lanyon LE : Loading-related

Clin Invest 26: 544-548, 1996

increases in prostaglandin production in cores of59）Ogata T: Fluid flow induces enhancement of theadult canine cancellous bone in vitro: a role for

egr-1 mRNA level in osteoblast-like cells:

prostacylin in adaptive bone remodeling. J Boneinvolvement of tyrosine kinase and serum. J Cell

Miner Res 6: 1345-1351, 1991
69）Chow JWM, Jagger CJ and Chambers TJ:

Physiol 170: 27-34, 1997
60）Johnson DL, McAllister TN and Frangos JA:

Characterization of osteogenic response to

Fluid flow stimulates rapid and continuous

mechanical stimulation in cancellous bone of rat

release of nitric oxide in osteoblasts. Am J

caudal vertebrae. Am J Physiol 265: E340-E347,

Physiol 271: E205-E208, 1996

199361）Pitsillides AA, Rawlinson SCF, Suswillo RFL,70）Guignandon A, Usson Y, Laroche N, Lafage-

Bourrin S, Zaman G and Lanyon LE: Mechanical

Proust M-H, Sabido O, Alexandre C and Vico L:

strain-induced NO production by bone cells: a

Effects

possible role in adaptive bone（ re）modeling?

gravitational stresses on cell-matrix adhesion:

FASEB J 9 : 1614-1622, 1995

quantitative analysis of focal contacts in62）Klein-Nulend J, Burger EH, Semein CM, Raisz
LG and Pilbeam CC: Pulsating fluid flowofintermittent

orcontinuous

osteoblastic ROS 17/2.8 cells. Exp Cell Res 236:
66-75, 1997

stimulates prostaglandin release and inducible71）Brighton CT, Sennet BJ, Farmer JC, Iannotti JP,

prostaglandin G/H synthase mRNA expression

Hansen CA, Williams JL and Williamson J: The

in primary mouse bone cells. J Bone Miner Res

inositol phosphate pathway as a mediator in the

12: 45-51, 1997

proliferative response of rat calvarial bone cells63）Neidlinger-Wilke C, Stalla I, Claes L, Brand R,
Hollen I, Rubenacker S, Adam M and Kinzl L:

to cyclical biaxial mechanical strain. J Orthp Res
10: 385-393, 1992

Human osteoblasts from younger normal and72）Hickory WB and Nanda R: Effect of tensile force

osteoporotic donors show differences inmagnitude on release of cranial suture cells in S

proliferation and TGF beta-release in response

phase. Am J Orthod Dentofac Orthop 91: 328-

to cyclic strain. J Biomech 28: 1411-1418, 1995

334, 1987

64）Jones DB, Nolte H, Scholubbers J-G, Turner E
and Veltel D: Biochemical signal transduction of
mechanical strain in osteoblast-like cells.
Biomaterials 12: 101-110, 1991
65）Duncan RL, Kizer N, Barry EL, Friedman PA and
Hruska KA: Antisense oligo-deoxynucleotide
inhibition of a swelling-activated cation channel
in osteoblast-like osteosarcoma cells. Proc Natl−10−