P−－16

微生物による多様な金属酸化物の合成に関する研究〇山本 兼由（法政大学生命科学部）

要旨
Mn(II)を酸化してMn(IV)酸化物を合成する真菌や細菌が報告されている．Actinobacteria門，Firmicutes門，Proteobacteria門を含む様々な細菌がMn酸化能をもつことが推測されている．本研究では，微生物の金属酸化システムを再構成させ，金属酸化物の効率的な発酵合成と多様な金属酸化物合成デザインの制御を目指し，Mn酸化物を合成するPseudomonas putidaから逆遺伝学的にMn酸化物合成酵素遺伝子を単離同定することを行った．P. putida KT2440株を，金属を含むM9グリセロール寒天培地に30oCで画線培養し，コロニーの呈色を確認した．また，KT2440株のシングルコロニーを，金属を含むM9グリセロール液体培地に30oCで終夜培養し，培養液および培養上清の呈色を確認した． P. putida GB-1株で推定される全7種類のMn酸化遺伝子のすべてをKT2440で確認した．KT2440株の lapA （PP̲0168）， cumA（PP̲1034），copA2（PP̲2205），mopA（PP̲2561），mcoA（PP̲3184），mnxG（PP̲3490），copA1（PP̲5380）のそれぞれの遺伝子上流側300 bpと下流側300 bpを，一方の末端にベクターの挿入領域との相同配列をもつように設計したプライマー対を用い，KT2440ゲノムを鋳型としてPCRで増幅し，精製した．つぎに，ゲンタマイシン耐性遺伝子カセットを，増幅した遺伝子の上流領域の一部と相同な配列を一方の末端に，増幅した遺伝子の下流領域の一部と相同な配列を他方の末端にもつように設計したプライマー対を用い，pPS856プラスミドを鋳型として，PCRで増幅し，精製した．これら3つのDNA断片とSal IとPst Iを用いて線状化したpK19mobsacBを混合し，試験管内組換え酵素によって，全てが連結した組換え遺伝子をもつプラスミドを大腸菌DH5αへの形質転換によって，PP̲5380，PP̲0168，PP̲1034，
PP̲2205，PP̲2561，PP̲3490，PP̲3184のそれぞれがゲンタマイシン耐性遺伝子カセットで破壊された組換え遺伝子プラスミドを構築した．ゲンタマイシン耐性遺伝子カセットで破壊された組換え遺伝子プラスミドは，大腸菌S17-1 λpirへ導入し，大腸菌形質転換体とKT2440株と混合し，接合反応後，クロラムフェニコールとゲンタマイシンへの耐性によって，まずシングルクロスオーバー組換えにより目的組換え遺伝子がKT2440ゲノム上に導入された形質転換体を選抜した．その後，ダブルクロスオーバー組換えにより目的遺伝子がゲンタマイシン耐性遺伝子カセットで破壊された形質転換体を，スクロース耐性株とした．P.

putida KT2440株はGB-1株と同様に，培地中のMn(II)の存在で呈色するコロニーを形成した．また，銅(II)と亜鉛(II)でも呈色コロニーを確認した．これらの呈色した成分は細胞外に分泌されており，培養液の上清に存在することが明らかとなった．KT2440を親株としたlapA，cumA，copA2，mopA，mcoA，mnxG，copA1の欠失株は，親株と比較して，寒天培地上のMn(II)添加による呈色コロニー形成に顕著な違いを確認できなかった．また，銅(II)と亜鉛(II)添加による呈色コロニーでも同様に違いを確認できなかった．これらの結果より，KT2440株の金属酸化能は複数の遺伝的要因で行われることが示唆された．

２.Pseudomonas putida GB-1のマンガン酸化能１.マンガン酸化土壌に含まれる細菌とマンガン酸化細菌
MoxA in Pedomicrobium sp. strain ACM 3067

Pseudomonas putida GB-1 strain
Ridge et al., (2007) Environ. Microbiol.

MopA in Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1
MopA in Erythrobacter sp. strain SD-21 Anderson et al., (2009) Appl. Environ. Microbiol.
CumA in Psuedomonas putida GB-1 Brouwers et al., (1999) Appl. Environ. Microbiol.

MofA in Leptothrix discophora SS-1 Corstjens et al., (1997) Geomicrobiol. J.

Geszvain et al. (2013) Appl. Environ. Microbiol.

MnxG in Bacillus sp. strain SG-1 Dick et al., (2008) Appl. Environ. Microbiol.

Francis & Tobe (2001) Appl. Environ. Microbiol.

Yan et al., (2013) PLoS ONE

Upstream300 bp

PCR 1

up-R
primerup-F primer
up-R primer

None

3.0

0.1mM CuSO4

2.5

None

吸光度

2.01mM MnSO4

1.50.1mM ZnCl21.0

遠心分離後0.1mM FeCl30.5

None

0.1mM CuSO4down-Fprimer

Terget geneDownstream
300 bpGm-R

down-Rprimer

FRT0.1mM FeCl2190290

390

490

590

690

波長（nm）

790

890

990

1090

５.マンガン酸化遺伝子破壊株のマンガン酸化能
KT2440
FB5380(parent strain) (copA1::Gmr)

Gentamicin
casetteFRT

FB0168(lapA::Gmr)

FB1034(cumA::Gmr)

FB2205(copA2::Gmr)

FB2561(mopA::Gmr)

FB3184(mcoA::Gmr)

FB3490(mnxG::Gmr)

Gm-F

PCR 1

down-F primer
down-R primer

0.00.1mM ZnCl2

４.P. putida KT2440のマンガン酸化遺伝子破壊株
up-Fprimer培養上清の分光測定

培養液
遠心分離前

M9グリセロールの組成
・Na2HPO 440 mM・KH 2PO 422 mM
・NaCl
8.6 mM・NH 4Cl
20 mM
・MgCl21 mM
・K 2SO 40.25 mM
・CaCl20.1 mM・Glycerol
10 mM
・Casamino acids 0.2%

P.Putida KT2440
genome0.1mM ZnCl20.1mM FeCl30.1mM CuSO40.1mM FeCl20.1mM FeCl31mM MnSO40.1mM FeCl2

P. putida KT2440↓M9グリセロール培地+金属↓
P. putida KT2440株を植菌↓30℃で一晩培養

1mM MnSO4３.Pseudomonas putida KT2440の金属酸化pPS856
Gm-F primer
Gm-R primer

None

1 kb

Purification of PCR product(Agarose gel electrophoresis& gel cutout)

pK19mobsacB/Sal, PstKmr

1 mM MnSO4sacB

pK19mobsacB
Target gene:: GmKmrsacB

６.マンガン酸化遺伝子破壊株の金属酸化能
1：Parent strain
2： copA1::Gm r strain
3： lapA ::Gm r strain
4： cumA ::Gm r strain
5： copA2::Gm r strain
6： mopA ::Gm r strain
7： mcoA ::Gm r strain
8： mnxG ::Gm r strain

1 mM MnSO4

0.1 mM FeCl2

0.1 mM FeCl3

8 176KT2440 parent strain
FB5380 copA1::Gm r
FB0168 lapA ::Gm r
FB1034 cumA ::Gm r
FB2205 copA2::Gm r
FB2561 mopA ::Gm r
FB3184 mcoA ::Gm r
FB3490 mnxG ::Gm r

25 4

７.まとめ
(1) P. putida KT2440株はGB-1株と同様に，培地中のMn(II)の存在でマンガン酸化物生成能を示した。
(2) また，銅(II)と亜鉛(II)の存在でも金属酸化物を生成していることを確認した。これらの金属酸化物は呈色が異なる性質をもっていた。
(3) これらの呈色した金属酸化物は細胞外に分泌されいた。
(4) KT2440ゲノム上のlapA，cumA，copA2，mopA，mcoA，mnxG，copA1のそれぞれの単独欠失株では，マンガンを含む金属酸化物生成能に顕著な違いを確認できなかった。

3None0.1 mM CuSO40.1 mM ZnCl2

KT2440株の金属酸化能は複数の遺伝的要因で行われることが示唆された。今後，(1)多重遺伝子欠失株を作成し，金属酸化物生成に関わる遺伝子群を同定する。また，(2)金属酸化物生成に関わる遺伝子群の発現を一括で制御する遺伝因子を探索する。
＊本研究は東京大学生物生産工学センター野尻秀昭教授との共同研究で行われた。