Photon Factory Activity Report 2019 #37 (2020)

BL-1A, BL-17A/2019G081

胃発がんに関わるピロリ菌 CagA-細胞内標的分子複合体の構造学的解析
Structural analysis of the Helicobacter pylori CagA-intracellular target complex
involved in gastric carcinogenesis
長瀬里沙 1, 千田美紀 1,千田俊哉 1,*
1

高エネ機構, 〒305-0801 茨城県つくば市大穂 1-1
Lisa Nagase1, Miki Senda1 and Toshiya Senda1,*

1

Photon Factory, KEK, 1-1 Oho, Tsukuba, Ibaraki 305-0801, Japan

1 はじめにヘリコバクター・ピロリ（ピロリ菌）は世界人口の約半数が感染しているとされるグラム陰性桿菌で、その慢性持続性感染は種々の胃粘膜病変を引き起こす。近年の研究からピロリ菌感染が胃がんの発症に重要な役割を担うことが明らかになってきた。さらに、大規模疫学調査ならびに動物モデルを用いた研究から cagA 遺伝子陽性ピロリ菌感染と胃がんとの密接な関連が明らかとなった。このことから、cagA 遺伝子産物である CagA タンパク質の生物活性発現における分子機構の解明が、胃がん発症機序への理解や胃がん治療への応用に重要な意義を持つものと期待される。我々のグループでは、CagA ががんタンパク質として働くしくみを理解するための第一歩として、CagA の N 末側構造領域（CaA-N）の結晶構
造 を 世 界 に 先 駆 け て 決 定 し た [1] （ 課 題 番 号
2010G616）。ピロリ菌体内で産生された CagA は注射針様装置である IV 型分泌機構を介して胃上皮細胞内に侵入した後、その C 末側領域に複数存在する
EPIYA (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala) モチーフ内のチロシン残基が Src ファミリーキナーゼによりチロシンリン酸化される。CagA の C 末側領域は、EPIYA モチーフ
周辺のアミノ酸配列を異にする 4 つのセグメント(EPIYA-A, -B, -C, -D) が種々に組み合わされて構成される。CagA は EPIYA-C セグメントを持つ欧米型
CagA と EPIYA-D セグメントを持つ東アジア型 CagAに大別される。CagA は EPIYA-C または EPIYA-D セ
グメント内のチロシンリン酸化依存的にがんタンパク質である SHP2 チロシンホスファターゼと特異的に結合する。SHP2 は N 末側に 2 つの SH2 ドメイン
（タンデム SH2 ドメイン）、C 末側にホスファター
ゼ活性を担う PTP ドメインを持つ。CagA は SHP2 のSH2 ドメインに結合することで SHP2 を異常に活性化する。一方で、CagA はチロシンリン酸化非依存
的 に EPIYA モ チ ー フ の 近 傍 に 存 在 す る CagAmultimerization（CM）配列を介して細胞極性の主要制御因子である PAR1 キナーゼの触媒ドメインと結合する。その結果、PAR1 のキナーゼ活性が抑制され、胃上皮細胞は密着結合が破壊されて上皮細胞極性を喪失する。このように、CagA は SHP2 や PAR1
等の標的分子と複合体を形成することで発がんに関わる宿主細胞内シグナルを撹乱すると考えられている。以上のことから、CagA は異なる領域で SHP2、
PAR1 それぞれと結合して三者複合体を形成することで、ピロリ菌感染を起点とした胃発がんに本質的に関与していると考えられており、この複合体の詳
細な構造情報は胃がん予防・治療薬開発のために活用できる可能性がある。
なお、本課題の関連課題 2017G115 では、CagA のEPIYA-D セグメント及び EPIYA-C セグメントを模倣したリン酸化ペプチドと SHP2 のタンデム SH2 ドメインとの複合体の結晶構造を明らかにし、それらの構造を比較することで、東アジア型 CagA が有する強い生物活性の分子メカニズムを解明することに成功している[2]。
2 実験
【結晶化】
本研究では SHP2（全長 597 残基）の N 末側 SH2
ドメイン (N-SH2) を使用した。また、PAR1（全長745 残基）は N 末端と C 末側を欠失させた変異体(39-364 残基: PAR1KD)を用いた。これらの変異体の大量発現および精製を行い、高純度サンプルを取得した。CagA については CagA の EPIYA-D セグメン
トおよび CM 配列を含む領域を模倣したチロシンリ
ン酸化ペプチド (CagA ペプチド) を用いた。高エネ
ルギー加速器研究機構の構造生物学研究センターの結晶化ロボット PXS を用いた CagA ペプチド–
PAR1KD–N-SH2 複合体の結晶化スクリーニングを行った。
【X 線回折データの収集】
結晶化スクリーニングで得られた結晶を用いて、PF のビームライン BL-1A、BL-17A において X 線回折実験を行った。
3 結果および考察
N-SH2、PAR1KD、CagA ペプチドを混合したタン
パク質の結晶化スクリーニングの結果、複数の条件

Photon Factory Activity Report 2019 #37 (2020)

で結晶が得られた。PF の構造生物学ビームライン
PF BL-1A で、得られた結晶を用いて X 線回折実験を行った結果、異なる結晶化条件で得られた２つの結晶から回折データが収集できた。分解能はそれぞれ 4.3 Å、5.5 Å であった。xds と aimless を用いたデータ処理の結果、前者の空間群は P312, a=b=110,
c=42 Å であった(表 1)。格子定数から、N-SH2 単独の結晶であることが推察された。後者の空間群は
P21, a=84, b=190, c=117 Å, β=110°であった(表 2)。この結果から、複合体である可能性が考えられたが、分解能が低いため解析が困難であった。そこで、得られた結晶を溶解し、それに対して抗 His タグ抗体
を用いてイムノブロットを行った。その結果、この結晶は PAR1KD 単独の結晶であることがわかった。
4 まとめ
今 回 得 ら れ た 結 晶 は 、 N-SH2 単 独 あ る い は
PAR1KD 単独であった。目的の複合体結晶ではなかったが、今回の結果から複合体の安定性に問題があることがわかり、今後の実験計画に大変有用だった。
現在、結晶化に用いる複合体の安定性が向上する条件の検討を進めている。

表 1: Crystallographic summary 1
Data collection
X-ray source
Beamline
Osc. angle (°)
Exposure time (s)Wavelength (Å)
Temperature (K)Space group
Unit-cell parameters (Å)
Resolution (Å)

PF
BL-1A
0.5
0.3
1.900095
P312
a=b=110.23, c=42.01
47.73–4.33 (4.84–4.33)

Observations

19,069 (4,812)

Unique reflections
Completeness (%)
Redundancy
Average I/s(I)Rpim (%)
Mosaicity (°)
B-factor (Å )1,993 (546)99.6 (99.4)
9.6 (8.8)
7.2 (3.7)
7.7 (22.4)
0.53
10.50

2

表 2: Crystallographic summary 2
Data collection
X-ray source
Beamline
Osc. angle (°)
Exposure time (s)Wavelength (Å)
Temperature (K)Space group
Unit-cell parameters(Å, °)
Resolution (Å)

PF
BL-1A
0.5
1
1.900095
P2
a=83.77, b=190.82, c=116.93,
β=109.53
49.53–5.51 (6.16–5.51)
1

Observations

81,885 (23,859)

Unique reflections
Completeness (%)
Redundancy
Average I/s(I)Rpim (%)
Mosaicity (°)
B-factor (Å )11,189 (3,183)
99.2 (99.6)
7.3 (7.5)
5.0 (2.3)
8.4 (29.8)
0.42
61.68

2

参考文献
[1] T. Hayashi et al., Cell Host and Microbe. 12, 2033 (2012).
[2] T. Hayashi et al., Cell Reports 20, 2876-2890(2017).
* toshiya.senda@kek.jp