P-23

公益財団法人発酵研究所 第14回助成研究報告会
ミコール酸含有細菌の接触刺激による放線菌二次代謝応答機構の変異ゲノム解析を用いた解明
浅水 俊平（東京大学大学院農学生命科学研究科）

異属細菌間の相互作用
放線菌とミコール酸含有細菌

放線菌は生きたミコール酸含有細菌と液体培地中で共凝集する

透析膜を介して信号は伝わらない“INDUCER bacteria”
Tukamurella pulmonis TP-B0596(mycolic acid-containing bacteria)

透析膜“PRODUCER bacteria”
Streptomyces lividans TK23

Sl
10 μm

放線菌は何を感知して二次代謝応答に至るのか?

1 μm

Asamizu S. et al. PlosONE (2015)

Onaka H. et al. AEM (2011)

Sl: S. lividans TK23, Tp: T. pulmonis

放線菌はミコール酸含有細菌との細胞間接触を介した信号を感知している?

逆遺伝学的手法（応答性変異株の原因遺伝子を調べる）を用いて機構解明を目指す
ランダム変異導入には放線菌胞子への重イオン(12C5+)ビーム照射を用いた

Tp

放線菌二次代謝非応答性変異株（野生株と比較しRED生産が変化した変異株）のスクリーニング
赤色色素生産が減少した変異株を選抜

生存率 (CFU)

炭素イオン
12C5+

Sco

重イオンビームを照射した胞子ライブラリーを寒天培地上で生育させる

Tp

照射

2-3 days
Scoのコロニーが観察できる

RED生産異常変異株

Sco: Streptomyces coelicolor JCM4020

T. pulmonis

高崎量子応用研究所のAVFサイクロトロン（イオンビームの加速器）

変異点
炭素イオンビームを放線菌の胞子に照射し、ランダム変異導入ライブラリーを作製

2-3 days

約152,000の生育したコロニー
Asamizu S. et al. IFO Res.Commun. 32:95-104, (2018)

Mt-i25_1変異株のRED生産遅延はjcm4020_18220（TetR様転写制御遺伝子）の変異が原因であった
jcm4020_18220

変異株○○5（3）

gltB
(1)

rplD
(1)

59 高浸透圧培地（NaCl入り）
での単独のREDを生産能

RED
(3)

1 kb

S. lividans TK24

未知100

100

100

10010099

100 100 100 100

99

10099

10099

100

10099

10099

100 100 100 100

99

100 (%)

破壊株

Tp

野生株

野生株
接触

tetR-like

2h
27 h

なし

RED生産

ABC transporter

破壊株

29 h

10 h

表現型（RED生産応答性）の再評価
早生産
4(3)

非接触
5(4)

正常

形質不安定

35

遅延

早生産

・相互作用をタイムラプス撮影したところ、野生株ではコロニー同士の接触後2時間でRED生産応答が観察されることに対し、破壊株では１０時間かかり、確かにtetR-like遺伝子の破壊により応答の遅延がが起こることが確認できた。
・tetR-like遺伝子の破壊により隣接するABCトランスポーターが転写されることが報告されている（Compton CL, et al.
ACS Infect Dis. 1(1):53-8. 2015）ことから、破壊株ではABCトランスポーターが構成的に発現していることが示唆されてた。

30 h

RED生産

37 h

株数と（新たにゲノムリシーケンスを行った株数）
非生産

99

25 h

接触

サンガー法によるsarA変異の検出

遅延13(11)(WT + pTYM1a)99

モデル放線菌Streptomyces coelicolor A3(2) M145を用いた標的遺伝子破壊株の遺伝学的解析

表現型の再評価とsarA変異株の検出

非生産
13(8)

野生株

S. coelicolor A3(2) M145

遺伝子相補により表現型が回復した遺伝子と(変異が見いだされた株数)

43(Mt i25_1 + pTYM1a-tetR)

S. coelicolor JCM4020

・一次代謝や翻訳系の異常が二次代謝の生産応答にも関与することが明らかになった。しかし、環境応答や転写制御に関与する遺伝子は見いだせず、再検討を要した。
・sarA変異が多数（8/16株）が見いだされたことから、次にsarA変異株をサンガーシーケンスにより同定し、変異点の同定を進めた。
Asamizu S. et al. IFO Res.Commun. 32:95-104, (2018)16（非生産）相補株

jcm4020_18220遺伝子周辺領域と保存性

×54（13）ゲノムリシーケンス
sarA(8)(Mt i25_1 + pTYM1a)

34番目のAが欠損した結果、12番目のTrpからフレームシフト変異となり、遺伝子機能が失われた

86
きなこ培地での気中菌糸形成能×

遺伝子相補による表現型の回復705 bp○あり

260のRED生産異常変異株

Growth of T. pulmonis

Asamizu S. et al. IFO Res.Commun. 32:95-104, (2018)

×5960-120 コロニー/ プレート1枚（合計1,800枚）

照射量に依存した生存率の低下を確認し、100-200 Gyを照射したサンプルを以後の実験に使用したスクリーニングの工程と1度目のリシーケンス解析の結果のまとめ260
対峙培養でRED生産応答性異常
正常118
最小培地での生育能

fusA
(1)

Tpをプレート全面に塗布する

40 h

非接触

tetR-like遺伝子破壊株に観察された現象の推定機構
Tp

野生株

変異株

野生株

変異株

野生株

変異株

・最終的な生産量（赤色の見た目の度合い）は変異株において野生株より少ないが、得られた変異株は、経時的に観察すると主に4つのパターンに表現型を分けることができた。
・未解析の26株についてゲノムリシーケンス解析を行った。RED生産遅延の表現型を示したMti25_1に、転写制御因子の変異が同定されたことから、以後さらに解析を進めた。

謝辞
・Grant-in-Aid for endowed research lab. from Amano Enzyme Foundation(2017.10-2022.9) (to SA, and HO)・Grant-in-Aid for endowed research lab. from Institute for Fermentation, Osaka (IFO)(2012.10-2017.9) (to SA and HO)・Grant-in-Aid for general research from Institute for Fermentation, Osaka (IFO) (to SA)

野生株

未同定の低分子化合物 X

Tp
破壊株
ABCトランスポーターの構成的発現

SCO1719

変異株

SCO1719野生株

1720 1720

・tetR-like遺伝子の破壊により隣接するABCトランスポーターが構成的に発現していることが示唆されてた。
・Tpの接触刺激により「未同定の低分子化合物 X」が細胞内に蓄積し、過剰な蓄積が細胞ストレスとなり、REDの生産を引き起こすことが示唆された。
・ABCトランスポーターは「未同定の低分子化合物 X」の排出を担うことが示唆され、破壊株では過剰な蓄積による細胞ストレスが緩和され、応答の遅延につながることが示唆された。
・「未同定の低分子化合物 X」を同定すれば、シグナルの上流を明らかにできると考えられる。