Technical Review

Chromatography, Vol.28 No.2 (2007)

Technical Review

液体クロマトグラフィーにおける超高速・超高分離技術の確立

江崎達哉，田中直美

New Foundation of Ultra−High−Speed andSeparation Technologies on Liquid Chromatography
Tatsuya Ezaki, Naomi Tanaka
日本ウォーターズ株式会社

東京都品川区北品川１−３−１２Abstract
The resolution needs to be compromised if the run time needs to be shorted in the traditional HPLC analysis as fast LC. To shorten the runtime, the column length should be shorter and the mobile phase flow rate should be faster. But the resolution can be lower at the same time.
“Van Deemter’s law” explains the resolution can be maximized using theoretically suitable mobile phase flow rate. Also it shows the smallercolumn particle brings higher resolution. But it was so difficult to develop the LC columns and the hardware, which had higher resistance topressure. Waters BEH technology and UPLC system technology made such ideal separation technology possible.
Keywords: Ultra Performance LC, UPLC, HPLC, Fast LC, UV, Van Deemter’s Law

い分離が実現されている．これも，またvan Deemterの法則

１．緒言HPLCによる分離分析では，分析時間の短縮と分離度の向を利用することにより容易に説明できる．van Deemterの法上は両立しえない関係にある．分析時間を短縮するには，カ則における異なる粒子径（１０，５，３．
５及び１．
７µm）での移ラム長さを短くする，移動相の流速を速めるなどの手法があ

動相線速度と理論段高（HETP）の関係を図２に示す．図２

るが，その代償として分離度（Rs）が低下する（図１）．最から粒子径を小さくすると，理論的に最適な線速度が高まる

も高い分離度を得るためには，最適な流速を使用する必要が特性が見られ，特に１．
７µmの粒子径では高い線速度の広いある．この基本的な原則は，van Deemterの法則［１］を利用領域において高いカラム効率が得られることがわかる．すなすることにより説明できる．LCの新たな可能性を示唆する

わち，粒子径１．
７µmのゲルを充填したカラムを用いること

M.L.Leeの報告［２］［３］や，J.W.Jorgenson［４］の報告でで，これまでのLC分析で両立しえなかった分離と分析時間は，よりカラム充填剤の粒子径を小さくすることで，より良の関係を変えることができる．しかしながら，この理論をLC

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図２van Deemterの法則における各充填剤粒子径での理論
段高（HETP）と線速度の関係

（a）

（b）

（c）

図３ LC用充填ゲルと毛髪のSEM画像（×１０００）（a）５．
０umシリカゲル（b）人の毛髪（c）１．
７um BEH Technologyによる高耐圧ゲル

図１ ４．
６mmI.D.×５０mm ５um ODSカラムにおける分離度（Rs）と移動相の流量との関係を示すクロマトグラ
ム（a）移動相流量が２．
０mL/分におけるクロマトグラム（b）移動相流量が３．
０mL/分におけるクロマトグラム
システムとして実現するためには，ポンプ，検出器及び，カラム充填剤の改良及び開発が必要であり，その詳細について報告する．

図４BEH Technologyによる高耐圧ゲルの化学的構造

２．技術的な課題
図２から，カラム充填剤の粒子径を小さくすることによりるためには，２つの課題がある．ひとつは検出器のデータ取分離能が向上することを示したが，理論にそった結果を得る込み速度を高めること，もうひとつは光学系の検出器においためには，同時にいくつかの技術的な課題を解決しなければてダイナミックレンジと感度を犠牲にすることなくセル容量ならない．そのひとつは，さらに微小な粒子がカラムに充填を小さくすることである．
以降，高速分離LCとして世界で最初に上市されたWatersされることでその充填密度が高まり，その結果として移動相送液時の背圧が高まることである．これまでのHPLCシステのUltra Performance LC（UPLC）におけるこれらの課題にムでは，その最大使用圧力が５０００psi程度であるから３ µm対する対策について詳細を示していく．の粒子径のカラムでは１００〜１５０mmのカラム長さが実用上の限界であった．また，粒子径２ µm程度のゲルを合成し て

２．
１．カラム充填用ゲルの改良と高速分離用カラムの開発

も，シリカベースの充填剤では，それ自体の耐圧が５０００psi

２ µm以下の粒子径が均一なゲルを合成し，厳密な規格が程度であることから高圧下では使用できない．これらの課題得られるよう再現性よく充填すること自体も困難な課題であを解決するには，LCシステム及びカラム充填剤の耐圧を改る．図３に，ラボでよく用いられる５ µmのゲルと１．
７µmの善し，さらに高圧下での充填技術を確立しなければならなゲルの違いを同じ倍率で撮影した毛髪のSEM写真とともにい．

示す．細孔がない粒子は機械的な強度は増すが，その表面積粒子径が小さくなると理論段高が向上し，ピーク幅が狭まが減ることで負荷量とピークキャパシティが落ち，粒子径をるすなわち，より濃縮されて検出されることになる．した

小さくしてカラム効率を高める意義を損なうことになる．

がって，感度の向上も付加的に期待されるが，その結果を得HPLCと同等の負荷量を維持し，それ以上のキャパシティを―７６―Chromatography, Vol.28 No.2 (2007)

Tatsuya Ezaki, Naomi Tanaka

図６

超高速高分離LCにおける低容量セルの構造データを取り込める技術が必要となる．図５に，サンプリングレートによりどのようにクロマトグラムが変化するのかを
図５示す．図３から遅くとも１０Hz以上，好ましくは２０Hz以上で高速LCにおけるサンプリングレートによるクロマトグラムの変化データを取り込む必要があることがわかる．
また，２ µm前後の粒子径のカラムにおける分離という利得るには，多孔性でなければならない．Watersは，多孔性で点を有効に維持するには，光学系検出器セル内における拡散あっても機械的強度が高く，耐アルカリ性の高いゲルであるを最小限に抑える必要がある．セル容量を抑えるためには，エチレン架橋されたポリエトキシシラン（BEH Technology

一般的に光路長を短くするか，受光面を狭めるしか方法がなによる高耐圧ゲル：図４）を開発し，この高耐圧ゲルに関すい．しかし，光路長を短くした場合には感度が犠牲になり，る特許［５］を取得した．このゲルは，２００００psi以上の耐圧受光面を狭めた場合には検出に用いられるUVの強度が弱ま性を有しているので，充填密度を容易に最適化できるだけでりダイナミックレンジが犠牲となる．UPLCでは，どちらもなく，分析時における粒子破砕による閉塞などのトラブルが犠牲にすることなくµL以下のセル容量を実現した．光路長起きにくい．また，小さな粒子ほど充填する素管の内壁は滑は従来通りの１０mmであるが，図６に示すPTFEでコーティらかである必要があり，エンドフィッティングは目詰まりしングされたセルを用い，受光面に対して斜めに入ってきたないようにするだけでなく，配管内径とのバランスでその厚UVも全反射により有効に活用する．これにより，従来のLCさを最適化した設計にしなければならない．と変わらないUV強度を得ることができ，十分なダイナミックレンジが確保される．

参考までに，これまでにHPLCによる分析に使用されたと

２．
４．トータルシステムと配管接続報告されている最小の粒子径は０．
６７µmである［６］．

微粒子カラムによる分離性能を最大限に引き出すために

２．
２．送液ポンプの開発
高圧下において種々の溶媒でグラジエント分析を行うこと

は，セル容量だけでなくシステム容量を低減する必要があを想定した場合，広い圧力範囲において溶媒圧縮率を補正でる．UPLCシステムでは，各ユニット間などを結ぶ配管長がきる必要がある．UPLCシステムにおける送液ポンプは，独最短となるよう位置関係を設計の段階から考慮した．

立駆動のプライマリーピストンチャンバーとアキュウムレー

また，高圧下で使用されることを考慮すると，配管接続部ターピストンチャンバー各１基を一式とした２式による高圧位におけるシール性は重要である．接続部位では，フェルーグラジエントシステムである．各吐出部に配置された圧力トルの固定される箇所の配管外面をよく研磨し，シール性を高ランスデューサーからの情報を連続的にフィードバックし，めている．これにより，弱い力でも十分にシールし，繰り返各ピストンの動作速度に反映することが，より高精度で安定し使用することができる．

した送液を可能にする．また，プランジャーシールなどの各
３．高速分離LCへのメソッド移管シール部位では厳格な機密性を得るために，加工精度や研磨同じ長さのカラムであれば，充填剤の粒子径を小さくする技術を高める必要がある．

ことで分離能を高めることができる．粒子径（dp）を小さく

２．
３．光学系検出器
２ µm前後の粒子径のカラムを利用したLCシステムで得らすると同時に長さ（L）を比例関係で短くしていくと分離能れるピークの半値幅は，理論上１秒程度になる．ピークを波は同等となる．そこで，分析を短時間化することを目的とす

形解析において，再現性よく正確に認識できるだけの十分なる場合のメソッド移管の事例と分離改善を目的としたメソッデータポイント（１ピーク中に１５ポイント）がピーク内にカド移管について計算例を示す．

ウントされるよう，検出器では高いサンプリングレートで３．
１．分析の短時間化を目的としたメソッド移管―７
７―

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テム耐圧及び，カラムに用いる充填ゲルの耐圧を高めることの必要性と重要性が明確になる．参照するためのクロマトグ
ラムとして，分離能の極めて高い１５cmカラムで朝鮮人参中の成分を抽出した成分（天然物）を分析した事例を図８に示します．
４．おわりにUPLCを用い分離を改善することは，メタボローム研究における多成分で構成される試料の分析［７］［８］に有効であるだけでなく，夾雑物質の多い食品または環境中に残留する農薬のLC−MS分析［９］［１０］においても有効である．
また，分析時間を短縮することは，ハイスループットスク
図７

リーニングを必要とする創薬の基礎研究において有用である

分離度Rsを維持した超高速LCへの分析法移管［１１］［１２］．
分離という観点から，このHPLCにおける高速，分離分析技術を考えると，キャピラリーGCが発表され，１０年かからずにパックドカラムからキャピラリーカラムへの移行が進んだことを思い浮かべる人は少なくないであろう．今後，製造業においては，より厳格な品質管理，より高い生産性，さらには迅速な開発が要求され，その厳しい環境においてLCの高速・分離技術がより活用されることを期待している．
References[1]

J.J. van Deemter, F.J Zuiderweg, and A. Klinkenberg,
Chem. Eng. Sci., 1956, 5.

[2]

N.Wu, J.A. Lippert and M.L. Lee, “Practical Aspects of Ultra −high Pressure Liquid Chromatography, J.Chromatogr.
2001, 911.

図８

朝鮮人参から抽出された成分の超高速高分離LCによる分析事例[3]

N. Wu, D.C. Collins, J.A. Lippert, Y. Xiang and M.L. Lee,
“Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography/ Time−of−
Flight Mass Spectrometry for Fast Separations”, J.Microcol.

分析時間を短くする目的で，HPLCからUPLCへメソッド

2000, Sep. 12, 462.

移管する場合には，L/dpの値を保つようにカラム長さを決定[4]する．

Anton D. Jerkovich, J. Scott Mellors and James W. Jorgenson, “The Use of Micrometer−Sized Particles in Ultra Pres-HPLCで用いているカラムの長さが１５０mmで，充填剤粒子径が５ µmの場合にL/dpは，sure Liquid Chromatography”, LCGC North America 2003,
21 (7)

L/dp =１５０／０．
００５＝３００００となる．粒子径が１．
７µmのカラムを用いる場合には，
L =３００００×dp =３００００×０．
００１７=５１mm[5]US. Patent No. 6, 686, 035 B 2.

[6]

J.M. Cintron, L.A. Colon, “Organo−silica Nanoparticles
Used in Ultrahigh−Pressure Liquid Chromatography”, The

５０mmのカラムを選択すればよいことになる．

Analyst, 2002, 127, 701−704.

この理論に基づきメソッド移管をおこなった場合のクロマ[7]

トグラムを図７に示す．充填密度を各粒子径に応じて最適化

Yin P, Zhao X, Li Q, Wang J, Li J, Xu G, “Metabonomics

することで，理論どおりのメソッド移管が可能になる．

study of intestinal fistulas based on ultra performance liquid

３．
２．分離改善を目的としたメソッド移管

chromatography coupled with Q−TOF mass spectrometry(UPLC/Q−TOF MS).”, J Proteome Res., 2006, 5, 2135−

分離度を高める目的で，HPLCからUPLCへメソッド移管

2143.

する場合には，L/dpの値が高まるようにカラム長さを決定す[8]

る．分離度はカラム長さの平方根に比例するので，４．
１．で計Wang G, Hsieh Y, Cui X, Cheng KC, Korfmacher WA, “Ul-算した事例を基準に考えると，粒子径１．
７µmの微粒子カラ

tra−performance liquid chromatography/tandem mass spec-ムであっても１０cm以上の長さを必要とする．ここで，シスtrometric determination of testosterone and its metabolites in―７８―

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Tatsuya Ezaki, Naomi Tanaka

2006, 1109 (2) 222−227

in vitro samples.”, Rapid Commun Mass Spectrom., 2006,[11] Mensch J, Noppe M, Adriaensen J, Melis A, Mackie C,20, 2215−2221.
[9]Kovalczuk T, Jech M, Poustka J, Hajslova J, “Ultra−per-Augustijns P, Brewster ME, “Novel generic UPLC/MS/MS

formance liquid chromatography−tandem mass spectrome-

method for high throughput analysis applied to permeability

try: A novel challenge in multiresidue pesticide analysis inassessment in early Drug Discovery.”, J Chromatogr B

food.”, Anal Chim Acta. 2006 Sep 1, 577, 8−17.

Analyt Technol Biomed Life Sci., 2006.

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