P37

公益財団法⼈発酵研究所 第14回 助成研究報告会
2020/06/05

結晶性酸化鉄を還元する新規な微⽣物の分離培養と代謝メカニズムの解明
⻘柳 智（⽯巻専修⼤学共創研究センター、現 産業技術総合研究所環境創⽣研究部⾨）e-mail: aoyagi-to@aist.go.jp

背景と⽬的
鉄は地殻構成元素の第４位であり、地球の⼤部分を占める嫌気⼟壌圏には様々な結晶性酸化鉄が豊富に存在する。そのため、その⽣物学的還元反応は地球の炭素・エネルギー循環を理解する上で重要であるものの、結晶性酸化鉄を還元する微⽣物に関する知⾒は乏しい。我々はこれまでに様々な⾃然環境試料を接種源に結晶性酸化鉄（Goethite、Hematite、Lepidocrocite、Magnetite）による集積培養系を構築し、そこから新規な鉄還元菌６種を分離培養してきた。これらの新規な細菌は、結晶性酸化鉄に電⼦を伝達する特別な代謝系を持つことにより、貧栄養環境下においても⽣き続けられると予想される。本研究は、結晶性酸化鉄での集積培養系から分離したDeltaproteobacteria綱の新規細菌6種の⽣理学的特徴付けとゲノム解読による還元メカニズムの解明、加えて、さらなる新規な当該微⽣物の⾼度集積・分離培養を試みた。ここでは分離菌の⽣理学的特徴付けとゲノム解読の結果について報告する。

材料と⽅法● ⼟壌圏に存在する様々な結晶性酸化鉄
Oxyhydroxides/ΔG0’(kJ/mol)
Formula

Mineral

MineralOxides/Formula

ΔGo’(kJ/mol)

Goethiteα(FeOOH

(488.9

HemaFteα(Fe2O3

(742.8

Akageneiteβ(FeOOH

(752.7

Ferrihydrite

Fe5HO84H2O

(699.0

Lepidocrocite

γ(FeOOH

(477.7

MagneFte

Fe3O4

(1016.1

Feroxyhyteδ’(FeOOH

notCknownMaghemiteγ(Fe2O3

(711.1

Schwertmann and Cornell, Iron oxides in the laboratory, (2000)

実験１ 結晶性酸化鉄での培養試験
Goethite

分離菌の系統学的位置
Geobacter bremensis Dfr1T (U96917)

98

Geobacter humireducens (AY187306)

99

Geobacter uraniireducens Rf4T (EF527427)

99

Geobacter daltioni FRC-32T (EU660516)
99

Geobacter toluenoxydans TMJ1T (EU711072)

AOG2 (LC008328)

63
100

Geobacter thiogenes K1T (AF223382)
Geobacter lovleyi SZT (AY914177)

99

100

Geobacter psychrophilus P35T (AY653549)

58
79

Pelobacter propionicus DSM 2379T (NR_074975)

26

AOG3 (LC008329)AOG1 (LC008327)

99

Geobacter luticola OSK6T (AB682759)

44
31 45

対照区
● 既知菌3種︓Geobacter sulfurreducens、G. bemidjiensis、G. pelophilus● 菌体無添加系および各菌をオートクレーブ処理し添加した滅菌系を⽤意

Geobacter argillaceus G12T (NR_043575)

AOG5 (LC008330)

100

Geobacter pelophilus Dfr2T (U96918)

57

AOG4 (LC008331)

71

Magnetite分析項⽬
● 鉄還元︓⾼濃度塩酸による鉄抽出、フェロジン法での⼆価鉄・全鉄の定量● 酢酸酸化︓HPLCによる酢酸の定量

Geobacter chapellei 172T (U41561)

67

Lepidocrocite

培養条件● 電⼦受容体︓Goethite (20 mM)
Hematite (10 mM)
Lepidocrocite (20 mM)
写真︓分離菌を結晶性酸化鉄で培養する前（左）と6ヶ⽉以上培養した後（右）Magnetite (10 mM)● 電⼦供与体︓酢酸 (5 mM)● 培養期間︓30⽇（菌体量を⼀定にして培養開始）● 培養温度︓25℃ （静置）● 気相︓N2/CO2 (80%/20%)

Geobacter bemidjiensis BemT (AY187307)

100

Hematite

Geobacter pickeringii G13T (DQ145535)
Geobacter sulfurreducens PCAT (NR_075009)

74
96

Geobacter hydrogenophilus H-2T (NR_025974)

100

Geobacter grbiciae TACP-2T (AF335183)

実験２ ゲノム解読

94 Geobacter metallireducens GS-15T (NR_075011)

Pelobacter seleniigenes KMT (NR_044032)

100

Pelobacter acidigallici MaGa12T (X77216)

AOP6 (LC008332)

4270

Pelobacter cabinolicus DSM 2380T (NR_075013)

98
94

Pelobacter venetianus Gra PEG 1T (NR_044779)
Pelobacter acetylenicus WoAcy1T (NR_029238)
Geoalkalibacter subterraneus Red1T (EU182247)

ライブラリ● Paired-end library︓insert size 〜500 bp● Mate-paired library︓insert size 〜3,100 bp

Hydrogenobacter thermophilus TK-6T (Z30214)

0.05

T. Hori, T. Aoyagi, et al., Front. in Microbiol. (2015)

結果と考察
初めに結晶性酸化鉄の還元を評価するための鉄抽出⽅法を検討した。⼟壌等の環境
試料では0.5N塩酸により鉄を抽出するが、この⽅法では結晶性酸化鉄はほとんど抽出されないためである。ここでは、４種の結晶性酸化鉄（Goethite [20 mM]、Hematite[10 mM]、Lepidocrocite [20 mM]、Magnetite [10 mM]）に対し、2N、2.5N、3N、6Nの塩酸で抽出を⾏い、それぞれの⼆価鉄および全鉄を定量した。
全鉄

鉄濃度 (mM)

1210● Hematite、Lepidocrocite、Magnetiteは8

⾼濃度の塩酸により鉄の抽出効率が向上し、6Nで投⼊した鉄濃度と同等の全鉄の抽出を達成

64
206N

3N

2.5N

シークエンス︓MiSeq (Illumina)、250 x 250 bp
アセンブラー︓allpathslg ver.46449(2-1) 分離菌のドラフトゲノムアセンブル(1-1) ⾼濃度塩酸による結晶性酸化鉄抽出の最適化

⼆価鉄● コンプリートゲノム解読（AOP6のみ）
プレアセンブラー ︓Unicycler ver.0.4.8
アセンブラー︓SPAdes ver.3.13.0
ギャップクローズ ︓ PCR/サンガーシークエンス 3730xl (ABI)
アノテーション ︓ DFAST ver.1.2.2

2N

塩酸濃度

● Goethiteは上記の3種ほどではないが、⾼濃度塩酸により抽出効率が向上

図︓異なる塩酸濃度で抽出した際の10mM Hematiteの⼆価鉄、全鉄濃度(1-2) 結晶性酸化鉄に対する分離菌の還元能
分離菌6種は4種の結晶性酸化鉄に対して還元活性を⽰し、既知鉄還元菌 G.
sulfurreducensやG. bemidjiensis、G. pelophilusよりも⾼い濃度の⼆価鉄の⽣成が観察されたが、AOG3、AOG4はいずれもLepidocrociteに対する還元活性のみ既知鉄還元菌よりも低かった。⼀⽅で、AOG1はLepidocrociteに対して、AOG5はGoethite、Hematite、Lepidocrociteに対して、既知鉄還元菌と⽐べて2〜4倍の⼆価鉄がに⽣成した。このことは、分離菌がこれまで知られていない細胞外への電⼦伝達機構を有することを強く⽰唆している。

AOG1



AOG2

＊AOG4、AOG5は現在データ取得中
AOG5
AOP6

AOG3

PE/MPPE

MPPE

MPPE

MPPE

MP

PEMP

Number+of+reads

1,950,584

800,232

2,122,640

725,682

1,981,504

836,208

1,992,030

648,678

1,965,922

897,7

Sequence+coverage

111.2

49.5

106.6

42.3

84.2

35.4

95.7

33.2

118.8

63.3

Number+of+valid+pairs+
assembled

925,639

367,461

993,962

325,895

848,690

312,067

929,487

284,343866,943408,43,755,042

4,073,310

4,483,750

4,317,774

3,235,45598955

Largest+conIg

1,239,746

2,483,994

2,685,659

2,304,067

1,135,596

GC+(%)

57.37

57.2

56.97

58.08

56.57

N50

1,125,079

2,483,994

2,685,659

2,304,067

1,001,157

Total+length
Number+of+conIgs(2-2) AOP6コンプリートゲノム解析
環状ゲノムサイズ︓ 3,269,909 bp
GC含量︓56.44%
rRNA数︓2

CDS数︓3,000
type IV pili CDS数︓31tRNA数︓50
CRISPR 様座位数︓2c-type cytochrome
CDS数︓71

結晶性酸化鉄への電⼦伝達メカニズムは未知遺伝⼦が関与する可能性が⾼い。今後、取得したゲノム情報と結晶性酸化鉄での培養試験を融合させた⽐較ゲノムや網羅的遺伝⼦発現解析により、分離菌の代謝メカニズムの解明を進めてゆく。

Desulfuromonas sp.
AOP6
3,269,909 bp
G+C content, 56.44%

Y. Guo, T. Aoyagi, et al.,Microbiol. Resour. Announc. (2020)

まとめと展望● 分離菌AOG5は、結晶性酸化鉄に対して⾼い還元活性能を有し、特に⾼結晶性のGoethiteとHematiteを唯⼀還元
à 結晶性酸化鉄への電⼦伝達のメカニズムをゲノム情報を基に解明してゆく