バイオテクノロジスト

バイオ技術最前線②

ゲノム編集技術の発展と海外の実験教育
大藤道衛
専門学校東京テクニカルカレッジ・バイオテクノロジー科
ゲノム編集技術の根幹は、細胞内でDNAが切断されたトすることで作出した褐変しにくいマッシュルームが、米後、細胞がもつ修復機構による切断部位への変異導入ある

国農務省（USDA）の規制範囲外とされ流通が可能となっいは相同組換えによるDNA断片の挿入による遺伝情報のた 。我国においては、高濃度のγアミノ酪酸（GABA）改変である 。この技術で重要な役割を果たす分子が、人を含むトマト（GABA高蓄積トマト）がCRSPR-Cas9を用工制限酵素でありゲノム編集ツールと呼ばれている。1996

いたゲノム編集技術により開発され 、厚生労働省への届

年に報告されたDNA結合ドメインとDNA切断ドメインをけ出を経て、2021年より家庭菜園向け苗の提供、青果物のもつDNA人工制限酵素Zincフィンガータンパク質 よりゲ販売が開始されている。

1）

2）

8）

9）

ノム編集技術は生まれ（第一世代）、2010年に報告された

一方、RNA誘導型酵素のCasファミリーのうちCas12a、。しかし、人工制限酵
TALEN へと進展した（第二世代）

Cas13、Cas3などは、 1 本鎖DNAをランダムに切断するコ素の調製や実験の煩雑さから、なかなか普及には至らなかラテラル切断活性（collateral cleavage activity）を有する。

った。

このようなCasを用いたCRISPR-Cas系による核酸の高感度

3）

一 方、2012年 に 報 告 さ れ たRNA誘 導 型 酵 素 系 で あ る検出法が開発され、SARS-CoV-2検出法として活用されて

CRISPR-Cas9 に よ り、 ゲ ノ ム 編 集 技 術 の 汎 用 性 が 高 まいる。実際の検出では、まずウイルスのRNAを逆転写してり、現在では生命科学研究の基礎技術のみならず、バイオDNAとして増幅する。続いてガイドRNAが目的とするウイテクノロジーの基盤技術として広く応用されている（第三ルス塩基配列を捉えCas酵素が切断する際に、色素等が結世代）。RNA誘導型酵素は、DNA切断ドメインをもつCas9合した 1 本鎖オリゴヌクレオチドプローブを共存させる。

ヌクレアーゼであり、標的遺伝子に対するガイドRNAが認

ここで、コラテラル活性により 1 本鎖プローブは切断さ識するDNA配列を、特異的に 2 本鎖切断（DSB）することれ、オリゴヌクレオチドプローブならびに切断された低分が可能である 。DSB部位では、非相同性末端結合（NHEJ）子核酸となる。これらの核酸を認識する特異的な抗体を用で生ずる塩基の挿入・欠失などの修復エラーにより遺伝子いてイムノクロマトを行うことでプローブの切断が起こっのノックアウトが可能である。一方、外来遺伝子をドナーたか否か、すなわちウイルスの塩基配列の有無を簡便に検DNAとして共存させるとDSB部位での相同組換え（HR）に出できるよる遺伝子ノックインも可能である。これは、遺伝子組換え

出 系 に は、Cas12aを 用 い たDNA Endonuclease-Targeted

実験と同じであるが、遺伝子の挿入部位が正確に決められCRISPR Trans Reporter（DETECTR） 、Cas13aを 用 い たる。実験では主に化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）

Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing

由来のCas9が用いられてきたが、より低分子の黄色ブドウ（SHERLOCK） 、Cas3を用いたCas3 Operated Nucleic Acid

球菌（Staphylococcus aureus）由来Cas9も使われている 。

detectioN（CONAN） がある。

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1）

5）

2020年、CRISPR-Cas系の開発者であるEmmanuelle CharpentierとJennifer A. Doudnaが、ノーベル化学賞を受賞している 。

。PCRを用いず等温増幅法を組み合わせた検10, 11, 12）

10）

11）

12）

いずれもCasコラテラル活性を用いることで、短時間で微量の核酸を検出できる。
このようにゲノム編集技術が急速に発展する中、ゲノム6）

ゲノム編集技術は遺伝子改変によるモデル動物をはじリテラシー教育においても実体験を通じてゲノム編集を学め、遺伝子ノックアウト動物の報告がなされている 。まぶ教材が、米国バイオ企業で開発され学校教育で活用された、NHEJで生ずる変異による遺伝子ノックアウトは、農作ている。このキットはBio-Rad Laboratories社 が開発し、物の育種技術にも活用されている 。2016年には、CRISPR-

Out of the Blue CRISPR kitとして、2020年より米国内で市Cas9系によりポリフェノールオキシダーゼをノックアウ販されている。

1）

7）

10

（注）

バイオ技術最前線
実験は、大腸菌の平板培養系にて実施する。実験ではβナー DNAの相同組換え（HR）による挿入を行った大腸菌ガラクトシダーゼ遺伝子（LacZ）ならびにCas9とDNA修復のコロニーは青く発色せず、βガラクトシターゼがノック系を有する大腸菌に、LacZの一部を標的とするガイドRNAアウトしていることを視覚的に観察できた（図 2 ）。さらを導入し、CRISPR-Cas9の系で特異的にLacZを切断（DSB）に、ドナー DNAを認識する特異的プライマーをもちいたする。このときDNA修復系によりストップコドンを含むPCR増幅と電気泳動結果から～650 bp付近にドナー DNAドナー DNAがLacZに相同組換え（HR）で挿入されると、の挿入が確認できた（図 2 、（←））
。この結果には再現性

LacZはノックアウトされβガラクトシダーゼが不活化すがあり、キットに付属する生徒・学生用マニュアル、教師る。この実験は、βガラクトシダーゼの人工基質である用マニュアルを用いることで実験を含む授業に容易に活用X-galが含まれた培地を用いて行っている。このためβガラできることが示唆される。

クトシダーゼが正常に機能する場合は、X-galが分解され青

米国では、このような教育キットが、大学等の高等教育色の色素が生成され青いコロニーが形成される。一方、相機関ばかりでなく、高等学校や中等教育機関の実験授業に同組換え（HR）によりドナー DNAが挿入されたLacZからおいて用いられ、ゲノム編集を身近な技術として理解する

は活性型のβガラクトシターゼが発現しないため、白いコ素地を作っている。

ロニーが形成される（図 1 ）。このように、コロニーの色

2022年 6 月27日のニューヨーク・タイムスは、“CRISPRの違いで、ゲノム編集による遺伝子ノックアウトの有無をin the Classroom”と題し、この製品を用いた現場の教員か判別できる。さらに、挿入されたドナー DNA断片の有無らの感想や評価が紹介され注目されている 。
13）を、挿入部位を認識する特異的なプライマーを用いたPCR

新しいバイオ技術や遺伝子解析技術の普及は、医療、農増幅と電気泳動解析により検出できる。本キットには、プ業、産業に新たなイノベーションに繋がっている。これにラ イ マ ー を 始 め 全 て の 試 薬 が 含 ま れ て い るGenotyping

伴い、一般市民のゲノムリテラシーの醸成には、新しい技Extension Kitがオプションとして市販されている。この製術に触れ体感できる実験教育が重要である 。ゲノム編集

品は、電気泳動解析によりゲノム編集の分子メカニズムも技術は、医学研究や育種に貢献しているばかりでなく、新学べる実験系である。

たな高感度検査方法の開発にも寄与している。そして教育14）

実際に本キットを用いた結果では、ガイドRNA添加系で現場にてゲノム編集実験を行うことは、生徒・学生、一般

はCas9に よ るLacZのDSB後、 ス ト ッ プ コ ド ン を 含 む ド

市民がゲノム編集技術の有用性を理解し、社会実装におけドナーDNA－ガイドRNA

ドナーDNA＋ガイドRNA
LacZ

LacZ
Cas9導入大腸菌

DSB

修復系ON/OFF

図1

大腸菌のゲノム編集

DNA修復系を含むCas9組換え大腸菌へのドナー DNA（ストップコドンを含むDNA断片）の挿入。培地には人工基質（X-gal）が含まれており、LacZ が発現するとコロニーは青くなる。一方、ガイドRNAを加えた系では、Cas9によるLacZ の切断（DSB）、修復系によるドナー DNAの挿入（HR）が起こりLacZ はノックアウトされることで、LacZ の発現は抑制され白いコロニーとなる。

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バイオテクノロジスト

図2

実際のノックアウト実験とPCR-電気泳動の結果修復系（＋）：修復酵素反応（HR）あり、修復系（－）：修復酵素反応（HR）なし、ガイドRNA（＋）：LacZ の切断（DSB）あり、ガイドRNA（－）：LacZ の切断（DSB）なし、コロニー（＋）：青色コロニー、コロニー（－）：白色コロニー
電気泳動実験サンプル
C：プレートCのコロニーから抽出したDNAサンプル（ドナー DNA断片未挿入。青コロニーの大腸菌）、M：塩基対マーカー＊（1,000、700、500、200、100 bp）、PC：陽性コントロール （～ 1,100、～ 650、～ 350 bp）、D1、D2： プレートDのコロニーから抽出したゲノム編集DNAサンプル（ドナー DNA断片挿入。白コロニーの大腸菌）＊PCの各DNA断片サイズ：～ 1,100 bp DNA断片は、ドナー DNA未挿入の対照実験、ドナー DNA配列挿入サイトのプライマーによる増幅産物；～ 650 bp DNA断片は、ドナー DNA配列のプライマーによる増幅産物（図中←表示）；～ 350 bp DNA
断片は、PCR増幅の対照実験でありLacZ 以外のゲノムDNA上のプライマーによる増幅産物。

る問題点を科学的な視点から議論できる素地を作ることに

Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive

なる。日本においてもゲノム編集技術は、医学研究や遺伝

Bacterial Immunity. Science 337: 816-821.（2012）

子検査、さらにはGABA高蓄積トマトを始め、ゲノム編集

doi: 10.1126/science.1225829

農作物の社会実装が始まっている。すでに先行している米

5）Ran FA, Cong L, Yan WX, et al. In vivo genome editing

国の教育事情に目を向け、我国の教育事情に適応したゲノ

using Staphylococcus aureus Cas9 Nature 520: 186–191

ムリテラシー教育を模索することが必要であろう。

（2015）（注）Bio-Rad Laboratories社は、教育機関向けの分子生物学実験教

doi: 10.1038/nature14299

材シリーズとしてBio-Rad Explorerを1990年代から市販している 。同社からは、日本においても教育目的遺伝子組換え実6）The Nobel Prize in Chemistry15）験 として高等学校等の教育機関で実施できるpGLO Bacterial
16）

Transformation kit（GFP遺伝子を大腸菌に導入し、遺伝子発現を蛍光で観察できる遺伝子組換え実験キット）を始め、様々な教育キットが市販されている。

https://www.nobelprize.org/prizes/chemistr y/2020/
summary/7）江面浩：ゲノム編集食品の動向と高GABAトマトの開発・実用化について 野菜情報（独立行政法人 農畜産振興機構）2020年 1 月号：34-40.（2020）

参考文献
1）永井慎 ゲノム編集 バイオテクニシャン 24（2）: 5-9.
（2016）

8）Waltz E Gene-edited CRISPR mushroom escapes US
regulation. Nature 532: 293.（2016）
doi: 10.1038/nature.2016.19754

2）Kim YG, Cha J, and Chandrasegaran S. Hybrid9）Nonaka S, Arai C, Takayama M et al. Efficient increase

restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok Iof ɣ-aminobutyric acid（GABA）content in tomato fruits

cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 1156–

by targeted mutagenesis. Sci. Rep. 7:7057.（2017）

1160.（1996）

doi: 10.1038/s41598-017-06400-y

doi: 10.1073/pnas.93.3.1156
3）Christian M, Cermak T, Doyle EL, et al. Targeting DNA

based detection of SARS-CoV-2 Nat. Biotechnol. 38:

double-strand breaks with TAL ef fector nucleases.

870–874.（2020）

Genetics 186:757-761.（2010）

doi: 10.1038/s41587-020-0513-4

doi: 10.1534/genetics.110.120717. Epub 2010 Jul 26.
4）Jinek M, Chylinski K, Fonfara I A, et al. Programmable1210）Broughton JP, Deng X, Yuet G, et al. CRISPR–Cas12-11）Patchsung M, Jantarug K, Pattama A, et al. Clinicalvalidation of a Cas13-based assay for the detection ofバイオ技術最前線
SARS-CoV-2 RNA. Nat Biomed Eng 4: 1140-1149.（2020）14）大藤道衛 遺伝子解析技術とゲノムリテラシー教育
医療と検査機器・試薬43:268-275.（2020）

doi: 10.1038/s41551-020-00603-x
12）Yoshimi K, Takeshita K, Yamayoshi S, et al. CRISPRCas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and influenza
virus. iScience 25: 103830.（2022）

15）Bio-Rad Explorer
http://explorer.bio-rad.com
16）高等学校等において教育目的で行われる遺伝子組換え

doi: 10.1016/j.isci.2022.103830. Epub 2022 Jan 30.

実験の「遺伝子組換え 生物等の使用等の規制による13）Lutz E. CRISPR in the Classroom The New York Times

生物の多様性の確保に関する法律」における取扱いに

June 27, 2022.

ついて（文部科学省 平成16年 2 月18日）

https://www.nytimes.com/interactive/2022/06/27/

https://www.biodic.go.jp/bch/download/law/notifica

science/crispr-anniversary-classroom-explainer.html

tion_mext_E16021.pdf◆著者紹介
大藤 道衛 Michiei Oto

専門学校東京テクニカルカレッジ・バイ

主 な 著 書：「ゲノム情報解析－次世代オテクノロジー科講師、1980年千葉大学シーケンサーの最新の方法と応用－」共園芸学部農芸化学科卒、医学博士（東京

監訳NTS（2016）、「そこが知りたい！電医科歯科大学）。日本バイオ技術教育学

気泳動なるほどＱ＆Ａ改定版」羊土社

会顧問、日本電気泳動学会評議員、日本（2012）、「バイオ実験超基本Q＆A 改訂

DNAアドバイザー協会理事。

版」 羊土社（2010）他。
専門分野：DNA診断技術、遺伝子リテ
ラシー教育13