Chromatography, Vol.29 No.2 (2008)

Focusing Review

Focusing Review

親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）―開発の背景，および分離モードの特徴
池上亨，田窪宏貴，田中信男

A Perspective of Hydrophilic Interaction Chromatography―Development and the Characteristics of the separation mode
Tohru Ikegami, Hirotaka Takubo, Nobuo Tanaka
Department of Biomolecular Engineering,Graduate School of Science and Technology,
Kyoto Institute of Technology, Matsugasaki, Sakyo−ku, Kyoto 606−8585
Received for review July 22, 2008. Accepted September 4, 2008.

Abstract
Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) has been focusing attentions of chromatographers in these years, because it is important anduseful for the separation of highly polar analytes such as pharmaceutical drugs, neurotransmitters, nucleosides, nucleotides, amino acids, peptides, proteins, oligosaccharides, carbohydrates, and so on. Aqueous organic solvents are used as mobile phases on more polar stationary
phases in the HILIC mode separation. A variety of stationary phases including bare silica, and silica phases modified with amino, amide,
zwitterionic functional group, polyols including saccharides and other polar groups are used in the separation mode. This review discusses thevariation and the historical view of the stationary phases, and column efficiency of HILIC stationary phases in relation to solute and stationary
phase structures to provide a perspective of HILIC type stationary phases, and their separation efficiencies and retention tendencies.
Keywords:
分離モードである。古典的な順相クロマトグラフィーには非緒言
近年，親水性相互作用型クロマトグラフィー（HILIC）に水溶性の有機溶媒を移動相に用いることが多く，親水性の化関する文献と研究の数は劇的に増加している。これは HILIC

合物の中にはこの溶媒系に溶解しないため分析できないといに用いる様々な固定相が開発され，各メーカーから発売されう問題があった。HILIC モードが高極性化合物の分離を研究始 め た こ と に よ る。HILIC は 順 相 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

する様々な科学的分野の研究者たちの注目を集めているの（NPLC）の一種であり，水と有機溶媒（多くの場合アセト

は，移動相が水系であり，高極性の化合物も溶解，分析でき

ニトリル）の混合溶液と，それより高極性の固定相を用いるるという特徴に依っている。HILIC モードでは，移動相に有

京都工芸繊維大学 大学院工芸科学研究科 生体分子工学部門〒６０６―８５８５ 京都市左京区松ヶ崎御所海道町
電話：０７５―７２４―７８０１
FAX：０７５―７２４―７７１０―１―

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機溶媒を多く含み，イオン化効率が良いため，Electrospray

どの場合でグラジエント分析が行なわれている。これについIonization−Mass Spectrometer（ESI−MS）を検出部に用いた分ては Naidong が詳細な総説を書いている［４］。主要なカラム

析に適している。

は Betasil（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）［５］，Hy-

HILIC モードでは，古典的な未修飾シリカに加えて，アミpersil（Thermo Scientific）［６］，Inertsil（GL Science, Tokyo, Ja-

ノプロピル基，アミド基，ジオール，シアノ基，ポリスクシpan）［７］，Kromasil（EKA Chemicals, Göteborg, Sweden）

ンイミド誘導体，双性イオン，シクロデキストリンのような［８］，Atlantis（Waters）［９―１１］な ど で あ る。Naidong の 総

多様な高極性官能基が修飾されたシリカゲルが分離に適応可説の時点では充填剤の粒子径は５µm であったが，近年は３能である［１］。

µm の粒子を充填したカラムも用いられている［９―１１］。Ac-

スルホキシル化ポリマーやジオール基を含むポリマーのよ

quity（Waters）は１．
７µm の粒子を充填したカラムであり，うなポリマー基材の固定相も使用可能である［１］。HILIC は

HILIC モードの超高速液体クロマトグラフィー（UPLC）に

高極性化合物をアイソクラティックやグラジエント溶出を用用いられている［１２］。

いて分離するときに逆相クロマトグラフィーの代替モードとして使用できるが，その分離性能については未だ詳細な検討

１．
２ アミノシリカが加えられていない。一般的に HILIC モードでは逆相クロ3−aminopropyl 基を固定したシリカも HILIC モードの分離

マトグラフィーほどの分離性能は発現できないことが知られに使用可能である。１９７０年代には既に糖類の分離にアミノシている［２］。

リカのカラムが用いられ，今日 HILIC の分離条件と考えら

アミノ酸，ペプチド，糖類，ヌクレオシド，ヌクレオチド，

れる移動相中で使用されている［１，２］。主要 な カ ラ ム は神経伝達物質などの生命情報を司る極性の小分子化合物や，

YMC−Pack NH2（YMC, Kyoto, Japan）［１３，
１４］，Luna Amino

疾病の診断に用いられるバイオマーカーは HILIC を用いる

（Phenomenex, Torrance, CA, USA）［１５］，Hypersil APS2

分析の適用例が非常に多い。それらの分析例は薬化学，農（Thermo Science）［１６］，Zorbax NH2（Agilent, Santa Clara,

業・食物化学，医化学，プロテオミクス，メタボロミクス，

CA, USA）［１７］などがある。アミノシリカの分離対象は糖

グライコミクスに貢献している。

等の炭水化物［１８］，アミノ酸［１９］，ペプチド［１４］，カル

逆相クロマトグラフィーの分離場であるカラム担体は，殆ボン酸，ヌクレオシド［２０，２１］テトラサイクリン型抗生物

どの場合アルキル基を含むシリル化剤で化学修飾されたシリ質［１６］などが知られている。アミノシリカカラムの保持傾

カを用いるが，HILIC 型固定相では，化学修飾に用いられて向は独特である。それは親水性の分配相互作用とイオン交換いる官能基の構造の種類が多いことも特徴である。各種の極相互作用が両方発現する場合があるためである。従って酸性性官能基に移動相中の水が濃縮され，固定相表面に「水で濡

官能基を持つ分子の分離挙動には移動相の pH が重要な役割れた」層ができて，この層と移動相の間の分配平衡が HILICを果たす。アミノシリカカラムは NPLC と HILIC の両方にモードの分離において重要な位置を占めている，とされてい利用可能な分離媒体であるが，アミノ基の反応性がしばしばる［１］。以下に，各種の固定相とその特徴，使用例等を挙げ問題になる。カルボニル化合物の非可逆な吸着や，固定相のる。

自己分解（特に MS を検出器に用いる場合，バックグラウン
ドが高くなる）などである。

１．HILIC モードの固定相
HILIC という術語は，１９９０年に Alpert によって最初に提案

１．
３ アミドシリカ

されたが，その当時は入手可能な HILIC カラムが限られてアミド基を親水性の官能基として含むアミドシリカを充填

いたこともあり，あまり注目を集めなかった［３］。今日重要したカラムは，HILIC 型の分離媒体としては最もポピュラーとなっている HILIC 分離の例は多くが２００３年以降に発表さな分離メディアの１つである。代表的なカラム は TSKgel

れたものである。

Amide−８０（Tosoh, Tokyo, Japan）であり，単糖類［２２］，ペプチド［２３，２４］，ピリジルアミノ化糖［２５］，アンモニウム

１．
１ 未修飾シリカ

塩［２６］，アミノ酸［２７］，ポリフェノール［２８］などの分離

未修飾シリカは順相液体クロマトグラフィーの古典的な固に幅広く使用されている。このカラムは HILIC という術語

定相として，クロマトグラフィーが発明された後長年にわが提唱される前から，ペプチドや糖のマッピングに利用されたって用いられてきた。そして，最近の研究，特に液体クロている。アミド官能基は化学的に安定であるが，移動相の pH

マトグラフィーと質量分析を連結した HILIC−ESI−MS シスや塩類の添加によってクロマトグラムが変化することがあ

テムに広く使用されている。MS システムに接続される ESI

る。ごく最近，TSKgel Amide−80 のタイプのカラムで，３µm型イオン源にとって，HILIC の移動相は好都合であることにの粒子を充填したものが発売された。理論段高７µm の発現よる。未修飾シリカによる分離対象は主に生体サンプル（血が可能な，高性能の HILIC 型カラムであると言える。

液や尿等）の中の医薬品とその代謝物であることが多く，殆―２―

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ジオール結合型［４３］，シアノ基結合型のカラムも HILIC

１．
４ スクシンイミド誘導体結合型シリカ
１９８３年に Alpert は，アミノシリカのポリスクシンイミド

モードでの分離に適用可能だが，あまり分離例は知られてい誘導体化によって新しいタイプのシリカベースの固定相を合ない。ジオール結合型カラムは最近上梓するカラムメーカー

成した［２９］。ポリスクシンイミドは種々の HILIC タイプ固もあり，今後分離例が増えることが予想される。シクロデキ

定相のプラットホームと言え，スクシンイミド部分の加水分

ストリンを結合したシリカによるカラムは，本来光学分割に解やアミノリシス反応によってポリ（アスパラギン酸），ポ

用いられているが，HILIC モードで糖の分離をする際にも使リ（2−ヒドロキシエチルアスパルタミド），のポリ（2−スル

用可能で，糖鎖の効率よい分離を達成している［４
４，
４５］。ご

ホキシエチルアスパルタミド）などの固定相を調製した。こく最近発売され始めた 1,2,4−トリ ア ゾ ー ル 結 合 型 シ リ カ

れ ら の 固 定 相 を 充 填 し た カ ラ ム は PolyCAT A，PolyHy-

Cosmosil HILIC（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）は，トリアゾー

droxyethyl A，PolyGlycoplex，および PolySulfoethyl A としてルの塩基性に基づくユニークな保持力を持っている。移動相

３µm および５µm の粒子を充填したカラムが PolyLC から市を変えることによって，弱い陰イオン交換固定相としても使販されている［３］。既に報告された主な分離対象は次の通り

用できる［４
６］。
最近，ソルビトールメタクリレートをグラフト重合したシである。

リカが HILIC 用分離媒体として発表された［４７］。このよう

PolyHydroxyethyl A リン酸化アミノ酸，多糖類［３］，に，新しい分離媒体を調製する試みは続けられており，これペプチド［３０，
３１］
PolyGlycoplex

からも様々な HILIC 型固定相が現れるものと予測される。

オリゴ糖，シアル糖，多糖類［３２］PolySulfoethyl A ペプチド［３３］，塩基性化合物［３４］，２．結論

医薬品［３５］

表１は，各種の HILIC 型固定相で種々の化合物（グルーこのタイプのカラムは，他の HILIC 型分離媒体に比べてプごとに分かれている）を分離した際の理論段高である。多その分離性能（理論段数）があまり高くないことが欠点であくは雑誌に掲載されているクロマトグラムから理論段数を推るが，分離選択性の面では興味深い分離媒体である。LC−MS

算した結果得た値であり，カラム外効果も含まれているのにこのカラムを適用すると，シリカを被覆しているポリマー

で，ここに示す数値がすぐにそのカラムの性能の良否に繋がが流出することでベースラインが高くなることがある。新しるものではない。しかし，分離しようとする分子が既に決いカラムではこの現象は殆ど起こらないが，カラムを長時間まっているとき，どのカラムを選べば良いかを判断する際に使用することでポリマーの溶出が起こるようになる［３６］。

有用であると考え，ここにまとめたものである。HILIC の分
離モードでは，特定のテストサンプルを用いて種々のカラムに対し横断的な保持特性，分離性能を比較した研究がまだ少１．
５ 双性イオン結合型シリカ
分子内にアンモニウムカチオンとスルホン酸アニオンの両ない［４８］。分離対象と分離条件（カラムの選択と移動相組方を持つ，スルフォアルキルベタインを重合修飾したシリカ

成）に関しては，最近総説が発表されたので併せて参考にさが近年発売され注目を集めている。このカラムは双性イオン

れたい［４９］。HILIC を多次元 HPLC に利用したり［５０］，イに基づくアニオン分離，カチオン分離にも利用可能である。

オン交換との混合モードでの分離に応用したり［５１］する例

代表的なカラムは ZIC−HILIC（Merck Se Quant AB, Umea,

が続々と発表されており，今後も HILIC に関する研究は発Sweden）であり，ネオマイシン［３７］，モルヒネとその誘導展していくことが予想される。

体［３８］，ア ミ ノ 糖［３９］，代 謝 物［４０］，N −糖 化 ペ プ チ ド

なお，モノリス型シリカの骨格上に親水性の置換基を化学［４１］などの分離例がある。LC−MS にこのカラムを適用し修飾したカラムは，一定の圧力限界下で粒子充填型（３およても，シリカを被覆しているポリマーが流出することでベーび５µm の粒子を充填したもの）に比べて，２〜３倍速い分

スラインが高くなることは殆どないことが知ら れ ている

離条件下で同じ理論段数を発現することが知られている。将［４２］。このカラムは最も良い分離性能を与える最適線速度

来の高速分離，および高性能分離に向けて有望な分離媒体でがやや遅いことが欠点であるが，選択性や安定性を含めるとあると考えられるが，まだ市販されていないので本総説では

良い HILIC 型カラムと言える［４２］。

割愛した。興味のある読者は別の総説を参照して頂きたい［２］。

１．
６ その他の分離媒体
従来，タンパク質等親水性の分子の分離に用いられてきた―３―

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表１

HILIC 型カラムによる各種極性化合物の分離性能（理論段高）の比較

例 １０µm，芳香族カルボン酸，８５％MeCN−２０mM AB，UV
芳香族カルボン酸の分離で理論段高が１０ µm であったことを示す。この際の移動相が８５％ MeCN−２０ mM AB（緩衝液の略称は後述），検出は紫外可視検出器（UV）で行なわれたことを示す。なおこの表に挙げた理論段高は，それぞれの引用文献のク
ロマトグラムのピーク幅を基に計算したものが多く，誤差を含む値である。引用文献で分析条件の最適化が行なわれているかどうか分からない場合もあるので，この表の値が直ちに各分離媒体の分離性能を示すものではない。
検出器の略称 UV：紫外可視検出器；RI：視差屈折検出器；ESI−MS：エレクトロスプレーイオン化−質量分析計；PAD：パルスアンペロメトリー検出器；ELSD：蒸発光散乱検出器
緩衝液の略称 AB：酢酸アンモニウム緩衝液；CB：クエン酸緩衝液；FB：ギ酸ナトリウム緩衝液；PB：リン酸ナトリウム
緩衝液；TB：リン酸トリエチルアンモニウム緩衝液
未修飾シリカ酸類

アミノシリカ

10 µm，芳香族カルボン酸，85% MeCN−20 mM AB， 44−60 µm，芳香族カルボン酸，85% MeCN−20 mM
UV［１３］
AB，UV［１３］塩基類20−35 µm，アミノアルコール，80% MeCN，RI［１７］−アミド，尿素類 10 µm，サリチルアミド，85% MeCN−20 mM AB，
UV［１３］
ポリオール類50 µm，サリチルアミド，85% MeCN−20 mM AB，
UV［１３］

21−25 µm，エ ピ ル ビ シ ン，90% MeCN，20 mM FB 13 µm，3 µm column，テ ト ラ サ イ ク リ ン，85%(pH 2.9)，UV［８］MeCN，1 mM CB (pH5)，UV［１６］

アミノ酸類

−

58−100 µm，アミノ酸，60% MeOH，ESI−MS［１９］

ペプチド類

−

22−95 µm，10 µm column，ジペプチド，92% MeCN
−2.5 mM AB［１４］核酸類

10−12 µm，核酸塩基，ヌクレオシド 85% MeCN−20
mM AB，UV［１３］14−20 µm，核酸塩基，ヌクレオシド 85% MeCN−20
mM AB，UV［１３］糖類

33−43 µm by a 3 µm column，グルクロン酸誘導体，
87% MeCN−100 mM AB［１１］43−180 µm by a 10 µm column，二糖，85% MeCN
［５２］

備考

非可逆的吸着が起こりやすい

試料によっては非可逆的吸着が起こりやすい。カラムが平衡に達するのが遅い，修飾した官能基が剥落することがある。

アミドシリカポリ（スクシンイミド）誘導体シリカ

酸類

14 µm，芳香族カルボン酸，85% MeCN−20 mM
AB，UV［１３］

−

塩基類

−

−

アミド，尿素類

15 µm，サリチルアミド，85% MeCN−20 mM AB，
UV［１３］−

ポリオール類250 µm，ポリフェノール類，84% MeCN，UV［２
８］

−

アミノ酸類

−

50−67 µm，アミノ酸，80% MeCN−5 mM TB (pH2.8)，UV［３］ペプチド類

例は多いが，ほとんどがグラジエント条件で分離さ 33−37 µm，アトシバン，89% MeCN−10m M TB，UVれている。
［１４］；69−87 µm，ジペプチド，80% MeCN−10 mM
TB，UV［３］核酸類

13−16 µm，核酸塩基，ヌクレオシド 85% MeCN−20
mM AB，UV［１３］−糖類

7 µm (3 µm 粒子)，13 µm (5 µm 粒子)，マンニトー
ル ，75% MeCN RI［５３］57−66 µm，シアル化糖，80% MeCN−10 mM TB；20−22 µm，キシログルカン，70% MeCN−10 mM TB，
PAD［３２］

備考

カラムへの溶質の吸着は少ない

固定相の剥落が起こることがある―４―

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Column

池上 亨，田窪宏貴，田中信男

双性イオン結合型シリカ

トリアゾール結合型シリカ酸類

12−21 µm，芳香族カルボン酸 85% MeCN−5 mM 11 µm，シュウ酸，50% MeCN−10 mM PB (pH 7)，
AB， UV［１３］UV；17µm，安息香酸，50% MeCN−10 mM AB，UV
［４６］

塩基類

15 µm，モルヒネ，70% MeCN−20 mM AB，UV［４２］ 33 µm，ベンズアミジン，90% MeCN−10 mM AB，
UV［４６］

アミド，尿素類 13 µm，サリチルアミド，85% MeCN−20 mM AB，
UV［１３］

17 µm，尿素，90% MeCN，UV；20 µm，シアヌル酸，50% MeCN−10 mM AB，UV［４６］ポリオール類26−35 µm，フラボノイド，75% MeCN−30 mM AB， 11 µm，ロイシン；13 µm，バリン；14 µm；イソロUV［４２］
イシン；70% MeCN−10 mM AB，UV；30 µm，ヒスチジン，70% MeCN−10 mM CB，UV［４６］

アミノ酸類

−

ペプチド類

33 µm，ニューロテンシン；56 µm，ブラジキニン； 35 µm，オ キ シ ト シ ン，70% MeCN−10 mM AB，
70% MeCN−50 mM AB，UV［４２］UV；33 µm，アンジオテンシン II，50% MeCN−10mM AB，UV［４６］核酸類

17−21 µm，核酸塩基，ヌクレオシド，85% MeCN− 14 µm，ウリジン，90% MeCN−10 mM AB，UV；21
20 mM AB，UV［１３］；36−84 µm ヌクレオチド， µm，シチジン，80% MeCN−10 mM AB，UV［４６］70% MeCN−100 mM AB，UV［４２］糖類

33−38 µm，モルヒネ配糖体，70% MeCN−20 mM
AB，UV［４２］30 µm，グルコース，60% MeCN−20 mM PB (pH 7)，
RI，18 µm；グルコース−1−リン酸エステル，60%
MeCN−20 mM PB (pH 7)，RI［４６］備考

固定相の剥落は少ない。

応用例が豊富14µm，1，2，6−ヘ キ サ ン ト リ オ ー ル，90%MeCN，
ELSD［４６］

2008, 31, 1511−1518.

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