「植物異物同定用プライマーセット」
技術資料集

株式会社 ファスマック
遺伝子検査事業部

I. 食品における異物とは…
本来その製品中にあってはならないもの、つまり使用原料以外に当該製品中に混入した物質

II. 植物に由来する異物の同定方法（１）形態的特長を用いた同定
・現在の主流な同定方法

・異物は微量であったり、加熱等での変性のため、熟練された解析技術が必要（２）DNA塩基配列情報を用いた同定 (本方法）・近年開発が進んできた、客観性のある同定方法
・異物が微量であったり、変性していても抽出したDNAを用いて同定が可能『正確』 に植物由来の異物を同定する、DNA塩基配列情報を用いた検査方法が求められている

Ⅲ.プライマーの設計
18S
ｒRNA

【保存領域】
植物全般に保存されている

ITS1

5.8S
rRNA

【非保存領域】
植物種ごとに特異的な塩基配列を有する

植物異物同定用プライマーの特徴
・植物種ごとに特異的な塩基配列を有するITS領域を挟む保存領域の塩基配列から設計
・植物全般 に保存され、かつカビ・酵母と配列が異なる塩基配列から設計・PCR増幅産物長（ 約350～400 bp）が短いためDNAが加熱等で損傷していても増幅し易い

Ⅳ.検査手順①ＤＮＡ
抽出植物異物同定用プライマー使用

②ＰＣＲ
増幅

④データベー照ス
合③シーケンスAB・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・⑤
異物同定

Ⅴ．検証事例（１）モデル食品を用いた例
それぞれのモデルサンプルの大きさは1mgと10mgとして検証を行った。
（食品中の異物として見つかる植物片の多くが数mgのため）

A. 焦げたタマネギの皮
105℃、16hr処理後の乾燥皮
B. 表面に他の植物組織が付着したタマネギの皮
B1：カレーパウダー中に2ヶ月浸した乾燥皮B2：レトルトソース中の具材だったタマネギ

C. 原料や野菜の非可食部
C1：リンゴ果柄 C2：かぼちゃのヘタ C3：落花生の種皮A～CのそれぞれからDNAを抽出し、鋳型DNAとする。

<PCR反応液組成>
dH2O
10× PCR buffer Ⅱ（-MgCl 2）
dNTP mixture
25mM MgCl 2
forward primer （25uM）
reverse primer （25uM）
AmpliTaq Gold （5U/ul）
template DNA
トータル液量final conc.

ul-14.875

×1

2.5

0.2mM
1.5mM
0.5uM
0.5uM
0.625U
適当量

2.5
1.5
0.5
0.5
0.125
2.525ul<PCRサイクル>
℃min
94℃
9min
96℃
1min
58℃
1min
72℃
1min
72℃
5min
4℃
∞PCR反応後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅を確認する。

35cyclesPCR産物の塩基配列を決定しPCR増幅結果
モデルサンプル

重量10mg
A 焦げたタマネギ皮
1mg
B1 カレーパウダーに浸した
10mg
タマネギ皮
1mg
B2 レトルトソース中の100mg（ ※）具材タマネギ10mg（ ※）
10mg
C1 リンゴ果柄
1mg
10mg
C2 カボチャのヘタ
1mg
10mg
C3 落花生の種皮1mg

PCR（350bp）++++++++++++

サンプルの状態、場所によらず、PCR産物が検出された

BLAST検索（GenBank）の結果○タマネギ（Allium cepa） サンプルA、B1、B2・上位7データがAllium属○リンゴの果柄（Malus domestica） サンプルC1・Malus属に分類される植物データが上位に並んだ○カボチャのヘタ（Cucurbita moschata） サンプルC2・カボチャ属に分類される植物データが上位に並んだ○落花生の種皮（Arachis hypogaea） サンプルC3・最も近いデータはArachis hypogaea
・2番目以下もArachis属に分類

（２）原料を用いた例１（相同性の高い上位５つを記載）
ハウス食品 植物異物同定プライマー
使用プライマーデータベース
サンプル
トウモロコシ（ 学名：Zea mays ）トウモロコシ（学名：Zea mays ）大豆（学名：Glycine max）

キウイ
（学名：Actinidia deliciosa
あるいはActinidiachinensis）

DDBJ
Sequence Entry
Zea mays clone 1503689 mRNA sequence
Zea mays cultivar line X17 16S ribosomal RNA,16S-23S ribosomal RNA
intergenic spacer, partial sequence
Zea mays cultivar line T62 16S ribosomal RNA,16S-23S ribosomal RNA
intergenic spacer, partial sequence
Zea mays clone Contig488 mRNA sequence
Zea mays subsp. mays x Zea perennis 16S ribosomal RNA, 16S-23Sribosomal RNA intergenic spacer,partial sequence
Glycine max 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internaltranscribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribedspacer 2, complete sequence; and 26S りribosomal RNA gene, partial
sequence
Glycine max cultivar Hwangkeum 18S ribosomal RNA gene, partial
sequence; internal transcribed spacer 1, complete sequence; and 5.8S
ribosomal RNA gene,partial sequence
Glycine soja cultivar IT182932 18S ribosomal RNA ene,partial sequence;
internal transcribed spacer 1, complete sequence; and 5.8S ribosomal
RNA gene, partial sequence
Glycine max voucher PS1684MT01 18S ribosomal RNA gene, partialsequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, andinternal transcribed spacer 2,complete sequence; and 28S ribosomal RNAgene, partial sequence
Glycine max isolate 48Hidatsa internal transcribed spacer 1, partial
sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internaltranscribed space 2, partial sequence
Actinidia deliciosa genes for 18S ribosomal RNA, internal transcribedspacer 1, 5.8S ribosomal RNA, partial and complete sequence
Actinidia henanensis internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S
ribosomal RNA gene,complete sequence; and internal transcribed spacer
2, partial sequence
Actinidia deliciosa clone 1 internal transcribed spacer 1, partial sequence;
5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribedspacer 2, partial sequence
Actinidia callosa var. strigillosa clone 20 internal transcribed spacer 1,partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; andinternal transcribed spacer 2, partial sequence
Actinidia callosa var. strigillosa clone 10 internal transcribed spacer 1,partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; andinternal transcribed spacer 2, partial sequence

Accession No
EU955045%
96.65

DQ369917

96.3

DQ369910

96.3

BT016655

95.91

DQ369908

95.17

FJ609734

100

EU118312

100

EU118313

100FJ980442

100

AF144654

99.47

AB253775

99.66

AF323841

99.62

AF323830

99.62

AF323829

99.62

AF323827

99.61

上位5つ全てがトウモロコシ属（Zea）

上位５つ全てが大豆属（Glycine）

上位５つ全てがマタタビ属（Actinidia)

（２）原料を用いた例２（相同性の高い上位５つを表示）
使用プライマー

ハウス食品 植物異物同定プライマー

データベース

DDBJ

サンプル

Sequence Entry
Solanum lycopersicum genes for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S
rRNA, partial and complete sequence, cultivar: Momotaro
Solanum lycopersicum genes for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S
トマト（ Solanum トマト
lycopersicum ） rRNA, partial and complete sequence, note: jtomate creollo
Solanum lycopersicum var. cerasiforme genes for 18S rRNA, ITS1, 5.8S
（学名：Solanum
rRNA, ITS2, 28S rRNA, partial and complete sequence
lycopersicum）
Solanum pimpinellifolium genes for 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S
rRNA, partial and complete sequence
Lycopersicon esculentum internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal
RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence
Malus domestica cultivar Ashmeads Kernal internal transcribed spacer 1,
5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, completesequence
Malus domestica cultivar Reinette Simerenko internal transcribed spacer
1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, completesequence
Malus sieversii isolate sieversiiJ5 internal transcribed spacer 1, 5.8S
リンゴ
ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete（学名：Malus pumila）
sequence
Malus sieversii isolate sieversiiJ8 internal transcribed spacer 1, 5.8S
ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, completesequence
Malus sieversii isolate siversiiJ7 internal transcribed spacer 1, 5.8S
ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, completesequence
Citrus x paradisi bio-material SOFRI:STGBC603 18S ribosomal RNA gene,partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene,and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal
RNA gene, partial sequence
Citrus maxima bio-material BIRDI:SH-TKD5 18S ribosomal RNA gene,partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene,and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal
RNA gene, partial sequence
Citrus maxima bio-material BIRDI:SH-P36 18S ribosomal RNA gene,
グレープフルーツ
partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene,（学名：Citrus x paradisi）
and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal
RNA gene, partial sequence
Citrus maxima bio-material BIRDI:SH-P9 18S ribosomal RNA gene, partial
sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, andinternal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNAgene, partial sequence
Citrus maxima bio-material FRDC:SH-P47 18S ribosomal RNA gene,partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene,and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal
RNA gene, partial sequence

Accession No%

AB373816.1
AB373816.1

100%

AB373815.1
AB373815.1

100%

AB373814.1
AB373814.1

100%

AB373813.1
AB373813.1

100%

AF244747.1
AF244747.1

100%

AF186480.1
AF186480.1

97%

AF186478.1
AF186478.1

97%

AF186490.1
AF186490.1

97%

AF186493.1
AF186493.1

97%

AF186492.1
AF186492.1

97%

FJ641956.1
FJ641956.1

99%

FJ641954.1
FJ641954.1

99%

FJ641953.1
FJ641953.1

99%

Citrus x paradisi、またはCitrus属になった

FJ641952.1
FJ641952.1

99%※グレープフルーツはCitrus maximaを親として交配したものと言われている

FJ641951.1
FJ641951.1

99%

上位がSolanum属
5位のLycopersicon esculentumは、以前にトマトの学名として広く用いられていた

上位５つ全てがリンゴ属（Malus）

Ⅵ．製品紹介
商品名：植物異物同定用プライマーセット

商品コード ：F111-1K
容量：30反応分 (● F-primer、● R-primer)

保存方法

：－20℃

有効期限

：製造から2年希望納入価格：23,000円（税別）◆ 製品は、ハウス食品グループ本社株式会社のライセンスを受けて、株式会社ファスマックが製造販売しています。
◆ 製品は、PCRに必要な酵素やバッファー類やシーケンス解析に必要な試薬類は含まれておりません。
◆ 技術資料は、ハウス食品グループ本社株式会社から資料（特許第4205485号）の提供を受けて、株式会社ファスマックが編集しています。

【問い合せ先】〒243-0041 神奈川県厚木市緑ヶ丘5-1-3
株式会社ファスマック 遺伝子検査事業部
TEL 046-295-8787
FAX 046-294-3738
URL http：//www.fasmac.co.jp
E-mail gmo@fasmac.co.jp