Technical Review

CHROMATOGRAPHY, Vol.31 No.1 (2010)

Technical Review

逆相分取 HPLC を用いる効率的な精製方法
表正克、山下智恵、森下潔、小路庸子、栗山尚浩

Effective preparative purification method for peptides andproteins using silica based reversed phase packing materials
Masakatsu Omote, Chie Yamashita, Kiyoshi Morishita
Noriko Shoji, Naohiro Kuriyama
YMC CO., LTD ., 5−28 Kokufudai Komatsu-shi, Ishikawa, 923−8557, JapanAbstract
Reversed phase HPLC is an essential tool for analytical and preparative separation of peptides and proteins. Purification in preparative scale,
it is important to choose optimum pore size and ligand. We discuss the difference between analytical and preparative HPLC, and show actual
method developments effectively in preparative scale.
We also show chemically durable packing material, named Exphere series which is suitable for peptides separation. The material is using
complete sphere and mono dispersed silica which enables higher mechanical strength than conventional gel in repacking evaluation.
Keywords: preparative chromatography, peptides and proteins separation, cost effective

れるようになっている。さらに抗生物質、発酵生成物などを

１．緒言
高速液体クロマトグラフィには一般的にラボ用の 分 析

含め対象物質が増加しつつあるため、ますます分取クロマト

HPLC から少量用のセミ分取 HPLC、さらに生産に使用されグラフィの適用分野は広がり、その役割は重要になってきてる工業用の分取クロマトグラフィが含まれるが、近年、工業いる。
分析では、 より正確に検出する用の分取クロマトグラフィが国内外で使用されるケースが増ことが目的であるのに加している。これは付加価値の高い医薬をはじめとする生産

対し、分取では目的純度以上で分け取ることが目的であ物の製造が増加していること、とりわけクロマトグラフィがるため、その手法は全く異なる。特に実製造のような大量ス必須とされるペプチド、タンパク質の医薬品が急速に増加しケール生産では条件設定が重要であり、製造原価、生産効率ていることも要因の一つと考えられる。また近年は先進国のにも大きく影響する。

みならず、発展途上国での使用頻度も増加している。このた

本稿ではより高純度にかつ安全、安価に化合物を分け取る

め分取対象物は新薬のみならず、ジェネリック品でも使用さことを目的とする逆相分取クロマトグラフィへのスケール株式会社ワイエムシィ研究開発部〒９２３−８５５７ 石川県小松市国府台５−２
８７―８０１０
Tel:０７６１―４０１８
Fax:０７６１―４７―８
E-mail: m-omote@ymc.co.jp―３１―

CHROMATOGRAPHY, Vol.31 No.1 (2010)

アップを、ペプチド等の工業用分取を実例にそれらのファク量の溶離液を使用するため、溶媒コストも考慮しなければな

ター、注目すべきポイント、手順などを紹介する。

らない。実際の分取ユーザーではコスト低減のため、価格のまた、我々はより効率的な分取を進めるための分取用充填高いアセトニトリルを使用せずに、アルコール系溶媒を選定剤、分取用クロマト装置やシステムソフトの開発を進めてきするケースも見られる。また、国により特定の溶媒が認可さた。その中から、最近開発した高機械強度かつ酸性耐久性をれにくいこともあるため、注意が必要である。アセトニトリ持つ新規分取用充填剤である弊社 Exphere シリーズの特長もルは分取クロマトグラフィでも汎用的な溶媒ではあるが、環併せて報告する。

境意識の向上に伴いアルコール系への代替が求められている。
さらに、温度により分離挙動が異なる場合には、注意が必２．分析 HPLC と分取 HPLC の違い
分析 HPLC と分取 HPLC では、要求されるファクターが要である。一般に５０mm I.D.以上のカラムを使用する場合、大きく異なる。分析にて要求されるファクターは、分離能、均一な温度制御が難しいといわれている。これは、分取カラ定量性、ピーク形状、感度であり、目的化合物を高精度に定ム中心部と側壁付近の温度勾配が形成されることが原因であ性・定量することが目的となる。これに対し分取で要求される。このため、カラム内の試料の流れが不均一となり、結果るファクターは、純度、回収率、生産効率、回収方法、安全としてテイリングやピーク割れが起きてしまう。このような性となり、目標とする純度で、より効率よく目的物を回収す現象を起こさないためにも、スケールアップ時には温度制御ることが必要とされる。分取方法にも、単カラム法、リサイが可能な室温下での分取が望まれる。

クル分取法、SMB 法（擬似移動床式クロマト分離法）、SFC

最初の段階で分離条件を検討することは分析時と同じであ法（超臨界流体クロマトグラフ法）等があり、それぞれの長る。ただ、上記のような分取（＝スケールアップ）を前提と所短所がある。なかでも単カラム法は、効率やコスト面で優した条件設定をすることが求められる。また、分取では有機れるため、本稿ではこの方法に着目して紹介する。

溶媒等、危険物の取扱量が増えるため、安全性や後処理面を十分に考慮した上で作業を進めたほうがよい。

分取における、スケールアップの流れを Scheme 1 にまとめた。実際の分取に至るまで、４段階に分かれており、さまStep 2：基本分離条件の次には、分取用充填剤の選択、分取カラムサイズを検討する。

ざまなファクターを考慮する必要がある。各段階での検討項

分取用充填剤は、Step 1 での分離挙動と同じ分離挙動の充目を、逆相系を分離モードに選んだときを実例に、以下にま填剤を選ぶ。特殊なカラムで条件設定すると、バルクで同じとめる。

充填剤が入手できないこともあるため注意が必要である。

Step 1：まず分析スケールで基本となる分取用分離条件を選定する。目的化合物と不純物を分離するためには、分析用分取用充填剤の粒子径は、カラム段数（分離度）、圧力損分離と同様に適切な溶離液、充填剤種類を選択する必要があ失の兼合いで決定する。小さな粒子径ではコストが高くなるる。一例として、ジアステレオマー分離での溶媒選択例をため、許容できる分離の範囲で大きめな粒子径の充填剤選択

Figures 1 に示す。アセトニトリル系では、２つの異性体ピーを推奨している。

クが重なり分離不可であったのに対し、メタノール系では分取クロマトグラフィでは、必要量に応じたスケール（分ベースライン分離した。溶媒選択について、大量分取では多取カラムサイズ）を選択する。カラム内径に応じ大まかに分類すると、分析カラムを用いた少量分取、１０〜３０mm I.D.でのセミ分取スケール、５０〜１００mm I.D.のパイロット分取ス
ケール、２００mm I.D.以上の実生産分取スケールに分けられScheme 1. スケールアップの基本的な流れ

Figures 1.

―３２―

ジアステレオマー分離における溶媒選択例

CHROMATOGRAPHY, Vol.31 No.1 (2010)

Technical Review

る。カラムサイズは、試料の負荷量（処理量）により決定すの目的純度が得られる負荷量のことである。負荷量検討時のる。負荷量が数１０mg〜数１００mg なら１０〜２０mm I.D.、数１００クロマトグラムを Figures 2 に示す。

mg〜数 g なら５０mm I.D.、数 g 以上ならば１００〜２００mm I.D.

クルードサンプルを０．
４mg から順に負荷量を増加させ、以上のカラム内径を選択することになる。弊社で推奨する負影のついた部分を回収し、純度を確認した。負荷量を上げる

荷量に対する粒子径・カラム内径の組合せを Table 1 にまとと全般的にピーク幅が広くなるため、目的化合物ピークと前めた。実際に使われる粒子径は、粗分取では５０µm 以上、精後不純物ピークとの重なりが増え、結果として目的物の純度

密分取では１０〜３０µm 粒子を使用することが多いようであは低下する。目標純度が高い場合には、回収量を犠牲にしてる。

分取範囲を狭くする必要があるが、それほど高くない場合にStep 3：最後に分取条件の最適化を進めることになる。こは広く分取して回収率を上げることも可能である。また、目れまでの検討で基本条件は確立されているので、実スケール的ピークを細かくフラクションすることで、高純度で得るこで回収することを前提にした微調整を行う。具体的には、分とも出来る。

取レベルで十分な分離が得られるよう溶離液の組成を改善し一般に負荷量は、分取用カラム内に充填されている充填剤たり、洗浄頻度、インジェクションサイクル（運転プラン）量に依存する。ただし、ペプチド・タンパク質のような生体の設定が必要となる。以上のような調整の後、生産性向上の高分子の場合、吸脱着による分離機構、充填剤細孔径によるための負荷量検討を行う。

分子サイズふるい効果があるため、低分子化合物の分離とは異なるため注意が必要である。充填剤選定の仕方について分取作業を効率よく進めるには、目標とする純度の化合物は、改めて次項でまとめる。

を（基本的には）１回のクロマト操作で出来るだけ多く分け取る必要がある。このため実スケールでの最大負荷量を確認

以上のステップ１〜３を経た後に実際の分取作業を行うこしてから、作業を始めるようにする。最大負荷量とは、カラとになる。プラントスケール（kg スケール以上）でのコスム評価でサンプルインジェクション量を徐々に増やしたとき

トは、イニシャルコスト（装置、充填剤）よりもランニングコスト（溶離液、人件費）の方が高額になる場合も多いた
め、作業開始前の綿密な試算が必要になる。

Table 1. 負荷量に対する推奨粒子径・カラム内径の組合せ
３．ペプチド・タンパク質分離における充填剤選定方法
逆相 HPLC にてペプチド・タンパク質を分離する際、用いる充填剤の細孔径は分離に大きな影響を及ぼす。例えば、タンパク質のような大きな分子量の化合物を分離する場合、

Figures 2.

植物由来成分中の目的化合物の分取（目標純度≧９５％）

Figures 3.

―３３―

細孔径がカラム効率に与える影響

CHROMATOGRAPHY, Vol.31 No.1 (2010)







Figures 4.

細孔径がピーク形状に与える影響

小さな細孔の充填剤を選んでしまうとタンパク質分子が細孔内に入り込むことが出来ないため、適切な分離能や分離選択性が得られない場合がある。
アンジオテンシンⅡ（MW１０４６）及びイン ス リ ン（MW５７００）について、C４官能基を修飾した３種類の細孔径（１２nm，２０nm，３０nm）を用い、負荷量に対するカラム効率を評価した。結果を Figures 3 に示す。
分子量の小さなアンジオテンシンⅡでは１２nm が高効率を、また分子量が５７００のインスリンでは２０nm が高効率を示した。さらに分子量が１００００以上のサンプルでは、３０nm 細孔径が最も高段数を示した（３０nm のデータは省略）。以上の検討から、より良い分離を得るには、サンプル分子量に対し最適な細孔径を選ぶ必要があることが示唆された。実例とし て、ア ン ジ オ テ ン シ ンⅡと ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン（MW６７０００，以後、BSA と略）を、C４官能基を修飾した２種類の細孔径（１２nm，３０nm）で測定した。クロマトグラムを Figures 4 に示す。
アンジオテンシンⅡの場合、１２nm ではメインピーク幅が（３０nm よりも）狭いため、近接して溶出する不純物ピークとの分離が良好であった。一方、BSA では３０nm で測定した場合にピーク形状、分離ともに優れていた。このことからも、化合物の分子量に相応した細孔径選択が必要であることがわかる。
次に官能基がカラム効率に与える影響を調べるため、C４，C８，C１８官能基を修飾した２種類の細孔径（１２nm，３０Figures 5.

nm）を用い、酸化型インスリン B 鎖（MW３４９５）及び BSA各細孔径（１２，３０nm）において官能基がカラム効率に与える影響を測定した。負荷量とカラム効率の関係を Figures 5 に示す。
その結果、小さなタンパク質、ペプチドでは疎水性の大きい目安をまとめると、Table 2 のようになる。

官能基（C１８）が高いカラム効率を示した。一方、分子量数万程度のタンパク質では疎水性の小さい官能基（C４）が高試料の分子量が５０００程度までは１２nm，C１８の組合せ、分い値を示した。以上、細孔径と官能基について充填剤選択の子量５０００から２００００程度までは２０nm，C８の組合せ、分子量―３４―

CHROMATOGRAPHY, Vol.31 No.1 (2010)

Technical Review

Scheme 2−1.

スケールアップ検討

Table 2. ペプチド・タンパク質分離における充填剤選択の目安が２００００以上１０万以下では３０nm，C４の組合せが、それぞれの分子量に対し最適な細孔径と官能基の組合せと考えられ、これら組合せをもとに充填剤を選択し、条件の最適化を進めることで効率的な分取が可能になると考えられる。
４．分取実例
分取実例として、合成反応後の目的化合物の精製例を示す（Schemes 2）。未精製原料のクロマトグラムでは目的ピーク前後に不純物が現れるため、非常に困難な分取の一例として紹介する。純度９５％以上を目標に分取を試みた。

Scheme 2−2.

分析カラムにて、溶離液（有機溶媒の種類や濃度）、添加Scheme 2物（酸や塩の種類）を検討した結果、Scheme 2−1 左側クロ負荷量検討

分取精製の実例

マトグラムの条件にて目的物前後の不純物とのベースライン分離が得られた。粒子径を大きくすると、不純物との分離がカリ洗浄によって充填剤の寿命を延ばすことも重要な課題で悪くなったため、セミ分取スケールでの条件を最適化し（有ある。
以上のような現状から、弊社では高強度の新開発シリカゲ

機 溶 媒 比 率 変 更）、純 度９５％以 上 で 目 的 物 が 得 ら れ た

ルに独自の化学修飾を施した高耐久性充填剤、Exphere（エ（Scheme 2−1 右側クロマトグラム）。

クスフェア）シリーズを新たに開発した。このシリカゲルのさらに負荷量検討を行ったところ（Scheme 2−2）、１０mm

SEM 写真ならびに物性値を Figures 6 に示した。

内径では１．
８mg まで負荷することができた。この負荷量をSEM 写真において、従来品シリカゲルと比較するとより本精製に適用したところ、ピークの影付き部分を回収し純度球状で、凹凸面が見られずスムーズな表面となっている。ま

９７．
６％の目的物を得た。

た従来品と比べ粒度分布、細孔分布が狭いことが特長である。このシリカゲルを ODS 修飾し、可動栓式カラムによる５．高耐久性 分取用充填剤の開発
ペプチド・タンパク質分離を初めとする分取クロマトグラ

繰り返し充填評価に供した。一般に可動栓式カラムの繰り返フィが増えるに従い、分取メソッドの安定化や充填剤の機械し充填は数回程度までであるが、今回は有意差が現れるまで的、化学的長寿命化がますます求められている。

試験を実施した。評価は他社従来品とカラム圧力の変化を比較した。結果を Figures 7 にまとめた。

実生産スケールにおいてはコストダウンを図るため、大型従来品は充填１回目から粒子が割れ始めている。数回までの可動栓式カラムを用いた分取クロマトグラフィが近年多用されているが、カラム内が高度に圧縮された条件下で使用すは許容範囲内の圧力上昇であるが充填を繰り返し続けると、るため充填剤粒子が粉砕し、カラム圧力が上昇することもあ

１０回目以降から急激にカラム圧が上昇し、１３回目以降は充填る。このような粒子の粉砕を防ぎ使用回数を向上させることできなくなった。この原因は SEM 写真から見られるようは、充填剤コストを改善する上での課題となっている。に、粒子が割れてしまい、圧力が上昇したと考えられる。一方、Exphere は１３回目までカラム圧はほとんど変わらず、ままた、酸性の溶離液条件への耐久性や吸着性不純物のアル―３５―

CHROMATOGRAPHY, Vol.31 No.1 (2010)

Figures 6.

新開発シリカゲルの SEM 写真、ならびに細孔分布

Figures 8.

Figures 7.

繰り返し充填によるカラム圧力の変化ならびに充填剤 SEM 写真

Exphere シリーズの耐酸、耐アルカリ性テストた粒子の割れも見られなかったことから、充填剤として機械定が効率的な分取精製に不可欠であることが理解していただ

強度に優れることが分かった。

けたと思う。
スケールアップ例・分取実例では大量分取を中心に解説しExphere シリーズにおいては耐酸性のみならず、従来の弱た。実生産でのコストを考えると、初期投資である分取装置点であったアルカリ性での耐久性も向上させるため、独自のや充填剤に気を取られがちではあるが、実際にはランニング分子設計・最適化による新開発のポリメリック修飾・エンドコストである溶離液や人件費がかなりの部分を占めることもキャップ修飾方法を採用した。他社品との耐酸、耐アルカリ多い。このため、実作業を始める前に十分な計画をたてる必性テスト比較を Figures 8 にまとめた。

要がある。

耐酸 性 テ ス ト（Figures 8 左 側）に て、Exphere は１００時 間分取クロマトグラフィの展望としては、充填剤寿命が延び経過後も初期の保持時間の値を維持した。また耐アルカリ性

るよう、さらに高い化学的耐久性の材料が期待されている。

テストでも理論段数が長時間にわたり安定していたため、従このため我々は、ポリマー充填剤の良さを併せ持ち、Exphere来品と比較し２倍以上の耐久性を持つことが期待される。

以上の高アルカリ耐久性の充填剤開発を進めている。
弊社では創業以来、高品質なクロマト関連商品を安定供給できるよう、開発・生産・サポートを進めてきた。今後も次６．結言

世代の充填剤や分取装置を開発し、分取クロマトグラフィの以上、分取クロマトグラフィでは分析 HPLC とは異なる発展に寄与するつもりである。

視点が必要であり、適切な充填剤選択、最適な分取条件の設―３６―