生産と技術

第60巻第４号（2008）

イオンチャネルスクリーニングのための平面脂質二重膜マイクロアレイチップ
鈴 木 宏 明＊

研究ノート

Planar Lipid Bilayer Micro-array Chip for
Screening of Ion Channel Proteins
Key Words : Lipid Bilayer, Ion Channel Recording, Array Chip, Microtechnology

１．はじめに近年、Micro Total Analysis Systems（μTAS）または Lab-on-a-Chip と呼ばれる技術が急速に発達している[1, 2]．チップ上に微細な流路や反応容器を加工し，そのような微小空間中で化学分析や生化学反応を行うことにより，従来のアッセイ法に比べて必要な試薬量が大幅に削減できる，反応・分析時間が短縮される，反応から検出までをひとつのチップ

Fig. 1 (a) パッチクランプ法の模式図。ガラス細管に細胞を吸引し、細胞膜に発現したイオンチャネルを通過する電流を計測する。
(b) Langmuir-Blodgette 法による平面脂質二重膜形成法。

上で効率的に行うことができるなどの利点が提唱されている。この技術を用いることにより、薬剤スクリーニングのハイスループット化が期待されている。
創薬ターゲットとして、膜タンパク質（イオンチャ販されているが、ギガオームシール形成の再現性にネル、トランスポータ等）の重要性は広く認識され難が残るようである[7-10]。一方，精製または合成ているが[3-5]、その扱いの困難さから、汎用的・標したリン脂質分子から，細胞膜モデルとしての平面準的なハイスループットアッセイ系の確立が遅れて脂質二重膜を人工的に形成し，そこにイオンチャネいる。同様に、膜タンパク質を扱うμTAS 技術にルを再構成して電気生理計測を行うという手法が存ついても報告例が比較的少ないのが現状である。膜在する（Fig. 1b）[6]．この手法では，究極的には一タンパク質には様々な種類が存在するが、中でもイ分子レベルの少ないタンパク質量でアッセイができオンチャネルはパッチクランプ法（Fig. 1a）の発展る，実験条件を任意に設定可能，目的タンパク質のによりその機能がよく知られている[6]。しかし、機能のみを純粋に調べることができる，など細胞の従来のパッチクランプ法は職人的技術を要するため、パッチクランプ法を補完する様々な利点が得られる．

ハイスループット化に向かない。最近ではマイクロ

しかし，従来の平面人工脂質二重膜形成法は再現性

加工技術によって多数の均一径孔を基板上に形成し、が悪く，一般に広く用いられてこなかった。

そこにイオンチャネルを発現させた細胞を吸引させ筆者らは，マイクロチップ上に平面人工脂質二重多数の細胞パッチクランプ計測を実現する装置が市膜のアレイを形成し、イオンチャネル電流計測をハイスループットで行うためのプラットフォーム開発＊Hiroaki SUZUKI

1973年8月生
東京大学大学院 工学系研究科 機械工学専攻（2003年）
現在、大阪大学大学院 情報科学研究科
バイオ情報工学専攻 准教授 博士（工学） バイオMEMS
TEL：06-6879-4151
FAX：06-6879-7433
E-mail：suzuki@ist.osaka-u.ac.jp

を継続して行ってきた[11-14]．マイクロ孔に制御して脂質溶液を分配することにより、平面脂質二重膜形成の再現性を大幅に向上させることに成功している。本報では、その最新の成果を報告する。
２．平面脂質二重膜マイクロチップの構造および脂質膜形成原理
脂質平面膜形成の従来法では、テフロン膜に直径− 66 −

生産と技術第60巻第４号（2008）

50-200μm 程度の孔を手作りで形成し、そこにリンイクロメートルの孔構造を組み込むことができる。

脂質の単分子膜を張り合わせる（Fig. 1b）、または平面脂質膜の形成は以下のような手順で行った（すリン脂質を溶解させた溶媒をはけで塗布する、といべてピペットマンによる操作）。まず、上側ウェルった方法が使われていた[6]。筆者らは、微細加工にバッファ（300 mM KCl を含む。pH=7.0）を注入により形成したより微細かつ形状の揃った貫通孔と、する。その後、下側流路の注入口から少量（〜5μL ）マイクロ流路システムを利用して、脂質平面膜形成の脂質溶液（10 mg リン脂質/1 mL n-デカン）を、の再現性の向上を試みた。再現性の向上により、多続けてバッファを注入する。この操作により、脂質数の脂質平面膜を同時形成し、計測のスループット溶液がマイクロ孔部分を通過した後、下側流路がバを大幅に上げることが可能になる。Fig. 2(a) に、我々ッファで満たされる。このとき、マイクロ孔部分をが開発した 96 ウェルの平面脂質二重膜チップの概覆うように脂質溶液の薄膜層が形成される。時間の観を示す。4 × 3 cm2 のチップ上に、9 6個（12×8）

経過によってこの脂質層がさらに薄膜化し、脂質二の計測ウェル（直径 2mm、深さ 3mm ）が配置され重膜が形成される。ている。Fig. 2(b) に単一ウェルの断面模式図を示す。
マイクロチップは三層構造で構成されており、上側のウェル、平面脂質膜を形成するためのマイクロ孔構造を持つ薄膜ポリマー（ポリパラキシリレン）シート（シート厚 20μm、孔直径 30μm ）、そして下側の流路から成っている。計測時には、上側ウェルと下側流路がバッファで満たされた状態で、それらを隔てている薄膜シートに形成されたマイクロ孔に平面脂質二重膜が形成される。膜タンパク質は、上Fig. 2 (a) 96ウェルの平面脂質二重膜チップの概観写真。
チップのサイズは 4×3 cm2。
(b)単一ウェルの断面模式図。上側ウェル、マイク
ロ貫通孔を持つパリレン膜、および下側流路から構成される。

側のウェルに例えばプロテオリポソーム（膜タンパク質を再構成したリポソーム）の懸濁液を添加すると、自発的に平面膜に融合して再構成される。イオンチャネルを通過する膜電流は通常ピコアンペア〜ナノアンペアと小さいため、計測はパッチクランプ用の電流増幅器を用いて行う。増幅器の計測ヘッド

３．96ウェルチップでのイオンチャネル計測再現性実験に接続した電極をウェルに挿入し、グラウンド電極を下側流路の導入口に挿入することにより、定電圧

上記の手順で脂質二重膜を形成し、モデルイオン下での膜電流を計測する（電圧クランプ）。ウェルチャネルであるグラミシジンＡを用いて電気生理計は電気的に絶縁されているため、個々のウェルで独測の再現性を評価した。グラミシジンは水層から脂立な計測をパラレルに行うことが可能である。

質二重膜に自発的に挿入し、一価のイオンを透過すデバイスの作製は、市販のステレオリソグラフィるチャネルを形成する。グラミシジンは、0.5装置（Perfactory, envisiontec 社，ドイツ製）を用mg/mLの濃度であらかじめ上側に注入するバッフいた．製作するデバイスを CAD ソフトウェア上でァに溶解させた。計測は、計測電極を 96 個のウェデザインすると，z 方向に 25μm または 50μm 毎ルに対して順番に移動させる方法で行った。Fig.の層に分割した平面データを作成し，そのプロジェ

2(a) 中のアドレスで計測されたイオンチャネル電流クタ像をガラス基板上の光硬化性樹脂に照射して積の例を Fig. 3 に示す。Fig. 3(a) は、脂質膜形成後約層する．マイクロ孔を有するポリマーシートはフォ20 分後に計測されたシグナルであり、イオンチャトリソグラフィ技術により別途作製し、樹脂の積層ネル１〜２分子の開閉がステップ様の電流の変化との中間にサンドイッチする方法を開発した（ハイブして観測される。(b)では、別のウェルで計測開始

リッド光造形技術）。この方法により、ステレオリから約 35 分後に計測されたものであり、シグナルソグラフィ装置の空間解像度を補って、直径数十マのステップの変化から複数のイオンチャネルが再構− 67 −

生産と技術第60巻第４号（2008）成されていることがわかる。(c) および (b) は計測

従来の方法では、このような再現率を算出すること開始からそれぞれ約 45 分後および 60 分後に観測さが困難なほど、平面脂質膜形成およびイオンチャネれたものである。多数のイオンチャネルの重ね合わル再構成の再現性がばらつくため、ここで得られたせにより、個々のチャネルの開閉（ステップ様の信再現率は非常に良好であり、今後のハイスループッ号）はもはやみられず、電流の大きな揺動が観測さト化に大いに期待が持てる結果であるといえる。

れている。
Fig. 3のようなイオンチャネル電流は、再現性の問題から、全てのウェルで観測されるわけではない。
リン脂質二重膜は、厚さ 5-10 nm の薄膜であるため、形成されにくく、また壊れやすい。本デバイスにおける、脂質二重膜形成及びイオンチャネル電流計測の再現性を評価するため、全 96 ウェルにおけるイオンチャネル電流計測の結果を Fig. 4 にまとめた。
前述のように、平面膜の形成及びイオンチャネルの再構成は経時的に変化するが、計測システムの制限から、全てのウェルを同時計測することは不可能である。電極を順番に移動させ全ウェルを計測したが、１回目の計測後に薄膜化が進行し、イオンチャネルが再構成される可能性が否定できない。従って、脂Fig. 4 全 96 ウェルにおけるイオンチャネル電流計測の結果。
一度の平面膜再構成に対して２回計測を行った。

質膜形成の操作を行った後、全ウェルの順次電気計測を２回行った。（ここで、１ウェルの計測に 3060 秒を要するため、96 ウェルをスイープするのに約１時間を要した。従って、２回の全計測には、約４．まとめと展望２時間を要した。
）Fig. 4 中、(i), (ii), および (iii) でバイオチップ技術の発展により、様々な生化学ア表されるウェルでは、２回の計測においてどちらもッセイ法やその装置が小型化され、検出効率の向上

イオンチャネル電流が観測されなかった。一方、やアッセイ時間短縮などが具現化されている。その(iv), (v), および (vi) で表されるウェルでは、２回の中で、膜タンパク質の簡便かつ効率的なアッセイ手計測のうち両方、またはどちらか１回においてイオ法の開発は急務である。我々が提案する平面脂質二ンチャネル電流が観測された。96 ウェルのうち、重膜をプラットフォームとするハイスループットス

少なくとも１回の計測においてイオンチャネル電流クリーニング法が、ひとつの解法となることを願っが観測された割合を求めると、約 46 ％であった。ている。
５．謝辞
本研究は、筆者が東京大学生産技術研究所竹内研究室に在籍時、竹内昌治博士および B. Le Pioufle 博士との共同研究により行った。また、本プロジェク
ト立ち上げの段階で、大阪大学の井出徹博士および野地博行博士に脂質二重膜の形成法およびイオンチャネル計測法を教わった。そのほかにも、多くの共同研究者の協力が本プロジェクトの進展を支えた。
謹んで感謝いたします。

Fig. 3

個々のウェルで計測されたグラミシジンAを通過するイオン透過に伴う電流信号の例。
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第４号（2008）

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