Original

Chromatography, Vol.24 No.2 (2003)

Original

喜樹中のカンプトテシン及びその類縁物質の高沸点溶媒を使用した抽出法並びにモノリスカラムによる迅速HPLC分析法
中沢真子、籏野

博、長岡正人、相山律男＊

Extraction Method with High Boiling Solvent for Camptothecin andIts Analogues in Camptotheca acuminata, and Rapid HPLC Analysis
with Monolithic Column.
Masako Nakazawa, Hiroshi Hatano, Masato Nagaoka and Ritsuo Aiyama
Yakult Central Institute for Microbiological Research, 1796 Yaho, Kunitachi−shi, Tokyo, 186−8650, Japan
Received April 3, 2003. Revised manuscript received May 7, 2003. Accepted May 9, 2003

Abstruct
For determining camptothecin and its analogues in several parts of a Chinese tree, Camptotheca acuminata, a small−scale extraction methodwith a high boiling solvent such as 2−methoxyethanol and a high throughput analysis using a monolithic column were developed. A numberof plant samples were simultaneously extracted in a small scale and the contents of the constituents in the extracts were measured within 4
min by this HPLC method.
Keywords: camptothecin ,HPLC, monolithic column, 2−methoxyethanol, extraction（１０MCP）［５］、２０―Deoxycamptothecin（２０DOC）［６］【緒言】中国原産の喜樹（Camptotheca acuminata DECNE.）などかなどがある。

ら単離・抽出されたカンプトテシン（CPT）は高い抗腫瘍

これらの物質の樹齢や樹木の各部位における含量変動、ま活性を示すアルカロイドである。
［１］１
９７０年代に米国国立た季節変動等を検討するにあたり、多検体の同時抽出処理法

がん研究所により癌化学療法剤として開発が試みられたが、および短時間分析法が必要となった。従来、喜樹中のCPT重篤な副作用のため断念された。［２］その後、誘導体の合成含量の定量ではメタノール還流による抽出が最も効率がよい研究が進められ、副作用の軽減された水溶性誘導体である塩とされてきたが、還流抽出操作の繰り返しは煩雑であり、多酸イリノテカンが見出された。［３］塩酸イリノテカンは、Ⅰ検体の抽出には適さない。そこで、より簡単に多くの検体を型DNAトポイソメラーゼを阻害する事によってDNA合成を抽出処理する方法について検討を行った。また、多検体を分阻害する癌化学療法剤として現在広く知られている。［４］析するためにはHPLCによる短時間分析法も同時に必要であ

喜樹に含まれるCPTとその類縁物質として主なものにはるため、迅速分析法について検討を行った。

１０―Hydroxycamptotecin（OPT）、１０―Methoxycamptothecin〒１８６‐８６５０ 東京都国立市谷保１７９６番地

ヤクルト本社中央研究所

TEL: 042−577−8970, FAX: 042−577−3020*E−mail: ritsuo−aiyama@yakult.co.jp―８１―

Chromatography, Vol.24 No.2 (2003)【材料と方法】

測定方法

装置

①

約２〜３mgを量り、溶媒を５mL加え室温平衡法で行った。

HPLC分析は、Waters社製ミレニアムを解析装置とした②

Waters社製液体クロマトグラフ装置２６９０セパレーションモ

得られた液を遠心分離し上清の２µLをHPLCで分析した。

ジュール（アライアンス）を使用した。
③

ドライバスはScinics社製のAL―２５０型に直径１７mm、深さただし、ジメチルスルホキシドの場合はCPTの秤量を約２０mgとし、注入量は１µLで分析した。

５cmの穴を４０個あけたアルミニウム製ブロックを入れて用いた。

メタノールによる加熱還流法

小型超高速粉砕機は大阪ケミカル株式会社製のワンダーブ
レンダーWB―１（電気容量：７００W、回転数：２５０００回転、容５００mLのメタノールに５gのサンプルを加え、約２時間の量：１５０mL）及びワンダークラッシュミルWDL―１（電気容加熱還流を３回繰り返した後ろ過処理を行う。ろ液を合わせ量：１０００W、回転数：２５０００回転、容量：２００mL）を使用した後、減圧下濃縮乾固し、これを一定量のジメチルスルホキた。

シドに溶かしてHPLC用サンプルとした。

超音波洗浄器はEYELA製のMUS―２０（発振出力：２５０W、HPLC測定条件

周波数：３８KHz、槽容量：約１２L）を使用した。
RP１８CPT及びその類縁物質は以下のHPLC条件で分析した。カGP（５µm；４．
６×２５０mm、５µm；４．
６×１５０mm、３µm；

ラムはMightysil RP１８GP（５µm；４．
６×２５０mm）を２５℃で４．
６×７５mm、３µm；４．
６×５０mm、３µm；４．
６×３０mm）、用いた。移動相は、メタノール、アセトニトリル、及び５０Develosil C３０―UG―３（３µm；４．
６×５０mm）、Xterra RP１８mmol／LのKH２PO４を容量比３５：１５：５０で混液 と し、流 速 を（３µm；４．
６×５０mm)、Symmetry

１．
２mL／minとした。クロマトグラムの測定は検出波長２５４HPLCカラムは以下のものを使用した。MightysilC１８（３µm；４．
６×５０mm）、Chromolith Performance RP―１８e（４．
６×１００mm）nmで行った。HPLCによる分析１サイクルを４５分間とした。
迅速HPLC法は以下の条件で行った。カラムはChromolith

試験管はガラス製ディスポーザブルの１６×１２５mmサイズ

Performance RP―１８e（４．
６×１００mm）を３０℃で用いた。移を使用した。

動相は、メタノール、アセトニトリル、及び５０mmol／LのKH２
試薬と材料

PO４を容量比５：１５：８０で混液としたものを１液とし、５：ジメチルスルホキシド（和光純薬特級、和光純薬生化学

４０：５５で 混 和 し た も の を２液 と し て、２液 の 割 合 を０〜用、関東化学分光分析用、関東化学特級）、２―メトキシエタ

１００％まで４分間で変化させるリニアグラジェントとした。

ノール（純正化学特級）、メタノール（和光純薬特級）、エタ

流量は６．
０mL／minから４分間で７．
０mL／minの流量グラジェ

ノール（和光純薬特級）、エチレングリコール（関東化学特ントで行った。クロマトグラムの測定は検出波長２５４nmで級）、２―エトキシエタノール（関東化学特級）、２―ブトキシ行った。HPLCによる分析を４分間とし、続いて初期状態へエタノール（関東化学特級）、２―（２-エトキシエトキシ）エの洗浄は１液を用いて１分間行い、都合５分間を分析１サイ

タノール（関東化学特級）、２―（２-メトキシエトキシ）エタクルとした。

ノール（関東化学特級）、炭酸プロピレン（関東化学特級）、HPLC用アセトニトリルおよびメタノール（関東化学）を使【結果と考察】用した。

１．抽出方法の検討①

喜樹はヤクルト本社所有の静岡県の栽培地より樹齢２０年高溶媒の選択さ約１５mの木を採取した。幹については地上部から約２ m

一般的に植物からの抽出には、溶媒にメタノールを使用すごとに７箇所サンプリングし、下から順に１〜７の番号をつるため加熱還流装置が必要である。また、正しい値を得るたけた。枝については、１本の枝から３箇所サンプリングし、めには数回の繰返し抽出操作が必要であるため、１日に抽出幹に近いほうから順に１〜３の番号を付けた。根は４箇所サできるサンプル数は数検体に限られる。そこで、より多くのンプリングし、地上に近い方から順に１〜４の番号を付け、検体を同時に抽出できる方法の確立を目的として以下の検討

更に皮の部分と木部の部分に分けた。その他，葉、果実、果を行った。
サンプルは抽出効率を上げ、かつ小容量化を図るため、粉実の柄をサンプリングした。これらの各部位について十分に砕ミルで微粉砕した。抽出溶媒は、煩雑な還流装置を使用せ乾燥させた後、粉砕機で微粉砕した。

ずに加熱抽出するために高沸点溶媒の使用を試みた。以下に検討を試みた高沸点溶媒とその沸点を示した。エチレングリ

溶解度測定法コール（１９８℃）、２―メトキシエタノール（１２５℃）、２―エト

各溶媒におけるCPTの溶解度は以下の方法で測定した。

キシエタノール（１３５℃）、２―ブトキシエタノール（１７０℃）、―８２―Chromatography, Vol.24 No.2 (2003)

Masako Nakazawa, Hiroshi Hatano, Masato Nagaoka and Ritsuo Aiyama

Figure 1. Solubility of CPT in high boiling solvents

Figure 3. Relationship between heating times after ultrasonictreatment and CPT amounts in extracts

２―（２―エトキシエトキシ）エタノール（１９６℃）、２―（２―メト キ シ エ ト キ シ）エ タ ノ ー ル（１９３℃）、炭 酸 プ ロ ピ レ ンの不純物ピークが存在する場合、分析を妨害する可能性があ（２４１℃）、ジメチルスルホキシド（DMSO；１８９℃）。

る。そこで、DMSOと２―メトキシエタノールについてHPLC

CPTは各種溶媒に非常に溶けにくい性質を持つため、抽における不純物ピークを比較した。DMSOは製造元やグレー出する際にはその溶解度が重要な因子となる。従って、上記ドを変えても不純物ピークが多く、HPLC溶媒としての使用の溶媒における溶解度を測定した。結果をFigure１に示す。に適さないと考えられた。一方、２―メトキシエタノールはこの結果から、全ての溶媒がメタノールやエタノールよりも分析に影響を与えるような不純物ピークを検出しなかったた

高い溶解度を示した。CPTは波長２５４nm付近に吸収の極大め、これを抽出溶媒として選択した（Figure ２）。

を示し、この波長によるクロマトグラム上でCPTピークの②抽出方法の検討

高さが約０．
８AUとなる試料濃度は、０．
２mg／mL（１０µL注入

粉砕したサンプルを試験管にとり、溶媒を加えた後超音波時）である。この濃度が試料溶液の最大濃度と考えられ、こで処理し、その後過熱した。抽出溶媒としては、２―メトキの濃度を明らかに超える溶媒は、５種類であった。この中でシエタノールのみを加えた場合と、予め水を加えた後２―メ

最 も 高 い 溶 解 度 を 示 し た 溶 媒 はDMSOの４．
４mg／mLで あトキシエタノールを加えた場合とで比較した。結果をFigureり、続いて２―メトキシエタノールの０．
６mg／mLであった。

３に示す。２―メトキシエタノールのみを加えた場合では、そこで、これらを抽出溶媒の候補とし、以下の試験を行った。

超音波処理により植物の乾燥重量あたり０．
０２０％のCPTが抽抽出したサンプルはHPLCで分析するため、抽出溶媒由来出され、その後の加熱で０．
０４５％まで抽出された。これは、メタノール還流法とほぼ同程度の値であった。一方、加水したサンプルでは超音波処理のみでも０．
０４５％を超え、加熱により最終的に０．
０５５％という値が得られた。このように抽出効率が改善された理由としては、メタノール抽出では還流操作の繰返しによる回収率の損失があること、また水による膨潤と２―メトキシエタノールによる溶解度の向上が考えられた。
これらの検討の結果、抽出方法を以下のように決定した。
ａ．粉砕した喜樹の０．
５gを試験管に秤量する。
ｂ．水１mLを正確に添加する。
ｃ．攪拌の後３０分間放置する。
ｄ．２―メトキシエタノール４ mLを正確に添加する。
ｅ．１０分間超音波処理する。
ｆ．ドライバス上８０℃で２０分間加熱する。

Figure 2. Result of solvent tests
HPLC conditions: column, Mightysil RP 18 GP, 5µm,4.6×250 mm; flow rate: 1.0mL/min; eluent, 50mM potassium phosphate− methanol−acetonitrile (50:35:15, v/v); detection, 254nm; temperature, 25℃.

ｇ．遠心分離して上清を得る。
２．分析方法の検討
喜樹中には、CPTとその類縁物質及び、エラグ酸の誘導―８３―

Chromatography, Vol.24 No.2 (2003)

体などがいくつか存在している。これらの成分の定量分析

長さのカラムでは約２５分間に、また７５mmの長さのカラムでは、汎 用 型 カ ラ ム を 使 用 し 通 常４
５分 か け て 実 施 し て いたは約１５分間まで分析時間を短縮できた。更に、同じ充填剤で（Figure ４）。しかし、多数の検体を分析する為にはより短粒子径を３µmと小さくし、長さも５０mm、３０mmと短くし時間での分析方法が必要であるため、以下の検討を行った。

たカラムによる分析を試みた。その結果、５０mmのカラムで上述のカラムと同じ充填剤で、長さを１５０mm、７５mmとは約１０分間で分析が可能であった。しかし、３０mmのカラム短くしたカラムによる分析を試みた。その結果、１５０mmのでは良好な分離が得られなかった（Figure ５）。そこで、５０mmのカラムについてさらに詳細な検討を進めた。各メーカーの５０mmカラムにおける分析結果をFigure ６に示す。
これらのクロマトグラムから、最も分離が良いと思われたのはカラムCであり、その分析時間は約８分であった。このカラムCについて、さらに分析時間の短縮を試みた。流速を１．０

Figure 4. Typical chromatogram of plant extract in the usual manner
HPLC conditions: column, Mightysil RP 18 GP, 5µm,4.6×250 mm; flow rate: 1.0mL/min; eluent, 50mM potassium phosphate− methanol−acetonitrile (50:35:15, v/v); detection, 254nm; temperature, 25℃.

Figure 6. Comparative study with columns by different suppliers
HPLC conditions: flow rate: 1.0mL/min; eluent, 50mM
potassium phosphate−methanol−acetonitrile (50:35:15,v/v); detection, 254 nm; temperature, 25℃．

Figure 5. Effect of length of packed columns
HPLC conditions: column, Mightysil RP 18 GP, 5µm,4.6×250 mm, Mightysil RP 18 GP, 5µm, 4.6×150mm,Mightysil RP 18 GP, 5µm, 4.6×75mm, Mightysil RP 18
GP, 3µm, 4.6×50mm, Mightysil RP 18 GP, 3µm, 4.6×30 mm; flow rate:1.0mL/min; eluent, 50mM potassium
phosphate−methanol−acetonitrile (50:35:15, v/v); detection, 254nm; temperature, 25℃.

Figure 7. Isocratic chromatogram with a monolithic column
HPLC conditions: column, Chromolith Performance RP−18 e, 4.6×100mm; flow rate: 5.0 mL/min; eluent, 50mM potassium phosphate−Methanol−acetonitrile (60:20:20, v/v); detection, 254 nm; temperature, 30℃.

―８４―Chromatography, Vol.24 No.2 (2003)

Masako Nakazawa, Hiroshi Hatano, Masato Nagaoka and Ritsuo Aiyama

Table 1. Detection and Quantitation Limits

Table 2. Range for Quantitation

Figure 8. Proposed chromatogram for rapid analysis
HPLC conditions: column, Chromolith Performance RP−18e, 4.6×100mm; flow rate: 6.0〜7.0mL/min in 4minutes; eluent A:50mM potassium−phosphate−acetonitrile−methanol (80:15:5, v/v), eluent B: 50mM potassium phosphate−acetonitrile−methanol (55:40:5, v/v),
0% to 100% B in 4minutes; detection, 254nm; temperature, 30℃.

Table 3. Repeatability

mL／minから１．
５mL／minに上げたところ、分析時間は約６分に短縮することができたが、各ピーク間の分離度が著しく低下した。従って、これ以上分析時間を短縮することは困難であると判断した。
そこで、従来の粒子充填型のカラムと異なる新規に開発されたモノリスカラム［７］［８］［９］［１０］を使用した分析

あ り、そ れ ぞ れ の 係 数 は 以 下 の 式 で 示 し た。OPT；y＝法の検討を試みた。このカラムを使用して、高流速での分析

７５５．
１０ x −７０．
９３（ R ＝０．
９９９８）、 CPT ； y ＝７８０．
８９ x −を行ったところ、Figure ７に示したように約４分間でのア

３５０１．
４８（R＝０．
９９９８）、１０MCP；y＝７７７．
６２x−５０７．
３８（Rイソクラティック分析条件が得られた。しかし、実際の抽出＝0.9998）、２０DOC；y＝７８８．
１２x−２６７．
９４（R＝０．
９９９７）。

サンプルの中には注入直後に大きなピークが現れることがあ

検出限界及び定量限界は、定量限界付近の低濃度測定点の回り、この条件ではOPTが重なり、検出できないことが明ら

帰分析による残渣標準偏差及び回帰直線の傾きから算出したかになった（Figure ７）。OPTの溶出を遅らせ、かつ短時間（Table １）。範囲はTable ２に示した。併行精度 は、６回での分析が可能となるようにグラジェント法を用いた条件にの繰り返し注入の結果から相対標準偏差で示した（Table

ついて更に検討した。その結果、メタノール含量を５％に保３）。真度は回収率として表し、ほぼ１００％に近い値が得られ

ち、アセトニトリル含量を１５％から４０％に増加させるリニア

た（Table ４）。

グラジェントに、移動相の流速を６．
０mL／minから７．
０mL／
４．喜樹中のCPT及びその類縁物質の測定minに上昇させる流量グラジェントを組み合わせることで、この方法を用いて測定した１本の喜樹におけるCPTとそ分析時間を４分間とするHPLC法を確立した。Figure ８にクの類縁物質の含量測定の結果をTable ５に示した。CPTと１０ロマトグラムを示す。

MCPは根から幹に向かって徐々に含量が減少する傾向にあり、OPTは幹の部分でこれらと違った挙動を示した。枝で３．分析法のバリデーション
OPT、CPT、１０MCPおよび２０DOCのクロマトグラム かは、部位による差は認められなかった。果実では果実の柄とら判定すると、それぞれの成分ピークはベースライン分離し分 け て 分 析 し た と こ ろ、果 実 で はCPT含 量 は 約０．
０７％でており、このカラムでの高い 分 離 特 異 性 が 得 ら れ て いるあったが、柄の部分では他の成分は同程度であるにもかかわ（Figure ８参照）。また各物質を用いた検量線には直線性がらず、CPTは低い値であった。

―８５―

Chromatography, Vol.24 No.2 (2003)

Table 4. Accuracy

Table 5. Contents of CPT and it’s analogues in several parts of Camptotheca acuminata―８６―

Chromatography, Vol.24 No.2 (2003)②0.016%①0.023%

Masako Nakazawa, Hiroshi Hatano, Masato Nagaoka and Ritsuo Aiyama③0.010%①0.010%②0.008%⑨0.009%⑥0.009%⑩0.009%⑦0.009%⑪0.009%③0.007%④0.012%⑤0.012%④0.007%

Figure 9. CPT contents in each leaf on the same branch⑧0.008%⑤0.007%

次に、最もCPT含量が多かった根について、皮と木部に分けて分析した。根の皮の部分にはCPTも多く含まれているが、不純物であるOPTも含まれていた。葉におけるCPT含量は０．
０５％、OPT含量は０．
０１５％であり、果実の柄におけるCPT含量は０．
０１％、OPT含量は０．
０１１％であった。これら

Figure 10. CPT contents in different parts of leafは他の部位に比較して、CPTの含量に対しOPT含量が多い傾向にあった。

【文献】

また、Figure ９に示したように、１本の枝についていた[1]５枚の葉で比較すると、最も若い１番の葉に多くのCPTがM. E. Wall; M. C. Wani; C. E. Cooc; K. H. Palmer; A. T.
McPhail; G. A. Sim, J., Am. Chem. Soc., 1966; 88, 3888

含まれていた。しかし、Figure１０に示したように１枚の葉[2]J.−C. Cai; C. R. Hutchingson, The Alkaloids, 1983, vol. 21,[3]

S. Sawada; S. Okajima; R. Aiyama; K. Nokata; T. Furuta; T.

においてはCPT含量の差は認められなかった。

ed. By A. Brossi, Academic Press, new York, p.101.

５．結論

Yokokura; E. Sugino; K. Yamaguchi; T. Miyasaka, Chem.

喜樹中のCPTとその類縁物質含量を測定するために、多Pharm. Bull., 1991, 39 (6) 1446−1454

検体同時抽出法ならびにHPLCによる迅速分析法を確立し[4]た。

Kjeldsen, E.; Svejstrup, J. Q.; Gromova, I. I.; Alsner, J.;
Westergaargaard,. O., J. Mol. Biol., 1992, 228, 1025−1030.

従来行われていた抽出法では、煩雑な加熱還流装置を用い[5]

Wani, M. C.; Wall, M. E., J. Org. Chem. 1969, 34, 1364.

た繰返し操作が必要であり、サンプルは数g必要であった。

[6]

Adamovics, John A.; Cina, Jeff A.; Hutchinson, C. Richard,[7]K.Cabrera; G. Wieland; K. Nakanishi; N. Soga; H. Mi-

１日に抽出できる検体数は限られ、多くの検体の抽出には不Phytochemistry 1979, 18 (6), 1085−6.

向きであった。本法では、高沸点溶媒による抽出を行うた
め、試験管とドライバスによる簡易多検体抽出が可能とな

nakuchi and K.K. Unger, Trends in Analytical Chemistry,

り、１日の抽出数が約１００検体となった。また、サンプル調

1998, 17, 50−53.

製に微粉砕化工程を設けたため、必要なサンプル量は従来の[8]

K. Nakanishi, J. Porous Mat. 1997, 4, 67−112.

１／１０程度で十分となった。

[9]

H. Minakuchi; K.Nakanishi; N. Soga; N Ishizuka; N.

分析法については、一般的な粒子充填型HPLCカラム（内Tanaka, J. Chromatogr. 1997, 762, 135−146.

径４．
６mm、長さ２５cm）を用いて、４５分かけて測定してい[10] H. Minakuchi; K. Nakanishi; N. Soga; N Ishizuka; N.

たが、モノリスカラムを用い、有機溶媒グラジェントと流速

Tanaka, J. Chromatogr. 1998, 797, 121−131.

グラジェントの組合わせによって４分間の分析が可能となった。

―８７―