Technical Review

Chromatography, Vol.27 No.2 (2006)

Technical Review

Dual Exchange Gradient SystemによるナノLCを使用したタンパク質解析用LC / Linear Ion Trap−Time of Flight MSの測定
緒方いずみ、石井公彦、山下絵理、吉岡信二、照井康

LC / Linear Ion Trap−Time of Flight Mass Spectrometer for Protein Analysis
Using Nano LC With Dual Exchange Gradient System
Izumi Ogata, Kimihiko Ishii, Eri Yamashita, Shinji Yoshioka and Yasushi Terui
Hitachi High−Technologies Corporation, 882, Ichige, Hitachinaka, Ibaraki, 312−8504, Japan

Abstract“NanoFrontier LD”, a new LC/Linear Ion Trap (LIT)− Time of Flight (TOF) MS for protein analysis has developed by Hitachi High−Technologies Corp. One of its remarkable features is NanoLC with Dual Exchange Gradient System (DEGS). DEGS offers great reproducibility ofnano−flow gradient elution. Connecting NanoLC and LIT−TOF MS which MSn analysis with high mass accuracy is available, Information
Based Acquisition (IBA) is also available. With IBA, the efficiency of protein identification by MS/MS improves.
Keywords : LC/MS ; nanoLC ; proteomics

析法を搭載し、試料の構造情報をより多く得る事が可能と緒言
創薬や体外診断において、疾病メカニズム解明および疾患なった。さらにソフトウェアは独自機能Information Based Ac-関連マーカー（以下、バイオマーカー）探索のために、細胞、quisition（以下、IBA）を実装し、タンパク質の同定精度が血清、尿などに含まれるタンパク質や代謝物の解析が盛んに向上した。

行われている。株式会社日立ハイテクノロジーズでは、２００６

本稿では、NanoFrontier LDの特長の一つであるナノLCの送年５月にタンパク質解析用液体クロマトグラフ/リニアイオ液方式と、ナノLCの保持時間再現性の高さを活用した独自

ントラップ飛行時間型質量分析装置（以下、LIT−TOF MS）

機能IBAについて述べる。

「NanoFrontier LD」を発売した（Figure １）。
NanoFrontier LDは、スプリットレスのナノLCによる優れたDual Exchange Gradient System（DEGS）

グラジエント再現性、またLITとTOFを結合したMSの多段階

NanoFrontier

LD搭載のナノLCは、当社独自のDual

Ex-MS/MS分析による構造解析と高質量数精度計測に加え、検change Gradient System（以下、DEGS）[1] [2]により、流量１０出系を改良、ダイナミックレンジ５，０００以上を達成し、測定〜２５０nL/minでの安定したグラジエント送液を実現した。
DEGSの概略構成図をFigure ２に示す。このシステムは、試料の量的変動解析を可能にした。また、複数のMS/MS分㈱日立ハイテクノロジーズ ナノテクノロジー製品事業本部
那珂事業所 バイオシステム設計部 緒方いずみ〒３１２―８５０４ 茨城県ひたちなか市市毛８８２―６９―

Chromatography, Vol.27 No.2 (2006)

ンプが送液するナノ流量の溶媒も、１０方バルブのもう一方のループへ送液される。１０方バルブの切り替えに応じ、それぞれのループに満たされたグラジエント溶液は、ナノ流量の溶媒によりサンプルインジェクタ、カラムへと押し出される。
このようにDEGSは、グラジエント再現性をセミミクロポンプ、ナノ流量の送液安定性をイソクラティックポンプが担う事により、スプリットレスで再現の良いナノグラジエント送液を実現した。
Figure ３に、BSAトリプシン消化物を流量５０nL/minで測定したクロマトグラムを示す。また、Table １に同試料を６回繰り返し測定した保持時間の再現性評価結果を示す。主なペFigure 1. NanoFrontier LD

プチド４成分のピーク保持時間RSDが０．
３〜０．
６％と、良好な結果を示した。

セミミクロ流量の低圧グラジエントポンプ（以下、グラジエント ポ ン プ）、ナ ノ 流 量 で 単 一 溶 媒 を 送 液 す る イ ソ ク ラ

Information Based Acquisition（IBA）
バイオマーカー探索では生体試料中のタンパク質・ペプチティックポンプ（以下、ナノフローポンプ）、容量の等しいドを網羅的に解析し、その中からマーカーとなる成分を見出２つのループを備えた１０方バルブで構成している。
送液を開始すると、グラジエントポンプとナノフローポンす。生体試料中に存在するタンパク質・ペプチドは種類も量プは同時に送液を開始し、１０方バルブが一定時間（例えば１も様々であり、いかに分離の良いクロマトグラフィーでもそ分）毎に流路を切り替える。グラジエントポンプが作製するれらを完全に分離する事は不可能である。

グラジエント溶液は１０方バルブの片方のループへ送液され、IBAは、LCでの分離が不十分で、ほぼ同時にカラムから溶ループを満たしドレインへ排出される。また、ナノフローポ出する複数成分を出来る限り多く同定するために開発した。

Figure 2. Schematic diagram of Dual Exchange Gradient System―７０―Chromatography, Vol.27 No.2 (2006)

Izumi Ogata, Kimihiko Ishii, Eri Yamashita, Shinji Yoshioka and Yasushi Terui

Table 1. Reproducibility of peak retention times of BSA tryptic

IBAは、同一試料を繰り返し測定する際にMS/MS測定したターゲット成分の情報（質量数と保持時間）をリアルタイムdigestに内部データベースへ記憶し、複数回の測定でMS/MS測定

Retention time (minutes)

する成分の重複を防ぐ機能である[2]。また、同内部データベースは編集可能であり、測定試料に混在、又は前処理や環境により混入する夾雑成分等の既知情報の追加が可能である。NanoFrontier LDは、この内部データベースを参照しながら繰り返し測定を行うため、特定ターゲット成分を選択的に効率良くMS/MS測定可能である。
IBAを用いた、大腸菌抽出サンプル酵素消化物の４回繰り返し測定の結果を示す。Figure ４は試料のトータルイオンク

peak 1peak 2peak 3peak 4

exp. 1

15.4

27.4

31.4

40.9

exp. 2

15.3

27.2

31.4

40.8

exp. 3

15.4

27.3

31.2

40.9

exp. 4

15.3

27.3

31.4

40.5

exp. 5

15.6

27.3

31.0

40.9

mean

15.4

27.3

31.3

40.8

ロマトグラム（以下、TIC）である。４つのクロマトグラム

std. dev

0.095

0.090

0.1880.172の感度および溶出パターンに大きな変動は無い。次に、MS/rsd (%)

0.618

0.331

0.601

0.421

MSのみのTIC（Figure ５）を見ると、４つのクロマトグラムのパターンがそれぞれ変動している事が判る。これは、IBAにより同一成分のMS/MS測定が回避された為である。これ
らの測定結果をタンパク質検索エンジンMASCOT で検索し、ヒットしたタンパク質数の変化をFigure ６に示す。タン
パク質数は測定回数に応じて増加した。
（本機能はNEDO助成事業の成果の一部です。）
結論
DEGSにより、セミミクロLC同等のグラジエント送液安定性と保持時間再現性がナノLCで得られるようになった。また、保持時間再現性の高いナノLCをLIT−TOF/MSと接続する事でIBAが実現し、MS/MSによる構造解析効率の向上を達成した。
上記独自技術による優れた同定機能と、定量機能を兼ね備

Figure 3. Total Ion Chromatogram of BSA tryptic digest at 50 nL/min.

えたNanoFrontier LDは、バイオマーカータンパク質探索へのFigure 4. Total Ion Chromatograms of E.coli digest at 200 nL/min.

―７１―Chromatography, Vol.27 No.2 (2006)

Figure 5. MS/MS Chromatograms of E.coli digest at 200 nL/min.
多大な貢献が期待される。
参考文献
[1]

Deguchi, K. ; Ito, S. ; Yoshioka, S. ; Ogata, I. ; Takeda,
A. Anal. Chem. 2004, 76, 1524−1528.

[2]

Ito, S. ; Yoshioka, S. ; Ogata, I. ; Takeda, A. ; Yamashita,[3]

Yokosuka, T. ; Yoshinari, K. ; Kobayashi, K. ; Ohtake,E. ; Deguchi, K. J. Chromatogr. A 2004, 1051, 19−23.
A. ; Hirabayashi, A. ; Hashimoto, Y. ; Waki, I. ; Takao, T.
Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006, in press.

Figure 6. Statistics showing identified proteins for data number―７２―