卿絲氏42 (課程博士(和文))2023年
機械工学専攻

学耒昔番号

7月7日

柴田隆行

弟 173154 号
指導教員

氏名

永井萌士

夏原大悟

論文内容の要旨(博士)
博士学位論文名

マイクロ流体制御技術に基づく標的遺伝子の多検体・多項貝同時定量診断システム(要旨 1,200字程度)
新型コロナウイルス感染症(C0ⅥD、19)の世界的な大流行(パンデミック)が引き起こしたように,ウィルス感染症がもたらす人々への恐怖や,経済活動へ与える影響は計り知れない.感染の拡大防止には,迅速かつ正確な診断技術が必要となる.本論文では,マイクロ流体チップテクノロジーと等温遺伝子増幅法(LAMP法)を組み合わせることで、 1回の作業工程で,標的遺伝子の多検体・多項目同時定冕診断が行えるシステムを開発した
はじめに,提案するマルチプレックス遺伝子診断デバイスの基本原理として,横型相ガイドによる複数の反応容器への検体・試薬の分注技術,横型ミキサによる高効率な混合,蛍光LAMP法による多項目同時遺伝子診断を示した.しかし,実用化に向けの技術的課題として,多段階の作製プロセスが必要なこと,迅速診断が困難であること,蛍光観察のための特殊な装置が必要であることが挙げられた

次に,分注操作における受動バルブの決壊圧力の向上を目的とし,縦型相ガイドを老案し,導ノ＼流量の向上を実現した.また,本デバイスの分注理論を構築し,各反応容器に設置した2個垰且のバノレブに必要となる決壊圧力の設計指針を明らかにした.さらに,受動バノレブを空気排出流路内に配置した

エアープラグィンバルブ構造を老案し,導入流量のさらなる向上を実現した.反応容器への充填が完了すると,対向する受動バノレブ間に捕捉された空気を介して液体が互いに押し合い、受動バノレブに印,加される圧力が減殺できることを示した.その結果,最大導入流量70μUminの導入を可能にした
続いて,混合部において, 1回のプロセスで簡易に作製できる高効率な受動ミキサ(P・ACEミキサ)を開発した.流路長手方向に対し,左右非対称な障害物構造を流路壁面に設けることで、 2液が流路幅方向に対して交互に入れ替りながら混合が促進されることを示した.その結果,広いレイノルズ数の範囲(Re=0.B B)において高い混合性能を実現した(送液距雛20mmで混合効率90 %以上)
現場即時検査を目的として,デバイス上で比色指示薬を用いた遺伝子増幅実験を行った.節足動物

媒介性ウィルス,有毒植物,ヒト感染性ウィルス,農作物病害虫,植物性食物アレルギー物質の多項
目同時診断を実現し,反応容器の色の変化による定性診断が可能であることを示した.さらに,遺伝子1卸幅中のデバイス画像を取得するタイムラプス撮影装置と,取得画像から反応容器の色相変化を解析するプログラムを開発し,比色指示薬を用いた検体中の標的遺伝子の定量診断手法を確立した.ヒ
トヘルペスウイルスの遺伝子定量診断に適用し,その有効性を実証した.
、ニ^

多検体の同時遺伝子診断を実現するために,遠心力によって送液が可能なデバイスを開発した.遠心力による流体操作に適した流路デザインを検討し,複数の反応容器への逐次的な分注を行うための遠心分注理論を構築した.開発した速心送液型デバイスを用いて,食物アレルギー物質の 4検体・4 1頁
目同時定量検査を実現した

卿俳氏41 (課程博士(英文))Date of submisslon (month day, yeal')
Department

July 7,2023

Of

MechanicalStudenuD NumberEngineering
APP11Cant's nameTakayukishibata

D173154
Supervisors

Daigo Natsuhara

Moeto Na曾ai

Abstract (Doctor)
Title ofThesis

A Micl'0打Uidic・Based Quantitative Analysis system forthe simultaneous Detection
OfMultiple Nucleic Acid Tal、gets in Multiple samples

Approx.80o words

A risk management strategy to address em引'ging and reem引'ging viralinfectious diseases is aPressing global public health cha11enge. Early detection of viruses thl'ough rapid and accurate
diagnostic techn010gies iS 御'eventing the spread of infection. Therefore, a mi引'0"uidic・based
quantitative analysis systenl has been developed for the multゆlexed genetic diagnosis of multiple
nucleic acid tω、gets in multゆle samples in a single operation by combining the microfluidic
techn010gy and the loop・mediated isoth引'mal amplification (上AMP) method

The basic principle of the multゆlex genetic diagnosis device,including liquid dispensing into anωlay of miu'ochambers, highly efficient liquid mixing, and multiplexed genetic diagnosis based
On a aUω'escent LAMp method, was presented. However, seV引'altechnical chaⅡenges remain for
Practical application, such as the need for a two・step fabrication process, the difficulty of rapid
diaσnosis, and the need for the nuorescence observation setup
To address such issues, a vertical・type phaseguide Sれ'ucture was introduced to impl'ove the bⅢ'stPresSⅢ'e ofthe passive valve in the dispensing region, thus resulting in an increase in aow rate to
be dispensed into microchambers. Moreover, a microauidic flo、刃 Controltheory was developed toProvide design guidelines for a pair ofpassive valves. To further improve the maximum aow rate,a passive valve connguration with high pressure resistance P引formance, termed an " air plug‑inValve", was proposed. By implelnenting the air plug・in valve, a maximal aⅡOwable ao、N rate of 70μL/11)in could be achieved for sequentia1 Ⅱquid dispensing int0 10 mi引'ochambers
In a mixing region, an efficient micromixer with a simple geometrical feature, termed a 孤P‑ACEmixer", was developed. The p・ACE mixier with vertical obstacle structⅢ'es asymmetricaⅡyarranged on both side圦ノa11S, which can be easily fabricated via only a sinσle・step photolithography
Process, exhibited a high mixinσ efficiency of 90% or more within a miⅨ'ochanne11ength of 20
mm over a wide range ofReynolds numbers(Re = 0.B‑B)
Xvith the aim of enablinσ on・site diaσnostics, LAMp assays were performed using a c010rimetricindicator on the fabricated devices. simultaneous diagnosis of arbovirus infections, toxic plants,

human viral infections, agricultural pests, and plant food aⅡ劔'gens were demonstrated. A
qualitative detection was made possible by a c010r change in a positive reaction chamb引'Moreover, a mi引'oauidic・based quantitative analysis system was developed; it consists of a time・Iapse imaging equipment to acquire the device image during DNA ampli6Cation reaction and aProgram to analyze the hue change of reaction chambers n'om the obtained images based on theC010rimetric LAMp assays. using this system, a quantitative genetic diagnosis of humanherpesvirus with high accuracy was successfUⅡy demonstrated

To realize simultaneous genetic diagnosis of multiple samples, a newly designed centrifugal
microfluidic device capable of sequential dispensing of multiple samples 、vas developed.1naddition, the desi8n guideline was proposed to sequentia11y dispense a liquid into multiple
microchamber in a centrifugal pumping system. Furthermore, a quantitative dia今nosis offour fooda11ergens was P引formed simultaneously for four food samples