がん転移治療を可能にする生分解性高分子を素材としたがん指向性核酸搭載ミセル設計
福岡大学 薬学部
免疫・分子治療学
助教 櫨川舞2021年5月20日
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核酸医薬開発における従来技術とその問題点
核酸の実用化には、核酸の特徴である①血中安定性の低さ、②細胞膜透過性の低さ、③速やかな腎排泄の課題により、ドラッグデリバリー技術の応用が必須である。さらに、近年では、製剤化に用いられる④高分子の毒性により臨床試験に至らない事例が発生し、製剤の安全性も重要な課題である。
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siRNA-PLGAハイブリッドミセルの構造と細胞内取り込み機序
siRNA-PLGA複合体①カチオン性高分子による細胞透過性向上＋＋＋＋＋＋＋O＋＋＋＋S

H
NS＋

siRNA

N
H

PLGA（生分解性高分子）＋＋＋＋＋

がん細胞＋＋＋⑥タンパクノックダウン
による細胞増殖抑制＋②エンドサイトーシス ＋による細胞内取込＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

siRNA⑤フリーのsiRNAの細胞質内放出＋＋＋＋③カチオン性高分子によるエンドソーム膜不安定化によるエンドソーム脱出④PLGAの生体内分解によるsiRNA-PLGAハイブリッドの崩壊

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疾患背景①：早期発見の難しい卵巣がん治療
卵巣がんの病期（ステージ）分類

腹膜播種、腹水が認められる卵巣がんは、自覚症状がないため早期発見が難しく、発見時にはⅢ期以上であることが多く、Ⅲ期以上の5年生存率は40％以下と非常に治療困難な疾患である。Ⅲ期以上で腹膜播種が認められ、手術困難な場合には、抗がん剤を使用した治療が行われるが現在腹膜播種に有効な治療薬がない。
そのため、卵巣がんの治療においては、いかに早期発見をするか、または有効な腹膜播種治療薬を開発することが急務である。
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疾患背景②：GPC3の高発現は、卵巣がんの予後の悪化を促進する
標的遺伝子Glypican-3（GPC3）とは：
GPC3は悪性度の高い卵巣がん患者に特に高発現しており（下図参照）、がんの増殖、転移に関与するグリピカンファミリーの一つである糖タンパクである。肝臓がんでも高発現していることが知られており、膜表面からその一部が切断され、血清中に可溶性タンパクとして存在することから腫瘍マーカーとして使用されている。
また、GPC3は、T細胞やB細胞、マクロファージなどの免疫細胞にも存在しており、炎症作用を介してがん転移の進展への関与も知られている。

baMonths after surgery

Months after surgery
引用：Maeda D, et al, Mod Pathol, 22(6): 824-832 (2009)5開発製剤の標的遺伝子抑制による卵巣がん細胞増殖抑制効果＜方法＞
細胞株：マウス卵巣がん細胞株HM-1
ミセル製剤添加24時間培養後にウェスタンブロッティングおよび細胞増殖/細胞毒性アッセイキット
WST-8による細胞生存率の評価を行った。チオール基修飾siRNAは、サーモフィッシャー社より購入した。

＜ウェスタンブロッティングによるGPC3発現量の定量＞＜細胞増殖/細胞毒性アッセイキットWST-8による細胞生存率の評価＞
Cell viability (%)

name of formulations
Control (non treatment with siRNA)

100.0±1.2

siRNA (Gpc3)

99.7±0.5

siRNA-PLGA hybrid micelles

86.5±0.9 **Liner polyethylenimine (LPEI) 25k coatedsiRNA-PLGA hybrid micelles

LPEI 2.5kcoatedsiRNA-PLGA hybrid micelles

N/P 10 ※63.3±2.6 **N/P 2058.5±2.5 **N/P 4056.2±5.4 **N/P 2085.0±0.3 **N/P 4074.7±1.9 **N/P 8070.6±0.3 **※N/P比：siRNAに対するLPEIのモル比
Mean ±SD（n=3）**p<0.01 vs control (Bonferroni test/ANOVA)

開発製剤は、細胞内取り込み効率が高く、がん細胞の増殖を有意に抑制した。
6卵巣がん腹膜転移モデルマウスにおける開発製剤のがん転移抑制効果＜方法＞卵巣がん腹膜転移モデル：B6C3F1雌性マウスにマウス卵巣がん細胞株HM-1を腹腔内に移植し14日後に開腹し、腹腔内転移コロニー数の計測、腹水を回収し、腹水中のサイトカインをELISA法にて定量した。
ミセル製剤は、HM-1腹腔内移植24時間後に1回 （100 pmol/mouse） 腹腔内投与した。
＜開腹後の腸間膜の様子＞
controlsiRNAmicelle

LPEI coated micelle＜腹腔内の転移コロニー数＞＜腹水中IL-6量＞＜腹水中IFN-γ量＞

Mean ±SD（n=5）**p<0.01 vs control (Bonferroni test/ANOVA)

開発製剤は、卵巣がん腹膜転移モデルの転移コロニー数、腹水中の炎症を有意に抑制した。
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卵巣がん腹膜転移モデルマウスにおける開発製剤のがん転移抑制効果（標準治療薬との比較）
control

Carboplatin 50 mg/kg

LPEI-micelle 100pmol

Paclitaxel 2.5 mg/kg

実験14日目の腹腔内腫瘍数

28日間における生存率

The number of disseminatednodules / mouse

353025201510**5******0control

carboplatin

paclitaxel

micelleLPEI-micelle

Mean ±SD（n=6）**p<0.01 vs control (Bonferroni test/ANOVA)

開発製剤は、標準治療薬であるカルボプラチンやパクリタキセルよりも生存率を延長させた。
8がん指向性開発製剤の特異的標的細胞集積効果の検証＜がん指向性ミセル製剤の構造と細胞内取り込み機序＞

Fab’（抗CD71抗体）＜蛍光標識siRNAの細胞内送達効率の評価＞

PLGA
青：DAPI 緑：Alexa488標識siRNA（A) control(B) LPEI-micelle(C) Fab’ –modifiedLPEI-micelle

Fluorescence intensity (ex 495 nm/em 519 nm)

がん指向性開発製剤は、特異的に標的細胞を認識し、siRNAの細胞内送達効率を向上した。
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新技術の特徴・従来技術との比較• 使用している高分子が安全な素材である。
• 本技術であるPLGAハイブリッドミセルを利用した高効率な核酸送達により、in vivoにおいて、核酸の投与量が従来の1/10～1/50に削減できる（100pmol（siRNAとして）/mouse1回投与で２週間有効：スライド7参照）。
• 多様な疾患治療薬開発を目指した、本研究とは異なる標的遺伝子や標的細胞認識分子への応用が可能なユニバーサルデザインである。
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想定される用途• 本ミセル製剤は、核酸医薬の安全かつ安定なDDSとして期待できる。
• 本ミセル製剤は、ペプチドも含有できる特徴を生かし、生理活性のあるペプチド含有医薬品への応用も可能である。
• 遺伝子導入試薬への応用も可能である。

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実用化に向けた課題• 現在、本開発製剤の卵巣がん転移治療効果については、標準治療薬と比較して、有意な治療効果、生存期間の延長効果まで検証済みである。
• 今後、実用化に向けて、がん細胞特異的集積性をさらに高めるために、静脈内投与後の開発製剤のマウスにおける体内分布について実験データを取得し、静脈投与可能な製剤設計条件設定を行っていく。

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企業への期待• 未解決の製剤の集積性向上は、がん細胞表面に特異的に発現する分子の中から最適な候補分子を選択することで克服できると考えている。
• 核酸医薬の開発、また難治性がん、遺伝子疾患、希少疾患の治療薬の研究開発に展開する製薬企業との共同研究を希望する。
• また、遺伝子導入試薬の製造・販売に関与する企業に、本技術の導入を期待する。

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本技術に関する知的財産権
発明の名称
出願番号
出願人
発明者

：薬物送達粒子及び医薬組成物：特願2020-172692：学校法人福岡大学
：櫨川 舞

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お問い合わせ先
福岡大学

研究推進部

産学官連携センター

ＴＥＬ：092－871－6631
ＦＡＸ：092－866－2308
e-mail：sanchi＠adm.fukuoka-u.ac.jp

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