⽣殖⼯学：今さら聞けないこんなこと、あんなこと
動物⽣殖⼯学研究会理事会編
会員の皆様は、⽣殖⼯学関連業務に従事してから数年〜⼗数年経過している⽅々が多いと思います。その経験を重ねる過程の中で様々なノウハウが蓄積される⼀⽅で、いくつかの疑問にも直⾯していると推察いたします。専⾨家として育成される過程で、しばしば、知識として蓄えなければならない事項（⽤語、メカニズムなど）を素通りしてしまい、「今さら聞けない」事態に陥っている場合が少なくないことを反映しているように思われます。
本稿は、このような専⾨家や経験を蓄積途上の⽅々を対象に、互いの知識や経験を交換する卒後教育の場を提供しようと企画されました。研究会・学会は、会員相互による卒後教育の機能を担っていると考えます。この場を通じて、多くの会員の皆様の疑問が解消でき、質の⾼い⽣殖⼯学の振興に貢献されることを期待しています。

Q1：⽣殖⼯学と発⽣⼯学の違いを教えて下さい。
発⽣⼯学は、「主に哺乳動物を対象として、⽣殖細胞、初期胚あるいは多分化能を有する細胞に対し、何らかの遺伝⼦操作を加えて発⽣の過程を操作する⽅法や、その操作によって得られた動物の解析や利⽤を研究する領域」と理解することができます。つまり、発⽣⼯学は、分⼦⽣物学（遺伝⼦⼯学）、⽣理学（病態⽣理学）、組織学（病理学）、実験動物学、繁殖学（⽣殖⼯学）などから構成される統合的な研究領域であり、in vivo の遺伝⼦機能解析系であると考えられます。
また、⽣殖⼯学は⼈⼯繁殖技術や⽣殖補助医療技術を包含するとともに、⽣殖細胞・胚操作技術を中⼼とした発⽣⼯学の⼀部を構成する研究・技術領域であると考えられます。胚操作技術の単独利⽤で本来 in vivo で起きる現象を in vitro で再現させることや、⾃然界では存在し得ない個体の⼈為的作成を発⽣⼯学に含める考え⽅もあるようですが、これらは⽣殖⼯学に分類されるのが適切かと思われます。
Q2：マウスなどの初期胚を保存する⽅法に、凍結保存⽅法とガラス化保存⽅法がありますが、その違いは何でしょうか？
⼤きな違いは、冷却した際に、氷の結晶が細胞内外に形成されるか否かです。凍
結保存⽅法は氷の結晶を成⻑させながら冷却します。⼀⽅、ガラス化保存は氷の結晶を⽣じさせずに冷却します。

哺乳動物の卵⼦や胚の細胞質は、85％程度が⽔で構成されています。これらの細胞を氷点下まで冷却すると氷晶を形成しますが、細胞内の氷晶形成は細胞を物理的に破壊することになるので、細胞の凍結保存においては、これを防ぐことが最⼤の課題と⾔えます。このため、保存液に凍結保護物質を添加しています。細胞を⻑期間保存するためには、（多くの⽔分を含む）細胞を固体にしなければなりませんが、液体が固化する場合には氷晶を形成する場合と形成しない場合があり、後者をガラス化(vitrification)と呼んでいます。これは、低温下で液体の粘度が⾼まり、⼀定の温度（ガラス化転移温度）以下で固化する現象で、氷晶を形成しないのが特徴です。
ちなみに、細胞内のガラス化転移温度は−１３０℃ですので、ガラス化した細胞の保存には、ドライアイス（−７９℃）ではなく液体窒素（−１９６℃）が必要です。
Q3：凍結保存液やガラス化保存液はどのような物質から構成されていますか？また、それぞれの構成要素の役割は何ですか？
グリセロール、エチレングリコール、DMSO、プロピレングリコール等は分⼦量が 100 以下ですが、これらは細胞膜を浸透することのできる凍結保護物質として⽤いられています。また、凍結前の平衡での細胞内の急激な脱⽔、融解後の細胞内への急激な⽔の流⼊防⽌といった細胞膜の保護のために、細胞膜を透過せず浸透圧効果のあるシュクロースやラフィノースなどの少糖類や⾼分⼦物質を⽣理的な溶液に添加しています。
Q4：液体窒素中で保存している凍結保存胚や精⼦についての保存可能期間は何年くらいですか？
液体窒素中で⽣きた細胞を凍結保存すると、すべての代謝活性がほぼ停⽌し、半永久的に保存可能と⾔われています。唯⼀問題となるのは、保存期間中に受ける宇宙や地中などに由来する⾃然放射線の影響ですが、バックグラウンドの放射線量（⾃然放射線）の 84 倍量の放射線を 29 ヶ⽉間照射（約 200 年間の⾃然放射線線量相当）した凍結胚において、融解後の⽣存性や得られた産⼦には、まったく影響がなかったとの報告があります(Whittingham et al., Long-term storage of mouseembryos at -196 degrees C: the effect of background radiation. Genet Res 29:171181, 1977)。
また、25 年間液体窒素中に凍結保存したマウス胚から正常な産⼦が⽣まれていますし、家畜においても、20 年間保存されたウシの凍結精⼦の⼈⼯授精で産⼦が得られています。 従って、胚や精⼦を液体窒素中で凍結しておけば、半永久的な保存が可能と思われます。

Q5：２細胞期で凍結したマウス胚の融解後、⽚側割球が死滅していました（もう⽚⽅の割球は正常）。この胚を移植しても産⼦へ発⽣が期待できますか？
発⽣率は低いですが、正常な産⼦へと発⽣します。移植胚の 10〜20％が産⼦へ発⽣し、その後の発育や繁殖能⼒も正常であることを経験しています。
また、⼈為的にマウスの 2 細胞期胚あるいは４細胞期胚の割球を２分離（それぞれ 1/2 胚、2/4 胚）して体外培養後、桑実胚および胚盤胞に発⽣した２分離胚を移植した結果、1/2 胚では 25％、2/4 胚では 29％が産⼦へ発⽣したことが報告されています（富樫ら、マウスの２細胞期胚分離による⼀卵性双⽣仔の作出、家畜繁殖誌、33: 51-57、1987）。
Q6：ドライシッパーに液体窒素を⼗分に充填して海外へ送ったのですが、結果的に液体窒素がカラになってサンプルは融けていました。このドライシッパーは故障（不良品）していたのでしょうか？
輸送中にドライシッパーが転倒していたと思われます。ドライシッパーを横倒しの状態で置くと、5〜6 ⽇で液体窒素が蒸発し、凍結精⼦や胚が融解してしまいます。必ず、上⾯に THIS SIDE UP と注意書きをして、輸送中に横倒しにしないようにしてもらうことが重要です。
Q7：凍結サンプルの⼊ったストローやチューブを液体窒素タンクに⼊れて輸送したいのですが、通常の宅配便で良いでしょうか？
宅配業者毎に液体窒素の取り扱い規定が異なります。通常の液体窒素タンクは扱いませんが、タンクが倒れても液体窒素がこぼれないドライシッパーは取り扱う業者もあります。さらに同じ業者でも地域によって扱いが異なりますので、事前の確認が必要です。
Q8：遺伝⼦改変マウスの精巣上体尾部の輸送に関しても、カルタヘナ議定書のルールが適⽤されるのでしょうか？
通常の組織は適⽤外ですが、卵巣、精巣、精巣上体、精管などの⽣殖器・副⽣殖器は、卵⼦や精⼦を含んでいるため、⽣殖細胞と同じと⾒なされ、カルタヘナ議定書のルールが適⽤されます。
Q9：レシピエントマウスへ胚移植を⾏う適切なタイミングを教えてください。
胚移植する初期胚の発⽣ステージによって異なります。レシピエントマウスにプラグがついた当⽇（0.5 dpc）は、前核期受精卵〜８細胞期胚を卵管に移植します。
また、8 細胞期胚から胚盤胞を移植する場合には 2.5 dpc（あるいは 3.5 dpc）に⼦宮に移植します。要するに卵管ステージの初期胚は卵管に、⼦宮ステージの胚は⼦宮に移植するのが⼀般的です。また、⼦宮ステージの胚を 0.5 dpc の卵管に移植することも可能です。この場合、レシピエントの妊娠⽇令に合わせて分娩されます。
しかし、卵管ステージの胚を⼦宮に移植することは現実的ではありません。また、
レシピエントの妊娠⽇齢が初期胚の発⽣⽇齢より進んでいると、胚移植しても妊娠しないので注意してください。
さらに、プラグ確認⽇であっても深夜の移植になると移植胚が着床することはありませんので注意が必要です。これは卵管上⽪細胞の繊⽑運動が変化することによって胚の移動が妨げられることが原因と推察されます。⽇中忙しくて移植ができなかった場合は、深夜まで働くことは避け、改めて移植実験を設定するようにしてください。
Q10：マウスの凍結保存胚を融解した結果、数個の２細胞期胚と数個の桑実胚が残りました。少数の胚を移植した場合には分娩が遅延して結果的に産⼦を得ることができないので帝王切開が必要になると聞きました。⾥親を⽤意していません。どうしたら良いでしょうか？
⼤丈夫です。２細胞期胚と桑実胚を⼀緒に卵管に移植してください。両者ともにレシピエントの妊娠⽇令に合わせて発⽣します。発⽣時期の異なる胚が移植された
場合には、着床後に胚の発⽣が同調することが報告されています(Ueda et al.,Possible expansion of “window of implantation” in pseudopregnant mice: Time ofimplantation of embryos at different stages of development transferred into the same
recipient. Biol Reprod 69; 1085-1090, 2003)。また、⽑⾊の異なる他の系統の胚が⽤意できるのであれば、それらと⼀緒に移植するのも⼀つの⽅法です。
Q11：体外受精と⼈⼯授精の違いを教えてください。
体外受精は、卵⼦も精⼦も体外に取り出して培地内で受精させます。⼀⽅、⼈⼯授精は体外に取り出した精⼦を⼦宮や卵管に注⼊して受精させます。⼈⼯授精では「授精」を⽤い、「受精」とは記載しないことに注意してください。
Q12：前培養したマウスの精⼦は、培養何時間⽬まで精⼦を体外受精に使⽤できますか？例えば、前培養 10 時間後の精⼦でも受精することができますか？
ご質問は、受精能獲得のための培養（前培養）をどれだけ延⻑できるのか？ということと理解します。前培養１０時間の成績は持っておりませんが、24 時間後には受精することはほとんどないことが報告されています。37℃、5％CO2、95％空気の気相下で 24 時間培養した 150 精⼦/μｌの濃度の精⼦の受精率は０％、750 精⼦/μｌの濃度の精⼦の受精率は、わずか１％でした。しかし、37℃、5％CO2、95％空気の気相下で１〜1.5 時間培養した受精能獲得精⼦を 24℃、100％空気、あるいは 24℃、5％CO2、95％空気の気相下で 24 時間培養（放置）した精⼦を 37℃、5％CO2、95％空気の気相下で１〜1.5 時間追加培養して媒精した結果、150 精⼦/μｌの濃度の精⼦では 37.46％、750 精⼦/μｌの濃度の精⼦では 63.66％の受精率が得られています。さらに、24℃、100％空気の条件で 24 時間培養（放置）する際の精⼦濃度を 2.4×10^4/μｌに⾼めることによって 100％近い受精率が得られることも報告されています。得られた受精卵は体外培養によって⾼率に胚盤胞に発⽣すること、移植によって移植胚の 70％以上が産仔に発⽣することも⽰されています。
ちなみに、冷蔵庫温度で保存された受精能獲得精⼦の受精率は、37℃と同様に極めて 低 い も の で し た (Jishage & Suzuki, Maintenance of the fertilizing ability incapacitated mouse spermatozoa. J Reprod Dev 39; 363-367, 1993)。したがいまして、今⽇使⽤した精⼦のシャーレを机の上に置いておけば、明⽇、温め直して再利⽤できるということになります。
Q13：体外受精後の受精卵を受精⽤培地から体外培養⽤培地（mWM や KSOM、mCZB）に移すベストなタイミングはいつでしょうか？２細胞期で移すより、前核期で移したほうが良いでしょうか？
培養液に添加される 10〜100μM の濃度の EDTA は、そもそも 2-cell block を克服するために添加されていますが、2-cell block に対する EDTA の添加は２細胞期では効果がなく、前核期から添加することが必要です。したがいまして、例え、2-cell block を⽰さない系統の培養であっても前核期から添加することが望ましいと考えられます。
Q14：過排卵処理卵⼦の受精能保有時間はどのぐらいでしょうか？
ICR 系のマウスの場合、hCG 注射後 24 時間に採卵し媒精しても受精はしますが正常に発⽣する卵はほとんど有りません。TYH 培地で授精した場合の受精率は90%以上ですが、これらの受精卵⼦を Whitten 培地＋100μM EDTA で培養すると胚盤胞への発⽣率は 30%程度です。
通常の体外受精（hCG 投与後 15.16 時間に媒精）の受精率とその後の発⽣率について遜⾊の無い成績を得るためには、hCG 注射後 18 時間以内に採卵して媒精することが必要です。
Q15：体外受精においては、採卵後、直ちに精⼦を添加することが推奨されていますが、どの位の時間媒精せずに卵⼦を培地内でインキュベートすることが許容されるのでしょうか？
ICR の場合、hCG 注射後 15〜16 時間で採卵して、その後８時間程度培地内に置いても受精は起こりますが、採卵後４時間を過ぎた当たりから異常受精が起こります。TYH 培地で授精した場合の受精率は 90%以上ですが、その後、Whitten 培地＋100μM EDTA で培養した場合の胚盤胞への発⽣率は 40%程度です。
受精後の正常な発⽣を望むのであれば 2 時間以内に媒精した⽅が良いと思います。
Q16：ヒトやマウスにおいて、運動性の低い精⼦を⽤いた体外受精をする場合に透明帯の⼀部を切開してバイパスすることが推奨されていますが、これに使⽤する機材（レーザー照射装置）が⾮常に⾼価です。これを⽤いることなく透明帯をバイパス⽅法はないのでしょうか？
マウスにおいて、マニュアルで透明帯を切開する⽅法が報告されています。これは、未受精卵⼦をシュクロース溶液に暴露することによって卵細胞質を収縮させ、囲卵腔の拡⼤を図った後に注射針を⽤いて透明帯を切開する⽅法で、凍結融解マウス精⼦の受精率向上に⼤きく寄与することが⽰されています。しかし、この⽅法では、どうしても透明帯の切開が⼤きくなることから、受精卵⼦を卵管に移植すると割球が透明帯の切開部分から脱出してしまい、満⾜な移植成績を得ることができな
いので、桑実胚以降まで体外培養して⼦宮に移植することが必要です（Nakagata etal., Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing
capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility.
Biol Reprod 57: 1050-1055, 1997）。
この弊害を解決する⼿段としては、ピエゾマイクロマニプレーターを⽤いて透明帯を切開することが有効であることも報告されています。この⽅法では、透明帯を任意の⻑さに切開することが可能ですので、受精卵⼦を卵管に移植することを可能とさせています(Kawase et al., Effect of partial incision of the zona pellucida bypiezo-micromanipulator for in vitro fertilization using frozen-thawed mouse
spermatozoa on the developmental rate of embryos transferred at 2-cell stage. BiolReprod 66: 381-385, 2002)。⼀度、試してみてください。
Q17：マウスの過排卵処理においては幼若マウスの⽅がホルモンへの反応性が⾼く多くの卵⼦を得ることができると聞いたので、ICR の３週令程度の幼若マウスに過排卵処理を施しましたが、得られた卵⼦数は 12 週令のマウスより少ないものでした。なぜでしょうか？過排卵処理は PMSG と hCG が各５単位で、48 時間間隔で⽪下に投与しました。採卵は hCG 投与後 15 時間で⾏いました。

幼若マウスを⽤いた過排卵処理では、系統によって反応性が⼤きく異なり、C57BL 等においては⾮常に多くの卵⼦を得ることができますが、ICR 等では成熟マウスより少ない卵⼦しか得ることが出来ないようです。また、多く排卵される系
統においても３週令前後で過排卵処理を施した場合、その後の発⽣が芳しくない場合もあります。そのような系統においても、4 週令まで待って過排卵を施すことで排卵数も多くその後の発⽣にも問題の無い卵⼦が採卵できるようです。
C57BL の場合 3 週令で過排卵処理を施すと排卵陽性個体は 80%以上、排卵数は平均 35〜40 個ですが、2 細胞期で発⽣が停⽌してしまう場合があります。4 週令
では排卵陽性個体は 80%以上、排卵数は平均 25〜30 個と若⼲排卵数は減少するのですが発⽣停⽌卵は⾒られません。
Q18：マウスの過排卵処置において、hCG は暗期で作⽤して排卵を促すとされているので、通常、⼣⽅に投与していますが、朝に PMSG と hCG の投与を⾏っても過剰排卵を誘起することが出来るのでしょうか？
朝８時に４８時間間隔で過排卵処理を⾏なうと、hCG 投与後１３時間以降に通常の過剰排卵処理と同程度の排卵数を得ることができます。
また、マウス胚の操作マニュアル（第３版）、第 3 章トランスジェニックマウス
およびキメラマウスの項に下記の記述がありますので、参考にしてください。「ほとんどの系統では、PMSG 注射と hCG 注射の間に 42〜48 時間の間隔をおくことが、卵の収率について最適であることが知られている。⼀般に、排卵は hCG 注射後 10〜13 時間後に起こるが、正確に排卵時間を制御するためには内因性 LH の放出前に hCG を投与することが重要である。ほとんどの系統では PMSG 注射後 2回⽬の暗期の中間点から 15〜20 時間後に内因性 LH の放出が起こる。例えば、明期を午前 5 時〜午後７時とした場合、PMSG は午後１時から午後２時に、hCG はその 46〜48 時間後、通常、午後０時から午後１時に投与すれば、少なくとも内因性 LH 放出の 2〜3 時間前となる。」
Q19：マウスの体外受精で使⽤できる動物の週齢の上限はどれくらいでしょうか？
オスに関しては 30 か⽉齢でも運動性のある精⼦が得られれば可能です。しかし、メスは 12 か⽉齢を過ぎるとホルモンに対する感受性が低下し未受精卵の採取が難しくなります。この時経験したのは、オスは B6 バックのトランスジェニックマウスで、2 年半もの間、マウス室の傍らで忘れられていたところを保存胚の作製が依頼されたものでした。メスに関しては週齢差を検討したわけではありませんが、系統維持などで、3 産程度させた後に保存胚作製の依頼が来るケースもあり、そのような場合では 12 か⽉齢以上となっており、過排卵処置がうまくいかないケースがありました。
IVCS 系統を⽤いて雌雄の加齢に伴う妊孕能の低下、過剰排卵処理によるレスポンスおよび体外受精成績を検討した報告があります。この報告によると IVCS 系統
では、初交配を６ヶ⽉令を過ぎて迎えると胚の吸収率が⼤きく増加することから、⾃然交配で５ケ⽉齢までに産⼦が得られない場合には、体外受精を適⽤するのが望ましいと思われます。
また、外因性のホルモンに対する反応も加齢とともに低下しており、PMSG お
よび hCG 各５単位の過剰排卵処理では２ヶ⽉令の反応が最も⾼く平均６４個の卵⼦が得られますが、７ケ⽉令、９ヶ⽉令および１１ヶ⽉令では、それぞれ、１５、１０、および３であったと報告されています。体外受精成績をみると、低率ながら１１ヶ⽉令の雌雄マウス由来の産⼦が得られていますが（受精率：５１％、移植後の発⽣率：２１％）、少なくとも、この系統の場合には１１ヶ⽉令までに体外受精を適⽤することが望ましいと考えられます。（Suzuki et al., Relationship between
age-related decline in fertility and in vitro fertilization rate in IVCS mice. J Reprod
Dev 40: 107-116, 1994.）
Q20：受精卵の培養を実施する実験室で、卵⼦や受精卵の核染⾊を実施しても⼤丈夫でしょうか？
染⾊時に⽤いる固定液の種類により異なります。少量のエタノールであれば問題ありませんが、酢酸を⽤いる場合、酢酸は卵⼦や受精卵の⽣存性に悪影響を及ぼしますので別の部屋で操作することが必要です。さらに、ドラフト等の排気装置があることが望ましいと思われます。
Q21：受精卵の培養を実施する実験室の照明に⼀般的な蛍光灯を⽤いても問題ないでしょうか？
紫外線は受精卵の⽣存性に良くありませんので、可能であれば、紫外線放射量の少ない紫外線吸収膜付美術館、博物館⽤蛍光灯を⽤いることが望ましいです。商品
例：パナソニック、FL40S･W-EDL･NU
Q22：⼊⼿直後の馴致をしていない雌マウスに過排卵処理をしても影響はありませんか？馴致期間は必要ですか？
PMSG に反応しての内因性 LH の放出時間は明暗周期に依存するので、⼊⼿後は数⽇間、飼育室の明暗周期に適応させる必要があります。
Q23：死亡雄個体から採取した精⼦で、体外受精は可能でしょうか？

死亡した動物が飼育されていた動物室の温度・湿度などにも左右されると思いま
すが、通常の飼育室（温度：22±2℃前後、湿度：40.60％）では、C57BL/6J（12〜13 週齢）の場合、死亡後 12〜18 時間以内であれば、死亡個体から採取した精⼦で体外受精が可能です。体外受精率は、死後 12 時間で約 50％、死後 18 時間で約20％を経験しています。尚、体外受精に⽤いた卵⼦は凍結卵丘除去卵⼦（凍結法：簡易ガラス化法）です。ルーチンワークでは、実際に雄マウスが死亡した場合、新鮮卵⼦を⽤いて体外受精を⾏うのは不可能であるため、凍結卵丘除去卵⼦を⽤いたデータを記載しました。
Q24：TYH 培地で胚盤胞期まで培養できますか？
TYH 培地は受精⽤の培地ですので胚盤胞期までの培養は困難です。体外受精卵を胚盤胞まで培養する場合は、体外受精当⽇の前核期から体外受精翌⽇の午前中までに培養⽤の培地（例えば TYH-280、kSOM、Whitten＋100μEDTA 等）の培養⽤培地に胚を移し替えたほうが良いと思います。
ちなみに、Whitten＋100μM EDTA 培地は体外受精から胚盤胞までの培養を通じて使⽤することが可能です。
Q25：受精⽤あるいは培養⽤培地の最少液量は集団培養と個別培養でどのくらいでしょうか（マウス、ウシ）？例えば、体外受精⽤ドロップを 300μl で作成した場合、何匹の雌（もしくは何個の卵⼦）がそのドロップで受精可能でしょうか？
ウシでは卵⼦や胚を個別に体外培養すると胚盤胞への発⽣率が低いため、多くのラボでは最低 5 個以上で卵⼦や胚の培養が実施されています。培養⽤培地の最少液量は、メディウムチェンジの有無等でラボによって異なりますが、卵⼦や胚 1 個あたり 1〜1.5μl として⽤いられています。体外受精⽤では多くのラボで 1 卵⼦あたり 5μl の培地が使⽤されていますので、体外受精⽤ドロップ 300μl では 60 個の卵⼦を培養可能です。（Nagao Y, Iijima R, Saeki K. (2008) Interaction between
embryos and culture conditions during in vitro development of bovine early embryos.
Zygote 16, 127.133.）
Q26：いくつかの液体培地は業者からアンプル封⼊の状態で購⼊可能ですが、開封した培地は開封後何⽇⽬まで使⽤可能でしょうか？
保存条件に依存するでしょうが、開封後はパラフィルムで覆い冷蔵庫で保存することによって、３⽇後までなら使⽤できることを経験しています。いずれにしても、説明書にしたがって取り扱うことをお勧めします。

Q27：培養⽤ドロップを覆うオイルについて、フィッシャー社製のオイルは洗浄（オイルに培養液を⼊れて数⽇スターラーにて撹拌する操作）してから使⽤しています
が、他社製のオイルには洗浄無しでも使えるものがあります。なぜフィッシャー社製のオイルは洗浄が必要なのでしょうか？
元来、ミネラルオイルを培養液で洗浄するのは、オイルの中に含まれている⽔に溶けだす物質を吸着させる⽬的で実施されてきました。したがいまして、その懸念のないオイルであれば洗浄操作を⾏わなくても問題ないと思われます。
⼀部で「フィッシャーのオイルは⽔を吸収するから、使⽤前に洗浄を⾏わないと、せっかく作製した培養液のドロップが“ぺしゃんこ”になると」信じられており、洗浄操作が推奨されているようです。
Q28：顕微鏡で観察するとマウスやヒトの卵⼦や受精卵は透明感があり前核が⾒えますが、ウシやブタの卵⼦や受精卵は⾊が濃く前核が⾒えません。動物種によって卵⼦や受精卵の⾊の濃度が異なるのはなぜですか？
ウシやブタの卵⼦や受精卵は脂肪滴が多く、脂肪滴が多いと濃く⾒えます。特にブタの卵⼦や受精卵は脂肪滴が多く、凍結保存に弱いと報告されています。
Q29：胚盤胞を⽤いた注⼊キメラ胚の作成のため、過排卵処理マウスから胚盤胞を採取しようとして 3.5 dpc に⼦宮を還流しましたが、ほとんど胚が回収できませんでした。なぜでしょうか？胚盤胞を効率に得る最も良い⽅法を教えてください？
経験的に、マウスに過排卵処理した後に⼦宮還流によって胚盤胞を得ることは困難であることが知られています。
過排卵処理の影響で⾃然な胚の移動より早く卵管内を通過すること、また、⼦宮⼝が開いて⼦宮に達した胚が体外に排出されてしまうと推察されます。
そのため、2.5 dpc で卵管と⼦宮を還流し、得られた 8 細胞期胚〜桑実胚を１晩培養して胚盤胞を得るのが効率的だと考えられます。また、⾃然排卵で 3.5 dpc に⼦宮を還流して胚盤胞を得るのも⼀つの⽅法です。
Q30：マウスを⼀般の飼育棚（オープンラック）で飼育する場合、オスケージとメスケージを同⼀ラックで飼育可能でしょうか？
ウイッテン効果に関するご質問と思います。オスマウスを雌の集団に⼊れ込むと、雌の発情周期が同期化するといわれています。そのため、例えば、オスマウスを上段、メスマウスを下段で飼育すると、メスの発情周期が同調してしまうことがあり、偽妊娠メスを作成するときなど、ある⽇に発情前期のマウスが集中してしまう場合もあります。

したがいまして、少なくとも同じラックに雌雄を同居させるのは避けた⽅が良いように思われます。
Q31：成熟オスを複数飼育していたら激しい喧嘩が始まったがどうすればよいのでしょうか？
マウスは社会順位制を持つため、有意なオスを外しても残りの群の中で No.2 のオスが優位となり、再度喧嘩が始まるので個別飼育にするしかありません。
しかし、離乳直後から同居している雄同⼠であれば、喧嘩の程度は低いことが経験されています。
Q32：遺伝⼦改変マウスが野外に逃亡したら、本当に野⽣マウスと交配してしまうのでしょうか？
実験動物としてのマウスや野⽣マウスは、Mus Musculus に属します。従いまして、遺伝⼦改変マウスが野外に逃亡したら、野⽣マウスと交配してしまうと考えられます。
（しかし、逃亡したマウスが雌の場合は容易に雄の野⽣マウスを受け⼊れますが、実験動物化された雄マウスが雌の野⽣マウスと交配するのは⾄難の業と考えられます。）
Q33：マウス胚の移植において、経卵管采法と経卵管壁法のメリットとデメリットを教えてください。
両者にデメリットは無いように思われます。両⽅を試して⾃⾝に合った⽅法を採⽤してください。ちなみに、通常は経卵管采法を利⽤して、極端に卵管采が細かったり短かったりした場合（１％程度のマウスで経験します）に、卵管壁を切開して移植している⼈もいます。これは経卵管采法ではハサミを⽤いないことが理由となっているようです。
Q34：移植の際のキャピラリの材質と形状について教えてください。
材質は硬質ガラスが適度なこしがあり移植には向いています。ドラモンド社のマイクロサンプリングピペット（200μｌ容）がその⼀例です。また、形状は先曲りを推奨している研究者もいます。これはピペットが曲がっていることで卵管采への挿⼊が容易となるためです。
卵⼦の移し替えなどの作業には、より柔らかいガラス（ドラモンド社のヘマトクリット管）が適当です。

Q35：移植時（おもにマウス）の⿇酔薬はどんなものがよいでしょうか？
最近は吸⼊⿇酔（イソフルラン）が主流になってきています。注射薬よりも覚醒が早いのは⼤きな利点ですし、卵巣嚢の⾎管が収縮するのでボスミンを⽤いなくても出⾎することがほとんどありません。
ペントバルビタールなど向精神薬は、その管理・取り扱いが厳しくなってきております。また。⾮医薬品グレードの化合物（エーテルなど）の使⽤は妥当性などを動物愛護の観点からも判断を慎重に⾏わなければなりません。引⽕性もありますので、最近ではあまり推奨されるものではありません（施設によっては使⽤禁⽌といったところもあります）。
また、吸⼊⿇酔におけるチューブの存在が⼿術の操作性に影響することを懸念する⼈もいるようですが、マスクの⼿前のチューブをマグネット付のクリップではさみマグネットを加温版に付けるとチューブの影響は少なくなります。
Q36：⾥親は出産後何⽇⽬まで⾥⼦を受け⼊れることが可能でしょうか？
経験上は出産後７⽇⽬まで可能です。この場合は、⾥親の⼦供たちはすべて取り除き、⾥⼦のみを哺育させることが必要です。
Q37：マウスを連続同居で繁殖をしています。より効率的に⽣産するために早期に雄を雌から離して別の雌と交配させたいのですが、毎朝プラグを確認する余裕もありません。プラグを確認する以外に、何か良い交尾確認・妊娠診断法はありませんか？
古くから膣内に綿棒を挿⼊して胎盤徴候（出⾎を確認する）を検出する⽅法が知られていますが、より簡便な⽅法としては、触診による妊娠診断が可能です。妊娠
10 ⽇⽬を過ぎると数珠状に配列した胎児を触ることができます。
マウスを保定して、親指と⼈差し指で腹側と背中側から挟むように⼦宮の位置を探ってください。⼩⾖⼤の胎児が数珠状に連なっているのがわかります。慣れてくると胎児数も知ることが出来ますので練習してみてください。雌のお腹が⼤きくなってから雄を離すよりも 5 ⽇〜7 ⽇は早期に雄の有効利⽤が可能です。
以上。
無断転載はご遠慮ください。また、この他の質問（回答）をお寄せください。
動物⽣殖⼯学研究会 <sarb-admin@umin.ac.jp>