Technical Review

CHROMATOGRAPHY, Vol.32 No.3 (2011)

Technical Review

液体クロマトグラフィー核磁気共鳴（LC-NMR）の有効な使い方――医薬品の類縁物質および代謝物の構造決定を目指して――
川口謙、中野隆行、木村一雄

How do you use liquid chromatography-nuclear magneticresonance (LC-NMR) effectively for structural determinations ofpharmaceutical impurities and metabolites?
Ken Kawaguchi, Takayuki Nakano and Kazuo Kimura
Toray Research Center, Inc., Biological Science Labs.
10-1 Tebiro 6-chome, Kamakura-shi, Kanagawa-ken 248-0036, Japan

Abstract
Structural determinations of pharmaceutical impurities called as related substances and its metabolites are required in the process of new pharmaceuticals developments. Liquid chromatography-nuclear magnetic resonance (LC-NMR) is a powerful tool for the structural determinations in spite of its low sensitivity. In the case of low molecular weight compounds, amount of target sample needed for LC-NMR measurement using stop-flow method is 1-5 µg per a target peak. The amount is too small for NMR but too large for HPLC. To use LC-NMR effectively for the purpose, some points to keep in mind for selecting mobile phase will be provided besides those for injection of the large amountinto column and analysis approach.
Keywords: liquid chromatography-nuclear magnetic resonance (LC-NMR), structural determination, pharmaceutical impurity, related substance, metabolite, high performance liquid chromatography (HPLC)

物などで、類縁物質と呼ばれており、主として医薬品の保存１．緒言
新規医薬品の開発において、不純物や代謝物の構造決定は中に生じてくるものである。医薬品の種類にもよるが、代表製造販売承認の申請で避けて通れない。本稿で対象としてい的な例では、原薬中で０．
１０％を越える含有量の不純物についる医薬品は合成低分子医薬品であり、その不純物の化学的実て構造決定の努力が義務付けられる。薬効主成分に対して約態は、主に薬効主成分の熱または光分解物や添加剤との反応

０．
１％の含有量は、核磁気共鳴（NMR）測定にとっては極微

株式会社東レリサーチセンター生物科学研究部〒２４８―００３６ 神奈川県鎌倉市手広六丁目１０番１号
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E-mail: Ken_Kawaguchi@trc.toray.co.jp―１７１―

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技術である溶媒シグナルの消去法について述べる。

量のため、測定が著しく困難になる。
不純物および代謝物の構造決定は、まず感度のよい液体ク

LC-NMR では溶媒シグナルの消去法として通常、WET 法ロマトグラフィー質量分析（LC-MS）から実施することが（water suppression enhanced through T1 effect）を用いて溶媒多いが、LC-MS ですべてが解決するわけではなく、未解決消去を行なっている[3]。WET 法を用いると、Figure１に示の成分は NMR 分析で解決を目指すことが多い。従来の方法

すように、溶媒がたとえ軽水であっても溶媒消去を効率的にでは各成分を分離、精製してから NMR 分析をしていたが、行なうことが可能になる。以下に WET 法について説明す

精製する段階で苦労することが多い。分取した目的の不純物る。
WET 法は、Figure１中央左の挿入図の１H と Gz で示したよや代謝物を乾燥（または濃縮）する段階で分解したり、乾燥後に溶媒に不溶となったりするためである。

うに、「選択励起パルス―pulsed-field gradient pulse」の繰り液体クロマトグラフィー核磁気共鳴（LC-NMR）は、この返しで構成されている（以下 pulsed-field gradient pulse を PFGような分取の労力を大きく低減できるため大変有用であるがと略す）。Figure１挿入図の１H と Gz は、それぞれプロトン選[1]、まだ感度面での制約も多い。本講ではそのような制約択励起パルス及び PFG を表している（ただし１H の最後の四の中で、医薬品分析においてどのように LC-NMR を有効に角形は通常の励起パルスである）。挿入図の１３C は下で説明す活用するかを解説する。

るように炭素核のデカップリングパルスである。この pulsetrain は、消去したい溶媒プロトンシグナルを選択励起し、２．LC-NMR 実用化の技術的背景

PFG で dephase させて溶媒シグナルをつぶし、溶媒シグナル

LC-NMR は液体クロマトグラフィーと NMR を直結した分が観測されないようにするものである。

析機器であり、最初の報告は１９７８年にさかのぼる[2]。しかWET 法の大きな特徴は、この pulse train を複数用いる際し実用的な分析方法となったのは１９９０年代半ばである。に、フリップアングルを調節した選択励起パルスを用いるこLC-NMR の実用化の背景には、９００MHz 装置などに代表さとである[3,4]。この方法により、回転磁場の不均一性やシグれる NMR 用磁石の高磁場化や検出器の改良による高感度ナル間で異なる縦緩和時間の影響をキャンセルでき、効率の化、及び溶媒消去技術がある。特に溶媒消去技術は、HPLC優れたシグナル消去が可能になる。筆者らは、フリップアン移動相に由来する NMR シグナルを大幅に軽減し、LC-NMRグルがそれぞれ約（９８°、８０°、７５°、１５２°）の４pulse versionの実用化に大きな力となった。以下、LC-NMR に不可欠なの WET 法を用いて溶媒消去を行なっている。

Figure 1 Solvent suppression by WET method.
(Upper) Conventional 1H NMR measurement.
(Lower) 1H NMR measurement by WET. WET pulse sequence is shown on the middle left-hand side (see text for details).
Sample: 2 mg/mL peptide solution in 90% H2O, 10% D2O.

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次に PFG 強度についてであるが、溶媒シグナルから生成３．LC-NMR 装置と測定の実際されるエコーシグナルを抑えるために（すなわち溶媒シグナ

LC-NMR の構成は、通常の NMR 装置に HPLC と LC-NMR

ルの消え残りを抑えるために）、PFG の強度は、前の PFG 強プローブ、制御用ソフトウエア、PFG ユニット、選択励起度の１／２（または２倍）に調節して用いている[5]。４pulse ver-ユニットなどを追加して構成されている（Figure２）。LC-sion の WET 法では、この方法を用いると、観測パルス直前

NMR システムの最も大きな特徴は、LC-NMR プローブが、の PFG の強度は、最初に用いた PFG の強度の１／８になり、HPLC と直結されている事である。従って、サンプルが移動

eddy-current effect（渦電流効果）による磁化成分への余分な相と共に直接検出器に流れこむため、NMR 試料管が不要な付加を防ぎ、NMR シグナルへの悪影響を抑えるためにも有システムとなっている。また LC-NMR プローブは PFG を装利になる。

備した１H インバース検出タイプであるため、stop-flow 法（下最後に溶媒消去に用いる選択励起パルスについてである

記（２）参 照）を 用 い る と、１H NMR 測 定 以 外 に２次 元 NMRが、選択励起パルス内の位相を周期的に変化させたパルス測定（理想的には HSQC 測定などの異種核相関も含む）も（SLP）を組み合わせて用いることにより[6]、観測中心（通可能である。

常は水）から外れた溶媒シグナルの消去も同時に行うことがLC-NMR 測 定 に お け る HPLC の 条 件 の 詳 細 は 後 述 す る

できる。これによって水／アセトニトリルなどの混合溶媒でが、通常用いられている逆相系条件のほとんどが適用可能であっても複数の溶媒シグナルを同時に消去できる。分子内にある（ただし水の代わりに重水を用いる）。なお、LC-NMR

炭素を含んだ物質を溶媒として用いる際には、選択励起パル

測定は、移動相の流れを止めるかどうかで、次の on-flow 法スの間に、１３C デカップリングを行なうことで、溶媒の１３C サと stop-flow 法の２通りに大きく分けられる。

１３

テライトシグナルも同時に消去することが可能である。 Cサテライトシグナルはメインのプロトンシグナルの１．
１％の（１）on-flow 法

１

シグナル強度のため、通常の H NMR 測定では妨害となるこ

on-flow 法は、LC の移動相を流したまま NMR 測定を行なとはほとんどないが、微量成分の LC-NMR 測定では、目的う方法である。NMR 測定は８回積算程度で行い、NMR 化物の１H NMR シグナルよりも溶媒の１３C サテライトシグナル

学シフト軸と LC 保持時間軸の２次元表示で示される。このの方が大きくなるので、消去が必要となる。

方法は、UV 吸収のない成分の検出や一斉分析で試料の全体像を把握するのに適している。しか し、８回 程 度 の 積 算

Figure 2Schematic diagram of LC-NMR system (right) and a photograph of HPLC and magnet of LC-NMR apparatus (left).

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で１H NMR 測定を繰り返し行うため、シグナルを検出するた

Figure３の NMR 測定では、内径４．
６mm の逆相カラムと、めには、比較的高濃度の試料が必要になる。LC-NMR 測定

通常の HPLC 溶媒であるアセトニトリルを使用しているは、通常、目的成分が微量である試料について行う事が多い

が、溶媒由来のシグナルは、WET 法を用いて消去している

ため、大部分は次に述べる stop-flow 法で測定することにな

ので、NMR スペクトルの重大な妨害にはなっていない。しる。

かし、アセトニトリルのシグナル（１．
９２ppm）から約±０．
２（２）stop-flow 法ppm の領域に検出される成分のシグナルは、アセトニトリ

stop-flow 法は、HPLC ピークが LC-NMR プローブに到着ルのシグナルと共に消去されるので観測が困難となる。そのした時点で移動相の流れを止め、測定を行う方法である。

場合は、溶媒を重アセトニトリルにする、あるいは重メタ

stop-flow 法が on-flow 法と大きく異なる点は、stop-flow 法はノール等に変えるなどの対処方法が考えられる。
なお、stop-flow 法は、溶媒消去技術が必要になる事以外移動相の流れを止めて測定を行うため、時間のかかる測定が可能である点である。従ってこの方法を用いれば、長時間積は、通常の NMR と変わらないため、２次元 NMR 測定も可算を必要とする微量成分の１H NMR 測定や２次元 NMR 測定能である。ただし、感度面の制約がある。

も可能になる。on-flow 法が試料の全体像を把握するのに適４．LC-NMR を有効に使うためにしているに対し、stop-flow 法は、目的成分について詳しく医薬品の不純物や代謝物の LC-NMR 測定では、ともかく構造情報を得られる特徴がある。
次に stop-flow 法における測定の流れについて説明する。

目的成分が微量であることが、最大の難関となる。その一方

まず HPLC の UV 検出器でピークが観測されると、ピークで、移動相については LC-MS よりも有利な点もある。以下

が、LC-NMR プローブに到達した時点で、HPLC のポンプがに有効に使うための留意点などについて述べる。

止まる（自動停止可能）。ポンプが止まるタイミングは、ピー
クが UV 検出器から NMR プローブに到達するまでの時間の（１）LC-NMR の感度遅れを考慮している。次に、ポンプを止めた状態で NMR 測

筆者の研究室で使用している LC-NMR は、６００MHz 装置定を開始することになるが、HPLC のクロマトパターンに対に常温 LC プローブ（すなわち極低温プローブではない）をする拡散などの影響は、数時間以内の NMR 測定であればほ装着した構成であり、１H NMR を観測するためには、目的成とんど影響ない。Figure３に stop-flow 法の測定例を示 す。

分が HPLC の１ピーク当たりに１〜５µg 以上存在すること

Figure３のクロマトグラムは、「P１で停止―NMR 測定―流が 必 要 で あ る（低 分 子 化 合 物 を 想 定 し た 場 合）。こ の 量れを再開―P２で停止―……」と P３まで繰 返 し て NMR を

で１H NMR の測定時間は数時間から１５時間程度かかる。した測定した結果であるが、拡散などの影響をほとんど受けていがって各 LC ピークで送液を停止して stop-flow モードで測ないことがわかる。

定する。また、１H-１H２次元 NMR を測定するためには、約Figure 3 LC-NMR (stop-flow method).
(Left) HPLC chromatogram when LC-NMR was measured. Flow of mobile phase was stopped at position 1, 2,3 and re-flow after NMR measurements.
(Right) LC-NMR spectra by stop-flow method (１H NMR, 600MHz).
P1: Phenol (14 µg), P2: N,N -diethyl-m-toluamide (12 µg), P3: toluene (80 µg).

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１５〜２０µg 以上が必用である。なお、極低温プローブ（クラ成分主成分）の一部分のみが構造変化した場合が多いので、イオプローブ）を装着した装置では、感度は上記の３〜５倍未変化体とのスペクトル及び帰属を比較すること程度になる（ただし塩が含まれる場合は感度上昇率が下がで、１H NMR と LC-MS だけで解析できることが多い。以下る）。に構造解析の例を示す。

ところで、上記の感度では０．
１％含有の不純物について、１回の注入では LC-NMR（１H NMR）を直接観測できない。

（１）酢酸ゲラニルに見出された不純物

そのために、目的成分を予備分取あるいは予備濃縮してから市販試薬（酢酸ゲラニル）に LC-NMR を適用した例を示注入することになる。経験的に直接観測できる含有量は約す[1]。市販試薬の酢酸ゲラニルは、HPLC 分析から、主成分０．
６％以上の場合である。の酢酸ゲラニル以外に不純物が含まれていることが分かってなお、HPLC の１つのマイナーピークに１〜５µg といういた。そこで、主成分および不純物ピークについて stop-flow

量は、NMR にとっては微量でも、HPLC にとっては過剰注法で１H NMR スペクトルを測定した。Figure４に市販試薬（酢入となることが多いため、大量に注入してもクロマトグラム

酸ゲラニル）の LC-NMR スペクトルを示す。酢酸ゲラニルのピークパターンが再現するかの確認が必要となる（ピークと不純物の NMR スペクトルを比較すると、不純物のスペク形状が多少悪くても目をつぶる）。まさに too small for NMR

トルでは、二重結合性プロトンが１個無くなると共にメチル

but too large for HPLC である。

ピークの化学シフトが変化し、さらにメチレン・メチンピークが新たに出現したことがわかる。変化したメチルピークの（２）LC-NMR の移動相についてシグナル形状もシングレットからダブレットピークに変化し１LC-NMR で用いる移動相の選択基準は、 H NMR スペクトていた。これらの結果から、不純物は酢酸ゲラニルの中央付ルの妨害にならないことである。そのために１H シグナルの近の二重結合が還元された構造と解析できる。この結果は高種類が少ない溶媒が望ましい。例えば、水、アセトニトリル

分解能 LC-MS でも確認された。一般的に不純物の構造解析などである。ヘキサンやイソプロピルアルコールは NMR シは、未変化体の NMR 帰属や LC-MS の結果が事前に分かっグナルが複数の場所に観測されるので適していない。ているとうまくできることが多い。

一方、NMR 装置の分解能調整や少しでも溶媒シグナルの妨害を減らしたい事情から、重水素化溶媒を使うことが多（２）Diclofenac sodium の光分解物

い。原理的にはすべてを重水素化溶媒にする必用はないが、原薬である Diclofenac sodium とその光分解物の LC-NMR

微量測定のためには実用上は必要となる。そのような溶媒のを解析した結果を Figure５に示した。光分解物では、低磁場種類としては、重水、重アセトニトリルを使用することが多側にシフトした２種類のシグナルがあり、また、原薬の I にい。メタノールは、HPLC の配管などにかなり長期にわたっ相当するシグナルが消失していることが特徴的であった。一て吸着するため使いづらく、また、重メタノールはコストが方、光分解物についての LC-MS の結果から、塩素２個が脱かさむので、できれば避けたい。

離していること、さらに LC-MS/MS の結果からカルボキシ１

添加塩や緩衝液についても、 H NMR スペクトルの妨害にル基の構造は保存されていることが推測されていた。以上のならなければ使用できる。例えばリン酸緩衝液は LC-MS にことから、Figure５に示すような分子の中央で環化した構造は向かないが LC-NMR には適している。また酢酸塩よりもが光分解物であると推定された。この結果は、NMR の化学ギ酸塩の方が NMR スペクトルの妨害となりにくい。

シフト予測によっても妥当性が確認された。

移動相にグラジエントを用いる場合も、急勾配なグラジエント以外は問題ない。通常は毎分２％以下が望ましい。急勾（３）極低温プローブの利用

配な場合は、LC-NMR のセル内（通常６０〜１２０µL）の上下で上記と同じ原薬 Diclofenac sodium のアルカリ熱分解物中濃度差が生じ、NMR の分解能が上がらなくなるためであに含まれる０．
０５％含量の不純物について、７００MHz 装置に極る。

低温プローブを装着して LC-NMR 測定の直接観測を試みた

なお、重水素化溶媒を移動相に使うと保持時間が遅くなる

例が Figure６である。直接観測というのは、濃縮操作などのと言われているが、いまだ確認されていないと思われる。こ

前処理なく、試料溶液をそのまま LC-NMR に注入して観測

れは筆者が１０年ほど前に NMR メーカー（当時はバリアン）することを指している。のユーザーズミーティングで話題にしたことがきっかけの一

通常は０．
１％レベルの不純物では何らかの濃縮操作を行っつと考えているが、当時も検証されていたわけではない。てから LC-NMR に導入するが、極低温 LC-NMR プローブを利用すれば、感度が従来よりも３〜５倍程度向上する。このプローブを備えた７００MHz NMR 装置を利用して０．
０５％前後

５．構造解析LC-NMR ではほとんどの場合１H NMR のみで解析することの含有量ピークに対して直接観測することに成功した[7]。になるが、幸い、類縁物質でも代謝物でも、未変化体（薬効ただし、ここで測定した HPLC ピークには２成分以上が含―１７５―CHROMATOGRAPHY, Vol.32 No.3 (2011)

Figure 4LC-NMR analysis of an impurity found in Geranyl acetate.

Figure 5 LC-NMR analysis of a photolyte of Diclofenac sodium.
(Upper) LC-NMR spectrum of the photolyte and the estimated structure.
(Lower) LC-NMR spectrum and the structure of Diclofenac sodium.

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Figure 6Ken Kawaguchi, Takayuki Nakano and Kazuo Kimura

A trial measurement of a 0.05% content impurity by direct injection of alkaline thermal degradation
products of Diclofenac sodium by using cryo-LC probe with 700 MHz NMR [7].
を分離する方法であ る[10,11]。DOSY 法 に 比 較 し て、LC-まれていることが判明し、推定構造を得るには至っていな

NMR 法は分離能力、感度ともに優れているが、１本の HPLCい。

ピーク内に複数の成分が含まれる場合、LC-NMR 法で混合物のシグナルを分離するためには、HPLC 条件を再検討する（４）Long range COSY の利用
これまで述べてきたように LC-NMR では微量成分を測定ことが必要になる。しかし、DOSY 法を併用すれば HPLCするため、通常の構造解析では威力を発揮する HMBC（異条件を変えることなく、それらも分離することが可能なケー種核遠隔結合相関２次元 NMR）などの測定法が感度不足のスがある。

ため利用できない。そこで筆者らが着目したのが Long range

一般に DOSY 法を用い混合物のシグナルを分離するため

COSY 法である。この方法は、HMBC が登場する以前であには、試料に関して、拡散係数に大きな差があること、シグる１９８０年代前半までは利用されていたものである。感度もナルが重なっていないこと、濃度が高いこと（高いシグナル

HMBC や NOESY よりは高く、LC-NMR の測定法（pulse se-の S/N 比）などが要求される。これらの条件は、LC-NMR-quence）に組み込むのも比較的簡単である。Figure７で示し

DOSY 法を用いる際にも要求される。このため、LC-NMR-

たように、１５µg のイノシンで糖部分の１ 位プロトンと塩基DOSY 法は、混合物を分離して観測する能力に関して言えの８位プロト ン の 遠隔 相 関 が 観 測 で き た[8]。こ の ようにば、適用範囲は限られる。しかし HPLC で分離が困難なケー

HMBC や NOESY の測定が感度面で難しい場合でも利用でスでは、LC-NMR-DOSY 法は試してみる価値のある測定法

き、構造解析に大変有用であり、まさに温故知新である。と考えられる。

６．LC-NMR-DOSY への展開

NMR-DOSY 測定は、LC-NMR を用いて DOSY 測定を行うた

以 下 に LC-NMR-DOSY 法 を 応 用 し た 例 を 示 す[1]。LCLC-NMR-DOSY 法は、その名の通り LC-NMR 法と DOSY

め、WET 法を組み込んだ BPPLED 法（bipolar LED sequence）法を組み合わせたもので、筆者らが開発した方法である[9]。

[12]を作成して行った。試料は、トルエンとトルアミドの混LC-NMR 法が HPLC の保持時間で混合物のシグナルを分離合試料を用い、LC 条件をあえて保持時間が重なるように調するのに対し DOSY 法（Diffusion Ordered Spectroscopy）は、整し行った。Figure８に LC-NMR-DOSY 測定結果 を示す。

分子の自己拡散係数の違いによって混合物の NMR シグナル

トルエンとトルアミドのシグナルが良く分離していることが―１
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Figure 7 Long range COSY spectrum of Inosine.
The correlation between position 1’ and 8 is observed by long range COSY, but can not by HMBC
under small amount of sample.

わかる（拡散係数の小さい方がトルアミド）。このように、[2]LC-NMR-DOSY 法を用いると、スペクトル上ではあるが、Watanabe, N.; Niki, E. Proc. Japan Acad. 1978, 54, Ser. B,194.

混合物のシグナルを分離して観測することが可能なことがわ[3]かる。

Smallcombe, S. H.; Patt, S. L.; Keifer P. A. J. Magn. Reson.
A 1995, 117, 295.

[4]７．まとめ

Ogg, R. J.; Kingsley, P. B.; Taylor, J. S. J. Magn. Reson. B
1995, 104, 1.

医薬品不純物や代謝物の LC-NMR は、感度ぎりぎりのと[5]ころで分析しているのが現状である。

Moonen, C. T.; van Zijli, P. C. M. J. Magn. Reson. 1990,88, 28.

１H NMR 測定に必用な感度は１〜５µg/peak、１H-１H 二次元[6]Patt, S. L. J. Magn. Reson. 1992, 96, 94.

NMR では１５〜２０µg/peak である（極低温プローブの利用に[7]

川口謙， 超高磁場超高感度 NMR 装置利用による化合物のスクリーニング ；横浜市立大学；平成２２年利用

よって、この感度は理想的には３〜５倍向上することが期待される）。移動相としては水―アセトニトリル系が適してお成果報告．

り、メタノールはできるだけ避けたい。また、LC-MS と異[8]中野隆行，木村一雄，川口[9]川口 謙,謙， 第４７回 NMR 討論会

講演要旨集 ；2008；p 270．

なりリン酸緩衝液は問題なく使用できる。
未変化体（薬効成分主成分）の１H NMR スペクトルの帰属が完了していることが前提となるが、未変化体と目的不純物

木村一雄，第３９回 NMR 討論会講演要旨集 ；2000；p 202．

や代謝物のスペクトルとを比較することにより、また、LC-[10] Morris, K. F.; Jonson, C. S. J. Am. Chem. 1993, 115, 4291.

MS の情報も総合して構造解析が達成できる。

[11] Barjat, H.; Morris, G. A.; Smart, S.; Swanson, A. G.;

文献[12] Wu, D.; Chen, A.; Johnson, C. S. Jr. J. Magn. Reson. AWilliams, S. C. R. J. Magn. Reson. B 1995, 108, 170.
[1]

川口 謙， 広がる NMR の世界―４０人の研究者からの熱1995, 115, 260.

いメッセージ― ；朝倉哲郎編著；コロナ社，2011；p130．

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Ken Kawaguchi, Takayuki Nakano and Kazuo Kimura(㎡/s)

Figure 8 LC-NMR-DOSY.
(Upper) Stop-flow LC-NMR spectrum measured from a single peak.
(Lower) LC-NMR-DOSY spectrum measured from the upper spectrum.
Vertical axis: diffusion coefficient, horizontal axis: NMR chemical shift. Two mixed components in the upperspectrum are separated in the lower one by difference of diffusion coefficient.

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