クロマトグラフィー科学会創立２０周年記念特集号

CHROMATOGRAPHY, Vol.30 No.2 (2009)

学会創立２０周年記念特集

複合糖質の LC/MS 分析のための特異的濃縮法の開発
吉年正宏，生田朋子，毛利幸恵，小山武裕，鈴木茂生

Development of Methods for the Specific Enrichment of
Glycopeptides for the LC/MS Analysis
Masahiro Yodoshi, Tomoko Ikuta, Yukie Mohri, Takehiro Oyama, Shigeo Suzuki
School of Pharmacy, Kinki University, 3−4−1, Kowakae, Higashi−osaka, 577−8502, Japan.

Abstract
Glycosylation affects various biological functions of proteins, and it also recognized as an indicator of disease. Recent glycoproteomics studies require methods capable to enrich glycopeptides from protease digests, because MS sensitivity of glycopeptides is much lower than that of
peptides. In addition salts or detergents added in the course of sample preparation impair ionization efficiency of glycoconjugates. Therefore,
many researchers have been surveyed the methods to enrich glycoproteins and glycopeptides from crude samples such as urine, plasma andcells. Here we overview recent progresses of the enrichment methods of glycopeptides and glycans applied for the determination of glycosylation sites, structural analysis of carbohydrates, and their applications to glycomics or glycoproteomics studies. After that we introduced our recent studies on three novel methods for the enrichment of glycoconjugates; serotonin−immobilized silica SPE for trapping sialic acid−containing glycoconjugates, borate form anion exchanger to trap all of glycoconjugates, and various lectins and centrifugal ultrafiltration membrane for specific recovery of glycoconjugates based on the specificities of lectins to glycan structures.
Keywords: solid phase extraction, glycoproteomics, MS, enrichment, serotonin−bonded silica, borate form anion exchanger, lectin.

糖鎖が多数共存する上、それぞれの糖鎖の構造ならびに量的はじめに糖鎖付加はタンパク質の主要な翻訳後修飾の１つであり、な分布は結合部位ごとに異なる。この糖鎖の構造分布がその生体内タンパク質の６０％以上は糖鎖が結合した「糖タンパク

機能発現とも関係しており、数多くの疾患の発現や進行とと質」として存在している[1]。糖鎖は極めて種類が多く、アもに糖鎖構造が変化することが知られている[5−7]。また、

スパラギン結合型だけでも、その数は５００種類を越える[2]。

疾患によっては特異な構造を持つ糖鎖が発現することがあ

この糖鎖はタンパク質や脂質と結合した、いわゆる複合糖質

り、近年では診断マーカーとしても注目されてきている。しという形で存在して初めてその機能を発現するが[3, 4]、微かし、糖鎖構造と生理機能との関連に関する分子機構は未だ小不均一性（microheterogeneity）、すなわち構造の類似した謎が多い。もしこの複雑な糖鎖の構造変化を迅速かつ高感〒５７７−８５０２ 東大阪市小若江３−４−１
近畿大学薬学部医療薬学科 薬品分析学研究室
School of Pharmacy, Kinki University, 3−4−1, Kowakae, Higashi−osaka, 577−8502, Japan.
Correspondence autor : Shigeo Suzuki
Tel : 06−6721−2332
Fax : 06−6721−2353
E−mail : suzuki@phar.kindai.ac.jp―６１―

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度・高精度に分析することができれば、糖鎖変化を伴う種々の疾病の発症機構の解明のみならず、診断薬や治療薬の開発にもつながることが期待される。すでに糖鎖研究はポストゲ
ノムの重要な課題の一つであり、世界規模で多くの糖鎖関連
プロジェクトが推進され、糖鎖の構造解析技術も着実に進歩している[7−11]。とりわけ、構造糖鎖生物学において分離分
析は重要な地位を占めており、様々なモードを用いた高速液体クロマトグラフィー（LC）による分離分析法は、オフラ
インでのマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（MALDI−MS）法をはじめ、LC とエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI−MS）を直接組み合わせたオンライン LC/ESI−MS 法として繁用されている。これらは糖鎖プロファ
イリングと構造解析を同時に可能とすることから、グライコ
プロテオミクス研究に欠かせない手法として定着しつつあり[12−15]、その一部は総説としてまとめられている[16−21]。
これらはいずれも糖タンパク質をプロテアーゼなどで処理し、ペプチドおよび糖ペプチド混合物としたものを LC など

Scheme 1. Compexation between boric acid or phenylboronic acidand saccharides.

で分離し、MS あるいはタンデム質量分析（MSn）を行うことで、糖鎖構造とその結合部位のアミノ酸配列を決定するものである。ところが、無数のペプチドピークの中から糖鎖や条件下ではホウ素原子にさらに OH−イオンが配位してアニ糖ペプチドピークを特定することは難しい上、糖鎖の付加にオン型となり安定性が増大する。この糖とボロン酸の親和性

より疎水性が低下するので、質量分析において糖ペプチドはの高さを利用して、フェニルボロン酸をリガンドとするアペプチドよりも大幅に感度が低くなる。しかも糖ペプチドは

フィニティー担体が古くから知られている[24−27]。最近で多量の遊離ペプチドと共存するとその検出感度が著しく低下

は、ジボロン酸を磁性ビーズに固定化したマトリックス[28]する[22]。さらに糖鎖構造の微少不均一性によってスペクトや、アガロース系担体にフェニルボロン酸を結合させたゲルルが複雑化することが多く、LC/MS によるグライコミクス[29]のほか、糖ペプチドを特異的にエンリッチすることを目

解析が必ずしも成功しているとは言い難い。したがって、グ的として、フェニルボロン酸を多孔質シリカゲルに固定した

ライコミクス解析を行う上では、微量試料中からいかに簡潔

担体[30]も登場した。さらには、後に述べる糖鎖認識タンパにそのピークを検出するかがカギとなる。現段階において

ク質であるレクチンとともに結合させたハイブリットタイプ

は、生体試料から微量の糖鎖を高速・高収率かつ高精度に精の固相抽出法も報告されている[31]。しかしながら、フェニ製する戦略が欠落しており、まして血清等の臨床試料を診断

ルボロン酸はカテコールアミンやポリアルコール、環状糖で等に応用することなど依然として現実のものとはなっていな

はフラノース類と親和性を示すものの、糖鎖を構成するピラい。しかし生体内の糖鎖を高速・簡便に回収・濃縮（エンノース類とは親和性が極めて低いと言われており、改善の余リッチ）することができれば、糖鎖が関係する様々な疾患の地がある。いずれにせよ、固相抽出（SPE）用としてグライ

分子診断や発症の分子メカニズムの解明に大きく貢献し、医コプロテオミクスにおける前処理に利用するためには、後述

薬品の開発にも寄与することが期待される。このような理由する我々の開発した遊離ホウ酸イオンを陰イオン交換樹脂にから、我々の研究室では糖鎖あるいは糖ペプチドのエンリッ固定化したもので行う方法も有効であるものと思われる。

チ技術の開発に取り組んでいる。
本稿では、固相抽出（SPE）技術を利用したグライコミク

２．カーボン SPE

ス・グライコプロテオミクスを指向したエンリッチ技術につ活性炭は化学安定性が非常に高く、特有の吸着性能を有す

いて、これまで報告されているものに加え、我々が現在行っることから様々な物質の回収に利用されてきた。糖関係ではている研究成果の一部を紹介する。

活性炭−セライトカラム

として、多糖類の部分加水分解で得られたオリゴ糖混合物の分離カラムとして利用されてき１．研究の背景（代表的な糖鎖精製技術）

た。これは糖の環の内側が相対的に高い疎水性を示すことか

１．ボロン酸ら、カーボンとの疎水相互作用により保持されることを利用

ボロン酸は Scheme 1 に示すようにフルクトースなどの糖している。その後、グラファイトカーボンを充填したカラム

残基のシス−ジオール基と可逆的に五〜六員環複合体を形成（Hypercarb ）の登場により、オリゴ糖の新たな分離モード

し、強く結合することが知られている[23]。しかも、塩基性として利用されるようになった。このカラムでは、TFA を―６
２―

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吉年正宏，生田朋子，毛利幸恵，小山武裕，鈴木茂生

含むアセトニトリル／水などの揮発性溶媒を溶離液に用いるスケールでの精製を試み、MALDI−MS において高感度を与ので、MS においても相性の良いモードとして注目され、多えることを報告した[58]。しかしながら、糖鎖が結合していくの糖分析に利用されている[32−38]。

ないペプチドでも親水性の高いものは同様に保持されるので一方、Packer らは糖鎖混合物からペプチドや塩を除去する

注意を要する。いずれにせよ、これらの方法は生体試料中の方法として、グラファイトカーボンを固相とする SPE 法の糖鎖分析にも応用されており[47, 57]、今後も糖鎖や糖ペプ利用を提案した[39]。糖鎖のようなオリゴ糖も捕捉されるこ

チドのエンリッチ法として利用されると思われる。

とから、遊離糖鎖の精製やエンリッチに利用できる画期的な
４．レクチンアフィニティークロマトグラフィー方法である。また、ペプチド鎖の短いものであれば、糖ペプ
チドの分離にも利用できる。すでに、市販のカーボンカート

レクチンは糖と特異的に結合するタンパク質の総称であリッジを用いて糖鎖の精製を試みた例[40]や、糖ペプチドのり、古くから糖鎖解析のツールとして利用されてきた[59]。

多段階精製を目的としてその一段階目の逆相系カラムで共存

レクチンは単糖ばかりではなく、糖鎖構造の微妙な違いを区ペプチドを除去し、その後カーボンを充填したマイクロカラ

別できることが知られている[60]。例えば、タチナタマメレ

ムで捕捉・脱塩するという２ステップシステムを用い、試料

クチン（Con A）とレンズマメレクチン（LCA）はともにグ中の微量糖ペプチドのエンリッチと MALDI−MS における感

ルコースやマンノース認識レクチンであるが、Con A は高マ

度向上を達成している[41]。しかしながら、トリプシン消化

ンノース型や、分岐マンノース側鎖をもつ混成型糖鎖に強いにより得られる比較的長いペプチド鎖を有する糖ペプチドに親和性を示し、複合型では二本鎖糖鎖に対してのみに弱いな

対しては選択的な分離が難しく、その適用範囲に制限があ

がらも結合性を示す。一方、LCA は高マンノース型糖鎖をる。

認識せず、還元末端側がフコースで修飾された複合型糖鎖を選択的に認識する。このようなレクチンの持つ特性を組み合わせることで、グライコームに代表される糖鎖の網羅的解析

３．親水性相互作用アフィニティー SPE
最近、親水性相互作用クロマトグラフィー（hydrophilic in-が急速に進められている。このレクチンアフィニティーカラ

teraction chromatography; HILIC）[42−44]が、生体成分のようムは、既に糖タンパク質などの複合糖質の分離や遊離糖鎖のな親水性化合物の分離に利用されており、すでに各社から精製にも利用されている。レクチンカラムに捕捉された糖タ

様々なタイプの HILIC カラムが発売され、糖鎖の適用例もンパク質はハプテン糖を含む緩衝液で溶出することができ増えている[18, 45−47]。HILIC は順相クロマトグラフィーのる。レクチンカラムも、最初はセファロース系[61−63]担体

一種として扱われ、水とアセトニトリルなどの有機溶媒の混が用いられたが、その後アガロース[64]やシリカゲル[65]も合溶液を移動相に用い、それよりも高極性の固定相を組み合利用されるようになった。さらに、近年では MALDI−MS やわせて用いる。糖ペプチドの場合、その保持は主に糖鎖の親LC/ESI−MS 解析の前処理への応用が検討され、操作性を高水性と分子サイズで決まり、糖ペプチド画分はペプチドよりめるために磁性ビーズに固定化したもの[28]や、シリカゲルも遅れて溶出される。アセトニトリルなど揮発性有機溶媒をベースのマイクロカラム[66, 67]が現れ、微量糖鎖のエンリッ多量に含む溶離液を用いるので、LC/ESI−MS との相性が高チのみならず、質量分析における感度向上にも寄与していく、糖 ペ プ チ ド の イ オ ン 化 効 率 も 高 い[48−50]。ま た、る。また、種々のレクチンカラムを組み合わせた「マルチレTakegawa や Deguchi のグループらは両性イオン性（zwitteri-

クチンカラム」[68, 69]や、Hirabayashi らが考案した「グラonic）HILIC カラム（ZIC −HILIC）が糖鎖異性体に対する高イコキャッチ」と呼ばれる糖鎖の特異的回収法[70−72]は独い構造認識能を示すことを見出し、糖鎖や糖ペプチドへ適用

自の糖鎖解析法として発展している。さらに細胞中の糖タンしている[51−54]。

パク質の特異的抽出・精製に利用した例もあり[73]、糖鎖構

HILIC の性質を利用した糖鎖精製法も報告されている。

造解析にとってもレクチンは欠かせないツールであることはShimizu らがセルロースカラムクロマトグラフィーで、N 型

間違いない。レクチンを用いたエンリッチ法に関しては最近

糖鎖や N −結合型糖ペプチドの精製法を確立し[55]、結晶セの総説を参照されたい[74]。

ルロースやセファロース SPE を用いて調製した 糖 試料を
MALDI−MS や多段階質量分析（MSn）に応用し、良好な結２．LC/MS を指向した糖鎖固相抽出法

果を得た[56, 57]。これは糖鎖と担体間での水素結合を利用

１．セロトニン固定化シリカゲルを用いたシアル酸含有複合
糖質の特異的回収したもので、いずれもブタノール／エタノール／水（４：１：１v/v）などを吸着溶媒に用い、エタノール／水（１：１

生体内の糖鎖の非還元末端には一般にシアル酸が結合し、v/v）などで溶出させる。糖鎖への選択性が高く、しかも操赤血球や活性タンパク質の代謝調節や細胞接着、分解酵素に作が簡便なことからハイスループット分析に適している。ま対する抵抗性の賦与など、複合糖質の構成成分として重要なた、Yu らは未標識の遊離糖鎖に対してアミノプロピルシリ

生物学的機能を担っている。シアル酸と特異的に結合するレカゲル担体を充填した９６穴 SPE プレートを用いたマイクロクチンとしてはイヌエンジュレクチン（MAM）やニホンニ―６３―

CHROMATOGRAPHY, Vol.30 No.2 (2009)ワトコレクチン（SSA）が知られているが、これらのレクチ
ンはシアル酸単独では親和性を示さず、結合特異性も異なる。ところで、神経伝達物質の１つでもあるセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン；5HT）は、分子量がわずか１７６と極めて小さな分子でありながら、シアル酸（特に N−アセチ
ルノイラミン酸；NeuAc）に対して強く結合することが知られている。Sturgeon らはこの点に着目し、シアル酸含有糖鎖のアフィニティークロマトグラフィーにセロトニン固定化カラムを利用した[75]。そこで筆者らは生体試料のような複雑
Fig. 2. Reversed phase HPLC analysis of AP−labeled glycans derived from human transferrin before (a) and after (b) specific extraction with Si−5HT SPE cartridge. Analytical conditions: column, ODS−silica column (6.0×150 mm, Nacalai
Tesque); buffer, (A)10 mM NaH2PO4 (pH 3.8), (B)buffer A
containing 0.5% 1−BuOH; eluent, 70% to 5% of buffer A
for 100 min; flow rate, 1.0 ml/min; detection, fluorescenceat 310 (ex)/390 (em) nm.

な試料成分からシアル酸含有糖タンパク質を特異的に回収することを目的とし、セロトニンによる固相抽出法を利用した
シアル酸含有複合糖質の簡易抽出法の開発を試みた。
市販のシリカゲル（３０〜５０µm、１０nm）を γ−グリシドキ
シプロピルトリメトキシシランで処理してエポキシ基を導入した後、数ステップの反応を経てアルデヒド基に変換した。
これと 5HT のアミノエチル基を還元的アミノ化反応を利用
して結合させることで、目的の 5HT 固定化シリカゲルを得た（Scheme 2）[65]。合成した SPE 担体は Fig. 1 で示した操

誘導体化後の過剰試薬の除去までも行うことが可能であり、作に従ってシアル酸含糖鎖を特異的に捕捉し、試料溶液中に回収率も８０％以上であった。また、高マンノース型糖鎖など含まれる夾雑物は水で溶 出 さ せ る こ と が で き た。試料にの中性糖は全く保持されず、シアル酸含有糖鎖のみを選択的

NeuAc を用いて溶出条件を検討した結果、加温した０．
１％酢に回収することができた。糖ペプチド回収においては、一部

酸含有０．
５M 酢酸アンモニウム水溶液で溶出すれば、ほぼ定のペプチドのわずかな非特異的吸着が見られるもののシアル

量的に回収することが可能であった。AP 標識化直後のシア酸含有糖ペプチドに特異的であることが判明した。糖鎖の構

ル酸含有糖鎖の精製に適用したところ、Fig. 2 に示すように

造解析や機能解析を行う際に、このシアル酸含有複合糖質を選択的に捕捉できるので、疾病や病態に伴う糖鎖の変化を捕らえる際に簡便な前処理法となる。
２．ホウ酸結合型陰イオン交換樹脂を用いた複合糖質の特異的回収法
先にも述べたように、ポリアルコール構造を有する糖類はホウ酸イオンに配位することが知られ（Scheme 1 参照）、ホ
ウ酸型陰イオン交換カラムは糖分析に広く利用されてきた。
そこで、中性糖鎖あるいは糖ペプチドのエンリッチを目的として、ホウ酸結合型陰イオン交換樹脂を利用した固相抽出法

Scheme 2. Synthesis of the serotonin−immobilized silica.

（ホウ酸 SPE）による糖試料のエンリッチについて検討を試みた。
糖試料を１％アンモニア水に溶解したのち、ホウ酸結合型
イオン交換樹脂に結合させ、アセトニトリル−水で夾雑物を洗浄・除去した後、糖鎖はホウ酸アンモニウム（pH１０．
０）で溶出させた。トリプシン消化により調製したウシ膵臓リボ
ヌクレアーゼ B（RNase B）由来糖ペプチドに適用した結果を Fig. 3 に示す。なお解析は LC/MS で行った。本糖タンパ
ク質は５種の高マンノース型糖鎖を含み、一カ所のアスパラギン残基に結合していることが知られている。トリプシン消化直後の TIC（Fig. 3(a)）では、１０分付近に高マンノース型
糖ペプチドが観察された。また、２２．
５分以降に夾雑物に由来するピークが観測されているが、ホウ酸 SPE を通すことにFig. 1. Procedure for purification of sialylated glycan derivatives
and/or peptides using Si−5HT SPE.

より、５〜９残基のマンノースを含む糖ペプチドのスペクト―６
４―

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吉年正宏，生田朋子，毛利幸恵，小山武裕，鈴木茂生

Fig. 3. Total ion current chromatograms of reversed−phase LC/ESI−MS of tryptic digests of ribonuclease B before (a) and after (b) specific extraction with borate form anion exchange
resins. MS scan range: 1000−1700 m/z. GlcNac; N −acethyl−glucosamine, Man; Mannose.

Fig. 4. Total ion current chromatograms of reversed−phase LC/ESI−MS of tryptic digests of ribonuclease B before (a) and after (b) specific extraction with Con A. MS scan range: 1000
−1700 m/z. GlcNac; N −acethyl−glucosamine, Man; Mannose.

ルが明瞭に観察され、夾雑物 由 来 の シ グ ナ ル は 消 滅 した

ことなく目的糖ペプチドのみを特異的に回収することが出来（Fig. 3(b)）。ここには示していないが、他の糖ペプチドに関た。また、シアル酸含有糖鎖をもつヒト血清トランスフェリ

しても同様にエンリッチすることができた。先述のセロトニンや α１−酸性糖タンパク質の糖ペプチドはシアル酸認識レク

ン SPE とを組み合わせて使用することにより、従来の煩雑チンである SSA を用いることで、特異的に回収することがな操作を必要とする糖鎖分析の問題点を大幅に改善することできた。本法により、糖タンパク質糖鎖の部分構造情報と分ができ、ハイスループット分析が可能になると考えている。

子量を同時に決定できることから糖鎖のより詳細な解析が可

しかしながら、まだ回収率が低いため、現在は溶出条件など能になる。

の検討を行っている。
３．おわりに
３．レクチンを用いる構造選択的糖鎖特異的回収法

質量分析法は、近年のめざましい感度の向上によりグライ

先にも述べたとおり、これまではレクチンをセルロースなコミクスにおける高感度分析ツールとして定着しつつある。

どの担体に固定化したアフィニティーカラムを用いて、糖鎖

今後は、目的に応じた前処理法を上手く組み合わせた解析なの構造解析が行われてきた。しかしながら、タンパク質の固どの応用的手法の開発が求められてくる。糖鎖構造解析を行

定化には煩雑な操作が必要な上に、その安定性にも問題があう前処理として、前半に述べた様々な手法が存在している。

る。しかもディスポーサブルカラムとして用いるには、安定

いずれも、オールマイティーな手法とは言えず、ユーザーは性だけでなくコスト面についても問題がある。これらの現状

対象物に応じた選択を行うことになる。しかしながら、微量を踏まえ、我々は糖鎖の部分構造を認識するレクチンと限外糖鎖を簡便、高速かつ特異的に分析するとなれば既存の方法

ろ過膜を用いて糖鎖構造選択的な糖ペプチドの簡易精製・回だけでは不十分であると言えよう。

収法の検討を行った。

生体内の多くの微量試料中から糖鎖複合体を特異的に回収

本法の操作を次に示す。レクチン２５０µg を０．
２M NaCl、する方法として、ここ紹介した我々の方法は、病態変化や感２０mM CaCl２、２mM MnCl２、２mM MgCl２を含む０．
１M Tris−

染などにともなう翻訳後修飾としての糖鎖複合体の解析を容HCl（pH７．
０）緩衝液に溶解後、１００µg 相当の目的試料溶液

易にするツールとして有用なものと思われ、グライコミクス

とともに分画分子量１０，０００の限外濾過用遠心分離型チューブの前処理法として更なる発展が期待できる。例えば、糖鎖複に充填する。その後緩衝液および精製水で洗浄し、不要成分

合体のみをホウ酸 SPE で回収し、その中でシアル酸結合糖を４℃で遠心しながら除去する。最終的に TFA を含む酢酸

鎖含有成分をセロトニン SPE を用いればそれぞれの成分を

水溶液２mL を用いて、レクチンを酸性条件下で変性させ、特異的にエンリッチすることが可能である。さらに、レクチ保持された成分を回収した。各々のレクチンは糖ペプチドとンでその結合様式毎に分類し、同時に回収ことが可能とな

予想通りの選択性で特異的に結合し、試料溶液中に含まれるる。したがって単に試料のエンリッチだけではなく構造推定

非特異成分は緩衝液および水で溶出することができた。Fig.

までも可能とする。

4 に RNase B 由来の高マンノース型糖ペプチドの精製に Con

さらに、種類と組み合わせを検討すれば、糖鎖や糖ペプチ

A を用いた結果を示す。遊離ペプチドはほとんど保持されるドの構造解析におけるハイスループット分析を可能にするも―６５―

CHROMATOGRAPHY, Vol.30 No.2 (2009)のと考えており、現在はより詳細な検討を行っているところ[21] Wuhrer, M.; Catalina, M. I.; Deelder, A. M.; Hokke, C. H.,

である。

J. Chromatogr. B, 2007, 849, 115−128.
[22] Annesley, T. M., Clin. Chem., 2003, 49, 1041−1044.

謝辞[23] Hageman, J. H.; Kuehn, G. D., Methods Mol. Biol., 1992,

本研究は文部科学省ハイテク・リサーチ・センター事業に

11, 45−71.

よる私学助成を得て行われた。

[24] Gould, B. J.; Hall, P. M.; Cook, J. G., Ann. Clin. Biochem.,

Reference[25] Rendell, M.; Rasbold, K.; Nierenberg, J.; Krohn, R.; Her-

1984, 21 (Pt 1), 16−21.
[1][2]

Apweiler, R.; Hermjakob, H.; Sharon, N., Biochim. Bio-

manson, G.; Klenk, D.; Smith, P. K., Clin. Biochem., 1986,

phys. Acta, 1999, 1473, 4−8.

19, 216−220.
[26] Danze, P. M.; Tarjoman, A.; Rousseaux, J.; Fossati, P.;

Takahashi, N.; Kato, K., Trends in Glycosci. Glycotech.,

Dautrevaux, M., Clin. Chim. Acta, 1987, 166, 143−153.

2003, 15, 234−251.
[3][27] Gould, B. J.; Hall, P. M., Clin. Chim. Acta, 1987, 163, 225−

Moloney, D. J.; Panin, V. M.; Johnston, S. H.; Chen, J.;

230.

Shao, L.; Wilson, R.; Wang, Y.; Stanley, P.; Irvine, K. D.;[28] Sparbier, K.; Koch, S.; Kessler, I.; Wenzel, T.; Kostrzewa,

Haltiwanger, R. S.; Vogt, T. F., Nature, 2000, 406, 369−

M., J. Biomol. Tech., 2005, 16, 407−413.

375.

[29] Zhang, Q.; Tang, N.; Brock, J. W.; Mottaz, H. M.; Ames, J.

[4]

Lehle, L.; Strahl, S.; Tanner, W., Angew. Chem. Int. Ed.,
2006, 45, 6802−6818.

M.; Baynes, J. W.; Smith, R. D.; Metz, T. O., J. Proteome.

[5]

Varki, A., Glycobiology, 1993, 3, 97−130.

Res., 2007, 6, 2323−2330.

[6]

Dwek, R. A., Chem. Rev., 1996, 96, 683−720.

[7]

Rudd, P. M.; Dwek, R. A., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.,[8]

Banks, R. E.; Dunn, M. J.; Hochstrasser, D. F.; Sanchez, J.

[30] Xu, Y.; Wu, Z.; Zhang, L.; Lu, H.; Yang, P.; Webley, P. A.;
Zhao, D., Anal. Chem., 2009, 81, 503−508.
[31] Monzo, A.; Bonn, G. K.; Guttman, A., Anal. Bioanal.

1997, 32, 1−100.

Chem., 2007, 389, 2097−2102.
[32] Davies, M.; Smith, K. D.; Harbin, A. M.; Hounsell, E. F., J.

C.; Blackstock, W.; Pappin, D. J.; Selby, P. J., Lancet, 2000,

Chromatogr., 1992, 609, 125−131.

356, 1749−1756.
[9][33] Fan, J. Q.; Kondo, A.; Kato, I.; Lee, Y. C., Anal. Biochem.,

Harvey, D. J., Proteomics, 2001, 1, 311−328.

1994, 219, 224−229.

[10] Kuster, B.; Krogh, T. N.; Mortz, E.; Harvey, D. J., Proteom-[34] Koizumi, K., J. Chromatogr. A, 1996, 720, 119−126.

ics, 2001, 1, 350−361.

[35] Kawasaki, N.; Ohta, M.; Hyuga, S.; Hashimoto, O.; Hayak-[11] Spiro, R. G., Glycobiology, 2002, 12, 43R−56R.

awa, T., Anal. Biochem., 1999, 269, 297−303.

[12] Kawasaki, N.; Ohta, M.; Itoh, S.; Hyuga, M.; Hyuga, S.;[36] Itoh, S.; Kawasaki, N.; Ohta, M.; Hyuga, M.; Hyuga, S.;

Hayakawa, T., Biologicals, 2002, 30, 113−123.

Hayakawa, T., J. Chromatogr. A, 2002, 968, 89−100.

[13] Karlsson, N. G.; Schulz, B. L.; Packer, N. H., J. Am. Soc.

[37] Hashii, N.; Kawasaki, N.; Itoh, S.; Hyuga, M.; Kawanishi,

Mass Spectrom., 2004, 15, 659−672.

T.; Hayakawa, T., Proteomics, 2005, 5, 4665−4672.

[14] Kremmer, T.; Szollosi, E.; Boldizsar, M.; Vincze, B.;[38] Itoh, S.; Kawasaki, N.; Hashii, N.; Harazono, A.; Matsuishi,

Ludanyi, K.; Imre, T.; Schlosser, G.; Vekey, K., Biomed.

Y.; Hayakawa, T.; Kawanishi, T., J. Chromatogr. A, 2006,

Chromatogr., 2004, 18, 323−329.

1103, 296−306.

[15] Zamfir, A.; Seidler, D. G.; Schonherr, E.; Kresse, H.; Peter−[39] Packer, N. H.; Lawson, M. A.; Jardine, D. R.; Redmond, J.

Katalinic, J., Electrophoresis, 2004, 25, 2010−2016.

W., Glycoconj. J., 1998, 15, 737−747.

[16] Harvey, D. J., Expert Rev. Proteomics, 2005, 2, 87−101.

[40] Nakano, M.; Kakehi, K.; Lee, Y. C., J. Chromatogr. A,[17] Kawasaki, N.; Itoh, S.; Harazono, A.; Hashii, N.; Matsuishi,

2003, 1005, 13−21.

Y.; Hayakawa, T.; Kawanishi, T., Trends in Glycosci. Gly-[41] Larsen, M. R.; Hojrup, P.; Roepstorff, P., Mol. Cell. Pro-

cotech., 2005, 17, 193−203.

teomics, 2005, 4, 107−119.

[18] Wuhrer, M.; Deelder, A. M.; Hokke, C. H., J. Chromatogr.

[42] Alpert, A. J., J Chromatogr, 1990, 499, 177−196.

B, 2005, 825, 124−133.

[43] Alpert, A. J.; Shukla, M.; Shukla, A. K.; Zieske, L. R.;[19] Geyer, H.; Geyer, R., Biochim. Biophys. Acta, 2006, 1764,

Yuen, S. W.; Ferguson, M. A.; Mehlert, A.; Pauly, M.; Or-

1853−1869.

lando, R., J. Chromatogr. A, 1994, 676, 191−122.

[20] Kaji, H.; Isobe, T., Trends in Glycosci. Glycotech., 2006,[44] Boersema, P. J.; Mohammed, S.; Heck, A. J., Anal. Bioanal.

18, 313−322.

―６６―

CHROMATOGRAPHY, Vol.30 No.2 (2009)

吉年正宏，生田朋子，毛利幸恵，小山武裕，鈴木茂生

339.

Chem., 2008, 391, 151−159.

[60] Goldstein, I. J.; Hughes, R. C.; Monsigny, M.; Osawa, T.;[45] Hagglund, P.; Bunkenborg, J.; Elortza, F.; Jensen, O. N.;

Sharon, N., Nature, 1980, 285, 66.

Roepstorff, P., J. Proteome. Res., 2004, 3, 556−566.

[61] Ogata, S.; Muramatsu, T.; Kobata, A., J. Biochem, 1975, 78,[46] Wuhrer, M.; Koeleman, C. A.; Hokke, C. H.; Deelder, A.

687−696.

M., Anal. Chem., 2005, 77, 886−894.

[62] Krusius, T.; Finne, J.; H., R., FEBS Lett., 1976, 71, 117−[47] Ruhaak, L. R.; Huhn, C.; Waterreus, W. J.; de Boer, A. R.;

120.

Neususs, C.; Hokke, C. H.; Deelder, A. M.; Wuhrer, M.,[63] Kornfeld, K.; Reitman, M. L.; Kornfeld, R., J. Biol. Chem.,

Anal. Chem., 2008, 80, 6119−6126.

1981, 256, 6633−6640.

[48] Grumbach, E. S.; Wagrowski−Diehl, D. M.; Mazzeo, J. R.;[64] Cummings, R. D.; Kornfeld, S., J. Biol. Chem., 1982, 257,

Alden, B.; Iraneta, P. C., LC GC North America 2004, 22,11235−11240.

1010−1023.

[65] Larsson, P. O., Methods Enzymol., 1984, 104, 212−223.

[49] Shou, W. Z.; Naidong, W., J. Chromatogr. B, 2005, 825,[66] Madera, M.; Mechref, Y.; Novotny, M. V., Anal. Chem.,

186−192.

2005, 77, 4081−4090.

[50] Hemstrom, P.; Irgum, K., J. Sep. Sci., 2006, 29, 1784−1821.

[67] Madera, M.; Mechref, Y.; Klouckova, I.; Novotny, M. V., J.

[51] Takegawa, Y.; Deguchi, K.; Ito, H.; Keira, T.; Nakagawa,

Chromatogr. B, 2007, 845, 121−137.

H.; Nishimura, S., J. Sep. Sci., 2006, 29, 2533−2540.

[68] Yang, Z.; Hancock, W. S., J. Chromatogr. A, 2004, 1053,[52] Takegawa, Y.; Deguchi, K.; Keira, T.; Ito, H.; Nakagawa,

79−88.

H.; Nishimura, S., J. Chromatogr. A, 2006, 1113, 177−181.

[69] Yang, Z.; Hancock, W. S., J. Chromatogr. A, 2005, 1070,[53] Deguchi, K., Chromatography, 2008, 29, 17−27.

57−64.

[54] Deguchi, K.; Keira, T.; Yamada, K.; Ito, H.; Takegawa, Y.;[70] Hirabayashi, J.; Arata, Y.; Kasai, K., Proteomics, 2001, 1,

Nakagawa, H.; Nishimura, S., J. Chromatogr. A, 2008,

295−303.

1189, 169−174.

[71] Hirabayashi, J.; Hayama, K.; Kaji, H.; Isobe, T.; Kasai, K.,[55] Shimizu, Y.; Nakata, M.; Kuroda, Y.; Tsutsumi, F.; Kojima,

J. Biochem., 2002, 132, 103−114.

N.; Mizuochi, T., Carbohydr. Res., 2001, 332, 381−388.

[72] Hirabayashi, J.; Kasai, K., J. Chromatogr. B, 2002, 771, 67[56] Wada, Y.; Tajiri, M.; Yoshida, S., Anal. Chem., 2004, 76,−87.

6560−6565.

[73] Hirabayashi, J., Glycoconj. J., 2004, 21, 35−40.

[57] Tajiri, M.; Yoshida, S.; Wada, Y., Glycobiology, 2005, 15,[74] Mechref, Y.; Madera, M.; Novotny, M. V., Methods Mol.

1332−1340.

Biol., 2008, 424, 373−396.

[58] Yu, Y. Q.; Gilar, M.; Kaska, J.; Gebler, J. C., Rapid Com-[75] Sturgeon, R. J.; Sturgeon, C. M., Carbohydr. Res., 1982,

mun Mass Spectrom., 2005, 19, 2331−2336.

103, 213−219.

[59] Boyd, W. C.; Reguera, R. M., J. Immunol., 1949, 62, 333−―６７―