Technical Review

Chromatography, Vol.27 No.3 (2006)

Technical Review

次世代のHPLC―超高速液体クロマトグラフィーシステム―を用いた
医薬品成分の高速分離
坊之下雅夫、宮路敏彦、岩谷敬仁、東館栄、山口高歩、斎藤宗雄

Ultra High−Speed Separation of Tuberculosis Drugs
using Extreme Liquid Chromatography System
Masao Bounoshita, Toshihiko Miyaji, Keijin Iwaya, Sakae Higashidate,
Takayuki Yamaguchi and Muneo Saito
JASCO Corporation, 2967−5 Ishikawa−cho, Hachioji−shi, Tokyo, 192−8537 Japan

Abstract
Ultra high−speed separation has become increasingly important in pharmacology, food science, agrochemistry and other areas. In general,
conventional HPLC separation has been performed on columns packed with 5 µm particles. However, conventional HPLC requires a longanalysis time and big amounts of solvents. In case of X−LC (extreme liquid chromatography), shorter columns typically 50−100 mm in length
packed with ultra micro−particles, which particle size is less than 2 µm, are used. X−LC offers higher efficiency and sensitivity, and reduction of organic solvents without sacrificing separation efficiency. We compared efficiency of X−LC with conventional HPLC in separation ofmedicines listed in Pharmacopeia. In case of conventional HPLC with a 5 µm column (I.D. 4.6 mm x 150 mmL) for the separation of Isoniazid, Rifampin, Pyrazinamide, the analysis time was a little over 8 minutes, whereas, X−LC with a 2 µm column (I.D. 2.1 mm x 50 mmL)
gave a very short analysis time of 1.3 min, which is 6 times faster than conventional HPLC.
Keywords : X−LC, Extreme liquid chromatography, Drugs, Pharmacopeia, High−Throughput

は、カラムサイズのダウンサイジングや移動相流速を速くす

１．緒言ることによる分離効率の低下などの要因から、高速かつ高分高速液体クロマトグラフィーは、医薬品、農薬、食品、化離測定を行うことが困難である。

成品、そして天然物などの広い分野に渡る多種多様な物質の分離分析法として、製品開発や品質管理で使用されている。

２µm以下の微小粒子充填カラムを使用した超高速液体ク

そのため、数多くの分析試料の測定が必要となり、分析時間

ロマトグラフィーは、高い線速度領域の移動相流量でも、高の短縮が可能な高効率分離が求められている。しかしながい分離効率を維持したまま、高感度、短時間測定が実現できら、現在、一般的に利用されている５µm粒子充填カラムでる手法である。このような超高速液体クロマトグラフィー〒１９２―８５３７ 東京都八王子市石川町２９６７―５
日本分光株式会社 LC技術部 LC応用技術課
TEL : 042−646−4109 FAX : 042−660−7513
E−mail : masao.bounoshita@jasco.co.jp―１３１―

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Table 1. 従来のHPLCの測定条件
Flow rate :1.5 mL/min
Column :CrestPak C 18 S (4.6 mm ID x 150 mm L, 5 µm)
Column temp. : 25℃
Mobile phase : A : 0.01 M Na2HPO4 /CH3CN (96/4) (pH 6.8)
B : 0.01 M Na2HPO4 /CH3CN (45/55) (pH 6.8)
Wavelength : 238 nm
Sample :0.16 mg/L Rifampin, 0.08 mg/L Isoniazid,0.43 mg/L Pyrazinamide (in Na2HPO4 /CH3OH (96/4))
Gradient Conditions
Time (min)Figure 1. 結核治療薬（Rifampin, Isoniazid, Pyrazinamide）の構造式

Solution A (%)

Solution B (%)

Elution01000equilibration

0−51000isocratic

5−6100 → 00 → 100

Linear gradient6−150100

isocratic

は、５µm粒子充填カラムと比較して、同じ分離度を示すク

Table 2. X−LCの測定条件

ロマトグラムを約１/５〜１/１０程度の短時間で得ることがで

Flow rate :0.8 mL/min
Column :X−PressPak C 18 S (2.1 mm ID x 50 mm L, 2 µm)
Column temp. : 25℃
Mobile phase : A : 0.01 M Na2HPO4 /CH3CN (96/4) (pH 6.8)
B : 0.01 M Na2HPO4 /CH3CN (45/55) (pH 6.8)
Wavelength : 238 nm
Sample :0.16 mg/L Rifampin, 0.08 mg/L Isoniazid,
0.43 mg/L Pyrazinamide (in Na2HPO4 /CH3OH (96/4))

きる。
このような超高速分離を実現するためには、非常にシャープなピークに対応できる設計がなされている超高速液体クロマトグラフが必要となる。今回の測定に使用した日本分光製
超高速液体クロマトグラフX−LCは、１）カラム外効果によるピークの拡がりを抑えたシステム流路の設計、２）シャープなピークを適確に検出できる高速データ出力機能を備えた

Gradient Conditions

検出器（UV検出器：１００Data points/sec）、３）微小充填剤カTime (min)ラムを高い線流速で使用するための高耐圧設計（送液ポンプ、高圧混合グラジェントミキサ、オートサンプラから、カラム入り口までの流路：１００MPa耐圧）に対応したシステムである。
本報では、この超高速液体クロマトグラフィーを用いて、Solution A (%)

Solution B (%)

Elution01000

equilibration

0−0.71000isocratic

0.7−0.9

100→00→100

Linear gradient0.9−1.50100isocratic

米国薬局方（USP）に掲載されている医薬品の結核治療薬（３成分混合：Rifampin，Isoniazid，Pyrazinamide，化学構造間化し測定を行った。従来のHPLCで測定した条件をTable

式をFigure１に示す。）の混合標準液の高速分離を検討し、１、超高速液体クロマトグラフィーで採用した条件をTable

従来のHPLCと超高速液体クロマトグラフとの性能比較を２に示す。溶離液は、リン酸緩衝液（pH６．
８に調製）とアセUSP記載の測定条件に基づいて行ったので報告する。

トニトリルの９６/４の混合溶媒をA溶媒、４５/５５の混合溶液をB溶媒として使用した。A溶媒を用いてIsoniazidとPyrazinamideを溶出させた後、B溶媒に切換えてRifampinを溶出させてい２．実験る条件である。

実験に使用した超高速液体クロマトグラフは、X−LC３０８５PU型 移 動 相 送 液 ポ ン プ（２台）、X−LC ３０８０DG型 デ超高速液体クロマトグラフィーのグラジェント溶出条件

ガッサ、X−LC ３０８０MX型高圧混合ミキサ（５０µL容量を使は、２µmカラムの約１０分の１に短縮した時間に設定した。

用）、X−LC ３０６７CO型カラムオーブン、X−LC ３０７０UV型紫測定に使用した３種類の標準試料は、SIGMA−ALDRICH社

外可視検出器、X−LC ３０５９AS型オートサンプラ、これらモ（USA）から購入した。

ジュールの制御とデータ処理を行うChromNAVから構成され３．結果と考察る２ポンプ高圧グラジェントシステムを使用した。カラムは、粒子径２ µmの逆相型シリカODSカラムのX−PressPak C

従来のHPLCを用い、１０µLの混合標準液（１；Isoniazid，２；Pyrazinamide，３；Rifampin）を注入して得られたクロ

１８S（内径２．
１x長さ５０mm）を使用した。
溶離液および、グラジェント法は、米国薬局方（USP ２７マトグラムをFigure２に示す。分離カラムは、粒径５µmの充（２００４），Page１６５４）に掲載されている条件を参考に、短時填剤を充填したCrestPak C１８S（内径４．
６mm、長さ１５０mm）―１３２―

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Masao Bounoshita, Toshihiko Miyaji, Keijin Iwaya, Sakae Higashidate,
Takayuki Yamaguchi and Muneo Saito

Figure 2. 従来のHPLC（５µm充てん剤カラム）によるクロマトグラム

Figure 3. X−LC（２µm充てん剤カラム）によるクロマトグラムを使用し、溶離液の流量は１．
５mL/minとした。分析時間は約

来のHPLCによる分析時間に比べて約１/６の短時間測定がで８分で終了した。測定時のカラム圧力はグラジェント溶出法

きた。さらに、注入量が１０分の１でもほぼ同じ高さのピークであるため１４．
４〜１６．
８MPaを示した。

を得ることができ、約１０倍の感度の向上となった。Table３

X−LCシステムを用い、１µLの混合標準液を注入して得らに分析時間および１分析当たりの溶媒消費量を示した。溶媒れたクロマトグラムをFigure ３に示す。溶離液の流量は、消費量は、５ µm充填剤カラムの約５．
３％となり、約２０分の０．
８mL/minに設定し測定した。この流量は、５µmの充填剤１に削減することができた。超高速液体クロマトグラフィー

カラム使用時の約半分である。カラム圧力は、３９．
１〜４４．
４により得られたピーク面積と保持時間の再現性を比較した結MPaと高い圧力を示し、この圧力では、通常のHPLCシステ果をTable４に示した。保持時間の再現性は、相対標準偏差

ムは利用することが難しい。分析時間は約１．
３分であり、従値（RSD％）で、０．
２５〜０．
２９％と良好な再現性を得ることが―１３３―

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Table 3. X−LC（２µm）とHPLC（５µm）の比較

４．結論
以上のように、超高速液体クロマトグラフX−LCを用いる

Pyrazinamide（Peak＃２）HPLC（５µm） X−LC（２µm） X−LC/HPLC＊

分析時間（min）

８１．
３０．
１
６３

溶媒消費量
＊＊
（mL/１分析）

３０１．
６０．
０
５３

ピーク高さ（mAU）

３３７３７８１．
１２２

注入量（µL）

１０１０．
１

＊
＊＊

ことにより、従来のHPLCに比べて大幅なスピードアップが可能であり、検出限界の向上と同時に溶媒の消費量の低減も実現することができた。さらに、本報告で示したようにX−LCは従来のHPLCで設定した測定条件とほとんど同じ条件を踏襲することができるため、すでに測定条件を確立した試料の分析に対して、比較的容易に適用することができる。
以上の結果から、本システムは、医薬品をはじめとする各分析時間については、初期条件に戻す時間を除く。
溶媒消費量は、１分析サイクル（再生時間含む）で計算。

種成分の高速分離分析に有効に利用することが期待できる。

Table 4. ピーク面積と保持時間の再現性

５．おわりに高速液体クロマトグラフィーの測定時間の短縮は、微小粒ピーク面積の再現性（n＝１０）子充填カラムを使用した短いカラムで測定する方法が、２０年Standard deviation（min） %RSD

PeakArea Average

Isoniazid

１０７７１２５７９．
８００．
５４

Pyrazinamide

３７３３０９１０７５．
３２０．
２９Rifampin

２７１５０６３９４２．
２４１．
４５以上も前から検討されていた。この間、充填剤は、１０µmから５µm、３µmへと微小な粒子径の利用が可能になり、短いカラムによる分析時間の高速化が検討され、徐々に実現されてきていた。しかしながら、通常のHPLCシステムでは、数秒の幅で溶出する非常にシャープなピークに対応した検出保持時間の再現性（n＝１０）
Peak器、ピークの拡がりに対する適切な流路設計、さらに、微小Rt Average（min） Standard deviation（min） %RSD

充填剤を使用することによる高いカラム圧力下での安定な使

Isoniazid

０．
２
７９０．
０００７５８９０．
２７用が困難であった。そのため、２µm以下の充填剤カラムをPyrazinamide

０．
３７３０．
０００９３９５０．
２５使用できるシステムとして作動させることは難しかった。

Rifampin

１．
１９９０．
００３５２
７４０．
２９現在、XLCシステムのように、非常にシャープなピークへの対応、高い耐圧性能を有する超高速液体クロマトグラフが登場し、さらに、市販されている２µm前後の各種充填剤カTable 5. X−LCによる測定結果とUSPの規定ピークパラメー
タ値との比較
Resolution, R
Rifampin（Between isoniazid and（Peak＃３）
pyrazinamide）

ラムも増え、容易に入手することができるようになってき

NTP

TailingfactorReplicateinjections（RSD％）た。すなわち、身近に超高速液体クロマトグラフを利用できる状況が整ってきたといえる。
本Technical

Reviewの実験に使用した超高速液体クロマト

X−LC

４．
１９６５０１４１．
２５３＜１．
４５

グラフX−LCは、蛍光検出器をラインアップに加え、蛍光物USP規定値＞４＞５００００＜２＜２．
０

質やプレカラム蛍光誘導体化物質など、多くの測定対象試料に通用することができるシステムとなっている。また、３ポンプ高圧混合グラジェントシステムや１ポンプ定組成送液シできた。
USPに定められている規定値（分離度、理論段数、テーリステムなど分析目的に適したシステムを構築することがでングファクタ、注入再現性）と比較した値をTable５に示す。

き、もちろん３µm充填剤のカラムや従来から使用している分離度は、R＞４（Not less than４）に対して、IsoniazidとPyraz-５µm充填剤のカラムも利用することができる。今後も多く

inamide間でR＝４．
１９、PyrazinamideとRifampin間でR＝３７．
２をのアプリケーションの紹介を行い、次世代のHPLCシステム得られ、注入再現性は、２．
０％未満（RSD％）に対して、０．
２９として、利用していただけるよう発展させていきたい。

〜１．
４５％と規定値内であることが確認できた。
References
[1]

―１
３４―

U. S. Pharmacopeia 27 (2004), pp. 1653−1654