放線菌門に属さない放線菌様系統「クテドノバクテリア」の選択的培養法の確立と分離及び創薬微生物資源としての有効性の検証
矢部 修平（東北大学大学院農学研究科）
要約
創薬生物資源「放線菌」

クテドノバクテリア（綱）は放射状の菌糸に胞子を着生させ、種々の抗菌活性を示すなど第二の放線菌と称し得る形態分化と性質を持つユニークな分類群であるが、培養株が少ない未開拓遺伝資源である。本研究では、分離培養法を改良しながら本系統を拡充し、有益な遺伝資源と成り得るかを検証した。
国内の火山地帯の堆積物や土壌及び「食べられる土」として知られる微生物塊「天狗の麦飯」から19株のクテドノバクテリア綱に属する菌種の分離に成功した。それらの分類学的性質を解明し、１新科、１新属、6新種を提唱した。また本綱を提唱したCavalettiらとの共同研究で、8株の未分類のクテドノバクテリア株を分譲頂き、それらも分類学的性質を明らかとして2新科、3新属、6新種を提唱予定である。さらに一部の菌種は胞子嚢を形成することを見出した。胞子嚢を形成する細菌系統の存在は放線菌、粘液細菌に次いで3例目である。これら分離株のゲノム中には二次代謝物生合成遺伝子群が最大で22個と放線菌に匹敵するほど多く、それらのほとんどは新規であることが示唆された。分離株はグラム陽性菌から陰性菌まで幅広く抗菌活性を示し、その培養物から新規と推定されるアントラキノン化合物を見出した。以上、本研究により、本系統を拡充することに成功し、その生合成ポテンシャルの高さを証明するに至った。

新奇未培養菌群「クテドノバクテリア（綱）」分離培養に成功日本放線菌学会 (by M. Hayakawa et al.)

抗生物質で人類に貢献

培養株僅か
抗菌薬の発見頻度低下

生物活性物質生産
新規生物資源の発掘が不可欠

開拓の余地

クテドノバクテリアは人類に有益な遺伝資源

系統を拡充して二次代謝生合成ポテンシャルを検証

分離戦略

クテドノバクテリアの分離源
天狗の麦飯

鬼首温泉地熱地帯

蔵王山火口湖荒廃土壌

浅間・烏帽子火山群（標高2100m） 標高約1600mの荒廃土壌の荒廃土壌に棲息する。昔、信州地方の修行僧が食べていたとされる微生物塊

培地：10×R2A（ゲランガム固化）培地にアジ化ナトリウムを30mg/L添加したもの
培養条件：30-70℃
培養期間：7-60日
判別1：デジタルマイクロスコープによる形態判別
判別2：放線菌⇒ジオスミン臭、クテドノバクテリア⇒甘い香り

温度80℃程度の熱水噴出孔付近の赤色の粘土質土壌

Digital Microscope KH-8700
を用いてシャーレの1つ1つのコロニーを直接観察

出芽胞子は放線菌の分節胞子と異なるため、高い確率で放線菌とKtedonobacteriaを判別可能

Ktedonobacteira様コロニーを純粋分離

系統分類学的特徴
100

Dictyobacter sp. SOSP1-9 (Novel species?)
Dictyobacter kobayashii sp. nov. (Uno11T)
Dictyobacter alpinus sp. nov. (Uno16T)

100
100

Dictyobacter vulcani sp. nov. (W12T)

100Dictyobacter sp. Uno17(Novel species?)

99

Dictyobacteraceae bacterium SOSP1-142 (New genus?)

100

Tengunoibacter tsumagoiensis gen. nov. sp. nov. (Uno3T)

99

Sporangia formationfrom stalk cell

Dictyobacter aurantiacus S27

Ktedonobacterales bacterium 150039 (New family?)Ktedonobacterales bacterium 150040 (New famimli?)

86

Ktedonobacterales bacterium SCAWS-G2

Order
Ktedonobacterales

Ktedonobacteraceae bacterium SOSP1-1 (New genus?)

100

Ktedonobacter sp. SOSP1-30

100

Ktedonobacter sp. SOSP1-52(Novel species?)

100Family
Ktedonobacteraceae

Ktedonobacter racemifer SOSP1-21T

100

Spore maturation

100100

Thermogemmatispora argilla sp. nov. (A3-2T)
100 100

10077

Thermosporothrix hazakensis SK20-1T

Thermogemmatispora aurantia sp. nov. (A1-2T)
Thermogemmatispora sp. T81

100

Thermogemmatispora onikobensis ONI-1T

100

Order
Thermogemmatispora carboxidivorans PM5T
Thermogemmatisporales

FamilyFamilyThermosporotrichaceae Thermogemmatisporace
ae

Thermosporothrix hazakensis COM3

図２. D. aurantiacusの推定生活環

表1. クテドノバクテリア綱の培養生理・化学分類学的特徴

出芽胞子クラスタータイプ
Ktedonobacter SOSP1-52

New family strain 150040

Other classes in p_Chloroflexi

p_Firmicutes
90

p_Cyanobacteria
o_Myxobacteria

0.050

p_Actinobacteria

図１. パンゲノム解析によるクテドノバクテリア（綱）の系統樹.
The NJ tree was built on the basis of 13 core genes (7321aligned positions of amino acid sequences) extracted fromthose genomes using the USEARCH algorithm (50%sequence identity).

Pre-sporeby budding

Division of pre-spore cells?

Ktedonobacter sp. SOSP1-85

PhylumChloroflexi

Spore germinationand substrate
mycelium growthSporedispersal?

Dictyobacteraceae
fam. nov.

100Class
Ktedonobacteria

Free spores(Non-motile)

胞子嚢形成タイプ

Dictyobacter aurantiacus S27T

100Tg. onikobensis ONI-1

Ts. hazakensis SK20-1

Order

Ktedonobacterales

Thermogemmatisporales

FamilyDictyobacteraceae

Ktedonobacteraceae Thermosporotrichaceae Thermogemmatisporaceae

Spore formation

Sporangiospore

Budding

Oxygen demand
Gram stain
G+C (mol%)
Optimal temp. (°C)
Optimal pH
Nutrition metabolism
Cellulose hydrolysis
Major menaquinone
Cell wall amino acids
Cell wall sugars

Aerobic
Positive50
25~3050
6.0-7.0
Heterotrophic

VariableMK-9(H2) or MK9
VariableComplex mixMajor cellular fatty acid6055~65

Cellulolytic
MK-9(H2)
SerGlu, Gly, Ala, β-Ala, OrnXyl
Man

C16:0, C16:1-2OH, iso-C17:0, iso-C17:0

Man, Ara, Xyl
iso-C17:0, iso-C19:0, 12,17dimethyl C18:0

天狗の麦飯から16株、蔵王山荒廃土壌から1株、鬼首温泉地熱地帯から2株の分離に成功し、１新科、１新属、6新種を樹立し、2新科、3新属、6新種を提唱予定である。多くは出芽胞子クラスタータイプであるがD. aurantiacusは胞子嚢を形成する。胞子嚢を持つ細菌系統は放線菌、粘液細菌に次いで３例目、70年ぶりの発見となる。本綱の共通して細胞壁ペプチドグリカンにβ-アラニンを有するなどユニークな化学分類学的特徴を持つ。

今後の展望

二次代謝生合成のポテンシャル

クテドノバクテリアは未だ系統分類学的知見の乏しい系統である。引き続き、本系統の拡充して分類学的特徴を包括的に明らかとしたい。また本系統の分布と生態及び分化プロセス全貌（細胞内微細構造や胞子や隔壁の形成、染色体の分配プロセス）などは全く分かっておらず今後の研究課題である。本系統は原核生物における新しい生命現象を切り拓く可能性を秘めた原石であり、近い将来、基礎・応用両面で人類にとって有益な遺伝資源と成り得る。

謝辞
本研究は公益財団法人発酵研究所の一般研究助成の支援のもと行われました。心から感謝申し上げます。

図２. クテドノバクテリア23株のゲノム中の二次代謝生合成遺伝子クラスター

図３. クテドノバクテリア由来二次代謝生合成遺伝子クラスターのMIBiGデータベースに基づく既知遺伝子との相同性

本系統のゲノム中には二次代謝物生合成遺伝子群が最大で22個と放線菌に匹敵するほど多く、それらのほとんどは既知のものとの相同性が極めて低く新規であることが示唆された。