ホワイトペーパー

現在の「十分な」サンプル前処理で本当に十分か?
脂質と次善のマトリックス除去の隠れた危険性

はじめにラボでは長年、ワークフローの管理性と効率の向上に向けた改善が進 められてきました。生体サンプルの前処理にはタンパク質沈殿 (PPT) が、食品サンプルの前処理には QuEChERS がよく用いられます。

これらは、簡単な方法で複雑なサンプルを前処理できるという好例です。分析者に現在のワークフローについて尋ねてみると、おそらく十分に作業をこなせると答えるでしょう。しかし、そのようなサンプル前処理で本当に十分なのでしょうか。

ラボのワークフローは多くの課題に直面しており、効率やスループットの指標の改善を常に求められています。一般的なワークフローは、サンプル収集、サンプル前処理、機器への導入、分析、データ確認、最終的なデータ報告という構成です。このうちサンプル前処理は、常にボトルネックとなり速度低下につながる手順と見なされてきました。最新の高度な機器では、複雑なサンプル試験において必要な感度、選択性、信頼性、実現可能性を考慮しながら、さまざまなサンプルを分析できるようになっています。そのため、サンプル前処理手順を最小限に減らして、時間短縮、コスト削減、複雑さの解消、汎用性の向上を実現し、これで十分と言えるまでに省力化が進みました。

最も重要なワークフローは、ラボによって異なります。次善のサンプル前処理には、時間の浪費、機器のメンテナンス/故障の問題、不正確なデータなど、複数の危険性が潜んでおり、これらの問題が発生すると全体の成功に影響する可能性があります。このような隠 れた危険性は、適切なサンプル前処理ワークフロー戦略によって、大幅に低減できます。この改善を実現するために、科学者の再教育や、大規模な投資、標準操作手順書 (SOP) の書き直しは必要ありません。

このホワイトペーパーでは、日常的に直面する既知のサンプル干渉の概要と、サンプル前処場合があります (図 1)。LC、LC/MS、LC/MS/

MS 分析では、マトリックス微粒子と塩によっ質量分析は感度と選択性が高いため、幅広いアプリケーションでよく使用される分析手法です。ただし、マトリックス成分 によるイオン抑理ワークフローでマトリックス除去を最適化して、バルブ、オンラインフィルタ、LC カラムが障害について説明します。また、既知および未出物によって MS ソースのイオン抑制が大きくを向上させ、技術者の効率を高め、分析機器る可能性 があります。多くの 分析科学者 はサフュージョンは、マトリックスによるイオン抑制て、前述のような既知の危険性を回避します。の実験 の一般的 な設定方法です (アプリケー

ない場合に発生しうる、認知度の低い隠 れた知の結果について説明するとともに、生産性損傷する可能性 があります。マトリックス共溶なり (図 2)、メソッドの信頼性が大幅に低下すの汚染リスクを軽減するための新しいソリュー

ンプルをフローシステムに注入する前にろ過しに変更することなく、またスループットの低下

またろ過によって微粒子のマトリックス効果をションも紹介します。これにより、SOP を大幅やワークフローの複雑化を招くことなく、回収率と再現性 の向上 が可能 になります。それでこそ、本当の意味で十分 なサンプル前処理と言えるでしょう。

サンプルクリーンアップが必要な理由

サンプル前処理が必要な理由は、主に 2 つあ最小化することもできますが、溶解した不要な制やイオン増感が、(高い相対標準偏差 (RSD)が示すように) 真度、精度、堅牢性に悪影響を与える可能性 があります。ポストカラムインやイオン増感 を同定する手法です。図 3 はこションノート 5991-8007JAJP3 を参照してください)。

マトリックスについてはどうでしょうか。また、

この比較実験によって、「十分な」サンプル前

図 2 は、溶解した不要なマトリックス共溶出物ことがわかる場合もあります。アジレントのサ除去しないと、分析ハードウェアに悪影響を与分 な」サンプル前処理の効率と信頼性をさらろ過だけの場合はどうなるでしょうか。

(溶解した塩、色素、タンパク質、脂質など) をえる可能性があることを示しています。

処理の効率が、必要なレベルに達していない

ンプル前処理ソリューションなら、現在の「十に高めることができます。

ります。

••

不要なマトリックスの除去
分析対象物の濃縮

このホワイトペーパーでは、マトリックス除去作業を可能な限り効率的に実行しない場合に発生し得る明白な問題と、潜在的な問題について説明します。

不要なマトリックス成分を処理しない場合、または 十分 に 除去しない 場合、流路 の 汚染 につな がる 可 能 性 があります。GC、GC/MS、GC/MS/MS 分析では、非揮発性マトリックス共溶出物によって、注入口、ゴールドシール、カラムなどの GC フロー部品に悪影響が出る

図 2.「十分な」サンプル前処理ルーチンでの塩の残留による LC/MS イオン源の塩の蓄積

LC カラム図 1.「十分な」サンプル前処理ルーチンによる
GC システムの部品の汚染

マトリックスブランクの注入

MS 検出

シリンジポンプシリンジポンプによる純粋な標準溶液の連続注入

図 3. マトリックスイオン抑制の評価および比較研究における標準ポストカラムインフュージョンの設定図

2

脂質による重大な影響

中の余分 なタンパク質の除去には効果的です

メソッドの適用性

最 も重大であるにもかかわらず見過ごされが脂質を除去することはできません (アプリケー

ションノート 5991-8007JAJP3 を参照してく•

データ品質が低いと、ラボ全体の生産性が大•LC/MS/MS 分析または GC/MS/MS 分析で•すべてのサンプルマトリックス共溶出 のうち、ちな成分 は、脂質かもしれません。脂質 は 効率的に除去にくく、蓄積しても目視で判別しにくいためです。(図 3 のような) ポストカラムイ
ンフュージョンの実験では、MS 信号での例えば血清や血漿によるマトリックス効果を、マトリックスブランクの 連続的 なインフュージョンによって評価できます。信号強度が変化する場

合 は、イオン抑制またはイオン増大の原因となるマトリックスからの物質が存在する可能性があります。

この例 (図 4 のゾーン 2 および 3) は、脂質がデータ品質 に多大 な影響 を与えることを示しています。タンパク質沈殿 は 生体マトリックス×104が、重大 なイオン抑制 の 原因 となりうるリン•

メソッドの開発と最適化の長期化

メソッドのトラブルシューティングの増加
マトリックスによる検出結果のばらつき

ださい)。

•幅に低下します。

質量分析計の清浄度

マトリックス除去が不十分であると、生産性に次のような影響を与える可能性があります。

メソッドの信頼性とデータ品質•

メソッドの感度と選択性 が許容範囲外と•検量線の直線性が許容範囲外となる••

なる

サンプル再分析の増加

MS イオン源のクリーニング頻度の増加•キャピラリのクリーニングまたは 交換頻•

真空レベルを確立または維持できない•

度の増加

トラブルシューティングの増加

メソッドの真度と精度の低下

ピークの識別と積分が困難になる

ゾーン 3

PPT + EMR-Lipid クリーンアップによって調製された血清ブランクを注入するポストカラムインフュージョンのプロファイル
PPT のみによって調製された血清ブランクを注入するポストカラムインフュージョンのプロファイル

PPT + 他社の製品クリーンアップによって調製された血清ブランクを注入するポストカラムインフュージョンのプロファイル

6
ゾーン 2543
ゾーン 12101234567

図 4. 標準ポストカラムインフュージョンのプロファイルの比較とターゲット化合物に対するマトリックスイオン抑制の実証

3

「十分な」サンプル前処理だけでは有効な解決方法にならない理由

カラムへの脂質の蓄積
••••
•
•

LC および GC カラム試験寿命の短縮

GC 注入口のメンテナンス頻度の増加

GC カラムのクリッピング頻度の増加

データ品質を高 め、生産性を大幅に向上させ

LC カラムの背圧上昇

るには、脂質 と一般的 なマトリックスを除去システムの洗浄や平衡化の頻度の増加するための有効かつシンプルな手法 が必要で分析時間の長期化す。これが Captiva EMR-Lipid を開発した理由です。この 製品では、簡単 なワークフロー

脂質除去のワークフローは 存在しますが、現でサンプルを効率的 にクリーニングできます。

行のサンプルクリーンアップメソッドでは 一部

Captiva EMR-Lipid によるアプローチはシンのターゲット化合物 が 脂質とともに除去されプルで汎用性が高く、脂質 ベースのマトリックてしまい、分析対象物の回収率 が低下するこス効果を低減でき、分析対象物の回収率も良とがあります。多くの分析者 は、メンテナンス食品マトリックスや生体マトリックスなどの、分析困難で複雑 なサンプルを分析する場合 は、ターゲット化合物 に最適 なサンプル 前処理法を決定する必要 があります。多くの 手法 は 困難で手間と時間がかかり、化合物回収率やマトリックス干渉 などの問題 も残っています。サンプル前処理 は 一般的に、簡単 なプロトコルと少 ない手順で実行できることが 求 められます。サンプルクリーンアップによって効率的 にマトリックス干渉を除去し、さまざまな成分の回収率への影響を最小限に抑える必要があります。

好です。

回数や消耗品の交換頻度 を増やしたり、より包括的 なサンプル前処理方法を実践したりすることで、このような状況 に対応しています。

後者の方法を使用するとデータ品質 は 上 がりますが、コスト、時間、専門性が大幅に上がるため、生産性が下がります。

ろ過主体の PPT + Agilent Captiva EMR-Lipid クリーンアップ (96 ウェルプレート) との比較
表 1. 遠心分離主体のプレート上の従来型 PPT (96 ウェルプレート) と、従来の PPT (96 ウェルプレート)

ステップ

30

内部標準添加5

変性溶媒の添加

5

遠心分離

10

サンプルの混合
サンプルの混合

コレクションプレートラベリング
上澄み移送、必要なサンプル前処理合計時間

機器の分析時間および溶媒の使用マトリックス除去

4

所要時間 (分)プレートラベリングおよびサンプル分注

サンプルの後処理

PPT + Captiva EMR-Lipid クリーンアップ (96 ウェルプレート)(遠心分離)

必要な消耗品96 チップ (サイズ小)1 コレクションプレート
1 リピーターチップ
プレートカバー2

1 リピーターチップ
プレートカバー

5

96 チップ (サイズ中)30
条件により異なる

1 コレクションプレート
1 プレートマット

87 分間の後処理
100 %タンパク質のみ(ろ過)ステップ

所要時間(分)プレートラベリングおよびサンプル分注

30

1 コレクションプレート

内部標準添加5

1 リピーターチップ

サンプルの混合

変性溶媒の添加サンプルの混合ろ過

サンプルの後処理必要なサンプル前処理合計時間

機器の分析時間および溶媒の使用マトリックス除去

必要な消耗品96 チップ (サイズ小)1 EMR-Lipid プレート
プレートカバー2

1 リピーターチップ

5510
条件により異なる

プレートカバーは撹拌による混合にのみ必要

1 プレートマット

57 分間の後処理 (およそ 30 % の時間節約)<90 % (時間および溶媒使用の 10 % 以上の節約)
タンパク質および脂質

大量 のマトリックス成分 が 存在する中で分析ンアップ (最適な処理) を実行した後の、アボう。図 5 は後処理なし (未処理)、C18 クリーを比較したものです。

対象化合物 を同定する場合 を考えてみましょンアップ (不十分 な処理)、EMR-Lipid クリー

カド抽出物の GC フルスキャンクロマトグラム

×106
1.7

アボカド抽出物

C18/PSAEMR—Lipid

1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1

カウント

1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
取り込み時間 (分)図 5. QuEChERS アボカド抽出液 (黒) を従来の C18/PSA 分散 SPE (赤) と Agilent EMR–Lipid で処理した抽出液 (青) を比較した
GC/MS フルスキャンクロマトグラムの重ね表示

5大きくなり、検出感度やメソッド再現性が下がる可能性 があります。生体マトリックスに含まれるリン脂質は、マトリックス効果が大幅に上がる原因となるため、よく分析の妨げとなります。図 6 は、ビタミン D 代謝物の分析において、Captiva EMR-Lipid でクリーンアップしたサンプルの方が、PPT のみで処理したサンプルよりも、分析対象物のレスポンスと RSD が優れていることを示しています。

×104
2.6
2.5
2.4
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.20.10A25-OH D3

Captiva EMR—Lipid

25-OH D2*

RSD <3 %カウント

脂質によってマトリックスイオン抑制 が非常に

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

取り込み時間 (分)

3.2

3.3

3.4

3.2

3.3

3.4

B

タンパク質沈殿のみ
RSD >25 %

カウント

×104
2.6
2.5
2.4
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
025-OH D3
25-OH D2

*

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

取り込み時間 (分)3.1

図 6. PPT のみと、EMR-Lipid と PPT を組み合わせて処理した場合の、分析対象物のレスポンスおよびRSD 値の比較

6

脂質の効率的な除去がもたらす分析速度の向上

マトグラフィーでこれらの疎水性化合物が溶出

Captiva EMR-Lipid を用いることで、分析メ成果をあげられることを意味します。

サンプルがクリーンになると、分析時間を短縮でき、システムの洗浄頻度も減らすことができ能になります。図 7 のグラフは、サンプル導入

分析できるサンプル数も増加します。つまりラ

く、分析時間の短縮やラボの生産性向上も可ます。また、所定の点検サービス回数の間 に前にリン脂質を十分除去したため、逆相クロ

6.2

プルスループットが向上し、より大きな経済的短縮できたことを示しています。

ソッドの信頼性とデータ品質 の 向上 だけでな×105められるということです。これは、ラボのサンするのを待つ必要 がなく、機器の使用時間をボの現在の能力で、サンプルスループットを高A

PPT + EMR—Lipid cleanup whole blood matrix blank

カウント

6.1
6.0

5.9

カウント×106B4.5
PPT whole blood matrix blank
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.5

1.01.52.02.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

取り込み時間 (分)

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

11.0

11.5

12.0

マトリックスブランクのリン脂質プロファイルの比較
図 7. サイクル時間の短縮の実現可能性を示す、

結論

サンプル 前処理ワークフローにおいて、十分クフロー 時間 を延 ばしたりする必要 はありま

サンプルクリーンアップが重要なのは、複雑なする利点 は、ラボにおける機器の稼働時間を成分のピークがわかりにくくなり、正確に定量分析の妨げとなる多くのマトリックス成分が含潜在的なクロマトグラフィー分析時間を短縮しサンプルに脂質、タンパク質、塩、色素など、まれているためです。脂質は、いくつかの理由

から最 も問題 のあるマトリックス成分 の 1 つです。

なワークフローより優れたワークフローを使用せん。サンプル 前処理 を実行しないと、対象延 ばし、分析者のベンチワーク時間を短縮し、できなくなる可能性があります。実際に、ピーて、日常的に分析できるサンプルを増やせるこような影響によって、データ処理時間が延び、ならない場合の最大の要因は、マトリックスにプルやバッチの数が増える可能性があります。とです。メンテナンスを頻繁に実施しなければよる汚染です。マトリックスの除去量 が増えれクがまったくわからない場合 もあります。この

データ品質の不良により再分析 が必要 なサンば、メンテナンス作業の間隔を延 ばすことができます。このために SOP を変更したり、ワー

7Agilent Captiva EMR-Lipid の詳細

推奨アプリケーションノート

php?id=1004776

1.

www.chem-agilent.com/contents.

Agilent Captiva EMR-Lipid クリーン

動物用医薬品分析については、Journalof Chromatography A の学術論文も参照してください。

全血中の依存性薬物の定量、アジレント・

veterinary drugs in meat using enhanced

アップを用いた LC/MS/MS によるヒトテクノロジー、アプリケーションノート、

publication number 5991-9251JAJP.

2.

Captiva EMR-Lipid 96 ウェルプレートを用いた生体サンプルのタンパク処理、

アジレント・テクノロジー、アプリケーショ

ンノート、publication number 5991-9222JAJP.

3.

Agilent Captiva EMR-Lipid クリーンアップを用いたヒト血清中薬物の LC/

MS/MS 定量分析、アジレント・テ

クノロジー、アプリケーションノート、

Agilent Captiva EMR-Lipid クリーンアップ

publication number 5991-8007JAJP.

4.

Agilent Captiva EMR-Lipid を用いた

生体サンプル中のビタミン D 代謝物の分析、アジレント・テクノロジー、アプリ

ケーションノート、publication number5991-7956JAJP.

5.

牛肉中の残留動物用医薬品の多成分同時分析、アジレント・テクノロジー、

アプリケーションノート、publication

number 5991-8598JAJP.

ホームページ

www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2018
Printed in Japan, August 6, 20185994-0110JAJP

Multiclass multiresidue analysis of
matrix removal lipid cleanup andliquid chromatography-tandem mass
spectrometry, Journal of Chromatography
A, Volume 1549, 14-24.