ISSN 0073 － 8751

NUMBER

34

INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKARESEARCH
COMMUNICATIONS

2020
公益財団法人

発

酵

研

究

所

RESEARCH COMMUNICATIONS

No.

34

2 0 2 0I N S T I T U T E F O R F E R M E N TAT I O N , O S A K A ( I F O )Published by
INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA
17 — 85, JUSO — HONMACHI 2 — CHOMEYODOGAWA — KU, OSAKA 532 — 8686, JAPAN公益財団法人発酵研究所

理 事 長

中濱

一雄

常務理事

樽井

直樹

理

事

熊谷
清水
冨田
原島

英彦
昌
房男
俊

左子
鈴木
永井
古川

芳彦
健一朗
和夫
謙介

監

事

下元

高文

藤井

智幸

大島 敏久
笹川 千尋
関 達治
谷 吉樹
藤田 正憲

北本
下田
武田
土屋
吉田

勝ひこ
親
直久
英子
敏臣

評 議 員

目

次
房男

1

絶滅危惧樹木の保全に不可欠な菌根菌の系統分類と菌株コレクションの構築…………………………………………………………… 奈良

一秀

3

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した
新規高密度培養技術の開発………………………………………………………… 阿部敬悦

17

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わる
シグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明……………………………………… 小林哲夫

41

バイオ合成による環境適合型半導体製造技術基盤の構築:
細菌による多様なカルコゲン代謝機構の解明と合理的活用法の検討………… 池

道彦

57

琢自

67

巻頭言………………………………………………………………………………… 冨田■ 2018年度大型研究助成■ 2014年度寄付講座助成
微生物二次代謝産物の物理化学的性質に着目した
physicochemical screening による新規物質の発掘とその実用化研究 ……… 中島
質量分析による新規物質の探索……………………………… 松尾

洋孝，中島

琢自

75

質量分析および主成分分析を利用した探索系による含窒素物質の探索……………………………… 松尾

洋孝，中島

琢自

93

モリブデン酸化および質量分析を組み合わせた
含硫黄物質探索系の構築と新規含硫黄物質の取得………… 松尾

洋孝，中島

琢自

101

エルゴステロール修飾シリカ（ ES シリカ)を用いた
新規物質の探索………………………………………………… 松尾

洋孝，中島

琢自

111

PC screening を活用した放線菌ゲノムからの新規物質探索および生合成研究……………………………… 稲橋

佑起，中島

琢自

121

■ 2018年度 一般研究助成
緑藻クロレラの細胞内共生による繊毛虫の進化と多様性のメカニズムの解明………………………………………………………… 児玉

有紀

129

かつお節かび付け工程で働く好乾性糸状菌の分類と菌叢解析に関する研究……………………………………………………………… 竹中

慎治

129

日本産海岸生地衣類の種多様性解明と同定ツールの開発および分類………… 原田浩

130

熱帯アジアで猛威を振るうぶどうサビ病菌の生態学的・分類学的研究……… 小野

義隆

131

木材腐朽菌の進化仮説を実験室内で実証する…………………………………… 中沢

威人

132

難分解性物質を利用する昆虫における共生酵母とその機能…………………… 土岐和多瑠

132

放線菌門に属さない放線菌様系統「クテドノバクテリア」の選択的培養法の確立と分離及び創薬微生物資源としての有効性の検証……… 矢部

修平

133

シロアリ腸内原生生物に細胞共生する Desulfovibrio 属細菌の共生進化 ……… 桑原

宏和

134

市民科学者とアカデミアの協働体制の構築と博物館が所蔵する学術的レガシーの活用による未記載・未解明大型担子菌類探求の推進……… 佐久間大輔

135

アーキア界に広がるメチル化合物利用性メタン生成アーキアの分離とその進化・生態……………………………………………………………………… 春田

伸

135

酵母の接合型遺伝子のグローバルな機能とホモタリズムとの相互作用……… 前川

裕美

136

アーキア膜脂質によるバクテリア膜脂質の置換に基づく大腸菌の細胞膜エンジニアリング…………………………………………………………… 邊見久137

空気と電気から含窒素有機化合物を製造する革新的発酵プロセスの創出に向けた基盤研究……………………………………………………………… 高妻

篤史

138

微生物が備える可逆的ゲノム改編による環境適応メカニズムの解明………… 田中

誠司

138

変動環境下における葉面細菌のストレス対処と増殖に関する研究…………… 井口

博之

139

人工ゲノム再編系による酵母発酵性能の改良…………………………………… 太田

邦史

140

グリシン誘導性 small RNA GcvB によるサルモネラ増殖抑制機構の解析 …… 宮腰

昌利

141

ゲノムマイニングおよび培養試験から存在が見いだされた
新規な亜硝酸還元酵素の正体と機能をつきとめる……………………………… 押木守

141tRNA 依存型ペプチド合成酵素の tRNA 基質認識機構の解明と新規ペプチド系抗生物質の創製…………………………………………………… 丸山千登勢

142

分裂酵母における細胞壁ホメオスタシスの化学遺伝学的解析………………… 西村

143

慎一

自然界からは未発見の有用アミノ酸脱水素酵素の酵素工学的創製…………… 櫻庭

春彦

143

大腸からの粘液分泌を活性化する菌株の同定とその作用機序の解明～腸内フローラの変動から推察される微生物叢への着目～…………………… 東村

泰希

144

ミコール酸含有細菌の接触刺激による放線菌二次代謝応答機構の変異ゲノム解析を用いた解明……………………………………………………… 浅水

俊平

145

脂質代謝異常に対する新たな防御応答機構の解明と有用スフィンゴ脂質生産の基盤構築への応用…………………………………… 谷

元洋

146

光による大腸菌組換えタンパク質大量発現系の開発…………………………… 華岡

光正

146

酸素耐性ビフィズス菌が有する抗酸化機構の解明……………………………… 山本

裕司

147

海洋性紅色光合成細菌によるバイオポリエステル生産システムの開発……… 樋口美栄子

148

鉄腐食性メタン生成菌固定化電極を用いた
省エネルギー型二酸化炭素変換技術の開発……………………………………… 若井暁

149

リグノセルロース系バイオマスからの有用芳香族化合物生産に向けた
環境汚染物質分解細菌の利用……………………………………………………… 渡邊

崇人

149

埋立地浸出水処理槽において低濃度・低負荷条件で
1,4-ジオキサン分解を担う微生物群集機能の解明 ……………………………… 宮田

直幸

150

カニ殻堆肥由来の放線菌 Cellulosimicrobium sp. NTK2 の遺伝資源と特性を利用した次世代バイオマス“キチン”からの有用物質生産…………… 有馬

二朗

151

光駆動 ATP 再生ミトコンドリアを用いた光エネルギー利用型酵母の創製とバイオファインケミカル生産への応用…………………………………… 原

清敬

152

1 細胞解析による遺伝子発現ノイズ制御機構の網羅的解明 …………………… 宮崎亮

152

微生物により生成される高蓄電ミネラルの生成機構解明……………………… 二又

裕之

153

芳香族化合物を特異的に吸着する微生物を用いた活性汚泥の機能向上に関する研究………………………………………………… 森

一博

154

軽油相当の炭化水素を大量生産可能なシアノバクテリアの創出……………… 新井

宗仁

155

智

157

■ 2017年度若手研究者助成
結晶性酸化鉄を還元する新規な微生物の分離培養と代謝メカニズムの解明……………………………………………………………… 青柳

巻

巻

頭

言

頭

言
冨

田

房

男＊

昨年（ 2019 年)中国武漢市で発生した新型コロナウイルスのパンデミックのためこれまでに経験のない年になってしまった．様々の専門分野である微生物を取り扱うのを本職とする学会も例年のようには開催できず全く予想外の年である．本財団も 3 月に理事会を開催したが，その後の会はネットでしか開催できなかった．ネットでの開催は，初めてのことであり，なかなかうまくできなかったと反省しきりである．
開催できなかった国際学会もある．私の関係するものではタイ・バンコックでの AFSLAB（アジア乳酸菌学会連合)が中止になったことと韓国・大田市での IUMS（国際微生物会連合)
がネットとを主体とする開催になったことが残念なことである．
さて我々が扱う領域は，微生物で細菌，カビ，酵母が主体であり，古細菌，原核生物，真核生物など全生物をカバーするものである．これにウイルスも入るので生物全体の対象とす
る広大なものと理解している．先に述べた IUMS が，カバーしているのも同じである．
私の研究分野は，原核生物が主体で少しの真核生物分野もあった．またファージも研究したので先の述べた領域にすべて関わりがあると言わせていただくことをお許しいただきたい．私は，幸いにも微生物に対する注目が集まっている時代を過ごしてきた．微生物工業の盛んなときであり，微生物の研究開発おける基礎から応用まですべてに注目が集まっていた．
ノーベル賞受賞の大村智先生のエバーメクチンの発見もこの時代（ 1979 年)にあった．
また，このところ遺伝子組換え作物の故か，遺伝子組換え作物・食品などに対する科学的根拠のない反対がある．遺伝子組換えで微生物の発酵生産の改良やインスリンの生産を酵母で行うなど素晴らしい成果があり，一般に歓迎されていた良い時代を過ごしてきたと感謝している．
これを書いているときに「ゲノム編集」にノーベル化学賞授賞の報道が入ってきた．ゲノ
ム編集は，ご承知のように微生物での研究がきっかけであり，その貢献は極めて大きい．これが植物，動物，ヒトにまで展開されていることは喜ばしいことである．私の考えでは，上に述べた遺伝子組換えに起こったような反対運動が起こらないように願っている．遺伝子組換えよりもより正確に遺伝子改変を行えることに期待している．
さて，わが国の昨今の微生物分野の活動を見るにそれほどの活況を呈していないように見える．例えばアミノ酸の発酵生産は，国内ではほとんど行われておらず，原体を持込み，精製と製品化しか行われていない．また抗生物質を含む生理活性物質の探索研究もあまり目に冨田房男
北海道大学名誉教授・公益財団法人発酵研究所（IFO )理事

＊

－1－

冨

田

房

男

しない．ただし，新聞情報では，微生物を使った発電，コンクリートの劣化修復，地盤固めや夢に近いが津波の高さを抑えるなどユニークな報告がある．
また，チャレンジ精神のあらわれの一つとして最近の報告(Nature Plants Sep.14, 2020)を注目したい．
ここでは，ルビスコ（炭素固定化の第一段階を触媒する酵素)遺伝子を大腸菌に導入して，光合成効率を向上させるための戦略的作物の収量向上の聖域である光合成のスピードアップを研究するための最適な実験環境を構築したことが報告されている．
私の望んでいるところは，当財団理事長のお考え，『国がやらない，やれないような特色ある研究助成にしたいと思っております．例えば，微生物の研究にとって重要であるが，地味で目立たず，あまり評価されないために科研費などの競争的資金を獲得しにくい「微生物の分類に関する研究」および真理の探究を目指した「微生物の基礎研究」に重点的に助成金を支給しております．研究助成の対象としては，独創的，チャレンジングで夢のある研究の応募を歓迎します．』と同じである．
我々が手にしている微生物は，想定されている存在種の 0.01 % 以下とも言われており，圧倒的にわからないものが多いということを再認識したいものである．微生物との共生，腸内菌叢，極限微生物などなど
興味津々のところが多い．
私は，微生物の研究には，チャレンジ精神プラス根気が科学的発想豊かさと同等に手法の研究・開発が大事だと思っている．生理活性物質の探索には特にこれらのことが大事と思っている．斬新な手法で新規微生物発見と活用にチャレンジしてほしいと願っています．わが国は天然資源に恵まれていないが微生物
資源，そしてこの分野の人材に恵まれていると信じている．また，我が国の今ある微生物資源も相当なもので，この活用も肝要である．微生物資源の保存は，我が国の国家事業である．これらに立脚した「科学・技術立国」こそ我が国の特色と考えている．
皆様のチャレンジを期待するものです．どうか研究課題「微生物の分類に関する研究」と「微生物の基礎研究」への応募を多く寄せていただきたいものです．

－2－

2018 年度大型研究助成の研究報告
助成期間:2018 年 4 月～ 2020 年 3 月

IFO Res.Commun. 34
3-15, 2020

絶滅危惧樹木の保全に不可欠な菌根菌の系統分類と菌株コレクションの構築
奈

良

一

秀

東京大学大学院新領域創成科学研究科〒277-8563

柏市柏の葉5-1-5

Inferring phylogeny and isolating culture strains of the key ectomycorrhizal fungito the conservation of endangered host trees
Kazuhide Nara
Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo
5-1-5 Kashiwanoha, Kashiwa city, Chiba 277-8563
Many tree species depend on ectomycorrhizal (ECM) fungi, root colonizing symbiotic microbes, for soil nutrientsand thus for growth and survival, although ECM associations of endangered tree species remained unknown. In
previous studies, we discovered new ECM fungal species, Rhizopogon togasawarius and Rhizopogon yakushimensis
that specifically colonize endangered trees Pseudotsuga japonica and Pinus amamiana, respectively. Both fungi are
the most dominant species in soil spore banks within the remaining forest patches and would play key roles inseedling establishment and forest regeneration after disturbance. To assess the conser vation values of theseimpor tant and potentially endangered ECM fungi, we need to know more about their evolutionar y andbiogeographic backgrounds, but it is often challenging to estimate divergent time of fungi due to the scarcity offungal fossils necessary for time calibration. In place of the fungal fossils, here we applied the robust divergent
time of the host Pseudotsuga lineages to fungal phylogeny. Phylogenetic trees of R. togasawarius with closely
related species found two monophyletic groups, representing Asian and North American species groups, as
exactly the same as the host phylogeny. Given the divergence between the two groups happened 32 million years
ago as evidenced in the host lineages, the nucleotide substitution rate of fungal ITS regions was estimated to be
0.52±0.11(substitutions per site per 10 9 years), which was very close to the rate of the host, i.e. 0.56±0.07. This
correspondence indicates that the hosts and ECM fungi should have similar generation time, and indeed both are
pioneer species that regenerate after disturbance. Using the derived substitution rates, we estimated that
R. togasawarius diverged from Chinese and Taiwanese relatives around 17.5 and 14.5 millions years ago,
respectively. When the same substitution rate was applied to the phylogeny of R. yakushimensis and their relatives,
R. yakushimensis was estimated to have diverged from their relatives in Southern China or Japan around 16.2
millions years ago. The estimated divergence of R. togasawarius and R. yakushimensis coincided with the initialformation of Japan archipelago, indicating that they originated from allopatric speciation associated with thegeological event. These findings may have profound implications to ECM fungal evolution, providing time scales
for ITS phylogeny and clear evidence of biogeographic effects on fungal evolution.
Given both R. togasawarius and R. yakushimensis have the same distribution ranges as their specific hots, it ishighly likely that these fungal species deserve endangered status. So far, very few fungal species are included in
IUCN Redlist due to the dif ficulty in the assessment. Here, we successfully isolated 21 and 11 strains of
R. togasawarius and R. yakushimensis from soil spore banks collected from the entire distribution ranges. Four
representative strains were deposited to NBRC culture collections for in vitro conservation of the fungi and futureapplication to the endangered hosts. While microbial culture collections have not yet been utilized for ECM fungal
conservation, they may play important roles in future. We also tried to maintain fungal strains in association withhost seedlings in a greenhouse. ECM seedlings colonized by R. yakushimensis were successfully maintained for
two years without any airborne contamination, showing far better growth compared to nonmycorrhizal seedlings.
While long-term sub-culturing of ECM strains often results in the loss of mycorrhiza formation abilities, we can
avoid the trouble by maintaining the strains under the ECM symbiosis.
Key words: ectomycorrhizal fungi, endangered tree species, soil spore bank, molecular clock, evolutionary rates
E-mail: nara@k.u-tokyo.ac.jp
共同研究者:村田政穂（東京大学大学院新領域創成科学研究科)
阿部寛史（東京大学大学院新領域創成科学研究科)

杉山賢子（東京大学大学院新領域創成科学研究科)
大嶋健資（東京大学大学院新領域創成科学研究科)

－3－

奈

緒

良

言

一

秀

の森林破壊・人工林化によって生息域が縮小・断片化し，絶滅の危機に瀕している種が存在する．本研究で対象と外生菌根菌（以下，菌根菌)はマツ科やブナ科などのするトガサワラ（ Pseudotsuga japonica )は高知県の東樹木細根に共生する真菌類であり，担子菌と子嚢菌の多部と紀伊半島の一部にのみ生息する日本の固有種であ様な系統群が含まれる（ Smith & Read, 2008 )．菌根菌

り，絶滅危惧種に指定されている（ IUCN, 2020 )．残存は樹木の光合成産物を受け取ることで生きており，土壌する林分はいずれも規模が小さく，スギやヒノキの人工中に菌糸を広げて子実体を発生させるためにも樹木との林の中にパッチ状に残存する形で存在する．化石や分子共生は不可欠である（ Lamhamedi et al., 1994; Wu et al.,

時計による証拠によって，トガサワラの祖先は約 3200

2001 )．一方，菌根菌は土壌中の菌糸で効率的に吸収し万年前に北米からベーリング陸橋経由でアジアに渡り，た窒素やリンなどの養分を植物に供給している（Hobbie

その後中国のシナトガサワラ（ Pseudotsuga sinensis )と& Högberg, 2012; Köhler et al., 2018 )．事実上，宿主樹約 2000 万年前に分化したと推定されている（ Wei et al.,

木の成長に必要な養分のほとんどは菌根菌から供給され2010 )．

ているため，宿主樹木が成長・生存するためには菌根菌

トガサワラと同属のベイマツ（ Pseudotsuga menziesii )と の 共 生 が 必 須 で あ る（ Smith & Read., 2008; 奈 良，は北米西部に広大な分布域を持つ同地域の森林生態系を2014 )．以上のように，樹木と菌根菌の共生は相利的な代表する樹種である．林業上も中心となる樹種であるこ関係であり，その上に森林生態系が成り立っているととから，多くの研究蓄積がある．菌根菌については，ベ言っても過言ではない．

イマツにしか共生しないショウロ属（トガサワラ属に特

自然界での菌根菌の感染経路として，土壌中の菌糸

異的な Villosuli 亜属)が存在し（ Grubisha et al., 2002 )，ネットワークと胞子（菌核等を含む)の 2 つが存在する．

埋土胞子で優占すること，山火事などの撹乱後にベイマ

既に成立した森林では，樹木の菌根とそこから伸びる菌

ツの更新を助ける重要な機能を持つことが明らかにされ糸ネットワークが土壌中に普遍的に存在し，発生する子ている（ Barker et al., 2013 )．そこで日本のトガサワラで実体から胞子も供給されるため，宿主樹木のほぼ全てのも菌根を調べたところ，トガサワラに特異的な菌根菌が細根が菌根化している．大規模な撹乱によって宿主樹木

存在し，埋土胞子として最も優占することが示され，撹乱が死滅してしまうと，土壌中の菌糸ネットワークは消失

後の実生定着に中心的な役割を持っていると推測された

し，胞子の供給も激減するため，宿主樹木の定着は著し（ Murata et al., 2017a )．この菌種は Mujic et al.(2014)にく阻害される（ Nara & Hogetsu, 2004; Nara, 2006 )．しかよって Rhizopogon togasawariana（のちに R. togasawarius

し，土壌中に蓄積された休眠状態の胞子（埋土胞子)がと訂正，和名はトガサワラショウロ)として記載され，主要な感染源として機能する場合があり，親和性のある
宿主樹木の定着が優先的に促進される（ Baar et al., 1999;

Villosuli 亜属に含まれることが示された．Villosuli 亜属がトガサワラ属樹木にのみ共生すること，宿主のトガサ

Izzo et al., 2006)．このような埋土胞子を形成する菌種は，

ワラ属は北米とアジアで 3200 万年前に分岐しているこ

成木に共生している菌根菌群集とは大きく異なり，より少と，ショウロ属は地中に子実体を形成し，動物に胞子散ない種で構成されるのが一般的である（ Taylor & Bruns,

布を依存しているため長距離散布ができないことを考え

1999; Miyamoto & Nara 2016; Murata et al., 2017a )．

ると，トガサワラショウロも宿主と同じ時期に種分化しマツ科のマツ属（Pinus )やトガサワラ属（Pseudotsuga )たものと考えられる．

は光要求性の高い陽樹であり，撹乱後にいち早く定着す

トガサワラとトガサワラショウロの共進化系は，菌根る先駆種的な性質を持っている．このような樹木は，埋土菌の系統進化において重要な知見を提供してくれる可能

胞子として優占することが多いショウロ属（Rhizopogon)性がある．植物や脊椎動物に比べて菌類の化石標本は極やアミタケ属（ Suillus )に親和性があるため，他の樹

めて少なく，分子系統樹の分岐年代推定の補正が困難で木より優先的に撹乱地に侵入することができる（ Baar

ある（ Barbee & Taylor, 2010 )．全く異なる系統群の化

et al., 1999; Izzo et al., 2006; Peay et al., 2009 )．特にショ
ウロ属（ Rhizopogon )の埋土胞子の寿命は長く，少な石を利用せざるを得ないため，菌類の分岐年代推定にはくとも数十年は土壌中で感染性を維持すると考えられおともある（ Lücking et al., 2009 )．一方，植物寄生菌のり（ Bruns et al., 2009 )，マツ林だけでなく，遷移の進

分岐年代推定に宿主植物の分岐年代を用いた例がある

んだ多様な森林土壌中に検出される（ Miyamoto & Nara,（ Takamatsu & Matsuda, 2004 )．同様の手法が菌根菌の2016 )．このように，宿主樹木も菌根菌も撹乱環境に適

分岐年代推定に応用された例はないが，化石によって補大きな誤差が含まれ，その推定値が 3 ～ 5 倍も異なるこ

正され信頼性も高いトガサワラの分岐年代を使うことで応することで存続している共生関係と言える．
マツ属やトガサワラ属には，被子植物との競争や近年（ Wei et al., 2010 )，トガサワラショウロと近縁種の分岐－4－

絶滅危惧樹木の保全に不可欠な菌根菌の系統分類と菌株コレクションの構築

年代推定ができるものと考えられる．さらに，生態的にれる．本種についても，異なる集団から菌株を網羅的に密接な関係にある宿主と菌根菌の塩基置換速度の比較に収集し，カルチャーコレクションとして整備することで，よって世代時間などに示唆を与える知見が得られるであ

本菌種の保全だけでなく，絶滅危惧種である宿主の保全

ろう．

にも活用することができると考えられ研究意義は大きい．

トガサワラショウロは宿主樹木と同じ分布域しか持た菌根菌の菌株を維持するために継代培養が一般的に行ないため，宿主樹木と同様に絶滅危惧種に該当する可能われる（ Corbery & LeTacon, 1997 )．しかし，長期間継性が高い．さらにマイクロサテライトマーカーを用いた代培養した菌株は樹木との共生能力が失われることも多集団遺伝解析によって，分断化された集団間の遺伝子流い（ Marx & Daniel, 1976; Thomson et al., 1993 )． 純 水

動は宿主よりも菌根菌の方で制限され，集団の遺伝的分やミネラルオイル，アルギン酸ビーズに培養菌糸を封入化が遥かに進行していることが明らかになった（ Abe et

して低温保存する試みもあるが，有効性が実証された菌al., unpublished )．これは花粉を風によって長距離散布することができるトガサワラにくらべ，胞子散布を小型種は少数であり，これらの手法では死滅してしまう菌種

動物に依存しているトガサワラショウロの方で強い分散存で用いられている凍結乾燥や凍結保存は，菌根菌に適制限が加わっているためである．つまり，隔離集団内の応するのが難しい場合が多いものの，様々な改良が行わ

近交弱勢によって絶滅に至るリスクは宿主よりも菌根菌れており技術が確立されれば有効な菌株維持手法になるの方で高いことを示唆している．これまで，トガサワラと思われる（ Homolka et al., 2006; Crahay et al., 2013 )．

をはじめとする絶滅危惧樹木の保全では，種子の収集やしかし，現段階では菌根菌の菌株維持に凍結乾燥や凍結保存，栽培，域外への植栽など，対象樹木にのみ注意が保存を標準としているカルチャーコレクションはなく，払われてきた．しかし，トガサワラとトガサワラショロ

高額な機器を必要とする点も問題であろう．一般的な研の密接な生態的関係と長い共進化の歴史から考えると，究室レベルでも菌株を長期間にわたって安定的に維持でトガサワラショウロがなければ希少なトガサワラ林を自きる新たな手法が望まれる．

も存在する（ Lalaymia et al., 2014 )．一般的な微生物株保然に維持することはできないであろう．トガサワラショ

絶対共生菌であり培地上での生育が困難なアーバス

ウロを菌株として保管・維持することができれば，絶滅キュラー菌根菌の場合，INVAM 等のカルチャーコレク

の危機にある樹木と菌根菌の保全上，重要な意義があるションでは植物と共生させてポット栽培することで菌株と考えられる．この場合，集団間の遺伝的分化が進んでが維持されている．人工培地上で生育する菌種も多い外いることを考慮すると，できる限り異なる集団から菌株

生菌根菌の場合はこのような手法で菌株が維持されるこを収集することが重要となる．

とはなかったものの，菌株の感染能力を維持したまま自本研究で対象とするもう一つの宿主樹木はヤクタネゴ
ヨウである．ヤクタネゴヨウの系統進化や生物地理につ然な状態で菌株を維持できるメリットは大きいと考えられる．

いての詳細は不明である．現在は，屋久島と種子島の限

そこで本研究では，(1)宿主の分岐年代を適用するこられた地域にしか生息せず，近年はマツ材線虫病の被害とで，トガサワラショウロの分岐年代や進化速度を明らによってさらに個体数が減少傾向にある絶滅危惧種であかにすること，(2)推定された進化速度をヤクタネショる（ Akiba & Nakamura, 2005 )．本種の菌根菌を調べたウロに適用してその種分化の過程を明らかにすること，ところ，ヤクタネゴヨウにしか共生しない新種のショウロ属(3)埋土胞子を用いてトガサワラショウロおよびヤクタ菌を発見し，ヤクタネショウロ（ Rhizopogon yakushimensis )ネショウロの菌株を単離すること，(4)宿主樹木と共生として記載された（Sugiyama et al., 2018 )．ヤクタネショ

させた状態で菌株の維持が可能かを検証することを目的

ウロも残存林の埋土胞子群集で最も優占する菌種であとする．

り，撹乱後の宿主実生の定着に重要な役割を果たしてい実験方法ると推定できる（ Murata et al., 2017b )．
ヤクタネショウロについてもマイクロサテライトマー
カーを用いた集団遺伝解析によって，宿主以上に遺伝子調査地と土壌サンプリング

流動が制限されて集団分化が進んでいることが明らかに宿主樹木の主要生息地を網羅的に調査地としたされている（ Sugiyama et al., unpublished )．風媒花の（ Fig. 1 )．トガサワラショウロについては，トガサワラ

宿主よりも小型動物に胞子散布を依存するヤクタネショが優占する奈良県吉野郡川上村の三之公川，和歌山県日ウロで強い分散制限がかかっているためである．トガサ

高郡印南町の川又観音，和歌山県東牟婁郡本宮町の大塔

ワラショウロと同様に，ヤクタネショウロも絶滅危惧種

山，高知県安芸郡馬路村の安田川山と魚梁瀬，高知県安に該当し，そのリスクは宿主以上に深刻であると考えら

芸市の西ノ川山の計 6 林分を対象とした（ Table 1 )．ヤ

－5－

奈

良

一

秀

Research Site

Nara

Bioassay

Mie

Soil spore bank

Wakayama

Soil sampling

KouchiInfection fromsoil spore bankPseudotsuga japonica
ECM roots

Culture strains

Mycorrhizal seedlingConservation in
Culture Collections

Tanegashima
Yakushima

Isolation
Sequencing

Pinus amamiana

Conservation of endangered fungal species

Conservation inGreenhouse

Fig. 1 Distribution of endangered Pseudotsuga japonica and Pinus amamiana forests (left) and illustration of research outline (right)

Table 1.

Sampling site information

Fig.1 奈良 Illustrator CC2019 にて作成

クタネショウロについてはヤクタネゴヨウが優占する鹿どちらの菌種も宿主樹木の残存林において埋土胞子群集

児島県熊毛郡屋久島町の平内と大川林道万里，鹿児島県

では最も優占することが判明しており，埋土胞子から菌熊毛郡中種子町の早稲田川の計 3 林分を対象とした株を得られれば遺伝資源収集に理想的である．そこで，（ Table 1 )．一般的に菌根菌の菌株単離には子実体が用各調査対象林分内で無作為に選んだトガサワラまたはヤ

いられることが多い．しかし，トガサワラショウロとヤ

クタネゴヨウの周辺の 21 ～ 50 地点において，5 cm×

クタネショウロについては，子実体の発見例が極めて少

5 cm×10 cm（深さ)の土壌ブロックを採取した．各林

なく（ Mujic et al., 2014; Sugiyama et al., 2018 )，網羅的

分のサンプリング地点数は林分サイズや宿主樹木の残存な菌株収集に利用することは事実上不可能である．一方，数によって異なる．

－6－

絶滅危惧樹木の保全に不可欠な菌根菌の系統分類と菌株コレクションの構築

バイオアッセイ

くは ITS4 をプライマーとしてシーケンスを行った．得採取した土壌試料から粗大有機物を取り除いて 1 ヶ月られた配列データは，シーケンスアセンブリソフトウェ

以上風乾させた．Murata et al.(2017a)に従ってバイオ

ア ATGC ver. 7（ GENETYX 社，日本)で波形確認とベーアッセイ容器を作成し，チューブに土壌を入れ，トガサ

スコールのエラーを修正した後，配列のマッチングを

ワラ林分から採取された土壌にはベイマツの種子を，ヤ行 っ た．ITS 領 域 の 相 同 性 が 97 % 以 上 を 同 じ 種

クタネゴヨウ林分から採取された土壌にはヤクタネゴヨ（ MOTU:molecular operational taxonomic unit )と 定 義ウまたはヒメコマツの種子を植えて光と温度環境が制御し，配列のクラスタリングを行った．その後，NCBIされた実験室のクリーンブース（日照 16 時間，暗条件（ National Center for Biotechnology Infermation )が提供

8 時間，温度 25 ℃)で約 6 カ月育苗した．ベイマツとヒしている BLAST プログラムを使用し，登録されている

メコマツはトガサワラやヤクタネゴヨウの種子の入手が菌種との相同性の検索を行い，種の同定を行った．バイ

困難であったため，同属近縁種で代用したものであり，オアッセイ苗の菌根から分離された菌株は，純化の後，先行研究でトガサワラショウロまたはヤクタネショウロ

上記の同定によってトガサワラショウロまたはヤクタネの埋土胞子から菌根を形成することが確認されている

ショウロであることが確認されたもののみを菌株として（ Murata et al., 2017a, 2017b )．育苗期間中，苗当たり 2扱った．また，同じ土壌サンプル由来であっても別の菌～ 3 ml の水道水を 3 ～ 5 日ごとに潅水した．

根から分離された菌は異なる菌株として扱った．

なお，バイオアッセイ苗の菌根の DNA 解析によって（下記参照)，ヤクタネショウロが感染していることが確系統解析認された苗はポリポットに移植し，温室（自然光)に設置

トガサワラショウロの ITS 塩基配列を query として，したクリーンブース内（温度 25 ℃)で維持管理を行った．

NCBI の Blast 検 索（ Megablast ) に よ っ て 相 同 性 が95 %以上の近縁な塩基配列を取得した．系統解析の際

外生菌根の形態類別と菌根菌の分離・培養に冗長となる同一地域の同一塩基配列や，一部領域に欠先行研究（ Ishida et al., 2007; Nara et al., 2003 )と同損のある配列は削除した．トガサワラショウロを含む様にバイオアッセイ苗の全ての菌根を丁寧に水道水で洗浄し，実体顕微鏡下で観察し，菌根表面の色や形状など

Villosuli 亜 属 と 近 縁 な 別 亜 属 か ら Rhizopogon vulgaris（ AF062931，AF062934 )を外群として加えて系統解析の特徴により形態類別を行った．トガサワラショウロまの配列データセットとした．以降の系統解析は全て

たはヤクタネショウロの菌根形態タイプのみを解析対象

MEGA ver.10（ Stecher et al. 2020 )を用いて行った．アとし，各苗あたり最大で 3 つの菌根を反復試料としてララインメントは MUSCLE のデフォルト設定で行ったのンダムに採取したのち，それぞれ個別の 2 ml チューブ

ち，両端の塩基長が不揃いな部分を手作業で削除した．

に入れ，DNA 抽出に供した．また，比較的新しく形成系 統 解 析 の 塩 基 置 換 モ デ ル に は，BIC（ Bayesian

されたと思われる菌根を別に選択し，菌根菌の分離試験

Information Criterion )scores が最も低いものを最適モに供した．

デルとして用いた．系統樹は最尤法（ ML 法)と近隣接採取した菌根は，次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素濃合法（ NJ 法)によって作成した．いずれも，ギャップ

度 1 %)で 2 分 30 秒間表面殺菌した後，滅菌水で 2 回洗は pairwise deletion として扱い，分岐の信頼度は 500 回

浄 し，30 ppm の テ ト ラ サ イ ク リ ン を 添 加 し た MMNのブートストラップ検定によって算出した．

（ Marx, 1969 )平板培地上に静置し，20 ℃で約 1 ヶ月間

ヤクタネショウロについても同様にして系統解析を培養した．その後，トガサワラショウロとヤクタネショ

行 っ た． 外 群 に は Rhizopogon evadens（ AF062927 ) お

ウロ様の菌叢形態を示したものを新たな MMN 培地に

よび Rhizopogon occidentalis（ AF058305 )を使用した．

移植し純化した．純化した菌叢から菌糸を採取し DNA
ITS 領域の変異速度，および近縁種との分岐年代の推定抽出に供した．

トガサワラショウロの系統解析に使用した ITS 領域
分子生物学的手法による菌根菌の同定

全体（ ITS1, 5.8S, ITS2 )のアラインメントから外群の改 変 さ れ た CTAB 法（ Nara et al., 2003 ) に よ っ て

配列を除き，トガサワラショウロを含むアジア種群と北DNA を 抽 出 し， フ ォ ア ― ド プ ラ イ マ ー の ITS1F や米種群の平均遺伝距離を MEGA ver.10 によって算出し

ITS0F-T とリバースプライマーの ITS4 や ITS4B，LB-W

た．算出の際には最適な塩基置換モデルを採用した．そを 用 い て リ ボ ソ ー ム DNA の ITS 領 域 を 増 幅 し た

れぞれの特異的宿主であるトガサワラ属樹木が分岐した（ Bahram et al., 2011; Gardes & Bruns, 1993; Tedersoo etのは化石などの証拠から約 3200 万年前と推定されていal., 2008; White et al., 1990 )．増幅した産物を ITS1 もしる（ Wei et al., 2010 )．そこで，これらのトガサワラ属

－7－

奈

良

一

秀

結果と考察

樹木と特異的に共生するアジア種群と北米種群が分岐し た の も 同 じ 年 代 と 仮 定 し，ITS 領 域 の 変 異 速 度

トガサワラショウロの系統進化と進化速度（% divergence / My )を推定した．その後，推定された変異速度を用いて，中国本土の近縁種，および台湾の近安田川山の調査地から採取した 50 の土壌サンプルの縁種との分岐年代の推定を行なった．

うち，48 においてバイオアッセイ苗にトガサワラショ

ITS1 領域のみ，ITS2 領域のみ，および ITS1 と ITS2

ウロの菌根が形成され，埋土胞子の存在が確認された．

領域（ITS 領域全体から保存された 5.8S 領域を除いたもこれらのトガサワラショウロ菌根，および菌根から単離の)でも同様の変異速度と，アジア種群の分岐年代推定

した菌株（後述)の ITS 配列は全て，Murata et al.(2017b)を行なった．ただし，遺伝距離推定には，それぞれのデー

がバイオアッセイ苗の菌根から得た配列（ LC260453 )，タセットに最適な塩基置換モデルを新たに選択した．宿および Mujic et al.(2014)が新種記載に用いた子実体タ

主の ITS 領域についても，シナトガサワラ（ Pseudotsuga

イプ標本の配列（ KC542888 )と同一であった（ただしsinensis, Pseudotsuga sinensis var. wilsoniana )，ベイマツ（ Pseudotsuga menziessi )，Pseudotsuga macrocarpa の塩基

後述するように 1 塩基の多型サイトが含まれる)．これ

配列を NCBI から取得し，上記と同様な変異速度の推定

統解析によって，トガサワラショウロとトガサワラショを行なった．

ウロに近縁な種は（簡略化のため未記載の MOTU を含らの配列とデータベース上の近縁な配列を含めた分子系

トガサワラショウロと近縁種の系統解析では塩基置換

めて種と表現する)，北米とアジアの明瞭な 2 つの系統

数は十分に少数であったことから，塩基置換モデルを考群に別れた（ Fig. 2 )．また，アジア地域内では中国と慮しない遺伝距離（ substitutions/site/10 9 years )でも台湾の種が単系統であり，トガサワラショウロと姉妹群

分岐年代を推定した．ここでも北米種群とアジア種群のを形成した．このような樹形は宿主であるトガサワラ属

分岐年代を 3200 万年前と仮定し，相対遺伝距離によっの系統関係と全く同一であり（ Gernandt & Liston, 1999;てアジア地域内の分岐年代の推定を行った．また，宿主Wei et al., 2010 )，互いに宿主特異性を維持したまま共の塩基置換速度との比較も上記と同様に行った．

進化をしてきたことが示唆される．

100/990.010

98/100

Rhizopogon togasawarius (KC542888)
uncultured ECM Jp (LC260453)
uncultured ECM Tw (MH919321 )85/97

uncultured ECM Ch (MH919320 )Rhizopogon parksii US (AF058314)

100/99Rhizopogon subareolatus US (KC306766)
uncultured ECM Ca (KP403083)
Rhizopogon vulgaris (AF062931)

100/100

Fig. 2

Rhizopogon vulgaris (AF062934)

Phylogenetic trees of Rhizopogon togasawarius and related species based on ITS sequences
Branching supports based on bootstrap tests on Maximum Likelihood (ML) and Neighbor
Joining (ML) trees are shown (ML/NJ). Kimura's two parameter model with gamma distributed
rate variation was used as the best substitution model. NCBI accession numbers are included in
the OTU labels. ITS sequences obtained from ectomycorrhizal roots
and culture
strainsFig. 2 (ECM)
奈良 Illustrator
CC 2019にて作成
in this study were identical to the underlined published sequences from ECM (LC260453) or
sporocarp type specimens (KC542888). Abbreviations: ECM, ectomycorrhiza; Jp, Japan; Ch,
China; Tw, Taiwan; US, United States; Ca, Canada.

－8－絶滅危惧樹木の保全に不可欠な菌根菌の系統分類と菌株コレクションの構築

北米種群とアジア種群が宿主と同様に 3200 万年前に（ substitutions / site / 109 years )の推定値は，ITS 領域全分岐したと仮定した場合，ITS 領域全体（ 5.8S rDNA を

体で 0.52，保存された 5.8S 領域を除くと 0.70 であった含む)の進化速度は 0.11 % divergence / My と推定され（ Table 3 )．トガサワラショウロが中国と台湾の近縁種た．これを元に，トガサワラショウロと中国の近縁種が分から分岐した年代は，それぞれ 1750 万年前と推定され岐した年代は 1710 万年前，ドガサワラショウロと台湾のた．Takamatsu & Matsuda(2004)によってウドンコカ

近縁種との分岐は 1410 万年前と推定された（ Table 2 )．

ビ菌（ Goloviomyces )で推定された ITS 領域の塩基置換

完全に保存されていた 5.8S 領域を除いた ITS1 と ITS2

速度は 2.52±0.11 と本研究の推定値よりも数倍も速い．

領域の進化速度は 0.15 % divergence / My と大きくなっ

全く生態の異なる菌群のため単純な比較はできないが，たものの，推定分岐年代は大きく変化しなかった．これ

この塩基置換速度の大きな差異は植物や動物で明らかに

らの分岐年代は，地殻変動によってユーラシア大陸からされているように，主に世代時間の違いを反映している

日本列島が形成された時期と一致する（鎌田，2016 )．

ものと考えられる．また，これらの結果は，分子系統解

また，宿主であるトガサワラとシナトガサワラの分岐年

析に時間軸を取り入れる場合，生態も異なる全く別系統

代とも大きく乖離しない（ Wei et al., 2010 )．つまり，の化石によって補正を行うことが不適切であることを明

トガサワラショウロとその近縁種は，宿主特異性を維持示している．いずれにせよ，ITS 領域は菌根菌の群集解したまま宿主樹木と同じ生物地理学的なプロセスを辿っ

析や種レベルの系統解析に最も利用されている部位であてきたものと考えられる．

り，本研究で示した進化速度の推定値はこれらの研究分

中国と台湾の近縁種間の分岐年代を同様に計算したと
ころ 590 万年前と推定されたものの，ITS1 領域の塩基

野におおよその時間軸を提供できる意義のある結果であると考えている．

配列は全く同じであった．このことから台湾と中国に陸トガサワラ属樹木の ITS 領域の進化速度を計算する橋が形成された氷期に移入交雑が起こった可能性が考えと，ITS 領域全体では 0.11 % divergence / My，保存さられる．宿主についても，タイワントガサワラを独立しれ た 5.8 領 域 を 除 く と 0.13 % divergence / My と な り，た種とするか，中国のシナトガサワラと同一とするかは

トガサワラショウロの推定値とほぼ同じ値を示した

議論が分かれている（ Farjon, 1990 )．移入交雑によっ（ Table 2 )． 塩 基 置 換 速 度 の 推 定 値（ substitutions /て部分的に遺伝子の交換が行われるような場合はゲノム

site / 10 9 years ) で も，ITS 領 域 全 体 で 0.56，5.8S 領 域

ワイドな解析を行わなければ正確な進化プロセスを明らを除くと 0.62 と推定され，ともにトガサワラショウロ

かにすることはできないであろう．

と近縁種群の推定値と同程度であった（ Table 3 )．進化

トガサワラショウロと近縁種間の塩基置換速度

Table 2.

速度は世代時間と関係があり，世代時間が短いほど進化

Evolutionary rates of ITS regions and estimated divergence time within Rhizopogon togasawarius and their host lineages－9－

奈
Table 3.

良一

秀

Estimated substitution rates of ITS regions for Rhizopogon togasawarius and its relatives in comarison to their coevolved hosts

は早くなる（ Smith & Donoghue, 2008 )．トガサワラも部で分岐するという結果であった．

トガサワラショウロも撹乱に依存した生存戦略を持つとトガサワラショウロで推定された ITS 領域全体の進考えられることから，その世代時間は撹乱周期と対応し化速度を用いて，中国南部で検出された種とヤクタネている可能性がある．

ショウロの分岐年代を推定すると 1780 万年前となった（ Table 4 )．単系統群内の日本の近縁配列との分岐年代

ヤクタネショウロの系統進化と分岐年代推定は 1640 万年前と推定された．同様にトガサワラショウ

3 つの調査地から採取した大半の土壌サンプルでバイロで推定された塩基置換速度からヤクタネショウロの分

オアッセイ苗にヤクタネショウロの菌根が形成され（平岐年代を推定したところ，中国南部の近縁種，日本国内

内 19/26，万里 15/21，早稲田川 25/32 )，埋土胞子のの近縁種とはそれぞれ 1770 万年前，1620 万年前に分岐存在が確認された．これらの菌根，および菌根から単離したと推定された（ Table 5 )．この単系統群内では，した菌株（後述)の ITS 配列は全て，Murata et al.(2017a)

ITS1 領域に比べて ITS2 領域の変異が少なく，特にヤクが現地ヤクタネゴヨウ成木から得た菌根（ LC315873 )，タネショウロ以外の日本の配列と中国南部の配列には 2および Sugiyama et al.(2018)がヤクタネショウロの新種

塩基の置換しかなかった．つまり，それほど古くない時

記載に用いた子実体タイプ標本の配列（ LC216339 )と代に，中国南部とヤクタネショウロ以外の日本の近縁種完全に一致した．これらのヤクタネショウロの配列との間に移入交雑が起こった可能性がある．いずれにせよ，

データベースに登録された近縁な塩基配列は（相同性がヤクタネショウロはアジアの近縁種と分岐して 1600 万

95 %以上)，いずれも日本および中国で採取された菌根

年以上も独自進化をした希少種であることは間違いない．

から検出されたものであり，ショウロ属の既知種とは系

ヤクタネショウロの宿主であるヤクタネゴヨウの系統

統的に大きく離れていた（ Fig. 3 )．これまでに提唱さ進化や生物地理についてはほとんど分かっていない．仮れているショウロ属のどの亜属にも含まれない新たな亜にヤクタネショウロとヤクタネゴヨウが宿主特異性を維属と考えられる（ Sugiyama et al., 2018 )．ヤクタネショ

持したまま共進化をしてきたと仮定すると，ヤクタネゴ

ウロは中国の中部や北部の菌種ではなく，中国南部の種

ヨウも古い地質時代に中国南部との共通祖先から分岐しと単系統群を形成する点については高い信頼性が得られた可能性が高い．また，上述したようにトガサワラやトた．この単系統群には日本で採取された菌根由来の配列

ガサワラショウロが同じ時代に中国の近縁種と分岐したも含まれているが，これらの系統関係については ML 法と推定されていることから，いずれも日本列島の形成初と NJ 法で一致しなかった部分がある．ML 法では中国期にユーラシア大陸から隔離される形で異所的種分化の南部の種が単系統群内の他の種と姉妹関係にあったが過程を辿ったものと考えられる．

（ Fig. 3 )，NJ 法ではヤクタネショウロが他の種と最も基－ 10 －

絶滅危惧樹木の保全に不可欠な菌根菌の系統分類と菌株コレクションの構築
uncultured ECM Jp (LC260454)
58/47

uncultured ECM Jp (LC171572)

43/-

uncultured ECM Jp (AB923019)

0.020
65/-

100/100

Rhizopogon yakushimensis (LC216339)
100/100 uncultured ECM Jp (LC315873)
uncultured ECM ChS (JQ991778)
uncultured ECM ChN (LC176637)
uncultured Pyrola ECM Jp (LC096324)

100/100 uncultured ECM ChC (AB636449)
uncultured ECM ChC (AB839390)
Rhizopogon evadens (AF062927)
Rhizopogon occidentalis (AF058305)

Fig. 3Phylogenetic trees of Rhizopogon yakushimensis and related species based on ITS sequences
Branching supports based on bootstrap tests on Maximum Likelihood (ML) and Neighbor
Joining (ML) trees are shown (ML/NJ). Kimura's two parameter model with gamma distributed
Fig.3 奈良 Illustrator CC 2019にて作成
rate variation was used as the best substitution model. NCBI accession numbers are included in
the OTU labels. ITS sequences obtained from ectomycorrhizal roots (ECM) and culture strainsin this study were identical to the underlined published sequences from ECM (LC315873) andsporocarp type specimens (LC216339). Abbreviations: ECM, ectomycorrhiza; Pyrola, Pyrola
mycorrhiza; Jp, Japan; ChS, Southern China; ChN, Northern China; ChC, Central China.

Table 4.

Estimated divergence time of Rhizopogon yakushimensis from their relatives in Asia based on evolutionary distances

Table 5.

Estimated divergence time of Rhizopogon yakushimensis from their relatives in Asia based on ITS substitution rates－ 11 －

奈良

トガサワラショウロとヤクタネショウロの菌株単離

一秀このため，カルチャーコレクションで菌類の絶滅危惧種

トガサワラショウロの菌株採取地のうち三之公川と川を保全するという概念自体も存在していなかった．本研

又観音，大塔山，魚梁瀬，西ノ川山は大雨による林道寸究によって，絶滅危惧微生物の保存というカルチャーコ

断などの影響によりサンプリングを一年延期せざるをえ

レクションの新たな機能がさらに発展することを願う．

なかったため，現在バイオアッセイ中であり，菌株取得

トガサワラショウロまたはヤクタネショウロの菌株間には至っていない．それ以外の菌株採取地のうち，トガの菌叢形態を比較したところ，各菌種ともに菌株間に大サワラショウロは安田川山で 21 菌株，ヤクタネショウ

きな違いはなかった．さらに，採取された菌根や分離菌

ロは平内で 1 菌株と大川林道万里で 5 菌株，早稲田川で

株の ITS 領域の塩基配列を比較したところ，トガサワ

5 菌株の単離に成功した．MMN 平板培地上での菌叢形

ラショウロでは 1 塩基で多型が観察された（菌株では態はトガサワラショウロは暗黒色，ヤクタネショウロは

21 菌株中 7 菌株が T で 14 菌株が C，菌根では 140 サン

こげ茶色で，ともに気中菌糸はあまり形成しなかった

プル中 3 つが T で残りの 137 が C )．同じ土壌サンプル（ Fig. 4 )．これらの結果は，子実体が得にくい希少菌種

内では同一の多型タイプを示すことが多かったものの，でも埋土胞子を利用することにより 1 回の現地調査で効

一部では同じ土壌サンプル内で 2 つのタイプが存在して率的に遺伝資源の収集が可能であることを示している．

いたことから，集団内で固定されていないことが明らか単離された菌株のうち，トガサワラショウロの 1 菌株にされた．一方，ヤクタネショウロの菌根や分離菌株のとヤクタネショウロ 3 菌株を菌株保存機関である独立行

ITS 領域の配列は全く同一であり，多型はなかった．一政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセン

般に，ITS 領域には種内変異が存在する場合が多く，同ター（ NBRC )に寄託した（ Table 6 )．動物や植物に比じ地下生菌のイボセイヨウショウロなどでは 10 塩基サ

べて分布域や個体数を調べることが困難な菌類は，同じイト以上で確認されている（ Kinoshita et al., 2011 )．お

真核多細胞生物でありながらデータ不足によって絶滅危

そらく，絶滅危惧樹木にのみ共生することから，集団の惧種としての登録数が圧倒的に少ない（ IUCN, 2020 )．

サイズが小さいために遺伝的浮動の影響を強く受け，固Fig. 4Cultured strains of Rhizopogon togasawarius (left) and Rhizopogon yakushimensis(right) grown on Modified Melin-Norkrans in a 90 mm plate.

Table 6.

Deposited culture strains of ectomycorrhizal fungi isolated from soil spore banks－ 12 －

絶滅危惧樹木の保全に不可欠な菌根菌の系統分類と菌株コレクションの構築

Fig. 5

Pinus amamiana seedlings, nonmycorrhizal (above) or ectomycorrhizal with Rhizopogon
yakushimensis (below), grown for two years in a green house

ネショウロとして記載された．どちらの菌種もそれぞれ

定（ fixation )が進んだと考えられる．

の絶滅危惧樹木に特異的に共生するため，宿主の系統進
宿主苗と共生状態での菌株維持化や生物地理の影響を強く受けている可能性が高い．ト

ヤクタネショウロの感染した苗は，対照区の非感染の

ガサワラの分岐年代については化石標本等によって詳細

苗に比べて顕著に成長が促進されていた（ Fig. 5 )．2 年に明らかにされているため，これをトガサワラショウロ

後でもヤクタネショウロの菌根は確認できたことから，の分岐年代推定や進化速度推定に活用できると考えた．

苗との共生状態で菌株を維持できることが実証できた．

そこで本研究ではトガサワラショウロと近縁な登録配列

HEPA フィルターを実装したクリーンブース内で育ててを NCBI から取得して系統解析を行ったところ，宿主のいることもあり，周囲から胞子で他の菌根菌が侵入する

系統進化と同様に北米種群とアジア種群に明確に別れことも確認されていない．同様の環境で育苗している他

た．この分岐年代を宿主の分岐年代である 3200 万年前のマツとショウロの組み合わせでは子実体の発生も確認と仮定すると，中国や台湾の近縁種とトガサワラショウ

されていることから，ヤクタネショウロの子実体が栽培

ロが分岐したのは 1500 ～ 1800 万年前であると推定されによって得られる可能性もある．その場合は，特定菌株た．また，宿主樹木と菌根菌の ITS 領域の塩基置換速の胞子が大量に採取できるため，埋土胞子による菌株の度は同程度であったことから（ 0.5 substitutions / site /維持へも繋がるであろう．さらに，有性生殖によってよ

109 years )，両者の生態的な世代時間が近い可能性を示

り優れた菌株を得るような実験も可能となるなど，発展している．

性が望める菌株の維持管理方法である．

要

ヤクタネショウロについても同様の系統解析を行った
ところ，中国南部や国内の一部の未記載種と単系統群に約なることが明らかにされた．この系統群はこれまで知られているどの亜属にも含まれないことから，アジアで進

樹木の成長や生存には菌根菌という根に共生する菌類

化した固有の系統群である可能性が高い．トガサワラが不可欠だが，絶滅危惧樹木と菌根菌の相互作用に関すショウロで得られた塩基置換速度を利用してヤクタネ

る知見は乏しい．先行研究において，絶滅危惧種に指定

ショウロの分岐年代を推定したところ，少なくともされているトガサワラとヤクタネゴヨウの菌根菌を調べ

1600 万年以上前に分岐したと推定された．トガサワラ

たところ，いずれもその樹種にしか共生しない新種の菌ショウロとヤクタネショウロの両方がほぼ同時期に日本根菌が発見され，それぞれトガサワラショウロ，ヤクタの固有種として分岐し，それが日本列島が大陸から切り－ 13 －

奈良

一秀
本森林学会大会 (3月27-30日, 名古屋)
7) 村田政穂, 金谷整一, 奈良一秀. 2020. ヤクタネショウロの埋土胞子は何年生きるか:過去の松枯れ被害地から推定.
第131回日本森林学会大会 (3月27-30日, 名古屋)

離された時期と一致することから，両種とも地殻変動にともなう異所的種分化によって誕生したと考えられる．
トガサワラショウロもヤクタネショウロも絶滅危惧種に指定された宿主樹木の存在する場所にしか生息していないため，発見された菌根菌自体も絶滅の危機にあることが強く示唆される．また，どちらの菌種も埋土胞子として最も優占していたことから，絶滅危惧樹木実生の定着や森林の更新に中心的な役割を担っていると考えられる．そこで本研究では，これら宿主樹木，菌根菌，そして希少な森林生態系保全に資するため，トガサワラショ
ウロとヤクタネショウロの菌株を網羅的に分離収集した．どちらも子実体の収集が困難であることから，埋土
胞子から宿主実生に菌根を形成させるバイオアッセイ試
験で釣り上げて分離を試みた結果，トガサワラショウロ
で 21 菌株，ヤクタネショウロで 11 菌株の分離に成功した．この一部を NBRC のカルチャーコレクションとし

原著論文
1) Sugiyama, Y., Murata, M., Kanetani, S. & Nara, K. 2019.
Towards the conser vation of ectomycorrhizal fungi on
endangered trees: native fungal species on Pinus amamiana
are rarely conserved in trees planted ex situ. Mycorrhiza 29:
195-205.
2) Miyamoto, Y., Maximov, T.C., Sugimoto, A. & Nara, K. 2019.
Discovery of Rhizopogon assocated with Larix from northeastern Siberia: insights into host shift of ectomycorrhizal
fungi. Mycoscience 60: 274-280.
その他（総説・書籍)
1) 奈良一秀, 村田政穂. 2018. 絶滅危惧樹木を支えるキノコの発見:共進化した菌根菌が保全の鍵. 遺伝 72: 448-453.

て寄託した．埋土胞子からの菌根菌株収集，絶滅危惧菌謝

種を保全するためのカルチャーコレクション利用は，ともに新しい試みであり，今後の発展が期待できる．

辞

菌根菌の菌株維持は一般的に継代培養によって行われ本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公るが，それが長期間に及ぶと菌根形成能力が失われるこ益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，とも多い．そこで，樹木と共生状態での菌株維持のため，本研究の一部は科学研究費補助金を利用して行われましバイオアッセイの過程でヤクタネショウロの感染が確認た．現地調査の許可をいただきました林野庁，奈良県川されたヤクタネゴヨウ苗を温室に設置されたクリーン

上村，屋久島森林生態系保全センターに感謝申し上げま

ブース内で 2 年間育てた．その結果，外部から他の菌根す．現地調査では金谷整一氏，手塚賢至氏，斎藤俊浩氏

菌の侵入もなく，ヤクタネショウロが維持できることをにご協力をいただきました．

確認した．さらに育苗を続けることで子実体が発生する

文可能性もあり，さまざまな発展性が考えられる．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 村田政穂, 杉山賢子, 奈良一秀. 2018. 屋久島のヤクタネゴ
ヨウ人工林における外生菌根菌の埋土胞子群集. 第62回日
本菌学会大会（5月25-27日, 伊那)2) 小泉敬彦, 奈良一秀. 2019. 外生菌根菌の群集形成における気温の寄与. 第66回日本生態学会大会 （3月15-19日, 神戸)3) 大嶋健資, 杉山賢子, 金谷整一, 村田政穂, 奈良一秀. 2019.
埋土胞子の混合接種による遺伝的に分化した外 生菌根菌
集団間の外交配の誘導. 第130回日本森林学会大会（3月
20-23日, 新潟)
4) Nara, K. 2019. What will happen to ectomycorrhizal fungi infragmented forests? : population genetic implications fromendangered or relict forests. The 10 th Inter national
Workshop on Edible Mycorrhizal Mushroom (Oct. 20-25,
Suwa, Nagano)5) 大嶋健資, 杉山賢子, 金谷整一, 村田政穂, 奈良一秀. 2020.
絶滅危惧樹木ヤクタネゴヨウ保全のための外生菌根菌の遺伝的救助. 第131回日本森林学会大会 (3月27-30日, 名古屋)
6) 酒井敦, 安藤暁子, 奈良一秀. 2020. 高知県安田川山希少個体群保護林におけるトガサワラの成長と更新. 第131回日

献

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IFO Res.Commun. 34
17-40, 2020

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した
新規高密度培養技術の開発
阿

部

敬

悦

東北大学大学院農学研究科〒980-8572

仙台市青葉区荒巻字青葉468-1

Novel technology of high-cell density culture by controlling hyphal aggregation offilamentous fungi in submerged culture
Keietsu Abe
Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University468-1, Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai 980-8572
Filamentous fungi are widely used for production of enzymes and chemicals, and are industrially cultivated both inliquid and solid cultures. Submerged culture is often used as liquid culture for filamentous fungi. In submerged
culture, filamentous fungi show diverse macromorphology such as hyphal pellets and dispersed hyphae depending
on culture conditions and genetic backgrounds of fungal strains. Although the macromorphology greatly affects
the productivity of submerged cultures, the specific cellular components needed for hyphal aggregation have notbeen characterized. The fungal cell wall, a complex and highly dynamic structure, is composed mainly ofpolysaccharides. In Aspergillus species, these polysaccharides are mostly α-glucans (α -1,3-glucan (AG) with asmall amount of α-1,4-glucan), β-glucans (β-1,3-glucan with 1,6-branches), chitin, and galactomannan. Some fungi
have an extracellular matrix (ECM), which is composed of polysaccharides including galactosaminogalactan(GAG), and is associated with (or attached to) the major cell wall polysaccharides. Through functional analysis of
AG synthase genes in Aspergillus nidulans, we found that the hyphae of an AG-deficient strain are dispersed underliquid culture conditions, whereas wild-type mycelia form pellets. A. nidulans has two AG synthase genes, agsA andagsB. To clarify the role of AG in hyphal aggregation, we constructed strains overexpressing agsA (agsAOE ) or agsB
(agsB OE ), in which the other AG synthase gene was disrupted. Cell wall analysis of the two strains revealed thathyphal pellet formation depends on the molecular mass and spatial localization of AG as well as the amount of AG
in the cell wall of A. nidulans. In addition, we discovered that the AG and the extracellular polysaccharide GAG
contribute to hyphal aggregation in the industrial fungus Aspergillus oryzae, and that a strain deficient in both AG
and GAG (AG-GAGΔ) shows dispersed hyphae in liquid culture. Under flask culture conditions, the productivity ofa recombinant polyesterase, CutL1 was significantly higher in the AG-GAGΔ strain than in the wild type and AGdeficient (AGΔ) strains. Furthermore, computational fluid dynamics (CFD) simulation revealed that the AG-GAGΔ
strain achieved markedly better mixing than the wild type strain in the whole space of 3L bioreactor, causing thehigher productivity of enzyme by AG-GAGΔ strain. Through our study, we demonstrated the contribution ofchemical properties of AG and GAG to hyphal aggregation. Since various filamentous fungi have AG synthasegene(s) and/or GAG biosynthetic genes, regulation of the biosynthesis of the two polysaccharides could be apotential way of controlling formation of hyphal pellets and thus can improve productivity of industrial fermentation
using filamentous fungi.
Key words: Key words: fungi, hyphae, aggregation, α-1,3-glucan, galactosaminogalactan

E-mail: keietsu.abe.b5@tohoku.ac.jp
共同研究者:宮澤 拳（東北大学大学院農学研究科)，
吉見 啓（東北大学未来科学技術共同研究センター)－ 17 －

阿

緒

部

言

敬

悦

になる“非凝集型”に分けられると報告した．この二つの型は培養条件にも影響されるが，主としてその菌株の糸状菌は様々な環境に適応し，多様な代謝能を有する特性によるものであると考えられており，Aspergillus niger

ことから，酵素や化成品などの生産に利用されているは凝集型を，Penicillium chrysogenum は非凝集型をとる

種 も 多 く 存 在 す る(Cairns et al., 2019, Abe et al., 2006,と考えられている(Takahashi & Yamada, 1959)．このモ

Papagianni, 2004)．糸状菌を用いた有用物質の工業生産

デ ル は 近 年 で も 支 持 さ れ て い る(Veiter et al., 2018,

は，栄養や誘導基質の拡散が容易な液体培養で行われる

Zhang & Zhang, 2016)．A. niger においては塊の形成がことが一般的で，その生産スケールは数百 kL にも及ぶ．

顕著であるが，本菌の産業的な重要性が高いことから，

糸状菌は培養条件に依存してペレット状からパルプ状まmorphology engineering という学問分野としてその形態

で様々な形態を示すが(Veiter et al., 2018)，この性質が制御が議論されている．従来のペレット制御方法として，

発酵生産効率の不安定要因となっている．しかしながら，

攪拌回転数や温度，pH，接種分生子数の制御によって糸状菌の形態を完全に制御する手法は確立されておらその凝集性を制御することが試みられてきた(Bizukojc

ず，発酵産業における課題となっている．液体培養にお& Ledakowicz, 2010, Lopez et al., 2005, Kelly et al., 2004,

ける糸状菌のペレット形成には細胞表層の因子が関与す

Papagianni, 2004, Nielsen et al., 1995, Nielsen & Krabben,

ると考えられるが，その要因については形態学的なアプ

1995)．近年になって，"modern morphology engineering

ローチがなされるにとどまっており，根本的なペレット

techniques" として，微粒子の添加によるペレットサイズ

形成の要因については明らかになっていなかった．

の 低 減(Gonciarz & Bizukojc, 2014, Driouch et al., 2012,

糸状菌の液体培養条件下の形態の違いは培養条件に強Driouch et al., 2010)や，浸透圧によるペレット形態の制く依存しており，目的生産物の生産性と強い相関がある

御手法(Wucherpfennig et al., 2011)とそれに伴う生産性(Antecka et al., 2016)．ペレット形成時にはその直径が改善が報告されている．これらの手法により，形態学的数 mm にもなり，ペレット内部への栄養や酸素供給がな観点からの菌糸ペレットの制御手法は大きく進歩して制限される(Antecka et al., 2016)．酸素や栄養供給はペ

きたが，生物学的なペレット形成のメカニズムやその形

レット表面から約 200 μm までしか十分でないことも報

成因子については依然不明のままであった．
菌糸のペレット形成には細胞表層の因子が関与するこ

告されている(Driouch et al., 2012)．菌糸がペレットを1形成する場合，培養液はニュートン性 を示す(Krull etとが推察される．糸状菌の菌糸の表面は多糖を主成分とal., 2013)．一方，菌糸が分散状態の場合には，培養液
粘 度 が 上 昇 し， 攪 拌 効 率 が 悪 化 す る(Antecka et al.,

した細胞壁に覆われている(Yoshimi et al., 2016 )．細胞

2

壁は細胞形態の維持や細胞の保護，細胞外情報の細胞内2016)．加えて，培養液が強い非ニュートン性 を示すたへの伝達など，生育に必須の役割を担っている．また，め，対流酸素輸送が制限される(Antecka et al., 2016)．

細胞壁は菌が外界（宿主細胞，基質および菌自身の細胞)

Aspergillus 属菌は通常，ペレット形態をとることが多い(Henry et al., 2019, Jeennor et al., 2019, Tokashiki et al.,と最初に接触する構造体であることから(Yoshimi et al.,2019, Yoshimi et al., 2013, Driouch et al., 2012, Porcel et

感染症や発酵生産効率の制御に重要であると考えられal., 2005)．Trichoderma 属菌はセルラーゼの生産に用いられる産業菌であるが，それらの菌糸は通常は分散状態

る．細胞壁は多糖が複雑に絡み合った構造体でありながを と る(Limón et al., 2011, Ahamed & Vermette, 2009)．

体でもある(Latgè & Beauvais, 2014)．細胞壁を構成す2016)，細胞壁の構造を理解することは真菌に起因する

ら，常に合成と再構築が繰り返される高度に動的な構造

Penicillium 属菌はペレットを形成する(Cronenberg et

る主要な多糖として，α-グルカン（ α -1,3 -グルカン(AG)al., 1994, Hotop et al., 1993)．クモノスカビ Rhizopus oryzae
は通常分散形態をとるが，その場合の粘度上昇が顕著なおよび少量の α -1,4 -グルカン)，β -グルカン（ β -1,6 分岐ため，ペレット形成条件が探索されている(Liu et al.,β -1,3 -グルカン)，キチン，ガラクトマンナンが知られている(Yoshimi et al., 2016, Beauvais et al., 2014, Latgè,

2008, Liao et al., 2007a, Liao et al., 2007b, Zhou et al.,2010)．細胞壁にはガラクトマンノプロテイン，GPI-ア

2000)．Neurospora 属菌の菌糸も一般的にはペレットをンカー型タンパク質，細胞壁タンパク質も含まれており，
細胞外情報の伝達や細胞壁再構築における役割を有する形成する(Nair et al., 2016)．
Takahashi & Yamada(1959)は，ペレットの形成過程(Gow et al., 2017)．真菌の中には，細胞壁の外側に細胞は 2 通りあり，分生子が発芽前に凝集する“凝集型”と，外マトリクス（ ECM )を有する種も存在する．ECM

個々の菌糸が独立して分岐生長を続けた結果ペレット状

は多糖やタンパク質，脂質，核酸からなり，バイオフィ

1
2

流れの剪断応力とずり速度の関係が比例した粘性の性質を持つ流体．
流れの剪断応力とずり速度の関係が線形ではない粘性の性質を持つ流体．

ル ム の 構 成 因 子 と し て 知 ら れ て い る(Beauvais et al.,2014)．また，ECM は菌種によって非常に多様性が高い－ 18 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発(Latgè, 2010)．Aspergillus 属糸状菌においては，ECM に

37 ℃で行い，A. oryzae では 30 ℃で培養を行った．

含まれる多糖としてガラクトサミノガラクタン（ GAG )や AG，ガラクトマンナンが知られている(Loussert et al.,2010, Beauvais et al., 2007)．
筆者らは，Aspergillus 属を中心とした糸状菌のシグナ
ル伝達系を撹乱する抗真菌剤の研究開発過程において，A. nidulans における α-1,3 -グルカン合成酵素遺伝子 agsAおよび agsB 単独高発現株の作製
A. nidulas は 2 種の AG の合成酵素遺伝子 agsA, agsBを有しており通常の栄養生長では agsB のみが発現して糸状菌に特徴的な細胞壁多糖 AG を欠失した菌株が菌糸いる．両遺伝子の機能解析を目的に agsA 単独高発現株

塊を形成せず，菌糸が培地中に均一分散することを発見(agsAOE 株)および agsB 単独高発現株(agsB OE 株)を作した(Yoshimi et al., 2016)．また，産業菌である麹菌では，製した．agsAOE 株および agsB OE 株は，各々の遺伝子の内AG に加えて水溶性バイオフィルム構成多糖の GAG も在性プロモータを，構成的に高発現する tef1 プロモータに菌糸塊形成に関与することを見出した(Miyazawa et al.,それぞれ置換することにより作製した．agsAOE 株の取2019)．本論文では，これらの多糖が菌糸接着因子とし得のため，プラスミド pAPyT-agsA を作製した．agsA のて機能することを発見した経緯と，菌糸接着因子を欠損

5' 非 翻 訳 領 域（ amplicon 1 )お よ び 翻 訳 領 域 の 一 部

した分散型菌株が高密度培養に好適であり，工業培養の（ amplicon 2 )を A. nidulans ABPU1 のゲノム DNA を鋳

革新的技術につながる可能性について報告する．

型として増幅した．また，pyroA マーカー（ amplicon 3 )をプラスミド pUCpyroA(Yoshimi et al., 2013)を鋳型とし実験方法て増幅した．tef1 プロモータ（ amplicon 4 )は A. nidulansのゲノム DNA を鋳型として増幅した．これら 4 断片と菌株，培養条件，遺伝学的実験
モデル糸状菌 A. nidulans の野生型株として ABPU1 株

BamHI で 線 状 化 し た pUC19 を In-Fusion HD Cloning
Kit(Clontech Laboratories)を用いて連結した．得られた(Motoyama et al., 1996)を用いた．
また，産業用糸状菌（麹

プラスミドは NotI で処理し，ΔagsB 株の形質転換に用いた．

菌 )A. oryzae の 野 生 型 株 と し て RIB40 系 統 の NS4 株(niaD , sC )に非相同末端組換え修復遺伝子 ligD およびagsB OE 株の取得のため，プラスミド pAPyT-agsB を作製した．agsB の 5' 非翻訳領域（ amplicon 1 )および翻ア デ ニ ン 生 合 成 遺 伝 子 adeA を 破 壊 し た(ΔligD::sC,

訳領域の一部（ amplicon 2 )を A. nidulans ABPU1 のゲ

ΔadeA::ptrA)株(Mizutani et al., 2008)を 用 い た．A.

ノム DNA を鋳型として増幅した．また，pyroA マーカー--

nidulans および A. oryzae の形質転換はプロトプラスト・
PEG 法(Gomi et al., 1987)により行った．本研究では，A.

（ amplicon 3 ) を プ ラ ス ミ ド pUCpyroA(Yoshimi et al.,nidulans および A. oryzae の最少培地として Czapek-Dox（ CD )培地を使用した．A. nidulans では，栄養要求性4 )は A. nidulans のゲノム DNA を鋳型として増幅した．

に応じてアルギニン（ 0.2 g/L )，ビオチン（ 0.02 mg/L )，HD Cloning Kit(Clontech Laboratories)を用いて連結し2013)を鋳型として増幅した．tef1 プロモータ（amplicon
これら 4 断片と BamHI で線状化した pUC19 を In-Fusion

ピリドキシン（ 0.5 mg/L )，ウリジン（ 1.22 g/L )，ウラた．得られたプラスミドは NotI で処理し，ΔagsA 株のシル（ 1.12 g/L )を添加した．A. oryzae では，niaD の形質転換に用いた．agsA および agsB 高発現株は pyroA

栄養要求性を持つ株の培養の際は 10×Stock Sol. の窒素源を 70 mM 硝酸ナトリウムの代わりに 70 mM L(+)- グの要求性により選抜した．両高発現コンストラクトの正ルタミン酸ナトリウム 1 水和物にした CD 培地（ CDE

アルギニン要求性を持つ株に対しては，BamHI で処しい導入はサザンブロット解析により確認した．

培地)を用いた．また，adeA の栄養要求性を持つ株を理した pA-AoargB を形質転換することによりその要求培養する際は，0.01 %となるようにアデニンを添加した性を回復させた．pA-AoargB は以下の手順で作製した．

CDE 培地（CDEA 培地)を用いた．また A. oryzae のペレット形成能評価などの表現型観察や酵素生産性評価には富A. nidulans の argB 遺伝子の 5' 非翻訳領域（ amplicon 1 )および 3' 非翻訳領域（ amplicon 2 )をぞれぞれ A. nidulans

栄養培地 YPD 培地を用いた(Miyazawa et al., 2016)．平

ABPU1 の ゲ ノ ム DNA を 鋳 型 と し て 増 幅 し た． ま た，

均ペレット直径は，無作為に選んだ 10 個の菌糸塊を実A. oryzae の argB マーカー（ amplicon 3 )を A. oryzae の
ゲノム DNA を鋳型として増幅した．これら 3 断片と体顕微鏡 M125(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)
で観察して測定した．Escherichia coli の培養には LB 培
地を用い，抗生物質として適宜アンピシリンやカナマイ

BamHI で線状化した pUC19 を In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech Laboratories)を用いて連結した．得られたプ

シンを添加した．上記培地を寒天平板培地として使用すラスミドは NotI で処理し，アルギニン要求性株の形質る場合には終濃度 1.5 %(w/v)となるよう寒天を加えた．

転換に用いた．A. oryzae argB マーカーの置換は PCR に

A. nidulans の寒天平板培養および液体振盪培養は通常はより確認した．一部の例外を除くすべての ligD 遺伝子－ 19 －

阿

部

敬

悦

破壊株は，NotI 処理したプラスミド pAP-CligD を形質酸の終濃度 0.5 M )．加水分解反応後の溶液に炭酸バリ転換して ligD 遺伝子を相補させた．

ウムを加えて中和し，8,000×g, 10 分間遠心分離し，上清を取得した．加水分解物の上清の構成単糖は HighA. nidulans の 細 胞 内 ア ミ ラ ー ゼ 遺 伝 子 amyG 破 壊 株(ΔamyG)の作製

Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed

amyG 遺伝子の 5' 非翻訳領域（ amplicon 1 )および翻訳領域（ amplicon 2 )を A. nidulans のゲノム DNA を鋳定 量 し た． 分 析 カ ラ ム と し て CarboPac PA1(4 mm x型として，pyrG マーカー（ amplicon 3 )を A. oryzae の（カラム温度 35 ℃)．18 mM NaOH を溶離液として流速

ゲノム DNA を鋳型としてそれぞれ増幅した．得られた

1mL/min で分析を行った．単糖成分の標準糖としてグ

3 断片はゲル抽出し，2 次目の PCR の鋳型として用い，

ルコース，ガラクトース，グルコサミン，ガラクトサミ

3 断片を融合した．得られた PCR 産物はゲル抽出し，ンおよびマンノースを用いた．

Amperometric Detection (HPAEC-PAD) 法により検出し250 cm)に CaboPacPA1 guard カラムを付けて使用した

ABPU1(ΔligD)株の形質転換に用いた．amyG 遺伝子の置換は PCR により確認した．

α-1,3 -グルカン平均分子量の測定(HPSEC 法)
AS2 画分に含まれる主要多糖 AG の分子量は，分子篩A. oryzae における GAG 合成酵素遺伝子の破壊株の作製

カラム Sugar KS-805(8.0 cm x 300 mm; Showa Denko Co.

A. oryzae の GAG 合成酵素遺伝子クラスターのうちLtd., Tokyo, Japan)および Sugar KS-G68 6B ガードカラ

ugeZ と sphZ 遺 伝 子 を 以 下 の 方 法 で 同 時 に 破 壊 し た(Miyazawa et al., 2019)．ugeZ 遺伝子および sphZ 遺伝子ム（ Showa Denko )を用い，1 M NaOH を移動相としてDionex ICS-5000 の耐アルカリポンプにより流速 1mL/minの 3' 非翻訳領域（それぞれ amplicon 1, 2 )および adeA

で分析を行った(Miyazawa et al., 2018)．検出は示唆屈遺伝子（ amplicon 3 )を PCR により増幅した．PCR の折計で行った．AS2 画分 10 mg を 1M NaOH 溶解し，分鋳型として amplicon1, 2 では A. oryzae ゲノム DNA を，析を行った．分子量は，デキストランをスタンダードとamplicon 3 で は TOPO-2.1-adeA プ ラ ス ミ ド を 用 い た．

して算出した．

各 PCR 産物はゲル抽出して 2 次目の PCR の鋳型として用いて 3 断片を融合した．目的の PCR 産物はゲル抽出し，ガラクトサミノガラクタンの部分精製
麹菌 A. oryzae AGΔ 株もしくは AGΔ 株に対して GAG

A. oryzae の野生型株および AGΔ 株(agsA, agsB, agsC の
三 重 破 壊 株)の 形 質 転 換 に 用 い た(Miyazawa et al.,

生合成遺伝子を破壊した AG-GAGΔ 株(mock)の分生子

2016)．sphZ および ugeZ 遺伝子の破壊はサザンブロッ

を 終 濃 度 1.0×106 個 と な る よ う 1 L の 改 変 Brian 培 地

ト解析により確認した．

（ Fontaine et al., 2011 )3 本（ 計 3 L ) に 接 種 し，30 ℃,
160 rpm, 72 時間振盪培養した．培養液を Miracloth でろ

細胞壁からの多糖の分画過し，菌糸を除去し，上清を取得した．培養上清はガラ

CD 培地で 24 時間培養した菌糸を Miracloth(Merck

スフィルターで再度ろ過し，3 本の培養液を合わせて，Milipore, Darmstadt, Germany)でろ過回収し，純水で洗

1 L までロータリーエバポレータを用いて濃縮した．濃浄後，凍結乾燥した．凍結乾燥菌体をボールミルで粉砕縮した培養液は 4 ℃で水に対して透析し，再度 1 L とな

後，熱水抽出，アルカリ抽出を行って，水溶性画分，アるようエバポレータで濃縮した．次に，20 g の水酸化ナ

ルカリ(2 M NaOH)可溶性画分(AS)，アルカリ不溶性

トリウムを加え（終濃度 0.5 M )，4 ℃で攪拌した．この画分(AI)に分画した（Yoshimi et al., 2013 )．AS 画分は，溶液を 3,000×g, 4 ℃, 10 分間遠心分離し，残渣を回収しアルカリ中和時に可溶性の AS1 画分と不溶性の AS2 画

た（ 0 倍量エタノール画分)．上清には 0.5 L のエタノー

分に分けられる．各画分は粗精製であり，多糖とそれ以ルを加え，4 ℃で 5 時間攪拌しながら保持した．この溶外の物質も含んでいる．例えば AS2 画分は 35 %(重量)液を 3,000×g, 4 ℃, 10 分間遠心分離し，残渣を回収したが多糖（主に α -1,3 -グルカン)，40 %が脂質，25 %は夾

（ 0.5 倍量エタノール画分)．この操作を繰り返し，1, 1.5,

雑物である．菌糸を事前にクロロホルム:メタノール

2, 2.5 倍量エタノール画分をそれぞれ取得した．各画分(1:1)で脱脂した場合は，多糖の重量%が 70 %に改善

とも 3 M 塩酸で中和し，水に対して透析し，凍結乾燥しされるので，必要に応じて脱脂を実施した．

た．各画分に含まれる単糖成分は細胞壁からの多糖の分各画分の単糖成分は以下の方法で定量した（ Yoshimi

画で得られた画分と同様に定量した．分生子凝集性の評

et al., 2013 )．各画分 10 mg を 200 μL の 12.5 M 硫酸に懸濁し，4 ℃, 16 時間 インキュベートした．その後，4.8 mL

価には，2 mg の AGΔ 株由来各エタノール画分またはAG-GAGΔ 株由来 1.5 倍量エタノール画分を 1 mL の 0.1 Mの水を懸濁液に加え，100 ℃，12 h 加熱し加水分解した（硫塩酸に溶解し，10 分間 vortex したものを用いた．

－ 20 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発

Smith 分解による α -1,3 -グルカン糖鎖ユニットの決定

濃度 100 mM；pH 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 )および 25 μL のAS2 画 分(20 mg)を 0.1 M 酢 酸 緩 衝 液(pH 3.9)10 mL

1.5 倍量エタノール画分と混合した溶液を 1 時間攪拌し，に溶解し，終濃度 30 mM になるように過ヨウ素酸ナト

実体顕微鏡で観察することにより行った．用いた緩衝液

リウムを添加した．その混合液を 4 ℃で暗所 72 時間攪

は，酢酸ナトリウム緩衝液（ pH 4.0 - 5.0 )，リン酸ナト

拌しながら保持した後，エチレングリコール 0.1 mL を

リウム緩衝液（ pH 6.0 - 7.0 )，トリシン - 水酸化ナトリ

加えて，過剰な過ヨウ素酸ナトリウムを除去した．そのウム緩衝液（ pH 8.0 )である．

試料を透析した後，NaBH(30mg)を加えて 3 時間室温4水素結合形成の阻害による凝集への影響の評価は，で保持した．その試料を 10 %(v/v)酢酸で中和後，透25 μL の菌糸懸濁液を 450 μL のリン酸ナトリウム緩衝液

析した．氷酢酸を終濃度 0.5 M になるように添加して 24（ 終 濃 度 100 mM )，0，1，2，4 ま た は 8 M 尿 素 お よ び

時間室温で保持した．その試料を凍結乾燥し，少量の25 μL の 1.5 倍量エタノール画分と混合した溶液を 1 時間

1 M NaOH に溶解後，先述の HPSEC 法で分子量を分析

攪拌し，実体顕微鏡で観察することにより行った．

した．Smith 分解前の分子量と分解後の分子量を比較し，構成単位の分子量を決定した(Miyazawa et al., 2018)．

GAG のガラクトサミン残基のアセチル化

菌糸細胞壁多糖の蛍光標識による解析

800 μL の氷冷 0.5 M NaOH に溶解し，氷冷 2 M HCl で中5 mg の 1.5 倍 量 エ タ ノ ー ル 画 分(GAG 濃 縮 画 分)を菌糸細胞壁多糖の蛍光染色は，Miyazawa et al.,(2018)

和することにより GAG を溶解した．この溶液に 4 mL のの方法に従った．菌糸をスライドグラスの上に置き 55 ℃

50 mM 酢酸ナトリウムを加え混合した．次に，4 mL ので 15 分間乾燥させた．次いで 50 mM リン酸カリウム緩メタノールと 10 mg の無水酢酸を加え，室温で 24 時間攪

衝液（ pH 6.5 )で 2 回洗浄した後，4 %のパラホルムア

拌しながら保持しアセチル化反応を行った．反応の後のルデヒドで固定した．10 μg/mL AG 分解酵素の α-1,3 -グ

サンプルは水に対して透析し，凍結乾燥した．この反応をルカン結合ドメインと GFP の融合体(AGBD-GFP)で菌もう一度繰り返し，計 2 回のアセチル化反応を実施した．

糸細胞壁の AG を染色した．β -1,3 -グルカンは 100 μg/mLの抗 β -1,3 -グルカンモノクローナル抗体で染色した．キ

コロイド滴定による GAG のアセチル化度（DD）の決定

チンは 10 μg/mL の Alexa Fluor 350 結合小麦胚芽レクチ

GAG の DD はキトサンの DD の測定方法であるコロイ

ン で 染 色 し た．GAG は 100 μg/mL の Alexa Fluor 647-

ド滴定法により決定した(Hattori et al., 2009, Terayama,

conjugated soybean agglutinin(SBA-Alexa Fluor 647;

1952)．凍結乾燥した 5 mg の GAG を 0.1 M 塩酸に溶解し，Invitrogen)で染色した(Miyazawa et al., 2019)．菌糸の0.1 M 塩酸を用いて 1 g とした．30 mL の水を GAG を含

AG 分 解 酵 素 処 理 に は，Bacillus circulans KA-304 のむ溶液に加え，300 mL の三角フラスコに移してスター

α -1,3 -グルカナーゼ(Yano et al., 2006)を使用し，β -1,3 グル カ ン 分 解 で は A. niger 由 来 の β -1,3 -グル カ ナ ー ゼ

ラで攪拌しながら，滴定の指示薬として 0.1 %(w/v)ト(Sigma, St. Louis, MO, USA)を用いた．

含む溶液に対し，N/400 ポリビニル硫酸カリウム（PVSK;

ルイジンブルーを数滴溶液に滴下した．次に，GAG を
Fujifilm Wako, Osaka, Japan )をビュレットを用いてス菌糸の凝集アッセイ

ターラで攪拌しながら滴下した．溶液の色が青色から桃

GAG 存在下の菌糸の凝集性評価は以下の方法で行っ色に変化する点を滴定の終点とした．

た．AG-GAGΔ 株 の 分 生 子 を 1.0×107/mL と な る よ う

GAG の N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基の DD

50 mL の YPD 培地に接種し，120 rpm, 30 ℃, 9 時間振盪は下記の式から求めた．1.5 倍量エタノール画分中の GAG培養した．培養液は Miracloth を用いてろ過し，菌糸細以外の成分を考慮するため，AG-GAGΔ 株の 1.5 倍量エタ

胞を水で 2 回洗浄した．湿重 500 mg の菌糸細胞を 10 mL

ノール画分の滴定量を各サンプルの滴定量から引いた．1.5の リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(10 mM リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム，

倍量エタノール画分に含まれる総ヘキソサミン量は改変 Blix

137 mM NaCl，pH 7.4)に懸濁し，これを菌糸懸濁液と法(Johnson, 1971)により求めた．すなわち，1.5 倍量エタ

して凝集性評価に用いた．400 μL の水，50 μL の 1 M リ

ノール画分を 8 M 塩酸に懸濁し，100 ℃, 4 時間加熱し加水ン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)，25 μL の菌糸懸濁液お分解した．次に，加水分解した溶液をねじ付ガラス試験管

よび 25 μL のエタノール画分を含む溶液を混合した．混中で総量 1 mL となるよう水で希釈した．この時，塩酸濃度

合液はプレートミキサーを用いて 1,200 rpm, 30 ℃, 1 時

が 0.2 M 以下となるよう留意した．この溶液に 1 mL のアセ

間攪拌し，実体顕微鏡を用いて凝集体の形成を観察した．

チルアセトン試薬( 4 %アセチルアセトンin 1.5 N 炭酸ナトリ

GAG 存在下における菌糸の凝集に対する pH の影響のウム)を加えて混合し，沸騰水浴中で 30 分間反応させア

評価は，25 μL の菌糸懸濁液を 450 μL の各種緩衝液（終セチル化した．室温で放冷し，5 mL のエタノールを添加－ 21 －

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悦

し混合した．これに 1 mL の Ehrlich 試薬(2.67 %(w/v)

に対して agsA 高発現カセットを，ΔagsA 株に対して agsB

p-dimethylaminobenzaldehyde in 95 % ethanol : conc.
HCl(1:1)solution)を加えて混合し，室温で 25 分間放置

高発現カセットをそれぞれ導入することにより作製した．

し発色させた．この溶液の A 528 を測定し，ガラクトサミンの標準曲線からサンプル中の総ヘキソサミン量を算出した．

まず，agsAOE 株の agsA 遺伝子の発現量を解析したところ，野生型株や ΔagsB 株に比べて顕著に増加した（ P < 0.05;
Fig. 1A )．また，agsB OE 株の agsB の発現量は野生型株
や ΔagsA 株に比べて顕著に増加した（ P < 0.05; Fig. 1B )．
このことから，それぞれの高発現株において agsA または agsB の発現上昇が認められることが示された．
CD 寒天平板培地上で 4 日間培養させたコロニーの生
育は各株の間で顕著な差異は認められなかった．CD 液体培地を用いた液体振盪培養においては，先行研究と一致して(Yoshimi et al., 2013)，野生型株や ΔagsA 株は緊
密な菌糸塊を形成したのに対し，ΔagsB では菌糸が分散した（ Fig. 1C )．agsAOE 株において ΔagsB 株の菌糸分散

where:a, sample (g); b, ratio of total hexosamine in 1.5-vol. EtOH fraction from AGΔ; v, titer of N/400 PVSK solution (mL); f, factor of
N/400 PVSK solution（ Fig. 1C )．agsB OE 株は野生型株と類似した緊密な菌糸モデル酵素クチナーゼ CutL1 分泌生産量の評価

ら，agsAOE 株と agsB OE 株の間の凝集性の違いが AgsA

クチナーゼ高発現株 AG-GAGΔ-cutL1 株はプラスミド
pNGA-gla-Cut(Maeda et al., 2005)を用いて以前と同様

性 は 回 復 し， 菌 糸 密 度 の 低 い 菌 糸 の 塊 を 形 成 し たの塊を形成しながら生育した（ Fig. 1C )．以上のことかと AgsB により合成される多糖の化学構造の違いに起因する可能性が示唆された．

の方法で作製した(Miyazawa et al., 2016)．cutL1 高発現
コンストラクトの niaD 遺伝子座への 1 コピーでの挿入をサ
ザンブロット解析により確認した．酵素生産性は以下の方
法 で 評 価 し た．WT-cutL1, AGΔ-cutL1, AG-GAGΔ-cutL1

A. nidulans agsAOE 株および agsB OE 株のアルカリ可溶性
グルカンは α-1,3 -グルカン(AG)であるの各株の分生子を 1.0×10 /mL となるようそれぞれ 50 mL

agsAOE 株および agsB OE 株の細胞壁成分を解析するために，熱水アルカリ抽出法によって細胞壁成分を分画しの YPM 液体培地に接種し，30 ℃, 100 rpm, 24 時間回転た．先行研究からアルカリ可溶性画分で中和後水不溶性の4振盪培養した．培養液は Miracloth でろ過した．菌糸細AS2 画分に AG が含まれることが知られている（ Yoshimi

胞は水で洗浄し 70 ℃, 24 時間乾燥後に重量を測定した．
400 μL の培養上清に 200 μL の 100 %(w/v)のトリクロロ

et al., 2013)．AS2 画分は主にグルコースと少量のマンノースを含んでいたが，ΔagsAΔagsB 株においてはほと酢酸を加え，培養上清中に含まれるタンパク質を沈殿さんどグルコースを含まなかった（ Fig. 2A )．agsAOE 株おせ，SDS-PAGE によりタンパク質を分離させ，CBB 染色

よび agsB OE 株の総画分重量に対する AS2 画分中のグルした．染色されたタンパク質のバンドのうちクチナーゼ

コ ー ス 量 は そ れ ぞ れ 18.9 % お よ び 18.2 % で， 野 生 株

CutL1 のバンドを ImageJ を用いて定量した．CutL1 量（ 6.6 %)の約 3 倍であった．AI 画分には各株ともそれは精製 CutL1 を用いて作成した標準曲線から算出した．

ぞれ 10 %のグルコサミンとグルコースおよび 1 - 2 %のマンノースが含まれていた（ Fig. 2B )．以上をまとめる

菌糸分散麹菌 A. oryzae AG-GAGΔ 株と野生株の培養液と，agsAOE 株，agsB OE 株とも細胞壁中のアルカリ可溶性の流体特性解析

グルカンの量が野生型株に比べて増加することが示された．

佐竹化学機械工業㈱製 3 L 容ジャー型発酵槽に 1.5 L の野生型株の AS2 画分およびポジティブコントロール

培地を仕込み，30 ℃, 660 rpm, 60 時間培養を行った．佐として用いたムタンをそれぞれ α-1,3 -グルカナーゼで処

竹化学機械工業㈱に依頼して，解析ソフトウエア Fluent

理したところ糖の遊離が検出された．一方，ΔagsAΔagsB(Ansys, Canonsburg, PA, USA)を用いて，乱流モデルに

株の AS2 画分およびネガティブコントロールとして用Realizable k-e(Shih et al., 1995)を適用して computational

いたカードランからはほとんど糖の遊離は認められな

fluid dynamics(CFD)シミュレーション解析を行った．

かった(Miyazawa et al., 2018)．agsAOE 株と agsB OE 株のAS2 画分からは共に，野生株やムタンの場合と同様に糖結果の遊離が認められた(Miyazawa et al., 2018)．

モデル糸状菌 A. nidulans agsA 株および agsB
OE

A. nidulans の agsA

OE

株および agsB

OE

OE

株の表現型

株は，ΔagsB 株

13

C NMR 解析により，野生株の AS2 画分と Streptococcus

salivarius 由来の糖転移酵素 GTF-J により酵素合成され－ 22 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発

Fig. 1 Characterization of the agsAOE and agsB OE strains in liquid culture. Conidia (final concentration, 5×105/mL)of the wild-type, agsAOE, agsB OE, ΔagsA, and ΔagsB strains were inoculated into CD liquid medium and rotated at
160 rpm at 37 ℃ for 24 h. (A, B) Transcript levels of the (A) agsA and (B) agsB genes were determined by quantitative PCR on total RNA. Error bars represent the standard deviation of the mean calculated from three replicates.
Asterisks denote significant differences based on Tukey's test (*P < 0.05). (C) Growth of the wild-type, ΔagsB, agsAOE,
ΔagsB, agsB OE strains. Upper row, photographs of cultures in Erlenmeyer flasks; lower row, representative hyphalpellets of each strain under a stereomicroscope. Scale intervals are 1 mm. (Reproduced from Miyazawa et al., 2018)

Fig. 2 Monosaccharide composition of cell wall fractions from the wild-type (WT), ΔagsAΔagsB, agsAOE, andagsBOE strains. The strains were cultured in CD medium (160 rpm, 37 ℃ , 24 h). (A) Alkali-soluble, insoluble inwater at neutral pH fraction (AS2). (B) Alkali-insoluble (AI) fraction. Error bars represent the standard error of themean calculated from three replicates. Different letters denote significant differences based on Tukey's test
(P < 0.05). GalN, galactosamine; GlcN, glucosamine; Gal, galactose; Glc, glucose; Man, mannose. (Reproduced from
Miyazawa et al., 2018)－ 23 －

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部

敬

悦

たムタンでは典型的な AG のシグナルが検出された．

AS2 画分からはいずれも同じメチル化糖誘導体が検出さ

agsAOE 株と agsB OE 株の AS2 画分からは共に，ムタンと同一の化学シフトにシグナルが検出された(Miyazawa etれた．以上の三つの解析から，野生型株，agsAOE 株おal., 2018)．
次に，多糖のメチル化分析を行い，AS2 画分中の多糖ることが明らかになった(Miyazawa et al., 2018)．

の結合様式を決定した(Miyazawa et al., 2018)．野生型
株 の AS2 画 分 に は 主 に 1,3 -グ ル コ シ ド 結 合 を 示 すA. nidulans の細胞壁 AS2 画分のアルカリ可溶性グルカ
ンの平均分子量

2,4,6 -tri- O -methyl(Me)-glucose(Glc)(1,3,5 -triacetyl-

糸状菌のアルカリ可溶性グルカンの分子量は約

2,4,6-tri-O-methyl-D-glucitol)が 含 ま れ て い た． ま た，

1,000,000 で あ る こ と が 推 定 さ れ て お り(Choma et al.,

少量の 2,3,4,6-tetra-O-Me-Glc（非還元末端），3,4,6-tri-O-2013)，その大きさから正確な分子量の推定が難しいとよび agsB OE 株の AS2 画分は主に AG から構成されていMe-Glc（1,2-グ ル コ シ ド 結 合），2,4-di-O-Me-Glc（3,6-分

されてきた．本研究では，HPSEC を用いてアルカリ可岐）も 検 出 さ れ た．1,4 -グ ル コ シ ド 結 合（ 2,3,6-tri-O-

溶性グルカンの分子量の効率的な評価方法を確立した．

Me-Glc）は AG 鎖のプライマーまたはスペーサー分子由

分子量標準として用いたデキストランは，溶出量が大き来と考えられる．1,2 -グルコシド結合はガラクトマンナ

くなるとその分子量が小さくなり，70,000 - 2,160,000 のンに由来すると考えられる．3,6 -分岐は AS2 画分に混間で対数近似しその分子量を見積もった．agsAOE 株のア

入する β -1,3/1,6 -グルカンに由来すると考えられる．野ルカリ可溶性グルカンのピークは agsB OE に比べて小さ

生 型 株 の AS2 画 分 と 同 様 に，agsA

い溶出量に検出された（ Fig. 3A )．agsAOE 株のアルカリOE

株 と agsB

OE

株のFig. 3 High-performance size-exclusion chromatography elution profiles of (A) AS2 fractions and (B) Smith-degraded AS2 fractions from the wild-type, agsAOE, and agsBOE strains. The AS2 fraction (10 mg) from each strain
was dissolved in 1 M NaOH/H2O. Glucan elution was monitored as refractive index. Molecular masses of the glucan
peaks were determined from a calibration curve of dextran standards. Elution profiles shown in gray in (B) are the sameas in (A). The results of a representative of three experiments are shown. (Reproduced from Miyazawa et al., 2018)－ 24 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発

可溶性グルカンのピークトップ分子量（ Mp )は 1,480,000±80,000 で，agsB

OE

株（372,000±47,000 )の約 4 倍であった（ P < 0.01; Table 1 )．野生型株のアルカリ可溶性グルカンの Mp は agsB

OE相当する（ Table 1 )．agsAOE 株と agsB OE 株の間で Smith
分解したアルカリ可溶性グルカンの分子量に顕著な差異は認められなかった．

株よりも小さかった（ P < 0.05; Table

1 )．野生型株のアルカリ可溶性グルカンの量は agsB OE

株よりも少なかったことから，野生型株のアルカリ可溶

糸状菌 A. nidulans の細胞壁の蛍光染色による α-1,3 -グル

カン(AG)の局在の解析

性グルカンが分解に対して感受性が高い可能性が考えら

上述のように，agsAOE 株と agsB OE 株の液体振盪培養れる．これらの分子量は平均糖鎖重合度（ DP )としてにおける表現型がアルカリ可溶性グルカンの分子量と関

9,160±520(agsA )，2,230±290(agsB )，908±319

係していることが示唆された．一方，AG の分子量の違（wild-type）に相当する（Table 1 )．野生型株においては，

いにより，両高発現株の間で細胞壁中の AG の空間分布

13.5 mL 付近にも大きなピークが検出されたが，これはに違いが生じ，それが菌糸の凝集性の違いに寄与した可分解されたアルカリ可溶性グルカンに由来すると考えら

能性も考えられた．そこで，この仮説を検証するために，れる（ Fig. 3A )．すなわち，agsAOE 株および agsB OE 株の野生株，agsAOE ，agsB OE 株の AG，β -1,3 -グルカンおよ

間のアルカリ可溶性グルカンの分子量の違いが菌糸凝集

びキチンを蛍光標識し観察した．野生型株においては，性の違いの主要な要因であることが示唆された．

AG が細胞の輪郭に沿って強く蛍光標識された一方，

agsA 株および agsB 株のアルカリ可溶性グルカンの間で，AG サブユニットの化学構造が異なる可能性が

β -1,3 -グルカンやキチンは弱く標識されたのみであった（ Fig. 4 )．ΔagsAΔagsB 株においては，β -1,3 -グルカンや考えられた．そこで，AS2 画分に対して糖鎖中の 1,4- 結

キチンが強く蛍光標識された（ Fig. 4 )．agsB OE 株にお合を選択的に加水分解する Smith 分解を行い，HPSEC

いては AG が強く蛍光標識された一方，agsAOE 株の AG

による分子量計測を行った．agsA

株とも，は弱く標識されたのみであった（ Fig. 4 )．また，β -1,3 -Smith 分解によりピークが非分解時よりも大きな溶出時グルカンやキチンは agsAOE 株において明瞭に蛍光標識間に検出された（ Fig. 3B )．Smith 分解したアルカリ可された一方，agsB OE 株ではほとんど標識されなかった

溶性グルカンの分子量は 10,000 - 110,000 のデキストラ（ Fig. 4 )．これらのことは，野生型株や agsB OE 株の AG

ンのピーク保持時間から作成した標準曲線から求めた．

は細胞壁の最外層に局在している一方，agsAOE 株の AG

そ の 結 果，Smith 分 解 に よ り，agsAが β -1,3 -グルカンやキチンに覆われている可能性を示唆

OE

OE

OE

OE

OE

株，agsBOE

OE

株 で は 41,600，

agsB 株では 38,300，野生型株では 31,600 の Mp を示した（ Table 1 )．これらの Mp はそれぞれ，DP として 257
OE±36(agsA )，237±19(agsB )，195±23( 野 生 型)に
OE

TABLE 1.

OEしている．
上述の結果をさらに検証するため，agsAOE 株およびagsB OE 株の菌糸を α-1,3 -グルカナーゼまたは β -1,3 -グル

Molecular mass and degree of polymerization of alkali-soluble glucans from α-1,3-glucan synthase–overexpressing strains－ 25 －

阿

部

敬

悦

Fig. 4 Localization of cell wall polysaccharides of vegetative hyphae. Hyphae cultured in CD liquid medium for
12 h were fixed and stained with AGBD-GFP for α-1,3-glucan, fluorophore-labeled antibody for β-1,3-glucan,
and fluorophore-labeled lectin for chitin. Scale bars are 10 μm. (Reproduced from Miyazawa et al., 2018)

カナーゼで処理した後，蛍光標識して細胞壁成分を観察した．α -1,3 -グルカナーゼで処理した agsAOE 株や β -1,3 -agsAOE 株では β -1,3 -グルカンに被覆されていることが示唆された．

グルカナーゼで処理した agsB OE 株（ Fig. 5 )では，酵素処理していない場合（ Fig. 4 )と類似の結果であった．

麹菌 A. oryzae GAG 生合成遺伝子破壊株の液体振盪培養

β -1,3 -グルカナーゼで処理した agsA 株では，AG が細胞の外周およびドット状に蛍光標識され，β -1,3 -グルカにおける表現型

ンやキチンについても標識された（ Fig. 5 )．α -1,3 -グル

糸接着因子であることが明らかとなっている(Yoshimi

カナーゼ処理した agsB OE 株（ Fig. 5 )では，AG の蛍光は酵素非処理時（ Fig. 4 )と比べて弱くなった．それにet al., 2013)．一方，麹菌 A. oryzae において 3 種存在す
る AG 合成酵素遺伝子(agsA, agsB, agsC)全てを破壊し

対 し，agsB OE 株 の 菌 糸 の α -1,3 -グル カ ナ ー ゼ 処 理 時

た AGΔ 株の菌糸は野生型株よりも小さなペレットを形（ Fig. 5 ) の β -1,3 -グル カ ン の 蛍 光 は， 酵 素 非 処 理 時成したが，完全分散しなかった(Miyazawa et al., 2016)．

（ Fig. 4 )と比べて増大した．以上のことから，agsB

そのため A. oryzae においては，第 2 の菌糸接着因子のOE

OE

株の AG はほとんど細胞壁の外層に局在している一方，

これまでの解析から A. nidulans においては AG が菌存在が想定された．ヒト感染性糸状菌 A. fumigatus では，－ 26 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発

Fig. 5

Localization of cell wall polysaccharides after treatment with α-1,3-glucanase or β-1,3-glucanase.
Vegetative hyphae cultured for 12 h were fixed and treated with α-1,3-glucanase (AGase) or β-1,3-glucanase (BGase)
for 6 h. The hyphae were stained with AGBD-GFP for α-1,3-glucan, fluorophore-labeled antibody for β-1,3-glucan,
and fluorophore-labeled lectin for chitin. Scale bars are 10 μm. (Reproduced from Miyazawa et al., 2018)

感染因子となるバイオフィルムとして GAG が分泌生産

分生子形成を示した．次に，YPD 液体培地で 30 ℃，24

されることが知られていた(Fontaine et al., 2011)．A.

時間培養したところ，野生株の菌糸塊は直径 3.7±0.2 mmoryzae のゲノムにも GAG 生合成遺伝子クラスターが保存されていたことから GAG を第 2 の菌糸接着因子と仮で，AGΔ 株（ 2.7±0.3 mm )に比べて，顕著に大きかっ

定し，A. oryzae の野生型株および AGΔ 株を親株としてていた(Miyazawa et al., 2016)．また，AG-GAGΔ 株の菌

GAG 生合成遺伝子のクラスター内の sphZ および ugeZ 遺

糸は完全に分散した一方，GAGΔ 株は野生株よりも顕著

伝子を破壊して，GAGΔ 株および AG-GAGΔ 株を取得しに大きな菌糸塊（6.2±0.0 mm )を形成した（Figs. 6A, B )．

た(Miyazawa et al., 2019)．野 生 株，AGΔ 株，AG-GAGΔ

こ れ ら の こ と は，A. oryzae に お い て は AG に 加 え て株および GAGΔ 株を CD 寒天平板培地上で 30 ℃，5 日

GAG も菌糸凝集に寄与しており，A. oryzae の菌糸完全間培養したところ，いずれもほとんど同等の菌糸生長と分散には AG と GAG の生合成遺伝子両方の欠損が必要た（ Figs. 6A, B )．この結果は以前の結果とよく一致し－ 27 －

阿

部

敬

悦

Fig. 6 Phenotypes of Aspergillus oryzae ΔagsAΔagsBΔagsCΔsphZΔugeZ (AG-GAGΔ) and ΔsphZΔugeZ (GAGΔ)
strains in liquid culture. (A) The wild-type (WT), ΔagsAΔagsBΔagsC (AGΔ), AG-GAGΔ, and GAGΔ strains were cultured
in Erlenmeyer flasks (upper row), and images of hyphal pellets were taken under a stereomicroscope (bottom row; scale,1 mm) at 24 h of culture. (B) The mean diameter of hyphal pellets was determined by measuring 10 randomly selectedpellets per replicate under a stereomicroscope. Error bars represent standard deviations calculated from three replicates.
Different letters indicate significant differences within each condition by Tukey's test (p < 0.05). (C) Galactosamine (GalN)
content in the hot water–soluble fraction of the cell wall from the WT, AGΔ, AG-GAGΔ, and GAGΔ strains. Error bars represent standard error of the mean calculated from three replicates. (Reproduced from Miyazawa et al., 2019)

たエタノール沈殿物を完全加水分解し，そこに含まれるであることを示唆している．
走査型電子顕微鏡観察により，A. fumigatus の菌糸にガラクトサミン(GalN)量として GAG 量を定量した．こは GAG 依存的な凹凸のある修飾が見られ，これは sph3,の方法を A. oryzae にも適用し，各株の HW 画分の加水

uge3 および agd3 遺伝子の各破壊株において欠失すること が 報 告 さ れ て い る(Lee et al., 2016, Bamford et al.,

分解物に含まれる糖を陰イオン交換クロマトグラフィに

2015, Lee et al., 2014)．そこで，A. oryzae の GAGΔ 株お分には 1 g バイオマス当たり 0.2 - 0.3 mg の GalN が含ま

よび AG-GAGΔ 株において菌糸の修飾が欠失するか否かれていた一方，GAGΔ 株や AG-GAGΔ 株の HW 画分かより分析した．野生型株や AGΔ 株の熱水抽出(HW)画を観察した．予想した通り，A. oryzae の野生株およびらは GalN はほとんど検出されなかった（ Fig. 6C )．こ

AGΔ 株では菌糸表面の繊維状の修飾が観察されたのにのことは，A. oryzae において ugeZ と sphZ の一方または

対し，GAGΔ 株および AG-GAGΔ 株の菌糸は滑面であっ両方が，GAG の生合成に必須であることを示している．

た(Miyazawa et al., 2019)．これらのことは，A. oryzae

GAGΔ 株において菌糸が大きな塊を形成した要因につにおいて菌糸表面の繊維状の修飾が GAG 生合成遺伝子

いて，GAGΔ 株の AG の化学構造の面から解析を行ったの存在に起因することを示唆している．また，GAG のが野生型株との差異が認められず，GAGΔ 株が大きな菌欠損により固体表面上でのバイオフィルム形成が欠失す

糸塊を形成した理由について明らかにすることはできなることも観察された(Miyazawa et al., 2019)．

かった(Miyazawa et al., 2019)．

(Gravelat et al., 2013)は A. fumigatus の培養液から得－ 28 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発

In vitro での GAG 依存的菌糸凝集の観察と凝集体形成のpH 依存性こで，培養上清から GAG を取得するためエタノール分

Fontaine et al.(2011)によって報告された GAG 精製法

1，2，2.5 倍量エタノール画分にはいずれも約 8 %のガラを参考にして，A. oryzae AGΔ 株の培養上清のエタノー

クトースと 5 %のマンノースおよび少量の GalN が含まル沈殿物を 150 mM 塩化ナトリウムで洗浄したところ，れていた（ Fig. 7A )．AGΔ 株由来 1.5 倍量エタノール画

沈殿物は 150 mM 塩化ナトリウムに完全に溶解した．そ分には 16 %の GalN と 17 %のガラクトースおよび 4 %別沈殿法を確立し，六つの画分を得た．AGΔ 株由来 0，0.5,

Fig. 7 Aggregation of mycelia of the AG-GAGΔ strain induced by ethanol-precipitated GAG. (A) Composition of thefractions obtained by ethanol precipitation. (B) Mycelial suspension of the AG-GAGΔ strain (25 μL) was added into a
mixture of 400 μL of water, 50 μL of 1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), and 25 μL of 2 mg/mL of the fractions preparedfrom the AGΔ or AG-GAGΔ strains, as indicated. Samples were incubated at 30 ℃ for 1 h with shaking and examined
under a stereomicroscope (magnification, ×8). (C) Mycelia incubated for 1 h in the presence of EtOH-precipitated GAG
were stained with soybean agglutinin–Alexa Flour 647 conjugates and obser ved under a confocal laser-scanningmicroscope (×1000). Scale bars, 20 μm. (D) Aggregation assay with the 1.5-vol. fraction from AGΔ was performed as in(A), with or without mycelial suspension of AG-GAGΔ. (Reproduced from Miyazawa et al., 2019)－ 29 －阿TABLE 2.

部

敬悦Degrees of deacetylation of N-acetylgalactosamine residues of galactosaminogalactanのマンノースが含まれていた（ Fig. 7A )．すなわち，こ介して菌糸凝集に寄与したと推察される．pH 8 においての画分に主に GAG とガラクトマンナンが含まれている

凝集体が形成されなかった要因については不明である．

と考えられた．AG-GAGΔ 株由来 1.5 倍量エタノール画
分には GalN が含まれておらず，8 %のガラクトースとGAG 依存的菌糸凝集への水素結合の寄与と脱アセチル

5 %のマンノースが含まれていた（ Fig. 7A )．AG-GAGΔ

化の重要性

株由来 1.5 倍量エタノール画分の構成糖から推定すると，

GAG 依存的な凝集体形成は GalN のアミノ基を介したAGΔ 株由来 1.5 倍量エタノール画分には GAG が約 25 %

水素結合に起因すると仮説を立てた．この仮説を検証す含まれていると考えられる．菌糸の凝集が in vitro で再るため，AGΔ 株由来 1.5 倍量エタノール画分を無水酢酸現されるか否かを評価するため，各画分を AG-GAGΔ 株

存在下（アセチル化)および非存在下で処理し，凝集性の菌糸と混合し，凝集体の形成を観察した．その結果，を評価した．N-アセチル化されていない GAG は Fig. 7B

AGΔ 株由来 1.5 倍量エタノール画分を加えた場合にのみと同様に AG-GAGΔ 株の菌糸を凝集させた一方，N-アセ凝集体が形成された（Fig. 7B)．この凝集体は SBA-Alexa

チル化により菌糸凝集は減衰した（ Fig. 9A )．N-アセチ

Fluor 647 により染色された（ Fig. 7C )．AGΔ 株由来 1.5

ル化された 1.5 倍量エタノール画分の脱アセチル化度は倍量エタノール画分では菌糸非存在下では凝集しなかっ2.0±0.5 %であり，N-アセチル化されていない 1.5 倍量た（ Fig. 7D )．コロイド滴定により決定した AGΔ 株由エタノール画分の脱アセチル化度（ 43.6±5.2 %)に比来 1.5 倍量エタノール画分に含まれる GAG 中の GalNAc

べて顕著に減少した（ P < 0.01; Table 2 )．これらのことの脱アセチル化度は 48.9±4.6 %であった（ Table 2)．

から，GalN のアミノ基は GAG 依存的な凝集に寄与してGAG 中の GalNAc 残基は A. fumigatus において部分的いることが示唆された．

に脱アセチル化され，正電荷を持つことが報告されていGAG 依存的凝集が水素結合によるものか否かを検証たことから(Fontaine et al., 2011)，GAG 依存的凝集体するため，水素結合を破壊する尿素の存在下で菌糸凝集形成の pH 依存性について評価を試みた．AGΔ 株由来 1.5

評価を行った．尿素非存在下では菌糸が凝集した一方，倍量エタノール画分を AG-GAGΔ 株の菌糸と混合した

尿 素 濃 度 依 存 的 に 凝 集 は 弱 ま っ た(Miyazawa et al.,際，pH 6，7 の場合には凝集が見られた一方，pH 4，5，8

2019)．以上のことから，GalN のアミノ基を介した水素

ではほとんど凝集しなかった（ Fig. 8A, B )．AG-GAGΔ結合の形成が GAG 依存的な凝集体形成に重要であるこ

株由来 1.5 倍量エタノール画分を加えた場合，どの pHとが強く示唆された．

条件でも菌糸は分散したままであった（ Fig. 8A, B )．また，GAG 非存在下において AG-GAGΔ 株の菌糸が pH 4,

AG-GAG 欠損株の組み換え酵素生産性の評価

5 において弱い凝集体が形成された（ Fig. 8B )．この理菌糸の分散性が A. oryzae のバイオマスおよび酵素生

由については不明であるが，低 pH で機能する未知の凝産の増加に寄与するか否かを検証した．YPM 液体培地

集因子が AG-GAGΔ 株に残存しているのかもしれない．

で培養したところ，AG-GAGΔ-cutL1 株は菌糸が分散し，これらのことから，低 pH 条件下での GAG の正電荷のAGΔ-cutL1 株では野生株に比べて小さな菌糸の塊を形成増加が GAG 間の静電反発を引き起こし，GAG 依存的なした（ Fig. 10A )．24 時間培養後の培養上清を SDS-PAGE

凝集体形成が妨げられたことが示唆された．中性 pH 付に供した結果，AG-GAGΔ-cutL1 株の分泌タンパク質プ

近では正電荷が弱いため，GAG が非静電的相互作用を

ロファイルは WT-cutL1 株や AGΔ-cutL1 株に比べて増加－ 30 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発していた（ Fig. 10B )．また，バイオマスやクチナーゼ

から，AG や GAG をどちらか一方もしくは両方を有すの 分 泌 生 産 量 は い ず れ も，AG-GAGΔ-cutL1 株 とる糸状菌において，バイオマスや組換え酵素の生産性がAGΔ-cutL1 株で野生型株に比べてそれぞれ約 10 倍およ

AG や GAG の欠損による菌糸分散性によって増加する

び約 4 倍に増加していた（ Fig. 10C, D )．これらのこと可能性が示唆された(Miyazawa et al., 2019)．

Fig. 8 pH-dependence of GAG aggregation. Mycelial suspension of the AG-GAGΔ strain (25 μL) was added to450 μL of buffers with different pH and 25 μL of the 1.5-vol. EtOH fraction prepared from the AGΔ or AG-GAGΔ
strain as indicated. Samples were incubated at 30 ℃ for (A) 0 h and (B) 1 h with shaking and examined under astereomicroscope (magnification, ×8). (Reproduced from Miyazawa et al., 2019)－ 31 －

阿

部

敬

悦

Fig. 9 Mycelial aggregation in the presence of (A) acetylated GAG or (B) urea. (A) The amino groups of ethanol-precipitated GAG were acetylated with acetic anhydrate. Mycelial suspension of the AG-GAGΔ strain (25 μL)
was added to a mixture of 450 μL of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and 25 μL of the 1.5-vol. EtOH
fraction prepared from AGΔ (acetylated or not). (B) Mycelial suspension of the AG-GAGΔ strain (25 μL) was
added to a mixture of 450 μL of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0, 1, 2, 4, or 8 M urea, and25 μL of the 1.5-vol. EtOH fraction prepared from the AGΔ strain. Samples were incubated at 30 ℃ for 1 h withshaking and examined under a stereomicroscope (magnification, ×8). (Reproduced from Miyazawa et al., 2019)－ 32 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発

Fig. 10

Recombinant CutL1 production by the W T-cutL1, AGΔ-cutL1, and AG-GAGΔ-cutL1 strains inliquid culture. (A) Phenotypes of the WT-cutL1, AGΔ-cutL1, and AG-GAGΔ-cutL1 strains under liquid
culture conditions. Conidia (final concentration, 1×104/mL) of each strain were inoculated into YPM medium
and rotated at 100 rpm at 30 ℃ for 24 h. (B) Secreted protein profiles of each strain. Lanes W, D1, D2: proteins
precipitated from culture supernatants (250 μL) of wild-type-cutL1, AGΔ-cutL1, and AG-GAGΔ-cutL1 strains,respectively; lane C: 1 μg of purified CutL1. (C) Mycelial dry weight of each strain. Mycelia grown for 24 h
were collected by filtration through Miracloth, dried at 70 ℃ and weighed. (D) Concentration of secreted
CutL1 in culture supernatants. In (C) and (D), error bars represent the standard error of the mean calculated
from three replicates (*p < 0.05; **p < 0.01). ns, not significant. (Reproduced from Miyazawa et al., 2019)－ 33 －

阿

部

敬

悦

菌糸分散麹菌 A. oryzae AG-GAGΔ 株と野生型株の培養
液の流体特性解析

してスリップしており培養槽上部まで培養液流動が形成

ジャー発酵槽（ 3 L )においても CutL1 生産量はこれまい菌糸完全分散性 AG-GAGΔ 株では培養槽内全域に渡るでの結果が再現され，菌糸完全分散性の AG-GAGΔ 株で流動を形成することが推測された(Fig. 11)．CFD シミュ

は野生型株に比べて約 2 倍高かった．CFD シミュレー

レーションの結果は，野生型株では培養液の下層に通気

ション解析の結果，非ニュートン性の強い野生型株の培が留まるの対して，AG-GAGΔ 株では通気が培養液全体

養液の流動は翼周りを中心としてその外側の培養液に対に拡散することを示している．

Fig. 11

されなかったが，同じ非ニュートン性流体でも粘性が低

CFD simulation results of WT and AG-GAGΔ strains in culture. (pass line)
WT and (B) AG-GAGΔ strains were grown in a jar fermenter (3 L) with 1.5 L YPD medium.
Conidia (final concentration, 1×10 5/mL) of each strain were inoculated into YPD medium androtated at 660 rpm at 30 ℃ for 60 h. The calculation model is the turbulence-model (Realizablek-e). Red circles indicate the reactor upper space, and the AG-GAGΔ strain has better flow
than the WT strain in the reactor upper space.

－ 34 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発

考察

排出されると予想されている．細胞外に出た AG 鎖は細胞外ドメインによって糖転移されて相互に連結し，成熟

α -1,3 -グルカン(AG)の病原性に関する機能について
は A. fumigatus に お い て(Beauvais et al., 2013, Maubon
et al., 2006, Beauvais et al., 2005)，菌糸接着における役割については A. fumigatus(Henry et al., 2012, Fontaine

AG 鎖 に な る と 考 え ら れ る(Yoshimi et al., 2017)．S.
pombe の温度感受性変異体 ags1-1ts は細胞外ドメインのG696S に変異を有し，おそらく糖転移能の欠失により未成熟の短い α-グルカン鎖を合成する(Grün et al., 2005)．

et al., 2010), A. nidulans(He et al., 2014, Yoshimi et al.,2013)お よ び A. oryzae(Zhang et al., 2017, Miyazawa et

G696 は A. nidulans の AgsA, AgsB にも保存されている

al., 2016)において報告されてきたが，糸状菌の AG の化
学構造については Choma et al.(2013)らによる A. wentii

data)．agsAOE 株と agsB OE 株の間のアルカリ可溶性グルにおけるアルカリ可溶性グルカンの化学構造およびムタの機能の違いに起因するのかもしれない．この違いの要が， そ の 周 囲 の 残 基 の 保 存 性 高 く な い(unpublished
カンの分子量の違いは，両合成酵素間の細胞外ドメイン

ナーゼ（ α -1,3 -グルカナーゼ ; Streptococcus mutans の繁因を明らかにするためには，AgsA と AgsB のさらなる殖を防ぐための歯磨き粉の成分として利用)の基質とし生化学的および酵素学的解析が必要である．

ての特性が解析されたのが唯一の例である．A. nidulans

蛍光顕微鏡観察により，AG は野生型株や agsB OE 株でには二種の AG 合成酵素遺伝子（agsA, agsB )が存在する．

は細胞壁最外層に局在しているのに対し，agsAOE 株で栄養菌糸においては，主に AgsB によって AG が合成さは細胞壁内層に位置していることが示唆された（ Fig. 4,

れ て い る(He et al., 2014, Yoshimi et al., 2013)． ま た，

5 )．この違いは，(1)直接的に AG の空間分布に影響をagsA 遺伝子は分生子形成に関与すると考えられている(He et al., 2014)．しかしながら，agsA の詳細な機能や，与える AgsA と AgsB の酵素学的特性の違い，(2)水可溶AgsA, AgsB により合成される多糖の化学構造について

違い，のいずれかにより説明できると考えられる．細胞は不明であった．

壁多糖は一般的に菌糸の極性生長時に菌糸先端で合成さ性のような AG の分子量に影響される物理化学的特性の本 研 究 で は，agsA, agsB の 高 発 現（ agsAOE, agsB OE )れる(Riquelme et al., 2018)．細胞膜上で AG が生合成さ株を作製し，これらの株の細胞壁に含まれる多糖の化学

れると，糖鎖は膜外空間に放出され，不溶化および固定構造を詳細に解析した．野生型株や agsB OE 株の菌糸は化 さ れ て 細 胞 壁 の 一 部 に な る と 考 え ら れ る(Latgè &液体振盪培養において緊密な塊を形成した一方，agsAOE

Beauvais, 2014)．分子量の大きな多糖は一般的に水に対株では密度の低い菌糸塊を形成しながら生育した

してより不溶性である(Guo et al., 2017)．そのため，分（ Fig. 1 )．アルカリ可溶性グルカンの種々の化学構造解子量の大きな AG は細胞壁の内層に局在した一方，分子析により，野生株，agsAOE 株および agsB OE 株のアルカ量が小さいと細胞壁の外層に分布したものと考えられ

リ 可 溶 性 グ ル カ ン は 主 に AG か ら 成 る こ と（ Fig. 2;

る．agsB OE 株の細胞中での低分子量のアルカリ可溶性

Miyazawa et al., 2018 )，アルカリ可溶性グルカンの Mp

グルカンが占める割合は，agsAOE 株よりも多く，このは 野 生 株 や agsB OE 株 で は そ れ ぞ れ 150,000 お よ び

370,000 であった一方，agsA

ことが agsB OE 株の細胞壁において AG がより外層に呈株では 1,480,000 であるこ

示された要因である可能性が考えられる（Fig. 3 )．また，とが示された（ Fig. 3, Table 1 )．また，アルカリ可溶性

α-1,3 -グルカナーゼ非処理時の agsAOE 株の菌糸では，細胞の輪郭に沿って弱い AGBD-GFP の蛍光が観察されたOE

グルカンの Smith 分解により，野生株，agsAOE 株およびagsB OE 株のアルカリ可溶性グルカンはいずれも，約 200
残基の 1,3 -結合の α -グルコースからなるサブユニット

が（ Fig. 4 )，これは低分子量で細胞表層に位置する AGが少量存在することに起因しており，その結果弱い菌糸構造を有することが示された（ Table 1 )．agsAOE 株の凝集（ Fig. 1 )を示した可能性が考えられる．ΔamyG 株

AG サブユニットの数は agsB OE 株の約 4 倍であった .

の AGBD-GFP による AG の蛍光標識の結果も，この説

agsAOE 株と agsB OE 株の間でアルカリ可溶性グルカンの分子量が異なる要因については不明のままである．S.

明 を 支 持 し て い る(Miyazawa et al., 2018)． 最 近，A.

pombe の AG 合成酵素 Ags1 は細胞外ドメイン，細胞内ドメインおよび多重膜貫通ドメインの 3 つのドメインから成る(Hochstenbach et al., 1998)．A. nidulans の AgsA,

fumigatus の細胞壁の分子構造が固相 NMR 法により解析され，AG が細胞壁の外殻と細胞内層に局在することが報告された(Kang et al., 2018)．A. nidulans の野生株において，二つの酵素により合成される AG の細胞壁中

AgsB にもこれらのドメインが保存されている(He et al.,の空間分布が異なることが想定されるが，これは AG の2014)．1,3 - 結合の α -グルカン鎖は細胞内ドメインによ

分子量の違いに起因するのかもしれない．異なる分子量り合成され（ 1,4 -結合の α -グルカンのプライマーを伴うの AG の局在と物理化学的特性との関係性を明らかにす可能性もある)，多重膜貫通ドメインを通って細胞外にるためには，さらなる解析が必要である．

－ 35 －

阿

部

敬

悦

真 菌 に お け る AG の 生 合 成 に は，AG 合 成 酵 素 に 加が な か っ た． 本 研 究 で A. oryzae に お い て GAG 欠 損

え て 細 胞 内 α -アミラーゼ と UTP-glucose-1-phosphate（ GAGΔ ) 株 お よ び AG と GAG の 両 方 が 欠 損 し たuridylyltransferase も必要である(He et al., 2014, Camacho

AG-GAG 欠損（ AG-GAGΔ )株を作製し，液体振盪培養

et al., 2012, Marion et al., 2006)．細胞内 α -アミラーゼは
AG 合成に必要な α -1,4-グルカノオリゴ糖プライマーを時の表現型を観察した．その結果，AG-GAGΔ 株は菌糸が完全分散したのに対し，GAGΔ 株は野生株に比べて菌合 成 す る と 考 え ら れ て い る(Camacho et al., 2012, van

糸が大きなペレットを形成しながら生育したことから

der Kaaij et al., 2007, Marion et al., 2006)．A. niger の細（ Fig. 6 )，A. oryzae においては AG だけでなく GAG も菌

胞内 α -アミラーゼ AmyD はデンプンを加水分解して主糸のペレット形成に寄与することが明らかとなった．

に マ ル ト ト リ オ ー ス を 生 成 す る(van der Kaaij et al.,

AG-GAGΔ 株の菌糸と部分精製した GAG を混合する

2007)．A. nidulans の amyG 遺伝子の破壊により，細胞

こ と に よ り in vitro の 凝 集 体 形 成 の 観 察 に 成 功 し た

壁 AG は顕著に減少する(He et al., 2014)．A. wentii のア（ Fig. 7 )．この in vitro の菌糸凝集解析から，GAG 存在

ルカリ可溶性グルカンは 1,4 -結合の α -グルコース残基か下において，pH 6，7 では AG-GAGΔ 株の菌糸はより凝らなる短いスペーサーを有し，AG サブユニット同士を集した一方，酸性 pH 条件下ではその凝集が弱まった

隔てている(Choma et al., 2013)．本研究で，A. nidulans（ Fig. 8 )．GAG 生合成遺伝子クラスターにおいて，agd3のアルカリ可溶性グルカンは約 90 %の 1,3 -結合の α-グ

は N-アセチルガラクトサミン脱アセチル化酵素をコー

ルカンと少量の Smith 分解可能なグルカン（おそらく 1,4-

ドしている(Lee et al., 2016)．また，A. fumigatus にお結合の α -グルカン)からなり，AG サブユニットは 1,4-

いて，GAG 中の GalNAc 残基は一部が脱アセチル化さ結合のグルカンによって隔てられている可能性を示したれていることが報告されている(Fontaine et al., 2011)．

（ Table 1, Fig. 3; Miyazawa et al., 2018 )．A. nidulans のA. fumigatus において，agd3 遺伝子の破壊により GAGの脱アセチル化が起こらなくなり，細胞壁への GAG のΔamyG 株のアルカリ可溶性グルカンの分子量は 93,500
で，親株（ ABPU1 ΔligD )に比べて顕著に小さかった結合が欠失したことが報告されている(Lee et al., 2016)．

（ Miyazawa et al., 2018 )．AmyG は AG のスペーサーとしまた，GalNAc 残基の脱アセチル化により生じたアミノて機能するオリゴ糖を合成すると考えられる．A. nidulans

基の正電荷は菌糸の負電荷表面への接着に必要で(LeeΔamyG 株 の ア ル カ リ 可 溶 性 グ ル カ ン は Smith 分 解 によって，非分解時より分子量が減少した（ unpublishedet al., 2016)，酸性 pH 条件では静電反発を介して菌糸凝集を妨げていると考えられる．このアミノ基は中性 pH

data )．このことは，AmyG に加えて未知の因子もスペー付近（特に GAG の等電点付近)ではプロトンが付加さ

サー合成に関与する可能性が考えられる．

れていない状態である．このことから，中性 pH 付近で

A. oryzae においては AG 欠損株で野生株に比べて小さな菌糸の塊を形成したが，A. nidulans とは異なり，菌糸GAG が接触することが，GAG 中の GalN のアミノ基と，分散には至らなかった(Miyazawa et al., 2016)．すなわ

鎖中のヒドロキシ基との間の水素結合形成の引き金とち，A. oryzae には AG 以外の菌糸接着因子が残存していなっている可能性が考えられる．AGΔ 株由来の GAG のると考えられた．本研究では，残存する接着因子として脱アセチル化度(DD)は約 50 %であった（ Table 2 )．無細胞外分泌多糖の構成成分である GAG に着目し解析を水酢酸によりアセチル化した AGΔ 株由来 GAG はほとん

細胞壁表層のグルカンや細胞壁に接着している GAG 糖行った．( Lee et al., 2016)は A. fumigatus において GAG

ど菌糸凝集を誘導せず（ Fig. 9 )，DD も非アセチル化時の 生 合 成 が 遺 伝 子 ク ラ ス タ ー を 成 す 5 遺 伝 子（ gtb3,と比べて顕著に減少した（ Table 2 )．これらの結果は，

agd3, ega3, sph3, uge3 )によって制御されており，類似の 遺 伝 子 ク ラ ス タ ー が A. niger, A. nidulans, Botrytis

凝集に重要であることを示唆している．さらに，GAG

GAG の GalNAc 残基の脱アセチル化が GAG 依存的菌糸依 存 的 な 菌 糸 凝 集 は 8M 尿 素 存 在 下 で 阻 害 さ れ た

cinerea などいくつかの子嚢菌にも保存されていることを報告している．本研究において，A. oryzae のゲノム

（ Miyazawa et al., 2019 )．このことは，アミノ基のアセ上にもこのクラスターが保存されていることが明らかにチル化により，GAG とグルカンおよび細胞壁に接着しなった（ Miyazawa et al., 2019 )．

た GAG との間の水素結合が形成されなくなったことをGAG は A. fumigatus においてプラスチックやフィブ

示唆している．水素結合は中性 pH 付近での GAG 依存

ロネクチン，上皮細胞への接着に寄与し，病原性に関す的菌糸凝集の主要な力であると考えられる．中性 pH 付

る 機 能 を 有 す る こ と が 知 ら れ て い る(Gravelat et al.,

近で GAG を添加し凝集した菌糸は，酸性 pH（ pH 4.0 )2013)．GAG はまた，プレート培養時のバイオフィルムに移しても凝集体は分散しなかったことから（ data not形成にも関与する(Gravelat et al., 2013)．しかしながら，

shown )，一旦凝集体が形成されると GAG 間の接着が酸

これまで GAG と菌糸凝集の関係性については全く報告

性 pH 条件に耐性であることを示唆している．

－ 36 －

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発

Aspergillus 属菌を含む糸状菌を用いた発酵産業において，菌糸ペレットの形成はその内部が不活性状態となる

されないが，AG-GAGΔ 株ではスリップが起こらずに槽ことから(Driouch et al., 2010)，
生産性の制限要因となっていた．A. niger において，ペレットの大きさを最小化す

Aspergillus 属糸状菌の菌糸接着因子である細胞表層多糖の機能を明らかにし，菌糸ペレットの制御を行うことにるためにチタン粒子が用いられた例がある(Driouch et al.,

成功した．AG および GAG は比較的広範に糸状菌に分2012)．このような物理的な手法は効果的であるが，培地布しており，本技術を適用することで種々の糸状菌のペの選択を制限してしまう．AG-GAGΔ 株は AGΔ 株や野生レット形成を制御し，発酵生産の生産性を改善できるも株に比べて菌体生育量やクチナーゼの生産量が顕著に増のと思われる．

内全体が攪拌されることが示唆された．以上，我々は加した．すなわち，菌糸ペレット形成因子の制御が発酵

本助成で得られた研究成果の報告

産業への革新的なアプローチとなることが期待される．

要

約

糸状菌は液体培養によるタンパク質・化成品の工業生産に利用される．糸状菌を工業生産用に大量培養する場
合，糸状に生育した菌糸が絡まり合い，塊を形成するために，その高密度培養が困難となっていた．我々はモデ
ル糸状菌 A. nidulans において細胞壁多糖 α -1,3 -グルカン(AG)が菌糸接着因子であることをすでに見出していた．本研究での成果をまとめると以下のようになる．
(1)
A. nidulans の agsA と agsB の単独高発現株の AG の分子量が夫々 140 万，40 万であることを発見した．
(2)AGの細胞壁中の分布解析の結果，AgsA の合成する AG は細胞壁内層に AgsB の合成する AG は外層に分布し，主に外層に分布する AG が菌糸接着に寄与することが予想された．(3)産業用糸状菌の麹菌 A. oryzae では細胞壁外層多糖の AG と細胞外マトリックス多糖ガラクトサミノ
ガラクタン（ GAG )の 2 種が菌糸接着因子であることを見出した．すなわち，麹菌野生型株が菌糸塊(ペレット)を 形 成 す る の に 対 し，AG と GAG の 二 重 欠 損 株（ AG-GAGΔ 株)では菌糸が均一分散し，菌体量が増加
して高密度培養に適することを発見した．
(4)麹菌精製
GAG と菌糸完全分散性の AG-GAGΔ 株の菌糸を用いてin vitro で GAG による菌糸接着能を解析した．その結果，精製 GAG を AG-GAGΔ 株菌糸に添加して菌糸凝集の再現に成功した．GAG 中のガラクトサミン(GalN)のアミノ基をアセチル化すると菌糸凝集能が低下し，GalN のアミノ基が水素結合を介して菌糸凝集に寄与することが示 唆 さ れ た．(5)麹 菌 の 野 生 型 株，AGΔ 株 及 び
AG-GAGΔ 株 の 酵 素 生 産 性 を フ ラ ス コ で 評 価 し，
AG-GAGΔ 株の高い酵素生産性が確認された．(6)野生型株と AG-GAGΔ 株を 3 L ジャーで 660 rpm, 60 時間培養した結果，AG-GAGΔ 株の酵素生産量が顕著に高かった．
培養液の流体特性を解析したところ，AG-GAGΔ 株は野生株と比較して培養液の非ニュートン性が低下し，野生型株では培養槽内の回転翼の近傍の培養液とその外側の培養液の間でスリップが起こるために培養槽全体が攪拌

口頭発表
1) 小泉亜未, 尾形慎, 矢野成和, 宮澤拳, 吉見啓, 佐野元昭, 阿部敬悦. 2020. 麹菌の細胞壁α -1,3 -グルカン生合成に関与するα -アミラーゼAgtAの酵素学的性質の解明. 日本農芸化学会2020年度大会 3月25-28日, 福岡2) 宮澤拳, 竹内歩, 小泉亜未, 吉見啓, 佐野元昭, 中島佑, 阿部
敬悦. 2020. 糸状菌の細胞壁多糖α -1,3 -グルカンの生合成における細胞内α -アミラーゼ遺伝子の機能解析. 日本農芸化学会2020年度大会 3月25-28日, 福岡3) 織 田 隆 太 郎 , 宮 澤 拳 , 吉 見 啓 , 阿 部 敬 悦 . 2 0 1 9 . 麹 菌
Aspergillus oryzaeにおける液体振盪培養時の菌体への刺激がもたらすα -1,3 -グルカン合成量への影響の解析. 日本農芸化学会2019年度東北支部大会 11月9日, 弘前4) 宮澤拳, 山下雄章, 小泉亜未, 吉見啓, 中島佑, 阿部敬悦.
2019. モデル糸状菌Aspergillus nidulansの細胞壁α -1,3 -グルカン生合成に対するα - amylase遺伝子amyD, amyGの寄与の解析. 日本農芸化学会2019年度東北支部大会 11月9日,
弘前5) 宮澤拳. 2019. 糸状菌の液体培養時の菌糸凝集メカニズムの解明とその発酵生産への応用. 日本農芸化学会東北支部
若手奨励賞受賞講演 11月8日, 弘前6) 宮澤拳, 吉見啓, 中島佑, 阿部敬悦. 2019. 麹菌における細胞
外分泌多糖ガラクトサミノガラクタンによる菌糸凝集メ
カニズムの解析. 第19回糸状菌分子生物学コンファレンス
11月6-7日, 札幌7) 市川暉, 宮澤拳, 吉見啓, 古明地敬介, 加藤好一, 阿部敬悦.
2019. 麹菌Aspergillus oryzae菌糸完全分散変異株の液体培
養における流体特性の解析. 第71回日本生物工学会大会
9月16-18日, 岡山8) 宮澤拳, 吉見啓, 中島佑, 阿部敬悦. 2019. 麹菌における細胞
外分泌多糖ガラクトサミノガラクタンを介した菌糸塊形
成機構の解析. 第67回日本応用糖質科学会2019年度大会
9月11-13日, 岐阜
9) 阿部敬悦. 2019. 糸状菌の細胞表層を介した菌糸接着機構とその制御による酵素生産技術の開発. 第21回生体触媒化
学シンポジウム 8月29-30日, 金沢10) 山下雄章, 吉見啓, 宮澤拳, 小泉亜未, 矢野成和, 佐野元昭,
阿部敬悦. 2019. モデル糸状菌Aspergillus nidulansのGPIア
ンカー型α -アミラーゼAgtAによる細胞壁多糖α -1,3 -グルカ
ンの分子量制御. 日本農芸化学会2019年度大会 3月24-27
日, 東京
11) 宮澤拳, 吉見啓, 矢野成和, 佐野元昭, 阿部敬悦. 2019. 麹菌
Aspergillus oryzaeの液体振盪培養における菌糸塊形成メカ
ニズムの解析. 日本農芸化学会2019年度大会 3月24-27日,
東京－ 37 －

阿部12) Miyazawa, K., Yoshimi, A., Yamashita, T., Koizumi, A., Yano,
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Aspergillus nidulans. The 16th International Aspergillus
Meeting (Asperfest16) March 11-12, Pacific Grove, USA
13) 宮澤拳, 吉見啓, 山下雄章, 小泉亜未, 矢野成和, 笠原紳, 佐野元昭, 阿部敬悦. 2018. 糸状菌Aspergillus nidulansの細胞壁多糖α -1,3 -グルカンの分子量は細胞壁中の局在と菌糸接着性に影響する. 第18回糸状菌分子生物学コンファレンス
11月15-16日, 長岡14) 小泉亜未, 矢野成和, 宮澤拳, 吉見啓, 佐野元昭, 阿部敬悦.
2018. 麹菌Aspergillus oryzaeのGPIアンカー型α -アミラーゼ
AgtAの酵素学的性質の解明. 第67回日本応用糖質科学会平成30年度大会 9月10-12日, 秋田15) 宮澤拳, 吉見啓, 小泉亜未, 笠原紳, 佐野元昭, 阿部敬悦.
2018. モデル糸状菌Aspergillus nidulansの細胞壁多糖α -1,3 グルカンの化学構造と菌糸接着性. 第67回日本応用糖質科
学会平成30年度大会 9月10-12日, 秋田16) 吉見啓. 2018. 糸状菌の細胞表層多糖解析による菌糸接着の理解と高密度培養への応用. 第7回応用糖質フレッシュ
シンポジウム. 9月9日, 秋田17) 宮澤拳, 吉見啓, 古明地敬介, 田畑風華, 佐野元昭, 阿部敬悦.
2018. 麹菌Aspergillus oryzaeの液体培養における菌糸完全
分散株の作製とその酵素生産への応用. 第70回日本生物工学会大会 9月5-7日, 大阪18) 古明地敬介, 宮澤拳, 吉見啓, 市川暉, 佐野元昭, 阿部敬悦.
2018. 麹菌Aspergillus oryzae菌糸完全分散変異株の液体培
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3) 吉見啓, 宮澤拳, 小泉亜未, 阿部敬悦. 2019. 糸状菌の細胞表層多糖解析による菌糸接着の理解と高密度培養への応用.
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162-167, CMC出版, 東京

謝辞本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心よりお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力をいただいた金沢工業大学ゲノム
生物工学センター 佐野元昭 教授，山形大学工学部 矢野成和 准教授，宮城大学食産業学部 笠原紳 教授，佐竹機械化学工業株式会社

加藤好一 攪拌技術研究所所長，

東北大学大学院農学研究科学生諸氏に感謝いたします．

文

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IFO Res.Commun. 34
41-56, 2020

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わる
シグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明
小

林

哲

夫

名古屋大学大学院生命農学研究科〒464-8601

名古屋市千種区不老町

Elucidation of signal transduction and gene regulation mechanisms related
to priority determination of polysaccharide utilization in filamentous fungi
Tetsuo Kobayashi
Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University
Furo-cho, Chikusa-ku, Nagoya 464-8601
Production of polysaccharide degrading enzymes in filamentous fungi is generally under regulation of carbon
catabolite repression (CCR), however, sensitivity to CCR differs depending on the enzyme type; for example,
cellulases are more sensitive than amylases. Strength of CCR also differs depending on the repressing carbon
source. Thus, the production is finely regulated although the mechanisms underlying the complex regulation
remains to be elucidated. CCR is mediated by the transcription factor CreA as well as by PkaA (cAMP-dependent
protein kinase) and GanB (Gα; α-subunit of trimeric G protein) in Aspergillus nidulans. The deubiquitinase CreB is
also required for CCR. To further understand mechanisms of CCR, we compared the effects of creA deletion withdeletion of pkaA and ganB genes as well as creB. This study revealed that PkaA and GanB participate in CreAindependent CCR and that contribution of CreA, PkaA, and GanB in CCR differs depending on the inducers,
repressing carbon sources, the enzyme types and culture conditions (plate or submerged). It also revealed that
CreB functions independently of GanB. In addition, we identified a promising candidate of PkaA substrate that
regulates CCR.
Key words: Aspergillus, polysaccharide degrading enzyme, carbon catabolite repression, cAMP signaling緒

言と が 報 告 さ れ た（ Ebbole, 1998; Tonukari et al., 2003;
Tudzynski el al., 2000 )．CreA が転写抑制するのは多数

微生物は一般的にカーボンカタボライト抑制（ carbonの炭素源代謝に関わる遺伝子であり，その中には産業上

catabolite repression, CCR )というシステムを持ってお重要なアミラーゼ，セルラーゼ，キシラナーゼ，マンナ

り，これにより容易に代謝できる炭素源の存在下では，

ナーゼなどの多糖分解酵素も含まれる．CreA の活性はほかの炭素源の資化が抑制される．従って，CCR は代

細胞質と核の間の移動により制御されており，抑制炭素

謝の容易さに基づいて炭素源資化の優先順位を決定する源の存在下では核に局在するが，非存在下では核から排システムである．糸状菌は極めて多種の炭素源を利用可

出されて分解される（ Brown et al., 2013; de Assis et al.,能であるため，CCR も複雑であることが予想される．

2015; Tanaka et al., 2018 )．この核からの排出にはプロ

糸状菌の CCR システムを構成する因子として最初に同テインキナーゼの SnfA や SchA が関与している（ Brown

定 さ れ た の は，Aspergillus nidulans の 転 写 抑 制 因 子
CreA であり（ Dowzer & Kelly, 1989 )，その後ほかの糸et al., 2013 )．一方，cAMP 依存性プロテインキナーゼ
PkaA は SnfA の機能を阻害すると報告されている（ de状菌においても本因子のオルソログが CCR に関わるこAssis et al., 2015 )．
CreA 依存的システムが CCR の唯一のシステムではな

E-mail: koba@nuagr1.agr.nagoya-u.ac.jp
共同研究者:國武絵美（三重大学大学院生物資源学研究科)

い．脱ユビキチン化酵素 CreB やこれと相互作用する
CreC をコードする遺伝子の機能欠損で CCR からの脱抑－ 41 －

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実験方法

制 が 起 こ り（ Boase et al., 2003; Lockington & Kelly,
2002 )，これらは当初は CreA の安定性を制御すると考えられていた．しかし，最近の報告では CreA のユビキ

CCR 関連因子の遺伝子破壊

チン化が見られないことや（ Alam el al., 2017 )，creB のAspergillus nidulans ABPU1 株（ biA1 pyrG89 ; wA3 ;変異や破壊が CreA の安定性に影響を与えないこと（Ries

argB2 ; pyroA4 ) を 親 株 と し て 遺 伝 子 破 壊 を 行 っ た（ Motoyama et al., 1997 )．本株は，ビオチン，ウリジン，et al., 2016; Tanaka, et al., 2018 )，creA と creB の二重破壊株で単独破壊株より高いアミラーゼ，キシラナーゼ，
β -グルコシダーゼ生産が見られることなどから（Ichinose
et al., 2014, 2018 )，CreA と CreB は独立して CCR に関与すると考えられている．creB や creC 変異のサプレッ

アルギニン，ピリドキシン要求性の変異株である．A.
nidulans ABU 株は ABPU1 株の pyroA4 を野生型 pyroA と交換した株である．遺伝子破壊用のプラスミド作製は以下のように行った．まず，Aspergillus genome database

サー変異株から同定されたアレスチン様タンパク質（ AspGD, http://www.aspgd.org )上の配列データをもCreD とユビキチン化酵素 HulA も CCR に関わっているとにプライマーを設計し，候補遺伝子の構造遺伝子部分（ Boase & Kelly, 2004 )．

の上流約 1 kb と下流約 1 kb，およびマーカー遺伝子をこれまでに糸状菌における CCR に関して数多の報告

KOD Fx Neo DNA ポリメラーゼ（東洋紡㈱，大阪)をがあるが，ほとんどがグルコースを代表的な抑制炭素源として用いている．しかし，ほかにも多くの炭素源がもちいて PCR で増幅し，これらを制限酵素で 1 カ所切
断した pBluescript II KS(+)と混合し，GeneArt Seamless

CCR を引き起こし，その程度は抑制炭素源の種類や標

Cloning and Assembly（ Thermo Fisher Scientific Inc.

的遺伝子によって変化する．なぜ，このようなことが起

Waltham, MA, USA )あるいは In-Fusion HD Cloning Kit

こるかについては，CCR に関する知見が十分でないた（タカラバイオ㈱，滋賀)で処理した．これを用いて E.

め明らかでない．我々は，PkaA が明らかに CreA とは独立して CCR に関わることを見出したため，本研究でcoli XL1-Blue あるいは DH5α を形質転換して，破壊カセットを持つプラスミド（破壊用プラスミド)を得た．

は cAMP シグナリングと CreA による CCR との違いや

破壊カセットは上流断片と下流断片の間にマーカー遺伝

CreB との関係について，複数の抑制炭素源や複数の多子が挿入された構造を持っている．ただし，pkaA 破壊株

糖分解酵素を対象として検討した．

については従来の制限酵素とリガーゼを用いた方法で破壊 用 プ ラ ス ミ ド を 得 た．マ ー カ ー 遺 伝 子 と し て は A.
nidulans の pyroA あるいは A. oyrzae の pyrG 遺伝子を用いた．

Fig. 1

CCR mechanism in A. nidulans. HxkA; hexokinase, GlkA; glucokinase, GPCR; G-protein coupled
receptor, PkaR; regulatory subunit of PkaA. α, β, and γ denote α, β, and γ, subunits of trimeric
G protein, namely GanB, SfaD, and GpgA, respectively.

－ 42 －

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わるシグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明

破壊用プラスミドを制限酵素で一カ所切断し，これを酵素活性測定プロトプラスト法により A. nidulans に導入した．ピリ

前培養した菌体を誘導物質，抑制物質を含む最少培地

ドキシン要求性あるいはウリジン要求性が回復した形質に植菌し，37 ℃で 6 時間および 12 時間培養後の培養上転換株の中から，相同組み換えにより標的遺伝子が破壊

清の酵素活性を測定した．キシラナーゼでは誘導物質とされた株を PCR により選択し，最終的にサザンブロッ

して 1 %キシロース，抑制物質として 1 %グルコースをティングにより目的部位以外に破壊カセットの挿入がな用い，マンナナーゼでは誘導物質として 0.5 % locust

いことを確認した．なお，creA/pkaA 二重破壊株，およbean gum，抑制物質として 1 %グルコースを用いた．活び ganA ，ganB，fadA 破壊株の作製にはマーカーリサ

性測定の基質としてはキシラナーゼでは 0.5 % Azo-Xylan，

イクリング法を用いた（Kunitake et al., 2019 )．マーカー

マンナナーゼでは 0.5 % Azo-Carob Galactomannan を用

リサイクリング用に特別に設計した破壊株カセットは，い，50 mM コハク酸緩衝液（ pH 5.5 )中 40 ℃で反応さ

上流，AopyrG，上流，下流と順次連結した構造を有しせた．1 単位の活性を 595 nm の吸光度を一分間に 0.1 上ている．これを用いてウリジン要求性の回復により第一昇させる酵素量と定義した．

段階の破壊株を取得し，フルオロオロチン酸耐性を指標として二つの上流配列間の相同組み換えで AopyrG が脱転写解析

落した破壊株を取得した．すなわち，上記の破壊株はウ前培養した A. nidulans の菌体をフィルターろ過によリジン要求性である．creA/ganB 二重破壊株は，このより集菌し，炭素源を含まない最少培地でよく洗浄した後，うに作製した ganB 遺伝子破壊株を親株とし，AopyrG を

湿重量 0.4 g の菌体を最少培地 40 mL に懸濁し，37 ℃でマーカーとして creA 遺伝子を破壊することによって作本培養した．その後フィルターろ過で菌体を回収し，液製した．

体窒素で凍結した．凍結菌体を凍結破砕器具 SK-ミル（フナ コ シ ㈱， 東 京 ) を 用 い て 粉 砕 し，TRIzol reagent

プレートアッセイ（ Thermo Fisher Scientific Inc. )を用いて total RNA を抽多糖と抑制炭素源を含む最少培地に各菌株の分生子懸出した．cDNA 合成のための逆転写反応には ReverTra

濁液（分生子数 10 4 )をスポットし，37 ℃で 3 日間培養

Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（東洋紡

した．抑制炭素源の濃度は 1 %とした．また，コロニー㈱)を使用した．RT-qPCR の機器には StepOne（Thermoの巨大化を防ぐために 0.1 %の TritonX-100 を培地に添

Fisher Scientific Inc. )， 反 応 試 薬 に は THUNDERBIRD

加した．アミラーゼでは 1 %デンプンを用い，培養後にSYBR qPCR（東洋紡㈱)を使用した．内部標準遺伝子

デンプンの分解をヨードデンプン反応により検出した．

として actin 遺伝子（ actA )を用い，定量対象遺伝子のセルラーゼでは，多糖として 1 %のカルボキシメチルセ

actA に対する相対量を算出した．

ルロース（ carboxymethyl cellulose, CMC )を用い，培養後にプレートを 0.1 %のコンゴレッド（ Congo Red )結果および考察

で染色，その後 0.8 M NaCl 溶液で脱色し，CMC 分解の指標となるハローを可視化した．キシラナーゼでは，0.05 % AZCL -キシランを用い誘導物質として 10 mM キ

cAMP シグナリング経路による CreA 非依存的な CCR

シロースを添加した．AZCL -キシランの分解により青CreA は CCR に関与する転写抑制因子であり，グル色のハローとしてキシラナーゼ活性が可視化される．マコースのような易資化性の炭素源の存在下で他の炭素源

ンナナーゼでは，ガラクトマンナンを主成分とする資化に関わる多様な遺伝子の発現抑制に関与する．しかlocust bean gum を 0.5 %の濃度で用い，培養後にエタし，creA 遺伝子破壊株ではプレート培養においてアミ

ノールを重層して高分子の多糖を沈殿させることによ

ラーゼ生産のグルコース抑制は解除されるものの，セルり，マンナナーゼ活性を可視化した．なお，プロテアー

ラーゼ生産は解除されない（ Fig. 2 )．このような違い

ゼでは 1 %のカゼインプレートを用いて 37 ℃で 5 日間

は CreA に依存しない CCR システムの存在を示してい培養し，不溶性のカゼインの分解消失を指標として活性る．一方，我々はセルラーゼ遺伝子の CCR に関わるプを検出した．

ロテインキナーゼが存在するのではないかと考え，約100 株からなるプロテインキナーゼ遺伝子破壊株ライブ

セルラーゼのザイモグラフィー

ラリーを探索したところ，pkaA 破壊株においてセルラー

培 養 上 清 を 0.1 % CMC を 含 有 し た ゲ ル を 用 い た

ゼ生産抑制が大きく解除されることを見出した（ denative-PAGE に供し，プレートアッセイと同様にコンゴ

Souza et al., 2013 )．破壊株ライブラリーで用いている親

レッド染色を行って活性バンドを可視化した．

株の遺伝型が，我々が通常用いている菌株と異なるため，－ 43 －

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Fig. 2 Growth (a) and amylase and cellulase production (b) of the deletion strains on agar plates containing starch or
CMC with D-glucose.

pkaA 破壊株を新たに作製して creA 破壊株と比較した（ Fig. 2 )．図に示すようにグルコースを炭素源としたプ

在下で GanB が CyaA を活性化して cAMP が生成し，そレートにおいて，pkaA 破壊株は creA 破壊株と同様に著て活性化するとセルラーゼの CCR が引き起こされるとし い 生 育 低 下 を 示 し た． 一 方，creA 破 壊 株 と は 逆 に考えられた．なお，cyaA 破壊株は著しい生育低下を示

pkaA 破壊株ではアミラーゼ生産抑制は解除されないのに 対 し， セ ル ラ ー ゼ 生 産 抑 制 は 大 き く 解 除 さ れ た．

すものの致死ではないとされている（ Fillinger et al.,の結果，PkaA が調節サブユニットの PkaR から解離し2002 )．そこで我々も取得を試みたが成功に至っていない．

PkaA は CreA の核局在を部分的に制御すると報告され

三量体 G タンパク質は G プロテイン共役受容体ていたが（ de Assis et al., 2015 )，Fig. 2 の結果はむしろ（ G protein coupled receptor; GPCR )によりその活性がCreA と PkaA が独立して CCR に関与することを示して制御される．A. nidulans のゲノムには 16 種の GPCR といる．pkaA と creA の二重破壊株では，pkaA 破壊株と思われる遺伝子がコードされている．この中で CCR に比較してセルラーゼ生産の指標であるハローの直径が大関与するものを同定するため，これまで 8 種（ gprA，B，

きくなっているため，弱いながら CreA もセルラーゼの

C，D，F，H，I，M )の遺伝子破壊株を作製したが未だ同定に至っていない．最近，グルコースに応答した cAMP

CCR に関与していると示唆された．
cAMP 合成酵素であるアデニル酸シクラーゼ（ CyaA )レベルの上昇に関わるのは gprH，I，M であると報告との活性は三量体 G タンパク質により制御されている．

されている（ dos Reis et al., 2019 )．本報告によるとこ

そこで，三量体 G タンパク質の α サブユニット（ Gα )れら遺伝子の単独破壊でグルコース応答性の cAMP レ

をコードする 3 種の遺伝子，ganA ，ganB，fadA の破壊

ベルの上昇がほぼ消失する．しかし，我々が取得したによる生育と CCR への影響を解析した（ Fig. 2 )．グル
コースを単一炭素源としての生育への影響はいずれの破gprH と gprI 破壊株では CCR の解除は起こらなかった．
CCR 関連 GPCR が同定できないのは機能重複のためと壊株においても微弱であった．また，アミラーゼ生産抑考えていたが，不思議なことに上記報告では二重破壊株，

制は pkaA 破壊株と同様にいずれの破壊でもほとんど解三重破壊株でグルコース応答が復帰するとされており，除されなかったが，セルラーゼ生産抑制の明らかな解除

破 壊 株 中 心 の 現 在 の ア プ ロ ー チ で は CCR に 関 わ るが ganB 破壊株で認められた．すなわち，グルコース存

GPCR の同定は困難と考えられた．

－ 44 －

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わるシグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明

cAMP シグナリングを介したセルラーゼ遺伝子発現のグあり，こちらも部分的脱抑制に過ぎなかった．プレート

ルコース抑制

アッセイの結果と比較して考えると，以上の結果は培養

cAMP シグナリングがセルラーゼ生産の抑制に関与す条件の違いによって CreA と PkaA の CCR への関与の程ることが明らかとなったが，定量性に乏しいプレート

度が変わってくる可能性を示している．二重破壊株におアッセイの結果であるため，液体培養でのセルラーゼ遺ける抑制条件下の eglA 転写量は親株（ WT )の 135 倍，

伝子の CCR について RT-qPCR を用いて定量的に解析した．セルラーゼ遺伝子発現の誘導物質としてはセロビ

ganB 破壊株では 89 倍であり，cbhA はそれぞれ 155 倍と 123 倍であった．しかし，いずれの破壊株においてもオースを用い，その分解を抑えるために β -グルコシダー

完全な脱抑制は見られず，最も脱抑制の程度が大きい二ゼ阻害剤の 2 -デオキシノジリマイシン（ DNJ )を添加

重破壊株でも抑制条件の転写量はどちらの遺伝子についしてある．また，抑制物質としてはグルコースアナログても非抑制条件の 3 分の 1 程度にとどまった．これはほの 2 -デオキシグルコースを用いた．誘導物質，抑制物

かにも独立して CCR を引き起こすシステムが存在する質 添 加 か ら 90 分 後 の エ ン ド グ ル カ ナ ー ゼ A 遺 伝 子ことを示唆している．

（ eglA )とセロビオヒドロラーゼ A 遺伝子（ cbhA )の誘導物質をボールミル粉砕セルロース（ Ball Milled

転写量を Fig. 3 に示す．いずれの遺伝子についても遺伝

Cellulose; BMC )，抑制物質をグルコースとして，液体子破壊による脱抑制のプロファイルはほぼ同じであっ

培養でのエンドグルカナーゼ生産と eglA ，cbhA 発現をた．プレートアッセイと異なり，両遺伝子とも creA 破

解析した結果を Fig. 4 に示す．エンドグルカナーゼ活性壊株で脱抑制が観察された．転写量は対数正規分布に近の検出はザイモグラフィーにより行った．図の下の活性いとされているため図の縦軸は対数値であるが，アクチ

バンドが EglA ，上の複数のバンドが糖鎖修飾の程度がン遺伝子（ actA )で標準化した相対転写量そのものに異なる EglB である（ Endo et al., 2008 )．プレート培養

換算すると，eglA の抑制条件下の転写量は creA 破壊株と大きく異なり，セルラーゼ生産への各破壊の影響はほで親株（ WT )の 34 倍，cbhA では 24 倍である．しかし，

ぼ逆となった．すなわち，非抑制条件下では対象株

非抑制条件の転写量と比べると例えば eglA で 14 分の 1，

ABU と各破壊株の間に大きな違いはないが，抑制条件

cbhA で 18 分の 1 に過ぎなかった．一方，pkaA 破壊株では eglA の抑制条件下の転写量は（ WT )の 59 倍，cbhA下においては creA 破壊株で遅延しながらも EglA ，EglB

では 50 倍と脱抑制の程度は creA 破壊株より大きいが，

破 壊 株 で は 生 産 は 認 め ら れ な か っ た． 一 方，creA と非抑制条件と比較するとそれぞれ 7 分の 1 と 5 分の 1 でpkaA の二重破壊株では抑制条件での EglA と EglB の生の生産が認められた．これに対し pkaA 破壊株と ganB

Fig. 3 Expression of eglA and cbhA, evaluated by RT-qPCR, under 3 mM cellobiose-induced conditions with orwithout 2.5 mM 2-deoxyglucose (2-DG). 2-Deoxynojirimycin (DNJ) was added to prevent cellobiosehydrolysis by β-glucosidase. Relative expression levels of the genes normalized with actA are shown by alogarithmic scale. Error bars indicate the standard errors of more than three independent experiments.

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Fig. 4 Cellulase production and eglA and cbhA expression under 0.5 % BMC (ball milled cellulose) -induced conditions
with or without 1 % D-glucose. Each strain was cultivated in the minimal medium containing BMC with orwithout D-glucose for 6 h and 12 h. Culture supernatant (15 μL) of each deletion strain was subjected to zymography (a), and total RNA extracted from the mycelia was subjected to RT-qPCR analysis (b).

産が 6 時間で認められているため，両者は協調的かつ独

ラクトースを除いてグルコースの場合と同様であった

立して生産抑制に関与していることは確認された．転写が，ガラクトース単一炭素源では pkaA と ganB の破壊解析の結果も全く同様である．この結果は，プレート培株で極端な生育低下が見られた．これはガラクトース資

養や液体培養という違いだけでなく，誘導物質の違いに化に cAMP シグナリングが関わることを示唆している．

よっても CreA と PkaA の関与の程度が異なることを示

また，キシロース単一炭素源での生育も不安定であり，している．セロビオースと BMC という誘導物質間での植菌した分生子数が少ないと著しい生育低下がたびたび決定的な違いは，前者は直接の誘導物質であるのに対し見られた．CCR については，まず親株の ABPU1 や対象て，後者はセルロースが分解されないと誘導物質セロビ

株の ABU でわかるようにフルクトース，マンノース，

オースが生成しないという点にある．セルロースからのキシロースが強い抑制，ガラクトースとアラビノースがセロビオース生成速度について各破壊株間で比較すれ弱い抑制を引き起こした．フルクトースとマンノース抑ば，CreA に よ る CCR と cAMP シ グ ナ リ ン グ に よ る

制は creA と pkaA 破壊株でわずかに，二重破壊株で大きCCR の違いの一端が明らかになると考えられる．

く解除され，ganB 破壊株ではその中間となった．キシ

グルコース以外の単糖によるセルラーゼ遺伝子発現抑制

壊によりも creA 破壊で大きく，キシロースの場合ではへの cAMP シグナリングの関わり
そもそも CCR とは炭素源のランキングに働くシステ

ganB 破壊株は中間的であった．これはペントースによる抑制では CreA の役割が非常に大きいことを示唆してムであり，グルコース以外の様々な炭素源が抑制を引きいる．興味深いことに，キシロースによる抑制は fadA起こすが，その程度は抑制炭素源の種類により異なる．

破壊株でもわずかに解除されていた．

ロースとアラビノース抑制からの CCR 解除は pkaA 破

そ こ で，creA ，pkaA ，ganA ，ganB，fadA の 破 壊 が 各

セロビオースを誘導物質，各種単糖を抑制物質として種単糖存在下での生育と CCR に与える影響をプレート

転写解析を行った結果を Fig. 6 に示した．プレートアッ

アッセイにより解析した（ Fig. 5 )．生育への影響はガセイと同じように，グルコース，フルクトース，マンノー－ 46 －

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わるシグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明

Fig. 5 Growth (a) on and repression of cellulase production (b) by various monosaccharides. Strains were cultured onminimal medium agar plates containing indicated sugars as carbon sources.

Fig. 6 Transcriptional analysis of eglA and cbhA under 3 mM cellobiose-induced conditions in the presence of various
repressing monosaccharides (30 mM). 2-Deoxynojirimycin (DNJ) was added to prevent cellobiose hydrolysis
by β-glucosidase. The data without the repressing carbon sources are the same as those used in Fig. 2. Error
bars indicate the standard errors of three independent experiments.

－ 47 －

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スは強い抑制物質で，これらに比べてキシロースは弱く，

キシラナーゼ遺伝子の CCR

アラビノースはより弱いことが示された．creA 破壊株
ではキシロースとアラビノースによる抑制は完全に解除

creA ，pkaA ，ganA ，ganB，fadA の破壊がグルコー
スとキシロース存在下でのキシラナーゼの CCR に与えされ，グルコース，フルクトース，マンノースの抑制はる影響をプレートアッセイにより比較解析した（Fig. 7 )．

部分的解除にとどまった．pkaA 破壊株ではいずれの単抑制炭素源の非存在下やキシロース存在下で pkaA 破壊糖の場合も部分的解除で，二重破壊株では全てについて

株でのキシラナーゼ生産が低下しているのは，前述した

ほぼ完全に解除された．興味深いのは ganB 破壊株で，ように本破壊株の生育がキシロース単一炭素源で不安定

PkaA の上流因子と考えられるにも関わらずいずれの抑で，しばしば著しい生育低下を示すためと思われる．グ

制単糖でも pkaA 破壊株を超える脱抑制を引き起こした．

ルコース存在下では，ganA 以外の全ての破壊株で脱抑なお，2 -デオキシグルコースはいずれの株でも抑制が強制が認められた．キシロースはキシラナーゼ発現の誘導く出ているが，これはほかの単糖が代謝されるのに対し，物質であるが，A. niger で高濃度では CreA 依存的な抑代謝されないアナログであるためと考えられる．

制物質として働くことが報告されている（ de Vries etganB 破壊株での脱抑制が pkaA 破壊株より強いという事実は，pkaA の上流でシグナル伝達経路が分岐してal., 1999 )．従って，結果の解釈は難しいが，高濃度キシロース存在下で A. nidulans でも creA 破壊株だけでなくいる可能性を示している．ほかの生物の情報を参考にす
るとホスホリパーゼ C の可能性があったため，これをganB 破壊株でも脱抑制が認められ，さらに興味深いことに fadA 破壊株で特に著しい脱抑制が観察された．こ

コードする plcA ，plcB 破壊株の取得を試みたが成功しの結果は，FadA が特にキシロースへの応答に重要な役ていない．一方，cAMP 結合タンパク質がほかにもある

割を持っていることを示唆している．fadA 破壊株におけのではと考えゲノム情報を探索したところ，FbxA がるキシロースからの脱抑制はセルラーゼ生産抑制でもプcAMP 結 合 モ チ ー フ を 持 つ こ と が 明 ら か と な っ た．

レートアッセイでわずかながら認められていた（Fig. 5)．

FbxA は F-box protein に分類される．この一群のタンパ

1 %キシロースを誘導物質とし，1 %グルコースを抑

ク質はユビキチン化に関わる SCF 複合体の構成因子で制物質とした時の液体培養でのキシラナーゼ生産解析結

基質と結合する．fbxA の破壊株ではキシラナーゼ発現が果を Fig. 8 に示す．後述する転写解析と異なり誘導物質

低下することが示されるとともに，CCR への関与も示

濃度が高いが，これは培養時間が 6 時間や 12 時間と長く，唆されていた（ Colabardini et al., 2012 )．そこで fbxA 破誘導物質の枯渇が起こるからである．実際に培養 12 時

壊株および本因子の cAMP 結合モチーフを欠失した変間においてキシロースの枯渇によると考えられるキシラ

異体の発現株を作製し，キシラナーゼ発現および CCR

ナーゼ生産の低下が認められている．しかし，高濃度キについて解析したが有意な結果は得られないだけでな

シロースを誘導物質としたために，親株において誘導とく，既報の結果の再現性も得られなかった．おそらく，抑制が同時に起こっている可能性がある．というのは親実験条件に微妙な違いがあるものと思われる．

株（ ABPU1 )と比較して全ての破壊株でグルコース非存在下でも非常に高いキシラナーゼ生産が認められるた

Fig. 7 Xylanase production on minimal medium agar plate containing 0.05 % AZCL-Xylan and 10 mM xylose withor without 1 % of D-glucose or D-xylose.

－ 48 －

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わるシグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明

Fig. 8 X
 ylanase production of the deletion strains in submerged culture containing 1 % D-xylose withor without 1 % D-glucose.

Fig. 9 ranscriptional analysis of xlnA-C and xlnR under 3 mM D-xylose-induced conditions in the presence ofT
30 mM D-glucose. Error bars indicate the standard errors of three independent experiments.

めである．グルコース添加条件ではプレートアッセイと

転写解析の結果を Fig. 9 に示す．xlnA-C はいずれもエ異なり fadA 破壊株での脱抑制は大きく低下したが，ほンドキシラナーゼ遺伝子である．各遺伝子破壊の影響はか の 破 壊 株 で は 明 瞭 な 脱 抑 制 が 認 め ら れ た．creA ，遺伝子ごとに異なり，xlnA は CreA と PkaA による協調

pkaA ，ganB の破壊の効果はほぼ同等であり，creA と的な制御，xlnB と xlnC は主として PkaA に制御されてpkaA や creA と ganB の二重破壊株においてさらに高い生産性が見られた．

存しないように見えるが，creA 破壊株では親株（ WT )いると考えられた．図では xlnB の CCR は全く creA に依－ 49 －

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の 2 倍程度の転写量であり，xlnC とほとんど変わらない．

が認められた．一方，キシロース存在下では pkaA 破壊

fadA 破壊の影響が明確に見られたのは xlnB だけであった．XlnR はキシロースに応答したキシラナーゼ遺伝子

株で脱抑制は認められず，むしろ親株（ ABPU1 )より誘 導 を 担 う 転 写 因 子 で あ り，xlnA と xlnB の CCR はな脱抑制が認められるようであるが，定量性に乏しいプ

CreA 依存的な xlnR の転写抑制の結果であると報告されレートアッセイでは有意とは言い切れない．液体培養でも低い生産量となった．fadA 破壊株に関してはわずかている（ Tamayo et al., 2008 )．しかし，我々の実験条件

は，Fig. 4 のセルラーゼ生産と極めて類似したプロファ

では破壊株ごとに 2-4 倍程度の発現変動はあるものの，イルを示した（ Fig. 10(b))．すなわち，多糖のローカ抑制条件での転写量はどの株においても非抑制条件の 3

ストビーンガム（ LBG，ガラクトマンナンが主成分)

分の 1 から 4 分の 1 であり，creA を含むいずれの破壊にを誘導物質，グルコースを抑制物質とした場合に，creA

おいても明確な xlnR 発現の脱抑制は認めらなかった．

破壊株で生産が遅延しながらも脱抑制が見られるが，マンナナーゼ遺伝子の CCR

pkaA の二重破壊でグルコース存在下での生産が早期に起こるという点である．

pkaA や ganB の 破 壊 で は 脱 抑 制 効 果 は な く，creA と
creA ，pkaA ，ganA ，ganB，fadA の破壊がマンナナー
ゼ生産の CCR に与える影響をプレートアッセイにより解析した結果を Fig. 10(a)に示した．グルコース存在下
では，ganA ，fadA 以外の全ての破壊株で明瞭な脱抑制

Fig. 10

転写解析では，エンドマンナナーゼをコード する
manB と manC のグルコース抑制には CreA と PkaA がセルラーゼと同様に独立的に関与し，キシロースによるMannanase production on minimal medium agar plate containing 0.5 % locust bean gum (LBG) with orwithout 1 % of glucose or xylose (a) and in submerged culture containing 0.5 % locust bean gum with orwithout 1 % of D-glucose.

－ 50 －

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わるシグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明

抑制は CreA が主要因子で PkaA は補助的に働くと考えるためには，制御系をしっかり理解しなければならない．

られる結果となった（ Fig. 11 )．これもセルラーゼ遺伝

CCR に関わる PkaA の基質を同定するため，出芽酵母

子の場合と類似している．なお，β -マンノシダーゼ遺伝におけるプロテインキナーゼ A（ PKA )の直接の基質

子 mndB やマンナナーゼ遺伝子の主要転写因子をコードとされるプロテインキナーゼである Yak1，Rim15 のホ

する manS（未発表)では，各株での多少の発現変動はモログ（ YakA，SrrB )や酵母の凝集に関わる遺伝子のあるものの，そもそも親株（ ABPU1 )での CCR がほと

転写抑制因子 Sfl1p ホモログ（ SflA と命名)の遺伝子破んど観察されなかった．液体培養における酵素生産や転壊株，グルコーストランスポーターの転写抑制因子

写解析において，親株（ ABPU1 )と fadA 破壊株以外のRgt1（必須遺伝子)ホモログ（ AN1927 )の高発現株な破壊株で非抑制条件下でも高い酵素生産や転写が起こっどの解析を行ったが，いずれについても明確な CCR へたが，これは分解産物のマンノースにより CCR が引きの関与は認められなかった．そこで，cAMP シグナリン

起こされるためと思われる．

グで制御されると考えられる CCR 以外の表現型に着目した．プロテアーゼ生産である．

CCR に関わる PkaA の標的
上記のように，実験条件や標的遺伝子によって CCR

A. nidulans における主要菌体外プロテアーゼは PrtA
で，その遺伝子発現は炭素源飢餓や窒素源飢餓で起こる関連各因子遺伝子の破壊の影響が異なる．これは CCR（ Katz et al., 2008. )．さらに，prtA の発現は GanB によのシステム自体の複雑性に加えて，誘導物質や抑制物質

り 正 に 制 御 さ れ る と 報 告 さ れ て い る（ Molnár et al.,の資化による濃度変化の影響も大きく受けているためと2006 )．グルコース応答に関わる GanB が炭素源飢餓条

考えられる．しかし，後者は自然界で常に起こっている

件でのプロテアーゼの発現誘導に必要であるという点がことであり，だからこそ複雑な CCR システムに至った

奇異に感じられたため，再現性を取るためにプロテアーのだと考えざるを得ない．この複雑なシステムを理解す

ゼ生産に与える ganB 破壊と pkaA 破壊の影響を確認しFig. 11

Transcriptional analysis of manB, manC, mndB, and manS under 3 mM mannobiose-induced conditions in
the presence of 30 mM D-glucose or D-xylose. Error bars indicate the standard errors of three independent
experiments.

－ 51 －小林

た（ Fig. 12(a))．カゼインプレート上で親株（ ABPU1 )哲

夫がアミノ末端の DNA 結合ドメインは極めて相同性が高ではプロテアーゼ生産を示すハローをわずかながら形成

く，その直後に PKA のリン酸化部位と考えられる RRXS

し た が， 確 か に ganB 破 壊 株 で は 消 失 し， さ ら に はモチーフが存在する．SflA も同様な制御を受けている

pkaA 破壊株でも消失していた．そこで，sflA 破壊株でのプロテアーゼ生産をプレートアッセイにより確認したと仮定すると，PrtA によりリン酸化された SflA が DNAから解離し prtA の脱抑制が起こることになる．

ところ，親株（ ABPU1 )よりも生産性が向上している

イモチ病菌 Magnaporthe oryzae において，PKA 遺伝

ことが明らかとなった．prtA の発現解析を行ったとこ

子の破壊による著しい生育阻害や病原性の消失が復帰しろ，ganB と pkaA 破壊株ではほとんど発現が起こらないた変異株の原因遺伝子が，sfl1 ホモログの Mosfl1 であるのに対し，sflA 破壊株では飢餓条件とカゼイン存在下でことが明らかにされた（ Li et al., 2017 )．そこで，我々親 株（ ABPU1 ) よ り 発 現 量 が 大 幅 に 増 加 し て い たは ganB と sflA の二重破壊株の表現型も検討することと（ Fig. 12(b))．グルコース存在下での発現上昇は認めらした．プレートアッセイの結果，sflA の破壊はセルラーれなかった．prtA の発現は CreA 依存的な CCR によりゼ生産や生産抑制に全く影響を与えなかったが，二重破制 御 さ れ て い る こ と が 報 告 さ れ て お り（ Katz et al.,

壊では ganB 破壊株で認められていた CCR の解除が完

2008. )，我々もこれを確認している．したがって，これ

全 に 消 失 し た（ Fig. 13(a))． 転 写 解 析 に お い て も，がグルコース存在下で発現上昇が起こらなかった原因と考えられる．飢餓条件下での cAMP レベルの上昇は報ganB 破壊株で脱抑制されていた eglA と cbhA の発現が，二重破壊株では再度 CCR の制御下となった．なお，こ告されているので（ dos Reis et al., 2019 )，飢餓条件にのグラフの縦軸は対数ではなく対アクチン遺伝子あたり

おいて細胞壁の α -グルカンや β -グルカンの分解が起こっの相対発現量そのものである（ Fig. 13(b))．
以上の結果を総合して考えられるモデルとしては，抑て少量のグルコースが生成され，これにより GanB の活制炭素源の非存在下では SflA により抑制されていた未性化が起こるのではないかと考えている．
出芽酵母の Sfl1 は PKA である Tpk2 によりリン酸化

知遺伝子が，存在下では PkaA によるリン酸化で SflA

されると DNA 結合を失うと報告されている（ Conlan &が不活性化して脱抑制が起こり，CCR が引き起こされTzamarias, 2001 )．SflA は Sfl1 との全体の相同性は低い

るというものである．しかし，この未知遺伝子の産物はFig. 12

Protease production of the deletion strains on agar plates containing casein (a), and transcriptional
analysis of prtA without carbon source (starvation) and with casein or D-glucose (b). Error bars
indicate the standard errors of three independent experiments.

－ 52 －

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わるシグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明

Fig. 13

Cellulase production of the deletion strains on agar plates containing CMC and CMC + D-glucose (a),and transcriptional analysis of eglA and cbhA under 3 mM cellobiose-induced conditions with orwithout 2.5 mM 2-DG, 30 mM D-glucose or 30 mM D-xylsoe (b). Error bars indicate the standard
errors of three independent experiments.

翻訳されれば活性を持つとは考えられない．sflA 破壊株

ことが示された（ Alam el al., 2017; Ichinose et al., 2014,

や sflA/ganB 二重破壊株において抑制炭素源の非存在下

2018; Ries et al., 2016; Tanaka, et al., 2018 )．各種多糖分におけるセルラーゼ遺伝子発現量低下は認められるとは解酵素への関与を俯瞰的に見ようとする我々に類似した言え，その低下の程度は 2 分の 1 から 3 分の 1 に過ぎな研究が見当たらなかったため，creB 破壊株についてもいためである．未知遺伝子の産物が完全な活性を持つた解析を行った．グルコースを抑制炭素源としたプレート

めには抑制炭素源の存在が必要であると考えられる．

アッセイの結果，creB 破壊株ではアミラーゼとセルラーcAMP シグナリングによる CCR を理解するためにはこ

ゼ 生 産 の 抑 制 解 除 が 起 こ っ た（ Fig. 14(a))． こ れ はの未知の因子の同定が極めて重要であると考えられる．

creA ，pkaA ，ganB の破壊株では認められなかった表現型である．これにより，CreA と CreB が独立して CCR

脱ユビキチン化酵素 CreB と CCRに関わることが確認されるとともに，CreB が PkaA や変異や破壊によって CCR が解除されると報告されてGanB とも独立して機能することが明らかとなった．さいる遺伝子の一つに creB がある．緒言に述べたようにらに転写解析では，creB と ganB の二重破壊株で特にヘCreB は脱ユビキチン化酵素に分類されるタンパク質でキソースによる転写抑制が相加的に解除されることも認あり，CreC との複合体として機能する（ Boase et al.,

められた（ Fig. 14(b))．

2003; Lockington & Kelly, 2002 )．当初 CreB は脱ユビキ

CreB は真核生物に幅広く保存された脱ユビキチン化

チン化により CreA を安定化するとのモデルが提唱され酵素であり，トランスポーターなどの膜タンパク質のエていたが，近年 CreA と CreB は独立して CCR に関わる

ンドサイトーシスと分解に関わる．また，A. nidulans で－ 53 －

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林

哲

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Fig. 14 Amylase and cellulase production of the deletion strains on starch or CMC agar plates in the presence of D-glucose (a),and transcriptional analysis of eglA and cbhA under 3 mM cellobiose-induced conditions with or without various
repressing monosaccharides (b). Error bars indicate the standard errors of three independent experiments.

要は CreB と CreC のヘテロ二量体と考えられているが，動約

物 や 分 裂 酵 母 で は USP46（ CreB )，WDR48，WDR20（ CreC )のヘテロ三量体である（ Hodul et al., 2017 )．そ

糸状菌における多糖分解酵素の生産は，一般にカーボ

こで，WDR48 にあたる遺伝子を AspGD で探索したとこ

ンカタボライト抑制（ CCR )の制御下にあるが，CCR

ろ，AN10017 が該当した．本遺伝子の破壊株では明らかに対する感受性は酵素の種類によって異なり，たとえば，にアミラーゼとともにセルラーゼの CCR が解除されてセルラーゼはアミラーゼよりも敏感である．CCR の強おり，creB 破壊株と類似した表現型であった（ data not

さも抑制炭素源によって異なるため，生産は複雑に制御

shown )．従って，CreB は CreC とともに AN10017 ともされているが，そのメカニズムの詳細が十分に解明され複合体を形成していると考えられる．CreB の機能としているとは言えない．CCR のメカニズムをさらに理解ては他生物の情報からトランスポーターの維持が重要とするため，creA の破壊の影響をプロテインキナーゼ A

思われ，CCR 関連で考慮するとグルコーストランスポー（ pkaA )および Gα（ ganB )遺伝子や creB の破壊の影響

ターの安定化が考えられた．そこで，グルコースの消費と比較した．その結果，PkaA および GanB が CreA 非を親株と creB 破壊株で比較したところ，グルコース特依 存 性 の CCR に 関 与 す る こ と，CCR に お け る CreA，

異的な消費遅延が確認された．しかし，わずかな遅延でPkaA ，および GanB の寄与の程度が，インデューサーあることから，これが CCR 解除を引き起こすとは考えや抑制炭素源，酵素の種類，培養条件によって異なるこられず，CCR に関わる CreB の標的はほかに存在するととが明らかとなった．また，CreB が GanB とは独立し思われる．

て機能することも明らかとなった．さらに，CCR を制御する PkaA 基質の有望な候補を特定した．

－ 54 －

糸状菌における多糖資化の優先順位決定に関わるシグナル伝達・遺伝子発現制御機構の解明

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 國武絵美, 木村哲哉, 小林哲夫. 2020. Aspergillus nidulansにおけるcAMPシグナリング関連因子のヘミセルラーゼ発現抑制への関与. 日本農芸化学会2020年度大会（3月25 - 28日, 福岡)
2) 柴山智洋, 浅野圭祐, 金丸京子, 木村真, 國武絵, 小林哲夫.
2020. 糸状菌Aspergillus nidulansにおけるプロテアーゼの生産制御. 日本農芸化学会2020年度大会（3月25 - 28日, 福岡)3) 上條順也, 木村哲哉, 小林哲夫, 國武絵美. 2019. Aspergillus
nidulansにおける出芽酵母Rgt1類似因子のカーボンカタボ
ライト抑制への関与. 第19回糸状菌分子生物学コンファレ
ンス（11月6 - 7日, 札幌)4) 國武絵美, 木村哲哉, 小林哲夫. 2019. Aspergillus nidulansにおけるヘミセルラーゼ遺伝子のカーボンカタボライト抑制機構. 第19回糸状菌分子生物学コンファレンス（11月
6 - 7日, 札幌)5) 小林哲夫. 2019. 糸状菌における多糖分解酵素遺伝子群の発現制御に関する研究. 日本農芸化学会2019年度大会（3月24 - 27日, 東京)
6) Kunitake, E., Li, Y., Uchida, R., Nohara, T., Asano, K., Hattori,
A., Kimura, T., Kanamaru, K., Kimura, M. & Kobayashi, T.
2019. Carbon catabolite repression of cellulase genes via
protein kinase A pathway in Aspergillus nidulans. 30th Fungal
Genetics Conference (March 12-17, Pacific Grove, CA)
原著論文
1) Kunitake, E., Li, Y., Uchida, R., Nohara, T., Asano, K., Hattori,
A., Kimura, T., Kanamaru, K., Kimura, M. & Kobayashi, T.
2019. CreA-independent carbon catabolite repression ofcellulase genes by trimeric G-protein and protein kinase A
in Aspergillus nidulans. Curr. Genet. 65: 941 - 952.
その他（総説・書籍)
1) 國武絵美, 小林哲夫. 2019. 転写制御からみる糸状菌の多糖資化戦略. 化学と生物. 57: 532 - 540.

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた名古屋大学大学院生命農学研究科と三重大学大学院生物資源学研究科の学生諸氏に感謝の意を表します．

文

献Alam, M.A., Kamlangdee, N. & Kelly, J.M. 2017. The CreB
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－ 56 －

IFO Res.Commun. 34
57-65, 2020

バイオ合成による環境適合型半導体製造技術基盤の構築：
細菌による多様なカルコゲン代謝機構の解明と合理的活用法の検討
池道彦

大阪大学大学院工学研究科〒565-0871

大阪府吹田市山田丘2-1

Establishment of technologies for green production of semi-conductors by biosynthesis:
elucidation of mechanisms of bacterial chalcogen-metabolism and their application
Michihiko Ike
Graduate School of Engineering, Osaka University
2-1, Yamada-Oka, Suita, Osaka 565-0871
The existing physico-chemcal processes for production of semiconductor materials commonly possess
shortcomings like use of hazardous chemicals and huge energy consumption, i.e., high environmental burden.
Biological synthesis can be the eco-friendly and energy-saving alternative to overcome such shortcomings, andmay turn the semiconductor production processes to be "green" in future. To establish the basis for developing
semiconductor biosynthesis technologies, a variety of chalcogen-metabolizing bacteria were extensively andintensively examined for their potential to synthesize chalcogenide semiconductors (ChSCs), an important
category of semiconductor material. Attempts were made to produce ChSC nanoparticles using the bacterial
strains capable of reduce sulfur (S), selenium (Se) and/or tellurium (Te) oxyanions under aerobic conditions,
resulted in the success in biosynthesis of CdS, CuS, ZnS, CdSe and Bi 2 Se 3 nanoparticles as binary (two elements)
ChSCs. Further, production of CdSxSe(1-x) and Bi 2 SxSe(3-x) nanoparticles, ternary (three elements) ChSCs, was also
observed. On the other hand, efficient synthesis of Te-containing semiconductors could not be confirmed within
this study. From the study on Bi 2 Se 3 synthesis properties by chalcogen-metabolizing bacteria including a versatile
Se-metabolizing bacterium Pseudomonas stutzeri NT-I, it was suggested that efficient biosynthesis of Se-containing
semiconductors was attributed to high Se-volatilizing activities of the bacterial strains. Selenol-containing
compounds as intermediates of Se-volatilizing metabolic pathways, such as methane selenol and selenocysteine,
may play an important role in biosynthesis of Se-containing semiconductors.
Key words: Chalcogenide semiconductors, chalcogen-metabolizing bacteria, green production,
selenium volatilization緒言に よ っ て 行 わ れ て い る が（ Gao et al., 2013 ; Ma et al.,2008 )，これらの方法では，有害な薬品の利用，高温・半導体素子は先端産業に欠かせない電子部品であり，高圧下の反応，多大なエネルギーの投入など，環境負荷

特に，構成元素の組合せにより独特な性質を示す化合物が高くなるという問題を抱えており，より環境調和型の半導体ナノ粒子の利用が急拡大してきている．現在，化合成・製造技術への転換（グリーン化)が求められてい合物半導体ナノ粒子の合成・製造は物理化学的プロセス

る．半導体ナノ粒子合成をグリーン化する手段として，
近年，微生物の持つ金属・非金属元素の特殊な代謝を利E-mail: ike@see.eng.osaka-u.ac.jp
共同研究者:井上大介（大阪大学大学院工学研究科)，
黒田真史（大阪大学大学院工学研究科；
現 常葉大学社会環境学部)

用する“バイオ合成”が提案されている（ Mal et al.,2016 )．微生物反応は常温・常圧下で進行し，有害な薬品を用いる必要もないため，本来省エネルギー・省資源
かつ低環境負荷型であり，バイオ合成は半導体ナノ粒子－ 57 －

池道

彦

合成の抱える多くの問題を解決できる十分なポテンシャ（ Sweeney et al., 2004 )や Saccharomyces cerevisiae（ Cuiルを有している．また，マイクロファクトリーともいわれる微生物細胞レベルでの合成系は，ナノサイズの粒子

et al., 2009 )等カルコゲン代謝に優れたものとはいえないモデル微生物であり，産業利用可能なレベルの効率的の製造に適しているといえ（ Klaus et al., 1999 )，さらに，バイオ合成に適用し得る微生物触媒が獲得・整備されて微生物により合成された金属ナノ粒子は，表層がタンパいないことが，バイオ合成を実現するうえでの大きなボク質等で覆われることで生物への適合性が高くなるとトルネックとなっている．

いった応用上有用な特性を持つことも知られるなど（ Li

本研究は，ChSCs 合成に活用できる有効なカルコゲ

et al., 2014 )，付加的なメリットも大きいと考えられる．
硫黄（ S )，セレン（ Se)，テルル（ Te )等のカルコン代謝微生物を探索し，その ChSCs ナノ粒子合成の特性を詳細に把握することを通じて，実用的な ChSCs バ

ゲンを含むカルコゲン系半導体（ ChSCs:Chalcogenide

イオ合成の材料・知識基盤を構築することを目的とした

Semi-Conductors )は，光学的・電気的に他の材料になものである．ここでは，好気条件下においてチオ硫酸塩

い特性を有し，発光素子，熱電変換材料，フォトニクス，（S2O32- )，亜セレン酸塩（SeO32- )，亜テルル酸塩（TeO32- )バイオイメージングなどで広範に利用されている重要な等のカルコゲン酸化物イオンを効率的に還元する能力を化合物半導体の一カテゴリーであり，細菌や酵母等の微有する細菌株に焦点を当てて，ChSCs 合成微生物を探生物によって，そのナノ粒子がバイオ合成可能であるこ索した．我々の研究グループでは，廃水中のセレンやテとが明らかにされている（Mal et al., 2016 )．概括的には，

ルルを無害化・除去する目的でカルコゲン酸化物イオン

ChSCs のバイオ合成は Fig. 1 に示す反応で行われる．すを効率的に還元することのできる細菌株を探索・取得しなわち，微生物代謝により，+VI 価，+IV 価などのカルてきたが，研究を進めるなかで，好気的にカルコゲンのコゲン酸化物を－ II 価にまで還元し，これと別途与えた還元を行う細菌株が，嫌気下で還元を行う既存の細菌株

金属イオンが化合することにより ChSCs が生じる．しには類を見ない非常に効率的な還元を行うことが明らか

かし，現状ではバイオ合成可能な ChSCs の種類は限定になってきたことから（ Kuroda et al., 2011 ; Kagami et

されており，合成メカニズムについても必ずしも十分にal., 2012, 2013 )，この研究の戦略を構想した．

解明されていないことから，合理的な合成技術が確立されているとはいえない．特に，これまでに ChSCs 合

実験方法

成に用いられてきた微生物の多くは，Escherichia coli

使用菌株および培地
本研究に用いた菌株とそれらが代謝可能なカルコゲン
を Table 1 に示す．これらは，研究室でカルコゲンの酸化物イオンを好気培養において還元する細菌株として分離したものであり，特に効率的な還元能を有するものを今回の検討に用いた．ここでは，チオ硫酸塩，セレン酸塩または亜セレン酸塩，および亜テルル酸塩を還元するものとして分離された菌株をそれぞれ，S 代謝菌，Se 代
Fig. 1

Schematic of ChSCs biosynthesis process.

Table 1

謝菌，Te 代謝菌と分類している．

Bacterial strains used in this study－ 58 －

バイオ合成による環境適合型半導体製造技術基盤の構築：細菌による多様なカルコゲン代謝機構の解明と合理的活用法の検討

これら菌株の培養には基本的に TSB 培地（ BactoTM

分析方法

Tryptic Soy Broth )を用い，必要に応じて 1 mM，1.5 mM，採取した培養液を，4 ℃，21,900×g で 5 分間遠心分離

2 mM，または 6 mM のカルコゲン（チオ硫酸塩（ Na 2 S2O3 )，

した後，得られた上清を孔径 0.20 μm のフィルターでろ

亜セレン酸塩（ Na2SeO3 )，亜テルル酸塩（ Na2TeO3 ))過したものを液相試料とした．また，同様にして得られを添加した．平板培養を行う際には，液体培地に 18 g/L

た沈殿物を超純水で洗浄したものを固相試料とした．液の寒天を加えることで固化させて用いた．また，ChSCs

相試料を 5 %硝酸で 10 倍希釈し，誘導結合プラズマ発光合成試験には，カルコゲンを含む TSB 培地に，カルコ

分光分析（ Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission

ゲンと化合物を形成する可能性のある金属類を 1 mM のSpectrometry ; ICP-AES ; SPS7800 SII Nano Technology )濃度で添加し，十分に溶解させるためキレート剤としてに供することで液相中のカルコゲンおよび金属類の濃度

2 mM または 20 mM のニトリロ三酢酸を添加した培地をを測定した．固相試料は濃硝酸中で 100 ℃，10 分間処理

用 い た． こ こ で 金 属 類 は，Bi(III)，Cd(II)，Co(II)，することで消化し，超純水で適宜希釈した後に ICP-AES

Cr(III)，Cu(II)，Fe(III)，Ga(III)，In(II)，Mn(II)，に供することで，カルコゲンおよび金属類の含量を測定

Ni(II)，Sc(III)，V(III)，および Zn(II)については塩酸塩，した．

Pb(II) については硝酸塩として添加した．また，HM1

セレン代謝試験において，細胞内のセレンを含む代謝株および HM2 株を用いた ChSCs 合成試験においては，物の検出は，高速液体クロマトグラフ（ HPLC ; HIC-SP,

試験培地に 100 mM の 2 -モルホリノエタンスルホン酸

Shimadzu )- 水 素 化 物 発 生 原 子 蛍 光 分 析（ HG-AFS ;（ MES )緩衝液（ pH 6.0 )を添加することにより pH を

Millennium Excalibur, PS analytical )により行った．培

安定化させた．

養液を 4 ℃，6,000×g で 10 分間遠心分離することにより回収した菌体を生理食塩水で 2 度洗浄し，適当量の生

ChSCs 合成試験

理食塩水に懸濁した後，超音波処理により破砕し，遠心Table 1 のカルコゲン代謝細菌株を培養した寒天培地

分 離（ 4 ℃，6,000×g，10 min ) 後 の 上 清 を HPLC-

から 1 コロニーを釣菌し，50 mL 容バイアルに分注した

HG-AFS に供した．標準試料として 5 μM のセレン酸塩，

20 mL の TSB 培地に植種して，好気的に 24 時間の回転

亜セレン酸塩，セレノシステイン，セレノメチオニンを振盪培養（ 28 ℃，120 rpm )を行った．その後，培養液用いて，保持時間を比較することにより試料中のセレンの 5 %を同組成の培地に植種し，同様の条件で 12 時間

化合物の定性分析を行った．

培養した培養液を前培養液として試験に供した．続いて，カルコゲン（チオ硫酸塩:2 mM，亜セレン酸塩:1 mM，亜テルル酸塩:1 mM，ただし Bi 2 Se3 および Bi 2 Te3 合成

ChSCs ナノ粒子の観察
ChSCs 合成試験で得られた固相試料を超純水に懸濁試験においては亜セレン酸塩，亜テルル酸塩:1.5 mM )，し，その 10 µL をエラスチックカーボン支持膜付きの銅および金属類（各 1 mM )，ニトリロ三酢酸（ 2 mM，たメッシュグリッド（ ELS-C10，応研商事)上に滴下し，だし Bi 2 Se3 および Bi 2 Te3 合成試験では 20 mM )，さら

自然乾燥により固着させた．この試料を透過型電子顕微に HM1 株および HM2 株の培養時には MES 100 mM を鏡（ TEM ; JEM-2100F, 日本電子)およびエネルギー分

加えた 20 mL の TSB 培地を 50 mL 容バイアルに分注し

散型 X 線分析（ EDS ; EX-24063JGT, 日本電子)に供し，た試験系に，前培養液を OD600 が 0.02（ NT-I 株，RB 株，

加速電圧 200 kV にて観察および元素分析を行った．

TI-1 株，TI-2 株，TI-3 株)または 0.1（ HM1 株，HM2 株)結果および考察になるように植種し，好気的に回転振盪培養（ 28 ℃，
120 rpm )を行い ChSCs 合成試験とした．培養開始後，経時的に培養液を採取し，各種分析に供した．

カルコゲン代謝細菌株の ChSCs 合成能

セレン代謝試験

Se，Te ) と 様 々 な 金 属 類（ Bi(III)，Cd(II)，Co(II)，

カルコゲン代謝細菌を用いて，3 種のカルコゲン（ S，NT-I 株，RB 株，TI-1 株，TI-2 株， お よ び TI-3 株 にCr(III)，Cu(II)，Fe(III)，Ga(III)，In(II)，Mn(II)，

対しては，そのセレン代謝能を詳細に検討する試験を

Ni(II)，Sc(III)，V(III)，Zn(II)，Pb(II))の組み合わせ行った．これらの菌株を前項と同様に前培養し，50 mLによる ChSCs 合成を試みた．ここで ChSCs 試験におい容バイアル中に分注した 1.5 mM の亜セレン酸塩を含むて，カルコゲンと金属類の水相からの有意な除去が認め

TSB 培地に OD600 が 0.02 になるように植菌した．これられた系に対して，TEM による固相の観察を行うこと

を好気的に回転振盪培養（ 28 ℃，120 rpm )し，経時的で ChSCs の合成を確認した．ChSCs 合成が確認されたに培養液を採取して各種分析に供した．

カルコゲンと金属の組み合わせの一覧を Table 2 に，ま－ 59 －

池

道彦

た菌株ごとに合成することのできた ChSCs を Table 3 にな ChSCs 合 成 が 認 め ら れ た も の は Cd(II)，Bi(III)，示している．S 代謝菌である HM1 株または HM2 株を用Cu(II)，Zn(II)，Pb(II) の 5 種のみであり，かなり限定いることにより，Cd(II)，Bi(III)，Cu(II)，Zn(II)，お的であった．また，硫化物半導体がこれら 5 種類の金属

よび Pb(II) の硫化物半導体の合成に成功した．また，類から合成できたのに対して，セレン化物半導体はSe お よ び Te 代 謝 菌 で あ る NT-I 株，RB 株，TI-1 株，

Cd(II) と Bi(III) のみから合成できたのにとどまり，テTI-2 株，TI-3 株のいずれもがセレン化物半導体である

ルル化物半導体について全ての金属と合成は確認でき

Bi 2 Se3 を合成できることが確認された．加えて，NT-I

ず，硫化物系，セレン化物系，テルル化物系の順に半導株および RB 株は CdSe も合成可能であることが確認さ体のバイオ合成の難易度は高くなることが明らかとなっれた．合成が確認された 2 元素系のセレン化物半導体

た．これらのことは，Fig. 1 に示した ChSCs バイオ合成

Bi 2 Se3 および CdSe については，別途の合成試験を行いのスキームにおいて，カルコゲン代謝細菌によって生成生成した粒子を詳細に解析したところ，培養条件や培養される－ II 価のカルコゲン（図中 Ch2- )と金属イオン（図時間によって，TSB 培地に由来すると考えられる S を含中 +2 価の Me2+ として例示)の化合は無条件で進行す

む粒子であることが明らかとなり，Bi 2 Se3 および CdSe

るものでなく，その組み合わせによってある種の反応性

よび Bi 2 SxSe(3-x) の合成も行えることが示唆された．3 元

る．ここでは S 代謝菌により，比較的幅広い金属種に対の合成細菌は，3 元素系の ChSCs である CdSxSe(1-x) おの差，あるいは選択性のある反応であることを示してい素系の ChSCs がバイオ合成され得ることが明確に示さして硫化物半導体が合成されたが，容易に難溶性の硫化れたのは初の報告である．一方，テルル化物半導体につ物塩を形成する Fe(II)，Ni(II)，Sn(II) からの合成は確

いては，いずれの金属と組み合わせた場合も明確な半導認されなかったことから，単純に－ II 価の S として硫化体合成は認められなかった．また，試験に用いた金属物イオン（ S 2- )が生じ，金属イオンと化合する反応を類 の う ち，Co(II)，Cr(III)，Fe(III)，Ga(III)，In(II)，想定することはできない．S 代謝によって生じた S 2- 以

Mn(II)，Ni(II)，Sc(III)，V(III) については，試験した外の含 S 化合物が，何らかの複雑な生化学的あるいは化

いずれのカルコゲンとも半導体合成が確認できなかった．

学的メカニズムにより金属イオンと化合物を生成したも

ここではカルコゲンと化合し ChSCs を合成し得る金のと考えるのが妥当であるといえる．また，セレン化物

属類として 14 種の元素を用いた試験を行ったが，明確半導体の合成についても同様な議論を行うことができる．

Table 2

ChSCs synthesized in this study

カルコゲン代謝細菌による Bi 2 Se3 の合成
これまでに，いくつかの ChSCs のバイオ合成が報告されてきているが（ Mal et al., 2016 )，その多くは硫化物系であり，セレン化物系半導体の合成に関する報告は限られている．特に，Bi 2 Se3 の合成については，唯一Zhou ら（ 2018 )が Lysinibacillus sp. ZYM-1 を用いて合成した Bi 2 Se3 ナノシートの工学的特性を評価した報告があるのみで，Bi 2 Se3 バイオ合成そのものについては詳細な記述がなく，その特性は定性的・定量的両側で評価がなされていない．そこで，セレン化物半導体のバイオ合成の特徴を明らかにし，そのメカニズム解明の手掛かりとするため，Se および Te 代謝細菌株による Bi 2 Se3 のTable 3

ChSCs synthesis capabilities of the bacterial strains

合成特性を詳細に調べた（ Kuroda et al., 2019 )．

Se(IV) および Bi(III) を含む培地中で NT-I 株，RB 株，
TI-1 株，TI-2 株，および TI-3 株を培養した際の液相のSe および Bi 濃度の経時変化を Fig. 2 に示す．全ての菌株が 48 時間以内にほとんどの Se と Bi を同調的に除去し，この時，培養液は Bi 2 Se3 に特徴的な黒色を呈した．

さらに培養を継続したところ，192 時間以降，RB 株，
TI-1 株，TI-2 株，および TI-3 株の 4 菌株において Bi 濃度の上昇が確認された．これは，何らかの作用により生成した Bi 2 Se3 から Bi が脱離し再溶解したものと推測さ－ 60 －

バイオ合成による環境適合型半導体製造技術基盤の構築：細菌による多様なカルコゲン代謝機構の解明と合理的活用法の検討

Fig. 2Time courses of the soluble Se and Bi in liquid phase.
(a) P. stutzeri NT-I ; (b) P. aeruginosa RB ; (c) S. maltophilia TI-1 ; (d) O. anthropi TI-2 ; (e) O. anthropi TI-3.
Closed circles, Se in liquid phase ; open circles, Bi in liquid phase. (Reproduced from Kuroda et al., 2019)

Fig. 3Morphologies of synthesized particles at 48 h cultivation.
(a) P. stutzeri NT-I ; (b) P. aeruginosa RB ; (c) S. maltophilia TI-1 ; (d) O. anthropi TI-2 ; (e) O. anthropi TI-3.
(Reproduced from Kuroda et al., 2019)

れ，これらの菌株による効率的な Bi 2 Se3 合成には適切

Bi 2 Se3 の合成が完了したと考えられた 48 時間時点の固方，NT-I 株においては培養時間が長くなっても Bi 濃度

NT-I 株，RB 株，TI-2 株， お よ び TI-3 株 で は， 細 胞 外の上昇は確認されず，合成された Bi 2 Se3 粒子が安定にに直径 50 - 100 nm 程の粒子を形成していたのに対して，

全 て の 菌 株 で 液 相 の Bi と Se が ほ ぼ 全 て 除 去 さ れ，成していた．続いて，EDS による観察された粒子の元に培養時間を制御する必要があるものと考えられた．一

維持されたものと考えられた．

相 試 料 を TEM に よ り 観 察 し た 結 果 を Fig. 3 に 示 す．

TI-1 株は細胞内または表面に直径数 nm の粒子を多数形－ 61 －

池道彦

素分析の結果を Table 4 に示す．RB 株，TI-1 株，TI-2 株，

マスバランスから，代謝によってセレンは揮発化し培養および TI-3 株の 4 菌株が生成した粒子はカルコゲンと系から失われたものと考えられた．多くの微生物においして Se のみならず S を含んでいたが，NT-I 株が生成してセレンの揮発化はごくわずかに生じる反応であり，著た粒子はほぼ Se のみを含んでいた．カルコゲンと Bi の量のセレンを揮発化させる細菌は NT-I 株を含めたごく

存 在 比 (S+Se)/Bi は， い ず れ の 場 合 も Bi 2 Se3 ま た は

わずかな種であると考えられていることから（ Kagami

Bi 2 SxSe(3-x) の理論値である 1.5 に近い値を示したことから，NT-I 株は純度の高い 2 元素系半導体 Bi 2 Se3 を生成し，et al., 2013 )，本研究によって NT-I 株以外の 4 菌株も極めて高い Se 揮発化能を持つことが明らかになったこと

その他の菌株については Bi-S-Se の 3 元素系半導体粒子

は驚くべきことである．NT-I 株におけるこれまでの研を生成したことが確認された．ここで，Bi 2 SxSe(3-x) 中の究において，揮発化したセレンの化学形態はジメチルセ

成分の濃度を低下させることで，NT-I 株以外の菌株に等のメチル化物であることが明らかになっている．細菌

S は TSB 培地の成分に由来するものといえ，培地中の S

よっても純度の高い Bi 2 Se3 を合成させることが可能であるとも考えられる．なお，TI-1 株については Bi，S，Se に加えて Na，P，Cl も検出されたが，これは粒子がレニド（ (CH3)2 Se)，ジメチルジセレニド（ (CH3)2 Se2 )のセレン代謝経路の詳細は未だ明らかになっていないものの，硫黄代謝と類似したものであると考えられ，メチル化物生成の過程でメタンセレノール（ CH3 SeH )やセ細胞表面に形成されていたために，EDS 分析の際に細レノシステイン（ Se-Cys)等のセレノール基を持つ化

胞成分が検出されたためだと考えられた．

合物が中間体として生成することが推測されている．

以上より，NT-I 株，RB 株，TI-1 株，TI-2 株，および

ここで，セレンを含む化合物を分離し特異的に検出でTI-3 株の 5 種の Se・Te 代謝菌は効率的に Bi 2 Se3 が合成

きる HPLC-HG-AFS により NT-I 株の菌体内セレン化合可能であることが明らかになった．特に NT-I 株が生成物の検出を試みた結果を Fig. 5 に示す．培養開始 12 時

した Bi 2 Se3 は純度が高く，また長時間の培養において間後には多数のセレンを含む代謝物が検出された．培養も Bi の再溶解が生じず安定していたことから，NT-I 株

12 ～ 24 時間にかけては Se-Cys と推定されるピークがわ

は特に有望な Bi 2 Se3 合成細菌であると考えられた．

ずかに存在しており，また，培養 12 時間以降，保持時

好気性カルコゲン代謝細菌による ChSCs 合成メカニズ

された．これらより，NT-I 株は，亜セレン酸塩還元のムの推定過程で細胞内にセレンを含む代謝物を蓄積していること

間 3.5 ～ 4 分に未知セレン化合物の顕著なピークが検出

NT-I 株，RB 株，TI-1 株，TI-2 株， お よ び TI-3 株 が効率的に Bi 2 Se3 を合成するメカニズムを探るために，が明らかになり，これらが関与して半導体が合成されるものと推測された．
以上の考察に基づいて，Fig. 6 に本研究から推定されこれら菌株によるセレン代謝を経時的に調べた．結果をFig. 4 に示している．いずれの菌株も，24 時間までに添加した亜セレン酸塩のほとんどを元素態セレンへと還元た Bi 2 Se3 のバイオ合成メカニズムの模式図を示している．Se 代謝菌は，好気条件下で亜セレン酸塩を同化的し，液相から固相へと移行させた．生成した元素態セレに還元し，セレノール化合物（－ II 価の Se 化合物)を経

ンは 24 時間以降に減少に転じ，96 - 288 時間にかけて除由して (CH3)2Se2 等の揮発性セレン化合物を生成する能去された．この時，液相および固相に含まれるセレンのTable 4

力を持つ．セレノール化合物は酸素の存在化では不安定

Elemental compositions of synthesized particles at 48 h of cultivation－ 62 －

バイオ合成による環境適合型半導体製造技術基盤の構築：細菌による多様なカルコゲン代謝機構の解明と合理的活用法の検討

Fig. 4

Time courses of the Se species amounts in the cultures of the bacterial strains.
(a) P. stutzeri NT-I ; (b) P. aeruginosa RB ; (c) S. maltophilia TI-1 ; (d) O. anthropi TI-2 ; (e) O. anthropi TI-3.
Closed circles, Se in liquid phase ; closed squares, Se in solid phase ; closed triangles, volatilized Se (estimated).
(Reproduced from Kuroda et al., 2019)

Fig. 6

Potential pathway of Se metabolism and Bi 2 Se 3
production.
Solid and dashed arrows represent biologicaland spontaneous reactions, respectively.
(Reproduced from Kuroda et al., 2019)であり，自然酸化により元素態セレンに酸化されるが，高いセレン代謝能力を持つ菌株はこの元素態セレンを再度還元してセレノール化合物に戻すことができるものと推定している．ここで培養液中に Bi(III) イオンが存在
す る 場 合 に は， 反 応 性 の 高 い セ レ ノ ー ル 化 合 物 はFig. 5Detection of Se-containing metabolites in strain NT-I
cultivated in TSB medium containing selenite by HPLCHG-AFS.

Bi(III) と結合し Bi 2 Se3 ナノ粒子を形成するものと考えられる．TI-1 株は細胞内または表面で Bi 2 Se3 ナノ粒子を形成し，その他の菌株は細胞外に形成することが観察－ 63 －

池道彦

されたが，これは，これら菌株のセレノール化合物の細なる材料・知識を得ることができたが，実用化のために胞外への排出機構に違いがあることに起因するのではな

はさらに，バイオ反応によって生じる ChSCs ナノ粒子

いかと推測される．水中に Bi 2 Se3 ナノ粒子を長時間放の回収・精製法を確立し，生成ナノ粒子の特性を明確に置すると，ナノ粒子特有の反応性の高さによって一部はしていく必要がある．

分解し，Bi(III) が再溶解するとともにセレノール化合

要

物は酸化されて元素態セレンに変換されるが，NT-I 株
については，高いセレン代謝活性により元素態セレンを還元し続け，Bi 2 Se3 ナノ粒子を安定に維持し得るものと推測された．

約

化合物半導体ナノ粒子の合成に係る環境負荷を大幅に低減し，グリーン化する手段として，微生物の代謝作用推定された Bi 2 Se3 合成のメカニズムは，好気性の Seを利用するバイオ合成が提案されているが，現状では実代謝菌を利用した CdSe 等の他のセレン化物半導体合成用化のために必要な生物触媒や合成技術の基盤が十分ににも共通するものと考えられる．また，NT-I 株は Se の整備されているとはいえない．本研究では，細菌による揮 発 化 試 験 に お い て， ジ メ チ ル セ レ ノ ス ル フ ィ ド

カルコゲンの代謝を利用して重要な化合物半導体の一カ（ (CH3)2 SeS)やジメチルジスルフィド（ (CH3)2 S2 )な

テゴリーである ChSCs ナノ粒子をバイオ合成する技術

化作用は S 代謝と関連していることが推定されている

好気条件下において効率的にカルコゲン酸化物（ S2O32- ，

ど S を含む揮発化物をも生成することから，Se の揮発（ Kagami et al., 2013 )．このことから，Fig. 6 と類似したメカニズムで硫化物半導体のバイオ合成が行われ得るものとも考えられる．

基盤の確立を目的として一連の研究を行った．
SeO32- ，TeO32- )の還元能を示す多様な細菌株に対して，

Cd 2+ 等金属イオンを添加した培養を行い，ChSCs の合成ポテンシャルを調べた結果，2 元素系 ChSCs として

CdS，CuS，ZnS，CdSe，Bi 2 Se3 の 含 S お よ び 含 Se ナ

ChSCs バイオ合成実用化へ向けての課題

ノ粒子の合成が確認された．また，3 元素系の ChSCs と本研究においては，好気条件下でカルコゲン還元能を示す微生物から，これまでにない高い効率で硫化物，おして，CdSxSe(1-x) および Bi 2 SxSe(3-x) の合成も行えることも初めて明らかとなった．一方，何れのカルコゲン代

よびセレン化物半導体を合成することのできる複数のカ

謝細菌を用いた場合にも，Te を含む ChSCs の明確な合

ルコゲン代謝細菌株を選抜し，ChSCs 製造に用いる微成は確認することができず，効率的なバイオ合成が困難

生物材料のライブラリとして整備することができた．今であることが示唆された．バイオ合成に関する知見が極回得ることのできなかったテルル化物半導体の合成微生

めて少ない Bi 2 Se3 合成については，その詳細を明らか物については，今後さらに探索していく必要がある．本にする試みを行い，複数の Se 代謝細菌および Te 代謝細研究ではまた，セレン化物半導体が，合成微生物が生成菌により合成が可能であることが示されたが，特に，多するセレノール化合物が金属イオンと化学的に反応する様な Se 代謝を極めて効率的に行う P. stutzeri NT-I によことで合成されるという合成経路を提案することがでり安定した合成が行われた．ここで，Bi 2 Se3 を含む Se

き，硫化物半導体合成も類似の経路（チオールと金属イオンの化学反応)によって行われることが推測された．
こ の こ と か ら， 好 気 性 カ ル コ ゲ ン 代 謝 菌 を 用 い た
ChSCs 合成においては，微生物によるセレノール，チオールの生成を促進する培養条件を選定するのみでな
く，これらの生成物が金属イオンと化学反応を生じやす
い条件についても考慮することが重要であるといえる．

含有 ChSCs の合成は，Se 代謝細菌による Se の揮発化能（ (CH3)2 Se，(CH3)2 Se2 等 の Se メ チ ル 化 物 の 生 成 )と関連付けられることが示唆された．すなわち，CdSe
や Bi 2 Se3 合成は，Se の揮発化につながる同化型還元の過程で中間体として生じる CH3 SeH や Se-Cys などの含セレノール化合物が，添加された Cd(II) や Bi(II) と反応することで行われたものと推測された．

すなわち，生物反応と化学反応をバランスよく制御する

本研究で ChSCs の合成能が確認された好気的カルコ

ことによって ChSCs 合成の最適化を図るという ChSCs

ゲン代謝細菌株，特に Se 代謝菌株は，ChSCs ナノ粒子

バイオ合成技術開発の基本的な方向性を示すことができバイオ合成の実用化を進めるうえで有望な微生物触媒でた．今後，カルコゲン代謝菌が生成するチオール，セレ

あるといえる．また，本研究で Se を含む ChSCs 合成のノール化合物を同定し，その合成経路の詳細を明らかにメカニズムの一端が明らかになったことにより，より合するとともに，各種金属イオンと化合物を形成する条件

理的な ChSCs のバイオ合成技術が開発されていくことを明確にすることによって，より効率的に，より多様なが期待される．

ChSCs を製造することのできる技術の確立が期待される．以上のように ChSCs バイオ合成技術確立の基盤と－ 64 －

バイオ合成による環境適合型半導体製造技術基盤の構築：細菌による多様なカルコゲン代謝機構の解明と合理的活用法の検討

本助成で得られた研究成果の報告

謝口頭発表1) 黒田真史，畠中玄彦，井上大介，池道彦．2018．Pseudomonas
stutzeri N T-Iによる水相からのテルルの揮発化除去と回収．第70回日本生物工学会大会（9月5 - 7日，吹田)
2) 黒田真史，惣田訓，池道彦．2018．Pseudomonas属細菌のセレン・テルル代謝の解析と半導体ナノ粒子合成への応用（シンポジウム『半金属元素のバイオテクノロジー』)．
第70回日本生物工学会大会（9月5 - 7日，吹田)
3) 畠中玄彦，黒田真史，井上大介，池道彦．2018．Pseudomonas
stutzeri NT-Iによるテルル揮発化に影響を及ぼす因子の検討．日本水処理生物学会第55回大会（11月2 - 4日，郡山)
4) 末神悠人，畠中玄彦，黒田真史，井上大介，池道彦．
2019．Pseudomonas stutzeri NT-Iの揮発化作用による水相からのテルルの除去と回収．第53回日本水環境学会年会（3月7 - 9日，甲府)
5) 黒田真史，畠中玄彦，末神悠人，池道彦．2019．Pseudomonas
stutzeri NT-Iによる水相からのテルルの揮発化と回収．環境バイオテクノロジー学会2019年度大会（6月15 - 16日，
吹田)6) 佐藤守，黒田真史，井上大介，池道彦．2019．Pseudomonas
stutzeri NT-Iによるセレン化物半導体ナノ粒子の合成．環
境技術学会第19回年次大会（6月29日，京都)
7) Kuroda, M., Hatanaka, H., Suegami, Y., Inoue, D. & Ike, M.
2019. Ef ficient biovolatilization of tellurium from waterphase by Pseudomonas stutzeri NT-I. Federation of European
Microbiological Societies 2019（July, 7–11, Glasgow, UK)8) Ikeda, M., Kuroda, M., Inoue, D. & Ike, M. 2019. Nutrients
accelerating selenium removal by Pseudomonas stutzeri
NT-I. Water and Environment Technology Conference 2019
（July, 13 – 14, Suita, Japan)
9) 池 田 美 紗 希 ， 黒 田 真 史 ， 井 上 大 介 ， 池 道 彦 ． 2 0 1 9 ．
Pseudomonas stutzeri NT-Iのセレン代謝を促進する培地成分の検討．第71回日本生物工学会大会（9月16 - 18日，岡山)10) 黒田真史，小林慎，高山一也，池道彦．2019．好気的硫
黄代謝細菌を活用した重金属除去．第71回日本生物工学会大会 （9月16 - 18日，岡山)
11) 佐藤守，黒田真史，井上大介，池道彦．2019．Pseudomonas
stutzeri NT-Iによるセレン化物半導体ナノ粒子の合成．第71回日本生物工学会大会（9月16 - 18日，岡山)
12) Kuroda, M. & Ike, M. 2019. Removal and recovery of selenium
from wastewater utilizing biovolatilization by selenium-metabolizing bacteria. 23rd International Biohydrometallurgy
Symposium（October, 20 – 23，Fukuoka, Japan)13) 黒田真史，池田美紗希，池道彦．2019．Pseudomonas stutzeri
NT-Iのセレン代謝に及ぼす培地成分の影響．日本水処理生物学会第56回大会（11月8 - 10日，野々市)
原著論文
1) Kuroda, M., Suda, S., Ayano, H., Ohishi, Y., Nishikawa, H.,
Soda, S. & Ike, M. 2019. Biosynthesis of bismuth selenide
nanoparticles using chalcogen-metabolizing bacteria. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 103: 8853–8861.

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，予備的段階を含め，本研究の遂行においてご協力をいた
だいた県立広島大学生命環境学部の阪口利文教授，大阪大学接合科学研究所の西川宏教授，大阪大学大学院工学研究科の大石佑治准教授，立命館大学理工学部の惣田訓教授に感謝の意を表します．実験研究に直接・間接に貢献いただいた多数の学生諸氏にも感謝いたします．

文

献

Ayano, H., Miyake, M., Terasawa, K., Kuroda, M., Soda, S.,
Sakaguchi, T. & Ike, M. 2014. Isolation of a selenite-reducing
and cadmium-resistant bacterium Pseudomonas sp. Strain RB
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Gao, M.R., Xu, Y.F., Jiang, J. & Yu, S.H. 2013. Nanostructured
metal chalcogenides: synthesis, modification, and applicationin energy conversion and storage devices. Chem. Soc. Rev. 42:
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Kagami, T., Fudemoto, A., Fujimoto, N., Notaguchi, E., Kanzaki,
M., Kuroda, M., Soda, S., Yamashita, M. & Ike, M. 2012. Isolationand characterization of bacteria capable of reducing tellurium
oxyanions to insoluble elemental tellurium for tellurium recovery
from wastewater. Waste Biomass Valorization 3: 409 – 418.
Kagami, T., Narita, T., Kuroda, M., Notaguchi, E., Yamashita, M.,
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Chem. Eng. 6: 4863 – 4870.

－ 65 －

2014 年度寄付講座助成の研究報告
助成期間:2014 年 10 月～ 2020 年 3 月

IFO Res.Commun. 34
67-74, 2020

微生物二次代謝産物の物理化学的性質に着目した
physicochemical screening による新規物質の発掘とその実用化研究
中

島

琢

自

北里生命科学研究所創薬資源微生物学寄付講座〒108-8641

東京都港区白金5-9-1

Search for new compounds using physicochemical screening focusedon physicochemical properties of microbial secondary metabolites
Takuji Nakashima
Laboratory of Microbiology for Drug Discovery, Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University
5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo 108-8641, Japan
Global public health faces a desperate situation, due to the lack of effective antibiotics. Coordinated steps need tobe taken, worldwide, to rectify this situation and protect the advances in modern medicine made over the last 100
years. Japanese work has been in the vanguard of many such advances, and work is being proactively tailored topromote the discover y of urgently needed antimicrobials. Numerous research group has isolated multiple
microorganisms for a long time ago. The resulting collection comprises a broad spectrum of microorganisms,
including strains producing novel and diverse compounds with biological activities. A bioassay-guided fractionationof microbial culture broths has been employed to screen the microbial collection due to searching for new
biological active compounds. And many novel natural products have been discovered among the microbial
metabolites produced by members of the collection. However, there has been a decline in the pace of newcompounds discovery from microbial metabolites. One of the problems in the field of natural product is the highrate of re-discovery of known compounds. Recently, it has become easy to acquire the ultraviolet (UV) and mass
spectrometry (MS) spectra of many single components of microbial culture broths in combination with highperformance liquid chromatography (HPLC). New compounds from microbial culture broths were investigated by
employing an approach based on the physico-chemical properties using spectral analyses such as UV and MS,
collectively designated as physicochemical (PC) screening. As a result of physicochemical screening, eighty newcompounds were identified among the secondary metabolites of fresh isolates and stock strains producing known
compounds.

第一章

はじめに

た．その後，ワックスマン博士が初めて放線菌から網羅

1929 年のフレミング博士によるペニシリンの発見

的抗生物質の探索を行い，Streptomyces antibioticus から（ Fleming, 1929 )，1940 年のフローリー博士とチェン博

ア ク チ ノ マ イ シ ン（ Waksman & Tishler, 1942 )，S.

士によるペニシリンの精製単離（ Chain et al., 1940 )，lavendulae からストレプトスリシン（ Waksman & Woodruff,
1942 )，そして 1944 年に S. griseus からストレプトマイ

そして 1943 年にペニシリンは欧米において実用化されシン（ Schatz et al., 1944 )を発見した．これらの抗生物
E-mail:中島琢自（ takuji@lisci.kitasato-u.ac.jp )（現 , 早稲田大学リサー
チイノベーションセンター 〒 162-0041 東京都新宿区鶴巻町 513 )教員
松尾洋孝（現 , 国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所)，
稲橋祐起（現 , 北里大学大村智記念研究所)，
須賀拓弥（現 , 日本マイクロバイオファーマ株式会社)

質の発見を機に，多く研究機関や製薬企業は微生物が生産する二次代謝産物に焦点をあて，新規物質の探索研究を進めてきた．一般的な生物活性物質探索の方法では，ある特定の生物活性を指標に微生物培養液抽出物を評価
し，活性を示した抽出物をクロマトグラフィーなどで分画し，その分画試料の活性を再評価する．これを繰り返すことで目的の活性物質を精製する．精製後，NMR や－ 67 －

中島MS などを用いて構造解析を行う．この方法で，微生物琢自る．化合物の構造多様性はケミカルスペースによって表

代謝産物から多くの医薬品が発見された．しかし，微生すことができる（ Christopher, 2004 )．ケミカルスペー

物が生産する天然物そのものが抗生物質として利用され

スは，化合物の溶解性など物理化学的な性質や化合物にたのは，1987 年に発見され，2003 年に上市されたリポペ

含まれる全炭素中の sp3 炭素の割合を示す Fsp3 係数が高プチド系抗生物質ダプトマイシンが最後である（ Silver,

い（ Lovering et al., 2009 )などのトポロジカルな構造的2011 )．Baltz（ 2006 )は，環境から 10 株の放線菌を分特徴など，化合物の化学的特性範囲を評価できる．骨格

離すればダプトマイシンを発見できると報告している．

多様な天然物は化学合成品よりケミカルスペースが広い

多くの製薬企業は以下の理由から天然物探索研究から撤といわれており，創薬研究に用いられるリード化合物と退している．すなわち，微生物の収集・培養，生物活性評

して再評価されている．

7

価，精製や構造決定に時間と費用がかかり，また，微生物

ゲノム解析技術の進展により，微生物は多種多様な二が生産する化合物は構造的に多様で，合成展開が難しい．

次代謝産物の生合成遺伝子を有することがあきらかと

一方，1990 年代に欧米の製薬企業で相次いで導入さなった（ Crits-Christoph et al., 2018 )．その二次代謝生合れたハイスループットスクリーニング（ HTS)は，化

成経路はポリケチド，メバロン酸・非メバロン酸，アミ合物ライブラリーの評価を高速で行うことができ，初期ノ酸，糖質，シキミ酸経路の 5 つに大別できる．単独もの新薬候補化合物の探索や医薬品リード化合物の選択にしくは複数の代謝系が関わって二次代謝産物（天然物)用いられるようになった．日本の製薬企業でも HTS をの複雑・多様な構造が生み出される．そこには二次代謝導入する傾向になり，医薬品の探索源が天然物からコンの基質となる原料の違いや修飾酵素など様々な要因が関ビナトリアル合成品へと移り変わった．コンビナトリア

わっており，ナナオマイシン類（ Fig. 1; Ōmura et al.,ル合成品は，当初は出発原料にシキミ酸を用い，200 万

1974; Nakashima et al., 2017a; Nakanishi et al., 2019;

以上の二環性骨格化合物(Derek et al., 1998)，最近はビMatsuo et al., 2019a, 2019b )に見られる様に，放線菌

ルディングブロックとして注目されている窒素が結合しStreptomyces rosa subsp. notoensis OS-3966 株 1 菌株から，今回の我々の成果を含めて 12 類縁体が発見された．またアルキン化合物イナミドを用いた合成品（ Wang etal., 2014 )などが使用されている．上に述べた最後の天然物抗生物質ダプトマイシンの発見と時を同じくして創た，これらの類縁体はわずかな構造的な違いにより異な薬研究に HTS が用いられた．しかし，コンビナトリア

微生物が生産する二次代謝産物の種類は天文学的な数にル合成品から医薬品となった例はほとんど無く，近年，なる．

る生物活性を示した．培養方法や検出方法の工夫により天然物の構造や生物活性の多様性が再評価され，再度微微生物培養液には多くの夾雑物が含まれており，従来

生物代謝産物の探索研究が注目されつつある．一例としから行われている生物活性ではメイン物質の活性の陰にて，クロイソカイメン由来のハリコンドリン B を元に隠れてしまい，見落としている可能性がある．近年，ク創薬されたエブリン（ Towle et al., 2001 )は，2010 年にロマトグラフィーと質量分析は目覚ましい発展を遂げ，抗がん剤として FDA に承認された．この成果は，天然

高分離・高感度・高分解能な質量スペクトルが得られ，物が創薬の探索源として依然活用できることを示してい正確に微量成分を分析できるようになってきた．

Fig. 1

Structures of nanaomycin analogs.
Nanaomycin A (1) showed antimicrobial activity against Trichophyton spp. Nanaomycin H (2)and nanaomycin K (3) showed cytotoxic activity against MCDK cell-induced Epithelial
Mesenchymal Transition.

－ 68 －

微生物二次代謝産物の物理化学的性質に着目した physicochemical screening による新規物質の発掘とその実用化研究

本寄付講座では，微生物の多様な化合物生産能力を引分離した糸状菌を用いた．

き 出 す た め に， 特 定 の 生 物 活 性 で は な く，LC/UV や（ⅰ)長期保存株 KML:約 1,200 の放線菌培養液抽出

LC/MS 等で化合物の物理化学的性状を解析し，化合物

物 の LC/MS 分 析 デ ー タ を 用 い， 主 成 分 分 析の新規性を予測して単離・精製および構造決定を行う方（ MakerView™ ソフトウェア，エービーサイエックス)法で新規物質の探索を行った．この生物活性によらないにより解析した．この主成分分析により，複数のサンプ探索法を physicochemical(PC)screening（ Nakashima

ル群の間でデータを比較した．ここで，データセットのet al., 2017b; Takahashi & Nakashima, 2018; 高橋・中島，
2018 )と称した．

グループ化を行い，そのグループをスコアプロットするとグラフィカルに表示できる(Fig. 2)．培養液抽出物に

北里大村創薬グループは，長年に渡り，様々な分離法

ついて主成分分析を行って，20,000 のピークを抽出し，を駆使して微生物株を分離し，その培養液をスクリーニ

化合物の分子量関連イオンであるモノアイソトピック

ングに供し，エバーメクチン（ Burg et al., 1979 )やラ

ピークを検出し，4,662 ピークまで絞り込んだ．それぞクタシスチン（ Ōmura et al., 1991 )など有用物質を含れのピークの精密質量値，紫外線極大吸収スペクトル，

む約 520 の新規物質を発見してきた．北里微生物資源ラMS/MS フラグメント分析情報を得た．これらの情報をイブラリー（ KML )では，これら生産菌株と探索研究

天然物データーベース DNP に掲載されている既知物質の過程で既知物質と同定された物質の生産菌も含めて，の情報と比較することにより，新規と推定される化合物

長期保存法等により保存されている．常時，多様な微生を選択し，精製および構造決定へと進めた．

物資源を得るために，分離法の工夫や様々な環境に注目

Fig. 2 に 一 例 を 示 す．Streptomyces griseus OS-3601 株

し，放線菌や糸状菌を分離している．例えば，植物の根が生産する一つのモノアイソトピックピークに着目しより分離される放線菌は，一般土壌からは分離されにくた．その精密質量値から選択した化合物の分子組成はい Streptomyces 属以外の希少放線菌が多く，その中から

C17H24N+ と推定できた．紫外線極大吸収は 272 および新属・新種の放線菌を多数報告している(Matsumoto &284 nm を示し，これらのデータを DNP で検索したとこ

Takahashi, 2017)．

ろ，既知物質の情報と一致しなかったので，新規物質と本寄付講座は，北里大村創薬グループの共同研究体制推定した．各種クロマトグラフィーで精製後，NMR での一員として参画し，KML に保存されている様々な菌

解 析 し， イ ミ ニ マ イ シ ン 類（ Nakashima et al., 2016a,

株の培養液を用いて PC screening による新規物質の探2016b )と決定した．

索を行った．

本方法で，Streptomyces rosa subsp. notoensis OS-3966

PC screening 法の概略は以下の通りである．予め設定

株からナナオマイシン類(Nakashima et al., 2015b, 2017a;

しておいた 4 種類の液体培地で培養後，当量のエタノー

Matsuo et al., 2019a, 2020a)，Actinomadura sp. K13-0306

ルを加え，よく混和し菌体を破砕した後に遠心により上株からサガミラクタム(Kimura et al., 2016)，Allostreptomyces

清を回収し，分析試料とした．LC/MS や LC/UV 分析デー

sp. K12-0794 株からハムラマイシン類(Suga et al., 2018)，

タを取得後，培養液抽出物に含まれている質量分析値や紫Lechevalieria aerocolonigenes K10-0216 株からピリゾマイ

外線極大吸収のデータを Dictionary of Natural Products（ DNP, CRC press, Taylor & Francis Group )で検索した．
質量分析は内部標準もしくは外部標準で精密質量値を取得し，可能な限り分子式まで求めた．分子量が大きいものは範囲をもたせた MS 値で検索した．紫外線極大吸収値と合わせることで既知物質の dereplication の精度が向上し，さらに生産菌情報などから化合物を絞り込んだ．
絞り込んだ化合物の MS/MS フラグメントの計算値と実測値を合わせて化合物を推定した．既知物質と同定された化合物の MS/MS フラグメントをライブラリ化し，インハウスデータベースとして構築した．

第二章

研究成果の概要

1）質量分析による新規物質の探索
探索源としては KML の保存菌株および特殊環境から－ 69 －

Fig. 2

Principal component analysis of microbial culture
extracts.

中

島

琢

自

シン(Kimura et al., 2018a)，Mumia sp. YSP-2-79 株からムミアマイシン(Kimura et al., 2018b)を発見した．
（ⅱ)特殊環境分離糸状菌:北里生命科学研究所 微生
物資源研究センターでは海洋島や深海の堆積物などの特殊環境から新属・新種の糸状菌や希少な糸状菌を多数分離

Fig. 3

Principle of molybdenum oxidation reaction.

している．海洋島および深海由来糸状菌を探索源として，
上記の（ⅰ）と同様に PC screening を行い，海洋島由来糸状菌 Pochonia chlamydosporia var. spinulospora FKI-7537 株よりポコニオライド類(Miyano et al., 2018), Neocosmosporaal., 2020d)，Leptobacillium leptobactrum FKI-7961 株からレプトチオニンを見出した．

sp. FKI-7792 株 よ り ケ ト チ ベ ル シ ン C(Matsuo et al.,2020b)，深海由来糸状菌 Sarcopodium sp. FKJ-0025 株よ3）エルゴステロール修飾シリカ（ ES シリカ）を用いた

りサルコポディノール類(Matsuo et al., 2018)，Penicillium

新規物質の探索brevicompactum FKJ-0123 株よりシプラルフェリン(Matsuo

真菌の細胞膜主要成分であるエルゴステロールは抗真et al., 2019b)，Penicillium steckii FKJ-0213 株よりハツサミド類を発見した．

菌物質アンホテリシン B の標的分子である．シリカゲ
ルのシラノール基にエルゴステロールを結合させた樹脂（ ES シリカ)を開発し，エルゴステロールと特異的に

2）ヘテロ元素含有新規物質の探索（新規含窒素化合物

結合する化合物を放線菌培養液から探索した．放線菌培と新規含硫黄化合物）

養液抽出物 859 サンプルから ES シリカと結合する化合天然物データベース DNP には 267,132 の有機化合物物を探索し，既知物質 94 化合物を同定して，推定新規が 登 録 さ れ， そ の う ち 含 窒 素 化 合 物 は 62,100 化 合 物

物質 29 化合物を見出した．既知物質は，ポリエン化合( 23 %)，含硫黄化合物は 5,087 化合物( 2 %)である．一物だけでなく，様々な化合物が ES シリカに結合するこ方，KEGG MEDICUS(Kanehisa et al., 2010)には日本おとがわかった．また，ピペラジン化合物や核酸系化合物

よび米国の医薬品添付文書をもとに 10,484 の医薬品がなど窒素を含む複素環式化合物が多く検出され，既知物登録されている．そのうち，7,207 化合物( 69 %)が窒素，

質 94 化合物のうち 75 化合物（ 80 %)が微生物アルカ

2,430 化合物( 23 %)が硫黄を含んでいる．このようにヘロイドだった．新規物質と推定した化合物の中からテロ元素を含む化合物は構造的に多様性を生み出し，医薬品として利用されている化合物も多い．そこで，窒素Amycolatopsis sp. K16-0194 株 よ り ジ ピ リ マ イ シ ン 類（ Izuta et al., 2018 )および Streptomyces sp. K16-0477 株

または硫黄を含む化合物のスクリーニング系を構築し，

よりデイジアミド C を発見した．同定した既知物質や新規物質探索を行った．

ジピリマイシンの結果より，ES シリカは微生物アルカ

新規含窒素化合物は主成分分析と窒素ルールを用いてロイドと結合する可能性が示唆された．

探索した．窒素ルールとは，分子量が奇数になる化合物
は窒素が奇数個含まれているというルールである．主成4）PC screening を活用した放線菌ゲノムからの新規物
質探索および生合成研究

分分析は MakerView™ ソフトウェアを用いて解析し，分子量が奇数のピークを選択し，PC screening より新規

放線菌ゲノムからの生合成遺伝子の探索とPC screeningと推定した化合物を精製・構造決定した．その結果，を組み合わせ，新規物質の取得を試みた．ユニークな骨Trichoderma virens FKI-7573 株よりトリコチオネイックア
シッド(Miyano et al., 2020)，Oidiodendron maius FKI-7498

格であるアミノビニルシステインの生合成遺伝子を放線

株よりペニシドン E，Sarocladium oryzae KF-140 株よsubsp. irumaensis" AM-3603 株 お よ び S. nitrosporeus

りサロクラディックアシッドを発見した．

K93-0711 株よりサイペマイシン新規類縁体を発見した．

菌 768 株 か ら 探 索 す る こ と で "Streptomyces subflavus

天然物に含まれるヘテロ元素のなかで硫黄は窒素に次また，Streptomyces sp. KO-7888 株より二次代謝を正に制

いで含有率が多い元素である．しかし，硫黄化合物を簡御する転写制御因子を利用した新規物質探索を行うこと

便かつ選択的に探索する方法はない．そこで，Fig. 3 にで 新 規 リ ポ ペ プ チ ド， サ ー ペ プ チ ン 類 を 発 見 し た

示す硫黄選択的酸化反応(モリブデン酸化)，(Trost &(Koomsiri et al, 2019)．さらに，PC screening により得Masuyama, 1984)および質量分析計を組み合わせた微生

られた新規物質の生合成研究を行い，トレハンジェリン

物由来含硫黄物質検出系(MoS-screening)を構築した(Inahashi et al., 2016)，アクチノアロライド(Inahashi et(Matsuo et al., 2020c)．MoS-screening により Trichodermaal., 2018)およびピリゾマイシンの生合成遺伝子クラス
ターを同定した .

polypori FKI-7382 株からチオポリジオール類(Matsuo et－ 70 －

微生物二次代謝産物の物理化学的性質に着目した physicochemical screening による新規物質の発掘とその実用化研究

第三章

おわりに

規物質や生体分子修飾シリカのスクリーニングでは，多くの推定新規化合物が含まれていた．
1940 年から 2010 年で微生物の代謝産物から 33,500 の2014 年 か ら 2020 年 ま で の 寄 付 講 座 期 間 中 に PC
screening で見いだされた新規物質を Table 1 にまとめ化合物が発見され，その中の 10,800 は，2,000 年からのた．放線菌 19 株および糸状菌 10 株から，新規物質 32

10 年間で発見されている（Bérdy, 2012)．また，Newman

化合物（類縁体を含めると 50 化合物)を発見した．こ& Cragg（ 2016 )によると，1981 年から 2014 年の 34 年

こで特記される点は，これら PC screening によって発間に 1,211 の低分子医薬品が米国食品医薬品局（ FDA )見された化合物の多くは，単離・構造決定後に何らかので承認され，その 50 %程度が天然物あるいはそれをヒ

生物活性が見いだされることである．ヘテロ元素含有新ントにして創られた化合物であり，天然物探索の重要性

Table 1

List of new compounds by PC screening (2014.10 - 2020.3)－ 71 －

中

島

琢

自

が指摘されている．当寄付講座は PC screening というもうひとつはトレハンジェリンの発見である．トレハ

手法を用いて，微生物が生産する物質に焦点をあて，新ンジェリンは西表島のキンギン草の根から分離された希規物質を探索してきた．これまで微生物の二次代謝産物

少放線菌 Polymorphospora rubra K10-0510 株の培養液かから多くの化合物が発見され，有効活用されているが，ら PC screening で見出された．本物質は，トレハロー

当寄付講座の結果は，多くの新規物質が未発見のまま残スに 2 分子のアンジェリカ酸が結合した構造であり，当初， 細 胞 膜 の 光 酸 化 抑 制 効 果 が 見 出 さ れ て い た

されていることを示唆している．
今回の研究は，新規物質探索では微生物資源の質およ（ Nakashima et al., 2013 )．本寄付講座期間中に企業と共び 多 様 性 が 重 要 で あ る こ と を 示 し て い る．Tiwari &同研究で応用展開し，コラーゲン生成促進効果（神谷ら，

Gupta(2012)は，いわゆる希少放線菌から発見された化2016 )およびオートファジー誘導効果（小坂ら，2017 )合物についてまとめており，新規物質の探索源として興が確認された．現在，トレハンジェリンの生産量は産業

味深いと述べている．本寄付講座でも，Table 1 に示し利用できるまで向上し，効果はコラーゲン生成促進効果

たように Streptomyces 属 10 株であるのに対して，9 株のに加え，ラメラ構造の修復能力（神谷ら，2020 )が観

希少放線菌から新規物質を発見した．寄付講座以前に察された．また，コマツナを使ったポット試験で葉緑体行っていた PC screening で発見したマングロマイシン

濃度を向上させる効果（矢嶋・小坂，2019 )を示した．

類(Nakashima et al., 2014a, 2014b, 2015a)や ト レ ハ ン

トレハンジェリンは株式会社ファンケルおよび長瀬産業

ジェリン(Nakashima et al., 2013)などを含めると，希少株式会社と共同で開発を進め，2021 年に化粧品および放線菌から発見できた新規物質の数は Streptomyces 属か洗浄剤として上市予定である．

ら見出された数を上回る．一方，糸状菌に目を向けると，

謝

頻繁に分離される Penicillium 属から 3 つの新規物質が発見できたが，これまで二次代謝産物の生産菌として報辞告 例 が 少 な い Pochonia chlamydosporia var. spinulospora

本研究は，公益法人発酵研究所の 2014 年度寄付講座

FKI-7537 か ら ポ コ ニ オ ラ イ ド 類，Leptobacillium lepto-

助成である北里大学 北里生命科学研究所 創薬資源微生

bactrum FKI-7961 からレプトチオニン類，Trichoderma

物学研究室で行われたものであります．本助成を賜った

polypori FKI-7382 からチオポリジオール類などの新規物質が発見できた．

発酵研究所に深く感謝申し上げます．また，この研究は，
大村 智先生および高橋洋子先生の終始変わらぬご指導

近年，天然物探索が見直され，再び微生物由来の新規とご支援によってなされたものであり，改めて心より感化合物の探索が注目されている（ Grushkin, 2013 )．ゲ

謝申し上げます．また，北里大村創薬グループの皆様，

ノム解析により，菌株によっては 30 以上の二次代謝産特に微生物資源でお世話になりました松本厚子博士およ

物生合成遺伝子を持っていることが報告されており，本び野中健一博士，構造解析でお世話になりました岩月正寄付講座で発見できた新規物質の結果は当然のこととも

人博士および砂塚敏明博士に感謝申し上げます．PC

言える．しかし，ゲノム解析から予測される化合物と，

screening による新規化合物の探索をともに遂行してく

実際に取得できる化合物には数の上で大きな開きがあださった，稲橋佑起博士，松尾洋孝博士，須賀拓弥博士

り，多くの新規物質が未発見のまま取り残されている．

と多くの学生諸氏に感謝申し上げます．

PC screening は物質ありきで進めてきたが，化合物があ

文れば新たな活性が見つかり社会に貢献できる道が開け
る．また，二次代謝産物の生産が確認された菌株が保存されていることが重要であり，見落とされてきた能力を新たに発見できる可能性を秘めている．菌株の遺伝子解析 に よ り 得 ら れ る 情 報 や 遺 伝 子 操 作 等 に 加 え，PC
screening によるアプローチとこれまで蓄積してきたデータベースを駆使することによって新規化合物発見も飛躍的に高まると考える．
本寄付講座の最大の目標である実用化研究では，以下の 2 件があげられる．
そのひとつは，エルゴステロールと特異的に結合する化合物を検出するシリカゲル（ES シリカ)の開発であり，
2019 年に富士シリシア化学㈱から市販された．

献

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－ 73 －

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* 本助成で得られた研究成果の報告－ 74 －

IFO Res.Commun. 34
75-92, 2020

質量分析による新規物質の探索
松尾

洋孝，中島

琢自

北里大学北里生命科学研究所創薬資源微生物学寄付講座〒108-8641

東京都港区白金5-9-1

The search for new compounds by mass spectrometry
Hirotaka Matsuo, Takuji Nakashima
Laboratory of Microbiology for Drug Discovery,
Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University
5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo, 108-8641, Japan
Microorganisms have been known to produce natural products with unique chemical structures. These products
are produced from their interaction with the environment they live in as a strategy for survival. This suggests thatthese diverse chemical structures are often associated with vast strong biological activity. This is reason why
natural products are an important source for drug discovery. At present bioactive compounds were often screened
through bioactivity-guided approach. However, this approach could miss potentially valuable compounds in suchminor components or secondary metabolites without the specific biological activity, and it is possible to miss oroverlook potential and valuable compounds. The development of analyzers, such as HPLC and MS, are possible tophysicochemically detect compounds produced by microorganisms. In our laboratory, we have identified new
unique compounds using the physicochemical (PC) screening approach. PC screening is performed by indexing
the physicochemical properties of the produced compounds. In this study, we report the new compounds and their
biological activities discovered by PC screening from actinomycete and fungal strains.
Key words: Kitasato Microbial Library, deep-sea fungi, endophytic actinomycetes, mass spectrometry,
physicochemical screening緒

言コンパクチン(Endo et al., 1976)等が発見され，医薬，動微生物は，多様な構造をもつ二次代謝産物を生産する

物薬，農薬などの分野で大きな社会貢献を果たしてきた．

ことで知られており，これまで様々な生物活性物質を求従来から行われている探索研究として生物活性を指標

めて探索研究がなされてきた．放線菌からストレプトマとした方法がある．この探索方法は，微生物培養液抽出

イシン(Schatz et al., 1944)やエバーメクチン(Burg et

物をある特定の生物活性で評価し，活性を示した抽出物

al., 1979)等，糸状菌からペニシリン(Fleming, 1929)やを分配やクロマトグラフィーなどで分画し，その分画の活性を再評価することで精製を進め，化合物を特定してE-mail: matsu-h@lisci.kitasato-u.ac.jp, takuji@lisci.kitasato-u.ac.jp
共同研究者:目代貴之（東北大学金属材料研究所)，
庭野吉巳（秀明大学看護学部)，
大西康夫（東京大学大学院農学生命科学研究科)，
中西 淳（国立研究開発法人物質・材料研究機構)，
重村克己（神戸大学医学部)，
坂戸久子（株式会社 BF アグロ)，
松本厚子（北里大学北里生命科学研究所)，
野中健一（北里大学北里生命科学研究所)，
岩月正人（北里大学北里生命科学研究所)，
廣瀬友靖（北里大学北里生命科学研究所)，
砂塚敏明（北里大学北里生命科学研究所)

いく．この方法は，合目的的で開発の道筋が明確であり将来の展開も考え易い．しかし，この方法だけでは，微生物の多くがその物質生産能力を充分に生かされずに見逃されてきたと考えられる．
Crits-Christoph et al.(2018)は，土壌から抽出した遺伝子の解析から，微生物は多くの二次代謝産物生合成遺伝子を保有していることを報告している．また，これらの遺伝子には休眠状態のものも多く，覚醒させる遺伝子工学技術も開発されつつある(尾仲，2014；浅井・大島，
2016)．例えば，土壌分離放線菌のリボゾームまたは－ 75 －

松尾

洋孝，中島

琢自

RNA ポリメラーゼに変異を導入し，抗生物質耐性をも320 株が，それぞれ 4 種類の異なる培地で培養された

たせることで，休眠遺伝子が活性化し，親株では生産し2,820 および 1,280(計 4,100)サンプルの培養液を新規物ていなかった 4 分子のピペリジンを含む新規抗菌物質ピ質探索源として使用した．

ペリダマイシンを生産するようになったとの報告がある(Hosaka et al., 2009)．このような技術革新によって，多生産培地
放線菌用生産培地として次の 4 種類を用いた．

様な二次代謝生合成遺伝子を有する微生物がさらに活か301 培 地:2.4 % starch, 1.0 % glucose, 0.5 % yeast

されることが期待される．
そこで，本寄付講座では，微生物培養液抽出物から，生産化合物の物理化学的性状を LC/UV や LC/MS などで解析し，データベースと照合することにより化合物の新規性を予測し，単離・精製を進めた．本アプローチを
physcochemical(PC)screening(Nakashima et al., 2017;
Takahashi ＆ Nakashima, 2018)と称し，新規物質の探索研究を適用した．使用した微生物は，北里大学大村創薬
グループより提供された．大村創薬グループでは，長年

extract, 0.3 % meat extract, 0.3 % peptone, 0.4 % CaCO3 ,pH 7.0; No. 51 培 地:0.5 % glucose, 0.5 % corn steep
powder, 1.0 % oatmeal, 1.0 % pharmamedia, 0.5 % K 2HPO4 ,0.4 % MgSO4·7H2O, 1 mL/L trace metals solution(0.1 %FeSO 4 ·7H 2O, 0.1 % MnCl 2 ·4H 2O, 0.1 % ZnSO 4 ·7H 2O,

0.1 % CuSO4·5H2O, 0.1 % CoCl2 ·6H2O), pH 7.0 ; No. 54 培

地:2 % soluble starch, 1 % defatted wheat germ, 0.5 %glycerol, 0.3 % dry yeast, 0.3 % meat extract, 0.5 % CaCO3 ,に渡り微生物が生産する二次代謝産物から新規物質の探pH 7.0 ; NSGS 培 地:3.3 % nutrient broth, 3.3 % soybean

索研究を進め，類縁体を含めて約 520 の新規物質を発見

meal, 2.2 % glycerol, 2.2 % soluble starch, 0.5 % CaCO3 ,してきた(Ōmura, 2015)．これらの生産菌株と探索研究

pH 未調整の過程で得られた既知物質生産菌は北里微生物資源ライ

糸状菌用生産培地として次の 4 種類を用いた．

ブラリーと称するコレクションとして，長期保存法によF8 培 地:3 % soluble starch, 1 % glycerol, 2 % soybean

り保存しており，本研究では，その保存微生物を探索研

meal, 0.3 % dr y yeast, 0.3 % KCl, 0.2 % CaCO3 , 0.05 %究に用いた．また，共同研究先である北里生命科学研究所 微生物資源研究センターや微生物機能研究室では，
毎年約 1,000 株以上の糸状菌や放線菌を分離しており，
その分離源が特徴的である．これまでに日本本土と一度も陸続きとならなかった海洋島や海面から 200 m 以深でMgSO4 ·7H2O, 0.05 % KH2PO4 ; F8Q 培 地:3 % soluble

starch, 1 % glycerol, 2 % soybean meal, 0.3 % dry yeast,
0.3 % KCl, 0.2 % CaCO3 , 0.05 % MgSO4·7H 2O, 0.05 %KH2PO4 , 0.03 % , quercetin dehydrate; F36 培 地:500 g
rice, 5 μg/mL seaweed tea(0.1 mg/mL); F38 培地:3.0 %ある深海，植物の根などである．このような特殊環境か

sucrose, 3.0 % soluble starch, 1.0 % malt extract, 0.3 %ら新属・新種の糸状菌や，一般土壌からあまり分離されEbios, 0.5 % KH2PO4 , 0.05 % , MgSO4·7H2O, pH 未調整

ない希少な糸状菌や放線菌が分離されている(増間・野中 , 2013，Matsumoto & Takahashi, 2017)．海洋島，深海，

LC/MS 測定条件

植物根などの特殊環境から取得された糸状菌や放線菌か
らの新鮮分離株を探索研究に用いた．

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は Agilent 1200
series( ア ジ レ ン ト テ ク ノ ロ ジ ー)， 質 量 分 析 装 置 は
QSTAR Elite Hybrid LC/MS/MS System(エービー・サイ

実験材料と実験方法エックス)および TripleTOF ® 5600+ System(エービー・
サイエックス)を用いた．LC/MS の測定条件は Table 1

北里微生物資源ライブラリーの利用

および 2 に記載した．

スタウロスポリン(Ōmura et al., 1977)やナナオマイシン(Ōmura et al., 1974)など大村創薬グループで発見

推定新規物質の選定

した新規物質を生産する放線菌の他に，ストレプトマイ

主成分分析ソフト MarkerViewTM ソフトウェア(エーシンなど既知物質を生産する放線菌が長期保存法によりビー・サイエック)を用いて，新規物質を探索した．

保存されている．これらの長期保存放線菌 340 株を復元

MarkerViewTM ソフトウェアはメタボロミクスやタンパ

し，4 種類の培地で培養し，機器分析試料(1,360 試料)

ク質／ペプチドバイオマーカーのプロファイリング用にとした．

設計されたプログラムである．放線菌培養液抽出物 1,360
試料を QSTAR で分析し，得られたデータをMarkerViewTM

特殊環境から分離した糸状菌

ソフトウェアで解析し，1 試料にのみ含まれている化合

北里生命科学研究所 微生物資源研究センターより提物を選択した．一方，糸状菌培養液抽出物 4,100 サンプ

供された海洋島由来糸状菌 705 株および深海由来糸状菌

ルの培養液を QSTAR で分析し，新属・新種の可能性を－ 76 －

質量分析による新規物質の探索
Table 1

Table 2

LC/MS condition in QSTAR

LC/MS condition in TripleTOF ® 5600 +有する糸状菌の培養液や特徴的な紫外線(UV)スペクト

ラフィーなどにより精製した．得られた物質は，MS お

ル を 有 す る 化 合 物 を 選 択 し た． 選 択 し た 化 合 物 は，

よび NMR 等により平面構造の解析後，各手法を用いてAnalyst® ソフトウェア(エービー・サイエック)を用い立体構造の決定を検討した．なお，詳細については各化て，精密質量値や UV スペクトルなど，選択した化合物

合物の論文を参考にしていただきたい．

の物理化学的性状を解析した．そのデータを用いて，天然物データベース Dictionary of Natural Products(DNP)

生物活性評価に収録されている既知物質情報の比較や MS/MS データ

抗菌活性試験は，ペーパーディスク法で測定した．真からなるインハウスデータベースで検索し，新規性を推菌として Candida albicans ATCC 64548，Saccharomyces

定した．

cerevisiae ATCC 9763 ，Aspergillus niger ATCC 6275 ，
Mucor racemosus IFO 4581，グラム陽性菌としてとして培養，精製および構造解析
新規物質と推定された化合物を取得するため，大量培

Kocuria rhizophila ATCC 9341 ，Bacillus subtilis ATCC
6633，グラム陰性菌としてとして Escherichia coli NIHJ，養を行い，シリカゲルカラムや ODS カラムクロマトグ

Xanthomonas campestris pv. oryzae KB 88 を検定菌とした．

－ 77 －

松尾

洋孝，中島

琢自

細胞毒性試験は，Cell Counting Kit-8（同仁化学)を

配置は Fig. 1B のようにシクロプロパン環とアルキル鎖用いて行った．ヒト子宮頸部類上皮癌細胞 HeLa S3，ヒがアンチの関係であると決定した．また，絶対立体配置

ト 結 腸 腺 癌 細 胞 HT29， ヒ ト 肺 胞 基 底 上 皮 腺 癌 細 胞は，計算化学ソフト Gaussian 09(Frisch et al., 2009)を

A549，ヒト肺腺癌細胞 H1299，ヒト膵臓腺癌 PANC-1，

用いた円二色性(CD)スペクトルの計算値と実測値を比

ヒト急性単球性白血病細胞 THP-1，ヒト T 細胞性白血

較することにより決定した．イミニマイシン A は，シ病細胞 Jurkat，ヒト前骨髄性白血病細胞 HL-60 を用いた．

クロプロパン環とアルキル鎖がアンチの関係であること

抗酸化活性は，スーパーオキシドアニオンラジカル，から，(2R, 3S)または(2S, 3R)の 2 通りの立体構造が考ヒドロキシラジカル，一重項酸素消去活性を評価した．

えられた．そこで，Gaussian 09 によりその 2 通りの CD
スペクトルを計算したところ，(2R, 3S)の結果と一致し，結果および考察イミニマイシン A の構造は，Fig. 1C のように絶対立体配置を決定した．イミニマイシン A は，微生物代謝産

質量分析による新規物質の探索物では初の報告となる分子内にイミニウムイオンを有し

1,360 放線菌培養液抽出物（物質生産放線菌約 340 株ていた．

を 4 種類の培地で培養した培養液)の LC/MS データをイミニマイシン B の 2D-NMR 解析の結果，Fig. 2A にMarkerView ソフトフェアで主成分分析した．Streptomyces

示すように，構造内にピリジニウムイオン，N-アセチル

griseus OS-3601 株(ストレプトマイシン生産菌として
1973 年に凍結乾燥で長期保存)の No. 54 培地（小麦脱脂

システインを有する構造であることが明らかになり，

胚芽培地)の培養液抽出物にのみ検出された化合物に注にシクロプロパン環とアルキル鎖がアンチの関係である

目した．その化合物の物理化学的性状は，m/z 242.1910と 決 定 し た． イ ミ ニ マ イ シ ン B の 絶 対 立 体 配 置 は，+
[M]
(C17H24N+)，UV 極大吸収 270 および 280 nm を示し

Gaussian 09(Frisch et al., 2009)により CD スペクトルをた．この物理化学的性状をデータベース（ Dictionary of

ROESY により相対立体配置はイミニマイシン A と同様計算したところ，(2R, 3S)の結果と一致した．また，2'Natural Products およびインハウスデータベース)で検位の絶対立体配置は，ラネーニッケル(Mozingo et al.,

索した結果，該当する化合物はなく，新規物質(イミニ

1943)および改良マーフィー法(Marfey, 1984)により決

マイシン A と命名)と推定し，精製および構造決定した．

定した．ラネーニッケルを用いて N-アセチルシステイ

S. griseus OS-3601 株を 10 L の No. 54 培地で 5 日間培
養し，培養上清と菌体に濾別した．その培養上清を各種

ンを切断後，遊離した N-アセチルシステインを加水分

クロマトグラフィーで処理し，最終的に HPLC でイミニ

dinitrophenyl)-alaninamide)で標識した．標品の L -およマイシン A を 3.0 mg 精製した(Nakashima et al., 2016a)．

び D -アラニンを FDLA で標識し，LC-UV/MS で解析し解 し， 生 成 し た ア ラ ニ ン を FDLA(N α(5-Fluoro-2,4-

ま た， 目 的 物 質 の 精 製 過 程 で， イ ミ ニ マ イ シ ン A のた．イミニマイシン B 由来のアラニンは，LC/MS におMS/MS フラグメントが類似した類縁物質(イミニマイ

いて MS 値および溶出時間が L 体の標品一致したため，2'

シン B, Nakashima et al., 2016b)を 28.5 mg 得た．

位は S 配置であると決定した．以上の結果より，イミニ

イミニマイシン A の 2D-NMR 解析の結果，Fig. 1A にマイシン B の構造を Fig. 2B のように決定した．

示すように，構造内にイミニウムイオンを有する構造でイミニマイシン A および B の生物活性を評価した結あることが明らかになった．ROESY 解析より相対立体果，イミニマイシン A は HeLa S3 細胞において IC50＝

Fig. 1

Structure elucidation of iminimycin A.
A, 1H-1H COSY (bold lines) and selected HMBC correlation (arrows) of iminimycin A. B, Key ROESY and NOE
correlations (arrows) and coupling constants (dotted arrows) of iminimycin A. C, Relative configurations ofiminimycin A.

－ 78 －

質量分析による新規物質の探索

Fig. 2

Structure elucidation of iminimycin B.
A, 1H-1H COSY (bold lines) and selected HMBC correlation (arrows) of iminimycin B. B, Relative configurationsof iminimycin B.

43.1 μM および Jurkat 細胞において IC50＝36.0 μM で細胞

対立体配置は key ROESY と糖の部分はカップリングコ

増殖阻害活性を示した．また，Bacillus subtilis KB-211

ンスタントから決定した．N-アセチルシステインの 2' 位に対して 50 ～ 100 μg/disk，Kocuria rhizophila KB-212 ，はラネーニッケル(Mozingo et al., 1943)および改良マー

Xanthomonas campestris pv. oryzae KB-88 に 対 し て
100 μg/disk で 阻 止 円 を 形 成 し た．Iminimycin B は X.

フ ィ ー 法(Marfey, 1984)に よ り 立 体 配 置 を 決 定 し た(Fig. 3C)．ナナオマイシン H の構造はナナオマイシン

campestris pv. oryzae KB-88 に対して 100 μg/disk でわず
かな抗菌活性を示した．

の基本骨格であるナフトキノン骨格にマイコチオールがストレプトマイシン生産菌である Streptomyces griseus

ナオマイシン H の精製の過程で，新規類縁体ナナオマ

OS-3601 株から新規物質イミニマイシン類が見出され，

イシン F および G も見出された．ナナオマイシン F は結合した化合物であった(Nakashima et al., 2017a)．ナ

この結果は微生物が生産する二次代謝産物のなかに，多4a 位の水酸化化合物(Fig. 3D)，ナナオマイシン G はキ

くの新規物質が取り残されている可能性を示唆していノ ン 骨 格 が 縮 環 し，5 員 環 に な っ た 化 合 物 で あ っ た

る．また，同種であるゲノム解析株 Streptomyces griseus(Fig. 3E, Nakashima et al., 2015)．さらに，ナナオマイシ

IFO 13350 株(Onishi et al., 2008)もイミニマイシン類をン H の生物活性評価を行うために，生産培養を繰り返し生産することがわかった．現在，共同研究で生合成研究た．その過程で，新規類縁体ナナオマイシン I(Fig. 3F)，を進めている．

J(Fig. 3G, Matsuo et al., 2019)および K(Fig. 3H, Matsuo

Streptomyces rosa subsp. notoensis OS-3966 株は，動物用抗真菌剤として使用されているナナオマイシン A

et al., 2020)を発見した．
ナナオマイシン新規類縁体には抗菌活性や細胞毒性は(Fig. 3A, Ōmura et al., 1974)の生産菌として 1974 年から観察されなかった．キノン抗生物質であるナナオマイシ

凍結乾燥で長期保存されていた．MarkerView ソフト

ン A(Fig. 3A)は，キノンの還元もしくはセミキノンラ

ウェアで主成分分析結果から，同株の No. 54 培地（小ジカルの生成により活性酸素を発生する(Marumo et al.,

麦脱脂胚芽培地)の培養液抽出物にのみ検出された化合1980; Hayashi et al., 1982)．この活性酸素発生のために物に注目した．その化合物の物理化学的性状は，m/z

は，ナフトキノン骨格の 4a と 10a の二重結合が重要で805.2307，UV 極大吸収 233 および 270 nm を示した．こある．WST-1 を用いてスーパーオキシドラジカル(O2-)の物理化学的性状をデータベースで検索した結果，該当の産生を測定した結果，ナナオマイシン A は濃度依存する既知化合物はなく，新規物質と推定し，精製および的に O2- の産生が確認できたが，F, G, H は O2- の産生が構造決定した．

ほとんど認められなかった．このことから，新規類縁体

S. rosa subsp. notoensis OS-3966 株 を 10 L の No. 54 培
地で 6 日間培養し，培養上清と菌体に濾別した．その培の 4a および 10a 位に水酸基もしくはカルボニル基が結養上清を各種クロマトグラフィーで処理し，最終的に消失したと考えられる．

合することにより，O2- の産生能力を失い，抗菌活性がHPLC で ナ ナ オ マ イ シ ン H を 4.1 mg 取 得 し た． 各 種

物質材料研究機構(NIMS)の中西 淳先生との共同研

NMR および質量分析よりナナオマイシン H の構造決定

究で，ナナオマイシン H に上皮間葉転換（ EMT )によを行った．Fig. 3B に示すように COSY より 5 カ所の部

り間葉細胞化した細胞(MDCK)に対して選択的に傷害

分構造および HMBC 相関より平面構造を決定した．相を与えることがわかった．高密度培養細胞と低密度培養－ 79 －

松尾

Fig. 3洋孝，中島琢自Structure elucidation of nanaomycin H.
A, 1H-1H COSY (bold lines) and selected HMBC correlation (arrows) of nanaomycin H. B, Relative configurationsof nanaomycin H. Nanaomycin H (C), nanaomycin F (D), nanaomycin G (E), nanaomycin I (F), nanaomycin J (G),nanaomycin K (H).

－ 80 －

質量分析による新規物質の探索

細胞に TGF-β で EMT を誘導させ，ナナオマイシン H のある N -カドヘリンおよびビメンチンの減少が見られた．

細胞毒性効果を調べた．高密度培養細胞より低密度培養

これらの結果からナナオマイシン K は EMT が誘導され細胞に対してより高い細胞毒性が見られた(Fig. 4A)．

た細胞に対して増殖抑制効果があると示唆された．

Fig. 4B(A)は DMSO，(B)はナナオマイシン H で処理

MarkerViewTM ソフトウェアを用いた PC screening で，した時の顕微鏡写真である．低密度培養は高密度培養よ海 洋 細 菌 Mumia sp. YSP-2-79 株 か ら ム ミ ア マ イ シ ン

り EMT を誘導した細胞が移動しやすいため細胞毒性が(Kimura et al., 2018a), Lechevalieria aerocolonigenes

見られた(Nakanishi et al., 2019)．ナナオマイシン F お

K10-0216 株からピリゾマイシン(Kimura et al., 2018b),

よび G には EMT 誘導細胞に対して効果は無く，ナナオ
マイシン I, J, K には増殖抑制効果が見られた．類縁体のStreptomyces sp. AM-2504 株からビラントマイシン B & C(Kimura et al., 2019)などを見出し報告した．これらの中で，ナナオマイシン H および K が強力な活性を示し

新規物質の構造は Fig. 6 に記載した．

た(Nakashima et al., 2017; Nakanishi et al., 2019; Matsuo
et al., 2020).
EMT 関連転写因子発現と癌との関係は調べられてお特殊環境分離糸状菌り(Chaffer & Weinberg, 2011)，EMT 関連転写因子ファ

微生物機能研究室では，海洋島や深海の堆積物，植物のミリーである Snail 1 は，癌の転移や再発との相関が高根などの特殊な分離源から糸状菌や放線菌を分離していいと報告されている(Peinado et al., 2007)．ナナオマイる．海洋島および深海由来糸状菌，植物内生放線菌を探北里生命科学研究所・微生物資源研究センターおよび

シン H および K の EMT に関連した癌に対する効果を確

索 源 と し て PC screening を 行 い， 海 洋 島 由 来 糸 状 菌認するため，神戸大学の重村克巳先生との共同研究で膀
胱癌に対する細胞増殖抑制効果を調べた．ヒト膀胱癌細Pochonia chlamydosporia var. spinulospora FKI-7537 株よりポコニオライド類，Neocosmospora sp. FKI-7792 株よ胞株は KK-47 株（低浸潤株)および T24 株（高浸潤株)

りケトチベルシン C，深海由来糸状菌 Sarcopodium sp.

の 2 種類を用いた．KK-47 株および T24 株の担ガンマウ

FKJ-0025 株 よ り サ ル コ ポ デ ィ ノ ー ル 類，Penicillium

スを作製し，ナナオマイシン K を腫瘍内に投与し，腫brevicompactum FKJ-0123 株 よ り シ プ ラ ル フ ェ リ ン，

瘍の体積を経時的に測定した．その結果，コントロール

Penicillium steckii FKJ-0213 株 よ り ハ ツ サ ミ ド 類，と比較して腫瘍の体積は増加せず，腫瘍の増殖を抑制しAllostreptomyces sp. K12-0794 株よりハムラマイシン類を発見したのでここに報告する．

た(Fig. 5)．回収した腫瘍の免疫染色の結果，上皮系マーカーである E -カドヘリンが上昇し，間葉系マーカーでFig. 4

Effect of nanomycin H on MDCK cells undergoing EMT by TGF-β1 stimulation.
A, MDCK cells were treated with 10 ng/mL TGF-β1 plus 0.001 % BSA, or 0.001 % BSA alone, for 3 d. The cells were
harvested by trypsin-EDTA and seeded at 2000 or 20000 cells/well density in a Falcon 96-well plate (Corning, NY, USA)and allowed to attach for 1 d. The cells were treated with 50 μg/mL nanaomycin H containing DMSO (final concentration
0.5 % ) or DMSO only and incubated for 1 day. Finally, the cell viability was analyzed by MTS cell proliferation colorimetricassay kit (Funakoshi) according to the manufacturer's instructions. Data are means±SDs (n = 3).
B, Representative images during expansion of a circular cluster in the presence of 0.5 % DMSO (A) and 50 μg/mL
nanaomycin H plus 0.5 % DMSO (B). Only the cells indicated by arrow heads were dying. Scale bar: 100 μm.

－ 81 －

松尾

Fig. 5洋孝，中島琢自Antitumor effect of nanaomycin K on KK47 (A) and T24 (B) cells in vivo.
Two bladder cancer cells, KK47 and T24 cells (1×106 cells) were inoculated at day 0 in Balb/c nu/nu mice (age
6-8 weeks). Tumor volume was expressed by the following formula: (longest diameter)×(shortest diameter)2
×0.5. After the longest tumor diameter reached 10 mm, every mice with tumor (KK47, T24) were randomly
assigned to treatment groups and control groups and then administered Gelform (Pfizer) containing 0.5 mg,
1 mg nanaomycin K or DMSO. After inoculation, tumor diameter of mice was measured every 24 h for 9 days.
Mice were sacrificed and tumors were collected at the last day of the experiment. Tumors were fixed andembedded with paraffin. All aspects of the experimental design and procedure were reviewed and approvedby the institutional ethics and animal welfare committees of Kobe University. Data are means±SDs (n = 4).

Fig. 6 Structures of (A) pyrizomicin A, (B) pyrizomicin B, (C) virantmycin B, (D) virantmycin C, and (E) mumiamicin.

－ 82 －

質量分析による新規物質の探索

ポコニオライド A および B

ケトチベルシン C

Pochonia chlamydosporia var. spinulospora FKI-7537 株
は，東京都新島の土壌から単離された．本菌株が F8Q

Neocosmospora sp. FKI-7792 株は，東京都新島の土壌か
ら単離された．本菌株が F36 培地で生産する FKI-7792A

培地で生産する FKI-7537 A および B 物質は，UV 極大吸+(C15H11O8)，FKI-7537
収 274 nm，m/z 319.0461[M + H]

[M – H]＝399.0842(C18H20ClO8)の 物 性 を 示 し，MS のB 物 質 は UV 極 大 吸 収 226，277，314，380 nm，m/z
335.0391[M + H]+(C15H11O9)の物性を示し，DNP 検索の物質は，UV 極大吸収 204，262，306，318，351，367 nm，-同位体パターンから塩素原子を一つ有することが分かった．これらの情報を DNP 検索した結果，該当する既知結果，これら物性と一致する既知物質はなく，新規物質

物質はなく，新規物質と推定された．そこで，FKI-7792と推定した．そこで，FKI-7537 株を大量培養後，各種株を大量培養後，各種カラムクロマトグラフィーによりカラムクロマトグラフィーにより精製し，FKI-7537 A

精製し，FKI-7792A を 5.2 mg 取得した．各種 NMR 解析

を 10 mg，FKI-7537 B を 46 mg 取得した．NMR 構造解の結果，FKI-7792A 物質はイソクマリン骨格を有するケ

析の結果，FKI-7537 A および B はクロモン骨格にムコ

トチベルシン類(Wijeratne et al., 2006)の新規類縁物質

ノラクトンが結合した新規物質で，菌株名に因んでポコ

で，ケトチベルシン C と命名した(Fig. 8A)．本物質は 4ニオライド A および B と命名した(Fig. 7A，B)．ポコニ

つの不斉炭素を有していたため，その立体構造の検討を

オライド A および B は旋光度，円二色性スペクトルお行った．1,3-diol 構造の相対立体配置は，そのアセター

よびキラルカラムによる HPLC 解析により，ラセミ体でル誘導体の CDCl3 中における 1H-NMR ケミカルシフト

存在することが示された．ポコニオライド B は強いヒから経験的に決定できることが知られている

ドロキシラジカルおよび一重項酸素消去作用を有してお(Rychnovsky et al., 1993)．そこで，ケトチベルシン Cり(Fig. 7C，D)，アミノ酸と還元糖を熱処理した際に生の 2 つのジオールをアセタール化して bis-acetal 体とし，じる有害物質であるアクリルアミドを低減する作用も見1

出され，特許出願を行った(大村ら，2017)．

anti の関係にあることが分かった(Fig. 8B)．次に，3´
位および 8´位の MTPA ester 体を調製し，それぞれの絶Fig. 7

H-NMR を測定した結果，3´, 5´- diol は syn，6´, 8´- diol はStructures and biological activity of pochoniolide A (A) and B (B).
Eliminating performance of ･OH and 1 O2 by pochoniolides A and B. (C) ･OH with DMPO-OH values and(D) 1 O2 with spin concentration values measured by ESR spectrum. Quercetin used as positive control.
Mean±SD (n = 3), *** p < 0.001 vs. control (t-test).

－ 83 －

松尾

Fig. 8洋孝，中島琢自(A) 1D, 2D-NMR correlations for chaetochiversin C, (B) 13C-NMR chemical shifts of bis-acetal analog
for chaetochiversin C in CDCl3.

Fig. 9 The Δδ values [(Δδ in parts per million) = δS –δR] obtained for (S)- and (R)-α-methoxy-α-(trifluoromethyl)(MTPA) esters.

対立体配置を決定した．フェノール性水酸基の保護をするため，ケトチベルシン C を TMS-diazomethane でメチル化後，(S)-MTPA-OH および (R)-MTPA-OH と反応さの消去活性を見出した．コントロール(アセトン)を 1 O2

発生率 100 %としたとき，ケトチベルシン C を 2.5 mMで処理した群では 55 %まで発生率を抑制した(Fig. 10)．

せた．反応物をかきとり TLC で精製し，C-3´-(S)-MTPA
ester および C-3´-(R)-MTPA ester から，C-3´位の絶対立

サルコポディノール A および B

体配置は S であることが明らかになった(Fig. 9A)．また，

Sarcopodium sp. FKJ-0025 株は，鹿児島県若尊カルデ
ラ深海 200 m の堆積物から単離された．本菌株が F38 培

C-8´-(S)-MTPA ester お よ び C-8´-(R)-MTPA ester は 他の MTPA ester との混合物で得られたため，それぞれの混 合 物 の H- H COSY を 測 定 し，C-8´-(S)-MTPA ester

地で生産する 2 つの物質 FKJ-0025A および B 物質はそ++および 281.1747[M + H]
れぞれ，m/z＝297.1702[M + H]

および C-8´-(R)-MTPA ester の鍵となる 1H-NMR を詳細に擬分子イオンピークを有し，分子式は C16H24O5 およ11に同定した．その結果，Fig. 9B に示した通り，C-8´位

び C16H24O4 と推定された．また，220 および 290 nm 付の絶対立体配置は R であることが明らかになった．上記

近に UV 極大吸収を有し，これらのデータを DNP で検の相対立体配置の結果を踏まえ，ケトチベルシン C の索した結果，該当する既知物質はなく，新規物質と推定

絶 対 立 体 配 置 を 3´S, 5´R, 6´S お よ び 8´R と 決 定 し た

された．そこで，F38 培地で FKJ-0025 株を培養後，各(Fig. 9C)．

種カラムクロマトグラフィーで精製した結果，最終的にケトチベルシン C の抗菌活性，細胞毒性，抗マラリ

サルコポディノール A を 2.5 mg，サルコポディノール B

ア活性，抗酸化活性を評価した結果，一重項酸素(1 O2)

を 1.5 mg 得た．それぞれの物質を NMR および LC/MS－ 84 －

質量分析による新規物質の探索

Fig. 10

Quenching effect of Chaetochiversin C on singlet oxygen (1 O2 ). The 1 O2 spin concentration
values were measured by electron spin resonance (ESR). NaN3 was used as a positive control
at 2.5 mM. Error bars indicate the standard deviations of measurements (n = 3) and asterisks
indicate significant differences from the control, *p < 0.05 and **p < 0.01 (Student's t-test).

Fig. 11

Selected 2D-NMR correlations for sarcopodinol A and B.

を用いて構造解析した結果，Fig. 11A および B に示すようなヒドロキシキノールを基本骨格とする構造であることが明らかになった．これらの新規物質は Sarcopodium
属糸状菌が生産するアルコールであることから，サルコ
ポディノール A およびサルコポディノール B と命名した．
サルコポディノール A は，5´位に 2 級水酸基が結合する不斉炭素を有することから，改良モッシャー法を用いてFig. 12その絶対立体配置を決定した．フェノール性水酸基の保護Δδ values [(Δδ in ppm) = δS - δR] obtained for(S)- and (R)-MTPA esters.

をするため，サルコポディノール A を TMS-diazomethane
でメチル化後，(R)-MTPA-Cl および (S)-MTPA-Cl と反応させ，(S)-MTPA エステル体および (R)-MTPA エス
テル体を得た．両 MTPA エステル体の 1H-NMR の差から，および IC50＝66 μg/mL で細胞毒性を示した．

これまでに，Sarcopodium 属からの二次代謝産物の報

サルコポディノール A の 5´位の絶対立体配置は S であ

告はなく，本物質が初の知見となった．サルコポディノー

ることが明らかとなった(Fig. 12)．

ル B は Jurkat 細胞のみに細胞毒性を示したのに対し，

サルコポディノール A およびサルコポディノール B

サルコポディノール A は HL-60，Jurkat および PANK-1の抗菌活性および細胞毒性を評価した結果，サルコポ細胞に対して弱い細胞毒性を示し，この活性の差は，5´

ディノール A は Jurkat 細胞に対して IC50＝47 μg/mL で，位の水酸基の有無に起因すると考えられた．今後，サルサルコポディノール B は HL-60，Jurkat および PANK-1

コポディノール A および B のさらなる有用な生物活性細胞に対してそれぞれ IC50＝37 μg/mL ，IC50＝47 μg/mLの発見に期待したい．

－ 85 －

松尾

Fig. 13

Fig. 14

洋孝，中島

琢自(A) Selected 2D- NMR correlations of cipralphelin, (B) MS/MS fragmentations of cipralphelin.

Absolute structure of cipralphelin.

シプラルフェリン
Penicillium brevicompactum FKJ-0123 株は，沖縄県琉球海溝の深海 283 m の堆積物から単離された．本菌株がFig. 15 Scavenging activity of cipralphelin against hydroxy radical.

F36 培地で生産する FKJ-0123A 物質は，UV 極大吸収205, 283 nm，m/z＝478.2331[M + H]+(C25H32N3O5)の 物とが明らかとなった．したがって，シプラルフェリンの性を示し，DNP 検索の結果，これら物性と一致する既知

シプラルフェリンの抗菌活性，細胞毒性，抗マラリア物質はなく，新規物質と推定された．そこで，FKJ-0123

活性，抗酸化活性を評価した結果，ヒドロキシラジカル

株を大量培養後，各種カラムクロマトグラフィーにより消去活性を見出した．コントロールでは，ヒドロキシラ

精 製 し，FKJ-0123A を 10.1 mg 取 得 し た．NMR お よ

ジカルの発生を DMPO-OH で換算したとき，2.5 μM の絶対構造を Fig. 14 のように決定した．

び MS/MS フ ラ グ メ ン ト 解 析 の 結 果(Fig. 13A, B)，

発生量であった．一方，シプラルフェリンを 0.1 mM で

FKJ-0123A 物質はケイヒ酸，プロリン(Pro)，アラニン処理した群では約 0.5 μM まで発生量を抑制し，その作(Ala)，フェニルアラニンメチルエステル(Phe methyl

用はポジティブコントロールのクエルセチンと同等で

ester)の順にアミド結合した新規物質で，それらの頭文あった(Fig. 15)．

字に因んでシプラルフェリンと命名した．各アミノ酸のケイヒ酸誘導体は一般的に，植物に多く含まれている

立体は，改良マーフィー法を用いて検討した．シプラル

物質である．その誘導体の多くは抗酸化作用が報告されフェリン 1.0 mg を 6 M HCl で加水分解後，D-FDLA で修ており(Chen & Ho, 1997)，シプラルフェリンもヒドロ飾した．また，D, L -プロリン，D, L -アラニン，D, L -フェ

キシラジカル消去活性を示すことが予想され，実際，ポニルアラニンの標品も同様に D-FDLA 修飾し，LC/MS

ジティブコントロールに匹敵する活性を認めた．また，でそれぞれ分析した．その結果，シプラルフェリン由来

ケイヒ酸とプロリンが直接結合した物質はこれまで糸状のプロリン，アラニン，フェニルアラニンはそれぞれ，菌から取得された例はなく，本物質が初の報告となった

D -プロリン，L -アラニン，L -フェニルアラニンであるこ(DNP 調べ)．

－ 86 －

質量分析による新規物質の探索

ハツサミド A および Bが明らかとなった．生産菌の採取地にちなみ，ハツサ

Penicillium steckii FKJ-0213 株 は， 静 岡 県 初 島 沖 の深海 1,171 m の堆積物から単離された．本菌株が F8 培

ミド A および B と命名した．また，これら新規物質取地 で 生 産 す る FKJ-0213A 物 質 は，UV 極 大 吸 収 206，+
(C39H46N2O10)，
270 ，332 nm ，m/z＝703.3221[M + H]

コデルマミド C も取得した(Fig. 16C，D)．タンザワ酸

FKJ-0213B 物質は UV 極大吸収 206，229(sh)，252(sh)，+326 nm，m/z＝449.1560[M + H]
(C21H24N2O9)を 示 し，DNP 検索の結果，これら物性と一致する既知物質はな得の過程で，既知物質であるタンザワ酸 B およびトリB は相対立体配置が，トリコデルマミド C は絶対立体
配置がそれぞれ報告されている(Ando et al., 1993, Daviset al., 2008)．そこで，タンザワ酸 B の絶対立体配置を決定することで，ハツサミド A の絶対立体配置を決定

く，新規物質と推定された．そこで，FKJ-0213 株を大することとした．天然由来のタンザワ酸 B をメタノー量培養後，各種カラムクロマトグラフィーにより精製

ル中で結晶化後，X 線結晶構造解析を行い，絶対立体

し，FKJ-0213A を 10.1 mg，FKJ-0213B を 28.3 mg 取 得

配 置 を 決 定 し た． 次 に， ハ ツ サ ミ ド A 10.3 mg を 2 Mした．NMR 構造解析および加水分解などの検討により，

NaOH 中，2 時間室温で加水分解した．10 % H2SO4 でFKJ-0213A はタンザワ酸 B およびトリコデルマミド C

中和し，減圧留去後，かきとり TLC で粗精製した．最がエステル結合した新規物質(Fig. 16A)，FKJ-0213B は終的に分取 HPLC で精製した結果，ハツサミド A 由来

アスペルギラジン類の新規類縁体(Fig. 16B)であることのタンザワ酸 B およびトリコデルマミド C をそれぞれFig. 16

Selected 2D-NMR correlations of (A) hatsusamide A and (B) hatsusamide B. Structures ofknown compounds, (C) trichodermamide C and (D) tanzawaic acid B.

－ 87 －

松尾

洋孝，中島

琢自

0.6 mg，0.5 mg 得た．これら物質と，天然由来のタン

2005)やペニシラジン類(Lin et al., 2000)と同様の生合

ザワ酸 B およびトリコデルマミド C の比旋光度を比較

成経路で生産されていると予想されるため，最終的にした結果，良い一致を示したため，ハツサミド A の絶Fig. 17B に示すような相対立体配置と決定した．

対立体配置を 4´S，5´R，8´R，9´S，6´´R，7´´R，10´´S，

ハツサミド A，ハツサミド B，タンザワ酸 B およびト12´
´R，14´´S，15´´R と決定した(Fig. 17A)．次いで，ハ

リコデルマミド C の抗菌活性，細胞毒性，抗マラリアツサミド B の相対立体配置を結合定数，ROESY 相関お活性を評価した結果を Table 3 および Table 4 に示した．

よびその推定生合成経路により決定した．H-6´と H-3´

細胞毒性試験では，ハツサミド A のみ HeLa S3，HT29，の ROESY 相関によりこれらは β 配置，H-5´と H-6´のA549，H1299，PANC-1 細 胞 に 対 し て， そ れ ぞ れ IC50

結合定数が 8.0 Hz より，H-5´は α 配置と決定した．また，ハツサミド B は，アスペルギラジン類(Capon et al.,Fig. 17

15.0，6.8，13.7，18.8，12.9 μM で 細 胞 毒 性 を 示 し た．

また，抗マラリア活性では，ハツサミド A は K1 および(A) Absolute configuration of hatsusamide A, (B) Relative configuration of hasusamide B.

Table 3

Table 4

Cytotoxic activity of the compounds against five human tumor cell lines

Anti-malarial activity of the compounds against K1 and FCR3 strains－ 88 －

質量分析による新規物質の探索

FCR3 株においてそれぞれ IC50 27.2 および 27.9 μM で活性を示し，タンザワ酸 B は K1 および FCR3 株においてそれぞれ IC50 78.5 および 79.2 μM で活性を示した．これ

らの結果から，タンザワ酸 B あるいはトリコデルマミ

産する K12-0794A および B 物質は，UV 極大吸収 265，+
(C 35 H 50 O 7 )，275 ，330 nm ，m/z＝605.3450[M + Na]

K12-0794B 物質は UV 極大吸収 265，275，330 nm，m/z–＝5833620[M – H]
(C35H52O7)を示し，DNP 検索の結果，

ド C 単体よりも，それらがエステル結合したハツサミ

これら物性と一致する既知物質はなく，新規物質と推定

ド A の方が強い活性を示すことが明らかになった．こされた．そこで，K12-0794 株を大量培養後，各種カラれらの結果は，活性のない既知物質同士が結合すれば，

ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 精 製 し，K12-0794A を新たな有用物質へと変換することができる可能性を示唆

329.3 mg，K12-0794B を 397.9 mg 取得した．NMR 構造

するものであった．

解析の結果，K12-0794A および B は，アルキル側鎖を有する新規 22 員環マクロライドであることが明らかとハムラマイシン A および Bなった(Fig. 18)．生産菌の採取地にちなみ，ハムラマイ

Allostreptomyces sp. K12-0794 株は，東京都羽村市のシダ植物の根から単離された．本菌株が No. 54 培地で生シン A および B と命名した(Suga et al., 2018)．
ハムラマイシン A および B の抗菌活性およびヒト細胞に対する細胞毒性の結果を Table 5 および 6 にそれぞれ 示 し た． ハ ム ラ マ イ シ ン A お よ び B は，Kocuria
rhizophia および Xanthomonas oryzae pv. oryzae に対して抗菌活性を示し，試験した細胞種全てにおいて細胞毒性を示した．Allostreptomyces 属由来の二次代謝産物の報告
はこれまでになく，ハムラマイシン A および B が初の報告となった．
このように，特殊な環境から分離された微生物を用いた PC screening により，非常にユニークな構造を有す
る二次代謝産物を得ることができた．いずれの物質も様々な生物活性が見出され，今後の有用性を期待させる結果であった．深海や植物内など，特殊環境から分離される微生物は，新属や新種の微生物も多数分離されている．今後，そのような菌からの新規物質の発見が期待さ

Fig. 18

Structures of hamuramicin A and B.

Table 5

Table 6れる．

The MIC values against eight bacteria

Cytotoxic activity against five human tumor cell lines－ 89 －

松尾

要

洋孝，中島

約

on the Biology of Actinomycetes, 23–27 May. Cheju, Korea
7) Nakashima T., Miyano R., Iwatsuki M., Shirahata T.,
Petersson GA., Takahashi Y. & Ōmura S. New iminium andpyridinium metabolites, iminimycin A and B, produced by
Streptomyces griseus OS-3601. 18th International Symposiumon the Biology of Actinomycetes, 23–27 May. Cheju, Korea
8) Inahashi Y., Kimura T., Shiomi K., Takahashi Y., Ōmura S.
& Nakashima T. Biosynthesis of pyrizomicin in Lechevalieria
aerocolonigenes K10-0216. 18th International Symposium on
the Biology of Actinomycetes, 23–27 May. Cheju, Korea
9) 宮野怜, 松尾洋孝, 野中健一, 塩見和朗, 高橋洋子, 大村智,中島琢自. 2018. Physicochemical screeningによる糸状菌由来新規アルカロイドの探索–アルカロイド生産培地の検討と見出された化合物について–. 日本農芸化学会2018年度
大会 3月17-20日. 名古屋
10) 松尾洋孝, 目代貴之, 野中健一, 長野由梨子, 矢吹彬憲, 藤倉克則, 庭野吉己, 高橋洋子, 大村智, 中島琢自. 2018. 深海由
来糸状菌 Penicillium sp. FKJ-0123株が生産する新規シンナ
モイルトリペプチドについて. 日本農芸化学会2019年度大会 3月24-27日. 名古屋

微生物はこれまでに，人知の及ばない構造を有する化合物を提供してきた．それらは長い生存競争の過程における生命活動に伴い作り出された化合物であるため，強力な生物活性を示すものが多い．化学構造の多様性は，生物活性の多様性と深く関わっており，新しい構造を有する化合物(新規化合物)の取得は，創薬研究において重要な課題である．これまでに見出されてきた生物活性物質の多くは，その活性を指標に探索されてきたため，目的の生物活性と偶然に一致した場合のみ，化合物が取得されてきた．すなわち，目的以外の物質は，新規化合物であったとしても見逃されている可能性が高いと考えられる．近年の画期的な分析機器の発展は，多くの化合物の検出を可能にし，微生物の化合物生産能を最大限に引き出すことを可能にした．PC screening は，化合物の物理化学的性状を指標とするため，生物活性を指標とす
るスクリーニングと比較してより多くの化合物が対象となり，新規物質の発見に特化した方法である．本研究では，放線菌および糸状菌から生物活性を有する新規物質を見出すことに成功し，PC screening の有効性を明確にした．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 宮野怜, 松尾洋孝, 木村徹, 浅見行弘, 岩月正人, 佐藤倫子,
塩見和朗, 高橋洋子, 大村智, 中島琢自. 2015. 放線菌
Streptomyces griseus OS-3601 株が生産する新規物質について. 第30回日本放線菌学会大会 9月7-8日. 富山2) 宮野怜, 松尾洋孝, 木村徹, 浅見行弘, 岩月正人, 佐藤倫子,
塩見和朗, 高橋洋子, 大村智, 中島琢自. 2017. Physicochemical
Screeningによる新規物質の探索–放線菌Streptomyces griseus
OS-3601株が生産する新規物質–, 第28回北里大学バイオサ
イエンスフォーラム 8月6-7日. 相模原
3) 木村徹, 稲橋佑起, 高田拓和, 岩月正人, 塩見和朗, 高橋 洋子, 大村 智. 2017. 希少放線菌Lechevalieria aerocolonigenes
K10-0216株が生産するpyrizomicinの生合成研究. 日本農芸化学会2017年度大会 3月17-20日. 京都
4) 宮野怜, 松尾洋孝, 野中健一, 庭野吉己, 塩見和朗, 高橋洋子,
大村智, 中島琢自. 2017. 糸状菌 Pochonia sp. FKI-7537 株培
養液抽出物から得られた新規化合物 pochoniolide A および B について. 日本農芸化学会2017年度大会 3月17-20日.
京都5) 松尾洋孝, 野中健一, 高橋洋子, 大村智, 中島琢自. 2017. 糸状菌を探索源としたphysicochemical screeningによる新規物質の探索. 日本農芸化学会2017年度大会 3月17-20日. 京都6) Kimura, T., Inahashi, Y., Matsumoto, A., Shiomi, K.,
Ta k a h a s h i , Y. , Ō m u r a , S . & N a k a s h i m a , T. 2 0 1 7 .
Sagamilactam, Mumiamicin and Pyrizomicin, newcompounds from rare actinomycetes, discovered by
Physicochemical screening. 18th International Symposium

琢自

原著論文
1) Nakashima, T., Boonsnongcheep, P., Kimura, T., Iwatsuki,
M., Sato, N., Nonaka, K., Prathanturarug, S., Takahashi, Y.
& Ōmura, S. 2015. New compounds, nanaomycin F and
G, Discovered by Physicochemical Screening from a culture
broth of Streptomyces rosa subsp. notoensis OS -3966. J.
Biosci. Bioeng. 120: 596–600.
2) Nakashima, T., Miyano, R., Iwatsuki, M., Shirahata, T.,
Kimura, T., Asami, Y., Kobayashi, Y.,Shiomi, K., Petersson,
G. A., Takahashi, Y. & Ōmura, S. 2016. Iminimycin A, the
new iminium metabolite produced by Streptomyces griseus
OS-3601. J. Antibiot. 69: 611–615.
3) Nakashima, T., Miyano, R., Matsuo, H., Iwatsuki, M.,
Shirahata, T., Kobayashi, Y., Shiomi,, K., Peretsson G. A.,
Takahashi, Y. & Ōmura, S. 2016. Absolute configuration ofiminimyin B, a new indolizidine alkaloid, from Streptomyces
griseus OS-3601. Tetrahedron Lett. 30: 3284–3286.
4) Nakashima, T., Kimura, T., Miyano, R., Matsuo, H., Hirose,T., Kimishima, A., Nonaka, K., Iwatsuki, M., Nakanishi, J.,
Takahashi, Y. & Ōmura, S. 2017. Nanaomycin H: A
new nanaomycin analog. J. Biosci. Bioeng. 123: 765–770.
5) Kimura, T., Tajima, A., Inahashi, Y., Iwatsuki, M., Kasai, H.,
Mokudai, T., Niwano, Y., Shiomi, K., Takahashi, Y., Ōmura,S. & Nakashima, T. 2018a. Mumiamicin: str ucture
and bioactivity of a new fatty acid from Mumia sp. YSP-2-79.
J. Gen. Appl. Microbiol. 64: 62–67.
6) Kimura, T., Inahashi, Y., Matsuo, H., Suga, T., Iwatsuki, M.,
Shiomi, K., Takahashi, Y., Ōmura, S. & Nakashima, T.
2018b. Pyrizomicin A and B: Structure and bioactivity of
new thiazolyl pyridines from Lechevalieria aerocolonigenes
K10-0216. J. Antibiot. 71: 606–608.
7) Suga, T., Kimura, T., Inahashi, Y., Iwatsuki, M., Nonaka, K.,
Take, A., Matsumoto, A., Takahashi, Y., Ōmura, S. &Nakashima, T. 2018. Hamuramicins A and B, 22-memberedmacrolides, produced by an endophytic actinomycete
Allostreptomyces sp. K12-0794. J. Antibiot. 71: 619–625.
8) Matsuo, H., Nonaka, K., Nagano, Y., Yabuki, A., Fujikura, K.,－ 90 －

質量分析による新規物質の探索
Takahashi, Y., Ōmura, S. & Nakashima, T. 2018. New metabolites, sarcopodinols A and B, isolated from deep-sea
derived fungal strain Sarcopodium sp. FKJ-0025. Biosci.
Biotechnol. Biochem. 82: 1323–1326.
9) Miyano, R., Matsuo, H., Nonaka, K., Mokudai, T., Niwano, Y.,
Shiomi, K., Takahashi, Y., Ōmura, S. & Nakashima, T. 2018.
Pochoniolides A and B, new antioxidants from the fungal
strain Pochonia chlamydosporia var. spinulospora FKI-7537. J.
Biosci. Bioeng. 126: 661–666.
10) Kimura, T., Inahashi, Y., Matsuo, H., Suga, T., Iwatsuki, M.,
Shiomi, K., Takahashi, Y., Ōmura, S. & Nakashima, T. 2018.
Pyrizomicin A and B: Structure and bioactivity of new thiazolyl
pyridines from Lechevalieria aerocolonigenes K10 -0216. J.
Antibiot. 71: 606–608.
11) Kimura, T., Suga, T., Inahashi, Y., Matsuo, H., Iwatsuki, M.,
Shiomi, K., Takahashi, Y., Ōmura, S. & Nakashima, T. 2019.
New tetrahydroquinoline and indoline compounds
containing a hydroxy cyclopentenone, virantmycin B and C,
produced by Streptomyces sp. AM-2504. J. Antibiot. 71:
169–173.
12) Matsuo, H., Noguchi, Y., Také, A., Nakanishi, J., Shigemura,K., Sunazuka, T., Takahashi, Y., Ōmura, S. & Nakashima, T.
2019. Nanaomycin I and J: new nanaomycins generated bymycothiol-mediated compounds from "Streptomyces rosa
subsp. notensis OS-3966". J. Biosci. Bioeng. 127: 549–553.
13) Matsuo, H., Mokudai, T., Higo, M., Nonaka, K., Nagano, Y.,
Nagahama, T., Niwano, Y., Takahashi, Y., Ōmura, S. &Nakashima, T. 2019. Cipralphelin, a new anti-oxidative N-cinnamoyl tripeptide produced by the deep-sea
derived fungal strain Penicillium brevicompactum FKJ-0123.
J. Antibiot. 72: 775–778.
14) Matsuo, H., Nakanishi, J., Noguchi, Y., Kitagawa, K.,
Shigemura, K., Sunazuka, T., Takahashi, Y., Ōmura, S. &Nakashima, T. 2020. Nanaomycin K, a new epithelial-mesenchymal transition inhibitor produced by the actinomycete"Streptomyces rosa subsp. notensis OS -3966”. J. Biosci.
Bioeng. 129: 291–295.
15) Matsuo, H., Hirose, T., Mokudai, T., Nonaka, K., Niwano, Y.,
Sunazuka, T., Takahashi, Y., Ōmura, S. & Nakashima, T.
2020. Absolute str ucture and anti-oxidative activity ofchaetochiversin C isolated from fungal strain Neocosmospor
a sp. FKI-7792. J. Gen. Appl. Microbiol. (in press)
その他（特許)1) 大村智, 高橋洋子, 中島琢自, 松本厚子, 中西淳, 松尾洋孝.
2016. 新規ナナオマイシンH化合物及びその誘導体, 並びに, それらを有効成分として含有する上皮間葉転換が誘導された細胞に傷害を与える薬剤. 特願2016-186970.
2) 大村智, 高橋洋子, 中島琢自, 松尾洋孝, 野中健一, 坂戸久子.
2017. 新規ポコニオライド化物及びその使用. 特願2017050861.

謝

辞

本研究は，公益財団法人発酵研究所( IFO)の寄付助成により支援されたもので，この場を借りて感謝致します．NMR および MS を測定してくださいました北里大
学薬学部の佐藤倫子氏，長井賢一郎博士に深く感謝致します．また，本研究は当寄付講座に在籍した学生，北里生命研大村創薬グループの皆さんのご協力があったからこそ成し遂げられたもので，ここに感謝致します．

文

献Ando, K., Azuma, T., Matsuda, Y., Morishita, Y. & Saito, Y. 1993.
Japan patent JPH07179391A.
浅井禎吾, 大島吉輝 2016. エピジェネティック制御を利用する
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IFO Res.Commun. 34
93-100, 2020

質量分析および主成分分析を利用した探索系による含窒素物質の探索
松尾

洋孝，中島

琢自

北里大学北里生命科学研究所創薬資源微生物学寄付講座〒108-8641

東京都港区白金5-9-1

Screening for nitrogen compounds by principle component analysis
with liquid chromatography-mass spectrometry
Hirotaka Matsuo, Takuji Nakashima
Laboratory of Microbiology for Drug Discovery,
Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University
5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo, 108-8641, Japan
Filamentous fungi produce secondary metabolites with various structures. Recent genome analyses of filamentous
fungi indicate that there are far more biosynthetic gene clusters of secondary metabolites than the number ofcompounds discovered thus far. This indicates that filamentous fungi potentially produce unknown and usefulsecondary metabolites. Physicochemical (PC) screening systems enable the detection of even minute amounts ofcompounds in a culture broth. According to the KEGG MEDICUS database (https://www.kegg.jp/kegg/
medicus/), which provides molecular information about commercially available medicines, 87 % of medicines
contain nitrogen. The nitrogen is important constituent of most medicines. Thus, to conduct PC screening for new
nitrogen compounds from secondary metabolites of filamentous fungi and actinomycetes, we established modern
screening method of nitrogen compounds using principle component analysis and liquid chromatography-mass
spectrometry. During the course of these screening, three new nitrogen compounds produced by Trichoderma
virens FKI-7573, Sarocladium oryzae KF-140 and Oidiodendron maius FKI-7498 were discovered. Here we report
the establishment of screening and purification, structure elucidation and biological activities of these compounds.
Key words: fungal metabolites, nitrogen compounds, principal component analysis緒言子から考えられる化合物数には遠く及ばない（ Keller,
2019 )．特にヘテロ元素，とりわけ窒素や硫黄原子を含糸状菌を探索源とした physicochemical screening をむ二次代謝産物は，生産されているにも関わらず，見逃実施している中で，取得された新規物質はどれも，炭素，されている可能性がある．実際，放線菌と糸状菌から，水素，酸素のみから成るポリケタイドやテルペン系の化

何らかの生物活性を指標とした探索により取得された含合物であった．近年の糸状菌ゲノム解析の結果によると，窒素物質数を調べると，放線菌では 65 %（2,865/8,291 )，

糸状菌から報告されている二次代謝産物は，生合成遺伝

糸状菌では 31 %（4,112/13,340 )と大きな差がある（DNP
調べ)．真核生物である糸状菌は放線菌と同等，あるいE-mail: matsu-h@lisci.kitasato-u.ac.jp, takuji@lisci.kitasato-u.ac.jp
共同研究者:松本厚子（北里大学北里生命科学研究所)，
野中健一（北里大学北里生命科学研究所)，
野口吉彦（北里大学北里生命科学研究所)，
廣瀬友靖（北里大学北里生命科学研究所)，
砂塚敏明（北里大学北里生命科学研究所)，
目代貴之（東北大学金属材料研究所)，
庭野吉巳（秀明大学看護学部)

はそれ以上の物質生産能力を有していると考えられているにも関わらず，含窒素物質の取得数にはこのように大きな差があり，糸状菌の物質生産能を完全に活かしきれていない可能性がある．また，ゲノム・疾患・医薬品
データベースである KEGG MEDICUS（ Kanehisa et al.,2010 )に登録されている低分子医薬品（ 0.1 - 1 kDa )における含窒素医薬品の割合を調べると，約 80 %に窒素

－ 93 －

松尾

洋孝，中島

琢自

が含まれている．つまり，含窒素物質を選択的に取得すスナップコニカルに入れた．天然物の窒素源およびきなることで，効率的に医薬品のシード物質を探索すること

粉をそれぞれ秤量し，米を入れたスナップコニカルに入が期待できる．

れた．秤量したこぶ茶粉末を水で溶き，塩類の窒素源を

含窒素物質の探索方法は，古くから様々な方法が知ら

添加し，米を入れたスナップコニカルに分注した．軽くれている．例えば，アミノ酸を呈色するニンヒドリン反

蓋を締め，アルミ箔をかぶせて 121 ℃，15 分間オートク

応や（ Kawerau & Wieland, 1951 )，3 級および 4 級アミレーブ滅菌した．種培養液を 5 %となるように植菌し，ンを呈色するドラーゲンドルフ反応（ Rubia & Gomez,

25 ℃で 14 日間静置培養した．生産培養後，培養物に1977 )などがある．これらの反応は，培養液への直接

20 mL のメタノールを加え，破砕機で米と菌体を砕いた．

添加や TLC に噴霧して検出する方法が一般的だが，検1,500×g で 5 分間遠心分離し，上清を回収した．上清を出感度は高いとは言えず，生産量の少ない物質には不向シリンジフィルターでろ過し，LC/MS を測定した．

きである．
一方，分子量が奇数の物質は，構造内に奇数個の窒素

新規物質探索および精製，構造解析

原子を含んでいるという窒素ルールがある．近年の分析

MarkerView software を用いて主成分分析を行い，奇機器の発展は目覚ましく，少量のサンプルで微量成分ま数の分子量を有する物質のみをピックアップし，その物で検出できる LC/MS などの開発により，微生物培養液

理化学的性状を DNP と比較した．

中の物質を網羅的に検出できるようになった．そこで本

推定新規含窒素物質生産菌を対応した培地で培養後，研究では，LC/MS により得られたデータをもとに，主シリカゲルカラム，ODS カラムクロマトグラフィーな成分分析を行い，窒素ルールにしたがって奇数の分子量

どにより精製した．得られた物質は，一次元および二次を示す物質を簡便に探索する方法を構築した．また，当元 NMR 等により平面構造の解析を行い，各種手法によ研究所内における生物活性物質の探索に用いられている

り立体構造までを検討した．

培地の中で，最も新規物質の取得率が高かった米培地に窒素源を加えるなど，培養方法の工夫による取り組みを

生物活性評価
抗菌活性試験は，ペーパーディスク法で測定した．真行った．
これらの方法により，Trichoderma virens FKI-7573 株

菌として Candida albicans ATCC 64548，Saccharomycesよりトリコチオネ酸，Sarocladium oryzae KF-140 株より

cerevisiae ATCC 9763 ，Aspergillus niger ATCC 6275 ，サロクラド酸，Oidiodendron maius FKI-7498 株よりペMucor racemosus IFO 4581，グラム陽性菌としてとしてニシドンの新規含窒素物質を取得したので報告する．

Kocuria rhizophila ATCC 9341 ，Bacillus subtilis ATCC
6633，グラム陰性菌としてとして Escherichia coli NIHJ，

実験方法

Xanthomonas campestris pv. oryzae KB 88 を検定菌とした．
細胞毒性試験は，Cell Counting Kit-8（同仁化学)を探索源用いて行った．ヒト子宮頸部類上皮癌細胞 HeLa S3 ，

北里生命科学研究所微生物資源研究センターより提供
された糸状菌 100 株を用いた．

ヒト結腸腺癌細胞 HT29，ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞
A549，ヒト肺腺癌細胞 H1299，ヒト膵臓腺癌 PANC-1，
ヒト急性単球性白血病細胞 THP-1，ヒト T 細胞性白血

窒素源の探索病細胞 Jurkat，ヒト前骨髄性白血病細胞 HL-60 を用いた．

F36 培地を基本培地とし，天然物の窒素源としてペプ

抗酸化活性は，スーパーオキシドアニオンラジカル，

トン，ハイポリペプトン，NZ アミン，ファーマメディア，

ヒドロキシラジカル，一重項酸素消去活性を評価した．

カツオエキス，乾燥ブイヨンの 6 成分を添加した．塩類結果および考察の窒素源としては硝酸ナトリウム，塩化アンモニウム，
硫酸アンモニウム（ AS )，酢酸アンモニウム，コハク酸
アンモニウム，酒石酸アンモニウムの 6 成分を添加した．

生産培地の選定

また，Nose et al.,（ 2000 )らの報告を参考に，上記の各含窒素物質を探索するにあたり，まず初めに生産培地

培地にきな粉（ SBM )を添加した（ Nose et al., 2000 )．

の改良を行った．含窒素化合物である gliotoxin 類の生産菌である Trichoderma virens FKI-7573 株をモデル糸状培養および培養液の LC/MS 解析

菌として用いて生産培地の検討を行った．Gliotoxin は生産培地は F36 培地を基本とした計 26 種類を用いた．

NRPS で生合成される diketopiperazine 構造を持つ含窒

米を 1 時間半水に漬けた後に水をきり，10 g を 50 mL の素物質である（ Dolan et al., 2015 )．種々検討の結果，－ 94 －

質量分析および主成分分析を利用した探索系による含窒素物質の探索

Gliotoxin 類の生産量が良く向上し，他の二次代謝産物

ウェア MarkerView™（株式会社エービー・サイエックス)の生産量の向上も見られた F36-きなこ（SBM）/ 硫酸アで解析した．MarkerView™ では 400 サンプルに含まれるンモニウム（AS）培地を含窒素物質の探索に使用する生

全化合物の m/z 値を一覧できる．Fig. 2 に MarkerView™

産培地として選択した（ Fig. 1 )．さらに，比較対象との表の一部を示した．Row は列番号，Index は各化合物

し F36 培地，F36-AS 培地，F36 培地にきな粉を添加しに割り振られた数字，Peak Name は m/z 値 / 溶出時間

た F36-SBM 培地を選択し，計 4 種類を本研究における（ Index )，m/z は 各 化 合 物 の m/z 値，Ret. Time は 溶 出生産培地とした．

時間，Group は各化合物のグループ，Use はチェックした化合物を主成分分析の対象とすることを意味していMakerView software による窒素ルールを適用した含窒る．この表を用いることで，m/z 値が偶数（分子量が奇素物質の探索数)の化合物ある含窒素化合物のみを抽出し，主成分分400 サ ン プ ル の LC/MS デ ー タ を 主 成 分 分 析 ソ フ ト

Fig. 1

Fig. 2

析をすることができる．

The LC/UV chromatogram of the cultured broth of FKI-7573

The partial table of compounds analyzed by MarkerView software－ 95 －

松尾

洋孝，中島

琢自

m/z 値が偶数（分子量が奇数)の化合物を選択し，主成分分析を行った結果の散布図を Fig. 3 に示した．この散布図の 1 つの点が 1 つの化合物を示している．この中から 1 つの化合物を選択すると Fig. 4 に示したグラフが表示される．このグラフは横軸がサンプルナンバーを表し，縦軸は検出量を表しており，選択した化合物がどのサンプルにどの程度含まれているかを表している．例えば Fig. 4 上段のようなグラフを示す化合物は複数の培養
液抽出物サンプルに含まれている化合物である．このような化合物は様々な糸状菌が生産する一般的な化合物である可能性がある．本研究では，ある菌株が特異的に生産するユニークな含窒素化合物を取得するため，Fig. 4
下段に示すような，ある 1 菌株のサンプルにのみ含まれていた化合物を選択した．さらに本研究では，従来の培Fig. 3 The result of principal component analysis

Fig. 4地（ F36 培地)では得ることが困難と考えられた化合物を取得するために，改変培地（ F36-AS ，F36-SBM，

The graph of selected sample. (A) The example of the compound produced byseveral strains. (B) The example of the compound produced by one strain.

－ 96 －

質量分析および主成分分析を利用した探索系による含窒素物質の探索

F36-SBM-AS)での生産量が基本培地よりも向上していジン酸にエルゴチオネインが結合した新規物質でる化合物（ Fig. 4B がその例)を選択した．このような（ Fig. 5 )，Trichoderma 属と物質名に因んでトリコチオ

方法により，400 サンプルに含まれていた m/z 値が偶数

ネ酸と命名した．

（分子量が奇数)の物質を 1197 件選択した．この中から，

相対立体配置を検討するため，ROESY 相関およびカッ菌株特異的な物質を 781 物質選択し，改変培地で生産量

プリングコンスタントの解析を行った結果，トリコチオが増加していた物質を絞り込み，284 物質を選択した．

ネ酸の相対立体配置を Fig. 6 のように決定した．さらに，

この内の 8 物質の物理化学的性状情報を DNP で検索しC-5´の絶対立体配置は，ラネーニッケル反応（Mozingo

た結果，5 つの物質が新規含窒素物質であると推定されet al., 1943）による脱硫反応で生じるヘルシニンの比旋光度を，（S）- ヘルシニンの文献（ Reinhold et al., 1968 )とた．それ以外の物質については解析中である．
1197 件の m/z 値が偶数（分子量が奇数)の物質を見比較することで決定した．トリコチオネ酸をラネーニッ

出したことにより，1 株あたり平均約 12 の含窒素物質

ケルで脱硫し，HPLC 分取することで，トリコチオネ酸
23 +由来のヘルシニンを得た．その比旋光度は
[α]
53.4
D

を生産していることが明らかになった．さらに，菌株特異的な物質については 1 株あたり約 8 物質を生産してい22 +で，（S）- ヘルシニンの文献値は[α]44.7 であったたDることが分かった．このように，培地改変や探索方法をめ，トリコチオネ酸由来のヘルシニンは（S）- ヘルシニン

工夫することで，糸状菌の含窒素物質生産能を引き出すであると決定した．ヘプテリジン酸部分の絶対立体配置ことに成功した．

は CD スペクトルにより決定した．CD スペクトルの計

Trichoderma virens FKI-7573 株が F36SBM-AS 培地で生産するトリコチオネ酸について

Gaussian, Inc. ) を 用 い た． 実 測 の CD ス ペ ク ト ル と算には Spartan 16（ Wavefunction, Inc. )と Gaussian 16

本菌株が F36SBM-AS 培地で生産する FKI-7573A 物+
質は，UV 極大吸収 216，249 nm，m/z＝510.2255[M + H]
（C24H35N3O7S）の物性を示し，DNP 検索の結果，これら

Fig. 6 の絶対立体配置をもとにして算出された円二色性
スペクトルを Fig. 7 に示した．実測，計算値ともに正のコットン効果を示したことから，トリコチオネ酸のヘプ
テリジン酸部分の絶対立体配置は 1S，6S，7R，10S で物性と一致する既知物質はなく，新規物質と推定された．

あると決定した．以上の結果から，トリコチオネ酸はそこで，FKI-7573 株を大量培養後，各種カラムクロマ

Fig. 8 に示した絶対立体配置であると決定した．

トグラフィーにより精製し，FKI-7573A 物質を 55 mg 取トリコチオネ酸の抗菌活性，細胞毒性，抗マラリア活得した．NMR 解析の結果，FKI-7573A 物質はヘプテリ

Fig. 7

Fig. 5 1D and 2D NMR correlations of trichothioneic acid

Fig. 6 Analyses of ROESY correlations and coupling constants－ 97 －

The comparison with CD spectra of trichothioneic
acid (full line: observation, dotted line: computation)

Fig. 8Absolute structure of trichothioneic acid

松尾

洋孝，中島

琢自

性，抗酸化活性を評価した結果，ヒドロキシラジカル

つ の 構 造 が 推 定 さ れ た（ Fig. 10A-C )．KF-140 物 質 を（ · OH）および一重項酸素（1 O2）消去活性を見出した．ヒ

Sarocladium 属とテトラミン酸に因んでサロクラド酸と命名した．

ドロキシラジカルに対する 0.1 mM のトリコチオネ酸の消去活性は陽性対照であるクエルセチンと同程度であっ推定構造 C について，トリフェニルホスフィンを用いた．また，一重項酸素に対するトリコチオネ酸の消去活て還元したところ，まったく反応は進行しなかった．また，性は，陽性対照である 2.5 mM アジ化ナトリウムと同程

サロクラド酸を TMS ジアゾメタンでメチル化したところ，

度であった（ Fig. 9 )．

最大で 3 つのメチル基が導入されることを確認した．この条件を満たすのは推定構造 A である．さらに，MS/MS

Sarocladium oryzae KF-140 株が F36SBM-AS 培地で生産するサロクラド酸について
本菌株が F36SBM-AS 培地で生産する KF-140 物質は，

フラグメントを解析したところ，推定構造 A でなければ見られないフラグメントが観測されたため（ Fig. 11 )，サロクラド酸の構造を推定構造 A であると決定した．サUV 極大吸収 264 nm，m/z＝382.1875[M + H]
（C19H28NO7）

ロクラド酸の生物活性については探索中である．

既知物質はなく，新規物質と推定された．そこで，KF-140

Oidiodendron maius FKI-7498 株 が F36SBM-AS 培 地 で生産するペニシドン E および F について+の物性を示し，DNP 検索の結果，これら物性と一致する株を大量培養後，各種カラムクロマトグラフィーにより精製し，KF-140 物質を 55 mg 取得した．NMR 解析の結本菌株が F36SBM-AS 培地で生産する FKI-7498A お果，KF-140 物質はテトラミン酸を部分構造に有する 3

よび B 物質は，それぞれ UV 極大吸収 226, 260, 314 nm，Fig. 9The ·OH- and 1 O2-eliminating performance of trichothioneic acid. (A) ·OH with DMPO-OH values and(B) 1 O2 with spin concentration values measured byelectron spin resonance spectra. Quercetin and
NaN3 were used as respective positive controls. Mean
±SD (n = 3), **p < 0.01 vs. NC (t-test).

Fig. 10 Three deduced structures of sarocladic acid1
H–1H COSY (bold) and HMBC (arrow) correlationsof deduced structure 1 (A), 2 (B) and 3 (C).

－ 98 －

質量分析および主成分分析を利用した探索系による含窒素物質の探索

Fig. 11

MS/MS fragments of sarocladic acid

Fig. 12 1D and 2D NMR correlations of penicidones E and F(A) 1D and 2D NMR correlations of penicidone E and (B) 1D and 2D NMR correlations of penicidone F.

2008 )および D（ Liu et al., 2015 )のみ報告されており，

m/z＝418.2005[M + H]（ C22H27NO7 )および UV 極大吸+
収 226，260，316 nm，m/z＝432.2038[M + H]
（C22H29NO7 )非常にユニークな構造であった．ペニシドン C はコルの物性を示し，DNP 検索の結果，これら物性と一致す

ククヌギの幹から得られた内生糸状菌である Penicillium

る既知物質はなく，新規物質と推定された．そこで，

sp. IFB-E022 から見出され，弱い細胞毒性が報告されてFKI-7498 株を大量培養後，各種カラムクロマトグラ

いる．また，ペニシドン D はマングローブの枝から得フィーにより精製し FKI-7498A および B 物質それぞれられた内生糸状菌である Penicillium sp. HN29-3B1 からを 25 mg，14 mg 取 得 し た．NMR 解 析 の 結 果，

得られている．ペニシドン C，D の関連化合物であるフ

FKI-7498A お よ び B 物 質 は 2（4- -ピリドン- 3 -カルボニニコンは 8 つの類縁物質が DNP に掲載されているが，

ル)-安息香酸を基本骨格とするペニシドン類の新規類縁

こ れ ら の 化 合 物 の 生 産 菌 は Penicillium 属 あ る い は物質であることが分かり（ Fig. 12 )，ペニシドン E およTalaromyces 属（ Penicillium 属の完全世代の一つ)の糸状菌である．Oidiodendron 属と Penicillium 属はそれぞ+

び F と命名した．
ペニシドン E および F は，2 -（4-pyridone-3-carbonyl )れ Leotiomycetes 綱および Eurotiomycetes 綱に分類されてbenzoic acid を基本骨格とする化合物であった．この骨おり系統的に遠い関係にある．糸状菌は属ごとに生産す

格 を 有 す る 天 然 物 と し て は ペ ニ シ ド ン C（ Ge et al.,る物質が異なることが知られており，これら 2 種の糸状－ 99 －

松尾洋孝，中島菌において同じ基本骨格を有する物質が得られたこと
は，生合成遺伝子クラスターの伝播や進化の観点から大変興味深いことであった．加えて，O. maius は菌根菌として知られており（ Martino et al., 2018 )，ペニシドン
C, D は植物内生糸状菌から得られていることから，ペ

原著論文
1) Miyano, R., Matsuo, H., Mokudai, T., Higo, M., Nonaka, K.,
Niwano, Y., Shiomi, K., Takahashi, Y., Ōmura, S. &Nakashima, T. 2020. Trichothioneic acid, a new antioxidant
compound produced by the fungal strain Trichoderma virens
FKI-7573. J. Biosci. Bioeng. 129, 508–513.

ニシドン E，F は植物に対して何らかの影響を与える活謝性が期待される．

要

約

琢自

辞

本研究は，公益財団法人発酵研究所（ IFO)の 2014
年度寄付講座助成により支援されたもので，この場を借

糸状菌を探索源とした physicochemical screening を実りて感謝致します．NMR および MS を測定してくださ施している中で，取得された新規物質はどれも，炭素，水いました北里大学薬学部の佐藤倫子氏，長井賢一郎博士

素，酸素のみから成るポリケタイドやテルペン系の化合に深く感謝致します．また，本研究は当寄付講座に在籍物であった．しかし，糸状菌は様々な構造を有する二次した学生，北里生命研大村創薬グループの皆さんのご協

代謝産物を生産している．近年のゲノム解析の結果，糸状力があったからこそ成し遂げられたもので，ここに感謝

菌は報告されている二次代謝産物数を超える生合成遺伝

致します．

子を有していることが明らかとなった．つまり，糸状菌は

文

まだ多くの未知物質を生産していることが示唆された．
医薬品データベースである KEGG MEDICUS によると，
低分子医薬品における含窒素物質の割合は 87 %であっ
た．したがって，窒素は医薬品にとって重要な構成元素である．そこで，新規含窒素物質を選択的に探索するため，主成分分析と LC/MS を用いて新たなスクリニーン
グ方法を構築した．糸状菌培養液を用いたスクリニーン
グ の 結 果，Trichoderma virens FKI-7573 ，Sarocladiumoryzae KF-140，Oidiodendron maius FKI-7498 株から 3 つの新規含窒素物質を発見したのでここに報告する．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 宮野怜, 松尾洋孝, 野中健一, 塩見和朗, 高橋洋子, 大村智,中島琢自. 2018. Physicochemical screening による糸状菌
由来新規アルカロイドの探索 -生産培地の検討と二次代謝産物の解析-. 日本農芸化学会2018年度大会 3月15-18日. 名古屋2) 宮野怜, 松尾洋孝, 野中健一, 塩見和朗, 高橋洋子, 大村智,中島琢自. 2018. Physicochemical Screening による糸状菌
由来新規アルカロイドの探索―新規アルカロイド trichothioneic acidについて―. 第 31 回北里大学バイオサイエン
スフォーラム 8月8-9日. 相模原
3) 宮野怜, 松尾洋孝, 野中健一, 目代貴之, 庭野吉己, 塩見和朗,
高橋洋子, 大村智, 中島琢自. 2019. 「Physicochemical
screeningによる新規化合物の探索-Trichoderma virens
FK I-7573株が生産する新規含窒素化合物について-. 日本
農芸化学会 2019 年度大会 3月24-27日. 東京
4) 宮野怜, 松尾洋孝, 野中健一, 塩見和朗, 高橋洋子, 大村智,中島琢自. 2019. Physicochemical screeningによる新規化合物の探索-Sarocladium oryzae KF-140 株が生産する新規含窒素化合物について-. 第 32 回北里大学バイオサイエンスフォーラム 8月7–8日. 東京

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－ 100 －

IFO Res.Commun. 34
101-110, 2020

モリブデン酸化および質量分析を組み合わせた
含硫黄物質探索系の構築と新規含硫黄物質の取得
松尾

洋孝，中島

琢自

北里大学北里生命科学研究所創薬資源微生物学寄付講座〒108-8641

東京都港区白金5-9-1

Screening for sulfur compounds by molybdenum-catalyzed oxodation
with liquid chromatography-mass spectrometry
Hirotaka Matsuo, Takuji Nakashima
Laboratory of Microbiology for Drug Discovery,
Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University
5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo, 108-8641, Japan
Natural products are often used as drugs, agricultural chemicals, and chemical reagents. Compounds containing
sulfur are often useful due to their strong biological activities. According to the KEGG MEDICUS database(https://www.kegg.jp/kegg/medicus/), which provides molecular information about commercially available
medicines, 25 % of medicines contain sulfur. Thus, sulfur is important constituent of most medicines. We
established modern screening (MoS-screening) for sulfur compounds based on Mo-catalyzed oxidation and liquid
chromatography-mass spectrometry. Here, we report the establishment of MoS-screening and two new sulfur
compounds produced by Trichoderma polypori FKI-7382 and Leptobacillium leptobactrum FKI-7961.
Key words: molybdenum-catalyzed oxidation, sulfur compounds, MoS screening緒

言

Natural Products（ 2017 年版)によると，炭素，水素，酸素を基本構成元素とした場合，収録されている約 27

硫黄は，単体自体で医薬品として用いられている他，万化合物のうち含窒素物質は約 65,000 件（ 24 %)，含硫

含硫黄物質は様々な生理活性や生物活性を示すため，重

黄物質は約 9,800 件（ 3.6 %)，含塩素物質は約 5,400 件

要な医薬品の構成元素の一つである．ゲノム・疾患・医（ 2 %)，含臭素物質は約 4,000 件（ 1.5 %)，含リン物質

薬品データベースである KEGG MEDICUS（ Kanehisa

は約 980 件（ 0.4 %)，含ヨウ素物質は 324 件（ 0.1 %)，et al., 2010 )に登録されている低分子医薬品（0.1 - 1 kDa )における含硫黄医薬品の割合を調べると，約 25 %が含硫

含フッ素物質は 210 件（ 0.08 %)であった．含硫黄物質

黄医薬品であった．つまり，含硫黄物質を選択的に取得の特異的な探索方法（検出方法)は，硝酸銀（ Pollard

することができれば，新規な医薬品の発見が期待できる．

et al., 1962, Coyne & Maw, 1964 )やニトロプルシドなどを用いた TLC の呈色反応（ Korte & Vogel, 1962 )など

天然物では，その構造は基本的に炭素，水素，酸素，が知られているが，微量成分の検出は困難である．この窒素，硫黄，塩素，臭素（稀にリン，ヨウ素，フッ素)

ような背景の中，2013 年に理化学研究所と山口大学のから成る．既知天然物データベースである Dictionary of

共同研究で，質量分析を用いた含硫黄物質の網羅的解析

E-mail: matsu-h@lisci.kitasato-u.ac.jp, takuji@lisci.kitasato-u.ac.jp
共同研究者:松本厚子（北里大学北里生命科学研究所)，
野中健一（北里大学北里生命科学研究所)，
野口吉彦（北里大学北里生命科学研究所)，
廣瀬友靖（北里大学北里生命科学研究所)，
砂塚敏明（北里大学北里生命科学研究所)

2013 )． こ れ は， 硫 黄 の 天 然 存 在 比（ 32S: 94.9 %，34S:
4.29 %)を，超高分解能質量分析を用いて M+2 領域を法「 S -オ ミ ク ス 」 が 報 告 さ れ た（ Nakabayashi et al.,

見分ける方法である．しかし残念ながら，この質量分析装置は非常に高価であり，熟練した技術・経験を必要とし，国内でも限られた機関のみが所有しているため，現－ 101 －

松尾

洋孝，中島

琢自

AB Sciex 社製 TripleTOF ® 5600 + System を用いた．ポジ

状では汎用性に欠ける装置といえる．
モ リ ブ デ ン 酸 化 は，1984 年 に Trost & Masuyama

ティブイオンモードで測定し，各種測定条件は以下の通（ 1984 )らが報告したモリブデンを触媒とし，過酸化水

り．Ion Source Gas1: 50 psi ，Ion Source Gas2: 50 psi ，素を酸化剤として用いる酸化反応である．通常，塩基性

Cur tain Gas: 25 psi ，Temperature: 500 ℃，IonSpray

条件下で 1 級水酸基の存在下，2 級水酸基の酸化に用い

Voltage Floating: 5500 V ，Declustering Potential: 80 V ，られる．Jeyakumar et al.（ 2009 )らはこの応用例として，

Collision Energy: 45 V ，Collision Energy Spread: 15 V ，スルフィドをスルフォンへと酸化する簡便な方法を報告

Ion Release Delay: 30 µs，Ion Release Delay Width: 15 µs．

した．さらに，この酸化では 1 級および 2 級水酸基やオレ各データは，Analyst software（ AB Sciex )を用いて解フィンの酸化はほとんど起きない．そこで我々は，この析した．

反応を利用することによって，微生物培養液中の含硫黄物質を同定できるのではないかと考えた．すなわち，微探索源

生物培養液中の含硫黄物質をモリブデン酸化により酸化

糸状菌新鮮分離株培養液および北里生命科学研究所で（硫黄原子に酸素を付加)し，未反応サンプルと酸化サン

長期保存されていた放線菌株を培養した培養液，放線菌

プルを LC/MS で比較することにより，酸化された含硫新鮮分離株培養液を用いた．

黄物質は酸化サンプル上から消失し，分子量が 32（酸素原子 2 つ分)増加した新たなピークが出現する．未酸化サ

新規物質探索および精製，構造解析

ンプルから消失したピークを同定することにより含硫黄物

MoS-screening により含硫黄物質であると推定された質を同定できる．本 研究では，モリブデン酸化と LC/MS

物質について，その物理化学的性状を DNP と比較した．

を組み合わせることにより，含硫黄物質の新たな探索系

推定新規含硫黄物質生産菌を対応した培地で培養後，シを 構 築 し，MoS-screening と 命 名 し た（ Matsuo et al.,

リカゲルカラム，ODS カラムクロマトグラフィーなど

2020a )．本項目では，MoS-screening の構築および本探により精製した．得られた物質は，一次元および二次元索系による Trichoderma polypori FKI-7382 株から N-アセ

NMR 等により平面構造の解析を行い，各種手法によりチルシステインを部分構造に有するチオポリジオール類

立体構造までを検討した．

（ Matsuo et al., 2020b )，Leptobacillium leptobactrum
FKI-7961 株よりシスタチオニンを部分構造に有するレ

生物活性評価
抗菌活性試験は，グラム陽性菌として Bacillus subtilis

プトチオニン（ unpublished )の取得について報告する．

KB-211，Kocuria rhizophila KB-212 を，グラム陰性菌とし実験方法て Escherichia coli KB-213，Xanthomonas oryzae pv. oryzae

モリブデン酸化KB-88 を， 真 菌 と し て Candida albicans KF-1，Mucor

被 験 サ ン プ ル を 1 mg/mL に な る よ う メ タ ノ ー ル

racemosus KF-233 を用いた．
細胞毒性試験は，ヒト前骨髄性白血病細胞 HL-60，

200 μL に 溶 解 し，100 μL ず つ そ れ ぞ れ 2 枚 の 96 well

ヒト T 細胞性白血病細胞 Jurkat，ヒト急性単球性白血病

plate に 分 注 し た．1 枚 目（ 酸 化 用 plate ) に は，細胞 THP-1，ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞 A549，ヒト膵

10 mg/mL に 調 製 し た（ NH4）6 Mo7O24 ·4H2O 水 溶 液 を

臓腺癌 PANC-1，ヒト子宮頸部類上皮癌細胞 HeLa S3，

10 μL および 30 %過酸化水素水を 10 μL 加え，2 枚目（未ヒト結腸腺癌細胞 HT29，ヒト肺腺癌細胞 H1299 を用

酸化用 plate )には濃度調整のため水を 20 μL 加えた．室いた．
抗酸化活性は，スーパーオキシドアニオンラジカル，

温で 6 時間，プレートシェーカーで振盪後，各サンプル

ヒドロキシラジカル，一重項酸素消去活性を評価した．

を LC/MS で分析した．

結果および考察LC/MS 測定条件
LC は，AB Sciex 社製 ExionLC

TMを用い，各種条件は以下の通り．Column: CPCELL CORE C18 S2.7（3.0 mmI.D.

まず始めに，複雑な構造を有する天然物でも簡便にス×100 mm )，Column temperature: 40 ℃，Eluent A: H2O

ルフィドからスルフォンへ酸化できるかどうかを検討す+ 0.1 % formic acid ，B: methanol + 0.1 % formic acid ，るため，Fig. 1 に示した硫黄原子の架橋構造を有するオー

Gradient system:（A/B )，0 min（95/5 )→ 2 min（95/5 )→トヴィリン A（ Kajula et al., 2016 )，スルフィド構造を

10 min（0/100 )→ 12 min（0/100 )，Flow rate: 0.5mL/min，有するナナオマイシン K（ Matsuo et al., 2020c )およびWavelength: 200 - 600 nm，Injection volume: 1 µL．MS は，

N-アセチルシステインを有するラクタシスチン（ Ōmura

－ 102 －

モリブデン酸化および質量分析を組み合わせた含硫黄物質探索系の構築と新規含硫黄物質の取得

Fig. 1

Structures of outovirin A, nanaomycin K and lactacystin.

Fig. 2 Chromatograms are shown for Mo-catalyzed oxidation and control samples containing of sulfur compounds:(A) outovirin A and (B) nanaomyin K. Chromatograms ( i ) and (iii) were acquired prior to Mo-catalyzed
oxidation and chromatograms (ii) and (iv) were acquired after Mo-catalyzed oxidation. Mass-to-charge ratios(m/z) are indicated as [M + H]+.

次に，これらの含硫黄物質が混合物中でも同定できる

et al., 1991a, 1991b )をそれぞれモリブデン酸化した．
未酸化サンプルと比較した結果の LC/MS クロマトグラのかどうかを検討した．硫黄非含有物質としてタンザワ酸

ム を Fig. 2 に 示 し た． オ ー ト ヴ ィ リ ン A（ m/z＝481,

B（ Kuramoto et al., 1997 )，ボーベリシン（ Hamill et al.,13.44 min; Fig. 2A - i )は，酸化により完全にピークが消1969 )，SF-227（ Mizushima et al., 2012 )，アクレモリン B

失し，酸化後クロマトグラム上で酸素原子が 1 つ付加し（Tian et al., 2015)を用い，含硫黄物質としてオートヴィリ

たピーク（ m/z＝497，12.55 min )として出現した．ナン A およびナナオマイシン K を用いた．それぞれ 1 mg を

ナオマイシン K（m/z＝548, 13.38 min; Fig. 2B - i )もまた，含んだメタノール溶液 1 mL を，酸化用および未酸化用と酸化により完全にピークが消失し，酸化後クロマトグラ

して 100 μL ずつ分注して反応させ，LC/MS で測定した

ム 上 で 酸 素 原 子 が 2 つ 付 加 し た ピ ー ク（ m/z＝580,

結果を Fig. 3 に示した．各物質の構造，保持時間（ RT )，12.08 min; Fig. 2B - ii )として出現した．一方，ラクタシ

質量電荷比（ m/z )は Table 1 に示した．未酸化クロマト

スチンは酸化後クロマトグラム上で全くピークが検出さグラム上（ Fig. 3A )の peak 1 ～ 6 は，その m/z 値およれなかったため，酸化反応により分解したものと考えた．

び UV スペクトルから Table 1 に示したように同定した．

以上の結果から，天然物を用いた場合では，酸化反応に

酸化後クロマトグラム上では（ Fig. 3B )，その RT，UV

耐えうる含硫黄物質は，スルフィニルあるいはスルフォ

ス ペ ク ト ル お よ び m/z 値 か ら，peak 1´（ 11.56 min )，ニル体として同定できることが分かった．

peak 2´（ 11.16 min )および peak 4´（ 7.10 min )をそれ
－ 103 －

松尾

洋孝，中島

琢自

Fig. 3 An LC/MS chromatogram of a mixture of compounds with and without sulfur. (A) Control (non-oxided)
sample, (B) oxidized sample. Intensity refers to the output of a photodiode array detector (DAD) operating in
total wavelength chromatography (TWC) mode.

Table 1The structures and LC/MS data of the compounds used in this study.

Continued on the next page.

－ 104 －

モリブデン酸化および質量分析を組み合わせた含硫黄物質探索系の構築と新規含硫黄物質の取得
Table 1

continued
Continued.

－ 105 －

松尾

洋孝，中島

琢自

ぞれタンザワ酸 B，ボーベリシンおよびアクレモリン B とをモリブデン（ Mo）酸化を用いた硫黄（S）物質の探索系同定した．Peak 5（ 6.52 min )および peak 6（ 6.45 min )にちなみ，MoS-screening と名付けた．

は，酸化後クロマトグラム上では消失しており，新たに

最後に，MoS-screening を用いて微生物培養液中からpeak 5a（ 5.72 min )，peak 6a（ 5.62 min ) お よ び peak

含硫黄物質の探索を行なった．北里生命科学研究所微生

6b（ 6.21 min )が出現した．Peak 6a および peak 6b はそれぞれ，m/z＝564 および 580[M + H]+ に擬分子イオン物機能研究室松本准教授および微生物資源研究センター

ピークを示し，peak 6 と同様の UV スペクトルを示した．
+
また，peak 5a は m/z＝497[M + H]に擬分子イオンピー

150 株の培養液（50 % エタノールブロス）を 96 well plate

クを示し，peak 5 と同様の UV スペクトルを示した．以水溶液を 10 μL および 30 %過酸化水素水を 10 μL 加え，

野中講師により提供された放線菌および糸状菌それぞれに分注し，2 枚作成した．1 枚目には（NH4）6 Mo7O24 ·4H2O

上のことから，peak 5a，peak 6a および peak 6b はそれぞ2 枚目（未酸化用 plate )には濃度調整のため水を 20 μLれ，スルフィニルオートヴィリン A，スルフィニルナナオマイ

加えた．室温で 6 時間，プレートシェーカーで振盪後，シン K およびスルフォニルナナオマイシン K と同定した．

各サンプルを LC/MS で分析した．その結果，放線菌

Peak 3（ SF-227 )の酸化体（ m/z＝297 )は酸化後クロマより分解したと考えられた．オートヴィリン A（ peak 5 )Kitasatospora setae KM-6054T 株が生産する物質を含硫黄物質と推定した．本物質は，RT 7.11 min，m/z＝402.1103+[M + H]に 擬 分 子 イ オ ン ピ ー ク を 示 し， 分 子 式 はとスルフィニルオートヴィリン A（ peak 5a )のように，

C19H20N3O5S（ calculated value for m/z 402.1124 )と推定

トグラム上で検出されなかったため，モリブデン酸化に

UV スペクトルにはほとんど変化がないため，同定は容さ れ，214，242，276，310，384 nm に 特 徴 的 な UV 極易であった．以上の結果から，混合物中の含硫黄物質は大吸収を示す物質であった（ Fig. 4A )．これらの物理化

モリブデン酸化により，スルフィニル体，スルフォニル

学 的 性 状 を 天 然 物 デ ー タ ベ ー ス Dictionary of Natural体あるいは両方の酸化体としてオリジナルのピーク付近

Products で検索した結果，キタセタリン（Aroonsri et al.,に検出されることが明らかになり，混合物中における含2012 )と良く一致した．キタセタリンは，2012 年に放線

硫黄物質の同定が可能であることが示唆され，本探索系

菌 Kitasatospora setae NBRC 14216 T 株 か ら 単 離 さ れ た

Fig. 4

LC/MS chromatograms of kitasetaline-containing broth for the control (non-oxidized)(A) and Mo-catalyzed samples (B). The physicochemical properties of kitasetaline arealso shown. Mass-to-charge ratios (m/z) are indicated as [M + H]+.

－ 106 －

モリブデン酸化および質量分析を組み合わせた含硫黄物質探索系の構築と新規含硫黄物質の取得

トグラフィーにより精製し FKI-7382A および B 物質そβ-カルボリン物質である（ Fig. 4 )．各種物理化学的性状と生産菌が一致していることから，本物質をキタセタリ

れぞれを 15.4 mg，6.3 mg 取得した．NMR 解析の結果，ンと同定した．キタセタリンは，構造内に N-アセチルシ

FKI-7382A および B 物質は互いに立体異性体の関係にステインを有しており，モリブデン酸化によってスルフィあることが分かり，Fig. 5A および B に示す N-アセチルドがスルフォンへと酸化され，7.48 min の m/z＝434.1018

システインを部分構造に有する新規含硫黄物質であるこを示すピークとして出現したと考えられる（ Fig. 4B )．

とが明らかとった．生産菌の種名および部分構造からチ以上のように，微生物培養液中の含硫黄物質の同定に成

オポリジオール A および B と命名した．

功し，MoS-screening が含硫黄物質の探索に有効である

チオポリジオール A および B は，1,2 -ジオール部位おことが示された．そこで，MoS-screening による微生物

よび N-アセチルシステイン部位にキラル中心を有する培養液からの新規含硫黄物質の探索を行なった結果，ため，立体構造の検討を行った．1,2 -ジオール部位の相Trichoderma polypori FKI-7382 株から N-アセチルシステ
イ ン を 部 分 構 造 に 有 す る チ オ ポ リ ジ オ ー ル 類，

チオポリジオール A のアルファ-メトキシ-アルファ-（トLeptobacillium leptobactrum FKI-7961 株よりシスタチオ
ニンを部分構造に有するレプトチオニンを取得した．

対立体構造は，Freire et al.（ 2007 )らの報告を参考に，
リフルオロメチル)フェニル酢酸（ MPA )ジエステルを調製し，25 ℃およびマイナス 30 ℃の 1H-NMR ケミカ
ルシフトの差（ Fig. 6 )から Fig. 7 のように決定した．

チオポリジオール A および B

また，チオポリジオール A をラネーニッケルにより脱Trichoderma polypori FKI-7382 株が F36SBM-AS 培地で生産する FKI-7382A および B 物質は，それぞれ UV+（ C18H29NO5S )極大吸収 233 nm，m/z＝372.1835[M + H]

硫し，加水分解により生じたアラニンに FDLA を修飾後，

お よ び UV 極 大 吸 収 232 nm，m/z＝372.1837[M + H]+

念ながら，取得量が少なかったためチオポリジオール B（ C18H29NO5S )の物性を示し，UV スペクトルが似ていの立体構造を決定することができなかった．

ることから，FKI-7382A および B 物質は類縁体の関係に

チオポリジオール A および B の抗菌活性，細胞毒性，あると推定された．DNP 検索の結果，これら物性と一抗マラリア活性を評価した結果，チオポリジオール B

致する既知物質はなく，新規含硫黄物質と推定された．

が Candida albicans に対して抗菌活性を示した．6 mm

そこで，FKI-7382 株を大量培養後，各種カラムクロマ

ペーパーディスクを用い，30 μg のチオポリジオール B

Fig. 5

Fig. 6

改良マーフィー法を適用することにより N-アセチルシ
ステイン部分の絶対構造を Fig. 7 のように決定した．残1D and 2D NMR correlations of (A) thioporidiol A and (B) thioporidiol B∆δT1T2 values (ppm, -30 and 25 ℃) obtained forbis-(R)-MPA ester of thioporidiol A

Fig. 7－ 107 －The stereochemistry of thioporidiol A

松尾

洋孝，中島

を用いたとき，8 mm の阻止円を形成した．

琢自

2 -アミノ酪酸の立体構造を決定した．その結果，レプト

糸状菌由来の二次代謝産物で，N-アセチルシステイン

チオニン由来の各アミノ酸は L -アラニンおよび L -2 -アを部分構造に有する物質の報告は，DNP で調べた限り，

ミノ酪酸であることが明らかとなったため（ Fig. 9 )，存在しない．放線菌では，N-アセチルシステインを部分

レプトチオニンの絶対構造を Fig. 10 のように決定した．

構造に有する物質の報告は比較的多く，ナナオマイシン

レプトチオニンの抗菌活性，細胞毒性，抗マラリア活

H のように，マイコチオールの一部として存在している性 を 評 価 し た 結 果，6 種 の 癌 細 胞，HL-60，THP-1，（ Nakashima et al., 2017 )．マイコチオールは，多くのアHeLa S3，A549，Panc1，HT-29，H1299 に対し，それクチノバクテリアが生産していることが知られており，

ぞれ IC 50 18.1±5.3 ，4.1±0.4 ，33.0±4.8 ，76.7±8.5 ，酸化ストレスに対する耐性に関与していると考えられて52.6±5.3，71.1±8.2，87.7±6.9 μM で毒性を示した．

いる（ Newton et al., 1995 )．糸状菌でも，N-アセチルシ

シスタチオニンは，メチオニンからシステインが合成

ステインによるそのような作用を有することが考えられされる際の中間体として知られている．これまでに，シるが，その由来や役割などはまだ分かっておらず，今後

スタチオニンを含む天然物の報告は 1974 年に報告されの解明が期待される．

たエゾマイシン類のみである（ Sakata et al., 1974 )．したがって，シスタチオニンを含む天然物の発見は，実にレプトチオニン

35 年振りとなった．このように，MoS-screening によLeptobacillium leptobactrum FKI-7961 株が F36SBM-AS
培 地 で 生 産 す る FKI-7961A 物 質 は，UV 極 大 吸 収 207,
248, 288 nm，m/z＝513.1313[M + H]+（ C25H24N2O8S）のり発見されたチオポリジオールやレプトチオニンは，非物性を示し，DNP 検索の結果，これら物性と一致する

常にユニークな新規含硫黄物質であった．新規探索系の開発は，まだ見ぬ新規（新奇)物質の発見へと導いてくれるに違いない．

既知物質はなく，新規含硫黄物質と推定された．そこで，

要

FKI-7961 株を大量培養後，各種カラムクロマトグラ
フィーにより精製し FKI-7961A 物質を 6.3 mg 取得した．

約

NMR 解析の結果，Fig. 8 に示すシスタチオニンを部分構造内に硫黄を含む天然物は，時にペニシリンのよう構造に有する新規含硫黄物質であることが明らかとなな強力な抗菌活性などを示すため，しばしば医薬品，農り，生産菌の属名および部分構造からレプトチオニンと薬，試薬などに利用される．医薬品データベースである

命名した．

KEGG MEDICUS によると，低分子医薬品の 25 %は硫黄

レプトチオニンは，シスタチオニン部位に 2 つのキラを含んでいる．したがって，硫黄は重要な医薬品の構成

ル中心を有するため，絶対立体構造の検討を行った．レ元素である．そこで我々は，モリブデン酸化と LC/MS

プトチオニンを加水分解後，生じたシスタチオニンをラを組み合わせることにより，含硫黄物質の探索系を構築

ネーニッケルにより脱硫し，アラニンと 2 -アミノ酪酸のした（ MoS-screening )．本報告では，その構築した方混合物を得た．次に，混合物を FDLA で修飾し，D，L -法と Trichoderma polypori FKI-7382 および Leptobacillium

アラニンと D，L -2 -アミノ酪酸もそれぞれ FDLA 修飾し，leptobactrum FKI-7961 株より得られた 2 つの新規含硫黄
物質について報告した．

改良マーフィー法にてレプトチオニン由来のアラニンとFig. 8

1D and 2D NMR correlations of leptothionine－ 108 －

モリブデン酸化および質量分析を組み合わせた含硫黄物質探索系の構築と新規含硫黄物質の取得

Fig. 9 LC/MS analyses of amino acids derived from 1 and standard preparation by advanced Marfey's method

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) Matsuo, H., Hanamure, Y., Miyano, R., Takahashi, Y.,Ōmura, S. & Nakashima, T. 2020. The search for novel
sulfur compounds using molybdenum-catalyzed oxidation
with liquid chromatography-mass spectrometr y. 3rd
International Conference on Natural Products Discovery &Development in the Genomic Era, 12–16 Jan, San Diego,
CA, USA.
Fig. 10

Absolute structure of leptothionine

原著論文
1) Matsuo, H., Hanamure, Y., Miyano, R., Takahashi, Y.,Ōmura, S. & Nakashima, T. 2020. Screening for sulfur
compounds by molybdenum-catalyzed oxidation combinedwith liquid chromatography-mass spectrometry. Molecules
25: 240.

－ 109 －

松尾

洋孝，中島

2) Matsuo, H., Noguchi, Y., Miyano, R., Higo, M., Nonaka, K.,
Sunazuka, T., Takahashi, Y., Ōmura, S. & Nakashima, T.
2020. Thioporidiols A and B: two new sulfur compounds
discovered by molybdenum-catalyzed oxidation screening
from Trichoderma polypori FKI-7382. Antibiotics 9: 236.

謝辞

本研究は，公益財団法人発酵研究所の 2014 年度寄付講座助成により支援されたもので，この場を借りて感謝致します．NMR および MS を測定してくださいました
北里大学薬学部の佐藤倫子氏，長井賢一郎博士，モリブ
デン酸化についてご教授頂きました北里大学北里生命科学研究所の廣瀬友靖博士に深く感謝致します．また，本研究は当寄付講座に在籍した学生，北里生命研大村創薬
グループの皆さんのご協力があったからこそ成し遂げられたもので，ここに感謝致します．

文

献Aroonsri, A., Kitani, S., Ikeda, H. & Nihira, T. 2012. Kitasetaline, anovel β-carboline alkaloid from Kitasatospora setae NBRC
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－ 110 －

IFO Res.Commun. 34
111-120, 2020

エルゴステロール修飾シリカ（ES シリカ）を用いた新規物質の探索
松尾

洋孝，中島

琢自

北里大学北里生命科学研究所創薬資源微生物学寄付講座〒108-8641

東京都港区白金5-9-1

The search for new compounds using ergosterol modified silica (ES silica)
Hirotaka Matsuo & Takuji Nakashima
Laboratory of Microbiology for Drug Discovery,
Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University
5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo, 108-8641, Japan
Ergosterol is an essential component for fungal growth because it is included in fungal cell membranes andcontrols membrane fluidity. Antifungal drugs that target ergosterol, such as amphotericin B (a polyenecompound), have been widely used to treat serious systemic fungal infections. Amphotericin B has been usedclinically for more than five decades due to its potent fungicidal activity and relatively few examples of drug
resistance. However, there are problems of medication methods by the drug's poor aqueous solubility. New
antifungal drugs that improved physico-chemical properties and binding with ergosterol could give effective
antifungal therapy more safety. Based on this concept, we developed silica-binding ergosterol (ES silica) resin andsearched for natural products interacting with ergosterol from 859 actinomycete culture broths. The physicochemical investigation in ES silica screening resulted in 94 known and 24 new compounds. It is suggested that not
only polyene compounds but also various ones interact with ES silica. Heterocyclic compounds with nitrogenatoms such as piperazine and nucleic acid compounds were detected in multiple strains. Approximately 80 % of
known compounds was microbial alkaloids. Dipyrimicins and Dietziamide C, new compounds interacted with ES
silica, were discovered from culture extracts of Amycolatopsis sp. K16 -0194 and Streptomyces sp. K16 -0477,
respectively. Dipyrimicins possess a 2,2′-dipyridine core skeleton. Dipyrimicin A, which is no interaction with ES
silica, and B have the structural different in carboxyl and amide groups. The amide group in dipyrimicin B could
be the primar y factor involved in the interaction with ES silica. Dietziamide C has a unique structure thatpossesses a N,N,N -trimethylpropan-1-aminium at the center of tetramic acid dimer.
Key words: Ergosterol, ES silica, new compounds, actinomycetes緒

言剤アンホテリシン B（ AMPH-B)が臨床で使用され，真菌症の治療が可能となった（Gold et al., 1955-1956; Stiller

真菌症は水虫に代表される表在性真菌症，皮膚の深部，
皮下組織に感染する深部真菌症と体の深部に感染する深et al., 1955-1956; Tilley, 1962 )．Streptomyces nodosus が生産する AMPH-B は，分子内にヘプタエンが存在し，こ在性真菌症に分けられる．特に，深在性真菌症は内臓真の疎水領域が病原真菌の細胞膜の成分であるエルゴステ菌症といわれるように脳，肺，肝臓，腎臓などの臓器にロールと結合して細胞膜の透過性を高める．その結果，感染し，診断が遅れた場合には重篤になる感染症である

細胞質成分の漏出を生じさせ，抗真菌作用を発揮する（山口，2010a )．

(Abu-Salah, 1996)．エルゴステロールは真菌細胞膜に普

深在性真菌症の治療薬は 1962 年にポリエン系抗真菌

遍的に存在するので，AMPH-B はほぼすべての病原真菌に対して殺菌的に作用する(Kitajima, 2000)．

E-mail: matsu-h@lisci.kitasato-u.ac.jp, takuji@lisci.kitasato-u.ac.jp
共同研究者:高坂尚平（富士シリシア化学㈱)，松本厚子（北里大学北里生命科学研究所)

近年，アゾール系やキャンディン系などの AMPH-Bに代わる抗真菌剤が開発され臨床で用いられている．これら抗真菌剤は，AMPH-B に比べ狭域な抗真菌スペク－ 111 －

松尾

洋孝，中島

琢自

トルであり，細胞に取り込まれて真菌の重要な代謝系をルゴステロールをシリカゲルに修飾した樹脂（ ES シリカ)

阻害することにより抗真菌活性を発揮する．そのため，を作製し，ES シリカに結合する化合物を探索した．

静菌的または代謝活性の高い細胞に対してのみ殺菌的効

実験材料と実験方法

果を示す．一方，薬剤排出ポンプ（ Bennett, 2004 )などによる薬剤耐性菌の出現が問題視されている（ Niimi

ES シリカの作製& Niimi, 2009; 山口, 2010b )．
AMPH-B は真菌の細胞膜に直接作用することで殺菌作

シリカゲルの表面の水酸基（シラノール)にエルゴス用を示すため，耐性菌が生じにくい．一方，コレステロール

テロールを結合させた ES シリカを富士シリシア化学㈱との選択性は完全なものではなく，投与時の発熱や悪寒，との共同研究で作製した．

低カリウム血症や腎機能障害などの重篤な副作用を有する

シリカゲルにシランカップリング剤（ 3 -メルカプトプ（ Yamagishi & Mikamo, 2010)．さらに，水やエタノールに

ロピルトリメトキシシラン)で処理してチオール修飾し，溶解しないため，経口投与ではほとんど吸収されない．エル

修飾したチオール基にエルゴステロールを反応させて固ゴステロールに結合し，適した物性を示す化合物を見いだ

定化し，ES シリカを作製した．500 mL のセパラブルフラ

すことができれば，新たな抗真菌剤を開発が期待できる．

スコに 20 g のシリカゲル（ Chromatorex MB100-75/200，

近年，二次代謝産物等の低分子化合物を極微量で網羅

富士シリシア化学)を入れ，トルエン 300 mL を加え，的に解析する技術が飛躍的に進歩し，多くの化合物を検スラリーを撹拌しながら 3 -メルカプトプロピルトリメ

出できるようになった．培養液抽出物に含まれている化

トキシシラン 5.9 g を加えて窒素雰囲気還流条件下で合物の UV 吸収スペクトル，分子量，分子組成，極性な80 ℃で 8 時間反応させた．冷却後，生成物をトルエンおど物理化学的性状を収集し，外部の天然物データベース

よびメタノールで洗浄した．さらに 80 ℃で 12 時間乾燥

（ Dictionary of Natural Products など)で検索することさせ，チオール基を表面に有するシリカゲル（チオールにより，ある放線菌の代謝産物の中に新規物質が含まれシリカ)を 21.5 g 得た．次に，チオールシリカ 20 g をているかどうか予測できるようになった．この方法を500 mL のセパラブルフラスコに入れ，1,4 -ジオキサン

physicochemical(PC)screening（ Nakashima et al.,

300 mL を加え，スラリーを撹拌しながら，エルゴステ

2017; Takahashi & Nakashima, 2018 )と称し，微生物代ロールを 4.0 g 加えて完全に溶解させた後，ラジカル開謝産物からの新規物質を探索した．PC screening の一つ

始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを 80 mg 加え，として，シリカゲルに生体低分子成分を修飾した樹脂を窒素雰囲気還流条件下で 85 ℃で 14 時間反応させた．冷作製し，放線菌培養液からその生体成分と相互作用を示

却後，スラリーをろ過し，トルエン，テトラヒドロフラ

す化合物を抽出し，PC screening で新規と推定した化合ンおよびメタノールで洗浄した．脱液し，80 ℃で 12 時

物を単離・構造決定する方法を考案した．本 研究では，間乾燥させてエルゴステロール修飾シリカゲル(ES シ

真菌の細胞膜構成因子で，AMPH-B の標的分子であるエリカ)を 20.7 g 得た（ Fig. 1A )．

Fig. 1Illustration of ES silica and screening flow.

－ 112 －

エルゴステロール修飾シリカ（ ES シリカ）を用いた新規物質の探索

放線菌培養液抽出物
スクリーニング源は，北里生命科学研究所 微生物機能

ZnSO4 ·7H 2O, 0.1 % CuSO 4 ·5H 2O, 0.1 % CoCl 2 ·6H 2O),
pH 7.0 を用いた．

研究室で作製された放線菌培養液抽出物を使用した．放線菌用生産培地は 30 培地:2.4 % starch, 1.0 % glucose,

LC/UV および LC/MS 測定条件

0.5 % yeast extract, 0.3 % meat extract, 0.3 % peptone,

高速液体クロマトグラフィー（ LC/UV )は ELITE

0.4 % CaCO3 , 5 mL/L trace metals solution(0.1 %LaChrome（日立ハイテクサイエンス)を使用した．LC/MS

0.1 % CuSO4 ·5H2O, 0.1 % CoCl2 ·6H2O), pH 7.0 を用いた．

質量分析装置に QSTAR Elite Hybrid LC/MS/MS System

FeSO 4 · 7H 2O, 0.1 % MnCl 2 ·4H 2O, 0.1 % ZnSO 4 ·7H 2O,は LC に Agilent 1200 series（アジレントテクノロジー)，

AMPH-B 生産のため，No. 51 培地:0.5 % glucose, 0.5 %（エービー・サイエックス)および LC に ExionLC TM（エーcorn steep powder, 1.0 % oatmeal, 1.0 % pharmamedia,

ビー・サイエックス)，質量分析装置は TripleTOF ® 5600 +0.5 % K 2 HPO4 , 0.4 % MgSO4 ·7H2O, 1 mL/L trace metals

System システム（エービー・サイエックス)を用いた．LC/

solution(0.1 % FeSO4 ·7H2O, 0.1 % MnCl2 ·4H2O, 0.1 %Table 1

Table 2MS の測定条件はそれぞれ Table 1 および 2 に記載した．

LC/MS condition in QSTAR

LC/MS condition in TripleTOF5600+ system－ 113 －

松尾

洋孝，中島

琢自

ES シリカスクリーニング
スクリーニングの流れを Fig. 1B に示す．放線菌培養
液抽出物 1 mL を水で平衡化した ES シリカ 300 mg に供した．4 mL の水で洗浄の後，4 mL のメタノールで溶出した．このメタノール溶出画分を 4 倍濃縮して ES シリ
カ処理サンプルを取得した．このサンプルを LC/UV-MS
で解析し，ES シリカと相互作用を示す化合物の物理化
学的性状(UV 吸収スペクトル，分子量，分子組成，極性など)を収集した．各 ES シリカ処理サンプルの LC/
UV-MS データを解析し，得られた情報をもとに天然物
デ ー タ ベ ー ス（ Dictionary of Natural Products, DNP )およびインハウスデータベースで検索し，既知物質の同定および新規物質を探索した．新規と推定された化合物
は精製し，構造解析を行った．
生物活性評価
抗菌活性試験は，ペーパーディスク法で測定した．真菌として Candida albicans ATCC 64548，Saccharomyces
cerevisiae ATCC 9763 ，Aspergillus niger ATCC 6275 ，
Mucor racemosus IFO 4581，グラム陽性菌としてとしてKocuria rhizophila ATCC 9341 ，Bacillus subtilis ATCC
6633，グラム陰性菌としてとして Escherichia coli NIHJ，
Xanthomonas campestris pv. oryzae KB 88 を検定菌とした．
細胞毒性試験は，Cell Counting Kit-8（同仁化学)を用いて行った．ヒト子宮頸部類上皮癌細胞 HeLa S3 ，
ヒト結腸腺癌細胞 HT29，ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞
A549，ヒト肺腺癌細胞 H1299，ヒト膵臓腺癌 PANC-1，
ヒト急性単球性白血病細胞 THP-1，ヒト T 細胞性白血病
細胞 Jurkat，ヒト前骨髄性白血病細胞 HL-60 を用いた．

結果および考察ES シリカスクリーニング系の確立

Fig. 2

AMPH-B 生産菌 Streptomyces sp. K04-0037 株培養液抽出物を用いて，結合・溶出試験を行った．ES シリカ
100 mg に K04-0037 株培養液抽出物 1 mL をチャージし，
4 mL の水で洗浄後，4 mL のメタノールで溶出した．さらに，4 mL の 1 mM エルゴステロール含有メタノール
溶液で溶出させた．ES シリカ通過画分，水洗浄画分，メタノール溶出画分およびエルゴステロール含有メタノ ー ル 溶 出 画 分 を LC/UV で 分 析 し た． そ の 結 果 をFig. 2 に示す．樹脂量に対しチャージしたサンプル量がLC/UV analysis of fractions treated with ES silica
using culture extract including AMPH-B
Fifty percent EtOH extract (A) of Streptomyces sp.
K04-0037 strain, AMPH-B producer, was subjected
on ES silica. And then pass (B), washing with water(C), eluting with MeOH (D), and eluting with MeOH
with 1 mM ergosterol fractions (E) were analyzed by
LC/UV. LC conditions are as follows: Inetsil ODS-4(3×250 mm); 5 % → 100 % MeOH in 0.1 % formic
acid (0 → 30 min); 100 % MeOH in 0.1 % formic acid
(30 → 35 min); detection, 254 nm.

過剰だったため，ES シリカ通過画分に AMPH-B のピー
クが確認された．水洗浄画分には AMPH-B のピークが確認されず，メタノール溶出画分に AMPH-B のピークが確認された．また，1 mM エルゴステロールメタノー

ことから，放線菌培養液に含まれている AMPH-B は ES

ルで溶出した画分にはわずかに AMPH-B が検出されたシリカに結合し，メタノールで溶出することがわかった．

－ 114 －

エルゴステロール修飾シリカ（ ES シリカ）を用いた新規物質の探索

ES シリカスクリーニング

ES シリカはチオールシリカにエルゴステロールを修飾

放線菌培養液抽出物 859 サンプルを ES シリカで処理させ，作製している．シリカに修飾したエルゴステロー

し，ES シリカ処理サンプルを LC/UV-MS で解析した．

ル量はシリカ 1 g あたり約 50 μmol であり，シリカ表面は化合物の物理化学的性状のデータをもとにデータベース

チオール基が残存した状態である．検出された多くの微で検索した結果，104 株から 94 化合物(重複を含めると生物アルカロイドは，この残存したチオール基と相互作

167 化合物)を既知物質と同定した．もっとも多く 11 株

用を示している可能性があり，今後の検討が必要である．

の放線菌から生産が確認できたピロリジン含有ペプチド化合物タンブロマイシン類の同定について例を示す．放ES シリカスクリーニングによる新規物質の探索

線菌 K18-0349 株の培養液抽出物および ES シリカ処理

ES シリカを用いたスクリーニングの結果，29 化合物

サンプルの LC/UV クロマトグラムを Fig. 3A および 3B

が新規物質と推定された．そのうち，新規性や生産性のに示す．ES シリカ処理することで，溶出時間 7.7 分，8.1

再現などを考慮し，Amycolatopsis sp. K16-0194 株（ Izuta

分および 8.4 分に 3 本のピークが観察された．これら 3

et al., 2018 )および Streptomyces sp. K16-0477 株が生産する推定新規物質の単離・精製を行った．

化合物は UV スペクトルが類似していることから類縁体であることが示唆された(Fig. 3B)．溶出時間 7.7 分はNa 付加体である m/z 558.1726 が観察され，親イオンを+
m/z 536.1931[M + H]と決定した(Fig. 3C)．溶出時間 8.1

Amycolatopsis sp. K16-0194 の培養液抽出物には溶出時
間 19.2 分および 20.1 分にピークが観察されたが，ES シ
リカで処理すると溶出時間 19.2 分のピークは消失し，分および 8.4 分の化合物も同様に親イオンをそれぞれ++
m/z 796.3394[M + H]および m/z 435.1499[M + H]と決溶出時間 20.1 分のピークが観察された（ Fig. 4A )．2 つ

定した．DNP で MS 値を 535.18 ～ 535.20 および UV 極し（ Fig. 4B )，類縁物質と推定された．溶出時間 19.2 分

大吸収を 280 nm ～ 320 nm の範囲で検索した結果，ジャの化合物（ジピリマイシン A と命名)は，m/z 247.0714++[M + H](C12H10N2O4 )を示した．一方，溶出時間 20.1

ドマイシン DNV（ C29H29NO9 , Dupuis et al., 2011 )とタ

ンブロマイシン A（ C24H30ClN5O7 , Izumikawa et al., 2015;

Goering et al., 2016 )の 2 件がヒットした．溶出時間 7.7+分の化合物の同位体ピーク[M + H]+ 2（ m/z 538 )は親のピークは共に UV 極大吸収 240 nm および 320 nm を示

分の化合物（ジピリマイシン B と命名)は，m/z 246.0771[M + H](C12H11N3O3 )を示した．
++

イオン（ m/z 536 )の約 30 %の高さのであることから，

Amycolatopsis sp. K16-0194 を 6 L の 30 培地で 9 日間培
養し，培養上清と菌体に濾別した．その菌体をメタノー

1 分子の塩素を含んでいることがわかる．よって，溶出ルで抽出し，その抽出物をダイヤイオン HP-20 および

時間 7.7 分の化合物は，塩素を含んでいるタンブロマイ

ODS クロマトグラフィーで処理し，類縁体ジピリマイ

シン A と推定した．最終的に，2 つの MS/MS フラグメ

シン A を 86.7 mg 精製した．ジピリマイシン B は，培養

ントイオン（ m/z 263 および m/z 417 )が一致し，既知

上清を酢酸エチルで抽出し，その抽出物を ES シリカで物質タンブロマイシン A と同定した（ Fig. 3D )．溶出時処理し，目的物ジピリマイシン B を 16.6 mg 精製した．

間 8.1 分および 8.4 分の化合物についても同様に検索しその精製フローを Fig. 5 に示す．

た結果，溶出時間 8.1 分および 8.4 分の化合物は，それジピリマイシン A および B の物理化学的性状を Table 3

ぞれタンブロマイシン C および B（ Fig. 3E, Goering etに示す．HRESI-MS スペクトルによりジピリマイシン Aal., 2016 )と同定した．
既 知 物 質 を 同 定 し た 結 果， ポ リ エ ン 系 化 合 物 は，は 分 子 量 246， 分 子 式 C12H10N2O4 （ 測 定 値:m/z

AMPH-B，ストレベルテン A やフィリピンⅢなど 11 化

分子量 245，分子式 C12H11N3O3 （測定値:m/z 246.0884，+

247.0714，理論値:m/z 247.0719 )，ピリマイシン B は+合物が検出された．ポリエン系化合物以外にも様々な構

理論値:m/z 246.0879 )と推定した．ジピリマイシン A造を有する化合物が同定できた．部分構造にヒドロキシおよび B は，水，メタノールおよびエタノールに可溶

サム酸を有する化合物トリコスタチン類は複数の株の代であった．IR スペクトルではジピリマイシン A および

謝産物から検出された．ピペラジン構造を有するマレマ

B に存在するカルボン酸およびアミドのカルボニル炭素

イシン類やグリセオルテイン酸など，核酸系化合物サンと酸素の二重結合由来の 1670 cm-1 のピークとカルボン

ギバマイシン類やシネファンギンなど窒素を含む複素環

酸およびアミドの酸素および窒素と水素の結合由来の式化合物が多く検出され，既知物質 94 化合物のうち，3300 cm-1 付近のピークが観察された．また，融点では75 化合物が微生物アルカロイドだった．

ジピリマイシン A は 112 ℃，ジピリマイシン B は 84 ℃

ES シリカで処理したメタノール溶出液に多くのポリ（ decomp.）を示した．

エン系化合物が検出されることから，ES シリカのエル

ジピリマイシン A および B の NMR 解析の結果，構造ゴステロール分子を認識していることがわかった．一方，

内にピリジンが 2 つ結合したジピリジン骨格をコア構造－ 115 －

松尾

Fig. 3

洋孝，中島琢自Identification process of known compounds in ES silica screening.
A, HPLC charts of culture extract of Streptomyces sp. K04-0037 (top) and MeOH eluate treated with ES silica (bottom);
B, UV spectra of compounds eluted at 7.7 min (top), 8.1 min (middle) and 8.4 min (bottom); C, MS spectrum ofcompound 7.7 min; D, MS/MS spectrum of compound 7.7 min; E, Structures of tambromycin B (top) and C (bottom).
LC conditions are as follows: Capcell Core C18 (2.1φ x 100 mm); 5 % MeOH in 0.1 % formic acid (0 → 2 min); 5 %→ 100 % MeOH in 0.1 % formic acid (2 → 12 min); 100 % MeOH in 0.1 % formic acid (12 → 14 min); detection, 254 nm.

－ 116 －

エルゴステロール修飾シリカ（ ES シリカ）を用いた新規物質の探索

Fig. 4

Analysis of Amycolatopsis sp. K16-0194 metabolites.
A, HPLC chart of culture extract of Amycolatopsis sp. K16-0194 () and MeOH eluate treated with ES silica(); B, UV spectra of compounds eluted at 19.2 min (, dypyrimicin A) and 20.1 min (, dypyrimicin B).
LC conditions are as follows: Inetsil ODS - 4 (3×250 mm); 5 % → 100 % MeOH in 0.1 % formic acid
(0 → 30 min); 100 % MeOH in 0.1 % formic acid (30 → 35 min); detection, 400 nm.

Fig. 5

Purification of dipyrimicin A and B.

－ 117 －

松尾
Table 3洋孝，中島

琢自Physical and chemical data of dipyrimicin A and B.

に有していた（ Fig. 6 )．側鎖に違いがあり，ジピリマ
イシン A はカルボン酸，ジピリマイシン B はアミドを有していた．ジピリマイシン B をチオールシリカ（ ES
シリカ作製の際にエルゴステロールを固定化する前のシリカ)に供すると水洗浄画分に検出され，吸着しなかったことから，ジピリマイシン B はエルゴステロールに結合していることが示唆された．
Fig. 6Structures of dipyrimicin A and B isolated from a culture
broth of Amycolatopsis sp. K16-0194.
Bold line, 1H-1H COSY; arrows, 1H-13C HMBC.

Table 4

ジピリマイシン A および B の抗菌活性および細胞毒性を測定した．その結果を Table 4 に示す．ジピリマイ

Biological activities of dipyrimicin A and B.

－ 118 －

エルゴステロール修飾シリカ（ ES シリカ）を用いた新規物質の探索

要約

真菌の膜成分であるエルゴステロールは膜の流動性に関わり，生命維持に必須な膜成分である．ポリエン系抗真菌剤アンホテリシン B は強力な抗真菌活性を示し，薬剤への耐性化が起こりにくいため，深在性真菌症の治療薬として 50 年以上使用されている．しかし，アンホFig. 7

テリシン B は水に対する溶解性が悪く，薬剤投与方法

Structure of dietziamide Cなど様々な問題がある．アンホテリシン B の標的であるエルゴステロールと結合する化合物は，新たな抗真菌剤として期待できる．

シン A は A. niger ATCC 6275 以外の真菌に対して，抗菌・

このコンセプトをもとに，シリカゲルにエルゴステ

抗真菌活性を示し，動物細胞株に対して 10 μM 以下でロールを修飾させた樹脂（ ES シリカ)を作製した．放IC50 値を示した．一方，ジピリマイシン B は，E. coli

線菌培養液抽出物から ES シリカと結合する化合物を探

NIHJ に対して弱い抗菌活性を示し，動物細胞株に対し索し，放線菌培養液抽出物 859 サンプルから既知物質てジピリマイシン A より弱かった．ただし，H1299 細胞

94 化合物を同定し，推定新規物質 29 化合物を見出した．
既知物質は，ポリエン化合物だけでなく，様々な化合に対して同等以上の細胞増殖抑制活性を示した．
Streptomyces sp. K16-0477 の培養液抽出物に UV 極大
吸収 270 nm および HRESI-MS より m/z 334.1751 を示し，

物が ES シリカに結合することがわかった．また，ピペ

分子組成 C17H23N3O4 と推定した化合物が含まれていた．

合物が多く検出された．既知物質 94 化合物のうち 75 化

本物質は，テトラミン酸の 2 量体で 5 位にプロパ - 1- エ

ラジン化合物や核酸系化合物など窒素を含む複素環式化合物が微生物アルカロイドだった．

ンが結合し，N,N,N-トリメチルエチルアミニウムがテES シリカと結合する新規物質は，Amycolatopsis sp.

トラミン酸 2 量体の中心に結合した構造であった

K16-0194 が生産するジピリマイシン B と Streptomyces（ Fig. 7A )．テトラミン酸のダイマー化合物は，希少放sp. K16-0477 が生産するジエトジアミド C が得られた．

線菌 Dietzia timorensis MZ-3 株から発見されたジエトジ

ジピリマイシン B はコア骨格にジピリジン構造を有す

アミド A およびＢの報告（ Hoshino et al., 2015 )があり，る化合物であった．ES シリカ非結合物質である類縁体

本物質をジエトジアミド C と命名した（未報告)．ジエ

ジピリマイシン A は側鎖にカルボン酸，ジピリマイシ

トジアミド C は抗菌活性および細胞増殖抑制活性は示

ン B は側鎖にアミド基が結合した構造的違いがあった

さなかった．

（ Fig. 6 )．このことから，ES シリカに結合するためには，

AMPH-B は真菌細胞膜成分エルゴステロールと結合アミドが重要であることが示唆された．ジエトジアミド

し，イオンチャネルを形成することで膜障害を引き起こ

C は N,N,N-トリメチルエチルアミニウムがテトラミン

し，殺菌作用を示す（Borowski & Cybulska, 1967 )．一方，

酸 2 量体の中心に結合したユニークな構造であった．

Gray et al.,（ 2012 )は AMPH-B の水酸基をクロスカッ

本助成で得られた研究成果の報告プリングで欠如させた誘導体を作製し，酵母に対する抗真菌活性を評価した．水酸基をはずした誘導体は，酵母からカリウムイオンの流出は認められなかったが，抗真菌活性を示した．この結果は，AMPH-B は生理的に重要なエルゴステロールに結合することによって抗真菌活性を発揮することを示唆している．チャネル形成は
AMPH-B の抗真菌活性に必須ではなく，膜透過性を亢進させ，薬剤の感受性を相補的に向上させている．
しかし，ジピリマイシン B やジエトジアミド C は ES
シリカに結合するが，抗真菌活性は示さなかった．ジピ
リマイシン B やジエトジアミド C は AMPH-B と比較して分子量が小さい．ゆえに，エルゴステロールと結合してもその生理的な機能は失わず，生育できるのかもしれ
ない．

口頭発表
1) 伊豆田祥子, 宮野怜, 松本厚子, 三浦宏美, 野中健一, 高橋洋子, 大村智, 中島琢自. 2017. エルゴステロール樹脂を用いた新規物質の探索. 日本放線菌学会第32回大会 9月7-8日.
長野2) 伊豆田祥子, 高坂尚平, 河合真ら. 2018. エルゴステロール
樹脂を用いた新規物質の探索. 日本農芸化学会2018年度大会 3月15-18日. 名古屋
3) Nakashima, T. 2018. Search for new microbial metabolites
by physicochemical screening using new resin, ES-silica.
Microbial Natural Products: Discovery of Novel Compounds
and Biosynthetic Pathways. 27 November, Bangkok,
Thailand4) 伊豆田祥子, 宮野怜, 松本厚子, 高橋洋子, 大村智, 中島琢自.
エルゴステロール修飾シリカゲルの特徴と新規化合物の－ 119 －

松尾

洋孝，中島

探索. 日本放線菌学会第34回大会 9月23-24日. 札幌5) Izuta, S., Kosaka, S., Suda, M., Kanchanasin, P., Suzuki, Y.,
Miyano, R., Matsuo, H., Tanasupawat, S., Takahashi, Y.,
Omura, S. & Nakashima, T. 2020. Search for new compounds
from actinomycetes using ES silica. 3rd Natural ProductDiscover y and Development in the Genomic Era. 12－16
January, San Diego, USA
原著論文1) Izuta, S., Kosaka, S., Kawai, M., Miyano, R., Matsuo, H.,
Matsumoto, A., Nonaka, K., Takahashi, Y., Ōmura, S. &Nakashima, T. 2018. Dipyrimicin A and B, microbial
compounds isolated from Amycolatopsis sp. K16-0194. J.
Antibiot. 71: 535-537.
その他（特許)1) 大村智, 中島琢自, 高橋洋子, 河合真, 高坂尚平, 本田博文.
2016. エルゴステロール修飾担体, 抗真菌剤の候補物質のスクリーニング方法, 及び抗真菌剤の原料の精製方法. 特開2018-4603（富士シリシア化学株式会社, 学校法人北里研
究所)

謝

辞

本研究は，公益財団法人発酵研究所の 2014 年寄付講
座助成により支援されたもので，この場を借りて感謝致します．NMR および MS を測定してくださいました北里大学薬学部の佐藤倫子氏，長井賢一郎博士に深く感謝致します．また，本研究は当，富士シリシア化学㈱寄付講座に在籍した学生，北里生命研大村創薬グループの皆さんのご協力があったからこそ成し遂げられたもので，ここに感謝致します．

文

献Abu-Salah, K.M. 1996. Amphotericin B: an update. Br. J. Biomed.
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－ 120 －

IFO Res.Commun. 34
121-128, 2020

PC screening を活用した放線菌ゲノムからの新規物質探索および生合成研究
稲橋

佑起，中島

琢自

北里大学北里生命科学研究所創薬資源微生物学寄付講座〒108-8641 東京都港区白金5-9-1

Search for new compounds from actinomycete genome
using PC screening and their biosynthetic study
Yuki Inahashi, Takuji Nakashima
Laboratory of Microbiology for Drug Discovery,
Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University
5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo, 108-8641, Japan
Genome mining of actinomycetes has revealed several uncharacterized biosynthetic gene clusters with potential of
new secondary metabolites. It is known that actiomycetes harbor much more biosynthetic gene clusters than thecompounds they produce. We employed both physicochemical (PC) screening and genetic approach to discover
new compounds from actinomycetes and performed three experiments in this study. 1) we screened a uniquebiosynthetic gene, which was involved in aminovinylcysteine (AviCys) biosynthesis, from actinomycete strains in
the Kitasato Microbial Library using a PCR method. Then those actinomycetes were characterized their productionof new bioactive compounds by LC/MS analysis. As the results, two new AviCys compounds were discovered from"Streptomyces subflavus subsp. irumaensis" AM-3603 and Streptomyces nitrosporeus K93-0711. 2) positive pathwayspecific regulator genes were selected from the genome sequence of actinomycetes and overexpressed in thecorresponding hosts to achieve new metabolites. As the result, two new lipopeptides were discovered from
Streptomyces sp. KO-7888. 3) biosynthetic gene clusters of trehangelin, actinoallolide and pyrizomicin, which werediscovered by PC screening, were identified using heterologous expression. Furthermore, we revealed thebiosynthetic pathway from acetyl-CoA to angelyl-CoA in trehangelin biosynthesis.
Key words: aminovinylcystein, transcriptional regulator, biosynthesis, heterologous expression

緒

言

化合物の生合成遺伝子が明らかとなってきた．従来は生物活性を指標に新規物質の探索が行なわれていたが，放微生物は酵素反応により有機合成では合成困難な化合

線菌のゲノム情報から二次代謝産物の生合成遺伝子を探

物を効率よく生産する．特に放線菌の二次代謝産物は多索することで，新規物質や目的の構造を有する物質を効様性に富んだ構造を有し，アミノビニルシステインやビ率良く取得することが可能になってきている．

ニルアゾキシ等のユニークな構造の化合物が報告されて一方，放線菌のゲノムには，菌株によって 30 以上のおり，それらは癌や MRSA ，結核菌，線虫等に対して二次代謝産物生合成遺伝子クラスターを有することが明の活性が報告されている（ Sit et al., 2011 )．しかし，そらかとなっているが（ Nett et al., 2009 )，殆どの生合成の様な化合物の発見例はごく僅かであり，医薬品への応

遺伝子クラスターは休眠状態にある．放線菌の二次代謝用に至っていないものが殆どである．近年，遺伝子工学

産物生合成遺伝子の発現を活性化するレギュレーターとの急速な発展により放線菌のゲノム解析が進み，様々なして Streptomyces antibiotic regulator y protein（ SARP )や large ATP-binding regulators of the LuxR family（ LAL

E-mail: y-ina@lisci.kitasato-u.ac.jp, takuji @lisci.kitasato-u.ac.jp
共同研究者:葛山智久（東京大学大学院農学生命科学研究科)

family ) と い っ た タ ン パ ク 質 が 知 ら れ て お り（ Bibb,
2005 )，レギュレーター遺伝子を導入し，休眠状態の生－ 121 －

稲橋

佑起，中島

合成遺伝子クラスターを目覚めさせることで，スタンボ琢自ゲノムシークエンスからの生合成遺伝子クラスターの探索

マイシンなどの新規物質が発見されている（ Laureti et

ドラフトゲノムシークエンスを antiSMASH（ Medemaal., 2011 )．
本編では，放線菌ゲノムからの生合成遺伝子の探索（いet al., 2011 )で解析することで，二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの探索を行なった．antiSMASH でヒッ

わゆるゲノムマイニング)と PC screening を組み合わトしない遺伝子に関しては Local BLAST を用いて，相せることで新規物質の取得を試みた．具体的には，ユニー

同な生合成遺伝子を検索することで遺伝子クラスターのクな骨格であるアミノビニルシステイン系化合物の探索

探索を行なった．

およびレギュレーター遺伝子を利用した新規物質の探索について報告する．さらに，PC screening により得られ生合成関連遺伝子のクローニングおよび発現株作製
Table 1 のプライマーを用いて，Phusion High-Fidelity

た新規物質トレハンジェリン，アクチノアロライドおよびピリゾマイシンの生合成研究について報告する．

DNA polymerase（ニュー・イングランド・バイオラボ)
にて，熱変性:95 ℃ 10 秒，アニーリング:68 ℃ 30 秒，

実験方法

伸長:72 ℃ 1 分の反応を 35 サイクル行うことで各種生
合 成 関 連 遺 伝 子 を 増 幅 後， 放 線 菌 用 発 現 ベ ク タ ー

探索源

pOSV556（ Prof. Gregory. L. Challis, Warwick Univesity,

放線菌ゲノムからのアミノビニルシステイン系化合物

UK )あるいは大腸菌用発現ベクター pET15b（シグマの探索には，北里生命科学研究所微生物機能研究室より

アルドリッチ)にクローニングした．放線菌用ベクター提供された放線菌 768 株を使用した．レギュレーター遺に つ い て は， エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン に よ り E. coli

伝 子 発 現 に よ る 新 規 物 質 探 索 に は Streptomyces sp.

ET12567/pUZ8002 に導入後，接合伝達により放線菌宿KO-7888 株（フィトキサゾリン生産菌)を使用した．生主（Streptomyces albus J1074, S. coelicolor M1152 または S.

合成遺伝子クラスター解析には Polymorphospora rubra
K07-0510 株（トレハンジェリン生産菌)，Actinoallomuruslividans TK24 )へ導入することで遺伝子発現株を作製した．

fulvus K09-0307 株（アクチノアロライド生産菌)および Lechevalieria aerocolonigenes K10-0216 株（ マ ン グ ロ

生合成酵素の機能解析
生合成遺伝子をクローニングした pET15b を E. coli

マイシン，ピリゾマイシン生産菌)を使用した．

BL21(DE3)にエレクトロポレーションで導入後，LB 培
アミノビニルシステイン系化合物の探索

地で培養し，IPTG でタンパク質の発現誘導した．培養

アミノビニルシステイン（ AviCys)はアミノ基とチ液から菌体を回収し，超音波により菌体を破砕すること

オール基がビニレンを介して結合したユニークな構造をで，タンパク質を溶出させた．生産された His 6- 組換え有する化合物である．AviCys 系化合物を放線菌ゲノム

タンパク質を Ni カラムで精製後，各基質と反応させる

よ り PCR を 用 い て 探 索 す る た め に，Streptomyces sp.

ことでその機能解析を行った．

OH-4156 株が生産する AviCys 系化合物であるサイペマ
イシンの AviCys 合成酵素である CypD（Claesen & Bibb,

ゲノムのコスミドライブラリー作製および生合成遺伝子

2010a )およびそのオルソログである GrmD（ Claesen

クラスターの取得& Bibb, 2010b )の遺伝子塩基配列より AviCys 合成遺伝

生合成遺伝子クラスターのサイズが 30 kb 以上で PCR子の特異プライマーを設計した（ Table 1 )．放線菌 768による増幅が困難な場合は，放線菌ゲノムのコスミドラ

株 よ り， 菌 体 を Tris-EDTA buffer(10 mM Tris, 1 mM

イブラリーを以下の方法で作製し，生合成遺伝子クラス

EDTA, pH 8.0)に懸濁し超音波で 10 分間処理することでタ ー の 取 得 を 行 っ た． コ ス ミ ド ベ ク タ ー pOJ446

DNA を抽出し，Taq DNA polymerase（ニュー・イング（ Bierman et al., 1992 )の BamHI 消化物および放線菌ゲ

ランド・バイオラボ)を用いて，熱変性:95 ℃ 10 秒，

ノム DNA の MboI 部分消化物をライゲーションさせ，

アニーリング:52 ℃ 30 秒，伸長:68 ℃ 1 分を 35 サイ

LAMBDA INN（ニッポンジーン)を使用してパッケー

クル行うことで PCR を行い，目的の遺伝子を保有する

ジングを行った後，E. coli XL1 Blue MRF ' へ導入するこ菌株をスクリーニングした．ヒットした菌株についてはとでコスミドライブラリーを作製した．

サイペマイシンの前駆体ペプチドをコードする cypA

コスミドライブラリーからの生合成遺伝子クラスター（ Claesen & Bibb, 2010a )と相同な遺伝子の塩基配列をの探索は，遺伝子クラスターの左端，真中，右端をそれ解析することで，その構造を推定した．

ぞれ特異的に増幅させるプライマー（ Table 1 )を用いて行なった．PCR は Taq DNA polymerase（ニュー・イ－ 122 －

PC screening を活用した放線菌ゲノムからの新規物質探索および生合成研究

ングランド・バイオラボ)にて，熱変性:95 ℃ 10 秒，

遠心分離し，上清を回収し，QSTAR Elite Hybrid LC/

アニーリング:59 ℃ 30 秒，伸長:68 ℃ 1 分の反応を 35

MS/MS System（ AB サイエックス)を用いて LC/MS

サイクルで行なった．取得したコスミドに生合成遺伝子

解析した．

クラスターの全領域が含まれていない場合は，複数のコレギュレーター遺伝子発現による新規物質探索では，スミドから切り出した領域および PCR で増幅させた領レギュレーターの発現により生産誘導される物質の物理域を Gibson Assembly（ Gibson et al., 2009 )によって繋

化学的性状を天然物データベース Dictionary of Natural

ぎ合わせることで，クラスターの全領域を含むベクター

Products で検索することでその新規性を予測した．

を作製した．
単離精製および構造解析
培養および培養液の LC/MS 解析

培養液を HP20，シリカゲルおよび ODS カラムクロ

生 産 培 地 に は No. 43 培 地（ 5 % maltose, 1.5 % dry

マトグラフィーで粗精製し，分取 HPLC により単離した．

yeast, 2.5 % ebios, 1 % KBr, 0.05 % KH 2 PO4 , 0.05 %得られた物質について QSTAR（ AB サイエックス)を用

MgSO4·7H2O, pH 7.0 )，No. 43-2 培 地（ No. 43 培 地 のいて高分解能質量分析および MS/MS フラグメント解析

maltose を 0.5 % に 変 え た 組 成 )，YD 培 地（ 1 % yeast

を行い，Agilent 400-MR DD2（アジレント・テクノロジー)

extract, 1 % glucose, pH 未 調 整 )，No. 58 培 地（ 0.5 %を用いて各種 NMR 解析を行うことにより，その平面構

glucose, 5.0 % soluble starch, 0.3 % CaCO3 , 1.0 % dr y

造を決定した．また，改良マーフィー法によりアミノ酸

yeast, 1.0 % 脱脂小麦胚芽，pH 未調整)を使用した．生の絶対立体配置を決定した．

産培地に種培養液を 1 %となるように植菌し，27 ℃で 6
日間振とう培養した．生産培養後，培養液に等量のエタ

生物活性評価

ノールを加え，菌体成分を抽出し，3,000 rpm で 10 分間

Table 1

抗菌活性試験は，グラム陽性菌として Bacillus subtilis

Primers used in this study－ 123 －

稲橋

佑起，中島

琢自

KB-211，Kocuria rhizophila KB-212 を，グラム陰性菌としLC/MS 解析を組み合わせた手法で探索した結果，放線て Escherichia coli KB-213，Xanthomonas oryzae pv. oryzae

菌 768 株より AviCys 生産菌 2 株を効率良く選択するこKB-88 を，真菌として Candida albicans KF-1，Mucorとができた．この手法は AviCys 以外にも幅広く適応で

racemosus KF-233 を用いた．

き，今後，PC screening 等で発見された新規骨格物質の類縁体探索にも応用したい．

結果および考察レギュレーター遺伝子発現による新規物質探索

放線菌ゲノムからのアミノビニルシステイン系化合物のStreptomcyes sp. KO-7888 株 の ゲ ノ ム よ り 16 個 の レ
ギュレーター遺伝子を選択し，それぞれ pOSV556 にク探索

ローニング後，KO-7888 株に導入した．レギュレーター

AviCys 生合成遺伝子をターゲットとし，放線菌 768

発現株の培養液を LC/UV および LC/MS 解析した結果，

株 に 対 し て PCR で ス ク リ ー ニ ン グ を 行 な っ た 結 果，

SARP family 転写制御因子発現株である Streptomcyes sp.

"Streptomyces subflavus subsp. irumaensis" AM-3603 株（イ

KO-7888/pOSV556::speR の YD 培 養 液 に お い て コ ン ト

ルママイシン生産菌)および Streptomyces nitrosporeus

ロールにはない化合物ピーク 2 本（ KO-7888A および

K93-0711 株（マジンドリン生産菌)の 2 株がヒットした．

KO-7888B ) を 検 出 し た． 両 ピ ー ク と も UV 極 大 吸 収

ヒットした 2 株について前駆体ペプチドをコードする

268 nm， 分 子 量 は そ れ ぞ れ 920 お よ び 934 で あ り，

cypA に相同な遺伝子の塩基配列解析を行なった結果，サイペマイシンと比較して，AM-3603 株では 8 番目のDictionary of Natural Products 検索した結果，該当するVal が Ala に，K93-0711 株 で は 13 番 目 の Ile が Val に 置
き換わっていた（ Fig. 1 )．AviCys でこのような配列のStreptomcyes sp. KO-7888/pOSV556::speR を 大 量 培 養
後， 各 種 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で 単 離 精 製 し，ペプチドの報告はなく，AM-3603 株および K93-0711 株

KO-7888A お よ び KO-7888B を 6.9 mg お よ び 12.9 mg 取

化合物は無く，新規物質と推定された．

はそれぞれ分子量 2067 および 2081 の新規 AviCys を生得した．高分解能質量分析により，KO-7888A は m/z＝産することが示唆された．

+
921.4106[M + H]
(C47H60N4O15)，KO-7888B は m/z＝+935.4356[M + H](C48H62N4O15)であった．MS/MS フラ

AM-3603 株および K93-0711 株の培養液を LC/MS 解析した結果，それぞれ No. 43 培地および No. 43-2 培地培

グメント解析，NMR 解析および改良マーフィー法によ養液より推定した分子量を示す化合物 AM-3603A およびるアミノ酸分析により，脂肪酸側鎖にグリシン，グリシ

K93-0711A の生産が確認された．大量培養後，各種カラン，3 -ヒドロキシアスパラギン酸，L -チロシン，L -スレ

ムクロマトグラフィーにより精製し AM-3603A および

オニンおよび D -ロイシンおよび 3 -ヒドロキシアスパラ

K93-0711A を 0.2 mg および 9.0 mg 取得した．高分解能

ギン酸アミドが縮合した新規リポペプチドと決定した

質 量 分 析 お よ び MS/MS フ ラ グ メ ン ト 解 析 の 結 果，

（ Fig. 2 )．SARP family 転写制御因子の発現により得ら

AM-3603A および K93-0711A を Fig. 1 に示す構造と決定れた物質からサーペプチン A および B と命名した．サーした．抗菌活性試験の結果，AM-3603A および K93-0711A

ペプチン A および B の抗菌活性試験を行なった結果，は K. rhizophila KB-212 に対して活性を示した．

いずれの検定菌に対しても活性を示さなかった．

構造的にユニークな AviCys に着目し，PCR ならびにFig. 1.

二次代謝産物生合成遺伝子の発現を制御するレギュ

Structures of cypemycin, AM-3603A and K93-0711A.

－ 124 －

PC screening を活用した放線菌ゲノムからの新規物質探索および生合成研究

Fig. 2.

Fig. 3.

Structures of sarpeptins A and B.

Gene cluster and proposed pathway for trehangelin biosynthesis.

レーター遺伝子の発現と PC screening を組み合わせる

Local BLAST を 用 い て K07-0510 株 の ド ラ フ ト ゲ ノ ム

ことで，新規物質サーペプチン A および B を取得した．

シークエンスから SF2575 のアンジェリル CoA 合成酵素

今後，様々な生物活性評価系にて評価を行うことで生物と推定されるタンパク質（ SsfN, K, J )と相同性の高い活性が見出されることを期待する．

タンパク質を含む遺伝子クラスターを検索することで，トレハンジェリン生合成遺伝子クラスターを推定した．

トレハンジェリン生合成遺伝子クラスターの同定

本遺伝子クラスターは 16 kb の DNA 領域からなり，12

トレハンジェリンは P. rubra K07-0510 株が生産するト種類の遺伝子が含まれていた（Fig. 3 )．その内，アンジェ

レハロースに 2 分子のアンジェリカ酸が縮合した新規物

リル CoA 合成酵素およびアンジェリル CoA 転移酵素と質である（ Nakashima et al., 2013 )．アンジェリカ酸は推定される遺伝子（ thgH, I, J, K )を PCR で増幅後，放カモミールなどの植物成分として有名であるが，アン線菌の発現用ベクター pOSV556 にクローニングし，S.

ジェリカ酸を有する微生物由来天然物はトレハンジェリ
ン と SF2575 の み で あ り，Pickens et al.(2009)に よ り

albus J1074 株に導入した．遺伝子導入株をトレハロース
含有 YD 培地で培養し，培養液を LC/MS 解析したとこ

SF2575 の生合成遺伝子クラスターが報告されている．

ろ，トレハンジェリンの生産が確認されたため，当該遺－ 125 －

稲橋

佑起，中島

琢自

伝子クラスターをトレハンジェリン生合成遺伝子クラスと PCR 産物を連結させることでアクチノアロライド生

ターと同定した．さらに，それぞれの組換えタンパク質

合成遺伝子クラスターの全領域を含むベクターを作製しを大腸菌で発現させ，Ni カラムで精製後，その機能解た． 得 ら れ た ベ ク タ ー を 接 合 伝 達 に よ り S. coelicolor

析を行った結果，ThgI ，K および H が順次反応するこM1152 へと導入し，作製した放線菌を YD 培地で培養しとにより，メチルマロニル CoA からアンジェリル CoA

LC/MS 解析した結果，アクチノアロライドの生産が確が合成されることを確認した（ Fig. 3 )．アンジェリカ

認された．以上の結果より当該遺伝子クラスターをアク酸の生合成に関する報告は複数あるものの（ Basey &チノアロライド生合成遺伝子クラスターと同定した．ア

Woolley, 1973; McGaw & Wooley, 1979 )，それらは推定

クチノアロライドは I 型 PKS によりポリケチド鎖が合成のみで，今回の結果が酵素によるアンジェリル CoA 生

された後に，12 員環ラクトン形成ならびに P450 による合成経路の初の証明となる．

5 員環ヘミアセタール形成によって合成されることが推測される（ Fig. 4 )．

アクチノアロライド生合成遺伝子クラスターの同定
アクチノアロライドは A. fulvus MK10-036 株およびピリゾマイシン生合成遺伝子クラスターの同定

K09-0307 株が生産する抗トリパノソーマ活性を示すマ

ピリゾマイシンは L. aerocolonigenes K10-0216 が生産

ク ロ ラ イ ド 化 合 物 で あ る（ Inahashi et al., 2015 )．

するピリジン環とチアゾール環が連結した特徴を有する

K09-0307 株のドラフトゲノムシークエンスを antiSMASH化合物であり（ Kimura et al., 2018 )，生合成経路の報告で解析することで，アクチノアロライド生合成遺伝子クはない．K10-0216 株のドラフトゲノムシークエンスを

ラスターを推定した．推定されたアクチノアロライド生

antiSMASH で解析することで，ピリゾマシン生合成遺合成遺伝子クラスターは約 50 kb の DNA 領域からなり，

伝子クラスターを推定した．推定されたピリゾマイシン

I 型ポリケチド合成酵素（ PKS )やシトクロム P450 を生合成遺伝子クラスターは約 40 kb の DNA 領域からな含む 7 種類の遺伝子から構成されていた（ Fig. 4 )．コスり，非リボソームペプチド合成酵素（ NRPS )およびミドライブラリーより得られた遺伝子クラスターの一部

PKS 等の 16 種類の遺伝子を含有しており，ピリゾマイ

Fig. 4.

Gene cluster and proposed pathway for actinoallolide biosynthesis.

－ 126 －

PC screening を活用した放線菌ゲノムからの新規物質探索および生合成研究

Fig. 5.

Gene cluster and proposed pathway for pyrizomicin biosynthesis.

シンは脂肪酸をスターターとし，システイン 2 分子，マ
ロニル CoA およびロイシンを基質に合成されることが示唆された（ Fig. 5 )．コスミドライブラリーより得られた遺伝子クラスターの一部と PCR 産物を連結させる
ことでピリゾマイシン生合成遺伝子クラスターの全領域を含むベクターを作製した．また，当該遺伝子クラスターに含まれる LuxR family 転写制御因子の遺伝子を発現用ベクターに別途クローニングした．得られたベクターを
S. lividans TK24 へと導入し，作製した放線菌を No. 58
培地で培養し LC/UV 解析した結果，当該遺伝子クラス
ターのみ導入した株ではピリゾマイシンの生産が確認されなかった一方，遺伝子クラスターと転写制御因子を共Fig. 6.

発現させた株においてピリゾマシンおよびその類縁体である AFA0320 物質（菅原ら，1999 )の生産が確認された（ Fig. 6 )．以上の結果より当該遺伝子クラスターがピリゾマイシン生合成遺伝子クラスターであり，その発
現はクラスター内の LuxR family 転写制御因子により正に制御されていることが明らかとなった．ピリゾマイシ
ンのピリジン環およびチアゾール環の形成については未解明なため，今後，遺伝子破壊や酵素反応によりその生合成機構が解明されることを期待する．
－ 127 －The LC/UV chromatogram of pyrizomicin production.
(A) the cultured broth of TK24 introduced the empty
vector, (B) the cultured broth of TK 24 introduced
pyrizomicin biosynthetic gene cluster, (C) the cultured
broth of TK 24 introduced pyrizomicin biosynthetic
gene cluster and co-expressed with the transcriptional
regulator, (D) pyrizomycin A, (E) AFA0320, (F) pyrizomicin B.

稲橋

要

佑起，中島

約

大学の Arinthip Thamchaipenet 博士，Wilaiwan Koomsiri
博士，北里大学北里生命科学研究所の松本厚子博士，野放線菌のゲノム情報より新規物質生合成に関わる未知の二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの探索が可能と

中健一博士，岩月正人博士，武晃博士ならびに学生諸氏に感謝の意を表します．

なってきた．菌株によって 30 以上の二次代謝産物生合

文

成遺伝子クラスターを有することが明らかとなっているが，殆どの生合成遺伝子クラスターは休眠状態にある．
本研究では，放線菌ゲノムからの生合成遺伝子の探索とPC screening を組み合わせ，新規物質の取得を試みた．
まず，ユニークな骨格であるアミノビニルシステインの生 合 成 遺 伝 子 を 放 線 菌 768 株 か ら 探 索 す る こ と で"Streptomyces subflavus subsp. irumaensis" AM-3603 株および S. nitrosporeus K93-0711 株よりサイペマイシン新規類縁体を発見した．次に，Streptomyces sp. KO-7888 株よりレギュレーター遺伝子を利用した新規物質探索を行うことで新規リポペプチド，サーペプチン類を発見した．
最後に，PC screening により得られた新規物質の生合成研究を行い，トレハンジェリン，アクチノアロライドおよびピリゾマイシンの生合成遺伝子クラスターを同定した．さらに，トレハンジェリンの生合成におけるアンジェ
リル CoA の生合成経路を特定した．

本助成で得られた研究成果の報告
原著論文
1) Inahashi, Y., Shiraishi, T., Palm, K. et al. 2016. Biosynthesisof trehangelin in Polymorphospora rubra K07-0510: identification of metabolic pathway to angelyl-CoA. Chembiochem.
17: 1442-1447.
2) Inahashi, Y., Shiraishi, T., Také, A. et al. 2018. Identificationand heterologous expression of the actinoallolide biosynthetic gene cluster. J Antibiot. 71: 749-752.
3) Inahashi, Y. 2019. Isolation of endophytic actinomycetes andthe search for new secondary metabolites. Actinomycetologica
33: S56-S63.
4) Koomsiri, W., Inahashi, Y., Leetanasaksakul, K. et al. 2019.
Sarpeptins A and B, lipopeptides produced by Streptomyces
sp. KO-7888 overexpressing a specific SARP regulator. J.
Nat. Prod. 82: 2144-2151.
その他
1) 大村 智, 中島 琢自, 高橋 洋子, 稲橋 佑起. 2017. トレハン
ジェリンの製造法. 特開2017-158546,（学校法人北里研究所, 長瀬産業株式会社)

謝

琢自

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，
本研究の一部は北里大学学術奨励資金により成されました．本研究の遂行にご協力いただいた東京大学大学院農学生命科学研究科の白石太郎博士，タイ王国カセサート

献Basey K., Woolley J. G. 1973. Biosynthesis of the tigloyl esters of
Datura: cis-trans isomerism. Phytochem, 12: 2883–2886.
Bierman, M., Logan, R., O'Brien, K. et al. 1992. Plasmid cloning
vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli
to Streptomyces spp. Gene 116: 43–49.
Bibb, M.J. 2005. Regulation of secondar y metabolism inStreptomyces. Curr. Opin. Microbiol. 8: 208-215.
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107: 16297-16302.
Claesen, J. & Bibb, M.J. 2010b. Biosynthesis and regulation ofgrisemycin, a new member of the linaridin family of ribosomallysynthesized peptides produced by Streptomyces griseus IFO
13350. J. Bacteriol. 193: 2510-2516.
Gibson, G. D., Young, L., Chuang, R. et al. 2009. Enzymatic
assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.
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A-E, new anti-trypanosomal macrolides, produced by an endophytic actinomycete, Actinoallomurus fulvus MK10-036. Org.
Lett. 17: 864-867.
Kimura, T., Inahashi, Y., Matsuo, H. et al. 2018. Pyrizomicin A
and B: structure and bioactivity of new thiazolyl pyridines from
Lechevalieria aerocolonigenes K10-0216. J. Antibiot. 71: 606-608.
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McGaw, B. A., Woolley, J. G. 1979. The biosynthesis of angelic
acid in Cynoglossum officinale. Phytochem, 18: 1647–1649.
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Rapid identification, annotation and analysis of secondar ymetabolite biosynthesis gene clusters. Nucleic Acids Res. 39:
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Nakashima, T., Okuyama, R., Kamiya, Y. et al. 2013. Trehangelins
A, B and C, novel photo-oxidative hemolysis inhibitors produced
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J. Antibiot. 66: 311-317.
Nett, M., Ikeda, H. & Moore, B.S. 2009. Genomic basis for natural
product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod.
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Pickens, L.B., Kim, W., Wang, P. et al. 2009. Biochemical analysisof the biosynthetic pathway of an anticancer tetracycline
SF2575. J. Am. Chem. Soc. 131: 17677-17689.
Sit, C.S., Yoganathan, S. & Vederas, J.C. 2011. Biosynthesis ofaminovinyl-cysteine-containing peptides and Its application in
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44: 261-268.
菅原孝子, 丹羽智宏, 金田佳枝ら. 1999. チアゾリルピリジン系化合物. 公開特許公報. 特開平11-60572.

－ 128 －

2018 年度一般研究助成の研究報告
助成期間:2018 年 4 月～ 2020 年 3 月

IFO Res.Commun. 34
2020

ラを取り囲んでいた．ミトコンドリア選択的蛍光色素の緑藻クロレラの細胞内共生による繊毛虫の進化と多様性のメカニズムの解明児玉有Mito Tracker® Green FM を使い同様の結果を得た．抗血清を使用した蛍光抗体法の結果，白色株と緑色株の差

紀

異は検出できなかった．藻類と共生することで宿主は，島根大学生物資源科学部
kodama@life.shimane-u.ac.jp

光合成による酸化ストレスを受ける．共生藻を持つ複数

目的:ミトコンドリアや葉緑体を生み出した細胞内共生

コンドリアの機能の低下と，抗酸化酵素遺伝子の発現のは現在でも多くの生物同士で見られ真核細胞の進化や多上昇が報告されている．一方ミドリゾウリムシにおいて様化の原動力となっている．しかし細胞内共生の成立やは白色株で抗酸化酵素遺伝子が高発現し，その理由は不維持の機構はほとんど明らかにされていない．この謎を明であったが，本研究からミトコンドリア数の減少が酸解明するためのモデル生物が繊毛虫のミドリゾウリムシ

化ストレスを軽減している可能性が示唆された．トキソである．ミドリゾウリムシの細胞質内に約 700 細胞存在

プラズマやレジオネラの寄生胞も宿主ミトコンドリアとしている共生クロレラは，1 細胞ずつ宿主食胞膜由来の密着・融合している．これは相利共生関係や寄生関係にPV 膜と呼ばれる共生胞に包まれている．ミドリゾウリ

おける共生胞や寄生胞と宿主ミトコンドリアとの関連のムシとクロレラは相利共生関係であるが，それぞれ単独

重要性や普遍性を示唆している．今後はクロレラの共生での生存が可能である．これは両者の関係が細胞内共生過程におけるマイトファジーの可能性などを調べ，元はによる進化の初期段階にあることを示している．クロレ

共生細菌由来であるミトコンドリアと共生クロレラの関ラはゾウリムシ以外の多種原生生物やヒドラやカイメン係に迫りたい．

種の宿主において，活性酸素種の発生源となる宿主ミト等にも共生しており，クロレラと動物細胞の細胞内共生は普遍的現象である．本研究はミドリゾウリムシを用い

かつお節かび付け工程で働く好乾性糸状菌の分類と菌叢解析に関する研究

た細胞内共生による真核細胞の進化と多様化のメカニズ
ムの解明を目的としている．

竹

方法:共生クロレラは宿主ミトコンドリアと PV 膜との

中

慎

治

神戸大学大学院農学研究科
stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

接着によって細胞表層直下に固定されている．共生の成立や維持における宿主ミトコンドリアの機能を調べるた
めに，抗ミドリゾウリムシミトコンドリアモノクローナ

目的:日本の伝統食品である鰹節は，荒節と枯節に大別

ル抗体を作製した．その抗体を使用して，クロレラ除去

できる．カツオ肉を煮熟・焙乾ものが荒節であり，さら株（白色株)と保持株（緑色株)の抗原の局在性を蛍光に Aspergillus 属糸状菌（鰹節カビ)にてかび付け発酵・抗体法で比較した．さらにミドリゾウリムシのトランス

熟成させたものが枯節である．かび付け工程は，約 6 か

クリプトームデータから，抗酸化物質の一つであるグル

月間かけて「かび付け⇒天日干し⇒かびの払落し」を 4

タチオンを付加する反応を触媒するグルタチオン S -トラ

回ほど繰り返す作業であり，脂肪の分解，香味の付与，

ンスフェラーゼの部分塩基配列を使って合成ペプチドを色相の変化などをもたらすとともにまろやかな風味や上作製し，それを抗原にした抗血清を使用して抗原の局在

品な色合いを有する節に変えてくれる．鰹節カビは，A.

性を蛍光抗体法で比較した．

glaucus およびその類縁種と言われてきたが，かび付け

結果・考察:モノクローナル抗体を使用した蛍光抗体法

工程で，どのような Aspergillus 属糸状菌がこれを担っての結果，緑色株と比較して白色株のミトコンドリア数がいるか明らかではない．本研究では，かび付け工程やサ多いことが分かった．緑色株のミトコンドリアはクロレ

ンプルの違いによる好乾性糸状菌の優占種やそれらの加－ 129 －

IFO Res.Commun. 34
2020

水分解酵素の生産特性の解明を目的とした．

日本産海岸生地衣類の種多様性解明と同定ツールの開発および分類

方法:ゲノム DNA は，「同じ製造元から入手した 1 番から 4 番枯節」と「問屋から入手した製造元の異なる 4 番

原枯節」を鰹節カビ分離源とし，MY20 平板培地で培養し田浩

千葉県立中央博物館植物学研究科
harada@chiba-muse.or.jpて得られた菌糸体から混合ゲノム DNA として調製した．
PCR-DGGE 法は β -チューブリン遺伝子（BenA 部分断片，
約 400 bp )を増幅し，変性剤濃度 5 %から 35 %，60 ℃

目的:ほとんどの生物にとって過酷な環境となる，岩石の条件で行った．リパーゼ，ペプチダーゼおよび酸性・

海岸の潮間帯から飛沫帯にかけては，地衣類が卓越し時

中性プロテアーゼの酵素活性測定は鰹節（荒節)粉によに明瞭な分布帯を形成することから，生態学をはじめとる固体培養（ 0.85 および 0.95aw )で得られた細胞抽出液する様々な分野において研究対象として期待されるが，を用いて行った．

国内での研究はほとんど進んでいない．そこで本研究で結果・考察:枯節から A. amstelodami，A. chevalieri，A.

は，その基礎となる種多様性解明を進めるとともに，分

pseudoglaucus，A. ruber，A. sydowii の 5 種を分離・同定

類学者以外にも利用可能とするための，図鑑・化学成分した．次に，混合培養・ゲノム DNA 調製法を検討後，データベース・DNA データベースの 3 つの同定ツール

BenA 遺伝子の増幅と DGGE で菌叢解析した．DGGEの構築を目指した．

のマーカーは，同定した 5 種のカビより調製した BenA

方法:長崎周辺・千葉・秋田県周辺を 3 重点地区として，部分断片とした．「同じ製造元から入手した 1 番から 4

原田らが野外調査を行い採集した新規標本と，千葉県立番 枯 節 」 に つ い て 優 占 種 の 推 移 を 調 べ た 結 果，A.

中央博物館に保管されている既存標本を用いた．新規標

pseudoglaucus および A. chevalieri が優占種であり，かび本から削り出した試料について，アセトンにより抽出し，付け発酵が進むとともにこれらの構成比が徐々に 1:1

LC/MS による分析を行い，含有化学成分を同定した．抽に収束した．また，「製造元が異なる 4 番枯節」につい出後の乾燥試料（あるいは採集後まもなく冷凍した（一ては，上述の 2 種の他に A. amstelodami，A. ruber，A.

部は冷蔵，常温保存))は，市販のキットを用いて DNA

sydowii も優占種となっていた．さらに，鰹節の水分含を抽出した．その後，地衣菌の核リボゾーム DNA の量が 15 %程度の鰹節サンプルでは A. amstelodami が，

ITS 領域を増幅し，塩基配列を決定した．既に分類が解

脂質含量が 3.5 %の鰹節サンプルでは A. chevalieri が優明された群については，新規標本に既存標本を加え，形占種となる傾向が見られた．つづいて，「製造元が異な態等の観察を行い，分類学的再検討と同定を進めた．分

る 4 番枯節（ 13 サンプル)」から回収した胞子（カビ混

類が未解明の群については，DNA 配列と文献から得ら合サンプル)を水分含量の異なる鰹節固体培地（ 0.85

れた形態形質との間に矛盾が見られた標本について同定

および 0.95 aw )で培養し，得られた抽出液（粗酵素液)を進めた．確認された全種について，生物顕微鏡・実体について加水分解酵素活性を調べた．その結果，低水分

顕微鏡に装着したデジタルカメラにより画像を取得し，下（ 0.85 aw )で培養して得られた抽出液において測定

Adobe®Photoshop による画像処理を行い，原図とした．

した加水分解酵素活性値が高い傾向が見られた．特に，結果・考察:日本産海岸生地衣類として 11 目 17 科 34

脂質の加水分解に関わるリパーゼの活性だけでなく，筆属 55 種を同定し，この他未同定種を含めると計 12 目 20者が提唱した鰹肉の脱色に関わるアスパルティックプロ

科 41 属 72 種を認めた．同定された 55 種について概ね

テアーゼの活性は，低水分活性下で培養したサンプルに図（写真)と記載をそろえ，群ごとに図鑑として誌上でおいてそのほとんどが高活性であった．

公表するとともに，ウェブ図鑑の公開準備を進めた．未
同定種についても同様に進めている．DNA バーコーディ－ 130 －

IFO Res.Commun. 34
2020

ングを目的として，約半数の 26 種の ITS 領域を取得し活環の研究は，タイ・チェンマイ県，ナコンラチャシマ（この他，検討を要する種として約 10 種から得ている)，

県，及びカンチャナブリ県にある国立公園とその隣接地

データベース公開の準備を進めた．化学成分（LC/MS 等)域での調査と収集した標本に基づいた．これらの調査・は，ダイダイゴケ科等について解析を概ね完了し，残る

研 究 は， タ イ 国 家 学 術 調 査 委 員 会（ the National

群についてもまもなく完了する予定である．

Research Council of Thailand )の承認のもとに実施した．

既存の DNA 情報と得られた情報を比較することに国立公園内での調査と標本収集は，タイ国立公園・野生よって，同定が可能になった分類群，従来の同定に疑問

動物・植物保護局の許可を得た．ベトナムの GLR 菌標が生じた分類群などがあった．これまで日本産の分類が本は，ベトナム国立農業大学及びホーチミン市バイオテ

よく分かっていなかったダイダイゴケ科 Teloschistaceae

クノロジーセンターの研究者の協力を得てハノイ，ニンについては，近年韓国で研究が進み DNA 情報が充実しトゥアン省，タイニン省で収集した．分子系統解析にはていたため，3 種を新たに日本産として同定することがITS2 及び LSU rRNA(D1/D2 領域 ) の配列を用いた．

できた．アナイボゴケ科 Verrucariaceae については，一

結果・考察:BKF，IBAR，TSH 所蔵標本，及びタイで通り形態分類が終了した結果をまとめたが，認められたの野外調査と新たに収集した標本を精査したが，東南ア

複数の種について，学名の修正の必要が生じた．チャシジア・オーストラレーシア GLR 菌が栽培ぶどう以外のブゴケ属 Lecanora については，日本と周辺地域の DNA

野生ブドウ科植物に寄生している事実は確認できなかっ

情報が貧弱であり，また海岸生種の研究が進んでいない

た．しかし，夏胞子堆側糸の形態が異なることと，分子ため，ほとんど確実な同定ができなかったため，未同定

系統解析で推定した系統樹で東アジア GLR 菌 2 種とは明種としてデータベース化することとした．

確に異なるクレード（ clade )を構成することから，東
南アジア・オーストラレーシア GLR 菌は Neophysopella属の新種であると結論した．これまでの接種試験による

熱帯アジアで猛威を振るうぶどうサビ病菌の生態学的・分類学的研究
小野義研究から，ブドウ科 Ampelocissus 属植物が東南アジア・
オーストラレーシア GLR 菌の野生宿主である可能性を推隆定していたが，タイで新たに見出した A. araneosa に寄茨城大学教育学部
yoshitaka.ono.grapes@vc.ibaraki.ac.jp

生するサビキンは東南アジア・オーストラレーシア GLR
菌とは形態的にも分子系統的にも異なる Neophysopella

目的:ぶどうサビ病（ GLR )は，東南アジアにおいて，属の新種であることを明らかにした．タイにおいて GLR

栽培規模が大きくなく計画的な薬剤散布が充分でないブ菌の異種寄生宿主となりえるアワブキ（ Meliosma )属植

ドウ園で猛威を振るい，早期落葉とともに果実の収量と物に寄生するサビキンを調査した結果，M. simplicifolia

品質の低下をもたらしている．本研究は，東南アジアとにさび胞子世代形成するサビキンを見出したが，本菌はオーストラレーシアに広く分布し，南アメリカにも侵入・

Neophysopella 属菌であることが明らかになった．また，定着した GLR 病原菌の宿主範囲・生活環及び分類学的M. arnottiana に寄生しさび胞子世代を形成するサビキ

位置を明らかにすることを目的とした．

ンも見いだしたが，本菌も Neophysopella 属の新種であ

方法: 東 南 ア ジ ア と オ ー ス ト ラ レ ー シ ア に 分 布するることが明らかになった．

GLR 菌と東アジアに分布する 2 種の GLR 菌との比較研
究にはタイ国立公園・野生動物・植物保護局 Forestry
Herbarium:BKF，茨城大学菌類標本庫:IBAR，筑波大
学菌類標本庫:TSH 所蔵の標本を用いた．宿主範囲と生－ 131 －

IFO Res.Commun. 34
2020の概ね 70 %以上が fcy1，pex1，gat1 の単独遺伝子変異

木材腐朽菌の進化仮説を実験室内で実証する
中沢威

株であることが判明したため，C. subvermispora における効率的なゲノム編集法が確立できたと考えられる．ま人

た，当研究室の先行研究と同様に，形質転換体を継代す

京都大学大学院農学研究科
tnakazaw@kais.kyoto-u.ac.jp

ると，その約半数のハイグロマイシン耐性が消失した．
また，PCR による耐性消失株からのハイグロマイシン

目的:近年旺盛に行われた木材腐朽菌（担子菌の一部)

耐性遺伝子の増幅がみられなくなった．このことは，本の比較ゲノミクス解析の結果，木材分解機構の進化，変遷研究におけるハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は一過ならびに多様性に関する幾つかの興味深い仮説が提唱さ性であることが示唆される．そのため，ハイグロマイシれた．例えば，褐色腐朽菌が進化して白色腐朽菌が発生

ン耐性形質転換を繰り返すことにより，多重遺伝子変異したと考えられる．特にタマチョレイタケ目（ Polyporales )株の作成が可能であると考えられる．このことは，このにおいては，木材中の多糖をほとんど分解しない選択

C. subvermispora におけるゲノム編集系が，ゲノム上に的 白 色 腐 朽 菌 Ceriporiopsis subvermispora が，Trametes

多コピー存在する木質分解系酵素遺伝子群の大規模改変

versicolor などの他の白色腐朽菌よりも褐色腐朽菌に進に有効であることを示唆する．次に，親株と pex1 およ化的に近く，これらの一般的な白色腐朽菌から選択的白び gat1 単独遺伝子変異株の間でブナ木粉培地中のリグ色腐朽菌へと変化し，その後に褐色腐朽菌へと進化した

ニン分解量を比較したところ，これらの株における分解可能性も考えられる．しかし，この仮説を実験的に実証能の低下が確認された．このことは，本手法で作製したする（再現する)ことは行われていない．このことを踏

遺伝子変異株と親株との間で，木質分解能の比較解析がまえて本研究では，この進化仮説を実験室内で再現およ可能であることを示す．今後は，本研究で確立したゲノび実証することを目的として行った．

ム編集系を用いて，実際に実験室内での進化仮説の実証

方法:タマチョレイタケ目に分類される木材腐朽菌でを行う予定である．また，T. versicolor におけるゲノムは，効率的な遺伝子ターゲティング実験系が開発されて編集系の確立にも取り組んでいる．

いない．そこで C. subvermispora において CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集による遺伝子変異導入を行うため，難分解性物質を利用する昆虫における共生酵母とその機能

本菌の野生モノカリオン株由来のプロトプラストに，ハ
イグロマイシン耐性遺伝子，gRNA および Cas9 の発現

土

カセットを有するプラスミドを導入した．本研究で C.

岐和多瑠

名古屋大学大学院生命農学研究科
tokiw@agr.nagoya-u.ac.jp

subvermispora に変異を導入した遺伝子は，fcy1（変異株は 5 - fluorocytosine 耐性を示すため，表現型で変異導入を簡便に調査可能な遺伝子)に加えて，ヒラタケでリグ

目的:昆虫類は，様々な環境へ進出するばかりでなく，

ニン分解能を顕著に低下させる遺伝子（ pex1 および普通の動物では利用困難な餌資源を利用するものまで知gat1 )である．pex1 および gat1 の単独遺伝子変異がリられる．これらの昆虫は微生物と共生関係を結ぶことでグニン分解能に及ぼす影響を評価するために，各 C.

そのような利用困難な資源を利用可能になったことがわ

subvermispora 株をブナ木粉培地上で 11 日間および 20

かりつつある．昆虫の中でも特に顕著な多様化を遂げた

日間培養し，Klason 法に従って残存リグニン量を比較

甲虫では，多くの種類で消化管などから様々な酵母が見した．

出されている．しかしながら，甲虫－酵母共生系の研究

結果・考察:得られたハイグロマイシン耐性形質転換体

は緒に就いたばかりであり，酵母の役割についてはほと－ 132 －

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2020

んどわかっていない．木材は森林に豊富に存在するが，寄与する可能性が示唆された．以上より，昆虫による木

難分解性物質（セルロース，ヘミセルロース，リグニン)

材利用には，共生菌の難分解性物質利用能力が重要な役に富み，利用困難な資源である．本研究は，木材依存性割を果たす場合が多いことを示唆する．

甲虫が木材を資源として利用可能になったのが，それらを分解する酵母と共生関係を持つことによるものかどう

放線菌門に属さない放線菌様系統「クテドノバクテリア」の選択的培養法の確立と分離及び創薬微生物資源としての有効性の検証かを明らかにすることを目的とした．
方法:木材依存性甲虫（主にツツシンクイムシ科，オオ
キノコムシ科コメツキモドキ亜科)を野外よりサンプリ
ン グ し， 成 虫 体 内， 幼 虫 体 表 面 よ り 酵 母 を 分 離 し，矢DNA 情報に基づいて同定した．これらの培養菌株を用

部

修

平

東北大学大学院農学研究科
shuhei.yabe.b2@tohoku.ac.jp

いて難消化性物質の資化活性の有無を実験的に調べた．
コメツキモドキ亜科のうち，タケの空洞内で幼虫が栽培した酵母を食べて成長するニホンホホビロコメツキモド

目的:近年，多剤耐性菌による感染症が拡大する中，創キ（ニホンホホビロ)については，酵母の増殖基質を明

薬資源「放線菌」からの新規抗生物質の創出は急減してらかにするため，タケの髄組織，酵母培養後の髄組織，おり，探索源の開拓が急務である．2006 年に創設され幼虫飼育後の髄組織に含まれる糖組成をイオンクロマト

た「クテドノバクテリア（綱)」は，放射状の気菌糸にグラフィー分析によって調べた．

胞子を形成し種々の生物活性を示すことから，放線菌の結果・考察:ニホンホホビロについて，タケの髄組織に次の世代の探索源として期待できる．しかしながら，こはアラビノース，ガラクトース，グルコース，キシローの分類群は培養株が少なく遺伝資源として未開拓であるスを主として 10 種の糖が含まれ，酵母培養後のサンプ

ため多様な培養菌種を得ることが課題であった．本研究

ルではマンノースの増加が見られた一方，幼虫飼育後のは，クテドノバクテリア綱の選択的分離法を改良するとサンプルではマンノースが少量検出された．炭素源の資ともに，本綱の新しい系統に属する細菌の分離と分類及化性試験により，酵母はグルコースに強い資化性を示し，

びゲノム解析，新規二次代謝物の探索に取り組んだもの

キシラン，セロビオース，キシロースに弱い資化性を示である．

し，セルロース，アラビノース，ガラクトースには資化

方法:宮城県鬼首温泉地熱地帯の泥土，蔵王山御釜湖付性を示さなかった．これらの結果から，ニホンホホビロ

近の土壌，浅間・烏帽子火山群に棲息し「食べられる土」

共生酵母はタケに含まれる難分解性物質を積極的に分解として知られる微生物塊「天狗の麦飯」を採集した．10

するものではない可能性が考えられた．海外産ホホビロ

倍希釈 R2A 培地にアジ化ナトリウムを 30 - 60 mg/L 添加

コメツキモドキ由来の 3 種の酵母はキシロースに強い資し，1.5 %ゲランガムにより固化したものを選択培地と化性を示し，そのうちの 2 種ではキシランにも強い資化

して直接接種法により培養した．培養は 30 - 60 ℃にて性を示した．これらは，積極的に難分解性物質を分解し，

7 - 60 日間行い，分離株は 16S rRNA 遺伝子塩基配列に幼虫の成長に寄与する可能性を示唆する．ツツシンクイ

基づき同定した．基準株は培養生理学的，化学分類学的，

ムシについては，枯死木利用性のクシヒゲツツシンクイ

ゲノム解析及び分子系統分類学的解析を行い系統分類し由来の酵母 4 種を炭素源の資化性試験に供試したとこた．
また in silico による新規二次代謝物生合成ポテンシャ

ろ，全てがキシロースとキシランに資化性を示し，1 種

ルの解析に加え，培養法による探索，精製，構造解析もについてはガラクツロン酸にも資化性を示したことか

併せて行った .

ら，材中の様々な難分解性物質を分解して幼虫の成長に結果・考察: 計 19 株 の ク テ ド ノ バ ク テ リ ア の 分 離 に－ 133 －

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2020

成 功 し た． そ れ ら の 分 類 学 的 性 質 を 解 明 し，1 新共生に着目し，その共生進化過程を明らかとするため，科（ Dictyobacteraceae fam. nov. )，1 新種

ほぼ細胞内共生細菌である Rs -N31 と，完全に細胞体が（ Tengunoibacter tsumagoiensis gen. nov., sp. nov. )，5 新

露出した状態で原生生物細胞表面に付着共生する種（ Thermogemmatispora aurantia sp. nov., T. argillosa

ZnDsv-02 の比較ゲノム解析を行った．

sp. nov., Dictyobacter kobayashii sp. nov., Dictyobacter

方法:ネバダオオシロアリの腸内に共生する T. collaris

alpinus sp. nov., Dictyobacter vulcani sp. nov.)を提唱した．

1 細胞を顕微操作により物理的に単離し，洗浄後マイク

さらに一部の菌種は胞子嚢を形成することを見出した．

ロメスで解剖し，目的の ZnDsv-02 を含む細胞前部をマ

胞子嚢を形成する細菌系統の発見は，放線菌，粘液細菌

イクロチューブ回収した．回収したサンプルにたいしてに次いで 3 例目である．これら分離株のゲノム中には二全ゲノム増幅を行い十分量のゲノム DNA を取得後，次次代謝物生合成遺伝子群が最大で 22 個と放線菌に匹敵世代シーケンサー（ MiSeq )用のライブラリー（ペアするほど多く，それらのほとんどは新規であることが示

エンドとメイトペア解析用)を調製した．ライブラリー

唆された．分離株はグラム陽性菌から陰性菌まで幅広くを イ ル ミ ナ MiSeq で シ ー ケ ン ス を 行 っ た． さ ら に

抗菌活性を示し，その培養物から新規と推定されるアン

PacBio でのロングリードの取得も行った．ZnDsv-02 のトラキノン化合物を見出した．以上，本研究により，本ゲノムを再構成し，ゲノム解析および，比較ゲノム解析

系統を拡充することに成功し，その生合成ポテンシャルを行った．

の高さを証明するに至った．

結果・考察:得られた配列をアッセンブルした結果，

属・1 新

ZnDsv-02 の ほ ぼ 完 全 長 の ゲ ノ ム の 取 得 に 成 功 し た．
ZnDsv-02 のゲノムサイズは 1.6 Mb であり，Rs -N31 のシロアリ腸内原生生物に細胞共生する
Desulfovibrio 属細菌の共生進化
桑原宏

1.4 Mb よ り や や 大 き い が， 近 縁 の 自 由 生 活 型
Desulfovibrio fairfieldensis（ 3.7 Mbp )，D. desulfuricans

和（ 2.9 Mbp )と比べ大幅に縮小していることが明らかと

東京工業大学生命理工学院
hkuwahara@bio.titech.ac.jp

な っ た． 遺 伝 子 を 機 能 分 類 し 比 較 解 析 し た 結 果，
ZnDsv-02 と Rs -N31 の遺伝子欠失のパターンはよく似て目的:シロアリ腸内には，微生物間，特に原核生物と真いた．興味深いことに ZnDsv-02 は宿主細胞外の環境に核生物（原生生物)間での多様な共生関係が存在してお曝されているにも関わらず，Rs -N31 と同様にシグナル

り，細胞共生研究の格好のモデルとなっている．ヤマト伝達に関わる遺伝子の多くを欠失していた．しかしながシロアリ腸内原生生物 Trichonympha agilis に共生する未ら，ZnDsv-02 は，Rs -N31 で は 偽 遺 伝 子 化 し て い る

培 養 細 菌“ Candidatus Desulfovibrio trichonymphae ”

CRISPR-Cas システムや制限修飾系に関わる遺伝子を保Rs -N31 は，宿主細胞表層に埋没し，直径 50 nm の穴で持しており，外環境のファージや外来 DNA に曝されてのみ外界に通じている．我々は，同細菌ゲノムの解読にいるためだと考えられる．また，ZnDsv-02 には接合伝成功し，サイズが 1.4 Mb に縮小しているものの，水素達に用いられる type IV 分泌システムに関する遺伝子が酸化による硫酸還元能力とアミノ酸，補酵素合成能力を存在するが，Rs -N31 では失われていた．現在の ZnDsv-02

保持することを明らかにした．一方，ネバダオオシロア

は，type IV 分泌システムの DNA 伝達に関わる遺伝子

リの腸内に共生する T. collaris の細胞表面には，細胞体(virB4, B7, traI)を失っており，現存の構成成分を用いが 完 全 に 露 出 し た 状 態 で“ Ca. D. trichonymphae ”て宿主原生生物細胞に接着していると考えられる．さらZnDsv-02 が 付 着 共 生 し て い る． 本 研 究 で は，に ZnDsv-02 は乳酸利用経路を保持していたが，Rs -N31

Desulfovibrio 属細菌と Trichonympha 属原生生物の細胞では偽遺伝子化していた．一般的な Desulfovibrio 属細菌－ 134 －

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2020

は乳酸を炭素源やエネルギー源とするが，ほぼ細胞内共群の記載に役立てる試みをおこなった．

生している Rs -N31 は乳酸の取り込みが困難だと考えら

結果・考察:多くの未活用資料について，整理を進め活れ，またエネルギー源として水素を使用することは宿主用可能な状況とした．未記載分類群を多く取り扱った『日原生生物にとってより有益な可能性がある．本研究によ本きのこ図版』に関わる青木実資料のうち，ポジ写真

り，細胞表面細菌であってもゲノム縮小が起こっており

1900 枚およびネガ 1100 枚あまりをデジタル化，記載と共生進化過程の一端が明らかとなった．

の整合を取り，利用可能な整理をした．普及版図鑑著者であった上田俊穂氏の標本資料 750 点，描画資料など
400 点の公開に向けた準備を行った．さらに香川県の研

市民科学者とアカデミアの協働体制の構築と博物館が所蔵する学術的レガシーの活用による未記載・未解明大型担子菌類
探求の推進
佐久間

大

究家豊嶋弘氏の図譜など未公表資料 1200 枚の発掘を行い，また保育社『原色菌類図鑑』の本郷次雄氏の初期の描画資料 800 枚など研究資料群の収集整理を行った．成果は日本菌学会などでの発表の他，順次資料研究の成果

輔として公表をしていく．標本利用の活性化にはアカデミ

大阪市立自然史博物館学芸課
sakuma@mus-nh.city.osaka.jp

ア所属研究者の利用だけでなく市民科学者の利用拡大が鍵を握る．このため，幅広い菌類教育プログラムを展開

目的:今日，日本の菌類学の担い手として市民科学者のし，成果を集約して山と渓谷社より菌類研究の手引とな存在は無視することができない．特に，大型担子菌類にる一般書として，『きのこの教科書

おいてはアマチュア研究者の存在は大きい．地方菌類相門』の刊行した．ほかにも，参加者からの要望を受けての解明にとどまらず，新種探索や系統解析など，多くの切片観察，DNA 配列決定，参考資料提供など市民科学

研究にアマチュア研究者の協力・参画がある．南方熊楠，者の観察力を引き上げる環境構築を図った．

観察と種同定の入原摂祐の時代から，近年でも青木実などアカデミア外の市民科学者による菌類研究を進展させるためにも，ア

研究者たちの活躍が日本の菌類多様性情報の基礎となっカデミアによる研究にアマチュア資料の活用を促進するている．これら過去の研究者の知見に触れる手段として，ためにも，博物館はかなめとなる必要がある．今回の取文献とともに標本や記録資料がある．しかし，必ずしもり組みで生態観察から一歩深めた，標本・資料を活用す整理された情報ばかりでもなく，未発掘な資料も多い．

る研究へと進めることができた．

本研究では将来の研究資料となる過去の標本及び描画，
顕微鏡記録など「学術的レガシー」の活用をすすめるこ

アーキア界に広がるメチル化合物利用性
メタン生成アーキアの分離とその進化・生態とを目的とした．
方法:2018 年に大阪市立自然史博物館で行われた特別

春展に向けて，所在調査をした未発掘資料を対象とした．

田伸

東京都立大学大学院理学研究科
sharuta@tmu.ac.jp

特に研究上重要と思われた在野の市民科学者の資料，未発掘の研究者資料に注目し，現在および将来の研究者が利用できる体制構築を試みた．具体には，各種の記録類

目的:Thermoplasmata 綱において，2013 年に新目提案について標本や発表著作との関係を中心とした資料研究された Methanomassiliicoccales は，メチル化合物利用性を行うとともに，劣化の危険の大きい 1970 年代以前のの新しいメタン菌グループである．しかし，純粋分離に

ポジフィルム，水彩画を中心にデジタル化をすすめた．

成功した例は中温環境からの一例のみである．本研究で近年採取された標本との対比なども行い，未記載の分類

は，特に高温環境に注目し，Thermoplasmata メタン菌

－ 135 －

IFO Res.Commun. 34
2020の生態，多様性および代謝生理を明らかにすることを目られているゲノム情報はまだ少ないが，部分的な代謝経的とした．

路の欠損が考えられ，他菌と強い共生関係を築いて生存方法:ゲノム解析には，DNBSEQ-G400（ MGI 社)おしている可能性がある．

よび GridION XS（ Oxford Nanopore 社)を用いて塩基配列データを取得しアセンブルした．PCR アンプリコ

酵母の接合型遺伝子のグローバルな機能とホモタリズムとの相互作用

ン解析では，MiSeq（ Illumina 社)によるペアエンド法で得たデータを QIIME を用いて解析した．

前

結果・考察: 高 温 嫌 気 消 化 汚 泥 か ら 取 得 し た

川

裕

美

九州大学大学院農学研究院
hmaekawa@agr.kyushu-u.ac.jp

Thermoplasmata メタン菌 Ca. Methanogranum caenicolaについてゲノム解析したところ，ゲノムサイスは 1,130,161 bp，
ORF 数は 1,158 であり，既報の Thermoplasmata メタン

目的:一般に酵母には明らかな性的二型は見られず，ほ菌のなかでも最小であった．DNA G＋C 含量（ mol%)

ぼ同じ大きさの細胞間で接合する．一方，メタノール資が 62.2 %と高い特徴も見られた．またそのゲノムには，化酵母 Ogataea polymorpha ではサイズの異なる細胞間

メタノール還元メタン生成に必要な mtaABC および mcrAでの接合がみられるが，接合型との関係は明らかでない．

遺伝子が揃っていたが，いくつかの代謝経路に欠失があ接合型遺伝子は転写因子をコードしており，出芽酵母ると考えられた．本菌は未だ純粋分離に成功していない

Saccharomyces cerevisiae では接合フェロモンおよびそのが，共存他菌による代謝補完があると予想される．

受容体遺伝子などが標的遺伝子として知られているが，日本各地の陸上温泉から 50 ℃～ 90 ℃の温泉水が噴出

広範な遺伝子発現が影響を受ける例も報告されている．

する高温土壌を採取し，全 DNA を抽出して，16S rRNA

本研究では，メタノール資化酵母 O. polymorpha の性差遺伝子，メタン生成の鍵酵素遺伝子 mcrA，メチル化合の理解を目指して，2 つの接合型細胞での遺伝子発現の物代謝を担う酵素遺伝子 mtaBC を対象とする PCR アン

全体像を明らかにすることを目的とした．

プリコン解析を行った．系統解析の結果，弱アルカリ性

方法:O. polymorpha 野生型株は接合が誘導される飢餓の高温土壌から，メチル化合物利用性と考えられる複数

条件では接合型を変換するホモタリック株である．接合系統の Thermoplasmata メタン菌が検出された．宮城県型に依存した遺伝子発現解析のために，本研究では接合

鬼首温泉郷からは，既報の mcrA との相同性が 85 %以下

型変換不能とした a 型および α 型一倍体人工へテロタの配列も検出され，新しい系統群の存在が示唆された．

リック株を用いた．また，α 型細胞中で a1 遺伝子を発陸上温泉の高温土壌をメタノールを主要炭素源とする嫌現することにより接合しなくなった擬似二倍体株（ a + α

気培地に接種して集積培養を繰り返し，これらメチル化型)も併せて解析した．これまでに O. polymorpha では

合物利用性メタン菌の分離を試みた．鬼首温泉土壌から液体培養の富栄養および栄養飢餓条件での遺伝子発現解得た 50 ℃の培養系から Thermoplasmata メタン菌が検出

析が報告されているが，本研究では接合率が比較的高いされ，その 16S rRNA 遺伝子塩基配列は，既知菌の配列

MAME 固体培地上での培養を飢餓条件とした．遺伝子との相同性が 93 %と低く，Thermoplasmata 綱の新属新発現解析には CAGE（ Cap Analysis of Gene Expression )種と考えられた．

法を用いた．

これまで Thermoplasmata メタン菌は主に動物腸内から結果・考察:富栄養条件において a 型細胞と α 型細胞で見つかっていたが，本研究により，広く高温自然環境に4 倍以上の発現量の差を示すのは接合型遺伝子を含めても多様な種が分布していることが，培養法および非培養

19 個と少なかったが，全遺伝子の約 6 %に相当する 300

法によって明らかになった．これらメタン菌について得以 上 の 遺 伝 子 が 有 意 差 を 示 し た． こ の こ と か ら，－ 136 －

IFO Res.Commun. 34
2020

O. polymorpha の接合型遺伝子は飢餓条件で接合に関与る．そこで，同経路とは完全に独立した前駆体供給経路する遺伝子発現を制御するだけでなく，多くの遺伝子発であるメバロン酸経路の導入により，アーキア膜脂質の現レベルに影響を与えていることが示唆された．

生産量の大幅な向上を図ることとした．酵母由来の古典

a 型細胞，α 型細胞，a + α 型の全ての株において，飢的メバロン酸経路，および近年アーキアなどから見出さ

餓条件での多数の遺伝子の発現誘導・抑制がみられたが，れている変形メバロン酸経路を大腸菌に導入し，イソプ

約半数は共通しており，a 型細胞または α 型細胞でのみ

レノイド生産に与える影響を検証した．検証にはカロテ発現誘導される遺伝子は各々約 40 個であった．接合型

ノイド色素の生産系を導入した大腸菌を用い，カロテノ

特異性が高く，転写開始点が明確な遺伝子を抽出し，未イド生産量を指標とした分析を行った．

同定の 14 遺伝子を同定した．S. cerevisiae にホモログが結果・考察:酵母のメバロン酸経路遺伝子については，

存在する遺伝子は主に代謝に関与すると予想され，機能プラスミドを用いた方法だけでなく，CRISPR/Cas9 シ

未知の遺伝子の中には子嚢菌酵母に保存されていない遺ステムを利用したゲノムへの挿入によっても大腸菌への伝子が含まれていた．また，接合型変換に必須の DNA導入を図ったが，プラスミドの方がはるかに高いイソプ

損傷修復因子 RAD17 遺伝子は飢餓条件で a 型特異的に

レノイド生産向上効果をもたらしたため，以降の遺伝子高発現していた．本研究により，各接合型の遺伝子発現

導入にはプラスミドを利用した．真正細菌のメバロン酸

プロファイルを取得，新たに接合型特異的に発現する遺経路はフィードバック阻害により活性調節されており，伝子を同定することができた．

それがイソプレノイド大量生産の妨げになるとされている．そこでその代替として，我々が近年好熱性アーキア
Thermoplasma acidophilum より見出した変形メバロン酸

アーキア膜脂質によるバクテリア膜
脂質の置換に基づく大腸菌の細胞膜エンジニアリング
邊見経路の利用を試みた．同経路そのものの導入はほとんど効果を上げなかった一方で，その一部酵素の機能改変によって構築した人工的な変形メバロン酸経路は，酵母由久来のメバロン酸経路と同等のイソプレノイド生産向上効名古屋大学大学院生命農学研究科
hhemmi@agr.nagoya-u.ac.jp

果を有していた．我々はさらに，超好熱性アーキア
Aeropyrum pernix より ATP 要求性の低い新型の変形メ

目的:高温や高塩濃度，低 pH といった極限環境に生育

バロン酸経路を見出し，これをアーキア型経路と命名しするアーキアにとって，それらが生産する特殊な構造のた．その大腸菌への導入は，興味深いことに，パラフィ

イソプレノイド膜脂質によって構成される，広い温度領ンを重層して振とうすることで達成した準嫌気培養条件

域で低いイオン透過性を保つことのできる細胞膜は生育においてのみイソプレノイド生産を向上させ，特に常温に有利な形質である．我々は，このアーキア膜脂質を大性メタン生成アーキアである Methanosarcina mazei の遺腸菌に生産させることで細胞膜の性質を変化させ，塩や伝子を用いた場合には強い効果が見られた．準嫌気条件

有機溶剤に耐性を持つ菌株を構築するという，大腸菌のにおける機能発揮の原因としては，同経路が他のメバロ

細胞膜エンジニアリングに取り組んでいる．アーキア膜

ン酸経路には無い酸素感受性の酵素を含むためだと考え脂質の生合成系を導入した大腸菌は既に構築済みである

られた．同経路の性質は，大腸菌での生産に嫌気条件がため，本研究では生合成前駆体供給経路の強化による，

望まれるアーキア膜脂質の増産に適しており，細胞膜エ

アーキア膜脂質の生産強化を目的とした．

ンジニアリングでの有用性が期待できる．

方法:大腸菌はイソプレノイド生合成の前駆体供給経路
としてメチルエリスリトールリン酸経路のみを有してい－ 137 －

IFO Res.Commun. 34
2020

がこれらの遺伝子の転写活性化因子として働くことが示

空気と電気から含窒素有機化合物を製造する革新的発酵プロセスの創出に向けた基盤研究
高妻篤唆された．また，nifA-OE 株は野生型株よりも高いニト
ロゲナーゼ活性を示した．nifA-OE 株を電気化学培養した結果，野生型株の培養液中には NH4+ が検出されなかっ史たのに対して，nifA-OE 株の培養液中からは有意な量の東京薬科大学生命科学部
akouzuma@toyaku.ac.jp

NH4+ が検出された．また，電極に電位を印加しなかった場合には NH4+ が生産されなかったことから，NH4+ の目的:本研究では，大気成分（ CO2 ，N2 )と電気エネ

合成は電気エネルギーに依存することが確認された．以ルギーから含窒素有機化合物を合成する革新的発酵プロ上の結果から，nifA の過剰発現によって A. ferrooxidans

セスを創出するための技術基盤を確立することを目的との窒素固定能力が向上し，これにより大気成分と電気かした．具体的には，電気エネルギーを利用して炭酸固定

らの窒素化合物生産が促進されることが示された．また，と 窒 素 固 定 を 行 う こ と が 可 能 な 細 菌 Acidithiobacillus

本細菌が保持可能なプラスミド（pBBR1MCS -2)をベー

ferrooxidans の遺伝子操作技術を確立し，本細菌の窒素スとしたゲノム編集用ベクターを開発した．今後はこれ固定能力（ニトロゲナーゼ活性)を増強することにより，らの知見を元に，アミノ酸等の含窒素有機物を生産可能

様々な含窒素有機化合物の電気合成のベースとなる遺伝な遺伝子改変株の構築を行う予定である．

子改変株の構築を目指した．
方法:nifA 遺伝子を広宿主域ベクター pBBR1MCS -2 に微生物が備える可逆的ゲノム改編による環境適応メカニズムの解明

クローニングし，接合伝達法によって A. ferrooxidans
ATCC 23270 株に導入することにより，nifA 過剰発現株

田（ nifA-OE 株)を作出した．nifA-OE 株における遺伝子

中

誠

司

高知工科大学環境理工学群
tanaka.seiji@kochi-tech.ac.jp

発現変動は DNA マイクロアレイにより解析した．ニト
ロゲナーゼ活性の評価はアセチレン還元法によって行った．アンモニウムイオン（ NH4+ )濃度はイオンクロマ

目的:微生物の多くは，個々の細胞が直接外的環境に晒

トグラフィーにより定量した．電気化学培養にはグラされており，外的環境の変化に敏感，かつ即座に対応・

ファイトフェルト（ 12 cm2 )を作用極，Ag/AgCl 電極

適応するためのプログラムを備える．例えば，栄養飢餓を参照極，白金線を対極とした三電極系二槽式電気化学の環境下では，細胞周期停止・胞子形成等の飢餓対応プセル（培地容量 150 ml )を用いた．作用極電位は 0 V

ログラムが発動することは広く知られている．その実体(vs. Ag/AgCl)に設定した．

は，ほとんどの場合，環境適応に関わる因子・経路の活結果・考察:A. ferrooxidans の ニ ト ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子性化や抑制であり，生命の設計図であるゲノム情報，す（ nif HDK )の近傍には転写制御因子をコードすると推

なわちその生物のアイデンティティに影響が及ぶことは定される遺伝子（ nifA )が存在し，その遺伝子産物がない．これに対し，少数ではあるがゲノム情報を直接改窒素固定系の制御に関与していると予想された．そこで編することで環境変化に対応する例も知られている．こA. ferrooxidans の nifA 過剰発現株（nifA-OE 株)を作製し，のような環境適応戦略は，ゲノム不安定化のリスクを伴本変異株の遺伝子発現を野生型株と比較することによう可能性があるが，実際には部分的な改編のみでゲノム

り，NifA の窒素固定制御への関与を調べた．その結果，全体を不安定化させることは無い．このような特殊な機

nifA-OE 株では nif HDK を含む多くの窒素固定関連遺伝

構の解明は，微生物の環境適応戦略の全体像の理解やゲ子の発現が顕著に増加していることが確認され，NifA

ノム編成の進化的理解につながることが期待できる．そ－ 138 －

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こで，環境中の銅イオン濃度によりコピー数変動が起き

変動環境下における葉面細菌のストレス対処と増殖に関する研究

ることが知られている出芽酵母 CUP1 遺伝子をモデルとして，ゲノム改編を伴う環境適応戦略を支える分子メカ

井ニズムの解明を目指した．

口

博

之

京都先端科学大学バイオ環境学部
iguchi.hiroyuki@kuas.ac.jp

方法:Saccharomyces cerevisiae 研究室株 W303 をもとに，
CUP1 遺伝子（ ORF 長 184 bp )を含む約 2 kb のリピートユニットをそれぞれ 0, 1, 2 コピー持つモデル細胞を作

目的:自然環境中では気象変動により微生物の生息環境製した上で，ダメージ応答に関わる因子や，転写で生じは絶えず変化している．植物葉面など表面に生息する微る R -ループ（ DNA:RNA ハイブリッド)解消に働くと生物はその変化の影響を大きく受け，生育に適さない環される RNase H の破壊株を作製した．これらを用いて，境時には細胞損傷もしていると考えられるが，その様な銅イオン添加後のゲノム改編状況を調べた．

中での増殖状況は不明である．そこで本研究では，葉面結果・考察:解析の結果，i )ゲノム改編には 2 コピー以細菌の温度変動環境下での生理状態や変動環境への適応

上の CUP1 ユニットが必要で，ii )改編は CUP1 遺伝子で機構の解明を目指した．

はなく，リピートユニットの整数倍として起きること，

方法:主要な葉面微生物である Methylobacterium 属細菌iii )相同組換え関連遺伝子の欠損株では，コピー数増加（近年の再分類により別属となった菌種も含む)を対象が顕著に抑制されること，iv )非相同末端結合に関与すと し， 詳 細 な 解 析 に は 本 属 の モ デ ル 株 M. extorquens

る因子の欠損株では影響は見られないこと，v )RNase H

AM1 を使用した．生育至適温度 30 ℃と，夏期に達するの欠損株では，コピー数の増加が促進されること，を見高温 37 ℃の間での周期的な温度変動環境の下，寒天培

出した．

地にて本属細菌の培養を行い，増殖・細胞生理・転写な以上の結果は，銅イオンの添加により CUP1 遺伝子のどの解析を行った．

転写活性化の結果生じる R -ループと複製フォークの衝結果・考察:Methylobacterium 属菌種の各基準株を培養

突による DNA2 本鎖切断と，その後の相同組換え修復した結果，37 ℃での生育可 26 株・不可 14 株となり，3がコピー数変動の主因であることを示唆する．しかし，分の 1 が 37 ℃で生育できないことを確認した．30 / 37 ℃

従来より CUP1 リピートユニット内にあるとされていたのサイクル時間を様々設定して，37 ℃で生育不可の複製起点は，転写とすぐさま衝突するような位置関係に

AM1 株 を 培 養 し た と こ ろ，30 ℃ 6 hr / 37 ℃ 18 hr で ははない．そこで，ユニット内の複製起点活性を調べたと60 %程度が生育（コロニー形成)したのに対し，30 ℃

ころ，従来報告されていた位置ではなく，ORF 3' 側直3 hr / 37 ℃ 21 hr では全く生育が認められず，生育には下に活性があるという，上記モデルを支持する結果が得

30 ℃下で 3 時間より長時間を必要と考えられた．またられた．

37 ℃で一定時間保持してから 30 ℃へ移行したときの生

本研究により，遺伝子コピー数の増加が，その遺伝子

存率は 48 hr 保持で 32 %など，37 ℃は亜致死的温度であ産物の必要量に応じた段階的な発現レベルの制御に関わることが分かった．顕微鏡で細胞を観察すると，37 ℃る機構の一環となっているという，出芽酵母が備える非時には桿状の細胞が異常に伸張していた．30 ℃に移すと常にスマートな環境応答戦略のメカニズムが明らかと

4 hr 程度で細胞長は正常に戻ったことから，37 ℃では細なった．

胞分裂の異常が示唆された．しかし，シロイヌナズナ葉上で生息する細胞を 37 ℃に置いても，異常伸張の細胞はほとんど見られなかった．これは，寒天培地上と葉上との細胞分裂の活発さの違いを表していると推察した．
－ 139 －

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次に，温度変動環境への適応機構を調べるため，温度

限酵素 Taq I を細胞内に導入して一過的に加温すること

サイクル環境で生育する細胞について DNA マイクロアで，ゲノム中に多数の DNA 切断を誘発し，転座や変異，レイ解析を行った．30 ℃時に比べて 37 ℃時には約 8 %

ヘテロ接合性喪失などのゲノム再編成を誘発できる．この遺伝子の転写量が 2 倍以上に上昇し，約 10 %が半分の方法により新規表現型を持つ実験室出芽酵母や植物の以下に減少していた．これら遺伝子のうち，転写減少で作出に成功した．そこで今回，TAQing システムを醸造

は鞭毛と細胞分裂，転写増加ではシャペロンの機能が注

酵母株に適用し，醸造や物質生産に適した株を構築する目された．温度サイクル環境での生育に寄与する制御因方法を確立し，最終的に責任遺伝子を同定する道筋を得子を明らかにするため，37 ℃時と 30 ℃時に顕著に転写たいと考えた．本研究では，特に酵母細胞内に TaqI タ

増加する制御遺伝子をそれぞれ 2 個，3 個抽出し，各遺ンパク質を直接送致して TAQing システムを実現するた

伝子破壊株を構築した．1 個の遺伝子の破壊株は 37 ℃恒め，醸造酵母に好適な条件の探索と実施例の獲得を目的

温培養での生存率が減少し，2 個の遺伝子の破壊株はサとした．

イクル培養での生育割合が上昇した．後者の遺伝子破壊

方法:醸造酵母として清酒酵母・ワイン酵母・トルラ酵

株の 1 つは，シャペロン遺伝子の転写量が増加していた

母，対照株として実験室出芽酵母株を用いた．培養条件

ことから，本遺伝子はシャペロンの制御を介して生育には出芽酵母の標準的方法を用いた．TaqI タンパク質は，寄与することが示唆された．

大腸菌内で発現させたヒスチジンタグ付き TaqI をコバ

以上の研究により，Methylobacterium 属細菌の温度変ルトレジンにより精製した．TaqI タンパク質の酵母細胞動環境下における生理状態や生育に寄与する制御遺伝子への導入は，クロンテック社の Xfect トランスフェクショを明らかにできた．今後，これら制御遺伝子の変動環境

ン試薬を用い酵母に最適な条件を見出して行なった．

での生育・生存を高めるような機能や制御機構について，

結果・考察:実験室株での TAQing システム処理条件を

さらなる解析を進めていきたい．

最適化し，その条件を参考に各種醸造酵母での条件の検討を行った．その結果，各種醸造酵母を G1 期に同調させたのち，SD 培地中にて 42 度で 30 分間加温する条件

人工ゲノム再編系による酵母発酵性能の改良
太田邦が最適であることがわかった．次に，TaqI タンパク質を Xfect トランスフェクション試薬により酵母細胞内へ史導入する条件を検討した．この実験には定量的分析のた

東京大学大学院総合文化研究科
kohta2@bio.c.u-tokyo.ac.jp

め，GFP タンパク質を用いた．試薬の標準プロトコルに従ったところ，酵母の種類を問わず，約 3 割の細胞で目的:酵母の発酵性能の改良では，変異源処理や自然変

GFP 蛍光が認められた．種々の導入条件を検討しさら

異，胞子形成を伴う遺伝的な交配によってゲノムを改変に改良したところ，トルラ酵母と清酒酵母で 9 割の細胞

し，醸造に好適な形質を持つ酵母を選択する方法が主流に導入する条件を見出した．この条件で清酒酵母およびである．しかし，従来手法では新規の形質が飽和状態を

トルラ酵母に TaqI を導入し，新形質を有する株を含む

迎えつつあり，また醸造酵母の多くが胞子形成能を失っ

30 クローン以上の変異株を得た．パルスフィールド電ていることから，新しい方法の開発が必要である．醸造

気泳動法を用いてゲノム再編成を簡便に視覚化する泳動用酵母で交配時のようなゲノム再編成を活性化できれ条件を決定し，トルラ酵母変異株については，パルス

ば，新しい有用発酵形質を持つ酵母の獲得が期待できる．

フィールド電気泳動法で染色体再編成の発生を確認し筆者らは，新規ゲノム再編成システム TAQing システ

た．以上から，TAQing システムの醸造酵母での実施法ムを確立した．TAQing システムでは，高熱菌由来の制が確立できたと判断した．

－ 140 －

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謝主要経路をより強く阻害することが示唆された．そのグリシン誘導性 small RNA GcvB による
サルモネラ増殖抑制機構の解析
宮

腰昌

相違の一つとして，GcvB は E. coli の二成分制御系因子
をコードする phoP mRNA と塩基対を形成して発現を抑利制する一方で，S. Typhimurium の phoP は GcvB と塩基対形成せず制御を受けないことを明らかにした．PhoP

秋田県立大学生物資源科学部，
現 筑波大学医学医療系
mmiyakoshi@md.tsukuba.ac.jp

は S. Typhimurium の病原因子の発現を司る二成分制御系因子であることから，GcvB は S. Typhimurium の病

目的:グリシンによって誘導される small RNA GcvB は

原 性 発 現 に は 関 与 し な い こ と が 示 唆 さ れ た． ま た，

腸内細菌科細菌に広く保存され，アミノ酸代謝に関与す

RNA-seq 解析によって S. Typhimurium の GcvB レギュ

る複数の mRNA を転写後レベルで制御する．GcvB の細ロンを探索し，GFP 翻訳融合体による発現解析を用い

胞内存在量は新生転写速度と分解速度によって決定されて複数の新規標的遺伝子を同定した．

る．GcvB の合成はグリシンによって誘導される一方，その分解速度はグルタミン酸・アスパラギン酸 ABC ト

ゲノムマイニングおよび培養試験から存在が見いだされた新規な亜硝酸還元酵素の正体と機能をつきとめる

ランスポーター mRNA から生成する small RNA SroC に依存する．本研究は GcvB の制御メカニズムを明らかにし，天然アミノ酸であるグリシンによる腸内細菌叢の制押御に応用することを目的とする．

木守

長岡工業高等専門学校環境都市工学科
oshiki@eng.hokudai.ac.jp

方法:Salmonella enterica serovar Typhimurium も し く
は Escherichia coli 由来の GcvB を構成的に発現するプラスミドを構築し，S. Typhimurium SL1344 株もしくは目的:以下の二種類の微生物群がこれまでに報告されてE. coli BW25113 株を形質転換した．それぞれの菌株をいない新奇な亜硝酸還元酵素を有することを見いだし，

0.2 %グルコースを炭素源とする MOPS 最少培地で培養

本研究ではタンパク質工学的手法によってこれらの細菌

し，OD600 を 10 分毎に測定した．また，GcvB の発現をが保有する亜硝酸還元酵素を同定することを目指した:

アラビノースによって誘導するプラスミドを構築し，

1) 嫌気性アンモニウム酸化細菌 Candidatus Brocadia 属

GcvB およびその変異体の過剰発現による SL1344 株の細菌，2) 乳酸菌 Lactobacillus 属細菌．

トランスクリプトーム変化を RNA-seq 法によって解析

方法:Ca. Brocadia 属細菌については，大型カラムリア

し，新規標的遺伝子を探索した．抽出された標的遺伝子

クターで本菌を大量培養し，培養物(20 g-wet)をフレン

について GFP 翻訳融合体を作製し，GcvB 発現によるチプレスで破砕し，粗抽出液を得た．メチルバイオロゲ

GFP 蛍光強度の変化をマイクロプレートリーダーを用

ンを電子供与体，亜硝酸を電子受容体とする比活性試験

いて測定した．

を行い，亜硝酸還元(Nir)活性を測定した．粗抽出液を結果・考察:GcvB の過剰発現によって S. Typhimurium

イオン交換，疎水性相互作用，ヒドロキシアパタイト，と E. coli の生育阻害が観察された．グルコースを炭素ゲル濾過クロマトグラフィーへ供し，Nir 活性を指標とし源とする場合には，S. Typhimurium は E. coli よりも顕たタンパク質精製を行った．Lactobacillus 属細菌につい著な遅滞期の延長が見られた．また，GcvB を安定化すて は，L. brevis，L. farciminis，L. buchneri，L. suebicus

る sroC 破壊株ではより顕著な遅延を引き起こした．こを培養し，菌体および粗抽出液の Nir 活性を上述と同様の こ と か ら，GcvB レ ギ ュ ロ ン は S. Typhimurium とに測定した．

E. coli では相違があり，S. Typhimurium では GcvB が代結果・考察:Ca. Brocadia について，粗抽出液の Nir 総－ 141 －

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活性の大半が可溶性画分に存在したため，可溶性画分かtRNA 依存型ペプチド合成酵素のtRNA 基質認識機構の解明と新規ペプチド系抗生物質の創製

ら Nir の 精 製 を 試 み た． 陰 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ
フィーに供したところ，約 1 割の Nir 活性が担体へ吸着し，本画分をさらにヒドロキシアパタイトクロマトグラ

丸

フィーで精製した．精製物を Native PAGE ヘ供し，活山

千登勢

福井県立大学生物資源学部
c-maruyama@fpu.ac.jp

性染色によって Nir 活性を示すタンパク質バンドを可視化 し た．Nir 活 性 を 示 し た バ ン ド を 切 り 出 し， 現 在，
LC-MS/MS 解析によって同定を試みている．一方，陰目的:近年，一部の微生物が生命活動に必須な一次代謝

イオン交換クロマトグラフィーを素通りした 9 割の Nirであるタンパク質翻訳システムからアミノアシル- tRNA

活性は，興味深いことに，我々が検討したいずれの担体

アミノ酸（aa-tRNAaa）をハイジャックし，抗生物質などの二(陽イオン交換，疎水性相互作用)にも吸着が認められ次代謝産物を生合成することが認められた．最近申請者なかった．さらに，本 Nir 活性は極めて安定であり，例

らにおいても，放線菌が aa-tRNAaa 依存的なアミド合成

えば，プロテアーゼ処理を行っても Nir 活性の減少は認酵素により抗生物質を生合成していることを見出した．

められなかった．我々は Ca. Brocadia の Nir がタンパク

本酵素 Orf11 は，Gly-tRNAGly を基質として利用し，抗質分子以外によって構成されるきわめて新規性が高い触生物質 glycylthricin(GT)における Gly 側鎖のアミド合媒分子でないかと想像し，現在，同定作業を進めている．

成を触媒することを明らかにした．タンパク質翻訳シス

乳 酸 菌 Lactobacillus 属 細 菌 に つ い て，MRS 培 地 へ

テムにおいては，Gly-tRNAGly を含め 20 種の aa-tRNAaa

NO2- を添加して 33 時間培養した結果，15 NO2- の大部が存在する．従って Orf11 ホモログ酵素の中に Gly 以外

分が 15NO まで還元された．一方，Nir 活性を示した菌の aa-tRNAaa を基質として認識する同様の酵素が存在す体を破砕して得られた粗抽出液は Nir 活性を示さなかっれば，『 tRNA 依存型アミド合成酵素における tRNA 基質

た．細胞破砕の過程で Nir が失活した可能性を考え，様々認識機構の解明』が可能である．実際に，放線菌ゲノムな検討実験を実施したが，いずれにおいても Nir 活性を

情報より Orf11 に高い相同性を示す酵素遺伝子を探索し見いだすことはできなかった．この結果から， NO2 かたところ，最近 Orf11 ホモログ酵素遺伝子 sba18 を新たら NO への還元反応が非生物的に生じていたのではなに見出した．そこで本研究では，Sba18 組換え酵素を用

いかと我々は着想し，検証を行った．MRS 培地の pH を

いた tRNA 基質認識機構の解明を試みた．

5.5 程度(乳酸菌の培養終了時と同程度)に調整し，菌体方法:大腸菌由来の aa-tRNAaa を基質に，Sba18 組換えを添加せず，NO2- を添加して培養したところ，NO2- が酵素による in vitro 反応を行い，Sba18 の基質を網羅的

顕著に消失することを確認した．従って，乳酸菌の培養に探索した．次に Sba18 の tRNAaa 構造に対する基質認過程で認められた 15 NO2- から 15 NO への還元は非生物的識機構を詳細に理解するために tRNAaa を in vitro 合成し，な反応に由来することが明らかとなった．非生物的な

人工 RNA 触媒 Flexizyme を用いてアミノアシル化した

NO2 の消費が生じることは従来広く認知されてこな

人工基質 Gly-tRNAaa を基質に酵素反応を行った．

かったが，本研究によって，化学反応も窒素代謝へ寄与

結果・考察:Sba18 組換え酵素による in vitro 反応の結しうることが明らかとなった．

果，Sba18 は Gly- tRNA Gly だ け で な く Ala- tRNA Ala ，

15

15

-

15

-

Ser-tRNASer を基質認識することが判明し，新規 GT 類
縁化合物の酵素合成に成功した．さらに人工合成した
aa-tRNAaa ，Gly-tRNAGly ，Gly-tRNAAla ，Gly-tRNASer を 基質とした反応では，Sba18 は全ての Gly-tRNAaa を基質認
－ 142 －

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識し，GT を生成した．また興味深いことに，tRNAGlyのがセオネラミドによる細胞壁の異常蓄積部位にリクの acceptor stem 構 造 の み か ら な る tRNA mimic 基 質

ルートされ（グループ 1 )，別の 30 余りのものは細胞表

Microhelix RNA を基質とした場合においても，Sba18 は層から細胞内に局在を変化させた（グループ 2 )．約 10

GT を生成したことから，Sba18 の tRNAaa 基質認識には，のタンパク質は細胞表層にとどまるものの，壁異常個所

acceptor stem 構造が重要であることが判明した．従っから排除されていた（グループ 3 )．残りの 30 余りにつて Orf11 と Sba18 は高い相同性（ 75 %)を示しながらいてはそれ以外の局在変化を示した（グループ 4 )．そその基質特異性は大きく異なり，Sba18 は広い基質特異

れぞれのグループについて構成因子をタンパク質間相互性を有するアミド合成酵素であることを明らかにした．

作用情報や Gene Ontology により解析すると，グループ
1 のタンパク質には細胞骨格形成に関連するものが濃縮されていることが示された．別な実験からセオネラミド

分裂酵母における細胞壁ホメオスタシスの
化学遺伝学的解析
西村

慎の処理によりいくつかのグルカン合成酵素が細胞壁異常部位に集積することが分かっており，これは細胞骨格の一変調に起因する可能性が考えられる．一方，細胞壁成分

東京大学大学院農学生命科学研究科
anshin@mail.ecc.u-tokyo.ac.jpの分析では，細胞壁中の 1,3 - β -グルカンの比率がセオネ
ラミドの処理時間依存的に上昇することが明らかになっ目的:真菌の細胞壁は細胞形態を維持するために必須なた．今後，細胞骨格関連因子を含むグループ 1 に含まれ構造体であり，壁合成は抗真菌剤の標的でもある．主にるタンパク質の 1,3 - β -グルカン合成における機能を解明

多糖からなる細胞壁のホメオスタシスは細胞周期依存的することで，真菌の細胞壁合成の全貌と詳細を理解したに制御されるが，その分子メカニズムには未解明な点がい．また，グループ 2 にはトランスポーターが濃縮され多く，そもそも必須因子の全貌も明らかではない．本研ており，抗真菌化合物セオネラミドの作用機序の新たな究ではエルゴステロールに結合して未解明の分子機構を側面の存在が示唆された．グループ 3 および 4 について通して細胞壁の異常合成を誘起する抗真菌化合物セオネ

は有意な機能や構造の濃縮は見られていないが，セオネ

ラミドを用いて，細胞壁合成の制御メカニズムの解明をラミドが標的にするエルゴステロールとの機能的な関連試みた．

があるはずであり，今後，詳細な解析を行う予定である．

方法:分裂酵母のほぼ全てのタンパク質（約 5000 )について整備されている，蛍光タンパク質との融合タンパ

自然界からは未発見の有用アミノ酸
脱水素酵素の酵素工学的創製

ク質の発現株コレクションを用いて，蛍光顕微鏡下で細胞内局在を観察した．

櫻

結果・考察:セオネラミドは分裂酵母細胞の成長端及び

庭

春

彦

香川大学農学部
sakuraba.haruhiko@kagawa-u.ac.jp

隔壁周辺の細胞膜エルゴステロールに結合する．タンパ
ク質の細胞内局在データベースによると約 350 のタンパ
ク質が細胞表層に，約 130 のタンパク質が細胞の成長端

目的:本研究では酵素の構造情報を踏まえ，産業に有用と隔壁部分に局在すると注釈されている．それらについな D -グルタミン酸，D -フェニルアラニンおよび L -トリて一株ずつ，セオネラミドを処理して細胞内局在の変化

プトファンなどの合成に利用できる人工アミノ酸脱水素を観察したところ，100 余りのタンパク質が局在変化を酵素を創製することを目的とした．

示すことを見出した．それらを局在変化パターンによっ

方法:2 種のアミノ酸脱水素酵素を対象に，基質特異性て 4 つのグループに分類して集計すると，30 余りのもを変換した人工酵素の創製を検討した．対象とする酵素－ 143 －

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2020

は meso-ジアミノピメリン酸脱水素酵素（ DAPDH )か

ファンに対する反応性が上昇した．

ら作成した人工 D -アミノ酸脱水素酵素（ DA ADH )と
L -フェニルアラニン脱水素酵素（ L -PheDH )である．

大腸からの粘液分泌を活性化する菌株の同定とその作用機序の解明～腸内フローラの変動から推察される
微生物叢への着目～

これらの酵素は好熱菌由来で高い安定性を保持する．
DA ADH は，主に分岐鎖 D -アミノ酸や D- リジンなどに高い活性を示し，逆反応を利用してこれらを 1 ステップで合成できるが，他の D -アミノ酸に対する反応性が低

東くその利用が限られる．L -トリプトファン脱水素酵素

村

泰

希

石川県立大学生物資源環境学部
yasuki@ishikawa-pu.ac.jp（ L -TrpDH )はラン藻などに存在するが，不安定で利用が困難である．我々が見出した耐熱性 L -PheDH は弱いながらも L -トリプトファンに対する反応性を示す．こ目的:大腸管腔は，粘液分泌細胞から分泌された粘液での 2 つの酵素の基質結合ポケットを形成するアミノ酸に覆われており，有害な微生物やその代謝物から宿主を保変異を加え基質特異性の改変を図った．

護するバリア層を形成している．悪質な食習慣に伴うバ結果・考察:DAADH の構造解析（アポ型:5gz1 )を行

リア機能の低下が叫ばれる昨今，本邦における大腸がんい，Symbiobacterium thermophilum 由来の DAPDH の構や潰瘍性大腸炎などの罹患率は劇的に上昇している．マ造（ NADPH /基質結合型:3wbf )と比較すると Asp94

ウスを用いたこれまでの研究において，我々は，腸内にが基質結合部位の一部を形成する可能性が示された．

生育する Bifidobacterium 属細菌の中に，粘液分泌細胞

D94A を作成したところ変異酵素は基質特異性を大きくからの粘液産生を促進する働きを有する細菌がいる可能

変え，D-フェニルアラニンに対する活性が親酵素と比性を見出している．従って，本研究では，腸粘液産生をべて約 50 倍上昇した．また，D -メチオニン，D -ロイシン，促進する Bifidobacterium 属細菌の同定とその作用機序

D-トリプトファンに対する活性も上昇していた．基質の解明を目的とした．

結合ポケットの拡大と疎水性の増大により，かさ高い側方法:ヒトおよびげっ歯類の腸内に存在する 12 菌種の鎖を持つ疎水性 D -アミノ酸に対する反応性が上昇した

Bifidobacterium 属細菌を用いた．培養した各菌について，と考えられる．一方，DA ADH および D94A は D -グルタ

粘液産生能を有するヒト大腸がん細胞株である LS174T

ミン酸に全く反応性を示さない．Clostridium symbiosum細胞との共培養を実施した．評価項目としては，ムチン

由来 L -グルタミン酸脱水素酵素の構造（基質結合型:

糖鎖を標的としたアルシアンブルー染色および過ヨウ素

1bgv )を参考に D -グルタミン酸に活性を示す変異酵素

酸シッフ染色，大腸粘液を構成する主要タンパク質であの 候 補 と し て，D94A /W148K 二 重 変 異 体 と D94A /る Mucin 2（ MUC2 )の発現変動を指標とした定量的

W148K /D124S 三重変異体を作製した．その結果，三重

PCR 法およびレポーターアッセイ系を用いた．レポー

変異体は D-グルタミン酸に対する反応性を獲得した．

ターアッセイ系に関しては，ヒト MUC2 プロモーター

また好熱菌 Geobacillus kaustophilus 由来 L -PheDH の構領域（-1131 ～ +20 )を組み込んだルシフェラーゼレポー

造解析（アポ型)を行い，すでに構造を明らかにしていターベクターを作製し，MUC2 の発現変動をルシフェ

る常温性ラン藻 Nostoc punctiforme 由来の L -TrpDH（アラーゼ活性として測定した．また，LS174T 細胞からのポ型:5b37 )と比較したところ，L -PheDH において基粘液産生促進におけるポジティブコントロールとして質 の 側 鎖 周 辺 に 存 在 す る Leu50 お よ び Leu313 が，Notch 経路阻害剤である LY411575（ LY )を使用した．

L -TrpDH ではメチオニンに置換されていた．L -PheDH

結果・考察:LS174T 細胞を LY の存在下で 6 日間の培養の L50M /L313M 変異体を作製したところ，L -トリプトすることで粘液分泌細胞への分化を促進させた．得られ－ 144 －

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た細胞をアルシアンブルー染色および過ヨウ素酸シッフ

抜した．このうち 16 株について次世代シーケンサーを染色で染色した．画像解析による染色面積の評価ならび用いたゲノムリシーケンス解析を行った．この 16 株かに，細胞破砕液を用いた吸光度測定をおこなった結果，らは応答機構に直接的に関与する有望な原因遺伝子を見

上述の染色法を用いた解析では LY による分化促進作用を出すことが出来なかった．そこで，59 株の表現型の再検出することができなかった．続いて，MUC2 の発現変評価を行った後，形質の安定した 51 株の中で未解析の動を指標とした定量的 PCR 法およびレポーターアッセイ

26 株についてゲノムリシーケンス解析を更に行い，変系を用いて，LY の分化促進効果を評価した．その結果，異点が確認された遺伝子について遺伝子相補及び標的遺LY 存在下において，MUC2 mRNA 発現およびルシフェ

伝子破壊による確認を行った．

ラーゼ活性の有意な上昇が確認された．以上の結果より，結果・考察:変異点の同定及びその遺伝子相補を行い，当該評価系は粘液産生促能を有する Bifidobacterium 属細最初の 16 変異株のリシーケンス解析では，グルタミン菌の探索に際して効果的なスクリーニング系であること

酸合成酵素（ gltB )，翻訳伸長因子（ fasA )，機能未知が示唆された．従って，各 Bifidobacterium 属細菌と共培

膜蛋白質（ sarA )の遺伝子相補実験の結果，表現型の養した LS174T 細胞において，当該評価系を用いて MUC2回復が確認でき，RED 生産応答に異常を起こす原因遺の発現変動を解析した．その結果，MUC2 mRNA の発現伝子であることが示唆された．次の 26 変異株のリシーレベルを有意に亢進させる細菌として，Bifidobacterium

ケンス解析では，モリブドプテリン生合成酵素（ moeA )，angulatum と Bifidobacterium faecale を同定した．今後は，機能未知 TetR 様転写制御因子（ sco1718 )の遺伝子相

有効成分の同定ならびに作用機序の解明を目指す．

補実験の結果，表現型の回復が確認できた．この中で転写制御因子と推定された TetR 様蛋白質遺伝子について注目し，標的遺伝子破壊株を作製し，野生型株との表現

ミコール酸含有細菌の接触刺激による放線菌二次代謝応答機構の変異ゲノム解析を用いた解明
浅水俊型の比較解析を行った．その結果，破壊株ではランダム変異株と同様に，生育能に変化はなく RED 生産が遅延する表現型が確認された．またバイオインフォマティッ

平

クス解析の結果などから本 TetR 様蛋白質は低分子化合東京大学大学院農学生命科学研究科
asamizu@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

物をリガンドとするリプレッサー蛋白質であると推定され，近傍に存在する ABC 輸送体の転写抑制を担うと考目的:放線菌 Streptomyces coelicolor A3(2) はミコール酸

えられた．つまり変異株では ABC 輸送体が構成的に発含 有 細 菌 Tsukamurella pulmonis TP-B0596（Tp）の 細 胞現していることが予想され，なんらかの低分子化合物が間接触を介した刺激に応答し，赤色二次代謝産物（RED )排出されていることが考えられた．以上の結果から，複を生産する．この微生物間相互作用には異属細菌の細胞合培養では Tp の接触依存的な作用により S. coelicolor 細間接触が要求されることから未知の機構が存在すること

胞内に未知小分子が蓄積し，それがストレスとなりが示唆された．本研究では順遺伝学的手法を用い，すな

RED 生産が起こる機構の存在が示唆された．今後は応わち S. coelicolor の RED 生産応答性変異株を選抜，ゲノ答機構の全容の解明に向けてまずは ABC 輸送体によりム中の変異点を同定し，更にその遺伝学的解析から応答排出される未知小分子の同定を行う予定である．

機構に関与する原因遺伝子の同定を目指した．
方法:重イオンビーム（ 12 C5+ )照射により作製した変異胞子ライブラリー（約 15 万個)より 59 株の RED 応
答生産に異常を示した変異株をスクリーニングにより選－ 145 －

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2020

一方で，AUR1 発現抑制下では活性酸素種（ROS）の増加

脂質代謝異常に対する新たな防御応答機構の解明と有用スフィンゴ脂質生産の基盤構築への応用
谷

元が観察されることが以前から知られていた．今回，ミトコンドリア呼吸鎖欠失変異株(rho0)では，AUR1 発現抑制による ROS 増加及び生育阻害効果が弱まることが新洋

たに判明し，ROS の発生源がミトコンドリアであるこ

九州大学大学院理学研究院
tani@chem.kyushu-univ.jpとが示唆された．さらに FMP48 過剰発現は，AUR1 発
現抑制下での ROS の増加を抑制することが分かった．

目的:近年，スフィンゴ脂質の疎水性部の構造であるセFmp48 は転写調節因子である Mks1 と相互作用すること

ラミドの産業応用に大変注目が集まっている．本研究でが，網羅的タンパク質相互作用解析でわかっている．

は，出芽酵母を用いたセラミド大量生産の基盤技術構築

AUR1 発現抑制下での FMP48 過剰発現による生育補填を目指した．酵母にセラミドを大量に蓄積させるために効果および ROS の抑制効果は，MKS1 欠損で見られなは，スフィンゴ脂質代謝系を大きく改変する必要がある

くなった．これらのことより，酵母は AUR1 発現抑制下が，代謝バランスに変動が生じると致死となる．我々は，で HOG 経路依存的に Fmp48 の発現を上昇させ，Mks1

これまでにスフィンゴ脂質の代謝系が破綻すると高浸透を介してミトコンドリア由来の ROS の増加を抑制して圧ストレス応答経路（ HOG 経路)が活性化され，代謝いることが考えられた．

破綻に対する防御応答をしていることを見出している．
この防御応答機構を強化できれば，セラミドを大量生産

光による大腸菌組換えタンパク質
大量発現系の開発

できる酵母の創成に繋がることが期待される．そこで，
スフィンゴ脂質代謝破綻下における HOG 経路の救済メ

華

カニズムを明らかにすることを試みた．

岡

光

正

千葉大学大学院園芸学研究科
mhanaoka@faculty.chiba-u.jp

方法:複合スフィンゴ脂質合成酵素遺伝子（AUR1）の発現抑制によって生育阻害を誘導した際に HOG 経路依存的に転写が増大する遺伝子を DNA マイクロアレイに

目的:大腸菌を用いた組換えタンパク質の大量発現系

よって網羅的に検索した．特に発現誘導の高かった遺伝は，現在も広く利用され多くの実績がある．しかし，こ子に関して，AUR1 発現抑制株に過剰発現させ，生育阻の技術の基盤となる転写誘導系については，今のところ

害抑制能の評価をおこなった．

バリエーションは少なく，薬剤処理などによる従来法に結果・考察:AUR1 発現抑制下で HOG 経路依存的な発加え，簡便で発現効率の高い新たな技術の創出が期待さ

現が上昇する遺伝子 30 個の中から，過剰発現によってれる．本研究では，光合成微生物であるシアノバクテリ

生 育 を 補 填（ 救 済) す る 遺 伝 子 と し て， 機 能 未知のアの光応答転写制御系をさらに明らかにするとともに，

FMP48, UIP4 遺伝子を同定した．UIP4 過剰発現によるその知見を利用して大腸菌における組換えタンパク質の生育補填効果は，FMP48 欠損によって見られなくなっ発現を光で誘導することができる「光発現システム」のたが，UIP4 欠損は FMP48 過剰発現の生育補填効果に影開発を目的とした．

響を及ぼさなかった．このことより，Fmp48 と Uip4 は

方法:本研究では，光依存的な発現調節に関わる転写因共同で救済に寄与するが，Fmp48 が主要な役割を担う

子 と し て， シ ア ノ バ ク テ リ ア Synechococcus elongatus

ことが示唆された．AUR1 発現抑制下で Fmp48 は HOG

PCC 7942 のレスポンスレギュレーター RpaB に着目し経路の MAP kinase（Hog1）とその下流の転写因子であた．S. elongatus を様々な光強度で培養した後，より強る Msn2/4 を介して発現が上昇することが確認された．

い光条件にシフトした際の遺伝子発現パターンと RpaB

－ 146 －

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2020のリン酸化状態の変化を調べた．また RpaB を中心に，酸素耐性ビフィズス菌が有する
抗酸化機構の解明

その標的プロモーターや対応するセンサーキナーゼなどを導入した大腸菌を作出し，RpaB による光発現誘導シ山

ステムの構築を試みた．

本

裕

司

北里大学獣医学部
yyamamot@vmas.kitasato-u.ac.jp

結果・考察:これまでの研究で，RpaB は強光ストレス応答に関わることが示されている．通常条件では RpaBはリン酸化され hliA など標的遺伝子のプロモーターに目的:Bifidobacterium animalis subsp. lactis は， 動 物 の結合し転写を抑制するが，強光条件では速やかに脱リン

消化管に棲息するビフィズス菌の中で酸素に耐性を示す

酸化され転写が開始することから，発現系における優れ

数少ない菌種であり，そのストレス耐性の高さから生菌たリプレッサーとしての利用が期待された．しかし，が必要とされるプロバイオティクスで広く利用されていRpaB が活性酸素など光ストレスに応答するのか，あるる．ビフィズス菌の中には，Bifidobacterium asteroides

いは光自身に応答するのかは不明であったため，多様なや Bifidobacterium indicum のように SOD やカタラーゼ

光強度変化に際した転写制御を詳細に調べた．その結果，を持ち，酸素に耐性を示す菌種も報告されているが，B.

強光のみならず，暗→明や弱光→通常光など他の光条件

animalis は両酵素を持たず，なぜ酸素に耐性を示すかはにおいても hliA などの発現が上昇し，それに伴い RpaB

分かっていない．本研究では，B. animalis JCM 10602

が脱リン酸化されることを明らかにした．続いて，これ株より酸素感受性株と耐性株を分離し，それらの性状をらの知見も踏まえ，大腸菌における光発現誘導系の構築

解析することで，本菌の抗酸化機構の解明を試みた．

を行った．RpaB に対するセンサーキナーゼは NblS で

方法:酸素感受性株と耐性株の分離には変異剤であるあることが示されているため，NblS・RpaB を恒常的に

1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine を用いた．酸素感受発現させるとともに，RpaB に認識されるプロモーター

性株については，大気下で振盪培養した際の増殖能が低の下流に目的遺伝子が連結されるようなプラスミドを作下した株を取得した．酸素耐性株については，通常寒天出した．一方，NblS は強光に伴って生じる酸化ストレ培地上でコロニーを形成できない微好気条件下でもコロスや光合成レドックスの変化により調節される可能性もニーを形成できる株を分離した．分離株のゲノム解析に指摘されているため，光環境を直接認識する別のセンは Illumia HiSeq を用いた．また，もう一つの解析手法

サーキナーゼ Cph1 にも着目し，N 末端の光認識ドメイと し て， 酸 素 に 感 受 性 を 示 す Bifidobacteirum longum

ンは Cph1，C 末端のキナーゼドメインは NblS というキ105A 株に B. animalis のゲノムライブラリーを導入し，メラセンサーを発現させる複数のプラスミドも作出し，

大気下での生育能あるいは低温生残性を向上させる遺伝大腸菌に導入した．これらの系において，光による目的

子を選抜した．

遺伝子の発現誘導を一定のレベルで検出することに成功

結果・考察:酸素感受性株については，振盪培養時の増したが，誘導効率や安定性には多少の課題が残され，光殖能が有意に低下した株を 5 株取得することができた．

照射条件や発現誘導のタイミング，あるいはプロモー取得した 5 株のゲノムを解析した結果，3 株で共通してター配列の改変など，実験条件のさらなる最適化が必要

細胞壁合成系遺伝子に，1 株でストレス耐性への関与がであると考えられた．

報告されている clpP 遺伝子に変異が認められた．同定
された遺伝子の野生型遺伝子をそれぞれの酸素感受性株に導入したところ，好気条件での生育能が回復したことから，これらの遺伝子が酸素耐性に寄与していることが確認された．また，細胞壁合成系遺伝子に変異が認めら－ 147 －

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れた株は，リゾチームやペニシリンに感受性を示し，細分析計により測定した．

胞壁に何らかの異常が生じていると推定された．酸素耐結果・考察:培養光は，生育と PHA 生産のいずれにお性株については，取得した 3 株のうち，2 株で共通していても 800 nm の照射が有効であった．ピルビン酸とリ転写制御因子 X に変異が見られ，酸素耐性への関与が示

ンゴ酸を炭素源として培養すると，好気培養では PHA

唆された．酸素に感受性を示す B. longum 105A 株を用を生産しないが，酢酸ナトリウムを添加すると PHA 生

いたスクリーニングでは，B. longum 105A 株の生育能を産量が大きく増加することを発見した．好気培養時の遺向上させる遺伝子を取得することはできなかったが，低伝子発現解析を行った結果，TCA サイクルの主要な酵

温生残性を向上させる遺伝子としてジヒロド葉酸還元酵

素の発現レベルが低下しており，TCA サイクルの低下

素遺伝子を同定することに成功した．

により PHA が生産されないことが示唆された．また炭以上より，細胞壁や ClpP の正常な機能を保つことが素代謝などの制御に関与する転写因子の転写量が，酢酸

B. animalis の酸素耐性に寄与していることが明らかとの添加により強く誘導されており，酢酸誘導性の PHAなった．また，ジヒドロ葉酸還元酵素が大気下の生残性生産の制御に関与していることが示唆された．

の維持に関与することが見出された．本研究で同定され二酸化炭素を炭素源とした生育について，複数の還元剤た遺伝子は酸素耐性との関係について不明なものが多いと炭酸水素ナトリウムの濃度の効果を検証したところ，ことから，今後さらに解析を進めることで，B. animalis

8 mM チオ硫酸ナトリウムと 20 mM 炭酸水素ナトリウムの抗酸化機構の解明につながると期待される．

の存在下で，最も良い生育を示した．さらに，安定同位体標識した炭酸水素ナトリウムのアミノ酸への取り込みを調べた結果，どのアミノ酸へも炭酸水素ナトリウムが海洋性紅色光合成細菌によるバイオポリエステル生産システムの開発
樋口

取り込まれていた．また炭酸水素ナトリウムを炭素源とした PHA 生産を検証し，チオ硫酸ナトリウム濃度の増美栄子

加により，PHA 生産も増加することを見出した．

理化学研究所環境資源科学研究センター
mieko.higuchi@riken.jp

窒素固定能検証のため，窒素ガスを唯一の窒素源とした条件における生育を観察した結果，数株の紅色光合成

目的:海洋性紅色光合成細菌は，二酸化炭素固定と窒素細菌について生育が認められた．窒素のアンモニアへの固定を行うことが知られており，地球上に豊富に存在す変換を触媒するニトロゲナーゼの活性を評価した結果，る海水を原材料とし，太陽エネルギーを利用できる，環窒素制限条件下でよい生育を示した株は，高いニトロゲ

境負荷低減のための理想的な生物生産システムである．

ナーゼ活性を示した．またニトロゲナーゼ欠損株は窒素

また，バイオプラスチックの一種であるポリヒドロキシガスのみでは生育できなかったことから，ニトロゲナー

アルカン酸（ PHA )合成を行う微生物のひとつである．

ゼによる窒素固定により生育することが示唆された．窒しかし，紅色光合成細菌の二酸化炭素と窒素固定反応が，素固定培養条件における PHA 生産を解析した結果，リどれくらい生育に寄与するのか，また PHA 生産にどのンゴ酸を炭素源とすると PHA を生産しないが，酢酸をように影響するのかは精査されていない．そこで，海洋

炭素源とすると PHA を生産することを見出した．
このように海洋性紅色光合成細菌は，窒素，二酸化炭性 の 紅 色 光 合 成 細 菌（ Rhodovulum sulfidophilum ) のPHA 生産について解析した．

素，光を利用した環境負荷の軽減に貢献できる物質生産

方法:紅色光合成細菌の培養光には，近赤外光（ 730,システムとなり得る微生物であることが示された．

800, 850 nm ) の LED を 用 い た． 生 育 は 濁 度（ OD660 )により測定し，PHA 量はガスクロマトグラフィー質量－ 148 －

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2020

酸素発生はメタン菌に有害であるため，対極を純鉄試験

鉄腐食性メタン生成菌固定化電極を用いた
省エネルギー型二酸化炭素変換技術の開発
若井

片電極とすることで，陽極反応をガス発生から金属鉄の溶解反応へと置換した．次に，鉄腐食性メタン生成菌固暁

定化電極と純鉄試験片電極を太陽電池に接続して通電した結果，気相にメタンが確認された．したがって，当初

神戸大学大学院科学技術イノベーション研究科，
現 海洋研究開発機構超先鋭研究開発部門
wakais@jamstec.go.jp

目標としていた光エネルギー駆動による二酸化炭素からのメタン生成に成功したと言える．一方で，副産物とし目的:再生可能エネルギーを利用した物質生産技術は，て著量の水素も検出された．これは，ステンレス鋼電極

持続可能社会形成に重要なピースの一つである．本研究の露出面が小さく，固定化されているメタン生成菌のメでは，金属腐食を加速させる鉄腐食性メタン生成菌の固タン生成速度を超えて過剰な電流が流れたことにより水体金属から電子を受け取ってメタンガスを生産するとい素が生じたと考えられる．

う能力に注目し，再生可能エネルギーの一つである光エ

最後に，二槽式電気化学セルを用い，対極を白金電極

ネルギーを利用した光駆動型の二酸化炭素変換技術を開としたシステムも構築した．電極からの気泡の発生は確発することを目的とした．

認できたが，電気化学セル全容量が大き過ぎて気相部に方法:本実験には，鉄腐食性メタン生成菌 Methanococcus

メタンを検出することが出来なかった．陽極の劣化消失

maripaludis NBRC 102054（ KA1 株)を使用した．本菌は，を防ぐためには二槽式電気化学セルを用いた耐食性の高

水素をエネルギー源として培養できることに加えて，金い電極を使う必要があるが，今後，鉄腐食性メタン生成

属鉄を電子供与体として培養することも可能である．耐菌固定化電極の表面積拡張や単位面積当たりの固定化量

食性の高いステンレス鋼板（ SUS316:30×10×0.1 mm )の増加，細胞外電子伝達系の高発現株の作成などにより，にエナメル被覆銅線を接続し，絶縁シリコン樹脂で露出

二槽式電気化学セルでの高効率生産が可能であると考え

面が 2 cm2 残るように被覆して電極を作成した．このスている．

テンレス鋼電極に鉄腐食性メタン生成菌を固定化して作用極とし，白金ワイヤーあるいは純鉄試験片で作成したリグノセルロース系バイオマスからの有用芳香族化合物生産に向けた
環境汚染物質分解細菌の利用

対極を太陽電池（単結晶シリコン，最大出力 1.9 W )に接続し，通電後のガス生産量をガスクロマトグラフィー
により分析した．

渡

結果・考察:これまでの研究により，鉄腐食性メタン生

邊

崇

人

京都大学生存圏研究所
takahito@rish.kyoto-u.ac.jp

成菌は金属鉄を用いて生育する際に著量の付着物が金属表面や培養瓶の内壁に形成されることが分かっており，
この能力を用いて電極表面への固定化を検討した．ステ

目的:我々はこれまでに土壌中より Pseudomonas 属やンレス鋼電極を浸漬し，金属鉄顆粒を用いて鉄腐食性メ

Rhodococcus 属を始めとするビフェニル/ポリ塩化ビフェ

タン生成菌を培養することで，電極表面に固定することニル(PCB)分解細菌を十数株単離し，それらの遺伝生に成功した．

化学的研究及びゲノム解析を行ってきた．その結果，こ一槽式電気化学セルを想定した対照実験として，嫌気れらの細菌は，ビフェニル/PCB 等の環境汚染物質だけ瓶中に固定化処理をしていないステンレス鋼電極と対極ではなく，様々な芳香族化合物の分解・代謝に関与するを浸漬し，通電した．対極に白金を用いた結果，気相部

遺伝子を有していると予想された．一方，これらの環境に水素が有意に検出されたが，同時に酸素も検出された．

汚染物質分解細菌は新規な芳香族化合物分解系を獲得し－ 149 －

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2020

た末端リグニン分解細菌の一種とも考えられている．本

確となり，リグノセルロース系バイオマスからの有用芳研究は，リグノセルロース系バイオマスからの有用芳香

香族化合物生産への利用価値が高まると考えられる．

族化合物生産を行う上でビフェニル/PCB 分解細菌を利用できるのかどうか，その可能性について探ることを目

埋立地浸出水処理槽において低濃度・低負荷条件で 1, 4 -ジオキサン
分解を担う微生物群集機能の解明的とした．
方法:ゲノム解析を終了した 12 株のビフェニル/PCB
分解細菌について，様々なリグニン由来の芳香族化合物

宮等に対する資化性を調べ，資化性が良好である株を選抜

田

直

幸

秋田県立大学生物資源科学部
nmiyata@akita-pu.ac.jp

した．その選抜した株については，基質（芳香族化合物)を添加及び非添加の条件で培養後，調製したタンパク質を異なる波長を持つ 2 種類の蛍光色素でそれぞれ標識

目的:有害化合物である 1,4 -ジオキサン（以下，DIOX )し，蛍光ディファレンスゲル二次元電気泳動に供した．

を含有する廃水や汚染地下水を効率的に浄化できる生物

泳動後，それぞれの蛍光波長でゲルイメージを異なる色処理技術の開発が求められている．本研究では埋立処分で取得し，これらを重ね合わせることで発現量に差があ

場の浸出水処理槽において，流入濃度約 2 mg/L の DIOX

ると予想されるタンパク質を優先的にペプチドマスフィ

が生物分解されていることに着目した．この生物処理槽

ンガープリンティング法により同定した．一方，ゲノムにおける DIOX 分解の仕組みを明らかにすることで，生解析や今回得られたプロテオミクスの情報により，リグ物処理槽の安定で効率的な運転管理手法の構築につながニン由来の芳香族化合物の分解等に有用と推定される遺るほか，新たな生物処理技術の提案にもつながると期待

伝 子 に つ い て は， 個 々 に ク ロ ー ニ ン グ し， 大 腸菌やされた．本研究では，この生物処理槽の DIOX 分解を担Rhodococcus 属細菌の発現系を用いて異種発現を行った．

う微生物群集の機能を明らかにすることを目的とした．

結果・考察:今回用いたビフェニル/PCB 分解細菌のリ方法:埋立処分場の浸出水生物処理槽から採取した生物

グニン由来の芳香族化合物の資化性については，種や株汚泥混合液をジャーファメンターに入れ，DIOX 濃度をによって大きく異なることが分かった．その内，比較的6 mg/L に調整した浸出水を流入させて 20 ℃で連続培養

多くの基質を資化する株について蛍光ディファレンスゲ

した．途中で流入水のアンモニア態窒素または亜硝酸態

ル二次元電気泳動に供した結果，発現量の変化を視覚的

窒素を上昇させて馴養汚泥を調製した．DIOX 濃度はガに捉えることや基質添加によって誘導されるタンパク質

スクロマトグラフ質量分析装置で定量した．生物汚泥にを容易に特定でき，さらに，質量分析及びデータベース

よる同化量を調べる実験では 13C 標識 DIOX を添加し，検索による同定も可能となった．同定できたタンパク質

生物汚泥に取り込まれた 13C 含量を安定同位体質量分析を推定される機能によって分類した結果，芳香族化合物

装置で測定した．生物汚泥の細菌叢は，全 DNA を抽出の分解・代謝酵素や輸送等に関与するタンパク質が多した後，プライマー 515F 及び 806R を用いて 16S rRNA

かった．一方，今回用いたビフェニル/PCB 分解細菌よ遺伝子を PCR 増幅し，Illumina Miseq で解析した．

り，リグニンの化学結合様式で最も多い β-O-4 結合の開結果・考察:採取した生物汚泥の回分培養の結果，硝化裂に有用と推定される細菌由来のリグニンペルオキシ

阻 害 剤 1 -アリル- 2 -チオウレア（ ATU ) の 添 加 に よ り

ダーゼ遺伝子を複数発見し，高発現に成功した．以上，

DIOX 分解が大きく阻害されることが判明した．生物汚ゲノム情報の精査やプロテオミクスを詳細に行うことに泥の連続培養では，アンモニア態窒素の流入濃度を 20

より，ビフェニル/PCB 分解細菌は芳香族化合物の分解・～ 80 mg/L に上昇させると DIOX 除去速度が 2 ～ 3 倍に代謝に有用な酵素や遺伝子を数多く有することがより明増加したが，亜硝酸態窒素の流入濃度を上昇させても－ 150 －

IFO Res.Commun. 34
2020

DIOX 分解速度はほとんど増加しなかった．一方で，アCellulosimicrobium sp. NTK2（以下 NTK2 株)を単離しンモニア馴養汚泥の回分培養では，ATU 添加によりた．NTK2 株は，8 つのキチナーゼ遺伝子と 2 つのキチ

DIOX 分解は大きく阻害されるものの，ATU 添加時でもン結合タンパク質（ CBP )遺伝子を持つ．本研究では，

依然として無添加時の 59 %の除去速度が示され，DIOX

NTK2 株やその遺伝資源を利用した穏和な環境でのキチ分解におけるアンモニア酸化菌及びそれ以外の微生物のン分解，分解物／キチナーゼの有効利用の実現を目指し，寄与率はそれぞれ 41 %，59 %と見積もられた．アンモNTK2 株の特性や NTK2 株が持つキチナーゼの能力にニア馴養汚泥を用いた 13C 標識 DIOX の分解試験においついて評価した．

て，4 日間で分解された DIOX の 24 %に相当する炭素が方法:NTK2 株の培養は 25 ℃で好気的に行い，培地と生物汚泥に同化された．先の分解試験と同様に，ATU

して ISP1（必要に応じてキチンパウダー（CP )等を添加)

添加でも約 60 %の DIOX が分解されたが，ATU 添加時

または，2 %キチン廃棄物（水道水)を使用した．タンの炭素同化量は 8 %程度に留まり，ATU 無添加時の 1/3

パク質の同定は，N 末解析結果をゲノム情報と照らし合にまで減少することが明らかになった．即ち，DIOX 分

わせた．キチナーゼ活性の評価には，エチレングリコー

解におけるアンモニア酸化菌の寄与率は約 40 %で他のルキチン（EGC）を基質としたザイモグラフィー，CP，分解菌の寄与率の方が大きいが，生物汚泥による同化量

EGC，キチンナノファイバー（ CNF )との反応後の還で比較するとアンモニア酸化菌の寄与が 2/3（＝約 70 %)元末端増加，p-nitrophenyl chitobiose((GlcNAc)
2 -pNP)を占めていた．細菌叢解析の結果，アンモニア馴養汚泥に対する pNP 遊離活性，キチンオリゴ糖（ COS )分解

では DIOX 除去速度がアンモニア酸化細菌 Nitrosomonas

後の TLC を採用した．胞子発芽抑制試験には，Alternaria

ureae（ r = 0.71; p < 0.01 ) 及 び 従 属 栄 養 細 菌 Pandoraea

brassicicola の胞子を使用した．

sp.（ r = 0.84; p < 0.01 )の検出割合と高い相関を示した．

結果・考察:NTK2 株を 2 % CP 存在下で培養すると，以上の結果から，低濃度 DIOX の分解資化においてアン

著しく生育が向上し，複数のタンパク質の分泌と高い

モニア酸化菌が関与し得るとの新しい知見が得られた．

EGC 分解活性（ザイモグラフィー)が見られた．分泌今後，アンモニア酸化菌が関与して生物汚泥による同化されたタンパク質の N 末解析から，4 種のキチナーゼ，に至るまでの経路を解明する必要がある．

CBP，2 種の Bacterial solute binding protein が同定された．また，2 %キチン廃棄物（カニ殻，イカ中骨，シイタケ柄)を培地として NTK2 株を培養しても良好な生

カニ殻堆肥由来の放線菌
Cellulosimicrobium sp. NTK2 の遺伝資源と特性を利用した次世代バイオマス“キチン”からの有用物質生産
有馬

二

育と廃棄物の分解がみられ，培養上清の SDS -PAGE や
ザイモグラフィーから，分泌されるタンパク質は廃棄物ごとで差が見られた．特にカニ殻で培養すると，NTK2
株は 2 種のプロテアーゼも分泌し，これらはカニ殻を構朗成するタンパク質分解に関わると考えられた．一方で鳥取大学農学部
arima@tottori-u.ac.jp

NTK2 株は，グルコースやデキストリンの濃度に比例して生育が阻害された．8 つのキチナーゼの組換え酵素を目的:キチンは生理活性物質の材料やセルロースに次構築し，(GlcNAc)
₂ -pNP，COS，EGC，CNF，CP に対ぐ次世代バイオマス資源としての利用に期待されていする反応性を調べた結果，7 つについてはいずれかの基る多糖であるが，その分解には煩雑な作業や環境負荷質に対して反応性を示し，それぞれで基質特異性は異を伴い，未だ有効利用には至っていない．我々はこれなっていた．また，いずれの酵素も CP に対する分解活までに，カニ殻堆肥からキチンを迅速に分解する放線菌性が見られなかったが，全ての組換え酵素を混合すると，－ 151 －

IFO Res.Commun. 34
2020

比較的高い分解活性が観察された．さらには，5 つの組

ルタロドプシンを発現させたところ，ATP レベルが向換え酵素は，キャベツ黒すす病原菌 A. brassicicola の胞

上した．これは，ミトコンドリアにおける呼吸鎖電子伝

子発芽も抑制した．

達系に加え，デルタロドプシンにもプロトン濃度勾配を形成させることで，ATP レベルが向上したと考えられる．つぎに，この出芽酵母の細胞膜に，以前に発表者ら

光駆動 ATP 再生ミトコンドリアを用いた
光エネルギー利用型酵母の創製とバイオファインケミカル生産への応用
原

清がグルタチオン排出トランスポーターであることを見出した Gxa1 を発現させ，光受容分子（ all-trans-retinal )を含む最少培地にて，光を照射しながら培養した．その敬

結果，細胞内グルタチオン濃度の上昇だけでなく，細胞

静岡県立大学食品栄養科学部
k-hara@u-shizuoka-ken.ac.jp

外グルタチオン濃度の上昇も観察された．グルタチオンの生合成と ABC トランスポーターである Gxa1 による目的:酵母に代謝工学的な改良を施し，様々な有用物質

グルタチオンの細胞外への排出には ATP の消費を伴うの発酵生産性を向上させる研究が行われている．しかし，ため，細胞内および細胞外のグルタチオン濃度の向上は，目的物質の生産性が向上するにつれ，酵母が細胞内エネ

デルタロドプシン発現により ATP 再生が活性化された

ルギー不足に陥り，生育の低下や目的物質の生産性の頭ことに起因すると考えられる．

打ちに直面することが少なくない．これは，発酵そのものが，インプットである炭素源を，「細胞自身の材料」，「目

1 細胞解析による遺伝子発現ノイズ制御機構の網羅的解明的生産物」，「細胞内エネルギー」の 3 つのアウトプットに振り分けるプロセスであり，これらがトレードオフの宮関係にあることに，根本的な原因が存在すると考えられ崎亮

産業技術総合研究所生物プロセス研究部門
ryo.miyazaki@aist.go.jp

る．そこで我々は，この三つ巴の状態にある発酵プロセスから「細胞内エネルギー」を切り離すべく，本来は光エネルギーを利用できない酵母への光エネルギー利用能

目的:近年の 1 細胞解析技術の進展によって，同一条件の付与を目的とした．

で培養したクローン細胞集団であっても個々の細胞レベ

方法:本研究では有用物質生産によく用いられる出芽酵

ルの表現型は均一でないことが明らかとなってきた．そ母を宿主として用いた．また，その ATP 再生を活性化のような 1 細胞レベルの表現型の不均一性がクローン集させるために，高度好塩菌 Haloterrigena turkmenica が団内に機能的多様性と柔軟性を生み出し，集団全体のスもつ光駆動型プロトンポンプの一種であるデルタロドプ

トレス耐性や物質代謝など様々な環境適応能力を促進さ

シンを出芽酵母のミトコンドリア膜に発現させた．デル

せることも報告されている．一方で，遺伝子発現ノイズ

タロドプシンのミトコンドリア膜での特異的発現は，は全生物・全細胞・全遺伝子で起こる普遍的な現象であウェスタンブロッティングにより確認した．ATP レベ

るにも関わらず，その制御機構を網羅的に解明した例は

ルは，ルシフェリン - ルシフェラーゼ法を用いて測定し皆無である．そこで本研究では，環境細菌をモデルとした．また，生産される際に ATP を消費するファインケて進化実験，ゲノミクス，マイクロ工学を統合したアプ

ミカルのモデルとして，グルタチオンを生産物の指標とローチにより遺伝子発現ノイズの制御因子をゲノムワイ

して DTNB 法を用いて測定した．

ドに同定し，その制御機構の解明を目的とした．

結果・考察:現在グルタチオンは，出芽酵母を用いて生方法:まず，一般モデル生物の Escherichia coli MG1655

産される場合が多い．出芽酵母のミトコンドリア膜にデ（大腸菌)と病原菌モデルの Pseudomonas aeruginosa PAO1

－ 152 －

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2020（緑膿菌)のゲノムから必須遺伝子と非必須遺伝子をそ微生物により生成される
高蓄電ミネラルの生成機構解明

れぞれ複数選び，緑色蛍光タンパク質（ GFP)遺伝子との転写融合レポーター株を構築した．遺伝子発現を正二確に定量するために，レポーター断片は染色体の同一部

又

裕

之

静岡大学グリーン科学技術研究所
futamata.hiroyuki@shizuoka.ac.jp

位に 1 コピーとなるように挿入した．各遺伝子の発現量
ならびにノイズ（ Coefficient of Variation )は，セルソー
ターを用いて同一培養条件・同一成長期の約 10 万細胞

目的:バイオマスの有効利活用とグリーンエネルギーのから測定した．次に，セルソーターを用いて遺伝子発現

創製は，循環型低炭素社会の構築に向けて必須の課題で量の平均値周辺 5 %の細胞集団の継続的分取，あるいはある．本研究室において微生物燃料電池負電極上より分

両端 5 %の集団の交互分取を繰り返すことによって，遺離された硫酸還元細菌 Desulfovibrio sp. HK-II 株と AY-IV

伝子発現ノイズが野生型の値から変化した進化変異株の株は，系統学的に非常に近縁であるにも関わらず，有機取得を試みた．変異部位の同定は，進化変異株の全ゲノ物分解に伴い電気化学的特性が異なる蓄電ミネラルを生ムリシーケンスによって行った．最後に，進化変異株で成した．そこで本研究では，両菌株の蓄電ミネラル生成見つかった変異を相同組換えによって野生型株

機構を明らかにし，微生物学的知見の深化と新規蓄電部（ MG1655 および PAO1 )に再導入し，遺伝子発現ノイ材開発に資すことを目的とした．

ズを制御する因子の同定を試みた．

方法:ゲノムデータをベースに硫酸還元に関わる遺伝子

結果・考察:約 1 ヶ月の進化実験を経て，MG1655 株のを選抜し比較した．微生物が生成したミネラルは XRD，

非必須遺伝子の発現ノイズが低下した進化株が 3 株，

EDX および FE-SEM 等による物質科学的解析を実施しPAO1 株の必須遺伝子の発現ノイズが低下した進化株がた．カーボングラファイトを負電極とする微生物燃料電1 株ならびに非必須遺伝子の発現ノイズが上昇した進化

池を構築し電気化学的解析を実施した．

株が 1 株得られた．これら進化株の全ゲノムをリシーケ

結果・考察:Average Nucleotide Identiy（ ANI )解析のンスし野生型株のゲノムと比較したところ，各進化株の結果，HK-II 株および AY-IV 株のゲノム間の相同性はゲノムに複数の点変異または欠失が見つかった．そこで，

99.99 %であった．HK-II 株由来の Mackinawite は襞構造

これらの変異の中から非同義置換や明らかに影響がないを有する数十 μm サイズの箔片である一方，HK-IV 由来と考えられる非コード領域の変異等を除き，遺伝子アノの Mackinawite は数十 μm サイズの箔片上に半球状の構

テーション情報を精査したところ，興味深いことに，各造体が観察された．Mackinawite 生成に関与すると推定進化株に特異的な変異だけでなく，複数の進化株に共通される硫化水素生成速度の影響が考えられた．そこで硫するオルソログ遺伝子（すなわち普遍的に遺伝子発現ノ酸還元代謝遺伝子を比較解析した結果，両菌株とも各種イズを制御すると考えられる因子)にも変異が認められ遺伝子が 100 %一致しておりゲノム情報から生成機構のた．これらの中から実際に遺伝子発現ノイズに影響を与糸口を探ることは困難であった．

えている変異を同定するため，野生型株において各変異

AY-IV 株が生成する蓄電物質（ RBM-IV )の充放電容を個別に相同組換えによって導入し，計 6 株（大腸菌 3 株，

量は，HK-II 株が生産するそれ（ RBM-II )と比較して 2.3

緑膿菌 3 株)の再変異株の作製に成功した．現在，これ倍高かった．SEM 観察から，RBM-II は数～数十 μm のら再変異株の遺伝子発現ノイズをセルソーターおよびタ

襞状構造を有し，RBM-IV ではそれに加え数十～数百

イムラプス顕微鏡により測定しており，遺伝子発現ノイnm の粒子が確認された．EDX 解析から，RBM-II およズ制御因子の同定を試みている．

び RBM-IV 中の鉄および硫黄の構成割合は，それぞれ
55.1 %および 67.4 %であった．以上の結果から，これら－ 153 －

IFO Res.Commun. 34
2020の RBM-II および RBM-IV の充放電容量が異なる要因と試験に用いた．BPA 浄化試験は，吸着菌と分解菌を各々して，物質の形状および構成元素の違いが考えられた．

単独または混合条件で懸濁させた系に BPA を添加する

今後，RBM-IV にのみ確認された 100 nm の粒子や微量ことで行った．試料は経時的に採取し，遠心分離による元素が充放電容量に及ぼす影響について解析する必要が

上澄液中の BPA（液中 BPA )と，回収菌体を溶媒で洗ある．一方，硫酸を最終電子受容体とする硫酸還元条件

浄することで回収された BPA（菌体吸着 BPA )をそれ下で HK-II 株を培養した際，本株は不完全酸化型代謝のぞれ高速液体クロマトグラフィー（ HPLC )により経時ために電子供与体の乳酸を酢酸に変換し細胞外に排出す的に測定した．さらに，BPA で長期間馴養した活性汚る．一方で，細胞外電子伝達時にはこの酢酸の再利用が泥に吸着菌を導入し，BPA 含有人工排水を用いる場合可能であった．この結果より，HK-II 株は細胞外の電位も含めて同様の浄化試験を行った．

を感知し代謝を変換可能であることが示された．

結果・考察:環境試料からの各分離菌株による芳香族化

以上の結果から，本研究では近縁の微生物株が生成す合物吸着試験の結果，除去効果は菌株により大きく異る蓄電性ミネラルの特性を明らかにし，微生物の電気的なっていた．この中から菌体濃度 OD600 で 1.0，BPA 初期

代謝制御の可能性を示した．今後，蓄電機構の解明，細

濃度 0.1 mM とした吸着試験において 10 分以内に BPA 濃胞外電子伝達機構および電気的代謝変換機構の解明を進度を 50 %低減し，濃度を適宜変えた試験から Freundlich

める予定である．

の吸着等温式に従うと共に，広い pH と温度，混在する有機物などの環境条件下で安定した吸着特性を示す株を選抜した．なお，液中から除去された菌体吸着 BPA は

芳香族化合物を特異的に吸着する微生物を用いた活性汚泥の機能向上に関する研究
森

一

菌体を溶媒で洗浄することで容易に回収できることを確認している．続いて，吸着菌や分解菌を用いた BPA 浄化試験を行った．BPA 吸着菌を単独で BPA 含有水に懸博

濁させた場合は，菌体への吸着により短時間の内に液中

山梨大学大学院総合研究部
mori@yamanashi.ac.jp

BPA 濃度が減少し，以後，試験終了まで変化は見られなかったが，供試分解菌単独の系では生分解作用により

目的:各種分解菌に着目した有害化学物質の代謝機構の

徐々に液中 BPA 濃度が低下した．一方，両者を混合し解明と水質浄化への応用が広く研究されているが，浄化た系では，速やかに液中 BPA 濃度及び菌体吸着 BPA 量系での生物吸着の作用機作とその応用はあまり検討されが減少し，系内の全残存 BPA 量の消失も分解菌単独のていない．ここでは，様々な環境試料から各種芳香族化

系よりも飛躍的に高まることが観察され，吸着菌が分解合物を特異的に吸着する細菌を分離し，特にビスフェ菌の作用を向上させることが明らかとなった．続いて，ノール A（BPA )に高い吸着効果を示した菌株を用いて，馴養活性汚泥と吸着菌の混合系で除去試験を行ったとこ

分解菌や活性汚泥との併用による水質浄化効果の向上のろ，吸着菌の添加により BPA 濃度の低減が馴養活性汚可能性を検討した．

泥単独の場合よりも促進され，吸着作用をもつ微生物が方法:各種環境試料より栄養培地を用いて網羅的に細菌

活性汚泥の機能向上に寄与することが示された．

を分離した後，各分離株の菌体と各種芳香族化合物を液中で混合する吸着試験において優れた吸着除去効果を示す株を選抜した．続いて，特に BPA に対して優れた吸着効果を示した菌株と，既往研究において取得された
BPA 分解菌 Novosphingobium sp. FID3 を以後の水質浄化－ 154 －

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2020の活性や可溶性 AAR 量を増大させ，炭化水素生産性を

軽油相当の炭化水素を大量生産可能な
シアノバクテリアの創出
新井宗向上させる上で重要なアミノ酸残基を 6 つ見出した．これらの多重変異体を 26 種作製したところ，これまでで仁

最も高活性な AAR 変異体の創出に成功した．

東京大学大学院総合文化研究科
arai@bio.c.u-tokyo.ac.jp

同様にして，酵素 ADO の高機能化に取り組んだ．その結果，PCC 7942 に由来する ADO が最も高活性だった．

目的:シアノバクテリアは，アシル ACP 還元酵素（AAR )また，37 個の 1 アミノ酸置換変異体を作製した変異解とアルデヒド脱ホルミル化オキシゲナーゼ（ ADO )と析により，ADO の高活性化に重要なアミノ酸部位を 20

いう 2 つの酵素を用い，光合成によって軽油相当の炭化か所見出し，可溶性 ADO 量を増大させる変異の同定に水素を合成できることから，地球温暖化の防止に有効なも成功した．さらに，ADO が AAR から基質を受け取る

再生可能バイオエネルギーの生産源として注目されてい際に，AAR と結合する部位を同定した．

る．これらの酵素を，大腸菌に導入すると炭化水素を生最後に，上記の高活性型 AAR と ADO を多様な組み合産可能になることから，AAR と ADO は微生物を利用しわせで導入したシアノバクテリア Synechocystis sp. PCC

た炭化水素生産に必須である．しかし，AAR と ADO の6803 の変異株を 24 種類作製した結果，軽油相当の炭化活性は低いため，両酵素の高活性化が急務である．そこ

水素の生産量が野生型株よりも 5 倍以上向上したシアノで本研究では，AAR と ADO の高活性型変異体を創出し，バクテリアの創出に成功した．

軽油相当の炭化水素を大量生産可能なシアノバクテリアの創出を目指した．
方法:AAR の活性を測定する際には，AAR の反応が律速段階となる条件で ADO とともに大腸菌内で共発現させ，生産された炭化水素（ヘプタデセンもしくはペンタデカン)をガスクロマトグラフ質量分析計で定量した．
また，大腸菌内の可溶性画分に存在する AAR の量（可溶性 AAR 量)を SDS -PAGE やウェスタンブロットで定量した．そして，炭化水素生産量を可溶性 AAR 量で割った値を活性とした．ADO や各変異体の活性も同様にして測定した．最後に，シアノバクテリア Synechocystis
sp. PCC 6803 に両酵素の遺伝子を導入して培養後，合成された炭化水素を定量した．
結果・考察:まず，AAR の高機能化変異体を構築した．
代表的なシアノバクテリア 12 種類がもつ AAR を比較した 結 果，Synechococcus elongatus PCC 7942 由 来 の AARが最も高活性だった．また，淡水性よりも海洋性のシアノバクテリアに由来する AAR のほうが炭素数の少ないアルカンを多く生産した．次に，低活性型 AAR のアミノ酸配列を，高活性型 AAR に近づけるようにして，1 ア
ミノ酸置換変異体を約 80 個作製した．その結果，AAR－ 155 －

2017 年度若手研究者助成の研究報告
助成期間:2017 年 4 月～ 2020 年 3 月

IFO Res.Commun. 34
2020

株では既知鉄還元菌 Geobactor sulfurreducens や Geobactor

結晶性酸化鉄を還元する新規な微生物の分離培養と代謝メカニズムの解明
青柳bemidjiensis と比べて 2 ～ 4 倍の二価鉄の生成が観察された．このことは，分離菌がこれまで知られていない細智

胞外への電子伝達機構を有することを強く示唆している．ドラフトゲノム配列解読の結果，分離菌のゲノムサ

石巻専修大学共創研究センター，
現 産業技術総合研究所環境創生研究部門
aoyagi-to@aist.go.jp

イ ズ は 各 々 3.68 MB（ AOG1 株 )，3.92 MB（ AOG2 株 )，4.48 MB（AOG3 株)，4.31 MB（AOG5 株)，3.27 MB（AOP6

目的:地球の大部分を占める嫌気土壌圏には様々な結晶株)であり，細胞外電子伝達の主要な機構として知られ性酸化鉄が豊富に存在するため，その生物学的還元反応

るシトクロム c や導電性ナノワイヤーと推察される線毛は地球の炭素・エネルギー循環を理解する上で重要であ遺伝子の保有が確認された．新しい電子伝達機構は未知る．しかし，結晶性酸化鉄の微生物還元に関する知見は遺伝子が関与する可能性が高いと想定されるため，ゲノ乏しい．本研究は，結晶性酸化鉄での集積培養系から分

ム情報と結晶性酸化鉄での培養試験を融合させた比較ゲ

離した Deltaproteobacteria 綱の新規細菌 6 種の生理学的ノムや網羅的遺伝子発現解析により，分離菌の鉄還元メ

特徴付けとゲノム解読による還元メカニズムの解明，おカニズムの解明を進めてゆく．
一方，結晶性酸化鉄での集積培養系では，溶解性鉄でよびさらなる新規な当該微生物の高度集積・分離培養を試みた．

の 培 養 で は 全 く 得 ら れ な い 新 規 な Proteobacteria 門 や方 法: 鉄 還 元 能 を 有 す る 分 離 菌 6 種[Geobacter spp.

Firmicutes 門などに属する微生物が高度に集積してい(AOG1 ，AOG2 ，AOG3 ，AOG4 ，AOG5)，Desulfuromonas

た．30 の高度集積系を対象に，酢酸と溶解性鉄での限sp.(AOP6)]を結晶性酸化鉄[4 種：Goethite，Hematite，

界希釈培養および共存する主要な微生物が利用できない

Lepidocrocite，Magnetite(10 または 20 mM)]を電子受と想定された炭素源（糖類)と溶解性鉄での培養系も用容体，酢酸（ 5 mM )を電子供与体として用いて 1 ヶ月

意し，希釈培養を複数回実施した結果，Firmicutes 門に間培養し，独自に最適化した高濃度塩酸での鉄抽出法に属する 2 種の純粋培養に成功した．これらの新しい分離よる二価鉄の生成量を評価し，生理学的に特徴付けた．

菌も未知の細胞外電子伝達メカニズム解明へ向けた手掛

さらに，分離菌 6 種の鉄還元メカニズムを明らかにすべ

かりになるだろう．

く，2 種（メイトペアとペアドエンド)の DNA ライブ
ラリを作成し，ゲノム解読を実施した．一方で，未培養の新しい微生物を獲得するため，水田や森林などの陸域土壌および海底下コアサンプルを微生物接種源に，酢酸と結晶性酸化鉄にて約 100 の条件で培養を開始した．4
年以上集積培養を継続した培養系を対象に，微生物 16S
rRNA 遺伝子を対象とした次世代シークエンサー解析を実施し，その結果に基づいて限界希釈培養および難利用
性の結晶性鉄から易利用性の溶解性鉄へ培養基質の置換を行い，高度に集積させた標的微生物の生育を促進させて純粋培養系の構築を行った．
結果・考察:生理試験の結果，分離菌 6 種は結晶性酸化鉄に対して還元活性を示し，特に AOG1 株および AOG5
－ 157 －

発酵研究所助成研究報告集

第 34 号【非売品】

令和２年 12 月 10 日 印刷
令和２年 12 月 20 日 発行
編集委員長
編集委員
発行人
発行所

印刷所

横田 明
大島敏久，加藤暢夫，金子嘉信
高橋洋子，藤田正憲
樽井直樹
公益財団法人発酵研究所
大阪市淀川区十三本町 2 丁目 17 番 85 号
TEL. 06 － 6300 － 6555
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