Photon Factory Activity Report 2018 #36 (2019)

AR-NW12A/2017G051

ビリベルジン結合型シアノバクテリオクロム・AnPixJg2 変異体の構造解析
Structural analysis of a cyanobacteriochrome AnPixJg2 mutant that can incorporate
biliverdin
宮崎剛亜 1,2*, 伏見圭司 2,3, 成川礼 1,2,31
静岡大学グリーン科学技術研究所 〒422-8529 静岡県静岡市駿河区大谷 836
2静岡大学大学院総合科学技術研究科 〒422-8529 静岡県静岡市駿河区大谷 836
3
JST CREST, 〒332-0012 埼玉県川口市本町 4-1-8
Takatsugu MIYAZAKI1,2*, Keiji FUSHIMI2,3 and Rei NARIKAWA1,2,31
Research Institute of Green Science and Technology, Shizuoka University,836 Ohya, Suruga-ku, Shizuoka, 422-8529, Japan
2
Graduate School of Integrated Science and Technology, Shizuoka University,
836 Ohya, Suruga-ku, Shizuoka, 422-8529, Japan
3JST CREST, 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332-0012, Japan
1 はじめに
光は光質（波長）、光量（強度）、照射場所、照射時間という 4 つのパラメーターを自由に制御することが可能なツールであり、数多くの分析技術に利用されている。最近では、光合成生物を始めとする様々な生物のゲノム情報から光を感知する「光受容体」が単離・同定され、その諸性質が明らかにされている。光受容体は色素タンパク質の一種であり、特定の波長光を吸収することによって光変換（可逆的な分子構造の変化）を示す。この特徴的な特性を利用し、光操作によって生物活性を制御する「光スイッチ」の開発を目指す光遺伝学（オプトジェネティクス）が急速に発展している中で、哺乳類に対して非侵襲、高浸透である長波長光を感知する光受容体が特に注目を浴びている。
シアノバクテリアのみに保存されている光受容体であるシアノバクテリオクロム（CBCR）はビリン色素を結合することで光変換を示す。これまでに様々な波長領域で光変換を示す CBCR が発見され、特に、シアノバクテリア Anabaena sp. PCC7120 由来の CBCR・AnPixJg2 はフィコシアノビリン（PCB）が結合した結晶構造 [1] としてその構造が明らかにされている。我々は、CBCR を基盤に光スイッチの開発 [2] や哺乳類等の様々な生物に存在し、天然物の中で最も長波長の光を吸収するビリベルジン（BV）を結合する CBCR の発見 [3, 4] をしてきた。
そこで、本研究では BV を結合する CBCR を利用した長波長光感知型光スイッチの開発を目指し、CBCR に BV を効率的に結合させるための分子機構を明らかにすべく、AnPixJg2 を基盤にした変異導入法による色素結合効率の評価と X 線結晶構造解析を行った。

2 実験
CBCR の分子構造 [1] とアミノ酸配列の比較からBV の結合に重要なアミノ酸残基を抽出し、pET28aベクターに組み込まれた AnPixJg2 の各箇所に部位特異的変異導入を施した。生化学的、光化学的解析から、最終的に H293Y, F308T, H318Y, I336V の 4 つの変異導入を施した変異体・AnPixJg2_BV4 が最も効率的に BV を結合すると判断した。AnPixJg2_BV4 を BV合成系プラスミド pKT270 [5] を保有する大腸菌 C41株にて発現させ、His タグを利用した Ni アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーによって電気泳動的に単一に精製した。精製したタンパク質を 0.2 M 硫酸アンモニウム、0.1 M
カ コ ジ ル 酸 ナ ト リ ウ ム （pH 6.0–6.3） 、26–34%
PEG3350 存在下でハンギングドロップ蒸気拡散法にて結晶化させた。X 線回折実験は PF-AR NW12A ビームラインで行った。
3 結果および考察
1.6 Å 分解能で X 線回折データを収集した。空間群は C2 に属し、結晶学的非対称単位中に 1 分子のAnPixJg2_BV4 が含まれていることが分かった。野生型の AnPixJg2 の立体構造 [1] を鋳型にした分子置換法により AnPixJg2_BV4 の立体構造を決定した。
全体構造は野生型とほとんど一致していたが（Cα のRMSD にして 0.908 Å）（図１）、PCB を結合する
AnPixJg2 は C31 位に結合しているのに対して、BVを結合する AnPixJg2_BV4 は C32 位に結合していた（図２）。それに伴い、PCB と比べて、BV は結合ポケットの奥側にずれていた。変異導入を施した 4つアミノ酸残基は、この空間的なずれによって生じた立体障害を回避するとともに、新たな水素結合ネットワークを形成することにより、色素を安定的に結合することを可能にしていると考えられた。

Photon Factory Activity Report 2018 #36 (2019)

-O-OO

O-OO

N
H

[2] Fushimi, K. et al., Photochem. Photobiol., 93, 681–691(2017).
[3] Narikawa, R. et al., Sci. Rep., 5, 7950 (2015).
[4] Fushimi, K. et al., Front. Microbiol., 7, 588 (2016).
[5] Mukougawa, K. et al., FEBS Lett., 580, 1333–1338(2006).

O

N
H+HN

H
NNH-O+HNH
N

NHOO

OO

図 １ ：BV 結 合 型 CBCR・AnPixJg2_BV4（ 左 ） とPCB 結合型 CBCR・AnPixJg2（右）の全体構造。
Thr308Phe3083231Val336
BV

Ile336PCB

Tyr318
Val336

His318Ile336Thr308Phe308Tyr293Arg301

His293Arg301

図２：AnPixJg2_BV4 と BV（左）および AnPixJg2と PCB（右）との相互作用の比較。PCB は 31 位に結合しているのに対して、BV は 32 位に結合している。変異導入を施した 4 つのアミノ酸残基は、BVとの立体障害を回避するとともに、新たな水素結合ネットワークを形成することで色素の構造を安定化している。
4 まとめ
AnPixJg2 を基盤にした変異導入法による評価の結果、BV を効率的に結合させるために重要となる 4 つのアミノ酸残基を特定した。
こ の 4 つ ア ミ ノ 酸 残 基 の 変 異 導 入 （H293Y, F308T,H318Y, I336V）を施した変異体・AnPixJg2_BV4 に BVを結合させた結晶から、1.6 Å の分解能で X 線回折データを収集した。
PCB を結合する野生型の AnPixJg2 と BV を結合する変異体の AnPixJg2_BV4 の分子構造を比較した結果、全体構造はほとんど一致していたが、色素との結合部位が異なっており、それに伴って、PCB と比べて、BV は結合ポケットの奥側にずれていた。
変異導入を施した 4 つアミノ酸残基は、このずれによって生じた立体障害を回避するとともに、新たな水素結合ネットワークを形成することにより、色素の結合を安定化していることが示唆された。
謝辞
X 線回折実験を行うにあたり、ご協力いただきました PF スタッフの方々に感謝申し上げます。
本研究は、JST CREST JPMJCR1653、JSPS 科研費26702036「若手研究 A」の助成を得て実施されました。
参考文献[1] Narikawa, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 110,918–923 (2013).

成果
1. 伏見圭司ほか、「哺乳類内在性色素結合型シアノバクテリオクロムを基盤とした汎用的光遺伝学ツールの開発」藍藻の分子生物学 2017、2017
年 12 月 1 日、かずさアカデミアホール（千葉県木更津市）
2. Narikawa, R., “Molecular basis of biliverdin
incorporation
intheexpandedred/green
cyanobacteriochromelineage”
Photosensory
Receptors and Signal Transduction (Gordon ResearchConference), March, 5th, 2018, Renaissance Tuscany
Il Ciocco (Barga, Lucca, Italy).
3. 伏見圭司ほか、「哺乳類内在性色素結合型シアノバクテリオクロムの分子機構」日本農芸化学会 2018 年度大会、2018 年 3 月 17 日、名城大学
天白キャンパス（愛知県名古屋市）
4. 伏見圭司ほか、「哺乳類内在性色素結合型シアノバクテリオクロムを利用した光スイッチの開発」第 17 回新規素材探究研究会、2018 年 6 月 8日、新横浜フジビューホテル（神奈川県横浜市）
5. 伏見圭司ほか、「哺乳類内在性色素結合型シアノバクテリオクロムの分子機構」第 20 回光生物学協会年会、2018 年 8 月 8 日、京都大学吉田キャンパス（京都府京都市）
6. Narikawa, R., “Cyanobacteriochromes covering UVto-FR region: Newcomers to the photoreceptor fieldpotentially useful for bio-imaging and optogenetics”
第 56 回日本生物物理学会年会、2018 年 9 月 16日、岡山大学津島キャンパス（岡山県岡山市）
7. Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 116,8301–8309 (2019).
* miyazaki.takatsugu@shizuoka.ac.jp