Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 2. (2003)

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Review
ブレファリズマの接合
春本 晃江*・杉浦 真由美
奈良女子大学大学院人間文化研究科共生自然科学専攻〒630-8506 奈良市北魚屋西町

Conjugation in Blepharisma japonicum
Terue Harumoto and Mayumi Sugiura
Graduate School of Human Culture, Nara Women's University
Kita-Uoya-Nishi-machi, Nara 630-8506, Japan.
ブレファリズマは１９７０年代頃より繊毛虫類の接合研究によく用いられてきた。本総説では、ブレファリズマのもつ特色に焦点を当て、これまでの研究の歴史を辿りながら最近の研究を紹介し、今後の展望について述べてみたい。

る。多くは淡水産であるが海産のものもいる(Giese,
1973)。接合研究に用いられてきたのはこのうち長い
ひも状の大核をもつ淡水産のBlepharisma japonicum v.
intermedium (以前B. intermediumと呼ばれていたもの)である。本総説では、特に断わらない限り、ブレファ
リズマというとB. japonicum を指すことにする。

ブレファリズマの分類
ブレファリズマの形態
ブレファリズマは、繊毛虫門（Phylum Ciliophora）、
異毛綱（Class Heterotrichea）、異毛目（Order Heterotrichida）のブレファリズマ属に分類される繊毛虫である（Lynn and Small, 1997）。異毛類は、以前はスティ
ロニキアやオキシトリカなどの棘毛類と共に旋毛綱（Spirotrichea）として分類されていたこともあったが、現 在 は、異 毛 類 は 綱 に 昇 格 し、原 始 大 核 綱（Karyorelictea）と共に繊毛虫の系統では最初に分岐したグループとされ、細胞の形態や接合時の核変化な
どに古いなごりを留めていることから、繊毛虫類の進化や動物の起源を探る上で興味深い材料と考えられている。ブレファリズマ属には約２０種が知られており、大核の形態から４つのグループに分けられてい*Corresponding author
Tel/Fax: +81-0742-20-3421
E-mail: harumoto@cc.nara-wu.ac.jp
Received 27 Aug 2003

ブレファリズマは繊毛虫の中でも大型で、バクテリアをエサとして培養すると体長約300 μmであるが、飢餓状態に置かれると同種の細胞間で捕食が始まり、体長が通常の２倍にも達する細胞が生じることがある。
ブレファリズマは通常赤色の色素ブレファリズミン（blepharismin）をもつ。ブレファリズミンは、植物のオトギリソウなどがもつヒペリシン（hypericin）や
ソライロラッパムシがもつステントリン（stentorin）に似た構造をしており、光受容体であるとされるが、近年、捕食性の繊毛虫に対して防御の機能があることが分かった（Miyake, 2002 総説参照）。
ブレファリズマの口部にはよく発達した繊毛列があ り、膜 板 帯（zoon of membranelles）と 波 動 膜（undulating membrane）を形成している（後述）。細
胞表面にも多くの繊毛をもつが、泳ぐスピードはゾウ
リムシなどに比して遅く、いくぶんのたりのたりしている印象を与える。細胞の後端に１個の収縮胞をも
つ。

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原生動物学雑誌 第36巻 2003年

表１ SMB の組成
濃度（mM）

図１ Blepharisma japonicum の DAPI 染色した蛍光顕微鏡像。ひも状の大核と20個ほどの小核が観察される。三宅章雄博士提供

ブレファリズマは繊毛虫の特徴である大核と小核という２種類の核をもつ（図１）。大核は大きくひも状でDNA量が多く、細胞の形質発現を担っている。小核は小さく二倍体で、世代を超えて遺伝情報を子孫に伝える。１細胞当たり、大核は１個であるが、小核の数は細胞によって異なり６−３０個である。接合の際、小核が減数分裂し、生じた配偶核の一個を接合の相手の細胞と交換して受精核を形成し、その受精核か
ら新しい小核と大核が作られる。大核は受精核から生じた新しい大核に置き換えられ、古い大核は消失する。ブレファリズマに特徴的なのは、接合の際、小核の半数は減数分裂を経ずに成長することである（後述）。この核は受精核から生じた大核が何らかの理由
で成長してこなかった場合に大核として機能することが知られている（Miyake et al. 1991）。

NaCl

1.5

KCl

0.05

CaCl2

0.4

MgCl2

0.05

MgSO4

0.05

EDTA

2 × 10-3

Na-phosphate buffer(pH 6.8)2

上記のSMB は「SMB III」である。
ブレファリズマの生理的塩類溶液として、「SMB I」「SMB II」「SMB III」（Miyake, 1981）の他に、「SMB III」からEDTAを除いたもの（｢SMB−｣）の計4種類のうち、いずれかが用いられているが、本総説ではすべて「SMB」とした。組成の詳細が必要な場合は原著論文を参照されたい。

十分な量の空気の層を確保するようにする。さらに大きな容器で培養することもできるが、ポンプで培養槽に空気を送り込むなどの工夫が必要である。さらに植え継ぐ場合は、定常期になったカルチャーに、バクテリアを接種した同量の培養液を混ぜてから二つに分ける。培養がうまくいった場合は、密度は約500-1000
cells/ml まで上がり、１リットルの培養から約0.5 ml のpacked cells （~1×10６ cells）が得られる。
ブレファリズマは、バクテリアをエサとした培養の他、小型の繊毛虫（Sathrophilus sp.など）を用いて培養することもできる。まず、Sathrophilus sp.を、レタス
浸出液の培養液で培養し、定常期に達した細胞をSMBで洗い、SMBに浮遊させたものをエサとして用いる。
ブレファリズマの培養
なぜかは不明であるが、小型の繊毛虫を用いて培養したブレファリズマはバクテリアをエサにして培養しブレファリズマの培養には、通常、レタス浸出液や たものよりも細胞のサイズが大きい。
小麦若葉粉末（Wheat Grass Powder。昔 Cerophylと呼ば長期にわたる株の保存には、20-50 cc の大きさのガれていた。現在はPines International, Inc. USAで取り ラスの採集ビンを用いる。Enterobacter aerogenes を接扱っている）の浸出液をSMB（表１）で薄めたものに、 種したレタス浸出液の培養液：SMB：純水を1：4：5
バクテリアEnterobacter aerogenes を接種し、２５℃に の割合で混ぜたものをビンに入れ、この中に乾熱滅菌
１−２日置いてバクテリアを増殖させたものを培養 した米２−３粒とブレファリズマを数十細胞入れ、フ液として用いる。ブレファリズマの大量培養の際に タを開けて19 - 25℃においておくと１−２ヶ月はもは、細心の注意を払って雑菌の混入を防ぐようにしな つ。液の交換時には、3/4ほどを捨て、新しい液を足し、ければ高い密度の培養は得られない。通常、綿栓をし 米粒が少なくなっていれば足す。
た500ml - 5Lの三角フラスコで２５℃で培養するが、培養液の量はフラスコの容量の４０％程度に抑えて、

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図２ ブレファリズマの特殊な株における接合型転換。細胞分裂時に分裂環の前方の細胞（Ａ）、後方の細胞（Ｐ）、I：接合型I、II：接合型IIであることを示す。（Miyake and Harumoto, 1990）

接合型と接合誘導物質の発見
野外で採集されたブレファリズマのクローンは、
多くの場合自系接合（selfing）をする。すなわち、同じクローンの細胞同士の間で接合が起こる。そのために、ブレファリズマにおける接合型の発見は遅れたが、ブレファリズマの赤い色素をもつ系統と白いアルビノの系統を混ぜると、赤−白の接合対が赤−赤や白―白の接合対よりもより多く生じることから、相補的な接合型が存在するのではないかということが示唆された（Isquith and Hirshfield, 1966, 1968）。のちに、自系接合をほとんど起こさないクローンを得ること
によって、ブレファリズマに相補的な接合型が存在することが明らかになり、その接合型はIおよびIIと名付けられた（Miyake and Beyer, 1973）。
ブレファリズマを培養していると、分裂を繰り返すうちにI型細胞のクローンからII型細胞が生じたり、その逆も起こりうる。その結果、同じクローンの中にわずかに接合対（自系接合対）が観察される。しかし、基本的に接合型は細胞分裂を経ても安定であり、I型細胞からはI型が、II型細胞からはII型の細胞が生じる。
しかし、ブレファリズマの株の中には、高頻度に自系接合を起こす株があり、この株では、細胞が定常期になるとクローンのほとんど１００％の細胞が接合対をつくる。この株の細胞を再びクローニングし直しても同じことが起こる。これは、個々の細胞が接合型
IまたはIIを発現しているのか、それとも何らかの理由によって相補的な接合型を伴わない接合が起こっているのかについて、詳しい研究がなされた（Miyake
and Harumoto, 1990）。興味深いことに、この株では、細胞分裂の際に分裂環より前方の細胞であった細胞は接合型Iのままであるが、後方の細胞は接合型IIとな
り、約２４時間後にまた接合型Iに戻る（図２）。この
約２４時間の間、クローンの中には接合型IとIIの細胞149が混在することになり、このために高頻度で接合が起こる。これは特別な株であるが、いずれにしてもブレファリズマには接合型が存在し、相補的な接合型の細胞が存在することによって接合が引き起こされる。
ブレファリズマは、繊毛虫類において接合誘導物
質が単離された初めての生物である（Kubota et al.
1973）。三宅（1968）は、ブレファリズマの赤い系統
が、アルビノの系統に接合対を誘導する物質を外液に出していることを見つけ、これをＲ因子と名付けた。
また、アルビノの系統は、同様に赤い系統に接合対を誘導する物質を出していることを見つけＡ因子と名付けた。のちに、R因子は接合型IIの細胞が出す接合誘導物質としてガモン２と呼ばれ、A因子は接合型Iが出す物質としてガモン１と呼ばれた（Miyake and Beyer,1973）。その後、それらの物質の詳しい分子構造が明ら か に さ れ、ガ モ ン １ は blepharmone、ガ モ ン 2 は
blepharismone（注 参照）と名付けられた。また、赤い色素の有無と接合型とは関係がないことはのちにわかった。（注：R因子は最初blepharisminと名付けられた [Kubota et al. 1973] が、当 時 未 出 版 で あ っ た 本[Giese,A.C., Blepharisma, Stanford Univ. Press, Stanford,
1973]の中で、ブレファリズマのもつ赤い色素の名称
がzoopurpurinからblepharisminに変更されたため、三宅、Giese、久保田らが協議の結果、翌年blepharismoneに改名された。Miyake and Beyer, 1974。三宅 私信）
接合誘導条件とガモンの活性の測定
ブレファリズマが接合できるかどうかには内的要
因と外的要因が関わっている。内的要因としては、細胞が「成熟期」にあるかどうかで、成熟期に達するまでの未熟期の間は、たとえその他の条件が整っていたとしても接合には入らない。ブレファリズマの場合、接合後約５０分裂までに８４％のクローンが成熟期に入り、接合できるようになったという報告がある(Bleyman, 1975)。外的要因としては、栄養条件と相補的なガモンの存在が挙げられる。成熟期に入り、適度な飢餓条件下に置かれた細胞は接合反応性をもつようになる。このとき相補的なI型とII型の細胞が混ぜ合
わされると、お互いの出すガモンにより細胞は活性化
され１−２時間後に接合対が生じる。本総説では、接合反応性をもつようになった細胞を「接合前細胞（preconjugants）」と呼ぶことにする。
一方の接合型の接合前細胞を他方の型のガモンを含む液の中に入れると、１−２時間で同じ接合型の細胞同士の間で接合対が形成されるが、これをガモンの活性の強さを測る指標としている。ガモンの活性の強さは、以下の方法のいずれか一方または両方で測定す
る。

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原生動物学雑誌 第36巻 2003年（１）Unit法（Miyake and Beyer, 1973; Miyake,
1981a）
ガモンの活性の１Unitは、500-1000細胞を浮遊した
1 ml SMB中で、少なくともひとつの接合対を誘導するのに必要な最少の活性と定義されている。ガモンの活性を測定したいサンプルの２倍希釈シリーズを作り、SMB中で1000-2000 cells/mlに調整した同量の細胞浮遊液と混合する。実体顕微鏡下で観察し、もし、接合対が2n倍希釈したところまで誘導されたら、そのサンプルの活性は、2n+1 Unit (U) とする。
（２）Index法（Sugiura and Harumoto, 2001）
これは（１）と同様に調整した細胞浮遊液と同量のサンプルを混ぜ、細胞の約何％が接合対を形成するかを実体顕微鏡下で判定する方法である。Indexは0−５の数値で記述し、Index 5：ほとんどの細胞が接合対を形成している、Index 3：約半数の細胞が接合対を形成している、Index 1：数細胞が接合対を形成している、
Index 0：接合対形成が見られないとし、Index 4とIndex 2は、それぞれIndex 5とIndex 3およびIndex 3とIndex 1の間を表している。Indexの数値が高いほど、つまり形成された接合対の割合が高いほど、ガモンの活性が強いことを示している。普通、サンプルを混ぜてから３時間後、５時間後および20時間後に判定を行う。この方法は、少量ずつ得られた多数のサンプルのうち、強いガモン活性のあるものはどれかを調べるような場合に用いられる。

2001）。

ガモン１
ガモン1の単離（1974年）
初めてガモン1が単離されたときには、接合型Iのアルビノ細胞が材料として用いられた。初めに、大量に培養したI型のアルビノ細胞を、ガモン2（32 U/ml）とBSA（0.01％）を加えたSMBにサスペンドした（10 ml
packed cells/liter）。ガモン2はI型細胞を刺激しガモン1を多量に合成させるため、BSAはガモン1のプロテクターとして加えられた。そのサスペンションを25℃条
件下で一晩置き、細胞に多量のガモン1を合成、分泌させた後、緩やかに遠心処理を行って完全に細胞を取り除いた上清、つまり細胞外液（cell-free fluid: CFF）を
ガモン1の精製に用いた。20リットルのCFFを濃縮、凍結乾燥後に少量の水に溶解し、さらに遠心処理を行って得た上清を、ゲルろ過カラム（Bio-Gel P-150カラム）、陽イオン交換カラム〔carboxymethyl cellulose（CM-cellulose）カラム〕、陰イオン交換カラム（DEAEcelluloseカラム）の順にかけることにより、最終的に2mgのガモン1（1.6×107 U/mg）が単離された（Miyake
and Beyer, 1974）。
ガモン1の精製サンプルをアクリルアミドゲル電気泳動によって分離後、アミドブラック染色した結果、活性と対応する1本のバンドが検出され、その等電点はpH 7.5と示された。また、PAS（periodic acid-Schiff’s
reagent）染色の結果、ガモン1は5％の割合で炭水化物をもつことが推定された。これらの結果から、ガモン
接合誘導物質（ガモン）の単離と分子的特徴
1はわずかに塩基性の糖タンパク質であると結論付け
初期の研究により、接合型Iの細胞が合成、分泌する られた（Miyake and Beyer, 1974）。
ガモン1は、熱に不安定で透析不可能な物質であり、接ガモン1の精製サンプルを用いたアミノ酸分析お合型IIの細胞が合成、分泌するガモン2は、熱に安定で よび糖分析の結果、ガモン1は175アミノ酸（lys7, His1,
透析可能な物質であることが報告された（Miyake, Arg4, Asp26, Thr17, Ser19, Glu7, Pro8, Gly13, Ala13,1968）。その後、単離精製が進められ、1973年にガモ Cys4, Val11, Met6, Ile8, Leu12, Tyr13, Phe6）と6糖ン2が同定された（Kubota et al. 1973）。一方ガモン1は、 （glucosamine：3残基, mannose：3残基）からなると推その不安定な性質（25℃条件下で一晩おくと活性が 定され（Braun and Miyake, 1975）、Tyrの含有率が高く、1/2以下に、凍結融解後には1/4以下にまで下がる）と取 Gluの含有率が低いという特徴的な性質が示された
り扱いの難しさから単離精製が非常に困難であった （Braun and Miyake, 1975）。
また、ガモン1の分子量は、ゲルろ過クロマトグラ
が、ウシ血清アルブミン（BSA）を添加することにより活性が保持されるという発見をもとに（Miyake and フィーの結果から約20 kDaから30 kDa、SDS-PAGEのBeyer, 1973）、1974年に初めて単離精製された（Miyake 結果から約30 kDaであると推定された（Miyake andand Beyer, 1974）。ガモン1は、糖タンパク質として同 Beyer, 1974; Braun and Miyake, 1975）。
定され、おおよその分子量とアミノ酸組成、糖組成などが報告されたが、当時の技術的な制限からアミノ酸 ガモン1の単離と部分的アミノ酸配列の決定（2001年）
配列の決定には至らず、それから20年以上の間、ガモ
ガモン1の遺伝子を単離することを目的とし、ガモン1のアミノ酸配列は明らかにされていなかった。近 ン1の部分的アミノ酸配列を決定するために再度ガモ
年、ガモン1遺伝子の単離、アミノ酸配列の決定を目的 ン１の単離を行った。その際、以前報告された精製法
として、再びガモン1の精製が行われ、2001年にその遺 では多量のサンプルとそれを処理する装置が必要で伝子の全配列が決定された（Sugiura and Harumoto, あること、条件設定が難しいことなどの理由から、ガJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 2. (2003)

図 ３ ガ モ ン １ の 新 し い 精 製 法（Sugiura andHarumoto, 2001）

モン1の新しい精製法を検討した。ガモン1の活性は非常に不安定であるため、その活性に影響を与えることなく精製できる方法として、主にカラムクロマトグラ
フィーを用いた方法と、電気泳動法による方法について 検 討 し た。そ の 結 果、Con A Sepharose ア フ ィ ニ
ティーカラムを用いると、ガモン1 が担体に結合し、マンノースで溶出することにより活性を保ったまま回収できることがわかった。他の吸着型カラムでは、
ガモン1 は担体に結合すると完全に活性を失ってしまうので、Con Aカラムはガモン1活性を保持したまま濃縮する手法として大変有効であった。また、電気泳動を用いた精製法について検討した結果、ガモン1活性を確認しつつガモン1を分離できる方法として、未変性条件下で電気泳動した後、ゲルからタンパク質を抽出する方法が有効であることがわかった。泳動後のゲルを上端から細く切り出し、各ゲル片の一部をガモン1の活性測定用、残りをSDS-PAGEでさらに分離するサンプル用と分けて抽出することにより、ガモン1の活性に対応するバンドを同定することが可能であると考えた。
これらの結果をもとに、最終的にCon A Sepharose
カラム（HiTrap Con Aカラム、Amersham Pharmacia Bio-tech）を用いたアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーとNATIVE-PAGEを組み合わせたガモン１の新しい精製法を確立した（図３）。初めに80 ml（２16 U/

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図 ４ NATIVE-PAGE に よ る ガ モ ン １ の 精 製。
NATIVE-PAGE 後 の ゲ ル か ら抽 出 し た サ ンプ ル
（１−５）とwhole sample（W）およびタンパク質
分子量マーカー（M）をSDS-PAGEで分離後銀染色した結果を示した。マーカーの分子量は泳動像の左端に示した。ガモン１の強い活性が見られたサ
ンプル２、３に特異的な約30 kDaのバンドを＊で示した。

ml）のCFFをHiTrap Con Aカラムにかけ、カラムを素通りしてくる多くのタンパク質とカラムに結合するガ
モン1とを分離した。分取した各フラクションのガモ
ン1活性をIndex法によって測定し、ガモン1の強い活性が見られたフラクションをプールした。その活性フラクションを、凍結乾燥機にかけ、３ mlのSMBに溶かし、次にNATIVE-PAGEにかけて分離した。電気泳動後のゲルの一部を縦に切り出し銀染色を行った結果、ゲルの下方はタンパク質量が多く全体的にスメア状になっていたが、ゲルの上方は比較的タンパク質量が少なく数本のバンド状に分離していた。染色していない
ゲルの残りの部分は、上端から５ mm 間隔に切り出して、ゲル片１−５とし、各ゲル片からタンパク質を抽出した。各ゲル片の一部は活性測定用にBSA存在下で、残りを SDS-PAGE 用に BSA 非存在下でタンパク質を抽出した。活性測定用に抽出したサンプルをUnit法によって測定した結果、ゲル片１から順に、29（0.05
×104）U、215（3.3×104）U、213（0.8×104）U、29（0.05
×104）U、28（0.02×104）Uを示し、活性の主なピーク
はゲル片２にあることがわかった。SDS-PAGE用に抽出したサンプルは、凍結乾燥機にかけた後、各サンプ
ルを数十µl の SMB に溶かしてSDS-PAGEで分離した。分離後のゲルを銀染色した結果、ガモン1の最も強い活性が見られたゲル片２からのサンプル中に分子量約30 kDaのバンドがはっきりと検出された（図４）。

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表２ ガモン1の部分的アミノ酸配列
Gm_57

DTSLW

Gm_71

GVSNINYNRWISFY

Gm_75

VWLGVYVIGAY

Gm_77/81

SMRYNFHEALDLVST

左端に各アミノ酸配列の名称を示す。

この30 kDaのバンドは、ガモン1の活性の強さに対応して検出され、1974年に報告されているガモン1の分
子量とも一致していることから、ガモン1のバンドであると考えられた。この精製法のガモン1回収率は、精製初めからNATIVE-PAGE後のゲルから回収したサン
プルをSDS-PAGEにかけるまでで約20％であり、80 mlのCFFから約13 µg のガモン1が単離された。
次に、ガモン1の精製サンプルを用いてアミノ酸配列分析を行った。最初にN末端アミノ酸配列分析を行った結果、サンプル量は十分であったにもかかわらず、ガモン1のN末端からの配列を読むことはできなかった。よって、ガモン1のN末端は、何らかの修飾を受けている（ブロックされている）と考えられた。次に、内部アミノ酸配列分析を行った結果、５ペプチドの部分的なアミノ酸配列を読むことができた。そのう
ち２つは重複していたため、最終的に10残基前後の合計４ペプチドの内部アミノ酸配列を決定した（表２）。

図５ RACE PCR産物のアライメント。RACE PCRで得られた各断片を、クローニングしシークエンスした結果を元にアライメントした。矢印はPCRに用いたプライマーを示し、（ ）内は各断片の塩基数を示した。これらの断片のシークエンス結果
から、最終的にガモン１cDNAの全長（948 bp）を決定した。この配列は、915 bpから成るORFをもっており、推定されるアミノ酸配列中には、精製したガモン１から明らかにした部分的アミノ酸配列（Gm_71、Gm_77/81、Gm_75、Gm_57）が全て含まれていた。

ガモン 1 特異的な identical primer（Gm_2rev）を作製し（表３）、5’-RACE を行った。その結果、約 500 bp のシングルバンドが増幅された。同様にして、その 5’RACE PCR 産物の塩基配列を決定しアミノ酸に翻訳したところ、内部アミノ酸配列（Gm_71 と Gm_77/81）と完全に一致する配列が含まれていた。決定した塩基配列を基に、ガモン 1 特異的なプライマー（Gm_3rev、
Gm_4for）を作製し（表３）、さらに RACE PCR を繰り返した。最終的に、５断片の塩基配列を完全に決定
ガモン1遺伝子の単離PCR 法を用いてガモン１の cDNA を単離するため、 し、各断片をオーバーラップさせることにより、ガモ精製したガモン１タンパク質から明らかにされた内 ン 1 cDNA の全塩基配列（948 bp）を決定した（図５）。
部アミノ酸配列を基に、degenerate primer を設計した その配列は、11 塩基の 5’ 側非翻訳領域、22 塩基の 3’（表３）。また、ガモン２によって活性化された I 型 側非翻訳領域と 305 アミノ酸をコードしている ORF
細胞から total RNA を抽出し、poly (A)＋ RNA を精製し を含んでいた。アミノ酸配列中には、精製ガモン 1 のて、それを基に cDNA を合成した。この cDNA を鋳型 内部アミノ酸配列分析の結果明らかになった 4 ペプに、ガ モ ン 1 特 異 的 な degenerate primer と UPM チドの配列（表２）が、全て完全に含まれていた（図（universal primer mix）をプライマーとして、RACE ６、DDBJ accession no. AB056696）。また、終止コドン
PCR を行った。その結果、プライマー Gm_77/81 を用 は、TAA であった。ゾウリムシやテトラヒメナなどをいた 3’-RACE によって、約 500 bp の PCR 産物が増幅 含む多くの繊毛虫では、終止コドンのいずれかを読みされた。この 3’-RACE PCR 産物を精製し、pCR2.1- 枠内でセンスコドンとして使用している例が報告さ
TOPO ベクターでクローニング後、シークエンスを れているが、ブレファリズマ（Blepharisma japonicum）
行った。読み取った塩基配列をアミノ酸に翻訳したと ではまだそのような報告はない。今回明らかにしたガころ、
ガモン 1 の内部アミノ酸配列（Gm_75 と Gm_57） モン 1 遺伝子の読み枠中には TAG や TGA は現れず、と完全に一致する配列が含まれており、得られた 3’- TAA を終止コドンとして使用しており、これまでの報
RACE PCR 産物は、ガモン 1 cDNA の断片であると考 告（Liang and Heckmann, 1993）と矛盾しなかった。
えられた。したがって、その断片の塩基配列を基に、

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表３ ガモン1 cDNAの単離に用いたプライマー
Gm_57

Gm_71

Asp- Thra 3' CTR TGD
b 3' CTR TGD
Gly- Val-

Gm_75

Val-

Gm_77/81

Ser- Met- Arg- Tyr- Asn- Phe- His- Glu- Ala5' ATG AGA TAY AAY TTY CAY GAR 3'

Trp-

Ser- Leu- Trp
AGD GAV ACC 5'
AGD AAY ACC 5'
Ser-

Asn-

Ile- Asn- Tyr- Asn- Arg- Trp- Ile5' AAY TAY AAY AGA TGG 3'

Leu-

Gly-

Val- Tyr- Val-Gm_2rev

5' ATCTGCCCAATTAGTGTTATC 3'

Gm_3rev

5' GGAGGGAGAAAGCCATCATC 3'

Gm_4for5' GAGTGTATGTAATTGGAGC 3'

Ile-

Gly-

Ala-

Ser- Phe- Tyr

Tyr

Leu- Asp- Leu- Val- Ser- Thr

左端に各プライマーの名称を示す。Degenerate primers（Gm_57, Gm_71, Gm_75, Gm_77/81）は、それぞれ対応して表記されているアミノ酸配列を基に設計した。Identical primers（Gm_2rev, Gm_3rev,
Gm_4for）は、単離したガモン1断片の塩基配列を基に設計した。

ガモン 1 遺伝子の解析
ガモン１のアミノ酸配列を基に、PSORT II prediction ( http://psort.nibb.ac.jp/form2.html )を用いて、ガモン１タンパク質の細胞内局在について調べたところ、
ガモン１は、N 末端に 16 残基（Met-１− Ala-16）からなるシグナルペプチドをもつ分泌タンパク質であると推定された。
また、細胞外へ分泌されたガモン 1（mature gamone
1）の N 末端を決定するために、BSA を含まない I 型細胞の CFF を凍結乾燥して濃縮し、SDS-PAGE で分離
後、約 30 kDa のガモン１のバンドを切り出して N 末端
アミノ酸配列分析を行った。その結果、１サイクル目
はアミノ酸を確定することはできなかったが、２サイ
ク ル 目 か ら 13 残 基 の ア ミ ノ 酸 配 列（VCTGKTNCYAVFL）を読むことができた。この配列は単離したガモン 1cDNA を基に推定したアミノ酸配列の 35 − 47 番目のアミノ酸配列と完全に一致したので、mature-gamone 1 は 34 残基目の Gly から 305 残基目の Trp までの 272 アミノ酸から構成されていると考えられた（図６）。
以上の結果から、単離したガモン１遺伝子は、16 ア
ミノ酸からなるシグナル配列（Met-１− Ala-16）、17
アミノ酸からなるプロ配列（Asp-17 − Thr-33）、272
アミノ酸からなる mature-gamone （1 Gly-34 − Trp-305）の計 305 アミノ酸をコードしており、ガモン 1 は初め
prepro-gamone 1 の形で合成されると考えられた。ガモ
ン１ mRNA から合成された prepro-gamone 1（305 アミノ酸）は、その分泌シグナルペプチドが切断された後、289 アミノ酸から成る pro-gamone 1 として小胞体内に送られ、さらに、pro-gamone 1 は、細胞外へ分泌される過程で糖鎖の付加およびプロセシングを受け、最終的に 272 アミノ酸から成る mature gamone 1 として細胞外へ分泌されると考えられた（図７）。また、アミノ酸配列から推定される mature gamone 1 の分子量は約 30 kDa であり、SDS-PAGE の結果と一致した。
相同性検索
BLAST を用いて相同性検索を行った。その結果、ガモン１と高い相同性を示すタンパク質はなく、ガモン
１は、これまでに報告されていない新規のタンパク質であることがわかった。また、高い相同性は示さない
が、ガモン１と部分的に（約 150 残基の範囲内で）20 − 30％の相同性および類似性を示すものとして、
Saccharomyces cerevisiae の IRA1（Inhibitory regulator
protein）があることがわかった。IRA1 は、GAP（GTPase-activating proteins）フ ァ ミ リ ー に 属 し て お り、S.
cerevisiae の Ras-cyclic AMP pathway に お け る
Inhibitory regulator（negative regulator）として知られている（Tanaka. et al.1989 ; Tanaka et al. 1990）。GAP ファ
ミリーに属するタンパク質は、
約 250 残基からなる ras-specific GAP catalytic domain をもっており、その領域内にこのファミリーに特徴的な 15 残基から成る最も保存されたモチーフが含まれている（Wang et al.
1991）。しかし、ガモン 1 と IRA1 との間で相同性が見られた領域は、IRA1 の ras-specific GAP catalytic domainとは異なっており、二者間で検出されるモチーフや２次構造レベルでの相同性はほとんど見られないため、
ガモン１が IRA1 と同様の機能をもっている可能性は

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原生動物学雑誌 第36巻 2003年

図６ ガモン１cDNAの全塩基配列と推定アミノ酸配列。ガモン１cDNAの全塩基配列（小文字）と推定アミノ酸配列（大文字）を示した。四角（破線）は、推定上の翻訳開始コドンを示し、終止コドンを＊で示した。ガモン１cDNAは、305アミノ酸をコードしており、ガモン１の部分的アミノ酸配列（Gm_71、Gm_77/81、Gm_75、Gm_57）と完全に一致する領域を四角で示した。矢頭は推定上の分泌
シグナル配列の切断部位を、矢印はmature gamone 1のN末端を示した。また、N結合型糖鎖の結合可能なアスパラギン残基をイタリック体（N）で示した（Sugiura and Harumoto, 2001）。

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図７ ガモン１の生合成過程の模式図。本文参照。
低いと考えられた。
繊毛虫類の中で、ブレファリズマの他に接合誘導
物質の遺伝子が単離されているのは、Euplotes raikoviと E. octocarinatus の２種であるが、これら２種の接合誘導物質もガモン 1 と同様に prepro-pheromone の形をしていることが知られている（Miceli et al. 1989 ;Meyer et al. 1991 ; Luporini et al. 1995）。また、これらのアミノ酸配列を比較すると、mature pheromone の領域には有意な相同性は見られないが、prepro 領域は、２種間で比較的保存されていることがわかっている（Luporini et al. 1995）。そこで、ブレファリズマのガモン 1 の prepro 領域とこれら２種の接合誘導物質のprepro 領域、または mature 領域のアミノ酸配列を比較した。しかし、ガモン１との間には、prepro 領域、mature
領域共に有意な相同性は見られなかった。Euplotes の２種の接合誘導物質は、比較的小さなペプチド性の物
質であるのに対して、ブレファリズマのガモン１は、それらに比べると分子量の大きな糖タンパク質であり、温度感受性などの性質も異なる。接合誘導物質は、自然界で同種を見極め正しく有性生殖を行うために重要な認識物質である。したがって、種特異性を高めるために、全く異なるタイプの物質を接合誘導物質として使用しているのは意味のあることであろう。
構造予測＜疎水性プロフィール＞
ガモン１の疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸の分布について調べた。その結果、ガモン１の N 末端側（約20 残基くらいの領域）に疎水性の高いアミノ酸が偏って分布しており、分泌シグナルペプチドの存在を示唆した。また、その他の領域は、疎水性、親水性アミノ酸が特に偏って存在している所はなく、ガモン 1 が可溶性タンパク質（soluble protein）であることが示された。
＜モチーフ＞
ガモン１のアミノ酸配列を基にモチーフ検索を155行った（図８）。その結果、４箇所のN-glycosylation site（168 ： NTTY、176 ： NTTS、192 ： NFTT、240 ：NTTM）、１箇所のGlycosaminoglycan attachment site
（119：SGNG）、４箇所のProtein kinase C phosphorylation site（37：TGK、49：TTR、128：TSK、133：
SMR）、１箇所のTyrosine kinase phosphorylation site
（57：RWDEMPLY）、６箇所のN-myristoylation site
（26：GLQGSS、29：GSSYTG、34：GVCTGK、120：
GNGINC、191：GNFTTA、202：GISNAL）、４箇所のMicrobodies C-terminal targeting signal（50：TRA、164：
TKA、259：NKV、275：NKY）が検出された。
ガモン１は糖タンパク質であり、シンプルな形のN-結合型糖鎖をもつと考えられている（図９、後述）。
ガモン1のアミノ酸配列中には、N-結合型糖鎖が結合する可能性のある部位が４箇所見られたことから、このうちの何れかに、N-結合型糖鎖が付加されていると考えられる。
＜２次構造＞The predictproteinサーバー（EMBL）を用いて、ガモ
ン１の２次構造を予測した（図８）。その結果、ガモ
ン1は、19.67％ αへリックス、30.82％ βシートの構造をとると予測され、 mixed type に分類された。傾向として、ガモン１の前半部分（約１−200残基の領域）は、
αへリックスとβシートが混在した構造をしており、後半部分（約200−300残基の領域）は、高い割合でβシート構造をとっていた。したがって、ガモン1は、大きく２つのドメインから構成されていると考えられた。
ガモン1の糖鎖構造の推定
ガ モ ン 1 は 糖 タ ン パ ク 質 で あ り、そ の 糖組 成 はglucosamine；３残基、mannose；３残基であると報告された（Braun and Miyake, 1975）が、ガモン１に付加されている糖鎖の機能や構造については当時明らかにされなかった。
タンパク質に結合する糖鎖は、結合するアミノ酸残基の種類により大きく２つのタイプ、O-結合型糖鎖とN-結合型糖鎖に分類される。N-結合型糖鎖は、その側鎖の構造の違いから、さらに３つのタイプ（高マン
ノース型、複合型、混成型）に分類される。これらの構造は、それぞれレクチンに対して異なる親和性をもつため、各種レクチンとの親和性を調べることにより、おおまかな糖鎖構造を推定することが可能である。そこで、ガモン1を含むCFFをLentil Lectin（LCA）、
Concanavalin A（Con A）、Wheat Germ Agglutinin（WGA）の各種レクチンカラムにかけ、ガモン1と各種レクチ
ンの親和性を調べた。その結果、ガモン1は、LCAとWGAとは結合せず、Con Aとは結合することがわかった。従って、この糖鎖は、N-結合型糖鎖の高マンノー

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原生動物学雑誌 第36巻 2003年

ス型、２本鎖複合型、混成型のタイプのどれかであると 推 定 さ れ た。し か し、ガ モ ン 1 の 糖 組 成（glucosamine；３残基、mannose；３残基）を考慮すると、高マンノース型ではなく、２本鎖複合型または混成型であると考えられた。N-結合型糖鎖は、基本的に３つのマンノースと２つのN-アセチルグルコサミン
からなる共通のコア領域と末端領域から成ることが知られている。よって、ガモン１の糖組成から、この糖鎖は、共通のコア領域にあと１箇所、N-アセチルグ
ルコサミンが結合した形をしていると考えられた。残りのN-アセチルグルコサミンは、末端マンノースに結合しているかBisect型で結合しているかのどちらかであると考えられるが、Bisect型のN-結合型糖鎖と強い結合性を示すWGAとガモン1が結合しなかったことから、Bisect型ではないことが推定された。また、LCAには結合しなかったことから、フコース修飾はないと考えられた。
以上の結果から、ガモン１の糖鎖は、N-結合型糖鎖のコア領域の末端に、N-アセチルグルコサミンが１つ結合した形をしていると推定された（図９A）。
当初、1975年に報告された糖組成を元に糖鎖構造が 推 定 さ れ、上 述 し た よ う な 結 果 が 報 告 さ れ た（Sugiura and Harumoto, 2001）が、ガモン１の遺伝子が単離され、ガモン１の分子量が20 kDaから30 kDaに見直されたことにより、その糖組成もglucosamine；４残基、mannose；３残基に見直されるに至った(飯尾 私信)。その結果、ガモン1に付加されている糖鎖は（図9B）のような構造をしていると考えられた。ガモン1遺伝子の解析結果から、ガモン1にはN-結合型糖鎖の結合可能な位置が4箇所検出されたが、以前に糖鎖の質
量比は分子量の５％であると定量されている（Braun，and Miyake, 1975）ことを考慮すると、ガモン1には推定された構造の糖鎖が1つ結合していると考えられる。

フラクション中に見られ、UV照射によって薄い青色の蛍光を発した。このフラクションをDWで抽出し、ガモン2を結晶化した（106 U/mg）。この方法で、48リッ
トルのCFF（80 U/ml）から3.68 mgのガモン2が単離された。X線結晶解析などの方法によって、ガモン2は3-( 2’-formylamino-5’-hydroxybenzoyl ) lactateとして同定され（Kubota et al. 1973）、カルシウム塩の形で最も安定であると考えられた（図10A）。また、ガモン２は、
すでに有機化学的合成が可能になっており（Tokoroyama et al. 1973 ; Tokoroyama et al. 1978 ;Entzeroth, and Jaenicke, 1981 ; Entzeroth et al. 1983）、立体構造モデルも示されている（図10B）。化学合成した
ガモン２は自然界に存在するガモン２の半分の活性しかない。これはD型ガモン２がほとんど活性をもたないからであろうと考えられていた（Tokoroyama etal. 1973）が、のちに化学合成したD型ガモン２を用いて、そのことが確かめられた（Entzeroth, 博士論文
1983, Jaenicke 1984に引用）。

接合誘導物質（ガモン）の生合成と発現調節
ガモン１
前述したように、適度な条件下におかれたI型細胞において、ガモン1遺伝子からガモン1mRNAが転写され、それを基にガモン1前駆体（prepro-gamone 1）が合成されると考えられた。そして、分泌シグナルペプチ
ドが切断された後、pro-gamone 1として小胞体内に輸送され、糖鎖の付加およびプロセシングを受け、最終的にmature gamone 1が合成、分泌されると考えられた（図７）。
ガモン1は、接合のための様々な条件が揃ったI型細胞において、接合を開始するための最初のシグナルとして合成、分泌される。特異的な条件下におけるガモン 1 の 発 現 に つ い て は、様 々 な 条 件 下 に あ る カ ル
チャーからCFFを回収し、そのCFF中にガモン１活性が検出されるかどうかを調べることによって示されガモン２てきた（Miyake and Beyer, 1973）。ガモン１活性は、ガモン2の単離と構造決定（1973年）
性的に成熟期にあり、かつ適度な飢餓条件下に置かれ大量に培養したII型の細胞を、I型細胞から調製し たI型細胞のCFF中にのみ見られ、未熟期にある細胞やたCFFを加えたSMBにサスペンドした（5 ml packed 富栄養条件下にある細胞（対数増殖期にある細胞）のcells/liter）。I型細胞のCFFは、その中に含まれるガモ CFF中には見られない。また、どの時期のII型細胞のン1によってII型細胞を刺激しガモン２を多量に合成 CFF中にもガモン１活性は検出されない。さらに、ガさせる目的で加えられた。そのサスペンションを25℃ モン２の刺激を受けたI型細胞のCFF中には、高いガモ
条件下で一晩置きII型細胞のCFFを回収した。この ン１活性が検出される。このように、ガモン１活性は、CFFを50℃以下で濃縮し、エタノールで抽出、乾燥後、 接合型、細胞の性成熟度、飢餓状態、ガモン２の刺激
75％のn-propanolに溶解した。その濃縮サンプルを によって影響を受け、これらの条件によって厳密に制cellulose columnにかけ、75％ n-propanolで溶出した。ガ 御されていると考えられる。
このような特定の条件下でおこるガモン1活性のモン2は、シングルピークとして溶出され、このピークのフラクションを乾燥後、DWに溶解し、ペーパークロ 発現はどのように制御されているのだろうか。ガモン
マトグラフィーで分離した。ガモン2活性は、シングル １遺伝子の転写レベルで制御されているのか、ガモン

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図８ ガモン１のモチーフ検索と２次構造予測。モチーフ検索の結果をアミノ酸配列の下に色分けして示した。四角内に検出されたモチーフを示した。また、２次構
造予測の結果、ヘリックス構造をとり得るアミノ酸配列を赤色で、シート構造をとり得る配列を青色で示した。

図１０ ガモン２の分子構造（A）と立体構造モデル（Ｂ）。立体構造モデルは、カルシウムの結合していない形を空間充填モデルで示した。飯尾英夫博士提供

図９ ガモン１の推定糖鎖構造。
（A）レクチンとの親和性および糖組成（1975）を元に推定された糖鎖構造 (Sugiura and Harumoto, 2001)。（B）分子量の変更を元に見直された糖鎖構造（飯尾, 私信）。

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原生動物学雑誌 第36巻 2003年

１遺伝子の転写後、および翻訳後の制御機構が関わっているのか、細胞外への分泌機構の段階で制御されているのか。これらの可能性を検討するため、様々な条件下におけるガモン1遺伝子の転写レベルおよび細胞外へ分泌されたガモン1タンパク質量とガモン1活性を調べた。ガモン1転写産物の発現をノーザンハイブ
リダイゼーションで、細胞外へ分泌されたガモン1タ
ンパク質をSDS-PAGEで分離後、銀染色で検出し、ガモン1活性をUnit法、Index法の両方で測定した。
ノーザンハイブリダイゼーションによってI型細胞におけるガモン１遺伝子の転写産物について調べた
ところ、約1,000 baseのシングルバンドが検出された。
したがって、ブレファリズマのI型細胞では、ガモン１
遺伝子由来のmRNAが１種類のみ作られていることがわかった（図11）。
接合型が異なる細胞（I型、II型）においてガモン１
遺伝子の転写レベルを調べた結果（図12）、I型細胞は、対数増殖期にある時はガモン１遺伝子を転写せず、初期定常期に入り、適度な飢餓刺激を受けた時に初めて、ガモン１遺伝子を転写するようになることがわかった。また、飢餓刺激に加えてガモン２の刺激が加わると、さらにガモン１遺伝子の転写が促進されることがわかった。また、II型細胞では、適度な飢餓刺激やガモン２の存在に関わらず、ガモン１遺伝子は転写されていないことがわかった。SDS-PAGEの結果および活性測定の結果、細胞外のガモン１タンパク質量は、ほぼmRNAの量と関連しており、特定条件下で転写されたガモン1 mRNAから合成されたガモン1タンパク
質は、合成されてすぐに細胞外へ分泌されていると考えられた。つまり、これらの条件によるガモン１の発現制御が、ガモン１の分泌過程や翻訳後修飾の過程で調節されているのではなく、ガモン１遺伝子の転写レベルで調節されている可能性が高いことが示された。
ガモン１遺伝子発現に対するガモン２刺激の影響を経時的に調べた結果（図13）、初期定常期にあるI型細胞は、飢餓刺激によって少量のガモン１を合成したが、ガモン２の刺激が加わると、比較的短時間（２時間以内）でガモン1遺伝子の転写が促進され、少なくとも６時間後までは著しく促進された。
また、ガモン１遺伝子発現に対する飢餓刺激の程度が及ぼす影響について調べた結果（図14）、I型細胞では、飢餓刺激が強くなるに従って、ガモン１遺伝子の転写が促進されることがわかった。また、定常期に入って５日目の細胞でも、ガモン２に対する反応性を保持していることがわかった。
以上の結果から、接合型の違い、飢餓刺激、ガモン
２の刺激によって、ガモン１の発現は転写レベルで厳密に制御されており、細胞にはそのような制御機構が備わっていると考えられた。これらの刺激の他に、細胞が接合活性を獲得するためには、性的未熟期から成熟期へと移り変わることが必要であるが、この未熟期と成熟期の変化が何によって支配されており、その刺激によってガモン１遺伝子の転写がどのような影響を受けるかについては大変興味深い。そして、接合型の違い、細胞の時間制御機構と関わる性的成熟過程、外的要因（飢餓刺激）との相互作用、ガモン２を介した相補的な細胞間の相互作用が、どのように関連し合って、ガモン１遺伝子の発現を調節し、最終的に細胞を接合に至らせるのか、その分子メカニズムを明らかにしていくことが今後の大きな課題である。
ガモン２
接合型IIの細胞には、I型細胞のように自発的にガモン2を発現し始めるタイプ（augex 型）とガモン1の刺激を受けて初めてガモン2を発現し始めるタイプ（non-augex型）とがある。
Non-augex型のII型細胞をガモン1（104 U/ml）で刺激すると、約２時間でガモン２が合成され、すぐに細胞外へ分泌される（Miyake and Beyer, 1973）。また、II型細胞をガモン１で１−２時間処理した後外液中からガモン１を除いても、その後数時間の間は、継続してガモン１刺激を与えた場合と同じレベルのガモン２が合成、分泌される。これは、ガモン２生合成のメカ
ニズムは、一度ガモン１によって誘導されると数時間の間はガモン１非存在下でも機能しつづけることを示している。このことより、ガモン１はガモン２の生合成系を作動させる働きをしており、ガモン１刺激によってガモン２の生合成系に関与するガモン２合成
酵素の発現が誘導されると考えられる(Miyake, 1978)。
ガモン２の構造（図10）から、ガモン２はトリプトファンから合成されていると考えられ、これは[14C]-トリ
プトファンとII型細胞をインキュベートすると、細胞外液中に[14C]ラベルされたガモン２が分泌されてくるという実験により裏付けられた（Miyake, 1981a）。
ガモン２は、L-tryptophan 5-hydroxy-L-tryptophan
5-hydroxy-N-formyl-L-kynurenine
L-blepharismone（ガモン２）という経路を経て生合成されると考えられている（Jaenicke, 1984）。ガモン１によって発現を誘導されるのはこの経路に携わる酵素であろう。
接合対形成過程
ブレファリズマの接合対は囲口部前庭（peristomial
floor）で接着している。図１５に示すように、ブレファリズマには口部域（oral area）を囲むように特殊化した繊毛列がある。向かって右側（細胞の左側）には囲口部（peristome）の縁に沿って口部膜板帯（adoral zone ofmembranelles）(AZM)と呼ばれる束になった繊毛の列

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図１１ ガモン１遺伝子の転写産物。
（A）I型細胞（R1072株）から抽出したtotal RNAを、それぞれ2µg、5 µg、11 µg、11 µg（lane1-4）アプライし、１％
変性アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマ
イド染色を行った（左）。DIG標識したガモン１
cDNA断片〔（B）プローブ１〕をプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った（右）。
矢頭は、検出されたガモン１mRNA（約1,000 base）を示す。また、RNA分子量マーカー（M）の分子量を泳動像の左端に示した。プローブ２（B）を使用した場合も、同様の結果が得られた。

があり、向かって左側（細胞の右側）には囲口部の縁の後方約1/3にわたって繊毛が結合してできた波動膜（undulating membrane）(UM)（繊毛虫類では口縁膜
paroral membraneと呼ばれることもある）が存在する。
UMの前方には繊毛列（antUM またはextUM）がある。
口部域はこれらの繊毛列に囲まれており、囲口部前庭（peristomial floor）には繊毛はない。前庭の奥には口腔（buccal cavity）が続き、エサはここを通って細胞口（cytostome）から細胞咽頭（cytopharynx）へ取り込まれる。
相補的な接合型の接合前細胞が混ぜ合わされる
か、または、一方の接合型の接合前細胞が相補的な接合型のガモンで処理されると、１−２時間後に接合対が生じてくる。
接 合 対 形 成 過 程 は 大 き く preunion, ciliary union,
conjugant union（またはglued union）という３つのステージに分けられる（Miyake and Beyer, 1973; Miyake,
1981a）。

159

図１２ 接合型、飢餓刺激およびガモン２刺激のガモン１遺伝子発現への影響。対数増殖期にあるI型細胞（log）と初期定常期にあるI型細胞およびII型細胞のガモン1遺伝子の発現を調べた。また初期
定常期にある両接合型細胞において、ガモン２（G２）刺激の影響を調べた。（A）各細胞から回収したtotal RNA（６μg/lane）を１％変性アガロースゲル
で電気泳動し、全長ガモン１cDNAをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った。初期定常期にあるI型細胞にのみ、約1,000 baseのガモン1mRNAのバンドが検出された（矢頭）。またガ
モン２刺激によってガモン1mRNAの合成量が顕著に増加した。（B）各細胞のCFFを回収し、SDS-PAGEおよび銀染色を行った。細胞外へ分泌された約30 kDaのガモン1タンパク（矢頭）のバンドが、I型細胞で検出された。（C）CFF中のガモン1活性を調べた。活性の強さは、接合対形成度（棒グラフ）
お よ び units（表）で 表 し た。T121 ： II 型 細 胞 ,R1072：I型細胞, G2(＋)：ガモン２刺激を与えた
もの, G2(−)：ガモン２刺激を与えてないものをPreunionステージ
相補的な細胞やガモンを混ぜ合わせた後、１−２時間に当たる時期で、この時期にはまだ接合対は見られない。繊毛虫の接合過程で待機期（waiting period）と呼ばれる時期に当たる。この時期の終わりごろに、細胞同士が接着したciliary unionが現れてくる。この時期の接合前細胞同士の相互作用
は図１６のように考えられている。相互作用は７つの段階に分かれ、まず、I型の接合前細胞が自発的にガモ

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原生動物学雑誌 第36巻 2003年

図１３ ガモン２刺激によるガモン１遺伝子発現の経時的変化。初期定常期のI型細胞において、
ガモン２添加後の時間経過に伴うガモン1遺伝子の発現量の変化を調べた。（A）ガモン２添加後、０、２、４、６、８、20時間後の細胞から抽出したtotal RNA（6 µg/lane）を１％変性アガロースゲ
ルで電気泳動し、ガモン1cDNAをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った。ガモン１遺伝子の発現量は、ガモン２添加後の経過時間に伴って次第に増加していく傾向を示した。
（B）各時間に回収したCFFをSDS-PAGEで分離し銀染色を行った。細胞外へ分泌されたガモン１が、徐々に増加していく様子が示された。（C）各
CFFのガモン１活性を接合対形成度（棒グラフ）とunits（表）で示した。

ン１を出し始める（１）と、ガモン１は特異的にII型の接合前細胞に働き（２）、細胞を接合できるように変化させる（３）と同時にガモン２の産生を誘導または促進させる（４）。ガモン２は特異的にI型の接合前細胞に働き（５）、細胞を接合できるように変化させる（６）と同時にガモン１の産生を促進させるように働く（１）。このようにして両接合型の接合前細胞は、正のフィードバックによりさらに多くのガモンを放出してお互いを刺激しあい、接合対形成へと導かれる（７）（Miyake and Beyer, 1973; Miyake, 1978, 1981a,
1996）。
相補的な型の細胞を混ぜ合わせた場合には、相補的な型からなる異型接合対（heterotypic pair）だけでな

図１４ ガモン１遺伝子の発現に対する飢餓刺激の影響。初期定常期にあるI型細胞（１D）と定常期に入って５日間飢餓状態にあったI型細胞（５D）における、ガモン１遺伝子の発現およびガモン２刺激に対する反応を調べた。（A）それぞれの飢餓状態にある細胞をガモン２（G2）処理したものとしていないものを用意し、各細胞からtotal RNAを抽出した。各total RNA（9 µg/lane）を１％変性アガ
ロースゲルで電気泳動し、ガモン１cDNAをプロー
ブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った。定常期に入ってさらに５日間飢餓刺激を与えた細胞では、ガモン１遺伝子の発現量が増加していた。また、１D、５D共にガモン２刺激に対して反応した。（B）各条件下におけるCFFを回収し、SDS-PAGEを行った。（C）CFFのガモン１活性を接合対形成度（棒グラフ）とunits（表）で表した。
G2(＋)：ガモン２刺激を与えたもの, G2(−)：ガ
モン２刺激を与えてないものを示す。

く、同じ型から成る同型接合対（homotypeic pair）も現れる。一方の型の接合前細胞を相補的なガモンで処理した場合には同型接合対のみが現れる。ブレファリズ
マにおいて特徴的なことは、減数分裂に始まる核変化
が異型接合対のみで起こり、同型接合対では起こらな
いことである（Miyake, 1868; Miyake and Beyer, 1973）。
Ciliary unionステージ
このステージはpreunion
ステージの後１−２時間続く。細胞はお互いに向かい合って口部域で接着しているが、この接着は強固ではなく、繊毛同士が接着しているだけなので、ピペットで強い水流を起こしてやると容易に離れる。このス

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図１５ ブレファリズマの口部域の走査型電子顕微鏡写真。図Ｃは図Ｂの、図Ｂは図Ａの一部拡大。
１．口部膜板帯（AZM）、２．波動膜（UM）、３．
波動膜前方の繊毛（antUM）、４．体表の繊毛、５．
囲口部前庭（peristomial floor）。（バーは５ミクロン）

テージでは、細胞自身のAZMと、相手の細胞のUMの前方にある繊毛antUMとが相互に接着している(図１７)。つまり細胞は囲口部前庭をはさんで相互に向かい合うことになる。この時期に囲口部前庭は膨張しはじめ、次の強固な接着への準備段階となる。Ciliary
unionの形成には、AZMとantUMの両方が接着能をもつようになることが必要で、まずAZM、次にantUMの順で接着能を獲得するという（Honda and Miyake,1976）。Ciliary unionは、細胞同士を定まった位置に保持し、さらに強固な接合へ向かわせるはたらきがあるのだろう（Miyake, 1981a）。
Conjugant union（またはglued union）ステージ
接合対の間の接着がより強固になり、細胞同士が繊毛ではなく、細胞体で接着する時期である。膨張した囲口
部前庭同士の接着が、最初口部域の前端で始まり後方へと広がっていく。この時期には、異型接合対と同型接合対の違いがはっきりと現れてくる。異型接合対では接着部位は囲口部前庭の後端にまで及ぶが、同型接合対では接着部位はその半分くらいまでしか到達しない(Bedini et al. 1978)。この時期に、栄養にはならな
い色素を与えて食胞形成の様子を観察すると、異型接合対では食胞形成能が落ちるのに対し、同型接合対では 落 ち な い ま ま で あ る (Yoshimura and Harumoto,2000)。つまり、異型接合対では囲口部が完全にふさがれてしまうが、同型接合対では閉じていない。ゾウリ

161

図1６ ブレファリズマにおける接合前細胞の相互作用。I：接合型Iの接合前細胞、II：接合型IIの接合前細胞。（Miyake, 1978）１−７の説明は本文参照。

ムシの接合で見られるような腹側の繊毛の退化は起こらないようだ（Bedini et al. 1978）。異型接合対では、接合時に特徴的な大核と小核の核変化が起こり、約１日後に接合対は離れる。一方、同型接合対においては、
核変化は起こらず、接合対は数時間ないし数日間接着したあとで離れてしまう。
同型接合対では細胞同士の接着範囲が狭いことと、小核の減数分裂などの核変化が起こらないこと以外は、接合対の形成過程において同型接合対と異型接合対の間で違いは見られない。従って、一種類の接合型の細胞と相補的なガモンがあれば容易に接合を誘導できる同型接合対は、接合対形成過程を調べるためのよいモデルシステムとなる。また、異型接合対では減数分裂が起こるのに、なぜ同型接合対では起こらな
いのかということを調べることにより、減数分裂の開始機構が明らかになるかもしれない（後述）。
接合対形成におけるタンパク質合成
ガモンにより同型接合対を誘導する際に、シクロ
ヘキシミド（10 mg /ml）を入れておくと接合対形成は完全に阻害されるので、接合対形成にはタンパク質合成が必要と考えられる（Miyake and Honda, 1976）。ガ
モン処理により、アミノ酸の取り込みは増加する。ガモン処理後約５分で取り込みが始まり、約２時間の間急激に増加し、この後ciliary unionが形成される。ガモン処理した細胞と処理していない細胞では、合成されるタンパク質の量が違うことに加え、SDS-PAGEで分離すると、合成されるタンパク質のパターンもかなり異なっている。ガモン処理により誘導されたタンパク162

原生動物学雑誌 第36巻 2003年

図１７ （A）ブレファリズマの囲口部と（B）ciliary
unionステージの細胞（断面図）の模式図。１．口部膜板帯（AZM）、２．波動膜（UM）、３．波動
膜前方の繊毛（antUM）、４．体表の繊毛、５．囲
口部前庭（peristomial floor）(Miyake, 1981)

図１９ ブレファリズマの接合誘導時におけるガモンを介した細胞間相互作用の模式図。I：I型細胞、II：II型細胞、G1：ガモン1、G2：ガモン２、
G1-R；推定上のガモン１受容体、G2-R：推定上のガモン２受容体、Trp：トリプトファンを示す。

図１８ ガモン2（blepharismone）と化学合成されたガモン2の誘導体。
（ ）内はガモン2活性が見られなかったもの。（Miyake, 1996）

質の多くは、膜タンパク質ではないかと推測されている（Miyake and Honda, 1976）。
また、すでに形成されていたciliary union も、シクロ
ヘキシミド処理によりしばらくすると離れる。Ciliary
unionの維持にもタンパク質合成が必要なのであろう（Miyake and Honda, 1976）。
接合対形成時の微細構造
接合対で細胞は約200 nm の距離をおいて接着している。この接着面にはしばしば細胞質連絡や小胞が見られる（Bedini et al. 1978）。
Conjugant union の最初の２−３時間に、接着面に近い細胞質中にはPACM（perpendicularly associated withthe cell membrane）微小管や、多くの袋状の小胞構造が現れる（Bedini et al. 1978）。PACM微小管は細胞膜近辺に発し、細胞質へ向かって細胞膜に垂直または斜めに走っている（Ototake, 1969; Miyake, 1978）。これらの構造は、異型接合対では接合対ができて数時間後に消失するが、同型接合対では１０時間以上も続く。袋状構造は細胞質中どこにでも、またいつの時期にも見られるが、特に接合面に近いところに多く、conjugant
union 形成の早期によく見られる(Miyake, 1978)。
細胞を単離してガモン処理を行っても、PACM微小管が形成され袋状構造も現れるので、これらの構造は接合対が形成された結果ではなく、相補的なガモンによって引き起こされた細胞の反応であると考えられる。これらのことから、PACM微小管や袋状構造は接合対形成のための装置で、袋状構造は中にガモンにより誘導されたタンパク質を含み、PACM微小管により細胞の接着面へ輸送されているのではないかと考えられている（Miyake and Honda, 1976; Miyake, 1978）。
ガモンの機能ガモンの機能は言うまでもなく接合対形成作用であるが、一連の接合対形成過程の中で、何がガモンによって引き起こされる現象であるかを見極めることが大切であろう。少なくとも以下の６つの作用がガモンにあると考えられる。
細胞誘引作用ガモン２は10-3 U/ml（1.3 pM）でI型の接合前細胞を誘引する作用がある（Honda and Miyake, 1975）。この濃度は接合対を誘導するよりも千倍も低い。この誘引作用はシクロヘキシミドで阻害されないので、接合対形成とは異なり、細胞がガモン２によって誘引されるためには新たなタンパク質合成は必要ないと考えらJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 2. (2003)

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図２０ ブレファリズマの接合における小核の核変化のタイムテーブル。横棒はそれぞれのス
テージの長さ（数字は時間）を表わす。接合過程を同調させるために、I型およびII型の細胞はそれぞれ別々に相補的なガモンで処理し、２時間後に、形成されつつある同型接合対を分離し、二つの型の細胞を混ぜ合わせた。混ぜ合わせた直後に接合対が形成されその数は急速に増えた。横軸は相補的な型の細胞を混ぜてからの時間。実験は２４℃で行われた（Miyake et. al., 1979）。

れる（Honda and Miyake, 1975）。ガモン２による接合対形成を阻害する5-hydroxy-L-tryptophanは、細胞誘引作用も阻害する。このことは細胞誘引のためのガモン２受容体と接合対形成のためのガモン２受容体が共通であることを示唆している（Honda, 1979）。ガモン
２はガモン２受容体に結合して細胞誘引や接合対形成を起こさせると考えられるが、細胞がガモン２の濃度勾配を感知してより濃度の高い方向に移動するためには、ガモン２とその受容体の結合が強すぎては都合が悪いことになる。
ガモン１による細胞誘引作用については議論があった（Miyake and Rivola, 1989）が、ガモン２ほど顕著ではないがII型の接合前細胞を誘引する作用がある。平底ビーカーに底面をパラフィルムで覆った筒を立て、筒の内外へそれぞれ相補的な接合型細胞を入れる。筒の下から数ミリの位置に直径約２mmの穴を一箇所だけ開けておき、穴をメッシュで覆うことによって細胞は通過できないが物質（ガモン）の行き来は可能な状態にする。細胞密度を合わせた各接合型細胞の浮遊液を加えて静置すると、約15時間頃から細胞が穴の付近へ集まってくるのが観察された。細胞の分布の様子を相対的に見ると、穴の位置に近い領域にほとんどの細胞が集まっており、穴の反対側の領域には細胞はほとんど見られなかった。この現象は、I型細胞のみ
ならずII型細胞にも同様に見られたことから、ガモン
１によるII型細胞の誘引作用が証明されたことになる（塩谷、杉浦、春本未発表）。また、どちらの接合型細胞においても、ある濃度以上（ガモン２の場合は約２U以上）の相補的なガモンが存在する条件下では、約30分後には約7割の細胞が前進遊泳しなくなり同じ場所にとどまって回転運動していることがわかった。
このことより、ブレファリズマは相補的な型のガモンの濃度が高い場所へ行くと、前進遊泳できなくなり、方向転換の頻度が増え、回転運動が盛んになることに
よってその場に停止する細胞が多くなり、その結果、ガモンの濃度が高い場所に細胞がとどまると考えられる。
接着能獲得作用
相補的なガモンで処理した接合前細胞の浮遊液をスターラーで常時撹拌しておくと、接合対はできてこない。しかし撹拌をやめた途端に、それまでのガモンの刺激の長さに応じて、ciliary unionや conjugant union
ができてくる（Honda and Miyake, 1976）。従って、AZM

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図２１ ブレファリズマの接合における小核の形態変化。ローマ数字はステージを表わす。１，２，３は、小核のうちのいくつかが核変化の進行を停止するポイント。Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３：それぞれのポイントで進行を停止した核。Ｋ：核融合（karyogamy）（Miyake et. al., 1979）

やantUMや囲口部前庭の接着能の獲得には細胞間の接触は必要ではなく、相補的なガモンによる刺激があればよいと考えられる。
ガモンの産生誘導・促進作用
前述したように、non-augex型のII型接合前細胞をガ
モン1（104 U/ml）で刺激すると、約２時間でガモン２が合成され分泌される。augex型のII型接合前細胞をガ
モン1（103 U/ml）で刺激すると、２時間後には外液のガモン２活性が上昇し、１４時間後も上昇し続け、ガモン１で刺激する前の３２倍もの活性があったという。この間コントロールのガモン１で刺激しなかったものでは、わずか２倍にしか活性は増えていなかった。これらのことから、ガモン１はnon-augex型のII型
接合前細胞に働いてガモン２の産生を誘導するだけ
でなく、augex型のII型接合前細胞に働いて、ガモン２の産生を促進するように働くことがわかる。ガモン１
によるガモン２の産生誘導は、接合対形成を誘導する
濃度の1/5以下でよいという（Miyake and Beyer, 1973）。
また、ガモン２（32 U/ml）をI型接合前細胞に作用させると、作用させなかったものよりも、２時間後には約２倍、４時間後には約４倍多くのガモン１を産生するようになった（Miyake and Beyer, 1973）。前述のように、近年の研究から、このガモン２によるガモン
１の産生促進の制御は転写レベルで行われていることが明らかになった。
これらの結果は、相補的なガモンがガモンの産生誘導や促進を起こさせることを示している。
タンパク質合成誘導作用
相補的なガモンで処理された接合前細胞は、前述
したようにciliary union 形成に先立ってアミノ酸の取り込みが急激に増加する。これは相補的なガモンによる 作 用 で、相 補 的 で な い ガ モ ン で は 起 こ ら な い（Miyake and Honda, 1976）。この中には、ガモン１や、ガモン２の合成経路に関わる酵素群も含まれると考えられる。
細胞の形態変化誘起作用
接合対が生じるとき細胞は短く丸くなりねじれやすくなる。特に長さの短縮化はII型の細胞で顕著であった（Miyake and Beyer, 1973）。細胞の短縮化および丸形化は、相補的な細胞を混ぜ合わせたり、一方の接合型の細胞を相補的なガモンで処理してからciliary
unionが形成される１−２時間後から顕著になり、その後さらに数時間にわたってつづく。IまたはII型の接合前細胞を単離して、相補的なガモンで処理しても同様に短縮化および丸形化が起こることから、細胞の短縮化はガモンの作用であると考えられる（Yoshimura,Sugiura and Harumoto, 2000）。
同型接合対維持作用
一方の接合型の細胞を相補的なガモンで処理してできたconjugant unionを相補的なガモンを含まない
SMBに移すと、次第に接合対は離れ始め２−３時間でほぼ全ての細胞は一匹に戻る。しかしこの時に相補的なガモンをSMBに入れておくと接合対は維持される（Yoshimura, Sugiura and Harumoto, 2000）。このこと
は、相補的なガモンに同型接合対を維持させる働きがあることを示している。相補的なガモンによって
PACM微小管や袋状構造形成が引き起こされる（前述）が、ガモンの刺激がなくなるとそれらの構造がなくなり、接合対を維持できなくなると考えられる。異型接合対はSMBに移しても離れることはない。異型接合対がSMB中でも維持されるのは、細胞が接合後も相補的なガモンを作り続けているためか、異型接合対は

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図２２ ブレファリズマの接合における核変化の模式図。縦軸の時間は、相補的なガモンで前処理した二つの型の細胞を混ぜ合わせてからの時間。ⅠからⅩⅥのステージは図２１に従う。S:受精核形成期、D:分裂期、I:中 間 期、E ： 胚 性 期（Miyake et al. 1991）

Blepharismoneから5’ 位の水酸基を取った5-desoxyblepharismoneの活性はblepharismoneの約1/40であった
が、ホ ル ミ ル ア ミ ノ 基 を 取 っ た 2-desformylaminoガモンと仮想のガモン受容体
blephaismoneの活性は約1/1200であったことから、5’位の水酸基よりもホルミルアミノ基の方がガモン２のガモン１および２の受容体として、それぞれに特異 活性に重要なのかもしれない。
的なガモン１受容体およびガモン２受容体が考えら
ガモン２と類似した構造をもつ物質が、ガモン２れている。これらの受容体は、細胞外のシグナルであ の活性を競合的に阻害するならば、その物質はI型細るガモンを受容し、それを細胞内のシグナルに変換す 胞のガモン２受容体に結合する可能性があり興味深ると考えられている。これらの受容体はまだ単離され い。そのような物質として、ガモン２の前駆体と考えていないが、ガモン２が小分子であることを利用し られているtryptophan、5-hydroxytryptophan、N-formylて、接合誘導活性に必須なガモン２の構造やガモン２ 5-hydroxy-L-kynurenineや、ガモン２の誘導体であるN受容体の性質を調べる試みがなされている（Entzeroth acetyl-blepharismone、N-formyl-L-kynurenine、5-hydroxy
and Jaenicke, 1981, 1982; Miyake, 1981a, 1996）（図１ -L-kynurenineや、阻害効果はわずかではあるがアミノ８）。ガモン２（blepharismone）とN-formyl-5-hydroxy 酸のleucineがある（Miyake, 1974, 1981a, 1996; Jaenicke,-kynurenineについてみると、後者が活性をもたないこ 1984）。Tryptophan、5-hydroxytryptophan に関しては、とから、側鎖中の水酸基はガモン２の接合誘導活性に L型はD型よりも２倍から４倍の効果があったという必 須 で あ る と 考 え ら れ る。ま た、5-desoxy- （Miyake, 1981a）。これらの阻害作用が、ガモン２受
blepharismone と 5-bromo-blepharismone は い ず れ も 容体への結合に関して、ガモン２と拮抗した結果であ
blepharismoneよりも活性が低い（または活性がない） るならば、これらの物質を用いてガモン２受容体の探ことから、5’ 位の水酸基も重要であると考えられる。 索が可能になるかもしれない。
さ ら に 2-desformylamino-blephaismone と 2-acetamido接合型Iの細胞を固定しておき、そこに125Iでラベル
blepharismoneも活性が低い（または活性がない）こと したガモン２を作用させると、ガモン２は細胞に結合から、ホルミルアミノ基も重要であると考えられる。 するが、この結合はラベルされていないガモン２で阻同型接合対にない機構で接合対を強化しているのかは明らかではない。

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図２３ 接合完了体のDAPI染色した蛍光顕微鏡
像。大きな2個の一次大核原基、１０個近くの二次大核原基、8個の新小核が観察される。三宅章雄博士提供害される。この系によると細胞当たり約3 × 10 6 のガモン２分子が結合するという（Revoltella et al. 1976）。また、ガモン２によって接合対を誘導する際に、ガモン
２を誘導できるぎりぎりの量まで減らしておくと、
phytohemagglutininW やConAや抗チューブリン抗体によって接合対形成が阻害されたという。しかしこれらのリガンドはガモン２受容体とは異なる部位に結合するのであろう（Revoltella et al. 1976）。このように、ガモン２の受容体についての研究は少しなされてはいるがまだ受容体の同定には至っていない。ガモン１受容体についての研究はまだ報告されていない。また、ガモン１とガモン２は相互作用を起こさないようだ。二つのガモンが共存しても、それぞれのガモンの活性は変わらないことがわかっている（Miyake, 1974,
1978, 1981a）。
接合対形成の分子機構
ブレファリズマにおけるガモンを介したI型細胞とII型細胞の相互作用についての模式図を示した（図１９）。性的に成熟期にある細胞が、飢餓刺激を受けると、初めにI型細胞においてガモン１遺伝子の発現が誘導される。ガモン1遺伝子から転写されたmRNAを基にprepro-gamone 1が合成され、細胞外へ分泌される過程でプロセシングおよび糖鎖の付加を受けmaturegamone 1（G１）となる。細胞外へ分泌されたガモン１は、飢餓刺激によって接合活性を有しているII型細胞に特異的に認識される。その際、II型細胞表面上に存在する推定上のガモン１受容体（Ｇ１-Ｒ）を介して細胞内へシグナルが伝えられる。II型細胞内に伝達されたシグナルによって、ガモン２合成酵素が誘導されると推定される。それによって、トリプトファンからガモ
ン２が合成され、細胞外へ分泌されると考えられる。
II型細胞によって合成されたガモン２は、I型細胞に特異的に認識され、I型細胞の表面上に存在する推定上のガモン２受容体（Ｇ２-Ｒ）を介してI型細胞内にシグナルが伝達される。その結果、ガモン１遺伝子の転写をさらに促進するメカニズムが働き、ガモン１遺伝子の発現率が著しく増加し、多量のガモン１が合成、分泌される。相補的なガモンの刺激を受けると、ガモンの合成系が促進されると共に様々なタンパク質の合成が誘導される。これらのタンパク質発現によって、細胞の短縮化や丸形化、繊毛の接着能の獲得、細胞内微細構造の変化などが誘導され、最終的に接合対が形成されると考えられる。
これまでに、ブレファリズマにおいて接合を引き起こす鍵となる物質、ガモンの性質が明らかになった。今後、無性生殖期から有性生殖期への変換および接合誘導の分子機構を解明するためには、次の段階として各ガモンに対する受容体分子の同定が必須となってくる。そして、性成熟過程や飢餓刺激と接合能の獲得（ガモンと受容体の発現）の関係、それらの刺激とガモンの刺激による細胞内情報伝達系、ガモンと受容体との分子間相互作用、ガモン１とガモン２の合成分泌経路などが解明されていくことが期待される。
他種のブレファリズマにおけるガモン
ブレファリズマ属の他の種では、まだガモンを単離したという報告はない。しかし、B. americanum, B.
musculus, B. stoltei, B. tropicum においては、相補的な接合型が存在し、それぞれはガモンを放出して、他方の型の細胞に接合対を誘導することが知られている。B.
japonicum の場合と同様に、これらの種でも、接合型Iの細胞が出すガモン１は透析されず熱に不安定で、接合型IIの出すガモン２は透析可能で熱に安定である（Miyake and Bleyman, 1976; Miyake and Mancini,1978）。
B. americanum, B. musculus, B. stoltei, B. tropicum の接合型Iの細胞は、B. japonicumのガモン２に反応し、接合対を形成した。また、上記の４種から得た接合型IIの細胞のガモンは、いずれもB. japonicumの接合型Iの細胞に接合対を誘導した（Miyake and Bleyman, 1976;
Miyake and Mancini, 1978）。B. americanumとB. japonicumのガモン２は、薄層クロマトグラフィーでも分離できなかったという報告もある（Miyake, 1981a）。
従 っ て、こ れ ら ５ 種 の ガ モ ン ２ は 共 通 の 分 子

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図２４ ブレファリズマの接合における大核形成の二つの経路。性的な経路では新大核と新小核は受精核に由来する。しかし、半性的な経路では新小核は受精核に由来するが、新大核は減数分裂を行わずに大核原基に発達した小核(体質小核)に由来する（Miyake et al. 1991）。

blepharismoneと考えられる。一方、ガモン１はこれらの５種でそれぞれ種特異的らしい(Miyake, 1981a)。このことはブレファリズマの種分化を考える上で興味深い。

し、静止核と融合し、融合核（synkaryon）（または受精核（fertilization nucleus）ともいう）を形成する（ステージXVII）。
ブレファリズマにある約２０個の小核のうち、約半数は膨潤した後、減数分裂に入るが、残りは減数分接合の際の核変化
裂に入らず体質小核となる（後述）。また、減数分裂の第一分裂を終えた小核のうち第二分裂に入るのは小核の減数分裂と受精核の形成、新大核および新 数個程度である。そしてこのうち口部域の前方に近い
小 核 の 形 成、旧 大 核 の 形 態 変 化 と 消 失、 位置にある１個だけが第二分裂を完了し配偶核（移動somatomicronucleus（体質小核）の形態変化が、ブレ 核と静止核）を作る。従って、小核が受精前核となる
ファリズマの接合の際に見られる主な核変化である。 までには、３つの関門（図２１ １，２，３）があることになる。同じ細胞質中にある小核が、この関門を小核の減数分裂と受精核の形成突破するものとそうでないものとに分かれるのは、どブレファリズマにおける小核の減数分裂から受精 のような機構によるものかは興味深い問題である。
核形成へのタイムテーブルを図２０に、この時の小核
他の多くの繊毛虫の配偶核形成時の核変化と比べの形態変化を図２１に示す（Miyake et al. 1979）。受精 て、ブレファリズマの特徴は、（１）複数ある小核の核形成までの小核の核変化は１７のステージに分け うち、約半数が減数分裂に入るが、残りは入らずに体られている。減数分裂に入る前の小核（ステージ I ） 質小核（後述）となること。（２）減数分裂の結果生は二倍体である。初めに小核が膨潤する（ステージ II ） じた二つの配偶核は分裂せずにそれぞれ移動核と静ので、このステージでDNA合成が行われていると思わ 止核となり、接合対の相手方の細胞と相互に移動核をれる。次に小核は繊毛虫の接合でしばしば特徴的に見 交換し受精が起こる。従って、ひとつの接合対由来のられるパラシュート型を形成する（ステージ III ）。こ ２つの接合完了体は遺伝的に異なるものである。これの時期は、減数分裂の第一分裂の前期といわれる。中 らの特徴は同じ異毛綱に属するソライロラッパムシ期に入ると（ステージ VIII ）、染色質小体（chromatin （Stentor coeruleus）でも見られるらしい（Miyake andbody）が赤道面に並ぶようになり、その後小核は後期 Rivola, 1995）。
（ステージIX）から終期（ステージX）に入り、第一分裂を完了する。第二分裂に入る小核はさらに分裂を 新大核および新小核の形成
進行し、第二分裂中期（ステージXIII ）、後期（ステー接合の際に新大核と新小核が形成される様子を模
ジXIV）、終期（XV）を経て減数分裂の第二分裂を終 式 図 で 図 ２ ２ に、タ イ ム テ ー ブ ル を 表 ４ に 示 すえる。ブレファリズマの小核の減数分裂の際に現れる （Miyake et al. 1991）。移動核と静止核が融合してまも染色質小体の数はn=５９であった。第二分裂を終えた なく受精核は分裂する。ゾウリムシ（Harumoto and小核は少し膨潤し、受精前核（pronuclei）となる。受 Hiwatashi, 1982）やテトラヒメナ（Doerder and Debault,
精前核のうち移動核は接合対の相手方の細胞に移動 1975）の場合と同様に、ブレファリズマでも受精前に

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表４

ブレファリズマの接合における受精核形成後の核変化のステージ

ステージ

継続時間（h）

a

接合開始からの時間（h）-18.95受精核形成前S （受精核形成期）

0.20

18.95-19.15

D1（第一分裂期）

1.08

19.15-20.23

I1 （第一分裂間期）

0.76

20.23-20.99

D2（第二分裂期）

1.03

20.99-22.02

I2 （第二分裂間期）

1.26

22.02-23.28

D3（第三分裂期）

0.95

23.28-24.23

I3 （第三分裂間期）

1.72

24.23-25.95

D4 （第四分裂期）

1.79

25.95-27.74

E1 （胚性期I）27.74-a

相補的なガモンでそれぞれ前処理したI型とIIの細胞を混ぜてからの時間。（Miyake et al. 1991）より一部改編。

anlagen）と呼ばれる（Miyake et al. 1991）。

図２５ ５細胞のダブレット（II型細胞）から成る
同型接合対の鎖の端に、I型細胞が接合したもの。
生細胞で染色はしていないが、I型細胞はアルビノを用いているので細胞質がよく見える。矢印は、II型細胞より受け取った移動核。ダブレットの細胞質中に見られる丸く濃いものは、減数分裂中の小核や受精前の配偶核と思われる。I型細胞から一番
遠 い ダ ブ レ ッ ト に は ま だ 見 ら れ な い（Miyake,1978）。

配偶核はすでにDNA量を倍加しているらしい。受精核の形成は常に口部に近い細胞質中で起こり、１回目の分裂が起こり２核となる。このうち口部に近い方の核は次の分裂で２個の核を生じ、これらは発達して新大核となる。口部から遠い方の核はさらに３回の分裂を行って新小核を作る。受精核から生じた核から発達した 大 核 原 基 は 一 次 大 核 原 基（primary macronuclear

旧大核の形態変化と消失
繊毛虫の接合では、通常、前の世代の大核は消失する。ブレファリズマでは、ひも状の大核は、接合過程
でＵ字形やとぐろを巻く形に形態変化を起こした後、大きさがやや小さくなり、新大核原基が発達し細胞が接合後初めての分裂を行う頃に、極めて短時間で全体が崩壊するようだ（Miyake et al. 1991）。ゾウリムシのいくつかの種で見られるような大核の断片化は観察されない。
Somatomicronucleus（体質小核）の形態変化
前述したように、２０個余りの小核のうち、接合の際に減数分裂に入るのは約半数である。残りの小核は、分裂を行わず、長くくねった染色体様構造が見られる時期や染色体様構造が消失する時期を経て次第に大きさを増し、二次大核原基（secondary macronuclear anlagen）となる。接合を終えたばかりの細胞には、２個の一次大核原基と、10個位の二次大核原基と、８個の新小核が存在することになる(図２３)。この後、一次大核原基は棒状に伸長し、細胞が分裂する際に分配される。新小核は分裂するらしい。二次大核原基も分配されるが、通常、細胞が分裂を経るにつれてその数が減り、16細胞になる頃には消失してしまう。
同じ細胞質中にあって、小核のあるものは減数分裂を行い、あるものは二次大核原基への道をたどる機構については全くわかっていないが、その生物学的なJpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 2. (2003)

意義については次のようなことが考えられる（Miyake
et al. 1991）。
接合を終えて離れた細胞を顕微手術して新大核を含まない断片を作ると、その細胞の中で体質小核は成長し大核となる。おそらく通常でも、体質小核は新大核が発達してこなかった場合のセーフティーディバ
イスとなっているのであろう。前述した高頻度に自系接合を起こす株は、接合時に常にこの第２経路を使っているという。これは同系交配による遺伝的リスクを抑えるためかもしれない。
ブレファリズマにおける二種類の大核形成経路を
図２４に示した（Miyake et al. 1991）。通常の大核形成経路を性的な接合過程（sexual conjugation）と呼ぶのな
ら、減数分裂や受精を経ずに小核が直接大核原基に発達するような経路は半性的な接合過程（hemisexual
conjugation）と呼ぶことができるだろう。

169

く、並んでいる順に核変化が少しずつ遅れて進行していた。長い鎖では短い鎖に比べて、各々の細胞の核変化は遅れて起こった。5細胞から成るダブレットの5番目の細胞は核変化が起こらない場合もあり、それ以上長い鎖になると６番目以降のダブレットでは核変化は起こらなかった。
これらの結果から、三宅らは、核変化を誘起する因子は異型接合対で作られ、ダブレットの鎖を構成する細胞に、順に、接合面を通って細胞質を拡散して伝えられていき、ある程度の濃度になるとその細胞で核変化を引き起こすと考えた（Miyake, 1975; Miyake et al.
1977; Miyake, 1981a, 1981b）。
ダブレットではない普通の細胞で異型接合対を作り、時間を追って接合対を切り離し、核変化の活性化にはどのくらいの時間が必要かを調べた実験がある。
0.8時間以下では核変化は起こらず、1.8時間以上結合していれば全ての細胞で核変化は起こった。0.8時間
核変化開始機構
以上1.8時間以下では、時間が立つほど核変化を起こす細胞の割合は増え、５０％の細胞が核変化を起こす
これまでブレファリズマの接合における小核の減 時間は約1時間となった（Miyake et al. 1979）。この時
数分裂を初めとする一連の核変化について述べてき 間はまだ小核が形態変化を起こしていない時であるた。では、これらの核変化はどのような機構によって が、すでに核変化へ向けて「活性化」されていると考開始され、進行するのであろうか。これらの核変化は えられる。
同型接合対では起こらず、異型接合対にのみ起こるの核変化の開始および進行には新たなタンパク質合で、異型接合対に特異的な何らかの因子が引き金を引 成が必要である。異型接合対をシクロヘキシミド（10いていることになる。ブレファリズマのこのような特 μg/ml）で処理すると、タンパク質合成はほとんど処理
徴を生かして、1970−80年代にエレガントな実験が行 と同時に停止する。タンパク合成が停止した細胞ではわれた。三宅らは２つの細胞を融合させ、口部が２つ 核変化は起こらない。しかし、処理時間を短時間（0.5あるブレファリズマ（「ダブレット」と呼ばれる）を 〜2時間）行った後、処理を止めると、ほぼ処理時間の作製した。ダブレットは通常分裂してもその形態は維 長さの分だけ核変化は遅れて起こる。このことは、核持される。II型のダブレットをガモン1で処理すると同 変化の開始にはタンパク質合成が必要であり、シクロ型接合対が形成されるが、口部が2箇所あるので、他の ヘキシミド処理によって核変化を開始させる機構そ2細胞のダブレットと接合することが可能である。結 のものを壊しているわけではないことを示している
果として、ダブレットがつながった鎖が形成される。 （Miyake et al. 1979）。
この鎖は同型接合対なので核変化を起こさないが、こここでいう核変化には大核の核変化も含まれていの鎖の端にI 型の細胞を結合させると核変化が開始さ るが、最初に起こるのは小核の減数分裂への変化であれる（図２５）。しかもなぜかはわからないが、減数 る。これらの結果から、三宅らは、減数分裂を誘起す
分裂の第二分裂の頃から配偶核や受精核の形成の頃 る因子の存在を仮定した。この因子は、異型接合対でにかけて、小核の周りを赤色の色素顆粒が取り囲むよ 作られる細胞質因子で、小核に減数分裂を開始させうになり、生細胞でも核変化の様子がよくわかる。ダ る。この因子が作られるためには新たなタンパク質合ブレットが数細胞から成る鎖を作り、端に I 型の細胞 成が必要となると考えられている。
を結合させたのち、時間を追って接合対を切り離し、減数分裂はいったん開始されると、そのまま終了
各々の細胞で核変化が起こっているかどうかを調べ まで停止せずに進行するのであろうか、それとも減数た。その結果、I 型細胞と接合しているダブレットだけ 分裂の次のステージに進むためには、別の因子が必要
でなく、鎖を構成している他のダブレットでも核変化 なのであろうか。これについて詳しい実験がなされたが起こった。どんな核変化のステージでも、I 型の細胞 （Friedl et al. 1983）。減数分裂のさまざまな時期にあに近いダブレットの方がステージが進んでおり、遠く る異型接合対をシクロヘキシミド（10 μg/ml）で処理しにへだたっているダブレットほどステージは遅れて て、その後の核変化を時間を追って観察した。その結いた。核変化は途中の細胞を飛ばして起こることはな 果、減数分裂の進行は、どの時期で処理したかによっ170

原生動物学雑誌 第36巻 2003年て、停止する時期が異なることがわかった。つまり処理したステージのままで停止する場合や、次のステージに進んで停止する場合、またいくつかのステージを進んでから停止するものがあった。停止するポイント
は6箇所あり、ステージI、II、III、IV、XI、XIIであった。このことは、例えばステージⅠからⅡへ進行するには、新たなタンパク質合成が必要となることを示している。すなわち、減数分裂の開始・進行には、少な
くとも６つの新しく合成されるタンパク質が必要と
考 え ら れ る（Miyake and Heckmann, 1986; Miyake,1996）。
これらの研究は、細胞周期やその調節因子についての知識の乏しかった時代に行われたが、現在でもその結果の重要性は失われていない。しかしこれらの結果を最近の知見に照らし、結果を見直し再考してみることが必要であろう。
終わりにブレファリズマの接合におけるこれまでの研究について述べてきた。
ブレファリズマが接合研究に有利な材料で、かつ興味深い材料であることについては、少なくとも次の８つのことが挙げられるだろう。１）ブレファリズマ
は、繊毛虫の系統進化的に興味深い位置にいる種であること、２）接合型がI型とII型という2種類でシンプルな接合型システムをもっていること、３）接合誘導物
質が外液中に分泌されるので、単離が比較的容易で純粋な形で得やすいこと。ブレファリズマは、相補的な両方の型の接合誘導物質がすでに明らかになっている数少ない繊毛虫のうちのひとつである。すでに接合誘導物質が明らかになっているEuplotesの2種は多くの接合型をもっているために解析が難しい面がある。
４）糖タンパク質（ガモン1）とトリプトファンから作られる小分子（ガモン2）という全く異なる２種類の物
質を接合誘導物質として用いていること。また、ガモン2は繊毛虫類の接合誘導物質の中でも最も原始的なものと考えられている。５）大量培養が可能で、生物活性分子や核酸を純粋に大量に得ることができること。６）ガモンで前処理した細胞を用いることにより、接合対形成や減数分裂が同調した細胞集団を得ることができること、７）同型接合対では接合対は形成されるが減数分裂を含む核変化が起こらないことから、接合対形成の機構と減数分裂等の開始・進行の機構を分けて解析できる系であること、８）細胞が比較的大きいので顕微手術などの手法が使いやすいこと、などが挙げられる。これらの利点を活かし、今後の研究の発展が望まれる。

ブレファリズマにおける接合研究は1970-80年代に盛んであったが、1990年代以降は接合研究の主流から忘れ去られたような感がある。ひとつには遺伝子レベルでの研究が立ち遅れたこと、また、研究者の少なさが理由に挙げられる。しかし、この総説に述べたように、ブレファリズマを接合研究に用いる利点は多くあり、現在でもそのことは変わっていない。遺伝子レベルでの研究も数年前に始まり、ガモン1の全アミノ酸配列が明らかになり、ガモン1の発現の様子が分子レベルで調べられるようになった。ブレファリズマの接合研究においても、分子生物学的な手法を用いることが可能であることを示すことができた意義は大きい。
繊毛虫の接合誘導機構の研究は長い歴史をもち、繊毛虫を材料とする研究者の永遠のテーマであるが、この分野の研究者人口が国際的にも減っている現状を考えると危惧を感じざるを得ない。この時期に、より多くの人にブレファリズマの接合研究の面白さ、ユ
ニークさをわかってもらえればこの総説の意義は達せられたものと思っている。
謝辞
この総説を書くに当たり、協力してくださったカ
メリーノ大学三宅章雄教授に心から感謝の意を表します。また、未発表のデータを提供してくださった大
阪市立大学大学院飯尾英夫教授、いつも励まし続けてくださる奈良女子大学理学部高木由臣教授、総説を完成させるに当たりたいへんお世話になりました神戸大学理学部洲崎敏伸助教授に深くお礼を申し上げます。この仕事は、山田科学技術振興財団(研究援助)と日
本学術振興会（科学研究費補助金）によって支えられ
ています。
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