厚生労働科学研究費補助金（難治性疾患等克服研究事業）	 分担研究報告書	 	 FOP における筋損傷に伴う異所性骨化の機序に関する研究	 	 
研究分担者	  片桐岳信	  埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門	  教授	 研究要旨	  進行性骨化性線維異形成症（FOP）は、骨形成を促す BMP の I 型受容体
ALK2 の機能獲得型変異によって発症すると考えられる。FOP では、骨格筋組織の損傷が局所的な異所性骨化を誘発する。この機序を解析した結果、筋損傷時に BMPの II 型受容体の発現が増加し、これが変異 ALK2 をリン酸化によって活性化する可能性が示された。	 	 
Ａ．	  研究目的	 

ACTR-IIB）の発現は、SYBR	 Green 法による進 行 性 骨 化 性 線 維 異 形 成 症

リアルタイム PCR で定量化した。野生型お(Fibrodysplasia	 ossificans	 progressiva,	 

よび R206H 変異を導入した ALK2 のリン酸化

FOP)は、主に筋組織の中で異所性骨化が進レベルは、細胞抽出液を Phos-tag を添加し行する遺伝性疾患で、2006 年、ヒト２番染た条件下でポリアクリルアミド電気泳動を色体上の BMP の I 型受容体をコードする行い、抗 V5 抗体を用いた Western	 blot 法

ACVR1/ALK2 が責任遺伝子として同定された。

で検出される ALK2 の移動度で解析した。

これまでに我々は、FOP 症例で同定された

ALK2 の活性は、C2C12 細胞におけるアルカ変異 ALK2 が、リガンド非依存的に BMP の細リホスファターゼ（ALP）の誘導活性を指標胞内情報伝達系を活性化する機能獲得型変に定量化した。	 

異であることを報告した。典型的 FOP 症例（倫理面での配慮）	 

では、局所的な筋損傷によって急激な異所なし。	 

性骨化が誘発されることが知られている。	 

そこで本研究では、FOP の変異 ALK2 の活性Ｃ．研究結果	 化における筋損傷の役割を検討した。そのマウスの前頸骨筋に cardiotoxin を投与

結果、筋損傷時に発現量の増加する BMP のすると、BMP の II 型受容体 mRNA の発現量II 型受容体による ALK2 のリン酸化が、BMPが増加した。特に、BMPR-II の発現は、対の細胞内情報伝達系の活性化に重要なこと

照の PBS 投与群に比べて有意に増加したが明らかとなった。	 

（図１A）。	 	 
Ｂ．研究方法	 発現の増加した BMPR-II の活性を、C2C12細胞で検討した。BMPR-II 単独、あるいは筋再生は、マウスの前脛骨筋に野生型 ALK2 と共発現してもほとんど ALP 活

cardiotoxin を投与して誘導した。投与３性を誘導しなかったが、FOP の R206H 変異日後に前頸骨筋を抽出し、常法に従って全を有する ALK2 と共発現すると、C2C12 細胞

RNA を抽出した後、cDNA に逆転写した。BMPの ALP 活性を相乗的に誘導した（図１B）。	 の II 型受容体（BMPR-II,	 ActR-II,	 および	 

そこで、BMPR-II と ALK2 を共発現させた際の ALK2 のリン酸化レベルを検討した。
R206H 変異体は、BMPR-II 非存在下でも野生型よりもリン酸化されていたが、BMPR-IIを共発現させると 90%以上がリン酸化された。	 	 
Ｄ．考察	 
FOP 症例では、遺伝的な ALK2 の変異が認められている。これまで、この ALK2 変異体は構成的活性型変異と考えられてきた。しかし、FOP 症例では筋損傷によって局所的な異所性骨化が誘導されることが知られており、遺伝的な ALK2 の変異に加えて、さらに BMP シグナルを活性化する機序の存在が示唆された。	 
本研究では、マウスの筋再生モデルを用
い て BMP の II 型 受 容 体 の １ 種 で あ る
BMPR-II の mRNA レベルが筋損傷後に増加することを見いだした。BMPR-II と FOP の	 ALK2 の GS ドメインに存在する９カ所のセリンとスレオニン残基を、それぞれアラニンとバリンに置換した変異体（9AV）を作製し、BMPR-II によるリン酸化をと活性化を検討した。すると、9AV 変異を導入した
ALK2 は 、 R206H 変 異 を 有 し て い て も 、
BMPR-II によるリン酸化をほとんど受けなかった。さらに、この変異体を BMPR-II とC2C12 細胞に共発現しても、ALP 活性の誘導は認められなかった。	 	 	 R206H 変異 ALK2 を共発現すると、ALK2 のリン酸化が更新すると共に、ALP の誘導活性が亢進した。一方、ALK2 のリン酸化部位を変異させると、BMPR-II による活性化は消失した。これらの結果は、R206H は II 型受容体によってリン酸化を受けやすい変異体であり、筋損傷によって II 型受容体の発現量が増加することが、FOP の急激な異所性骨化の一因である可能性が示唆する。従来、
ALK2 の活性阻害薬が FOP の治療薬として検討されてきたが、II 型受容体の阻害も、新たな FOP 治療薬を提供する可能性が考えられる。	 

	 5)	 Yamamoto	 R,	 Matsushita	 M,	 Kitoh	 H,	 Ｅ．結論	 

Masuda	 A,	 Ito	 M,	 Katagiri	 T,	 Kawai	 T,	 FOP の R206H 変異 ALK2 は、BMP の II 型受Ishiguro	  N,	  Ohno	  K.	  Clinically	 

容体によるリン酸化と活性化を受けやすい

applicable	 

antianginal	 agents	 

ことが、FOP の異所性骨化の原因である可suppress	  osteoblastic	  transformation	 

能性が考えられる。	 

of	  myogenic	  cell	  and	  heterotopic	 	 Ｆ．健康危険情報	 	 総括研究報告書にまとめて記載。	 

ossification	  in	  mice.	  J	  Bone	  Miner	 Ｇ．研究発表	 

ゴニストによる異所性骨化の強力な阻害.	 

Metab,	 in	 press.	 
6)	 片桐岳信.	 レチノイン酸受容体-γア

1.論文発表	 

Olive	 2:	 192-194,	 2012.	 

1)	 Ohte	 S,	 Kokabu	 S,	 Iemura	 S,	 Sasanuma	 7)	 片桐岳信.	 BMP シグナルと骨形成・炎

H,	 Yoneyama	 K,	 Shin	 M,	 Suzuki	 S,	 Fukuda	 症	 .	 Clinical	 Calcium	 22:	 1677-1683,	 

T,	 Nakamura	 Y,	 Jimi	 E,	 Natsume	 T,	 and	 2012.	 

Katagiri	 and	 7)	 片桐岳信.	 進行性骨化性線維異形成

functional	  analysis	  of	  Zranb2	  as	  a	 症（FOP）.	 Bone	 Joint	 Nerve,	 印刷中.	 

novel	  Smad-binding	  protein	  that	 	 suppresses	  BMP	  signaling.	  J	  Cell	 

2.学会発表	 Biochem	 113:	 808-814,	 2012.	 

1)	 片桐岳信.	 筋肉が骨になるメカニズ2)	 Takahashi	 M,	 Katagiri	 T,	 Furuya	 H,	 ム.	 Clinical	 Science	 Forum	 (2012 年 5and	  Hohjo	  H.	  Disease-causing	  allele	 

月 19 日、東京）	 

specific	  silencing	  against	  the	  ALK2	 2)	 片桐岳信.	 転写因子 Smad による細胞

mutants,	 

in	 

分化モデルの確立.	 第 11 回松本ボーン

Fibrodysplasia	 Ossificans	 Progressiva.	 

フォーラム	 (2012 年 5 月 25 日、長野）	 

Gene	 Ther	 19:	 781-785,	 2012.	 

3)	  Katagiri	  T,	  Tsukamoto	  S,	  Ohte	  S,	 3)	  Katagiri	  T.	  Recent	  topics	  in	 Shin	  M,	  Yoneyama	  K,	  Fujimoto	  M,	 fibrodysplasia	 ossificans	 progressiva.	 

Sasanuma	 

54:	 119-123,	 2012.	 

Smad-dependent	 4)	 Shin	 M,	 Ohte	 S,	 Fukuda	 T,	 Sasanuma	 signaling	 

H,	 Yoneyama	 K,	 Kokabu	 S,	 Miyamoto	 A,	 heterotopic	 bone	 formation	 induced	 by	 

Tsukamoto	  S,	  Hohjoh	  H,	  Jimi	  E	  and	 BMPs	  in	  skeletal	  muscle.	  Gordon	 Katagiri	 T.	 Identification	 of	 a	 novel	 

Research	 

BMP-inducible	  transcript,	  BIT-1,	  by	 excoitation/contraction	 

utilizing	 

(June	  3-8,	  2012,	  Les	  Diablerets,	 T.	 

Identification	 

R206H	 

and	 

the	 

G356D,	 

conserved	 H	 and	 Miyamoto	 

A:	 intracellular	 pathway	 Conference	 regulates	 on	 

Muscle:	 
coupling	 

BMP-responsive	  elements	  in	  the	  Id	 

Switzerland)	 

genes.	 J	 None	 Miner	 Metab,	 in	 press.	 

4)	 塚本翔、大手聡、米山克美、藤本舞、

進正史、笹沼寛樹、自見英治郎、片桐岳

性骨化性線維異形成症から同定された新信：BMP 及び TGF-β特異的シグナルを伝達

規 ALK2 変異体の機能解析.	 第 54 回歯科する構成的活性型 Smad の解析.	 第 30 回

基礎医学会（2012 年 9 月 14−16 日、福島）	 

日本骨代謝学会学術集会（2012 年 7 月11)	 片桐岳信.	 変異型 Smad1/5/8 を用い

19-21 日、東京）	 

た BMP 細胞内シグナルの解析.	 第 54 回歯5)	 大手聡、藤本舞、米山克美、笹沼寛樹、科基礎医学会（2012 年 9 月 14−16 日、福進正史、塚本翔、福田亨、古株彰一郎、島）	 

片桐岳信：I 型 BMP 受容体 ALK2 の活性化

12)	  Satoshi	  Ohte,	  Mai	  Fujimoto,	 には II 型 BMP 受容体による GS ドメイン

Katsumi	  Yoneyama,	  Hiroki	  Sasanuma,	 

内 Thr203 のリン酸化が必須である.	 第Masashi	  Shin,	  Sho	  Tsukamoto,	  Arei	 

30 回日本骨代謝学会学術集会（2012 年 7月 19-21 日、東京）	 

Miyamoto,	  Toru	  Fukuda,	  Shoichiro	 
Kokabu,	  Takenobu	  Katagiri.	  Critical	 6)	 米山克美、塚本翔、大手聡、笹沼寛樹、Role	 of	 ALK2	 Phosphorylation	 at	 Thr203	 

進正史、藤本舞、片桐岳信：BMP 受容体

in	 Activation	 by	 BMP	 type	 II	 Receptors.	 

ALK2 の Tet-On 誘導システムによる発現

American	 Society	 for	 Bone	 and	 Mineral	 

誘導細胞の樹立.	 第 30 回日本骨代謝学Research	 2012	 Annual	 Meeting	 (October	 会学術集会（2012 年 7 月 19-21 日、東京）	 

12-15,	 2012,	 Minneapolis,	 Minnesota,	 7)	 片桐岳信、進正史、大手聡、福田亨、USA)	 

笹沼寛樹、米山克美、古株彰一郎、宮本13)	 Masashi	 Shin,	 Satoshi	 Ohte,	 Toru	 

阿礼、塚本翔、自見英治郎：Id 遺伝子のFukuda,	  Hiroki	  Sasanuma,	  Katsumi	 BMP 応答領域の解析に基づく新規 BMP 応

Yoneyama,	  Shoichiro	  Kokabu,	  Sho	 

答転写産物の同定.	 第 30 回日本骨代謝

Tsukamoto,	  Hirohiko	  Hohjoh,	  Eijiro	 

学会学術集会（2012 年 7 月 19-21 日、東Jimi,	 京）	 Identification	 8)	 大手聡、藤本舞、米山克美、笹沼寛樹、

BMP-inducible	  Transcript,	  BIT-1,	  by	 

進正史、塚本翔、福田亨、古株彰一郎、

Utilizing	 

片桐岳信：進行性骨化性線維異形成症にBMP-Responsive	  Elements	  in	  the	  Id	 

おける変異型 BMP 受容体 ALK2 の活性化機

Genes.	 American	 Society	 for	 Bone	 and	 構.	 第 19 回 BMP 研究会（2012 年 7 月 22

Mineral	 Research	 2012	 Annual	 Meeting	 日、東京）	 

(October	  12-15,	  2012,	  Minneapolis,	 9)	 塚本翔、大手聡、米山克美、藤本舞、Minnesota,	 USA)	 

進正史、笹沼寛樹、片桐岳信：BMP の異14)	  Sho	  Tsukamoto,	  Satoshi	  Ohte,	 

所性骨化を伝達する細胞内シグナルの解

Katsumi	 Yoneyama,	 Mai	 Fujimoto,	 Arei	 析.	 第 19 回 BMP 研究会（2012 年 7 月 22

Miyamoto,	  Eiko	  Murata,	  Eijiro	  Jimi,	 

日、東京）	 

Takenobu	 Katagiri.	 Linker	 Regions	 of	 10)	 藤本舞、須田直人、片桐岳信.	 進行Smad1/5/8	 

Takenobu	 
of	 the	 Regulate	 

Katagiri.	 
a	 Novel	 Conserved	 Bone-inducing	 Activity	 of	 BMPs.	 American	 Society	 for	 Bone	 and	 Mineral	 Research	 2012	 Annual	 Meeting	 (October	 

12-15,	 Minneapolis,	 Minnesota,	 USA)	 	 
Ｈ．知的財産権の出願・登録状況	 
1.特許取得	 なし。	 
2.実用新案登録	 なし。	 
3.その他	 なし。	 	 

2012,