108

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)6稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガス

クロマトグラフ質量分析計による同時定量法
佐藤梢 *，風間鈴子 *Determination of Benfuresate and Cyhalofop-butyl
in Rice Straw and Paddy Rice by GC-MS
Kozue SATOU * and Reiko KAZAMA *( Food and Agricultural Materials Inspection Center, Sendai Regional Center)*

An analytical method was developed to determine levels of benfuresate and cyhalofop-butyl inrice straw and paddy rice for feed using gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS).
After adding water to the samples, benfuresate and cyhalofop-butyl were extracted with acetone,
and the resulting solutions were filtered.

The extract was then purified with InertSep K-solute(GL Sciences Inc.; Tokyo, Japan), gel permeation chromatography (GPC), Bond Elut PSA
cartridge (Agilent Technologies Inc.; Santa Clara, CA, U.S.) connected in tandem over a Sep-Pak
Plus Florisil cartridge (Waters; Milford, MA, U.S.), and injected into the GC-MS for
determination of pesticides.

GC separation was carried out on a fused silica capillary column(DB-5MS+DG; 0.25 mm i.d.× 30 m, film thickness 0.25 µm with 10 m DuraGuard from Agilent
Technologies).

Mass spectrometer operation was carried out using electron ionization (EI) mode.

Spike tests were conducted on rice straw spiked with 2000, 300 and 20 µg/kg of each pesticide andpaddy rice spiked with 2000, 200, 20 and 10 µg/kg of each pesticide.

Recoveries ranged from

92.6 to 119 % for benfuresate and from 74.2 to 109 % for cyhalofop-butyl.

The relative standard

deviations of repeatability were not more than 4.9 % and 18 %, for benfuresate and cyhalofopbutyl, respectively.
A collaborative study was conducted in nine laboratories using rice straw spiked with 300 µg/kg ofbenfuresate and 2000 µg/kg of cyhalofop-butyl, and paddy rice spiked with 30 µg/kg ofbenfuresate and 200 µg/kg of cyhalofop-butyl.

The range of mean recovery, repeatability andreproducibility in terms of the relative standard deviation (RSDr and RSDR), and HorRat,
respectively, were 96.3 to 103 % and not more than 6.8 %, 21 %, and 0.96 for benfuresate, and77.9 to 80.2 % and not more than 9.4 %, 29 %, and 1.8 for cyhalofop-butyl.
This method was validated and established for use in the inspection of benfuresate and cyhalofopbutyl in rice straw and paddy rice for feed.
Key words: benfuresate, cyhalofop-butyl, gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS), feed,
rice straw, paddy rice, collaborative study*

独立行政法人農林水産消費安全技術センター

仙台センター

稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

109

キーワード：ベンフレセート；シハロホップブチル；ガスクロマトグラフ質量分析計；飼料；稲わら；籾米；共同試験

1

緒

言

ベンフレセートはシェーリング社により開発されたベンゾフレミルアルキルスルホン酸系の水田用除草剤で，日本では 1994 年に農薬登録されている．飼料中の指導基準はないが，食品中の残留
農薬基準値 1)は玄米で 0.05 ppm となっている．
シハロホップブチルはダウ・ケミカル社が開発したフェノキシ系の水田用除草剤で，日本では1996 年に農薬登録されている．飼料中の指導基準 2)は稲わらで 2 mg/kg，稲発酵粗飼料で 0.1 mg/kg，
籾米で 2 mg/kg となっており，食品中の残留農薬基準値は玄米で 0.1 ppm となっている．
両農薬とも飼料分析基準 3)に分析法はないが，厚生労働省通知 4)には，個別試験法（ガスクロマ
トグラフ及びガスクロマトグラフ質量分析計による方法）及びガスクロマトグラフ質量分析計による一斉試験法が示されている．
今回，一般財団法人日本食品分析センターが「平成 22 年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業」において，厚生労働省通知の個別試験法を基に開発した飼料中のベンフレセート及びシハロ
ホップブチルの分析法 5) （以下「JFRL 法」という．）について，飼料分析基準への適用の可否について検討を行ったので，その概要を報告する．
参考にベンフレセート及びシハロホップブチルの構造式等を Fig. 1-1 及び Fig. 1-2 に示した．
O

CH3CH2SO2O

CH3
H3C

2,3-dihydro-3,3-dimethylbenzofuran-5-yl ethanesulfonate
C12H16O4S

MW: 256.3

Fig. 1-1

CAS No.: 68505-69-1

Chemical structure of benfuresate

F
CH3
N

C

O

O

C

H

CO2CH2CH2CH2CH3

butyl (R)-2-[4-(4-cyano-2-fluorophenoxy) phenoxy] propionate
C20H20 FNO4
Fig. 1-2

MW: 357.3

CAS No: 122008-85-9

Chemical structure of cyhalofop-butyl

110

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)

2
2.1

試

実験方法

料

稲わら及び籾米を 1 mm の網ふるいを通過するまで粉砕し，供試試料とした．稲発酵粗飼料
は，60 °C で 55 時間乾燥後，同様に粉砕したものを供試試料とした．
2.2
1)

試

薬

ベンフレセート標準原液
ベンフレセート標準品（和光純薬工業製，純度 99.0 %）25 mg を正確に量って 50 mL の全量
フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてベンフレセート標準
原液を調製した（この液 1 mL はベンフレセートとして 0.5 mg（f=0.990）を含有する．）．

2)

シハロホップブチル標準原液
シハロホップブチル標準品（林純薬工業製，純度 99.9 %）25 mg を正確に量って 50 mL の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてシハロホップブチ
ル標準原液を調製した（この液 1 mL はシハロホップブチルとして 0.5 mg（f=0.999）を含有す
る．）．

3)

農薬混合標準原液
ベンフレセート標準原液及びシハロホップブチル標準原液の一定量を混合し，希釈溶媒で正確に希釈し，1 mL 中にベンフレセート及びシハロホップブチルとしてそれぞれ 0.002，0.005，
0.01，0.02，0.03，0.1，0.2，0.3，0.4 及び 0.5 µg を含有する各農薬混合標準液を調製した．

4)

添加回収試験用混合標準液
ベンフレセート標準原液及びシハロホップブチル標準原液の一定量を混合し，アセトンで正確に希釈し，1 mL 中にベンフレセート及びシハロホップブチルとしてそれぞれ 0.1，0.2，2，
3 及び 20 µg を含有する各添加回収試験用混合標準液を調製した．

5)

希釈溶媒

ポリエチレングリコール（平均分子量 400）50 µL をアセトン 100 mL に加えて希釈溶媒を調製した．
6)

ゲル浸透クロマトグラフィー（以下「GPC」という．）の溶離液のシクロヘキサン及びアセトンは液体クロマトグラフ用を用いた．それ以外のアセトン及びヘキサンは残留農薬・PCB試験用を用いた．水は超純水（JIS K 0211 に定める 5218 の超純水）を用いた．その他，特記している以外の試薬については特級を用いた．

2.3

装置及び器具1)

振とう機：タイテック製

SR-2W

2)

ロータリーエバポレーター：東京理化器械製

3)ガスクロマトグラフ質量分析計（以下「GC-MS」という．）：

レシプロシェーカー

N-1000ガスクロマトグラフ部：Agilent Technologies 製
質量分析計部：Agilent Technologies 製
4)

7890A

5975C inert XL MSD

ゲル浸透クロマトグラフ：
ポンプ：ジーエルサイエンス製

G-Prep GPC8100 Plus

オートサンプラー：ジーエルサイエンス製

G-Prep AS

フラクションコレクター：ジーエルサイエンス製
5)

多孔性ケイソウ土カラム：ジーエルサイエンス製

6)

フロリジルミニカラム：Waters 製

G-Prep GPC8100 Plus

InertSep K-solute（20 mL 保持用）

Sep-Pak Plus Florisil Cartridge（充てん剤量 910 mg）

稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

7)

111

エ チ レ ン ジ ア ミ ン -N-プ ロ ピ ル シ リ ル 化 シ リ カ ゲ ル ミ ニ カ ラ ム ：Agilent Technologies 製
Bond Elut PSA（充てん剤量 500 mg）

8)

メンブランフィルター：東洋濾紙製

DISMIC-13HP （孔径 0.45 µm，直径 13 mm，親水性

PTFE）
2.4
1)

定量方法
抽

出

分析試料 10.0 g を量って 300 mL の共栓三角フラスコに入れ，水 20 mL（稲わらは 30 mL）
を加え，30 分間静置後，更にアセトン 100 mL（稲わらは 120 mL）を加え，30 分間振り混ぜて（300 rpm）抽出した．200 mL の全量フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さを順次アセトン 50 mL で洗浄し，同様に吸引ろ過した．更に全量フラスコの標線までアセトンを加えた．定容した抽出液 40 mL
を 100 mL のなす形フラスコに正確に入れ，40 °C 以下の水浴で約 4 mL（稲わらは約 6 mL）まで減圧濃縮し，カラム処理 I に供する試料溶液とした．
2)

カラム処理 I
試料溶液を多孔性ケイソウ土カラムに入れ，試料溶液の入っていたなす形フラスコを水 5
mL で洗浄し，洗液をカラムに加えた後，10 分間静置した．200 mL のなす形フラスコをカラムの下に置き，試料溶液の入っていたなす形フラスコをヘキサン 5 mL ずつで 2 回洗浄し，洗液を順次カラムに加え，液面が充てん剤の上端に達するまで流下させ各農薬を溶出させた．更にヘキサン 70 mL をカラムに加えて同様に溶出させ，溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．シクロヘキサン－アセトン（4+1）
10 mL を正確に加えて残留物を溶かし，メンブランフィルターでろ過し，GPC に供する試料溶液とした．

3)

GPC
試料溶液 5.0 mL をゲル浸透クロマトグラフに注入し，各農薬が溶出する画分を 200 mL のなす形フラスコに分取し，40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．なお，GPC の条件を Table 1 に示した．
ヘキサン 2 mL を加えて残留物を溶かし，カラム処理 II に供する試料溶液とした．
Table 1

Operating conditions of GPC for purifying benfuresate and cyhalofop-butyl

ColumnGuard column
EluentFlow rate
Fraction volume
4)

Shodex CLNpak EV-2000 AC (20 mm i.d.×300 mm, 15 µm)
Shodex CLNpak EV-G AC (20 mm i.d.×100 mm, 15 µm)
Cyclohexane-acetone (4:1)
5 mL/min60~115 mL

カラム処理 II
エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（以下「PSA ミニカラム」という．）の下にフロリジルミニカラムを連結し，ヘキサン 10 mL で洗浄した．試料溶液をミニカラムに入れ，流速 1~2 mL 程度で液面が充てん剤の上端に達するまで流出させた．試料
溶液の入っていたなす形フラスコをヘキサン 8 mL で洗浄し，洗液をミニカラムに加え，同様

112

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)に流出させた．更にヘキサン－アセトン（99+1）10 mL で試料溶液の入っていたなす形フラス
コを洗浄し，洗液をミニカラムに加え，同様に流出させた．
次に，PSA ミニカラムをはずし，50 mL のなす形フラスコをフロリジルミニカラムの下に置き，ヘキサン－アセトン（19+1）20 mL をフロリジルミニカラムに加えて，流速 1~2 mL 程度
で液面が充てん剤の上端に達するまで流下してベンフレセート及びシハロホップブチルを溶出させた．溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．希釈溶媒 1 mL を正確に加えて残留物を溶かし，GC-MS による測定に供する試料溶液とした．
5)

GC-MS による測定
試料溶液及び各農薬混合標準液各 2 µL を GC-MS に注入し，選択イオン検出（以下「SIM」という．）クロマトグラムを得た．
GC-MS の測定条件を Table 2 に示した．
Table 2

Operating conditions of GC-MS for analyzing benfuresate and cyhalofop-butyl

ColumnAgilent Technologies DB-5MS+DG(0.25 mm i.d.×30 m+10 m guard column, 0.25 µm film thickness)
Column temperature
80 °C (1 min)→20 °C/min→280 °C (10 min)Injection mode
Splitless (60 s)
Injection port temperature 250 °C
Carrier gas
He 1.0 mL/min
Transferline temperature 280 °C
Ion source temperature
230 °C
Ionization
Electron ionization
Ionization energy
70 eV
Monitor ion
Benfuresate: m/z 256 (for quantification) , 163 (for confirmation)
Cyhalofop-butyl: m/z 357 (for quantification) , 256 (for confirmation)
6)

計

算

得られた SIM クロマトグラムからピーク面積又は高さを求めて検量線を作成し，試料中のベンフレセート及びシハロホップブチルの量を算出した．
定量法の概要を Scheme 1 に示した．

稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

113

Sample 10 g
add 20 mL of water (rice straw: 30 mL) and allow to stand for 30 min
add 100 mL of acetone (rice straw: 120 mL) and shake for 30 min
filtrate under suction filter (No. 5B)
wash with 50 mL of acetone
top up to 200 mL with acetone
evaporate 40 mL of sample solution to about 4 mL (rice straw: 6 mL) under 40 °C
InertSep K-solute
apply sample solution
wash flask with 5 mL of water and apply the solution and allow to stand for 10 min
wash flask with 5 mL of hexane and apply the solution (twice)elute with 70 mL of hexane
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 10 mL of cyclohexane-acetone (4:1)
filtrate with membrane filter (<0.5 µm)
GPC
apply 5 mL of sample solution
collect the fraction of 60~115 mL
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 2 mL of hexane
Sep-Pak Plus Florisil and Bond Elut PSA cartridges
connect Sep-Pak Plus Florisil cartridge under Bond Elut PSA cartridge and prewash with 10 mL of hexane
apply sample solution
wash flask with 8 mL of hexane and apply the solution
wash flask with 10 mL of hexane-acetone (99:1) and apply the solution
remove Bond Elut PSA cartridge
elute with 20 mL of hexane-acetone (19:1)
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 1 mL of acetone-polyethylen glycol (2000:1)
GC-MS
Scheme 1
Analytical procedure for benfuresate and cyhalofop-butyl in feeds
2.5

GPC 溶出画分の検討方法
GPC におけるベンフレセート及びシハロホップブチルの最適な溶出画分は，以下の方法に従い確認した．1 mL 中にベンフレセート及びシハロホップブチルとして 2 µg を含有する標準液を調製し，この液 2 mL をなす形フラスコに入れ，窒素ガスを送って乾固した．シクロヘキサン－
アセトン（4+1）10 mL を正確に加えて残留物を溶かし，メンブランフィルターでろ過し，GPCに供する試料溶液とした．試料溶液を 2.4 の 3)に従って精製し，60~70 mL，70~80 mL，80~115
mL 及び 115~125 mL の溶出画分をそれぞれ 100 mL のなす形フラスコに分取し，それぞれの溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．
60~70 mL 及び 115~125 mL の画分については希釈溶媒 1 mL を，70~80 mL 及び 80~115 mL の画分については希釈溶媒 5 mL を，正確に加えて残留物を溶かし，GC-MS による測定に供する試料溶液とした．

114

2.6

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)

稲発酵粗飼料における検討方法
2.1 で調製した稲発酵粗飼料を用いて，以下の方法により本法への適用の可否を検討した．

1)

稲発酵粗飼料 10.0 g に 2 及び 0.1 µg/mL の標準液 1 mL を添加し，一晩放置したものを，以下本法に従って定量し，回収率及び繰返し精度を求めた．

2)

稲発酵粗飼料 10.0 g を本法に従って調製し，2.4 の 4)で得られた溶出液を乾固した後，0.01µg/mL の標準液 1 mL を正確に加えて残留物を溶かし，2.4 の 5)に従って測定した．

3)1)に従って調製した 10 µg/kg 相当量添加した試料液について，希釈溶媒を用いて 2 倍及び 5倍に希釈し，それぞれを 2.4 の 5)に従って測定した．

3
3.1

結果及び考察検量線
2.2 の 3)に従って調製した各農薬混合標準液 2 µL を GC-MS に注入し，得られた SIM クロマト

グラムからピーク面積及び高さを求めて検量線を作成した．その結果，Fig. 2-1 及び Fig. 2-2 のと お り ， ベ ン フ レ セ ー ト 及 び シ ハ ロ ホ ッ プ ブ チ ル と し て 0.005~0.5 µg/mL （ 注 入 量 と し て
0.01~1.0 ng）の範囲で直線性を示した．

稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

800000y = 1.4E+06 x - 10847
R² = 0.9974

700000Peak area/ arb.units

115

600000y = 822111 x + 830
R² = 0.9992

500000400000300000Benfuresate

200000Cyhalofop-butyl

100000
0
0

0.2

0.4

0.6

Concentration/[µg/mL]

Fig. 2-1

Calibration curves of each pesticide by peak area

50000

y = 94148 x - 992
R² = 0.9942

45000

Peak height/ arb.units

40000

y = 83907 x - 46
R² = 0.9998

35000
30000
25000
20000

Benfuresate

15000
10000

Cyhalofop-butyl

5000
0
0

0.2

0.4

0.6

Concentration/[µg/mL]

Fig. 2-2
3.2

Calibration curves of each pesticide by peak height

妨害物質の検討
稲わら（3 種），稲発酵粗飼料（4 種），籾米（2 種）について，本法に従い GC-MS による測定に供する試料溶液を調製し，ベンフレセート及びシハロホップブチルの定量を妨げるピークの有無を確認した．妨害物質の検討で得られた SIM クロマトグラムの一例を Fig. 3-1 及び Fig. 3-2に示した．その結果，稲発酵粗飼料及び籾米のそれぞれ 1 試料において，Fig. 3-1 の(B)及び(C)のとおり，ベンフレセートの SIM クロマトグラムにピークが認められたが，ベンフレセートは
基準値がない農薬であり，定量下限相当ピークの 1/3 以下であるため，定量に問題はないと考えられた．その他の試料については，定量を妨害するピークは検出されなかった．

116

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)(A)
Intensity/arb.units

300

200

100

0

9.00

10.00

11.00

12.00

13.00

11.00

12.00

13.00

11.00

12.00

13.00

Retention time/min(B)
Intensity/arb.unit

300

200

100

0

(C)

9.00

10.00

9.00

10.00

Retention time/min

200

100

s

Intensity/arb.unit

3000Fig. 3-1

Retention time/min

SIM chromatograms of blank samples(Arrows indicate peaks or retention time of benfuresate)(A)

Rice straw(B)

Paddy rice(C)

Whole-crop rice silage

稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

(A)

117

Intensity/arb.units

300

200

100

0

9.00

10.00

11.00

12.00

13.00

12.00

13.00

12.00

13.00

Retention time/min(B)
Intensity/arb.units

300

200

100

0

9.00

10.00

11.00

Retention time/min(C)
Intensity/arb.units

300

200

100

0

9.00

Fig. 3-2

10.00

11.00

Retention time/min

SIM chromatograms of blank samples(Arrows indicate peaks or retention time of cyhalofop-butyl)(A)
3.3

Rice straw(B)

Paddy rice(C)

Whole-crop rice silage

GPC 溶出画分の検討
2.5 に従い，GPC におけるベンフレセート及びシハロホップブチルの溶出画分を検討した．なお，検討はベンフレセート及びシハロホップブチルが 2 mg/kg（稲わら中のシハロホップブチルの指導基準）残留していた場合を想定して行った．その結果，Table 3 のとおり，70~80 mL の画分で大半の溶出が認められたが，マトリックスの影響による変動を考慮して分取画分を 60~115
mL とすることとした．

118

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)

Table 3Fraction volume (mL)

60~70
0
0

a)

Recovery of benfuresate (%)
Recovery of cyhalofop-butyl (%)a)a)
3.4

Elution pattern from GPC

70~80
92
71

80~1150
18

115~125
0
0

Total
92
90

n=1
稲発酵粗飼料における検討
2.1 で調製した稲発酵粗飼料にベンフレセート及びシハロホップブチルとして 200 及び 10µg/kg 相当量を添加した試料を用いて，2.6 の 1)に従い回収率及び繰返し精度を求めた．その結果は Table 4 のとおりであり，ベンフレセートの平均回収率は 109 及び 130 %，その繰返し精度
は相対標準偏差（RSDr）として 7.5 %以下，シハロホップブチルの平均回収率は 127 及び 136 %，RSDr は 5.6 %以下となった．この原因は夾雑成分によるものと推定し，2.6 の 2)及び 3)の検討を行った．
GC-MS 測定時の問題かどうかを確認するため，2.6 の 2)に従い回収率を求めた結果，ベンフレセートの回収率は 125 %，シハロホップブチルの回収率は 166 %であり，夾雑成分の影響を受けていると思われた．また，2.6 の 3)に従って調製した試料溶液を測定した結果，ベンフレセート
については，2 倍及び 5 倍に希釈した回収率はそれぞれ 129 及び 126 %，シハロホップブチルについてはそれぞれ 138 及び 127 %であり，回収率は多少改善したものの，稲発酵粗飼料についてはさらなる検討が必要であると考えられたため，本法から除外することとした．
Table 4

Recoveries from whole-crop rice silage

Kind ofpesticide
Benfuresate
Cyhalofop-butyl

3.5

Spiked level(µg/kg)
200
10
200
10

Recoverya)
(%)
109
130
127
136

a)

Mean (n=3)b)

Relative standard deviation of repeatability

b)

RSDr
(%)
7.5
2.6
5.6
2.4

添加回収試験
稲わらにベンフレセート及びシハロホップブチルとして 2000，300，20 及び 10 µg/kg 相当量（最終試料溶液中で各 2，0.3，0.02 及び 0.01 µg/mL 相当量），籾米にそれぞれ 2000，200，20
及び 10 µg/kg 相当量（最終試料溶液中で各 2，0.2，0.02 及び 0.01 µg/mL 相当量）を添加した試料を用いて，回収率及び繰返し精度を求めた．
その結果，Table 5 のとおり，ベンフレセートの平均回収率は 92.6~124 %，RSDr は 5.3 %以下，
シハロホップブチルの平均回収率は 63.4~121 %，RSDr は 18 %以下となった．

稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

Table 5

Kind ofpesticide

Benfuresate

Cyhalofop-butyl

3.6

119

Recoveries of benfuresate and cyhalofop-butyl

Spiked level（µg/kg）
2000
300
200
20
10
2000
300
200
20
10

Rice straw
Recoverya) RSDrb)
(%)
(%)
102
1.0
102
4.9
119
1.7
124
5.3
84.7
6.3
93.5
10
109
4.6
121
5.0

a)

Mean (n=3)b)

Relative standard deviation of repeatability

Paddy rice
RSDr
Recovery
(%)
(%)
92.6
4.2
113
4.1
116
4.1
102
1.7
74.2
13
89.9
18
80.6
5.8
63.4
18

定量下限及び検出下限
本法の定量下限及び検出下限を確認するため，稲わら及び籾米に各農薬を添加し，添加回収試

験により得られるピークの SN 比が 10 以上及び 3 となる濃度を求めた．
その結果，稲わら中のベンフレセートについては，定量下限は 20 µg/kg，検出下限は 0.3µg/kg であった．稲わら中のシハロホップブチルについては，定量下限は 20 µg/kg，検出下限は2 µg/kg であった．また，籾米中のベンフレセートについては，定量下限は 10 µg/kg，検出下限
は 0.3 µg/kg であった．籾米中のシハロホップブチルについては，定量下限は 20 µg/kg，検出下
限は 2 µg/kg であった．
添加回収試験で得られたクロマトグラムの一例を Fig. 4 に示した．

120

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)

Intensity /arb.units

(A)

(1)

1400
1200
1000
800
600
400
200
0
9.00

9.50

10.00

10.50

11.00

11.50

12.00

12.50

1400
1200
1000
800
600
400
200
0

13.00

(2)

9.00

9.50

10.00

10.50

11.00

11.50

12.00

12.50

13.00

12.00

12.50

13.00

Retention time/min

Intensity /arb.units

(B)

1400
1200
1000
800
600
400
200
0

(1)

9.00

9.50

10.00

10.50

11.00

11.50

1400
1200
1000
800
600
400
200
0

(2)

9.00

9.50

10.00

10.50

11.00

11.50

12.00

12.50

13.00

Retention time/min
Fig. 4SIM chromatograms(Arrows indicate peaks of benfuresate (1) or cyhalofop-butyl (2) )

3.7

(A)

Standard solution (The amount of each pesticide is 0.02 µg/mL)(B)

Sample solution of rice straw (Spiked at 20 µg/kg of each pesticide)

共同試験
本法の室間再現精度を確認するため，稲わら及び籾米にベンフレセート及びシハロホップブチ

ルを添加した共通試料を用い，9 試験室で共同試験を実施した．試験の概要は以下のとおりである．
i)

分析試料の調製

遠心粉砕機で粉砕した無添加試料を送付し，各試験室において一定量を稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

121

量り取った後，濃度非通知の添加用標準液（水溶液，各 1 mL）を分析開始の前日に添加して調製した．2 種類の試料について，非明示の 2 点反復で試験を実施した．それぞれの添加濃度
は Table 12 のとおりである．
ii)

参加試験室

一般社団法人日本科学飼料協会科学飼料研究センター，一般財団法人日本食品分析センター多摩研究所，JA 東日本くみあい飼料株式会社，独立行政法人農林水産消費安
全技術センター肥飼料安全検査部，同札幌センター，同仙台センター，同名古屋センター，同
神戸センター及び同福岡センター（計 9 試験室）．
iii)

結果の解析

国際的にハーモナイズされた共同試験に関する手順 6), 7) を参考に，Cochran検定，はずれ値 1 個の Grubbs 検定及びはずれ値 2 個の Grubbs 検定を行った後，平均回収率，
繰返し精度の相対標準偏差（RSDr ）及び室間再現精度の相対標準偏差（RSDR ）を算出した．
得られた RSDR から，修正 Horwitz 式を用いて HorRat を求めた．なお，各検定により棄却された試験室はなかった．
結果の概要は以下のとおりである．
1)

ベンフレセート

ベンフレセートの分析結果及び統計解析結果は Table 6-1 のとおりであり，稲わら及び籾米について，平均回収率（%）はそれぞれ 96.3 及び 103 ，RSDr（%）はそ
れぞれ 5.5 及び 6.8 ，RSDR（%）はそれぞれ 15 及び 21，HorRat はそれぞれ 0.80 及び 0.96 であった．いずれも良好な結果であった．
2)

シハロホップブチル

シハロホップブチルの分析結果及び統計解析結果は Table 6-2 のとおりであり，稲わら及び籾米について，平均回収率（%）はそれぞれ 77.9 及び 80.2，RSDr（%）はそれぞれ 9.4 及び 8.2，RSDR（%）はそれぞれ 27 及び 29，HorRat はそれぞれ 1.8 及び1.4 であった．
参考のため，各試験室で使用した GC-MS の機種等を Table 7 に示した．

122

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)

Table 6-1

Collaborative study results of benfuresateLab. No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Spiked level (µg/kg)a)Mean value (µg/kg)
Recoverya)(%)

Feed types
Rice straw
Paddy rice(µg/kg)(µg/kg)
301
313
27.2
29.6
327
339
32.4
32.6
258
298
34.8
29.1
346
347
40.5
39.3
275
304
29.2
26.9
199
197
19.2
16.7
292
277
27.8
28.9
308
296
36.1
31.5
281
243
38.3
35.8
300
30
289

31.0

96.3

103

RSDr

b)

(%)

5.5

6.8

RSDR

c)

(%)

15

21

19

22

0.80

0.96

PRSDR

d)

(%)

HorRat
a)

n=18

b)

Relative standard deviation of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviation of reproducibility between laboratoriesd)Predicted relative standard deviation of reproducibility between laboratories
calculated from the modified Horwitz equation

稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

Table 6-2

Collaborative study results of cyhalofop-butyl
Feed types
Lab. No.
Rice straw
Paddy rice(µg/kg)(µg/kg)
1790
1920
152
173
1
1640
1790
135
143
2
2180
2140
167
183
3
1790
1760
150
170
4
917
1260
106
132
5
844
856
78.4
73.5
6
1540
1770
184
169
7
1190
1600
219
226
8
1560
1500
228
197
9
2000
200
Spiked level (µg/kg)a)Mean value (µg/kg)
Recovery
RSDr

b)

RSDR

c)

PRSDR

a)

1560

160

77.9

80.2

(%)

9.4

8.2

(%)

27

29

15

21

1.8

1.4

d)

(%)

(%)

HorRat
a)

n=18

b)

Relative standard deviation of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviation of reproducibility between laboratoriesd)Predicted relative standard deviation of reproducibility between
laboratories calculated from the modified Horwitz equation

123

124

飼料研究報告 Vol. 38 (2013)

Table 7

Instruments used in the collaborative study

Lab. No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9

GC-MS a)Shimadzu GCMS-QP2010Plus
Shimadzu GCMS-QP2010
Shimadzu GCMS-QP2010Plus
GC: Agilent Technologies 7890 A
MS: Agilent Technologies 5975C inertXL MSD
Shimadzu GCMS-QP2010
GC: Agilent Technologies 6890N
MS: Agilent Technologies 5973N
GC: Agilent Technologies 6890N
MS: Agilent Technologies 5973inert
Shimadzu GCMS-QP2010Plus
GC: Agilent Technologies 6890N
MS: Agilent Technologies 5973Na) GC column (i.d. × length, film thickness) : Agilent Technologies
DB-5MS+DG (0.25 mm × 30 m + 10 m guard column (Duraguard), 0.25 µm)

4まとめ稲わら，籾米及び稲発酵粗飼料中に残留するベンフレセート及びシハロホップブチルについて，
JFRL 法を基に，GC-MS を用いた定量法の飼料分析基準への適用の可否について検討したところ，
次の結果が得られ，適用が可能であると考えられた．
1)

ベンフレセート及びシハロホップブチルの検量線は 0.005~0.5 µg/mL（注入量として 0.01~1.0ng）の範囲で直線性を示した．

2)

稲わら（3 種），稲発酵粗飼料（4 種），籾米（2 種）について本法に従ってクロマトグラムを作成したところ，定量を妨害するピークは認められなかった．

3)

稲発酵粗飼料を用いてベンフレセート及びシハロホップブチルの添加回収試験を実施した結果，共に高く定量される傾向が認められたため，本法の適用は難しいと考えられた．

4)

稲わら及び籾米にベンフレセート及びシハロホップブチルを添加して，添加回収試験及び共同試験を実施した結果，ベンフレセート及びシハロホップブチルについて，真度，併行精度，室間再現精度のいずれも良好な結果が得られたため，当該 2 成分について本法の適用が可能であった．

5)

添加回収試験及びその際のピークの SN 比から定量下限及び検出下限を求めた．その結果，ベンフレセートは，稲わら中で定量下限が 20 µg/kg，検出下限が 0.3 µg/kg，籾米中で定量下限が10 µg/kg，検出下限が 0.3 µg/kg となった．シハロホップブチルは稲わら中で定量下限が 20 µg/kg，
検出下限が 2 µg/kg，籾米中で定量下限が 20 µg/kg，検出下限が 2 µg/kg となった．

謝

辞共同試験に参加していただいた一般社団法人日本科学飼料協会科学飼料研究センター，一般財団
法人日本食品分析センター多摩研究所，JA 東日本くみあい飼料株式会社における関係者各位に感謝の意を表します．

稲わら及び籾米中のベンフレセート及びシハロホップブチルのガスクロマトグラフ質量分析計による同時定量法

文

125

献

1)

厚生省告示：食品，添加物等の規格基準，昭和 34 年 12 月 28 日，厚生省告示第 370 号 (1959).

2)

農林水産省畜産局長通知：飼料の有害物質の指導基準の制定について，昭和 63 年 10 月 14 日，
63 畜 B 第 2050 号 (1988).

3)農林水産省消費・安全局長通知：飼料分析基準の制定について，平成 20 年 4 月 1 日，19 消安
第 14729 号 (2008).

4)

厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について，平成 17 年 1 月 24 日，食安発第 0124001 号 (2005).

5)

財団法人日本食品分析センター：平成 22 年度飼料中の有害物質等分析法委託事業

飼料中の有害物質等の分析法の開発 (2010).
6)

Horwitz, W., Protocol for Design, Conduct and Interpretation of Method - Performance Studies, Pure &Appl. Chem., 67 (2), 331-343 (1995).

7)

AOAC Int., Appendix D: Guidelines for Collaborative Study Procedures to Validate Characteristics of a
Method of Analysis. In Official Methods of Analysis of AOAC Int. 19th Edition, Volume II,
Gaithersburg, MD, USA (2012).