下水試料中の女性ホルモン測定法の課題−LC/MS/MS と ELISA の比較から−
建設省土木研究所：○高橋明宏、小森行也、矢古宇靖子、岡安祐司、斉藤正義、東谷忠、田中宏明
Determination of Female Hormone in Sewage Samples by LC/MS/MS and ELISA, Akihiro TAKAHASHI, Kouya
KOMORI, Yasuko YAKOU, Yuuji OKAYASU, Masayosi SAITO, Tadashi HIGASHITANI and Hiroaki TANAKA (PublicWorks Research Institute, Ministry of Construction)
1. はじめに

試料 1000mL を C18 固相カラムを用いた固相抽

近年、生物の内分泌作用を攪乱し、悪影響を及出法（MeOH 溶出）により処理し、10000 倍のぼ す 外 因 性 の 内 分 泌 攪 乱 物 質 (EDs) へ の 関 心 が高まっており、その環境汚染が懸念されている。

測定試料（ｼﾞﾒﾁﾙｽﾙﾎｷｼﾄﾞ溶液）を得た。
・ LC/MS/MS 用試料

これに対し、関係省庁や研究機関が様々な調査を検討の結果 ５ ）、C18 固相カラムを用いた固相行い成果を挙げつつある。建設省においても地方抽出法（MeOH 溶出）の抽出物を、n-Hx/水に公共団体と共同で下水試料に適した EDs の分析

よる抽出、ﾌﾛﾘｼﾞﾙｶﾗﾑによるｸﾘｰﾝｱｯﾌﾟ、TLC（ｼ方法の検討及び下水処理場における EDs の実態ﾘｶｹﾞﾙ）による精製を順次行い測定試料を得た。

調査を実施している。対象物質は環境庁が「環境2.3 ELISA 法の測定

ホルモン戦略計画 SPEED’98」の中で提示していELISA 法は Assay Designs,Inc.製の Correlate-る 67 の化学物質から下水道に含まれる可能性が

EIA 17β-Estradiol Enzyme Immunoassay Kit をある 11 の化学物質とその関連物質のﾉﾆﾙﾌｪﾉｰﾙｴﾄｷ使用し、下水処理場における EDs の実態調査ｼﾚｰﾄ及びヒト女性ホルモンの 17β-ｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙでで用いた方法 ６ ） に従い測定した。

ある。これらの物質の内分泌攪乱作用については、17β-ｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙの内分泌攪乱作用が、他の化学物質に比べて非常に高いことが報告

３）４）されており、下水試料の内分泌攪乱作用に占める 17β-ｴｽ３）ﾄﾗｼﾞｵｰﾙの割合が非常に大きいとの指摘もある。

2.4 LC/MS/MS の測定
測定条件を以下に示す。
・装

置：TSQ7000、HP1100

・ｶﾗﾑ：HP Zorbax Eclops XDB-C18、2.1×150mm
・移動相：ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ/水（60:40）、0.2mL/min

しかし、上記の実態調査において、17β-ｴｽﾄﾗｼﾞｵ・注入量：10μLｰﾙの測定に使用している ELISA 法は GC/MS 等の・ｲｵﾝ化 ：AP-ESI Negative、Collision Energy 40eV、機器分析に較べて試料の前処理が簡易という利点

Argon 2.2-2.3 mTorrがあるものの、抗原抗体反応を利用しているため、・測定質量数：271( Parent )、145( Daughter )類似物質による正の測定誤差や妨害物質による負3. 結果の測定誤差が検出機構上避けられず、測定値の正3.1 ELISA 法確さを確認する必要があると考えられた。

測定結果を表−２に示す。 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙの範

そこで今回、実際の下水試料を対象として、

囲 と 中 央 値 は 、 流 入 水 で 0.022 〜 0.075μ g/L 、ELISA 法及び LC/MS/MS 法により 17β-ｴｽﾄﾗｼﾞｵｰ

0.047μg/L、放流水で 0.004〜0.036μg/L、0.017

ﾙの測定・比較を行ったので結果を報告する。

μg/L であり、放流水の濃度は流入水の 1.5〜11

2. 実験方法倍（平均 3.6 倍）であった。

2.1 下水試料表−１

主に生活系の排水を処理する A〜E の５ヶ所の下水処理場の流入下水と二次処理水を対象とした。
いずれも晴天時にスポット採水で行った。処理場

ABの概要を表−１に示す。

C

2.2 試料の前処理

D

試料の採取は平成 11 年 7 月、8 月、9 月の３回、・ ELISA 用試料
下水道の測定マニュアル案６）に従い、下水E調査した下水処理場の概要

下水処理方式
標準活性汚泥法
標準活性汚泥法
標準活性汚泥法＋砂ろ過＋礫間接触酸化循環式硝化脱窒法
凝集剤添加循環変法＋砂ろ過

処理水量(m 3 /日)
172,210
152,060
49,00892,474
117,615

3.2 LC/MS/MS 法
測定結果を表−３に示す。 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙの範囲と中央値は流入水で 0.007〜0.015μg/L、0.011μg/L、放流水では２つの試料が 0.001μg/L であった他はすべて 0.001μg/L 未満であった。
4. 考察
4.1 下水試料
今回の測定結果を下水処理場における EDs の実態調査

１）と比較すると流入水および処理水の範囲と中央値は概ね同様であり、今回調査対象とした処理場は 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙの濃度に関しては平均的な処理場と考えられた。
4.2 ELISA 法と LC/MS/MS 法の比較
２つの測定方法により流入水の 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙ

表−２ ＥＬＩ
ＳＡ法の測定結果
放流水 (μg/L）
流入水 (μg/L）
処理場 ７月 ８月 ９月 ７月 ８月 ９月
A
0.058 0.036 0.062 0.020 0.019 0.025
B0.057 0.046 0.058 0.036 0.017 0.019
C0.075 0.047 0.022 0.015 0.010 0.008
D0.057 0.030 0.028 0.024 0.022 0.013
E0.031 0.036 0.041 0.006 0.006 0.004
表−３ LC/MS/MSの測定結果
流入水 (μg/L）
放流水 (μg/L）
処理場 ７月 ８月 ９月 ７月 ８月 ９月
A
0.011 0.01 0.009 <0.001 <0.001 <0.001
B
0.011 0.012 0.007 <0.00１<0.00１<0.00１
C
0.014 0.008 0.011 <0.001 0.001 <0.001
D
0.015 0.007 0.013 <0.001 <0.001 <0.001
E
0.007 0.007 0.011 <0.001 <0.001 0.001の濃度を測定した結果を図−１に比較して示す。

0.020
LC/MS/MS法（μg/L）

図から分かるように、すべての流入水試料において、ELISA 法の測定結果が高く、その比率（ELISA法／LC/MS/MS 法）は 2.0〜8.3 倍（平均 4.7 倍）であった。このことから流入下水において、ELISA法の測定結果は測定対象物質である 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙ以外の物質の影響により LC/MS/MS 法の結果0.0150.010

0.005

0.0000.000よりも高くなることが推察された。また、 ELISA法と LC/MS/MS 法の測定結果の相関係数はＲ ２ ＝0.0996 と低く、さらに ELISA 法と LC/MS/MS 法

y = 0.0548x + 0.0077
R2 = 0.0996

0.020
0.040
0.060
E L I S A 法 （μ g / L ）0.080

図 − １ ＥＬＩ
ＳＡ法 とL C / M S / M S の 比 較 ( 流 入 水 )の比率と調査対象処理場及び試料採取時期の間にも明確な傾向が認められなかった。
放流水中の 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙについては ELISA 法持つことも考えられるため、測定に影響している物質の検索も今後行う必要があると考えられた。の結果に較べ LC/MS/MS 法の測定結果はほとん<参考文献>

どが 0.001μg/L 未満と非常に低く、流入水と同

1) 建設省都市局下水道部，平成 11 年度

下水道様、ELISA 法の測定結果は測定対象物質である 17における内分泌攪乱化学物質に関する調査報告

βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙ以外の物質の影響を受け高くなるこ書とが推察された。
5. 結論
今回の検討の結果、ELISA 法を用いて下水試料

建設省都市局下水道部，平成 12 年 4 月

2) 環境庁，外因性内分泌攪乱化学物質への環境庁の対応方針について−環境ホルモン戦略計画
SPEED’98，環境庁，平成 10 年 5 月

中の 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙを測定する場合、実際に含ま

3) 矢古宇靖子，高橋明宏，東谷忠，田中宏明，組れている濃度よりも高い測定結果が得られること

み換え酵母を用いた下水中のエストロゲン活性が確認されたが、両者の測定結果には明確な相関の測定，環境工学研究論文集，Vol.36，1999

が確認できなかった。このことから下水試料の測4) Nisikawa，J.et al.，Toxicology and applied

定に ELISA 法 を 適 用 す る た め に は 、 試 料 の 前 処

pharmacology，Vol.154，76‑83，1999

理において何らかのｸﾘｰﾝｱｯﾌﾟ操作を行い、測定に5) 小森行也，高橋明宏，田中宏明，LC/MS による影響する夾雑物質を除去することが望ましいと考

下水試料中の 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙの分析，第９回環えられた。

境科学討論会講演集，346‑347，2000

また、ELISA 法はその測定機構上 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵ

6) 建設省都市局下水道部，下水道における内分泌ｰﾙと構造が似ている物質を合わせて測定している

攪乱化学物質水質調査マニュアル，（社）日本

可能性もあり、それらの物質が内分泌攪乱作用を下水道協会，1999