製品シート

Twist cfDNA Library Preparation Kit
主な利点

ワークフローの最適化による頑健なパフォーマンス
• 高いライブラリ変換率により低頻度のバリアントを確実に検出（VAF0.1% 以下）• 高いライブラリ収量を duplex-UMI で実現• 1 ～ 20 ng のサンプル量に対応• 2 時間以内にライブラリを調製可能

Twist cfDNA Library Preparation Kit は、循環セルフリー DNA（cfDNA）からライブラリを調製する際の課題に対応します。リキッドバイオプシーは、腫瘍学研究、特に末梢血に存在する腫瘍由来の遺伝子による潜在的バイオマーカーの研究において注目されています。このキットでは、Illumina システムによる次世代シーケンシング（NGS）用のcfDNA ライブラリを高い変換率で調製することができ、少量のインプット、cfDNA の劣化、採取が困難のため DNA 量が限られる尿や脳髄液（CSF）など、その他のサンプルに伴う技術的な課題を克服します。

Twist cfDNA ライブラリ調製キットは当社の最高品質のライブラリ調製ソリューション
であり、少量のサンプルインプットでも頑健なパフォーマンスと非常に高い変換率を提供します。

Twist cfDNA LibraryPreparation Kit

サンプル調製ライブラリ調製

ターゲットエンリッチメント

シーケンシング

Twist cfDNA Library Preparation and Hyb Mix Kit

解析

図 1：Twist cfDNA Library Preparation
Kit、Twist cfDNA Library Preparationand Hyb Mix Kit では、全ゲノムシーケンス（WGS）およびターゲットエンリッチ
メントワークフローが可能です

最適化された効率合理化された高パフォーマンスの Twist cfDNA Library Preparation プロトコルは 2 時間で高効率の結果が得られるようデザインされており、お客様のリキッドバイオプシー研究に変革をもたらします。このプロトコルではサンプルの取扱いが最小限に抑えられており、本分野のワークフローを簡素化することが可能です。実験工程は３ステップからなります。
1. 末端修復と dA- 付加：精製を行わずに末端修復と dA- 付加をワンステップで実施
2. ライゲーション：15 分間で UMI アダプターを結合、短いインキュベーション時間で高いコンバージョン率と低アーチファクトを実現
3. PCR 増幅：サンプルのマルチプレクシングのための増幅およびインデックス付加

効率、精度、および使いやすさを重視した Twist cfDNA Library Preparation プロトコルは、リキッドバイオプシー研究方法の進歩に対する当社の取り組みの成果であり、研究者の皆様に cfDNA 解析が持つ可能性を最大限に引き出す強力なツールを提供します。

cfDNA サンプルのコンバージョン率を増強

図 2：Twist cfDNA Library Preparation Kit は高収量の cfDNA ライブラリを実現。ライブラリ
TM調製後、サンプルを 20 µL の水に溶出し、1 µL を Qubit dsDNA Broad Range Kit で定量。

ライブラリ収量

cfDNAキット
Twist cfDNA
競合他社A
競合他社B
競合他社C
競合他社D

140120QUIBIT定量値（ng/µL）

Twist cfDNA Library Preparation Kit は、最新のターゲットエンリッチ
メントワークフローと組み合わせることで、インプットした DNA 分子をシークエンスライブラリに高効率で変換します。リキッドバイオプシー
研究では高感度検出のためにはライブラリ複雑性が必要であるため、このような変換率の向上はきわめて重要です。cfDNA に推奨される
他の NGS ライブラリ調製キットと比較して（図 2）、当社のアプローチ
ではライブラリ収量が増加し、さらに複雑性が向上します。

10080604020
015 NG、0% VAFスタンダード

15 NG、0.25% VAFスタンダード

DNA基質

cfDNA LIBRARY PREPARATION KIT | TWIST BIOSCIENCE

このように Qubit で測定した変換率は向上しており、高値の平均ターゲットカバレッジが得られます。分子バーコード（UMI）を duplication
除去とエラー補正のために組み合わせても、一貫して高いカバレッジが認められます（図 3）。ユニークカバレッジを増やすことで、低頻度変異を信頼性高く検出する可能性を高めます。
ライブラリの複雑性

キット | ワークフロー

Fold 80ベースペナルティ

1000

500

02-1-1

1-0-0

アーチファクト5

T | cfDNA Hyb
T | Std Hyb v2
A | Std Hyb v2
B | Std Hyb v2
C | Std Hyb v2
D | Std Hyb v2

1500

均一性UMIフィルター

図 3：Twist cfDNA Library Preparation and Hyb Mix Kit は、UMI
duplication 除去の有無にかかわらず高い複雑性を示します。
ライブラリは、現行または最新の推奨ターゲットエンリッチメントを用いて、cfDNA 標準サンプルのバリアント部位を標的とするカスタム
50 kb オンコロジーパネルでシングルプレックスでキャプチャを行いました。

1.20
4

キメラ率（102）

2000
平均ターゲットカバレッジ

1.25

1.15

31.10

キット | ワークフロー
T | cfDNA Hyb
T | Std Hyb v2
A | Std Hyb v2
B | Std Hyb v2
C | Std Hyb v2
D | Std Hyb v2

21.05

11.000

図 4：Twist cfDNA Library Preparation and Hyb Mix Kit は、アーチファクトを最小限に抑えながら高い均一性が得られます。1-0-0 fgbio UMI フィルタリングパラメータによるUMI 補正後、Picard hybrid-selection メトリクスおよびアライメントメトリクスを算出しました。Fold 80 ベースペナルティは低いほど標的部位全体の均一性が良好であることを示すため低値が望ましく、アーチファクトが最小限に抑えられていることを確認するために低キメラ率が推奨されます。

高カバレッジと UMI により低 VAF の検出を実現

バリアント数1050
100 UMIフィルター1550

未検出バリアント率（1ファミリー未満）

未検出バリアント率（1ファミリー未満）

Twist cfDNA Library Preparation Kit は、インプットした cDNA をより多くシークエンス可能なライブラリに変換することで、他の製品と比較してより低いバリアントアレル頻度（VAF）の検出を可能にします。
キット | ワークフロー
T | cfDNA Hyb
T | Std Hyb v2
A | Std Hyb v2
B | Std Hyb v2
C | Std Hyb v2
D | Std Hyb v2

401030205100100 UMIフィルター0211 UMIフィルター

図 5：Twist cfDNA Library Preparation and Hyb Mix Kit では、VAF0.25% で高感度かつ正確なバリアントの検出が可能です。ライブラリは、Pan-Cancer Standard サンプルの217SNP バリアント部位を標的とするカスタム 50 kb オンコロジーカスタムパネルを用いてシングルプレックスでキャプチャされました。未検出バリアント率は、1 バリアントファミリー未満のサイトの合計を検出可能なバリアントサイトの合計で除して算出しました。

ライブラリ収量

cfDNA LIBRARY PREPARATION KIT | TWIST BIOSCIENCE

ネイティブ cfDNA サンプルへの適合性

cfDNAキット
Twist cfDNA
競合他社A
競合他社B
競合他社C
競合他社D

160140QUIBIT定量値（ng/µL）

コントロールサンプルで観察された高いライブラリ変換率は、ネイティブなcfDNA ライブラリでも再現されました。さらに、インプットのきわめて低い
1 ng でも、低量範囲のインプットにおける変換の質が実証されました。
これらの結果は、Twist cfDNA Library Preparation ワークフローによって、上記のコントロール実験と同様に実際のサンプルでも優れた変換率およびバリアント検出が得られることを強く示しています。

12010080604020

図 6：Twist cfDNA Library Preparation Kit はネイティブな cfDNA サンプルで高収量のcfDNA ライブラリを実現します。ライブラリ調製後、サンプルを 20 µL の水に溶出し、1 µL を
QubitTM dsDNA Broad Range Kit で定量しました。

015 NG、Native cfDNA

1 NG、Native cfDNA

DNAスタートサンプル量cfDNA サンプルに最適化されたデータ忠実性

Twist cfDNA Library Preparation Kit は、サンプルの質と完全性を損なうことなく cfDNA をシーケンス可能な分子に高確率で変換します。
高確率での分子変換により、シーケンシングカバレッジが均一になりキメラアーチファクトが低減します（図 9）。
15 ng COVERAGE  NATIVE cfDNA

1 ng COVERAGE  NATIVE cfDNA

15 ng Native cfDNA

キット | ワークフロー

150

平均ターゲットカバレッジ

平均ターゲットカバレッジ

125

1500100

図 7：Twist cfDNA Library Preparation Kit は検体由来の cfDNAサンプルと互換性があります。ライブラリは 15 ng の Native cfDNA、PCR8 サイクルで調製。最終ライブラリ 1 µL を、Agilent Bioanalyzer
7500 チップにて解析。

1.20
1.15
1.10
1.05
1.00

均一性

1000

5050025

1-0-0

2-1-1

UMIフィルター

7654321001-0-0

2-1-1

UMIフィルター

図 8：Twist cfDNA Library Preparation and Hyb Mix Kit は、検体由来の cfDNA サンプルと互換性があります。ライブラリはスタンダードサンプルのバリアント部位を標的とする 50 Kb カスタムオン
コロジーパネルを用いてシングルプレックスでキャプチャを実施しました。

アーチファクト

キメラ率（102）

Fold 80ベースペナルティ

1.25750

T | cfDNA Hyb
T | Std Hyb v2
A | Std Hyb v2
B | Std Hyb v2
C | Std Hyb v2
D | Std Hyb v2

2000

キット | ワークフロー
T | cfDNA HybT | Std Hyb v2
A | Std Hyb v2
B | Std Hyb v2
C | Std Hyb v2
D | Std Hyb v2

図 9：Twist cfDNA Library Preparation and Hyb
Mix Kit は、native cfDNA のアーチファクトを 15 ngと最小限に抑えながら高い均一性が得られます。
1-0-0 fgbio UMI フィルタリングパラメータによるUMI 補正後、Picard hybrid-selection メトリクスおよびアライメントメトリクスを算出しました。Fold 80
ベースペナルティは低いほど標的領域のカバレッジ均一性が良好であることを示すため低値が望ましく、アーチファクトが最小限であることを見るためにはキメラ率がより低い値であることが理想です。

cfDNA LIBRARY PREPARATION KIT | TWIST BIOSCIENCE

方法

ここに示すデータは、Twist cfDNA Library Preparation Kit および競合他社キット A、B、C、D で作成されたライブラリから生成されました。
各キットごとに４つの異なるサンプルを実施しました：15 ng of Twist cfDNA Pan-Cancer Reference Standards v2 0.25% VAF, 15 ng ofTwist cfDNA Pan-Cancer Reference Standards v2 0% VAF, 1 ng of native cfDNA (Plasmalab), and 15 ng of native cfDNA (Plasmalab)。
ライゲーション後、すべてのキットでインデックス PCR サイクルを統一しました。1 ng のインプットサンプルは PCR で 12 サイクル増幅し、15 ng のインプットサンプルは PCR で 8 サイクル増幅しました。最終溶出は 20 µL の水で行いました。

ライブラリ調製後、すべてのライブラリを Twist Target Enrichment Standard Hybridization v2 プロトコルに従ってハイブリダイゼーションし、500 ng をキャプチャ工程に使用しました。このハイブリダイゼーションのワークフローは、データでは「Std Hyb v2」と記載しています。
さらに、このキットとともにリリースされた最新の cfDNA Target Enrichment Standard Hybridization プロトコルに従って Twist ライブラリもハイブリダイゼーションし、1 ng サンプルは 80 ng、15 ng サンプルは 1200 ng がキャプチャされました。このハイブリダイゼーションのワークフローは、データでは「cfDNA Hyb」と記載しています。競合製品に対して、Twist cfDNA Library Preparation Kit と最新のハイブリダイゼーションワークフローによる複合的な改善を示すために、この区分を行なっております。キャプチャされたライブラリをプールし、Nextseq550 150-cycle kit（Illumina）を使用して 80,000x カバレッジでシークエンスしました。UMI duplication 除去は fgbio を使用し、
1 0 0 または 2 1 1 UMI フラグフィルターにて実施し、メトリクスは Picard から算出しました。

詳しくは、twistbioscience.com/ngs
sales@twistbioscience.comをご覧ください。

注文情報

cfDNA Library Prep
107603: Twist cfDNA Library Preparation Kit–16 Samples
107604: Twist cfDNA Library Preparation Kit- 96 Samples
cfDNA Library Prep and Hybridization
107609: Twist cfDNA Library Preparation and Hyb Mix Kit–16 Samples and 2 Reactions
107610: Twist cfDNA Library Preparation and Hyb Mix Kit–96 Samples and 12 Reactions

For research use only. Not for use in any diagnostic or clinical procedures.
DOC-001476 改訂1.0版