〈一般研究課題〉 連続モニタリング可能な新規環境
モニタリングシステムの開発
助 成 研 究 者

名古屋工業大学

樋口真弘

連続モニタリング可能な新規環境
モニタリングシステムの開発
樋口 真弘（名古屋工業大学）

Research and Development of Novel Environmental
Sensing Systems Fabricated by Self-Organization
Masahiro Higuchi(Nagoya Institute of Technology)

Abstract
We have development of novel environmental sensing tips fabricated by self-organization. Heavy
metal ions and proteins were chosen as target molecules for sensing. For the heavy metal ion
sensing tip, the self-assembled monolayers of polyethylene glycol (PEG) were prepared on gold
deposited glass plates. We investigated the sensing abilities of the PEG monolayers for thevarious heavy metal ions from the changes in the dielectric constant of the PEG layer caused bymultiple weak interactions between the heavy metal ion and the oxygen atoms of PEG layer.
Further more, we fabricated the protein sensing tips having multi-recognition and signaltransduction ability. The protein tips composed of target protein induced amphiphilic glycopeptides
assemblies that act as protein binding site and ion channel in lipid bilayer membrane. Theinteraction between the sites of the target protein and the terminal glycol-chains of the amphiphilic
peptides could induce the specific location of the amphiphilic glycopeptides rod, i.e., formation of
specific protein binding site on the membrane and the ion channel in the membrane. The amphiphilic
glycopeptides assemblies in the membrane were fixed on an electrode to fabricate a novel sensing
device for the target proteins. The recognition ability is monitored by electro-chemical signal
which is generated by the ion permeability changes through the membrane on the electrode.

－ 49 －

１. 緒言有害物質や新種ウィルス等の迅速・簡便な環境モニタリングシステムの構築が全世界的に重要視されている。ホスト-ゲスト化学や超分子化学の手法を用いて特定の物質を高感度に認識する受容体は種々報告されているが、これらは各々の認識対象物質に対しその都度、受容体の分子設計・合成を行わなければならず、また、その検出には大掛かりな分析システムを必要とした。本研究では空港等における新規感染症の迅速な初期診断や、家庭でのパーソナルユーズの汚染物質の簡易モニ
タリングシステムの構築を目的とした。
特定の有害物質を高感度に認識する受容体として、Kitovらは多糖の化学合成により調製した糖クラスターを用い、ベロ毒素を特異的に結合する受容体の構築 1)を報告している。しかしながら、
これら化学合成による受容体の構築は、各々の認識対象物質に対しその都度、その受容体の分子設計・合成を行わなければならず、迅速なセンシングシステムの構築という観点からは十分なものではない。また、その検出には大掛かりな分析システムを必要としているのが現状である。一方、
Cornellら 2)や、Vogelら 3)は抗体を結合させたチャネルペプチドを用い、抗原の結合によるチャネル
孔の閉塞による膜のイオン透過性の変化から、簡便に対象抗原をセンシングするシステムの構築を報告している。しかしながら、これら抗体-チャネル複合体を用いたセンシングシステムにおいても、物質認識部に抗体を用いており、認識対象物質ごとに、認識部の変換、すなわち抗体の作成が必要であった。
本研究では、環境中の有害物質を、特殊な分析機器を用いず、簡便・迅速にモニタリング可能なセンシングチップを自己組織化的に構築し、その認識能と信号発信能に関して検討した。具体的には、重金属イオンイオンの連続モニタリングを目的とした重金属イオンセンサー、及び、多種多様なウイルス検出を目標とした、認識多様性を有するタンパク質センサーの構築と、その評価を行った。
２. 多点での弱い相互作用を利用した重金属イオンセンサー
２.１.はじめに重金属イオンの人体に与える影響は大きい。重金属イオンによる水質汚染の影響は、肝臓や腎臓障害、最近では、水銀と発達障害や自閉症との関係が注目されている。4）このような環境汚染による障害を未然に防止するために、環境中の重金属イオンを常時モニタリングするシステムの開発が求められる。既存の環境中の重金属イオン検出法は、操作が煩雑であったり、大型の測定機器が必要であったり、現場に赴かなければ測定ができないなど多くの問題が存在する。そこで
本節では、重金属イオンの可逆的な連続モニタリングを目的に、金蒸着ガラス基板表面をポリエ
チレングリコール(PEG)層で被覆し、重金属イオンと表面PEG鎖の酸素原子との多点での弱い相互作用を用いた、重金属イオンセンシングチップの構築を検討した。同センシングチップは
PEG鎖中の酸素原子と対象重金属イオンとの多点での弱い相互作用により錯体が形成され、ク
ラウンエーテル様の包接錯体の形成が期待されるとともに、弱い相互作用を利用しているため、洗浄により、脱離・再生させることが容易となる。これにより繰り返し使用可能な河川、湖沼中の重金属イオンの常時モニタリングシステムとして期待できる。

－ 50 －

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２.２.実験方法㸰㸬㸰㸬㸯㸬ࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࡢᵓ⠏
２.２.１.センシングチップの構築
重金属イオンセンシングチップとし用㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉ࡜ࡋ
⏝࠸ࡓࠊ3(* ⿕そᇶᯈࡣࠊ௨ୗ࡟ᚑ࠸いた、PEG被覆基板は、以下に従い構ᵓ⠏ࡋࡓ 6FKHPHࠋᇶᯈ⾲㠃࡟࣏
築した(Scheme1-1)。基板表面にポリエ

Scheme 1-1. 㔠⵨╔ᇶᯈ⾲㠃࡬ࡢ PEG 㙐⿕そ࡟ࡼࡿࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࡢᵓ⠏  ࣉࣟࣆ࢜ࣥ㓟⮬ᕫ⤌⧊໬༢ศᏊ⭷ࡢᙧᡂࠋ  ࣉࣟࣆ࢜ࣥ㓟ᮎ➃࢝ࣝ࣎࢟ࢩࣝᇶࡢάᛶ໬ࠋ  ࣉࣟࣆ࢜ࣥ㓟ᮎ➃࢝ࣝ࣎࢟ࢩࣝᇶ࡜ PEG ᮎ➃࢔࣑ࣀᇶ࡜ࡢ⦰ྜࠋ

࢚ࣜࢳࣞࣥࢢࣜࢥ࣮ࣝ㙐ࢆᅛᐃ໬ࡉࡏ
チレングリコール鎖を固定化させるたࡿࡓࡵࠊ⾲㠃࡟ࣉࣟࣆ࢜ࣥ㓟ࡢ⮬ᕫ⤌
め、表面にプロピオン酸の自己組織化単⧊໬༢ศᏊ⭷ࢆᙧᡂࡋࡓࠋࢪࢳ࢜ࣉࣟ
分子膜を形成した。ジチオプロピオン酸
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のエタノール溶液（6.3g / 30mL）に金蒸
P/㸧࡟㔠⵨╔ᇶᯈࢆ ᫬㛫ᾐₕࡉࡏࠊ
着基板を24 時間浸漬させ、同基板上にྠᇶᯈୖ࡟ࣉࣟࣆ࢜ࣥ㓟ࡢ⮬ᕫ⤌⧊໬
プロピオン酸の自己組織化単分子膜を形༢ศᏊ⭷ࢆᙧᡂࡋࡓࠋࡇࡢ㝿ࠊᇶᯈ࡟成した。この際、基板には、金蒸着ガラࡣࠊ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈཬࡧࠊ㔠⵨╔Ỉ
ス基板及び、金蒸着水晶振動子を用いᬗ᣺ືᏊࢆ⏝࠸ࡓࠋᇶᯈ⾲㠃࡟ᅛᐃ໬ࡋࡓࣉࣟࣆ࢜ࣥ㓟ࡢᮎ➃࢝ࣝ࣎࢟ࢩࣝᇶࢆࠊࢫࢡࢩࣥ࢖
た。基板表面に固定化したプロピオン酸の末端カルボキシル基を、スクシンイミド化し、活性化࣑ࢻ໬ࡋࠊάᛶ໬ࡋࡓᚋࠊᮎ➃࢔࣑ࣀ໬࣏࢚ࣜࢳࣞࣥࢢࣜࢥ࣮ࣝ 0Z㸻 ࡢỈ⁐ᾮ PJ
した後、末端アミノ化ポリエチレングリコール(Mw ＝ 50000)の水溶液(1.5mg / 30mL)に24時間
P/ ࡟  ᫬㛫ᾐₕࡉࡏࠊ3(* ⿕そᇶᯈࢆᵓ⠏ࡋࡓࠋ
浸漬させ、PEG被覆基板を構築した。
㸰㸬㸰㸬㸰㸬ࢭࣥࢩࣥࢢ⬟ホ౯
２.２.２.センシング能評価 ᑐ㇟࡜ࡋࡓ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ✀ࡣࠊ&Xࠊ&Rࠊ0Qࠊ1L ࡜ࡋࠊࡑࢀࡒࢀࡢ㓑㓟ሷࢆ⏝࠸ࡓࠋࡲࡓࠊ⎔対象とした重金属イオン種は、Cu、Co、Mn、Niとし、それぞれの酢酸塩を用いた。また、環ቃ୰࡛ࡢࡇࢀࡽ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡢࢭࣥࢩࣥࢢࢆ┠ⓗ࡜ࡍࡿࡓࡵࠊ⎔ቃ୰࡟ከ㔞࡟ྵࡲࢀࡿ  ౯ࡢ㔠
境中でのこれら重金属イオンのセンシングを目的とするため、環境中に多量に含まれる1価の金ᒓ࢖࢜ࣥ࡜ࡋ࡚ࠊ1D ཬࡧ . ࡢሷ໬≀ࢆᑐ↷㔠ᒓ࢖࢜ࣥ࡜ࡋࡓࠋ
属イオンとして、Na及びKの塩化物を対照金属イオンとした。
 ᚓࡽࢀࡓࠊࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࢭࣥࢩࣥࢢ⬟ࢆࠊ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ἲࢆ⏝࠸ࠊ
得られた、センシングチップの重金属イオンセンシング能を、表面プラズモン共鳴法を用い、ྛ✀㔠ᒓ࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡍࡿࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࡢ⤖ྜ㏿ᗘᐃᩘࠊゎ㞳㏿ᗘᐃᩘࠊཬࡧぶ࿴ᐃᩘࢆồࡵ
各種金属イオンに対するセンシングチップの結合速度定数、解離速度定数、及び親和定数を求め
ࡓࠋࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉ࡟ࡣࠊ3(* ࢆ⿕そࡋࡓ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈࢆ⏝࠸ࡓࠋ ᐃࡣࠊ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔた。センシングチップには、PEGを被覆した金蒸着ガラス基板を用いた。測定は、表面プラズࣥඹ㬆ࣂ࢖࢜ࢭࣥࢧ࣮ ᪥ᮏ࣮ࣞࢨ࣮㟁Ꮚ ᰴ 〇635 ᆺ ࢆ⏝࠸ࠊྛ✀㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࢆྵࡴ⁐モン共鳴バイオセンサー(日本レーザー電子(株)製 SPR670型)を用い、各種重金属イオンを含む
ᾮࢆࠊὶ㏿ P/PLQ ࡛ࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉ⾲㠃࡟ὶࡋࠊࡇࡢ࡜ࡁࡢඹ㬆ゅኚ໬࠿ࡽࠊ⟬ฟࡋ
溶液を、流速30μL / minでセンシングチップ表面に流し、このときの共鳴角変化から、算出しࡓࠋ ᐃ ᗘࡣࠊᐊ Υ࡜ࡋࡓࠋ
た。測定温度は、室温25℃とした。
 ࡲࡓࠊ⎔ቃ୰࡛ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡢᐃ㔞ࢆ┠ⓗ࡟ࠊỈᬗ᣺ືᏊ࣐࢖ࢡࣟࣂࣛࣥࢫ 4&0 ᐃࢆ⾜また、環境中での重金属イオンの定量を目的に、水晶振動子マイクロバランス(QCM)測定を
ࡗࡓࠋࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉ࡟ࡣࠊ3(*㙐ࢆ⿕そࡋࡓ㔠⵨╔Ỉᬗ᣺ືᏊࢆ⏝࠸ࡓࠋ3(* ⿕そỈᬗ᣺ື
行った。センシングチップには、PEG鎖を被覆した金蒸着水晶振動子を用いた。PEG被覆水晶Ꮚࢆࢸࣇࣟࣥ〇࢙࢘ࣝᆺࢭࣝ 6(,.2(* * ᰴ 〇4$&/ ᆺ ࡟⿦╔ࡋࠊỈ㐨Ỉ࡛ࢭࣝࢆ‶ࡓࡋࡓࠋ振動子をテフロン製ウェル型セル(SEIKO
EG&G(株)製 QA-CL4型)に装着し、水道水でセルを満ࡇࡢ⁐ᾮ୰࡟Ỉ㐨Ỉ࡟⁐ゎࡉࡏࡓ㓑㓟ࢥࣂࣝࢺỈ⁐ᾮࢆ✀ࠎࡢ⃰ᗘ࡛ῧຍࡋ࡚࠸ࡁࠊࡇࡢ㝿ࡢ࿘
たした。この溶液中に水道水に溶解させた酢酸コバルト水溶液を種々の濃度で添加していき、こἼᩘኚ໬ +HZOHWW3DFNDUG&R/WG〇PRGHO$ ࠿ࡽࠊࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉ⾲㠃࡟⤖ྜ
の際の周波数変化(Hewlett Packard Co., Ltd. 製 model 53 / 31A)から、センシングチップ表面に結合したコバルトイオンの重量を算出した。
２.３.結果と考察
２.３.１.センシングチップの重金属イオン認識能
図1-1に、PEG被覆金蒸着ガラス基板表面に、0.1mMの酢酸コバルト水溶液を流した際、及び、純水にて洗浄した際の表面プラズモン共鳴角変化量,Δθ,を示した。重金属イオンの添加に伴いΔθの値は増加し、一定の値,Δθeq, (図1-1の矢印)に達した後、洗浄により減少していき、Δθは0になり、初期値を回復した。この変化は、他の重金属イオン(Cu, Mn, Ni)でも、観察さ－ 51 －

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㸰㸬㸱㸬㸯㸬ࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥㄆ㆑⬟ 㸰㸬㸱㸬⤖ᯝ࡜⪃ᐹᅗ  ࡟ࠊ3(* ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ⾲㠃࡟ࠊ
P0 ࡢ㓑㓟ࢥࣂࣝࢺỈ⁐ᾮࢆὶࡋࡓ㝿ࠊཬࡧࠊ㸰㸬㸱㸬㸯㸬ࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥㄆ㆑⬟⣧Ỉ࡟࡚Ὑίࡋࡓ㝿ࡢ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅኚ ᅗ  ࡟ࠊ3(* ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ⾲㠃࡟ࠊ
れ、同チップが、洗浄により再生可能であるこ໬㔞'Tࢆ♧ࡋࡓࠋ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡢῧຍ࡟క࠸
P0 ࡢ㓑㓟ࢥࣂࣝࢺỈ⁐ᾮࢆὶࡋࡓ㝿ࠊཬࡧࠊとが示された。表面プラズモン共鳴角のシフト'Tࡢ್ࡣቑຍࡋࠊ୍ᐃࡢ್'T
HT ᅗ  ࡢ▮⣧Ỉ࡟࡚Ὑίࡋࡓ㝿ࡢ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅኚ
量は、基板表面に結合した物質量に比例するの༳໬㔞'Tࢆ♧ࡋࡓࠋ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡢῧຍ࡟క࠸
࡟㐩ࡋࡓᚋࠊὙί࡟ࡼࡾῶᑡࡋ࡚࠸ࡁࠊ'Tࡣ
で 5)、各重金属イオンに対する、平衡時の表面
 ࡟࡞ࡾࠊึᮇ್ࢆᅇ᚟ࡋࡓࠋࡇࡢኚ໬ࡣࠊ௚ࡢ
'Tࡢ್ࡣቑຍࡋࠊ୍ᐃࡢ್'THT ᅗ  ࡢ▮
プラズモン共鳴角のシフト量,Δθeq,をその濃㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ
&X0Q1L ࡛ࡶࠊほᐹࡉࢀࠊྠࢳ༳ ࡟㐩ࡋࡓᚋࠊὙί࡟ࡼࡾῶᑡࡋ࡚࠸ࡁࠊ'Tࡣ
度に対しプロットし、PEG自己組織化単分子膜ࢵࣉࡀࠊὙί࡟ࡼࡾ෌⏕ྍ⬟࡛࠶ࡿࡇ࡜ࡀ♧ࡉࢀ ࡟࡞ࡾࠊึᮇ್ࢆᅇ᚟ࡋࡓࠋࡇࡢኚ໬ࡣࠊ௚ࡢ
への吸着等温曲線を得た(図1-2)。比較のため、
ࡓࠋ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࡢࢩࣇࢺ㔞ࡣࠊᇶᯈ⾲㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ &X0Q1L ࡛ࡶࠊほᐹࡉࢀࠊྠࢳ Figure 1-1. PEG ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ࡬ࡢ㓑㓟ࢥ
1価のイオンである、塩化ナトリウム及び塩化ࣂࣝࢺ(0.1 mM)ࡢ⤖ྜ᫬ཬࡧὙί᫬
㠃࡟⤖ྜࡋࡓ≀㉁㔞࡟ẚ౛ࡍࡿࡢ࡛
ࠊྛ㔜㔠ᒓࢵࣉࡀࠊὙί࡟ࡼࡾ෌⏕ྍ⬟࡛࠶ࡿࡇ࡜ࡀ♧ࡉࢀࡢ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࡢኚ໬ࠋ
カリウムの結果も合わせて示した。Naイオン及࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡍࡿࠊ
ᖹ⾮᫬ࡢ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࡓࠋ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࡢࢩࣇࢺ㔞ࡣࠊᇶᯈ⾲ Figure 1-1. PEG ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ࡬ࡢ㓑㓟ࢥ
びKイオンに関しては、この濃度域で、プラズࡢࢩࣇࢺ㔞'Tࣂࣝࢺ(0.1 mM)ࡢ⤖ྜ᫬ཬࡧὙί᫬
HTࢆࡑࡢ⃰ᗘ࡟ᑐࡋࣉࣟࢵࢺࡋࠊ
㠃࡟⤖ྜࡋࡓ≀㉁㔞࡟ẚ౛ࡍࡿࡢ࡛
ࠊྛ㔜㔠ᒓࡢ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࡢኚ໬ࠋ
モン共鳴角のシフト量が非常の少ないのに対3(*⮬ᕫ⤌⧊໬༢ศᏊ⭷࡬ࡢ྾╔➼᭤⥺ࢆᚓ࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡍࡿࠊ
ᖹ⾮᫬ࡢ⾲㠃ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅし、Cu、Co、Mn、Niの重金属イオンでは有意ࡓࡢࢩࣇࢺ㔞'Tᅗ  ࠋẚ㍑ࡢࡓࡵࠊ
౯ࡢ࢖࡛࢜ࣥ࠶ࡿࠊ
HTࢆࡑࡢ⃰ᗘ࡟ᑐࡋࣉࣟࢵࢺࡋࠊ
なプラズモン共鳴角シフトが認められ、飽和型ሷ໬ࢼࢺ࣒ࣜ࢘ཬࡧሷ໬࣒࢝ࣜ࢘ࡢ⤖ᯝࡶྜࢃ3(* ⮬ᕫ⤌⧊໬༢ศᏊ⭷࡬ࡢ྾╔➼ ᭤⥺ࢆᚓの結合等温曲線を示した。このことは、基板表ࡏ࡚♧ࡋࡓࠋ
࢖࢜ࣥཬࡧ . ࢖࢜ࣥ࡟㛵ࡋ࡚ࡣࠊࡓ ᅗ  1D
ࠋẚ㍑ࡢࡓࡵࠊ
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面のPEG鎖中に重金属イオン対する特異的な結ࡇࡢ⃰ᗘᇦ࡛ࠊ
ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࡢࢩࣇࢺ㔞ࡀ㠀ሷ໬ࢼࢺ࣒ࣜ࢘ཬࡧሷ໬࣒࢝ࣜ࢘ࡢ⤖ᯝࡶྜࢃ合サイトが形成されたことを意味する。
ᖖࡢᑡ࡞࠸ࡢ࡟ᑐࡋࠊ&Xࠊ&Rࠊ0Qࠊ1Lࡢ㔜㔠ᒓࡏ࡚♧ࡋࡓࠋ1D ࢖࢜ࣥཬࡧ . ࢖࢜ࣥ࡟㛵ࡋ࡚ࡣࠊ
そこで、１式の平衡反応を考え、図1-1の重࢖࡛࢜ࣥࡣ᭷ព࡞ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࢩࣇࢺࡀㄆ
ࡇࡢ⃰ᗘᇦ࡛ࠊࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࡢࢩࣇࢺ㔞ࡀ㠀
金属イオン結合時の共鳴角の時間変化より、２ࡵࡽࢀࠊ㣬࿴ᆺࡢ⤖ྜ➼᭤⥺ࢆ♧ࡋࡓࠋࡇࡢࡇ
ᖖࡢᑡ࡞࠸ࡢ࡟ᑐࡋࠊ&Xࠊ&Rࠊ0Qࠊ1Lࡢ㔜㔠ᒓ-1
式を用い、結合速度定数,k+(Ms-1 ),解離速度定 Figure 1-2. PEG ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ࡬ࡢྛ✀㔜㔠
࡜ࡣࠊ
ᇶᯈ⾲㠃ࡢ
3(*
㙐୰࡟㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥᑐࡍࡿ
࢖࡛࢜ࣥࡣ᭷ព࡞ࣉࣛࢬࣔࣥඹ㬆ゅࢩࣇࢺࡀㄆ
ᒓ࢖࢜ࣥ㓑㓟ሷ(Cu, Mn, Co, Ni)ཬࡧሷ
-1-1໬ࢼࢺ࣒ࣜ࢘ࠊሷ໬࣒࢝ࣜ࢘ࡢ⤖ྜ➼数,k-(s),及びその比である親和定数K(M)を算≉␗ⓗ࡞⤖ྜࢧ࢖ࢺࡀᙧᡂࡉࢀࡓࡇ࡜ࢆព࿡ࡍ
ࡵࡽࢀࠊ㣬࿴ᆺࡢ⤖ྜ➼ ᭤⥺ࢆ♧ࡋࡓࠋࡇࡢࡇ᭤⥺ࠋ

出した。ここで、[Metal]、[PEG]、[PEG-Metal]
Figure 1-2. PEG ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ࡬ࡢྛ✀㔜㔠ࡿࠋ࡜ࡣࠊᇶᯈ⾲㠃ࡢ 3(* 㙐୰࡟㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥᑐࡍࡿ
ᒓ࢖࢜ࣥ㓑㓟ሷ(Cu, Mn, Co, Ni)ཬࡧሷ
໬ࢼࢺ࣒ࣜ࢘ࠊሷ໬࣒࢝ࣜ࢘ࡢ⤖ྜ➼ はそれぞれ、重金属イオン、PEG中の結合サイࡑࡇ࡛ࠊ㸯ᘧࡢᖹ⾮཯ᛂࢆ⪃࠼ࠊᅗࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ⤖ྜ᫬ࡢඹ㬆ゅࡢ᫬㛫ኚ໬ࡼࡾࠊ㸰ᘧ≉␗ⓗ࡞⤖ྜࢧ࢖ࢺࡀᙧᡂࡉࢀࡓࡇ࡜ࢆព࿡ࡍ
᭤⥺ࠋ

ト、重金属イオン-PEG複合体の濃度である。
ࢆ⏝࠸ࠊ⤖ྜ㏿ᗘᐃᩘN 0V ゎ㞳㏿ᗘᐃᩘN V ཬࡧࡑࡢẚ࡛࠶ࡿぶ࿴ᐃᩘ . 0 ࢆࡿࠋ
また、重金属イオン-PEG複合体の濃度,⟬ฟࡋࡓࠋࡇࡇ࡛ࠊ>0HWDO@ࠊ>3(*@ࠊ>3(*0HWDO@ࡣࡑࢀࡒࢀࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࠊ3(*୰ࡢ⤖ྜࢧ ࡑࡇ࡛ࠊ㸯ᘧࡢᖹ⾮཯ᛂࢆ⪃࠼ࠊᅗ [PEG-Metal],は、各時間における共鳴角シフト量,Δθ,ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ⤖ྜ᫬ࡢඹ㬆ゅࡢ᫬㛫ኚ໬ࡼࡾࠊ㸰ᘧ
に比例し、PEG中の全結合サイトは、図1-2における共鳴角シフトの飽和値,Δθmax,に比例す࢖ࢺࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ3(*」ྜయࡢ⃰ᗘ
ࢆ⏝࠸ࠊ⤖ྜ㏿ᗘᐃᩘN」ྜయࡢ⃰ᗘ࡛࠶ࡿࠋࡲࡓࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ3(*0V ゎ㞳㏿ᗘᐃᩘN V ཬࡧࡑࡢẚ࡛࠶ࡿぶ࿴ᐃᩘ. 0 ࢆ6)
るとした。
>3(*0HWDO@ࡣࠊྛ᫬㛫࡟࠾ࡅࡿඹ㬆ゅࢩࣇࢺ㔞'T࡟ẚ౛ࡋࠊ3(* ୰ࡢ⤖ྜࢧ࢖ࢺ>3(*@ࡣࠊ⟬ฟࡋࡓࠋࡇࡇ࡛ࠊ>0HWDO@ࠊ>3(*@ࠊ>3(*0HWDO@ࡣࡑࢀࡒࢀࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࠊ3(*୰ࡢ⤖ྜࢧᅗ࢖ࢺࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ3(* ࡟࠾ࡅࡿඹ㬆ゅࢩࣇࢺࡢ㣬࿴್'T
PD[࡟ẚ౛ࡍࡿ࡜ࡋࡓࠋ 」ྜయࡢ⃰ᗘ࡛࠶ࡿࠋࡲࡓࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ3(*」ྜయࡢ⃰ᗘ
 >3(*0HWDO@ࡣࠊྛ᫬㛫࡟࠾ࡅࡿඹ㬆ゅࢩࣇࢺ㔞'T࡟ẚ౛ࡋࠊ
3(* ୰ࡢ⤖ྜࢧ࢖ࢺ>3(*@ࡣࠊk+[PEG] + [Metal] ࡟ẚ౛ࡍࡿ࡜ࡋࡓࠋ
[PEG-Metal]  ᅗ  ࡟࠾ࡅࡿඹ㬆ゅࢩࣇࢺࡢ㣬࿴್'T
PD[







[PEG] + [Metal]kk+k-[PEG-Metal]

(1)

(1)

d 'T
k  [ Metal ]  'T max  (k  [ Metal ]  k  )  'Tࠉࠉࠉࠉࠉࠉࠉ
(2)
dt
K k / kලయⓗ࡟ࡣࠊᅗ  ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ⤖ྜ᫬ࡢྛ᫬㛫࡟࠾ࡅࡿࠊඹ㬆ゅኚ໬㏿ᗘ d'T / dt ࢆ⦪㍈࡟ࠊࡑࡢ᫬㛫࡟࠾ࡅࡿඹ㬆ゅࡢࢩࣇࢺ

Table 1-㸯. PEG ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ࡬ࡢྛ✀㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ㓑㓟ሷ(Cu, Mn, Co, Ni)⤖ྜ㏿ᗘᐃᩘ ,k+,ゎ㞳㏿ᗘᐃᩘ,k-,ཬࡧぶ࿴ᐃᩘ,Kࠋ㔞 'T ࢆᶓ㍈࡟෌ࣉࣟࢵࢺࡋࠊࡑࡢ┤⥺ࡢഴࡁࠊཬࡧษ∦ࡼࡾࠊ⤖ྜ㏿ᗘᐃᩘN 0V － 52 －
ゎ㞳㏿ᗘᐃᩘN V ཬࡧࡑࡢẚ࡛࠶ࡿぶ࿴ᐃᩘ . 0 ࢆồࡵࡓࠋ⤖ᯝࢆ⾲  ࡟ࡲ࡜ࡵࡓࠋ






'TT
dd'
ࠉࠉࠉࠉࠉࠉࠉ
Metal]] ''TT max  ((kk [[Metal
Metal]] kk  )) ''TTࠉࠉࠉࠉࠉࠉࠉ
(2)kk[[Metal
(2)
max


dt
dt
K kk  // kk Kලయⓗ࡟ࡣࠊᅗ  ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ⤖ྜ᫬ࡢྛࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ⤖ྜ᫬ࡢྛ Table 1-㸯. PEG ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ࡬ࡢྛ✀㔜㔠
具体的には、図1-1の重金属イオン結合時のලయⓗ࡟ࡣࠊ
ᅗ
Table 1-㸯. PEG ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ࡬ࡢྛ✀㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ㓑㓟ሷ(Cu, Mn, Co, Ni)⤖ྜ㏿᫬㛫࡟࠾ࡅࡿࠊ
ඹ㬆ゅኚ໬㏿ᗘ
ࢆ
d
'
T
/
dt
⦪
ᒓ࢖࢜ࣥ㓑㓟ሷ(Cu, Mn, Co, Ni)⤖ྜ㏿᫬㛫࡟࠾ࡅࡿࠊඹ㬆ゅኚ໬㏿ᗘ d'Δθ/T / dtdࢆ
各時間における、共鳴角変化速度,dt ,を⦪
ᗘᐃᩘ ,k ,ゎ㞳㏿ᗘᐃᩘ,k ,ཬࡧぶ࿴ᐃᗘᐃᩘ ,k++,ゎ㞳㏿ᗘᐃᩘ,k--,ཬࡧぶ࿴ᐃ
ᩘ,Kࠋ
㍈
࡟
ࠊ
ࡑ
ࡢ
᫬
㛫
࡟
࠾
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ᩘ,Kࠋ
ࠊࡑ
㛫に
࡟お
࠾け
ࡅる
ࡿ共
ඹ鳴
㬆角
ゅの
ࡢシ
ࢩフ
ࣇトࢺ
縦㍈
軸࡟
に、
そࡢ
の᫬
時間
㔞 '
'TT ࢆᶓ㍈࡟෌ࣉࣟࢵࢺࡋࠊࡑࡢ┤⥺ࡢഴࢆᶓ㍈࡟෌ࣉࣟࢵࢺࡋࠊࡑࡢ┤⥺ࡢഴ㔞
量,Δθ,を横軸に再プロットし、その直線の傾V ࡁࠊཬࡧษ∦ࡼࡾࠊ⤖ྜ㏿ᗘᐃᩘN -100 ࡁࠊཬࡧษ∦ࡼࡾࠊ⤖ྜ㏿ᗘᐃᩘN s-1V),解き、及び切片より、結合速度定数,k+(Mゎ㞳㏿ᗘᐃᩘN
V ཬࡧࡑࡢẚ࡛࠶ࡿぶ࿴-1  V ཬࡧࡑࡢẚ࡛࠶ࡿぶ࿴ゎ㞳㏿ᗘᐃᩘN
離速度定数,k-(s),及びその比である親和定数ᐃᩘ. 0 ࢆồࡵࡓࠋ⤖ᯝࢆ⾲
࡟ࡲ࡜ࡵࡓࠋ
࡟ࡲ࡜ࡵࡓࠋ
-1 . 0 ࢆồࡵࡓࠋ
ᐃᩘ
⤖ᯝࢆ⾲
K(M
)を求めた。結果を表1-1にまとめた。表⾲ࡼࡾࠊ3(* ᒙ࡟ᑐࡍࡿぶ࿴ᐃᩘࡣࠊ࠸ࡎࢀࡢ
ᒙ࡟ᑐࡍࡿぶ࿴ᐃᩘࡣࠊ࠸ࡎࢀࡢ
⾲ࡼࡾࠊ3(*
より、PEG層に対する親和定数は、いずれの0 ࣮࢜ࢲ࡜ࠊ
㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡋ࡚ࡶࠊ ࣮࢜ࢲ࡜ࠊ
4 0㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡋ࡚ࡶࠊ
重金属イオンに対しても、10M-1 オーダと、比ẚ㍑ⓗ㧗࠸್ࢆ♧ࡋࠊࡲࡓࠊゎ㞳㏿ᗘᐃᩘࡶ-3ẚ㍑ⓗ㧗࠸್ࢆ♧ࡋࠊࡲࡓࠊゎ㞳㏿ᗘᐃᩘࡶ較的高い値を示し、また、解離速度定数も10s-1 オーダであり、基板表面のPEG層は、重金属
V ࣮࢜ࢲ࡛࠶ࡾࠊ

ᇶᯈ⾲㠃ࡢ
3(*
ᒙࡣࠊ
㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡋ≉␗ⓗ࡞⤖ྜࢧ࢖ࢺࢆᙧᡂࡋࠊ
V ࣮࢜ࢲ࡛࠶ࡾࠊᇶᯈ⾲㠃ࡢ 3(* ᒙࡣࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡋ≉␗ⓗ࡞⤖ྜࢧ࢖ࢺࢆᙧᡂࡋࠊ
イオンに対し特異的な結合サイトを形成し、さらに、結合した、重金属イオンは、洗浄により比ࡉࡽ࡟ࠊ⤖ྜࡋࡓࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡣࠊὙί࡟ࡼࡾẚ㍑ⓗࡓࡸࡍࡃ⬺㞳ࡍࡿࡇ࡜ࡀศ࠿ࡗࡓࠋ
ࡉࡽ࡟ࠊ⤖ྜࡋࡓࠊ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡣࠊὙί࡟ࡼࡾẚ㍑ⓗࡓࡸࡍࡃ⬺㞳ࡍࡿࡇ࡜ࡀศ࠿ࡗࡓࠋ
較的たやすく脱離することが分かった。
㸰㸬㸱㸬㸰㸬Ỉ㐨Ỉ୰ࡢ㔜㔠ᒓ㸰㸬㸱㸬㸰㸬Ỉ㐨Ỉ୰ࡢ㔜㔠ᒓ
２.３.２. 水道水中の重金属
࢖࢜ࣥࡢㄆ㆑
࢖࢜ࣥࡢㄆ㆑
イオンの認識ࡑࡇ࡛ࠊᐇ㝿ࡢ⎔ቃ୰࡛ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ ࡑࡇ࡛ࠊᐇ㝿ࡢ⎔ቃ୰࡛ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜
そこで、実際の環境中での重金属イオン
ࣥࡢࢭࣥࢩࣥࢢ⬟ࢆホ౯ࡍࡿࡓࡵ࡟ࠊỈࣥࡢࢭࣥࢩࣥࢢ⬟ࢆホ౯ࡍࡿࡓࡵ࡟ࠊỈのセンシング能を評価するために、水道水㐨Ỉ୰ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡢࢭࣥࢩࣥࢢࢆヨ㐨Ỉ୰ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡢࢭࣥࢩࣥࢢࢆヨ
中の重金属イオンのセンシングを試みた。
ࡳࡓࠋࡇࢀࡣࠊඛ࡟ࠊᅗ  ࡟♧ࡋࡓࡼ࡟♧ࡋࡓࡼࡳࡓࠋࡇࢀࡣࠊඛ࡟ࠊᅗ
こ れ は、 先 に、 図 1- 2 に 示 し た よ う に、࠺࡟ࠊ3(*
3(* ᒙࡣࠊ
ᒙࡣࠊ ౯ࡢ㔠ᒓ࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡋ
౯ࡢ㔠ᒓ࢖࢜ࣥ࡟ᑐࡋ
࠺࡟ࠊ
PEG層 は、1価 の 金 属 イ オ ン に 対 し て は、࡚ࡣࠊ࡯࡜ࢇ࡝⤖ྜ⬟ࢆ♧ࡉ࡞࠸ࡇ࡜࠿
࡚ࡣࠊ࡯࡜ࢇ࡝⤖ྜ⬟ࢆ♧ࡉ࡞࠸ࡇ࡜࠿
ほとんど結合能を示さないことから、実環ࡽࠊᐇ⎔ቃ㸦Ỉ㐨Ỉ㸧࡛ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥࡽࠊᐇ⎔ቃ㸦Ỉ㐨Ỉ㸧࡛ࡢ㔜㔠ᒓ࢖࢜ࣥ境（水道水）
での重金属イオンのセンシングࡢࢭࣥࢩࣥࢢࡀྍ⬟࡛ࡣ࡞࠸࠿࡜⪃࠼ࡓࡢࢭࣥࢩࣥࢢࡀྍ⬟࡛ࡣ࡞࠸࠿࡜⪃࠼ࡓ
が可能ではないかと考えたためである。測ࡓࡵ࡛࠶ࡿࠋ ᐃࡣࠊᐃࡣࠊỈ㐨Ỉࢆ⏝࠸ࠊỈ㐨Ỉࢆ⏝࠸ࠊ✀ࠎ✀ࠎࡓࡵ࡛࠶ࡿࠋ
定は、水道水を用い、種々の濃度に調整しࡢ⃰ᗘ࡟ㄪᩚࡋࡓ㓑㓟ࢥࣂࣝࢺ⁐ᾮ࡟ࠊࡢ⃰ᗘ࡟ㄪᩚࡋࡓ㓑㓟ࢥࣂࣝࢺ⁐ᾮ࡟ࠊ
た酢酸コバルト溶液に、PEG被覆水晶振動
3(* ⿕そỈᬗ᣺ືᏊࢆᾐₕࡉࡏࠊᖹ⾮྾⿕そỈᬗ᣺ືᏊࢆᾐₕࡉࡏࠊᖹ⾮྾3(*
Figure 1-3. PEG ⿕そ㔠⵨╔Ỉᬗ᣺ືᏊ⾲㠃࡬ࡢࠊỈ㐨
子を浸漬させ、平衡吸着時の周波数変化かFigure 1-3. PEG ⿕そ㔠⵨╔Ỉᬗ᣺ືᏊ⾲㠃࡬ࡢࠊỈ㐨╔᫬ࡢ࿘Ἴᩘኚ໬࠿ࡽࠊ6DXHUEUH\ ᘧᘧ Ỉ୰ࡢ⁐ゎࡉࡏࡓ㓑㓟ࢥࣂࣝࢺࡢ⤖ྜ㔞ࠋ╔᫬ࡢ࿘Ἴᩘኚ໬࠿ࡽࠊ6DXHUEUH\Ỉ୰ࡢ⁐ゎࡉࡏࡓ㓑㓟ࢥࣂࣝࢺࡢ⤖ྜ㔞ࠋ
7)ら、Sauerbrey式
を用い、単位面積当たりࢆ⏝࠸ࠊ༢఩㠃✚ᙜࡓࡾ࡟⤖ྜࡋࡓࠊ㓑ࢆ⏝࠸ࠊ༢఩㠃✚ᙜࡓࡾ࡟⤖ྜࡋࡓࠊ㓑に結合した、酢酸コバルトの質量を求めた。結果を図1-3に示す。PEG層は、水道水中のコバル㓟ࢥࣂࣝࢺࡢ㉁㔞ࢆồࡵࡓࠋ⤖ᯝࢆᅗ  ࡟♧ࡍࠋ3(*
࡟♧ࡍࠋ3(* ᒙࡣࠊỈ㐨Ỉ୰ࡢࢥࣂࣝࢺ࢖࢜ࣥࢆȣ0ᒙࡣࠊỈ㐨Ỉ୰ࡢࢥࣂࣝࢺ࢖࢜ࣥࢆȣ0㓟ࢥࣂࣝࢺࡢ㉁㔞ࢆồࡵࡓࠋ⤖ᯝࢆᅗ
トイオンをμMオーダーの濃度（酢酸コバルト換算で、数mg/ L）で濃度に対し線形的に吸着し、࣮࢜ࢲ࣮ࡢ⃰ᗘ㸦㓑㓟ࢥࣂࣝࢺ᥮⟬࡛ࠊᩘ
PJ/㸧࡛⃰ᗘ࡟ᑐࡋ⥺ᙧⓗ࡟྾╔ࡋࠊࡑࡢᐇ⎔ቃ࣮࢜ࢲ࣮ࡢ⃰ᗘ㸦㓑㓟ࢥࣂࣝࢺ᥮⟬࡛ࠊᩘ
PJ/㸧࡛⃰ᗘ࡟ᑐࡋ⥺ᙧⓗ࡟྾╔ࡋࠊࡑࡢᐇ⎔ቃ
その実環境中でのセンシングが可能であることが示された。
୰࡛ࡢࢭࣥࢩࣥࢢࡀྍ⬟࡛࠶ࡿࡇ࡜ࡀ♧ࡉࢀࡓࠋ
୰࡛ࡢࢭࣥࢩࣥࢢࡀྍ⬟࡛࠶ࡿࡇ࡜ࡀ♧ࡉࢀࡓࠋ

今後は、表面PEG鎖の密度を最適化することにより、より高いセンシング能を有する重金属イ௒ᚋࡣࠊ⾲㠃
⾲㠃 3(*
3(* 㙐ࡢᐦᗘࢆ᭱㐺໬ࡍࡿࡇ࡜࡟ࡼࡾࠊ
㙐ࡢᐦᗘࢆ᭱㐺໬ࡍࡿࡇ࡜࡟ࡼࡾࠊࡼࡾ㧗࠸ࢭࣥࢩࣥࢢ⬟ࢆ᭷ࡍࡿ㔜㔠ᒓ࢖ࡼࡾ㧗࠸ࢭࣥࢩࣥࢢ⬟ࢆ᭷ࡍࡿ㔜㔠ᒓ࢖ ௒ᚋࡣࠊ
オンのセンサー構築の可能性が期待される。将来的にはフォトリソグラフィーにより形成される
࢜ࣥࡢࢭࣥࢧ࣮ᵓ⠏ࡢྍ⬟ᛶࡀᮇᚅࡉࢀࡿࠋ
ᑗ᮶ⓗ࡟ࡣࣇ࢛ࢺࣜࢯࢢࣛࣇ࢕࣮࡟ࡼࡾᙧᡂࡉࢀࡿ
࢜ࣥࡢࢭࣥࢧ࣮ᵓ⠏ࡢྍ⬟ᛶࡀᮇᚅࡉࢀࡿࠋ
ᑗ᮶ⓗ࡟ࡣࣇ࢛ࢺࣜࢯࢢࣛࣇ࢕࣮࡟ࡼࡾᙧᡂࡉࢀࡿ
凹凸構造中にPEG層を形成させたセンシングチップの構築を目指す。これは重金属イオンを捕捉したPEG層の誘電率変化を構造色変化として視覚的に検出することを目的とするものである。
３. 標的タンパク質により誘起される、認識多様性を有するタンパク質センサー
３.１.はじめに
空気中には様々なウイルスが存在し、その人体への感染は世界的に深刻な問題となっている。
これらウイルス及び、新型ウイルスによる疾病の早期診断のための迅速・簡便で高感度なセンシ－ 53 －

ングシステムの構築が全世界的に重要視されている。現在一般的なセンシングデバイスは、
ELISA法に代表される人体の免疫機能と関連のある抗原と抗体の相互作用を用いた系が多く、これは高い特異的認識能を有するという利点がある半面、標的物質特有の抗体をその都度調製する必要があるため、まずは標的物質の構造を明らかにしなければデバイスを構築できない。また、認識情報を変換、発信、視覚化するためには大規模な装置や特別な施設が必要である場合が多い。そこで本節では、簡便に構築可能で、空港や家庭等で使用でき、迅速に結果を得ることの出来る高感度なセンシングデバイスの構築を目指した。
具体的には、生体機能を模倣し、物質、特にタンパク質を認識対象とし、その認識部位として糖ペプチドクラスターを、信号変換部位としてイオンチャネル構造を、簡便な手法を用い、脂質二分子膜中に構築することを試みた。これは、標的タンパク質の糖ペプチドクラスターへの再結合に伴うチャネル孔の閉塞を利用して、タンパク質認識情報をイオン透過性の変化という電気化学信号への変換を試みるものである。
３.２.実験方法
３.２.１.試料
チャネル形成能を有する両親媒性糖ペプチドは、DeGradoのアミノ酸シーケンス 8)を用い、親水性のセリン(S)と疎水性のロイシン(L)より成る(L-S-S-L-L-S-L)（LS）を固相法により合成し、3
C 末端にグルコース(Glc-LS)或いはガラクトース(Gal-LS)を導入した。また、糖ペプチドクラス
ター形成時のスペーサーとして、ロイシン21量体(Leu21 )も同様に合成した。
認識対象のタンパク質には、Glcを選択的に認識するコンカナバリンA(ConA)と、Galを選択的に認識するピーナッツレクチン(PNA)を用いた。また、対照タンパク質として、糖鎖と特異的な結合能を持たないタンパク質として、牛血清アルブミン(BSA)を用いた。
これら3種のペプチド(Glc-LS, Gal-LS, Leu21 ; モル比1:1:8)と、L-α-ホスファチジルコリンジ
パルミトイル (DPPC)（DPPCと全ペプチドとのモル比100 : 1）をフラスコ中でクロロホルムに完
全に溶解させた後、溶媒を蒸発させ、壁面に薄膜を形成させた。この薄膜を、
 ࣌ࣉࢳࢻࢆྵࡴ࣋ࢩࢡࣝࢆࠊࡑࡢࢤࣝ
0.1 M HEPES-Tris,
pH 7.2緩衝液に水ᾮᬗ㌿⛣ᗘ௨ୖ࡟ຍ⇕ࡍࡿ࡜ࠊ⬡㉁஧
和分散させ後、超音波照射によりペプศᏊ⭷ࡢὶືᛶࡀቑࡋࠊ࣌ࣉࢳࢻࡣᐜ᫆
チド含有ベシクルを形成した。DPPC࡟⭷୰ࢆഃ᪉ᣑᩓࡍࡿࠋ࣌ࣉࢳࢻᮎ➃ࡢ
の終濃度は0.2wt%とした。
⢾㙐࡜≉␗ⓗ࡟┦஫స⏝ࡍࡿࢱࣥࣃࢡ㉁３.２.２.標的タンパク質との相補的相ࡀᏑᅾࡍࡿሙྜࠊྠ⢾࣌ࣉࢳࢻࡣ⭷୰࡛
互作用による受容体構造の形成෌㓄ิࡋࠊᑐ㇟ࢱࣥࣃࢡ㉁ࢆ≉␗ⓗ࡟ㄆ
ペプチドを含むベシクルを、そのゲ㆑ࡍࡿ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࡢᙧᡂࡀᮇ
ル-液晶転移温度以上に加熱すると、脂ᚅ࡛ࡁࡿࠋࡇࡢࡇ࡜ࢆ฼⏝ࡋࠊᶆⓗࢱࣥ
質二分子膜の流動性が増し、ペプチド
ࣃࢡ㉁࡟ᑐࡍࡿㄆ㆑㒊఩࡜ࡋ࡚⢾࣌ࣉࢳ
は容易に膜中を側方拡散する。ペプチࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࡢᙧᡂࢆヨࡳࡓࠋ31$
ㄆ㆑
ド末端の糖鎖と特異的に相互作用する⬟ࢆ᭷ࡍࡿ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࡢᙧᡂ
タンパク質が存在する場合、同糖ペプ
ࢆ௨ୗ࡟♧ࡍࠋඛ࡟ᙧᡂࡋࡓ ✀ࡢ࣌ࣉ

ࢳࢻࢆᇙࡵ㎸ࢇࡔ࣋ࢩࢡࣝ⁐ᾮ࡟ࠊᶆⓗ
チドは膜中で再配列し、対象タンパク

Scheme 2-1. a)࣋ࢩࢡࣝ୰࡛ࡢᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁࡜࣌ࣉࢳࢻᮎ➃⢾㙐࡜ࡢ┦⿵ⓗ┦஫స⏝࡟ࡼࡿࠊ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫ
ࢱ࣮ᙧᡂࡢᶍᘧᅗࠋ b)PEG ⿕そ㔠⵨╔ᇶᯈ⾲㠃࡬ࡢ⭷⼥ྜἲ࡟ࡼࡿࠊ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆྵࡴ
஧ศᏊ⭷ࡢᅛᐃ໬ࠋ

ࢱࣥࣃࢡ㉁࡛࠶ࡿ 31$ ࢆຍ࠼ࠊ'33& ࡢࢤࣝᾮᬗ㌿⛣ ᗘ Υ ௨ୖ࡛࠶ࡿ Υ࡟࡚  ศ㛫࢖࣮ࣥ࢟ࣗ࣋ࢺࡋࡓᚋࠊịỈ୰࡛෭༷ࡋࠊ࣋ࢩࢡࣝ஧ศᏊ⭷୰࡟ 31$ ࡟ᅛ᭷࡞⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ
－ 54 －

࣮ࢆᅛᐃ໬ࡋࡓ 6FKHPHD ࠋ㸱㸬㸰㸬㸱㸬ࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࡢᵓ⠏

質を特異的に認識する糖ペプチドクラスターの形成が期待できる。このことを利用し、標的タン
パク質に対する認識部位として糖ペプチドクラスターの形成を試みた。PNA認識能を有する糖ペプチドクラスターの形成を以下に示す。先に形成した3種のペプチドを埋め込んだベシクル溶
液に、標的タンパク質であるPNAを加え、DPPCのゲル-液晶転移温度(41℃)以上である60℃にて15分間インキュベートした後、氷水中で冷却し、ベシクル二分子膜中にPNAに固有な糖ペプ
チドクラスターを固定化した(Scheme 2-1a)。
３.２.３.センシングチップの構築
センシングチップの構築は以下に従い行った。１－２節で用いたPGE被覆金蒸着ガラス基板
表面に、PNAに固有な糖ペプチドクラスターを含むDPPC二分子膜を膜融合法 9)により、固定化
した。ここで、PEG層は、チャネルとして機能する糖ペプチドクラスターを介し透過した、イオンのリザバーとして用いた。PNAにより誘起されたガラクトース糖ペプチドクラスター集合体を含むベシクル溶液に、上記PGE被覆金蒸着ガラス基板を浸漬させ、24時間、温和な条件下で放置することで、PEG層表面に、PNAにより誘起されたガラクトース糖クラスターを含む二分子膜層を形成、固定化した(Scheme 2-1b)。その後、PNAを取り除く目的で、同基板を8.33x
10-4 Mのガラクトースを含む緩衝液で満たしたシャーレに浸し、24時間振とうさせた後、緩衝液で数回洗浄した。
３.２.４.センシング能評価
両親媒性糖ペプチドは集合体を形成する際、脂質二分子膜中でその親水部分を互いに向け合い
疎水性部分を脂質側に配向させ、膜を貫く安定なチャネルを形成する。標的タンパク質の認識情報を同タンパク質によって誘起されるチャネル孔への、タンパク質の再結合に伴う膜を介するイ
オン透過性の変化として検出した。測定は、PNAにより誘起されたガラクトース糖ペプチドク㸱㸬㸱㸬⤖ᯝ࡜⪃ᐹ
ラスター集合体を含むDPPC二分子膜を固定化した、PGE被覆金蒸着ガラス基板を作用電極と㸱㸬㸱㸬㸯㸬⢾࣌ࣉࢳࢻᮎ➃⢾㙐࡜ᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁ࡢ
して、三電極法を用い、一定電圧印加時(-50mV)の電流値を読み取った。電流値の減少量は、┦⿵ⓗ┦஫స⏝࡟ᇶ࡙ࡃࢡࣛࢫࢱ࣮ࡢᙧᡂ
PNAの再結合に伴うチャネル孔の閉塞として、イオン透過性の減少、すなわち電流値の減少度
 ࣌ࣉࢳࢻᮎ➃ࡢ⢾㙐࡜ࢱࣥࣃࢡ㉁࡜ࡢ┦より、センサーとしての可能性を評価した。
⿵ⓗ┦஫స⏝࡟ࡼࡿࢡࣛࢫࢱ࣮ᙧᡂࡣࠊ࣌ࣉ
３.３.結果と考察ࢳ 1 ᮎ➃࡟ᑟධࡋࡓࣆࣞࢽࣝᇶࡢ࢚࢟ࢩ࣐࣮
３.３.１.
糖ペプチド末端糖鎖と標的タンパクⓎග࡟ࡼࡾホ౯ࡋࡓࠋࣆࣞࢽࣝᇶࡣ఍ྜయࢆ
質の相補的相互作用に基づくクラスターの形
ᙧᡂࡍࡿ࡜ࠊQP ௜㏆࡟࢚࢟ࢩ࣐࣮Ⓨග࡟成ᇶ࡙ࡃ⺯ගࢆⓎࡍࡿࡇ࡜ࡀ▱ࡽࢀ࡚࠸ࡿࠋࡇ
ペプチド末端の糖鎖とタンパク質との相補ࡢᛶ㉁ࢆ฼⏝ࡋࠊࢱࣥࣃࢡ㉁ῧຍ࡟ࡼࡾࠊ⭷的相互作用によるクラスター形成は、ペプチ୰࡛ᙧᡂࡉࢀࡿ⢾࣌ࣉࢳࢻ఍ྜయࢆࠊࡑࡢᮎ
N末端に導入したピレニル基のエキシマー発➃ࣆࣞࢽࣝᇶࡢ࢚࢟ࢩ࣐࣮Ⓨගᙉᗘ࡜ࣔࣀ
光により評価した。ピレニル基は会合体を形
࣐࣮Ⓨගᙉᗘࡢẚࡼࡾホ౯ࡋࡓࠋ*DO ࢆ᭷ࡍ
成すると、480nm付近にエキシマー発光に基ࡿ୧ぶ፹ᛶ࣌ࣉࢳࢻࡢᮎ➃࡟ࣆࣞࢽࣝᇶࢆ
づく蛍光を発することが知られている。このᑟධࡋࡓ࣌ࣉࢳࢻࢆྵࡴ࣋ࢩࢡࣝ
性質を利用し、タンパク質添加により、膜中*DO/63\*OX/6/HX ࢆࣔࣝẚ࡛ 
で形成される糖ペプチド会合体を、その末端ྵࡴ ⁐ᾮ࡟ࠊ31$ ࢆ *DO/63\ ࡟ᑐࡋࠊ✀ࠎ
ピレニル基のエキシマー発光強度とモノマー
ࡢࣔࣝẚ࡛ῧຍࡋࡓሙྜࡢࠊQP ࡢࣆࣞࣥࡢࣔࣀ࣐࣮Ⓨග࡟ᑐࡍࡿࠊQP ࡢ࢚࢟ࢩ࣐
－ 55 －
࣮Ⓨගᙉᗘࡢẚ,H,P ࢆᅗ  ࡟♧ࡋࡓࠋẚ㍑ࡢࡓࡵࠊ*OX ࡟ᑐࡋ≉␗ⓗ࡞ &RQ$ ཬࡧࠊ⢾Figure 2-1. Gal-LS-Py, Glu-LS, Leu21 ࢆ ྵ ࡴ
DPPC ࣋ࢩࢡࣝ⁐ᾮࡢ Ie/Im ࡜ࢱࣥ
ࣃࢡ㉁(PAN, ConA, BSA)ῧຍ㔞࡜ࡢ㛵ಀࠋ್ࡣࠊ3 ᅇࡢ ᐃࡢᖹᆒ್ࡿ୧ぶ፹ᛶ࣌ࣉࢳࢻࡢᮎ➃࡟ࣆࣞࢽࣝᇶࢆ
ᑟධࡋࡓ࣌ࣉࢳࢻࢆྵࡴ࣋ࢩࢡࣝ
*DO/63\*OX/6/HX ࢆࣔࣝẚ࡛ ྵࡴ ⁐ᾮ࡟ࠊ31$ ࢆ *DO/63\ ࡟ᑐࡋࠊ✀ࠎ

Figure 2-1. Gal-LS-Py, Glu-LS, Leu21 ࢆ ྵ ࡴ
DPPC ࣋ࢩࢡࣝ⁐ᾮࡢ Ie/Im ࡜ࢱࣥ
ࣃࢡ㉁(PAN, ConA, BSA)ῧຍ㔞࡜ࡢ㛵ಀࠋ್ࡣࠊ3 ᅇࡢ ᐃࡢᖹᆒ್

ࡢࣔࣝẚ࡛ῧຍࡋࡓሙྜࡢࠊQP ࡢࣆࣞࣥ発光強度の比より評価した。Galを有する両親ࡢࣔࣀ࣐࣮Ⓨග࡟ᑐࡍࡿࠊQP ࡢ࢚࢟ࢩ࣐
媒性ペプチドの末端にピレニル基を導入した
࣮Ⓨගᙉᗘࡢẚ,H,P ࢆᅗ  ࡟♧ࡋࡓࠋẚ
ペプチドを含むベシクル(Gal-LS-Py, Glu-LS,㍑ࡢࡓࡵࠊ*OX ࡟ᑐࡋ≉␗ⓗ࡞ &RQ$ ཬࡧࠊ⢾Leu 21 を モ ル 比 で 1: 1: 8 含 む)溶 液 に、PNAを㙐࡜ࡣ┦஫స⏝ࡋ࡞࠸ %6$ ࢆῧຍࡋࡓ㝿ࡢ⤖
Gal-LS-Pyに対し、種々のモル比で添加したᯝࢆేࡏ࡚♧ࡍࠋ31$ ῧຍ࡟ࡼࡾ ,H,P ್ࡀ
場合の、376nmのピレンのモノマー発光に対す≉␗ⓗ࡟ቑຍࡋ࡚࠸ࡿࡀࠊ&RQ$ ཬࡧ %6$ ࢆῧる、480nmのエキシマー発光強度の比,Ie/Imをຍࡋࡓሙྜࡣࠊࡑࡢ್࡟㢧ⴭ࡞ኚ໬ࡣぢࡽࢀ
図2-1に示した。比較のため、Gluに対し特異࡞࠿ࡗࡓࠋࡇࡢ⤖ᯝࡣࠊ31$ ࡟ࡼࡾ⭷୰ࡢ
的なConA及び、糖鎖とは相互作用しないBSA*DO/6 ࡀ఍ྜయࢆᙧᡂࡋࡓࡇ࡜ࢆ♧၀ࡍࡿ࡛ྠࢱࣥࣃࢡ㉁ࢆㄆ㆑ࡋࠊ
⭷ෆ࡛ࡢ࣌ࣉࢳࢻࡢ㓄ิࢆㄏ㉳ࡉࡏࡿࡇ࡜࡛ 31$ ࡟ᅛ᭷ࡢ *DO ࣌ࣉࢳを添加した際の結果を併せて示す。PNA添加ࡶࡢ࡛࠶ࡿࠋࡑࡇ࡛ࠊ⭷୰ࡢ࣌ࣉࢳࢻ㞟ྜయࢻ㞟ྜయࢆᙧᡂࡍࡿࡇ࡜ࡀ᫂ࡽ࠿࡜࡞ࡗࡓࠋ
に よ りIe/Im値 が 特 異 的 に 増 加 し て い る が、ࡢᙧែࢆ┤᥋ほᐹࡍࡿࡓࡵ࡟㏱㐣㟁Ꮚ㢧ᚤ㸱㸬㸱㸬㸰㸬୧ぶ፹ᛶ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ᅛᐃ໬ࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࡢ
ConA及びBSAを添加した場合は、その値に顕㙾 ᪥ᮏ㟁Ꮚ ࢱࣥࣃࢡ㉁ㄆ㆑⬟ࡢホ౯
ᰴ -(0] ほᐹࢆ⾜ࡗࡓࠋFigure 2-2. PAN ࡟ࡼࡾ࣋ࢩࢡࣝ஧ศᏊ⭷୰࡟ᙧᡂࡉࢀࡓ Gal ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱࡼࡾᡂ
著 な 変 化 は 見 ら れ な か っ た。 こ の 結 果 は、
ࢆ *DO/6 ࡟ᑐࡋࣔࣝẚ࡛  ῧຍࡋࡓ࣋
ࡿ⭷ෆ⢏Ꮚࡢ TEM ⏬ീࠋ
31$๓⠇࡟࠾࠸࡚ࠊᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁31$࡟ࡼࡾࠊ࣋ࢩࢡࣝ஧ศᏊ⭷୰࡟ㄏ㉳ࡉࢀࡓ୧ぶ፹ᛶ⢾࣌
PNAにより膜中のGal-LSが会合体を形成したࢩࢡࣝ⁐ᾮࢆࠊ෾⤖๭᩿ࣞࣉࣜ࢝సᡂ⿦⨨
᪥ᮏ㟁Ꮚ
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ࢆ⏝࠸ࠊ࣋ࢩࢡࣝࡢ๭᩿㠃ࡢࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆࠊ3(* ⿕そ㔠⵨╔࢞ࣛࢫᇶᯈ⾲㠃࡟ࠊ⭷⼥ྜἲࢆ⏝࠸ᅛᐃ໬ࡋࠊྠࢱࣥࣃࢡ
ことを示唆するものである。そこで、膜中のペプチド集合体の形態を直接観察するために透過電ࣞࣉࣜ࢝⭷ࢆసᡂࡋࠊຍ㏿㟁ᅽ 㹩9࡟࡚ࠊほᐹࢆ⾜ࡗࡓࠋᅗ ࡟♧ࡍࡼ࠺࡟┤ᚄ QP ⛬ᗘ㉁ࡢࢭࣥࢩࣥࢢࢳࢵࣉࢆᵓ⠏ࡋࡓࠋ
⼥ྜ࡟ࡼࡾࠊ⬡㉁஧ศᏊ⭷ࡀ㔠㟁ᴟ⾲㠃ୖࢆḞ㝗࡞ࡃ⿕そࡋ
子顕微鏡(日本電子(株)JEM-z2500)観察を行った。PNAをGal-LSに対しモル比で2.0添加したベࡢ⭷ෆ⢏Ꮚࡀ」ᩘほᐹࡉࢀࡓࠋ௨ୖࡢ⤖ᯝࡼࡾࠊㄆ㆑ᑐ㇟࡜ࡍࡿࢱࣥࣃࢡ㉁ࠊ31$ࠊࡣ࣋ࢩࢡࣝ
࡚࠸ࡿࡇ࡜ࢆ☜ㄆࡍࡿࡓࡵࠊ4&0ᐃ࡜ࢧ࢖ࢡࣜࢵࢡ࣎ࣝࢱ࣓ࣥࢺ࣮ࣜ㸦&9㸧ࢆ⾜ࡗࡓࠋ ᐃ࡟
シクル溶液を、凍結割断レプリカ作成装置(日本電子(株)製JEFII)を用い、ベシクルの割断面のレ࡟ᇙࡵ㎸ࢇࡔ୧ぶ፹ᛶ⢾࣌ࣉࢳࢻࡢ≉ᐃࡢᮎ➃⢾㙐ࠊ*DOࠊ࡜≉␗ⓗ࡟┦⿵ⓗ┦஫స⏝ࡍࡿࡇ࡜ࡣ࣌ࣉࢳࢻࢆྵࡲ࡞࠸ '33& ࣋ࢩࢡࣝ⁐ᾮ࡟ࠊ3(* ⿕そ㔠⵨╔Ỉᬗ᣺ືᏊࢆᾐₕࡋࠊ'33& ஧ศᏊ
プリカ膜を作成し、加速電圧100kVにて、観察を行った。図2-2に示すように直径8nm程度の膜⭷ࡢ⭷⼥ྜࢆ⾜ࡗࡓࠋ4&0 ᐃࡢ⤖ᯝࡼࡾࠊᇶᯈୖࡢ '33& ࡢ㉁㔞ࡣ QJ ࡛࠶ࡗࡓࠋ'33&
内粒子が複数観察された。以上の結果より、認識対象とするタンパク質、PNA、はベシクルにศᏊࡢ༨᭷㠃✚ࡣ QPࠊ㔠௜╔᣺ືᏊࡢ㠃✚ࡣ PP ࡼࡾࠊ'33& ஧ศᏊ⭷ࡀ୍ᒙ࡛Ḟ
埋め込んだ両親媒性糖ペプチドの特定の末端糖鎖、Gal、と特異的に相補的相互作用することで㝗࡞ࡃ㔠௜╔᣺ືᏊ⾲㠃ࢆ⿕そࡋ࡚࠸ࡿ࡜௬ᐃࡋ࡚ィ⟬ࡍࡿ࡜ࠊQJ ࡛࠶ࡿࠋ௨ୖࡢ⤖ᯝ
同タンパク質を認識し、膜内でのペプチドの再配列を誘起させることでPNAに固有のGalペプチࡼࡾࠊᇶᯈୖ࡟ '33& ࡢ஧ศᏊ⭷ᒙࡀ୍ᒙ࡟ᙧᡂࡉࢀ࡚࠸ࡿࡇ࡜ࡀࢃ࠿ࡿࠋࡲࡓࠊ㟁ゎ㉁࡟ࣇ࢙
ド集合体を形成することが明らかとなった。
ࣟࢩ࢔ࣥ໬࣒࢝ࣜ࢘ࢆ⏝࠸ࠊྠᇶᯈࢆస⏝㟁ᴟ࡜ࡋࡓࠊ&9 ࡛ࡣࠊ㓟໬㑏ඖࣆ࣮ࢡࡀㄆࡵࡽࢀ࡞
３.３.２.両親媒性糖ペプチドクラスター固定化センシングチップのタンパク質認識能の評価࠸ࡇ࡜࠿ࡽࠊ'33& ஧ศᏊ⭷ࡣࣇ࢙ࣜࢩ࢔ࣥ໬≀࢖࢜ࣥ࡯࡝ࡢ኱ࡁࡉࡢ኱ࡁ࡞Ḟ㝗ࡣ࡞ࡃࠊᇶᯈ
前節において、標的タンパク質,PNA,により、ベシクル二分子膜中に誘起された両親媒性糖ペ⾲㠃ࢆ⿕そࡋ࡚࠸ࡿ࡜⪃࠼ࡽࢀࡿࠋ
プチドクラスターを、PEG被覆金蒸着ガラス ᮏ◊✲࡛⏝࠸ࡓ⢾࣌ࣉࢳࢻࡢ࢔࣑ࣀ㓟ࢩ࣮
基板表面に、膜融合法を用い固定化し、同タࢣࣥࢫ࡟ࡣࠊ୧ぶ፹ᛶD࣊ࣜࢵࢡࢫᵓ㐀ࢆᙧ
ンパク質のセンシングチップを構築した。融ᡂࡍࡿࡼ࠺ศᏊタィࡉࢀ࡚࠸ࡿࡇ࡜࠿ࡽࠊᶆ
合により、脂質二分子膜が金電極表面上を欠ⓗࢱࣥࣃࢡ㉁࡟ࡼࡾㄏ㉳ࡉࢀࡓ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡ
陥ࣛࢫࢱ࣮୰࡟ࡣࠊࢳࣕࢿࣝᵝᵓ㐀యࡢᙧᡂࡀ
な く 被 覆 し て い る こ と を 確 認 す る た め、
QCM測定とサイクリックボルタンメトリーᮇᚅࡉࢀ࡚࠸ࡿࠋࡑࡇ࡛ࠊ⢾࡜ࢱࣥࣃࢡ㉁࡜
（CV）を行った。測定にはペプチドを含まないࡢ┦⿵ⓗ┦஫స⏝࡟ࡼࡾᙧᡂࡍࡿ⢾࣌ࣉࢳࢻ
DPPCベシクル溶液に、PEG被覆金蒸着水晶ࢡࣛࢫࢱ࣮୰ࡢࢳࣕࢿࣝᵝᵓ㐀యࡢάᛶࢆホ
振動子を浸漬し、DPPC二分子膜の膜融合を౯ࡍࡿࡓࡵࠊ⭷⼥ྜἲ࡟ࡼࡾᚓࡽࢀࡓ୧ぶ፹行ᛶ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ᅛᐃ໬ࢭࣥࢩࣥࢢࢳ
っ た。QCM 測 定 の 結 果 よ り、 基 板 上 のDPPCの質量は108.50ngであった。DPPC1分
ࢵࣉࢆస⏝ᴟ࡜ࡋࡓࠊ㟁ὶ㟁ᅽ ,9ᐃࢆ
2
子の占有面積は0.47nm、金付着振動子の面積
⾜ࡗࡓࠋẚ㍑ࡢࡓࡵࠊ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮
2ࢆᙧᡂࡉࡏ࡚࠸࡞࠸
'33& ஧ศᏊ⭷ࢆ⿕そࡋは19.625mm
より、DPPC二分子膜が一層で欠ࡓ㟁ᴟࢆసᡂࡋࠊྠᵝ࡟ ,9 ᐃࢆ⾜ࡗࡓࠋ31$
陥なく金付着振動子表面を被覆していると仮Figure 2-3. PAN ࡟ࡼࡾㄏ㉳ࡉࢀࡓ Gal ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱࢆྵࡴ(‫ ;ە‬with Gal cluster)ཬ ࡧ ྵ ࡲ ࡞ ࠸ ( ‫ ; ۑ‬without Galacluster) DPPC ஧ศᏊ⭷ࢆᅛᐃ໬ࡋࡓ
㟁ᴟࡢ I-V ≉ᛶࠋ࡟ࡼࡾㄏ㉳ࡉࢀࡓ *DO ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆᅛᐃ໬ࡋࡓ㟁ᴟࡣࠊᙧᡂࡉࡏ࡚࠸࡞࠸㟁ᴟ࡜ẚ㍑
ࡋࠊ࣐࢖ࢼࢫ㟁఩༳ຍ᫬࡟኱ࡁ࡞㟁ὶᛂ⟅ࢆ♧ࡋࡓࠋࡇࢀࡣࠊ⬡㉁஧ศᏊ⭷ࢆ㈏ࡃ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮
－ 56 －

㞟ྜయ୰࡟ࠊࢳࣕࢿࣝᵝࡢ࢖࢜ࣥ㏱㐣㊰ࡀᙧᡂࡉࢀ࡚࠾ࡾࠊ࣐࢖ࢼࢫ㟁ᅽ༳ຍ᫬࡟㟁ゎ㉁୰ࡢ࢝
ࢳ࢜ࣥࡀ '33& ஧ศᏊ⭷୰ࡢࢳࣕࢿࣝᵝࡢ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆ௓ࡋ࡚㏱㐣ࡋࠊẚ㍑ⓗ኱ࡁ࡞ࡇࢀࡲ࡛࡟ࠊ'33& ஧ศᏊ⭷୰࡛ࠊ୧ぶ፹ᛶ
定して計算すると、101.83
ngである。以上の⢾࣌ࣉࢳࢻࡣࠊᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁࡜ᮎ➃⢾㙐࡜ࡢ
結果より、基板上にDPPCの二分子膜層が一層┦⿵ⓗ┦஫స⏝࡟ࡼࡾ෌㓄ิࡋ࡚㞟ྜయࢆᙧに形成されていることがわかる。また、電解ᡂࡋࠊᚓࡽࢀࡓ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࡣࢳࣕࢿ
質にフェロシアン化カリウムを用い、同基板ࣝάᛶࢆ᭷ࡍࡿࡇ࡜ࢆ᫂ࡽ࠿࡟ࡋࡓࠋᮏ⠇࡛ࡣࠊ
を作用電極とした、CVでは、酸化還元ピーク
ࢱࣥࣃࢡ㉁ㄆ㆑᝟ሗࢆࠊ⭷ࢆ௓ࡍࡿ࢖࢜ࣥ㏱㐣
が認められないことから、DPPC二分子膜はᛶࡢኚ໬࡟ᇶ࡙ࡃ㟁Ẽ໬Ꮫ᝟ሗ࡟ኚ᥮ࡍࡿࡇ
フェリシアン化物イオンほどの大きさの大き࡜࡟ࡼࡿࠊ⡆౽࣭㎿㏿࡞ࢭࣥࢧ࣮࡜ࡋ࡚ࡢᶵ⬟
な欠陥はなく、基板表面を被覆していると考ࡢⓎ⌧ࢆホ౯ࡋࡓࠋ୍ᐃ㟁ᅽP9 ༳ຍ᫬ࠊえられる。
㟁ゎ㉁࡟ࢱࣥࣃࢡ㉁ࢆ✀ࠎࡢ⃰ᗘ࡛ῧຍࡋࠊ⢾本研究で用いた糖ペプチドのアミノ酸シー
Figure 2-4. PNA ࡛ㄏ㉳ࡋࡓ࢞ࣛࢡࢺ࣮ࢫ⢾ࢡ࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ෆࡢࢳࣕࢿࣝᏍࢆ௓ࡍࡿ
ࣛࢫࢱ࣮ࢆྵࡴ DPPC ஧ศᏊ⭷ᅛ
ケンスには、両親媒性α-ヘリックス構造を形ᐃ໬㟁ᴟࡢࠊPNA ῧຍ࡟ࡼࡿ㟁ὶ
࢖࢜ࣥ㏱㐣ᛶኚ໬࡟ࡼࡗ࡚㉳ࡇࡿࠊ㟁ὶ್ࡢኚ成するよう分子設計されていることから、標ᛂ⟅ࠋPNA ῧຍ⃰ᗘ 0.67 nMࠊ༳ຍ㟁ᅽ-50 mVࠋ໬ࢆㄞࡳྲྀࡗࡓࠋ
的タンパク質により誘起された糖ペプチドク࢞ࣛࢡࢺ࣮ࢫ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮࡬ࡢ 31$ ࡢ෌⤖
ラスター中には、チャネル様構造体の形成がྜ࡟ࡼࡿ㟁ὶ್ࡢኚ໬ࢆᅗ  ࡟♧ࡋࡓࠋ
期待されている。そこで、糖とタンパク質と◚⥺ࡣ 31$ ࡢῧຍ᫬ࢆ♧ࡋ࡚࠾ࡾࠊ31$ ࡢῧの相補的相互作用により形成する糖ペプチドຍ⃰ᗘࡣࠊQ0 ࡜ࡋࡓࠋ31$ ῧຍᚋ࡟ࠊ
クラスター中のチャネル様構造体の活性を評㟁ὶࡀῶᑡࡋࠊ᭱⤊ⓗ࡟㣬࿴ࡍࡿᵝᏊࡀ☜ㄆ
価するため、膜融合法により得られた両親媒ࡉࢀࡓࠋࡇࡢ᧯సࢆࠊࢱࣥࣃࢡ㉁⃰ᗘ  ࠿ࡽ性糖ペプチドクラスター固定化センシング
Q0 ࡢ⠊ᅖ࡛⾜ࡗࡓࠋ㟁ᴟ࡟ࡣ 31$ ࡟ㄏ㉳ࡉ
チップを作用極とした、電流-電圧(I-V)測定を
ࢀࡓࠊ࢞ࣛࢡࢺ࣮ࢫ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆᅛᐃ໬ࡋ
行った。比較のため、糖ペプチドクラスターࡓ㟁ᴟ࡜ࠊྠ✀㢮ࡢ࣌ࣉࢳࢻࢆྵࡴࡀ 31$ ࡟を形成させていないDPPC二分子膜を被覆した
ࡼࡾ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆㄏ㉳ࡉࡏ࡚࠸࡞࠸㟁ᴟ
電極を作成し、同様にIV測定を行った。PNAࡢ  ✀㢮ࢆ⏝࠸ࡓࠋ⤖ᯝࢆᅗ  ࡟♧ࡍࠋにより誘起されたGal糖ペプチドクラスターを
ẚ㍑ࡢࡓࡵࠊᑐ↷ࢱࣥࣃࢡ㉁࡜ࡋ࡚ &RQ$ ࢆ
Figure 2-5. PNA ࡟ࡼࡾㄏ㉳ࡉࢀࡓ࢞ࣛࢡࢺ࣮ࢫ⢾固定化した電極は、形成させていない電極と࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆྵࡴ஧ศᏊ⭷ῧຍࡋࡓ㝿ࡢ㟁ὶ್ኚ໬ࡶేࡏ࡚♧ࡋࡓࠋᅛᐃ໬㟁ᴟ ᐇ⥺ ཬࡧࠊࢡࣛࢫࢱ࣮ᙧ
比較し、マイナス電位印加時に大きな電流応ᡂ๓ࡢ࣌ࣉࢳࢻྵ᭷ DPPC ஧ศᏊ⭷31$ ࡟ㄏ㉳ࡉࢀࡓࠊ࢞ࣛࢡࢺ࣮ࢫ⢾ࢡࣛࢫࢱᅛᐃ໬㟁ᴟ Ⅼ⥺ ࡢ PNA㸦‫ە‬ᶆⓗࢱ
答を示した。これは、脂質二分子膜を貫く糖ࣥࣃࢡ㉁㸧ཬࡧࠊConA㸦‫ۑ‬ᑐ↷ࢱ࣮ࢆᅛᐃ໬ࡋࡓ㟁ᴟ࡟ 31$ ࢆῧຍࡋࡓሙྜࠊ
ࣥࣃࢡ㉁㸧ῧຍ࡟క࠺㟁ὶᛂ⟅ࠋ༳クラスター集合体中に、チャネル様のイオンຍ㟁ᅽP9ࠋ
31$ ࡢ෌⤖ྜ࡟ࡼࡾࠊࢳࣕࢿࣝࢆᰦࡢࡼ࠺࡟
透過路が形成されており、マイナス電圧印加ሰࡂࠊ㟁ὶ್ࡢῶᑡࡀㄆࡵࡽࢀࠊࡇࡢῶᑡ㔞ࡣࠊ31$ ࡢ⃰ᗘ࡟ᑐࡋ㣬࿴ࡍࡿഴྥࢆ♧ࡋࡓࠋ୍᪉ࠊ
時に電解質中のカチオンがDPPC二分子膜中のチャネル様の糖ペプチドクラスターを介して透過
31$ ࡟ࡼࡾㄏ㉳ࡉࢀࡓ࢞ࣛࢡࢺ࣮ࢫ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆᙧᡂࡉࡏࡓ㟁ᴟ࡟ࠊᑐ↷ࢱࣥࣃࢡ㉁し、比較的大きな電流応答が見られたと考えられる。
࡛࠶ࡿ &RQ$ ࢆῧຍࡋࡓሙྜࠊཬࡧࠊ*OD ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆᙧᡂࡉࡏ࡚࠸࡞࠸㟁ᴟ࡟ࠊᶆⓗࢱࣥࣃ
これまでに、DPPC二分子膜中で、両親媒性糖ペプチドは、標的タンパク質と末端糖鎖との相ࢡ㉁࡛࠶ࡿ 31$ ཬࡧࠊ&RQ$ ࢆῧຍࡋࡓሙྜ࡟ࡣࠊ࠸ࡎࢀࡶ㟁ὶ್ࡢῶᑡࡣㄆࡵࡽࢀ࡞࠿ࡗࡓࠋ
補的相互作用により再配列して集合体を形成し、得られた糖ペプチドクラスターはチャネル活性ࡇࡢ≉␗࡛㢧ⴭ࡞㟁ὶ್ࡢῶᑡࡣࠊᵓ⠏ࡋࡓࢹࣂ࢖ࢫࡀ㧗࠸ 31$ ㄆ㆑⬟ࢆᣢࡘࡇ࡜ࢆ♧၀ࡋ࡚࠸
を有することを明らかにした。本節では、タンパク質認識情報を、膜を介するイオン透過性の変ࡿࠋ
化に基づく電気化学情報に変換することによる、簡便・迅速なセンサーとしての機能の発現を評 ᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁ࡢ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮࡬ࡢ෌⤖ྜ࡟క࠺㟁ὶ್ࡢῶᑡࡣࠊᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁ 31$ ࡀ࢞
価した。一定電圧-50mV印加時、電解質にタンパク質を種々の濃度で添加し、糖ペプチドクラス
ター内のチャネル孔を介するイオン透過性変化によって起こる、電流値の変化を読み取った。
ガラクトース糖クラスターへのPNAの再結合による電流値の変化を図2-4に示した。破線は－ 57 －

PNAの添加時を示しており、PNAの添加濃度は、2.64 nMとした。PNA添加後に、電流が減少
し、最終的に飽和する様子が確認された。この操作を、タンパク質濃度0から6 nMの範囲で行った。電極にはPNAに誘起された、ガラクトース糖クラスターを固定化した電極と、同種類のペプチドを含むがPNAにより糖クラスターを誘起させていない電極の2種類を用いた。結果を図2-5に示す。比較のため、対照タンパク質としてConAを添加した際の電流値変化も併せて示した。PNAに誘起された、ガラクトース糖クラスターを固定化した電極にPNAを添加した場合、PNAの再結合により、チャネルを栓のように塞ぎ、電流値の減少が認められ、この減少量は、
PNAの濃度に対し飽和する傾向を示した。一方、PNAにより誘起されたガラクトース糖ペプチ
ドクラスターを形成させた電極に、対照タンパク質であるConAを添加した場合、及び、Gla糖ク
ラスターを形成させていない電極に、標的タンパク質であるPNA及び、ConAを添加した場合には、いずれも電流値の減少は認められなかった。この特異で顕著な電流値の減少は、構築したデバイスが高いPNA認識能を持つことを示唆している。
標的タンパク質の糖クラスターへの再結合に伴う電流値の減少は、標的タンパク質(PNA)がガ
ラクトース糖クラスター集合体に結合し、複合体を形成する次式の平衡反応を考え、標的タンパ
ク質の糖クラスターへ親和定数を求め、認識能の特異性の評価を行った。ここで、kaとkdはそࣛࢡࢺ࣮ࢫ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮㞟ྜయ࡟⤖ྜࡋࠊ」ྜయࢆᙧᡂࡍࡿḟᘧࡢᖹ⾮཯ᛂࢆ⪃࠼ࠊᶆⓗࢱࣥࣃ
れぞれ、結合速度定数、解離速度定数であり、その比、ka/kdが親和定数K (M-1 )である。
ࢡ㉁ࡢ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮࡬ぶ࿴ᐃᩘࢆồࡵࠊㄆ㆑⬟ࡢ≉␗ᛶࡢホ౯ࢆ⾜ࡗࡓࠋࡇࡇ࡛ࠊND ࡜ NG ࡣࡑᶆⓗ䝍䞁䝟䜽㉁ + ⢾䜽䝷䝇䝍䞊䠄㻼㻺 㻭䠅䠄㻳㼍 㼘㻌㼏㼘㼡 㼟㼠㼑㼞䠅ka

GGGGGG GGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGkdᶆⓗ䝍䞁䝟䜽㉁ 䇵 ⢾䜽䝷䝇䝍䞊」ྜయ
䠄 㻼㻺 㻭㻌䇵 㻳㼍 㼘㻌㼏㼘㼡 㼟㼠㼑㼞䠅ࢀࡒࢀࠊ⤖ྜ㏿ᗘᐃᩘࠊゎ㞳㏿ᗘᐃᩘ࡛࠶ࡾࠊࡑࡢẚࠊNDNG ࡀぶ࿴ᐃᩘ . 0 ࡛࠶ࡿࠋ
ここでは応答電流の減少量とPNAとガラクトース糖クラスターが結合した複合体の濃度が比ࡇࡇ࡛ࡣᛂ⟅㟁ὶࡢῶᑡ㔞࡜
31$ ࡜࢞ࣛࢡࢺ࣮ࢫ⢾ࢡࣛࢫࢱ࣮ࡀ⤖ྜࡋࡓ」ྜయࡢ⃰ᗘࡀẚ౛
34 10)
例すると仮定した。一般的な単糖とレクチンとの親和定数は10から10であるのに対し、本研ࡍࡿ࡜௬ᐃࡋࡓࠋ୍⯡ⓗ࡞༢⢾࡜ࣞࢡࢳࣥ࡜ࡢぶ࿴ᐃᩘࡣ ࠿ࡽ
 ࡛࠶ࡿࡢ࡟ᑐࡋࠊᮏ◊究で構築した標的タンパク質で誘起させた糖ペプチドクラスターを固定化したデバイスは5.08✲࡛ᵓ⠏ࡋࡓᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁࡛ㄏ㉳ࡉࡏࡓ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆᅛᐃ໬ࡋࡓࢹࣂ࢖ࢫࡣ
x108の親和定数を持つことから、非常に高い認識能を持つことがわかった。また抗原抗体反応の[
ࡢぶ࿴ᐃᩘࢆᣢࡘࡇ࡜࠿ࡽࠊ㠀ᖖ࡟㧗࠸ㄆ㆑⬟ࢆᣢࡘࡇ࡜ࡀࢃ࠿ࡗࡓࠋࡲࡓᢠཎᢠయ཯ᛂ
9 
 ࠿ࡽ 
親和定数が10ということから、抗原抗体反応と同レベルの認識能を有することが示唆さࡢぶ࿴ᐃᩘࡀ
6 から10࡜࠸࠺ࡇ࡜࠿ࡽࠊᢠཎᢠయ཯ᛂ࡜ྠࣞ࣋ࣝࡢㄆ㆑⬟ࢆ᭷ࡍࡿࡇ࡜ࡀ♧れた。この原因には、標的タンパク質により誘起させたクラスターを用いていることから、認識၀ࡉࢀࡓࠋࡇࡢཎᅉ࡟ࡣࠊᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁࡟ࡼࡾㄏ㉳ࡉࡏࡓࢡࣛࢫࢱ࣮ࢆ⏝࠸࡚࠸ࡿࡇ࡜࠿ࡽࠊ

ㄆ㆑㒊఩ࡀྛᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁≉᭷ࡢ✵㛫㓄⨨ࢆᣢࡕࠊᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁୰ࡢከᩘࡢ⤖ྜࢧ࢖ࢺ㸦31$
部位が各標的タンパク質特有の空間配置を持ち、標的タンパク質中の多数の結合サイト
（PNAの
ࡢሙྜ
 ಶ㸧
࡜ࠊ⢾࣌ࣉࢳࢻࢡࣛࢫࢱ࣮୰ࡢ⢾㙐࡜ከⅬ࡛ࡢ┦஫స⏝ࡀྍ⬟࡛࠶ࡿࡓࡵ࡜⪃࠼ࡽ場合4個）と、糖ペプチドクラスター中の糖鎖と多点での相互作用が可能であるためと考えられ
ࢀࡿࠋ
る。
 ᮏ◊✲
࡛⏝࠸ࡓᡭἲ࡛ࡣࠊᶆⓗࢱࣥࣃࢡ㉁ࡢῧຍ࡟ࡼࡾࠊ⮬Ⓨⓗ࡟᝟ሗࡢㄆ㆑㒊఩ཬࡧࠊኚ᥮࣭
本研究で用いた手法では、標的タンパク質の添加により、自発的に情報の認識部位及び、変Ⓨಙ㒊఩ࢆᙧᡂࡉࡏࡿࡓࡵࠊ
ྠࡌᮦᩱࢆ⏝࠸࡚⮬ᕫ⤌⧊໬ⓗ࡟ᵝࠎ࡞ࢱࣥࣃࢡ㉁࡟ᑐᛂࡍࡿࢭࣥ
換・発信部位を形成させるため、同じ材料を用いて自己組織化的に様々なタンパク質に対応する
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センシングチップの作成が可能という利点がある。また、認識部位の形成と同時に、両親媒性ペࢻ㒊ศࡀ᝟ሗࡢኚ᥮࣭Ⓨಙ㒊఩࡜ࡋ࡚ᶵ⬟ࡍࡿࢳࣕࢿࣝᵓ㐀ࢆᙧᡂࡍࡿࡓࡵࠊᚑ᮶ࠊ≉ู࡞᪋タ
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施設や大型装置を必要としていた認識情報の変換も、電気化学的手法により簡便・迅速に行うこ࡛ࡁࡿ࡜࠸࠺฼Ⅼࡶ࠶ࡿࠋࡇࢀࡽ฼Ⅼ࡜ࠊ⡆౽࡞ᡭἲ࡟ࡼࡾᵓ⠏ྍ⬟࡛࠶ࡿⅬ࠿ࡽࠊᮍ▱ࡢẘ≀とができるという利点もある。これら利点と、簡便な手法により構築可能である点から、未知のࡸ࢘࢖ࣝࢫ࡟ᑐࡋ࡚⡆౽࣭㎿㏿࡞ࢭࣥࢩࣥࢢࢹࣂ࢖ࢫ࡜ࡋ࡚ࡢྍ⬟ᛶࡀᮇᚅࡉࢀࡿࠋ
毒物やウイルスに対して簡便・迅速なセンシングデバイスとしての可能性が期待される。
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本研究では、環境中の有害物質を、迅速、且つ、簡便に検出可能な、センシングデバイスを自己組織化手法を用いて構築した。重金属イオンのセンシングデバイスでは、感度的には、最適化の必要があるものの、実環境において、連続センシング可能な、センシングチップの構築に成功した。
また、未知ウイルスの検出を目的とした、タンパク質センシングチップでは、標的タンパク質との相互作用により形成される両親媒性糖ペプチド集合体を、受容部及び情報変換部として用いること
により、抗原-抗体反応と同程度の高い認識能を有し、その認識情報を単純な電気信号として取り出すことに成功した。今後は、実際の使用を念頭に置いた、センシングチップの安定性の向上等が必要である。最後に、本研究機会を頂いた、日比科学技術振興機構ならびに、実際の実験を行っていただいた、名古屋工業大学

樋口研究室の学生諸君、特に、荒井麻央・近藤伸哉両君に、深く感謝いたします。
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