原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

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ミドリゾウリムシにおけるオートガミーの人為的誘導
柳 明（石巻専修大・理工）

Artificial induction of autogamy in Paramecium bursaria
Akira YANAGI (Department of Biotechnology, Senshu University of Ishinomaki)
SUMMARY

Autogamy in Paramecium is a sexual process occurring in a single cell. Autogamy brings about complete homozygosity in the progeny and simplifies genetic analysis. As autogamy has not been found to occur naturally in Paramecium
bursaria, artificial induction of autogamy would be useful for genetic studies. I attempted to induce autogamy in P.
bursaria by treating the cells with methyl cellulose, because methyl cellulose has been reported to induce not only
autogamy in P. caudatum but also selfing conjugation in some species of Paramecium (P. bursaria, P. caudatum, P.
tetraurelia and P. multimicronuclatum ). When isolated single cells of P. bursaria were treated with 1.25% methyl cellulose, most of the single cells underwent micronuclear changes without cell adhesion. This suggests that the cells underwent autogamy. Treatment with methyl cellulose for at least 3 h was necessary for the induction of autogamy. Cytological observations indicated that micronuclear processes in the methyl cellulose-induced autogamy were substantiallysimilar to those in natural conjugation following the mating reaction and that ventral cilia in the autogamous cells degenerated. The observations show that methyl cellulose induces autogamy with normal micronuclear processes in P. bursaria. The induction of autogamy will facilitate genetic studies in P. bursaria.

[目的]オートガミーを起こすと細胞のすべての遺伝

小核の変化が起こるかどうかを調べた。細胞を単離子座がホモ接合体となる。従って、オートガミーをして、0、0.75、1.25% (w/v)のメチルセルロースで24誘導できると遺伝解析に役立つ。ところが、ミドリ

時間処理した。その結果、0%メチルセルロースで処ゾウリムシ（Paramecium bursaria）は、自然にオー理した細胞では、オートガミーに特徴的な小核の変トガミーを起こさないだけでなく、人為的にオート化は全く観察されなかった。しかし、0.75%メチルセ

ガミーを誘導することにも成功していない。そこ

ルロースで処理したところ、Dd1という株で6.7%、

で、ミドリゾウリムシのオートガミーを人為的に誘KM2という株で21.7%の細胞がオートガミーに特徴導することを試みた。

的な小核の変化を起こした。さらに、1.25%メチルセ[材料と方法]P.bursariaのDd1, KM2, Bnd, Th1, Os1wという株を用いた。これらの株は茨城大学の三輪五十二先生から頂いた。オートガミーを人為的に誘導するための薬品としてメチルセルロース（和光純薬、100 cp ）を用いた。なぜならば、メチルセル
ロースは、ゾウリムシ（P. caudatum ）にオートガ
ミーを誘導できるだけでなく、ミドリゾウリムシ・ゾウリムシ・P. tetraurelia・P. multimicronucleatumに接合を誘導できることが報告されているからであ
る1, 2。メチルセルロース処理は、細胞を含む培養液
0.5 mlと蒸留水に溶かしたメチルセルロース液0.5 mlとをデプレッションスライドの穴の中で混合することにより行った。小核の変化は、酢酸オルセイン染
色して観察した。実験は、25〜26ºCで行った。

ル ロ ー ス で 処 理 し た 場 合、Dd1 で 42.9%、KM2 で65.6%の細胞がオートガミーに特徴的な小核の変化を起こした。この結果は、メチルセルロースが単離したミドリゾウリムシにオートガミーに特徴的な小核の変化を誘導できることを示している。
次に、オートガミー誘導に必要なメチルセルロー
スの処理時間を調べるために、1.25%メチルセルロー
スで処理し始めてから0, 1, 2, 3, 5, 24時間後に細胞をK-DS（ミドリゾウリムシの生理食塩水）で洗い、メ
チルセルロース処理開始後24時間に細胞を染色してオートガミーに特徴的な小核の変化を起こしている細胞の割合を調べた。この時、０〜５時間メチルセ
ルロース処理した細胞は、K-DSで洗った直後に単離した。また、24時間メチルセルロース処理した細胞
は、処理を開始してから１〜３時間後に1.25%メチル[結果と考察]まず、単離したミドリゾウリムシをメ

セルロース液中に単離した。その結果、1時間と2時

チルセルロースで処理してオートガミーに特徴的な間のメチルセルロース処理では、オートガミー誘導

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後24時間の細胞と同じような小核の変化を起こしての結果は、メチルセルロースが正常なオートガミー

いる細胞は観察できなかったが、３時間以上のメチをミドリゾウリムシに誘導できることを示していルセルロース処理ではそのような小核の変化を起こる。

している細胞を観察することができた。つまり、ミまた、ゾウリムシのオートガミーを化学的に誘導

ドリゾウリムシにオートガミーを誘導するためにはす る と 腹 側 の 繊 毛 が 退 化 す る 1, 3 。し か し、P.

３時間以上メチルセルロースで細胞を処理する必要

tetraureliaの自然に起こるオートガミーでは腹側繊毛がある。ただし、２時間と３時間のメチルセルロー

は退化しない。それでは、メチルセルロースによっス処理では、オートガミー初期の細胞のように膨潤て誘導されたミドリゾウリムシのオートガミーでして丸くなった小核を持っている細胞が観察されは、腹側の繊毛はどうなっているのだろうか。光学た。この細胞は、小核の活性化は起こったが、メチ顕微鏡を使って観察したところ、メチルセルロース

ルセルロース処理時間が短すぎたためにその後の過によって誘導されたミドリゾウリムシのオートガ

程に進行できなかったものと考えられる。従って、

ミーでも腹側の繊毛が退化することがわかった。
遠藤（1987）4 は、接合を誘導する化学物質（10この細胞は、最終的にオートガミーを起こす前の細胞の状態に戻ると推察される。

µM Ca2+, 8 mM K+, 40 µg/ml acriflavine and 100 mM

上の結果のようにオートガミーを誘導するために

acetoamide）で単離したミドリゾウリムシを処理したはメチルセルロースで３時間以上処理することが必が、オートガミーを誘導できなかったと報告してい要である。つまり、細胞がオートガミーへと拘束る。しかし、本報告では、メチルセルロースが単離（コミット）されるのに３時間以上のメチルセル

したミドリゾウリムシにオートガミーを誘導した。

ロール処理が必要なのである。このコミットメント

このことと過去の報告2は、メチルセルロースが遠藤の実体はわからないが、３時間という時間を考えるの報告した化学物質とは違うメカニズムで細胞にと減数分裂が開始することがその実体である可能性

オートガミーを誘導したことを示唆している。

が考えられる。今後はこのコミットメントの実体を今後、メチルセルロースによるオートガミー誘導

あきらかにするために、３時間のメチルセルロースのメカニズムを調べることにより、オートガミー及処理の間に細胞で何が起こっているのか、さらに、びその化学的誘導のメカニズムを解明できるものとメチルセルロースが細胞のどこに作用しているのか

考 え て い る。さ ら に、メ チ ル セ ル ロ ー ス はを調べたい。

簡単かつ高率にオートガミーを誘導できるので遺伝

次に、メチルセルロース処理によって誘導された
オートガミーにおける小核の変化を観察した。メチルセルロース処理後４時間と７時間では、減数第一分裂の途中の時期であった。メチルセルロース処理
後２４時間では、受精核の１〜２回目の分裂の時期であった。このメチルセルロース処理によって誘導された小核の変化は、交配反応によって誘導される
普通の接合と本質的に変わりなく進行した。これら

解析に役立つと考えられる。
[文献]
1)
2)
3)
4)

Yanagi, A. & Haga, N. (1996) Eur. J. Protistol. 32,(Suppl. I), 183-186.
Yanagi, A. & Haga, N. (1998) J. Euk. Microbiol. 45,
87-90.
Watanabe, T. (1978) J. Cell Sci. 32, 55-66.
Endoh, H. (1987) Jpn. J. Genet. 62, 21-25.

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ミドリゾウリムシの共生クロレラの感染過程
児玉 有紀,、藤島 政博 (山口大・理・生物)

Infection process for symbiotic Chlorella in Paramecium bursaria
Yuuki KODAMA and Masahiro FUJISHIMA (Biol. Inst., Fac. of Sci., Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
Cells of Paramecium bursaria harbor several hundred symbiotic Chlorella in their cytoplasm. Chlorella-free aposymbiotic cells can be easily reinfected with Chlorella isolated from symbiotic cells. However, the processes of digestive
vacuole formation in the host cell and timing of the escape of Chlorella from the digestive vacuole have not yet beenclarified. By using a pulse label (1.5 min) and chase with bromphenol blue-stained Saccharomyces cerevisiae or isolated
Chlorella at 25ºC, we found that both acidification of the digestive vacuole and digestion of Chlorella in the vacuole
occurred at an earlier time than in P. multimicronucleatum and P. caudatum.

[目的]ミドリゾウリムシは他のゾウリムシとは異なして 1.5 分の間に取り込まれたクロレラの運命を追跡

りクロレラを細胞内共生させる能力を持っている。シした。

ンビオティック細胞から共生クロレラを単離し，クロpH 指示薬標識酵母菌 100 µl の酵母 (Saccharomyces

レラを持たないアポシンビオティック細胞と混合す

cereviseae) 浮遊液に 500 µl の 0.5% (w/v) ブロムフェ

ると，クロレラは食胞を経由して宿主ライソソームがノールブルー溶液 (Dryl の液に溶解) を加え，100 ℃で融合しない perialgal vacuole (PV) 膜に包まれて宿主細60 分間ボイルし，Dryl の液で洗浄して酵母菌の細胞密胞質に維持される。このように，ミドリゾウリムシと度を 104-105/ml に調整した 1。10,000 cells/ml のアポシ

クロレラは，動物細胞と藻類との細胞内共生の感染初

ンビオティック細胞 250µl に前述の酵母菌浮遊液を期過程で何が行われるのかを解明するのに適した材

30µl に加え， 25ºC，恒明条件で 30 秒間のパルスラベ料である。しかし，これまでミドリゾウリムシの食胞ルを行った。30 秒後細胞浮遊液１滴をスライドガラス

形成過程や，クロレラの感染初期過程のどの時期に消にのせ，微分干渉顕微鏡を用いてブロムフェノールブ

化を免れることができるようになるかについてはほ

ルーの色の変化で食胞内の pH の変化を経時的に観察

とんど明らかにされていなかった。そこで，この研究した。

は，クロレラをミドリゾウリムシに一定条件で短時間だけ与えて洗浄する方法 (パルスラベルとチェイス)
で宿主食胞内に取り込まれるクロレラ数を制限し，食胞に取り込まれたクロレラが消化されずに細胞内共生に成功することが決定される時期を明らかにすることを目的として行った。
[方法]クロレラの単離[結果及び考察]これまでに P. multimicronucleatum の
DV-IIは4-10分，DV-IIIは8-20分で出現することが報告されている1。P. multimicronucleatum における食胞の形態の特徴に基づいて，ミドリゾウリムシの食胞を分類し，時間経過に伴う出現頻度を観察した。その結果，ミドリゾウリムシにおける食胞の分化は非定常期初期のシンビオ

常に短時間で起こり，30秒でDV-II，２分でDV-IIIがティック細胞 (OS1g) を遠心し，Dryl の液で洗浄して出現した。また，ブロムフェノールブルーで標識し1ml に濃縮し最終濃度 0.1 mM の PMSF を加え，テフロた酵母菌を用い，DV-I， II ，IIIの食胞内 pHは，そンホモジナイザーを用いて氷冷してホモジナイズしれぞれ，5.0 以上 ， 3.5以下 ， 5.0 以上であることがた。そのホモジネートを 15µm ナイロンメッシュで濾明らかになった。

過し，濾液を遠心で集め Dryl の液で洗浄してクロレラを調整した。

パルスラベルとチェイスの方法により，クロレラと混合後30分以内の P. bursaria の食胞に単独で存在

アポシンビオティック細する緑色のクロレラは全て消化され，細胞内共生を

胞 5,000 cells/ml と，単離クロレラを 1:104 で混合し，成立できるクロレラは30分以後に，消化されたクロ25ºC で恒明条件で 1.5 分のパルスラベルを行った。そレラと緑色のクロレラが共存するライソソームが融の後，15 µm ナイロンメッシュで濾過して，ドリルの合した食胞から新たに脱出したクロレラであること

液で細胞を洗浄して外液のクロレラを除去し，チェイが明らかになった。この結果は1989年のMeierによるスし，経時的に 4% (w/v) パラホルムアルデヒドで固定｢PV膜の分化はアシドソーム融合後の3分から，ライ

パルスラベルとチェイス

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ソソーム融合前の7分の間に起こる2｣という結果とは異なるものである。これらの結果から感染初期過程
では，PV膜で包まれる前にライソソームが融合しても消化されないように変化するしくみがあると予測された。今後，この時期に何が起こっているかを明39らかにする必要があると考えられる。
[文献]
1. Fok, A. et al., (1982) J. Protozool. 29, 409-414.
2. Meier, R. and Wiessner, W. (1989) J. Cell. Sci. 93, 571579.

ミドリゾウリムシの共生藻に関する研究 I

無菌株の単離と確立

鎌戸伸一郎，保科 亮，今村信孝（立命大・理工・化生工）

Endosymbiotic algae of Paramecium bursaria I
Isolation and establishment of axenic strains
Shin-ichiro KAMAKO, Ryo HOSHINA and Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)
SUMMARY
Cells of green paramecium, Paramecium bursaria, have several hundred endosymbiotic algae. To investigate therelationship between P. bursaria and its symbiotic algae, we attempted to isolate the algae in axenic condition. Algal cells
from the paramecia were spread onto C agar medium which contained only nitrate as a nitrogen source. Colonies which
seemed microscopically free from bacteria grew poorly on the medium, and colonies growing well were contaminated withbacteria. Colonies that seemed free of bacteria were grown on C + peptone agar medium and the resulting clones wereconcluded to be axenic from the results of DAPI stain, culture tests for bacterial contamination, and denaturing gradient gelelectrophoresis (DGGE) –PCR method. Three axenic strains were established from three P. bursaria strains and all strains
were unable to grow on C agar medium. Thus, axenic symbiotic algae of P. bursaria are not able to use nitrate for growth.
[目的] ミドリゾウリムシは数百の共生藻を細胞内共胞を遠心破砕(1,270 g, 5 min)した。破砕液を遠心(560 g,

生させており，宿主と共生藻を分離できることか

5 min, 3 cycles) 洗浄して，混在しているバクテリアのら，細胞内共生関係の良い研究材料として用いられ一部を除去した後，硝酸塩を唯一の窒素源とする C 寒てきた。これまでに単離された共生藻についての形

天培地に共生藻懸濁液を塗布した。25ºC，40 µmol

態，生理などの研究が行われているが，用いた共生

photon m-2s-1，明暗 16 時間 8 時間の条件で静置培養し藻が無菌であったかは余り意に介されてこなかった。これ以降は実験進行状況によって以下の 4 つの方た。そのため無菌株と記された報告でも，単に抗生法で行った。① 1 ヶ月間培養した。② 1 週間後に顕微物質処理1もしくは，滅菌バッファー洗浄2を行ったの鏡で観察した。③顕微鏡観察時に無菌と思われたコロ

みであり無菌か否かの確認は行われていない。一ニーを C 寒天培地に画線した。④種々有機物を添加す

方，無菌化するために共生藻を宿主から分離するることによって栄養強化した C 寒天培地に画線した。

と，水中に存在する特異なクロロウィルスが感染し無菌の確認：得られた無菌株をペプトン添加 C 液体て共生藻が死滅するとの報告 3 や，これに関連して培地で培養し，培養液を種々の蛋白質や糖を添加した

クロロウィルスの感染を妨げるバクテリアが存在す

C 寒天培地に塗布して，30℃で一晩培養した。また，る時のみ，共生藻を分離できるのではないかとの考培養液を DAPI 染色して蛍光顕微鏡で観察した。さら察4もある。いずれにせよ共生藻無菌株が確立されたに，全バクテリア種を確認できるとされ環境中の微生

状況ではなく，また，宿主と共生藻の共生関係を研

物の解析に用いられている DGGE-PCR 法 5 を行った。

究していく上で共生藻無菌株が必要と考えたので，

すなわち，培養液の遠心沈殿物から全 DNA を抽出し，無菌株の作成，確立を試みた。

バクテリアの 16S rDNA に特異なプライマーを用い[方法] 無菌株の取得：ミドリゾウリムシ(株名:F36,
OK1, So13)培養液から細胞をろ紙上に濃縮し，宿主細て，16S rDNA を増幅して解析を行い，バクテリアが存在するか否かを評価した。

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原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年[結果及び考察] ミドリゾウリムシからの共生藻を C

シーケンスしたところ，Chlorella vlugaris Beijerinck の培地に塗布して，１ヶ月培養後、直径 1 mm 以上の緑

葉緑体の 16S rDNA と高い相同性(98.7 %)があり，葉緑色コロニーが生育したが，バクテリアが混在してい体の 16S rDNA 由来のものと考えられた。以上のことた。そこで，C 培地に塗布して一週間培養したプレーより，本研究で得られた共生藻は無菌株であると判断

トを顕微鏡観察した。その結果，バクテリアが混在しした。

て水に濡れているように見える緑色コロニー(wet

無菌の共生藻はペプトン添加の C 培地では生育でcolony)と乾いて見えるコロニー(dry colony)が観察さ

き，硝酸塩を唯一の窒素源とする C 培地では生育できれた。1 ヶ月培養し続けると，wet colony は直径 1 mm

ないことから，硝酸塩を生育に利用できない特異な微以上までにせいいくしたが，dry colony は 0.1 mm 以上細藻であると考えられた。

生育しなかった。この dry colony を新たな C 培地に画線しても生育できず，dry colony は C 培地で生育できないのではと考えた。そこで，種々の栄養強化培地を検討した結果，dry colony をペプトン添加の C 培地に画線することにより，無菌と考えられる共生藻を取得した。
得られた共生藻の培養液を，無菌チェック用 C 培地に塗布したが，バクテリアのコロニーは出現しなかった。また，DAPI 染色により培養液中の全細胞を染色したが，染色された細胞は全て共生藻であり，バクテリ
アは確認できなかった。DGGE-PCR 法では，無菌株培
養液の DNA 抽出物から 16S rDNA フラグメントが 1 つ[文献]
1. Van Etten J. L., Meints R. H., Kuczmarski D., Burbank D.
E., Lee K., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,
3867-3871
2. McAuley, P. J. (1986) Limnol. Oceanogr. 31, 222-224
3. Meints, R. H., Van Etten, J. L., Kuczmarski, D., Lee, K.,
and Ang, B. (1981) Virology 113, 698-703.
4. Nishihara, N., Horiike, SW., Takahashi, T., Kosaka, T.,
Shigenaka, Y. and Hosoya, H. (1998) Protoplasma 203,
91-99
5. Ishii, K., Nakagawa, T., and Fukui, M., (2000) Microbes
and Enbironments 15, 59-73

検出された。しかし，現れたフラグメントを抽出してミドリゾウリムシの共生藻に関する研究 II
18S rDNAにもとづく共生藻の系統的位置
保科 亮, 鎌戸伸一郎, 今村信孝 (立命大・理工・化生工)

Endosymbiotic algae of Paramecium bursaria II
Phylogenetic position inferred from 18S rDNA
Ryo HOSHINA, Shin-ichiro KAMAKO and Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)
SUMMARY
Small subunit ribosomal RNA gene sequences of endosymbiotic green algae originating from three Japanese Paramecium bursaria were analyzed. The DNA contains three group I introns (one IE and two IC1), which results in an unexpected length of 3271bp. There was no substitution in the DNA among the symbionts analyzed here. The phylogenetic
tree (exon only) indicates that the symbionts belong to Chlorella sensu stricto (Huss, V. A. R., Frank, C., Hartmann, E. C.,
Hirmer, M., Kloboucek, A., Seidel, B. M., Wenzeler, P., and Kessler, E. (1999) J. Phycol. 35, 587-598), and are geneticallycloser to the C. vulgaris group (including C. vulgaris, C. lobophora and C. sorokiniana) than to C. kessleri as previously
proposed (Takeda, H. (1995) Phytochemistry 40, 457-459).

Jpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)

41[目的] ミドリゾウリムシは500-600の球状で緑色をより) IE, IC1, IC1に所属するグループ1イントロンで呈す藻類を細胞内共生させている。この共生藻に関あること判明した。これらと相同性を持つ配列をしてはこれまで形態, 生理, 化学組成など様々な視点

GenBankで検索したが, 相同性の高いものは得られてから研究が行われ, それらは既存の(フリーリビング

いない。

の)種に当てはめることが可能であり, とくにクロレ

18S rDNA (エクソン)にもとづく系統樹を構築した結ラ属(トレボウクシア藻綱)との近縁性が指摘されてき果, 共生藻は系統的に真のChlorella1クレードに含まれた (3, 4)。しかし形態によるクロレラの分類は困難でた。この中で共生藻はC. vulgarisグループ(C. vulgaris,

あり, DNAシークエンスにもとづいた共生藻の分類学

C. lobophora およびC. sorokiniana)とともにクラス的検討が待たれていた。

ターを形成し, C. kessleriがそれら全体の姉妹群をな

共生藻が所属すると考えられうるトレボウクシア藻した。すなわち共生藻とChlorella属藻類との近縁性

綱や緑藻綱における系統解析では伝統的に核のスを指摘するこれまでの多くの研究3, 4を支持する一方,

モールサブユニットリボゾーマルDNA (18S rDNA)が日本産および中国産のミドリゾウリムシの共生藻が用いられてきており, 現在それらの豊富なデータは近アメリカやヨーロッパ産のものとは異なりC. kessleri

縁種の同定や系統的位置の特定に用いられている。

に最も近縁であるとするTakeda2の見解とは異なる結

したがって本研究では共生藻の18S rDNAシークエン

果となった。

スを決定し, 緑色藻類における共生藻の系統的位置,

共生藻を含むC. vulgarisグループ内の遺伝的距離は小既存種との関係, 共生藻株間の関係を解析することをさく, 保存性の高い18S rDNAではこれらの進化的分目的とした。

岐順を類推することが不可能であると考えられ, これ[方法] 物理的に破砕したミドリゾウリムシ(株名:So13, OK1, F36)懸濁液を寒天培地に塗布し, 緑色のコ
ロニーを採取, 液体培地に移して単藻培養を確立した。
CTAB 法を用いて 共生藻の トー タルDNA を抽 出した。PCRはユニバーサルプライマーを用いて増幅したあと, 同様もしくは新たにデザインしたプライマーを用いてシークエンスを行った。イントロンらしきらの解決にはより進化速度の速い分子種が必要である。
本研究で用いたミドリゾウリムシ株はほんの3株であり, これら共生藻の系統が日本全域で同一のものなのかはわからない。また特徴が異なるとされるアメリ
カやヨーロッパのものとも比較することにより, 今後
ミドリゾウリムシとの共生関係, またミドリゾウリム
シ自体の進化の道筋が明らかになると考えられる。

配列が見つかったため, RT-PCRにより, 正確なコード[文献]

領域の特定を行った。

1. Huss, V. A. R., Frank, C., Hartmann, E. C., Hirmer, M.,

系統樹の構築には最尤法(ML), 最節約法(MP), 近隣結合法(NJ)を用いた。
[結果および考察] 決定した18S rDNAは用いた共生藻
株間で完全に同一であったため, 以降の解析には1
OTU (operational taxonomic unit)として扱った。
共生藻の18S rDNA中には3つのイントロンが介在しており, それらの二次構造を構築した結果それぞれ(5’Kloboucek, A., Seidel, B. M., Wenzeler, P., andKessler, E. (1999) J. Phycol. 35, 587-598.
2. Takeda, H. (1995) Phytochemistry 40, 457-459.
3. Douglas, A. E. and Huss, V. A. R. (1986) Arch. Microbiol. 145, 80-84.
4. Reisser, W. Vietze, S., and Widowski, M. (1988) Symbiosis 6, 253-270.

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

42

ミドリゾウリムシの共生藻に関する研究 III
窒素化合物の利用について
上野聖子, 鎌戸伸一郎, 加藤 豊, 今村信孝（立命大・理工・化生工）

Endosymbiotic algae of Paramecium bursaria III
Utilization of nitrogen compounds
Seiko UENO, Shin-ichiro KAMAKO, Yutaka KATO and Nobutaka IMAMURA(Sci. and Eng., Dept. Biosci. and Bioeng., Ritsumeikan Univ.)
SUMMARY
Utilization of nitrogen compounds by an axenic endosymbiotic alga isolated from Paramecium bursaria was investigated. Since higher plants and algae generally have enzymes for nitrate metabolism, they can use nitrate for their growth.
However, the axenic symbiont required peptone and was not able to grow in C medium in which nitrate was the only
nitrogen source. Therefore, the symbiont seemed to differ from other plants and Chlorella spp. in nitrogen requirement,
and utilization of amino acids and ammonium ions was therefore examined. We found that amino acids such as L-Ser, LArg and L-Glu, as well as ammonium ions could be used by the symbiont for its growth. Free-living Chlorella kessleri
does not use such organic nitrogen sources. These results suggest that the symbiont might lack a part of the metabolic
pathway from nitrate to ammonium ion. We therefore measured its nitrate reductase activity and no activity was detected.
[目的]淡水原生動物ミドリゾウリムシは、その体内生藻をそれぞれ接種後、その細胞数を約１週間測定にクロレラ様の藻類が細胞内共生している。これました。その結果、共生藻はL-Ser, L-ArgやL-Gluなどでの研究では、宿主ミドリゾウリムシの排泄物であの特定のアミノ酸を生育に利用すること、また株にるアンモニアを、共生藻が受け取って窒素源としてよって増殖に影響のあるアミノ酸が多少異なることいると考えられてきた。また、共生中には硝酸還元がわかった。一方、同様の実験を共生していない

酵素を持たず、一方、宿主から単離された共生藻はChlorella kessleri C-143株を用いて行ったところ、C.

硝酸還元酵素が無機塩培地では誘導されて、硝酸塩

kessleri ではどのアミノ酸を添加しても増殖に影響はを利用して生育できるようになるとされてきたなかった。このことから、C. kessleri は培地中の硝酸（Albers and Wiessner）。今回、共生藻の無菌株を確

塩を窒素源として利用し、硝酸塩存在下ではアミノ立したところ、硝酸塩のみを窒素源とした培地では酸を利用しないと考えられた。一般に植物や藻類

生育できず、ペプトンの添加が必要なことが示されは、硝酸を硝酸還元酵素で亜硝酸にし、次に亜硝酸た（鎌戸ら, 2003）。そこで、本研究では共生藻無菌

還元酵素を用いてアンモニアへまで還元して、これ株の窒素源と、窒素代謝関連酵素について知見を得からアミノ酸を生合成する。共生藻が硝酸塩は利用ることを目的とした。

できないがアミノ酸を利用できるがことから、アン[方法・結果] 硝酸塩を唯一の窒素源とするＣ培地と、Ｃ培地にペプトン1 g/Lを添加した培地に３株の共生藻（F36-ZK、So13-ZK、OK1-ZK株）をそれぞれ接種し、7日間細胞数を測定した（培養条件：25℃,
L:D=16:8, 120µmol photon/m2･s 以後同条件で培養を行った）。硝酸塩のみのC培地ではいずれの株でも7日後に細胞数の減少が認められたが、ペプトンを加えた培地では顕著な増殖が確認された。ペプトンがタンパク質の加水分解物であることから、次に共生藻３株の増殖へのアミノ酸の影響を検討した。Ｃ培地に各種アミノ酸を200 µg/mlになるよう添加し、共モニアの利用についてもF36-ZK株を用いて検討を行った。C培地にアンモニアや尿素などの関連化合物
を200 µg/mlになるよう添加し、共生藻を接種後、細胞数を約１週間測定した所、共生藻はアンモニアや関連化合物を増殖に利用できた。これら結果から、共生藻では硝酸塩からアンモニアへ還元する経路の酵素の一部、あるいは全てが欠損していると考えた。これを確認するためにまず硝酸還元酵素活性について、F36-ZK株と対照にC. kessreliを用いて検討を行った。藻体を破砕し、粗酵素を抽出後、基質の硝酸とＮＡＤＨを加えて酵素反応を行い、生成した亜硝酸を発色試薬を用いて比色定量して硝酸還元酵素

Jpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)

43の活性を測定した。その結果、フリーリビングのC.

を示すものとも考えられる。ミドリゾウリムシの細kessleri とは異なり、共生藻藻体には硝酸還元酵素の胞内で共生しているうちに、共生藻が藻類の機能の活性が認められなかった。

一部を失って、オルガネラ化が始まっているのでは[考察] 今回の結果から、無菌の共生藻は硝酸還元酵
素を持たないため硝酸塩を利用できなかった。これは、共生藻がミドリゾウリムシ体内で長い間硝酸塩を用いる機会が無く、その環境に適応してきたためと思われる。共生説によれば、葉緑体の起源はラン藻と考えられている。ラン藻が持っていた硝酸還元
酵素は葉緑体へのオルガネラ化の過程で失われ、真核藻類では細胞質が硝酸還元を担っている。今回の結果は、同様な過程が共生藻で起こっている可能性ないだろうか。
[文献]
Dierk Albers and Wolfgang Wiessner (1982), Nitrogen
nutrition of endosymbiotic Chlorella spec., Endocyt.C.Res., 2, 55-64
Timothy D. Sherman and Edward A. Funkhouser (1989),
Induction and Synthesis of Nitrate Reductase in
Chlorella Vulgaris, Archives of Biochemistry andBiophysics, 274, 525-531
鎌戸伸一郎，保科 亮（2003），原生動物学会

ゾウリムシの大核内共生細菌Holospora obtusaの増殖型への分化過程における核様体および細胞壁抗原の変化
道羅英夫１, 野村 亘２（１静岡大・遺伝子実験施設, ２静岡大・理工・生物地球環境科学）

Changes in nucleoid and cell wall antigen during differentiation to the reproductive
form of Holospora obtusa of the ciliate Paramecium caudatum
Hideo DOHRA1 and Wataru NOMURA2( Inst. Genet. Res. & Biotech., Shizuoka Univ. and 2Grad. School of Sci. & Engin., Shizuoka Univ.)
1

SUMMARY
The macronuclear endosymbiotic bacterium Holospora obtusa differentiates from the infectious form to the reproductive form after re-infection to the macronucleus of the host Paramecium caudatum. We examind changes in the nucleoid structure and DNA content in the differentiation process to the reproductive form. As a result, it was suggested
that the bacterium started DNA synthesis at 12-24 hr after re-infection and that the fluorescence intensity of bacterial
DNA increased twice and four times as much as that of the infectious form and the reproductive form, at 30 hr after reinfection, respectively. We also examined changes in localization and amount of the cell wall antigen by immunofluorescence microscopy and immunoblotting with a monoclonal antibody against cell wall antigen. The antigen localized
uniformly at the cell wall of the infectious form, but its localization changed in patches at 24 hr after re-infection. Immunoblotting showed that the antigen was not detected in the bacterium at 30-36 hr after re-infection, but it was unclear
whether the antigen temporarily disappeared or an epitope of the antigen was not recognized by the antibody.
[目的] ゾウリムシParamecium caudatumの大核内共ついて調べた。また、細胞分裂をはっきりと目視す

生細菌Holospora obtusaは宿主が増殖している間は宿るために細胞壁抗原に対する抗体を用いた間接蛍光

主大核内で２分裂によって増殖するが、宿主が飢餓抗体法を行ったところ、抗原の局在の変化が見られ状態になると感染型へと分化する。感染型は宿主大たので、感染後の時間経過に伴う細胞壁抗原の量的

核内に再感染した後、しばらくするといくつかのく

変化についても検討した。

びれを生じて多分裂を行い、増殖型へと分化する。
そこで本研究では、この感染型から増殖型への分化機構を明らかにすることを目的として、まず分化過程における核様体の構造変化およびDNA量の変化に[方法] ゾウリムシP. caudatumの培養液にH. obtusaを加えて再感染させ、１時間後に宿主細胞に取り込まれなかった余分なH. obtusaを洗浄によって除去した。その後、3、6、12、24、36、48時間後に宿主細44

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

胞を33％メタノールで固定し、ホモジナイズした個の核様体を持っていると考えられる。再感染後30後、パーコール不連続密度勾配遠心によってH. ob-

時間後のH. obtusaは感染型よりもさらにDNAの蛍光tusaを単離した。これをDAPI (1 mg/ml)で染色し、核強度が約２倍に増加しており、増殖型への分化のた様体の構造を観察した。また、DAPIで染色した増殖

めにさらにDNA合成が起こっていると考えられる。

型、感染型、再感染後30時間後のH. obtusaを蛍光顕

また、細胞分裂をはっきりと目視するために増殖型微鏡で観察するとともに冷却CCDデジタルカメラでと感染型では細胞壁に均一に存在する細胞壁抗原に撮影し、NIH Imageを用いてそれぞれの核様体の蛍光対するモノクローナル抗体で間接蛍光抗体法を行っ強度を測定した。さらに、再感染後6、12、18、24、

たところ、細胞壁抗原は再感染後12時間後には細胞30、36時間後のH. obtusaを単離し、SDS-PAGEにかけの中央部分で減少し、24時間後には細胞壁にパッチて細胞壁抗原に対するモノクローナル抗体を用い状の局所的な局在を示しているように見えるようにて、再感染過程における細胞壁抗原の量的変化を調なった。そこで、イムノブロットにより再感染後のべた。

時間経過に伴う細胞壁抗原の量的変化を調べた結[結果と考察] 再感染後の時間経過に伴うH. obtusaの核様体の構造の変化を調べた結果、３〜12時間後にはDNAはまず２つに分かれて分散し、それが次第に拡がっていくことが明らかになった。そのときの蛍
光強度は感染型の核様体（DAPIで光る２つの点）に比べてかなり弱くなっていた。これは感染型の２個の核様体がDNA合成を伴わずにそれぞれ分散したためであると考えられる。24時間後になると蛍光は強くなり、核様体が分離し始めることから、再感染後12〜24時間後の間にDNA合成が起こると考えられる。36〜48時間後にははっきりした核様体の構造をとるようになり、くびれの形成も起こった。これらの結果から、再感染したH. obtusaの核様体の変化は
1. 核様体の分散、2. DNA合成、3. 核様体の分離 の３

果、局在が変化している12〜24時間後にはバンドの変化は見られなかったが、再感染後30〜36時間後には細胞壁抗原は一時的に検出できなくなり、増殖型で再び現れることが明らかになった。ただし、これは抗原が消失しているためなのか、抗原決定基を認識できなくなっているためなのかは明らかではない。今後、別の抗原決定基を認識するモノクローナ
ル抗体を用いて抗原が本当に消失しているのか検証する必要がある。また、この細胞壁抗原はその分子量から以前に報告されている多機能性細胞壁物質と同一物質である可能性がある 1, 2 。細胞壁抗原の同定、構造解析および機能解析を行うことによって、感染過程や増殖型への分化過程における細胞壁抗原の機能についても明らかにしていく予定である。

段階からなることが示唆された。また、増殖型、感[文献]

染型、再感染後30時間後のH. obtusaの核様体の蛍光1. 河合美紀・藤島政博（1997）核内共生細菌ホロス

強度を比較したところ、感染型のDNAの蛍光強度は

ポラ・オブツサの多機能性細胞壁物質.

増殖型の約２倍に増加していた。DAPI 染色したH.

動物学会第68回大会予稿集 p. 52

日本

obtusaの蛍光像と併せて考えると、増殖型は１個、感2. 河合美紀・道羅英夫・藤島政博（1998）ゾウリム

染型は２個の核様体を持ち、感染型は再感染後の増シの核内共生細菌ホロスポラの細胞壁抗原の性殖型への分化の準備としてすでにDNAを複製して２質. 原生動物学雑誌第31巻第1号 p. 22

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36, No. 1. (2004)(2003)

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核内共生細菌Holospora obtusaは宿主Paramecium caudatumの
dad-1遺伝子発現を増加させる
相川 知徳, 中村 欽光, 安岐 昌子, 堀 学, 藤島 政博（山口大・理・生物）

Infection of endonuclear symbiotic bacterium Holospora obtusa enhances
dad1 gene expression of the host Paramecium caudatum
Tomonori AIKAWA, Yoshimitsu NAKAMURA, Masako AKI, Manabu HORI and Masahiro FUJISHIMA (Biol. Inst., Fac. of Sci., Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
The Gram-negative bacterium Holospora obtusa is a macronucleus-specific symbiont of the ciliate Paramecium
caudatum. Differential cDNA display analyses showed that P. caudatum changes the gene expressions after infection of
H. obtusa. One of the cDNA clones showed 41% identical (63% similar) with DAD-1 (defender against apoptotic cell
death-1). DAD-1 is one of programmed cell death suppressor gene product (Sugimoto, A., et al., 1995, EMBO J., 14,4434-4441) and is a subunit of mammalian oligosaccharyltransferase (Kelleher, D. J., et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 94, 4994-4999, Sanjay, A., et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, 26094-26099). Northern blot analyses showed thatthe expression level of the dad1 gene of the H. obtusa-bearing cell was the double of that of H. obtusa- nonbearing cell.
When the infected H. obtusa was removed from the H. obtusa-bearing cell by treatment with penicillin, resulting cellrecovered the expression level of the dad1 gene in the H. obtusa-nonbearing cell. We show here that H. obtusa selectively enhances the dad-1 gene expression of the host P. caudatum.
[目的]グラム陰性細菌H. obtusaは，繊毛虫P. cauda-

COR dNA sequencerで解析を行った。解析後の配列はtumの大核に感染して大核内で増殖する核内共生細菌

DNASISプログラムを用いてアミノ酸配列を推定し，で，宿主外では増殖できない。この細菌が宿主に感BLAST検索を行った。

染すると，宿主の特定の遺伝子発現の変化が起こる

Northern blot

ことがDifferential cDNA display法を用いた実験で明ら性アガロースゲルで分離し，ナイロンメンブレンにか に さ れ て い る（安 岐 昌 子，中 村 欽 光，未 発 表）

転 写 し た。転 写 後，DIG を 用 い て PCR ラ ベ ル し た(4)

精製したpoly(A)+RNAをホルマリン変。この研究では，Differential cDNA display法で再現

probeを使いhybridizationを行った。Hybridization後，性のある発現変化が確認された20種のcDNAの機能を洗浄してから抗DIG抗体−AP処理し，さらに洗浄して明らかにする目的で行われた。

からCDP-starを用いて発光検出を行った。検出には[方法]RNA purification Symbiotic cellとaposym-biotic
cellの両方からISOGENを用いてtotal RNAを抽出した。さらにoligotex dT 30を用いてpoly(A)+RNAを精製した。

hyper filmを使用し，さらに画像解析にはimage analyzerを使用した。
5’-RACE Total RNA を template と し て gene racer kit(invitrogen)を用いて1st strand cDNA合成を行った。1st
strand cDNA 合 成 後，Taq polymerase を 用 い て 2nd

Differential cDNA display (DD) Poly(A)+RNAから4種

strand cDNAを合成しPCRを行った。得られたcDNAのOligo dT primer をもとに1 st strand cDNA合成後，20をpGEM T easy vectorにクローニングした。クローニ

種のarbitrary primerを用いて2nd cDNA合成しPCRを用

ング後，sequencingを行った。

いて増幅を行った。増幅後のcDNAをシークエンスゲ
ルで分離し，銀染色で検出を行った。
Sub-cloning and sequencing DDより得られた断片を
templateとしてPCRで再増幅を行いpGEM T easy vectorにクローニングした。クローニング後，M13 sequencing primerを用いてsequencing反応を行い，LI-[ 結 果 ]20 種 の 遺 伝 子 発 現 変 化 を 確 認 し た。
Aposymbiotic cell で 多 量 に発現 す る遺 伝子は 6 種，
symbiotic cellで多量に発現する遺伝子は14種であった。20種の遺伝子の内，10種の遺伝子のサブクロー
ニングに成功した。サブクローニング後，sequencing
を行い，配列を決定した。決定した配列からDNASIS

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

46

を用い解析を行い，さらにアミノ酸配列を決定し

主P. caudatumの２０種の遺伝子発現を確認した。そた。決定したアミノ酸配列を基にBLASTを用いた相の１種のdad-1と考えられる遺伝子はH. obtusaの感染

同性検索を行い，symbiotic cellで多量に発現しているにより発現が増加した。バクテリアや病原体の感染

１種の遺伝子がXenopus laevisのdad-1 (defender against

は細胞死を誘導する遺伝子の発現を促進するという

apoptotic cell death-1) に41% (positive 63%) の相同性を報告が多数ある。H. obtusaの感染によってP. cauda-示した。多種生物でも約40%の相同性の結果が得ら

tumでも細胞死を誘導する遺伝子の発現が促進されるれ た。こ の cDNA ク ロ ー ン を CS29 と す る。さ ら にとすれば，dad-1の高発現は細胞死を抑制する機能をNorthern blotを行い，CS29の発現変化を確認した。そ果している可能性が考えられる。

の結果，CS29の発現がsymbiotic cellではaposymbiotic
cellの２倍の発現量であることが明らかになった。さらにsymbiotic cellをpenicillinで処理してH. obtusaを除去し，CS29の発現を確認した。その結果，CS29の発
現はaposymbiotic cellと同程度まで回復した。さらに
5’-RACEを行い，dad-1のクローニングを試みた。その結果，dad-1のORFをクローニングすることに成功
した。

[文献]
Sugimoto, A., et al., (1995) EMBO J., 14, 4434-4441.
Kelleher, D. J., et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA,94, 4994-4999.
Sanjay, A., et al., (1998) J. Biol. Chem., 273, 2609426099.
Hori, M. and Fujishima, M., (2003) J. Euk. Microbiol., 50,
293-298.

[考察]DDによりH. obtusaの感染によって変化する宿核内共生細菌 Holospora obtuse は宿主 Paramecium caudatum で発現している
surface antigen の型を可逆的に変化させる
中村 欽光， 堀 学， 藤島

政博 （山口大・理・生物）

Endonuclear symbiotic bacterium Holospora obtusa reversibly changes types of
surface antigens expressed in the host Paramecium caudatum
Yoshimitsu NAKAMURA, Manabu HORI and Masahiro FUJISHIMA(Biol. Inst., Fac. Sci., Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
Holospora obtusa is an endonuclear symbiotic bacterium of the ciliate Paramecium caudatum. Infection of
Holospora obtusa to the host endonucleus alteres gene expression to another serotype of the surface antigen (SAg) Ghomolog in the host cell, or no SAgs are expressed after infection of H. obtusa. So we attempted to survey expression of
SAg in the host cells both aposymbiotic cell (A-cell) and symbiotic cell (S-cell). The problem is whether the SAgGhomolog transforms in A-cell and S-cell using salt/alcohol extraction method. As a result, the SAg-like protein over 250
kDa in molecular mass was extracted from the A-cell. However, expression of SAgG-like protein could not be detectedfrom the S-cell. Instead, S-cell specific SAg was expressed. Indirect immunofluorescence microscopy with a monoclonal
antibody specific for the SAgG-like protein showed that the antigen appeared only on the cell surface membranes of the
A-cell. Furthermore, S-cell specific SAg reversibly changed to that of A-cell specific SAg after eliminating H.obtusa
from the host macronucleus.
[目的]繊毛虫のパラメシウム属の核内に共生する、依存に関与する遺伝子の同定を目的として、DD法(4)グラム陰性のホロスポラ属細菌はその宿主との相互を行った結果、ホロスポラが感染することで発現の関係や、感染機構に関する細胞生物学的研究(1,2,3)に変化する宿主遺伝子を35種発見した。それらの内、より、これらの関係が現在でも進行中の寄生から共Aposymbiotic cellに特異的な発現を示すCA10-1断片が生への移行期であると考えられる。そこで我々はパ

P. primaurelia stock 168G surface antigen (5)（Accession

ラメシウムとホロスポラの共生関係において、相互

No. X52133）と64.9%の相同性を示した。よって実際

Jpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)

47にP. caudatumのsurface antigenが、ホロスポラの感染

ローナル抗体を用いたA-cell、S-cellの間接蛍光抗体

によりどのように変化するのかをタンパク質レベル法においても、この抗原がA-cell特異的であることがで調べ、パラメシウムとホロスポラの共生関係にお示 さ れ た。A-cell、S-ell そ れ ぞ れ を 用 い た

いて、どのような役割を果たしうるのか、その可能

Immobilization testの結果、A-cellでは抗体により細胞性を検討した。

はImmobilizeされ遊泳行動を停止したが、S-cellに変[材料と方法] 細胞はP. caudatum Rb-1株 (syngen 4, E型) を用いた。Aposymbiotic cell (A-cell)、Symbiotic
cell (S-cell) そ れ ぞ れ か ら salt/alcohol 抽 出 法 (6) で P.
caudatum の surface antigen (SAg) を 抽 出 し、SDSPAGE、CBB染色で検出した。さらにその局在性を確認するため、モノクローナル抗体の作製を行った。
抗原はWhole cellを用い、繊毛を含む細胞表面全体を認識する抗体を得た。A-cell、S-cellそれぞれを抗体に晒し (Immobilization test) 細胞の遊泳行動を観察した。この抗体を用いてウエスタンブロット解析、間化はなかった。ホロスポラの感染により宿主のSAg発現が変化したことを確認するため、S-cellをペニシリン処理しホロスポラを除去した (PS-cell) 。その結
果PS-cellにおいて、SAgの発現は回復することが明かとなった。以上の結果から、ホロスポラの感染がこのタンパク質発現の変化を誘導することを強く示唆する。S-cellの温度耐性の獲得(3)と、温度変化による
A-cell SAgの発現変化の関連性を調べた結果、S-cellで見られるのと同様の抗原型の変化は見られなかった。

接蛍光抗体法を行った。ペニシリン処理による、ホ[文献]

ロスポラ除去後の宿主を用いて、SAgの発現が可逆(1) Fujishima, M., Nagahara, K. & Kojima, Y. (1990).

的であることを確認した。A-cellを温度条件（10℃,
15℃, 25℃, 35℃）を変えて培養し、P. caudatum Rb-1
株のSAgが温度に対してどのような特徴を持つのかを調べた。

Zool. Sci., 7: 849-860.
(2) Fujishima, M. & Fujita, M. (1985). J. Cell. Sci., 76:
179-187.
(3) Kawai, M., Yamamoto, R. & Fujishima, M. (2003). Jpn.

[結果と考察]P. caudatumのSAg発現量を比較した結果、A-cellでのみ検出され、その分子量は約300KDa
であることが確認された。 P. primaureliaにおけるSAgは、分子量約300KDaのファミリータンパクである(5)。繊毛を含む細胞表面タンパクに対するモノク

J. Protozool., 36, No 1.: 77-78.
(4) Liang, P. & Pardee, A. B. (1992). Science ., 257: 967971.
(5) Prat, A. (1990). J. Mol. Biol., 211: 521-535.
(6) Preer, J. R., Jr., Preer, L. B. & Rudman, B. M. (1981).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 11: 6776-6778.

Paramecium tetraurelia における形態異常変異体の遺伝解析
菅野 恵, 三輪五十二（茨城大・理・自然機能）

Genetic analysis of morphological mutant in Paramecium tetraurelia
Megumi KANNO and Isoji MIWA (Dept. Biol., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARY
We isolated four trichocyst-nondischarge mutants of Paramecium tetraurelia by treatment with N-methyl-Nnitorosoguanidine. One clone of them was slow-growing mutant named Bf-4. The cells of Bf-4 showed a normal shape
like wild-type cells in mass culture, but they became bigger and more spherical when they were cultured in isolated conditions. In isolation culture, the fission rate of Bf-4 was very low and some cells died. To analyze its genetic characteristic,
F1 progeny cells were obtained after cross with the wild type. If conjugation process progressed normally, all F1 progeny
ought to express the same phenotypes as wild-type cells. In this case, however, many progeny showed different phenotypes
in each ex-conjugant. And most of them showed the parental phenotype. Some progeny showed the medium rate of cell
division after conjugation. To analyze the cause of unexpected results of F1 progeny from crossing of Bf-4 and wild type,

48

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

we induced autogamy in F1 progeny that showed the same phenotype in both ex-conjugants and a different phenotype.
Autogamy progeny from F1 of the same phenotype segregated wild type and mutant characters. These characters containa trichocyst-nondischarge, a cell division rate and an abnormal shape. On the other hand, autogamy progeny from parental
F1 showed the same characters of each F1 progeny. Now we are analyzing the rate of segregated phenotype in autogamyprogeny of F1 that showed the medium rate of cell division.
[目的]Paramecium tetraurelia細胞をニトロソグアニジ

離し、F1 の示す表現型について調べた。突然変異のンで処理することにより、トリコシストを放出せ形質が、単一の劣性遺伝子に支配され、メンデル遺ず、細胞分裂速度の遅い形態異常変異体Bf-4を分離

伝を示すなら、F1 の遺伝子型はヘテロとなる。よっした。この変異体は試験管での集団培養中では野生てF1 は野生株と同じ表現型を示すはずである。しか株とほぼ同じ形態を示すが、デプレッションスライ

し、交雑の結果では、予想される表現型を示さない

ドを用いた単離培養に移すと、形態が異常に大型でF1 が多かった。F1 の表現型についてはいくつかパ球形になり、分裂速度が著しく低下する。この変異

ターンがあり、ほとんどがex-conjugantごとに異なる体の形質について遺伝様式を解析し、分裂速度異常

表現型を示した。また、分裂速度に関しては野生株と形態異常に関する遺伝子について調べる。

でも変異体でもなく、その中間の速度を示すクロー[材料と方法]突然変異を誘導するために処理した株はP. tetraurelia hrd(Ⅶ)である。オートガミー成熟期の細胞を最終濃度80 µg/mlのN-メチル-N’-ニトロ-N-ニ
トロソグアニジンで1時間処理し、その後細胞を10数回分裂させた後飢餓状態に入れ、オートガミーを誘導する。60穴マルチプレートに細胞を1個体ずつ960
個体単離し、3回分裂した後試験管に入れクローンにして増やす。トリコシストを放出できない変異体を分離するため、これらのクローンにピクリン酸を滴下し調べたところ、4クローンのトリコシストを放出できない変異体を分離した。この4クローンの培養を継続するうち1クローンに形態異常変異体を見出した。この変異体Bf-4を遺伝解析するため、野生株とかけあわせてF1 を単離し、その表現型について、ト
リコシストの放出、分裂速度、形態異常の観点から調べた。さらにF1 にオートガミーを誘導し、その子孫の示す表現型の分離比を調べた。

ンが出現した。これらの原因としては、変異体の細胞質に、次世代の表現型に影響を及ぼす要因がある
可能性や、突然変異を示す形質が複数の遺伝に支配されているなどの可能性が考えられる。これらのF1の遺伝子型がどのようになっているのか調べるた
め、それぞれにオートガミーを誘導し、その子孫の示 す 表 現 型 の 分 離 比 に つ い て 調 べ た。結 果、exconjugant間で同じ表現型を示したF1 から得られた子
孫では、トリコシストの放出、分裂速度、形態異常のすべての表現型において、野生株の形質を示すク
ローンも突然変異の形質を示すクローンも確認された。よって、これらのF1 の遺伝子型はヘテロであると考えられる。一方、ex-conjugant間で異なる表現型を示したF1 から得られた子孫では、例外を除き、親であるF1 と同じ表現型を示した。ただし、中間の分裂速度を示したF1 にオートガミーを誘導したところ、分裂速度は極端に低下し、変異体と同じ程度の分裂速度を示すようになった。

[結果と考察]Bf-4は、トリコシストを放出できない

Bf-4 が示 すこれ らの特 殊な遺 伝様式 の要因 とし突然変異体であり、野生株に比べると分裂速度が遅て、接合過程が正常に行われなかった事が考えられい。また、試験管での集団培養の場合、細胞の形態

る。Bf-4 は野 生株 に 比べ Cell cycle の 進 行が遅 い たは野生株とほとんど変わらないが、デプレッション

め、stationary phaseに入るのも遅く、接合活性も低スライドを用いた単離培養に移すと、細胞の体積がい。野生株と異なるこれらの点、あるいは異常な形

増加し形態が異常に大型で球形になり、さらに分裂態が正常な接合を阻害する要因となっているのかも速度が著しく低下する。集団培養では1日あたり平均しれない。これらの要因により、核交換や核融合、

1.25回という分裂速度を示すが、単離培養に移すと1

大核形成時に異常が発生し、このような遺伝を示し

日あたり平均0.68回という分裂速度を示す。その他ているのではないかと考えられる。今後は、Bf-4のにも単離培養では、遊泳速度の低下や分裂を停止し接合過程を、時間を追って詳しく調べ、どのようなて死んでしまう細胞がよく見られる。

条件だと接合異常が起こるのかを解明する必要があ

Bf-4のこれらの特徴についての遺伝様式を調べる
ため、Bf-4と野生株を掛け合わせて得た子世代F1を単る。

Jpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)[文献]

492) Matsuda, A., and Mihoko, T. (2001) Genet. Res. Camb.,

1) Takagi, Y., Izumi, K., Kinoshita, H., Yamada, T., Kaji,

78:1-12.

K. and Tanabe, H. (1989) Genetics. 123:749-759.

ゾウリムシの行動突然変異株cnrC の原因遺伝子の正体
権田幸祐, 吉田亜紀子, 大網一則, 高橋三保子 （筑波大学、生物科学系）

The cloning and molecular analysis of cnrC+ controlling behavior of
Paramecium caudatum
Kohsuke GONDA, Akiko YOSHIDA, Kazunori OAMI and Mihoko TAKAHASHI(Inst. Biol. Sci., Univ. Tsukuba)
SUMMARY
Internal Ca2+ concentration regulates the waveform and beat direction of flagella and cilia of various eukaryotes. In
Paramecium, Ca2+-dependent ciliary reversal depends on the Ca2+ influx through the voltage-gated Ca2+ channels on theciliary membrane. However, little is known about the molecular mechanisms of the Ca2+ channels that control ciliary
reversal. The cnrC mutant, which is one of P. caudatum mutants with a defect in the voltage-gated Ca2+ channel activity,neither produces Ca2+ action potentials nor responds to any depolarizing stimuli. Applying complementation method, thetotal genomic DNA of the wild type was individually digested with the restriction enzymes and then microinjected into amacronucleus of cnrC cells. Of five restriction enzymes, BamHI and BglII did not cut the cnrC+. Since the transformation ability was observed in the 2 to 4-kb size fraction, we made a genomic DNA library using 2 to 4-kb genomic DNA
fraction, screened the library for clones which restored Ca2+ channel function of cnrC, and finally isolated a single clone.
The plasmid contained the insert sequence consisting of 2025-bp. Among the 2025-bp DNA, the 1213-bp fragment fromwild type possesses an activity to restore Ca2+ channel function of cnrC. This result suggests the wild type 1213-bp contain cnrC+ gene.
[目的] 繊毛は波打ち運動を行う細胞小器官であBglIIとBamHIで分解した断片を用いてgenomic DNA

り、ヒトを含む様々な生物に広く存在している。繊libraryを調製した。そして、このlibraryに含まれてい毛虫ゾウリムシは細胞表層に約１万本の繊毛を持るゲノムDNA 断片をcnrC株の大核に顕微注入し、ち、この繊毛打の方向と頻度を変えることで、遊泳

cnrC株の電位依存性Ca2+ チャンネルの活性化を指標

方向を巧みに変化させている。繊毛運動の調節にはと し てス クリー ニ ング を行っ た。電 位依存 性Ca2+

2+

Ca が重要な役割を果たしており、ゾウリムシではチャンネルの活性化を調べる方法として、以下の２繊毛膜に存在する電位依存性Ca2+ チャンネルが繊毛つの方法を行った。

内 Ca2+ 濃 度 の調 節 を 行 っ てい る (1)。し かし、こ の①定電流刺激に対する膜電位反応：野生型のゾウリ

2+Ca チャンネルの実体や制御機構はよく分かってい2+

ムシに外向き電流刺激を与えると、電位依存性Ca2+ない。ゾウリムシでは、Ca チャンネルの制御機構

チャンネルが活性化して、スパイク状のCa2+ 活動電に欠陥のある突然変異株cnrCが単離されている(2,位が見られる。一方、cnrC株ではこのようなCa2+ 活3)。我々はcnrC 遺伝子をクローニングし、その遺伝

動電位は全く見られない+

2+

子 産 物の 実体や 機 能を 明らか に する ことで、Ca②高K+刺激溶液への反応性：ゾウリムシの電位依存チャンネルの制御機構の解明に迫りたいと考えてい性 Ca2+ チ ャ ンネ ル は 高 K+ 刺激 溶 液 (20 mM KCl inる。

Dryl’s solution)中でも活性化されることが知られている。この活性化により、野生型のゾウリムシは繊毛[方法] 野生型ゾウリムシの全ゲノムDNAを制限酵素

打の方向が逆転(繊毛逆転)し、約50秒の後退遊泳を行

50

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

う。一方、cnrC株ではこのような後退遊泳は全く行

cnrC+ 遺伝子内に存在していると考えられるDraI、わない。

EcoRI、HindIIIの認識部位が含まれていた。そこで、[結果と考察] genomic DNA libraryの調製に適した制DraI、EcoRI、HindIII認識部位を指標に2025bpの断片

限酵素を探索することを目的として、野生型ゾウリ
ムシの全ゲノムDNAをBamHI、BglII、DraI、EcoRI、
HindIIIで分解し、cnrC株の大核に顕微注入した。これらの細胞の高K+刺激溶液への反応性を調べたとこ
ろ、BamHIとBglIIで分解したゲノムDNA断片はcnrC
株のCa2+ チャンネルを活性化させる効果を示した。
一方、残りの3つの制限酵素にはそのような治癒効果は見られなかった。この結果は、cnrC+ 遺伝子内にBamHIとBglIIの認識配列がないことを示している。
そこで、これら2つの制限酵素で分解したゲノムDNA
断片をアガロース電気泳動により分画し、治癒効果

内の1213bpに注目し、この領域を野性株からサブク
ローニングした。この1213bpのゲノムDNA断片を
cnrC株の大核に顕微注入したところ、cnrC株のCa2+
チャンネルの機能が回復し、野性株と同様のCa2+ 活
動電位が見られた。また、この形質転換体は野生株と同様に高K+ 刺激溶液中における後退遊泳も行った。cnrC 株 から ク ロー ニ ング し た 1213bpの ゲ ノム
DNA断片をcnrC株に顕微注入してもCa2+ チャンネルの機能は回復しなかった。以上の結果は1213bpのゲ
ノムDNA断片にcnrC+遺伝子が含まれていることを示唆している。

を示す画分を検討したところ、2-4kb画分にCa2+チャ[文献]

ンネルを活性化させる効果が見られた。この画分を1) Naitoh, Y. (1982) in ‘Simple’ Invertebrates. (ed. Shel-

用いてgenomic DNA libraryを調製し、スクリーニン

ton, G. A. B.) 1-48 (Clarendon Press, Oxford,).

グを行った結果、治癒効果を示す2025bpのゲノム
DNA断片を同定した。このゲノムDNA断片には、

2) Takahashi, M. & Naitoh, Y. (1978) Nature 271, 656659.

ゾウリムシにおける新小核の決定と核退化
高 法子 , 見上 一幸 （宮城教育大学 ・ EEC）

Determination of germinal micronucleus division or degeneration in exconjugants of
Paramecium caudatum
Noriko TAKA, Kazuyuki MIKAMI (EEC, Miyagi University of Education)
SUMMARY
In Paramecium caudatum each cell has a germinal micronucleus. There are four presumptive micronuclei in an
exconjugant and it is generally believed that only one of these micronuclei remains and the other three degenerate before
the first post-conjugational fission. However, we obtained contradictory evidence with immunostaining with α-tubulin
antibody and DAPI staining: four micronuclei remained in most dividing cells regardless of nutritional condition, though
their frequency of degeneration was higher in cells under continuous well-fed conditions (WF) than in cells that had beenin starvation conditions (ST) for 48 hours after conjugation. At the first fission, only one micronucleus divided. This isan exconjugant-specific phenomenon, because two micronuclei can divide during the vegetative phase after nuclear
transplantation. The dividing micronucleus was always located along with the central axis of the cell between the oral
apparatus at the ventral side and the macronuclear anlagen at the dorsal side. After artificial removal of the dividing
micronucleus at the first fission, each cell produced two daughter cells. These daughter cells divided a few times but,with a few exceptions, eventually disappeared. The cells were amicronucleate under WF and micronucleate under ST
conditions. In conclusion, the three non-dividing presumptive micronuclei remain morphologically intact but in manycases lose their ability to divide under WF conditions. However, the occurrence of micronuclear division in some cells
after micronuclear removal showed that the remaining micronuclei sometimes retain the ability to divide at the first postconjugational fission.

Jpn. J. Protozool. Vol. 37, No. 1. (2004)

51[目的] ゾウリムシ（Paramecium caudatum）の接合

養条件に置いた細胞では、ほとんどが無小核クロー

完了体において、４つある小核のうちの１核のみンとなった。小核を除去された細胞は、数分裂後にが、小核として選択され分裂する。これは、接合完

分裂を停止したが、手術による傷の影響ではなく、了体に特異的である。なぜなら、栄養期の小核では小核が除去された影響によると考えらえた。

マイクロインジェクションにより2小核体にしたとき、少なくとも数分裂の間、２小核はともに分裂して、２小核状態が維持されるからである（荒木、見上；未発表）。接合完了体の場合、４小核のうちの１核が分裂し、核分裂できない３小核は、細胞分裂
前 に 退 化・消 失 す る と 考 え ら れ て き た（Maupas,1889 ; Klitzke,1914）。しかし、黒川ら（黒川ら.1998，日本動物学会）によれば、実際には、退化すべき小核は細胞内にまだ残っていることが多い。しかし、この実験系では、細胞は接合から48時間、飢餓状態下にあり、小核の生き残りと退化に対して影響しているのではないかという指摘がなされている（Yang and Takahashi, 2000）。本研究では株と細胞の栄養条件を変えて、接合後の分裂核の決定と３小核退化の機構について、解析を行った。

[考察] 本研究では、株の違いや栄養条件に関わらず、接合後第1回細胞分裂時にはまだ細胞内に分裂していない多くの小核が残っていることを確認した。
このことにより、従来の「接合完了体の選ばれなかった小核は、細胞分裂前に退化・消失する」という考えと、「この現象が細胞のおかれた栄養条件によって左右される」という考えを排除することが出来た。しかし、栄養条件に関わらず形態的には細胞内に小核は残っていたが、それらが小核としての機能を持ち続けているか、また、小核の退化が不可逆的なものになっているかという点については、栄養条件の影響を受けているという結果になった。接合直後から富栄養条件下に置かれた細胞の多くは、分裂中の小核を除去すると後の娘細胞のほとんどが無小核クローンとなることから、この条件ではすでに[ 方 法 ] 株 は、Paramecium caudatum の Syngen3 の分裂しない小核は退化への方向が決定的となってい

16Boo1sⅡB5(O)とKC1A01(E)を使用した。接合完了

るか、分裂の能力を失う方向にあると考えられる。

体の第1回細胞分裂中の細胞内に残る小核を観察する

しかし、その一方で、分裂する小核に代わって、次ため、DAPI染色（1μg/ml）と抗-αtubulin抗体によの細胞分裂では、分裂できるものがあるということ

る間接蛍光抗体法を用いた（Ishida et al., 1999）。さから、接合の第1回細胞分裂を境として、退化する小らに、マイクロインジェクション法により、第1回細核の運命が決定されるというわけではないといえ

胞分裂時の分裂中の小核を除去することで、細胞内る。接合完了体において、細胞内に残る小核の機能に残る小核が小核としての機能を持っているのかどがなぜ栄養条件に左右されるのかということに関しうかを調べた。

ては、大核原基や旧大核の影響を現在調べている。

[結果] 16Boo1sⅡB5(O)とKC1A01(E)の接合完了体において、４８時間飢餓条件においた後、富栄養条件に移し、第1回細胞分裂時に観察を行ったところ、分裂しない３小核が残っていた。次に、細胞を飢餓状態に置かないで調べたところ、同じ結果が確認された。

しかし、飢餓状態に置かれた細胞と比較すると、富栄養条件の細胞は細胞内に残る小核の数が少ない傾向にあった。また、分裂する小核は、僅かな接合完了細胞に特異的に、1核だけが選択的に分裂を行うことについては、何らかの接合完了体に特異的な機構が存在すると考えられる。小核の分裂像が常に細胞の口と背側に寄った大核原基との間にあるということは、1小核の分裂に細胞内の位置が関係している可能性もある。この核分裂に関して１小核選
択機構がどのようなものであるかは、今後さらに研究しなければならない問題である。

細胞で２核観察したが、多くの細胞で１核であっ[文献]た。分裂中の核は、細胞の口と背側の大核原基とのMaupas, E. (1889)間に位置していた。
つぎにこれらの細胞内に残る小核が小核としての機能を持っているかどうかを知る目的で、マイクロインジェクション法を用いて分裂小核を除去し、残る小核を調べた。分裂中の小核を除去後、娘細胞をArchs Zool. exp. gen. (2) 7, 149-

517.
Mikami, K. (1982)

J. Cell Sci. 56,453-460.

Ishida, M. , Nakajima, Y. , Kirokawa, K. , Mikami, K.
(1999) Zool. Sci., 16: 915-926
Yang, X., Takahashi, M.(2000) Proc. Japan Acad., 76 ,

培養したところ、飢餓状態に置かれた細胞では約7割

SerB (7), 87-91.

が有小核クローンになったのに対して、ずっと富栄

Klitzke, M. (1914)

Arch. Protistenk. 33, 1-20

原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

52

Parameciumの細胞サイズの変動パターンと大核DNA量との関係について
越後屋史織1，高木由臣2（ 奈良女大院・人間文化・生物科学，2奈良女大・理・生物科学）
1

Modification pattern of cell size and its relationship with macronuclear DNA content
in Paramecium
Shiori ECHIGOYA1 and Yoshiomi TAKAGI2 (1Division of Biological Science, Graduate School of
Human Culture, 2Department of Biological Science, Faculty of Science, Nara Women’s University)
SUMMARY
Cell size is similar in different animals, but the same body has cells of different size. The size of renal epidermal cellsof the salamander depends on the ploidy. In 7 species of ciliate in 5 genera, log cell volume has been reported to be
proportional to log macronuclear DNA content (Soldo, A. T., 1981, J. Protozool., 28, 377-383). Our data also show thatcell size varies with the macronuclear DNA content in three species of Paramecium, P. tetraurelia (Pt), P. caudatum (Pc)
and P. multimicronucleatum (Pm). When Paramecium cells were grown in a flask culture, it was found that 1) the cell size
increased during the early half of the log phase and decreased during the late half, and 2) the cell size halved during thestationary phase. These phenomena were common to Pt, Pc and Pm. The turning point for cell size during the log phase
was shown to be related to cell density in the culture. We found that the cell-size increase during a cell cycle occurred in
two steps, the first at G1 stage and the second at S phase. This suggests that the cell size of Paramecium is modulated in two
ways: DNA-dependent modulation (DDM) and DNA-indepenedent modulation (DIM). We obtained preliminary datasuggesting that the cell size halving during the stationary phase was a DDM type, but this needs to be studied further.
[目的]繊毛虫では、種ごとに大きなサイズの違いが染色をPI濃度2.5と5 µg/mlで行った。その後Cooled

あり、そのため、各種に何らかのサイズ調節機構がCCDカメラによる蛍光顕微鏡撮影を行い、NIH Imageあると考えられる。たとえば、５属７種の繊毛虫にで画像処理を行って、蛍光強度を基にDNA量を算出

おいて、logスケールでとった細胞サイズとlogスケー

した。

ルでとったDNA量との間に、比例関係があることが報告されており 1)、DNA量がサイズの調節に関わることが示唆されている。しかし、繊毛虫のサイズ
は、同じ種でも環境条件などにより、大きく変動する。そこで我々は、3種のParameciumについて、対数
増殖期、定常期、衰退期を通じてのサイズの変動パ
ターンを詳細に調べ、大核DNA量との関係に注目した。

[結果と考察] Parameciumが、増殖段階に応じて実際にどの程度サイズ変動するのかを詳しく調べた。その結果、3種のParameciumで共通に、対数増殖期の前半に体積が増大し、後半に減少すること、また定常期の始めと終わりの間に体積がほぼ半減するという現象が明らかになった。対数増殖期には、細胞周期が回転しているので、まずは細胞周期に沿ってのサ
イズ変化を詳細に調べた。これまでの報告では、[材料と方法] P. tetraurelia（Pt）の51株、P. caudatum

dividersをとって１時間おきに計測しており、細胞周（Pc）のKNZ82株とKoscA4株、P. multimicronuclea-

期を通じて一直線にサイズが増大するとされていた

tum（Pm）のYM25株を用いた。培養は10 mlの培養が 2)、我々はdividersをとったあと、細かく時間を区液を入れた50 mlフラスコで、25℃で行った。細胞サ

切ってサイズを測定した。その結果、分裂後1時間以イズの測定には、2つの方法を用いた。１つは、体長内に急速にサイズが増大し、いったん短い定常状態と体幅を計測し、ゾウリムシを回転楕円体とみなしを経た後、改めて増大するという2段階の変動パターてπ/6×(体長)×(体幅)2 の計算式により体積を求めンが見られた。細胞周期と照らし合わせてみると、た。もう1つは、画像解析ソフトNIH Imageを用いて

G1期に１段階目のサイズの増大があり、S期に２段面積を求めた。同じ細胞群のサイズをこれら２つの階目の増大があるというパターンとなった。このこ方法で測定した時、同様な変動パターンとなった。

とは、ゾウリムシのサイズ調節には、DNA量とは無大核DNA定量は、スライドガラス上で細胞を風乾関係な調節（DNA independent modulation: DIM）と、し、カルノア固定をした後RNase処理を2ｈ行い、PI

DNA量に連動する調節(DNA dependent modulation:

Jpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)

DDM) があることを示唆する。

53

大核DNA量の変動を伴っているのかどうかを調べる

対数増殖期の前半と後半の違いは、細胞密度の違ために、定常期のDNA量の変化を調べた。結果は、

いや、カルチャーの組成、たとえばエサとなるバク

PI濃度5 µg/mlでは、DNA量は減少し、サイズと同様

テリアや老廃物の量の違いが考えられる。そのような変化を示した。しかし2.5 µg/mlでは横ばいの変化

な外部要因が細胞のサイズに影響するかどうかを調であった。同じ対象であるのに実験方法を変えると

べ る た め、培 養 開 始 の 細 胞 密 度 を 1、10、100、結果が異なったため、定常期でDNA量が変化すると1,000、10,000 cells/mlにして数日間培養し、サイズをいう確証は得られなかった。これには、実験方法や測定した。その結果、１mlあたり数百細胞の密度を他の種で行うなどのさらなる検討が必要である。

境に、対数増殖期前半のサイズ増大、後半でのサイズ減少というパターンが見られた。よって、増殖の過程で、細胞密度とサイズの間に何らかの関係があることが示唆された。
最後に、定常期でのサイズの半減という現象が、[文献]
1) A. T. Soldo (1981), J. Protozool., 28(3), 377-383.
2) J. D. Berger (2001), J. Eukayot. Microbiol., 48(5), 505518.

ヒストン修飾によるゾウリムシ未熟細胞の性的成熟化
木村 直美（金沢大・理・生物）

Histone modification and developmental regulation of sexual maturityin Paramecium caudatum
Naomi KIMURA (Department of Biology, Faculty of Science, Kanazawa University)
SUMMARY
Coordinated gene expression during mammalian development is thought to be regulated by histone modifications
such as acetylation-methylation balance. In Paramecium caudatum, a maternal macronucleus is fragmented into some
40 pieces during conjugation. Microsurgical removal of the new macronucleus during the stages later than the 5th cell
cycle produced many clones which regenerated the maternal macronucleus. These clones unexpectedly showed no mating reactivity for about 50 fissions, as if they became sexually immature, implying that ‘re-programming’ of the maternal
macronucleus did occur. This observation leads us to the assumption that normal ‘programming’ of the new macronucleus or a reset of aging occurs at this critical period. Here, we demonstrate that the initiation of the maternal macronuclear degeneration occurs at about the same fifth cell cycle using acridine orange staining. In addition, to investigate
whether histone modification plays a crucial role in the expression of mating reactivity, we treated immature Paramecium cells with Trichostatin A (TSA) that is a histone deacetylase inhibitor. Resultant histone hyperacetylation by TSAtreatment leads to a partial recovery of mating reactivity, i.e. the appearance of sexually mature cells, although they were
essentially still in immaturity period. This suggests that histone acetylation-methylation is involved in the‘programming’ and the subsequent developmental regulation in P. caudatum.
[目的]繊毛虫ゾウリムシ（Paramecium caudatum ）を持った細胞は接合能力のない細胞となる。つまは、有性生殖後、受精核から新たに4つの新大核と１り、新大核の影響によりリプログラミングされる。

つの小核が分化 1) し、旧大核は、約50個に断片化す

本研究では、新・旧大核の挙動をアクリジンオレン

る。4つの新大核は分裂することなく、接合後2回目

ジ染色・オルセイン染色で明らかにした結果や旧大の細胞分裂までに分配され、その後は通常に分裂す

核の若返り（リプログラミング）2)を元に第 4,5 細胞る。一方、断片化した旧大核は第4細胞周期までサイ周期を境に大きく変わる発生プログラミングに関わズ増加をするが、その後挙動は一変し、サイズを減る要因を明らかにすることである。

少し退化へと向かう。また、この第5細胞周期以降で新大核除去をおこなうと、旧大核は再生し、その核[材料と方法]ゾウリムシ（P.caudatum） syngen 3に属す、野生型株KNZ 5（接合型 O）、KNZ 2（接合型原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

54

E）およびKN0303（未熟細胞）を使用し、培養及び接合は、25±1℃でおこなった。

この発生プログラミングに関わる要因として、最染色は、細胞をカ

近、広く考えられているヒストン修飾に着目した。

ルノア液で固定し、5N HClで10分処理したあと水洗

ヒストン脱アセチル化阻害剤であるTrichostatin A

いし、2%酢酸オルセインで染色、光学顕微鏡で観察(TSA)を成熟期と未熟期の細胞に作用させ、接合能力した。アクリジンオレンジ染色は、細胞に最終濃度1の有無を調べた。成熟期の細胞にTSAを作用させてg/mlになるように加え、蛍光顕微鏡で観察した。

も接合能力を保持したままで大きな変化は得られな

ま た、脱 ア セ チ ル 化 阻 害 剤 で あ る Trichostatin A

かった。しかし、未熟期間である接合後20,30分裂の(Sigma)は最終濃度0.5 µg/ml(100%エタノール)で細胞接合能力がない未熟細胞にTSAを作用させたとこを24時間処理し、凝集塊形成を調べた。

ろ、小さな凝集塊がいくつも出現した。ところが、[結果と考察]接合後の新・旧大核の挙動について調べた。接合完了時、第1細胞周期で観察された旧大核（断片）は、48時間の飢餓状態に置くことにより、約50個の断片の内10個前後が退化していることが、
アクリジン染色から明らかになった。しかし、退化せずに残った約40個の旧大核断片は、そのサイズを第4細胞周期まで増加させていった。ところが、第5細胞周期では、旧大核が新大核に接近しているが、一部、新大核から離れた旧大核が退化している像を観察できた。これは、第6細胞周期でも観察することができ、第7細胞周期ではほとんどの核が退化した。
つまり、旧大核は、第4,5細胞周期を境に大きく挙動を変えることが明らかになった。これは、第4細胞周期で量的・質的に完成した新大核の影響だと思われる。つまり、第4,5細胞周期を境に、新大核の発生プ

これらの細胞は接合対を形成することはなかった。
つまり、TSAによって接合の最初のカスケード（凝集反応）のみ活性化されたと考えられる。このこと
から細胞が成熟になる発生プログラミングにはヒストンのアセチル化が関係していることが言える。
これらの結果をふまえると、接合後第5細胞周期に大量の脱アセチル化酵素が細胞内に存在し、ヒスト
ンのアセチレーションのレベルを減少させることに
より未熟期に発現する遺伝子が活性化されると考えられる。このことが、新大核除去した際に、旧大核のリプログラミングの原因になっていると考えられる。
[文献]
1) Mikami, K. (1980) Develop.Biol.80: 46-55
2) Kimura, N. and Mikami, K. (2003) Differentiation 71(6): 337-345

ログラミングが大きく変化した結果と考えられる。

ゾウリムシのclonal aging における繊毛再生能力の変化
太田 聡, 芳賀 信幸 （石巻専修大学・理工）

The changes in the ability of Paramecium cells to regenerate cilia
according to clonal aging
Satoshi OHTA and Nobuyuki HAGA (Dept. of Biotech. Ishinomaki Senshu Univ.)
SUMMARY
The ability to regenerate cilia called ciliary regeneration is an important character in Paramecium. Ciliary regeneration is brought about in exconjugant cells to repair the deciliated area in the ventral surface of the cell. Ciliary regeneration is also observed in the cells that are artificially deciliated. However, it is unknown whether the ability to regeneratecilia is a deteriorative character in clonal aging or not. In this report we examined the ability to regenerate cilia in theartificially deciliated cells and compared the time course of regeneration and swimming velocity of cells after regenerationof cilia between young and old Paramecium. First, to measure the time course of ciliary regeneration, we examined thecorrelation between swimming velocity and the length of cilia and found that it was proportional. Then, by using swimming velocity of cells after the treatment of deciliation, we made the profile of the time course of ciliary regeneration. The
comparison of the correlation coefficients between young and old cells indicated that there were statistically significant
differences in both KNZ and SOS strains. In both cases the ability of ciliary regeneration was reduced in old cells. On theother hand, the swimming velocity of cells after completion of ciliary regeneration that was measured at 24 hours afterJpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)

55

deciliation indicated that there were no statistical differences between young and old cells in both strains. Our results
suggest that reconstructive activity of cilia is a deteriorative character but the locomotive activity of reconstructed cilia is
not. Our findings would give a new point of view in the consideration of clonal aging and would provide a new experimental approach to understand the molecular mechanisms underlying clonal aging of the cell.
[目的] ゾウリムシは接合初期過程において退化した
腹側の繊毛を接合終了後に再生する。また、エタ
ノールによって人為的に細胞全体の繊毛を脱繊毛す
ると全ての繊毛を再生する。
ゾウリムシのclonal agingでは細胞分裂速度や稔性などの細胞機能が低下することが知られているが(Takagi et al., 1980 ; Karino et al., 1981)、繊毛再生能力はclonal agingに伴って低下するのであろうか。このことを明らかにするために細胞分裂齢の異なる細胞間で人為的に脱繊毛した後の繊毛再生速度と再生した繊毛の運動機能を比較した。

controlの細胞で比較した。
[結果と考察]＜繊毛再生速度＞

細胞の遊泳速度を脱繊毛直後から経時的に測定した結果、KNZ52では分裂齢の異なるいずれの細胞でも直ちに遊泳速度が上昇し始め
KNZ52 f=50では12時間後、KNZ52 f=700では14時間後に定常状態となった。遊泳速度の差は遊泳速度が定常状態になるまでの回帰直線の傾きの差を検定することで求めた。その結果、回帰直線はKNZ52 f=50
ではy=0.2x-0.05、KNZ52 f=700ではy=0.12x+0.02となり、回 帰 直 線 も 傾 き に 有 意 な 差 が 確 認 さ れ た ( α[材料と方法] 遺伝的背景の異なる2つの株について=0.05)。一方で、SOS2においても脱繊毛直後から遊細胞分裂齢の異なる細胞を準備した（KNZ52 f=50,

泳速度が上昇し始め、SOS2 f=50では4時間後、SOS2

700. SOS2 f=50, 500）。KNZ52 f=700とSOS2 f=500は

f=500では9時間後に定常状態となった。遊泳速度が細胞分裂速度が低下している老化の兆候が見られる

定常状態になるまでの回帰直線は、SOS2 f=50では細胞である。本研究では繊毛再生能力を評価するた

y=0.2x-0.09、SOS2 f=500ではy=0.12x-0.19で、回帰直めに、繊毛再生速度と再生した繊毛の運動機能につ線の傾きに有意な差が確認された(α=0.05)。以上のいて同じ株内の分裂齢の異なる細胞間で比較した。

ことから、ゾウリムシでは生活史の晩年の細胞にお＜繊毛再生速度＞

いては、繊毛再生速度が低下していることが明らか

繊毛再生速度を求めるためには、繊毛再生が完了するまでの時間を把握することとなった。

が重要である。そこで、まず細胞の遊泳速度が繊毛＜再生した繊毛の運動機能＞

再生の度合いを推定する指標となりうるかどうかを機能を調べるために、脱繊毛してから24時間後の細検討した。KNZ52 f=700について脱繊毛処理後0, 1, 6,胞の遊泳速度と脱繊毛していないcontrolの細胞の遊12,15時間後の繊毛長と遊泳速度を測定し相関関係が泳速度を測定した。その結果、KNZ52では分裂齢のみられるかどうかを検討した。繊毛長は、スライド

異なるいずれの細胞においてもcontrolの細胞との間上で風乾した細胞の顕微鏡写真から繊毛長を実測すに有意な差は認められなかった(α=0.05)。また、

ることにより求めた。その際、脱繊毛処理後の各時

SOS2においても同様のことが確認された。以上のこ間につき3細胞、それぞれの細胞につき3箇所の繊毛とから、ゾウリムシは脱繊毛しても脱繊毛される前長を測定し、その平均値をその時間の繊毛長としと同等の運動機能を持った繊毛を再生することがでた。繊毛の長さと細胞の遊泳速度の相関関係を検討

き、これは分裂を重ねても低下しないことがわかっした結果、有意に相関があるということがわかった

た。

再生した繊毛の運動本研究において、ゾウリムシの細胞機能にはclonal（r=0.955, α=0.05）。
以上のことから、細胞の遊泳速度を脱繊毛直後か

agingに伴って低下するものと、安定して維持される

ら経時的に測定し、遊泳速度の上昇が定常状態に達ものとがあることが示唆された。このことは、ゾウした時間を繊毛再生が完了した時間と判断した。

リムシを用いた老化研究に新たな視点を提供するも従って、分裂齢の異なる細胞の繊毛再生速度の差のと期待される。

は、遊泳速度が定常状態に達するまでの時間の回帰
直線の傾きの差を検定することで求めた。
＜再生した繊毛の運動機能＞

繊毛の運動機能を細胞の遊泳速度を指標として、脱繊毛してから24時間
後 の 繊 毛 が 再 生 し た 細 胞 と、脱 繊 毛 し て い な い[文献]
Y. Takagi., M. Yoshida. (1980) J. Cell Sci., 41: 177-91
S. Karino., K. Hiwatashi. (1981) Exp. Cell Res., 136: 407415

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

56

ケイジドカルシウムのゆっくりとした光分解によるゾウリムシの繊毛逆転・細胞収縮の高速ビデオでの記録
岩楯 好昭1，中岡 保夫2（1徳島大・総合科学，2阪大院・生命機能）

High speed video recording of ciliary reversal and cell body contraction in Paramecium induced by slow photolysis of caged calcium
Yoshiaki IWADATE1 and Yasuo NAKAOKA2 (1Fac. Integr. Arts Sci., The Univ. Tokushima, 2Grad.
Sch. Frontier Biosci., Osaka Univ.)
SUMMARY
Cell body contraction and ciliary reversal in Paramecium caudatum are controlled by intracellular calcium concentration.
We injected caged calcium into P. caudatum cells and applied ultraviolet (UV) light to the cell continuously. The UV
was filtered through neutral density (ND) filters to raise the intracellular calcium concentration slowly. When UV wasapplied through a 1/64 ND filter, the Paramecium cell began to contract just after the start of UV application and thecontraction continued for about 4 s. Whereas, ciliary reorientation began 1.5 s after the start of UV application. The
period required for ciliary reorientation was about 100 ms. In the case when UV light was applied through no ND filter,
the Paramecium cell began to contract just after the start of UV application and finished the contraction after 0.3 s.
Whereas, ciliary reorientation began 8 ms after the start of UV application. The period required for ciliary reorientation
was about 100 ms as is the case of 1/64 ND filter. These results strongly suggest that (1) cell body contraction takes
place in an intracellular calcium concentration dependent manner and (2) ciliary reversal takes place in an all-or-nothingmanner in living P. caudatum.
[目的] ゾウリムシの繊毛逆転・細胞収縮・トリコシ細胞が完全に収縮するまでの時間は，紫外線強度1，

スト放出はカルシウムイオンによって誘発される。

1/8，1/32，1/64それぞれ，約0.3，0.8，1.5，4秒と，我々は，以前，トリコシスト放出を誘発するカルシ

照射強度に応じて異なった。ところが，細胞の最終

ウム濃度の閾値は，繊毛逆転・細胞収縮の閾値より的な収縮率を画像から計測してみると，いずれの場高いことを報告した1が，繊毛逆転・細胞収縮とカル合も同じだった。これらの結果は，細胞内のカルシ

シウム濃度の関係を検討するには至らなかった。今ウム濃度を上げるスピードと，細胞の収縮スピード

回，生きたゾウリムシにケイジドカルシウムの光分に相関があることを強く示唆している。一方，繊毛解法を用い，カルシウム濃度変化に対し，繊毛逆転

逆転について検討してみると，紫外線照射開始からは全か無か的に，細胞収縮は濃度依存的に生じるこ繊毛逆転の開始までの時間は，紫外線強度1，1/8，とを確かめた。
[方法] ゾウリムシ（P. caudatum, G3株）にケイジド
カルシウム（NP-EGTA）を最終濃度約2 mMで顕微注射し，倒立顕微鏡のステージ上で固定する。ケイ
ジドカルシウムからカルシウムイオンを解放させる
300-400 nmの波長の紫外線を，対物レンズを通じて
ゾウリムシの細胞全体に照射し，細胞の様子を高速ビデオカメラで撮影しコンピュータに記録した。紫
外線の強度は ND フィルターを用い調整した。

1/32，1/64それぞれ，約0.008，0.14，0.45，1.5秒と紫外線強度によって異なる値を得た。ところが，繊毛逆転にかかる時間はいずれの場合も約0.1秒だった。
これらの結果は，繊毛逆転は，細胞収縮と異なり，細胞内のカルシウム濃度変化の極めて小さい間に，繊毛の逆転が生じることを強く示唆している。最後に，紫外線を当て始めてから細胞収縮と繊毛逆転の生じる前後関係を検討すると，紫外線強度1，1/8，
1/32，1/64いずれの場合も，紫外線照射から間もなく
細胞収縮が始まり，収縮の途中で繊毛が逆転し，そ[結果と考察] NDフィルタ無しの紫外線強度を１との後も細胞収縮が続くことが分かった。以上の結果

して，1，1/8，1/32，1/64の４通りの強度で，あらかから，ゾウリムシの細胞収縮・繊毛逆転に関して，

じめケイジドカルシウムを注射しておいたゾウリム

細胞収縮はカルシウム濃度依存的に起こる一方，繊シに紫外線を照射した。いずれの場合も細胞収縮・毛逆転は細胞収縮に比べ極めて狭いカルシウム濃度

繊毛逆転の両方が観察された。紫外線照射開始から

Jpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)

57の変化で生じることが強く示唆される。また，細胞[文献]

体収縮が始まるカルシウム濃度は，繊毛逆転が起き

1) Iwadate, Y., Kikuyama, M. and Asai, H. (1999)

るカルシウム濃度よりも低いことが分かった。

Photolysis of caged Ca2+ induces trichocyst discharge inParamecium caudatum. Protoplasma, 206: 11-19.

Euglena gracilisの膜内在性タンパク質IP39のクローニング
末友靖隆，角田宗一郎，洲崎敏伸（神戸大・理・生物）

Molecular cloning of the integral membrane protein IP39 of Euglena gracilis
Yasutaka SUETOMO, Soichiro KAKUTA and Toshinobu SUZAKI(Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)
SUMMARY
Flagellates of the genus Euglena perform a characteristic movement called “euglenoid movement”. Intramembraneproteins called IP39, which are regularly and densely arranged in the plasma membrane of the pellicular strip have been
implicated in this movement (Suzaki and Murata, 1997). We carried out PCR-based cDNA cloning of IP39 from Euglena gracilis. As a result, we found two types of cDNA (α- and β-types). The α- and β-type cDNAs consisted of 792and 795-base pairs, respectively. Molecular weights of both types of IP39 protein were predicted to be 29 kDa, which ismuch smaller than the 39 kDa estimated by SDS-PAGE. Between α- and β-type cDNAs, differences were found over
the whole sequence. However, between the deduced amino acid sequences, differences were restricted to the C-terminal
region, except for two residues in the middle part. Predicted secondary structures of both types of IP39 suggest that they
are multipass transmembrane proteins with two or four transmembrane regions.
[目的]ユーグレナ類は、ユーグレナ運動と呼ばれるを、ア ミ ノ 酸 配 列 解 析 に は ALL-IN-ONE-SEQ-

活発な細胞変形運動を行うことが知られており、こANALYZERを、ホモロジーサーチにはBLASTを、タの運動のメカニズムとして、細胞体表面を覆う膜状

ンパク質局在部位予測にはPSORTを、モチーフ検索外被であるペリクルの表皮帯 (pellicular strip)同士のにはPROSITEを、膜貫通領域予測にはTOPPREDを、滑りがユーグレナ運動を引き起こすという仮説

2次構造予測にはPAPIA内のNew Joint法を、分子量及(Suzaki and Williamson, 1985)と、ペリクルの表皮帯のびアミノ酸組成の予測にはProtParam toolを用いた。

構造変化がユーグレナ運動を引き起こすという仮説が考えられている。後者の仮説では、ペリクルの細胞膜に規則的に密に配列している推定分子量39 kDaの膜内在性タンパク質（IP39）が、ユーグレナ運動に関与しているのではないかと考えられている(Murata et al., 2000)。そこで本研究では、IP39のユー
グレナ運動に対する関与を解明するために、IP39タ
ンパク質をコードするcDNAのPCRクローニングを行った。

[結果と考察]IP39のdegenerate primerから増幅された
cDNAの塩基配列を解析した結果、2種類のcDNAが見つかった。そこで、一方をα型、もう一方をβ型と名付けた。α型は792塩基、β型は795塩基から構成されていた。α型とβ型の塩基配列を比較したところ、全体に渡って違いが見られ、相同性は約88 %であった。また、α型とβ型のアミノ酸配列を比較したところ、C 末 端付 近と そ の他 一部の 残 基に 違いが 見 られ、相 同 性 は 94% で あ っ た。ま た、α 型 と β 型 は 共[材料と方法]本研究室の過去の研究によって既に明に、IP39のN末端アミノ酸配列の解析結果と完全に一らかになっていた、Euglena gracilisの膜内在性タンパ

致しており、IP39をコードするcDNAである可能性がク 質 IP39 の N 末 端 配 列 解 析 結 果 を 基 に degenerate

強く示唆された。さらに、アミノ酸配列から推測さ

primerを設計し、それを用いてcDNAのPCRクローニ

れる分子量は約29 kDであり、SDS-PAGEから予測さングを行った。アラインメントの解析にはClustalW

れてきた分子量である39 kD (Dubreuil et al., 1985)より

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

58

小さなものとなった。この理由は明らかではない

素化される可能性がある領域が殆ど存在しないこと

が、可能性の一つとしては、タンパク質が修飾されになる。細胞の膜外露出領域はヨウ素化されないとている可能性が考えられる。α型、β型は共に、全ていう過去の報告があり (Dubreuil et al., 1988)、また、の構造予測において、ほぼ同じ結果が得られた。モ

フリーズフラクチャー法で細胞膜を割断すると、細チーフ検索により、3箇所のCasein kinase Ⅱリン酸化

胞質側の割断面にIP39が偏在している (Murata et al.,

サイト、3箇所のPKCリン酸化サイトが検出された。

2000)、つまり、IP39の露出部位は細胞質側に偏在しこの結果は、IP39がキナーゼによってリン酸化されている可能性が高いことから、4回膜貫通型タンパクるという過去の報告 (Fazio et al., 1995)と一致した。

質よりも、2回膜貫通型タンパク質の可能性が高いこ

ホモロジーサーチにより、既存のどのタンパク質ととが示唆された。今後は、α型とβ型の細胞内での局も高い相同性が見られなかったことから、IP39は新在性について調べ、さらに、IP39がどのようにユー

しいタンパク質であることが示された。膜貫通領域

グレナ運動に関与しているのかを解明していきた

予測、及びタンパク質局在部位予測から、細胞膜にい。

局在する4回膜貫通型タンパク質の可能性が示唆されたが、2次構造予測からは、2回膜貫通型タンパク質である可能性が示唆された。4回膜貫通型タンパク質と仮定すると、細胞外露出領域を含む、細胞の至る所にヨウ素化される可能性がある領域が存在し、また、細胞外露出領域：細胞質露出領域は、約4：5と、あまり差が見られないことになる。一方、2回膜貫通型タンパク質と仮定すると、細胞外露出領域：
細胞質露出領域は、約1：8と、露出領域が細胞質側に大きく偏っているうえ、細胞外露出領域にはヨウ[文献]1) Suzaki, T. and Williamson, R. E. (1985) Protoplasma,124:137-146.
2) Dubreuil, R. R. and Bouck, G. B. (1985) J. Cell Biol.,
101:1884-1896.
3) Dubreuil, R. R. et al. (1988) J. Cell Biol., 107:191-200.
4) Rosiere, T. K. et al. (1990) J. Cell Biol., 110:10771088.
5) Fazio, M. J. et al. (1995) J. Euk. Microbiol., 42:570-579
6) Murata, K. et al. (2000) Protoplasma 214:73-79

タイヨウチュウ Actinophrys sol の捕食関連タンパク質の解析
角田宗一郎, 洲崎敏伸（神戸大・理・生物）

Analysis of proteins involved in the process of feedingin the heliozoon Actinophrys sol.
Soichiro KAKUTA and Toshinobu SUZAKI (Dept. Biol., Fac. Sci., Kobe Univ.)
SUMMARY
Actinophrys sol captures food organisms using axopodia that radiate from the spherical cell body. Beneath the cellsurface of axopodia and the cell body, there are many extrusomes, which discharge their contents when prey make contact
with the axopodial surface. A 40-kDa glycoprotein (gp40) is stored in the extrusome and is considered to play an importantrole in prey recognition and ingestion. Using Con A-affinity chromatography, gp40 was purified and its N-terminal aminoacid sequence was determined. We cloned and sequenced a PCR product that was amplified using degenerate primers
designed from the N-terminal amino acid sequence of gp40. The sequence of the PCR product was not identical to theamino acid sequence of gp40, but showed high identity with the sequence of TPPI (tripeptidylpeptidase I), one of thelysosomal enzymes. Antibodies were raised against the N-terminal amino acid sequences of gp40 and TPPI of A. sol
Immunofluorescence microscopy and immunoelectron microscopy with these antibodies showed localization of the proteins. Gp40 was localized around the cell body and on the axopodia, especially in the extrusomes, and anti-TPPI antibodies
recognized small vesicles and food vacuoles.

Jpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)[目的]太陽虫Actinophrys sol は球状の細胞体から放射状に伸びた軸足を持っており、細胞体および軸足の細胞膜直下には多数のエクストルソームが存在する。A. sol は軸足によって餌となる生物を捕獲するが、これにエクストルソームが関与していると考えられている。これまでにA. sol のエクストルソーム内に含まれるタンパク質としてgp40が知られている(Sakaguchi et al., 2001) 。今回gp40のN末端アミノ酸配列からdegenerate primer を設計し、PCRによるクロー
ニングを試みた。またその結果得られたライソソー
ム酵素TPPI及びgp40の抗体を作製し、それらを用いて免疫標識した細胞の蛍光顕微鏡および電子顕微鏡観察を行い、gp40及びTPPIの局在性を調べた。

59

微鏡で観察した。
[結果と考察]クローニング産物は、その塩基配列から当初目的としたgp40ではなく、ライソソーム酵素の一種であるTPPI (tripeptidyl-peptidase I) と高い相同性を持つことが分かった。免疫蛍光法で局在性を調べた結果、gp40は細胞表面及び軸足上に点在する様子が観察できた。またTPPIでは餌を与え無かった細胞では小さな顆粒として、餌を与えた細胞では比較的大きな構造として観察された。これらは前者が食胞に融合する前のライソソーム、後者がライソソー
ム融合後の食胞であると思われる。次に免疫電子顕微鏡法でより詳細な観察を行った結果、抗gp40抗体
がエクストルソーム内容物に結合している様子が確[材料と方法] A. solはSakaguchi and Suzaki (1999) に認でき、TPPIが食胞周辺のライソソームらしき小胞

従って無菌培養したものを用いた。Gp40のN末端アから食胞へと移行していく様子を観察することがで

ミノ酸配列 (Sakaguchi et al., 2001) をもとに設計したきた。今後は餌を与えてからの時間経過とTPPIの局

プライマーでPCRを行い増幅産物をクローニング、

在との関連を調べ、包埋後免疫標識法により細胞内塩基配列を決定した。その結果得られたA. sol のTPPI部でのより正確な局在性を調べていく。またgp40のを大腸菌に発現させウサギ抗体を作製した。また

抗体が得られたこととそれによりN末端アミノ酸配gp40のN末端アミノ酸配列に対する抗ペプチド抗体列が確認できたことを利用して、再度gp40のクローを作製しウェスタンブロッティングでそれぞれの抗ニングを試みるつもりである。

体の特異性を確認した。4%ホルムアルデヒドで固定しエタノールで脱膜処理した細胞を抗体で処理、蛍光標識し共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また4%
ホルムアルデヒドと0.4%グルタルアルデヒドで固定
して、0.5% TritonX-100で脱膜処理した細胞を抗体処理し、金粒子で標識後、Spurr樹脂に包埋して電子顕[文献]
Sakaguchi, M. and Suzaki, T. (1999) Europ. J. Protistol.,
35, 411-415.
Sakaguchi, M., Suzaki, T. and Murakami, H. (2001) Protist, 152, 33-41.

ボルボックスの走光性リズム
石橋宗典, 三輪五十二 (茨城大・理・自然機能)

Phototaxis rhythms in Volvox carteri
Munenori ISHIBASHI and Isoji MIWA (Dept. Biol., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARY
It is well known that the alga Volvox shows positive phototaxis and swims in the direction of light. This movement,
however, has not been analyzed quantitatively so far. First, the intensity of phototaxis was quantitatively determined bycounting how many Volvox carteri, in a rectangular pool divided into light and dark regions, accumulated in the light area.
Second, we examined the intensity of phototaxis shown by V. carteri maintained on a 12-hr light / 12-hr dark cycle. It was
found that V. carteri showed positive phototaxis during the light period, but not in the dark period. The peaks of positive
phototaxis and non-phototaxis were respectively around 8 hours after the light was turned on or off. The intensity data

60

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

fitted a sine curve. Third, this entrained daily rhythm of phototaxis was tested to see if it persisted under constant light
conditions. It was found that the rhythm persisted for at least 1.5 days under constant light. Now we have tested if it
persists on a 1-hr light / 1-hr dark cycle. In this test we found that V. carteri on a LD=1/1 cycle behaved as if under constantlight after a 12-hr light period, but as if under constant dark after a 12-hr dark period. This suggests the existence of aswitching or hysteretic mechanism of phototaxis. These results strongly indicate that V. carteri has a circadian clock.

[目的] 多くの生物は、生存に適さない環境を避け、内に4度行った。このときの画像を解析し、全体の総快適な環境のもとに移動することができる。このよ

数のうち何個体が明るいほうへ集まったかをカウン

うに生物が外刺激に反応して方向性のある運動を起トし、明域へ集まった割合を算出した。最後に、得こすことを走性（Taxis）という。走性は、外刺激にられた4回分の値を平均し、これをある時刻の走光性

対する興奮と適応により現れる。そのため、“入力の指標とした。この指標を元に、LD=12/12条件下でに対する応答”の生物モデルとして、生物物理学やの走光性の変移を調べた。さらに、LD=12/12後の恒制御工学の分野でも題材にされることが多い。本研明（LL）・恒 暗（DD）・LD=1/1 条 件 下 で の、走 光

究では、走性における研究対象としてVolvox carteri性についても調べた。

を用いた。直径0.3〜0.8 mmの緑色をした球形の原生生物で、光合成を行いエネルギーを得ている。緑藻
植物の一種であるが、表面にある多数の鞭毛を用いて泳ぐことができる。V. carteriは明確な走光性を示
すにもかかわらず、多細胞性の群体形成生物ということもあり、単細胞生物に比べ走性に関する研究はあまり行われていない。今回の研究ではV. carteriの走光性に主眼を置き、時間生物学的アプローチを試みた。時間生物学とは、生命の周期的現象を研究す
る学問である。さまざまな生物において、ある方向性を持った行動というのは、ある特定の時間帯や期間であることが多い。そのため，走性の時間的変移
やリズムを研究することは非常に重要である。

[結果と考察]LD=12/12条件下では、V. carteriは培養時の明暗環境に同調し、走光性をよく示す状態と、あまり示さない状態を交互に繰り返すという、リズ
ムをもつことがわかった。このときの走光性の指標
は、sin曲線上にフィッティングできる。このことか
ら、概日時計によるリズム発現が予測されるため、LLにおけるリズム持続性の検証をおこなった。この
結果、最低1.5日間のリズム持続が確認された。しかし、概日時計の証明のためには、1.5日間だけの持続では不十分である。リズムが最低3日間は持続する恒常条件を見つけるため、現在LD=1/1条件下での持続性を検証している。この実験は、単細胞生物ミドリ
ゾウリムシの接合活性リズムが、LD=1/1条件下で[方法]今回実験に用いた株は、京都大学から分与さは、LLもしくはDD状態と等しくなるということを参れたVolvox carteri f. nagariensisである。培養液には、考にしている。この実験の中で、以下のような興味

1)

SVM（Standard Volvox Medium）を用いた 。V. car-

深い現象を発見した。LD=12/12培養の明期12時間のteriの培養は、明るさ2500 〜 5000 Luxの明期12時

あとにLD=1/1とすると、LL条件下で見られるような間・暗期12時間の24時間サイクル（LD=12/12）上に走光性が強く発現された状態が維持される。しかおかれているフラスコ内でおこなった。培養時の温し、暗期12時間のあとLD=1/1とすると、DD条件下で度は25℃一定である。測定は、すべて成長曲線にお観測されるような、あまり走光性を示さない状態と

いて飽和状態にあったものを使用した。次に、寒天なる。このことは、走光性の発現に、スイッチング

を9 mm×17 mm× 2 mmの大きさに切り抜き、その機構もしくは履歴現象の存在を示唆している。そこ

プールの中でV. carteriを泳がせて走光性の測定をおには、より高等な現象である記憶の問題が隠れていこなった。まず、プールを半分だけ暗くした状態にるかもしれない。

すると、V. carteriは明るいほうへ次第に集まってくる。60秒以上経過すると、明るい部分への集まり具合は平衡状態へと達するので、このときの状態をカメラで撮影する。以上の測定を、1回の実験で10分以[文献]David L. Kirk and Marilyn M. Kirk (1983) Dev. Biol.
96:493-506

Jpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)

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緑藻存在下における枝分かれツリガネムシの長期安定培養法
中島淳，浅井博 (早稲田大学理工学部)

A stable and long term culture method for the branched Vorticellidae
in the presence of green algae
Jun NAKAJIMA and Hiroshi ASAI
(Dept. of Physics, School of Science and Engineering, Waseda Univ.)
SUMMARY
The peritrich ciliate, Vorticellida sp., is usually cultivated with a nutrient extract like lettuce juice and Vita-shrimp
infusion in the presence of a bacterium such as Aerobacter. However, when, Carchesium sp., one of the branched peritrich
ciliates, is cultured, it sometimes proliferates as solitary organisms, not as branched ones. Furthermore, there is no reportof laboratory culture of Zoothamnium sp., another species of branched vorticellidae. We have recently developed a method
to cultivate Carchesium polypinum and Zoothamnium procerius in the presence of the green alga, Chlamydomonas
reinhardtii, along with bacteria as food. These peritrich ciliates grew and proliferated stably and successfully for a long
period when Chlamydomonas reinhardtii was employed as a second nonaxenic food. A symbiotic green vorticellidae(Vorticella chlorellate) can be stably cultivated in the presence of small amounts of nutrient with a bacterium. This may bepossible because of the intracellular presence of Zoochlorella .
[目的]ツリガネムシは繊毛虫門、貧膜口網、周毛亜3000 luxの条件下で培養し、それをミネラルウォー

網、周毛目に属する原生動物である。柄の内部には

ター(南アルプスの天然水)で15倍希釈し、2日間置い

スパズモネームと呼ばれる繊維が縦走し、刺激をうたものをさらにミネラルウォーターで1〜5倍に薄1

けると急速(約10 ms)に収縮する 。ツリガネムシ類にめ、バクテリアを培養した液を1/500〜1/1000（v/v）

は単体性のVorticella属と柄が枝分かれして群体をな加えたものを用いた。直径60 mmシャーレを使ってすCarchesium属およびZoothamnium属とがある。これ

20℃、約150 luxの条件の下、ツリガネムシ用培養液

までVorticellaに関してはレタスジュースやビタシュ

中でC. polypinum と Z. proceriusを培養した。またC.

リンプ抽出液などでの培養が可能で、生活史やスパ

polypinumの遊泳形態を8〜12 cell植え継ぎ、そのときズモネームに関しての研究がなされてきたが 1,2、をt=0として毎日培養液を代えながら10℃〜25℃で一Carchesium sp.に関しては、レタスジュースやビタ

日ごとに細胞数を調べた。

シュリンプ抽出液で培養すると単体で増殖してしまい、Zoothamnium spは研究室での培養例は報告されていない。我々は緑藻の一種であるChlamydomonas
reinhardtiiとバクテリアを餌として与えることにより、Carchesium polypinum ( 以 下、C. polypinum) とZoothamnium procerius(以下、Z. procerius)を長期的かつ大量に研究室で培養することに成功したので、報告する。

[結果と考察]ツリガネムシ用培養液を毎日交換して
C. polypinumとZ. proceriusを培養したところ、両種とも 一 つ の コ ロ ニ ー が 非 常 に 大 き く (60 〜 200 cell/colony) な り、コ ロ ニ ー か ら 発 生 し た 遊 泳 形 態 がシャーレの底に固着してまた新しいコロニーを作り、最終的にはC. polypinumは50 cell/mm2程度、Z. proceriusは10 cell/mm2程度まで増殖した。C. polypinumの増殖実験を行ったところ、15℃〜22.5℃で安[方法] C. polypinumは2002年7月、Z. proceriusは2003

定して増殖（1〜3 division/day）し、22.５℃では6日

年7月にそれぞれ埼玉県川越市の伊佐沼で採集されたで細胞数がt=0のときに比べ、1000倍以上になった。

ものを用いた。Chlamydomonas reinhardtiiはIAMより

しかし25℃では3日で30倍ほどに増殖した後、減衰し譲渡して頂いたものを用いた。バクテリアは、ツリていった。両種ともChlamydomonas reinhardtiiのみをガネムシを採集した場所の水を肉汁を含んだLB培地

餌として与えると、途中で増殖が止まってしまい、に少量添加し、37℃で一晩置くことにより培養しバクテリアのみを餌として与えるとまったく増殖した。ツリガネムシ用培養液として、Chlamydomonas

なかった。

reinhardtiiをMinimal培養液中で20℃、L:D=14h:10h、また研究室でもとより培養されていたVorticella

原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

62

sp.、埼玉県川越市で採集した2種のVorticella sp.と1種以上、C. polypinumと Z. proceriusが長期にわたっのEpistilys sp.及び北多摩下水処理場で採集された1種て安定して研究室で培養することが可能になったこのEpistilys sp.を同培養法で培養を試みたところ、あとにより、生活史、タンパク質、遺伝子などの実験

る程度培養できた。この培養法はツリガネムシ全般

をより効率的に行うことができるのではないかと考にわりと有効である可能性がある。

える。

またツリガネムシのChlamydomonas reinhardtii捕食の様子を観察したところ、ツリガネムシは常に、細胞口の周りを半時計回りに餌を滑らせて捕食することが分かった。その他、C. polypinumに関しては接合
体や、Preconjugantと推測される細胞も観察できた。

[文献]
Moriyama, Y., Hiyama, S., and Asai, H. (1998). Biophys.
J., 74, 487-491
Finley H. E. (1966). Acta Protozoologica, 4, 67-74

ボウフラから発見された繊毛虫テトラヒメナの無菌培養とシスト形成について
久富裕子, 赤川裕美, 内田眞砂子, 高橋忠夫（西九州大・生物）

Axenic cultivation and encystment induction of the ciliate Tetrahymena
in a dead mosquito larva
Yuko HISATOMI, Yumi AKAGAWA, Masako UCHIDA and Tadao TAKAHASHI(Biol. Lab., Nishikyushu Univ.)
SUMMARY
The ciliate, Tetrahymena sp., which was found in a dead mosquito larva, grew well in lettuce infusion (0.5 g/1,000ml) with a piece of poultry-meat (2 g/1,000 ml), and then some transformed to cysts at the stationary phase of growth.
When the logarithmically growing cells were transferred to CFF (cell-free fluid) which was prepared by centrifugation(1,500 rpm, 5 min), pre-filtration (DP70), and Millipore-filtration (0.45 µm in diameter) of the cell suspension from astationary growth phase, more than 40% of the cells transformed to the cysts. This suggests that a certain factor which is
responsible for the encystment of the ciliate is included in the CFF. In order to purify such an encystment-inducing factor,
it is important that the ciliate is axenically cultured with any medium. Thus, the ciliate which had been cultured by lettuce
infusion with a piece of poultry-meat, was washed 8 times with an inorganic salt solution SMB-II, and then transferred to
PY medium (1% proteose peptone, 0.5% yeast extract) containing antibiotics (4,000 U/ml penicillin G, 200 µg/ml streptomycin sulfate and 5µg/ml vancomycin), and was maintained at 23±1°C. We, however, could not prevent the growth ofcontaminating bacteria by such a culture method. Thus, we washed the ciliate with SMB-II, and then applied 100 µl cellsuspension on a 0.9% PY agar plate containing antibiotics, and then the PY agar plate was maintained at 23±1°C. Twodays later, a pure colony of the ciliate on the agar plate was transferred to a 10 ml Erlenmeyer’s flask containing 2 ml PY
medium with antibiotics. As a result, we succeeded in axenically culturing the ciliate. We will try to purify the encystment-inducing factor from the axenic culture in the near future.
[目的] 多くの繊毛虫がシストを形成することは良く
1

明されていない1,4-7。我々は今回発見したテトラヒメ

知られている 。ヒトスジシマカのボウフラの死体かナのシスト形成誘導因子を明らかにすることを目的

ら発見された繊毛虫テトラヒメナもレタス浸出液にに研究を行っている。その場合、本種を無菌的に培

鶏肉を加えると増殖するが、定常期にはシストを形養し、さらに、シスト形成誘導法を確立することが成する2,3 。この遊泳型の繊毛虫が、どのような細胞重要である。今回は、その第一歩として培養の無菌

外シグナルを受容してシスト化するのかという問題化を試みた。

に関していくつかの報告があるが、まだ十分には解[材料と方法] ヒトスジシマカのボウフラの死体から

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No. 1. 2004年(2004)
原生動物学雑誌
第36巻
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発見されたテトラヒメナの保存株はレタス浸出液（0.5g/1000ｍl）に鶏肉（2g/1000ml）を加え、20±1℃に保った。無菌培養の培地としてPY培地（1% Proteose peptone, 0.5% Yeast extract）を用い、これに、抗生物質ペニシリンG（final conc, 4000 U/ml）、硫酸ス
トレプトマイシン（final conc, 200 µg/ml）、バンコマ
イシン（final conc, 5 µg/m）をそれぞれ、孔径0.45 µmのメンブランフィルターでろ過除菌して加えた。テ
トラヒメナを洗う場合はSMBⅡ（1.5 mM NaCl, 0.05
mM KCl, 0.04 mM CaCl2･2H2O, 0.1 mM MgSO4･7H2O,
0.002 mM EDTA, 2.0 mM Na-phosphate buffer）を用いた。テトラヒメナの増殖曲線を調べる場合、50mlの三角フラスコに10mlの培養液を入れ、初期細胞密度は10 cells/mlとして、23±1℃に保った。その後、毎日、一定量の細胞懸濁液を細胞計算板に移し、ブアン氏液で固定したのち、ズーム式実体顕微鏡の下で数取器を用いて計数した。レタス浸出液に鶏肉を加えて培養したものからの細胞除去液（CFF）は細胞懸濁液をAdvantecのろ紙（NO.2）でろ過し、このろ液を変形遠心管に移し、1500 rpm、5分で遠心して、上清を集めた。この上清をAdvantecのろ紙、DP70でプレフィルトレーションした後、孔径が10 µm、続いて0.45 µmのメンブレンフィルターを通して、テトラ
ヒメナ細胞とバクテリア及び、サイズが0.45 µg以上の混入物を除去して作成した。

された。このことはCFF中にシストを誘導する因子が存在することを示唆している。この因子を特定するためにはテトラヒメナを無菌培養することが重要と考え、テトラヒメナをSMBⅡで8回洗った後、PY培地に抗生物質のペニシリンG（4000 U/ml）と硫酸
ストレプトマイシン（200 µg/ml）を加えて培養を試みた。しかし、この方法ではバクテリアの増殖は抑制できず、さらに作用機序の異なる抗生物質である
バンコマイシン（5 µg/ml）を加えて培養したが、同様に無菌化することはできなかった。そこで0.9％のPY寒天培地を作成し、これに、ペニシリンG、硫酸
ストレプトマイシン、及び、バンコマイシンを同濃度で加えたものに洗ったテトラヒメナを塗布し、テトラヒメナのみが増えている部分を2 mlの新たに作成したPY培地（3種類の抗生物質を同濃度含む）を入れた10 mlの三角フラスコに移し、23±1℃に保った。これによってこのテトラヒメナを無菌的に培養することに成功した。このPY培地における増殖曲線を調べたところ、極めてよく増殖し、最高細胞密度は11日目に約116,000 cells/mlとなり、さらにシストが形成されることも分かった。今後は、培養液中に存在することが示唆されているシスト形成誘導因子
を、この無菌培養系を用いて解明する予定である。

[結果と考察]今回用いたテトラヒメナはバクテリアを加えたレタス浸出液ではほとんど増殖しないが、鶏肉片を加えたレタス浸出液では非常によく増殖し、最高細胞密度は約2,000 cells/mlに達すること、及び、レタス浸出液に肉エキス（2g/1000ml）を加えたものでは培養できないことはすでに報告した６。レタ
ス浸出液に鶏肉片を加えて、2日間培養した対数期細胞を鶏肉片は含まないが、バクテリアを含むレタス
浸出液に移したところ21時間後に3.8±0.8％、27時間
後に3.3±2.7％、45時間後に20.1±10.6%％のシストが形成された。これに対して、対数期細胞をCFFに移し た と こ ろ 21 時 間 後 に 18.1±8.8％、27 時 間 後 に18.2±8.9％、45時間後には43.1±16.4％のシストが形成

cros. Soc., 93, 578-593.
高橋忠夫, 三好孝和, 鈴木武雄, 上滝良一, 砂原俊彦

[文献]
Corliss, J.O. and Esser, S.C． (1974) Trans. Amer. Mi-(2002) Jpn. J. Protozool., 35, 35.
高橋忠夫，三好孝和，鈴木武雄，上瀧良一，砂原俊
彦 （2002） 日本電子ニュース, 34， 6-9.
Tomaru, A. (2002) Zool. Sci., 19, 741-746.
Watoh, T., Yonezawa, M., Nagao, M., Oginuma, K. andMatsuoka, T. (2003) Jpn. J. Protozool., 36, 105-111.
Yonezawa, F. (1985) J. Sci. Hiroshima Univ., Ser. B, Div.
1, 32, 73-82.
Yonezawa, F. and Takahashi, T. (1990) Zool. Sci., 7.
1157a.

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36,第1号
No. 1. 2004年(2003)(2004)
原生動物学雑誌

コルポーダ (Colpoda sp.) におけるシスト形成抑制因子
山崎千春，松岡達臣 （高知大・理・自然）

Encystment-suppressing factors in Colpoda sp
Chiharu YAMASAKI and Tatsuomi MATSUOKA(Inst. Biol, Fac. Sci., Kochi Univ.)
SUMMARYIn Colpoda sp. isolated from fallen leaves, encystment induced by suspending the cells in a saline solution (1 mM
CaCl2, 1 mM KCl, 5 mM Tris-HCl, pH 7.2) was cancelled by bacteria suspended in the surrounding medium. Continuation of uptake of polystyrene latex particles into the food vacuoles caused a slight suppression of encystment. When thecells of Colpoda containing a large number of food vacuoles filled with bacteria were transferred into a fresh saline solution, the contents of food vacuoles were promptly expelled prior to encystment. Supernatant obtained from bacterial
suspension completely suppressed encystment, and dialysis (MWCO: 10,000) of the supernatant reduced encystmentsuppressing effect. The present results indicate that the essential factors for suppression of encystment were certain components derived from bacteria and continuation in simple formation of food vacuoles.
[目的]シスト形成や脱シストは、環境シグナルによはシスト形成がほぼ完全に抑制された。この結果かり活性化される遺伝子発現を伴う細胞内シグナリン

ら、シスト形成を抑制する因子として、１）食胞形

グによってもたらされる劇的な細胞再構築（細胞内成（物理的因子）、２）食胞からの栄養供給、３）分化）の過程である。この現象の分子機構解明の突外液に放出されたバクテリア細胞由来の分子が考え破口を開く戦略の１つは、シスト形成や脱シスト過られる。

程に関与する環境シグナル分子の特定とその標識プ（1）非栄養粒子による食胞形成の効果：バクテリア

ローブを用いた受容体の探索であろう。本研究で用の代わりに非栄養粒子であるポリスチレンラテック

いたコルポーダの場合、シスト形成は塩濃度の上昇

ス粒子（PLP; 直径 1 µm）を外液に懸濁すると（107（乾燥シグナル）によって促進され、外液にバクテ

粒子/ml）、シスト誘導が部分的に抑制された。この。バクテリアによる

結果は、食胞形成という物理的因子がシスト形成をリアが存在すると抑制される

１）

シスト形成抑制因子の候補として、１）食胞形成(物ある程度抑制していることを示している。

理的要因)、２）食胞からの栄養供給、３）バクテリ（2）栄養供給の効果：バクテリアを取り込ませて多ア細胞由来分子の存在が挙げられる。本研究ではこ数の食胞を形成させた細胞を新鮮な塩類溶液に移しれらの候補因子について検討し、主な因子はバクテてシスト誘導を行った。もし、栄養供給がシスト誘

リア細胞成分由来の分子であることを明かにした。

導を阻害するのであれば、食胞が存在する期間はシ[材料と方法]コルポーダ（Colpoda sp.）は乾燥した落ち葉に付着したシストから単離し、バクテリア（Enterobacter aerogenes）を植え付けた麦葉浸出液（0.1％）で培養した。シスト誘導は、2〜3日培養した栄養細胞を標準塩類溶液（1mM CaCl2, 1 mM KCl, 5
mM Tris-HCl, pH 7.2）を含む各テスト溶液に懸濁することによって行った。バクテリアやポリスチレン
ラテックス粒子（PLP）の密度は分光学的に測定した。

スト形成が抑制されるはずである。ところが、シスト誘導液（塩類溶液）に移したコルポーダは、食胞の内容物を速やかに放出した後シスト化した。この
結果は、食胞からの栄養供給がシスト誘導を抑制す
るのではなく、シスト誘導条件に置かれた細胞はシスト化に向かうために積極的に食胞を放棄することを示している。
（3）バクテリア細胞成分の効果：生きたバクテリア
を塩類溶液に懸濁し（106〜108細胞/ml）2日間放置して細胞成分を放出させた。この液中（固形成分は除[結果と考察]コルポーダを標準塩類溶液に移した場

去したもの）では完全にシスト形成が抑制された。

合、数時間以内にほぼ100％の細胞においてシスト形

熱処理したバクテリアを懸濁して得た成分もシスト成が誘導されたが、生きたバクテリアや熱殺菌した形成抑制効果が認められた。これらの結果は、生きバクテリア（107 細胞/ml）を懸濁した塩類溶液中でたバクテリアの代謝産物だけでなくその他の細胞成

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分もシスト抑制因子であることを示唆している。有た、上清を熱処理した場合はその効果が部分的に失効成分の大きさを推定するために生きたバクテリア

われることから、高分子成分も関与している可能性

懸濁液から得た上清の透析を行った。分画分子量がある。

10,000の透析膜を使用した場合、シスト化抑制効果はかなり失われたが完全には抑制されなかった。ま[文献]1）和唐ら（2003）原生動物学雑誌36,105-111.

MPN法による土壌繊毛虫のバイオマス推定における土壌試料の処理について
河知圭介，西内万里，原 安奈，比嘉 望，日隈潤一，杠
（西九州大・生物）

勇治，米村太樹，高橋忠夫

Pre-treatment conditions of the soil samples to the estimationof biomass of soil ciliates using the MPN method
Keisuke KAWACHI, Mari NISHIUCHI, Nozomi HIGA, Jun-ichi HIGUMA, Yuji YUZURIHA, Taiki
YONEMURA and Tadao TAKAHASHI (Biol. Lab., Nishikyushu Univ.)
SUMMARY
The purpose of the work is to clarify the role of soil ciliates in the soil ecosystem, and to establish a method for theevaluation of soil environment by using ciliates’ fauna and biomass. Takahashi et al. (2002) suggested that the soil ciliates’ biomass could be estimated by using the modified MPN method. They did not, however, examine the most efficient method for separating the soil ciliates’ cysts and active forms from the soil particles. Either a vibratory mixer or an
ultrasonic cleaner was used to disperse the soil particles. The survival ratio of the free-swimming ciliate, Paramecium
caudatum, was more than 90% by any of these treatments. In contrast, when the soil samples were treated by using theultrasonic cleaner, the number of the detected ciliates was less than half that detected using the vibratory mixer. Furthermore, it was suggested that 3-5 minutes of treatment using the vibratory mixer is more efficient in separating the soil
ciliates from the soil particles than are the other treatments.
[目的】土壌生態系における繊毛虫の役割を解明し、そこで都城市にある九州沖縄農業研究センターの協さらには、それら土壌繊毛虫相およびそれらのバイ力を得て、家畜由来の有機肥料を投与量、投与方法

オマスから土壌環境を評価する方法の確立を目指しとも厳重な管理の下で長期投与し続けられている圃ている。高橋ら（2002）は土壌バクテリア等のバイ場の土壌を用いた。この圃場は有機肥料投与量が1ha

オマスを推定する手法であるMPN法を改良した方法

当 り 300t、150t、60t の 3 種 類、2 反 復 の 試 験 圃 場 でを用いることで、土壌繊毛虫のバイオマスを推定すあった。対照として有機肥料が撒かれていない自然ることが可能であることを示唆した1‐2。この方法の雑草地土壌を用いた。土壌粒子分散処理による繊毛

場合、繊毛虫の活動体やシストと土壌粒子とを効率

虫のダメージを知るために、レタス浸出液にバクテよく分離することが、正確なバイオマス推定にとっリアを植えた培養液で23℃、2日間培養したゾウリムて重要であるが、この土壌分散処理法については全シ（Paramecium caudatumの株S-1）を用いた。タッく検討されていない。そこで、独自に開発したタッチミキサーを改造した土壌分散装置（1400 rpm）おチミキサーを改良した土壌分散装置と超音波洗浄器

よび超音波洗浄器の処理時間はそれぞれ5 min、10を用いた土壌分散処理が土壌繊毛虫のバイオマス推minとした。一方、サンプル土壌は1.00 gを50 ml遠心定にどのような影響を及ぼすか検討した。

チューブに入れ、レタス浸出液10 mlを加え同様の分【材料と方法】上記の目的のためには、土性やその歴史的背景が明確な土壌を用いることが望ましい、

散処理をした。これを土壌の10倍希釈懸濁液とし、それを10倍希釈系列で100,000倍希釈液まで作製した各希釈液を96穴マルチウェルに8ウェルずつ各ウェル

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原生動物学雑誌

100μl分注し、このような8連反復を2シリーズ作製

散 時 間 は 1min、3min、5min、10min と し た。そ の 結

し、２週間の観察期間で繊毛虫が確認されたウェル

果、土壌粒子分散時間は、ばらつきはあるものの、3数から土壌1g当たりの繊毛虫個体数をMPN法によっ

分または5分処理のとき、最も多数の繊毛虫が検出さて推定した。

れる場合が多かったので、処理時間は3分から5分で【結果と考察】土壌粒子を含まない培養液中を自由遊泳しているゾウリムシは、どの分散処理の後でも90％以上の生残率を示した。サンプル土壌を同様の処理をしたのち土壌１g当りの繊毛虫個体数をMPN法で推定したところ、土壌分散装置を用いた場合では土壌1g当り15,000個体以上生息していると推定されたのに対して、超音波処理では7,000個体以下となった。

十分であるらしいことが示唆された。また、サンプ
ル土壌を室温で1ヶ月保存すると、検出される繊毛虫の個体数は土壌採取直後に比べて60％以下にまで減少した。このことは保存中に、40％以上の繊毛虫が死滅したか、または何らかの理由で脱シストしなくなったことを示唆している。これらのことから、より正確な環境評価を行うための、土壌処理法及び土壌保存法についてさらに検討する必要がある。

このことは、土壌粒子が存在している場合、超音波【文献】

処理では繊毛虫に対するダメージがタッチミキサー

高橋忠夫他（2002）原生動物学雑誌，36，18−19．

処理より大きいことを示唆している。そこで、以後

土壌微生物研究会（1997）土壌微生物実験法，養賢の実験はすべてタッチミキサーで行い、土壌粒子分堂．

家畜スラリー連用圃場における土壌原生動物及び微生物群の動態解明
三好孝和1*，橋本知義1，高橋忠夫2（1九州沖縄農研・土微研，2西九州大・生物，*現在：東北農研）

Dynamics of soil protozoa and bacterial population in upland soil
with slurry application
Norikazu MIYOSHI1*, Tomoyoshi HASHIMOTO1 and Tadao TAKAHASHI2( Natl. Agr. Res. Cent. Kyushu Okinawa Reg., 2Biol. Lab., Nishikyushu Univ. *To whom correspondence should be addressed at Natl. Agr. Res. Cent. Tohoku Reg.)
1

SUMMARY
Effect of manure application on soil protozoan fauna and bacterial populations was examined in the upland soil with
0, 60, 150 and 300t/ha of slurry application levels, which field was located in Natl. Agr. Res. Cent. Kyushu Okinawa
Reg., Miyakonjo-city, Miyazaki prefecture. Soil samples were collected from the surface Kuroboku soil (0-15 cm) on
June 5th 2003. Bacterial population was enumerated with the plate dilution method. Protozoan fauna was examined witha modified MPN (most probable number) method by Takahashi et al. (2003) to enumerate viable number of each identified taxonomical groups. In this study, the amoebae were categorized to 4 morphological groups. The ciliates were identified as species levels. The total count was examined in the flagellate. As increasing the slurry application levels, bacterial and fungi populations were significantly increased in 60, 150 t/ha plots. Flagellate, amoeba and ciliate number werealso increased. The identified group number of amoeba was also increased in the slurry applied plots. The biodiversity ofciliate increased with slurry application levels, 3, 10, 11 and 14 species for 0, 60, 150 and 300 t/ha plots, respectively.
The modified MPN method could be one of valuable tools to analyze the protozoan community structure in soil ecosystems to investigate effect of manure application or other agricultural activities.

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36, No. 1. (2004)(2003)

67[目的] 家畜スラリーの投入が土壌生態系に及ぼす

糸状菌胞子数の計測にRB（rose bengal）培地を用い影響の解析を目的として、家畜スラリー長期連用畑

た。

圃場（新美, 2002）の表層クロボク層における土壌中の原生動物、および微生物群集の動態を調査した。
原生動物については、高橋ら（2003）の改良MPN法を利用し、各分類群ごとに分類を試み、それぞれの生息数の比較を行った。
[材料と方法]—土壌サンプリングー
実験で用いた土壌サンプルは、宮崎県都城市九州

[結果及び考察] 全アメーバ数を処理区別に比較した
ところ、0ｔ区（14,151個体）に比べ、他の3処理区（57,289〜64,812個体）で多い傾向が見られた。これを改良MPN法を用いて分類群別に比較すると、A-2
グループは全ての処理区で確認されたのに対して、
A-3グループは150t区だけで確認された。また、アメーバのグループ数は0t区（2グループ）に比べ、スラリー投入区（3グループ）で多い傾向が見られた。

沖縄農業研究センター内の家畜スラリー連用畑圃場

鞭毛虫の結果は0t区（11,451個体）に比べ、家畜から平成15年6月5日に採集した。採取区画は家畜ス

スラリー投入区（114,525〜313,065個体）が多いとい

ラリー投入量が1ha当たり0t、60t、150t、300tの4処理う傾向が見られた。

区で、深さ約15 cmまでの表層土壌を採取し、2 mm

繊毛虫を種ごとに分類した結果、0tでは3種、60tのふるいに通した湿潤細土を使用した。

区では10種、150t区では11種、300t区では14種とスラ—原生動物の計測（MPN法）—

リー投入量が増加するにしたがって種数が増加する

MPN法（島野ら, 2002）を用いて、土壌原生動物傾向があった。また、処理区別に全繊毛虫数を比較数を推定した。すなわち、土壌サンプル1 gにバクテ

す る と、0t 区（157 個 体）に 比べ、ス ラ リ ー投 入 区

リアを植えたレタス乾葉熱水浸出液10 mlを加えたも（1,714〜2,043個体）で個体数の増加が見られた。

のを10-1 土壌希釈溶液とし、5分間振とう分散処理し微生物群集の結果は、DNB培地、およびRB培地にた後、10倍希釈系列を作製した。これらをアメーバ

おいて生菌数がスラリー投入により有意に増加した類と鞭毛虫類観察用として96穴マルチウエルに、繊（DNB 培 地（Log10）： 0t 区 7.55、ス ラ リ ー 投 入 区

毛虫類観察用として3穴のデプレッション・スライド

7.70〜7.87、RB培地（Log10）：0t区 5.1、スラリー投に100 µlずつ分注し、20±1℃で培養した。検鏡期間は入区 5.4〜5.5）。しかし、300t区は0t区に比べ多い傾

培養開始後2週間、実験開始1日目から8日目までは1向を示したが、処理区間に有意差は認められなかっ日おきに、9日目から14日目までは2日おきに観察すた。

るものとし、1処理区について合計6回の観察を行った。

今回の実験では家畜スラリー投入により、微生物
および原生動物群の生息数は増加するものの、両者改良MPN法により各原生動物を分類した。アメーに明らかな相関は見られなかった。しかしながら、バ類は4つのグループ、すなわち、形を変えずに移動改良MPN法により、グループごと、また、種ごとのするグループ（A-1）、仮足を伸ばしながら移動する

生息数を明らかに出来ることから、各処理区の種構

グループ（A-2）、初めに透明な部分が広がり、その成、および個体数の違いといった群集構造を解析出後、その部分に向かって収縮するグループ（A-3）、来ることが示唆された。今後は、家畜スラリー投入

有殻アメーバ類と思われるグループ（A-4）に分類し量と微生物、ならびに原生動物群との関係を明らかた。

にするために、土壌環境の季節変動、年次変動につ鞭毛虫類については今回グループ分けを行わなかった。
繊毛虫類の分類は形態情報、遊泳方法などの種々の情報を用い、それぞれの処理区について種数、および個体数を推定した。
—微生物数の測定（希釈平板法）—
各種微生物群集の計数は希釈平板法を用いて行った（大 田、1992）。こ の 場 合、一 般 細 菌 数 用 に NB
（nutrient broth）培地を、低栄養細菌用にNB培地を100倍希釈したDNB（diluted nutrient broth）培地を、いても検討を行う必要がある。
[文献]
1) 新美洋 (2002) システム農学. 18, 161-173.
2) 太田寛行 (1992) 土壌バイオマス測定法. pp.35-41,
土壌微生物研究会編. 新編土壌微生物実験法, 養賢
堂，東京．
3) 島野智之ら (2002) 原生動物学会誌. 35, 41.
4) 高橋忠夫ら (2003) 原生動物学会誌. 36, 18-19.

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Jpn. J. Protozool.第37巻Vol. 37,
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No. 1. 2004年(2003)(2004)
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異なる環境下に生息する土壌有殻アメーバ（I）
島野智之1，盛下

勇2（1東北農研・福島，2土木研）

Comparison of soil testatate communities under the various environments (I)Satoshi SHIMANO1 and Isamu MORISHITA2( National Agricultural Research Center Tohoku Region, 2 Public Works Research Institute)
1

SUMMARY
We conducted a preliminary study of enumerating soil testate amoebae by culture method (easy-to-use method)and direct counting method, and of species inventory by SEM observation. Soil samples were taken from the several
environments around this conference space (Nippon Veterinary and Animal Science University) before four months ago.
The soil sample were taken from 5 materials: 1) the dry gravel of bicycle-parking space of the university , 2) the moss on
the Castanopsis tree trunk near bicycle-parking, 3) fresh fallen leaves of the Castanopsis tree, 4) the soil (A1 layer) of theplantation of the entrance turn in the front of the train station, 5) fresh fallen leaves (A0 layer) of the Zelkova tree mainlyin the plantation. The population of the tastacea included plasma body g-1 by culture method were 20, 667, 713, 806 and
1520 for the Castanopsis litter, the moss of the Castanopsis tree trunk, the Zelkova litter, the soil of the plantation and the
dry gravel of bicycle-parking, respectively. The population of the tastacea included plasmabody g-1 by direct counting
method were 36, 152 and 316 for the Zelkova litter, the soil of the plantation and the moss on the Castanopsis tree trunk,
respectively. The other samples included only empty test. The following species were identified from the soil of theplantation with SEM observation: Assulina sp.; Centropyxis af. minuta Deflandre; Centropyxis sp.; Cyclopyxis sp. 1;
Cyclopyxis sp. 2; Plagiopyxis declivis Thomas; Trinema encherys Dujardin. Also, the following species were identified
from the moss on the Castanopsis tree trunk with SEM : Centropyxis elongata Penard; Centropyxis minuta Deflandre;
Centropyxis sp.; Cyclopyxis cf. eurystoma Deflandre; Euglypha compressa Carter; Euglypha cristata Leidy; Euglypha
tuberculata Dejardin; Trinema encherys Dujardin.
[目的] 土壌に生息する有殻アメーバは，これまでに

1）培 養法（簡便 法）：土 壌 3ｇ ま たは 落 葉を 直 径

約300種が記載され、さらに各々には多くのバリエー

9cmシャーレの1.5％素寒天に静置した。10mlの蒸留ション（変種）が記録されている。

水を添加し、湿度ほぼ100％のタッパウエアに入れ、さまざまな環境下における有殻アメーバ相を今後

25℃で4ヶ月間培養するという最も簡単な方法をとっ比較し，明らかにしてゆきたいと考えている。その先た。餌としてのバクテリアも添加しなかった。Stout

駆けとしてまず足下の土壌にも，たくさんの有殻ア(1958)やFoissner (1992)のように土壌試料に水分勾配

メーバが生息していることを検証したいと考え，学会のための傾斜はつけなかった。また，石井(1999)など

会場とその周辺の土壌試料を用いて，土壌から有殻アのように培養液・緩衝液も使用しなかった。培養

メーバを検出する方法の検討と，それにより出現した

後，100μlずつ5回培地中より土壌懸濁液を採取し個種を整理した。

体数を計測し平均化した。

[材料と方法]—土壌試料の採取—実験で用いた土壌試料は，2003年5月24日に，第36回原生動物学会大会会場：日本獣医畜産大学構内の
1）駐輪場の乾燥した砂利，2）シイ林の樹幹のコケ類，3）シイの落葉，4）JR武蔵境駅南口ロータリー
内（都市植栽）の土壌（A1層），5）ロータリー内に植裁されたケヤキの落葉層（A0 層）およびそこに含まれる未分解の落葉として採取した。
—検出法の検討—

2）modified Aoki & Coûteaux法 (Coûteaux, 1967; Aoki,
2003)：250 mgの湿土壌試料を80 mlの溶液にし100mlのビーカーに懸濁した。この際フェノリックアニリ
ンブルーを滴下し，殻の中の細胞質の有無を確認した。スターラーを使用し600 rpmで90分撹拌した。懸濁液は、最終濃度2 mMのNa4P2O7 を含む，リン酸緩衝液（Na塩；pH6.5）を使用した。次に土壌懸濁液を175Ｇにて、20分遠心した。バクテリア細胞や細かな粘土鉱物を含む上清を捨てるが，上清には1%以下の有殻アメーバしか含まれない(Aoki, 2003；島野ら，

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J. Protozool.第37巻Vol. 37,第1号
No. 1. 2004年(2004)
原生動物学雑誌
第36巻
2003年

未発表)。回収率はほぼ99%であった。沈殿は、懸濁6969

幹のコケ（316）の順であった。

液で0.1〜0.2の間の吸光度OD660 に懸濁した。ニュク

出現頻度の高いTrinema 属とEuglypha属とその他

リポァーフィルター直径25 mm上に透過させた。

の属に分けた再計測では「シイ樹幹のコケ」で， 1

フィルターは，カナダバルサムにて透徹できるた

ｇの試料あたりその他の属が220個体で最も多く，め，スライドグラスの上に静置し，26 mmの方形カ

Trinema 属80個体，Euglypha属88個体となった。

バーグラスをかけて封入保存した。

無栄養の本培養法では，砂利のような土壌有機物—SEM（走査型電子顕微鏡）用試料の作成と同定—の少ない試料の有殻アメーバが良く増殖し，直接検試料は「ロータリーの土壌」と「シイ林樹幹のコ

鏡では，樹幹のコケのような有機的試料に最も多くケ」を用いた。既述のmodified Aoki & Coûteaux法にの有殻アメーバが検出される傾向がみられた。

より，フィルター上の土壌試料を26mmの円形カバー

3）SEM観察によって，ロータリーの土壌からは，グラス上に導電性銀ペーストで接着し，さらに試料

Assulina sp.；Centropyxis af. minuta；Centropyxis sp.；

台に両面テープで接着した。試料に白金蒸着をおこ

Cyclopyxis sp. 1 ； Cyclopyxis sp. 2 ； Plagiopyxis de-

なったあとSEM(HITACHI, S-3000N)で加速電子5〜

clivis；Trinema encherysの計7種，シイ樹幹のコケか

10kvにて観察した。
[結果および考察]

ら は，Centropyxis elongata ； Centropyxis minuta ；1）培養法では，細胞質の入っている全有殻アメーバの1 gあたりの平均個体数は，シイ落葉（20）＜シイ樹幹のコケ（667）＜ロータリーのケヤキ落葉（713）＜ロータリーの土壌（806）＜
駐輪場の土壌（1520）の順であった。常緑広葉樹の
シイの落葉を寒天上に静置した処理区からは，培養される個体はごくわずかしかなかった。
出現頻度の高いTrinema 属とEuglypha属とその他のCentropyxis sp.； Cyclopyxis cf. eurystoma ； Euglypha
compressa；Euglypha cristata；Euglypha tuberculata；
Trinema encherys の計8種が同定された。なおこれは棲息種の一部である。
JRバスロータリーなどの都市植栽，大学の駐輪場の砂利などわずかの土壌があれば有殻アメーバは生息していることが明らかになった。
[文献]

属に分けて，再計測したところ，ほとんどの処理区

1) Aoki S (2003) J. Microbiol.Methods, 55:791-795.

でTrinema 属が優占した。しかし，シイ林樹幹のコケ

2) Coûteaux M-M (1967) Rev. Ecol. Boil. Sol. 4: 593-596.
3) 石井圭一 (1999) アメーバ図鑑, 掘上英紀･木原章編

類では，Euglypha属が優占した。ロータリー内の土壌ではEuglypha属が少なく，その他の属がこれを上回った。

金原出版, 253p. 東京.
4) Stout JD (1958) Biological studies of some Tussock-2）modified Aoki & Coûteaux法では，「駐輪場の乾燥

grassland soils VII. Protozoa, New-Zealand Journal

した砂利」，「シイの落葉」からは，細胞質の入っof Agricultural Research, 1: 974-984.

ている殻は検出できなかった。細胞質の入っている

5) Foissner W (1992) Protocols in Protozoology. Society

有殻アメーバの1 gあたりの個体数はロータリーのケ

of Protozoologists, Allen Press, Lawrence, Kansas,

ヤキ落葉（36）＜ロータリーの土壌（152）＜シイ樹

B-10.1 - B-10.2.

ラオス産オオシロアリ科２種の共生鞭毛虫組成
北出 理，近藤武司（茨城大・理）Symbiotic flagellate faunae of two termopsid termites from Laos
Osamu KITADE, Takeshi, KONDOH (Faculty of Science, Ibaraki University)
SUMMARY
The termite family Termiosidae, consists of five genera, is known to have diverse symbiotic flagellate faunae. In
this study, we investigated symbiotic flagellates from two termopsid species, Archotermopsis sp. and Hodotermopsis

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36,第1号
No. 1. 2004年(2003)(2004)
原生動物学雑誌

sjoestedti from northern Laos. Stained specimens of intestinal contents were observed on three colonies of the former
and on four colonies from the latter. The materials were fixed with 1% OsO4 and Schaudinn’s fluid and subjected toprotalgol staining. A. sp. possessed five flagellate species that belong to five genera, sharing Trichomitopsis and Protrichonympha with A. wroughtoni in northern India. It also shared four flagellate genera with Zootermopsis spp. in North
America, suggesting these two host genera are closely related taxa. Hodotermopsis sjoestedi from Laos retained 20 species that belong to nine genera. The fauna was identical to that of populations from Japan, China, and Taiwan and was
greatly different from that of Archotermopsis spp. and Zootermopsis spp. A preliminary analysis of host phylogeny
based on COII gene showed good correspondence to the similarity patterns of symbiotic flagellate faunae.

[目的]オオシロアリ科は、大型で祖先形質を多く残はTrichomitopsis sp.とStreblomastix sp.が優占した。生すシロアリの分類群であり、5属15種の既知種からな体の観察ではさらに１種が確認されたが、染色標本る。本科のシロアリは世界の温帯域に遺存的に分布では確認できなかった。この鞭毛虫の属組成はインする。北半球では、北米にZootermopsis属の３種、イド北部の同属 のA. wroughtoniとTrichomitopsis, Pro-ン ド 北 部 に Archotermopsis 属 の １ 種、南 西 諸 島・台trichonyphaの２属を共有する。しかしながら、北米

湾・中国南部・北ベトナムにHodotermopsis属の１種の Zootermopsis 属 の 宿 主 と も Trichomitopsis 属、が分布する。オオシロアリ科の共生鞭毛虫はシロア

Tricercomitus属、Hexamastix属を共有し、両者の中間

リ類全体の中でも多様であることが知られ1)、シロア

的な組成であった。原生生物組成が宿主系統を強くリの共生鞭毛虫相を理解する上で重要な分類群であ反映するとすれば、これらのシロアリは系統的にかる。本研究ではラオス北部のPam 山においてオオシなり近い関係にあることが示唆される。これに対し

ロアリ科の２種を採取し、その鞭毛虫組成を検査すてラオスで採集されたHodotermopsis sjoestedtiの原生ることで本科の鞭毛虫組成についてさらに検討を加

生物は南西諸島を含む東アジアの個体群と全く同じ9えた。

属20種からなる組成を持っていた。この鞭毛虫組成[材料と方法]オオシロアリ科に属する２種のシロア
リ（Hodotermopsis

sjoestedti お よ び Archotermopsissp.）はハンマーを用いて倒木を崩し、採集した。消化管内容物ははじめに１%オスミウム酸を用いて固定し、ゼラチン・アルブミン接着剤でカバーガラスに接着した後、数分間冷却固化させ、さらに酢酸を抜いたSchaudinn液（昇汞飽和水溶液：90％エタノー
ル ＝ ２： １）で 固 定し た 後、ヨ ウ素 で 脱昇 汞 し、
70％エタノール中で保存した。染色はプロタルゴー
ル鍍銀法2)によって行った。H. sjoestedtiについては４
コロニー、A. sp. については３コロニーの標本を作製し、検査した。
[結果と考察]Archotermopsis sp.からはトリコモナス
目のTrichomitopsis sp., Tricercomitus sp., Hexamastix
sp., 超鞭毛虫目のProtrichonympha sp., オキシモナス目のStreblomastix sp.の5属５種が確認された。個体数ではArchotermopsisやZootermopsisのもつ鞭毛虫組成と大きく異なるものであり、Hodotermopsis属は北半球の他の２属のオオシロアリ科とはやや遠いグループである可能性が示唆される。北半球のオオシロアリ
科３種対象とした、最近のミトコンドリア遺伝子（COII）の配列にもとづく分子系統解析（松本他、
未 発 表）の 結 果、ラ オ ス 産 Archotermopsis sp.はZootermopsis nevadensis と 姉 妹 群 と な り、ラ オ ス 産
Hodotermopsisは日本や中国の同属のクレードの内部に完全に含まれた。これは原生生物組成の結果とき
れいな対応を示す。
[文献]
1) Yamin, M. A. (1978) Sociobiology. 4, 1-119.
2) Honigberg, B. M. & Davenport, H. A. (1951) Stain
Technology. 29, 241-246.

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36, No. 1. (2004)(2003)

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繊毛虫ブレファリズマの接合誘導物質（ガモン1）の大量発現系の構築
杉浦真由美，春本晃江（奈良女子大学大学院・人間文化研究科・共生自然科学専攻）

Expression system of the conjugation-inducing substance (gamone 1) in the ciliate
Blepharisma japonicum
Mayumi SUGIURA and Terue HARUMOTO(Graduate School of Human Culture, Nara Women’s Univ.)
SUMMARY
Conjugation in the ciliate Blepharisma japonicum is induced by interaction between complementary mating-type
cells, types I and II. When mature cells are moderately starved, they start expressing the conjugation-inducing substances,gamones. Gamone 1 produced by type I cells is a glycoprotein consisting of 272 amino acids and 7 sugars. Gamone 2
produced by type II cells is a small molecule that was identified as 3-(2’-formylamino-5’-hydroxybenzoyl) lactate. In thisstudy, we precisely analyzed the structure of gamone 1 to speculate on the functions of gamone 1 in the conjugationinducing process. The results showed that gamone 1 has several interesting motifs including four possible attachment sitesof N-linked oligosaccharide and five phosphorylation sites. The prediction of secondary structure indicated that gamone 1
is composed of two domains, one of which consists of alpha-helices and beta-sheets, the other of only beta-sheets. We also
estimated the tertiary structure of gamone 1 by the 3D-1D method, which showed that the tertiary structure of gamone 1 hassignificant homology to that of cathepsin B-like cysteine protease. We constructed an expression system of His-tagged
gamone 1 by integrating mature gamone 1 cDNA with pQE60 vector (QIAGEN).
[目的] 繊毛虫類異毛綱に属するブレファリズマに

MAC 10.1〕、二 次 構 造 予 測〔European Molecularは、相補的な接合型であるI型とII型があり、性的にBiology Laboratory ( EMBL ) 提供The Predictprotein

成熟した細胞が適度な飢餓状態におかれると相補的server〕、立体構造予測〔3D-PSSM Server〕。

な接合型細胞間で接合対を形成し、有性生殖（接Hisタグ標識したガモン１の大量発現系を構築する

合）を開始する。接合対の形成は、両接合型細胞がため、matureガモン１配列をPCRで増幅後、pCR2.1-

合成、分泌する接合誘導物質、ガモンを介した細胞

TOPOベクター(Invitrogen)でクローニングし、pQE60

間相互作用の結果引き起こされることが知られていベクター（QIAGEN）でサブクローニングした。作る。ブレファリズマのガモンはすでに単離同定され製 し た プ ラ ス ミ ド を ホ ス ト 大 腸 菌 株（BL21-ており、I型細胞が合成するガモン１は、272アミノ

CodonPlus-RIL）に導入し、1 mM IPTGを添加してタ酸と７つの糖からなる糖タンパク質であることが報

ンパク質合成を誘導した。誘導後、0, 2, 4時間後にサ告されている1) 2) また、II型細胞が合成するガモン２

ンプリングし、可溶性画分、不溶性画分を抽出しては、3-(2’-formylamino-5’-hydroxybenzoyl) lactate と し

SDS-PAGE で 分離 し た。ま た、SDS-PAGE 後、PVDFて同定されている3)。しかし、これらの物質が、接合膜にトランスファーし、抗His抗体を用いてウエスタを誘導する際にどのようにはたらいているのか、そンブロッティングおよびN末端アミノ酸配列分析をの詳しい作用機序については明らかにされていな行った。Hisタグ標識タンパクは、Ni-NTAアガロー

い。本研究では、ブレファリズマにおける接合誘導

スビーズとHisタグの親和性を利用して精製した。

の分子機構を解明することを目的として、ガモン１のはたらきを明らかにするため、その分子的特徴を解析した。また、受容体を始めガモン１と相互作用する分子の探索やガモン１の活性部位を明らかにするために、ガモン１の大量発現系の構築を試みた。

[結果と考察] ガモン1のアミノ酸配列をPSORT II
predictionを用いて解析したところ、ガモン1は、N末端に16アミノ酸の分泌シグナルペプチドをもつ細胞
外タンパク質と予測された。この結果とガモン1のN
末端アミノ酸配列分析の結果から、ガモン1の生合成[方法] 各解析は、以下のソフトおよびサーバーを用過程を推定した。ガモン1は、305アミノ酸のpreproガ

い て 行 っ た。細 胞 内 タ ン パ ク 質 局 在 部 位 予 測

モン１として合成された後、分泌シグナルが切断さ〔PSORT II prediction 〕、モチーフ検索〔GENETIX-

れて289アミノ酸からなるproガモン１として小胞体

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第36巻 第1号 2004年
2003年

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内へ送られ、さらに細胞外へ小胞輸送される過程で大 量 に 得 ら れ る よ う な 発 現 系 の 構 築 を 試 み た。

糖鎖の付加およびプロセシングを受け、最終的に272

Matureガモン1の配列をpQE60ベクターに挿入して大アミノ酸からなるmatureガモン１になると考えられ腸菌に導入しタンパク質発現を誘導した結果、誘導た。モチーフ検索を行った結果、４箇所のN-結合型

後の時間経過に伴って発現量が顕著に増加する４つ糖鎖結合部位、１箇所のGlycosaminoglycan attachmentのタンパク質が検出された。その中で最も発現量がsite、４箇所のProtein kinase C phosphorylation site、１多くガモン1の分子量（約30 kDa）に相当するタンパ

箇所のTyrosine kinase phosphorylation site、６箇所のク質に注目し、ウエスタンブロッティングによるHis

N-myristoylation site、４箇所のMicrobodies C-terminal

タグの検出およびN末端アミノ酸配列分析を行った

targetting signalが検出された。ガモン１は、シンプル

ところ、このタンパク質が全長のHisタグ標識ガモン

な構造のN-結合型糖鎖をもつと推定されているが、1であることが確認された。得られたHisタグ標識ガ検出された４箇所のN-結合型糖鎖結合部位の何れか

モン1をNi-NTAビーズを用いて精製し、バイオアッ

１箇所に糖鎖が付加されていると考えられた。二次

セイを行った結果、ガモン1がもつ接合誘導活性は見

構造予測を行ったところ、ガモン１の前半約３分のられなかった。その主な原因として、Hisタグ標識ガ２の領域はα‐へリックスとβ‐シートが混在した

モン1の大部分が不溶性画分に移行してしまったた

構造をしており、後半３分の１の領域は主にβ‐め、本来の立体構造が保持されなかったと考えられシートで構成されていると予測され、ガモン１は大る。したがって、活性のある組換えガモン1を得るた

きく二つのドメインから成っていると考えられた。

めには更なる検討が必要であるが、今回構築した系

３D-1D法によりガモン１の立体構造を予測した結によって多量のHisタグ標識ガモン1を発現すること

果、ガモン１の立体構造と高い類似性をもつものとが可能になり、ガモン1の抗体作製などに活用できる

して、cathepsin B-like cysteine proteaseが検出された。

と考えられた。

ガモン１の立体構造は、この構造とかなり高い類似性をもっていると考えられるが、cysteine proteaseに共通して見られる活性中心は保存されていないため
cysteine proteaseとしての機能はないと思われた。
次に、解析結果をもとにガモン１の活性部位および機能を実験的に調べるため、またガモン１受容体の探索やガモン１抗体の作製のために、ガモン１を[文献]
1) Sugiura, M. and Harumoto, T. (2001) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 98(25), 14446-14451.
2) Harumoto, T. and Sugiura, M. (2003) Jpn. J. Protozool.,
36(2), 147-172. (in Japanese)3) Kubota, T., Tokoroyama, T., Tsukuda, Y., Koyama, H.
and Miyake, A. (1973) Science, 179, 400-402.

小麦胚芽レクチン(WGA)のParamecium caudatum 接合対形成に与える影響
福家有子1,2, 佐藤勝幸2 (1兵庫教育大院・連合学校教育学、2鳴門教大)The influence of wheat germ agglutinin on mating pair formationin Paramecium caudatum
Ariko Fuke1,2 and Katsuyuki Sato2 (1Joint Graduate School in the Science of School Education, Hyogo
University of Teacher Education, 2Naruto University of Education)
SUMMARY
Conjugation is a sexual process in ciliates induced by mixing complementary mating type cells. Previous studies
indicated that concanavalin A (ConA) inhibits mating pair formation in Paramecium caudatum, and wheat germ agglutinin (WGA) inhibits mating pair formation in both P. tetraurelia and P. primaurelia. In the mating reaction, cells adhereJpn. J. Protozool. Vol. 37,
36, No. 1. (2004)(2003)

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at the anterioventral surface (holdfast union) and later the adhesion spreads over the whole ventral site (paroral union). It
has been also shown that labeling of the cell by FITC-WGA starts at the anterioventral adhesion sites during the holdfast
union stage and later spreads over the whole ventral site. The aim of this study was to investigate the mechanism of
mating pair formation by using WGA and FITC-WGA in P. caudatum mating cells. A low concentration of WGA(above 1.5 µg/ml) inhibited mating pair formation. This indicates that the WGA binding sites are involved in intercellular adhesion and cell fusion at conjugation in P. caudatum. In conjugating cells at early stages (0-2h after mixing cells),
appreciable staining was not detectable. But conjugating cells at the holdfast union stage began to be stained at the anterioventral adhesion site and later FITC-WGA staining spread over the whole adhesion site. After the mating pair separated, cells were stained only at the oral regions. At more advanced stages, appreciable staining was not detectable. It
seems that WGA binding sites may be transported from the intracellular region to the cell membrane.

[目的〕繊毛虫Paramecium caudatumは接合と呼ばれFITC-WGA染色は接合細胞懸濁液に最終濃度が30る有性生殖を行い、接合は相補的接合型の細胞を混µg/mlになるようにFITC-WGAを加え、その後４％パ合することにより開始される。相補的接合型を混合

ラホルムアルデヒドで固定、PBSで洗浄を行った。

した直後に交配反応と呼ばれる現象が起こり、交配

接合段階を確認するためにDAPIで核染色を行い、蛍反応後に細胞口がある腹側の細胞先端表面が接着し光 顕 微 鏡 で 観 察、写 真 撮 影 を 行 って接合対を形成する。接合が進行すると接合対の接た。

着は細胞の腹側全体に及び、部分的に膜融合を起こすため結合はより強固なものとなる。そして、小核の減数分裂により生じた配偶核が接合対を形成している細胞間同士で交換され受精核を形成し、接合対が離れる。しかし、接合の初期段階から特定の糖配列を認識し、結合するレクチンの一種であるコンカ
ナバリンA (ConA)を作用させると交配反応は影響を受けないが、接合対形成は阻害されることが明らかとなっている1)。またP.t etraureliaやP. primaureliaでは小麦胚芽レクチン(WGA)が接合対形成を阻害し2)3)、P. tetraureliaにおいてはFITC-WGAによって接合面が染色されることが明らかとなっている2)。これ
ら の こ と か ら P. caudatum や P. tetraurelia、P. primaureliaの接合対形成には糖鎖が関与することが示唆されている。
今回、接合対形成のメカニズムを明らかにするために、P.tetraureliaやP.primaureliaの接合対形成物質、及び他の細胞の細胞間接着に関与すると思われる糖鎖を認識し、結合するWGAを用いて接合に与える影響を調べた。
〔方法〕本研究ではP. caudatumのKNZ５(接合型O)とKNZ２(接合型E)を用いた。WGAの接合阻害作用は2500cells/mlの 相補的接合型細胞を等量、デプレッ
ションスライドガラスで混合し、混合時にWGAを最終濃度が０〜３µｇ/mlになるように加え、５〜６時間後に固定して接合率を算出した。

〔結果および考察〕WGAによる接合対阻害実験は、
1.0 µg/mlで接合対阻害作用がみられ、1.5 µg/ml以上の濃度で対形成がほとんど阻害された。FITC-WGA
染色の結果は接合の初期段階(細胞混合後０〜２時間)
では顕著な染色は見られなかった。しかし、接合が進み、細胞同士の接着が強くなると接合面に染色がみられはじめ、対が強固に接着すると接合面に顕著な染色が見られるようになった。この接合面のFITCWGAによる染色は接合対が離れはじめるまで続き、受精核が形成されて接合対が離れた後は細胞口や接合面であった部分の一部に染色が見られるのみとな
り、さらに時間が経つと顕著な染色はみられなくなった。
以上の結果よりWGA結合部位は接合対形成において細胞同士の接着や膜融合に関与していると思われ、その部位に存在する糖配列はWGAが認識するN-アセ
チルグルコサミンもしくはN-アセチルノイラミン酸(シアル酸)を有すると思われる。
〔文献〕
1)Tsukii, Y and Hiwatashi, K.(1978) J.Exp.Zool.204,171179
2)Pape,R., Haacke-Bell,B., Luthe,N. and Plattner,H.(1988)
J.Cell.Sci.90,37-49
3)Delmonte Corrado MU, Locatelli D, Paleari L, Bottiroli
G.(1997) J.Euk.Microbiol.44,603-608

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2003年

74

Paramecium 属のsyngen と遺伝的種の分子系統的な関係について
堀 学, 藤島 政博（山口大・理・生物科学）

Comparison of the evolutionary distance among the syngens and the genetic speciesof the genus Paramecium using hsp70 sequences
Manabu HORI and Masahiro FUJISHIMA (Dept. of Biosci., Fac. of Sci., Yamaguchi Univ.)
SUMMARY
The morphological species Paramecium aurelia includes fourteen biological (=genetic) species that are sexually
isolated from each other. These biological species were initially defined as syngens, because they are sibling species which
could be categorized previously only by mating tests. The mating-type groups of the other Paramecium species, such as P.
caudatum, are also called syngens for the same reasons. Following Sonneborn’s establishment of classification criteria
based on isozyme analysis, the syngens of P. aurelia became recognized as genetical species. However, molecular markers
for the classification of the syngens of the other Paramecium species is not yet established. Previously, we demonstrated
that the relationships among the syngens of P. caudatum were not clear based on analysis of hsp70 sequences. In thepresent study, to investigate the evolutional relationships between the syngens and the biological species, we analyzed thecytosolic hsp70 genes from 44 strains of P. aurelia complex, P. caudatum and P. multimicronucleatum. We constructed
phylogenetic trees for each set of sequences using ME methods. The resulting tree had shown that the divergent time
among the biological species of P. aurelia complex is evidently earlier than that of among the syngens of P. caudatum.
[目的]P. aurelia complexは、複数の同胞種で構成さ

cytosol型 hsp70遺伝子の断片は、pGEM-T easy vector

れ、これらは、遺伝的には隔離されているが、凝集にクローニングし、塩基配列を決定した。分子系統

反応によってしか分類できないことから、Sonneborn

樹の作成には、既知の”bursaria” groupのcytosol型hsp

は、種とは区別してsyngenと名付けた。その後、ザ70遺伝子をoutgroupとして、分子系統樹推定プログラ

イモグラムなどによって、記載による種の同定が可ムMEGAを用いてME法による系統樹を作成した。

能になったことから、syngenから遺伝的種へと格上げされた。しかし、P. caudatumを初め、多くの原生生物に存在する接合型グループは、記載による種の同定が不可能であるため、現在でもsyngenと呼ばれている。ところが、P. caudatumのsyngenは、P. aurelia complexで定義されたsyngenとは異なり、syngen
間雑種に稔性がある。これは、遺伝的隔離のレベルが異なることを意味しており、本来のsyngenと現在使われているsyngenは、進化的に異なる単位であると考えられる。
本研究は、P. aurelia coplexの遺伝的種とP. caudatumなどのsyngenの進化的な位置関係を知ることを目的に行った。

[結果と考察]今回用いた3つの形態種の全ての系統か
ら、418bpのPCR産物が得られた。同じ形態種の系統間での相同性は、90%以上であり、この3種の形態種間でも80%以上の相同性があった。これらの塩基配列を元に、ME法による分子系統樹を作成した。
P. aurelia complexは、大きく6つのクラスターに分かれ、それぞれのクラスター間の進化距離は、今回の3つの形態種間の進化距離の半分程度であった。又、同じ遺伝的種に属する系統は、採集地が異なっていても、収束する傾向があった。このことは、各々の遺伝的種が、分化してからの時間は長くはないが、遺伝子レベルで隔離が起こっていることを示している。

ところが、P. caudatumは、これまでに得られ[材料と方法]P. aurelia complexの14種とP. caudatum

た結果と同様、ひとつのクラスターを形成し、各々の7syngen、及び、P. multimicronucleatumのsyngen2との系統間で進化距離はなく、各syngenの特異性や採野生株を材料に用いた。cytosol型hsp70遺伝子は、P.

集された地域の特異性を反映するような収束は見ら

caudatum SE2株で得られた塩基配列をもとにprimerをれ な か っ た。又、P.

作成し、418bpの断片を増幅した。templateは、細胞

syngen2と野生株との間で、大きな分岐は見られず、を ドリ ル液 で洗 浄 後、そのま ま、PCR tube に 加え

P. caudatumで見られた結果と同様に、系統間の進化て、95℃で 10分 加 熱し た もの を 用い た。得 ら れた

距離がないクラスターを形成した。これらの結果

multimicronucleatum で も、

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36, No. 1. (2004)(2003)

は、P. caudatumやP. multimicronucleatumのsyngenは、性的な隔離が起こってからの時間が短く、各syngen
間での遺伝的な隔離が十分ではないため、現在も、syngen間で遺伝子交流が起こっている可能性を示している。従って、現在、P. caudatumやP. multimicronucleatumの接合型グループに使われているsyngenという分類は、Sonnebornが定義したsyngenとは異質であるため、syngenの共通認識を新たに定義し直す必75

要があると考えられる。
[文献]
Hori, M., Tomikawa, I. and Fujishima, M. (2001) Jpn. J.
Protozool. 34, 21.
Tsukii, Y. (1994) Jpn. J. Genet. 69, 307-319.
Sonneborn, T. M. (1975) Trans Am Microsc SOC. 94,
155-178.
Sonneborn, T. M. (1957) In: The species problem. 155-

宿主からの継続的な遺伝子転移(LGT)は寄生生物の進化を駆動しうるか？：
中生動物ニハイチュウ＝キメラ説の提唱
能登朋子，遠藤浩（金沢大・理・生物）

A chimera theory on the origin of dicyemid mesozoans: Evolution driven by frequent
lateral gene transfer (LGT) from the host to parasites
Tomoko NOTO and Hiroshi ENDOH (Dept. Biol., Fac. Sci., Kanazawa Univ.)
SUMMARY
The phylogenetic status of the enigmatic dicyemid mesozoans is still uncertain. Are they multicellular protozoans
or degenerate triploblastic animals? Presently, the latter view is favored. A phylogenetic analysis of 18S rDNA sequences placed dicyemids within the animal clade, and this was supported by the discovery of a Hox-type gene with alophotrochozoan signature sequence. This molecular information suggests that dicyemid mesozoans evolved from anancestral animal degenerately. Considering their extreme simplicity, they might have come from an early embryo via
neoteny. In spite of this molecular information, dicyemid mesozoans retain many protistan-like features, such as doublestranded ciliary necklace, tubular mitochondrial cristae, endocytic ability from the outer surface, and the absence of collagenous tissue, while they do not share noticeable synapomorphy with animals. In addition, the 5S rRNA phylogeny
suggests a closer kinship with protozoan ciliates than with animals. If we accept this clear contradiction, dicyemids
should be regarded as a chimera of animals and protistans. Here, we propose a new “chimera” theory: Dicyemid mesozoans are exposed to a continual flow of genetic information via eating host tissues, because of their absolute dependency
on the host for nutrients. Consequently, many of their intrinsic protozoan genes have been replaced by host-derived
genes through lateral gene transfer (LGT), implying that LGT is a key driving force in the evolution of dicyemid mesozoans.
30に正しいのだろうか。ニハイチュウは多くの原生生物的特個ほどの細胞からなる単純な体制の多細胞生物である。

徴をもつのに対し、動物との共有派生形質はほとんどな

その単純な体制から、van Beneden は 1867 年に原生動物い。ここでは、そのような分子情報と生物学的特徴との矛と後生動物をつなぐ中間的な生物として、中生動物なる名

盾をクローズアップし、この矛盾を解消する新たな説とし前を与えた。現在、三胚葉動物が寄生生活に適応し二次て、中生動物キメラ説を考察する。

[背景と目的]中生動物ニハイチュウ類は、およそ的に単純化したとする寄生・退化説と、ニハイチュウは原生動物が独自の多細胞化を遂げたとする多細胞原生動
物説とが対峙している。昨今の分子生物学的研究から、退化説が受け入れられる傾向がある。しかし、この説は本当[退化説の検討]1883 年、Whitman はニハイチュウの体制の単純さは、まったく原始的なものではなく、動物が寄生生活に適応した結果、二次的に獲得されたものとする見解を表明した。以来この説を支持する研究者は多い。18S

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原生動物学雑誌 第37巻
第36巻 第1号 2004年
2003年

rDNA による系統解析は、ニハイチュウを三胚葉動物内にるタコに栄養物のすべてを依存している。上述したよ分岐する生物であることを示した。同様の結果は、われわ

うに、ニハイチュウは体表から微粒子を取り込むエン

れの β-tubulin 遺伝子系統樹からも得られた。さらに、Hox

ドサイトーシスの能力を保持している。実際、彼らが-type 遺伝子の解析は、ニハイチュウの Hox 遺伝子はい

タコの精子を細胞内に取り込んでいるのは何度も確

わゆる前・中・後のうちの中間グループに分類され、さらに認されている。Doolittle による Food hypothesis が提出さロフォトロコゾア動物群（Lophotrochozoa）に特異的なペプれて以来、食物として取り込んだ生物の遺伝子の水平転

チドモチーフの存在をもとに、ニハイチュウは三胚葉動物

移（ＬＧＴ）の証拠が集まりつつあり、このことは真核生物のであるとしている。もしニハイチュウが三胚葉動物から退化

ゲノムがキメラ的性質をもつことを示唆している。ニハイ

的に進化したとすると、神経系や消化管までをも失うようなチュウはタコの腎嚢組織片や精子を食物として摂取して退化は桑実胚段階からのネオテニーを想定せざるを得なおり、このことは宿主からニハイチュウへのＬＧＴが頻繁にい。

起こっている可能性を示唆している。もしこれが本当だと[原生動物的特徴]1907 年、Hartmann は、ニハイチュウの
原生動物的特徴に気づき、Moruloidea （桑実胚生物）という名称を与えた。以来、以下に示すような原生動物的ある
いはきわめて原始的な特徴を示す証拠が提示されている。１）繊毛虫類とオパリナ類とのみ共通の二本鎖繊毛
ネックレス。動物の繊毛ネックレスは海綿動物や刺胞動物を含めてすべて三本鎖である。２）管状ミトコンドリアクリス
テ。動物・植物・菌類はすべて扁平状のクリステをもつ。３）体表からのエンドサイトーシスによる微粒子の取り込み。

すれば、原生動物であるニハイチュウの祖先のゲノムにかつて存在していたハウスキーピング遺伝子の多くは、宿主から転移してきた遺伝子によって相当数が置換されていることになる。一方、体制を支配するような調節遺伝子が転移し機能する確率は低く、ニハイチュウは原生動物としての本来の特徴のほとんどを残すことになった。
こうして原生動物の入れ物に動物由来の遺伝子をもつ
キメラ生物が誕生したというシナリオは、ニハイチュウが示す矛盾を合理的に解消することができる。

動物の胚は原腸胚段階ですらエンドサイトーシスの能力【展望】これまでのところ、5S rRNA 遺伝子はニハはもたない。この能力をもつのは口と消化管ができた後でイチュウの原生動物説を支持する唯一の遺伝子であある。４）コラーゲン等細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の欠如。動る。今後クローニングされる遺伝子数が増えれば、物の重要な共有派生形質のひとつは、細胞間のコラーゲ

このタイプの遺伝子がさらに見つかるかもしれなンなどの構造であって、多細胞体制ではない。５）無性生

い。また、ニハイチュウのミトコンドリアゲノムに殖と有性生殖相の分離。ニハイチュウは、軸原細胞と呼ば関する情報は現在のところ多くはない。ミトコンド

れる二倍体の幹細胞から無性的に増殖するネマトジェン

リアについては、さらなる研究の進展を期待した期と有性生殖を行うロンボジェン期の二つの相が完全にい。以上のような二つの観点からの研究は、われわ

分離している。

れのキメラ説を支持するさらなる証拠となりうるで

ニハイチュウの原生動物的特徴は古くから示唆されてあろう。

いたが、この説を明瞭に定式化したのはカヴァリエ・スミス
をもって嚆矢とする。現在のところ、少なくとも 5S rRNA による系統解析はこの説を支持している。
【キメラ説】ニハイチュウ類は頭足類の腎嚢に生息する絶対寄生生物である。したがって、彼らは宿主であ【文献】
Cavalier-Smith, T. (1993) Microbiol. Rev. 57:953-994.
Doolittle, W. F. (1998) Trends Genet. 14: 307-311.
Noto, T. & Endoh, H. (2004) BioSystems, 73:73-83.

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36, No. 1. (2004)(2003)

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中生動物ニハイチュウの発生初期におけるミトコンドリアの分化とゲノムDNAの構造的変化
粟田ひろ子（金沢大・理・生物）

Differentiation of mitochondria and structural change of mtDNA
during early development in the mesozoan dicyemids
Hiroko AWATA (Dept. Biol., Fac. Sci., Kanazawa Univ.)
SUMMARY
Mitochondria of mesozoan dicyemid carry minicircle DNAs, on each of which a single gene is encoded. Unfortunately, whether the minicircles reflect on a unique form of mitochondrial genome or a form of differentiated mtDNA isstill an open question. In this study, a search for the original mtDNA different from the minicircles was carried out. I
tried identification of such a mtDNA by two different methods: 1) Separation of the mtDNA through CsCl-Hoechst density gradient and 2) Southern blot analysis. The results obtained from these experiments showed that a very poor amountof high-molecular-weight (HMW) mtDNA exists in mitochondria of dicyemids as well as abundant minicircles. These
two forms might correspond to differentiated mtDNA (minicircle) and undifferentiated original mitochondrial genome(HMW), respectively. Furthermore, in situ hybridization revealed that amplification and the subsequent dilution of theminicircle mtDNAs during early development do occur. These observations lead me to the following "amplificationdilution" model: only mitochondria in stem cells, such as axoblasts or germinal cells, preserve the undifferentiatedmtDNA in a large size. In the early embryogenesis, amplification and rearrangement of the mtDNA would occur concomitantly with germline and soma differentiation, resulting in the formation of the numerous minicircles. This model
inevitably predicts the lack of replication of the minicircles. As mitochondria increase their number by divisions, theamplified minicircles in somatic cells would be diluted, reflecting on the lack or faintness of in situ hybridization signal
in somatic mitochondria such as those in the jacket cells.
[目的] 中生動物ニハイチュウはタコなど頭足類の腎[方法] CsCl-Hoechst密度勾配遠心：10µg Total DNA-嚢に寄生する、単純な体制の多細胞生物である。こ1g/ml CsCl-0.2mg/ml Hoechst (in TE-buffer)溶液を20°の生物の系統関係は今なお不明で、核遺伝子の系統

C、4時間250kGavで超遠心した。長波長UV下でDNA

解析では後生動物の退化型とする説と、多細胞の原を回収、2-Butanol抽出、2-4倍に希釈後Ethanol沈殿、生動物とする説の両方を指示する結果となった。こ

70% Ethanol リ ン ス 後、滅 菌 水 に 溶 か し た。こ れ をのため本研究はミトコンドリアゲノムの観点からニAgarose gel 電 気 泳 動、PCR・Inverse PCR に 使 用 しハイチュウの系統関係を検証することを最終目的とた。Southern blot analysis ： BamHI- 完 全 分 解 Total

した。ニハイチュウのミトコンドリアではMinicircle

DNAと未処理のTotal DNAを10µgずつ準備し、0.6%という環状DNAの存在が報告されている(1)。これまAgarose gelで電気泳動後、Blottingし、 [α-32P] dCTPででに見つかったMinicircleは6種類で、全てミトコンド

ラ ベ ル し た cox1･ cox3 部 分 配 列 を Probe と し てリアに局在する呼吸鎖タンパク質やrRNAを１つずつHybridization を 行 っ た。手 順 は 文 献 3 参 照。in situ

コ ー ド し て い る。大 き さ は 0.8-1.7kb と 小 さ く、非hybridization：Probeにはcox1部分断片をDIG-11-UTP

コード領域に共通配列は見られず、複製機構は不明

でラベルしたものを用いた。その他手順は文献4参である。近年様々な生物でミトコンドリアゲノムプ

照。

ロジェクトが進行し、後生動物や原生動物のミトコ
ンドリアゲノムの特徴が明らかになってきた(2)が、ニハイチュウのMinicircleはそれのどちらにも該当しない。そのためMinicircle以外にもmtDNAが存在するかもしれないと考え、ニハイチュウのミトコンドリ
アゲノム構造解析を行うことにした。

[結果] CsCl-Hoechst密度勾配遠心：UV下で2種のDNAバンドが確認できた。バンドごとに分画し(分画I･II)、その下の部分も3つに分画した(分画III･IV･V)。分画からDNAを回収し、Agarose gel電気泳動を行った結果、分画I･II･III･Vに高分子DNAが含まれていた。これらを鋳型として、cox1特異的Primerを用い

原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

78てPCR･Inverse PCRを行った。分画III･VではPCRでの[考察] これらの結果から次のようなミトコンドリア

み増幅が見られ、Inverse PCRでは全く増幅が見られ分化とmtDNA構造変化のモデルを考えている。ニハなかった。このことはMinicircle以外の形状でcox1をイチュウのミトコンドリアゲノムは高分子のDNAでコードしたmtDNAが存在することを示している。

あるが、これは生殖細胞など未分化状態の細胞にしSouthern blot analysis：Minicircleに相当する位置に強か存在しない。発生の開始と同時に、mtDNAの大量

いシグナルが見られ、高分子DNAに相当するところ増幅と再編成によりMinicircleが形成され高コピー状に弱いシグナルが見られた。このことはニハイチュ

態となる。この後は複製されることなく、ミトコン

ウのmtDNAの大部分はMinicircleとして存在し、高分

ドリアの分裂に従って分配されるので、体皮細胞な子DNAはごく微量存在していることを示している。

どの分化細胞では低コピー状態となる。このように

また滴虫型幼生のTotal DNAに高分子mtDNAのシグ

考えると、mtDNAのコピー数の変動や高分子mtDNA

ナルが検出されなかったため、高分子mtDNAの割合

が微量にしか存在しないことがうまく説明できる。

は変化し滴虫型幼生期にはその割合が低いことが示された。in situ hybridization：生殖細胞や初期胚に強いシグナルが見られ、そのシグナルは発生が進むにつれ弱くなる傾向が見られた。また体皮細胞など分化した細胞にはシグナルはほとんど検出されなかった。

[文献]
1. Watanabe KI et al. (1999) J Mol Biol 286(3) 645-50
2. Gray MW et al. (1998) Nucleic Acids Res 26(4) 865-78
3. 中山広樹, 西方敬人 (1995) バイオ実験イラストレイ
テッド２遺伝子解析の基礎 秀潤社
4. Noto T et al. (2003) Chromosoma 111(6) 359-68

テトラヒメナの受精と受精核の生細胞観察
菅井俊郎（茨城大・理・自然機能）

Observation of fertilization and synkaryon in living Tetrahymena cells
Toshiro SUGAI (Dept. Mater. Biol. Sci., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARY
During conjugation in Tetrahymena thermophila, many important nuclear events occur within a rather short time.
These nuclear events have been defined by staining of chromatin only. In the present study, fertilization and synkaryon
were observed in living cells. After nuclear exchange, both the migratory nucleus and stationary nucleus changed tospindle shapes and attached to the conjugation junction by one end of each nucleus. The nuclei contacted each other atregions near the junction and fused within 20-30 seconds to give rise to a synkaryon. The synkaryon detached from thejunction and was positioned just anterior to the macronucleus. In the spindle-shaped synkaryon at interphase, two chromatin threads, derived from the gametic nucleus, lay parallel along the long axis of the nucleus. This figure looks like adividing nucleus and is thought to be the nucleus undergoing fertilization. The synkaryon rounded and chromatin dispersed homogeneously just before the first postzygotic division. When the conjugation junction was partially destroyed
under Ca-poor conditions, two synkarya sometimes contacted and fused to give a 4n nucleus. Fertilization involving
three gametic nuclei has been reported. It seems that, in this species, many nuclei in the common cytoplasm could fuseat this stage. Tetrahymena is a good subject for the study of fertilization.
[目的] テトラヒメナの接合では、減数分裂、配偶ンの形は核の外形と大きく異なる時期が多く、時期

核形成、核交換、受精や核分化などの重要な核の変を再定義する必要があることがわかり、また多くの化が連続して起こる。これらの過程は染色されたク

新しい現象が見い出された。生細胞の連続観察は非ロマチンを核とみなして定義されてきた１。

常に重要な研究方法である。

これまで生細胞を透明化することと、クロマチンと核膜染色により、接合時の核の外形とその変化を明らかにした。その結果、核と思われていたクロマチ

本研究では、受精と受精核について詳細に観察した。

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36, No. 1. (2004)(2003)

79[材料と方法] Tetrahymena thermophila B株を、高濃の長軸と平行に並び、まるで分裂中の核のような形

度のペプトン培地で培養した。対数増殖期初期に細態をとる。これは中間期の受精核（融合核）である

胞を接合用溶液に移し、軽い飢餓状態にしてから、が、従来受精中の核と思われていた。紡錘形の受精

異なる交配型の細胞を混合し接合を誘導した。

核は、次の分裂直前に球形になり、同時にクロマチ

核 膜 は 蛍 光 色 素 DiO6 で、ク ロ マ チ ン は DNA をンも均一に核内に分布した。

Hoechst33342で染色することにより観察した。光学Ca-poorな条件下では、細胞が脆弱であり、核交換

系は、暗視野、DICおよび位相差を比較したが、核後に部分的に破壊されることがある。この場合、２の外形全体をカバーするのとコントラストの点で位個の受精核が接触すると融合し、４nの核を形成する

相差が適していた。

ことがわかった。この核は２回分裂を行い、接合対[結果] 接合対間の接着面は、核交換を行った部分が乱れるので、交換前後が容易に区別可能であった。
交換された配偶核（移動核）は紡錘形になり、一端で接着面に付着する。もう一方の配偶核（静止核）あたり2個の大核原基と２個の小核を形成した（通常の半分）。
また、2個の受精核が、分裂後期に接触すると融合す
ることがわかた。

は、核交換前第３分裂が終了した時は、長いスピン[考察] 本種では、３個の配偶核が受精することが知ドルによって接着面から離れた位置に置かれ、球形られており、本研究での受精核の融合を考えると、でクロマチンは均一に核内に分布する。これが、移受精の時期の小核は、同じ細胞質中に存在して接触

動核が交換されると、接着面に移動を始め、紡錘形

すれば、配偶核同士でなくても、数に関係なく融合に変化し、核内クロマチンは細長くなり、核の中心するものと思われる。融合能は配偶核に限られなに位置するようになった。その後、移動核に接近

く、長時間継続することがわかる。本種は、受精のし、核の一端が接着面に付着した。両方の核は付着研究に適した材料と思われる。

したまま、付着点に近い部分で接触し20~30秒の間に融合し受精核を形成した。受精核はその後、接着面から離れ大核前方に移動した。外形は紡錘形のままであり、もとの配偶核のクロマチンは細長く、核[文献]
1. Martindale, N.W., Allis,C.D., Bruns,P.J.(1982)
Exptl.Cell Res.140:227-236

テトラヒメナの新規ミオシンの探索
岩滝仁範, 染矢晋太郎, 権田幸祐, 箕浦高子, 沼田治（筑波大・生物科学）

Screening of novel myosins from Tetrahymena
Yoshinori IWATAKI, Shintaro SOMEYA, Kohsuke GONDA, Takako KATO-MINOURA
and Osamu NUMATA (Inst. Biol. Sci., Univ. Tsukuba)
SUMMARY
The superfamily of myosins found in eukaryotic cells were known to contain at least 18 different classes. Members
were classified based on the phylogenetic analysis of the head domains located at the amino terminus of the polypeptide.
Using degenerated primers that had been designed from bases of class II myosin motor domain, 7 myosin cDNAs(MYO1, myo2-myo7) were cloned from Tetrahymena by RT-PCR. We extended 6 myosin nucleotide sequences (myo2myo7) by 3'-, 5'RACE and inverse PCR. Moreover, we searched TIGR (The Institute for genomic research) Tetrahymena thermophila sequence BLAST Search (http://tigrblast.tigr.org/er-blast/index.cgi?project=ttg), using myo2-myo7
sequences. We found 12 myosin genomic DNAs in the Tetrahymena genome database. Five myosin cDNAs were identical with MYO1, myo3, myo4, myo5 and myo7, respectively. Seven myosin genomic DNAs were novel Tetrahymena
myosins. myo2 and myo6 did not exist in this Tetrahymena genome database, because the database did not cover all
Tetrahymena genome. Thus, we found that Tetrahymena has at least 14 myosin genomic DNAs. Moreover, 5 myosinsequences (MYO1, myo3, myo4, myo5, myo7) were aligned with those of other organism myosins, and produced a phy-

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Jpn. J. Protozool.第37巻Vol. 37,
36,第1号
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原生動物学雑誌

logenetic tree. In this tree, MYO1, myo3, myo4, myo5 and myo7 were not contained to 18 classes, although these 5
myosins were clustering a novel class. Therefore, we propose that the novel class containing MYO1, myo3, myo4, myo5
and myo7 refer to as class XIX myosin.
[目的] ミオシンは筋肉以外の細胞にも存在し、細胞オシンであり、うち３種はMYO１と最も高い相同性

質分裂などで重要な機能を果たしている。近年、構を示した。残りの４種はそれぞれ、シロイヌナズナ

造が異なる多くのミオシンが発見され、ミオシンがのclass IXミオシン、キイロショウジョウバエのclass

スーパーファミリーを形成することが明らかになっVIIミオシン、出芽酵母のclass Vミオシン、細胞性粘た。現在までに１８種類のclassが報告された1)。

菌のclass VIIミオシンと最も高い相同性を示した。

テトラヒメナのミオシンに関しては、神澤らが抗

また、myo2とmyo6はこのデータベースには存在しザリガニミオシンII抗体に反応する双頭で尾部の長いなかった。これはこのデータベースがまだテトラヒ

ミオシンを確認した2)。また遺伝子ではミオシン遺伝

メナの全ゲノムを網羅していないためであると考え

子MYO1の頭部領域の部分配列がクローニングされられる。

た。MYO１は機能としては食胞形成や大核の形態維

今回のゲノムデータベースの検索の結果、既に部持に関与しているが、ミオシンのどのclassにも属し

分 配 列が クロー ニ ング されて い た MYO1、myo3、ていなかった 3)。染矢らは６種のミオシン遺伝子

myo4、myo5、myo7 の ５ 種、新 規 に 見 つ か っ た ７

myo2〜myo7の頭部部分配列をクローニングした。こ種、そしてゲノムデータベースからは得られなかっのうちの１種が骨格筋の収縮や細胞質分裂に関わる

たがRT-PCRで存在が確認されているmyo2とmyo6のclass IIに属しているが、残りのmyo3〜myo7はどの２種を合わせて、テトラヒメナには少なくとも１４classに属すかは不明であった4)。

種類のミオシン遺伝子が存在していることが確認さこのようにテトラヒメナのミオシンはミオシンれた。

スーパーファミリーの既存のclassに入らないものがさ ら に MYO1、myo3、myo4、myo5、myo7に 関 し多かったので、テトラヒメナのミオシンを網羅的にてエキソン領域を予測してアミノ酸配列に翻訳し探索して分類することを目的として本研究を行った。このアミノ酸配列を元に他のミオシンと共にアた。

ライメントを行い、無根系統樹を作成した。その結[方法]ゲノムDNA配列のクローニングは、myo2〜
myo7のcDNA部分配列を元にPCR法により行った。
また、ゲノムDNA配列をより長く決定するために
3'RACE 法 や inverse-PCR 法 を 行 っ た。さ ら に、今 秋
TIGR (The Institute for genomic research) により公開されたTetrahymena thermophila sequence BLAST Search（http://tigrblast.tigr.org/er-blast/index.cgi?project=ttg）
を用いて、myo2〜myo7の６種のミオシン部分配列を元にTetrahymenaゲノムデータベース内のMyosin遺伝子を探索した。このTetrahymenaゲノムデータベース
はまだ全ゲノムを網羅してはいない。
[結果と考察]myo2〜myo7の６種類のミオシンcDNA
部分配列を元にゲノムDNA配列をクローニングした。その後myo2〜myo7の６種類のミオシンcDNA部
分配列及びゲノム部分配列を元にTIGRのTetrahymena
thermophila sequence BLAST Searchを検索した。その結果、ゲノムデータベースより１２種類のゲノム配列が高い相同性を示した。これらのうち５種はそれぞ れ MYO1、myo3、myo4、myo5、myo7 と 一 致 した。他の７種は今までに記載されていない新規のミ果この５種のミオシンは１８ある既存のclassには属さず、これら５種で１つの新規のclassを構成していることが明らかになった。
従 っ て 我々は MYO1、myo3、myo4、myo5、myo7で構成される新規のclassを、ミオシンスーパーファ
ミリーのclass XIXとすることを提唱する。
※文献4)でRT-PCRによってクローニングされた６種のミオシンのうちclass II のミオシンをmyo6としていたが、今回、classのローマ数字と一致するようmyo2とした。以下１つずつ変更して旧myo２をmyo3、旧
myo3をmyo4、旧myo4をmyo5、旧myo5をmyo6とした。
[文献]
1) Berg, J. S. et al. (2001) Mol. Biol. Cell 12:780-794.
2) Kanzawa, N. et al. (1996) Comp. Biochem. Physiol.
115:547-551
3) Williams, S. et al. (2000) J Eukaryot Microbiol.
47:561-8.
4) Someya, S. et al. (2000) Jpn. J. Protoz. 76.

Jpn. J. Protozool. Vol. 37, No. 1. (2004)

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繊毛虫 Tetrahymena における細胞分裂時のtetrin 及び tetrin 関連蛋白質の局在平野賢史, 丸尾文昭, 沼田治１（１筑波大・生物科学系）

Localization of tetrin and tetrin-associated protein during cell divisionin Tetrahymena
Takashi HIRANO, Fumiaki MARUO and Osamu NUMATA1 (Inst. Biol. Sci., Univ. Tsukuba)
SUMMARY
To investigate the molecular mechanism of oral morphogenesis in Tetrahymena, we prepared five monoclonal
antibodies, HM12, HM04, HM03, HM54, and HM44, using isolated oral apparatus. A 12 kDa protein recognized with
HM12 was localized in basal bodies in the oral apparatus and the cell surface. An antigen recognized with HM04 was
localized in doughnut-like structures surrounding basal bodies. These localizations did not change during cell division.
Three monoclonal antibodies, HM03, HM54, and HM44, reacted to 72 kDa, 78 kDa and 140 kDa proteins, respectively.
In interphase cells, these three proteins were localized in the undulating membrane and three membranelles in the oral
apparatus. During cell division, these proteins dispersed in the cytoplasm and were localized in old and new oral apparatuses. Interphase localizations of those proteins were similar to those of tetrin 1-4 which are components of the fibrillar
network of the oral apparatus. To examine cross-reactivity among HM03, HM54, HM44 and tetrins, we purified tetrins
from Tetrahymena. HM03 and HM54 reacted to tetrins, while HM44 reacted to 140 kDa protein in tetrin fractions.
These results suggest that 72 kDa and 78 kDa proteins are tetrins and that 140 kDa protein is a tetrin-associated protein.
[目的]口部装置はbasal bodyから構成された4枚の膜は口部装置のbasal bodyとともに細胞全体の繊毛基部板、undulating membrane, membranela1、2、3と膜板のbasal bodyにも存在した。また、細胞分裂時には口をつなぐ微小管およびtetrin繊維から成る。tetrin繊維部形態形成領域に集合して来たbasal bodyにも局在しは分子量8万前後の4種類のtetrin１−４からなる直径3ていた。12kDa蛋白質はbasal bodyそのものに存在し〜4nmの繊維で、口部のbasal bodyをつないでいる。

ていた。しかし、細胞分裂時にはその局在には大きこのような複雑な構造をした口部装置の形態形成のな変化はなかった。

分子機構を明らかにするために、我々は口部装置にモノクローナル抗体HM04が認識する抗原蛋白質は対するモノクローナル抗体を作成し、抗体が認識すbasal bodyの周囲を取り巻く構造を認識し、口部装置

る抗原蛋白質の局在を検討した。その結果、細胞分とともに細胞表層にも存在した。口部形態形成時に裂期に局在が著しく変化する蛋白質を見つけたのではbasal bodyとともに分布していた。この抗原蛋白質報告する。

に関しても細胞分裂時には大きな分布の変化は見ら[材料と方法]細胞はTetrahymena thermophilaを用いた。Tetrahymenaの口部装置はRannestad and Williamsの方法で単離し、口部装置全体をマウスの背中に注射して、モノクローナル抗体を調製した。ウエスタ
ンブロッティングはTowbinらの方法で行った。間接蛍光抗体法はパラホルムアルデヒドで固定した
Tetrahymena細胞に一次抗体として調製したモノク
ローナル抗体を、二次抗体にはFITC結合ヤギ抗マウ
ス抗体を処理して行った。

れなかった。
一方、HM03、HM54、HM140の3種類の抗体が認識する72kDa蛋白質、78kDa蛋白質、140kDa蛋白質は細胞分裂の過程でその局在が大きく変化した。これ
らの蛋白質は間期には口部の4枚の膜板に局在し、分裂期には口部とともに細胞全体および表層のbasal
bodyに存在した。これら3種類の蛋白質の局在性が全く同じであること、間期の分布がすでに報告されているｔetrinの局在に類似していることなどから、これらの蛋白質とtetrinの関係を調べた。Williamsの方[結果と考察] 得られたモノクローナル抗体の特異性法にしたがって、Tetrahymenaよりtetrin分画を取り、と認識する抗原の局在性より次の5種類のモノクロー

モノクローナル抗体HM03、HM54、HM140とtetrin分

ナ ル 抗 体、HM12、HM04、HM03、HM54、HM44 に画との反応性を二次元電気泳動法とウェスタンブ

関して詳細に検討した。
モノクローナル抗体HM12が認識する12kDa蛋白質

ロッティング法を用いて調べた。その結果、HM03が認識する72kDa蛋白質とHM54が認識する78kDa蛋白原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

82

質は4種類のtetrinのうちの2つに相当することが判っ[文献]た。また、HM44が認識する140kDaの蛋白質もtetrin

Rannestad、J. and Williams, N. F. (1971) J. Cell Biol. 50,

分画に存在したので、この140kDa蛋白質はtetrin結合
蛋白質であると考えらる。
ｔetrin分画を構成する蛋白質が分裂期に細胞全体に分布することから、tetrin蛋白質は分裂期に一斉に合成され、口部形態形成に参加するものと考えられ

709-720.
Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.
Williams, N. E. (2000) Method in Cell Biology. 62, 441447.

る。

テトラヒメナの同極双体：同極双体への転換と接合佐藤亮一, 岡崎雅子, 鈴木恵一, 菅井俊郎 （茨城大・理・自然機能）

Homopolar doublets in Tetrahymena thermophila:
induction of homopolar doublets and their conjugation
Ryoichi SATO, Masako OKAZAKI, Keiichi SUZUKI and Toshiro SUGAI(Dept. Mater. Biol. Sci., Fac. Sci., Ibaraki Univ.)
SUMMARY
A cell of Tetrahymena thermophila has one oral apparatus. Sometimes a cell called a homopolar doublet occurs
which has two sets of cell cortex with the same polarity. Conjugation of homopolar doublets has not been reported. As
it has two oral apparatuses, a doublet could possibly conjugate with two other cells. If so, two conjugation junctions
would influence the behavior of the nuclei, as the junction is important in normal conjugation. In this study, we developed an easy and quick method to transform normal cells to homopolar doublets. Conjugation of doublets was induced
and we found that the doublet could conjugate with two other cells forming a triplet. Nuclear behavior was observed
using Giemsa staining which reveals cell cortex structure and nuclei simultaneously. At the macronuclear anlagen stage,n, 2n and 3n micronuclei were found in one triplet but in other triplets all cells had 2n micronuclei. At the third prezygotic division, an anaphase micronucleus was observed attached at both ends to the two junctions. This suggests that thetwo products of the third division became migratory nuclei and the doublet cell contained no stationary nucleus. If normal fertilization in the two normal cells and fertilization between two migratory nuclei in the doublet cell occurred, thenall cells would have 2n micronuclei.
[目的] Tetrahymena thermophilaは通常、口部装置をの同極双体は大核と小核を１つずつ持つのに対し、１つ持つが、表層構造を正常細胞の２つ分持つ細胞

Gaertigらのheteropolar doubletは２つずつ持つ。これも存在し、これを双体（doublet）という。表層構造

らのことから、同極双体が２つの細胞と接合してもの向きが同じである双体を特に同極双体(homopolar

正常細胞及び、heteropolar doubletとは異なる核変化

doublet)1)、向きが逆である双体をheteropolar doubletとをすることが予想される。

呼ぶ。Gaertigらは、heteropolar doublet が１つあるい同極双体が２つの細胞と接合すれば接着面が２つは２つの正常細胞と接合し、特に２つの細胞と接合形成されることになる。正常な接合では、この接着した時の核変化がheteropolar doublet特有の表層構造

面が非常に重要であり、例えば減数分裂で生じた４に強く影響されることを明らかにした2)。

つの核の内、接着面に最も近い核が付着し、その後一方、同極双体も口部装置を２つ持つことから、２つの正常細胞と接合する可能性がある。ほとんどの核変化を行なうが他の３つの核は退化する。
そこで、同極双体と正常細胞を接合させたとこ

Jpn.
J. Protozool. Vol.
37, 1号
No. 1.2004年(2004)
原生動物学雑誌
第37巻

83

ろ、２つの正常細胞と接着したので同極双体の接合る作成方法の違いが原因であるかどうか調べるたの核変化の観察を行なった。

め、接合対の融合で作成した同極双体と、小麦の穂[材料と方法] ⑴同極双体の作成：低調処理による接合対の融合又は、特定の培地で培養することによって転換する方法を用いた。⑵核変化の観察：一晩饑
餓状態においた同極双体と正常細胞を接合させた。
接合開始から経時的に固定し、核と表面構造をギムザで染色し観察した。

培地で転換した同極双体をそれぞれ接合させ、大核原基の時期でパターンの比率を調べた。その結果、
同極双体の作成方法は核変化にあまり影響しないよ
うだった。ただし、この時は同極双体が4n、正常細胞がどちらも2nであるパターンは観察されなかった。
大核原基の時期で同極双体と２つの正常細胞がい[結果と考察] ⑴同極双体の作成：正常細胞をゾウリ

ずれも2nになるパターンの率が非常に高い時の減数

ムシの培養に用いられるレタスジュース培地で培養

分裂後の核変化を詳しく観察した。接合開始から６したところ同極双体に転換した（藤島 私信）。この時間後、同極双体の小核の１つが細胞の先端で横に追試を行なったところ、転換には２〜３ヶ月かかる

伸びている像が最も多く観察された。この観察でことが分かった。もっと短期間で転換する条件があ

は、細胞をスライドに広げたので、核の位置や向きるか調べるため、何種類かの植物の抽出液で正常細が乱れている可能性があった。そこで固定した細胞胞を培養した。その結果、小麦の穂培地では２〜３をそのまま立体的に観察したが、同じように細胞の日という短期間で転換が起こった。転換後の同極双先端で横に伸びていた。この横に伸びた核の両端が体には小核を２つ持つ細胞も存在したことから、分

接着面を向いていることから、両方の接着面から伸裂阻害が原因である可能性が考えられる。

びた細胞骨格に支えられているのかも知れない。

⑵同極双体の核変化：同極双体と２つの正常細胞

6.25時間後では、同極双体の２つの接着面に核が付が接合した時、減数分裂終了までは正常な核変化と着し、細胞質には退化中の３つの核がある像が最も同じだった。減数分裂後の核変化を予備的に観察し多かった。さらに、それぞれの接着面に分裂中の核たところ、大核原基の時期で大きく３つのパターンの両端が付着している像も観察された。これらの観が観察された。⑴同極双体が3n、一方の正常細胞が察から、減数分裂後、１つの小核が細胞の先端で第2n、もう一方の正常細胞がn。⑵同極双体が4n、正常

３分裂を行ない、どちらの核も接着面に付着した可細胞はいずれも2n。⑶同極双体と２つの正常細胞全能性が高い。この場合、核交換後、正常細胞側ではてで2n。なぜいろいろなパターンに分かれるのか、正常な受精が行なわれるが、静止核のない同極双体

実際に観察された像をもとに予想された。⑴の場側では正常細胞からの移動核同士が受精し、３つ全合、減数分裂で生じた４つの核の内、１つがいずれての細胞の小核が2nになった可能性がある。

かの接着面に付着した。⑵の場合、減数分裂で生じた４つの核の内、２つが別々の接着面に付着した。
⑶の場合、減数分裂で生じた４つの核の内、１つが分裂して別々の接着面に付着した。しかし、これらの３つのパターンの比率は観察の度に異なった。条件が同一ではなかったことから、可能性の１つであ[文献]
Frankel,J. (1999) Methods in Cell Biology., 62:28-103.
Acad. Pr., N. Y.
Gaertig,J., Cole, E.S. (2000) J. Eukaryot. Microbiol.,47:590-596.

原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

84

テトラヒメナの多機能蛋白質 III：接合過程におけるhsp70 の局在性
魚住由布子１, 上野裕則１, 権田幸祐１, 竹田哲也２, 沼田治１（１筑波大・生物科学系、２Columbia Univ., Dept. Microbiology）

Tetrahymena multifunctional proteins III: localization of hsp70 during conjugation
Yuko UOZUMI1, Hironori UENO1, Kohsuke GONDA1, Tetsuya TAKEDA2 and Osamu NUMATA1(1Inst. Biol. Sci., Univ. Tsukuba, 2Dept. Microbiology, Columbia Univ.)
SUMMARYIn Tetrahymena, a series of dynamic nuclear events occurs during conjugation, for example, elongation of micronuclei (crescent formations), meiosis, exchange configuration of micronucleus, fertilization, differentiation of macronucleus, and disappearance of the old macronucleus. These nuclear events are correlated to dynamic changes of microtubules and cytoskeletal structures. The 70-kDa heat shock protein (hsp70) is a highly conserved protein from bacteria tomammals, and is known to assist folding of immature proteins in normal condition and to repair abnormal proteins understressed conditions, such as heat shock or chemical shock. To analyze functions of hsp70 during conjugation, we examined localization of hsp70 in Nonidet P40 (NP-40) extracted Tetrahymena cell model during conjugation using
immnofluorescent staining with anti-human Hsp70 monoclonal antibody (3a3). Immunoblot analysis with 3a3 showedthat the amount of hsp70 was more than that of the 70-kDa heat shock cognate protein (hsc70) in NP-40 extracted cell
models prepared from cells during starvation, costimulation and conjugation. Immunofluorescent microscopy showedinteresting localizations of hsp70 in (i) macronuclei and micronuclei during costimulation, (ii) elongated micronuclei
during the crescent stage, (iii) macronuclei and micronuclei during meiosis, gametogenesis, and fertilization. Furthermore, hsp70 disappeared from the old macronucleus and appeared in the new micronuclei and macronuclei during
macronuclear differentiation. These results strongly suggest that hsp70 plays crucial roles in nuclear events during conjugation.
[目的] 我々は一つの蛋白質が多数の機能を持つ多べた結果、hsp70が細胞全体に一様に分布することが機能蛋白質の存在も重要であると考え、「生命現象分かった。そこで、NP‐40で細胞を処理し、細胞骨の各ステップに１：１で対応する蛋白質とともに、格と核が残る細胞モデルを作成してhsp70の局在を調いろいろなステップに対応する多機能蛋白質が存在べることにした。まず、接合細胞モデルで3a3抗体がすることにより、生物は限られた遺伝子を効率的に認識する抗原をウェスタンブロッティング法で調べ利用している。」という仮説を提唱している。今回た。栄養増殖期の細胞モデル中ではハウスキーピン

はhsp70に注目した。hsp70は原核生物から真核生物

グ蛋白質であるhsc70の方がhsp70より多く存在してまで広く分布し、シャペロンとして蛋白質のフォーいた。しかし、飢餓状態においたinitiationの時期、接ル デ ィ ン グ で 重 要 な 働 き を し て い る (Parsell and合型の違う細胞を混合し接合を誘導したcostimulation

Lindquist, 1993)。今回我々は接合過程中のhsp70の局の時期、そして接合過程の細胞モデルではhsp70が多在性を調べ、hsp70が染色体と相互作用している知見

く存在し、Hsc70はほとんど含まれていないことが分を得たので報告する。

かった。したがって、接合細胞モデル中で3a3抗体が[材料と方法] 細胞はTetrahymena thermophilaの接合型ⅡとⅦを用いた。接合は0.004% KCl、0.1% NaCl、
0.006% CaCl2 中で20時間、飢餓状態にした接合型ⅡとⅦの細胞を混合することによって誘導した。Hsp70の局在性を調べる間接蛍光抗体法は、種を超えてhsp70ファミリー蛋白質と反応するモノクローナル抗体3a3 (Affinity Bioreagents, Inc. USA)を１次抗体として用い、２次抗体としてCy3を結合したヤギ抗マウス
IgGを用いて行った。NP-40を用いた細胞モデルの調製はGoodenoughの方法に従った。
[結果と考察] 間接蛍光抗体法でhsp70の局在性を調認識するものはhsp70であると結論した。
接合型の異なる細胞を混合した後のcostimulationの時期の細胞モデルでは、混合直後にはほとんどHsp70の蛍光は見られなかったが、時間経過とともにhsp70が大核に出現することが分かった。hsp70の大核への出現は接合対形成に先立つ反応であり、接合誘導過程の最も早い反応のひとつであると考えられる。
クレスセント期になると大核とともに長く伸張した小核の上に点状にhsp70が分布することが分かった。小核の伸張は微小管の重合によること、hsp70が微小管のオーガニゼーションにも関与することなどが知られているので、hsp70が微小管上に点状に局在Jpn. J. Protozool. Vol. 37, No. 1. (2004)85

すると予想し、免疫電子顕微鏡法でhsp70の局在性をるのでhsp70はその過程にも関与しているものと考え調べた。その結果、hsp70は微小管上に局在せず、染られる。

色体の上に分布することが判った。そこで、クレス

このようにhsp70はcostimulation期の大核、クレス

セント期の細胞モデルをDNaseで処理した後、hsp70

セント期の小核、そして大核分化中の新大核に出現の局在性を調べた。DNaseで処理するとhsp70の局在した。このような場所でhsp70が従来どおりシャペロ

は大核からも伸張した小核からも消失した。したンとして蛋白質のフォールディングに働いているのがって、クレスセント期の小核内でhsp70は染色体とかは明らかではない。しかし、クロマチンと相互作結合していることが分かった。伸張した小核内では用していることからヌクレオソームの巻き戻しや、染色体の組み換えが起きていると考えられているのクロマチンのリモデリングなどにも関与している可で、hsp70がその過程で何らかの機能を果たしている能性があり、hsp70の新しい機能の存在を示すものでと考えられる。

ある。今後、接合過程におけるhsp70の機能解析は重大核分化の時期にもhsp70は興味深い局在性を示した。旧大核に多く分布していたhsp70は大核分化とともに旧大核から消失して新大核に出現し、さらに新小核にも出現することが分かった。特に新大核形成の時には大核内でダイナミックなDNA再編成が起こ要な課題である。
[文献]
Parsell, D. A., and Lindquist, S. (1993) Annu. Rev. Genetics 27, 437-496.
Goodenough, U. W. (1983) J. Cell Biol. 96, 1610-1621.

棘毛目繊毛虫 Sterkiella cavicola における栄養体とシストの核タンパク質組成の比較
木本慶一郎１，松坂理夫２（ 熊本大・自然科学・自然システム，２熊本大・理・環境理学）
１Comparison of the nuclear protein composition between vegetative and cystic cells of
the stichotrich ciliate, Sterkiella cavicola
Keiichirou KIMOTO1 and Tadao MATSUSAKA2 (1Syst. Nat. Env., Grad. Sch. Sci. Technol.,
Kumamoto Univ., 2Dept. Env. Sci., Fac. Sci., Kumamoto Univ.)
SUMMARY
In the stichotrich ciliate, Sterkiella cavicola, Himura (1993) has demonstrated a cyst specific 140 kD micronuclear
polypeptide, supposing it as a protective peptide for micronuclear chromatin against environmental stresses. Gutierrez(1985) has reported in Gastrostyla steinii that cystic nuclear proteins are arginine-rich and has suggested that these arginine-rich proteins may induce cystic macronuclear chromatin condensation. Since then, however, only few biochemical
data on the cystic nuclear proteins have been presented. In the present study, we tried to identify cyst specific nuclear
proteins other than 140 kD polypeptide using S. cavicola. Cystic nuclei were separated from the nylon mesh filtrate of
the cystic homogenate by Percoll gradient centrifugation. Vegetative cell nuclei were obtained by similar manner from
Triton X-100 cell lysate. Nuclear proteins were separated by SDS-PAGE or 4M urea SDS-PAGE. Basic proteins wereextracted and separated by acetic acid urea PAGE. The purity of the nuclear fraction was confirmed after staining withaceto-orcein or DAPI. All electrophoretograms demonstrated the existence of polypeptides specific to or rich in vegetative cell nuclear fraction but not in cystic nuclear fraction. Disappearance or decrease of these polypeptides during encystment might have functions as suggested by Himura (1993) or Gutierrez (1985), but the exact function of these peptides remains to be clarified.

86

原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年[目的] Himura（1993）は抗体を用いた研究で、棘毛画分（大核と小核の混合物）であることが分かっ目繊毛虫 Sterkiella cavicola休眠シストの小核に特異た。

的な分子量140kDのポリペプチドの存在を明らかに

SDS-PAGE の 結 果、シ ス ト の 核 画 分 に Himura

した。彼はシストが栄養体よりも環境ストレスに対（1993）の報告にある140kDのポリペプチドバンド

する耐性が高い（Corliss & Esser 1974）ということかを再確認した。さらに今回新たに、栄養体核画分にら、140kDポリペプチドが小核クロマチンの保護機

特異的な13.5kDのポリペプチドバンドと、シストで能 を 持 つ 可 能 性 を 示 唆 し た。ま た、Gutierrez

薄くなる数本のバンドを見いだした。4M urea SDS-

（1985）は、棘毛 目 繊 毛 虫Gastrostyla steinii を 用 い

PAGEでも栄養体の核画分に特異的なバンドが1本見て、シストのヒストンでリジンに対するアルギニン

つかったが、シストの核画分に特異的なポリペプチの比率が高くなることを細胞化学的に示し、このこ

ドは140kDのバンドと思われるもの以外は見られなとがシストの大核クロマチンを凝縮させる要因にかった。塩基性タンパク質における違いを調べるべなっているのではないかと示唆した。本研究では、

くacetic acid urea PAGEも行ってみたが、この方法でHimura（1993）と Gutierrez（1980）の 考 察 か ら 存 在も、栄養体に特異的なバンドと、シストで薄くなるが予想されるシストの核タンパク質を検索すること

バンドを数本同定する結果となった。

を目的とした。
[材料と方法] 繊毛虫Sterkiella cavicolaは緑色鞭毛虫
Chlorogonium elongatumを餌として培養し、餌の欠乏に伴う自発的なシスト形成をさせた。シストの核の単離は、シストをホモジナイズし、ナイロンメッ
シュを用いてシスト壁と細胞質画分を分離した後、細胞質画分を80％Percollの上に重層させ、8000 ×gで1時間遠心することにより行った。栄養体の核は、0.5％Triton X-100で溶解した栄養体から、Percoll密度
勾配遠心によって単離した。単離した核画分は酢酸オルセインまたはDAPIで染色し、純度を確認した。
これらの核画分についてSDS-PAGEまたは4M urea
SDS-PAGEによる比較を行った。また、核画分から本研究は当初、Himura（1993）とGutierrez (1985）の考察からシストの核に存在が予想されるタンパク質の検索を目指して行った。しかし、予想に反して、シストの核画分に特異的なあるいは栄養体の核画分より多いタンパク質は見つけられず、逆に、栄養体の核画分に特異的なバンドや、シストで減少するポリペプチドのみが見いだされた。本研究で見つけた13.5kDポリペプチドをはじめとする栄養体に特異的、またはシストで減少しているポリペプチド
が、Gutierrez（1985）の示唆しているように、クロマチン凝縮に関与しているのかもしれないが、推測の域を出ない。今後、これらの点についてさらに研究を進める必要がある。

塩 基 性 タ ン パ ク 質 の 抽 出 を 行 い、acetic acid urea

[文献]

PAGEによる比較も行った。

Corliss & Esser (1974) Trans. Amer. Micros. Soc. 93, 578-

[結果と考察] 本研究ではまず、核の単離法を開発した。得られた核画分を検鏡した結果、純度の高い核

593.
Gutierrez (1985) Microbios 43, 43-51.
Himura (1993) Zool. Sci., 10 (Suppl.), 150.

Jpn. J. Protozool. Vol. 37, No. 1. (2004)

87

集合する繊毛虫 Sorogena stoianovitchae の累積子実体発生ステージの解析杉本大樹（金沢大・理・生物）

Sorocarp developmental stages of the aggregative ciliate Sorogena stoianovitchae
Hiroki SUGIMOTO (Dept. Biol., Fac. Sci., Kanazawa Univ.)

SUMMARY
The sorocarp-forming ciliate Sorogena stoianovitchae is a rare instance of showing mullticellularity in ciliates andits life cycle is similar to that of the cellular slime molds, although both organisms have evolved independently. In fact,
multicellularity has evolved many times even in the kingdoms, Monera and Protista. Recent discovery of the adherens
junction and a β-catenin homologue in the cellular slime mold Dictyostelium discoideum has facilitated a special interest
how Sorogena has developed its multicellularity. In this regard the sorocarp development is an interesting phenomenon
for studying the strategy. Based on the morphological changes, stages of the sorocarp development are divided in thefollowing distinct five stages; aggregation stage 1, aggregation stage 2, secretion stage, rising stage, completion stage.
This division of these stages was consistent with that obtained by CHX treatment. To examine an influence of light
induction, the sorocarp formation was analysed by changing the length of dark periods from 10 to 23 h. The tendency
was observed that the longer the dark periods become, the larger the aggregates get in the beginning of light period, but
23 h dark period completely inhibited the progress from the aggregation stage 2 to the subsequent stages. These results
suggest that a material responsible for aggregation is synthesized during the dark period, and that the aggregate in thestage 1 or 2 requires light stimulation for the transition from the stage 2 to the secretion stage.

[ 目 的 ]Sorogena stoianovitchae は，累 積 子 実 体観察した。Sorocarp形成に対する光の影響を見るた（Sorocarp）を形成する唯一の繊毛虫である。そのラ

め，誘導の際の暗期の時間を10,12,14,16, 23 hに設定

イフサイクルはむしろ細胞性粘菌と似ている(1)。しし，発生過程を観察した。一方，遺伝子の発現をみかし，両者は全く独立に進化したものである。実るためタンパク質合成阻害剤cycloheximide(CHX) を際，生物の進化の歴史において多細胞化は何度も独各集合期にfinal 1µg/mlになるように加えた。

立に獲得されている(2)。細胞性粘菌では近年，細胞接着に後生動物との類似性が示されている(3)。核分化した繊毛虫であるSorogena のSorocarp形成は生物の多細胞化を考える上で非常に興味深い。そしてSorocarpがどのように形成されるのかを分子レベルで解析するためには，まずその発生ステージを区分することが重要であり，今回その解析を行った。

[結果と考察]Sorocarpの形成は形態的特徴から，ゆるやかな集合の時期を集合期１，集合がより密になった時期を集合期２，粘液物質を出し光沢を帯びはじめた時期を分泌期，柄がのびる時期を上昇期，そして最後，完成にいたる時期を完成期というように五つのステージにわけることができる。
暗期継続時間を変えた実験では各暗期とも明期が[材料と方法]Sorogena はATCCより購入した。培養始まった時点で集合期に達していた。そして，そのは Sorogena の エ サ で あ る Colpoda inflata を LY 溶 液

集合体は暗期が長かったもの程大きくなっていた。

（Lactose 0.1% Yeast extract 0.05% pH6.0）に Entero-

その後の発生も集合体が大きい程短時間で完成期に

bacter aerogenesを加え培養し，その一部をSorogena

達した。しかし暗期１０hの集合はその後集合が解離と共にレタスジュース（pH6.0）に加え26℃で震盪培してしまうなど正常に発生しなかった。また，恒常養（80rpm）し た。Sorocarp は，十 分 な 密 度（約暗期に対応する暗期２３hは明期になった時点で既に500cells/ml）に達した培養液をシャーレにまき明暗

集合期２で停止しており，それ以上発生は進まな

12:12hのサイクル，21±１℃のインキュベータ−におかった。このことはSorocarpの形成には１０h以上２き誘導した。

３h以内の暗期が必須であること，集合物質は暗期中Sorocarp形成の形態変化は実体顕微鏡(OLYMPUS)でにつくられ暗期継続時間に比例し集合体は大きくな

88

原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

り，その後発生の速度に影響を与えること，そしてだろう。さらに，光刺激が集合期２から分泌期にか

集合期２から分泌期へ進むのに光刺激が重要である

け必要であったが，同様にタンパク質の合成も必要ことを示していると考えられる。おそらく，粘液物であり，このことはこの時期に光に応答する遺伝子

質の合成開始に光が関わっているのだろう。

発現の制御システムの存在を示唆する。さらなる解CHX処理の結果，ステージごとに違いがみられた。集合期１；発生はそれ以上進行しなかった。その後，集合は解離し消失した。集合期２；発生はCHX添加時点で停止していた。その後も集合体に変化は起こらなかった。分泌期；発生は上昇期まで進んだ。分泌物の内部で細胞は動いていた。上昇期；発生は完成期まで進行した。細胞の動きは完全に停止していた。このことは形態で分けた五つのステー
ジがタンパク質の合成レベルにおいてもあてはまることを意味し，今後の解析をより容易なものにする

析のためには，転写レベルでの変化や，集合開始時
期の特定が必要である。
[文献](1) Olive,L.S. and Blanton,R.L (1980) J.protozool.,
27:293-299(2) Bonner,J.T. (1998) Integrat Biol.1:27-36(3) Grimson,M.J.,Coat,J.C.,Reynolds,J.P.,Shipman,M.,
Blanton,R.L.andHarWoo,A.J.(2000)Nature.408,727731.

Amoeba proteus からの収縮胞の単離西原絵里, 新免輝男, 園部誠司（姫路工大院・理・生命）

Isolation of contractile vacuoles from Amoeba proteus
Eri NISHIHARA, Teruo SHIMMEN and Seiji SONOBE(Dep. Life Sci., Grad. Sch. Sci., Himeji Inst. Tech.)
SUMMARY
Contractile vacuole (CV) of Amoeba proteus is an osmoregulatory organelle. Electron microscopy revealed that acontractile vacuole of Amoeba proteus is surrounded by many small vesicles (about 0.1 µm), suggesting that these vesicles first collect cytoplasmic water and then fuse with each other to form a contractile vacuole. In immunoblot analysis,an antibody against a subunit of V1 sector of V-ATPase recognized a 70 kDa polypeptide in crude extract of amoebae.
The molecular mass was consistent with that reported for V-ATPase in other materials. Immunofluorescence microscopy and immunoelectron microscopy suggested the presence of V-ATPase in the membrane of the CV and that of small
vesicles surrounding CV. We tried to isolate CV. When amoebae were centrifuged at 10,000×g for 10 min in 35% Percoll, cell fragments containing CV were obtained. CVs could be released from the cell fragments by homogenization.
They were stained with anti-V-ATPase antibody, confirming that CVs could be successfully collected. This success
opened a way to the biochemical analysis of CV functions.
[目的]収縮胞は淡水性原生動物特有の細胞小器官

日以上飢餓状態にした細胞を用いた。

で、浸透圧調節が主な役割である(1)。しかし、その収縮胞の微細構造を、電子顕微鏡を用いて観察し詳細な機能は明らかにされていない。その機能を知た。Amoeba細胞を2.5％ グルタルアルデヒドで前固るために、収縮胞に存在するタンパク質を同定し定し、2％ 四酸化オスミウムで後固定した。次に、て、その機能を解析することを目的している。生化

エタノールとプロピレンオキシドによって脱水処理

学的解析を行なうためには収縮胞を大量に単離する

し、樹脂包埋を行なった。切片を作製した後、透過ことが必要である。そこで、Percollを用いた密度勾型電子顕微鏡で観察した。

配遠心により収縮胞の大量単離を試みた。
〔材 料 と 方 法〕材 料 に は Amoeba proteus を 用 い、Tetrahymenaを餌として与え、培養した。実験には2

V-ATPaseV1 セクターのAサブユニットを抗原とした抗体（V-ATPase抗体）を用いて、イムノブロットを行なった。Amoeba細胞をサンプルバッファー中でJpn. J. Protozool. Vol. 37, No. 1. (2004)

89

30分以上処理し、SDS-PAGEを行なった。また、コた。また、この蛍光には厚みがあったことから、収ントロールとして、マウス腎臓とその膜画分も同様

縮胞周辺の小胞が染色されている可能性が考えられの処理をして用いた。その後、PVDF膜に転写し、た。そこで、イムノゴールドを用いた免疫電顕によ0.1％ BSAでブロッキングした。一次抗体、二次抗体

り、詳細なV-ATPaseの分布を観察した。その結果、処理に続いて、アルカリホォスファターゼにより、金粒子は収縮胞膜よりもその周囲にある小胞膜のほバンドを可視化した。

うに多数局在していた。

Amoeba細胞中でのV-ATPaseの分布を観察するため

生化学的解析を行なうため、収縮胞の大量単離をに、V-ATPase抗体を用いて免疫染色を行なった。細

試みた。細胞を30 mM MgCl2を含む35％ Percollに懸胞を100％ メタノール（-20℃）で10分固定した後、濁し、10分間10,000×gの遠心をした。その結果、2

一次抗体、二次抗体処理を行ない、共焦点顕微鏡で層目に収縮胞を含む膜ゴーストを得ることができ観察した。また、同じ抗体を用いて、免疫電顕観察

た。明視野顕微鏡で観察したところ、その膜ゴースも行なった。

トには顆粒質が含まれていなかった。さらにこれ

収 縮 胞 を 大 量 に 単 離 す る た め、細 胞 を 30 mMを、電子顕微鏡を用いて観察すると、膜ゴースト内

MgCl2を含む35％ Percollに懸濁し、10 分間10,000×gにはミトコンドリアやゴルジ体等の細胞小器官は含の遠心をした。得られた2層目を3.7％ ホルマリンでまれていなかった。また、収縮胞の周辺には通常の固定した。上記と同様の処理を行ない、電子顕微鏡

細胞で観察された多数の小胞が局在しているのが確で観察した。また、35％ Percollによる遠心で得られ認できた。この膜ゴーストを注射針でピペッティン

た2層目を注射針でピペッティングした後、再び10グした後、再び10分間10,000×gの遠心を行なった。

分間10,000×gの遠心をした。その結果、収縮胞らし

その結果、収縮胞らしき球状の構造物を得ることがき球状の構造物を得ることができた。これが収縮胞できた。V-ATPase抗体によって免疫染色を行なったであるかどうかを調べるために、3.7％ ホルマリン

ところ、球状の構造物に強い蛍光が観られた。まで固定、回収した後、V-ATPase抗体を用いて免疫染た、電子顕微鏡観察により、多数の小胞に取り囲ま色した。それと同時に、上記と同様の処理を行なれた収縮胞を確認することができた。このように、い、電子顕微鏡で観察を行なった。

Amoeba細胞から収縮胞を単離することに成功した。

〔結果と考察〕Amoeba細胞の収縮胞を、電子顕微鏡を用いて観察した結果、収縮胞の周辺には約0.1 µmの小胞が多数局在していることがわかった。また、
その切片よりもさらに上層の部位を観察した結果、2個の小胞が隣接しており、その小胞の周囲にも多数の小胞の局在が確認できた。以前の明視野顕微鏡による観察や、今回の電子顕微鏡観察により、収縮胞
は収縮時に小胞を形成し、それらが融合することで数個の小胞を形成し、さらにそれらが融合して収縮胞を形成すると示唆された。
以前に、ParameciumやAcanthamoebaの収縮胞にVATPaseが局在することが報告されている(2)(3)。そこ

本研究において、Amoeba proteusの収縮胞の周辺部に存在する膜小胞にはV-ATPaseが存在していることが示唆された。収縮胞内へ水が集積される際にプロトンが関与している可能性があり、今後プロトンの動向について調べたいと考えている。また、それに伴う無機イオン等の動きについても調べる必要がある。さらに収縮胞に特異的に存在するその他のタン
パク質も明らかにし、そのタンパク質の機能と収縮胞の関係についても調べていく予定である。
本研究に用いた、V-ATPase抗体をご供与いただきました森山芳則博士（岡山大学大学院自然科学研究科）に感謝申し上げます。

で、抗V-ATPase抗体を用いて、Amoeba細胞内におけ〔文献〕

るV-ATPaseの有無を、イムノブロットを行ない調べ(1) Patterson DJ. (1980) Biol. Rev. 55: 1-46

た。また、コントロールとして、V-ATPaseが多く発(2) Fok AK, Aihara MS, Ishida M, Nolta KV, Steck TL,

現しているマウスの腎臓とその膜画分を用いた(4)。

Allen RD. (1995)J Cell Sci. 10: 3163-3170

その結果、70 kDa付近に単一バンドが確認できた。

(3) Fok AK., Clarke M., and Allen RD. (1993) J. Cell Sci.

マウス腎臓と同様の位置にバンドがでたことから、今回用いたV-ATPase抗体はAmoebaのV-ATPaseも認識することが示唆された。この抗体を用いて免疫染色を行なったところ、収縮胞に強い蛍光が確認でき

106: 1103-1113(4) Nelson N. (1992) J. exp. Biol. 172: 149-153

90

原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

温水環境より分離したNaegleria 属アメーバの遺伝子型別朝倉登喜子，八木田健司，下河原理江子，泉山信司，遠藤卓郎（国立感染症研究所・寄生動物部）

Genotyping of Naegleria isolates from thermal waters in Japan
Tokiko ASAKURA, Kenji YAGITA, Rieko FURUSHIMA-SHIMOGAWARA, Shinji IZUMIYAMA
and Takuro ENDO (Department of Parasitology, National Institute of Infectious Diseases, Japan)
SUMMARY
The free-living amoebae, possible aetiological agents of amoebic meningoencephalitis, appear to be ubiquitousorganisms in a variety of thermal waters. The distribution of the pathogenic species is not well documented in relation to
those of non-pathogenic. A total of 713 thermal waters, mainly from whirlpool baths and hot spring spas from 16 districts in Japan were examined the occurrence of the genus Naegleria that were tolerate ≥42°C. Approximately 38% of
the water samples examined were positive for variety of amoebae species. By the use of PCR-RFLP and/or DNA sequencing of the internal transcribed spacer (ITS) regions of the rRNA gene, Naegleria isolates were clustered into several cladistic groups, including N. lovaniensis, N. australiensis, N. philippinensis, N. italica, N. andersoni, N. clarki N.
jamiesoni and others. The 5.8S rDNA with flanking ITS sequences of the isolates gave high similarities with the published sequences: N. lovaniensis (100%), N. australiensis (100%), N. philippinensis (98.1%), N. italica (97.9%), N.
andersoni (99.7%), N. clarki (100%), N. jamiesoni (99-100%) and Naegleria sp. PNMA-1 (98-99%) of which scientificnames have not yet been given. Those isolates closely related to known pathogenic species such as N. philippinensis andN. italica were tested for their pathogenicity to mice. They were injected intracerebrally into mice, but did not kill themice.
[目的]40℃付近の温水環境を好む自由生活性アメーない。これまでの研究では試験法により解析能力がバには、Naegleria属アメーバが知られている。この

制限されており、多数の環境試料に適用可能でよりNaegleria属にはヒトの急性アメーバ性髄膜脳炎の起簡便な方法が求められていた。昨年の本研究班の調因アメーバであるN. fowleriが存在し、強い病原性を査では、Naegleria属と同定されたアメーバのうちN.

有する。N. philippinensisはヒトからの分離が報告さ

lovaniensis が 約 半 数 を 占 め て お り、続 い て N. aus-

れており（Matias、1991）、N. australiensisおよびN.

traliensisが検出されたが、二種以外は未同定のまま

italicaはマウスに実験的に脳炎を起こすことが示されであった。本研究事業ではPCR/RFLP法および直接塩て い る（De Jonckheere ら、1984）。非 病 原 性 の N.

基配列決定による遺伝子型別を行った。その結果、

lovaniensisはN. fowleriと形態学的には同一種であり、様々な分離株が得られたことから、その有効性につ

同じ環境条件において生育することからN. fowleriのいて報告する。

指標アメーバと見なされている。近年、個人住宅のみならず公衆浴場や旅館において循環式浴槽が普及し、アメーバの生育に好適な環境が整っていると考えられている。昨年度の研究では実際に入浴施設からN. australiensisが検出された（朝倉ら、2003）。病
原性アメーバによる健康被害を最小限に抑えるには、わが国のアメーバによる汚染状況を把握することが重要となりつつある。これまでアメーバの同定に用いられてきた方法は形態学的観察が中心であり、これにアイソザイム型分析を加えることにより
詳細な型別が行われていた。しかしながら、この分析法は操作が繁雑で多数の試料の処理には不向きであり、かつ熟練を要することから一般に普及してい[材料と方法]水試料は16自治体の協力を得て、大規模入浴施設とその排水、工場温排水、および水槽水の計713検体を採取した。アメーバの分離には大腸菌を塗布した寒天平板培地を使用し、試料水50mlより遠心濃縮した1mlあるいは原液1mlを接種した。寒天
培地は42℃で3日間培養した。培地上でプラーク状に生育したアメーバを新しい寒天平板培地に継代し、充分に生育したアメーバを以降の同定に供した。増殖中の栄養虫体を適当量とり、Triton X-100溶液を加え、熱処理したものをPCRのテンプレートとした。
PCRはITS（Internal Transcribed Spacer Region）領域を標的としたプライマー（5’- GAA CCT GCG TAG

Jpn. J. Protozool. Vol. 37, No. 1. (2004)

91

GGA TCA TTT -3’及び5’- TTT CTT TTC CTC CCC（355/363）〜99.4%（361/363）であった。Naegleria

TTA TTA -3’）を 用 い た（Pelandakis and Pernin,のITS領域は重複する種も含めて60以上の配列が2002）。反応プログラムは94℃5分の後、94℃30秒、

GenBankに登録されているが、今回得られた分離株

55℃30秒、72℃45秒の反応を35サイクル行い、最後の中にはこれらと完全に一致しない配列を有する株に72℃5分の伸長反応を行った。Naegleria属に特異的が複数存在し、配列の多様性が観察された。

なバンド（約400bp）が観察されたものを制限酵素

N. philippinensisおよびN. italicaは病原性が報告され

Mse IおよびNla IVで切断し、得られた反応産物を5％ていることから相同性の高い配列を有する分離株よポリアクリドアミドゲルで分離した。RFLP法にて判りそれぞれ2株を選び、マウスを用いて脳内接種によ定されなかった分離株については塩基配列決定を行る病原性試験を行ったが、いずれも病原性は見られ

い、既存の配列との相同性を確認した。相同率は、なかった。最近になってDe Jonckheereによりいくつ

ITS1、5.8S rRNA、ITS2の配列から求めた。

かの配列が追加登録されたことから相同性の再検討

N. philippinensis および N. italica に近縁であると考えらを行ったところ、N. philippinensisに近い配列を有すれた分離株については、分離株ごとに 3 頭のマウス（ddY、る 株 は N. endoi（AJ566629）と 配 列 が 100％ 一 致

メス、4 週齢）を用いて病原性の有無を検討した。寒天培地（320/320）した。N. italicaに近い配列を有する株はあるいは SCGYEM 培地で増殖した栄養虫体を遠心洗浄

N. laresi（AJ566630）との比較で若干高い一致率を示し、約 1×104/µｌに調整した後に約 20µｌずつマウスの脳内した（98.4％（363/369））。新規登録された株の病に接種した。マウスの観察は 1 ヶ月間行なった。動物実験

原性の有無は不明である。本研究で用いた遺伝子型

は動物愛護上の問題が生じないよう、動物実験委員会の別は有効に機能し、わが国の温水環境中に多様な指導のもとで行った。

Naegleria属アメーバが存在していることを確認し[結果と考察] RFLPによる型別の結果、N. australien-

た。

sisは16県中11県から検出された。調査の試料数を増[文献]

やすに従い検出される県の数は増加すると予想さ

Matias, R. R. (1991) Naegleria philippinensis: characteri-

れ、わが国には広くN. australiensisが存在しているこ

zation based on morphology, surface membraneとが明らかとなった。RFLPにより型別されなかった

antigens, isoenzyme patterns and hydrolases. Doc-

分離株の塩基配列を決定した結果、N. philippinensis

toral dissertation, University of the Philippines.

(AY033618)、N. italica（X96574）、N. andersoni

De Jonckheere, J. F., Pernin, P., Scaglia, M. and Michel,（X96572）、N. clarki（X96575）、N. jamiesoni

R. A. (1984) J. Protozool.31, 324-331.
朝倉登喜子，八木田健二，泉山信司，下河原理江（X96570）、Naegleria sp. PNMA-1（AY033614）と一致あるいは高い相同性を持つ配列が得られた。塩子，遠藤卓郎. (2003) 原生動物学雑誌 36, 21-22.

基配列の一致率は順に、98.1%（317/323）、97.9%

Pelandakis, M. and Pernin, P. (2002) Appl. Environ. Mi-（365/373）、99.7%（308/309）、100%(408/408）、

crobiol. 68, 2061-2065.

98.1%（302/308）〜98.7%（304/308）、97.8%

2D-PAGE及びウェスタンブロットによる
Naegleria fowleri 総タンパク質の解析
小村 麻子1, 八木田 健司1, 泉山 信司1, 下河原 理江子1, 中村 健２, 遠藤 卓郎1（1国立感染症研究所，２北里大･医）

2D-PAGE and western blotting analysis on Naegleria fowleri total protein
Mako OMURA1, Kenji YAGITA1, Shinji IZUMIYAMA1, Rieko SHIMOGAWARA1, Takeshi NAKAMURA2 and Takuro ENDO1 (1Dept Parasitol, NIID, 2Med, Kitasato Univ,)

92

原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

SUMMARY
Naegleria fowleri, a causative agent of PAM is morphologically indistinguishable from non-pathogenic N.
lovaniensis. We compared proteins of closely related these species by analyzing the protein spots into amino acid level
after separation by 2D-PAGE (ImageMaster). The protein spots that were common between N. fowleri and N. lovaniensis were 88 and the similarity between two was 38.6%. A total of 102 proteins were detected that were specific to N.
fowleri. Among the spots common in 5 strains of N. fowleri, 53 spots were analyzed N-terminal amino acid sequences.
According to their sequences of about 20 residues, 10 spots were those already known, including MP2CL5 and others.
For further characterization of N. fowleri specific proteins, the protein spots were blotted on PVDF membrane after being
separated by 2D-PAGE and reacted with either a rabbit anti-actin antibody or a N. fowleri specific monoclonal antibody
according to the method using DyeChrome Western blot stain kit. Of 5 spots labeled with the rabbit antibody, four wereidentical to those detected on the CBB stained 2D-PAGE. Similarly, 5 spots were labeled with Nf-5D12u, and 2 of themwere identified to those detected on the CBB stained gel from the localization analysis of the spots.
[目的]強い病原性を持ち原発性アメーバ性髄膜脳炎

検出することにより、特異的タンパク質の位置を特を引き起こすN. fowleriと、本種と形態的同一種であ定した。1次抗体は回虫体壁斜紋筋精製アクチンを抗るN. lovaniensisは、病原性の有無と一部のアイソザイ

原とした家兎抗アクチン抗体とN. fowleriモノクロー

ムパターンの差異を除き、多くの共通点を持つ。N.

ナル抗体(以下 Nf-5D12u，Indicia Biotechnology社)、

fowleriのタンパク質の網羅的解析を目的に、第1段階

2次抗体はアルカリフォスファターゼ標識抗体を用いとしてこれらの2種間のタンパクレベルでの2D-PAGEた。

による比較を行った結果、88個の2種間共通タンパク質を明らかにし、相同率は38.6％であった。
今回は N. fowleri特異的なタンパク質の検出を目的に2D-PAGEの画像解析を行うとともに、N末端アミノ酸配列解析を行い、さらにWestern blotによる2DPAGEスポットパターンの解析を行った。

[ 結 果 及 び 考 察 ]N. fowleri 及 び N. lovaniensis の 2DPAGE画像解析の結果N. fowleri特異的なタンパク質102個を検出した。N. fowleriのアミノ酸配列解析では30個のスポットについてN末端アミノ酸配列が得られた。相同性検索の結果、10個のスポットが既存の
タ ン パ ク 質 (N. fowleri の MP2CL5、N. andersoni の[方法]N. fowleri 5株(Nf66株、KUL株、LEE株、76/14/

GAPDH等)と相同性を認めた。Western blot解析では

S3株及びKurume株)、N. lovaniensis 2株(Aq/9/1/45D株

抗アクチン抗体に反応したスポット5個、及び Nf-

及びTS株)をSCGYEMを用いて30℃で無菌培養した。

5D12u に反応したスポット5個が得られた。使用した虫体をTCA(10%)処理して得た総タンパク画分を2D-

抗アクチン抗体は回虫のみならず、原虫、哺乳類のPAGEにより(1D：pH3-10、18cm及び13cm Immobiline

骨格筋等にも広範囲の特異性を持つことが確認されDryStrip、35KVh，2D：12.5％、SDS−PAGE)分離しており、今回分離したタンパク質中に複数のアクチた。ゲルをCBB染色しImage Master 2D Elite ver.4.01

ン様タンパク質が存在することが示された。文献に(Amersham-biosciences 社 ) を 用 い て 画 像 解 析 を 行 っ

よ る と N. gruberi の ア ク チ ン の 場 合、分 子 量 は 42

た。N. fowleri特異的なタンパク質を検出する為に、

kDa、全タンパクに占める割合は5〜16％とされていN. fowleri 5株からは種内共通のスポットパターン(A)る。今回抗アクチン抗体に対し、特に強い反応を示を作成し、N. lovaniensis 2株については2株の和集合

した1個のスポットは約42ｋDa, pI 5.23で、スポットを表すスポットパターン(B)を作成した。(A)から(B)ボリューム比は約７％であった。一方、市販品であと合致するパターンを差引き、残りのスポットをN.

るNf-5D12uはN. fowleriの膜タンパク画分に反応し、

fowleri特異的タンパクとした。また、N. fowleri Nf66

糖 鎖 を 認 識 す る と さ れ て お り、最 も 近 縁 の N.

株を2D-PAGE後、ゲルをPVDF膜にブロッティング

lovaniensisとも交叉反応しないものとされている。しし、メ ン ブ レ ン を N 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 解 析 及 び

かし今回の結果では、Nf-5D12uは2種間で共通と確認

Western blot解析に用いた。アミノ酸配列解析にはされたスポットとも反応した。この共通スポットに

Procise 494cLC(Applied Biosystems 社 ) を 用 い た。

ついては、今後解析を進める予定である。

Western blot解析には DyeChrome Western Blot Stain

当研究室ではこれまでの2D-PAGE解析及びアミノ

kit (Molecular Probes社)を使用し、同一メンブレン上酸配列解析で得た情報をもとに、Naegleriaのデータ

で総タンパク質と特異的タンパク質を蛍光染色してベースを構築し、公開に向けて準備中である。

Jpn. J. Protozool. Vol. 37, No. 1. (2004)

93

[文献]

3) J Biol Chem. 1984;259(11):7349-54.;Sussman DJ. et al.

1)Amphizoic Amoebae Human Pathology, 1987, ed. Ron-

4) Electrophoresis. 2001;22(5):896-905; Top KP. et al.

danelli EG, Piccin Nuova Libraria ; Padova

5) Jpn. J. Parasitol.,1992;294-299: Nakamura T. et al.

2) Freshwater and Soil Gymnamoebae, 1988, ed. Page.

6) Parasitol. Res., 2000; 86:634-641; Reveiller FL et al.

FC, Titus Wilson & Son Ltd.; Kendal

赤痢アメーバのファルネシル転移酵素の特性
熊谷正広 , 牧岡朝夫1, 竹内 勤2, 野崎智義3、4 (1慈恵医大・熱帯医学、
慶大・医・熱帯医学・寄生虫学、3感染研・寄生動物、4PRESTO・科技団）
1

2

Molecular characterization of farnesyltransferase of Entamoeba histolytica
Masahiro KUMAGAI1, Asao MAKIOKA1, Tsutomu TAKEUCHI2 and Tomoyoshi NOZAKI3,4( Dept. Trop. Med., Jikei Univ. Sch. Med., 2Dept. Trop. Med. & Parasitol., Keio Univ. Sch. Med., 3
Dept. Parasitol., Natl. Inst. Infect. Dis., 4PRESTO. JST)
1

SUMMARY
Farnesylransferase (FT) catalyzes farnesylation, which is one of the post-translational lipid modifications of proteins. Since farnesylation is necessary for Ras to function, FT has attracted attention as a target for cancer chemotherapy.
We have already cloned the gene of FT of Entamoeba histolytica and expressed the protein in Escherichia coli, showed
its enzyme activity, and identified one of its intrinsic substrates (EhRas-CVVA) belonging to Ras superfamily proteins.
Phylogenetical analysis revealed that EhFT was independent of FTs from other species. Among the Ras superfamily
proteins of E. histolytica, EhRas-CVVA located philogenetically between Ras/Rap and Rho/Rac families. EhFT showed
highly resistant to the inhibitors for human FT. These results suggest that EhFT is remarkably different from human FT
in binding to substrates and inhibitors, which highlight this enzyme as a novel target for the development of chemotherapeutics against amebiasis.
[目的] ファルネシル転移酵素(FT)は、αサブユニット（FTα）とβサブユニット(FTβ）からなる2量体の酵素で、翻訳後脂質修飾のひとつであるファルネシ
ル化を触媒する。細胞の増殖や分化の情報伝達のON/OFFの分子スイッチとして働いているRasタンパ
ク質がその機能を発揮するためには、ファルネシル
化されることが必須であり、また、Rasタンパク質が恒常的にONになるような突然変異による発癌が知られていることから、FTは癌の化学療法の標的としても注目されてきている。そして、ヒトのFTに対する
数多くの阻害剤が作成され、効果が検討されている。我々は赤痢アメーバの増殖と分化におけるファ
ルネシル化の重要性および創薬標的としての可能性を明らかにするために、本原虫のFTについて解析を加えており、これまでに、その遺伝子塩基配列を決定し、組換えタンパク質を発現させ、ヒトのRasタン
パク質を基質として酵素活性を確認した。また、赤痢 ア メ ー バ の Ras 相 同 タ ン パ ク 質 で あ る EhRas1 とEhRas2が本酵素の基質とならないことを示し、赤痢
アメーバ自体が持つ基質としてCVVA末端をもつRas
スーパーファミリーのタンパク質（EhRas-CVVA）を同定したことを報告した。今回は、赤痢アメーバ
FTとEhRas-CVVAの系統解析を行い、またヒトのFTに対する阻害剤の赤痢アメーバのFTに対する阻害効
果を調べた。
[方法] 赤痢アメーバのFTは、発現プラスミドを作成して大腸菌に産生させ、付加したヒスチジン・タグを用いて精製した。 酵素活性は、Rasへの[3H]ファルネシル・ピロリン酸の取り込みによって測定した。阻害効果については、種々の濃度の阻害剤存在下での酵素活性の低下率からIC50を求めた。近隣結合法による系統樹は、ClustalWとTreeViewを用いて作

原生動物学雑誌 第37巻 第1号 2004年

94

成した。
[結果及び考察] 赤痢アメーバのFTの両サブユニットについて、哺乳類、植物、酵母、Trypanosomaを用いて系統解析を行ったところ、FTα、FTβともに、他種生物のものとは離れており、独自の進化をしたものと考えられた。また、両サブユニットの形がおおよそ相似していることから、両サブユニットは、各生物種で一定の比率の速度で変異したものと考えられた。EhRas-CVVAに関して、赤痢アメーバの他のRasスーパーファミリーのタンパク質と系統解析を行ったところ、このタンパク質は、Ras/Rapファミ
リーとRho/Racファミリーの中間に位置することがわかった。次に、赤痢アメーバの組換えRas-CVVAとファルネシルピロリン酸を基質として、赤痢アメー

バFTに対するヒトのFT阻害剤の効果を調べたとこ
ろ、FPT inhibitor II (ファルネシル基類似体) とFTI276（CaaMペプチド類似体）に対するIC50は2µM程度であったのに対し、FPT inhibitor I、Gliotoxin、HFPA(以上ファルネシル基類似体)、に対しては30µM以上であった。これは、ヒトH-Rasを基質としたときのヒトFTに対するこれらの阻害剤のIC50 (500pM〜1µM)に比べて著しく高い値であった。以上のことから、
赤痢アメーバのFTは、系統的にも、また、FT阻害剤
に対する感受性に関しても、ヒトFTと著しく異なっていることが明らかになった。
[文献]
Kumagai, M., Makioka, A., Takeuchi, T., and Nozaki, T.
(2004) J. Biol. Chem. 279, 2316-2323.

Entamoeba の脱嚢および発育に対するカルシウムイオン
およびカルモデュリン阻害剤の効果牧岡朝夫1, 熊谷正広1, 小林正規2, 竹内 勤2（ 慈恵医大・熱帯医学、2慶大・医・熱帯医学・寄生虫学)
1

Effect of calcium antagonists and calmodulin inhibitors on Entamoeba excystationand metacystic development
Asao MAKIOKA1, Masahiro KUMAGAI1, Seiki KOBAYASHI2 and Tsutomu TAKEUCHI2( Dept. Trop. Med., Jikei Univ. Sch. Med., 2Dept. Trop. Med. Parasitol., Keio Univ. Sch. Med.)1

SUMMARY
The effect of calcium ions (Ca2+) and calmodulin (CaM) on the excystation and metacystic development of Entamoeba invadens was examined by transfer of cysts to a growth medium containing calcium antagonists and CaM inhibitor. Excystation, which was assessed by counting the number of metacystic amoebae after induction of excystation, wasinhibited by the calcium chelators ethyleneglycol bis (β-aminoethyl ether)-N,N’-tetraacetate (EGTA) and ethylenediaminetetraacetate (EDTA), with EDTA being more potent than EGTA. The inhibitory effect of higher concentrationsof these chelators on excystation was associated with reduced viability of cysts. Metacystic development, when determined by the number of nuclei in an amoeba, was delayed by EGTA, because the percentage of four-nucleate amoebae
was higher than in controls at day 3 of incubation. EDTA made metacystic development unusual by producing a large
number of metacystic amoebae with more than ten nuclei. The inhibition of excystation by these chelators was partiallyabrogated by their removal. A putative antagonist of intracellular calcium flux, 8-(N,N-diethylamino) octyl-3,4,5trimethoxybenzoate (TMB-8) also inhibited the excystation and metacystic development, but had little effect on cyst
viability. The slow Na+-Ca2+ channel blocker bepridil but not verapamil inhibited the excystation and metacystic development, associating with reduced cyst viability at higher concentrations. The inhibitory effect of bepridil on excystation
was abrogated by removal of the drug. The CaM inhibitor trifluoperazine (TFP) inhibited the excystation and metacystic
development. The inhibitory effect of TFP on excystation was also abrogated by removal of the drug. These results
indicate that extracellular calcium ions, amoebic intracellular calcium flux, calcium channels, and a CaM-dependent
process contribute to the excystation and metacystic development of E. invadens.

Jpn. J. Protozool. Vol. 37, No. 1. (2004)

95[目的]Entamoebaの脱嚢および脱嚢後アメーバの発育少が認められた。EDTAのほうがEGTAよりも強い阻は感染の成立のために必須な過程であるがその機構

害効果を示した。嚢子の生存率は高濃度のキレートはほとんど明らかでない。この機構の解明は感染の剤存在下で減少した。脱嚢後アメーバの発育をその理解ならびに新規薬剤開発の標的の探求において重核数により調べた結果、EGTAは発育を遅延させ、2+要である。カルシウムイオン(Ca )ならびにカルモ

EDTAは発育異常を引き起こした。これらのキレート

デュリン(CaM)は多くの細胞機能を有し、我々は先に剤の除去により虫体数の部分的な回復が認められ

Ca2+/CaM阻害剤がEntamoebaの増殖および嚢子形成をた。Ca2+ fluxの阻害剤TMB-8も両過程に対する阻害

阻害することを明らかにした。今回、脱嚢および脱効果を示したが、嚢子の生存率には影響しなかっ2+

嚢後アメーバの発育に対するCa /CaM阻害剤の効果た。Ca2+channel blockerであるbepridilは両過程を阻害を調べた。

し、高濃度では嚢子の生存率を減少させた。また、[方法]E. invadens栄養型を嚢子形成液に移し３日間培養することにより嚢子を得、この嚢子を栄養型培養
液に戻すことにより脱嚢を誘導した。その後３日間
metacystic amoebaeの数をカウントし、また虫体当りの核数を求めた。

bepridilの除去によりアメーバ虫体数の回復がみられた。CaM阻害剤trifluoperazine(TFP)も両過程に対する阻害効果を示し、bepridilの場合と同様、TFPの除去
によりアメーバ虫体数の回復が認められた。

以上の結果はCa2+ /CaMがEntamoebaの脱嚢および脱嚢後アメーバの発育にも関与していることを示唆してい[結果及び考察]種々の濃度のCa2+キレート剤EGTA、
EDTA存在下で脱嚢後アメーバ虫体数を比較した結果、EGTA 1-10 mMの濃度でほぼ同様な虫体数の減少が認められ、EDTAでは濃度に依存した虫体数の減る。
[文献]
Makioka, A. et al. (2002). Parasitol. Res. 88, 873-843.

糸状架橋構造; Trypanosoma evansi の形態形成に及ぼす役割
比留木武雄(島根大学・医・医・微生物免疫)

Filamentous Bridging Structure; A Role Playing in the Morphogenesis
of Trypanosoma evansi
Takeo HIRUKI (Dept. Microbiol. & Immunol., Sch. Med., Shimane Uni.)
SUMMARY
Even after 16 minutes of pronase incubation of 500 micrograms at final concentration per 1 ml of 0.15M Na-K
phosphate buffer (pH 7.2), the rivet structures (maculae adherence : m.a.) of Trypanosoma evansi were confirmed toremain in situ with a transmission electron microscope, although Frevert, U. et al. (1986) described in T. congolense thatm.a. were completely removed after 2 minutes incubation with pronase, at the same final concentration as this work. The
flagellum became detached from the parasite body of T. evansi in this work, to my surprise, was proved to be accompanied by the architecture of m.a. Hemphill et al. (1991) demonstrated clearly in T. brucei that there was a filamentous
bridging structure (FBS) joining the paraxial rods of the flagellum to the subpellicular microtubules of the parasite body.
FBS appears to be an adhesive structure appendant to the m.a. as seen in the transmembrane linker of mammalian desmosomes. Therefore, the flagellar detachment from the parasite body in T. evansi would be responsible for not the digestion of m.a but that of the FBS. Moreover, the cause of morphological alteration, from the slender form to the stumpy
form, would be also sought to not the flagellar internalization and the accumulation of cell organelles at the former posterior end of the parasite body but the digestion of the FBS, because the intermediate filaments and the FBS (or transmembrane linkers) together with the m.a. (or cytoplasmic plaques) are considered to relate to the cell shape and the localization of cell organelles including a kinetoplast as well as the flagellum-to-cell joining, by the analogy with mammalian
desmosomes.

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原生動物学雑誌

96[目的]トリパノゾーマの細胞の形態的変化は、生活でのm.a.構造に加えて、今回は新たに、虫体側のm.a.

環(life cycle)の中のmorphological transformationと呼ばの明瞭に維持された構造を紹介する。則ち、これられる形態的変異と、消化酵素などの作用を受けた場の写真は、鞭毛が剥離した後もm.a.の構造はよく維合の退行的変化のひとつとしての形態変化

持されていることを示す。このことは、酵素にょる（morphological alteration or morphological change）のTrypanosomaの形態変化の始発点をm.a.の消失におい二 つ の 変 化 が あ る 1)。

Frevert et.al. (1986) はた考えが間違いであることを示す。則ち、m.a.が消Trypanosoma congolense（T. congolense）を用いて,こ失したから、鞭毛が剥離するのではない。動物細胞の後者の場合の形態変化について電子顕微鏡を用いの接着構造desmosomeでは、隣接する細胞を結合すた研究を行い、pronase 500 micrograms / mlの投与をるものはtransmembrane linker(:TL)であることが既に受けた細胞が、消化時間2 分で細胞のデスモゾーム

明らかにされている４）。Hemphill et al.( 1991)２）はTL様の接着構造{これを当該原虫ではmaculae adherensと 良 く 似 た filamentous bridging structure(:FBS) が T.

（m.a.）またはrivet structureと呼んでいる。}を完全

bruceiで存在することを証明している。おそらく鞭毛

1)に失うことを観察した 。彼女等はm.a.が完全融解さが剥離するためには、この構造の蛋白融解酵素によれることにより、鞭毛が細胞内に陥入して、細胞内る 除 去 で 十 分 と 考 え ら れ る。な お desmosome はの小器官を連累して、鞭毛のbasal partが存在する

intermediate filamentsと共に『舫い杭』として細胞内Former Posterior End（: FPE）と呼ばれる部分に巻きのorganellesを定位置に固定させる構造であるから、あがるためにslender-formからstumpy-formへの形態変

Trypanosomaの場合もm.a.を介して細胞膜を相互に結化が生じると考えた1)。演者は、全く、同様な実験を合する構造であるFBSが融解されると、organellesはT. evansiで行い、報告してきた3)。今回は新たな成果

細胞内で定着点を失うのであろう。また、運動といを追加して、Frevert U. et al.の上記の仮説とは異なっう 機 能 を 果 た す よ う に、細 胞 の 周 囲 を 螺 旋 状 に
paraxial rodsとsubpellicular microtubulesの間を、このた考えを提唱する。
[材料と方法]T. evansi (Taiwan strain)をBALB/c Slc
strain miceに接種して、原虫を生体内で増殖させ採血して、それを遠心分離して、trypsinとpronaseで設定時間の処理を行い、透過型電顕試料作成をおこない観察した。その詳細については、既に報告してあるので、そちらを参照されたい3)。
[結果と考察]これまでに報告しているようにm.a.はT.
evansi で は 16 分 の Frevert et.al.の 使 用 と 同 じ 濃 度 のpronaseでの処理で、除去されず、原位置に電顕下に3)観察された 。酵素処理１６分後に観察された鞭毛側FBSで連結しているので、このFBSが失われた場合
は、細胞 は鞭毛 の basal part を 中 心と して、丸 くな
り、形態変化するものと考えられる. 従って、融解酵素を使用したTrypanosomaの形態変化は、FBSがこの原虫の形態形成に深く関与することを示唆すると考える。
[文献]
1) Frevert, U.et al.(1986) J. Ultrast. Mol. Res., 94,140-148
2) Hemphill, A.et al.(1991) Parasitol., 77(4), 603-612
3) 比留木武雄(2000) 山口獣医学雑誌、27,19-32
4) Staehelin,L.A.&Hull,B.E.(1978) Sci.Ame. 238,140-147

関東地方におけるイヌのEncephalitozoon 感染の
血清疫学的調査佐々木志朗1, 朝倉登喜子2, 澤田拓士1, 古屋宏二2（ 日本獣医畜産大学・獣医微生物, 2国立感染研究所・寄生動物部）
1

Seroepidemiological survey of Encephalitozoon infection in dog in the Kanto district
Shiro SASAKI1, Tokiko ASAKURA2, Takuo SAWADA1, Koji FURUYA2(1Nippon Vet. Anim. Sci. Univ., 2Dept. Parasitol., NIID, Japan)

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SUMMARY
Encephaltitozoon cuniculi is the obligate intracellular protozoan parasite belonging to the phylum Microsporidiathat infect a wide range of invertebrate and vertebrate hosts including humans. After AIDS virus emerged in1983, manycases of human encephalitozoonosis caused by E. cuniculi infection have also been reported from various developed
countries for the last 10 years, except for Japan. More recently, it was revealed that two genotypes exist in human E.
cuniculi isolates, i.e. genotype I and genotype III. These two types have host specificity respectively. Genotype I was
isolated from rabbits and genotype III from dogs. Whereas rabbit E. cuniculi infection commonly is seen throughout theworld, the prevalence state of dog E. cuniculi infection is obscure to us, in Japan in particular, since probably that has notbeen surveyed up to now. Therefore, we started to survey seroepidemiologically the current conditions of E. cuniculi
infection in dogs. This report shows the results of serosurvey in the Kanto area. We tested 159 dogs’ sera by ELISA,
and obtained only one positive serum. The results indicated that E. cuniculi infection in dogs might be poorly prevalent
as far as we surveyed by serological means.
[目的]Encephalitozoon cuniculiはMicrosporaに属PBS で200倍希釈した。希釈血清と抗原の反応は室する細胞内寄生原虫である。WHOは1993年に本原

温で1時間行った。2次抗体反応には、HRP標識プロ虫を新興病原体として規定し、ヒトへの感染の広まテインAを用いた。発色基質としてABTSを用い、室りに注意を喚起している。現在、E. cunuiculi 感染

温で30分間反応させた。SDSを用いて反応停止後、によるencephalitozoonosisは人獣共通感染症と考え

直ちにプレートリーダ(Bio-Rad Benchmark)でられており、ヒトへの感染源宿主としてウサギとイ

415nmの吸光度を測定した。カットオフ値は、0.5未ヌが報告されている。近年、ヒトとイヌの関わりが満を陰性、0.5〜1.0を疑陽性、1.0以上を陽性とした

親密化していることから、イヌからの感染防止のたが、ウサギ血清を用いた過去の調査結果に基づいてめの対策が公衆衛生上重要になってきている設定した（古屋ら、未発表）。

（Antonella et al., 2002）。欧米では、既にイヌにおけるE. cuniculi感染についての流行調査が進められているが、同様な調査はわが国ではこれまで行われていない。今回、ELISA法を用いて関東地方におけるイヌの血清疫学的調査を行ったのでその結果について報告する。

[結果と考察]今回、調査対象としたイヌの血清検体
159例のうち８例がOD 0.565から0.918 のELISA疑陽性値を、１例がOD 1.412のELISA陽性値を示した。残りの血清検体はすべてOD 0.5以下のELISA陰性値であった。OD 1.0以上の検体を血清学的に陽性とすると、陽性率は0.62％（1／159）となる。欧米[材料と方法]本研究では関東地方の動物病院の協力のELISAによる血清疫学的調査例によると、スロバの下に得られたイヌ血清159試料を調査の対象としてキアで37.8％（イヌ血清検体193例中73例が陽性）用いた。陽性対照には有症ウサギ血清を2試料、陰性の陽性率が得られたが、ノルウエーでは調査した

対照には健常ウサギ血清1試料を用いた。血清中のE.

1104例はすべて陰性、スイスでも調査した212例はcuniculi に対するIgG 抗体は常法に従いELISA法ですべて陰性の結果を示した(Monika et al.,2003;

測定した。抗原は感染培養細胞から分離した

Johan, 2003)。今回の調査結果から推察すると、血E. cuniculi 胞子をPBS (phosphate buffered saline)

清学的手段により調査する限り、関東地方におけるで十分に洗浄した後にLaemmli sample buffer (Bio-

イヌのE. cuniculi感染の流行状況はかなり低いのでRad)で95℃5分間加熱処理し、遠心後の上清をTrisはないかと考えられた。なお、今回ELISA陽性、疑バッファー(PH 8.0)で平衡化したNAP-5カラム

陽性となったイヌには臨床的にencephalitozoonosis(Pharmacia) に通して脱塩し、抗原液とした。96穴を疑う症状は認められなかった。

マイクロプレートの各ウェルに抗原液を100μl入
れ、4℃で3日間インキュベートを行った。ブロッキ
ングにはSuper Block Blocking Buffer を用いた。検体血清、対照血清はそれぞれ0.05% Tween20 in[文献]
Antonella, T. et al. (2002) Mod. Pathol., 15:577-583.
Monika, H. et al. (2003) Ann. Agric. Environ. Med.,
10,117-120.

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Amoebae isolated from some ornamental fish in Thailand
Thitiporn Laoprasert1 , Somkiat Kanchanakhan1 , Supranee Chinabut1 and Kishio Hatai2(1 Aquatic Animal Health Research Institute, Department of Fisheries, Thailand
2
Nippon Veterinary and Animal Science University, Japan)
SUMMARY
Recently, oscar fish faced with disease, which is difficult to control. It caused productive and economic losses. A
small pieces of gills and kidney of oscar fish were taken from the fish and inoculated on a NNE-plate. Amoebae isolated
were classified into three different groups. The first group isolated from the kidney had two stages, trophozoites andcysts, and was classified in the genus Acanthamoeba. The second group was isolated from the gills. Trophozoite
showed typical fan-like shape with about 20 µm in size. This amoeba was classified in the genus Vannella. The thirdgroup was isolated from the gills and water. This group formed three stages as trophozoite, flagellum and cyst. This
study is a first report on isolation and identification of various group of amoeba from oscar fish.
[Introduction] Oscar fish, Astronotus ocellatus, wasverted microscope. The amoebae were identified accord-

introduced to Thailand in several years ago. To date, it

ing to Page, (1988).

became popular species. Fish farmers succeeded in producing the larvae in large number to export some ornamental fish markets in the world. Recently, oscar fish
faced with disease, which is difficult to control. It caused
productive and economic losses. In the previous study,
Laoprasert et al. (2002) isolated a kind of amoeba, Acanthamoeba sp. from oscar fish. Amoebae in the genera
Hartmannella, Acanthamoeba, Naegleria, Vannella, Vexillifera and Rosculus, and the genera Thecamoeba and Paramoeba have been reported from some freshwater fishes
and marine fishes, respectively (Sawyer et al., 1974; Dykova et al., 1998; 1999a, b; Clark and Nowak, 1999; Kent,
2000). However, it has been few reported from tropicalcountries. Therefore, we attempted to isolate and identify
amoebae from oscar fish.

[Results] A large number of trophozoites were observedin NNE-plate. Newly born trophozoites accumulated on
the growth line. Microscopic observation indicated thatamoebae were classified into three different groups. The
first group was isolated from the kidney, which had twostages, trophozoites and cysts. The trophozoite had spinylike flexible micro-pseudopodia with about 10-30 µm in
size. The cysts were polygonal shape with double wall andabout 12-15 µm in size. This amoeba was classified in thegenus Acanthamoeba.

The second group was isolated

from the gills. This amoeba showed only one stage, trophozoites. But just before attaching to a substrate, theamoeba showed a floating form with long radial as star.
Trophozoite showed typical fan-like shape with about 20µm in size. This amoeba was classified in the genera Van-

[Isolation and purification] Oscar fish and water

nella. The third group was isolated from the gills andfrom rearing tank were collected from some fish farms. A

water. This group formed three stages as trophozoite, fla-

small piece of gills and kidney were taken from the fish andgellum and cyst. Trophozoites showed eruptive shape, andinoculated on a NNE-plate (20 ml of non-nutrient agar plate

were about 20 µm in size. Once it is free-living in water,

surfaced with heat-killed Escherichia coli). The plates

trophozoite transformed to flagellate stage with two andwere then incubated at 25oC for 3-5 days. Examination waslong flagella. In the other hand, once a condition in agar

done daily. In case of contamination with others organisms,

plate becomes unfavorable condition, trophozoites, thenpurification was made by re-inoculating a small piece ofamoebae transformed to cyst, which had round shape with,amoeba colony onto a new NNE-plate. Each amoeba isolatesmooth and thicken wall, and were about 10-12 µm in size.

was stocked at 25 oC in incubator for maintenance andidentification.

[Discussion] This study is a first report on isolation andidentification of various group of amoeba from oscar fish

[Identification] Identification was made from the

However, pathogenicity to animals is not known. Further

morphological characteristics of the amoeba under in-study is needed. Besides, identification at species level,

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原生動物学雑誌

and biological characteristics including molecular study
are purpose to develop a specific primer or probe to be auseful tool of rapid diagnosis for prevention and control.

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of turbot Scophthalmus maximus. Disease of
Aquatic Organisms 33(2): 137-141.
Dykova, I., J. Lom, J. M. Schroeder-Diedrich, G. C.
Booton and T. J. Byers. 1999a. Acanthamoeba[References]
Clark, A. and B. F. Nowak. 1999 Field investigations ofamoebic gill disease in Atlantic salmon, Salmosalar L., in Tasmania. Journal of Fish Diseases
22: 433-443.
Dykova, I., A. Figueras and B. Novoa. 1999. Epizoic
amoebae from the gills of turbot Scophthalmus
maximus. Disease of Aquatic Organisms 38(1):33-38.
Dykova, I., A. Fiqueras, B. Novoa and J. F. Casal. 1998.
Paramoeba sp., an agent of amoebic gills diseasestrains isolated from organs of freshwater fishes.
Journal of Parasitology 85(6): 1106-1113.
Kent M. L. 2000. Marine netpen farming lead to infections with some unusual parasites. Int Journal of
Parasitology 30(3): 321-326.
Laoprasert, T., S. Kanchanakhan, S. Chinabut and K.
Hatai. 2002. First Report of Systemic amoebosis
in oscar, Astronotus ocellatus.

Handbook andabstract of 5th symposium on Diseases in Asian
Aquaculture. 24-28 November 2002. Queensland,
Australia.

鞭毛基部体に異常を持つクラミドモナス新規突然変異株の単離
中澤友紀1，Paul A. Lefebvre2，神谷律1，広野雅文1（1東京大学・生物科学，2ミネソタ大学・植物）

Isolation of new Chlamydomonas mutants deficient in basal body formation
Yuki NAKAZAWA1, Paul A. LEFEBVRE2, Ritsu KAMIYA1 and Masafumi HIRONO1(1Dept. Biol. Sci., Univ. Tokyo, 2Dept. Plant Biol., Univ. Minnesota)
SUMMARY
We have isolated a Chlamydomonas mutant, bld10, which totally lacks basal bodies. The fact that the mutant isviable without basal bodies demonstrates the usefulness of Chlamydomonas as a tool for studying the mechanism ofbasal body/centriole assembly by using a variety of mutants. To isolate new basal-body mutants, we produced mutants
by insertional mutagenesis and screened for strains showing similar phenotypes to those of bld10, such as the defects inflagellar formation and mitosis. Of about 25,000 transformants, eight strains that fulfill the criteria were isolated. Immunofluoresence microscopy using anti-centrin, anti-tubulin, anti-Bld10p, and anti-tektin antibodies revealed that four
strains (No. 135, 214, 2E7, 1B9) show abnormal staining patterns of the basal bodies and its related cytoskeletons. Of
these four strains, strain 135 and 214 were found to be new alleles of bld10 by crossing with several known basal bodymutants. Electron microscopic observations of the rest two strains revealed that strain 2E7 has truncated basal bodies
and strain 1B9 has multiple basal bodies in the apical region of the cell. These observations suggest that strain 2E7 has adefect at a step in the elongation of the basal body during the assembly process and strain 1B9 has in the regulation of
duplicating the basal body.
[目的] 中心小体(centriole)は中心体の核となって微小にも構造的にも相同な小器官である鞭毛基部体をも管の配向を決定する重要な細胞内小器官である．こつ．最近，我々の研究室の松浦らは，基部体を完全の構造は細胞周期ごとに自己複製するという興味深に欠損したクラミドモナス突然変異体，bld10を単離い性質をもつが，その形成・複製の機構は，現代細し，その解析から基部体形成に必須な蛋白質を同定

胞生物学の中でまったく未知の研究領域のまま残さすることに成功した．この研究により，クラミドモれている．クラミドモナスはこの中心小体と機能的

ナスは基部体がなくても生育できるため，その形成

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機構を遺伝学的に研究する上で最適な材料であるこ株，2E7株，1B9株の４株はいずれの抗体で染色してとが示された．そこで新たな基部体変異株を多数単も異常なパターンを示した．さらに基部体タンパク離することを目的として，鞭毛が欠失する，生育が質を認識する抗-Bld10pおよび抗-テクチン抗体で染色遅い，細胞あたりの核数に異常がある，などのbld10

すると，野生型では基部体の蛍光が観察されるのにに共通する表現型を指標にスクリーニングを行っ

対し，135株と214株では蛍光が全く観察されず，2E7

た．

株では野生型に比べてごく弱い蛍光が観察された．

[方法] 突然変異株はinsertional mutagenesis法によって作出した．栄養要求性突然変異株nit1 またはthi10
に対し，それを相補する遺伝子をインサートに持つ
プラスミドpMN56 (NIT gene)またはpTHI4.9 (THI10gene)をガラスビーズ法により形質転換した．得られた形質転換体を液体の選択培地に希釈して試験管に入 れ，８ 時 間 静 置 培 養 し た 後，寒 天 培 地（選 択 培地）に移して１０日間培養した．出現したコロニーを１つずつ液体培地に移した後，スクリーニングを行った．

また1B9株では基部体の蛍光が細胞内に複数見られた．
これら４株と既存の基部体変異株との関係を遺伝学 的 解析 に よっ て 調べ た とこ ろ，135 株，214 株 は
bld10の新規alleleであること がわかった．2E7株と1B9株については電子顕微鏡観察を行った．2E7株では基部体らしい構造はほとんど観察できなかったが，わずかにcartwheelらしい構造と，短い微小管からなる基部体様構造が観察された．従ってこの変異
株は，基部体形成過程のうちBLD10が働くcartwheel
形成期よりも後に構築が停止する変異株であること[結果と考察] Insertional mutagenesis法により作出しが強く示唆された．また1B9株の細胞を観察すると，た変異株約25,000株から，遊泳細胞を含まない約400

基部体構造そのものは野生型を同様であったが，１の株を選出し，その中から細胞壁溶解酵素処理をしカ所に４つ以上の基部体およびその関連構造が高頻ても鞭毛を形成しないものを51株得た．次に細胞の度で観察された．従ってこの変異株は正常な基部体核を染色し，異常な核数をもつ細胞の割合が高いも構造は形成できるが，その複製制御機構が異常にのを探したところ，異常細胞の割合が野生型の２倍なっている可能性が示唆された．

以上ある株が８株得られた．

今回，多数の基部体変異株を得ることを目的としこれらの株の中に鞭毛基部体変異株が含まれていて比較的大規模なスクリーニングを行った．その結るかどうかを調べるため，基部体とつながる細胞骨果，新規と思われる基部体変異株を２つ得ることが格に異常があるかどうかを，抗-セントリンおよび抗-できたが，既存の変異株bld10のalleleも２つ単離されアセチル化チューブリン抗体を用いた間接蛍光抗体

た．今後は変異作出およびスクリーニング法にさら法によって調べた．その結果，８株のうち４株は野に工夫を加えてさらに新規の基部体変異株を試みる

生 型 と同 じ 染色 パ ター ン であ っ たが，135株，214予定である．

マレーシア産ジャワマメジカ（Tragulus javanicus）のルーメン内繊毛虫相
上野まどか1，池和憲1，森田達志1，今井壮一1，木村順平2，福田勝洋3（1日獣大・獣医寄生虫，2日大･獣医内科，3名古屋大・農）Rumen ciliate protozoal fauna of lesser mouse deer (Tragulus javanicus) in Malaysia
Madoka UENO1, Kazunori IKE1, Tatsushi MORITA1, Soichi IMAI1, Junpei KIMURA2 and Katsuhiro
FUKUTA3 (1Nippon Vet. Anim. Sci. Univ., 2Vet. Int. Med., Nihon Univ., 3Fuc . Agr., Nagoya Univ.)Jpn.
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SUMMARY
The rumen ciliate fauna of the lesser mouse deer in Malaysia was surveyed. The ciliate composition was simple;
only four species belonging to the genus Entodinium, E. simplex, E. parvum, E. dibardi and Entodinium sp., were found.
Entodinium sp. had a slender body, length 50.3 µm and width 25.1 µm on average. Its macronucleus was rod-shaped and26.9 µm in length on average, and a micronucleus was situated at the antero-ventral side of the macronucleus. A distinct
groove runs from the anterior end to the posterior end of the body at the ventral-left side of the macronucleus. A contractile vacuole was situated at the ventral side of the groove. In the SEM, the groove was observed as well as many striations on the body surface running obliquely to the body axis. Comparison of this species with morphologically related
species suggests that it should be described as a new species. Since the composition rate of this species was high, 3080% of the total ciliates, this species might have evolved in the environment of the mouse deer.

[緒言] 反芻動物は難消化性の植物繊維を消化、分解しているのが認められた。走査型電子顕微鏡によるするためのルーメンと呼ばれる特殊な器官を有して観察では体表全体に体軸に対し斜めに走行しているいる。この中には細菌、真菌、原生動物などが多数

線条構造が認められた。光学顕微鏡で観察された溝

定着しており、その中でも原生動物は繊毛虫が多くも体軸に対し斜めに走行していた。また収縮胞開口を占め、大型で様々な形態を有するため今日まで形部がこの溝の腹側前端付近に開口しているのが観察

態分類学的側面から様々な研究が行われてきた

さ れ た。Entodinium sp.は 形 態、大 き さ 共 に E. par-（1）。今回、ジャワマメジカのルーメン内容物を得vum、E. costatumに類似していたため、形態学的な比る機会を得たのでそのルーメン内繊毛虫について検較を行った結果、体長、体幅は類似していたが、大索を行った。

核／体長比、体表の溝の有無、ならびにその走行よ[材料および方法]マレーシア、コタ･キナバルにて採取されたジャワマメジカ（Tragulugs javanicus）3頭のルーメン内容物を10％ホルマリン液にて固定したものを材料とした。光学顕微鏡での観察にはこの材料をさらにMFS液で核染色を施したものを使用した。またMFS液に浸漬した試料を脱ホルマリンした
後、２％オスミウム液で再固定したものを水洗し、エタノールシリーズで脱水、第3ブチルアルコールへの浸漬を経て凍結乾燥したものを走査型電子顕微鏡用試料として用いた。

り、Entodinium sp.はE. parvumとも E. costatumのいずれとも異なる種であると考えられ、新種として記載されるべきものであると判断された。今回の調査でジャワマメジカのルーメン内繊毛虫相がEntodinium属
のみからなる単純なものであった理由の一つとしてルーメン内pHが低かったことが考えられる。ルーメ
ン内繊毛虫相は宿主の食性に依存しており、マメジ
カのように果実や木の芽などのような高栄養の食物を摂取している場合（ブラウザー型）はルーメン内
pHが急激に低下することでルーメン内環境が大きく変化し、低ｐHでも生存できるEntodinium属のみが生[結果と考察]繊毛虫構成はEntodinium属の4種が観察

き残ると考えられる。またマメジカ類は単独生活者

れ、E.parvum、E.simplex、E.dubardi、Entodiniumであることから、他個体との接触が極めて少ないた

sp.から成る単純な繊毛虫構成が認められた。これら

め他の反芻動物との接触による繊毛虫の伝播も起このうちEntodinium sp.は既知種とは異なる形態を有しりにくいと考えられる。Entodinium sp.は繊毛虫全体ていると思われた事から、詳細な形態学的な検索をの30−80％を占めており優勢種であったことからジャ行 っ た。本 種 は 細 長 い 体 型 を 持 ち、体 長 は 平 均

ワマメジカのルーメン内環境で独自の進化を遂げた

50.3µm、体幅は平均25.1µmであった。大核はこん棒ものと考えられた。

さ状で長さは26.9µｍであった。小核は大核の前端近くの腹側に位置していた。大核の腹側には虫体頭部か
ら尾部にかけて１本の明瞭な溝が存在していた。また収縮胞が大核の前端部、溝のさらに腹側に1個存在[文献]
1. Imai, S. (1998) Phylogenetic taxonomy of rumen ciliate
protozoa based on their morphology and distribution. J. Appl. Anim. Res. 13: 17-36