ヒト尿解析への HPLC 法の適用 49

ヒト尿解析への HPLC 法の適用
治京玉記
Application of HPLC in Human Urine Analysis

Tamaki JIKYO

Abstract
Comprehensive analyses, using biological specimens, such as blood, urine and organs, are highly likely
to enable researchers to acquire an understanding and manage the risks of the fluctuations of biologicalinformation. Unlike blood and organs, urine can be obtained non-invasively. Containing miscellaneous
categories of substances, such as organic acids, amino acids, purines, pyrimidines, sugars, sugar alcohols,
peptides and proteins, human urine specimens can provide information comprehensively for the diagnosisof metabolic abnormalities. However, urine components are problematic in that peptides and proteins areunstable, the physiological fluctuation range is large, the measured value is not constant and there aremany contaminants.
This study aimed to present a new urine analysis method by performing a comprehensive patternanalysis, using high-performance liquid chromatography（HPLC）of the organic components in humanurine specimens. First, it assessed the measurement conditions of the pretreatment method and those of
the HPLC method to rapidly and easily measure human urine specimens. Next, comprehensive patternanalysis of human urinary organic components was performed on urine specimens from three Japanesewomen in their 20s to 30s, using the established measurement conditions of the pretreatment method andHPLC.

Keywords；	High-performance liquid chromatography 高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
Human urine analysis

ヒト尿解析

Comprehensive analyses
Proteomic analysis

網羅的解析

プロテオーム解析

Metabolomic analysis

メタボローム解析

1．はじめに生体では、誕生から死にいたるまで絶え間なく尿が生産され、健常人では１日に約 1.5リットルの尿を排泄しており人生 80 年の間

50 大阪夕陽丘学園短期大学

紀要

第 60 号

2017に出す尿の平均量は約 35 トンといわれていカー探索において重要な役割が期待されてる。尿成分は、約 98% が水分、約 2% が尿素、いる。2008 年には腎臓と尿プロテオームプ

その他、タンパク質、糖、赤血球およびヘモロジェクト（The Human Kidney and Urine

グロビン、ケトン体、ビリルビンおよびウロ

Proteome Project; HKUPP） か ら 尿 プ ロ テ

ビリノーゲン、亜硝酸塩、ポルフィリン体、オーム解析標準化のためのガイドライン 2）

バニリルマンデル酸等の有機成分、食塩、ナとして、採尿法（早朝第二尿の中間）、防腐トリウム、カリウム、カルシウム、マグネシ剤の必要性（必要、室温、8 時間以内、４℃、ウム、塩素、総硫酸、エーテル硫酸、リン、16 時間以内）、タンパク質分解酵素の必要性

鉄等の無機成分から構成されている。これら（必要なし）、前処理と保存法（30 分以内にの組成は、血清成分に比べ著しく変動しやす

低速遠心、細胞成分、円柱除去後、凍結保く、尿成分の定性・定量解析することで腎疾存）、質的差異（性差、年齢、人種、運動負荷、患、肝疾患、糖尿病、先天性代謝異常、退行食事など）、標準的プラットフォーム（今後性疾患、感染症、代謝異常、栄養障害の診断の課題）、質量分析法（Mass Spectrometry;および治療モニタリングがなされており、さMS）データベース化（今後の課題）などのらに新たな疾患関連物質のバイオマーカー探提案がなされている。また、幾つかの尿プロ索が期待されている。しかしながら、尿成分テオーム解析のための尿試料調整法 3）-6）も報は、ペプチド、タンパク質が不安定であるこ告されている。と、生理的変動幅が大きいこと、測定値に一

尿 プ ロ テ オ ー ム 解 析 研 究 と し て は、 膀定幅がないこと、多くの夾雑物が含まれる等

胱 癌 7）、 前 立 腺 癌 7）-10）、 子 宮 頸 管 癌 患 者、の問題点に加え尿成分の定性・定量性が弱く、妊婦および非妊婦を対象とした血清およそれらに対する問題解決が望まれている。

び尿解析の液体クロマトグラフィー質量

また、遺伝子産物であるタンパク質は最終分析法（Liquid Chromatography Mass的な生体機能を担っており、疾患に対して直Spectrometry; LC/MS）の時間配列アルゴリ接的な関連付けが可能である。また生体内にズム解析 11）、腎臓移植時の慢性同種移植機能は核酸やタンパク質のほかに、糖、有機酸、障害 12）、冠動脈疾患の症状を訴えている患

アミノ酸など多くの低分子化合物が存在し、者 の 尿 CE/MS（Capillary Electrophoresis/

これらの物質の多くは酵素などの代謝活動にMass Spectrometry） パ タ ー ン 解 析 13）、 慢よって作り出された代謝物質である。現在で性腎臓病での定量的尿プロテオーム分析 14）、は、生体の機能から解析されてきたタンパク

新生児での尿のポリペプチドの分析からの尿質の網羅的解析（プロテオミクス）および代管腎盂移行部接合障害 15） などのバイオマー

謝産物の網羅的解析（メタボロミクス）にシカー探索と多岐にわたって報告されている。

フトしており、ゲノム解析、トランスクリプ

尿メタボローム解析研究については、尿中トーム解析は、いままでの手法では発見できメタボロームの相対濃度のパターンと、被験ない疾患関連タンパク質・因子を発見できる者の血圧との関連が統計的解析によりバイオ可能性が高いと考えられている 。

マーカー候補の代謝物質が複数発見され 16）、

1）

血清に比べ著しく変動しやすい尿試料を用

また、血漿と尿試料を用いたフラビンの CE/

いたプロテオーム解析研究およびメタボロー

MS 分析 17）、GC/MS を用いた先天性代謝異ム解析研究では、腎・尿路系疾患だけでなく常の突然変異へのアプローチ 18）、頭蓋変形新全身性疾患の診断、治療、予後、予防の判定、生児の GC/MS を用いた尿のステロイドのプ

さらに新たな創薬ターゲット、バイオマー

ロファイリング 19）、新生児による大規な網羅ヒト尿解析への HPLC 法の適用 51
HPLC 法を用いたヒト尿解析への適用
3的解析からのβ -ureidopropionase 欠陥の 5を用いた尿のステロイドのプロファイリングつのケースが示され 20）、1H-NMR（1H-Nuclear19)、新生児による大規な網羅的解析からのβMagnetic Resonance spectroscopic analysis）-ureidopropionase 欠陥の５つのケースが示と MS を用いた食事摂取量の多様性が及ぼされ 20)、1H-NMR（1H-Nuclear Magnetic
すヒト尿メタボローム解析プロフィールのResonancespectroscopic analysis）と MS を変 動 21）、 尿 と 血 漿 で の 生 化 学 的 な 測 定 と用いた食事摂取量の多様性が及ぼすヒト尿メ
1H-NMR ベースのメタボロミクスからの間欠タボローム解析プロフィールの変動 21)、尿と性跛行症患者での局所貧血－再潅流の新陳代
血漿での生化学的な測定と 1H-NMR ベースのメ
謝の効果とビタミンＣとＥの効果 22）、腎臓タボロミクスからの間欠性跛行症患者での局移植モニタリングのためのプロテオミクスと所貧血-再潅流の新陳代謝の効果とビタミンＣ
ゲノム技術への補完としてのメタボロミクス
22)とＥの効果、腎臓移植モニタリングのため
解析 23）、NMR を用いたブドウ / ワイン抽出のプロテオミクスとゲノム技術への補完とし物消費の尿代謝性プロフィールについての栄23)てのメタボロミクス解析、NMR を用いたブド
養学的介入研究 24）、代謝産物フィンガープ
ウ/ワイン抽出物消費の尿代謝性プロフィール
リンティングによる食事の特徴 25） など多岐についての栄養学的介入研究 24)、代謝産物フにわたって報告がなされている。
ィンガープリンティングによる食事の特徴 25)
本 研 究 で は、 ヒ ト 尿 試 料 中 の 有 機 成 分など多岐にわたって報告がなされている。に 対 し て、 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
本研究では、ヒト尿試料中の有機成分に対し（High-performance liquid chromatography;て、高速液体クロマトグラフィーHPLC）法による網羅的パターン解析を行う（High-performance liquid chromatography；HPLC）ことで、新たな尿解析の手法を提示すること法による網羅的パターン解析を行うことで、新を目的としている。まず、ヒト尿試料を迅速たな尿解析の手法を提示することを目的としかつ簡易に測定するための前処理方法およびている。まず、ヒト尿試料を迅速かつ簡易に測HPLC 法の測定条件について検討を行った。
定するための前処理方法および HPLC 法の測次いで、20 ～ 30 代日本人女性 3 名に対して、定条件について検討を行った。次いで、20～30確立した前処理法および HPLC 測定条件を代日本人女性３名に対して、確立した前処理法用いてヒト尿中有機成分の網羅的パターン解および HPLC 測定条件を用いてヒト尿中有機成析を行った。
分の網羅的パターン解析を行った。
2．結果
2. 結果
まず、ヒト尿試料測定のための試料前処理
まず、ヒト尿試料測定のための試料前処理方
方法として、限外ろ過（Ultrafiltration; UF）
法として、限外ろ過(Ultrafiltration; UF)法
法による尿中夾雑物の除去を行った。UF 法による尿中夾雑物の除去を行った。UF 法は、は、極微少の粒子や溶液中に溶解している分極微少の粒子や溶液中に溶解している分子を子を分離するための膜分離技術であり、分離分離するための膜分離技術であり、分離の原理の原理は、分子の形や帯電状態などの要因は、分子の形や帯電状態などの要因に影響を受に影響を受けるものの、基本的には分子のけるものの、基本的には分子の大きさ(分子量)大きさ（分子量）で分離される。異物が膜で分離される。異物が膜内部で捕捉される精密内部で捕捉される精密ろ過（Microfiltration
ろ過(Microfiltration Membrane; MF)膜とは異Membrane; MF） 膜 と は 異 な り、UF 膜 でなり、UF 膜では、膜の孔よりも大きな分子がは、膜の孔よりも大きな分子が膜表面に保持
膜表面に保持され、ろ過操作中に濃縮される。
され、ろ過操作中に濃縮される。UF 膜の特UF 膜の特徴として、１．処理する分子へのダ徴として、①処理する分子へのダメージが少メージが少ない、２．タンパク質の変性を招くない、②タンパク質の変性を招くような操作ような操作(例えば、有機溶媒による抽出など)（例えば、有機溶媒による抽出など）を必要を必要としない、３．イオン強度や pH を保てとしない、③イオン強度や pH を保てる、④る、４．時間がかからず比較的安価である、５．
時間がかからず比較的安価である、⑤低温（例低温(例えば低温室)での操作が可能である、非えば低温室）での操作が可能である、非常に常に効率的で、分子の精製と濃縮とが同時に行効率的で、分子の精製と濃縮とが同時に行ええるなど利点が多い。今回、早朝第二中間尿試るなど利点が多い。今回、早朝第二中間尿試
料 1mL に対して、UF 膜 100K（MicrosepTM 100K）
料 1mL に対して、UF 膜 100K（MicrosepTMを用い、Beckman 社超遠心機により 2,000 RPM,100K）を用い、Beckman 社超遠心機により1min, 4℃の条件で夾雑物の除去を行った。
2,000RPM、1min、4℃の条件で夾雑物の除次に、尿解析の定性・定量分析として、GILSON去を行った。
Trilution LC システムを用いた逆相 HPLC のFig.1．尿成分の HPLC 解析

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紀要 第●号
第 60 号201●
2017
4 大阪夕陽丘学園短期大学
大阪夕陽学園短期大学 紀要

Fig.2．尿成分の変動パターン解析
測定条件の検討を行った。その結果、Inertsil024）実施した。
尿は血液や臓器とは異なり非侵襲的に得ら次 に、
尿 解4.6
析のODS-3(5μm,×定性・定量分析として、250mm, GL Science Inc.)

れ、古くから代謝の鏡といわれており、一般検

GILSON Trilution
カラム、移動相0% LC
B inシステムを用いた逆相
10min、0 - 60% B in

3．まとめ
査、個別検査に用いられ、試験紙法による簡HPLC の測定条件の検討を行った。その結20min（A;5% ACN、0.1% TFA、B; 95% ACN、0.1%以上、HPLC法を用いたヒト尿試料中の有易・迅速化により臨床検査検体の中でも尿の使果、Inertsil ODS-3（5μm、4.6× 250mm、TFA）グラジエント、流速
1.0 mL/min、UV(214

機成分の定性的・定量的分離パターン解析に用率が最も高い。
そこで、質量分析装置等の技GL 280nm)検出、Science Inc.）カ ラ ム、 移 動 相 0% B inand室温測定という条件設定を確ついて述べた。
術革新から始まった網羅的なタンパク質およ10min、0-60% 。
B in 20min（A; 5% アセトニ
立した（Fig.1）

尿は血液や臓器とは異なり非侵襲的に得らび代謝物の定量・定性解析に注目が集まっておトリル、0.1%
トリフルオロ酢酸、B; 95%ア確立した前処理方法・測定条件を基に20～れ、古くから代謝の鏡といわれており、一般り、尿プロテオーム解析、尿メタボローム解析

セトニトリル、0.1%
30
代女性 3 名に対してトリフルオロ酢酸）グ30 日間の変動のパター検査、個別検査に用いられ、試験紙法によるの必要性が高まっている。
しかしながら、オーラジエント、流速 1.0mL/min、UV（214 andン解析を行った（Fig.
2）。紫外吸収（UV）法

簡易・迅速化により臨床検査検体の中でも尿ム科学であるプロテオーム解析、メタボローム280nm）検出、室温測定という条件設定を確により、まず214nm 付近の特性吸収帯を持つ解析は、計り知れない情報を与える有用技術との使用率が最も高い。そこで、質量分析装置脂肪族化合物が特定され、次いで芳香族核を有立した（Fig.1）。

して期待される半面，各種測定機器類から測定等の技術革新から始まった網羅的なタンパクする化合物は280nm 付近に特性吸収帯を持つ確立した前処理方法・測定条件を基に20 〜

手法さらにはデータ解析法とその技術内容が質および代謝物の定量・定性解析に注目が集ことから芳香族化合物領域を特定した。
さらに、30 代女性 3 名に対して 30 日間の変動のパ分かりにくく、多くの情報を統括し、診断に活まっており、尿プロテオーム解析、尿メタボ

1ターン解析を行った
分毎の各フラクションに対してニンヒドリ（Fig. 2）
。紫外吸収（UV）

かすことはなされていない。
ローム解析の必要性が高まっている。しかし

ン反応による1 級アミン定性反応を行なうこ法により、まず214nm 付近の特性吸収帯を現状のプロテオーム解析、メタボローム解析ながら、オーム科学であるプロテオーム解析、とでタンパク質・ペプチド領域を決定した。
持つ脂肪族化合物が特定され、次いで芳香族の主要基盤技術である
LC/MS 法では、分離・精メタボローム解析は、計り知れない情報を与本研究は、中村学園大学・中村学園大学短期核を有する化合物は280nm 付近に特性吸収製時の簡便化、迅速化、低コスト化等多くの問える有用技術として期待される半面，各種測大学部倫理委員会の承認を得（倫理-08-024）帯を持つことから芳香族化合物領域を特定し題点の解決が切望されていた。本研究では、定機器類から測定手法さらにはデータ解析法実施した。
た。さらに、1 分毎の各フラクションに対しHPLC法による網羅的パターン解析が行うこととその技術内容が分かりにくく、多くの情報てニンヒドリン反応による 1 級アミン定性反で、簡便且つ迅速・低コスト化の可能性を提示を統括し、診断に活かすことはなされていな

3.まとめ応を行うことでタンパク質・ペプチド領域をすることが出来た。今後は、脂肪族化合物領い。

以上、HPLC 法を用いたヒト尿試料中の有機決定した。

域・タンパク質・ペプチド領域の分離技術を向現状のプロテオーム解析、メタボローム解成分の定性的・定量的分離パターン解析につい本研究は、中村学園大学・中村学園大学短上させることでHPLC 法による尿解析が従来の析の主要基盤技術である
LC/MS 法では、分て述べた。
期大学部倫理委員会の承認を得（倫理-08-

離・精製時の簡便化、迅速化、低コスト化等ヒト尿解析への HPLC 法の適用 53

多くの問題点の解決が切望されていた。本研
究では、HPLC 法による網羅的パターン解析が行うことで、簡便かつ迅速・低コスト化の可能性を提示することが出来た。今後は、脂肪族化合物領域・タンパク質・ペプチド領域の分離技術を向上させることで HPLC 法による尿解析が従来の尿検査に加え診断研究に役立つことを期待したい。

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