別紙 1

国内の FOP 患者で見いだされた新しい ALK2 変異に関する研究
研究分担者

片桐岳信

埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門

研究分担者

芳賀信彦

東京大学大学院医学系研究科リハビリテーション医学

研究協力者

福田

埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門

亨教授
教授
助教

研究要旨 2008 年、臨床症状が従来の FOP と異なる国内の FOP 患者から、新しいALK2 の Gly356Asp 変異が見いだされた。従来の変異 ALK2 と新しい変異体を生化学的に比較検討し、FOP の臨床症状と ALK2 が誘導する細胞内シグナルの関連を検討した。その結果、FOP における筋組織内における異所性骨化は、変異 ALK2 によって誘導される Smad1/5/8 のリン酸化レベルと相関する可能性が示唆された。

A. 研究目的

FOP 患者から見いだされた R206H および

進 行 性 骨 化 性 線 維 異 形 成 症

G356D 変異 ALK2 の発現ベクターを構築した。

（Fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP）

こ れ ら を 、 Smad1 と 共 に マ ウ ス 筋 芽 細 胞

は、主に筋組織の中で異所性骨化が進行する（C2C12 細胞）に過剰発現させ、細胞内シグナ遺伝性疾患である。常染色体優性遺伝を示し、ルおよび細胞分化に対する影響を検討した。

2006 年、２番染色体上の ACVR1/ALK2 遺伝リガンド存在下での活性を検討するため、子に家族性および孤発性 FOP に共通の、ALK2 を過剰発現させた細胞を、BMP-4 また617G>A へテロ接合変異が同定された。

は BMP-7 で刺激した。BMP 受容体の特異的

この遺伝子変異は、骨形成に重要なサイト
カ イ ン と し て 知 ら れ る Bone morphogenetic阻害剤として報告されている Dosromorphin による ALK2 の阻害効果を検討した。

protein (BMP)受容体の一種である ALK2 の仮性制御領域に位置し、Arg206 を His に変異さC. 研究結果せる。我々は、この変異 ALK2(R206H)が、リガBMP シグナルのレポーター遺伝子として、ンド非依存的に活性化された構成的活性型変ID1 遺伝子の BMP 応答領域を組み込んだ異受容体であることを見いだした。

IdWT4F-luc を用いて、変異 ALK2 の活性を検2008 年、国内の FOP 患者から新しい ALK2討した。新しく見いだされた ALK2(G356D)変の変異として G356D が見いだされた。この患異体はレポーターを活性化したが、従来から者は、筋組織における異所性骨化の進行が極FOP で知られている ALK2(R206H)や、構成的めて遅く、また、足の指が左右対称性に欠失仮性型変異として知られている ALK2(Q207D)するなど、従来の FOP 患者と異なる臨床症状変異体よりも活性が弱かった（図１A）。一方、を呈した。そこで、培養細胞を用いて、ALK2

BMP シグナル以外の経路として、TGF-βシグの変異部位と FOP の臨床症状の関連を解析

ナルを CAGA-luc レポーターを用いて検討しした。

たが、いずれの ALK2 変異体も活性化しなかった（図２B）。

B. 研究方法

さらに、ウエスタンブロット法で ALK2 変異体

による細胞内シグナルの活性化を検討した。の発現で ALK2(G356D)により有意に誘導されBMP 受容体の基質となる Smad1 のリン酸化は、た が 、 そ の ALP 活 性 は ALK2(R206H) やG356D < R206H < Q207D の順で誘導された

ALK2(Q207D)によって誘導されたものよりも弱が、ERK1/2 や p38 MAP キナーゼのリン酸化

か っ た （ 図 2B ） 。 ALK2(G356D) は 、は誘導されなかった（図 1C）。

ALK2(R206H)と同様にリガンド存在下で ALKP活性を誘導し、特に BMP-7 と相乗的に ALP活性を誘導した（図 2C）。

図 2. ALK2 変異体の筋分化および骨芽細胞分化に対する影響

図 1. ALK2 変異体による細胞内シグナルの活性化
図 3. Dorsomorphin による ALK2 変異体のALK2 変異体の筋分化に対する影響を検討したところ、G356D < R206H < Q207D の順でミ抑制
ALK2(G356D)に対する BMP 受容体阻害剤

オシン重鎖陽性の筋細胞への分化を抑制した

Dorsomorphinの 効 果 を 検 討 し た 。

（図 2A）。骨芽細胞の分化マーカとなるアルカ

Dorsomorphin

はリホスファターゼ（ALP）活性も、Smad1/5/8 とALK2(Q207D)の場合と同様に、ALK2(G356D)、ALK2(R206H)

や

変異体が誘導する IdWT4F-luc や ALP 活性をによる母趾の欠失機序は明らかでないが、今濃度依存的に抑制した（図 3）。

後、タンパクの安定性や細胞内局在の変化などを検討する必要があると思われる。

D. 考察

従来の ALK2(R206H)による FOP 症例と、今これまでに、国内の FOP 症例の遺伝的変異回見いだされた ALK2(G356D)による症例の特として ALK2(R206H)のみが知られていた。最徴から、ALK2 には少なくとも２つの働きがある

近、新しい ALK2 の変異として、臨床症状がやことが推察される。すなわち、１つは胎生期にや異なる FOP 症例から、ALK2(G356D)変異がおける手足の指の形成制御であり、もう１つは見いだされた。本症例は、特に母趾が欠失す

FOP における筋組織での異所性骨形成の誘る点では従来の FOP よりも重篤な症例とも考導である。本研究により、少なくとも後者の作えられるが、その一方で筋組織内での異所性用は、細胞内の Smad1/5/8 のリン酸化を介し骨化の進展は極めて遅い特徴を併せ持つ。そた作用であることが示唆され、このシグナル計

こで、これらの症状の機序を解明する目的で、の阻害剤である Dorsomorphin のような薬剤が変異 ALK2 を in vitro で生化学的に解析した。

有効であることが示された。

ALK2(G356D)は、BMP のレポーター遺伝子を活性化すると共に、筋分化を抑制し、骨芽E. 結論細胞分化を誘導したことから、従来の R206H

FOP は、ALP2 の変異によって起こる疾患で変異と同様に構成的活性型であることが明らあり、変異部位の違いにより誘導される細胞内かとなった。しかし、その活性は R206H やシグナルの量的・質的さにより、症状に差が認

Q207D 変異体に比べて極めて弱いことが判明められる可能性がある。

した。これらの活性は、BMP 受容体の細胞内基質である転写調節因子 Smad1 のリン酸化レ

F. 研究発表

ベルと良く相関していた。従って、

1.論文発表ALK2(G356D)変異体による異所性骨化は、受1) Fukuda T, Kanomata K, Nojima J,

容体の構成的活性によるもので、本症例の進Kokabu S, Akita M, Ikebuchi K, Jimi E,

行が遅いことは、受容体のキナーゼ活性が弱Komori

いためと考えられた。

Miyazono K, Nakayama K, Nanba A, Tomoda

T,MarukiY,MatsuokaM,一方、母趾の欠失のように、G356D 変異のH, Okazaki Y, Ohtake A, Oda H, Owan I,

方が重篤な症状を呈する原因は、Smad1/5/8

Yoda T, Haga N, Furuya H, and Katagiri

リン酸化とは別の機序によると推測された。そT. (2008) A unique mutation of ALK2,

こで、ALK2(G356D)が Smad1/5/8 ではなく、G356D,

一般的に TGF-β受容体の基質と考えられていfibrodysplasia ossificans progressiva

る Smad2/3 を活性化するか否かを検討した。しis a moderately activated BMP type I

か し 、 CAGA-luc の 活 性 化 は 認 め ら れ ず 、

receptor. Biochem Biophys Res Commun

Smad 以外の ERK1/2 や p38 MAP キナーゼの37: 905-909.

活性化も認められなかった。現時点で G356D

foundinapatientwith

2) Kaplan FS, Shen Q, Lounev V, Seemann

Bloch KD. (2008) BMP type I receptor

P, Groppe J, Katagiri T, Pignolo RJ,

inhibitionandSkeletalossification in a mouse model offibrodysplasia

fibrodysplasia ossificans progressiva.

ShoreEM.

Metamorphosis(2008)

inossificans progressiva (FOP). J Bonepreventsectopic

Nat Med 14: 1363-1369.

Miner Metab 26: 521-530.
2.学会発表3)

TheConsortium

InternationalonFOP,

contributing member).
Management
Ossificansof

Clinical(KatagiriT,The Medical
Fibrodysplasia

Progressiva:Current

1） 大竹 明、織田弘美、池淵研二、片桐岳信、岡崎康司：進行性骨化性線維異形成症（Fibrodysplasia Ossificans
Progressiva: FOP）の５症例. 第2回埼玉北西部骨代謝研究会

Treatment Considerations. Clin Proc

Intl Clin Consort FOP 3 (1):1-82, 2008.

2） 大竹 明、織田弘美、池淵研二、片桐岳信、岡崎康司：進行性骨化性線維異形成

4) Fukuda T, Kohda M, Kanomata K,症（Fibrodysplasia Ossificans

Nojima J, Nakamura A, Kamizono J,Progressiva: FOP）の５症例. 第38回埼玉

Noguchi Y, Iwakiri K, Kondo T, Kurose

小児発育障害研究会

J, Endo K, Awakura T, Fukushi J,
Nakashima Y, Chiyonobu T, Kawara A,3） 野島淳也、古株彰一郎、依田哲也、片Nishida Y, Wada I, Akita M, Komori T,

桐岳信：筋分化におけるSmad4 - E4F1相互

Nakayama K, Nanba A, Maruki Y, Yoda T,作用の役割. 第50回歯科基礎医学会

Tomoda H, Yu PB, Shore EM, Kaplan FS,Miyazono K, Matsuoka M, Ikebuchi K,4） 古株彰一郎、野島淳也、依田哲也、片Ohtake A, Oda H, Jimi E, Owan I, Okazaki

桐岳信：BMPシグナルにおけるSmad1のリンY,酸化と脱リン酸化の役割. 第50回歯科基andKatagiriT.

(2008)

Constitutively activated ALK-2 andincreased

Smad1/5

礎医学会学術大会

cooperativelyinduce BMP signaling in fibrodysplasia

5） Nojima J, Kanomata K, Fukuda T,

ossificans progressiva. J Biol Chem,Nakamura A, Tsukui T, Okazaki Y, Kamijoin press.

R, Yoda T, Katagiri T.: Dual Roles ofSmad Proteins in the Conversion from5) Yu PB, Deng DY, Lai CS, Hong CC, Cuny

Myoblasts to Osteoblastic Cells by BMPs.

GD, Bouxsein ML, Hong DW, McManus PM,30th ASBMR (American Society for Bone

Katagiri T, Sachidanandan C, Kamiya N,and Mineral Research) annual meeting

Fukuda T, Mishina Y, Peterson RT, and6） 鹿又一洋、福田 亨、野島淳也、中村12） 古株彰一郎、野島淳也、福田 亨、厚、古株彰一郎、片桐岳信：BMP補助受容鹿又一洋、依田哲也、片桐岳信：Smadのホ体DRAGONはBMPによる骨芽細胞分化を抑制

スファターゼPPM1AはSmadの脱リン酸化でする．第6回RCGMフロンティアシンポジウ

はなく分解を促進してBMPシグナルを抑制ムする. 第26回日本骨代謝学会学術集会

7） 古株彰一郎、野島淳也、福田 亨、鹿13） 古株彰一郎、野島淳也、福田 亨、又一洋、中村中村厚、依田哲也、片桐岳信：

厚、鹿又一洋、依田哲也、片桐岳信：

R-SmadのホスファターゼPPM1AはSmadの脱R-SmadのホスファターゼPPM1AによるBMP

リン酸化ではなく分解を促しBMP活性を抑の活性抑制には脱リン酸化に依存しない制する. 第6回RCGMフロンティアシンポ

Smadの分解が重要である. 第31回日本分ジウム

子生物学会年会・第81回日本生化学会大会
合同大会（BMB2008）8） 野島淳也、鹿又一洋、福田 亨、中村厚、古株彰一郎、岡崎康司、依田哲也、片14） 野島淳也、鹿又一洋、福田 亨、中桐岳信：BMPはSmad4−E4F1を介して筋分化村を抑制する. 第15回BMP研究会

片桐岳信：BMPシグナルはSmad4−E4F1を介厚、古株彰一郎、岡崎康司、依田哲也、して筋分化を制御する. 第31回日本分子
9） 古株彰一郎、野島淳也、福田 亨、鹿生物学会年会・第81回日本生化学会大会合

又一洋、依田哲也、片桐岳信：R-Smadのホ

同大会（BMB2008）

スファターゼPPM1AによるBMP活性の抑制
はSmadの脱リン酸化に依存しない分解を

15） 片桐岳信：成長に伴い筋が骨化する

介す. 第15回BMP研究会

難病・進行性骨化性線維異形成症. 第19回小児成長研究会・教育講演

10） 野島淳也、鹿又一洋、福田 亨、中村厚、古株彰一郎, 依田哲也、片桐岳

16) Katagiri T.: Constitutively

信：BMPシグナルは核内のSmad4とE4F1の相activated ALK2 and increased Smad1/5

互作用によって筋分化を抑制する. 第26

cooperatively induce BMP signaling in回日本骨代謝学会学術集会

fibrodysplasia ossificans progressiva.
7th International Conference on BMPs.

11） 鹿又一洋、福田 亨、野島淳也、中村 厚、古株彰一郎、片桐岳信：BMP補助17) Katagiri T.: Constitutively

受容体DRAGONはBMPによる骨芽細胞分化をactivated ALK2 and increased Smad1/5抑制する．第26回日本骨代謝学会学術集会

cooperatively induce BMP signaling infibrodysplasia ossificans progressiva.
Gordon Research Conference onMusculoskeletal Biology &Bioengineering.
18) 片桐岳信：全身の骨化を伴う難病：進行性骨化性線維異形成症（FOP） ―発症メカニズムの解明から治療法に向けて−.
第50回歯科基礎医学会・シンポジウム３19) 片桐岳信：難病・進行性骨化性線維異形成症（FOP）研究の進歩. 第６回RCGM国際シンポジウム20) 片桐岳信：進行性骨化性線維異形成症（FOP）研究における最近の進歩.

第15回BMP研究会・教育講演
21) 片桐岳信：筋組織が骨化する難病・進行性骨化性線維異形成症（FOP）. 第26回日本骨代謝学会学術集会・ミニシンポジ
ウム922) 片桐岳信：小児の難病・進行性骨化性線維異形成症（FOP）. 第26回小児代謝性骨疾患研究会・教育講演
G. 知的財産権の出願・登録状況
該当無し