Jpn. J. Protozool. Vol. 44, No. 2. (2011)

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Review

シロアリ腸内原生生物と原核生物の細胞共生本郷 裕一
東京工業大学大学院生命理工学研究科〒152-8550 東京都目黒区大岡山 2-12-1-W3-48

Cellular symbiosis between protists and prokaryotes
in termite guts
Yuichi HONGOH
Department of Biological Sciences, Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo
Institute of Technology, Tokyo 152-8550, Japan
Key words: Insect, Protozoa, Lignocellulose, Gut bacteria

はじめに
シロアリは植物枯死体のみを餌とする社会性昆虫で，温帯から熱帯にかけて分布している．分子系統学的にはゴキブリの一群であり，キゴキブリ
属 Cryptocercus が最もシロアリに近縁である（Loet al., 2000）．キゴキブリと下等シロアリは後腸内に多数の原生生物を保有しており（Fig. 1），ゴキ
ブリからシロアリが進化する以前（〜1.5 億年前）か ら共生し ていたと 考えられる（Ohkuma et al.,2009）．下等シロアリから派生した共生原生生物を欠く一群（シロアリ科）を，高等シロアリと呼ぶ．
下等シロアリの大多数とキゴキブリは枯死材のTel: +81-3-5734-2865/Fax: +81-3-5734-2946
E-mail: yhongo@bio.titech.ac.jp
Received: 30 August 2011; Accepted: 4 October 2011.

みを摂食する．枯死材は主に木質（リグノセルロー
ス）で構成される．リグノセルロースはリグニン（ポリフェノール系高分子化合物），セルロース（β-グルコース重合体）とヘミセルロース（キシラン，
マンナン，アラビノースなど，セルロース以外の植物系多糖の総称）の堅牢な複合体であり，ほとんどの動物はこれらを消化する能力を持たない（Watanabe and Tokuda, 2001）．つまり，動物に食べられないように進化した，植物の体の支持と防御を兼ねた構造体である．
この堅固な構造物を，シロアリは頑丈な大顎と前腸内のクチクラの隆起で物理的に破砕し，10-20 µmに断片化する（Fujita et al., 2010）．さらに，唾液腺や中腸からセルラーゼ（セルロース繊維の非結晶部位を加水分解してセロビオースにする endo-β-1,4glucanase と，セロビオースを β-グルコースに加水分解する β-glucosidase）を分泌して木質の一部を消化するが（Watanabe and Tokuda, 2010），大部分は未消

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シロアリ腸内原生生物と原核生物の細胞共生

Fig. 1. Termite and gut microbiota. (A) The lower termites
Reticulitermes speratus. Bar = 1 mm. (B) A removed gutof R. speratus. Bar = 1 mm. (C) Phase contrast microscopy of protists in the gut of R. speratus. Bar = 50 µm. R.
speratus harbors 13 species of gut protists (Kitade, 2007).

化のまま後腸に送られる．これを共生原生生物が食作用によって細胞内に取り込み，セルラーゼ（endoβ-1,4-glucanase, β-glucosidase および結晶性セルロース
を加水分解する cellobiohydrolase）とヘミセルラーゼ
で 単 糖 に 分 解 し て，嫌 気 的 に 発 酵 す る（Hongoh,2011）．結果として，セルロースは n(C6H1206) + n(2H2O) → n(2CH3COOH + 2CO2 + 4H2) の反応によって，酢酸と二酸化炭素と水素に変換される（Yamin,
1981）．生成した酢酸は後腸で吸収され，シロアリの主な炭素・エネルギー源となる（Slaytor, 2000）．
このように，腸内原生生物はシロアリの栄養に必須の貢献をしており，原生生物を除去するとシロア
リは生存できない（Cleveland, 1923）．通常，1 から10 数種類の原生生物が腸あたり数万細胞以上共生
し，シロアリの種ごとに特異的な群集構造をとる（Inoue et al., 2000）．これらの原生生物種は下等シ
ロアリとキゴキブリの腸以外には存在せず，分類学
的には Excavata 界の Parabasalia 門と Preaxostyla 門のどちらかに属する．絶対嫌気性でミトコンドリアを欠くため，ミトコンドリアの祖先細菌が細胞内共生する以前に分岐した“Archezoa”として注目されたこともあるが，現在では否定されている（CavalierSmith, 1989, 1993）．Parabasalia 門原生生物ではミトコンドリアはヒドロゲノソームに変化し（Boxma etal., 2005），Preaxostyla 門はヒドロゲノソームも欠くが，核内にミトコンドリアから移行したと思われる遺伝子が残存しているため，二次的に喪失したと考えられる（Hampl et al., 2008）．共生原生生物の詳細な系統分類と形態学的特徴は，Kitade (2007) を参照
してもらいたい．
シロアリと原生生物の絶対共生は 1920 年代から研究されてきたが，共生原生生物は純粋培養が極めて困難であり，詳細な生理・生態は依然として謎のままである．複数の細胞を出発点とした（つまりクロ ー ン で は な い）Parabasalia 門 原 生 生 物 Trichomitopsis termopsidis と Trichonympha sphaerica の純粋培養成功例があり（Yamin, 1981; Odelson and Breznak,
1985），上記のようなセルロース分解・発酵能力の存在が確認されたが，それら培養株も現存しない．
培養困難なため，1990 年代後半からは，原生生物
各種をマイクロマニピュレーターなどで回収し，PCR 法による個々の遺伝子配列の取得・解析が行われてきた．rRNA や EF1-α，GAPDH などの遺伝子配列に基づく詳細な系統進化が明らかにされつつあり（Ohkuma et al., 1998; Moriya et al., 2001; Ohkuma etal., 2007a; Noda et al., 2009b），セルラーゼ遺伝子の存在も確認された（Ohtoko et al., 2000; Nakashima etal., 2002; Li et al., 2003; Inoue et al., 2005）．2000 年代
後半からは腸内原生生物群集全体のメタトランスク
リプトーム（転写産物）解析が行われ，遺伝子レベルでの網羅的機能解析がはじまっている（Todaka etal., 2007; Tartar et al., 2009; Todaka et al., 2010）．
原生生物の分子生物学的解析と平行して，シロア
リ腸内に共生する真正細菌と古細菌の解析も進んでいる．原生生物同様，これらも難培養性で，1990 年
代後半に 16S rRNA 遺伝子配列に基づく分子生態学的解析法が導入されるまでは，群集構造すら不明であった．通常，数百種以上の真正細菌と数種以上の古細菌が 1 つの腸内に共生し，その群集構造はシロ
アリの種に特異的である．これらは 24 もの多様な門
レベルクラスターに分類され，各門内で一つないし複数のシロアリ特異的単系統群を形成する（Hongoh, 2010）．つまり原生生物，真正細菌，古細菌からなる腸内微生物群集が，一つの共生群体としてシロアリと共進化を遂げてきたといえよう．
シロアリと腸内微生物の特異的関係は，シロアリの社会性によって維持されている．シロアリは他の節足動物同様，脱皮を繰り返して成長する．その際，外胚葉由来の前腸と後腸の内皮を腸内微生物ごと脱ぎ捨ててしまう．したがって，脱皮直後の個体
は腸内微生物をほとんど持たないが，他の個体の肛門から直接腸内微生物を受け取ることで（肛門食proctodeal trophallaxis），共生群集を速やかに再構築Jpn. J. Protozool. Vol. 44, No. 2. (2011)

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Fig. 2. Bacterial symbionts of protists in the gut of the termite Reticulitermes speratus. (A) Phase contrast microscopy ofprotists in the gut of R. speratus. These protists were fixed in 4% formaldehyde and dehydrated with ethanol series. (B)Fluoroscent microscopy of the microbiota. DNA in the bacterial cells and nuclei of protists were stained with 4,6diamidino-2-phenylindole (DAPI). All of the protist cells harbored endo- and/or ectosymbiotic bacteria. Bar = 50 µm.

する（Kitade et al., 1997）．こうしてコロニーの構成
メンバーは，腸内微生物群集を共有することにな
る．
コロニー内の腸内微生物群集は有翅生殖虫にも受け継がれる．有翅生殖虫は巣を離れて結婚飛行を行った後，雌雄で共同して土中や枯木中などに営巣し，産卵する．孵化した個体は腸内微生物を持たな
いが，親（女王と王）からの肛門食により腸内微生物を受け取る．このように，必ず親が子供と共存することで，確実に腸内微生物を子孫に垂直伝播していくのである．実際，腸内細菌は，シロアリ特異的な各単系統群内で宿主シロアリ種ごとにクラスターを形成する傾向が強い．ただし，腸内微生物は排泄物や共食いなどを介して，シロアリ種間で比較的水平伝播しやすいためか，アブラムシと細胞内共生細菌 Buchnera の関係のような，長期にわたる厳密な共種分化はみられない（Munson et al., 1991; Hongoh etal., 2005）．ちなみに，シロアリは通常肉食をしないが，傷ついたシロアリ個体と死骸は例外的に摂食される．枯死材に乏しい窒素分を保存するために進化した習性であろう．
厳密な共種分化はしていなくとも，長い進化過程
で共存してきた腸内微生物は，群集内で複雑かつ巧妙な共生関係を持っているであろう．それを象徴する の が，原 生 生 物 と 原 核 生 物 の 細 胞 共 生 で あ る（Ohkuma, 2008）．下等シロアリ腸内に生息する原生生物の大多数は，細胞表面や細胞質に原核生物を共生させており（Fig. 2），核内に共生する例も知られている（Kirby, 1944; d'Ambrosio et al., 1999）．共生する原核生物の分類群も共生形態も多様で，真核生物と原核生物の細胞共生研究には絶好の材料である．本総説では，原生生物と原核生物の細胞共生に焦点を当て，分子生態学や環境ゲノム科学的手法により明らかにされつつある，シロアリ腸内の多重共生機構を紹介する．
原生生物細胞表面に付着共生する細菌の多様性と役割
シロアリ腸内の多くの原生生物種は，Fig. 2 のように，鞭毛か繊毛のようにも見える，毛状に突出した
原 核 生 物 を 付 着 さ せ て い る．こ れ ら の 多 く はSpirochaetes 門 の Treponema 属 か Bacteroidetes 門
Bacteroidales目の絶対嫌気性真正細菌である（Hongoh
et al., 2007b）．何れも螺旋か波形あるいは繊維状で，蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization: FISH）法で特異的に染め分けないと，種同定は困難である．透過型電子顕微鏡
観察では，各々の分類群に特徴的な細胞断面が確認できる（Fig. 3）（Hongoh et al., 2007b）．

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シロアリ腸内原生生物と原核生物の細胞共生

Fig. 3. Transmission electron microscopy of bristle-likeectosymbionts attached to the oxymonad protist Dinenympha porteri type II. S: spirochetal ectosymbionts, B: bacteroides ectosymbionts. Bar = 0.5 µm. This picture wasoriginally published in Hongoh et al. (2007a) and slightly
modified here.

16S rRNA 遺伝子配列に基づく系統解析によると，
これらスピロヘータとバクテロイデスは，シロアリ
腸内のみから PCR 法によって検出される難培養系統群に属している（Noda et al., 2003; Hongoh et al.,2007b）．腸液中を遊泳する多様な細菌種がランダムに結合するわけではなく，宿主原生生物種に各々特異的な種類が常に共生している（Hongoh and Ohkuma, 2011）．宿主と同調して分裂するのか，あるいは原生生物細胞から離れることがあるのか，などは不明である．
形態が原生生物の鞭毛に類似するため（Figs. 2,
4A, B），これらの真正細菌の原生生物の運動への関与が想像されるが，それが観察・証明された例は 1
つしかない．ムカシシロアリ Mastotermes darwiniensis の腸内に見られる Parabasalia 門原生生物 Mixotricha paradoxa は，細胞表面に多数の Treponema 属ス
ピ ロ ヘ ー タ を 共 生 さ せ て い る（Wenzel et al.,2003）．Cleveland and Grimstone (1964) は，これら共
生スピロヘータの同調した波状運動によってのみ宿主原生生物が遊泳可能であることを，実験的に証明した．細胞内共生説（endosymbiotic theory) を唱えた
Lynn Margulis (1979) は，この原生生物とスピロヘー
タの運動共生から，スピロヘータが真核生物の鞭毛の起源であると発想したほどである．真核生物の鞭毛がスピロヘータ細胞由来であるという形態学的・分子生物学的証拠は乏しく，現在ではあまり支持されていない．
鞭毛状の共生体以外では，シロアリ腸内原生生物と付着細菌の運動共生は，あと 1 例知られている．
米国に生息するシロアリの一種 Cryptotermes cavifronsの腸内には，Parabasalia 門原生生物 Caduceia versa-

tilis が共生している（Fig. 4C）．この原生生物は 4本の鞭毛をもつが駆動力は無く，驚くべきことに，
細胞表面に共生する桿菌（棒状の細菌，rod）の鞭毛の 波状 運動 によ っての み遊 泳可 能で あ る（Tamm,
1982）．こ の 桿 菌 は，原 生 生物 1 細 胞 あ た り 2,5003,000 個ほど共生し，表面を螺旋状に取り巻くように並列している（Fig. 4D）（Tamm, 1980; Hongoh et al.,2007a）．Tamm (1980, 1982) によると，桿菌細胞の2/3 ほどが原生生物細胞表層に埋まり，残りの開口部分から 12 本の鞭毛が出ている．これらが同調して波動すると 1 本の鞭毛束となり，それが桿菌の長軸方向の前後に隣接する桿菌の鞭毛束と融合し，結果として宿主原生生物細胞を螺旋状に巻く長大な鞭毛束になるという．この鞭毛束の同調した波状運動により，宿主原生生物は遊泳する．筆者も実際に位相差顕微鏡で観察したが，スライドグラス面を，かなりのスピードで滑るように移動していた．
同原生生物の細胞表面には，運動共生桿菌の隙間を埋めるように，繊維状の細菌がさらに共生している（Fig. 4E, F）．Tamm (1980) の電子顕微鏡観察によると，宿主細胞表面の凸部に適合する形で細菌細胞に切れ込みが入っている（Fig. 5）．筆者らが 16S
rRNA 遺伝子配列解析と FISH 解析を行ったところ，
この繊維状細菌は Bacteroidales 目に，運動共生桿菌
は Synergistetes 門に属することが明らかとなった（Hongoh et al., 2007a）．Synergistetes 門細菌は絶対嫌気性で，アミノ酸を主要な栄養源とし，鞭毛をもつ種が多い．同門の細菌は多様なシロアリ種の腸内から PCR 法で検出され，それらはシロアリ特異的単系統群を形成する．本運動共生細菌も，この未培養
単 系 統 群 の メ ン バ ー で あ り，Candidatus Tammella
caduceiae と命名した（未培養種を仮記載する場合にCandidatus をつける）．本種以外は腸内で自由遊泳型として存在するらしく，どのような過程を経て奇妙な共生系が進化したのかは不明である．
このように，繊維状細菌または桿菌が毛状に突出するのではなく，細胞表面に張り付く形で付着共生する例は，シロアリ腸内原生生物において普通に見られる．これらの多くは Bacteroidales 目に属し，シロアリ特異的な複数の単系統群を形成する（Stingl etal., 2004; Noda et al., 2006a; Noda et al., 2006b）．毛状のものと，張り付く桿菌タイプ，同繊維状のもの
は，各々別の単系統群を形成する傾向がある．宿主
原生生物の同属内では Bacteroidales 目細菌との共種分化が見られるが，属より上のレベルでは一致しない．したがって，複数回，独立に付着共生が進化した と 考 え ら れ る（Noda et al., 2009a; Desai et al.,2010）．
原生生物細胞表面に共生する Bacteroidales 目細菌

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Fig. 4. Ectosymbiotic bacteria discovered on the surface of protist cells in termite guts. (A) Phase contrast image of theoxymonad protist Dinenympha porteri type II from the gut of the termite Reticulitermes speratus. (B) Detection of theectosymbiotic spirochetes and Bacteroidales bacteria by FISH analysis using taxon-specific probes. All the bristle-likestructures were ectosymbiotic bacteria except the true flagella of the protist host indicated by arrowheads in panel A. Bar= 10 µm in panel A. (C) Phase contrast image of the parabasalid protist Caduceia versatilis from the gut of the termite
Cryptotermes cavifrons. (D) FISH analysis of the ectosymbiotic “Candidatus Tammella caduceiae” in the phylum Synergistetes. (E) FISH analysis of ectosymbiotic Bacteroidales bacteria. Bar = 50 µm in panel C. (F) DAPI-stained ectosymbiotic bacteria on the surface of a Caduceia versatilis cell. Bar = 5 µm. Panels A and B were originally published in
Hongoh et al. (2007b). Panels C–F were originally published in Hongoh et al. (2007a).

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シロアリ腸内原生生物と原核生物の細胞共生

Fig. 5. Transmission electron microscopy of ectosymbiotic
bacteria on the cell surface of the parabasalid protist Caduceia versatilis. The larger bacteria are “Candidatus Tammella caduceiae” in the phylum Synergistetes and thesmaller belong to the order Bacteroidales. This picture wasoriginally published in Tamm (1980). See the reference
paper for the detail.

の系統群は，腸内で自由生活する系統と姉妹群を形成することが多い（Noda et al., 2009a）．つまり，シロアリ腸内に特異的な Bacteroidales 目の系統群があり，その中の腸内自由生活型のある種が，ある要因によって，原生生物細胞表面に共生する．宿主と共生細菌はある期間，共種分化するが，いずれ別の細菌系統に置き代わられる．シロアリ腸内における原生生物のバイオマスは巨大で，その中の優占種と細胞共生する細菌種も，腸内における優占種となる．
原生生物はシロアリの栄養に不可欠な存在であり，原生生物と細胞共生していれば，その細菌種も確実に垂直伝播され，優占種であり続けられる．腸内の自由生活型 Bacteroidales 目細菌種群は，原生生物との付着共生というニッチをめぐって競争する，共生体予備軍と見ることもできよう．
ス ピ ロ ヘ ー タ に つ い て も 同 じ こ と が 言 え る．
Spirochaetes 門 Treponema 属には，2 つのシロアリ特異的単系統群が存在する．尐なくとも一方の系統群には腸内自由生活型と原生生物共生型が混在しており（Iida et al., 2000），原生生物との関係は宿主特異的であるものの，共種分化は見られない（Noda et al.,2003）．バクテロイデス同様に，何度も独立に原生
生 物 と の 付 着 共 生 が 進 化 し た の で あ ろ う．
Spirochaetes 門では Spirochaeta 属にもシロアリ特異的単系統群があるが，原生生物との細胞共生例は知られていない．
シロアリ腸内原生生物に付着共生する細菌の培養成功例は皆無で，機能は未知である．運動共生例を除けば，共生系における役割も不明である．現状では，比較的近縁な腸内自由生活型の培養株の性質から推定するしかない．Spirochaetes 門 Treponema 属のシロアリ特異的系統群からは，これまでに 3 種が単離培養に成功している（Leadbetter et al., 1999; Lilburn
et al., 2001; Dröge et al., 2008）．絶対嫌気性という以外は，各種ごとに性質はかなり異なる．
Zootermopsis angusticollis というシロアリの腸内から単離培養された Treponema primitia は，グルコースやアラビノース，キシランなど，リグノセルロース
由来の単糖や二炭糖を発酵してエネルギーを得られるが，還元的酢酸生成能により独立栄養生活を営むこともできる（Graber and Breznak, 2004）．後者では，4H2 + 2CO2 → CH3COOH + 2H2O という代謝を行う．原生生物によるセルロース分解・発酵では，n(C6H1206) + n(2H2O) → n(2CH3COOH + 2CO2 + 4H2) の反応により，グルコース 1 分子あたり，酢酸 2 分子のほかに 4H2 と 2CO2 が生成する．原生生物のみの代謝では水素と二酸化炭素はシロアリ体外に捨てられ，エネルギーと炭素源が無駄になるが，還元的酢酸生成細菌がいればそれらはさらに酢酸に変換され，シロアリの栄養源となる．
Treponema primitia は腸内を自由遊泳するスピロ
ヘータだが，水素と二酸化炭素の主発生源である原生生物細胞に付着共生することができれば，還元的酢酸生成菌としてのメリットは大きいであろう．腸内は辺縁部から中央に向かって急激に酸素分圧が低下し，中央では 0 となるが，水素は逆の勾配を持つ（Ebert and Brune, 1997; Pester and Brune, 2007）．しかし原生生物に付着共生していれば，細菌は安定した水素供給を受けることができる．
一方，原生生物にメリットはあるだろうか．一般に，水素が高濃度に蓄積すると，発酵は阻害される．Parabasalia 門 原 生 生 物 は，ヒ ド ロ ゲ ノ ソ ー ム（hydrogenosome）というミトコンドリア起源とされる細胞内小器官を持ち，ヒドロゲナーゼのはたらきによって水素と ATP を生産する．結果としてシロア
リ 後 腸 内 の 水 素 分 圧 は，15-72 kPa に も 達 す る（Pester and Brune, 2007）．ただしこの数値は，腸を取り出してアガロースに包埋し，微小電極を挿入して計測したもので，実際の生きたシロアリ個体から放出される水素は 1/30 から 1/50 程度にすぎない．これは健全な状態のシロアリ腸内では，発生する水素の大部分が還元的酢酸生成細菌などにより消費されることを示唆している．したがって，細胞表面にそうした水素消費型細菌が共生していると仮定すれば，原生生物自身が産生する水素の速やかな除去という点で，利益があるものと推測される．いずれにせよ還元的酢酸生成菌は，水素除去による原生生物

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Fig. 6. Endosymbiotic Rs-D17 bacteria in the phylum Elusimicrobia (Termite Group 1) inside the cell of the parabasalid
protist Trichonympha agilis. (A) Phase contrast image of the T. agilis from the gut of the termite Reticulitermes speratus.
(B) Detection of Rs-D17 by FISH analysis. Bars = 20 µm. (C) Transmission electron microscopy of Rs-D17. Bar = 0.5µm. The pictures were originally published in Hongoh et al. (2008a).

のリグノセルロース発酵促進と，水素と二酸化炭素
からの酢酸生成により，原生生物にもシロアリにも大きな利益を与えている．
原生生物自身も，高濃度水素に適応した進化を遂げている．Inoue et al. (2007) は，イエシロアリ腸内のParabasalia 門原生生物 Pseudotrichonympha grassii が持つ 2 種類の鉄ヒドロゲナーゼ遺伝子を取得し，大腸菌での異種発現に成功した．いずれも水素発生型
で，20 kPa という高い水素分圧下でも，活性の半分を維持していた（Inoue et al., 2007）．
Bacteroidales 目の付着共生細菌については，近縁の培養株が存在しない．ただ，原生生物に細胞内共生する，比較的近縁な Bacteroidales 目細菌の機能が解明されたため（Hongoh et al., 2008b），ある程度の推測が可能である．これについては後述する．
原生生物細胞内に共生する細菌の多様性と役割
シロアリ腸内原生生物の多くは，細胞表面だけではなく，細胞内にも原核生物を共生させている（Fig.
2）．通常，1 ないし複数種が共生しており，原生生物種に特異的なことが多い．これまでに，Termite
Group 1 (TG1) (Elusimicrobia) 門，Bacteroidetes 門
Bacteroidales 目，Tenericutes 門 Mycoplasmatales 目，
Proteobacteria 門 Desulfovibrio 属などの真正細菌と，
Euryarchaeota 門 Methanobrevibacter 属のメタン生成
古細菌などが，原生生物細胞内共生体として同定されている（Hongoh and Ohkuma, 2011）．

最も古くから認識されていたシロアリ腸内原生生
物細胞内共生体は，メタン生成古細菌である．様々な環境中の嫌気性原生生物の細胞内共生体としても知られているが，シロアリ腸内の Parabasalia 門原生生物 Trichomitopsis termopsidis や Hexamastix termopsidis，Spirotrichonympha leidyi，Microjoenia sp.，ま た
Preaxostyla 門の Dinenympha parva などの細胞内に共生している（Lee et al., 1987; Tsunoda et al., 1993; Tokura et al., 2000; Hara et al., 2004）．何れも未培養種
で，S. leidyi，Microjoenia sp.，D. parva の共生菌については，16S rRNA 遺伝子配列に基づき，Methanobrevibacter 属 古 細 菌 で あ る こ と が わ か っ て い る（Tokura et al., 2000; Hara et al., 2004; Inoue et al.,2008）．
下 等 シ ロ ア リ 腸 内 か ら は，こ れ ま で に 3 種 のMethanobrevibater 属 古細菌が単離 培養され ている（Leadbetter and Breznak, 1996; Leadbetter et al.,1998）．何れも後腸上皮に付着共生する水素依存型
メタン生成菌で，4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O という代謝 を 行 う 独 立 栄 養 生 物 で あ る．3 種 の 中 で もMethanobrevibacter filiformis は原生生物共生体に比較的 近 縁 で，16S rRNA 配 列 で 95-97% 相 同 で あ る（Hongoh and Ohkuma, 2011）．原生生物細胞内に共生するメタン生成菌も同様の性質を持つと仮定する
ならば，前述の還元的酢酸生成菌同様，水素消費による発酵促進という役割を持つであろう．
も う 一 点，重 要 な 示 唆 が な さ れ て い る．Yamin(1978) は Trichomitopsis termopsidis の培養に成功した

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シロアリ腸内原生生物と原核生物の細胞共生が，この原生生物種にはメタン生成古細菌が細胞内共生している（Lee et al., 1987）．Breznak and Odelson (1985) はこの原生生物培養株にメタン菌の活動を阻害する試薬を加え，除去に成功した．ところが，細胞内共生体を除去した株は，それまでの培養条件では増殖困難になった．彼らの試行錯誤の結果，ある系統の細菌培養株をオートクレーブしたものを与えると，再増殖させることができたが，他の細菌系
統を与えても増殖しなかった．このことから，細胞内共生メタン生成古細菌は，何らかの特殊な成長因子を宿主原生生物に与えていたと考えられる．また，再増殖中の純粋培養株に Methanospirillum hungatii という生きたメタン生成古細菌を加えて培養すると，培養液から水素の代わりにメタンが発生するようになり，Trichomitopsis termopsidis の増殖が促進された．これは，メタン生成古細菌との共生によって水素が消費され，原生生物の成長が促されることを裏付けている．
原生生物細胞内共生体の機能の全貌が初めて明らか と な っ た の は，ヤ マ ト シ ロ ア リ Reticulitermes
speratus 腸 内 に 生 息 す る Parabasalia 門 原 生 生 物
Trichonympha agilis の細胞内共生菌 Rs-D17 においてである（Fig. 6）（Hongoh et al., 2008a）．Rs-D17 は
当時培養株が存在しなかった Termite Group 1 (TG1)(Elusimicrobia) 門 に 属 し て い る（Hongoh et al.,2003）．TG1 門は，シロアリ腸から PCR 増幅された
16S rRNA 遺伝子配列により，初めてその存在が報告された真正細菌の一群である（Ohkuma and Kudo,
1996）．その後，このグループが多様なシロアリ腸内原生生物種の細胞内共生菌であることが明らかになるとともに（Stingl et al., 2005; Ikeda-Ohtsubo et al.,2007; Ohkuma et al., 2007b），原生生物の共生体ではないと考えられる姉妹群の存在も発見された（Herlemann et al., 2007; Ohkuma et al., 2007b; IkedaOhtsubo et al., 2010）．後者は多様な環境から PCR に
よって 16S rRNA 遺伝子配列が取得されていたが，ハナムグリ（コガネムシ科）幼虫の腸内からの単離
培養株 Elusimicrobium minutum が記載され，TG1 もElusimicrobia 門と正式に命名された（Geissinger et al.,2009; Herlemann et al., 2009）．
Elusimicrobia 門の原生生物細胞内共生体は単系統
群 を 形 成 し（“Endomicrobia” 綱）（Stingl et al.,2005），現在でも培養株は存在しない．筆者らは，これら細胞内共生体の機能を解明するため，Rs-D17のゲノム完全長配列取得を目指した．細菌ゲノムの完全長取得には通常 1010 細胞以上必要であるが，培養不能なため，Phi29 DNA polymerase による等温全ゲ ノ ム 増 幅 を 行 う 戦 略 を と っ た．宿 主 原 生 生 物
Trichonympha agilis も培養不能であり，一つの腸内に複数の系統が混在している．宿主の系統が異なれば，細胞内共生細菌の系統も異なる可能性が高い．
そこで，宿主原生生物を 1 細胞のみマイクロマニ
ピュレーションで分離し，界面活性剤で細胞膜を破壊して，漏出した Rs-D17 と見られる細胞を数十から数百個程度回収した．全ゲノム増幅の詳細な手順に
つ い て は，他 に 記 し た（Hongoh and Toyoda,
2011）．
塩基配列解析の結果，1.1 Mb の，完全長の環状染
色体配列取得に成功した（Hongoh et al., 2008a）．曖
昧な塩基サイトは尐なく，宿主 1 細胞内の Rs-D17 細菌がほぼ単一系統であることがわかった．得られた染色体配列は 761 個のタンパク遺伝子をコードしていたが，それに加えて，偽遺伝子が 121 個も見出された．これは，Rs-D17 細菌のゲノムが縮小進化過程にあることを示している．興味深いことに，染色体複製開始因子 DnaA の遺伝子まで偽遺伝子化しており，Rs-D17 は宿主細胞外での増殖能を既に失っている可能性が高い．既知の配列との相同性から代謝系を予測したところ，Rs-D17 細菌は，グルコース-6リン酸とウロン酸を主な炭素・エネルギー源とする，
絶対嫌気性の発酵性細菌であることが明らかとなった．宿主原生生物によるリグノセルロース分解産物であるグルコースとウロン酸は，豊富に宿主細胞質に存在するはずである．
一 方，窒 素 源 に つ い て は，ア ン モ ニ ア 輸 送 体
AmtB とグルタミン合成酵素 GlnA の遺伝子が偽遺伝
子化しており，宿主からのグルタミン供給が必須である．しかし，15 種類のアミノ酸と数種のビタミン類および核酸の合成系は保持していた．このことは，細胞壁（莢膜）成分のリポ多糖合成系や制限酵
素ユニットなどの防御系，各種膜間輸送体などの遺伝子の多くが偽遺伝子化していたことと対照的である．また，Chlamydiales 目や Rickettsiales 目の細胞内寄生性細菌（病原菌）が多くの窒素化合物の合成能を失い，宿主からの供給に依存するのとも大きく異なっている．
シロアリは窒素分をほとんど含まない枯死材のみを餌とするため，シロアリも腸内原生生物も，餌の木材から必須窒素化合物を補給できない．それらを合成し，供給するのが Rs-D17 細菌だと考えられる．
つまり，Rs-D17 は原生生物とシロアリの相利共生者である．ただし，原生生物の窒素代謝系は未知なため，アブラムシと細胞内共生細菌 Buchnera の間で見られるような（Shigenobu et al., 2000），正確な栄養相補関係にあるのかは不明である．また，Rs-D17 から原生生物，さらにシロアリへと，どのように窒素化合物が受け渡されるかも，わかっていない．
Rs-D17 は水素産生型の鉄ヒドロゲナーゼ遺伝子をJpn. J. Protozool. Vol. 44, No. 2. (2011)123

Fig. 7. Endosymbiotic CfPt1-2 bacteria (“Candidatus Azobacteroides pseudotrichonymphae”) inside the cell of the parabasalid protist Pseudotrichonympha grassii. (A) Phase contrast image of P. grassii from the gut of the termite Coptotermes formosanus. Bar = 50 µm. (B) Detection of CfPt1-2 by FISH analysis. Bar = 10 µm. The pictures were originallypublished as supporting information in Hongoh et al. (2008b).

もっており，メタン生成古細菌や還元的酢酸生成細菌のように，水素消費によって原生生物の発酵を促進することはなさそうである．ところが，宿主のTrichonympha agilis にはもう 1 種類，細胞内共生体と見られる真正細菌が存在し，これが水素を消費している可能性が高い．Trichonympha 細胞前部の細胞膜直下，ヒドロゲノソーム近傍に局在する Candidatus
Desulfovibrio trichonymphae と 命 名 し た 細 菌 で，Deltaproteobacteria 綱 Desulfovibrio 属の，シロアリ特異的な未培養単系統群のメンバーである（Sato et al.,2009）．ゲノムは未解読だが，PCR 法によって，水
素酸化型の鉄ニッケル含有ヒドロゲナーゼ遺伝子と，同属の生理的特徴である硫酸還元関連遺伝子の存在と発現が確認されている．
次に，上記のゲノム増幅法を用いて，イエシロア
リ腸内原生生物 Pseudotrichonympha grassii の細胞内共生細菌である CfPt1-2 についても（Fig. 7），ゲノ
ム配列取得を試みた．その結果，1.1 Mb の完全長の環状染色体配列再構築に成功した（Hongoh et al.,2008b）．CfPt1-2 細菌は，前述の原生生物細胞表面
共生細菌とともに，Bacteroidetes 門 Bacteroidales 目のシロアリ腸内由来未培養系統群に属している（Nodaet al., 2005）．Pseudotrichonympha 属原生生物と宿主のミゾガシラシロアリ科（Rhinotermitidae）のシロア

リ，そして CfPt1-2 を含む Pseudotrichonympha 細胞
内共生細菌は，かなり厳密な共種分化を遂げている（Noda et al., 2007）．
ゲノム解読の結果，758 個のタンパク遺伝子をコードしており，Rs-D17 同様に，細胞壁合成系や制限酵素などの防御系，膜間輸送系など多くの遺伝子を欠失している一方，19 種類のアミノ酸と数種のビ
タ ミ ン，そ れ に 核 酸 の 合 成 系 を 保 持 し て い た（Hongoh et al., 2008b）．注目されるのは，空中窒素固定遺伝子群（nif オペロンなど）を保有していたことである．これは，Bacteroidetes 門細菌からは初めての発見であった．ニトロゲナーゼをコードする
nifH 遺伝子の発現も，RT-PCR により確認した．また，原生生物の窒素老廃物と予想される尿素とアンモニアを取込んで再利用する系も存在した．
イエシロアリは P. grassii を除去すると，他種の原生生物が健在でも，木材消化能力を失うことが知られており，必須の共生原生生物である（Yoshimura,1995）．CfPt1-2 細菌は，その P. grassii の 1 細胞あたりに数万個も共生しており，合計で腸内細菌細胞
総数の 6-7 割をも占める（Noda et al., 2005）．それが空中からの窒素補給能力を持っていたのである．
CfPt1-2 細菌の炭素源は，原生生物によるリグノセル
ロース分解産物のグルコース，キシロース，ウロン

124

シロアリ腸内原生生物と原核生物の細胞共生

Fig. 8. Predicted functions of endosymbiotic Rs-D17 bacteria (A) and CfPt1-2 bacteria (B). Panel A was originallypublished in Hongoh et al. (2008a) and panel B was published as supporting information in Hongoh et al. (2008b).

酸であり，解糖系によるこれらの発酵と，水素を電子供与体とするフマル酸呼吸によって ATP を生成すると推定された．これら単糖と水素は原生生物細胞内に豊富に存在するはずである．
CfPt1-2 が水素を消費することは，P. grassii の細胞を多数集めて分画した生理化学実験から示唆されていた（Inoue et al., 2007）．ゲノム上には典型的な水素酸化型ヒドロゲナーゼは存在しないが，メタン生
成古細菌の heterodisulfide reductase やヒドロゲナーゼのサブユニットに相同なタンパク遺伝子群がオペロンを形成しており，それらが役割を果たすものと推定した．空中窒素固定は，一般的には N2 + 8H+ + e- +16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi という，ATP を大量に消費する反応である．そのため，窒素固定を行わない Rs-D17 とは異なり，発酵に加え，より効率的なフマル酸呼吸能を残しているのではないだろう

か．また水素をエネルギー源として消費することで，これまで述べてきたように宿主の発酵を促進す
るとともに，窒素固定反応の副産物として生じる水素も無駄にせず利用することができる．CfPt1-2 は，その窒素固定能にちなんで，Candidatus Azobacteroides pseudotrichonymphae と命名した．
CfPt1-2 と Rs-D17 の共生系における役割を，簡略に Fig. 8 にまとめた．細胞内共生メタン生成古細菌と Ca. Desulfovibrio trichonympha も含めて考えると，
結局これら細胞内共生体の役割は，アミノ酸，ビタミンなどの窒素化合物供給と，水素消費による宿主
原生生物のリグノセルロース分解・発酵の促進，と考えられる．特に CfPt1-2 は，空中窒素固定という極めて重要な役割も担っている．原生生物細胞表面に付着共生するバクテロイデスの機能は未知であるが，CfPt1-2 と同様の機能を持つ可能性もある．実際，付着共生バクテロイデスが宿主原生生物細胞内に取り込まれて消化されるかのような電子顕微鏡観察も報告されており（Noda et al., 2006a），栄養面で重要な役割を果すのかもしれない．シロアリ腸内から単離培養されたスピロヘータの一種 Treponema
azotonutricum は，高い空中窒素固定能を持つことが知られており（Graber et al., 2004），原生生物細胞表面に付着共生するスピロヘータも同様の機能をもつかもしれない．
結論として，シロアリが枯死材を摂食・粉砕して，腸内原生生物がそれを分解・発酵して酢酸とし，細胞内外の共生細菌が宿主原生生物の発酵を促進するとともに窒素分の固定・合成を担当するという，3 者の複雑で巧妙な多重共生が，シロアリに枯死材の高効率な利用という特別なニッチを与えているのである．
これからの展望
本総説では，原生生物に細胞共生するいくつかの原核生物の機能を中心に述べてきた．しかし，その全貌がわかっているのはゲノム解析に成功した 2 種の細胞内共生細菌のみであり，その他の多様な共生
細菌と宿主原生生物の生理・生態の詳細は，依然として未知のままである．また，腸内を自由遊泳する，あるいは腸壁に付着する原核生物の大多数も培養不能であり，機能は未知である．
こうした難培養微生物種の培養法の最適化を進めることも重要だが，そのための情報取得という意味
でも，ここで紹介したような手法により，個々の微生物種の全ゲノム解析を進めていくべきである．
2000 年代半ば以降，メタゲノム，メタトランスクリ
プトーム，メタボロームといった，培養不能種も含Jpn. J. Protozool. Vol. 44, No. 2. (2011)

めた微生物群集全体を網羅的に解析するオミックス
的手法が普及しているが，個々の微生物種の機能や相互作用を解明することはできない．現在，筆者らは，単一の細菌細胞あるいは原生生物の単核からのゲノム解析，すなわちシングルセル・ゲノミクスの確立を目指している（本郷と大熊, 2010）．同様の試
みは米国のいくつかのグループでも行われ，徐々に成果が出始めている（Rodrigue et al., 2009; Woyke etal., 2009; Allen et al., 2011; Blainey et al., 2011; Yoon etal., 2011）．メタ解析で群集全体の機能を概観し，シングルセルゲノム解析で優占種やキーストーン種の詳細な解析が可能となれば，微生物群集に関する知
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