⽂献セミナー回答(2021.9.2 Nuclear analysis using Raman Spectroscopy)
M2 野崎◎ 仮想励起状態とは何か。

量⼦⼒学モデルでは光散乱を⼆光⼦過程として取り扱います。⼆光⼦過程で、はじめにフォトンと分⼦との衝突が起こり、その結果、極端に短い時間の間、分⼦は⾼いエネルギー状態に仮想的に励起されます。きわめて短い時間の後、第 2 の過程としてフォトンの放出がおこります。
ラマン散乱強度⽅程式内の変数（ラマン散乱テンソル）を定義する⽅程式である Kramers-Heisenberg-Diracの分散式を⽤いて仮想励起状態について考えます。

Kramers-Heisenberg-Dirac の分散式は、分⼦の始状態|m>、終状態|n>以外のあらゆる中間状態|e>に関する求和を含んでいます。それぞれの中間状態の寄与が位相を持って (絶対値の 2 乗 | |2 をとる前に) 求和される
ことは、ラマン散乱の過程で分⼦が中間状態|e>に実際に分布するわけではないことを意味しています。その意味で中間状態は仮想的(virtual)であると⾔うことができます。
細かいパラメータや量⼦論モデルでのラマンの解釈は参考⽂献をご参照いただければと思います。
・濱⼝研究室ホームページ

http://hamalab.com/basic/RamanTheory.html◎ 励起波⻑を選ばないというが、⽤いる波⻑によって何か違いは⽣じてこないのか？

励起波⻑によってラマンの感度が変わってくることが知られています。
・光散乱の強度は⼊射光の強度に⽐例し、波⻑の 4 乗に反⽐例することが知られています（いわゆる ν4 則）。
そのため、レーザー波⻑が⻑いほど結果的にラマン信号強度が弱くなってしまい、逆に短波⻑のレーザーを使えば強いラマン散乱光を得ることができます。

・CCD 検出の検出感度（量⼦効率）の具合が波⻑によって違うことにも留意する必要があります。多くのラマンの測定は、光電⾯にて光を電⼦に変換し、電⼦倍増管で増幅、電流として信号を出⼒する CCD 検出器によって⾏われます。光を電⼦に変換する効率（量⼦効率）は波⻑によって異なり、⼀般に 550nm ぐらいをピークに⻑波⻑になるにつれて感度が落ちてくることが知られています。
・励起波⻑によってはフラビン補酵素などに由来する⾃家蛍光が励起され、バックグラウンドの蛍光が上がってしまい、ラマンシグナルが埋もれてしまうという懸念点もあります。
このような特徴から、⾃発ラマン光の測定には 532 nm が励起波⻑として使われることが多いです。
また、測定する分⼦ごとに最適な励起波⻑は異なります。例えば、シトクロム c には，510〜550 nm の光を吸収するヘムタンパク質が含まれているため，この波⻑域の光を照射すると，強い共鳴ラマン散乱が観測されます。
・Hamada, K.;... Kawata, S. J. Biomed. Opt. 2008, 13 , 044027.
・濱⼝宏夫, 分光法シリーズ 1 ラマン分光法, 講談社, 2015
・https://www.ites.co.jp/analyzenews/analyzeblog/vol-006.html◎ ⾦ナノ粒⼦の細胞内への導⼊

⾦ナノ粒⼦の細胞への取り込みには、ファゴサイトーシス、ピノサイトーシス、マクロピノサイトーシス、クラスリンおよびカベオリンを介したエンドサイトーシスなど、さまざまなメカニズムが関与していることが知られています。様々な細胞株を⽤いた研究では、エネルギー依存性の受容体媒介エンドサイトーシス（RME）が主なメカニズムであることが⽰されています。
エンドソームからの脱出に関しては、複数の localization peptide や PEG, BSA などのタンパク質で⾦ナノ粒⼦を修飾することで物性を最適化していることが多いようです。
・Huefner, A....; Mahajan, S. Nano Lett. 2013, 13 , 2463.
・Hecht, S. M. Acc. Chem. Res. 1986, 19 , 383.

◎ ⽣細胞でどのくらいの時間、連続観測できるのか？退⾊はおこりにくい？

蛍光と⽐較してラマンの⽅が退⾊が起こりにくい（ほとんど起こらない）ことが⼀般に知られています。これは、ラマン散乱の寿命が極めて短いため，励起状態にあるレポーターの光退⾊，エネルギー移動，消光が起こらないことによります。ただし、SERS については、⾦ナノ粒⼦の拡散や局所的な光熱効果による破壊などによってシグナルが徐々に弱くなることも報告されています。拡散を防ぐために細胞を固定したり、コアシェル構造を作って安定性を向上させることで破壊を防ぐといった⼯夫によってシグナルの減少を防ぐ研究も⾏われているようです。
⽂献を調べた中では、連続露光時間ですと 40 分程度、インターバルを挟んで 24 時間以上の継続して計測した例などがありました。
・Shen, Y.; ... Xu, S. Theranostics 2021, 11, 4872.
・Wang, Y.; ...Chen, L. Chem. Rev. 2013, 113, 1391.

◎ 吸収はイメージングには使えないのか？

ラマンと対をなす測定法である⾚外分光法は，試料に⾚外光を照射し，どの波⻑（波数）でどのくらいの光が吸収されるかを測定します。イメージングへの利⽤については、顕微鏡の空間分解能は波⻑に⽐例する回折限界によって制限されるため、可視光を⽤いるラマン顕微鏡では細胞レベルの観察が可能な⼀⽅で、⾚外光を⽤いる⾚外顕微鏡では 10 µm 程度の空間分解能しか得ることができず、組織レベルでのイメージング利⽤に限られていました。しかしながら、近年では⾚外分光を⽤いて⽣細胞観察ができる顕微鏡が開発されています。
その⼀つが⾚外フォトサーマル定量位相顕微鏡です。この顕微鏡は、⽣体分⼦が⾚外光を吸収して振動することにより発⽣する温度上昇（フォトサーマル効果）に伴う屈折率の変化を定量位相顕微鏡により検出します。
フォトサーマル効果による屈折率変化を可視光で検出するため、⾼い分解能および、⽔の影響を受けない観測を達成しています。

・Tamamitsu, M.;... Ideguchi, T. Optica 2020, 7 , 359.

◎ ⾦ナノ粒⼦によるラマン増幅の影響はどのくらいの範囲に及ぶのか。

SERS の効果が及ぶ範囲としては、観測対象の分⼦が⾦ナノ粒⼦の表⾯近く、約 1 nm ~ 10 nm の距離に位置していることが必要とされています。
・Pilot, R.;...Fabris, L. Biosensors 2019, 9 .

◎ フェニル基のついたアルキンのラマン強度が⼤きいのはなぜか。

様々な化合物のラマン強度の測定から、フェニル基を持つアルキンおよび、フェニル基の 4 位にホルミルやエステルを置換基としてもつアルキンの強度が増すことから、アルキンの伸びる⽅向への π 軌道の拡張が重要であることが実験的に⽰唆されています。

原理については ATRI 関連の論⽂にはほとんど記されていませんでしたが、クムレンの炭素鎖の構造と分光学的特性に関する論⽂で、アルキンの伸⻑⽅向へアリール基を付けると、アリール基のπ軌道がsp 炭素鎖の外側に伸びる共役⻑を増加させることで分⼦の分極性を向上させ、その結果 CC 伸縮座標に対する分⼦分極性が上がることでラマンシグナルが増強すると主張しているものもありました。
・Bakthavatsalam, S.; ...Sodeoka, M. RSC Chem. Biol. 2021.
・Tommasini, M.; ...Tykwinski, R. R., J. Phys. Chem. C ,2014, 118 , 26415.

◎ alkyne のラマン、シグナルが弱いので、DNA やヒストンのような量の多い⽣体分⼦しか出来ない？

現状、報告されている alkyne ラマン(ATRI)は核酸、脂質、糖のような、⼤量に体内に存在し、取り込まれる⽣体分⼦の修飾がほとんどです。ATRI の増強にはセミナー内で触れたアルキン構造の改変や、SRS など顕微鏡側の最適化が⾏われていますが、やはり応⽤範囲は量の多い分⼦に限られているようです。（そのため）
袖岡先⽣の研究室では、薬物にアルキンタグをつけて ATRI を SERS で増強し、⽣細胞内への取り込みを追跡するなど、⽣体内分⼦に限らず多様な分⼦のイメージングへと研究を展開されています。
・Koike, K.;... Sodeoka, M.; Fujita, K. ACS Nano 2020, 14 , 15032.
・Bakthavatsalam, S.; ...Sodeoka, M., RSC Chem. Biol. 2021.

◎ ⾦ナノ粒⼦をアシル化でヒストンに付けるのはどう？

SERS で使われる⾦ナノ粒⼦の直径は約 30-60 nm であり、⼀⽅ヒストンの直径は約 10 nm です。従って、ヒストンの⾦ナノ粒⼦修飾は、蛍光タンパク質を共発現させるのと同じように、細胞内⽣理環境への影響が⼤きく、ラマンの強みや触媒医療の強みを活かせないのではないかと思います。
BAHA 触媒によるアシル化の background が低いこと、およびヒストンが細胞内に多く存在することから、BAHA であれば、SERS を使わなくても SRS（ラマンの測定法の⼀種、励起光と同時にストークス光を照射し、誘導放出を起こすことでストークス光を増幅する、ラマン顕微鏡ではかなり⼀般的に使われている⼿法）など測定法を⼯夫することでラマンイメージングが可能なのではないかと思います。
◎ 今のラマン技術における解決すべき問題は何でしょうか。例えば浦野研の神⾕さんは何をやろうとしているの？

神⾕先⽣のグループでは、加⽔分解酵素によってラマン信号を出すような ON/OFF 型のラマンプローブを合成し、⽣細胞内で複数の酵素活性を同時に可視化するという研究をされています。ラマン活性の ON/OFF スイッ
チングは、分⼦の吸収波⻑よりも 100-200 nm ⻑波⻑の光で励起すると検出感度が⾶躍的に増⼤するという前期共鳴(EPR)ラマンを利⽤します。キ
サンテン⾻格のラマン⾊素にアミド結合を介して酵素基質部位を導⼊した
プローブは、酵素反応により励起波⻑が⻑波⻑化し EPR 条件を満たすようになり、強いシグナルが観測されます（=ラマン活性が ON になった）。
この研究の肝となっているのは、ラマンの共鳴の幅（スペクトルの幅）が狭いことであり、蛍光標識ではスペクトルが重なってしまうために難易度の⾼かった、multi color imaging を実現し、がん細胞種間での酵素活性パターンの違いを可視化することに成功しています。現状はニトリル基（およびその重標識体）をラマンタ
グとして⽤いていますが、将来的にはアルキンなども導⼊し、さらにたくさんの染め分けを⾏う計画のようです。
最終的には、浦野研の蛍光プローブのようにがん臨床検体の染⾊などに使うことを志向していると考えられますが、解決すべき問題点として、やはり感度が低いことが挙げられると思います。実際、発表されているプローブでも SRS や EPR を使うことでラマンシグナルの intensity の向上を図っています。しかしながら、現状
では sub-micro molor の検出感度にとどまっており、さらなる感度の向上が必要と考えられます。
・Fujioka, H.; ... Kamiya, M. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142 , 20701