癌の転移•生存戦略におけるSialyl-Tn糖鎖抗原の役割
熊本大学 大学院 生命科学研究部
生体分子制御解析学講座
大坪 和明

講義内容
低酸素環境によって誘導されるSialyl-Tn
糖鎖抗原
sTn抗原の発現とがん転移
腫瘍微小環境のリモデリングとsTn抗原
sTn抗原を標的としたがん治療の可能性

細胞微小環境変化に応じた糖鎖合成
細胞外
酸素 イオン 増殖因子
レベル レベル サイトカイン マトリックス

バクテリア AGE

栄養素
環境適応

受容体

RAGE

接着分子

トランスポーター

細胞機能の制御

NOX
シグナル伝達キャリアー分子の機能変化
細胞内代謝

転写因子の活性化

糖鎖合成
転写制御
遺伝子群
核

糖ヌクレオチド合成
糖転移酵素
糖分解酵素
糖ヌクレオチド輸送体

糖鎖異常と疾患
糖タンパク質のフォールディング

細胞接着
細胞反発

細胞内輸送

代謝
受容体の２量体化

糖鎖異常に起因する疾患数

エンド
サイトーシスクリアランス

シグナル伝達
ホモ多量体形成

ヘテロ多量体形成

Ohtsubo, K. and Marth JD.
Cell 126: 855-867, 2006より改変

Hudson H. F. et al. AJHG 94:161-175, 2014

がんの発生•進展と糖鎖構造の変化
軽度
異形成
正常

遺伝子異常

中等度異形成高度異形成

遺伝子異常の蓄積（前がん状態）

上皮内
がん

がん

がん化および、がんの進展
糖鎖構造の変化腫瘍マーカー分子・がんの進展のモニタリング
・治療の効果の判定
・転移・再発の検出Sialyl-Tn (sTn)糖鎖抗原の分布
がん腫別のsTn抗原の陽性率

Julien S., et al., Biomol. 2:435-66, 2012

がんの種類に関係なく発現が認められる正常組織には発現が認められない

sTn抗原とがん患者の予後
胃がん患者

乳がん患者

Nakagoe, T., et al, EJSO 27: 731-739, 2001

Xu, F., et al, Gland surgery 10: 2673-2685, 2021

食道がん患者

Cotton, S., et al, Int J Mol Sci. 22: 1664, 2021

sTn抗原の合成
O-型糖鎖の初期合成経路

OH

ppGalNAc-Ts

Ser/Thr

C1GalTC2GnT-Ser/Thr--Ser/Thr--Ser/Thr-

ポリペプチド鎖

ST6GalNAc-I
ST6GalNAc-II

CMPCMP

N-アセチルガラクトサミン

a2,6-Ser/Thr-

Sialyl-Tn (sTn)
糖鎖抗原
N-アセチルグルコサミン

ガラクトースシアル酸

低酸素によるsTn抗原の発現誘導
正常酸素濃度O2O2

HIF-1a

低酸素によるsTn抗原の誘導

PHD
OH

HIF-1a

低酸素

OH

細胞質

VHL
OH

HIF-1aUb
Ub
Ub

プロテアソームによる分解

核OH

HIF-1aHIF-1bHRE

標的遺伝子

PDH:prolyl hydroxylase, VHL:von Hippel–Lindau

低酸素暴露細胞の浸潤能亢進とsTn抗体による阻害

膀胱癌組織におけるsTn抗原の発現とHIF-1aの核局在
HIF-1asTn抗原

Peixoto, A., et al, Oncotarget 7: 63138-63158, 2016

講義内容
低酸素環境によって誘導されるSialyl-Tn
糖鎖抗原
sTn抗原の発現とがん転移
腫瘍微小環境のリモデリングとsTn抗原
sTn抗原を標的としたがん治療の可能性

低酸素とがん転移を促す微小環境形成
がん細胞と骨髄由来細胞の相互作用と成長因子の分泌

Bone marrow
Derived cell

Hypoxic condition

マクロファージの動員と成長因子の分泌Resident fibroblast

Macrophage

線維芽細胞の動員と成長因子による活性化

Tumor cell

コラーゲン修飾酵素の誘導
Extracellularmatrix

浸潤と血管侵襲

Recruitedfibroblast

コラーゲン繊維の産生とリモデリング
Blood vessel

sTn抗原の発現と転移
Serum sialyl-tn antigen level as a prognostic indicator in patients with gastric-cancer.
Maeda K, Chung Y, Onoda N, Nakanishi I, Nitta A, Arimoto Y, Yamada N, Kondo Y, Kato Y, Sowa M.
Int J Oncol. 1994 Jan;4(1):129-32. PMID: 21566901
Correlation between sialyl Tn antigen and lymphatic metastasis in patients with Borrmann type IV gastric carcinoma.
Kakeji Y, Maehara Y, Morita M, Matsukuma A, Furusawa M, Takahashi I, Kusumoto T, Ohno S, Sugimachi K.
Br J Cancer. 1995 Jan;71(1):191-5. doi: 10.1038/bjc.1995.39. PMID: 7819038

sTn抗原の発現と胃がんのリンパ節転移sTn抗原の発現と胃がんのリンパ節転移

Immunohistochemical expression of sialyl Tn and sialyl Lewis(a) antigens in stromal tissue correlates with peritoneal dissemination in stage IV humangastric cancer.
sTn抗原の発現とIkeda Y, Mori M, Kamakura T, Saku M, Sugimachi K.
胃がんの腹膜播種
Eur J Surg Oncol. 1995 Apr;21(2):168-75. doi: 10.1016/s0748-7983(95)90369-0. PMID: 7720892
Expression of sialyl-Tn in breast cancer. Correlation with prognostic parameters.
Soares R, Marinho A, Schmitt F.
Pathol Res Pract. 1996 Dec;192(12):1181-6. doi: 10.1016/S0344-0338(96)80148-8. PMID: 9182286

sTn抗原の発現と乳がんのリンパ節転移

実験的にsTn抗原発現細胞の性状を解析
Cloning and expression of a human gene encoding an N-acetylgalactosamine-alpha2,6-sialyltransferase (ST6GalNAc I): a candidate for synthesis ofcancer-associated sialyl-Tn antigens.
Ikehara Y, Kojima N, Kurosawa N, Kudo T, Kono M, Nishihara S, Issiki S, Morozumi K,Itzkowitz S, Tsuda T, Nishimura SI, Tsuji S, Narimatsu H.
Glycobiology. 1999 Nov;9(11):1213-24. doi: 10.1093/glycob/9.11.1213.

ST6GalNAc-I遺伝子のクローニング

sTn抗原の発現と転移
sTn抗原(+)/GFP(+)細胞の樹立
sTn抗体処理による腹膜播種抑制

sTn抗原発現細胞の腹膜播種亢進

6s:sTn Ag (-)

6L:sTn Ag (+)

Ozaki, H., et al.Clin Exp Metastsis 29:229-238, 2012

講義内容
低酸素環境によって誘導されるSialyl-Tn
糖鎖抗原
sTn抗原の発現とがん転移
腫瘍微小環境のリモデリングとsTn抗原
sTn抗原を標的としたがん治療の可能性

腫瘍微小環境を構成する細胞群
Resident
fibroblast

NK cell

B cellMacrophage

Dendritic cell

Tumor cell

T cellPericyte

Recruitedfibroblast

Red blood cell

sTn抗原発現がん細胞に附随するマクロファージはSiglec-15を発現している
CD68/Siglec-15

sTn抗原

ヒト肺ガン組織CD68/sTn/DAPI

Siglec-15/DAPI
Human monocyte
Treated with
GM-CSF (M1)

M-CSF(M2)

がん進展の補助Takamiya, R., et al., Glycobiology 23: 178-187, 2012

Siglec-15を介したTGF-bの産生誘導
MOCKST6exp

Co-culture of tumor cells andMacrophages
Humanmacrophage

cytokines

Human lung carcinoma cells(sTn antigen (-) or (+))

がん微小環境sTn抗原-Siglec15 相互作用を介したマクロファージの活性化
腫瘍随伴
マクロファージ
Takamiya, R., et al., Glycobiology 23: 178-187, 2012

sTn抗原発現
がん細胞

TGF-bによる上皮間葉転換の誘導

がん細胞由来細胞外小胞(Extracellular vesicles)による低酸素がん微小環境の制御
細胞外小胞(Extracellular Vesicles; EVs)
エクソソームexosome

マイクロベシクル
Microvesicles (MVs)

アポトーシス小体
Apoptotic bodies

Exosome:30~150nm
MV:100~1000nm
Apoptotic body:50~5000nm

Meng W., et al., Mol Cancer 18: 57, 2019

sTn抗原発現細胞における細胞外小胞(EV)産生レベルの亢進

Mock cell(sTn antigen (-))

filtration andultracentrifugation Cont-EVs
EVs

ST6exp cell(sTn antigen (+))

sTn-EVs

113

2.0[Cont-EVs]

Mock cell

1.5

ST6exp cell

1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0

100nm

0200117400 600[sTn-EVs]

100nm

0200 400 600

Vesicle size (nm)

Relative EV-production(vesicle number)

EVs

Vesicle concentration （x107/ml）

細胞外小胞の調製とサイズ分布解析

10.0

p<0.001

8.0
6.0
4.0
2.00Nagao, K. et al., J Biochem. 171: 543-554, 2022

TSAP6依存的細胞外小胞産生

Pavlakis E. et al., Int J Mol Sci 21:9648, 2020

TSAP6発現レベル

3.0

ST6exp cellp<0.012.0

p<0.01
Relative EV
production levels

Relative expression levels

Mock cell

TSAP6 knock downとEV産生レベル
p<0.05

6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.00

Flotillin-1

1.0

Control Oligo +TSAP6 siRNA -0
TSAP6++-+Nagao, K. et al., J Biochem. 171: 543-554, 2022

EV受容細胞の運動能促進
細胞運動能Donor cellCont-EVs
recipient cellsTn-EVs
recipient cellEVs

Relative cellular motility

Recipient cell

2.0
Boyden chamber assay(analyze cellular1.5 motility)

Mock cellEVs
H157 cell
ST6exp cell

Cell migration# of migrating cells/field

No EVs80

p<0.05Cont-EVs

1.00.50sTn-EVs

HEK293T

HL-60

U937

THP-1

p<0.001p<0.0001

p<0.0001

p<0.001p<0.00140

p<0.0001

p<0.00150

p<0.001

4050
403030201020100010060

30

4020200Nagao, K. et al., J Biochem. 171: 543-554, 2022

EVが輸送するFAK
EVが含有するFAKタンパク質- + - - +(KDa)
18013010075
6348
Ponceau-S FAK

Relative FAK protein levels

Cont-EVs - + sTn-EVs - - +3.0

No EVsrecipient cellCont-EVs
recipient cellsTn-EVs
recipient cellp<0.01p<0.05

Relative cellular motility

2.0
1.5
1.0

10075
6348

1.0

Ponceau-S FAK-sTn-EVsp<0.05

3.0
2.0
1.000

No EVsrecipient cellCont-EVs
recipient cellsTn-EVs
recipient cell+Recipient cellsTn antigen facilitates extracellularvesicle-mediated FAK transfer

Cellular motility

sTn antigen

Transfer FAK
FAK
TSAP6N.S.

0.50PF-573228

1801302.0

FAK阻害におけるEV受容細胞の運動能
p<0.05p<0.01(KDa)

Cont-EVs

Relative FAK protein levels

Recipient cellContsT EVn- sEVsCo
ntsT EVn- sEVs

EV受容細胞内のFAKタンパクレベル

Extracellular vesicles
Production ofExtracellularvesicles

TP53

TSAP6Donor cellNagao, K. et al., J Biochem. 171: 543-554, 2022

講義内容
低酸素環境によって誘導されるSialyl-Tn
糖鎖抗原
sTn抗原の発現とがん転移
腫瘍微小環境のリモデリングとsTn抗原
sTn抗原を標的としたがん治療の可能性

sTn抗原を標的とした治療法（薬）の開発
sTn抗原(+)/GFP(+)細胞の樹立
sTn抗体処理による腹膜播種抑制

sTn抗原発現細胞の腹膜播種亢進

6s:sTn Ag (-)

6L:sTn Ag (+)

Ozaki, H., et al.Clin Exp Metastsis 29:229-238, 2012

sTn抗原を標的としたワクチン療法の開発
sTn抗原特異的抗体の誘導

腫瘍抑制効果KLH(Keyhole Limpet
Hemocyanin)
Theratope

vaccination

Julien, S., et al. Br J Cancer 100: 1746-1754, 2009

結論
• sTn抗原は低酸素環境下で転写因子HIF-1によって誘導されるST6GalNAC-Iによって合成される。
• sTn抗原発現細胞は浸潤能を獲得し、高い転移能を有する。
• sTn抗原発現細胞はSiglec-15を介して腫瘍随伴マクロファージを活性化し、上皮間葉転換をTGF-bの分泌を促す。
• sTn抗原発現細胞では細胞外小胞の産生が亢進し、周辺細胞へFAKを輸送する。
• ST6GalNAc-IおよびsTn抗原は、がん転移抑制の標的となる可能性がある。

参考文献
Ohtsubo K, Marth JD. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 2006 Sep 8;126(5):855-67. doi:
10.1016/j.cell.2006.08.019.
Freeze HH, Chong JX, Bamshad MJ, Ng BG. Solving glycosylation disorders: fundamental approaches reveal complicatedpathways. Am J Hum Genet. 2014 Feb 6;94(2):161-75. doi: 10.1016/j.ajhg.2013.10.024.
Julien S, Videira PA, Delannoy P. Sialyl-tn in cancer: (how) did we miss the target? Biomolecules. 2012 Oct 11;2(4):435-66.
doi: 10.3390/biom2040435.
Nakagoe T, Tsuji T, Jibiki M, Nanashima A, Yamaguchi H, Yasutake T, Ayabe H, Arisawa K, Ishikawa H. Pre-operative serum
levels of sialyl Tn antigen predict liver metastasis and poor prognosis in patients with gastric cancer. Eur J Surg Oncol.2001
Dec;27(8):731-9. doi: 10.1053/ejso.2001.1199.
Xu F, Li M, Li J, Jiang H. Diagnostic accuracy and prognostic value of three-dimensional electrical impedance tomography
imaging in patients with breast cancer. Gland Surg. 2021 Sep;10(9):2673-2685. doi: 10.21037/gs-21-348.
Cotton S, Ferreira D, Soares J, Peixoto A, Relvas-Santos M, Azevedo R, Piairo P, Diéguez L, Palmeira C, Lima L, Silva AMN,
Lara Santos L, Ferreira JA. Target Score-A Proteomics Data Selection Tool Applied to Esophageal Cancer Identifies GLUT1Sialyl Tn Glycoforms as Biomarkers of Cancer Aggressiveness. Int J Mol Sci. 2021 Feb 7;22(4):1664. doi:
10.3390/ijms22041664.
Peixoto A, Fernandes E, Gaiteiro C, Lima L, Azevedo R, Soares J, Cotton S, Parreira B, Neves M, Amaro T, Tavares A, Teixeira
F, Palmeira C, Rangel M, Silva AM, Reis CA, Santos LL, Oliveira MJ, Ferreira JA. Hypoxia enhances the malignant nature ofbladder cancer cells and concomitantly antagonizes protein O-glycosylation extension. Oncotarget. 2016 Sep
27;7(39):63138-63157. doi: 10.18632/oncotarget.11257.

参考文献
Ozaki H, Matsuzaki H, Ando H, Kaji H, Nakanishi H, Ikehara Y, Narimatsu H. Enhancement of metastatic ability by ectopic
expression of ST6GalNAcI on a gastric cancer cell line in a mouse model. Clin Exp Metastasis. 2012 Mar;29(3):229-38. doi:
10.1007/s10585-011-9445-1. Epub 2012 Jan 8.
Takamiya R, Ohtsubo K, Takamatsu S, Taniguchi N, Angata T. The interaction between Siglec-15 and tumor-associatedsialyl-Tn antigen enhances TGF-β secretion from monocytes/macrophages through the DAP12-Syk pathway.
Glycobiology. 2013 Feb;23(2):178-87. doi: 10.1093/glycob/cws139. Epub 2012 Oct 3.
Meng W, Hao Y, He C, Li L, Zhu G. Exosome-orchestrated hypoxic tumor microenvironment. Mol Cancer. 2019 Mar
30;18(1):57. doi: 10.1186/s12943-019-0982-6.
Nagao K, Maeda K, Hosomi K, Morioka K, Inuzuka T, Ohtsubo K. Sialyl-Tn antigen facilitates extracellular vesicle-mediatedtransfer of FAK and enhances motility of recipient cells. J Biochem. 2022 May 11;171(5):543-554.doi:10.1093/jb/mvac008.
Julien S, Picco G, Sewell R, Vercoutter-Edouart AS, Tarp M, Miles D, Clausen H, Taylor-Papadimitriou J, Burchell JM. SialylTn vaccine induces antibody-mediated tumour protection in a relevant murine model. Br J Cancer. 2009 Jun
2;100(11):1746-54. doi: 10.1038/sj.bjc.6605083. Epub 2009 May 12.

謝辞•大阪国際がんセンター •理化学研究所
長田裕之
谷口直之
是金宏昭
前田賢人
•京都大学
•東北医科薬科大学
井上正宏
山口芳樹
奥山博昭
•Academia Sinica
安形高志
•大阪大学
黒澤努
高松真二
•Grant Support•H.U.グループ
中央研究所
犬塚達俊

•熊本大学
藤井柊作 池部桂生 橋本華奈子
田嶋彩香 日和田拓也
長尾恵介 川上ゆうか
細見夏純 福嶋昌俊
伊藤瑠架 宮武優太

科研費、熊本大学めばえ研究推進事業、
大阪対がん協会、日本応用酵素協会、武田科学振興財団