STR 開発講習会資料	  	  	  文責：山﨑 曜（京都大学大学院理学研究科）

初版：2014/5/30
改訂版：2016/2/4

資料内容
作業内容
A．VirtualBox と Linux の環境設定 ・・・・・・・・・・・・・・・・・p.1
B．QDD3 を用いた NGS データからの STR 解析用プライマー設計・・・p.5
C．優良プライマーの選別と Multiplex 系の構築・・・・・・・・・・・・p.11

はじめに
この資料の作成にあたり，武島弘彦博士，武藤望生博士，STR 開発セミナー参
加者の方々に大変お世話になりました．この場を借りてお礼申し上げます．

作業内容
A．VirtualBox と Linux の環境設定
VirtualBox は，ホストの OS（Win，mac など）上でゲストの OS（Linux など）を動かすためのソフトです．今回の STR 開発ではソフトウェア QDD（Meglécz et al., 2010,2014）を使用して STR のプライマーを設計します．すでに QDD がインストールされている LinuxOS が配布されていますので，今回はそれを VirtualBox で動かして解析します．QDD で解析する前にまずは，Linux 上のネットワーク環境やホストとゲストのOS 間での共有フォルダの設定などを行って解析の下準備を行います．この過程は一度設定すれば，繰り返し行う必要はありません．

1. VirtualBox のインストールと Linux の読み込み
参考 URL
全般
http://net.imbe.fr/~emeglecz/qdd̲installation.html
VirtualBox のインストール：
http://www.kkaneko.com/rinkou/virtualbox/virtualbox.html①	  VirutalBox の Web ページからダウンロードした実行ファイル「VirtualBox-4.3.12-93733-win.exe」をクリックします．ウィザードに従ってインストールします．設定はデフォルトで OK です.

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②	  QDD3 の Web ページから”QDD-VM version3.1.1”をダウンロードします．容量が重いので時間がかかります．ダウンロードしたファイルはパソコンの適当な場所に置いてください．この QDD-Galaxy 3.1.1 は LinuxOS の一種である ubuntu に，QDD などの解析ソフトがすでにインストールされている状態のものです．
③	  インストールした VirutalBox を起動します．Windows7 で起動しない場合，右クリックで VirtualBox のプロパティを開き，互換モードでいずれかの OS を選択するとよい場合があります．起動後，「ファイル→仮想アプライアンスのインポート」を選択します．設定はデフォルトで大丈夫です．仮想アプライアンスには，「QDD-VM」を選択してください．成功すれば，VirtualBox マネージャー上に「QDD-Galaxy-3.1.1」が現れます．windows にて，ubuntu が 32bit として読み込まれてしまい，起動できなくなる問題が確認されています．執筆者は mac なので詳
しくはわからないのですが，bios の設定を変更すると 64bit として読み込めるようになるそうです．詳しくはググってください．
④	  「設定」をクリックし，「システム」タブから自分のパソコンのスペックに見合ったCPU（「マザーボード」タブから）やメモリ（「プロセッサー」タブから）を割り当ててください．メモリや CPU を多く割り当てると，それだけ解析時間が早くなります．念のため，デフォルト以下の値にはしないでください．

2. Linux 上での各種設定①	  画面左のアイコンをダブルクリックして QDD-Galaxy を起動してください．パスワ
ードは“qddGalaxy”です．デ フ ォ ル ト で は キ ー ボ ー ド の 配 列 が フ ラ ン ス 語 に なっていますので，右上のアイコンをクリックし英語を選択してから入力してください．
②	  日本版のキーボード配置に設定し直します．左側の「System Setting→KeyboardLayout」を選択してください．左下の「+」マークをクリックして，表示されたリストから日本版のキーボード配置を選択し,「add」をクリックして使用リストに加えください．フランス語や英語のキーボード配置は「­」を押して削除するほうがよいと思います．不要な配置を削除しない場合，デスクトップの右上のキーボードのアイコンから，Japanese を選択する必要があります．
③	  Linux 上での操作性を改善するため，Gest Additions をインストールします．ホス
ト側のタブから「Device→Insert Gest Additions CD image」(日本語表示の場合「デバイス→「Guest additions の CD イメージを挿入」）を選択します．Linux 側から

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のメッセージに従ってインストールを実行してください．パスワードは qddGalaxyです．
④	  オプション
ネットワークを設定します．左のアイコンから「System Setting→Network→Network proxy→Automatic」を選択し，”http://wpad.kuins.net/proxy.pac”と記入し Apply system wide をクリックして適用してください（Fig.1）．このアドレス部分は京大内での設定になります．他の機関の内部で使用される場合，その機関内でのプロキシ設定方法に準じてください（自動プロキシ設定についての項目がありましたら，そこに記載されているアドレスを入力すれば大丈夫と思います）．

Fig. 1 上記のように入力してください．

⑤	  FireFox を立ち上げて Web ページが開けることを確認してください．

3. ホスト OS と Linux 間の共有ファイルの設定①	  ホストと Linux 間でデータ交換をするためのフォルダをホスト側に設置します．ホストの適当な位置に新規のフォルダを設置してください．この資料では，「qddGalaxy」と名付けたとして話を進めます．
②	  VirtualBox マネージャーの「設定→共有フォルダ」を選択し，ウィンドウ右端の小さいフォルダアイコン「新規共有フォルダを追加する」を選択します．さきほど作ったフォルダを選択し，「永続化する」にだけチェックを入れます．

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③	  Linux 側にも同じ名前のファイルを作成します．特にこだわりが無ければ，homeに作成されることをお薦めします．
④	  左側のアイコン「Dash home」で「terminal」をクリックしてください．そこに，
sudo gedit /etc/rc.localと入力してください．パスワードは“qddGalaxy”です．打ち込んでもパスワードは表示されませんが，入力されていますので大丈夫です．
⑤	  テキストエディタが表示されます．最終行の”exit 0”の前の行にmount.vboxsf –o uid=1000 qddGalaxy /home/qdd/qddGalaxyと入力し，保存（save アイコンをクリック）した後，テキストエディタを閉じてください(Fig. 2)．

Fig. 2 下線の位置に書き加えてください．

⑥	  ターミナルにもう一度，
mount.vboxsf –o uid=1000 qddGalaxy /home/qdd/qddGalaxyと入力してください．ホスト側からフォルダ「qddGalaxy」に解析する FASTA フ
ァイルを移動してみて，Linux 側からもそのファイルが開けることを確認してくだ
さい．

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B. QDD3 を用いた NGS データからの STR 解析用プライマー設計
STR 領域のプライマーを設計するソフトは幾つかあるようですが，今回は QDD3 というソフトを使用します．QDD3 は Perl 言語で書かれた以下の 4 つの解析プログラムから構成されています．
1． STR 領域の抽出
2． コンセンサス配列の作成
3． プライマーの作成
4． BLAST
今回は 3 までを実施します．
QDD による解析を一度中断した場合（ウェブブラウザを閉じた場合）は，この項目を始めから実行してください．

参考 URL全般
http://net.imbe.fr/~emeglecz/qdd̲run.html
Galaxy について
http://www.nabe-intl.co.jp/takeruwiki/index.php?Galaxy を動かしてみました
http://blog.amelieff.jp/?day=20120807①	  Galaxy サーバーを起動します．Galaxy はゲノムデータを，web ブラウザを利用しGUI で動かすためのシステムです．Galaxy 内には多数のソフトが内包されています．QDD の web ページからダウンロードした ubuntu には QDD がインストールされている Galaxy サーバーを搭載しているため，容易に解析が行えます．まずは
Dash home から terminal を起動し，cd ~/galaxy-dist/と入力してください．次にsudo sh run.shと入力してください．パスワードが要求されますので，また“qddGalaxy”と入力してください．
②	  terminal に「serving on http//127.0.1:8080」と表示されるまで待ってください．
しばらく時間がかかります．

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③	  表示されましたら，FireFox を起動します．URL 入力欄に“http://127.0.0.1:8080/”と入力してください．FireFox に Galaxy サーバーが表示されます (Fig. 3)．

Fig. 3 terminal に上記の表示が出たら，FireFox に http://127.0.0.1:8080 と入力してください．

④	  アカウントに入ります．ウィンドウ上部の“User”から入ります．
Email: qddGalaxy@gmail.com
Pass:qddGalaxyです．アカウントに入ることで，解析の保存ができるようになります．解析結果は要所要所で自動的に保存されます．保存内容は User→saved history から閲覧できます．
⑤	  新規の解析セッションを作成します．右上の歯車マークをクリックし，「CreateNew」を選択してください．新規に名前を付けてください．
⑥	  データを読み込ませます．左端の Tools 欄の上から 2 番目に「Get Data」があります．その中の「Upload File」を選択してください．
「Browse」をクリックし，画面右の「Places」から「qdd」を選び，ホストとの共有フォルダ「qddGalaxy」中に置いてある，解析に用いる FASTA ファイルを選択します．最後に「Execute」をクリックすると，ファイルが Galaxy サーバーに upload されます．NGS からはき出された file を使用する場合，予めタグ配列を除去し，Galaxy に upload してから6

FASTA 形式に変換してください．sff や fastq 形式から fasta 形式への変更は Galaxy
内で行えます（Convert Formats から行えます）．

pipe ごとに解析を行う⑦	  解析を開始します．まずは STR 領域の探索です．QDD の pipe１では，input ファイルの中から STR 領域を探索し，また一定以下の長さの配列を除外する解析を行います．「Tools」の一番上にある「QDD」をクリックしてください．その中の「QDD̲pipe1」をクリックしてください．表示された画面上で，以下の様に選択してください．
Input fasta file: 解析する FASTA ファイル
Input sequence are already assembled: yes（未アセンブルデータの場合は no）
Flanking region length: 200~300
Sequence length limit: 80
選択が終わったら，「Execute」をクリックしてください．解析が終了すると，右端の「history」に新しくファイルが表示され，黄色から緑色になります(Fig. 4)．灰色の場合は histrory 右の更新ボタンをクリックします．

Fig. 4 pipe1 解析画面の様子⑧	  次はコンセンサス配列の作成ですが，今回使用するデータはすでにアセンブルされたデータです．
「Tools」から「QDD̲pipe2」を選択してください．
「Sequence with7

microsatellites」が「Input for pipe2」になっていることを確認し，”Make consensussequences?”は”No”を選択し，「Execute」をクリックしてください．もし NGS データをそのまま解析する場合，配列データの中には同じ領域が複数本含まれる場合があります．それらを把握して，重複した配列を無くす必要があります．そのときは”Make consensus sequences?”を”yes”にしてください．解析終了まで少し時間が掛かります．「History」のファイルがグレーのときは，上の更新ボタンを押してください．
⑨	  最後はプライマーの設計です．pipe3 は，設定されたパラメータに基づいてプライマーを設計します．プライマー長やアニーリング温度などを入力します．入力し終わったら，また「Execute」をクリックします．解析には時間が掛かります（データ量次第ですが，今回のミツバチゲノムデータの場合数時間くらい）(Fig. 5)．ユニ
バーサル蛍光プライマーのアニーリング温度が 59℃ですので，それを大きく異なる温度設定にはしないでください．

Fig. 5 pipe3 解析画面の様子⑩	  解析が終了したら，ファイル「Table with primer」をクリックし，次いでフロッピーマークをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください．ホーム内のダウンロードフォルダに保存されます．ダウンロードされたファイルをホスト側に移動させ，エクセルで開きます．各行が設計されたプライマーと，それに関する情報を表しています．

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Workflow 機能を利用した解析
上記では pipe ごとに解析を実行しましたが，下図のような Workflow 機能を使えば，一度に全ての変数を設定し，解析を実行することができるため非常に楽です． (Fig. 6)．

Fig. 6 ワークフロー機能を利用した解析⑪ Workflow の管理画面に移ります．ブラウザの上方にある Workflow をクリックします．
⑫ Create new workflow をクリックします．workflow name を記入し，createをクリックします．すると管理画面に作成した workflow が追加されます．
⑬ workflow の内容作成画面に移ります．作成した workflow に表示されている下向き三角をクリックし，edit を選択します．
⑭ workflow を作成します．左端の Tools に，Galaxy に含まれるプログラム群が表示されています．workflow 機能ではこれらの解析を予め繋ぎ，変数を設定します．このことで，スタートボタンを押すだけで解析が完了します．まず Tools 内の QDD をクリックし，続いて QDD_pipe1 をクリックします．画
面中央には QDD_pipe1 の input file と out file の内容が表示されます．右端には，QDD_pipe1 で設定する変数とその変数の説明が表示されます．”Input
sequences are already assembled”は，今回はすでにアセンブルされているデータを用いますので，yes を選択してください．
⑮ QDD_pipe2 をクリックします．すると，同じように QDD_pipe2 が表示されます．QDD_pipe1 の out putfile のうち，”file_msfas”を pipe2 渡しますので，”file_msfas”の右端矢印をつかみ，pipe2 の”Sequences with microsatellites

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(Output of pipe1)”の左端の矢印に持って行きます．今回のデータはすでにアセンブルされていますので，”Make consensus sequences?”は No を選択します．
⑯ QDD_pipe3 を ク リ ッ ク し ま す ． さ き ほ ど と 同 様 に ， QDD_pipe2の”file_pipe3_inp”の矢印を QDD_pipe3 の”Input fasta file”に接続します．
QDD_pipe3 の変数はプライマー設計に関するものになります．各自設定ください．
⑯ この workflow を保存します．右上の歯車マークをクリックし，save を選択します．
⑰ 解析を開始します．同じ歯車マークの中の Run を選択します．次に表示された画面で，Input fasta file で解析したいファイルを選択します．最後に Run
workflow をクリックすると解析が開始されます．

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C．優良プライマーの選別と Multiplex 系の構築
QDD で作成された候補プライマーは大量です．その中から優良なプライマーを選別し，Multiplex 系を構築できるような組み合わせを抽出する必要があります．選別の方法は一つではありませんが，今回はその一つの考え方と実際の手順を説明します．他にも QDD の HP にある”How to choose primers from the primer table.”も参考にしてください．

①	  STR 領域が単純なものを選別します．QDD は領域の複雑さごとに，A〜G までのランク分けを行います．今回候補は大量にあるはずなので，けちらずに単純で解析しやすい領域だけを抽出します．もっとも単純なのはランク A です（詳しくはマニュアル p.39 を参照）．Excel のフィルター機能で「Design」の列を並べ替えて，A ランクのものだけをコピーし，新しいシートにペーストしてください (Fig. 7)．フィ
ルター機能で要らない行を隠しても大丈夫です．

Fig. 7 シートを増やしながらソートしていきます．

②	  すでに一定以上のリピートが確認されているものを選びます．あまりにリピート数が 短 い も の は ， 多 型 性 が な い 可 能 性 が あ る か ら で す ．
「TARGET̲MS̲LENGTH̲IN̲REPEAT̲NUMBER」を並べ替えて，一定以上のリピート数が確認されたプライマーデザインだけをコピーし次のシートにコピーしま
しょう．参考に，筆者は 9 回以上のものを選びました．
③	  STR 領域に近すぎる位置に設計されたプライマーはあまり使いたくないので，それらを排除します．「MIN̲PRIMER̲TARGET̲DIST」は STR 領域と設定されたプラ
イマー領域の間の距離を表しています．これが一定以上のものだけ選択し，新しいシートに移します．参考に筆者は 6bp 以上離れたものを選択して以降の解析に回しました．
④	  各 STR 領 域 に つ い て 最 も 優 良 な プ ラ イ マ ー を 選 択 し ま す ．
「ONE̲PRIMER̲FOR̲EACH̲SEQ」が「1」のプライマーは，計算上ではそのリードに対してもっとも上手く設計されたプライマーとなります．この列が１のものだけを選択し，次のシートにコピーしてください．

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⑤	  ここで，マルチプレックス系の構築について一度考えます．4 色の蛍光を使えるのであれば，大体 12 領域程をマルチプレックスできます．100bp 付近，200bp 付近，300bp 付近にそれぞれ 4 領域，といった具合です．残った候補プライマーを「PCR̲PRODUCT̲SIZE」順に並べ，このようなマルチプレックス系が何個組めそうか考えます．そして必要予定数に到達していれば，そのままマルチプレックスを実際に組みます．必要予定数のプライマーが残っていなければ，今までのソートの過程を緩めてもう一度ソートし直すか，ピンポイントで欲しいプライマー（例えば，AC 以外のリピート領域など）を選び出してきます．
⑥	  実際にマルチプレックス系を組みます．多型の範囲を「PCR̲PRODUCT̲SIZE」の50bp 以内と見積もり，同じ蛍光を付ける予定のもの同士で「PCR̲PRODUCT̲SIZE50bp」が重複しないように設計します．
「PCR̲PRODUCT̲SIZE」の前に新しく 2つの列を追加し，それぞれ「PCR̲PRODUCT̲SIZE」に 50 足した値と引いた値を入力します．この 3 つの列を選択し，Excel の株価グラフを作成します (Fig. 8)．
このグラフを確認しながら，どのプライマーにどの色をつけるか，また産物範囲がかぶった場合は他の候補と入れ替えながらマルチプレックスの組み合わせを考えていきます．scaffold 上の領域は連鎖しているため，同じ scaffold からは 1 つの STR領域のみを選ぶようにしてください．
450
400350300+50250-50200

PCR_PRODUCT_SIZE

150100500Fig. 8 株価グラフで書いたマルチプレックス設計図．+50bp を高値，-50bp を安値，12

product size を終値として指定し，グラフを作成する．

⑦	  各プライマー配列の forward 側にユニバーサル蛍光プライマー用の配列（Blacketet al., 2012）を，reverse 側に PIG-tailing （GTTTCTT）を付加し，マルチプレックス可能かどうかを再度確認します．ここでは MultiplexManager （Holleleyand Geert, 2009）というソフトを使用し，アニーリング温度，１マルチプレックス内でのプライマーの組み合わせの善し悪しなどを確認します．
MultiplexManager は web ページよりダウンロード，ウィザードに従ってインストールしてください．MultiplexManager 用のインプットファイルを作成します．
MultiplexManager を起動し，表示された項目について新しい Excel シートに作成していきます． 「Chromosome」は１，「Genetic location」「Heterozygosity」は０，Number of Alleles は１，「Annealing Temperature」は空白とし，「ForwardSequence」はユニバーサル蛍光プライマーの配列を加えたものとしてください．
⑧	  作成した Excel シートを csv 形式で保存し，MultiplexManager に読み込ませます．
読み込みが成功したら，Utilities の「Calculate All Annealing Temperatures」を選択し，アニーリング温度を計算します．次に 「Dyes and Option」を選択し，各プライマーの蛍光を選択します．最後に「Analyse Multiplex」を選択し，解析を開始します．
⑨	  解析結果について，アニーリング温度が極端に違わないこと，同じ色のプライマー同士で重複する領域がないこと，プライマー同士が結合しにくいことなどを確認してください (Fig. 9).

Fig. 9 このような結果が出てきます．

以上で解析は終了になります．あとはプライマーを注文するだけです．お疲れ様でした．

補足
今回のマルチプレックス系の構築方法はかなり大雑把な方法です．各マルチプレック
スで 12 個すべてが使えることはあまりないと思いますし，解析を始めてから蛍光が重複する場合が出てくる可能性もあります．時間をかけてもいいので，より丁寧で解析し13

やすいマルチプレックス系を構築したい場合は Guichoux et al. (2011)や，陶山 (2012)を参考にしてください．

引用文献
Blacket, M.J., Robin, C., Good, R.T., Lee, S.F., Miller, A.D., 2012. Universal primers forfluorescent labeling of PCR fragment–an efficient and cost–effective approach togenotyping by fluorescence. Mol. Ecol. Resour. 12, 456-463.
Guichoux, E., Lagache, L., Wagner, S., Chaumeil, P., Leger, P., Lepais, O., Lepoittevin,C., Malausa, T., Revardel, E., Salin, F., Petit, R.J., 2011. Current trends inmicrosatellite genotyping Mol. Ecol. Resour. 11, 591-611.
Holleley, C.E., Geerts, P.G., 2009. Multiplex Manager 1.0: acrossplatform computer
program that plans and optimizes multiplex PCR. Bio Techniques, 46, 511-517.
Kenta, T., Gratten, J., Haigh, N.S., Hinten, G.N., Slate, J., Butlin, R.K., Burke, T., 2008.
Multiplex SNP-SCALE: a cost-effective medium-throughput single nucleotide
polymorphism genotyping method. Mol Ecol. Resour. 8, 1230-1238.
Meglécz, E. Costedoat, C., Dubut, V., Gilles, A., Malausa, T., Pech, N. and Martin J-F.
2010. QDD: a user-friendly program to select microsatellite markers anddesignprimers from large sequencing projects. Bioinformatics, 26(3) 403–404.
Meglécz, E., Pech, N., Gilles, A., Dubut, V., Hingamp, P., Trilles, A., Grenier, R. andMartin, JF. 2014. QDD version 3.1: A user friendly computer program for
microsatellite selection and primer design revisited: experimental validation ofvariables

determining

genotyping

successrate.

Mol.

Ecol.

Resour.

doi:

10.1111/1755-0998.12271.
陶山佳久, 2012.

SSR ジェノタイピング手法. in: 津村義彦，陶山佳久（編）森の分子

生態学２，文一総合出版，東京，pp.291-323

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