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助成番号 １６０９５５
研 究 成 果 報 告 書（国立情報学研究所の民間助成研究成果概要データベース・登録原稿）
研究テーマ（和文） ＡＢ

S-アデノシルメチオニンのイメージング法の開発とメチル化制御解析への応用

研究テーマ（欧文） ＡＺ

Development of FRET-based biosensor for the detection of S-adenosyl methionine

研究氏
代表名
者

ｶﾀｶﾅ ＣＣ

ニシカワケイゾウ

研究期間 Ｂ

2016 ～ 2017 年

漢字 ＣＢ

西川恵三

報告年度 ＹR

2017 年

Keizo

研究機関名

大阪大学

ﾛｰﾏ字 ＣＺ Nishikawa

研究代表者 ＣＤ
所属機関・職名

大阪大学免疫学フロンティア研究センター・特任准教授

概要 ＥＡ (600 字～800 字程度にまとめてください。)
本 研 究 では 、骨 代 謝 を担 う破 骨 細 胞 の 分 化 調 節 因 子 であ る S-アデ ノシルメチオニン (SAM)の 蛍 光 可視 化 法 の開 発 に取 り組 んだ。近 年 、 SAM の蛍 光 可 視 化 手 段 として、 R NA アプタマーの有 用 性 が報 告された( Science 2012) 。しかし、当 該 論 文 の方 法 では破 骨 細 胞 内 の S AM を検 出 するには感 度 が低 い
こ と を 確 認 し て い る 。 そ こ で 、 R NA ア プ タ マ ー の 代 替 手 段 と し て 、 Fluorescent resonance energytransfer(FRET)の原理を利用した SAM に対するバイオセンサーの作製に取り組んだ。まず最初に、SAM のセンサー領域の選別を試みた。結晶構造が報告されている SAM 結合ドメインのなかで、SAM 結合依存的に構造が大きく変化することが予想される細菌並びにヒト由来の SAM 結合ドメイン 2 種を選出した。次に、SAM 結合ドメインの両側に、Cyan fluorescent protein の改良タンパク質と yellow fluorescent protein (YFP)の改良蛍光タン
パク質 Venus を接続することで FRET センサープロトタイプの cDNA を構築した。当該 cDNA を導入した大腸菌の発現ベクターを構築し、得られた組み換え蛋白質を用いて、SAM 添加に伴う FRET シグナルの変化を検討した。その結果、ヒト由来に比べて、細菌由来の SAM 結合ドメインをもつプロトタイプでは、SAM の濃度に応じた FRET シグナルの増加が観察された(ダイナミックレンジ 24.9％)。続いて、SAM センサープロトタイプの応答性を改善するために、(1)リンカー配列の改変、(2)蛍光蛋白質の円順列変異体の利用、(3)SAM 結合ドメインの点変異導入によって約200 種類のプロトタイプを作製した。その結果、高感度型 SAM センサーの作製に成功した(ダイナミックレンジ52.8％)。

キーワード ＦＡSAM

破骨細胞

細胞内代謝（以下は記入しないでください。）
助成財団ｺｰﾄﾞ ＴＡ

研究課題番号 ＡＡ

研究機関番号 ＡＣシート番号- 1 -イメージング

発表文献（この研究を発表した雑誌・図書について記入してください。）
論文標題ＧＢ
雑誌

著者名 ＧＡ
ページ ＧＦ

雑誌名 ＧＣ～発行年 ＧＥ

巻号 ＧＤ

論文標題ＧＢ
雑誌

著者名 ＧＡ
ページ ＧＦ

雑誌名 ＧＣ～発行年 ＧＥ

巻号 ＧＤ

論文標題ＧＢ
雑誌

著者名 ＧＡ

雑誌名 ＧＣ

ページ ＧＦ～発行年 ＧＥ

巻号 ＧＤ

著者名 ＨＡ

西川恵三

書名 ＨＣ

マクロファージのすべて(松島綱治

図書

出版者 ＨＢ発行年 ＨＤ2016

総ﾍﾟｰｼﾞ ＨＥ268

著者名 ＨＡ

Kikuta J, Nishikawa K and Ishii M

書名 ＨＣ

Chronic Inflammation: Mechanisms and Regulation (Masahiro Miyawaki and Kiyoshi

図書医歯薬出版編集)

出版者 ＨＢ

Takatsu edition)
Springer

発行年 ＨＤ2016

総ﾍﾟｰｼﾞ ＨＥ702

欧文概要 ＥＺIn this study, I attempted to develop fluorescence imaging probe for S-adenosyl methionine (SAM), which is a key
metabolite in the regulation of osteoclasts. Recently, it has been shown that RNA aptamer is useful for detecting
SAM in bacteria (Science 2012). However, I could not visualize endogenous SAM in osteoclast using RNA aptamer
method. Alternatively, I tried to develop FRET-based biosensor for the detection of SAM. First of all, I attempted toscreen for SAM binding domains. Based on the crystal structure of SAM binding proteins, I focused on bacteria- andhuman-derived SAM binding domains whose structure is predicted to change in response to SAM. Next, FRET
sensor prototype was constructed by fusing mseCFP11 and Venus to both ends of the SAM binding domains. The
prototype carrying bacteria-derived SAM binding domain was moderate with a sensitivity of dynamic rage, 24.9%,
while the prototype carrying SAM binding domain derived from human has poor dynamic range. I further
improved sensitivity and specificity of bacteria-based prototype by (1) modification of linker sequence, (2) use of
circular permutation mutant of fluorescent protein, and (3) introduction of point mutation of SAM binding domain.
As a result, I have succeeded in developing a highly sensitive and specific FRET-based biosensor for the detection ofSAM (dynamic range, 52.8%).

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