はじめに

XDR-200 システムは、Xcellerex バイオリアクタープラットフォームの一つであり、システムプラットフォームは10 〜 2,000 L の最大培養液量に対応しています。このプラットフォームは、GMP 製造環境の要求を満たすために開発されたモジュール式の Ready-to-use のバイオリアク

ターフォーマットで、シングルユース技術と撹拌槽設計に優れています。

ReadyToProcess WAVE 25 ロッキング式バイオリアクター

システムは、迅速に設置でき、簡便に取り扱えるよう設計されており、最大 25 L のスケールで正確な性能を発揮します。このシステムは、プロセス開発、研究開発、シードトレイン、小規模生産に適しています。

生産段階

このアプリケーションノートでは、シングルユース撹拌式の Xcellerex XDR-200 とロッキング式の ReadyToProcess
WAVE 25 バイオリアクターシステムを使用したフェドバッチ培養プロセスでモノクローナル抗体（MAb）を産生する手法を紹介します。200 L の撹拌式バイオリアクターに播種するために、15 L のロッキング式バイオリアクターを使用して細胞を増殖させました。WAVE 25 の性能とXDR-200 の性能を比較するために、200 L 培養液から 7 Lを並列させた WAVE 25 に移して、総培養液量を 10 L にしました。XDR-200 および WAVE 25 での MAb 収量はそれぞれ 5.0 g/L、4.9 g/L でした。両バイオリアクター培養において代謝物のプロファイルは非常に類似していました。
ReadyToProcess WAVE 25 および Xcellerex XDR バイオリ
アクターシステムは共に、シングルユースフォーマットにおいて組換えタンパク質産生のために堅牢で拡張性の高いソリューションを提供します。さらに、WAVE 25 はシードトレインとプロセス開発との両方に使用できる汎用性の高いツールです。

種培養段階

シングルユース撹拌式およびロッキング式
バイオリアクターシステムを用いた
フェドバッチ培養での効率的で高力価のモノクローナル抗体産生

図1. 標準的な方法を用いて凍結細胞を融解しました。はじめに振とうフラスコで細胞培養を行ったあと、WAVE 25で最終種培養液量が15 Lになるまで培養しました。続いて種培養液をMAb産生用のXDR-200に移しました。XDR-200培養液の一部をWAVE 25に移し、バイオリアクター培養間でのMAb産生を比較しました。

このアプリケーションノートでは、WAVE 25 をシードトレインバイオリアクターとして使用し、ActiCHO で培養した CHO DG44 細胞株を使用して、MAb 産生における XDR200 と WAVE 25 との性能を比較します。実験手順を図 1に示しています。

材料および方法

凍結保存された細胞の融解と種培養

CHO DG44 細 胞（licensed from Cellca GmbH, Laupheim,Germany）を標準プロトコールに従って凍結保存から融解し、3 〜 4 日ごとに継代培養しました。播種した細胞を増殖させるために、WAVE 25 を、表 1 に示した操作パラメー

ターおよび条件で使用しました。バイオリアクターを用いて最初に 2.6 L で、3 日後に新たな培地の添加により 15L での 2 段階で拡大培養をしました。

Application note, 71-3948-12

表1. 種培養時のWAVE 25の操作パラメーターおよび条件

MediumCulture chamber
Rocking
Low-volume stage
Full-volume stage
Gas flow
Seed cell concentration
pH set point
Low-volume stage

ActiCHO P with 6 mM L-glutamine
50 L Cellbag bioreactor
20 rpm, 6 rocking angle
20 rpm, 8 rocking angle
0.3 L/min
0.3 106 viable cells/mL

No pH control(initial 7.5% CO2 in headspace)
Full-volume stage
pH controlled at 7.0 with CO2
Dissolved oxygen (DO) set point
40%Working volume
2.6 L for initial 3 d in shaker flasks,15 L to target cell concentration in
ReadyToProcess WAVE 25
Target cell concentration at transfer3.5 to 4.5 106 viable cells/mL
Viability criteria at transfer> 95%

生産段階の細胞培養

ぺ リ ス タ リ ッ ク ポ ン プ（600 シ リ ー ズ ポ ン プ、WatsonMarlow）を使用して、15 L の種培養液全量を WAVE 25 から XDR-200 に無菌的に移しました。総容量 145 L まで培地を満たした後、培養液 7 L を WAVE 25 に移し、比較用のMAb 産生バイオリアクターとして稼働させました。Mab
産生用バイオリアクターの操作パラメーターおよび条件を表 2 に示しています。

表2. 生産段階時のXDR-200およびWAVE 25の操作パラメーターおよび条件Medium
Culture chamberStarting viable cell concentrationInoculum volume
Medium fill volume
Starting operating volume
Impeller/rocker speed
pH set point
pH PID* settings

Base for pH control
DO set point
DO PID* settings

Air gassing

Oxygen flow

Antifoam
Feeds

Feed starting point
Daily feed volumes

Harvest criteria

XDR-200
ActiCHO P with 6 mM L-glutamineStandard bag assembly: Development
0.35 to 0.45 106 viable cells/mL
15 L
130 L
145 L
138 L after transfer to satellite bioreactor
150 rpm
20 to 30 rpm, 8 rocking angle, 30% rocking motion
7.1
7.1
P: 0.5
Factory settings(automatically computed by the system)I: 1.0
D: 0
7.5% w/v NaHCO3
7.5% w/v NaHCO340%40%
P: 0.254
Factory settings(automatically computed by the system)
I: 4.083
D: 02 L/min head-space gassing
On demand (from DO and pH control)
DO-controlled gassing administered
0.2 L/min total gas flow
through 1 mm sparger
Controller output: 0% to 20%: 1 to 5 L/min (sparged)
20% to 100%: 5 L/min (sparged)
On demand (from DO PID control)
On demand (from DO PID control) max. 50%
administered through 20 µm sparger
0.2 L/min total gas flow
Controller output: 0% to 20%: 0 L/min
20% to 100%: 0 to 5 L/min (sparged)
Medical antifoam C (Sigma-Aldrich)
Medical antifoam C (Sigma-Aldrich)(added as required)(added as required)
ActiCHO Feed-A
ActiCHO Feed-A
ActiCHO Feed-B
ActiCHO Feed-B
400 g/L D-glucose
400 g/L D-glucose
Day 2
Day 2
ActiCHO Feed-A: 5.915 L
ActiCHO Feed-A: 0.295 L
ActiCHO Feed-B: 0.592 L
ActiCHO Feed-B: 0.0295 L
Glucose: as required with target of 6 g/L
Glucose: as required with target of 6 g/L
excluding ActiCHO Feed-A
excluding ActiCHO Feed-A
13 elapsed days and/or when culture
13 elapsed days and/or when culture
viability was < 60%
viability was < 60%* PID＝Proportional-integral-derivative（P：比例、I：積分、D：微分）

271-3948-12

WAVE 25
ActiCHO P with 6 mM L-glutamine
20 L Cellbag bioreactor with DO and pH sensors
0.35 to 0.45 106 viable cells/mL
7.0 L transferred from XDR-200
N/A
7.0 L

18120用いた分析方法を表 3 に示しています。

Type of sample
Cell suspension
Cell suspension
Cell suspension
Cell suspension
Cell suspension
Cell suspension
Cell suspension
Clarifiedcell culture
supernatantDissolved oxygen (%)

表 3. 分析方法

Measured
Assay typeparameter
Cell concentration Bioprofile FLEX analyzer
and viability(Nova Biomedical Corp.)
GlucoseBioprofile FLEX analyzer
LactateBioprofile FLEX analyzer
Ammonium
Bioprofile FLEX analyzer
Glutamine
Bioprofile FLEX analyzer
Glutamate
Bioprofile FLEX analyzer
Osmolality
Bioprofile FLEX analyzer
Product
CEDEX Bio analyzer
concentration(Roche)16100

141280

1060

840

64200

Culture weight (kg)

分析方法20244872960120Time (h)図3. WAVE 25の種培養液量と溶存酸素（DO）のオンライン測定値。

7.57.47.37.2

結果と考察

pH7.1

種培養段階の細胞増殖

7.0
6.93602401200024487296

Viability (%)

Viable cell concentration (106 cells/mL)

6.8
融解後の CHO DG44 細胞株を、振とうフラスコで拡大培
6.7養させ、培養液を WAVE 25 の 50 L Cellbag に移しました。
6.6
バイオリアクターを 7.5% CO2 混合空気で膨張させ、総容66.5
量 2.56 L 中、細胞密度 0.3 10 cells/mL で播種しました。
024487296120
約 72 時 間 後、ReadyToProcess Pump 25 と WAVE 25 のTime (h)フィード添加 機能を利用して、培地をポンプ添加し、培養 図4. 種培養時のWAVE 25のオンラインpH測定値。オフラインキャリブレーシ
ョンは約96時間時点で行われ、96時間以前の実際のpHは、測定された液を 15 L に増量しました。ガスおよび pH 制御は、設定点pHよりも約0.1 pH高いことを示しました。
7.0（塩基制御なし）で開始しました。細胞増殖および生存率を図 2 に示しています。バイオリアクターの重量、DO、pH のオンライン測定値を図 3 および 4 に示しています。 XDR-200 バイオリアクター培養
さらに 48 時間後、種培養液全量を生細胞密度 3.25 106 播種の 1 日前に、XDR-200 を 130 L の生産培地で満たし、cells/mL で XDR-200 に移しました。
37℃、pH 7.1 に平衡化させました。このバイオリアクターに、WAVE 25 の種培養液全量（15 L）を最終細胞密度が 0.381005106 cells/mL になるまで播種しました。播種後の XDR200 中の容量は 145 L であり、種培養液の約 10 倍に拡大804しました。

平衡化後、培養液 7 L を XDR-200 から WAVE 25 に移すことで、138 L を XDR-200 で培養しましました。連日のフィード添加後、回収時の最終液量は XDR-200 では約 200 L、WAVE 25 では約 10 L でした。

0120Time (h)図2. WAVE 25における種培養の細胞増殖と生存率。培養容量が72時間で2.56 Lから15 Lに増えました。

71-3948-123

表 4 および図 5 に示すように、両培養液は、3 段階の特徴的な増殖期をもつ非常に類似した増殖曲線を示しました。
すなわち、最初の約 72 時間の初期急速増殖期、それに続くよりゆるやかな増殖期、そして約 144 時間後から回収までの生存率低下を伴う増殖停止および死滅期がありました。65.3 〜 73.0% の生存率で培養液を回収しました。両培養液は類似した生産性を示しました（図 6 および表 4）。

2.51009025802.01.51.07020601550401030100244872096 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336Time (h)図5. 生産培養液中の生細胞密度と生存率の比較。両培養液が類似した増殖および生存率曲線を示しました。測定用の各サンプルはフィード直前に回収しました。
XDR-200

WAVE 25 satellite

6543210244872960.50024487296120 144 168 192 216 240 264 288 312 336Time (h)図7. 生産培養における乳酸濃度の比較。測定用の各サンプルはフィード直前および直後に回収しました。

2050

Product concentration (g/L)

WAVE 25 satellite

3.0Lactate (g/L)

300

XDR-200

WAVE 25 satellite
WAVE 25 satellite, viability

Viability (%)

Viable cell concentration (106 cells/mL)

XDR-200
XDR-200, viability

両培養液において、乳酸濃度は培養初期の指数増殖期に急速な増加を示し、その後よりゆるやかな増殖期で減少し、そして最大生細胞密度に達した後、採取するまで一定の低い濃度を示しました（図 7）。

120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

Time (h)両培養液のアンモニウム濃度曲線を示しました（図 8）。
アンモニウム濃度は、培養初期の約 48 時間に急速な増加を示し、その後、培養約 120 時間まで徐々に減少した後、回収するまでに再び増加しました。培養中の異なる時点でのアンモニウム産生および消費の変動は、グルタミン合成酵素活性に関連するとともに、細胞周期中のグルタミンや他のアミノ酸のさまざまな代謝速度にも関連しています。たとえば、乳酸生成速度が低下してグルタミン生成速度が上昇する約 72 時間の時点では、明らかな代謝のシフトが見られます。この時点では、高レベルの解糖と高いグルタミン消費を伴う速い成長速度から、トリカルボン酸（TCA）サイクルにおけるより低い成長速度でより高いエネルギー産生へ細胞がシフトします。グルタミンはグルタミン合成酵素によってグルタミン酸とアンモニウムから生成されるので、図 9 および 10 にも反映されるように、これらの 3 つの化合物は密接に関連しています。グルタミン酸がフィード培地中で供給される一方で、グルタミンはベース培地でのみ供給されました。

図6. 生産培養におけるMAb濃度の比較。測定用の各サンプルはフィード直前に回収しました。
表4. バイオリアクターによるMAb産生培養からの結果

培養方法（スケール）

XDR-200
WAVE 25 satellite

471-3948-12

培養液中最大生細胞数（106 cells/mL）

回収細胞生存率（%）

回収抗体産生濃度（g/L）

細胞特異的生成物体積（pg/細胞/d）23.722.765.373.05.04.92728

XDR-200

WAVE 25 satellite

14Ammonium (mM)

121086

各フィード培地添加の前後で浸透圧を測定しました。主にアミノ酸濃度の増加に起因するため、各フィード培地添加によって浸透圧が増加しました（図 11）。アミノ酸が消費されるにつれて、浸透圧も低下しました。しかし、フィード培地および pH 調製において塩類も供給されるので、培養中の浸透圧は徐々に増加しました。さらに、消費されていない栄養素も浸透圧の増加に影響します。

4XDR-20020244872450

96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

Time (h)図8. 生産培養におけるアンモニウム濃度の比較。測定用の各サンプルはフィード直前および直後に回収しました。
XDR-200

WAVE 25 satellite

1.4

Osmolality (mOsm/kg)

0Glutamate (g/L)

WAVE 25 satellite

5004003503001.22501.020000.824487296 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

Time (h)図11. 生産培養における浸透圧の比較。
測定用の各サンプルはフィード直前および直後に回収しました。

0.60.40.200244872

96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

Time (h)図9.生産培養におけるグルタミン酸濃度の比較。測定用の各サンプルはフィード直前および直後に回収しました。

培養中の二酸化炭素圧（pCO2）曲線を図 12 に示しています。乳酸が培養初期に産生されると、pCO2 は減少して pHを維持し、逆にフィード培地と炭酸水素ナトリウムが追加されると、乳酸濃度が低下し pCO2 は増加します。
XDR-200

WAVE 25 satellite

XDR-2000.9

WAVE 25 satellite

0.8

Glutamine (g/L)

0.70.60.50.40.3

Partial dioxide pressure (kPa)

302520151050.200.100024487296 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

Time (h)24487296 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336

Time (h)図12. 生産培養における培養液中の二酸化炭素圧の比較。

図10.生産培養におけるグルタミン濃度の比較。

71-3948-125

結論

本結果は、種培養とプロセス開発の両方の目的に WAVE25 を使用できることを示しています。また、生産培養の比較結果より、WAVE 25 と XDR-200 は同等であることが示されました。 両方のバイオリアクターでの培養では、類似した細胞増殖および生存率、代謝産物含量、MAb 生産性を示し、XDR-200 および WAVE 25 において収量はそれぞれ 5.0 g/L、4.9 g/L でした。リアクターの幾何学的形状は異なりますが、WAVE 25 での培養結果は、XDR-200 を使用したより大スケールな培養プロセスを反映するものでした。結論として、ReadyToProcess WAVE 25 と Xcellerex
バイオリアクターシステムの組合せは、最大 2,000 L ス
ケールまでの組換えタンパク質産生における信頼性と拡張性の高いソリューションとなります。

注文情報
Product
ReadyToProcess WAVE 25, rocker
ReadyToProcess CBCU Full
ReadyToProcess Pump 25
Tray 50
Lid 50UNICORN 6.3.2 WrkStn-pure-BP
Cellbag 20 L
Cellbag 50 L

Code number
28-9880-00
29-0440-81
29-0320-03
29-0444-74
29-0444-77
29-0469-18
29-0152-14
29-0152-16

Standard bag assembly: Development

29-0410-66

ActiCHO Level 1 CD Pwd Kit

29-0925-41

Related literature
ReadyToProcess WAVE 25, data file
Disposable Cellbag bioreactors forWAVE Bioreactor systems, data file
Xcellerex XDR cell culture bioreactor systems,
data file
UNICORN 6 control software, data file

Code number
29-0566-95
28-9511-36
29-0929-25
28-9573-46

For more information on the XDR-200 bioreactor system, please contact your local sales
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