厚生労働科学研究費補助金（難治性疾患克服研究事業）	 分担研究報告書	 	 
FOP の治療を目指した BMP シグナル抑制機構の解析に関する研究	 	 

研究分担者	  片桐岳信	  埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門	  教授研究協力者	  大手	  聡	  埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門	  助教	 
研究要旨	  進行性骨化性線維異形成症（FOP）は、骨形成を促す受容体 ALK2 の構成的活性型変異によると考えられる。BMP の細胞内情報伝達系を抑制する分子として、受容体がリン酸化する転写因子 Smad の脱リン酸化反応を触媒すると考えられている SCP1 の作用機序を解析した。SCP1 の標的は Smad の下流因子であり、本因子は FOP の治療を目指した新しい標的分子になる可能性が示唆された。	 	 
Ａ．	  研究目的	 
進 行 性 骨 化 性 線 維 異 形 成 症

処 理 の 他 に 、 構 成 的 活 性 型 BMP 受 容 体(BMPR-IAca)、構成的活性型転写因子 Smad1	 (Fibrodysplasia	 ossificans	 progressiva,	  (Smad1(DVD))の過剰発現を行った。BMP シFOP)は、主に筋組織の中で異所性骨化が進

グナルは、骨芽細胞の分化マーカーとして行する遺伝性疾患で、2006 年、２番染色体上アルカリホスファターゼ(ALP)活性、BMP 初の BMP 受容体をコードする ACVR1/ALK2 が期応答遺伝子の Smad 結合配列を含むルシ責任遺伝子として同定された。これまでに我々

フェラーゼレポーターアッセイで定量化しは、国内 FOP 症例の 1 例を除く全ての症例がた。さらに、Smad のリン酸化レベルや目的ALK2 タンパク質の 206Arg が His 残基に変異タンパク質の細胞内局在は、ウエスタンブした典型的変異を有することを報告し、さらに、ロット法や免疫染色法で検出した。	 

この変異体がリガンド非依存的に細胞内情報（倫理面での配慮）	 伝達系を活性化する構成的活性型であることなし。	 

を明らかにした。そこで本研究では、FOP の治	 療法への応用を目指して、BMP 活性を阻害す

Ｃ．研究結果	 るシグナルとして、ALK2 がリン酸化する転写因マウス SCP1	 mRNA の発現量は、検討した子の脱リン酸化反応を触媒することが報告され臓器の中で特に骨格筋が高かった（図１A）。

たホスファターゼ SCP1 の作用機序を解析した。 C2C12 における SCP1 タンパク質は、細胞質内の核周囲に局在した（図１B)。	 
Ｂ．研究方法	 
マウス SCP1 の発現は、各臓器から調整した cDNA を用いてリアルタイム PCR 法で定量化 し た 。 SCP1	  cDNA は 、 マ ウ ス 筋 芽 細 胞
C2C12 からクローニングし、発現ベクターを構築した。C2C12 細胞の BMP シグナルを活性化するために、リコンビナント BMP-4	 
Ｄ．考察	 

従来の報告のように、SCP1 は BMP-4 処理、 （図 3B）。	 
または構成的活性型 BMP 受容体によって誘	 導される ALP 活性を抑制した(図 2A、未発

これまでに我々は、別の Smad ホスファ表)。この SCP1 による BMP シグナルの抑制

ターゼである PPM1A が、Smad の分解を促し活性は、C2C12 細胞のみならず初代培養骨て BMP-4 活性を抑制することを報告した。

芽細胞でも認められた（図 2B）。	 

そこで、SCP1 の Smad レベルに対する作用をウエスタンブロット法で解析した。すると、SCP1 は PPM1A とは異なり、Smad1 のタンパクレベルを減少させないことが判明した(図４)。	 	 
SCP1 による BMP の抑制作用が Smad の脱リン酸化によるか否かを検討するために、
我 々 が 樹 立 し た 構 成 的 活 性 型 Smad1	 (Smad1(DVD))に対する効果を検討した。この Smad1 は、末端のアミノ酸置換により活	 性化状態のリン酸化 Smad と同様の構造を取SCP1 と PPM1A の作用を比較するため、り、リン酸化を受けなくとも BMP 活性を示

Smad1 の標的遺伝子である Id1 プロモーす。図 3A に示すように、SCP1 はこの構成ター・エンハンサーを組み込んだ瑠ルシ的活性型 Smad1 の活性も抑制した。	 

フェラーゼレポーターに対する作用を検討した。すると、PPM1A は構成的活性型 BMP受容体や構成的活性型 Smad1 が誘導するレポーター活性を抑制したのに対し、SCP1 はこれらの活性を殆ど抑制しなかった(図５）。	 

さらに、SCP1 の抑制作用が Smad1 のリンカー領域の脱リン酸化作用を介したものであるか否かを検討するために、Smad1(DVD)のリンカー領域内の 4 カ所のリン酸化部位に変異を導入した Smad1(MAPK-DVD)変異体への効果を検討した。その結果、SCP1 はこ	 のリンカー領域のリン酸化部位を持たないSCP1 の作用機序を明らかにするため、変異体の活性も抑制することが判明した

BMP シグナルによる骨芽細胞分化の中で、Smad のさらに下流で働く転写因子 Runx2 にMurata	 E,	 Kanomata	 K,	 Nojima	 J,	 Ono	 Y,	 対する SCP1 の作用を検討した。すると、

Yoda	  T,	  Fukuda	  T,	  and	  Katagiri	  T.	 

SCP1 は、Runx2 が誘導する ALP やオステオ(2011)	  Suppression	  of	  BMP-Smad	  axis-カルシンの発現も抑制することが判明した

induced	  osteoblastic	  differentiation	 (図６）。	 

by	 

small	 

C-terminal	 

domain	 phosphatase	  1,	  a	  Smad	  phosphatase.	 

Molec	 Endocrinol, 	 in	 press.	 	 
２）Ono	 Y,	 Calbaheu	 F,	 Morgan	 JE,	 
Katagiri	 T,	 Amthor	 H,	 and	 Zammit	 PS.	 
(2011)	 BMP	 signaling	 permits	 	 	 Ｅ．結論	 
以上のように、ホスファターゼの 1 種でpopulation	 expansion	 by	 preventing	 
premature	 myogenic	 differentiation	 in	 muscle	 satellite	 cells.	 Cell	 Death	 Differ ,	 in	 press.	 

ある SCP1 は、BMP 受容体の活性化による骨	 芽細胞分化を抑制した。しかし、この作用

３）Tokuzawa	 Y,	 Yagi	 K,	 Yamashita	 Y,	 

機序は、受容体によってリン酸化される

Nakachi	 Y,	 Nikaido	 I,	 Bono	 H,	 Smad の 脱 リ ン 酸 化 を 促 す の で は な く 、Ninomiya	 Y,	 Kanesaki-Yatsuka	 Y,	 Akita	 

Runx2 またはさらに下流で骨芽細胞分化にM,	 Motegi	 H,	 Wakana	 S,	 Noda	 T,	 働く転写因子を標的とすることが判明した。

Sablitzky	 F,	 Arai	 S,	 Kurokawa	 R,	 

これは、従来の仮説であるホスファターゼ

Fukuda	 T,	 Katagiri	 T,	 Schonbach	 C,	 が Smad の脱リン酸化によって BMP 活性を阻

Suda	 T,	 Mizuno	 Y,	 and	 Okazaki	 Y.	 

害することを否定すると共に、BMP シグナ(2010)	 Id4,	 a	 new	 candidate	 gene	 for	 

ルによって誘導される骨芽細胞分化におけsenile	 osteoporosis	 acts	 as	 a	 る新しい重要な転写因子の存在を示唆する。

molecular	 switch	 promoting	 osteoblast	 

今後の研究により、SCP1 の標的分子が明ら

differentiation.	 PLoS	 Genet 	 

かとなれば、BMP が誘導する骨形成の分子6:e1001019.	 

メカニズムが明らかになると共に、FOP の	 新しい治療標的となる可能性が期待できる。	  ４）Fukuda	 T,	 Kokabu	 S,	 Ohte	 S,	 	 
Ｆ．健康危険情報	 	 総括研究報告書にまとめて記載。	 	 

Sasanuma	 H,	 Kanomata	 K,	 Yoneyama	 K,	 Ｇ．研究発表	 cooperatively	 induce	 osteoblastic	 

1.論文発表	 differentiation	 through	 a	 GSK3b-１ ） Kokabu	  S,	  Ohte	  S,	  Sasanuma	  H,	 dependent	 but	 a	 b-catenin-independent	 

Kato	 H,	 Akita	 M,	 Oda	 H,	 and	 Katagiri	 T.	 (2010)	 Canonical	 Wnts	 and	 BMPs	 mechanism.	  Differentiation 	 80:46-52.	 

線維異形成症の歯科治療について	 	 歯 界	 

展 望 	 115:556-557.	 

５）Nojima	 J,	 Kanomata	 K,	 Takada	 Y,	 	 

Fukuda	 T,	 Kokabu	 S,	 Ohte	 S,	 Takada	 T,	 2.学会発表	 Tsukui	 T,	 Yamamoto	 TS,	 Sasanuma	 H,	 １）Katagiri	 T.:	 Potentiation	 of	 bone	 

Yoneyama	 K,	 Ueno	 N,	 Okazaki	 Y,	 Kamijo	 

morphogenetic	  protein	  activity	  in	  the	 R,	 Yoda	 T,	 and	 Katagiri	 T.	 (2010)	 

extracellular	 

Dual	 roles	 of	 Smad	 proteins	 in	 the	 Research	 

conversion	 from	 myoblasts	 to	 Transduction	  by	  Tissue	  Engineered	 

osteoblastic	 cells	 by	 bone	 

Extracellular	 Matrices.	 （2010 年 6 月

morphogenetic	 proteins.	 J	 Biol	 Chem 	 27-7 月 2 日、米国メイン州）	 

285:15577-15586.	 	 	 2）大手聡、古株彰一郎、福田亨、笹沼寛

６）Kokabu	 S,	 Nojima	 J,	 Kanomata	 K,	 樹、米山克美、進正史、自見英治郎、片Ohte	 S,	 Yoda	 T,	 Fukuda	 T	 and	 Katagiri	 

桐岳信：新規 Smad 結合分子 Zranb2 の同T.	 (2010)	 Protein	 phosphatase	 

定と BMP シグナル阻害因子の解析.	  第 28magnesium-dependent	 1A-mediated	 回日本骨代謝学会学術集会（2010 年 7 月

inhibition	 of	 BMP	 signaling	 is	 21 日、東京）	 

independent	  of	  Smad-dephosphorylation.	 	 

J	 Bone	 Miner	 Res 	 25:653-660.	 

3)雪田聡、細谷明宏、片桐岳信、中村浩	 

彰：骨芽細胞分化における SUMO 化修飾の

７）片桐岳信、神薗淳司、中島康晴、鬼役割.	  第 28 回日本骨代謝学会学術集会

頭浩史、須佐美隆史、芳賀信彦（2010）（2010 年 7 月 21 日、東京）	 

BMP と進行性骨化性線維異形成症.	 	 ク リ	 

ニ カ ル カ ル シ ウ ム 	 20:1510-1517	 

4)片桐岳信、福田亨、古株彰一郎、大手	 聡、福島秀文、野島淳也、米山克美、笹８）片桐岳信（2010）進行性骨化性線維

沼寛樹、進正史、自見英治郎、豊田宏光、

environment.	 

Conference	 on	 Gordon	 
Signal	 異形成症(FOP)の病態と新規治療薬の開発.	 	  高岡邦夫、小池達也、片桐岳信：血小板ク リ ニ カ ル カ ル シ ウ ム 	 20:1204-1211.	 

第 4 因子は血中の新規 BMP 活性促進因子	 である.	  第 28 回日本骨代謝学会学術集９）片桐岳信（2010）進行性骨化性線維会（2010 年 7 月 22 日、東京）	 

異形成症(FOP)の発症メカニズム.	 	 Clin	 	 Nerosci	 28:480-481.	 

5)自見英治郎、片桐岳信、永野健一、青	 木和広、大谷啓一、福島秀文：aly/aly マ10）松崎	  哲、片桐岳信、松崎文子、見ウスでは BMP による Smad1/5/8 のリン酸崎	  徹、大竹	  明（2010）進行性骨化性化 が 亢 進 す る こ と で 骨 形 成 が 亢 進 す る .	 

第 28 回日本骨代謝学会学術集会（2010 年

Smad ホスファターゼに夜冷え誘導性骨芽7 月 22 日、東京）	 

細胞分化の抑制機序.	  第 52 回歯科基礎	 

医学会学術大会（2010 年 9 月 22 日、東6)Ohte	  S,	  Kokabu	  S,	  Fukuda	  T,	  Iemura	 京）	 S,	  Sasanuma	  H,	  Yoneyama	  K,	  Shin	  M,	 	 

Jimi	  E,	  Natsume	  T,	  Katagiri	  T:	 11)妹尾吉訓、福島秀文、片桐岳信、青木Identification	  and	  characterization	 

和広、永野健一、大谷啓一、細川隆司、of	  a	  nuclear	  protein	  as	  a	  co-

自見英治郎：aly/aly マウスにおける骨形suppressor	  of	  BMP-regulated	  Smads.	 

成メカニズムの解明.	  第 52 回歯科基礎8th	  International	  Conference	  on	  Bone	 

医学会学術大会（2010 年 9 月 22 日、東Morphogenetic	  Proteins	  (September	  15-京）	 

18,	 2010,	 Leuven,	 Belgium)	 	 	 12)平田志津、福島秀文、片桐岳信、諸冨7)	 

Katagiri	  T,	  Kokabu	  S,	  Ohte	  S,	 孝彦、青木和広、永野健一、大谷啓一、

Sasanuma	  H,	  Shin	  M,	  Yoneyama	  K,	 北村知昭、寺下正道、自見英治郎：NF-kB

Fukuda	  T:	  PPM1A	  and	  SCP1,	  Smad	 

シグナルの抑制は BMP による骨形成を促

phosphatases,	 

inhibit	 進する.	  第 52 回歯科基礎医学会学術大osteoblastic	 differentiation	 

BMP-induced	 by	 会（2010 年 9 月 22 日、東京）	 

different	  molecular	  mechanisms.	  8th	 	 International	  Conference	  on	  Bone	 13）Katagiri	 T,	 Fukuda	 T,	 Tomoyasu	 A,	 Morphogenetic	  Proteins	  (September	  15-

Goto	  M,	  Kodaira	  K,	  Kokabu	  S,	  Ohte	  S,	 18,	 2010,	 Leuven,	 Belgium)	 

Kanomata	  K,	  Tsukui	  T,	  Fukushima	  H,	 	 

Serizawa	  H,	  Nojima	  J,	  Nakamura	  A,	 8)進正史、福島秀文、吉田弘之、青木和

Yoneyama	  K,	  Sasanuma	  H,	  Shin	  M,	 広、Masuda	 Kahn、大谷啓一、片桐岳信、Fujita	 K,	 Akita	 M,	 Kowalska	 A,	 Jimi	 E,	 自見英治郎：航空がん細胞の顎骨浸潤にToyoda	  H,	  Takaoka	  K,	  Koike	  T,	 おける BMP シグナル活性化の役割.	  第 52

Higashio	 K,	 Suda	 T:	 Platelet	 factor	 4	 回歯科基礎医学会学術大会（2010 年 9 月

is	 a	 novel	 potentiator	 of	 BMP-induced	 

21 日、東京）	 

osteoblastic	  differentiation	  and	  bone	 	 formation.	  ASBMR	  (American	  Society	 9)雪田聡、細谷明宏、片桐岳信、中村浩for	  Bone	  and	  Mineral	  Research)	  2010	 

彰 ： BMP に よ る 分 化 制 御 機 構 に お け る

annual	  meeting	  (October	  15-19,	  2010,	 

SUMO 化修飾の役割.	  第 52 回歯科基礎医

Toronto,	 Ontario,	 Canada)	 

学会学術大会（2010 年 9 月 22 日、東京）	 	 	 

14)	 

10)	 

片桐岳信、古株彰一郎、進正史：

Ohte	  S,	  Kokabu	  S,	  Fukuda	  T,	 Iemura	  S,	  Sasanuma	  H,	  Yoneyama	  K,	 

Shin	  M,	  Jimi	  E,	  Natsume	  T,	  Katagiri	 

学校法人北里研究所、埼玉医科大学、発T:	  Identification	  of	  Zranb2,	  a	  novel	 

明者：供田洋、松田大介、内田龍児、片R-Smads	 

桐岳信、野中健一、増間碌郎、大村智	 binding	 

protein,	 

as	 a	 suppressor	  of	  BMP	  signaling.	  ASBMR	 	 

(American	 2.実用新案登録	 

Society	 for	 Bone	 and	 Mineral	  Research)	  2010	  annual	  meeting	 なし。	 

(October	 3.その他	 

15-19,	 

2010,	 Toronto,	 Ontario,	 Canada)	 なし。	 	 	 15)大手聡、古株彰一郎、家村俊一郎、笹沼寛樹、米山克美、進正史、自見英治郎、夏目徹、福田亨、片桐岳信：新規 Smad 結合分子 Zranb2 は BMP シグナル抑制因子である.	  第 8 回 RCGM フロンティア国際シンポジウム（2010 年 11 月 3 日、埼玉）	 	 
16)笹沼寛樹、福田亨、大手聡、古株彰一郎、進正史、米山克美、加藤仁、穐田真澄、織田弘美、片桐岳信：骨芽細胞分化における BMP と Wnt シグナルの相互作用の解明.	  	  第 8 回 RCGM フロンティア国際シンポジウム（2010 年 11 月 3 日、埼玉）	 	 
17)進正史、古株彰一郎、大手聡、米山克美、笹沼寛樹、福田亨、片桐岳信：SCP1
は BMP 誘 導 性 の 骨 芽 細 胞 分 化 に お い てSmad の 下 流 因 子 を 抑 制 す る . 	  第 8 回
RCGM フ ロ ン テ ィ ア 国 際 シ ン ポ ジ ウ ム（2010 年 11 月 3 日、埼玉）	 	 
Ｈ．知的財産権の出願・登録状況	 
（予定を含む。）	 
1.特許取得	 １）特願	 2010-255134、名称：「骨分化阻害剤およびその製造方法」、特許出願人：