テクニカルノート

SARS-CoV-2および異なる呼吸器系病原体の同時検出用Twist呼吸器系ウイルスコントロールの有用性

結果

Twist Respiratory Virus Research Panel（品番：103066、103067、103068）のポジティブコントロールとしてのTwist呼吸器系ウイルスコントロールの適合性を判定するために、NGSターゲットエンリッチメント用ライブラリを調製しました。ライブラリは
50 ngのヒト参照RNAに当該ウイルスコントロール100万コピーを加えて調製されました。Twist Standard hybridization kit（品番：101279、101025、101026）を用いた16時間のハイブリダイゼーションによってキャプチャを行いました。

100万コピーでのウイルスコントロールのキャプチャは優れたカバレッジ、濃縮、均一性を示しました。すべてのウイルステンプレートは、入力画分の2500倍以上に濃縮され、塩基の99.9%以上が1x以上のカバレッジでカバーされました（図1）。キャプチャ後は、インフルエンザなど断片化されたウイルスであっても、ウイルスゲノム全体でカバレッジは比較的均一でした。この均一なカバレッジはキャプチャ効率によるものですが、当該ウイルスコントロールの合成および製造における卓越性も反映しています。図2は、塩基の99.9%が少なくとも20xカバレッジでキャプチャされ、読み取った配列の95%以上が期待通りの参照アレル（参照対立遺伝子）を含むことを示しています。

ウイルスコントロールでは、ハイブリッドキャプチャは非常に特異的なため、コンタミネーションやクロスアラインメントはほとんど起こりません。クロスコンタミネーションやクロスアラインメントを測定するために、それぞれのTwist呼吸器系ウイルスコントロールに対してキャプチャ結果を並べました。キャプチャされたすべてのコントロールについて、パネルのキャプチャスペー
スに位置する読み取り配列の少なくとも99.3%がターゲットゲノ
ムにマッピングされました（図3）。

100%

1X以 上 の 塩 基 の 割 合 ( % )

98%
96%
94%
92%
90%
hBoV
MeV

HRV
hPIV4

D68
229E

H1N1
NL63

H3N2SARS

IBV
SCV-2

MuV
MERS

hPIV1
OC43

図1：ターゲットエンリッチメント後のウイルスコントロールにおける濃縮倍率と1xカバレッジのゲノムの割合。各ウイルスの完全な名称は表1に記載しています。
100%

M E R Sコ ロ ナ ウ イ ル ス

50%0%
100%

ヒトライノウイルス

50%
0%

0%

20%

40%
60%
ウイルステンプレート上の位置

80%

100%

図2：MERSコロナウイルス（上）およびヒトライノウイルス（下）の合成テンプ
レートの全塩基における、参照アレルを含む読み取り配列の割合。
D68
HRV
H1N1
H3N2
IBV
hPIV1
hPIV4
MeV
MuV
hBoV
MERS
NL63
OC43
229E
SARS
SARS COV2

マルチプレックスアッセイ（1回の検査で複数の病原体を検出するアッセイ）では、より多くの異なるウイルスコントロールを含むセットが必要となります。このテクニカルノートでは、Twist
Respiratory Virus Research Panelのポジティブコントロールとしての、さまざまなTwist呼吸器系ウイルスコントロールの適合性をご紹介します。また、それらの同じウイルスコントロールがSARS-CoV-2のルーチン検査用の有用なネガティブコントロールとして機能することもご紹介します。

0%参照アレル

SARS-CoV-2による症状は、呼吸器疾患を引き起こすその他のさまざまなウイルス性病原体によるものと似ています。インフルエン
ザの流行する季節が近づき、1回の検査で複数の病原体を検出できる検査法を開発する動きがあります。これにより、さまざまな種類の病原体について一つずつ除外していくような時間のかかる体系的な検査なしに、迅速な病原体の特定が可能になります。

濃縮倍率

5,000

%参照アレル

新しいウイルス感染症には、検出・測定用のアッセイ開発に迅速な対応が求められます。これは新型コロナウイルス感染症（COVID-19）パンデミックには特に当てはまります。研究者は定量PCR（qPCR）や次世代シーケンス（NGS）など、SARS-CoV-2ウイルスのゲノム検出のための迅速検査法を開発することで対応しました。

10,000D68
HRV
H1N1H3N2
IBV
hPIV1
hPIV4
MeV
MuV
hBoV
MERS
NL63
OC43229ESARSSARS COV2

10080

サン プ ルゲ ノ ム

はじめに604020マッピングされるゲノム

0

図3：濃縮パネルでカバーされる各ゲノム（列）に対してマッピングされる各濃縮サンプルからの読み取り配列（行）の割合。対角線上には読み取り配列がターゲッ
ト通りである割合が示され、対角線以外の位置にはターゲットから外れた読み取り配列の割合が示されています。各ウイルスの完全な名称は表1に記載しています。

TWIST BIOSCIENCE | テクニカルノート

A. 系統樹B. SARSCoV2キャプチャからのカバレッジ
2,500

MERS

0SARS

1SARSCoV21コロナウイルスHKU1

1コロナウイルスOC43

1コロナウイルス229E

1コロナウイルスNL63

図4：A. すべてのヒト感染性コロナウイルスの参照ゲノム全体のマルチプルアラインメントから作成した系統樹。B. スタンダードとして合成されたすべてのコロナ
ウイルスゲノムに対するSARS-CoV-2キャプチャ実験のカバレッジ。紫色の領域は、
SARS-CoV-2と特定の種の間の相同性が非常に高い領域（97%超）を表します。

ウイルスゲノムトルツメに対するカバレッジ

1SARSCoV250

SARS

01MERS

01OC4301

NL6301229E

005,000

10,00015,00020,000
ウイルスゲノムの座標

25,00030,000

ウイルスゲノムの座標
6,000

50

コ ピ ー 数 /µ L

4,000
コピー数/µL

252,000

水

229E
D68H1N1H3N2hB
oV
hP
IV
1hP
IV
4HR
V
IB
V
M
ERS
M
eV
M
uV
NL
63
OC
43
SA
RS

0ウイルス

水SC
V2

43RS

SA

63

OCuV
M

NL

eV

S

M

ウイルスM

VIB

ER

4HR
V

1IV
hP

oV

IVhP

N2hB

H38N1H1

D6229E

0図5：Twist呼吸器系ウイルスコントロールのそれぞれについて、CDC 2019-nCoVリアルタイムRT-PCR診断パネルを使用したqPCRデータを示す箱ひげ図。Twist SARS-CoV-2
RNAコントロール2をポジティブコントロールとして5,000コピー加えました。すべてのウイルスは、テンプレートなしの水コントロールと類似の挙動を示し、μLあたり1コピー未満のSARS-CoV-2を含んでいます。各ウイルスの完全な名称は表1に記載しています。右の拡大図は、上記のRNAコントロール（0～50コピー/µl）からのqPCRデータを示しています。

SARSとSARS-CoV-2ゲノムは近縁であり、配列レベルで約80%が同一です（図4A）。これらのゲノムでは、2種類のウイルス間の相同性の高い領域で発生する相互クロスアラインメントは非常に低レベル（読み取り配列の0.05%未満）でした（図4B）。読み取り配列の大半はこれら2種類のコントロール間の正しいゲノムに割り当てられましたが、SARS-CoV-2コントロールを使用する場合はSARSゲノムへのアラインメント、またはSARSコントロールを使用する場合はSARS-CoV-2ゲノムへのアラインメントを解釈する際に注意が必要です。

また、これらのTwist呼吸器系ウイルスコントロールを診断検査のネガティブコントロールとして利用できるかを判断するために、FDAがEUA（緊急使用許可）として承認したSARS-CoV-2用qPCR診断アッセイで試しました。CDC 2019-nCoVリアルタイムRT-PCR診
6
断パネルをTaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mixと共に使用して、テンプレートとして約10 コピー/µlの各Twist呼吸器系ウイルスコントロールを用いて一連のアッセイを実施しました。さらに、定量的参照スタンダードとしてのATCC Quantitative Synthetic SARS-CoV-2
RNAに対するポジティブコントロールとしてTwist SARS-CoV-2 RNA Control 2 (品番：102024)を5,000コピー使用しました。予想通り、各ウイルスの6回のテクニカルレプリケートではSARS-CoV-2は事実上検出されず、SARS-CoV-2ゲノムのコピー数はμLあたり1コピー未満でした。Twist呼吸器系ウイルスコントロールは、本質的にテンプレートを含まない水コントロールのように機能します。以上の結果は、これらのウイルスコントロールがSARS-CoV-2検出におけるルーチン分析において有用なネガティブコントロールとして機能することを示しています。

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まとめ

本文書では、ターゲットエンリッチメントによる異なる呼吸器系病原体の同時検出のポジティブコントロールとして、またSARSCoV-2を検出するqPCRアッセイのネガティブコントロールとしての、15種類のTwist呼吸器系ウイルスコントロールの有用性をご紹介しました。15種類のTwist呼吸器系ウイルスコントロールによって、Twist Respiratory Panelでキャプチャした後、99.9%の配列のカバレッジと2500倍以上の濃縮が得られました。FDA-EUA承認のqPCR SARS-CoV-2検出アッセイでTwist呼吸器系ウイルスコントロールを使用した場合、テンプレートなしの水コントロールと同様のバックグラウンドレベルを示し、これらのコントロールがSARS-CoV-2アッセイで有用なネガティブコントロールとして機能することが示されました。
品番名称

略称102024

Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (MN908947.3)

SCV-2103001

Twist Synthetic Influenza H1N1 (2009) RNA control

H1N1103002

Twist Synthetic Influenza H3N2 RNA control

H3N2103003

Twist Synthetic Influenza B RNA control

IBV103004

Twist Synthetic Human bocavirus 1 DNA control

hBoV

103005

Twist Synthetic Human enterovirus 68 RNA control

D68103006

Twist Synthetic Human rhinovirus 89 RNA control

HRV103007

Twist Synthetic Mumps virus RNA control

MuV103008

Twist Synthetic Human parainfluenza virus 1 RNA control

hPIV1103009

Twist Synthetic Measles virus RNA control

MeV103010

Twist Synthetic Human parainfluenza virus 4 RNA control

hPIV4103011

Twist Synthetic Human coronavirus 229E RNA control

229E103012

Twist Synthetic Human coronavirus NL63 RNA control

NL63103013

Twist Synthetic Human coronavirus OC43 RNA control

OC43103014

Twist Synthetic SARS coronavirus Tor2 RNA control

SARS

103015

Twist Synthetic MERS coronavirus 2c EMC/2012 RNA control

MERS

核酸の種類

保管

一本鎖RNA–90℃～–70℃

一本鎖RNA–90℃～–70℃

一本鎖RNA
一本鎖RNA

一本鎖DNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA
一本鎖RNA–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃–90℃～–70℃

表1：Twist Respiratory Synthetic Controls。

本文書に記載されている Twist製品は研究用途以外での使用はできません。 Twistの供給取引条件 (www.twistbioscience.com/supply-terms-and-conditions)で規定されている通り、さらなる使用制限が適用されます。

DOC-001174 REV 1.1