シングルユースバイオリアクターにおけるアデノウイルスの生産
Teres Persson, Gustaf Ahlén, Susanne Stier, Mia Bennemo, and Mats Lundgren
GE Healthcare Bio-Sciences AB, Björkgatan 30, 751 84 Uppsala, Sweden
はじめに

アデノウイルスベクターは、ワクチンやがん治療にとって有用な送達システムです。安全かつ有効な臨床グレードのウイルスの製造を可能にするには、スケールアップが容易でコスト効率の高い生産技術が求められます。付着細胞では、一般的にローラーボトルまたはセルファクトリーが培養のプロセスで使用されます。しかし、これらの技術を用いたスケールアップは複雑であり、付着細胞が増殖に利用できる表面積によってスケールアップが制限されます。1 つの解決法は、マイクロキャリアを用いてスケールアップすることです。別の解決法は、浮遊化させた細胞を使用することで、スケールアップを促進することです。
本報では、浮遊培養に順応させた HEK293 細胞を使用して、シングルユースバイオリアクターにおけるアデノウイルス生産の効率的なプロセスについて紹介します。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するヒトアデノウイルス 5 をモデル系として使用しました。さまざまな細胞培養用培地（CCM）を評価し、小スケールでウイルス増殖を最適化することにより、Xcellerex XDR-10 バイオリアクター（培養量 10 L）において、このプロセスを確立することができました。このプロセスにより、生産規模へのさらなるスケールアップが可能になります。本研究のストラテジーを図 1 に示しています。
AdV5-GFP% infection

MOI: 0.01-10

TOH
36-72 h24-72 h

3 x freeze/thaw(detergent lysis)

Cell media evaluation
TOI: 0.5-2 x 106 cells/mL
図 1. 本研究に用いたプロセス開発ストラテジー

バッチモードにおける細胞増殖を、異なる 5 つの CCM（以下、5 つの CCM をそれぞれを A〜 E とする。すべてが HEK293 細胞用に開発されたもの）で評価しました。異なる CCM
で細胞増殖および生存率において違いがみられました（図 2）。培地 B、E のみが 2.5 106
cells/mL を超える細胞密度に到達することができました。細胞の形態と凝集体形成を測定するために、細胞を顕微鏡観察しました（図 3）。細胞増殖をもっともよくサポートし、凝集体形成が少ない培地は、CCM B、CCM E の 2 つでした。

感染多重度（MOI）が 1 および 10 である CCM B、CCM E について、AdV5-GFP の生産性を評価しました。すべての実験において、培地 B がより高い感染性ウイルス力価を示しま。そのため、さらなる最適化を培地 B で行いました。培地 B は CDM4HEK293した（図 4）（HyClone、Cytiva）です。異なる MOI の効果を 0.01 〜 10 の範囲の MOI でさらに検討し。MOI 1 と 2 の間で生産性がわずかな上昇に留まったため、より高い MOI でました（図 5）は横ばいになると推測しました。MOI 2 以上でみられたより高い力価を確保するために、
MOI 10 を選択しました。より高い細胞密度において ivp/cell が失われたため（データは示されていません）、スケールアッププロセス用に感染時間（TOI）1 106 cells/mL を選択しました。

C VDC
D VDC

E VDC
A Viability

10011B Viability
C Viability

E

D Viability
E Viability

図 2. CCM 評価における細胞増殖と生存率。VCD = 生存細胞密度

図 3. CCM A 〜 E における細胞増殖

1.0E+10
6.3E+08
3.9E+08

CCM B
CCM E

3.8E+08

1.0E+08
3.0E+07

6.1E+08

4.8E+072.8E+07

4.9E+07

1.0E+07

Infectious virus titer (ivp/mL)

1.0E+09

1.0E+101.0E+09

7.2E+087.8E+08
4.2E+08
7.0E+07

1.0E+08

1.0E+07

1.0E+06
MOI 1 (r1)

MOI 1 (r2)

MOI 10 (r1)“10”

MOI 10 (r2)

図 4. MOI 1 および MOI 10 を用いて培地 B、培地 E でバッチ培養した感染性ウイルス力価。TOI で培養液を新しい細胞培養培地により希釈。TOI：1 106 cells/mL、TOH：
42 時間。各培養を 2 回反復実施（r1、r2）

Additions

4mM L-gln

Starting cell density

0.3 x 10 cells/mL

Starting volume

5L

Final volume

10 L

pH setpoint

7.1

DO setpoint

40%

Temperature

37 °C

Agitation

100 rpm

SpargerAir, CO2

0.5 mmSparger 2

Air, O2

20 µmTOI

1 x 106 cells/mL

MOI10TOH

48 h“2”“1”
MOI“0,1”“0,01”

図 5. 感染後 42 時間で異なる MOI を有する感染性ウイルスの力価。細胞を培地 B（CDM4HEK293）で増殖させ、感染前に 1 106 cells/mL で同じ培地により希釈

結論

1.0E+101.0E+09
1.0E+086ることを示しています。

• バッチ培養での最終力価が 109 ivp/mL の際に Xcellerex XDR-10 バイオリアクターによるAdV5-GFP 生産のスケールアップが効果的であることを示されました。

40300123Elapsed time (d)XDR-10 VCD
Control B VCD
Control A Viability

1.0E+11 5.1E+10560

Control A VCD
XDR-10 Viability
Control B Viability

4.3E+1048 h

図 7. Xcellerex XDR-10 バイオリアクターおよび対照群において、24、42、48 hpi に自動蛍光顕微鏡を用いて測定された感染性ウイルス力価

2.8E+10

1.5E+101.0E+102.0E+09

2.9E+09
9.2E+08

1.0E+09

7.9E+08

1.0E+08
1.0E+07
1.0E+06
1.0E+05
F/T

Detergent lysis

XDR-1042 h410

図 6. 細胞増殖と生存率。バイオリアクター培養と振とうフラスコ培養との比較（対照群 A および対照群 B）。
ウイルス力価分析用に、感染の 24、42、48 時間後にサンプルを回収しましたX
Sh DR
ak -10ef
Sh lasak k AeflaskBXDR10lysisX
Sh DR
ak -10eSh flasak k AeflaskB

101.0E+06

24 h50201.0E+07

XSh DRak -10
eSh flasak k AeflaskB

6048h

Time post infection

1.0E+05• 培地のスクリーニング検討は、細胞増殖およびウイルス生産性の両方にとって重要です。
• 本結果は、振とうフラスコと Xcellerex XDR バイオリアクターとの間に堅牢な拡張性があ7042h

Viability (%)

CDM4HEK293

4.5E+06

1.0E+06

1.0E+05

Cell culture media

Viable cell density (106 cells/mL)

98024hHEK293.2 sus

qPCR (vp/mL); Infectios virsu particles (ivp/mL)

DDilution

2Cell line

2.7E+090.0100

Bioreactor settings and process201.0

A VDC
B VDC

Infectious virus titer (ivp/mL)

BC

表 1. Xcellerex XDR-10 バイオリアクターにおける培養のためのバイオリアクター設定とプロセスパラメーター

2.7E+09402.0

フラスコ培養物と比較すると、細胞増殖およびウイルス生産性はともにバイオリアクターのスケールアップにおいて向上しました。

8.4E+08
7.9
E+08

3.08

• 総ウイルス粒子数（vp）：qPCR で測定

Xcellerex XDR-10 バ イ オ リ ア ク タ ー に 0.3 106 cells/mL を 播 種 し ま し た。 細 胞 をCDM4HEK293 培地中で 2 106 cells/mL まで増殖させた後、二倍希釈しました。1 106cells/mL の細胞を MOI 10 で感染させました。感染後（hpi）48 時間の時点で、細胞をバイオリアクター内で溶解させました。リアクターの設定とプロセスパラメーターを表 1 に示しています。細胞増殖と生存率を比較するために、2 つの振とうフラスコ対照群を示しました（図 6）。42 〜 48 hpi では、感染性ウイルスの力価に有意な増加はみられませんでした（図 7）。プロセスがより効率的かつ簡便であることから、今後のハーベストのために 42hpi を選択しました。図 7 は界面活性剤細胞溶解によって感染性ウイルスの力価が影響されないことも示しています。42 hpi でのバイオリアクター内の全ウイルス粒子と感染性ウイルスの力価との比は約 15：1 であり、この比は AdV の規制基準内です（図 8）。振とう

2.0E+0960

4.04567
Elapsed time (days)• 大型培養槽：Xcellerex XDR-10 バイオリXcellerex XDR-10 バイオリアクターにおけるスケールアップ

9.2E+08
7.9E+08A5.03角フラスコ

90802• 小型培養槽：125 〜 500 mL の振とう三カス係数自動蛍光顕微鏡で測定

Xcellerex XDR-10

1.1E+08
6.1
E+076.7
E+07100

Viability (%)

Viable cell density (x106 cells/mL)

7.0
6.01

• CCM：5 つの市販の無血清培地（すべてHEK293 細胞用に開発されたもの）

TOI = 感染時間、MOI = 感染多重度、TOH = ハーベスト時期

小スケールの最適化

0• ウイルス：GFP を発現する組換えアデノウイルス血清型 5（AdV5-GFP）

アクター

Automated flourescencemicroscopy

Flow cytometry• 細胞株：異なる CCM に馴化させた HEK293.2sus（ATCC）• 感染性ウイルス粒子数（ivp）：GFP フォー

Infectious virus titer (GFP foci/mL)

HEK-293.2sus

Microscope

Infectious virus titerivp/mL
Scale-up

材料と方法

qPCR (vp/mL)

F/T

F/T

Control A

Control B

Infectious virus titer (ivp/mL)

図 8. 感染後 42 時間での全ウイルス粒子（vp/mL）と感染
性ウイルス力価※記載されている所属は、執筆／取材当時のものです。

Cytiva（サイティバ）

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