別添資料（1）：リアルタイムPCRにおける外部精度評価の参考資料 （検索キーワード：external quality assessment, external quality assessment scheme, EQA, Proficiency Testing, PT, real time PCR, reverse transcription
quantitative PCR, CAP, 外部精度評価, 外部精度管理, リアルタイムPCR）
No.

論文

1

Ramsden SC, Daly S, Geilenkeuser
WJ, et al. EQUAL-quant: aninternational external quality
assessment scheme for realtime PCR.
Clin Chem. 2006;52(8):15841591.
doi:10.1373/clinchem.2005.06601
92

3

論文の概要

EQAの概要EQAで提供された試料

・ABL遺伝子プライマー及びTaqManプライ
このEQAスキームは、リアルタイムPCRにおけマーる技術面での標準化のための要求事項とそ EQUAL project(EU)が実施したTaqMan ・検量線用ABL標準プラスミド(copy数の異のニーズが記載されている。このプロジェクトで real-time PCRのEQAプログラム。
なる5検体)
EUを中心、計103施設が参加開発された試薬デザインと統計ツールは、
EQUALより検査室に試薬、サンプルを送付 ・テストDNA検体(copy数の異なる3検EQA標準化のためのベンチマークとすることが し、Ct値を比較する
体：T1, T2, T3)できる。
・テスト細胞株検体(2検体：C1, C2)
・詳細な作業手順書

・患者検体のcDNAからプラスミドにクローニ
Fu Y, Zhang R, Wu Q, Zhang J, Bao
ングされたBCR-ABL1およびBCR, GUSB,
L, Li J. External quality
中国初のEQAにおいて、偽陽性や偽陰性な
B2M, ABL1を大腸菌で発現させたRNA
assessment of p210 BCR-ABL1
ど、p210 BCR-ABL1検出に関する様々な・armored RNA
中国初のp210 BCR-ABL1検査のEQA
transcript quantification by RT- 問題点が発見された。これらの問題を解決・凍結乾燥品
スキーム。NCCLからRNAサンプルを送付し、
qPCR: Findings andすることにより、p210 BCR-ABL1の検出性
・％BCR-ABL1 ratios 10.0% (Level
71施設のコピー数を比較する
recommendations. Int J Lab
能を向上させ、中国における検査室診断能
1(L1)), 1.0%-10.0% (L2), 0.1%Hematol. 2019;41(1):46-54.
力を強固なものにすることができる。
1.0% (L3), 0.01%-0.1% (L4),
doi:10.1111/ijlh.12919<0.01% (L5)を配布。一部重複含め、10サンプルを配布。

Haselmann V, Ahmad-Nejad P,
Geilenkeuser WJ, et al. Results ofthe first external quality
assessment scheme (EQA) for
isolation and analysis of
circulating tumour DNA(ctDNA). Clin Chem Lab Med.
2018;56(2):220-228.
doi:10.1515/cclm-2017-0283

EQA参加施設

EQAに含まれる分析工程とその測定方法

分析中：TaqMan real-time PCR

・検量線
・T1, T2, T3のABL copy数
・C1, C2のABL copy数※T1, T2, T3検体の真値はEQUALの測定値※C1, C2の真値はEQUALの測定値

・テストDNA検体（T1, T2, T3）について、93検査室中、74検査室が正確な推定値を測定し、品質指標をパスした。
・解析の実施を任意としたテスト細胞株検体（C1, C2）については、75検査室中、48検査検査室が95%信頼区間内の測定値であった。

分析後：Ct値からcopy数を算出

分析中：real-time PCR
・市販のキット、LDT

分析後：Ct値及びcopy数の算出

RfB (Reference Institute forBioanalytics)およびEMQN(European
このパイロットEQAスキームにより、検体量、・腫瘍細胞株から分離・断片化された
Molecular Genetic Quality Network)
cfDNA定量法、ジェノタイピング・プラット
gDNAをスパイクインした2mL human K3が実施した循環腫瘍細胞DNAを対象としEU圏37施設が参加(EU圏42施設にサンフォームの選択において最もばらつきが大き
EDTA plasma (CE certified material,たEQAスキーム。EU圏42施設にDNAサン
プル送付)
く、臨床的影響が大きいことが明らかになっ
In.vent DIAGNOSTICA GmbH).
プルを配布し、BRAF, KRASの既知バリアた。品質保証のために、手順とワークフローの・KRASおよびBRAFの9つの既知バリアンントの検出性能を比較する。測定方法は、調和を図ることが急務であることが示された。
ト。MAF 0-10%の3サンプルを配布
リアルタイムPCR、キャピラリーシーケンシン
グ、パイロシーケンシング、NGSなど。

EQAの結果

分析前：RNA抽出

分析前：RNA抽出
・TRIzol, Spin columns
中国の71施設
・病院の臨床検査室66施設
・商業検査センター3施設
・試薬メーカー2施設

EQAで求められた品質指標

・統計解析には、SPSS
17.0/GraphPadPrism 5.0を使用した
・参加66施設のうち、p210のBCR-ABL1
・p210-BCR-ABL1/CGガウス分布は、コ 測定結果の変動係数 (CV%)は、ルモゴロフ=スミルノフ検定による正規性につ 60.0% から 100.0% の範囲で大きなばらいて検定した。
つきが認められた。
・実験グループ間の差は、対応のあるt検定と ・24 の国際スケール (IS) 検査室では、結一元配置分散分析にかけた果の CV% が 82.4% から 61.6% に減・ピアソン相関分析でp210%BCR少した。
ABL1/CG比の高低調査をした
・また、偽陰性および偽陽性の結果が今回の EQAで認められた。

分析前
・保管：試料の保管期間と条件、資料受領から精製までの期間と条件、血漿1mLあたりのcfDNA分離量の平均値とCV値と作業時間と溶出量
・cfDNA抽出法：RSC ccf Plasma Kit(Promega), Maxwell_Circulating NA(Promega), Chemagic Viral(Chemagen), QiaSymphony Circulating
・検体が送られた42施設のうち、72.3%の・保管：期間
DNA Kit (Qiagen), EeasyMAG
施設が、cfDNAを用手法で分離、62.5%(BioMerieux), QIAmp circulating nucleic ・RNA抽出：cfDNA濃度の施設は、血漿全量をcfDNA分離に使・バリアント同定：genotypingacid (Qiagen), RealLine Extraction
用、38.5%の施設で遺伝子型判定のため※標準検体のDNA濃度は、LINE1(BIORON Diagnostics), NucleoSpinに抽出されたcfDNAを10%以上使用するこ79bp-qPCR assayによる実測値により決Plasma XS (Machery Nagel), MagMaxとが明らかとなった。
定。
cell-free DNA Isolation (Thermofisher),・核酸定量に使用された方法のうち、
QIAamp DNA blood Mini (Qiagen), PME ※標準検体のBRAF V600EのMAFは
PicoGreenは最も低い変動係数
free-circulating DNA Extraction (Analytik BEAMing (digital droplet PCR)と（33.7%）を示した。
Jena), Cobas cfDNA Sample Preparation allele-specific amplification-PCRによ ・ジェノタイピングでは、11種類の方法が報る実測値により決定。
(Roche), Quick-cfDNA Serum and告され、最もエラー率が高かったのはサンガー※標準検体のKRASコドン12/13の一般的Plasma (Zymoresearch)
シーケンス法で、最も低かったのはデジタルな変異のMAFは、cold-PCRと・cfDNA抽出QC：Qubit, Quantifluor,PCRのような高感度の方法であった。合計でpyrosequencingによる実測値により決Nanodrop, Picogreen, qPCR, Agarose gel
197の遺伝子型が決定され、全体のエラー定。
率は6.09%であった。

分析中・各種測定法：dPCR, real-time PCR, NGS,
Sangar sequencing, Pyrosequencing,other
分析後・バリアントの同定456

日本臨床検査自動化学会 遺伝子・プロテ
オミクス技術委員会 第5回 Major BCRABL1 mRNA 定量の外部精度管理

CAP国際臨床検査成績評価プログラム微小残存病変（MRD,MRD1,MRD2）

Normanno N, Fenizia F, CastiglioneF, et al. External quality
assessment for EGFR mutations
in Italy: improvements inperformances over the time.
ESMO Open. 2017;2(2):e000160.
Published 2017 May 26.
doi:10.1136/esmoopen-2017000160

分析前・RNA抽出：Isogen(ニッポンジーン社) 1ml 、または、Buffer RLT(溶解液)(QIAGEN 社)
350μlをバイアルに加え、指定のプロトコルでRNA抽出する・RNA抽出：RNA濃度、A260/A280比
・real-time PCR：ターゲットmRNAの実分析中測値（定量値）、報告値（補正値）
・real-time PCR・Major BCR-ABL1 mRNA 定量：５バ
イアル・Minor BCR-ABL1 mRNA 定量：１バ
国内におけるMajor BCR-ABL1、イアル
minor BCR-ABL1、PML-RARA、・PML-RARA (bcr1) mRNA 定量：５
WT1のmRNA定量の外部精度管理プロ
バイアルグラム。
・WT1 mRNA 定量：２バイアル※2x10^6個の細胞/バイアル※凍結乾燥品

分析後・実測値、報告値の算出

CAPサーベイプログラム。BCR-ABL1またBCR-ABL1 p190、BCR-ABL1 p210、は PML-RARA融合転写物量の測定によ
PML-RARAについて、滅菌水に入ったRNA
り白血病の腫瘍組織量をモニタリングかつ診試料3本が送付される断している施設向けのサーベイ。

このEQAスキームで得られた結果は、EGFR イタリアの臨床腫瘍学会と病理学会がFFPE
検査をする検査室において、診断方法の改 サンプルを配布し、非小細胞肺がんEGFR・非小細胞肺がん検体善、ガイドラインや教育プログラムの更新、最 のバリアントの同定結果を調査したEQAス
・腫瘍含有量50%以上のFFPE
適な治療法を特定するための高品質なバイ キーム。測定方法は、リアルタイムPCR、サ・10μmのスライドを10サンプルずつ配布
オマーカー検査を患者に提供するのに役立つ ンガーシーケンシング、パイロシーケンシングと思われる。など。

施設指定の手順にて実施

・2011年：47施設
・2013年：86施設
・2015年：92施設

分析後・EGFRのジェノタイピング：サンガーシークエンシン
グ、パイロシークエンシング、リアルタイムPCR、
MassArray、Therascreen EGFR RGQキット、NGS※2011年には、エクソン18-21のダイレクトシーク
エンス、エクソン19欠失のフラグメント解析、p.L858R検出のための対立遺伝子識別ベースのリアルタイムアプローチ、Therascreen EGFR
RGQキットがサンプル解析に使用された。また、2013年には、使用した材料の妥当性をさらに確認するために、次世代シーケンサー（NGS）を追加的な確認方法として導入

・ダイレクトシークエンスの使用は2011年の78.7%から2015年にはわずか14.1%に減少したが、パイロシークエンスとリアルタイムPCRの使用は逆に増加した。
・ダイレクトシークエンスを使用した施設が不合格となった数は、単一のスキームを分析し配布試料中のEGFR遺伝子のエクソン18、た場合と3つのEQAを組み合わせた場合の19、20、21変異の存在可能性を検査し、両方で、他の方法を使用して不合格となった
出荷日から3週間以内に結果を提出するこ数よりも有意に高かった。と・2011年と2013年には、参加施設の約29％がプログラムの第1段階で不合格となったのに対し、2015年には13％の施設が不合格となり、より高感度で堅牢な手法への切り替えにより、優良施設の割合を増加させることが可能であることが示唆された。