最近の研究から

高等植物の集光性複合体 (LHC-II) の結晶構造解析とその周辺
坂部貴和子，坂部知平

国際科学振興財団

研究開発部

Crystal structure analysis of spinach major light-harvesting
complex II and circumstance of the study
Kiwako SAKABE , Noriyoshi SAKABE
Foundation for Advancement of International Science
１．はじめにいてはマックスプランク研究所のミシェル (H. Michel) 博

今回は，イメージングプレート（IP）を検出器として開士，ダイセンホファー（J. Deisenhofer）博士，フーバー（R.

発された蛋白結晶構造解析用ビームライン BL-6B を使っHuber）博士らが紅色光合成細菌の反応中心複合体の分解てチャン（Wen-rui Chang）教授をリーダーとする中国科

能 2.3 Å のＸ線結晶構造解析に関する研究で 1988 年ノー学院生物物理学研究所の蛋白結晶学グループが行ったホベル化学賞を受賞された [1]。この成果はその後の光合成ウレンソウ主要集光性複合体の分解能 2.72 Å の結晶構造研究に大きな変革をもたらしたことはいうまでもない。

解析を紹介する。解析経過や構造を紹介する前に生物学的植物型についても 2 つの光化学反応系についてＸ線結晶な意義をご理解いただくためにバックグランドを少し述べ構造解析が長年待たれていたが，膜蛋白であるため結晶る。

化が難しくなかなか成功にいたらなかった。従って今回

人類を含めた地球上の生命活動に消費されるエネルギーの成功は高等植物の光合成系では最初の高分解能Ｘ線結晶の源泉は，殆ど全ての場合，光合成により固定された太構造解析である。つまり，新たに高等植物の光合成系の構陽エネルギーである。光合成はその反応に伴う酸素発生造にメスを入れた点でその功績は高く評価されている。今（電子供与体としての水の利用）の有無により区別される

回解析された部分は葉緑体チラコイド膜中の全 PS Ⅱ粒子

2 つの型，植物型と細菌型に分類される。高等植物 · 藻類

（Fig. 1）中に存在する光合成の初期反応において光を吸収· シアノバクテリアなどによって営まれる前者の型に属すする集光型アンテナ蛋白質複合体の Lhcb1+2+3 の部分でる光合成は光化学反応系Ⅰ（PSI）と光化学反応系Ⅱ（PSある。ここで吸収された光のエネルギーは反応中心複合体Ⅱ）の 2 種類の反応中心を有するのに反し後者の型ではたⅡ (PSII) に渡され，ここで水が分解され酸素とプロトンがだ 1 種類の反応中心を含んでいるのみである。細菌型につ発生する。
２．解析に至るまでの経緯
高等植物の主要 LHC-II の結晶化のためにホウレンソウを材料に選ばれたことは大変幸運であった。この解析で苦労された点は先ず良質の結晶を得ること，つまりこの結晶も初期の段階の結晶は通常の膜蛋白質の結晶と同様Ｘ線の回折能が大変低かったが改良を積み重ね，現在では回折斑点に異方性が少ない巨大な結晶が得られている。この結晶の空間群は R32 で格子定数が a=b=260 Å，c=650 Å, α=β=90 度，γ=120 度であるが，問題は c 軸の長さが 650 Å と非常に大きくラボのＸ線回折計を使ってのデータ収集が事実上できなかったことであった。この結晶構造解析に当時（1999 年頃）Ｘ線の利用できる放射光実験施設を自国にもたない北京の中国科学院生物物理学研究所の Chang 教授をはじめ多くの研究者，大学院の学生さんやポスドクの方々，技官の方々が PF に来られてこのテーマに挑戦され，世界ではじめて高等植物の光合成蛋白質の高分解能の解析

Figure 1
The whole PS Ⅱ particle located in the thylakoid membrane ofchloroplast. The marked part "Lhcb1+2+3" is protein LHC-II in thethylakoid membrane of chloroplast and the location of the major
light-havesting complex II. This figure is referenced from Nield, J.(1997)
Ph.D. Thesis, University of London, UK.に成功されたことに対し心より敬意を払うと共に，長年同じ放射光共同利用実験グループのメンバーとして，データー収集の環境作りに協力できたことを大変誇りに思う。
膜蛋白の解析で Deisenhofer らがノーベル賞を受賞され19

PHOTON FACTORY NEWS Vol. 22 No. 4 FEB.

た頃，すでに Chang 教授のグループでも膜蛋白の結晶化わらず大変きれいな電子密度分布図が得られた。この手法に挑戦しておられ，我々が教授のラボを訪れた時，「ドイを使って最終的に LHC-II 単量体に含まれる 232 アミノ酸ツに先にやられちゃった」と残念そうに結晶を見せて下さ残基の 94％が決定された。LHC-II の構造解析の難しさはったことを今もはっきりと覚えている。

単量体に含まれている光化学反応に関係する全ての物質の最初の頃，彼らの持って来る膜蛋白の結晶は概して反射構造を正しく決定することが機能との関係を明らかにする能が低かったので PF の感度の高いイメージングプレート上から必須であることであった。つまり，そこに至るまでを検出器とするデータ収集システムが大変威力を発揮しては兎に角何が何でも良質な結晶を得る努力を続けねばならいた。現在では北京と PF の間は国際宅急便で 3 日も待てなかった訳である。幸い最終段階で LHC-II 単量体に含まば届くが，2 年程前までは 1 週間から 10 日以上かかりクれている 14 個のクロロフィル，4 個のカロチノイド，2 個ライオの状態で送られてきたサンプルを使える状態で受けのリピッド PG, DGDG（界面活性剤），約 70 個の水分子等取ることは不可能だった。そこで最初の頃は PF のビームの位置が決定された。Table 1 に単量体の構成成分を示す。

ラインで結晶化条件とクライオ条件を検討しながらデータクロロフィル a（Chla）とクロロフィル b（Chlb）の構造の収集を行うことを繰り返しておられ，毎年 1 回多いときにちがいは，Table 1 の化学構造式で示すように，7 の位置のは 2 回 PF に来られ，1 回の滞在期間も短くて 2 週間，長Ｒが Chla では CH3，Chlb では CHO であることだけである。

いときには 1 ヶ月近く頑張ってサーベーを続けてこられ

そこで 14 個のクロロフィルは Fig. 2a 及び Fig. 2b のそれた。勿論その期間全体を本研究に使われるのではなく約

ぞれ 2Fo-Fc 及び Fo-Fc の電子密度図を使って区別するこ

40 名のメンバーからなるグループの方々の 1 年間に必要とができ，8 個は Chla，6 個は Chlb と同定された。この内なデータを全て収集して帰られた。

10 個はフィチル側鎖を含めてモデルを組み立てることがこの解析は PF の BL-6B で集められた分解能 3.5Å まで出来たが，残りの 4 個は部分的にしかモデルが組めなかっの母結晶と 1 種類の重原子誘導体を使って位相決定がなた。また遷移双極子モーメントの配向についても，帰属すされ，最後に北京高能物理研究所・放射光実験施設の蛋白ることができた。4 個のカロチノイドのうち，3 個のカロ用ビームラインで集められた分解能 3.5 〜 2.72Å までのデチノイド分子は 2 個のルテインと 1 個のネオキサンチンでータを加えて構造の精密化が行なわれた。分解能 2.7Å まあることが分かり，残りの 4 個目はキサントフィル−サイでの独立な 211,079 の反射による信頼度因子（Rmerge）はクルの種々のカロチノイドが混った電子密度として説明さ0.082 であった。この結果を用いて差フーリエを計算したれた。

結果，Fig．2 に示すように LHC-II が膜蛋白であるにも拘Fig. 3 に結晶の c 軸に沿ってみた 12 面体 LHC-II DGDG
Table 1 Composition of a monomeric LHC-II
232-amino-acid residue-polypeptide
14 Chlorofiles
8 Chla, 4 Chlb
4 carotenoids
2 lutein,1 neoxanthin,1 xanthophyl-cycle carotenoid
2 lipid molecules
1PG, 1DGDG (detergent)

Figure 2
Electron-density map at 2.72 Å resolution. 2Fo–Fc density (1.5 × σlevel) are all shown as royal purple. a, Chla and b, Chlb. The cyan
cage in b shows Fo–Fc density (4.0 × σ level). No residual 2Fo–Fc orFo–Fc density appears around Chla C7-methyl, while strong 2Fo–Fcand Fo–Fc densities show up at the position of Chlb C7-formyl if it isomitted. c, N-terminal region including binding sites for a Chlb (cyan)
and a phospholipid coordinated to a Chla (green). d, Two antiparallel
polypeptide strands in the EC loop region with one Chlb bound.

Figure 3
Organization and packing of the icosahedral particles. a, Schematic
drawing of one-half of the LHC-II proteoliposome viewed along
the c axis of the hexagonal cell. b, Packing diagram of ‘Type III’membrane-protein crystal, showing the contacts between icosahedral
spherical particles in the hexagonal cell. Only polypeptides are shownfor clarity. The N-terminal domain and AC loop region located at thestromal surface are involved in the crystal packing.

20

最近の研究からプロテオリポソーム粒子の 1/2（Fig. 3a）と菱面体格子内の LHC-II の 3 量体の構造モデルである。前述したようにでのリポソーム粒子間の接触の様子（Fig. 3b）を示す。図Fig. 1 に示した全 PSII 粒子のうち LHC-II は Lhcb1+2+3 に

中 12 面体粒子の 1 つの C3 軸と 2 つの C2 軸は結晶の対称相当し，従って Fig. 4 に示した膜内での LHC-II の構造モ性と完全に一致している。12 面体プロテオリポソーム粒

デルは Lhcb1+2+3 部分に相当する。Fig. 4 の 3 量体のヘリ子のパッキングはこれまで Michel らにより報告されていックスは緑，青，赤及び黄色で色分けされている。手前のるものとは全く異なっており今回新しくタイプⅢのパッキ

2 本の赤と 1 本の黄色からなる単量体を Fig. 5a の単量体ングが見つかった。

モデルと重ね合わせると，分子中で交叉する黄色と赤のヘリックスが擬似 2 回対称の関係になっている。3 回軸まわ３．全 PSII 粒子を構成する LHC-II の構造モデル
次に全 PS Ⅱ粒子（Fig. 1）中での LHC-II の構造モデルを考えてみよう。この解析が発表される前に藤吉好則ら[2] は電子顕微鏡を使って，豆の LHC-II の構造に関するアポプロテインの 2 次構造について発表しており，大筋では今回解析された構造と一致していた。Fig. 4 は膜内でFigure 5
Secondary structure of monomeric LHC-II apoprotein and trimerization.
View in parallel with the membrane plane. a, The vertical line indicatesthe approximate direction of the membrane normal and the position of
the pseudo-C2 axis. Helices are labelled A–E. Helix E is newly defined,
whereas others are labelled as before[2]. The inclination of each helix
with respect to the membrane normal is shown in parentheses, along withthe residue range marked below each value. b, The interface between
two adjacent monomers is shown, yellow, amino-acid residues; green,Chla; cyan and blue, Chlb; magenta, xanthophyll-cycle carotenoid;
pink, PG; red, water; maroon, Cα traces of N-terminal (Ser 14–Asp 54)
and C-terminal (Asp 215–Gly 231) polypeptide chain. The vertical line
represents the local C3 axis of an LHC-II trimer.

Figure 4
LHC-II trimer located in the biological membrane. The colorized part isthe center of the LHC-II trimer, including peptide, pigments and lipids.
The two black lines at each side of LHC-II show the lipid bilayer ofmembrane. And the upside one shows the stromal layer of membrane,
and down one shows the lumeral side of the lipid bilayer.

Figure 6
Pigment arrangement in the trimeric and monomeric LHC-II. a, Stereo view showing the pigment arrangement pattern in the LHC-II trimer. View fromthe stromal side. Monomers are labelled I–III. For clarity, the chlorophyll phytyl chains and lipids are omitted. Green, Chla; blue, Chlb; yellow, lutein;orange, neoxanthin; magenta, xanthophyll-cycle carotenoid. b, c, Pigment pattern in a monomer at the stromal and lumenal sides, respectively. Colour
designation the same as in a. d, e, Arrangement of chlorophylls within a LHC-II trimer at the stromal and lumenal sides, respectively. Chlorophylls arerepresented by three atoms: the central magnesium atom and two nitrogen atoms. The connecting line between the two nitrogens defines the directionsof the Qy transition dipole. Green, Chla nitrogen; blue, Chlb nitrogen; grey, magnesium; purple and blue ellipse, approximate monomer area. The
magenta numerical note near the dark line connecting two chlorophylls indicates the distance (Å ) of central magnesium.

21PHOTON FACTORY NEWS Vol. 22 No. 4 FEB.

りの最短距離にある 2 つの単量体中のピグメントの配列が分子複合体が関与しており，それぞれが固有の LHC をもFig. 5b に示されている。Fig. 4 の中で黒い線は脂質二重層っている。さらに PSI ，PSII の両方に親和性のある移動の両端を示しており，図中上側がストロマサイド，下側が性 LHC も存在している。最近バクテリア（R. viridis）のルーメンサイドである。ストロマサイドはルーメンサイド

LHC-1 のコアー複合体が原田一明らにより結晶化されたと比較して分子が膜外に飛び出している。

[4]。まだ分解能が 8 Å と低いので結晶化への努力が要求

ストロマサイドの構造は Fig. 6a, 6b に相当し，ルーメンされるが構造と機能との関係から興味がある。のサイドは Fig. 6c に相当する。ストロマサイドにある 8今回解析されたものは LHC-II の主成分であるので他の個のクロロフィルは Fig. 6d に示されたように単量体表面ものの解析は今後の課題として残されている。高等植物のに円周に沿って分布しており，アンテナの役割を果たし反応中心複合体 II の構造研究は沈建仁らにより行われたていると考えられる。また，ルーメンサイドにも 6 個の[5]。彼らは結晶化に成功し，分解能 7 Å の 6 方晶系に属クロロフィルが存在しており Fig. 6e に見られるように 4する結晶を得たが , 回折パターンから c 軸長が 1,050 Å と個がクラスターを形成し 2 個が対を作っている。これら

非常に長く，その上 ab 面内には 3 倍の格子長の超格子にのクロロフィルは強い光が来た時構造が壊れないように由来する回折スポットが存在し，未だ構造解析には至ってnon-photochemical quenching に関与していると考えられていない。一方最近高等植物に非常に類似性の高いラン藻のいる [3]。近接する 2 つのクロロフィルは単量体間にも存PSII（LHC を含まない）の分解能 3.7 Å の構造が神谷信夫，在し，各々の距離は Fig. 6d と Fig. 6e に示されており，平沈建仁ら [6] により得られた。この構造を基礎として高等

均距離は 12Å である。クロロフィルの存在状態を示すた

植物の PSII の構造が得られれば Chang らによる LHC-II とめ Mg2+ との配位，C131- ケトグループ及び Chlb の場合は組み合わせて近い将来 LHC-II PSII の結合モデルを作るこC7- ホルミルグループとの水素結合を Table 2 に示した。とが可能になるかもしれない。そうすればこれを使って高クロロフィル−カロチノイド間の距離は光の効率的な移動等植物の光合成のメカニズムがこれまでよりはっきりと理と関係して特に興味があるが今回の報告では正確な値は明解できるようになると期待される。

らかにされていない。結晶化剤として加えた脂質 DGDG

ここで LHC-II で行われている反応について考えて見るは 12 面体プロテオリポゾーム粒子の形成に関与している。と，初期反応は光とクロロフィル分子間の相互作用に始まこの脂質構造は液晶−ゲル相転移と関係していることが明り，フェムト秒からピコ秒の時間領域で起こる超高速過程

らかになっており，温度変化と関係した構造変化を伴うのがつづく [7]。可逆反応ではないので吸収される光の波長で興味があるが解明は未だこれからである。Fig. 1 から明を変えて集光と移動過程における構造変化との関係を追求

らかなように LHC-II 3 量体に相当する Lhcb1+2+3 は 3 回する時間分解による動的構造研究は，大変興味があるが残軸に平行な 2 つの面で明らかに異なった分子間接触がみ念ながら現在のところ不可能である。LHC-II について我々られる。即ち一方は 2 重膜の内部に接触しており，他方はが一番知りたいことは，LHC-II が集合してできる 300 個

小 LHC-II 即ち Lhcb4, 5, 6 と接触している。この事から，のクロロフィル a,b や種々のカロチノイド等による巨大ア

LHC-II 3 量体を一つの剛体として見た場合，3 回回転軸周ンテナからどのようにして効率よく反応中心にある特別なりでの回転のし易さと機能発現とを結び付けることができ1 対のクロロフィル（P680）に光が運ばれて行くかであるかもしれない。即ち，それは接触面の性質に大いに関わる。今後結晶化について更に検討が加えられ，構造解析のっていると考えることができる。

精度が上がればクロロフィル，カロチノイドなどのピグメ

ホウレンソウの光合成反応には PSI，PSII の 2 種類の超ントを含む構造の揺らぎの解析，すなわちダイナミックス

Table 2 Coordinations of chlorophylls and their interactions with local environments.
Chlorophylls

Central ligands

Hydrogen bond partner of Chlb
C7-formyl

Hydrogen bond partner tochlorophyll C131-keto group

Chlb 601
Chla 602
Chla 603
Chla 604
Chlb 605
Chlb 606
Chlb 607
Chlb 608
Chlb 609
Chla 610
Chla 611
Chla 612
Chla 613
Chla 614

Tyr 24 ∗Glu 65His 68
Wat 309
Val 119 ∗Wat 310
Wat 308
Wat 302
Glu 139
Glu 180
Phospho-diester
Asn 183
Gln 197
His 212Gln 122 N, Ser 123 N
Wat 308 (ligand of Chlb 607)
Gln 131 NE2
Leu 148 N
Gln 131 NE2-Tyr 44 N, Trp 46 N
Wat
Leu 113 N
Arg 70 NH1
His 68 ND1
Gly 158 N-∗ These residues contribute their backbone carbonyls to coordinate with the central magnesium of chlorophylls.

22

最近の研究から謝辞の研究が可能になり，その結果，光の移動過程，スイッチ
ングメカニズム，消光等についても定量的に解明されるこ

最後に，この文章を書くにあたり，Chang 教授から図，表，とが期待される。このような解析には量子化学的な手法の資料の提供を受けました。先生のご好意に対し厚く御礼申導入が不可欠であり，超精密解析が必要になるであろう。

し上げます。

Chang 教授のグループのこの基礎的で且つ非常に重要な研究を今後も応援したいと思っている。細かい構造や機能と引用文献の関係についてはすでに Nature[3] に報告されているので[1] Deisenhofer, J., Epp,O., Miki, K., Huber, R. & Michel, H. :是非お読み頂きたい。

Nature (London) 318, 618-624 (1985).
[2] Kuhlbrandt, W., Wang, D., N. & Fujiyoshi, Y. : Nature

４．おわりに(London) 367, 614-621 (1994).

ここで中国科学院生物物理学研究所の蛋白結晶学グルー[3] Liu, Z., Yan, M., Wang, K., Kuang, T., Zhang, S., Gul,プと我々のグループとのこれまでの関係を少し紹介する。

L., An, X. & Chang, W. : Nature (London) 428, 287-292

1972 年田中首相が初めて中国を訪問された，そして第 2(2004).

次世界大戦後，はじめて日中国交が樹立した。しかし同年[4] Saijo, S., Sato, T., Kumasaka, T., Tanaka, N., Harata, K., &京都で開催された国際結晶学会の時にはまだ，中国とは国

Odahara, T.: Acta Cryst. F61, 83-86 (2005).

交がなかったため，中国の研究者は出席できなかった。そ[5] Shen, lian-Ren: Private Comunication.

こでオックスフォード大学のホジキン教授が中国を訪れ分[6] Kamiya, N & Shen, lian-Ren: PNAS 100, 98-103 (2003).

解能 2.5 Å の非常に美しい 2 亜鉛インスリンの MIR によ[7] 柴田和雄，右衛佐重雄，原富之，宮地重遠編，光生物る電子密度分布図の手書きのコピーを貰ってこられた。そ学上：学会出版センター (1979).

れをメインレクチュアーの時中国の研究者に代わって，お[8] Sakabe, N., Sakabe, K. & Sasaki, K.:J. Synchrotron Rad. 11

示しになりその素晴らしさを話された。その後我々はホジ

12-16 (2004).

キン教授のもとに留学し，1975 年帰国した。そして電子密度分布図の本物を見せて頂きたいと思い，当時研究所の（2005 年 1 月 14 日原稿受付）
著者紹介

所長であり，中国で国家プロジェクトとして行われていたインスリン結晶構造解析のリーダーを勤められていたリヤ

坂部貴和子ン（Dongcai Liang）教授に申し込んだところ大変快く承諾（財）国際科学振興財団し北京へ招待してくれた。1979 年ブタ 2 亜鉛インスリン構〒 305-0801

造の精密化をいっしょに行っていた佐々木教祐氏ととも北Tel. 029-877-0019

京を訪れ念願のマップを見ることが出来た。それから 27

e-mail ksakabe@sbsp.jp

SAKABE Kiwako
研究開発部

つくば市大穂 1-1
Fax. 029-877-0018

年にわたる長いお付き合いをさせて頂いている。Chang 教授もその主要メンバーの一人である。

坂部知平

Liang 教授は我々が最初に知り合った時から中国科学院

SAKABE Noriyoshi（財）国際科学振興財団のメンバーであり 73 歳の今も研究を続けておられる。今〒 305-0801

年は Chang 教授が体調を崩されたので，Liang 教授が大学

Tel. 029-877-0020

院の学生や技術者をつれて回折データ収集に来られた。そe-mail nsakabe@sbsp.jp

研究開発部

つくば市大穂 1-1
Fax. 029-877-0018の際，これまでとは別の材料から得られた LHC-II 結晶の回折データも BL-6B で収集された。我々は同じ結晶を頂き BL-6C に設置されている Galaxy[8] を使って回折データを収集し，その処理結果を北京に送った。
Chang 教授はまもなく研究所の定年を迎えられるが，LHC-II 関係の構造解析はまだまだ続くであろう。3 年前に北京でも高能研究所に蛋白用のビームラインができた。しかし，1 年に 1 ケ月しか利用できないとのことである。上海に第 3 世代の放射光施設の建設が昨年認められたが，実際に動き出すのは 4 年先とのことである。少なくともそれまでの間，これまで通り彼らが研究を継続できるよう PFで格子定数が 650 Å より大きな膜超分子結晶でも，超高分解能まで回折データが収集できるように，特に高感度高精度の測定器を整備されることをお願いする次第である。
北京郊外にあるラマ教寺院（承徳，中国，2004 年 9 月）〔向かって右から，坂部知平，Chang 教授，坂部貴和子）

23