46

飼料研究報告 Vol. 47 (2022)

4 飼料用稲中のベンスルフロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型
質量分析計による分析法の開発
武田 然也 *，船木 紀夫 *，関口 好浩 *Development of Determination Method of Bensulfuron-Methyl in Rice Straw,
Whole-Crop Rice Silage and Paddy Rice for Feed by LC-MS/MS
TAKEDA Zenya*, FUNAKI Norio* and SEKIGUCHI Yoshihiro*(* Nagoya Regional Center, Food and Agricultural Materials Inspection Center)
We have developed a quantitative determination method of the concentration of bensulfuron-methyl
in rice straw, whole-crop rice silage (WCRS) and paddy rice for feed using a liquid-chromatographelectrospray-ionization tandem mass spectrometer (LC-ESI-MS/MS). In addition, the applicationof azimsulfuron, cyclosulfamuron, ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl andimazosulfuron for a simultaneous determination method with bensulfuron-methyl was examined.
Having added water to a sample, azimsulfuron, bensulfuron-methyl, cyclosulfamuron,ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron were extracted withacetone, and the extracted solution was filtered. The filtrate was then diluted with acetone. The
diluted solution was purified with two types of solid phase extraction columns (InertSep K-solute,
GL Sciences Inc.; Tokyo, Japan and ENVI-Carb, Sigma-Aldrich Co. LLC.; St. Louis, MO, USA),and injected into an LC-MS/MS to determine the concentration of azimsulfuron, bensulfuron-methyl,
cyclosulfamuron, ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron. LC
separation was then carried out on an ODS column (Mightysil RP-18, 2.1 mm i.d. × 150 mm, 5 µm,
Kanto Chemical Co.,Inc.; Tokyo, Japan) with a gradient of 2 mmol/L ammonium acetate solution
and methanol as a mobile phase. In the MS/MS analysis, the positive mode electrospray ionization(ESI+) was used.
Recovery tests were conducted on rice straw, WCRS and paddy rice. Azimsulfuron, bensulfuronmethyl, cyclosulfamuron, ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron
were added at the levels of 0.01 and 0.2 mg/kg for rice straw, 0.004 and 0.09 mg/kg for WCRS, and0.01 and 0.2 mg/kg for paddy rice respectively. The resulting mean recoveries ranged as following:
65.1 % to 84.7 % for azimsulfuron; 88.4 % to 102 % for bensulfuron-methyl; 88.8 % to 105 % for
cyclosulfamuron; 84.9 % to 91.2 % for ethoxysulfuron; 78.4 % to 87.9 % for flucetosulfuron; 60.9 %to 87.9 % for halosulfuron-methyl; and 62.5 % to 74.5 % for imazosulfuron. The repeatability inthe form of the relative standard deviation (RSDr) was as following: less than 14 % for azimsulfuron;less than 5.3 % for bensulfuron-methyl; less than 7.1 % for cyclosulfamuron; less than 8.8 % forethoxysulfuron; less than 18 % for flucetosulfuron; less than 15 % for halosulfuron-methyl; and lessthan 14 % for imazosulfuron.
Key words: bensulfuron-methyl; azimsulfuron; cyclosulfamuron; ethoxysulfuron; flucetosulfuron;
halosulfuron-methyl; imazosulfuron; liquid-chromatograph tandem mass spectrometer (LCMS/MS); electrospray ionization (ESI); rice straw; whole-crop rice silage; paddy rice*

独立行政法人農林水産消費安全技術センター名古屋センター<52>飼料用稲中のベンフルスロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の開発

47

キーワード：アジムスルフロン；ベンスルフロンメチル；シクロスルファムロン；エトキ
シスルフロン；フルセトスルフロン；ハロスルフロンメチル；イマゾスルフロン；液体クロマトグラフタンデム型質量分析計；エレクトロスプレーイオン化法；稲わら；
稲発酵粗飼料；籾米

1

緒言

ベンスルフロンメチルは，DuPont de Nemours（米国）により開発されたスルホニルウレア系除草剤であり，ノビエを除く主要な水田雑草に卓効を示す 1)．我が国では 1987 年に農薬登録されており，飼料中の管理基準値 2)として，稲わらで 0.1 mg/kg，稲発酵粗飼料（以下「WCRS」という．）
で 0.05 mg/kg と設定されているが，その分析法は飼料分析基準 3)に収載されていない．
このため今回，一般財団法人日本食品分析センターが「平成 25 年度飼料中の有害物質等分析法
開発委託事業」において開発した液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（以下「LC-MS/MS」という．）を用いたアジムスルフロン，イマゾスルフロン，エトキシスルフロン，シクロスルファ
ムロン及びベンスルフロンメチルの同時定量法 4)（以下「JFRL 法」という．）を基に，飼料用稲（稲わら，WCRS 及び籾米）中のベンスルフロンメチルを対象に飼料分析基準への収載の可否を検討した．
なお，アジムスルフロン，イマゾスルフロン，エトキシスルフロン，シクロスルファムロン及びフルセトスルフロンについては管理基準値が定められていないため本検討課題の主目的とする成分ではないが，ベンスルフロンメチルと同様のスルホニアウレア系除草剤であり，同じ分析法を適用できる可能性が高いことから，同時定量法としての適用を併行して検討した．フルセトスルフロン
については，平成 27 年に一般財団法人日本食品分析センターにより JFRL 法への適用の妥当性が確認されている 5)．
さらに，管理基準値として稲わらで 0.2 mg/kg，WCRS で 0.1 mg/kg と設定されており，平成 21
年に JFRL 法とは異なる方法 6)が開発されているハロスルフロンメチルについても，上述の農薬と同じスルホニルウレア系除草剤であることから，同時定量法の適用の可能性を検討した．
参考に各農薬の構造式等を Fig. 1 に示した．

<53>

48

飼料研究報告 Vol. 47 (2022)

Azimsulfuron

Bensulfuron-methyl

CH3
N

N
N

N
N

SO2NHCONH

N

OCH3
N
N

CH3

OCH3

1-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-3-[1-methyl-4-(2-methyl-

Methyl α -(4,6-dimethoxypyrimidin-2-

2H-tetrazol-5-yl)pyrazol-5-ylsulfonyl]urea

ylcarbamoylsulfamoyl)-o-toluate

C13H16N10O5S

MW: 424.4

CAS No.: 120162-55-2

C16H18N4O7S

MW: 410.4

Cyclosulfamuron

CO

Ethoxysulfuron
OCH2CH3

OCH3

N
NH SO2NHCONH

CAS No.: 83055-99-6

N
O SO2NHCONH

N

OCH3

N
OCH3

OCH3
1-[2-(cyclopropylcarbonyl)phenylsulfamoyl]-3-(4,6-

1-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-3-(2-dimethoxypyrimidin-2-yl)urea

ethoxyphenoxysulfonyl)urea

C17H19N5O6S

MW: 421.4

CAS No.: 136849-15-5

C15H18N4O7S

Flucetosulfuron

MW: 398.4

CAS No.: 126801-58-9

Halosulfuron-methyl

CO2CH3Cl
N

N

N

SO2NHCONH

OCH3

N
OCH3

CH3
1-{3- [(4,6-dimethoxypyrimidin-2-ylcarbamoyl)sulfamoyl]-

methyl 3-chloro-5-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-2-pyridyl}-2-fluoropropyl methoxyacetate

ylcarbamoylsulfamoyl)-1-methylpyrazole-4-carboxylate

C18H22FN5O8S

MW: 487.5

CAS No.: 412928-75-7

C13H15ClN6O7S

MW: 434.8

CAS No.: 100784-20-1

Imazosulfuron
Cl
N

N
N

SO2NHCONH

OCH3

N
OCH3

1-(2-chloroimidazo[1,2-a]pyridin-3-ylsulfonyl)-3-(4,6dimethoxypyrimidin-2-yl)urea
C14H13ClN6O5S

Fig. 1

MW: 412.8

CAS No.: 122548-33-8

Chemical structures of azimsulfuron, bensulfuron-methyl, cyclosulfamuron,ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron

<54>

49

飼料用稲中のベンフルスロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の開発

2
2.1

試

実験方法

料

稲わら及び籾米はそれぞれ目開き 1 mm のスクリーンを装着した粉砕機で粉砕し，分析用試料とした．WCRS は 60 °C で 10 時間乾燥後，更に室内に静置して風乾した後，同様に粉砕し，分析用試料とした．
2.2
1)

試

薬

アセトニトリル，アセトン，酢酸エチル及びヘキサンは残留農薬・PCB 試験用を用いた．メ
タノールは液体クロマトグラフ用（富士フイルム和光純薬製）を用いた．塩酸及びギ酸（質量分率 98 %）は試薬特級を用いた．酢酸アンモニウムは高速液体クロマトグラフ用（1 mol/L 水
溶液，富士フイルム和光純薬製）を用いた．水は Milli-Q Advantage（Merck Millipore 製）により精製した超純水（JIS K0211 の 5218 に定義された超純水）を用いた．

2)

各農薬標準品
アジムスルフロン，ベンスルフロンメチル，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン，
フルセトスルフロン，ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンの標準品は，Table 1 に示した供給業者，純度のものを用いた．

3)

各農薬標準原液
農薬標準品各 25 mg を正確に量ってそれぞれ 50 mL の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて各農薬標準原液を調製した（これらの液各 1 mL は，各農薬として 0.5 mg を含有）．

4)

農薬混合標準液
7 成分の農薬標準原液各 1 mL を 25 mL の全量フラスコに正確に入れて混合し，更に標線までアセトンを加えて農薬混合標準原液を調製した（この液 1 mL は，各農薬としてそれぞれ 20µg を含有）．
使用に際して，農薬混合標準原液の一定量を，アセトニトリル－水（1+1）で正確に希釈し，1 mL 中に各農薬として 0.5，1，2，4，6，8，10，20，40，60，80 及び 100 ng を含有する各農薬混合標準液を調製した．

5)

1 v/v%ギ酸溶液
ギ酸 1 mL に水を加えて 100 mL とした．
Table 1

Pesticide standards used in the present study

Compound

Manufacturer

Molecular formula

MW

CAS No.

Purity(%)

Azimsulfuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical

C13 H16 N10 O5 S

424.40120162-55-2

99.9

Bensulfuron-methyl

FUJIFILM Wako Pure Chemical

C16 H18 N4 O7 S

410.4083055-99-6

100

Cyclosulfamuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical

C17 H19 N5 O6 S

421.43

136849-15-5

99.3

Ethoxysulfuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical

C15 H18 N4 O7 S

398.39126801-58-9

99.7

Flucetosulfuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical

C18 H22 FN5 O8 S

487.46412928-75-7

99.6

Halosulfuron-methyl

FUJIFILM Wako Pure Chemical

C13 H15 ClN6 O7 S

434.81

100784-20-1

99.9

Imazosulfuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical

C14 H13 ClN6 O5 S

412.81122548-33-8

100

<55>

50

飼料研究報告 Vol. 47 (2022)

2.3
1)

装置及び器具粉砕機：
粉砕機 1（籾米用）：ZM 200

Retsch 製（目開き 1 mm スクリーン，使用時回転数 18000 rpm）

粉砕機 2（稲わら及び WCRS 用）：SM 100

Retsch 製（目開き 1 mm スクリーン，回転数（仕様）1690 rpm）
2)

振り混ぜ機：レシプロシェーカーSR-2W タイテック製（使用時振とう数 300 rpm）

3)

多孔性ケイソウ土カラム：InertSep K-solute（5 mL 保持用）

4)

グラファイトカーボンミニカラム（以下「ミニカラム」という．）：ENVI-Carb（500 mg）

ジーエルサイエンス製

Sigma-Aldrich 製
5)メンブランフィルター：DISMIC-25HP（孔径 0.20 µm，直径 25 mm，親水性 PTFE）東洋濾紙
製

6)

LC-MS/MS：LC 部：ACQUITY UPLC System Waters 製
MS/MS 部：ACQUITY TQ Detector Waters 製

2.4
1)

定量方法
抽

出

分析試料 10.0 g を量って 300 mL の共栓三角フラスコに入れ，水 30 mL を加え，30 分間静置
後，更にアセトン 120 mL を加え，30 分間振り混ぜて抽出した．200 mL の全量フラスコをブフ
ナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さを順次アセトン 50 mL で洗浄し，同様に吸引ろ過した．さらに，全量フラスコの標線までアセトンを加えた．この液 10 mL を 50 mL のなす形フラスコに正確に入れ，40 °C 以下の水浴で約1 mL まで減圧濃縮し，カラム処理 I に供する試料溶液とした．
2)

カラム処理 I
試料溶液に 0.1 mol/L 塩酸 2.5 mL を加え軽く振り混ぜた後，多孔性ケイソウ土カラム（5 mL保持用）に入れ，10 分間静置した．
100 mL のなす形フラスコをカラムの下に置き，試料溶液の入っていたなす形フラスコをヘキサン－酢酸エチル（3+1）5 mL ずつで 2 回洗浄し，洗液を順次カラムに加え，液面が充てん剤の上端に達するまで流下した後，更にヘキサン－酢酸エチル（3+1） 40 mL をカラムに加え，
ベンスルフロンメチル等を溶出させた．
溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．アセトニトリル－水－ギ酸（50+50+1）10 mL を加えて残留物を溶かし，カラム処理 IIに供する試料溶液とした．

3)

カラム処理 II
ミニカラムをアセトニトリル 5 mL 及び 1 v/v%ギ酸溶液 5 mL で順次洗浄した．試料溶液をミニカラムに入れ，液面が充てん剤の上端に達するまで流下（必要に応じて流速が 1 mL/min
程度になるよう吸引した．以下同様．）した．試料溶液の入っていたなす形フラスコをアセト
ニトリル－ギ酸（99+1）5 mL ずつで 2 回洗浄し，洗液をミニカラムに加え，同様に流出させた．
100 mL の な す 形 フ ラ ス コ を ミ ニ カ ラ ム の 下 に 置 き ， ア セ ト ニ ト リ ル － ト ル エ ン － ギ 酸<56>飼料用稲中のベンフルスロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の開発

51（75+25+1）30 mL をミニカラムに加えてベンスルフロンメチル等を溶出させた．
溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．アセトニトリル－水（1+1）5 mL を正確に加えて残留物を溶かした後，メンブランフィ
ルターでろ過し，LC-MS/MS による測定に供する試料溶液とした．
4)

LC-MS/MS による測定
試料溶液及び各農薬混合標準液各 4 µL を LC-MS/MS に注入し，選択反応検出（以下「SRM」という．）クロマトグラムを得た．測定条件を Table 2 及び 3 に示した．

ColumnMobile phase
Flow rate
Column temperature
Ionization
Source temperature
Desolvation gas
Capillary voltage
Cone gas
Collision gas

Table 2
Operation conditions of LC-MS/MS
Mightysil RP-18 GP (2.0 mm i.d. × 150 mm, 5 μm), Kanto Chemical
2 mmol/L ammonium acetate solution- methanol (9:1) →5 min → (1:1) (hold for 15 min)→ (1:9) (hold for 15 min) →5 min → (9:1)
0.2 mL/min
40 °C
Electrospray ionization (ESI) (Positive ion mode)
120 °CN2 (600 L/h, 400 °C)
1.0 kVN2 (50 L/h)
Ar (0.25 mL/min)TargetTable 3

MS/MS parameters

Precursor

Product ion

Cone

Collisionion

Quantifier

Qualifiervoltageenergy(m/z )(m/z )(m/z )

(V)

(eV)

182

－

25

15

－

156

25

36

149

－

28

21

－

91

28

58

261

－

25

16

－

218

25

27

261

－

27

14

－

218

27

24

156

-

32

17

－

273

32

23

182

－

27

20

－

83

27

52

153

－

22

10

－

258

22

23
23

Azimsulfuron

425

Bensulfuron-methyl

411

Cyclosulfamuron

422

Ethoxysulfuron

399

Flucetosulfuron

488

Halosulfuron-methyl

435

Imazosulfuron

413

<57>

52

飼料研究報告 Vol. 47 (2022)

5)

計

算

得られた SRM クロマトグラムからピーク面積及び高さを求めて検量線を作成し，試料中の各農薬量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．
Sample 10.0 g (300 mL Erlenmeyer flask)
added 30 mL of water and allowed to stand for 30 min
added 120 mL of acetone and shook for 30 min
filtered through filter paper (No. 5B of JIS P3801) under reduced pressure
washed with 50 mL of acetone
filled up to 200 mL with acetone
transferred 10 mL of sample solution to 50 mL eggplant flask
evaporated to the volume of 1 mL under 40 °C
added 2.5 mL of 0.1 mol/L hydrochloric acid
InertSep K-solute (applicable sample volume 5 mL)

placed a receiver (100 mL eggplant flask)
applied sample solution and allowed to stand for 10 min
washed the eggplant flask with 5 mL of hexane-ethyl acetate (3:1) and eluted (twice)eluted with 40 mL of hexane-ethyl acetate (3:1)
evaporated to under 40 °C and dried with nitrogen gas
added 10 mL of acetonitrile-water-formic acid (50:50:1)
ENVI-Carb（500 mg）

washed with 5 mL of acetonitrile and 5 mL of 1 v/v% formic acid solution
applied sample solution
washed the eggplant flask with 5 mL of acetonitrile-formic acid (99:1) and eluted (twice)placed a receiver (100 mL eggplant flask)
eluted with 30 mL of acetonitrile-toluene-formic acid (75:25:1)
evaporated to under 40 °C and dried with nitrogen gas
added 5 mL of acetonitrile-water (1:1)
filtrated through a membrane filter (0.2 µm)
LC-MS/MS

Scheme 1

Analytical procedure for azimsulfuron, bensulfuron-methyl, cyclosulfamuron,ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron
in rice straw, whole-crop silage (WCRS) and paddy rice
2.5

添加回収試験
2.2 の 3)の各農薬標準原液をアセトニトリル－水（1+1）で正確に希釈し添加に用いた．
アジムスルフロン，ベンスルフロンメチル，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン，フルセトスルフロン，ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンとしてそれぞれ，稲わらに 0.01
及び 0.2 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 1 及び 20 ng/mL），WCRS に原物換算して 0.004 及び0.09 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 1 及び 20 ng/mL），籾米に 0.01 及び 0.2 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 1 及び 20 ng/mL）になるようにそれぞれ添加後よく混合し，一夜静置した後に2.4 に従って定量し，平均回収率及び繰返し精度を求めた．

<58>

53

飼料用稲中のベンフルスロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の開発

なお，WCRS への添加は風乾物試料に対し各農薬として 0.01 及び 0.2 mg/kg 相当量になるよう行い，原物中濃度への換算は，原物中及び風乾物中の水分含有量を 60 %及び 10 %と想定して，原物（水分含有量 60 %）中濃度＝風乾物（水分含有量 10 %）中濃度／2.25 の式により行った．

3
3.1

結果及び考察検量線
2.2 の 4)により調製した農薬混合標準液各 4 µL を LC-MS/MS に注入し，得られた SRM クロマ

トグラムからピーク面積及び高さを用いて検量線を作成した．
得 ら れ た 検 量 線 の 一 例 は Fig. 2-1~2-7 の と お り で あ り ， 各 0.5~100 ng/mL（ 注 入 量 と し て
0.002~0.4 ng 相当量）の範囲で直線性を示した．
なお，当該検量線の濃度範囲は，各農薬を 0.005~1 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の各農薬濃度範囲に相当する．

10000000

1000000

Peak height/ arb. units

Peak area/ arb. units

1200000

y = 10099x + 15456
R² = 0.9965

8000006000004000002000008000000

y = 90768x + 198554
R² = 0.9943

6000000
4000000
2000000

0

0
0

20

40

60

80

100

0

Concentration of azimsulfuron/ [ng/mL]

20

40

60

80

100

Concentration of azimsulfuron/ [ng/mL]

Fig. 2-1

Calibration curves of azimsulfuron by peak area (left) and peak height (right)

1400000

7000000

Peak height/ arb. units

Peak area/ arb. units

1200000
y = 11552x + 1711.6
R² = 0.9992

1000000
8000006000004000002000006000000

4000000
3000000
2000000
1000000

0

0
0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Concentration of bensulfuron-methyl/ [ng/mL]

Concentration of bensulfuron-methyl/ [ng/mL]

Fig. 2-2

y = 59991x + 55830
R² = 0.9989

5000000

Calibration curves of bensulfuron-methyl by peak area (left) and peak height (right)<59>

飼料研究報告 Vol. 47 (2022)
8000003500000

7000003000000

600000Peak height/ arb. units

Peak area/ arb. units54

y = 7017.6x + 825.4
R² = 0.9999

5000004000003000002000001000002500000

y = 29062x + 23341
R² = 0.9997

2000000
1500000
1000000
500000

0

0
0

20

40

60

80

100

0

Concentration of cyclosulfamuron/ [ng/mL]

Fig. 2-3

60

80

100

9000000

1000000

Peak height/ arb. units

Peak area/ arb. units

40

Calibration curves of cyclosulfamuron by peak area (left) and peak height (right)

1200000

y = 10622x + 9643.5
R² = 0.999

8000006000004000002000007500000
y = 81024x + 104970
R² = 0.9981

6000000
4500000
3000000
1500000

0

0
0

20

40

60

80

100

0

Concentration of ethoxysulfuron/ [ng/mL]

Fig. 2-4

40

60

80

100

Calibration curves of ethoxysulfuron by peak area (left) and peak height (right)
3500000

Peak height/ arb. units

300000y = 2951.9x + 308.12
R² = 0.9998

25000020000015000010000050000

3000000
y = 32904x + 9527.4
R² = 0.9995

2500000
2000000
1500000
10000000500000
0

0

20

40

60

80

100

0

Concentration of flucetosulfuron/ [ng/mL]

Fig. 2-5

20

Concentration of ethoxysulfuron/ [ng/mL]

350000Peak area/ arb. units

20

Concentration of cyclosulfamuron/ [ng/mL]

20

40

60

80

100

Concentration of flucetosulfuron/ [ng/mL]

Calibration curves of flucetosulfuron by peak area (left) and peak height (right)

<60>

55

飼料用稲中のベンフルスロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の開発
7000000

700000Peak height/ arb. units

Peak area/ arb. units

600000y = 5988.6x + 7767.6
R² = 0.9972

5000004000003000002000001000006000000

4000000
3000000
2000000
1000000

0

0
0

20

40

60

80

100

0

60

80

100

2400000

200000Peak height/ arb. units

Peak area/ arb. units

40

Calibration curves of halosulfuron-methyl by peak area (left) and peak height (right)

240000y = 2171.5x + 3005.5
R² = 0.9971

16000012000080000
40000

2000000

1200000
800000400000
0

0

20

40

60

80

100

0

Concentration of imazosulfuron/ [ng/mL]

Fig. 2-7

y = 22666x + 52375
R² = 0.9935

1600000

0

3.2

20

Concentration of halosulfuron-methyl/ [ng/mL]

Concentration of halosulfuron-methyl/ [ng/mL]

Fig. 2-6

y = 61582x + 115571
R² = 0.9952

5000000

20

40

60

80

100

Concentration of imazosulfuron/ [ng/mL]

Calibration curves of imazosulfuron by peak area (left) and peak height (right)

妨害物質の検討稲わら 2 検体，WCRS 2 検体及び籾米 2 検体を試料として，2.4 により調製した試料溶液を LC-

MS/MS に注入し，得られた SRM クロマトグラムを確認したところ，いずれの試料においても定量を妨げるピークは認められなかった．
なお，得られた SRM クロマトグラムの一例を Fig. 3 に示した．

<61>

56

飼料研究報告 Vol. 47 (2022)

A

1↓

10000090000

Intensity / arb.units

80000

4
↓

70000
60000
50000

2
↓

40000
30000

5
↓

6
↓

7
↓

3
↓

20000
10000
0
-10000
4

6

8

10

12

14

16

Retention time / min

B100000

7
↓

90000

6
↓

Intensity / arb.units

80000
70000
60000

5
↓

4
3 ↓
2↓
1 ↓
↓

50000
40000
30000
20000
10000
0
-10000
4

6

8

10

12

14

16

Retention time / minC10000090000

Intensity / arb.units

80000
70000
60000

5
↓

4
3 ↓
2↓
1 ↓
↓

50000
40000
30000
20000
10000
0

7
↓

6
↓

-10000
4

6

8

10

12

14

16

Retention time / minD10000090000

Intensity / arb.units

80000
70000
60000
50000

3
2↓
1 ↓
↓

40000
30000
20000
10000

5
↓

4
↓

7
↓

6
↓

0
-10000
4

6

8

10

12

14

16

Retention time / minFig. 3

Typical selected reaction monitoring (SRM) chromatograms of pesticides in standard andblank sample solutions(LC-MS/MS conditions are shown in Tables 2 and 3.

Arrows indicate the retention times of

1: azimsulfuron, 2: imazosulfuron, 3: flucetosulfuron, 4: halosulfuron-methyl, 5: ethoxysulfuron,
6: bensulfuron-methyl and 7: cyclosulfamuron.

The baselines are shifted for display.)

A: Standard solution (1 ng/mL: 0.004 ng as each pesticide), B: Sample solution of rice straw,
C: Sample solution of WCRS, D: Sample solution of paddy rice<62>

飼料用稲中のベンフルスロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の開発

3.3

57

マトリックス効果の確認
2.4 の 1)から 3)により調製した稲わら，WCRS 及び籾米のブランク試料溶液にアジムスルフロ

ン，ベンスルフロンメチル，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン，フルセトスルフロン，
ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンとしてそれぞれ 0.1 mg/kg 相当量（最終試料溶液中
で 10 ng/mL 相当量）を添加した各マトリックス標準液について，2.2 の 4)に従って調製した同濃度の農薬混合標準液に対するピーク面積比を確認した．その結果は Table 4 のとおりであり，稲わら及び WCRS 中のアジムスルフロン，ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンについて
はイオン化を抑制するマトリックス効果が認められたが，その他ではマトリックス効果は認められなかった．
Table 4

Matrix effect studya)

Rice straw

Matrix effect (%)
WCRS

Paddy rice

Azimsulfuron

62.4

68.9

89.1

Bensulfuron-methyl

109

107

102

Cyclosulfamuron

105

105

96.1

Ethoxysulfuron

91.7

93.3

94.1

Flucetosulfuron

82.7

87.7

96.8

Halosulfuron-methyl

51.3

49.7

85.2

Imazosulfuron

49.1

58.2

87.4

Pesticidesn=3a) Ratio of peak area of pesticides in the presence of matrix to that in the absenceof matrix. The concentration in matrix standard solution was 10 ng/mL (spiked
at 0.1 mg/kg as air-dry basis).
3.4

添加回収試験
2.5 により添加回収試験を実施した．その結果は Table 5 とおり，ベンスルフロンメチルについては，平均回収率は 88.4~102 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSDr）として 5.3 %以下の成績が得られ，飼料分析基準別表 3 の妥当性確認法ガイドライン 4)（以下「妥当性確認法ガイドラ
イン」という．）に定められた目標値（真度：70 %以上 120 %以下，精度：22 %以下（添加濃度0.01 mg/kg）又は 20 %以下（同 0.2 mg/kg））を満たす良好な結果であった．
同様に，アジムスルフロンについては，平均回収率は 65.1~84.7 %，RSDr は 14 %以下，シクロ
スルファムロンについては，平均回収率は 88.8~105 %，RSDr は 7.1 %以下，エトキシスルフロン
については，平均回収率は 84.9~91.2 %，RSDr は 8.8 %以下，フルセトスルフロンについては，
平均回収率は 78.4~87.4 %，RSDr は 18 %以下，ハロスルフロンメチルについては，平均回収率は60.9~87.9 %，RSDr は 15 %以下，イマゾスルフロンについては，平均回収率は 62.5~74.5 %，RSDr
は 14 %以下であり，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン及びフルセトスルフロンは妥
当性確認法ガイドラインに定められた目標値を満たす良好な結果であった．しかし，アジムスル
フロン，ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンについては，稲わら及び WCRS では真度の目標値を満たしていなかった．
なお，得られた SRM クロマトグラムの一例を Fig. 4 に示した．

<63>

58

飼料研究報告 Vol. 47 (2022)

Table 5
Feed types

Spiked level(mg/kg as fed

WCRS
Paddy rice

Feed types

basis)

Recovery
(%)

0.01

75.2

0.2

Paddy rice

Bensulfuron-methylb)(%)

Recovery
(%)

9.8

96.2

66.4

14

0.004

65.1

0.09

73.0

0.01
0.2

Cyclosulfamuronb)

Ethoxysulfuron(%)

Recovery
(%)

c)
RSDr

2.6

99.2

97.9

2.0

100

14

88.4

2.2

10

102

2.4

77.4

2.0

91.9

5.3

84.7

4.0

95.9

1.4

Flucetosulfuronb)b)basis)

Recovery(%)(%)

Recovery
(%)

0.01

82.5

9.7

66.0

0.2

80.8

6.8

0.004

78.4

12

0.09

82.4

0.01

87.4

0.2

85.1

c)
RSDr

c)

(%)

RSDr
(%)

1.4

88.7

4.1

3.0

88.9

2.9

95.4

3.8

84.9

4.0

105

1.2

89.2

5.5

88.8

7.1

85.3

8.8

99.5

1.4

91.2

3.9

Imazosulfuron
b)

c)

(%)

Recovery
(%)

RSDr
(%)

15

64.1

12

60.9

11

62.5

7.0

61.1

11

63.1

14

15

65.5

15

67.6

9.6

18

77.2

4.2

71.8

7.2

6.9

87.9

11

74.5

9.0

a) The pesticides were spiked to air-dried WCRS samples one night prior to extraction.
were 0.01 and 0.2 mg/kg as air-dry basis for each pesticide.

b)

Recovery(%)

Halosulfuron-methyl

c)
RSDr

a)

WCRS

Recoveries for pesticidesc)
RSDr

Spiked level(mg/kg as fed

Rice straw

b)

c)
RSDr

a)

Rice straw

Azimsulfuron

The spiked levels

The levels of pesticides as fed basis were

calculated with following equation on the assumption that the moisture content of WCRS samples was
60 % as fed basis and 10 % as air-dry basis.
The levels of pesticides as fed basis (moisture 60 %)= the levels of pesticides as air-dry basis (moisture 10 %) / 2.25b) Mean (n = 5)c) Relative standard deviation of repeatability

<64>

59

飼料用稲中のベンフルスロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の開発

1↓

Intensity / arb.units

2800000

5↓

4↓2300000

B

6
↓

7
↓

2300000

23↓↓

1800000
1300000
800000300000-200000

5↓

1↓2800000

Intensity / arb.units

A

3
2↓
↓

1800000
1300000
8000004↓7↓300000-200000

4

6

8

10

12

14

16

4

6

8

5
↓

1
↓

2800000
2300000
1800000

23↓↓

1300000
800000

D

6
↓

4
↓

7
↓

1
↓

2800000

Intensity / arb.units

C

10

12

14

16

Retention time / min

Retention time / min

Intensity / arb.units

6↓

2300000

5
↓

4
↓

6
↓

7
↓

3
2↓
↓

1800000
1300000
800000300000300000-200000-200000
4

6

8

10

12

14

4

16

Retention time / minFig. 4

6

8

10

12

14

16

Retention time / min

Typical SRM chromatograms of pesticides in standard and spiked sample solutions(LC-MS/MS conditions are shown in Tables 2 and 3.

Arrows indicate the peaks of 1: azimsulfuron,

2: imazosulfuron, 3: flucetosulfuron, 4: halosulfuron-methyl, 5: ethoxysulfuron, 6: bensulfuron-methyl and7: cyclosulfamuron.

The baselines are shifted for display.)

A: Standard solution (20 ng/mL: 0.08 ng as each pesticide)
B: Sample solution of rice straw (spiked at 0.2 mg/kg of each pesticide (as 20 ng/mL in sample solution))
C: Sample solution of WCRS (spiked at 0.09 mg/kg fed basis of each pesticide (as 20 ng/mL in sample
solution))
D: Sample solution of paddy rice (spiked at 0.2 mg/kg of each pesticide (as 20 ng/mL in sample solution))
3.5

定量下限及び検出下限
ベンスルフロンメチルの検量線が直線性を示した範囲，各 0.5~100 ng/mL の下端付近となる濃度（試料中で 0.01 mg/kg 相当量（最終試料液中濃度 1 ng/mL 相当量））の添加回収試験の結果はTable 5 のとおり良好であり，得られたピークの SN 比が 10 以上であったため，ベンスルフロン
メチルの定量下限の濃度は試料中で 0.01 mg/kg とした．この濃度は，ベンスルフロンメチルの稲わら及び WCRS 中の管理基準値の風乾物中換算値（それぞれ 0.1 及び 0.1125 mg/kg）に対してそれぞれ 1/10 及び 4/45 であり，妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値（基準値に対して1/5 以下）を満たしていた．また，ベンスルフロンメチルの検出下限を確認するため，添加回収試験により得られたピークの SN 比が 3 となる濃度を求めた．その結果，検出下限は試料中で0.003 mg/kg であり，同様に妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値（基準値に対して1/10 以下）を満たしていた．
同様に，添加回収試験の結果が良好であったシクロスルファムロン，エトキシスルフロン及びフルセトスルフロンについても，得られたピークの SN 比が 10 以上であったため，定量下限の濃度は試料中で 0.01 mg/kg とした．また，添加回収試験により得られたピークの SN 比が 3 となる

<65>

60

飼料研究報告 Vol. 47 (2022)

濃度を求めたところ，検出下限は試料中で 0.003 mg/kg であった．
3.6

希釈液におけるマトリックス効果の確認
3.3 において，稲わら及び WCRS 中のアジムスルフロン，ハロスルフロンメチル及びイマゾス

ルフロンについて，測定時にイオン化を抑制するマトリックス効果が認められた．そこで，最終試料溶液を希釈することによりマトリックス効果の低減を検討した．2.4 の 1)から 3)により調製した稲わら及び WCRS のブランク試料溶液に，各農薬として 0.1 mg/kg 相当量（最終試料溶液中
で 10 ng/mL 相当量）を添加した各マトリックス標準液並びに同マトリックス標準液をアセトニ
トリル－水（1+1）で 2，5，7 及び 10 倍に希釈した液について，同濃度の農薬混合標準液に対するピーク面積比を確認した．その結果は Table 6 のとおり，アジムスルフロン，ハロスルフロン
メチル及びイマゾスルフロンについて、希釈することでマトリックス効果によるイオン化抑制の低減が認められ，5 倍以上の希釈をすることで，農薬混合標準液に対するピーク面積比が80~120 %以内となり，マトリックスによる大きな影響を受けることなく定量が可能であった．
Table 6

Matrix effect study by diluted sample solutona)Matrix effect (%)
Pesticides

Rice straw
b)

×1
74.8

c)

×2
87.8

Bensulfuron-methyl

96.9

Cyclosulfamuron
Ethoxysulfuron

WCRS

×5
94.4

e)

×7
102

f)

×10
99.1

b)

×1
66.6

×2
64.1

×5
95.4

×7
101

e)

×10
101

100

96.7

93.2

91.0

96.7

92.2

100

103

91.8

96.4

101

96.8

102

92.3

96.1

98.0

97.5

104

94.7

87.7

99.3

92.7

103

82.3

89.8

84.9

94.3

102

86.6

Flucetosulfuron

79.5

90.5

100

107

88.0

78.1

74.0

98.0

104

86.0

Halosulfuron-methyl

70.2

82.6

92.4

102

105

63.8

59.6

82.9

104

111

Imazosulfuron

67.7

83.1

91.9

98.1

86.6

65.5

67.0

89.7

104

81.0

Azimsulfuron

d)

c)

d)

a) Ratio of peak area of pesticides in the presence of matrix to that in the absence of matrix.

f)

The

concentration in matrix standard solution was 10 ng/mL (spiked at 0.1 mg/kg as air-dry basis).
b) n = 3 (no dilution)c) n = 1 (2 times dilution)d) n = 3 (5 times dilution)e) n = 2 (7 times dilution)f) n = 1 (10 times dilution)

4まとめ

飼料用稲に残留するベンスルフロンメチルについて，LC-MS/MS を用いた定量法の飼料分析基準への収載の可否について検討したところ，以下の結果が得られた．また，アジムスルフロン，イマゾスルフロン，エトキシスルフロン，シクロスルファムロン，ハロスルフロンメチル及びフルセト
スルフロンについて，ベンスルフロンメチルとの同時定量法としての適用を併行して検討したところ，以下の結果が得られた．
1)

検量線はそれぞれ 0.5~100 ng/mL 相当量（注入量として 0.002~0.4 ng 相当量）の範囲で直線性を示した．
なお，当該検量線の濃度範囲は，各農薬を 0.005~1 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の濃度範囲に相当する．

<66>

飼料用稲中のベンフルスロンメチルの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の開発

61

2)

本法に従って得られたクロマトグラムには，定量を妨げるピークは認められなかった．

3)

本法に従い得られた試料溶液についてマトリックス効果を確認した結果，ベンスルフロンメチ
ルについてはマトリックス効果は認められなかったが，稲わら及び WCRS 中のアジムスルフロ
ン，イマゾスルフロン及びハロスルフロンメチルはマトリックスによる影響が認められた．

4)

稲わら及び籾米に各農薬として 0.01 及び 0.2 mg/kg 相当量，WCRS に各農薬として原物換算して 0.004 及び 0.09 mg/kg 相当量を添加し，本法に従って 5 点併行分析を実施し，回収率及び繰返し精度を求めたところ，ベンスルフロンメチルについては妥当性確認法ガイドラインに定められた真度及び併行精度の目標値を満たす良好な結果が得られた．また，エトキシスルフロン，シクロスルファムロン及びフルセトスルフロンについても妥当性確認法ガイドラインの目標値を満た
していた．

5)

本法のベンスルフロンメチルの定量下限は 0.01 mg/kg，検出下限は 0.003 mg/kg であった．設定
した定量下限及び検出下限は，妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値を満たしていた．
同様に，エトキシスルフロン，シクロスルファムロン及びフルセトスルフロンの定量下限は 0.01
mg/kg，検出下限は 0.003 mg/kg であった．

6)

本法においてマトリックスによる影響が認められた稲わら及び WCRS 中のアジムスルフロン，
イマゾスルフロン及びハロスルフロンメチルについて，最終試料溶液を溶媒で希釈して測定した
ところ，5 倍以上に希釈することで，マトリックス効果による影響を受けずに測定が可能であっ
た．

文

献

1)

食品安全委員会農薬専門調査会：農薬評価書

ベンスルフロンメチル，平成 22 年 10 月 (2010).

2)

農林水産省畜産局長通知：飼料の有害物質の指導基準及び管理基準について，昭和 63 年 10 月
14 日，63 畜 B 第 2050 号 (1988).

3)農林水産省消費・安全局長通知：飼料分析基準の制定について，平成 20 年 4 月 1 日，19 消安
第 14729 号 (2008).

4)

一般財団法人日本食品分析センター：平成 25 年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業
飼料中の有害物質等の分析法の開発 (2014).

5)

一般財団法人日本食品分析センター：平成 27 年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業
飼料中の有害物質等の分析法の開発 (2016).

6)

財団法人日本食品分析センター：平成 21 年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業
中の有害物質等の分析法の開発 (2010).

<67>

飼料