「新産業を生む科学技術」 研究成果報告会２０２３

大量細胞集団を超網羅的に問診するロボットの実現
研究代表者

氏名 太田禎生 東京大学 先端科学技術研究センター 准教授
共同研究者

氏名 林洋平 理化学研究所 バイオリソース研究センター チームリーダー＜Space＞
1. 研究の背景と達成目標
細胞の構造（イメージ）情報を判別する際に、私たちは既存の知識や経験・勘に頼って来ました。最近では、AIを使った解析も進んでいます。しかし AI を使っても、教えるのが私たち人である限り、未知の対象に対して意味のある判別を行うのは困難です。この人の限界を越えるための一つのアプローチは、大量の細胞ひとつひとつからイメージデータと分子（シークエンス）データを多角計測し、その統合データからイメージ情報を判別する解析モデルを開発することだと考えました。
そこで本研究では、観察対象を閉じ込めた微小ゲル/液滴に対して、新規「イメージ核酸（ID: Image and DNA）バーコーディング」とインプット DNA バーコーディングを行い、装置間の壁を越えて識別することにより、迅速かつ網羅的に解析を行う ID サイトメトリーを開発することを目指しました。この手法を、様々な細胞モデルに適用し、技術の実証を行うと共に、細胞応答機構や疾患機構解明や細胞機能制御を、大量のノンバイアスデータの統合的解析から図ることを提案しました。このような系の開発により、最終的には、生きた細胞の状態をイメージングデータから読み取り、適した摂動を与えることで私達生体の構成ユニットでありながら未知に包まれた大量の細胞との、最適なコミュニケーションの術を探索できることを目指しています。
2. 主な研究成果と社会、学術へのインパクト①イメージ核酸バーコーディング技術の開発：idBB（image and DNA barcoding beads）の安定・大量作製手法を開発して、イメージ核酸バーコーディング手法の開発に成功しました。また、idBB の正確な読み取りのための機械学習手法も開発しました。本手法により、浮遊したゲルや液滴ユニットごとに、様々な手法や装置で計測されたデータを、計測後にバーコーディング情報で、マルチモーダルに繋ぐことができるようになりました（論文査読中、５項の論文[1][2]）。本手法により、idBB を実用化して細胞の多角解析技術として利用することが考えられるだけでなく、人の能力・知識で及ばない精細・迅速な細胞形態医療診断などに繋がると期待しています。
②光流体三次元イメージング解析装置の開発：細胞三次元構造情報と、idBB にエンコードされた蛍光コード情報を、正確に読み出すための、高速三次元多色蛍光イメージング計測手法を開発し、数十万細胞の解析を実施しました（論文査読中、５項の論文４、５番）。世界最速の三次元蛍光イメージングフローサイトメトリー法であり、研究用装置だけでなく、高精細・迅速な細胞形態医療診断などに繋がると期待しています。
③三次元細胞培養系の開発：ハイドロゲルビーズを細胞培養の担体として用いた多細胞スフェロイド培養系を開発し、単一細胞イメージングだけでなく、相互作用をしている複数細胞モデル系を開発し、その画像解析プラットフォームも開発しました。上記のマルチモーダル計測系や三次元イメージング計測系と組み合わせることで、様々な生命科学の研究や、細胞表現型創薬スクリーニングなどにおいて、活用可能性があると考えています。

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「新新産業を生む科科学技術」 研究
究成果報告会２００２３3. 研究成果
果
①イメージ
ジ核酸バーコーーディング技術の開発
本技術は、光強度やササイズと言ったた光学識別情情報と１対１対応応する固有 DNA
D
バーコーードで修飾しした光核酸バーーる事で、光流体デバイス中中に細胞を通通してイメージジン
コードビーズ（image and DNA barcoode beads: iddBB）を用いる
伝子シークエエンシング解析析するだけで、一細胞毎にに結びついたた光画像と遺伝伝子発現情報報グし、丸ごと一細胞遺伝測できる仕組みです。具体体的には、数十十種の idBB
B を大量に用用意し、細胞とと共に複数・ラランダムに微小小を大量計測
液滴中に封封入すると、iidBB の組みみ合わせ爆発発により多数のの細胞を固有有に光学バーコーディンググします。さらに互いに全てて異なる DNAA バーコード
ドで修飾した別別のビーズ（市販品）と組組み合わせ、一一細胞遺伝子
子発現シークエンシングをを行う事で、１細細胞単位に形形態と発現情情報が紐付く仕仕組みです。
より具体的的に本研究ででは、idBB 担体としてアル担ルギン酸のハハイドロゲール
ルビーズを採採用し、光イメージングによより判別可能なな色素の 25 種類の組み合種合わせと、対応応した DNA オリゴを修飾オ飾させる作成法法を開発しましした。その結果
果、作られたビ
ビーズライブラ
ラリを光イメーージングし、そその輝度スペククトル情報を解解析した結果
果、スペクトルル情報により、しっかりと 255 種に分類可可能であることとが検証されまました（下図左左）。
次に、作作製した
idBB のライ
イブラリが複数閉じ込め度で、細られる濃度胞と共にア
アガロー
スハイドロ
ロゲルビーズに、ママイクロ液滴生成 技術を用いて包埋するBB の組ことで、idB
み合わせ で標識
ニ トをさ れ た ユ ニッ作製しまし
し た。この上で、ユユニットを市販販イメージンググ装置で迅速速に大量撮影を行い、細胞胞画像を得るとと同時にビーーズ画像を得て、画像解析にによりビーズのの組み合わせせを読み出します。その後後、撮影を終ええたユニット群群を、マイクロロ液滴技術を用
用
いた、１細胞胞遺伝子発現現解析アッセ
セーにかけ、シシークエンス解解析を行うこことにより、１細細胞遺伝子発発現情報と共に、一緒にいたた idBB を標識識していた DN
NA オリゴの組組み合わせがが読み出されれます。最終的的に、イメージジング下で読みみ出された iddBB の組み合合わせと、シーークエンス下で読み出されれた idBB の組組み合わせをを照合することとで、細胞の顕顕微鏡画像とと遺伝子発現現情報を紐づけ、プールささせた細胞集団のマルチモモーダル解析
析を実現しましした[1, 2]。
②光流体三三次元イメージング解析装装置の開発
市販の装置置を使った際際のイメージジング速度ででは足りなかかったため、我々は、我
Axiial-plane opticcal microscoppy（APOM）と名付けたた光学系を改改変することとにより、単単一の対物レレンズを用いてライトシート励起光を作り、同じじ対物レンズズを用いてラライトシート
ト内で励起さされた対象のの 2D 切断面面を、カメラの検出素子に結像する装装置を開発しし、高速な 3D
3 イメージジング系を確確立しました
た。次頁の左左上図の顕微
微鏡光学系の模模-22-

「新新産業を生む科科学技術」 研究
究成果報告会２００２３

式図に示す
すように、単一一対物レンズズでの 3D
ライトシートト蛍光顕微鏡鏡システムを実実現しました。また、ssCMOS カメ
メラの稼働素子子を右上図のようにに狭めることででフレームレーート上げ、
後述する流流体技術に合合わせてイメメージングを高速化でできるように工工夫しました。検証として、培養細細胞の細胞質質と細胞核をそそれぞれ緑色と青色色に染めてガガラス管でで きた光音
響デバイス
スに送液し、流流路内にて音音響により整列されてて並進しているる細胞の(右図図中断)、ライトシー ト光切断二次次元画像を連連続的に得た上で、三次元画像像を構築しましした。その結果、世界界最速スピードドでの、2,0000 細胞毎秒以上の検検出スループプットでの撮影影に成功しました(右右図下段 [55])。さらに、分分裂中のK562 細胞胞の核形態のの解析を、迅速速大規模に行いましした。5 分間程程度で撮影さされた 40万程度の細胞に対し、核染色に用いた
DAPI と MPM-2Mの輝度度から、Mitottic Phase
中の細胞ををゲートし、細細胞の三次元元画像から核をセグ
グメンテーシションし、そしして PCA:
Principal Component
CAAnalysisに基づいた手法により、迅迅速に楕円体体である核のの長軸・短軸を自動的的に計算し、アアスペクト比をを算出しました
た。その結果果、二次元画像像の解析で得得られるアスペペクト比に比べべて、三次元
元画像の解析
析ではより大ききな比が得られれており[5]。より正確な、細細胞内構造のの解析に有用用である証左
左となったと考考えています。
③三次元細細胞培養系のの開発
数十 µm 直径のハイドロ直ロゲルビーズをを、細胞培養養の担体としてて用いた多細細胞スフェロイイド培養系を開開発し、相互作作用をしていいる複数細胞モモデル系を開開発しました。
。このモデル系に対して、上記の三次次元イメージン
ング計測解析
析を適用し、大大量に多色蛍蛍光観察したススフェロイド系系に対して、画画像解析プララットフォームムを開発しましした（論文投稿稿準備中）。さらに、マイク
クロデバイス内内に液滴やゲゲルを捕獲・アレイ化するる手法を開発
発し、長時間のの培養・観察にを確立させていいます[3]。
適した系を
4. 今後の展展開
上記に開発
発した光学核核酸バーコーディング計測
測法、高速三三次元計測手法、そして三三次元培養細細胞モデルを融融合し、細胞胞応答機構やや疾患機構解解明や細胞機機能制御を、大大量のノンババイアスデータタの統合的解解析から図る挑挑戦を進めてています。上記
記のマルチモモーダル計測
測系や三次元元イメージング
グ計測系と組組み合わせることで、様々な生命科学のの研究や、細細胞表現型創創薬スクリーニニングなどにおおいて、活用用可能性がありります。そしてて、生きた細胞胞の状態をイイメージングデ
データから読読み取り、適しした摂動を与ええることで、大大量の細胞にに対する最適適なコミュニケーーションの術術を研究していいきます。

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5. 発表実績
論文発表
1. Kawasaki F, Mimori T, Mori Y, Sato I, Ota S*, Identification of In-droplet Multicellular Communities byLight-induced Combinatorial DNA Barcoding, under review.
2. Kawasaki F†, Mimori T†, Mori Y, Aburatani H, Yachie N, Sato I*, Ota S* († equal contributions),
Computational microdroplet design for optical cell barcoding, under review.
3. Hattori K, Goda Y, Yamashita M, Yoshioka Y, Kojima R, Ota S*, Droplet array-based platform for parallel
optical analysis of dynamic extracellular vesicle secretion from single cells, Anal. Chem. 94, 32,11209–11215, (2022).
4. Ugawa M, Ota S*, High-speed 3D-imaging flow cytometry with optofluidic spatial transformation,
Biomedical Optics Express 6:3647-3656, (2022).
5. Ugawa M, Ota S*, High-throughput parallel optofluidic 3D-imaging flow cytometry, Small Science,(2022).
6. Ota S., Sato, I. and Horisaki, R., Implementing Machine Learning Methods for Imaging Flow Cytometry.
Microscopy. 69 (2), 61-68 (2020).
特許1. Y. Tsuyama, Y. Yoshioka, S. Ota, 高速液滴分析装置, 2022. 出願番号: 63/422611
2. M. Ugawa, S. Ota, ３次元画像撮像装置, 2022, 特願 2022-037527
3. F. Kawasaki, Y. Mori, S. Ota, 細胞標識分子及び細胞の分析方法, 2021, 特願 2021-157113
4. M. Ugawa, S. Ota, Imaging Flow Cytometer, 2020, 特願 2020-152331
5.

S. Ota, Image-barcoded cytometry 2020, 62/959,420、特願 2020-065988 号

6.

S. Ota, Tsubouchi, A., Kawasaki, F., New Method for cell-based phenotypic screening, 2020

主な国際学会発表
Ugawa M, Ota S, High-speed 3D light-sheet imaging of cells flowing at over 10 m/s, High-Speed
Biomedical Imaging and Spectroscopy VIII, part of SPIE BiOS (2023).

Yamashita M, Hattori K, Kirisako H, Chen X, Ugawa M, Ota, S, High-throughput parallel optofuidic
3D-imaging of adherent cells in adherent state, The 26th International Conference on Miniaturized Systemsfor Chemistry and Life Sciences (2022).

Ugawa M, Ota, S, High-speeed 3D imaging flow cytometry, The 26th International Conference onMiniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (2022).

主な招待講演（国際）The 1st Virtual Human Development Consortium Workshop, Vancouver, Canada, 10/2022

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The 1st SIG meeting of Data Analytics for Imaging Systems (DAISy), Glakso Smith Kline, Online
03/2021-4-「新産業を生む科学技術」 研究成果報告会２０２３The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2021, High-dimensional flow cytometry
for studying heterogeneity of small particles, 2021

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