「新新産業を生む科科学技術」 研究
究成果報告会２００２３

転
転写開始点点の光操作作により実現
現する革新
新的タンパク
ク質局在制制御技術
研
研究代表者

松松下
智直 京都大学大学
京学院理学研研究科 教授＜＜Space＞
1. 研究の背背景と達成目標標
生命現象
象の基盤はタタンパク質の機機能であり、これまでのババイオ産業のの多くは個々ののタンパク質の機能改変に基づくものであった。しかしながら、11 つの生物にに存在するタンンパク質の種種類の総数はは数万・数十万万にも及ぶため、従来方法にによる生命現現象の人為的制制御は極めてて限定的であある。
そこで本
本研究では、タタンパク質のの細胞内での局在部位およびその機能能をゲノム規模模で自由自在在に制御し、これまで成しし得なかったレレベルで生命命現象を操る技術の開発をを目指し、それを実現させせるための技術的基盤の構構築を行う。
フィトクロ
ロムは、赤色光光で活性化さされ、遠赤色光光で不活性化化される、植物物の主要な光光受容体でああり、PIF と呼ばれる転写因因子群の働ききを阻害し、そその 2,000 ほどの標的遺ほ遺伝子の転写量量を変化させせることで、植植物の様々な光光応答を引きき起こすと考ええられている。しかしながら我々は最近
近、フィトクロムムが、上記のの転写量制御に加えて、ささらに別の 2,0000 を超える遺遺伝子に直接接働きかけそそれらの転写開開始点を変化化させること、そそしてこれにに伴い 400 以上
上ものタンパ
パク質の細胞内内局在が、様様々な細胞内区画の間で、、様々な方向向に、様々なタタイムコースでで変化するこことを発見した
た（Ushijima ett al., Cell 2017）。
したがっって、これらのの多様なタンパパク質局在変変化パターンをを示す標的遺遺伝子の、ププロモーター領領域を含む 5ʼ5末端断片をを、それぞれ異なる任意タタンパク質遺伝伝子のコードド領域に付加しし、それら全ててを 1 つの細細胞に導入すする
ことで、シググナル配列以以外の余計ななドメインを付付加することななく、複数タンパク質の細胞胞内局在を、任意の細胞内区画間で、任意の方向向に、任意のタタイムコースでで、それぞれ自由自在に同同時光操作すすることが可能能になると考えられる。
そこで本
本研究では、現現在不明でああるフィトクロムによる転写写開始点制御御の分子機構
構をモデル植物物であるシロ
ロイヌナズナににおいて解明明し、その制御御系を酵母やや動物細胞でで再構成するこことで、転写開開始点の光操操作によってて、複数のタググ無しタンパクク質の細胞内内局在を、それれぞれ自由自自在に、同時時に操る、革新新的タンパク質局在制御技技術の開発をを目指す。そしてそのためめに、具体的にに以下の 4 つの研究項目
つ目の達成を目標とする。
①フィトクロロムによる転写写開始点制御
御の分子機構構解明
転写因子の標的遺伝伝子への結合合様式の解明
明、フィトクロムによる転写写開始点制御
御に必要な因子の順遺伝学
学的同定
定。
②フィトクロロムによる転写写開始点制御
御の出芽酵母母における再構
構成
上記研研究開発項目でで同定されたた構成要素とフィトクロム遺遺伝子を、標的的遺伝子のゲゲノム DNA 断片と共に、断出芽酵母母に導入する。
③様々なパパターンでタンンパク局在変変化を示すプロモーターラライブラリーの作製
形質転転換シロイヌナ
ナズナの実験系
系で、当該制制御を受けるののに十分な最最短のプロモーター領域をを同定する。
④再構成系
系における複複数任意タンパパク質の細胞胞内局在の同同時光操作
複数のプロモーター
ー最小断片のの 3ʼ末端に、そそれぞれ異ななる蛍光タンパパク質遺伝子子を付加し、ここれら全ての断断片を、上
上記の再構成成系においてて 1 つの出芽酵酵母ゲノムへへ挿入する。

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2. 主な研究
究成果と社会、、学術へのイ
インパクト・フィトクロム
ムによる転写写開始点制御系の構成に十十分なタンパパク質性因子ににおける要素素を明らかにすするために、当該制御に必必要な因子のの順遺伝学的的・逆遺伝学的的同定を進めめた。そして逆逆遺伝学的解解析により当該制御に必要要な因子としして特定の転写因子を同定定し、さらにここの転写因子子が通常とは異異なる特殊なな結合様式にによって標的遺遺伝子上に結結合していることを明らかにした。また変変異体スクリーニングによよる順遺伝学学的解析によりり、当該制御に必要な因子子の同定を進進めた。
・標的遺伝伝子のプロモーーター解析ににより、タバコ植植物を用いた
た Agrobacterrium infiltrattion 法による一過的発現系系
において、当該制御に必要なプロモモーター上のの特定の領域を同定し、また当該制御にに十分なプロロモーター領域域を大幅に狭狭めることに成成功した。そししてそれらの結果を、シロロイヌナズナのの形質転換植植物を用いた安定発現系において確認認することに成成功した。
・転写開始
始点選択というう現象は、転転写・スプライシング・翻訳訳と並んで、真真核生物の遺遺伝子発現制制御における普普遍的な一過過程であると考えられるたため、本研究によりそのユユニークな制御御機構が解明明されれば、生物学一般における極めめて重要な成成果となる。したたがってそのの知識は、将来来的に教科書書に記載されれるなどして、科学的啓蒙蒙という観点かから社会・国民民に広く還元さされるべきもののと考えられる。

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3. 研究成果
フィトクロムによる転写開始点制御系を酵母や動物細胞で再構成するためには、まずその分子機構を解明し、当該制御の構成に十分な、タンパク質性因子と DNA シス配列における要素をそれぞれ明らかにする必要がある。
そのために我々は、フィトクロムによる転写開始点制御に必要な因子の順遺伝学的・逆遺伝学的同定、および当該制御に必要十分なプロモーター領域の同定を進めた。そしてその結果、逆遺伝学的解析により、当該制御において中心的な役割を担う転写因子の同定に至った。
また変異体スクリーニングによる順遺伝学的解析では、当該制御に必要な因子の候補を複数得た。一方、標的遺伝子のプロモーター解析では、タバコ植物を用いた Agrobacterium infiltration 法による一過的発現系において、当該制御に必要なプロモーター上の特定の領域を同定し、また当該制御に十分なプロモーター領域を大幅に狭めることに成功した。そしてそれらの結果を、シロイヌナズナの形質転換植物を用いた安定発現系において確認することに成功した。
さらに、フィトクロムによる転写開始点制御に必須の因子として同定した特定の転写因子が、通常とは異なるしくみで標的遺伝子のプロモーター領域に結合していることを発見したが、その詳細な分子機構を解明するまでには至らず、当該制御を受けるのに十分なプロモーター最小断片を同定したものの、当該制御の酵母細胞内での再構成を果たすことはできなかった。

4. 今後の展開
本研究で解明される転写開始点制御の分子機構は、真核生物に共通に備わる機構である可能性が高く、したがって本研究で開発する技術は全ての真核生物に応用可能な、極めて汎用性の高い技術として、基礎・応用の両面から様々な場面で活用されると考えられるため、本技術を開発後は、直ちに特許を取得し知的財産を確保する必要がある。
同規模の転写開始点変化によるタンパク局在制御は、植物のフィトクロムシグナルに限らず、真核生物におけるありとあらゆるシグナルによっても引き起こされると考えられる。よって、今後動物でも、様々なシグナルによる同規模のタンパク局在制御が発見されると思われるが、その際、それらの生命現象の解析には、本研究で得られる知識と技術が不可欠となるであろう。
技術的には、プロモーターライブラリーを、1) タンパク質の局在変化のパターン、そしてその変化の 2) 方向と、3) タイムコース、の 3 点について、さらに選択肢を増やして充実させる必要がある。そのためには、まずはフィトクロムによる制御系において、さらに様々なタイムコースで TSS-seq を行い、より多くの標的遺伝子を同定する必要があるだろう。そして将来的には、それらの何千という数の標的遺伝子を解析することで、転写開始点変化の方向やタイムコースを規定する分子機構も解明されるものと思われる。
本技術がすぐに応用されることが想定される用途の一例として、酵母などにおける人工代謝経路設計による有用物質の効率的な生産などが挙げられる。本技術により、ある代謝経路上の全ての酵素の細胞内局在を、他の任意細胞内区画に一気に変化させることが可能となる。その際、本技術の特徴である、赤色光／遠赤色光の強度比によるアナログ可変操作と、個々の遺伝子の total mRNA 量を一定に保ったままの転写開始点制御によって、これまで困難であった内在性代謝経路からバイパス経路への状況に応じた精密な切り換え制御が可能となる。これはあくまでも応用の一例に過ぎず、同様の繊細かつ大胆な光操作は、真核生物におけるありとあらゆる系に応用可能であると考えられる。

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5. 発表実績

原著論文
1. Kobayashi H, Murakami K, Sugano SS, Tamura K, Oka Y, Matsushita T, Shimada T. Comprehensive analysis ofpeptide-coding genes and initial characterization of an LRR-only microprotein in Marchantia polymorpha. Front

Plant Sci. 13: 1051017 (2023)
2. Moriya KC, Shirakawa M, Loue-Manifel J, Matsuda Y, Lu YT, Tamura K, Oka Y, Matsushita T, Hara-Nishimura I,
Ingram G, Nishihama R, Goodrich J, Kohchi T, Shimada T. Stomatal regulators are co-opted for seta developmentin the astomatous liverwort Marchantia polymorpha. Nat Plants 9: 302-314 (2023)
3. Takeda T, Shirai K, Kim YW, Higuchi-Takeuchi M, Shimizu M, Kondo T, Ushijima T, Matsushita T, Shinozaki K,Hanada K. A de novo gene originating from the mitochondria controls floral transition in Arabidopsis thaliana. Plant

Mol Biol. 111: 189-203 (2023)
4. Nomoto M, Skelly MJ, Itaya T, Mori T, Suzuki T, Matsushita T, Tokizawa M, Kuwata K, Mori H, Yamamoto YY,Higashiyama T, Tsukagoshi H, Spoel SH, and Tada Y. Suppression of MYC transcription activators by the immune
cofactor NPR1 fine-tunes plant immune responses. Cell Rep. 37: 110125 (2021)
5. Yagi H, Tamura K, Matsushita T, and Shimada T. Spatiotemporal relationship between auxin dynamics andhydathode development in Arabidopsis leaf teeth. Plant Signal Behav. 16: 1989216 (2021)
6. Yagi H, Nagano AJ, Kim J, Tamura K, Mochizuki N, Nagatani A, Matsushita T, and Shimada T. Fluorescentprotein-based imaging and tissue-specific RNA-seq analysis of Arabidopsis hydathodes. J. Exp. Bot. 72:
1260-1270 (2021)
招待講演
1.

Matsushita T “Phytochrome regulates alternative promoter selection in Arabidopsis”
International Conference of the Genetics Society of Korea 2022 (Jeju, South Korea, October 2022)2.

松下智直 「植物の光受容体フィトクロムによる遺伝子発現の多段階制御機構」
DIC 総合研究所セミナー (佐倉、2022 年 5 月)

3.

松下智直 「植物の不均一環境変動への適応を支える転写開始点制御機構」
植物科学シンポジウム 2021 (東京、2021 年 11 月)

4.

松下智直 「植物が光を感じる秘密」
特別展「植物」オンライン講演会 特別講演 (東京、2021 年 7 月)

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