Jpn. J. Protozool. Vol. 36, No. 2. (2003)

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Original
繊毛虫コルポーダ（Colpoda sp.）のシスト形成・脱シスト誘導因子
和唐智子1・山岡雅仁1・長尾美智子2・荻沼一男2・松岡達臣1,*1
2

高知大学理学部自然環境科学科 〒780-8520 高知市曙町2-5-1
高知女子大学生活科学部環境理学科 〒780-8515 高知市永国寺町 5-15

Inducing factors for encystment and excystment in ciliated protozoan Colpoda sp.
Tomoko WATOH1, Masahito YAMAOKA1, Michiko NAGAO2, Kazuo OGINUMA2
and Tatsuomi MATSUOKA1
1

Department of Natural Environmental Science, Faculty of Science, Kochi University,
Kochi 780-8520, Japan2
Department of Environmental Science, Kochi Women’s University, Kochi 780-8515,
JapanSUMMARY
In many kinds of protozoans, cyst formation (encystment) and excystment which involves structuraltransformation processes constitute the drastic process of cell reconstruction mediated by signaling chains
including gene expression that is triggered by environmental signals. In order to establish a model system
for understanding the molecular mechanisms of encystment and excystment, we aimed to elucidate theenvironmental factors that activate the signal transduction chain leading to encystment and excystment ofColpoda sp. The present study showed that cyst formation of Colpoda was repressed by bacteria, whileaccelerated by saline solution. The excystment of the cells was induced by certain components containedin dried cereal leaves.

はじめに原生動物の多くは乾燥、飢餓、周囲の水環境の悪化といった急激に変化する野外の苛酷な条件下で生活している。このような外部環境変化の下で生き延びるために、原生動物の一部にはシストになって休眠する*Corresponding author
Tel: +81-88-844-8315
Fax: +81-88-844-8356
E-mail: tmatsuok@cc.kochi-u.ac.jp
Received 17 June 2003; Accepted 14 July 2003

ものがある。休眠シスト形成および脱シスト過程では、環境シグナルの受容・変換および細胞内シグナリングを介した多くの遺伝子の発現調節を伴う細胞の劇的な再編成が起きると考えられる。現在までに、電子顕微鏡等を用いた形態変化の追跡（Delgado et al.,
1987; Delmonte Corrado et al., 1996; Foissner and Foissner, 1987; Grimes, 1973; Matsusaka, 1979; Matsusaka etal., 1989; Repak, 1968; Repak and Pfister, 1967;高橋ら,2002）、シスト化・脱シスト化誘導因子の探索（Rastogiet al., 1973; Tomaru, 2002; Yonezawa and Takahashi,1990）、シスト特異的に発現するタンパク質の解析（Hirukawa et al., 1998; Izquierdo, et al., 2000; Suizu andMatuoka, 1998; Villalobo et al., 2001）、シスト形成・脱106

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Fig. 1. Life cycle of Colpoda.

シスト誘導に関わる受容体の探索（Yang and Villemez,1994）などに関する多くの研究がなされ様々な知見が得られている。しかし、残念ながら、多様な原生動物種においてなされた研究成果を統合しても、シスト形成や脱シストに至る全容を分子レベルで理解することは現時点では困難である。シスト形成や脱シスト化を高率にかつ同調的に速やかに誘導できる材料と実験系が用いられていないことが、分子レベルでの研究を飛躍的に展開できない一因であると思われる。それゆえに、分子レベルでの解析を可能にするようなモデル生物／実験系を構築することが重要である。
本研究の実験材料として用いたコルポーダ（Colpoda sp.）は畑の落ち葉から単離したものであるが、この種は増殖速度が非常に速く、短時間で高率にシスト形成／脱シストを誘導できることがわかった。
すでにコルポーダのシスト形成に関しては複数の研究報告がなさているが（Delmonte Corrado et al., 1996;
Izquierdo et al., 2000）、その誘導因子に関する確かな実証すら得られていないのが現状である。本研究では、コルポーダを用いてシスト形成／脱シスト誘導機構の全容解明に向けたモデル実験系を確立することを視野に入れ、その基盤的研究としてシスト形成および脱シストの誘導因子の探索を行い誘導因子を明らかにした。

材料と方法
畑で採取した落ち葉を蒸留水に浸し、脱シストして増殖したコルポーダ（Colpoda sp.）を単離し、麦葉浸出液（0.01~0.1%）にバクテリア（Enterobacter aerogenes）を植え付けた培養液を用いてクローン培養を行った（23℃，暗黒条件下）。麦葉浸出液（１％）は、乾燥麦葉粉末（5 g）を500 mlの蒸留水に懸濁し数分間煮沸したものをろ過して作成した。バクテリアは0.5%ポリペプトン、1% 肉エキス、0.5 % NaClを含む1.5% 寒天培地で室温にて培養した。
シスト形成の誘導実験では、２～３日間培養したコルポーダをピペットを用いて時計皿に満たした約2mlの各種テスト液（本文および図の説明に記述）に懸濁し、数回洗った後一定時間後に実体顕微鏡下で観察した。脱シスト誘導実験では、シスト化して数週間経過したものをピペットを用いて塩類溶液 （1 mM
CaCl2, 1 mM KCl，5 mM Tris-HCl，pH 7.1）に懸濁して数回洗った後各種テスト液に移した。すべての実験は約25℃、室内蛍光灯の光条件下（0.1～0.5 W/m2）で行った。
麦 葉 成 分 を HPLC（ナ カ ラ イ、Cosmosil 5C18AR300カラム装着）分析する場合は、５mlの麦葉浸出液（1%）をロータリーエバポレータで乾燥し、0.1%TFAを含む0.5 mlの蒸留水に再溶解（10倍濃縮）

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Fig. 2. Effects of salts (CaCl2 and KCl) or mannitol on induction of Colpoda encystment. (a)Typical time course of encystment. The rate of encystment was expressed as the percentage oftotal number of tested cells (50-60 cells). (b) The rate of encystment (%) at 8 hr after induction.
Columns and attached bars correspond to the means of four identical measurements (50-60 cells
per measurement) and standard error. △ and open column, 0.1 mM Tris-HCl buffer (pH 7.1)
containing 1 mM CaCl2 and 1 mM KCl; ○, and shaded column, 0.1 mM Tris-HCl buffer (pH7.1); ● and closed column, 0.1 mM Tris-HCl (pH 7.1) containing 5 mM mannitol.

したものを試料として用いた。上記サンプル100 µlをカラムにアプライして得れらた各分画を乾燥した後100 µlの塩類溶液（1 mM CaCl2, 1 mM KCl，5 mM
Tris-HCl，pH 7.1）に溶解した。この液を10 µlとってシストを懸濁した990 µlの塩類溶液に加え（0.1%麦葉浸出液1 mlに含まれる成分量に相当）、脱シストを観察した。
結果と考察
Fig. 1にコルポーダの生活環を示す。バクテリアを含む培養液中では、ほとんどのコルポーダは増殖サイクルをくり返した。増殖過程では、運動は停止し（繊毛が退化している可能性もある）、薄膜につつまれた状態で細胞分裂が起きて2細胞または４細胞が生じた（増殖型シスト）（Fig. 1Ｆ）。なお、栄養細胞（Fig.
1A）のままで細胞分裂する個体は現在のところ観察されていない。休眠シスト形成が誘導されると、数時間以内に繊毛が退化するとともに細胞体は丸くなり（Fig. 1B, 1C）、完成したシストの表面には複数の突起様のものが観察された（Fig. 1D、矢印）。脱シストは誘導後数時間から24時間くらいまでに起きるが、脱シスト直前のものでは収縮胞が活動を開始するので識別が可能である。収縮胞が活動を開始してから約２時間程度経過すると、薄膜（Fig. 1E、矢印）に包まれた細胞がシストの殻から出現し、数分後には薄膜が消失して繊毛を有する新生栄養細胞となった。薄膜から細胞が出てくるのか薄膜が細胞に吸収されるのかについては現在のところ不明である。
塩類を含まない非常に薄い緩衝液（0.1 mM Tris-HCl,pH 7.1）にコルポーダを懸濁した場合は、シスト形成が比較的高率に誘導される場合もあるがほとんど誘導されないこともあり、４回の実験結果の平均値は低い値を示した（Fig. 2b）。一方、外液に塩類が存在する場合はこのような不安定さは観察されず、各実験群においてほとんどの細胞がシスト化した（Fig. 2b）。
この結果は、外液にシスト形成誘導因子や抑制因子が存在しない場合は、細胞がシスト化に向かうか栄養細胞の状態でとどまるかといった決定機構が不安定な状態にあることを示唆している。Fig. 2の結果は、外液中の塩類（イオン）濃度の上昇がシスト形成を誘導するために有効であることを示しているが、これは外液の浸透圧の上昇に起因するものかも知れない。このため、塩類溶液（1 mM CaCl2, 1 mM KCl）と浸透圧的に等価な5 mMマニトール溶液中でのシスト形成率を観察した。この結果、マニトールによる外液浸透圧の上昇はシスト誘導効果はなく、むしろ抑制的な傾向がみられた（Fig. 2）。なお、Fig. 2bに示す3実験群間においては有意な差が認められた（p < 0.05, Kruskal-Wallistest）。
Fig. 3に示すように、培養液中のコルポーダ栄養細胞を標準塩類溶液（1 mM CaCl2, 1 mM KCl, 5 mM Tris-108

原生動物学雑誌 第36巻 2003年Fig. 3. Supression of encystment of Colpoda by living bacteria. (a) Typical time course of encystment. The rate of encystment was expressed as the percentage of total number of tested cells(50 cells). (b) The rate of encystment (%) at 10 hr after induction. Columns and attached bars
correspond to the means of four identical measurements (50 cells per measurement) and standard
error. ○ and open column, standard saline solution (1 mM CaCl2, 1 mM KCl, 5 mM Tris-HCl, pH7.1); ● and closed column, standard saline solution containing living bacteria (Enterobacteraerogenes) (about 106 cells/ml).

Fig. 4. Induction of excystment of Colpoda by cereal components. (a) A typical time course ofexcystment. The rate of excystment was expressed as the percentage of the total number oftested cells (50-100 cells). (b) The rate of excystment (%) at 24 hr after induction. Columns andattached bars correspond to the means of four identical measurements (50-100 cells per measurement) and standard error. ○ and open column, standard saline solution; ● and closed column,
standard saline solution containing living bacteria (about 107 cells/ml); □ and shaded column,
standard saline solution containing 0.1% cereal infusion. Cysts kept in the saline solution forseveral weeks were transferred into the test media.

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Fig. 5. (a) An elution profile of cereal components by a reverse-phase HPLC equipped with a column(Cosmosil 5C18 AR-300) having a 0-40% acetonitrile gradient containing 0.1% TFA. Prior to applicationof the sample (100 µl ) to the column, 5 ml of cereal infusion (1%) were dried and dissolved in 500 µl ofdistilled water containing 0.1% TFA. (b) Effect of cereal components fractionated by HPLC on Colpoda
excystment. ○, whole components of cereal infusion; □, fraction A; △, fraction B; ●, fraction C; ▲,fraction D. Fractionated samples were dried and dissolved in 100 µl of the saline solution. For assays, 10 µlof the medium containing fractionated components was added to 990 µl of saline solution suspending thecysts. The cysts kept in the saline solution for several weeks were transferred into the test media. The rate ofexcystment was expressed as the percentage of the total number of tested cells (50-100 cells).

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HCl, pH 7.1）に懸濁した場合、顕著なシスト化が起きたが、バクテリアを含む塩類溶液に懸濁した場合はシスト化はほとんど観察されなかった。この場合、２実験群間に有意な差が認められた（p < 0.05, MannWhitney test）。この結果は、バクテリアの存在は塩類（イオン）濃度の上昇によって誘導されるシスト化を抑制することを示している。
標準塩類溶液に放置しておいたシストをバクテリアを植え付けた培養液（麦葉浸出液）に移すと脱シストが誘導される。この場合、脱シストを誘導した因子として、1）培養液成分（麦葉成分）、2）バクテリアの存在、3）塩濃度の減少が考えられる。そこで、同時に誘導し放置しておいたシストを種々の条件下において脱シスト率を調べた（Fig. 4）。この結果、新鮮な標準塩類溶液では脱シスト誘導効果がなかったが、麦葉浸出液を含む標準塩類溶液中では顕著な脱シストがおきた。この場合、麦葉成分を含む塩類溶液にバクテリアが増殖し、バクテリア単独あるいは麦葉成分との相乗的な作用によって脱シストが誘導された可能性も否定できない。このため、シストを30分ごとに新鮮な液（麦葉浸出液を含む標準塩類溶液）に移しかえバクテリアが増殖しないようにした条件下で脱シストの観察を行った。この結果、４時間後の脱シスト率は、30分ごとにシストを移しかえた場合は55.3%（４回の実験の平均値）、移しかえなかった場合54.5%（４回の実験の平均値）であり、バクテリアの増殖の影響を排除した条件下でも脱シストが誘導されることがわかった。さらに、通常の培養液に増殖する程度の密度のバクテリアを懸濁した標準塩類溶液中では、脱シスト率は非常に低かった（Fig. 4）、しかし、 Fig. 4bに示す３実験群間において有意な差が認められたので（p< 0.01, Kruskal-Wallis test）、微弱ながらバクテリアの存在も脱シスト誘導効果をもつことは否定できないが、脱シストを誘導する主因子は麦葉成分であるといえる。塩濃度の減少が脱シストを誘導するかどうかについては現在詳細に調査中である。
葉浸出液に含まれる脱シスト誘導効果をもつ成分を同定するために、逆相HPLC分析を行った（Fig. 5a）。
得られた分画を４つに分け（A~D）、それぞれの分画に含まれる成分が脱シスト誘導効果をもつかどうかを調べた。この結果、分画Cに含まれる成分のみが脱シスト誘導効果を示すことがわかった（Fig. 5b）。現在のところ分画Cに含まれる成分をさらに分離することには成功していないが、乾燥麦葉に含まれる主要な水溶性成分が有効であることは確かである。
バクテリアの枯渇（Gutiérrez et al., 2001; Tomaru,
2002）や乾燥（山田・山際, 1980）はシスト形成誘導因子としてよく知られている事実であるが、本研究では、外液の塩（イオン）濃度の上昇によって誘導されるシスト形成はバクテリアによってキャンセルされることが明らかになった。しかし、この結果から、野外でのコルポーダのシスト化を説明することは困難であるように思われる。なぜならば、本研究で用いたコルポーダのように一時的に出現する水環境を生き延びている原生動物の場合、乾燥に向かいつつある環境シグナルを感知してシスト化する誘導経路が最優先されることが重要であると考えられるからである。
このため、乾燥シグナルとして働くと思われる外液中の塩類（イオン）濃度の上昇効果とバクテリア密度の関係について詳細に検討する必要がある。一方、脱シスト誘導因子は乾燥麦葉に含まれる水溶性成分である。この事実は、落ち葉周辺にごく短期間出現する水環境に適応した原生動物の生活環を説明することが可能である。すなわち、植物の枯葉の浸出液はバクテリアが増殖するために十分な栄養を供給できるので、このような成分を含む水環境は、コルポーダのようなバクテリア捕食性の原生動物が増殖するのに適していると考えられる。
謝辞
高知大学自然環境科学科の町田吉彦氏にはデータの統計分析をお願いするとともに有益なご助言を頂いた。ここにお礼を申し上げる。
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