別紙 1	 	 

厚生労働科学研究費補助金（難治性疾患克服研究事業）	 	 分担研究報告書	 	 
FOP の治療を目指した BMP シグナル抑制機構の解析に関する研究	 	 

研究分担者	  片桐岳信	  埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門	  教授研究協力者	  福田	  亨	  埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門	  助教	 
研究要旨	  進行性骨化性線維異形成症（FOP）は、骨形成を促す受容体タンパク
ALK2 の変異によると考えられる。BMP 活性を抑制する分子として、補助受容体と考えられていた DRAGON と、Smad のホスファターゼ PPM1A の作用機序を解析した。
DRAGON や PPM1A のような BMP シグナルの抑制因子は、FOP の治療を目指した新しい標的分子になる可能性がある。	 	 
Ａ．	  研究目的	 

様にクローニングして発現ベクターを構築

進 行 性 骨 化 性 線 維 異 形 成 症（Fibrodysplasia	 した。	 

ossificans	 

こ れ ら を 、 BMP シ グ ナ ル で 刺 激 し たprogressiva,	 FOP）は、主に筋組織の中でC2C12 にトランスフェクションし、骨芽細異所性骨化が進行する遺伝性疾患である。

胞分化マーカーとして ALP 活性、BMP シグ

常染色体優性遺伝を示し、2006 年、２番染色ナルの指標として、BMP 初期応答遺伝子

体上の ACVR1/ALK2 遺伝子に家族性およびId1 のプロモーター・エンハンサーを含む

孤発性 FOP に共通の、617G>A へテロ接合

ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。

変異が同定された。

目的タンパク質は、ウエスタンブロット法、すでに我々は、この変異が ALK2 を構成的及び免疫染色法で検出した。	 に活性化することで、骨形成を促進する Bone（倫理面での配慮）	 

Morphogenetic Protein (BMP)の細胞内シグナなし	 

ルが活性化されることを見出した。そこで本研	 

究では、FOP の治療法への応用を目指して、Ｃ．研究結果	 

ALK2 活性を阻害するシグナルを解析した。

DRAGON は、BMP の構成的活性型受容体で	 Ｂ．研究方法	 ある ALK2(Q207D)と共に筋芽細胞で発現させると、ALK2 によって誘導される ALP 活

BMP の 補 助 受 容 体 と 考 え ら れ て い る性を抑制した。この作用は DRAGON に特異

DRAGON、及びそのファミリーである RGMa

的で、同じファミリーの RGMa と RGMc にはと RGMc をマウス筋芽細胞からクローニン認められなかった（図１）。	 

グし、発現ベクターを構築した。また、	 

BMP シグナルの中で転写因子 Smad のホス	 ファターゼと報告されている PPM1A も、同	 	 また、Smad のホスファターゼ PPM1A は、	 抑制に必要と考えられる C 末端の BMP 受容	 体によるリン酸化部位に変異を導入した	 

Smad1 変異体の活性も抑制した（図３）。	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	  DRAGON による BMP 活性の抑制ドメイン	 を解析したところ、シグナルペプチドを含	 む分泌型 DRAGON に抑制活性が認められ、	 他の分泌タンパク質のシグナルペプチドと	 置換しても、強い抑制活性が認められた	 （図２）。	 	 	 	 	 	 	 	 	 	  Smad1 と PPM1A を 共 発 現 さ せ る と 、	 

Smad1 の発現量が低下することが、免疫染	 色法とウエスタンブロット法で確認された	 （図４）。	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 Ｄ．考察	 	 DRAGON は、BMP の補助受容体として同定	 された分子で、肝細胞では BMP 活性を促進	 することが知られている。しかし、本研究	 の結果、少なくとも筋芽細胞では、DRAGONによって BMP 活性が強力に抑制されること

inhibition	 of	 BMP	 signaling	 is	 が判明した。この活性は分泌型 DRAGON にindependent	  of	  Smad-dephosphorylation.	 

認められることから、細胞外で BMP 受容体

J	 Bone	 Miner	 Res ,	 in	 press.	 

等に作用するものと考えられた。	 	 

一方、SmadC 末端のホスファターゼとし3)	  Shen	  Q,	  Little	  SC,	  Xu	  M,	  Haupt	  J,	 て知られる PPM1A は、予想されるリン酸化Ast	  C,	  Katagiri	  T,	  Mundlos	  S,	  Seemann	 

部位を持たない Smad1 の活性も強力に阻害

P,	 Kaplan	 FS,	 Mullins	 MC	 and	 Shore	 EM.	 

した。このとき、Smad1 のタンパク質レベ(2009)	 

ルが減少しており、脱リン酸化反応よりも

progressiva	 

ACVR1	 

タンパクの分解亢進が抑制の機序である可activates	 

ligand-independent	 

能性が考えられた。	 

ligand-sensitive	  chondrogenesis	  and	 

DRAGON と PPM1A は、構成的活性型 BMP

Fibrodysplasia	 

regulates	 ossificans	 

R206H	 

zebrafish	 

mutation	 and	 

dorso-ventral	 

受容体を抑制したことから、これらの発現

patterning.	  J	  Clin	  Invest	  119:	 

亢進を促すことにより、FOP における BMP

3462-3472.	 

シグナルも阻害できる可能性が考えられる。	  	 	 

4)	 Katagiri	 T.	 (2010)	 Heterotopic	 bone	 Ｅ．結論	 

formation	 DRAGON や PPM1A のように構成的活性型

morphogenetic	 induced	 by	 protein	 bone	 

signaling:	 

BMP 受容体を阻害する分子は、新しい FOP

fibrodysplasia	  ossificans	  progressiva.	 の治療法の確立に役立つ可能性がある。。	 

J	 Oral	 Biosci ,	 in	 press.	 	 
Ｆ．健康危険情報	 	 なし	 	 Ｇ．研究発表	 	 5)	 片桐岳信（2009）FOP（進行性骨化性線維異形成症）.	 	 Arthritis,	 印刷中.	 
6)	 片桐岳信（2010）進行性骨化性線維異1.論文発表	 1)	  Kanomata	  K,	  Kokabu	  S,	  Nojima	  J,	 形成症（FOP）の発症メカニズムの解明とFukuda	 T	 and	 Katagiri	 T.	 (2009)	 DRAGON,	 

治療法.	 	 日 本 未 熟 児 新 生 児 学 会 雑 誌 ,	 a	 

印刷中.	 

GPI-anchored	 

membrane	 

protein,	 inhibits	  BMP	  signaling	  in	  C2C12	 	 

myoblasts.	  Genes	  Cells 	  14:695-702,	 

7)	 片桐岳信（2010）進行性骨化性線維異2009.	 

形 成 症 (FOP) の 発 症 メ カ ニ ズ ム .	  	  Clin	 	 

Nerosci,	 印刷中.	 

2)	  Kokabu	  S,	  Nojima	  J,	  Kanomata	  K,	 	 

Ohte	  S,	  Yoda	  T,	  Fukuda	  T	  and	  Katagiri	 

2.学会発表	 T.	 

(2010)	 

Protein	 magnesium-dependent	 

phosphatase	 

1)	 古株彰一郎、野島淳也、福田亨、大手1A-mediated	 

聡、鹿又一洋、依田哲也、片桐岳信：R-Smad	 のホスファターゼ PPM1A による BMP

代謝学会学術集会	 

活性の抑制には Smad の脱リン酸化に依存	 しない分解が重要である.	  第 8 回松本

9)	 福田亨、古株彰一郎、大手聡、片桐岳

ボーンフォーラム	 

信	 progressiva	 (FOP)	 で同定された	 ALK2	 変2)	 片桐岳信：筋肉が骨になる難病・進行異体の解析.	 第 27 回日本骨代謝学会学術性骨化性線維異形成症（FOP）.	 第 20 回電集会	 

顕サマースクール	 	 	 10)	 古株彰一郎、大手聡、福田亨、片桐岳3)	 福田亨、古株彰一郎、大手聡、片桐岳

信：Smad1	 のリン酸化・脱リン酸化による

信：筋組織内に異所性骨化を生じる遺伝性骨芽細胞分化誘導の制御.	 第 16 回	 BMP	 研

難 病 	  (Fibrodysplasia	  Ossificans	 究会	 Progressiva).	  運動器科学研究会	 	 	 11)	 福田亨、古株彰一郎、大手聡、片桐岳

4)	 片桐岳信：筋組織における異所性骨化

信の 機 序 解 明 と 治 療 へ の 応 用 . 	  第 	  7	  回	 progressiva	  (FOP)	  で 新 た に 同 定 さ れ た	 RCGM	 フロンティアシンポジウム	 ALK2	 変異体の解析.	 第 16 回	 BMP	 研究会	 	 	 

5)	 片桐岳信：筋肉が骨になる難病・進行12)	 片桐岳信、古株彰一郎、依田哲也：性骨化性線維異形成症（FOP）.	 九州歯科

Smad1	 のリン酸化・脱リン酸化による骨芽大学	 最新生命科学	 

細胞分化誘導の制御.	  第 51 回歯科基礎医	 学会学術集会・総会	 6)	 片桐岳信：「難病・進行性骨化性繊維	 異形成症（FOP）の研究者から」.	  FOP 講

13)	 片桐岳信：BMP の Smad 依存的シグナ

演会	 

ルによる筋芽細胞分化の抑制機構.	  第 64	 回日本体力医学会大会	 

7)	 Katagiri	 T.:	 Roles	 of	 Smad	 pathways	 	 in	  the	  conversion	  of	  myoblasts	  to	 14)	  Fukuda	  T,	  Kokabu	  S,	  Ohte	  S,	 osteoblastic	  cells	  by	  BMPs.	  Gordon	 Katagiri	  T.:	  Functional	  Analysis	  of	 Research	 Conference	 on	 Bones	 &	 Teeth	 Mutant	 	 Fibrodysplasia	  ossificans	  progressiva	 

8)	 古株彰一郎、大手聡、野島淳也、依田(FOP).	  31st	  ASBMR	  (American	  Society	 

哲也、福田亨、片桐岳信：Smad	 C	 末端のfor	  Bone	  and	  Mineral	  Research)	  annual	 

ホ ス フ ァ タ ー ゼ PPM1A	  と 	  SCP1	  は リ ン

meeting	 

カー領域の	 MAPK	 リン酸化部位を介して	 	 BMP	 シグナルを抑制する.	 第 27 回日本骨15)	  Kokabu	  S,	  Ohte	  S,	  Nojima	  J,	 ：：Fibrodysplasia	 

Fibrodysplasia	 

ALK2	 

Receptors	 

ossificans	 ossificans	 

Found	 in	 

Kanomata	 K,	 Yoda	 T,	 Katagiri	 T.:	 PPM1A	 

3.その他	 

and	  SCP1	  suppress	  BMP	  activity	  via	 

なし	 novel	 mechanism	 independent	 of	 Smad	 Cterminal	 dephosphorylation.	 31st	 ASBMR	 (American	 Society	 for	 Bone	 and	 Mineral	 Research)	 annual	 meeting	 	 16)	 大手聡、福田亨、古株彰一郎、片桐岳
信：骨芽細胞における Smad と Runx2 のクロストーク.	  第 7 回	 RCGM フロンティアシンポジウム	 	 17)	 古株彰一郎、大手聡、依田哲也、福田亨、片桐岳信：Smad1 の骨芽細胞分化誘導
活性は C 末端とリンカー領域のリン酸化により制御される.	 第 7 回	 RCGM フロンティ
アシンポジウム	 	 18)	 塚本翔、佐藤康敬、鍋島麻子、大手聡、
古株彰一郎、福田亨、片桐岳信：進行性骨化 性 線 維 異 形 成 症 	  (FOP)	  で 同 定 さ れ た	 
ALK2	 変異体の安定発現細胞の樹立.	 第 7回	 RCGM フロンティアシンポジウム	 	 19)	 福田亨、古株彰一郎、大手聡、片桐岳 信 ： Fibrodysplasia	  ossificans	 
progressiva	 (FOP)で同定された 10 種類のALK2 変異体の機能解析.	  第 7 回	 RCGM フ
ロンティアシンポジウム	 	 Ｈ．知的財産権の出願・登録状況	 
（予定を含む。）	 
1.特許取得	 なし	 2.実用新案登録	 なし