〈特別研究課題〉 建築性廃棄物となった CCA 処理木材の発癌毒性の評価と毒性減弱方法の開発
助 成 研 究 者

中部大学

加藤昌志

建築性廃棄物となったCCA処理木材の発癌毒性の評価と毒性減弱方法の開発（中間報告）
加藤 昌志（中部大学）

Establishment of preventive therapy for heavy metal-relateddiseases through analysis for carcinogenic risk of CCA(cupper, chromium and arsenic)-treated wood
Masashi Kato(Chubu University)
Abstract:
We examined the effect of arsenic on levels of fibroblast-derived matrix metalloproteinase (MMP)-2
and -14, which have been reported to be associated with tumor progression. First, arsenic promotes
production of the fibroblast-derived active form of MMP-2. Arsenic (100 and 1000 μM) also increased
MMP-14 expression levels in fibroblasts. Finally, 1000 μM of mercury, but not arsenic, directly affects
pro-MMP-2 protein and converts the proenzyme into its active form. As MMP-14 is an activator of proMMP-2, our results suggest that arsenic promotes production of the fibroblast-derived active form ofMMP-2 through augmentation of MMP-14. The activity of arsenic for conversion of pro-MMP-2 into its
active form may be weaker than that of mercury.

1. はじめに
CCA 処理木材は、木材の防腐・防蟻を目的として CCA（クロム・銅・ヒ素化合物系木材防腐剤）を木材内部に加圧注入処理したもので、昭和 38 年から使用され、昭和 45 年頃から長期にわたり年間 10 万トン近く使用された。CCA 処理木材は現在でも金融公庫の建築基準に指定され、使用されている。今後、建築物の解体に伴い CCA 処理木材が建築系廃棄物として大量に排出され、健康や環− 1 −境に影響を与える事が問題視されている。欧州委員会（EC）は、2001 年「ヒ素」を含む木材防腐処理剤（CCA 防腐処理木材）の使用禁止を提案した。欧州委員会企業総局は「重金属が健康に与える直接的影響」、「癌の誘発」、「ヒ素によって生じる低リン酸塩海域における水生生物への影響」等の理由で 2002 年末までに CCA 処理木材の使用を禁止した。これらは、クロム・銅・ヒ素の重金属のうち、強い発癌性がヒトで証明されているヒ素が特に問題になっていることを示している。
CCA 処理木材には 460mg/kg 程度のヒ素が含まれ、この焼却灰には約 180-360mg/kg のヒ素が含まれる。焼却灰の値は、環境省の定めた「金属を含む煤塵・汚泥に係る判定基準」をはるかに上回る濃度である。さらに、問題はヒ素の発癌機構がほとんど不明であるため、基準値そのものが詳細な科学的知見に基づいて検討されたものとは言えない事である。それゆえ、基準値は各国間でばらつきがあり、近年でも改訂が加えられている。こうした状況から、ヒ素をはじめとするチオール基反応性重金属における人体に対する発癌毒性を医学・生物学的に解析・評価し、科学的根拠に基づいた基準値を策定するとともに、健康への影響に配慮した適切な CCA 処理木材廃棄処理方法の開発が望まれている。
マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) は亜鉛結合 endopeptidase のファミリーに属し、この発現は悪性腫瘍の浸潤や転移に関与している (Stetler-Stevenson, 1990)。特に、MMP-2 と MMP-14 は腫瘍の進展に深く関与していることが報告されている(Dalberg et al., 2000; Noël et al., 1994). MMP2 はプロエンザイム型 (pro-matrix metalloproteinase-2; pro-MMP-2)として分泌され、腫瘍増殖依存性に活性化される (Stetler-Stevenson, 1990; Kato et al., 1998). MMP-14 の発現レベルは、MMP-2 の活性化に深く関与しているのみならず、癌患者の予後に関係している (Nomura et al., 1995; Itoh etal.,2006)。MMP-2 と MMP-14 は悪性腫瘍細胞だけでなく、腫瘍周囲の線維芽細胞からも分泌される(Dalberg et al., 2000; Noël et al., 1994; Zhang et al., 2006)。悪性腫瘍細胞における MMP-14 の発現は腫瘍の浸潤性増殖に関与しているのに対して、線維芽細胞における MMP-14 の発現は、悪性腫瘍細胞の浸潤性増殖による組織リモデリングの過程に関与していると考えられている (Ohtani H et al.,1996)。
上記のように、MMP-2 と MMP-14 は悪性腫瘍の進展に決定的に重要な役割を果たしているのであるが、ヒ素を介した活性型 MMP-2 の分泌機構については、ほとんど報告がない。さらに、我々の調べうる範囲では、ヒ素が MMP-14 の発現に与える影響について言及してある報告はなかった。本研究では、ヒ素が線維芽細胞における MMP-2 と MMP-14 に与える影響に焦点を当て、ヒ素を介した悪性腫瘍発症について新しい可能性を提唱する。

2. 実験方法及び実験材料
本研究では、NIH3T3 細胞を線維芽細胞として使用した。 ヒ素 (NaAsO2 ) は、和光純薬より購入した。抗β-アクチン抗体と4-aminophenylmercuric acetate (APMA)は Sigma-Aldrichより購入した。
抗 MMP-14 抗体と BB-94 は、金沢大学の佐藤博教授より供与された。リコンビナント pro-MMP-2 蛋
白質は以前に述べられた方法 (Li et al., 2004) で作製された。ザイモグラフィーとウエスタンブロットは、以前に述べられた方法にしたがって行われた(Kato et al., 1998)。 MMP-14 の劣化を予防する目的で、線維芽細胞の培養に BB-94が使用された。

− 2 −3. 結果
無刺激の線維芽細胞において、活性型 MMP-2 は、ほとんど検出できなかった。100μM と 1000μM のヒ素は、線維芽細胞からの活性化型 MMP-2 の分泌を有意に亢進させた。そこで、ヒ素は線維芽細胞における MMP-14 の発現レベルを賦活するかどうかを調べた。無刺激の線維芽細胞では、MMP-14 の発現はほとんど検出できなかったが、100μM と 1000μM のヒ素は、線維芽細胞におけるMMP-14 の発現を著明に亢進させた。
MMP-14 の発現非依存的に活性型 MMP-2 の産生が亢進する経路があることは既に知られている(Zhou et al., 2005)。実際に、我々の結果では、1000μM の水銀(APMA)が、直接不活性型 MMP-2（pro-MMP-2）蛋白質に作用し、活性化型 MMP-2 の産生を促進するという結果を得た。そこで、最後に、ヒ素も水銀のように直接不活性化型 MMP-2 蛋白質に作用し、活性化型 MMP-2 蛋白質を誘導するかどうかを調べた。予想に反して、100μM 及び 1000μM のヒ素は、不活性化型 MMP-2 蛋白質を直接変換し、活性化型 MMP-2 蛋白質を産生することはなかった。これは、不活性化型 MMP-2 蛋白質を活性化型 MMP-2 蛋白質に変換する作用については、ヒ素は、水銀よりも弱い可能性を示している。

4. 考察
NIH3T3 細胞は線維芽細胞の一種であり、形質転換活性や転移能は持っていない(Kato et al., 2002)。
活性化型 MMP-2 は、悪性の細胞に特異的に検出され、通常、良性の細胞では検出されない(Azzamet al., 1993; Brown et al., 1993)。我々の「ヒ素が活性化型 MMP-2 の分泌を促進する」という結果は、線維芽細胞がヒ素刺激を受け、1 つ悪性の性質を獲得したことを示している。MMP-14 は、不活性化型MMP-2 に作用して活性化型 MMP-2 を誘導する(Seiki et al., 2003)ので、我々の「ヒ素を介したMMP-14 発現の亢進」という結果は、ヒ素は MMP-14 の発現促進を介して活性化型 MMP-2 産生を亢進することを示している。腫瘍周辺の線維芽細胞由来の MMP-14 は試験管内においても、生体内においても腫瘍の浸潤を促進することが報告されている(Zhang et al., 2006)。ヒ素は、線維芽細胞におけるMMP-14の発現の亢進を介して悪性腫瘍の病態に関与しているかもしれない。
健康人の髪の毛 1 グラムあたりのヒ素含有量はほぼ 500μ（250-880μg）である。これが 1000μg/gをこえるとヒ素中毒である(Cö l et al., 1999)。これらのヒトにおけるヒ素濃度は、100 〜 1000μM のヒ素が線維芽細胞における活性化型 MMP-2 と MMP-14 の発現を増加させるのに十分である可能性を示している。
結論として、本研究では、ヒ素が線維芽細胞における MMP-14 の発現を増加させ、線維芽細胞由来の活性型 MMP-2の産生を増加させることを示すことにより、ヒ素の新しい発癌機構を提案した。

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