別添資料（2）：NGSにおける外部精度評価の参考資料 （検索キーワード：external quality assurance, external quality assessment, external quality assessment scheme, EQA, proficiency testing, PT, quality control,
next generation sequencing, NGS, circulating tumour DNA, ctDNA）
No.

論文

Verderio P, Ciniselli CM, Gaignaux
A, et al.
External Quality Assurance
programs for processing
1

methods provide evidence on
impact of preanalyticalvariables
N Biotechnol. 2022;72:29-37.
doi:10.1016/j.nbt.2022.08.006

23

論文の概要

EQAの概要EQAで提供された試料

EQAに含まれる分析工程とその測定方法

・全血DNA：PAXgene Blood DNAチューブ1本
・全血RNA：PAXgene Blood RNA
チューブ1本
過去10年間にわたって実施した生物試料の 核酸抽出や末梢血単核細胞（PBMC）
・全血cfDNA：モノヌクレオソームが混入さプロセッシング方法についてのEQAは、分析 の分離・凍結保存などの処理方法の性能れた安定化血液のPAXgene Blood
前プロセスの影響および異なるプロセッシング を6年間10種類のスキームを各施設（施設
分析前
ccfDNAチューブ1本方法（キット含む）の比較性能に対して、 数不明、数としては約1000件）で評価し、過去10年間、約1000件分のデータを解析 ・自動化またはマニュアルでの抽出・FFPE：厚さ10µmのFFPE切片2枚独自の証拠に基づく洞察を提供するとともこれまでの散発的なEQAの結論と概ね一致
・シリカメンブレンまたは磁気ビーズ
・凍結組織：10 - 20mgのcryoExtractに、検査室がプロセッシング方法の妥当性を することを確認した。
コア1個確認することを支援する。
・saliva：Omnigene.Oral tube
・stool：安定化便の Omnigene.Guttube・PMBC

Kirchner M, Glade J, Lehmann U, etal.
NTRK testing: First results of theFISHおよびRNA/DNAベースのQuiP-EQA scheme and atargeted NGS(tNGS)のNTRK融合 ・FISH：厚さ0.5μmのFFPE
comprehensive map of NTRK
QuiP-EQAスキームの最初のNTRK検査に遺伝子検出への適合性を欧州27施設で評 ・NGS:厚さ5μmのFFPE4枚（ローインプッ
fusion variants and their
おいてFISH及びNGSとも高い成功率でルー価し、事前にチェックした答えと比較してFISH ト）と6枚（ハイインプット）、およびHEスラ
diagnostic coverage by targeted チンの診断が確立できることを示した。
およびtNGSベースのNTRK検査がルーチン イド1枚
RNA-based NGS assays.
診断環境において十分に確立できることを実Genes Chromosomes Cancer.
証した。
2020;59(8):445-453.
doi:10.1002/gcc.22853

Haselmann V, Ahmad-Nejad P,
Geilenkeuser WJ, et al.
Results of the first external
quality assessment scheme(EQA) for isolation and analysis
of circulating tumour DNA(ctDNA).
Clin Chem Lab Med.
2018;56(2):220-228.
doi:10.1515/cclm-2017-0283

EQA参加施設45

6

Deveson IW, Gong B, Lai K, et al.
Evaluating the analytical validityof circulating tumor DNA
sequencing assays for precisiononcology.
Nat Biotechnol. 2021;39(9):11151128. doi:10.1038/s41587-02100857-z

各EQAスキームにおいて、参加者から提供された分類された前処理データおよび生産された検体の関連する品質属性（zスコア）の集中測定に基づいて実施
・いくつかの例外を除き、これまでの散発的な・核酸抽出方法と使用キット
EQA実施による結論と概ね一致。
・溶出バッファー・FFPE DNAについては、以前はシリカカラム
・酵素の使用ベースの抽出法が磁気ビーズベースの抽出・保存温度法よりも高い%dsDNAを示したが、後者は・遠心分離条件前者よりも高いPCR増幅率を示した。
・分析前の重要な要因が様々な種類の検体の定量的または定性的属性に与える影響
・時系列での検査室パフォーマンスパターンを評価

ドイツ（24）、オーストリア（1）、スイス（2）合計27施設※FISH（9施設）、NGS（18施設）
NGSでは高と低インプットに分けた

・検出された変異を事前にとったデータと比較
・NTRK 検出の経験を持つ 8 つの病理学 ・tNGSに基づく解析の感度は92.2%
分析中研究所のエキスパートパネルが、標的 RNA （65/70），特異度は100%・ライブラリー作製:Multiplex PCRベースの ベースの NGS と FISH により、異なる腫瘍 （105/105）であった．
アッセイ(17)、Hybrid Captureベース(1) タイプの NTRK 融合陽性 14 例と NTRK ・研究室間テストで得られたRNAベースの・シークエンシング:Illumina(8), Thermo 融合陰性 10 例の内部パネル試験を事前 tNGS解析の感度は95.3％（62/65）、Fisher Scientific(10)に実施
特異度は100％（100/100）
・陰性検体6検体、陽性検体4検体を配布
分析後
・解析

・このEQAスキームは、cfDNAの処理と解析
分析前の複数の段階における現在のばらつきを示し
・抽出:自動または手動抽出で数種類のキッ ・抽出を実施したタイミング、保存方法
・抽出キットと使用血漿量ており、その結果、全体のエラー率は6.09%
トを使用
・QC方法であった。最もばらつきが大きく、臨床的影響・核酸量（添加量との比較）が大きいのは、検体量、cfDNA定量法、ジェctDNAの臨床検査診断における分析品質・解析方法の比較（NGSやサンガーなど） ノタイピングプラットフォームの選択などであっ
今回のEQAでは、検体量、cfDNA定量法、 の問題を解決することを目的に 欧州10か KRASコドン12/13およびBRAF V600Eの 欧州10カ国42施設に送付され、37施設が・標準検体のDNA濃度は、LINE1-79bp- た。品質保証に関しては、手順とワークフロー分析中ジェノタイピングプラットフォームの選択などでば 国36施設から遺伝子判定のEQAを実施
9つの既知の配列変異を分析するために、変 参加。うち35施設が抽出手順を詳しく報告
qPCR assayによる実測値により決定の調和が急務である。
・ライブラリー作製
らつきが多く、臨床的影響が大きかった。品 し、検体量、定量法、ジェノタイピングのプラッ 異アレルの頻度が0％から10％の範囲で断 し、36施設が遺伝子型判定結果を提出
・標準検体のBRAF V600EのMAFは・NGSにおいては、マイナーアレル頻度・シークエンシング
質保証のために手順とワークフローの調和が トフォームの選択によりばらつきや臨床的影響 片化したゲノムDNAを添加した2mLの※ドイツ（12）、ベルギー（5）、オーストリ
BEAMing (digital droplet PCR)と（MAF）0.01%の同定に必要な分析感必要。
が出ることがわかった。
EDTA-血漿3検体
ア（4）、フランス（4)、他
allele-specific amplification-PCRによ 度を達成するためには、少なくとも2mL血漿る実測値により決定。
から分離したcfDNAの全量を下流分析に使・標準検体のKRASコドン12/13の一般的 用する必要がある。
な変異のMAFは、cold-PCRと・NanoDrop による分光光度法の標準偏分析後pyrosequencingによる実測値により決差が大きいので、PicoGreenと標的遺伝子・解析定。に応じたqPCR（35）が定量に最も適していることが判明。

NGSに基づく検査、特に検査結果が臨床的臨床的NGSの標準化の確立のため、研究判断に影響を与える場合に、その基準を確
ヨーロッパの15の分子診断研究所室間の比較を欧州15施設で評価し、異な 8つの肺がんおよび8つの大腸がんのFFPEか立することが重要であり、その基準を推測す※スイスから11、ドイツから2、オーストリアかる手法で検出された変異結果は、研究室間 ら抽出されたDNAるために複数の異なるラボからのデータセット
ら2で非常に高い一致を示すことを確認した。
を系統的に解析する必要がある。

分析中・ライブラリー作製:アンプリコンまたはキャプ
チャー法・シークエンシング:Illumina又はThermo
Fisher Scientific

分析後・解析

Maekawa M, Taniguchi T, Nishio K,
et al.
Precision cancer genome testingneeds proficiency testing
involving all stakeholders.
Sci Rep. 2022;12(1):1494.
Published 2022 Jan 27.
doi:10.1038/s41598-022-05589-x

EQAの結果

分析前
・抽出

分析前
・抽出

Zhong Q, Wagner U, Kurt H, et al.
Multi-laboratory proficiency
testing of clinical cancer
genomic profiling by nextgeneration sequencing. Pathol
Res Pract. 2018;214(7):957-963.
doi:10.1016/j.prp.2018.05.020

EQAで求められた品質指標

今回の患者検体を用いた技能試験のパイロット研究により、参加施設のがんゲノム検査の現状を垣間見ることができ、現地におけるPTの実施は情報共有の場として貴重であった。さらなるがんゲノム検査の充実を図るためには、現地でのPTの実施や、関係者が主催者・参加者として参加することが重要である。

・各参加者のバリアントコールフォーマット（VCF）ファイルのバリアントを、University
Hospital Zurich(USZ)のそれと比較
・サンガーによる検証
・異なるNGSサイトによって検出された変異の・インフォマティクスパイプラインの検証
結果は、非常に高い研究室間の一致を示し
・統計解析：318チップ上でAmpliSeqた。
Library Kit 2.0、Ion PGM Template・欧州の15の研究室でPTを実施し、標的アOT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing
ンプリコンシークエンシングの堅牢性、再現
200 Kit v2。データはIon Reporter (IR)性、精度を実証したことで、固形がんの詳細ソフトウェアにより、Ion AmpliSeq Cancer
な分子特性を高い診断感度で評価できるよHotspot Panel v2 (CHP2) およびIonうになった。
AmpliSeq Colon and Lung Cancer
Research Panel v2 (CLP2) の標準ワー
クフローのデフォルト設定で標的Amplicon領域で処理

分析中・ライブラリー作製：ハイブリッドキャプチャー
ベース法(5)、アンプリコンベース法(10)・腫瘍組織（T）と正常血球（N）におけるマッチドペアサンプル解析(7)、腫瘍組織のみ(8)検査施設で普及している次世代シークエンサー（NGS）プラットフォームやがんゲノム
浜松医科大学病院診断病理学部より入手 15施設
検査の品質を調査するため、15施設で患・同定したバリアント結果した肺がん、大腸がん患者5名のFFPE組織 （12の病院臨床検査室と3の登録臨床検者検体を用いたパイロットPTを実施し、一部と、末梢血から得られた正常試料査室）
分析後を除いて病原性のバリアント検出に成功し・解析プラットフォーム：遺伝子パネル（対た。
象遺伝子、エクソンまたはホットスポットのみ）・バイオインフォマティクス：解析パイプライン、報告可能範囲などは各研究所によって異なる。

ctDNAアッセイの標準化された技能試験のための独自の標準物質と注釈のセットおよび ctDNAアッセイの分析性能を、マルチサイ分析的枠組みを確立し、SEQC2
ト、クロスプラットフォーム12施設で評価し、Oncopanel Sequencing Working
高い感度、精度、再現性で変異を検出しGroupは、そのような将来の研究のための基 た。
盤作りに貢献した。

・参加した研究室のほとんどが、密接に位置する2つのKRAS変異とEGFRの25bp欠損挿入変異を除いて、病原性バリアントの同定に成功した。逆に、EGFR L858R変異体の同定には成功し、その対立遺伝子頻度はすべての研究室で同様であった。

分析中・ライブラリー作製：ハイブリッドキャプチャー
ベース法、アンプリコンベース法
・シークエンシング：Illumina又はThermoFisher Scientific

人工的なリファレンスDNAサンプル

・カバレッジ深度と不均一性
・感度・正確性・アッセイごとの再現性
・インプットctDNA量と血漿からの抽出の影 参加したすべてのアッセイで、約0.5％のVAF
米国・英国・中国・オーストラリアの12の検査
響を超える変異が高い感度、精度、再現性で
室・アンプリコン法とハイブリッドキャプチャー法の 検出された。
分析後
比較・情報解析：インフォマティクスの部分は特に ※合成コントロールDNAの配列は、予め商規定せず、ベンダーごとの内部パイプラインを 業ベンダー（Thermo Fisher Scientific,使用GeneArt）により合成され、検証された。

分析前
・抽出

78

Jones W, Gong B, Novoradovskaya
N, et al.
A verified genomic reference
sample for assessing
performance of cancer panels
detecting small variants of low
allele frequency.
Genome Biol. 2021;22(1):111.
Published 2021 Apr 16.
doi:10.1186/s13059-021-02316-z

オンコパネルの解析性能を適切に評価する
10種類のがん細胞株から作成した新しいリ ために、既知のポジティブおよびネガティブなファレンスサンプルとその混合物は、小規模か （バリアント）コーディングポジションを適切な 10種類のがん細胞株をプールしたもの、
ら大規模のオンコパネルの品質管理、分析 数で有する参照サンプルを開発し、6施設で Agilent OneSeq Human Reference
精度、およびリキッドバイオプシーアッセイのバ 評価し、オンコパネルの品質管理、分析精 DNA（PN 5190-8848）、これらの2種
リデーションを行うための優れた機能を備えて 度、およびリキッドバイオプシーアッセイのバリ 類を割合を変えて混合したものいる。
デーションを行うための優れた機能を備えていることを確認した。

テキサス大学サウスウェスタン医療センター、
Novogene、Agilent、Thermo Fisher
Scientific、コーネル大学、国立心肺血液研究所
・WES1、2:テキサス大学サウスウェスタン医療センター、Novogene
・WES3：Novogene、Agilent
・WES4:Thermo Fisher Scientific・WGS1:コーネル大学、国立心肺血液研
究所

生殖細胞系スキーム：塩析法で抽出したリンパ芽球系細胞株（Coriell Cell
Repositories, Camden, New Jersey,
USA; 2015-cell line NA00536;
2016-cell line NA06926; 2017-cellline NA21070）からゲノムDNA(g.DNA) 10 µg.
体細胞スキーム：Horizon Discovery
Plc, Cambridge, UKが製造した体細胞
生殖細胞変異と体細胞変異を検査する臨
Gutowska-Ding MW, Deans ZC,変異体を含む遺伝子操作細胞株、または床診断施設の現在の要件から将来の要件
Roos C, et al.
患者由来材料から得られた同一の基準物まで拡張できるように設計された、NGS用の
One byte at a time: evidencing
3回のEQA結果から、臨床診断施設の高品質。2015年には、FFPE細胞株製品（3種
プラットフォームおよび遺伝子標的に依存しな
the quality of clinical service
質のNGSサービスを提供と、バリアントコーリン類の細胞株バックグラウンド-SW48、RKO、 3年間で合計48カ国から423の異なる研究
い独自のEQAスキームの開発について説
next-generation sequencing for グの能力が向上していることが示されたが、HCT116におけるバリアントのマルチプレックス 室が参加し、大部分（75.6%）が11カ国明。
germline and somatic variants.
EQAの提供が直面する課題はまだ複数あを含むHD200）から抽出したDNA 5μg。 から参加
3回のEQA結果から、臨床診断施設はます
Eur J Hum Genet. 2020;28(2):202- る。
2016年には、体細胞変異を有する細胞株
ます高品質のNGSサービスを提供し、バリア
212. doi:10.1038/s41431-019（Horizon Discovery Plc. 細胞株
ントコーリングの能力が向上していることが示
0515-1
HD301-KRAS Gene-Specific
された。
Multiplex Reference Standard）を含む10μm FFPE切片が、マッチした正常対照の10μm FFPE切片（HorizonDiscovery Plc. 細胞株 HD320PI3KCA Wild Type ReferenceStandard）と共に提供。2017年には、乳房腫瘍FFPE切片から抽出した150ngのDNAと、マッチした正常リンパ節から抽出した150ngのDNAが提供。

分析中・ライブラリー作製:4種類のWESと1種類のWGS（アンプリコンまたはキャプチャー法）
シークエンシング:Illumina又はThermo
Fisher Scientific・ddPCRとの比較
分析後・解析:GATK Haplotyper, FreeBayes,Mutect1 and Mutect2, Platypus,Samtools, Sentieon TNscope,VarDict, VarScan, SomaticSeqなどの変種判定方法を異なる配列戦略 (bwamem,bwa,bowtie2, etc) の組み合わせ

分析前
・抽出

個々の細胞株およびサンプル A の ddPCRと WES コンセンサス VAF 推定値を比較す
ると、異なるクラスからのバリアントの 100%が陽性として検証され、99.65% が一致した。
ddPCR解析の結果、WESの結果にはわずかなリファレンスバイアスが検出された。このバイアスは、サンプルAで測定されたバリアントのダイナミックレンジの中央部で最も大きく、一般にSNVよりもIndelで大きくなった。

NGSワークフローのためのEQAスキームを確立した。これは汎用的で、技術や検査状況にとらわれず、新しいプロセスやファイルを導入することなく検査パスウェイやバイオインフォマティクス解析とシームレスに統合することができる。したがって、このEQAは、単一遺伝子検分析中査から全ゲノム解析までの全範囲をカバーすライブラリー作製:illumina、Thermoなど
・Agree (true positives:TP)：期待される生殖細胞系および体細胞系バリアント検
シークエンシング:Illumina、Thermo
るバリアントと一致、Disagree (false査の設定に適している。
Fisher Scientificなど
positives:FP, false negatives: FN)：
2015年には、74％の研究所がバリアント結期待されるバリアントと不一致、Extra
果のコールに対して80％以上の感度を得(FP)：予想されない箇所のバリアントであって、同じ遺伝子を検査したときに大多数の研た、Missing (FN)：期待されるバリアントが究所が同じバリアントを検出した（示さ見つからなかった。
ず）。これは2016年に改善され、89%の検・ddPCRとイルミナHi-Seqプラットフォームの査室がバリアント結果のコールに対して80%
WESを用いてメーカーにより独自に検証以上の感度を得ていた（図4a）。生殖細胞系2016/2017のFスコア>0.80は分析後83%/93%の検査室、体細胞系は解析:参加者の大部分（91％）は社内の43%/71%であった。生殖細胞系のFスコア
バイオインフォマティクス・パイプライン（自作ま> 0.95は2016/2017年それぞれ
たは市販のソフトウェアツールを使用）を使用
65%/82%の検査室、体細胞系は33%/43%であった。

分析前・抽出:使用検体に合わせて4種類のキットを使用

9

Kofanova O, Bellora C, Garcia
Frasquilho S, et al.
Standardization of thepreanalytical phase of DNA
extraction from fixed tissue fornext-generation sequencing
analyses.
N Biotechnol. 2020;54:52-61.
doi:10.1016/j.nbt.2019.07.005

・乳房腫瘍3例、正常結腸3例、正常皮膚(1) DNA抽出と固定組織サンプルの適格 3例、腫瘍2例と正常腎臓1例、腫瘍1例とNGS解析におけるFFPEからのDNA抽出の 性に特に焦点を当てた固定組織DNA前処 正常子宮2例について、15個のFFPE組織標準化のため、抽出とサンプルにあった前処 理に関するレビューと、(2) NGS指標と異な ブロック、15個のペアPFPE組織ブロック、およー理のレビューと、品質指標の観点から異なる るDNA品質指標の観点から、異なる方法で び15個のペアRNALater安定化サンプルを方法でサンプル調整したFFPE抽出結果を 固定または安定化した組織サンプルからの用意して使用。
比較した。
DNA抽出を比較した結果について紹介
・6つの腫瘍組織サンプルについて、腫瘍面積は40-90％、正常組織面積は5-10％、壊死は最大20％・FFPE切片は、20μmを2-3枚。

分析中・ライブラリー作製:TruSeq Amplicon
Cancer Panel・シークエンシング:Illumina

分析後・解析:MiSeq reporter

・すべての重要な分析前段階の標準化と文書化とは別に、抽出方法が一貫して実行されることを保証するために、工程内QC材料を使用することが重要である。
・固定された組織からの最も良質なDNAは、
PFPEからはPAXgene Tissue DNAキットで、FFPE組織からはQIAamp DNA FFPE・DNA の濃度と純度キットで抽出されたものであることがわかった。
・DNA Integrity Number(DIN値)
・multiplex PCRで評価した固定材料から・全ゲノム増幅法（WGA）によるDNAの最も良質なDNAは、PFPEまたはFFPE組
intergrity評価
織からChemagic DNA Tissue Kitで抽・TruSeq NGSによるバリアントの同定結果 出されたDNAであった。
・whole genome amplification(WGA)によって評価された固定材料からの最高の品質のDNAは、FFPE組織からChemagic DNA Tissue kitを使用したものであった。
・すべてのサンプルで総複製率が80%以上、カバレッジが1000倍である。

分析前・抽出:任意の方法

10Richman SD, Fairley J, Hall JA, etal.
Results of the UK NEQAS for
Molecular Genetics reference
sample analysis.
J Clin Pathol. 2018;71(11):989994. doi:10.1136/jclinpath-2018205277

100以上の検査室が「教育用標準試料」を検査する機会を得て、検査プラットフォームの ジェノタイピングとバリアントアレル頻度の結検証をさらに進めようとする意欲が示された 果を101の検査室から収集し、最も多く検 ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）細が、バリアントの報告は解釈の余地があるた 査に使用されたNGSにおいて、7遺伝子の 胞系材料の切片（厚さ10μm）1枚め、臨床的関連性またはバリアント頻度のい 5-27の有効なバリアントのうち8施設が※Thermo Fisher Scientific社
ずれかによって、検査施設がバリアントを選択 NRASの5つのバリアントを、2施設が8つのAcroMetrix製品的に報告しているかどうかを明らかにすることが BRAFのバリアントをすべてを正しく報告した。
必要である。

101施設

分析中・ライブラリー作製:アンプリコンまたはキャプ
チャー法・シークエンシング:Illumina又はThermo
Fisher Scientific

ここで報告した7つの遺伝子には、5～27の有効なバリアントがあった。8施設が5つのNRASバリアントすべてを正しく報告し、2施設が8つのBRAFバリアントすべてを正しく報・バリアントとバリアントアレル頻度（最も一般告した。検証された平均バリアント頻度は、的に検査される7つの遺伝子について）参加した検査室が決定した頻度よりも低く、・変異体の有無に関する検査の精度
単一遺伝子の検査方法は、NGSプラット・ddPCRと比較フォームよりも推定頻度のばらつきが少ないことが示された。検査室は、臨床的に関連するバリアントを正しく同定する可能性がより高かった。

分析後・解析：-1112

Elsink K, Huibers MMH, Hollink
IHIM, et al.
National external quality
assessment for next-generation
sequencing-based diagnostics ofprimary immunodeficiencies.
Eur J Hum Genet. 2021;29(1):2028. doi:10.1038/s41431-0200702-0

Keppens C, Dequeker EMC, Patton
SJ, et al.
International pilot external
quality assessment scheme foranalysis and reporting of
circulating tumour DNA.
BMC Cancer. 2018;18(1):804.
Published 2018 Aug 9.
doi:10.1186/s12885-018-4694-x

分析前・抽出PathogenicまたはLikely pathogenicに分類されるバリアントの大部分は、正しく同定
先天性免疫不全症のNGSベースの診断にされ、記載されていた。
おけるバリアントフィルタリング、解釈、報告 1施設あたり2件の先天性免疫不全症患者
・バリアントの分類と報告
次世代シーケンサーを用いた原発性免疫不オランダの4つの主要なゲノム診断センターが 分析中・EQA実施時の臨床検査技師の経験を評の均一性を分析するために、外部品質評 解析の注釈なしバリアントコールフォーマット
・オランダの異なるGDC間でのその均一性
・ライブラリー作製
全症診断の遺伝学的データから適切な結論
参加価するため、本調査の参加者全員にアンケー
価をオランダ 4施設で評価し、遺伝学的デー （VCF）ファイルを4つのDutch genome
・臨床検査技師の経験に関する調査。遺伝を導き出すためには、専門医による臨床的・すべての臨床検査室はISO15189の認証と ・シークエンシング
トを送付
タから適切な結論を導き出すためには、専門 diagnostic centers（GDC）に配布し、子解析の最終的な解釈と結論は、参加した免疫学的データが必要である。
認定を受けている・アプローチと解析の多様性にもかかわらず、医による臨床的・免疫学的データが必要なこ 解析、解釈した（計8件の解析）
4つの遺伝子センターで統一された専門医に送られる診断報告書に含まれる変分析後とが分かった。
異は、8つの変異を除いて、4つのセンターで・解析:独自の解析パイプラインと標準ワーク一貫していた。
フローで解析

ctDNA EQAスキームの実現可能性と、臨床的に重要な低頻度バリアント検出での高いエラー率に起因するEQAスキームの必要性が実証された。

Horizon Discovery社からの購入検体
・ヒト血漿に変異を含む細胞株由来ゲノムDNAを添加した検体を使用
・血漿量は3ml
cfDNA中の臨床的に重要な変異の検出を
・4検体がEGFR変異有、4検体がRAS変評価するEQA実施可能性の調査と、報告異有、2検体が正常検体
16ヶ国から32施設参加様式を分析するために、32施設で評価し、・MAFは1%又は5%
主にEU施設EQAの結果の見直しとエラーが発生していな※検体は、5つのreference labにて、2つのことの確認が必要であることがわかった。
異なるcfDNA抽出方法、及び6つの検出方
法ーCobas, NGS (Illumina, IonTorent), Therascreen, ddPCR,
BEAMingーによって検証された

分析前
・QIAamp Circulating Nucleic AcidKit (Qiagen)・Cobas cfDNA Sample Preparation
Kit (Roche)
・MagMAX Cell-Free DNA Isolation
Kit(Thermo Fisher Scientific)
・Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit(Promega)・Nucleospin Plasma XS (MachereyNagel)
・QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit(Qiagen) version 2

・全検体と全施設を総合した変異検出エ
ラー率は20.1%。
・変異検出性有無を評価。VAF返却は求め ・RAS変異の方がEGFR変異よりも変異検られなかった
出エラー率が高い。
分析中・Horizaon検体をreference labで測定し ・1%MAF検体の方が、5%MAF検体よりも・NGS-アンプリコン法:Ampliseq 50 gene た結果が真値
変異検出エラー率が高い。
hotspot panel, Ion Proton
・複数変異を含む検体の方が、1つの変異を(LifeTechnologies)含む検体よりも、変異検出エラー率が高い。
・NGS-キャプチャー法:SureSelect(Agilent),MiSeq (Illumina)
・OncoBEAM®RAS CRC IVD KIT(Sysmex-Inostics)
・Cobas® EGFR Mutation Test v2(Roche)・Therascreen®EGFR Plasma RGQ
PCR Kit(Qiagen)・QX200 Droplet Digital PCR System(Bio-rad)
分析後
・解析

2症例

13

・Case1：男性、進行性大腸癌、標準化
Sunami K, Naito Y, Aimono E, et al.
学療法奏功無し、BRAF, ATM, NF1,The initial assessment of expert
TP53, APC, ARAF, NTRK2に体細胞変
panel performance in core
日本のがんゲノム医療中核拠点病院におけ異有、BRCA2遺伝子生殖細胞系列変異
2つの模擬症例を用いてエキスパートパネル
hospitals for cancer genomic
るエキスパートパネルのパフォーマンスに関する有、NCCオンコパネルによる測定結果のパフォーマンスを11施設のがんゲノム医
medicine in Japan
初期評価は、臨床現場におけるプレシジョ
がんゲノム医療中核拠点病院(11施設:療中核拠点病院に対して評価し、各施設[published correction appears in Int ン・オンコロジーの応用のための参考データを・Case2：女性、進行性乳がん、標準治療 2020年1月時点)
で推奨治療が異なるため、エキパネのさらなJ Clin Oncol. 2021提供する。臨床アノテーションの標準化に関で増悪、PIK3CA, ERBB2, CCND1遺伝る標準化が必要であることが確認された。
May;26(5):1007]. Int J Clin Oncol. しさらなる調査が必要である。
子増幅有、FoundationOneCDxによる測
2021;26(3):443-449.
定結果
doi:10.1007/s10147-020-01844-1※上記2症例の臨床所見、CGPテスト結果、C-CAT findingsが参加施設に送付され、エキパネを実施した。

【Case 1】
・9/11施設でBRAF V600Eを標的にしたdabrafenib+trametinibを推奨。
・2/11施設でencorafenib+binimetinib+cetuximabを推奨。

エキスパートパネル
エキスパートパネルで推奨された治療法（各・NCC Oncopanelで測定された結果施設での比較のみ）【Case 2】・FoundationOne CDxで測定された結果
・ 4/11施設でeverolimus+exemestaneを推奨。
・3/11施設でAlpelisibを推奨。
・2/11施設でTrastuzumab
deruxtecanを推奨。
・2/11施設で推奨薬剤無し。