ミルクオリゴ糖（乳中少糖）の比較生化学（XII）
Comparative Biochemistry of Milk Oligosaccharides (XII)

─ラクト-N-ビオースによるビフィズスフローラ形成──Construction of Bifidobacterium flora by lacto-N-biose─
国立大学法人東北大学大学院農学研究科

教授

農学博士

齋藤忠夫

TADAO SAITO Dr. Agric.
Graduate School of Agricultural Science, TOHOKU University
国立大学法人

帯広畜産大学大学院畜産学研究科

教授

農学博士

浦島

匡

TADASU URASHIMA Dr. Agric.
Graduate School of Food Hygiene, OBIHIRO University of Agriculture and Veterinary Medicine

までに115種類の化学構造が報告されており、いまだに新1．はじめに規のオリゴ糖の報告が続いている。人乳HMOでは、
そ著者らは、
このミルクオリゴ糖シリーズの初回に、ヒトミ

れぞれの基本骨格のオリゴ糖に、フコース（Fuc）やN-アセ

ルクオリゴ糖（HMO）の基本骨格（コア）構造に基づく分チルノイラミン酸（NeuAc）などが結合してさらに複雑な化学

１）類とその化学構造上の特徴などについて概説した 。最構造を示すことが知られている。これらのHMOの生体で近、天野らによりラクト-N-デカオースおよびラクト-N-ネオの役割には、デカオースを基本骨格（コア）とする新規な20種類のオリゴ・プレバイオティクスとしての作用（小腸で消化されずに大糖が加わり、新しく13系列からなるHMOのコア構造を提腸に到達し、乳酸桿菌やビフィズス菌の特異的な糖源・2）案されていることは前回紹介した 。最近、日本人の研究

C源・エネルギー源・炭素源となる）

者によりHMOの人乳における存在意義について、ビフィズ・感染防御因子としての作用（可溶性の細菌レセプターア

ス菌との関連性で魅力的な学説が提出された。また、本ナログとしてCampylobacter jejuniなどの病原性細菌や稿の著者の一人である浦島によっても、ヒトに近縁であるノロウイルスなどが腸管上皮に付着するのを阻止する）

霊長類のミルクオリゴ糖の構造化学研究より、ヒトの進化などの役割が推定されている。最近、食品総合研究所のとビフィズス菌の共生についての学説（共生進化説）も提北岡本光博士らの研究グループにより、HMO側からの研出された。本稿では、以上の学説などを紹介することで、究でなく、腸内でこれらを資化するビフィズス菌側からのアさらにミルクオリゴ糖の哺乳動物における存在意義と重プローチにより、HMOの存在意義の一端が解明された。

要性について考察することにする。

母乳栄養児では、生後一週間以内に腸内細菌叢（フローラ）がBifidobactrerium（ビフィズス菌）により最優勢に2．HMOとビフィズスフローラの形成なることが知られている（図１）。このように、腸内細菌全体の95〜99.9％がビフィズス菌に占有されるフローラの状態

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ヒトでは、ウシの場合よりもはるかに複雑な化学構造のを「ビフィズスフローラ」と呼んでいる3,4）。一方、牛乳を原料ミルクオリゴ糖を初乳期だけでなく常乳期にも分泌する。とする育児用調製粉乳（粉ミルク）
では、ラクチュロースやガ

人乳には多量の糖質が含まれており、その常乳中での含ラクトオリゴ糖などの有用オリゴ糖が添加されている場合

量は乳糖（ラクトース）の約7g/dlに加えて、HMOは1.2−でも、10％はエンテロバクテリアが占め、ビフィズス菌によ1.4g/dlにも達する。初乳ではさらに高いHMOが含まれ、る占有率は70−90％に止まり、母乳栄養児には及ばない。

2.2−2.4g/dlにも達する。HMOの種類は豊富であり、現在このビフィズス菌占有率の差異は、人乳に含まれている

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ミルクオリゴ糖（乳中少糖）の比較生化学(XII)HMOに由来するものと考えられている。人乳には多種類

報は全く不明であった。のHMOが含まれているために、それらの内のどれかの2005 年 、食 品 総 合 研 究 所 の 北 岡らは、B.bifidum

分子がビフィズスフローラの形成に重要な働きをしている

JCM1254をグルコース糖源で培養後、菌体破砕液からと推定されていたが、その詳細は不明であった。

各種クロマトグラフィーを駆使してLNBPと思われる酵素を母乳栄養児における腸内フローラのビフィズス菌にど精製した 6）。本酵素の分子量は約86 kDaであり、N-末端のような菌種がいるだろうか。森永乳業㈱は、４ヶ月齢の配列と内部の合計２ケ所のアミノ酸配列のBlast searchを母乳のみを飲んでいる乳児糞便より、腸内フローラ解析行った。その 結 果 、ゲノム既 読 のビフィズス菌 であるを培養法により実施した。その結果、Bifidobacterium

B.longum NCC2705株のBL1641遺伝子のコードする機（B.）
breveが77％、B.pseudocatenulatumが17%、B.bifidum

能未知タンパク質と高い相同性を示した。そこで、基準株が3％、B.longumが2%およびその他が1%を占めていた。

B.longum JCM1217から相当遺伝子BL1641のクローニン

すなわち、乳児の腸内フローラは完全にビフィズスフローラ

グを行い、酵素を大腸菌中に大量発現させた。得られになっており、その約8割はB.breveに偏っていることが判った組み替え酵素は、活性測定よりLNBPであることが初た。この結果は、乳児糞便の「培養法」による菌数定量のめて確認された。本酵素は、全く新しい酵素ファミリー結果であり、非培養法（遺伝子法）を用いればまた違った（EC 2.4.1.211）に属することが判明し、Lactobacillus,結果が出るだろう。培養法でコロニーが得られない菌は難Bacteroides, Escherichiaなどの他の主要な腸内細菌ゲノ培養性菌（uncultured bacterium）と呼ばれているが、そのよム中には本酵素をコードする遺伝子は見出されず、腸内うな菌がヒト腸管にも沢山存在することが知られている。

細菌ではビフィズス菌にのみ特異的な酵素と考えられた。
これは、腸内でビフィズス菌の優位性を説明できる重要な出発情報となった。
B.longum NCC2705株において本酵素をコードする遺伝子の上流および下流域の遺伝子解析を進めた結果、図２に示したような一連の遺伝子クラスターが明らかとなり、また各遺伝子がコードする各酵素の役割が明らかとなった7,8）。

図1 ヒト新生児の生後７日までの腸内細菌叢の推移

3．ビフィズス菌における LNB の資化経路の発見
1999年、Derensy-Dronらにより、B.bifidumの菌体内酵素としてラクト-N-ビオースホスホリラーゼ（LNBP, EC 2.4.1.211）の存在が、染色体DNA（ゲノム）中に推定された5）。この酵素

図2 B.longum NCC2705におけるLNB資化性の遺伝子クラスター7,8）は、ラクト-N-ビオース（Galβ1-3GlcNAc）とガラクト-N-ビオース（Galβ1-3GalNAc）の両基質を加水分解する加リン酸分すなわち、初めの３つの遺伝子1638, 1639, 1640がコー解酵素である。本酵素の最大の特徴は、他の加リン酸分ドするのは糖の取込みに関するABCトランスポーターで解酵素と異なり、ガラクトシド結合に作用する唯一の酵素あった。本タンパク質は、ラクト-N-ビオースを認識して細であり、ムチン代謝に関連してビフィズス菌が腸管粘膜のム胞内に取り込む重要な役割を持ち、他の腸内細菌よりもチン糖鎖を分解する酵素と推定されていた。しかしながら、糖源確保の観点で大きく優位に立てる。ついで、取り込ま本酵素はその後精製されることはなく、完全な遺伝子情れたラクト-N-ビオースは遺伝子1641がコードするLNBPTHE CHEMICAL TIMES 2011 No.2
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により加リン酸分解を受け、Gal-1-PとGlcNAcに分かれ3GlcNAc）に代表される（１→３）
結合の「I型構造」と、N-アる。直接Gal-1-Pが得られることは、通常のβ-ガラクトシダセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）に代表される（１→４結ーゼと比較してリン酸基を転移させる際のATPを一分子合）の「II型構造」に２分される。図３では、HMOの基本骨節約できるので、他の腸内細菌よりもさらに優位に立てる。

格中でこのI型構造のラクト-N-ビオース部分を下線で示

その他でも遺伝子1643のコードするGal-1-P uridylyl

した。ビフィズス菌の有する特徴的なLNBPは、HMOのtransferaseはUDP-GalとUDP-GalNAcを同時に生合成約50％以上を占めるI型オリゴ糖を利用できる優位性をでき、また遺伝子1644のコードするUDP-Glc 4 epimerase持つことが理解される。

はUDP-GlcとUDP-GlcNAcを同時にエピメリ化でき、
そしかし、実際には人乳中には遊離状態で２糖のラクト-の後のGlc-1-PとGlcNAc-1-Pは解糖系でエネルギーを獲N-ビオースが存在している訳ではなく、HMOの分子構造得できる。以上のように、この菌株ではいかに他の腸内の中に構成単位として組み込まれている。したがって、
こ細菌と比較して優位にラクト-N-ビオースを資化利用できるの２糖単位をHMOから酵素的加水分解で取り出さなくてかが良く理解できる。

は、ビフィズス菌は優位性を他の腸内細菌に対して発揮できない。例えば、人乳中に多く含まれているHMOの一４．ビフィズス菌とラクト-N-ビオースの関係つに、ラクト-N-フコペンタオースI（５糖）があり、化学構造はFucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc

ビフィズス菌はラクト-N-ビオースを特異的に菌体内にである。この５糖には確かに下線部のラクト-N-ビオース取込み、資化利用できることが判った。実際にHMOのが構造単位として含まれているが、この２糖単位を得るた

化 学 構 造を検 討 すると、ラクト-N-ビオース（Galβ1-めには非還元末端側のFucのα結合を加水分解するα-フ図3 人乳中のヒトミルクオリゴ糖（HMO）の化学構造による分類

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ミルクオリゴ糖（乳中少糖）の比較生化学(XII)

コシダーゼが必要である。また、同時に２糖の還元末端持している。

側を内部から加水分解するラクト-N-ビオシダーゼが必要

北岡博士のラクト-N-ビオース説は、母乳栄養児のビフィである。その後のクローニングと大腸菌発現実験により、ズスフローラ形成を説明するのには、極めて有力な学説

9）

10）

α-フコシダーゼ およびラクト-N-ビオシダーゼ の存在がと考えられる。しかしながら、ビフィズス菌はHMO中のラB.bifidum JCM1254株において確認された。

クト-N-ビオース含有オリゴ糖から、どの程度積極的にこの

しかしながら、ビフィズス菌の持つフコシダーゼの活性２糖単位を切り出して利用しているかは全く不明である。

は余り強くないことが指摘されており、実際に腸内でのとくに、ビフィズス菌のフコシダーゼ活性や2糖単位を切りHMOの資化利用には、他の腸内菌のフコシダーゼなどで出すラクト-N-ビオシダーゼの実際の腸管内フローラでの切り出されたオリゴ糖を間接利用している可能性もあり、発現と酵素活性の強さなどはまだ明らかにされていない。

今後の研究課題として残されている。初期にラクト-N-ビ

また、ラクト-N-ビオースを実際に摂取した乳児腸管におオースの特異的資化性で優位にたったビフィズス菌は、そける、腸内フローラの非培養法による解析やメタゲノム解の後は人乳中に７％と多量に含まれるラクトースを糖源と析が将来望まれている。

して増殖しているのかもしれない。

2008年、カリフォルニア大学デービス校のMills教授ら

森永乳業㈱の肖（清水）
博士らと北岡博士らの共同研の研究グループは、B.longum subsp. infantisの菌株にお究により、ラクト-N-ビオースを資化するビフィズス菌側の特いて、大きな分子量のHMOをまず菌体に取込み、菌体

11）

徴について報告がなされている（表1） 。すなわち、各種の内において非還元末端から逐次酵素で加水分解利用

ビフィズス菌株に対して、ラクト-N-ビオースを資化するかどうする新しい代謝経路を報告した12）。北岡らの代謝経路かを検討し、また同時にこの２糖の分解利用に関するとは全く別の経路を利用しての、取込み利用方法の報GLNBP遺伝子を保持しているかどうかを試験した。その告である。 彼らは、本菌株のゲノム中には高分子量オリ結果、B.longum subsp. longum, B.longum subsp. infantis,

ゴ糖を特異的に取り込むトランスポーター遺伝子と共に、B.breve, B.bifidumの４菌種がラクト-N-ビオースを資化し、β-ヘキソサミニダーゼ、シアリダーゼ、フコシダーゼ、β-ガ

かつGLNBP遺伝子も保有していることが判った。その他

ラクトシダーゼなどの一連の糖鎖分解酵素から成る遺伝のビフィズス菌であるB.adolescentis, B.catenulatum, B.

子クラスターを発見し、７糖以下のオリゴ糖の代謝利用をanimalis subsp. lactisなどでは本２糖を資化することがで明快に説明できるとしている。従って、B.longum subsp.

きず、またGLNBP遺伝子も保有していないことが判った。

infantisでは、高分子量のHMOを他の腸内細菌よりも取この研究では、乳児糞便から単離したビフィズス菌はラクり込み段階から有効利用できることが説明でき、
この学ト-N-ビオースを良く利用し、成人や他の動物由来のビフ説からも母乳栄養児の早期ビフィズスフローラ形成を十ィズス菌はこの２糖を分解利用出来ないことが判明し、母分説明可能と考えられる。一方、ビフィズス菌の中でも乳栄養児のHMOによるビフィズスフローラの形成を強く支B.longum subsp. longumでは、他の乳酸菌と比較して６糖

表1 ビフィズス菌の各菌種によるLNBの資化性とGLNBP遺伝子の有無11）や７糖のフルクトオリゴ糖を優先的にβ-フルクトフラノシダー
ゼによりフルクトースを切り出した後に、それを酢酸に資化利用し、腸管出血性O-157などの大腸菌を撃退できることが知られている。これは、離乳後に同菌株が食品中のフルクトオリゴ糖を利用する機構を示していると考えられる。

5．ラクト-N-ビオースと特定保健用食品
（トクホ）
平成３年
（1991年）、当時の厚生省により特定保健用食品（トクホ）の制度が開始された。平成23年2月の段階では、合計960品目以上の商品が、許認可され市販されている。トクホの市場は7,000億円市場と拡大しているが、そのTHE CHEMICAL TIMES 2011 No.2
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約50％を占めるのが、「おなかの調子を整える食品」
であ

6．ヒトとビフィズス菌の共生進化説

り、発酵乳（ヨーグルト）、オリゴ糖および食物繊維である。
トクホに使用されている整腸作用が期待されるオリゴ糖

ヒトは二足歩行と脳の発達により胎盤が小さくなり、そのには、乳果オリゴ糖（ラクトスクロース）、ガラクトオリゴ糖お結果、妊娠期間が短縮され、未熟な新生児を出産するよよびラクチュロースなどが知られている。これらの３種類うになった。しかし、未熟な新生児は細菌やウイルスなどにのオリゴ糖は、いずれも牛乳に多量に含まれている比較

よる感染に極めて弱いので、母乳中に乳児を感染から守的安価な乳糖（ラクトース）を出発材料としている。ラクト-る成分の合成と分泌が必要であったと考えられる。浦島

N-ビオースも将来的に大量合成されれば、そのビフィズス

らは、ボノボ、ゴリラ、オラウータンおよびテナガザルなどの類因子としての有用な作用や安全性を確認することが可能

人猿や旧世界ザルおよび新世界ザルの乳や初乳中のミルとなるため、本２糖を大量合成するという試みも北岡らのクオリゴ糖の種類と化学構造に関する検討を行った12, 13）。

研究グループにより既に開始されている13）。

その結果、ラクト-N-ビオースを含むタイプI型オリゴ糖は、チT

西本と北岡は４種類の酵素であるSP, Gal , GalE,ンパンジー、ボノボ、オラウータンには存在するものの、タイGLNBPを用いて、糖基質としてのスクロースとUDP-GlcおプII型オリゴ糖の方が優先的であった。従って、乳中でよびGlcNAcに対して反応させることで、高い収率でラクのタイプI型オリゴ糖の優先性は、人乳にのみ特徴的であト-N-ビオースを得ることに成功した。反応の内容は図４ることが判明した。この研究成果は極めて重要であり、に示した。7L規模の培養液で反応させた調製実験でタイプI型オリゴ糖はヒト乳児の腸内にビフィズス菌を住みは、反応収率87％という高い収率を得ている。ただし、着かせることに極めて有利に働いたと推定される。

反応酵素は全て大腸菌による組み換え体を用いる実験

また、Albrechtらの研究 14）では、母乳栄養児の糞便中室レベルの試みであるので、実際の食品への利用にはさのオリゴ糖を解析した結果では、タイプI型のラクト-N-テトらに工夫が必要とされている。しかし、北岡らの試みは、ラオースが母乳レベルよりも著しく含有量が低かったとい将来的に必ず実現するだろうと考えている。また、現在のう事実や、
ラクト-N-ネオヘキサオースからラクト-N-ビオース

トクホに認可されているオリゴ糖では、乳果オリゴ糖もラが切り出された結果、タイプII型オリゴ糖のみが残ったオクチュロースも天然界には存在しない人工オリゴ糖であリゴ糖像が確認されるなど、タイプI型HMOが優先的にり、ガラクトオリゴ糖もHMOの中では存在比は低いもの腸内ビフィズス菌に利用されている可能性が示唆されてである。従って、HMOの約50％以上に構造単位として含いる。人乳中のHMOの約50％以上はラクト-N-ビオース

まれるラクト-N-ビオースの安全な大量調製法が確立すれを構造単位として含むタイプI型のオリゴ糖であり、これらば、これらの添加した育児用調製粉乳では人乳に匹敵すのプレバイオティクスとしての働きにより、乳児が感染からるビフィズスフローラを実現させることが可能ではないか

守られるようになったヒトとビフィズス菌の共生関係を彷彿と、大いに期待されている。

させる学説である。

7．おわりにミツバチの腸管にもビフィズス菌の存在が報告されている。母乳栄養児におけるビフィズスフローラとHMOの関係
は、北岡博士のラクト-N-ビオース仮説により大分理解が進んできた。しかし、この仮説だけでは説明できないことも確かなようである。この仮説以外にも、ビフィズス菌の乳児腸管や成人腸管における存在や優位性を説明する
Mills学説も存在し、どちらも重要であるように考えられる。
図4 ４酵素の同時反応によるLNB生産法13）

いずれにしても、HMOの存在意義に関するより詳細な実験を計画するには、多量のオリゴ糖が試験材料として必16

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ミルクオリゴ糖（乳中少糖）の比較生化学(XII)要であり、現時点ではあまりにも高価なためにそれらの実験を実施することが不可能である。北岡博士らの遺伝子工学を駆使した試みにより、将来的に各種のHMOが自由に酵素合成できるようになれば、さらに神秘的な乳児フローラ解析が飛躍的に進展するものと期待されている。
また、
著者らがこれまで本誌にて発表したミルクオリゴ糖
研究 1,2,17-25）、および関連研究 26-37）の紹介も是非参照して頂き、MOの多様性の生物学的意義と将来的な高度利用性などについてご興味を持って頂けたら幸いである。

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