CKANTO CHEMICAL CO., INC.

2013 No.3（通巻229号）

ISSN  0285-2446

原始クラミジアから紐解く病原体の細胞内生存戦略と制御

山口

博之

2

コア粒子表面にグラフトされたシェル層を触媒に利用した複合粒子の調製

谷口

竜王

9

脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析

樺山一哉

プルシアンブルー；新しい応用とそのナノ粒子

𠮷野

和典

最近のトピックス



小島

寿夫

鈴木

佑典

15
23
28

原始クラミジアから紐解く
病原体の細胞内生存戦略と制御
Primitive chlamydiae: a hint to uncover the intracellular survival strategy of human pathogens
北海道大学大学院保健科学研究院病態解析学分野

感染制御検査学研究室

山口 博之

Hiroyuki Yamaguchi
Departoment of Medical Laboratry Sciences, Faculty of Health Sciences,
Hokkaido University Graduate School of Health Sciences

入らない。一方、2004 年、Science に一本の興味深い

1. はじめに論文が掲載された。驚いたことに自然環境に広く生息性感染症や呼吸器疾患を起こすクラミジアは、長いする原生動物アカントアメーバ（以下アメーバ）に、クラミ

年月をかけ感染する細胞に認識されないようにさまざま

ジアが進化の過程で捨ててしまった分子をいまだ温存な分子を捨てヒトを含む哺乳細胞に適応進化してきた。

する原始的なクラミジアが現存しているというものであっ失った分 子の中には、感 染 細 胞にいち早く認 知され、た［ヒトに起病性のあるクラミジアの平均ゲノムサイズが病原体の排除機構を効率良く活性化する分子が含ま1.0-1.2Mbp 程度と比較的小さいのに比べ、この原始れているはずであり、その分子の機能解析は、細胞内クラミジア（Protochlamydia UWE25）のゲノムサイズはに持 続 的に寄 生するさまざまな病 原 体を制 御する上

約 2.4Mbpと2 倍近く大きい］。そこで私達は、クラミジ

で、新たな戦略を生み出す可能性がある。だが残念な

アが 哺 乳 細 胞に適 応 進 化する過 程で捨てた分 子をことに、クラミジアが一度失った分子は、そう容易く手に求め、土 壌や水 系 環 境から原 始クラミジアが共 生す

図 1 16S rRNAを指標にしたクラミジアの系統分類

2

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参考文献 1、Figure 1 より引用

原始クラミジアから紐解く病原体の細胞内生存戦略と制御るアメーバを株化し、共生する原始クラミジアのユニーへと変換して行くが、封入体膜上には食胞が成熟する

クな特 性について細 胞 分 子レベルでの 検 討を始めために必要なマーカーが見られず、リソソームとの融合た。本 稿では、まずクラミジアの概 要を説 明した上でが起こらない 8, 9）。更に、感染した宿主細胞がアポトーシ

原 始クラミジアのユニークな特 徴について私 達 の 実スに陥らない様な細胞修飾機構を保有している 10）。そ験データをもとに紹介したい。

の機構も良く調べられていて、菌体から分泌され細胞質に放出されるCPAF（chlamydial protease/proteosome-

2. 病原性クラミジアと原始クラミジア

like activity factor）が、アポトーシス刺激の主要なセンサーであるBH3-only proteinを分解することで、感染クラミジアの分類上の広がりは極めて広くクラミジアスー細胞がミトコンドリアの機能不全を介してアポトーシスに

パーファミリーとも称されている（図 1）1）。現在クラミジア目陥ることを防いでいる 11）。その一方、強力な殺菌機構

は、Chlamydiaceae、Parachlamydiaceae、Waddliaceae、を備えたアメーバへの感染様式やアメーバ内での原始

Simkaniaceae の 4 科に分類されている。ヒトに感染し、クラミジアの宿 主 細 胞 への修 飾 機 構は全く明らかに

肺炎や性感染症の原因となるChlamydia pneumoniae

なっていない。

や C. trachomatis などを 含 む 病 原 性クラミジアはChlamydiaceae の 1 科に属し、後者 3 科が原始クラミジ

Aアである。原始クラミジアと病原性クラミジアの分岐は今から7 億年以上前に遡るが、分岐後の進化の過程で適応した宿主域は大きく異なり、病原性クラミジアが哺乳動物から魚類に至るまで、脊椎動物に幅広く生息す
る一方、原始クラミジアの生息環境は主にアメーバなど
原生動物に限られている 1, 2）。一方、どちらのクラミジア
も他の細 菌 種には見られないユニークな増 殖 環を持ち、宿主細胞への感染能力はあるが分裂増殖能を欠いた基本小体（elementary body：EB）と感染能力はない細胞内にて分裂する網様体（reticulate body：RB）
より構成されている（図 2）1）。原始クラミジアには更にユ
ニークな形 態 学 的な特 徴があり、環 境の劣 悪 化に伴い、EB から三日月体（crescent body：CB）という特異なB

形態が観察される場合がある（図 2B、c）。病原性クラミ
ジアの細 胞 への付 着ならびに細 胞 内での生 存・増 殖
様式は大変良く調べられている。まず病原性クラミジアの宿主細胞への付着には、菌体表層に発現している
外膜蛋白 OmcB やストレス蛋白質 HSP70 が宿主細胞上の細胞外マトリックスプロテオグリカンの側鎖ヘパリン
や繊維芽細胞増殖因子 2 に結合することが重要である 3-5）。その後、細胞に付着した EB の III 型分泌装置
にて細胞質に打ち込まれるTARP（translocated actin
recruiting phosphoprotein）
によりアクチンの再重合が誘導され、それに伴い形成される細胞表層の台座を介して宿主細胞内へと取り込まれて行く6, 7）。宿主細胞内に移行したEB は食胞に類似した封入体膜に包まれ RB

図 2 原始クラミジアの増殖環と形態学的な特徴
A. 原始クラミジアの増殖環。最終分化や死滅する過程ではないので生活環とは呼ばない。aからg：増殖環の進行方向。EB：基本小体、RB：網様体、CB：三日月体。参考文献 1、Figure 3より引用
B. 原始クラミジアの形態学的な特徴を示す透過型電子顕微鏡像。左（a）：
ヒト上皮細胞 HEp-2 細胞に感染した病原性クラミジア（Chlamydia
pneumoniae TW183 株）とその封入体。感染後 72 時間。右（b, c）：ア（c）
はP.
メーバに感染したParachlamydia acanthameobae 。三日月体
acanthaomebae の特徴と考えられているが、電顕固定時のアーチファ
クトの可能性も否定できない。一部の電顕写真は、私達の発表論文（Microbiology and Immunology, 54：63-73, 2010）より転用。

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図 3 FISHによる株化アメーバ内共生細菌の可視化
アメーバを固定後、アメーバ18SrRNA（緑）とクラミジアあるいはクラミジアを除く細菌 16SrRNA（赤）に特異的なプローブを用いてFISHを行い、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。参考文献 12, Figure 2 より引用、一部改変

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原始クラミジアから紐解く病原体の細胞内生存戦略と制御

3. 原始クラミジアが共生するアメーバの株化と共生細菌の可視化や栄養分枯渇など生育環境の悪化に伴い耐久型シストに移行する。シストに移行した休眠状態のアメーバは分裂・増殖せず、代謝活性が極めて低い状態に維持さ既に述べたように原始クラミジアは、病原性クラミジア

れているので、シストは偏性細胞内寄生性の環境クラミの適応進化を紐解く鍵になる有用なモデルにもかかわジアにとっても極めて過酷な環境であると考えられる。そらず、その宿主細胞への修飾機構は明らかになっていこで私達は、アメーバシスト内でもProtochlamydia R18ない。そこで私達は、土壌や河川水から41 株のアメーの生 存 性や感 染 性が維 持されているかどうか 検 討しバを株化し、共生細菌の有無を調査することから始めた。シスト移行後 1ヶ月間 4℃に放置したアメーバを復帰た。その結果、偏性細胞内寄生性の細菌が共生する5 株のアメーバ
株の樹 立に成 功し系 統 解 析の結果、そのうち 3 株に原 始クラミジア（NeochlamydiaとProtochlamydia）
が共生していることをつきとめた 12）。
FISH による可視化からは、いずれの共生細菌もアメーバ細胞質に広く分 布していることが判 明した（図3）12）。樹 立したアメーバ内でのこれら原 始クラミジアの共 生 様 式は
極 めて 興 味 深く、以 下 に 紹 介 する。原 始クラミジア Neochlamydia

図 4 原始クラミジアProtochlamydia R18はアメーバに再感染できるがNeochlamydia S13はできない。
（TEM）
上段：アメーバより取り出したNeochlamydia S13 のアメーバへの再感染後の透過型電子顕微鏡
像。アメーバに侵入するが、その後の分裂増殖は認められない。
下段：アメーバより取り出したProtochlamydia R18 のアメーバへの再感染後の TEM 像。
参考文献 12, Figure 4 より引用、一部改変

S13とProtochlamydia R18 が共生するアメーバ株は土 壌ならびに河川水よりそれぞれ分離株化された。これらアメーバに共生するどちらの原始クラミジアも、アメーバから取り出すと24 時 間 以 内に死 滅した。興味深いことにアメーバより取り出された Protochlamydia R18 は
容 易にアメーバへ 再 感 染したが、Neochlamydia S13 はアメーバに侵 入できるが 消 化されてしまい再感 染 の 成 立 は 確 認 できなかった（図 4）12）。このように他の原始クラ
ミジア Protochlamydia R18に比べNeochlamydia S13 は進化の過程
で、アメーバへの依存度が増したものと考えられる。
一 方、アメーバは、栄 養 分が豊富にある環境では活発に分裂増殖する栄養型として存在するが、乾燥

図 5 TEM 解析で観察されたアメーバシスト内の原始クラミジアProtochlamydia R18 の局在と栄養型に復帰したアメーバ細胞質での分裂増殖。
A. アメーバシスト内のProtochlamydia R18。E：基本小体 □は拡大
（B）
B. シスト内共生細菌の微細構造。mt：ミトコンドリア（D）
C. 栄養型に復帰したアメーバ内のProtochlamydia R18。E：基本小体 R：網様体 □は拡大
D. 栄養型に復帰したアメーバ内共生細菌の微細構造。mt：ミトコンドリア

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させ菌数算定や FISH にてアメー
バ 内 の Protochlamydia R18 の動態についてモニタリングした。その 結 果、シストから復 帰 後 のアメーバで菌 数の増 加 が 確 認されたことより、Protochlamydia R18
がアメーバシスト内においても感染性を維 持しながら生 存できることが明らかになった（図 5）13）。このよ
うに Protochlamydia R18 にとってアメーバシストは土壌や河川水など
自然環境中で普遍的に起こりうる激しい温度や栄養分の変化から身を守るためのシェルターとして機能し
図 6 Protochlamydia 除菌アメーバで観察された糸状仮足の異常発現。
Neochlamydia S13 除菌アメーバではこのような現象は観察されなかった。
参考文献 14、Figure 5より引用ている可能性がある。
4. 原始クラミジアProtochlamydia R18による
宿主アメーバの運動能と発育スピードの制御
何故、アメーバは原始クラミジアの共生を許容したのだろうか。その理由を探るためにアメーバに共生する原始クラミジアを抗菌剤で除菌し無菌アメーバを樹立し、除菌前の親アメーバの発育スピードや運動能などの表
現 型について比 較した。その 結 果、原 始クラミジア

無添加

スタウロスポリン添加

Protochlamydia R18 添加
図 7 Protochlamydia R18 刺激ヒト上皮細胞株 HEp-2 細胞はアポトーシスを誘導する。
Protochlamydia R18をMOI 90でHEp-2 細胞に添加し、24 時間後に、
TUNEL 染色にて核酸の断片化を可視化した。緑はTUNEL 染色陽性のア
ポトーシス細胞。倍率：100 倍
参考文献 16、Figure 2 より引用、改変

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図 8 低温30℃培養条件下ヒト細胞株HEp-2細胞内で増殖するParachlamydia
Bn9。
（30℃）
下で3日間培養し、HEp-2細胞にParachlamydia Bn9を添加し低温固定後、抗Parachlamydia ポリクローナル抗体で染色した. 標本は共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。緑：菌体 青：DAPI

原始クラミジアから紐解く病原体の細胞内生存戦略と制御

Protochlamydia R18を除菌したアメーバでは、アメー活性を阻害することで、アポトーシスからの回避を妨げ

バの増殖と運動能が顕著に低下し、再感染アメーバでるコンパウンドとして知られているが 17）、この薬剤添加は回復することを見つけた 14）。一方、除菌はアメーバのは Protochlamydia R18 によるアポトーシス誘導も顕著

飲作用や貪食には影響を与えなかった。興味深いこに抑制した 18）。この結果は、病原性クラミジアと原始クとに Protochlamydia 除菌アメーバではアクチン再重合

ラミジアがそれぞれ保有するCPAF の基質特異性が、の鈍化と異常な糸状仮足が観察され、共生細菌による進化の過程で大きく変化した可能性を示唆するものでアメーバの制御は、アメーバアクチン重合系の修飾を要あり極めて興味深い。

14）

求する可能性が示唆された（図 6） 。これらの現象は
14）

Neochlamydia S13共生アメーバでは見いだすことができなかった。このように、アメーバと共生する原始クラミジ

6. 原始クラミジア（Parachlamydia Bn9）の低温下でのヒト株化細胞 HEp-2 内不完全増殖

アとの間には極めて安定したしかも特異な共生様式が存在する可能性が示唆された。Protochlamydia R18

既に述べたように原始クラミジアは、37°C ではヒト株の共生は、アメーバが効率良く周囲の細菌を補食する化上皮細胞へ侵入できるが増殖できない。その一方、ことを可能とし、アメーバの生存性に大きな優位性を賦

低温下（30°C）で Parachlamydia Bn 9 は細胞に侵入し与している可能性が高い。一方、Neochlamydia S13

核周囲にて活発に分裂増殖できることを見つけた（図8）の除菌は、アメーバの増殖スピードを向上させた。予（未発表データ）。しかしながら原始クラミジアの成熟は想に反したこの結果はどのように解釈したら良いのだろ

不 完 全であり、周 辺 細 胞 への二 次 感 染は起こらないうか。私達はその理由を探るべく検討を進めている。

（未発表データ）。何故、低温下で原始クラミジアはヒト

14）細胞に侵入し不完全ながらも増殖できるようになるのだ
5. 原始クラミジアProtochlamydia R18による
ヒト上皮系細胞株 HEp-2 細胞へのアポトーシス誘導

ろうか。クラミジアの細胞への侵入には III 型分泌装置
を介して細胞質に打ち込まれるエフェクターTARP へのグアニンヌクレオチド交換因子（VAV）の結合を介した

私達は、通常の培養条件下において一部の原始ク

Rho GTPase の活性化に伴うアクチン重合が必要であ

ラミジア（Parachlamydia Bn 9 ）が株化ヒト細胞内で増る 19）。しかしながらいずれの原 始クラミジアゲノムにも殖できないことを見つけた 15）。何故、増殖できないのだ

TARP ホモログは存 在せず、未 知エフェクターとVAV

ろうか。その理由を明らかにすべく、Protochlamydiaの結合を介してアクチン重合が促進されている可能性

R18をヒト上皮細胞株 HEp-2 細胞に添加し細胞の修がある。また感染細胞の脂質を利用し成熟するクラミジ

飾 変 化について詳 細に解 析 することにした。その結アは、その菌体周囲に形成した“封入体膜”へ宿主細果、驚いたことに Protochlamydia R18 生 菌 刺 激は胞の CERT（脂質輸送蛋白）とSMS（スフィンゴ脂質合

HEp-2 細胞にアポトーシスを誘導した（図 7）16）。このア成酵素）
を、エフェクターIncを巧みに利用し動員していポトーシス誘導は、アクチン重合阻害剤サイトカラシンDることが明らかにされた 20）。競合するエフェクターの存やカスパーゼ 3 阻害剤の添加で顕著に抑制された 16）。

在は脂 質の獲 得に障 害を与えている可 能 性がある。

その一方、細胞内での Protochlamydia R18 の増殖

現在 VAV、CERT、SMSと会合する菌体エフェクターは確認できなかった 16）。これらの結果は、このアポトー

分子を原始クラミジアのゲノム情報を基に見つけだす

シス誘導には、Protochlamydia R18 の細胞内への侵作業を現在進めている。

入が不可欠であるが、菌体増殖に伴う代謝活性は要
求しないことを示唆している。このアポトーシスを誘導するProtochlamydia R18 エフェクターとはどのような分

7. 今後の展望

子なのだろうか。私達はそのヒントを既に見つけている。

病原性クラミジアは長い年月をかけ、感染細胞の監

プロテオソーム阻害剤ラクタシスチンは病原性クラミジア

視ネットワークに捉えられ易い分子を捨てることで哺乳から分泌されるCPAF に結合し、CPAF のプロテアーゼ

細胞への適応進化に成功したと考えられる。失った分THE CHEMICAL TIMES

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子を見つけその機能を紐解く作業は細胞寄生性病原

8）Scidmore-Carlson, M.A.; Shaw, E.I.; Dooley, C.A.; Fischer,体の細胞内生存戦略を理解する上で極めて興味深い

E.R.; Hackstadt, T. Molecular Microbiology. 1999, 33, 753-

研究の方向性であるが、失った分子を病原性クラミジ
ア自身から求めことはできない。そこで私達は独自に株化した原始クラミジアのエフェクター分子の機能解析か
らその手掛かりを探っている。幾つかの原始クラミジアのゲノム解読も並列して進めているが、ユニークなゲノ
ム構造やその配列から蛋白・蛋白相互作用に関わるロ
イシンリッチリピートやアンキリンモチーフを含む機能未知の分子が多数同定されている。これら分子中にはク
ラミジアの進化を説明するものや、細胞内に侵入する
病原体の制御に極めてクリティカルな機能を保有するものが含まれているものと期 待している。まだ研 究は始まったばかりである。
本研究プロジェクトは松尾淳司先生（北海道大学保
健科学研究院）、中村眞二先生（順天堂大学医学研究科）、林田京子先生（北海道大学人獣共通感染症
リサーチセンター）、杉 本 千 尋 先 生（北 海 道 大 学 人 獣
共 通 感 染 症リサーチセンター）、黒田誠 先 生（国 立 感染症研究所）、関塚剛史先生（国立感染症研究所）、
竹内史比古先生（国立感染症研究所）、永井宏樹先生（大阪大学微生物病研究所）との共同研究として進められています。また研究に関わってくれた多くの大学院生に深謝します。

参考文献
1）Horn, M. Annual Review of Microbiology. 2008, 62, 113-131.
2）Horn, M.; Collingro, A.; Schmitz-Esser, S.; Beier, C.L.;
Purkhold, U.; Fartmann, B.; Brandt, P.; Nyakatura, G.J.;
Droege, M.; Frishman, D.; Rattei, T.; Mewes, H.W.; Wagner, M.
Science. 2004,304, 728-730.
3）Zhang, J.P.; Stephens, R.S. Cell. 1992, 69, 861-869.
4）Raulston, J.E.; Davis, C.H.; Paul, T.R.; Hobbs, J.D.; Wyrick, P.B.
Infection and Immunity. 2002, 70, 535-543.
5）Kim, J.H.; Jiang, S.; Elwell, C.A.; Engel, J.N. PLoS
Pathogenesis. 2012, 7, e1002285.
6）Clifton, D.R.; Fields, K.A.; Grieshaber, S.S.; Dooley, C.A.;
Fischer, E.R.; Mead, D.J.; Carabeo, R.A.; Hackstadt, T. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2004, 101, 10166-10171.
7）Jewett, T.J,; Fischer, E.R.; Mead, D.J.; Hackstadt, T. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2006, 103, 15599-15604.

8

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（通巻 229 号）

765.
9）Beatty, W.L. Journal of Cell Science. 2006, 119（2）, 350-359.
10）Byrne, G.I.; Ojcius, D.M. Nature Review Microbiology. 2004,
2, 802-808.
11）Pirbhai, M.; Dong, F.; Zhong, Y.; Pan, K.Z.; Zhong, G. Journalof Biological Chemistry. 2006, 281, 31495-31501.
12）Matsuo, J.; Kawaguchi, K.; Nakamura, S.; Hayashi, Y.;
Yoshida, M.; Takahashi, K.; Mizutani, Y.; Yao, Y.; Yamaguchi, H.
Environmental Microbiology Reports. 2010, 2, 524-533.
13）Nakamura, S.; Matsuo, J.; Hayashi, Y.; Kawaguchi, K.;
Yoshida, M.; Takahashi, K.; Mizutani, Y.; Yao, Y.; Yamaguchi, H.
Environmental Microbiology Reports. 2010, 2, 611-618.
14）Okude, M.; Matsuo, J.; Nakamura, S.; Kawaguchi, K.; Hayashi,Y.; Sakai, H.; Yoshida, M.; Takahashi, K.; Yamaguchi, H.
Microbes and Environments. 2012, 27, 423-429.
15）Hayashi, Y.; Nakamura, S.; Matsuo, J.; Fukumoto, T.; Yoshida,M.; Takahashi, K.; Mizutani, Y.; Yao, T.; Yamaguchi, H.
Microbiology and Immunology. 2010, 54, 707-713.
16）Ito, A.; Matsuo, J.; Nakamura, S.; Yoshida, A.; Okude, M.;
Hayashi, Y; Sakai, H.; Yoshida, M.; Takahashi, K.; Yamaguchi,
H. PLoS One. 2012, 7, e30270.
17）Jorgensen, I.; Bednar, M.M.; Amin, V.; Davis, B.K.; Ting, J.P.;
McCafferty, D.G.; Valdivia, R.H. Cell Host Microbe. 2011, 10,21-32.
18）Matsuo, J.; Nakamura, S.; Ito, A.; Yamazaki, T.; Ishida,K.; Hayashi, Y.; Yoshida, M.; Takahashi, K.; Sekizuka, T.;
Takeuchi, F.; Kuroda, M.; Nagai, H.; Hayashida, K.; Sugimoto,C.; Yamaguchi, H. PLoS One. 2013, 8, e56005.
19）Lane, B.J.; Mutchler, C.; Al Khodor, S.; Grieshaber, S.S.;
Carabeo, R.A. PLoS Pathogenesis. 2008, 4, e1000014.
20）Elwell, C.A.; Jiang, S.; Kim, J.H.; Lee, A.; Wittmann, T.;
Hanada, K.; Melancon, P.; Engel, J.N. PLoS Pathogenesis.
2011, 7, e1002198.

コア粒子表面にグラフトされたシェル層を触媒に利用した複合粒子の調製
Preparation of hybrid particles by using shell layers grafted on core particles as catalysts
千葉大学大学院工学研究科

准教授

谷口 竜王

Tatsuo TANIGUCHI (Associate Professor)

Graduate School of Engineering, Chiba University

1. はじめにことのできる制 御 /リビングラジカル重 合（Controlled/

高分子微粒子およびその水分散液であるラテックス

from”法に応用した研究が活発に行われている。CRP

は、塗料や接着剤などに使用される重要な工業用分散の進展とともに新しい重合系が数多く開発されており、材料のひとつであるが、液晶ディスプレイ用スペーサー、

遷移金属錯体を用いた原子移動ラジカル重合（Atom

カラム充填剤、臨床検査薬などの高付加価値材料へのTransfer Radical Polymerization: ATRP）、連鎖移動

応用も盛んになっている。また、近年では有機化合物と剤を用いた 可 逆 的 付 加 開 裂 連 鎖 移 動（Reversible

無機化合物の特性を兼ね備えた有機 / 無機複合材料

Addition Fragmentation chain Transfer: RAFT）重合、のテンプレートとして、様々な分野で利用されている。高そして安定ニトロキシドを用いたニトロキシド媒介重合

分子微粒子とシリカやチタニアなどの金属酸化物との複は、精力（Nitroxide Mediated Polymerization: NMP）

合化については、カチオン性高分子微粒子へのシリカの的に研究されている。

Living Radical Polymerization: CRP）を“grafting-

吸 着、シラノール基を有するモノマーとの共 重 合など

我々は、ソープフリー乳化重合などのラテックス合成

様々な手法が提案されており、大きな比表面積を有する法により調製したコア粒子表面からの ATRP による各種

高分子微粒子のコロイド特性を支配する粒子表面の物

モノマーのグラフト重合を行い、コア粒子表面にグラフト

理化学的特性の重要性が指摘されている。

されたシェル層をシリカ生成の反応場および堆積場とし粒子の表面組成が内部組成と異なるコア - シェル型て利用した有機 / 無機複合粒子の調製について検討し構造を有するラテックス粒子は、高分子微粒子の用途をてきた。本稿では、ATRP 開始基を有する高分子コア粒

拡大することが期待され、多種多様な表面修飾法が開子の合成、高分子微粒子表面からの ATRPによるコア-

発されており、なかでも表面グラフト重合が注目されていシェル粒子の調製、そして無機材料との複合化についる。表面グラフト重合は、既成の高分子と表面の官能基て紹介する。

の反応による“grafting-to”法と、表面に化学的に固定された開始基からの重合反応による“grafting-from”法に大別することができる。“grafting-to”法では、予め調製し2. ATRP 開始基を有するコア粒子の合成

た分子量分布の狭いポリマーを用いることにより、均一な

ラテックス合成法として最もよく知られている乳化重合

長さのグラフト鎖を導入することができるが、溶液中に溶は、界面活性剤（乳化剤）水溶液中で水溶性開始剤を解した高分子鎖の広がりのためグラフト密度の増加に限用いて油溶性モノマーを重合する手法である。乳化重界がある。一方、“grafting-from”法では高密度なグラフ

合の動力学的研究は、Harkins の定性的な反応機構を

ト鎖の構築が可能となるが、グラフト鎖長の制御が問題基盤とするSmith-Ewart の定量的な解析により進展し、となる。近年では、分子量および分子量分布を制御するモノマーで膨潤した高分子微粒子が主要な生長場とし

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て重合反応が進行することが示されている 1）。乳化重

溶性モノマーを仕込み（batch）、重合開始後に機能団を合において界面活性剤はミセル形成など重要な役割を導入するために機能性モノマーを追加して加える（shot

果たしている一方で、界面活性剤の脱離による泡立ち

addition）手法を組み合わせた高分子微粒子合成を行っやブリードアウト、バイオメディカル分野における応用ではている 3）。粒径を制御するためにカチオン性の N-n-butyl-

タンパク質の変性などの問題が指摘されている。このよN-2-methacryloyloxyethyl-N,N-dimethylammonium

うな問題を解決する方法として、界面活性剤を使用しな

bromide（C4DMAEMA）、表面にATRP 開始基を導入すい乳化重合であるソープフリー乳化重合が広く行われるために2-（2-chloropropionyloxy）ethyl methacrylateている。油溶性モノマーの代表であるstyrene（ St）
もわ（CPEM）、開始剤に 2,2ʼ-azobis（ 2-amidinopropane）

ずか（0.03wt%）
ながら水に溶解するため、水相中で St

dihydrochloride（V50）を用いた St のソープフリー乳化の重合が進行する。高分子鎖が臨界鎖長まで生長す

重合により、高分子微粒子を合成した（図 2）。Stに対す

ると析出して核を生成するが、開始剤由来の親水基がるC 4 DMAEMA 仕込み濃度の増加とともに高分子微核の表面に露出したミセル類似構造を形成するため、以降は乳化重合と同様の過程を経てポリマー粒子となる（均一相核生成プロセス）。ソープフリー乳化重合の利点として、図 1 に示す様々な機能性モノマーとの共重合による高分子微粒子表面への官能基および反応性
基の導入と、水溶性モノマーを添加することによる高分子微粒子の粒径制御をあげることができる 2）。
ATRP 開始基を高分子微粒子表面に導入する方法として、ATRP 開始基を有するモノマーとの乳化重合、シード重合、懸濁重合、さらには粒子表面の官能基の変換などが報告されているが、我々はソープフリー乳化重合の特徴を活かして、重合開始時に粒径制御に使用する水図 3 ソープフリー乳化重合における水溶性モノマーC4DMAEMA 仕込み濃度による高分子微粒子の粒径制御

図 1 高分子微粒子表面に官能基および反応性基を導入する際に使用される機能性モノマー

図 2 ソープフリー乳化重合によるATRP 開始基を有する高分子微粒子の合成

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コア粒子表面にグラフトされたシェル層を触媒に利用した複合粒子の調製

粒子の粒径は減少しており、水溶性モノマーの添加量

着目している。DMAEMA を用いたポリマーのテンプ

によりサブミクロンサイズの高 分 子 微 粒 子の粒 径を制レートとしては、ArmesらによるDMAEMAと疎水性の2-御することが可能であることがわかる（図 3）。1 H NMR（N,N-diisopropylamino）ethyl methacr ylateとのブ

測 定より、高 分 子 微 粒 子には ATRP 開 始 基を有する

ロックポリマーからなるポリマーミセル、四 級 化した

CPEM が St に対して 10 mol% 程度まで定量的に共重DMAEMAとacrylamideとのミクロゲルなどが報告され合されることが示されている。

ているが、いずれもシリカとの静電吸着を基盤とした複合化である 5）。DMAEMA は側鎖にジメチルアミノ基を

3. ATRPによる高分子微粒子表面からのグラフト重合

有しており（pK a = 7.4）、DMAEMA の重合により得られるポリマーPDMAEMA が水溶液中でプロトン化すると、

ATRP は、澤本、Matyjaszewski、そしてPercecらによ

PDMAEMA 周辺における水酸化物イオンの局所濃度り開発され、現在ではブロックポリマー、グラフトポリマー、が高く、コア粒子表面にグラフトした PDMAEMAシェル

星形ポリマーなど様々な形態の高分子が開発されてい層内で選択的にシリカやチタニアなどの金属酸化物のる 。ATRP では、
ドーマント種（P n–X）のハロゲンが遷移前駆体である金属アルコキシドが加水分解と重縮合が金属錯体（Mt n X n Ligand）に引き抜かれることにより、活進行することが期待できる（図 5）。また、ジメチルアミノ性種である生長炭素ラジカル（P n •）が生成し、重合が進基の還元作用を利用した金属イオンの還元による複合

行する。ドーマント種と活性種の平衡によりラジカル濃度化も可能であることも別途報告している 6）。

4）が低く保たれるため、ラジカルどうしの二分子反応である

図 3 に示した ATRP 開始基を有するラテックス粒子を停止反応が一次反応である生長反応に対して相対的用いて、DMAEMA の表面開始 ATRPを行ったところ、に抑制され、リビング的にラジカル重合が進行する（図それぞれ 100 nm 程度までシェル層の厚みを増加させる

4）。これまでに ATRP に適用できるモノマーの種類、開ことができた。また、1 H NMR によりグラフト量を測定した

始剤、錯体など重合系の設計に関する研究が行われてところ、DMAEMA 仕 込 み 量とともに St に 対して 30

おり、総説などにまとめられている。

mol% 程度まで増加しており、コアの粒径とシェルの厚

高分子微粒子表面からの ATRP によるグラフト重合

みを独立に制御することが可能であった。なお、高分子

では、目的とする用途に適合するモノマーを選択するこ

微粒子表面の ATRP 開始基密度を見積もる方法としてとが重要である。我々は、PEG マクロモノマー、糖骨格

は滴定法しか報告されていないが、クリックケミストリーとを有するモノマーの ATRPによるグラフト重合を検討して

蛍 光 法とを組 み 合わ せた我々の 評 価 手 法 では、0.2

きたが、無 機 材 料との複 合 化には水 溶 性の 2-（N,N-

groups/nm 2 程度であり、準濃厚ブラシ密度に相当する

dimethylamino）ethyl methacrylate（DMAEMA）に

グラフト鎖の導入が可能であると考えられる。

図 4 ATRP の反応機構

図 5 コア-シェル粒子をテンプレートに用いた有機 / 無機複合粒子および中空粒子の調製

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4. コア粒子表面にグラフトしたシェル層における金属酸化物の触媒的担持による複合化

た。熱重量分析装置（TGA）
により測定したコア-シェル
粒子 1 個あたりに担持されたシリカの重量は、コア粒子とは無関係にPDMAEMAグラフト量に比例した（図 7）。コ

はじめに、コア-シェル型の高分子微粒子とシリカとのア粒子表面には親水性モノマーC 4DMAEMA および開複 合 化 について 検 討した。コア - シェル 粒 子 の 水 /始剤 V50 に由来する四級アンモニウム基およびアミジン

methanol 分散液に tetraethoxysilane（TEOS）
を加え、基が存在するため、チタニアが静電的に吸着する機構もシリカとの複合化を行った。複合化に最適な反応条件考えられるが、PDMAEMAグラフト量が 0 であるコア粒を検討したところ、60/40（v/v）の混合溶媒中、20°C で子表面に担持されたチタニアの重量（切片）はきわめて

48 h 反応させることにより、均一なモルフォロジーを有す

小さく、PDMAMEAグラフト層が TnBT の加水分解と重る有機 / 無機複合粒子を得ることができた（図 6）7）。

縮合の効果的な触媒として機能することにより、チタニア

本手法は、tetra-n-butyl titanate（TnBT）を用いたチが担持されていることがわかる。また、500°C でポリマー

タニアとの複合化も可能である 。なお、TEOSと比較し成分を熱分解すると、5 〜 10nm 程度の大きさを有するチて TnBT の加水分解と重縮合の反応速度が大きいこと

タニア結晶から成る中空粒子を得ることができた（図 8）。

が知られており、acetylacetoneを少量添加して検討しX 線回析（XRD）測定によりチタニアの結晶構造を評

8）

図 6 各種粒子の SEM 写真 .（a）
コア粒子，
（b）
コア-シェル粒子，（c）
有機 / 無機複合粒子

図 7 コア-シェル粒子の PDMAEMAグラフト量に対するチタニアの担持量

図 8 各種粒子の TEM 写真 .   粒径の小さなコア-シェル粒子（流体力学的直径
dcore=211nm, dcore-shell=342nm）から調製した（a-1）
有機 / 無機複合粒子
および（a-2）チタニア 中 空 粒 子 .   粒 径 の 大きなコア - シェル 粒 子
から調製した（b-1）
有機 / 無機複合粒子（dcore=442nm, dcore-shell=619nm）
および
（b-2）
チタニア中空粒子 .  Scale bars 100nm

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コア粒子表面にグラフトされたシェル層を触媒に利用した複合粒子の調製価したところ、コア - シェル粒子および加熱前の複合粒得られた。一方、被覆率の高いヘテロ凝集体（b-1）で子は 20°付近にアモルファスあるいは長周期構造を持たは、シェル粒子表面で連続的なPDMAEMAグラフト層

ないガラスに見られるハローパターンが現れているだけが形成されるために、ミクロンサイズのラズベリー型のシであったが、加熱処理後の中空粒子では光活性を示す

リカ中空粒子（b-2）が得られた。破断面を観察すると、アナターゼ型のチタニアに特徴的なピークを観察するこコア粒子とシェル粒子とが接する部分にはシリカが堆積とができた（図 9）。また、ルチルやブルッカイトなど他の構せず、内壁に多数の空孔が形成されていた。以上の結造がないことから、純度の高いチタニア中空粒子が得ら果より、固体材料表面にグラフトした PDMAEMAシェル

れていると考えられる。グラフトポリマーを触媒として利用

層の触媒作用を利用した本手法は、テンプレートの形する本手法は、従来までのチタニア中空粒子調製法と状を反映した有機 / 複合粒子および無機中空粒子の調は異なる手法として有効であることが示された 9）。

製法として有用であると示された。

また、テンプレートの形状をどの程度まで反 映することができるのか 検討するために、異 種 粒 子 間 凝 集 体（ヘテロ凝 集 体）を用いた複 合 粒 子
および中空粒子の調製を試みた（図10）10）。なお、ミクロンサイズのコア粒子および ATRP 開始基を有するミクロ
ンサイズのシェル粒子は、それぞれ Stの 分 散 重 合 および 前 述 のソープフ
リー乳 化 重 合により合 成し、被 覆 率の異なるヘテロ凝 集 体を調 製した。
被覆率の低いヘテロ凝集体（a-1）では、コア粒子上にシェル粒子表面のPDMAEMAグラフト層が孤立して存在しているため、複合化粒子を熱分解す
ると表面に空孔構造を有するサブミク
ロンサイズのシリカ中空粒子（a-2）が

図 10 被覆率（θ）の異なるヘテロ凝集体をテンプレートに用いて調製したシリカ中空粒子の SEM 写真 .  
（a-1）：ヘテロ凝集体（θ = 0.51）（a-2）， ：サブミクロンサイズの空孔を有するシリカ中空粒子，
（b-1）
：ヘ
テロ凝集体
（θ = 0.81）（b-2）， ：ミクロンサイズのラズベリー型シリカ中空粒子とその内部構造（inset）

5. おわりに
本稿では、サブミクロンサイズの高分子微粒子を用いた DMAEMA の表面開始 ATRP によりコア-シェル粒子を合成し、PDMAEMA の触媒活性を利用した有機 / 無機複合粒子および無機中空粒子の調製について報告した。コア粒子表面にグラフトされた PDMAEMAシェル
層をアト（10 -18 ）リットルスケールの触媒的反応容器として利用することにより、テンプレートの形状を反映した各種粒子のモルフォロジーの制御が可能であった。今後
は、テンプレートの構造を厳密に分析し、機能と構造と
図 9 各種粒子のXRDパターン.  
（a）
コア-シェル粒子，（b）
有機/無機複合粒子，（c）
チタニア中空粒子，（d）
アナターゼチタニア（from the International
Center for Diffraction Center）の関連性から複合粒子および中空粒子の高機能化を図る必要があると考えられる。これらの技術の進展ととも

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に反射防止材料や断熱材などの工業製品だけでなく、
バイオなどの他分野でも高分子微粒子を利用した複合材料の開発が発展していくことを期待したい。
最後に、本稿で紹介した研究を支援していただいた
積水化学工業株式会社、花王株式会社、新日鐵住金
化学株式会社（旧新日鐵化学株式会社）、新中村化学
工業株式会社に深く感謝いたします。

参考文献
1）（a）Harkins, W.D. J. Chem. Phys. 1945, 13, 381-382. （b）
Harkins, W.D. J. Chem. Phys. 1946, 14, 47-48. （c）Harkins,
W.D. J. Am. Chem. Soc. 1947, 69, 1428-1444. （d）Smith,W.V.; Ewart, R.H. J. Chem. Phys. 1948, 16, 592-599.
2）（a）Ceska, G. W. J. Appl. Polym. Sci. 1974, 18, 427-437.
（b）Ceska, G. W. J. Appl. Polym. Sci. 1974, 18, 2493-2499.
（c）Ganachaud, F.; Sauzedde, F.; Elaïssari, A.; Pichot, C. J.
Appl. Polym. Sci. 1997, 65, 2315-2330. （d）Sauzedde, F.;
Ganachaud, F.; Elaïssari, A.; Pichot, C. J. Appl. Polym. Sci.
1997, 65, 2331-2342. （e）Chu, H.-H.; Ou, E.-D. Polym. Bull.
2000, 44, 337-344. （f）Imroz Ali, A.M.; Tauera, K.; Sedlak,
M. Polym. 2005, 46, 1017-1023.（g）Zurlová, E.; Bouchal, K.;
Zdenkova, D.; Pelzbauer, Z.; Svec, F.; Kálal, J.; Batz, H.G. J.
Polym. Sci. Polym. Chem. 1983, 21, 2949-2960.（h）Mouaziz,
H.; Larsson, A.; Sherrington, D.C. Macromolecules. 2004, 37,
1319-1323. （i）Verrier-Charleux, B.; Graillat, C.; Chevalier,Y.; Pichot, C.; Revillon, A. Colloid Polym. Sci. 1991, 269,
398-405. （j）Delair, T.; Marguet, V.; Pichot, C.; Mandrand, B.
Colloid Polym. Sci. 1994, 272, 962-970. （k）Kashiwabara,M.; Fujimoto, K.; Kawaguchi, H. Colloid Polym. Sci. 1995,
273, 339-345.（l）Nakahama, K.; Kawaguchi, H.; Fujimoto, K.
Langmuir. 2000, 16, 7882-7886. （m）Nagai, K.; Ohashi, T.;
Kaneko, R.; Taniguchi, T. Colloids Surfaces A: Physicochem.
Eng. Aspects. 1999, 153, 133-136. （n）Herold, M.; Brunner,
H.; Tovar, Günter E.M. Macromol. Chem. Phys. 2003, 204,
770-778.
3）（a）Guerrini, M.M.; Charleux, B.; Vairon, J.-P. Macromol.
Rapid Commun. 2000, 21, 669-674. （b）Taniguchi,T.; Kasuya, M.; Kunisada, Y.; Miyai, T.; Nagasawa, H.;
Nakahira, T. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 2009, 71,
194-199. （c）Taniguchi, T.; Kunisada, Y.; Shinohara, M.;
Kasuya, M.; Ogawa, T.; Kohri, M.; Nakahira, T. Colloids
Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 2010, 369, 240245. （d）Jayachandran, N.K.; Takacs-Cox, A.; Brooks, D.E.
Macromolecules 2002, 35, 4247-4257. （e）Cheng, Z.; Zhu,
X.; Shi, Z.L.; Neoh, K.G.; Kang, E.T. Ind. Eng. Chem. Res.
2005, 44, 7098-7104. （f）Min, K.; Hu, J.; Wang, C.; Elaïssari,
A. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2002, 40, 892-900.
（g）Sonmez, H.B.; Senkal, B.F.; Sherrington, D.C.; Bicak, N.
React. Funct. Polym. 2003, 55, 1-8. （h）Senkal, B.F.; Bicak,
N. Euro. Polym. J. 2003, 39, 327-331. （i）Zheng, G.; Stöver,14

THE CHEMICAL TIMES

2013  No.3
（通巻 229 号）

H.D.H. Macromolecules. 2002, 35, 6828-6834. （j）Zheng,G.; Stöver, H.D.H. Macromolecules. 2002, 35, 7612-7619.
（k）Bontempo, D.; Tirelli, N.; Masci, G.; Crescenzi, V. J. A.
Hubbell, Macromol. Rapid Commun. 2002, 23, 417-422. （l）
Ahmad, H.; Saito, N.; Kagawa, Y.; Okubo, M. Langmuir. 2008,
24, 688-691.（m）Chen, Y.; Kang, E.-T.; Neoh, K.-G.; Greiner,
A. Adv. Funct. Mater. 2005, 15, 113-117.
4）（a）Kato, M.; Kamigaito, M.; Sawamoto, M.; Higashimura,
T. Macromolecules. 1995, 28, 1721-1723. （b）Wang, J.-S.;
Matyjaszewski, K. Macromolecules. 1995, 28, 7901-7910.
（c）Percec, V.; Barboiu, B. Macromolecules. 1995, 28, 79707972. （d）Matyjaszewski, K.; Xia, J. Chem. Rev. 2001, 101,
2921-2990. （e）Coessens, V.; Pintauer, T.; Matyjaszewski,
K. Prog. Polym. Sci. 2001, 26, 337-377. （f）Kamigaito, M.;
Ando, T.; Sawamoto, M. Chem. Rev. 2001, 101, 3689-3746.
（g）Kamigaito, M.; Ando, T.; Sawamoto, M. Chem. Rec.
2004, 3, 159-175. （h）Braunecker, W.A.; Matyjaszewski, K.
Prog. Polym. Sci. 2007, 32, 93-146.
5）（a）Yuan, J.-J.; Mykhaylyk, O.O.; Ryan, A.J.; Armes, S.P. J.
Am. Chem. Soc. 2007, 129, 1717-1723. （b）Zhou, F.; Li, S.;
Vo, C.D.; Yuan, J.-J.; Chai, S.; Gao, Q.; Armes, S.P.; Lu, C.;
Cheng, S. Langmuir. 2007, 23, 9737-9744.
6）Taniguchi, T.; Inada, T.; Kashiwakura, T.; Murakami, F.; Kohri,
M.; Nakahira, T. Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng.
Aspects. 2011, 377, 63-69.
7）Taniguchi, T.; Kashiwakura, T.; Inada, T.; Kunisada, Y.; Kasuya,M.; Kohri, M.; Nakahira, T. J. Colloid Interface Sci. 2010,
347, 62-68.
8）Taniguchi, T.; Murakami, F.; Kasuya, M.; Kojima, T.; Kohri, M.;
Saito, K.; Nakahira, T. Colloid Polym. Sci. 2013, 291, 215222.
9）（a）Imhof, A. Langmuir. 2001, 17, 3579-3585.（b）Cheng, X.;
Chen, M.; Wu, L.; Gu, G. Langmuir. 2006, 22, 3858-3863.（c）Caruso, F.; Shi, X.; Caruso, R.A.; Susha, A. Adv. Mater. 2001,
13, 740-744. （d）Agrawal, M.; Pich, A.; Zafeiropoulos, N.E.;
Stamm, M. Colloid Polym. Sci. 2008, 286, 593-601. （e）Yu,
J.; Liu, W.; Yu, H. Cryst. Growth Des. 2008, 8, 930-934. （f）
Yang, H.G.; Zeng, H.C. J. Phys. Chem. B. 2004, 108, 34923495. （g）Wang, X.M.; Xiao, P. J. Mater. Res. 2005, 20, 796800.
10）（a）Taniguchi, T.; Ogawa, T.; Kamata, Y.; Kobaru, S.; Takeuchi,N.; Kohri, M.; Nakahira, T.; Wakiya, T. Colloids Surfaces
A: Physicochem. Eng. Aspects. 2010, 356, 169-175. （b）
Taniguchi, T.; Obi, S.; Kamata, Y.; Kashiwakura, T.; Kasuya,M.; Ogawa, T.; Kohri, M.; Nakahira, T. J. Colloid Interface
Sci. 2012, 368, 107-114.

脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析
Structural analyses of glycosphingolipids in lipid rafts
東海大学

糖鎖科学研究所

准教授

樺山 一哉

Kazuya Kabayama (Associate Professor)
Institute of Glycoscience, Tokai University
立命館大学

生命科学部

助教

小島

寿夫

Hisao Kojima (Assistant Professor)
College of Life Sciences, Ritsumeikan University
日本大学

理工学部

助教

鈴木

佑典

Yusuke Suzuki (Assistant Professor)
College of Science and Technology, Nihon University

1. はじめに響を及ぼすメカニズムの解明研究において、蛍光顕微

シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質であるガングリオシド

れてきた生化学的手法により得られた脂質ラフトに存在は、疎水性の脂質部分であるセラミドと親水性の糖鎖かするガングリオシドの構造解析を行い、多角的に得られら構成され、さらに、セラミド部分はスフィンゴイド塩基と脂たデータをすり合わせた考察を展開していくことを目標と肪酸から構成されている。この細胞膜に埋め込まれていしている。

鏡を用いた分子動態解析と並行して、従来から用いらるセラミド部分は、スフィンゴミエリン、コレステロール等と脂 質ラフトの分 離 精 製の生 化 学 的 解 析 手 段として疎水性相互作用に基づいて互いに会合し、様々な情報

は、Triton X-100, Lubrol 98, Brij 58/97, NP-40 等の非伝達分子が集積している微小領域（脂質ラフト）の形成

イオン性界面活性剤を用いて、低温下でショ糖密度勾に重要な役割を果たしていると考えられている。そして、

配超遠心により界面活性剤不溶性画分（DRM）
として

セラミ
ド部分の構造変化、特に脂肪酸組成変化は、膜の分画する方法が一般的に用いられている（図 1）。しか流動性や膜マイクロドメインへの細胞内情報伝達因子

し、得られた DRM 中のガングリオシドの構造解析においの集積を変化させることにより、脂質ラフトを介した情報て、界面活性剤の除去は必須であり、各種カラムクロマ

伝達や特異的部位への膜輸送を調節し、細胞の内外をトグラフィーによる精製法等が報告されているものの、簡繋ぐ様々な生命現象を制御していると考えられている。

便な操作で完全にガングリオシドから界面活性剤を分

現在我々が進めているガングリオシドが形成する生体離・除去できる方法は未だ報告されていない。この問題

膜の微小領域が膜受容体の局在及びシグナリングに影を解決するために以下の実験を行った。

図 1 ショ糖密度勾配超遠心による界面活性剤不溶性画分
（DRM）
の分画法

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2. 各種カラムクロマトグラフィーによる界面活性剤除去 1）を確認した結果、1ng 以下まで除去する必要があること

ショ糖密度勾配超遠心による脂質ラフト分画システム

次に、Triton X-100（ 4µg）- GM3（ 4µg）混合物を作製の確認、及び分画後に残存する界面活性剤の MSスペ

し、従 来 から界 面 活 性 剤 の 除 去 に用 いられている

クトル測 定 への影 響を確 認するため、脂 肪 前 駆 細 胞

SepPak C18、DEAE-sephadex A-25、Iatrobeads、及び（3T3-L1）を材料とし、ショ糖密度勾配超遠心分離及びFlorisilカラム（オープン）
によるTriton X-100 の除去率をSepPak C18カートリッジによる脱塩後、薄層クロマトグラ

TLC 及び MALDI-QIT-TOF MSスペクトル測定によってフィー（TLC）解析及びマトリックス支援レーザー脱離イオ

確認した。その結果、TLC 展開後のプリムリン発色結果

ン化 四 重 極イオントラップ 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 法

では、それぞれ 90％以上の Triton X-100 の除去は可能（MALDI-QIT-TOF MS）
によるMSスペクトル測定を行っであったものの、MALDI-QIT-TOF MSスペクトルでは残た。TLC 解析の結果、DRM はコレステロール及びガング

存するTriton X-100 のためにGM3 由来ピークを検出すが判った（Data not shown）。

リオシド GM3 が集積しているフラクショ
ンNo.4 及び 5 であり、Triton X-100 濃度はショ糖濃度勾配に伴って分配されていることが明らかになった（図 1）。また、MALDI-QIT-TOF MSスペクトル測
定 結 果では、すべてのフラクションでTriton X-100に起因する44 Da 間隔のピークのみが検出され、GM3 由来ピー
クを検出することはできなかった（図 2）。
そこで、Triton X-100 の希釈倍列を作製し、MSスペクトル測定時にGM3 のイオン化を阻害しない Triton X-100 濃度

表 1 本研究に使用した有機溶媒の諸性質

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図 2 超遠心画分（脱塩後）の MALDI-QIT-TOF-MS 解析（No.4 and
ポジティブイオンモード測定。▶がガングリオシドGM3に起因するフラグメント。DRM 画分
5）にGM3 由来ピークが検出されない。

脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析

ることはできなかった。またカラムへのガングリオシドの吸の GM3 の損失が確認された（図 3）。
しかしTLCによる解着が生じるため、完全に回収できていないことが判った

析において、DCEによる洗浄ではGM3 の損失なくTriton（Data not shown）。それ故、新たな界面活性剤除去法

X-100のみを完全に除去できることが確認された。
さらに、を確立するために以下の実験を行った。

MALDI-QIT-TOF MSスペクトル測定を行った結果では、
DCE 洗浄によりTriton X-100 は 1ng の検出限界以下ま3. 各種有機溶媒洗浄による界面活性剤の除去 1）

で完全に除去され、GM3 由来ピークが検出されることが確認された（図 4）。

GM3-Triton X-100 混合物をTLC により展開すると、GM3 の R f 値は約 0.5 であるが、Triton X-100 は溶媒先端部まで移動し、GM3とTriton X-100はTLC 上で完全

4. DCEによる各種界面活性剤の除去 1）に分 離することから、TLC 上のシリカゲルの水 酸 基と

上述のように、D C E 洗浄により、ガラス試験管内でTriton X-100 は相 互 相 関しないと考えられた（図 1）。

乾 固し た GM3-Triton X-100 混 合 物 か ら 完 全 に

TLC 上のシリカゲルと同様に、ガラス表面には水酸基がTr i t o n X -100 のみを除去することが可能であったこと露出していることから、GM3-Triton X-100 混合物をガラから、次に、脂質ラフト分画に用いられる他の非イオンス製試験管内に乾固し、各種有機溶媒による洗浄を検討

性界面活性剤であるBrij 58、Brij 97、及び NP-40や、し、水酸基と相互相関しないTriton X-100 のみを除去で糖 脂 質の糖 転 移 酵 素・糖 加 水 分 解 酵 素 反 応に用いきるか確認を行った。検討はアセトニトリル、メタノール、アられる3-［（3-Cholamidopropyl）-dimethylammonio］

セトン、1-ブタノール、ピリジン、テトラヒド
ロフラン、酢酸メチル、ジエチルエーテ
ル、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、
トルエン、ベンゼン、キシレン、ジイソプロ
ピルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタ
ン、1,2-ジクロロエタン（DCE）の性質の異なる有機溶媒、計 18 種類で行った（表 1）。
その結果、極性の高い有機溶媒で洗浄した場合、Triton X-100と同時にGM3もガラス試験管表面（Residue, R）
から除去され、洗浄画分（Wash fraction, W）に

図 3 各種有機溶媒で洗浄後の界面活性剤 TritonX-100とGM3 複合体の TLC 解析

移行してしまう傾向が観察された（図 3）。
逆に非極性の有機溶媒による洗浄では
GM3は試験管表面に保持され、Triton
X-100 のみが除去される傾向が観察された。一方で、検討した非極性有機溶媒の中で、誘電率の低いヘキサン、シク
ロヘキサン、ヘプタンによる洗浄では、
Triton X-100 が試験管表面に残存することが確認された。
その他の非極性有機溶媒による洗浄 や Svennerholm 分 配 法 で、Triton
X-100 の除去が可能であったが、多少

図 4 各種有機溶媒で洗浄後の界面活性剤 TritonX-100とGM3 複合体の MS 解析▶がガングリオシドGM3に起因するフラグメント。

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表 2 本研究に使用した界面活性剤の諸性質- 1 - p r o p a n e s u l f o n a t e（ C H A P S ）,Taurocholic acid, Deoxycholic acidに関して、DCE 洗浄によってこれらの界面 活 性 剤 が 除 去 可 能 で あるか を
MALDI-QIT-TOF MS により確認した（表 2）。
その結果、Brij 58 及び CHAPS は界 面 活 性 剤 由来ピークが検出されたが、大部分が除去可能であり、すべての界面活性剤を含むサンプルで、GM3由来ピークが検出されることを確認した（図 5）。

図 5 各種界面活性剤とGM3 複合体におけるDCE 洗浄後の MS 解析

5. 脂肪前駆細胞の脂質ラフト画分
からの Triton X-100 の除去 1）
次に当初の目的であった脂質ラフト画
分の糖脂質の構造解析を行うために、
3T3-L1 脂肪前駆細胞を材料とし、ショ糖密度勾配超遠心による脂質ラフト分
画及び脱塩後、さらにSvennerholm 分
配及び DCE 洗浄後、MALDI-QIT-TOF
MSを行った。その結果、界面活性剤由来ピークは 検 出され ず、フラクション
No.4-5 及び No.6-9 でGM3の分子種に由来するピークを検出した（図 6）。

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図 6 超遠心画分（DCE 洗浄後）の MALDI-QIT-TOF-MS 解析（DRM 画
ポジティブイオンモード測定。▶がガングリオシドGM3に起因するフラグメント。No.4および 5
分）とNo.6-9にGM3 由来ピークが検出された。

脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析

そして、MALDIイオン化質量分析法よりも界面活性剤によるサンプルのイオン化が抑制されやす
い液 体イオン化 質 量 分 析 法においても、これら
GM3分子種由来イオンが検出されることを確認した（Data not shown）。
さらに、上記サンプルのネガティ
ブイオンモードによるMALDI-QIT-TOF MSスペクト
ル解析結果から、脂肪前駆細胞の脂質ラフト上に存在するGM3 の分子種は d18:1（スフィンゴイド塩基）-C16:0（脂 肪 酸）、-C18:0、-C20:0、-C22:0、-C22:1、-C23:0、-C24:0、及び -C24:1 であることを確認した（図 7）。

図 7 3T3-L1 脂肪前駆細胞の DRM 画分に存在するGM3 のセラミド構造（MS2 から推定）

6. 脂肪組織 / 細胞におけるトリグリセリドの簡便な除去法の検討

処理によりインスリン抵抗性に惹起した 3T3-L1 脂肪細胞のインスリン感受性を高めることが報告された 5）ことから、脂肪細胞の糖脂質全般の重要性が認識されつつあ2）

1993 年に Spiegelmanら により肥満マウス脂肪組織る。そこで、TNFα処理によりインスリン抵抗性に惹起しでの TNFα産生の亢進が報告されて以降、脂肪細胞のた 3T3-L1 脂肪細胞において簡便にトリグリセリドを除去

分子細胞生物学的な研究が進展したことにより、脂肪する方法を検討することで、脂肪細胞の糖脂質全般の細胞は多彩な生理活性物質（アディポサイトカイン）を産分析を行った。

生・分泌し、糖・脂質代謝および動脈壁の恒常性維持に重要な役割を果たす器官であることが分かってきた。
肥満による脂肪の蓄積でアディポサイトカインの産生が異常になることで、糖尿病を始めとする種々の生活習慣病を発症することが明らかとなっている。

7. 脂肪組織での DCE 洗浄によるトリグリセリドの除去
上述したように、ショ糖密度勾配遠心法で調製した界面活性剤不溶性画分（DRM）からの界面活性剤の効我々の研究室では、2 型糖尿病における糖脂質の役

率的かつ簡便な除去法が開発された 1）。この方法では割の解明を上述したような様々なアプローチで進めておTriton X-100を始めとして生化学的な研究に一般的にり、現在までに、3T3-L1 脂肪細胞をTNFα処理した 2 型

多用される数種の界面活性剤についても有用であり、固糖尿病の病態において、発現が亢進するガングリオシド

相抽出の前処理カラムおよび各種のカラムワークでは除GM3 が細胞膜上の負電荷のクラスターを形成し、イン

去しきれず質量分析でイオン化妨害を引き起こす界面活

スリン受容体の細胞膜直上のリジン残基と相互作用す性剤をほぼ完全に除去できることが明らかとなった。これることでインスリン受容体をカベオラ構造から引き剥がすらの 界 面 活 性 剤 は 順 相 系 の 薄 層クロマトグラフィー

ためにインスリンシグナルが伝達されなくなることを示して（TLC）では溶媒先端付近まで展開される物質であるこいる 。一方、肥満モデル動物の脂肪組織においてもとから、同様に溶媒先端付近まで展開されるトリグリセリド

GM3の発現亢進が報告されているが、脂肪組織はエネへの応用の可能性が考えられた。

3）

4）

ルギー貯蔵臓器として大量のトリグリセリドを蓄積していそこで、マウス（C57BL/6J）の副睾丸脂肪組織より総ることから、同じように極性の低い脂質である糖脂質全脂質を抽出し、これをトリグリセリドとみなしてDCE 洗浄に般の分析がトリグリセリドの妨害を受けるために困難であよる除去を試みた。総脂質と中性糖脂質の標準品を混り、そのために特に中性糖脂質については明確にその合したもので試した結果、脂肪量に関わらずトリグリセリド

構造やプロファイルを明らかにした報告はない。しかしなは洗浄画分（Wash fraction, W）に移行し、ガラス表面

がら、近年、グルコシルセラミド（GlcCer）の合成阻害剤（Residue, R）には残らないことが分かった（図 8A）。まであるAMP-Deoxynojirimycin（ AMP-DNM）が TNFα

た、副睾丸脂肪を大量に用いて DCE 洗浄を行ったとこ

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ろ、副睾丸脂肪由来の脂質がバンドとして可視化できた（図 8B）。

その結果、CMH（セラミドモノヘキソシド）と考えられるR f値のバンドを確認した（図 10 左）ものの、CDH（セラミ
ドジヘ
キソシド）
の移動度からGM3の移動度までの間にリン脂質と考えられる複数のバンドを認めたため（図 10 右）、最終目標である糖脂質の一斉質量分析のためにはリン脂質の分解除去が必要と考えられた。そこで、アルカリメタノリシスお図 8 マウス副睾丸脂肪の DCE 洗浄（A）トリグリセリドは完全にW 画分に移行し、中性糖脂質は大半が R 画分に残留する。
（B）大量の副睾丸脂肪をDCE 洗浄するとR 画分に副睾丸脂肪由来の脂質が見えてくる。

8. 脂肪細胞での DCE 洗浄によるトリグリセリドの除去

図 9 TNFα処理した3T3-L1 脂肪細胞での DCE 洗浄によるTG の除去（0.1mgprotein 相当）

DCE 洗浄によりトリグリセリドの効果的な除去が可能であることが示されたので、次に、TNFα処理によりインスリン抵抗性を惹起した3T3-L1 脂肪細胞を用いて総脂質を抽出し、一部（0.1mg protein 相当）を用いてDCE 洗浄によるトリグリセリドの除去効果を検証した（図 9）。その結果、副睾丸脂肪での場合と同様に、トリグリセリドはW 画分に完全に移行し、糖脂質はR画分に残留したことから同洗浄により効
果的に分画が行えた。

図 10 TNFα処理した3T3-L1 脂肪細胞での DCE 洗浄によるTG の除去（1mg protein 相当）

しかしながら、0.1mg protein 相当分では、糖脂質としてはGM3とGD1aのバンド
しかオルシノール試薬で呈色が見られなかった。これら2 種類のガングリオシドに関しては、トリグリセリドが大量に存在する条件下でもシアル酸残基の負電荷を利用した陰イオン交換（DEAE）
カラムクロマトグラ
フィーを行ってトリグリセリドから分離が可能であることから、既に報告がなされている。よって、より大量（1mg protein 相当）に処理することで未報告の中性糖脂質のバンドが検出できるかを試みた（図 10）。

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図 11 TNFα処理した3T3-L1 脂肪細胞での DCE 洗浄によるTG の除去（1mg protein 相当）とリン脂質の分解除去

脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析

よび Sep-pak C18による脱塩を行ってTLC 分析に処した。

ることで分子種の同定を行った（表 3）。これまでは、脂肪その結果、溶媒先端付近にやや夾雑物が見られるものの組織の糖脂質については、ブタの後背部脂肪（ロインバッ

上述のリン脂質を除去することが出来、質量分析に供しう

ク）を用いて大量のトリグリセリドをアセトン脱脂して古典的ると考えられる試料を調製することが出来た。
（図 11）

な糖脂質構造解析した報告 6）、ブタ腹膜（大網）の内臓脂
肪の糖脂質をTLC 解析した報告 7）、マウス副睾丸脂肪の9. 脂肪細胞における中性糖脂質の検出と構造解析

GlcCer 量をLC-MS 解析した報告 8）、マウスの卵巣周囲脂肪および副睾丸脂肪のガングリオシド量をLC-MS 解析

上述の1,2-ジクロロエタン（DCE）洗浄法により脂肪細胞した報告 9）などがあるが、糖脂質のセラミド組成を詳細にのトリグリセリドを効果的に除去しえたことから、さらにリン脂調べた報告は見られない。よって、本報告は脂肪細胞の質を弱アルカリ処理して分解除去し、Sep-pak C18による脱糖脂質、特に中性糖脂質の詳細な構造解析を行った初

塩の後、液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）でネガの報告である。脂肪細胞では主要な糖脂質はGM3 であティブイオンモードにて糖脂質の分子種の解析を試みた。

り、次いでGD1a、CMH、CDH が検出されたが、いずれも

本 実 験では MS による構 造 解 析が可 能な装 置（島 津

長鎖塩基はd18:1を成分とした分子種が豊富で、脂肪酸

LCMS-IT-TOF）
を用い、MS3 でセラミドの分子量を設定し、はC16からC24の飽和脂肪酸が優勢であった。

n

脂肪酸および長鎖塩基由来のフラグメントの出現を確認す
表 3 3T3-L1 脂肪細胞における主な糖脂質とその分子種

10. 脂肪細胞におけるDRMに集積する糖脂質の分子種解析
ショ糖密度勾配遠心法で用いたTriton X-100（1%）
は質量分析に影響を及ぼすため、脂質ラフト分画後に氷冷
DCE 洗浄を行い、Triton X-100を除去した（図 12）。DRM
画分をそのままLC-MS 解析したところ、糖脂質以外の成分が多いためにMS の検出器が飽和し、回避するために希釈するとベースラインノイズの影響が見られた。そこで、

図 12 TNFα処理前後での 3T3-L1 脂肪細胞をショ糖密度勾配遠心法による分画の後 DCE 洗浄・脱塩したTLC（サンプル量は1mg protein 相当量）
呈色試薬はオルシノール硫酸（A）
およびプリムリン（B）を用いた。糖脂質はNo.5 画分を中心にNo.4-6（DRM 画分）に分画され、TNFα処理によってGM3 の量が増加した。

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Svennerholm 分配によって極性の低い物質を除去したの型解析やリスクファクターとしての定量解析が報告されるばち、LC-MS 解析を行った（図 13）。以前に100pM 96 時間

かりであり、上記分子を構成成分とする細胞膜表面上でどのTNFα処理により脂肪細胞のGM3 が約 2 倍に増加するのような変化が起こっているのか（細胞膜上のシグナル伝ことを報告しているが、増加する際にセラミド鎖長の選択性達分子にどのような影響を及ぼすのか）に関しては、依然とは見られずほぼ一様に増加することが分かった。

して明確な説明は成されていない。

今回解析した3T3-L1 脂肪細胞では TNFα処理によっ

我々の研究において細胞膜脂質の体系的な解析法がてGM3 は分子種に関わらず 2 倍に増加する結果を得た

確立しつつある。細胞膜の流動性および細胞膜受容体のが、高脂肪食を与えた高齢肥満マウス（C57BL/6J）副睾

側方拡散についての情報を数値化するためには、ライブセ

丸脂肪や高齢の糖尿病モデルマウス（KKおよび KKAy）

ルイメージング技術が非常に適しており、細胞膜構成脂質の卵巣周囲脂肪において詳細な分子種は報告されていなの構造解析にはLC-MSを主力とする各種質量分析技術

いながら短鎖脂肪酸（C16 や C18）の割合が増加することが不可欠であると考えている。これらの技術を併用してが報告されている 。また、高齢 ob/ob マウスの脂肪組織

様々な病態モデルを解析することが、細胞膜脂質の矯正において短鎖脂肪酸（C16）を含むスフィンゴミエリン（SM）

療法が未来の治療戦略になっていくことを願い、より一層が増加し、長鎖脂肪酸（C24）のSM が減少することが示さ研究に邁進していきたい。

9）

れている

。このように肥満状態でスフィンゴ脂質のセラミ10）

ド鎖長変化が報告されていることから、今後、若齢の肥満
モデルマウスを用いて GM3 をはじめとする糖 脂 質のLC-MS 解析を行うことで、肥満を引き金とする2 型糖尿病の病態のさらなる解明を行う予定である。

参考文献
1）Suzuki, Y.; Kabayama, K. Journal of lipid research. 2012, 53,
599-608.
2）Hotamisligil, G.S.; Shargill, N.S.; Spiegelman, B.M. Science.
1993, 259, 87-91.
3）Tagami, S.; Inokuchi, J.; Kabayama, K.; Yoshimura, H.;
Kitamura, F.; Uemura, S.; Ogawa, C.; Ishii, A.; Saito, M.;
Ohtsuka, Y.; Sakaue, S.; Igarashi, Y. J. Biol. Chem. 2002, 277,3085-3092. Epub 2001 Nov 3013.
4）Kabayama, K.; Sato, T.; Saito, K.; Loberto, N.; Prinetti, A.;
Sonnino, S.; Kinjo, M.; Igarashi, Y.; Inokuchi, J. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica. 2007, 104, 13678-13683.

図 13 脂肪細胞の DRM 画分の GM3 分子種DRM 画分をSvennerholm 分配で粗精製し、LC-MSで解析した。TNF
α処理でGM3が約 2 倍に増加するが、セラミド分子種の選択的な増加は見られなかった。

6）Ohashi, M.; Yamakawa, T. Journal of biochemistry. 1977, 81,
1675-1690.

11. おわりに

7）McCluer, R.H.; Evans, J.E.; Kamarei, A.R.; Williams, M.A.
Lipids. 1989, 24, 951-956.

近年、体内の脂質代謝に対する医療分野の注目度はさ

8）Wu, D.; Ren, Z.; Pae, M.; Guo, W.; Cui, X.; Merrill, A.H.;
Meydani, S.N. J. Immunol. 2007, 179, 4829-4839.

らに増していると感じる。コレステロールの代謝抑制はもちろんのこと、最近では糖脂質の生合成を抑制したり、糖脂質分子そのものを補充したりすることで、生活習慣病や癌、腎臓および神経疾患に対する研究開発が進行している。
しかしながらその作用機序としては、個体レベルでの表現

225）Aerts, J.M.; Ottenhoff, R.; Powlson, A.S.; Grefhorst, A.; vanEijk, M.; Dubbelhuis, P.F.; Aten, J.; Kuipers, F.; Serlie, M.J.;
Wennekes, T.; Sethi, J.K.; O'Rahilly, S.; Overkleeft, H.S.
Diabetes. 2007, 56, 1341-1349.

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9）Tanabe, A.; Matsuda, M.; Fukuhara, A.; Miyata, Y.; Komuro, R.;
Shimomura, I.; Tojo, H. Biochemical and biophysical researchcommunication. 2009, 379, 547-552.
10）Samad, F.; Hester, K.D.; Yang, G.; Hannun, Y.A.; Bielawski, J.
Diabetes. 2006, 55, 2579-2587.

プルシアンブルー；新しい応用とそのナノ粒子
Prussian blue; New applications and its nanoparticles

関東化学株式会社

技術・開発本部 中央研究所

第三研究室

𠮷野

室長

和典

KAZUNORI YOSHINOGroup manager, Central Research Laboratory, Technology & Development Division, Kanto Chemical Co., Inc.

1. はじめにド鉄（II）酸鉄（III）、フェロシアン化鉄（III）、フェロシアン化

プルシアンブルーは約 300 年前に合成された古い化合

的に化学式はFe［Fe（CN）6］
4
3 で示されるが、実際には次物であるが、近年、機能材料として活発な研究が行われの二種類の化合物の総称である。一つは、
「不溶性」
タイ

ている新しい化合物でもある。

2+
プと呼ばれFe3+［Fe（CN）（x =14〜16）で示され
6］
3･xH2O4

第二鉄、紺青などはプルシアンブルーの別名である。一般

プルシアンブルーは青色顔料や青写真などに用いられてる。このタイプは凝集した粒子であり水や溶媒中で沈降すきた 。特に、青色顔料としては200 年以上にわたり主役をる。
もう一つは「可溶性」
タイプでM+Fe3+
［Fe2+
（CN）
･yH2O
6］

務め、北斎やゴッホも絵具として用いている。また、絵具以（M +：K +, NH4+ など、y=1〜5）で示される。水に加えると微外に新聞用インキや赤青鉛筆、プリンターのインクリボンな

細粒子が分散して青色の液体となる。これは、ろ過してもどにも用いられる日常生活に欠かせない化合物である。

ろ紙に何も残らないほか、長時間静置しても何も沈降しな

1）

機能材料としての研究は約 40 年前に始まった。結晶い。つまり、溶液と同様の挙動を示すため「可溶性」と呼ば構造が詳細に解析されたほか薄膜（電析膜）の製法が開れている。M + の種類により、カリ紺青、アンモニウム紺青な発された 2,3）。これらを基礎にしてエレクトロクロミック素子、どと区別されることもある。

二次電池、バイオセンサーなど幅広い分野での研究が行

なお、プルシアンブルーは CN−を含むため土壌汚染対

われてきた。そして、ナノ粒子分散液を用いた塗布成膜技策法の特定有害物質であり、水質汚濁防止法の総シアン術の進展 により、さまざまな研究が一気に実用化されつとして検出される。このため、廃棄には適切な対応が必要つある。

である。しかし、プルシアンブルー自体に毒性はなく、毒物

4）

本稿では、プルシアンブルーのさまざまな機能やその発現機構、ナノ粒子を用いた機能の実用化などを紹介する。

及び劇物取締法でも「有毒な無機シアン化合物」から除外されている。
2.2 機能材料としてのプルシアンブルー

2. プルシアンブルーの特徴と機能

プルシアンブルーの機能材料としての特徴は、混合原
子価化合物（mixed valence compound）であることとフプルシアンブルーはさまざまな機能を示す優れた材料でレームワーク構造を持つことである。これらの特徴を利用ある。多彩な機能の原理は、混合原子価化合物であること

してさまざまな応用が研究されている（表 1）。例えば、混とフレームワーク構造を持つことである。
さらに、同様の構造

合原子価化合物であることを利用して顔料、青写真、セを持つ「類似体」を形成できることから、材料設計の自由ンサーなどが、フレームワーク構造からは有害物質の吸度が高いことも特徴である。

着剤、水素吸蔵材料および磁性材料が開発されている。

2.1 プルシアンブルーとは

電子カーテン、電子ペーパー（エレクトロクロミック素子）、

プルシアンブルーは濃青色の錯体である。ヘキサシアニ

二次電池などは両方の機能をもとにしている。さらに、光THE CHEMICAL TIMES

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23磁性材料や強誘電強磁性材料などの複合機能材料も研究されている。
また、プルシアンブルーは新規機能材料の基礎となる化合物でもある。プルシアンブルーのFe3+を他の金属で置換すると、同様の結晶構造を持つプルシアンブルー類似体（Prussian Blue analogue（s））が 得られる。一 方、［Fe

表 2 鉄の原子価と生成物の色（カッコ内は化合物名）

組成

4−
6］
［Fe2+
（CN）

3−
6］
［Fe3+
（CN）

Fe2+

無色
（白色）
不安定
（ベルリンホワイト） （プルシアンブルーに変化）

Fe3+

濃青色
（プルシアンブルー）

黄色～褐色
（溶液）
（プルシアンイエロー）（CN）6］4−の Fe2+ や CN−の配位数を変更した化合物はポリシアノ錯体と呼ばれる錯体群となる。さらに、CN 以外のプルシアンブルー類似体を用いることで、青色以外も発配位子を導入すると、MOF（金属有機構造体 , Metal

色できる。たとえば、ニッケル置換体（M+2Ni2+［Fe2+（CN）6］

Organic Framework（s））
もしくは PCP（多孔性配位高分･yH2O）
は黄色であり、部分置換体では緑色（青と黄色の子、Porous Coordination Polymer（s））と呼ばれ、あらたな混色）である7）。ニッケルや銅の置換体はプルシアンブルー

研究領域として高い注目を集める材料となる5）。このようなと同様にエレクトロクロミック現象を示す。また、アルカリ溶解

材料設計の自由度の高さもプルシアンブルーの特徴の一度などの化学的性質が変化する。このため、類似体は顔つである。なお、本稿では一部で「プルシアンブルー」の中料の耐久性向上や青写真の色変換に用いられてきたほにプルシアンブルー類似体も含めて記している。

か、電子ペーパーのフルカラー化に有用である。
2.4 フレームワーク構造

表 1 プルシアンブルーの機能と応用例

もう一つの特徴がフレームワーク構造である。プルシアン

機能

応用例

ブルーの結晶は立方晶である（図 1）1）。面心立方（頂点と顔料

絵具、樹脂着色剤、インキ

面の中心）にFe2+ が位置し、立方体各辺の中心にFe3+ がエレクトロクロミック

電子カーテン、防眩ミラー、
電子ペーパー、表示デバイス

酸化還元

過酸化水素センサー、
グルコースセンサー、バイオセンサー

カチオン交換リチウムイオン二次電池用電極、ナトリウムイオン二次電池用電極、
放射性セシウム吸着剤、
タリウム吸着剤、医薬品

水素吸脱着

燃料電池用水素吸蔵材料る。また、水素分子の吸脱着が、燃料電池用の水素貯蔵

分子磁性材料

磁性材料、光磁気材料

材料として研究されている8）。フレームワーク構造は強固で位置している。Fe2+とFe3+ はCNによりFe2+-C-N-Fe3+と架橋されている。Fe2+-Fe3+ の距離は0.5nmと大きいため、ジャン
グルジムのように大きな空隙を持っている。
大きな空隙はさまざまなカチオンや分子を脱挿入できる。
カチオンの脱挿入はイオン交換体として機能する。なかでも、Li + や Na + の脱挿入は二次電池への応用が研究されている。放射性セシウム（Cs +）や毒性が高いタリウム（Tl +）の吸着は、有害物質除去剤や医薬品として利用されてい安定であり、吸脱着による構造変化はわずかである。この2.3 混合原子価化合物

ため、吸脱着を繰り返しても性能が劣化しにくい。また、脱混合原子価化合物は、異なる原子価を持つ同種の元素を含む化合物である。わかりやすい例が四酸化三鉄

め、選択性が高いことも特徴である。

（Fe3O4 = Fe2+O･Fe3+2O3）
であり、プルシアンブルーも2 種類

この構造は分子磁性体としても機能する 9）。分子磁性の原子価の鉄（Fe2+とFe3+）を含んでいる。プルシアンブ

体は分子構造により形成される電子軌道における電子スピ

3+

ルーの濃青色は Fe からFe への原子価間電荷移動にンを利用した磁性体である。一般的な磁石と異なり、分子起因し 、酸化や還元により混合原子価状態を解消すると構造の制御により磁性体としての特性を調整できる。プル

色が変化する（表 2）。これは、青写真の原理として長年利

シアンブルーでは光による電子状態の変化により磁気特性用されてきたほか、エレクトロクロミック現象の原理でもある。

が変化する材料などが研究されている。

2+

6）

また、複数の酸化還元状態を取ることは、過酸化水素やグ
ルコースなどのセンサーへの応用が研究されている。

24

挿入できるカチオンや分子は空隙の大きさに依存するた

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プルシアンブルー類似体はプルシアンブルーと同様のフレームワーク構造を持つ。しかし、格子定数が異なるため

プルシアンブルー；新しい応用とそのナノ粒子

図 1 プルシアンブルーの結晶構造 1）a）：一般的な構造、b）：可溶性タイプ：M+ が空隙を占拠している。c）：不溶性タイプ：Fe2+ サイトの 1/4が欠陥で、そこに水分子が配位している。

空隙の大きさや電子状態が異なる。つまり、化学組成を調

そこで、より粒径が小さいナノ粒子の安価な製造技術と整することで、脱挿入物質に応じた空隙の大きさや、磁気それを用いた成膜技術が開発された 10）。この技術は、不特性に応じた電子状態を設計することができる。

溶性タイプを表面修飾して分散させるもので、薄膜を安価に量産できる。従来からある不溶性タイプは約 10nm のナ

3. ナノ粒子を用いた塗布成膜技術の開発とプルシアンブルー機能材料の実用化

ノ粒子の凝集体であった。これを、フェロシアン化物イオン
やオレイルアミンで表面修飾すると、水やトルエン、アルコー
ル 11）などに分散できた。この分散液を塗布成膜することで薄膜原料として使用できるナノ粒子分散液の開発によ

良質な薄膜が作成できた。すでに、薄膜がエレクトロクロ

り、機能材料としてのプルシアンブルーは急速に実用化へ

ミック素子として作動することが確認されている12）。
また、ナと進展している。電子カーテンや電子ペーパーが実用化

ノ粒子の量産製法が開発されている 13）ほか、いくつかの段階にあるほか、二次電池やセンサーなども開発が進めら類似体にも適用できることが明らかとなっている。

れている。
3.1 ナノ粒子を用いた塗布成膜技術の開発

このナノ粒子は、塗布成膜原料以外の用途にも展開されている。ナノ粒子は比表面積が大きいため、イオン交換

薄膜はパターニングや異種材料との積層が可能で、光体、吸着剤としての性能向上が期待できる。福島第一原

学デバイスや電気化学デバイスに適した形態である。しか発事故により、放射性セシウム吸着剤としてプルシアンブ

し、プルシアンブルーの電析膜は量産性が低く実用化の課ルーが活発に研究されている。この中で、高い吸着能を示

題となっていた。前述の様に、プルシアンブルーは水や有す吸着剤 14）が開発されている。

機溶媒に溶解しないため、溶液を塗布して成膜することが3.2 電子カーテン・電子ペーパー（エレクトロクロミック

できない。また、可溶性タイプは分散液を塗布成膜できるが、その粒径は50〜100nm で、膜厚や密度などを制御した機能材料としての薄膜は作成できなかった。

素子）
プルシアンブルーナノ粒子の機能性材料としての利用に関しては、エレクトロクロミック素子への応用が最も先行して

図 2 GESIMAT 社の電子カーテン 16）

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25

いる。電子カーテンとしてさまざまな製品が開発されている

り返し充放電特性（サイクル特性）の向上が期待できる。まほか、電子ペーパーへの展開も期待されている。

た、Coを用いないことやナトリウムイオン電池への適用など

プルシアンブルーのエレクトロクロミック現象は 1978 年に電析膜で報告された 。
（1）式に従い、わずか 0.8V の印
3）加で電子とK が脱挿入して色が変わる。
+

プルシアンブルーは主に正極への適用が研究されている。欠陥がないプルシアンブルーの理論容量は174mAh/g

2+
Fe3+［Fe（CN）＋ 4e−＋ 4K+ ⇌
6］
3（青色）
4

と計算 20）されており、現行材料と比較して遜色ない値であ2+
K4Fe2+［Fe
（CN）
…（1）
6］
3（無色）
4

る。水溶液中の Li + や Na + は水和してイオン半径が大きく

電子の授受は変色時のみであり、状態の保持には電気なっているため、プルシアンブルーに脱挿入できない。しかを消費しない。このため、大面積化しても消費電力が少なし、二次電池の電解液は炭酸プロピレンなどの非極性溶

いほか、簡易な電源でデバイスを構築できる。

媒であり、脱挿入できることが確認されている21）。プルシア

これを応用したのが、電子カーテンや電子ペーパーであンブルーを導電助剤（アセチレンブラック）、結着剤（PTFE）

る。電子カーテンは開いた状態と閉じた状態を透明⇌青と混合・成形してリチウムイオン二次電池の正極とした場色の変色で実現している。プルシアンブルーを用いた電子

合、電池容量（110mAh/g）
やサイクル特性が劣っていた。

カーテンは、自動車のサンルーフ、ミラー、住宅の窓、人工

しかし、類似体の適用や水和数の調整などの検討により、衛星などに用いられている

A xMn［Fe（CN）6］･nH2O（A：K, Rb）
で良好なサイクル特y。スイッチ一つで開閉を制

15,16）

御できる（図 2）。このため、自動車では車体重量の軽減、建物では集中管理による施設管理コストの低減や空調効率の向上などが期待できる。

性が見出されている22）。
一方、電析膜を用いた正極で高い容量が得られている
23）（128mAh/g）。薄膜正極は100C 以上の高速充放電が

電子カーテンに白色層を設けると電子ペーパーにな可能であること、充放電により変色することなど興味深い。文字や図柄の部分のみを青色にすることで様々な特性を示している24）。ナノ粒子を塗布成膜した正極もすで情報を表示できる。電子ペーパーは電子ブック市場の活に報告されており25）、今後はプルシアンブルーに適した電発化により需要が拡大している。軽量・フレキシブルで低価池の構造や部材の開発が進むものと予想される。

格なデバイスが目標であり、低消費電力と高い視認性が求

3.4 過酸化水素水センサー・グルコースセンサー

る

17）

められている。携帯端末よりも、値札、POP、カード、広告、ポスターなどへの応用が期待されている。

18）

プルシアンブルーは過酸化水素やグルコースなどのセンサーとしても利用できる。過酸化水素は食品の漂白剤やこれまでの製品はほとんどが電析膜によるものであった

食品・設備の殺菌剤として用いられており、食品の残留濃が、ナノ粒子を塗布成膜したデバイスもすでに実用段階度分析が実施されている。一方、グルコースは血糖や尿糖に達しつつある 。プルシアンブルーを用いた電子ペー検査として健康診断などで分析が行われている。

4）

パーは高反射率（60% 以上）かつ高寿命（100 万回以上

プルシアンブルーを用いた過酸化水素センサーの特徴

書換可能）である。デバイスのフレキシブル化や全固体化は高い感度であり、イオン移動スペクトロメトリやヨウ素電量19）なども研究が進展しており、あらたな用途の開拓が期

滴定と比較してその検出感度は300 倍以上である 26）。食

待されている。

品中に多く存在するアスコルビン酸の妨害に強いことも特3.3 二次電池

徴である。さらに、グルコースを酵素酸化して生じる過酸化

プルシアンブルーは二次電池の電極材料にも適用でき、水素を分析することで、高感度なグルコースセンサーとして電池コストの低減や電池特性の向上が研究されている。

も利用できる。過酸化水素やグルコース（血糖・尿糖）の分開発は研究レベルのものが多いが、現行材料を上回る結析装置は、安全意識の向上や高齢化、健康意識の向上

果が得られつつある。

により有望な市場となっている。近年では、グルコース以外

プルシアンブルーの電極反応は、前章に示したエレクトロのセンサーとしても数多く報告されており27）、プルシアンブ

クロミック反応とほぼ同じである。つまり、フレームワーク構造

ルーを用いたセンサーは幅広い応用が期待されている。

へのLi などのイオンの脱挿入と、金属の価数変化である。

センサーについても塗布成膜技術の適用が有効であイオンの脱挿入による構造変化がわずかであることから、繰

る 28）。すでに、ナノ粒子を塗布成膜した薄膜が過酸化+26から、コスト低減も期待されている。

THE CHEMICAL TIMES

2013  No.3
（通巻 229 号）

プルシアンブルー；新しい応用とそのナノ粒子

水素センサーに適用できることが確認されている。食品や生体の分析では夾雑物によるセンサーの汚染・劣化が避けられない。この対策にはセンサーの使い捨てが有効であり、センサーが安価であることが重要である。また、微量分析への対応として、微細化も重要な課題である。塗布成膜技術はこれらの解決に大きく貢献する技術である。
4. まとめプルシアンブルーの応用分野はエネルギー、エレクトロニ
クスからバイオまで幅広いものである。この中には、青写真のように時代の変化で衰退したものもある。
しかし、それらを上回る数の新たな応用分野が生まれてきている。プルシア
ンブルーの機能はまだまだ奥が深いようである。
ナノ粒子分散液を用いた塗布成膜技術は、プルシアン
ブルーのさまざまな機能を実用化できる優れた技術である。
弊社はプルシアンブルーナノ粒子の量産製法を開発し、供給体制の構築に取り組んでいる。研究から試作・量産などのすべての開発ステージにナノ粒子を供給することで、プルシアンブルー研究の発展に貢献していきたい。

参考文献
1）Ware, M. J. Chem. Educ. 2008, 85, 612-621.
2）Buser, H.J.; Schwarzenbach, D.; Petter, W.; Ludi, A. Inorg.
Chem. 1977, 16, 2704-2710.
3）Neff, V.D. J. Electrochem. Soc. 1978, 125, 886-887.
4）（独）産 業 技 術 総 合 研 究 所 プレスリリース . http://www.aist.
go.jp/aist_j/press_release/pr2012/pr20121120/pr20121120.
html5）北川進 監修 . 配位空間の化学‐最新技術と応用‐.（株）シーエムシー出版 , 2009, 345p.
6）入江正浩 監修 . 機能性色素の応用 .（株）シーエムシー出版 ,2002, 312p.
7）Ishizaki, M.; Gotoh, A.; Abe, M.; Sakamoto, M.; Tanaka, H.;
Kawamoto, T.; Kurihara, M. Chem. Lett. 2010, 39, 762-763.
8）Kaye, S.S.; Long, J.R. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 65066507.
9）Sato, O.; Hayami, S.; Einaga, Y.; Gu, Z. Bull. Chem. Soc. Jpn.
2003, 76, 443-470.
10）（独）産業技術総合研究所 . 国際公開特許 WO2006/087950.
2006-08-24.; Gotoh, A.; Uchida, H.; Ishizaki, M.; Satoh, T.;

Kaga, S.; Okamoto, S.; Ohta, M.; Sakamoto, M.; Kawamoto, T.;
Tanaka, H.; Tokumoto, M.; Hara, S.; Shiozaki, H.; Yamada, M.;
Miyake, M.; Kurihara, M. Nanotechnology. 2007, 18, 345609.;
Kurihara, M. Bull. Jpn. Soc. Coord. Chem. 2007, 49, 34-46.
11）Ishizaki, M.; Abe, M.; Hoshi, Y.; Sakamoto, M.; Tanaka, H.;
Kawamoto, T.; Kurihara, M. Chem. Lett. 2010, 39, 138-139.
12）Hara, S.; Shiozaki, H.; Omura, A.; Tanaka, H.; Kawamoto,T.; Tokumoto, M.; Yamada, M.; Gotoh, A.; Kurihara, M.;
Sakamoto, M. Appl. Phys. Express. 2008, 1, 104002.
13）（独）産 業 技 術 総 合 研 究 所 プレスリリース . http://www.aist.
go.jp/aist_j/press_release/pr2012/pr20120208/pr20120208.
html14）Kitajima, A.; Tanaka, H.; Minami, N.; Yoshino, K.; Kawamoto,T. Chem. Lett. 2012, 41, 1473-1474.；髙﨑幹大 , 岩井良太 ,北島明子 , 田中寿 , 川本徹 , 𠮷野和典 . “ プルシアンブルーナ
ノ粒子造粒体の粒径とCs 吸着特性の関係” . 第 2 回環境放射能除染研究発表会要旨集 . 2013-6-5/7. 環境放射能除染
学会 , 2013, p152.
15）“SGS Lightuning® electrochromic glass”. SAINT-GOBAIN
社 資 料 . http://www.saint-gobain.com/en/group/innovationand-research/new-products/sgs-lightuning ; SAINTGOBAIN 社ウェブサイト. http://www.saint-gobain-sekurit.com/
en/?nav1=PR&id=372 ; ECLIPS Energy systems社ウェブサイト.
http://eclipsethinfilms.com/
16）“Elektrochrome Verbundgläser”. GESIMAT 社 ウェブ サ イト .
http://www.gesimat.de/elektrochrom.htm
17）面谷信 監修 . 電子ペーパーの最新技術動向と応用展開 .
（株）シーエムシー出版 , 2011, 201p.
18）“電 子 ペーパー”. 凸 版 印 刷（株）ウェブ サイト . http://www.
toppan.co.jp/denshi_paper/
19）（独）産業技術総合研究所 . 国際公開特許 WO2011/030790.
2011-03-17.
20）守友 浩 , 栗原 佑太朗 . 機能材料 . 2011, 31（12）, 35-41.
21）Imanishi, N.; Morikawa, T.; Kondo, J.; Takeda,. Y.; Yamamoto,O.; Kinugasa, N.; Yamagishi, T. J. Power Source. 1999, 79,
215-219.
22）Okubo, M.; Asakura, D.; Mizuno, Y.; Kim, J.-D.; Mizokawa, T.;
Kudo, T.; Honma, I. J. Phys. Chem. Lett. 2010, 1, 2063-2071.
23）Matsuda, T.; Moritomo, Y. Appl. Phys. Express. 2011, 4,047101.
24）Moritomo, Y.; Takachi, M.; Kurihara, Y.; Matsuda, T. Appl.
Phys. Express. 2012, 5, 041801.
25）（独）
産業技術総合研究所 . 特開 2011-180469. 2011-09-15.
26）Karyakin, A.A.; Puganova, E.A.; Budashov, I.A.; Kurochkin,
I.N.; Karyakina, E.E.; Levchenko, V.A.; Matveyenko, V.N.;
Varfolomeyev, S.D. Anal. Chem. 2004, 76, 474-478.
27）Ricci, M.; Amine, A.; Palleschi, G.; Moscone, D. Biosens.
Bioelectron. 2003, 18, 165-174.
28）（独）
産業技術総合研究所 . 特許第 4889015 号 . 2012-02-29.

THE CHEMICAL TIMES

2013  No.3
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最 近 の ト ピ ッ ク ス〜多様化するβ-ラクタマーゼと検査試薬に関する一考〜
ペニシリン系、セフェム系、カルバペネム系薬などのβ-ラクタ
一方、CPDXを基剤とし、ESBL阻害剤、AmpC阻害剤、そム系薬は様々な病原微生物に対する抗菌活性の強さと、ヒトに して両阻害剤を含有した4ディスク法によるAmpC／ESBL鑑
対する安全性の高さからもっとも汎用されている抗菌薬である。 別ディスクは、従来のDDST（Double Disc Synergy Test）
法と（図2）。ESBL産生菌の中にしかしながら、ペニシリン実用化から60年余りで様々な耐性 同等の精度を有す簡易法である
メカニズムによる薬剤耐性菌が出現してきている。1980年代よ はAmpCを同時に産生するタイプもあり、その場合にも非常にり第三世代セファロスポリンが発売され、TEM型やSHV型 わかりやすく判別可能である3）。よって、クロモアガーESBLと本
Extended-spectrum β-lactamase（ESBL）
産生菌、イミペネムが 試薬を組み合わせることにより、煩雑な検査の簡略化が期待（図3）。このような手法を用いることにより、様々な腸内細1980年代半ばより発売されるも、IMP-1を産生するカルバペネ されるから、積極的に耐性菌
ム耐性緑膿菌やセラチアが、1990年代にはCTX-M型ESBL 菌が存在するような検体（特に便検体）産生菌が出現し、2000年代より世界的に蔓延してきている。現 を検出できるようになり、アクティブサーベイランス等にも有用と
在、IMP型やVIM型、さらにはNDM型のMetallo-β-lactamase 考えられる。
（MBL）、さらにはKPC型、OXA型などの様々なカルバペネ
参考文献
マーゼ産生菌が世界を覆いつくそうとしている。
これら武装化した微生物の侵入を早期にキャッチし、感染
1）Saito, R.; Koyano, S.; Nagai, R.; Okamura, N.; Moriya, K.; Koike,
K. Evaluation of a chromogenic agar medium for the detection of対策をとるシステムの必要性はますます高まるものと考える。
薬剤耐性菌の中で特に増加傾向の著しいESBL産生菌
は、CPDXなどの第三世代セフェム薬による選択分離培地の利用によりスクリーニングできるようになっている。また、酵素基質を利用することにより主要なESBL産生菌をコロニーの呈色で簡易鑑別できるようになった。本手法を利用したクロモアガー
ESBL（図1）
は、ESBL産生菌の検出を目的として開発され、優れた検出感度を有している1）。しかし、
AmpCやMBL産生菌などの耐性菌の発育も認められ偽陽性として報告されている1、2）。

extended-spectrumβ-lactamase-producing Enterobacteriaceae. Lettersin Applied Microbiology. 2010, 51, 704-706.

2）浅原 美和, 川上 小夜子, 厚川 喜子, 石垣 しのぶ, 田中 孝志, 斧 康
雄, 古川 泰司. 基質拡張型βラクタマーゼ（ESBLｓ）産生菌のスクリー
ニング培地クロモアガーESBLの検討．
日本臨床微生物学会総会
2012.
3）森 千尋, 川上 小夜子, 浅原 美和, 市川 りさ, 西野 入燈, 田中 孝志,
中野 竜一, 斧 康雄, 古川 泰司. AmpC／ESBL鑑別ディスクによるβラクタマーゼ分類法の検討．
日本臨床微生物学会総会 2012.

図2 AmpC／ESBL鑑別ディスクにおける鑑別基準

図1 クロモアガーESBL上のESBL発育所見

図3 β-lactamase産生菌の簡易鑑別スキーム

C K
表紙写真：ハクサンシャジン（撮影／北原音作）〒103-0022 東京都中央区日本橋室町2丁目2番1号
室町東三井ビルディング
電話（03）
6214−1056 FAX（03）3241−1029
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編集責任者 金田 尚
平成25年7月1日 発行「無断転載および複製を禁じます。」