ハイスループット自動パッチクランプ
システムの進展：安全性薬理試験への応用○嶋根 三好1)、岡 貴之1)、大槻 篤史1)、松浦 勝久2)、原口 裕次2)、清水 達也2)
1) ナニオン テクノロジーズ ジャパン株式会社
2) 東京女子医科大学 先端生命医科学研究所

info@nanion.jp

生理的温度（35℃）でのhERG チャネル測定緒 言
2002年に創薬向け自動パッチクランプシステムが上市されてから今日に至るまで、本システムはイオンチャネルを標的とするライブラリースクリーニングならびに安全性薬理試験に大きく貢献している。その機能は主にユーザーの需要に沿って開発が行われ、近年ではComprehensive in vitro Proarrhythmic Assay（CiPA）イニシアチブの議論を受けて、生理的条件下での測定が可能なシステムが求められている。本研究では、384ウェル同時測定ハイ
スループット自動パッチクランプシステムSyncroPatch 384PE を用いて心筋イオンチャネル（Cav1.2（Ica），Kv4.3（ITO），Kir2.1（IK1），Kir3.1/Kir3.4（IKACh）チャネル）の測定を行うとともに、生理的温度での測定が可能となった温度調節機能、ならびにiPS 細胞由来心筋細胞の活動電位記録（Current clamp モード）についてデータを示す。

図6．温度調節機能付きSyncroPatch 384PE

方 法
測定システム：SyncroPatch 384PE （Nanion Technologies 社：図1）

図7．35℃でのhERG チャネル測定（上）とErythromycin の用量反応曲線（右）細胞：
Cav1.2-CHO，Kv4.3-CHO，Kir2.1-HEK，Kir3.1/Kir3.4-HEK 細胞（CT6004，CT6171，CT6103，CT6017：Charles River 社）

Chip

Patch clamp config.

IC50

Success rate (%)

CompoundTemp. (deg C)

IC50

Literature

4 holes

Whole-cell

Erythromycin 60.5 mM(Literature 115 mM*5)

94.7(n =364)

Erythromycin

25598 mM

1410 mM*53560.5 mM

115 mM*5

表5．35℃でのhERG チャネル測定条件とErythromycin のIC50 ならびに実験成功率

細胞培養ならびに細胞調製：
Nanion’s Standard Procedure に従って行った

図1．SyncroPatch 384PE

細胞内液（mM）：
Cav1.2：140 CsF，10 NaCl，1 EGTA，10 Hepes，pH 7.2 （CsOH）
Kv4.3，Kir2.1，Kir3.1/Kir3.4：120 KF，10 NaCl，20 KCl，5 EGTA，10 Hepes，pH 7.2 （KOH）
細胞外液（mM）：
135 NaCl，4 KCl，2/5 CaCl2，1 MgCl2，5 D-Glucose，10 Hepes，pH 7.4 （NaOH）

表6．Erythromycin のIC50 と測定温度

SyncroPatch 384PE はシステム全体をケージで囲って温度調節を行うため、測定部分のみならず溶液やピペットチップ等を含めたシステム全体の温度管理が可能となり、より精密な温度調節が可能となっている（図6）。本実験ではシステムを生理的温度（35℃）に設定してhERG チャネルの測定を行った（図7）。Erythromycin の用量反応曲線を作成してIC50 を算出したところ、60.5 mM であった（表5）。室温（25℃）では598 mM となり、約10倍の差が見られた。（表6）*5. Kirsch et al. J Pharmacol Toxicol Methods. 2004, 50 (2), 93-101.

iPS 細胞由来心筋細胞の活動電位記録（Current clamp モード）
心筋イオンチャネルの測定
Cav1.2 (Ica)

図2．Cav1.2（Ica） チャネルの電流波形（左、中）とNifedipine の用量反応曲線（右）ChipPatch clamp config.

IC50Success rate (%)

4 holes

Perforated(25 mM Escin)

Nifedipine 106 nM(Literature 100 nM*1)

94.7(n =364)

表1．Cav1.2（Ica） チャネルの測定条件とNifedipine のIC50 ならびに実験成功率

Kv4.3 (ITO)

APD50 (ms)

APD90 (ms)APRiseTime (ms)14125210.3

図8．iPS 細胞由来心筋細胞の活動電位（左、右）

表7．iPS 細胞由来心筋細胞の活動電位（左）のAPD50，APD90 ならびにAPRiseTime

東京女子医科大学先端生命医科学研究所から提供されたiPS 細胞由来心筋細胞*6-7を剥離・調 製 し 、 Current clamp モ ー ド で 活 動 電 位 を 記 録 し た （ 図 8 ） 。 APD50 等 の 解 析 はSyncroPatch 384PE 専用解析ソフトウェアDataControl384 を用いて行った。（表7）*6. Matsuura et al. Biochem Biophys Res Commun. 2012, 425 (2), 321-7.
*7. Matsuura et al. Sci Rep. 2016, 6, 21747.

細胞内液置換機能
図3．Kv4.3（ITO） チャネルの電流波形（左、中）とQuinidine の用量反応曲線（右）ChipPatch clamp config.

IC50

Success rate (%)

4 holes

Whole-cell

Quinidine 21.2 mM(Literature 79.3 mM*2)

95.3(n =366)+ATP-ATP表2．Kv4.3（ITO） チャネルの測定条件とQuinidine のIC50 ならびに実験成功率

Kir2.1 (IK1)

図9．細胞内液置換機能のイメージ
図4．Kir2.1（IK1） チャネルの電流波形（左、中）とBa2+ の用量反応曲線（右）ChipPatch clamp config.

IC50

Success rate (%)

4 holes

Whole-cellBa2+ 6.38 mM(Literature 16.2 mM*3)

93.2(n =358)

表3．Kir2.1（IK1） チャネルの測定条件とBa2+ のIC50 ならびに実験成功率

Kir3.1/Kir3.4 (IKACh)

図10．Kv7.1/KCNE1（IKs） チャネルの電流波形（左）と電流値の経時変化（右）SyncroPatch 384PE は、測定チップ底面側の溶液（細胞内液）を測定中にいつでも列単位で他の溶液に置換することが可能である（図9）。本機能を使用して、Kv7.1/KCNE1（IKs）チャネル測定時に細胞内液をATP を含む溶液と含まない溶液に置換して、電流値に変化が見られるか検討した。ATP を含む溶液に置換した列は電流値の変化は見られなかったが、含まない溶液に置換した列は顕著に電流値のrundown が見られた。（図10：溶液を置換してから3分間電流値を記録し（右）、黒色の電流波形は溶液を置換してから3分後の波形を示している（左））結 論
図5．Kir3.1/Kir3.4（IKACh） チャネルの電流波形（左、中）とBa2+ の用量反応曲線（右）ChipPatch clamp config.

IC50

Success rate (%)

1 holePerforated(25 mM Escin)

Ba2+ 17.4 mM(Literature 6.8 mM*4)

92.1(n =354)

表4． Kir3.1/Kir3.4（IKACh） チャネルの測定条件とBa2+ のIC50 ならびに実験成功率

全ての実験で化合物を全ウェルに累積で添加して用量反応曲線を作成し、IC50 を算出した。その値は文献値とよく一致し、実験成功率は90 % 以上だった。
*1. Liao et al. J Biol Chem. 2007, 282 (48), 35133-42.
*2. Crumb et al. J Pharmacol Toxicol Methods. 2016, 81, 251-62.
*3. Schram et al. Cardiovasc Res. 2003, 59 (2), 328-38. *4. hKir3.1/Kir3.4-HEK Data Sheet, Charles River• SyncroPatch 384PE を用いて、心筋イオンチャネル（Cav1.2（Ica），Kv4.3（ITO），Kir2.1（IK1），Kir3.1/Kir3.4（IKACh）チャネル）を90 % 以上の実験成功率で測定することができた• 温度調節機能によって、生理的温度（35℃）でのhERG チャネル測定が可能になり、測定温度によるIC50 の差が確認できた• Current clamp モードによって、iPS 細胞由来心筋細胞の活動電位が記録できた• 細胞内液置換機能によって、Kv7.1/KCNE1（IKs）チャネル測定において細胞内液のATP が電流値のrundown を防ぐことが確認できた