様式第2号

公益財団法人

東京医科大学がん研究事業団

がん研究助成金研究報告書
平成30年6月30日

公益財団法人

がん研究事業団理事長
氏

研

究者

（職 名）

研 究 目

所

名森谷 昇太（ 助教 ）

研 究 課 題殿㊞

施 東京医科大学
設
名 生化学分野属

施所 160-8402
在地 新宿区新宿6-1-1

設
電 03-3351-6141
話 (内線：434)

多発性骨髄腫の分子病態における骨髄ストローマ細胞のオートファジーの関与とその治療応用- マクロライド抗生剤のオートファジー阻害機構の解明と臨床応用を踏まえて-

オートファジー系はプロテアソーム系と並ぶ主要な細胞内タンパク分解機構である。申請者はこれら二大タンパク分解系を同時に阻害することで多発性骨髄腫細胞に小胞体ストレス負荷増大を介した癌細胞死が強力に誘導されることを明らかにし、「小胞体ストレス誘導療法」という新概念の癌治療法を提唱してきた1-6。
これまでのオートファジーと癌の研究は癌細胞側に着目しているものが殆どであり、微小環境（癌細胞とストローマ細胞の相互作用）および微小環境誘導性薬剤抵抗（CAM-DR）におけるオートファ的 ジーの役割については全く解明されていない。そこで本研究ではCAM-DRにおけるオートファジーの多発性骨髄腫分子病態への関与を明らかにし、CAM-DR克服に向けた新規基盤形成を行うとともに、これまでに見出してきた本療法の有効性を「骨髄微小環境による分子レベル」と「骨髄腫疾患モデルによる治療効果」の両面から検証することを目的とする。また、マクロライド抗生剤のオートファジー阻害活性における標的分子を同定することで、より効率的なオートファジーの人為的制御法を開発し、他の癌種への応用も含めた革新的癌治療戦略へと展開したい。

骨髄腫細胞株RPMI8226, IM-9, KMS-12-PEに対して、エレクトロポレーション法(Nepa Gene)にてpEGFP-C1ベクター(Clontech)の導入を行い、G418薬剤セレクションにてEGFP強陽性の安定発現株を樹立した。
ストローマ細胞株LP101およびAA101（日本大学 相澤信教授より供与）の単層上に各種EGFP標識骨髄腫細研 究 方 法 胞株を播種し、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブおよびカーフィルゾミブや、オートファジー阻害活性を持つクラリスロマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシン誘導体などのマクロライドの併用投与を行うことにより、プロテアソーム系とオートファジー系の同時阻害を試みた。48時間培養後、フローサイトメーターにてEGFP陽性の骨髄腫細胞の生細胞数を定量評価した。

これまでの研究により、研究代表者らはクラリスロマイシン（CAM）を初めとするマクロライド抗生剤がオートファジーの阻害作用を持つこと、及び、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ（BZ）との併用により骨髄腫細胞に対して小胞体ストレス負荷を介した殺細胞増強効果を生じることを明らかにしてきた。(Moriya S. Int J Oncol. 2013,2015)

研 究 成 果 近年、骨髄ストローマ細胞（骨髄微小環境）と骨髄腫細胞との相互作用が骨髄腫細胞の増殖・生存を促進し、BZへの抵抗性を生じることが報告されている。そこで骨髄微小環境下での本併用療法の有用性を検証するた
めに、ストローマ細胞株と骨髄腫細胞株の共培養実験系の構築を試みた。
共培養系における細胞識別のために、まず、各種骨髄腫細胞株（RPMI8226, IM-9, KMS-12-PE）のEGFP安定発現株を樹立した。

次に、ストローマ細胞株LP101およびAA101（日本大学 相澤信教授より供与）の単層培養上に各種骨髄腫細胞株を共培養し、BZ添加後のEGFP陽性で示される骨髄腫細胞株の生細胞数をフローサイトメーターにより経時的に測定すると、骨髄腫単独培養系に比べてBZの殺細胞効果の減弱が観察され、CAM-DRによる殺細胞作用の阻害と考えられた。
しかし、ここにCAMを同時添加することで殺細胞増強効果が認められた。
また、CAM単剤ではストローマ細胞株および骨髄腫細胞株への細胞毒性はほとんど認められなかった。

研 究 成

この共培養系における殺細胞増強効果は他のマクロライドの併用添加でも再現された。
また、ストローマ細胞株との共培養による薬剤抵抗は第二世代型プロテアソーム阻害剤であるカーフィルゾミブ(CZ)によっても認められたが、マクロライドとCZを併用投与すると骨髄腫細胞株の殺細胞作用の増強が認めら果 れた。
以上の結果より、骨髄微小環境下でのプロテアソーム阻害剤抵抗性の克服にマクロライド抗生剤が有用であることが示唆された。

文献：5) Moriya S, et al. Int J Oncol. 2015.
1) Kawaguchi T, Moriya S,et al. Int J Oncol. 2011.
6) Miyahara K, Moriya S, et al. Int J Oncol. 2016.
2) Moriya S, et al. Int J Oncol. 2013.
7) Moriya S, et al. Int J Oncol. 2011.
3) Komatsu S, Moriya S, et al. Int J Oncol. 2012.
4) Komatsu S, Moriya S, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2013.

研究は論文発表に向けて継続中であり、また本研究助成により共培養系でのアッセイ系の確立や遺伝子導入細胞株の樹立が行われたことにより、今後さらに発展・加速することが期待される。
本研究期間中においてCRISPER/Cas9法によりオートファゴソーム形成に不可欠なATG5遺伝子を欠損させたストローマ細胞株の樹立に成功した。また、小胞体ストレス誘導性細胞死を誘導する転写因子であるCHOP遺伝子のshRNAベクターを作成し、CHOPノックダウン骨髄腫細胞株・ストローマ細胞株の樹立を進めている。

今 後 の 予 定

他にも、オートファジーの定量評価に用いられるmCherry-GFP-LC3ベクターを導入した各種細胞株も樹立済みであり、今後はこれら細胞株を使用した共培養実験において骨髄微小環境におけるオートファジーや小胞体ストレスの骨髄腫分子病態への関与の解明をさらに進める予定である。
また、マクロライドを機能性磁性ビーズに固相化し、質量分析法にてマクロライドのオートファジー阻害因子を解明するほか、マウス骨髄腫疾患モデルに対し、BZやマクロライドを併用投与し、抗腫瘍効果を検証することにより本療法の実臨床試験に向けた基盤形成を行う予定である。

様式第3号

公益財団法人

東京医科大学がん研究事業団

がん研究助成金収支決算報告書
平成30年6月30日

公益財団法人

がん研究事業団理事長殿研究者所属施設名
氏

収

支

決

東京医科大学
森谷

名

算

生化学分野
昇太㊞

書(単位 円)

交付を受けた助成金額
費

金 2,000,000 円

目明

細単 価 及 金 額

計額

設備、備品費

支出内訳

試薬、抗体、各品目多数のため別種生化学・分子紙および伝票原
消 耗 品 費 生物学実験器
本、預金通帳複写
具、培養器具類
物参照など¥2,000,476

計
過 △ 不 足 額¥2,000,476△ \476
超過分 \476 は自己支出により補てんしました。
使用明細に関しましては、品目多数のため別紙および、預金通帳の複写を添付しました。

備考
本学の常時取引店においては、預金通帳の振込み記録を持って領収書となります。

支区分金

出額

費

内根訳
拠設備、備品費¥2,000,476

消 耗 品 費

別紙使用明細および伝票原本、預金通帳複写 参照