ViewaBlue® Stain KANTO染色によるアガロースゲルからのDNA回収における問題点の解消
Resolution of technical issues on DNA recovery from agarose gel by ViewaBlue® Stain KANTO
高橋（独）農業・食品産業技術総合研究機構

宏和、松本敦子、金原

食品総合研究所

食品工学研究領域

浩子、杉山 滋、小堀俊郎

Hirokazu Takahashi, Atsuko Matsumoto, Hiroko Kanahara, Shigeru Sugiyama, Toshiro Kobori
Food Engineering Division, National Food Research Institute, National Agriculture and Food Research Organization
関東化学株式会社

技術・開発本部

伊勢原研究所

生化学研究室山嵜

裕之、千室智之

Hiroyuki Yamazaki, Tomoyuki Chimuro
Isehara Research Laboratory, Technology & Development Division, Kanto Chemical Co., Inc.
関東化学株式会社

試薬事業本部

試薬部

技術部 バイオケミカル課

小林祟良Takayoshi Kobayashi
Biochemicals, Reagent Development Department, Reagent Division, Kanto Chemical Co., Inc.

In this paper, we describe the results of DNA staining with ViewaBlue® Stain KANTO, a reagent for recovering DNA fromagarose gels. ViewaBlue® stained DNA migrated as a band in the gel after or during electrophoresis, and DNA bands wereeasily visualized under natural light. The DNA recovered from the band showed little damage because the visible light
spectrum only slightly covers ultraviolet wavelengths in the laboratory environment. In addition, ViewaBlue® had little
mutagenicity; therefore, ViewaBlue® provides a simple and safe means of performing experimental procedures including
staining, observation, and recovery of desired DNA without dedicated devices.

1. はじめに

うに、いずれの方法にも長所と短所があるためどちらをデオキシリボ核酸（DNA）やリボ核酸（RNA）を検出す

試薬の安定性、ランニングコスト、高い検出感度の点かる際、アガロースゲルによる電気泳動で分離した試料をら、アガロースゲル電気泳動での核酸検出に汎用されてエチジウムブロミド（EtBr）によって染色し、ピーク波長がいる。

採用するかは研究室によって異なるものの、EtBr 染色は260 nm の紫外線（UV-C）
を照射することによって可視

アガロースゲルで分離した DNAをゲルから回収して化することが一般的である。染色方法は二通りに大別さ別の実験（例えば塩基配列解析やクローニング）に使うれ、予め EtBrを添加してアガロースゲルを作製して電気ことがしばしばあるが、EtBr 染色ではアガロースゲルか泳動に使用する、いわゆる「先染め」と、EtBrを添加せらDNAを回収する工程で細心の注意を払わないと継続ずにアガロースゲルを作製し、電気泳動後に EtBr 染色して行う実験がうまくいかない。DNAはチミンやシトシンの液に浸す「後染め」である。
「先染め」は電気泳動中にピリミジン塩基とアデニンとグアニンのプリン塩基から構成核酸の分離状況を確認することが可能であり、泳動後されるが、このピリミジン塩基が 2 つ近接しているときににゲルを染色する必要がないことから検出時間が短縮

UV-Cが照射されると、2個の塩基間で架橋が生じてピリできる。ただし、EtBr は変異原性物質 であるため、ゲミジンダイマー（図 1）が形成される 2）。ピリミジンダイマー

ルや電気泳動緩衝液の取り扱いには注意を払う必要がが生成した DNA は、PCR や塩基配列解析の反応の鋳ある。
「後染め」は、電気泳動緩衝液の取り扱いは簡便型としても、またはプラスミド等を利用した大腸菌などのであるが、検出まで時間がかかる（約 30 分）、染色液や宿主細胞によるクローニングにおいても著しく効率が低染色後のゲルの取り扱いには注意が必要である。このよ下する。そのためアガロースゲル中の DNAを回収する

1）

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場合には工夫が必要となる。すなわち、DNAを確認用

照 射に比 べて EtBr の 蛍 光 強 度 が 減 少 するものの、レーンと回収用レーンの二つのレーンに分けて泳動を行DNA へ のダメージを低 減させることを第 一に考えてい、確認用レーンにだけ紫外線を照射して目的 DNA の

UV-A や UV-B で作業を行うこともある。ただし、暗室で位置を確認する一方で、回収用レーンではアルミホイルUV 照射を短時間で行う必要があるなど、UV-C 照射と等で覆うことにより紫外線を照射せず、確認用レーンで同様に操作上の制約がある。の位置を参照して目測で目的 DNAを切り出す（図 2）、とそのため DNA 回収を簡便に行うために、近年 EtBrいった手技がとられる。またこの操作は、確認用レーンかに代わる様々な核酸検出用蛍光色素が各社から販売さら目的 DNAを目視で確認するために暗室で行い、さらにれている。これらの蛍光色素は励起波長が紫外光では実験者を有害な紫外線から目や皮膚を防御するためになく可視光（400-800 nm）であるため、DNA に対するダ専用の保護具を使用するといった結構手間のかかる手メージはほとんどない。しかし、暗室等に加えて可視光を法が未だに使われている。また、現在では UV-C のみな

照射する専用の機材と試薬が必要であり、新たにシステ

らず UV-A や B の照射を選択できる機器があり、UV-C

ム導入のための初期投資が必要となる3）。多くの研究室には既に EtBr 染色用の機材が導入されているため、アガロースゲルからの DNA 回収のためだけにこうした試薬や機材を新たに導入するのにはいささか抵抗があると思われる。
2. 塩基性核酸染色試薬
アガロースゲルにおける核酸染色試薬としては非蛍光の染色薬、例えばメチレンブルー等の塩基性の染色薬が古くから知られている 4-5）。これらの塩基性染色試薬の中でも酢酸カーミン溶液は、小中学校の顕微鏡観察でも

図 1 紫外線照射によって形成される主なピリミジンダイマー

細胞の核を染めるのにも使われているので聞き覚えがある人も多いかと思う。核酸はその構造中に多数のリン酸基があるため全体として負電荷を帯びた分子であり、正電荷を帯びている塩基性染色試薬と静電的に結合する。また、色素自身が特定の色を有しているためDNA 検出に紫外線照射や検出用機器が不要である。さらに核酸との結合様式が EtBrとは異なり2 本鎖 DNA 内にインターカーレートしないため、使用者にとっても安全な核酸染色試薬として認知されている。一方、塩基性の核酸染色試薬は染色液の調製が煩雑であることに加えて、検出時間が長く感度が低いといった短所があるため 6-7）、通常の分子生物学実験で用いられることは少ない。
アガロースゲルからの DNA 回収における問題点を踏まえて、筆者らは導入費用が安価で、DNA 回収に十分な検出感度を持ち、かつ簡便で安全性の高い DNA 染色試薬の開発を要望していた。本稿では、DNA 回収に

図 2 EtBr 染色におけるアガロースゲルからの目的 DNA 断片の回収
確認用ゲルの目的 DNA（黒矢印）を目安として、回収用ゲルから目的 DNAが有ると予想されるゲル部分（白矢印）を切り出し、回収する。

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適した新しい DNA 染色試薬であるViewaBlue ® Stain
KANTO（以下 ViewaBlue ®）の使用事例を報告する。

ViewaBlue® Stain KANTO 染色によるアガロースゲルからの DNA 回収における問題点の解消

3. ViewaBlue® Stain KANTOによるDNA 染色

初めに、「後染め」法において検出までに要する作業時間と検出感度を検討した。アガロースゲル電気泳動

ViewaBlue ® によるアガロースゲルの DNA 染色には、（約 30 分間）後、ゲルをViewaBlue ® に浸し、5 分間静置

EtBr 染色と同様に「先染め」と「後染め」の 2 通りの染色した。その後、ゲルを精製水に浸して 5 分間振盪する脱方法が選択できる。一般的な塩基性のDNA染色試薬が色作業を2 回繰り返した後、自然光下で目的 DNAを観「後染め」であるため利便性が向上したと言える。そこ察した（図 3）。
「後染め」における作業時間は電気泳動で、各染色方法で検出までにかかる時間と検出感度をの時間を含めても1 時間以内に終了するため、EtBr 染評価した。この際、試料 DNAとしてプラスミド DNA の色の「後染め」と同程度である。ゲルに白色光を照らし、

pAcGFP-1（クローンテック社）
を制限酵素 EcoRI で切断

コントラストを上げると、目視で約 5 〜 10 ng の DNA が確して精製した後、段階希釈により様々な濃度に調製した認でき、EtBr 染色したゲルをポラロイドカメラで撮影したDNA 溶液を用いた。

場合には 4 ng 程度の DNA が確認できることから、検出感度も同程度であった。ちなみに、脱色作業を30 分程度延長すればより鮮明な泳動像を得ることができる。
次に、「先染め」での検出までに要する作業時間と検出感度を検討した。ViewaBlue ®を最終濃度で1%となるように添加したアガロースゲルと泳動用緩衝液（1xTAE）を電気泳動に使用した。電気泳動中にDNA バンドが観察できるかどうかを検討するため、泳動開始から15 分および 30 分後に自然光下で目的 DNAを観察した（図 4）。
泳動像そのものは「後染め」に比べて分離能が劣るが、白色光下の目視では、約 20 〜 50 ng 程度の DNA が視認された。
「後染め」法と比べると、ゲルおよび泳動用緩衝液の作製に多少の手間がかかる上、検出感度も低下
しているが、泳動中あるいは泳動後すぐに観察できるた

図 3 後染めにおけるViewaBlue Stain KANTO の検出感度
レーン上部の数字は泳動に使用したDNA 量（ng）を示す。また、黒矢印は目的 DNA（pAcGFP-1, EcoRI 切断済み）の位置を示す。
®

め、DNA 回収等の作業に速やかに移ることができるといった利点がある。

図 4 先染めにおけるViewaBlue® Stain KANTO の検出感度
左は泳動後 15 分後、右は30 分後に観察。レーン上部の数字は泳動に使用したDNA 量（ng）を示す。また、黒矢印は目的 DNA の位置を示す。

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市販の DNA 回収用キットを用いてDNAを回収する場
合、100 ng 以上の DNAを回収用アガロースゲル電気泳

4. アガロースゲルからの回収効率の比較動に供することが一般的である。ViewaBlue ® を用いたアガロースゲルからの DNA の回収効率について、自「後染め」と「先染め」では 20 ng 程度の DNA が確認で然 光 下で作 業できる ViewaBlue ® と、UV-C 下で行うきるため、キットを用いた通常の DNA 回収法にそのままEtBr 染色、および青色光下で行うSYBR-Safe（インビト適用できる。従って、ViewaBlue ® の試薬としての安全性ロジェン社）と比較した。前述の制限酵素 EcoRI で切断や可視光下で作業できる簡便性等を考慮すれば、電気した 3 µg の pAcGFP-1を電気泳動したゲルをそれぞれ泳動におけるDNA 検出や回収においてViewaBlue はの染色試薬で「後染め」した後（図 5）、pAcGFP-1 のバ

EtBr 染色等の蛍光系染色試薬より使い勝手がよいだろ

ンドを切り出し、DNA 回 収 用キットである Wizard Gelう。

and PCR purif ication system（プロメガ社）を用いて切®

®

り出したアガロースゲルから DNA を回 収した。回 収を用いた DNA 検出には 2 つの課題がある。1 つは、目視DNA 量はどの染色方法を用いても大きな差は見られなで非常に薄くしか見えない DNA バンドをデジタルカメラ等かった。現在市販されているDNA 回収用キットは、高濃で記録することが難しく、露光やシャッタースピードで強度度のカオトロピック塩存在下で DNAをシリカメンブレンやを上げられる蛍光試薬による染色とは異なる。2 点目としシリカビーズに選択的に吸着させるものが主流である。て、一般的な泳動用のローディングダイに含まれる色素でそのため ViewaBlue ® によって DNA のシリカへの吸着あるブロモフェノールブルーやキシレンシアノールと色調がが阻害される可能性も考えられたが、実際にはほとんど干渉することが挙げられる。ViewaBlue ® で染色した場影響しないことが確認された。また、エタノール含有溶液

合、これらの色素と標的 DNA のバンドとが重なると両者で洗浄する工程で、DNA に吸着しているViewaBlue ®

を区別することができない。そのため、ViewaBlue ® 用のは DNA から遊離して洗い流されたため、UV 吸光度測ローディングダイには色調が異なるオレンジG のみを添加定や蛍光試薬による回収 DNA の濃度検定には影響しした別売の 6 倍濃縮ローディングバッファー オレンジGをなかった。

しかし、蛍光系DNA染色試薬とは異なり、ViewaBlue使用することが望ましい。

回収した各々の DNA の一部（25 ng）
は、20 µl でライ

図 5 アガロースゲルからの目的 DNA の回収。
アガロースゲルに、それぞれ3 µg の EcoRI 切断したpAcGFP-1を泳動後、EtBr、SYBR®Safe、ViewaBlue® Stain KANTOで染色後、EtBr 染色は紫外線で、（インビトロジェン社）と専用フィルターで可視化した。ViewaBlue® Stain KANTO 染色したゲルは、スSYBR®SafeはSafe Imager ™ blue light transilluminator
キャナーで画像を取り込んだ。黒矢印は目的 DNA（pAcGFP-1, EcoRI 切断済み）を示す。

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ViewaBlue® Stain KANTO 染色によるアガロースゲルからの DNA 回収における問題点の解消

ゲーション反 応を行い、そのうち 5 µl（DNA 量 で 6.25ng）を用いて大腸菌を形質転換することにより、回収した5. おわりにDNA の品質を評価することとした。もし回収 DNA にピリ

EtBr 染色したアガロースゲルに UV-Cを照射して移ミジンダイマーのような損傷が入っていれば、形質転換さ動度を確認した後に DNAを回収してクローニングを行う

れて生育できる大腸菌のコロニー数が減少する。EtBrと、ピリミジンダイマーの形成により著しく効率が低下す

染色とUV-C の組み合わせでは、DNA にピリミジンダイる。また、EtBr は変異原性物質であるため、染色廃液やマーが生成することが知られているため、UV-C は 15 秒

観察後のゲル等の廃棄物の処理方法については以前間と30 秒間照射する試験区を設けた。その結果、青色より議論の対象となっている。ViewaBlue ®によるアガロー

光照射下で作業を行うSYBR ® -Safe 染色と、自然光下スゲル染色の利点は、EtBr で認められる上述の課題をで作業するViewaBlue ® 染色では、非常に多くの形質克服できることである。蛍光系染色試薬とは異なり、観転換された大腸菌コロニーが観察された（図 6）。一方、察に特別な機材を必要としない、または滅菌蒸留水でEtBr 染色したゲルから回収した DNAを用いた場合は、脱色できる等、利便性が高く一般的な研究室であればUV-C の照射時間が長くなるにつれて形質転換体のコすぐに導入できる。一方、ルーチンで電気泳動像を観察ロニー数が減ることが明らかとなった。以上の結果から、するには、写真撮影で融通が利く蛍光系染色試薬の方自然光下で作業できるViewaBlue 染色したアガロースが優れていると思われる。そのため我々の研究室では、ゲルから回収した DNAを用いたクローニング効率は、電気泳動像を撮影する際には蛍光系染色試薬でゲルDNA 損傷が生じない SYBR -Safe で染色した場合とを染色し、DNA 回収には ViewaBlue ® を使っている。特同程度であった。つまりViewaBlue ® を用いた場合でもにアガロースゲルからの DNA 回収は、作業工程の多さUVを用いないためゲルからの回収時に DNA に損傷がや安全性を考えるとViewaBlue ® を使うメリットは大きい。

入らず、その後の実験に適用できることが判明した。

また、検出条件によっては、EtBrに近い検出感度である®

®

上に利便性や安全性が高いため、大学や高校教育における学生実験でも十分活用できる核酸染色試薬であろう。

参考文献
1）Singer,V. L.; Lawlor, T. E.; Yue, S. Mutat. Res. 1999, 439, 3747.
2）Cariello, N.F.; Keohavong, P.; Sanderson, B.J.; Thilly, W.G.
Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4157.
3）Martineau, C.; Whyte, L.G.; Greer, C.W. J. Microbiol.
Methods. 2008, 73, 199-202.
4）Flores, N.; Valle, F.; Bolivar, F.; Merino, E. BioTechniques.
1992, 13, 203-205.
5）Adkins, S.; Burmeister, M. Anal. Biochem. 1996, 240, 17-23.
6）Turgut-Balik, D.; Çelik, V.; Moreton, K.; Brady, R.L. ActaBiol. Hung. 2005, 56, 389-397.
図 6 回収したDNAの損傷度の比較
pAcGFP-1によって形質転換された大腸菌は蛍光タンパク質であるGFPを発 現するため、GFP を発 現した形 質 転 換 体のコロニーを可 視 化した。
SYBR®SafeおよびViewaBlue® Stain KANTOで染色したゲルから回収したプラスミドDNAを用いた場合、非常に多くの形質転換されたコロニーが観察される。一方でEtBr 染色後に紫外線照射されたDNAは、照射時間の増加に伴ってDNAが損傷するため、形質転換体のコロニーの数も減少する。

7）Raymer, D.M.; Smith, D.E. Electrophoresis. 2007, 28, 746748.

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