厚生労働科学研究費補助金（難治性疾患克服研究事業）
分担研究報告書
FOP の治療を目指した BMP シグナル抑制因子 Zranb2 の同定と機能解析

研究分担者

片桐岳信

埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門

教授

研究協力者

大手埼玉医科大学ゲノム医学研究センター病態生理部門

助教

研究要旨

聡

進行性骨化性線維異形成症（FOP）は、骨形成を促す BMP 受容体の１種

ALK2 の活性型変異によると考えられる。BMP の骨形成作用を伝達する転写因子
Smad の新規制御因子を探索し、Zinc-finger, RAN-binding domain-containing
protein 2 (Zranb2)を同定した。Zranb2 は R-Smad に結合し、Smad 複合体の標的遺伝子の転写活性を抑制した。従って、Zranb2 は FOP のような BMP 活性による骨形成を伴う疾患に対する新しい創薬標的分子になる可能性が示唆された。
Ａ．

研究目的

用いて細胞内で Smad1 と複合体を形成する

進 行 性 骨 化 性 線 維 異 形 成 症

分子を免疫沈降法で濃縮した。Smad 複合体(Fibrodysplasia ossificans progressiva,の構成成分を SDS-PAGE で分画した後、各タFOP)は、主に筋組織の中で異所性骨化が進

ンパク質を LC-MS/MS 解析で同定した。その行する遺伝性疾患で、2006 年、ヒト２番染

中 に 、 本 研 究 で 解 析 し た Zinc-finger,

色 体 上 の BMP 受 容 体 を コ ー ド す る

RAN-binding domain- containing protein 2

ACVR1/ALK2 が責任遺伝子として同定された。

(Zranb2)が見出された。マウス筋芽細胞

これまでに我々は、国内 FOP 症例の 1 例をC2C12 から調整した cDNA を用いて、Myc タ除く全ての症例において ALK2 タンパク質グを付加した Zranb2 をクローニングし、発の 206Arg が His 残基に変わる典型的な変異現ベクターを構築した。

を有することを報告し、さらに、この変異Zranb2 と Smad の結合は、抗 Myc 抗体と体 ALK2 がリガンド非依存的に BMP の転写因抗 FALG 抗体を用いた免疫沈降とウエスタ

子 Smad を介した細胞内情報伝達系を活性ンブロット法で解析した。Zranb2 の BMP 活化することを明らかにした。そこで本研究性に対する作用は、C2C12 細胞の骨芽細胞

では、FOP の治療法への応用を目指して、の分化マーカーであるアルカリホスファタ

BMP の骨形成作用を伝達する Smad の新規制ーゼ(ALP)活性、BMP 初期応答遺伝子の Smad御因子を探索した。その結果、R-Smad と結結合配列を含む Id1 ルシフェラーゼレポー合する Zranb2 を同定することに成功する

ター(Id1WT4F-luc)アッセイで定量化した。

と共に、Zranb2 が Smad の転写活性抑制因

さらに、Zranb2 の細胞内局在は、抗 Myc 抗子であることを明らかにした。

体を用いた免疫染色法で検出した。Zranb2のリン酸化 Smad レベルに対する作用は、ウ

Ｂ．研究方法エスタンブロット法と抗リン酸化HEK293T 細胞に FLAG-タグを付加したマ

Smad1/5/8 抗体を用いた免疫染色法で解析

ウス Smad1 を過剰発現させ、抗 FALG 抗体をした。Smad の DNA 結合能は、ビオチン化した Id1 の Smad 結合配列を４個タンデムに配骨芽細胞分化に重要な転写因子 Osterix の置した標的 DNA を用いて、ストレプトアビ発現を抑制した（図 2B）。さらに、Zranb2

ジンビーズを用いた沈降ーウエスタンブロの過剰発現により、BMP-4 刺激で誘導されット法で解析した。

る Smad 標的遺伝子のルシフェラーゼレポ（倫理面での配慮）ーター活性も抑制された（図 2C）。

なし。
Ｃ．研究結果FLAG-Smad1 と 相 互 作 用 す る 分 子 をHEK293T 細胞を用いて探索した結果、ZRANB2と一致するシグナルが同定された（図１A）。
Myc タグを付加した Zranb2 は、BMP 受容体によってリン酸化される Smad1（図 1B）、Smad5、Smad8 と結合したが（data not shown）、Smad4 との結合はほとんど認められなかった（図 1B）。Zranb2 と Smad1 の結合は、BMP-4刺激の有無で変化しなかった（図１C）。

欠失変異体の作成により、Zranb2 の BMPシグナル抑制作用に重要なドメインを解析した（図 3A）。細胞内の局在は、Zranb2 内の２つの Zn フィンガーや Glu ドメインを欠失させても、野生型と同様に核内に認められた（図３B）。一方、C 末端側に位置する
Ser-Arg (SR)リッチドメインを欠失させると細胞質に局在し、SR リッチドメインだけを発現させると核内に集積することが判明した（図３B）。
こ れ ら の 変 異 体 を 用 い て 、マウス筋芽細胞 C2C12 を用いて、BMP シ

BMPR-IA(Q233D)と Smad1 の共発現で誘導しグナルに対する Zranb2 の効果を検討した。

た ALP 活性に対する作用を検討すると、核Zranb2 の過剰発現は、BMP 受容体の構成的内に局在した Zranb2 変異体は全て ALP を抑活性型変異体である BMPR-IA(Q233D)（図制したが、細胞質に局在したSR 変異体は2A）および ALK2(R206H)と Smad1 の共発現

むしろ ALP 活性を促進した（図 3C）。

で誘導される ALP 活性（data not shown）、そこで、Zranb2 に対する siRNA を用いて、ノックダウンによる Smad の DNA 結合能を検討した。２種類の異なる siRNA は、いずれも内在性 Zranb2 のタンパク質レベルを減少させた。この条件下で Smad1 の DNA 結合能を解析すると、scramble RNA を導入したコントロール群と差が認められないことが判明した（図 5A）。一方、Zranb2 siRNA の導 入 に よ り 、 BMP-4 刺 激 で 誘 導 さ れ る
Id1WT4F-luc の活性が上昇した（図 5B）。

Zranb2 の作用機序を解明するため、リン酸化 Smad に対する影響を検討した。その結Ｄ．考察果、Zranb2 を過剰発現しても、Smad1 のリFOP は、BMP 受容体の１種である ALK2 のン酸化レベルや（図 4A）、細胞内の核への活性化によって引き起こされる。これまで集積には変化が認められなかった（図 4B）。の我々の研究から、BMP 受容体の下流で骨形成促進作用を伝達するのは、主に転写因子 Smad を介した細胞内情報伝達経路であることが判明している。そこで、Smad の活性を制御する新規分子を探索する目的で、FLAG-Smad1 を用いて結合分子を解析した結果、Zranb2 を同定した。
Zranb2 は、Zn フィンガーを介して RNA に結合することで、ある種の RNA のスプライシングに関与する可能性が報告されている。
我々の解析結果から、Zranb2 は BMP 活性を抑制することが明らかとなったが、この抑制活性に Zn フィンガー領域は必須ではなかった。このことから、Zranb2 は従来の報告のような RNA のスプライシングを介して

2) Ohte S, Shin M, Sasanuma H, Yoneyama

BMP 活性を抑制するのではなく、別の機序

K, Akita M, Ikebuchi K, Jimi E, Maruki

で BMP 活性を抑制すると考えられた。

Y, Matsuoka M, Nanba A, Tomoda H,

Zranb2 を過剰発現させても、Smad のリン

Okazaki Y, Ohtake A, Oda H, Owan I, Yoda

酸化レベルや各集積には影響せずに、標的T, Furuya H, Kamizono J, Kitoh H,遺伝子の転写が抑制された。また、Zranb2

Nakashima Y, Susami T, Haga N, Komori

は Smad 複合体の DNA への結合にも影響しな

T and Katagiri T. (2011) A novel

かった。これらの結果より、Zranb2 は DNA

mutation of ALK2, L196P, found in theに結合した Smad 複合体の転写活性を抑制

most benign case of fibrodysplasia

するものと予想された。Smad の転写活性にossificans

は p300 などのコアクチベータが必要であBMP-specific intracellular signaling

ることから、Zranb2 はこれらと Smad の相

equivalent to a typical mutation,互作用を阻害するか、転写活性を抑制する

R206H. Biochem Biophys Res Commun

コリプレッサーをリクルートする可能性が407:213-218.

progressiva

activates

考えられる。
3) Kaplan FS, Shore EM, Pignolo RJ
Ｅ．結論(eds),

Katagiri

TandTheZranb2 は、BMP の骨形成作用を抑制する

International Clinical Consortium on

新規 Smad 結合因子であった。Zranb2 の発FOP (2011) The medical management of

現を促進するような化合物は、FOP のよう

fibrodysplasia

な BMP シグナルを介した異所性骨化の新しprogressiva:い創薬標的分子となる可能性がある。

considerations. Clin Proc Intl Clin

ossificans
current

treatment

Consort FOP 4:1-100.
Ｆ．健康危険情報
総括研究報告書にまとめて記載。

4) Takahashi M, Katagiri T, Furuya H,Ｇ．研究発表

and Hohjo H. (2012) Disease-causing

1.論文発表allele specific silencing against the1) Ohte S, Kokabu S, Iemura S, Sasanuma

ALK2 mutants, R206H and G356D, inH, Yoneyama K, Shin M, Suzuki S, Fukuda

Fibrodysplasia Ossificans Progressiva.

T, Nakamura Y, Jimi E, Natsume T, andGene Ther, in press.

Katagiri T. (2011) Identification andfunctional analysis of Zranb2 as a2.学会発表

novel

Smad-binding

suppressesBMP

proteinthat1)

J

Cell

formation and muscle regeneration. 第signaling.

Biochem, in press.

Katagiri

T:Heterotopic

32 回日本炎症・再生医学会
ム（2011 年６月３日、京都）

bone

シンポジウ

3.その他
2) Katagiri T, Ohte S, Sasanuma H, ShinM, Yoneyama K, Kokabu S, Fukuda T,Suzuki S, Tsukamoto S and Sato Y:
Characterization of mutant forms ofALK2

foundinpatients

withfibrodysplasia ossificans progressiva.
Gordon Research Conference on Bones andTeeth. （ 2011 年 6 月 19-24 日 、 Les
Diablerets, Switzerland）
3) 片桐岳信：筋芽細胞骨化する難病・進
行性骨化性線維異形成症. 第 29 回日本骨代謝学会学術集会

シンポジウム (2011年 7 月 30 日、大阪)
4) 大手聡、古株彰一郎、家村俊一郎、福田亨、笹沼寛樹、米山克美、進正史、福田亨、片桐岳信：新規 Smad 結合分子 Zranb2
は BMP シグナル抑制因子である. 第 18 回
BMP 研究会（2011 年 7 月 31 日、大阪）
5) 片桐岳信：Smad の新規転写抑制因子
Zranb2 の同定と機能解析. 第 53 回歯科基礎医学会学術大会 (2011 年 10 月 1 日、岐阜)
6) 片桐岳信：筋肉が骨になるメカニズム.
第 9 回 RCGM フロンティアシンポジウム.
(2011 年 11 月 3 日、埼玉)
Ｈ．知的財産権の出願・登録状況
1.特許取得なし。
2.実用新案登録なし。

なし。