KANTO CHEMICAL CO., INC.

Cç2005 No.3（通巻197号）

ISSN 0285-2446

香り の機能性 ― 発ガン予防 ―宮澤 三雄

超臨界CO2中での酵素反応による有用物質の合成松田 知子

高感度アンモニア測定試薬の開発

千室 智之

化学分析における基礎技術の重要性（3） ― 微量分析における汚染源の特定とその対策 ―

井上 達也

17

ドイツの切手に現れた科学者、技術者達（10） イマニュエル・カント

原田

22

編集後記

馨

奥野 祥治

2
8

小口 雄二

14

24

香り の機能性 ― 発ガン予防 ―Biological Function of Fragrance — Cancer Prevention at the Initiation Stage —近畿大学 大学院総合理工学研究科 / 近畿大学 理工学部応用化学科 教授

宮澤 三雄

MITSUO MIYAZAWA
Kinki University, Interdisciplinary Graduate School of Science and Technology, Professor
Kinki University, Department of Applied Chemistry, Professor
近畿大学 大学院総合理工学研究科 博士研究員

奥野 祥治

YOSHIHARU OKUNO
Kinki University, Interdisciplinary Graduate School of Science and Technology, Postdoctoral

1. はじめに常細胞が発ガン物質の影響を受け、DNA及び染色体に突然変異が起こる。我々は、このように突然変異を起こ

ヒトは「香り」
によって、気分がリラックスしたり食欲が増す物質（変異原物質）を失活させたり、この変異原物質

すなどの反応を無意識に起こす。このように我々が今日によって生じた突然変異の修復を助ける物質（抗変異原まで自然に身につけてきた「香り」の効用が、近年、科学物質）を見出すことが、ガン予防の観点からも大変重要な的に解明され、現在、食品、嗜好品、化粧品等の分野ことと考えている。ここでは、香気成分テルペノイドなどので実用化されている。我々は、この「香り」
を一つの化学

抗変異原性に関する我々の研究を概説する。

物質として捕らえ、その機能性と効用について先導的に研究を行い、「香り」を構成する化合物（香気成分と称す

2-2 抗変異原性試験法

る）から種々の生理活性成分を特定し、その本体を解明

抗変異原性試験法には大きく分けて、微生物、培養してきた。そして、この香気成分の中に、発ガン抑制等、動物細胞、昆虫類、および動物を用いる方法がある。微非常に強い生理活性機能が発現していることを明らかに生物試験法では1975年に米国Ames博士らによって開発してきた。これを有効的に利用するならば現在のようにヒされたサルモネラ菌を試験菌株とする変異原性物質を検トが、病気治療の為の薬を経口投与や静脈内投与等の出する復帰突然変異試験法（Ames テスト）が、試験の簡攻撃的な方法で体内に取り込むのではなく、近い将来に便さから抗変異原性試験法として、現在世界中で広く用はごく自然に「香りを嗅ぐ」という動作で、鼻や口から香気いられている。しかしながら、この方法でも2日間の日数

成分を体内に取り入れる等、体にとってより優しい方法で、を要する。これに比べて1985年に開発された umu テスト

病気の予防や治療が可能になるのではないか、と我々（図1）では数時間でDNA損傷の有無の検出を可能にしは期待している。

た。Umu テストはDNA損傷によって誘導されるSOS反応

本稿では、今まで我々が、科学的に明らかにしてきた（図2）を指標とする試験であり、我々はこの umu テストをこの香気成分の各種生理活性に関する研究を、数回に応用し、変異原性物質の検出ではなく抗変異原性試験

分けて紹介する。

法としてシステムを構築し、抗変異原性物質を約5時間で検出することに成功した。それ以来、我々はこの方法で2. 香気成分の発ガン予防に関する研究
2-1 香気成分による抗変異原性の研究

2

天然物の抗変異原活性を多数明らかにしている。1）〜23）
2-3 モノテルペンの抗変異原性 10）

発ガンの要因は種々あるが、その大部分は外因性のモノテルペン炭化水素の抗変異原性については、表1

環境因子によるものである。人間の正常細胞は、幾つもに示した8種（1~8）の化合物について我々が行った変異の段階を経てガン化するが、その第一段階では、まず正原物質Furylfuramide（AF-2）に対する抑制効果の結果

THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

香り の機能性 ―発ガン予防―

図1 Umu テストが 知られて い るの みで ある 。（ + ）Limonene（ 1）は柑橘類の代表的な香気成分として知られ、ヒトは日常生活においてかなりの量を摂取している。抗変異原性に関しては umu テスト図 1において0.7µmol/mLの濃度で8.2%の抑制効果を示した。
（-）-体（2）は天然物には少なく、ミント油、シトロネラ油に少量存在するのみで、抗変異原性は認められていない。
Limoneneの異性体である（1R）（- +）trans-Isolimonene（3）では4.1%の抑制効果を示した。γ-Terpinene（5）および（+）p-Menth-1-ene（7）は、炭化水素類のなかでは比較的強い抑制効果を示し、それぞれ14.6%、20.2%であった。α-Terpinene（ 4）, Ter pinolene（ 6）お よ び αPhellandrene（ 8）においては若干の抑制効果を認めた。
モノテルペンアルコールでは1.0µmol/mLの濃度において、（+）-Menthol（9）、（-）図2 SOS反応

Menthol（10）、（+）-Isomenthol（11）および（-）-Dihydrocarveol（15）はモノテルペ

THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

3

ンケトン類とほぼ同様の強い抑制効果を示し、それぞれ

表1. モノテルペノイドの抗変異原活性

77.2%, 79.5%, 70.0%および67.1%であった。また（+）-

suppressive effect(0.1µmol/mL)

ID50c(µmol/mL)

Terpinen-4-ol（13）,（-）-Terpinen-4-ol（14）, および1(+)-Limonene

8.2-

Cuminyl alcohol（16）においては化合物 9、10、11、15に

2(-)-Limonene0-

比べ若干低い値を示している。

31R-(+)-trans-Isolimonene

4.1

-

4

α-Terpinene

2.8-

モノテルペンケトンでは1.0µmol/mLの濃度において、

5γ-Terpinene

14.6

-

（ + ）- P u l e g o n e（ 1 7 ）、
（ - ）- M e n t h o n e（ 2 0 ）、
（ - ）-

6

Terpinolene

2.5-

Isomenthone（21）およびPiperitenone（23）はかなり強い抑7(+)-p-Menth-1-ene

20.2

-

8

6.3

-

制効果を示し、その値は67.4%、61.1%、61.3%およびα-Phellandrene

9(+)-Menthol

77.2

0.52

79.6%であった。また（+）-Carvone（ 18）、（-）-Carvone

10(-)-Menthol

79.5

0.65

（19）、
（+）-Piperitone（22）においても強い抑制効果が認

11(+)-Isomenthol

70.0

0.60

12

Isopulegol

55.9

0.80

13

(+)-Terpinen-4-ol

41.2

-

14

(-)-Terpinen-4-ol

57.3

0.92

15

(-)-Dihydrocarveol

61.5

0.85

16

Cuminyl alcohol

29.3

-

ン、モノテルペンアルコールとほぼ同等の強い抑制効果を

17(+)-Pulegone

67.4

0.52

我々は見い出している。これらp-menthan骨格を有する化

18(+)-Carvone

51.8

0.90

合物（図3）の構造活性相関についての検討から、モノテ

19(-)-Carvone

44.6

-

20

(-)-Menthone

61.1

0.79

ルペンケトンおよびモノテルペンアルコールでは六員環内の21(-)-Isomenthone

61.3

0.80

オレフィンの有無が抑制効果の発現に影響を与えており、

22(+)-Piperitone

21.7

-

オレフィンを持たない方が強い抑制効果を発現することを

23

Piperitenone

79.6

0.52

24

(-)-Perilla aldehyde

70.3

0.60

25

Cuminaldehyde

75.4

0.52

められた。
モノテルペンアルデヒドである（-）-Perilla aldehyde（24）およびCuminaldehyde（25）においては、モノテルペンケト

示している。またアルデヒト類では環内にオレフィンを有す
るにも関わらず強い抑制効果を示していることから、アルデヒド基が抑制効果の発現因子であると考えられる。

図3 p-Menthan骨格を有するモノテルペノイド

4compoundTHE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

a

Furylfuramide was added at 0.05 mg. Positive control was added
at furylfuramide without terpenoids. b Hydrocarbons were added at
a concentration of 0.07mmol/mL. c Dose for 50% inhibition

香り の機能性 ―発ガン予防―

2-4 セスキテル ペンの抗変異原性 24, 25）

3. 植物成分の発がん予防に関する研究

モノテルペン類と同様に変異原物質であるFurylfuramideに対する抑制効果について、7種のセスキテルペ

3-1 山薬の抗変異原性 26）

ン類を調べた。その結果を表2に示す。この結果から、我々の抗変異原性に関する一連の研究において、和比較的強い抑制効果を示した化合物は、（-）-Aristolene

漢生薬「山薬」から活性成分としてセスキテルペノイドで

（30）、
（-）
-α-Copaene（32）であり、0.1µmol/mLの濃度で、ある β-Eudesmol（33）を単離した（図5）。試料として用50％以上の抑制効果を示した。

いた山薬はヤマノイモ科ヤマイモ（Dioscorea japonica）の根茎の外皮を除去して乾燥させたものであり、滋養・強壮薬として用いられている。化合物33は umu テストにおいて、Furylfuramideおよび肉などの焼け焦げから単離された 変異原物質であるTr p-P-1（3-amino-1,4dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indol）に対して0.18µmol/mL
で80%、48%の抑制効果を示した（図6）。また化合物33
はSalmonella typhimurium TA100を用いた Ames テスト
においても両変異原物質に対して強い抗変異原活性を確認した。生薬の香気成分に含まれるこれらの抗変異原物質は、今後、漢方製剤の香りが発ガン予防をもたらす可能性を示唆しているものと考えられる。

図4 抗変異原活性を示したセスキテルペノイド
表2. セスキテルペノイドの抗変異原活性

compoundsuppressive effect(0.1µmol/mL)

ID50b(µmol/mL)

26(-)-Isolongifolene

50.9

0.10

27

(-)-8(15)-Cedrene-9-ol

53.4

0.08

28

(-)-Caryophyllene oxide

58.1

0.08

29

(-)-Isoledene

51.9

0.10

30

(-)-Aristolene

66.6

0.07

31

(+)-Calarene

57.5

0.08

32

(-)-α-Copaene

60.0

0.07

図5 山薬から単離された抗変異原性セスキテルペノイドaFurylfuramide was added at 0.05 mg. Positive control was added
at furylfuramide without terpenoids. bDose for 50% inhibition.

以上、モノ、セスキテルペン類の研究から各種変異原
図6 β-Eudesmlの抗変異原活性○：Furylfuramide □：Trp-P-1物質に対する抗変異原性の物質を見出してきた。現在、植物中の抗変異原物質に関する報告は、フラボノイド、

3-2 黒米の抗変異原性 27）

カテキン類などのポリフェノール系化合物において、抗植物成分から抗変異原物質を探索することは、前述

変異原性の作用機序に関する研究が盛んに行われての生薬同様、新たな抗変異原物質の解明につながる。

来ているが、テルペン類についてはここで述べてきたよ

現在、我々が食している現代米のルーツを探ると「赤米」、

うに、最近になってようやくin vitro での抗変異原性が見「黒米」と呼ばれる古代米に辿り着く。このような野生種

い出されたものが殆んどであり、作用機序について、あには現代米への新品種開発の過程で失った古代米特

まり明らかになっていないのが現状である。

有の生理活性成分が存在するものと考えられている。

THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

5

我々は古代米である「黒米」について抗変異原物質の探索を行った。

化合物34、35のFurylfuramideおよびTrp-P-1に対する抗変異原活性について検討した結果、両変異原物質にこの研究では、黒米の糠のアルコール抽出物を、前対し化合物35が化合物34よりも強い抑制効果を示した

述のテルペン類と同様に、抗変異原性試験法（2-2）
を用（図8）。このことより、3位の水酸基が活性の発現に重要いて、抗変異原活性成分を単離したところ、香気成分

な要因であると考えられた。またこれらの化合物のTrp-であるVanillic acid（34）とProtocatechuic acid（35）（図7）P-1に対する阻害機構を検討するために、Trp-P-1を事前を得た。化合物34は薄いビターテイストの香りを有する。

にラット肝臓の酸化酵素群であるP450を含むS9mixにより代謝活性化させた活性化Trp-P-1を用いた umu テストを行った（図8）。その結果，化合物34、35の抑制効果は大きく減少した。このことから両化合物のTrp-P-1に対する抑制効果はS9 mixによる代謝活性化を阻害することに起因していることが明らかになった。
「米」
は、日本の気候風土に適した素晴しい作物であ

図7 黒米の糠から単離された抗変異原性物質る。我々日本人の食文化の根底となる伝統的な食品に存在する抗変異原物質・抗発ガン物質を解明することは、発ガン予防に向けた食品素材研究に於いても、大変重要な課題であると考える。

4. おわりに
テルペン類は多種多様の複雑な化学構造を有する化合物群である。また、ポリフェノール系化合物等の他の二次代謝産物群と比較して、動植物には微量ではあるが、多種多様存在しているところに特徴がある。これら
一つ一つの化合物について、それぞれの機能性と効用を解明していくことは大変重要ではあるが、その為には
厖大な時間が必要である。多数の揮発性テルペン類で構成される植物精油は、単品では表現することが出来ない独特の香りを醸ち出し、この複合効果は現代科学でも解明しがたい部分である。最近の我々の研究において、精油の主要構成成分の単品から精油の構成組成に近づくにしたがい生理機能が向上する植物精油の持
つ不思議な相乗効果を見出しており、その神秘性も我々の研究によって徐々に解明されつつある。今後も我々は、
ここに示した揮発性テルペン類の抗変異原性・抗発ガン性の他に、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性などの各種生理活性や生体内動態、代謝に関与するヒトP450
分子種の決定などについて探究を続け、それらの作用機序を解明するとともに、香りの機能性の全貌を明らかにしたいと考えている。
図8 Vanilic acidおよびProtocatechuic acidの抗変異原活性○：Vanilic acid □：Protocatechuic acid6

THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

香り の機能性 ―発ガン予防―文

献1）M. Miyazawa, H. Shimamura, S. Nakamura, H. Kameoka, J.
Agric Food Chem., 43, 284（1995）.
2）M. Miyazawa, H. Shimamura, S. Nakamura, H. Kameoka, J.
Agric Food Chem., 43, 1428（1995）.
3）M. Miyazawa, H. Shimamura, S. Nakamura, H. Kameoka, J.
Agric Food Chem., 43, 3012（1995）.
4）M. Miyazawa, H. Shimamura, S. Nakamura, H. Kameoka, J.

24）嶽崎まゆ子、宮澤三雄、第44回 香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会・講演要旨集、p. 64-66 （2000）.
25）奥野祥治、嶽崎まゆ子、宮澤三雄、第46回香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会・国際精油シンポジウム（ISEO）合同大会要旨集、p. 95-97（2002）.
26）Ｍ. Miyazawa, H. Shimamura, S. Nakamura, H. Kameoka, J.
Agric Food Chem., 44, 1647（1996）.
27）M. Miyazawa, T. Oshima, M. Tokura, M. Hisama, J.Oleo Sci., 52,
471-481（2003）.

Agric Food Chem., 44, 3444（1996）.
5）F. Uenobe, S. Nakamura, M. Miyazawa, Mutat. Res. 373, 197（1997）.
6）M. Miyazawa, H. Shimamura, S. Nakamura, H. Kameoka, J.
Agric Food Chem., 45, 2849（1997）.
7）H. Shimamura, M. Miyazawa, K. Emonoto, S. Nakamura, H.
Kameoka, Nat. Prod. Lett. 10, 261（1997）.
8）M. Miyazawa, Y. Okuno, S. Nakamura, H. Kameoka, J. Agric
Food Chem., 46, 904（1998）9）M. Miyazawa, Y. Okuno, K. Oshiro, H. Kasahara, H. Shimamura,
S. Nakamura, H. Kameoka, Biosci. Biotechol. Biochem., 62, 1425
（1998）.
10）M. Miyazawa, Y. Okuno, S. Nakamura, H. Kosaka, J. Agric.Food
Chem. 48, 5440-5443（2000）.
11）M. Miyazawa, Y. Okuno, S. Nakamura, H. Kosaka，J. Agric.
Food Chem., 48, 642-647（2000）.
12）M. Miyazawa, H. Shimamura, S. Nakamura, W. Sugiura，J.
Agric. Food Chem., 48, 4377-4380（2000）.
13）M. Miyazawa, K. Sakano, S. Nakamura, , H. Kosaka，J. Agric.
Food Chem., 49, 336-341（2001）.
14）M. Miyazawa, Y. Nakamura, K. Sakano, S. Nakamura, H. Kosaka，
J. Oleo Sci., 50, 485-489（2001）.
15）M. Miyazawa, K. Sakano, S. Nakamura, H. Shimamura, H.
Kosaka，J. Oleo Sci., 50, 545-554（2001）.
16）M. Miyazawa, M. Hisama，J. Agric. Food Chem., 49, 4019-4025（2001）.
17）M. Miyazawa, H. Kinoshita, Y. Okuno，J. Food Sci., 68, 52-56（2003）
18）M. Miyazawa, T. Yamada, H. Utsunomiya，Nat. Prod. Res., 17,319-323（2003）.
19）M. Miyazawa, M. Hisama，Biosci. Biotechnol. Biochem., 67,
2091-2099（2003）.
20）M. Miyazawa, M. Hisama，J. Agric. Food Chem., 51, 6413-6422（2003）.
21）Y. Okuno, M. Miyazawa，Lett. Drug Design and Discovery, 1,
66-68（2004）.
22）M. Miyazawa, G. Kohno，Nat. Prod.Res., 19, 29-36（2005）.
23）M. Miyazawa, Y. Okuno, K. Imanishi，J. Agric. Food Chem., 53,
2312-2315（2005）.

THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

7超臨界CO2中での酵素反応による有用物質の合成
Organic synthesis by enzymes in supercritical CO2

東京工業大学 大学院生命理工学研究科 講師

松田 知子

TOMOKO MATSUDATokyo Institute of Technology, Department of Bioengineering, Associate Professor

1. はじめに

2. 加水分解酵素を用いるラセミ体アルコールの速度論的分割反応―立体選択性の制御3）二酸化炭素は、常温常圧では気体であるが、温度を31度（臨界温度）以上とし、圧力を73気圧（臨界圧力）以

加水分解酵素であるリパーゼは、図2（a）に示すように、上とすると、 超臨界流体 となる。超臨界CO2は、図1に自然界では脂肪酸エステルを加水分解する酵素である。

示すように、液体と気体の両方の性質を併せ持つ溶媒

ところが、水が少ない環境、つまり、有機溶媒中で用いであり、高機能性溶媒として、様々な分野で利用されてると、その逆反応のエステル化反応を触媒する
（図2
（b））。

いる。例えば、拡散性が高いことや物質を溶かすことがアセチル化剤としては、vinyl acetateが頻繁に用いられできるため、コーヒー豆からのカフェインの抽出、ビールている。基 質のアセチル 化と同 時に 生 成するv i ny l

用のポップエキスの抽出、香料の抽出、クロマトグラフィ

alcoholがacetaldehydeに変換されるため、生成したエスー用の溶媒、染色、精密部品の洗浄等に用いられてきテルの分解反応を防げるためである（図2（c））。本研究た。また、有機合成反応や高分子合成の溶媒や反応剤

では、ラセミ体の二級アルコールを基質として用い、アセとしても用いられている1）。本研究では、超臨界CO 2中チル化反応を行った。R体とS体では反応速度が異なる

2）で酵素反応 を行い、光学活性体等の有用物質を合成ため、どちらかをエステルに変換して逆側をアルコールできたので、紹介したい。

のままで残す速度論的分割反応が可能である
（図2
（d））。

図1（a）
CO2の相図（b）超臨界流体のイメージ（密閉された容器の中で液体を加熱すると、臨界温度で液相と気相の区別がなくなり、超臨界流体となる。
）

8

THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

超臨界CO2中での酵素反応による有用物質の合成

図2（a）自然界でのリパーゼの反応 （b）
リパーゼの逆反応 （c）
アセチル化剤としてvinyl acetateを用いるアセチル化反応（d）ラセミ体アルコールの速度論的分割反応

反応の立体選択性を示す尺度としては、反応が速い異せると、分子の形がかわるため、その影響までが出てし性体と遅い異性体の反応速度の比であるE 値を用いまう。一方、超臨界CO2を用いると、分子の形は変化した。

ない。さらに、有機溶媒の性質は連続的に変化させることは不可能である。例えば、ヘキサンをヘプタンにする

リパーゼの反応を、有機溶媒中ではなく、超臨界CO2と、炭素数は、6から7へと変化する。しかし、6.1や6.2

中で行った理由は、CO2は、1）安価であり、2）無害での炭素数の化合物は存在しないため、その間がどのよあり、3）地球上に多量に存在し、4）反応終了後は常圧うになっているのかは、調べることができない。ところが、に戻すだけで生成物と簡単に分離でき、5）拡散性が高超臨界CO2を用いる場合には、圧力や温度は連続的にいので反応速度が加速できるためである。さらに、超臨次第に変化させることができるので、立体選択性も連続

界CO 2は、その溶媒の性質を圧力や温度によって制御的に変化させることができる。

できる。超臨界流体は、図1（b）に示すように、気体のよ
うに密度が低い部分と液体のように密度が高い部分が図3に結果を示す。 図3（a）に示すリパーゼの反応の混ざっている状態であるので、例えば、少し圧力を上げ

立体選択性は、圧力や温度を変化させることにより連続

ると、密度が高い部分が多くなり、その結果、溶解度や的に変化した（図3（b,c））。ここで、超臨界CO2を利用す

誘電率、拡散係数等の物理化学的な性質が大きく変化

ると、圧力や温度により立体選択性を制御できることがする。本研究では、反応溶媒として用いるCO2の圧力やわかった。また、その変化は、密度の変化（図3（d））と温度が、リパーゼの立体選択性におよぼす影響を調べも関係深いことがわかった。ではなぜ、温度や圧力によた。有機溶媒の種類を変化させることにより、リパーゼ

り超臨界CO2の密度が変化すると、反応の立体選択性の反応の溶媒効果を検討した例は多数ある。しかし、が変化するのか考察した。CO2の酵素への吸着等によ有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒の種類を変化さる酵素の構造の微妙な変化が立体選択性に影響を与え

THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

9

ているのではないかと考えているが、詳しくは現在検討

そこでの説明に用いられている絶対反応速度式を、超中である。温度により立体選択性の制御に関しては、有臨界CO2中での反応を説明するためにも用いることがで

4）

機溶媒中のリパーゼの反応においても報告されており 、きた（図3（e））。

図3 超臨界CO2中でのリパーゼによるフルオロアルコールの速度論的分割反応の立体選択性におよぼす圧力および温度の影響 （a）反応スキーム （b）55 ℃での立体選択性におよぼす圧力の影響 （c）様々な温度での立体選択性におよぼす圧力の影響 （d）CO2の密度5）（e）CO2の密度一定条件下（0.75 g/mL）
での立体選択性におよぼす温度の影響

3. 加水分解酵素を用いるラセミ体アルコールの速度論的分割反応―大量合成6）わかった（図4（ a））。ラセミ体の1-phenylethanolとvinyl
acetate を用いて反応を行ったところ、R体のアルコールが 選 択 的にアセチル化され 、S 体は未 反 応であった

10

超臨界CO 2を用いる反応では、高圧容器を必要とす（図4（ b））。まずラセミ体のアルコールとvinyl acetateのるため、なるべく単位スペースあたりの収率が高い方

モル比を1:0.5とし、反応を行った。結果を表1に示す。

が有利である。そのため、フロー系の反応を行った。

反応はスムーズに進行し、ほぼ定量的にR体のアセテ反応には、Candida antarctica由来の固定化リパーゼ

ートが高い光学純度で得られた。この時、立体選択性であるNovozym435を用いた。この酵素は固定化されを示すE値は非常に高く、1800以上であった。反応条ているので、反応管に簡単に充填できる。ラセミ体の件を検討したところ、vinyl acetateを少過剰量用いるこ

基質をCO 2と酵素を充填した反応管へ 送液することにとにより、収率を47%から50%へと向上させることが可より、生成物である光学活性化合物が連続的にしかも能であり、R体のアセテートのみではなく、未反応のS体

バッチ式に比べて高い効率（400倍）で得られることがのアルコールも99%以上の不斉収率で得ることができ

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超臨界CO2中での酵素反応による有用物質の合成た。vinyl acetateを大過剰に用いても、S体のアルコー

素（Novozym435）を用いて、221gの ラセミ体のアルコ

ルの過剰反応は避けられた。また、圧力の検討により、ールを99%ee以上のS体のアルコールおよびR体のアセ9-20MPaの範囲で同様の結果が得られ、この反応は圧テートへと変換できた。本反応の、基質特異性の検討

力に影響を受けないことがわかった。さらに、3日間のを行ったところ、 図4（d,e）に示すように、2-undecanolの連続運転反応を行ったところ、図4（c）に示すように収ような脂肪族や1-tetralolのような環状アルコールの速度率や立体選択性の低下は見られず、1.73gの固定化酵

論的分割反応にも成功した。

図4（a）フロー系超臨界CO2反応装置の概要 （b）1-phenylethanolの速度論的分割反応（c）1-phenylethanolを基質とする3日間の連続運転反応（d）2-undecanolの フロー系速度論的分割反応（e）1-tetralolのフロー系速度論的分割反応

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（通巻197号）

11

表1. 超臨界CO2中でのリパーゼNovozym によるラセミ体1-phenylethanolのフロー系速度論的分割反応の条件検討

1-phenylethanol:vinyl acetate

圧力（S）-alcohol（R）-alcohol

変換率
d

E

mol/mol

MPa

%ee

%ee

%

1:0.50a

13.0

89.6

99.7

47

1850

1:0.60b

13.0

98.8

99.2

50

1240

1:1.30c

12.9

>99.5

99.0

50

>1000

1:1.30c

8.9

>99.5

99.0

50

>1000

1:1.30c

20.0

>99.5

99.0

50

>1000

反応条件：42-43 ℃, Novozym: 5.0 mL, 超臨界CO2流速：1.5 mL/min, 1-phenylethanolの流速：0.050 mL/min（1-phenylethanolとvinyl acetateの混合物の流速：a0.070 mL/min, b0.074 mL/min, c0.100 mL/min）d 1-phenylethanolを基準としたアセチル化体への変換率.

表2 チチカビによる超臨界CO2中でのケトンの不斉還元

4. アルコール脱水素酵素によるケトンの不斉還元反応7）
チチカビ（Geotrichum candidum IFO5767）由来のア
ルコール脱水素酵素はケトンの不斉還元反応を行うための触媒として有用であるが、超臨界CO2が反応媒体として有望であることも分かった。一般に水中での反応では、水からの生成物の抽出が困難であるが超臨界CO2中の反応では、分離の問題が解決できる。触媒としては、単離酵素ではなく、細胞を水と2-propanolの懸濁液とし、そこに吸水性ポリマーを加えることにより、ポリマー上に固定化、分散させたものを用いた。この反応により、初めてアルコール脱水素酵素が超臨界CO2中で活性を示す
ことを見い出した。また、様々な基質の還元反応は、非常に高い立体選択性で進行し、光学活性なアルコールが生成した。
（表2）。

5. 脱炭酸酵素によるCO2の固定化反応（カルボ
キシル化反応）8）であるため、超臨界CO 2中の反応においては細胞そのものを用いた。その結果、脱炭酸酵素によるピロールのカルボキシル化反応が、超臨界CO2中においても進行す12

脱炭酸酵素を超臨界CO 2中で用いると、その逆反応

ることを見い出した（図5（a））。系内を0.1 MPa（常圧）ににより、CO 2 の 固定化反応が 開発できる。ここでは、保つと反応はほとんど進行せず、10 MPaの方がはるか

Bacillus megaterium PYR2910由来の脱炭酸酵素を、超に速く進行した（図5（b））。圧力は臨界点付近以下の圧

臨界CO2層と水層の二層系の反応系で用いた。この酵力で収率は最高となり、臨界圧力以上で減少した（図5

素は、長澤らにより通常の条件において効率的にピロー（c））。水層のpHの低下や、基質と生成物の水層と超臨ルのカルボキシル化反応を触媒し、ピロール-2-カルボキ

界CO2層への分配等が原因であると考えられる。このシシレートを36g/L蓄積できることが見い出されている。単ステムは他の脱炭酸酵素を用いたCO2の固定化反応に離された酵素よりは細胞中に存在する酵素の方が安定も応用可能であり、今後のさらなる発展が期待される。

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（通巻197号）

超臨界CO2中での酵素反応による有用物質の合成

図5 （a）Bacillus megateriumによる超臨界CO2中でのピロールのカルボキシル化反応 （b）
経時変化 （c）
圧力の影響

6. まとめ超臨界CO2を利用したバイオプロセスの開発は、始まったばかりであり、超臨界流体の特徴を十二分に生かせる系を構築するには、多くの技術的改良および新しい反応の開発が必要である。今後、これらの研究開発が進めば、CO2を用いた新規合成反応群が生み出されるだろう。最終的には、微生物や植物がCO2をバランス良
く循環させているように、人類も酵素を駆使することにより自然界に多量に存在するCO2を用い、持続的社会を築けるようになることが期待される。

7. 謝辞
本研究を行うにあたり、龍谷大学理工学部の原田忠夫教授に御指導頂き、感謝致します。また、本研究は龍谷大学理工学部原田研究室の卒業生の皆様との共同研究の結果であり感謝致します。また、3章のリパーゼによる光学活性体の大量合成は、碇屋隆雄教授、有田佳生氏、美澄幸弘博士、市川真一郎氏（東京工業大学）との共同研究であり、4章のアルコール脱水素酵素の反応は、中村薫助教授（京都大学）との共同研究であり、5章の脱炭酸酵素の反応は、長澤透教授（岐阜大学）との共同研究であり、ここに感謝致します。

文献1）For organic synthesis in scCO2, see: P. G. Jessop, T. Ikariya, R.
Noyori, Nature, 1994, 368, 231; P. G. Jessop, T. Ikariya, R.
Noyori, Science, 1995, 269, 1065; P. G. Jessop, T. Ikariya, R.

Noyori, Chem. Rev., 1999, 99, 475; P. G. Jessop, W. Leitner, Eds.
Chemical Synthesis Using Supercritical Fluids; Wiley–VCH:
Weinheim, 1999; R. Noyori, T. Ikariya, In Stimulating Concepts
in Chemistry; F. Vögtle, J. F. Stoddart, M. Shibasaki, Eds.;
Wiley_VCH: Weinheim, 2000; pp 13_24; M. F. Sellin, I. Bach, J.
M. Webster, F. Montilla, V. Rosa, T. Aviles, M. Poliakoff, D. J.
Cole-Hamilton, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 2002, 24, 4569; W.
Leitner, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 746; J. M. DeSimone,
Science, 2002, 297, 799.
2）For enzymatic reaction in scCO2, see: T. Matsuda, T. Harada, K.
Nakamura, T. Ikariya, Tetrahedron: Asymm., 2005, 16, 909; T.
Mori, Y. Okahata, Chem. Commun., 1998, 2215; T. Mori, A.
Kobayashi, Y. Okahata, Chem. Lett., 1998, 921; A. J. Mesiano, E.
J. Beckman, A. J. Russell, Chem. Rev., 1999, 99, 623; Y.
Ikushima, N. Saito, M. Arai, H. W. Blanch, J. Phys. Chem., 1995,
99, 8941.
3）T. Matsuda, R. Kanamaru, K. Watanabe, T. Harada, K.
Nakamura, Tetrahedron Lett., 2001, 42, 8319; T. Matsuda, R.
Kanamaru, K. Watanabe, T. Kamitanaka, T. Harada, K.
Nakamura, Tetrahedron: Asymm., 2003, 14, 2087.
4）T. Sakai, I. Kawabata, T. Kishimoto, T.Ema, M. Utaka, J. Org.
Chem. 1997, 62, 4906; T. Sakai,T. Kishimoto, Y. Tanaka, T. Ema,
M. Utaka, Tetrahedron Lett. 1998, 39, 7881.
5）T. Moriyoshi, T. Kita, Y. Uosaki, Ber. Bunsenges. Phys.Chem.
1993, 97, 589.
6）T. Matsuda, K. Watanabe, T. Harada, K. Nakamura, Y. Arita, Y.
Misumi, S. Ichikawa, T. Ikariya, Chem. Commun., 2004, 2286.
7）T. Matsuda, T. Harada, K. Nakamura, Chem. Commun., 2000,
1367; T. Matsuda, K. Watanabe, T. Kamitanaka, T. Harada, K.
Nakamura, Chem. Commun., 2003, 1198.
8）For carboxylation under ambient conditions, see: M. Wieser, T.
Yoshida, T. Nagasawa, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 4309; M.
Wieser, N. Fujii, T. Yoshida, T. Nagasawa, Eur. J. Biochem., 1998,
257, 495; T. Yoshida, T. Nagasawa, J. Biosci. Bioeng., 2000, 89,
111; M. Wieser, T. Yoshida, T. Nagasawa, J. Mol. Catal. B:
Enzymatic, 2001, 11, 179.
9）T. Matsuda, Y. Ohashi, T. Harada, R. Yanagihara, T. Nagasawa, K.
Nakamura, Chem. Commun., 2001, 2194.

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高感度アンモニア測定試薬の開発
Development of a highly sensitive reagent for the determination of ammonia

関東化学株式会社 技術・開発本部 伊勢原研究所 生化学研究室

千室 智之

TOMOYUKI CHIMURO
Biochemical Department of Isehara Research Laboratory, Technology & Development Division, Kanto Chemical Co., Inc.
関東化学株式会社 技術・開発本部 伊勢原研究所 臨床化学研究室

小口 雄二

YUJI OGUCHI
Clinical Department of Isehara Research Laboratory, Technology & Development Division, Kanto Chemical Co., Inc.

1. はじめに2. 開発の背景

栄養素として取り込まれたアミノ酸のうち、タンパク質や先に述べたように、健常人の血中アンモニアは低濃度

核酸の生合成に利用されなかった過剰なアミノ酸は、水、に保たれている。従って、測定法には少なくとも数μg/

二酸化炭素、アンモニアに分解される。アンモニアは非100mLレベルのアンモニアを測定できる性能が要求され常に毒性の強い物質であるにもかかわらず、生命を維持る。また、赤血球中にはAMPデアミナーゼのようなアンモする過程で絶えず産生されている。また、腸内に大量にニア産生に関与する一連の酵素（核酸代謝酵素）と基質

常在している細菌もアンモニアを産生しており、産生されであるプリンヌクレオチドが存在しているため、検体中のたアンモニアの一部は腸管壁を経て体内に侵入してくる。

アンモニア濃度は非常に上昇し易く3）、採血後直ちに測このように、生体は常にアンモニアの脅威にさらされてい定する場合以外は何らかの前処理が必要になる。通常、1）るといえる 。これに対して生体はアンモニアを無毒化す

この前処理は検体の希釈を伴うため、測定法にはさらにるシステム（解毒システム）を体内に構築し、対応している。

低濃度のアンモニアを測定できる性能が望まれる。

その中心となるのが肝臓の尿素サイクルである。血中のア

体外診断薬として重要な点は測定結果の信頼性を確

ンモニアはここで直ちに無毒な尿素に変換され、尿として保することであり、測定感度の向上はこれを達成するた

体外に排泄される。さらに、体中の組織や腎臓にも複数めの必須要件であるが、その他に操作の簡便性、試薬のアンモニア消去機能があり、たとえシステムの一部に軽の安定性、汎用型自動分析装置への適用性などが求め度な障害が生じたとしても、血中のアンモニアは常に低られる。現在、臨床検査に用いられている主な血中アン濃度（10〜70 μg/100mL程度）に保たれるようになっていモニア測定法を表1に示したが、いずれの方法も一長一1）る 。一方、肝硬変、肝癌、劇症肝炎などの重篤な肝臓短があり、求められている性能のすべてをもつような測定疾患や先天性の尿素サイクル欠損症といったこのシステム法は見出されていない。

に重度な障害を生じた患者は、血中のアンモニアを消去

表1 血中アンモニア測定法と性能の比較しきれないため、アンモニア中毒におちいるリスクが高くなる。アンモニア中毒が進むと昏睡や死に至ることもあることから、特にこのような患者に対しては血中アンモニア濃度を把握することが極めて重要になる2）。
今般著者らは、旭化成株式会社（現旭化成ファーマ株
式会社）と共同で、血中アンモニアを測定する新たな方法を開発した。本稿ではその測定方法を体外診断薬に応用した例を中心として紹介する。

14

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高感度アンモニア測定試薬の開発

3. 酵素サイクリング法によるアンモニアの高感度測定

比や反応時間など）を設定した。設定した条件でアンモニア標準液（200 μg/100mL）を測定したときのタイムコー

今般著者らは、3種類の酵素反応を組み合わせたアンスを図2に示す。

モニアの測定方法を考案した（図１）。

図1 高感度アンモニア測定試薬の測定原理
NADS: NAD synthetase; GlucDH: glucose dehydrogenase;
DI: diaphorase

本法は検体中のアンモニアをNAD +に変換する反応と、生成したNAD+をグルコースデヒドロゲナーゼ（以下図2 アンモニア標準液（200μg/100mL）の測定（タイムコース）
本法：水溶性ホルマザンを検出（450nmにおける吸光度）
対照法：NADHを検出（増幅なし、340nmにおける吸光度）

GlucDHと略）とジアホラーゼ（以下DIと略）とで増幅する

本法の場合、吸光度は時間軸に対して一次的に上昇反応（酵素サイクリング反応）の2段階で構成されている。

し、5分間の吸光度変化量は0.75に達した。一方、酵素

GlucDHとDIによってNAD+とNADH間のサイクリング反サイクリングをさせない対照法では、反応開始後ほぼ1分+

応がn回転すると、NAD （またはNADH）のn倍量の水でプラトーに達し、5分経過した時の吸光度変化量は溶性のホルマザン色素がWST-8から生成し蓄積される0.02でしかなかった。5分間の反応において、本法は対ために、単位時間あたりの回転数が多いほど感度が上照法に対して37.5倍に増感された。なお、反応時間を延昇することになる。さらに、水溶性ホルマザンの生成速

長することでさらに感度を上昇させることができるし、本+度はアンモニアから変換されたNAD の濃度と比例関係法の場合はGlucDH濃度を2倍、3倍と増やすだけでも感にあるため、水溶性ホルマザンを分光学的に測定する

度を上昇させることが可能である（図3）。究極的にはことで検体中のアンモニア濃度を求めることができる。

1000倍以上感度を高められる可能性がある。

4. 測定感度の設定
測定感度はサイクリング定数Kcと時間tの積で決まり、
Kc＝（Ka×Kb）／（Ka＋Kb）であるため、Ka＋Kbを一定としたとき、K a＝K bでK cが 最 大になる（ K a 、K bは
GlucDHとDIの酵素反応定数）8）。実際には、必要な測定可能範囲や試薬の安定性を考慮して、酵素濃度を調整し、Kcを決定する。本検討では血中のアンモニアを測定することを意図し、400 μg/100mLのアンモニアを検体としたとき測定終了時の吸光度が2.0以下で、かつ基準範囲（12〜66 μg/100mL2））付近の測定再現性がCV 3%
以下を満足するような試薬処方と分析条件（検体／試薬

図3 グルコースデヒドロゲナーゼ濃度と測定感度の関係
GlucDH : glucose dehydrogenase

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5. 使用方法

7. 他項目への応用展開

本測定原理に基づき、第1試薬と第2試薬の2つの試

本稿で紹介した酵素サイクリング法は、ATPやK + 、薬から成るキットを作製した。

Mg 2+（金属濃度に応じてNADSが活性化する）の高感

標準的な測定手順は次のとおりである。先ず検体と30度測定試薬としてそのまま応用が可能である。さらに、倍量の第1試薬を混合し、37℃で5分間インキュベートす

図4に示したようにアンモニア、ATP、deamido-NAD+のる。続けて10倍量の第2試薬を加えて反応を開始し、いずれかを生成する酵素を組み合わせることで、様々な

450 nmでの吸光度変化量（⊿E/min）を測定する。そし物質の定量や酵素活性のための高感度測定試薬へのて、専用の標準液を用いて予め作成した検量線から検展開も可能である。

体中のアンモニア濃度を算出する。

6. 基本性能
臨床検査で広く普及している汎用型の自動分析装置を用いて本試薬の基本性能を評価した。
（1）
ヒト血漿を検体とした場合再現性は日内および日間とも変動係数（CV）が1〜3％、測定可能な濃度範囲は3〜400 μg/100mLであった。測定を妨害する可能性がある還元性物質（アスコルビン酸、グルタチオン等）やビリルビン、さらには溶血、乳び等の

図4 酵素サイクリング反応を用いた高感度試薬
ALP: alkaline phosphatase; CK: creatine kinase; PK: pyruvate kinase;
CDI: creatinine deimidase; CP: creatine phosphate;
PEP: phosphoenol pyruvate

影響はほとんど認められなかった。従来の酵素法試薬との相関性は本法をY軸にした場合、
回帰式y=1.02x-6.76、

8. おわりに

相関係数r=0.999と良好であった。
（2）全血を前処理した検体の場合

酵素サイクリング法は、高感度測定法として以前から採血後に生じる検体中のアンモニア濃度の上昇を防研究されているものである9）。酵素サイクリング法は生体

ぐには、タングステン酸ナトリウムを含んだ強酸性溶液で試料のように多種多様な成分を含む場合でも目的物質

除タンパクする方法が有効である。この処理を行った検のシグナルのみを増幅させることができるため、臨床検

体は、長期間安定であるため信頼性を確保するのに有査のように迅速性が要求される場合には特に有効な方用であるが、これまでは検体の性質により直接比色法

法と考えられる。しかし、一般的に分析操作が煩雑な場（用手法）にしか適用できなかった。本法はこの除タンパ合が多く、胆汁酸、ケトン体、カルニチンなど一部の項目クを行った検体についても血漿を検体とした場合と同等にしか利用されていない。本稿では酵素サイクリング法の性能を示し、全血を検体として用いるドライケミストリーの実用化の一例として血中アンモニアの測定試薬の開法との 相 関 では 、本 法を Y 軸とした 場 合 、回 帰 式発について紹介させて頂いた。この試薬はReady to

y=0.969x+6.250相関係数r=0.998と良好な結果が得られUseな試薬であり、高感度で再現性、特異性に優れ、長た。

期間安定であるという特徴を有している。さらに、従来本キットは製造後8ヶ月（冷蔵保存）
以上安定であった。

法と比べて検体／試薬比を小さくすることができるため、本キットは体外診断薬として十分な性能を有していると夾雑成分や除タンパク試薬の影響を受けにくく、従来法考えられた。

では困難であった全血を除タンパク処理した上清も検体として用いることが可能である。このことから、本試薬は臨床検査の様々な状況に対応できると考えている。
なお、
本試薬は平成15年8月からシカリキッドNH 3として、さら※21ページに続く

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（通巻197号）

化学分析における基礎技術の重要性（3）Importance of Basic Technique on Chemical Analysis (3)― 微量分析における汚染源の特定とその対策 ―関東化学株式会社 草加工場 検査部

井上 達也
TATSUYA INOUE

Department of Inspection, Soka Factory, Kanto Chemical Co.,Inc.

1. はじめにある試験要員の試験結果が、常にナトリウムと亜鉛の2項目で他者に比べ 高い値を示したことがあった。そのISO 17025や各種GLPなどの認定取得において、試試験要員の動作を一部始終観察したが、当初は他者と験データの信頼性が問われることが最近一般的になりつ異なる操作は認められなかった。しかし、何回か観察すつある。妥当性確認をされた公定試験法であっても、そるうちに頭を指で掻く癖があることに気付き、その試験要れを用いる試験所ごとにデータの信頼性が異なることが員の髪を超純水で洗い、その洗浄液を筆者自身のそれ多い。一般的に、データの信頼性は使用する設備機器と比較した結果、亜鉛が高いことが判明した。この試験の性能とその保守管理、試験要員の熟練度、使用する要員の整髪料や洗髪料等を調査したところ、シャンプー

試薬類の純度とその管理、それぞれの取扱いやサンプに亜鉛が含まれていることが明らかとなった。この他にリング、器具洗浄などの作業標準類等いわゆる４Ｍのレも制汗剤に含まれる銀をはじめとして様々な化粧品に含ベルに左右される。特に微量分析の場合、汚染源の特まれる金属化合物の汚染事例があるが、これらの汚染

定とそれらへの対策がきわめて重要な課題となる。本稿

要因は服装や操作、こまめな手の洗浄等の規制によりあ

では、我々が今までに経験した汚染源に関する情報をる程度防止することができる。

紹介し、微量分析の基礎技術習得の一助となることを期待する。
表1. 吸着マットに吸着された金属元素

元素

ng/cm2元素

ng/cm2

Fe

1800

Mn

28

試験室に運び込まれる汚染は、汗や唾液等の人体が

Na

1500

Cr

27

発する物質、衣服に付着している物質、化粧品を介し

Ca

930

Sr

22

て持ち込まれる物質及び靴底に付着して持ち込まれる

Zn

870

B

15

物質等が主流である。

Al

400

Cd

<10

Mg

260

Co

<10

Si

200

Li

<10

人体が発する汚染物質の代表は、汗と唾液であるが、

Cu

81

Bi

<10

ナトリウム等これらに多く含まれる元素はほぼ定常的に検

Ni

73

Mo

<10

出される。しかし、それ以外の元素は分析結果が毎回

Ba

58

V

<10

大きく異なり、摂取した食品の影響も強く受ける。

Pb

49

Be

<10

K

33

2. 試験室に運び込まれる汚染

2.1 人体が発する汚染物質

化粧品の類による汚染では、次のような経験がある。

THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

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2.2 靴底に付着して持ち込まれる汚染物質
最近では、試験室の入り口に靴底の汚れを室内に持マット等の使用は大変効果的であるので、分析施設の各所入口に設置されるよう推奨したい。

ち込ませないため吸着マットのが設置が普及している。
試験室入り口に設置したゴム製吸着マットに吸着された

2.3 新設のクリーンルームやクリーンベンチから発生する汚染物質元素の測定例を表1.に示す。
サンプリングは、使用済みのマットの中央部分10cm四一般の試験室のみならずクリーンルームでも室内で表1

方を披検試料とし、事前に酸で洗浄し超純水を染込ませの上位7元素が観測される。過去の経験では、新設した

たろ紙（５種Ｃ）で拭きとることにより行った。そのろ紙をクリーンルームでは稼動当初にこれらの元素が顕著に観酸で洗浄して金属を抽出し、ICP発光分析で定量した。

測されることが多い。例えば、エアー・パーティクル・カウン

こうしたデータを解析することで汚染源を特定することがタでは何らの異常も検出できないが、放置法で金属汚染可能となる。表1の場合、多く捕獲された元素はセメントを調査すると前記の元素が観測され、日を追うごとに減の成分であるSiO2、Al2O3、Fe2O3、CaO、MgOあるいは少するもののその速度が極めて遅いといった現象に遭天井材として使用される石膏ボード成分、アルミサッシ成遇することがある。即ち、エアー・パーティクル・カウンタで分等と一致する傾向にある。また、塗料の成分である亜は検出できない更に微細な塵埃が室内に残留している

鉛もしばしば検出される。鉄については意外な盲点があため、このような状態がしばしば見られる。設置工事中

り、シューズボックスが汚染源である場合がある。試験に飛散したコンクリートや金属等の極微粉末が壁に付着室に入る際、通常室外履きと室内履きを履き替えるが、し、これらが徐々に剥がれ落ちてくるものと考えられ、そ同じシューズボックスに両方を入れる場合、金属製のシの対処として壁を洗浄したり拭き掃除すれば汚染レベル

ューズボックスでは、雨に濡れた室外履きを入れておくとを劇的に下げることができる。

かなり早い時期から錆が発生し、室内履きに金属汚染

図1は、クリーンルーム設置後運転を開始し、室内のカが伝播してしまうので無視できない対策点といえよう。一ルシウムが低下していく過程を測定したグラフである。初方、陰イオンについて検証したところ、表2に示す陰イオ回の測定値を100として放置法により経時変化を追った。

ンが検出された。

Ｃａの低下が遅いため、15日目に壁の洗浄を実施したところ顕著な効果が認められ、Ｃａ汚染が壁に付着した成表2. 吸着マットに吸着されたイオン

イオン

ng/cm2

Cl−

7000

NO3−

3500

SO42−

5700

分に起因していることが判明した。

サンプリングは、使用済みのマットの中央部分10cm四方を被検試料とし、事前に超純水で洗浄し超純水を染込ませたろ紙（５種Ｃ）で拭きとることにより行った。そのろ紙を超純水で洗浄しイオンを抽出して、イオンクロマ
トグラフで定量した。
観測されたイオンは、Ｃｌ−、NO3−、SO42−など最も一般

図1. 新設クリーンルーム内のCaの変化

的なイオンばかりであった。これらの実験は、いずれもマット洗浄後5日間放置後のデータである。

18

同時に他の成分も似た挙動を示した。この結果は、

以上のように、試験室には常に外部からの汚染が侵

ICP質量分析装置が、クリーンルームに1台設置されてい入する危険性があるため、試験要員は可能な限り汚染る状況下での観測例であり、室内に各種装置、機器が物質を持込まないよう心掛けることが重要である。吸着更に設置されている場合では、更に複雑な観測結果とな

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（通巻197号）

化学分析における基礎技術の重要性（３）ろう。クリーンルームだから安心して運用できるわけではないという事例であるが、施設の適合性評価がいかに重要であるかお分かりいただけよう。

3. 室内で発生する汚染
我々の試験室では、試薬の分析を中心とした試験を実施している。試薬の試験では塩酸、硝酸を用いた比色、比濁分析あるいは加熱分解、蒸発乾固等の操作が頻繁に行われている。当然のことながら、これらの酸に

図3. ガラスに付着した成分のイオンクロマトグラム

よる室内汚染が気になる点である。そこで300 mLのガラス製ビーカーに酸性ガスの吸収液として超純水300 mL

グラフで分析した結果である。先にも述べたように試薬を入れ、試験室に放置した後その吸収液をイオンクロマの試験では塩酸とアンモニア水の使用が多く、その状況トグラフで分析し、その経時変化を追った。

によく一致した結果が得られた。
また、稀にではあるが、分析機器間での汚染も起きる。
実際にイオンクロマトグラフのすぐ脇にpH計を設置した場
合、塩化物イオンのブランクが上昇するケースがある。これは、pH電極の内部液及び保管液が塩化カリウム溶液
であることに起因する。塩化カリウムは、乾燥再結晶化の際、温度条件及び空調（気流）によっては綿菓子のような軽い結晶となり飛散しやすくなる。試験室において分析装置間の交差汚染にも注意を払う必要があり、その際には空調（気流）と配置を関連付けて考慮しなければならない。

図2. 試験室内の陰イオンの変化

4. 各種材質からの汚染
図2にその結果を示す。Cl - 、NO 3-の吸収量、即ち室内の塩酸や硝酸ガスによる汚染は、時間の経過と共に

上述の各項では、環境からの汚染について述べたが、進行していることが分かる。この汚染は作業時間帯（日

容器や器具等試料及び試薬と接触する材質からの汚染中）に集中し、作業をしていない時間帯（夜間）では少な

は、それを上回るインパクトを与える。最近では頻繁に使い様子が伺える。
図2中、初期の段階では、イオン吸収量が多く認められたが、これはハングリーウォーター（炭酸を含めイオンを含まない水）の効果によるのもと思われる。
また、試験室のガラスは、長らく清掃を怠ると白くなることがある。溶剤を多く使用する試験室では別であるが、ほとんどの 場合、試験室で使用した塩酸、硝酸、酢
酸のアンモニウム塩が付着していることが多い。図3はガラスの付着物を超純水で洗い、その液をイオンクロマト

図4. 市販のPFAボトルの金属不純物測定例

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（通巻197号）

19

用されるようになったPFAに代表されるふっ素樹脂製のでどのような処理がなされているかなど、複数の要因に容器は、清浄な材質と錯覚されやすいが、実際には多く支配されている。したがって、ふっ素樹脂製容器は、購の不純物を含んでいる。

入後の洗浄が不可欠な要素である。例えば、マイクロウ

図4は、市販のPFA製ボトルの側面を切り取り、切り取ェーブ分解装置の分解容器はPFAが主流であり、μg／g

った試料を表面側と裏面側に二分して切り離し、それぞレベルの分析には重宝であるが、ng／g付近からの高感

れを分解処理しICP質量分析で金属を測定した結果で度分析では、図4に示すようなブランクの高さを示すので、ある。

なかなか信頼性のあるデータが得られず苦労することが一般的にふっ素樹脂製容器は真鍮製の金型で成型さ多い。その模範として、pptレベルで金属不純物を保証しれるため、その成分である銅及び亜鉛を取り込んでしまている市販の超高純度酸では、PFA容器に充填して供う。特にボトルの外側に多く残存していることがわかる。

給されている事例が挙げられるが、このようなテフロンのさらにPFAは多孔質であるためガス透過性が強く、容器汚染データを踏まえ、大変高度な容器の洗浄技術が投の内側だけを洗浄しても外側付近に残存する金属不純入され、品質が維持されているということがよく理解でき物であっても容器の内側に取り込まれる可能性が残り、よう。一方、ポリエチレン製容器では各種の添加剤が使信頼できる清浄度を維持しにくい傾向を有している。

用され、それらが汚染の要因となることが知られている。
表4にポリエチレン容器に含まれる金属不純物の測定例を示す。カルシウム及びマグネシウムが最も多く含まれ、表3. 容器成型前のPFA粉末に含まれる金属不純物測定例

元素

ng/g

元素

ng/g

またアルミニウム及びけい素もしばしば検出される。即ち

Al

7

Li

<5

チグラーナッター系の重合触媒（けい素担体にアルミニウ

Ba

<5

Mg

28

ム及びチタン化合物を含む触媒）の残留やさらには着色

Ca

110

Mn

<5

剤として用いられる銅フタロシアニン（青）、チタン
（白）、ク

Cd

<5

Na

22

ロム
（緑）等の影響によるものである。これら一連のデータ

Co

<5

Ni

5

は、各材質に含まれる不純物の例であるが、分析に各種

Cr

21

Pb

<5

材質の容器や器具を用いる場合、こうした背景を理解し、

Cu

6

Sr

<5

適切な処理や目的にあった使い方が肝要である。

Fe

23

Tl

<5

また、分析の前処理に用いる白金製のるつぼ及び蒸

Ga

<5

V

<5

発皿では、しばしば研磨剤による汚染が問題となりやす

K

<5

Zn

9

い。もともと白金器具は成型加工の直後では市販品ほどの輝きは無く、これを研磨して仕上げられるため、研磨剤

表3は、成型前のPFA粉末の測定例であるが、図４のの残留が分析結果に影響を及ぼす場合がある。アルミニ

成型された市販品の測定結果と比較すると、成型時のウムのブランクがなかなか下がらないという状況に悩まさ

汚染の状況が良く理解できよう。

れた方も多いかと推察しますが、白金器具でもこのようなこれらの汚染状況は、金型の管理や成型品のバリ取り

影響の除去を考慮しなければならない。

表4. 市販のポリエチレン容器に含まれる金属不純物測定例

20

ng/g

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Al

650

93

200

70

1700

40000

2200

29000

1100

12000

Ca

100

90

110

230

200

320

6700

540

310

16000

Fe

100

66

47

33

54

52

77

91

34

120

Mg

53

30

320

88

1500

44000

2400

41000

1400

5200

Na

10

10

200

200

500

450

900

580

430

3700

Si

150

120

190

730

920

930

390

1700

290

1200

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（通巻197号）

化学分析における基礎技術の重要性（３）高感度アンモニア測定試薬の開発

さらには加熱器具からの汚染も無視できない事例があ

高感度アンモニア測定試薬の開発※16ページより続くる。熱伝導型のホットプレート市販品の多くは本体がアルミニウムで作られており、非常に細かい錆が徐々に発生に、平成16年10月からは専用の検体前処理試薬（シカし、特に本体内部にファンを装備している場合では、微リキッドNH3除蛋白液）
を加えて販売中である。

量の汚染を噴出するような状態で引き起こしやすい。こ酵 素 サイクリング 法は 本 稿 で 紹 介した 以 外にもうした場合、金属部の表面を樹脂等でコーティングした

ELISA 10）やバイオセンサー11）などへの応用が検討されり、本体の材質を樹脂製のものに換えるなど、また表面ている。また、近年盛んに研究されているμ-TASのようがガラスセラミック製の赤外線ホットプレートやハロゲンラな微小空間での微量試料の分析にも有効と思われる。

ンプホットプレートなどに換えることで、より汚染の少ない

このように酵素サイクリング法は超高感度検出法の一つ分析が可能となる。

として応用性が高いと考えている。

5. 分析による汚染

最後に、本試薬の開発にあたり、ご懇篤なるご指導を頂いた旭化成株式会社 診断薬事業部（現旭化成ファー

水酸化ナトリウムなどのナトリウム塩中の金属不純物をマ株式会社）の皆様に厚くお礼を申し上げる。

測定する場合、主成分を除去せずに各種の試料をICP
質量分析装置に導入することがあるが、そのような場合

参考文献

白金製のスキマーコーンを使用すると、熱伝導の関係で2時間ほどでスキマーコーンの穴がナトリウム塩で塞がれてしまう。その対策としてニッケル製のスキマーコーンを使用することとなるが、この場合、ニッケル製スキマーコーンをステンレス製スキマーベースと組み合わせると銅の汚染が発生し、時として銅の測定が困難となることがあり、このような場合にはスキマーベースを真鍮製にすると汚染が発生しなくなる。このように装置自身の部品の材質によって特異な汚染があるので配慮を要する。また導入系からスキマーベースに至る部品を新しいもので交換

1）上代淑人監訳: ハーパー･生化学 原書25版, 343-350, 2001, 丸
善.
2）Medical Practice編集委員会編: アンモニア窒素 臨床検査ガ
イド2001〜2002, 234-236, 2001, 文光堂.
3）伏見了, 国沢貴久美, 林長蔵: 採血後のアンモニア上昇に対する研究, 臨床化学, 8: 311-319, 1979.
4）奥田拓道, 藤井節郎: 血中アンモニア直接比色定量法, 最新医学, 21: 622-627, 1966.
5）伏見了, 木下憲明, 林長蔵：ドライケミスリーの原理とその評価,
Medical Technology, 15: 984-986, 1987.

し次の測定を実施すれば、効果的に前の試料の影響を

6）Mondzac A, Ehrlich G E, Seegmiller J E: An enzymatic

除くことができるほか、ICP発光分析の場合では、試料導determination of ammonia in biological fluids, J Lab & Clin Med,

入前に界面活性剤を注入して汚れを落とす等のテクニッ
クも効果があるので推奨したい。

66: 526-531, 1965.
7）山田満廣, 小味渕智雄: 新しい酵素反応系を用いた液状による
血液中アンモニアの測定法に関する評価, 日本臨床検査自動化学会誌, 25: 207-212, 2000.

5. おわりに8）美崎英生: 酵素サイクリング法による高感度測定法の原理, 検査と技術, 27: 973-980, 1999.

分析は、常に汚染との戦いといった一面を持っており、その目的を達成するためにいかなる環境下でどのような

9）加藤尚彦: 基礎生化学実験法（阿南功一ら編）vol 6 生化学的測定, 101-146, 1976, 丸善.

器具や試薬を用い、いかなる方法で行なうかを確実なも10）Johannson A, Stanley C J, Self C H: A fast high sensitiveのとすることが望ましい。しかし、実際の分析では予期

colorimetric enzyme immunoassay system demonstrating benefits

できない汚染に直面することも多く、それらをどれだけ多of enzyme amplification in clinical chemistry, Clin Chem Acta,

く認識できるかが重要なポイントとなる。さらには、試験方法の妥当性確認を実施し、かたよりのない結果が得られることを事前に確認しておくことも大切である。

149: 119-124, 1985.
11）Hasebe Y, Uchiyama S: Chemically amplified adrenal medulla
hormone sensor, based on substrate recycling using tyrosinase
and l-ascorbic acid, Anal Sci, 9: 855-857, 1993.

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ドイツの切手に現れた科学者、技術者達（10）イマニュエル・カント
Scientists and Engineers in German Stamps (10). Immanuel Kant
筑波大学名誉教授

原田馨

KAORU HARADA
Professor Emeritus,University of Tsukuba.

イマニュエル・カント
イマニュエル・カント（Immanuel Kant、1724-1804）哲学者。
東プロシアのケーニヒスベルク（Konigsberg, 現在のロシア領カリーニング
ラード、Kaliningrad）に生まれた。カントの両親はルッター派の敬虔主義派に属した人々であり、この家庭環境がカントの哲学の成立に影響を及ぼした。ケーニヒスベルク大学で哲学、神学、数学、物理学を学んだ後、同大学で教え、1770年哲学の教授となり、亡くなるまでケーニヒスベルクを離れることはなかった。彼はドイツ観念論哲学の創始者とされている。
カントの哲学は前期と後期に分かれる。彼は学生時代から自然科学に
ドイツの有名人普通切手全15枚中の1枚。
イマニュエル・カント、哲学者、自然学者、17241804。

親しんでおり、ニュートンの物理学にも通じていた。これらの知識を発展させた自然哲学が、カントの前期哲学の主題であった。前期の代表的著作に「天体の一般自然史と理論」（1755）があるが、ここに描かれた太陽系生成論は明らかにニュートンの物理学の上に立っている。カントの太陽系
生成のメカニズムはいわゆるカント・ラプラス（Laplace, 1748-1827）の星雲説と呼ばれるように原始太陽系星雲が次々と組織化を起し太陽系が生成したと考えた。カントはこのように星雲説の発案者として知られている。ラ
プラスに先んじて提出されたカントの星雲説は定性的であり、ラプラスの説は数理的ではあるが、その物理的内容は同じである。同様な星雲説は現在の物理学的太陽系生成論に於ても受け入れられている。これについては後に述べる。
カントの哲学の後半は種々の批判哲学であり、先ず認識の問題から始まり自然、人間の自由意志、道徳、神などの重要な諸問題を含む合理的哲学体系の批判的創造を試みた。以上のようにカント哲学後期は観念論的批判哲学であり、彼はドイツ観念論哲学の創始者であった。
現在の太陽系像は次のようなものである。中心に巨大な太陽があり、そ22

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ドイツの切手に現れた科学者、技術者達（10）イマニュエル・カントのまわりに水星、金星、地球、火星の内側惑星があるが、これらの惑星は
岩石と鉄よりなる天体であり、密度が高い。これらの内側惑星の外側には木星、土星、天王星、海王星、冥王星がそれぞれの軌道をまわっているが、これらはガスと氷よりなる巨大な天体で低密度である。また太陽から惑星への距離には「ティティウス・ボーデの法則（Titius-Bode）」が存在し太陽から惑星への距離がほぼ等比級数になっている。もし太陽系生成論が提出されたならば、その生成論は現在の太陽系が持つ力学的特性の多くを説明できなければならない。現在太陽系は上述のように塵を含む巨大な星間ガスから生成したと考えられている。いろいろな条件設定の細かい点を無視して現在の太陽系生成論の大略を述べると次のようになる。
巨大な塵を含むガスが重力により凝集をはじめるとガス体は回転をはじめ、凝集が進むとガスと塵は回転し凝集し原始太陽系星雲となり赤道面に沈澱する。沈澱した物質の質量が増大すると重力不安定を起こし、塵22ページの切手のポートレートの原図に相当する肖像画の層は分裂凝集して無数の微惑星を生成する。これらの微惑星は更に衝突を繰り返して凝集し原始惑星へと成長する。ガス塵の凝集のために内側惑星に相当する部分の温度は上昇し、ガスは原始太陽系の外側に追いやられる。このようにして内側惑星はガスのない高温の下で生成し、外側惑星はガスの多い低温で生成したので、内側惑星は揮発性物質に乏
しく、外側惑星はガスと揮発性物質に富む。このように現代の太陽系生成論により、内側と外側惑星の組成と構造の差などについて説明することができる。火星と木星の間にある小惑星帯は惑星生成の過程で生まれた原
始惑星、または原始惑星になり切れないもの、または原始惑星が破壊された様々な段階のものであり、原始太陽系生成の諸段階の残存物であると考えられる。それ故小惑星帯から飛来したと考えられる隕石は太陽系生成の初期の諸段階の残存物であり、太陽系生成過程の化石であると見做すことができる。隕石は小惑星帯から飛来するものばかりでなく、月からのものもある。最近火星から飛来してきた火星隕石と考えられるものが20個あまり発見された。
このようにカントにより提唱された
太陽系生成の星雲説は現代に復活し、現在太陽系生成の諸段階に関する物理的に詳細な研究が進行しつつある。
大学教授の盛装して講議するカントの立像※本稿に掲載の写真は全て著者の撮影したものである。
大理石のカントの頭部の像

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ドイツの切手に現れた科学者、技術者達（10）イマニュエル・カント
東ドイツが1974年に発行した 有名人
切手5枚の内の1
枚、カント。

カントの誕生200年記念切手
1974年。
西ドイツが発行。

カリーニンググラード（ケーニ
ヒスベルグ）にあるカントの墓碑. 有名な碑文が刻まれている。
「それを思うことが、たび重なれば重なるほど、また長ければ長いほど、ますます新たな、かつますます強い感
歎と崇敬の念とをもって、心をみたすものが二つある。わが上なる星空と、わが内なる道徳律とである。」

カントの宇宙創造論は星雲説の最初のものであった。
星雲説はラプラスによって物理的に論ぜられたのでカント・ラプラスの星雲説と呼ばれる。

カントの規則正しい日常
生活はよく知られている。
散歩においても勿論そう
であった。

編

表紙写真
水芭蕉
（サトイモ科ミズバショウ属）
開花情報により、この季節の尾瀬の大変な混雑ぶりが名高いように、水芭蕉は高山植物の中で

集

後

記

草木が日々その緑を深めるこの季節。今年は、ことが多い。それゆえ多くの人達が、自然の科学

空梅雨が危ぶまれるが、この時期に降り注ぐ雨は、に畏敬の念をもって接し、これを解明する夢を追い

やはり自然の恵みには無くてはならない。山野の草続けているのだと思う。初夏の大地と雨と陽の恵み

最も親しまれているものの一つでしょう。これは木の姿、形、色、香り、そして食味などは、いにしを受けて、勢いよく成長する草木の中は、化学の福島県・駒止湿原での撮影ですが、仏炎苞（ぶつ

えから変わらず同じ趣を醸し出し、人々に和みを与

お手本の塊のようなもの、自然の不思議と脅威をえんほう・葉が変形した花びらに見える白いモ

え、また食を通じて健康にも深く関わってきた。いわ

感じつつ、また楽しい観察のし方があることでしょう。

ゆる天然物の化学、なかでも光合成は素晴らしいケミカルタイムズも、研究者のご支援を得て、そのよ営みである。環境に優しい最高の技術といえる。

うな夢を解きほぐす情報を一つでも多く読者にご紹これを極めるには、まだまだ自然の神様から教わる

介できればと願っています。

ノ）が一株から２つ出ているのは、他ではあまり見られない特異なものと聞きました。
（写真・文 北原）

C K

（古藤記）

〒103-0023 東京都中央区日本橋本町3丁目2番8号
電話（03）3279−1751 FAX（03）3279−5560
インターネットホームページ http://www.kanto.co.jp
編集責任者 古藤 薫
平成17年7月1日 発行