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免疫染色玉手箱
技術

成人および小児膜性腎症におけるM-type ホスホリパーゼ A2 受容体の免疫組織学的検出
東京女子医科大学腎臓病総合医療センター病理検査室
堀田 茂

はじめに膜性腎症は、糸球体基底膜上皮下に形成される免疫複合体により糸球体上皮障害が惹起される糸球体腎炎である。本邦においては、成人ネフローゼ症候群の原因では膜性腎症が一番多く約35％を占め、小児では少なく 1%~7%と報告されている。発症年齢は、成人では 40 歳以上、小児では 7 歳~12 歳が多い。
最近まで、特発性膜性腎症が膜性腎症全体の 70%~80%を占め、IgG のサブクラスでは IgG1・IgG4 が優位で、特に IgG4 が優位に沈着する事が知られていた（図 1）。残りの 20%~30%は続発性で、自己免疫疾患や感染症、薬剤性、悪性腫瘍に合併し、IgG のサブクラスでは IgG4 が優位に沈着する症例は少ない。小児の特発性膜性腎症では、IgG1・IgG3 が優位に沈着する症例が多い事が報告されている（図 3）。
2009 年に、成人の特発性膜性腎症の約 70%で、ヒト糸球体上皮細胞中に存在する M-type ホス
ホリパーゼ A2 受容体（PLA2R1）に対する自己抗体が血中に認められる事が Beck らにより報告された(1)。糸球体の免疫複合体中にも抗原として確認されることから、特発性膜性腎症の主要な抗原であると推定されている。また、血清中の抗 PLA2R1 自己抗体の大部分は、糸球体免疫沈着物中の PLA2R1 と優位な IgG4 と同様である事が報告されている(2)。腎生検のパラフィン標本を用いた免疫染色の検討で、PLA2R1 陽性特発性膜性腎症は、IgG4 抗体が優位であり(3)、小児腎では陽性率が低いことが報告されている(4)。
PLA2R1 は、分子量 185KD のⅠ型膜タンパク質で、糸球体上皮細胞、肺、好中球などに発現している。機能としては、不明な点が多いが、最近では細胞の老化や腫瘍化との関連性が報告されている。
最近、新たな抗原としてトロンボスポンジン 1 型ドメイン含有 7A(THSD7A)が同定された(5)。この抗原は、特発性膜性腎症の約 10％に認められると報告されている。
本邦でも、特発性膜性腎症に関する腎生検での免疫組織学的解析で、PLA2R1 は 52.7％、THSD7A は 9.1％で陽性が確認されている(6)。
我々は、現在凍結切片を用いた蛍光抗体法で、PLA2R1 および THSD7A の染色性を検討している。今回は、当施設における染色方法を紹介する。

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免疫染色玉手箱技術

染色方法
糸球体腎炎における免疫複合体の検出は、通常凍結切片を用いた蛍光抗体法で行われる。
PLA2R1 や THSD7A の検出も、凍結切片を用いた間接蛍光抗体法が、感度や特異性・検査の簡便性において最も優れた方法である（図 1,2,3）。また、PLA2R1 抗体は、メーカーやロットにより染色性に差があり、IgG との二重蛍光抗体法を用いることで、特異性が上り正確に確認する事ができる（図 4）。
蛍光抗体法用の組織に糸球体が入っていないときには、パラフィン切片による検出も可能である。
パラフィン切片を用いた PLA2R1 および THSD7A の検出は、蛍光抗体法および酵素抗体法どちらでも染色可能である（図 5,6）
。パラフィン切片では、熱による前処理が必要で多少煩雑であり、また IgG と PLA2R1 および THSD7A を二重染色することができないため、一次抗体の種類によっては注意を要する。常に、陽性および陰性のコントロール切片を同時に用いて染色することが重要である。
特発性膜性腎症と続発性膜性腎症の鑑別のために、PLA2R1 および THSD7A の免疫染色は必要不可欠である。今後は、PLA2R1 および THSD7A の血中抗体価の測定が一般的になると、腎生検前に特発性膜性腎症の診断や治療効果の予測が可能になり、免疫染色による診断は少なくなると思われる。

凍結標本による PLA2R 1 の蛍光染色
二重染色（間接蛍光抗体・直接蛍光抗体法）
腎生検組織として 2μm の新鮮凍結切片を用いた。
1 PBS

5分3回

2 一次抗体 抗ヒト PLA2R 1・THSD7A ウサギポリクローナル抗体

室温 1 時間

3 PBS

5分3回

4 二次抗体 Alexa Fluor488 標識抗ウサギ IgG ロバポリクローナル抗体

室温 1 時間

5 PBS

5分3回

6 正常ヤギ血清

室温 10 分

7 ローダミン標識抗ヒト IgG ヤギポリクローナル抗体

室温 1 時間

8 PBS

5分3回

9 封入、 蛍光顕微鏡にて観察し画像を保存
凍結標本による IgG サブクラスの蛍光染色
1 PBS

5分3回

2 FITC 標識抗ヒト IgG1～IgG4 ヒツジ IgG ポリクローナル抗体

室温 1 時間

3 PBS

5分3回4 封入、蛍光顕微鏡にて観察し画像を保存-2-

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図 1 成人特発性膜性腎症
PLA2R1 および THSD7A(Alexa Fluor488)と IgG(TRITC)を用いた二重染色
a,d: IgG(TRITC) b: PLA2R1 (Alexa Fluor488) c: Mage (a,b) e: THSD7A(AlexaFluor488) f: Mage (d,e)
糸球体基底膜上皮下に沿って IgG (a) および PLA2R1 (b) の細顆粒状沈着が認められ、同一部位に分布することが確認できる (c)。
糸球体基底膜上皮下に沿って IgG (d) の細顆粒状沈着が認められるが、THSD7A (e) は陰性である。
IgG サブクラス(FITC)直接蛍光抗体法
g: IgG1 h: IgG2 i: IgG3 j: IgG4
糸球体基底膜上皮下に沿って IgG1 と IgG4 の細顆粒状沈着が認められる。特に IgG4 が優位に陽性で IgG2 と IgG3 はほぼ陰性である。

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免疫染色玉手箱技術acb

図 2 成人特発性膜性腎症
THSD7A(Alexa Fluor488)と IgG(TRITC)を用いた二重染色
a: IgG(TRITC) b: THSD7A (Alexa Fluor488) c: Mage (a,b)
糸球体基底膜上皮下に沿って IgG (a) および THSD7A (b) の細顆粒状沈着が認められ、同一部位に分布することが確認できる (c)。

adcbefg

図 3 小児特発性膜性腎症
PLA2R1 (Alexa Fluor488)と IgG (TRITC)を用いた二重染色
a: IgG(TRITC) b: PLA2R1(Alexa Fluor488) c: Mage
糸球体基底膜上皮下に沿って IgG (a) の細顆粒状沈着が認められるが、PLA2R1 (b) は陰性である。
IgG サブクラス (FITC)直接蛍光抗体法
d: IgG1 e: IgG2 f: IgG3 g: IgG4
糸球体基底膜上皮下に沿って IgG1 と IgG3 の細顆粒状沈着が認められる。
IgG2 と IgG4 は、ほぼ陰性である。

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図4b
特発性膜性腎症
PLA2R1 抗体のロットによる染色性の差
PLA2R1 (Alexa Fluor488)と IgG (TRITC)を用いた二重染色a IgG と PLA2R1 が、糸球体基底膜上皮下の同一部位に細顆粒状の沈着を認める。
b PLA2R1 は、免疫複合体以外にも糸球体上皮細胞や尿細管上皮細胞にも軽度陽性である。IgG と PLA2R1 を二重染色をすることで、PLA2R1 は免疫複合体の同一部位に細顆粒状に陽性で、糸球体上皮や尿細管上皮との染色性を容易に鑑別する事ができる。

パラフィン標本による PLA2R 1 の蛍光染色
腎生検組織として 2～3μm のパラフィン切片を用いた。
1 脱パラフィン、水洗
2 pH6.0 クエン酸緩衝液

121℃ 10 分オートクレーブで前処理

3 PBS

5分3回

4 一次抗体抗ヒト PLA2R1 ウサギポリクローナル抗体

室温 1 時間

5 PBS

5分3回

6 二次抗体 AlexaFluor488 標識抗ウサギ IgG ロバポリクローナル抗体

室温 1 時間

7 PBS

5分3回

封入、蛍光顕微鏡にて観察し画像を保存-5-免疫染色玉手箱
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図5b

成人特発性膜性腎症
PLA2R1 (Alexa Fluor488 による間接蛍光抗体法)

パラフィン切片

糸球体基底膜上皮下に PLA2R1 の細顆粒状沈着を認める (a,b)。
PLA2R1 抗体のロットの違いにより、免疫複合体以外に糸球体上皮細胞や尿細管上皮細胞にも軽度陽性を認める (b)。

パラフィン標本による PLA2R 1 の酵素抗体法
腎生検組織として 2～3μm のパラフィン切片を用いた。
1 脱パラフィン、水洗
2 pH6.0 クエン酸緩衝液

121℃ 10 分オートクレーブで前処理

3 PBS

5分3回

4 一次抗体抗ヒト PLA2R1 ウサギポリクローナル抗体

室温 1 時間

5 PBS

5分3回

6 二次抗体 シンプルステイン MAX-PO(MULTI)（ニチレイバイオサイエンス社）
7 PBS

室温 30 分~1 時間
5分3回

8 DAB 発色、核染、封入-6-免疫染色玉手箱技術

図6

成人特発性膜性腎症
PLA2R1 (シンプルステイン MAX-PO による酵素抗体法)
糸球体基底膜上皮下に沿って PLA2R1 の細顆粒状沈着が認められる。

文献
1. Beck LH Jr, et.al: M-type phospholipase A2 receptor as target antigen in idiopathic
membranous nephropathy. N Engl J Med 2009 ; 361 : 11-21
2. Svobodova E, et.al: Kidney biopsy is a sensitive tool for retrospective diagnosis of
PLA2R-related membranous nephropathy. Nephrol Dial Transplant 2013; 28 : 1839-1844
3. Larsen CP, et.al: Determination of primary versus secondary membranous glomerulopathy
utilizing phospholipase A 2 receptor staining in renal biopsies. Mod Pathol 2013 ; 26 :709-715
4. Cossey LN, et.al:
Phospholipase A 2 receptor staining in pediatric idiopathic
membranous glomerulopathy. Pediatr Nephrol 2013 ; 28 : 2307-2311
5. Tomas NM, et.al: Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous
nephropathy. N Engl J Med 2014; 371:2277.
6. Iwakura T, et al： Prevalence of enhanced granular expression of thrombospondin type-1
domain-containing 7A in the glomeruli of Japanese patients with idiopathic membranous
nephropathy. PLoS One 2015; 10:e0138841-7-