血液、血清、血しょうからの DNA 抽出キット
アイソス

ピン

ISOSPIN Blood & Plasma DNA
マニュアル（第 3 版）

Code No. 312-08131

NIPPON GENE CO., LTD.

I 製品説明ISOSPIN Blood & Plasma DNA（アイソスピン ブラッド＆プラズマ DNA）は、血液、血清、血しょうから DNA を抽出するためのキットです。
本キットは、カオトロピックイオン存在下で DNA がシリカへ吸着する原理を応用しており、フェノールやクロロホルムなどの毒性有機溶媒を使用しません。使用するスピンカラムは、カラム容積を最大限確保しており、内封されたシリカゲル膜は、充分な DNA 吸着容量と高い溶出効率を確保しています。本キットを使用して得られた DNA はリアルタイム PCR などの各種分子生物学実験に使用することが可能です

II キット内容ISOSPIN Blood & Plasma DNA (Code No. 312-08131)

キット構成品

容量（50 回用）

保存温度

備考

BE Buffer15 ml × 1 本室温Proteinase K

1 ml × 1 本–20℃

BW1 Buffer

48 ml × 1 本室温

エタノール含有＊1BW2 Buffer

35 ml × 1 本室温

エタノール含有＊1Elution Buffer

14 ml × 1 本

室温Spin Column

50 本 × 1 袋

室温Collection Tube

50 本 × 2 袋

室温

組成：10 mM Tris-HCl (pH 9.0),
0.1 mM EDTA
上部パーツ：カラム
下部パーツ：Collection Tube

III 保存輸送・保管温度：

室温（到着後、Proteinase K は–20℃保存）＊1 BW1 Buffer および BW2 Buffer にはエタノールが含まれています。ご使用後は蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め、保管して下さい。

1

IV 使用上の注意・ 本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 製品安全データシート（SDS）は、ニッポンジーン Web サイト（www.nippongene.com）
よりご覧になれます。

V プロトコール＜キット以外に必要な器具、機器など＞
試薬： ・エタノール器

具： ・マイクロピペット
・ピペットチップ・1.5 ml マイクロチューブ

機

器： ・卓上遠心機（スピンダウン用）
・遠心分離機・ボルテックスミキサー
・ヒートブロック＜抽出プロトコールを始める前に＞□ 血液サンプルを室温（15℃～25℃）に戻す。
□ ヒートブロックを 56℃に加熱しておく。

2

＜抽出プロトコール＞①

1.5ml マイクロチューブに Proteinase K を 20μl 加える。

②

室温に戻した血液あるいは血しょう、血清サンプルを転倒混和にて撹拌し、200 ~ 250μl 加える。
注）サンプルが有核赤血球を含む血液（魚類、両生類、爬虫類、鳥類の血液）の場合、血液10μl に生理食塩水 190 μl を加えたものを抽出サンプルとする。
注）撹拌が不十分の場合、同一サンプルでも DNA の抽出量に差が生じる場合がある。
注）サンプルが 200μl 以下の場合、生理食塩水でサンプル量を 200μl に合わせる。
PBS など緩衝能のある Buffer を使用すると抽出効率が低下する。

サンプルと等量（200 ~ 250μl）の BE Buffer を加え、ボルテックスミキサ③ーで 15 秒間撹拌する。軽くスピンダウンする。
注）サンプルと BE Buffer が完全に混和するように撹拌する。
撹拌が不足している場合、抽出効率が低下する。
注）RNA フリーな DNA が必要な場合は BE Buffer を添加する前に、Ribonuclease (DNasefree) Glycerol Solution（Code No. 312-01931）を 20μl 添加する。

④

56℃で 10 分間保温する。

⑤

サンプルと等量（200 ~ 250μl）のエタノールを加える。ボルテックスで 15秒撹拌し、軽くスピンダウンする。
注）混合液とエタノールが完全に混和するように撹拌する。
撹拌が不足している場合、抽出効率が低下する。

↓
メンブレンに DNA を吸着させるため、混合液を全量 Spin Column に添加す⑥る。
注）血清、血しょうサンプルの場合、一つのカラムに複数の混合液を添加することができる。
だだし、混合液の添加回数が増えるとカラムが目詰まりする可能性がある。
通常の血しょうサンプルでは一つのカラムに 5 回まで混合液の添加が可能だが、目詰まりしやすい場合は混合液の添加回数を控えるようにする⑦

遠心（12,000×g、1 分間、室温）する。

⑧

ろ液を Collection Tube ごと廃棄し、カラムを新しい Collection Tube に装着する。
↓3

⑨

洗浄のため、750μl の BW1 Buffer を Spin Column に添加する。

⑩

遠心（12,000×g、1 分間、室温）する。

⑪ろ液を Collection Tube ごと廃棄し、カラムを新しい Collection Tube に装着する。
↓⑫

洗浄のため、500μl の BW2 Buffer を Spin Column に添加する。

⑬

遠心（12,000×g、5 分間、室温）する。

⑭

ろ液を Collection Tube ごと廃棄し、カラムを新しい 1.5ml マイクロチュー
ブに装着する。
注）ろ液が付着しないようにカラムを慎重に取り外し、新しいチューブへ装着する。
カラム本体にろ液が付着した場合はオプションプロトコールを行う。

↓※【オプションプロトコール】○Spin Column を空の状態のまま遠心（12,000×g、1 分間、室温）し、メンブレンを乾燥させる。
注）オプションプロトコールを行うことで BW2 Buffer に含まれるエタノールをより丁寧に取り除くことができる。

ろ液を 1.5ml マイクロチューブごと廃棄し、カラムを新しい 1.5ml マイク○ロチューブに装着する。
↓⑮

DNA を溶出させるため、20 ~ 200μl の Elution Buffer をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
注）Elution Buffer（10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 9.0）の代わりに Nuclease フリー水も溶出液として使用できる。回収した DNA 溶液を長期保存する場合は、Elution Buffer で溶出することを勧める。
注）Elution Buffer の量と DNA 濃度および回収量の関係は p.7 のデータを参照。

⑯

遠心（12,000×g、1 分間、室温）する。

⑰DNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される。

4

＜簡易プロトコール＞
ヒートブロックを 56℃に温めておく
血液あるいは血しょう、血清を室温に戻す
1.5 ml マイクロチューブに Proteinase K を 20μl 添加
血液あるいは血しょう、血清を転倒混和後、200～250μl 添加
サンプルと等量（200 ~ 250μl）の BE Buffer を添加
ボルテックスミキサーで 15 秒間撹拌
軽くスピンダウン56℃で 10 分間保温
サンプルと等量（200 ~ 250μl）のエタノールを添加
ボルテックスミキサーで 15 秒間撹拌
軽くスピンダウン
Spin Column に混合液を全量添加
遠心（12,000×g, 1 分間, 室温）
ろ液を Collection Tube ごと廃棄し、カラムを新しい Collection Tube に装着
750μl の BW1 Buffer を添加
遠心（12,000×g, 1 分間, 室温）
ろ液を Collection Tube ごと廃棄し、カラムを新しい Collection Tube に装着
500μl の BW2 Buffer を添加
遠心（12,000×g, 5 分間, 室温）
ろ液を Collection Tube ごと廃棄
Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す【オプション】
空の状態で遠心（12,000×g, 1 分間, 室温）
カラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブに装着
20 ~ 200μl の Elution Buffer をメンブレン中央に滴下
室温静置 3 分間
遠心（12,000×g, 1 分間, 室温）DNA 溶液5VI トラブルシューティングトラブル予想される原因

対 策

低収量

抽出液と血液の撹拌が不十分

BE Buffer と血液サンプルをボルテックスミキサーで 15 秒以上しっかり撹拌する。

混合液とエタノールの撹拌が不十分

混合液とエタノールをボルテックスミキサーにて 15 秒撹拌した後、カラムにアプライする。
100 l ~ 200 l の Elution Buffer で溶出する

溶出の効率が悪いと溶出の効率が最も良くなる。ただし溶出される DNA の濃度は低くなる。
Elution Buffer ではなく蒸留水で溶蒸留水の pH が低い場合 DNA の回収量が出した。

少なくなる。蒸留水で溶出する場合は pHを確認し pH 7.0 以下のものは使用しない。

一回目のカラサンプルの溶解が不十分

抽出液と血液をボルテックスミキサーで15 秒以上しっかり撹拌する。

ムの洗浄後もメンブレンがプロトコール⑫を行う前に、BW1 Bufferカラムの洗浄が不十分着色するを使用したカラムの洗浄（プロトコール⑧~ ⑪）をもう一度行う。

得られた DNA

20 l ~ 50 l の Elution Buffer で溶出すると溶出量が多すぎるDNA 濃度が高くなる。ただし DNA の回収の濃度が低い量は少なくなる。
抽出した DNA

溶出した DNA 溶液中にエタノール

BW2 Buffer で洗浄した後、カラムにろ液がを用いたダウが残留している。

付着しない様に慎重に取り外し、新しいチンストリーム

ューブへ装着する。カラムにろ液が付着し実験がうまくた場合はオプションプロトコールを行いいかないカラムからろ液を取り除く。

6VII データ
溶出液量による DNA 回収量と濃度の変動
100μl 溶出時の回収量および濃度を100 とした場合

白血球数と DNA 回収量の関係
サンプル量：200μl
溶出 Buffer 量：100μl

VIII 関連製品
Code No.

製品名

包装単位

312-01931

Ribonuclease (DNase free ) Glycerol Solution

1 ml

319-08141
315-08143

Collection Tube

100 回用500 回用株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課 TEL 076-451-6548 URL https://www.nippongene.com/
・お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。
・マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。
ISOSPIN Blood & Plasma DNA マニュアル（第 3 版）201501-1703-20107