多光子イメージング／神経科学

超高速レーザがさらに掘り下げる
神経科学
ジュリアン・クライン
赤外線におけるレーザパフォーマンスが大きく向上しており、次世代型の高ピークパワー超高速レーザが研究イノベーションの新たな波を巻き起こしている。遺伝的にコードされるカルシウムインジケータの継続的な開発と合わせ、2 光子または 3 光子顕微鏡法を用いて、神経科学はこれまでにない深さに到達している。
神経科学は、脳の構造と機能をさらである。なぜなら、非侵襲的であり、の蛍光タンパク質同様、GECI は IR 内に解明しようとしている。技術開発に脳の構造と、影響を受けやすい脳組織のさまざまな波長で励起する。たとえよって感受性と選択性が向上し、よりの活性の両方を観察できるからだ。赤ば、
GCaMPファミリは920〜950nmで、広大な脳内の神経ネットワークをより外線（ IR ）波長域の照明は優しいため、赤方偏移種（たとえば jRCaMP1a,b ）は深いところまで観察できるようにな観察領域にダメージや摂動を与えるこ1000 〜 1100nm で励起する（ 1 ）。

り、ミニブレイン（脳の構造と機能をとなく、長期間の連続イメージングが似せた細胞集団）、ゼブラフィッシュ、可能である。

2 光子・3 光子イメージング

げっ歯類を含む幅広いモデルの研究がさらに現在では、ウイルス感染や遺2 光子励起蛍光顕微鏡法（ 2PM ）は、加速している。さらに、米コーネル大

伝子発現によって、主要なモデル動物

特に 10 〜 100 μの深さにおける in vivo

（ Cornell University ）のクリス・シュ氏

で多様な蛍光タンパク質を発現でき（生体内）の神経活性のビデオレートイ（ Chris Xu ）のような研究者は、イメる。特に神経活性の観察目的には、科メージングや直接観察によく適する。

ージングエンベロープを推し進めたい

学者は遺伝的にコードされたカルシウ

2PM で選ばれる励起源は、一般的にとする。たとえば、マウスにおいて、ムインジケータ（ GECI ）を利用する。

高繰り返し率のフェムト秒レーザであ

複雑な情報処理と関連する皮質や海馬

GECI は、神経活性のプロキシである

り、生きた組織内で IR 侵入窓をカバを観察するといったことだ。

カルシウム存在下で、光学的励起に反ーできる調整可能な高スペクトル出力多光子励起蛍光顕微鏡法（ MPM ）応して蛍光を発する活性感受的な指標をもつ。900 〜 1300nm 間 の波 長 は、は、このような研究では一般的なものである。多光子顕微鏡法で使われる他主要な蛍光タンパク質に適した励起や、IR における散乱抑制に特に重要で

G P
GCaMPP

図 1 スペクトラ・フィジ
ッ ク ス 社 の InSight X3の ピ ー ク パ ワ ー は、900nm 以上の波長で古いチタンサファイアのピークパワー 以 上 であり、invivo イメージングにおける緑、赤色蛍光タンパク質や GECI が 2PM で利用できる。

PCaMP

ピークパワー aInSight X3
InSight X3
ピークパワー

チタンサファイアある。
米 ス ペ ク ト ラ・ フ ィ ジ ッ ク ス 社（ Spectra-Physics ）の InSight X3 のような、新たに導入されたレーザプラットフォームでは、このレンジで高ピークパワーのパフォーマンスが可能だ。
近年のパワー増強により、このプラットフォームは、900nm 以上の波長では古いチタンサファイアレーザより性能がよく、緑、黄、赤色蛍光タンパク質

00

3600

9001000 1100
波長 nm2017.7 Laser Focus World Japan

1200

1300の 2 光子励起に対する有用性が証明されている（図 1 ）。

2PM で到達可能な最高侵入度はバある。これにより、損傷、特に平均パックグラウンドノイズによって決まワー超過と関連する熱、光毒性、光損り、生きた組織内では通常 1mm が限傷の影響を受けやすい構造のイメージ界である。これは、多くのマウスの皮ングの適合性を確保する（ 3 ）。

質イメージングには適するが、1mm 以下の深さにある海馬などの皮質下構造高性能のレーザツールをイメージングできない。侵入度をよファイバまたはダイオード励起固体り拡張するために、神経科学者は 3 光（ DPSS ）アーキテクチュアをベースに子励起蛍光顕微鏡法（ 3PM ）に切り替する 1 μのイッテルビウム超高速増幅える。その理由を簡単に説明しよう。

器は、これらのニーズをサポートする

3PM 技術は、蛍光タンパク質が IRのによく適する。ロバストでコンパク

光子 3 つを同時に吸光するという非線トであり、使いやすくするために全自形プロセスに依存する。このような励動化されている。再生増幅スキームに

起には、狭い焦点ボリュームのみで実より、アプリケーション要求に正確に現しうる高い時空間的な光子密度が要一致する、さまざまな繰り返し率とパ求される。この空間的に限定される光ルスエネルギーで操作できる。3PM の学効果によって、2PM よりバックグラ場合、1MHz の繰り返し率と数十μ Jウンドレベルを数オーダー低くできる。のパルスエネルギーが一般的である。

IR レーザの励起波長は、対象となる主イッテルビウム超高速レーザと増幅器

要な蛍光タンパク質や GECI の 3 光子の重要な制限は、スペクトル選択性が吸光窓に合わせ、比較的吸水率の低いないことであり、1 μ m 励起のアプリスペクトル窓に置く必要がある。リン

ケーションに適合する直接使用に限定ヤン・シー氏（ Lingyan Shi ）と協働者される。3PM で必要とされる 1.3μmが証明したように、より長い IR 波長や 1.7μm の波長とするために、共線・を操作することで、光学散乱をさらに非線形ハイブリッドな光パラメトリッ減少させ、侵入度を拡張できる。こク増幅器（ OPA ）が、イッテルビウムれらの理由により、3PM における最適増幅器からの 1μm の放出波長の第二な励起波長は、緑色タンパク質では高調波と合わせてポンプすることが考

1.3μm、 赤 色タンパク質 では 1.7μm

えられる（図 2 ）。

（2）となる。

このタイプのハイブリッド OPA を光3 光子吸光プロセスは低確率のイベ源として使用する 3PM の設定では、高ントであり、蛍光シグナルが発生するパワーのイッテルビウム超高速増幅器ためには超高ピークパワーを必要とす（スペクトラ・フィジックス社の 30W のる。2PM と比べると、瞬間的なピークSpirit レーザなど）を、最初に 520nm にパワーと光子密度は数オーダー高くな周波数を倍増させる。残った 1040nm

ければならず、一般的には 1 〜 100MWの一部は、適切な媒体に照射されて幅範囲だ。このピークパワーの増加は、広いスーパーコンティウムを発生する。

パルスエネルギーをマイクロジュールレ

これは、光パラメトリック増幅プロセベルにまで上げ、一時的なパルス幅をスのシードとして作用する。増幅は、100fs 以下にまで下げるときに最大に達2 種類の逐次段階によって実現する。

するが、操作するときは適度な平均パ

第 1 段階で使われる非共線スキームでワーレベル（通常は数十〜数百ｍ W ）では、広いスペクトル波長域が発生し、Laser Focus World Japan 2017.7

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650 900nm

520nm ポン 光

10 0nm

シグ ル光
リ ム器

SHG
520nm

520nm

1200 2500nm
色光
シードOPAOPA

アイドラー光バルク器

図 2 ハイブリッド光パラメトリック増幅器（ OPA ）の一般的なアーキテクチュアは、高パワーのイッテルビウムベースの超高速増幅器によって励起される。コンパクト、ロバスト、フレキシブルであり、3PM の要求を完全にサポートする。

やがて時間的に短パルスに圧縮されく、時間的に分光される。プリズムベを光学的に記録したことを明らかにしる。第 2 の共線段階では、シグナル光ースのスキーム内のシグナル光と、バた（ 4 ）。
「かつては不可能だったが、今とアイドラー光の両方の波長に広がルクスキーム内のアイドラー光の両方

では無傷のマウス内で活動中の神経細り、広く調整可能な出力をもたらす。の出力ビームは最後に再圧縮され、極胞を一細胞解像度で見ることができ両方の段階で、高パワーの 520nm ビめて短いパルス持続時間（ 100fs 未満）る。これは、神経科学の研究に対してームをポンプする。シグナル光とアイと超高ピークパワー（ 20MW 以上）に到新たな可能性を開くものだ」とシュ氏

ドラー光のビームはスペクトル的に広達する。特に、アイドラー光は 20MWは言う。

L5L6以上のピークパワーで 1200 〜 2500nm研究（図 3 ）は、特注の 3 光子顕微鏡のスペクトル域をカバーする。この値と、シングルボックスの全自動 1μmは、3 光子イメージングにおけるピーク超高速増幅器（ Spirit ）によってポンプパワーのいき値を超える。

された非共線光パラメトリック増幅器

in vivo の海馬に届く（ Spirit-NOPA ）を用いて実施された。
「 Spirit-NOPA システムなど、新たにシュ 氏 とカーネル大 の協 働 者 は、発売された商業レーザは、今では1.3μmEC

3PM 開発と、脳の深部の機能的イメと1.7μm に調整可能な出力を簡単に実ージング利用のパイオニアである。最行でき、3 光子イメージングを実用的SP

近の研究では、同氏のチームは、無傷なものにしている」と同氏は述べる。のマウス脳内で 1mm より深いところ「これらのレーザは扱いやすく、既存にある海馬の神経細胞からの自然活動の多光子顕微鏡に組込みやすい」。

図 3 マウスの皮質（ L5 と L6 ）と海馬（ SP ）において、遺伝的にコードされたカルシウムインジケータ（ GECI ）である GcaMP6s でラベルされた神経細胞が、3PM によって緑で、第三高調波（ THG ）によって赤で描かれている。海馬（ SP ）の神経細胞の自然活動が、脳表面から 1mm 以下の深いところで記録された（ 4 ）。（提供：カーネル大、シュ氏）

参考文献（ 1 ）H. Dana et al., eLife, doi:10.7554/eLife.12727 (2016).
（ 2 ）L. Shi et al., J. Biophoton., 9, 1-2, 38-43 (2016); doi:10.1002/jbio.201500192.
（ 3 ）J. Klein, "Ultrahigh peak power femtosecond lasers advance bioimaging," BioOptics World,8, 9, 72-77 (Sept. 2015).
（ 4 ）D. Ouzounov et al., Nat. Methods, doi:10.1038/nmeth.4183 (2017).
著者紹介
ジュリアン・ クラインは米スペクトラ・ フィジックス／ MKS インストゥルメント社（ MKSInstruments ）の製品マーケティングのシニアマネージャー。

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