京都府保環研年報第68号（2023）

魚類加工食品中に含まれるヒスタミンをはじめとする７種アミン類のLC MS/MS分析吉井要

中村貴憲

鳥居潤

宇野玲子

土田貴正

Quantitative Determination of Seven Nonvolatile Amines including
Histamine in Processed Fish Foods by LC MS/MS
Kaname YOSHII Takanori NAKAMURA Jun TORII
Reiko UNO Takamasa TSUCHIDA

要旨LC MS/MSによる魚類加工食品中のアミン類の一斉分析法を確立した。魚類加工食品として、オイルサーディン、さばのへしこ及びキハダマグロの刺身を使用し、測定対象のアミン類は、ヒスタミン、アグマチン、カダべリン、フェネチルアミン、プトレシン、トリプタミン、チラミンの７種類とした。試料からの測定成分の抽出は、５%トリクロロ酢酸水溶液を使用した。抽出液の精製は、逆相固相カラムに夾雑物を保持させる方法で検討し、その結果、充填剤にオクチル基を有するInertSep C8が最も良好であった。定量は、精製後の溶液を測定時の移動相と同組成の溶媒で希釈したものをLC MS/MSにより分析し、絶対検量線法で行った。測定法の妥当性は、「食品に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドライン」（厚生労働省通知. 平成22年12月24日. 食安発1224第１号、以下「妥当性評価ガイドライン」という。
）に従い、１日２併行の標準品添加回収試験を５日間実施して評価した。妥当性評価の結果、選択性、真度、併行精度及び室内精度について、妥当性評価ガイドラインの目標値を満たした。

キーワード：ヒスタミン、不揮発性腐敗アミン類、魚類加工食品、高速液体クロマトグラフィー ‐ タンデム質量分析計
K e y w o r d ：Histamine, Nonvolatile amines, Processed ﬁsh foods, LC‑MS/MS

象に、食品中のヒスタミン濃度の基準値を腐敗基準としてはじめに100 mg/kg、衛生及び取扱基準として200 mg/kgを設定しているが、日本国内においては、食品中のヒスタミン濃度に関ヒスタミンは、食品に含まれるアミノ酸の一種であるヒスする規制は設けられていない。魚類が腐敗する際にタンパクチジンがヒスタミン産生菌の働きで脱炭酸により生成するア質等の分解を経て生成するアミン類は、ヒスタミンの他にもミンである。高濃度のヒスタミンを含む食品、特に魚類及び多数存在し、これらを不揮発性腐敗アミン類（以下、アミンその加工食品を喫食すると、顔面の紅潮、じんましん、発熱、類）という。ヒスタミン以外のアミン類は国際的にみても基嘔吐、頭痛などのアレルギー症状に似た症状を呈することが準値設定等がされていない状況である。ヒスタミン食中毒のある。このヒスタミン食中毒は、半日程度で回復することがメカニズムは依然として不明な点が多いが、ヒスタミン以外ほとんどで、重症化することは少ない。厚生労働省ホームのアミン類が、ヒスタミン食中毒の影響因子である可能性をページ「ヒスタミンによる食中毒について」（https://www.

指摘する報告1,2） もあり、ヒスタミンだけでなく、他のアミmhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/0000130677.html） にン類の食品中濃度を調べることには意義がある。

よると、平成25年から令和４年までの10年間に日本国内で京都府では、ヒスタミン食中毒予防の観点から京都府食品発生したヒスタミン食中毒事件数は年間平均9.7件であるが、衛生監視指導計画に基づく流通食品の収去検査を令和４年度

同患者数の年間平均は204.4人であり、保育園や学校が関係から実施している。収去する流通食品は、京都府内で製造さする大規模な食中毒事例が多く見られる。食品中のヒスタミれた魚類加工食品を主なターゲットとしている。当研究所でンは調理工程での加熱に対して安定であり、調理工程で除去は、これに向けて令和３年度からヒスタミン分析法の検討をすることができないため、ヒスタミン食中毒の予防には、ヒ開始した。今回、分析法確立時に得られた知見について報告

スタミン産生菌の働きを抑えてヒスタミンの生成反応を進行する。なお、収去検査の検査成分はヒスタミンであるが、前させないことが重要であるので、原材料である魚の保管、製述のとおり、ヒスタミン食中毒とほかのアミン類との関連を造工程、加工食品の保存及び喫食までの一貫した温度管理が指摘する報告等も散見されることから、測定対象化合物はヒ求められる。食品の安全性や品質に関する国際的な基準を定スタミンに加えてアグマチン、カダべリン、フェネチルアミ

めるコーデックス規格は、ヒスチジン含有量が高い魚種を対ン、プトレシン、トリプタミン及びチラミンの合計７種類とした。

（令和６年１月４日受理）−1−京都府保環研年報第68号（2023）

アミン類の分析法は、食品衛生検査指針には、固相カラム

ニルエチルアミン及びトリプタミンは、富士フィルム和光純による精製ののちにダンシルクロライドを用いて誘導体化し、薬（株）製、アグマチン硫酸塩は東京化成（株）製を使用した。

蛍光検出器付きHPLCで測定する方法が掲載されている3）。近アセトニトリル、メタノール、ギ酸、1 mol/Lギ酸アンモ

年は、LC‑MS/MSを用いて、誘導体化せずに直接アミン類ニウム水溶液、トリクロロ酢酸は富士フィルム和光純薬（株）を分析する方法が数多く報告されており、LC‑MS/MSは、製を使用した。水はメルクミリポア社製Milli‑Q Direct16にHPLCと比べて非常に高感度で分析ができることから、煩雑より精製して使用した。

な精製操作を行わず、溶媒による希釈のみを前処理とする分析を可能としている4,5）。しかし、夾雑物が特に多い加工食品

３．試液の調製
5％（w/v）トリクロロ酢酸水溶液は、50.0 gのトリクロを分析するにあたっては、精製工程が必要と考えられるケー6）スが多く、弱陽イオン交換カラムで精製する方法 、逆相系ロ酢酸を1000 mLに定容して調製した。0.1%（w/v）ギ酸

ポリマーカラムと陽イオン交換カラムを組み合わせて精製す水溶液は、1.0 gのギ酸を1000 mLに定容して調製した。107）

る方法 などが報告されている。これらの方法は、誘導体化

mmol/Lギ酸アンモニウム及び0.1％（w/v）ギ酸含有水溶液を要しないものの、固相カラムに通液するにあたってpH調は、1 mol/Lギ酸アンモニウム水溶液10 mLを0.1%（w/v）

整や緩衝溶液の使用等を必要とし、工数が多くなっている。

ギ酸水溶液で1000 mLに定容して調製した。希釈用溶液は、我々は簡便かつマトリックスの影響を抑える前処理方法を検10 mmol/Lギ酸アンモニウム及び0.1％（w/v）ギ酸含有水溶討したので報告する。

液400 mLとアセトニトリル600 mLを混合して調製した。検量線の作成に使用する混合標準溶液は、各アミン類の標準品材料及び方法をそれぞれ0.1 mol/L塩酸を用いて5 µg/mLの標準原液を調製した。それらを混合し、希釈用溶液で段階的に希釈して0.1１．試料

ng/mL〜20 ng/mLの範囲で調製した。

試料は、市販のオイルサーディンの缶詰、さばのへしこ及4.

びキハダマグロの刺身を使用した。「へしこ」は、北陸地方

機器及び測定条件

周辺の日本海沿岸地域の伝統料理であり、さば等の赤身魚を高速液体クロマトグラフシステムは、島津製作所（株）製

塩漬けにした後、米糠に長期間漬け込み熟成させた保存食でNexera X2、タンデム質量分析計はAB Sciex社製QTRAP4500ある。さばのへしこは骨及びヒレを取り除き、表面に付着しを使用した。分析カラムは、ペンタフルオロフェニル（PFP）た麹等の添加物を拭き取り、オイルサーディンはオイルを切

カラムSUPELCO社製Discovery HS 5‑3（粒径3.0 µm、内径2.1り、固形部分をフードプロセッサーで均一化し、冷凍と融解mm、長さ100 mm）を使用した。各アミンのMRM条件は表を繰り返さないように5 gずつ小分けにして冷凍保存したも１に、LC及びMS/MSの測定条件は表２に示した。MRM条件のを検査に供した。

は、QTRAP4500オペレーションソフトのインフュージョン分析により最適化した。MS/MS測定条件も、同ソフトのフロー２．試薬等インジェクション方式による自動最適化により決定した。LC

ヒスタミン二塩酸塩標準品、チラミン塩酸塩標準品、プト

測定条件は、PFPカラムを用いて水産物加工品中の４種のアミン類を分析した藤井ら6）の報告を参考に設定した。

レシン二塩酸塩標準品、カダべリン二塩酸塩標準品、2‑フェ表１．各アミン類のMRM条件
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'3ʁυέϧηνϨϱήుҒɻɻ&(ʁαϨζϥϱΦϋϩάʖɻ−2−京都府保環研年報第68号（2023）

表２．LC及びMS/MSの測定条件/&଎ఈড়݇

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΢ΨϱηϕϪʖుѻ9Φϱφϧϱηుѻ9５．試験溶液の調製方法
試験溶液の調製方法を図１に示す。試料の前処理工程の概略は以下の通りである。すなわち、試料に除タンパク作用の‫ۋ‬ҲԿࢾྋJあるトリクロロ酢酸水溶液を加え、セラミックホモジナイ

ɻφϨέϫϫਥ࢐P/ザー（Agilent Technologies社製）を入れて振とうした。そɻιϧϝρέϙϠζψ΢δʖ‫ݺ‬の後、遠心分離し、ろ紙（ADVANTEC No.5C 110mm）を৾ͳ͑෾ؔ用いて上清と沈殿を分離した。沈殿に対して同抽出操作を２ԗৼ෾཯USP෾ؔˈ

度繰り返し、上清３回分を合わせてトリクロロ酢酸水溶液で৏ੜ

50 mLに定容して抽出液とした。抽出液を逆相固相カラムで௞ాɻφϨέϫϫਥ࢐P/精製した後、希釈用溶液で希釈して試験溶液とした。

৾ͳ͑෾ؔ

なお、測定対象のアミン類は、ガラス器具に吸着しやすいԗৼ෾཯USP෾ؔˈ

ため、各種標準溶液の調製から試料の前処理及び測定試料を৏ੜ封入するバイアルに至るまで、全ての器具についてポリプロ௞ాɻφϨέϫϫਥ࢐P/ピレン（PP）製又はポリメチルペンテン（PMP）製の樹脂

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製品を使用した。

ԗৼ෾཯USP෾ؔˈ
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６．標準品添加回収試験の方法
添加試料は、試料5 gにコーデックス規格の腐敗基準に従௞ాʤഉ‫ؼ‬ʥԗৼ෾཯ͪ͢৏ੜյ෾Νյ໪͖Δॳ൬ͶࣙષΘգ

い試料中濃度が100 mg/kgとなるように標準品を添加して作ˍφϨέϫϫਥ࢐ਭ༻ӹͲ̾/Ͷఈ༲

製した。試料及び添加試料から抽出・精製等を経て作製した試験溶液をLC MS/MS測定し、絶対検量線法で定量した。

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ない試料（ブランク試料）に試験対象の農薬等を添加した試௔९ਭ̾/Ν௪ӹ͢ͱસྖյफ
௔९ਭͲP/Ͷఈ༲

料（添加試料）」を用いて標準品添加回収試験を行うこととしているが、本分析法の測定対象であるアミン類は生体内の

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化学反応で生成するため、完全にこれらのアミン類を含まな੠੣ӹ ࢾ‫༻ݩ‬ӹ/&0606

いブランク試料を準備するのは困難である。そのため、ブラ結果から差し引き、標準品添加回収率を算出した。

பड़ӹɻαϱυΡεϥωϱήɻϟνόʖϩP/ɼਭP/

妥当性評価ガイドラインは、「試験対象である農薬等を含まンク試料からアミン類を検出した場合には、添加試料の測定

図１．LC MS/MSによる７種アミン類の定量分析に供する魚類加工食品の抽出及び精製工程−3−京都府保環研年報第68号（2023）

７．抽出液の精製法の検討

結果及び考察7−1．抽出液に含まれる夾雑成分によるマトリックス効果の確認

１．測定条件の検討

オイルサーディン、さばのへしこ及びキハダマグロの刺身

表１のとおり、MRM条件は、プトレシン以外のアミン類の添加試料をそれぞれ図１に従って処理し、得られた抽出液は「定量イオン」と「確認イオン」の２種類のトランジショを25 µL分取し、希釈用溶液で25 mLに定容したものを直接ンを設定することができた。プトレシンは、低分子量のため測定し、標準品添加回収率を計算した。この実験はn = 2でプロトン付加体と考えられるm/z 89.1のプリカーサーイオン２日間実施し、回収率の平均値を算出した。と同イオンから中性のアンモニア分子が脱離したものに相当するm/z 72.0のプロダクトイオンの組み合わせからなる一つ

7−2．固相カラムを用いた精製法の検討のトランジションのみを設定するに留まった。

後述するように、上述の抽出液を溶媒で希釈するのみの前ヒスタミン等の高極性塩基性化合物を誘導体化せずにLC処理では、マトリックスの影響を十分除去できなかったため、で分離する方法として、順相クロマトグラフィーの一種であ抽出液を固相カラムを用いて精製した。固相カラムによる精る親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）を用いる方

製は、測定成分を保持させ共存している夾雑成分を分離・洗法が一般的である。逆相クロマトグラフィーにおいては、汎浄する手法（保持法）と、測定成分を素通りさせ夾雑成分を用性の高いオクタデシル（C18）カラムは高極性塩基性化合固相に保持させる手法（素通り法）がある。本検討は、固相物の保持が困難とされているが、ペンタフルオロフェニルカラム通液で精製と同時に濃度を希釈することができる素通（PFP）カラムはフェニル基に電気陰性度が高いフッ素原子り法で検討した。また、前処理操作をより簡便にするため、が結合していることによる水素結合性及び双極子相互作用等抽出液にpH調整等を施さずに直接固相カラムに通液するが、高極性塩基性化合物の保持を可能としている。藤井ら6）

方法で検討した。固相カラムは、Waters社製Oasis PRiME

は、PFPカラムを用いて、ヒスタミン、カダべリン、プトレHLB（200 mg）、ジーエルサイエンス（株）製InertSep PLS-2

シン及びチラミンの４種類のアミンを分析したが、我々は、（270 mg）、InertSep C18 FF（500 mg）、InertSep C8（200同条件でアグマチン、フェネチルアミン及びトリプタミンにmg）及びInertSep CH（200 mg）の５種類を使用した。使ついても分離、ピーク形状ともに良好であることを確認した。

用した５種の逆相固相カラムは、PLS-2が最も充填剤の疎水性が高く、次いでHLB、C18、C8、CHの順である。PLS-2は２．前処理工程の検討

スチレンジビニルベンゼン共重合体（SDB）を、HLBはジ

魚類加工食品は、魚由来のたんぱく質や油脂だけでなく、ビニルベンゼンとN−ビニルピロリドンとの共重合体を充填製造時に添加する塩、植物油、調味料等、LC MS/MS分析剤とするカラムである。C18及びC8はそれぞれオクタデシルにおいてマトリックス効果をもたらす物質及びカラムの劣化基及びオクチル基を有するシリカゲルベースのカラムであ等が懸念される物質を多量に含む。また、抽出補助剤に使用

り、CHは官能基としてシクロヘキシル基を有する特殊なもしたトリクロロ酢酸は強酸であり、高濃度ではLCに導入でので、エチル基（C2）固相と同程度の極性をもつ。図１のきない。西名ら4）は、水産物及び水産物加工食品をトリクロ前処理フローにより、オイルサーディンを試料として５種ロ酢酸水溶液及び精製水で抽出した後、精製水で希釈する方の固相カラムを用いて標準品添加回収試験をn = 1で実施し、法でLC MS/MSによる８種のアミン類の迅速一斉分析法を標準品添加回収率を比較した。

報告した。本検討では、抽出液を希釈用溶液で1000倍に希釈して測定したときのマトリックス効果の影響を確認した。結果を図２に示す。標準品添加回収率は、すべての試料で７種ϐηνϝϱΠήϜοϱΩξ΄ϨϱϓΥϋοϩΠϝϱϕφϪεϱφϨϕνϝϱ

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図２．３種類の魚類加工食品を試料とした７種アミン類の標準品添加回収試験において抽出液に溶媒希釈のみの前処理を施した場合の添加回収率−4−京都府保環研年報

第68号（2023）

類のアミン類について100％を超える結果となり、特に、オ本検討では固相カラムを素通り法で検討したため、回収率がイルサーディンのチラミン、さばのへしこのプトレシン及び低下したアミンは、固相に吸着し、脱離し難かったものと考

マグロのヒスタミン、カダべリン、フェネチルアミン、プトえられる。PLS‑2及びHLBにおいて共通して回収率が低かっ

レシン、チラミンについては120％を超える回収率となった。

た３種のアミンはいずれもベンゼン環を有し、固相のベンゼ

この結果から、マトリックス成分によるイオン化促進が示唆ン環と強い親和性があったものと考えられる。固相にベンされ、本検討の試料の種類及び希釈倍率において、溶媒希釈ゼン環を含まないC18カラムの結果は、PLS‑2及びHLBと比のみではマトリックス効果を低減できないと考え、次に、固べて改善したがトリプタミンの65.3％が70％を下回る結果と相カラムによる精製を検討した。

なった。検討した充填剤の中で最も疎水性が低いCHは、トリプタミンを除くアミン類については回収率が78％〜91％と３．固相カラムによる精製条件の検討良好であったが、トリプタミンの回収率が10.3％と70％を大結果を図３に示す。いずれのカラムの結果も、標準品添加きく下回った。この原因は定かではないが、CHカラムの充回収率が100％以下に収まったことから、逆相固相カラムで填剤とトリプタミンの分子構造との間に特異的な相互作用が精製することにより、図２で見られたマトリックス効果（イ生じた結果であると考えられる。最も良好な結果は、C8カオン化促進）は低減することができたと考えられる。個別

ラムで得られ、７種のアミン類において約78％〜96％の標準の結果については以下のとおり考察する。PLS‑2はフェネチ品添加回収率であった。C8カラムは、充填剤にベンゼン環ルアミン及びトリプタミンが標準品添加回収率０%、チラミを含まずC18よりも疎水性が低いため、測定成分の固相からンが63%となり、３種のアミンが妥当性評価ガイドラインのの脱離性が向上したことで良好な結果が得られたと考える。

目標値である70〜120％を逸脱した。HLBはトリプタミンがこの結果から、精製に用いる固相カラムはInertSep C8を採0％、フェネチルアミンが50.7％、チラミンが68.6%であった。

用した。

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InertSepC18FFϕφϪεϱφϨϕνϝϱ

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InertSepC8

InertSepCH

図３．オイルサーディンを試料とした７種アミン類の標準品添加回収試験における固相カラムの種類ごとの添加回収率
なり、すべての試料及び項目について妥当性評価ガイドライ４．妥当性評価試験
妥当性評価ガイドラインに従い、１日２併行の標準品添加ンの目標値を満たした。定量下限値は、検量線試料の測定結回収試験を５日間実施して評価した。結果を表３に示す。い果からS/N≧10を満たす濃度に設定することとし、ヒスタミずれの試料においても、７種のアミン類において、定量を妨ン、カダべリン、フェネチルアミン、トリプタミン及びチラ害するピークは確認されず選択性は良好であった。真度はミンは試料中1 mg/kg、アグマチン及びプトレシンは試料中73.9〜98.3%、併行精度は1.5〜6.4%、室内精度は2.3〜8.8%と2 mg/kgとなった。

表３．妥当性評価試験の結果
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京都府保環研年報第68号（2023）

５）茶屋真弓，穂積和佳，岩元由佳，原口卓也，吉田純一．

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