CKANTO CHEMICAL CO., INC.

2015 No.4（通巻238号）

ISSN  0285-2446

海洋微細藻類の光合成・物質生産と地球環境

白岩

善博

2

微生物の産生する高機能性バイオポリマーの産業応用

倉根隆一郎

10

流体物理洗浄（3）ジェット洗浄、ブラシ洗浄、その他
1細胞ゲノミックスの為の試薬と環境
DNA-free phi29 DNAポリメラーゼの開発
最近のトピックス

高橋

宏和


真田

俊之

渡部

正夫

16

岡村

好子

小堀

俊郎

22
28

海洋微細藻類の光合成・物質生産と地球環境
Photosynthetic biomass production by marine microalgae and its impact on global environment
筑波大学

生命環境系

白岩

善博

Professor Yoshihiro Shiraiwa, PhD

Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

細胞殻（ココリス）から成る石灰岩として著名である（図

1. はじめに1）。また、英国・東方海域の北海には、北海油田で知ら

地球誕生直後は大気中に存在しなかった分子状酸れるように原油や天然ガスの埋蔵地域と石灰岩床の分素（O2）は、水（H2O）から還元力を獲得する光合成生

布地域が広がっている 1）（図 2）。

物の出現によってその量を増大させ始め、その大気中「藻類」とは、酸素発生型光合成機能を有する維管の濃度は 21% にまで上昇してきた。それは、太陽光エネ

束植物とコケ植物以外の生物群を総称する。ほとんど

ルギーを利用して水（H2O）
を分解し、その結果得られは水中生活をするが、気生藻類のように木や壁などのた還元物質の作用により二酸化炭素（CO2）を還元し有表面で生活するものもある。また、進化の過程で光合成機物を合成する生命体の出現によるものである。一方、機能を消失した生物群もあり、それらも藻類に入れる場

地球大気の大部分を占めていた CO2 は減少を続け、氷合が多い。生活環境は淡水性、海水性、高塩濃度湖

期には 180 ppm、間氷期には 280 ppmにまで達した。し沼性、気生性など多岐に渡る。

かし、産業革命後の化石燃料の消費に伴うCO2 放出に海洋微細藻類は光合成作用によりCO2 を固定し物

より、その濃度は急速に上昇し始め、2015 年 3 月にはつ質生産を担い、それを代謝過程により様々な物質に変

いに 400 ppmを記録した。

換し細胞増殖に寄与すると共に、増殖した細胞体自身

地球環境の変遷は地殻変動などの地球科学的要因に加え、光合成生物をはじめとする生命活動の結果によって大きく影響されてきた。そして、それらの変化が光合成生物自身やその他の生物にも大きな影響をもたらし、生 物 進 化による様々な生 物の誕 生にも関わってきた。例えば、海洋植物プランクトンの一種のハプト藻類
円石藻は細胞殻として方解石型炭酸カルシウム結晶から成る構造体（円石、ココリス）を有する。円石藻は約 2億年前に誕生し、中生代白亜紀に大量に繁茂したことで知られる。その大増殖の結果、円石藻が大量に海底へと沈降し、そして蓄積した。そこで細胞殻は石灰岩を形成し、細胞の有機質部分は地球化学的作用により
原油・天然ガスの基となる有機物を大量に生産し、大気中の CO2を減少させたことが明らかにされている。英
仏間海峡に面する英国・ドーバーの白い崖は円石藻の2THE CHEMICAL TIMES

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図 1（上左）化石になった白亜紀の円石藻。イギリスドーバー海峡のホワイトクリ
フを形成する白亜紀の円石藻化石の走査電子顕微鏡
（SEM）
写真。円石
藻の膨大な増殖が白亜紀にあったことを示すものである。
（上右）
現世のイギリス周辺海域で単離された生きた円石藻 E. huxleyi の走査電子顕微鏡像（下）
ドーバー海峡の白い崖（インターネットより取得 Fanny. "White Cliffs
of Dover" flickr. https://www.flickr.com/photos/fanny/555925/,（accessed 2015-08-26）.）

海洋微細藻類の光合成・物質生産と地球環境

は動物プランクトンの餌となるなど、海洋生態系を支える

本稿では、海洋微細藻類の光合成、代謝、物質生産

重要な一次生産者としての役割を果たしている。さらについて紹介すると共に、海洋微細藻類が担ってきた海に、代謝産物の一部は生細胞から分泌されると共に、

洋・地球環境とのかかわりを俯瞰し、それらの機能を人捕食などで死骸となった場合にも海水中に遊離し、バク類がどのように未来に役立てて行くべきかを考察する。

テリアなどの増殖を支える。それと同時に、一部の揮発性化合物は大気中へと放出される。当然、光合成生成物としての 酸 素 が 放 出される他、ジメチルスルフィド

2. 海洋微細藻類のバイオマス（DMS）等 の 揮 発 性 化 合 物も大 気 へと放 出される。

海洋光合成は現在の地球上の一次生産の約 50%

DMSは硫黄化合物であり、雲核となり、大気上空におを占めるとされている 2）。中でも、ハプト藻類（真核生物）

ける雲の形成に寄与することが明らかにされている。しは、円石形成種群（円石藻）および非円石形成種群をたがって、海洋微細藻類の増殖は当該海域の天候に合わせて海洋における主要な光合成生物群の一つでも影響を与えることが明らかにされている（図 3）。

あり、他に優占種として知られるシアノバクテリア（原核生物・ラン藻類）や珪藻類（真核生物）の 2 倍の光合成生産量を占めていると見積もられている3）（図4）。Brown（1995）によれ ば、Global Composites of Costal Zone
Color Scanner（CZCS）画 像 解 析において、円 石 藻ブ
ルームは乳白色もしくはトルコブルー色として観察され、その成果に基づき、高緯度海域（40-60°）における71％で円石藻のブルームが見られ、その面積は 1400 万 km2に達すると報告されている 4）。さらに、詳細な解析から、年間 40-130 万トンの炭酸カルシウムの生産と1 万トンの
DMS が生産されていると見積もられている。

図 2 1）北海における原油および天然ガスの埋蔵地域と石灰岩床の分布地域（Gibson, 2014を一部改変）

図 3 海洋微細藻類円石藻の光合成及び石灰化反応による炭素固定・物質生
産機構と海洋・大気環境との関わりとそのインパクト

図 4 西暦 2000 年における海洋微細藻類のクロロフィル a および補助色素に基づくバイオマス生産量の見積もり。 A: ハプト藻、B: 珪藻、C: シアノバクテ
リア。3）

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3

北大西洋における円石藻 E. huxleyiの大増殖（ブルー

成功し、海洋における光合成生物（植物プランクトン）のム）
において、細胞数は 850 万個 /L（8.5 x 106/L）で海域

分布やその変動が明らかにされ、その膨大なバイオマ

はトルコブルーに変色した。細胞増殖は深度 60 mまで

ス生産量が見積もられてきた。現在、海洋における光合及び、1 m あたり40 g の炭酸カルシウムが生産された。

成生物の動態の指標となるそのデータは海洋開発研

ブルーム海域は 7,200 km に及んだことから、7.2 万トン

究機構（JAMSTEC）とアメリカ航空宇宙局（NASA）によの方解石型炭酸カルシウムが生産されたと見積もられてる解析を経て、SeaWiFS 衛星画像としてほぼリアルタイ

いる。更に、高緯度海域において、円石藻 Coccolithus

ムで公開されている（図 5）。

2

2

pelagicusのブルームにおいて、年間 0.7-33.1 g/m の炭酸

何故、円石藻は世界中の海で繁茂し、その広い分布

カルシウムの生産があったと見積もられており、範囲をを保つことができるのか？ 何故、多様な生息環境に適

7,200 km2と仮定すると、5–238 キロトンの炭酸カルシウム

応し、その高い生息数を保ち続けることができるのか？

生産があったと見積もられる 。過去の円石藻ブルーム

なぜ、多様な変異を持つ株（種類）が存在するのか？そにおいて、数週間の増殖で約 8メガトン（一日換算で約

れらは大きな謎となっていた（図 6）。その解明のために100キロトン）の炭酸カルシウムが形成され、沈降したとの

円石藻 E. huxleyi CCMP1517 株の核ゲノムの全塩基配見積もりもあり、その二酸化炭素固定化能と隔離のポテ列の解読・解析が行われた。その結果、海洋性植物プ

ンシャルは現世の海洋においても膨大である。

ランクトンとしては最もゲノムサイズは大きく約 168 Mbp

25）円石藻が生産するジメチルスルヒド（DMS）は円石藻で、33,431 個の遺伝子をコードすることが明らかとなっ類の浸透圧調節機能を担う硫黄化合物であるジメチル

た。さらに、13 の地理的系統についてゲノム解析結果

スルヒドプロピオネートの分解産物として生産され、ガスを比較した結果、光合成、栄養摂取、殻形成などに関体として海 洋 から大 気 中に放 出される物 質 である。

与する塩基配列に系統間で大きな変異が見出された。

DMSは大気上空で二酸化硫黄や硫酸イオンに酸化さそれらの変異は 33,431 個の遺伝子を含む全ゲノムのうれ エ アロゾ ルを 形 成し、雲 核（Cloud Condensation

ちの「パンゲノム」領 域（約 18,000 個の遺 伝 子）であっ

Nuclei, CCN）となり雲の形成に寄与することが知られてた。パンゲノムの存在が確認されたのは、真核微生物

いる（CLAW 仮説 ）。

では初めてである 8）。

6）

海洋植物プランクトン群集の全世界的な調査に基づく生物多様性研究から、バイオマス量が中間レベルの時にその多様性は最大となり、大発生期に最小となることが 示されている 7）。1997 年には衛 星に搭 載された
SeaWiFS 海色センサーによるクロロフィル a の画像化が

図 6 世界の海で見られる円石藻 E. huxleyi の多様性
（タイプ）を示す走査電子
顕微鏡像 8）

3. 海洋微細藻類の光合成
一次共生と二次共生：
酸素発生型光合成を最初に獲得した生物は原核生
図 5 2015 年 7月29日に観測されたバレンツ海における円石藻類の大増殖（ブルーム）。NASA‘s Ocean Color Web（http://oceancolor.gsfc.nasa.
gov/cms/）の Aqua-MODIS 画像をGoogle Earth 上に配置。

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物のシアノバクテリア（ラン藻類）で、核膜やオルガネラ
包膜を持たない生物群である。そして、光合成機能を海洋微細藻類の光合成・物質生産と地球環境有しない真核細胞がシアノバクテリアを細胞内に取り込

多様性が大きい。しかし、それらの補助色素からエネル

む形で、光合成機能を有する細胞器官（葉緑体）と分ギーを受け取り最終的に光エネルギーを集約する機能

子状酸素を利用して有機物を酸化してエネルギーを取を持つ光合成反応中心を構成する色素はクロロフィルa

り出す細胞器官（ミトコンドリア）を獲得したのが一次植物に限定されている点と、複数の種類があるクロロフィル（一次共生生物）である。それらは、緑藻類・緑色植物、のポルフィリン環に配位する元素はマグネシウムである

灰色植物、紅藻類・紅色植物である。そして、それら一点は共通している。ただし、パラオ島のクラゲに共生し次植物を更に真核細胞が取り込む形で進化した生物ているアカリオクロリス（シアノバクテリア）ではクロロフィ

群が二次植物（二次共生生物）である。そして、一次

ル d が主要光合成色素として機能することが例外的に共生を経て様々な真核生物が光合成機能を獲得する発見されている 9）。

こととなり、さらに二次共生によってその多様性を拡大することとなった 。
9）

藻類の光合成による二酸化炭素固定と有機物合成
はカルビン・ベンソン回路（C 3 回路、還元的ペントースリン

細胞内共生が成立する過程では、共生体（葉緑体）

酸回路）により行われる。それはリブロース-1,5-ビスリンと宿主細胞のゲノムが統合されると共に、細胞器官（オ酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（Rubisco）
によるCO2ルガネラ）がその機能を十分に発揮するためには、オルガ固定反応を起点とする代謝回路であり、CO2 固定段階

ネラ間の代謝産物輸送システムの確立など、ダイナミック→還元段階→ C5 化合物再生段階の 3 段階から成る。

な変化が不可欠であった。特に、二度の共生を経て誕生

最初の CO2 固定反応生成化合物は 3- ホスホグリセリン

した二次植物では、ゲノムおよび代謝経路の改変の度酸（3-PGA）である。それは更に光化学系で生産された

合いも大きく、多様な藻類の比較ゲノム解析や生化学的高エネルギー物質であるアデノシン三リン酸（ATP）と還解析によりその細胞機能が解明されなければならない。

元物質ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADPH）

一次植物の葉緑体には 2 枚の包膜があり、その外膜を利用したリン酸化反応と還元反応を経て、グリセロアにはポーリン様タンパク質が存在し代謝産物の透過はルデヒドリン酸（GAP）およびジヒドロキシアセトンリン酸

自由である。しかし、内膜では代謝産物の輸送には輸（DHAP）（ 合わせてトリオースリン酸（Triose-P）と呼ぶ）に送体が必要であり、その輸送体が細胞全体の代謝を転換される。そして、再生段階で生成されるC 6 代謝中制御する役割を果たしている。一方、二次植物の葉緑間体（フルクトースジリン酸、フルクトースリン酸）を経て、体は一次植物の葉緑体が有するものと同じ内膜と外膜

C 5 化合物が再生されると共に、新たに固定された CO 2に加え、そのさらに外側に、その進化の過程の違いによに相当する炭素量の分がグルコースポリマー合成系にり3 枚目、4 枚目の包膜を持つこととなり、最も外側には

導かれ、その結果、光合成の最終産物として葉緑体に核膜と連結した膜を有している。しかし、現状では二次貯蔵性多糖（デンプンなど）
として蓄積される。カルビン・

植物の葉緑体における代謝産物輸送体の生化学的解

ベンソン回路は各種の光合成生物間で非常に共通性

析は不十分であり、更なる研究が必要である。

の高い代謝系であり、その基本的な機構は一次植物や二次植物など、種や分類群による相違は見られない。

藻類の光合成と代謝系：

一方、カルビン・ベンソン回路の代謝速度や Rubisco

藻類の光合成系の多様性は非常に大きい。まずはの性質、CO2 固定効率、O2 による拮抗阻害の程度など

多様な光環境に生育する中で獲得した形質やその環は分類群により大きく異なっており、進化の過程において境への適応のために進化過程で藻類が獲得したものと環境変動を反映する特徴を有している。さらに、炭素貯して光合成色素の多様性が挙げられる。藻類の「色」

蔵体に関して、陸上植物や緑藻類を含む緑色植物のはその分 類 上の重 要な形 質として長 年 利 用され、藍光合成炭素貯蔵体はデンプン（α-1,4- 結合による主鎖藻、灰色藻、緑藻、褐藻、紅藻、黄金色藻、黄緑藻などにα-1,6- 結合による分枝を有するグルコースポリマー）の分類群が設定されてきた。光合成で光エネルギーをであるが、藻類のそれはその分類群によって大きな多様

化学エネルギーに変換する光化学系において、最初に性がある。特に、パラミロンやクリソラミナラン（β-1,3- 結

光を吸収するアンテナ色素系（光合成補助色素）には合による主鎖にβ-1,6- 結合による分枝を有するグルコー

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スポリマー）は水溶性であるなど、貯蔵物質としての性てクロロフィル （c クロロフィル a と異なりフィトール鎖がな

質が大きく異なり、それらを有する生物群の多糖合成代い）を持つ点など共 通 点が多い。珪 藻やハプト藻にも謝系がそれぞれの生物の性質にも大きく影響している。

TPT 相同遺伝子が存在している。しかし、4 枚すべての包膜に TPT が存在するか否かは確認されておらず、ま一次植物と二次植物の葉緑体内代謝系の特徴：
一次植物の葉緑体包膜の内膜には、トリオースリン酸

た TPTの分子特性（基質特異性など）は実験的に確認されていない 10, 11）。

と無機リン酸（Pi）の対向輸送を行うトリオースリン酸 /リ

一方、一次植物が持つ PPTの相同遺伝子は、珪藻

ン酸輸送体（TPT）が存在し、トリオースリン酸の一部はやハプト藻のゲノムには存在せず、PPTによる細胞質か葉緑体から細胞質へ運び出される（図 7）。細胞質に運ら葉緑体への PEP の輸送は行われていない可能性がび出されたトリオースリン酸は、細胞質でホスホエノール高い。一方、3-PGAを PEPに変換するために必要な 2ピルビン酸（PEP）に変換される。そして細胞質で作られ種の酵素（3−ホスホグリセリン酸ムターゼとエノラーゼ）

たPEPの一部は、PEP/リン酸輸送体（PPT）
を介して、再が葉緑体に局在すると予測されている。そのため、葉び葉緑体内に取り込まれる（図 7）。葉緑体内では、PEP

緑体内での生合成に必要な PEP は、細胞質から取りおよびピルビン酸から、イソプレノイド、芳香族アミノ酸、込むのではなく、葉緑体内で C 3 回路から直接合成され脂肪酸など、様々な物質が合成される。この代謝モデる（図 8）。また、ハプト藻や珪藻では、葉緑体局在と予ルは、陸上植物で確立されたものだが、緑藻や紅藻な測されるピルビン酸カルボキシラーゼ（PYC）という酵素をどの一次植物にも当てはまると考えられている。なお、一もち、葉緑体内で C 3 化合物（ピルビン酸 PYR）
を C4 化次植物である緑藻や紅藻では、葉緑体内にエノラーゼ

合物（オキサロ酢酸 OAA）に変換することが可能であという酵素が存在しないため、葉緑体内で直接 3-PGAる。すなわち、C 3 回路で合成された C 3 化合物を C 4 化

からPEPを作ることはできない

合物に変換する経路（図 8）は、一次植物には存在せ。

10,11）

ず、一部の二次植物に特異的な代謝経路であると考えられる 10, 11）。二次植物では、教科書で標準とされている
陸上植物の代謝モデルが当てはまらない例が多数あり、二次植物が多大なバイオマスを占める海洋の一次生産
性や物質循環を解析する上で、今後、体系的な解明が必要である。

図 7 緑藻・緑色植物（一次植物）の光合成初期代謝系 10）,11）。 紅藻（一次植物）
はアミロペクチン様デンプン（紅藻デンプン）を合成しそれを細胞質に蓄積する点で異なるが、PEPを葉緑体独自で合成できない点は共通している。
それは、3-PGA ムターゼとエノラーゼを持たないことに起因している。
3-PGA, 3-phosphoglycerate; Triose-P, triose phosphate; F6P,
fructose 6-phosphate; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate;
Pi, inorganic phosphate; TPT, triose phosphate/Pi translocator;
PPT, PEP/Pi translocator.

二次植物の葉緑体の起源は多様であり、全ての二次植物に当てはまる代謝モデルは存在しないため、ここでは紅藻の二次共生により葉緑体を獲得した珪藻（不等毛植物）とハプト藻（ハプト植物）について、ゲノム情報から推測される代謝モデルについて概説する。それ
らの葉緑体は、一次植物の葉緑体にさらに 2 枚の包膜が加わり、計 4 枚の包膜に包まれ、光合成補助色素とし

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図 8 円石藻と珪藻（二次植物）の光合成初期代謝系 10）,11）。 本生物群ではPPT の存在は見出されていないが、TPT 様輸送体の存在がゲノム上で確認されている（局在は不明）。尚、珪藻T. pseudonana のゲノムには葉緑体型エノラーゼは存在せず、二次植物内での多様性が存在する。3-PGA,
3-phosphoglycerate; Triose-P, triose phosphate; F6P, fructose
6-phosphate; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate; Pi,inorganic phosphate; TPT, triose phosphate/Pi translocator; PPT,PEP/Pi translocator; OAA, oxaloacetate; PGM, 3-PGA mutase;
ENO, enolase; PYC, pyruvate carboxylase.

海洋微細藻類の光合成・物質生産と地球環境

4. 海洋微細藻類・円石藻の物質生産の特徴
現在世界のエネルギー源として経済・産業基盤を支える原油は化 石燃料である。地 球科 学 的 知 見によれ

飽和ケトン
（アルケノン）を乾燥重量の 20-30% 程度有する。そのため、熱分解によって生成したこれらの化合物は、長鎖のアルケノンの分解産物であると考えられ
る 14, 15）。

ば、有機物起源の原油および天然ガスの形成は、約 6アルケノンは、現在、化石や現世種を含め海洋種 4割程度が中生代白亜紀（1.4 億年〜6,500 万年前）にお種および湖沼種 1 種のハプト藻（円石藻も含まれる2 次

ける植物プランクトンが生産した有機物が起源と考えら共生によって生じた生物群）のみで知られる種特異性れている。中でも、中東・中生代の石油は、石灰質ナノの高い脂質化合物である。アルケノン分子の特徴は、プランクトン（円石藻など）が生産者の主体であったとす

炭素数 37〜40 の長い炭素鎖、トランス型の炭素二重る知見があり、現在も海洋バイオマス生産に寄与してい結合（2〜4 個）および末端にケト基を有することである。

る微細藻類種の祖先型が原油生成に寄与したと考えその分子の特徴は、炭素数 16〜22 の炭素鎖、シス型られている。石灰岩は生物起源と化学的沈殿によっての炭素二重結合（0〜3）および末端にカルボキシル基を形成されたとされているが、イギリスのドーバー海峡の白有する脂肪酸と比較すると明らかである（図 9）。この化

い崖（white cliff）は円石藻の大量堆積で形成されたも合物がハプト藻自身にとってどのような役割を担っているので、円石藻の細胞殻（ココリス）が走査電子顕微鏡でか、どのような合成経路を経て合成されるのかは未解

確認できる（図 1）。

明であり、今後の研究の進展が期待されている。トリグ

筆者らは、ハプト藻類円石藻株 E. huxleyiを対象に、リセリド、糖脂質、リン脂質などの微細藻類の脂質は、光合成 CO2 固定機構を解析した。その結果、「動物型」

細胞内でオイルドロップや膜脂質として存在する。円石酵 素として知られてきたピルビン酸カルボキシラーゼ

藻は他の微細藻類が貯蔵脂質として合成するトリグリ（PYC）が、その葉緑体で Rubiscoに続く2 つ目の CO 2 固

セリドを有しないため、細胞内のオイルドロップレットはア定酵素として機能していることを発見したルケノンであると推測された。

。 C-トレー12） 14サを用いた炭素代謝解析の結果、PYC が光合成器官
においてアミノ酸合成（窒素化合物）と脂質・糖合成（炭水化物）への炭素の流れを調整する重要な機能がある
ことも明らかになっている（図 8）。さらに、生理学的な解析において、円石藻 E. huxleyi が、他の藻類とは異なり、多糖（β-グルカン）ではなく、アルケノン・アルケンなどの脂質を貯蔵物質とすることを明らかにした。光合成による物質生産の律速段階は CO 2 吸収・固定段階であることやアルケノン・アルケン脂質体が主要炭素貯蔵体であり、光合成で固定された炭素の 20％を占めることも明ら
かにした

。

13）

図 9 脂肪酸
（リノール酸）と長鎖不飽和ケトン（C37：2 アルケノン）の分子構造

そのオイルドロップの組成を解明するため、アルケノン
合成ハプト藻類株 Tisochrysis lutea 細胞からアルケノン

筆者らは、円石藻 E. huxleyiを実験室で培養し、円蓄積細胞小器官（脂質体）
を単離・精製する技術開発

石藻が原油の起源生物となり得るかを確認した。円石が行われた。円石藻 E. huxleyiからのオイルボディ単離

藻の乾燥粉末をガラス管に封入して無酸素状態で熱は困難であり、ココリスを有しないアルケノン合成株が用

分解（pyrolysis）を行った結果、300℃で液体炭化水素いられた。その結果、まずその脂質体の組成が、アルケが多く得られ、それらの成分には炭素数 31（ C31）以下

ノン（74%）、アルケン（1%）、ステロールを含むその他のの種々の炭化水素分子が含まれることを見出した。更脂質（25%）から成ることが明らかにされ、「アルケノンボに、400〜500℃では、メタンやエタンを主とするガス状

ディ」と命名された。さらに、プロテオミクス解析から、主の炭化水素分子が生成されることを確認した。円石藻

なアルケノンボディタンパク質はV-ATPaseであることが明は、中性脂質成分として炭素数 37を主とする長鎖不らかとなった 16）（図 10）。

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造が未確定な化合物について、その構造決定を行った。
その結果、C 29 アルケンを主要産物とする非常に珍しいハプト藻類円石藻 E. huxleyiとGephyrocapsa oceanicaの新規の株が見出された 18）。
5. 原油起源生物・円石藻による再生可能エネルギー生産への技術開発
中生代原油の起源生物とされる海洋ハプト藻類で乾燥重量の 20-30%を占める脂質アルケノン（超長鎖不飽
和ケトン）
およびアルケンを活用し、海水利用の Drop-inFuelタイプのバイオ燃料や原油代替原料生産を人工的に強化するための基盤技術の開発を目的として研究を精力的に進めてきた。アルケノンは陸上植物や多くの藻図 10（左）円石藻E. huxleyi の光合成産物の合成速度の定量的比較。
（右上）
円石藻E. huxleyi の SEM 画像、オイルドロップ（オイル体）の蛍光顕微鏡像および細胞塊から染み出るオイル成分。
（右下）
アルケノン生産ハプト
藻類株 T. lutea のトランスクリプトーム解析とメタボローム解析から得られたデータに基づくアルケノンボディの模式図

異なり、直鎖中性脂質分子である点でユニークである。
また、藻類エネルギー生産においては、膨大な量の培
養液（水資源）を必要とするため、今後世界的に淡水のアルケノン合成生物による脂質の合成能を増強する

供給が不足することが懸念される中、海水利用のバイオ

ためには、その合成・調節・不飽和化に関わる酵素を

マスエネルギー生産は開発が期待される技術分野の一同定するなど、その合成機構を解明する必要がある。

つである。円石藻は海洋性の藻類であることから淡水を筆者らは、まず、ハプト藻類が高度不飽和脂肪酸 18:5

必要とせず、近い将来予測される水不足問題を回避で（炭素数 18 で 5 個の不飽和結合を有する）
を合成する

きるに点で期待に応えるポテンシャルを持っている。筆者ことに注目した。次に、円石藻 E. huxleyiの酵素遺伝子

らは、JST/CRESTプロジェクト：研究領域「藻類・水圏微をシアノバクテリアにおいて異種発現させる実験系を確

生物の機能解明と制御によるバイオエネルギー創成の立した。その上で、E. huxleyiのゲノム情報 から18：5

ための 基 盤 技 術 の 創 出」の 研 究 代 表 者（研 究 期 間

脂肪酸合成に関与すると推定した 4 つの不飽和化酵

2010 〜 2015 年度）として、海洋微細藻類のメタボローム

素遺伝子を異種発現させ、解析した。その結果、その解析システムを作り上げ、全く未解析であったアルケノン

内の一 種 類の酵 素の同定に成 功した。興 味あること

生産生物の脂質合成機構の解明に取り組んできた。

8）に、当該酵素は、他の生物におけるΔ15 不飽和化酵素

また、原油生成の起源生物の代表種とされるハプト藻とは系統学的に全く異なるクレードに属したことから、新類円石藻 E. huxleyiの全ゲノム解読やアルケノン・アルケ

規なΔ15 不飽和化酵素であることを明らかにした。本酵

ン生産生物を網羅的にスクリーニングして最適生物の同素は、ハプト藻類のドコサヘキサエン酸（DHA, 22:6）の定に成功した。これらの成果を通して、海洋ハプト藻類

合成にもかかわる重要な酵素であると考えられるが、藻類バイオマスエネルギー資源として高いポテンシャ。

17）

アルケノンは炭素数 37〜40、trans 型炭素不飽和結合8類が生産する貯蔵脂質がトリグリセリドであることと大きくルを有することを明らかにした。

を2〜4 個、酸素 1 原子を有する直鎖状分子であることは世界中のハプト藻株から、アルケノン・アルケン分子

知られていたが、アルケンに関しては、trans 型に加えて、種の組成と含有量の定量解析を行い、最適株の選抜

cis 型炭素不飽和結合を有する2 種類の分子形が存在と燃料や化学改質に有利な C 29 アルケンを主生産脂質する。そこで筆者らは、アルケノン合成の中間体のバイオとするハプト藻類株の取得に成功した 19）。これらの成果リファイナリーとしての利用に関する研究において、アルケ

は、Drop-in-fuel として使用できる更に炭素鎖の短いハノン合成中間体の定量解析を行うとともに、アルケンやス

プト藻類株がスクリーニングにより発見できる可能性を示

テロールなどのアルケノン以外の脂質の分析を行い、構唆している。

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海洋微細藻類の光合成・物質生産と地球環境

シアノバクテリア、ユーグレナ、緑藻ドナリエラはトリア
シルグリセロールを貯蔵脂質として合成する。それらの藻類とアルケノン生産藻類であるハプト藻類円石藻 E.
huxleyi 株の乾燥藻体をPyrolysis 処理したところ、Crude
Oil の生産性とオイル回収率に関して、ハプト藻類が最も優位であることを示した。この成果は、現有用藻類の中で、ハプト藻類が原油成分生産に最適であることを示すものである。
中生代白亜紀における原油生産に寄与した微細藻類の 1 種である海洋ハプト藻類の長鎖脂質生合成系の解明に実績を上げ、当該微細藻類を利用した現代におけるバイオ燃料生産においても大きなポテンシャルを有することについて実験的証拠を積み上げつつある。それによって、藻類バイオ燃料開発に向けた基盤研究を推進し、今後の研究や技術開発において生物工学的な手法を駆使する際に必要な知見の拡充に努めることで、マリンバイオ
テクノロジーの発展に大いに貢献するものと考えられる。
アルケノン分子は、他の脂質分子と比較してバクテリ
アの分解を受けにくく、海底堆積物として良く保存されている。また、炭素数 37 で不飽和結合を2 個有するア
ルケノン分子（C 37：2 ）と3 個有する分子（C 37：3 ）の比（アルケノン不 飽 和 度 指 数）が培 養 温 度を変 化させた場合に変化する。これを利用すれば温度変化により性質の異なる化合物の生合成が可能である。また、アルケ
ノン合 成 種を用いた代 謝 改 変 技 術を確 立することによって、燃料使用に最適な中間代謝産物を合成させることが出来れば、大量の熱エネルギーを使用する熱分解によらなくても燃料適合性の化合物の合成が可能であると考えている。大量培養規模の拡大技術の開発により低コストなバイオリファイナリー生産の道が開かれていくことが期待される。

5）Heimdal, B.R. “Moder n Coccolithophorids”. Marine
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微生物の産生する
高機能性バイオポリマーの産業応用
Industrial application of the high functional polysaccharide by microorganism production
中部大学 応用生物学部 応用生物化学科

教授

倉根隆一郎

Ryuichiro Kurane (Professor)

Chubu University, Department of Biological Chemistry, Applied Microbiology

1. はじめに；「土は宝の山」は本当？

ら遂行していることは当然のことであります。生物多様性「土は宝の山」と言う言葉を聞いて一般の方々はどの利用して商業化した場合には、条約に従い、利益をもたような考え、感じ方を持たれるのでしょうか？ひょっとした

らす微生物がもともと住んでいたその国に利益の相当部

ら、身の周りの「土」が「金」に変わるような“中世の錬金分を支払うことが義務付けられております。そのため、経術”を思い浮かべ、PC の上を情報が走り回っている現済産業省・NEDOによる複合生物系プロジェクト（筆者が代においては、“そんなばかな”と頭から切り捨ててしまわ

プロジェクトリーダーを務めました）が行われてきました。

れるのではないでしょうか？

条約に従うと、海外での土壌等から分離した微生物をところで、皆さんは土壌 1グラムにどの位の微生物数

私ども、応用微生物工学を専攻している者にとってが存在しているかご存知でしょうか？例えば、肥沃な畑は、極めて高い実感と真実性を持っており、まさに本当

土壌 1グラムにはなんと1 億もの微生物が住みついていの言葉であります。例えば、皆さんが抗生物質として使るのです。この途方もない微生物群の中から目的の微用しているカスガマイシンは奈良の春日大社の土から分生物を見つける為には、確かな知恵、工夫と眼が必要離された微生物が生産する抗生物質であるように、多くであると共に女神様の優しい微笑みの幸運に恵まれるの抗生物質、抗真菌剤、各種のアミノ酸、各種の核酸、ことが必要です。

様々な環境汚染物質分解等は土壌等自然界から分離される微生物のなせる業であります。例えば、筑波山麓の土壌から分離された微生物が生産する医薬品で年10

2. 女神様の微笑みに恵まれた有用微生物の産業応用例

商 1,000 億円にのぼる事例があげられます。すなわち、“でん粉”と聞いてだれしも植物を考えると思います。

私ども人間の健康と環境を守っているものが、土壌など

微生物がまさか“でん粉”を生産するとは考えつかないと自然界から分離された微生物が基になっているのです。

思います。カイコが繭として絹蛋白を生産するように、あまた、企業にも莫大な利益をもたらしております。

る種の微生物も菌体の外に“でん粉”を生産してきます。

このような背景のもと、微生物に携わる多くの研究者

この微生物でん粉はわずかスプーン1 杯（1グラム）で実は新たな微生物資源を求めて、生物多様性が豊富なアに最高で自重の 2,000 倍すなわち 2リットルの水を吸水

マゾンの奥地、東南アジアなどの熱帯雨林、温度差を求保水する性能を有しております。この微生物でん粉は国

めて極寒の南極大陸、北極やツンドラ地帯、灼熱の火

内では大手化粧品メーカーによって保湿剤として実用

山地帯、高低差を求めてヒマラヤへと土壌採取に出か化商品化され、さらに海外においては世界第 2 位及びけてきました。勿論、生物多様性条約が国際条約として第 4 位の化粧品メーカーにより欧米にて商品化されてお発効している今日においては、これらの微生物資源が存り、世界の先進諸国のご婦人、ご令嬢など多くの方々に在している国々とMOUなどの覚書をきちんと締結してか使って頂いておりますと共に、海外旅行をされる方々はTHE CHEMICAL TIMES

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微生物の産生する高機能性バイオポリマーの産業応用

空港等免税店にて購入して頂いていると思われます。
本 稿では「微 生 物の産 生する高 機 能 性バイオポリ
マーの産業応用」について以下に記すことに致します。

③Alcaligenes latus B-16 株の生産する新規な吸水保水性バイオポリマー
ライフスタイルの変化と共に、種々様々な使い捨て紙
オムツや衛生用品が汎用されてきており、これらに人工

3. 微生物が生産する高機能性吸水保水性バイオポリマー①はじめにの合成高分子吸水剤が使用されている。これら合成高分子吸水剤はコストパフォーマンスが良く高い吸水率を示すが、しかしながら、使い捨てであるが故に環境中で21 世紀型産業を考える時に、産業の持続的発展とは容易には分解されず長期間留まり、かつこれらの合環 境との調 和が大きな問 題となってきます。その為に成高分子吸水剤の重合用モノマーはアクリル酸又はアは、新しい工業的アプローチが必要不可欠であり、21

クリルアミドであるアクリル酸は人体に強いかゆみを生ず

世紀の産業を考えるとき、製造時・廃棄後に発生するる恐れがあり（Merck Indexより）、またアクリルアミドは神汚染物質を未来の子孫に付け残すのではなく、現時点

経毒（Merck Indexより）と共に人体に強い発ガン性を示で処理・浄化することは当然のこととして、同時にそのす 1）2）。このように生態系への影響を解決するために、発生を事前に防止・予防することに発想自体を広げな生分解性があり人と環境に優しい吸水保水機能を持ければならないと考えられます。

つ代替品の開発が求められていた。

すなわち、人と環境に優しくかつ高機能性の製品を開発することにより、汚染の発生を事前に防止すること（1）吸水能（プリベンション）に産業構造を切り替える必要がありま

後述の培地で Alcaligenes latus B-16 株を培養するとす。生分解性を持ち、安全で人と環境に優しく、かつ各

多量のバイオポリマーを菌体外に生産してくる。このバイ種の優れた高機能性を有する環境調和型次世代 ｢ 高オポリマーを電気泳動的に均一にまで精製した。この精機能バイオポリマー｣ の開発は多方面より期待されてお製バイオポリマーを用いて、いわゆるティーバック法にてります。例えば、カイコが絹蛋白というすばらしい機能性

吸水能力を調べたところTable 1に示すように、本精製素材を体外に生産するように、微生物もさまざまなバイオ

バイオポリマーは自重の 1,300 倍（最高値：自重の 2,000

ポリマーを菌体外に生産しています。
「人と環境に優し

倍の水を吸水）の水を吸水する高い能力を示した。こい ｣という視点からバイオポリマーをバイオ新素材（バイの値は汎用合成高分子吸水剤の約 4〜5 倍の吸水能

オニューマテリアル）として捉え、環境調和型の微生物

力を持つことを示している。

が生産する高機能バイオポリマーの実用化への道を切り開く事を目的として研究開発を開始しました。
本技術的特徴は、自然界で水と炭酸ガスにまで完全に分解される生分解性を持ち、安全で各種の優れた高機能性、すなわち既存の合成吸水剤をはるかに凌駕する性能を有する次世代型の吸水保水性バイオポリマーの微生物生産とその実用化に関するものです。以下に概説します。
②吸水保水性バイオポリマー生産菌
菌体外にバイオポリマーを生産することを指標として、土壌よりの分離株をスクリーニングした結果、B-16 株と名付けた細菌が吸水保水性バイオポリマーを最も良く生産することを見出した。本細菌はグラム陰性細菌で
Alcaligenes latusと同定された。

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（2）保水能

食塩水中でも自重の約 500 倍の水を吸水する能力を示

3 つの異なる相対湿度、64.8%, 34%, 33%（いずれもし、汎用合成高分子吸水剤の 20 倍近い能力を持って20℃ 室温下）において本精製バイオポリマーがどの程いた。この 500 倍という値は合成高分子吸水剤の真水度保水能力を有しているかを合成高分子吸水剤等とにおける吸水量の約 2 倍の値である。

比較検討した。その結果、例えば、Fig. 1に示すように、
相対湿度 33% の乾燥条件下に 24 時間放置しても保水率 80％以上を保持していた。一方、合成吸水剤等は乾（4）Alcaligenes latus B-16 株の生産する吸水保水性
バイオポリマーの培養条件と精製

燥条件下にての保水性は低い。このように Alcaligenes

本吸水保水性バイオポリマーの生産には、炭素源としlatus B-16 株が菌体外に生産してくる本バイオポリマーてグルコース、シュークロース、キシロース、フラクトース、は冬の乾燥下においても保水性が極めて優れているこ

ラムノース、セロビオースが好ましく、リンの濃度はリン酸ととが判明した。

して 0.03%〜0.6%、無機窒素源としては尿素が、また有機窒素源等としての酵母エキスの濃度は 0.5% が最も好ましいことが検討の結果判かった。このような結果から
Alcaligenes latusによる本吸水保水性バイオポリマーの生産培地として、1リットル当たり、Sucrose（ 又はGlucose）
10g, K2HPO4 4.5g, KH2PO4 1.5g, MgSO4・7H2O 0.2g,
Nacl 0.1g, Urea 1g, Yeast Extract 0.5g（ pH7.2）と決定し、30℃にて 5〜7日間培養生産することとした。以上のような結果より、本菌は本バイオポリマーを培養液 1リットル
当たり乾燥重量で 20〜25g 菌体外に生産する。
ところで、Alcaligenes latus が菌体外に生産するバイ
オポリマーは精製の過程より2 種類存在する事が判明した。その精製工程をFig. 3 に示す。一方は高分子酸（3）食塩存在下での吸水能
各濃度の食塩存在下での本精製バイオポリマーの吸水能力をFig. 2に示した。この結果、合成高分子吸水剤が食塩中でその機能を大幅に低下させるのに対し、Alcaligenes latus 由来の本バイオポリマーは 0.9% の

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微生物の産生する高機能性バイオポリマーの産業応用

性多糖（分子量 ; 約 5×109）であり、他方は低分子中性
多糖（分子量 ; 50,000〜100,000）であった。その生産比（5-2）吸水保水性バイオポリマー等の多糖結合様式の決定

は高分子酸性多糖が 20に対し低分子中性多糖は 1 に

電気泳動的に均一にまで精製した本バイオポリマーすぎない。このうちどちらの多糖が吸水保水性バイオポを用いて、単糖類分析、メチレーション分析、一次元及リマーであるかを調べたところ、高分子酸性多糖が自重

び二次元の 1H 及び 13CNMR 分析と酵素分解を駆使し、の約 1,400 倍の吸水の値を示したことによりAlcaligenes

MALDI-TOF-MSとLC-MS機器分析を行うことによって、

latusが生産する吸水保水性バイオポリマーは分子量がその繰り返し構造（リピートユニット）の結合様式を決定

5×10 である巨大高分子酸性多糖であることが判明しした。吸水性バイオポリマーは、特定のユニットの繰り返た。この吸水保水性バイオポリマーはFig. 3に示すフロー

しで構成されており、下記の特定のユニットの繰り返しで精製したところ、電気泳動的に均一であった。

構造を有すると結論された。

（5）Alcaligenes latus の生産する多糖性吸水保水性{→3）-β-D-Glucopyranose-（1→4）-β-D-Glucuronic acid-9

バイオポリマーの構成糖の決定と結合様式の決定（5-1）吸水保水性バイオポリマーの構成糖の決定（1→4）-β-D-Glucopyranose（1→4）-α-L-Rhamnopyranose（1 → }nα-L-Fucopyranose（1 → 3）

電気泳動的に均一にまで精製した本吸水保水性バ
イオポリマーを2M H2SO4 で 100℃ 2 時間加水分解して5-1 及び 5-2 の結果より、Alcaligenes latusの生産するから、TLC, HP, LC, GC 及び GC-MSにて構成糖を調べ

吸水保水性バイオポリマーは 4 種の糖より構成されておた。一例として HPLCの分析チャートをFig. 4に示した。

り、その主鎖としてはグルコース、ラムノース、グルクロン

4 種類の分析結果より、本吸水保水性バイオポリマー

酸の 3 種類の糖が結合し、側鎖としてフコースより構成

はグルコース、ラムノース、フコース、グルクロン酸の 4 種類されている事が判明した。これら4 種の糖の中で特に注の糖より構成されている多糖類であることを明らかにした。

目されるのはフコースである。フコースは小麦や稲等の各々の構成糖比は、加水分解条件をいろいろとふる

陸上の植物からは見つからず、わずかにヒジキや海草ことにより、グルコース：ラムノース：フコース：グルクロン酸

等の海の植物中に検出される極めてめずらしい糖であ=1.8：1.1：1：1とした。

る。吸水保水性バイオポリマーは、合成高分子吸収剤

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がイオン結合の力で水分を取り込んでいるのに対して、
特定の繰り返し構造を構成する4 種の糖が、特に手に相当するフコースが水分子をまるで抱きかかえるようにして水を吸水しているものと強く示唆された。
（6）大量工業品の実生産プロセスならびに高純度精製
実生産プロセスの開発
酵母エキスは Alcaligenes latus B-16株が吸水保水性
バイオポリマーを生産する上で有効な培地成分である。
しかしながら、実規模で大量に実生産プロセスに乗せる
上で少なからず問題点を含んでいる。例えば酵母エキ
スそのものに基準品（スタンダード）がなく、かつ工業上（7）実用商品化で大量に使用するには高価格である。これらの問題点（7-1）吸水保水性バイオポリマーの基本的性状を解決するために完全合成培地の検討を行った。酵母実用・商品化を行う上での本吸水保水性バイオポリエキスの代替としてアミノ酸の効果についてTable 2に示

マーの基本的な性状を検討した。本吸水保水性バイオ

した。Table 2に示すように、数種のアミノ酸の培地へのポリマーはシュウドプラスチック性を示すと共に、温度安

添加が、特に価格等を考慮するとGlycineの添加が有定性も極めて優れていた。粘度を指標として各種のポリ効であった。同様に微量なミネラルの効果について検討

マーの温度安定性をFig. 5に示した。Fig. 5に示すようにしたところ鉄イオンの添加が有効であることが示された。

本吸水保水性バイオポリマーは 5℃〜80℃まで完 全に

以上のような結果より、完全合成培地として培地 1リット

安定であることが示された。さらに、pH 安定性もpH4-12

ル当たり、Glucose 10g, K2HPO4 4.5g, KH2PO4 1.5g, Ureaの範囲で一定である（pH3でゲル化）。塩濃度安定性も1g, FeSO4・7H2O 10mg, Glycine 0.1g, pH7と決定した。

0.025%NaCl 濃度以上でわずかに上昇した後 1%まで

また、吸水保水性バイオポリマーは高い増粘性も示

一定の安定性を示すと共に保存安定性も極めて優れす。この増粘性をコントロールする手段としてアルカリ条ており、また、5℃、32℃、50℃の保存下で 4 週間の高い件下での熱処理を試みたところTable 3に示すようにそ安定性を示し、商品の販売における様々な環境条件下の粘性をコントロール出来ることが示された。

にて何ら問題点が無いことが示された。

（7-2）化粧品等への適用による実用・商品化
Alcaligenes latus B-16 株が生産する吸水保水性バイ
オポリマーの化粧品への実用・商品化はカネボウ化粧品研究所により開発された。化粧品の分野においては

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微生物の産生する高機能性バイオポリマーの産業応用

人間の肌にいかに水分を与えてうるおいを与えるかが過ぎない極乾燥条件下においても、十分な水を散水して極めて重要であり、人と環境に優しいバイオポリマーをいる時と同様な発芽割合と成長速度が確認された。微その素材として用途開発がなされ、厚生省（当時）の審生物が産生する吸水保水性バイオポリマーは砂漠緑化

査を経て発売され、今日に至るまでその使用量は年々という地球規模での大問題に、もしかしたら寄与できうる

増加してきている。最初に発売された新しいタイプのパッ可能性を秘めているものと考えている。すなわち、微生物

クと共に現在では化粧水や乳液にも採用されている。まが作り出す吸水保水性バイオポリマーは、4 種類の糖よりた、海外の世界第 2 位および第 4 位の化粧品メーカー構成されている人と環境に優しいバイオポリマーである。

にも本吸水保水性バイオポリマーは輸出されている。今土に混ぜてもいずれは生分解されると共に、環境に悪影

後とも様々な化粧品の可能性が大きく開けるものと期待響がなく、わずかな水で水分豊かな肥沃な大地を作り出されている。

せる可能性を秘めている。21 世紀が直面する大きなグ

さらに、工 業 品グレードの本 吸 水 保 水 性バイオポリ

ローバルイシューとして地球全体で進む砂漠化防止にマーがボールペンにも書きやすさと途中で途切れないこ

役立つ大きなポテンシャルがある可能性が期待できる。

とから採用され販売されている。
【謝（7-3）さらなる可能性を目指して；砂漠の緑化

辞】

本吸水保水性バイオポリマーは伯東（株）四日市研

21 世紀をおびやかす地球規模でのグローバルな問究所の野畑靖浩氏と黒宮友美氏との共同研究成果で題として地球温暖化と共に砂漠化の急速な拡大があす。心より感謝の念を示します。また、吸水保水性バイオる。国連等の統計によると、地球全体で毎年 20 年前にポリマーの構成糖結合様式の決定については京都大は 60,000km（ほぼ日本の四国の総面積に匹敵）が、そ学大学院（農学系）東 順一教授に、実生産培養につして今日では砂漠化面積は年々増加し日本の九州の総いては（株）興 人 久 芳 啓 資 氏をはじめ関 係 者の皆 様

面積が砂漠化していると報告されている。

に、化粧品の実用化については当時のカネボウ（株）化

2

Alcaligenes latus の生産する吸水保水性バイオポリ粧品研究所の大西重樹博士はじめ、さらに多くのご賛

マーを砂とわずかに混ぜて保水力を調べてみた。Fig. 6

同者・ご協力者の皆さまに対して、本紙面を借りましてにその結果を示した（Fig. 6 左 20℃、真ん中 45℃、右厚くお礼申し上げます。

70℃）。Fig. 6に示すように他の吸水保水剤と比較して、極少量の添加量で本吸水保水性バイオポリマーの保水力が極めて優れていることが判かる。この基本的な性質を基にして、ホウレン草レベルであるが種子の発芽割合
及び苗の成長速度が極めて少量の水を供給しているに

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流体物理洗浄（3）ジェット洗浄、ブラシ洗浄、その他
Physical Fluid Cleaning (3) Jet, Brush, and other topics
静岡大学

学術院

工学領域

准教授

真田 俊之

Sanada Toshiyuki (Associate Professor)
College of Engineering, Academic Institute, Shizuoka University
北海道大学

大学院工学研究院

機械宇宙工学専攻

教授

渡部

正夫

Watanabe Masao (Professor)
Division of Mechanical and Space Engineering, Faculty of Engineering, Hokkaido University

1. はじめに2. ジェット洗浄

3 度目となる流体物理洗浄の紹介は、前回の超音波ジェットとは英語のJetのことで、広辞苑では、「孔口かに引き続き、幅広く使用されている洗浄手法であるジェッら流体が連続的に噴出する形態。また、その噴出物。

ト洗浄やブラシ洗浄について、現在理解されているメカ

噴流。」となっている。第一回で紹介したように、気体のニズムを紹介する。このようなシンプルな現象でさえ、未噴流のみでは洗浄効果は低い。そのため、物理的作用

解決な物理がふんだんに含まれていることを強調したが必要な洗浄物では、液滴などを衝突させることによっい。その後、微細な孔やパターンの中などの洗浄で問て高い圧力や局所的な高速な流れを発生させ洗浄を題になる、細孔内への液体侵入について私見を述べ可能としている。このような気体と液体を混合させ高速たい。

で噴射し洗浄する技術を2 流体ジェットと呼ぶが、この 2

微細な液滴群であるスプレーは、工業上幅広い分野

流体にすることのメリットや周囲気体の影響などについで使用されている。しかしジェット洗浄を行うには一工夫ては他にもレビュー記事を執筆しているのでそちらを参が必要である。その工夫や、液滴を衝突させることに考にしていただきたい 1-2）。簡単に述べれば、簡単に圧よって発生する高い圧力や速い流れはどのように形成さ縮できる気体を用いて高速な流れを作り、密度が気体れるのかを紹介する。

の 1,000 倍近い液体を加速させて被洗浄物へと衝突さ一方、接触式のブラシ洗浄はどうやって不純物を除去しているのだろうか。ブラシの種類にもよるが、まだ完せるのである。今回は高い圧力や高速な流れが発生す
る理由について紹介する。

全には理解されていない。半導体デバイス製品から洗前回の記事において、非圧縮性流体のベルヌーイの車まで幅広く使用されているPVAブラシの洗浄メカニズ定理と呼ばれる式を紹介した。ベルヌーイの式は、速度ムについて現在提案されているモデルを述べると共に、と圧力の関係を示した式であり、研究者によって行われてきた議論を紹介する。
最後に、表面を濡らしたい場合、表面張力は低い方が良いのか、それとも高い方が良いのであろうか。どうと示された。ここで、p は圧力、V は速度、ρは密度であやって液体は細孔へと侵入しているのであろうか。表面る。この式によれば、流れが遅くなる地点では圧力が高張力という分かりにくい物理量と、洗浄で重要となる濡くなる。一方で、流体の流れを急にせき止めた場合にれについて議論したい。

は、流体が圧縮され、その際の圧力上昇Δp は次式で示される。
ここで、C は音速、ΔV は速度の変化である。この圧力

16

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（通巻 238 号）

流体物理洗浄（3） ジェット洗浄、ブラシ洗浄、その他の急激な上昇は密度や音速の大きな液体で顕著に観図 1 にモデル図を示す。原点で対称な放物線が x =察され、流体が水の場合には水撃（Water hammer）と呼0の壁面へと衝突することを考える。この時、壁は剛体壁

ばれている。水道などで急激に蛇口を閉めるとカーンと（変形しない）とする。t = 0 で衝突したと仮定し、その後いう音がすることがあるが、これはこの水撃現象と関係の時刻の放物線を求めると、次式で示される。

しており、バルブ等を破壊する恐れがあり注意が必要である。
それでは、この一次元の水撃理論によって発生する

ここで、L は液滴径程度の大きさで、長さの次元を持つ

圧力を見積もってみよう。また流れをせき止めて発生す

量、V は衝突速度である。液滴が衝突して圧縮されるとるベルヌーイの定 理から導かれる圧 力とも比 較してみ考えると、y < 0 の領域の面積が圧縮されることになる。

る。V = 10 m/s 程度の水の流れを考える。水の密度はそのとき、接触点（X e, Ye）の座標を考える。この接触点

1,000 kg/m 程度、音速は1500 m/s程度となる。ベルヌーの x 座標の値は液滴が衝突後どのように変化するかをイの定理から導かれる圧力は 1/2 × 1,000 × 10 = 5×10

見るため、X e を求めると

3

2

4

Pa 程度と、1 気圧が 101.3 kPa ≒ 10 Paであることを考え
5

るとそれほど大きな値では無い。一 方、水 撃 圧 力は、となる。この接触点の速度は時間微分となるため

1,000 × 1,500 × 10 = 1.5×10 Paと150 気圧程度となる。
7

非常に大きな値である。さらに高速な場合、例えば数100 m/s程度になると、水撃圧力はさらに大きくなってしま
い、材料の降伏応力と同程度の値となってしまう。これと表される。すなわち、横方向速度 Ve は、衝突時 t = 0でが、液滴衝突によって発生するエロージョン（前回のキャ

は無限大となって発散してしまう（数学的には特異点とビテーションエロージョンも同じ）の原因となる。このよう呼ばれる）。実際には無限大の速度は無いので、t = 0に、液体の流れを急激にせき止めると非常に高い圧力を除いて考えれば良い。速度は時間と共に放物線的にが発生する。なお、液滴が衝突した際に発生する圧力減少するものの、初期の段階では非常に高速となる。

は、液滴が曲率を持つため、さらに複雑となり、局所的

実際に、数値解析や実験の観察結果においても、衝突にはこの水撃圧力よりも高い圧力が発生し、水撃圧程

速度の数倍に達することが観察されており6）、条件に度では破壊されない材料でさえも、エロージョンが観察

よっては液中の音速を大きく超える。

されることが知られている 3）。
液滴などを高速で衝突させ、局所的に高圧を発生させると、表面が振動し、その振動の加速度による慣性力
が付着力を上まわれば、表面の粒子を除去することができる。これは Hoppingや Tramplingと言った粒子除去モデルとして知られている。実際にレーザーを使って局所的にかつ短時間で対象物を熱膨張させ、その作用によって不純物が除去できることが観察されている 4）。
一方、第一回で紹介したように、流体の流れを使用して微粒子を除去する場合には粒子を回転させるRollingが主たるメカニズムである。液滴が衝突した際には高速

図 1 放物線を持つ曲率の衝突

な横方向流れが観察されることが知られているが、何以上のように曲率を持った液滴を高速で衝突させる故だろうか。場合によっては、衝突速度の数倍にもなると、単純には予想できないような様々な物理現象があり、高速な流れを発生させることができる。その理由の一つ

このような現象が洗浄に絡んでいるのである。なお、今として液滴の曲率が挙げられる。簡単な2 次関数（放物回は接触線の詳細物理については割愛したが、固体と線）を使って説明する 5）。

液体および気体の三相界面は非常に深い物理があり、THE CHEMICAL TIMES

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多くの研究者が熱心に研究を続けている 7）。
これまで説明したように、二流体ジェットでは高速な液研磨剤のように扱うメラミン系のスポンジも存在するが、今回は除外して検討する。

滴衝突が重要となる。一方で、気体と液体を混合して雑巾のようなスポンジによる洗 浄も複 数の研 究 者に噴射するノズルは様々な目的のために開発されており、よって調査されてきた。しかし、その文献を見る限りとて二流体ノズルと呼ばれるものであってもそれが洗浄に適も混乱しているように思う。例えば CMPと呼ばれる半導しているとは限らない。特に二流体用のノズルは、微細体製造プロセスの工程後の洗浄のモデルにおける提案

な液滴を発生させ、液滴の表面積を増加させることを目を見てみると、主として 2 つのメカニズムが提案され、同的にしたものが多い。そのため状況に応じてノズルは自一の著 者であっても、時 期によって主 張が異なったり、作する必 要がある。このような場 合には混 相用のノズ

その 2 つのメカニズムが同時に発生しているという説明

ル、例えば溶射技術などを参考にすれば良いだろう8）。

が多い。この洗浄工程では PVAブラシと呼ばれる高分

気相の加速だけでなく、液相の加速区間も十分に考慮子が使用されるが、その PVAブラシで提案されている2する必要がある点が重要である。すなわち液体と気体

つの洗浄メカニズムを見てみよう。

には相対速度が存在する。このことは数値解析によってノズル設計を行う際にも重要である 9）。

一つは第一回で紹介したせん断流れによって粒子がRollingを行うというものである。この洗浄メカニズムを主張している論文では、図 2 に示すように、スポンジと洗浄対象物とは接しておらず、その間の流体に速度勾配が3. ブラシ洗浄

存在し、その速度勾配によって除去されるというもので筆者の経験ではブラシ洗浄は大きく2 種類に分けらある。このような速度勾配は固体表面間では十分に考れる。1 つは歯ブラシのようにナイロン系樹脂を使用した

えられる（軸受けは、おおよそこのような速度分布と考えもので、他方は水を十分に染み込ませたスポンジ状のもられている）。しかしこの仮定には、筆者は疑問を感じのである。この 2 種類の特長について、ある展示会にてる。多孔質体とも見なせ、複数の孔が開いているスポン

洗浄用スポンジを販売しているメーカーより聞いた言葉

ジにおいて、表面は滑り無し境界条件（速度がゼロ）とが的を射ており、ここで紹介したい。その説明とは、ナイは限らない。そのため、このような速度勾配がそもそも発

ロンは「ほうき」、スポンジは「雑巾」というものである。

生しているかは自明ではなく、また信頼できる観察結果

ナイロン系の樹脂での洗浄は、ほうきとしての機能が重要となる。不純物を掃いて取り除くのである。そのた

さて、PVAブラシの研究では摩擦力を測定して、そのめ、どの程度の弾性を持っているかが重要となり、たわ

摩擦力からどのような接触状態になっているかを予測すみを持たせた後にどの程度の時間で元に戻り、その際る研究が多い。固体と表面との間に液膜があり、一定のにどの程度の力を発生させるかが詳細に調査されてい速度勾配が形成される条件になると摩擦はどうなるのでる 10）。また歯磨きなどで使用される場合には、歯磨き粉あろうか。固体間が液体で満たされて相対運動する状などとの相性や歯磨きの方法が重要となるようである。

態を流体潤滑と呼ぶが、このような状態での摩擦係数

このようなほうきにおいては、対象物に応じて工夫が必は 0.001から0.01 程度と言われている。一方で PVAブラ

要だが、洗浄のメカニズムとしては樹脂などに蓄えられシの表面との摩擦係数は、様々な研究者が測定しておた弾性エネルギーを開放する際に、その樹脂が高速でり液体のpHに依存するが、0.1から1.0程度である11-13）。

動き、粒子を除去すると言えよう。そのため、ブラシが変

これは流体潤滑とは言いがたい。そのため、単純なせ形してしまい、へたってしまったら交換時期となる。

ん断流れによって粒子が除去されているモデルは、現実

一方、スポンジによる洗浄は、十分に水を保有してい18も報告されていない。

とは異なると予想する。

るため弾性を持つ固体と粘性を持つ液体とが混在し表

なお、ロールブラシを回転させるためのトルクは測定し面をこする。この固液混相状態が洗浄メカニズムの理やすい物理量である。その際に、どの程度の粒子が除解を難しくしている。本稿では、この点について議論し去可能かを見積もるため、トルクと粒子除去の関連も検てみたい。スポンジをこすることによって一部脱落させ、討されている 14）。しかしその解析手法は、一定の速度

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流体物理洗浄（3） ジェット洗浄、ブラシ洗浄、その他

勾配を持つ液膜が存在すると仮定し、この速度勾配にけの接触面積の 1％程度、1 つの真実接触点の大きさ

よって散逸するエネルギーとブラシを回転させるためのトは 10 µm 程度かそれ以下と言われている 16）。接触してルクによる仕事が釣り合うとの仮定によって、液膜厚さをいるように見えても、ミクロスケールで見てみれば接触し見積もる解析となる。
しかしながら、そもそもブラシを回転ている箇所は非常に限られている。そのため、PVAブラさせるための仕事は、液膜内での粘性散逸のみとは限シの場合を考えてもブラシと表面の微小パーティクルがらず、ブラシを回転させるための仕事と表面摩擦による直接接触する確率は極めて低いことが予想される。以

仕事の組み合わせであるため、その仮定から間違って上ように接触と言っても未だに未解明な点は多い。

おり、結果が正しい保証は無い。

なお、筆 者らの研 究によって、ブラシと表 面の摩 擦は、特にロール型ブラシを使用する際に対象物濡れ性に依存することや、ブラシの粘弾性とノジュール
（表面の
突起物）
によって局所的に摩擦力を増加させることができることなどを示した。詳細は文献を参照されたい 17-18）。
今後、よりミクロな領域での研究を続ける予定である。

図 2 PVAブラシの洗浄モデル 左：rolling、右：full-contact 15）

4. 微細パターンへの液体侵入

もう一つのモデル洗浄モデルは、付着である。図 2に示

洗浄対象物は平坦とは限らない。このような表面を洗すようにブラシが接触する際に、表面に存在する不純物

浄する際には、液体と表面の濡れ性や液体自身の表面がブラシと付着し、取り除かれるというメカニズムである。

張力が重要となる。微細パターン内の洗浄を行う際に、雑巾等で表面を掃除すれば、雑巾が汚れるため、まず予洗浄液がパターンに入らない限り効果的な洗浄が期待

想するメカニズムである。しかし、微小なスケールの不純できないためである。本節ではこのような凹凸を持つ表面物の除去を考えると、それほど現象は単純では無い。

において、表面はどのように濡れるのかを検討する。表面

例えば、ブラシ洗浄のモデルに関するNortheastern

張力の説明には力の考え方とエネルギーの考え方があ、様々な理論を用いるが、筆者には界面近傍分子の圧力テンソルの非等方て表面に存在する微粒子除去メカニズムを検討してい性という力の概念が分かりやすい 19）。しかし、この表面る。前述した rollingによる作用では、微粒子を除去する

張力の概念は難解であり、その説明のみで一つの解説

ことは困難で、直接接触（full-contact）
によるモーメントをになってしまうためここでは省略する。参考のため、表面評価している。直接接触で得られるモーメントは、除去

張力をイメージするのに優れた文献を引用しておく20-21）。

に必要な値に比べ 1015 倍以上も大きなオーダーであり、

なお、最近、細管内に液体が侵入している際の現象を

このメカニズムであれば 100％除去可能である。しかし説明するにはエネルギーのみでは不十分で、力の概念

現実には 100％除去することは困難であり、このような付が必要だという主張の論文も報告されている 22）。

Universityのグループの論文では

15）着力が発生していれば、洗浄後ブラシに接触した粒子

さて、表面張力と濡れおよび洗浄に関して以下のようは取り除くことが出来ないだろう。しかし、実際のプロセな説明が一般的である。例えば、なぜフッ素系洗浄剤

スでは、PVAブラシは繰り返し使用され、洗浄時には粒が精密部品などの微粒子洗浄に用いられるか、という子を表面から取り除き、その後クロスコンタミネーション

質問であれば、洗浄液の表面張力が小さいからという防止のため、ブラシから粒子を取り除く必要があるため、答えである。表面の微細な隙間に洗浄液が入り込むこそれほど単純では無いことが予想される。

とが容易であるからである。表面張力が低い方が微細

一般的に摩擦は、真実接触面積と呼ばれるミクロス
ケールで実際に表面と接している面積に強く関連しておな隙間に洗浄液が入りやすいのだろうか。ここで、力学的視点から表面張力による濡れを考えてみよう。

り、見かけの接触面積とは大きく異なる。ここで一般的

まず、表面張力が低いほど濡れるとは、どのような場な固体において、真実接触面積は荷重に比例し、みか合であろうか。例えば同じ表面エネルギーを持った固体

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19

の場合には、液体の表面張力が低いほど、接触角は小接触角θで正負が逆転することからも、濡れやすさを接さくなる。例えば図 3 に示すように、比較的表面エネル

触角によって整理できることが理解できるだろう。この点

ギーの小さな高分子の膜の上では、表面張力の大きなにおいても、同じ材料であれば、接触角が重要となる。

水は丸くなり接 触 角は大きく、表 面 張 力の小さなアル視点を変えこの毛管現象について、細管の大きさにコールは接触角が小さい。先ほどの回答は、このようなついて考えてみる。式によれば、管が小さいほど上昇量

考え方に依存していると予想する。これは、油汚れなどは大きくなる（図5）。接触角が異なる場合でも、管が小さの除去のイメージ図と一致する。例えば図 4 のような油くなることで上昇量を同じにすることができる。これは検が水中の表面に存在した際に、界面活性剤を添加した討している系における表面張力の支配度を示しており、とする。界 面 活 性 剤の添 加は接 触 角を徐々に変 化さ微細な管では重力などの作用に比べ表面張力が支配せ、最終的に油が離脱する。ローリングアップと呼ばれ的になることを意味する。

る現象である。この際には、表面張力を低くすることで水の濡れが促進し、油の除去が可能となる。すなわち表面張力を低くすることで、表面と油の間にその液体が濡れていくのである。

図 3 シリコンラバー上の液滴（左：水

右：エタノール）
図 5 毛細管現象

このような視点から表面張力を考えるとどうであろうか？ つまり細管では、通常の管に比べて表面張力が支配的であり、表面張力が（相対的に）大きいから上昇量が大きくなるといえる。例えば、筆者は以下のような質問を頻繁に受ける。近年のパターンの微細化によって洗浄液が細孔に入らなくなる。どうすれば良いか。この回答として言えることは、同じ材料である限り、孔が小さく
図 4 界 面 活 性 剤によるローリング
アップモデルなることで洗浄液が入らなくなることは無い。むしろ、小さな孔の方が表面張力が（相対的に）大きくなって、入りやすくなるはずである。入らないのは、新規材料等を導一方、凹凸や微細なパターンなどを持った表面の場

入することによって、そもそも接触角が大きな液体と材料合どうであろうか？例えば毛細管現象という微細な管のの組み合わせであることが多い。これらの効果は微細中を液体が上昇（もしくは下降）する場合を考える。図 5になればなるほど強調されるため、問題が表面化するに示すように固体表面上の接触角と同様に考え、濡れのであろう。

やすい細管、例えばガラスなどは液体が上昇する。逆細管の先端が封じられている場合はどうであろうか。

に、濡れにくいテフロンなどの細管では下降してしまう。

このような場合には、表面張力と空気の溶解、外部圧

この際の上昇（下降）量 h は、力が重要となる。液体が侵入するということは、気体の体積を小さくすることで、気体の液体への溶解や気体排出のための流路が確保されない限り、圧力が上昇しで示される。ここでσは表面張力、d は細管径である。

20

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（通巻 238 号）てしまうためである。これらに関しては、空気の溶解の流体物理洗浄（3） ジェット洗浄、ブラシ洗浄、その他

みでの見 積もり23）や実 験による調 査 24）が報 告されている。著者らの見積もりによれば、数ミリメートルから数

参考文献

十マイクロメートルまでは表面張力は支配的では無く、

1）真田俊之 , 渡部正夫 , 関映子 , 林田充司 . 砥粒化工学会誌 .
2011, 55（11）
, 640-643.

侵 入のためには外 圧が必 要となる。すなわち二 流 体2）真田俊之 , 渡部正夫 . エアロゾル研究 . 2014, 29（4）, 236-240.

ジェット等の液滴の衝突が必要である。さらにサブマイ

3）Kennedy, C.F.; Field, J.E. J. Mater. Sci. 2000, 35（21）, 53315339.

クロメートルの微細管になれば、表面張力が支配的となり気体が圧縮され高圧に、気体が高圧になればヘンリーの法 則によって溶 解が促 進されるという現 象が予測できる。すなわち、管が小さいほど液体侵入は問題では無くなるのである。なおナノスケールの表面では表面ナノバブルなど、まだ物 理 学の問 題としても活 発に議論がされている話題もある。また、ナノスケールでは
表 面 張 力の作 用を大きくすれば（接 触 角が 小さけれ
ば）液体は簡単に侵入するが、一方で乾燥時のパター
ン倒壊の原因となりうる。そのため接触角の制御が重
要となる

。

25）

4）Kudryashov, S.I.; Allen, S.D. J. Appl. Phys. 2002, 92（9）, 51595162.
5）Lesser, M. Drop-Surface Interactions CISM International
Centre for Mechanical Sciences. Rein, M., ed. Springer Vienna,
2002, 456, 39-102.
6）Tatekura, Y.;Fujikawa, T.; Jinbo, Y.; Sanada, T.; Kobayashi,K.; Watanabe, M. ECS J. Solid State Sci. Technol. 2015, 4(9),N117-N123.
7）Snoeijer, J.H.; Andreotti, B. Ann. Rev. Fluid Mech. 2013, 45,
269-292.
8）片野田洋 , 山本秀樹 , 松岡武司 , 松尾一泰 . 日本機械学會論
文集 B 編 . 2006, 72（714）, 271-278.
9）Sanada, T.; Mitsuhashi, Y.; Mizutani, H.; Saito, T. Nuclear
Engineering and Design. 2010, 240（12）, 3974-3983.

6. 流体物理洗浄のまとめと謝辞
3 回に渡って流 体が絡む物 理 洗 浄について紹 介を行った。今回紹介したように、その物理現象は非常に

10）Vanegas Useche, L.V.; Abdel Wahab, M.M.; Parker, G.A. J.
Sound Vib. 2007, 307（3-5）, 778-801.
11）Philipossian, A.; Mustapha, L. J. Electrochem. Soc. 2004, 151（7）, G456-G460.

複雑であり、未だに解明されていない事項も多い。その

12）Dedy, N.; Hong, L. J. Tribol. 2008, 130（2）, 021603-021603-5.

ため技術開発の際には試行錯誤になり易い。一方で、

13）Fujiwara, T.; Sanada, T.; Fukunaga, A.; Hiyama, H. Solid State
Phenomena. 2013, 195, 213-216.

単なる試 行 錯 誤 のみによらず、原 理 原 則に従えば、様々な洗浄可能性も見えてくる場合が多い。試行錯誤の際にも、メカニズムを再考することで、検討しなかった

14）Xu, K.; Vos, R.; Vereecke, G.; Doumen, G.; Fyen, W.; Mertens,
P.W.; Heyns, M.M.; Vinckier, C.; Fransaer, J.; Kovacs, F. J. Vac.
Sci. Technol. B. 2005, 23（5）, 2160-2175.

いただきたい。なお、この物理洗浄という技術は広範囲

15）Busnaina, A.A.; Lin, H.; Moumen, N.; Feng, J.; Taylor, J. IEEE
Transactions on Semiconductor Manufacturing. 2002, 15（4）,374-382.

で使用されているにも関わらず、その基本概念が体系

16）松川宏 . 摩擦の物理 . 岩波書店 , 2012, 116p.

パラメータが浮上する可能性もある。ぜひ、再検討して的に整理されているとは言い難い。他の技術と比べ、論文等も極めて少ない。そのため、これからも体系化に向けて研究を続ける予定である。
最後に、本研究遂行には科研費等の支援を受けたものが多く、また多く知見は、共同研究の成果として得られたものである。特にアクアサイエンス株式会社との 2
流体ジェットの共同開発、および株式会社荏原製作所との PVAブラシの洗浄メカニズム解明の共同研究によ17）Hara, Y.; Sanada, T.; Fukunaga, A.; Hiyama, H. Solid State
Phenomena. 2015, 219, 148-152.
18）Hara, Y.; Sanada, T.; Fukunaga, A.; Hiyama, H. ECS J. Solid
State Sci. Technol. 2015, 4（5）, 141-148.
19）小野周 . 表面張力 . 共立出版 , 1980, 146p.
20）Berry, M.V. Phys. Educ. 1971, 6（2）, 79-84.
21）Marchand, A.; Weijs, J.H.; Snoeijer, J.H.; Andreott, B. Am. J.
Phys. 2011, 79（10）, 999-1008.

る経験に依存している点が多い。また応用物理学会界

22）Extrand, C.W.; Moon, S.I.; Langmuir. 2012, 28（44）, 1562915633.

面ナノ電子化学研究会での交流によっても様々な知見

23）Olim, M. J. Electrochem. Soc. 1997, 144（12）, 4331-4335.

を得た。ここに記して関係者への謝辞としたい。

24）Ota, K.; Tsutsumi, A. ECS Trans. 2007, 11（2）, 299-306.
25）Ogawa, Y. Solid State Phenomena. 2012, 195, 7-12.

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21

1 細胞ゲノミックスの為の試薬と環境
DNA-free phi29 DNA ポリメラーゼの開発
Reagents and environment for single cell genomics
高橋

宏和① , ② , ③、岡村好子① , ②、小堀俊郎③

Hirokazu Takahashi, Yoshiko Okamura, Toshiro Kobori①広島大学大学院 先端物質科学研究科
Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University②独立行政法人科学技術振興機構 , CREST, 広島
CREST, Japan Science and Technology Agency (JST), Hiroshima③（独）農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所
National Food Research Institute, National Agriculture and Food Research Organization

短く、特に NGSではさらに短いため、様々な微生物種のはじめに膨大な短い断片情報の中から、断片化前のゲノム配列

人類にとって微生物は重要な生物資源であり、これを再構築して有用遺伝子を探索することは非常に困難

までに様々な酵素が微生物から発見され、食品加工やである。そのため、メタゲノム解析で新規有用遺伝子を医薬品製造など多くの産業分野で利用されている。し

単離したという報告は、メタゲノム解析の報告数に比べかし、従来の微生物研究は単離・培養を基本技術として格段に少ない。

ていることから、これまでは培養可能な微生物しか有用

そこで近年では難培養微生物の生態や生理機能を酵素の探索対象にされてこなかった。このため、地球上解析する方法として、シングルセルゲノミクス（single cellに存在する微生物種の 99% 以上を占めると言われていgenomics）と呼ばれる手法が提案されている 3）。これは、る培養が困難または不能な難培養微生物の生態につ

環境中の微生物群集から微生物 1 細胞を単離し、全ゲ

いては現在もほとんど解析が進んでいない。従って、難ノム増幅（Whole genome amplification, 以下 WGA）と呼培養微生物は生物資源として非常に大きな潜在的可ばれる手法でゲノムDNA 全体を複製し、複製したゲノ

能性を秘めているにも関わらず、未だ手付かずの状態

ム DNA の塩基配列を決定する方法である。微生物 1である 。

細胞から全ゲノム配列の解析が可能となれば、培養す

1）22これら難培養微生物を解析する方法としてメタゲノム

ることができない微生物であってもゲノムDNAの情報か解析という手法が主に利用されてきた。メタゲノム解析

ら生態や生理機能を推測することができ4-5）、さらにはゲ

は、海水や土壌など環境サンプルに含まれる微生物群

ノム配列情報から難培養性微生物の培養条件の推定集や、糞便に含まれる腸内細菌群集の DNAをまとめてや、新規有用遺伝子群を探索することも可能であるとさ

回収し、その塩基配列をそのまま大量解読する手法でれている。この WGAに最適な増幅方法として、10 年ほ

ある 2）。メタゲノム解析はサンプルに含まれる微生物のど前からphi29 DNAポリメラーゼ（以下、phi29 DNAP）

種類やその構成等を解析するには非常に有効な手法を利用した Multiple displacement amplification（ MDA）

であり、特に次世代シークエンサー（NGS）の登場によっ法 6）が有力な方法として今日最も多く利用されている。

て解析量が飛躍的に拡大してからは、メタゲノム解析

しかしながら、実際に MDAをシングルセルゲノミクスにの報告は年々増加増傾向にあり、例えば、腸内細菌の適用するためにはいくつかの問題が存在している。

種類比が肥満に関与していることや病気との因果関係

本報ではまず初めに、シングルセルゲノミクスのキーポなどが示唆されている。しかしながら、シークエンサーでイントであるWGAに適した試薬としての DNA-free phi29

解読できる個々の塩基配列長は長くても600 bp 程度とDNAPの開発について報告する。

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1 細胞ゲノミックスの為の試薬と環境

DNA-free phi29 DNA ポリメラーゼの開発て、（1）増幅バイアスが起きにくい、（2）全ゲノム配列に対

phi29 DNAPとMDA 法

するカバー率が高い、（3）増幅後の収量がマイクログラ

phi29 DNAPは、枯草菌（Bacillus subtilis）に感染する

ムからミリグラムオーダーと非常に高い、などがあり、限ら

7）

バクテリオファージphi29が持つDNAポリメラーゼである 。

れた数の細胞や貴重なサンプルもMDA で試料 DNA 全

phi29 DNAPは、（1）30℃付近で活性を持つ、（2）強い 3ʼ

体を複製することにより、様々な遺伝子解析に用いること→ 5ʼエキソヌクレアーゼ活性を持ち、複製のエラー率がが可能になる。実際 MDA は現時点で最も主力となる

極めて低い、（3）DNA 合成速度が速い、（4）一度の反WGAであり、既に海外メーカーでキット化されている。

応で長い DNA（70 kb 以上）を合成できる、そしてなにより（5）強い鎖 置 換 活 性を持ち、伸 張 方 向にある 2 本 鎖
DNAをほどきながらDNA 合成を進めることができる（図

MDA の問題点

1）、といった他の DNAポリメラーゼにはないユニークな特MDAは極わずかな試料 DNA でもDNA 全体を正確徴を持つ。phi29 DNAPのこのような特徴を最大限に利用かつ大量に複製することができる革新的な技術である。

したMDAの増幅原理 は図 2に示す。MDAの特性とし

しかし、MDAはその増幅原理から、反応溶液に含まれ6）

る全ての DNA が増幅されてしまう。そればかりか反応
溶液に試料 DNAを添加していないにも関わらず、試料DNAを添加した場合とほぼ同等量の増幅産物が検出され（図 3）、何らかの DNA が非特異的な増幅産物として生成されたことが分かる。また、極めて微量の試料
DNAを MDAに用いた場合、試料 DNAに対する夾雑
DNAの割合が高くなり、結果として非特異産物が大部分を占めることになり、実験結果の信頼性を揺るがす大きな問題になる。このように、増幅産物の有無または増幅量だけでは目的の DNA が増幅されたかどうかを判断できないため、増幅産物が目的の試料 DNAに由来するかどうかを検証する何らかの方法、例えば制限酵素切
図 1 phi29 DNAポリメラーゼによるDNA 合成の模式図
phi29 DNAポリメラーゼは強い鎖置換活性を持ち、伸張方向にある2 本鎖DNAをほどきながら（鎖置換反応）、DNA 合成はそのまま継続される。

断によるバンドパターンの解析や PCRによる既知領域の増幅等が必要である 8-9）。

図 3 MDA 反応産物のアガロース電気泳動結果
（+）
鋳型有り、
（−）
鋳型無し、MはDNAサイズマーカー。全ゲノムMDA 反
応産物は非常に大きな長さになるため、ゲノム DNA の電気泳動同様に約20 kb 近辺に滞留する。

例として、既に市販されているphi29 DNAPを用いて試料 DNA（pUC19）
で MDA 反応を行い、増幅産物を制図 2 MDA 法の全ゲノム増幅模式図

限酵素（BamH Ⅰ／EcoR Ⅰ）で切断した結果を示す（図THE CHEMICAL TIMES

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（通巻 238 号）

234）。pUC19 DNAに由来する増幅産物は図中に黄色の菌のゲノム DNAを吸着し、精製した酵素溶液に夾雑

矢印で示した約 2.7 kb の明瞭なバンドとして検出され、DNAとして混入するものと考えられている。このような夾

pUC19 DNAに由来しない非特異産物（赤矢印）と区別

雑 DNAによるDNA 合成酵素の汚染は、PCRで用いられすることができる。試料 DNAが多い場合は pUC19 DNA

る耐熱性 DNAポリメラーゼでも報告 10）されており、このた

由来の増幅産物が検出されるが、試料 DNA が少なくな

め PCRは非常に高感度であるにもかかわらず、これまでるにつれ pUC19 DNA 由来の増幅産物は認められず、

特に原核微生物感染症診断には積極的に利用されてこ非特異産物だけが検出されることが分かる。しかしながなかった経緯がある11）。そこで我々は関東化学株式会社

ら、配列情報が不明な難培養微生物ではこのような検と共 同で、phi29 DNAP の DNA-free 化を図ることで、証を行うことができないため、配列解析の結果が出るま

MDAにおける非特異産物の抑制を目指すこととした。

で「何が増幅されたか判らない」という状況にある。
従来法によるphi29 DNAP の精製
DNA に高い親和性を示す酵素の精製方法として、
DNA 分解酵素（以下、DNase）により夾雑 DNAを分解除去する方法が一般的に用いられてきた 12）。PCR 法に使用される耐熱性の DNAポリメラーゼでは、非耐熱性のDNaseを用いて夾雑 DNAを分解した後、加熱処理に
図 4 増幅産物を制限酵素 BamHⅠ/EcoRⅠで切断後に電気泳動した結果
pUC19 由来の産物は2.7 kb の明瞭なバンド（黄矢印）
を示すのに対し、非
特異産物
（赤矢印）
は制限酵素で切断されないため区別が可能。

し かし、phi29 DNAP は 中 温 性 の 酵 素 であるため、
DNase だけを熱 変 性させることはできない。そこで、

このように試料 DNA が少ないほど、非特異産物のリ

phi29 DNAPを精製用タグとの融合タンパク質として大スクが高まるため、既報の MDA 法の推奨プロトコルで腸 菌に発 現させ、アフィニティーレジンにタグを介しては、安定した増幅産物を得るために、1 ナノグラム以上

phi29 DNAPを固定化し、DNaseと分解した夾雑 DNAを（ヒト細胞で 10 細胞分、大腸菌で 10 細胞分）の試料洗浄除去する方法をまず始めに検討した（図 5A）。

3

6

DNAを要求している。したがって、MDAによる再現性・

本精製方法を用いて、DNaseとしてDNA 断片の末端

信頼性の高いシングルセルゲノミクスを行うためには、こから分解する酵素、DNA 断片の内部から分解する酵の非特異産物の問題を原因から解決する必要があっ

素、2 本鎖 DNAを分解する酵素、1 本鎖 DNAを分解すた。その原因は、増幅に使用するランダム DNAプライる酵素など種々の DNaseを用いて夾雑 DNA の分解除マー同 士 による増 幅と phi29 DNAP に 夾 雑している去を試みた。しかし、何れの DNaseを用いて調製した

DNA 由来の増幅であるとされ、国内外の研究者がこの

phi29 DNAPも全ゲノム増幅法において、非特異産物を問題におよそ 10 年以上も取り組んでいる。

抑えることはできなかった（図 5B）。この 原 因として、

我々はまず、プライマーの構成をDNAからRNAに変更

phi29 DNAPとDNase が立体的に干渉し、phi29 DNAPすることによって、プライマー由来の非特異産物を抑制すと結合した DNA 分子に DNase が接触できなかったのでることに成功した 9）。phi29 DNAPは逆転写酵素活性を持はないかと推測した。また、逆に DNase 由来と思われる

たないため、RNAを鋳型としては使えないが、プライマーとDNAの混入が一部で観察された（図 5C）。さらには、本しては使えるためである。しかしながら、RNAプライマーの精 製 方 法 は 大 量 の DNase を 使 用 するため、phi29

利用によって、phi29 DNAPに夾雑しているDNA が増幅

DNAP からDNaseを完全に洗浄・除去することが非常結果に直接影響すること、すなわちphi29 DNAP 製品のに困 難 であることも判 明した。同 様な DNase 残 存 や

ロット間差がより明確に結果に現れるようになってきた。

DNA 混入は、耐熱性 DNAポリメラーゼの DNA-free 化

phi29 DNAPは遺伝子組換え大腸菌で生産されるため、生産過程や精製過程において、phi29 DNAP が大腸

24

よりDNaseだけを熱変性により失活させることができる。

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でも報告 11-12）があったため、DNaseに依存しない全く新しい精製方法を検討することとした。

1 細胞ゲノミックスの為の試薬と環境

DNA-free phi29 DNA ポリメラーゼの開発

一方で菌体を破砕すると、菌体から溶出される高分子ゲノムDNAが破砕液粘度の上昇を引き起こすため、
一 般 的には超 音 波 処 理や DNaseによる DNA 断 片 化処理が行われる。しかし、この断片化処理が強いとゲ
ノムDNAとphi29 DNAPの吸着を促進する傾向が見られた。そのため、菌 体 破 砕 液の粘 度 低 下を確 保しつつ、ゲノム DNA の断 片 化を極 力抑える条 件を検 討した。その結果、DNase（ Benzonase ™ , Millipore 社）
を用い、100 mM NaCl 存在下で氷温下、5 分間処理する条件が最適と判断された。さらにこの菌体破砕液に PEI溶液を添加することでゲノムDNAを不溶化させ、遠心分 離により菌 体 破 砕 物 残 渣と一 緒にゲノム DNAを沈殿 物として除 去した。結 果 的に菌 体 破 砕 液で検出された DNAは、PEI 添加後の遠心上清にはアガロースゲ
ル電気泳動レベルでの確認では全く検出されず、大部分のゲノムDNAを菌体破砕液から速やかに除去することが可能となった。
（2）EMAによるdsDNA の不活化
PEI 処理により大部分のゲノムDNAは除去されるが、phi29 DNAPと結合したDNA断片は残存したままである。
耐熱性 DNAポリメラーゼの場合、残存 DNAに対し短波長の紫外線（260 nm）を照射することにより、DNAを不活化することがこれまでにも行われてきた。しかしながら、紫外線照射は phi29 DNAPそのものにもダメージを与え活性の低下を引き起こすばかりか、完全に残存 DNAを不活化することができないことが報告されている 14）。
図 5 従来法によるphi29 DNAP の精製（A）
DNaseを用いた非耐熱性酵素の精製工程。
（B）
従来法で精製した酵
素による増幅結果その 1。
（C）
従来法で精製した酵素による増幅結果その2。増幅産物はBamHⅠ/EcoRⅠで切断後、電気泳動している。M, 1kb
DNA サイズマーカー；NTC, no template control.

そこで、酵素活性には影響を与えない可視光を照射することで、2 本鎖 DNA（以下、dsDNA）
を架橋可能なエチ
ジウムブロミドモノアジド（以下、EMA）
を利用して、残存するDNA 分子を不活化する方法 15）を検討することとした。

新たな精製方法の開発（1）PEIによるゲノムDNA の沈殿除去

EMA は低分子の化学物質であるため、高分子である
DNaseのように立体障害を受けることなく、phi29 DNAPに結合したdsDNAにも作用することができると考えられる。

phi29 DNAPを大腸菌から抽出する過程で、ゲノム光源としては、これまで利用されてきたハロゲンランプ

DNAを速やかに分離することが有効と考え、既に古典や 蛍 光 灯 では 無く、市 販 品 の 白 色 発 光ダイオード

的な方法となりつつあるが、マイナスに荷電した DNA 分（LED）
ランプを利用した。白色 LEDランプは酵素にとっ子をプラスに荷電した分子、特に現存する素材の中でて有害な紫外線領域の波長を一切含まず、EMA の吸最もカチオン密度が高いポリマーであるポリエチレンイミン

収波長（456 nm, 青色波長）を含む。また、LEDランプは（以下、PEI）で電気的に中和することで DNA 分子を沈

発熱量が低いため、40℃以上ではすぐに失活してしまう

殿させる方法を検討した 13）。

phi29 DNAPにとっては、熱の影響を回避しながら、不THE CHEMICAL TIMES

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活化に必要な量の可視光を照射することが可能となり、を抑制する方法、例えば非イオン性の界面活性剤等の結果的に phi29 DNAPの失活を防ぎながらEMAによる添加物を検討した。その結果、酵素溶液にトレハロース

dsDNAの不活化に成功した。

を添加することで、phi29 DNAPの凝集を抑制できることを見出した。トレハロースは phi29 DNA 合成酵素の活性（3）phi29 DNAPによるssDNA の分解を阻害しないため 18）、phi29 DNAPを30℃付近で加温す

EMAによるDNA 不活化処理は dsDNAを架橋するもることができ、かつphi29 DNAPの3ʼ→ 5ʼエキソヌクレアーのであり、1 本鎖 DNA（以下、ssDNA）
を不活化すること

ゼ活性を利用した ssDNAの分解除去が可能となった。

はできない。その一 方で、phi29 DNAP は dsDNAより

これまでに検討してきた（1）PEIによるゲノム DNA の

ssDNAに対して親和性が高い。さらに phi29 DNAPを利迅速な沈殿除去、（2）白色 LEDとEMAによる夾雑 2 本

用した DNA 増幅では ssDNAも非特異産物の原因にな

鎖 DNAの不活化、（3）phi29 DNAPによる夾雑 ssDNAることからの分解除去の 3 工程を組み合わせ、新たなDNAポリメ、ssDNAの混入に対しても新たな対策が16-17）

必要であった。そこで、我々は phi29 DNAP自身が持つ強い 3ʼ→ 5ʼエキソヌクレアーゼ活性に着目し、ssDNAを分解することができないか検討することとした。

ラーゼの精製方法として確立した（図 6）。
本精製方法で調製した phi29 DNAPの SDS-PAGEの結果を図 7に示した。本精製方法により、タンパク質の純

phi29 DNAP は 30℃付 近 で高 い 活 性を持 つため、度としてシングルバンドの phi29 DNAP（ 約 67 kDa）
を調

ssDNAを分解するためには 30℃付近で加温する必要が製することができた。収量は大腸菌 1 g 当たり約 1.5 mgある。しかし、精製途中の phi29 DNAPは非常に不安定であり、phi29 DNAP 精製の原著論文 19）とほぼ同程度であり、30℃付近で加温すると凝集体を生じ、収量が著（50 mg/40 g of cells）かそれ以上を確保できている 20）。

しく減少する問題が生じた。そこで、phi29 DNAPの凝集

図 7 各精製工程の SDS−PAGE 結果
M, サイズマーカー；1, 大腸菌破砕液；2, PEI 沈殿後上清；3, カラム非吸
着画分； 4, タグ切断前レジン； 5, タグ切断後レジン； 6, 精製画分
（グリセ
ロール添加前）； 7, 精製画分（グリセロール添加前）； 8, 市販酵素（1µg）
。
黒矢印はGST-phi29、赤矢印はphi29 DNAP
（64kDa）を示す。

（4）DNA-free phi29 DNAP の品質評価
新たに開 発した精 製 方 法で調 製した高 純 度 phi29
DNAPの品質を評価するため、本酵素をMDAに適用した（図 8）。試料 DNAとしてpUC19 DNAを用いて、MDA
での 検 出 下 限を調 査した 結 果、わ ず か 10 コピーのpUC19 DNAを特異的に増幅することが可能であった。
10コピーの pUC19 DNA は約 30アトグラム（3×10−17 g）
であり、大腸菌 1 細胞のゲノムDNAが約 5フェムトグラム（5×10−15 g）であることから、10コピーの pUC19 DNAは大腸菌ゲノムDNAの約 100 分の 1 量に相当する。
このことから、今回我々が開発した DNA-free phi29
図 6 新しく開発した非耐熱性ポリメラーゼの精製工程の模式図

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DNAPを利用して MDAを行うことにより、微生物 1 細胞

1 細胞ゲノミックスの為の試薬と環境分のゲノムDNAを試料としても、十分に特異的に増幅できるものと考えられる。

DNA-free phi29 DNA ポリメラーゼの開発

参考文献
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図 8 MDA 増幅産物の電気泳動増幅反応には開発した精製方法で精製したphi29 DNAポリメラーゼを用いた。増幅産物はBamHⅠ/EcoRⅠで切断後、電気泳動している。M, 1kb
DNA サイズマーカー；N, no template control.

まとめ
今回我々はDNA合成酵素の新たな精製方法を開発
し、DNA-free phi29 DNAポリメラーゼの生産に成功した。本酵素をMDAに適用することで、夾雑 DNA の混入による非特異的なDNA 増幅を大幅に抑制することが可能となった。この結果、適切な条件で本酵素をMDAに用いれば、十分に 1 細胞分の DNAでも全ゲノム解析
が可 能なまで増 幅 可 能となる。本 方 法で精 製された
phi29 DNAPは、平成 26年 12月に「phi29 DNAポリメラー
ゼセット」
として販売が開始されている。
その一方で、本酵素とMDAを利用して DNA 増幅に使用する際には非常に注意しなければならない別の問
題もより明確となった。ある程度予想はしていたことではあるが、MDA 増幅反応を行う実験環境そのものが、増幅結果に多大な影響を与えることがこれまで以上に明確になってきた。実験環境そのもの、特に空気中に浮遊している微生物や細胞の死骸由来の DNA が、直接 DNA
増幅結果に影響をもたらすことは、これまでにも感染症検査や、古生物の DNA 増幅、法医学検査でもしばしば指摘されていた。MDAではその増幅原理のため影響が大きく、これまで PCR で取られてきた実験環境対策では不十分であることがより顕著になった（論文投稿中）。すな
わち、内在性の DNAコンタミネーション問題を解決した先にあったのは、外因性DNAコンタミネーション問題である。
次の機会に、シングルセルゲノミックスのみならず、DNA増幅を行う為の実験環境の重要性とその対策について報告する。

4）Hongoh, Y.; Sharma, V.K.; Prakash, T.; Noda, S.; Taylor, T.D.;
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Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105（14）, 5555-5560.
5）Hongoh, Y.; Sharma, V.K.; Prakash, T.; Noda, S.; Toh, H.;
Taylor, T.D.; Kudo, T.; Sakaki, Y.; Toyoda, A.; Hattori, M.;
Ohkuma, M. Science. 2008, 322（5904）, 1108-1109.
6）Dean, F.B.; Hosono, S.; Fang, L.; Wu, X.; Faruqi, A.F.; BrayWard, P.; Sun, Z.; Zong, Q.; Du, Y.; Du, J.; Driscoll, M.; Song,W.; Kingsmore, S.F.; Egholm, M.;Lasken, R.S. Proc. Natl.
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最 近 の ト ピ ッ ク ス
検査が難しい脂質要求性の酵母様真菌
検査が難しいとされる脂質要求性酵母様真菌Malassezia 表１ Malassezia 属真菌の関与が認められている疾患と起炎菌
属真菌は、特殊な脂質要求性を有する皮膚の常在酵母です。ヒトでは頭部、顔面、前胸部、上背部、頚部などに存在し、疾患としては、癜風、マラセチア毛包炎、マラセチア外耳
また、IVHカテーテル
道炎の起因菌として知られています1，2）。
3）に関連したマラセチア菌血症の報告 も相次いでおり臨床上重要な病原微生物として認識されるようになりました（表1）。近年では、脂漏性皮膚炎やアトピー性皮膚炎の増悪因子としても注目されてきています1）。
起因菌の菌種を同定して診断を確定するためには培養検査が必要であり、起因菌の分離率を高めるためには、適切な培地を選ばなくてはなりません。
利用する培地によって、属レベルの鑑別は比較的容易に分けることができ、特に、Candida属についてはクロモアガー カンジダのような酵素基質培地を用いる
ことにより主要菌種を鑑別することが可能となっています4）。
しかしながらMalassezia属真菌に対しては、適切な分離培地が上市されていなかったこともあり、分離
培養同定はほとんど実施されていませんでした。そ 図1 代表的なMalassezia 属真菌のクロモアガーマラセチア／カンジダ上の培養所見のような背景のもと開発されたクロモアガー マラセチ
ア／カンジダ生培地は、Malassezia属真菌の分離の良好な脂質を添加した酵素基質培地です。本培
地上では、培地中に白色沈殿物を形成する群（M.
pachydermatis、M. sympodialis、M. dermatis、M.
globosa）と形成しない群（M. restricta、M. furfur、M.
slooffiae、M. obtsusa、M. japonica）に大きく分けることもできます（図1）。また、M. furfurは菊花状のコロニーを形成し、本所見をもって簡易鑑別できます。M.
pachydermatisのように脂質要求性が無く、Malassezia
様の酵母形態が認められる場合や、M. restrictaのよ
うにカタラーゼ反応が陰性であれば、この性状をもっ
図2 表現形を利用したMalassezia 属真菌の簡易菌種同定法て菌種鑑別できます。臨床上重要とされるM. furfur、
参考文献
M. restricta、M. globosa、M. pachydermatisなどは図2の方
5）1）清 佳浩. : Malassezia関連疾患. 真菌誌 47 : 75-80. 2006.
法 により簡易培養同定できるようになりました。
表現形質に基づくMalassezia属真菌培養・鑑別・同定法 2）塩田量子、金子孝昌、矢野裕明ら. : Malassezia属真菌を含む健常人外耳道微生物叢と外耳道炎．
医学検査 59 : 1131-1136. 2010.
また、 3）Ashbee HR., Evans EG. Immunology of diseases associated with Malasseziaについて述べましたが、培養同定には限界があります。
species. Clin Microbiol Rev 15 : 21–57. 2002.
分子生物学の進歩に伴い、多くの病原真菌が分子系統解4）Odds FC, Bernaerts R : CHROMagar Candida, a new differential isolation
析結果に基づいて再分類されています。今後も、新菌種報
medium for presumptive identification of clinically important Candida
species. J Clin Microbiol 32 : 1923-1929, 1994.
告や再分類が行われれば改善が必要となることを最後に書5）Kaneko T, Makimura K, Abe M et al. : Revised culture-based system for
き添えます。
identification of Malassezia species. J Clin Microbiol 45 : 3737-3742. 2007.

C K
表紙写真：ヤナギラン（撮影／北原音作）〒103-0022 東京都中央区日本橋室町2丁目2番1号
室町東三井ビルディング
電話（03）
6214−1090   FAX（03）3241−1047
インターネットホームページ  http://www.kanto.co.jp
編集責任者 猪瀬 真人
平成27年10月1日  発行「無断転載および複製を禁じます。」