Blunting-Convenience Kit Manual（第 4 版）

Code No. 312-06291

25 反応用～解説～
目的の遺伝子をベクターDNA に連結する際に適当な制限酵素がない場合、DNA 末端が平滑であれば配列に依存することなくライゲーションすることができます。T4 DNA Polymerase は、DNA 依存性 DNA ポリメラーゼ
で、3’→ 5’ Exonuclease 活性と 5’→ 3’ Polymerase 活性を持ち、5’突出末端及び 3’突出末端のどちらの場合もこの酵素で平滑化することができます。また、ライゲーション反応を短時間で行うことができる
2×Ligation Mix (Ligation-Convenience Kit)と組み合わせることによって、平滑化からライゲーションまでを短時間で行うことができます。

Ⅰ.特長● DNA 末端の平滑化からライゲーションまでを迅速、簡便に行うことが出来ます。
● 10×Blunting Buffer には反応に必要な dNTP などが含まれているので、T4 DNA Polymerase を 加える
だけで、簡単に DNA 末端の平滑化が行えます。
● 5’突出末端 DNA, 3’突出末端 DNA および 3’末端に A が付加した PCR 産物などを平滑化できます。
● 2×Ligation Mix を用いて、ライゲーション反応を短時間で行うことができます。

Ⅱ.キット内容試薬

25 反応用*T4 DNA Polymerase

25μl×1 本

10×Blunting Buffer

50μl×1 本

2×Ligation Mix

250μl×1 本* 平滑化，ライゲーション共に 20μl の反応系で使用した場合の反応数です。

Ⅲ.保存および融解方法−20℃保存・ 失活を避けるため、T4 DNA Polymerase は絶対にボルテックスしないでください。
・ 2×Ligation Mix は、使用時に氷上にて完全に融解させ、ピペッティングでよく混ぜてから使用して下さい。
・ 2×Ligation Mix は、50 回までの凍結融解による反応効率の低下は認められておりません。

- 1 -Ⅳ.プロトコルおよび実験例＜1. プロトコル＞（1）平滑化反応液の調製
5’突出末端、3’突出末端及び PCR 産物など、末端を平滑化したい DNA（DNA 末端濃度で 0.1～10pmol)を 17μlに調製する。＊1
次に、10×Blunting Buffer を 2μl 加え混合する。
（2）酵素の添加
T4 DNA Polymerase を 1μl 加え、ピペッティングで混合する。＊2（3）平滑化反応＜Blunting 反応＞
サンプル DNA 溶液（0.1～10 pmol） 17μl
10×Blunting Buffer2μl

T4 DNA Polymerase を 1μl 加える
37℃で 5 分間反応させる
氷上に置き反応を停止させる (平滑化反応液)

37℃で 5 分間反応させる。＊3（4）反応の停止
平滑化反応液を氷中に置き反応を停止する。

*平滑化反応液は必要量使用する（1～5μl）＊6

すぐに使用しない場合はフェノール/クロロホルム/イソア
ミルアルコール抽出、エタノール沈澱を行い−20℃で保存する。

＜Ligation 反応＞
平滑化反応液（5）ライゲーション反応液の調製
平滑化反応液、平滑末端 DNA ベクター溶液を合わせて10μl の DNA 溶液を調製する。
10μl の 2×Ligation Mix を添加し、混和する。
（6）ライゲーション反応
16℃で 5～30 分間反応させる。＊4

平滑末端 DNA ベクター溶液 up to 10μl
ddH2O
2×Ligation Mix10μl

Total20μl

16℃で 5～30 分間反応させる（7）形質転換
反応液をそのまま形質転換に用いる。＊5

形質転換または in vitro パッケージング*1 DNA 末端濃度 0.1〜10pmol は pUC19（2686bp）0.1〜10μg に相当します。
*2 T4 DNA Polymerase は絶対にボルテックスしないでください。ボルテックスにより失活する恐れがあります。
*3 反応時間は 5 分間を厳守してください。
*4 16 時間、オーバーナイト等の長時間のライゲーションを行うと、形質転換効率が著しく低下する場合があります。
*5 形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの 1/10 量以下にして下さい。多量の反応液を使用すると、形質転換効率が低下することがあります。
反応液の量がコンピテントセルの 1/10 量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈澱法によって DNA を回収し、その DNA をコンピテントセルの 1/10 量以下になるように ddH2O または TE（pH 8.0）に溶解してから形質転換に使用してください。
- 2 -

*6

ライゲーション反応に持ち込む平滑化反応液は 5μl 以下にして下さい。5μl 以上持ち込む場

合はフェノール/クロ ロホルム/イソアミルアルコール抽出後、エタノール沈殿を行い ddH2Oまたは TE（pH 8.0）に溶解してから使用して下さい。

＜2. 実験例＞
ベクター平滑化の確認
1)

pUC19 を EcoRⅠ（5’突出末端）と PstⅠ（3’突出末端）で切断し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後、TE バッファーに溶解した。

2)

EcoRⅠと PstⅠで切断した pUC19 1μg をプロトコルに従って末端を平滑化した。

3)

平滑化した DNA の一部を 2×Ligation Mix を用いて 16℃ 30 分間ライゲーション反応を行った。

4)

ライゲーション反応後、未切断の pUC19 を除きバックグラウンドをなくすため、ライゲーション反応液を 5 倍希釈し 65℃ 5 分間熱処理することで T4 DNA Ligase を失活させた後、BamH
Ⅰで切断した。

5)

BamHⅠで切断したライゲーション反応液で ECOSTM Competent E.coli DH5αを形質転換し、生じたコロニー数を計測した。
下に pUC19 で形質転換したときのコロニー数を 1 としたときの、平滑化後セルフライゲーシ
ョンによって生じたコロニー数の割合を示す。
ベクターの平滑化の確認

ベクターの平滑化の確認

結果

1.20

青コロニー
白コロニー1.00

pUC19 を EcoRⅠと PstⅠで切断したベクターを平滑化し、セルフライゲーションすると、LacZ のフレームが合い青コロニーを生じる。
BamHⅠで切断することで、pUC19 由来の青0.80コロニーは排除されているので、生じた青コロニーは末端平滑化後にセルフライゲーショ0.60ンでできたプラスミドである。
左記のグラフより、5 分間の反応で約 6 割の0.40ベクターが平滑末端ライゲーションされていることがわかる。
0.20

0.00
pUC19
pUC19

平滑化あり

平滑化なし
平滑化なし

- 3 -

インサート DNA の平滑化
1)

pBluescriptⅡSK(＋)を EcoRⅤで切断し脱リン酸化後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後に TE に溶解した。

2)

λDNA を鋳型にして増幅した 500bp の断片を EcoRⅠ及び PstⅠで切断し、2 種類の断片を調製した。

3)

プロトコルに従って、2 種類の断片を平滑化した。

4)

pBluescriptⅡSK(＋)を EcoRⅤで切断し脱リン酸化したベクターと平滑化した断片を 2×
Ligation Mix を用いてインサート/ベクターモル比 = 5 で 16℃ 30 分間ライゲーション反応を行った。また、コントロールとしてλDNA を鋳型にして増幅した断片を EcoRⅤで切断した断片のライゲーション反応も行った。
ライゲーション反応液の一部で ECOSTM Competent E.coli DH5αを形質転換し、生じたコロニ

5)ー数を計測した。
青コロニー
白コロニー

Pst Iインサート

EcoインサートEcoRI
R I インサート

Pst I インサート
700

90.0

90.0
80.0

70.0800

60.050.0600

40.0400

30.0

平滑化なし
平滑化なし

60.050.0300

40.0200

30.0

10.000.0
平滑化あり
平滑化あり

70.0400

10010.00500

20.020.0

200

コロニー数
コロニー数（個）80.0

白コロニー率（%）
白コロニー率

コロニー数
コロニー数（個）

1000

100.0

600

白コロニー率（%）
白コロニー率

100.0

1200

白コロニー率（%）

コントロールControlfragment）
EcoR V DNA
断片）（（EcoRⅤ

0.0
平滑化あり平滑化あり

平滑化なし
平滑化なし

Control
コントロールfragment）
EcoR V DNA
断片）（（EcoRⅤ

結果
5’突出末端、3’突出末端にかかわらず、平滑化したインサートは EcoRⅤ断片と同じ割合でライゲーションできたことから、EcoRⅠ断片及び PstⅠ断片は 37℃ 5 分間の反応で十分に平滑化されていることがわかった。

- 4 -＜3. 参考データ＞
1. PCR 産物の平滑化について
PCR で増幅した 500bp の断片を、プロトコールに従って平滑化した。
① 一方は、平滑化後にそのまま EcoRⅤで切断した pBluescriptⅡSK(＋)にライゲーションした。
② も う 一 方 は 、 平 滑 化 後 に T4 Polynucleotide Kinase で リ ン 酸 化 し 、 熱 処 理 を し て
T4 Polynucleotide Kinase を失活させた後、EcoRⅤで切断，脱リン酸化した pBluescriptⅡ
SK(＋)とライゲーションした。*
下のグラフは生じたコロニー数を 1 とした時の、青コロニーと白コロニーの割合を示した。

平滑化後のリン酸化の有無について
平滑化後のリン酸化の有無について
青コロニー

1.20

白コロニー

結果
PCR 産物を平滑化後、そのままリン酸が付加しているベクターとライゲーションした場合は、白コロニーの割合が約 13%だった。一方、PCR 産物をリン酸化1.00

し、脱リン酸化したベクターとライゲーションした場
合は、90%以上の割合で白コロニーが得られた。

0.800.60

PCR 産物を平滑化してライゲーションに用いる場合、通常、PCR 産物の 5’末端にはリン酸基が付加0.40

していないため、脱リン酸化していないベクターを用0.20いる必要があります。しかし、脱リン酸化していないベクターをライゲーションに用いると、ベクターのセ0.00
リン酸化無し①

リン酸化あり②

ルフライゲーションの割合が多くなるため、PCR 産物を平滑化してライゲーションする場合は、平滑化
後に T4 Polynucleotide Kinase を用いてリン酸化し、かつ、ベクターは脱リン酸化することをお薦めします。

* ニッポンジーンの T4 Polynucleotide Kinase (Code No. 312-01551)を利用する場合、10×Kinase
Buffer A でリン酸化を行った場合は、熱処理後そのまま 2×Ligation Mix でライゲー シ ョ ン 反 応を行っても構いません。10×Kinase Buffer B でリン酸化を行った場合は、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後、エタノール沈澱してから 2×Ligation Mix でライゲーション反応を行ってください。

- 5 -2. ライゲーションにおけるインサートモル比の検討
ライゲーションの際のベクター：インサートの比は、ライゲーション効率に大きく影響します。以下は、平滑末端
ライゲーションにおいて、様々な長さのインサート DNA をライゲーション、形質転換し、最も良い結果が得られたモル比を示した表です。

・ 平滑末端インサート長 200 bp
ベクター
1
インサート
5600 bp
151000 bp 3000 bp
1
12～100.5～2

ベクター ：Sma I で切断した pUC19 ( 0.03 pmol )インサート ：Sma I で切断したインサート DNA( 0.015 pmol , 0.03 pmol , 0.06 pmol , 0.15 pmol , 0.3 pmol )ライゲーション反応：16℃, 5 分間

ライゲーション反応における注意点
16 時間、オーバーナイト等の長時間ライゲーションを行うと、形質転換効率が著しく低下する場合があります。



高塩濃度のバッファーに DNA を溶解させると、ライゲーション効率が著しく低下します。DNA 溶液はddH2O または TE buffer（pH8.0）にて調製して下さい。



形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの 1/10 量以下にして下さい。多量の反応液を使用すると、形質転換効率が低下することがあります。



反応液の量がコンピテントセルの 1/10 量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈澱法によって DNA を回収し、その DNA をコンピテントセルの 1/10 量以下になるように ddH2O に溶解してから形質転換を行って下さい。

ライゲーション反応に用いる DNA の精製度、使用する制限酵素の違いによってライゲーション効率が異なる場合があります。



パッケージングに用いる反応液の量はパッケージング Extract の 1/10 量以下にして下さい。多量の反応液を使用すると、パッケージング効率が低下する場合があります。



パッケージング Extract の 1/10 量以上の反応液を使用する場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈澱法によって DNA を回収し、その DNA をパッケージング Extract の 1/10 量以下になるように ddH2O に溶解してから形質転換を行って下さい。

Gigapack（Stratagene 社）を使用してもパッケージングを阻害することはありません。

- 6 -お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
TEL 076-451-6548
www.nippongene.com「Blunting-Convenience Kit」 マニュアル（第 4 版）0505-2305- 7 -