エルゴチオネインによる脱落膜化制御機構

エルゴチオネインによる脱落膜化制御機構
田中進・吉田南海香・麩谷健介・澤近美彩
Regulatory mechanism of decidualization by ergothioneine
Susumu TANAKA, Namika YOSHIDA, Kensuke FUTANI and
Misa SAWACHIKA

要

旨

ヒト子宮内膜では、卵巣からのステロイドホルモンの影響を受けて、周期的な増殖、分泌性の変化、間質の脱落膜化、ならびに剥離（月経）が起こる。排卵後の黄体から分泌されるプロゲステロンを受けて、子宮内膜に含まれる間質細胞は脱落膜化し、胚着床のための環境を整える。この脱落膜化に異常が生じることで、着床障害や流産、妊娠高血圧腎症、胎児発育不全、癒着胎盤などが起こる。われわれは過去に脱落膜化ヒト子宮内膜間質細胞における機能性食品エルゴチオネインのトランスポーター OCTN1 の発現上昇を見出しており、本研究において脱落膜化へのエルゴチオネインの効果を検討した。エルゴチオネイン
によってヒト子宮内膜間質細胞株での脱落膜化のマーカーであり、かつ絨毛外栄養膜細胞に働きかけることで胎盤形成にも関与する IGFBP1 の発現上昇が抑制されることを見出した。さらに、この抑制には転写制御因子 FOXO1 の減少が関与することも見出した。エルゴチオネインは OCTN1 を介し、胎盤形成を促す IGFBP1 の発現を抑制することで、癒着胎盤等を予防している可能性が示唆された。
キーワード：子宮内膜、脱落膜化、エルゴチオネイン、IGFBP1、FOXO1

所属：
長崎県立大学看護栄養学部栄養健康学科
Department of Nutrition Science, Faculty of Nursing and Nutrition, University of Nagasaki, Siebold− 27 −

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看護栄養学部紀要

緒言
ヒ ト の 子 宮 内 膜 は 約 28 日 の 月 経 周 期 を 持
ち、 月 経、 増 殖 期、 な ら び に 分 泌 期 を 繰 り 返す 1）。月経後、卵巣では卵細胞を取り巻く卵胞からエストロゲンが血中に分泌され、このホルモンの影響を受けて子宮内膜に含まれる間質細胞（Endometrial Stromal Cells, EnSC） が 増 殖
し、子宮内膜は厚みを増す。これを増殖期と呼ぶ。その後、卵巣で排卵が起こると、卵胞は黄
体化し、黄体からプロゲステロンが血中に分泌されるようなる。これに呼応して子宮内膜で粘膜腺上皮細胞の分泌が上昇するため、この時期の子宮内膜を分泌期と呼ぶ。このとき、腺上皮の変化のみならず、子宮内膜に最も多く含まれる EnSC が丸みを帯びて上皮様の細胞へと分化する 1）。この EnSC で起こる分化を「脱落膜化」と呼び、排卵後のプロゲステロンレベルの上昇が起因となる。子宮内膜でのプロゲステロン受容体欠損等によるプロゲステロンシグナルの減
弱は下流の多数の遺伝子の調節不全を起こし 2）、
不妊症や不育症の原因ともなっている 3）。
プロゲステロンシグナルの正常な伝達により
EnSC は脱落膜化し、下垂体前葉ホルモンとして知られるプロラクチン（Prolactin, PRL）、イン
スリン様成長因子結合タンパク質（Insulin-likegrowth factor binding protein 1, IGFBP1）、イ
ンターロイキン 15（Interleukin-15, IL15）等の
合 成・ 分 泌 を 開 始 す る。PRL は 血 管 内 皮 細 胞に働きかけることでラセン動脈の発達を促し、
IGFBP1 は胚盤胞に由来する絨毛外栄養膜細胞に働きかけ胎盤形成を促す 4）。IL15 は末梢に存在するナチュラルキラー細胞と比較して細胞毒性の低い子宮特異的ナチュラルキラー（Uterine
natural killer, uNK）細胞の増殖と分化を制御し、uNK 細胞は EnSC と協調しながらラセン動脈のリモデリングを促すことで、子宮内膜の脱落膜化をさらに促進させる。一方で uNK 細胞は胚受容における免疫寛容にも重要な働きを果たす 3）。
脱落膜化に異常が生じることで、着床障害や流産、妊娠高血圧腎症、胎児発育不全、癒着胎盤などが起こる 5） ため、EnSC の脱落膜化を理解することは非常に重要である。一方、ヒトでは着床に先立ち EnSC の脱落膜化が起こるのに対し、実験動物では胚着床後にのみ開始されるという大きな違いがあり、実験動物での結果との− 28 −

第22巻 （2024）

乖離がみられる。そこで、われわれは患者からの単離 EnSC ならびに樹立された EnSC 細胞株を用いてヒト子宮内膜の脱落膜化を研究してきた。
わ れ わ れ の 先 行 研 究 に お い て、 子 宮 内 膜 の
脱 落 膜 化 を 制 御 し う る 新 規 因 子 を 探 索 し、 機
能 性 食 品 エ ル ゴ チ オ ネ イ ン（ergothioneine,
EGT） の 特 異 的 な ト ラ ン ス ポ ー タ ー carnitine
organic cation transporter 1（OCTN1） が 脱
落膜化 EnSC で有意に上昇していることを見出し、EGT の脱落膜化への関与を想起した。EGT
は、Tanret によって麦角から発見された分子量229.3 の親水性含硫アミノ酸であり 6）、強い抗酸化作用を示す機能性食品であることが知られている 7）。血中から細胞への取り込みに特異的ト
ランスポーター OCTN1 が同定され 8）、細胞内に取り込まれることで細胞内の酸化ストレスの恒常性に寄与する。EGT は生体内の防御システ
ムとは独立しており、生体の既存の防御システ
ムでは対応できないヒドロキシラジカルを素早く還元できるという特徴を持つ 9）。その機能性により抗老化作用、抗炎症作用、ならびに抗神
経変性作用があることが報告されている 9）。一方、加齢に伴い血中 EGT 濃度は減少することが知られており 10）、この減少が子宮内膜の抗酸化力を低下させ 11）、脱落膜化の障害とそれに続く癒着
胎盤等の妊娠合併症の発症や妊娠率の低下に関与している可能性を考えた。
そ こ で 本 研 究 で は、EGT が OCTN1 を 介 して EnSC の脱落膜化にどのような影響を及ぼすのかを目的として研究を行った。ヒト EnSC 株
KC02-44D を用い、in vitro で脱落膜化を誘導した後、定量 PCR 法にて EGT による影響を検討した。続いて、ウェスタンブロッティング法により脱落膜化時のマーカータンパク量の変化を検討し、EnSC の脱落膜化における EGT の効果
に迫った。

材料と方法
1. EnSC 株（KC02-44D）の培養

ヒ ト EnSC 細 胞 株 KC02-44D を American
Type Culture Collection（Manassas, VA） から購入し、10％ fetal bovine serum（FBS）、10mM HEPES（Life Technologies, NY, USA）、
な ら び に 1 ％ Antibiotics 含 有 Dulbecco‘sエルゴチオネインによる脱落膜化制御機構

modified Eagle’s medium（DMEM）（4.5
g/L D-Glucose、 フ ェ ノ ー ル レ ッ ド な ら び に
L-Glutamine 含有）（Life Technologies, NY, USA）の培地（DMEM・FBS）を用いて細胞培養を行った。10 ㎝シャーレにコンフルエントになった細胞（1.2 × 10⁶ 細胞数）を 12 well プレートへ継代した。

⁶ M）、ならびに 8-Bromo-cAMP（Sigma-Aldrich
Co. LLC）（0.5 mM）を DMEM・CS-FBS に加え、
3 日おきに培地交換をしながら 6 日間刺激した。
3. EGT の脱落膜化への影響

先行研究 15） を参考にして KC02-44D 細胞の脱落膜化処理時に加える EGT の適正刺激濃度検定を行い、100 µM を適性濃度として決定した。
ヒト血中での EGT 濃度は 2.3 〜 3.0 mg/100 ml（100.3 ～ 130.5 µM）程度であることが報告されている 16）。

2. KC02-44D 細胞への脱落膜化処理

12 well プ レ ー ト（ コ ー ニ ン グ ） に 撒 き な お
してコンフルエントになったことを確認し、①
コントロール群と②脱落膜化処理群に分け（それ ぞ れ の 群 で n=5）、 刺 激 を 行 っ た。Phenol
red は エ ス ト ロ ゲ ン 作 用 物 質 と し て 知 ら れ る
た め 12-14）、 コ ン ト ロ ー ル 群 は 10% の Charcoal
Stripped（CS）-FBS（ 活 性 炭 を 用 い る こ と で血清中に含まれる他のホルモンを吸着し除去する）、10 mM の HEPES、1% の Antibiotics、1%の GlutaMAX を含む DMEM（phenol red 不含）（DMEM・CS-FBS）にて 3 日おきに培地交換をしながら 6 日間培養した。脱落膜化処理群はエス ト ロ ゲ ン（10-⁸ M）、 プ ロ ゲ ス テ ロ ン ア ナ ログ（medroxyprogesterone acetate, MPA）（10-4. 定量ＰＣＲ

脱落膜化処理 / 未処理後の KC02-44D 細胞（0.4× 10⁶ 細胞数）から Sepasol®︎-RNA I Super G（ナカライテスク , KYOTO, JAPAN）を用いて total
RNA を抽出した。その後、250 ng の total RNAと ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with
gDNA Remover（TOYOBO） を 用 い て 逆 転 写反応を行った。得られた cDNA での脱落膜化の誘導や脱落膜化時の EGT の影響を見るため、定量 PCR を 行 っ た。 定 量 PCR は preincubation（95℃、30 秒）後、2 step Amplification（95℃、

表１ 3ULPHUOLVW*HQH1DPH

*HQH
6\PERO+\SR[DQWKLQH
3KRVSKRULERV\OWUDQVIHUDVH +357

3URODFWLQ

35/

,QVXOLQOLNH*URZWK
,*)%3)DFWRU%LQGLQJ3URWHLQ,QWHUOHXOLQ,/+HDUWDQG1HXUDO&UHVW'HULYDWLYHVH[SUHVVHG+$1'2UJDQLF&DWLRQ(UJRWKLRQHLQH
7UDQVSRUWHU

2&71IRUNKHDGER[SURWHLQ2

)2;2

3ULPHU
6HTXHQFH
1DPH
)

 &7$*77&7*7**&&$7&7*&77$* 5  ***$$&7*$7$*7&7$7$**&7&$7$*7* )

 $77&*$7$$$&**7$7$&&&$7**& 5 77*&7&&7&$$7&7&7$&$*&777* )

 &7$7*$7**&7&*$$**&7& 5 77&77*77*&$*777**&$* )

 *77&$&&&&$*77*&$$$*7 5 &&7&&$*77&&7&$&$77& )  $*$**$$*$$**$*&7*$$&*$ 5  &*7&&**&&777**7777 )

 $7***&&$*$7&7&&$$&7$7* 5 7$$*&$$$&$*7**&$*&$* )  $7*7*77*&&&$$&&$$$*& 5  77**$&7*&77&7&7&$*77&& − 29 −

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5 秒 → 60℃、30 秒）を 45 サイクル繰り返し、さらに Primer の特異性の確認として melting 反応（95℃、10 秒 → 65℃、60 秒 → 97℃、1 秒）を行った。測定した遺伝子名と Primer 配列は表１に示す。各遺伝子の相対変化は hypoxanthine
phosphoribosyltransferase 1（HPRT1） を 内 部
標準として ddct 法により算出した 17）。
5. 細胞毒性アッセイ

KC02-44D 細胞を 500 cells/well となるよう 96
穴マイクロプレートの各ウェルに播種し、脱落膜化未処理群、脱落膜化処理群それぞれに EGT
を 5 µM、10 µM、50 µM、または 100 µM とな
るよう添加し、3 日おきに同様の培地に交換をしながら CO₂ インキュベーター内（37℃、5％CO₂）で 6 日間培養した。その後、Cytotoxicity
LDH Assay Kit-WST（ 同 仁 化 学 , Kumamoto,Japan）にて細胞毒性を測定した。各ウェルの450nm の 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー（ パ ー キ ン エ ル マ ー ジ ャ パ ン , YOKOHAMA,
JAPAN）で測定し、未処理群の値を 0％として、各条件での培地中に放出される LDH（本来細胞内に存在する）量を算出した。
6. 細胞増殖アッセイ

KC02-44D 細 胞 を 500 cells/well と な る よ う
96 穴マイクロプレートの各ウェルに播種し、脱落 膜 化 未 処 理 群、 脱 落 膜 化 処 理 群 そ れ ぞ れ に
EGT を 5 µM、10 µM、50 µM、または 100 µMとなるよう添加し、3 日おきに同様の培地に交換をしながら CO₂ インキュベーター内（37℃、5 ％ CO₂） で 6 日 間 培 養 し た。 そ の 後、Cell
Counting Kit-8（同仁化学）にて細胞生存率を測定した。脱落膜化未処理群と脱落膜化処理単独
群で細胞生存率に有意差があるのか、あるいはEGT の濃度と細胞生存率に相関があるのかを検討した。
7. ウェスタンブロッティング法

ウェスタンブロッティング法にて EGT による
forkhead Box O1（FOXO1）タンパク量の変化を検討した。脱落膜化未処理群（対照群）、培地に 100 µM の EGT を添加した群、脱落膜化処理
時に 100 µM の EGT を添加した群、脱落膜化処
理単独群の 4 群を用意し、6 日間の培養を行った。6 日後、KC02-44D 細胞からプロテアーゼイ− 30 −

第22巻 （2024）

ンヒビター（ナカライテスク）を加えた冷 RIPA
緩衝液（ナカライテスク）にて RIPA 可溶性画分を抽出し、濃度測定を BCA アッセイ（ナカライテスク）を用いて行った。次いで、10 µg のRIPA 可溶性画分を SDS-PAGE（153 mA、35 分）
にてタンパクを分離した後、トランスブロット
SD セル（Bio-rad, CA, USA）を用いてタンパク
を Clear Blot P+ メンブレン（アトー , TOKYO,
JAPAN） に 転 写 し た。 転 写 後 の メ ン ブ レ ン を
0.1% Tween-20 を含む TBS（TBS-T）で軽く洗浄した後、Blocking One（ナカライテスク）を用 い て 1 時 間 室 温 に て ブ ロ ッ キ ン グ し た。 ブ
ロッキング後のメンブレンを、一次抗体反応液（1/1,000 FoxO1（C29H4）Rabbit mAb #2880（Cell Signaling Tech, MS, USA）in TBS-T with
5％ Blocking One）中で 4℃、一晩インキュベー
トした。次の日に TBS-T で 5 分 3 回洗浄後、二次 抗 体 反 応 と し て、1/3,000 HRP Horse Anti
Rabbit IgG Antibody（Peroxidase）（VECTOR
PI-1000）in TBS-T with 5 ％ Blocking One にて 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た。TBS-T で 5 分 3
回 洗 浄 後、Chemi-Lumi One L（ ナ カ ラ イ テ スク）を加えて 1 分間反応させたのち、LAS4000（GE ヘルスケアジャパン ,TOKYO, JAPAN）を用いてタンパクバンドを可視化した。バンドの
定 量 は ImageJ を 用 い て 行 い FOXO1 の タ ン パ
ク量は actin beta（ACTB）タンパク量にて補正 し た。ACTB の 検 出 に は 1/10,000 モ ノ ク ロ
ナール抗β - アクチンマウス宿主抗体（Merck,
Germany, Darmstadt）と 1/3,000Anti-IgG（H+L）,
Mouse, Horse-Poly, HRP（VECTOR PI-2000）を使用した。
8. 統計解析得られたデータに対し、Shapiro-Wilk 正規性検定を行い各群の正規性を確認した後、両側でWelch の T 検定を行った。その後、Bonferroni
補正を行い、有意水準となる p 値を決定した。
統 計 解 析 は IBM SPSS Statistics version 29.0
（IBM Corp., Armonk, NY, USA）を用いて行った。

結果
1. ヒト EnSC 株での OCTN1 発現の検討

KC02-44D 細胞において脱落膜化処理によって

エルゴチオネインによる脱落膜化制御機構

OCTN1 の発現上昇が確認された（p<0.05、各群
n=15、図 1）。
2. 脱落膜化マーカーへの濃度別 EGT の影響

EGT の効果を見るために KC02-44D 細胞を用
いて EGT の濃度の違いによる脱落膜化マーカーの発現変化を検討した。脱落膜化処理に各種濃度の EGT を加えた結果、PRL は未処理群に対して脱落膜化処理単独群で上昇したが（p<0.05）、
脱落膜化処理単独群と EGT 追加処理群との間に有意な差は生じなかった（図 2）。IGFBP1 に関しては未処理群に対して脱落膜化処理単独群
で 発 現 が 上 昇 し、50 µM と 100 µM の EGT を
加 え る と IGFBP1 の 有 意 な 減 少 が 観 察 さ れ た（p<0.05、図 2）。IL15 は未処理群に対して脱落
膜化処理単独群で有意に上昇し（p<0.05）、100µM の EGT 添加により有意に減少した（図 2）。
100 µM EGT に お け る 反 応 性 が 最 も 高 か っ た
ため、今後の検討では 100 µM EGT を使用し、KC02-44D 細胞自体ならびに脱落膜化への影響を検討した。

3. 脱落膜化への EGT の影響

KC02-44D 細 胞 を 用 い て 脱 落 膜 化 マ ー カ ー（PRL、IGFBP1、IL15、ならびに HAND2）への100 µM EGT の影響を検討した。PRL 発現は未処理群に対して脱落膜化処理単独群で有意に上昇した（p<0.05）。また、未処理群および脱落膜化
処理単独群に EGT を加えても、有意な変化はな
かった（図 3）。IGFBP1 発現は未処理群に対して脱落膜化処理単独群で有意に上昇した（p<0.05）。
未処理群に対して EGT を加えても有意な変化はなかったが、脱落膜化処理時に EGT を加えた時の有意な発現減少が再確認された（p<0.05、図 3）。
IL15 に関しては未処理群に対して脱落膜化処理
単独群で発現が有意に上昇した（p<0.05）。一方、
EGT の濃度検定実験とは違い、未処理群および脱落膜化処理単独群に EGT を加えても、有意な減少は見られなかった（図 3）。今後試行回数を増加させ再現性を確認する必要がある。HAND2に関しては未処理群に対して脱落膜化処理単独群
で有意に上昇した（p<0.05）。また、未処理群および脱落膜化処理単独群に EGT を加えても、有意な変化はなかった（図 3）。


図 脱落膜化ヒト子宮内膜間質細胞株 .&' での 2&71 発現.&' 細胞株に対して  日間の脱落膜化処理を行い、2&71P51$ 発現量の変化を T3&5 にて検討した。各バーは平均値、エラーバーは標準偏差を示す。各ドットは独立した実験を示す（Q  。
2&71FDUQLWLQHRUJDQLFFDWLRQWUDQVSRUWHU+357+\SR[DQWKLQHSKRVSKRULERV\OWUDQVIHUDVH S0.05 by using Welch’s TWHVWDJDLQVWFRQWURO− 31 −

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第22巻 （2024）
図 .&' 細胞におけるエルゴチオネインの濃度検定
.&' 細胞に対して脱落膜化処理および (*7 の濃度を変えて T3&5 で予備検討を行った。(*7 の濃度は µM にて検討した。各バーは平均値、エラーバーは標準偏差を示す。各ドットは独立した実験を示す（Q  。(*7(UJRWKLRQHLQH+357+\SR[DQWKLQHSKRVSKRULERV\OWUDQVIHUDVH SE\XVLQJ:HOFK’V7WHVWZLWK%RQIHUURQLFRUUHFWLRQDJDLQVWFRQWURO＋SE\XVLQJ:HOFK’V7WHVWZLWK%RQIHUURQLFRUUHFWLRQDJDLQVW
(03$F$03(*7(UJRWKLRQHLQH+357+\SR[DQWKLQHSKRVSKRULERV\OWUDQVIHUDVH(
HVWURJHQ





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エルゴチオネインによる脱落膜化制御機構


図 脱落膜化への (*7 の効果.&' 細胞に対して  日間の脱落膜化（GHFLGXDOL]DWLRQWUHDWPHQW）(*7 処理を行い、脱落膜化
マーカー遺伝子の発現量の変化を T3&5 にて検討した。各ドットは独立した実験を示す（Q  。
(*7HUJRWKLRQHLQH35/3URODFWLQ,*)%3,QVXOLQOLNHJURZWKIDFWRUELQGLQJSURWHLQ,/,QWHUOHXNLQ+$1'+HDUWDQGQHXUDOFUHVWGHULYDWLYHVH[SUHVVHG+357
+\SR[DQWKLQHSKRVSKRULERV\OWUDQVIHUDVH S0.05 by using Welch’s TWHVWZLWK%RQIHUURQLFRUUHFWLRQDJDLQVWFRQWURO＋S0.05 by using Welch’s TWHVWZLWK%RQIHUURQLFRUUHFWLRQDJDLQVWGHFLGXDOL]DWLRQWUHDWPHQW

4. 細胞機能への影響の確認

意な差が見られなかったことから、EGT 自体は
KC02-44D 細胞の生存率にも影響を与えないことがわかった。

脱 落 膜 化 時 に EGT を 加 え た 時 の IGFBP1 の発現低下が、細胞死による細胞数の減少もしく
は細胞活性の低下が関与している可能性を考え、EGT による細胞毒性を見たところ、脱落膜化処
理群ならびに脱落膜化未処理群どちらにおいても死細胞数（または細胞膜に障害を受けた細胞数）に EGT 濃度依存的な変化はなかった（図4）。続いて、EGT による細胞生存率の変化を見たところ、脱落膜化処理群で有意に細胞生存率が下がることを確認した（p<0.05、図 4）。ただし、脱落膜化により細胞が大きくなるため、限られたスペースによる細胞数の減少を見ているだけの可能性もある。一方で、脱落膜化処理時に濃度を変化させて EGT を加えても生存率に有5. 脱落膜化における FOXO1 の制御

プ ロ ゲ ス テ ロ ン は EnSC 細 胞 質 内 の PGR へと結合、核内に移行した後、PRL と IGFBP1 の転写を直接制御すると共に転写因子 HAND2 とFOXO1 の転写を誘導する。誘導された HAND2は PRL と IL15 の 転 写 を 制 御 し、FOXO1 はIGFBP1 の転写制御に加わる。そのため、EGTによる IGFBP1 の発現変化に FOXO1 の関与を想起した。
そ こ で、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に てEGT に よ る FOXO1 タ ン パ ク 量 の 変 化 を 検 討

− 33 −

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図 .&' 細胞機能への (*7 の影響.&' 細胞に対して  日間の脱落膜化(*7 処理を行い、/'+ アッセイにて細胞毒性を測定した。
(*7 の濃度を変化させても培地中に放出される /'+（本来細胞内に存在する）量は未処理細胞と比べても変化が無いため、(*7 によって死細胞または細胞膜に傷害を受けた細胞数に変化はないと考えられる。(*7(UJRWKLRQHLQH/'+/ODFWDWHGHK\GURJHQDVH.&' 細胞に対して  日間の脱落膜化(*7 処理を行い、&&. アッセイにて細胞生存率を測定した。脱落膜化処理自体は細胞生存率を低下させたが、そこから (*7 の濃度を変化させても細胞生存率に変化はなかった。(*7(UJRWKLRQHLQH&&.&HOO&RXQWLQJ.LW SYV脱落膜化処理  ZLWKRXWEGT by Welch’s Test with Bonferroni correction.
− 34 −

エルゴチオネインによる脱落膜化制御機構


図 (*7 による脱落膜化時の )2;2 上昇の抑制
$ .&' 細胞を  日間の脱落膜化(*7 処理した後、5,3$ 可溶性分画を調整し、6'63$*( により分離した。メンブレンに転写後、ブロッキング、)2;2 抗体反応、+53 標識  次抗体反応を行い、最後に化学発光にて )2;2 のバンドを検出した。得られたシグナルは ,PDJH- にて解析し、$&7%
バンド強度で補正した。
% .&' 細胞に対して  日間の脱落膜化(*7 処理を行い、)2;2 発現量の変化を T3&5 にて検討した。各ドットは独立した実験を示す（Q  。
)2;2 )RUNKHDG ER[ SURWHLQ 2 (*7 (UJRWKLRQHLQH +357 +\SR[DQWKLQHSKRVSKRULERV\OWUDQVIHUDVH  $&7% DFWLQEHWD  S  0.05 by using Welch’s TWHVW ZLWK%RQIHUURQLFRUUHFWLRQDJDLQVWFRQWURO＋S0.05 by using Welch’s TWHVWZLWK%RQIHUURQLFRUUHFWLRQDJDLQVW脱落膜化処理した。脱落膜化処理によって FOXO1 タンパクの発現が上昇した。脱落膜化処理時に 100 µM
EGT を添加したところ、FOXO1 タンパクの減
少 が 確 認 さ れ た（ 図 5A）。 こ の EGT に よ る 減
少が、転写の減少、翻訳の阻害、またはタンパ
ク分解の亢進によるのかを検討するため、qPCR
によって FOXO1 の発現変化を検討した。脱落
膜化処理単独群に比して EGT 追加処理群において FOXO1 の発現が有意に減少したため、EGTによる FOXO1 転写自体の減少がタンパク量の減 少 に つ な が っ て い る と 考 え ら れ た（p<0.05、
図 5B）。

は kelch like ECH associated protein1（KEAP1）により細胞質に留められ、ユビキチン化されることで常時プロテアソーム依存的なタンパク質
分解を受ける 19, 20）。一方、細胞が酸化ストレスに暴露されると、KEAP1 による NRF2 抑制機構は解除され、NRF2 は核に移行し、抗酸化応答
配 列（antioxidant response element, ARE） を介して抗酸化作用を持つタンパクをコードする遺伝子の発現を誘導する 21）。FOXO1 は IGFBP1の転写制御以外にも抗酸化作用をもつグルタチオンの代謝酵素であるグルタチオンペルオキシ
ダーゼおよびグルタチオンレダクターゼの転写 制 御 を 行 っ て お り 22）、 酸 化 ス ト レ ス に 対 する生体防御機構の一つとして働く 23）。さらに、FOXO1 転写制御領域には ARE が存在し、酸化ストレスによる NRF2 の核移行によって FOXO1の発現が促進される 24） 。KC02-44D 細胞において EGT の添加は脱落膜化時に生じる何らかの酸化ストレスを緩和し、本来であれば誘導されるは ず の NRF2 の 核 移 行 を、KEAP1 に よ る 分 解を再開させることで阻害し、結果、FOXO1 とそ

考察
EGT は細胞内に取り込まれることで細胞内の活性酸素種を除去し、細胞内の酸化ストレスを一定に保つ働きがある 18）。別の細胞内での抗酸化作用を誘導するタンパクとして核因子赤血球
関 連 因 子 ２（NF-E2 related factor ２, NRF2）が知られる 19）。非酸化ストレス下では、NRF2

− 35 −

長崎県立大学

看護栄養学部紀要

れに続く IGFBP1 の発現上昇を抑制したと考えられた。
本 研 究 に お い て EGT に よ る 脱 落 膜 化 時 のIGFBP1 の発現上昇の抑制が見られた。IGFBP1には細胞遊走を刺激し、絨毛外栄養膜細胞の浸潤を促す働きがある 25, 26）。脱落膜化 EnSC からの IGFBP1 は局所で絨毛外栄養膜細胞の持つイ
ンテグリンα 5 とβ 1 サブユニットを介して絨
毛 外 栄 養 膜 細 胞 の 遊 走 を 制 御 す る 25）。 そ の ため、厳密に規定された量の IGFBP1 は正常な胎盤の形成に必須であり、胎児の正常な発育を手助けすることになる。一方で、過剰な IGFBP1
発現は絨毛外栄養膜細胞の胎盤への浸潤を乱し、筋層にまでその浸潤が達することで、癒着胎盤の原因となり母子の生命を脅かす 27） 。さらに EnSC 自体がインテグリンα 5/ β 1 を発現するため、IGFBP1 は自己分泌によるネガティブ
フィードバック機構を介して EnSC の脱落膜化にも関与し 28）、脱落膜の薄層化にもつながる可能性がある。そこで EGT は EnSC の IGFBP1 発
現を規定することで、絨毛外栄養膜細胞の遊走制御と脱落膜の薄層化を防ぎ、癒着胎盤の予防に一役買っているのではないかと考えられた。
EGT に よ る 糖 尿 病 ラ ッ ト の 妊 娠 率 の 改 善 が報告されているが、子宮内膜脱落膜への影響は検討されていない 29, 30）。欧州食品安全機関は、EGT が 800 mg/kg/day でも無毒性であることを発表し、妊娠中および授乳中の女性、子供、ならびに乳児への EGT のサプリメント使用を承認している 31） 。OCTN1 は胎盤を形成する胚盤
胞由来の絨毛外栄養膜細胞にも存在する 32）。胎盤形成異常を基盤とする多因子性妊娠高血圧症候群である子癇前症モデルラットに EGT を投与すると、子癇前症のマーカーである血中 sFlt-1の減少、胎盤におけるミトコンドリア関連酵素の発現上昇、ミトコンドリアに由来する活性酸
素種の減少、ならびに胎児の体重増加、が観察されるため、絨毛外栄養膜細胞における OCTN1発現の重要性が示唆されている 33）。しかしここでも子宮内膜脱落膜での OCTN1 発現ならびにEGT の影響は調べられていない。我々は EGTの 特 異 的 な ト ラ ン ス ポ ー タ ー OCTN1 の EnSC
で の 発 現、 脱 落 膜 化 で の 発 現 上 昇、 な ら び に
IGFBP1 への効果を見出すことで EGT という隠れた着床ならびに妊娠維持のための重要なファクターを世界に先駆けて見出した。繰り返しに− 36 −

第22巻 （2024）

なるが、EGT が子宮脱落膜での IGFBP1 の発現を制御することで胎盤形成に制限をかけ、胎盤形成異常を基盤とする妊娠高血圧腎症や胎盤の過形成である癒着胎盤等を防いでいるのではな
いかと考えている。
血中 EGT には食事に由来するものだけでな
く、真菌類や腸内細菌が合成したものも含まれることが報告されている 34, 35）。一方、胃に含まれる H. pylori. や腸内細菌は食餌性 EGT の多くを代謝し、疾患関連代謝産物であるおりメチル
アミン N- オキシドの生成に寄与し、ヒトの健康に影響を与える可能性があることも示唆されて
おり 36）、腸内細菌の産生する EGT の役割が大きな意味を持つと考えられる。精神的ストレスを受けたラットにおいて、腸内細菌の一つである L.
reuteri が増加し、L. reuteri により合成された
EGT の急激な増加が知られている 37）。このラットへの EGT の経口投与はストレス軽減作用が示されており、妊娠中という様々な要因（特に自律神経の乱れ）でストレスを感じやすくなる状
態において、腸内細菌に由来する EGT がストレス軽減のみならず流産の予防にも重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

まとめ
本研究において EGT の特異的トランスポー
ターである OCTN1 が脱落膜化 EnSC で発現上昇することを見出した。EGT は OCTN1 を介し、胎盤形成を促す IGFBP1 の発現を抑制することから、癒着胎盤などを防いでいると考えられた。
本論文に関して、開示すべき利益相反関連事
項はない。

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