特集

食品衛生検査の理化学分析

かび毒分析の最近の動向～フザリウムかび毒の分析
State of the art in the analyisis of Fusarium mycotoxins

中 川 博 之 Hiroyuki Nakagawa (Principal researcher)

国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部門 食品安全研究領域 食品化学ハザードユニット 上級研究員

National Agriculture and Food Research Organization (NARO), Food Research Institute, Food Safety Division, Chemical Hazard Laboratory

フザリウム、LC-MS、モディファイドマイコトキシン

01

クドマイコトキシン、およびモディファイドマイコトキシン（後述））

かび毒とはの発見により注目されているフザリウムかび毒の分析の最新情報について、筆者らが実施した研究を中心に紹介する。

かび毒（マイコトキシン）とはかびの二次代謝産物（生命現象に直接関係のない生産物）の中で、ヒトや家畜に発がん性、変異原性、腎・肝障害性などの毒性を示す物質の総称である。ヒトや家畜がかびによって産生されたかび毒を含有した食物を摂取して02 フザリウム属とかび毒起こる中毒をマイコトキシコーシスというが、その原因は化学物

赤かび病は麦類やトウモロコシ等の主要作物の植物病原菌と質であるかび毒であり、かびによる感染（真菌症、マイコーシス）して知られるフザリウム属によって引き起こされる難防除病害とは全く別のものである。一般にかびは加熱加工によって死滅である3, 4)。温帯地域に位置するわが国では麦の生育期に降雨がするが、かび毒は熱に対して安定なものが多く食品中に残留す多く、赤かび病が発生しやすい。フザリウム属は農作物の栽培中るため、これらの汚染を受けた食品を摂取することにより被害がに圃場で感染し収量や品質低下を引き起こすが、その一部はか発生する。これまでに数多くのかび毒が発見・報告されているが、び毒を産生することが知られている。
トリコテセン系かび毒と呼中毒事例があるのはそのうちのごく一部である 。主要なかび毒ばれる一連の化合物（構造によりタイプA、タイプBに分類される）産生菌としてどのようなかびが存在し、その対策やかび毒分析法（図1）やゼアラレノン（ZEN, 図2）がその代表例として知られて1)としてどのような技術があるかに関しては、各種文献を参照されいる。中でもタイプBトリコテセン（C-8位にケトン基をもつ）の1（マスたい1, 2)。ここでは国内における汚染事例が多く、糖誘導体つであるデオキシニバレノール（DON、図1）
は世界各地で汚染

図2 ゼアラレノン（ZEN）

図1 トリコテセン系かび毒

14

THE CHEMICAL TIMESが発生することから、多くの国で基準値が設定されている2)。わが出操作を行う際の抽出効率のばらつきや、イオンソース部にお国では2002年に小麦中のDONについて 1.1mg/kgの暫定基ける夾雑成分によるイオン化への影響（マトリックス効果）
がしば

準値が設定された5)。アジア諸国では、DONとともにもう1つの（DON、しば問題視される 2)。本手法ではトリコテセン系かび毒タイプBトリコテセンであるニバレノール（NIV, 図1）の汚染が多

NIV、T-2、HT-2）にはベルカロール（VEL）、ZENにはゼアララノ

く報告されている 。このような背景からわが国では2008年に

ン（ZAN）（VEL、ZANの構造をそれぞれ図3に示す）を内部標準

麦類におけるDON, NIV汚染低減のための指針が策定されてい物質として使用することで、これらの変動要因の影響を低減できる 。ZENに関してはわが国では食品における基準値は設定されていると考えられる。内部標準物質となる化合物は構造や物理ていないが、家畜飼料については1mg/kgの暫定許容値が農林化学的挙動が目的化合物と類似していることが望ましい。最も有水産省により設定されている 。

効な内部標準物質は安定同位体標識したそれぞれのかび毒試

2)

6)

7)

薬であるが、そのような安定同位体標識試薬はとても高価であ

麦汚染主要フザリウムかび毒一斉分析法の開発と妥当性確認る。そこで本手法では分析法にかかるコスト面も考慮して内部標農林水産省では国産麦についてDON、NIV（平成14年度かた麦粉末試料（小麦、大麦）に内部標準物質を添加し、12時間以ら）
およびZEN（平成17年度から）の汚染実態調査を実施して上（他者による報告では、かび毒試薬添加後から抽出実施までのいるが、当初はこれら3種のかび毒を一斉分析可能な分析手

インターバルを30-60分程度の短時間に設定しているケースが

03

準物質としてVEL、ZANを使用した。
分析手順の概要は以下のとおりである9)。各種かび毒を添加し法がなかった。また、FAO/WHO合同食品添加物専門家会議多い。添加したかび毒を十分に農作物試料に吸着させるために(JECFA)では2001年にT-2トキシン（T-2）
およびHT-2トキシ

は、このインターバルを長く設定すべきであると筆者は考えてン（HT-2）（ 図１）
についてグループの暫定最大耐容一日摂取量いる）
冷暗所で保存した後にアセトニトリル/水混合液を用いて（PMTDI）を0.06μg/kg体重と設定していたため 、国内でも汚酢酸存在条件下で抽出した。遠心分離後、得られた上清をC18カ

染調査の是非が議論されていた。そこで筆者らは、麦を汚染するラムおよび多機能カラムに順次通して精製を行い、得られた試主要フザリウムかび毒であるDON、NIV、T-2、HT-2、ZENの5験溶液について溶媒交換を行った後、LC-MS/MSにより分析を種について、高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-行った。結果の一例として、DON（40μg/kg）、NIV（40μg/kg）、MS/MS）
法による一斉分析法の開発を行った 。LC-MS/MS法

ZEN（8μg/kg）、T-2（8μg/kg）、HT-2（8μg/kg）を添加した小によるかび毒分析においては、農作物や食品から溶媒による抽麦粉末を分析した際のLC-MS/MSクロマトグラムを示す
（図4）。

8)

9)

図3 ベルカロール（VEL）とゼアララノン（ZAN）の構造

図4 かび毒添加小麦粉末を分析した際のLC-MS/MSクロマトグラム

15

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食品衛生検査の理化学分析

DON、NIV、ZENは負イオン化条件、T-2、HT-2は正イオン化条

生する理由の一つとして、感染時に植物体内（穀類等）への菌糸件でそれぞれ良好に検出されている。いずれのかび毒も試験溶の侵入をより容易にするためであることが挙げられる。12)。一方、液の注入後20分以内にピークが確認され、LCカラムの平衡化

植物は外来異物の減毒機構として配糖化やマロニル化等の修飾時間も含めると1分析当たり30分程度で連続分析が可能であっ反応をして液胞の中に蓄積することが知られている。かび毒のよた。

うな生体外異物は植物体内においてはPhase I, II, IIIの3段階のこれらのPhase
代謝機構により減毒化されるといわれており13)、開発した分析手法について、AOACインターナショナルの「試IIの段階（conjugation）
で産生される誘導体（主に配糖体）はマ

験室間共同試験のガイドライン」 を参照して室間共同試験によスクドマイコトキシンと呼ばれている14)。マスクドマイコトキシン

かびる妥当性確認を実施した9)。12機関に本分析手法を提供し、は分子量や物理化学的性質が元の化合物とは異なるため従来毒添加麦（小麦・大麦）を用いた添加回収試験を行った。外れ値の分析法では検出できないが、腸内細菌等によって加水分解さ検定を行った後の有効なデータから、併行相対標準偏差（RSDr）れてかび毒を遊離するため14)、潜在ハザードとして注目されていを算出し、その値からHorRatと室間再現相対標準偏差（RSD R）る。

10)

（Horwitz ratio）
値を評価した（HorRat ＜2であれば、分析値

フザリウム属は複数種のかび毒を産生する（図1,2）が、代表の室間再現精度は許容範囲内とみなされる）。その結果、小麦お的なマスクドマイコトキシンとしてはDONおよびZEN由来のよび大麦に含まれる40～1,000μg/kgの濃度レベルのDON分

DON-3-グルコシド（DONGlc）
やZEN-14-グルコシド（ZENGlc）

析において本手法の妥当性が確認された。同様な手順により、（図5）が知られている。フザリウム属が植物（農作物）に感染す

小麦および大麦に含まれるNIV（40～1,000μg/kgの濃度レベるような状況下では、DONやZEN以外のかび毒に関しても減毒ル）、ZEN（8～1,000μg/kgの濃度レベル）、T-2（8～200μg/化（配糖化）される可能性があると予想された。そこで筆者らはkgの濃度レベル）、HT-2（8～200μg/kgの濃度レベル）のそれ新規マスクドマイコトキシンの探索を試みた。本研究を実施するぞれの分析について本手法の妥当性が確認された。さらに、自然際に課題となったのが分析試料の入手であった。分析試料として汚染試料として配付したT-2含有小麦試料（メーカーによる付与は「フザリウム属が植物（栽培中のもの）に感染し比較的高濃度で値111.2μg/kg）についてもHorRat ＜2が確認された。
したがっかび毒汚染が起こる条件」
で調製された農作物が望ましいと考て、本手法はかび毒添加試料だけではなく自然汚染試料の分析えられた。農研機構ではフザリウム属を感染させた麦類を栽培にも有効であることが確認された 。

可能な実験圃場を有しており、当時農林水産省リスク管理型委

9)LC-MS/MS法によるかび毒一斉分析については多くの手法が託プロジェクトの研究でDONおよびNIVによる高濃度汚染を受報告されているが、主要フザリウムかび毒5種（DON、NIV、T-2、けた麦を栽培していたため、この玄麦を分析試料とした。入手しHT-2、ZEN）を一斉分析可能で、室間共同試験によるフルバリた玄麦を粉砕した分析試料の抽出物（水/アセトニトリル/酢酸混デーションレベル
（有効試験室数8以上）
で妥当性確認がなされ合溶液で粉末試料を抽出し、遠心分離により得られた溶液を精製た分析手法は本手法が国内外を通じて最初の例である 。内部用カラムに通して夾雑物質を除去したもの）
について、高速液体標準物質による補正を取り入れており、大麦も分析対象にできるクロマトグラフィー・高分解能質量分析（LC-HRMS）
法による分析ことから、国産麦におけるフザリウムかび毒汚染を把握する上でを行った。その結果、新規マスクドマイコトキシンとしてNIV-グルも実用的な手法であるといえる。本分析手法は農林水産省によコシド（NIVGlc）、さらにNIVの前駆体であるフザレノン-X（FUX,

る国内麦かび毒汚染のサーベイランスにも採用されており、調図1）の配糖体であるFUX-グルコシド（FUXGlc）を検出した（図

査結果は報告書として公開されている11)。

15)。DON, NIV, FUXはいずれもタイプBトリコテセンであった
6）9)ことから、次に筆者らはタイプAトリコテセン（図1参照）
由来のマスクドマイコトキシンの探索を試みた16)。分析試料として、代表的04 新規かび毒誘導体の探索なタイプAトリコテセンであるT-2とHT-2を高濃度含有する精度管理用自然汚染トウモロコシ粉末試料を米国から購入した。入手

フザリウム属のような植物病原菌がDONのようなかび毒を産したトウモロコシ粉末試料について上記と同様な手法を用いて

図5 代表的なマスクドマイコトキシン

16THE CHEMICAL TIMES

15-18)
図6 筆者らが検出したマスクドマイコトキシン（モノ-グルコシド）

18)
図7 筆者らが検出したマスクドマイコトキシン（ジ-グルコシド）分析を行ったところ、T-2-グルコシド（T2Glc）とHT-2-グルコシド

これらのマスクドマイコトキシンはいずれも試薬標品が入手で（HT2Glc）がそれぞれ検出された（図6） 。同トウモロコシ粉末きない化合物であったため、検量線を用いた定量分析ができな

16)

試料においては、さらに別のタイプAトリコテセンであるネオソラかった。そこで、各試料中に共存するDONGlc/DONの割合をニオール（NES, 図1）
、ジアセトキシスシルペノール（DAS, 図1）
、調べた（DONGlcとDONは試薬標品が市販されている）
ところ、モノアセトキシスシルペノール（MAS, 図1）についてもグルコシ

前者の汚染小麦試料では重量比で15%程度、後者の精度管理。これらの発見により、マスクドマイコトキ

用自然汚染トウモロコシ粉末試料ではモル比で6%程度がグルシンがDONやZENのような特定のかび毒に対してのみではなコシル化されていることがわかった15, 16)。各種トリコテセン系かく、他のトリコテセン系かび毒についても広く存在することが明び毒における構造の類似性から、NIV, FUX, T-2, HT-2, NES,らかにされた。T2Glc、
HT2Glcについて筆者らはさらにグルコー

DAS等についても同等程度の割合でグルコシル化が起きていスが付加したT-2-ジグルコシド（T2GlcGlc）とHT-2-ジグルコシド

るのではないかと当時推定していたが、その後の研究によりタイ（HT2GlcGlc）も検出した（図7） 。

プAトリコテセンの方がタイプBトリコテセンよりもグルコシル化ドを検出した（図6）

17, 18)

18)

17

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食品衛生検査の理化学分析

図8 フモニシンとその糖誘導体される傾向が低いことが示唆された19)。
一方、トウモロコシ中のフモニシン（フザリウム属が産生する、トリコテセン系かび毒やZENとは異なる一群のかび毒）
は熱処理等によりその一部が分子内のアミノ基を介してグルコースとここで紹介したデータの一部は、農林水産省委託プロジェクト共有結合することが報告されている（図8）。米国の研究者らに研究「生産・流通・加工工程における体系的な危害要因の特性解由来のグルコース誘導体として、N -(1よりフモニシンB（FB11）

明とリスク低減技術の開発」
および「食品の安全性と動物衛生のDeoxy-D-fructos-1-yl) fumonisin B1 (NDfrc-FB1)が同定さ向上のためのプロジェクト」の一環として実施した研究の成果で、フモニシンB 3れている 。そこで筆者らはフモニシンB（FB22）ある。関係各位に深謝申し上げる。かび毒の配糖化は植物の減（FB 3）について同様な誘導体があるかLC-HRMSによる探索を毒機構（conjugation）によって起こるものである。ヒトや動物の21)
（図8）
。これら
行い、NDfrc-FB2、NDfrc-FB3を新たに検出した体内で異物が代謝や誘導化することにより減毒化されるように、はフモニシンと糖が結合した化合物であるためマスクドマイコ

植物が独自にこのような減毒機構を持っていることは学術的にトキシンと混同されがちであるが、植物体内における減毒機構も興味深い。かび毒減毒機構の詳細な知見を得ることで麦やト（conjugation） ではなく、化学的な反応で生成するものであ

ウモロコシの赤かび病抵抗性品種の選抜や育種にも利用できるる。
このため、本来の定義によれば区別されるべきである。
このよ可能性があることから、農業分野での応用も期待されると考えてうな経緯から最近ではマスクドマイコトキシンを含めたかび毒誘いる。上記にも述べたが、危害要因物質の定量的な議論をする

導体に対してモディファイド
（modified：修飾された）
マイコトキ

上でやはり試薬標品の供給がカギとなる。私の記憶が正しけれ

20)

14)

シンという名称を使うことが提案されている 。

ば、関東化学にはRomer Labs社のかび毒試薬製品の国内販売

22)

欧州食品安全機関（EFSA）
は2014年にかび毒のヒトへの暴ラインをいち早く整備して頂いた。この場を借りて心より御礼申

露量を評価する際にはこれらの誘導体による暴露も勘案するこし上げると同時に、今後もかび毒研究分野へのご理解とご協力とが適切であるとしており、その根拠としてその多くが生体内でをお願いしたい。

加水分解されて元のかび毒を遊離するためであるとしている 。
23)

DONやZENのグルコシドとサルフェート誘導体（DONGlc、ZENGlc、およびZENS）
が、ヒトの大腸の細菌叢によって効果的に加水分解されたという報告もある24)。今後モディファイドマイ
コトキシンがわが国でPMTDIへ算入されるか否かは不明であるが、食品安全委員会でも継続審議中である25), 26)。各種かび毒の適切なリスク評価に資することを目標として、今後もかび毒分析の研究に熱意をもって日々取り組みたいと考えている。

1805 おわりにTHE CHEMICAL TIMES
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19