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総説 ―日本歯周病学会学術賞受賞―
自然免疫系による歯周病原性細菌の認識機構についての解析吉村篤 利

長崎大学大学院医歯薬学総合研究科医療科学専攻
発生分化機能再建学講座歯周疾患病因・再生解析学分野

Recognition of Periodontopathic Bacteria by Innate Immune SystemAtsutoshi Yoshimura
Nagasaki University Graduate School of Biomedical Sciences, Course of Medical and Dental Sciences,
Department of Developmental and Reconstructive Medicine, Division of Periodontology

はじめに
歯周病は歯面に付着したデンタルプラークバイオフ
ィルム中の細菌を原因として発症する。一方，歯周組織にはこれらの細菌の侵入を防ぐために免疫系を中心とした宿主防御機構が備わる。免疫系は B リンパ球や T リンパ球などを主体としてそれぞれの抗原を特異的に認識する獲得免疫系と好中球や単球などを主体と し て 病 原 体 に 特 有 な 構 造 Pathogen AssociatedMolecular Patterns（PAMPs）を認識する自然免疫系に大別されるが，これらは歯周組織においても相互に協調して働いていると えられる（図 1)。このうち，自 然 免 疫 系 に 関 す る 研 究 は 1990年 代 後 半 のToll‑like receptor（TLR）ファミリーの発見以来，急速に進歩を遂げヒトにおいては TLR 1〜10までが歯周病原性細菌および菌体成分
・歯周組織の最前線で感染防御・抗原を特異的に認識・歯肉溝滲出液中にも存在・病原体特有分子構造パターンを認識

・2次応答を示す
・記憶を有する

自然免疫系細胞(多形核白血球，単球等)炎症反応の増強・抗原提示・獲得免疫系の活性化
獲得免疫系細胞(Ｔリンパ球，B リンパ球等)

図 1 歯周組織における自然免疫系と獲得免疫系のクロストーク
連絡先：吉村篤利〒 852‑8588 長崎市坂本 1‑7‑1 長崎大学大学院医歯薬学総合研究科医療科学専攻発生分化機能再建学講座歯周疾患病因・再生解析学分野
Atsutoshi Yoshimura
Nagasaki University Graduate School of Biomedical Sciences，Course of M edical and Dental Sciences,Departmentof Developmental and Reconstructive Medicine, Division of Periodontology
1‑7‑1, Sakamoto, Nagasaki 852‑8588, JapanE‑mail ayoshi＠net.nagasaki‑u.ac.jp

自然免疫系による歯周病原性細菌の認識機構についての解析同定され，そのリガンドや刺激伝達経路が明らかにされてきた。これら自然免疫系による歯周病原性細菌の認識機構に関する我々の取り組みを他の多くの研究者により明らかにされた最近の知見を交えて簡潔にまとめる。

1. 歯周病原性細菌リポ多糖（LPS）に対する単球，多形核白血球の応答

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量がいずれも明らかに低かった。また，マウス腹腔マ
ク ロ フ ァ ー ジ を こ れ ら の LPS で 刺 激 し た と こ ろ
TNF‑αの産生に関して同様の結果が得られた 。これ ら の 結 果 は Ogawa ら や Gemmell ら の P. gingivalis LPS の単球に対する低刺激性を示した報告と一致しており，歯周病原性細菌内毒素の菌種間での活性の違いを明らかとしたものではあるが，当時，内毒素に対する細胞内刺激伝達分子は発見されておらず，活性の差が何に起因するのか十分に解明するには至らなかった。

多くの菌体構成成分の中でもグラム陰性菌の外膜を構成する LPS は 1ng/ml 以下の低濃度で単球や多形核白血球を活性化する強力な免疫活性化因子として知2. LPS 刺激伝達分子られている。歯肉溝滲出液中の細胞成分の大半を占める多形核白血球は歯周組織において最初に菌体成分に
1990年，Wright ら は CD 14が LPS と LPS bindよる刺激を受ける細胞の 1つと えられるが，LPSing protein（LBP）複合体のレセプターであることにより活性化されると，IL‑1，IL‑8，TNF‑αなどを報告したが，その後の生化学的研究やノックアウトの炎症性サイトカインを産生し，局所での炎症反応をマウスを用いた研究等により，CD 14は LPS と物理拡大すると共に新たな炎症性細胞の遊走を誘導する。
的に結合し，CD 14存在下では LPS への感受性が非
我々 は，歯周病原性細菌から抽出した内毒素でヒト存在下と比較して飛躍的に高まることが証明された。
多形核白血球を刺激し，産生されるサイトカイン量を
しかしながら CD 14は glycosylphosphatidylinositol
測定して菌種による内毒素活性の違いについて解析し （GPI）アンカーを介して細胞膜と結合しているため，た。この研究において，ヒト多形核白血球を Porphy- 細胞膜貫通領域および細胞内領域は保有していない。
これは細胞内への刺激伝達には他の細胞内領域を有す
romonas gingivalis LPS，Capnocytophaga ochracea
LPS で刺激した場合，Actinobacillus actinomycetem- る分子が関与していることを意味する。我々 は LPS
刺激伝達分子を同定するために，Chinese hamster
comitans LPS，Fusobacterium nucleatum LPS で刺激した場合と比較して IL‑1，IL‑8，TNF‑αの産生
ovary fibroblasts（CHO 細胞）にヒト CD 14を発現

リポ蛋白
LBP

LPS
CD 14

M D‑2

TRIF

NF‑κB

CD 14

TLR 1/6

TLR‑4
TRAM

ペプチド
グリカン

リポアラビノマンナン

TLR 2

MyD 88

MyD 88
TIRAP

TIRAP

IKK α，β，γ

NF‑κB
PPIκBIκB
DEGRADATION

図 2 自然免疫系による病原体に特有な分子構造パターンの認識日歯周誌

9646(2)：94―100, 2004

lipid Alipid

CD 14aアンタゴニスト：
ヒトアゴニスト：ハムスター

図 3 Lipid A の種特異的認識させ，LPS レポーター細胞を作製した。このレポーター細胞に突然変異を誘発することにより，LPS 刺激伝達経路において，CD 14の下流に少なくとも 2つ以上の刺激伝達分子が存在することを明らかとした。
この直後に，Godowski ら と Rothe ら は LPS 非感受性の HEK 293細胞に TLR 2を発現させると LPS感受性になることを報告した。I 型膜貫通蛋白である
TLR 2が細胞内刺激伝達分子であることが証明されたわけである。しかしながら，我々の作製した CHO
レポーター細胞においては TLR 2は遺伝学的に発現されておらず，TLR 2が主要な刺激伝達分子ではないことが示された 。その後，LPS 低応答性マウスとし て 知 ら れ る C 3H/HeJ，C 57BL/10ScCr マ ウ ス
では Tlr4 遺伝子に変異がみられること ，TLR 4ノックアウトマウスは LPS に反応しないこと が報告され，LPS の主要な刺激伝達分子は TLR 4であることが明らかとなった（図 2)。

3. M D 2‑TLR 4複合体による lipid A の種特異的認識
Miyake ら は Toll と同様に細胞外に Leucin‑richrepeat を有する分子 RP 105が M D‑1と会合することを明らかにしていたが，M D‑1に相当性を示す分子
M D‑2をクローニングし，LPS 非感受 性 Ba/F 3細胞に TLR 4と MD‑2の両方を発現させると LPS 応
答 性 へ と 変 化 す る こ と を 明 ら か に し た。我々もCHO レ ポ ー タ ー 細 胞 の LPS 刺 激 伝 達 経 路 変 異 株
7.19には M D‑2の変異がみられ，野生株 M D‑2を発現させると LPS 応答性へと変化することから，LPS認識には MD‑2の発現も必須であることを明らかとした（図 2)。
また，CHO レポーター細胞はハムスター由来の細胞でありハムスター TLR 4を発現しているため lipidA 前駆体である lipid IVa や Rhodobacter sphaeroidesの lipid A（RSLA）を認識して応答するがヒト由来の細胞はこれらに不応答性である。我々 は CHO レポーター細胞にヒト TLR 4を過剰発現させると lipidIVa，RSLA に 不 応 答 性 へ と 変 化 す る こ と か ら，
TLR 4は内毒素の活性中心である lipid A への種特異的反応において必須の分子であることを明らかとした（図 3)。同 様 に Beutler ら も マ ウ ス TLR 4と ヒ ト
TLR 4を用いて lipid A の種特異的認識には TLR 4が重要な役割を果たすことを報告している。一方，
Miyake ら はこれらのリガンドに対する種特異性はMD‑2によるものであると報告している。これらの違いは，それぞれの実験系における TLR 4，MD‑2の発現量の違いによるものかもしれないが，これらの分子が LPS の活性中心である lipid A の種特異的認識に関与していることを示している点で共通しており，このような菌体成分の種特異的認識は宿主の病原体への感受性を決定する重要な因子の一つであると思われる。

4. TLR 2による菌体成分の認識
当初 LPS レセプターとして報告された TLR 2が，LPS の主要な刺激伝達分子でないとするとそのリガンドは何であろうか 我々は，TLR の発見以前から病原体特有の分子構造に対するパターン認識レセプタ

自然免疫系による歯周病原性細菌の認識機構についての解析ーとして知られていた CD 14が，LPS 以外の菌体成分も認識し得る点に注目した。LPS を保有しないグ
ラム陽性菌の細胞壁に存在するペプチドグリカンはCD 14の存在下で効率よく認識される。加熱処理したグラム陽性菌や可溶化ペプチドグリカンで遺伝学的にTLR 2を欠如した CHO/CD 14レポーター細胞を刺激しても NF‑κB の活性化は起こらなかったが，レポーター細胞に TLR 2を発現させると NF‑κB が活性化された。すなわち，TLR 2はグラム陽性菌やペプチドグリカンの認識に必須であった （図 2，4)。
また TLR 2は，ペプチドグリカン以外にも菌体由来のリポ蛋白，リポペプチド，リポアラビノマンナンなど多くの菌体成分を認識するパターン認識分子であることも明らかとなった。このうちリポ蛋白，リポペプチド等の認識には TLR 2と TLR 1，TLR 6が協調的に関与していることが明らかと な っ た が，は口腔由来の Mycoplasma salivarium
Shibata らや歯周病原性細菌 Bacteroides forsythus からリポ蛋白を抽出し，リポペプチドの構造と生物学的活性の関係を明らかにした。また，我々 は TLR 2がペプチドグリカンのどのような構造を認識しているかについても検討した。ペプチドグリカンは N ‑acetylmuramic―(GlcNAc‑ MurNAc) ―L‑Ala
D‑Glu（D isoGln など)
L‑Lys（meso DAP など)
ペプチド架橋D‑Ala

ペプチド架橋図 4 ペプチドグリカンの基本構造

P. gingivalis LPS

CD 14

ヒト TLR 4：
アンタゴニスト97

acid と N ‑acetylglucosamine が 交 互 に β1，4結 合した多糖体直鎖をペプチドが網目状に結ぶ構造物であるが，Staphylococcus epidermidis のペプチドグリカンの網目状ペプチド鎖を S. aureus lytic enzyme によって特異的に切断しても活性は失われなかったが，M ‑1 endo‑N ‑acetylmuramidase によって糖鎖を分解すると TLR 2による応答性は消失した（図 4)。すなわち，TLR 2はペプチドグリカン中の，ペプチドで修飾された糖鎖の重合構造を認識していることが明らかとなった。後に，ペプチドグリカン中のアジュバンド活性を示す最小構造単位として知られる MurNAc‑L‑Ala‑D‑isoGln（MDP）は Nod 2によ っ て，またグラム陰性菌ペプチ ド グ リ カ ン 中 の diaminopimelate を 含 む GlcNAc‑M urNAc tripeptide は
Nod 1に よ っ て 認 識 さ れ る こ と が 明 ら か と な った。

5.

LPS のTLR 4アンタゴニストとしての作用

前述したように代表的歯周病原性細菌 P. gingivalis
LPS で単球や多形核白血球を刺激した場合，炎症性サイトカインの産生量は他の細菌の LPS で刺激した場合と比較して著しく少ない。これは TLR を介するLPS 認識機構においてどのような特性を意味するのであろうか。我々 は，ヒト TLR 4を発現した CHO
レポーター細胞を P. gingivalis LPS で刺激したがレポ ー タ ー 細 胞 の NF‑κB は 活 性 化 さ れ ず，逆 に P.
gingivalis LPS は E. coli LPS や A. actinomycetemcomitans LPS により誘導される活性化を阻害した。
すなわち，P. gingivalis LPS はヒト TLR 4のアンタ
ゴ ニ ス ト と し て 作 用 し た。こ れ は Genco ら がTHP‑1細胞を E. coli LPS で刺激した場合に，P.

P. gingivalis LPS

CD 14

ヒト TLR 2：
アゴニスト

図 5 P. gingivalis LPS のヒト TLR 2および TLR 4への作用

98

日歯周誌

46(2)：94―100, 2004gingivalis LPS が TNF‑α，IL‑6産生を阻害したとする報告や，Darveau ら が TLR 4を発現したヒト血管内皮細胞を E. coli LPS で刺激した場合に P. gingivalis LPS が E‑selectin の発現や NF‑κB の活性化誘導を阻害したとする報告とも一致する。但し，精製P. gingivalis LPS は血球系細胞に弱い活性化作用を示すことが以前から知られている。Vogel ら は再精製により endotoxin protein を除去した P. gingivalis
LPS も TLR 2を 活 性 化 す る こ と を 示 し て お り，TLR 2と TLR 4の両方を発現した血球系細胞は，精製 P. gingivalis LPS で刺激された場合に主に TLR 2を介して活性化されるものと思われる。しかしながら
Ogawa ら は P. gingivalis lipid A を合成し，合成
lipid A は TLR 2に対して活性化作用を示さないことを報告しており，精製 P. gingivalis LPS の TLR 2に対する作用に関しては今後も議論の余地があるものと思われる。

6. 歯周組織における TLR 2およびTLR 4の発現
このように菌体成分の認識に重要な役割を果たす
TLR 2および TLR 4は，歯周組織においてどのような発現を示しているのであろうか。Mori ら は正常
歯肉および重度歯周炎罹患歯肉において，CD 14，TLR 2，TLR 4の発現を免疫組織学的に解析した。
主に血球系細胞にこれらの分子の強い発現が観察され，上皮，結合組織，血管内皮細胞における発現は比較的弱いものであった。正常歯肉と比較して重度歯周炎罹患歯肉では TLR 2および TLR 4の発現が上昇し，また，口腔上皮側の歯肉よりもポケット上皮側歯肉で発現の上昇がみられた。このことは重度歯周炎罹
患歯肉のポケット上皮側で炎症性細胞の接合上皮直下に侵入した菌体あるいは菌体成分がこれらのパターン認識分子で認識され得ることを意味している。これに対し，CD 14の発現率は正常歯肉と比較して重度歯周炎罹患歯肉で，また，口腔上皮側の歯肉よりもポケット上皮側歯肉で低下していた。これは歯周ポケットからの菌体成分，サイトカイン，ケミカルメディエーターによる刺激で浸潤細胞が活性化または分化したために起きた現象と思われる。このように機能的に変化した細胞によるサイトカイン産生や抗原提示は宿主防御のみならず組織破壊にも大きな影響を与えているものと思われ，今後も詳細な検討が必要と思われる。

おわりにこれらの研究成果は TLR を中心とした自然免疫系による菌体成分の認識機構を分子レベルで明らかにするとともに P. gingivalis など一部の歯周病原性細菌の自然免疫系による認識における特性についても解析したものである。今後，これら自然免疫系と歯周病原性細菌の相互作用をより詳細に検討することにより，歯周病の進行過程の解明，早期診断法ならびに予防法の開発に貢献できることが期待される。
謝辞稿を終えるにあたり，研究の遂行に終始ご指導，ご協力いただきました本学加藤伊八名誉教授，歯周疾患病因・再生解析学分野原宜興教授をはじめとする多くの先生方に深く感謝の意を表します。
本論文の要旨は，第 47回春季日本歯周病学会学術大会（平成 16年 5月 21日）において発表した。

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