2013 年 4 月 9 日

植物ホルモンアブシシン酸の応答経路を大規模に解明〜干ばつ・塩・低温等のストレス耐性機構の理解が大きく前進〜
◆詳説◆

1．背景

植物は絶えず外環境の変化にさらされており、それに対応するための独自のメカニズムを持っています。このメカニズムの中心となるのが、植物ホルモンの一種であるアブシシン酸（ABA）です（図 1a）。
たとえば植物が乾燥にさらされた場合、ABA が急速に合成され、植物の様々な環境応答機構のスイッチを入れます。その結果植物はある程度の乾燥ストレスに耐えることができるようになります。
さて、このような ABA の作用は、どのようにして起こるのでしょうか？その仕組みがわかれば、植物の乾燥耐性を改良するための重要な手がかりが得られるかもしれません。そのような観点から、ABAの作用機構が盛んに研究されてきました。大きな進展があったのは ABA 発見から約半世紀を経た 2009年のことであり、我々を含む複数の研究グループの成果によって「細胞内シグナル伝達系」と呼ばれる仕組みの大部分が明らかとなりました（前回のプレスリリース参照：http://www.jst.go.jp/pr/announce/20090922/）。
ABA の情報伝達経路は、受容体、タンパク質脱リン酸化酵素（PP2C）およびタンパク質リン酸化酵素（SnRK2）注５）と呼ばれる３つの中枢因子から構成されています。これらの因子が協調して働くことでSnRK2 の活性が調節されており、SnRK2 が標的タンパク質（基質）をリン酸化すると ABA 応答が引き起こされます（図 1b）。しかしながら、タンパク質リン酸化酵素の標的タンパク質を決めるのは技術的に困難であり、SnRK2 の標的タンパク質についてもごく一部の知見にとどまっていました。しかし、植物の ABA 応答機構の全容を解明するためには何とかして SnRK2 の標的タンパク質を明らかにすることが必要であり、重要な課題の一つになっていました。そして、この状況を打開するためには、これまでにない新しい切り口の研究が必要でした。
2．研究手法と成果
本研究の最大の特徴は、SnRK2 の標的タンパク質をきめるために、最新鋭の「リン酸化プロテオーム」解析技術を利用したことにあります。リン酸化プロテオーム解析は、細胞内に微量に存在するリン酸化タンパク質を大規模かつ好感度に解析することができる先端的な技法です（図 2）。高性能な質量分析計により、どのタンパク質がリン酸化されるか（同定）、タンパク質のどの部分がリン酸化されるか（リン酸化部位）、どの程度リン酸化されるか（定量）といったデータを一挙に取得できるのが特徴で、近年の技術革新によって測定性能が飛躍的に向上しています。本研究では、京都大学の石濱泰教授らのグループとの共同研究により、シロイヌナズナから 5000 種以上のリン酸化ペプチドを検出し、ABA あるいは乾燥ストレスに応答する多数のリン酸化タンパク質（178 個）を同定することに成功しました。これらのタンパク質は ABA 応答や乾燥耐性に関わる可能性が高く、今後の重要な基礎データとなります。
本研究の二つ目の特徴は、本研究グループが独自に作成した変異体植物を用いたことです（図 3）。我々
は、以前の研究で ABA 応答に関わる 3 つの SnRK2 遺伝子を破壊した三重変異体 srk2dei 注６）において、ABA 応答の大部分が失われることを見いだしていました。そこで、野生型と srk2dei のリン酸化プロテオームデータの比較解析を基本コンセプトとし、野生型で ABA に応答したリン酸化タンパク質群の中から、srk2dei でリン酸化が抑制されるものを 35 個同定して SnRK2 標的タンパク質の候補としました。
さらに、本研究ではリン酸化部位周辺のモチーフ(パターン)解析やトランスクリプトーム解析を組み合わせることで重要なリン酸化タンパク質を絞り込んでいき、実際に 3 つの例について詳しく解析を行いました。その結果、① ABA 応答性遺伝子発現を制御する AREB1 転写因子注７）に新たな活性調節機構が存在すること、② 動物等でもよく知られたタンパク質リン酸化酵素である MAP キナーゼ注８）経路の一つが SnRK2 の制御下にあること、および③ 機能未知のリン酸化タンパク質 SNS1 が ABA シグナ
1ルを負に制御する新規のシグナル伝達因子であること（図 4）、など多くの新事実を明らかにすることができました（図 5）。これらの結果はリン酸化プロテオーム解析を行ったからこそ得られたものであり、いずれもこれまでに知られていなかった ABA 応答機構を明らかにする研究成果として注目されます。
3．今後の期待
本研究のリン酸化プロテオーム解析では、シロイヌナズナ植物体から 5000 個以上のリン酸化ペプチドについて解析を行い、ABA 処理や乾燥ストレスによってリン酸化の制御を受けるタンパク質を多数同定しています。また、SnRK2 の標的タンパク質の候補もリストアップすることができました。これらのリン酸化タンパク質の中には、植物の乾燥耐性や耐塩性などのストレス応答に重要なものが含まれている可能性が高いのですが、本研究ではその全てを調べたわけではありません。したがって、今後研究を進めていくことで、さらに新しいメカニズムを発見できる可能性があります。また、それらの新しい因子を用いて植物のストレス耐性を遺伝子工学的に改良したり、他のシグナル伝達経路との関係を調べたりといった発展研究につながることが期待されます。
また、本研究はリン酸化プロテオーム解析技術を本格的に植物科学の分野に導入し、実際に重要なタンパク質を同定したという点に特徴があります。本研究において、ABA シグナル伝達に関する新しい知見が多数得られた事実は、この技術の有用性・可能性を端的に示しています。リン酸化プロテオーム解析は汎用性の高い技術であるため、同様のアプローチが他の植物種や他のシグナル伝達系の研究にも適用可能です。我々は、リン酸化プロテオーム解析技術が植物科学研究のさまざまな分野に対して大きな可能性を秘めており、特にタンパク質リン酸化酵素の標的タンパク質を決めるための方法論として有効であると考えています。
＜掲載論文＞
Umezawa, T., Sugiyama, N., Takahashi, F., Anderson, J.C., Ishihama, Y., Peck, S.C. and Shinozaki, K.
“Genetics and phosphoproteomics reveal a protein phosphorylation network in the abscisic acid pathway inArabidopsis thaliana.” Sci. Signal. 6, rs7 (2013)2

＜参考図＞＜図1

ABA
Aの生理作作用と細胞内内シグナル伝伝達機構a)a ABA の生生理作用は多多岐にわたっっており、代代表的なもののとして種子子品質の制御
御と環境ストレス耐性のの制御が挙げら制られる。b) ABA
Aの細胞内内シグナル伝伝達機構は、受容体（R）、タンパク質質脱リン酸化化酵素（PP2CC,PP）
P 、タンパパク質リン酸酸化酵素（SnRK2, PK）の 3 つの主主要因子で構構成される。SnRK2 が ABA 存在下下で活性化し、で、下流の標的的タンパク質質をリン酸化化することでで ABA 応答
答のスイッチ
チが ON にななる。今回研研究対象とした究たのは、SnR
RK2 によっってリン酸化化される下流流のタンパク質群であるる。

図2

リン酸
酸化プロテオ
オーム解析技術

植物に植ABA
A あるいは乾乾燥ストレススを与え、全全タンパク質質をトリプシシンで消化ししたペプチド
ド断片を出発発材料とする。
材。通常、全タタンパク質中中に含まれるるリン酸化タ
タンパク質はは微量なのでで、精製しななければなららない（本研究な究では、京都都大学石濱泰泰教授らが開開発した HAAMMOC 法注９）を用い た）。精製ししたリン酸化化
ペプチドを質ペ質量分析装置
置で解析し、どのタンパパク質がリンン酸化されてているか（同同定）、どの部部分がリン酸酸化されている化るか（リン酸酸化部位）、どの程度リ ン酸化されれているか（（定量）といいった情報をを取得する。
3

図3

本
本研究のコンンセプト

ABA
A
応答にに関与する 3 つの SnRK
K2 を全て破壊壊した変異体体である srrk2dei は、AABA 応答のの大部分が失失われている。
わ。この変異体体の中では、タンパク質 リン酸化酵素素である SnnRK2 が存在在しないのでで、本来 ABAAに応答するタにタンパク質ののリン酸化がが抑制されるるのではないいかと予想しした。そこでで、本研究ででは野生型ととsrk2deisのリリン酸化タンンパク質を比比較解析するることで、SnRK2 の標的的タンパク質質の同定を試試みた。

図4

リン酸化プ
プロテオーム 解析によって見つかったタンパク 質の例

a)a SNS1（SSnRK2 subsstrate 1）はは ABA によ ってリン酸化され、srkk2dei でリンン酸化が低下下するタンパパク質として見ク見出された。したがってて、SNS1 は SnRK2 の標的タンパク質である 可能性が高い。b) SNS
S1
遺伝子を破壊
遺壊したノック
クアウト変異異体（KO）を解析したところ、野生型に比べ て強い ABAA 感受性を示示した。
しこのこことから、SN
NS1 は ABA
A 応答を負にに制御する新新規シグナル
ル伝達因子でであることががわかった。
4図5

本研究
究でわかったことのまとめ

リン酸化タン
リンパク質を大大規模に解析析したことににより、①ABA や乾燥ス
ストレスによよる多数のリリン酸化タン
ン
パク質の変動パ動、②新規ななリン酸化タタンパク質（例：SNS1）の同定（AABA 応答をを抑制する因因子である）、③既知の因子③子の新しい制制御メカニズ
ズムの発見 （例：AREB
B1 転写因子子注７））、④別別のリン酸化化経路（例：注８）
MAPKM）が SnRK22 の制御下ににあること、、等々多くののことが明ららかとなったた。

＜補足説明＞＜＞
注１）
注
Science Signaliing
世界界でもっとも権威のある科学雑誌「「Science」のの姉妹誌（週週刊）で、生生物のシグナナル伝達に関関する 優れた原著著論文や解説記事を掲載載する。2008
8 年 9 月よりりオリジナル
ル論文の掲載載をスタートト
した 比較的新しい雑誌である。なお、Sccience の姉姉妹誌は本誌と Science TTranslation
nal Medicinneの二二誌のみである。Science Signalingg の日本語要要約記事が下下記サイトよより閲覧可能
能となっていいる。（http://wwww.cosmobio.co.jp/aaas__signal/）
注２）
注
アブブシジン酸（ABA）
植物
物ホルモンはは、比較的低低濃度で作用用する植物生生長調節物質質であり、アアブシジン酸酸（ABA）ははその １つである。英語名 abbscisic acid、、分子式 C15表される。ABBA の代表的的な生理作用用
1 H20O4 で表とし て、気孔の閉鎖、乾燥耐耐性の獲得、、種子成熟・休眠、落葉葉など器官脱脱離の促進ななどが挙げらられる 。また、最近
近では病害抵抵抗性にかかかわっているることが示唆
唆されておりり、ほかの植植物ホルモンンとの 相互作用も盛んに研究されている 。
注３）
注
シググナル伝達経経路
生体体内で、ある種のシグナルがほかの シグナルにに変換され、連続して伝伝わる過程のことを指すす。
生命命現象を制御御するもっとも基本的な プロセスである。一般的的にその担いい手はタンパパク質であるること が多く、シググナル伝達因因子と呼ばれれる。シグナ
ナル伝達因子子の中にはさ まざまな種種類があるがが、5タンパク質のリン酸化にかかわる因子はそのうちの１つである。この場合、シグナルがタンパク質のリン酸基という形に変換されて伝わることになる。
注４） リン酸化プロテオーム解析
リン酸化されたタンパク質を大規模に解析する技術の総称。いくつかの方法があるが、本研究では後述の HAMMOC 法によるリン酸化ペプチドの精製と、高速液体クロマトグラフィーに接続された質量分析計による一斉解析を組み合わせた手法を採用している。近年の技術革新により、現段階で数千種オーダーのリン酸化タンパク質を捉えることが可能になっている。
注５） SnRK2（SNF1-related protein kinase 2）植物に特異的に存在するタンパク質リン酸化酵素の１種で、シロイヌナズナには９個の SnRK2（SRK2A～J）が存在する。そのうち、SRK2D、E、I の３つが ABA によって強く活性化し、下流の標的タンパク質をリン酸化することで ABA 応答を正に制御する。ABA シグナル伝達における中枢因子の一つに数えられている。
注６） srk2dei 三重変異体
ABA 応答に関与する 3 つの SnRK2（SRK2D,E,I）が全て破壊された三重変異体。ABA 応答の大部分が失われる劇的な表現型を示す。たとえば、高濃度の ABA 存在下でも問題なく発芽したり（通常は発芽できない）、気孔が常に全開となるため乾燥に異常に弱い、種子が休眠しないために穂発芽しやすい、数百種の ABA 応答性遺伝子の発現に異常が見られる等々、あらゆる ABA応答が影響を受ける。
注７） AREB1 転写因子
ABA-responsive element-binding protein 1 の略。遺伝子発現を直接的に制御する転写因子の一つで、塩基性ロイシンジッパー型に分類される。植物の ABA 応答性遺伝子の発現を制御する主要な転写因子の一つとして知られている。リン酸化による AREB1 転写活性の制御は以前から知られていたが、今回の研究で新たなリン酸化部位による制御メカニズムが明らかとなった。
注８） MAPK キナーゼ
Mitogen-activated protein kinase の略。タンパク質リン酸化酵素の一種で、真核生物に広く保存されている。様々なシグナル伝達に関与しており、もっともよく研究されているタンパク質リン酸化酵素の一つである。植物には 20 種程度が存在しており、病害応答や植物ホルモン、活性酸素等の刺激によって活性化する他、細胞分裂制御や形態形成等に関わることが知られている
注９） HAMMOC 法
ヒドロキシ酸修飾酸化金属クロマトグラフィーの略で、京都大学の石濱泰教授、杉山直幸准教授らによって開発されたリン酸化ペプチドの精製技術。酸化金属（酸化チタンなど）に対するリン酸基の親和性を利用しており、本法ではさらにヒドロキシ酸を競合剤として加えることで、リン酸化ペプチドの精製効率が飛躍的に向上した。

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