シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回

一次構造から高次構造探求への道 ― 終点は新たな出発点

鏡 山 博 行 （かがみやま ひろゆき）
日本蛋白質科学会発足の記念祝賀会で、日本生

正確な測定、酵素精製ができることが生化学者と化学会会長として祝辞を述べたのが 2001 年、もしての第一歩であったように思います。多くの酵

う 20 年近く経ったのかとの思いです。当時我が素は生体内含量が少なく、10 mg も精製されれば国の蛋白質研究は国際的レベルに達していたと思御の字で、できることは限られていました。

いますが、私が学部教育（大阪大学医学部）を受一方、欧米では Sanger がインスリンのアミノ酸

けた昭和 30 年前半は、Sanger がインスリンのア配列を、Perutz や Kendrew がヘモグロビンやミオ

ミノ酸配列を決定して間もないころでした。講義

グロビンの立体構造を決め、Hershey、Chais がでは「蛋白質はアミノ酸の集合体である」というDNA が遺伝子の本体であることを突き止め、レベルで、「蛋白質の一次構造や高次構造」「構造

Watson、Crick が DNA 二重らせん構造を提唱すると機能相関」などの言葉は全く出てきませんでしなど、生命科学の新しい幕開けの時代に入ってい

た。

ました。

インターン、国家試験を終え、昭和 37（1962）

主任教授は早石修先生で、京都大学医学部医化

年生化学第一教室の院生となりました。4 年勉強学教授と 2 年間兼任された 2 年目でした。先生はして学位を手にしたら内科医になるつもりでした

NIH で、酸素分子を取り込んで行われる酸素添加が、結局生化学者、蛋白化学者として定年を迎え

反応、それを行う酵素である酸素添加酵素を発見ることになってしまいました。細かい記憶は薄れされて帰国され、京大教授として迎えられていまていますが、
その間の歩みを物語風に記すことで、した。大学院での最初の仕事は、米国留学から帰当時のわが国の蛋白化学の歴史の一端に触れられ国され、助手として赴任されたばかりの野崎光洋

ればと思います。

先生を手伝って、カテコール環を開裂するメタピ
ロカテカーゼという酸素添加酵素を緑膿菌から精研究者へのスタート

製する事でした。酸素添加酵素は極めて不安定な

当時は酵素の時代でした。生命の根源は酵素でため精製が難しく、安定化の条件を見出して精製ある、酵素に関わらない者は生化学者ではないとし、その性質を調べることを世界的に競っていまいった雰囲気で、権威のある学術集会「酵素化学した。酵素精製の意味も分からず、その手段など

シンポジュウム」には生化学の錚々たる先生方が見たことも聞いたこともない。
「病態生理学的なこ競って発表されていました。しかし、内容はとをしたい」との期待をもって生化学を選んだの「Purification and Characterization of …ase」と、新に、「こんな舌を噛みそうな名前のものを細菌からしい酵素を見つけ、精製して分子量を測定、至適

精製して調べて何の役に立つのか」と割り切れな

pH、基質特異性を調べ、Km や Vmax を出し、阻い気持ちを抱きながら、「テクニックの習得と思え

害剤とその様式を調べるというレベルのものが多ばいいか」と 2、3 か月野崎先生の後ろについて歩数を占めていました。不安定な酵素をいかに効率

いていました。偶然に 10%アセトンで安定化する

よく精製したかが評価される時代で、酵素活性のことが分かり、結晶化に成功しました（結晶化はシリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回

純化の一つの目安）。
酸素添加酵素で世界のトップすることになりました。人生の奇しき縁というもに躍り出たわけで、周囲からは「すごい仕事したのを実感しました。

な」と言われて、
何がどうすごいのかも分からず、戸惑っていたのが当時の私でした。おかげで、均ライフワークへのスタート

一性の確認や分子量の測定に、チゼリュウス電気

それから 40 年付き合うことになるのが、トラ

泳動、スピンコ超遠心機など大型機械を必要としンスアミナーゼの主流といえる GOT（Glutamate-

ますので、理学部や蛋白質研究所の専門の先生方Oxaloacetic Transaminase 、 現 在 は Aspartateにお願いして回り、夏休みがなくなってしまった

Aminotransferase で AST と呼ばれるが、以後もことも懐かしい思い出となっています。これが私GOT を用いることとする）です。アスパラギン酸

１）の研究者としての最初の論文になりました 。早のアミノ基をα-ケトグルタル酸に移し、オキザロ

石先生は兼任期間が切れて京大に戻られ、野崎先酢酸とグルタミン酸を産生する可逆反応を触媒す

生も一緒に京大へ移られたので、講師の和田博（→る酵素で、補酵素としてピリドキサール燐酸（PLP）

阪大薬理学教授）、助手の森野能昌（→熊大生化学を用いてアミノ基の移動を中継します
（図 1）
。
PLP

教授→同学長）両先生を中心に成果が出つつあっ自体極めて多様な反応を行うことが Snell によったトランスアミナーゼのグループに参加することて見いだされていました。
『金属イオン共存下でアになりました。

ミノ酸と反応させると、アミノ酸のアミノ基と余談になりますが、滋賀医科大学が新設された

PLP のアルデヒド基の間にシッフ塩基が形成され時、生化学第 1 講座の教授に京大から推薦されたる。ピリジン環がα炭素周辺から電子を引っ張る

野崎先生、助教授には阪大から推薦された私が就のでα炭素の三つの結合が切れやすくなる。カル

任することになり、また後に私が大阪医大の教授

ボキシル基が外れると脱炭酸反応、α水素との結として赴任して間もなく早石先生を学長にお迎え合が切れるとプロトンが外れるとともに以後の電子の動きによってトランスアミネーション、ラセ
ミ化、側鎖からの原子団の脱離や置換、側鎖が切れるとアルドール開裂反応が起こる（図 2）』という説明でした。Dunathan は、軌道の重なりから、ピリジン環に垂直になった結合が切れると考察し左から和田博先生、私、一人おいて右端森野能昌先生

図 1．GOT の反応

図 2．PLP とアミノ酸のモデル反応

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回ました。Jencks は著書「Catalysis in Chemistry andGOT はソ連の Braunstein によって発見された酵Enzymology」で、「神は、生物学者が生命を持つも素で、心臓や肝臓に比較的多く含まれているため、のの生理学についてどんな質問にも答えを見つけ

米国の Jenkins により早くから精製され（1959）、

られるように生命体を創造したといわれている。

物理化学的手法によって詳細な研究が進められ、もしそうなら、PLP は電子を動かすことに楽しみ

2、3 年にわたって J. Biol. Chem. に 10 報を超えるを感じる酵素学者や化学者に満足と啓発を与える

発表がありましたので、それを勉強することからように創造されたものと言わねばならない。とい始めました。ほぼ時を同じくして世界の複数のグ

うのは、この補酵素の化学的性質からうまく解釈

ループによって、血中に電気泳動で区別される 2できるような広い範囲の反応が、酵素系にもモデ

種の GOT が存在することが認められ、一つはミル系にも関与しているような補酵素は他にないか

トコンドリア分画、他方は細胞可溶性分画に存在らである。表面的には全く違うように見えるこれ

し、各々mGOT、
sGOT と呼ばれていました。
和田、らの反応の大部分は、ある一つの共通の構造的特森野両先生がブタ心筋の二つの細胞分画から両徴によって起こりうる」と述べました。このよう

GOT を別々に精製され、その性質を調べておられな多才な PLP も補酵素として特定の蛋白質と結合たところで、それを手伝うところから GOT とのすると、切れやすい結合が決まり基質特異性とと長い付き合いが始まりました。

もに反応特異性が決まり、反応効率もけた違いに精製の過程は省きますが、一回、20 kg の心筋か増大します。PLP 酵素のアポ蛋白質の働きに興味

ら一か月余りかければ、両酵素を 200 mg 前後得が集まるのは当然ですが、多くの酵素と同様生体ることができました。大量精製の現場は研究室と内含量が僅かであり、蛋白質部分の研究には手がいうより工場のようでした。両酵素ともに分子量届かない状態でした。

約 10 万、PLP 含量から 2 量体であること、基質特

図 3．GOT の反応過程（半反応）シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回

異性、基質に対する Km にも大差ないが、電気泳

pKa は、カルボキシル基の負電荷が中和されるた

動、
熱安定性、
尿素変性に対する抵抗性が異なり、めに低くなり、プロトンが pKa の上昇したシッフ

免疫学的にもそれぞれの抗体に対して交叉反応し塩基に移るので、正電荷のなくなったアミノ基がないなどから、当時 Kaplan が提唱していたアイソ

シッフ塩基の炭素を攻撃しやすくなってシッフ塩

ザイムであることが明らかになっていました。

基交換反応がスムーズに進む。さらにリシン残基

Jenkins によって精製されたのは sGOT でしたのε-アミノ基が基質のα水素を引き抜くためにが、数々の重要な特徴を提示していました（図 3）。

は、外シッフ塩基の pKa がリシン残基のεアミノ

PLP はリシン残基のεアミノ基とシッフ塩基を形

基の pKa より高くないといけない。でないとシッ成している（内シッフ塩基）（図 3-I）。基質アミノフ塩基からプロトンがεアミノ基に移ってしまい、酸が活性中心に結合するとシッフ塩基交換反応が基質のαプロトンを引き抜けなくなる（図 3-IV）。
』

生じ、アミノ酸のα-アミノ基とのシッフ塩基に変

初めからシッフ塩基が本来の高い pKa を持っていわる（外シッフ塩基）（図 3-III）。さらに、遊離して水素が結合していると、アミノ酸のアミノ基のたリシン残基のεアミノ基が基質アミノ酸のαH

水素をいったんどこかへ移すという余分なステッを引き抜き（図 3-V）
、反応が進行して行きます。

プを踏まなければならなくなるわけで、この酵素

PLP 酵素はシッフ塩基に基づく特徴的な吸収スペにはうまい仕組みが設けられていると説明したのクトルを示し、プロトン化、非プロトン化の状態です。

で変化します。彼はそれを解析し、内シッフ塩基

Karpeisly によって出されたこの美しいスキーの pKa が 6.8（本来の pKa は 12～13）で、活性中心

ムによってトランスアミナーゼの反応機構はすべでは異常に低いことを示しました。ここへ基質アてわかったと考えられたのでした。
しかしながら、

ナログであるマレイン酸（図 3-IX、アスパラギン

ここには酵素蛋白質の役割については何も語られ酸と同じく炭素数 4 のジカルボン酸、アミノ基がていないのです。当時の利用できる技術、手段でないためシッフ塩基交換反応は起こらない）を結は他の多くの酵素同様、これ以上の情報を得るの合すると pKa は 8.8、α-メチルアスパラギン酸（図は難しく、何を試みても「群盲象を撫でる」だけ

3-X、シッフ塩基交換反応は生じ、外シッフ塩基はで、酵素の実体には迫れませんでした。一方で分できるが、α-水素がないのでその段階で止まる）

子生物学や細胞生物学など興味をそそる新しい分を結合すると 11 以上になる、つまり反応が進行す野が拓かれたこともあって、多くの酵素ハンター

るにつれてシッフ塩基の塩基性が高まって行くとが酵素を離れ、酵素学黄金期は去った、というのいう重要な知見を得ていました。

が当時の私の印象でした。

Snell のモデル反応や Jenkins らの sGOT の研究

これ以上踏み込むためには構造を知るしかない、によって蓄積された、このような知見を基にソ連との思いは日を追って強くなりました。我々にはの Karpeisky という天才が GOT の反応機構を見事構造は異なるが同じ特異性を持った二種類の酵素に説明しました（1966）。この機構の説明は省略しがある。その一次構造を比較したら、反応に関与

ますが、多くの生化学の教科書に載っています。

する部分は類似し、細胞内局在を決めている部分

シッフ塩基の pKa の変化については以下のようには異なっているだろうという極めて単純な発想で説明しています。
『活性中心には基質のカルボキシした。立体構造決定は、酵素化学者にとってはま

ル基を結合する正電荷がシッフ塩基の傍らにあるだ全く別世界の夢物語でした。ヘモグロビンやミはず。そのために内シッフ塩基の pKa は低くなっ

オグロビンの立体構造はすでに決定されており、ている。基質が結合してその正電荷を中和するこ

技術的には不可能ではなくなっていたのですが、とによって pKa は上昇する。基質のαアミノ基の分子量 10 万という大きな蛋白質に挑戦されていシリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回

る方は、我が国にはまだおられなかったと思いま

確に示されました。sGOT はカルボキシペプチダ

す。

ーゼ A の処理でイソロイシンがストイキオメトリ
ックに出現するが、反応液を除蛋白し上清を塩酸

未知の蛋白化学へ踏み出すで加水分解するとグルタミン酸が同程度に増加し、「やるしかない」と踏ん切りをつけましたが、見えていたグルタミンが消失します。イソロイシ

スタッフ全員やったこともなければ、勉強したこ

ンかグルタミンかということになりましたが、ヒともない。どんな試薬、どんな器具、どんな装置

ドラジン分解ではイソロイシンはかけらも出ず、が要るのか想像もつかないという状況で、無謀とグルタミンにはこの方法は適用できないのです。

いえば無謀、
よく決心したものと思います。
ただ、「グルタミンと思うが、技術的な問題ではないの

医学部のすぐ裏に理学部、蛋白質研究所、酵素研で証明は難しい」というのが成田先生のご意見で究所があり、成田耕造、松原央、次田皓先生などした。途方にくれたのですが、「この間ペプチドシ

からご指導、ご支援を受けることができました。

ンポジウムで理研の松尾さんが C 末端残基の特異

先ずは、和田先生と親しかった松原先生への相談

的トリチウム標識という新しい方法を発表していから始まりました。
「Sanger の方法で N 末端を調たが、こんな大きな蛋白質には無理だろう」と成べることから始めましょう。丁度 4 年生の学生が田先生がつぶやかれたのに飛びつき、「やってみん

卒業実験でそれに取り組んでいるから一緒に勉強と分かりません。紹介してください」と頼み込んしてみては」ということになりました。その時で、サンプル持参で東京へ行き、理研で数日お世

DNP 法の手ほどきをしてくれた 4 年生の学生さん

話になりました。松尾壽之先生で、後に宮崎医科が吉川信也さんで、後に兵庫県立大学の教授にな大学で数々の生理活性ペプチドを発見され、学長られ、膜蛋白質の結晶解析の草分けとして脚光をになられました。先生はすでに米国へ発たれた後浴びられました。sGOT の N 末端はアラニン（すで、お弟子さんの藤本博士に面倒見ていただき、

でにイタリアのグループが報告していたので、技

mGOT リシン、sGOT はグルタミンであることが術習得の意味があった）、mGOT はセリンである

確認できました。この方法を大きな蛋白質に適用ことが同定でき、両者が異なった蛋白質であるこした最初の例になりました。この GOT アイソザとを化学的に証明できました。定量の結果分子量イムの両末端残基の同定が私の蛋白化学者として10 万につき 2 モルであることも分かりました。成のスタートになりました２）。何も知らない医学部田先生からメチオニンスルフォキサイドと鑑別し出の素人が、
多くの先生方に助けられ、励まされ、ておく必要があるとのコメントをいただき、その時には叱られながら 2 年近くを要し、100 mg 前後

ために数か月苦労したのも懐かしく思い出されまの試料を用いるという、今では信じられない手間す。

と材料を費やしました。

C 末端アミノ酸残基の決定には手こずりました。

ここで、米国へ行くことになり、カリフォルニ

ガイドブックに従ってカルボキシペプチダーゼをア大学バークレイ校、PLP のゴッドファーザー

作用させ、経時的に遊離してくるアミノ酸をアミSnell 教授の研究室で 3 年余り過ごました。これかノ酸自動分析機で分析するのですが、全てのサンらは「蛋白質の構造と機能相関」が酵素学の主流

プルを成田先生が自ら分析機にかけてくださいまになると考えておられ、大腸菌のトリプトファナ

した。新しい貴重な機械だったので他人に扱わせーゼという PLP 酵素（分子量 5 万のサブユニット

たくないのかなと勝手に推察していました。塩基からなる 2 量体）が大量に得られるので、その一性アミノ酸に特異的なカルボキシペプチダーゼ B

次構造を手掛けることになりました。すぐ近くの処理で、mGOT の C 末端がリシンであることは明スペースサイエンス研究所に松原先生が研究室をシリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回

構えておられたので、共同研究の形をとってもら

私が一人で 400 残基余りの蛋白質を手掛けて、定い、蛋白質の一次構造決定のストラテジーを学習

年まで頑張っても終わらんだろうと考えられて当しました。トリプシン消化によって得られたペプ

然でした。
「ほんまにやるんか？そんなら一生テー

チド断片のアミノ酸配列を決定して（全残基のマに困らんですむな」とからかわれたこともあり90%）帰国しましたが、後年 Snell 研で cDNA からますが、周囲の偽らざる見方だったと思います。

全構造を推定した時、私の決めた配列に間違いは蛋白質の一次構造決定には全く無縁の研究室になかったと Snell 先生が言っていたと人伝に聞き

米国の松原研の設計を思い出しながら、そして他ました。分子量数万でも時間をかければできるとのスタッフに遠慮しながら、器具、試薬、装置をいう手ごたえを得ました。

揃え、ペーパークロマトグラフィーや高圧ろ紙電1970 年の年末に帰国し、阪大医学部助手として気泳動あるいはエドマン分解を行う場所の確保な構造決定に取り掛かることにしました。Braunstein

どに 1 年ほどかかりましたが、その間に mGOT をの発見した酵素ということで、sGOT の一次構造

差し当たり 1 グラムを目途に溜めることを目指し決定をソ連共産党が国の威信をかけて手掛けていました。米国で使っていた 1、2、5、10λのミクロて、最終段階にあるとの情報が米国滞在中に入っ

ピペット、ガラス細管の先を細く引き伸ばした使ていたので、mGOT に専念することにしました。

い捨てのパスツールピペットも持ち帰り、一本一sGOT は 1972 年 412 残基の全構造が報告されまし

本洗っては何度も使ったのも、貧しいころの思いたが、当時決定されたアミノ酸配列としては、β出です。

ガラクトシダーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、IgG

一次構造決定のストラテジーはほぼ完成していに次いで 4 番目に長い配列でした。当時はすでにたと思います。蛋白質を断片化するために用いる

かなりの数の蛋白質の一次構造が報告されていま特異性の異なるプロテアーゼとして、
トリプシン、したが（それでも一次構造年間発表論文数は 50 もキモトリプシン、サーモライシン、スタフィロコ

なく、ほぼすべての論文に目を通すことができまッカスプロテアーゼ、化学的にメチオニンのカル

した）、2～300 残基以下が圧倒的に多く、400 残基

ボキシル側で切るブロムシアン、生成するペプチ

以上は極めて僅かでした（図 4）。我が国で蛋白質

ドを精製するためのイオン交換体（Dowex1、50、の一次構造決定に従事されていたのは、
成田耕造、

DE52、ホスホセルロスなど）、ゲルろ過用ゲル

松田源治、高橋健治、次田皓、松原央、岩永貞昭、（SephdexG25、50、Bio-Gel P2、4、10 など）、最田宮信雄などの諸先生数名であったと思います。

終段階でのペーパークロマトグラフィー、高圧ろ

我が国の蛋白化学の揺籃期あるいは黎明期と呼ん

紙電気泳動などが容易に利用でき、これ等をいかでもいい時代でした。Sanger がインスリン 51 残にうまく組み合わせて効率よく行うかが成功への基の構造決定にほぼ 10 年かかっており、素人のカギであり、研究者の腕の見せ所でした。イオン
交換クロマトグラフィーではペプチドの分離に揮
発性溶媒を用いる方法が確立しており、集めた分画を凍結乾燥して溶媒を容易に除去することができました。高速液クロはまだ影も形もなく、しかも数十個生成する断片を一つ残らず回収して均一の状態にまでもってくる、根気と気合と頭の使い方が必要でした。ゲルろ過も分離したいペプチド

図 4．1978 年時点での配列決定された蛋白質数と分子量（Walsch, K.A. et al. Ann. Rev. Biochem. 1981 より）の長さに応じて適切なゲルを選択、
直径 1 センチ、長さ 1.2 メートルほどのガラス管に詰め、1 分間

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回に 1 滴くらいの流速で 1〜2 ml ずつ分取する。ペ

上に打点され、ピークの高さとその 1/2 の所の幅

プチドの流出も自動的に記録されるのではなく、（実際はそこから上の打点の間の数を数える）か

溶出液を試験管から分光器のセルに移し、220 nm

ら求めるわけで（H×W 法、図 5）、電卓はまだなの吸収を測定する。溶媒の都合では少しずつ取り

く、計算尺の扱いはうまくなりました。記録紙が出してニンヒドリン反応を行う。これらの結果を少したまるとその計算だけでも半日ではすまない

グラフ用紙にプロットして集める分画を決める。

仕事でした。

おそらく今では想像できないであろう手間がかか詳細は省きます。39 トリプシンペプチドの 318

る仕事でした。エドマン分解法も一応出来上がっ

残基（全体の 80%）
、12 ブロムシアンペプチドのていました。PTH アミノ酸の検出も、蛍光シリカ

367 残基（全体の 90%）のアミノ酸配列を重ね合

ゲル上に紫外線を当てると紫外線を吸収して蛍光わせ、1977 年 401 残基を矛盾なく並べ終えることのバックに黒いスポットとして認められる方法がができました。当時の日本新記録でした。一生かでき、3 種類の展開溶媒で全アミノ酸の同定がでかっても終わらないだろうといわれていましたが、きるようになりました。しかし、投稿にあたって

7 年足らずで完成しました。
「蛋白質構造討論会」

レフェリーは定量的データーを要求し、薄層クロでの発表に胸躍らせていましたが、予稿集を見まマトで同定したという記述では通してくれません。

すと私の前の演題が、ワシントン大学の Neurath の

1 段階ごとに反応液の一部をくみ出して加水分解

研究室から帰国された千谷晃一先生の、ホスホリ

し、アミノ酸分析で前段階から減ったアミノ酸をラーゼ 800 余残基の完全構造となっていました。

知るという消去法を用いなければならず、量的に「せっかくの日本記録も影が薄くなるなあ」とのも時間的にも大変不経済でした。後に、遊離して思いで演壇に上がったのですが、並み居る先生方

くるアミノ酸のチアゾリノン誘導体を HI で分解のお顔を拝見し、開口一番「これからの私の発表

して遊離のアミノ酸にしてアミノ酸分析機で定量

は純国産であります」とスッと言えたシーンを思３）する方法ができ 、長いペプチドやシークエンサ

い出します。数年後、成田研からタカアミラーゼ

ーによる蛋白質のアミノ末端配列決定に有効でし

500 数十残基が報告されて記録は破られました。

た。アミノ酸分析も自動とは言うものの今のよう途中で伊・英国共同チームが同じ仕事を進めてに全自動ではなく、記録紙に描き出されたピーク

いることが分かり、それからは競走になりました。

面積を計算して、標準試料と比較するところは手

和田先生（薬理学の教授になっておられた）に薬動でした。吸光度は自動記録計で経時的に記録紙

理学の院生（榊原隆三君）をつけていただき、休日返上、連日ほぼ終電車といえる猛スピードで突っ走りました。JB の速報で報告しましたが、その3 か月後相手も FEBS Lett に全構造を発表したのです。受付日からみて一か月くらいの差でした。
JB の有難味を痛感しました。相手には数か所誤りがあり、「You win. Congratulation!」の手紙ももらいましたので、ゆっくり詳細を 3 報に分け、J. Biol.
Chem. に報告しました４−６）。
「働き方法案で労働時間云々」では競走には勝てなかったでしょう。疲
れなど感じたこともありませんでした（若かった図 5．H×W 法による記録紙上でのアミノ酸数の計算例（「生のでしょう）。ただ、苦労したのは 400 残基を間違

化学実験講座 1 タンパク質の化学 II」日本生化学会編より）

いなくタイプ打ちすることでした。コンピュータ

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回

ーはなく、今のように自由に削除したり、挿入して参加した近藤淑君が 2 年足らずで決定しました。

たり、行を変えたりできません。発表によってアcDNA から蛋白質の一次構造が推定できる時代

ミノ酸配列図のパターンを変えようしたり、またになっており、
国際的に微生物からヒトまで 10 種

その時一字でもミスが見つかると全てを最初から余りの GOT の一次構造を並べることができまし打ち直さなけらばならなくなるのです。

たが、機能を云々できる情報は得られず、立体構

1975 年新設の滋賀医科大学に助教授として赴造に取り掛かからなければとの思いが日に日に強任することになりましたが、附属病院開院までのまりました。しかし、結晶解析に適切な結晶を得

2 年間は別の場所の仮校舎で授業のみ行われたのるのが容易ではなく、量的な問題もあって我が国

で、研究はそのまま阪大で続け、1978 年に移りまの酵素研究者は二の足を踏んでいました。GOT にした。野崎教授が酸素添加酵素の一次構造決定をは量的な問題はなく、sGOT は米国、mGOT はス

希望され、最初からそれなりに研究室を設計でき

イスで結晶解析が行われ、ともに 1977 年に報告ました。酸素添加酵素では最初の一次構造決定をされました７，８）。PLP とリシン残基が内シッフ塩

残すことができました。

基を形成している事、活性中心にマレイン酸が結さて、GOT アイソザイムの構造比較という世界

合すると、活性中心を閉じるように小ドメインと的に初めての成果をあげ、所期の目的は達成でき呼ばれる部分が大ドメインと呼ばれる部分に向かたのですが、並べてみると（図 6）48%も類似性がって動く induced fit が生じること、外を向いていあり、何もわからないことに気づかされました。

た、基質のωカルボキシル基と結合するアルギニ

1980 年に教授として大阪医科大学に移りました。

ン残基の側鎖がそれを迎え入れるように活性中心

当時は財政的に余裕があったのか、イニシャルフの内方へ向きを変えるなどが示され、Karpeisky のァンドとして数千万円準備していただけました。

説明、Danathan の仮説が裏付けられました。しかペーパークロマトグラフィー、高圧ろ紙電気泳動

し、induced fit が生じる機構やその意味、活性中心装置、シークエンサー用の部屋も古い研究室の向の残基の役割など、酵素の真髄に迫れていないこ

かい側に作ってもらえ、高速液クロ、LKB 社の固とに変わりはありませんでした。結晶構造を眺め

相法シークエンサーも購入でき、仕事の微量化、ているだけでは何も解決しないことは明らかでし

迅速化はけた違いになりました。滋賀医大で精製た。

していた大腸菌 GOT の構造も、新しく助手とし

図 6．sGOT（上）と mGOT（下）の一次構造比較（太字の K は PLP とシッフ塩基を形成しているリシン）

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回

立体構造決定から蛋白質工学へ

う歪の解消によってもたらされていることを示し、1980 年代にはいると遺伝子組み換え技術が一反応効率を上昇させている仕組みが酵素蛋白質に般化し、試料の大量生産が可能になり、専門家の仕組まれているという、酵素科学上新しい概念を協力さえ得られれば結晶構造解析に取り組むこと提出し、この分野に大きな足跡を残すことができができる時代になりました。GOT の反応機構を蛋たと自負していますが、これからは近現代史にな

白質の微細構造解析をもとに説明したい、そのたりますので本稿では触れないことにします。

めには、アミノ酸側鎖の役割を知るのに従来用い自分だけと思っていても、世界中で誰かが、同られていた化学修飾では駄目で、部位特異的突然じころ、同じことを考えているものです。カリフ

変異を導入することが必要と確信し、遺伝子操作

ォルニア大学の J. Kirsch と激しい競争になりましをしやすい大腸菌 GOT へと対象を変えました。

た。変異を行う部位も同じころに同じことを考え

丁度倉光成紀君をスタッフに迎えたところで、大るものです。林君がリーダーとなって互角以上の腸菌の遺伝子を扱っておられた阪大理学部の小川

勝負をしてくれました。ともにこの分野では世界

英行教授の研究室に入り浸り、遺伝子操作技術をのトップグループを形成していたと思います。

習得し、GOT の遺伝子をクローニングしてもらい「We have enjoyed and benefited from our collegial
and friendly competition. This led to a much greater rateof discovery than if there had been no competition.」彼ました。そのころ大阪市立大学理学部の樋口泰一教授が訪ねてこられ、「これまで低分子の結晶解析を専らにしてきたが、これからは蛋白質の X 線結から私の退職記念誌に贈ってくれたメッセージで晶解析の時代と思うので一緒に勉強させてほしい」

す。

との申し入れがあり、「単に結晶構造を決めるだけ
でなく、それをもとに反応機構も一緒に議論しておわりにいただける」ことを条件に受け入れました。以後

今や、蛋白質の一次構造を化学的に決めるのは大市大の広津健助教授が中心となって、大腸菌の古い話になってしまいました。一次構造を決める

大量精製、酵素精製など慣れない仕事からお手伝

だけでは何ら評価されない時代です。しかし、そいいただきました。大腸菌酵素は、一次構造はんなことに骨身を削る時代もあったのです。振りmGOT との類似性は 50%ですが、立体構造を比較

返ってみると、そんな時代から出発して「GOT のすると活性中心の残基、並びにその空間配置はほ構造と機能相関」に最後まで関わり続けた推進力

ぼ同じで、induced fit も生じます。新たにスタッフ

は「終点を新たな出発点」としてきたことと考えとして林秀行君が加わり、数十種類の変異体を作ます。古典的酵素学は終点近くまで行ったが、何り、マレイン酸、αメチルアスパラギン酸を結合もわからない。
一次構造を決めれば道は開けると、させ、構造変化を精密に観察し、反応速度論的手

未知の世界に踏み込んで最後までやり遂げたが何法も取り入れて、活性中心の残基の役割を中心にも解決しない。それではと X 線結晶解析の道へと数々の新しい知見を発表しました。特に、遊離酵出発したが、立体構造を眺めるだけではそれで終素におけるシッフ塩基の pKa の低下が、PLP と周わりになります。今は、立体構造を決めただけで囲の残基との相互作用によって、内シッフ塩基がは「それがどうした」といわれる時代になってい歪まされていることでもたらされていることを示

るのではないでしょうか。部位特異的変異を導入しました。上述したシッフ塩基の pKa の調節が、し、基質類似体を結合させ、構造変化を精密に解Karpeisky の予想したような単なる基質の静電効

析するなりして酵素蛋白の重要な役割を示し、酵果でなく、PLP、基質、酵素蛋白質の相互作用でも素学への新しい概念を提出し、少しわかったようたらされるシッフ塩基の歪みと、反応の進行に伴な気になったのですが、まだまだ酵素の真髄に迫シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第 27 回

るまでには至りません。新たな出発には新たな技術の導入が必要であることも実感しました。
蛋白質の機能は蛋白質と他の物質（他の蛋白質を含めて）との相互作用と、それに続いて生じる化学反応です。その時の蛋白質の動的変化をとら

8.

Harris, C. M. & Metzler, D. E. J. Mol. Biol. 112,509-513 (1977)
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え、精密に解析し、その変化の意義を解くことが必要です。そのためには化学的、物理的、物理化
学的、分子生物学的、量子化学的手法、新しい技

鏡山 博行先生 ご略歴

術、考え方などを駆使してよりベーシックな領域に踏み込んでいくことで道を開くことです。そう昭和 10 年 大阪市に生まれる

しないと欧米の後も追えないようになってしまい

昭和 36 年 大阪大学医学部卒業

ます。日本蛋白質科学会とその若いメンバーの方々に期待して稿を終えます。

インターン開始
昭和 41 年 大阪大学大学院医学研究科単位修得
退学（医学博士）

文献

昭和 41 年 日本学術振興会奨励研究生

1.

昭和 42 年 米国カリフォルニア大学バークレイ

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校博士研究員昭和 45 年 大阪大学助手（医学部）
昭和 50 年 滋賀医科大学助教授
昭和 55 年 大阪医科大学教授
平成 12 年 日本生化学会会長
平成 15 年 日本ビタミン学会会長
平成 16 年 大阪医科大学名誉教授