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ウコン由来クルクミンは本当に生体内で抗酸化能を持つのか＜平成20年度＞

ウコン由来クルクミンは本当に生体内で抗酸化能を持つのか新井秀

明（東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻生命環境科学系）

1. 緒

言きず，食餌・飲水から VC を与えなければ壊血病により致死となる 7）。VC は強力な抗酸化作用を酸化ストレスはさまざまな疾患と関連が深く，持つ水溶性のビタミンであり，実際に SMP30/

特に，アルツハイマー病，パーキンソン病，筋萎GNL ノックアウトマウスの脳では酸化ストレス

縮性側索硬化症，糖尿病など，加齢・老化に関連の上昇が見られる 8）。また，このマウスの脳スラした疾患と密接に関係している。生体における酸イスを用いた実験からは，VC の欠乏状態では脳化ストレスを制御することは，これら老化関連疾に お い て， 活 性 酸 素 種（Reactive Oxygen

患の予防法を開発する上で極めて重要である。特Species；ROS）のひとつであるスーパーオキシに，食物由来の成分によって酸化ストレスを制御ドの上昇が見られる。このスーパーオキシドの上することは非常に現実的な手段となることが期待

昇は，マウスに VC を補給していた場合には観察できる。ウコンに含まれるクルクミンおよびそのされない 9）。さらに重要なことには，VC の欠乏代謝物・類似物質は試験管内で抗酸化作用を示す

条件下においても脳内のスーパオキシドディスミが 1 〜 5），実際に生体内で同様の作用を持つのかはューターゼなど抗酸化系の酵素は誘導されないの明らかとなっていない。ウコンは歴史上，極めてで，酸化ストレスの上昇を補完する抗酸化系酵素

長期間にわたって食用・薬用に用いられてきておの関与を無視できる。以上のことから，SMP30/り安全性が高いと考えられ，実用上の期待が非常

GNL ノックアウトマウスは，VC の補給の有無にに高いと言える。

より生体，特に脳での酸化ストレスを制御できる

我々の研究グループでは，加齢にともなって起非常に有用なモデル動物であると言える 9）。

こる老化という現象のメカニズムに関する研究を本研究では，SMP30/GNL ノックアウトマウス行ってきた。一連の研究の過程で，加齢にともなを用いて，VC 欠乏による酸化ストレスの負荷時って肝臓で特異的に減少するタンパク質として加にクルクミンが抗酸化作用を示すか否かを検討し

齢 指 標 タ ン パ ク 質 30（Senescence Marker

た。実験では，脳スライスを用いて Lucigenin をProtein 30；SMP30）を発見した 6）。SMP30 の機用いたスーパーオキシドの検出をリアルタイムバ

能は長い間不明であったが，2006 年になってこイオラジオグラフィー法により行った 10, 11）。本研のタンパク質がビタミン C（VC）の生合成に関与

究ではクルクミン添加食による飼育を行ったマウするグルコノラクトナーゼ（gluconolactonase；

スの脳のスライスを用いて実験を行ったため，クGNL）であることを発見した。この SMP30/GNL

ルクミンの抗酸化能をより生体内に近いかたちでの遺伝子を破壊したマウス（SMP30/GNL ノック検討できると考えられる。

アウトマウス）は体内で VC を合成することがで80

浦上財団研究報告書

2. 材料および方法
2. 1

動物

SMP30/GNL ノックアウトマウスは東京都健康Vol.17（2009）

オキシドの検出は先行研究にしたがって行った 9 〜 11）。マウスをジエチルエーテルで麻酔後，迅速に脳を取り出した。氷冷下でビブラトーム（Microslicer DTK-3000W；Dosaka EM, Kyoto,長寿医療センター研究所の動物施設においてJapan）により 300 nm 厚のスライスを作成した。

SPF 環境下で飼育した。体重は 10 日ごとに測定

線条体部分を含むスライスおよび海馬部分を含むした。

スライスをチャンバー内（124 mM NaCl, 5 mM

2. 2

飼育試料

KCl, ２ mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 1.2 mM

通常食として VC を含まない CL-2（日本クレKH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose）に固ア）を用いた。クルクミン添加飼料として，1000定した。スライスの入ったチャンバーをバッファppm（0.1 ％）のクルクミン（和光純薬）を CL-2ー中で 45 分間プレインキュベーションした後，2をベースとして混合，再ペレット化をしたものをmM lucigenin を含むバッファー 50 ml に移した。

用いた（日本クレア）。コントロール飼料および最初 120 分間は 100％の O2 ガスをバッファー中

クルクミン添加飼料は 30 KGy のガンマ線滅菌にに バ ブ リ ン グ し 酸 素 で 飽 和 さ せ た。 そ の 後，より滅菌した。

100% の N2 ガスに切り替え 15 分間低酸素状態に2. 3実験群した。さらにその後，再び 100％の O2 ガスに切全ての動物は，SMP30/GNL ノックアウトマウり替え再酸素化状態にした。イメージは 15 分ごスのメスを用いた。生後 4 週間で離乳し，その後とに積算し合計 17 フレームのイメージを得た。

６週間以下の４条件で飼育した。各群の個体数は９フレーム目が低酸素状態となる。

全て６匹である。
①飼育水に 1.5 g/l の VC を添加する。通常食（CL-2）を与える。
「VC（＋）通常食」群。
②飼育水に VC を添加しない。通常食（CL-2）を与える。
「VC（−）通常食」群。

Lucigenin に よ る 蛍 光 は photon-counting
camera（Intensified CCD camera C-2400-35；
Hamamatsu Photonics K.K., Hamamatsu,Japan）により検出し，イメージコントローラー（ARGUS-20; Hamamatsu Photonics K.K.,③飼育水に 1.5 g/l の VC を添加する。クルク

Hamamatsu, Japan）によりデータをプロセシンミン添加食（CL-2 ＋ 1000 ppm クルクミン）をグ し た。 シ グ ナ ル 強 度 は AQUACOSMOS与える。
「VC（＋）クルクミン」群。

（Hamamatsu Photonics K. K., Hamamatsu,④飼育水に VC を添加しない。クルクミン添加食（CL-2 ＋ 1000 ppm クルクミン）を与える。
「VC（−）クルクミン」群。
上 記 の VC の 条 件 で， 脳 内 の VC 量 は，VC（＋）群では野生型マウスと同程度の濃度となり，VC（−）群では顕著に減少することが分かっている 9）。
2. 4

リアルタイムバイオラジオグラフィー

脳スライスを用いた Lucigenin によるスーパーJapan）により定量化した。
９フレーム目が低酸素状態であり，７，８フレームのシグナル強度の平均値をbaseline，10，11，12 フ レ ー ム の シ グ ナ ル 強 度 の 平 均 値 をreoxygenationとしてデータ処理を行った。

3. 結果と考察
3. 1

体重の変化

VC の投与群では，クルクミンの添加・不添加ウコン由来クルクミンは本当に生体内で抗酸化能を持つのか81によらず飼育日数とともに体重が増加した。一方，リアルタイムバイオラジオグラフィーによるイVC の非投与群では離乳２週後から体重の減少がメージングの典型例を図 3 に示す。一過性の低酸見られた。VC の非投与群ではクルクミンの投与素状態の後，再酸素化を行うと図 3 に見られるよにより体重の減少が抑制された（図 1）。離乳６

うに急激にスーパーオキシドの生成量が上昇した。

週時では，通常食飼育では VC（＋）と VC（−）

こ の ス ー パ ー オ キ シ ド の 増 加 は， 再 酸 素 化 後で体重に有意な差が観察されたが，クルクミンの15-30 分でピークに達し，その後基底状態へと減投与群では有意な差がなかった（図 2）。このこ少していった（図 4）。このときの低酸素状態のとは，VC の欠乏により引き起こされる体重の減直前の２フレームを baseline と定義し，低酸素少に対して，クルクミンはこの減少を抑制する効直後の３フレームを reoxygenation と定義してデ果があることを示している。

ータの解析を行った（図 4）。

3. 2

スーパーオキシドの量の変化

図１

図２

Baseline ではクルクミンの有無に関わらず，体重の変化
VC（＋）：VC 投与群，VC（−）：VC 非投与群

飼育６週間後の体重データは平均値±標準偏差を表す。NS：有意差なし。

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浦上財団研究報告書

図３Vol.17（2009）

リアルタイムバイオラジオグラフィーによるスーパーオキシドの検出
各群には，線条体を含むスライス１枚と海馬を含むスライス２枚（左から右）合計３枚のスライスがのっている。

図４

虚血・再環流モデルにおけるスーパーオキシドの変化
データは平均値±標準偏差を表す。

VC 欠乏群でシグナルが強かった。一方で，VCシドの生成量の増加を抑制する効果は持たないこ

欠乏群においては，クルクミンはシグナルの強度とを意味する。に 影 響 を 与 え な か っ た（ 図 5）
。 同 様 に，クルクミンおよびその代謝物・類似物質は試験

reoxygenation において，クルクミンの非投与群管内では明確な抗酸化作用を示す 1 〜 5）。また，こでは VC の欠乏はシグナルを増加させる傾向があのような直接的な（化学物質としての）抗酸化作り（p ＝ 0.053），クルクミンの投与群では VC の用に加えて，内在性の酵素・タンパク質に作用し欠乏はシグナルを有意に増加させた。一方で VCて間接的に，抗酸化作用・細胞保護作用をもたら欠乏群においては，クルクミンはシグナルの強度すことが分かってきている 12）。これらの知見にに影響を与えなかった（図 6）。これらの結果は，反して，本実験では，VC の欠乏によるスーパークルクミンは VC 欠乏による脳内のスーパーオキオキシドの生成量の増加に対してクルクミンは影ウコン由来クルクミンは本当に生体内で抗酸化能を持つのか

図５

Baseline におけるスーパーオキシドの量
データは平均値±標準偏差を表す。NS：有意差なし。

図６Reoxygenation におけるスーパーオキシドの量
データは平均値±標準偏差を表す。NS：有意差なし。

83

響を与えない結果が得られた。この理由のひとつ

おいては，本実験で用いたのと同じレベルの投与として，本実験での投与条件では標的器官である量・投与方法を用いて，アルツハイマー病モデル

脳に十分量のクルクミンが到達・存在していない

マウスの脳内の酸化ストレスがクルクミンにより可能性が考えられる。しかしながら，先行研究に低減されたことが報告されている 13）。クルクミ

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浦上財団研究報告書

Vol.17（2009）

ンをエサに混合して投与する実験方法は多くの先謝辞

行研究で行われている方法であり，また添加する

本研究を遂行する上で，多大な研究助成金を賜

濃度も本実験で用いた濃度と同レベルである。まりました浦上食品・食文化振興財団に心より感謝た，クルクミンは脳血管関門を通過して脳内に達の意を表します。また，研究遂行にご協力頂きますることが報告されている 14）。したがって，本した東京都健康長寿医療センター研究所の佐々木実験で行った，クルクミンをエサに添加する方法

徹博士，近藤嘉高博士，丸山直記博士および東邦でも脳内にはクルクミンが存在していると考えら

大学薬学部の石神昭人博士に深謝いたします。

れる。
以上の結果から，次の二つの可能性が考えられ文る。ひとつは，クルクミンは試験管内では抗酸化１）作用を示すけれども，より生体に近い状態では実は抗酸化作用を持たないということである。もう献
Zhao B., Li X., He R., Cheng S., Wenjuan X.

Scavenging effects of green tea and natural antioxidants
on active oxygen radicals. Cell Biochem. Biophys. 14,
175-185（1989）.

ひとつは，VC 欠乏状態というのは実験条件とし

２） Osawa T., Sugiyama Y., Inayoshi M., Kawakishi S.ては厳しすぎるため，クルクミンの効果が検出でAntioxidative activity of tetrahydrocurcuminoids. Biosci.

きなかったことが考えられる。VC は非常に強力な抗酸化物質であり，本実験でも明らかとなった

Biotech. Biochem. 59, 1609-1612（1995）.
３） Sugiyama Y., Kawakishi S., Osawa T. Involvement of
the beta-diketone moiety in the antioxidative mechanism

ように，脳での ROS の除去に極めて重要な役割

of tetrahydrocurcumin. Biochem. Pharmacol. 52, 519-525を果たしていることが推測される。本実験で用い（1996）.

た VC 欠乏状態では，脳内の VC 濃度を非常に低４） Priyadarsini K. I., Maity D. K., Naik G. H., Kumar M. S.,
Unnikrishnan M. K., Satav J. G., Mohan H. Role of phenolic

下させてしまうことが我々の研究グループの研究

O-H and methylene hydrogen on the free radical reactionsから分かっている 。このような条件は，脳内のand antioxidant activity of curcumin. Free Radical Biol.

環境としては極めて過酷な条件である。このことMed. 35, 475-484（2003）.

9）により，クルクミンの効果は，仮にあったとして

５） Chen W. F., Deng S. L., Zhou B., Yang L., Liu Z. L.
Curcumin and its analogues as potent inhibitors of low

も，VC 欠乏という条件下では検出できなかった

density lipoprotein oxidation: H-atom abstraction from theのではないかと考えられる。

phenolic groups and possible involvement of the

一方で，クルクミンは，VC 欠乏による体重減少を抑制する効果を示した。このことは，VC と4-hydroxy-3-methoxyphenyl groups. Free Radical Biol.
Med. 40, 526-535（2006）.
６） Fujita T., Uchida K., Maruyama N. Purification of

クルクミンはなんらかの関連性を持つことを示唆

senescence marker protein-30（SMP30）and its androgen-している。クルクミンは，体重というレベルではindependent decrease with age in the rat liver. Biochim.

VC 欠乏というデフェクトを補完しているようで

Biophys. Acta 1116, 122-128（1992）.
７） Kondo Y., Inai Y., Sato Y., Handa S., Kubo S.,ある。予備的な実験からは，この体重減少抑制とShimokado K., Goto S., Nishikimi M., Maruyama N.,

いう減少は一部には食欲の調節を介している可能

Ishigami A. Senescence marker protein 30 functions as性を示唆する結果が得られている。これに関して

gluconolactonase in L-ascorbic acid biosynthesis, and its

はさらなる検討が必要である。

knockout mice are prone to scurvy. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 103, 5723-5728（2006）.
８） Son T. G., Zou Y., Jung K. J., Yu B. P., Ishigami A.,
Maruyama N., Lee J. SMP30 deﬁciency causes increased

ウコン由来クルクミンは本当に生体内で抗酸化能を持つのか
oxidative stress in brain. Mech. Ageing Dev. 127, 451-457（2006）.

85

7, 459-469（2008）.
12） Aggarwal B. B., Sung B. Pharmacological basis for the９） Kondo Y., Sasaki T., Sato Y., Amano A., Aizawa S.,

role of curcumin in chronic diseases: an age-old spice withIwama M., Handa S., Shimada N., Fukuda M., Akita M.,

modern targets. Trends Pharmacol. Sci. 30, 85-94（2008）.

Lee J., Jeong K. S., Maruyama N., Ishigami A. Vitamin C13） Lim G. P., Chu T., Yang F., Beech W., Frautschy S. A.,

depletion increases superoxide generation in brains ofCole G. M. The curry spice curcumin reduces oxidative

SMP30/GNL knockout mice. Biochem. Biophys. Res.

damage and amyloid pathology in Alzheimer transgenic

Commun. 377, 291-296（2008）.

mouse. J. Neurosci. 21, 8370-8377（2001）.

10） Sasaki T., Iwamoto A., Tsuboi H., Watanabe Y.

14） Yang F., Lim G. P. Benum A. N., Ubeda O. J., Simmons

Development of real-time bioradiographic system for

M. R., Ambegaokar S. S., Chen P., Kayed R., Glabe C. G.,

functional and metabolic imaging in living brain tissue.

Frautschy S. A., Cole G. M. Curcumin inhibits formation ofBrain Res. 1077, 161-169（2006）.

amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and11） Sasaki T., Unno K., Tahara S., Shimada A., Chiba Y.,
Hoshino M., Kaneko T. Age-related increase of superoxide
generation in the brains of mammals and birds. Aging Cell

reduces amyloid in vivo. J. Biol. Chem. 280, 5892-5901（2005）.

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URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.17（2009）

Does curcumin derived from turmeric show antioxidative effects in living brain？

Hideaki Arai
（Department of Life Sciences, Graduate School of Arts and Sciences, University of Tokyo）

Curcumin derived from turmeric functions as antioxidant in vitro, whereas its relevancy
in vivo remains obscure. Here we utilized SMP30/GNL knockout mice which have deﬁciency
in vitamin C（VC）biosynthesis. VC is a strong water-soluble antioxidant and hence SMP30/
GNL knockout mice are useful in vivo tool for the evaluation of the effects of oxidative stressand also the efficacy of food-derived compounds with potential antioxidative action. Themice were fed with or without curcumin in the presence or absence of VC in the drinking
water. Superoxide anion levels in the live brain were measured using a real-time imaging
system in which Lucigenin is the chemiluminescent probe for detecting superoxide.
The body weight of VC（− ）mice was signiﬁcantly less than VC（＋）mice in the control
diet groups. In contrast, the body weight of VC（−）mice showed no signiﬁcant difference
from that of VC（＋）mice in the curcumin-supplemented diet groups. Thus, curcumin suppressed thebody weight loss induced by the VC depletion. The superoxide-dependentchemiluminescence levels determined by ischemia-reperfusion tended to be higher（p=0.053）
in the VC（−）mice than VC（＋）mice in the control diet group. Similarly, the superoxidelevels were signiﬁcantly higher in the VC（−）mice than VC（＋）mice supplemented withcurcumin. Importantly, there was no signiﬁcant difference in the superoxide levels between
curcumin（−）mice and curcumin（＋）mice in the absence of VC. Thus, curcumin had nosuppressive effect on the increase of superoxide induced by VC depletion.
As opposed to the solid evidences for the function as an antioxidant in vitro, curcumin
actually could have less impact in the experimental settings more resembling in vivo
situation. Alternatively, oxidative stress induced by VC depletion could have been
overwhelmingly intense so that antioxidative action of curcumin, if any, might have been
undetectable by the methodology employed in the present study.