受賞者講演要旨《農芸化学技術賞》

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新規酵素による汎用的ペプチド新製法の開発とアスパルテームの工業生産
味の素株式会社
はじめに1901 年，E. Fischer による Gly-Gly の合成が初めて報告されて以来，ペプチド生産技術は飛躍的に発展してきた．不要ペプ
チド副生を抑制し効率的にペプチド鎖を延長するための保護基の導入技術の確立（1930 年代），必要な縮合エネルギーを得るための活性エステル法等によるカルボキシ成分の活性化方法の確立（1950 年代），固相ペプチド合成法の確立（1963 年）等の優れた技術開発によって，ペプチド合成法の基盤技術が確立された．一方，Bergman らによるプロテアーゼを用いるペプチド合成法の発見（1937 年）以来，化学合成法で問題となるアミノ

図 1.

酸のラセミ化を回避する方法として酵素法が開発されたが，生新規酵素によるペプチド生産様式

成ペプチドが沈殿して系外に除去される特殊な例を除き高い生いう課題をもつ Ala-Gln に着目し，（Ala-OMe＋Gln→Ala-Gln＋産性は得られていない．また，我々が本ペプチド新製法を発見

メタノール）の系を選定した．生成 Ala-Gln を分解する菌体内した直後に，ATP を要求する ligase を用いたジペプチド生産

プロテアーゼ活性を低下させ，ペプチド生成酵素が存在すれば方法が報告された．優れた方法であるが，生産可能なジペプチ菌体反応で Ala-Gln の蓄積が観察できる系を構築して微生物をドの種類が限定される点，トリペプチド以上のオリゴペプチド広く検索した結果，Ala-Gln を微量生成する微生物は比較的多生産が不可能な点等，汎用性に乏しいという課題も有してい数見出されたが，高収率，高生産で Ala-Gln を生産する微生物る．の採取は困難を極めた．スクリーニング条件の変更等により最

このように，汎用性と生産性が高い方法として化学合成法を終的には Empedobacter brevis 等の数株の優良株を採取するこ中心にペプチド合成技術が確立されたが，アミノ酸への保護基とができた．ペプチド合成の潜在能力を見極めるため，これらの導入・脱離工程が必須であるため，新たなブレークスルーが選抜株群から単離した精製酵素を用いてペプチド合成能を検討求められていた．

した結果，Ala-Gln の合成収率が 50％を超える酵素群と，十％1.

ペプチド新製法の開発
1-1.

新製法開発の考え方以下の酵素群に大別できた．精製酵素の分子量，これらの微生物からの目的酵素をコードする遺伝子の塩基配列決定により，従来の工業製法の欠点を克服すべく，アミノ酸への保護基の高い合成収率を与える Empedobacter brevis 由来の酵素は約導入と脱離工程の省略，縮合エネルギーとして高価な活性エス

70 kDa のモノマーからなる 2 量体のセリン酵素であった．既テルや ATP からの脱却を念頭に，化学合成法と同様に高い生存酵素にはアミノ酸配列に高い相同性を示すものがないことよ産性と汎用性を有する安価な酵素的新製法の構築を目指した．

り新規な酵素と推察された（amino acid ester acyl transferase

活性化エステル法に相当する方法として安価なメタノールを縮と命名）．一方，低い合成収率しか得られない Bacillus 属細菌合エネルギーとする方法，すなわちカルボキシ成分として N-無由来等の酵素はプロリンイミノペプチダーゼに高い相同性を示

保護のアミノ酸メチルエステル（アミノ酸-OMe），アミン成分すことより，本酵素群によるペプチド合成はプロテアーゼによとしては無保護のアミノ酸を基質とする方法を採用した（図 1）．

る転移反応により触媒され，そのため合成収率が低いものと考このような考えでの報告は極めて少なく，一部のペプチド合成えられた．

において，カルボキシペプチダーゼ Y（CPase Y）等を用いる最優良酵素として選出した Empedobacter brevis 由来の精製方法が特許報告されているのみで，多量の酵素量添加，反応速酵素を用いて，Ala-OMe（100 mM）と Gln（200 mM） からの度の低さ，汎用性の低さ等多くの課題を残していた．

Ala-Gln 合成反応を検討した結果，極めて短時間の反応で 80％

1-2.

新規酵素の探索と新製法の構築以上の高い合成収率が得られることが判明した．反応液には少新規酵素の探索において，アミノ酸がアミノ酸-OMe に求核量の Ala 副生が観察されたが，Ala-Ala, Gln-Ala, Ala-Ala-Gln 等攻撃してペプチドを生成する条件はアルカリ性下と予想されたのペプチド副生は観察されなかった．Ala-OMe は本反応系にが，アミノ酸-OMe はアルカリ水溶液中で容易にアミノ酸とメおいて短時間で完全に自発的に加水分解されるので，上記結果タノールに自発的分解するという基質の不安定性を有するので，は，本酵素が Ala-OMe の自発的分解を圧倒的に凌駕するペプ基質の自発的分解速度を圧倒的に凌駕するペプチド合成速度（比チド合成速度を有していることを示唆している．また，生成活性）を有する新規酵素を採取することが必須条件となった．

Ala-Gln の分解，Ala, Gln のラセミ化も全く観察されず，目的目的酵素を生産する微生物のスクリーニングに用いた系は，輸とした能力をそなえている転移酵素であることが確認された．

液成分として有用であるが高価なために需要が拡大できないと本酵素の能力を検証するため，Ala-Gln 生産性を，既知酵素

10《農芸化学技術賞》

受賞者講演要旨の中で最も能力の高いと報告されているカルボキシペプチダー
ゼ Y と 比 較 し た 結 果，CPase Y の Ala-Gln 生 産 の 比 活 性 は，0.042 μmoles/min/mg protein と極めて微弱であるのに対し，本酵素の比活性は，220 μmoles/min/mg protein と極めて高い値を示し，CPase Y の約 5000 倍という圧倒的なペプチド合成能力を示した（分子量当りの比活性は約 6000 倍）．
1-3.

新製法の長所

本酵素の利点は，高収率，高生産性に加え，Ala-Gln 以外の

図 2.

種々のジペプチド合成に汎用的に応用できる点にある．本酵素

アスパルテームの生産方法

は，カルボキシ成分，アミン成分の双方に広い基質特異性を有しており，種々のジペプチド生産に利用可能である．

し，変異型酵素を高発現させた微生物の培養条件，本微生物を本法の更なる利点は，上記ジペプチド生産に加え，鎖長 3 以用いた酵素反応条件を種々検討し，従来の化学合成法と同等の上のオリゴペプチドの生産も可能な点にある．本酵素は，N 成高生産性，短時間反応のアスパルテーム生産を達成した．この分としてジペプチド以上のペプチドも基質として認識でき，反応液からのペプチドの効率的精製条件も確立し，2012 年 7 月

種々のオリゴペプチド生産に応用可能である（図 1）．例えば，にアスパルテームの工業生産を開始した．現在も順調に稼働しThr-OMe と Gly-Gly, Gly-OMe と Gly-Tyr-Ala からの Thr-Gly-ている（図 2）．

Gly, Gly-Gly-Tyr-Ala 生産収率は，それぞれ 83％, 44％に達する．

2-1.

おわりに

また，本酵素は種々の非天然型アミノ酸-OMe，非天然型アミ本技術は，現在，輸液成分として有用なアラニルグルタミンノ酸も基質として認識できるので，非天然型アミノ酸を含むジと高甘味度甘味料として広く利用されているアスパルテームのペプチド合成にも応用可能であり，汎用性に優れた安価なオリ工業生産に使用されている．アラニルグルタミンはその輸液成

ゴペプチド新製法として期待される．

分としての有効性は高く評価されているものの，未だ市場規模

ペプチド新製法の工業化

2.

2-1.

アスパルテームの工業化は小さい．一方，アスパルテームは世界規模で年間約 2 万 5 千トンという巨大な市場を形成しており，味の素（株）のシェアはアスパルテーム（Asp-Phe-α-OMe）は通常のジペプチドとはその 30％程度を占めている（味の素（株）IR 資料 2016 年）．現

異なり，構成成分の Asp は 2 つのカルボキシ基を有しアミン成在，味の素㈱で生産するアスパルテーム全量が本技術で工業生分の Phe はメチルエステル化されているため，その製法には工産されるに至っている．

夫が必要であった．まず Asp をメチルエステル化し Asp のジ（引用文献）

メチルエステル体（MeO-β-Asp-α-OMe）に変換し，酵素反応でこの Asp ジメチルエステルに Phe を縮合させて OMe-β-Asp-Pheを生産する．生成された OMe-β-Asp-Phe のメチルエステルは塩酸酸性化で自発的にアミン成分の Phe のカルボキシ基に転移するとともに，転移生成した Asp-Phe-α-OMe（アスパルテーム）は難溶性の塩酸塩となって晶析するため，酵素反応で得られた OMe-β-Asp-Phe は全量アスパルテーム塩酸塩に転移晶析される．本転移晶析技術は，味の素（株）の従来の合成法において開発され工業化に大いに貢献した特徴ある技術である（図2）．

1）A Novel and Efficient Enzymatic Method for the Productionof Peptides from Unprotected Starting Materials. K. Yokozekiand S. Hara, J. Biotechnol., 115, 211–220（2005）
2）Gene Cloning and Characterization of α-Amino Acid Ester
Acyl Transferase in Empedobacter brevis ATCC 14234 andSphingobacterium siyangenis AJ2458; Isao Abe, Seiichi Haraand K. Yokozeki, BioSci. Biotechnol Biochem. 75, 2087–2092（2011）
3）A Powerful New Tool for Peptide Production; Kenzo Yokozeki, Specialty Chemicals Magazine, March, 42（2005）
4）新規酵素を用いる工業的ペプチド新製法の開発；横関健三，
バイオサイエンスとインダストリー，64, 75–81（2006）

新規酵素として Empedobacter brevis から見出されたペプチド生成酵素のアミノ酸配列に相同性を有する酵素ホモログを広謝

辞研究を終始温かく見守ってくださった京都大学名誉く検索し，更に工業化に適した性質を有する酵素を生産する微教授 山田秀明先生，京都大学名誉教授 清水昌先生，東北大学

生物として Sphingobacterium 属に属する細菌を選出した．更および東京農工大学名誉教授 一島英治先生に心より感謝いたにアスパルテームの効率生産に適した変異型酵素の取得に成功します．