ISSN

2432−7204

東海大学紀要 農学部
第 41 巻20 2 2

高度好塩菌由来 L- アスパラギン酸脱水素酵素の構造機能解析…………………………………………………………………………………米田一成・荒木朋洋……１
インジゴ還元酵素を利用した酵素化学実験の教材化…………………………………………米田一成・吉岡観沙・山下秀次・山口 浩・荒木朋洋……９キンカン属（Fortunella）植物の形態的特徴と果実特性……………………………………………………………………安田喜一・八幡昌紀・國武久登……17
カンキツ属 4 種とキンカン属 5 種を用いたカンキツ類の遺伝解析に有用な SSR マーカーの選定……………………………安田喜一・戸村大河・佐藤真衣・富永晃好・八幡昌紀・國武久登……29
Acetaminophen 硫酸体の有機合成………………………………………森田千紘・谷口玲央真・吉田実央・德永祐希・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田 伸……39

好塩性 L- アスパラギン酸脱水素酵素の構造機能解析
東海大農紀要 41：１−７（2022）

高度好塩菌由来 L アスパラギン酸脱水素酵素の構造機能解析
米田一成

１，３，
４，
５

・荒木朋洋

２，
３，
４

Structural analysis and enzymatic characterization of extremely halophilic L-aspartate
dehydrogenase
Kazunari YONEDA and Tomohiro ARAKI（Received 29 June 2021; accepted 5 July 2021）
Abstract
We succeeded in ﬁnding a gene（Halar_1793; Halo-aspDH）annotated as L-aspartate dehydrogenase（L-aspDH）from thegenomic information of the Halophilic archaeon DL31. The Halo-aspDH gene was artificially synthesized, expressed in
Escherichia coli, and puriﬁed using a His-tag afﬁnity column. After cleaving the His-tag sequence, the N-terminal amino acidsequence was analyzed using a protein sequencer. The resulting sequence was in complete agreement with the predicted
N-terminal amino acid sequence. However, L-aspDH activity was not detected upon activity measurement and staining.
Further, L-aspDH activity could not be detected even after various salt and heat treatments. Nevertheless, we revealed for the
first time that Halo-aspDH is an enzyme with extremely high thermal stability, which does not inactivate heat even after
treatment at 100 ℃ for 10 min.
The three-dimensional structure of Halo-aspDH was predicted by homology modeling based on the three-dimensional
structure of L-aspDH from the hyperthermophilic archaeon Archaeoglobus fulgidus. The predicted three-dimensional structureof Halo-aspDH was very similar to the overall structure of A. fulgidus L-aspDH（RMSD = 0.130 Å），but its surface charge
showed a significant negative inclination. Further, it demonstrated the structural characteristics of halophilic enzymes.
Although the obtained results are preliminary, they can provide useful information for future structural and functional analysesof amino acid dehydrogenases.

+（P） 生合成経路にどのように関与するのかを明らかに緒 言してきた．また，本酵素は食品中や血中のアミノ酸定量

L- アスパラギン酸脱水素酵素（L-aspDH）は L- アス

用酵素として有用な酵素であり，安定性の高い酵素の取パラギン酸からイミノアスパラギン酸への脱水素反応を得を目的として，好熱菌由来の酵素が単離・精製されて+触媒する NAD 依存性脱水素酵素である．L-aspDH はバ+

いるが，好塩性 L-aspDH は未だに報告例が無いのが現

クテリアおよび好熱菌では補酵素 NAD（P） 生合成経路状である（3 5）．食品の傷みを防ぐ目的で貯蔵や加工にに関与する酵素であることがすでに報告されており，Ｘは高濃度の塩が使用されている．塩蔵食品中のアミノ酸

線結晶構造解析により立体構造もすでに明らかになってを定量する場合，好塩性の L-aspDH であれば，塩に影

い る 酵 素 で あ る（1, 2）．我々はこれまでに超好熱菌

響されることなく食品中のアミノ酸を簡便に定量するこArchaeoglobus fulgidus L-aspDH の結晶構造解析を行うととが可能になると考えられる．そこで，KEGG ゲノム

共に，L-aspDH の酵素化学的性質や基質認識機構，NAD

ネット統合データベースを利用し，A. fulgidus L-aspDH

１

東海大学農学部バイオサイエンス学科

２

東海大学総合農学研究所

３

東海大学大学院農学研究科

４

東海大学大学院生物科学研究科

５

東海大学先進生命科学研究所

連絡先：米田一成

e-mail: kyoneda@agri.u-tokai.ac.jp
─1─米田一成・荒木朋洋+と相同性を有する好塩菌由来の L-aspDH 遺伝子を検索

ビン，L- アスパラギン酸ナトリウム，NAD はナカライ

した結果，A. fulgidus L-aspDH に28.95% とわずかではあテスク（京都）より入手した．宿主細胞である BL21-

るが，高度好塩菌 Halophilic archaeon DL31由来 L- アス

CodonPlus（ DE3）-RIPL お よ び，SHuffle T7 express

パラギン酸脱水素酵素（Halo-aspDH）とアノテーショ

competent E. coli はそれぞれ，Agilent Technologies（米国），

ンされている遺伝子（Halar_1793）を見出した．Halo-

New England Biolabs Japan（東京）より入手した．人工aspDH のアミノ酸配列の特徴を解析すると，脱水素酵素

遺伝子合成および，DNA シーケンス解析は株式会社+

活性に必須な補酵素 NAD の結合モチーフ（GXGXXG），がフ ァ ス マ ッ ク（ 神 奈 川 ） に 依 頼 し た．QIAprep Spin

厳密に保存されているだけでなく，A. fulgidus L-aspDH

Miniprep kit および，pET22b ベクターはそれぞれ，キア

において触媒に関与することがすでに明らかになっていゲン（ドイツ），Novagen（米国）より入手した．コバるヒスチジン残基（His189）が完全に保存されていた．

ルトアフィニティーカラムである Talon はタカラバイオ

そこで，本研究では高度好塩菌由来 L-aspDH の構造機

（滋賀）より入手した．タンパク質結晶化キットである

能解析を行うことを目的として，Halo-aspDH 遺伝子のWizard 1, 2，Wizard 3, 4および，Cryo 1, 2は Rigaku（東合成および，大腸菌における大量発現系の構築を行うと京）から購入した．96穴結晶化プレートは Rigaku（東共に，構造解析と酵素化学的実験を行った．

京）より購入した．その他の試薬は市販の特級または生
化学用試薬を用いた．

材料および方法

Halo-aspDH の pET15b ベクターへのクローニング
H. archaeon DL31由来 Halo-aspDH をコードする遺伝試薬
制限酵素 NdeI, BamHI は New England Biolabs Japan（東子の合成は株式会社ファスマックに依頼した．Halo-

京）から購入した．Ligation high は東洋紡（大阪）より

aspDH（Halar_1793）の塩基配列は，GC 含量が高く遺伝購入した．電気泳動用アガロース，IPTG（イソプロピ子合成が難しいため，Halo-aspDH のアミノ酸配列に基

ル - β - チオガラクトピラノシド），牛血漿由来トロン

づいて E. coli のコドンに最適化した塩基配列を合成しTable 1．Nucleotide sequence of the gene encoding Halo-aspDH. The restriction sites and start and stop codons are shown in underlined and bold
font, respectively.

Gene sequence
Halo-aspDH codon optimize（E.coli）
1

CAT

ATG TCC

TAT

CGC

ATT

GGG CTCATT

GGG TAT

GGC

CGC

ATT

GGC

46

AAG

GAC

TTT

GCC

GAT

CGT

GTT

CGC

GCG

GAT

TCT

GCG

TTT

GAG

CTG

91

GCG

TAC

GTG

TAT

GTC

CGC

AGC

TTG

AAA

CCC

GAA

CTG

CCG

GAG

TCG

136

ATT

CAG

TCT

ACC

GAG

CCT

GCA

GCC

CTG

GCA

GCC

ACA

CCA

GTC

GAT

181

GCG

GTG

GTA

GAA

GCG

GCT

ACG

CCA

GGC

GCG

TTA

GAA

GCA

CTT

GCT

226

GAA

CCG

GCG

TTA

GAA

GGT

GGC

GAT

CTG

TTT

GTC

CTG

TCA

GGT

AGC

271

GCC

TTT

GCG

GAC

CCA

GCA

GTG

GAG

GAA

CGT

CTG

CGT

GCG

CTG

ACG

316

ACG

AAT

TCG

GAC

AAT

GAC

CTG

TAT

CTG

CCG

CAT

GCA

GCA

CTG

TTT

361

GGT

ATC

GAC

GGT

TTA

GCC

GAT

GCA

CGG

GAT

GAG

CTT

ACC

AGC

GTC

406

CAC

ATT

GAG

GCC

ACC

AAA

GCT

CCG

GAT

CAC

CTT

GAT

TTC

GAG

TAT

451

GCG

GAT

ACG

GAA

CGT

CCG

GAA

GGC

ATC

GAT

GGT

CCG

ACC

GTA

ATC

496

TAC

GAA

GGG CCT

ACT

CGC

GGC

TTG

TGC

AAA

CGC

TTT

CCG

CGC

AAC

541

TTC

AAC

TCC

CAT

GCT

GCC

ATG

GCG

ATG

GCC

GGC

CTG

GGA

CTG

GAC

586

GAA

ACC

ACC

AGT

CGT

TTG

GTG

GCT

GAT

CCC

GAA

GCG

GAA

ACA

GCG

631

AAA

CAT

GTG

ACG

ACT

GCA

GAA

GGT

GAA

GGC

TTC

GAA

CTC

GAA

GCC

676

GTT

CGG

GAC

AGT

GAC

ATT

GCC

GGT

GTA

ACC

GGA

GAT

TAC

ACC

CTG

CGC

GTT

CTC

CGC

GCT

GAT

GAT

721

GTG

TCA

ACT

TGG

GGT

AGC

GTT

CGT

766

GGC

CCG

CAA

TTC

ATC

TAA

GGA

TCC

─2─

好塩性 L- アスパラギン酸脱水素酵素の構造機能解析
た（Table 1; Halo-aspDH codon optimize [E.coli]）．遺伝子

L-aspDH の活性測定+合成した pUC19/Halo-aspDH を NdeI, BamHI で制限酵素

NAD 依存性 L-aspDH の酵素活性測定（酸化的脱アミ処理し，アガロースゲル電気泳動した後，約800 bp のバノ反応）は下記の活性測定用反応溶液を用いて行った．

ンドを切り出し抽出することで精製した．pET15b もベ

すなわち，0.1 M グリシン /NaOH（pH 10），10 mM L- ア

クターと同様に NdeI, BamHI で制限酵素処理後，精製をスパラギン酸ナトリウム，1.25 mM NAD ，精製酵素，

行い，16℃ 3 時間ライゲーション反応を行い pET15b/

Milli-Q 水が合計 1 ml になるように調製した．NAD 以

Halo-aspDH の作製を行った．高純度なプラスミド DNA

外の反応溶液を光路長 1 cm のキュベットに入れて混合の調製には QIAprep Spin Miniprep kit を用いた．

した後，NAD を添加して波長340 nm における１分間のHalo-aspDH の発現および精製

U-2910）を用いて室温で測定した．酵素濃度の測定に

+

+

+

吸収の増加量（NADH の増加量）を分光光度計（Hitachi
pET15b/Halo-aspDH を 用 い， 大 腸 菌 BL21-CodonPlus

は Bradford 色素結合法を用い，検量線作成のための標（DE3）-RIPL の形質転換を行った，形質転換した大腸菌

準タンパク質はウシ血清アルブミン（BSA）を用いた．

を50μg/ml のアンピシリンを含む LB 平板寒天培地にプ

不活性型酵素を塩で処理することにより，活性を有す

レーティングし，37℃でインキュベートした．形成した成熟型へ変化する可能性があるため，NaCl,（NH4）2SO4，コロニーを50μg/ml アンピシリンを含む LB 培地（トリKCl，NH4Cl，LiSO4，KNO3，尿素，ギ酸をそれぞれ終プトン1.0 g，酵母エキス0.5 g，NaCl 1.0 g）100 ml に植濃度が約 4 M になるように添加し， 1 時間後および，菌し，37℃で OD600＝0.6になるまで振とう培養した後，4 時間後に活性測定を行った．また，熱による酵素の成1 mM になるように IPTG を加え Halo-aspDH の発現を誘熟化の可能性も考えられたため，20℃ ~100℃の各温度

導し，さらに20℃で16時間振とう培養した．培養終了後，で10分間熱処理後，遠心分離（12,000 rpm，10分間）を遠心分離（6,000 rpm，10分間）により集菌を行い，10行い，その上清を L-aspDH 活性測定に供した．活性染

mM Tris-HCl buffer（pH 8.0）50 ml に懸濁した．菌体懸濁色には，フェナジンメトサルフェート（PMS）および，液を超音波破砕し，遠心分離（12,000 rpm，10分間）に

臭化 3-（4,5- ジメチル -2- チアゾリル）-2,5- ジフェニルテより得られた上清を粗酵素液とした．Halo-aspDH 精製

トラゾリウム（MTT）を用いた．

には親和性クロマトグラフィーである Talon コバルトア
フィニティーカラムクロマトグラフィー（His-tag アフィ

Halo-aspDH の結晶化

ニティーカラム）を使用した．平衡化バッファーには10Amicon Ultra-15（NMWL 10 kDa，Millipore，米国）を

mM Tris-HCl buffer（pH 8.0）
，0.5 M NaCl, 5 mM イ ミ ダ

使用し精製酵素を2.6 mg/ml まで濃縮後，補酵素であるゾールを用い，溶出バッファーには平衡化バッファー中

NAD を終濃度1 mM になるように加えたホロ酵素を調に0.3 M イミダゾールを含むバッファーで溶出を行った．

製後，シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて結晶化

酵素精製の確認には SDS- ポリアクリルアミドゲル電気

スクリーニングを行った．すなわち，96穴結晶化プレー

泳動（SDS-PAGE）を用いた．

トを使用し，精製酵素 2μl とリザーバー溶液 2μl を混+合した後，リザーバー溶液100μl と共に密閉し，暗所
トロンビンを用いた His-tag の切断および N 末端アミノ（20℃）で約 2 ヶ月静置した．

酸配列分析
Halo-aspDH の N 末端に付加されている His-tag 配列の切断にはトロンビン（牛血漿由来）を用いた．トロンビ

ホモロジーモデリングによる Halo-aspDH の立体構造予測

ンによる切断は Halo-aspDH 精製酵素（2.2 mg/ml），切Halo-aspDH の ホ モ ロ ジ ー モ デ リ ン グ は，SWISS-

断 バ ッ フ ァ ー（10 mM Tris-HCl buffer [pH 8.0]，0.5 M

MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）を使用した．ホ

NaCl，2.5 mM CaCl ），トロンビン（2.5 U）を用いた．

モロジーモデリングのテンプレートには，超好熱菌

酵素反応を４℃で16時間行い，SDS-PAGE で His-tag 切

A. fulgidus 由 来 L-aspDH（PDB ID; 2DC1， 同 一 性断の確認を行った．その後，PVDF 膜に転写し，N 末端

28.95%）（2）を使用した．

2

ア ミ ノ 酸 配 列 を プ ロ テ イ ン シ ー ケ ン サ ー（Shimadzu
PPSQ-51A）を用いて15残基分析した．

─3─

米田一成・荒木朋洋
一致しており，約7.8 mg の精製酵素を得ることができた．

結果および考察

His-tag 配列を切断後，プロテインシーケンサーを用
い て N 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 の 分 析 を 行 っ た 結 果，

Halo-aspDH の発現および精製
His-tag アフィニティーカラムにより Halo-aspDH の精SHMSYRIGLIGYGRI の 配 列 が 検 出 さ れ た． 下 線 部 の製 を 行 い，SDS-PAGE に 供 し た 結 果，0.3 M の イ ミ ダ

His-tag 残存配列以外の13残基は Halo-aspDH の予測されゾール溶出画分でメインバンドが得られ，ほぼ単一に精る N 末端アミノ酸配列と完全に一致していることから，製する事に成功した（Fig. 1）．サブユニット分子量は約

好塩菌由来 L-aspDH の発現，精製に成功したと言える．

28 kDa であり，アミノ酸配列から予測される分子量とFig. 1．Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis（SDS-PAGE）of recombinantHalo-aspDH. Lane M, marker proteins; Lane 1,
crude extract; Lane 2, flow-through fraction;
Lane 3, puriﬁed Halo-aspDH.

Fig. 2．Thermal stability of Halo-aspDH. After incubating for 10 min at the indicatedtemperatures, the enzyme samples were analyzed by SDS-PAGE.

ても，熱失活した酵素の沈殿は確認できず，SDS-PAGE

L-aspDH 活性の検出+

精製酵素を用いて NAD 依存性 L- アスパラギン酸脱においてもメインバンドが確認できることから，本酵素

水素酵素活性の測定を行った．酸化的脱アミノ反応の基は熱安定性が非常に高い酵素であることを初めて明らか

質として，L- アスパラギン酸を用いたが，活性の検出にすることができた（Fig. 2）．

はできなかった．さらに，高感度に活性を検出できる，

超好熱菌 A. fulgidus L-aspDH の結晶構造は，すでに活性染色法でも L-aspDH 活性を検出することはできな

我々が明らかにしており（2）, その立体構造情報から補かった．ソニケーションバッファーや精製バッファー中酵素および基質の結合に関わるアミノ酸残基を特定してに2.0 M NaCl を添加した状態で精製を行っても活性は検いる．そこで，A. fulgidus L-aspDH と Halo-aspDH のアミ

出できず，宿主細胞を大腸菌 BL21-CodonPlus（DE3）ノ酸配列を比較したところ，Halo-aspDH では NAD 結-RIPL から SHufﬂe T7 express competent E. coli に変更し合モチーフである GXGXXG のグリシンリッチな配列はても活性が検出されることは無かった．

完全に保存されており，本酵素は補酵素 NAD を利用す

+

9

14

+

好 塩 菌 Haloarcula japonica 由 来2-deoxy-D-ribose-5-

る L-aspDH であることが示唆された（Fig. 3）．また，A.

phosphate aldolase（DERA）では，高濃度の塩で処理す

fulgidus L-aspDH において触媒に関与するアミノ酸残基ることにより，活性を有す成熟型へ変化することがすでである His189は Halo-aspDH では，His211として完全にに 報 告 さ れ て い る（6）． そ こ で， 各 種 の 塩 や20 ℃

保存されていた（Fig. 3）．その他にも基質の結合に関与~100℃の熱処理によって成熟型の酵素として活性が検すると考えられるアミノ酸残基にもわずかではあるが，出されるか検証したが，L-aspDH 活性は検出できなかっ類似性が見られることから，Halo-aspDH は L-aspDH とた．しかし，100℃ 10分間の熱処理後，遠心分離を行っして機能する酵素であることが推測される．

─4─

好塩性 L- アスパラギン酸脱水素酵素の構造機能解析

Fig. 3．Amino acid sequence alignment of Halo-aspDH and A. fulgidus L-aspDH. Sequences were aligned using CLUSTALW（8）．
914The boxes indicate conserved residues. The asterisks represent the GXGXXG and catalytic His211 residues.

Halo-aspDH の結晶化およびホモロジーモデリング

Halo-aspDH の立体構造と A. fulgidus L-aspDH の全体構造

本研究では Halo-aspDH の発現と精製には成功したが，を比較したところ，非常に類似していることを明らかに

L-aspDH 活性の検出には至らなかった．アミノ酸配列のした（主鎖原子の RMSD =0.130 Å，154残基の C αを使比較により，超好熱菌 A. fulgidus L-aspDH ですでに明ら用），（Fig. 4）．さらに，両酵素の表面電荷（静電ポテン

かになっている触媒に関わるアミノ酸残基（His211）や，

シャル）を比較したところ，好塩菌由来の Halo-aspDH+

補 酵 素 NAD の 結 合 に 関 わ る ア ミ ノ 酸 残 基

では表面電荷が大きくマイナスに傾いた酸性タンパク（Gly9~Gly14），基質の結合に関わるアミノ酸残基質であることが明らかになり，好塩菌の酵素に特徴的（Lys140，Asn181） も Halo-aspDH に は 存 在 す る が， 活

な 構 造 が 観 察 さ れ た（Fig. 5）．Halo-aspDH と A.

性が全く検出できていない（Fig. 3）．酵素活性が検出でfulgidus L-aspDH の酸性アミノ酸残基数の総数（Asp +きない原因の解明だけでなく，基質結合部位の構造や好Glu）を比較したところ，それぞれ45個および，34個で塩性，耐塩性のメカニズム解明のためにも酵素の立体構あり，Halo-aspDH の方が酸性アミノ酸残基数が多く，

造情報は重要であると考えられる．そこで，結晶化条件

表面電荷がマイナスに偏りやすいことを明らかにした．

を約300条件スクリーニングしたが，Halo-aspDH の結晶

豊富な酸性アミノ酸残基は好塩性タンパク質の表面を負は取得できなかった．液体培地の容量を200 ml~400 ml

電荷でおおっている．この表面の負電荷に塩イオン（カに増やして培養・精製を行った後，酵素の濃縮を行ってチオン）とそれに結合した水分子が多量に群がり，も3 mg/ml 以上の濃度の酵素を調製することが難しいこ

hydrated ion network を形成して水和殻を作り，高濃度塩とから，本酵素は溶解度が低い難結晶化酵素であると考存在下でのタンパク質の安定性と機能性を維持しているえられる．そこで，超好熱菌 A. fulgidus 由来 L-aspDH のと さ れ て い る（7）． 熱 安 定 性 の 要 因 は，A. fulgidus

立体構造に基づいてホモロジーモデリングによる立体構

L-aspDH においてはサブユニット間の静電的相互作用

造予測を行った．ホモロジーモデリングで得られた（イオンペアネットワーク ; Glu201，Arg203）が主な要

─5─

米田一成・荒木朋洋
因であることがすでに明らかになっている．この部位周辺を Halo-aspDH で比較してみると，Glu201は保存されているが（Glu223），Arg203は電荷を持たないアミノ酸（Val225）に置換しており，また，この周辺部位は全て
赤色のマイナス電荷を帯びていることから，A. fulgidus（Fig.
L-aspDH とは異なる耐熱化機構であると考えられる
5，下図）．これらの研究結果は，今後アミノ酸脱水素酵素の発現や構造・機能解析の研究を行う上で有用な知見
である．

謝 辞
本研究を実施するにあたり，貴重なご意見や様々な支援を頂きました大阪工業大学工学部生命工学科 大島敏
久教授，香川大学農学部応用生物科学科 櫻庭春彦教授に感謝いたします．また，N 末端アミノ酸配列分析に携わって頂きました千々岩有紀 技術員に感謝を申し上げます．本研究は東海大学総合研究機構の研究奨励補助，
東海大学総合農学研究所プロジェクト研究の資金援助にFig. 4．The overall dimeric structure and structural comparison of
Halo-aspDH（cyan）with A. fulgidus L-aspDH（magenta）．
+
The adjacent subunit is shown in gray. NAD （yellow）and
citrate（orange）molecules are shown as stick models.

より実施されたものです．

Fig. 5．Electrostatic surface potential models of Halo-aspDH（A）and A. fulgidus L-aspDH（B）．Red and blue indicate
negatively and positively charged areas, respectively. Dotted circles indicate interactions between the subunits.

─6─

好塩性 L- アスパラギン酸脱水素酵素の構造機能解析
るが，アミノ酸脱水素酵素の構造機能解析を行う上で有要 約用な情報となりうる．

我々は，高度好塩菌 Halophilic archaeon DL31のゲノム情報から，L- アスパラギン酸脱水素酵素（L-aspDH）

引用文献とアノテーションされている遺伝子（Halar_1793; HaloaspDH）を見出すことに成功した．Halo-aspDH 遺伝子

1 ）Yang, Z., Savchenko, A., Yakunin, A., Zhang, R.,を人工合成し，大腸菌を宿主細胞として大量発現させる

Edwards, A., Arrowsmith, C. and Tong, L. 2003, J. Biol.

と共に，His-tag アフィニティーカラムにより精製を行っ

Chem. 278, 8804 8808.

た．His-tag 配列を切断後，プロテインシーケンサーを用いて N 末端アミノ酸配列分析を行った結果，予測される N 末端アミノ酸配列と完全に一致していた．しかし，

2 ）Yoneda, K., Sakuraba, H., Tsuge, H., Katunuma, N. andOhshima, T. 2007, FEBS J. 274, 4315 4325.
3 ）Yoneda, K., Kawakami, R., Tagashira, Y., Sakuraba, H.,

L-aspDH の活性測定や活性染色を行った結果，L-aspDH

Goda, S. and Ohshima, T. 2006, Biochim. Biophys. Acta活性の検出には至らなかった．各種の塩や熱処理によっ

1764, 1087 1093.

て活性を有す成熟型へ変化するか検証したが，L-aspDH
活性は検出できなかった．しかし，Halo-aspDH は100℃4 ）Li, Y., Ogola, H.J. and Sawa, Y. 2012, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 93, 503 516.

10分間の熱処理でも熱失活しない，非常に熱安定性が高5 ）Li, Y., Kawakami, N., Ogola, H.J., Ashida, H., Ishikawa,

い酵素であることを初めて明らかにすることができた．

T., Shibata, H. and Sawa, Y. 2011, Appl. Microbiol.

超 好 熱 菌 Archaeoglobus fulgidus 由来 L-aspDH の 立 体

Biotechnol. 90, 1953 1962.

構造に基づいて，Halo-aspDH の立体構造をホモロジー6 ）Ohshida, T., Hayashi, J., Satomura, T., Kawakami, R.,

モデリングで予測した．ホモロジーモデリングで得られOhshima, T. and Sakuraba, H. 2016, Protein Expr. Purif.

た Halo-aspDH の立体構造は A. fulgidus L-aspDH の全体

126, 62 68.

構造と非常に類似（主鎖原子の RMSD =0.130 Å）していたが，表面電荷が大きくマイナスに傾いていることを明らかにし，好塩菌由来の酵素に特徴的な構造が観察できた．これらの研究結果は，予備的な実験データではあ─7─7 ）Tokunaga, M., Tokunaga, H., Ishibashi, M. and Arakawa,T. 2009, Seikagaku 81, 401 406.
8 ）Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. 1994,
Nucleic Acids Res. 22, 4673 4680.

東海大農紀要 41：９−15（2022）

インジゴ還元酵素の教材化

インジゴ還元酵素を利用した酵素化学実験の教材化
米田一成

１，
３，
４，
５

１

・吉岡観沙 ・山下秀次

１，
３

・山口浩

３，
４，
６

・荒木朋洋

２，
３，
４

Teaching materials for enzyme chemistry experiments using indigo reductase
Kazunari YONEDA, Misa YOSHIOKA, Hideji YAMASHITA, Hiroshi YAMAGUCHI
and Tomohiro ARAKI（Received 24 August 2021; accepted 5 October 2021）
Abstract
We have found a novel indigo reductase（FMN-dependent NADH-indigo reductase）involved in indigo dyeing from
Bacillus smithii, a thermophilic Bacillus bacterium, and clariﬁed the function and structure of the enzyme. Indigo reductase isan enzyme that catalyzes an enzymatic reaction that transforms indigo（bluish color）into water-soluble leuco-indigo（yellowish color）． Since the indigo becomes water-soluble by the enzymatic reaction, it becomes possible to stain the ﬁbers.
From this, it can be said that indigo reductase is responsible for the important reaction of indigo dyeing. In this study, we
veriﬁed whether enzyme chemistry experiments using highly stable indigo reductase could be used as teaching materials. We
introduced purification of enzymes, determination of subunit molecular weight, visualization of enzyme reactions,
identiﬁcation of coenzymes, and methods for drawing three-dimensional structures. If indigo dyeing of ﬁbers using indigo
reductase becomes possible, it will be effective as educational teaching material for biological university students, graduate
students, high school science teachers, and high school students who are interested in the ﬁeld of agricultural chemistry.

近年，我々の研究室において藍染の染色に関わる新規緒 言な酵素（FMN 依存性 NADH-インジゴ還元酵素）を好熱

藍染は日本の伝統な染色技法であり，藍の葉を堆肥状性バシラス細菌である，Bacillus smithii から見出すと共にした「すくも」を発酵還元（藍建て発酵）することにに，インジゴ還元酵素の機能と構造について明らかにし

より繊維を染色する方法である．
「すくも」に含まれるてきた（1, 2）．また，1次構造のホモロジーから FMN

インジゴ（藍色の色素）は水に不溶であるためそのまま依存性 NADH- アゾ還元酵素（EC 1.7.1.6）に分類される繊維を染めることはできない．そこで，藍建て発酵の工酵素であることも明らかになっている（3 7）．一般的に程では常温性の好アルカリ性菌由来のインジゴ還元酵素

酵素の実験教材には消化酵素などの加水分解酵素が良くによってインジゴが還元されることにより，水溶性のロ用いられている．これは，酵素が比較的容易に入手できイコインジゴ（黄色）に変化する．この酵素反応によりることや，安定性が高いためである．一方，酸化還元酵「すくも」のインジゴは水に溶け，繊維を染色すること

素は酵素の安定性の低さや酵素反応の可視化という点でが可能となる（図1，A）．本研究では藍染のインジゴ還は，扱いにくい酵素であると思われる．しかし，インジ元反応に関与するインジゴ還元酵素を利用した酵素化学

ゴ還元酵素は，実は私達の身近な暮らしに関わる藍染に実験の教材化を行った．

関与しているという意外性や，本酵素の高い安定性は実１

東海大学農学部バイオサイエンス学科

２

東海大学総合農学研究所

３

東海大学大学院農学研究科

４

東海大学大学院生物科学研究科

５

東海大学先進生命科学研究所

６

九州教養教育センター

連絡先：米田一成

e-mail: kyoneda@agri.u-tokai.ac.jp
─9─米田一成・吉岡観沙・山下秀次・山口浩・荒木朋洋

図１．インジゴ還元酵素が触媒する酵素反応（A）および , インジゴカルミンの構造（B）

験・実習には最適であると考えられる（ 4 ℃で保存してビナント酵素として大腸菌を宿主細胞として大量に発現，おけば， 3 か月以上失活しない酵素である）．本酵素の精製する方法をすでに報告しているが（1,2），今後 可能実験により酵素化学の基礎的知識を広く深く学べること

であれば酵素製品を取り扱う，旭化成ファーマ株式会社

ができると思われる．生物系の大学生，大学院生，高等

診断薬製品部や天野エンザイム株式会社などの企業より

学校の理科教員だけでなく，農芸化学分野に興味を持つ入手できるようにしたいと考えている．研究室で酵素を高校生がインジゴ還元酵素の実験を通して酵素化学の魅大量調製する場合には，pET15b/indigo プラスミドベク

力に触れ，さらなる理解を深めて頂く機会となれば幸い

ターを用い，大腸菌 BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL の形である．

質転換を行う（1）．すなわち，プラスミドベクター溶液
5μl を大腸菌 BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL 100μl の入ったエッペンチューブに入れ，氷上で30分間放置する．次

材料および方法に，42 ℃で45秒恒温槽につけ，ヒートショックを行った後，１分間冷却する．続いて，SOC 培地100μl を加え，

試薬
インジゴカルミン，NADH はナカライテスク（京都）37 ℃で45 分間震盪培養し，回復培養を行う．形質転換より入手した．宿主細胞である大腸菌 BL21-CodonPlus

した大腸菌を50μg/ml のアンピシリンを含む LB 寒天培（DE3）-RIPL は Agilent Technologies（米国）より入手し地にプレーティングし，37℃でインキュベートする．コた． コバルトアフィニティーカラムである Talon はタカロニーが形成されたことを確認し，50μg/ml アンピシリ

ラバ イ オ（ 滋 賀 ） より入手した．薄層クロマト グ ランを含む LB 液体培地（トリプトン1.0 g，酵母エキス0.5 g，フィー（TLC）アルミシート シリカゲル60 F254 は Merck

NaCl 1.0 g）100 ml に植菌し，37℃で OD600＝0.6になるま（東京）から購入した．その他の試薬は市販の特級またで振とう培養した後，1 mM になるようにイソプロピル

は生化学用試薬を用いた．

-β- チオガラクトピラノシド（IPTG）を加えインジゴ
還元酵素の発現を誘導し，さらに20℃で16時間振とう培養することで，酵素の大量発現を行う．培養終了後，遠インジゴ還元酵素の発現および精製
酵素実験の教材化の場合，酵素サンプルの入手が最も心分離（6,000 rpm，10分間）により集菌を行い，10 mM重要である．B. smithii 由来インジゴ還元酵素はリコン

Tris-HCl buffer（pH 8.0）50 ml に懸濁する．菌体懸濁液

─ 10 ─

インジゴ還元酵素の教材化
を超音波破砕し，遠心分離（12,000 rpm，10分間）によへの変化を可視化し，定性的に酵素反応を観察することり得られた上清を粗酵素液とする．インジゴ還元酵素のもできる．窒素ガスボンベや圧力調整器の購入が難しい

精製には親和性クロマトグラフィーである Talon コバル

場合には，Kenis（大阪）から安価なスプレー式実験用

トアフィニティーカラムクロマトグラフィー（ヒスタグ

窒素ガスが販売されているので，購入すると良い．酵素

アフィニティーカラム）を使用して精製を行う．平衡化

活性を定性的に確認するだけであれば，分光光度計は不バッファーには10 mM Tris-HCl buffer（pH 8.0）
，0.5 M NaCl，

要である．

5 mM イミダゾールを用い，溶出バッファーには平衡化
バッファー中に50 mM 〜100 mM イミダゾールを含む

TLC を用いたインジゴ還元酵素の補酵素の同定

バッファーで溶出を行う．発現，精製がうまくいけば，

精製酵素を約10 mg/ml 以上に濃縮後，100℃，10分間

100 ml の LB 液体培地から10 mg 以上の酵素が容易に調以上の熱処理を行うことでインジゴ還元酵素に結合して製できる．

いる補酵素（フラビン化合物）を遊離させることができる．その後，遠心分離（12,000 rpm，10分間）を行い，得られた黄色い上清を TLC 用のサンプルとする．TLC

酵素精製の確認およびサブユニット分子量の測定
酵素精製およびサブユニット分子量の確認には12.5%の展開溶媒の組成は1−ブタノール : 酢酸 : 水が12:3:5にSDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

なるように溶媒を混合する．最近の TLC 展開槽は少量を用いると良い．CBB 染色液で染色後，蒸留水で脱色し，の溶媒でも展開が可能であり，展開溶媒は 4 ml あれば分子量マーカーサンプルの泳動距離を正確に測り，相対十分である．ﬂavin mononucleotide（FMN）の類似化合物

移動度（Rf 値）を算出する．次に，横軸に Rf 値，縦軸である，リボフラビンや ﬂavin adenine dinucleotide（FAD）に Log 分子量をとり，分子量マーカーの各バンドの値などの標準品と共にインジゴ還元酵素抽出物を TLC プ

をプロットし，分子量標準曲線を求める．次に，精製後レートにアプライし，約1時間展開する．展開終了後，の酵素の Rf 値を計算し，標準曲線の式に代入すること

風乾し，UV（365 nm）照射することでフラビン化合物

でサブユニット分子量が算出できる．また，発展的な実のスポットを検出する．

験として，酵素の４次構造を調べたい場合にはゲルろ過
クロマトグラフィーを使用することで，本酵素がダイマー

インジゴ還元酵素の立体構造描画
B. smithii 由 来 イ ン ジ ゴ 還 元 酵 素 の 立 体 構 造 情 報 は構造であることを実験的に確認することができる（1）．

Protein Data Bank（PDB; https://www.rcsb.org/）から入手可
インジゴ還元酵素の酵素活性測定および酵素活性の可視能 で あ る．PDB ID= 6JXN が wild type，PDB ID= 6JXSが Y151F 変 異 体 酵 素 で あ り，Pymol（https://pymol.

化
インジゴは不溶性化合物であり，そのままでは分光光

org/2/）などの構造描画ソフトで立体構造の詳細な作図

度計を用いた測定は不可能である．そのため，インジゴが可能である．Pymol ライセンスは基本有料であるが，にスルホ基を導入した水溶性のインジゴカルミンをモデ

教育用のアカデミックライセンスはウェブ上で申請する

ル基質として使用して，酵素活性を検出するのが良いことで，無料で発行される．

（図 1 ，B）．NADH 依存性インジゴカルミン還元活性測
定は下記の活性測定用反応溶液を用いて行う．すなわち，

結果および考察0.1 M リン酸バッファー（pH 7），50μM インジゴカルミ
ン，80μM NADH，精製酵素 5μl，蒸留水が合計 1 ml に

B. smithii 由来インジゴ還元酵の精製およびサブユニッ

なるように調製した．酵素以外の反応溶液を光路長1 cm

ト分子量の測定のプラスチック製キュベットに入れて混合した後，溶存

インジゴ還元酵素をヒスタグアフィニティーカラムを

酸素を除去するため窒素ガスパージを 3 分間行う．その使用することで簡便に精製することが可能である．精製後，酵素を 5μl 加え，色の変化を室温で確認する．分の結果を SDS-PAGE で確認した結果が図 2（A）である．

光光度計を使用して酵素反応を定量化する場合は，キュ

50 mM 〜100 mM のイミダゾール溶出画分でメインバン

ベット内で酵素反応を行い，610 nm の吸収の減少（イドが得られ，ほぼ単一に精製する事ができている．このンジゴカルミンの減少）を測定することができる．また，

SDS-PAGE の結果を用いて，図 2（B）のように解析す

エッペンチューブや試験管内で酵素反応を行い，インジることでサブユニット分子量が23 kDa であることが分

ゴカルミン（青）からロイコインジゴカルミン（黄色）かる（1）．また，これらの結果はアミノ酸配列から予測─ 11 ─

米田一成・吉岡観沙・山下秀次・山口浩・荒木朋洋

図２．SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による酵素の精製の確認（A）および，サブユ
ニット分子量の決定（B）．濃縮後のインジゴ還元酵素（C）．

される分子量と一致していることも確認できる．酵素のさらに，本酵素はインジゴカルミン以外にも2,6- ジク

１次構造から分子量を算出する場合は，ProtParam tool

ロロインドフェノール（DCIP），メチルレッド，アシッ（https://web.expasy.org/protparam/）を用いると便利である．

ドレッド88，メチルオレンジ，オレンジ II，コンゴー

本酵素は FMN を結合している酵素であるため，精製後レッドなどの様々なアゾ化合物に対する活性も有していの酵素は黄色をしており（図 2 , C），吸収スペクトルのる（図 4 ）
．広い基質特異性を有す低基質特異性酵素で測定を行うと，フラビンに特徴的な380 nm と460 nm にあるため，これらの基質を分解する酵素反応の観察も可吸収極大を有するスペクトルが得られる（1）．分光光度能である．例えば，DCIP（紺色）を基質とした場合，計にスペクトルスキャンの機能がある場合は測定してみ反応開始後，キュベットの溶液は瞬時に透明に変化する．

ると良い．

インジゴカルミン以外の基質の酵素活性を測定する場合
は，窒素ガスパージの必要はない．また，これらの基質

インジゴ還元酵素の酵素活性測定および酵素活性の可視を用いて分光光度計で酵素活性測定を行う場合は，各化

化

合物の吸収極大波長を用いて活性の測定を行うと良い

酵素反応産物であるロイコインジゴカルミンは黄色で（1）．通常の酵素における酵素活性測定の際には，分光あり，容易に酵素反応の進行を確認できる（図 3 ）．し光度計による反応基質等の吸収を測定しなければ測定でばらく観察していると徐々に黄色い溶液が元の青色にきなかったが，本酵素は基質として色素を使用している

戻っていく．これは，酵素反応で生じたロイコインジゴ

ため，容易に酵素活性を可視化できる．このため，これカルミンが空気酸化されて再び，インジゴカルミンにまで使用されてきた酵素と比較して初めて酵素活性を測戻ったためである．実際の藍染では，スルホ基の無い疎定する学生にとっては酵素の挙動を把握しやすくなる．

水性のインジゴが還元されて水溶性のロイコインジゴになり繊維に染み込む．その後，空気酸化されることで再TLC を用いたインジゴ還元酵素の補酵素の同定およびびインジゴになり，繊維が染色され，何度洗濯しても色立体構造描画が抜けなくなる．本酵素反応を利用して繊維の藍染を行

TLC を行うために，精製後の酵素を16 mg/ml に濃縮う実験の場合には，インジゴを用いるべきであるが，未することにより黄色の酵素溶液を調製した（図 2 , C）．

だに本酵素のインジゴ還元活性は検出できていない．イ

精製した酵素は吸収スペクトルの結果から，フラビン化

ンジゴは水に不溶であるため，分光光度計を用いて測定

合物が結合していることが強く示唆される．フラビン化

することが大変難しい．本酵素を用いて繊維の藍染がで合物には，リボフラビンやその補酵素型である FNM おきれば，さらに教育的な教材として効果的であると思わ

よび，FAD が考えられるため，これらの化合物を標準れる．

品としてインジゴ還元酵素熱抽出物と共に TLC に供し─ 12 ─

インジゴ還元酵素の教材化

図３．キュベット（A）やエッペンチューブ（B）を使用したインジゴカルミン還元活性の確認．酵素反応によりインジゴカルミン（反応前；青色）からロイコインジゴカルミン（反応後；黄色）に変化する．
反応後の溶液の上部が青いのは空気酸化によってインジゴカルミンが生成されているためである．

図４．インジゴ還元酵素が反応性を示す化合物（各50 μ M）．基質特異性などの実験に使用することができる．

た．その結果，FMN の移動度とほぼ同じ場所にスポッフォマティクス演習などの教材としても利用可能である．

トが検出されていることが分かる（図 5 ）．この結果からインジゴ還元酵素は FMN を補酵素として結合してい謝 辞ることが分かる（1）．TLC のスポットの検出には様々な方法があるが，UV で簡便に検出できることは大きなメリットである．

本論文の作成にあたり，貴重なご意見や様々な支援を頂きました大阪工業大学工学部生命工学科 大島敏久教

インジゴ還元酵素の結晶構造解析はすでに解明してい授，香川大学農学部応用生物科学科 櫻庭春彦教授に感るため，ダイマー構造や，TLC の実験で明らかにした

謝いたします．本研究は公益財団法人発酵研究所（IFO）

FMN が結合している詳細な原子レベルの構造を Pymolの一般研究助成（G-2017-2-001）の資金援助により実施を使用して確認することが可能である（図 6 ）（1, 2）．

されたものです．

本酵素はウェットラボである酵素化学実験だけでなく，
ドライラボであるコンピュータを利用した，バイオイン
─ 13 ─

米田一成・吉岡観沙・山下秀次・山口浩・荒木朋洋

図５．TLC を用いたインジゴ還元酵素の補酵素同定．UV 照射前（A）および UV 照射後（B）．UV 照射前でも黄色いスポットは確認できるが，UV 照射後はよりクリアにスポットが確認できる．

図６．Pymol を使用した B. smithii インジゴ還元酵素の立体構造描画．ダイマーの全体構造（A）および活性中
心の立体構造（B）．活性中心に結合している FNM 分子を黄色の電子密度とスティックで表示した．

還元酵素はインジゴ（青色）を水溶性のロイコインジゴ

要 約（黄色）に変化させる酵素反応を触媒する酵素である．

我々は，藍染の染色に関わる新規なインジゴ還元酵素

酵素反応によりインジゴは水溶性になるため，繊維を染（FMN 依存性 NADH- インジゴ還元酵素）を好熱性バシ

色することが可能になる．このことから，インジゴ還元

ラス属細菌である，Bacillus smithii から見出すと共に，

酵素は藍染の重要な反応を担っていると言える． 本研

酵素の機能と構造について明らかにしてきた．インジゴ

究では，安定性の高いインジゴ還元酵素を利用した酵素─ 14 ─

インジゴ還元酵素の教材化
化学実験が教材化できるか検証した．酵素の精製，サブ3 ）Gao, F., Ding, H., Shao, L., Xu, X. and Zhao, Y. 2015,
Appl Microbiol Biotechnol. 99, 255 267.

ユニット分子量の決定，酵素反応の可視化，補酵素の同定，立体構造の描画方法などを紹介した．本研究では，

4 ）Matsumoto, K., Mukai, Y., Ogata, D., Shozui, F., Nduko,

酵素反応のみを取り扱っているが，インジゴ還元酵素を

J.M., Taguchi, S. and Ooi, T. 2010, Appl Microbiol

用いた繊維の藍染が可能になれば，生物系の大学生，大Biotechnol. 86, 1431 1438.

学院生，高等学校の理科教員だけでなく，農芸化学分野

5 ）Pricelius, S., Held, C., Murkovic, M., Bozic, M., Kokol,に興味を持つ高校生に対して，より効果的な学習教材に

V., Cavaco−Paulo, A. and Guebitz, G.M. 2007, Appl

なりうると思われる．

Microbiol Biotechnol. 77, 321 327.
6 ）Sugiura, W., Yoda, T., Matsuba, T., Tanaka, Y. andSuzuki, Y. 2006, Biosci Biotechnol Biochem. 70, 1655

引用文献

1665.

1 ）Yoneda, K., Yoshioka, M., Sakuraba, H., Araki, T. and7 ）Yu, J., Ogata, D., Gai, Z., Taguchi, S., Tanaka, I., Ooi, T.

Ohshima, T. 2020, Int J Biol Macromol. 164, 3259 3267.

and Yao, M. 2014, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.

2 ）Yoneda, K., Sakuraba, H., Araki, T. and Ohshima T.
2021, FEBS Open Bio. 11, 1981 1986.

─ 15 ─

70, 553 564.

キンカン属植物の特性評価

東海大農紀要 41：17−27（2022）

キンカン属（Fortunella）植物の形態的特徴と果実特性
１２安田喜一 ・八幡昌紀 ・國武久登

３The morphological characterization and fruit charactersof Fortunella species
Kiichi YASUDA, Masaki YAHATA and Hisato KUNITAKE（Received 30 November 2021; accepted 27 December 2021）
Abstract
To evaluate all Fortunella 6 species introduced into Japan as a genetic resource for breeding, we investigated theirmorphological characteristics and fruit qualities. A high diversity of the morphological characteristics of leaves, ﬂower andfruits was observed among all species. Novel characteristics such as extremely small fruits and deep red-orange colored fruit
skin of the Hongkong kumquat（F. hindsii（Champ. ex Benth.）Swingle）were observed. The juice sac and peel in thekumquats showed a relatively higher sugar content than those in the satsuma mandarin（Citrus unshiu Marcow.）; however,
only Hongkong kumquat had a very low sugar content. The Changshou kumquat（F. obovata hort. ex Tanaka）had aparticularly high sugar content in peel. Although the major organic acid of kumquat was citric acid in juice sac, the ratios ofquinic acid and malic acid were hightened in the peel. On the other hand, the β-cryptoxanthin content in the whole fruit was
higher in the Hongkong kumquat, oval kumquat（F. margarita（Lour.）Swingle）and round kumquat（F. japonica（Thunb.）
Swingle）. Moreover, the Meiwa kumquat（F. crassifolia Swingle）, which had the best taste quality, had lower DPPH radical
scavenging activity, and the Hongkong kumquat and Malayan kumquat（F. polyandra（Ridl.）Tanaka）had hig her DPPH
radical scavenging activity than the others. Thus, these results suggest that five wild species except the cultivated species
Meiwa kumquat of kumquats have important traits that may be useful in the future breeding of kumquats.

果実はカンキツ類の中で最も小型であるものの，果皮緒 言（アルベドとフラベド）を生食できることがキンカン属

キンカン（Fortunella spp.）は，ミカン科（Rutaceae）

植物の特長である．我が国では，宮崎県（2,608 t），鹿

ミカン亜科（Aurantioideae）に属する中国南部原産の常児島県（909 t）および熊本県（87 t）などの比較的温暖

緑性低木果樹であり，産業的に重要であるカンキツ属な気候である九州南部で盛んに経済栽培されており（農（Citrus）とカラタチ属（Poncirus）を加えてカンキツ類

林水産省，http://www.tdb.maff.go.jp，2018年産特産果樹と総称される（1, 2）．欧米諸国でマイナーな果樹である

生産動態等調査），その用途は生食をはじめ，甘露煮，

一方，アジア圏では東南アジアや中国南部を中心にいく

マーマレード，果実酒，観賞樹など様々である．

つかの在来品種が栽培されており，特徴的な香気成分やキンカン属は，田中（6, 7）と Swingle（8）によって精油成分の貴重な供給源とされる他（3, 4），ベトナムの分 類 さ れ て お り， 前 者 に よ れ ば ナ ガ ハ キ ン カ ン［F.

旧正月の縁起物としての伝統的な家庭料理への利用されpolyandra（Ridl.）Tanaka］， マ ル キ ン カ ン［F. japonicaている（5）．我が国においても，キンカン属植物は，カ（Thunb.）Swingle］， マ メ キ ン カ ン［F. hindsii（Champ.

ンキツ属より比較的耐寒性や耐病害虫性が強く，樹冠がex Benth.）Swingle］， ニ ン ポ ウ キ ン カ ン（F. crassifolia

小さいため，古くから庭木として利用されてきた．また，Swingle），ナガキンカン［F. margarita（Lour.）Swingle］

１

東海大学農学部応用植物科学科

２

静岡大学大学院総合科学技術研究農学専攻３

宮崎大学農学部応用生物科学科

連絡先：安田喜一

e-mail: yk964422@tsc.u-tokai.ac.jp
─ 17 ─

安田喜一・八幡昌紀・國武久登
およびチョウジュキンカン（F. obovata hort. ex Tanaka）

材料および方法の計 6 種が存在する．しかし，我が国で生食用として経済栽培されているのはニンポウキンカンのみである．ま植物材料

た，2000年以降，キンカンの品種として ʻ こん太 ʼ（9），日本マンダリンセンター（鹿児島県出水郡長島町）植ʻ ぷちまる ʼ（10），ʻ ゆみちゃんのほっぺ ʼ（11）および栽の我が国に導入されているナガハキンカン（英名：ʻ 勇紅 ʼ（12, 13），ʻ 宮崎夢丸 ʼ（14），ʻ 宮崎王丸 ʼ（15）Malayan kumquat），マルキンカン（Round kumquat），マおよび ʻ 紅央 ʼ（16）などが登録されているものの，そメ キ ン カ ン（Hongkong kumquat）， ニ ン ポ ウ キ ン カ ン

れらはニンポウキンカンの枝変わりやその交雑から育成（Meiwa kumquat），ナガキンカン（Oval kumquat）およされたものである．このように，キンカンの栽培およびびチョウジュキンカン（Changshou kumquat）のキンカ

育種は，ニンポウキンカン 1 種に依存しているのが現状

ン 属 6 種 を 供 試 し た．β-ク リ プ ト キ サ ン チ ン 含 量 とである．

DPPH ラジカル消去能の測定以外では，対照植物として

最近のカンキツ育種は，豊産性，耐病虫害性，耐寒性

ウ ン シ ュ ウ ミ カ ン ʻ 青 島 温 州 ʼ（Satsuma mandarin）（C.

および耐乾性などの栽培特性や糖度，剥皮性，晩性およ［P.
unshiu Marcow.）およびカラタチ（Trifoliate orange）

び貯蔵性などの果実特性だけではなく，健康志向の高まtrifoliata（L.）Raf.］を供試した．なお，マメキンカン

りにより，健康機能性に着目した成分育種が盛んに行わに関しては二倍体の変種（F. hindsii var. chintou）を用いれるようになってきた（17, 18）．β-クリプトキサンチ

た．

ンは，カンキツに豊富に含まれるカロテノイドの一種であり，骨代謝調節作用をはじめ，健康のための生理機能形態調査が解明されており（18, 19），2015年にウンシュウミカン

葉，花および果実の形態調査を行った．完全に展開しにおいて健康機能性表示が生鮮食品で初めて登録されたた葉を10枚供試し，葉身長，葉幅，翼葉長の 3 項目を調ことで（20），健康機能性成分としての機運が高まって査するとともに，トゲの有無を確認した．開花期間を観いる．また，ポリフェノールやカロテノイド類，フラボ

察すると同時に， 7 月中旬に開花した二番花を10花用い，ノイド類，精油成分，ビタミン C およびビタミン E な

花色，全幅（完全開花時の最大直径），花弁数，雌ずい

どの抗酸化活性を有する物質は，疾病の原因となる活性数，雄ずい数，乾燥花粉の縦径と横径および花粉発芽率

酸素・フリーラジカルから生体を防御すると考えられての 8 項目を測定・観察した． 1 月中旬に完全着色した果

おり，いくつかのカンキツ類において抗酸化活性の評価

実（二番花）を15果収穫し，果皮色（色彩色差計 CR-が行われている（21-23）．

300，コニカミノルタホールディングス株式会社），果実

今後，特徴のあるキンカン品種を育成するためには，

重，直径，高さ，一果実あたりの種子数および種子重のキンカン属野生種（本報では我が国で経済栽培されるニ6 項目を調査した．なお，花粉発芽率は，10% スクロー

ンポウキンカン以外の 5 種を示す）の遺伝資源としてのスと 1 % 寒天を添加した寒天培地上に花粉を置床し，評価が必要不可欠であるものの，これらに対する基礎的

25℃・暗黒10時間培養後，光学顕微鏡（BX-51，オリン

情報は極めて乏しい．そこで本研究では，キンカン属植

パス株式会社）下で 1 反復あたり300個の花粉を供し，物6種について，葉，花および果実の形態調査を行うと5 反復行った．

ともに，果実の詳細な調査として高速液体クロマトグラ
フィー（HPLC）を用いた糖と有機酸の含量と組成およ糖および有機酸含量の測定

び健康機能性の評価として果実中のβ-クリプトキサンチ

形態調査と同時期に収穫した果実を果肉と果皮に分け，ン含量を測定した．また，抗酸化能の予備的な調査としホモジナイズした．その後，80% 熱エタノールで抽出し，て，1.1- ジフェニル -2- ピクリルヒドラジル（DPPH）

0.45 μm のメンブレンフィルターでろ過し，分析試料をラジカル消去能の測定を行った．さらに，これらの結果

調整後，向井ら（2000）の方法に従い，HPLC を用いてからキンカン野生種の育種素材としての可能性をそれぞ

糖（検出器：Shodex RI-71（昭和電工株式会社），カラれ考察した．

ム：Shodex SP-0810・SP-G（昭和電工株式会社））および有機酸含量（検出器：GULLIVER UV-970（日本分光
株 式 会 社 ）， カ ラ ム：Shodex Ion Pak KC-811・RS Pak
KC-G（昭和電工株式会社））を測定した．なお，試験は5 反復で行った．
─ 18 ─

キンカン属植物の特性評価
β−クリプトキサンチン含量の測定

結 果

形態調査と同時期に収穫したキンカン属植物 6 種の果実から種子を除き，果皮と果肉を分けずに可食部としてキンカン属植物の葉の形態調査を行った結果（表 1 ），供試した．凍結乾燥させた試料1.0 g を0.24 M ピロガロー

葉身長と葉幅は，ウンシュウミカンより小さかった．葉ル，13.6 M 水酸化カリウムでけん化（56℃，20分間）

形指数より，ナガハキンカンが314.5と最も細長く，チョした．常温まで冷ました後，0.17 M 塩化ナトリウム，

ウジュキンカンが164.9と最も丸かった．ウンシュウミ

2‐プロパノール2 mL および酢酸エチル：n-ヘキサン

カンとカラタチにおいて観察された翼葉は，キンカン属（1：9）液15 mL を加え，遠心分離（3,000 rpm， 1 分間）

植物では全く観察されなかった．トゲは，マメキンカン，

して上層をろ過した．さらに，水層を酢酸エチル：n-ナガハキンカンおよびマルキンカンにおいて観察され，ヘキサン（1：9）液15 mL で 2 回抽出し，ろ液をロータ

特にマメキンカンが鋭く長いトゲを有していた．

リーエバポレーター（35℃）で濃縮乾固した．これをエ

キンカン属植物の開花時期は，ウンシュウミカン（ 5タノール25 mL で定容し，0.2 μm のフィルターでろ過月）とカラタチ（ 4 月）と比較して， 6 月以降と遅かっしたものを分析試料とした．移動相はアセトニトリル：

た．さらに， 3 カ月という長い期間に数回に渡り花を着メタノール：テトラヒドロフラン（55：40：5）とし，けた（表 2 ）．キンカン属植物 6 種では，チョウジュキ

試料注入20 μL，カラム温度30℃，流速1.5 mL / min の測

ンカンが比較的開花が早かったものの，開花期間に大き定条件下で HPLC 分析（検出器：SPD-6AV（株式会社

な差異は見られなかった．キンカン属植物の花の大きさ

島津製作所），カラム：Shim-pack GLC G-ODS（株式会は，ウンシュウミカンより有意に小さかった．キンカン社島津製作所））を行い，絶対検量線法によりβ-クリプ

属植物内では，ナガハキンカン（24.6 mm）からマメキ

トキサンチン含量を定量した．なお，試験は 3 反復行っ

ンカン（7.5 mm）まで花の大きさに多様性がみられた．

た．

乾燥花粉粒径は，キンカン属植物内で顕著な差異は見られなかった．一方，花粉発芽率は，マメキンカンの5.8%からチョウジュキンカンの34.9% まで種間差異が大きDPPH ラジカル消去能の測定かった．

キンカン属植物 6 種の果実（種子を除く）における抗キンカン属植物の果実の形態調査を行った結果（図 1 ，

酸化活性の評価として，一部修正した須田（24）のマイクロプレート法を適用し，DPPH ラジカル消去能測定を

図 2 ，表 3 ）， 6 種すべてがそれぞれの種に特有な形態行った．凍結乾燥粉末を80% エタノールで10分間抽出し，的特徴を示した．まず，果皮色は，マメキンカンの a 値

0.45 μm のフィルターでろ過した．適量の200 mM 2-N-

が39.5であり，他の種より赤味が強かった．果実の大きモルフォリノエタンスルフォン酸（MES）と20% エタ

さは，ウンシュウミカンとカラタチより有意に小さかっノールを加えた抽出液に1.2 mM DPPH（和光純薬工業株

た．キンカンの中では，チョウジュキンカンが26.7 g と式会社）を添加し，室温で20分間静置後，分光光度計

最も重く，マメキンカンが1.3 g と最小であった．果形は，

IMMUNO-MINI NJ-2300（ ナ ル ジ ェ ヌ ン ク イ ン タ ー ナ

名前のようにマルキンカンが100.8と最も丸く，ナガキ

ショナル株式会社）で520 nm の吸光度を測定し，Trolox

ンカンが71.1と細長かった．果肉の砂じょうについては，（シグマアルドリッチジャパン株式会社）相当量としてチョウジュキンカンが最も発達していた．それに対し，評価した．なお，反復試験は行っていない．

マメキンカンと栽培種のニンポウキンカンの果肉では砂Table 1. The morphological characteristics of leaves in 6 Fortunella species, Satsuma mandarin and trifoliate orange.
Genus

Fortunella

Species

Leaf length（mm）
z

Leaf width（mm）

Shape index
xof leaf blade

Leaf
wing

Strength ofspines＋y

Malayan kumquat

99.8 ± 11.0b32.7 ± 4.5

c314.5 ± 75.3

none

Round kumquat

43.9 ± 4.6

f17.6 ± 2.0

e245.1 ± 40.8

none

＋

Hongkong kumquat

60.6 ± 6.8

de21.0 ± 4.2

de292.8 ± 42.1

none

＋＋

Meiwa kumquat

63.9 ± 8.4

cd27.0 ± 3.1

cd253.4 ± 57.3

none

−

Oval kumquat

74.8 ± 8.4

c27.1 ± 2.8

cd278.9 ± 40.8

none

−

Changshou kumquat

68.9 ± 6.0

cd42.1 ± 5.0b164.9 ± 14.9

none

−

CitrusSatsuma mandarin

128.2 ± 12.2

a51.7 ± 5.1

a248.8 ± 20.2

exist

−

Poncirus

Trifoliate orange

49.6 ± 5.5

ef26.6 ± 3.6

cd187.2 ± 13.3

exist

＋＋＋

z

Avarage ± standard deviation.
Different letters represent significant difference in Tukey’s multiple range test, 1% level（n = 10）.
x
（Leaf length / Leaf width）× 100y─ 19 ─

Jun.-Aug.

Jun.-Aug.

Jun.-Aug.

Jun.-Aug.

Jun.-Aug.

Jun.-Aug.

Malayan kumquat

Round kumquat

Hongkong kumquat

Meiwa kumquat

Oval kumquat

Changshou kumquat

FloweringseasonSpecies

White

White

White

White

White

White

Flowercolor

20.0 ± 1.0

18.0 ± 0.7

19.6 ± 0.8

7.5 ± 0.3

16.2 ± 0.8

24.6 ± 2.0

z

b

c

cd

c

e

d

y

Flower width
（mm）

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

a

a

a

a

a

a

Number of
petal
a
a
a
a
a
a

1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

Number ofpistil20.0 ± 1.1

15.7 ± 1.3

17.8 ± 1.6

15.0 ± 1.8

18.4 ± 1.4

22.3 ± 1.4

b

cd

bc

d

b

a

Number ofstamen33.3 ± 0.9

31.1 ± 1.1

32.1 ± 1.2

34.2 ± 0.6

30.6 ± 1.5

33.4 ± 1.0

Length

bc

cd

b-d

b

de

bc

18.0 ± 0.9

19.2 ± 1.1

17.6 ± 1.1

19.4 ± 1.1

16.8 ± 0.7

17.7 ± 0.5

WidthPollen grain（μm）

Satsuma mandarin
May.
White 32.2 ± 2.6 a
5.0 a
1.0 a
18.7 ± 2.5 b
28.6 ± 2.8 e
20.6 ± 3.9
Citrus
Trifoliate orange
Apr.
White 26.1 ± 1.8 b
5.0 a
1.0 a
23.8 ± 1.1 a
36.6 ± 1.2 a
20.8 ± 1.4
Poncirusz
Avarage ± standard deviation.
yDifferent letters represent significant difference in Tukey’s multiple range test, 1% level（Pollen germination percentages n = 5, Others n = 10）.
x
（Length / Width）×100.

Fortunella

Genus

Table 2．The morphological characteristics of ﬂowers in 6 Fortunella species, Satsuma mandarin and trifoliate orange.

143.8 ± 32.1
177.2 ± 12.3

a186.4 ± 6.3

162.4 ± 7.3

183.0 ± 8.7

177.0 ± 10.9

183.0 ± 8.7

188.9 ± 5.9

a

ab

ab

b

ab

b

b

Shape index ofxpollen grain
b

a

a

b

cd

15.0 ± 0.8

1.1 ± 0.1bcd34.9 ± 10.1 a

32.3 ± 1.9

33.8 ± 4.8

19.3 ± 4.0

5.8 ± 1.4

20.7 ± 4.6

Pollengermination
percentages（%）

安田喜一・八幡昌紀・國武久登

Fig.1．Photographs of the fruits in 6 Fortunella species. Top: the side,
Bottom: the transverse plane. Bar = 10 cm．A: Malayankumquat, B: Round kumquat, C: Hongkong kumquat, D:
Meiwa kumquat, E: Oval kumquat, F: Changshou kumquat.

Fig.2．Comparison of the pericarp color in 6 Fortunella species,
Satsuma mandarin and trifoliate orange. A: Malayan kumquat,
B: Round kumquat, C: Hongkong kumquat, D: Meiwa kumquat,
E: Oval kumquat, F: Changshou kumquat, G: Satsuma
zmandarin, H: Trifoliate orange. The color difference masured
by colorimeter CR-300（Konica Minolta, Inc）.

─ 20 ─

キンカン属植物の特性評価
Table 3．The morphological characteristics of fruits in 6 Fortunella species, Satsuma mandarin and trifoliate orange.
Genus

Fortunella

Species

Fruit size（mm）

Fruits weight（g）

DiameterHeightShape index
xof fruit

Number of seeds
per fruit

Seed weight（g）

Malayan kumquatz

14.9 ± 1.0

yd26.2 ± 0.9 e

27.0 ± 1.7 e

97.3 ± 6.2

5.7 ± 0.6 b

0.11 ± 0.02 b

Round kumquat

7.8 ± 0.9

ef

24.2 ± 1.4 e

24.1 ± 1.6 f

100.8 ± 4.6

3.1 ± 0.6 bc

0.11 ± 0.02 b

Hongkong kumquat

1.3 ± 0.2

f12.8 ± 1.2 f

12.2 ± 1.0 g

105.2 ± 7.1

2.5 ± 0.5 bc

0.10 ± 0.02 b

Meiwa kumquat

16.1 ± 1.4

d29.2 ± 3.2 d

31.6 ± 1.6 d

92.2 ± 7.7

5.3 ± 1.2 b

0.11 ± 0.02 b

Oval kumquat

14.0 ± 0.8

de25.3 ± 1.1 e

35.6 ± 1.8 c

71.1 ± 4.8

3.7 ± 0.6 b

0.09 ± 0.03 b

Changshou kumquat

26.7 ± 2.6

c35.2 ± 3.5 c

36.6 ± 3.7 c

96.4 ± 4.7

3.8 ± 0.7 b

0.22 ± 0.05 a

CitrusSatsuma mandarin

135.4 ± 13.6 a

90.4 ± 1.6 a

63.0 ± 2.2 a

143.4 ± 4.1

Poncirus

Trifoliate orange

46.7 ± 3.7

44.3 ± 0.9 b

43.3 ± 1.2 b

102.5 ± 1.4

b

0

c

29.0 ± 7.4 a−
0.22 ± 0.03 az

Avarage ± standard deviation. The fruits of kumquats were completely colored in mid-January, and those of Satsuma mandarin and trifoliateorange were harvested in early November.
yDifferent letters represent significant difference in Tukey’s multiple range test, 1% level（Seed weight n = 50, Others n = 15）.
x
（Diameter / Heiht）× 100.

Table 4．Total sugar and organic acid contents of fruits in 6 Fortunella species, Satsuma mandarin and trifoliate orange.
x

Genus

Fortunella

Species

Total sugar content（g / 100 g F.W.）
Pulpv

Pericarpw

Total organic acid content（g / 100 g F.W.）
Pulp

Pericarp

Malayan kumquat

4.30 ± 0.60

z

e

y

10.60 ± 0.63c2.29 ± 0.16

c

0.20 ± 0.11

Round kumquat

11.34 ± 0.89b14.47 ± 1.56b1.38 ± 0.53d0.15 ± 0.13d

Hongkong kumquat

1.07 ± 0.07

f4.59 ± 0.09e

1.76 ± 0.20

cd

0.38 ± 0.07

a-c

Meiwa kumquat

13.71 ± 0.63

a15.07 ± 0.30

ab

3.66 ± 0.37

ab

0.39 ± 0.06

abOval kumquat

9.00 ± 0.78c12.15 ± 0.84c2.22 ± 0.18c

0.17 ± 0.03

cd
b-d

b-d

Changshou kumquat

9.51 ± 0.23c

16.63 ± 0.89

a3.09 ± 0.29

b0.21 ± 0.01

CitrusSatsuma mandarin

5.84 ± 0.33

d6.88 ± 0.18

d0.49 ± 0.01e

0.24 ± 0.07

b-d

Poncirus

Trifoliate orange

4.82 ± 0.47

de2.42 ± 0.13

f

4.19 ± 0.29

a0.58 ± 0.13

az

Avarage ± standard deviation.
Different letters represent significant difference in Tukey’s multiple range test, 1% level（n = 5）.
x
Total amount of fructose, glucose and sucrose.
w
Total amount of quinic acid, malic acid and citric acid.
v
Pulp: juice sac, Pericarp: flavedo and albedo.
y

じょうが少なかった．種子はキンカン属 6 種すべてで認

ンシュウミカンとカラタチよりもスクロースの占める割められた．果実が最も小さかったマメキンカンが2.5個合が低い傾向が見られた（図 3 ）．一方，果皮におけるで最も少なく，ナガハキンカンが5.7個と最も多かった．

糖組成は，ウンシュウミカンにおいてグルコースが大き

栽培種のニンポウキンカンは5.3個とナガハキンカンにな割合を占めたのに対して，キンカン属植物とカラタチ

次いで種子が多く含まれていた．種子重は，チョウジュ

は果肉と同様の糖組成を示した．有機酸含量は，ニンポ

キンカンが0.22 g と他の種（0.09〜0.11 g）より有意に重ウキンカンが果皮（3.66 g / 100 g F.W.）および果肉（0.39

かった．なお，ナガキンカンの種子のみが単胚性を示し

g / 100 g F.W.）ともにキンカン属植物内では最も多かった（データ省略）．

た（表 4 ）
．それに対し，マルキンカンは果肉が1.38 g /次に，各試料を果肉と果皮に分け，HPLC による糖含100 g F.W. で，果皮が0.15 g / 100 g F.W. と最も少なかっ

量と有機酸含量の測定を行った（表 4 ）．キンカン属植

た．果肉における主要な有機酸はクエン酸で全体の80%

物の果実における糖含量は，マメキンカンを除き他のキ以上を占めており，次いで，リンゴ酸とキナ酸が少量含

ンカン 5 種の果皮の糖含量は10 g / 100 g F.W. 以上であっ

まれていた（図 4 ）．また，種間で組成比に大きな差はた．さらに，マルキンカンとニンポウキンカンは果肉のなかった．果皮の有機酸の組成比は，マルキンカンとニ

糖含量も10 g / 100 g F.W. 以上であった．キンカン属植

ンポウキンカンはクエン酸が多かったが，その他の4種物の中で，最も果肉の糖含量が多かったのはニンポウキ

はキナ酸が多く， 2 つのグループに大別された（図 4 ）．

ンカン（13.71 g / 100 g F.W.）で，果皮の糖含量はチョ

最後に，健康機能性成分の評価として，キンカン属植

ウジュキンカン（16.63 g / 100 g F.W.）であった．なお，

物 6 種におけるβ-クリプトキサンチン含量と DPPH ラジ

マメキンカンが果肉（1.07 g / 100 g F.W.）と果皮（4.59

カル消去能を測定，比較した．その結果，可食部におけg / 100 g F.W.）ともにキンカン属植物内で糖含量が最もるβ-クリプトキサンチン含量は，マメキンカンで1.82低かった．キンカン属植物の果肉における糖組成は，ウmg / 100 g D.W. と最も多く，ナガハキンカン，ニンポウ

─ 21 ─

安田喜一・八幡昌紀・國武久登

Fig. 3．Comparison of the sugar composition in the pulp and pericarp of 6 Fortunella species, Satsuma
mandarin and trifoliate orange.
z
Each sugar content / total of three sugars × 100（n = 5）.
yJuice sac.
x
ﬂavedo and albedo.

Fig. 4．Comparison of the organic acid composition in the pulp and pericarp of 6 Fortunella species,
Satsuma mandarin and trifoliate orange.
z
Each organic acid content / total of three organic acids × 100（n = 5）.
yJuice sac.
x
ﬂavedo and albedo.

─ 22 ─

キンカン属植物の特性評価

Fig.5．Comparison of the β-cryptoxanthin content in the edible part of 6 Fortunella species.
zDifferent letters represent signiﬁcant difference in Tukeyʼs multiple range test, 1% level（n = 3）.

Fig.6．Comparison of the antioxidant capacity（DPPH radical scavenging activity）in the edible part of 6
Fortunella species.
z
TE indicate Trolox equivalent.

キンカンおよびチョウジュの 3 種はそれぞれ0.70，0.78

考 察および0.78 mg / 100 g D.W. と比較的低い値であった（図5 ）．また，可食部における DPPH ラジカル消去能もマ

本研究では，特徴のあるキンカン品種を育成するため

メキンカンが27.65 μmol Trolox TE / 100 g D.W. で最も高に，キンカン属植物 6 種について，葉，花および果実のい値を示したのに対し（図 6 ），ニンポウキンカンが最形態調査を行うとともに，健康機能性成分の評価としても低い値であった（10.87 μmol Trolox TE / 100 g D.W.）．

果実中のβ-クリプトキサンチン含量の測定と DPPH ラジ
カル消去能の予備的な調査を行った．その結果，キンカ─ 23 ─

安田喜一・八幡昌紀・國武久登
ン属植物 6 種の間において，葉，花および果実の形態的32）．本研究で調査したマメキンカンの形態的な特徴は，特徴について高い多様性がみられた．また，β-クリプ

他の 5 種のキンカンとは大きく異なっていた．特徴的なトキサンチン含量や DPPH ラジカル消去能は，キンカ

ものとしては，極めて小さいも果実は濃橙色の果皮色をン属野生種の方がニンポウキンカンより高い傾向を示し

示し，キンカン属 6 種の中でβ-クリプトキサンチン含量

た．これらのことから，キンカン属野生種がキンカン属

が最も高く，DPPH ラジカル消去能も同様に最も高い傾植物における品種改良のための材料と成り得ることが示向であり，高い健康機能性を有することが示唆された．

唆された．そこで本研究で得られた知見をもとに，キン

近年，カンキツ品種において，ʻ 不知火 ʼ や ʻ 麗紅 ʼ のよカン 6 種それぞれの特徴と今後の利用法について考察しうなユニークな果形や果皮色は，品種間の差別化を図る

た．

重要な形質の一つである．食味に劣るため，これらの形

まず，栽培種であるニンポウキンカンは，果実の大き質の栽培種への導入は容易ではないが，品種の多様性がさと果皮の糖含量の値はキンカン属植物の中でフクシュ

低いキンカン育種にとって有用な資源であると考えられ

ウキンカンに次いで 2 番目に高く，果肉の糖と酸含量はる．

最も多かった．ニンポウキンカンの優れた食味は，果肉

マルキンカンは，栽培種であるニンポウキンカンに次がほとんどないため，果皮に対して果肉の割合が少なく，いで果肉と果皮の糖含量が多かったのに対し，それらの果実全体の糖と酸のバランスが良いことによるものと考

酸含量は最も少なく，低酸を示した．さらに，β-クリえられる．一方，一果実あたりの種子数は，5.3個とナプトキサンチン含量と DPPH ラジカル消去能の値はニガハキンカンに次いで多く，健康機能性であるβ-クリプ

ンポウキンカンより高い傾向にあった．これらの結果か

トキサンチン含量と DPPH ラジカル消去能の健康機能

ら品質面では非常に有用であることが言える．しかし，性はキンカン属植物内で最も低い傾向を示した．これら

マルキンカンは多胚性に加え，花粉稔性5.8% と他のキのことからニンポウキンカンの今後の改良点として，種ンカンと比べ著しく低いことが交配親として用いるとき子を減らし，健康機能性を向上させることが挙げられる．

に障害となる．Takami ら（33）は，この問題点を克服

これらの改良点を考慮した研究が，近年様々な手法を用するために，マルキンカンと ʻ 森田ネーブル ʼ オレンジ

いて進められている．例えば，八幡ら（25）は，無核性との細胞融合を行い，四倍体の体細胞雑種を作出した．

キンカンの育種素材として，ニンポウキンカン珠心胚へ

また，Nukaya ら（34）は，マルキンカンの珠心胚にコのコルヒチンとオリザリンの浸漬処理により，多くの四ルヒチン処理を行い，二倍体より花粉稔性の高い四倍体倍体および二倍体と四倍体の倍数性キメラを作出した．

の誘導に成功し，ニンポウキンカンとの交雑で三倍体がさらに，糠谷ら（26）と Nukaya ら（27）は，それぞれ獲得されている．これらのようにマルキンカンを使ったニンポウキンカンの四倍体と倍数性キメラを母本とした新たな育種素材の開発が試みられている．

二倍体との倍数体間交雑から，複数の三倍体雑種の獲得

ナガキンカンは，供試したキンカン属 6 種において唯した．宮崎県は，ニンポウキンカンの珠心胚由来の同質一単胚性を示す種であり，これは交雑育種を行う上で極四倍体（28）と二倍体の交雑より，極めて無核性の高い

めて重要な形質である．実際に，ナガキンカンを種子親

三倍体品種 ʻ 宮崎夢丸 ʼ を育成している．また，キンカに四倍体のニンポウキンカンを交雑し，三倍体の種子数

ン育種への新たなアプローチとして，Yasuda ら（29）は，の少ない ʻ ぷちまる ʼ の育成に成功している（10）．本研

カンキツ優良品種である ʻ 清見 ʼ タンゴールとニンポウ

究の形態調査の結果では，種名の通り果実が他のキンカ

キンカンとの二倍体間の属間交雑より，三倍体と三倍体ンより細長く，丸みを帯びた他のキンカンとは異なる形

様の異数体を示す雑種の獲得に成功した．Cheng ら（30）質であった．また，ナガキンカンのβ-クリプトキサンチ

は，細胞融合法を用いて，ニンポウキンカンと ʻ バレン

ン含量，DPPH ラジカル消去能は，ともに栽培種である

シア ʼ オレンジと四倍体の体細胞雑種を作出している．

ニンポウキンカンと比較して高い傾向を示した．これら

ニンポウキンカンの優れた果実特性と栽培種としてのイのことからも育種素材としての価値も高く，種子親としメージの定着を考慮すると，キンカンの育種は今後も当て活用することで新たなキンカン品種や中間母本の育成

種を中心として展開されていくと考えられる．

に寄与するものと考えられる．

野生種の中でも分類学的に他種と区別されており，原ナガハキンカンは，種名の通り大きく細長い葉が，他

始キンカン亜属（Protocitrus）に属するマメキンカンでのキンカンに類を見ない特徴である．また，果実の形態あるが（1, 7），最近は DNA・染色体レベルの研究におがニンポウキンカンと類似したものの，その糖含量はマいても他のキンカンと異なることが示されている（31,

メキンカンに次いで低かった．一方で，DPPH ラジカル

─ 24 ─

キンカン属植物の特性評価
消去能がニンポウキンカンの 2 倍以上を示したことから，

めに，それらの形態学的特徴と果実特性について調査し機能性キンカン育種の素材として利用できる可能性が示た．キンカン属植物 6 種の間において，葉，花および果唆された．さらに，「大実金柑」として一般流通する

実の形態的特徴の高い多様性がみられた．特に，マメキ

チョウジュキンカンは，他のキンカンと比べ，葉が丸く，ン カ ン［F. hindsii（Champ. ex Benth.）Swingle］ は， 果

大果で果皮の糖度が最も高かった．しかし，発達した果実が小さく濃橙色であるように，他の種と顕著に異なる肉の果汁には酸が多く含まれていたため，生食用として

形態的特徴を有していた．キンカン属植物の果実の糖含は不向きである．したがって，従来通りマーマレードを量は，果肉と果皮の両方でウンシュウミカン（Citrus

はじめとする加工品や観賞樹としての利用に限定される

unshiu Marcow.）より高い傾向が見られたが，マメキンと思われる．ナガハキンカンとチョウジュキンカンは，

カ ン の み 低 い 値 を 示 し た． チ ョ ウ ジ ュ キ ン カ ン（F.

それぞれキンカンとライムの属間およびキンカンの種間

obovata hort. ex Tanaka）は，果皮において特に高い糖含雑種と考えられており（1），近年の分子学的手法（31）量を示した．キンカン属植物の果肉における主要有機酸や染色体核型分析（32）の結果からこれら 2 種はカンキ

はクエン酸であったが，果皮ではキナ酸とリンゴ酸の割

ツとキンカン間の属間雑種であることが示唆されている．

合が増加した．β-クリプトキサンチン含量は，マメキ

そのため，これらとキンカンやカンキツとの戻し交雑を

ンカン，ナガキンカン［F. margarita（Lour.）Swingle］

行うことで，両属の特長を有する新奇カンキツ類の育成

およびマルキンカン［F. japonica（Thunb.）Swingle］でに繋がるかもしれない．

高い値を示した．さらに，DPPH ラジカル消去能は，栽以上より，我が国に導入されたキンカン属植物は 6 種

培種であるニンポウキンカン（F. crassifolia Swingle）はしかないものの，果実や葉の形態的特徴に多様性が存在最も低く，マメキンカンとナガハキンカン［F. polyandra

することが確認された．果実品質は，栽培種であるニン（Ridl.）Tanaka］で高い傾向を示した．これらの結果は，ポウキンカンが他の 5 種より優れていたが，健康機能性

キンカン属野生種が将来有望なキンカンを育種する上で表示で期待されるβ-クリプトキサンチン含量は，カンキ

重要な形質を有することを示唆した．

ツ と の 属 間 雑 種 と さ れ て い る 2 種 以 外 の 野 生 種 で，
DPPH ラジカル消去能は，すべての野生種においてニン

引用文献

ポウキンカンより高い傾向を示した．そのため，現在は
主にニンポウキンカン 1 種に依存しているキンカン育種

1 ）Swingle, W. T. and Reece, P. C., 1967, The botany ofにおいて，野生種を母本として用いることで，健康機能

Citrus and its wild relatives in the orange subfamily, p.

性成分やバラエティに富んだ新奇性の高いキンカン品種

190 430, In: W. Reuther, H. J. Webber and L. D.

の育成が可能になると思われる．今後，これらのキンカ

Bachelor（eds.）, The citrus industry, Vol. 1, Universityof California, Berkeley.

ン属植物について，開花・収穫期ごとの各種成分の変化，
果皮・果肉における部位別のβ-クリプトキサンチン含量，

2 ）Yin-Min, Y., 1985, The status of Fortunella genetic
resources in China, Fruit Var. J., 39, 17 20.

ポリフェノール含量などのより詳細な調査を行う予定である．また，予備的に実施した抗酸化能に関する調査で3 ）Goh, R. M. V., Pua, A., Liu, S. Q., Lassabliere, B.,

は，水溶性・脂溶性の分画に加え，ABTS や H-ORAC

Leong, K. C., Sun, J., Tan, L. P. and Yu, B., 2020,などの測定法を検討すべきと思われる．

Characterisation of volatile compounds in kumquat andcalamansi peel oil extracts, J. Essent. Oil Bear. Plants,
23, 953 969.

謝 辞4 ）Wang, Y. W., Zeng, W. C., Xu, P. Y., Lan, Y. J., Zhu, R.

本研究を遂行するにあたり，貴重な植物材料を提供頂

X., Zhong, K., Huang, Y. N. and Gao, H., 2012,

いた日本マンダリンセンターの職員の皆様に厚く御礼申Chemical composition and antimicrobial activity of the

し上げる．

essential oil of kumquat（Fortunella crassifolia
Swingle）peel, Int. J.Mol. Sci., 13, 3382 3393.
5 ）Avieli, N., 2005, Vietnamese new year rice cakes: iconic

要 約

festive dishes and contested national identity, Ethnology,
44, 167 178.

我が国に導入されているキンカン属（Fortunella）植物 6 種すべてを育種のための遺伝資源として評価するた

6 ）田中長三郎，1932，金柑属総説（一），柑橘研究，

─ 25 ─

安田喜一・八幡昌紀・國武久登
5，141 154．

and Patil, B. S., 2005, Antioxidant activity of citrus
limonoids, flavonoids, and coumarins, J. Agric. Food7 ）田中長三郎，1933，金柑属総説（二），柑橘研究，

Chem., 53, 2009 2014.

6，19 40．
8 ）Swingle, W. T., 1915, A new genus, Fortunella,24）須田郁夫，2000，食品機能研究法，光琳出版社，京comprising four species of kumquat oranges, J. Wash.

都，218 220， 抗 酸 化 機 能， 分 光 光 度 計 に よ る

Acad. Sci., 5, 165 176.

DPPH ラジカル消去能の測定，篠原和毅 , 鈴木建夫 ,上野川修一 編．

9 ）近藤恭史，2002，こん太，品種登録10249．
10）吉田俊雄，根角博久，吉岡照高，家城洋之，伊藤祐

25）八幡昌紀，柏原夕希子，黒木宏憲，國武久登，小松司，野々村睦子，上野 勇，山田彬雄，村瀬昭治，

春喜，2004，ニンポウキンカン種子へのコルヒチン

瀧下文孝，2002，ぷちまる，品種登録10379．

およびオリザリン処理が四倍体植物誘導に及ぼす影
響，園学研，3，11 16．

11）古屋良子，2007，ゆみちゃんのほっぺ，品種登録26）糠谷綱希，太田知宏，安田喜一，八幡昌紀，國武久

14785．
12）金丸 勇，2006，勇紅，品種登録14416．

登，小松春喜，新居直祐，向井啓雄，原田久，高木

13）安田喜一，國武久登，中川匠子，黒木宏憲，八幡昌

敏彦，2011，ニンポウキンカン珠心胚へのコルヒチ

紀，平田力也，吉倉幸博，川上郁夫，杉本安寛，

ン処理によって得た倍数体の特性とそれらの三倍体

2008，ニンポウキンカン ʻ 勇紅 ʼ の倍数性周縁キメ

育種への利用，園学研，10，1 8．

ラの証明とその形態的特性，園学研，7，165 171．

27）Nukaya, T., Sudo, M., Yahata, M., Ohta, T., Tominaga,

14）竹島久善，児玉良一，黒木重文，山口和典，徳満憲

A., Mukai, H., Yasuda, K. and Kunitake, H., 2019, The治，荒武貴浩，黒木恒和，木下哲次，平田力也，佐conﬁrmation of a ploidy periclinal chimera of the Meiwa

野真実，2010，宮崎夢丸，品種登録19999．

kumquat（Fortunella crassifolia Swingle）induced bycolchicine treatment to nucellar embryos and its

15）竹島久善，児玉良一，長田龍太郎，黒木重文，山口
和典，徳満憲治，荒武貴浩，黒木恒和，木下哲次，morphological characteristics, Agronomy, 9, 562.

平田力也，佐野真実，串間新一，2011，宮崎王丸，

28）河瀬憲次，八幡昌紀，中川匠子，原口加奈，國武久
登，2005，ニンポウキンカンにおける同質四倍体の品種登録20868．

選抜とその特性，園学研，4，141 146.

16）江藤義敦，2016，紅央，品種登録25294．
17）松本亮司，池松大亮，吉岡照高，山本雅史，2008，29）Yasuda, K., Yahata, M., Komatsu, H., Kuroki, Y. and抗リモニン抗血清を用いた酵素免疫測定法によるカ

Kunitake, H., 2010, Triploid and aneuploid hybrids from

ンキツの機能性成分，リモニン配糖体の定量，園学

diploid-diploid intergeneric crosses between Citrus

研，7，481 489．

cultivar ʻKiyomiʼ tangor and Meiwa kumquat（Fortunella18）矢野昌充，生駒吉織，杉浦

crassifolia Swingle）for seedless breeding of kumquats,

実，2005，β-クリプ

J. Japan. Soc. Hort. Sci., 79, 16 22.

トキサンチン研究最近の進歩，果樹研報，4，13 28．
19）Yamaguchi, M. and Uchiyama, S., 2004, Beta-

30）Cheng, Y. J., Guo, W. W. and Deng, X. X., 2003,

cryptoxanthin stimulates bone formation and inhibits

Molecular characterization of cytoplasmic and nuclear

bone resorption in tissue culture in vitro, Mol. Cell

genomes in phenotypically abnormal Valencia orange

Biochem., 258, 137 144.

（Citrus sinensis）+ Meiwa kumquat（Fortunella20）杉浦

crassifolia）intergeneric somatic hybrids, Plant Cell

実，2017，国産カンキツ類に多いβ-クリプト

Rep., 21, 445 451.

キサンチンと機能性食品の開発，化学と生物，55，

31）Yasuda, K., Yahata, M., Komatsu, H. and Kunitake, H.,

566 572．
21）近藤 悟，津田和彦，武藤徳男，中谷宗一，2002，

2010, Phylogeny and classification of Fortunella

カンキツ果実の発育中における抗酸化機能の推移，（Aurantioideae）inferred from DNA polymorphisms,

園学研，1，63 66．

Bull. Fac. Agr., Univ. Miyazaki, 56, 103 110.

22）Miyake, Y., 2006, Characteristics of flavonoids in32）Yasuda, K., Yahata, M. and Kunitake, H., 2016,

Niihime Fruit – a new sour citrus fruit, Food Sci.

Phylogeny and classification of kumquats（Fortunella

Technol. Res., 12, 186 193.

spp.）inferred from CMA karyotype composition, Hort.

23）Yu, J., Wang, L., Walzem, R. L., Miller, E. G., Pike, L. M.
─ 26 ─

J., 85, 115 121.

キンカン属植物の特性評価
33）Takami, K., Matsumaru, A., Yahata, M., Imayama, T.,

Yasuda, K., Tominaga, A., Mukai, H. and Kunitake, H.,

Kunitake, H. and Komatsu, H., 2004, Production of

2019, Characteristics in autotetraploid kumquatsintergeneric somatic hybrids between round kumquat（Fortunella spp.）induced by colchicine treatment to（Fortunella japonica Swingle）and ʻMorita navelʼ orange

nucellar embryos and their utilization for triploid（Citrus sinensis Osbeck）, Plant Cell Rep., 23, 39 45.

breeding, Sci. Hortic., 245, 210 217.

34）Nukaya, T., Sudo, M., Yahata, M., Nakajo, Y., Ohta, T.,─ 27 ─

カンキツ類の遺伝解析に有用な SSR マーカーの選定
東海大農紀要 41：29−37（2022）

カンキツ属 4 種とキンカン属 5 種を用いた
カンキツ類の遺伝解析に有用な SSR マーカーの選定
1

安田喜一 ・戸村大河

1,2

1

3

3

・佐藤真衣 ・富永晃好 ・八幡昌紀 ・國武久登

4

Selection of useful SSR markers for genetic analysis of citrus
using 4 Citrus and 5 Fortunella species
Kiichi YASUDA, Taiga TOMURA, Mai SATO,
Akiyoshi TOMINAGA, Masaki YAHATA and Hisato KUNITAKE（Received 25 November 2021; accepted 24 December 2021）
Abstract
SSR genotyping of the 9 citrus species using by public SSR markers and polyacrylamide electrophoresis was performed forscreening useful DNA marker to genetic analysis in citrus. As a result, 18 markers were primary selected from a total of 281
markers because of high polymorphism and difference of ampliﬁed fragment length between their alleles, and then, 8 markers
with high reproducibility and distinguishability were selected from these ones. In these SSR loci, many polymorphisms weredetected among the closely related 4 Citrus and 5 Fortunella species, and these species could be identiﬁed by a minimum of
two Markers, GSR3138 and CiBE3936. On the other hand, the direct-sequencing of bands different from the previously
expected fragment length suggested that multiple alleles might exist for one SSR marker in some species. In the future, using
the selected SSR markers, we plan to analyze genetic background of the tetraploids and hybrid strains produced in previous
studies, and at the same time, proceed with the design of SSR markers based on the public genomic information.

ため，開花時に正常な受精が阻害され，無核果が生じや

緒 言

すい．これまでに，カンキツ属やキンカン属では，四倍カンキツ類は，一般にカンキツ（Citrus）属，カラタ

体を用いた交雑によって多くの三倍体が得られており，チ（Poncirous）属およびキンカン（Fortunella）属の 3四倍体は無核性品種育成のための重要な育種素材である属を示す．これらの植物群はインド，東南アジア，中国，と言える（6 10）．従来，カンキツ類の同質四倍体は，フィリピン，台湾，日本，マレー諸島およびメラネシア

偶発的に出現する珠心胚実生から獲得されてきたが，その島々に分布する（1）．カンキツは生食用をはじめ加工の頻度は極めて低く，効率的な方法とはいえない（11）．

用まで幅広く利用されており，それらに利用される品種

そのため，近年ではコルヒチンやオリザリンなどの紡錘では，食べやすさ，扱いやすさから，無核（種無し）の糸形成阻害剤を種子や腋芽に処理する方法が主流となっものが多い．そのためカンキツ類では，無核性は極めてており，これまでに様々なカンキツ類で同質四倍体の作

重要な形質である．

出に成功している（7, 9, 12 14）．しかし，種子への紡錘

無核性カンキツの育成手法の一つとして，三倍体を利糸形成阻害剤処理方法では，有性胚由来の実生が混入し用した育種が挙げられる（2 5）．三倍体では，減数分裂ている可能性があるため（15），発生起源を確認する必時に異常な染色体数を持つ配偶子が高頻度で形成される

要がある．

１

東海大学農学部応用植物科学科

２

静岡大学大学院総合科学技術研究農学専攻３

静岡大学学術院農学領域

４

宮崎大学農学部応用生物科学科

連絡先：安田喜一

e-mail: yk964422@tsc.u-tokai.ac.jp
─ 29 ─

安田喜一・戸村大河・佐藤真衣・富永晃好・八幡昌紀・國武久登
もう一つの無核性カンキツの育成手法として，雄性・材料および方法

雌性不稔性を有する品種を母本とした交雑育種がある．
その代表的な育種母本として，ʻ 宮川早生 ʼ ウンシュウ

植物材料

ミカン（C. unshiu Marcow．
）と ʻ トロビタ ʼ スイートオ

静岡大学農学部附属地域フィールド科学教育研究セン

レンジ［C. sinensis（L.）Osbeck］の交雑より育成された

タ ー 植 栽 の ウ ン シ ュ ウ ミ カ ン ʻ 宮 川 早 生 ʼ（ 英 名：ʻ 清見 ʼ タンゴールが挙げられる（16）．当品種は，後代

Satsuma mandarin）（Citrus unshiu Marcow.），ポンカン ʻ 太に遺伝する核・細胞質型の葯退化タイプの雄性不稔性

田ポンカン ʼ（Ponkan mandarin）（C. reticulata Blanco），（17, 18）を有しており，種子親として ʻ 不知火 ʼ，ʻ はる

タチバナ（Tachibana）［C. tachibana（Makino）Tanaka］．

み ʼ および ʻ はれひめ ʼ などの多くの少核性・無核性品

シキキツ（Calamondin）（C. madurensis Lour．），ニンポ

種の育成に寄与している（19）．育種年限の長い果樹に

ウ キ ン カ ン（Meiwa kumquat）（Fortunella crassifolia

おいて，戦略的かつ効率的な交雑育種を推進するために

Swingle）， マ ル キ ン カ ン（Round kumquat）［F. japonica

は，交雑実生の早期雑種性解析は必要不可欠である．ま（Thunb.）Swingle］，マメキンカン（Hongkong kumquat）

た，近年では，植物の育成者権保護の関心が高まってお［F. hindsii（Champ. ex Benth）Swingle］，チョウジュキン

り，DNA マーカーによる品種識別により交雑親の間違カン（Changshou kumquat）（F. obavata hort. ex Tanaka），

い事例が発生している．例えば，愛媛県育成品種 ʻ 甘平 ʼ

ナガハキンカン（Malayan kumquat）［F. polyandra（Ridl.）

は，2007年の品種登録時には ʻ 西之香 ʼ と ʻ 不知火 ʼ の雑

Tanaka］のカンキツ属植物 4 種とキンカン属植物 5 種の種とされていたが， 7 年後に DNA 解析によって花粉親

計 9 種を供試した．なお，マメキンカンに関しては二倍がポンカンであることが判明した（20）．

体の変種（F. hindsii var. chintou），マルキンカンについこれまでにカンキツ類の珠心胚における有性胚と珠心ては，宮崎大学農学部植栽の実生を用いた．

胚の判別方法には，アイソザイム分析や CMA 染色体核型分析が用いられてきたが（21 24），最近の主流として

ゲノム DNA の抽出

Random Ampliﬁed Polymorphic DNA（RAPD）や Simple

供試植物の成葉から改変 CTAB 法（36）によりゲノ

Sequence Repeat（SSR）分析のような分子生物学的手法

ム DNA を抽出した．すなわち， 2 mL チューブに成葉が用いられている（11, 15, 25 28）．一方，カンキツ類の約200mg とクラッシャーを入れ，液体窒素と SK ミル

品種・種識別では，その他にも restriction fragment length（SK-100，Tokken, Inc.）を用いて凍結・粉砕した．そこ

polymorphism（RFLP）（29），cleaved ampliﬁed polymorphicに予熱した CTAB 溶液 1 mL とメルカプトエタノール10

sequence（CAPS）（30），single nucleotide polymorphism

μL を 加 え て 混 和， ブ ロ ッ ク イ ン キ ュ ベ ー タ ー（SNP）（31）などの DNA マーカーが利用されており，（PowerBLOCK Shaker, ATTO） で65 ℃，600rpm，30分 間交雑育種の雑種性解析に応用できる．そのなかでも，

振とう，その間に RNase を 4μL 添加した．その後，室SSR は多型性・再現性が高く，共優性の遺伝様式を示し，

温，14,000rpm， 5 分間遠心分離して得られた上清につゲノム中に豊富に存在するため，信頼性の高い DNA

いて，フェノール / クロロホルムとクロロホルム / イソ

マーカーとして様々な遺伝解析に用いられている．カン

アミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿を実

キツ属では，これまでに Ollitrault ら（32）や Shimizu ら

施し，DNA ペレットを TE buffer 100μL に溶解した．

（33）などによって多くの SSR マーカーが設計・公開さ微量分光光度計（NanoDrop2000c, ThermoFisher Scientiﬁc

れており，それらの情報に基づいた蛍光プライマーとK.K.）で DNA 溶液の濃度を測定後， 5 ng/μL に調整しキャピラリーシークエンサーを利用したフラグメント解て PCR に用いた．

析が主流となっている（33 35）．しかしながら，この手法では高価な機械や蛍光試薬が必要であり，その利用は

SSR マーカーの一次選抜
Ollitrault ら（32）がクレメンティン（C. clementina cv.

限定的である．
そこで本研究では，カンキツ類における同質四倍体のNules）のゲノム配列データより設計した526個の SSR

発生起源や交雑実生の雑種性の解析などに有用な DNA

マーカーより選抜した79個，Shimizu ら（33）がクレメ

マーカーの探索を目的として，既に設計・公開されていンティン，ウンシュウミカンおよびスイートオレンジ

る SSR マーカーから，比較的安価かつ容易なポリアク［C. sinensis（L.）Osbeck cv. Ridge Pineapple］のゲノム配リルアミドゲル電気泳動（Polyacrylamide gel electrophoresis,

列データより設計した202個の SSR マーカーを対象としPAGE）を用いた分析により選定を試みた．

た．これらのマーカーのうち，多型性の指標である多型
─ 30 ─

差異が約10bp 以上であるものを各連鎖群より最低 1 個以上選抜した．

SSR 分析および遺伝子型決定0.5ng/μL ゲ ノ ム DNA，0.2μM forward/reverse プ ラ イ

マ ー，2.5μL GoTaq Green Master Mix（Promega） を 含Ⓡ

む計 5μL を PCR 反応溶液とした．サーマルサイクラー（Thermal Cycler Dice Touch, Takara）を用いて PCR 反応を行った．なお，ポリメラーゼの違いなどにより期待された増幅が得られなかった場合は，PCR 条件を再検討し た． 最 適 化 さ れ た PCR 反 応 後， 反 応 溶 液 を100bp
DNA Ladder（Bioneer） と20bp DNA Ladder（Takara） とともに12% ポリアクリルアミドゲル上にアプライし，

電気泳動用電源装置（PowerStation Ghibli I, ATTO）を用

いて200V，80分間電気泳動を行った．泳動後，ポリア

クリルアミドゲルを0.1μg/mL のエチジウムブロマイドを含む TBE バッファーで30分染色後，紫外線照射下で（Microsoft）を用いて簡易処理し，100bp DNA Ladder 間
可 視 化 し た． デ ジ タ ル 画 像 を Microsoft PowerPointの直線を基準として増幅バンドの多型性により遺伝子型を決定した．

ダイレクトシークエンスおよび塩基配列決定

タチバナの NSX02遺伝子座における PCR 産物について， 4 % アガロースで電気泳動し，異なる 3 つの断片

長のバンドを含むゲル部分をカミソリで切り出し，Column（FAVORGEN Biotech Co.）を用いてゲル抽出を
GENECLEAN kit（MP Bio Japan K.K.）と GEL/PCR Puriﬁcation

行 っ た． 抽 出 し た 増 幅 産 物 は，ExoSAP-IT ™ Express

PCR Product Cleanup Reagent（ThermoFisher ScientificK.K.）により精製し，増幅産物13.36 μL と10 pmol のプ

ラ イ マ ー0.64 μL を 混 合・ 調 整 後 に，FASMAC Ltd. へ

シークエンス分析を委託した．Forward/reverse リード配

列のオーバーラップ領域で配列を決定し，比較した．

結 果

SSR マーカーの一次選抜の結果，Table 1 に示した18マーカーを本試験に用いることとした．それらのプライマーペアを用いたカンキツ属 4 種とキンカン属 5 種のPCR では，期待される増幅が得られなかったマーカーが多かったため，グラジエント PCR によりアニール温度を中心に条件の最適化を行った（Table 2）．その結果，

再現性が良く，増幅断片間の識別性が高い CiBE3936，

─ 31 ─

1

3

5

6

7

8

1

1

2

2

3

3

4

5

5

6

7

9

CiBE1644

CiBE4796

CiBE0447

CiBE2165

CiBE2227

NSX175

GSR2101

TSGR264

TSGR265

NSX02

NSX165

TSRA107

NSX43

GSR3138

NSX156

GSR6101

SSR07B25

Linkage
group

CiBE3936

Locus

AGGCTATCTCTAATCCATTGCTAAAAACAGAGCAGAAGGAAC

CAGGTAGGTGGCTTTAAGG

GCCTTTGCTAACTGGAAAGTCTTCTGGATCAAACTAGCTTCGT

GGATTTAGAGAAAGTAGAGCAACCA

GTTGTTCTTGTATGAAGGGTACAGACATCACATCGCCAATACCC

AACAGTCCGACTAATTCATCCTAACACCACCTTCAATTCCCA

AAATGAATTGTAAATAACGGAGATGAGCTTACTAATAGGATACGCTG

AGAACCAAGTCACCTCACAGAATCCACTCTCAAACACCAG

CACAAAGAGAGTAACCCACAA

Reverse（5' - 3'）

GCCATTGCTGTTCATTTACTCTGCAATCCCATAATAGCAAAGGGAGTTTGACAGTTTGAACCACATAAGCTTGCGTGTTGTGT

AACTTTAACCCTACAATCAGCC

TTTGAGAACCCAGCACTATACC

TTTGTTTGTCTGTTGGCTTGTCACTCGTGGGACTCATGACTCTATCTCCAAGACTCCAACCTGGCAAACTATTAGACCTCCGTGAGATTCTATAATTGAAAGCTCTC

ATTGTAAGGCGAATTGGATGGAGAGAAGGATAGGGATGGAAAACTGCCAAATAACTACCATTCCGTCAAGAAGAGAGAATGATGTTCAACCACACTGACGATAACAGAGAGAACCCGAAGAAGTATGAGATGCCTTGTATTGCT

Sequence（GA）n（CCGGCA）n（TTCCT）n（TAT）n（TCT）n（AAT）n（TTCATGA）n（TGAAGA）n（AT）n,（AGA）n（TA）n（CA）n（TA〔GCA〕）n（CAA）n（AAT）n（TA）n（GA）n（AAGA）n（AAT）n（AAC）7（TG）9（TTC）14（AG）10（GTT）11（TC）16

Motif

54

60

56

54

58

56

211

248

216

135

158

200

289

143

54
56

165

140

113

214

153

263

303

194

360

251

56

58

54

56

55

55

55

55

55

55

Annealing
Amplified fragment
temperature（℃）
length（bp）

CX074011

BUZY128935.g1

scaffold_42

BUZY63372.g1

scaffold_1

scaffold_6

scaffold_57

scaffold_3

scaffold_2

scaffold_2

BUZY106502.b1

scaffold_64

ET100673

ET102021

ET091388

ET110437

ET097780

ET104698

Accession ID

Shimizu et al., 2016

Ollitrault et al., 2010

Reference

情報含有量（PIC）値が高く，アレル間の増幅断片長のGATGAGAACGCTGATGCTACAGAAGAGGAGCCATTATTTGTAATGATAGCCGTTGGTCTT

Forward（5' - 3'）

Table 1．Information on SSR markers used in the present study with their linkage groups, primer sequences, repeat motifs, annealing tempertures, ampliﬁed fragment length, accession IDs, and bibliographic references.

カンキツ類の遺伝解析に有用な SSR マーカーの選定

安田喜一・戸村大河・佐藤真衣・富永晃好・八幡昌紀・國武久登
Table 2．Optimization of PCR conditions for 18 SSR markers.
Locus

PCR condition［temprature・time (℃・sec)］
Denaturation

Annealing

Elongation

Cycle

72・30

30

CiBE0447
CiBE1644
CiBE2227
CiBE3936

94・60

58

z

・30

CiBE4796
CiBE216560

SSR07B25

56

GSR3138

54

NSX02

・20

TSGR265・25

56 ・35・35

NSX175
TSGR264
NSX156

32
58

94

NSX43
TSRA107

・60

GSR2101

72

55

・60

56 ・25・35

55 ・45

・45

52

GSR6101

53

・60

・60

NSX16555 ・45・45z

35

Bold letters indicate modified conditions.

Table 3．The range of the ampliﬁed fragment length by PCR with 8 SSR markers.
Locus
CiBE3936
NSX175
TSGR264
NSX02
NSX165

Linkagegroup

Amplified fragment length（bp）
80~100101~120121~140141~160

161~1803

201~300

301~400

401~500

1A / 1B / 1C / 1D / 1E

1
2

181~200

1A
2A

2B / 2C

2D

3A / 3B

3C

5A / 5B

5C

1B / 1C

1D

3A / 3B / 3C

GSR3138

5

5D / 5E

GSR6101

7

7A

7B

SSR07B25

99A

9B / 9C

3D / 3E

5F / 5G
7C

NSX175，TSGR264，NSX02，NSX165，GSR3138，

ンカンの 2 種間，ポンカン，マルキンカンおよびマメキ

GSR6101および SSR07B25の 8 マーカーを選抜できた．

ンカンの 3 種間において同じ遺伝子型を示した．さらに，

8 マーカーを用いたカンキツ属 4 種とキンカン属 5 種

GSR3138で識別できなかった 2 組の種間では，それぞれの PCR と PAGE を行ったところ，すべての遺伝子座でまったく異なる遺伝子型を示した．一方，その他の 5 遺既報の期待される断片長を有する明瞭なバンドが得られ伝子座では，ホモ接合も多く，比較的多型性は低かった．

た（Table 3）．しかしながら，GSR3138（Fig. 1a）を除

興 味 深 い こ と に， 第 2 連 鎖 群 に 座 上 す る TSGR264の

く 7 マーカーでの PCR では，それら以外にも複数のバ

PCR では，キンカン属 5 種のみバンドがまったく検出

ンドが検出されたため，既報の断片長かつ明瞭な強いシ

されなかった（Fig. 1b）．

グナルを有するバンドを本研究における遺伝子型決定に既報の期待される断片長以外のバンドが SSR である

用いた（Fig. 1b, Fig. 2）．供試した 9 種の 8 遺伝子座にかどうかを確認するため，代表として第 3 連鎖群に座上おける遺伝子型を Table 4 に示した．最も多くの種間多する NSX02におけるタチバナで増幅された 3 本のバン型が得られたのは第 5 連鎖群に座上する GSR3138であドのダイレクトシークエンスを実施した．最も長い鎖長り，ウンシュウミカン，シキキツおよびチョウジュキンのバンド（l）は技術的な問題で明瞭な波形が得られな

カンの 3 種間，ナガハキンカンとマルキンカンの 2 種間かったが，残り 2 本のバンドでは一部の配列を決定するにおいて同じ遺伝子型を示した．また，ニンポウキンカことができ，中間の鎖長のバンド（m）は既報と同様のンを除く 8 種でヘテロ接合であった．第 1 連鎖群に座上

断片長を有するバンド（s）と少なくとも19塩基の差異

する CiBE3936は 9 種中 4 種でホモ接合であったものの，がある SSR 遺伝子座［
（TA）
n（CA）
n］であることが明ら

種間多型は多く観察され，ウンシュウミカンとナガハキかとなった（Fig. 2）．

─ 32 ─

─ 33 ─140 bp120 bp100 bp200 bp500 bpa

M1 M2 1 2

3 4

5 6 7 8 9 M1

He

He

He

He

He

He

Ho

He

b

M1 M2 1 2 3 4 5

7A / 7B
9B / 9CHe

Ho

Ho: homozygosity, He: heterozygosity in SSR allele.
n.d.: not detected.

3B / 3E

Ho
5A / 5G

3A / 3CHoHe

2A / 2AHeHe

1B / 1C
1C / 1DHo
1A / 1B

6 7 8 9 M1

9B / 9B

7A / 7B

5A / 5A

3C / 3E

3C / 3C

2B / 2C

1A / 1C

Fig.1．SSR analysis of 4 Citrus and 5 Fortunella species with PAGE in GSX3138（a）and
TSGR264（b）loci.
M1: 100bp ladder, M2: 20bp ladder, 1: Satsuma mandarin ʻMiyagawa-waseʼ,
2: Ponkan mandarin ʻOta-ponkanʼ, 3: Malayan kumquat, 4: Meiwa kumquat,
5: Tachibana, 6: Calamondin, 7: Round kumquat, 8: Hongkong kumquat,
9: Changshou kumquat. Gating: locus used for SSR genotyping.

yz

7B / 7C

9B / 9B

7

9GSR6101

SSR07B25

3A / 3E

3C / 3C

2D / 2D

1A / 1A

1D / 1D

5B / 5C

3

2

1

Ho

He

He

He

Ho

He

He

He

9B / 9C

7B / 7B

5B / 5C

3D / 3E

3C / 3C

2D / 2D

1C / 1C

1B / 1E

He

Ho

He

He

Ho

Ho

Ho

He
y

9B / 9B

7B / 7B

5B / 5C

3E / 3E

3A / 3Cn.d.

1C / 1C

1A / 1A

Ho

Ho

He

He

He

-

Ho

Ho

9A / 9A

7B / 7B

5C / 5F

3D / 3E

3C / 3Cn.d.

1A / 1A

1D / 1D

1B / 1B

9C / 9C

7A / 7B

5D / 5D

3E / 3E

3A / 3Bn.d.

1B / 1B

Ho

Ho

He

Ho

Ho

He

-

Ho

1B / 1C

9C / 9C

7A / 7B

5C / 5F

3C / 3E

3A / 3Bn.d.

1B / 1B

He

Ho

He

He

He

He

-

Ho

1B / 1C

9C / 9C

7A / 7B

5C / 5E

3D / 3E

3A / 3Cn.d.

1B / 1B

He

Ho

He

He

He

He

-

Ho

Fig. 2．SSR analysis of 4 Citrus and 5 Fortunella species
with PAGE in NSX02 locus（left）and the sequenceof tachibanaʼs ampliﬁed fragments（above）.
M1: 100bp ladder, M2: 20bp ladder, 1: Satsuma
mandarin ʻMiyagawa-waseʼ, 2: Ponkan mandarinʻOta-ponkanʼ, 3: Malayan kumquat, 4: Meiwa
kumquat, 5: Tachibana, 6: Calamondin, 7: Roundkumquat, 8: Hongkong kumquat, 9: Changshou
kumquat.
Gating: locus used for SSR genotyping, whitearrowhead: bands used for direct sequencing.

Ho

Ho

He

He

Ho

-

Ho

Ho

Citrus
Fortunella
Linkage
Satsuma mandarin
Ponkan mandarin
Changshou
MalayanMeiwa
Round
Hongkongzgroup
Ho / He
Ho / He Tachibana Ho / He Calamondin Ho / He
Ho / He
Ho / He
Ho / He
Ho / He
Ho / He‘Miyagawa-wase’
kumquatkumquatkumquatkumquat‘Ota-ponkan’kumquat5

GSR3138

NSX165NSX02

TSGR264

NSX175

CiBE3936

Locus

Table 4．SSR genotyping of 4 Citrus and 5 Fortunella species by using 8 markers.

カンキツ類の遺伝解析に有用な SSR マーカーの選定

安田喜一・戸村大河・佐藤真衣・富永晃好・八幡昌紀・國武久登や品種識別などにはしばしば混乱を生じさせる．近年，

考 察

カンキツ類と一部の近縁野生種の全ゲノム解読が進めら本研究では，TaKaRa Taq ™（TaKaRa，約27.5円/10μL

れており，スイートオレンジ（40），クレメンティン（C.

PCR 混合液）や rTaq DNA Polymerase（TOYOBO，約9.5，
clementina hort. ex Tanaka）（41），ウンシュウミカン（42）円/10μL PCR 混合液）などより比較的安価で操作性の良ブンタン（C. maxima Merr.），パペダ，シトロンおよびい GoTaq Green Master Mix（約7.8円/10μL PCR 混合液）

アタランティア（43），でゲノム配列が公開されている．

を用い，供試したプライマーペアのアニール温度を最適

また，農研機構は，カンキツの DNA マーカーの開発を化できた．汎用性を重視して PAGE による増幅産物の分支援するデータベース「ミカンゲノムデータベース離を試みたため，一次選抜した18マーカーのうち遺伝解（MiGD）」（https://mikan.dna.affrc.go.jp/）を開発・公開し析に有用なものは 8 個であった．これらの SSR 遺伝子ている．そのため，このような公開情報を利用して，将座において，供試 9 種には 3 〜 7 つのアレルが存在し，来的に単一遺伝子座かつ特異性の高い SSR マーカーの近縁であるカンキツ属とキンカン属の属間および属内で設計を行う必要性があると考えられた．

Ⓡ

多くの遺伝子多型を確認することができた．Yasuda ら

本研究において，特に有用な GSR3138と CiBE3936を（37）は，チョウジュキンカン，ナガハキンカンおよび含む 8 つの SSR マーカーを選定し，カンキツ属 4 種とシキキツがカンキツ属とキンカン属の属間雑種であるこ

キンカン属 5 種におけるそれらの遺伝子型を明らかにすとを明らかにしている．そのため，本研究でキンカン属

ることができた．これまでに，共同研究機関である宮崎が TSGR264のアレルを有していなかったことから，こ大学と静岡大学では，種子へのコルヒチンやオリザリン

れらのうちキンカン属 2 種は当遺伝子座にキンカン属由処理により多くの四倍体カンキツ類を作出している．一来のホモ接合，シキキツはカンキツ属由来のホモもしく部の四倍体系統については RAPD 分析（11，15）およはヘミ接合であることが示唆された．

び CMA 核型分析（7）による発生起源の解析が行われ明らかとなった 8 マーカー 9 種の SSR 遺伝子型によているが，未解析の四倍体系統が多く残されている．今り， こ れ ら の 種 は GSR3138と CiBE3936の 最 少 2 マ ー

後，本研究で選定した SSR マーカーを用いて同質四倍

カーで種の識別が可能であることが明らかとなった．カ

体の発生起源を明らかにするとともに，雑種性などの遺

ンキツ類の珠心胚における有性胚と珠心胚の判別には，

伝解析に有用な SSR マーカーの選定・設計を進める予

いくつかの遺伝子座における同一性とともに，周囲に植定である．

栽している別種・品種の遺伝子混入がないことを証明する必要性がある．Sudo ら（38）は，ウンシュウミカン

要 約の珠心胚より偶発的な倍加個体を獲得し，本研究で選定した NSX165と GSR3138を用いた遺伝解析により，このカンキツ類における遺伝解析に有用な DNA マーカー系統が珠心胚由来の同質四倍体であることを明らかにしの探索を目的として，カンキツ類 9 種および既に構築さている．一方，本研究では，すべての種において遺伝解れた SSR マーカーを供試し，ポリアクリルアミドゲル

析のために有用であるヘテロ接合のアレルを観察できた．

電気泳動による遺伝子型決定を行った．その結果，合計

Yasuda ら（39）は，一部の種でのみ明確なバンドが得

281マーカーについて，多型性が高く，アレル間の増幅られた NSX43と CiBE2227（データ省略）を用いて，ʻ 清

断片長差が大きい18マーカーを一次選抜し，さらにその見 ʼ タンゴールとニンポウキンカンとの二倍体間交雑よ中から再現性と識別性の高い 8 マーカーを選定することり得られた三倍体と異数体の雑種における SSR 解析にができた．これらの SSR 遺伝子座において，近縁であより，これらの倍数体化がニンポウキンカンの非還元配るカンキツ属とキンカン属の 9 種間に多くの多型を確認

偶子に由来することを明らかにしている．これらのようす る こ と が で き，GSR3138と CiBE3936の 最 少 2 つ のに，本研究で選定した SSR マーカーは，同質四倍体やマーカーで供試した種を識別することができた．一方で，雑種の発生起源のような遺伝解析に有用であると言える．

既報の期待される断片長以外のバンドの塩基配列決定に既報の期待される断片長以外のバンドの塩基配列決定より，一部の種において 1 つの SSR マーカーに対してにより，一部の種において 1 つの SSR マーカーに対し複数のアレルが存在する可能性が示唆された．今後，選て複数のアレルが存在する可能性が示唆された．このよ

定した SSR マーカーを用い，これまでに作出した四倍

うな場合，系統分類学や集団遺伝学的な研究では高い多体や雑種系統の遺伝解析を実施するとともに，公開され型性より有用なマーカーとなり得るが，優良個体の選抜ているゲノム情報を利用した SSR マーカーの設計を進─ 34 ─

カンキツ類の遺伝解析に有用な SSR マーカーの選定
32, 27 45.

める予定である．

13）津村哲宏，山尾正実，徳永忠士，2002，カンキツ
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19）吉田俊雄，2003，高品質・単胚性カンキツ品種「清見」の育成，育種学研究，5，103 107．

チン処理によって得た倍数体の特性とそれらの三倍

20）二宮泰造，島田武彦，遠藤朋子，野中圭介，大村三

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127 133．
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単胚性カンキツにおけるコルヒチン処理による四倍

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安田喜一・戸村大河・佐藤真衣・富永晃好・八幡昌紀・國武久登
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カンキツ類の遺伝解析に有用な SSR マーカーの選定
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Yoshioka, T., Toyoda, A., Fujiyama, A., Kaminuma, E.

─ 37 ─

primitive, wild and cultivated citrus provide insights into
asexual reproduction, Nat. Genet., 49, 765 772.

東海大農紀要 41：39−46（2022）

Acetaminophen 硫酸体の合成

Acetaminophen 硫酸体の有機合成
＊

＊＊

＊，
＊＊

＊＊＊

森田千紘 ・谷口玲央真
小野政輝

・黒木勝久

・吉田実央

＊＊

＊

・德永祐希 ・木下英樹

・榊原陽一

＊＊＊

・水光正仁

＊＊＊＊

＊，
＊＊

・安田伸

・

＊，
＊＊

Chemical Synthesis of Acetaminophen O-Sulfate
Chihiro MORITA, Reoma TANIGUCHI, Mio YOSHIDA, Yuki TOKUNAGA, Hideki KINOSHITA,
Masateru ONO, Katsuhisa KUROGI, Yoichi SAKAKIBARA, Masahito SUIKO and Shin YASUDA（Received 14 December 2021；accepted 18 January 2022）
Abstract
Sulfation is a major metabolic pathway responsible for inactivation and excretion of xenobiotics including drugs, wherein
cytosolic sulfotransferases play an important role. However, it has not been fully elucidated whether these end products may
possess any physiological functions, due to the difﬁculty of obtaining sufﬁcient amounts of various sulfated metabolites. This
study was designed to investigate whether acetaminophen（N-acetyl-p-aminophenol; APAP）, an antipyretic analgesic drug,
can react with sulfuric acid upon an established method for tyrosine O-sulfate synthesis to generate APAP O-sulfate（APAP-S）.
APAP was selected because it has a simple monophenol structure like tyrosine and undergoes sulfation in the body. Results
demonstrated that 91.1 mg of the product was obtained as crystals from 1 g of APAP, therefore the calculated yield was 5.11%
1
under molar basis. H-NMR spectrum supported the product to be APAP-S. Moreover, a measuring of absorbance at the
maximum absorption wavelength in UV absorption spectrum proved that purity of the synthesized APAP-S was 97.0% incomparison with an authentic standard.（163 words）

名 paracetamol や p-acetamidophenol とも呼称され，一世

緒 言紀以上の使用実績を持つ世界で広く使用される解熱鎮痛

細胞質に存在する可溶性の硫酸転移酵素により触媒さ薬の 1 つである（7，8）．アスピリンや，他の非ステロれる硫酸化は，生体内ではステロイドホルモンや神経伝

イド性の抗炎症剤と比較して副作用が低いなどの利点が達物質であるカテコールアミン類の恒常性維持だけでなある．APAP はフェノール構造を有しており，主要な薬

く，生体外異物や薬物の不活性化ならびに排泄を担う主物代謝経路を経て40−67% がグルクロン酸抱合へ，20

要な薬物代謝反応経路の 1 つである（1 4）．しかしなが−46% が硫酸抱合へ，約5% がシトクロム P450によってら，薬物代謝後の硫酸体がしばらくは体内に残存し循環

N-acetyl-p-benzoquinone imine（NAPQI）を経てグルタチすることや，ヒドロキシアリルアミンなど一部の化合物

オン抱合へと代謝変換される（7）．これまでに高用量のが硫酸化によって代謝活性化される事例もあることから

APAP が反応性代謝産物とされる NAPQI を介して肝毒（5），硫酸化後の代謝物の生理機能に関する研究は不明

性や細胞機能障害を引き起こすことが報告されているな部分も多く残る（6）．現状では安価で十分量の硫酸化（9）．複数薬剤投与時の薬物間相互作用を調べた過去の代謝物の入手と続く代謝物研究が容易ではない場合も多報告では，APAP の硫酸化ならびにグルクロン酸抱合化

い．

の遅延をフェノバルビタールとその代謝物が引き起こす

Acetaminophen（N-acetyl-p-aminophenol；APAP） は 別＊

東海大学大学院農学研究科＊＊

東海大学農学部バイオサイエンス学科＊＊＊

宮崎大学農学部応用生物科学科＊＊＊＊

宮崎大学キャリアマネジメント機構

連絡先：安田伸こと（10），一方で投与条件によっては APAP 硫酸体

e-mail：shin.yasuda@agri.u-tokai.ac.jp
─ 39 ─

森田千紘・谷口玲央真・吉田実央・德永祐希・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田伸（acetaminophen O-sulfate；APAP-S）が APAP 自体の体内（20 mg/mL，5μL）の標品とともに回収した上清の濃縮分布を促進しうること（11），APAP とは異なり APAP-S

液（10μL）をスポットし，UV 照射下で反応産物を検のみがアンチピリンの血中濃度の低下と脳内への移行を出した．展開溶媒には n - ブチルアルコール：イソプロパ

助長する働きを示すこと（12）が報告されている．しかノール：ギ酸：水（ 3：1：1：1；Vol．）を用いた（14）．

しながら，試薬が高価なこともあり，これまで APAP-S

APAP-S 合成物を含む反応液を予めエバポレーターでそのものの機能的有用性や生物活性についてはあまり注

30 mL に濃縮後，これを Dowex 陽イオン交換樹脂カラ

目されてこなかった．そのため，簡便で安価に APAP-S

ム（10 mL 相当量）に負荷し，水で溶出させることによを有機合成することが可能となれば今後様々な機能性研り，3 mL ずつの Fr.1 − Fr. 15の15画分に分画した．TLC究に繋がると考えられる．

プレートに APAP（10 mg/mL，1μL）および APAP-S（20

そこで本研究では既存のチロシン硫酸体（tyrosine O

mg/mL，1μL）の標品とともに回収した各画分（ 1 μL）-sulfate）合成法（13）を利用して，APAP を濃硫酸と反をスポットし，UV 照射下で確認後，合成物を含む画分

応させることで APAP-S の合成と分離精製が可能かどうを回収して再度濃縮を行い，計 3 回の分離精製を繰り返かの検証を行うこととした．APAP はチロシン同様に単し行った．
APAP-S 様の合成物を含む画分（計 8 本）を混合し，純なモノフェノール構造を有し，体内では硫酸化される

約 1 mL に 濃 縮 し た． 既 報（13） に 従 い， こ れ にため選択した．

1 M KOH を少量ずつ加えて pH 5.0に調整し，10倍量のEtOH と石油エーテル（1：1）の混合液の添加によって材料および方法

合成物を析出させることで APAP-S の結晶をカリウム塩と し て 得 た．APAP-S 合 成 物 は， ろ 紙（ADVANTEC

試薬類
n - ブチルアルコール，イソプロパノール，88% ギ酸，
硫 酸，p-acetamidophenol（APAP）， 水 酸 化 バ リ ウ ム8水No.3，最大孔径 5 μm）とともに吸引ろ過後，凍結乾燥させた．

和物（Ba（OH），8 mol/L 水酸化カリウム（KOH）水2）
溶液はナカライテスク（京都）より購入した．エタノー
TM

各種機器による APAP-S 合成物の測定と真正性の検証

50W ×4 100−200

APAP-S 合成物の真正性を調べるため，プロトン核磁

mesh（H）cation exchange resin（Dowex）は和光純薬（大気共鳴分光法（ H-nuclear magnetic resonance spectroscopy；阪）より入手した．本研究では MilliQ グレードの水を

1

ル（EtOH），石油エーテル，Dowex

1

H-NMR）によるスペクトルの測定を行った． H-NMR
1

使 用 し た．APAP-S の 標 品 と し て 4-acetamionophen

は JEOL α500（日本電子）を用い，試料を重メタノール

sulfate potassium salt を Tronto Research Chemicals 社（ カに溶解後，内部標準にテトラメチルシラン（TMS）を使ナダ）より購入した．薄層クロマトグラフィー（thin

用し，ケミカルシフトはδ（ppm）スケールで表示した．

layer chromatography；TLC）

用の silica gel 60 F254

高速液体クロマトグラフィー（high-performance liquid
chromatography；HPLC）による APAP および APAP-S の（1.05554.0001）プレートは Merck 社より購入した．

分離と UV 検出は，0.1 mM となるよう予め調製した試
料溶液を用いて，既報（15）を一部改良して行った．

APAP-S の合成，分離精製および結晶化
本研究では，Jevons のチロシン硫酸体合成法に従った

HPLC システムには，日本分光製のフォトダイオードア（13）．濃硫酸 10 mL に 1 g の APAP を少量ずつ加え，ス

レイ検出器（MD-4010）を備えた LC-2000 PLUS シリー

ターラーを用いて撹拌しながら

5 ℃で40分間反応させズとクロマトグラフィーデータシステム（ChromNAV

た．次に砕氷（約 350 mL）と過剰量（約 130 g）の Ba

Ver.2） を 使 用 し た． 即 ち，YMC 社 製 ODS カ ラ ム（OH）
2 に反応液を注ぎ，pH が塩基性に傾くまで撹拌し（YMC-Pack ODS-A，内径4.6 mm x 150 mm，粒子径 3 μm，た．その後，大量に発生した硫酸バリウムを沈殿させて細孔径12 nm）を用いた逆相クロマトグラフィーによる取り除くため，2,500 xg で10分間遠心し，上清を回収しアイソクラティック溶離法により，移動相メタノール：

た．上清に CO2 ガスを吹き込むことで中和し，余剰の水を40：60とともに，温度30℃，注入量10μL，流速 0.7

Ba（OH）2 を炭酸バリウムとして析出させた後に上清をmL/min，波長 241 nm における UV 検出を行った．

回収した．市販の pH 試験紙を用いて pH を確認し，中APAP と APAP-S の UV 吸 収 ス ペ ク ト ル は，0.03 mg/

性になるまで本操作を 3 回程度繰り返した．次に，TLC

mL となるよう予め調製した試料溶液を用いて，石英セ

プ レ ー ト に APAP（10 mg/mL，5μL） お よ び APAP-S

ルとともに分光光度計（V-530，日本分光）により測定した．

─ 40 ─

Acetaminophen 硫酸体の合成
め，これらの Fr. 2 から Fr. 9 を回収して混合し，再度同その他の解析法
APAP-S 合成物のサルファターゼ処理は既報に基づき，条件で陽イオン交換カラムに負荷して２回目の分画を

sulfatase from Petella vulgata type IV（keyhole limpet）（シ

行った．その結果，Fr. 2 から Fr. 9 までに明確な APAP-S

グマアルドリッチ）を用いて行った（16）．APAP-S 合様のスポットを認めた（Fig. 2 B）．特に Fr. 2 から Fr. 5成物の融点測定は常法に従い，融点測定器（ATM-02，ア

までは APAP の混入も無く，純度の高い APAP-S 様の生ズワン）を用いて APAP-S 標品の融点との比較を行った．

成物のみの画分が得られた．生成物の収量を確保するた
め，APAP の混入が認められた本 Fr. 6から Fr. 9 のみを混合してさらに同条件で３回目の分画を行った．その結結果および考察果，Fr. 2 から Fr. 5 において APAP の混入が無い APAP-S

本研究は，既存のチロシン硫酸体合成法（13）を利様のスポットのみを認めた（Fig. 2 C）．以上より， 2 回

用して，APAP-S の合成と分離精製が可能かの検証を目と 3 回目の分画で得たこれら Fr. 2から Fr. 5までの画行ったものである．各種分析手技により，得られた合成

分には APAP の混入がほとんど無く，高純度の APAP-S

物の真正性についても調べることとした．

が分離精製されていると考えられた．チロシン硫酸体の合成を行った我々の先行実験では，本研究で用いたカラム条件の半分量でも一度に分離精製が可能であった

APAP-S の合成，分離精製および結晶化
濃硫酸10 mL に 1 g の APAP を少量ずつ加えて反応さ（data not shown）．そのため，分離精製の工程を簡便にせ，さらに Ba（OH）2 処理ならびに CO2 ガス処理によりするためにも，APAP-S に適したカラムボリュームの検中和後の反応液の上清を濃縮した．その一部を TLC に討が今後も必要である．

供した結果，APAP（Rf 値：0.917）のほかに APAP-S 様

分離精製後の APAP-S 様の合成物を含む計８本の画分（Rf 値：0.639）の反応生成物の明確なスポットを認めたを混合して濃縮し，KOH 存在下で過剰量の EtOH と石（Fig. 1）．

油エーテルにより APAP-S 様の生成物を析出させ結晶を次に Dowex 陽イオン交換樹脂を用いて APAP-S 様の得た．その結果，1 g の APAP から 91.1 mg の生成物が合成物の分離精製を行った．反応液をカラムに負荷後，得られ，モル換算で 5.11 % の収率を得ることができた．

水を溶離液として3 mL ずつ分取し，計15の溶出画分をなお，Jevons の報告では 2 g のチロシンから濃硫酸との得た．これらを TLC に供した結果，Fr. 2から Fr. 9まで

反応で 0.3 g のチロシン硫酸体を得ている（13）．これまにはっきりとした APAP-S 様のスポットを認めたもののでに，氷冷クロロホルムとピリジン溶液またはジメチル（Fig. 2 A），本実験条件のカラムボリュームでは，いずアニリン溶液と塩化スルホン酸を用いることにより，れの画分においても APAP の混入が認められた．そのた

α - およびβ - ナフトールや，クレゾールおよびアルキ
ルフェノール類などの目的とするフェノール性硫酸体エ
ステルの合成法（平均収率70 90%）や（17），二硫化炭
素と塩化スルホン酸を用いた p- ヒドロキシフェニルピ
ルビン酸（0.7 g）からの硫酸体合成法（収量400 mg）（18）が報告されている．また，セリルグリシンのケースでは 400 mg を 0.5 mL の濃硫酸と室温で５分間反応させることで 331 mg の O 硫酸体が得られている（19）．
そのため，硫酸を用いた硫酸体合成法は汎用性に優れる
とともに工程が簡便で化合物や反応条件によっては高収率が見込まれる有益な手技であると考えられる．また，適切な溶媒の選択と低温下での析出により，効率の良い
冷 却 結 晶 化 法 が 報 告 さ れ て い る（15）． 本 研 究 で は
EtOH と石油エーテルとともに室温下で析出を行っているため，収率向上のための溶媒選択や冷却下での結晶化

Fig. １． Thin-layer analysis of the synthesized APAP-S with authentic
standards of APAP and APAP-S. APAP was reacted withsulfuric acid for 40 minutes and neutralized with Ba（OH）2.
Detection was performed under UV irradiation at 254 nm .

を行うなど，今後も析出条件の検討を必要とする．

─ 41 ─

森田千紘・谷口玲央真・吉田実央・德永祐希・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田伸

Fig. ２． Thin-layer analysis of the synthesized APAP-S after 1st（A）, 2nd（B）and 3rd（C）times ofDowex column fractionations. Detection was performed under UV irradiation at 254 nm.
Spots with dotted and lined circles indicate those of APAP and APAP-S, respectively.

有し，合成物は APAP-S の標品と一致したスペクトルをAPAP-S 合成物の真正性の検証得られた生成物の真正性について検証を行った．

示した（Fig. 5）．このときの極大吸収波長における吸光Sulfatase 処理した結果，TLC 上で脱硫酸化された APAP

度より，標品（> 98%）を基準とした際に APAP-S 合成のスポットを認めた（data not shown）．次に H-NMR ス

物は97.0% の純度であることが判明した．

1

ペクトルの測定を行った結果，（i）p- 置換フェニル基由

我々はこれまでに硫酸化代謝物の機能性に注目してき来の４個のアロマティックプロトン［δ：7.49（d-like，ており，ナフトールを例に硫酸化代謝物の硫酸基の位置］および（ii） 1 個
J = 9.0 Hz），7.23（d-like，J = 9.0 Hz）

によっては不活性化されずに抗酸化活性を有する場合がのアセチル基由来のシグナル［δ：2.10（s）］が認めらあること（22），インドキシル硫酸がマクロファージのれた（Fig. 3，Table 1）．したがって，TLC で APAP と異酸化レベルの亢進と貪食能の低下を引き起こすこと（23，なる Rf 値を示すこと，sulfatase 処理により脱硫酸化さ24）を報告してきた．薬物代謝を通じて標的化合物の多1

れ う る こ と， お よ び H-NMR の 結 果 よ り， 生 成 物 は

くは代謝物として体内に存在しうるため，例えば硫酸化

APAP-S であることが示唆された（20，21）．

を介してどの程度の活性を保持しうるのかをケースバイ

次に APAP-S 合成物の純度について調べた．APAP-S

ケースで調査することは（6），薬物代謝後の化合物の生合成物は標品と同一の融点を示した（data not shown）．

理活性を理解する上でも重要である（25）．近年，APAP

HPLC による分離検出を行った結果，標品の APAP と由来の代謝物として N-acylphenolamine（AM404）によAPAP-S の溶出時間はそれぞれ3.34 min（Fig. 4 A）と1.80

る受容体を介した鎮痛作用や抗炎症作用が報告されていmin（Fig. 4 B）であり，合成物においては APAP-S 標品

る（8）．APAP-S が免疫性血小板減少症の患者の抗体反の溶出時間と一致する単一のピークを認めた（Fig. 4 C）．

応に感作する可能性や（26），APAP-S のラットへの経

UV 吸収スペクトルを測定した結果，APAP，APAP-S，

口投与後には25%（22 32%）が直接腸管より吸収され，

APAP-S 合成物いずれも 241 nm 付近に極大吸収波長を50% 以上（50 98%）が腸内細菌による脱硫酸化を経て─ 42 ─

Acetaminophen 硫酸体の合成

Fig. ３． H-NMR spectrum of the synthesized APAP-S（in deutrated methanol, 500 MHz）.
1

Table １． H-NMR spectral data of the synthesized APAP-S（in deuterated methanol, 500 MHz）
1

2, 6 or 3, 5
8

Chemical shift（ppm）

Coupling constant（Hz）

7.23 d-like（2H, d-like J=9.0 Hz（8.60 Hz））*

7.49 d-like（2H, d-like J=9.0 Hz（9.15 Hz））*

2.10 s（3H, s）｛

δ in ppm from TMS（coupling constants（J）in Hz are given in parentheses）．
s；singlet，d；doublet，d-like；doublet-like .
*Values were considered to be equal to the theoretical 9.0 Hz.

APAP として吸収され APAP-S へと代謝抱合されること手が容易ではない場合も多く，研究者ごとに個々の化合（27）が報告されている．しかしながら，APAP-S の生物について有機合成（35 37）や酵素化学的な手技に基理作用や薬効などに着目した研究例はほとんどない．一づく合成が行われている（31，32）．したがって，APAP

方，フラボノイドの硫酸化がその生物活性を低下させるのみならず様々な硫酸化代謝物の生理機能や有効性につだけでなく（28，29），硫酸化される位置によっては弱いて明らかにしていくためにも，包括的な硫酸体合成法

いながらも活性が維持される場合など（30 32），硫酸化の確立と導入，続く代謝物レベルでの機能性研究が急務される水酸基と生物活性との関連性についても注目が集である．

まっている（25，33，34）．現状では各種の硫酸体の入─ 43 ─

森田千紘・谷口玲央真・吉田実央・德永祐希・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田伸

Fig. ４． HPLC chromatograms of standards of APAP（A）and APAP-S（B）, and the synthesized APAP-S（C）．A 10- μL aliquot of 0.1 mM sample
each was applied to HPLC. Detection was performed at 241 nm. The retention times for APAP and APAP-S were 3.34 and 1.80 min, respectively.

Fig. ５．UV spectrum of the synthesized APAP-S with standards of APAP and APAP-S at 0.03 mg/mL ranging from 200 nm to 400 nm.

─ 44 ─

Acetaminophen 硫酸体の合成
in Human Drug Metabolism: From Molecular Biology to

まとめ

Man（Jeffery, E.H. ed.）, CRC Press, Boca Raton, pp.101

以 上 よ り， 既 存 の Tyr-S 合 成 法 を 利 用 し て，1 g の115.

APAP から 91.1 mg の APAP-S 様の生成物を結晶として3 ）Weinshilboum, R. and Otterness, D., 1994, Sulfotransferase

得ることができ，モル換算で 5.11% の収率を得た．続

enzymes. in Conjugation-Deconjugation Reactions in

く H-NMR および UV 吸収スペクトル等の真正性の検Drug Metabolism and Toxicity（Kaufmann, F.C. ed.）,証結果より，生成物が高純度の APAP-S であることが確

Springer-Verlag, Berlin, pp.45 78.

14 ）Suiko, M., Kurogi, K., Hashiguchi, T., Sakakibara, Y.

認できた．

and Liu, M.-C., 2017, Biosci. Biotechnol. Biochem. 81,
63 72.

謝 辞5 ）DeBaun, J.R., Smith, J.Y., Miller, E.C. and Miller, J.A.,
1970, Science 167, 184−186.

本研究の一部は，日本学術振興会 JSPS の科研費基盤
研究（C）（JP20K05881）の助成を受けて実施されたも

6 ）Yi, L., Dratter, J., Wang, C., Tunge, J.A. and Desaire, H.,
2006, Anal. Bioanal. Chem. 386, 666 674.

のです．

7 ）Jozwiak-Bebenista, M. and Nowak, Z.J., 2014, Acta Pol.
Pharm. 71, 11 23.

要 約8 ）Ohashi, N. and Kohno, T., 2020, Front. Pharmacol. 11,

硫酸化は生体外異物や薬物の不活化ならびに排泄を担580289. https://doi.org/10.3389/fphar.2020.580289

う主要な代謝経路の１つであり，細胞質に存在する可溶

9 ）Nagatome, M., Kondo, Y., Kadowaki, D., Saishyo, Y.,

性の硫酸転移酵素が重要な役割を担っている．しかしな

Irikura, M., Irie, T. and Ishitsuka, Y., 2018, Heliyon 4,

がら十分量の様々な硫酸化代謝物の入手が容易ではない

e00521. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2018.e00521

ことから，これら最終産物が有する生理機能の有無につ10）Studenberg, S.D. and Brouwer, K.L. 1993, J. Pharmacokinet.
Biopharm. 21, 175 194.

いては完全には明らかになっていない．そこで本研究では既存のチロシン硫酸体（tyrosine O-sulfate）合成法を11）Sawamoto, T., Kurosaki, Y., Sasaki, K., Kimura, T. and

利用して，解熱鎮痛薬である acetaminophen（N-acetyl-p-

Nakayama, T., 1997, Int. J. Pharm. 146, 181 191.

aminophenol；APAP） を 濃 硫 酸 と 反 応 さ せ る こ と で12）Ohkawa, Y., Kiyohara, Y., Asoh, T., Maeda, H., Kurumi,

APAP 硫 酸 体（acetaminophen O-sulfate；APAP-S） の 合

M., Sasaki, K., Kurosaki, Y., Matsumura, M. and成と分離精製が可能か検証を行った．APAP はチロシン

Nakayama, T., 2001, Biol. Pharm. Bull. 24, 1404−1410.

同様に単純なモノフェノール構造を有し，体内では硫酸13）Jevons, F.R., 1963, Biochem. J. 89, 621 624.

化されるため選択した．その結果，1 g の APAP から

14）Yamamoto, A., Liu, M.-Y., Kurogi, K., Sakakibara, Y.,

91.1 mg の生成物が結晶として得られ，モル換算で 5.11%

Saeki, Y., Suiko, M. and Liu, M.-C. 2015, Biochem. J.

の収率を得た． H-NMR スペクトル測定により APAP-S

158, 497 504.

1の各プロトンに由来するシグナルが認められ，生成物は15）Weber, C.C., Kulkarni, S.A., Kunov-Kruse, A.J., Rogers,

APAP-S であることが支持された．さらに UV 吸収スペ

R.D. and Myerson, A.S., 2015, Cryst. Growth Des. 15,

クトルの極大吸収波長における吸光度より，標品を基準

4946 4951.

とした際の APAP-S 生成物は 97.0% の純度であることが16）Yasuda, S., Idell, S. and Liu, M.-C., 2007, Biochem. J.
401, 497 503.

判明した．

17）Feigenbaum, J. and Neunberg, C.A., 1941, J. Am. Chem.
Soc. 63, 3529 3530.

引用文献18）Rose, F.A. and Powell, G.M., 1963, Biochem. J. 87, 541

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G.J. ed.）, Taylor and Francis, London, pp.107 161.
2 ）Falany, C.N. and Roth, J.A., 1993, Properties of human20）Nakayama, T., Sawamoto, T., Kurosaki, Y. and Kimura,cytosolic sulfotransferases involved in drug metabolism.
─ 45 ─

T., 1995, Int. J. Pharm. 121, 55 63.

森田千紘・谷口玲央真・吉田実央・德永祐希・木下英樹
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21）Winum, J.Y., Vullo, D., Casini, A., Montero, J.L.,
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237.
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─ 46 ─

Agric. Food Chem. 65, 6460 6466.

紀 要 委 員 会
委 員 長
委
員

川
邊
隆
大
米
田
一
成
松
本
大
和
ロドリゲス 八木美樹

EDITORIAL COMMITTEE OF PROCEEDINGS
Chairman

Takahiro Kawanabe

MemberKazunari Yoneda
Hirokazu Matsumoto
Miki Rodriguez-Yagi

Published by
School of Agriculture, Tokai University
9 1 1 Toroku, Higashi-ku, Kumamoto-shi, Kumamoto,862 8652, Japan

東 海 大 学 紀 要
第41巻

農 学 部

2 0 2 2

2022年３月22日発行
発 行 所

東海大学農学部〒862−8652 熊本県熊本市東区渡鹿９丁目−１−１
電話 096（382）−1141

印 刷 所

有限会社ベストプロセス〒861−8038 熊本県熊本市東区長嶺東８丁目13−17
電話 096（388）−0889

PROCEEDINGSOFSCHOOL OF AGRICULTURE
TOKAI UNIVERSITY
Vol. 412 0 2 2

Structural analysis and enzymatic characterization of extremely halophilic L-aspartate dehydrogenase……………………………………………………………… Kazunari Yoneda and Tomohiro Araki ……１
Teaching materials for enzyme chemistry experiments using indigo reductase……………………………………………… Kazunari Yoneda, misa Yoshioka, Hideji Yamashita,
Hiroshi Yamaguchi and Tomohiro Araki ……９The morphological characterization and fruit characters of Fortunella species…………………………………………………Kiichi Yasuda, Masaki Yahata and Hisato Kunitake ……17
Selection of useful SSR markers for genetic analysis of citrus using 4 Citrus and 5 Fortunella species
Kiichi Yasuda, Taiga Tomura, Mai Sato, Akiyoshi Tominaga
Masaki Yahata and Hisato Kunitake……29

Chemical Synthesis of Acetaminophen O-Sulfate……………… Chihiro Morita, Reoma Taniguchi, Mio Yoshida, Yuki Tokunaga, Hideki Kinoshita
Masateru Ono, Katsuhisa Kurogi, Yoichi Sakakibara, Masahito Suiko and Shin Yasuda ……39