さけ・ます資源管理センター

Bulletin Of the National Salmon
Resources Center, N0. 1: 29‑34

研究報告 第 l 号
l998 年 l2 月

December 1998

RT‑PCR と細胞 暗責法を組 自せた伝染性造血 器 壊死 症
ウイルス (lHNV) の検出
吉仲桃子 "

・堀

友花 。 ，本画 見 "・

河西 ― 彦 。 ・山本

鈴木邦雄 " ， 宇賀神 光男 " ・野村 哲 ― "。〒 04@‑86l@

・

吉水

淳"

守"

北海道函館市港 BT3‑1‑1 北海道大学水産学部微生物学講座

ね〒 399‑7102 長野県東筑摩 郡明科W2871 長野野県水産試験場* 〒 198‑0l05 東京都西多摩 郡奥多摩町 720 東京郡水産試験場 奥多摩分場， 4〒 401‑0S11

山梨県南都留 郡忍野村志 草 3098‑1

が 〒 360‑0023

埼玉県熊谷市佐谷 田 4044 埼玉県水産試験場熊谷支場，6〒 32l‑0902，7 〒 062‑0922

山梨県水産技術センター 忍野支所

栃木県宇都宮市柳田 1260 栃木県水産試験場

札幌市豊平 E 中の島 2‑2 水産庁さけ・ます 資源管理センター

Detection 0f Infectious Hematopoietic Necrosis Virus
Using RT‑PCR COmbined with Tissue Culture
TOko YOshinaka*', Yuuka HOri*',Akira MOtomshi*2,Kazuhiko Kasai*
AtSuShIYamamoto*4 ， Kunio SuZuki*5， MItSuo UgaZIn*6，
TetSuIChINomura*7 ， and MamoPu YOShImIZu 刹" 血 horato りび M 而obiolosy ， 凡 cu めげ Fi 仙 g ies ， ガ。
た ka@doUn れ iversiゅ，「Minato 3‑1‑1,Hakodate, HOkkaido 041‑8611, Japan
Nagano Prefectural FisheriesExperimentalStation,
Akashina,Higashichikuma, Nagano 399‑7102, Japan
Okutama

Branch, TOkyo Fisheries Experimental

Station,0kutama, Nishitama,TOkyo 198‑0105,Japan' Oshino Branch, Yamanashi

Fisheries Technology Center,

Oshin0,Minamitsuru, Yamanashi40l‑0511,Japan*F
Kumagaya Branch, Saitama Prefectural FisheriesExperimentalStation,
Kumagaya, Saitama,360‑0023, Japan
TOchigiPrefectural FisheriesExperimentalStation,
Utsunomiya,TOchigi 321‑0902, Japan
Research Division, National Salmon

Resources Center, Fisheries Agency 0/ Japan,

2‑2 Nakanoshima, TOyohira‑ku, Sapporo 062‑ 0922, Japan
Abstract.‑ Direct RT‑PCR,

tissue culture and

RT‑PCR

combinedwithtissue culture werecom‑pared for the IHNV inspection fn juvenile masu (Oncorhynchus masou) and sockeye salmon (0.
nerka). The detection rate 0r IHNV from artificially infected rainbow trout (0. mykiss) was also
compared by using tissue culture and RT‑PCR
combined with tissue culture. IHNV‑infectedsalmonid fish were detected highly using KT‑PCR
combined with tissue culture. This method
restrained inhibition 0f IHNV RNA extraction,because IHNV was replicated in the inoculated cells
and inhibition 0f IHNV RNA extraction was diluted.The RT‑PCR combined with tissue culture isa go0d method for the routine examination Of IHNV.
Key words: virus detection, IHN, IHNV, RT‑PCR
COntribution A N0. 3 from the National Salmon Resources
Center.

@ 1998 National Salmon Resources Center

29‑34 頁

30

ます資源管理センター
所報 Bul1.Natl. SalmonResourcesCenter,N0.

材料と方法

緒

一一一一口

イルス 性疾病として初めて 報告されて以来， カナダを含めた北米人陸はもちろん ，口 本でも l97@ 年にいし Y毎 @芭
1974 年以後， □ 本各地にその 発生域を広めた (YOShimiZu199 が．現在では台湾 (Chene[a@ ． l983@ ，フランス (Baudinetal ． 1987) ，イタリア(BOVOe[ 引 ． l987) ， ドイツ (EnZmannetM． 1992) ，その他のヨーロッパ 諸国 (0@esen andKMsholm
1997)に発生が認めら ナ L，においても発生がみられる．
この致死性の高い IHN の疾病対策は ，サケマス類の畔化放流手業および 養殖業において 重要な課題である ． IHN は主として稚仔魚 期に発生するため ， 採卵用

親魚が病原体を 保有していれ l切卜や精子を介し 僻化
後のほとんど 抵抗方を持たない 椎仔魚へ 垂直感染する． t989a) ．そのため親魚が 感染を受けているか否かの調査が重要であ る(吉水 ・野村 1989) ．

さらに順化 仔年、 の伝染性造血盟壊死 症 ウイルス

感染実験 供試魚 サクラマス発服卵をヨード剤で 消

毒後 (50ppm,10分間 )，北海道大学水産学部の 魚類隔離実験室内臓化槽に 収容 し 脱塩素処理水道水を 川
いて流水飼育し ， SPF(specificpathogenfree) 魚、 を得た． 膀嚢 吸収直後の浮上稚魚に 10 ，，TCID @。/nil のIHNVC.hAh
株 (YOshimizuetal.1989b) で 60 分間浸「漬攻撃した．攻撃開始後 17H 日に死亡が観察されはじめ，その時の稚魚 13 尾 (平均体重 0 47g) を本実験に供試した．なお， 供試魚は使用するまで ‑20L に凍結保存した．
核酸抽出法 感染発症した 3 尾の頭部と尾部を 取り除き，内臓部分 (背筋，背骨を 含む) を細切後 ，プー・

伝染性造血 器 壊死 症 LnfeCHouShematopoietiC
necrosis:IHN) はサケ利 魚類，特にべ 二ザケ，ニジマ
ス，マス ノスケ，アマゴ，サクラマス
等の主として 椎
佳 ．期に発生する
極めて致死性の 高いウイルス ， 性疾病であ る． 本疾病は 1953 年に RuCkereta@ ． (l95刃 によってアメリカ合衆国ワシントン 州におけるべ 二ザケのウ(YOShimiZueta@l, 1998

ルして I． 5ml のマイクロチューブに入れ， 5 肌 lの dena‑tuhngso@ution を加えてホモジナイズ した・このホモジ
ナ イズ液を再度denaturingsoIutionを用いて 10 ，まで
凹
惜希釈した． 各希釈液列から AGpC 法 (Y ぴhinaka 引
引 ． 1997b)
により RNA を抽出し， RT‑PCRのテンプレートとした．次に ， 10 尾の瀕死あ るいは死亡 佳、 を 2群に分け， 5 尾については 個体別に同様にして I(10倍希釈液から 尺 NA を抽出した．残りの 5 尾については 個
体別に RTE‑2 細胞を用いたウイルス 検査を実施した．
1997b) の方法に従なおRT‑PCR はYOshinakaeta@.

け HNV)
保有の有無はその 後の種哨 生産の成否を 左右するため，稚魚期の 健康チェックはきわめて 重要である ．従来，魚類のウイルス検査法 は魚類由来の 株化細胞を用いたウイルス 分離を基本に 行われてきた． しかし最終結果を 出すまでに約 1 ‑2 週間を要する (吉水TCIDJml1996). 1HNVに分け，―方は卵巣腔液で l0 。 まで M 培希釈し他方をはじめ析類のウイルス 病の多くはそのい行った．
卵巣腔液を用いたウイルス 検出法 1995 年 9 月に北海道内の河川に 湖上した， IHNV

険性のサクラマ ス から採取した卵巣 腔 液を用い，卵巣腔液450 かに M58の IHNvChAb

休を 50 小加えた・その 後 2 つ

進行が早く，結果が 出るまでに析が 全滅することが 起はdenaturIngsolutlon

こり得る．

た．両希釈液列から上述の AGPC 法により RNA を抽出， RT‑pCR のテンプレートとした．なお ，卵巣腔液を希釈に用いた 試料では円 0 川を， denatur@ngsoluHon
で希釈した試料は 全量を RNA の抽出に供した．同時に，卵巣腔液 による希釈 液列をそれぞれ 細胞培養 用 6
ウェルプレートに培養した RTE‑2 細砲 に接種 し l5L
で 30 時間培養 後 ，細胞から RNA を抽出し， RT‑PCRのテンプレートとした．
分離ウイルスの 鑑別 け95 年 9 月に北海道の 標津川lと伊茶イ二 @llに 遡上したサクラマスの 卵巣腔液から分離したウイルスと愛知県水産試験場内水面漁業研究所から検査を依頼された 体重 70g の二ジマスから分離さ九

そこで，短時間で 正確な診断が 可能となる方法の開発が 進められ，特異的なプライマーを 設定した polymerasechainreaction(PCR) 法といった遺伝子に来づく診断法が 開発されてきた (wlnton l991;
・

l994@

・

LOpeZ‑laS汀 aetal l994;NiShiZawae[al・しかし，現状ではギャ リアや感染初期の稚魚の検査にはウ
イルス量が少ない上に，核酸の 抽出阻宮があ るなどの問題があ り，有効な検査法の 開発ヵ 望ま している．
木研究では IHNV の確定診断に 血清学的検査法の 代
ナ

用として rcverSetranばrip血 n (RT) ‑PCR が利用可能
であ るか否かの検討 と ， IHNVの分離に最適な 細胞 である RTR‑2 細胞 (Yushinakaeta1． 1997 日での培養法とRT‑PCR

法を組合せることで ， THN 特有の症状を 呈していない感染魚 からも THNV を検出することを 目的に検討し，現時点での 迅速・簡便かっ 正確な THN 診断
への RT‑PCRの応用を試みた．

を用いて同様に l0‑ 。 まで希釈したウイルス (OV‑A ， B) の言十 3 株を 24 ウエルプレートに培養した RTE‑2 細胞に接種 し ， CPEの発現を確認 後 ，培養 卜清を取り除き，感染細胞を 回収して denaturing
SOluHon を 500 かね えてホモジナイズし，前述のAGPC
口法により RNAを抽出して，RT‑PCR

した．尺 T‑PCR

は前述の方法に 従った ．

のテンプレートと吉仲ら ― RT‑PCRと培養法による IHNV

31

の検出

培養細胞により 増殖させたウイルスの RT PCR による検出
・

2 OX105cells/ml の RTE‑2 糸田胞5mI を細胞培養 用 6 ウェ・ルプレートに 播き， 20@C で 24 時間培養した．培地を耳X り除き , multiplicityofin
忙ction (M.0 1.)=1.0および 0 I になるようにそれぞれ IHNVChAh
株を接種 し15C で I 時間吸着 後 ，培地を5mI ずつ加え， 15C で O ，12,24,36 時間培養した・ 所定時間後，培養液を 取り除き，感染細胞を Hanks'BSS で 2 回洗浄 し denatur‑ingsolution を 500u¥ 加えて ホモジナイズ した・ AGPC法により RNA の抽出を行い ， PCR のテンプレートと

510

・

・

M

Fig. 1. Agarose gel electrophoresis Of RT‑PCR amplification
products from homogenate
Of IHNV‑infectedmasu
salmon fry. Gel was stained with Ethidium Bromide. M,
DNA molecular weight marker; 1, fish homogenate; 2,dilutedt0''with homogenate buffer;3, dilutedt0'2with

した・なお，ウイルスの感染 価は 培養液と感染細胞の両方にっいて 50%

1

終末 点 法により測定し ，logTCID50@mlとして表した・
細胞培養 と RT‑PCR の組合せによるウイルス 検査
1997 年 7 月に北海道内で 飼育されたサクラマス 稚魚、homogenate buffer;4, diluted I0'3with homogenate
buffer; 5, diluted I0'4with homogenate buffer

32 尾 とべ二ザケ稚魚、 30 尾 ， 1997 年 12 月から 1998 年 I月にかけて北海道大学水産学部微生物研究室および 山

梨県，埼玉県，東京都，栃木県および長野県の 各水産試験場で実施した 平均体重 0 15g の二ジマス 椎焦、 500・尾に対する同居感染実験に 供した二ジマス 稚魚 計

713
553
500

I ， 174 尾について，細胞培養 と RT‑PCR
を組合せて
IHNV 感染の有無を 検査した． 2 ． OX105cells/ml に調製した RTE‑2 細胞を細胞培養 用 96 ウェルプレートに 播
き ， 20L で 24 時間培養した．それぞれの椎佳、 は 1‑2 mIの抗生物質入り 緩衝 液 (AntIInk:penICIIIIn‑G I ， 500
1 U /mI ， Streptomyc;n・I ， 500

・

Pg/mI ， mycoSta[In800

unMmI を含む HankS BaIanCed SaItSoIutIon) を添古口して ホモジナイズし I 晩 4L で静直後，あ らかじめ培養しておいた 96 ウェルプレートに 4 ウェルずつ接種した．
48 時間後， 各 サンプルについて 2 ウェルは RNA 抽出に ， 残りの 2 ウェルは CPE 観察とウイルス 分離に使用
・した・ CPE 観察は 10 日間行った． RNA 抽出用の 2 ウ
ェルは培養液を 取り除き， 200dTEbuffer
(0 2M

510

427

M

1

3
2

4

Fig. 2. Detection Of IHNV by from cells inoculated with thediluted virus by ovarian fluid Of masu salmon. Gel was
stained with Ethidium Bromide. M, DNA molecularweight marker; 1, diluted 10‑' (103 8 TCID50/ml) with the
Ovarian fluid; 2, diluted 10‑2 (1028 TCID50/ml) with the
Ovarian fluid;3, diluted 10‑3(10'@CID.@o/ml) with the
Ovarian fluid;4, diluted I0'4(lo@TCID.@/ml) with the
Ovarian fluid.

・

TrIS‑HcIpH8

・

3 ， 0 IMEDTA)

で細胞を懸濁 し ，

・

I． 5

mI マイクロチューブに 移した・ Dena[urIngSo1utIon を
500 川加えて，上述と 同様に AGPc 法で RNA を抽出した・抽出した RNA

をテンプレートとして IHNv

み ウイルス核酸の 増幅が認められたが ，他の4 尾 からは PCR 産物は得られなかった．同時に 培養法を用いて検査した結果は 全て陰性であ った ．

卵巣腔 液を用いたウイルス 検出法
巣 腔液に lo5 8TCID ， o/mI の IHNVChAb

口ヒ

RT‑PCRを行った結果とも 比較した．

結果

lHN 感染発症群からのウイルス 遺伝子の検出
IHNV 感染発症群のサクラマス 稚魚、3 尾の内臓を プー
ルしホモジナイズ した試料を RT‑PCR で調べた．内臓 ホモジナ イズ波の原液から IHNVj 貴 伝子は検出されなかったが， 10‑l,10‑2,10‑3希釈 液 から THrへ@v 遺伝子が検出された (Fig.1) 供 試した 5 尾のうち I 尾 からの
・

・

の RT‑

PCR を行い，増幅産物の確認、を行った． 1997 年 7 月の'/海道内のサクラマス 椎焦、 とべ二ザケ稚魚， 各 60 尾については，稚魚のホモジナ イズを直接 RNA 抽出し

IHNV

険性の卵

株を懸濁 し ，

10‑4まで卵巣 腔 液と denaturingsolution
で希釈した後，RNAを抽出して RT‑PCR を行った．卵巣腔液 で希釈、した場合は， 各 希釈 液 の 100 川から抽出を 行ったため，感染価は H5 に減少していたが ，いずれの希釈液 列からも PcR 産物は得られなかった― 方 ， denaturIng
SOIutjonを用いて希釈した 場合は， 10‑@希釈 液 ( ウイルス 染価は IO"'TcID ，。/mI) から PcR 産物が得られた ．
同時に，ウイルス 懸濁卵巣 腔 波の 各 希釈液を 100d 宛・

RTE‑2 細胞に接種 し 30 時間培養した 培養細胞から
RNA を抽出し， PcR を行った結果， 10‑2希釈 液 (102，
TcID ，。/mI) を接種したものまで PcR 産物が確認された (Fig.2)

所報 Bul1.Nat1.Salmon ResourcesCenter,N0.

さけ・ます資源管理センター

32

4

3307

・

・

・

36

Fig. 4. Yield Of cell free and cell associated IHNV(ChAb)
RTE‑2 cells.

with

ssue

combined

HOkkaido

32/32(100%)

18/32
(56%)

Yamanashi
Saitama
TOkyo

0/30

10/30

0/30

TOchigi(0%)( 33%)( 0%)

Nagano0/32*Number Ofpositivefish/number
0ffishexamined(percentage
0fpositive
fish)

Univ

in

田た
す>
巾
木︒
re)
us
n
e
with

韻
知汁
地
UW
而

an

culture*(0%)
SOckeye salmonf]e0

M 0.1‑0・

tissue culture*salmon□へ NLO L‑0I 。Pl@‑rP。C

RT‑PCR*

Masu

十 M.0.l‑1.0cpll

1, 1998

34/177(19%)*3/220 ( 1%)
7/220 ( 3%)9/220 ( 4%)4/220 ( 1%)
6/117 ( 5%)7/177 (3%)
0/220 (0%)
0/220 (0%)
0/220 (0%)
1/220 (0.4%)
1/220(0.4%)*Number 0fpositivefish/number
0ffishexamined(percentage
0fpositivefish)古仲ら― RT‑PCRと培 英法によるIHNV口? 尾中 6 尾 から IHNV

の 寸食出

33

遺伝子が検出された ．

しかし，の感染細胞からウイルス 核酸を抽出し ， PCRを行った

CPR が観察されたのは 栃木県と長野県の 各 I 尾のみでところ，10‑希釈液 CloHTCmIDii/ml)の卵巣腔液を接あ った．対照魚、 はすべて陰性であ った．

種した細胞からも PCR 産物が得られ ，検出感度が凹倍上昇した．この 結果は，卵巣 腔液中に存在していた
ウイルス核酸の抽出または PCR に対して阻害的に働く

考察

物質の作用が ， 甘 体成分を含まない 希釈 液で希釈されウイルス病の診断に PcR 法を応用しようと 検討が始まった当初， 病丘の組織内にウイルス 遺伝 L が l コピーでも存在すみLば，理論的に検出が 可能であ ることか
ら多くの試みがなきれ ， dsRNA

ウイルスであ る IPNV・(LOpeZ‑laS[raeta@ l994) などでは RNAの抽出が比較

的容易なこともあ り多くの研究成果が報告されている ．

しかし，IHNV に関してはその 多くが培養ウイルスから抽出したRNA を用いたもので， 病年の組織から直接RNA の抽出を行った 報 占は少なく， 1995 年になってChlouetal ．

(1995) や Droleletal. (1995) らが実験・感染させた未発症魚での IHNV 遺伝了の存在部位をPCR 法と蛍光抗体法を 用いて比較検討した 結果を報告しているにすぎない．
そこで本研究ではまず ， THNV 感染発咋群のサクラ
マス稚魚、を吋象に RT‑PCR 法による IHNV;買 f云 子の検出を試みた． 3 尾 プールの魚体ホモジナ イズ波の原液からは遺伝子増幅産物は 検出されず， 10・希釈液から検出された． このことは，魚体にウイルス 核酸の抽出または PCR に阻害的に働く物質が咋在し，原液ではウイルス核酸の 抽出ができなかったかあ るいは pCRの反応 阻菩が起きたと考えられる． このように，核酸の抽出または pCR に阻害的に働く物質の存在が 示唆されたことから ，ウイルス核酸を 抽出する場合，試料を希釈することによって 阻害物質の濃度を 下げる必要があると考えられる．
上記と同― 祥の サクラマス椎焦、 を各個体毎に ，培養法と RT‑PCR 法によるウイルス 検査を行い比較したところ，培養法では THNV はいずれの化体からも 分離されなかったが ， RT‑PCR

法で I尾から PCR

産物が得らたことにより抑えられ，さらに 培養細胞 で ウイルスが増殖したために 検出感度が上昇したと 考えられる ．

通常分離したウイルスは ，中和試験を 行い同走す
る．このステップを PCR法で代用できるかどうか，

CPF の発現を待って KT‑PCR
間で PCR 産物が得られ THNVを行ったところ ，約8 時
であ ると判定し得た． このことは，中和試験に 比べると同定に 要する時間の 短
縮の点で優れていると 考えら る．

次に，ウイルスが 少ない試料への 対応として，細菌の場合に低く 実施されている 増菌培養手法を行うことを考え，RTE‑2 細胞を用いて 測定したウイルス 感染価をもとに IHNV のf 殖量と RT‑PCR による検出時期との関係をf食言、r した．M ． O ． I．を0． l としてウイルスを接種した場合，培養 l2 時間後から RT‑PcR 法により IHNV
食出され，その時のウイルス感染価は l02， TCIDMml

カ朴

であ った．M ． O ． I．がI． 0 の場合は，感染直後から 検出，され，その時のウイルス 感染価は l025TCIDMml であ
った ．

また今回は

M ． O ． r．を 0 ． t として検討したが，0 ． 001 の場今も 24 時間後には， ウイルス感染価が 本

pCR 法の検出限界 10MTCIDMml(YOSh;nakactal

を越えることから． 1997a) ， ;犬キ牛 を接種後 I 日 培養すれば， RT‑PCR 法での検出が l・分可能であると考えられた．同時に検討した 蛍光抗体法の 結果では， M ． O ． I．がl． 0 の場合は 12 時間
0． l の場合は 24 時間後， M ． O ． I．が後から陽性とな :]，そのときの感染価は l0 。 0TCIDJm@であった (データは示していない)．このことは検査材
料を・度 RTR‑2 細胞に接種 し ，細胞内でウイルスを 増殖させた後に PCR 法で IHNV 遺伝子を検出すれば ，時間にして l 日を余分に要するのみで ，従来よりも 早くれ， 魚体;桝斗希釈液からの本 PCR 法による検出感度が正確に診断が 可能になると 考えられる ．

通常の培養法と 比べ低くないことが 示された．ただ ，腔液 試料など， ―部の試料では 細胞方性効果を 示す場

今回は魚休が 小さく， 同 ―個体の標的臓器を 画法で検合もあ り，この場合は細胞内でのウイルス 増殖も遅いと考えられ，ウイルス接種後の培養時間を 長くするな

査していないため ，直接的な比較はできなかった ．

次に，卵巣腔液 成分によるウイルス 核酸の抽出阻 吾について RT‑PCR
を用いて検討したところ ，卵巣腔液で希邪、 した場合，いずれの濃度の試料・からも
PcR 産物は得られなかったが ， d natuHnBso@ut10n で希釈した場
巳

合は， l0・ 希釈液から PCR 産物が得られたのウイルス感染 而は 10 ， nTCID7ml

・であ った．

いずれにしてもウイルス 核酸抽出の前段階に培養細胞でのウイルス 増殖を行うことは，RT‑PCR による THNV の検出法において 有利に倒く方法であ ることが示された．

そのときこの細胞培養 と RT‑PCR を組合せて行う 方法が有効

これはであ ることは @997 年 7 月に北海道内のサクラマス 惟
乍。 べ二ザケ稚魚の THNV 検査結果と l997年 l2 月から @998年 l 月にかけて北海道大学水産学部微生物研究

本研究で設定した RT‑PCR の検出限界 10l8TCIDJmlと比較して l/00 も検出感度が低く，卵巣腔液申にもウイルス核酸に 対して阻害的に 働く物質 ヵ叩;在していると考えられた ． 次に，卵巣腔液 で希釈したウイルス
液を RTR‑2 細胞に接種 し ，どの工夫が必要であ ろう．

しかし，卵巣15C で 30 時間培養してそ室，山梨県，埼玉県。
東京都， 帆木県および長野県の各水産試験場で 行った二ジマスの lHNV 感染試験に関連して， IHNV 攻撃 群 中の感染率を 求めるために 無作

さけ・ます資源管理センター
所報 Bul1.Natl.SalmonResourcesCenter,N0.
1. 199834

為に採取した 二ジマス稚魚、の検査結果をみても 明らか
であ る． ウイルス分離による 検査方法では THNV 陽性焦、 をかなり見落としてしまうとともに ，細胞に現れた変化を細 抱毒性かどうか 判定するために 継代が必要であ り， さらに THNV による細胞変性であ ることを確認するために血清学的検査 ヵ泌、 要となる ．

これに対して，細胞培養 と RT‑PCR を組合せた方法では ，培養細胞に検体を接種することで RNA の抽出阻害として 働く 物
賀が希釈されるとともに ，ウイルスが 存在すれば， その量が増加することでより RT‑PCR で検出しやすくな
る

Of IHN virus tn Germany. Bul1. Eur.
Ass. Fish PathoL, t2: 185.
LOpez‑1astra, M., M. GOnzalez, M. Jashes, and A. M.
Demonstration

Sandin0. 1994. A detection method
creatic necrosis virus (IPNV)

for infectious

based

0n

pan‑

tran‑

reversescription polymerase chain reaction (RT‑PCR). J. Fish
Dis., I7: 269‑282.
Nishizawa, T., K. MOri, and T. Nakai. 1994. POlymerase
chain reaction amplification 0f RNA 0r striped jacknervousvirus (SJNNV). Dis. Aquat. Org., I8: 103‑107.

・

このように，病角、 の診断* および分離ウイルスの 鑑別に PCR法の応用が可能と 亡 ったが，実際のウイルス 検

査において，多数の 試料を扱う場合には ，ルを RTE‑2 細胞に接種し1‑2て RT‑PCR

現段階ではを行う方法が ，―度 サンプ

口後に細胞を 回収し‑ 香早く ，簡便 ，確実に診断できる 方法と考えられた

0lesen N. J. and

H. KOrsholm.

1997. COntrol

measuresfor viral diseases fn aquaculture: eradication 0t VHS
and IHN. Bul1. Eur. Ass. Fish Patho1., I7: 229‑223.

Rucker. R. R. ,W. J. Whipple, J. R. Parvin, and C. A.
Evans. 1953. A contagious disease 0f salmon possibly
0f virus origin. Fish. Wild1. Serv., Fish. Bul1., 76: 35‑
46.

謝

辞

木研究は日本水産資源保護協会の 委託事業「海外悪性伝染病影響評価シミュレーションモデル 開発」によった． ここに記して深く感謝申し 上げる ．

引用文献

Winton, J. R. 1991. Recent advances in detection andcontrol 0f infectious hematopoietic necrosis virus inaquaculture. Annual Rev. FishDis., 1: 83‑93
YOshimizu, M. 1996. Disease problems Of salmomd fishin Japan caused by international trade. Rev. Sci. Off.
1nt.Epiz., I5: 533‑549.
吉水 守 1996 ．ウイルス学的検査法魚病 学概論 (室賀清邦InFrance. Bul1. Eur. Ass.

Fish

・

SurVivab，

M ．， M ． SamI

Shin, and G‑H.

Of infectious

occurenceKOu.

hematopoietic

1983.

necrosistn cultured rainbow trout (Salmo gaird‑neri) in Taiwan. Proceeding Or Republic Of China‑
Japan CO0perative

Science Seminar

O0

Fish

Diseases.

56‑58.

Chiou, P. P., B. S. Drolet, and J. C. Leong. 1995.
POlymerase chain amplification 0f infectious
hematopoietic necrosis virus RNA extracted fromfixed and embedded fish tissue. J. Aquatic Animal
Health, 7: 9‑15.
Drolet, B. S., P. P. Chiou, J. Heide1, and J. C. Leong.

viruses fn anadoromous

and

H.

J.

Schlotfeldt.

1992.

OfmasuandChum

．

l989a

．

た HC neCro

ぬssalmonJmasu

salmon (Onchorhynchus

Selection 0f a suitable cell line for isolation

hematopoietic

Wizigmann,

KimuraOf theinfectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) from
Ovarian fluid Of Japanese salmonid fish. Fish Patho1.,
32: 75‑80.
YOshinaka, T., M. YOshimizu, T. Sawabe, and Y. Ezura.
1997b.

2140‑2147.
Bnzmann, P. J., H. Dangshat, B. Feneis, D. Schmitt, G.

T．

hematopo

masou) fn the northern part 0f Japan, 1976‑1987.
Phsio1. Eco1. Japan, Spec., VO1. 1: 559‑576
YOshinaka, T., M. YOshimizu, and Y. Ezura. 1997a.

1995. Detection 0f truncated virus particles in a pre‑in viv0. J. Virology, 69:．

andAquatic Animal Health, 1: 13‑20.
YOshimizu, M., T. NOmura, T. Awakura, Y. Ezura. andT. Kimura. 1989b. Prevalence Of pathogenic fish

sistent RNA

virus infection，

山ty OfinfeCHouS

vIruS in fert1l1ZcdeggS

Chen. S‑N.. S‑C‑Chi, H‑H.
virus (THNV)

・

・

63.

生物検査 法． 焦、 と卵， 158:49‑59
YOShimiZu・

BOv0, G., G. Giorgetti, P. E. V. JOrgensen, and N. J.
0lesen. 1987. Infectious hematopoietic necrosis: firstdetection tn Italy.Bul1. Eur. Ass. Fish Patho1., 7: 62‑

pP.

江草周 二編 ) ，恒星社厚ヰ 閣，東京・pp

・

吉水守 ・野村哲 ―． N89 ．サケマス採卵 親魚の病原微Patho1., 7: 104.

The

144‑148

・

Baudin. F. L. 1987. IHN

Detection

andidentification Of infectious

necrosis virus (IHNV)

byreversetran‑

scription (RT)‑polymerase chain reaction (PCR). Fish.
Sci.,63: 592‑595.