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体内時計をリセットする食餌内容に関する研究＜平成 20 年度助成＞

体内時計をリセットする食餌内容に関する研究
柴田重信（早稲田大学先進理工学部、電気・情報生命工学科）

1.

緒

言に大きく影響することから、薬物投与の時刻を考慮する投薬方法「時間薬理」がある。また、食物体内時計研究は時計遺伝子の発見とそれに続や栄養の作用が摂取時刻によって影響されること

く、時計の発振や同調の分子機構の研究に重点がから、同じカロリーと栄養素成分も摂食時刻に置かれ、10 年あまりが経過した。その後体内時より肥満になったりならなかったりすることが分計の研究は応用研究の方向に進んでいる。時計遺かってきた。このように摂食の時刻を考慮する摂伝子は視交差上核の主時計としのみならず、海馬食方法を「時間栄養学」 と呼ぶ（図 1）。

4）や大脳皮質などでは脳時計として働き、さらに末梢臓器では末梢時計として機能することが分かってきた。したがって、体のそれぞれの場所で働いている時計の働きに関して注目が集まるようになってきた。このことはそれぞれの臓器で働いている体内時計に関わる疾患の研究とも相まって研究が進んできた。時計遺伝子の変異に基づく体内時計の不調や、シフトワークなどによる体内時計の不調が、種々の疾患やメタボリックシンドロー
ムにどのように関わるかにつての研究が行われてきた 1-3）。これらの研究は、体内時計の不調が種々の疾患のリスクファクターになり得ることを示すものである。体内時計に作用する薬物は、メラト
ニン、ベンゾジアゼピン、リチウムなどが知られ

図1

体内時計と食・栄養の相互関係ているが、体内時計に選択的な薬物などは開発さ

視交差上核依存性の体内時計は外界の周期的なれていない。体内時計の遺伝子発現系は、ハイス光刺激によってリセットされるが、視交差上核非ループットの評価系に適していることから、最近依存性の給餌性リズム時計は周期的な餌の提示では多くの化合物がスクリーニングされ、体内時計リセットされる4）。給餌性リズム時計は視交差上の発振周期を遅くする化合物や、速くする化合物

核依存性の時計より強力であり、脳の時計や末が見つかって来た。また、時間生物学としての体梢臓器の時計は給餌性リズム時計の位相に一致

内時計の生物学的研究のみならず、この学問分野

し 4）、このような食や栄養の作用を「体内時計作から派生してきた数々の学問分野も構築されつつ用栄養学」と呼ぶことにする（図 1）。したがってある。例えば薬物の作用する時刻が薬効や副作用

餌の内容によって時計のリセットのされ方が異な32

浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）ってくると思われるが、インビトロの実験系では時刻が、肥満や代謝関連遺伝子発現に与える影響化合物や栄養物の位相反応を見るのはかなり難しを調べる実験では、ICR の雄マウスを用い、生後い。また、化合物や栄養物が給餌性リズムのリセ

6 週令から実験を開始し、高脂肪食負荷を 2 ヶ月

ット効果として働いているのか、光と似た効果で間行った。動物飼育室は 8 : 00 点灯、20 : 00 消灯

リセット効果として働いたのかは分かりづらい。の明暗条件とし、時間生物学の慣例にしたがい、そこで、ex vivo の系で餌による体内時計のリセッ

8 : 00 を ZT0、20 : 00 を ZT12 と表し、このマウス

ト効果を効率的にスクリーニングできる系を立ちを ex vivo で観測しているときは、8 : 00 を pZT0、上げた。すなわち、Per2 :: luciferase のノックイ

20 : 00 を pZT12 と表した。

ンマウスを用い、餌を一定時刻に与えることによ

2.2

飼育飼料

り、肝臓の時計遺伝子発現リズムの位相が変化す

通常食は、オリエンタル酵母社の MEQ を用いることを ex vivo の実験系で評価する。次にこのた。また、高脂肪食は、通常食に 15％牛脂を混実験系を用いて、体内時計をリセットする栄養物餌し固めた餌を用いた。また飼料の栄養成分を変の成分評価を行った。

更する実験では、通常食は AIN-93M とした。また、次に時間栄養学的観点の実験をおこなった。すそれぞれの栄養成分を増減した飼料を用いた。さなわち餌を摂取する時刻に応じて、餌の持つ効果らにコーンスターチを他のスターチに置換する実が変化することを調べることで、例えば同じカロ験では、試薬特級のでん粉を用いた。

リーの餌を、1 日 1 回で与えた場合と、2 回で与2.3

体内時計遺伝子発現モニター系えた場合、また 2 回与えるときにその比率を変え

ホタルは発光酵素であるルシフェラーゼた場合などで、体重増加や、代謝関連遺伝子発現（luciferase）が 発 光 基 質 で あ る ル シ フ ェ リ ンがどのような影響を受けるかを調べることであ（luciferin）を酸化することによって自ら発光する。人でも、朝食を欠食した食事の取り方が肥満る。このシステムを遺伝子のリズム解析に応用し5-6）。マウスたのが、本研究で使用した実験系であるルミサイの実験では、以下のようなスケジュールの実験をクル（ActiMetrics 社）である。Per 2 -luc K.I. マウ行った。15％牛脂を含む餌を 1 日 3.6 ｇとし、（１）スは前述したように、Per 2 遺伝子にルシフェラー朝食、（２）夕食、（３）朝食３：夕食１、（４）朝食１：ゼが含まれるため、ルシフェリンを加える事によ夕食３の割合で与える。その後、経日的に約 2 ヶり、Per 2 遺伝子の発現リズムを発光リズムとし月間体重を測定し、最後に血液やそれぞれの臓器て観測する事が可能となる。しかし、実際の発光を摘出し、血糖値や臓器の遺伝子発現パターンをは人の目で観測できるレベルではないため、微弱調べた。

な光も感知する事が可能な、非常に高感度な光電を引き起こしやすいと言われている2.

材料および方法

2.1

動子増倍管（Photo multiplier tubes ; PMT）を用いた。ルミサイクルとはこの PMT を 4 つ備えたシ物ステムであり、培養組織が生存している限り、リ

肝 臓 の Per2 時 計 遺 伝 子 発 現 リ ズ ム を モ ニ

アルタイムなリズムの測定が可能である。本研究タ ー す る た め に、Per 2 :: luciferase マ ウ ス をでは、ZT3 にサンプリングされた末梢組織（肝臓）7）Takahashi のグループから入手した 。このマウをルミサイクルの設置された 37℃のインキュベー

スを ICR 系のマウスと交配させ、F1 世代を得て、ター内で培養し、Per 2 遺伝子の発現リズム（発光おもに雄を用いて実験を行った。一方、餌の投与リズム）を解析した。解析には、計測データ（RAW体内時計をリセットする食餌内容に関する研究

33

制限給餌（RF）データ）から 24 時間分の移動平均値を引くディト

2.5

レンド処理を行い、その後 2 時間分の移動平均値

一 般 的 に、 制 限 給 餌（Restricted Feeding ; RF）

8）で平滑化する平滑化処理を行う 。この波形デーとは、強制的に食事のできる時間帯を定め、そのタの発光値の peak 値を算出し、データを比較す時間帯以外は餌を与えないことであり、決められる。また、peak1 の値が前進したか後退したかをた時間帯のみ餌が提示される。先述した通り、餌評価の基準とした（位相の前進・後退）。

を与える時間帯によって、末梢組織の時計遺伝子

尚、Per2 -luc K.I. マウス肝臓の、培養された後の位相が変化することが知られており9）、主観的のルシフェラーゼ発光プロファイルは、サンプリ

昼（ZT0-12）の時間帯における RF では位相の前ング時の体内の Per2 遺伝子の位相をそれぞれ正進が起こる。

しく対応して表現しているか、サンプリングによ本研究では、位相前進効果が見やすく、同調しる何らかのショックによってリセットされているやすい、摂食行動を目で追いやすいなどの理由かのではないか、という問題に関しては、サンプリ

ら、ZT6 からの RF で実験を行っている。これは、ング時の ZT と peak 時刻は高い相関を示してお24 時間の絶食後（前日の ZT6 に餌を抜く）、次のり、この実験系が in vivo での Per2 遺伝子発現の日から ZT6 に餌を提示するというスケジュール位相をよく表現していることが分かっている。つである。マウスがコントロール食に順応させるまり、末梢組織培養における Per2-luc 発光プロフために、実験の 4 日前に標準食からコントロール

ァイルはサンプリングによる影響をほとんど受け（AIN-93M）食に切り替えた。コントロール食かず、サンプリング時のマウスの組織での Per 2 遺らの 24h 絶食の後に、ZT6 にタブレットを各マウ伝子発現の位相にほぼ正確に対応している。

スに給餌した。また、このスケジュールにおいて、2.4培地組成

餌の提示時間は提示されてから 4 時間とし、RF滅菌したミリ Q 水に 100ml に対し、Dulbecco’s後に、食糧消費量をチェックした。4 時間以内にModified Eagle Medium（GIBCO）1 . 34g、HEPES

ほとんどのマウスは完食したが、嗜好性によって（WAKO）238mg、カナマイシン硫酸塩（WAKO）完食しなかったものもいる。ZT10 までに食べき2mg、 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム（WAKO）23mg をれなかった餌は取り除き、残っている餌が 2 日目

入 れ、PH が 7 . 2 に な る よ う に 調 整 後、 濾 過 滅に 0.09g/10g BW（一日摂食量の 2SEM）以上のも菌した。滅菌したミリ Q 水 50ml に対し、アポのは実験に使用しなかった。

ト ラ ン ス フ ェ リ ン（SIGMA）100mg、 イ ン ス リ

2.6

餌の組成とタブレット調合方法ン（SIGMA）5mg、 ス ト レ プ ト シ ン 二 塩 酸 塩

標準食は FF 時に用いられている餌（オリエン（ALEXIS）16.1mg、400mM プ ロ ゲ ス テ ロ ン

タル酵母工業のマウス・ラット・ハムスター用飼（SIGMA）50 μ l、6mM 亜 セ レ ン 酸 ナ ト リ ウ ム料 MEQ）を用いた。制限給餌実験のために、卓上（SIGMA）5 μ l の用量で作成した。35mm 組織培

簡易錠剤成型機（HANDTAB-100 ; 市橋精機株式

養用 dish に、培地 1ml（20 ×サプリメント 0 . 5 μ会社）を使用することでマウス BW あたり 0.5 - 2gl、10mM D-luciferin sodium salt（in vitro）0 . 01 μのタブレットを調合し、マウスに与えた。コントl を含む）を入れ、組織培養を行った。また、緩衝

ロール食に用いたのは、AIN-93M 調整食（オリエ液はサンプリング組織を一時的に保存しておく目ンタル酵母工業社の株式会社、東京、日本 ; 構成 :的で使用された。

カゼイン 14%、L- シスチン 0 . 3%、αコーンスター
チ 15%、βコーンスターチ 47%、シュークロース

34

浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

10%、大豆油 4%、セルロース 5%、AIN-93 ミネトを作成し投与した。 また、2 日間 RF のスケ

ラル MIX 3 . 5%、AIN-93 ビタミン MIX1%、酒石ジュールにおいては、摂食量の多い順に肝臓の位酸水素コリン 0 . 25%、tert- ブチル基ヒドロキノン相が有意に前進していることが確認された。（F4,0 . 0008%）であり、米国国立栄養研究所（American32 = 12.3, P<0.01, one-way ANOVA）（図 2A）。

Institute of Nutrition, AIN）から発表された組成

RF 日数の検討が世界各国で広く使われているものである。

RF 日数検討のために 0 . 85g/10 g BW の餌を 4時間（ZT6-ZT10）の RF し、その期間を 1，2，4，3.

結果と考察

3.1

体内時計リセットの栄養素

14 日間設けた（図 2B）。その結果、肝臓の時計の位相前進には最低でも 2 日必要であり、４日間以上の RF によって位相前進の最大値に達すること

餌の量の検討先行研究において、4 時間の RF がマウス肝臓がわかった。これは、RF を４時間に設定し、14の時計遺伝子発現の位相前進に必要であると報告

日間経過したときの位相前進と同様の値を示してされている10-12)。そこで、Per2 :: luciferase miceいるからである。したがって、本実験では 2 日間（23 . 8 ± 0 . 8g N = 26）を 用 い、24h 絶 食 後、4 時の RF スケジュールを実験に採用した。

間の摂食量測定したところ、1 日目は 1.4 ± 0.11

AIN-93M をコントロールとして、それぞれのg/ マウス (0 . 60 ± 0 . 040 g/10 g 体重 [BW]）、2 日栄養物のパーセント構成を示す。各栄養成分を

目 は 2 . 0 ± 0 . 13 g/ マ ウ ス（0 . 85 ± 0 . 047 g/10 g

完全置換したタブレットを初日に 0 . 6 g/10g BW、BW）であった。したがって、以降全ての実験に24 - h 絶食後の 2 日目に 0 . 85g/10g BW の用量をおいて、マウスの体重に適した用量のタブレッRF した。 肝臓の時計は 100 %のコーンスターチ

図2

肝臓時計遺伝子発現リズムの給餌性リセットの給餌量の効果（A）と給餌回数の効果（B)

一回の給餌は 0.85g/BW で、給餌回数は 2 日以上必要である。括弧内の数値は使用マウス数

体内時計をリセットする食餌内容に関する研究

35（図 3B）で観察され、同様に、大豆油でも位相前意に前進させた（vs.100%グルコース P<0.05）（図進（図 3B）が観察されたが、有意差は認められな4B）。また、コントロール食（AIN-93M）（19.9 ±か っ た（vs. 2day fasting P>0.05）。100 % シ ュ ー1.2、N=5）と標準食（MEQ）（19.0 ± 0.8、N=5）をクロース、100%グルコース、および 100%カゼイ

与えているマウスの肝臓の位相を比較すると両間ンにおいては、位相前進を引き起こさなかったに差は見られなかった。したがって、本研究にお（P>0.05、fisher PLSD test）。100%グルコースもいてコントロール食は標準食と同等の働きを有す100%のフルクトースも位相前進を引き起こさなるものと考えた。

かったので、AIN-93M に含まれた他の栄養成分

ところで、上記で用いた摂食のプロトコールを混合することによって、初めて肝臓の時計の位は、人の健康を考えた場合矛盾する。通常餌を食相前進への糖の機能が働くことが示唆された。

べている時間を無理に夜食の時間帯に設定する条

また、4 . 5%ビタミンミネラル MIX と 95 . 5 %件になっている。したがって、炭水化物・カゼイのグルコース、5%セルロースと 95%グルコース、ンの組み合わせ食が夜食として良いと言うことに

また 4 %大豆油と 96%グルコースとのの組み合わなる。そこで次に、あらかじめ餌を明期の最初のせは位相前進を引き起こさなかった（vs. 100%グ

4 時間与えることにより、人で言うところの夜だ

ルコース P>0.05）（図 4B）。しかし、14%カゼイン

け餌を食べたことにする。このようなマウスを不と 86%グルコースの組み合わせは肝臓の位相を有摂生マウスと呼び、これに正常な時間帯である暗図3

AIN-93 の飼料をそれぞれの栄養素 100％に置換した栄養の肝臓リズムセット効果

A は AIN-93M の構成比を示す。B は実験結果を示す。それぞれの栄養成分 100％は、AIN-93M と同等の効果を示さない。

図4

グルコースと AIN-93M 飼料の配分比の栄養素に置換した飼料（100%）の肝臓リズムセット効果

A は実験プロトコールを示す。B は実験結果を示す。グルコースとカゼインの組み合わせは AIN-93M と類似した効果を示す。

36

浦上財団研究報告書

期のはじめに餌を 1 - 2 日間 2 - 4 ｇ与えると、与Vol.18（2011）3.2

高脂肪食の時間栄養学的効果

えた餌の量依存的に肝臓の体内時計の位相が元に1 日量が 3.6g となる 15％牛脂混合の MEQ 食もどる。この系の利点は、機能性食品を含んだ餌を以下の 5 条件で与えた。自由摂食群、朝食のが、効率的に体内時計の位相を元に戻すことを指み（0 : 4）、朝食と夕食（1 : 3）、朝食と夕食（3 : 1）、標にできる。また餌を与えない時（ピーク位相が及び夕食のみ（4 : 0）の５群である。ICR 雄マウス

8 - 9 時）に比較して餌を与えたときの位相（15 - 176 週令の実験開始時の体重をそろえ、その後の増時）が大きく後退し、自由摂食時のマウスとほと加率を調べた結果、体重増加は自由摂食群、夕んど変わらない（図 5）。すなわち感度が良い点も食のみ（4 : 0）群、朝食のみ（0 : 4）群、朝食と夕食優れている。実際そのようにして、餌の成分を変（1 : 3）群、朝食と夕食（3 : 1）群の順番に大きかっえて評価した。その結果、穀類のスターチは芋類た（図 6）。また、空腹時の血糖も、この順番に高のスターチより、体内時計の崩れを戻す効果が強かった。さらに内臓脂肪の量を測定した結果もこかった。の順番に大きかった（図７）。予備的実験段階であ

図5

夕から夜食による位相手異常マウス（不摂生マウス）に対する朝食によるリセット効果

A は実験プロトコールを示す。B は実験結果を示す。朝食の餌の量依存的に自由摂食のレベルまで戻す。

図6

それぞれの摂食パターン別の体重変化

ZT0 : ZT12 の比を表す。朝食のみ（0：4）、朝食と夕食（1：3）、朝食と夕食（3：1）、及び夕食のみ（4：0）の 4 群。
FF（HFD）は高脂肪食の自由摂取群を表す。右側のカラムはそれぞれの摂食パターン別の有意差検定である。まず 1
日 1 食より、1 日 2 食の群が、体重増加が抑制される。1 日 2 食でも、1 日 1 食でも、朝食が多い方が体重増加が抑制される。

37

体内時計をリセットする食餌内容に関する研究

るが、肝臓の Ppar αの遺伝子発現量やホルモン食と夕食の量比が 1 : 3 と比較すると、前者はほと感受性リパーゼ（HSL）を調べたところ、この順んど夕食だけのグループに近かった。すなわち、番に低かった（図８）。これの結果は、夕食のみの朝食はある程度必要であり、0 . 5 と 1 の間に大きグループでは少なくとも肝臓で、脂肪酸酸化の促な隔たりがあることから、0 . 5 に相当する部分を、進作用がある Ppar αの遺伝子発現量が低下し、機能性を持たせた食事にすることにより、肥満防また脂肪分解 HSL の遺伝子発現が低下し、脂肪止をすることが可能であると考えられる。時間栄蓄積が起こり、肥満が起こったものと考えられる。

養学的な視点の研究は今始まったばかりであり、

ちなみにこれら 4 群の運動量には大差がなく、ま（１）食餌の栄養素のバランスを変えた場合の効果

た夜間と昼間の活動量比の違いも体重には反映さの違い、本当に朝食にタンパク質含量の多い食事れなかった。すなわち、活動量や活動パターンのをとれば、体重増加が阻止できるのかといった研違いにより、このような差が現れたとは考えにく究。
（２）朝食時に同時に、PPAR αや、 PPAR γい。また、朝食と夕食の量比を 0 . 5 : 3 . 5 とし、朝のアゴニスト作用を有する化合物をあたえると

図7それぞれの摂食パターン別の内蔵脂肪もしくは全体脂肪

ZT0 : ZT12 の比を表す。朝食のみ（0：4）、朝食と夕食（1：3）、朝食と夕食（3：1）、及び夕食のみ（4：0）の 4 群。ND は正常食を、HFD は高脂肪食を表す。FF は自由摂食群を表す。まず、高脂肪の FF 群が一番内蔵脂肪がつきやすい。朝食と夕食（1：3）や朝食と夕食（3：1）が明らかに脂肪の増大が抑制されている。

図8

それぞれの朝食パターン別の朝（ZT12）及び夕（ZT0）の肝臓の Ppar α、Hs1 遺伝子発現

ZT0 : ZT12 の比を表す。朝食のみ（0：4）、朝食と夕食（1：3）、朝食と夕食（3：1）、及び夕食のみ（4：0）の 4 群。右側のカラムはそれぞれの摂食パターン別の 1 日の遺伝子発現。朝食と夕食（1：3）が明らかにZT0, ZT12 のいずれの時刻でも遺伝子発現が高く、このことが、肥満防止に役立っているものと考えられる。

13,14）、

38

浦上財団研究報告書

時間栄養学的な効果が現れやすいのかなどを検討する必要がある。（３）先に述べたように天然化合物で体内時計をリセットする可能性がある物があるが、これらの中で、朝食に同時投与で、体重低下作用が認められるようであれば、これらの化合物を朝に投与すれば、体内時計の位相を前にもってくると同時に肥満予防になる。実際肥満者の食生活は乱れ、特に夜に食餌のウエイトが高い人が多いので、このような人がターゲットになり得る。
謝辞
本研究を遂行する上で、多大な研究助成金を賜りました浦上食品・食文化振興財団に心より感謝の意を表します。また、本研究の成果は、下記の論文に一部発表済みである。
(1) Hirao A, Tahara Y, Kimura I, Shibata S. A balanced
diet is necessary for proper entrainment signalsof the mouse liver clock. PLoS One. 2009 Sep
7;4(9) : e6909.
(2) Hirao A, Nagahama H, Tsuboi T, Hirao M, Tahara
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文献

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13) 飯田加賀美、永井和夫、萬 済泰、核内受容体リガンド活性を示す天然化合物、『生物機能開発研究所紀要』、９，55-61, (2009)Research of food and nutrition contents on feeding-induced reset of circadian rhythm in mice

Research of food and nutrition contents on feeding-induced
reset of circadian rhythm in mice
Shigenobu Shibata
Department of Pharmacology, School of Advanced Scienceand engineering, Waseda University
The rotation of the earth around its axis causes 24 h changes in environmental
conditions including temperature, food availability, light, and darkness. In addition,seasonal changes in the length of day occur as a consequence of the earth orbiting thesun. In order to cope with and anticipate these changes, most organisms throughout theplant and animal kingdom possess a circadian timing system. The peripheral circadianclock in mice is entrained not only by light-dark cycles but also by daily restricted feedingschedules. Behavioral and cell culture experiments suggest an increase in glucose levelas a factor in such feeding-induced entrainment. For application of feeding-inducedentrainment in humans, nutrient content and dietary variations should be considered. To
elucidate the food composition necessary for dietary entrainment, we examined whether
complete or partial substitution of dietary nutrients affected phase shifts in liver clocksof mice. Compared with fasting mice or ad libitum fed mice, the liver bioluminescencerhythm advanced by 3-4 h on the middle day in Per2::luciferase knock-in mice that wereadministered a standard mouse diet, i.e. AIN-93M formula [0.6 - 0.85 g/10 g mouse BW](composition: 14% casein, 47% cornstarch, 15% gelatinized cornstarch, 10% sugar,
4% soybean oil, and 10% other [fiber, vitamins, minerals, etc.]), for 2 days. When eachnutrient was tested alone (100% nutrient), an insignificant weak phase advance wasfound to be induced by cornstarch and soybean oil, but almost no phase advance was
induced by gelatinized cornstarch, high-amylose cornstarch, glucose, sucrose, or casein. Acombination of glucose and casein without oil, vitamin, or fiber caused a significant phaseadvance. When cornstarch in AIN-93M was substituted with glucose, sucrose, fructose,
polydextrose, high-amylose cornstarch, or gelatinized cornstarch, the amplitude of phaseadvance paralleled the increase in blood glucose concentration. Our results strongly suggest
the following: (1) balanced diets containing carbohydrates/sugars and proteins are good for
restricted feeding-induced entrainment of the peripheral circadian clock and (2) a balanced
diet that increases blood glucose, but not by sugar alone, is suitable for entrainment. Thesefindings may assist in the development of dietary recommendations for on-board meals
served to air travelers and shift workers to reduce jet lag-like symptoms. Feeding habits bsuch as breakfast skipping causes the obesity in humans and mice suggesting that one meal
per day (breakfast or dinner) or two meals per day (big breakfast or big dinner) may affectbody weight and energy metabolism. In the present experiment, we found big breakfast
with small dinner could protect high fat containing food-induced obesity. (body weightgain and visceral fat).

39