23．大阪府におけるパレコウイルス A3 型遺伝子の分子進化に関する研究〇中田 恵子 （地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所）
本村 和嗣 （地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所）【研究目的】
近年、ヒトパレコウイルス 3 型（HPeV-3）感染は乳幼児で敗血症、髄膜脳炎、死亡等、成人でも筋痛症を引き起こすことが明らかとなり、再興感染症として注目を集めている。しかし、HPeV-3 感染症を対象としたサーベイランスは実施されておらず、そのウイルス遺伝子変異に関する基礎的な情報が少ない。
そこで、本研究では近縁のウイルスであるエンテロウイルス（EV）感染症のサーベイランスを目的に収集した検体に対し、後方視的に解析行い、HPeV-3 遺伝子の進化と抗原性の変化を明らかにする。
【研究の必要性】
HPeV-3 は、ピコルナウイルス科に属し、1 本のプラス鎖RNAをゲノムとして持つ。流行時期や呼吸器症状や胃腸炎症状を引き起こす点で類似するため、同じ科のEV属に分類されていた。しかし、ゲノム構造が異なることが明らかとなり、1999 年に独立した属となった1）。2004 年以降、HPeV-3 が乳幼児で敗血症、髄膜脳炎、死亡等の原因となること、特に生後 3 か月未満の新生児で重症化する傾向があることが報告された2)3)4)。さらに 2007 年以降、国内で成人に筋痛症を引き起すことが報告されている5)6)。これらのことから、HPeV-3 感染症は小児科領域のみならず、成人神経科領域においても再興感染症として脚光を浴びている。しかし、HPeV-3 型感染症のサーベイランスは国内では実施されておらず、流行ごとのウイルスの遺伝子変異には不明な点が多い。さらに、ウイルス分離が容易ではないた
め、HPeV-3 の全長ゲノム解析の情報は非常に少ない。流行ごとにHPeV-3 の中和エピトープ(Viralprotein 1: VP1)領域の塩基配列の変異から抗原性の変化を把握すること、また、分離株の全長ゲノム解析を実施することでウイルスの病原性や流行に寄与する変異を明らかすることは、未だ不明な点が多いHPeV-3 感染症の病態解明の一助となる。
【研究計画】
HPeV-3 感染症患者では、発疹、発熱、無菌性髄膜炎等といった EV 感染症と類似する症状を呈することがある。そのため、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律（感染症法）で定められた EV 感染症（手足口病、ヘルパンギーナおよび無菌性髄膜炎）疑患者検体の一部から HPeV-3が散発的に検出されてきた。しかし、HPeV-3 がそれらの疾患の主原因となるとは考えられてこなかったため系統的には調査されてこなかった。我々は、2010 年以降、感染症法に基づき収集された EV 感染症疑い検体、約 2000 検体を保有している。それらの検体に対し、後方視的に HPeV-3 遺伝子を検出し、中和エピトープである VP1 領域の塩基配列に対し分子系統樹解析およびエントロピー解析を実施する。また、HPeV-3 は分離培養が容易ではないため、複数の流行期に分離された HPeV-3 の全長ゲノム情報を解析することは困難であった。しかし、我々は複数の培養細胞を用いて継代を繰り返すことによって、複数の流行期に得られた分離した株を保有している。それらのウイルス株に対し、次世代シーケンサーを用いた全長ゲノム解析を実施する。得られた塩基配列からアミノ酸の立体構造を解析することで変異を受けやすい場所を推測する。
【実施内容・結果】
2010 年 4 月より 2019 年 3 月までに得られたEV感染症疑患者由来検体（抽出核酸検体として凍結保存）を用いて、Realtime-RT-PCR7)でパレコウイルスに対するスクリーニングを実施した。陽性検体に対して、ヒトパレコウイルスVP1 領域をNested-RT-PCR8)9)で増幅し、ダイレクトシーケンスで塩基配列を決定した。得られた塩基配列に対し、近隣接合法を用いて分子系統樹解析を実施した。多様性解析には、Shannonのエントロピー解析法を用い10）、各座位における、アミノ酸(20 種類)の出現頻度の和を計算し、0.8 以上を多様性があると判定した。
上述の期間にRD-A、VeroE6、FL、Caco-2 細胞を用いてウイルス分離培養を実施し、得られた分離株からEVであったものを除いて、ヒトパレコウイルスVP1 領域をNested-RT-PCR9)で増幅した。増幅産物に対し、ダイレクトシーケンスを実施し、HPeV-3 と型別された株について次世代シーケンサーを用いた全長ゲノム解析を行った。
期間中に得られた 2664 検体のうち 113 検体がパレコウイルススクリーニング陽性となった。そのう
ち HPeV-3 の VP1 領域が増幅できたのは 73 検体であった。VP1 領域(677nt)の系統樹解析の結果、2018年度の一部の株を除いて、2013 年度以前と 2014 年度以降の検出株の 2 つのクラスターに分かれた。
それぞれのクラスターには複数の年から検出された株が混在し、全ての株で大きな塩基配列の変化は認められなかった（図 1）。アミノ酸の多様性解析の結果、VP1 蛋白質領域において、ほぼ保存されていることがわかった。 しかし、エントロピースコアが 0.8 以上の箇所が、C 末領域に 3 か所検出された（図 2）。
HPeV-3 の分離株は 2014 年度に 2 株、2016 年度に 8 株、2017 年度に 2 株、2018 年度に 2 株、合計14 株得られた。
これらの分離株よりウイルス RNA を抽出し、ライブラリーDNA を作成した後に illumina
社の Miseq を用いて全長ゲノム解析を実施した。アッセンブリは Filgen 社の CLC Genomic Workbenchを用いて Map to Reference 法で実施し、全ての株でほぼ全長塩基配列が得られた。得られた塩基配列
より PyMOL を用いて、ウイルスの構造蛋白質をコードする領域である VP0-VP3-VP1 の立体構造解析を実施した結果、VP0 では 30、272、274、VP3 では 143、VP1 では 231、215 番目（図内赤色で表示）の残基に変異が集積していた（図 3）。
【考察と今後の課題】
我が国では、HPeV-3 の近縁のウイルスであるEVが主原因とされる手足口病、ヘルパンギーナおよび無菌性髄膜炎はサーベイランスの対象とされている。それらのEV感染症疑いの患者検体からHPeV-3 遺伝子が検出され報告されることから、感染症法に基づいた発生動向調査事業で収集された病原体検出情報から間接的にHPeV-3 感染症の流行が把握されてきた。また、サーベイランス対象疾患以外にも新生児の死亡を含む低年齢層の重症化4）や筋痛症のようにHPeV-3 感染症に特徴的と思われる患者が0.02
Ljungan_virus_strain_AF327921
201616075HPeV-3VP1
LC383410Yamagata2016
2016274 HPeV-3 VP1
201627HPeV-3 VP1
201616033HPeV-3 VP1
201616076HPeV-3 VP1
201616077HPeV-3 VP1
201620HPeV-3 VP1
2016N40HPeV-3 VP1
2016N404HPeV-3 VP1
201638HPeV-3 VP1
2016N40HPeV-3 VP1
LC416089Yamagatas2017
201802HPeV-3VP1
2016200HPeV-3 VP1
2016N402HPeV-3 VP1
2016N403HPeV-3VP1
MF371335KOR2015
2019103HPeV-3VP1
20191030HPeV-3VP1
2019102HPeV-3VP1
2016359HPeV-3VP1
LC259196Yokohama2016
2016N43HPeV-3VP1
2016N428HPeV-3VP1
2016N392-1HPeV-3VP1
2016N392-2HPeV-3VP1
2016N391HPeV-3VP1
2016N399HPeV-3VP1
2016N390HPeV-3VP1
201634HPeV-3VP1
2016341HPeV-3VP1
201619HPeV-3VP1
804 20160197HPeV-3VP1
20161048HPeV-3VP1
201731HPeV-3VP1
201731HPeV-3VP1
LC259194Yokohama2016201731HPeV-3VP1
MF371334KOR2015
2016230HpeV-3VP1
20181010HPeV-3VP1
KU885060UK2011
LC027477Niigata2014
2014150HPeV-3VP1
LC133423Yokohama2014
2014136HPeV-3VP1
2014124HPeV-3VP1
860
2014047HPeV-3VP1
2014129HPeV-3VP1
2014093HPeV-3VP1
2014083HPeV-3VP1
2014104HPeV-3VP1
9502014105HPeV-3VP1
20141034HPeV-3VP1
2014126HPeV-3VP1
2014181HPeV-3VP1
2014187HPeV-3VP1
2014188HPeV-3VP1
2014186HPeV-3VP1
2014102HPeV-3VP1
2014073HPeV-3VP1
2014026HPeV-3VP1
966 2014024HPeV-3VP1
2014164HPeV-3VP1
2014069HPeV-3VP1
1000
2014/ 222HPeV-3VP1
992 2014/ N221HPeV-3VP1
2014/ N220HPeV-3VP1
2014/ N219HpeV-3VP1
2014108HpeV-3VP1
2014110HPeV-3VP1
LC062410Niigata2000
LC129271Yamagata2003
902
1000
2018150HPeV-3VP1
2018130HPeV-3VP1
FJ648758Thai2005
KU885009UK2011
JF919624USA2009
JQ229439FRANCE2009
2011283HpeV-3VP1
2013097HPeV-3VP1
901
2011282HPeV-3VP1
2011338HPeV-3VP1
LC133412Yokohama.JPN2011
AB759180Yamagata2011
2011212HPeV-3VP1
2011167HPeV-3VP1
2011381HPeV-3VP1
MH094172Thai2015
2011431HPeV-3VP1HPeV-1VP-1緑； 2011年度株
青； 2013年度株
赤； 2014年度株
紫； 2016年度株
黄緑； 2017年度株
黄； 2018年度株
茶； 2019年度株

1000

エン ト ロ ピ ー

図1.大阪府で検出されたHPeV-3のVP1(677nt)領域の分子系統樹

ア ミ ノ 酸残基の位置

図2.大阪府で検出されたHPeV-3型VP1多様性（73検体）

VP0:30

VP0:272,274

VP3:143
VP1:213,215（PDB: 5apm.pdb)
図3.パレコウイルス3型のVP0-VP3-VP1の構造報告5)6)されることから、疫学情報の解析が進められている。しかし、HPeV-3 は分離が容易ではないことや 2004 年に初めて報告11)された比較的新しく認知されたウイルスでることから、ウイルスの分子進化に関する情報が限られていた。
HPeV-3 はゲノムを一本鎖 RNA として持つウイルスであるため、VP1 領域の塩基配列は変化に富むと予想された。しかし、分子系統樹解析の結果では、約 10 年間に渡って塩基配列レベルでは大きな変異の蓄積は認められず、二つに大きく分かれたクラスター内にはそれぞれ複数の年度に検出された株が混在していた（図 1）。しかし、アミノ酸レベルでは C 末端領域にエントロピースコアが高い座位が 3 か所存在したことから（図 2）、中和抗体の選択圧を受けて変異をする箇所は限局していると考えられた。
また、分離株を用いた全長ゲノム解析を実施し、VP1 領域を含めて抗体との相互関係があると考えられるカプシドタンパク質の構造解析の結果、VP0-VP3-VP1 領域に変異が蓄積している座位が複数認められた（図 3）。これらの変異箇所は、抗体との直接的な相互関係が推測されることから、抗原エピトープ領域の一部の可能性がある。本結果は、未だ存在しない HPeV-3 の治療薬やワクチンの開発への足掛かりとなる可能性があると考えられた。
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【経費使途明細】
使途金額

消耗品費（オートクレーブ用バケツ、1000μL ロングフィルターチッ
プ 交換プレート、核酸抽出チップ・チップフォルダーセット）

50,000 円

解析委託費（NGS MiSeq v3 600 Cycle）

250,000 円

合計

大同生命厚生事業団助成金

300,000 円
300,000 円