抗酸化性 と乳化性を兼備 したアスコルビン酸脂肪酸エステルの大量合成とその性質

21

抗酸 化性 と乳化性 を兼 備 した アス コルビ ン酸 脂肪 酸
エ ス テル の大量合 成 とそ の性 質

安1.はじ め

達修二(京 都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻)

2.酵に

素法 に よるア スコル ビン酸脂 肪酸 エステ
ルの 大量合成

水溶性 ビ タミンで ある アスコル ビン酸(ビ タミンC)は還 元力 を もつ ため,抗 酸化剤 な どと して

2.1撹

拝槽 型反応 器に よる半連続 合成

種 々の食 品に添 加 されてい る。アス コル ビン酸 に

アセ トンな どの有機溶媒 に対す るア スコル ビン

脂 肪酸 などの疎 水基 を導入す る と,分 子内 に親水酸の 溶解 度は高 くない。 しか し,脂 肪酸 を付加 し基 と疎水 基 をもつ界面 活性 な物質 とな り,乳 化性たエ ステ ルは比較 的高い濃 度で溶 解す る。そ こで,を発揮す る と思 われ る。

固 定化 リパー ゼ(3.Og:乾燥 重量)を 含 む撹絆また,ア ス コル ビン酸 は液状油脂 には ほとん ど

槽型 反応器 に粉状 のアス コルビ ン酸 を加 え,そ こ

溶 けな いが,疎 水基 を導入 する ことに より油 溶性に アセ トンに溶解 した脂肪 酸を 所定流量 で供給 し,を示す よう になる と期 待 される。 さらに,ア ス コ生成 した アス コルビ ン酸脂 肪酸 エステ ルを同一流

ルビ ン酸 のエ ンジ オール基 以外の位 置に導 入すれ

量 で抜 き出す 操作 につ いて検 討 した(図1内ば,還 元 能は維 持 される と考え られる。 したが っ反応 器内 の液量 は350mLで,反て,ア スコ ルビ ン酸 に脂肪酸 を付加 した アス コルの ア ス コル ビ ン酸 を投 入 した 。供 給す る脂 肪酸ビ ン酸脂 肪酸 エステ ルは抗酸 化性 と乳化性 を兼備(濃度:200mmol/L)の図)。

応開 始時 に40g

種類 を変 えて,2.OmL/した食 品添加物 と して使用 で きる可 能性が あ り,化学合 成法 によ りステア リン酸やパ ル ミチ ン酸 を付 加 したアス コル ビ ン酸脂 肪酸エ ステルが 市販 されてい る。
本課 題で は,有 機 溶媒 中での酵素 反応 によ りアス コルビ ン酸のC6位に位 置選択 的 に各種 の脂肪酸 を縮 合 した アス コル ビン酸脂肪酸 エス テルの 合成に着 目 し,そ れ らの大量 調製法 につ いて検討 した。
なお,生 成物 は食 品へ の使用 を想定 して,溶 媒はア セ トンに限定 した。 また,合 成 したアス コルビン酸 脂肪酸 エス テルの諸 性質 につい ても検討 した。

図1連続撹拝槽型反応器 によるアスコルビン酸脂肪酸エステルの半連続合成【。 アスコルビ ン酸(口)ラウリン酸,(○)デ カン酸および(△)ミリスチ ン酸エステル,内 図:装 置図。1脂 肪酸のアセ トン溶液貯槽,2ポ ンプ,② 撹拝槽型反応器,4固定化 リパーゼを保持 したバスケッ ト,⑤ アスコル ビン酸を投入するための蓋,⑥ 恒温水槽,② マグネチ ックス ターラ,8流品液貯槽。

22

1甫卜.則fir]石11%L幸艮告 善}VoL12(2004)

minの 流 量(平 均 滞留 時 間:175min)で半 連続操作 を行 っ た。 なお,反 応は50℃ で 行っ た。 この間,約10g・日の アス コル ビン酸 が脂 肪酸に 変換 され,ま たアセ トンに溶 解 した未反応 のア スコル ビン酸が約10g/日の割 合で 反応器か ら流出 したの で,毎 日20gのアス コル ビン酸 粉末 を補給した 。図1に 示す よ うに,実 験 を行 った11日 間にわ たって安 定に操 作す るこ とが で き,酵 素の 失活は認 め られなか った。本操 作 におけ る生 産性 は,生成 物の 分子 量 に も依 存す るが,約57g/1!反応図2ア

器 ・日であ った。
2.2固定層 型反応 器 を用い た効率 的 な生産 システ ム

50℃ にお けるア スコル ビン酸 のアセ トンへの 溶解 度は25.8mmol/Lでスコルビン酸粉末 を充填 したカラムと固定化 リパーゼ充填カラムを連結した固定層型反応器システムによる各種アスコ
ルビン酸脂肪酸エ ステ ルの連続合成ぬ アスコルビン酸 〔○)アラキ ドン酸,(二)オ レイン酸,(◇)リ ノール酸,〔△1デカン酸,〔▽)ラウリン酸,ゆ ・〉ミリスチ ン酸エステル.内 図:
装置図一ユ脂肪酸のアセ トン溶液貯槽,2ポ ンプ.3r一 熱コイル,圭 アスコルビン酸粉末充填カラム,5固 定化 リパーゼ充填カラム,豆 流 出液貯槽,Z空 気恒温槽ある。 付 加す る 脂肪 酸 の分子 量 に よる が,例 えば ラ ウリ ン酸(分 子 量:作 した。 本装置 を用 いてア スコル ビン酸 に各種の200.32)を 反応率70%で縮 合す るこ とが で きれ ば,不飽和 または飽 和脂肪 酸を縮 合 して対 応す るエ ス

生成物 濃 度は6.5g/Lとな る。この値 は高 くは なテル を合成 したと きの,反 応 器出口 での生 成物濃いが,極 端 に低 くもない。 また,触 媒で ある酵素度を図2に 示す 。不飽和 脂肪酸 エス テルの濃 度がの濃 度に比 例 して 反応速 度は速 くなる。 固定化酵

低 い の は,使 用 した 不飽 和脂 肪 酸の 純 度が95%

素 を用 い る場 合,も っ とも酵 素濃 度の高 い状態 は,程度で あった ためで あ り,脂 肪 酸の種 類 に依 存せ

固定層 に充填 した場 合で ある。 また,反 応速度 とずほぼ一 定の反 応率が 維持 された。 これ らの生成

基質濃 度の 関係が上 に凸 となる一般 的な酵 素反 応

物 濃 度は,1.6〜1.9kg/L一

では,反 応 工学的 には固定 層型 反応器が もっ とも対 応 し,上 記 の撹拝槽 型反応器 を用 いた場合 の約効率 が よい。 そこで,図2の反応器 ・日の生 産性 に

内図 に示す よ うに'>1, 30倍 の高い生 産性 を達成 した。

粉 末 状 の ア ス コ ル ビ ン酸 を充 填 し た カ ラ ム(10mmi.d.×150mm)と固定 化酵素 充填 カ ラム(4.6mmi.d.×150mm)を連結 して,ア スコ ルビン酸脂 肪酸 エステ ルを連続 的に合 成する システ ム

3.ア
3.1水スコル ビン酸脂 肪酸エ ステル の諸性 質および油 脂に対 する溶解 度

ア スコル ビン酸は水 には よ く溶解す るが,油 にを構築 した 。すな わち,ア セ トンに溶解 した脂肪はほ とん ど溶 けない。 アス コルビ ン酸 に脂肪 酸 を酸(濃 度:200mmol/L)を

ア ス コル ビ ン酸 充填

付 加す る と油溶 性が付 与 され るが,水 への溶 解度カ ラムに供給 して アス コルビ ン酸 が飽和 溶解度 近は低下す る と思 われ る。そ こで,ア シル鎖長 の異くまで溶解 した溶液 を固定 化 リパ ーゼ充填 カ ラム

なる各種 アス コル ビン酸飽和脂 肪酸 エステ ルの水に供給 して縮 合反応 を行 い,対 応 するア スコ ルビ

および大 豆油へ の溶解 度を温 度の関数 と して測定

ン酸 脂肪 酸エ ス テル を合成 した。流量 は0.5mL/した(図3)P。

min(反ア スコ ル ビン酸 は大 豆 油 にmmol/Lの応器 の空塔 滞留時 間:5min),50℃で操脂 肪酸 を付加 す る こ とに よ り,オ ー ダー

抗酸 化 性 と乳化 性 を兼 備 した ア スコ ル ビン酸 脂肪 酸 エ ステ ルの 大 最合成 とその性 質

図3ア

23

スコルビン酸飽和脂肪酸エステルの水お よび大豆油への溶
解度の温 度依存性1、 ア スコルビン酸(○,●)デ カン酸(:.■)ラ ウリン酸,(△.▲)ミ リスチン酸,(▽)パ ルミチン酸.(◇)ス テアリン酸エ ステル、白抜 きと黒塗 りはそれぞ
れk豆 油および水への溶解度、で溶解す る ように な り,ア シル鎖長 の影響 は顕著
ではなか った。 一方,水 へ の溶解度 はア シル鎖長に大 きく依存 し,ア シル鎖長 が長 いほ ど溶 解 し難か った。 各ア スコル ビ ン酸脂 肪酸エ ステ ルの水および大豆 油への 溶解 度の温 度依存性 は,い ずれ もvan'tHoffの 式 で整理 す るこ とがで き,水 へ の溶

図4各

種アスコルビン酸飽和 脂肪酸エ ステ ルの水溶液の(a)濃度と表面張力の関係,お よび(b)臨 界 ミセ ル濃度と界面占
有面積のアシル鎖長依存性,(a)ア スコルビン酸(⊃)ヘ キサン酸,(○}オ クタン酸(△)デ カン酸(◇)ラ ウ リン酸エステル。(b)(●)臨 界 ミセル濃度,(○)界 面占有面積=

解 エ ンタル ピー △Hd;、は アシ ル鎖 長 にかか わ らず
90kJ/molであ り,ま た大 豆油へ の △Hdi、もア シル鎖に依 存せず20kJ/molで3.2乳レン基 当 りの エ ネル ギー は1.3×10‑21Jと算出あった。

され た。一 方,界 面占有面 積は アス コルビ ン酸脂化 剤 としての 基本的 な性 質肪酸 エ ステルの種 類に依 存せず,ほ ぼ 一定の0.30

各種の アス コル ビン酸飽和 脂肪酸 エステ ルの乳nm2で あ った。 この値 は,ア ス コル ビン酸分子 が化 剤 としての基 本的 な性質 の一つ として,水 溶液
系 にお ける各エ ステ ルの濃 度と表面 張力の 関係 を

球 形 で あ る と 仮 定 して 算 出 した 断 面 積(1.,nm‑)よ り小 さ く,ア ス コル ビ ン酸 の γ一ラ ク ト

測 定 した。これ らは以 前に,回 分式 反応器 を用いン環 が親水 基 となって いるこ とを示唆す る。て合成 したエ ステ ル を用いてWilhelmy法
測 定(25℃)しによ りた結 果3}であ るが,基 本的 な性質

3.30/W型

エマル シ ョンの 調製へ の利用

アス コルビ ン酸飽 和脂肪 酸エ ステルが 乳化剤 とで あるの で,こ こで記 述す る。各 アス コルビ ン酸して使用 できる ことを検証 する ために,各 種 アシ

脂 肪酸エ ステ ル水 溶液 の表面 張力 は濃 度の上 昇 とル鎖 長の アス コルビ ン酸飽 和脂肪 酸エ ステル を用と もに低 下 し,明 確 な臨 界 ミセル 濃度(CMC)

い て大豆 油 を油 相 とするO/W型が 認め られ た(図4(a))。CMCは調製 した4】。 また,調 製 したエ マ ルシ ョンの安 定

長 い ほど低 く,CMCの例 し(図4(b)),ア

ア シル鎖 長が対数値 は アシ ル鎖 に反比性 に及 ぼす水相pHのエ マ ルシ ョンを影響 につい て も検 討 した。

ス コル ビ ン酸 飽和 脂 肪 酸エ

なお,エ マ ル シ ョンは,ロ ー タ/ス テ ー タ式 ホモ

ステル を水 相か ら ミセル相 に移動 させ る際 のメチ

ジナイザ で乳化 したの ち,さ らに高圧 ホモ ジナイ

24

浦上 財 団研 究報 告 書VoLl2(2004)

図6ア

図5ア

シル鎖長の異なる各種アスコルビン酸飽和脂肪酸エ ステ ルを用いて調 製したOW型
エマルシ ョン中の油滴の メデ ィアン径とエステル濃 度の関係1、 アスコルビン酸(⊃ オクタン酸,(△)デ カ ン酸,(○)ラ ウリン酸,(◇}ミ リスチ ン酸,(▽)パルミチ ン酸エステル。内図:ア スコルビン酸脂肪酸エ
ステルの濃度が0.5mmolkgで調製したエマルシ ョン中の油滴 のメディア ン径に及ぼすエステルのアシル鎖長の影響。

ス コ ル ビ ン酸 デ カ ン 酸 エ ス テ ル の40℃.pH=(○}2.
(◇)3.(:)4.(△)J.(▽)6.([〉)7,([〉)8お(◎9にお け る分 解 過 程1.エの安 定性 につ いて検 討 した5}。アス コル ビ ン酸 デカン酸エ ステル の40℃,pH=2〜9でザ(約98MPa)で微細 化す る方法 に よ り調製 しを図6に 示す。pH=3での安定 性

もっ と も安 定 であ り,た。 種 々のアス コル ビン酸飽和 脂肪酸 エス テル濃

そ れよ り低 い または高 いpHで度 で調製 したエマ ル ショ ン中 の油滴の メデ ィア ン

また,pHニ9で径 を図5に 示す。 また,0.5mmol/kgの

きなか ったが,pH=6以エ ステルよびス テ ル の 濃 度 は い ず れ のpHにお い て も2.0×10‑'molL,は不 安定 にな った。

はエ ス テルの加 水分 解が 無視 で下で は加水 分解 は起 こ

濃 度で調 製 した エマル シ ョンの油滴の メデ ィア ンらなか っ た。 い ずれ のpHに径 とアス コル ビン酸飽和 脂肪酸 エス テルの アシル

Weibull式 で表 現す る ことが で きた 。 また,ア シ

鎖 長の関 係を図5の 内 図に示 す。ア スコル ビン酸

ル鎖 長が6,8,10まパ ル ミチ ン酸エ ステル を除い て,油 滴 の メディア肪酸 エス テルのpH=5でン径 が1.0〜1.5μmの微細 な エマ ル シ ョ ンを調定性 につ いて検討 した ところ,高 温ほ ど不安定 で,製 で きるこ とが示 され た。 また,各 種 アス コル ビ

分解 速度定 数の温 度依存性 はいず れのエ ステ ルにン酸飽和脂 肪酸 エステ ルを用 いて調製 したエ マ ル

つ い て もArrhenius式

シ ョンは,水 相のpHが高 いほ ど安定 であ った。

スコル ビ ン酸 脂肪 酸 エス テル の分解 過程(pH=

これ は,水 相 のpHが高 い ほ ど油滴 の 表 面電 位5)に はエ ン タル ピー ・エ ン トロ ピー補償 効果 が(ζ一電位)が 大 きな負 の値 になる ことに起 因す ることが示 され た。これ らの検討 か ら,微 細 で安定

お ける 分解 過 程 もたは12の アス コル ビン酸 脂
種々の温 度 におけ る安で整 理 で きた。 また,ア成立 する ことが示 され た。
3。5培 養動 物細胞 に対す る抗酸化 性

エマ ルシ ョ ンを調 製す る には,ア ス コ

アス コルビ ン酸 は還元 力を もち抗酸化 剤 と して

ルビ ン酸 のデ カン酸 または ラウ リン酸 エス テルが作 用する。 アス コル ビン酸 を付加 した 多価不飽 和

適 してい るこ とが示 された。

脂肪 酸は酸 化に対 して極 めて安 定にな る ことを明な0/W型

3.4水溶 液中で の安定性

らか にして いた6.r1。そ こで,ア ス コル ビ ン酸 脂

アス コル ビン酸 は不 安定で酸 化分解 な どを受 ける。 また,エ ステ ルは高pHで加 水分解 され易い。

そ こで,ア ス コル ビン酸脂肪酸 エ ステルの水 系で肪酸 エス テル を食用に供 する ことを想 定 して,小腸 上皮様 に分化 した培 養細胞(Caco‑2)を用 いて細 胞 に対す る酸化 抑 制効 果 につ いて 検討 した。

抗酸化性 と乳化性を兼備 したアスコルビン酸脂肪酸エステルの大量合成とその性質

2514)ア シル鎖長 の異 なる各種 アスコ ルビ ン酸飽
和脂肪 酸エ ステル水 溶液の臨 界 ミセ ル濃度および界 面占有 面積 を測定 した。
(5)各 種 アス コル ビン酸 飽和脂 肪酸エ ステ ルが0/W型

エマ ル シ ョンの調製 に使 用で き ることを検 証 した。
(6)各 種 アス コル ビン酸飽和脂 肪酸エ ステ ルの水系 での安 定性 に及ぼ すpHお

よ び温 度 の影

響 を明 らか に した。
図7鎖長 の 異 な る 各 種 ア ス コ ル ビ ン酸 脂 肪 酸 エ ステ ルのCaco‑2(7)ア ス コルビ ン酸飽 和脂肪酸 エス テルは培 養培 養 細 胞 に 対 す る 酸 化 抑 制 効 果8。Positivecontrol(P.C.)はア ス コル ビ ン 酸 ま た は ア ス コル ビ ン酸 脂 肪酸 エ ス テ ル を 加
蛍光プロ

細胞 の酸化 も効果 的に抑制 する ことを明 らか

Caco‑2培 養 細胞 に 種 々の ア シル鎖 長の ア ス コル

これ らの基礎 的 な成 果を もとに,食 品への 応用

えな か っ た 場 合,またnegativecontrol(NC.)はー ブ の み を 負 荷 し た場 合 を示 す 。に した。

ビ ン酸飽 和脂 肪酸エ ス テルを接触 させた のち洗 浄につい てさ らに検討す る必要が ある。 一例 として,し,硫 酸鉄 で酸化 を誘導 した ときの酸化 の程度 を既 に粉末 化油脂 への応 用につ いて検討 し,脂 質に蛍光 プ ロー ブを用 いて 評価 した8)。アス コル ビ ン

対す る酸 化抑制 効果 はア シル鎖 長に大 きく依 存す

酸脂肪 酸エ ステ ルは遊離 のアス コル ビン酸 に比 べ

るこ とを明 らか に してい る9)。今 後 も応 用の ためて高 い抗酸 化性 を示 し,こ とにアス コルビ ン酸 ミの基礎 的な検討 を行 い,各 種 アス コルビ ン酸 脂肪

リスチ ン酸 エステ ルが優 れて いた(図7)。

酸エ ステルの食 品添加 剤 としての機 能を明 らか にして行 きた い。

4.おわり に謝有 機溶媒 中での 固定化 リパ ーゼ を用 いた縮 合反辞

応 によ りアス コルビ ン酸 脂肪酸 エス テルの連続 生

本研 究課題 に対 して こ助 成を賜 りま した財団法

産 および生 成物 の諸性 質につ いて検討 し,以 下の人浦上 食品 ・食文化 振興財 団に深甚 の謝意 を表 し成果 を得 た。

ます。

(1)掩 絆 槽型反 応器 を用い て半連続 的に アス コ
ル ビン酸脂肪 酸エ ステ ルを合成す る方法 を提文出 した。

1)Watanabe.Y.,Kuwabara,K.,Adachi,S.,Nakanishi,K.,(2)固 定 層 型 反応 器 を用 い て1,6〜1,9kg/L一

献andNlatsuno.R.:ProductionofsaturatedacylL‑ascorbate
byim‑mobilizedlipaseusingacontinuousstirredtank

反応 器 ・日とい う高 い生 産性 でアス コ ルビ ン酸脂肪 酸エ ステ ルを連続 的に合 成す るシス テ
ム を確 立 した。

reactor.J.Agric.FoodChem.,51,4628‑4632(2003).
2)Kuwabara.K.,Watanabe,Y.,Adachi,S..Nakanishi,K.,
andMatsuno,R.:ContinuousProductionofacyl(3)合 成 した各種 アス コルビ ン酸 脂肪酸 エス テ

L‑ascorbatesusingapacked‑bedreactorwithimmobilized
lipase.J.Am.OilChem.Soc..80,895‑899(2003).

ル の水お よび大豆 油 に対 する溶 解度 を測定 し,大 豆油 には 約lmmol/kgのことを明 らか にした。

濃 度で 溶解 す る3)Watanabe.Y.,Adachi.S.,Fujii,T.,Nakanishi,K.,and
Matsuno.R.:Surfaceactivityof6‑0‑hexanoyl,octanoyl,
decanoylanddodecanoylascorbates.JapanJ.FoodEng.,2,26浦 上財 団研 究 報告 書Vo1.12(2004)

73‑75(2001).
4)Kuwabara.K,,Watanabe.Y.,Adachi.S.,Nakanishi.K.
andMatsuno,R.:Emulsifierpropertiesofsaturatedacyl
L‑ascorbatesforpreparationofO/Wemulsions.Food
Chem..82.191‑194(2003).
5)Kuwabara,K.,Watanabe.Y..Adachi,S..andMatsuno.
R.:StabilityofsaturatedacylL‑ascorbatesinaqueoussolution.submittedtoJ.FoodSci.
6)Watanabe,Y.,Adachi,S..Nakanishi,K..Shimada,Y.,andLipase‑catalyzedsynthesisofunsaturatedacylL‑ascorbate
anditsabilitytosuppresstheautoxidationofpolyun‑
saturatedfattyacid.J.Am.OilChem.Soc..78.823‑826(2001).
8)Kimura.Y.,Kanatani.H.,Shima,M.,Adachi.S.,andMatsuno,R.:Anti‑oxidantactivityofacylascorbatesininterstinalepithelialcells.Biotechnol.Lett..2a,1723‑1727(2003).
9)Watanabe,Y.,Fang.X.,Minemoto,Y.,Adachi.S.,and

Matsuno.R.:Lipase‑catalyzedsynthesisof

Matsuno.R.:Suppressiveeffectofsaturatedacyl

6‑0‑eicosapentaenoylL‑ascorbateinacetoneandits

L‑ascorbateontheoxidationoflinoleicacidencapsulatedautoxidation.Biotechnol.Lett.,22,637‑640(2000).

withmaltodextrinorgumarabicbyspray‑drying.J.Agric.

7)Watanabe,Y.,Adachi,S..Nakanishi,K,.andMatsuno.R.:

FoodChem.,50,3984‑3987(2002).

ContinuousSynthesisofAcylAscorbateswithAntioxidativeand
27

EmulsifyingAbilitiesandTheirProperties

ContinuousSynthesisofAcylAscorbateswithAntioxidativeand
EmulsifyingAbilitiesandTheirProperties

ShujiAdachi(DivisionofFoodScienceandBiotechnology.GraduateSchoolofAgriculture.KyotoUniv
TwosystemswereproposedforcontinuouslyproducingL‑ascorbateswithvariousacyl
chainsthroughimmobilized‑lipase‑catalyzedcondensationinacetone.Onesystemwas
constructedusingacontinuousstirredtankreactor,andtheotherusingaplug‑flowreactor.
Inthelatersystem,ahighproductivityof1.6to1.9kg/L‑reactor/daywasrealized.The
introductionofacylgroupintoascorbicacidsignificantlyincreasedintheoilsolubility.The
surfaceactivity,emulsifierabilityandstabilityinwaterofvariousacylascorbateswere
measured.Antioxidativeabilityoftheascorbatestoepithelialcellswasalsoestimated.
Theseresultsshowedthattheacylascorbateswerepromisingfoodadditivespossessing
boththeantioxidativeandemulsifyingabilities.