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食品製造施設へのリステリアの定着に寄与するバイオフィルムの解析＜平成 20 年度助成＞

食品製造施設へのリステリアの定着に寄与するバイオフィルムの解析
中（大阪市立環境科学研究所

1.

はじめに村寛海微生物保健担当）

解析結果から、各製造元に特有の菌株が存在する可能性が示唆された 1）。そこで、スモークサーモ

Listeria monocytogenes（ リステリア）は、食品ン製造施設におけるリステリア汚染源調査を行っを介してヒトにリステリア症を引き起こす、食品た結果、施設内から分離されるリステリアは特定媒介感染症の原因細菌の一種である。リステリアのタイプに偏る傾向が認められるとともに、同じ症は健康なヒトでは発症しにくく、妊婦や胎児・タイプの菌株が長期間繰り返し検出されることが新生児、免疫機能の低下したヒトなど特定の集団わかった 2）。このような傾向は、諸外国の調査にが罹りやすい、いわゆる日和見感染症の一種と考おいても認められており、スモークサーモンに限えられるが、その主症状は髄膜炎や敗血症およびらず、乳製品や食肉製品の製造施設においても同脳炎などで一般的な食中毒の症状に比べて重篤で様の報告が見られる 3）。これらは、長期間施設にあり、重症化すると致死率が高い。また，本菌は定着しているように見えることから、persistent4℃以下の低温でも増殖可能であり、わが国の食strain と言われ、長いものでは 7 から 12 年間も品衛生対策の柱ともいえる低温保存・流通ではリ同一施設から検出される 3）。

ステリアを制御することができない。すなわち、一方、近年、微生物の存在形態の一つとして，食品媒介リステリア症の発生を未然に防止するたバイオフィルムが注目されている。バイオフィ

めには食品を本菌に汚染させないことが肝要で

ルムとは、微生物が様々な物質表面に付着・増ある。

殖 し て 菌 体 外 多 糖 類（Extracellular polymeric

食品媒介リステリア症の原因食品としては、ナsubstances, EPS）を分泌し、それらに取り囲まチュラルチーズや食肉加工品、サラダなど加熱調れて存在する微生物の集合体のことを指す（Fig.

理せずにそのままで食べる、いわゆる ready-to-1）。バイオフィルムを形成した細菌は、遊離状

eat 食品が最も多く、諸外国では ready-to-eat 食態で存在する細菌（Planktonic cells）（Fig. 1）に品に対するリステリアの規格基準が設定されている。わが国では水産品の生食が一般的であり、ready-to-eat 食品のうちでも特に冷蔵保存期間のPlanktonic

Biofilm
EPS

長い水産加工品はリステリア症のリスクの高い食品であると考えられる。そこで、筆者らは readyto-eat 水産加工品のリステリア汚染実態を調べBacteriaた。その結果、リステリアがスモークサーモンから比較的高率に検出されることが明らかとなっSurface1）

た 。また、これらの製品から分離された菌株のFig. 1

Biofilm formation

124

浦上財団研究報告書

比べて、乾燥に対する耐性や薬剤への抵抗性を示

Vol.18（2011）2.

バイオフィルム形成条件 6）す 4）。リステリアもこのようなバイオフィルム

リステリア菌株を TSBYE 培地（トリプトソイ形成細菌の一種であり、ステンレスやプラスチッブロスに 0. 6 %になるように酵母エキスを添加しク表面にバイオフィルムを形成する。食品の製造たもの）で 24 時間培養し、培養後の培養液 100

施設においては、リステリアがバイオフィルムをμl を 10 ml の MWB 培地と混合し、32 ℃で 40 時形成して乾燥耐性や薬剤抵抗性を示すことにより、間培養後に形成されたリステリアバイオフィルム製品のリステリア汚染が引き起こされる可能性がを使用した。

ある 5）。バイオフィルムが示す乾燥耐性や薬剤抵3.

抗性に主体的な役割を担っているのは EPS である

TSBYE 培 養 液 100 μl を 10 ml の MWB 培 地とされているが 4）、リステリアバイオフィルムのEPS について詳しく調べられた報告はない。

クリスタルバイオレット（CV）法によるバイオフィルムの定量と混合してその 100μl をポリ塩化ビニル製（PVC）本研究は、バイオフィルムの形態や機能およびの 96 穴プレート（BD Falcon#353911）の 8 ウェル

物理化学的、生物学的な性質の鍵を担う EPS にに接種して 32 ℃で 16，24，40，48，72 時間培養着目し、スモークサーモン製造施設からの分離頻し、プレートに形成されるバイオフィルムの経時度が高かったリステリアと一度しか分離されな変化を CV 法により調べた。すなわち、プレートかったリステリア菌株を用いて、これらのリステ上の培養液を捨てて 200μl の滅菌水で 5 回洗浄し、リアの形成するバイオフィルムについて検討を行室温で 45 分乾燥させた。乾燥後 150μl の 0.1 % CVうとともに、リステリアバイオフィルムの EPSで 45 分染色した後に 200μl の滅菌水で 5 回洗浄の糖組成について明らかにし、定量を行うことをした。200μl の 95 %エタノールで CV を脱色し目的とする。て 100μl を新しいプレートに移し、Labsystems

2.

材料と方法

1.

使用菌株

マルチスキャン MS（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で OD 600 値を測定し、脱色された CV をバイオフィルム量として定量した。

スモークサーモン製造施設における 3 年間の調

4.

バイオフィルム形成菌数の計測

査の結果、分離頻度が最も高かったタイプのリス

PVC プレート上に形成されたリステリアバイ

テリア No.20-6 を persistent strain（PS）、施設かオフィルムを経時的に滅菌綿棒（日水製薬）で 100

ら一度しか分離されなかったタイプのリステリア

回擦りとり、1 ml の滅菌生理食塩水に菌を洗い出No.40-1 を transient strain（TS）とし 1）、実験に使して適宜希釈し、100μl を 2 枚のブレインハー用した（Table 1）。

ト イ ン フ ュ ー ジ ョ ン（BHI）寒 天 平 板 培 地（BD

Table 1Bacterial strains

Table 1 Bacterial strainsBacteria

StrainNo.

Type*

Sourcepersist or transient

Listeria monocytogenes

20-61Slicer

persistListeria monocytogenes

40-1

10Product trimmings fromslicing machinestransient*A total of 77 L. monocytogenes isolates were classified into 13 different types by combining the results of theserotyping, PFGE, and three PCR-based typing methods 1).

食品製造施設へのリステリアの定着に寄与するバイオフィルムの解析

125Difco#241830）に塗抹して 37 ℃ 24 時間後、BHI用した。各処理後、バイオフィルム溶液を 0.22μ培地上に形成されたコロニー数を計測し、1 ウェm のフィルター（DISMIC-25cs, ADVANTEC）でルあたりの菌数を算出した。

ろ過して菌体を取り除き、エタノール（99.5%）を

蛍光標識レクチンを用いたリステリアバイオ
フィルムの観察5.

Lab-Tek チ ャ ン バ ー ス ラ イ ド（Nunc#177429）

加えて多糖を析出させ、生じた沈殿の有無を目視により確認した。
6.-3

フェノール硫酸法による EPS の定量にバイオフィルムを形成させて固定後、蛍光標識バイオフィルムからの EPS 定量法は、フェノーレクチンを反応させ、蛍光顕微鏡で観察を行った。

ル硫酸法により実施した。すなわち、菌体を 0.22

蛍光標識レクチンとしては Alexa Fluor コンジュ

μm のフィルターで除去したバイオフィルム溶ゲ ー ト の コ ン カ ナ バ リ ン A（ConA）（Molecular

液 1 ml に 2.5 ml のエタノール（99.5%）を加えて混Probes#C11252）を用いた。

和し、生じた沈殿を遠心分離により回収した。上

6. バイオフィルムからの EPS の抽出および定量

清を除去し、沈渣を室温で乾燥させた後，滅菌水

6.-12 ml で溶解した。この EPS 溶液 0.5ml に 5%フェバイオフィルム溶液の作製

TSBYE 培 養 液 100 μl を 10 ml の MWB 培 地

ノール溶液 0.5 ml を加えて混和し、2.5ml の濃硫と混合してその 5 ml を滅菌プラスチックディッ酸を加えて室温で 20 - 30 分放置した。日立ダブ

シ ュ（ φ 60 x 15 mm, SUMILON#MS-11600）に

ルビーム分光光度計 U-2000 型（日立ハイテク）

接 種 し、32 ℃ で 40 時 間 培 養 し た。 培 養 後、 上を用いて、本試料液を 490 nm で定量し、得られ清を遊離状態のリステリアとして実験に使用し、たグルコース量をバイオフィルム中の EPS 量とディッシュの底に形成されたバイオフィルムをセした。

ルスクレイパー（IWAKI#9000-220）でかきとり、マイクロチューブに移しかえたものをバイオフィ
ルム溶液とした。
6.-2

各種前処理法の検討

3.

結果

1.

マイクロプレートを用いたクリスタルバイオレット（CV）法によるバイオフィルムの定量
および菌数の計測

バイオフィルムから EPS のみを抽出定量するために 6.-1 項で調製したバイオフィルム溶液を用マイクロプレートを用いた CV 法でプレート上いて以下の前処理法、すなわち、i ）超音波（ 1 %に形成されたバイオフィルム量を調べたところ、

Tween 80 溶 液 中 で 25 ℃ 30 分 間 超 音 波 処 理 ）、PS は TS に比べて、プレート上に形成されるバii ） エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸（ethylenediamine

イオフィルム量が多い傾向が認められた（Fig.

tetraacetic acid, EDTA）（0.5 M EDTA pH 8.0 溶2A）。しかしながら、プレート上の生菌数に差は

液 中 で 25 ℃ 3 時 間 処 理 ）、iii ） 加 熱（70 ℃ の 水

認められなかった（Fig. 2B）。

溶中で 1 時間加熱処理）、iv）アルカリ（1M 水

2.

酸化ナトリウム（NaOH）溶液中で 25 ℃ 3 時間処

蛍光標識レクチンを用いたリステリアバイオ
フィルムの観察理）、v）酸（0.5 M 硫酸（H 2 SO4 ）溶液中で 25 ℃ 3

蛍光標識レクチンを反応させたリステリアバイ

時間処理）、vi）糖分解酵素（Endoglycosidase H

オフィルムの観察を行った結果、いずれの菌株に（CARBIOCHEM）溶液中で 37 ℃一晩処理）につも ConA と結合する薄膜が観察された（データ示いて検討を行った。コントロールとして、リステさず）。

リアの MWB 試験管培養液と 25 ℃の滅菌水を使

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浦上財団研究報告書

A**

Vol.18（2011）

B*

Time (Hours)

Time (Hours)

Fig. 2 (A) Destained biofilm (measured at OD600) by crystal violet assay.
(B) L monocytogenes viable cell count. Closed circles ( ● ) are represented
L monocytogenes strain No. 20-6 (persistent strain). Opened triangles( △ ) are represented L monocytogenes strain No. 40-1 (transient strain).
Asterisks are represented significant value (P < 0.01) (A).

バイオフィルムからの EPS の抽出

このうち、0.5M EDTA（pH8.0）溶液は本溶液のバ イ オ フ ィ ル ム か ら 菌 体 を 除 去 し て EPS のみでも沈殿物を生じたことからこれを除去した。

み を 抽 出 す る た め の 前 処 理 法 と し て、 超 音

1M NaOH 溶液は菌体が溶菌している可能性が考波、EDTA、加熱、アルカリ、酸、糖分解酵素えられたため、0.01M から 1M までの間で、リス（Endoglycosidase H）について検討を行った。そテリア培養液およびリステリアバイオフィルム溶の 結 果、0.5 M EDTA（pH8.0）、 ア ル カ リ（1 M

液について影響を調べたところ、0.1M の NaOHNaOH）および Endoglycosidase 処理の場合のみ溶液で 10 分間処理が生菌への影響がなかったこ

エタノールにより沈殿物が確認された（Table 2）。と か ら、0.1M の NaOH 溶 液 と Endoglycosidase

3.

Table 22. Precipitation
Precipitation byEPS
isolation
methods
Tableby ethanol
ethanolusing
usingdifferent
different
EPS
isolation
methods

EPS isolation methodsPlanktonic cellSonication in 1% Tween 80 at 25 °C
0.5 M EDTA, pH 8.0 at 25 °C
Heat at 70 °C
1M NaOH at 25 °C
0.5 M H2SO4 at 25 °C
Endoglycosidase H at 37 °C
Sterile DDW at 25 °C

Incubation time

Precipitation by ethanol−30 min3h
1h
3h
3hO/N **3h+–+*–+–+–* Precipitation is obtained from only 0.5 M EDTA solution.
**OvernightABFig. 3

Extracellular polymeric substances (EPS) isolation methods fromL. monocytogenes biofilms and incubation time. (A) 0.1 M NaOH.
( B ) E n d o g l y c o s i d a s e H . C l o s e d c i rc l e s ( ● ) a re re p re s e n t e d L .
monocytogenes viable cell count (cfu/ml). Bars are represented glucose
yielded (ng/ml).

食品製造施設へのリステリアの定着に寄与するバイオフィルムの解析

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H（EndoH）溶液について処理時間と菌数変化お査の結果得られたリステリア菌株を血清型およびよびグルコース量についてさらに検討を行った結DNA 型に基づいて分類し、長期にわたって分離果を Fig. 3 に示した。NaOH 溶液処理では 60 分されたタイプの菌株（No. 20-6）を persistent strain

後にリステリアの溶菌により菌数が減少し、グル（PS）、一度しか分離されなかったタイプの菌株コース量が増加した。EndoH では一晩処理後も（No. 40-1）を transient strain（TS）と し て 1）、 こ菌数への影響は見られなかったが、NaOH 処理のれらの菌株のバイオフィルム形成に着目して解析グルコース量が多かったことから、リステリアバを行った。その結果、マイクロプレートを用いたイオフィルム溶液から EPS を抽出する方法としCV 法により、PS は経時的に CV 量が増加するては 0.1 M の NaOH 溶液で 10 分間処理を行うこ傾向が見られたが、TS では見られなかった（Fig.ととした。

2A）。しかしながら、これらの菌株間でプレートリステリアバイオフィルム中の EPS の定量上の生菌数に差はなかった（Fig. 2B）。蛍光標識

No.20-6 および No.40-1 リステリア菌株についレクチンを用いた顕微鏡観察の結果から、いずれて、3. 項で検討を行った処理法によってバイオの菌株も菌体外に ConA に結合するグルコースあフィルムから EPS を抽出し、遊離状態とバイオ

るいはマンノースを構成成分とする多糖の存在がフィルム形成時における EPS 量をフェノール硫確認されたことから（データ示さず）、PS は TS酸法でグルコース量として定量した。その経時に比べて菌体外に産生する多糖類が多い可能性が変化を Fig. 4 に示した。バイオフィルム形成時あると考えられた。そこで、リステリアバイオフィ

はいずれの菌株も遊離時に比べて EPS 量が高く、ルムの EPS について検討を行った。

4.

さらに PS である No.20-6 の EPS 量が TS である

一般的にバイオフィルムは菌体と菌体外分泌物が複雑に入り混じるマトリックスを形成し、それNo.40-1 に比べて高い傾向が見られた。

らが相互作用により互いに影響し合って存在して***おり 7）、EPS のみを抽出して定量することは容易ではない。そこで、これらのマトリックスから菌体外に存在する EPS のみを抽出するための処理方法について検討を行った。その結果、0.1 M のNaOH で 10 分間処理する方法で、リステリア菌体を破壊せずフェノール硫酸法によるグルコース

Fig. 44.

考Extracellular polymeric substances yieldvalues in L. monocytogenes planktonic cells
or biofilms. Closed circles ( ● ) are represented
biofilms, opened circles ( ○ ) are represented
planktonic cells of the L monocytogenes strain
No. 20-6 (persistent strain). Closed triangles( ▲ ) are represented biofilms, opened triangles( △ ) are represented planktonic cells of theL monocytogenes strain No. 40-1 (transientstrain). Asterisks are represented significant
value, * P < 0.05, ** P < 0.01.

察

スモークサーモン製造施設における 3 年間の調量として EPS を定量することが可能となった。
Sheng ら 8） は、 光 合 成 細 菌 で あ る

Rhodopseudomonas acidophila からの EPS 抽出法の検討において、EDTA 処理よりも NaOH 処理での EPS 回収が良好であったが、NaOH 処理では溶菌による菌体内成分の混入を指摘している。
Sheng ら 8） の使用している NaOH 濃度は 1 M であり、この濃度では、筆者の検討においても、リステリアの溶菌によると考えられる生菌数の低下とグルコース量の増加が見られた（Fig. 3）ことか

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

ら、菌体と EPS を区別するための NaOH 処理濃

ルム中に存在するアルギン酸にも特異的に結合す度について、バイオフィルムから菌体を破壊せずることを示した 1 0 ）。また、下水のバイオフィルに EPS を抽出することが可能な処理濃度を 0.1 M

ムから抽出される EPS は多糖よりもタンパク質とした（Fig. 3）。

や有機物が主要な構成成分であることから 7）、今以上の条件検討から、リステリアバイオフィ

回、バイオフィルム中に含まれる EPS 量が培養

ルムの EPS を 0.1 M の NaOH で処理した後に PS液 1ml あるいはシャーレ 1 枚（直径 60 mm）あたと TS について、遊離状態での存在時とバイオフィり数 ng であり少なかった原因として、EPS の構

ルム形成時における EPS 量を測定し、経時変化成糖としてグルコース以外の糖が含まれている可を調べて比較を行った。その結果、遊離状態で存能性があることや、リステリアバイオフィルムの在するリステリアよりもバイオフィルムを形成しEPS の主要な構成成分が多糖でなく、タンパク質ているリステリアの方が菌体外に存在する EPSや有機物である可能性も考えられる。

量が多いことが明らかとなった（Fig. 4）。また、リステリアのバイオフィルム形成培地としては

PS が TS よりも EPS 量が多かった。以上より、筆者らが用いた MWB の他に 1/2 濃度のトリプリステリアがバイオフィルムを形成すること、まトソイブイヨン（TSB）培地や BHI 培地など市販た、バイオフィルムを形成したリステリアのうちのものが使用されることもあるが、筆者が CV 法

でも菌体外に存在する EPS 量が多い方が施設へを用いて行った検討では TSB 培地や BHI 培地にの定着性に寄与している可能性が示唆された。

比べて MWB 培地のバイオフィルム形成が良好

EPS にはカプセル多糖とスライム多糖があり、であった（データ示さず）。また、リステリアと遺カプセル多糖は細胞表面のリン脂質や lipid-A に伝的に近縁とされる乳酸菌でも EPS を抽出およ共有結合しているとされる。一方、スライム多糖

び定量する際の培地としてタンパク質など培地成はカプセル多糖に比べその結合は非常に弱く、細分の影響がない chemically defined media が適し胞の外側を取り巻くように存在していると言われているとされるている。またこの両者を厳密に区別できない場形成のみでなく、リステリアバイオフィルム中の合も存在する

4, 7 , 9）。多糖類はしばしば、カルシウムイオンやマグネシウムイオンのような 2 価の11）。MWB 培地はバイオフィルム

EPS の抽出および定量にも適していると考えられる。

陽イオンで架橋されて容易にゲル化することがあ

Romanova ら 1 2 ）はマイクロプレート上に形成る 7）。 今 回、 リ ス テ リ ア バ イ オ フ ィ ル ム か らさせたリステリアバイオフィルムに対する塩化EPS を回収するための前処理法として NaOH がベンザルコニウムの影響を CV 染色法で調べた結EDTA より優れていたが、リステリアの EPS は果、CV 法では生菌のみが染まっているのではな

カプセル多糖である可能性が高いかもしれない。

く死菌も染まっていることを示している。筆者

ConA はα - D - グルコースやα - D - マンノーもマイクロプレートを用いた CV 法で PS においスを認識するレクチンであり、これらを含む多糖て経時的に CV 量が増加する傾向が見られたが、であるデキストラン、グリコーゲン、マンナン、EPS 以外の死菌も CV で染まっているかも知れなアミロペクチン、スフィンガンに結合することい。バイオフィルム形成リステリアの定量的な評が知られているが、Strathmann らは、蛍光標識価指標として、今後、CV 染色や生菌数測定以外

ConA がα - D - グルコースやα - D - マンノースにアデノシン三リン酸（adenosin 5 ′-triphosphateを含まない Pseudomonas aeruginosa のバイオフィATP）12,13,14）を測定することも検討したい。

食品製造施設へのリステリアの定着に寄与するバイオフィルムの解析

謝

辞本研究に対し、多額の助成金を賜りました浦上

食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上げます。
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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

Quantification and characterization of polysaccharides inthe biofilms of Listeria monocytogenes which resides infood processing plants
Hiromi Nakamura
Department of Microbiology
Osaka City Institute of Public Health and Environmental Sciences
Listeria monocytogenes is a food-borne pathogen that can lead to potentially lifethreatening listeriosis in high-risk populations. The foods reported to be associatedwith listeriosis are ready-to-eat foods consumed without further cooking. In Japan,
there are high health risks specifically in ready-to-eat seafood products, usually highlyprocessed, have an extended shelf life at refrigeration temperatures. In a previous report,
we investigated L. monocytogenes contamination in commercially available ready-toeat seafood products, and showed that there is a high incidence of L. monocytogenes
contamination in cold-smoked salmon. We detected and examined by molecular typing
methods L. monocytogenes isolates from a cold-smoked fish processing plant to trace thesource of contamination. Our study has indicated that L. monocytogenes resides in thisplant in the form of persistent strains during our investigation. Extracellular polymericsubstances (EPS) play an important role in the bacterial biofilms such as physicochemicaland biological characterization and structural configuration and function. Persistent strain(PS) is the specific L. monocytogenes strain types (combined with serotype, PFGE andPCR-based typing) frequently isolated for a long time, on the contrary, transient strain(TS) is the L. monocytogenes strain types isolated only one time during our investigationin the cold-smoked salmon processing plant. In the present study, we analyze to know
quantification and characterization of polysaccharides in the EPS of L. monocytogenes PSand TS biofilms. We elucidated that polysaccharide containing the fluorescently labeledlectins, concanavalin A (ConA) target sugars, α-D-glucose and α-D-mannnose seemed tobe involved in biofilm of L. monocytogenes. The 0.1 M NaOH extraction method withoutcell lysis from L. monocytogenes biofilm was found to be the most effective among the EPS
isolation methods we used. After the NaOH isolation steps, quantification of EPS yieldvalues in L. monocytogenes biofilm was obtained by phenol-sulfuric method. Consequently,
the total amount of EPS in L. monocytogenes biofilm was higher than in planktonic cells.
The total amount of EPS in PS of L. monocytogenes biofilm has higher than TS. Our study
was indicated that the higher amount of polysaccharides in EPS of L. monocytogenes
biofilms tend to reside in food processing plant.