東京農総研研報

19：51-58, 2024

（原著論文）

染色体数の計測およびフローサイトメトリーによるブバルディア属植物の倍数性の判定
大槻優華 1 ＊・宮下智人 1 ・菊池真司 21

東京都農林総合研究センター
2

千葉大学園芸学研究科

摘要

アカネ科の低木であるブバルディアの園芸品種には，複数の原種とその種間交雑で作出された多くのハイブリッド系品種 があるが，その大部分の倍数性は明らかにされていない。そこで原種 2 種 4 系統，ハイブリッド系15品種の計19種類について，染色体の観察とフローサイトメトリーによる倍数性の判定を行った。染色体観察の結果，原種 2 種（B. longiflora および B. ternifolia）各 1 系統は染色体が72本で 8 倍体（ 2 n= 8 x ＝ 72）であり，ハイブリッド系品種‘ヨホワイト’，‘チェリーピンク’は染色体が36本で 4 倍体（ 2 n= 4 x = 36）であることが明らかとなった。次に供試した19種類で DAPI 染色によるフローサイトメトリーを行い，相対的蛍光強度（RFI）を測定した。染色体を観察した 4 品種・系統では RFI と染色体数とが 1 %水準で有意な正の相関を示した。その一次回帰式を検量線に用いて，残り15品種・系統の倍数性を判定した。その結果，ハイブリッド系品種‘ライトピンク，レッド’が 4 倍体で，それ以外はすべて 8 倍体であると判定された。ブバルディアは高次倍数体の種や品種が多く，染色体調査では多くの作業時間と高度な技術を要することから，フローサイトメトリーはブバルディアにおける簡易な倍数性の判定法として有用と考えられた。
キーワード：倍数性育種，DAPI，蛍光染色，切り花，交雑育種
簡略表題

ブバルディア染色体

東京都農林総合研究センター研究報告19：51-58，2024＊

著者連絡先：Email：y-otsuki@tdfaff.com－ 51 －

東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

して， 2 倍体と 4 倍体の交雑実生からフローサイト
緒言

メーターを用いて 3 倍体が選抜された（八幡ら，2005）。 本手法をブバルディアでも活用できれば，ブバルディア（Bouvardia spp.） はアカネ科の花効率的な育種を行う上で有用と考えられる。

卉園芸作物であり，主に切り花として，一部で鉢物

そこで本研究では，まずブバルディアの原種およとして利用されている。主要な産地は国外ではオラ

び一部の栽培品種の染色体数を調査してその倍数性ンダ，国内では東京都，熊本県，静岡県，福岡県なを明らかにした。次いでその情報およびフローサイ

どであるが（東京都中央卸売市場，2020）， 国内外

トメトリーを用いて原種および栽培品種の倍数性のともに生産量は少なく，マイナー品目の位置づけで判定を行った。なお，本試験は2015年に実施し，本ある（宮下ら，2020）。

報告の一部は，園芸学会平成28年度春季大会で発表

現在商用として主に栽培されるハイブリッド系品
種は 3 つの種（B. leiantha Benth., B. longiflora（Cav.）

したものである（大槻ら，2016）。

Kunth, B. ternifolia（Cav.）Schldl.） 間の交雑により材料および方法育成されたと考えられている（石井・井上，1968）。
1 ．供試品種・系統
ブバルディア属の原種 2 種 4 系統，ハイブリッド

既存のハイブリッド系品種はそのほとんどがオランダの一部の企業のみで開発され，公開された育種情
リッド系品種は稔性が著しく低いとされ，採種でき系品種15品種，計19品種・系統を供試した（表 1 ）。
原種は B. longiflora BL-1，‘白王冠’，B. ternifolia BT-1なかったため，一部の枝変わり品種を除いて国内でおよび BT-2の 2 種 4 系統である。 ハイブリッド系の品種改良はほとんど進まなかった（宮下ら，2020）。

品種は1950年代以降に国内に導入された品種群から品種改良の主な手段として交雑育種があるが，倍‘チェリーピンク’ など 4 品種と，2000年代以降に数性の異なる個体間では交雑が困難になる事例があ導入された比較的新しい品種群から11品種を用いり（Husband and Sabara, 2003；Zohren et al. 2016），た。植物体は，東京都立川市の室温15℃以上に管理

多様な倍数性の存在する作物で育種を効率的に進めしたガラス室で鉢栽培している株を用いた。

報は少ない。また，国内に初期に導入されたハイブるためには，遺伝資源の倍数性に関する知見を得るいる（Lewis, 1962）。 しかし現在主流の栽培品種群

2 ．染色体数の計測（試験 1 ）（1）植物材料
B. longiflora BL-1，B. ternifolia BT-1，‘チ ェ リ ーを含め，遺伝資源の倍数性に関する知見はほとんどピンク’，‘ヨホワイト’の 4 種類を供試した。染色ない。また染色体の観察および染色体数の計測は，体数を観察する器官として BT-1，BL-1は葯を供試観察に適した材料の調達に時間や労力を要するこした。‘チェリーピンク’，‘ヨホワイト’ は予備試と，観察に熟練の技術と長い作業時間を要すること

験において花粉または葯が著しく少ない特性が確認などから，効率的かつ迅速な育種の実現のために，されたことから，根端を供試した。

ブバルディアにおいて倍数性を簡易評価できる手法（2）染色体標本の作成を開発することも必要である。

1）前処理ことが重要である。ブバルディア属植物の染色体基本数は 9 で， 4 ， 8 ，12倍体があることがわかって

フローサイトメトリーは DNA を蛍光染色してそ採取した組織を0.045% 8 -hidroxyquinoline に浸漬の蛍光強度を測定する手法であり，ゲノムサイズのし， 4 ℃で16時間の処理を行った。次に固定液（酢測定や倍数性の推定を簡易に行うことができる（三酸：エタノール＝ 1 ： 3 ）に浸し，常温で 5 日間静柴・ 三位，1998）。 野菜ではアブラナ科（Fahleson

置して固定した後，70％エタノールに浸して常温でet al. 1988） やトマト（Arumuganathan et al. 1991），保存した。

果 樹 で は ブ ル ー ベ リ ー（Costich et al. 1 9 9 3；2）標本の作成

Miyashita et al. 2009） やカキ（Tamura et al. 1998），酵素乖離法を用いて，各品種・系統当たり 5 ～10

花卉ではガーベラ（Tosca et al. 1999） やカーネー枚のスライド（染色体標本）を作成した。固定したション（牛尾ら，2002）など幅広い作物で用いられ組織を蒸留水に10分浸して洗浄した後，スライドガている。またビワでは，種なし品種の育成を目的とラス上でカミソリにて検体を調整した。余分な組織－ 52 －

染色体数の計測およびフローサイトメトリーによるブバルディア属植物の倍数性の判定

表1

供試したブバルディア属植物 a

や水を拭きとった後，酵素液（ 2 % cellulose Onozukaを滴下し，22×22mm のカバーガラスで封入した。

RS（Yakult（株））および 2 % pectolyase Y －23（協染色体数の計測は，Kikuchi et al.（2008）の方法に基和ケミカル（株））10µL を滴下して湿潤箱にスライづき，蛍光顕微鏡（OLYMPUS BX53）で観察し，良ドガラスを静置し，37℃で30分， 酵素乖離処理を好な染色体像を冷却 CCD カメラ（CoolSNAP MYO）行った。 処理後， 酵素液をろ紙で取り除き，45%で撮影後， ソフトウェア（MetaVue ver.7.8.2.0） で酢酸カーミンを滴下して 1 ～ 2 分静置した。 その画像処理を行った。

後，検体にカバーガラス（22×22mm）を被せ，アルコールランプで 1 秒以上加熱した後， ろ紙でカ2 ．フローサイトメトリーによる倍数性の推定（試スの上から組織を軽くたたき，細胞を展開させた。

験2）
ブバルディア属の原種 2 種 4 系統，ハイブリッド

次にスライドガラスをろ紙で挟み，指でゆっくり押系15品種，計19種類を供試した（表 1 ）。若い展開葉しつぶした。作成した標本を光学顕微鏡で観察し，5 mm 角程度をガラスシャーレにとり，High Resolution

染色体数の計測に適した標本を選抜した。以降，同DNA staining kit（CyStain UV Precise P，SYSMEX様の作業を必要な標本数が得られるまで繰り返しPARTEC GmbH）の A 液（Nuclei Extraction Buffer）100µLた。

を加えてカミソリで細断した。 これに A 液100 µL（3）DAPI 染色と純水200µL を加えて， 3 分静置後，30µm フィル

バーガラスの一端を抑えながら爪楊枝でカバーガラ作成した標本を－80℃のフリーザーに一晩置いてターでろ過して抽出した核を B 液（Staining Buffer）

凍結させ， カミソリでカバーガラスを取り除いた

1 mL と純水 1 mL を加えて染色した。この試料液を後，自然乾燥させた。乾燥させたスライドガラスをフローサイトメーター CyFlow PA（SYSMEX PARTEC

蒸留水に浸して軽く洗浄し，ブロワーで風乾した。

GmbH） を使って分析し， 相対的核 DNA 含量を表検体上に 5 µg／mL DAPI 溶液（蒸留水に溶解）10µL

す 相 対 蛍 光 強 度（Relative fluorescence intensity；－ 53 －東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

RFI）を 1 個体当たり 3 回測定して平均値を算出しBL-1（ 8 x） は‘チェリーピンク’（ 4 x） の約 2 倍た。 試験 1 により倍数性が明らかになった 4 種類
（B. longiflora BL-1，B. ternifolia BT-1，‘チェリーピの値のピークを示し，各々の倍数性の違いを明確にンク， ヨホワイト’） のデータをもとに，RFI からのすべての品種・系統においても 1 つの強いピーク倍数性を推定するための検量線を作成した。この検が認められたため，その値を各品種・系統の標準的量線を用いて，上記 4 種類を除く15種類の倍数性をな核 DNA 量を示す値と判断した。

測定することが可能であった（図 2 ）。 またその他供試した品種・ 系統の RFI 値は大きく 2 つのグ推定した。

ループに分かれた。 1 つ目が30前後の値（27.3～結果30.7）を示す 4 種類で，試験 1 で 4 倍体と判明した2 品種（‘チェリーピンク’，‘ヨホワイト’）が含ま

1 ．染色体の観察
ブバルディア属植物 4 種類について染色体を計測し た 結 果， 原 種 の B. longiflora BL-1，B. ternifolia

れた。 2 つ目が50～60程度（50.3～63.1） を示す15BT-1，の染色体数はどちらも72本であった（図 1 ）。
ブ バ ル デ ィ ア 属 の 基 本 染 色 体 数 は x = 9 （Lewis,

なった 4 品種・系統について，RFI と倍数性の関係を 分 析 し た 結 果， 1 % 水 準 で 有 意 な 正 の 相 関1962） であることから，BL-1と BT-1はどちらも 8倍体（ 2 n = 8 x =72）であることが明らかになった。

（r=0.9967）が認められた（図 3 ）。その一次回帰式
では，R2 =0.9935と高い決定係数が得られた。 この

また，ハイブリッド系品種‘チェリーピンク，ヨホ式（Y ＝0.1519× RFI －0.138） を検量線に用いて，ワイト’の染色体数はどちらも36本であり，倍数性は 4 倍体（ 2 n = 4 x =36）であることが明らかになっ倍数性の推定値を算出した。その結果，試験 1 で倍種類で，試験 1 で 8 倍体と確認された 2 系統（BL1 ，BT-1）が含まれた。試験 1 で倍数性が明らかにた。
2 ．フローサイトメトリーによる倍数性の推定
フローサイトメトリーでブバルディア属植物のRFI を測定した結果， 試験 1 で倍数性が判明した

図1

ブバルディア属植物の体細胞の染色体

B. longiflora BL-1（a），B.ternifolia BT-1（b），‘ヨホワイト’（c），‘チェ
リーピンク’（d），バーはすべて 5 µm

－ 54 －

図2

フローサイトメトリーによるブバルディ
ア属植物の相対的蛍光強度

矢印は各品種・系統における RFI のピークを示す

染色体数の計測およびフローサイトメトリーによるブバルディア属植物の倍数性の判定

図3

表2

ブバルディア属植物における倍数性と相対的蛍光強度の関係

ブバルディア属植物における相対的蛍光強度および推定倍数性数性が既知となった 4 種類を除く15種類では，ハイブリッド系品種の‘ライトピンク’および‘レッド’

考察が 4 倍体で，それ以外はすべて 8 倍体であると判定
1 ．ブバルディア遺伝資源の倍数性
本研究では染色体数の計測とフローサイトメトできた（表 2 ）。

リーにより，原種 2 種 4 系統とハイブリッド系品種15種類の倍数性を判定することができた。 その結－ 55 －東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

果，供試したハイブリッド系品種はいずれも， 4 倍謝体と 8 倍体の品種群に分かれることがわかった。 4辞倍体品種はいずれも1950年代以降に日本に導入された古い品種群である（表 1 ）。 一方， 8 倍体品種は

本研究の実施に当たり，試験全般にご助言いただ

いずれも2000年代以降に導入された新しい品種群でいた千葉大学の佐々英徳教授，植物材料をご提供いあり，現在の生産の主流となっている。この新しいただいた伊豆大島ブバルディア生産者部会の皆様な品種群は古い品種群に比べて花や植物体が大きい傾

らびに東京都島しょ農林水産総合センター大島事業向であり，これは両者の倍数性の違いに起因すると所の皆様に厚く御礼申し上げます。

考えられた。
引用文献

さらに，新しい品種群は古い品種群に比べて花が大きく茎が剛直だとされる（上原・南，2011）。ク
ワでは倍数体化に伴う巨大性によって導管の組織構

Arumuganathan K, Slattery J. P., Tanksley S. D., Earle E.

造が変化したことが報告されており（関・ 押金，D（1991）Preparation and flow cytometric analysis of1963），ブバルディアのハイブリッド系品種も染色

metaphase chromosomes of tomato. Theor. Appl.

体倍加したことで導管の組織構造に変化が生じ，水Genet. 82; 101-111.

揚げに影響した可能性がある。今後，日持ち性と倍Costich DE, Ortiz R, Meagher TR, Bruederle LP, Vorsa

数性との関係を明らかにするうえで，組織構造の調N（1 9 9 3）Determination of ploidy level and nuclear

査を行うことも重要と考えられる。

DNA content in blueberry by flow cytometry. Theor.
Appl. Genet. 86: 1001-1006.

2 ．簡易な倍数性検定法の確立
本研究により，フローサイトメーターを用いるこFahleson J, Dixelius J, Sundberg E, Glimelius K（1988）とで， 1 サンプル当たり10分程度と迅速な倍数性の判定が可能となった。これは顕微鏡による染色体数

nuclear DNA content and chromosome number insomatic hybrids within Brassicaceae. Plant Cell Rep.の調査の100分の 1 以下であり，大幅な時間短縮と

7 : 74-77.

Correlation between flow cytometric determination ofなる。今回観察したブバルディアの染色体は 1 ～ 2

Husband BC, Sabara HA（2003）Reproductive isolation

μ m と非常に小さく，また 8 倍体（72本）など高次倍数性の品種・系統では染色体数が極めて多いこと

between autotetraploids and their diploid progenitors
in fireweed, Chamerion angustifolium（Onagraceae）.

から，顕微鏡による染色体数の計測には熟練の技術

New Phytologist. 161: 703-713.と大きな労力を要した。そのため，フローサイトメ

石井林寧・ 井上頼数（1968）Bouvardia Salisb ブバ

トリーによる倍数性の判定法は，ブバルディアにおルディア属（最新園芸大辞典編集委員会編著）．

いて極めて有用と考えられた。

最新園芸大辞典．第 1 巻．誠文堂新光社，東京．

ブバルディアの倍数性や交雑に関して， 4 倍体とpp310-311．

8 倍体などの異倍数体間の交配で後代が得られること（宮下ら，2020），16倍体は雄性の稔性が高いこKikuchi S, Matsuki K, Tanaka H, Ohnishi O, Tsujimoto H（2008）Chromosome evolution among seven Fagopyrumと（宮下・小坂井，2021）が報告されている。このspecies revealed by Fluorescence in situ hybridization

ような異倍数体間の交雑や高次倍数体の後代から（FISH）probed with rDNAs. Chromosome Science.
11: 37-43.

は，従来にない多様な倍数性の個体が生じる可能性発が進められ，新品種が発表されている（宮下ら，Lewis, W, H（1 9 6 2）Chromosome numbers in North
American Rubiaseae. Brittonia. 14: 285-290.

2021）。本研究で得られたブバルディアの倍数性に三柴啓一郎・ 三位正洋（1998） フローサイトメト関する知見は，これらの研究においても試験設計やリー自由自在 植物研究への応用． 細胞工学．

考察で活用されている。また本研究で確立したブバ

17：609-615．

がある。また国内では近年，交雑育種による品種開ルディアの倍数性の簡易判定法は，今後も同様のブ

Miyashita C, Ishikawa S, Mii M（2 0 0 9）In vitro

バルディアにおける育種や倍数性の研究において有induction of the amphiploid in interspecific hybrid ofblueberry（Vaccinium corymbosum×Vaccinium用であると考えられる。

－ 56 －染色体数の計測およびフローサイトメトリーによるブバルディア属植物の倍数性の判定ashei）with colchicine treatment. Sci. Hortic. 1 2 2;
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－ 57 －東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

Determination of ploidy level in Bouvardia species bychromosome counting and flow cytometry
Yuka Otsuki 1 ＊ , Chieto Miyashita 1, Shinji Kikuchi 2
1

Tokyo Metropolitan Agriculture and Forestry Research Center
2

Faculty of Agriculture, Chiba University

Abstract
Bouvardia, a shrub of the family Rubiaceae, contains several hybrid cultivars and the original species, but theirploidy levels have not been elucidated. To determine this, chromosome observation and flow cytometry wereconducted in the 19 genetic resources in the Tokyo Metropolitan Agriculture and Forestry Research Center including
four original species and 15 cultivars. Two original species, B. longiflora and B. ternifolia, have 72 chromosomes,suggesting octoploidy (2n = 8x = 72). Conversely, the hybrid cultivars ‘Yo White’ and ‘Cherry Pink’ have 36
chromosomes, suggesting tetraploidy (2n = 4x = 36). Ploidy levels of the 19 original species and cultivars weredetermined by flow cytometry with DAPI staining. The results showed that the relative fluorescence intensity had asignificant positive correlation (p < 0.01) between the chromosome number and the ploidy level. The linear regression
equation was used as a calibration curve to estimate the ploidy levels of the remaining 15 species and cultivars. Theresults showed that the hybrid cultivars ‘Light Pink’ and ‘Red’ are tetraploid, whereas all other hybrid cultivars areoctoploid. Because the Bouvardia species have diverse ploidy levels, flow cytometry can be considered a powerful toolfor estimating the ploidy levels of Bouvardia species.
Key Words: crossbreeding, cut flower, DAPI, fluorescent staining, polyploidy breeding
Bulletin of Tokyo Metropolitan Agriculture and Forestry Research Center, 19: 51-58, 2024
Corresponding author: y-otsuki@tdfaff.com－ 58 －