補助事業番号

2022M-283

補助事業名

2022年度

補助事業者名呉工業高等専門学校 電気情報工学分野

１

神経細胞由来細胞外小胞の高感度検出法開発

補助事業

江口正徳

研究の概要

本事業では，神経やグリア細胞など脳の細胞から分泌される神経細胞由来エクソソームを末梢血中で高感度に検出可能な手法の開発を行う．具体的には，エクソソームの電気的特性（誘電率・導電率）に注目し，①誘電泳動による抗原抗体促進法の開発，②電気的動力現象によるエクソソームの集積・濃縮法の開発，③電気的特性測定によるエクソソームの検出法の開発を行う．
２

研究の目的と背景
近年，認知症やうつ病などの精神疾患を有する患者が急増しており，我が国の深刻な問題となっている．軽度な認知障害を含む認知症の診断は，脳機能テストである神経心理学 検査やMRIなどの脳画像診断によって行われているが， 煩雑かつ時間を要するので，末梢血中のバイオマーカーによる診断法の開発が望まれている．一方，直径 30〜100 nm程度の細胞外小胞であるエクソソームは，殆ど全て細胞から分泌され，分泌元の細胞を反映したタンパク質やmiRNAなどの因子を内包していることから，ガンなど各種疾患のバイオマーカーとして注目されている．しかしながら，脳細胞由来エクソソームは，そのナノスケールの大きさや，末梢血中に少数しか存在しないので，その単離・検出には高感度な技術が必要である．
そこで本事業では，電気的動力現象とマイクロ流路を用いて，高感度・高速に溶液中のエクソソームを抽出可能で手法の開発を目的とする．
３

研究内容（１）誘電泳動による抗原抗体促進法の開発
溶液中のエクソソームを抗原抗体反応により，効率的に特異的抽出を行うために誘電泳動を用いた抗原抗体促進法を開発した．誘電泳動とは，不均一電界下に存在する溶液中の粒子に力が生じる現象で，粒子を1箇所に収集することが可能である．その有効性を明らかにするため，生体細胞(HEK29)を用いた実験結果を図1に示す．図1より，細胞と抗体ビーズに負の誘電泳動が生じることにより，電極の中心に集まり，細胞と抗体ビーズの接触を確認できた．集積後に，磁石を図1（c）右上から誘電泳動用デバイスに近づけると，抗体ビーズと抗原抗体反応した細胞が磁石に引き寄せられる様子が確認された．また，抗体ビーズと接触していない，もしくは死細胞であることから抗原抗体反応していない細胞が電極中心に残った（図1（d））
．

（a）

（b）

（c）

（d）

図 1 生体細胞と抗体ビーズを用いた抗原抗体反応促進実験（a）電圧印加前，（b）
100 kHz, 30Vpp 電圧印加（4 分後），（c）（d）右上から磁石を用いて抗体ビーズを引き寄せる

図 2. エクソソーム検出デバイス（２）誘電泳動によるエクソソームの集積・濃縮法の開発
交流電気浸透とは，溶液中のイオンが外部電界によって移動することで溶液に流れが生じる現象である．エクソソームは，ナノオーダーの大きさから誘電泳動よりも電気浸透流が支配的である．本事業では，交流電気浸透を用いて，溶液中エクソソーム検出デバイスを開発し，デバイス作製および実用性の評価を実施した．開発した検出デバイスの構造図および顕微鏡写真を図2に示す．デバイスは，アルミ製の櫛形電極に絶縁膜（フォトレジスト）をパターニングした構造で，アルミ電極に電圧を加えると，円形のアルミ電極中心に集まるように対流が生じる，図3に，エクソソームの収集時の蛍光顕微鏡写真を示す．図3より，10 kHzの交流電界印加時に，円形電極中心にエクソソームが収集できていることが確認された．また図4より，絶縁膜の形状により，任意のパターンにエクソソームを収集可能であった．

図 4. エクソソーム検出の様子（KERIN）

図 3. エクソソーム検出の様子（円形電極）（３）電気的特性測定によるエクソソームの検出法の開発① インピーダンス計測によるエクソソーム検出
エクソソームの電気的特性を利用した検出法として，インピーダンス計測による検出法を提案した．具体的には，誘電泳動により，溶液中のエクソソームを誘電泳動により電極間に架橋し，その時のインピーダンスの変化を測定することで，エクソソームの検出を試みた．
図5にCastel Wall型電極を用いたエクソソームの架橋の様子を示す．エクソソーム架橋による電極間の導電率変化を図6に示す．図6から，エクソソームが捕集されるほど，電極間の導電率が増加していることが確認できた．
② 誘電泳動特性によるエクソソーム検出
本事業では，エクソソームの誘電特性（誘電率・導電率）に着目し，誘電泳動法と斜面重力を組み合わせた新たなエクソソーム検出法を提案した．具体的には，マイクロ粒子にエクソソームを固定化し，その粒子に生じる誘電泳動力の変化から，エクソソームの検出を試み
る．斜面重力とは，誘電泳動デバイスを斜面に置いた場合にデバイス内の粒子に生じる重力の斜面成分であり，これを利用すると粒子に生じる誘電泳動力を高精度に測定することが可能である．本提案手法の有効性を明らかにするために，生体分子であるDNAを用いた誘電泳動力の変化を測定した．図7にアビジンービオチン反応を用いて，マイクロ粒子表面にDNAを固定した蛍光染

色画像を示す．図7(b)より，マイクロ粒子表面にDNAが付着していることが確認できた．図8に，粒子に生じる誘電泳動力と斜面重力との平衡点の変化の様子を，図9にDNA固定化の有無による平衡点の周波数を示す．図9よりDNAを固定化により，平衡点が角周波数で10〜20 μm程度しており，本提案手法の有効性が明らかとなった．

図 5 電極間に固定化されたエクソソーム(a)

図 6 導電率の変動率（エクソソーム懸濁液）

(b)

(a)

(b)

図 7 蛍光染色画像．(a) DNA

図 8 斜面重力による平衡点の固定前．(b) DNA 固定後変化．(a) DNA 有．(b) DNA 無図 9. ポリスチレンビーズの周波数特性４

本研究が実社会にどう活かされるか―展望

近年，認知症やうつ病などの精神疾患を有する患者が急増しており，2014年の厚生労働省「患者調査」において，その患者数は392万人(国民の40人に1人)と報告されている．精神疾患の診断は，おもに医師による問診によりなされており，バイオマーカーの開発が望まれている．直径 30〜100 nm程度の細胞外小胞であるエクソソームは，ガンなど各種疾患のバイオマーカーとして注目され，その分泌・輸送様式や内包物質の解析など研究が盛んに行われている．エクソソームは，中枢神経系を構成する脳神経細胞やアストロサイト(グリア細胞の一種でヒトの大脳皮質において最も数が多い細胞)からも分泌されることが知られており，脳細胞由来のエクソソームが認知症やうつ病などの精神疾患のバイオマーカーになるのではないかと期待されている．本事業では，血液中エクソソームの抽出を目的とし，電気浸透現象および誘電泳動現象とマイクロ流路を組み合わせた抽出手法を開発した．誘電泳動により体液中の全てのエクソソームを電極に集積後，抗原抗体反応により標的のエクソソームを選択的に単離することが可能となれば，目的の細胞由来のエクソソームを高速に抽出することが可能となり，さらに抽出したエクソソームに含有するタンパク質やRNA等を網羅的に解析することで，様々な疾患の診断が可能になると予想できる．
５

教歴・研究歴の流れにおける今回研究の位置づけ
研究代表者はこれまでに，微細加工技術と誘電泳動現象や交流電気浸透現象などの電気的動力現象を用いて，血液中のがん細胞検出や生体細胞の電気的特性測定に関する研究を行ってきた．当該事業は，研究代表者がこれまでに培ってきた電気的動力現象および微細加工技術を駆使して，６ 本研究にかかわる知財・発表論文等
・町 依蕗，江口 正徳, 山川 烈，“斜面重力を用いた生体分子固定化マイクロビーズの誘電泳動特性測定,” 化学とマイクロ・ナノシステム学会第 45 回研究会（CHEMINAS45）講演要旨集，2022 年 5 月 21 日，p. 25.
・二重谷 光輝，西林 寛大，江口 正徳, 山川 烈，“クリークギャップ電極を用いた誘電泳動特性と電極界面インピーダンスとの一考察,” 化学とマイクロ・ナノシステム
学会第 45 回研究会（CHEMINAS 45）講演要旨集，2022 年 5 月 21 日，p. 31.
・町 依蕗，二重谷 光輝，甲斐 萌華，中岡 佑輔，江口 正徳，岡田 麻美，梶谷 直
人，“交流電気浸透流を用いたエクソソーム収集デバイスの開発,”第 34 回バイオエンジニアリング講演会, 2022 年 6 月 26 日.
・甲斐 萌華，町 依蕗，岡田 麻美，梶谷 直人，江口 正徳，“交流電界を用いた生体細胞と細胞外小胞の分離，”化学とマイクロ・ナノシステム学会第 46 回研究会
（CHEMINAS 46） 講演要旨集，2022 年 10 月 15 日．
・町 依蕗，西林 寛大，江口 正徳，“先端鋭利型対向電極を用いたエクソソームインピーダンス計測,”化学とマイクロ・ナノシステム学会第 46 回研究会（CHEMINAS46）講演要旨集，2022 年 10 月 15 日.
・Ibuki Machi, Kanta Nishibayashi and Masanori Eguchi,“Extracellular Vesicles
impedance measurement using a sharp-tipped counter electrode,” International
Conference on Science of Technology Innovation 2022．

７

補助事業に係る成果物（１）補助事業により作成したもの
該当なし（２）（１）以外で当事業において作成したもの
該当なし
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事業内容についての問い合わせ先
所属機関名：
住呉工業高等専門学校（クレコウギョウコウトウセンモンガッコウ）

所： 〒737-8506
広島県呉市阿賀南2-2-11

担当者：

准教授

江口正徳（エグチマサノリ）

担 当 部 署：

電気情報工学分野（デンキジョウホウコウガクブンヤ）

E - m a i l：m-eguchi@kure-nct.ac.jp

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ＲＬ：

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