51

魚由来タンパク質の筋インスリン抵抗性改善効果とそのメカニズムの解析＜平成20年度＞

魚由来タンパク質の筋インスリン抵抗性改善効果とそのメカニズムの解析
眞鍋康子（首都大学東京・人間健康科学研究科・ヘルスプロモーションサイエンス学域）

1. 緒

ことも報告されている（図 1）。インスリン非依言存的な運動による糖取り込み経路に重要な役割を国民健康・栄果たす分子として AMP キナーゼが注目されてい養調査の報告によると，糖尿病が強く疑われる人る。AMP キナーゼは細胞内エネルギーセンサー（疑有病者）および可能性を否定できない人（予とも呼ばれ，細胞内のエネルギー状態が良好な備軍）は，合わせて 2210 万人にのぼる 。一方（ATP が多い）場合は不活性型だが，ATP が使で，食事の国民の総エネルギー摂取量は 10 年前

用され AMP が増加するとリン酸化され活性型によりも減少してきており，糖尿病の増加要因がなる。

2007 年に行われた厚生労働省

1）「豊かな食生活によるエネルギー摂取過多」とい

これまで，生体内で AMP キナーゼを活性化さう単純なものではなく，食事の脂肪摂取比率，身せるものとしては，運動などの筋収縮，またはメ体活動量の減少など様々な要因が深く関連していトフォルミンなどの薬剤が知られていた。これにると考えられる。

加え，近年，飲料中に含まれるカフェインやカテ摂取した糖は，血糖降下作用ホルモンであるキンなどの食品中の微量成分が AMP キナーゼを「インスリン」により脂肪や骨格筋に取り込まれ， 活性化することや 3，4），タンパク源としての大豆生体は血糖値をほぼ一定に保つことができる。しの長期摂取が AMP キナーゼの活性化を通してイかし，多くのⅡ型糖尿病患者では，臓器におけるンスリン感受性を高めることが報告され 5），運「インスリン」の感受性が低下することで，各臓動・薬剤以外の因子でも AMP キナーゼを活性化器への糖取り込み能力が低下し，高血糖状態となっている。糖尿病患者にとって，インスリン経路以外の糖取り込みを活性化させることが血糖を正常に保つ上で重要であるが，インスリン以外に血糖降下作用をもつホルモンやシグナル伝達系は現在のところ発見されていない。しかし，近年，運動（筋収縮）がインスリン非依存的メカニズムで糖取り込み促進能力があることが明らかとなり 2）（図 1），インスリン感受性が低下した糖尿病患者に，運動が強くすすめられている。また，運動／筋収縮はインスリンの糖取り込み能力にも何らかの修飾を与えて，インスリン感受性を上昇させる

図1

インスリンによる糖取り込みと筋収縮による骨格筋細胞への糖取り込みの仕組み
筋収縮による糖取り込みの細胞内情報伝達経路（右側）には，AMP キナーゼが重要な役割を担っている。この経路はインスリンの経路（左側）と異なるため，インスリン抵抗性が生じてしまった場合でも正常に機能することができる。

52

浦上財団研究報告書させることで，臓器への糖取り込みを活性化する

Vol.17（2009）に尾部より採血し，血糖値を測定した。
2. 2

ことが示唆される。

餌の調整

本研究では，古来より日本で重要なタンパク源

白身魚粉末の調整は，スケトウダラの可食部をとして摂取されている魚タンパク質に注目し，魚凍結乾燥，粉砕，脱脂することにより調整した。

タンパク質の長期的な摂取が，高脂肪摂取によりコントロールのタンパク質としてカゼインを用い引き起こされる糖尿病を予防する効果を有するかた。各群における餌の組成は表 1 に示した。

について特に，骨格筋の糖取り込み能力，ならび

2. 3に，インスリン非依存的な経路で重要な役割を担

マ ウ ス の ヒ ラ メ 筋（soleus）， 長 指 伸 筋

う AMP キナーゼに注目して検討した。
2.
2. 1

糖取り込み試験（extensor digitorum longus;EDL）を摘出し，取り込み測定用の装置に取り付け，37℃に保ち，95

実験方法％酸素，５％二酸化炭素を通気しながら２ mM
ピルビン酸を含む KRB バッファー中で 20 分間

動物飼育・飼育中の測定項目

４週齢野生型 ICR 雄マウス 39 匹を，普通食＋前培養した。インスリン刺激を行う筋は前培養のカ ゼ イ ン 群（n ＝ ９）
，高脂肪食 + カゼイン群

段階から最終濃度 50mU/ml でインスリン刺激し（n=10），普通食＋白身魚群（n ＝ 10），高脂肪食た。 骨 格 筋 へ の グ ル コ ー ス の 取 り 込 み は，2-＋カゼイン群（n ＝ 10）の４群に分けた。マウ［3H］-deoxy-D-glucose（1.5 nCi/ml）お よ び D-

スは，室温 22 ±２℃に保たれた飼育室（明期：［14C］-mannitol（0.3 nCi/ml）を含む KRB バッフ

暗期 12 時間サイクル）にて，それぞれの食餌おァーで 30℃，10 分間インキュベートし，骨格筋よび水を自由に摂取させながら，12 週間飼育した。 にとりこまれた放射活性を測定した。結果は１時
飼育期間中，体重 , 血糖値，摂食量を随時測定し間における取り込み量として算出した 6）。

た。また飼育開始８週目に耐糖能テストを行った。

2. 4

耐糖能テストはグルコース（100mg/ml）をマウ

凍結した骨格筋は，粉砕したのちにサンプルのスの体重１ g あたり１ mg になるように腹腔注

10 倍量のホモジナイズバッファーを加えて，ホ射し，注射前（０分値），注射後（30 分，90 分）モジナイズしたのちに，13000rpm で 20 分間遠心

表１ウェスタンブロッティング

各群の餌の組成（カロリー比で表示）
普通食
高脂肪食 普通食
カゼイン カゼイン 白身魚（kcal） （kcal） （kcal）

タンパク質

カゼイン
スケトウダラ粉末

800

炭水化物

a コーンスターチ
デキストリン
シュークロース

1260
140
1400

食物繊維

セルロース＊

脂肪
ビタミン・ミネラル他

高脂肪食
白身魚（kcal）

800
0500
275.2

800

800

1260
140
1400

0500
275.2

0000

コーン油
ラード

225
180

225
2205

225
180

2252205

L- システイン
ミネラルmix（AIN76）＊
ビタミン mix（AIN76）
重酒石酸コリン＊

121212040004000400＊；重量として含まれているが，カロリーとしては０ kal のため０で表示。

120400魚由来タンパク質の筋インスリン抵抗性改善効果とそのメカニズムの解析

53し，上清を回収した 7）。タンパク濃度は Bradford

これは，高脂肪食摂取による骨格筋での糖取り込法により測定した。各サンプル 40 ng のタンパみの減少が起きていること，また，インスリン刺ク量となるようにサンプルを調整し SDS-PAGE

激による糖取り込みが正確に測定できていたことを行った後，PVDF 膜に転写した。メンブレンを示す。しかし，高脂肪食 - カゼイン食群と高脂は１次抗体（P-AMPK 抗体，b- アクチン）と４

肪食 - 白身魚タンパク質群の間には，安静時，イ度で一晩反応させ，その後 HRP- 標識２次抗体とンスリン刺激時両方とも有意な差は観察されなか１時間反応させた。検出は化学発光法により行っった（図 4）。糖取り込みの差は観察されなかった。

たが，そのシグナル伝達系に影響を与えないかに

3. 結

ついて代表的タンパク質である AMP キナーゼの果リン酸化をウェスタンブロット法により調べた。

マウスの実験開始前後における，体重変化，血糖値の変化と摂食量（匹／２週間）を表 2 に示し

図 5 に示すように，soleus, EDL ともに，AMPKリン酸化に差は観察されなかった（図 5）。

た。高脂肪食 - カゼイン群，高脂肪食 - 白身魚タ

4. 考

ンパク質群で有意な摂食量の増加と，体重の増加察が観察された。また，空腹時血糖も高脂肪食群で食品中の微量成分が AMP キナーゼを活性化さは有意な増加，さらに耐糖能テストにおける糖取せ，インスリン非依存的なメカニズムにより糖のり込みの有意な減少（図 2），各臓器の脂肪蓄積取り込みを増加させていることが報告されて（図 3）が観察され，肥満，高血糖，インスリンいる 3，4）。また，日本で古来より食されてきた重作用の低下の症状が観察された。しかし，高脂肪要なタンパク源の一つである大豆の摂取は，膵臓食 - カゼイン食群と高脂肪食 - 白身魚タンパク質からのインスリン分泌能を高めたり，全身性のイ群の間にはいずれも差が観察されなかった。

ンスリン感受性を改善したり，血漿プロファイル

骨格筋への糖取り込みは，三元配置による統計を改善するなど全身性に様々な効果が報告されて解析の結果，通常食群と高脂肪食群の間に有意ないる 8）。さらに骨格筋においては，大豆の長期摂差が（soleus, EDL ともに p ＜ 0.01），またコント

取によって AMP キナーゼ活性化による骨格筋でロール群とインスリン刺激群の間に有意な差がの糖取り込みの増加とインスリン感受性が報告さ（soleus；p ＜ 0.01, EDL；p ＜ 0.05） 観 察 さ れ た。

れている 5）。一方で，もう一つの重要なタンパク

表2

各群における体重，血糖値，摂食量

普通食
カゼイン
体重（g）
血糖値（mg/dl）
摂食量（kcal）
1 匹 /2week

高脂肪食カゼイン

飼育前18.1 ± 0.23

17.9 ± 0.18

飼育後48.3 ± 1.62

飼育前
飼育後

普通食
白身魚

高脂肪食
白身魚

18.8 ± 0.20

18.7 ± 0.21

66.2 ± 2.69**，

50.3 ± 2.17

68.3 ± 1.56**，##

77.2 ± 3.96

71.1 ± 5.54

66.9 ± 5.63

70.2 ± 4.96

126.6 ± 9.02

143.5 ± 8.61#

117.1 ± 8.57

157.6 ± 17.32#

194.4 ± 7.35

243.9 ± 13.4*

229.0 ± 22.5

317.1 ± 37.3*##*；普通食カゼイン群と比較して p<0.05 の危険率で有意差がある。
**；普通食カゼイン群と比較して p<0.01 の危険率で有意差がある。
#；普通食白身魚群と比較して p<0.05 の危険率で有意差がある。
##；普通食白身魚群と比較して p<0.01 の危険率で有意差がある。

54

浦上財団研究報告書

図2Vol.17（2009）

耐糖能テストの結果（a）経時変化と（b）グラフ下面積積算値*；普通食カゼイン食群に比べて p<0.05 の危険率で有意差あり（n=9 or 10）##；普通食白身魚群に比べて p<0.01 の危険率で有意差あり

図 3 各臓器における脂肪の蓄積*；普通食カゼイン食群に比べて p<0.05 の危険率で有意差あり（n=9or 10）**；普通食カゼイン食群に比べて p<0.01 の危険率で有意差あり#；普通食白身魚群に比べて p<0.05 の危険率で有意差あり##；普通食白身魚群に比べて p<0.01 の危険率で有意差あり

質源として食されてきた魚のタンパク質に関する研究はほとんどなされていない。

本研究では，日本人が古来より摂取してきた重要なタンパク質源である白身魚に注目し，「（１）魚由来タンパク質の筋インスリン抵抗性改善効果とそのメカニズムの解析

図455

Soleus（a）と EDL（b）における糖取り込み
インスリンなしの状態（Control；Con.）とインスリン刺激状態（Insulin；Ins.）での骨格筋の糖取り込みを測定。

高脂肪食により誘発されるインスリン感受性低下なかった。その原因としては（１）動物種差の違が同時に白身魚を摂取することで予防できるか，

い（２）脂肪摂取期間が 12 週間と長期にわたっそして（２）その機構が AMP キナーゼを介するているため，食事摂取による予防機能を超えてし経路に関係しているか」について検討した。

まった，などが考えられる。予備実験において短マウスへの高脂肪食モデルとして全カロリーの期間（４週間）の高脂肪食負荷を行ったが，耐糖60％を脂肪に置き換えて，12 週間の高脂肪食負能テストや血糖値に関して糖尿病症状を示さなか荷を行った。その結果マウスは，高血糖，インスったため，本実験では長期間の高脂肪負荷を実施

リン感受性の低下，体脂肪の蓄積と典型的な生活し全身性に糖尿病の症状を示すまで飼育した。食

習慣病の症状を示した。これらのマウスの骨格筋品成分は日常的に摂取するもので，薬剤ほどの強では，高脂肪食群で普通食群に比べ有意な糖取りい生理効果はないため本実験のような糖尿病を発込みの減少が観察されたが，白身魚タンパク食群症するほどの長期にわたる場合，もはや食品成分とカゼイン食群との間に差は観察されなかった。

のみで予防するのは困難であったのかもしれない。

ラットを用いた先行研究では白身魚摂取によりイ大豆の様々な効果は，大豆タンパク質（アミノ酸ンスリン抵抗性を予防できると報告されている組成）というよりもゲステイン，ダイゼインなどが 9），我々の今回の研究では同様な結果は得られのイソフラボン類が大きな役割を果たしていると

56

浦上財団研究報告書

図5

Vol.17（2009）

リン酸化 AMPK のウェスタンブロッティング（a）soleus（b）
EDL
AMPK のリン酸化抗体を用いて，アクティブな AMPK 量を検討した。バンドはベータアクチンで規格化した。

考えられている。しかし，魚に関しては大豆のよ文

うに特異的有効成分が存在しているのか，またタ１） 厚生労働省

ンパク質（アミノ酸の組成）が魚の有効効果を発揮するのかについてはほとんど知られていない。
本研究で，魚の摂取が糖尿病予防効果を有するかについては，少なくとも糖尿病を発症した後では効果を期待するのは難しいようだ。より効果的な摂取方法とタイミングを検討することが今後の課題である。

献
国民健康・栄養調査 http://www.mhlw.

go.jp/houdou/2008/12/h1225-5a.html.
２） Fujii N, Jessen N0, Goodyear LJ（2006）AMP-activatedprotein kinase and the regulation of glucose transport.
Am J Physiol Endocrinol Metab 291： E867-877.
３） Murase T, Misawa K, Haramizu S, Hase T（2009）
Catechin-induced activation of the LKB1/AMP-activatedprotein kinase pathway. Biochem Pharmacol 78：78-84.
４） Egawa T, Hamada T, Kameda N, Karaike K, Ma X, etal. （2009） Caffeine acutely activates 5'adenosine
monophosphate-activated protein kinase and increases

謝辞

insulin-independent glucose transport in rat skeletalmuscles. Metabolism.

本研究を遂行するに当たりまして，多大な助成

５） Cederroth CR, Vinciguerra M, Gjinovci A, Kuhne F,を賜りました財団法人 浦上食品・食文化振興財

Klein M, et al.（2008）Dietary phytoestrogens activate

団ならびに関係各位に厚く御礼申し上げます。

AMP-activated protein kinase with improvement in lipidand glucose metabolism. Diabetes 57：1176-1185.

魚由来タンパク質の筋インスリン抵抗性改善効果とそのメカニズムの解析

57６） Hayashi T, Hirshman MF, Kurth EJ, Winder WW,

８） Bhathena SJ, Velasquez MT（2002）Beneﬁcial role ofGoodyear LJ （1998） Evidence for 5' AMP-activateddietary phytoestrogens in obesity and diabetes. Am J Clin

protein kinase mediation of the effect of muscle

Nutr 76： 1191-1201.

contraction on glucose transport. Diabetes 47：1369-1373.

９） Lavigne C, Tremblay F, Asselin G, Jacques H, Marette７） Sakamoto K, Arnolds DE, Fujii N, Kramer HF,A（2001）Prevention of skeletal muscle insulin resistance

Hirshman MF, et al.（2006）Role of Akt2 in contraction-by dietary cod protein in high fat-fed rats. Am J Physiol

stimulated cell signaling and glucose uptake in skeletal

Endocrinol Metab 281：E62-71.

muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab 291：E1031-1037.

58

URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.17（2009）

The effect of dietary cod protein on the muscle insulin resistance in mice fed ahigh fat diet
Yasuko Manabe（Department of Health Promotion Sciences, Graduate Schoolof Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University）

Both insulin and exercise（muscle contraction）induce glucose uptake in the skeletal
muscle in a separate pathway. Although patients with type II diabetes show decreased
glucose uptake caused by decreased insulin sensitivity in the skeletal muscle, the glucose
uptake after exercise is normal, which is mediated by insulin independent AMP kinase
pathway. Recent studies suggest that enhancement of AMP kinase pathway is mediated not
only exercise but some food ingredients. In this study, we tested whether feeding codprotein could prevent insulin resistance induced by high fat diet through the activation ofAMP kinase pathway. ICR male mice were divided into 4 groups. Mice in each group werefed the normal casein diet, high fat casein diet（60％ fat）
, normal diet containing cod protein,or high fat diet containing cod protein（60％ fat）for 12 weeks. In the group fed high fat dietcontaining either casein or cod, mice showed a severe insulin resistance in the glucose
tolerance test at 8-weeks. These mice also showed high blood glucose at 12 weeks. Glucose
uptake in high-fat fed mice was signiﬁcantly decreased compared with that in mice fed thenormal diet under condition of both the basal and insulin stimulation. However, there wasno significant difference in glucose uptake between mice fed casein containing diet andthose fed cod containing diet. These results suggest that feeding cod protein could notprevent the reduction of insulin sensitivity after onset of diabetes symptom. There will be
another angle to be considered to get the better effect of cod protein.