東海大学紀要農学部 36 (2017)

耐熱性カルボニル還元酵素の結晶構造解析と基質認識機構の解明

5

米田一成 * ・福田雄大 ** ・荒木朋洋 **東海大学農学部バイオサイエンス学科**

東海大学大学院生物科学研究科

10

短縮表題：耐熱性カルボニル還元酵素の 結晶構造解析

15

Crystal structure analysis of extremely thermostable carbonyl reductase andstructural basis for substrate recognition

20

Kazunari YONEDA, Yudai FUKUDA and Tomohiro ARAKI(Received 13 July 2016; accepted 28 July 2016)

脚注：連絡先米田一成

e-mail: kyoneda@agri.u-tokai.ac.jp

25
1

原稿

ABSTRACTThe highly thermostable NAD(P)H-dependent carbonyl reductase (CR; EC1.1.1.184) from the hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix K1 was30

crystallized using the sitting-drop vapor diffusion method with L -(+)-tartaric acid(tartrate) as the precipitant.

The crystals were found to belong to hexagonal spacegroup P6 1 22, with unit-cell parameters a = b = 109.8 Å, c = 243.7 Å, α = β = 90˚, andγ = 120˚, and diffracted to 1.80 Å resolution on beamline AR-NW12A at the Photon
Factory.
35

The crystal structure of A. pernix CR was determined in the presence ofNADPH and the substrate analog, tartrate.

The ternary complex structure of A.

pernix CR was determined using the molecular replacement method, and was refinedat a resolution of 1.80 Å with a crystallographic R-factor of 22.5% (R free 23.4%).
The asymmetric unit consisted of one homodimer.

The final structure showed goodgeometry with no Ramachandran outliers, and consisted of 494 amino acid residues,
40

two NADPH molecules, two tartrate molecules, and 490 water molecules.

In thepresent model, a portion of the surface loop in the C-terminal domain (M192-L197 insubunit A) was disordered and not visible on the electron-density map.

Based on theorientation of the tartrate, we modeled the ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate[(S)-CHBE] as a product into the active site cavity of the A. pernix CR.
45

Within thisstructure, the hydroxyl group of (S)-CHBE forms a hydrogen bond with the side chainof Ser141 and Tyr155.

Therefore, in this paper, we describe the structural

determination and structure of CR based on the (S)-CHBE recognition mechanism andS-specific reduction reaction mechanism.

2緒50

言

カルボニル還元酵素(CR, EC: 1.1.1.184)はアルデヒド, ケトンあるいはキノンなどの様々なカルボニル化合物の酸化還元 反応を触媒する NAD(P)H 依存性の酸化還元酵素である. CR はあまりに基質特異性が広い酵素であるため, 生体内において毒物などの生体異物を分解あるいは排泄するための代謝反応に広く関与する酵素であることが推測され ているが, 本来の生理的意義はほとんど明ら55かにされていない. これまでに分子量 や酵素化学的諸性質が異なる多様な CRが様々な生物種から発見されているにも関わらず （1-4）, 全ての CR は短鎖型脱水素酵素/還元酵素ファミリー（SDR ファミリー）に属す. この SDR ファミ
リーに属す酵素のアミノ酸配列には, 触媒において重要な役割を担うチロシン残基が保存されているアミノ酸モチーフ (S-YXXX K)および酸化還元酵素活性に60必須な補酵素 NAD(P)H の結合アミノ酸モチーフ (GXXX GX G), の 2 つの共通する配列が厳密に保存されていることが既に知られている （5）.
我々はこれまでにニワトリの脂肪肝特異的に発現する機能未知タンパク質がCR 活 性 を 有 す る 酵 素 で あ る こ と や , 基 質 特 異 性 の 解 析 か ら ethyl
4-chloro-3-oxobutanoate (COBE)を良好な基質として, NAD(P)H 依存的に還元し,65(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate [(S)-CHBE]を生産する 酵素であるという知見を見出している（6, 7）. この反応は産業応用上重要な知見であり, 基質 COBE を不斉還元することで, 高コレステロール血症治療薬である HMG-CoA 還元酵素阻害剤の原料として有用な(S)-CHBE を合成することが可能である（8, 9）. また, 本酵素の結晶構造解析にも成功しており, 他の生物種の CR では見られな70

いユニークな基質結合に関わるアミノ酸残基の特定にも成功している（7）. しかしながら, ニワトリ脂肪肝由来 CR は 3 日で酵素活性が半減してしまうほど非常に不安定な酵素であり, 酵素の応用展開には大きな問題が ある ことも判明していた.
3そこで, 我々はゲノムデータベースを利用し, ニワトリ脂肪肝由来 CR と相75

同 性 を 有 す る 好 熱 菌 由 来 の CR ホ モ ロ グ 遺 伝 子 を 検 索 し た 結 果 , 超 好 熱 菌
Aeropyrum pernix K1（最適生育温度 95℃）に 28%とわずかではあるものの, CRをコードしていると予測される遺伝子(ORF ID: APE_2503.1)を見出すことに成功した. 本酵素はもともと脂肪酸生合成経路に関わる酵素として知られている
3-オキソア シル -アシ ルキャ リアプ ロテイン還 元酵素 とアノテ ーショ ンされ て

80

おり, CR 活性を有するのか, また, (S)-CHBE を合成することが可能な酵素であるか 全く 不明 で あっ たが , 酵素 の クロ ーニ ング お よび 機能 解 析を 行 った 結果 ,本酵素が高度耐熱性を有す CR であり, また COBE を良好な基質とすることを明らかにしている（10）. 超好熱菌由来の CR の報告例はこれまでに無く , 安定性の高い CR は有用なキラル化合物合成などへの有効利用が期待できる と考え85られる. 本酵素はすでに NADPH との 2 者複合体の X 線結晶構造解析を行い,NADPH の認識機構や安定化のメカニズムを明らかにしている が, 基質複合体結晶の作成や立体構造解析には至っておらず, 基質認識に関わる詳細な分子メカニズムの 情報は 不明のままである（10）. そこで, 本研究ではこれまでとは異 な っ た 晶 系 の 結 晶 を 作 成 し , 立 体 構 造 解 析 を 行 う こ と で A. pernix

90

CR-NADPH-酒石酸（基質アナログ）の 3 者複合体の構造決定を行うとともに, 基質 結 合 部 位 に 結 合 し て い た 酒 石 酸 の 構 造 に 基 づ い て CR の 反 応 産 物 で あ る(S)-CHBE をモデリングすることにより CR の基質認識機構および反応機構を考察した.

954材料および方法
100
試薬タン パ ク質 結 晶化 キ ット で あ る Crystal Screen お よ び Crystal Screen 2 はHampton Research（米国）から購入した. 96 穴結晶化プレートは Rigaku（東京）か ら 購 入 し た . L -(+)- 酒 石 酸 ナ ト リ ウ ム カ リ ウ ム 四 水 和 物 , 及 び105

[ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)] HEPES は ナ カ ラ イ テ ス ク（京都）より入手した.

その他の試薬は市販の特級または生化学用試薬を用いた．

耐熱性 CR の発現, 精製および結晶化
110

超好熱菌 Aeropyrum pernix K1 由来 CR の大腸菌を用いた発現, 精製は Fukuda
らの方法に従って行った（10）. MICROCON YM-30（Millipore, 米国）を使用
し精製酵素を 5.1 mg/ml まで濃縮後, 還元型補酵素である NADPH および酵素反応のプロダクトである(S)-CHBE をそれぞれ終濃度 0.2 mM になるように加え,シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて結晶化スクリーニングを行った . す115

なわち, 96 穴結晶化プレートを使用し, 精製酵素 1 μl とリザーバー溶液 1 μl を混合した後, リザーバー溶液 100 μl と共に密閉し, 暗所（20℃）で約 1 ヶ月静置した.

120

X 線回折データ測定得られた結晶を用い, 筑波の高エネルギー加速器研究機構（ KEK AR-NW12Aビームライン）において X 線回折実験を行った. データ測定には気体窒素を吹き か け, -180℃の極低温条件下で測定を行うクライオ 測定の技術を用いた. ク5ライオプロテクタント（抗凍結剤）にはエチレングリコールを選択し, 結晶化
125

条件に終濃度 30%（V/V）になるようにエチレングリコール溶液を加え実験に用いた.
X 線の波長は 1.00 Å, 振動角度は 1 イメージにつき 1˚, 結晶から X 線二次元検出器（ADSC Quantum 270）までの距離は 213.91 mm に設定にした. データの処理には HKL2000（11）を用いた.

130
位相決定および構築した構造の精密化得られた X 線回折データを元に分子置換法を用いて, A. pernix 由来 CR のNADPH-基質アナログ 3 者複合体の位相決定を行った. 分子置換のプログラムには MOLREP（12）を用いた. サーチモデルには A. pernix 由来 CR-NADPH の135

2 者複合体の立体構造データ（PDB code = 5B1Y）を用いた.
プログラム COOT（13）を用いて 1-250 アミノ酸残基をアミノ酸配列通りに電子密度にフィッティングを行 った. その後, プログラム REFMAC5（14）および CNS（15）により構造の精密化を行った. A. pernix CR の立体構造の妥当性（ペプチド結合の 2 面角の妥当性； , ψ 角）の評価は MOLPROBITY（16）を用い,

140

ラ マ チ ャ ン ド ラ ン プ ロ ッ ト で 解 析 を 行 っ た . (S)-CHBE の 座 標 フ ァ イ ル はChemDraw(HULINKSInc.)

およびPRODRG

サーバー(http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgi -bin/prodrg/)を用いて作成した . 水素結合の検 出 に は プ ロ グ ラ ム CCP4mg（ 17） を 用 い , 分 子 構 造 の 描 画 に は プ ロ グ ラ ムPyMOL (DeLano Scientiﬁc LLC.) を用いた.
145

6結果および考察
150
結晶化およびデータ測定
結晶化条件のスクリーニングを行ったところ, Crystal Screen No. 29 （0.1 MHEPES バッファーpH 7.5, 0.8 M L -(+)-酒石酸ナトリウムカリウム四水和物 ）の条件での単結晶の析出が確認できた. 更に, 沈殿剤である酒石酸の濃度を
155

0.4-1.0 M の範囲で条件展開することで約 0.3 mm のバイピラミッド型の単結晶を作成することに成功した（Fig. 1A）. 本結晶を用いて X 線回折実験を行った
ところ, 最高分解能 1.80 Å であり, 空間群は六方晶系である P6 1 22 であった
（Fig. 1B）. すでに報告している A. pernix 由来 CR-NADPH の 2 者複合体(PDBcode = 5B1Y)の解析に用いた結晶は 2.0 M NaCl を沈殿剤として得られた結晶で160あり, 最高分解能が 2.09 Å, 空間群 P4 3 2 1 2 であったことから, 本研究ではこれまでとは異なった晶系の結晶作成および, より高分解能なデータ収集を行うことができた.

“Fig. 1 を挿入”
165
立体構造解析および全体構造解析の結果, 活性中心には水以外の分子と予測される 明瞭な電子密度が観察されたため, クライオの測定溶媒に用いたエチレングリコール分子と予測して,電子密度にアサインしたものの , エチレングリコールが 2 分子分以上入る大き170さの電子密度であり, カルボキシル基と予測される形状の電子密度も観察された. そこで, 結晶化試薬として高濃度使用した酒石酸の存在が予測されたため,電子密度にアサインしたところ , ぴったり当ては まり, 活性中心に観測された電子密度を酒石酸として解釈することができた. また, NADPH は電子密度へ容7易 に フ ィ ッ テ ィ ン グ す る こ と が 可 能 で あ っ た . 最 終 的 に A. pernix 由 来175

CR-NADPH-酒石酸の 3 者複合体を R 値= 0.225, free R 値= 0.234 で構造決定することに成功した(Table 1). 非対称単位中にはホモダイマーが 1 分子存在しており, 494 アミノ酸残基, 2 分子の NADPH, 2 分子の酒石酸, 490 の水分子で構成されていた（Fig. 2）. また, マシューズ係数は 3.49 Å3 Da -1 , 結晶中の溶媒含有量は 64.5%であった. MOLPROBITY を用いたラマチャンドランプロットの解析 の180

結果, 全てのアミノ酸残基が許容範囲内 で あった. モノマー構造はロスマンフォールドドメイン（N 末ドメイン）と触媒ドメイン（ C 末ドメイン）の 2 つで構成されていた.
B サブユニットは Met1-Thr250 の 250 アミノ酸残基全てモデル構築することができたが, A サブユニットの分子表面のループ領域である Met192-Leu197 の 6185

アミノ酸残基は明瞭な電子密度が観察できず , アミノ酸をアサインすることができなかった. また, 本酵素は pET-15b（Novagen, 米国）をタンパク質発現用プラスミドとして使用している ため, His-tag 配列（20 アミノ酸）が CR の N 末端に付加されているが, 構造解析の結果, His-tag 配列の電子密度は観察されなかった. 結晶化の際に CR の酵素反応プロダクトである(S)-CHBE と共結晶化し190たものの, 結晶化の沈殿剤として使用した高濃度の酒石酸(0.8 M)が基質結合部位を占有し, (S)-CHBE は基質結合部位に結合しなかったと考えられる.
“Fig. 2 を挿入”
“Table 1 を挿入 ”

195

酒石酸複合体構造および(S)-CHBE のモデリング活 性 中 心 に 結 合 し て い る 酒 石 酸 の C1 カ ル ボ キ シ ル 基 は 触 媒 残 基 で あ る
Ser141, Tyr155 の 側 鎖 と 水 素 結 合 し て お り , 酒 石 酸 の C4 カ ル ボ キ シ ル 基 はArg248 の側鎖および, Val150, Ala151 の主鎖の NH と水素結合していた（Fig. 3A）.
8

また, 酒石酸のカルボニル基は Arg248 の側鎖と相互作用することを明らかに200した. 触媒残基である Lys159 は NADPH のニコチンアミドリボースのヒドロキシル基との水素結合していた（Fig. 3A）. 得られた酒石酸複合体の構造から C1カルボキシル基の部分が CR の基質のカルボニル基の位置に相当するのではないかと予測されたため, 活性中心に結合した酒石酸（基質アナログ）の配向か
ら CR の酵素反応産物である(S)-CHBE の結合モデルを構築し, これまで不明で205あった基質結合に関与するアミノ酸残基を同定した. モデリングの結果,(S)-CHBE のヒドロキシル基は触媒残基である Ser141, Tyr155 の側鎖と水素結合しており, (S)-CHBE のカルボニル基は Arg248 の側鎖と水素結合していた（Fig.
3B）. また Val150 が(S)-CHBE の酸素原子および疎水性のエチル基と相互作用することが予測され, S 体選択的に反応が可能な配向で(S)-CHBE が A. pernix 由

210

来 CR の触媒部位に結合することが示唆された（Fig. 3B）. 補酵素 NADPH のニ
コチンアミド-リボース間の結合が syn 型の構造であることから NADPH のピリジン環の C4 位からの水素転移は si 面(pro-S; B-type) 特異的に起こると考えられることも S 体選択的に COBE の還元反応が可能な理由と言える.

215“Fig. 3 を挿入”

A. pernix CR とニワトリ脂肪肝 CR の構造比較
これまでの我々の研究により A. pernix 由来 CR およびニワトリ脂肪肝由来
CR の両酵素において COBE が良好な基質となることをすでに明らかにしてい220

る（7, 10）. COBE に対する親和性はニワトリ脂肪肝由来 CR の方がはるかに高い事をすでに報告している（A. pernix CR; K m = 0.7 μM, ニワトリ脂肪肝由来 CR;
K m = 0.008 μM）が, その分子認識機構は未だに不明であった . そこで, (S)-CHBEのモデリングを行った A. pernix CR の構造とニワトリ脂肪肝由来 CR (PDB code9

= 3WXB)の重ね合わせを行い, 活性中心に結合した(S)-CHBE の周辺構造を比較225

することで, 基質に対する親和性の違いについて考察した . A. pernix CR では(S)-CHBE のエチル基とクロル基の周辺に存在するアミノ酸は Val150, Phe187,Arg248 であるが, ニワトリ脂肪肝由来 CR では(S)-CHBE の疎水性のエチル基を疎水性アミノ酸である Tyr168, Tyr172 が認識するとともに, マイナスにチャージしているクロル基と Trp210 の NH がインタラクションし, (S)-CHBE の酸素原

230

子は構造上, Arg179 がインタラクトすることが推定された（Fig. 3B）. ニワト
リ脂肪肝 CR の Tyr168, Tyr172 は基質結合部位にフタをする役割の”Active sitelid” (Ile164-Gln174)内に存在するアミノ酸残基であり, 他の生物種の CR ではアミノ酸残基の保存性が全くないユニークな配列である. 特に, Y172 に関してはアラニン置換変異体の解析により, 基質である 9,10-phenanthrenequinone に対す

235

る K m 値が 12.5 倍上昇することをすでに明らかにしている（7）. モデリングの結果では Y172 が活性中心で(S)-CHBE を抑え込むような形でインタラクションすることが予測されることから, モデリングした構造と酵素化学的データの結果 が 良 く 一 致 してい ると言える. これらの結果 より, ニワトリ脂肪肝由来 CR
では A. pernix CR と比較して(S)-CHBE とのインタラクションがより強固にな240っていることを立体構造に基づき説明することが可能となった. これらの結果
は , 高 脂 血 症 治 療 薬 の 合 成 中 間 体 と し て 有 用 な キ ラ ル 化 合 物 で あ る (S)-CHBEに対するハイアフィニティーな酵素の 創製などへの応用利用に役立つ情報となりうる.

245



10

謝250

辞本研究を実施するにあたり, 貴重なご意見や様々な支援を頂きました大阪工業大学工学部生命工学科 大島敏久教授, 香川大学農学部応用生物科学科 櫻庭春彦教授に感謝いたします. また, X 線回折実験を行った機関である 高エネル
ギー加速器研究機構のスタッフの皆様に感謝します. 本研究課題に関する放射光実験は, 放射光共同利用実験採択課題 番号 2014G502 で実施されたものです.

255

260

265

270

11要275

約

カルボニル還元酵素(CR, EC: 1.1.1.184)は NAD(P)H を補酵素として様々なカルボニル化合物の還元反応を触媒する酵素である. 安定性の高い CR は有用なキラル化合物合成などへの有効利用が期待できる . 本研究では超好熱菌である
Aeropyrum pernix K1 由来の耐熱性 CR の NADPH-酒石酸（基質アナログ）との3 者複合体の結晶構造解析を行うとともに, CR の酵素反応産物である(S)-4-ク

280

ロ ロ -3-ヒ ドロキシ 酪酸エチ ル [(S)-CHBE]の構造を 活性中心 に モデリ ング した .
0.8 M L -(+)-酒石酸を沈殿剤として NADPH-酒石酸との複合体結晶を取得し, X線回折実験を行った結果, 最高分解能 1.80 Å のデータを取得し, 最終的に分子置換法により A. pernix CR-NADPH-酒石酸の 3 者複合体の構造を決定することに成功した. 触媒部位では Ser141, Tyr155 が酒石酸の C1 カルボキシル基との水285素結合に関与し, Lys159 は NADPH のニコチンアミドリボースの ヒドロキシル基 と の 水 素結合に関与していた. 酒石酸の構造に基づいて(S)-CHBE のモデリングを行ったこところ, S 体選択的に反応可能な配向で(S)-CHBE が基質結合部位に結合することが示唆された . これら構造情報 は, 高脂血症治療薬の合成中間体として有用なキラル化合物である (S)-CHBE 生産のための人工 CR 創製への290応用利用に役立つ情報となりうる.

29512引用文献3001) Wermuth, B. 1985, Enzymology of Carbonyl Metabolism 2 (T.G. Flynn, H. Weiner,eds.) Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 209-230.
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13

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335

340

345

14図表・説明文350

Fig. 1Fig. 1. Hexagonal crystals and X-ray diffraction pattern of A. pernix CR.

(A) A.

pernix CR/NADPH/tartrate ternary complex at 1 month in the crystallization stepusing the sitting-drop vapor-diffusion method at 20C.
355

the crystal were 0.3  0.3  0.1 mm.
pernix CR crystal.

The maximum dimensions of(B) The X-ray diffraction pattern of a native A.

The resolution is approximately 1.80 Å at the edge.

high-resolution area is enlarged (inset).
15TheFig. 2360

Fig. 2. The dimeric structure of A. pernix CR.
green and pink, respectively.
shown as a stick model.

The subunit A and B are shown inNADPH (magenta) and tartrate (yellow) molecules are

Oxygen and nitrogen atoms are shown in red and blue,respectively.

365

16

Fig. 3Fig. 3. The tartrate coordinated within the active site and the proposed binding modelfor the (S)-CHBE molecule.
370(A) Schematic representation depicting the interactions

between tartrate and A. pernix CR.
dotted lines.

The networks of hydrogen bonds are shown by

The tartrate molecule is shown as a stick model in yellow.

The final

σA -weighted Fo-Fc omit electron density map for tartrate is shown at the 1σ level.
(B) Comparison of the A. pernix CR active site pocket with that of chicken fatty liver17

CR and the proposed binding model of the (S)-CHBE.
375

The C4 atom of the pyridine

ring (a hydride acceptor site), and si- and re-faces are labeled.

NADPH (magenta)and (S)-CHBE (cyan) molecules are shown as a stick model.

The structures of A.

pernix and chicken fatty liver CR are shown in pink and blue, respectively.
nitrogen and chloride atoms are shown in red, blue and green, respectively.

380385390

395

18Oxygen,400

Table 1. Data-collection, processing, phase determination, and refinement statistics
for A. pernix CR.

Data collection
Wavelength (Å)
Temperature (K)Space group
Unit cell parameters (Å, ˚)

1.00
100
P6 1 22a = b = 109.8, c = 243.7
α = β = 90, γ = 120
50.00-1.80 (1.83-1.80)
230761680994
28.5 (29.6)
0.080 (0.307)
0.016 (0.061)
99.9 (100)13.1

Resolution range (Å) a
No. measured reflections
No. unique reflections
Redundancy a
R merge a
R p.i.m. aCompleteness (%) aI/σ(I)
Refinement
Resolution range (Å)
R/R free bNo. of protein atoms
No. of water molecules
No. of ligands

35.5-1.80
0.225/0.234
3735
490
NADPH, 2
Tartaric acid, 2RMSD
Bond lengths (Å)
Bond angles (˚)
Average B-factors (Å 2 )Protein atoms
Water molecules
NADPH molecules
Tartaric acid molecules
Ramachandran quality cFavored regions (%)
Outliers (%)

0.025
2.3
21.0
36.9
44.1
41.3
96.5
0.0a405

Values in parentheses are for the last resolution shell.
R free was calculated with randomly selected reflections (5%).
cMOLPROBITY (16) was used to monitor and validate the structural model.
b410

19