ISSN

Vol. 38

東海大学紀要 農学部

PROCEEDINGSOFSCHOOL OF AGRICULTURE
TOKAI UNIVERSITY
2 0 1 9東海大学紀要 農学部
第 38 巻
2

Protein identiﬁcation using amino acid composition analysis

2432－7204

01

9……… Arisa Kikuchi, Sayaka Kumamoto, Chika Hosozawa, Takeshi Shibata and Tomohiro Araki……１
Study on improvement for protein identiﬁcation method by amino acid composition

Genome-wide transcriptome analysis in Rapid cycling Brassica rapa（Fast Plants type）

アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定手法の検討
第三八巻……………………………………………… Shun Furuta, Sayaka Kumamoto and Tomohiro Araki……13……………………………………………………………… Misaki Sakaba and Takahiro Kawanabe……23………………………………………菊地亜里沙・熊本紗也加・細澤知香・芝田猛・荒木朋洋……１
アミノ酸組成によるタンパク質同定手法の精度向上に関する研究…………………………………………………………………古田

A survey on the Transition of Mental Health of University Students by UPI Test

舜・熊本沙也加・荒木朋洋……13

アブラナ科植物 Fast Plants における全ゲノム転写解析and the Inﬂuence of the Earthquake Disaster…………………………………………………………………………………坂場美咲・川邊隆大……23……………………………………………………………………………………… Ryuta Kuroyama……29

UPI による大学生の精神的健康の変遷と震災の影響に関する実態調査………………………………………………………………………………………………黒山竜太……29

Academic English and Curriculum Development: Materials Evaluation
Under a Content Based Instruction（CBI）Rationale

アカデミック英語とカリキュラム開発：内容を重視した英語教育における教材評価………………………… Miki Rodriguez-Yagi・Ian Isemonger・Michael J. Rupp・Daniel Minor……39…………………………………………………………………………………ロドリゲス八木美樹……39
二〇一九

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東海大農紀要 38：１－11（2019）

アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定

アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定手法の検討

菊地亜里沙 ・熊本紗也加 ・細澤知香 ・芝田猛 ・荒木朋洋
１

１

１

２

３

Protein identiﬁcation using amino acid composition analysis
Arisa KIKUCHI, Sayaka KUMAMOTO, Chika HOSOZAWA, Takeshi SHIBATA and Tomohiro ARAKI（Received 3 December 2018; accepted 28 January 2019）
ABSTRACT
Currently, identiﬁcation of proteins is carried out by using partial sequence information in peptides obtained by enzymatic
digestion using mass spectrometry. This study examined a new protein identiﬁcation method using amino acid composition
analysis. Since identifying a protein from the amino acid composition ratio of the whole protein use the information different
from the conventional method, new identiﬁcation results may be obtained. First, proteins in beef meat were identiﬁed, and theresults were compared with conventional methods. Next, in order to evaluate the identification accuracy of this method,lysozymes carrying amino acid substitution with 1 to several residues were identiﬁed. Pigeon milk, protein components are
unknown，was subjected to SDS-PAGE, and some proteins were identified by amino acid composition analysis anddetermined keratin as major component. From these results, it was considered that the amino acid composition analysis could
identify the sample separated by SDS-PAGE.

プロテオーム解析は通常，生物の組織を2次元電気泳緒言動によって分離し，ディファレンシャルディスプレイにゲノムはスプライシングを経て mRNA となり，転写よって検出された特異的なタンパク質を質量分析によっや翻訳を経て最終的にタンパク質になる．生体内に存在て同定するもののほか（4），翻訳後修飾を解析するためする非常に多種多様なタンパク質はスプライシングによの modiﬁcomics（5），および定量を目的としたりタンパク質をコードする遺伝子の組み合わせを多種多quantitative proteomics（6）様に変化させることで可能となる（1）．すなわち全てのproteomics はシステイン残基に特異的に結合する同位体

タンパク質はゲノム情報から作られており，タンパク質

コードアフィニティータグ（ICAT）法（6）やアミン特はゲノムから作られる唯一の物質である．このゲノムか異的タグを使用する iTRAC 法（7）などがありこれらをら作られる全てのタンパク質はプロテオームといい，生用いた研究が近年盛んにおこなわれている．

がある．Quantitative

体内で発現しているタンパク質を網羅的に解析すること

質量分析は分離・検出したタンパク質を酵素消化後，をプロテオーム解析という（2）．タンパク質は時期や場得られたペプチド断片をペプチドマスフィンガープリン

所など条件によって発現するタンパク質の構造や機能がト法（PMF 解析）（3，5），シークエンスタグ法（8），変化するためプロテオーム解析では非常に多種類のタンあるいはデノボシークエンス法（9）により分析し同定

パク質を網羅的かつ迅速に同定することが重要である

する．最もハイスループットな PMF 解析はタンパク質（3）．

の酵素消化後，得られたペプチド混合物の質量スペクト
ルをデータベース上に存在する理論的なペプチドの質量１

東海大学大学院農学研究科

２

東海大学農学部総合農学研究所

３

東海大学農学部バイオサイエンス学科

連絡先：荒木朋洋

e-mail:araki@agri.u-tokai.ac.jp

パターンと比較する方法である． PMF 解析はマススペ
クトルを理論値と比較する方法であるため，ゲノム未知
生物種由来タンパク質のようなデータベース上に存在しないタンパク質は同定が困難な場合がある．また近年は
─1─

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菊地亜里沙・熊本紗也加・細澤知香・芝田

猛・荒木朋洋質量分析で得られた MS/MS スペクトルから SEQUEST

卵白から精製した凍結乾燥物を使用した（15）．リゾ

や Mascot を用いて検索し，理論値と比較して同定するチームは凍結乾燥物または精製標品を 1 mg/ml または 2手法が用いられる（10）．このように質量分析はゲノム

mg/ml になるように蒸留水に溶解し，調製した．牛肉は既知生物のプロテオミクスにおいて汎用的に使用されてサーロインを用いた．ピジョンミルクは２～６歳のドバいるが，ゲノム未知生物に対して精度が落ちる点に加えト個体がヒナに排出したものを採取した．

て，前処理が煩雑であることや，機器やその維持費が高額であり，分析機の種類によって熟練した操作を必要と試薬するといった問題点がある．そこで本研究ではアミノ酸

還元剤 β- メルカプトエタノール（β-ME）は GE ヘ

を正確に定量できるアミノ酸組成分析を用いてタンパク

ルスケアから購入した．そのほかの試薬は市販の特級ま質の同定を試みた．アミノ酸組成分析によるタンパク質

たは生化学用試薬を用いた．

同定手法はタンパク質を加水分解しそのアミノ酸組成比を使用し同定する方法である．プロテインシークエン

SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

サーや質量分析を用いたタンパク質同定はタンパク質のSDS-PAGE は Laemmli らの方法にしたがって行った

部分配列情報を基にタンパク質を同定するため，アミノ（16）．すなわち，分離ゲル用緩衝液は，トリス（ヒドロ

酸組成分析はこれらの手法とは全く異なるアプローチのキシメチル）アミノメタン 18.2 g ，1 M 塩酸 24 ml ，ド手法である．プロテオーム解析手法としてのアミノ酸組

デシル硫酸ナトリウム（SDS）0.4 g を蒸留水に溶解し成分析の利用は ExPASy の AACompIdent（11）や本研

た後，pH を8.8 に調整後，全容を100 ml にフィルアッ究室で開発した同定ソフト（12）などがあるが，本研究プした．濃縮ゲル用緩衝液は，トリス（ヒドロキシメチ

室で開発されたソフトは独自のアルゴリズムで設計してル）アミノメタン6.0 g，1 M 塩酸48 ml，SDS 0.4 g を蒸おり，さらにアミノ酸組成分析で得られたデータをダイ

留水に溶解し，pH6.8に調整後，全容を100 ml にフィル

レクトにソフトに読み込むことが可能であることに加えアップした．アクリルアミド / ビス混合酸はアクリルア

生物種の指定や特定のアミノ酸を除く細かい補正が可能

ミド（モノマー）30 g，N,N- メチレンビスアクリルアであるという優位性がある．AACompIdent は質量分析

ミド0.8 g を蒸留水に溶解後，全容を100 ml にフィルアッやアミノ酸配列分析手法であるプロテインシークエン

プした．10%（w/v）過硫酸アンモニウム（APS）溶液

サーとの比較検討や他手法と組み合わせて同定を行い精は過硫酸アンモニウム0.1 g を蒸留水1 ml で溶解した．

度の向上が見られた報告（13,14）があるが，本研究室

SDS 試料調製溶液はグリセリン2.0 ml，濃縮ゲル用緩衝で開発したソフトは他手法との比較検討は行われていな

液2.5 ml，β-ME 1 ml，SDS 0.4 g を加え，更に0.2 % ブ

い．本研究は牛肉中に含まれるタンパク質をプロテイン

ロモフェノールブルー（BPB）を含むメタノール溶液をシークエンサー，質量分析，およびアミノ酸組成分析の0.1 ml 加え，蒸留水で10 ml にフィルアップした．電気3 手法を用いてタンパク質を同定し，アミノ酸組成分析

泳動用緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタによる同定の特性を検討した．次に配列相同性が高いキ

ン6.0 g，SDS 1 g，Gly 28.8 g を蒸留水に溶解し，0.2 %ジ目近縁10種の卵白リゾチームをアミノ酸組成分析を用

ブロモフェノールブルー（BPB）を含むメタノール溶液

いて同定することでアミノ酸置換と同定精度の関係を調

0.1 ml を加え蒸留水で1000 ml にフィルアップした． タ

べた．さらにタンパク質成分が不明であるピジョンミル

ンパク質試料は材料および方法に述べたタンパク質溶液

クを試料としてアミノ酸組成分析を用いて同定を行い，と SDS 試 料 調 製 液 を1 : 1で 混 合 し，100 ℃ で2 min の

未知試料に対してもアミノ酸組成分析が有効であること

SDS 化を行った．電気泳動は濃縮ゲルで15 mA，分離ゲを明らかにした．

ルで20 mA で通電した．
トランスブロッティング

材料および方法

トランスブロッティングはセミドライ式で行った．ブ材料

ロッティング緩衝液は CAPS 緩衝液を用いた．まず，3-

本 研 究 に 用 い た ニ ワ ト リ 卵 白 由 来 C-type lysozyme

シクロヘキシル -1- プロパンスルホン酸（CAPS）11.1 g（HEL ; Hen egg lysozyme Code No. 100940）は生化学工業

で調製後，蒸留水で550 ml にフィルアップし保存溶液

株式会社から購入したものを使用した．キジ科鳥類卵白とした．ブロッティング緩衝液は，CAPS 保存溶液（pH由来リゾチームは陽イオン交換クロマトグラフィーにて11.0）：メタノール：蒸留水（1：1：8）の溶液に0.1 %─2─

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アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定になるように SDS を加えたものを調製した．膜は，BLAST 解析

Poly Vinilidene Diﬂuoride（PVDF 膜，Bio-Rad 製 ） を 使

Basic Local Alignment Search Tool（BLAST） 解 析 は，用した．ブロッティングはセミドライ式ブロッティング

データベース上に登録されている配列と，質量分析で得装置（ホライズブロット4 M-R WSE-4040・M 型，ATTOられた MS / MS 解析の配列（デノボシークエンス）を製）を用い，120 mA，2時間ブロッティングした．ブ

相 同 性 検 索 し て 同 定 し た（17）． す な わ ち，National

ロッティング後，染色前の PVDF 膜は蒸留水で５分間

Center for Biotechnology Information（NCBI http://www.

振盪・洗浄を計４回行った．洗浄後，Coomassie Brilliant

ncbi.nlm.nih.gov/）内の BLAST を用いて解析を行った．

Blue （CBB）で10秒間染色し，その後，15分間脱色した．

データベースは，Non-redundant protein sequence（nr）をさらに脱色後，蒸留水で５分間振盪・洗浄を計４回行い，選択した．アルゴリズムは blastp（ protein － protein blast ）20% メタノールにより５分間振盪・洗浄を計２回，50%を選択した．

メタノールにより５分間振盪・洗浄した．
牛肉タンパク質の粗抽出液の調製
アミノ酸組成分析

牛肉は脂肪や筋を切り分け，乳鉢でホモジナイズし1

PVDF 膜に転写したタンパク質バンドは12 mm 試験管

g 測り取った．試料は重量の10倍量の蒸留水を加えホモ内で十分に乾燥させた後，0.05% β-ME を含む混合酸

ジナイズし4000 g，15 min，4 ℃で遠心分離を行った．

（6 M HCl：トリフルオロ酢酸（TFA）=2：1）500 μl を

上清を回収し，粗抽出液とした．

加え，減圧下で封管後，110 ℃ で24時間加水分解を行った．加水分解物は減圧乾固した後，100～200 μl の0.02

ピジョンミルクの脱脂

M HCl に溶解し，0.45 μm のメンブレンフィルター（日試料は 0.2 ～ 0.5 g 計りとり，その重量の 2.5 倍量の蒸本ミリポア製 Cosmonice Filter φ 2 mm）で濾過した．

留水を加えて乳鉢でホモジナイズした．ホモジナイズ後試料は高速アミノ分析計 L-8900（日立製作所製）を溶液と等量のヘキサンを加えて激しく振った後，室温で用いてアミノ酸組成分析を行った．定量は外部標準法に8000 g 10 min 遠心分離後凍結乾燥し脱脂試料とした．

より加水分解の影響により脱アミド化されそれぞれ Asp

脱脂試料はその重量に対して 10 倍量の蒸留水を加えホと Glu になる Asn や Gln，その構造が破壊される Cys や

モジナイズした．試料溶液は 11200 g 4 ℃ 10 min 遠心分

Trp を除く，全20種類中16種類のアミノ酸で行った．

離し，上清を可溶性画分，沈殿を不溶性画分とした．
不溶性画分は重量に対して 15 倍量の SDS 試料調製溶液

N 末端配列分析

または膨潤緩衝液を加えホモジナイズした．SDS 試料

N 末端配列分析は，PVDF 膜からタンパク質バンドを調製溶液を加えた試料は 8000 g ，10 min 室温で遠心分切り取り，PPSQ⊖21A プロテインシークエンサー（島津離し，上清を SDS-PAGE 用試料とした．膨潤緩衝液を製作所製）を用いて行った．

加えた試料は固形分を取り除き，２次元電気泳動用試料
とした．

質量分析
SDS 電気泳動後のゲルはタンパク質バンドを切り取り，アミノ酸組成分析によるタンパク質同定

チューブ内で0.06 μg のトリプシンを加え，37 ℃で8時

アミノ酸組成情報を用いたタンパク質の同定はアミノ間トリプシン分解を行った．トリプシンペプチドは，50

酸組成分析による同定システム（特開 2010-96501）を

μl の 0.1% ギ酸 / アセトニトリルで抽出し，減圧濃縮機使用した．本システムは未知のタンパク質のアミノ酸組で 5 μl まで濃縮した．試料は Zip Tip による前処理を行

成クロマトファイルデータ（アミノ酸組成分析計より得い，Electro Spray Ionization（ ESI ），Quadrupole（Q）－

られたデータの ESD ファイル）を読み込ませることにTime Of Flight（ TOF ）（API QSTER Pulsar i : AB SCIEX

より，アミノ酸組成比（mol%）を求め，データベース

製）を用いて MS/MS（デノボシークエンス）による質上に存在するタンパク質のアミノ酸組成比の理論値との量分析を行い，フラグメントイオンの間隔から目視で配比較からタンパク質を検索する．同定用データベースは列を読んだ．質量校正方法はチューニングソリューショ

Uni-Prot 上に登録されている全タンパク質アミノ酸配列

ンキット（AB SCIEX 製）を用いた．

情 報 を 利 用 し，20種 類 の ア ミ ノ 酸 の ア ミ ノ 酸 組 成 比（mol%）として作成した組成比データベースを用いた．
タンパク質の同定において，Asn および Gln は加水分解
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菊地亜里沙・熊本紗也加・細澤知香・芝田

猛・荒木朋洋により脱アミド化されそれぞれ Asp と Glu になること

同性検索を行った．同定の基準は，E-Value が0.001 以下から，同定に用いるデータベースでは Asn と Gln の量であること（18）および分子量が電気泳動の結果と矛盾をそれぞれ Asp と Glu に残基数を合算して使用した．

しないこととした．その結果，8 バンド中２バンド（E

スコアは理論アミノ酸組成比（mol%）と実験によっておよび K）でタンパク質が同定できた（Table 1）．同定得られたアミノ酸組成比（mol%）とのマッチングによで き た 2 バ ン ド は16-17残 基 の 配 列 情 報 が 得 ら れ，り算出した．理論値－実験値 =0（完全一致）である場合，
スコア100となる．
同定システムの検索条件は牛肉とキジ科 10 種の卵白由来リゾチームで生物種を脊索動物に指定して検索をkDa行った．ピジョンミルクは発酵している可能性があり，微生物由来のタンパク質が含まれる可能性もあるため，生物種の指定を行わなかった．タンパク質同定は Gly，
Ser および Tyr のいずれかを除く補正と PVDF 膜のみで加水分解を行ったブランクにおいて検出されたアミノ酸による補正を行った．

結果および考察

97.2

M

66.4

L
K
J
I
H
G
F
E
D
C
B
A

牛肉のタンパク質同定
牛肉は可溶性タンパク質試料を SDS-PAGE で分離し，プロテインシークエンサー，質量分析およびアミノ酸組
成分析を用いてタンパク質同定を行い，3 手法を比較し45た．また，アミノ酸組成分析は未知試料に対して対応可能であることを検討した．その比較として質量分析も未知試料を標的としたデノボシークエンスを行った．まず，

29

SDS-PAGE で分離したタンパク質バンド（Fig.1）はプ
ロテインシークエンサーによって全13 バンド中 3 つのバンド（E, G および K）においてアミノ酸配列が得られた（Table 1）．得られた配列は blastp によって配列相Table 1

Band

Sequence

Fig.1

Soluble protein from beef separated by SDS-PAGE.

Fig.1

Protein identiﬁcation by protein sequencer

First yields(pmol)

ResultE-value

M

-

-

ND

-

L

DTEKY

5.6

ND

-

K

VKIVTVKTKAYQDTKQ

9.7

Phosphoglucomutase-1

J

SQIV

9.1

ND

-

I

ENGD

1.3

ND

-

H

-

-

ND

-

G

PFGNTANLV

3.5

Guanylate cyclase soluble subunit beta-1

F

ALTPK

13.8

ND

15.0

1.0E-09

0.84

Accession
number

Q08DP0.1

P16068.1-

E

VKVGVNGFGRIGAMVTR

D

-

-

ND

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

7.0E-09
-

C

-

-

ND

-

B

-

-

ND

-

A

SPK

3.6

ND

-

P10096.4

─4─

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アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定
E-value が低く高精度の同定が行えた．得られた配列がドの断片化が不十分でプロダクトイオンが十分に生成せ6 残基以下だったバンド（I，J および L）は N 末端アミず，信頼性の高い配列情報が得られなかったことが原因

ノ酸量が 10 pmol 未満だった．バンド F は N 末端アミであると考えられた．

ノ酸量が13.8 pmol であったが，6残基しか配列が得られ一方，アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定は，なかったため，blastp の E-Value が高く同定ができなかっ同定したスコアが 60 以上であること，分子量が泳動結た．また，バンド G は 9 残基の配列が得られたが，果と一致すること，および生物種が近いまたは一致して

E-Value が高く同定できなかった．その原因は N 末端アいることとした．その結果，全13バンドすべてを同定す

ミノ酸量の収量が少なかったことが原因と考えられ，正ることができた（Table 3）また，全 13 バンド中 11 バン

確な配列が得られなかったと考えられた．他 5 バンド

ドでウシ由来のタンパク質を同定した．ウシのタンパク（B ～ D，H および M）は N 末端の翻訳後修飾が原因で質を同定できなかったバンド J および F はデータベース

あったと考えられた．以上の結果から，プロテインシー

上にウシのタンパク質が登録されていなかった．このこクエンサーは N 末端が翻訳後修飾を受けておらず，Nとから，データベース上に登録されていれば，分析サン

末端アミノ酸量質量が10 pmol あれば同定が可能である

プルの生物種を含めて同定できる可能性が考えられる．

と考えられる．質量分析はデノボシークエンスにより 6

以上の 3 手法による牛肉のタンパク質同定結果を比較～15残基の配列が得られた（Table 2）．得られた配列はした．その結果，3 手法全ての同定結果で一致するもの

blastp により配列相同性検索を行った．同定の基準ははなかった（Table 1～3）．プロテインシークエンサーとE-value の値が0.001 以下とした．その結果全13バンド中

質量分析の同定結果を比較した結果，両手法で同定でき

6 バンドを同定した（Table 2）．バンド A および B は2たバンドはなかった．プロテインシークエンサーとアミ

種類の配列が検出された．これは質量分析が非常に高感

ノ酸組成分析の同定結果を比較した結果，2 バンドが一度であり試料中に複数のタンパク質が混在すればそれら致した（K，E）．この 2 バンドは質量分析では同定可能が同時に検出されることから，SDS-PAGE で分離不十分な配列が得られなかった．アミノ酸組成分析と質量分析であった混入タンパク質を同定した可能性が考えられた．

では，4 バンドが一致した（D，F，G および L）．このまた，E-value の値が高く同定できなかったバンドや同4 バンドの N 末端は翻訳後修飾を受けていることが考え定可能な配列が得られなかったバンドは TOF-MS で検られ，ヒトやシロイヌナズナのタンパク質でほとんどの出されたペプチドに対する MS/MS を行った際，ペプチ

タンパク質の N 末端が修飾を受けている報告がある

Table 2

Band

SequenceM

V I/L A I/L HNA I/L VSVPLGEYGFQNAA I/L VRKJ

YVDDG I/L I/L S I/L I/L VK

AP-5 complex subunit beta-1

0.540

G3MZC5.1

Serum albumin

2.0E-04

P02769.4

0.380

Q8SPF8.1

Creatine kinase M-type

6.0E-05

Q9XSC6.2

Fructose-bisphosphate aldolase B

3.0E-05

Q3T0S5.1

6.0E-10

P19858.2

BPI fold-containing family B member 1
ND

G

GSSEVEQVQ I/LF

DWTTTQG I/L DG I/L SER

E

ND
VVSNPVD I/L I/L TYVAWKCAAccession
numberND

H

B

E-value

Protein name

ND

I

D

Protein identiﬁcation of beef meat extract by de novo sequence

L-lactate dehydrogenase A chainND

PFWNDE I/L APQ I/L K
AAHGGG I/L DR
HG I/L I/L VDE I/L I/L GQK
I/L W I/L I/L NT I/L NNR

3.0E-06

Q32KV0.1

Aspartate--tRNA ligase, mitochondrial

Phosphoglycerate mutase 2

5.0

A6QPU5.1

Protein transport protein Sec61 subunit alpha isoform 2

0.380

Q2KHX4.3

Chitinase-3-like protein 1

0.740

P30922.3

─5─

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菊地亜里沙・熊本紗也加・細澤知香・芝田
Table 3
Band

猛・荒木朋洋Protein identiﬁcation of beef meat extract by amino acid analysis

protein nameSpecies

Score

kDa

Accession
numberM

Transitional endoplasmic reticulum ATPaseBos taurus (Bovine)

69

96

Q3ZBT1

L

Serum albumin

Bos taurus (Bovine)

68

67

P02769K

Phosphoglucomutase-1

Bos taurus (Bovine)

63

62

Q08DP0J

Pyruvate kinase isozyme M1

Pongo abelii (Smatran orangutan)

78

58

Q5NVN0I

Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II subunit delta

Bos taurus (Bovine)

63

55

Q2HJF7H

Beta-enolase

Bos taurus (Bovine)

7147

Q3ZC09G

Creatine kinase M-type

Bos taurus (Bovine)

66

43

Q9XSC6F

Fructose-bisphosphate aldolase A

Rattus norvegicus (Rat)

78

40

P05065E

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Bos taurus (Bovine)

63

36

P10096

D

L-lactate dehydrogenase A chain

Bos taurus (Bovine)

62

36

P19858C

Carbonic anhydrase 3

Bos taurus (Bovine)

73

29

Q3SZX4B

Phosphoglycerate mutase 2

Bos taurus (Bovine)

70

29

Q32KV0A

Triosephosphate isomerase

Bos taurus (Bovine)

77

27

Q5E956（19）．ヒトと同じ哺乳類であるウシのタンパク質のほと同定精度の相関を明らかにすることを目的としてキジ科んどが同様に修飾を受けている可能性が考えられる．そ

10種の卵白由来リゾチームを用いた精度評価を行った．

のためプロテインシークエンサーでは同定ができなかっこれらのリゾチームは1～数残基のアミノ酸置換を有すたと考えられた．また，アミノ酸組成分析と質量分析でるため（Fig. 2），アミノ酸組成分析によるタンパク質同同定結果が異なったバンド A は，SDS-PAGE で複数の定精度が明らかになると期待できる．各リゾチームはバンドが重なっている可能性が考えられた．バンド B

SDS-PAGE により分離しアミノ酸組成分析によるタンパ

は質量分析で2つのタンパク質を同定したが E-Value のク質同定を行った．その結果，すべてのリゾチームで実低かった方のタンパク質がアミノ酸組成分析の同定結果際に用いたリゾチームがトップにヒットし，置換のあると一致した．したがって，アミノ酸組成分析ではメイン

ものはスコアが低く同定された（Table 4）．このことか

バンドのみを同定した可能性が考えられた．このように

ら，アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定は 1 残基

質量分析は高感度であるため微量のタンパク質が混ざっの置換があったとしても分別同定可能であることが明らて存在する場合，コンタミネーションの判別が難しいとかとなった．すなわちプロテインシークエンサーや質量考えられるが，アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同分析によるタンパク質同定は部分配列情報を基にタンパ

定は微量なコンタミは同定に影響せず，主要タンパク質

ク質を同定しているため，置換があった配列の情報が得を同定するため SDS-PAGE のような簡便なタンパク質られなければ分別同定を行うことが困難であると考えら

分離手法を用いた場合でも同定可能であることが明らかれる．一方アミノ酸組成分析はタンパク質全体の組成比となった．質量分析は通常 2 次元電気泳動を用いてタン情報を基にタンパク質を同定しているために置換部位のパク質を同定するがアミノ酸組成分析では簡便な分離手情報が必ず含まれるため，同定可能であると考えられる．

法である SDS-PAGE で十分なタンパク質同定が可能でそのためこのような分別同定はアミノ酸組成分析の利点あると考えられる．

の一つであると考えられる．

以上の結果から，N 末端の翻訳後修飾を受けていてもタンパク質の同定が可能である点，微量のコンタミであ

ピジョンミルクのタンパク質同定れば主要タンパク質を同定することが可能である点およ

実際のプロテオーム解析は様々な状態および様々な量

び SDS-PAGE で分離したタンパク質を簡便に同定できのタンパク質を同定する必要がある．そこでタンパク質

る点はアミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定の利点

成分未知であるピジョンミルクを試料として，アミノ酸であると考えられる．

組成分析を用いて主成分を同定した．ピジョンミルクは脱脂を行った結果，Fig. 3 のように 4 層の画分が得られ

キジ科 10 種の卵白由来リゾチームを用いた同定精度評価

た．A 層は不溶性のワックス様画分で，B 層は液体の画

アミノ酸組成分析は簡便な手法としてタンパク質同定分，C 層は沈殿の画分として得られた（Fig. 3）．ヘキサに有用であることを明らかにした．そこで配列相同性とン層は除去し，A 層は SDS 試料調製溶液を用いて溶解し，

─6─

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アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定

Fig.2
Fig. 2 Comparison of amino acid sequence of lysozymes from 10 species of Galliformes.
The positions with amino acid substitution compared with pavo cristetus lysozyme sequence are indicated by one letter code.
“※” indicates the site preserved in the whole lysozyme. ":" Indicates a site with strong similarity, "." Indicates a site of weak similarity（20）.
Table 4

Peacock
Peacockb

Himalayan
Reeves's Copper
Chickenmonal
pheasant pheasantpheasant

Satyr
tragopan

Kalij
Helmeted Japanese Golden
pheasant guineafowl pheasant pheasant

73(1)

79(1)

65(4)

66(4)

51(4)

64(6)

53(7)

50(7)

74(2)

85 (1)

79

78(2)

70(3)

70(3)

56(3)

69(5)

57(6)

55(6)

79(1)

Reeves'spheasant

81(1)

68(2)

83

61(5)

61(5)

51(4)

63(6)

49(8)

48(8)

71(3)

Copperpheasant

71(4)

69(3)

66(5)

75

67(3)

51(5)

65(5)

57(5)

50(8)

75(2)

Chicken

69(4)

71(3)

65(5)

68(3)

81

61(4)

57

61(4)

51(8)

72(4)

Satyr
tragopan

69(4)

74(3)

69(4)

69(5)

70(4)

71

68(6)

57(7)

57(7)

76(4)

Kalij
pheasant

62(6)

61(5)

63(6)

62(5)

51(8)

50(6)

84

58(6)

58(6)

63(4)

Helmetedguineafowl

57(7)

56(6)

52(8)

60(5)

63(4)

52(7)

59(6)

79

61(6)

60(6)

Japanesepheasant

56(7)

57(6)

51(8)

56(8)

53(8)

53(7)

62(6)

62(6)

78

59(7)

Goldenpheasant

82(2)

77(1)

75(3)

73(2)

67(4)

55(4)

73(4)

57(6)

52(7)

83

Himalayan
monal
pheasant

87aIdentiﬁcation of lysozyme isoforms carrying amino acid substitutionscda : Analyzed sample, b : Identified sample, c : Identified score of protein, d : Number of amino acid substitution.
Peacock (Pavo cristatus), Himalayan monal pheasant (Lophophorus impejanus), Reeves’s pheasant (Syrmaticus reevesii)，
Copper pheasant (syrmaticus soemmerringii), Chicken (gallus gallus), Satyr tragopan (Iragopan satyra), Kalij pheasant (Lophuraleucomelana ), Helmeted guineafowl (Numida meleagris), Japanese pheasant (phasianus versicolor), Golden pheasant(Chysolophus pictus)

─7─

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菊地亜里沙・熊本紗也加・細澤知香・芝田

猛・荒木朋洋上清を SDS-PAGE に供した．B 層と C 層は，そのまま

SDS-PAGE の結果，A 層から抽出されたタンパク質は，

凍結乾燥を行い，その凍結乾燥物から蒸留水を用いて可およそ55 kDa と52 kDa に主要バンドを確認した（Fig.

溶性画分を抽出した．可溶性画分の残渣は，SDS 試料調

4-I）．B，C 層由来の可溶性画分は66 kDa 付近に主要バ

製 溶 液 を 用 い て 溶 解 し， 上 清 を 不 溶 性 画 分 と し た．

ンドを確認した（Fig. 4-II）．B，C 層由来の不溶性画分
は， お よ そ55 kDa と52 kDa に 主 要 バ ン ド を 確 認 し た（Fig. 4-III）．
SDS-PAGE で分離したタンパク質は A 層由来のタン
パク質画分を 2 バンド（A-1，A-2），B，C 層由来の可溶性タンパク質は1バンド（可溶性バンド A）および不溶性バンドは 2 バンド（不溶性バンド A，B）を同定しFig.3

Hexane layer
A layer
B layerC layer

結果と一致すること，および生物種が近いまたは一致し

The defatted pigeon milk after centrifugation.

性バンド A は微生物由来の t-RNA リガーゼを同定した

た（Fig. 4 -I，II，III）．同定の基準は同定ソフトにて同定した時，スコアが 60 以上であること，分子量が泳動ていることとした． A-1 はケラチンタイプ II を同定し，A-2はケラチンタイプ I を同定した（Table 5，6）
．可溶

Ⅱ

Ⅰ

Fig.3
97 kDa97 kDa66 kDa66 kDaSoluble band A

A-1
A-2

45 kDa45 kDa

Ⅲ
Fig.4
Fig.4

97 kDa66 kDaInsoluble band A
Insoluble band B

45 kDaFig.4

Fig. 4 Result of SDS-PAGE
I : A layer，II : Soluble fraction，III : Insoluble fraction

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アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定（Table 7）．不溶性バンド A はケラチンタイプ II を同定れたケラチンはピジョンミルクが嗉嚢の内側の壁が厚くした（Table 8）．不溶性バンド B はケラチンタイプ I をなって剥がれ落ちてできたものという報告と一致した同定した（Table 9）．A-1および A-2 と不溶性バンド A（21）．しかし，同定されたタンパク質のスコアは低かっ

および B は同定されたケラチンのタイプが一致した．

た．これはヒットしたケラチンがハトの嗉嚢内でイン

このことから，A 層はヘキサン抽出の際，不溶性タンパ

キュベートされ，プロテアーゼによる分解を受けた可能ク質が沈殿してできたものであると考えられた．同定さ性があり，分解されたことにより組成比が変わりスコア

Table 5

Protein identiﬁcation of A-1

Protein nameSpecies

Score

kDa

Accession number
Q29S21

Keratin, type II cytoskeletal 7

Bos taurus (Bovine)

62

52

Keratin, type II cytoskeletal cochleal

Gallus gallus (Chicken)

58

54

O93532

Keratin, type II cuticular Hb1

Bos taurus (Bovine)

57

55

Q148H4

Keratin, type II cuticular Hb3

Bos taurus (Bovine)

56

54

A4FUZ0Keratin, type II microfibrillar, component 7C

Ovis aries (Sheep)

54

54

P15241

Score

kDa

Accession number

Table 6

Protein nameProtein identiﬁcation of A-2

Species

Keratin, type I cytoskeletal 18

Homo sapiens (Human)

59

48

P05783

Keratin, type I cytoskeletal 14

Gallus gallus (Chicken)

56

51

Q6PVZ1

Keratin, type I cytoskeletal 19

Homo sapiens (Human)

55

44

P08727

Keratin, type I cytoskeletal 19

Pongo abelii (Sumatran orangutan)

54

44

Q5R8S9Keratin, type I cytoskeletal 42

Rattus norvegicus (Rat)

53

50

Q6IFU7

Table 7

Protein identiﬁcation of soluble fraction band A

Species

Score

kDa

Accession number

Bacillus velezensis (Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum)

80

91

A7Z7V7

Bacillus licheniformis (strain ATCC 14580 / DSM 13 / JCM 2505 / NBRC 12200 /NCIMB 9375 / NRRL NRS-1264 / Gibson 46)

75

92

Q65FX8Lactococcus lactis subsp. cremoris (strain SK11)75

94

Q030E7

Ajellomyces capsulatus (Histoplasma capsulatum)

74

69

C0NDZ7

Streptococcus thermophilus (strain CNRZ 1066)

73

94

Q5M1L6

Table 8

Protein identiﬁcation of insoluble fraction band A

Protein nameSpecies

Score

kDa

Accession number

Keratin, type II cytoskeletal 2 oral

Homo sapiens (Human)

70

66

Q01546

Keratin, type II cytoskeletal 2 oral

Mus musculus (Mouse)

66

63

Q3UV17

Keratin, type II cytoskeletal 7

Bos taurus (Bovine)

65

52

Q29S21

Protein sey1

Aspergillus niger (strain CBS 513.88 / FGSC A1513)

64

96

A2QR20Keratin, type II cytoskeletal

Xenopus laevis (African clawed frog)

63

55

O93532

Table 9Protein nameProtein identiﬁcation of insoluble fraction band B

Species

Score

kDa

Accession number

Keratin, type I cytoskeletal 24

Homo sapiens (Human)

63

55

Q2M2I5

Keratin, type II cytoskeletal 6A

Homo sapiens (Human)

61

60

P02538

Keratin, type II cytoskeletal 6B

Homo sapiens (Human)61

60

P04259Keratin, type II cytoskeletal 6C

Homo sapiens (Human)60

60

P48668

Keratin, type I cytoskeletal 15

Ovis aries (Sheep)

60

49

O77727

─9─

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菊地亜里沙・熊本紗也加・細澤知香・芝田

猛・荒木朋洋の低下につながったと考えられた．また，ケラチンは多謝辞

くの種類がありハトのケラチンはαケラチンとβケラチンに大別でき，αケラチンはタイプ I が17種とタイプ II

タンパク質同定システムの開発にご協力いただいた，が16種そしてβケラチンは羽毛型が14種，ツメ型が５種

株式会社日立ハイテクフィールディングに厚く御礼申し

そしてウロコ型が７種報告されており（21）
，配列が類

上げます．

似しているものから全く異なるものがある．そのため，
嗉嚢内で非常に構造の類似したケラチンが発現しそれが参考文献

剥がれ落ちて微生物による発酵を受けスコアの低下につながった可能性も考えられる．また，現在 Uni-Prot 上に１）Lander, E.S. et al., Initial sequencing and analysis of the

登録されているトリ由来のケラチンは25件ありそのうち
ハトのケラチンは５件であった．この５件は全て羽毛型

human genome, 2001, Nature, 409, 860-921.
２）Kahn, P., From genome to proteome: looking at a cell's

で皮膚型はなく，皮膚型が高分子であるのに対し羽毛型

proteins, 1995, Science, 270, 369-370.

が低分子であり全く異なったタンパク質である．トリ由３）片山博之，小田吉哉，プロテオミクスの展望：夢物

来の組成比の近いタンパク質データがないことから，生語に終わらないために，2002, J.Mass Spectrom.Soc.

物種の違いに基づくスコアの低下につながった可能性がJpn.,50, 126-134.

ある．

４）Chevalier1, S., Macdonald, N., Tonge, R., Rayner, S.,

アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定はスコアのRowlinson, R., Shaw, J., Young, J., Davison, M. and低下が見られたものの十分な精度で同定を行うことが出

Roberts, R.A., Proteomic analysis of differential protein

来た． このことから，アミノ酸組成分析は未知試料にexpression in primary hepatocytes induced by EGF,

対して主成分の同定が十分な精度で行えると考えられる．

tumor necrosis factor a or the peroxisome proliferator
nafenopin, 2000, Eur.J.Biochem., 267, 4624-4634.
５）Reinders, J., Sickmann, A., Modiﬁcomics: Posttranslational要約

modifications beyond protein phosphorylation andglycosylation, 2007, Biomol. Eng., 24, 169-177.

現在，タンパク質の同定は質量分析を用いて酵素消化したペプチド中の部分アミノ酸配列情報を用いて行って

６）Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M.

いることが多い．本研究はタンパク質のアミノ酸組成を

H., and Aebersold, R., Quantitative analysis of complex

用いる新しいタンパク質同定手法を検討した．タンパク

protein mixtures using isotope-coded afﬁnity tags, 1999,

質のアミノ酸組成情報は従来の手法とは異なる情報であNat. Biotechnol., 17, 994-999.

るため，新しい同定結果が得られる可能性がある．そこ

７）Shadforth, I. P., Dunkley, T. P., Lilley, K. S. and Bessant,で，SDS-PAGE で分離した牛肉中のタンパク質について

C., i-Tracker: For quantitative proteomics using iTRAQ,

同定を行いその結果を従来の手法と比較した．その結果，

2005, BMC Genomics, 6, 145.

質量分析は分離不十分なタンパク質は複数同定され，

８）Mann, M. and Wilm, M., Error-tolerant identiﬁcation of

MS/MS で同定可能な配列を得られなかったバンドがpeptides in sequence databases by peptide sequence tags,

あった．プロテインシークエンサーは N 末端がブロッ

1994, Anal. Chem., 66, 4390-4309.

クや，収量不足で同定できなかったバンドがあった．一

９）Seidler, J. et al., De novo sequencing of peptides by MS/
MS, 2010, Proteomics, 10, 634-649.

方，アミノ酸組成分析は全てのバンドを同定した．次に本手法の同定精度を調べるため，１から数残基の配列置

10）Cottrell, J. S., Protein identiﬁcation using MS/MS data,
2011, J. Proteomics, 74, 1842-1851.

換があるリゾチームの同定を行った．その結果，すべてのリゾチームで１残基の配列置換を含め，分別同定可能

11）SIB, AAcompIdent（protein identification by aaであった．また，タンパク質成分が未知であるピジョン

Composition), https://web.expasy.org/aacompident/.

ミルクについて SDS-PAGE で分離した主要バンドにつ12）細澤知香，荒木朋洋，ゲノム未知生物種の特異的発いて主成分がケラチンであることを明らかにした．以上

現タンパク質の同定に関する研究，2015，東海大学の結果から，本手法は簡便な SDS-PAGE で分離したタ

大学院修士論文 .

ンパク質試料について，その主成分を迅速に同定できる

13）Wilkins, M.R., Ou, K., Appel, R.D., Sanchez, J.-C., Yan,

手法であることを明らかにした．

J.X., Golaz, O., Farnsworth, V., Cartier, P., Hochstrasser,
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アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定
D.F, Williams, K.L. and Gooley, A.A. , Rapid protein18）Friedrich, A., Ripp, R., Garnier, N., Bettler, E., Deléage,identiﬁcation using N-terminal "sequence tag" and amino

G., Poch1, O. and Moulinier, L., Blast sampling foracid analysis, 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun.,structural and functional analyses, 2007, BMC

221, 609-613.

Bioinformatics, 8, 62.

14）Cordwell, S.J., Wilkins, M.R., Cerpa-Poljak, A., Gooley,19）Bienvenut, W. V., Sumpton, D., Martinez, A., Lilla, S.,

A.A., Duncan, M., Williams, K.L. and Humphery-Smith,Espagne, C., Meinnel, T. and Giglione, C., Comparative

I., Cross-sepcies identiﬁcation of proteins separated bylarge scale characterization of plant versus mammal

two-dimensional gel electrophoresis using matrix-

proteins reveals similar and idiosyncratic N-αassisted laser desorption time of ﬂight mass spectrometry-acetylation features, 2012, Mol. Cell. Proteomics, 11,

and amino acid composition, 1995, Electrophoresis, 16,

M111.015131.

438-443.

20）DDBJ, ClastalW https://www.ddbj.nig.ac.jp/faq/ja/

15）Araki, T., Kuramoto, M. and Torikata, T., The amino acidexplain-three-symbols.html.

sequence of Lady Amherst's pheasant（Chrysolophus

21）Gillespie, M. J., Crowley, T. M., Haring, V. R., Wilson, S.

amherstiae）and golden pheasant（Chrysolophus

L., Harper, J. A., Payne, J. S., Green, D., Monaghan, P.

pictus）egg-white lysozymes, 1990, Agric.Biol.Chem.,

Donald, J. A., Nicholas, K. R., and Moore, R. J.,

54, 2299-2308.

Transcriptome analysis of pigeon milk production －role16）Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during
the assembly of the head of bacteriophage T4, 1970,

of cornification and triglyceride synthesis genes, 2013,
BMC Genomics, 14, 169.

Nature, 227, 680-685.
17）Altschul, S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman
D.J., Basic local alignment search tool, 1990, J. Mol.
Biol., 215, 403-410.

─ 11 ─

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東海大農紀要 38：13－21（2019）

タンパク質同定手法の精度向上

アミノ酸組成によるタンパク質同定手法の精度向上に関する研究
古田

舜 ・熊本沙也加 ・荒木朋洋
＊

＊

＊＊

Study on improvement for protein identiﬁcation method by amino acid composition
Shun FURUTA, Sayaka KUMAMOTO and Tomohiro ARAKI（Received 29 November 2018; accepted 18 January 2019）
ABSTRACT
Protein identiﬁcation using amino acid composition analysis identiﬁes proteins by amino acid composition delived fromhydrolyzed protein. In hydrolysis, Cys and Trp can not be recovered because the decomposition of their structures. In addition,
Ile-Ile bonding, Ile-Val bonding and Ile-Leu bonding cause the low recovery rate of amino acid. These amino acids cause thedecrease of the quality of protein identiﬁcation. Therefore, improvement of identiﬁcation was required by using Cys, Trp and
Ile factors for protein identiﬁcation. As a result, we established the improvement method for protein identiﬁcation using bycorrected value of Cys, Trp and Ile.

化後のタンパク質から得られたペプチド断片を質量分析

緒言計で検出した際の質量スペクトルをデータベース化されプロテオーム解析とは生体内で発現されるタンパク質た理論的な質量スペクトルの質量パターンと照合，比較を網羅的に解析することである（1）．生体内のタンパクする方法である（10）．この方法はハイスループットな質は遺伝情報から作り出されている．この全遺伝情報をタンパク質同定法として汎用されるが，ゲノム未知生物

ゲノムといい，ゲノムから発現されるタンパク質の総称

由来タンパク質のようなデータベース上に存在しないタをプロテオームと呼ぶ．ゲノムは同じ生物種であれば同ンパク質は同定が困難である．そのような場合には，検じ遺伝子情報を持つが，プロテオームは時期や生育環境出したペプチドは二次マス（MS/MS）解析を行い，得などの違いによって発現するタンパク質が変化する．こられたフラグメントイオンの質量差からアミノ酸配列情のことからプロテオーム解析はそれぞれの条件下で発現報を得るデノボシークエンス法で，得られたアミノ酸配しているタンパク質を網羅的に同定する（2）．プロテ

列情報を用いて配列相同性からタンパク質を同定する．

オーム解析におけるタンパク質の同定は一般的に質量分これらの解析法はプロテオミクスにおいて汎用されてい析計を用いて行われる．生物の組織または細胞のタンパ

るが，前処理が煩雑であることや，機器やその維持費がク質を 2D-PAGE により分離し（3），ディファレンシャ

高額である．一方，アミノ酸組成分析計はタンパク質をルディスプレイによって検出された特異的なタンパク質

加水分解したのち，アミノ酸組成やアミノ酸含有量を正を同定する（4，5）．

確に定量することが可能である（11）．本手法の特徴はタンパク質はゲル中で酵素消化後，得られたペプチド

質量分析とは同定の際に用いる情報が大きく異なってい断片を質量分析計で検出し，ペプチドマスフィンガープ

るという点である．質量分析計を用いた同定法は部分ア

リント法（PMF 解析）やデノボシークエンス法などのミノ酸配列情報を用いて同定を行うが，アミノ酸組成を解析法を用いて同定する（6-9）． PMF 解析は，酵素消用いた同定手法はアミノ酸組成比情報を用いる．その情報の性質の違いから新しい視点からのタンパク質同定が東海大学大学院農学研究科＊＊＊

東海大学農学部バイオサイエンス学科

連絡先

荒木朋洋

e-mail:araki@agri.u-tokai.ac.jp

期待される．この同定手法はプロテオーム解析に一般的に活用されていないが，プロテオーム解析での有意性が
見 出 さ れ て い る（12）． ま た，Swiss Institute of─ 13 ─

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13

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古田

舜・熊本沙也加・荒木朋洋

Bioinformatics の ポ ー タ ル サ イ ト ExPASy に は

試薬

AACompIdent（13）というアミノ酸組成比を用いたタン

還元剤 β - メルカプトエタノール（β-ME）は GE ヘ

パク質同定ツールが公開されており，このツールを用い

ルスケアから購入した．そのほかの試薬は市販の特級また研究もいくつか報告されている（14，15）．本研究室

たは生化学用試薬を用いた．

でもアミノ酸組成分析によるタンパク質同定システム（Ver 1.2；特開2010-96501）を開発した．以上のように試料の調製
各タンパク質試料は精製標品を 1 mg/ml になるように

プロテオーム解析におけるアミノ酸組成分析の利用はこ

蒸留水に溶解し，調製した．

れまでいくつか報告されている（16）．
本研究はより簡便なアミノ酸組成分析を用いたタンパ
ク質同定手法の確立を目的とし，精度評価と本手法の精

SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

度向上を検討した．現在の手法は加水分解の影響により

Laemmli らの方法にしたがって SDS-PAGE を行った

脱アミド化されそれぞれ Asp と Glu になる Asn や Gln，

（17）．すなわち，分離ゲル用緩衝液（A 液）は，トリスその構造が破壊される Cys や Trp を除く，全20種類中16（ヒドロキシメチル）アミノメタン 18.2 g , 1 M 塩酸 24

種類のアミノ酸で行っている．また，タンパク質配列中ml ,の Ile-Ile 結合，Ile-Val 結合及び Ile-Leu 結合は加水分解

溶解し，pH を8.8 に調整後，全容を100 ml にフィルアッを受けにくく，アミノ酸組成分析において Ile 回収率がプした．濃縮ゲル用緩衝液（B 液）は，トリス（ヒドロ低下すると報告されており，タンパク質同定において同

キシメチル）アミノメタン6.0 g，1 M 塩酸48 ml，SDS

定精度を低下させている． そこでタンパク質同定に0.4 g を蒸留水に溶解し，pH6.8に調整後，全容を100 ml

Cys と Trp の情報を加えると共に，Ile の回収率を補正すにフィルアップした．アクリルアミド / ビス混合酸（Cることができればタンパク質同定精度が向上すると考え

液）はアクリルアミド（モノマー）30 g，N,N- メチレられる．そこで，Cys,Trp を含む18種のアミノ酸及び回ンビスアクリルアミド0.8 g を蒸留水に溶解後，全容を収率を補正した Ile の情報を用いてタンパク質同定精度

100 ml にフィルアップした．10%（w/v）過硫酸アンモの向上を検討した．

ニウム（APS）溶液（D 液）は過硫酸アンモニウム0.1 g

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）0.4 g を蒸留水にを蒸留水1 ml で溶解した．SDS 試料調製溶液はグリセ
リン2.0 ml，濃縮ゲル用緩衝液2.5 ml，β-ME 1 ml，SDS

材料および方法

0.4 g を 加 え， さ ら に0.2 % ブ ロ モ フ ェ ノ ー ル ブ ル ー

材料（BPB）を含むメタノール溶液を0.1 ml 加え，蒸留水で本 研 究 に 用 い た ニ ワ ト リ 卵 白 由 来 C-type lysozyme

10 ml にフィルアップした．電気泳動用緩衝液はトリス（hen egg lysozyme Code No . 100940）は生化学工業株式（ヒドロキシメチル）アミノメタン6.0 g，SDS 1 g，Gly

会社から購入し，本研究室で CM イオン交換クロマト

28.8 g を蒸留水に溶解し，0.2 % BPB を含むメタノール

グラフィーにてリクロマトし，凍結乾燥したものを使用

溶液0.1 ml を加え蒸留水で1000 ml にフィルアップした．

し た． ガ チ ョ ウ 卵 白 由 来 G-type lysozyme（goose egg

染色はコマジーブリリアントブルー R-250（CBB）を用

lysozyme ）は，本研究室で遺伝子を合成して発現，精い た． 泳 動 は ミ ニ ス ラ ブ 電 気 泳 動 装 置（AE-6440，

製を行ったリコンビナント G-type lysozyme を使用した．

ATTO 製）を使用した．

大 豆 由 来 trypsin inhibitor（Code No．106K7055）， ウ シ
由来 serum albumin（Code No．114K7545）はシグマ ア

トランスブロッティング
トランスブロッティングはセミドライ式で行った．ブルドリッチ ジャパンから購入したものを使用した．

ロッティング緩衝液は3- シクロヘキシル -1- プロパンス
リコンビナント G-type lysozyme の作製と精製

ル ホ ン 酸（CAPS） 緩 衝 液 を 用 い た． 膜 は，Poly

リコンビナント G-type lysozyme の遺伝子合成はアミVinilidene Diﬂuoride（PVDF 膜，Bio-Rad 製）を使用しセノ 酸 配 列 を も と に PCR 法 で 行 い， リ コ ン ビ ナ ン ト

ミドライ式ブロッティング装置（ホライズブロット4

G-type lysozyme の 全 体 遺 伝 子 を 作 製 し た． そ の 後，

M-R WSE-4040・M 型，ATTO 製）装置を用い120 mA，

BMGY 培地を用いてタンパク質発現を行った．発現し2時間で行った．

たタンパク質は CM- トヨパールカラムクロマトグラ
フィーで精製し凍結乾燥して使用した．
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タンパク質同定手法の精度向上
加水分解

いアミノ酸及び回収率の低いアミノ酸に対してアミノ酸

タンパク質バンドを転写した PVDF 膜は12 mm 試験

濃度を増加させ，スコアの変動をシミュレーションした．

管内で十分に乾燥させた後，0.05% β-ME を含む混合酸

Cys と Trp はアミノ酸組成分析にて定量されないため（6 M HCl：トリフルオロ酢酸（TFA）=2：1）300 μl をCys と Trp の回収された濃度を0として仮想濃度にて Cys

加え，減圧下で封管後，110 ℃で24時間加水分解を行っ

濃度と Trp 濃度を0から増加させた．補正はアミノ酸濃た（18）．加水分解物は減圧乾固した後，200 μl の0.02

度を増加させた際の同定スコアの変動をシミュレーショ

M HCl に溶解し，0.45 μm のメンブレンフィルター（日ンし，同定スコアが最大となった点の Cys と Trp の濃度

本ミリポア製 Cosmonice Filter φ 2 mm）で濾過した．

を用いる方法で行った．また，モデルタンパク質を用いた補正シミュレーションにおいて補正値に用いた Cys

アミノ酸組成分析と Trp の濃度と実際にアミノ酸組成分析で得られたタン

試料は高速アミノ分析計 L-8900（日立製作所製）を

パク質量から計算される Cys と Trp の濃度の理論値を比用いてアミノ酸組成分析を行った．アミノ酸は波長570較することで補正が適切に行えているか確認を行った．

nm で検出を行い，Pro は波長440 nm で検出を行った．

Ile はアミノ酸組成分析にて得られた Ile 濃度を増加させる補正を行い，スコアの変動をシミュレーションした．

タンパク質同定システムを用いたタンパク質同定

Ile に関しても，補正値として用いた Ile 濃度と実際に分アミノ酸組成情報を用いたタンパク質の同定はアミノ酸組成分析による同定システム（特開 2010-96501）を析したタンパク質量における Ile の理論値と比較することで補正が適切に行えているか確認を行った．

使用した．
同定用データベースは Uni-Prot 上に登録されている全結果及び考察タンパク質アミノ酸配列情報を利用し，シグナル配列が決定されているタンパク質はシグナル配列を除いた成熟

アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定

タンパク質部分の配列を，不明なものはシグナル配列をアミノ酸に対しての補正シミュレーションを行うため含む全配列を使用し，20種類のアミノ酸のアミノ酸組成に，ニワトリ（Gallus gallus）由来 C-type lysozyme，ダ比（mol%）として作成した組成比データベースを用い

イ ズ（Glycine max） 由 来 Trypsin inhibitor， ダ チ ョ ウ

た． Asn および Gln は加水分解により脱アミド化され（Anser anser）由来 G-type lysozyme，ウシ（Bos Taurus）

それぞれ Asp と Glu になることから，同定に用いるデー

由来 Serum albumin の4種のタンパク質についてアミノ

タベースでは Asn と Gln の量をそれぞれ Asp と Glu に

酸組成分析を行い，各アミノ酸実測値に対して補正をせ

残基数を加算して設定した．スコアはデータベース上のずにタンパク質同定を行った（Table 1）．このアミノ酸

理論アミノ酸組成比（mol%）と実験によって得られた

組成分析の結果を使用して，Cys，Trp に対する補正とアミノ酸組成比（mol%）とのマッチングにより算出しタンパク質配列中の特定の結合により回収率が低下する

た．理論値―実験値 =0（完全一致）である場合，スコIle に対する補正の検討を行った．

ア100とした．
アミノ酸組成分析結果の Cys 実測値に対する補正
アミノ酸濃度に対する補正

Cys は加水分解によって２分子結合を起こしてシスチ同定スコアの変動のシミュレーションは，アミノ酸組ンとして回収される（19）．しかし，シスチンの一部は

成分析で得られた各アミノ酸濃度に対して回収ができな

破壊されることや，Cys に還元されることがあるためTable 1

Identiﬁcation score of model proteins ︵Without correction︶

ProteinSpiecies

Score（Without correction）

Score
a）
With Cys

C-type lysozyme

Gallus gallus

78.92

55.63

Trypsin inhibitor

Glycine max

82.37

75.91

G-type lysozyme

Anser anser

73.29

68.39

Bos taurus

77.20

57.47

Serum albumina）Cys concentration was set to 0

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古田

舜・熊本沙也加・荒木朋洋

Fig.1

C
A

120
100

140
120

80

100

%

60

%

80
60

40

40

20

20
0

0

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Cys Trp

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Cys Trp

amino acidamino acid

B

140

120

D 120

100

100
80

%

%

80
60

60

40

40

20

20

0
Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Cys Trp0
Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Cys Trp

amino acidamino acidFig.1 Amino acid recovery compared to the theoretical value of model protein.
A ; C-type lysozyme（Gallus gallus）, B ; Trypsin inhibitor（Glycine max）, C ; G-type lysozyme（Anser anser）, D ; Serum albumin（Bostaurus）. The percentage
Fig.2on the vertical axis shows the yield based on the theoretical value when the theoretical value was taken as 100%.

90
80
70
Score

60
50
40
0.00
0.08
0.16
0.24
0.32
0.40
0.48
0.56
0.64
0.72
0.80
0.88
0.96
1.04
1.12
1.20
1.28
1.36
1.44
1.52
1.60
1.68
1.76
1.84
1.92

30
Cys amount (nmol)
Fig.2 Simulation of relationship between corrected concentration of Cys and identiﬁcation score.
Blue ; C-type lysozyme（Gallus gallus）, Orange ; Trypsin inhibitor（Glycine max）, Gray ; G-typelysozyme（Anser anser）, Yellow ; Serum albumin（Bos taurus）.

Table 2

Identiﬁcation score and Cys concentration

C-type lysozyme

Score

Corrected score

Corrected Cys
a）concentration

Theoretical Cysb）concentration

55.63

82.31

1.33 nmol

1.37 nmol

Trypsin inhibitor

75.91

84.28

0.43 nmol

0.43 nmolG-type lysozyme

68.39

76.30

0.32 nmol

0.32 nmol

Serum albumin

57.47

78.91

0.57 nmol

0.60 nmola）Cys concentration for highest identiﬁcation scoreb）The theoretical value of Cys concentration calculated from the amount of protein recovered as a result of
amino acid composition analysis

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タンパク質同定手法の精度向上
Cys を安定して定量することは難しい．そのため Cys のの Cys 濃度でスコアが55.63から82.86まで増加し，Cys

定量は還元アルキル化を行い，カルボキシメチルシステ

濃度の理論値は1.37 nmol で補正に用いた Cys 濃度とほインとして定量する方法が用いられている（20）．アル

ぼ同じとなった．Trypsin inhibitor は0.43 nmol の Cys 濃

キル化を用いる方法は，従来のアミノ酸組成分析に加え度でスコアが75.91から84.28まで増加し，Cys 濃度の理て化学修飾反応操作を行う必要がある．このことから現論値は0.43 nmol で補正に用いた Cys 濃度と同じとなっ在の同定手法は Cys の情報を用いていない．そこで補た．G-type lysozeme は0.32 nmol の Cys 濃度でスコアが正により Cys の値をシミュレートすることでタンパク

68.39か ら76.30ま で 増 加 し，Cys 濃 度 の 理 論 値 は0.32

質の同定精度向上を検討した．各モデルタンパク質のア

nmol で補正に用いた Cys 濃度と同じとなった．同様に

ミノ酸組成の理論値を100 % として実際のアミノ酸組成

Serum albumin は0.57 nmol の Cys 濃度として用いたとこ分析において回収されたアミノ酸ごとの回収量を示した

ろスコアが57.47から78.91まで増加し，Cys 濃度の理論（Fig.1）．Cys はアミノ酸組成分析で回収されていないた

値は0.60 nmol で補正に用いた Cys 濃度と同じとなった．

め0 % とした．Cys 補正が0時点の各タンパク質の同定

以上の結果より Cys の濃度を増加させていき，スコア

結果は Cys の濃度を0として同定を行っているため，通最大となった濃度を用いる補正を行うことで，より精度

常の Cys を含まずに行った同定結果よりも低い値となっの高いタンパク質同定が行えることが明らかになった．

ている（Table 1）．補正は Cys 濃度を0から増加させていき，スコアが最大となった Cys 濃度を用いた．スコア

アミノ酸組成分析結果の Trp 実測値に対する補正が最大となった Cys 濃度は濃度の増加量と同定スコア

Trp は側鎖にインドール環を持ち加水分解条件で酸化との関係をシミュレーションして求めた（Fig.2）. また，分解されるため現在の同定手法では Trp の情報を用いて補正後のスコアが最大となった Cys の濃度が理論値といない（19）．したがって補正により Trp の値をシミュ合っているかの判断基準としてアミノ酸組成分析結果でレートすることでタンパク質の同定精度向上を検討した．

回収されたタンパク質量から計算される Cys 濃度と比

各タンパク質は Trp 実測値の初期値を0として補正を較した（Table 2）その結果，C-typelysozeme は1.33 nmol
Fig.3

行った（Fig.1）．補正は Trp 濃度を0から増加させていき，

90

Score

80
70
60
50
40
0.00
0.08
0.16
0.24
0.32
0.40
0.48
0.56
0.64
0.72
0.80
0.88
0.96
1.04
1.12
1.20
1.28
1.36
1.44
1.52
1.60
1.68
1.76
1.84
1.92

30
Trp concentration (nmol)
Fig.3 Simulation of relationship between corrected concentration of Trp and identiﬁcation score.
Blue ; C-type lysozyme（Gallus gallus）, Orange ; Trypsin inhibitor（Glycine max）, Gray ; G-type lysozyme（Anser anser）, Yellow ; Serum albumin（Bos taurus）.
Table 3

Identiﬁcation score and Trp concentration

Proteinscore

corrected score

Trp correcteda）concentration

Trp theoreticalb）concentration

C-type lysozyme

62.48

82.63

0.97 nmol

0.99 nmol

Trypsin inhibitor

79.52

84.22

0.20 nmol

0.20 nmolG-type lysozyme

69.69

76.11

0.25 nmol

0.25 nmol

serum albumin

77.23

78.25

0.03 nmol

0.02 nmola）Trp concentration for highest identiﬁcation scoreb）Theoretical value of Trp concentration calculated from the amount of protein recovered as a result of aminoacid composition analysis

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古田

舜・熊本沙也加・荒木朋洋

スコアが最大となった Trp 濃度を補正値として用いた．

そこでアミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定においスコアが最大となった Trp 濃度は濃度の増加量と同定スて回収率が低い Ile の実測値を補正することでタンパクコアとの関係をシミュレーションして求めた（Fig.3）.

質の同定精度向上の可能性が考えられる．そこで各タン

また，Cys と同様に Trp 濃度の理論値と比較した（Table

パク質のアミノ酸回収量の理論値を100 % として実際に3）． そ の 結 果，C-type lysozeme は0.97 nmol の Trp 濃 度得られたアミノ酸回収量と比較した結果，すべてのタン

でスコアが62.48から82.63まで増加し，理論値とほぼ同パク質で Ile のアミノ酸回収量が100 % を下回っていたじとなった．Trypsin inhibitor は0.20 nmol の Trp 濃度で（Fig.1）．各タンパク質の実測値に補正せずに同定した

ス コ ア が79.52から84.22ま で 増 加 し， 理 論 値 と 同 じ と結 果，C-type lysozyme の 同 定 ス コ ア は78.92，Trypsin

なった．G-type lysozeme は0.25 nmol の Trp 濃度でスコ

inhibitor は82.37，G-type lysozyme は73.29，Serum

アが69.69から76.11まで増加し，理論値と同じとなった．

albumin は77.20となった（Table 1）．そこで，Ile の値を同様に Serum albumin は0.03 nmol の Trp 濃度として用＋方向へ補正することによりどのように同定のスコアがいたところスコアが77.23から78.25まで増加し，理論値変動するかについて，Ile の補正量と同定スコアの関係とほぼ同じとなった．以上の結果より Trp の濃度を増加をシミュレーションした（Fig.4）．また，各タンパク質させていき，スコア最大となった濃度を用いる補正を行の Ile の実測値と補正後の Ile の補正値とその補正が理うことで，より精度の高いタンパク質同定が可能となっ論値と合っているかの判断基準としてアミノ酸組成分析

た．

結果で回収されたタンパク質量から計算される Ile 濃度の理論値と比較した（Table 4）．その結果，Ile の補正にアミノ酸組成分析結果の Ile 実測値に対する補正

より C-type lysozyme の同定スコアは78.92から80.44まで

Ile，Val 及び Leu はアミノ酸側鎖のα鎖の近傍に枝分

上 昇 し た．Ile 実 測 値 は0.89 nmol で 補 正 に よ っ て1.05かれ構造を持つため，タンパク質配列中の Ile-Ile 結合，nmol で ス コ ア 最 大 と な っ た．Ile 濃 度 の 理 論 値 は1.12

Ile-Val 結合及び Ile-Leu 結合は加水分解を受けにくく，nmol で 補 正 に 用 い た Ile 濃 度 と ほ ぼ 同 じ と な っ た．

Fig.4

アミノ酸組成分析において Ile 回収率が低下する（19）．

Trypsin inhibitor 同定スコアは82.37から85.04まで上昇し，

90
85
Score

80
75
70
60

1.00
1.04
1.08
1.12
1.16
1.20
1.24
1.28
1.32
1.36
1.40
1.44
1.48
1.52
1.56
1.60
1.64
1.68
1.72
1.76
1.80
1.84
1.88
1.92
1.96
2.00

65

Corrected Ile value a)
Fig.4 Simulation of relationship between corrected Ile value and identiﬁcation score.
Blue ; C-type lysozyme（Gallus gallus）, orange ; Trypsin inhibitor（Glycine max）, gray ; G-type lysozyme（Anser anser）,yellow ; Serum albumin（Bos taurus）.
a）Corrected Ile value was indicated by simulated value of increased rate for measured value of Ile（1.00）.
Table 4Ile concentration and simulated values

Protein

Measuredconcentration

Corrected
concentrationa）

Theoreticalconcentrationb）

C-type lysozyme

0.89 nmol

1.05 nmol

1.12 nmol

Trypsin inhibitor

1.29 nmol

1.38 nmol

1.44 nmolG-type lysozyme

0.95 nmol

1.06 nmol

1.06 nmol

Serum albumin

0.18 nmol

0.22 nmol

0.22 nmola）Ile concentration when the score becomes maximum by Ile correctionb）Ile theoretical concentration calculated from the amount of protein recovered in theamino acid analysis

─ 18 ─

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タンパク質同定手法の精度向上
実測値の1.29 nmol から1.38 nmol でスコア最大となった．

が可能であると考えられる．

Ile 濃度の理論値は1.44 nmol で補正に用いた Ile 濃度とほぼ同じとなった．同様に G-type lysozyme の同定スコCys と Trp の補正濃度を使用し，Ile 実測値に対する補アは73.29から76.70まで上昇し，補正値は Ile 濃度の理正を行った３重補正

論値と同じとなった．さらに Serum albumin のタンパク

モデルタンパク質を用いた通常のアミノ酸組成分析に質の同定スコアは77.20から78.42まで上昇し，同様に補おいて，タンパク質同定にて得られていない Cys，Trp

正値は理論値と同じとなった．これを各タンパク質配列に対する補正とタンパク質配列中の特定の結合により回中の Ile 数，Ile-Ile 結合数，Ile-Val 結合数，Ile-Leu 結合収率が低下する Ile に対する補正を検討した結果，３種数と，同定スコアの関係を調べた結果，Ile-Ile 結合を２のアミノ酸全ての補正で同定精度向上の効果が確認でき

つもつ G-type lysozyme の Ile の実測値を補正した際のスた．そこで３種のアミノ酸全てを用いて３重補正を行う

コア上昇が他のタンパク質を補正した際のスコア上昇とことにより，補正手法の確立を目指した．すなわち各モ

比較して一番大きかった．このことから Ile-Ile 結合がデルタンパク質同定は，Cys と Trp の濃度に対する補正

Ile-Val 結合，Ile-Leu 結合よりも同定スコアへの影響がによってスコア最大となった Cys 濃度と Trp 濃度を加え大きいと考えられた．また，Ile-Val 結合と Ile-Leu 結合た18種のアミノ酸組成を使用し，Ile 実測値に対する補によりアミノ酸回収率に対して影響があると考えられる

正を行うことで３重補正についてのスコア変動を調べた

Val と Leu は，各タンパク質のアミノ酸回収率で理論値（Fig.5）．３重補正後の同定スコアを補正なしでの同定に対してほぼ100 % に近い回収率となっており，Val と

スコア，Cys，Trp 及び Ile に対して個々で補正を行った

Leu に対しては補正の必要性は小さいと考えられる．以際のスコア，Ile 補正を行う前の Cys，Trp を用いた２重上の結果より Ile の実測値を補正することで，より精度補正時のスコアと比較した（Table 5）．その結果，全ての高いタンパク質同定が行えることが明らかになった．

のモデルタンパク質で Cys,Trp 及び Ile に対する３重補

ここまでの Cys，Trp 及び Ile への補正はいずれも同定ス

正 は 同 定 ス コ ア の 上 昇 を 示 し た． 以 上 の 結 果 よ り

コアの上昇による同定精度向上が見込めるため，３種のCys,Trp 及び Ile に対する補正を個々で行うよりもスコア

アミノ酸全てを用いて補正を行うとより精度の高い同定
Fig.5

最大となった Cys,Trp 濃度を使用し，Ile 実測値に対する

90
85

Score

80
75
70
60

1.00
1.04
1.08
1.12
1.16
1.20
1.24
1.28
1.32
1.36
1.40
1.44
1.48
1.52
1.56
1.60
1.64
1.68
1.72
1.76
1.80
1.84
1.88
1.92
1.96
2.00

65

Corrected Ile value a)
Fig.5 Simulation of Ile concentration for Cys and Trp corrected values.
Blue ; C-type lysozyme（Gallus gallus）, Orange ; Trypsin inhibitor（Glycine max）, Gray ; G-typelysozyme（Anser anser）, Yellow ; Serum albumin（Bos taurus）.
a）Corrected Ile value was indicated by simulated value of increased rate for measured value of Ile（1.00）.
Table 5 Identiﬁcation score of model protein（without correction）, Cys corrected score, Trp corrected score, Ile corrected score, Cys,Trp Corrected
Score, and triple correction score

ProteinNo corrected
Score

Cys Corrected Trp Corrected Ile Corrected
score
score
score

Cys,Trp
Cys,Trp,IleCorrected Score Corrected score

C-type lysozyme

78.92

82.63

81.94

80.91

80.44

83.45

Trypsin inhibitor

82.37

84.28

84.22

85.04

83.54

86.02

G-type lysozyme

73.29

76.30

76.11

73.70

74.93

78.10

Serum albumin

77.20

78.91

78.25

78.42

79.02

80.19

─ 19 ─

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19

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古田

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補正を行うことにより精度の高いタンパク質同定が可能

なわちそれぞれのアミノ酸の濃度を増加させ，スコアがであることが明らかになった．

最大値となるよう補正値の検討を行った．その結果 Cys，

Cys と Trp は通常加水分解では回収できないが，モデ

Trp および Ile はいずれも補正により同定の精度が向上し，ルタンパク質のアミノ酸組成分析結果に Cys と Trp を仮

これらのアミノ酸濃度の３重補正により高精度のタンパ

想濃度にて追加する補正方法は，各モデルタンパク質のク質同定が可能であることを明らかにした．

同定スコアを上昇させた．また，Cys と Trp の仮想濃度
は各モデルタンパク質のアミノ酸組成分析結果のタンパ

参考文献

ク質回収量から計算される Cys と Trp の理論値に近い濃度となった．このことから Cys と Trp の仮想濃度として１．Shevchenko A., Jensen O.N., Podtelejnikov A.V.,

用いた濃度は理論的にも正しい濃度であり，この補正方

Sagliocco F., Wilm M.,Vorm O., Mortensen P.,

法は従来のアミノ酸組成分析を用いたタンパク質の同定

Shevchenko A., Boucherie H., Mann M., 1996, Linking

よりも精度が高いと考えられる．また特定のアミノ酸配genome and proteome by mass spectrometry: Large-scale

列により回収率が低下する Ile には，Ile 濃度を増加させidentification of yeast proteins from two dimensional

る補正を行ったところ，各モデルタンパク質の同定スコ

gels,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14440-14445.

アが上昇した．補正にてスコアが最大となった Ile 濃度

２．Malcolm G.P., Bogdanova A., Lopez M.,Gutierrez S.,

は，各モデルタンパク質のアミノ酸組成分析結果のタン

Pitt A.M., 2002, Multiwell In-gel protein digestion and

パク質回収量から計算される Ile の理論値に近い濃度とmicroscale sample preparation for protein identiﬁcation

なった．このことから回収率が低下した Ile 濃度を増加

by mass spectrometry, Prteomics，2, 145-150.

する補正は，従来のタンパク質同定と比較して精度が高

３． Fenyö D., 2000, Identifying the proteome:software

くなったと考えられる．さらに，Cys と Trp の仮想濃度

tools, Current Opinion in Biotechnology, 11, 391-395.

を使用し，Ile の濃度を増加させる３重補正は，Cys，

４． Shen Y.N., Kim S.H., Yoon D.H., Lee H.G., Kang H.S.,

Trp 及び Ile の補正を個々で行うよりもさらに精度が上

Seo K.S., 2012, Proteome analysis of bovine

昇し，本補正手法はアミノ酸組成を用いたタンパク質同Longissimus dorsi muscle associated with the marbling

定手法の補助手法として実用可能であると考えられる．

score,Asian-Aust. J. Anim. Sci., 25, 1083-1088.
５． Ghabooli M., Khatabi B., Ahmadi F.S., Sepehri M.,

謝辞

Mirzaei M.,Amirkhani A., Jorrín-Novo J.V., Salekdeh

タンパク質同定システムの開発にご協力いただいた，mechanisms underlying water stress tolerance induced

株式会社日立ハイテクフォールディングに感謝いたしまby Piriformospora indica in barley,J. Proteomics, 94,

G.H., 2013, Proteomics study reveals the molecular289-301.

す．

６．Perkins D.N., Pappin D.J.C., Creasy D.M., Cottrell J.S.,
1999, Probability-based protein identification by要約

searching sequence databases using mass spectrometry
date,Electrophoresis, 20, 3551-3567.

プロテオーム解析における同定手法として質量分析など部分アミノ酸配列情報を用いた解析が一般的である．

７．Steven G., Binz P.-A., Hochstrasser D.F., Appel R. D.,

しかし，質量分析はハイスループットであるが分析コス

2002, Peptide mass fingerprinting peak intensity

トが高額であり，デメリットがある．そこで本研究では，

prediction: Extracting knowledge from

低コストで操作も簡便なアミノ酸組成分析を用いたタン

spectra,Proteomics, 2, 1374-1391.

パク質同定手法の確立を目的とした．現在の手法では加８．Yergey A. L., Coorssen J. R., Backlund P. S., Blank P.

水分解の際に影響を受けるアミノ酸が数種類存在し，そS.Jr., Humphrey G.A., Zimmerberg J., 2002., De novoのアミノ酸の組成情報が欠落あるいは定量的な回収が困

sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF, J. Am.

難となっている．これらのアミノ酸組成情報を活用でき

Soc. Mass Spectrom, 13, 784-791.

れば同定の精度を向上できると考えられる。そこで加水

９．Standing K.G., 2003, Peptide and protein de novo

分解で回収が難しい Cys，Trp および Ile の収量に対して

sequencing by mass spectrometry, Curr. Opin. Struct.

補正方法を見出すことで同定精度の向上を検討した．すBiol., 13, 595-601.

─ 20 ─

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20

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タンパク質同定手法の精度向上
10．Aebersold R., Mann M., 2003, Mass spectrometry-based

Fountoulakis M.，1998, Effect of the hydrolysis method

proteomics，Nature, 422, 198-207.

on the determination of the amino acid composition ofproteins, J. Chromatogr. A, 795, 263-275.

11．Masuda A., Docmae N., 2013, Examination of an
absolute quantity of less than a hundred nanograms of

16．細澤知香，2015, ゲノム未知生物種の特異的発現タ

proteins by amino acid analysis,Anal. Bioanal. Chem.,

ンパク質の同定に関する研究，東海大学大学院平成405, 8073-8081.

27年度修士論文

12．Masuda A., Dohmae N., 2011, Amino acid analysis of

17．Laemmli U.K., 1970, Cleavage of structural proteins

sub-picomolar amounts of proteins by precolumn

during the assembly of the head of bacteriophage T4,

fluorescence derivatization with 6-aminoquinolyl-N-

Nature, 277, 680-685.

hydroxysuccinimidyl carbamate,BioSci. Trends., 5（6）,18．植木

厚，1987, 続生化学実験講座２ タンパク質の

化学 上，東京化学同人，192 - 193.

231-238.
13．SIB,AAAcompIdent（protein identification by aa

19．高橋礼子，1976, 生化学実験講座1 タンパク質の化

Composition）, < http://web.expasy.org/aacomident/ >学Ⅱ－一次構造決定法－，東京化学同人，30-36.

14．Fountoulakis M., Lahm H.W., 1998, Hydrolysis and20．Crestfield A.M., Moore S., Stein W.H., 1963, Theamino acid composition analysis of proteins,J.

preparation and enzymatic hydrolysis of reduced andChromatogr. A, 826, 109-113.

S-carboxymethylated proteins,J. Biol. Chem., 238, 622627.

15．Weiss M., Manneberg M., Juranville J. F., Lahm H. W.,

─ 21 ─

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東海大農紀要 38：23－28（2019）

Fast Plants における全ゲノム転写解析

アブラナ科植物 Fast Plants における全ゲノム転写解析
坂場美咲・川邊隆大
Genome-wide transcriptome analysis in Rapid cycling Brassica rapa（Fast Plants type）
Misaki SAKABA and Takahiro KAWANABE（Received 6 December 2018; accepted 30 January 2019）
Abstract
The species Brassica rapa is an important vegetable and oilseed crop, such as Chinese cabbage（var. pekinensis）, turnip（var. rapa）, pak choi（var. chinensis）, and Komatsuna（var. perviridis）. Rapid cycling Brassica rapa, known as Wisconsin
Fast Plants, are widely used organism in science education and genetic research. However there are few studies on thetranscriptome analysis in Fast Plants. In this study, we investigated the transcript proﬁles of ﬁve different tissues（bud, leaf,
stem, root, seed）in Fast Plants using RNA-seq. 87.7% of the total annotated genes were detected as expressed and 569 genes
were constitutively expressed across all tissues. We further deﬁned 1,641, 875, 428 and 965 tissue-speciﬁc expressed genes inbud, leaf, stem and root, respectively. A comprehensive expression analysis revealed that many auxin-inducible genes were atissue-speciﬁc manner. Notably, some SAUR genes were highly expressed in 10, 13 day after pollination seed, indicating theirputative role in seed development. The comprehensive analysis of RNA-seq data would provide a foundation for futurecomprehensive analysis in B. rapa.
CC）および異質倍数体の B. juncea（AABB），B. napus

緒言（AACC），B. carinata（BBCC）のゲノムの関係性が明ら

アブラナ科に属する植物には，モデル植物であるシロ

かとなっている（1）．B. napus は世界的に重要な油糧作

イヌナズナ（Arabidopsis thaliana）や，ハクサイ，キャ

物 で も あ り， そ の ゲ ノ ム 構 成 種 で あ る B. rapa はベツ，ダイコン等の野菜類，植物油の原料となるナタネ

Brassica 属の比較研究には欠かせないものである．

などが含まれる．特に，Brassica 属作物には多くの主要2011年に B. rapa のゲノム配列が公開され，ゲノムワな野菜が含まれており，ハクサイやカブなどの Brassica

イドスケールでの解析が可能となった（2）．その後，B.

rapa 種，キャベツやブロッコリーなどの B. oleracea 種

oleracea（3）， 複 二 倍 体 種 で あ る B. napus（4, 5），B.

などがある．これらは，日本の農業生産額において上位

juncea（6）のゲノム情報も公開されており，Brassica 属になる品目であることから重要な野菜である．B. rapa

間 の ゲ ノ ム 比 較 も 可 能 と な っ て き て い る．RNA-は農業上重要な種であるが，先にも述べたように，ハク

sequencing（RNA-seq）法は，次世代シークエンサーを

サイ，ミズナ，コマツナ，カブなどのように形態学的に用いて mRNA の配列を解読し，転写産物の発現量定量

多様な変種を含み，さらにはイエローサルソンなどの油化を行う手法である．配列を読むことから新規転写産物

糧作物も含むことからゲノム，進化学的研究のモデル植や新規スプライシングバリアントを網羅的解析すること

物として非常に重要である．また，Brassica 属は，U のができ，その発展に伴い，全ゲノム転写解析の手法とし三角形として知られているように，二倍体種の B. rapaて近年広く用いられるようになってきている．
Wisconsin Fast Plants として知られている Rapid cycling（2n=20, AA），B. nigra（2n=16, BB），B. oleracea（2n=18,

Brassica rapa（RCBr）は，科学教育における植物として
東海大農学部応用植物科学科

よく用いられている．この植物は，ウィスコンシン大学

連絡先：川邊隆大

の Paul Williams 博士によってアブラナ科植物の遺伝学

e-mail:314752@cc.u-tokai.ac.jp

─ 23 ─

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23

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坂場

美咲・川邊

研究を効率よく行う目的で開発された B. rapa の変種で隆大

RNA-seq データの解析あり（7），その生活環はとても短く，連続した光，水お取得した RNA-seq のデータ配列は，FastQC（https://

よび栄養が好適な条件下であれば，種を植えてから約14

www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/） を 用

日で開花し，約40日で成熟種子を採ることができるといいてクオリティチェックを行った．トリミングには，う特徴がある．

Trim galore! v0.4.5（https://www.bioinformatics.babraham.

オーキシンは胚発生や様々な器官の分化や伸長，非生

ac.uk/projects/trim_galore/）を用いて低クオリティのリー

物的ストレスへの応答など，植物の生活環全体で発生おドを除去した．リードの5ʼ 末端から14bp の除去，クオ

よび生長を調節する主要なホルモンである．その調節は，リティまたはアダプターのトリミングのため33bp より

オーキシン応答遺伝子である auxin/indole-3-acetic acid

も短いリードの除去，および配列のトリミングを必要と（Aux/IAA） 遺 伝 子 フ ァ ミ リ ー，auxin-response factor

するアダプター配列のオーバーラップを3に設定して（ARF）遺伝子ファミリー，small auxin-up RNAs（SAUR）

行 っ た． そ の 後，hisat2 v2.1.0（11） を 用 い て，

遺伝子ファミリー，gretchen hagen 3（GH3）遺伝子ファ

BrapaFPsc_277_v1.3にマッピングを行った．レファレン

ミリーらにより制御されている（8）．シロイヌナズナでスゲノムとして用いた BrapaFPsc_277_v1.3及び，そのアは Aux/IAA 遺伝子29個，ARF 遺伝子23個，SAUR 遺伝子

ノテーション情報は phytozome（https://phytozome.jgi.doe.

82個，GH3 遺伝子35個が存在しており，ダイズやキュgov/） よ り 入 手 し た．FPKM（Fragment Per Kilo-base ofウリ，タバコなどのその他様々な植物種においてもオーexon per Million mapped fragments）値は，cufﬂinks v.2.2.1

キシン応答遺伝子の同定が行われてきている（8）．B.

（12）を用いて算出した．

rapa でもオーキシン応答遺伝子の探索は行われており，その系統の一つである ʻChiifuʼ では ARF 遺伝子ファミ

発現の組織幅
組織特異的発現遺伝子の同定は Yanai らの方法によりリーが31個，Aux/IAA 遺伝子ファミリーが55個同定され行った（13）．

ている（9, 10）．
本研究では，Fast Plants の各組織の転写産物の発現定

Ti =量化を目的として，5つの組織（蕾，葉，茎，根および∑ （1⊖S（i, j）/ S（i, max））
n

j=1

n ⊖1

種子）で RNA-seq を行った．また，オーキシン応答遺伝子である ARF，Aux/IAA，SAUR，GH3 の各遺伝子ファ式における指数 T は組織特異性を表し，n は，調査対ミリーについてそれぞれの組織における遺伝子発現につ象である B. rapa 組織の数を示し，S（i, j）は，j 組織にいて解析を行った．

おける i 遺伝子の FPKM 値，S（i, max）は，n 組織における遺伝子 i の FPKM の最高値を示している．各組織において，対象組織が遺伝子 i における FPKM の最大値で材料および方法

あること，対象組織の FPKM が5以上，Ti が0.99以上，

植物材料

そして，他の組織の1-S（i, j）が0.99以上であるものをBrassica rapa Fast Plants は25℃の温室で育成し，明期

組織特異的に発現している遺伝子であると定義した．

16時間・暗期８時間で育成した．Fast Plants における蕾
（2サンプル；FP-bud），葉（2サンプル；FP-leaf），茎（2ヒートマップの作製

サンプル；FP-stem），根（FP-root）および交配10（FP-ヒートマップは，R studio（https://www.rstudio.com/）

10-seed），13（FP-13-seed），17日 後（FP-17-seed） の 種の geneﬁlter（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/

子 を 含 む5つ の 組 織 か ら RNeasy Plant Mini kit（Qiagen,html/geneﬁlter.html） お よ び ggplot2（https://bioconductor.

USA）を用いて total RNA を抽出した．RNA のクオリ

org/packages/release/bioc/html/ggbio.html） の パ ッ ケ ー ジ

ティは2100 bioanalyzer（Agilent Technologies, USA）を用を用い，FPKM 値を Z-score 化して作成した．

いて確認し，高品質であった RNA は NeoPrep ライブラ
リー調整システム（illumina, USA）により cDNA ライブ

結果および考察

ラ リ ー を 作 成 し た． 作 成 し た10個 の ラ イ ブ リ ー はNextSeq 500（illumina, USA）を用いてシークエンスを行
い，75bp シングルエンドの配列を取得した．

Fast Plants の５つの組織（蕾，葉，茎，根および種子）から10個の cDNA ライブラリーを作成し，75bp 長のシングルエンドリードを取得した．低品質のリードを─ 24 ─

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Fast Plants における全ゲノム転写解析
Table.1

Statistic of mapping reads

Sample nameRaw reads

Filtering reads

Alignment rate

FP-bud-1

47,552,981

47,515,481

95.71%

FP-bud-2

52,182,362

53,455,898

95.72%

FP-leaf-1

44,070,669

43,751,839

96.05%

FP-leaf-2

43,162,073

42,776,871

96.24%

FP-stem-1

53,115,878

53,058,521

96.05%

FP-stem-2

36,951,002

36,911,186

96.52%

FP-root

43,503,849

43,435,063

96.21%

FP-10DAP-seed

56,595,184

55,472,658

95.53%

FP-13DAP-seed

50,284,931

49,211,737

95.13%

FP-17DAP-seed

39,933,743

39,414,928

93.59%

除去したところ，高品質（Q>25）の4.6億リードが得らの組織に比べ，多くの遺伝子が発現していた（Fig. 2）．

れ，それらをその後の解析に用いた．公開されている全ての組織において遺伝子発現が見られた1,216個の遺Fast Plants のゲノム配列にマッピングを行なったところ，それぞれのライブラリーは約95% のマップ率であった（Table. 1）．
Fast Plants の蕾，葉，茎，根および種子の発現データをもとに，転写産物の発現は FPKM 値を用いて定量化し，各組織における発現レベルに関して比較した．同じ組織が同じクラスターに存在し，組織ごとにクラスタリング
されていることから，各組織において遺伝子発現が異なっていることが示された（Fig. 1）．35,528個の遺伝子（ 全40,492個 の ア ノ テ ー シ ョ ン さ れ て い る 遺 伝 子 の87.7％）は，少なくとも一つの組織において発現が確認され，1,216個の遺伝子は全ての組織において発現が確認された（Fig. 2）．また，交配10，13日後の種子では他
Fig.1

Fig.1. Dendrogram of four tissue transcriptomes based on clusteringof log2-transformed FPKM values of constitutive expressed genes.

35000

30000

Expressed gene number

25000

highly expressed
medium expressed
lowly expressed

20000

15000

10000

5000

0

Fig.2.

Fig.2

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25

The number of highly (FPKM > 50), medium (5 < FPKM ≤50), and lowly (FPKM ≤ 5) expressed genes in each tissues.

─ 25 ─

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坂場
Table. 2

美咲・川邊

隆大

The constitutively expressed gene whose FPKM value were greater than 5 in each tissues

Gene ID
Brara.A00999

FPKM
bud

leaf

stem

root

FP10

34.61

20.32

33.38

FP13

A.thaliana ID

FP17Arabidopsis
gene name43.69 AT4G17920

Gene description

36.09

41.61

37.51

Brara.A01511 1014.40 1203.17 1334.75 330.75

68.22

289.95 1277.80 AT4G23800

Brara.A02070

55.07

23.80

49.42

34.84

48.39

25.03

22.51 AT1G66910

Brara.B01172

44.83

41.07

49.83

56.73

68.75

70.56

66.82 AT5G18450

XTH32

integrase-type DNA-binding superfamily protein

HTA8xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase 32

Brara.C02570

37.21

23.00

21.85

29.37

41.36

32.48

26.28 AT2G36870

Brara.C02712

56.62

25.54

25.64

29.08

30.80

28.70

22.99 AT2G38810

Brara.C03057

21.84

22.99

20.95

14.64

29.69

24.52

17.66 AT2G45220

Brara.E01410

17.72

20.03

23.41

17.36

27.74

18.86

15.73 AT2G42350

Brara.F00547

11.65

11.75

9.86

15.50

14.24

13.90

10.73 AT3G12110

Brara.F02033

38.44

40.63

22.36

43.44

33.28

24.78

28.21 AT1G09440

Brara.H01691

63.06

32.91

15.55

63.82

33.09

41.86

7.45 AT1G77120

Brara.K00094

52.27

39.62

27.79

53.77

39.40

29.93

38.86 AT1G05600

RING/U-box superfamily protein
HMG (high mobility group) box protein
protein kinase superfamily protein

histone H2A 8plant invertase/pectin methylesterase inhibitor superfamily
ACT11

RING/U-box superfamily protein

ADH1protein kinase superfamily protein

actin-11
alcohol dehydrogenase 1
MAPKKK13 tetratricopeptide repeat (TPR)-like superfamily protein

Brara.K01036 2257.47 1202.22 1414.23 2520.25 3027.83 4135.06 2213.38 AT1G07150

mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13

Brara.K01475

911.66 429.65 585.14 816.81 1037.30 1948.50 2143.62 AT5G19390

rho GTPase activation protein (RhoGAP) with PH domain

Brara.K01516

62.96

tetratricopeptide repeat (TPR)-like superfamily protein

64.92

90.43

49.36

67.30

50.48

58.19 AT5G18950

FP-13DAP-seed

FP-10DAP-seed

伝子から FPKM が5以上のものを選抜したところ，非常に安定して発現している遺伝子が569個得られた．これ
ら の 遺 伝 子 は，protein kinase protein，tetratricopeptide
repeat protein，RING/U-box protein や integrase-type DNA
binding protein などをコードする遺伝子が多く含まれて285

おり，ハウスキーピング遺伝子であると考えられること

2500

2725

から，RT-qPCR などのコントロールとして用いること250ができ，非常に有用な情報であると考えられる（Table.2）．
蕾，葉，茎および根のそれぞれ４つの組織を比較し，

8

特異的な発現を示す遺伝子群の同定を行なった．蕾では，

125

1,641個 の 遺 伝 子 が 特 異 的 発 現 を 示 し，plant invertase/41

pectin methylesterase inhibitor，RING/U-box protein，
WRKY DNA-binding protein，serine carboxypeptidase-like，
ribosomal protein，protein phosphatase 2C protein，actin12
および protein kinase protein などをコードする遺伝子群が含まれていた．葉特異的発現遺伝子は，875個の遺伝FP-17DAP-seed

子 が 確 認 さ れ，pentatricopeptide repeat protein，protein

Fig. 3.

Fig.3
kinase protein，NAD（P）-binding
rossmann-fold protein，alpha/beta-hydrolases protein および major facilitator protein

Venn diagram of showing the overlap of speciﬁc genes at
10, 13, and 17 day after pollinated (DAP) seed.

などをコードする遺伝子群が含まれていた．茎特異的発それぞれにおいて特異的な発現を示す遺伝子の探索を

現 遺 伝 子 は，428個 の 遺 伝 子 が 特 異 的 で あ り，basic

行った．その結果，交配10日後で3,268個，交配13日後

helix-loop-helix（bHLH）DNA-binding protein，p-loop

で5,600個，交配17日後で424個の特異的な発現を示す遺containing nucleoside triphosphate hydrolases protein，

伝子がえられた．このうち250個の遺伝子は全てのス

leucine-rich repeat protein kinase protein お よ び protein

テージにおいて発現がみられた（Fig. 3）．交配10日後にkinase protein などが含まれていた．根特異的遺伝子発現

お い て は，pentatricopeptide repeat protein や major facilitatorに 関 し て は，965個 の 遺 伝 子 が 特 異 的 で あ り，majorwith SPX（SYG1/Pho81/XPR1）domain-containing protein，facilitator protein，pectin lyase-like protein，zinc finger

PPR protein，SCR-like 1 をコードする遺伝子が確認された．

protein，ribosomal protein および leucine-rich repeat protein

交 配13日 後 に お い て は，galactose oxidase/kelch repeat

kinase protein などをコードする遺伝子群が含まれていた．

protein や，hydroxyproline-rich glycoprotein protein をコー種子において，各サンプルを他の４つの組織と比較し，ドする遺伝子が特異的に発現していた．交配17日後の種─ 26 ─

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18:39:03

Fast Plants における全ゲノム転写解析
ARF

SAUR

Aux/IAA
IAA

GH3

Fig.4
Fig. 4. Expression proﬁles of the auxin-responsive genes. Heatmap showing expression proﬁles of auxinresponsive genes based on RNA-seq data in various tissues. Values represent the Z-score of FPKM.

子 特 異 的 遺 伝 子 発 現 に 関 し て は，cysteine proteinases

組織特異的な発現を示すものが多くみられた．SAUR 遺protein，dihydroneopterin aldolase および K-box region and

伝子の突然変異体では，組織特異性を示す遺伝子が多く

MADS-box transcription factor protein などが発現していた．

みられたが，交配10，13日後の種子において発現してい交配10，13日後の種子は交配17日後に比べ，遺伝子発現

る遺伝子が特に多いことが明らかとなった．SAUR の機数も多く，他の組織に比べて特異的発現する遺伝子数も能については未解明なことが多いが，近年の分子生物学多かった．これは，交配10日後から13日後は Fast Plants

的解析，遺伝学的解析，生化学的解析により植物の成長では胚乳が発達している時期であり，交配17日後は種子発達に関わっていることが示されてきている（14）．シの成熟期になり胚乳が消失している時期である．このこ

ロイヌナズナの SAUR36 遺伝子突然変異体は，種子発芽とから胚乳特異的発現遺伝子の存在が，この遺伝子数のに関わることが示されているが（15），種子発達時期に違いに影響していることが考えられた．

働く他の SAUR 遺伝子の機能については未解明のままでオーキシンは胚発生期において重要な役割を持つ植物あることから，さらなる解析が必要であると考えられる．

ホルモンである．Fast Plants におけるオーキシン応答遺本研究室では，B. rapa を用いて発達中の種子の組織

伝子の発現様式を明らかにするため，公開されているである胚乳で発現するゲノムインプリント遺伝子の同定

Fast Plants のアノテーション情報からオーキシン応答遺を行っている．ゲノムインプリンティングとは，2つの伝子を検索した．その結果，35個の ARF 遺伝子，38個

対立遺伝子が両親のどちらから由来するかによって遺伝の Aux/IAA 遺伝子，137個の SAUR 遺伝子，37個の GH3子の発現のオン・オフを決定する機構であり，ゲノムイ遺伝子が見出された．ʻChiifuʼ 系統では ARF 遺伝子が31

ンプリント遺伝子は，父親由来または，母親由来の対立

個，Aux/IAA 遺伝子が55個同定されているが（9, 10），遺伝子のみを発現する遺伝子のことである．植物では，

Fast Plants の遺伝子数とは異なっていることから，系統

ゲノムインプリンティングは胚乳組織でおこることが知によるオーキシン応答遺伝子の応答性の違いが系統の表られている（16）．本研究で得られたデータセットは，

現型にも影響している可能性が考えられた．同定した遺様々な植物組織での発現動向をみており，ゲノムインプ

伝子発現を調べたところ，7個の ARF，6個の Aux/IAA，

リント遺伝子の発現様式解析を行う際，有用な情報とな26個の SAUR，4個の GH3 遺伝子では全ての組織においるであろう．

て発現がみられなかった．さらに，各組織における発現量を比較した結果（Fig. 4），オーキシン応答遺伝子は，
─ 27 ─

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坂場

美咲・川邊

隆大

謝辞

引用文献

本研究を実施するにあたり，貴重なご意見や様々な支援を頂きました京都産業大学総合生命科学部生命資源環

１）Nagaharu U. 1935 Jpn J Bot. 7, 389-452.
２）Wang X., Wang H., Wang J., Sun R., Wu J., et al. 2011

境学科の河邊昭准教授，木村成介教授に感謝いたします．
また，次世代シークエンサーによる塩基配列解析を行っ

Nat. Genet. 43, 1035-1039.
３）Liu S, Liu Y, Yang X., Tong C., Edwards D., Parkin I.A.,

た機関である京都産業大学の降旗初佳氏に感謝します．

et al. 2014, Nat. Commun. 5, 3930.
４）Chalhoub B., Denoeud F., Liu S., Parkin I.A., Tang H., etal. 2014, Science 345, 950-953.

要約５）Bayer P.E., Hurgobin B., Golicz A.A., Chan C.K., Yuan

Brassica rapa は，葉菜類のハクサイやコマツナ，根菜Y., et al. 2017, Plant Biotechnol J. 15, 1602-1610.

類であるカブ，油糧作物であるアブラナなどを含み，世６）Yang J., Liu D., Wang X., Ji C., Cheng F., et al. 2016,
Nat. Genet. 48, 1225-1232

界中で栽培・消費されており農業上重要な野菜のひとつである．B. rapa は本来，自家不和合性を持ち遺伝学的７）Lauffer H.B., Lauffer D. Williams P. 2012, Wisconsin

解析を行うには困難が伴うが，Wisconsin Fast Plants として知られる Rapid cycling Brassica rapa は，自家和合性

Fast Plants Program
８）Chapman E.J. and Estelle M. 2009, Annu. Rev. Genet.
43:265-285.

であり，その上，生育期間が約40日短く，研究室内で生育 さ せ る の に 適 し た 性 質 を も つ． 本 研 究 で は，Fast

９）Mun J.H., Yu H.J., Shin J.Y., Oh M., Hwang H.J. 2012,
Mol. Genet. Genomics. 287, 765-784.

Plants の５つの組織（蕾，葉，茎，根および交配10，13，
17日後の種子）において RNA-seq 解析を行い，組織特10）Paul P., Dhandapani V., Rameneni J.J., Li X.,

異的な遺伝子およびオーキシン関連遺伝子の探索を行っ

Sivanandhan G., et al. 2016, PLoS one 11, e0151522.

た．アノテーションされている遺伝子のうち87.7% の遺11）Pertea M., Kim D., Pertea G.M., Leek J.T., Salzberg S.L.,
et al. 2016, Nat. Protoc. 11, 1650-1667.

伝子が発現しており，569個の遺伝子が全ての組織で恒12）Trapnell C., Roberts A., Goff L., Pertea G., Kim D., et al.

常的に発現していることが明らかとなった．

2012, Nat. Protoc. 7, 562-578.

次に，組織特異的な遺伝子の同定を行ったところ，蕾，葉，茎，根でそれぞれ1,641個，875個，428個，965個の13）Yanai I., Benjamin H., Shmoish M., Chalifa-Caspi V.,

組織特異的発現する遺伝子を同定することができた．

Shklar M., et al. 2005, Bioinformatics. 21, 650-659.

オーキシン応答遺伝子の発現様式について解析したとこ14）Ren H. and Gray W.M. 2015, Mol Plant. 8, 1153-1164.

ろ，組織特異的発現を示す遺伝子が多く見られたが，

15）Narsai R., Law S.R., Carrie C., Xu L., Whelan J. 2011,
Plant Physiol. 157, 1342-1362.

SAUR 遺伝子は交配10，13日後の種子において組織特異的発現示すものが多くみられた．本研究で得られたデー

16）Gehring M. 2013, Annu. Rev. Genet. 47, 187-208.

タセットは，Fast Plants において遺伝子発現様式解析を行う際，有用な情報となるであろう．

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東海大農紀要 38：29－37（2019）UPI による大学生の精神的健康の変遷と震災の影響

UPI による大学生の精神的健康の変遷と震災の影響に関する実態調査
黒山竜太

＊，＊＊

A survey on the Transition of Mental Health of University Students by UPI Test
and the Inﬂuence of the Earthquake Disaster
Ryuta KUROYAMA（Received 3 December 2018; accepted 5 January 2019）
Abstract
While the screening survey on mental health is often limited to freshmen, at Tokai University faculty of A it has been
conducting surveys by UPI test continuously for 4 years for all students with the aim of improvement in mental health. Also,
the faculty of A has changed the campus in the X year due to the disaster. Therefore, in this research, we investigated thepsychological impact of campus relocation especially from the survey results. In Analysis - I, the total of the surveyed subjects
was 2729 university students. According to a comparison with previous studies, the score of the faculty of A was average.
Because of analysis of variance, it was suggested that mental health tended to be particularly high in 4th graders than in 1st and2nd graders. Also, females tended to score higher than males. Analysis - Ⅱ examined the differences by year and sex for the
students who responded to all the survey periods to compare the age of each admission year. Because of analysis of variance, it
was shown that the X-2 year enrollment students were in a state of tension in the 4th grade. There was concern that depression
symptoms of the X-1 year enrollment students continued until the 4th year. The X year enrollment students also did not
improve depression symptoms in 3 years, and was also accompanied by anxiety. On the other hand, the X+1 year enrollment
students tended to improve their physical symptoms in the second year, and tended to be different from other grades. It wassuggested that direct or indirect inﬂuence of community loss due to campus relocation to student mental health appears every
grade.

降に見られる場合や，３年次以降研究室に配属されてか問題と目的らの新たな人間関係の構築や集団活動への適応，学習か

昨今，高校から大学への環境変化に対応するための予ら研究への学ぶ姿勢のシフトへの対応，及び卒業後の進防的取り組みとして，University Personality Inventory（以路に関わる自己決定にまつわる課題などがあり，決して下，UPI と略す）などを用いて一斉スクリーニングを実

低年次だけが援助の対象でよいわけではない．実際に，施する大学は多い．ただし，そうした取り組みは時間的２年次以降１年次に比べて学生生活に不適応傾向をきた

コストや部署間の調整，人的コストなどの問題があり，した学生の来談が増える（1）という指摘もあり，学生相

すべての大学の保健センターや学生相談機関が実施でき談機関は上位学年に対しても目を配る必要があると考えているわけではなく，また実施は入学段階のものに限定られる．一方で，悩みを抱えていながら相談に来ない学されることが多い．しかし，大学における不適応問題は生への対応は全国的な課題とされている（2）．援助を申入学時に限らず，むしろ生活リズムの安定した２年次以し出ることによる決まり悪さやスティグマなどの援助要
請コスト（3）から自発的には相談機関を利用しづらいと＊

東海大学九州教養教育センター

いう問題に対し，解決策の一つとして，スクリーニング

東海大学九州学生相談室

実施の方法を工夫することで，自主的に相談機関を利用

＊＊

連絡先

黒山竜太

e-mail: kuroyama@tokai-u.jp

しやすくなるような雰囲気づくりを醸成することにも貢─ 29 ─

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黒山

竜太

献できると考えられる．黒山ら（4）は，「この結果を知りの成長にとって大きな支えでもあったが，その喪失の影

たい」とチェックした学生や相談したいことがあればそ響が懸念されている（6）．そこで，本研究では UPI デーの旨を記載した学生には全員へ個別に通知を行うというタの統計学的比較から，被災及びキャンパス移転の心理取り組みを行うことで，学生相談室を訪れる敷居を下げ的影響について検討する．

る試みを行っている．
また，一斉調査を行うことにより，個別の状況理解に方とどまらず全体的傾向を把握することが可能となり，そ法の結果を学生にフィードバックすることで全体的傾向や対象）東海大学 A 学部（理系）に所属する X-1～ X+2

自分の相対的な状況をおおむね理解することができる．

年度の全学生．A 学部は震災発生まで山間部に位置し，また，各部局の教職員にフィードバックすることで，よ

そこは講義・実習・研究を一体的に行うキャンパスであり有益な学生支援体制の構築に貢献することが可能であり，近隣に学生のためのアパート集落が形成されていた．

る．そしてカウンセラーにとっても，学年の学部学科の震災後，同県内の市街地に位置する別キャンパスに仮移傾向を把握することは，学生への援助の際にその学生が転し，A 学部単独でコミュニティを形成する環境ではな所属するコミュニティを理解する一助となる．そして，

くなっている．

仮に学生が相談室を利用しなくとも，精神的健康の理解

調査内容）大学生のメンタルヘルスの実態を調査するたと向上についての重要性を啓発することにつながると考め全国大学保健管理協会が1966年に作成した，UPI を使えられる．田嶌
（5）は，社会のニーズが広がり，心理療用した．UPI は全60項目からなり，不調に関する自覚症

法・カウンセリングに対するニーズが多様なものになり

状56項目及び「いつも活動的である」など検証尺度４項

つつある昨今，セラピストに「節度ある押しつけがまし目について「はい」か「いいえ」の２択で回答する．本さ」という態度が有用となるのではないかと述べており，研究では沢崎・松原（7）の知見と同様に検証尺度を＜

まさに定期的な全学生へのアプローチは，大学コミュニ

陽性項目＞と解釈した．

ティそのものへの節度をもったアピール・啓発となるも調査時期及び実施方法）各年度開始の４月初旬に筆者がのと考えられる．

「学生相談室ガイダンス」を実施し，メンタルヘルスにこうした問題意識のもと，筆者の勤務する東海大学 A

関する講義とともに UPI を実施し回収した．また X 年

学部（以下，A 学部）では，X-3年度より年度のはじめ

度の実施は，震災発災直前であった．実施の際，プライに新入生へ一斉スクリーニング調査の実施を開始し，バシーの遵守についての説明とともに，将来回答内容を

X-2年度には UPI の簡易版を全学年に行い，そして X-1

全体的傾向把握のため統計的に処理したうえで公表する年度から UPI の完全版を全学生へ実施してきた．X+2年可能性があること，提出によってその旨を承諾されたも度で４年間分のデータを収集することができ，X-1年度のと判断するということについて説明した．４年生につの入学生が最終学年を迎えたことから，本研究では１年

いては，実施や回収についてプライバシー遵守への配慮

生から４年生までの４年間の精神的健康度の全体的傾向を行ったうえで各所属研究室単位での実施を依頼し，研及びその変遷について統計学的手法によって明らかにす

究室ごとに回収した．質問紙には UPI の質問項目や結ることを試みる．分析Ⅰでは，年度・学年・性別の３つ

果のフィードバック希望の有無，相談したいことがあるの要因を比較することで各学年の傾向を明らかにする．

場合の自由記述のほか，学生証番号の記入を求めた．回

そして分析Ⅱでは，UPI を受検した同一の学生の年度間収後，学生証番号から各学生の性別を照合し，累計2729の変遷を比較することで各年度入学生の傾向を明らかに名分の有効回答を得た（内訳は Table 1. を参照）．

する．

なお，本調査は学生相談室が所属学生への個別相談支

ところで，A 学部は X 年４月に地震被害を受け，他援に活用することを目的とした業務として学内で承認さキャンパスへの緊急仮移転が行われており，X-1・X 年

れているものであり，加えて東海大学「人を対象とすると X+1・X+2年とで所属キャンパスが異なっている．こ研究」に関する倫理審査委員会の審査を受けた（審査番

うした被災及び移転という環境的な変化は，学生生活に号2017年度 A-002）．

大きな影響をもたらすことが考えられるが，本邦ではこうした事例がほとんど経験されておらず，知見が積み重なっていない．特に A 学部には学生村コミュニティが存在していたことが学部としての強みであり，学生たち─ 30 ─

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４年生よりも，また２年生が３年生よりも有意に得点が結果と考察高かった．また，性別の主効果が認められ（F（1,2697）

分析Ⅰ）年度・学年・性別間比較=39.05，p<.001），女性の方が男性よりも有意に得点が高かった．交互作用は認められなかった．

UPI は精神身体的訴え（以下，身体症状），うつ傾向に関するもの（以下，抑うつ症状），対人面での不安に＜抑うつ症状＞では，学年の主効果が認められ（F関するもの（以下，不安症状），強迫傾向・被害関係念（3,2697）=3.38，p<.05），多重比較の結果，２・３年生が慮に関連するもの（以下，強迫症状）のグループに分類

４年生よりも有意に得点が高かった．また性別の主効果

することができるとされる（8）ことから，得られたデーが認められ（F（1,2697）=7.97，p<.01），女性の方が男性

タ（n=2729）について，自覚症状56項目の＜合計値＞，

よりも有意に得点が高かった．また年度と学年の主効果

及び＜身体症状（16項目）＞，＜抑うつ症状（20項目）が有意傾向であった（F（9,2697）=1.71，p<.10）．
＜不安症状＞では，年度の主効果が有意傾向であった＞，＜不安症状（10項目）＞，＜強迫症状（10項目）＞，＜陽性項目（４項目）＞を自覚症状領域ごとに合算して（F（3,2697）=2.18，p<.10）．また，学年の主効果が認めら平均値を算出した（Table 1. を参照）
．UPI の結果についれ（F（3,2697）=8.53，p<.001）， 多 重 比 較 の 結 果， １・ては多くの大学から報告されており，大学の種類，学科，

２・３年生が４年生よりも有意に得点が高かった．また，年度などによってばらつきが大きく，合計値の平均は９

性別の主効果が認められ（F（1,2697）=7.24，p<.01），女

点台から16点台まであることが指摘されている（9）．A

性の方が男性よりも有意に得点が高かった．また年度と学部における平均値は13.15であったことから，精神的学年の交互作用が有意であり（F（9,2697）=2.76，p<.01），

健康度は他の報告と比べて平均的であるといえる．また下位検定の結果，１年生において X 年度が X-1・X+1年

A 学部の陽性項目の平均値は1.38であり，2.60（9），1.55

度より有意に得点が高く，３年生において X-1年度が（10）と比べると低く，1.15
（11）
，0.47
（12）と比べると高X・X+1年度より，X+2年度が X 年度より有意に得点がいことから，陽性項目への肯定の程度も平均的であると高かった．そして X-1年度において１・２・３年生が４考えられる．

年生よりも有意に得点が高く，X 年度において１年生が２・３・４年生よりも，そして２年生が３年生よりも有次に，それぞれ年度（4）×学年（4）×性別（2）の対意に得点が高かった．

応のない３要因分散分析を行った（各群の平均値及び標準偏差は Table 2. を参照）
．分析には Anova4 on the web＜ 強 迫 症 状 ＞ で は， 学 年 の 主 効 果 が 認 め ら れ（Fを用いた．分散分析後の多重比較には ryan 法を用い，（3,2697）=8.40，p<.001），多重比較の結果，１・２年生

すべて₅％水準で検定を行った．

が３・４年生よりも有意に得点が高かった．性差や交互＜合計値＞では，学年の主効果が認められ（F（3,2697）

作用は有意でなかった．

=4.43，p<.01），多重比較の結果，１・２年生が４年生＜陽性項目＞では，年度の主効果が有意傾向であったよりも有意に得点が高いことが示された．また，性別の（F（3,2697）=2.39，p<.10）．また学年の主効果が認められ主効果が認められ（F（1,2697）=10.21，p<.01），女性の方（F（3,2697）=9.28，p<.001），多重比較の結果，１・４年が男性よりも有意に得点が高いことが示された．また，

生が２・３年生よりも有意に得点が高かった．

年 度 と 学 年 の 交 互 作 用 が 認 め ら れ（F（9,2697）=1.95，

以上より，まずいずれの自覚症状領域についても，年

p<.05），下位検定の結果，１年生において X 年度が他

度ごとの統計的差異は示されなかった．このことから，年度と比べ有意に得点が高く，X 年度において１・２年

地震によるキャンパス移転が直接精神的健康に否定的影生が３・４年生に比べて有意に得点が高かった．

響をもたらしたかどうか，本分析からは明らかにならな＜ 身 体 症 状 ＞ で は， 学 年 の 主 効 果 が 認 め ら れ（Fかった．一方，いずれの自覚症状領域でも学年差が示さ（3,2697）=4.29，p<.01），多重比較の結果，１年生が３・れ，４年生は低学年よりも値が低い傾向が認められたこ

Table 1．UPI の基本統計量（対象者全体：n=2729）

自覚症状合計

領域別
身体症状

抑うつ症状

不安症状

強迫症状

陽性項目

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

13.15 （10.07）

2.64（2.54）

5.20（4.33）

3.09（2.56）

2.22（2.23）

1.38（1.28）

M

─ 31 ─

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31

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黒山竜太

Table 2．年度ごとの UPI 得点についての平均値及び標準偏差1 年生
X－1 年度

2 年生

男性（n=167） 女性（n=70）
M

（SD）

M

（SD）

男性（n=92）
M

（SD）

3 年生

女性（n=79）M（SD）

男性（n=31）
M

（SD）

4 年生

女性（n=13） 男性（n=150） 女性（n=71）
M

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

合計値

12.32 （9.50） 14.47 （9.89） 14.63 （9.84） 15.27 （10.40） 15.97 （9.84） 15.23 （6.78） 10.73 （8.42） 12.90 （9.56）

身体症状2.29 （2.22） 3.50 （2.72） 2.61 （2.40） 3.47 （3.00） 2.13 （1.88） 2.62 （2.53） 1.99 （1.98） 2.99 （2.82）

抑うつ症状4.70 （4.17） 4.84 （4.11） 5.70 （4.14） 6.05 （4.11） 6.52 （4.13） 6.77 （3.74） 4.37 （3.84） 5.27 （4.18）

不安症状

3.14 （2.51） 3.56 （2.33） 3.40 （2.74） 3.22 （2.60） 4.29 （2.89） 3.77 （1.62） 2.47 （2.37） 2.75 （2.26）

強迫症状

2.19 （2.18） 2.57 （2.40） 2.92 （2.52） 2.53 （2.48） 3.03 （2.25） 2.08 （1.54） 1.91 （1.94） 1.90 （1.70）

陽性項目

1.30 （1.20） 1.67 （1.27） 1.26 （1.18） 1.00 （1.02） 1.32 （1.23） 0.92 （1.21） 1.60 （1.24） 1.52 （1.25）

X 年度

男性（n=158） 女性（n=74） 男性（n=105） 女性（n=59） 男性（n=100） 女性（n=89）

1 年生
M
合計値

（SD）

M

2 年生
（SD）

M

（SD）

3 年生

M

（SD）

M

（SD）

M

4 年生
（SD）

男性（n=80）M（SD）

女性（n=53）
M（SD）

14.76 （10.38） 17.54 （11.17） 12.97 （9.88） 16.49 （10.38） 10.87 （10.18） 12.74 （10.26） 12.78 （10.16） 11.30 （8.71）

身体症状2.92 （2.70） 3.92 （3.03） 2.42 （2.48） 3.83 （2.82） 1.71 （2.19） 2.82 （2.63） 2.50 （2.66） 2.68 （1.94）

抑うつ症状

5.47 （4.34） 6.28 （4.54） 5.30 （4.27） 6.15 （4.17） 4.68 （4.31） 5.27 （4.37） 5.10 （4.41） 4.55 （4.01）

不安症状3.59 （2.52） 4.38 （2.87） 2.90 （2.47） 3.83 （2.69） 2.48 （2.67） 2.83 （2.39） 2.99 （2.68） 2.49 （2.33）

強迫症状

2.77 （2.35） 2.96 （2.24） 2.35 （2.41） 2.68 （2.24） 2.00 （2.52） 1.82 （2.14） 2.19 （2.17） 1.58 （1.72）

陽性項目

1.49 （1.34） 1.45 （1.27） 1.08 （1.16） 1.39 （1.39） 1.26 （1.25） 1.07 （1.06） 1.43 （1.44） 1.68 （1.37）

X＋1 年度男性（n=144） 女性（n=67）

1 年生
M

（SD）

M

2 年生
（SD）

男性（n=98）
M

（SD）

3 年生

4 年生

女性（n=56） 男性（n=109） 女性（n=54） 男性（n=120） 女性（n=88）
M

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

合計値

12.91 （9.23） 12.69 （8.24） 12.33 （9.67） 14.79 （11.14） 10.98 （9.14） 13.87 （10.57） 11.52 （9.50） 13.58 （10.94）

身体症状2.72 （2.54） 2.70 （2.14） 2.15 （2.14） 3.29 （3.07） 1.89 （2.12） 2.78 （2.79） 2.63 （2.29） 3.17 （2.85）

抑うつ症状4.77 （3.78） 5.01 （4.08） 5.12 （4.20） 5.59 （4.69） 4.60 （4.29） 5.91 （4.55） 4.73 （4.37） 5.41 （4.58）

不安症状

3.15 （2.19） 3.09 （2.11） 2.81 （2.49） 3.32 （2.77） 2.61 （2.38） 3.30 （2.47） 2.30 （2.30） 2.95 （2.66）

強迫症状

2.26 （2.06） 1.88 （1.78） 2.24 （2.11） 2.59 （2.39） 1.89 （2.10） 1.89 （2.22） 1.86 （2.13） 2.05 （2.24）

陽性項目

1.51 （1.21） 1.67 （1.29） 1.10 （1.35） 1.21 （1.10） 1.21 （1.23） 1.11 （1.18） 1.56 （1.37） 1.25 （1.40）
1 年生

X＋2 年度

2 年生

男性（n=119） 女性（n=59）
M

（SD）

M

（SD）

男性（n=44）
M

（SD）

3 年生

女性（n=32）M（SD）

男性（n=99）
M

（SD）

4 年生

女性（n=46） 男性（n=147） 女性（n=56）
M

（SD）

M

（SD）

M

（SD）

合計値

14.24 （10.37） 13.17 （9.56） 13.20 （11.89） 15.19 （8.97） 12.78 （11.03） 14.96 （11.11） 11.74 （10.20） 13.27 （9.85）

身体症状2.83 （2.43） 2.56 （2.56） 2.25 （2.60） 2.88 （2.38） 2.60 （2.70） 2.89 （2.84） 2.14 （2.16） 2.82 （2.56）

抑うつ症状

5.54 （4.65） 4.88 （4.40） 5.25 （4.88） 6.59 （3.87） 5.22 （4.60） 6.04 （4.63） 4.88 （4.52） 5.52 （4.46）

不安症状

3.46 （2.63） 3.54 （2.32） 2.91 （2.77） 3.44 （2.49） 3.03 （2.68） 3.85 （2.79） 2.85 （2.65） 2.91 （2.52）

強迫症状

2.41 （2.27） 2.19 （1.91） 2.80 （2.49） 2.28 （1.79） 1.93 （2.28） 2.17 （2.23） 1.87 （2.22） 2.02 （2.05）

陽性項目

1.43 （1.29） 1.92 （1.25） 1.61 （1.35） 1.34 （1.08） 1.28 （1.26） 1.52 （1.35） 1.39 （1.32） 1.57 （1.47）とから，精神的健康度は少なくとも大学の４年間の間で陽性反応が抑制されると推測される．その後，進路選択

様々な経験を経て徐々に増進していく可能性が示唆され活動が３年次から本格化する中で，４年次には自己受容た．また，陽性項目が４年生で再び２・３年生よりも有が促進されるのではないだろうか．次に，性差が示され意に得点が高いことについても，震災の影響というより女性の方が男性よりもほとんどの自覚症状領域で高い傾は学年の影響ではないかと考えられる．陽性項目は「い向が示されたが，これは先行研究（（7）；（12））と一致

つも体の調子が良い」「よく他人に好かれる」など自己する結果であり，女性の方が自覚しやすく，またそのよを肯定的にとらえた内容である．吉良ら（1）は上位学年

うに回答しやすい傾向にあることが窺えた．女性の方がになると進路選択が課題となり，それとともに自己理解

男性よりも援助要請を行いやすいという先行研究もありについての相談の割合が高まることを指摘しており，２（（13）；（14）），妥当な結果であると考えられる．さらに，～３年次では楽観的でい続けることが難しくなるととも合計値や不安症状における年度差については，震災の否に，適正な自己評価を模索するようになることで単純な定的影響というよりは年度そのものの特性が示されたよ─ 32 ─

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UPI による大学生の精神的健康の変遷と震災の影響
Table 3．X－2 年度入学生の UPI 得点についての平均値と標準偏差（男性：n=55，女性：n=64）

X－1 年度（2 年次）
男性
M
合計
身体症状

（SD）

X 年度（3 年次）

女性
M

男性

（SD）

女性

（SD）

M

X＋1 年度（4 年次）

M

（SD）

男性
M

（SD）

女性
M

（SD）

14.22 （11.06） 16.16 （11.00） 11.59 （10.08） 13.39 （10.87） 10.98 （9.48） 15.33 （11.61）
2.51（2.51）

3.45（3.13）

1.62（2.21）

抑うつ症状

5.64

不安症状

3.36

強迫症状

2.71

陽性項目

1.31

2.78

（2.80）（4.55）

6.53（4.34）

5.02（3.05）

3.39（2.66）

2.71（2.65）

2.78（2.62）

2.33（1.13）

0.94（1.00）

1.45

2.38（2.10）（4.35）

5.61（2.68）

3.08（2.62）

1.92（1.32）

1.05

3.52（3.06）（4.63）

4.11（2.45）

2.45（3.99）

5.98（4.72）（2.40）

3.47（2.12）

2.04（2.74）（2.21）

2.36（2.44）（0.98）

1.51（1.32）

1.13（1.31）

うに思われる．特に X 年度入学生は１年次の合計得点＜陽性項目＞では，性別の主効果が認められ（F（1,234）が他年度入学生と比べて高かったことから，もともと何=5.05，p<.05），男性の方が女性よりも有意に得点が高らかの理由で入学時から支援の必要性が高い学年であっかった．
以上より，X-2生はほとんどの自覚症状領域においてた可能性がある．学年そのものの特性については分析Ⅱ

２年次と比べ３・４年次は得点が低減していることが示で詳述したい．

された．この学年は３年次に被災・移転を経験しており，分析Ⅱ

同一学生の経年比較

仮移転後の落ち着かない環境の中での卒業研究着手や就次に，同一学生の経年変化を比較することを目的とし職活動を余儀なくされている．しかし，上記の結果が出て分析を行った．X-1年度から X+2年度の実施期間すべたことは，X-2生は不遇な環境にも関わらず自分たちにてに回答した学生のうち，２年以上同一の学生が受検しできることを見つけて主体的に取り組む態度を形成するたことが確認できた X-2～ X+1年度入学生を対象とした．

ことができたのではないかと感じさせる．西野・いとう

なお，X-3年度入学生にも X-1年，X 年の２年間調査を（15）や黒山（16）などは被災後の大学生の Post-traumatic

行っているが，２年間にわたり同定できた学生数が17名

Growth（PTG）について述べており，彼らにそうしたと少数であったため，今回の分析からは除外した．

PTG が起こっていたのではないかと考えられる．ただし，

１）X-2年度入学生（2・3・4年次調査：以下 X-2生）

身体症状について女性で有意に得点が高く，また４年次

X-1～ X+1年の３年間分の回答が得られた X-2生119名

で再度３年次よりも得点が高くなった点については，先（男性55名，女性64名）のデータに対し，UPI の自覚症

行きへの不安や抑うつなどの精神症状の自覚をすること

状領域ごとに性別（2）×年次（3）の２要因混合計画にが少なかった一方で，身体症状として現れた可能性もあよる分散分析を行った（Table 3. 参照）．その結果，＜合る．黒山は大学再開後マッサージなどのボランティア

計値＞では年次の主効果が認められ（F（2,234）=6.82，

サービスや学生相談でもリラクセーションが有効であっp<.01），多重比較の結果，２年次が３・４年次よりも有たとしており，堀ら（17）も震災直後の１～２か月では心意に得点が高かった．＜身体症状＞では，性別の主効果

理・身体症状を訴えることが多く心理教育やリラクセーが認められ（F（1,234）=6.20，p<.05），女性が男性よりもションが有効であったとしていることから，震災復興初

得 点 が 高 か っ た． ま た 年 次 の 主 効 果 が 認 め ら れ（F期には特に身体症状への注目は重要ではないかと考えら（2,234）=8.60，p<.001），多重比較の結果，２・４年次がれる．しかし，卒業期の緊張感が高まる時期には，復興

３年次よりも有意に得点が高かった．＜抑うつ症状＞で初期にとどまらず年間を通じて身体症状への注目が重要は，年次の主効果が認められ（F（2,234）=5.27，p<.01），である可能性が示唆された．

多重比較の結果，２年次が３・４年次よりも有意に得点

２）X-1年度入学生（1・2・3・4年次調査：以下 X-1生）が高かった．＜不安症状＞では，年次の主効果が認めらX-1～ X+2年の４年間分の回答が得られた X-1生105名れたが（F（2,234）=3.04，p<.05），多重比較では有意差は（男性64名，女性41名）のデータに対し，UPI の自覚症

認められなかった．また，交互作用が有意傾向であった状領域ごとに性別（2）×年次（3）の２要因混合計画によ（F（2,234）=2.79，p<.10）．＜強迫症状＞では，年次の主る分散分析を行った（Table 4. 参照）．その結果，＜合計

効果が認められ（F（2,234）=5.04，p<.01），多重比較の結値＞では，年次の主効果が認められ（F（3,309）=2.96，

果，２年次が３・４年次よりも有意に得点が高かった．

p<.05），多重比較の結果，２年次が４年次よりも有意に─ 33 ─

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33

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黒山竜太

得点が高かった．＜身体症状＞では，性別の主効果が認は整備されてきていると思われるが，卒業までの時間がめられ（F（1,309）=8.18，p<.01），女性が男性よりも得点

X-2生と比べて長いことにより，PTG の効果は限定的とが高かった．また，年次の主効果が認められ（F（2,234）

なったのかもしれない．学生生活環境の喪失は抑うつ感=8.60，p<.001），多重比較の結果，２・４年次が３年次を継続させる可能性が示唆されたことから，そうした影よりも有意に得点が高かった．＜抑うつ症状＞では，年

響への理解・寄り添いとともに，未来への一歩を踏み出

次の主効果が認められ（F（3.309）=3.09，p<.05），多重比

すための支援が必要ではないかと考えられる．

較の結果，２年次が３・４年次よりも有意に得点が高３）X 年度入学生（1・2・3年次調査：以下 X 生）

かった．＜不安症状＞では，年次の主効果が認められ

X ～ X+2年の３年間分の回答が得られた X 生110名（F（3,309）=3.34，p<.05），多重比較の結果，１年次が４（男性71名，女性39名）のデータに対し，UPI の自覚症

年次よりも有意に得点が高かった．＜強迫症状＞では，状領域ごとに性別（2）×年次（3）の２要因混合計画に

年次の主効果が認められ（F（3,309）=3.79，p<.05），多重よる分散分析を行った（Table 5. 参照）．その結果，＜合比較の結果，２年次が４年次よりも有意に得点が高かっ

計値＞では，性差が有意傾向であり（F（1,216）=2.82，

た． ＜ 陽 性 項 目 ＞ で は， 交 互 作 用 が 認 め ら れ た（Fp<.10），また年次の主効果が認められ（F（2,216）=11.30，（3,309）=2.92，p<.05）が，単純効果の検定は有意でな

p<.001），多重比較の結果，１年次＞２年次＞３年次のかった．

順に有意差が示された．＜身体症状＞では，性差の主効

X-1生は，２年次へ進級した矢先に震災に遭った学年

果が認められ（F（1,216）=4.10，p<.05），女性が男性よりである．X-2生は合計得点では３年次と２年次との間でも有意に得点が高かった．また年次の主効果が認められ有意に低減したが，X-1生にはそれがみられず，４年次（F（2,216）=4.85，p<.01），多重比較の結果，１年次が２・になってようやく１・２年次との有意差が示された．ま

３年次よりも有意に得点が高かった．＜抑うつ症状＞でた，身体症状や抑うつ症状については年次差が示されなは，年次の主効果が有意傾向であった（F（2,216）=2.59，

かった．つまり，X-2生と比べて X-1生は，上位学年にp<.10）．＜不安症状＞では，性差の主効果が認められ進級しても精神身体的不調の程度が低減していないこと（F（1,216）=4.72，p<.05），女性が男性よりも有意に得点が窺える．年度・学年間比較では X-1生について特に目が高かった．また，年次の主効果が認められ（F（2,216）

立った特徴は示されなかったことから，学年特有の特徴=20.91，p<.001），多重比較の結果，１年次＞３年次＞が出ているとは考えにくい．つまりこれは，被災・移転

２年次の順で有意に得点差が認められた．＜強迫症状＞の環境変化の影響である可能性がある．黒山（6）は震災

で は， 年 次 差 の 主 効 果 が 認 め ら れ（F（2,216）=8.77，

後のキャンパス移転による学生村コミュニティの喪失の

p<.001），多重比較の結果，１年次が２・３年次よりも影響の大きさを示唆している．それまで大学から帰宅し有意に得点が高かった．＜陽性項目＞では，有意差は認ても同級生や先輩後輩，また大家から下宿で迎えてもらめられなかった．

え，大学生活だけでなく余暇や生活そのものを共に過ごX 生は，入学してすぐ被災し，キャンパスを移転した

すコミュニティが形成されていた．しかし，キャンパス学年である．学生村コミュニティへのコミットはさほど

移転に際して住居の引っ越しは学生各自で行われ，計画

強くないと思われ，コミュニティ喪失の影響は限定的で的な実行が困難であったことから友人同士近隣に住むこあると考えられる．そのためか，合計値をはじめほとんとが難しくなり，大家の見守りも失い，ネットワークはどの自覚症状領域で１年次よりも２年次で得点が低減し失われた．移転後，仮キャンパスでの教育研究環境などており，これは他年度生には見られなかった結果である．

Table 4．X－1 年度入学生の UPI 得点についての平均値と標準偏差（男性：n=64，女性：n=41）
X－1 年度（1 年次）
男性
M

（SD）

X 年度（2 年次）

女性
M

（SD）

男性
M

（SD）

X＋1 年度（3 年次）

女性
M

（SD）

男性
M

（SD）

X＋2 年度（4 年次）

女性
M

（SD）

男性
M

（SD）

女性
M

（SD）

合計

13.47 （10.01） 14.27 （9.81） 13.72 （10.07） 15.63 （10.34） 11.41 （9.03） 14.71 （10.38） 11.97 （10.03） 12.85 （10.20）

身体症状2.30 （2.00） 3.59 （2.78） 2.42 （2.33） 3.54 （2.50） 1.98 （2.10） 3.02 （2.66） 1.97 （2.00） 2.90 （2.76）

抑うつ症状5.03 （4.71） 4.66 （4.03） 5.69 （4.57） 5.66 （4.09） 4.67 （4.26） 6.00 （4.52） 5.14 （4.56） 5.07 （4.53）

不安症状3.64 （2.59） 3.63 （2.33） 3.20 （2.60） 3.78 （2.78） 2.70 （2.38） 3.63 （2.53） 2.97 （2.71） 2.95 （2.51）

強迫症状

2.50 （2.08） 2.39 （2.30） 2.41 （2.32） 2.66 （2.25） 2.05 （2.22） 2.05 （2.16） 1.89 （2.14） 1.93 （2.02）

陽性項目

1.13 （1.10） 1.54 （1.31） 1.11 （1.24） 1.49 （1.47） 1.41 （1.35） 1.12 （1.23） 1.25 （1.29） 1.46 （1.50）

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UPI による大学生の精神的健康の変遷と震災の影響
このことから，２年次には PTG の影響があった可能性=3.43，p<.10，１年次＞２年次）であった．＜強迫症状がある．一方，抑うつ症状は年次差が示されず，不安症＞及び＜陽性項目＞についても，いずれの要因も有意差

状も２年次より３年次で高まっていた．これは，X 生には示されなかった．

とってキャンパス喪失自体の影響は少ないものの，現在

X+1生は，A 学部が仮移転してからの入学生である．

の所属キャンパスが仮移転状態であることから，先行き２年間の比較ではあるが，抑うつ症状は他年度生と同様への不透明さが不安として表れたのかもしれない．もしに年次差が示されず，強迫症状も X-2生，X-1生と同様

くは，A 学部学生の大きな支えであった学生村コミュニに年次差が示されなかった．分析Ⅰの結果でも，いずれティが失われたことで，相互支援の仕組みが弱まり，上の自覚症状領域も１⊖２年生の間で有意差は示されな

位学年に進級しても抑うつや不安の程度が軽減されていかったことから，そもそも１年次と２年次で大きく自覚ない可能性が考えられる．つまり，A 学部が村コミュニ

症状が変動することはないのかもしれない．一方，X+1

ティを失ったことによる間接的影響の可能性が考えられ

生では２年次で１年次と比べ身体症状の軽減が認められ，る．また身体症状，不安症状で性差が示されていること

有意傾向ではあるが不安症状についても軽減の傾向が示から，女性がより強くその影響を受けている可能性が示された．X+1生は学生村コミュニティには全く所属して唆される．

おらず，また X+1生の入学前の状況を学生相談室では

４）X+1年度入学生（1・2年次調査：以下 X+1生）

把握できていないため，彼らに PTG が起こっている可X+1～ X+2年の２年間分の回答が得られた X+1生74名

能性を検討することはできないが，むしろこの傾向は仮（男性44名，女性30名）のデータに対し，UPI の自覚症とはいえ，キャンパスが以前の山間部から市街地へ変更

状領域ごとに性別（2）×年次（3）の２要因混合計画にされたことと関係するのかもしれない．なぜなら，X+1

よる分散分析を行った（Table 6. 参照）．その結果，＜合生に学生村コミュニティ喪失の直接的影響は考えづらい

計値＞は，いずれの要因も有意差は示されなかった．＜

うえ，生活面では以前のキャンパスの方が交通の便が悪身体症状＞は，年次の主効果が認められ（F（1,72）=5.43，

く不便であり，生活不安を抱えやすい状況であったから

p<.05），１年次が２年次よりも有意に得点が高かった．

である．しかし，これは本調査の結果だけでは推測の域＜抑うつ症状＞は，いずれの要因も有意差は示されず，を出ることができない．今後も継続的に調査していくこ＜不安症状＞は年次差の主効果が有意傾向（F（1,72）とで，震災の影響に加えてキャンパス変更の心理的影響

Table 5．X 年度入学生の UPI 得点についての平均値と標準偏差（男性：n=71，女性：n=39）

X 年度（1 年次）
男性
（SD）

M
合計
身体症状

女性
M

（SD）

X＋1 年度（2 年次）

X＋2 年度（3 年次）

男性

男性

女性

（SD）

M

（SD）

M

女性

（SD）

M

M

（SD）

14.49 （9.60） 18.38 （10.37） 12.03 （9.84） 14.85 （10.78） 12.55 （10.92） 15.64 （11.35）
2.68（2.32）

3.97（2.89）

2.27（2.28）

3.36（3.04）

2.51（2.78）

3.05（2.93）

抑うつ症状

5.52

（4.10）

6.21（4.15）

4.94（4.03）

5.44（4.52）

5.13（4.27）

6.26（4.73）

不安症状

3.66（2.27）

5.00（2.81）

2.70（2.54）

3.28（2.64）

2.93（2.55）

3.97（2.77）

強迫症状

2.63（2.27）

3.21（2.16）

2.11（2.13）

2.77（2.35）

1.99（2.33）

2.36（2.26）

陽性項目

1.32（1.28）

1.21（1.30）

1.17（1.41）

1.23（1.14）

1.24（1.29）

1.44（1.28）

Table 6．X+1年度入学生の UPI 得点についての平均値と標準偏差（男性：n=44，女性：n=30）

X＋1 年度（1 年次）
男性
M
合計

（SD）

X＋2 年度（2 年次）

女性
M

（SD）

男性
M

（SD）

女性
M

（SD）

14.23 （10.76） 14.30（9.41）

13.52 （11.80） 14.53（9.64）

身体症状

2.93（2.90）

3.20（2.44）

2.32（2.61）

2.73（2.37）

抑うつ症状

5.18

（4.21）

5.47（4.57）

5.43（4.84）

6.37（4.19）

不安症状

3.77（2.46）

3.63（2.01）

3.05（2.75）

3.27（2.62）

強迫症状

2.34（2.38）

2.00（2.03）

2.73（2.50）

2.17（1.85）

陽性項目

1.68（1.17）

1.50（1.36）

1.52（1.37）

1.43（1.09）

─ 35 ─

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黒山

竜太

をより詳細に明らかにすることができるのではないだろ

して４年間継続的に UPI による調査を実施してきた．

うか．

また A 学部は，X 年度に震災によってキャンパスを変更している．以上より，本研究ではその調査結果をもとに，特にキャンパス移転の心理的影響について検討をまとめと今後の課題行った．分析Ⅰでは，調査対象は累計2729名の大学生で本研究は，全学生を対象とした UPI の経年実施結果あった．先行研究との比較によると，A 学部の得点は平から，震災によりキャンパスを移転したことの心理的影均的であった．また分散分析の結果，特に４年生は１・

響を探ることを目的として統計的分析を行った．分析Ⅰ

２年生よりも精神的健康度が高い傾向にあることが示唆における年度・学年間比較からは，上位学年は下位学年された．また女性の方が男性よりも得点が高い傾向にと比べて精神的健康度が高いこと，特に４年生はその傾あった．分析Ⅱでは，入学年度ごとの経年比較を行うた向が顕著であることが示された．これは大学適応が求め

め，調査対象期間すべてに回答した学生について，年度

られる１・２年次と卒業後の進路に向けた準備に入る

及び性別による差異を検討した．分散分析の結果，X-2

３・４年次とで，学生生活の主な課題がシフトしていく

年度入学生は４年次も緊張状態にあったことが窺えた．

ためではないかと考えられる．また，不調の表しやすさ

X-1年度入学生は４年次まで抑うつ症状が継続しているの男女差が示された．以上より，大学生活における精神ことが懸念された．X 年度入学生も３年間で抑うつ症状

的健康の特徴と変遷を一定程度捉えることができたのでに改善が見られず，不安も伴っていた．一方，X+1年度

はないだろうか．

入学生は２年目で身体症状に改善が見られ，他学年と異一方，分析Ⅱにおける入学年度生ごとの経年比較では，なる傾向にあった．学年ごとに学生のメンタルヘルスに被災・移転の影響と思われる変化が表れた．特に震災直対してキャンパス移転によるコミュニティ喪失の直接的後に４年生を迎えた学年は精神的健康度が高まったのにないし間接的影響が表れていることが示唆された．

対し，時間が経過しかつ旧キャンパスでの生活経験のある学年は抑うつの継続や不安の喚起が確認され，旧キャ謝ンパスを経験していない学年は比較的早期に適応し精神辞的健康度が上がる傾向にあった．このことから，震災は本調査ならびに日頃から学生相談室活動へご協力・ご単に負の影響だけをもたらすものではないが，安定的な理解を頂いている学生の皆さん，教職員の皆様へ，厚く

学修・生活環境を奪うという要因が加わったことで，御礼申し上げます．なお本研究は，東海大学総合研究機

PTSD 等の恐怖反応とは異なる抑うつや不安反応を生じ

構「研究奨励補助計画」の助成を受けました．

させ学生生活を脅かすとともに，入学年度ごとの質的差
異を顕著にする可能性が示唆された．これは，一貫した

引用文献

教育・支援方針を立てることを困難化し，教職員にとっても対応の難しい状況にあることを明示している．より

１）吉良安之，田中健夫，福留留美，2007，学生相談来積極的にアウトリーチを行うなどして学生に寄り添うべ

談者の学年ごとの問題内容と学生期の諸課題，学生きであろう．

相談研究，28（1），1-13．

ところで，松山・池田（18）
は東日本大震災後，継続し２）木村真人，2017，悩みを抱えていながら相談に来なて定期的に全学生に対し学生生活に関する調査を実施し，い学生の理解と支援―援助要請研究の視座から―，

現在も震災時の対処等に関する情報提供の継続や震災に

教育心理学年報，56，186-201．

関する不安等心理面への支援が必要であるとしている．

３）高野明，宇留田麗，2002，援助要請行動から見たA 学部においても，今後も継続的に調査を続け，結果をサービスとしての学生相談，教育心理学研究，50，

踏まえた適切な心理支援の提供が求められる．

113-125．
４）黒山竜太，渋谷安紀子，田中宏尚，2016，全学年に要実施する「心の健康調査」の意義―自己との向かい

約

合いと心理的成長を目指して―，東海大学紀要 農学部，35，33-41.

メンタルヘルスについてのスクリーニング調査は新入学生への実施にとどまることが多いが，東海大学 A 学５）田嶌誠一，2009，多面的援助アプローチの考え方．

部ではメンタルヘルス向上を目的として全学生を対象と現実に介入しつつ心に関わる―多面的援助アプロー

─ 36 ─

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18:39:17

UPI による大学生の精神的健康の変遷と震災の影響
行動に関する研究の動向，教育心理学研究，47（4），

チと臨床の知恵―，金剛出版．

530-539．

６）黒山竜太，2018，震災後の大学コミュニティ危機への学生支援の検討―震災前後の学生相談活動の比較

14）木村真人，梅垣佑介，水野治久，2014，学生相談機

からみたキャンパス移転の影響―，日本学生相談学

関に対する大学生の援助要請行動のプロセスとその会第36回大会論文集，84．

関連要因―抑うつと自殺念慮の問題に焦点をあてて―，教育心理学研究，62（3），173-186．

７）沢崎達夫，松原達哉，1988，大学生の精神健康に関する研究（1），筑波大学心理学研究，（10），183-190．

15）西野美佐子，いとうたけひこ，2013，東日本震災を体験した大学生の文章のテキストマイニング―基本

８）吉武光世，1995，UPI からみた新入生の心の健康状
態について－他大学との比較を通して－，東洋女子的自尊感情，共感的自己肯定感，と心的外傷後成長，短期大学紀要，27，33-42．

PTG，に焦点を当てて―，東北福祉大学大学院研究
論文集総合福祉学研究，（10），45-63．

９）濱田庸子，鹿取淳子，荒木乳根子，池田由子，加藤恵，福田智子，佐藤いずみ，1991，大学生精神衛生

16）黒山竜太，2017，震災によりキャンパス移転を余儀スクリーング用チェックリスト（UPI）から見た女なくされた学生達への心理支援―地震直後から半期

子大学生の特徴，研究紀要 第三分冊 短期大学部，

授業終了までの４カ月間の活動―，学生相談研究，Ⅱ，24，125-133．

37（3），159-171．

10）西山温美，笹野友寿，2004，大学生の精神健康に関17）堀匡，池田忠義，佐藤静香，齋藤未紀子，吉武清

實，2013，学生相談における東日本大震災後の大学する実態調査，川崎医療福祉学会誌，14，183-187．

コミュニティ支援―震災後1年間の活動の検討―，

11）喜田裕子，高木茂子，2001，学生相談から見た大学生のメンタルヘルスと心の教育―富山国際大学にお東北大学高等教育開発推進センター紀要，
（8）
，63-

ける過去10年間の UPI 調査をもとに―，富山国際71．
18）松川春樹，池田忠義，2017，東日本大震災後の大学

大学人文社会部紀要，1，155-165．
12）中井大介，茅野理恵，佐野司，2007，UPI から見た生の心身の健康状態に関する分析―震災後5 年間の大学生のメンタルヘルスの実態，筑波学院大学紀要

経年変化に焦点をあてて―，東北大学高度教養教育

第２集，159-173．

･ 学生支援機構紀要，（3），169-182．

13）水野治久，石隈利紀，1999，被援助志向性 , 被援助─ 37 ─

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2019/03/27

18:39:17

東海大農紀要
Academic English
38：39－48（2019）
and Curriculum Development: Materials Evaluation Under a Content Based Instruction (CBI) Rationale

Academic English and Curriculum Development: Materials Evaluation
Under a Content Based Instruction（CBI）Rationale
Miki Rodriguez-Yagi ・Ian Isemonger＊

・Michael J. Rupp ・Daniel Minor

＊＊

＊

＊

（Received 30 December 2018; accepted 7 January 2019）
Summary
The research reported in this paper represents an extension of previous research into the development of a curriculum for the
School of Agriculture at Tokai University, but with modiﬁcations to research design which improve upon the past research, andwhich strengthen inferences. The research compares student evaluation of material selected under a（past）generalist agenda
with material selected under a new Content Based Instruction（CBI）agenda（Agriculture）, and under a repeated measuresdesign. Additionally, the effects of English proﬁciency（as measured by GTEC scores）on these evaluations was explored,
although inferences in this area are attenuated by qualiﬁcations, given a lack of design control around the independent variablesof teacher and proﬁciency level of the class. Findings suggest that the CBI reading was perceived to be harder, although for
Low Proﬁciency and Low-Intermediate Proﬁciency groups there was no perceived difference. There is possible evidence also
for the CBI reading being perceived as more interesting in the High-Intermediate Proficiency group, although this did notextend to the High Proﬁciency Group.

1.0

explored a variety of approaches towards teaching academic

Introduction

English（2-7）, including content-based instruction（CBI）,

In this section, the previous studies leading up to this study

language for specific purposes, content and language

and the rationale for this study are outlined. All of the work,

integrated learning（CLIL）and task-based language teaching

past and present, is situated within an ongoing institutional（ T B LT ）. C B I w a s c h o s e n a s t h e m o s t a p p r o p r i a t e

process of curriculum development for the teaching of

methodology for the teaching context at Tokai University as it

academic English in the School of Agriculture.

was the most balanced in terms of the technical knowledge
required of the teachers, who were not subject matter experts,

1.1

and it accommodated well with the language needs andPilot study1: Exploring Academic English for theinterests of the students. CBI falls under the umbrella of

New Curriculum at Tokai University
This investigation into the implementation of academic

communicative language teaching, and its aims are to provide

English as part of the curriculum for the School of Agriculture

learners with authentic and content-focused materials adaptedat Tokai University is part of an ongoing research trajectory

for their second language（L2）needs. Adaptation mightwhich began as a pilot study in 2015. The results of the ﬁrst

involve simpliﬁcation of language presented in the materials

pilot study were published in 2017（1）. The pilot study

or, and if this is difﬁcult, scaffolding of difﬁcult language toshowed a positive outcome but was limited for having

assist with understanding. CBI has been seen as bridging the

involved only self-selected participants, who were also small

gap between general English courses and the more technicalin number. A literature review conducted for the pilot study

readings（or gaisho koudoku［外書購読］）that are required
after students become members of laboratories in their junior＊

Kyushu Liberal Arts Education Center, Tokai University

year. Among the three major varieties of CBI identiﬁed in the

Department of Communication and Information Studies

literature（5）, which include theme-based language

and Graduate School of Social and Cultural Studies, Faculty

instruction, sheltered language instruction and adjunctof Letters, Kumamoto University

language instruction, the theme-based approach appeared to＊＊─ 39 ─

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39

2019/03/27

18:39:28

Miki Rodriguez-Yagi・Ian Isemonger・Michael J. Rupp・Daniel Minor
be the most appropriate approach for the School ofthis introduction began with the 2018 academic year. There

Agriculture at Tokai University given that foreign language

were two topics in the ﬁrst semester; one related to the global

teachers were not working in tandem with subject matterwater crisis and the other to the environmental impact ofexperts.

raising cattle. Readings on the topic were provided and a
related documentary about the topic was shown. Students

1.2 Pilot study 2: Developing Academic English for thewere then required to complete a writing activity on the topic.

New Curriculum at Tokai University

After the water crisis topic was completed, students engaged

In order to overcome some of the limitations of the 2015

with a unit from the Cambridge Unlock Reading and Writing

study, a second, more comprehensive study was conducted

Skills 2 textbook（9）. This textbook is to be adopted by the

involving more than a small cohort of volunteers. RegularInternational Education Center at Shonan Campus, Tokai

classes were used and this allowed for statistical analyses of

University, from spring 2019 both in Reading & Writing andlarger group sizes to compare student perceptions of reading

Academic English. The Center is not operating under the CBICBI academic English materials versus standard textbook

agenda, because there are many faculties at Shonan Campus,

materials（8）. Whereas the 2015 study only involved 8 self-

and it would be difﬁcult to satisfy this diversity under a CBI

selected participants, the second study, conducted in 2017 wasagenda. Therefore, the Unlock textbook was chosen as undernearly 10-fold larger and involved both agriculture and non-the rationale of having generalized content. There is some

agriculture students. This larger study provided some evidence

limited content focus in that while some units will be corethat students studying in the School of Agriculture were moreunits to be done by all students, others are for science majors

interested in the CBI materials. Due to the research limitations

or for humanities majors.

of this study which included the absence of matched pairs, it

In the latter half of the semester, students studied thewas determined that further research should be considered toenvironmental impact of raising cattle, and a reading entitledovercome this. The main feature of this research would be theCowspiracy（10）was included as one of the materials forpresence of matched pairs in a repeated measures design

this topic.
In the first two studies（1, 8）agriculture material was

aimed at reducing Type I（false positive）and Type II（false

found to be more appealing to the agriculture students thannegative）errors in the statistical analyses.

the regular reading, but the students were self-selected（1）orof intermediate level（8）. Because the English level and

1.3 New curriculum started in spring 2018
A new curriculum started in spring, 2018. Under thismotivation of intermediate level students were arguably

curriculum, Reading & Writing 1 and 2 were re-designated as

higher than that of lower level students, this was considered a

Reading & Writing and Academic English, respectively, while

factor limiting generalization to the entire student body. In

Listening & Speaking 1 and 2 were re-designated as Listening

this study, students at all levels participated. The purpose was& Speaking and Global Skills, respectively. Under thisto examine whether the finding in the previous two studies

scheme, Reading & Writing and Listening & Speaking areapplied more widely.

ﬁrst year classes, and Academic English and Global Skills aresecond-year classes. Therefore in the spring semester of 2018,

1.4 General Rationale for using CBI and the Present Study

there were two new curriculum classes underway, namely,

Brinton, et al.（2）have elucidated at least five distinct

Reading & Writing and Listening & Speaking. Both Reading

rationales supporting the integration of CBI into language& Writing and Academic English focus on reading andprograms. The first is based on the need for the syllabus towriting skills, though the second-year class（Academic

reﬂect future usage goals of the learners, which in the case ofEnglish）does not include these terms in the actual course

the School of Agriculture has been shown to be the reading ofname. Academic English should also be developed with theacademic articles in the studentsʼ ﬁelds. The second rationale

cooperation of academic teachers of the respective studentsʼ

is that learnersʼ motivation potentially increases when thefield of specialization, which is, of course, agriculture.

materials are aligned with their interests. Thirdly, CBI is seen

Agricultural-focused material, under the new curriculum, is

to have a sound pedagogical foundation in that it builds upon

introduced in the first-year class（Reading & Writing）, andprevious knowledge and experience of the learner. The fourth─ 40 ─

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40

2019/03/27

18:39:28

Academic English and Curriculum Development: Materials Evaluation Under a Content Based Instruction (CBI) Rationale
rationale lies in the situational context of the language use

and on separate days）, and these separate administrations

which allows learners to master higher levels of discourse andwere matched participant for participant. This allowed for alinguistic conventions by going beyond the more limited

dependent measures design to compare the evaluation of the

focus of sentence level features of discourse. The fifth

two materials. Classes were streamed using scores on therationale for using CBI is based on Krashenʼs input hypothesis

GTEC, and each class had a different teacher. This placed a（11, 12）. Evidence shows that in order to achieve a high level

design limitation on the study in terms of subsequentof receptive skills such as listening and reading, it is necessaryinferences; i.e. with respect to how proficiency might havefor the learner to have comprehensible input of the target

inﬂuenced outcomes on the dependent variable（i.e. response

language in which unfamiliar elements can be understoodscores to items on the survey questionnaire）. This was

through context and other clues such as the learnerʼsbecause the teacher variable was confounded with theknowledge and existing schema.

proficiency variable, given that each class had a different

Second language research supports the use of CBI, withteacher rather than the same teacher. Given institutional

studies showing that language studied under CBI can aid inconstraints on design ﬂexibility, and the requirement to deal

acquisition（13, 14）and that CBI promotes the negotiation

with intact classes for the execution of the study, theseof meaning, thus enhancing acquisition（15）. Furthermore,

limitations could not be overcome. These constraints on

Cummin（16）, in contrasting the notions of Cognitive

inference, therefore, have to be entered as qualiﬁcations when

Academic Language Proficiency（CALP）with Basicinterpretations are made with respect to proficiency in theInterpersonal Communication Skills（BICS）, emphasized that

discussion section. The research questions were as follows:learners must focus on content in order to develop CALP.
Finally, CBI is seen to help learners acquire language by

RQ1: Was there a significant difference in how students

virtue of its facilitation of mediation, consistent with theevaluate level of interest for the regular reading and

Vygotskian notion of the Zone of Proximal Development

the Cowspiracy reading?

（ZPD）, as learners engage in problem solving employing

RQ2: Was there a significant difference in how students

internally directed speech on the path towards task control

evaluate level of difficulty for the regular reading and（17, 18）.

the Cowspiracy reading?

The rationale for this study was to provide better research

RQ3: Was there a significant difference in how students

design than in the previous study, allowing for more secure

evaluate level of familiarity for the regular reading

inferences, as well as to further explore the introduction ofand the Cowspiracy reading?

CBI into the English reading and writing curriculum in the

RQ4: Were any of the evaluations for interest, difficulty and

School of Agriculture. This was achieved by expanding thefamiliarity moderated by proficiency level in English?

scope of the study to include a comparison with the new
curriculum materials proposed by the academic ofﬁces of the
Shonan Campus of Tokai University, while at the same time

3.0 Method

including the new Global Test of English Communication（GTEC）test scores as part of the data（19）.

The method for the study is presented in terms of theparticipants in the study（Section 3.1）, the materials used
（Section 3.2）and the procedures undertaken（Section 3.3）.

2.0

Design and Research Questions

3.1

Participants

The research design was primarily intended to help

Students from four reading and writing classes participated.

establish whether there were signiﬁcant differences across the

All of them were from the School of Agriculture and there

two materials（Regular Reading Material and Cowspiracy

were four classes which were streamed according to level of

Reading Material）in terms of how students evaluated themEnglish proﬁciency, and these classes could be summarized asfor 1）level of interest, 2）level of difﬁculty, and 3）level offollows:

familiarity. The questionnaire survey for each of the twomaterial items used followed the use of the material（i.e. in classClass 1（Teacher 1）: Low Proficiency Group─ 41 ─

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41

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18:39:28

Miki Rodriguez-Yagi・Ian Isemonger・Michael J. Rupp・Daniel MinorClass 2（Teacher 2）: Low-Intermediate Proficiency Grouprequirement, a number of cases had to be removed because

Class 3（Teacher 3）: High-Intermediate Proficiency Group1）a student had attended one administration of theClass 4（Teacher 4）: High Proficiency Groupquestionnaire but been absent for the other, or 2）a student
had omitted to write his/her identifying ID for one, or both,（Note: These labels are relative to the groups, and do not reference anadministrations of the questionnaire preventing a matchedexternal criterion）

pair. There were 84 cases remaining after this process wascomplete. Finally, three further cases were removed, because

Students were placed into the above groups using resultscomments provided by the respondent on the questionnairefrom the GTEC which has 21 listening multiple-choiceindicated that they had focused on all materials used in thequestions and 16 reading multiple-choice questions. New

class while completing the questionnaire, rather than on thestudents are required to take this test on entering thespecific material they had been asked to evaluate. The

University. The version of the test taken by Tokai students isremoval of these three cases left a ﬁnal sample of 81 matchedcalled the GTEC Academic version, and only includes apairs.

listening portion and a reading portion. The total test time is

There were seven cases where the student had not taken theapproximately 30 minutes, with 21 questions for listening and

GTEC test, and there were three cases where either one, or

16 questions for reading. Each portion of the test has aboth, components of the test（Listening and Reading）

maximum score of 250 points, for a total maximum of 500

received a score of zero. These three cases were treated as

points. The test questions can become harder or easier based

equal to the other seven cases; i.e. the student had not doneon the responses, so it is an adaptive test. The range of thethe test. This is because the most likely explanation for thisplacement test results was 29-111（Class 1）, 113-158（Class

score of zero is that the student had attended the test2）
, 159-189（Class 3）and 190-257（Class 4）. These ranges

nominally, but not attempted it seriously, or given up half-way

were established when classes were created, and are not thethrough. Thus there were 71 cases out of the total of 81 cases

ranges for the final sample extracted for this study, because

where a GTEC score was also available.

the final sample involved the removal of some cases（seebelow）from each class. The agriculture students are

3.2

Materials

Each class used two kinds of material. The ﬁrst was a unit

generally not conﬁdent in their English proﬁciency; and thisfrom the regular reading textbook and the second was a

includes even students in the most proﬁcient class.
Due to the Kumamoto earthquakes of 2016, the Aso

reading entitled Cowspiracy（10）.
The regular reading was selected from Unit 6 of the reading

Campus, where the School of Agriculture was located, wasseverely damaged. From July, 2016, agriculture students

textbook（9）, Unlock Reading & Writing Skills 2, and thestarted taking their classes at the Kumamoto Campus. Mainly

reading selection chosen was Reading 2, entitled Surviving the

because of this relocation, student enrollment declined by

Sea of Sand －How to stay alive in the Sahara Desert, by

about 10% in 2018. At the same time, there were more

Brad Rogers.

students from the affiliated high school in Kumamoto. This

The Cowspiracy reading was selected because it was

resulted in differences between the ﬁrst-year students and theamong the materials used in the earlier small-scale pilot study

more senior students. Anecdotally, some of the first-year（1）and the more recent study（8）; with both of these studies

students have expressed that they were not specificallyhaving been conducted under a different design. The topic forinterested in agriculture, and it is possible that the proﬁle ofthe material, under the CBI rationale, was aligned with theinterest of the new demographic has shifted slightly.

subject specialization of the participants, namely, agriculture.

From the four classes selected, there were a total of 116

The material is essentially a reading which covers acases in the initial dataset. However, due to the dependent

documentary film; essentially explaining the context of themeasures design for this study, it was required thatﬁlm and its impact on the audience（mostly younger people）.

participants reply to the survey on two occasions in the form

Unlock Reading & Writing Skills 2 is CEFR level A2 andof matched pairs（once after the regular-material class, andCowspiracy is set at CEFR level B1. This means that in terms

once after the Cowspiracy-material class）. Given thisof the CEFR scale, the Cowspiracy reading was more difﬁcult

─ 42 ─

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42

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18:39:28

Academic English and Curriculum Development: Materials Evaluation Under a Content Based Instruction (CBI) Rationale
than the regular reading, but only by one level on the six

GTEC; with data available for 71 out of the overall 81 cases

levels comprising the CEFR scale（20）.

in the sample. The minimum and maximum scores were
calculated, as well as the mean（as a measure of central

3.3

tendency）and standard deviation for the mean. Finally, theProcedure

Both material items were taught mainly by a grammartranslation approach, and especially for Class 1 students thismay have been a little challenging.
After each material item had been taught, participants
responded to a survey, for which the three Likert-scale items

critical ratio for skew and kurtosis was also calculated.
Results are available for inspection in Table 1 below.
Table 1. Descriptive Statistics for scores on the GTEC（N=71）by
Listening, Reading, and Total Score

Std.
N Minimum Maximum Mean Deviation Skewness Kurtosis

comprised the primary data for this report. These items
covered the level of interest（Item 1）, the level of difﬁculty（Item 2）, and the level of familiarity（Item 3）experienced
by each participant having completed working through thematerial under the instruction of the teacher. The Likert scales
for each item were anchored in the following way:
1. Interest－

GTEC
71
Listening27

131

88.06 23.109 ⊖.760

GTEC
71
Reading

5

132

69.89 30.990 ⊖.830 ⊖1.480

GTEC
Total

41

257

157.94 50.935 ⊖.820 ⊖1.010

71

⊖.280

Notable aspects of the results from Table 1 include thehighest level of interest equals 5 and lowest

lower mean score for reading when compared with listening,level equals 1
2. Difficulty－ lowest level of difficulty equals 5 andas well as the higher standard deviation around this mean
when compared to same. Skew and kurtosis on all measureshighest level equals 1
3. Familiarity－highest level of familiarity equals 5 andwere slightly negative. Assuming a threshold of acceptability
for the critical ratio of 2.0, these results are all acceptable,

lowest level equals 1

although kurtosis for reading seemed to be higher than forStudents put their student numbers on the survey so thatmatched pairs between the first and second administration

listening, and this affected the overall kurtosis for the total
score as well.

were possible. The study was conducted under informed
consent for both participants and the institution.

4.1.2

Descriptive Statistics for Scores on the Survey

Questionnaires

4.0

The means, standard deviations, and critical ratios for skew

Results

and kurtosis were calculated for the three survey items, andThe results are reported in terms of descriptive statistics（Section 4.1）and inferential statistics（Section 4.2）
. The

for the ﬁrst and second administrations of the questionnaire,
respectively. These results are presented in Table 2, below.

descriptive statistics describe score distributions for the

The results indicate that standard deviation around thesample. The inferential statistics address the speciﬁc researchmeans（with means to be compared below in the section onquestions for the study.

inferential statistics）was just below 1 in all cases; but withstandard deviation for the item measuring familiarity for the

4.1

Cowspiracy reading being a little lower. The critical ratio for

Descriptive Statistics

With respect to the descriptive statistics, these are reported

skew was relatively low in almost all cases, with only the item

separately for the GTEC scores and the scores from themeasuring interest for the Cowspiracy reading being a little

separate administration of the two questionnaires under ahigher, at just over 2.0. With respect to kurtosis, all results

matched-pairs design, and for the two respective materials,

were acceptable. The scale was relatively course for thesenamely, the regular material and the Cowspiracy material.

summary statistics, being a five-point ordinal scale, but theresults overall are reasonable.

4.1.1

Descriptive Statistics for Scores on the GTEC

Descriptive statistics were calculated for scores on the─ 43 ─

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43

2019/03/27

18:39:29

Miki Rodriguez-Yagi・Ian Isemonger・Michael J. Rupp・Daniel Minor
Table 2. Descriptive Statistics for Items on the Survey for Total Sample（N=81）by Regular Reading and Cowspiracy Reading

and for the Wilcoxon Signed Ranks test（.001; 2-tailed）met

Reading Typeand Item

met a more stringent alpha level of .01（or 1% probability ofN

Std.
Mean Deviation Skew Kurtosis

Regular Reading
81（Interest）

3.44

.975

－1.576－0.673

Regular Reading81（Difficulty）

3.15

.950

－0.803

0.516

Regular Reading
81（Familiarity）

2.86

.984

－0.765－0.949Cowspiracy Reading 81（Interest）

3.49

.989

－2.165

0.632

Cowspiracy Reading 81（Difﬁculty）

2.81

.910

-0.1080.579

Cowspiracy Reading 81（Familiarity）

2.69

.889

－0.410－0.409the alpha threshold of p < .05, and in fact, would have alsoa Type I error）. Given the directionality of the Likert scale forboth administrations of the questionnaire（lowest level of
difﬁculty equals 5 and highest equals 1）, the regular reading（mean of 3.15）was evaluated as less difficult than the
Cowspiracy reading（mean of 2.81）.
With respect to RQ3 which focused on the level offamiliarity with the text, there was no significant difference
between the regular reading and the Cowspiracy reading
either with the t-test or the Wilcoxon Signed Ranks test. The pvalue for the t-test（.094; 2-tailed）and the Wilcoxon Signed
Ranks test（.108; 2-tailed）both failed to meet the thresholdof p < .05.

4.2 Inferential Statistics
The inferential statistics conducted in this section were

The above results represent the entire sample. For further

designed to address the research questions directly. In the caseanalysis, the same tests were conducted but by subsample（i.e.

of each question, the initial test was a paired samples t-testby each streamed class）to assist with an analysis of thewhich is a parametric test, and therefore assumes interval

extent to which results for the three items on the survey mightscales. Strictly speaking, the results from a Likert scale

be affected by English proficiency level. These results are

represent ordinal scales, and therefore assumptions for thetabulated for inspection below（Table 3）.

t-test are not satisﬁed. Thus, the Wilcoxon Signed Ranks test

It is important to note that the subsamples（streamed

was also used, because this test is the non-parametricclasses）tested are obviously smaller in size than the total

substitute for a paired samples t-test when the data is not

sample, and therefore statistical power is lower in each caseinterval. The Wilcoxon Signed Ranks test lacks the statisticalthan it is for the entire sample; meaning that a Type II error

power of its parametric counterpart（paired samples t-test）,

becomes more likely. The following general observations canmeaning that it will be less sensitive to detecting a difference

be made about these tabulated results. There were nowhen there is one. Nonetheless, it has the advantage of not

signiﬁcant results across any of the survey items for the Low

making assumptions which exceed the data in this case. In

Proficiency Group and Low-Intermediate Proficiency Group.

both the case of the t-test and the Wilcoxon Signed Ranks test,

For the High-Intermediate Proficiency Group, there were

the alpha level was set in advance at .05（or 5% probability ofsignificant results for both Interest and Difficulty. Thea Type I error）.

Cowspiracy reading was evaluated as more interesting thanWith regard to RQ1, concerning the level of interest for thethe regular reading by this group, and it was also evaluated as

two respective readings, the results for both the t-test and themore difﬁcult（consistent with the overall results for difﬁculty

Wilcoxon Signed Ranks test were non-significant. Thisfor the total sample）. For the High-Proficiency Group, there

indicates that the two readings probably did not generate

was a signiﬁcant result only for the difﬁculty level, with thediffering levels of interest. The p value for the t-test was

Cowspiracy reading being evaluated as more difﬁcult than the（.673; 2-tailed）which is far from meeting the threshold of p

regular reading.

< .05. In the case of the Wilcoxon Signed Ranks test the pvalue（.629; 2-tailed）was similarly far from meeting thethreshold.

5.0 Discussion

The results for RQ2, concerning the level of difﬁculty for

Overall, the distributional properties of the data collected

the two respective readings, did produce a signiﬁcant result,for this study were reasonable. Results presented in theand in the case of both the t-test and the Wilcoxon Signed

descriptive statistics indicate that GTEC scores did not display

Ranks test. Both the p values for the t-test（.001; 2-tailed）

serious skew or kurtosis, with this indicating that proﬁciency

─ 44 ─

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44

2019/03/27

18:39:29

Academic English and Curriculum Development: Materials Evaluation Under a Content Based Instruction (CBI) Rationale
Table 3. Tabulated Results for T-Tests and Wilcoxon Tests by Proficiency Group（Streamed and Intact Classes）
Low Proficiency

Low-Intermediate
Proficiency

High-Intermediate
Proficiency

High Proficiency

T/WilcoxReg./Cow
Mean

T/WilcoxReg./Cow
Mean

T/WilcoxReg./Cow
Mean

T/WilcoxReg./Cow
Mean

Interest.272/.253

3.48/3.17.525/.458

3.18/3.32.006/.014

3.54/4.23.803/.796

3.61/3.57

Difficulty.648/.644

2.83/2.74.418/.405

3.09/2.95.018/.021

3.31/2.54.002/.005

3.43/2.91

Familiarity.714/.723

2.65/2.74.803/.803

2.82/2.86.068/.080

2.92/2.38.002/.004

3.09/2.65

n=23

n=22

n=13

n=23

levels among the students were relatively well distributed.

Group and High Proficiency Group, the Cowspiracy reading

S i m i l a r l y, t h e a c t u a l i t e m s c o m p r i s i n g t h e s u r v e y

was evaluated as more difﬁcult than the regular reading. In thequestionnaire also produced scores which did not evidencecase of both these groups, they may have moved into a

serious skew or kurtosis, and had relatively good

sufficiently-high bandwidth of proficiency to be able to

distributional properties.

distinguish one reading from the other in terms of difﬁculty.

From the perspective of the main research questions, it isInterestingly, however, the High-Intermediate Proficiency

clear that for RQ1 there was no evidence for a difference inGroup produced a significant result for level of interest

the level of interest for the two readings when the entire（Cowspiracy being viewed as more interesting）while thesample（N=81）was taken as a whole. The p value was very

High Proficiency Group did not. One would expect that if

far from meeting the threshold of < .05 in the case of bothincreased proficiency was resulting in a higher level oftests（parametric and nonparametric）. With respect to RQ2, ainterest for the High-Intermediate Proficiency Group whensigniﬁcant difference does appear when the responses for thecompared with the two lower proficiency groups, then this

difﬁculty item are compared across the two administrations ofwould also extend to the High Proficiency Group as well.

the survey; i.e. after the regular reading and after the

However, it did not, and no signiﬁcant result was obtained for

Cowspiracy reading. Participants evaluated the Cowspiracy

interest between the two materials in the High Proficiency

reading as being more difﬁcult than the regular reading. This

Group.

result is consistent with the CEFR levels for the two

There are two areas of explanation for this signiﬁcant result

respective reading materials with the regular reading being

on interest for the High-Intermediate Proficiency Group but

CEFR level A2 and the Cowspiracy reading being CEFR level

not the High Proficiency Group. The first concerns the low

B1. The results for RQ3, which focused on the level ofnumber of participants in this group（n = 13）when comparedfamiliarity with the content of the readings, indicate nowith the other groups. Because all four classes were relatively

differences between the two readings.

equal in size, the small number of participants in this group

The results become more interesting, and somewhat more

represents attrition, either through absences or failure to fill

difﬁcult to interpret, on turning to RQ4. The ﬁrst general issue

out the survey in such a way that matched pairs could bewith respect to these results is that there appears to be aestablished. One possibility is that this attrition was systematic

general pattern of significant results being more likely toin some way rather than random, and this affected the results

emerge with the High-Intermediate Proficiency Group andfor interest in this group. The second area of explanation, andHigh Proficiency Group than the Low Intermediate Proficiency

possibly the more likely, is that the teacher variable isGroup and Low Proficiency Group. No signiﬁcant results wereexpressing itself in these results. Each class had a different

obtained on any of the survey items for the Low Proficiency

teacher, and it is possible that the level of interest for theGroup and Low-Intermediated Proficiency Group. One

High-Intermediate Proficiency Group is bound up with the

explanation for this would be that both readings presented asteacherʼs approach to the readings in that class, rather than theso challenging for these groups that it would be difficult tolevel of proﬁciency in it.

distinguish between the two readings on any category ofevaluation（interest, difﬁculty, familiarity）.
In the case of both the High-Intermediate Proficiency
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Miki Rodriguez-Yagi・Ian Isemonger・Michael J. Rupp・Daniel Minor
learning in bilingual and multilingual education,

6.0 Concluding Remarks

Macmillan, London, UK.

The research reported in this paper overcomes some of the（5）Stryker, S.B. and Leaver, B.L. eds., 1997, Content-based

shortfalls which were evident in the previous study（8）. In the

instruction in foreign language education: Models andprevious study, matched pairs were not available and thismethods, Georgetown University Press, Washington, DC.

prevented a repeated measures design. Matched pairs were（6）Richards, J. C. and Rodgers, T. S., 1986, Approaches andavailable for this study, and the statistical analysis was

Methods in Language Teaching－Third Edition,

therefore more secure. The previous study also did not haveCambridge University Press, Cambridge, UK.

sufﬁcient representation of lower proﬁciency levels, and this（7）Tanaka, T., 2009, Communicative language teaching andstudy addresses this limitation with a better overall

its cultural appropriateness in Japan. Doshisha studies inEnglish, 84, 107-123.

representation of proficiency levels. This is an important
issue, as the analysis in this study actually suggests, because if（8）Rodriguez-Yagi, M., Minor, D., Rupp, M. andreadings are far too difficult（which they may be for lower

Isemonger, I., 2018, Developing Academic English forproficiency groups）, then this may affect other evaluations

the New Curriculum at Tokai University, Proceedings ofwith respect to the readings such as interest. With respect toSchool of Agriculture Tokai University, 37, 17-23.

future research, there are two main issues which present. The（9）OʼNeill, R., 2014, Unlock Reading & Writing Skills 2,
Cambridge University Press, Cambridge, UK.

first is that the confounding of proficiency level with theteacher variable should be overcome if possible; though this is（10）COWSPIRACY, The New Internationalist Easierdifficult given the institutional constraint of having to work

English Wiki, retrieved from https://eewiki.newint.org/

with intact classes（and assigned teachers）which are there

images/3/3d/Cowspiracy.pdf

for the interests of the curriculum rather than the interests of a（11）Krashen, S. D., 1985, The input hypothesis: Issues andimplications, Longman, London, UK.

research study. Finally, the research in this study is
generalizable only to the readings which were done（regular（12）Krashen, S. D., 1985, Input in second language
acquisition, Pergamon Press, Oxford, UK.

versus Cowspiracy）. To address the issue of an CBI rationale
for agriculture students, it would be beneficial to greater（13）Curtain, H. A. and Pesola, C. A., 1994, Languages andgeneralization if there were more than one regular reading andchildren: Making the match（2nd edition）, Longman,more than one CBI reading. The findings in such a study

NY, USA.

would be more generalizable to a class of material（regular（14）Met, M., 1991, Learning language through content:

versus CBI）rather than being bound to a single instance ofLearning content through language, Foreign Language
Annals, 24（4）, 281-295.

each class of material.

（15）Lightbown, P. M. and Spada, N., 1993, How languages
are learned, Oxford University Press, NY, USA.

References（16）Cummins, J., 1981, The role of primary language（1）Rodriguez-Yagi, M. and Minor, D., 2017, Exploring

development in promoting educational success foracademic English for the new curriculum at Tokai

language minority students, In Schooling and language

University, Proceedings of School of Agriculture Tokai

minority students: A theoretical framework（pp. 3-49）,

University, 36, 15-21.

California State University, Evaluation, Dissemination,（2）Brinton, D., Snow, M.A. and Wesche, M.B., 2003,
Content-based second language instruction, University ofand Assessment Center, Los Angeles, USA.
（17）Lantoff, J., 1994,（Ed.）Sociocultural theory andsecond language learning, Special issue of The Modern

Michigan Press, Ann Arbor, USA.

Language Journal, 78（4）.

（3）Mohan, B.A., 1986, Language and content（Vol. 5288）,
Addison Wesley Publishing Company, Reading, MA,（18）Lantoff, J., and Appel, G.（Eds.）, 1994, Vygotskian
approaches to second language research, Ablex,USA.
（4）Mehisto, P., Marsh, D. and Frigols, M. J., 2016,
Uncovering CLIL content and language integrated

Norwood, NJ, USA.
（19）GTEC, Overview of the GTEC tests, retrieved from─ 46 ─

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Academic English and Curriculum Development: Materials Evaluation Under a Content Based Instruction (CBI) Rationale
coe.int/en/web/common-european-framework-reference-https://www.benesse.co.jp/gtec/en/（20）CEFR（Common European Framework of Reference
for Languages）, Global scale－Table 1（CEFR 3.3）:

languages/table-1-cefr-3.3-common-reference-levelsglobal-scale

Common Reference levels, retrieved from https://www.

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Miki Rodriguez-Yagi・Ian Isemonger・Michael J. Rupp・Daniel Minor

アカデミック英語とカリキュラム開発：
内容を重視した英語教育における教材評価
ロドリゲス八木美樹
Ian Isemonger
Michael J. Rupp
Daniel Minor
抄録
東海大学農学部では2018年度の英語科目から新カリキュラムが始まり，２年生対象のアカデミック英語が新設された．アカデミック英語は農学部と連携した科目であり2015年度から内容（農学）を重視した教材開発を行っている．2015年度試行は希望者の参加であった為，少人数で英語力も高い方であった．2017年度は３クラスでの試行でより多くの学生が参加したが，英語力が高い方のクラスであった．本研究には農学部全学科１年１組全員が参加したので，英語力が低い学生から高い学生までいた．参加学生は農学ではない内容の教材を使用した授業を受けた後にその教材の難易度，興味深さ，内容に関する知識を評価するアンケートに回答した．そして，別の機会に農学に関係する内容の教材を使用した授業を受け，同じ項目のアンケートに回答した．2017年度の研究と異なり，学生一人一人の１回目のアンケート結果と２回目のアンケート結果を比較することが出来たので統計処理が改善され，より明らかな結果を得ることができた．さらに，入学時に受験した GTEC で測られた英語力とアンケート結果の相関も検証した．しかし，習熟度別４つのクラスは同時開講であった為，４人の異なる英語教員が担当した．そこで，英語力の差による影響か，担当者の相違によるものかは分からない．結果は農学の内容の教材の方が難易度は高いようであったが，英語力が一番下と下から２番目のクラスでは差がなかった．上から２番目のクラスは農学の内容の教材の方が興味深いとの結果であったが，一番上のクラスはそのような結果にはならなかった．

─ 48 ─

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紀

要

委 員 長
委
員

委

松
川
黒
米

員
本
邊
山
田

会
大
隆
竜
一

和
大
太
成

EDITORIAL COMMITTEE OF PROCEEDINGS
Chairman

Hirokazu Matsumoto

MemberTakahiro Kawanabe
Ryuta Kuroyama
Kazunari Yoneda

Published by
School of Agriculture, Tokai University
9⊖1⊖1 Toroku, Higashi-ku, Kumamoto-shi, Kumamoto,862⊖8652, Japan

東 海 大 学 紀 要
第38巻

農 学 部

2 0 1 92019年3月15日発行
発 行 所

東海大学農学部〒862－8652
電話

印 刷 所

096
（382）
－1141
（代）

有限会社ベストプロセス〒861－8038
電話

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2

熊本県熊本市東区渡鹿９－１－１

熊本県熊本市東区長嶺東8丁目13－17

096
（388）
－0889

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ISSN

Vol. 38

東海大学紀要 農学部

PROCEEDINGSOFSCHOOL OF AGRICULTURE
TOKAI UNIVERSITY
2 0 1 9東海大学紀要 農学部
第 38 巻
2

Protein identiﬁcation using amino acid composition analysis

2432－7204

01

9……… Arisa Kikuchi, Sayaka Kumamoto, Chika Hosozawa, Takeshi Shibata and Tomohiro Araki……１
Study on improvement for protein identiﬁcation method by amino acid composition

Genome-wide transcriptome analysis in Rapid cycling Brassica rapa（Fast Plants type）

アミノ酸組成分析を用いたタンパク質同定手法の検討
第三八巻……………………………………………… Shun Furuta, Sayaka Kumamoto and Tomohiro Araki……13……………………………………………………………… Misaki Sakaba and Takahiro Kawanabe……23………………………………………菊地亜里沙・熊本紗也加・細澤知香・芝田猛・荒木朋洋……１
アミノ酸組成によるタンパク質同定手法の精度向上に関する研究…………………………………………………………………古田

A survey on the Transition of Mental Health of University Students by UPI Test

舜・熊本沙也加・荒木朋洋……13

アブラナ科植物 Fast Plants における全ゲノム転写解析and the Inﬂuence of the Earthquake Disaster…………………………………………………………………………………坂場美咲・川邊隆大……23……………………………………………………………………………………… Ryuta Kuroyama……29

UPI による大学生の精神的健康の変遷と震災の影響に関する実態調査………………………………………………………………………………………………黒山竜太……29

Academic English and Curriculum Development: Materials Evaluation
Under a Content Based Instruction（CBI）Rationale

アカデミック英語とカリキュラム開発：内容を重視した英語教育における教材評価………………………… Miki Rodriguez-Yagi・Ian Isemonger・Michael J. Rupp・Daniel Minor……39…………………………………………………………………………………ロドリゲス八木美樹……39
二〇一九

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