広島県獣医学会雑誌
目
総

第22号

平成19年

次

説

プロスタサイクリンによる腎不全治療への展望
竹中雅彦

広島県福山市開業…………………………………………………………………

１……………………………………………………………………………………………

６

産業動物
乳成分を用いた牛群診断
桧山尚子

牛RSウイルス病の早期診断法の検討
恵谷

美江，山本

武，平井

潤思

……………………………………………………………

10

恭子，玉野

光博

……………………………………………………………

13

健雅，松重

忠美

……………………………………………………………

16……………………………………………………………

20

黒毛和種繁殖牛に発症したエンドファイト中毒症
玉川

朋治，石田

ウシ胚からの性判別用細胞採取法の開発
尾形

康弘，日高

レシピエント卵子の品種が核移植胚及び産子へ及ぼす影響
日高

健雅，尾形

康弘，松重

忠美

黒毛和種の白線部ヘルニアの１例
中谷

啓二，山崎

一男，平田

晴美，太田

国重

俊治，大川

雄三，篠塚

康典

哲夫，上高

宏，石橋

一郎，

……………………………………………………………

24……………………………………………………………………………

27

飼料給与を時間軸で考える要因分析事業
篠塚

康典，檜山

尚子

代謝プロファイルテストにおいてアルブミンの低下が認められた乳牛群の飼養状況とその要因鈴木俊彦……………………………………………………………………………………………

31

小 動 物
外科手術と化学療法で治療した頭蓋内髄膜腫の犬の１例
田村慎司，田村由美子，菅原

淳也，堀由

布子，菅原

雅俊，内田

和幸

……………

34

……………………………………………………………

39

持続的な嘔吐を呈した猫の肝嚢胞の１例
川上

正，園田

康広，川野

悦生

外科的結紮手術を行った犬の動脈管開存症の５例
園田
櫻田

康広，川上

正，長澤

晃，長谷川孝寿，大岡

裕，長澤
恵

晶子，小山

健，川村奈津子，……………………………………………………………

43

犬の両側手根関節脱臼の１例
櫻田晃，榎本巳知彦，板本

和宏，大村

斉，和田

美穂，伊藤

雄悟，山岡

安弘

……………………………

47

ネコの頭部に発生した粘液肉腫の一例
竹内

良成，福万

角田

利一，平野

朋子，塚根
健

和子，角田

睦子，

……………………………………………………………………………

50

広島市における東洋眼虫のホンドタヌキへの感染状況
渡辺
古川仁，野田亜矢子，南
敏紀

心司，大丸

秀士，柴崎

桃子，古本

佳代，

……………………………………………………………………………………………

54

公衆衛生
認定小規模食鳥処理施設における衛生対策に関する検討
東久保靖，伊坪堅香子，土井

中小規模学校給食施設における衛生指導について
矢野美奈子，新元章三……………………………………………………………

56〜特にドライ運用について〜

芳彦，小田真紀子，永田

猛，向井

健，山本

一夫

……………

61

司剛，川西

秀則，高橋

峰雄，

……………………………………………………………………………………………

65

広島県内における実験動物施設の現状について
大原佳世子，柳本
松田

政明

慎治，久保田早苗，池庄

広島市と畜場における地方病性牛白血病の抗体保有状況とその発生
大川

育之，阿部

恵子，太田

垣寧，佐伯

幸三，瀬尾

和範

……………………………

純也，山根

伸久，田口

和史，佐藤

敏浩，重東

和宏，三宅

伸子

68

Clostridium perfringensが分離された牛の壊疽性肝炎の１症例
赤木雅彦，仲宗根智彦，玉岡

隆司

……………

71

……………………………

75

清涼飲料水等に含まれるベンゼンの実態調査について
岩井会

報

関連学会案内
投稿規定

徹，西岡

達彦，中島

プロスタサイクリンによる腎不全治療への展望
竹

中

雅

彦

（受付：平成19年３月23日）

Prospects regarding the treatment of renal failure with prostacyclin
MASAHIKO TAKENAKA
Takenaka Animal Hospital
3-10-3 Zaocho, Fukuyama, Hiroshima, Japan

しろ間質障害の程度が，腎不全の予後と相関することがはじめに解ってきた．腎不全を進展させる要因として，さまざま

1930年に新鮮なヒト精液により子宮筋が規則的に収縮な因子が関与するが主な増悪因子として血液凝固系の亢することが発見され，精液から分離された物質は，前立進，各種炎症性サイトカインの産生増加，糸球体過剰濾腺（prostata）から作り出されたものでプロスタグラン

過，間質線維化の亢進などが知られている．これらの因ディン（prostaglandin: PG）と命名された．

子が複雑に関与して間質障害を促進させ腎不全を悪化させることになる．

その後，同様な分子構造の物質が犬を含むいくつかの動物から発見され，それらは循環器系，腎臓，凝固系ないかに間質性障害の進行を抑制し，さらに改善させる

どの生理学的機序に深く関与していることが解ってきかが現在の慢性腎不全治療の基本的な考え方である．そた．

こで注目されてきたのがPGI2の薬理作用で，先に述べたように腎不全の悪化因子をPGI2の薬理作用により改善さこれらのPGは，アラキドン酸の合成経路から生成され，共通の前駆物質PGH2を経て各種PGに分化する．そせられる可能性が期待されている．

の中で生理的に重要なPGは，PGD2，PGE2，PGF2α，プ

今回は，PGの生体における役割と作用について説明，トロンボキサンA2（TXA2）
ロスタサイクリン（PGI2）

し，腎臓内科領域でのPGI2を用いた腎不全治療の可能性などである．

について説明する．
１．生体における主なPGの役割

PGI2の血管拡張作用，抗血小板作用は古くから知られていたが，PGI2は，非常に不安定で，生体における半減

プロスタサイクリン（PGI2），トロンボキサンA2

期が数分ときわめて短いために，治療薬として用いるの（TXA2）の生成PGは，様々な細胞から生産されるが先は困難であった．しかしながら，1979年に経口投与が可ず， 細 胞 膜 の リ ン 脂 質 か ら フ ォ ス フ ォ リ パ ー ゼA2

能な安定したPGI2アナログであるベラプロストナトリウ（PLA2）によりアラキドン酸が分離され更にシクロオム（Beraprost Sodium:BPS）が世界に先駆けてわが国でキシゲナーゼ（COX）によりPG共通の前駆物質PGH2が開発された１,２）．現在，主に閉塞性血管疾患の治療薬と形成される．PGI2 は，PGH2 からプロスタサイクリン合して使用されているが，近年PGI2の研究から従来知られ成酵素により生産され細胞外に放出され標的細胞上の受ている血管拡張作用，抗血小板作用に加え新たに血管新容体に接合し作用を発現する．

生，血管内皮の保護作用，線維化抑制作用やサイトカイ

プロスタサイクリン（PGI2）は，主として血管内皮細ンに対する作用などが発見され臨床的意義が見直される胞で大部分生産され，血小板から産生されるトロンボキに至った．その中で人の腎臓内科領域でPGI2が注目され

サンA2 （TXA2）の作用に拮抗し，血行動態のホメオスている．

ターシスの維持に重要な働きをしている．
TXA2は，血小板にてアラキドン酸から生成されるPGH2

腎不全に対する考え方は，1970年代までは主に糸球体をへてトロンボキサン合成酵素により生成される．

障害が腎不全の本態であり間質障害は二次的な位置づけであった．しかし，最近の研究から糸球体障害よりもむ
竹中動物病院（〒721‑0971

広島県福山市蔵王町三丁目10−３）−1−広島県獣医学会雑誌

22（2007）

PGと血圧調整
生体の血圧調整は，主に自律神経である交感神経と副交感神経，レニン・アンジオテンシン・アルドステロン
系及びPGにより血圧を一定に保つように調整されている．その中でPGは，腎臓を介してノルアドレナリン及びアンジオテンシンに よ り 上 昇 し た 血 圧 をPGI2 とPGE2により低下させ血圧を調整している．
腎血流量におけるPGとアンジオテンシンの相互作用
腎血流量は，正常時において図−３Aのようにアンジオ
図１

プロスタサイクリン（PGI2），トロンボキサン

テンシン

A2（TXA2）の生成とPG（PGE2，PGI2）の相互作用により調整されている．図−3Bのように，レニンが刺激を受けアンジオテンシン

PGI2 とTXA2 の生理学的作用PGI2 は，強力な抗血が増加すると腎臓の血管は収縮するが，一方でPGE2,PGI2の生成を促進させる．その結果，の作用に拮抗し腎臓の血管は拡張さ

小板機能作用をもつほか，血管拡張作用，気管支拡張作

アンジオテンシン

用，平滑筋細胞遊走及び増殖抑制作用，血管新生作用，れるので腎血流量及び血圧は変動しない．しかし，PG

血管内皮細胞の保護作用などの多彩な作用を持つ３−５）．

の産生量が少なければアンジオテンシン の効果が優位

一方TXA2 は，PGI2 と拮抗する作用をもち血小板凝集になり腎臓の血管は，収縮傾向となり血流量が減少し，促進作用，血管収縮作用，気管支収縮作用，細胞崩壊作

血管抵抗が上昇するため血圧も上昇する．
図−３Cのようにレニンが刺激を受けアンジオテンシ

用を持っている．
PGI2 とTXA2 は，相互拮抗する作用を持つことで生体ン濃度が上昇している場合にシクロオキシゲナーゼ阻害薬である非ステロイド性抗炎症剤（nonsteroidal anti‑の生理的平衡を保っている．

inflammatory drugs, NSAID）を投与すると，PGの産生は極端に減少する．
表１

PGI2とTXA2の作用比較

プロスタサイクリン

その結果，アンジオテンシン が優位になり腎血流量は減少する．GFRも減少する結果，尿量は減少し重度のトロンボキサンA2

血小板凝集抑制

血小板凝集促進

血管拡張

血管収縮

気管支拡張

気管支収縮

細胞保護

細胞崩壊

場合では乏尿，無尿になることもある．
したがって，高血圧の患者，腎機能が低下している患者へのNSAIDの投与は注意を要する．
A（循環器疾患の薬物療法より転載・南江堂）

B

C

図３
図２ PGと血圧調整（循環器疾患の薬物療法より腎血流量におけるPGとアンジオテンシン の相互作用（循環器疾患の薬物療法より転載一
部改変・南江堂）

転載一部改変・南江堂）−2−

広島県獣医学会雑誌

２．腎臓内科領域におけるプロストサイクリン（PGI2）

22（2007）

腎疾患の特徴とPGI2投与で期待される効果の臨床応用

Ａ．糸球体腎炎，ループス腎炎

PGの中でPGI2は，従来から知られていた抗血小板作用，

糸球体腎炎の多くは免疫的機序により起こることが血管拡張作用に加え最近の研究から線維化抑制作用，炎知られている．

症性サイトカインの抑制，血管内皮細胞の再生と保護作

糸球体において沈着した抗原などから受ける免疫的刺用および血管新生作用など新たな薬理作用が報告されて激により補体活性が活性化されマクロファージ，好中いる．PGI2の作用について，いまだ完全には解明されて球の浸潤や凝固系の活性化，TNFαやMCP‑１などのおらず今後も更なる薬理作用の発見も期待されている．

炎症性サイトカインの放出などを招き障害が進行す

PGI2 は半減期が数分間と非常に短く臨床応用は困難でる．また慢性例では血中のPGE2 が低下していると報あったが，PGI2のアナログであるBPSの出現により臨床告されている６）．

応用が可能になった．このBPSの臨床応用は，血管外科

PGI2を投与すると炎症性サイトカインの産生や，血内科，循環器内科，糖尿病および内分泌，血液内科，脳液凝固活性が抑制されさらに免疫複合体の糸球体への神経外科，整形外科，皮膚科，眼科，耳科，腎臓内科，

沈着も減少し糸球体障害が軽減されることが報告され臓器移植，再生医療など多方面に渡る各科領域で使用さている７）．

れ始めた．

Ｂ．ネフローゼ症候群
ネフローゼ症候群はTXA2 の産生が亢進して，それその中で，腎臓内科領域におけるBPSの臨床応用につが大量の蛋白尿の原因の一つではないかとされていいて述べてみる．

る８）．そのためPGI2 を投与しTXA2 と拮抗させること
で蛋白の漏出を軽減させることが期待されている．
Ｃ．糖尿病性腎症
糖尿病ではTXA2 の増加による血小板凝集亢進や糸球体過剰濾過による糸球体高血圧症を併発し９），糸球体硬化症などの血管障害をおこす．PGI2を投与することでTXA2 の作用に拮抗させ改善を期待されている．
さらに糖尿病に伴う網膜症，末梢血管障害にBPSが有効であったという報告もあり10）今後治療において期待されている．
Ｄ．急性腎不全NSAIDOによる急性腎不全が報告されている11）．
これはシクロオキシゲナーゼ阻害によるPG産生低下
図４

腎疾患の進展における凝固・線溶系の関与によるものでありBPS投与により改善が期待される．

（プロスタサイクリンの多様性と今後の展望よＥ．慢性腎不全

り転載・メディカルレビュー社）

腎 不 全 初 期 で は， 腎 に お い てPGE2 の 産 生 は 増 加
し，代償的に腎機能を保持する．しかし，糸球体の荒腎疾患の病態について廃が進むにつれて腎血流量は低下し，さらに間質の血流も低下する結果となる．そして腎不全は悪化する経腎疾患を病態別に分類すると糸球体腎炎と間質性腎炎に大別され，経過において急性腎不全と慢性腎不全に大路を進む．
PGの慢性腎不全への効果は，腎不全の増悪因子で別される．
糸球体腎炎の多くは免疫的機序により糸球体が障害をある血液凝固系の亢進，炎症性サイトカインの放出，受けることにより発症する．糸球体において抗原抗体反間質の線維化などを抑制し，腎血流量の改善が期待さ応などの免疫学的機序により補体が活性化されマクロ

れている12，13）．

ファージ，好中球の浸潤を受ける．また，血小板も活性３．まとめ化され凝固系の亢進や，炎症性サイトカインの放出など

PGは，様々な細胞のリン脂質より生成され，アラキが起こり次第に糸球体は，機能を低下させる．これらの機序が長期間にわたり持続し慢性化すると腎臓の血流量

ドン酸からPGH2を経てPG合成酵素により生成される．

は次第に低下し間質障害が進展し腎機能を更に悪化させ

PGは，生成された局所にて作用を発現するが半減期がる結果になる．

数十秒から数分と極めて短く，短時間に作用は消失する．

また一方では残存した糸球体への血流量増加は，過剰

このPGの作用は局所的，超短期的ではあるが様々な組ろ過を招き残存糸球体への負荷を増し機能を低下させ織，臓器に作用し，その効果は生体全体に及ぶこともある．

る．PGのなかでプロスタサイクリン（PGI2）は，血液−3−

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

凝固，循環器，腎臓のホメオスターシスの維持に深く関の抑制ならびに間質の線維化抑制，糸球体毛細血管の内与するが，一方トロンボキサンA2（TXA2）やPGE2など

膜保護，血管新生作用などにより腎血流量を改善させ腎は逆に病態形成にも関与する．

不全の進行を抑制させることが期待されている．

こ の よ う にPGは， 非 常 に 多 彩 な 作 用 を 示 しPGI2 と慢性腎不全はヒトも動物においても根本的な治療法は

TXA2のようにお互い相反する作用を持つことで，バラなく対症療法に頼るしかないのが現状である．ヒトではンスをとりながら生体のホメオスターシスを維持してい血液透析などの回避的な処置が期待できるが動物においる．しかし，そのバランスが崩れると血栓症，高血圧，ては皆無である．獣医科領域において，慢性腎不全は中，腎機能低下などの病態を形成することになる．

高年齢の猫に多く認められ14），特に15歳以上の猫では全疾患の30％を占めている15）．

PGI2の薬理作用として抗血小板作用と血管拡張作用は知られていたが，先に述べたように極めて短時間で作用

現在，猫の慢性腎不全に対する治療方法は処方食およは消失するため臨床応用が困難であった．しかし，世界

び薬用活性炭などを使用する対症療法であるが，BPSにに先駆けわが国でPGI2のアナログであるベラプロストナ

よる治療は対症療法ではなく腎機能を改善させる積極的トリウム（BPS）の開発に成功し臨床応用が可能になっな治療方法と考えられる．BPSによる腎不全治療は，最た．BPSは，PGI2の受容体を介して効果を発揮するため，近になり取り組み始められた方法であり，人において治PGI2とほぼ同様の効果が認められる．現在BPSは，抗血験段階であるが，すでにいくつか良好な成績が報告がさ

小板作用と血管拡張作用を生かした循環器系の疾患に臨れている16）．
近年，腎不全治療に対する考え方が大きく変化してき床応用されている．
近年，遺伝子解析の発展に伴いPGI2の新たな薬理作用ている．現在，慢性腎不全の治療は，根本的な治療方法

が，発見されている．新たに発見された主なPGI2の作用はなく最終的には透析療法に頼るところである．しかし，は，線維化抑制作用（血管平滑筋細胞に対する遊走・増腎不全の研究は，めざましいものがあり腎臓の再生医療

殖抑制作用），炎症性サイトカイン抑制作用（マクロへの期待が膨らんでいる．BPSの治療法もまた広義におファージに対するPDGF産生抑制，TNF‑α産生抑制，IL

いて再生医療法の一つであるが，実験的にシクロスポリ‑１産生抑制作用，コレステロールエステラーゼ活性促

ン腎症モデルにおいてTGF‑βに対する中和抗体を投与進作用）や好中球に対する遊走抑制，スーパーオキサイ

すると，線維化が消失し尿細管萎縮が改善し腎機能が保ドアニオン産生抑制作用，HGF（肝細胞増殖因子）産たれという報告がある17）．動物実験段階ではあるが間生増加による血管新生作用，血管内皮細胞の新生と保護質の線維化が消失し，尿細管萎縮が改善したことは，慢作用，血液凝固に対する線溶系活性化作用などが報告さ

性腎不全治療の有力な治療法の一つになるかもしれなれている．これらの報告をうけてPGI2の臨床への再評価

い．近い将来，BPS療法，免疫療法などを含めた有効ながなされ，各科領域でBPSを用いて臨床応用が試みられ治療法が確立されたならば，慢性腎不全は不可逆的な疾ている．

患から可逆的な疾患へと変貌するであろう．

その中で腎臓内科領域では腎不全に対する治療が試み文られている．BPSによる慢性腎不全治療の目的は，初期

献１）西尾伸太郎：ベラプロストナトリウムの薬理作用，の腎不全に対しては治癒を，慢性腎不全に対しては，進現代医療24：109‑117，1992

行を抑制させ透析療法の遅延または回避を目指す薬物と

２）西尾伸太郎，車谷

して治療に用いられ始めた．

元：経口投与可能なPGI2誘導体

腎不全の病態において，糸球体病変よりもむしろ間質

ベラプロストナトリウムの薬理作用と臨床効果．日病変のほうが重要であり，予後と相関することが解って薬理誌（Folia Pharmacol Jpn）117：123‑130，2001

きた．間質病変とは，主に間質の線維化病変のことであ３）Lianos E. A.: Biosynthesis and role of arachidonic acid

り，いかに線維化の進行を抑制するかが，治療のポイン

metabolite in glomerulonephritis. Nephron, 37: 73-77,

トとなる．腎不全の進行過程は，ます腎臓疾患の初期に1984おいて遊走してきた血小板，マクロファージ，好中球な

４）Moncada S., Vane J. R.: An enzyme isolated from

どの刺激により炎症性サイトカインが活性化される．活arteries transforms prostaglandin endoperoxidases to an

性化された炎症性サイトカインは，間質への平滑筋細胞

unstable substance that inhibits platelet aggregation.

の遊走，浸潤を招き間質はしだいに線維化が進行する．

Nature (Lond), 263： 663-665, 1976
５）Cheng Y., Austin S. C., Rocca B., et al: Role of

その結果，腎臓の血液循環量は次第に減少し腎不全は悪

prostacyclin

化する．

in

the

cardiovascutar

responsetothromboxane A2, Sclence, 296: 539-541, 2002

BPSは，腎不全進行の各過程に抑制的に作用する．腎不全に対してBPSを投与して期待される効果は，PGI2，

６）Papanicolaou N, Mountokalakis T, Palassides A, et al:，TXA2とのバラ

Urinary prostaglandin in kidoney disease. Proataglandins

PGE2の低下に伴うアンジオテンシン

Med 3: 47-51, 1979

ンス改善，腎不全の増悪因子である炎症性サイトカイン−4−広島県獣医学会雑誌

７）Utsunomiya Y, Ogura M, KawamuraT, et al: Attenuation

22（2007）

improving

renal

blood

flow

without

glomerularof immune complex nephritis in NZB/W F1 by a

hypertension in patients with chronic renal insufficiency.

prostacyclin analogue.Clin Exp Immunol 99: 454-460.

Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 65: 223-227,

1995

2001

８）Remmuzzi G, Imberti L, Rossini M, et al: Increased13）Gerber JG, Keller RT, Nies AS: Prostaglandins and reninglomerular thromboxane synthesis as a possible cause of

release; The effect of PGI2, PGE2 and 13, 14-Dihydroproteinuria in experimental nephrosis. J Clin Invest 75:

PGE2 on the baroreceptor mechanism of rennin release94-101, 1985

in the dog. Circ Res 44: 796-799, 1979９）Wang LN, Tang Z ,Shou I, et al: Effects of the PGI214）DiBartola S. P., Rutgers H. C., Zack P. M., Tarr M. J.: J

analog beraprost sodium on glomerular prostanoid

Am Vet Med Assoc, 190, 1196-1202, 1987

synthesis in rats with streptozotocin-induced diabetes.

15）Lulich J., OBrien T., Osborne C., Polzin D.: The

Nephron 73: 637-643, 1996

Compendium Continuing Education, 14, 127-152, 1992

10）Lianos EA: Biosynthesis and role of arachidonic acid16）Fujita T, et al: Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acid

metabolite in glomerulonephritis. Nephron 37: 73-77,

65: 223-227, 2001

108417）Ling H, Li X , Jha S, Karetskaya L, et al: Therapeutic of11）Clive DM, Stoff JS: Renal syndorome associated with

TGF-β-neutralizing antibody in mouse cyclosporin A

nonsteroidal antiinflammatory drugs. N Engl J Med 310:

nephropathy: Morophologic improvement associated563-572, 1984

with functional preservation. J AmSoc Nephrol 14:12）Fujita T, Fuke Y Satomura A, et al: PGI2 analogue377-388, 2003

mitigates the progression rate of renal dysfunction−5−乳成分を用いた牛群診断
桧

山

尚

子

（受付：平成19年１月23日）

Evaluation of dairy herds by milk ingredient analysis
NAOKO HIYAMA
Miyoshi Veterinary Clinical Center, Hiroshima P.F.A.M.A.A
3-6-36, Tohkaichi-higashi, Miyoshi, Hiroshima 728-0013

SUMMARY
Feeding management guidance using data on milk components including milk urea nitrogen (MUN) in
dairy cattle tests is widely performed. In 2000, Ikuta et al. reported a correlation between MUN and themilk protein percentage in their study entitled
MUN and the milk protein percentage.

Simple nutritional diagnosis of lactating cows based on

Based on this correlation, we analyzed data on milk components

in dairy farms to determine to clarify the relationship between milk components and the feed sufficiency
rate/feed balance, to establish in an optimal feeding situation, and evaluated problems in each farm. Dataon 3 dairy farms within our jurisdiction were obtained, and all data were classified according to milk yield
into groups. The mean value in each group was calculated, and its association with the results of feed
calculation was evaluated.
In farm M, there were significant positive correlations between the sufficiency rate of the crude protein
content (CP) and MUN as well as the milk protein percentage, between the sufficiency rate of the total
digestible nutrients (TDN) and the milk protein percentage, and between MUN and the milk protein
percentage. There was also a significant positive correlation between TDN/CP, representing feed balance,
and the milk protein percentage. In farm Y, there were significant positive correlations between the CP
sufficiency rate and MUN as well as the milk protein percentage, between the TDN sufficiency rate and themilk protein percentage, and between TDN/CP and the milk protein percentage. In farm K, there was asignificant positive correlation between TDN/CP and the milk protein percentage.

Milk component

analysis in each cow allows only the determination of whether values are in the normal range, and is not
appropriate for the evaluation of the tendency of the entire farm. Analysis of farms data based oncorrelations that should be present in an appropriate feeding situation facilitated the evaluation of thetendency of each farm.

要約

乳中尿素態窒素（以下MUN）を含む乳牛検定の乳成分データを利用した飼養管理指導は広く行われている．今回の研究は，2000年に生田らが行った研究「乳中尿素態窒素と乳蛋白質率による泌乳牛の簡易栄養診断」で発表されたMUNと乳蛋白質率との相関関係を利用し，適正給与状況下で成立すべき飼料充足率・飼料バランスと乳成分の相関が実際の農場のデータで成立するのかどうかを分析し，その農場の問題点を探った．管内酪農家３戸のデータを供し，全データを乳量階層によりグループ分けし，それぞれの平均値を出し，飼料計算結果と相関を求めた．
Ｍ牧場は粗蛋白質含量（以下CP）充足率とMUNおよびCP充足率と乳蛋白質率との間に正の有NOSAI広島三次家畜診療所（〒728‑0013広島県三次市十日市東３−６−36）−6−広島県獣医学会雑誌

22（2007）

意な相関が成立した．可消化養分含量（以下TDN）充足率と乳蛋白質率およびMUNと乳蛋白質率の間に正の有意な相関が成立した．また，飼料バランスを示すTDN/CPと乳蛋白質率の間にも正の有意な相関が成立した．Ｙ牧場はCP充足率とMUNおよびCP充足率と乳蛋白質率との間に正の有意な相関が成立した．TDN充足率と乳蛋白質率の間に正の有意な相関が成立し，またTDN/CPと乳蛋白質率との間にも正の有意な相関が成立した．
Ｋ牧場ではTDN/CPと乳蛋白質率の間に正の有意な相関が成立した．個体ごとの乳成分分析は正常値内に入っているか否かの判定のみで農場全体の傾向は捉えにくい．適正給与状況下で成立すべき相関をもとに実際の農場のデータを分析すると，農場の傾向がつかみやすいことが分かっ
た．

序

文

成

績

広島県では平成17年よりMUNが乳牛検定成績表に記（図１・表２）Ｍ牧場は高泌乳グループでTDNとCP載されるようになった．MUNは血中尿素態窒素と相関充足率の両方が低い傾向があった．特にCPの充足率はがあることが分かっており，飼料バランスを把握する指非常に低い状況であった．生田の相関と比較してみる．

標となる．今回の研究の乳成分分析は，生田らによる１）

網掛けのマスは生田の相関と同じ相関関係であることを「乳中尿素態窒素と乳蛋白質率による泌乳牛の簡易栄養示している．Ｍ牧場はCP充足率とMUNに強い正の相関診断」にみられた相関関係を利用したものである．飼料がみられ，CP充足率と乳蛋白との間にも強い正の相関の適正給与状況下では相関関係が成立する．（表１）が見られる．CPが上がるほどMUNが高くなる関係が成立していて，飼料計算どおりにCPの不足が問題であり，

表１ 相関

中でも分解性蛋白質の不足が乳成分からも推測できる．

MUN

乳蛋白質率

CP充足率

―

―

TDN充足率

負の相関

正の相関

TDN／CP

負の相関

正の相関

次にTDNの充足率をみるとMUNと正の相関が成立した．
適切な飼養環境下では負の相関が成立する．（表１）必要な蛋白質が給与されていれば，エネルギー飼料の充足に伴ってMUNは低下するはずである．しかし，蛋白質の不足のためこの相関が成立しないと思われた．TDN―：相関成立せず
MUN：乳中尿素態窒素

充足率と乳蛋白質率の相関は生田の相関と同じく正の相関が成立した．正常なプロピオン酸発酵が行われている

TDN充足率が高いほど余剰アンモニアは減少する．すなわちMUNは減少するため負の相関が成立する．乳蛋
白質率はプロピオン酸発酵に反映するので可消化養分総量（以下TDN）と正の相関．TDN／粗蛋白質率（以下CP）この飼料バランスにMUNは負の，乳蛋白は正の相関が認められたとしている１）．この相関を利用し，実際の農場のデータを用いて，生田の相関が成立するかを検証し，その結果から農場の問題点を探った．

材料と方法
図１

平成17年５月〜18年２月（但し，Ｈ17年６月・11月は

Ｍ牧場の飼料充足率と乳成分の相関除く）の管内酪農家３戸の経産牛乳成分データ（n＝969）
表２と要因分析事業での飼料計算結果を利用した．但し，管

Ｍ牧場の飼料と乳成分の相関

内酪農家３軒ともTMR飼料を給与，飼養形態はＹ牧場
フリーストール，Ｍ・Ｋ牧場はタイストールである．乳成分データは月ごとではなく，農家ごとに全データを乳量階層によりグループ分けし，それぞれの平均値を出し，相関を求めた．求められた結果を生田の相関関係に照ら

−7−

乳蛋白質率

CP充足率

0.900**

0.934**

TDN充足率

0.773*

0.799*

TDN／CPNS

0.794***： P＜0.01*： P＜0.05
薄黒地：生田の相関と同じ

し，データに矛盾が無いか検討した．

MUN

CP：粗蛋白質含量
TDN：可消化養分総量
NS：有意差なし

広島県獣医学会雑誌

22（2007）と推測できる．TDNをCPで割った飼料バランスをみると，MUNとは相関が成立しなかった．適正給与では，MUNとは負の相関が成立する．Ｍ牧場では絶対的に蛋白質が不足しているためにこの関係は成立しないと思われた．飼料バランスと乳蛋白質率は生田と同じく正の相関が成立した．この農家では飼料中の分解性蛋白を上げて，乳成分の推移をチェックしていく必要があると考える．
図３

Ｋ牧場の飼料充足率と乳成分の相関

表４

図２

MUN

乳蛋白質率

0.722*

0.974**

TDN充足率NS

0.977**

TDN／CPNS

0.876**

乳蛋白質率

NS

NS

TDN充足率NS

NS

TDN／CPNS

0.781*

質率ともに相関は成立しなかった．CPが充足していてＹ牧場の飼料と乳成分の相関

CP充足率

MUN
CP充足率

CP：粗たんぱく質
TDN：可消化養分総量
MUN:乳中尿素態窒素
NS：有意差なし

Ｙ牧場の飼料充足率と乳成分の相関表３

Ｋ牧場の飼料と乳成分の相関

TDNも飼料計算上適正であるのに相関が成立していな
い．これは，エネルギー飼料の利用効率が悪い，分解ス
ピードが蛋白質と一致していない，ルーメンマットの脆弱性・ルーメン発酵の不良などが考えられる．粗飼料中の繊維質のチェックとエネルギー飼料が未消化のまま糞CP：粗たんぱく質
TDN：可消化養分総量
NS：有意差なしに出ていないか調べる必要がある．飼料バランスと
MUNは相関が成立していないが，乳蛋白質率とは強い正の相関が成立した．Ｋ牧場ではエネルギー飼料の正常（図２・表３）Ｙ牧場は低乳量群は飼料が過剰であり，な消化吸収が行われているかどうかを確認する必要があ

高泌乳牛群では蛋白質が不足していた．特に41キロ以上

る．

の２グループで充足率100％を切り，80％程度である．

考

乳成分との相関をみると，CP充足率とMUN間およびCP察

充足率と乳蛋白質率との間に強い正の相関が成立した．

現在行われているMUNを含む乳成分を用いたデータ

先ほどのＭ牧場と同じく蛋白質が不足するために成立し分析は，個体を月ごとに検討することが多く，その検討たと思われた．TDN充足率をみるとMUNとの間に相関

方法は正常値に入っているか否かの判定のみで，例えばは成立していない．適正給与下では負の相関が成立する．

高泌乳牛でエネルギーが不足している，分娩直後の牛が（表１）TDN充足率と乳蛋白質率では生田の相関と同食い込み不足であるなど個々を評価するものである．今じく強い正の相関が成立した．正常なプロピオン酸発酵回実施したように農家ごとに複数月分をデータ集約し，が行われていると推測できる．飼料バランスとMUNの乳量階層ごとにグループ分けする検討方法はあまり使わ間に相関は成立せず，乳蛋白質率との間には生田と同じれていない．

く強い正の相関が成立した．Ｙ牧場は飼料中の蛋白質割

現在の状態を捉えるには月ごとの分析が有効だと思わ合を上げ，乳量に見合った給与量に変更する必要がある

れるが，給与している飼料バランスの特徴やその農家のと思われた．

飼養管理の問題点を捉えるには，一月ごとよりも複数月（図３・表４）Ｋ牧場の飼料充足率は，過剰気味ではあに渡ってデータを集約した方がより正確にダイナミック

るがCP・TDNともにほぼ問題ないレベルであった．乳な数字として現れると考えられる．購入乾草の質の低下

成分との相関をみると，CP充足率とMUNおよび乳蛋白や暑熱の影響により，乳成分は容易に変動するため，月

質率との間に相関は成立しなかった．これは生田の相関毎の分析だけではデータを読み違える危険もある．さらどおりで，CPの充足率が適正なことが乳成分からも判に飼養頭数の少ない農家の場合，月毎の乳成分ではデー断できる．次にTDN充足率をみるとMUNおよび乳蛋白

タが少なすぎて傾向がつかみにくいが，今回用いた方法−8−広島県獣医学会雑誌

22（2007）であれば同じ個体から分娩後50日の情報も200日の情報

反映していることが分かった．それは特に，TDN充足も得ることができ，検討しやすい．他に適用例として，率・飼料バランスを良く反映しており，乳質の評価にはウォーターカップの改修や飼槽の張り替えを行い，カウ

MUNだけでなく，乳蛋白質率も合わせて判断すること

コンフォートが向上した時，その前後の比較にも利用でが重要であると考える．飼料計算という計算上の理論ときると考える．

実際の牛の反応として返ってきた乳成分とを照らし合わ

今回の結果から乳成分は牛群の飼料給与状況を反映しせることによって，より正確な牛群診断が可能であるこており，乳成分は個体で見るよりもグループで比較するとが分かった．但し，今回の分析では人的問題やカウコ方が特徴をより把握しやすいことがわかった．飼料充足

ンフォートの問題などは全く考慮してないので，現場を率が示すとおり，乳成分との相関が成立した農家もあれ

見て農家と話し合いながら，問題点を見つけていく必要

ば，飼料計算上は問題ないのに，乳成分との相関が成立がある．

しない農家もあった．給与量の思い込み，飼料給与順序

今回の分析を進めていて，飼料が乳成分へ与える影響

や間隔，あるいは飼料中諸成分の分解スピード，ルーメ

が良く理解できた．指導者の育成等にも活用できると考ンの発酵状況などにより，実際の乳成分データは理論値えている．

とは異なっていた面があったことはいなめない．乳成分

参考文献

は実際の飼養管理に対して牛が返してきた結果であることを考え，これを利用し現在の問題点を探っていきたい．

１）生田健太郎ほか：乳中尿素態窒素と乳蛋白質率による泌乳牛の簡易栄養診断，日獣会誌，53，289〜

今回は乳量グループを８階層に分けたが，その農家が292（2000）

給与している実態に即した方がより数字に表れやすいと思われる．乳成分の中でも乳蛋白質率は飼料状況をよく−9−牛RSウイルス病の早期診断法の検討
恵谷

美江１）

山本

武１）

平井

潤思２）

（受付：平成19年１月26日）

Evaluation of early diagnosis methods for bovine respiratory syncytial
virus infection
MIE EYA１), TAKESHI YAMAMOTO１), JYUNJI HIRAI２)
１）Higashi-Hiroshima Livestock Health & Hygine Service Center Hiroshima Prefecture
1-15, Saijogojo-cho, Higashi-Hiroshima, Hiroshima 739-0013
２）Geihoku Livestock Health & Hygine Service Center Hiroshima Prefecture
4-12-1, Kabe, Asakita-ku, Hiroshima 731-0221

SUMMARY
For the diagnosis of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) infection, virus isolation or antibody
examination using pair serum of cattle with this infection is generally used. However, the detection rate byvirus isolation is very low, and long-term subculture is necessary. Since antibody examination using pairserum requires serum samples both at the time of onset and during the recovery period, a long period isnecessary to obtain results.
For the rapid diagnosis of BRSV infection, we evaluated the HRSV kit and PCR. The detection
sensitivity was higher for PCR than for the HRSV kit. Some field cases in which BRSV was isolated werepositive for only PCR. These results suggested the usefulness of PCR as a rapid diagnosis method for
BRSV infection. At present, PCR is used as an adjunctive method and is not a diagnostic method
according to the manual. However, PCR may be an important examination method allowing the rapid
diagnosis of BRSV infection.

要約

牛RSウイルス病の診断法としては，一般にウイルス分離，発症牛のペア血清による抗体検査等が用いられている．しかしながら，ウイルス分離は，検出率が極めて低く，長期の継代が必要である．また，ペア血清の抗体検査は発症期と回復期の血清が必要なため，検査結果が出るまでに長期間を要している．
今回，牛RSウイルス病を迅速に診断する方法について，HRSVキットとPCR法の２種類について検討を行ったところ，PCR法はHRSVキットより検出感度が高く，BRSVが分離された野外材料からもPCR法のみが陽性と判断された症例もあり，BRSV感染症を迅速に診断する方法として
PCR法は有効な方法と考えられた．PCR法は，補助的診断に用いるのみで，マニュアル上では定められた診断方法ではない．しかし，牛呼吸器病に対して迅速に対応していく重要な検査方法と考えられた．

１）広島県東広島家畜保健衛生所（〒739‑0013
２）広島県芸北家畜保健衛生所（〒731‑0221

広島県東広島市西条御条町１‑15）
広島県広島市安佐北区可部４丁目12‑１）− 10 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

は じ め に
牛RSウイルス（BRSV）病は，病性鑑定マニュアル第２版１） において，蛍光抗体法または酵素免疫測定法，
抗体検査およびウイルス分離により診断される．現在，病性鑑定では，牛呼吸器病の原因究明依頼について，ウ
イルス分離と抗体検査を実施しているが，ウイルス分離
はその検出率が極めて低く，長期の継代が必要である．
また，抗体検査は，発症期と回復期の血清が必要なため，いずれも結果が出るまでに長時間を要している状況にある．今回，BRSV病に対する迅速検査方法として，15分で判定できる酵素抗体法：人用RSウイルス抗原検出キット（以下，「HRSVキット」という）と８時間程度

図１

HRSVキットによる検出で判定できるnested PCR法（以下，「PCR法」という）

この遠心上清にイソプロパノールを加え，10分間室温の２種類を比較検討したので報告する．

に放置後，遠心分離（15,000rpm，10分）した．この沈査をエタノールで洗浄後，再度遠心分離（15000

試験項目および方法

rpm，15分）により沈査を回収後，超純水に再浮遊させて，抽出RNAとした．

１．試験項目下記の試験１，試験２，試験３で，酵素抗体法：人BRSVに対するプライマー及び反応条件は，桐沢ら

用RSウイルス抗原検出キット（以下，「HRSVキット」の報告２） によるBRSV・Gタンパク遺伝子の約300bpという）とnested PCR法（以下，「PCR法」という）を標的とした２種類の正方向のプライマー（F１：の２方法での検出状況等を比較検討した．

ATC ACT CGT CAT CAC AGC CA，F２:AAA GCACCA CAC TGT CCC AA）と２種類の逆方向のプライ

１）試験１
10０ 〜10６TCID50 /0.1mlまで10倍階段希釈した既知

マー（R１:AGA GGA TGC CTT GTT GTG GA，R２:のBRSV液（NMK‑７株）を用いて，検出可能な範囲

TTT GAG GGT GAT TGT AGG GG）を使用した．プを確認した．

ログラム恒温槽はASTEC社製PC‑800を，酵素およびバッファーは，タカラバイオ(株)社製TaKaRa RNA２）試験２
過去の病性鑑定においてBRSVが分離された２症例

PCR Kit(AMV)Ver.3.0 とPERKIN ELMER社 製Gene（鼻汁14検体，血清24検体）についてウイルス分離及Amp EZ rTth RNA PCR Kitを使用した．逆転写反応は，

び抗体検査結果を比較し，検出状況を比較検討した．

TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0に従い，30℃10３）試験３分，42℃30分，99℃５分，５℃５分で行った．次に，

平成17年度に牛呼吸器病原因究明で依頼のあった52

F１ ,R１ の プ ラ イ マ ー セ ッ ト で １ 回 目 のPCR反 応

症例中，抗体検査からBRSV病と診断された６症例（鼻（DNA熱変性94℃１分，プライマーアニーリング60

汁26検体，血清50検体）についてウイルス分離及び抗℃１分，伸長反応72℃３分で，30サイクル）を行い，体検査結果を比較し，更に，２方法での検出状況を比F２ ,R２ の プ ラ イ マ ー セ ッ ト で ２ 回 目 のPCR反 応較検討した．

（DNA熱変性94℃１分，プライマーアニーリング60

２．方法℃１分，伸長反応72℃３分で，30サイクル）を行った．

１）HRSVキットによるBRSVの検出
日本ベクトン・デッキンソン株式会社製 ディレク
ティジェンEZ RSV を用い，使用説明書に従い，鼻汁（１症例をプール）を添付されている試薬と混合して，テストプレートに滴下後,図１のように判定部のＣ及びＴにラインが検出されたものを陽性，Ｃのみにラインが検出されたものを陰性とした．
２）PCR法によるBRSVの検出
ウ イ ル スRNAの 抽 出 は， ニ ッ ポ ン ジ ー ン 社 のISOGEN‑LSを用いた．鼻汁及び既知のBRSV液250μlに750μlのISOGEN‑LSを添加し攪拌，５分間室温に放置した．これをクロロホルム200μlで処理し，３分間室温に放置後，遠心分離（15,000rpm，10分）した．
− 11 −

図２

PCR法による検出広島県獣医学会雑誌

22（2007）

増幅した遺伝子は，２％アガロースゲル電気泳動を致していた．しかし，症例２及び４の場合，抗体検査実施後，エチジウムブロマイド染色を行い，１kbの成績でBRSV病と診断されたが，検討した２種類の方

DNAラダ−をマーカーとして同部位にバンドが確認

法では陰性と判定された．

（表２）

されたものを陽性とした．
表２ 抗体検査陽性例における検出方法の比較

３）ウイルス分離および抗体検査
発症牛からのBRSVのウイルス分離は，鼻汁をVero

ウイルス分離細胞に接種後34℃，７日間回転培養を行い，細胞変性効果を指標に３代継代した．
BRSVの抗体検査は，BRSV NMK‑７株を抗原として，Vero細胞で中和試験を実施した．BRSVが分離されるか，またはBRSV抗体が有意に上昇していた個体が認められた症例をBRSV感染症と診断した．

成ペア血清 HRSVキット

PCR法

症例１

0/4

1/4

陽性

4/4

症例２

0/5

1/5

陰性

0/5

症例３

0/4

2/3

陽性

4/4

症例４

0/4

4/4

陰性

0/4

症例５

0/5

2/5

陰性

1/5

症例６

0/4

4/4

陰性

2/4

績

１．試験１

考

既知のBRSV液では，HRSVキットは105〜106TCID50/
0.1mlまでが，PCR法は10１〜10６TCID50/0.1mlまでが陽性と判定した．

（図１，２）

察

PCR法はHRSVキットより10４倍検出感度が高かった．
また，BRSVが分離された野外材料でPCR法のみが陽性と判断された症例もあり，BRSV病を迅速に診断する方

２．試験２
過去の病性鑑定においてBRSVが分離された症例１法としてPCR法は有効な方法と考えられた．しかし，

及び２はHRSVキットでは検出されなかったが，PCR

BRSV病が抗体検査により確実に診断された症例におい法では症例１は全検体，症例２は８検体中６検体が陽て，PCR法では確認できなかったものが認められており，性であり，ウイルス分離と抗体検査によるBRSV感染

必ずウイルス分離，抗体検査を実施し，PCR法との検出症の診断とPCR法の結果は一致していた．

状況について比較確認していく必要があると考えられ

（表１）

た．
表１

PCR法は，補助的診断に用いるのみで，マニュアル上ウイルス分離例における検出方法の比較
ウイルス分離ペア血清 HRSVキット

では定められた診断方法ではない．しかし，牛呼吸器病

PCR法

症例１

1/6

1/5

陰性

6/6

症例２

1/8

3/7

陰性

6/8

に対して迅速に対応していく重要な検査方法である．
BRSV病にかかわらず，いかなる感染症に対しても，早期の防疫対応が重要であることからも，今後も，その対応が十分に取れるよう，迅速かつ確実な検査方法を検討

３．試験３

していく事が重要と考えられた．

平成17年度に抗体検査でBRSV病と診断された６症

文例からは,ウイルスは分離されなかった．このうち，
HRSVキットで２症例が陽性と判定された．また，

１）病性鑑定マニュアル（第２版）：牛RSウイルス病：

PCR法では，症例１及び３は全検体で，症例５では５
検体中１検体が，症例６では４検体中２検体が陽性と献

全国家畜衛生職員会：62〜63（2001）
２）桐沢力雄：ウシパラインフルエンザウイルス３型，ウシRSウイルス及びウシウイルス性下痢・粘膜病

判定した．
症例１及び３は抗体検査成績と２種類の方法の結果
が，症例５及び６は抗体検査成績とPCR法の結果が一− 12 −

ウイルス感染のPCRによる検出：J. Rakuno Gakuen
Univ.1994(1):225〜237(1994)

黒毛和種繁殖牛に発症したエンドファイト中毒症
玉川

朋治１）

石田

恭子２）

玉野

光博３)

（受付：平成19年１月26日）

A black Japanese cow with endophyte toxicosis
TOMOHARU TAMAGAWA１）, KYOKO ISIDA２）, and MITUHIRO TAMANO３）
１）Akitakata Veterinary Clinical Center, Hiroshima, P.F.A.M.A.A.
1775, Hongo, Midori-chou, Akitakata, Hiroshima, 731-0612
２）Fukuyama Livestock Health & Hygine Service Center, Hiroshima Prefecture396-1, Fukae, Joge-chou, Fuchu, Hiroshima, 729-3421
３）Geihoku Livestock Health & Hygine Service Center, Hiroshima Prefecture
1-12-4, Kbe, Asakita-ku, Hiroshima, Hiroshima, 731-0221

SUMMARY
In recent years, the provision of imported feed infected with endophytes has been shown to cause toxicosis due to toxins produced by the endophytes. We encountered a black Japanese cow maintained in a
farm in Hiroshima Prefecture that developed endophyte toxicosis.
In this farm, import feed purchased as Italian ryegrass was given daily (about 6 kg/cow), and the affected
cow showed neurological symptoms such as tremor of the four limbs and gait abnormalities. The imported
feed was perennial ryegrass and showed endophyte hyphae. The concentrations of toxins were relatively
high (ergovaline, 250 ppb; lolitrem B, 1,200 ppb), suggesting endophyte toxicosis.

要約近年，エンドファイトに感染した輸入飼料の家畜への給与による中毒が，エンドファイトの産生する毒素によって生じることが明らかになっている．今回，広島県内の農家で飼育されていた
黒毛和種繁殖牛で発症したエンドファイト中毒症に遭遇した．
発生のあった農家は，イタリアンライグラスとして購入した輸入飼料を，１日１頭当たり６㎏程度給与しており，患畜は四肢の振戦，歩様異常等の神経症状を呈した．輸入飼料はペレニアル
ライグラスであり，エンドファイト菌糸を認めた．毒素濃度は，エルゴバリン250ppb，ロリトレ
ムＢ 1200ppbと比較的高く，エンドファイト中毒症を引き起こしたものと思われた．

イトは菌自体が産生するアルカロイド等の毒素により牧

はじめに草へ耐病虫性，多収性を付与することから人工的に利用

エンドファイトは内生菌ともいわれ，植物体内で共生されている．近年，エンドファイトに感染したペレニア的に生活している菌類のことで，イネ科牧草を中心に

ルライグラスやトールフェスクの家畜への給与による中300種以上の牧草で感染が確認されている．エンドファ

毒が，エンドファイトの産生する毒素により生じること

１）NOSAI広島

安芸高田家畜診療所（〒731‑0612２）広島県福山家畜保健所（〒729‑3421

広島県安芸高田市美土里町本郷1775）

広島県府中市上下町深江396−１）

３）広島県芸北家畜保健衛生所（〒731‑0221

広島県広島市安佐北区可部１−12−４）− 13 −

広島県獣医学会雑誌が明らかになっている１，２）．

22（2007）

当たり４kg〜６kg程度であった．

今回，広島県庄原市内の農家で飼育されていた黒毛和発症経過と臨床症状

種繁殖牛に発症したエンドファイト中毒症に遭遇したの発症の経過は，購入飼料変更後12日目から33日目まで

でその概要について報告する．

の間に７頭の成牛が活力消失，体温の低下，起立困難，

発生農家の概要

四肢振戦，歩様異常等の神経症状を呈した．

飼育頭数約80頭の大型繁殖和牛農家で，４頭〜６頭の購入飼料変更後12日目の発症牛１頭は血液検査によりストール飼い．分娩１ヶ月前より分娩舎にて１頭飼いと低Ca血症を呈したが，29日目の発症牛１頭と32日目のしていた．

発症牛４頭には血液検査でのCa値の異常は認められな飼料給与は，購入飼料のフェスク・稲ワラおよび自給

かった．これらの臨床症状によりエンドファイト中毒を

飼料の給与体系をとっていたが，2005年10月20日から購

疑い,エンドファイト菌糸の検出を家畜保健衛生所に，入飼料のフェスクを米国Oregon州産のイタリアンスト

毒素濃度の定量を独立行政法人肥飼料検査所にそれぞれローに替えて給与することとした．給与量は，１日１頭

依頼した．

表１
症例番号

生年月日

性別

分娩予定日

1

H16. 1.29

雌H17.12. 5

2

H16. 5.11

雌H18. 4.21

3

H12. 6.11

雌H17.12.13

4

H 5. 6. 1

雌H18. 6. 7

5H14.10. 1

雌H18. 7. 8

6H12.12. 3

雌H18. 5. 5

7

H12.10.28

雌H18. 6.15

発症牛と臨床症状
体 温

発症日

症

（飼料変更後） （検査時）

H17.11. 1（12日目）
H17.11.18（29日目）
H17.11.21（32日目）
H17.11.21（32日目）
H17.11.21（32日目）
H17.11.21（32日目）
H17.11.22（33日目）

表２

状

等

38.2

起立困難、後躯の振戦、前躯歩様蹌踉、泥状便‑

起立困難、後躯の振戦、前躯歩様蹌踉、泥状便

38.5

起立困難、四肢の振戦、活力低下、胃腸運動微弱

38.3

起立困難、四肢の振戦、活力低下、皮温低下

38.4

起立困難、四肢の振戦、活力低下、皮温低下

38.4

起立困難、四肢の振戦、活力低下、削痩

38.2

起立困難、四肢の振戦、活力低下、皮温低下

初診時の血液検査結果

症例番号

1

2

3

4

5

6

検査年月日

H17.11.1

H17.11.18

H17.11.21

H17.11.21

H17.11.21

H17.11.21

RBC(×104/μl)

‑

‑

993

761

760

727

WBC

(×102/μl)

‑

‑

109

97

63

112

HGB

(g/dl)

‑

‑

12.4

15.4

11.2

12.5

Ht

(％)

‑

‑

29

35

26

29

TP

(g/dl)

6.6

6.1

6.4

6.7

6.5

6.6

Alb

(g/dl)

3.8

‑

3.3

4

3.4

3.6

Ca

(mg/dl)

5.1

12.2

11.7

11.4

11.8

11.4

Mg

(mg/dl)

‑

2.3

2.4

2.3

2.5

2.2

6.9

6.8

4.8

5.5

4.9

IP

(mg/dl)‑GOT(IU/L)

83

80

56

56

64

60

GGT

(IU/L)

29

‑

28

36

34

33

BUN

(mg/dl)

7

‑

10

10

9

9

CPK

(IU/L)

>2000

701

219

43

148

263

− 14 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

発症牛７例の年齢は比較的若齢のものが多く，すべて

考

妊娠牛であった．ほぼ全頭が低体温を示し，四肢振戦，察

今回の事例は，輸入飼料に存在していたエルゴバリン，

歩様異常等の神経症状を認めた（表１）．
初診時の血液検査結果からは，症例１に低Ca血症を認められたが，その他の５頭は正常のCa値であった．

ロリトレムＢの摂取によりエンドファイト中毒が発生したものと推測される．

CPKとGOTに軽度の上昇が認められるものの，血清学

毒素濃度は米国Oregon州における輸出前検査の基準値３） であるエルゴバリン500ppb，ロリトレムＢ 1800

的には著しい異常は無かった（表２）．
購入飼料変更から29日目，２頭目が発症した時点で購ppb以下の数値であったが，基準値以下であっても発症

入飼料の給与中止を指示し，その後６日目には全頭に症する例は報告されており１，４），今回の毒素量は，中毒状の改善が見られた．

症状を起しうる濃度であったと思われる．

結最初の発症牛１頭のみ低Ca血症であり，Ca剤の投与

果にて一時的に症状が軽減した．しかしながら，32日目に検査の結果イタリアンライグラスとして購入された輸は再び同一の神経症状を示し，輸入飼料の給与中止とともに症状の改善が見られたため，この１頭もエンドファ
イト中毒であると推測された．
今後このような症状に遭遇した場合，速やかに輸入飼料の給与中止又は給与量の減少を指示し，経過観察することが重要だと考えられた．

謝辞

エンドファイト菌糸の検出，毒素濃度の定量において，ご尽力いただいた家畜保健衛生所の先生方に深謝いたし
ます．

文

献

１）宮崎茂：エンドファイトが産生する毒素による家畜
写真１検出されたエンドファイト菌糸の中毒，臨床獣医，16（５），34−40（1998）．
２）仲嶺マチ子ら：エンドファイト感染輸入牧草給与牛に発生したライグラススタッガーが疑われた症例，

入飼料は，ペレニアルライグラスであった．

臨床獣医，16（11），38−45（1998）

ローズベンガル染色においてエンドファイト菌糸が認められ（写真１），毒素濃度は，エルゴバリン250ppb，

３）榎本勝治，宮崎茂：黒毛和種に発生したライグラス

ロリトレムＢ 1200ppbと比較的高値を示した．

ストローによるエンドファイト中毒症，家畜診療，
46，421−427（1999）．

類症鑑別として硝酸塩中毒とグラステタニーも考えられたが，硝酸体窒素濃度は261ppmと安全域であり，血４）Cornell, C. N. et al.; Establishing ergovaline levels for

中Mg濃度も正常であったため両疾病ともに否定された．

fescue toxicosis, with and without endoparasites, undercontrolled climatic conditions. Proceedings of International symposium on Acremonium/Grass interactions,
75〜79, (1990)− 15 −

ウシ胚からの性判別用細胞採取法の開発
尾形

康弘１）

堀内

俊孝２）

日高

健雅１）

松重

忠美１）

（受付：平成19年１月29日）

Development of a cell sampling method for the sexingof bovine embryos
YASUHIRO OGATA１）, TAKEMASA HIDAKA１）, TADAMI MATZUSHIGE１）, TOSHITAKA HORIUCHI２）
１）Hiroshima Prefectural Livestock Technology Research Center
584, Nanatuka-cho, Shobara, Hiroshima 727-0023
２）Hiroshima Prefectural University
562, Nanatuka-cho, Shobara, Hiroshima 727-0023

SUMMARY
To improve the quality of sexed bovine embryos, we developed a cell dissection method that is simple
and allows the collection of a small number of sample cells for sexing.
The number of cells collected by this method is about 1/5 of the conventional trophoblast metal blade
cutting method. This method can increase the number of cells in embryos in the blastocyst stage before
implantation without reducing the sexing rate for improvement in the quality of sexed embryos.
Conception of fresh embryos was not reduced by this method compared with no treatment or thetrophoblast metal blade cutting method.
After the implantation of embryos sexed by this cell dissection method, the production of female dairy
calves consistent with the results of sexing was possible.

要約

ウシの性判別胚の品質改善を目的として，簡易で少数の性判別用サンプル細胞を採取できる細胞剥離法を開発した．
この方法は，従来の栄養膜細胞の金属製ブレード切断法と比較して，採取する細胞数を約１/５まで減少させることができる．
性判定率を低下させることなく，移植前の胚盤胞期胚の細胞数を増加させることができ，性判
別胚の品質を改善することができる．
新鮮胚による受胎性も，無処置や栄養膜細胞の金属製ブレード切断法と比較して問題ないことが確認された．
細胞剥離法で性判別した胚を移植して，判定どおり雌乳用子牛を生産することができた．

１）広島県立畜産技術センター（〒727‑0023
２）県立広島大学（〒727‑0023

広島県庄原市七塚町584）

広島県庄原市七塚町562）− 16 −

広島県獣医学会雑誌

序22（2007）

児血清添加リン酸緩衝液に移し，３回以上洗浄した後，文

発生用培地TCM‑199＋５％FCSに移し，22〜24時間成熟

妊娠期間が長く，単胎動物であるウシにおいて，生ま培養を行った．
体外受精は，当センターの常法４）に従い，凍結精液をれてくる子牛の性によって畜産農家の経営に与える影響

用いて，精子濃度を６〜12×10６ /mlに調整して媒精をは少なくない．
希望する性の産子を得るために，これまでも様々な研６時間行った．媒精後72時間目までmSOF培地＋3mg/ml

究が行われており，現在，主に利用されているウシの性

牛血清アルブミン(Sigma A‑4378)＋0.25mg/mlリノール
酸アルブミン（Sigma L8384）で38.5℃，５％CO２，５

判別方法は大きく分けて二つある．
一つは，フローサイトメーターとセルソーターを利用％O２，90％N２の低酸素条件下で培養し，それ以降は，して，精子の段階でオス精子とメス精子に分画し人工授

mSOF培地＋10％FCS＋10μg/mlインスリン（Sigma I‑

精を行うもので，一部試験的に行われ着実に成果１）を挙

6634）でVero細胞との共培養を38.5℃，５％CO２，95

げている．

％airの気相条件下で行った．

もう一つは受精胚での性判別で，体内受精７日目の栄
養膜細胞の一部を金属製ブレードで切断するもの２，３）【性判別用サンプル細胞の採取】で，都道府県レベルでも性判別胚の供給を行っている．

性判別用のサンプル細胞の採取は，栄養膜細胞のブ

従来のブレード切断法による性判別用細胞のサンプリ

レード切断は，体外受精後７日目の胚盤胞期胚を用いた．

ングは，マイクロマニピュレータ等の高度な機器や熟練

顕微操作は，位相差倒立顕微鏡（Nikon Diaphoto 300）

した技術を必要とすることや，金属製ブレードでの切断と顕微操作システム（Leitz）に金属製ブレード（Microによる細胞損傷によって性判別胚の受胎性と保存性を低Feather BLADE K‑730）をセットし，栄養膜細胞の1/3下させてしまう等大きな問題があった．

程度を切断採取した．
胚の切断は，0.1Mサッカロース＋20％FCS添加M２

これらの問題を解決し，性判別胚の実用化を図ることを目的として我々は実験を行い，核移植時のドナー胚の液内で行った．
サンプル細胞として採取した切断胚は，20％FCS添加

処理方法を応用して，新しい性判別用細胞の採取法を開M２ 液 で ６ 回 洗 浄 し た 後， 20 ％FCS添 加mSOF培 地 で発した．
この細胞剥離法は，従来法と異なり，マイクロマニピュ

Vero細胞と共培養を２〜３時間行った．

レータ等の高度な機器を必要としない上，受精胚に対す細胞剥離法は，体外受精後５日目の桑実期胚を用いた．

る傷害が少ないため，胚盤胞期胚の品質が従来の金属製

桑実期胚を0.25％アクチナーゼＥ（科研製薬）に60秒

ブレード切断法よりも高く，受胎性についても無処置胚ほど静置し，透明帯を溶解した後，20％FCS添加M２液やブレード切断胚と同等であることが確認され，性判別で酵素の作用を停止させた．
透明帯を除去した胚を0.125％トリプシン（GIBCO

胚生産方法として有効性が高いと考えられる．

27250‑042）＋EDTA・4Na（Sigma E4DS）添加PBS‑に入

材料と方法

れ，市販のガラス製毛細管（Drummond 057910）をガ【体外受精胚の作出】

スバーナーで細く伸ばしピペットに加工した．

性判別に用いた体外受精胚は，と体卵巣由来もしくは，

そのピペットで数回ピペッティングすることで胚表層

広島県立畜産技術センターに繋養している黒毛和種及びの細胞を剥離させた．数個の細胞が剥離したところで，

ホルスタイン種からの経膣採卵によって得られた未成熟

20％FCS添加M２液で酵素の作用を停止させた．
細胞を剥離した胚は，20％FCS添加mSOF培地でVero

卵子を用いた．
と体卵巣からの卵子吸引は，37℃に加温した生理的食細胞と共培養を48時間行った．

塩水に卵巣を入れ，輸送・保存後，21Ｇ5/8注射針を５mlのディスポシリンジに装着し，卵胞径10mm以下のも【性判別法】のから吸引し集めた．

性判別は，ブレード切断及び細胞剥離のサンプル細胞

経膣採卵は，超音波画像診断装置（アロカ社SSD‑

ともに20％FCS添加M２液で６回洗浄後，１mg/mlPVA

1200） に 経 膣 穿 刺 用 コ ン ベ ッ ク ス 探 触 子 （ア ロ カ 社

添加PBS‑液で更に６回洗浄し，Loopamp牛胚性判別試薬

UHT‑9106‑7.5）を装着し，ディスポーザブル採卵針（ミキット（栄研化学）で性判定を行った．
サンプリングした性判別用細胞及び判別用操作胚の細サワ医科工業株式会社）及び卵子吸引システム（クック

胞数は，蛍光色素Hocehst33342で細胞核を染色し，蛍光

社K‑MAR‑5115）を用いて行った．
回収液は３％ウシ胎児血清（FCS）及び1.8ユニット/

顕微鏡下で細胞数をカウントした．

mlのヘパリンを添加した乳酸加リンゲル液を用い，吸引圧100mmHgの条件で卵胞液を吸引した．

【受精胚移植】それぞれの吸引液から卵丘卵子複合体のみを10％牛胎− 17 −

胚移植は，新鮮胚を発情後７日目の未経産ホルスタイ

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

性判別胚の移植成績は無処置区68.4％（13/19），ブレー

ン種の黄体側子宮角内に頚管経由法で行った．
妊娠診断は，妊娠30日目（移植後23日目）前後に超音波画像診断装置を用いて，胎仔心拍をもって妊娠と判定

ド切断区83.3％（５/６）及び細胞剥離区68.0％（17/25）
で，どの区間にも有意差はなかった．

した．
表４

成

績

試験区

性判別胚の受胎性（新鮮胚）
移植頭数

受胎頭数

受胎率

性判別用サンプル細胞の採取個数は，ブレード切断区

ブレード切断6583.3

13.2±1.4細胞（89胚），細胞剥離区2.7±0.2細胞（81胚）

細胞剥離

25

17

68.0

であった．

無処置

19

13

68.4

考

察

これまで，性判別法として，染色体分析５），パーコー
ル密度勾配法６）による精子分離，H‑Y抗原の利用７）や胚の発育スピードによる選別８）など様々な角度から研究が行われてきている．
ウシ胚のバイオプシーは金属製ブレードによる栄養膜
切断法９） が現在は主流となっており，この他にも金属
刃による細胞損傷を抑制するために透明帯にスリットを
図１

入れそこから膨出する細胞を採取するヘルニア法10）や，

性判別用サンプル細胞の採取個数

桑実期胚の割球をピペットで吸引する細胞吸引法11）等
サンプリング法別の性判別率は，ブレード切断区95.0が行われているがいずれの方法も，マイクロマニピュ％（19/20），細胞剥離区92.0％（46/50）であり，両者

レータ等の高度な機器と熟練した技術を必要とする．

の間に有意差はなかった．

しかもブレード切断法では，栄養膜細胞の切断による残りの胚へのダメージが大きく，このことが，その後の

表１

サンプリング法別の性判別率

性判別胚の受胎性や保存性を低下させることがあり，こ

試験区

供試胚数

性判別数

判定率(%)

れまで多くの研究機関で実用化試験が行われ，産子の生ブレード切断

20

19

95.0

産も行われているが，酪農家への普及はそれほど進んで

細胞剥離

50

46

92.0

いない．
今回行ったウシ受精胚からの性判別用サンプル細胞の性判別胚の発育性は，ブレード切断区84.6％（77/91）

採取は，従来の切断法とはまったく異なり，刃物によるが胞胚腔を再形成し，細胞剥離区91.4％（74/81）が胚切断ではなく，酵素の働きによって細胞間の結合を緩め

盤胞期胚に発育し，両者に有意差はなかった．

て剥離する方法なので，サンプリングする細胞数も13.2細胞から2.7細胞に少なくすることができた．また，切表２ 性判別胚の発育性断による細胞破壊によって細胞外へ溶出する水解小体等

試験区

供試胚数

胞胚腔形成

胞胚腔形成率(%)

により，残りの胚細胞の一部が傷害を受けるなどの影響

ブレード切断

91

77

84.6

で細胞を破壊することがない細胞剥離法は細胞への傷害

細胞剥離

81

74

91.4

を最小限にすることができると考えられ，結果として，性判別胚の総細胞数は，無処置区119.9±4.5細胞，ブレード切断区77.0±2.7細胞及び細胞剥離区100.0±6.7
細胞で，細胞剥離区はブレード切断区より有意に胚盤胞
期胚の細胞数が多かった．
表３ 性判別胚の総細胞数
試験区

供試胚数

総細胞数±S.E.

ブレード切断9177.0±2.7a

細胞剥離

32

100.0±6.7b

無処置

43

119.9±4.5c
写真１ 桑実期胚に細胞剥離法を適用した直後※異符号間で有意差（p＜0.05）− 18 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

今後，新鮮胚で例数を重ねながら性判定結果の正確度

細胞数の減少が抑制できたと考えられる．
実際，今回の実験でも，性判別胚の発育性には有意差調査を行い，最終的には，ガラス化保存した性判別胚をがなかったものの，ブレード切断区と比較して6.8ポイ

移植し，受胎性に与える影響を調査することで，実用化

ント（84.6％ vs 91.4％）改善されており，７日目の胚にむけた技術改善を行いたいと考えている．

盤胞期胚の総細胞数は，細胞剥離胚がブレード切断胚よ文

り有意に高いものとなっており，性判別胚の品質（細胞献１）Tubman, L. M., et al: Characteristics of calves produced数）を大幅に改善させることができた．

with sperm sexed by flow cytometry/cellsorting. J.

これまでの多くの報告で，凍結保存したバイオプシー

Anim. Sci, 82, (4), 1029-1036, (2004)

胚の受胎性の低さが問題視されており，沼辺らの報告でも無処置胚と比較すると受胎率が10%程度低下してい

２）Itagaki, Y., et al: Sexing of bovine embryos withる５）．これらを解決するために，緩慢凍結法ではなく，

male-specific repetitive DNA by polymerase chain

氷晶形成を伴わないガラス化法での性判別胚保存が試み

reaction, 9, (1), 65-72, (1993)12）．これらの胚のガラス化保存法とこの新

３）Machaty. Z.. et al. Biopsy and sex determination by PCR

しいサンプリング法を組み合わせることで，保存後の受of IVF bovine embryos, J Reprod Fertil, 98, 467-470

胎性改善が期待できると考えている．

(1993)られている

４）岩水正ら：ウシ体外受精胚の凍結保存，広島県獣医学雑誌,13,59‑62,(1998)
５）沼辺孝ら：牛胚の性染色体分析法およびPCR法による性判別，日本胚移植学雑誌,17,183‑189,(1995)
６）兼子智，押尾茂：細胞工学,秀潤社,13,(７),605‑
611,(1984)７）Utumi, K., et al: Embryo sex selection by a rat male specific antibody and the cytogenetic and developmental
confirmation in cattle embryos, 34, 25-32, (1993)
８）Avery, B., and Schmidt: Differential cleavage rates andsex determination in bovine embryos, Theriogenology,
写真２

32, (1), 139-147, (1989)

細胞剥離法で生産した性判別法

９）後藤充宏ら：PCR法によるウシ胚の性判別と臨床
これまでも，受精胚の一部をバイオプシーしたもので

応，日本胚移植学雑誌17,(１),19‑25,(1994)

も産子が得られており，細胞剥離法で作出した性判別胚10）青柳和重ら：新規法を用いたバイオプシー凍結胚にの受胎性も無処置の新鮮胚と同等であり，山中ら13）やよる子牛の生産，平成15年度東北農業研究成果情報

Niemannら

14）の報告にもあるように酵素処理や透明帯除360‑361(2004)
11）Herr. CM., Reed KC.,: Micromanipulation of bovine

去が受胎性に与える影響はないと考えられる．
この方法で生産された子牛も人工授精や受精胚移植産

embryos for sex determination, 35, 45-54, (1991)

子と同じように，妊娠期間，分娩状況ともに正常であり，

12）Y. Agca, et al: Normalcalves from transfer of biopsied,

この方法で子牛を生産することは，現在のところ問題はsexed and vitrified IVP bovine embryos, 50, 129-145

見当たらない．

(1998)
13）山中昌哉ら：牛体外作出胚およびバイオプシー胚の生存性におよぼすトリプシン洗浄処理の影響

日本

胚移植学雑誌19(２)89‑93(1997)
14）Takeda, T., et al: Deep freezing of split and intact bovine
embryo. Theriogenology, 27, (1), 285, (1987)

写真３

細胞剥離法で生まれた乳用雌ウシ− 19 −

レシピエント卵子の品種が核移植胚及び産子へ及ぼす影響
日高

健雅

尾形

康弘

松重

忠美

（受付：平成19年１月29日）

The Effect of Recipient Oocytes Species on Embryo
after Nuclear Transfer and Cloned Steers
TAKEMASA HIDAKA, YASUHIRO OGATA, and TADAMI MATSUSHIGE
Hiroshima Prefectural Livestock Technology Research Center
584, Nanatuka-cho, Shobara, Hiroshima 727-0023

SUMMARY
In order to investigate the effect of cytoplasm on embryos after nuclear transfer and cloned steers, we
performed nuclear transfer using donor cell from Japanese Black Cattle and recipient oocytes fromJapanese Black Cattle and Holstein Cattle. The developmental rate of embryos after nuclear transfer using
recipient oocytes from Japanese Black Cattle was significantly higher than embryos using recipient oocytes
from Holstein Cattle. The gestational period of cloned steers using recipient oocytes from Holstein Cattle
was significantly longer than cloned steers using Japanese Black Cattle. In comparison of birthweight ofcloned steers, embryos using recipient oocytes from Holstein Cattle was significantly heavier. In
conclusion, it was considered that development of embryo and steers were influenced by cytoplasm. It wassuggested that performing nuclear transfer using donor cell and recipient oocytes from same breed might
prevent abnormal delivery.

要

約

核移植胚及び核移植産子において，細胞質の違いが発生率や発育に及ぼす影響を調査するために，黒毛和種由来のドナー細胞と，黒毛和種及びホルスタイン種由来のレシピエント卵子を用いて核移植を行った．核移植胚の発生率は，黒毛和種由来のレシピエント卵子を用いた場合がホルスタイン種由来のレシピエント卵子を用いた場合より有意に高い発生率を示した．妊娠期間は，
ホルスタイン種由来のレシピエント卵子を用いた核移植産子が黒毛和種由来のレシピエント卵子を用いた場合と比較して有意に長かった．核移植産子の生時体重は，ホルスタイン種由来のレシ
ピエント卵子を用いた産子が有意に重かった．
このことから，レシピエント卵子の細胞質が，胚の発生や牛の発育に影響を及ぼしていることが考えられた．また，ドナー細胞とレシピエント卵子の品種を揃えることで異常産などが予防できる可能性が示唆された．

序外成熟後，除核したものをレシピエント卵子として用い

文て核移植を行う．その後体外培養を行い，胚盤胞まで発

受精卵核移植技術においては，桑実期の受精胚をド育した胚を移植し，核移植産子を作出する．

ナー細胞として，牛の卵巣から採取した未成熟卵子を体広島県立畜産技術センター（〒727‑0023

広島県庄原市七塚町584）− 20 −

この一連の操作において，ドナー細胞は一つの桑実期

広島県獣医学会雑誌

胚から用いるが，レシピエント卵子には異なった個体や22（2007）より行った５）．

品種の卵巣から採取した卵子を用いる場合が多いため，

除核卵子はカルシウムイオノフォア10μMとイノシ

核のDNAは同一でも，全く異なる細胞質を保有する核トール３リン酸25μg/mlで５分間処理した後，ピュー移植産子が生産されることになる．

ロマイシン100μg/mlと牛血清アルブミン（BSA）３mg

近 年， 細 胞 質 内 に 存 在 す る ミ ト コ ン ド リ ア のDNA

/mlを添加したCR１aa培地で６時間培養する複合活性化（mtDNA）が脂肪交雑などの経済形質に影響を及ぼす処理を施した．除核卵子に，受精後５日目の桑実期胚をと言われており，Boettcherら１） は，乳牛において生乳

ドナー細胞としてマイクロマニピュレーターにて挿入

生産量に細胞質が影響していると報告している．また万後，チンマーマン氏液中にて交流8.5V/mm ５sec，直年ら２，３）は肉用牛においてmtDNAのタイプに分けた群流75V/mm 50μsec×２回の電気パルスを印加すること

間に脂肪交雑などの経済形質に有意な差が認められたとにより細胞融合を行った．

報告している．このように母方からのみ遺伝する細胞質

体外培養は，電気インパルス印加後72時間目までは３も育種を行う上での重要な要因である可能性が示唆されmg／ml BSA添加CR１aa培地にて，５％O２・５％CO２・ている．

90％N２ ・38.5℃の条件下で，72時間目以降は10％FCS

一方で，Tessら

４）

は肉用牛の生産において細胞質の遺伝的な影響は重要ではないと報告している．また核移添加CR１aa培地にてVero細胞との共培養６）を行った．
３．レシピエント卵子の由来の異なる核移植胚の発生状
況調査

植産子を生産する中で，核移植産子の流産などの異常産や過大子，核移植産子間の肉質や増体などの経済形質の相似性など不明な点が多数ある．

核移植に用いたドナー細胞は，黒毛和種由来の受精後５日目の桑実期胚を用いた．試験区は，レシピエント卵

そこで今回我々は，核移植技術を活用して，品種の異子の由来別に区分し，未成熟卵子を黒毛和種の卵巣からなる牛から採取したレシピエント卵子を用いて核移植を採取した和牛区，ホルスタイン種及びＦ１（黒毛和種×行うことにより，細胞質が核移植胚や核移植産子に及ぼホルスタイン種）の卵巣から採取したホルス区とし，核す影響を調査した．

移植胚の融合率，発生率，総細胞数を比較調査した．
４．胚盤胞の構成細胞調査

材料と方法

総細胞数は，７日目に胚盤胞に発育したものについて，

１．牛卵子の採取と成熟培養

ヘキスト染色により胚を染色し，蛍光顕微鏡下にて核数

牛卵子の採取は，黒毛和種の生体卵巣からの経膣採卵を速やかにカウントすることにより確認した．
５．核移植産子の分娩状況調査と，と体卵巣からの吸引採取により行った．
経膣採卵は，経膣穿刺用7.5Mhzコンベックス探触子(アロカ社UHT‑9106‑7.5)，超音波画像診断装置(アロ

998年〜2006年まで当センターで生産された核移植産
子58頭について調査を行った．

カ社SSD‑1200)及び穿刺針(ミサワ社，COVA)を用いて試験区は，核移植胚の発生状況調査と同様に，レシピ行った．回収液は乳酸加リンゲル1000mlにつき３mlのエント卵子の由来別に分類し，未成熟卵子を黒毛和種の牛胎仔血清(FCS)と90ユニットのヘパリンNaを添加した

卵巣から採取した和牛区，ホルスタイン種及びＦ１の卵ものを用い，吸引圧は100mgHgにより未成熟卵子の回巣から採取したホルス区とし，それぞれの未受精卵をレ収を行った．と体卵巣からの吸引は，と体卵巣に存在す

シピエント卵子として用いて作出した核移植産子の妊娠

る直径７mm以下の卵胞から注射器(注射針:21Ｇ)を用

動態，生時体重を比較検討した．

いて卵胞液と共に卵子を吸引採取した．採取した牛未成
熟卵子は，卵丘細胞の付着度及び卵子の形態的観察によ

核移植産子の作出のためのドナー細胞は全て黒毛和種
由来の桑実期胚を用いた．

りＡ〜Ｅランクに分別し，卵丘細胞が２層以上付着し，成

かつ細胞質が均質なＢランク以上の卵子を試験に供し績

１．レシピエント卵子の由来の異なる核移植胚の発生状

た．
成熟培養は10％FCS，50ng/ml上皮成長因子(EGF)，況調査

0.12au/ml卵胞刺激ホルモン(FSH)添加TCM199培地にて和牛区及びホルス区の核移植胚の発生成績は，和牛区

５％O２・95％air条件下で22〜24時間行った．

では供試胚87個のうち融合率97.7％，８細胞期率77％，

２．核移植

桑実期率66.7％，胚盤胞期率62.1％，ホルス区では供試

成熟培養終了後，0.1％ヒアルロニダーゼ，0.1％コラ

胚83個のうち融合率95.2％，８細胞期率61.4％，桑実期

ゲナーゼ添加M２液中でピペッティングにより顆粒層細率41.0％，胚盤胞期率31.3％で，有意に和牛区が高い発胞を除去し，囲卵腔内に第一極体を放出した成熟卵子の生率を示した．

みを以降の実験に供した．
除核はマイクロマニピュレーターを用いて透明帯にスリットを形成し，極体を目印にした細胞質押し出し法に− 21 −

広島県獣医学会雑誌

表１ 核移植胚の発生率
融合数（％）

22（2007）

報を保有した牛を複数産出する技術であり，クローン検

試験区

供試胚数
（％）

和牛区

87

54ａ
85
67
58
（97.7） （77.0） （66.7） （62.1）

ホルス区

83

26ｂ
79
51
34
（95.2） （61.4） （41.0） （31.3）

定などの種雄牛造成への活用のため多くの研究機関で研8細胞数 桑実期数 胚盤胞数
（％）
（％）
（％）

究されてきた．クローン検定は従来の育種選抜手法に比べ検定期間の大幅な短縮化など検定効率の向上ならびに省力化を可能にする手法として期待されている．また，近年の核移植技術の進展により核移植産子の生産効率も体外受精由来胚の成績に近いものになり，クローン検定の実用化が可能になっている．しかし，核移植胚作出に異符号間に有意差あり（P＜0.01）

おいて，ドナー細胞とレシピエント卵子に由来が異なる卵子を用いる場合があるため，核DNAと細胞質の由来

２．胚盤胞の構成細胞調査
胚盤胞期胚まで発育した核移植胚の総細胞数は，和牛が異なる核移植胚や核移植産子が作出されることにな

区では，平均71.4±28.9個，ホルス区では70.4±28.8個り，胚の発生や産子の発育等への影響が懸念される．
今回我々が行った核移植胚の発生成績は，和牛区がホで，両区間に有意な差は認められなかった．

ルス区より有意に高い胚盤胞発生率を示した．
表２

安部ら７）は，ミトコンドリアの活性が高く酸素消費量

核移植胚の胚盤胞期胚の総細胞数

試験区

供試胚数

総細胞数±S.D

和牛区

38

71.4±28.9

ホルス区

17

70.4±28.8が高い胚が，胚盤胞への高い発生率を示し胚の質も良好であるとしている．ミトコンドリアの機能に必要な多くのタンパク質は，核にコードされた遺伝情報に依存しているため，ミトコンドリアの活性を高く維持するためにはmtDNAの正確な複製が行われる必要がある．ドナー

３．核移植産子の分娩状況調査

細胞とレシピエント卵子に由来品種が異なる卵子を用い

核移植産子の妊娠期間

ることにより，mtDNAの正確な複製が行われずミトコ

妊娠期間は，和牛区の平均は286±６日，ホルス区は289±2.3日と，ホルス区の方が約３日間，有意に長かっンドリアの呼吸活性などが低下し，その結果胚の発生成
績が低下した可能性が考えられた．

た．また当センターでは分娩予定日を５日間経過した場

家畜改良センターによる全国の試験機関アンケート８）

合，分娩誘起処置を行っているが，和牛区では，48頭中によると，核移植産子における難産の発生率は24.4％で８頭分娩誘起を行ったのに対し，ホルス区では10頭中５あり，牛の平均生時体重も48.3±11.9kgと過大子が生頭で分娩誘起を行っており，ホルス区で多くなる傾向が産される傾向が窺える．核移植後に生産された牛の過大認められた．

子はWilladsenら９）によって初めて報告され，その後牛や羊における操作胚から生産された胎仔の過大に関する
表３

報告が多く発表されている．その中でWalkerら10）によっ

核移植産子の妊娠期間

試験区

産子数

妊娠期間±S.D

誘起分娩

和牛区

48

286±6.0ａ

8

ホルス区

10

289±2.3ｂ

5て，in vitroにおける牛や羊の胚の操作が過大子の発生の原因となっている可能性が示唆されている．しかし，胚における遺伝子の発現と過大子との関連性に関する調査は報告11）されているが，過大子の発生にかかわる詳細な異符号間に有意差あり（P＜0.05）

メカニズムは未だ明らかになっていない．

核移植産子の生時体重本試験における核移植産子の調査では，和牛区と比較

生時体重の平均は，和牛区では35.5±6.7kg，ホルス

してホルス区の生時体重が約10kg重く，妊娠期間は約

区では45.3±8.9kgであり，ホルス区が有意に大きい値

３日間長かった．Walkerらは妊娠期間の延長も認められを示した．

るが，それだけでは生時体重の増加を説明するには不十分であるとしている．今回妊娠期間が290日以上であっ表４

核移植産子の生時体重

試験区

産子数

生時体重±S.D

和牛区

48

35.5±6.7ａ

ホルス区

10

45.3±8.9ｂ

た和牛区の生時体重とホルス区の生時体重の比較においても，ホルス区の生時体重は有意に大きかったことから，妊娠期間の延長の以外にも生時体重の増加に影響する要素がある可能性が示唆された．
また，一般的な人工授精を行った場合，ホルスタイン

異符号間に有意差あり（P＜0.05）

考

種の妊娠期間は黒毛和種より短くなるが，今回ホルス区の妊娠期間の延長が認められたことから，ドナー細胞と察

レシピエント卵子の品種が異なることにより，分娩を誘受精卵核移植技術は，一つの受精胚から同一の遺伝情起する機序に何らかの影響を及ぼしている可能性が示唆− 22 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）４）Tess, M. W, et. al.: Evaluation of cytoplasmic genetic

された．

effects in beef cattle using an animal model. Journal of

以上のことから，レシピエント卵子の細胞質が，胚のAnimal Science, 68, 1899-1909, (1990)

発生や牛の発育に影響を及ぼしていることが考えられた．またドナー細胞とレシピエント卵子の品種を揃える

５）高野ら：核移植実験系における電気刺激時の温度条ことで過大子やそれによる難産など異常産が予防できる件の検討，繁殖技術会誌，13，15‑19（1991）

可能性が示唆された．

６）尾形ら：マイクロドロップレット法で凍結保存した

我々は現在mtDNAのD‑Loop領域からミトコンドリア

牛のレシピエント卵子による核移植成績，広島県獣のタイプ分けを行い県内の牛のmtDNAタイプの分布調医学会雑誌，15，33‑36（2000）

査を行っているが，今後mtDNAタイプごとの性質やド７）Abe, Hiroyuki, et. al.: Evaluating the Quality of

ナー細胞とレシピエント卵子のタイプ間における関連性

individual Embryos with a Noninvasive and Highlyを調査し，ミトコンドリアが牛の発育や肉質へ及ぼす影

Sensitive Measurement of Oxygen Consumption by

響等を検討していきたいと考えている．

Scanning Electrochemical Microscopy. Journal of
Reroduction and Development, 52, 55-64, (2006)

文１）Boettcher,

PJ,

et.

献
al.:

Relationships８）橋谷田ら：肉用牛のクローン検定とそのための安定
between的双子クローン生産技術の展望と問題点，畜産技術，

Polymorphism for mitochondrial deoxyribonucleic acidand yield traits of holstein cows. Journal of Dairy

8月号，32‑36，（1998）
９）Willadsen, SM, et.al.: The viability of late morulae andScience, 79, 647-654, (1996)

blastcysts produced by nuclear transplantation in cattle.

２）Mannen, H, et. al.: Effect of mitochondrial DNA
variation on Carcass traits of Japanese black cattle.

Theriogenology, 35, 161-170, (1991)10）Walker, SK, et. al.: In vitro culture of sheep embryos

Journal of Animal Science, 76, 36-41, (1998)

without３）Mannen, H. et. al.: Identification of mitochondrial DNA
substitutions related to meat quality in Japanese Black

co-culture:

successes

andperspectives.

Theriogenology, 37, 111-126, (1992)
11）Young, LE, et. al.: Large offspring syndrome in cattle

cattle. Journal of Animal Science, 81, 68-73, (2003)

and sheep. Reviews of Reproduction, 3, 155-163 (1998)− 23 −

黒毛和種の白線部ヘルニアの１例
中谷石橋啓二１） 山崎一郎１） 国重

一男２） 平田俊治３） 大川（受付月日晴美１） 太田雄三１） 篠塚

哲夫２） 上高康典１）

宏３）

平成19年１月26日）

A Japanese black calf with white line hernia
KEIJI NAKATANI１）, KAZUO YAMASAKI２）, HARUMI HIRATA１）, TETUO OOTA２）,
HIROSI KAMITAKA３）, ITIROU ISHIBASHI１）, SHUNJI KUNISHIGE３）,YUUZO OOKAWA１）, and YASUNORI SHINOZUKA１）
１）Yamagata Veterinary Clinical Center, P.F.A.M.A.A.
461-1, Haruki, Kitahiroshima-cho, Yamagata-gun, Hiroshima 731-1531
２）Hiroshima, P.F.A.M.A.A.
1-2-23, Hikarimachi, Higashi-ku, Hiroshima, 732-0052
３）Higashihiroshima Veterinary Clinical Center, P.F.A.M.A.A.
284-1, Inaki, Takaya-cho, Higashihiroshima, Hiroshima 739-2106

SUMMARY
White line hernia in Japanese black cattle is rarely observed, and the treatment of large hernias isconsidered to be difficult. We report the treatment course in a Japanese black calf with white line hernia.
The calf showed no abnormalities at birth. About 3 months after birth, a hernial ring was observed in thewhite line immediately posterior to the navel, but it was healed after the 3rd operation.
The first and second operations were relatively easy, but hernia recurred from the lateral side of thesuture area after each operation.
In the 3rd operation, suturing for reinforcement was performed on the bilateral sides of the hernial ring
suture area using kitchen pads. Fever and suppuration persisted for about 40 days following operation, andthe kitchen pads were removed 43 days postoperatively. Subsequently, inflammation subsided, resulted inhealing.

要約

黒毛和種の白線部ヘルニアは発生が稀で大きなものは治癒困難と言われている．今回，黒毛和
種仔牛の白線部ヘルニアに遭遇したので，その治療経過の概要を報告する．
発生子牛は，出生時には異常を認めなかったが，約３ヶ月齢で臍直後の白線部にヘルニア輪を認め３回目の手術で治癒させることが出来た．
１回目，２回目の手術は比較的容易であったが，いずれも縫合部の外側から再発した．
３回目の手術ではキチンパッドを用いヘルニア輪縫合部の両側に補強縫合を施した．手術後，約40日間は発熱と化膿が続き，43日目にキチンパッドが排出され，その後炎症は消退し治癒した．

１）NOSAI山県家畜診療所（〒731‑1531
２）NOSAI広島（〒732‑0052

広島県山県郡北広島町春木461−１）

広島県広島市東区光町１−２−23）

３）NOSAI東広島家畜診療所（〒739‑2106

広島県東広島市高屋町稲木284−１）− 24 −

広島県獣医学会雑誌

序22（2007）

注射し仰臥保定とした（写真２）．

文ヘルニア輪確認後直径40cm切皮す

黒毛和種の腹壁ヘルニアは発生が稀で，大きなもの

る．比較的明瞭で硬度のあるヘルニ

また，特に白線部に発生したものは治癒困難と言われてア輪を認める．直径20cmのキチン

いる１，２）．

パッドをヘルニア輪に縫い付け（写今回，我々は黒毛和種仔牛の白線部ヘルニアに遭遇し，

真３），埋没させるようにヘルニア

３回目の手術で治癒させることが出来たのでその治療経

輪を縦に２重縫合した（写真４）．

過を報告する．

さらに，縫合部周囲から再発するた

患め，縫合部から左右に長さ10cmづ畜

つ補強縫合を施した（写真５）．皮発生子牛は，黒毛和種，メスで平成17年１月15日生ま膚を縫合し，起立させ，包帯を巻き，れ（約３ヶ月齢）であった．

手術を終了した（写真６）．
平成17年８月４日〜９月15日

治 療 経 過39.3〜40.5℃の熱発が続き，皮下患畜の臍部付近に径３cmの不明

平成17年４月？日に膿瘍形成が見られ，切開洗滌，抗瞭なヘルニア輪をみとる．
平成17年５月６日

生剤の投与を続けた．食欲，発育は，整復手術を行なう．ヘルニア輪は独特の硬さが認められず，整復手術

順調であった．
平成17年９月16日

は極めて容易に終了した．
平成17年５月17日

ら覗き，除去する．

抜糸したが，ヘルニア輪は認めな

口周囲は，結合織が厚く造成していかった．
平成17年５月25日

キチンパッドが押し出され創口かる．

再発確認し，その後経過観察するも次第にヘルニア輪拡大する．

平成17年６月29日

臍直後に幅５cm，長さ15cmの縦長のヘルニア（写真１）となり再手術を行なった．ヘルニア輪は軟
らかく，手術は比較的容易に終了
した．

平成17年７月１日

術部後端にヘルニア輪発生を認める．

平成17年８月３日

ヘルニア輪，極めて拡大速く，円形で，径30cmを超え再々手術を実施した．
推 定 体 重 180kgで， キ シ ラ ジ ン
0.06g（セラクタ−ル３cc）を筋肉
写真２

写真１

写真３

２回目の手術前− 25 −

３回目の手術漓 ヘルニア輪の確認

３回目の手術滷 キトサンパットの装着

広島県獣医学会雑誌

平成17年9月20日〜12月15日

22（2007）

平成18年１月13日

週１回創口の洗滌を行なう．体温したものと認めるの上昇は見られない．

写真４

３回目の手術澆

写真６（写真７）．

ヘルニア輪の縫合

３回目の手術潸

創口閉鎖し，脱出見られず，治癒

写真５

手術終了

写真７

３回目の手術潺 補強縫合

３回目の手術後150日目の患牛去してから発熱しなくなったことから，発熱の原因はキ考察およびまとめチンパットではないかと推察された．また，皮下の化膿

黒毛和種の腹壁ヘルニアの発生要因は，種々の外的要

は発熱の継続と補強縫合の非吸収性縫合糸が原因と思わ因（衝突，墜落，角突など）によって腹筋が挫傷を受け，れる．しかし，この炎症による結合織の増成が更なるヘ

１）

または皮下断裂をきたすことに起因して発生する．

ルニア輪の開口を防いだものと思われる．

今回の発生は月齢からみて先天的なものではなく，何ら

今後黒毛和種の腹壁ヘルニアの手術を行う場合，ヘルニ

かの外的要因によって発症したものと推察された．

ア輪縫合後，周囲の補強縫合を必ず施術することが必要

また，再発の要因としては，腹壁ヘルニア，特に白線と思われる．

部 に 発 生 し た も の は， 治 癒 し に く い と 言 わ れ て いる１−３）．当該牛も２回整復手術を行い，それぞれ，19

参考文献

日目，２日目に再発した．２回とも，ヘルニア輪縫合部

１）木全春生：新動物外科学，167〜168，地球社，東京（1975）の外側から再発生していた．再々手術では，ヘルニア輪
縫合部から左右に補強縫合を施し再発生を防ぐことが出

２）幡谷正明・黒川和雄ら：家畜外科学第５版，417〜
419，金原出版，東京（1995）

来た．
手術後の熱発と化膿については，三回目の手術後約40

３）中村良一：獣医ハンドブック第８版，474〜476，養日に亘り39.3〜40.5℃の発熱が続き，術部が化膿した．
平成17年９月16日キチンパットが押し出され，それを除− 26 −

賢堂，東京（1974）

飼料給与を時間軸で考える要因分析事業
篠塚

康典１）

檜山

尚子２）

（受付：平成19年１月31日）

Factor analysis project in which feeding is considered along the time axis
YASUNORI SHINOZUKA１）, and NAOKO HIYAMA２）
１）Yamagata Veterinary Center, Hiroshima P.F.A.M.A.A.
461-1, Haruki, Kitahiroshima-cho, Yamagata-gun, Hiroshima 731-1531
２）Miyoshi Veterinary Center, Hiroshima P.F.A.M.A.A.
3-6-36, Tokaichi-higashi, Miyoshi-shi, Hiroshima 728-0013

SUMMARY
In the factor analysis project performed in NOSAI Hiroshima, we used a graph representing the rumen
fermentation state. In Farm A, this graph was applied to conventional feed formulation, and a safe feed
design with synchronization of the protein degradation rate with the carbohydrate synchronization rate waspossible. In Farm B, the reason for contradictions between the feed design based on metabolic profile tests
and subsequent clinical symptoms could be clarified.
The incorporation of this graph in feed formulation may be useful because a feeding method necessary toattain the maximum rumen fermentation can be considered along the time axis.

要

約

NOSAI広島で実施している要因分析事業においてルーメン発酵状況を表すグラフを応用した．
Ａ農家では従来の飼料計算に本グラフを応用し，蛋白質の分解速度と炭水化物の分解速度をシンクロさせた安全な飼料設計を行うことができた．Ｂ農家では代謝プロファイルテストに基づいた飼料設計とその後の臨床症状の矛盾点が生じるにいたった理由が示された．
本グラフを飼料計算に組み込むことは，ルーメンの発酵を最大にするために必要な飼料給与方
法を時間軸にそって考えることが容易となり，有用であると考えられた．

序

なっている．牛群の問題は不適切な飼養管理によること

文が多く，飼料設計は非常に重要な作業となっている．単NOSAI広島では乳牛の要因分析事業を行っている．

胃動物とはきわめて異なる消化機能をもつ牛の飼料設計

これは疾病多発や低生産性などの牛群の問題を解決する

はルーメン発酵抜きにして考えることはできず，特に高目的のみでなく生産性をさらに高めるためにも広く利用

泌乳牛ではルーメン微生物の機能を最大に発揮して栄養されている事業である．事業内容は飼料計算，牛群チェッ

素の供給を効率的におこなう必要がある．最適なルーメ

ク，環境管理，代謝プロファイルテスト（以下MPT）

ン発酵，すなわち菌体蛋白質生産を最大にするためには，などを実施し改善点を農家とともに協議し，数ヵ月後にルーメン微生物自身への蛋白質とエネルギーの効率的供同様の検査を行って牛群の反応をみていくことが主と給をおこなうことが重要で，そのために現在の飼料計算

１）NOSAI広島山県家畜診療所（〒731‑1531

広島県山県郡北広島町春木461−１）

２）NOSAI広島三次家畜診療所（〒728‑0013

広島県三次市十日市東３丁目６−36）− 27 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

ではルーメン内分解蛋白（RDP）と非繊維性炭水化物を崩すことなく安全に繊維レベル，エネルギーレベルを（NFC）の量的バランスをとることによっている．しか上げることができたことが確認された．飼料給与改善後し，ルーメンは連続発酵槽であり，RDPとNFCの分解ス

は，牛の肋が起きる，糞中のコーンが見られなくなるな

ピードについて時間の概念がないために飼料設計の効果

どルーメンマットの良好な形成を認め，疾病の発生率なが思わしくないケースもある．そこで，筆者らの考案しど当該農家の問題点は改善された．

たルーメン発酵グラフを本事業に用いたところ有用であったのでその概要を報告する．

材料と方法
NOSAI広島で実施している要因分析事業実施農家のうち２農家（Ａ農家・Ｂ農家）を選定し，2005年２月から2006年１月にかけて行われた事業内容について時間軸を用いたルーメン発酵グラフを用いて考察を加えた．農家選定基準は当該農家が給与している飼料の炭水化物および蛋白質分画，通過スピードなどの基礎的データが既知であることとした．
１．Ａ農家の例
当農家は40頭飼養のタイストール，TMR給与の中規

図１

Ａ農家給与TMRの特徴

模牛群であった．牛群の問題点は夏バテする牛が多く，第四胃変位が多い．また乳成分のうち無脂固形分が低いというものであった．
２．Ｂ農家の例
当農家は30頭飼養のタイストール，分離給与で自動給餌機，連続水槽の設けられた牛群であった．この農家の問題点は繁殖成績が思わしくないということであった．
繁殖成績を示すJMRは25で悪化傾向にあった．
これらの農家について，MPT，飼料計算，BCS測定，環境調査など要因分析事業を実施し，そのうち飼料給与
内容（品目・量・給与時間など）を聞き取り，筆者らの考案した方法（文献１）を用いて第一胃内でのエネルギー
および蛋白質の分解状況を24時間グラフ化した．結果を

図２

Ａ農家のルーメン発酵状況

図３

Ａ農家のルーメン発酵状況

総合的に判断し改善を加えた後，数ヵ月後にもう一度当事業を実施し総括を行った．そして本方法を用いて作成したルーメン発酵状況グラフの事業における有用性について検討した．

成績

１．Ａ農家の場合当該農家で給与されていたTMRはNFC：RDPの比はバランスが取れていたが蛋白質の分解が先行するタイプの発酵パターンであった（図１）．このTMRと乾草（オーツヘイ）を組み合わせて一日４回給餌が行われており，
一日のルーメン発酵状況は図２のようであった．エネル
ギーと蛋白質の分解パターンはシンクロしており問題はないようだった．しかし，MPTの結果からNFC不足，臨床所見からルーメンマットの低形成が指摘されており，

２．Ｂ農家の例

ルーメンマットの形成と安全にエネルギーレベルを上げ

当農家は自動給餌機を利用して１日７回，市販の配合ることを目的に改善が行われた．オーツヘイとビートパ

飼料と自家配合飼料を給与していた．一日のルーメン発

ルプを用いて給与飼料内容を変更したところルーメンの酵状況は図４のようであった．朝のスーダン，ルーサン

発酵状況は図３のようになり，ルーメン発酵のバランスを給与した後と夜にソルゴーサイレージを給与した後に− 28 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

蛋白の分解が先行するがその他の時間帯はエネルギーの考

分解が多いという日内パターンであった．飼料計算においては乾物量，エネルギー，蛋白質レベルとも満足のい

察

１．Ａ農家

くレベルであったが（表１），MPTの結果，血糖値が低

飼料給与中のエネルギーレベル，特にNFCを上げるに

くBUNが高いという結果を得たため自家配合中のNFCはいくつかの方法があるが今回は分解スピードの中程度の増量とRDPを若干下げる飼料給与変更を行った．数ヵであるビートパルプを選択した．これは改善前のNFC：

月後の再検査ではBUNは正常範囲内となり繁殖成績もRDPが量的，時間的にも問題なくバランスが取れていた改善した（JMR8.1）が，Htが上昇するなど慢性的なアのでこのバランスを維持する必要があったこと，繊維をシドーシス傾向が見られるようになり，疾病の発生が懸同時に補うことを目的としたからである．改善後のルー念された．その時点でのルーメン発酵状況は図５のよう

メン発酵状況もバランスの取れたものであることを確認であり，一日のうち大半が蛋白に対してエネルギーの割することができた．本例はルーメン発酵に必要なエネル合が多くなっていた．

ギーと蛋白質のバランスは取れていたが，ルーメンマッ
トの形成が不充分であったために微生物発酵が計算どおりにいっていなかった例と考えられる．すなわち，ルーメンプロトゾアが利用すべきアンモニアとエネルギーが十分であるにもかかわらずルーメン内微生物の数が不十分で，かつ飼料の滞留時間が短いために十分利用されることなく下部消化管に送られていたと考えられる．結果として飼料の利用効率が低下し，牛体としてはエネル
ギー不足となり，低乳質や疾病多発につながっていたと考えられる．
２．農家Ｂ
一般的にMPTにおいて高BUN，低血糖がみられる場
合はルーメン内微生物の利用するエネルギーであるNFC

図４

Ｂ農家のルーメン発酵状況

不足によりルーメン内アンモニアが利用低下していると診断されることが多い．本例でもその診断に基づいてNFCの増量とRDPの若干の減量を行った．しかし，結果

表１ Ｂ農家飼料計算結果％（DM）

充足率（％）

CP

14.9

105.6

TDN

74.1

116.5

NFC

として返ってきた牛群の反応はルーメンアシドーシスであった．当初の飼料計算ではNFCとRDPのバランスは問題なかったが，MPTの結果に基づいてNFCを増量したわけで，血液性状と臨床症状が矛盾する結果となった．し29.4

かし，日内変動グラフでみてみるとMPTの採血が午前
乳量30kg/day

DMI 20.8kg/day

11時ごろ行われており，その2.5から４時間前に給与されている飼料給与内容はエネルギーの分解に比べ蛋白の分解が非常に多い内容であることがわかった．すなわち，ルーメン微生物が利用しきれないほどのアンモニアが大量に分解されオーバーフローしている状態となっている
時間帯に採血を行っていたのである．オーバーフローしたアンモニアはルーメン壁から吸収され肝でBUNに代謝される．初回のMPTはこのBUNを反映していたと考えられる．
当農家では本事業を数年間継続して受けており飼料給与には細心の注意を払っている．今回の事業実施時においても飼料計算上エネルギー，蛋白質いずれの充足率も

図５

Ｂ農家のルーメン発酵状況

満たしていたので，今回のMPTの結果は採血時間の影
響が強く出た例だと考えられる．日内変動の少ない蛋白代謝指標を用いることが望ましいが経費・手間の問題か
ら複数の項目を一度に検査できる血清は有効に利用すべきである．したがって日内変動の大きいBUNを用いてMPTを行う際は，本グラフを利用して慎重に採血時間− 29 −

広島県獣医学会雑誌を決定すべきであると考えられた．

22（2007）

分解されているかを知ることは必要不可欠であり，さらルーメンという連続発酵槽を持つ反芻動物の飼養管理にそれらのバランスを時間軸にそった動的視点で考えるは複雑である．すなわち，牛体そのものに対する要求量ことも重要なことである．複雑なこれらのことを視覚的のみでなくルーメン微生物に対する要求量も同時に満足にとらえることのできる本報でのグラフ化の方法はきわさせなければならないからである．さらにルーメン微生

めて有用なものであり，現在利用されている飼料計算ソ

物は適正なエネルギーと蛋白質の量的バランスを連続的フトに組み込み本事業に応用することにより，さらに精に求め続けている．これはルーメン発酵を最大にするた

密な飼料設計が可能になると考える．

めには必要なことであり，牛のもつポテンシャルを最大

文限に引き出すための飼養管理には欠かせない考え方である．そのためには飼料のルーメン内分解エネルギー

献１）篠塚康典ら：牛のルーメン発酵状況のグラフ化の試（NFC）とルーメン内分解蛋白質（RDP）がどのように− 30 −み，広島県獣医学会雑誌,21,13‑17（2006）

代謝プロファイルテストにおいてアルブミンの低下が認められた乳牛群の飼養状況とその要因
鈴

木

俊

彦

（受付：平成19年２月８日）

Breeding conditions and factors associated with low serum albumin levels
observed in metabolic profile tests in dairy herds
TOSHIHIKO SUZUKI
Veterinary Clinical Trainning Center, Hiroshima P.F.A.M.A.A.
284-1, Inaki, Takaya-cho, Higashihiroshima, Hiroshima, 739-2106

SUMMARY
We observed low albumin (alb) levels in metabolic profile tests in farms in Hiroshima Prefecture, andsurveyed and analyzed the influences of this decrease on dairy herds and factors causing this decrease
based on data in the management instruction project in 2005. As a result, low alb decreased milk
production and increased the incidences of diseases, injuries, and accidents. To improve these problems
and productivity, the re-evaluation of feed designs and feeding methods and improvement in the cowshedenvironment appropriate for high-level milk production may be necessary in many dairy farms.

要約近年，広島県内の農家を対象とした乳牛の代謝プロファイルテストにおいて低下傾向がみられるアルブミン(以下alb)の牛群に及ぼす影響と要因について，平成17年度の管理指導事業のデー
タを元に調査，分析した．その結果，低albは乳量の低下や病傷事故の増加につながり，それを改善し生産性を向上させるためには，多くの酪農家で，飼料設計・飼料給与方法の見直しと高泌乳化に適応した畜舎環境の整備が必要であると思われた．

序

文

材料および方法

３種類の主要な血漿タンパク質のうち，最も高濃度に１．調査期間存在するalbは肝臓で合成され，微量元素や脂肪酸などを体組織に運搬する重要な役割を果たしている．近年，2005年５月19日〜2006年１月30日
２．調査対象

広島県内の酪農家を対象とした乳牛の代謝プロファイル

県内酪農家53戸で飼養されている乳牛，延べ1,334頭

テストにおいてalbは低下傾向がみられ，それらの牛群

延べ69件の代謝プロファイルテストと各酪農家の飼料給では繁殖障害をはじめ病傷事故が多発する傾向にある．

与の調査，畜舎環境のチェック，および疾病に関するア

そこで特に分娩後から泌乳最盛期にかけてalbの低下がンケート認められた乳牛群の飼養状況とその低下要因について，
代謝プロファイルテストを用いた管理指導事業のデータを元に調査，分析したのでその概要を報告する．
広島県農業共済組合連合会家畜臨床研修所（〒739‑2106

広島県東広島市高屋町稲木284‑1）− 31 −

広島県獣医学会雑誌

成22（2007）績

低albを示した牛群は69件中19件，標準レベルにあった牛群は15件で，そのほかの牛群においてもalbの低下傾向がみられた．アンケート調査の結果，albが標準レ
ベルの農家では繁殖障害が多いと回答のあった割合は87％であり，低albの場合95％であった（図１）．肢蹄疾患
については，多いと回答のあった割合は標準レベルでは
わずか７％であるが，低albの場合36％にものぼった（図図３アンケート調査の結果，乳房炎の比較

２）．乳房炎は標準レベルの20％に対し低albでは42％（図３），周産期疾病は標準レベルの20％に対し，低albでは58％であった（図４）．乳牛１頭の１日当たりの泌乳量

図４

アンケート調査の結果，周産期疾病の比較

図１

アンケート調査の結果，繁殖障害の比較

図２

アンケート調査の結果，肢蹄疾患の比較

図５

図６

給与飼料の比較，CP− 32 −

低アルブミンと他のMPT項目との関係

広島県獣医学会雑誌

図７

22（2007）

給与飼料の比較，TDNを比較すると，標準レベルの牛群では32kgであり，低肉組織や角質の形成に悪影響を及ぼしているためと思わ

alb牛群では28kgであった．低alb牛群において他の代謝れた．さらにalbの低下による栄養状態の悪化は繁殖障

プロファイルテスト項目との関連性を調査した結果，同害や周産期疾病など，諸疾病の発生要因にもつながって時に，血糖の低下が見られたものは19件中９件，BUN

いるものと考えられた．また，低albを示した酪農家のの低下が見られたものは10件，BUNの上昇は２件，γ半数前後が同時に低血糖，低BUN，低Mgあるいは高γ

GTPの上昇は11件，Mgの低下は８件，血糖・BUN・alb

GTPを示したことから，その原因としては，栄養不足，ともに低下が見られたものが３件であった．
（図５ｙ）．

乾物摂取不足，第一胃の発酵不良，肝機能の低下などに給与飼料の栄養度を比較した結果，CPの濃度は標準

関連する飼養管理上の問題が考えられた．栄養不足に陥レベルの16.2％に対し低alb牛群は15.5％で，同時に低る要因の１つとして不適切な飼料設計が考えられ，血糖を示した牛群15.2％，低BUNを示した牛群15.5％，

TDN・CP％はその充足率とも標準レベルの農家を下回

低Mgを示した牛群は14.6％であった．CP充足率は 標るケースが大半であった．泌乳能力の増大した最近の乳準レベルの88.5％に対し，低alb牛群では82.5％であっ牛にとって従来のエサは栄養不足となり，能力を出し切た（図６）．TDNの濃度は標準レベルの75.7％に対し低れずに低泌乳を呈し，繁殖障害や肢蹄疾患などの疾病は

alb牛群は74.0％で，充足率は標準レベルの99.8％に対増加する傾向にあるものと思われた．また，乾物摂取量

し，低alb牛群では95.0％であった（図７）．

の低下要因としては，飼料給与量の不足以外に乾乳牛の考管理不足や飼槽・牛床・飲水施設など畜舎環境の不備も察考えられ，第一胃の発酵不良を招く要因として，繊維の代謝プロファイルテストにおいて牛群に低albが認められた酪農家は，アンケート調査の結果，繁殖障害，肢給与不足や飼料の不適切な給与順序なども見受けられた．

蹄疾患，乳房炎，周産期疾病のすべての項目に対して，以上のことから，低albを改善し生産性を向上させる

標準レベルの農家よりも強い問題意識を抱えているケー

ためには，多くの酪農家で，飼料設計・飼料給与法の見スが多くみられた．その中でも特に肢蹄疾患で悩んでい直しと高泌乳化に適応した畜舎環境の整備が必要である

る農家が標準レベルの７％に対し，低alb牛群では36％と思われた．

と両者に大きな開きがみられた．これはalbの低下が筋− 33 −

乳成分を用いた牛群診断
桧

山

尚

子

（受付：平成19年１月23日）

Evaluation of dairy herds by milk ingredient analysis
NAOKO HIYAMA
Miyoshi Veterinary Clinical Center, Hiroshima P.F.A.M.A.A
3-6-36, Tohkaichi-higashi, Miyoshi, Hiroshima 728-0013

SUMMARY
Feeding management guidance using data on milk components including milk urea nitrogen (MUN) in
dairy cattle tests is widely performed. In 2000, Ikuta et al. reported a correlation between MUN and themilk protein percentage in their study entitled
MUN and the milk protein percentage.

Simple nutritional diagnosis of lactating cows based on

Based on this correlation, we analyzed data on milk components

in dairy farms to determine to clarify the relationship between milk components and the feed sufficiency
rate/feed balance, to establish in an optimal feeding situation, and evaluated problems in each farm. Dataon 3 dairy farms within our jurisdiction were obtained, and all data were classified according to milk yield
into groups. The mean value in each group was calculated, and its association with the results of feed
calculation was evaluated.
In farm M, there were significant positive correlations between the sufficiency rate of the crude protein
content (CP) and MUN as well as the milk protein percentage, between the sufficiency rate of the total
digestible nutrients (TDN) and the milk protein percentage, and between MUN and the milk protein
percentage. There was also a significant positive correlation between TDN/CP, representing feed balance,
and the milk protein percentage. In farm Y, there were significant positive correlations between the CP
sufficiency rate and MUN as well as the milk protein percentage, between the TDN sufficiency rate and themilk protein percentage, and between TDN/CP and the milk protein percentage. In farm K, there was asignificant positive correlation between TDN/CP and the milk protein percentage.

Milk component

analysis in each cow allows only the determination of whether values are in the normal range, and is not
appropriate for the evaluation of the tendency of the entire farm. Analysis of farms data based oncorrelations that should be present in an appropriate feeding situation facilitated the evaluation of thetendency of each farm.

要約

乳中尿素態窒素（以下MUN）を含む乳牛検定の乳成分データを利用した飼養管理指導は広く行われている．今回の研究は，2000年に生田らが行った研究「乳中尿素態窒素と乳蛋白質率による泌乳牛の簡易栄養診断」で発表されたMUNと乳蛋白質率との相関関係を利用し，適正給与状況下で成立すべき飼料充足率・飼料バランスと乳成分の相関が実際の農場のデータで成立するのかどうかを分析し，その農場の問題点を探った．管内酪農家３戸のデータを供し，全データを乳量階層によりグループ分けし，それぞれの平均値を出し，飼料計算結果と相関を求めた．
Ｍ牧場は粗蛋白質含量（以下CP）充足率とMUNおよびCP充足率と乳蛋白質率との間に正の有NOSAI広島三次家畜診療所（〒728‑0013広島県三次市十日市東３−６−36）−6−広島県獣医学会雑誌

22（2007）

意な相関が成立した．可消化養分含量（以下TDN）充足率と乳蛋白質率およびMUNと乳蛋白質率の間に正の有意な相関が成立した．また，飼料バランスを示すTDN/CPと乳蛋白質率の間にも正の有意な相関が成立した．Ｙ牧場はCP充足率とMUNおよびCP充足率と乳蛋白質率との間に正の有意な相関が成立した．TDN充足率と乳蛋白質率の間に正の有意な相関が成立し，またTDN/CPと乳蛋白質率との間にも正の有意な相関が成立した．
Ｋ牧場ではTDN/CPと乳蛋白質率の間に正の有意な相関が成立した．個体ごとの乳成分分析は正常値内に入っているか否かの判定のみで農場全体の傾向は捉えにくい．適正給与状況下で成立すべき相関をもとに実際の農場のデータを分析すると，農場の傾向がつかみやすいことが分かっ
た．

序

文

成

績

広島県では平成17年よりMUNが乳牛検定成績表に記（図１・表２）Ｍ牧場は高泌乳グループでTDNとCP載されるようになった．MUNは血中尿素態窒素と相関充足率の両方が低い傾向があった．特にCPの充足率はがあることが分かっており，飼料バランスを把握する指非常に低い状況であった．生田の相関と比較してみる．

標となる．今回の研究の乳成分分析は，生田らによる１）

網掛けのマスは生田の相関と同じ相関関係であることを「乳中尿素態窒素と乳蛋白質率による泌乳牛の簡易栄養示している．Ｍ牧場はCP充足率とMUNに強い正の相関診断」にみられた相関関係を利用したものである．飼料がみられ，CP充足率と乳蛋白との間にも強い正の相関の適正給与状況下では相関関係が成立する．（表１）が見られる．CPが上がるほどMUNが高くなる関係が成立していて，飼料計算どおりにCPの不足が問題であり，

表１ 相関

中でも分解性蛋白質の不足が乳成分からも推測できる．

MUN

乳蛋白質率

CP充足率

―

―

TDN充足率

負の相関

正の相関

TDN／CP

負の相関

正の相関

次にTDNの充足率をみるとMUNと正の相関が成立した．
適切な飼養環境下では負の相関が成立する．（表１）必要な蛋白質が給与されていれば，エネルギー飼料の充足に伴ってMUNは低下するはずである．しかし，蛋白質の不足のためこの相関が成立しないと思われた．TDN―：相関成立せず
MUN：乳中尿素態窒素

充足率と乳蛋白質率の相関は生田の相関と同じく正の相関が成立した．正常なプロピオン酸発酵が行われている

TDN充足率が高いほど余剰アンモニアは減少する．すなわちMUNは減少するため負の相関が成立する．乳蛋
白質率はプロピオン酸発酵に反映するので可消化養分総量（以下TDN）と正の相関．TDN／粗蛋白質率（以下CP）この飼料バランスにMUNは負の，乳蛋白は正の相関が認められたとしている１）．この相関を利用し，実際の農場のデータを用いて，生田の相関が成立するかを検証し，その結果から農場の問題点を探った．

材料と方法
図１

平成17年５月〜18年２月（但し，Ｈ17年６月・11月は

Ｍ牧場の飼料充足率と乳成分の相関除く）の管内酪農家３戸の経産牛乳成分データ（n＝969）
表２と要因分析事業での飼料計算結果を利用した．但し，管

Ｍ牧場の飼料と乳成分の相関

内酪農家３軒ともTMR飼料を給与，飼養形態はＹ牧場
フリーストール，Ｍ・Ｋ牧場はタイストールである．乳成分データは月ごとではなく，農家ごとに全データを乳量階層によりグループ分けし，それぞれの平均値を出し，相関を求めた．求められた結果を生田の相関関係に照ら

−7−

乳蛋白質率

CP充足率

0.900**

0.934**

TDN充足率

0.773*

0.799*

TDN／CPNS

0.794***： P＜0.01*： P＜0.05
薄黒地：生田の相関と同じ

し，データに矛盾が無いか検討した．

MUN

CP：粗蛋白質含量
TDN：可消化養分総量
NS：有意差なし

広島県獣医学会雑誌

22（2007）と推測できる．TDNをCPで割った飼料バランスをみると，MUNとは相関が成立しなかった．適正給与では，MUNとは負の相関が成立する．Ｍ牧場では絶対的に蛋白質が不足しているためにこの関係は成立しないと思われた．飼料バランスと乳蛋白質率は生田と同じく正の相関が成立した．この農家では飼料中の分解性蛋白を上げて，乳成分の推移をチェックしていく必要があると考える．
図３

Ｋ牧場の飼料充足率と乳成分の相関

表４

図２

MUN

乳蛋白質率

0.722*

0.974**

TDN充足率NS

0.977**

TDN／CPNS

0.876**

乳蛋白質率

NS

NS

TDN充足率NS

NS

TDN／CPNS

0.781*

質率ともに相関は成立しなかった．CPが充足していてＹ牧場の飼料と乳成分の相関

CP充足率

MUN
CP充足率

CP：粗たんぱく質
TDN：可消化養分総量
MUN:乳中尿素態窒素
NS：有意差なし

Ｙ牧場の飼料充足率と乳成分の相関表３

Ｋ牧場の飼料と乳成分の相関

TDNも飼料計算上適正であるのに相関が成立していな
い．これは，エネルギー飼料の利用効率が悪い，分解ス
ピードが蛋白質と一致していない，ルーメンマットの脆弱性・ルーメン発酵の不良などが考えられる．粗飼料中の繊維質のチェックとエネルギー飼料が未消化のまま糞CP：粗たんぱく質
TDN：可消化養分総量
NS：有意差なしに出ていないか調べる必要がある．飼料バランスと
MUNは相関が成立していないが，乳蛋白質率とは強い正の相関が成立した．Ｋ牧場ではエネルギー飼料の正常（図２・表３）Ｙ牧場は低乳量群は飼料が過剰であり，な消化吸収が行われているかどうかを確認する必要があ

高泌乳牛群では蛋白質が不足していた．特に41キロ以上

る．

の２グループで充足率100％を切り，80％程度である．

考

乳成分との相関をみると，CP充足率とMUN間およびCP察

充足率と乳蛋白質率との間に強い正の相関が成立した．

現在行われているMUNを含む乳成分を用いたデータ

先ほどのＭ牧場と同じく蛋白質が不足するために成立し分析は，個体を月ごとに検討することが多く，その検討たと思われた．TDN充足率をみるとMUNとの間に相関

方法は正常値に入っているか否かの判定のみで，例えばは成立していない．適正給与下では負の相関が成立する．

高泌乳牛でエネルギーが不足している，分娩直後の牛が（表１）TDN充足率と乳蛋白質率では生田の相関と同食い込み不足であるなど個々を評価するものである．今じく強い正の相関が成立した．正常なプロピオン酸発酵回実施したように農家ごとに複数月分をデータ集約し，が行われていると推測できる．飼料バランスとMUNの乳量階層ごとにグループ分けする検討方法はあまり使わ間に相関は成立せず，乳蛋白質率との間には生田と同じれていない．

く強い正の相関が成立した．Ｙ牧場は飼料中の蛋白質割

現在の状態を捉えるには月ごとの分析が有効だと思わ合を上げ，乳量に見合った給与量に変更する必要がある

れるが，給与している飼料バランスの特徴やその農家のと思われた．

飼養管理の問題点を捉えるには，一月ごとよりも複数月（図３・表４）Ｋ牧場の飼料充足率は，過剰気味ではあに渡ってデータを集約した方がより正確にダイナミック

るがCP・TDNともにほぼ問題ないレベルであった．乳な数字として現れると考えられる．購入乾草の質の低下

成分との相関をみると，CP充足率とMUNおよび乳蛋白や暑熱の影響により，乳成分は容易に変動するため，月

質率との間に相関は成立しなかった．これは生田の相関毎の分析だけではデータを読み違える危険もある．さらどおりで，CPの充足率が適正なことが乳成分からも判に飼養頭数の少ない農家の場合，月毎の乳成分ではデー断できる．次にTDN充足率をみるとMUNおよび乳蛋白

タが少なすぎて傾向がつかみにくいが，今回用いた方法−8−広島県獣医学会雑誌

22（2007）であれば同じ個体から分娩後50日の情報も200日の情報

反映していることが分かった．それは特に，TDN充足も得ることができ，検討しやすい．他に適用例として，率・飼料バランスを良く反映しており，乳質の評価にはウォーターカップの改修や飼槽の張り替えを行い，カウ

MUNだけでなく，乳蛋白質率も合わせて判断すること

コンフォートが向上した時，その前後の比較にも利用でが重要であると考える．飼料計算という計算上の理論ときると考える．

実際の牛の反応として返ってきた乳成分とを照らし合わ

今回の結果から乳成分は牛群の飼料給与状況を反映しせることによって，より正確な牛群診断が可能であるこており，乳成分は個体で見るよりもグループで比較するとが分かった．但し，今回の分析では人的問題やカウコ方が特徴をより把握しやすいことがわかった．飼料充足

ンフォートの問題などは全く考慮してないので，現場を率が示すとおり，乳成分との相関が成立した農家もあれ

見て農家と話し合いながら，問題点を見つけていく必要

ば，飼料計算上は問題ないのに，乳成分との相関が成立がある．

しない農家もあった．給与量の思い込み，飼料給与順序

今回の分析を進めていて，飼料が乳成分へ与える影響

や間隔，あるいは飼料中諸成分の分解スピード，ルーメ

が良く理解できた．指導者の育成等にも活用できると考ンの発酵状況などにより，実際の乳成分データは理論値えている．

とは異なっていた面があったことはいなめない．乳成分

参考文献

は実際の飼養管理に対して牛が返してきた結果であることを考え，これを利用し現在の問題点を探っていきたい．

１）生田健太郎ほか：乳中尿素態窒素と乳蛋白質率による泌乳牛の簡易栄養診断，日獣会誌，53，289〜

今回は乳量グループを８階層に分けたが，その農家が292（2000）

給与している実態に即した方がより数字に表れやすいと思われる．乳成分の中でも乳蛋白質率は飼料状況をよく−9−牛RSウイルス病の早期診断法の検討
恵谷

美江１）

山本

武１）

平井

潤思２）

（受付：平成19年１月26日）

Evaluation of early diagnosis methods for bovine respiratory syncytial
virus infection
MIE EYA１), TAKESHI YAMAMOTO１), JYUNJI HIRAI２)
１）Higashi-Hiroshima Livestock Health & Hygine Service Center Hiroshima Prefecture
1-15, Saijogojo-cho, Higashi-Hiroshima, Hiroshima 739-0013
２）Geihoku Livestock Health & Hygine Service Center Hiroshima Prefecture
4-12-1, Kabe, Asakita-ku, Hiroshima 731-0221

SUMMARY
For the diagnosis of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) infection, virus isolation or antibody
examination using pair serum of cattle with this infection is generally used. However, the detection rate byvirus isolation is very low, and long-term subculture is necessary. Since antibody examination using pairserum requires serum samples both at the time of onset and during the recovery period, a long period isnecessary to obtain results.
For the rapid diagnosis of BRSV infection, we evaluated the HRSV kit and PCR. The detection
sensitivity was higher for PCR than for the HRSV kit. Some field cases in which BRSV was isolated werepositive for only PCR. These results suggested the usefulness of PCR as a rapid diagnosis method for
BRSV infection. At present, PCR is used as an adjunctive method and is not a diagnostic method
according to the manual. However, PCR may be an important examination method allowing the rapid
diagnosis of BRSV infection.

要約

牛RSウイルス病の診断法としては，一般にウイルス分離，発症牛のペア血清による抗体検査等が用いられている．しかしながら，ウイルス分離は，検出率が極めて低く，長期の継代が必要である．また，ペア血清の抗体検査は発症期と回復期の血清が必要なため，検査結果が出るまでに長期間を要している．
今回，牛RSウイルス病を迅速に診断する方法について，HRSVキットとPCR法の２種類について検討を行ったところ，PCR法はHRSVキットより検出感度が高く，BRSVが分離された野外材料からもPCR法のみが陽性と判断された症例もあり，BRSV感染症を迅速に診断する方法として
PCR法は有効な方法と考えられた．PCR法は，補助的診断に用いるのみで，マニュアル上では定められた診断方法ではない．しかし，牛呼吸器病に対して迅速に対応していく重要な検査方法と考えられた．

１）広島県東広島家畜保健衛生所（〒739‑0013
２）広島県芸北家畜保健衛生所（〒731‑0221

広島県東広島市西条御条町１‑15）
広島県広島市安佐北区可部４丁目12‑１）− 10 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

は じ め に
牛RSウイルス（BRSV）病は，病性鑑定マニュアル第２版１） において，蛍光抗体法または酵素免疫測定法，
抗体検査およびウイルス分離により診断される．現在，病性鑑定では，牛呼吸器病の原因究明依頼について，ウ
イルス分離と抗体検査を実施しているが，ウイルス分離
はその検出率が極めて低く，長期の継代が必要である．
また，抗体検査は，発症期と回復期の血清が必要なため，いずれも結果が出るまでに長時間を要している状況にある．今回，BRSV病に対する迅速検査方法として，15分で判定できる酵素抗体法：人用RSウイルス抗原検出キット（以下，「HRSVキット」という）と８時間程度

図１

HRSVキットによる検出で判定できるnested PCR法（以下，「PCR法」という）

この遠心上清にイソプロパノールを加え，10分間室温の２種類を比較検討したので報告する．

に放置後，遠心分離（15,000rpm，10分）した．この沈査をエタノールで洗浄後，再度遠心分離（15000

試験項目および方法

rpm，15分）により沈査を回収後，超純水に再浮遊させて，抽出RNAとした．

１．試験項目下記の試験１，試験２，試験３で，酵素抗体法：人BRSVに対するプライマー及び反応条件は，桐沢ら

用RSウイルス抗原検出キット（以下，「HRSVキット」の報告２） によるBRSV・Gタンパク遺伝子の約300bpという）とnested PCR法（以下，「PCR法」という）を標的とした２種類の正方向のプライマー（F１：の２方法での検出状況等を比較検討した．

ATC ACT CGT CAT CAC AGC CA，F２:AAA GCACCA CAC TGT CCC AA）と２種類の逆方向のプライ

１）試験１
10０ 〜10６TCID50 /0.1mlまで10倍階段希釈した既知

マー（R１:AGA GGA TGC CTT GTT GTG GA，R２:のBRSV液（NMK‑７株）を用いて，検出可能な範囲

TTT GAG GGT GAT TGT AGG GG）を使用した．プを確認した．

ログラム恒温槽はASTEC社製PC‑800を，酵素およびバッファーは，タカラバイオ(株)社製TaKaRa RNA２）試験２
過去の病性鑑定においてBRSVが分離された２症例

PCR Kit(AMV)Ver.3.0 とPERKIN ELMER社 製Gene（鼻汁14検体，血清24検体）についてウイルス分離及Amp EZ rTth RNA PCR Kitを使用した．逆転写反応は，

び抗体検査結果を比較し，検出状況を比較検討した．

TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0に従い，30℃10３）試験３分，42℃30分，99℃５分，５℃５分で行った．次に，

平成17年度に牛呼吸器病原因究明で依頼のあった52

F１ ,R１ の プ ラ イ マ ー セ ッ ト で １ 回 目 のPCR反 応

症例中，抗体検査からBRSV病と診断された６症例（鼻（DNA熱変性94℃１分，プライマーアニーリング60

汁26検体，血清50検体）についてウイルス分離及び抗℃１分，伸長反応72℃３分で，30サイクル）を行い，体検査結果を比較し，更に，２方法での検出状況を比F２ ,R２ の プ ラ イ マ ー セ ッ ト で ２ 回 目 のPCR反 応較検討した．

（DNA熱変性94℃１分，プライマーアニーリング60

２．方法℃１分，伸長反応72℃３分で，30サイクル）を行った．

１）HRSVキットによるBRSVの検出
日本ベクトン・デッキンソン株式会社製 ディレク
ティジェンEZ RSV を用い，使用説明書に従い，鼻汁（１症例をプール）を添付されている試薬と混合して，テストプレートに滴下後,図１のように判定部のＣ及びＴにラインが検出されたものを陽性，Ｃのみにラインが検出されたものを陰性とした．
２）PCR法によるBRSVの検出
ウ イ ル スRNAの 抽 出 は， ニ ッ ポ ン ジ ー ン 社 のISOGEN‑LSを用いた．鼻汁及び既知のBRSV液250μlに750μlのISOGEN‑LSを添加し攪拌，５分間室温に放置した．これをクロロホルム200μlで処理し，３分間室温に放置後，遠心分離（15,000rpm，10分）した．
− 11 −

図２

PCR法による検出広島県獣医学会雑誌

22（2007）

増幅した遺伝子は，２％アガロースゲル電気泳動を致していた．しかし，症例２及び４の場合，抗体検査実施後，エチジウムブロマイド染色を行い，１kbの成績でBRSV病と診断されたが，検討した２種類の方

DNAラダ−をマーカーとして同部位にバンドが確認

法では陰性と判定された．

（表２）

されたものを陽性とした．
表２ 抗体検査陽性例における検出方法の比較

３）ウイルス分離および抗体検査
発症牛からのBRSVのウイルス分離は，鼻汁をVero

ウイルス分離細胞に接種後34℃，７日間回転培養を行い，細胞変性効果を指標に３代継代した．
BRSVの抗体検査は，BRSV NMK‑７株を抗原として，Vero細胞で中和試験を実施した．BRSVが分離されるか，またはBRSV抗体が有意に上昇していた個体が認められた症例をBRSV感染症と診断した．

成ペア血清 HRSVキット

PCR法

症例１

0/4

1/4

陽性

4/4

症例２

0/5

1/5

陰性

0/5

症例３

0/4

2/3

陽性

4/4

症例４

0/4

4/4

陰性

0/4

症例５

0/5

2/5

陰性

1/5

症例６

0/4

4/4

陰性

2/4

績

１．試験１

考

既知のBRSV液では，HRSVキットは105〜106TCID50/
0.1mlまでが，PCR法は10１〜10６TCID50/0.1mlまでが陽性と判定した．

（図１，２）

察

PCR法はHRSVキットより10４倍検出感度が高かった．
また，BRSVが分離された野外材料でPCR法のみが陽性と判断された症例もあり，BRSV病を迅速に診断する方

２．試験２
過去の病性鑑定においてBRSVが分離された症例１法としてPCR法は有効な方法と考えられた．しかし，

及び２はHRSVキットでは検出されなかったが，PCR

BRSV病が抗体検査により確実に診断された症例におい法では症例１は全検体，症例２は８検体中６検体が陽て，PCR法では確認できなかったものが認められており，性であり，ウイルス分離と抗体検査によるBRSV感染

必ずウイルス分離，抗体検査を実施し，PCR法との検出症の診断とPCR法の結果は一致していた．

状況について比較確認していく必要があると考えられ

（表１）

た．
表１

PCR法は，補助的診断に用いるのみで，マニュアル上ウイルス分離例における検出方法の比較
ウイルス分離ペア血清 HRSVキット

では定められた診断方法ではない．しかし，牛呼吸器病

PCR法

症例１

1/6

1/5

陰性

6/6

症例２

1/8

3/7

陰性

6/8

に対して迅速に対応していく重要な検査方法である．
BRSV病にかかわらず，いかなる感染症に対しても，早期の防疫対応が重要であることからも，今後も，その対応が十分に取れるよう，迅速かつ確実な検査方法を検討

３．試験３

していく事が重要と考えられた．

平成17年度に抗体検査でBRSV病と診断された６症

文例からは,ウイルスは分離されなかった．このうち，
HRSVキットで２症例が陽性と判定された．また，

１）病性鑑定マニュアル（第２版）：牛RSウイルス病：

PCR法では，症例１及び３は全検体で，症例５では５
検体中１検体が，症例６では４検体中２検体が陽性と献

全国家畜衛生職員会：62〜63（2001）
２）桐沢力雄：ウシパラインフルエンザウイルス３型，ウシRSウイルス及びウシウイルス性下痢・粘膜病

判定した．
症例１及び３は抗体検査成績と２種類の方法の結果
が，症例５及び６は抗体検査成績とPCR法の結果が一− 12 −

ウイルス感染のPCRによる検出：J. Rakuno Gakuen
Univ.1994(1):225〜237(1994)

黒毛和種繁殖牛に発症したエンドファイト中毒症
玉川

朋治１）

石田

恭子２）

玉野

光博３)

（受付：平成19年１月26日）

A black Japanese cow with endophyte toxicosis
TOMOHARU TAMAGAWA１）, KYOKO ISIDA２）, and MITUHIRO TAMANO３）
１）Akitakata Veterinary Clinical Center, Hiroshima, P.F.A.M.A.A.
1775, Hongo, Midori-chou, Akitakata, Hiroshima, 731-0612
２）Fukuyama Livestock Health & Hygine Service Center, Hiroshima Prefecture396-1, Fukae, Joge-chou, Fuchu, Hiroshima, 729-3421
３）Geihoku Livestock Health & Hygine Service Center, Hiroshima Prefecture
1-12-4, Kbe, Asakita-ku, Hiroshima, Hiroshima, 731-0221

SUMMARY
In recent years, the provision of imported feed infected with endophytes has been shown to cause toxicosis due to toxins produced by the endophytes. We encountered a black Japanese cow maintained in a
farm in Hiroshima Prefecture that developed endophyte toxicosis.
In this farm, import feed purchased as Italian ryegrass was given daily (about 6 kg/cow), and the affected
cow showed neurological symptoms such as tremor of the four limbs and gait abnormalities. The imported
feed was perennial ryegrass and showed endophyte hyphae. The concentrations of toxins were relatively
high (ergovaline, 250 ppb; lolitrem B, 1,200 ppb), suggesting endophyte toxicosis.

要約近年，エンドファイトに感染した輸入飼料の家畜への給与による中毒が，エンドファイトの産生する毒素によって生じることが明らかになっている．今回，広島県内の農家で飼育されていた
黒毛和種繁殖牛で発症したエンドファイト中毒症に遭遇した．
発生のあった農家は，イタリアンライグラスとして購入した輸入飼料を，１日１頭当たり６㎏程度給与しており，患畜は四肢の振戦，歩様異常等の神経症状を呈した．輸入飼料はペレニアル
ライグラスであり，エンドファイト菌糸を認めた．毒素濃度は，エルゴバリン250ppb，ロリトレ
ムＢ 1200ppbと比較的高く，エンドファイト中毒症を引き起こしたものと思われた．

イトは菌自体が産生するアルカロイド等の毒素により牧

はじめに草へ耐病虫性，多収性を付与することから人工的に利用

エンドファイトは内生菌ともいわれ，植物体内で共生されている．近年，エンドファイトに感染したペレニア的に生活している菌類のことで，イネ科牧草を中心に

ルライグラスやトールフェスクの家畜への給与による中300種以上の牧草で感染が確認されている．エンドファ

毒が，エンドファイトの産生する毒素により生じること

１）NOSAI広島

安芸高田家畜診療所（〒731‑0612２）広島県福山家畜保健所（〒729‑3421

広島県安芸高田市美土里町本郷1775）

広島県府中市上下町深江396−１）

３）広島県芸北家畜保健衛生所（〒731‑0221

広島県広島市安佐北区可部１−12−４）− 13 −

広島県獣医学会雑誌が明らかになっている１，２）．

22（2007）

当たり４kg〜６kg程度であった．

今回，広島県庄原市内の農家で飼育されていた黒毛和発症経過と臨床症状

種繁殖牛に発症したエンドファイト中毒症に遭遇したの発症の経過は，購入飼料変更後12日目から33日目まで

でその概要について報告する．

の間に７頭の成牛が活力消失，体温の低下，起立困難，

発生農家の概要

四肢振戦，歩様異常等の神経症状を呈した．

飼育頭数約80頭の大型繁殖和牛農家で，４頭〜６頭の購入飼料変更後12日目の発症牛１頭は血液検査によりストール飼い．分娩１ヶ月前より分娩舎にて１頭飼いと低Ca血症を呈したが，29日目の発症牛１頭と32日目のしていた．

発症牛４頭には血液検査でのCa値の異常は認められな飼料給与は，購入飼料のフェスク・稲ワラおよび自給

かった．これらの臨床症状によりエンドファイト中毒を

飼料の給与体系をとっていたが，2005年10月20日から購

疑い,エンドファイト菌糸の検出を家畜保健衛生所に，入飼料のフェスクを米国Oregon州産のイタリアンスト

毒素濃度の定量を独立行政法人肥飼料検査所にそれぞれローに替えて給与することとした．給与量は，１日１頭

依頼した．

表１
症例番号

生年月日

性別

分娩予定日

1

H16. 1.29

雌H17.12. 5

2

H16. 5.11

雌H18. 4.21

3

H12. 6.11

雌H17.12.13

4

H 5. 6. 1

雌H18. 6. 7

5H14.10. 1

雌H18. 7. 8

6H12.12. 3

雌H18. 5. 5

7

H12.10.28

雌H18. 6.15

発症牛と臨床症状
体 温

発症日

症

（飼料変更後） （検査時）

H17.11. 1（12日目）
H17.11.18（29日目）
H17.11.21（32日目）
H17.11.21（32日目）
H17.11.21（32日目）
H17.11.21（32日目）
H17.11.22（33日目）

表２

状

等

38.2

起立困難、後躯の振戦、前躯歩様蹌踉、泥状便‑

起立困難、後躯の振戦、前躯歩様蹌踉、泥状便

38.5

起立困難、四肢の振戦、活力低下、胃腸運動微弱

38.3

起立困難、四肢の振戦、活力低下、皮温低下

38.4

起立困難、四肢の振戦、活力低下、皮温低下

38.4

起立困難、四肢の振戦、活力低下、削痩

38.2

起立困難、四肢の振戦、活力低下、皮温低下

初診時の血液検査結果

症例番号

1

2

3

4

5

6

検査年月日

H17.11.1

H17.11.18

H17.11.21

H17.11.21

H17.11.21

H17.11.21

RBC(×104/μl)

‑

‑

993

761

760

727

WBC

(×102/μl)

‑

‑

109

97

63

112

HGB

(g/dl)

‑

‑

12.4

15.4

11.2

12.5

Ht

(％)

‑

‑

29

35

26

29

TP

(g/dl)

6.6

6.1

6.4

6.7

6.5

6.6

Alb

(g/dl)

3.8

‑

3.3

4

3.4

3.6

Ca

(mg/dl)

5.1

12.2

11.7

11.4

11.8

11.4

Mg

(mg/dl)

‑

2.3

2.4

2.3

2.5

2.2

6.9

6.8

4.8

5.5

4.9

IP

(mg/dl)‑GOT(IU/L)

83

80

56

56

64

60

GGT

(IU/L)

29

‑

28

36

34

33

BUN

(mg/dl)

7

‑

10

10

9

9

CPK

(IU/L)

>2000

701

219

43

148

263

− 14 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

発症牛７例の年齢は比較的若齢のものが多く，すべて

考

妊娠牛であった．ほぼ全頭が低体温を示し，四肢振戦，察

今回の事例は，輸入飼料に存在していたエルゴバリン，

歩様異常等の神経症状を認めた（表１）．
初診時の血液検査結果からは，症例１に低Ca血症を認められたが，その他の５頭は正常のCa値であった．

ロリトレムＢの摂取によりエンドファイト中毒が発生したものと推測される．

CPKとGOTに軽度の上昇が認められるものの，血清学

毒素濃度は米国Oregon州における輸出前検査の基準値３） であるエルゴバリン500ppb，ロリトレムＢ 1800

的には著しい異常は無かった（表２）．
購入飼料変更から29日目，２頭目が発症した時点で購ppb以下の数値であったが，基準値以下であっても発症

入飼料の給与中止を指示し，その後６日目には全頭に症する例は報告されており１，４），今回の毒素量は，中毒状の改善が見られた．

症状を起しうる濃度であったと思われる．

結最初の発症牛１頭のみ低Ca血症であり，Ca剤の投与

果にて一時的に症状が軽減した．しかしながら，32日目に検査の結果イタリアンライグラスとして購入された輸は再び同一の神経症状を示し，輸入飼料の給与中止とともに症状の改善が見られたため，この１頭もエンドファ
イト中毒であると推測された．
今後このような症状に遭遇した場合，速やかに輸入飼料の給与中止又は給与量の減少を指示し，経過観察することが重要だと考えられた．

謝辞

エンドファイト菌糸の検出，毒素濃度の定量において，ご尽力いただいた家畜保健衛生所の先生方に深謝いたし
ます．

文

献

１）宮崎茂：エンドファイトが産生する毒素による家畜
写真１検出されたエンドファイト菌糸の中毒，臨床獣医，16（５），34−40（1998）．
２）仲嶺マチ子ら：エンドファイト感染輸入牧草給与牛に発生したライグラススタッガーが疑われた症例，

入飼料は，ペレニアルライグラスであった．

臨床獣医，16（11），38−45（1998）

ローズベンガル染色においてエンドファイト菌糸が認められ（写真１），毒素濃度は，エルゴバリン250ppb，

３）榎本勝治，宮崎茂：黒毛和種に発生したライグラス

ロリトレムＢ 1200ppbと比較的高値を示した．

ストローによるエンドファイト中毒症，家畜診療，
46，421−427（1999）．

類症鑑別として硝酸塩中毒とグラステタニーも考えられたが，硝酸体窒素濃度は261ppmと安全域であり，血４）Cornell, C. N. et al.; Establishing ergovaline levels for

中Mg濃度も正常であったため両疾病ともに否定された．

fescue toxicosis, with and without endoparasites, undercontrolled climatic conditions. Proceedings of International symposium on Acremonium/Grass interactions,
75〜79, (1990)− 15 −

ウシ胚からの性判別用細胞採取法の開発
尾形

康弘１）

堀内

俊孝２）

日高

健雅１）

松重

忠美１）

（受付：平成19年１月29日）

Development of a cell sampling method for the sexingof bovine embryos
YASUHIRO OGATA１）, TAKEMASA HIDAKA１）, TADAMI MATZUSHIGE１）, TOSHITAKA HORIUCHI２）
１）Hiroshima Prefectural Livestock Technology Research Center
584, Nanatuka-cho, Shobara, Hiroshima 727-0023
２）Hiroshima Prefectural University
562, Nanatuka-cho, Shobara, Hiroshima 727-0023

SUMMARY
To improve the quality of sexed bovine embryos, we developed a cell dissection method that is simple
and allows the collection of a small number of sample cells for sexing.
The number of cells collected by this method is about 1/5 of the conventional trophoblast metal blade
cutting method. This method can increase the number of cells in embryos in the blastocyst stage before
implantation without reducing the sexing rate for improvement in the quality of sexed embryos.
Conception of fresh embryos was not reduced by this method compared with no treatment or thetrophoblast metal blade cutting method.
After the implantation of embryos sexed by this cell dissection method, the production of female dairy
calves consistent with the results of sexing was possible.

要約

ウシの性判別胚の品質改善を目的として，簡易で少数の性判別用サンプル細胞を採取できる細胞剥離法を開発した．
この方法は，従来の栄養膜細胞の金属製ブレード切断法と比較して，採取する細胞数を約１/５まで減少させることができる．
性判定率を低下させることなく，移植前の胚盤胞期胚の細胞数を増加させることができ，性判
別胚の品質を改善することができる．
新鮮胚による受胎性も，無処置や栄養膜細胞の金属製ブレード切断法と比較して問題ないことが確認された．
細胞剥離法で性判別した胚を移植して，判定どおり雌乳用子牛を生産することができた．

１）広島県立畜産技術センター（〒727‑0023
２）県立広島大学（〒727‑0023

広島県庄原市七塚町584）

広島県庄原市七塚町562）− 16 −

広島県獣医学会雑誌

序22（2007）

児血清添加リン酸緩衝液に移し，３回以上洗浄した後，文

発生用培地TCM‑199＋５％FCSに移し，22〜24時間成熟

妊娠期間が長く，単胎動物であるウシにおいて，生ま培養を行った．
体外受精は，当センターの常法４）に従い，凍結精液をれてくる子牛の性によって畜産農家の経営に与える影響

用いて，精子濃度を６〜12×10６ /mlに調整して媒精をは少なくない．
希望する性の産子を得るために，これまでも様々な研６時間行った．媒精後72時間目までmSOF培地＋3mg/ml

究が行われており，現在，主に利用されているウシの性

牛血清アルブミン(Sigma A‑4378)＋0.25mg/mlリノール
酸アルブミン（Sigma L8384）で38.5℃，５％CO２，５

判別方法は大きく分けて二つある．
一つは，フローサイトメーターとセルソーターを利用％O２，90％N２の低酸素条件下で培養し，それ以降は，して，精子の段階でオス精子とメス精子に分画し人工授

mSOF培地＋10％FCS＋10μg/mlインスリン（Sigma I‑

精を行うもので，一部試験的に行われ着実に成果１）を挙

6634）でVero細胞との共培養を38.5℃，５％CO２，95

げている．

％airの気相条件下で行った．

もう一つは受精胚での性判別で，体内受精７日目の栄
養膜細胞の一部を金属製ブレードで切断するもの２，３）【性判別用サンプル細胞の採取】で，都道府県レベルでも性判別胚の供給を行っている．

性判別用のサンプル細胞の採取は，栄養膜細胞のブ

従来のブレード切断法による性判別用細胞のサンプリ

レード切断は，体外受精後７日目の胚盤胞期胚を用いた．

ングは，マイクロマニピュレータ等の高度な機器や熟練

顕微操作は，位相差倒立顕微鏡（Nikon Diaphoto 300）

した技術を必要とすることや，金属製ブレードでの切断と顕微操作システム（Leitz）に金属製ブレード（Microによる細胞損傷によって性判別胚の受胎性と保存性を低Feather BLADE K‑730）をセットし，栄養膜細胞の1/3下させてしまう等大きな問題があった．

程度を切断採取した．
胚の切断は，0.1Mサッカロース＋20％FCS添加M２

これらの問題を解決し，性判別胚の実用化を図ることを目的として我々は実験を行い，核移植時のドナー胚の液内で行った．
サンプル細胞として採取した切断胚は，20％FCS添加

処理方法を応用して，新しい性判別用細胞の採取法を開M２ 液 で ６ 回 洗 浄 し た 後， 20 ％FCS添 加mSOF培 地 で発した．
この細胞剥離法は，従来法と異なり，マイクロマニピュ

Vero細胞と共培養を２〜３時間行った．

レータ等の高度な機器を必要としない上，受精胚に対す細胞剥離法は，体外受精後５日目の桑実期胚を用いた．

る傷害が少ないため，胚盤胞期胚の品質が従来の金属製

桑実期胚を0.25％アクチナーゼＥ（科研製薬）に60秒

ブレード切断法よりも高く，受胎性についても無処置胚ほど静置し，透明帯を溶解した後，20％FCS添加M２液やブレード切断胚と同等であることが確認され，性判別で酵素の作用を停止させた．
透明帯を除去した胚を0.125％トリプシン（GIBCO

胚生産方法として有効性が高いと考えられる．

27250‑042）＋EDTA・4Na（Sigma E4DS）添加PBS‑に入

材料と方法

れ，市販のガラス製毛細管（Drummond 057910）をガ【体外受精胚の作出】

スバーナーで細く伸ばしピペットに加工した．

性判別に用いた体外受精胚は，と体卵巣由来もしくは，

そのピペットで数回ピペッティングすることで胚表層

広島県立畜産技術センターに繋養している黒毛和種及びの細胞を剥離させた．数個の細胞が剥離したところで，

ホルスタイン種からの経膣採卵によって得られた未成熟

20％FCS添加M２液で酵素の作用を停止させた．
細胞を剥離した胚は，20％FCS添加mSOF培地でVero

卵子を用いた．
と体卵巣からの卵子吸引は，37℃に加温した生理的食細胞と共培養を48時間行った．

塩水に卵巣を入れ，輸送・保存後，21Ｇ5/8注射針を５mlのディスポシリンジに装着し，卵胞径10mm以下のも【性判別法】のから吸引し集めた．

性判別は，ブレード切断及び細胞剥離のサンプル細胞

経膣採卵は，超音波画像診断装置（アロカ社SSD‑

ともに20％FCS添加M２液で６回洗浄後，１mg/mlPVA

1200） に 経 膣 穿 刺 用 コ ン ベ ッ ク ス 探 触 子 （ア ロ カ 社

添加PBS‑液で更に６回洗浄し，Loopamp牛胚性判別試薬

UHT‑9106‑7.5）を装着し，ディスポーザブル採卵針（ミキット（栄研化学）で性判定を行った．
サンプリングした性判別用細胞及び判別用操作胚の細サワ医科工業株式会社）及び卵子吸引システム（クック

胞数は，蛍光色素Hocehst33342で細胞核を染色し，蛍光

社K‑MAR‑5115）を用いて行った．
回収液は３％ウシ胎児血清（FCS）及び1.8ユニット/

顕微鏡下で細胞数をカウントした．

mlのヘパリンを添加した乳酸加リンゲル液を用い，吸引圧100mmHgの条件で卵胞液を吸引した．

【受精胚移植】それぞれの吸引液から卵丘卵子複合体のみを10％牛胎− 17 −

胚移植は，新鮮胚を発情後７日目の未経産ホルスタイ

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

性判別胚の移植成績は無処置区68.4％（13/19），ブレー

ン種の黄体側子宮角内に頚管経由法で行った．
妊娠診断は，妊娠30日目（移植後23日目）前後に超音波画像診断装置を用いて，胎仔心拍をもって妊娠と判定

ド切断区83.3％（５/６）及び細胞剥離区68.0％（17/25）
で，どの区間にも有意差はなかった．

した．
表４

成

績

試験区

性判別胚の受胎性（新鮮胚）
移植頭数

受胎頭数

受胎率

性判別用サンプル細胞の採取個数は，ブレード切断区

ブレード切断6583.3

13.2±1.4細胞（89胚），細胞剥離区2.7±0.2細胞（81胚）

細胞剥離

25

17

68.0

であった．

無処置

19

13

68.4

考

察

これまで，性判別法として，染色体分析５），パーコー
ル密度勾配法６）による精子分離，H‑Y抗原の利用７）や胚の発育スピードによる選別８）など様々な角度から研究が行われてきている．
ウシ胚のバイオプシーは金属製ブレードによる栄養膜
切断法９） が現在は主流となっており，この他にも金属
刃による細胞損傷を抑制するために透明帯にスリットを
図１

入れそこから膨出する細胞を採取するヘルニア法10）や，

性判別用サンプル細胞の採取個数

桑実期胚の割球をピペットで吸引する細胞吸引法11）等
サンプリング法別の性判別率は，ブレード切断区95.0が行われているがいずれの方法も，マイクロマニピュ％（19/20），細胞剥離区92.0％（46/50）であり，両者

レータ等の高度な機器と熟練した技術を必要とする．

の間に有意差はなかった．

しかもブレード切断法では，栄養膜細胞の切断による残りの胚へのダメージが大きく，このことが，その後の

表１

サンプリング法別の性判別率

性判別胚の受胎性や保存性を低下させることがあり，こ

試験区

供試胚数

性判別数

判定率(%)

れまで多くの研究機関で実用化試験が行われ，産子の生ブレード切断

20

19

95.0

産も行われているが，酪農家への普及はそれほど進んで

細胞剥離

50

46

92.0

いない．
今回行ったウシ受精胚からの性判別用サンプル細胞の性判別胚の発育性は，ブレード切断区84.6％（77/91）

採取は，従来の切断法とはまったく異なり，刃物によるが胞胚腔を再形成し，細胞剥離区91.4％（74/81）が胚切断ではなく，酵素の働きによって細胞間の結合を緩め

盤胞期胚に発育し，両者に有意差はなかった．

て剥離する方法なので，サンプリングする細胞数も13.2細胞から2.7細胞に少なくすることができた．また，切表２ 性判別胚の発育性断による細胞破壊によって細胞外へ溶出する水解小体等

試験区

供試胚数

胞胚腔形成

胞胚腔形成率(%)

により，残りの胚細胞の一部が傷害を受けるなどの影響

ブレード切断

91

77

84.6

で細胞を破壊することがない細胞剥離法は細胞への傷害

細胞剥離

81

74

91.4

を最小限にすることができると考えられ，結果として，性判別胚の総細胞数は，無処置区119.9±4.5細胞，ブレード切断区77.0±2.7細胞及び細胞剥離区100.0±6.7
細胞で，細胞剥離区はブレード切断区より有意に胚盤胞
期胚の細胞数が多かった．
表３ 性判別胚の総細胞数
試験区

供試胚数

総細胞数±S.E.

ブレード切断9177.0±2.7a

細胞剥離

32

100.0±6.7b

無処置

43

119.9±4.5c
写真１ 桑実期胚に細胞剥離法を適用した直後※異符号間で有意差（p＜0.05）− 18 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

今後，新鮮胚で例数を重ねながら性判定結果の正確度

細胞数の減少が抑制できたと考えられる．
実際，今回の実験でも，性判別胚の発育性には有意差調査を行い，最終的には，ガラス化保存した性判別胚をがなかったものの，ブレード切断区と比較して6.8ポイ

移植し，受胎性に与える影響を調査することで，実用化

ント（84.6％ vs 91.4％）改善されており，７日目の胚にむけた技術改善を行いたいと考えている．

盤胞期胚の総細胞数は，細胞剥離胚がブレード切断胚よ文

り有意に高いものとなっており，性判別胚の品質（細胞献１）Tubman, L. M., et al: Characteristics of calves produced数）を大幅に改善させることができた．

with sperm sexed by flow cytometry/cellsorting. J.

これまでの多くの報告で，凍結保存したバイオプシー

Anim. Sci, 82, (4), 1029-1036, (2004)

胚の受胎性の低さが問題視されており，沼辺らの報告でも無処置胚と比較すると受胎率が10%程度低下してい

２）Itagaki, Y., et al: Sexing of bovine embryos withる５）．これらを解決するために，緩慢凍結法ではなく，

male-specific repetitive DNA by polymerase chain

氷晶形成を伴わないガラス化法での性判別胚保存が試み

reaction, 9, (1), 65-72, (1993)12）．これらの胚のガラス化保存法とこの新

３）Machaty. Z.. et al. Biopsy and sex determination by PCR

しいサンプリング法を組み合わせることで，保存後の受of IVF bovine embryos, J Reprod Fertil, 98, 467-470

胎性改善が期待できると考えている．

(1993)られている

４）岩水正ら：ウシ体外受精胚の凍結保存，広島県獣医学雑誌,13,59‑62,(1998)
５）沼辺孝ら：牛胚の性染色体分析法およびPCR法による性判別，日本胚移植学雑誌,17,183‑189,(1995)
６）兼子智，押尾茂：細胞工学,秀潤社,13,(７),605‑
611,(1984)７）Utumi, K., et al: Embryo sex selection by a rat male specific antibody and the cytogenetic and developmental
confirmation in cattle embryos, 34, 25-32, (1993)
８）Avery, B., and Schmidt: Differential cleavage rates andsex determination in bovine embryos, Theriogenology,
写真２

32, (1), 139-147, (1989)

細胞剥離法で生産した性判別法

９）後藤充宏ら：PCR法によるウシ胚の性判別と臨床
これまでも，受精胚の一部をバイオプシーしたもので

応，日本胚移植学雑誌17,(１),19‑25,(1994)

も産子が得られており，細胞剥離法で作出した性判別胚10）青柳和重ら：新規法を用いたバイオプシー凍結胚にの受胎性も無処置の新鮮胚と同等であり，山中ら13）やよる子牛の生産，平成15年度東北農業研究成果情報

Niemannら

14）の報告にもあるように酵素処理や透明帯除360‑361(2004)
11）Herr. CM., Reed KC.,: Micromanipulation of bovine

去が受胎性に与える影響はないと考えられる．
この方法で生産された子牛も人工授精や受精胚移植産

embryos for sex determination, 35, 45-54, (1991)

子と同じように，妊娠期間，分娩状況ともに正常であり，

12）Y. Agca, et al: Normalcalves from transfer of biopsied,

この方法で子牛を生産することは，現在のところ問題はsexed and vitrified IVP bovine embryos, 50, 129-145

見当たらない．

(1998)
13）山中昌哉ら：牛体外作出胚およびバイオプシー胚の生存性におよぼすトリプシン洗浄処理の影響

日本

胚移植学雑誌19(２)89‑93(1997)
14）Takeda, T., et al: Deep freezing of split and intact bovine
embryo. Theriogenology, 27, (1), 285, (1987)

写真３

細胞剥離法で生まれた乳用雌ウシ− 19 −

レシピエント卵子の品種が核移植胚及び産子へ及ぼす影響
日高

健雅

尾形

康弘

松重

忠美

（受付：平成19年１月29日）

The Effect of Recipient Oocytes Species on Embryo
after Nuclear Transfer and Cloned Steers
TAKEMASA HIDAKA, YASUHIRO OGATA, and TADAMI MATSUSHIGE
Hiroshima Prefectural Livestock Technology Research Center
584, Nanatuka-cho, Shobara, Hiroshima 727-0023

SUMMARY
In order to investigate the effect of cytoplasm on embryos after nuclear transfer and cloned steers, we
performed nuclear transfer using donor cell from Japanese Black Cattle and recipient oocytes fromJapanese Black Cattle and Holstein Cattle. The developmental rate of embryos after nuclear transfer using
recipient oocytes from Japanese Black Cattle was significantly higher than embryos using recipient oocytes
from Holstein Cattle. The gestational period of cloned steers using recipient oocytes from Holstein Cattle
was significantly longer than cloned steers using Japanese Black Cattle. In comparison of birthweight ofcloned steers, embryos using recipient oocytes from Holstein Cattle was significantly heavier. In
conclusion, it was considered that development of embryo and steers were influenced by cytoplasm. It wassuggested that performing nuclear transfer using donor cell and recipient oocytes from same breed might
prevent abnormal delivery.

要

約

核移植胚及び核移植産子において，細胞質の違いが発生率や発育に及ぼす影響を調査するために，黒毛和種由来のドナー細胞と，黒毛和種及びホルスタイン種由来のレシピエント卵子を用いて核移植を行った．核移植胚の発生率は，黒毛和種由来のレシピエント卵子を用いた場合がホルスタイン種由来のレシピエント卵子を用いた場合より有意に高い発生率を示した．妊娠期間は，
ホルスタイン種由来のレシピエント卵子を用いた核移植産子が黒毛和種由来のレシピエント卵子を用いた場合と比較して有意に長かった．核移植産子の生時体重は，ホルスタイン種由来のレシ
ピエント卵子を用いた産子が有意に重かった．
このことから，レシピエント卵子の細胞質が，胚の発生や牛の発育に影響を及ぼしていることが考えられた．また，ドナー細胞とレシピエント卵子の品種を揃えることで異常産などが予防できる可能性が示唆された．

序外成熟後，除核したものをレシピエント卵子として用い

文て核移植を行う．その後体外培養を行い，胚盤胞まで発

受精卵核移植技術においては，桑実期の受精胚をド育した胚を移植し，核移植産子を作出する．

ナー細胞として，牛の卵巣から採取した未成熟卵子を体広島県立畜産技術センター（〒727‑0023

広島県庄原市七塚町584）− 20 −

この一連の操作において，ドナー細胞は一つの桑実期

広島県獣医学会雑誌

胚から用いるが，レシピエント卵子には異なった個体や22（2007）より行った５）．

品種の卵巣から採取した卵子を用いる場合が多いため，

除核卵子はカルシウムイオノフォア10μMとイノシ

核のDNAは同一でも，全く異なる細胞質を保有する核トール３リン酸25μg/mlで５分間処理した後，ピュー移植産子が生産されることになる．

ロマイシン100μg/mlと牛血清アルブミン（BSA）３mg

近 年， 細 胞 質 内 に 存 在 す る ミ ト コ ン ド リ ア のDNA

/mlを添加したCR１aa培地で６時間培養する複合活性化（mtDNA）が脂肪交雑などの経済形質に影響を及ぼす処理を施した．除核卵子に，受精後５日目の桑実期胚をと言われており，Boettcherら１） は，乳牛において生乳

ドナー細胞としてマイクロマニピュレーターにて挿入

生産量に細胞質が影響していると報告している．また万後，チンマーマン氏液中にて交流8.5V/mm ５sec，直年ら２，３）は肉用牛においてmtDNAのタイプに分けた群流75V/mm 50μsec×２回の電気パルスを印加すること

間に脂肪交雑などの経済形質に有意な差が認められたとにより細胞融合を行った．

報告している．このように母方からのみ遺伝する細胞質

体外培養は，電気インパルス印加後72時間目までは３も育種を行う上での重要な要因である可能性が示唆されmg／ml BSA添加CR１aa培地にて，５％O２・５％CO２・ている．

90％N２ ・38.5℃の条件下で，72時間目以降は10％FCS

一方で，Tessら

４）

は肉用牛の生産において細胞質の遺伝的な影響は重要ではないと報告している．また核移添加CR１aa培地にてVero細胞との共培養６）を行った．
３．レシピエント卵子の由来の異なる核移植胚の発生状
況調査

植産子を生産する中で，核移植産子の流産などの異常産や過大子，核移植産子間の肉質や増体などの経済形質の相似性など不明な点が多数ある．

核移植に用いたドナー細胞は，黒毛和種由来の受精後５日目の桑実期胚を用いた．試験区は，レシピエント卵

そこで今回我々は，核移植技術を活用して，品種の異子の由来別に区分し，未成熟卵子を黒毛和種の卵巣からなる牛から採取したレシピエント卵子を用いて核移植を採取した和牛区，ホルスタイン種及びＦ１（黒毛和種×行うことにより，細胞質が核移植胚や核移植産子に及ぼホルスタイン種）の卵巣から採取したホルス区とし，核す影響を調査した．

移植胚の融合率，発生率，総細胞数を比較調査した．
４．胚盤胞の構成細胞調査

材料と方法

総細胞数は，７日目に胚盤胞に発育したものについて，

１．牛卵子の採取と成熟培養

ヘキスト染色により胚を染色し，蛍光顕微鏡下にて核数

牛卵子の採取は，黒毛和種の生体卵巣からの経膣採卵を速やかにカウントすることにより確認した．
５．核移植産子の分娩状況調査と，と体卵巣からの吸引採取により行った．
経膣採卵は，経膣穿刺用7.5Mhzコンベックス探触子(アロカ社UHT‑9106‑7.5)，超音波画像診断装置(アロ

998年〜2006年まで当センターで生産された核移植産
子58頭について調査を行った．

カ社SSD‑1200)及び穿刺針(ミサワ社，COVA)を用いて試験区は，核移植胚の発生状況調査と同様に，レシピ行った．回収液は乳酸加リンゲル1000mlにつき３mlのエント卵子の由来別に分類し，未成熟卵子を黒毛和種の牛胎仔血清(FCS)と90ユニットのヘパリンNaを添加した

卵巣から採取した和牛区，ホルスタイン種及びＦ１の卵ものを用い，吸引圧は100mgHgにより未成熟卵子の回巣から採取したホルス区とし，それぞれの未受精卵をレ収を行った．と体卵巣からの吸引は，と体卵巣に存在す

シピエント卵子として用いて作出した核移植産子の妊娠

る直径７mm以下の卵胞から注射器(注射針:21Ｇ)を用

動態，生時体重を比較検討した．

いて卵胞液と共に卵子を吸引採取した．採取した牛未成
熟卵子は，卵丘細胞の付着度及び卵子の形態的観察によ

核移植産子の作出のためのドナー細胞は全て黒毛和種
由来の桑実期胚を用いた．

りＡ〜Ｅランクに分別し，卵丘細胞が２層以上付着し，成

かつ細胞質が均質なＢランク以上の卵子を試験に供し績

１．レシピエント卵子の由来の異なる核移植胚の発生状

た．
成熟培養は10％FCS，50ng/ml上皮成長因子(EGF)，況調査

0.12au/ml卵胞刺激ホルモン(FSH)添加TCM199培地にて和牛区及びホルス区の核移植胚の発生成績は，和牛区

５％O２・95％air条件下で22〜24時間行った．

では供試胚87個のうち融合率97.7％，８細胞期率77％，

２．核移植

桑実期率66.7％，胚盤胞期率62.1％，ホルス区では供試

成熟培養終了後，0.1％ヒアルロニダーゼ，0.1％コラ

胚83個のうち融合率95.2％，８細胞期率61.4％，桑実期

ゲナーゼ添加M２液中でピペッティングにより顆粒層細率41.0％，胚盤胞期率31.3％で，有意に和牛区が高い発胞を除去し，囲卵腔内に第一極体を放出した成熟卵子の生率を示した．

みを以降の実験に供した．
除核はマイクロマニピュレーターを用いて透明帯にスリットを形成し，極体を目印にした細胞質押し出し法に− 21 −

広島県獣医学会雑誌

表１ 核移植胚の発生率
融合数（％）

22（2007）

報を保有した牛を複数産出する技術であり，クローン検

試験区

供試胚数
（％）

和牛区

87

54ａ
85
67
58
（97.7） （77.0） （66.7） （62.1）

ホルス区

83

26ｂ
79
51
34
（95.2） （61.4） （41.0） （31.3）

定などの種雄牛造成への活用のため多くの研究機関で研8細胞数 桑実期数 胚盤胞数
（％）
（％）
（％）

究されてきた．クローン検定は従来の育種選抜手法に比べ検定期間の大幅な短縮化など検定効率の向上ならびに省力化を可能にする手法として期待されている．また，近年の核移植技術の進展により核移植産子の生産効率も体外受精由来胚の成績に近いものになり，クローン検定の実用化が可能になっている．しかし，核移植胚作出に異符号間に有意差あり（P＜0.01）

おいて，ドナー細胞とレシピエント卵子に由来が異なる卵子を用いる場合があるため，核DNAと細胞質の由来

２．胚盤胞の構成細胞調査
胚盤胞期胚まで発育した核移植胚の総細胞数は，和牛が異なる核移植胚や核移植産子が作出されることにな

区では，平均71.4±28.9個，ホルス区では70.4±28.8個り，胚の発生や産子の発育等への影響が懸念される．
今回我々が行った核移植胚の発生成績は，和牛区がホで，両区間に有意な差は認められなかった．

ルス区より有意に高い胚盤胞発生率を示した．
表２

安部ら７）は，ミトコンドリアの活性が高く酸素消費量

核移植胚の胚盤胞期胚の総細胞数

試験区

供試胚数

総細胞数±S.D

和牛区

38

71.4±28.9

ホルス区

17

70.4±28.8が高い胚が，胚盤胞への高い発生率を示し胚の質も良好であるとしている．ミトコンドリアの機能に必要な多くのタンパク質は，核にコードされた遺伝情報に依存しているため，ミトコンドリアの活性を高く維持するためにはmtDNAの正確な複製が行われる必要がある．ドナー

３．核移植産子の分娩状況調査

細胞とレシピエント卵子に由来品種が異なる卵子を用い

核移植産子の妊娠期間

ることにより，mtDNAの正確な複製が行われずミトコ

妊娠期間は，和牛区の平均は286±６日，ホルス区は289±2.3日と，ホルス区の方が約３日間，有意に長かっンドリアの呼吸活性などが低下し，その結果胚の発生成
績が低下した可能性が考えられた．

た．また当センターでは分娩予定日を５日間経過した場

家畜改良センターによる全国の試験機関アンケート８）

合，分娩誘起処置を行っているが，和牛区では，48頭中によると，核移植産子における難産の発生率は24.4％で８頭分娩誘起を行ったのに対し，ホルス区では10頭中５あり，牛の平均生時体重も48.3±11.9kgと過大子が生頭で分娩誘起を行っており，ホルス区で多くなる傾向が産される傾向が窺える．核移植後に生産された牛の過大認められた．

子はWilladsenら９）によって初めて報告され，その後牛や羊における操作胚から生産された胎仔の過大に関する
表３

報告が多く発表されている．その中でWalkerら10）によっ

核移植産子の妊娠期間

試験区

産子数

妊娠期間±S.D

誘起分娩

和牛区

48

286±6.0ａ

8

ホルス区

10

289±2.3ｂ

5て，in vitroにおける牛や羊の胚の操作が過大子の発生の原因となっている可能性が示唆されている．しかし，胚における遺伝子の発現と過大子との関連性に関する調査は報告11）されているが，過大子の発生にかかわる詳細な異符号間に有意差あり（P＜0.05）

メカニズムは未だ明らかになっていない．

核移植産子の生時体重本試験における核移植産子の調査では，和牛区と比較

生時体重の平均は，和牛区では35.5±6.7kg，ホルス

してホルス区の生時体重が約10kg重く，妊娠期間は約

区では45.3±8.9kgであり，ホルス区が有意に大きい値

３日間長かった．Walkerらは妊娠期間の延長も認められを示した．

るが，それだけでは生時体重の増加を説明するには不十分であるとしている．今回妊娠期間が290日以上であっ表４

核移植産子の生時体重

試験区

産子数

生時体重±S.D

和牛区

48

35.5±6.7ａ

ホルス区

10

45.3±8.9ｂ

た和牛区の生時体重とホルス区の生時体重の比較においても，ホルス区の生時体重は有意に大きかったことから，妊娠期間の延長の以外にも生時体重の増加に影響する要素がある可能性が示唆された．
また，一般的な人工授精を行った場合，ホルスタイン

異符号間に有意差あり（P＜0.05）

考

種の妊娠期間は黒毛和種より短くなるが，今回ホルス区の妊娠期間の延長が認められたことから，ドナー細胞と察

レシピエント卵子の品種が異なることにより，分娩を誘受精卵核移植技術は，一つの受精胚から同一の遺伝情起する機序に何らかの影響を及ぼしている可能性が示唆− 22 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）４）Tess, M. W, et. al.: Evaluation of cytoplasmic genetic

された．

effects in beef cattle using an animal model. Journal of

以上のことから，レシピエント卵子の細胞質が，胚のAnimal Science, 68, 1899-1909, (1990)

発生や牛の発育に影響を及ぼしていることが考えられた．またドナー細胞とレシピエント卵子の品種を揃える

５）高野ら：核移植実験系における電気刺激時の温度条ことで過大子やそれによる難産など異常産が予防できる件の検討，繁殖技術会誌，13，15‑19（1991）

可能性が示唆された．

６）尾形ら：マイクロドロップレット法で凍結保存した

我々は現在mtDNAのD‑Loop領域からミトコンドリア

牛のレシピエント卵子による核移植成績，広島県獣のタイプ分けを行い県内の牛のmtDNAタイプの分布調医学会雑誌，15，33‑36（2000）

査を行っているが，今後mtDNAタイプごとの性質やド７）Abe, Hiroyuki, et. al.: Evaluating the Quality of

ナー細胞とレシピエント卵子のタイプ間における関連性

individual Embryos with a Noninvasive and Highlyを調査し，ミトコンドリアが牛の発育や肉質へ及ぼす影

Sensitive Measurement of Oxygen Consumption by

響等を検討していきたいと考えている．

Scanning Electrochemical Microscopy. Journal of
Reroduction and Development, 52, 55-64, (2006)

文１）Boettcher,

PJ,

et.

献
al.:

Relationships８）橋谷田ら：肉用牛のクローン検定とそのための安定
between的双子クローン生産技術の展望と問題点，畜産技術，

Polymorphism for mitochondrial deoxyribonucleic acidand yield traits of holstein cows. Journal of Dairy

8月号，32‑36，（1998）
９）Willadsen, SM, et.al.: The viability of late morulae andScience, 79, 647-654, (1996)

blastcysts produced by nuclear transplantation in cattle.

２）Mannen, H, et. al.: Effect of mitochondrial DNA
variation on Carcass traits of Japanese black cattle.

Theriogenology, 35, 161-170, (1991)10）Walker, SK, et. al.: In vitro culture of sheep embryos

Journal of Animal Science, 76, 36-41, (1998)

without３）Mannen, H. et. al.: Identification of mitochondrial DNA
substitutions related to meat quality in Japanese Black

co-culture:

successes

andperspectives.

Theriogenology, 37, 111-126, (1992)
11）Young, LE, et. al.: Large offspring syndrome in cattle

cattle. Journal of Animal Science, 81, 68-73, (2003)

and sheep. Reviews of Reproduction, 3, 155-163 (1998)− 23 −

黒毛和種の白線部ヘルニアの１例
中谷石橋啓二１） 山崎一郎１） 国重

一男２） 平田俊治３） 大川（受付月日晴美１） 太田雄三１） 篠塚

哲夫２） 上高康典１）

宏３）

平成19年１月26日）

A Japanese black calf with white line hernia
KEIJI NAKATANI１）, KAZUO YAMASAKI２）, HARUMI HIRATA１）, TETUO OOTA２）,
HIROSI KAMITAKA３）, ITIROU ISHIBASHI１）, SHUNJI KUNISHIGE３）,YUUZO OOKAWA１）, and YASUNORI SHINOZUKA１）
１）Yamagata Veterinary Clinical Center, P.F.A.M.A.A.
461-1, Haruki, Kitahiroshima-cho, Yamagata-gun, Hiroshima 731-1531
２）Hiroshima, P.F.A.M.A.A.
1-2-23, Hikarimachi, Higashi-ku, Hiroshima, 732-0052
３）Higashihiroshima Veterinary Clinical Center, P.F.A.M.A.A.
284-1, Inaki, Takaya-cho, Higashihiroshima, Hiroshima 739-2106

SUMMARY
White line hernia in Japanese black cattle is rarely observed, and the treatment of large hernias isconsidered to be difficult. We report the treatment course in a Japanese black calf with white line hernia.
The calf showed no abnormalities at birth. About 3 months after birth, a hernial ring was observed in thewhite line immediately posterior to the navel, but it was healed after the 3rd operation.
The first and second operations were relatively easy, but hernia recurred from the lateral side of thesuture area after each operation.
In the 3rd operation, suturing for reinforcement was performed on the bilateral sides of the hernial ring
suture area using kitchen pads. Fever and suppuration persisted for about 40 days following operation, andthe kitchen pads were removed 43 days postoperatively. Subsequently, inflammation subsided, resulted inhealing.

要約

黒毛和種の白線部ヘルニアは発生が稀で大きなものは治癒困難と言われている．今回，黒毛和
種仔牛の白線部ヘルニアに遭遇したので，その治療経過の概要を報告する．
発生子牛は，出生時には異常を認めなかったが，約３ヶ月齢で臍直後の白線部にヘルニア輪を認め３回目の手術で治癒させることが出来た．
１回目，２回目の手術は比較的容易であったが，いずれも縫合部の外側から再発した．
３回目の手術ではキチンパッドを用いヘルニア輪縫合部の両側に補強縫合を施した．手術後，約40日間は発熱と化膿が続き，43日目にキチンパッドが排出され，その後炎症は消退し治癒した．

１）NOSAI山県家畜診療所（〒731‑1531
２）NOSAI広島（〒732‑0052

広島県山県郡北広島町春木461−１）

広島県広島市東区光町１−２−23）

３）NOSAI東広島家畜診療所（〒739‑2106

広島県東広島市高屋町稲木284−１）− 24 −

広島県獣医学会雑誌

序22（2007）

注射し仰臥保定とした（写真２）．

文ヘルニア輪確認後直径40cm切皮す

黒毛和種の腹壁ヘルニアは発生が稀で，大きなもの

る．比較的明瞭で硬度のあるヘルニ

また，特に白線部に発生したものは治癒困難と言われてア輪を認める．直径20cmのキチン

いる１，２）．

パッドをヘルニア輪に縫い付け（写今回，我々は黒毛和種仔牛の白線部ヘルニアに遭遇し，

真３），埋没させるようにヘルニア

３回目の手術で治癒させることが出来たのでその治療経

輪を縦に２重縫合した（写真４）．

過を報告する．

さらに，縫合部周囲から再発するた

患め，縫合部から左右に長さ10cmづ畜

つ補強縫合を施した（写真５）．皮発生子牛は，黒毛和種，メスで平成17年１月15日生ま膚を縫合し，起立させ，包帯を巻き，れ（約３ヶ月齢）であった．

手術を終了した（写真６）．
平成17年８月４日〜９月15日

治 療 経 過39.3〜40.5℃の熱発が続き，皮下患畜の臍部付近に径３cmの不明

平成17年４月？日に膿瘍形成が見られ，切開洗滌，抗瞭なヘルニア輪をみとる．
平成17年５月６日

生剤の投与を続けた．食欲，発育は，整復手術を行なう．ヘルニア輪は独特の硬さが認められず，整復手術

順調であった．
平成17年９月16日

は極めて容易に終了した．
平成17年５月17日

ら覗き，除去する．

抜糸したが，ヘルニア輪は認めな

口周囲は，結合織が厚く造成していかった．
平成17年５月25日

キチンパッドが押し出され創口かる．

再発確認し，その後経過観察するも次第にヘルニア輪拡大する．

平成17年６月29日

臍直後に幅５cm，長さ15cmの縦長のヘルニア（写真１）となり再手術を行なった．ヘルニア輪は軟
らかく，手術は比較的容易に終了
した．

平成17年７月１日

術部後端にヘルニア輪発生を認める．

平成17年８月３日

ヘルニア輪，極めて拡大速く，円形で，径30cmを超え再々手術を実施した．
推 定 体 重 180kgで， キ シ ラ ジ ン
0.06g（セラクタ−ル３cc）を筋肉
写真２

写真１

写真３

２回目の手術前− 25 −

３回目の手術漓 ヘルニア輪の確認

３回目の手術滷 キトサンパットの装着

広島県獣医学会雑誌

平成17年9月20日〜12月15日

22（2007）

平成18年１月13日

週１回創口の洗滌を行なう．体温したものと認めるの上昇は見られない．

写真４

３回目の手術澆

写真６（写真７）．

ヘルニア輪の縫合

３回目の手術潸

創口閉鎖し，脱出見られず，治癒

写真５

手術終了

写真７

３回目の手術潺 補強縫合

３回目の手術後150日目の患牛去してから発熱しなくなったことから，発熱の原因はキ考察およびまとめチンパットではないかと推察された．また，皮下の化膿

黒毛和種の腹壁ヘルニアの発生要因は，種々の外的要

は発熱の継続と補強縫合の非吸収性縫合糸が原因と思わ因（衝突，墜落，角突など）によって腹筋が挫傷を受け，れる．しかし，この炎症による結合織の増成が更なるヘ

１）

または皮下断裂をきたすことに起因して発生する．

ルニア輪の開口を防いだものと思われる．

今回の発生は月齢からみて先天的なものではなく，何ら

今後黒毛和種の腹壁ヘルニアの手術を行う場合，ヘルニ

かの外的要因によって発症したものと推察された．

ア輪縫合後，周囲の補強縫合を必ず施術することが必要

また，再発の要因としては，腹壁ヘルニア，特に白線と思われる．

部 に 発 生 し た も の は， 治 癒 し に く い と 言 わ れ て いる１−３）．当該牛も２回整復手術を行い，それぞれ，19

参考文献

日目，２日目に再発した．２回とも，ヘルニア輪縫合部

１）木全春生：新動物外科学，167〜168，地球社，東京（1975）の外側から再発生していた．再々手術では，ヘルニア輪
縫合部から左右に補強縫合を施し再発生を防ぐことが出

２）幡谷正明・黒川和雄ら：家畜外科学第５版，417〜
419，金原出版，東京（1995）

来た．
手術後の熱発と化膿については，三回目の手術後約40

３）中村良一：獣医ハンドブック第８版，474〜476，養日に亘り39.3〜40.5℃の発熱が続き，術部が化膿した．
平成17年９月16日キチンパットが押し出され，それを除− 26 −

賢堂，東京（1974）

飼料給与を時間軸で考える要因分析事業
篠塚

康典１）

檜山

尚子２）

（受付：平成19年１月31日）

Factor analysis project in which feeding is considered along the time axis
YASUNORI SHINOZUKA１）, and NAOKO HIYAMA２）
１）Yamagata Veterinary Center, Hiroshima P.F.A.M.A.A.
461-1, Haruki, Kitahiroshima-cho, Yamagata-gun, Hiroshima 731-1531
２）Miyoshi Veterinary Center, Hiroshima P.F.A.M.A.A.
3-6-36, Tokaichi-higashi, Miyoshi-shi, Hiroshima 728-0013

SUMMARY
In the factor analysis project performed in NOSAI Hiroshima, we used a graph representing the rumen
fermentation state. In Farm A, this graph was applied to conventional feed formulation, and a safe feed
design with synchronization of the protein degradation rate with the carbohydrate synchronization rate waspossible. In Farm B, the reason for contradictions between the feed design based on metabolic profile tests
and subsequent clinical symptoms could be clarified.
The incorporation of this graph in feed formulation may be useful because a feeding method necessary toattain the maximum rumen fermentation can be considered along the time axis.

要

約

NOSAI広島で実施している要因分析事業においてルーメン発酵状況を表すグラフを応用した．
Ａ農家では従来の飼料計算に本グラフを応用し，蛋白質の分解速度と炭水化物の分解速度をシンクロさせた安全な飼料設計を行うことができた．Ｂ農家では代謝プロファイルテストに基づいた飼料設計とその後の臨床症状の矛盾点が生じるにいたった理由が示された．
本グラフを飼料計算に組み込むことは，ルーメンの発酵を最大にするために必要な飼料給与方
法を時間軸にそって考えることが容易となり，有用であると考えられた．

序

なっている．牛群の問題は不適切な飼養管理によること

文が多く，飼料設計は非常に重要な作業となっている．単NOSAI広島では乳牛の要因分析事業を行っている．

胃動物とはきわめて異なる消化機能をもつ牛の飼料設計

これは疾病多発や低生産性などの牛群の問題を解決する

はルーメン発酵抜きにして考えることはできず，特に高目的のみでなく生産性をさらに高めるためにも広く利用

泌乳牛ではルーメン微生物の機能を最大に発揮して栄養されている事業である．事業内容は飼料計算，牛群チェッ

素の供給を効率的におこなう必要がある．最適なルーメ

ク，環境管理，代謝プロファイルテスト（以下MPT）

ン発酵，すなわち菌体蛋白質生産を最大にするためには，などを実施し改善点を農家とともに協議し，数ヵ月後にルーメン微生物自身への蛋白質とエネルギーの効率的供同様の検査を行って牛群の反応をみていくことが主と給をおこなうことが重要で，そのために現在の飼料計算

１）NOSAI広島山県家畜診療所（〒731‑1531

広島県山県郡北広島町春木461−１）

２）NOSAI広島三次家畜診療所（〒728‑0013

広島県三次市十日市東３丁目６−36）− 27 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

ではルーメン内分解蛋白（RDP）と非繊維性炭水化物を崩すことなく安全に繊維レベル，エネルギーレベルを（NFC）の量的バランスをとることによっている．しか上げることができたことが確認された．飼料給与改善後し，ルーメンは連続発酵槽であり，RDPとNFCの分解ス

は，牛の肋が起きる，糞中のコーンが見られなくなるな

ピードについて時間の概念がないために飼料設計の効果

どルーメンマットの良好な形成を認め，疾病の発生率なが思わしくないケースもある．そこで，筆者らの考案しど当該農家の問題点は改善された．

たルーメン発酵グラフを本事業に用いたところ有用であったのでその概要を報告する．

材料と方法
NOSAI広島で実施している要因分析事業実施農家のうち２農家（Ａ農家・Ｂ農家）を選定し，2005年２月から2006年１月にかけて行われた事業内容について時間軸を用いたルーメン発酵グラフを用いて考察を加えた．農家選定基準は当該農家が給与している飼料の炭水化物および蛋白質分画，通過スピードなどの基礎的データが既知であることとした．
１．Ａ農家の例
当農家は40頭飼養のタイストール，TMR給与の中規

図１

Ａ農家給与TMRの特徴

模牛群であった．牛群の問題点は夏バテする牛が多く，第四胃変位が多い．また乳成分のうち無脂固形分が低いというものであった．
２．Ｂ農家の例
当農家は30頭飼養のタイストール，分離給与で自動給餌機，連続水槽の設けられた牛群であった．この農家の問題点は繁殖成績が思わしくないということであった．
繁殖成績を示すJMRは25で悪化傾向にあった．
これらの農家について，MPT，飼料計算，BCS測定，環境調査など要因分析事業を実施し，そのうち飼料給与
内容（品目・量・給与時間など）を聞き取り，筆者らの考案した方法（文献１）を用いて第一胃内でのエネルギー
および蛋白質の分解状況を24時間グラフ化した．結果を

図２

Ａ農家のルーメン発酵状況

図３

Ａ農家のルーメン発酵状況

総合的に判断し改善を加えた後，数ヵ月後にもう一度当事業を実施し総括を行った．そして本方法を用いて作成したルーメン発酵状況グラフの事業における有用性について検討した．

成績

１．Ａ農家の場合当該農家で給与されていたTMRはNFC：RDPの比はバランスが取れていたが蛋白質の分解が先行するタイプの発酵パターンであった（図１）．このTMRと乾草（オーツヘイ）を組み合わせて一日４回給餌が行われており，
一日のルーメン発酵状況は図２のようであった．エネル
ギーと蛋白質の分解パターンはシンクロしており問題はないようだった．しかし，MPTの結果からNFC不足，臨床所見からルーメンマットの低形成が指摘されており，

２．Ｂ農家の例

ルーメンマットの形成と安全にエネルギーレベルを上げ

当農家は自動給餌機を利用して１日７回，市販の配合ることを目的に改善が行われた．オーツヘイとビートパ

飼料と自家配合飼料を給与していた．一日のルーメン発

ルプを用いて給与飼料内容を変更したところルーメンの酵状況は図４のようであった．朝のスーダン，ルーサン

発酵状況は図３のようになり，ルーメン発酵のバランスを給与した後と夜にソルゴーサイレージを給与した後に− 28 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

蛋白の分解が先行するがその他の時間帯はエネルギーの考

分解が多いという日内パターンであった．飼料計算においては乾物量，エネルギー，蛋白質レベルとも満足のい

察

１．Ａ農家

くレベルであったが（表１），MPTの結果，血糖値が低

飼料給与中のエネルギーレベル，特にNFCを上げるに

くBUNが高いという結果を得たため自家配合中のNFCはいくつかの方法があるが今回は分解スピードの中程度の増量とRDPを若干下げる飼料給与変更を行った．数ヵであるビートパルプを選択した．これは改善前のNFC：

月後の再検査ではBUNは正常範囲内となり繁殖成績もRDPが量的，時間的にも問題なくバランスが取れていた改善した（JMR8.1）が，Htが上昇するなど慢性的なアのでこのバランスを維持する必要があったこと，繊維をシドーシス傾向が見られるようになり，疾病の発生が懸同時に補うことを目的としたからである．改善後のルー念された．その時点でのルーメン発酵状況は図５のよう

メン発酵状況もバランスの取れたものであることを確認であり，一日のうち大半が蛋白に対してエネルギーの割することができた．本例はルーメン発酵に必要なエネル合が多くなっていた．

ギーと蛋白質のバランスは取れていたが，ルーメンマッ
トの形成が不充分であったために微生物発酵が計算どおりにいっていなかった例と考えられる．すなわち，ルーメンプロトゾアが利用すべきアンモニアとエネルギーが十分であるにもかかわらずルーメン内微生物の数が不十分で，かつ飼料の滞留時間が短いために十分利用されることなく下部消化管に送られていたと考えられる．結果として飼料の利用効率が低下し，牛体としてはエネル
ギー不足となり，低乳質や疾病多発につながっていたと考えられる．
２．農家Ｂ
一般的にMPTにおいて高BUN，低血糖がみられる場
合はルーメン内微生物の利用するエネルギーであるNFC

図４

Ｂ農家のルーメン発酵状況

不足によりルーメン内アンモニアが利用低下していると診断されることが多い．本例でもその診断に基づいてNFCの増量とRDPの若干の減量を行った．しかし，結果

表１ Ｂ農家飼料計算結果％（DM）

充足率（％）

CP

14.9

105.6

TDN

74.1

116.5

NFC

として返ってきた牛群の反応はルーメンアシドーシスであった．当初の飼料計算ではNFCとRDPのバランスは問題なかったが，MPTの結果に基づいてNFCを増量したわけで，血液性状と臨床症状が矛盾する結果となった．し29.4

かし，日内変動グラフでみてみるとMPTの採血が午前
乳量30kg/day

DMI 20.8kg/day

11時ごろ行われており，その2.5から４時間前に給与されている飼料給与内容はエネルギーの分解に比べ蛋白の分解が非常に多い内容であることがわかった．すなわち，ルーメン微生物が利用しきれないほどのアンモニアが大量に分解されオーバーフローしている状態となっている
時間帯に採血を行っていたのである．オーバーフローしたアンモニアはルーメン壁から吸収され肝でBUNに代謝される．初回のMPTはこのBUNを反映していたと考えられる．
当農家では本事業を数年間継続して受けており飼料給与には細心の注意を払っている．今回の事業実施時においても飼料計算上エネルギー，蛋白質いずれの充足率も

図５

Ｂ農家のルーメン発酵状況

満たしていたので，今回のMPTの結果は採血時間の影
響が強く出た例だと考えられる．日内変動の少ない蛋白代謝指標を用いることが望ましいが経費・手間の問題か
ら複数の項目を一度に検査できる血清は有効に利用すべきである．したがって日内変動の大きいBUNを用いてMPTを行う際は，本グラフを利用して慎重に採血時間− 29 −

広島県獣医学会雑誌を決定すべきであると考えられた．

22（2007）

分解されているかを知ることは必要不可欠であり，さらルーメンという連続発酵槽を持つ反芻動物の飼養管理にそれらのバランスを時間軸にそった動的視点で考えるは複雑である．すなわち，牛体そのものに対する要求量ことも重要なことである．複雑なこれらのことを視覚的のみでなくルーメン微生物に対する要求量も同時に満足にとらえることのできる本報でのグラフ化の方法はきわさせなければならないからである．さらにルーメン微生

めて有用なものであり，現在利用されている飼料計算ソ

物は適正なエネルギーと蛋白質の量的バランスを連続的フトに組み込み本事業に応用することにより，さらに精に求め続けている．これはルーメン発酵を最大にするた

密な飼料設計が可能になると考える．

めには必要なことであり，牛のもつポテンシャルを最大

文限に引き出すための飼養管理には欠かせない考え方である．そのためには飼料のルーメン内分解エネルギー

献１）篠塚康典ら：牛のルーメン発酵状況のグラフ化の試（NFC）とルーメン内分解蛋白質（RDP）がどのように− 30 −み，広島県獣医学会雑誌,21,13‑17（2006）

代謝プロファイルテストにおいてアルブミンの低下が認められた乳牛群の飼養状況とその要因
鈴

木

俊

彦

（受付：平成19年２月８日）

Breeding conditions and factors associated with low serum albumin levels
observed in metabolic profile tests in dairy herds
TOSHIHIKO SUZUKI
Veterinary Clinical Trainning Center, Hiroshima P.F.A.M.A.A.
284-1, Inaki, Takaya-cho, Higashihiroshima, Hiroshima, 739-2106

SUMMARY
We observed low albumin (alb) levels in metabolic profile tests in farms in Hiroshima Prefecture, andsurveyed and analyzed the influences of this decrease on dairy herds and factors causing this decrease
based on data in the management instruction project in 2005. As a result, low alb decreased milk
production and increased the incidences of diseases, injuries, and accidents. To improve these problems
and productivity, the re-evaluation of feed designs and feeding methods and improvement in the cowshedenvironment appropriate for high-level milk production may be necessary in many dairy farms.

要約近年，広島県内の農家を対象とした乳牛の代謝プロファイルテストにおいて低下傾向がみられるアルブミン(以下alb)の牛群に及ぼす影響と要因について，平成17年度の管理指導事業のデー
タを元に調査，分析した．その結果，低albは乳量の低下や病傷事故の増加につながり，それを改善し生産性を向上させるためには，多くの酪農家で，飼料設計・飼料給与方法の見直しと高泌乳化に適応した畜舎環境の整備が必要であると思われた．

序

文

材料および方法

３種類の主要な血漿タンパク質のうち，最も高濃度に１．調査期間存在するalbは肝臓で合成され，微量元素や脂肪酸などを体組織に運搬する重要な役割を果たしている．近年，2005年５月19日〜2006年１月30日
２．調査対象

広島県内の酪農家を対象とした乳牛の代謝プロファイル

県内酪農家53戸で飼養されている乳牛，延べ1,334頭

テストにおいてalbは低下傾向がみられ，それらの牛群

延べ69件の代謝プロファイルテストと各酪農家の飼料給では繁殖障害をはじめ病傷事故が多発する傾向にある．

与の調査，畜舎環境のチェック，および疾病に関するア

そこで特に分娩後から泌乳最盛期にかけてalbの低下がンケート認められた乳牛群の飼養状況とその低下要因について，
代謝プロファイルテストを用いた管理指導事業のデータを元に調査，分析したのでその概要を報告する．
広島県農業共済組合連合会家畜臨床研修所（〒739‑2106

広島県東広島市高屋町稲木284‑1）− 31 −

広島県獣医学会雑誌

成22（2007）績

低albを示した牛群は69件中19件，標準レベルにあった牛群は15件で，そのほかの牛群においてもalbの低下傾向がみられた．アンケート調査の結果，albが標準レ
ベルの農家では繁殖障害が多いと回答のあった割合は87％であり，低albの場合95％であった（図１）．肢蹄疾患
については，多いと回答のあった割合は標準レベルでは
わずか７％であるが，低albの場合36％にものぼった（図図３アンケート調査の結果，乳房炎の比較

２）．乳房炎は標準レベルの20％に対し低albでは42％（図３），周産期疾病は標準レベルの20％に対し，低albでは58％であった（図４）．乳牛１頭の１日当たりの泌乳量

図４

アンケート調査の結果，周産期疾病の比較

図１

アンケート調査の結果，繁殖障害の比較

図２

アンケート調査の結果，肢蹄疾患の比較

図５

図６

給与飼料の比較，CP− 32 −

低アルブミンと他のMPT項目との関係

広島県獣医学会雑誌

図７

22（2007）

給与飼料の比較，TDNを比較すると，標準レベルの牛群では32kgであり，低肉組織や角質の形成に悪影響を及ぼしているためと思わ

alb牛群では28kgであった．低alb牛群において他の代謝れた．さらにalbの低下による栄養状態の悪化は繁殖障

プロファイルテスト項目との関連性を調査した結果，同害や周産期疾病など，諸疾病の発生要因にもつながって時に，血糖の低下が見られたものは19件中９件，BUN

いるものと考えられた．また，低albを示した酪農家のの低下が見られたものは10件，BUNの上昇は２件，γ半数前後が同時に低血糖，低BUN，低Mgあるいは高γ

GTPの上昇は11件，Mgの低下は８件，血糖・BUN・alb

GTPを示したことから，その原因としては，栄養不足，ともに低下が見られたものが３件であった．
（図５ｙ）．

乾物摂取不足，第一胃の発酵不良，肝機能の低下などに給与飼料の栄養度を比較した結果，CPの濃度は標準

関連する飼養管理上の問題が考えられた．栄養不足に陥レベルの16.2％に対し低alb牛群は15.5％で，同時に低る要因の１つとして不適切な飼料設計が考えられ，血糖を示した牛群15.2％，低BUNを示した牛群15.5％，

TDN・CP％はその充足率とも標準レベルの農家を下回

低Mgを示した牛群は14.6％であった．CP充足率は 標るケースが大半であった．泌乳能力の増大した最近の乳準レベルの88.5％に対し，低alb牛群では82.5％であっ牛にとって従来のエサは栄養不足となり，能力を出し切た（図６）．TDNの濃度は標準レベルの75.7％に対し低れずに低泌乳を呈し，繁殖障害や肢蹄疾患などの疾病は

alb牛群は74.0％で，充足率は標準レベルの99.8％に対増加する傾向にあるものと思われた．また，乾物摂取量

し，低alb牛群では95.0％であった（図７）．

の低下要因としては，飼料給与量の不足以外に乾乳牛の考管理不足や飼槽・牛床・飲水施設など畜舎環境の不備も察考えられ，第一胃の発酵不良を招く要因として，繊維の代謝プロファイルテストにおいて牛群に低albが認められた酪農家は，アンケート調査の結果，繁殖障害，肢給与不足や飼料の不適切な給与順序なども見受けられた．

蹄疾患，乳房炎，周産期疾病のすべての項目に対して，以上のことから，低albを改善し生産性を向上させる

標準レベルの農家よりも強い問題意識を抱えているケー

ためには，多くの酪農家で，飼料設計・飼料給与法の見スが多くみられた．その中でも特に肢蹄疾患で悩んでい直しと高泌乳化に適応した畜舎環境の整備が必要である

る農家が標準レベルの７％に対し，低alb牛群では36％と思われた．

と両者に大きな開きがみられた．これはalbの低下が筋− 33 −

認定小規模食鳥処理施設における衛生対策に関する検討
東久保

靖

伊坪堅香子

土井

章三

（受付：平成19年１月21日）

Study on sanitary control in small-scale poultry processing plants
YASUSHI TOUKUBO，TAKAKO ITUBO，SHOUSOU DOI
Hiroshima Prefectural Meat Sanitation Inspection Station
1911-1, Awaya-cho, Miyoshi, Hiroshima 728-0025

SUMMARY
Between June and July, 2006, we performed a survey of the sanitary state in a certified small-scale
poultry processing plant (T plant). Carcasses after defeathering, cooling, towel wiping for the removal ofmoisture, and dismembering, instruments, and workers’ fingers were wiped, and the standard plate count(SPC), total coliform count (cf), and the Staphylococcus aureus cell count (S. aureus count) were
examined. After sanitary education, carcasses were wiped after towel wiping and dismembering, and asurvey after the practice of sanitary measures was performed. The sanitary state survey in the plant showeda detection in each bacteria count after defeathering, a decrease in the bacteria count after cooling, but anincrease after towel wiping, and a further increase after dismembering.

From the fingers of adismembering worker, many S. aureus cells were detected irrespective of before or during work. The
survey after the practice of sanitary measures showed slight decreases in SPC and cf after towel wiping anddismembering, but a marked decrease in S. aureus after each process. These results suggest that work
using bare hands is the main cause of contamination after cooling. In addition, secondary contamination
may extend due to the use of towels contaminated by bacteria on the fingers and their inadequate
washing/disinfection. We provided sanitary education in these suggested causes, and took measures. As aresult, the S. aureus count markedly decreased.

要約

平成18年６月から７月の間に，Ｔ認定小規模食鳥処理施設において，脱羽後，冷却後，水分除去のためのタオル清拭後（清拭後），解体後のと体，器具及び従事者手指を拭き取り，一般生菌数（SPC），大腸菌群数（cf），黄色ブドウ球菌数（ブ菌）について施設の衛生状況調査を行った．
また，衛生教育実施後に，清拭後，解体後のと体を拭き取り，衛生対策実施後調査を行った．
施設の衛生状況調査では，各菌種とも脱羽後には検出され，冷却後には減少するが，清拭後には再び増加し，解体後にはさらに高くなった．器具及び従事者手指のうち，解体者手指は作業前・中にかかわらず，ブ菌が多数検出された．ゴム手袋着用等の衛生対策実施後調査では，清拭後及
び解体後のSPC，cfはやや減少した程度であったが，ブ菌はどちらも著しく減少した．
これらのことから，今回の調査では，素手での作業が冷却後の汚染の最も大きな原因と推測された．さらに，手指から汚染を受けたタオルの使用，及び，その不十分な洗浄消毒によって二次汚染が拡大していくものと考えられた．これらの推測された原因について，衛生教育を実施し対策を行ったことによって，ブ菌については顕著な改善効果がみられた．

広島県食肉衛生検査所（〒728‑0025

広島県三次市粟屋町1911‑１）− 56 −

広島県獣医学会雑誌

序22（2007）

で，脱羽後1.2×102/cm2，冷却後1.7×101/cm2，清拭

文

後2.4×101/cm2，解体後1.9×102/cm2であった．脱羽

近年，BSE，鳥インフルエンザなどの発生に伴い，消後に検出されていたSPCは，冷却後には減少するが，費者の食に対する関心が高まり，安全･安心な食肉の提清拭後には再び増加し，解体後には最も高くなった（図供が重要な課題となっている．食鳥肉に関しては，平成２）．

４年４月に食鳥検査が始まり，安全の確保と同時に「食１）
鳥処理場におけるHACCP方式による衛生管理指針」も通知されて，衛生管理の徹底が図られているところである．
しかし，食鳥処理施設のうち，特に，認定小規模処理施設においては，施設や従事者の衛生意識の問題もあり，
微生物コントロールなどの衛生管理の向上は容易でない
現状にある．
今回，従事者の衛生意識が比較的高く，衛生状態も良好な，管内のある認定小規模処理施設から，食鳥肉の自主検査で黄色ブドウ球菌が検出されるため，その対策について相談があった．そこで，その対策の指導，及び，他の認定小規模処理施設への衛生指導の参考とするために，当該施設の各処理工程における衛生状況を調査し，衛生対策の改善への取り組みを行ったので報告する．

材料及び方法
調査期間：平成18年６月〜７月
調査対象施設：Ｔ認定小規模食鳥処理施設（平成図１

12年11月許可）

当該施設の食鳥処理工程及び採材ポイント

ア．処理形態：生鳥からのと鳥，外剥ぎ方法による解体処理（手作業）イ．処理羽数：シ ャ モ 地 鶏 （150 日 齢， 自 家 飼 育）
50〜120羽／日／週３回
ウ．従事者数：３名（うち食鳥処理衛生管理者２名）
調査検体
ア．施設の衛生状況調査（図１）
処理工程における脱羽後，冷却後，水分除去のためのタオル清拭後（清拭後），外剥ぎ解体後（解体後）のと体胸部拭き取り検体各３〜15検体の計72検体，器具（まな板，ナイフ）及び従事者手指の拭き取り検体
各１〜３検体の計17検体

図２

各処理工程における一般生菌数

図３

各処理工程における大腸菌群数

イ．衛生対策実施後調査処理工程におけるタオル清拭後，解体後のと体胸部拭き取り検体各10〜25検体の計35検体
検査項目：一般生菌数（SPC），大腸菌群数（cf），
黄色ブドウ球菌数（ブ菌）検査方法：「食鳥処理場におけるHACCP方式による衛生管理指針」１）及び「食品衛生検査２）に準じて実施した．
指針」

結

果

施設の衛生状況調査結果
ア．と体（図２，３，４）
各処理工程別のSPCは，それぞれ中央値（図中＊）− 57 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

ついて改善が行われた．
ア．ゴム手袋の着用
イ．手洗いの励行
ウ．と体清拭用，解体処理用タオル及び器具の消毒の徹底（温湯による有機物洗浄後の消毒）
エ．使用枚数の増加によるタオルの頻繁な交換の実施
オ．本冷却槽における次亜塩素酸Na濃度の管理徹底
衛生対策実施後調査結果（図２，３，４）
SPCは，清拭後では中央値で，改善前2.4×101/cm2，
改善後1.4×101/cm2，解体後では改善前1.9×10２/cm2，
図４

改善後2.2×102/cm2であった．清拭後のSPCは，改善に各処理工程における黄色ブドウ球菌数より減少したが，解体後のSPCは中央値では改善後にも各処理工程別のcfは，それぞれ中央値で，脱羽後やや増加した．しかし，解体後の改善前後における全体

8.0×10‑１ /cm2，冷却後陰性，清拭後陰性，解体後のデータの傾向をみると，改善後にはやや減少していた‑1

6.0×10 /cm2であった．脱羽後に検出されていたcfは，（図２）．
cfは，清拭後では中央値で，改善前陰性，改善後陰性，

冷却後，清拭後にはほとんど検出されなくなるが，解解体後では改善前6.0×10−１ /cm2，改善後4.0×10−１ /体後には再び検出されるようになった（図３）．
各処理工程別のブ菌は，それぞれ中央値で，脱羽後cm2 であった．清拭後のcfは，元々の菌数がほとんど検1.4×100 /cm2，冷却後陰性，清拭後4.0×10０ /cm2，

出されていないためあまり変動はなかったが，解体後の解体後1.2×10１ /cm2 であった．脱羽後に検出されてcfは改善によりやや減少した（図３）．

いたブ菌は，冷却後にほとんど検出されなくなるが，ブ菌は，清拭後では中央値で，改善前4.0×10０/cm2，

清拭後には再び増加し，解体後には最も高くなった．

改善後陰性，解体後では改善前1.2×10１ /cm2，改善後

なお，検出されたブ菌は，全てエンテロトキシン陰性

陰性であった．清拭後及び解体後のブ菌は，いずれも改型であった（図４）．

であり，コアグラーゼ型

善により著しく減少した（図４）．

イ．器具及び従事者手指（表１）

考表１よりSPCは，器具，手指，作業前・中にかかわらず，ほぼ102 〜103 /cm2であった．cfは，作業前手指‑１

察

今回の調査対象施設は，管内の認定小規模処理施設の/cm2 程度

中でも，従事者の衛生意識が比較的高く，衛生状態のかであった．ブ菌は，器具では101 /cm2 程度であり，内なり良好な施設である．今回のSPCの結果を，HACCP

では陰性であり，他拭き取り場所でも10程度であっの微生物学的目標基準（脱羽後1.0×10４ /cm2 以下，冷た．しかし，解体者手指では作業前・中にかかわらず，

却後及び食鳥肉1.0×10３ /cm2 以下）と比較すると，中SPCとほぼ同数の102〜103/cm2であった．検出された

央値ではいずれも基準を満たしていた．さらに，他者報ブ菌は，と体と同様に全てエンテロトキシン陰性であ告３−８）と比べると，処理施設によって多少のバラツキ

1

臓処理者，整形者の手指でも陰性〜10 /cm2

り，コアグラーゼ型型であった．

はあるが，当該施設では菌数あるいは検出率はいずれの衛生教育の実施及び衛生対策における改善点

処理工程，菌種でも概ね低い傾向にあった．

の衛生状況調査結果に基づいて，HACCP方式によま た， 当 該 施 設 で は， 脱 羽 後 の 汚 染 状 況 は 他 者 報る自主衛生管理の導入推進を含めた衛生教育を，従事者

告３−８）と比べてそれほど高くなく，これは生鳥搬入時全員に対して実施した．それによって，主に次の項目にの病鳥，汚染鳥排除や餌切りなどの生鳥管理，及び，糞表１ 器具及び従事者手指における一般生菌数，大腸菌群数及び黄色ブドウ球菌数
一般生菌数（CFU/cm2）

検 体

検体数 ＜10

10

大腸菌群数（CFU/cm2）

102

103

検体数 （‑） ＜1

処理まな板

3

2

1

3

処理ナイフ

3

2

1

3

作業前

2

1

1

2

作業中

3

1

2

3

手指
手指
手指

解体処理者
内臓処理者
整形処理者

作業前

1

作業中

2

1

作業前

1

1

作業中

2

1

1
1

2

− 58 −

10

102

103

2

1

1

2

2

検体数 （‑） ＜10

10

3

2

2

1

2

2

2
3
1

2
1

2

2

1

黄色ブドウ球菌数（CFU/cm2）

1
1

1

1

1

2

1

1
2

2

1
1
2

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

絞りによると体への糞便汚染の防止が徹底されているこ由来である可能性が高いと推測された．さらに，養鶏場とによると思われた．脱羽後の汚染は，次亜塩素酸Na

あるいは処理施設内では，生鳥，と体，器具及び従事者を添加した冷却槽での冷却後にはほとんど検出されなくの間でブ菌による汚染が循環しているとも推測された．

４，５）なっている．これらは，他者報告を追認するものであり，生鳥から脱羽，冷却工程までの衛生管理が比較

これらからも，生鳥段階からの総合的な衛生管理の必要性が示唆された．
一方で，今回の調査及び衛生教育の実施により，従事的コントロールできているものと考えられた．
今回の調査では，冷却後のタオル清拭及び解体処理に者自身が当該施設の具体的な衛生状況及び推測される汚より，菌数は脱羽後より増加している．これは，次亜塩

染源の把握を行うことができ，従事者の衛生意識の向上

素酸Na添加の冷却工程により減少した細菌汚染が，そがみられた．また，細菌汚染や，次亜塩素酸Naを使用の後の処理工程により増加していくという他者報すれば完璧な消毒が可能であるといった，いわゆる， 次告５−７）を追認するものであった．また，器具及び従事

亜塩神話 などの誤りを理解し，正しい知識の習得がな

者手指の調査により，解体処理従事者の手指は作業前かされたものと思われた．さらに，今回の衛生教育で得たらSPCと同程度の多数のブ菌が検出され，重度の手荒れ

衛生管理の手法について，可能な部分から導入していこ状態であった．

うという前向きな姿勢が窺えた．

このことから，素手での作業が冷却後の汚染の最も大なお，今回は，当該施設での自主検査が陰性であったきな原因と推測された．さらに，手指から汚染を受けたこともあり，食鳥肉の衛生管理で重要なサルモネラ及び清拭用及び解体処理用タオル，器具の使用，及び，そのカンピロバクターの調査は実施していない．糞便汚染が不十分な洗浄消毒によって二次汚染が拡大していくもの

これらの食中毒起因菌の主要な汚染源と考えれば，当該とも考えられた．

施設のSPCやcfのデータは良好で，汚染の程度はかなり一方で，冷却後には消毒工程がないことから，工程が低いものと考えられた．しかし，これらに対しても，衛進んでいくにつれて汚染が蓄積，拡大していくものとも

生状況調査及び衛生対策を検討する必要があると思われ考えられた．

た．

これらの推測された原因について，衛生教育を実施しまた，当該施設において，HACCP方式による自主衛対策を行ったことによって，全ての菌種である程度の改生管理の導入を試みたが，時間的制約やコスト面などで善効果がみられた．特に，ブ菌については，改善前後で導入までには至らなかったことから，引き続き導入に向は危険率５％で有意差が認められたことから，顕著な改けての取り組みを指導していく必要があると思われた．
今後は，今回の調査結果を参考として，他の認定小規

善効果がみられたものと考えられた．
SPCやcfについては，当該施設の衛生管理が良好で

模処理施設への衛生講習会の開催，当該施設への見学の

元々の菌数が低く抑えられていることから，あまり改善

推奨及びHACCP方式による自主衛生管理の導入推進な効果がみられなかったものと考えられた．

どの衛生指導を検討し実施していきたい．

ブ菌については，今回の汚染原因の推測及び改善策が文適切であったことが示唆された．しかし，素手よりも手袋の方の汚染度が高くなるという報告

８）もあることか

１）厚生省生活衛生局乳肉衛生課編：食鳥処理場におけるHACCP方式による衛生管理指針（1993）

ら，陰性，あるいは，より菌数の減少を目指すためには，手袋使用時の頻回の洗浄消毒，交換，さらには，生鳥段

２）厚生労働省：食品衛生検査指針（微生物編），社団

階からの総合的な衛生管理なども必要であると考えられた．

献

法人日本食品衛生協会，東京（2004）
３）永田祥代ら：認定小規模食鳥処理場の拭き取り検査

また，鶏の生鳥及びと体から分離されるブ菌は，鶏特結果に基づく衛生指導について，平成16年度食鳥肉有と考えられているコアグラーゼ型 型が多く，エンテ

衛生技術研修会・衛生発表会資料，42〜44（2005）

ロトキシンも陰性が多い

９）．一方，ヒトの食中毒事例

から分離されるブ菌は，コアグラーゼ型

４）桑折通房ら：腸管損傷が及ぼす食鳥と体表面の細菌， ， ，数の動向について，平成12年度食鳥肉衛生技術研修型が多く，エンテロトキシンもＡ型産生菌が比較的多
10)

い ．

会・衛生発表会資料，90〜92（2001）
５）片山正彦：食鳥処理方法別衛生実態調査について，

これらのことから，今回分離されたブ菌は全てエンテ

平成７年度全国食品衛生監視員研修会研究発表等抄

ロトキシン陰性であるため，直接食中毒の原因となる可能性は低いと考えられた．

録，62〜65（1996）
６）清水俊夫ら：食鳥処理・加工ラインにおける衛生上

また，当該施設では，生鳥を飼養しており，その飼養の問題点―と体及び部分肉の滞留について―，平成

管理を処理従事者が行っている．従って，元々の汚染源

５年度全国食品衛生監視員研修会研究発表抄録，を特定するのは容易でないが，分離されたブ菌が全てコ
アグラーゼ型

型であることから，全て同一由来でヒト

67〜70（1994）
７）安藤美保ら：小規模食鳥処理施設の衛生対策につい− 59 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）て―丸と体解体のための交差汚染防止マニュアルの

９）新 井 孝 典 ら ： 食 鳥 処 理 場 に お け るStaphylococcus

作成について―，食品衛生研究，52，75〜81（2002）

aureusの汚染状況と分離株の性状，日獣会誌，57，

８）中原賢一ら：認定小規模食鳥処理場のHACCP方式
導入における基礎調査，平成８年度全国食品衛生監

460〜464（2004）
10）寺山武：新訂食水系感染症と細菌性食中毒，坂崎利

視員研修会研究発表等抄録，267〜268（1997）

一編，454〜472，中央法規出版，東京（2000）− 60 −

中小規模学校給食施設における衛生指導について〜特にドライ運用について〜
矢野美奈子
永田
猛

新元
向井

芳彦
健

小田真紀子
山本 一夫

（受付：平成19年１月29日）

Hygiene guidance in small- and medium-scale schools providing meals―Dry use of the wet system―

MINAKO YANO, YOSHIHIKO SHINMOTO, ODA MAKIKO,
TAKESHI NAGATA, KEN MUKAI, KAZUO YAMAMOTO
Bihoku Regional Health Center Hiroshima Prefecture
4-6-1, Tohkaichi-higashi, Miyoshi, Hiroshima 728-0013

SUMMARY
In A city within our jurisdiction, the provision of school meals was entrusted to a private enterprise, andcooks were replaced by new employees. Since this change raised concern about possible poor hygiene
management, we repeatedly gave instructions to this institution, particularly regarding the dry use of thewet system, and obtained some findings.
Continuous surveillance was performed, instructions and training courses were given, and food stamps
were distributed to promote voluntary examination. Surveillance was performed again, and kitchens wereclassified into those showing or not showing improvement, and instructions were given again. Kitchens inwhich workers misunderstood the dry system and did not clean the floor, showed improvement andmaintained a hygienic state. In kitchens without improvement, since severe contamination was confirmed,
instructions were given.
We attempted to increase hygiene knowledge by promoting voluntary examination, but this attempt
sometimes had reverse effects. Though the introduction of the dry system has been advanced, cleaning is
not performed due to misunderstandings in many institutions. Hygiene guidance that is more easily
understood is necessary in the future.

要

約

管内Ａ市で学校給食業務が民間会社に委託され，調理従事者が新規採用者に交代となった．衛生管理不良が懸念されため，重点的に指導等を重ね，特にウェットシステムのドライ運用について指導を行い，若干の知見を得たので報告する．
継続監視を実施し，指導および講習会を実施し，フードスタンプを配布して自主検査を促した．
再度監視を行い改善された調理場と改善のみられなかった調理場を選び，再度指導を行った．ドライシステムを誤解し，床掃除をしていなかった調理場は，改善により衛生的に保たれていることが確認できた．改善がみられなかった調理場では重度の汚染が確認されたため，指導を行った．
自主検査により，衛生知識の高揚を図ったが，却ってって逆効果を招くこともあり得ることが明らかになった．ドライシステムの導入が進められているが，誤解から清掃をしないという施設も多く，今後さらに理解しやすい指導の必要性を感じた．
広島県備北地域保健所（〒728‑0013

広島県三次市十日市東４−６−１）− 61 −

広島県獣医学会雑誌

序22（2007）

文

成管内Ａ市では,学校給食調理業務が指定管理者制度に

１．Ｃ施設の場合

基づき,平成16年度から民間会社Ｂ社に委託された．それに伴い，調理従事者が調理経験のない新規採用者に交そこで当所では，大量調理施設衛生管理マニュアルに基づき重点的に監視や衛生講習会等の指導を重ねてきた．今回，特にウェットシステムのドライ運用について指導を行い，若干の知見を得たので，そのうちの代表的

調理作業用エプロンの衛生的な保管を行うこと．
洗浄室用長靴のまま調理室を歩かないこと．
その他，手洗い，そ族昆虫駆除，器具の消毒等
２）聞取り調査結果

指導および調査方法

指導を受け，週１回の床掃除を行っていたが，期間自主検査により，床および壁が非常に汚染されて平成17年４月〜平成18年７月

いることが確認されたため,毎日作業終了後に床

対象施設をブラッシングし，壁の拭き掃除と次亜塩素酸Ｎ

１） Ｃ学校給食共同調理場
食数等

４校へ配送

調理従事者数３名

ａによる消毒を行うように改善した．
165食

エプロンは毎日洗浄し，壁から離れた場所にエプロン掛けを設置した．

ウェットシステムのドライ運用を実施

洗浄室用長靴は，洗浄室でのみ使用するよう，

２） Ｄ学校給食調理場

履き替えを徹底した．

食数等

単独調理

調理従事者数７名

460食

調理作業中は，完全に床をドライに保つよう，
シンクのふちまで水を溜めない，野菜の水冷をシウェット方式
３

床掃除を全く行っていないので，作業終了後にについて．

な２施設について報告する．

２１）継続監視での指導事項
清掃をすること．

代となり，食品の取扱い不良等が懸念された．

１

績ンク内で行うなど，作業に工夫を加えた．

指導方法

３）フードスタンプでの検査結果

１）平成17年４月〜６月，Ａ市内学校給食施設に対検査結果は，表１に示すとおりであった．毎日の清し，調理開始から盛り付けまでの作業工程に立ち会い，掃により，床の汚染は除去されており，衛生的な状態監視を実施した（以下「継続監視」という．
）．また，が保たれていることが確認された．また，調理用靴のその監視結果をもって，学校栄養士，調理従事者，教底も生菌数は少なく，衛生的な状態が毎日維持されて育委員会担当者およびＢ社担当者の４者同席の上で，いることが推定された．ただ，意外な盲点として，ア

改善指導および衛生講習を実施した．

ルコールスプレー式自動消毒器の内側や，手洗い前面

２） 平 成 17 年 ７ 月、 フ ー ド ス タ ン プ ｛標 準 寒 天の壁の汚染などが確認された．

（SMA）生菌数用「ニッスイ」｝を配布し，自主検査

表１による取扱い等の自主改善を指導した．
３）平成18年５月，監視指導を行い，指示事項の改善確認を行うとともに，学校栄養士および調理従事者に，自主検査の結果による改善事項について聞き取り調査を行った．
４）平成18年６〜７月，指示事項のうち，床等の管理方法について改善がなされていたＣ施設と，改善がみられなかったＤ施設の２施設を選び，フードスタンプを用いて施設内等の検査を食品衛生監視員が行い，持ち帰って24時間36℃培養後判定した．なお，コロニー数により０を−（汚染なし），１〜９を±（ごくわずかに汚染），10〜29を＋（軽度に汚染），30〜99を＋＋

Ｃ施設簡易検査結果
結果

床（下処理作業後）

＋＋

下処理室

拭取り場所
調理室

床

＋

調理室

床

−

保管ラック最下段±

調理室用靴の底

＋

作業台上

±

作業台上

±

配送車内

床

−

手洗い前面の壁＋＋＋

アルコール消毒器内側側面＋＋＋（中等度に汚染），100以上を＋＋＋（重度に汚染）と以上の事項について，検査結果を基に学校栄養士，

した．検査結果およびコロニーの写真を持参し，学校

調理従事者全員に説明を行ったところ，「毎日の掃除

栄養士および調理従事者に検査結果を説明するとともは大変だと思っていたが，有効性が確認でき，さらにに，再度改善指示を行った．

意欲が湧いた．また，汚染が確認された消毒器等につ

５）平成18年７月，管理方法の改善状況確認を行った．

いても今後は清掃する」との回答を得た．清掃だけで− 62 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）以上について，検査結果を基に学校栄養士，調理従

なく，今後は手洗い等にも充分留意し，さらに二次汚染防止に努めるよう指導した．

事者全員に説明を行ったところ，床の汚染の重大性に

４）改善状況確認

気付き，汚染が配膳台まで拡散していた事実を確認し清掃が徹底され，衛生状態が改善されていることをた．今後は床をぬらさないように工夫し，作業後の清確認した．

掃にも努めるとの回答を得た．また，作業工程を改善

２．Ｄ施設の場合

し，作業台の洗浄，器具の洗浄を作業終了後に行うこ

１）継続監視での指導事項ととした．併せて手洗い等を実施し二次汚染の要因を作業中に前掛けに水をかけて洗浄しないこと．

なくすよう指導した．

ドライ用ザル置きに水をかけ水冷し，水があふ

４）改善状況確認

れているので，床をぬらさないこと．

ざるに水受けを設ける等，床をぬらさない作業を作業中に調理台の洗浄を行い，ホースで水をか行っていた．また，清潔作業時は長靴を履くことをや

けないこと．

め，調理用靴と布エプロンで作業することにより，水調理作業と器具洗浄作業を直近で平行して行わを流さないように改善されていた．調査時には、調理ないこと．また，床の上でホースを用いて洗浄し中の床はドライに保たれており，調理場の湿度も改善ないこと．

前の80％以上から５％程度低下していることが確認さ

その他，手洗い，そ族昆虫駆除，器具の消毒等れた．

について指導．

調理従事者からは，作業が楽になり，もっと早く試

２）聞取り調査結果

みれば良かったとの意見があった．

夏休み期間の大掃除後に，自主検査を行ったた

考

め汚染は確認できず，今まで通りで大丈夫である察

Ａ市内の学校給食施設において給食調理従事者が全員と思い，特に作業等に変更は加えなかった．
配間缶時のエプロンを布製にしたが，他はゴム製エプロンで，水をかけている．

入れ替わるという事態に対し，当所では立入り検査を始め，衛生講習会を繰り返すなど対応してきた．そして，器具洗浄用シンクを決めたが，作業を平行して

フードスタンプによる自主検査などにより，衛生的な知行っており，ホースをつないで床の上で洗浄を識が深まるものと期待していた．その結果，多くの施設行っている．

においては身近な汚染に気付き何らかの改善を行ってい

履物の履き替えがない．

たが，Ｄ施設においては，却って逆効果を招く結果となっ作業中も作業台の水洗を行っている．

た．フードスタンプの活用方法について，相手方に配布

３）フードスタンプでの検査結果するのみでは，このような逆効果も有り得るということ

検査結果は，表２のとおりであった．床は調理場のが判明し，今後の活用方法についての参考となった．今どの部分でも重度に汚染されており，床の水が流れる

回，調理作業中に食品衛生監視員が検査を行い，結果をことや，靴底によって汚染が調理場内すべてに拡散し写真で見ながら詳しく説明したことにより，清掃作業のていることが示唆された．床清掃も週に１回程度しか大切さが確認でき，Ｄ施設の調理従事者の考え方を変え行っておらず，はね水等による二次汚染が危惧された．

ることができた．その後は，ドライ運用にも積極的に取配缶を行う配膳台と調理台は，水洗をしていても中等り組むようになった．

度の汚染が確認され，やはりはね水等による汚染が考えられた．

ウェットシステムでは，はね水等による二次汚染，調理場内湿度の増大などの問題があり，近年，ドライシス
テムの導入がすすめられている．小沼ら１）の報告による

表２ Ｄ施設簡易検査結果
拭取り場所と，乾燥状態であっても有機物が残存している場合には，結果

細菌は長時間生残する．しかし，実際の調理現場では，

調理場

床

＋＋＋

吉田ら２）の報告にもあるように，ドライだから床洗浄を

調理場

床

＋＋＋

行わなくてもよいという認識の施設が多い．Ｃ施設におホースの手で握る部分＋＋＋

いても，ドライシステムの誤解から清掃がなされていな

作業台上

＋＋

かったが，今回の指導により，毎日の床洗浄の必要性を

配膳台上

＋＋

認識し，清掃作業にさらに積極的となった．

扇風機前面

＋＋＋

今後は，この結果を講習会等を通じて広め，清掃作業

手洗い背面

壁

±

の重要性についてさらに指導していきたい．また，今回

保管ラック

中段

±

はフードスタンプを用いて，調理従事者に対する視覚に±訴えた具体的な指導の有効性を確認できた．今後は，リ＋＋＋アルタイムで汚染度が判明するATP測定器等についても冷凍庫取っ手調理従事者手洗い後

親指− 63 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

使用を検討し，より理解しやすい指導を行っていきたい．

事業

参 考 文 献２）吉田まどか１）小沼博隆病原微生物データ分析実験作業成果報告書（2003）
田村有美

中野みずほ「学校給食施設

土屋禎「栄養分の有無ならびに湿潤・乾における床洗浄の実態とその必要性の検討」平成17燥環境下における病原菌の挙動に関する研究」平成年度全国食品衛生監視員研修会研究発表等抄録165

15年度農林水産省食品製造工程管理情報高度化促進−166（2005）− 64 −

広島県内における実験動物施設の現状について
大原佳世子
池庄司 剛

柳本 慎治
川西 秀則

久保田早苗
高橋 峰雄

松田

政明

（受付：平成19年１月31）

Present status of laboratory animal facilities in Hiroshima Prefecture
KAYOKO OHARA, SHINJI YANAGIMOTO, SANAE KUBOTA, TSUYOSHI IKESYOJI,
HIDENORI KAWANISHI, MINEO TAKAHASHI, MASAAKI MATSUDA
Hiroshima Prefectural Animal Management and Welfare Center
8915-2, Minamigata, Hongo-cho, Mihara, Hiroshima 729-0413

SUMMARY
To evaluate the present status of laboratory animal facilities, we performed an on-the-spot survey in 5
laboratory animal facilities as administrative organs to evaluate the present status. In all facilities, the careand use of laboratory animals were appropriate, and the 3R principles were also evaluated and observed.
However, there were some institutions where there are no regulations in the facility, or chloroform, whichis toxic to humans, is used for the anesthesia/killing of animals.
We informed the facilities of the results of this survey, thoroughly made the revision of the law known toeach facility, and gave instructions in the care and use of animals according to "Standards relating to thecare and management, etc., of experimental animals" for improvement.

要約

実験動物施設の現状を把握するため，行政機関である実験動物施設５施設に立ち入り，実態を調査したところ，全施設において実験動物の取扱いは適切であり，３Ｒの原則についても，検討，遵守されていると判断された．しかし，動物の管理等について，所内規定等が整備されていない施設があることが明らかとなり，また，人に対して毒性があるとされるクロロホルムを動物の麻酔，処分に使用している施設があった．
今回の調査結果を各施設に通知するとともに，各施設に対して法改正の周知徹底を図り，「飼養保管基準」に従った動物の取扱いについて改善指導した．

序

明記された．

文

これに伴い，「実験動物の飼養及び保管等に関する基「動物の愛護及び管理に関する法律」
（以下，
「動物愛

準」が改定され，実験動物の福祉に係る基本的考え方の護管理法」という．
）が改正され，平成18年６月１日か充実等を盛り込んだ「実験動物の飼養及び保管並びに苦ら施行された．今回の改正では，新たに動物を科学上の痛の軽減に関する基準」（以下「飼養保管基準」という．
）

利用に供する場合等に新たな規定が設けられ，動物を適が制定された．

切に利用することに関する配慮事項として「３Ｒの原則」

これらのことから，当センターでは，実験動物施設の（動物の苦痛の軽減，使用数の削減，代替法の活用）が現状を把握するため，行政機関である実験動物施設に立

広島県動物愛護センター（〒729‑0413

広島県三原市本郷町南方8915−２）− 65 −

広島県獣医学会雑誌

ち入り，実態を調査するとともに，各施設に対して法改22（2007）

５．管理記録正の周知徹底を図り，「飼養保管基準」に従った動物の取扱いについて改善指導したので，その結果を報告する．

１施設において，実験動物の管理状況が記録されていなかった．
管理状況を記録している施設は，実験記録に併せて，

調 査 方 法購入，繁殖，処分状況を記録していた．

１．調査対象：広島県立の実験動物飼養施設５施設

６．飼養施設（表２）２．調査方法：立入調査及び聞取り調査

すべての施設で，動物は動物舎もしくは実験室等の屋

３．実施時期：平成18年６月〜７月

内にケージ等の容器を置いて飼育されていた．

調査結果及び所見

ケージ等については，４施設が動物の飼養専用容器を

１．実験動物の使用状況（表１）

使用しており，専用容器を使用していない１施設におい

ウサギ，ひよこをそれぞれ１施設が使用しており，その他はすべてげっ歯類であった．

ても，容器は衛生状態の維持及び管理が容易で，動物が傷害等を受けるおそれのない構造であり，動物が逸走し実験動物として最も使用されているのはマウスで，５ない構造及び強度は保たれていた．

施設中４施設で使用されていた．

また，動物が，日常的な動作を容易に行うための広さ
及び空間は確保されており，エアコン，照明器具等の設表１ 実験動物の使用状況
動物種

施設
Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ
Ｅ

マウス

置により，適切な温度，湿度，換気，明るさ等を保つことができる構造となっていた．

年間使用数（匹）
1,225

モルモット

表２

実験動物飼養施設

3

ラット

施設

176

マウス

127

マウス

400

ハムスター

20

ウサギ

30

ひよこ

480

ラット

215

マウス

1,644

Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

２．実験動物取扱指針・マニュアル等

Ｅ「飼養保管基準」において，努力規定となっている実

動物種

飼養施設

マウス

ケージ（ポリカーボネート容器，金網蓋）

モルモット ケージ（ステンレス）
ラット

ケージ（ポリカーボネート容器，金網蓋）

マウス

ケージ（ポリカーボネート容器，金網蓋）

マウス

ケージ（ポリカーボネート容器，金網蓋）

ハムスター ケージ（ポリカーボネート容器，金網蓋）
ウサギ

ケージ（ステンレス）

ひよこ

コンテナ（プラスチック），金網蓋

ラット

ケージ（ポリカーボネート容器，金網蓋）

マウス

ケージ（ポリカーボネート容器，金網蓋）

験動物に関する取扱指針・マニュアル等について，制定しているのは１施設のみで，２施設が一部制定しており，

７．入手方法２施設が未制定であった．

４施設が実験動物を実験動物販売業者から購入し，そ一部制定している施設については，より具体的な取扱の内２施設は自家繁殖を併用していた．４施設とも，業指針の制定が必要と思われた．

者からの輸送時は，必要に応じた給餌給水，温度管理が３．管理者の設置なされ，逸走防止措置もとられていた．

実験動物管理者について，取扱指針等で規定している

残りの１施設は，実験動物販売業者から有精卵を購入のは１施設のみであった．

し，施設内で孵化させてひよこを使用していた．

４．職員研修等

８．管理方法

実験実施者研修を実施しているのは２施設であった．
内１施設は，実験開始前に実験動物の専門家から１週すべての施設で実験動物に対する給餌・給水，容器の清掃・消毒は適切に実施されていた．

間程度の研修を受けていた．

複数の実験動物を同一容器内で飼養する場合には，組もう１施設については，職員である実験動物の専門家が常時実験実施者の指導に当たる形をとっていた．

み合わせ，頭数の配慮がなされており，異なる種の実験動物を同一容器で飼育している施設はなかった．

研修未実施の３施設についても，実験動物に関する知

９．健康状態の確認

識及び経験を有するものが実験を実施しており，検査手
技の引継時に，動物の管理方法等を伝達しており，実験すべての施設で，搬入時，および飼養中は健康状態を目視確認しており，２施設で体重計測を行っていた．

実施者に対する必要な教育訓練は実施されているものと考えられた．

健康状態に異常が認められた動物については，全ての施設において速やかに殺処分していた．

− 66 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

10．動物の処分方法（表３）

動物の苦痛の軽減について，２施設で実験の際に麻酔

実験動物の処分方法は頚椎脱臼（２施設），麻酔下でが使用されていた．

の放血殺（３施設），深麻酔殺（４施設）であった．

その他の施設については，実験の内容により，苦痛軽吸入麻酔薬については，クロロホルムを使用している施設が２施設あり，その他はエーテルを使用していた．

減措置が施せないもの，また，その必要がないものであった．

「動物の処分方法に関する指針」において，「処分動また，健康状態に異常が認められた動物については，物の処分方法は，化学的又は物理的方法により，できる

速やかに殺処分するなど，全ての施設について，動物の限り処分動物に苦痛を与えない方法を用いて当該動物を苦痛の軽減に関して配慮がなされていた．

意識の喪失状態にし，心機能又は肺機能を非可逆的に停

13．使用数の削減，代替法の活用

止させる方法によるほか，社会的に容認されている通常の方法によること．」とされている．国際的に広く容認

３施設において実験に際して必要最小限の動物を使用していた．

されているガイドラインによると，殺処分方法として，

２施設において必要最小限数以上の動物を飼養してい麻酔薬の注射，吸入麻酔薬または炭酸ガスの吸入等があたが，その理由は検査体制の整備等であり，業務の実施

り，マウス，ラット等については熟練した者による頚椎上止むを得ないものと思われた．

脱臼も容認されている

１）．

また，実験の性格上，代替はできないとのことであっ今回，２施設で吸入麻酔薬としてクロロホルムを使用た．

していたが，これは人に対して毒性があるとされており，

ま

麻酔薬の変更が必要と思われた．

とめ

処分後の死体の処理については，特別管理廃棄物とし今回，調査対象とした５施設について，立入調査を実て処分している（２施設），一般廃棄物として処分して施したところ，飼養施設，管理方法，輸送方法等に関しいる（２施設），その他の施設に処分を依頼している（１て，実験動物の取扱いは適切であった．
３Ｒの原則についても，各施設で検討・遵守されてい施設）であった．

ると判断された．
表３ 動物種別の処分方法
動物種

しかし，動物の管理等について，「飼養保管基準」に基づいた取扱指針・マニュアル等を制定し，実験動物管

処 分 方 法エーテル深麻酔殺（１），エーテル麻酔下放理者を選定しているのは１施設であり，動物の福祉に対血殺（１），頚椎脱臼（２），クロロホルム深する配慮はなされているものの，所内規定等が整備され麻酔殺（１），クロロホルム麻酔下放血殺（１）エーテル深麻酔殺（１），エーテル麻酔下放ていない施設があることが明らかとなった．

血殺（１），頚椎脱臼（１），るクロロホルムを動物の麻酔・処分に使用しており，実モルモット

クロロホルム麻酔下放血殺（１）験実施者の健康管理の観点から，麻酔薬を変更すべきと

ハムスター

頚椎脱臼（１）

思われた．

ウサギ

キシラジン深麻酔殺（１）

マウス

ラット

ひよこ

また，２施設において，人に対して毒性があるとされ今回の調査結果については，各施設に通知するとともクロロホルム深麻酔殺（１），クロロホルムに，該当する各施設に対して改善指導を行った．

麻酔下放血殺（１）今後，他の実験動物施設に対しても，動物の福祉の保（）内は実施施設数持に努めるとともに，指針等を整備し，「動物愛護管理法」及び「飼養保管基準」を遵守するよう，指導の徹底

11．生活環境の保全を図っていきたいと考えている．

動物飼養施設内はすべての施設において清潔に保たれていた．
また，汚物等は一般廃棄物もしくは特別管理廃棄物と文献して処理されており，周辺環境の汚染は認められなかっ

１）伊井泰行ほか，実験動物の技術と応用

実践編，社

た．

団法人日本実験動物協会編，200〜201，株式会社ア12．動物の苦痛の軽減

ドスリー，東京（2004）− 67 −

広島市と畜場における地方病性牛白血病の抗体保有状況とその発生

大川

育之

阿部

恵子

太田垣

寧

佐伯

幸三

瀬尾

和範

（受付：平成19年１月31日）

Survey on The Prevalence of Antibodies and The Incidence of Enzootic
Bovine Leukosis in The Slaughterhouse in Hiroshima City.
YASUYUKI OKAWA, KEIKO ABE, YASUSHI OTAGAKI, KOUZOU SAIKI and KAZUNORI SEO
Hiroshima City Meat Inspection Office,1-11-1 Kusatsuminato, Nishi-ku, Hiroshima 733-0832

SUMMARY
We surveyed the incidence situation of enzootic bovine leukosis and the prevalence of anti- bovine
leukemia virus (BLV) antibody to the cattle brought in the slaughterhouse in Hiroshima City between April
2005 and August 2006. Among 331 cattle that were surveyed, 112 cases (33.8%) were positive, 8 cases ofthem were diagnosed as enzootic bovine leukosis and disposed. Even as for the cattle from 2 years old andunder, anti-BLV antibody positivity rate was showed the high rate (27.3%), and then it seemed that boththe number of incidence and positivity rate have been on a rise.

要約

平成17年４月から18年８月までに広島市と畜場に搬入された牛について，地方病性牛白血病の発生状況および抗体保有状況を調査した．抗体調査を実施した331頭中，抗体陽性牛は112頭（33.8％）で，このうち本疾患と診断され全廃棄になったものは８頭であった．年齢別にみると，２歳齢以下の牛でも27.3％と高い抗体陽性率を示し，発生頭数，抗体陽性率ともに上昇傾向がう
かがえた．

序

的に感染牛の２〜３％が発症するといわれており３），文発症した牛は 全部廃棄の対象となるため，畜産農家へ

地方病性牛白血病は，牛白血病ウイルス（BLV）によの影響は大きく，BLVの蔓延は重要視されている．近年，

る感染症で，と畜検査現場でも多発性腫瘍などとともに広島市と畜場において，牛白血病又は悪性リンパ腫で全しばしばみられる疾病である．感染様式は節足動物によ

部廃棄となる事例が増加してきた．そこで，今回，広島

る吸血や汚染器具などによる水平伝播，もしくは垂直伝市と畜場における発生状況を整理するとともに，搬入さ播によると考えられている１）．感染牛の多くは不顕性れた牛331頭の抗体保有状況調査を行ったので報告する．

２）

といわれる

が，BLVに感染した牛は抗体が陽転した材料および方法

後も体内から排除されず，持続感染状態となり，病態が進むと感染牛の約30％が，リンパ球増多ないしは持続性

平成17年４月から平成18年８月までに，広島市と畜場

リンパ球増多症を示す．さらに病態が進行すると 最終に病畜として搬入された牛および生体検査で精密検査が広島市食肉衛生検査所（〒733‑0832

広島県広島市西区草津港１‑11‑１）− 68 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

必要と判断し採血を実施した牛，さらに解体後の検査でとんどの症例では，消化管や胸部リンパ節に腫瘍病変を多発性腫瘍を疑いその検査に供した牛，計331頭の血清認めたが（表２），中には心臓と第４胃の小病変のみのについて調査した．

症例も存在した（写真１）．

抗体価の検査は受身赤血球凝集反応法（牛白血病抗体

抗体陽性率を年度別に集計すると，平成17年度は204

アッセイキット「日生研」）により実施した．判定は，頭中，陽性牛が59頭で陽性率は28.9％，平成18年度は測定キットの使用法に従い，定性試験，定量試験および127頭中，陽性牛は53頭で陽性率は41.7％であった．ま

阻止試験を行い，抗体価16倍以上のものを陽性とした．

た，好発年齢といわれる３歳齢４） で区切り，年齢別に成集計すると３歳齢を超えるものでは37.9％であったが，

績

２歳齢以下の牛でも27.3％もの抗体陽性率を示してい検査した牛331頭のうち，抗体価が陽性であったものは112頭，陽性率は33.8％であった．このうち病理学的た．品種別の集計では，ホルスタイン種37.9％，交雑種
26.7％，黒毛和種8.8％であった（表３）．

に牛白血病と診断し，全部廃棄された牛は８頭であった

抗体陽性牛のうち，発症する可能性が高いとされてい（表１）．

る５），抗体価256倍以上のものは全体で46.4％であり，８頭中７頭が心臓に腫瘍病変を認めた．また，その他ほ

２歳齢以下でも，45.7％の牛が256倍以上と，高い抗体価を持つものがみられた（図１）．

表１ 抗体保有状況

地方病性牛白血病発症牛の８頭のうち７頭が512倍以上の高い抗体価を示し（図２），１歳７ヶ月齢という若齢での発症もみられた（表２）．
表３

年齢・品種別抗体保有状況

表２ 発症牛の病変部位

：軽度病変
：重度病変

図１

写真１

第四胃に小さなくるみ大の腫瘤（丸印）が１つ認められるのみ

年齢別抗体陽性頭数

図２− 69 −

抗体価の分布広島県獣医学会雑誌考22（2007）

F1が高い陽性率を示した．ホルスタイン種に関係した察飼養形態や環境などの何らかの要因が関与しているので

牛白血病は，平成10年に届出伝染病に指定されて以来，はないかと考えられた．高橋ら５） の調査では，発症牛

全国的に発生頭数が増加してきているといわれているのほとんどが256倍以上の抗体価を示していたが，今回

３）．平成元年４月から平成18年８月までに広島市と畜私達の調査でも，発症牛の８頭中７頭は，512倍以上の場に搬入され，牛白血病と診断された牛を，年度毎に，高い抗体価を示していた．しかし，128倍で発症した事100万頭あたりの発生頭数に換算し，比較した．平成元

例や，腫瘍病変が数少ない事例，また小病変で見落とし

年度から平成12年度までは，100前後で推移してきたが，やすい事例もみられることから，今後は，牛白血病が増

平成 13年度以降は増加傾向がみられ，平成17年度は加している現状を念頭におき，搬入されると畜の検査の406.1，平成18年度は980.9と，大幅に増加していた（図際には十分注意を払う必要がある．そのため，抗体価の３）．抗体陽性率も，平成17年度と比較すると平成18年

検査結果を，できるだけ生体検査のデータとして活用で度は増加しており，ウイルス汚染の拡大傾向が示唆されきるように検査体制を整備し，地方病性牛白血病の確実た．

な診断の向上に努めていきたい．また，発症牛や抗体陽地方病性牛白血病の好発年齢は，３歳齢以上（特に５
歳齢から８歳齢）といわれている４）．今回の調査でも，発症牛８例中７例が３歳齢以上の牛であった．しかし，性牛などの情報を可能な限り畜産農家現場にフイード
バックし，地方病性牛白血病の減少につなげていければと考えている．

３歳齢以下の若齢での発症牛や高い抗体価を保有する牛文も多く認めたことから，早期での感染が疑われ，年齢に係わらず注意が必要と考えられる．品種別の抗体陽性率

１）小 沼 操 ：BLV伝 播 と そ の 清 浄 化， 臨 床 獣 医， 22は，乳用牛に比べ，肉用牛の方が高いとされている４）．
今回，広島市では，黒毛和種に比べ，ホルスタイン種，

献(3)，15〜19（2004）
２）日本獣医病理学会編：動物病理学各論，第１版83〜
84，文永堂出版，東京（1998）
３）小沼操：BLV感染と病態発現，臨床獣医，22(3)，
10〜14（2004）
４）小山弘之：獣医伝染病学，第３版，104〜106，近代
出版，東京（1992）
５）高橋壮一郎ら：地方病性牛白血病の検出状況と牛白血病ウイルス抗体調査，神奈川県食肉衛生検査所平
成12年度事業概要（2000）

図３

100万頭あたりの発生頭数− 70 −

Clostridium perfringensが分離された牛の壊疽性肝炎の１症例
赤木
山根

雅彦
伸久

仲宗根智彦
田口 和史

玉岡
佐藤

純也
隆司

（受付：平成19年１月31日）

A cow with gangrenous hepatitis from which
Clostridium perfringens was isolated
MASAHIKO AKAGI，TOMOHIKO NAKASONE，JUNYA TAMAOKA，NOBUHISA YAMANE，KAZUFUMI TAGUCHI，and TAKASHI SATO
Fukuyama City Meet Sanitation Inspection Station
1685-1, Nakatsuhara, Miyuki-cho, Fukuyama, Hiroshima 720-0004

SUMMARY
Gangrenous hepatitis was observed in a slaughtered cow that was transported to a slaughterhouse as
general livestock and showed no definite abnormalities in ante-mortem inspection. Therefore, pathologicaland bacteriological examinations were performed. The hepatic lesion slightly bulged on the diaphragmatic
surface and had a putrefactive smell when cut. On the cut surface, there were many cavities varying insize. Histologically, extensive necrosis of hepatic cells, inflammatory cell aggregates, and masses oflarge-sized bacillus cells in the necrotic foci were observed. Bacterial culture of the lesion resulted inisolation of a gram-positive large-sized bacillus, which was identified as Clostridium perfringens byproperty tests. Based on these results, this cow was diagnosed as having gangrenous hepatitis due to
Clostridium perfringens. In this cow, bacterial invasion into the liver via the portal vein and proliferation
were suggested.

要約

と畜場に一般畜として搬入され，生体検査において明瞭な異常を認めず，と畜された牛において壊疽性肝炎が見られた例について，病理学的検査及び細菌学的検査を実施した．肝臓の病変は横隔面においてやや膨隆，切開により腐敗臭を感じ，割面において大小不整形の空洞を多数認めた．組織学的には肝細胞の広範囲の壊死，炎症細胞の集簇，壊死巣における大型桿菌の菌塊を認めた．病変部の細菌培養からグラム陽性の大型桿菌が分離され，性状試験の結果からClostridium
perfringensと同定した．以上の結果から本症例をC. perfringensによる壊疽性肝炎と診断した．本症例は門脈血行路を介した肝臓への菌の侵入，増殖によるものであると推察された．

序

原因となる菌でもあり１），食品衛生上重要な細菌の一文つである．本菌による疾病には菌体外毒素が関与しておClostridium perfringensは，動物の腸管，下水，土壌中
等自然界に広く分布している菌である．また同時に，とり，その多くには浮腫，壊死，ガス産生や出血性病変が見られる１）．

畜場法における検査対象疾病である悪性水腫や食中毒の福山市食肉衛生検査所（720‑0004

広島県福山市御幸町中津原1685−１）− 71 −

今回，管内と畜場に一般畜として搬入され，と畜され広島県獣医学会雑誌

22（2007）

た牛に壊疽性肝炎が見られた．この病変について発生原因を明らかにするため，病理学的検査及び細菌学的検査を実施した結果，若干の知見を得たので報告する．

材料と方法
症例牛は，県内産の20ヶ月齢の交雑種（肉専用種×乳用種）去勢牛で，出荷時の体重は660kg，病歴・治療歴はなく，2006年７月12日に一般畜として搬入された．とさつ解体時に，壊疽性肝炎を確認したため，精密検査を実施した．
病理学的検査は，肝臓・肝リンパ節・小腸・腸間膜リンパ節を10％中性緩衝ホルマリン液で固定し，パラフィ
ン包埋及び薄切後，HE染色，グラム染色（ハッカー・

写真１ 肝臓横隔面コン法），アザン染色，及びメチレンブルー染色を定法どおり実施し，鏡検した．
細菌学的検査は，肝臓病変部の直接塗抹標本にグラム染色を実施し，鏡検した．また，肝臓病変部を血液寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン：トリプチケース
ソイ ５％ヒツジ血液寒天培地）に塗抹し，好気及び嫌気条件下で37℃，48時間培養した．
分離菌について，グラム染色及びメチレンブルー染色を実施し，鏡検した．発育条件及び鏡検像からクロスト
リジウム属菌を疑い，性状試験として，細菌同定検査キット（日本ビオメリュー：API20A）を用いた試験，ブド
ウ糖・乳糖・白糖について糖発酵試験（Phillipsの嫌気２），卵黄反応試験（日水製性菌用血液寒天平板発酵法）

薬：卵黄加カナマイシン不含CW寒天基礎培地，乾燥ウ
写真２ 肝臓病変部割面

エルシュ菌Ａ型抗毒素ろ紙）を実施し，菌種を同定した．

結果

かった．その他の臓器，体幹リンパ節，筋肉には異常を１．生体検査及び解体前検査所見認めなかった．

症例牛は生体検査において，望診等に異常を認めな

３．肝臓の組織学的所見

かった．また，解体前検査において血液等に異常を認め

病変中心部では，肝臓の固有構造がほとんど失われてなかった．

おり，また多くの肝細胞は核を失い，細胞質は均質に染

２．内臓の肉眼所見

色されていた．拡張した類洞に好中球やリンパ球の集簇

肝臓は全体にやや腫大，褪色しており，表面に点状出を認め，一部には赤血球の充満も認められた（写真３）．

血を認めた．胆嚢はやや腫大し，胆嚢壁は肥厚しており，

アザン染色によりグリソン鞘を中心とした結合組織の軽胆汁は黄色を呈していた．肝リンパ節の割面には出血が度の増生が認められた．炎症細胞の集簇した層の内部に認められ，また肝リンパ節周囲の脂肪組織には水腫がみみられる壊死肝細胞は特に淡明に染色され，著しい細胞られた．肝臓の病変は横隔面において，右葉から方形葉の萎縮，変形が認められた．しかしその細胞間には炎症にかけて実質が16cm×18cm程度やや膨隆し，硬度を増細胞はほとんど認められなかったが，黄褐色の色素の沈しており，表面が黄白色から赤色，暗赤色を呈していた着を認めた．また，押しつぶされたような扁平の壊死し（写真１）．病変部を切開すると，腐敗臭が感じられたた細胞で内張りされた大小不整形の空隙が認められたがこの臭気は切開前には認められず，また，切開により（写真４）．これらは少量の赤血球や漿液を容れている

液体の流出は認められなかった．病変部の割面には不潔ものもあったが，ほとんど内容物は認められなかった．

黄白色や黒色を呈する部位全体に大小不整形の空洞を多HE染色，メチレンブルー染色により空隙の周囲に大型数認めた（写真２）．

桿菌の菌塊を多数認めた（写真５）．

肝臓以外の臓器では，小腸炎，大腸炎，脾臓のうっ血，

病変辺縁部では，中心部に比べてグリソン鞘を中心と横隔膜炎が認められた．小腸は漿膜面においてやや赤色した結合組織の増生が多く認められたが，一部に肝臓のを呈していたが，ガスの貯留による膨満は認められな固有構造を保っている部位も認められた．しかし，壊死− 72 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

めた．
４．肝リンパ節，小腸，腸間膜リンパ節の組織学的所見
肝リンパ節は濾胞構造が一部消失しており，出血が認められた．また，肝臓で認められたものと同様の大型桿菌が認められ，その周囲には好中球の集簇を認めた．
小腸は粘膜上皮細胞の脱落や絨毛の萎縮が著しく，粘膜固有層にはリンパ球，陰窩には好中球の集簇が認められた．筋層及びその血管に著変は認められなかった．また，小腸及び腸間膜リンパ節の組織標本において細菌は確認できなかった．
５．細菌学的検査所見
写真３

肝臓

肝臓病変部の直接塗抹標本には，グラム陽性の大型桿

炎症細胞及び赤血球の集簇（HE染色 弱拡大）菌が認められ，一部に芽胞を有するものも見られた（写真６）．また，メチレンブルー染色標本において，莢膜の形成は認められなかった．
肝臓病変部の塗抹による菌分離において，嫌気培養平板のみからα溶血を示すグラム陽性大型桿菌が分離されたが，好気培養平板からは菌は分離されなかった．分離菌は，芽胞や莢膜の形成は認められなかったが，好気条
件では発育せず，以上の性状から偏性嫌気性のクロスト
リジウム属菌であることが疑われた．性状試験の結果は，ブドウ糖発酵（＋），乳糖発酵（＋），白糖発酵（＋），
インドール（−），ゼラチン液化（＋），ウレアーゼ（−），
乳光反応（＋），乾燥ウエルシュ菌抗毒素ろ紙による乳光反応の抑制（＋），真珠層の形成（−）であった．これをクロストリジウム属菌鑑別表２）と比較し，また，好写真４ 肝臓 大小不整形の空隙（HE染色 弱拡大）

気 条 件 下 で は 発 育 し な か っ た こ と か ら 分 離 菌 をC.
perfringensと同定した（表１）．

写真５ 肝臓 空隙周囲の大型桿菌の菌塊（メチレンブルー染色 中拡大及び強拡大）

写真６ 肝臓病変部の直接塗抹標本（グラム染色 ともに強拡大）巣との境界は不明瞭であった．また，病変中心部と同様に拡張した類洞内に炎症細胞の集簇や赤血球の充満が認

６．診断名められたが，それら集簇層の内部の淡明に染色される部

以 上 の 所 見 か ら， 肝 臓 の 壊 死 巣 及 び 空 洞 はC.

位には空隙の形成は認められなかった．この部位には病

perfringensの増殖に伴う毒素やガスの産生によるもので変中心部と同様の大型桿菌の菌塊を多数認めた．

あると推察され，本症例の診断名をC. perfringensによる肝臓の固有構造が保たれている部位でも，グリソン鞘

壊疽性肝炎とした．

を中心とした結合組織の増生が認められた．それらの小葉間静脈内にも病変部と同様の大型桿菌の菌塊を多数認− 73 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

表１ クロストリジウム属菌鑑別表
炭水化物分解
ブドウ糖

乳

糖

卵黄反応
白

糖

インドール

ゼラチン液化

ウレアーゼ

ウエルシュ菌
乳光反応

抗毒素ろ紙に真珠層よる抑制
C. perfringens

＋

＋

＋

−

＋

−

＋

＋

−

C. chauvoei

＋

＋

＋

−

＋

−

−

−

−

C. septicum

＋

＋

−

−

＋

−

−

−

−

C. botulinum

＋

−

＋

−

＋

−

−

−

＋

C. novyi

＋

−

−

−

＋

−

＋

−

＋

C. tetani

−

−

−

＋

＋

−

−

−

−

＋

＋

＋

−

＋

−

＋

＋

−

考

察

分 離 菌

となるとされている１）．この他にもClostridium属菌感染症は，局所の壊死や血行不良等が偏性嫌気生菌である

C. perfringensによる牛の感染症には，悪性水腫，出血

本菌の増殖の促進因子となる３）とされている．しかし，性壊死性腸炎，エンテロトキセミア等が知られてい本症例において寄生虫や中毒等による壊死巣の形成や血１）るが，本症例のように肝臓においてのみ壊疽性病変

行障害等の促進因子を特定することはできなかった．

の見られる症例は報告されていない．C. perfringensは正今後のと畜検査においても類似の症例に遭遇する可能

常な牛の消化管内に分布している菌である．常在微生物性が考えられる．C. perfringensによる感染症では敗血症叢を構成する微生物はしばしば感染の原因となり，本来や毒血症へと進行していく可能性を十分に考慮する必要の存在箇所とは別の箇所に移動すると感染を起こすことがある．生体検査時における発熱，腹痛，下痢，元気消が多い３） とされている．本症例では，小腸において著失，皮下及び筋肉の浮腫等の異常や，解体後検査時におしい粘膜上皮細胞の脱落や絨毛の萎縮が認められ，またける悪臭のあるガスや浸出物の貯留を伴う壊死病巣，点肝臓の小葉間静脈内に菌が認められたことから，本症例状出血等の異常５） に注意し，C. perfringens感染症が疑は門脈血行路を介して肝臓へ菌が侵入したものと推察さわれる場合には適切な病理学的・細菌学的検査を実施れる．しかし，今回の検査では小腸粘膜の塗抹標本の観し，診断を行うよう，本症例から得られた知見を生かし察や，小腸内容物の細菌培養を行っておらず，小腸炎とたと畜検査を行っていきたい．

C. perfringensの関係を断定するには至らなかった．したがって，本症例におけるC. perfringensの小葉間静脈への参 考 文 献侵 入 の 経 緯 に つ い て は 不 明 で あ る． 局 所 に お い てC.

１）明石博臣ほか：獣医微生物学，見上彪編，第４版，

perfringensの増殖が開始すると，各種毒素が産生され周107〜111，文永堂出版，東京（1997）

辺の組織の破壊が起こり，また，菌の増殖による代謝産２）Colman, G. et. al.: Cowan and Steel’ s Manual for the

物としてのガスの貯留が起こり，壊死巣が拡大していIdentification of Medical Bacteria, Barrow, G. I. and

３）とされている．本症例においても，肝臓に侵入しFeltham, R. K. A. editors, 3rd ed., 92〜95, Cambridge

たC. perfringensが増殖する過程において産生される外毒

University Press, New York (1993)：医学細菌同定のく素により肝細胞の広範囲の壊死が起こり，また，ガスの手びき（坂崎利一監訳）近代出版，東京（1993）

産生により肉眼的，組織学的に認められた大小不整形の

３）天児和暢ほか：戸田新細菌学，天児和暢，南嶋洋一

空洞が形成されたと推察される．動物種は異なるが，ブ編，第31版，505〜518，南山堂，東京（1997）

ロイラーの雛においてC. perfringens感染による壊死性肝４）Jun SASAKI, et. al.: Necrotic Hepatitis due to

４）．この症例では肉眼的に著明なClostridium perfringens Infection in Newly Hatched

病理学的変化が認められたのは肝臓だけであり，血行性Broiler Chicks， J. Vet. Med. Sci. 65 (11): 1249〜1251

あるいはリンパ行性の感染であるとされており，今回報(2003)炎が報告されている

告した症例はこれに類似したものであると推察される．

５）明石博臣ほか：獣医伝染病学，清水悠紀臣ほか編，

本症例に類似したClostridium novyiによる伝染性壊死第５版，111〜113，近代出版，東京（1999）

性肝炎では，肝蛭幼虫の寄生による肝細胞の壊死が起因− 74 −

清涼飲料水等に含まれるベンゼンの実態調査について
岩井

徹

西岡

達彦

中島

敏浩

重東

和宏

三宅

伸子

（受付：平成19年２月５日）

Present status survey of benzene contained in beverages such as soft drinks
TORU IWAI, TATSUHIKO NISHIOKA, TOSHIHIRO NAKASHIMA, SHIGETO KADUHIRO, NOBUKO MIYAKE
Fukuyama City Public Health Center
2-11-22, Miyoshi-cho-minami, Fukuyama-shi, Hiroshima 730-8512

SUMMARY
Benzene was detected in some commercially available soft drinks in Japan, and the involvement ofbenzoic and ascorbic acids as additives in these products containing benzene has been suggested. At
present, the mechanism of benzene formation is unclear. We performed a survey of benzene in samples ofsoft drinks and soy sauce containing benzoic acid that were produced by food production companies in thecity. As a result, benzene was detected in a sample containing both benzoic and ascorbic acids and 2
samples containing benzoic acid alone, but not detected in the other 12 samples including 3 containing
both benzoic and ascorbic acids. The samples containing benzene were all soft drinks. In addition, there
was no correlation between the amounts of benzoic acid and benzene. The 3 samples containing benzene
showed relatively high contents of Mg, Mn, Fe, Co, Sr, and Sn.
Since benzene was also detected in samples not containing ascorbic acid, there is a possibility that thecoexistence of reducing organic acids or saccharides causes the reduction of benzoic acid, resulting inbenzene formation.

Benzene formation from benzoic acid may be associated with the complicatedinvolvement of factors such as the presence of reducing substances or heavy metals and the time course.

要約

国内で流通する清涼飲料水からベンゼンが検出された事例が発生し，当該製品に添加された安息香酸およびアスコルビン酸のベンゼンの生成への関与が示唆されている．現時点ではベンゼンの生成機序が明らかにされておらず，市内の食品製造業で製造された安息香酸を使用する清涼飲料水および醤油に含まれるベンゼン等の調査を行った．結果は，安息香酸およびアスコルビン酸の両剤が添加された１検体，安息香酸のみ添加された２検体からベンゼンを検出した．安息香酸
およびアスコルビン酸が添加された３検体を含む12検体からは，ベンゼンは検出されなかった．
ベンゼンを検出した検体は全て清涼飲料水であった．また，安息香酸とベンゼンの検出量に相関は見られなかった．ベンゼンが検出された３検体はMg，Mn，Fe，Co，Sr，Sn等の含有量が比較的高い傾向が見られた．
アスコルビン酸を含有しない検体からもベンゼンを検出したことから，アスコルビン酸に限らず，還元性のある有機酸や糖類等の物質が共存すると，安息香酸が還元されベンゼンが生成する可能性が考えられた．安息香酸からのベンゼンの生成には，還元性物質や重金属の存在，時間経過等の要因が複雑に関与している可能性が示唆された．

福山市保健所（〒730‑8512

広島県福山市三吉町南二丁目11番22号）− 75 −

広島県獣医学会雑誌

序22（2007）文結

平成18年７月28日付け食安基発第0728008号厚生労働

１．安息香酸15検体すべてから，0.14〜0.54g/kg（安息香酸とし省医薬食品局食品安全部基準審査課長通知「清涼飲料水
中のベンゼンについて」（以下，「通知」という．
）によると，国内で流通する安息香酸およびアスコルビン酸の果て）の安息香酸を検出した（表１）．
２．ベンゼン

両剤を添加した清涼飲料水からベンゼンが検出された１）

今回の調査では，水道水質基準およびWHOの飲料
水ガイドライン値の10ppbを超える検体はなかったが，とのことであった．
現時点ではベンゼンの生成機序が明らかにされておら

検体記号F-1（以下，検体記号のみで表記する．）からず，当該製品に添加された安息香酸およびアスコルビン

1.06ppbのベンゼンを検出した．本来の検出限界（１酸のベンゼンの生成への関与が示唆されている．

ppb）未満ながら，B，F-2からも0.67ppb，0.79ppbのベンゼンを検出した．F-1，F-2はアスコルビン酸の使

そこで，安息香酸を使用する市内の清涼飲料水および醤油製造業施設で製造された製品に含まれるベンゼンの用がないにもかかわらず，ベンゼンを検出した．
アスコルビン酸を含有するE-1，E-2，E-3を含むそ調査を行った．
あわせて，安息香酸の含有量，アスコルビン酸の使用の他の検体からは，ベンゼンは検出されなかった．

の有無，pHおよび酸化還元電位，重金属の含有量につベンゼンを検出した検体は全て清涼飲料水で水道水いても調査し，ベンゼンの生成との関連性の調査を行っを原水としており，醤油からは検出しなかった．また，たところ，若干の知見を得たので報告する．

安息香酸とベンゼンの検出量に相関は見られなかった
（表１）．

材料と方法

検量線およびヘッドスペースGC/MS法の典型的な

１．調査期間クロマトグラムを図１に示す．
３．pH

2006年（平成18年）８月

pHの測定値は2.4〜4.9であった．

２．対象施設ベ ン ゼ ン が 検 出 さ れ たB，F-1，F-2のpHは そ れ ぞ

事前に聞取り調査を行い，安息香酸または安息香酸ナトリウムの使用実態のある市内の清涼飲料水製造業

れ，2.4，4.2，4.2であった（表１）．
４．酸化還元電位

５施設および醤油製造業２施設を選定した．

酸化還元電位の測定値は−66〜198mV，平均値は３．対象製品102mVで，全ての検体において還元系の領域にあっ清涼飲料水および醤油のうち，安息香酸およびアス
コルビン酸の両剤を添加した製品を優先し，安息香酸

た．

のみを使用した製品も対象とした．

また，醤油からベンゼンは検出されていないが，３

検体数は清涼飲料水12検体，醤油３検体である．

検体すべてが強い還元系にあった（表１）．

４．検査法
ア

５．重金属
F-1，F-2は重金属の含有量が全体的に高かった．

安息香酸
食品衛生検査指針に基づき，HPLC法によって測

また，ベンゼンを検出したB，F-1，F-2はMg，Mn，
Fe，Co，Sr，Sn等の含有量が比較的高い傾向が見ら定した．
イ

れた（表２）．

ベンゼン
通 知 の 「清 涼 飲 料 水 中 の ベ ン ゼ ン に 関 す る

考Q&A」中の別紙１「清涼飲料水中のベンゼン試験法」（ヘッドスペースGC/MS法）によって測定した．
なお，希釈が必要な清涼飲料水は使用法のとおり

ベンゼンは，安息香酸のカルボキシル基が還元されることによって生成すると考えられる（図２）．
Bからベンゼンが検出されたが，アスコルビン酸を含希釈し，カキ氷シロップおよび醤油は５倍に希釈し，有するE-1，E-2，E-3からはベンゼンは検出されなかっ測定を行った．
ウpH

た．
アスコルビン酸を含有しないF-1，F-2からもベンゼン

pHメーターにより測定した．
エオ

察

酸化還元電位が検出したことから，アスコルビン酸に限らず，安息香

酸化還元電位計により測定した．

酸のカルボキシル基を還元する力のある有機酸や糖類，

重金属

アルコール類等の物質が共存すると，安息香酸が還元さ

ICP/MS法により78元素（同位体を含む．）の半定

れベンゼンが生成する可能性があることが考えられた．

量を行った．

アスコルビン酸を含有するE-1，E-2，E-3からはベンゼ
ンは検出されなかったが，これは添加されたアスコルビ− 76 −

広島県獣医学会雑誌

22（2007）表１

検査結果（重金属を除く）

図１

検量線及びクロマトグラム− 77 −

表２

検査結果

広島県獣医学会雑誌− 78 −

22（2007）

広島県獣医学会雑誌

22（2007）

還元性の雰囲気にあり，酸化還元電位とベンゼンの生成との明確な関連性は不明であるが，F-1，F-2については
平衡電位より還元性の雰囲気であったこともベンゼン生成の一因になったと考えられる．
また，今回重金属が還元剤の役割を果たしていることを想定して，その関与についても調査を行った結果，ベンゼンを検出したF-1，F-2で重金属の含有量が全体的に高かった．ベンゼンを検出した３検体で，取りうる価数
図２

化学反応式（概念図）の多い遷移金属類が比較的高濃度で含有されていたため，ベンゼン生成への金属の関与の可能性は考えられたン酸がごく低濃度（0.00125％）であることや，ベンゼが，それ以上踏み込んだデータ解析ができなかった．

ンが生成されやすい何らかの条件がそろわなかったためと思われる．

結論として，安息香酸からのベンゼンの生成には，アスコルビン酸等の還元性物質や重金属の存在，時間の経

また，F-1，F-2は同一製造者の同一製品で，製造日のみが異なり，先に製造されたF-1のベンゼンの検出値が過等様々な要因が複雑に関与している可能性が示唆された．

高かったことから，経時的にベンゼンの生成が進むこと

今後も，ベンゼン生成へのアスコルビン酸以外の有機も考えられたがデータ数が少ないため，データ数を積み物や重金属の関与の有無，生成の指標となる測定項目の上げ，経時的変化の調査を行うことも検討したい．

特定等，更に調査を進め，明らかにしていきたい．

pHおよび酸化還元電位との関連性についても調査を文行ったが，全体として酸性傾向で，ベンゼンを検出した
３検体にもばらつきが見られたため，pH単独での大き献１）厚 生 労 働 省 ： 平 成 18 年 7 月 28 日 付 け 食 安 基 発 第0728008号厚生労働省医薬食品局食品安全部基準審

な関与は見られなかった．
酸化還元電位については，醤油が極めて低い値を示した．pHとあわせて考えると全ての検体で平衡電位より− 79 −

査課長通知「清涼飲料水中のベンゼンについて」