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細胞壁成分の改質を介した新食感を持つジャガイモの開発＜令和 2 年度助成＞

細胞壁成分の改質を介した新食感を持つジャガイモの開発
寺村浩・大沼万里子・高橋史憲（東京理科大学 先進工学部 生命システム工学科）

1．緒言食感のジャガイモを作出できると予想された。しかし、これまでに PME 遺伝子を欠損したジャガイモ

ジャガイモは全世界で年間およそ 3 億トン以上生産され、世界第 4 位の主要穀物であり、主食となるの変異体は作出されておらず、どのような表現型を示すのかは明らかになっていなかった。

イモ類では世界最大の生産量である。ジャガイモにそこで本研究では、ゲノム編集技術を用いて PMEは様々な品種が存在しており、品種間で食感が大き遺伝子を欠損した変異体を作出するための技術としく異なることが知られている。ジャガイモは食感でて、ゲノム編集技術である CRISPR/Cas9 に着目した。

大別すると、ほくほくとした食感の粉質とねっとり

この技術は、標的部位の選択の自由度が高く、編集とした粘質に分類できる。この食感の違いは、ジャ効率も高いとされている。CRISPR/Cas9 は、guideガイモの利用方法に大きく影響を与えることから、RNA（gRNA）と Cas9 タンパク質が複合体を形成し重要な形質であると考えられている。このジャガイたもので、作用機序として、gRNA がゲノム上のプモの食感には、塊茎を形成する細胞壁の構造およびロトスペーサー隣接モチーフ（Protospacer Adjacent組成が関わっていると考えられている。これまでに、

Motif：PAM）の下流に位置する標的配列と gRNA豆類などで、細胞壁に含まれるペクチンと呼ばれるが RNA-DNA 塩基対を形成することで、Cas9 ヌクレ多糖類が食感に大きく影響を与えることが報告されアーゼをゲノム上の適切な部位へ誘導する。ゲノムている。特にメチル化修飾されたペクチンの細胞壁DNA と複合体を形成した Cas9 ヌクレアーゼは、二中の含量が重要であり、これの含量が少ない品種で本鎖切断（Double Strand Breaks : DSBs）をゲノム

は加熱調理後に柔らかい食感を示し、含量が多い品DNA へ導入する。切断された DNA は、非相同末端種では硬い食感を示すことが報告されている。この連結（NHEJ）や相同組換え修復（HR）により修復メチル化修飾をされたペクチンの量を決定する因子されるが、CRISPR/Cas9 によって繰り返し DSBs がとして、ペクチンメチルエステラーゼという酵素が導入されることで、修復エラーを誘導する。修復エ注目されている。この酵素は、ペクチンからメチルラーによって挿入や欠失、置換などが生じ、遺伝子基を遊離させる機能を有しており、この酵素が機能内の変異であればフレームシフトを引き起こし、多することで細胞壁中のメチル化修飾をされたペクチ

くの場合、遺伝子がノックアウトされる。

ンの量を低下させることが知られている。この酵素

ジャガイモは栄養生殖性の同質 4 倍体植物である。

をコードした遺伝子（PME 遺伝子）は、ジャガイモ

このため、PME 遺伝子には 4 つの対立遺伝子（アリにも存在することから、ジャガイモにおいても同様

ル）が存在する。PME 遺伝子の活性を抑制したジャのメチル化修飾をされたペクチンの量を制御する機ガイモを作出するためには、これら 4 つのアリルの構が存在すると考えられる。そのため、この遺伝子全てに変異が導入された 4 アリル変異体を得る必要を欠損させた変異体を作出することで、メチル化修がある。4 アリル全てに変異を起こすためには、非飾をされたペクチンの量が増大したこれまでにない常に強力なゲノム編集ツールが必要である。そこで、

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高効率に PME 遺伝子の 4 アリル変異体を得るためた。一方で、pMR206 も EcoRV および NotI を用いに、翻訳エンハンサー dMac3 を利用した高効率なて制限酵素処理した。これらの制限酵素処理後のゲ ノ ム 編 集 技 術 に 着 目 し た。 翻 訳 エ ン ハ ン サ ー

DNA 断片と Ligation high を用いてライゲーション

dMac3 はイネの OsMac3 遺伝子に含まれる特殊な反応を行った。ライゲーション反応後のサンプルを塩基配列であり、これを組み込むことで下流の ORF用いて大腸菌の形質転換を行った。得られた大腸菌にコードされるタンパク質の翻訳効率を 10 倍以上のコロニー 20 個からプラスミド DNA の抽出を行い、増加させ、タンパク質の産生を大幅に増加させる。

得られたプラスミド DNA をシークエンス解析に用

これまでの研究で、翻訳エンハンサー dMac3 を用いた。

いて Cas9 タンパクの翻訳効率を上昇させることで、ジャガイモのゲノム編集の効率を上昇させることに2-3．ジャガイモの形質転換成功している。本研究では、翻訳エンハンサー dMac3

プラスミドを導入したアグロバクテリウムのコロを用いた高効率なゲノム編集を用いて PME 遺伝子ニーを爪楊枝で取り、Spectinomycin（50 mg/L）をを欠損した変異体ジャガイモを作出し、その表現型含む 2 mL の 2 × YT 液体培地に植菌し、28℃の暗を観察することを目的とした。

所で一晩振盪培養した。これをアグロバクテリウム懸濁液とした。滅菌 1.5 mL 容エッペンドルフチュー

2．方法

ブにアグロバクテリウム懸濁液を 150μL、アセトシリンゴン（10 mg/mL）を 2μL、3C5ZR 液体培地

2-1．植物の栽培条件

を 1 mL 入れ、調製菌液とした。ジャガイモの無菌

本実験では、ジャガイモの品種「さやか」を用いた。

植物から葉と根の部分を除去し、残った茎の節間を滅菌した試験管に約 5 mL のホルモンフリー MS 寒約 8 mm の長さに切った。この茎片を 3C5ZR 液体天培地を入れ、そこにジャガイモ無菌植物体の芽を培地 12 mL を入れた 15 mL ファルコンチューブに植えた。これを人工気象器（TOMY、CLH-301）内入れ、調製菌液 500μL を加えた後、時折転倒混和で 22 ℃、 照 度 7,000 〜 8,000 lux、 明 期 16 時 間、しながら 15 分間静置した。その後、濾紙を用いて暗期 8 時間の光条件で 3 〜 4 週間培養した。

茎片に付着している余分なアグロバクテリウム懸濁液を吸い取って除去し、3C5ZR 培地の上に茎片を置2-2．ジャガイモ DNA の抽出と PCR

床 し た。 そ の 後、 人 工 気 象 器（TOMY、CLH-301）

ジャガイモ品種「さやか」のゲノム DNA は、緑内で 22℃、照度 7,000 〜 8,000 lux、明期 16 時間、葉から DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いて暗期 8 時間の光条件で、アグロバクテリウムと 4 日抽出した。この DNA 溶液を鋳型として、PME 遺伝共存培養を行った。共存培養後、この茎片を滅菌水子中のゲノム編集の標的とした領域を含む 1000 bpで洗浄し、ハイグロマイシンおよびクラフォランをの 塩 基 配 列 を PCR を 用 い て 増 幅 し た。PCR は、加えた 3C5ZR 培地に移した。その後、人工気象器

GeneAmpⓇ PCR System 9700（Applied Biosystems）（TOMY、CLH-301）内で 22℃、照度 7,000 〜 8,000を用いた。94℃で 5 分間処理後、DNA の熱変性をlux、明期 16 時間、暗期 8 時間の光条件の下で生育し、98℃で 30 秒間、アニーリングを 58℃で 30 秒間、その後 2 週間おきに培地の交換を行った。1 ～ 2 か伸長反応を 68℃で 90 秒間行った。これを 35 回繰

月培養後、茎から形成されたカルスが芽を出したら、り返し、最後に 68℃で 7 分間の延長反応を行った。

シュート部分を切り取り、クラフォランを加えたホ反応後は 1% agarose ゲル電気泳動を行い、増幅さルモンフリー MS 培地に移植した。さらに 2 週間後、れた遺伝子断片を検出した。この増幅された遺伝子滅菌した試験管にホルモンフリー MS 培地を入れ、断片を EcoRV および NotI を用いて制限酵素処理しこれを移植し、人工気象器内で 22℃、照度 7,000

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39〜 8,000 lux、明期 16 時間、暗期 8 時間の光条件の塊茎にて最も高い発現量を示すものの特定を ePlant下で生育した。これによって得られた植物を形質転potato（http://bar.utoronto.ca/eplant_potato/）を用換体とした。

いて行った。その結果、NM_001288040.1 が塊茎にて最も高い発現量を示す PME 遺伝子であることが明らかになった。

3．結果

次に、PME 遺伝子の機能を CRISPR/Cas9 を用い

3-1．ジャガイモ塊茎中で働く PME 遺伝子のて 欠 損 さ せ る た め に、 こ の 遺 伝 子 を 標 的 と す るgRNA の設計を行った（図 1）。まず、CRISPRdirect

探索
これまでに、ジャガイモの塊茎にて働いているペを用いて、PME 遺伝子のエキソン 10 を標的とした、クチンメチルエステラーゼ（PME ）遺伝子に関する

3 つの gRNA（gRNA1、gRNA2、gRNA3）の配列を情報はなかった。一方で、ジャガイモのゲノム上に設計した（図 2）。このとき、gRNA1、gRNA2 配列は 2 個の PME 遺伝子が存在することが報告されてには制限酵素 Sal1 の切断サイトを含むよう設計しいる。これらの PME 遺伝子のうち、ジャガイモのた。

図 1 PME 遺伝子のゲノムの構造と CRISPR/Cas9 の標的位置の概略
黄色の四角形はエキソンを示す。灰色のバーはイントロンを示す。赤色の四角形はゲノム編集の標的とした領域を示す。ピンクの四角は活性中心に対応する部位を示す。

図 2 PME 遺伝子の標的配列周辺の遺伝子の多型
黄色の部位は全ての対立遺伝子で一致する領域を示す。赤色の部位は対立遺伝子間で多型が検出された部位を示す。
青色はガイド RNA を設計した領域を示す。ピンク色は酵素の活性中心をコードする領域を示す。

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3-2．CRISPR/Cas9 を 用 い た PME 遺 伝 子 欠損ジャガイモの作製
PME 遺伝子を標的とした CRISPR/Cas9 プラスミ
ド StPME -pZD-dxCas9 を、アグロバクテリウム法によりジャガイモに導入した。形質転換を計 2 回、50本の茎片に対して行ったところ、25 個の再分化した芽が得られた（図 3）。
これらの得られた再分化体植物からゲノム DNA を抽出し、外来性遺伝子（Cas9 遺伝子および HPT 遺伝 子 ） の 導 入 の 有 無 の 解 析 を 行 っ た。 そ の 結 果、HPT 遺伝子は、25 個体中 21 個体で PCR 断片の増殖が観察された（図 4）。また、Cas9 遺伝子でも 25 個体中 23 個体で PCR 断片の増殖が観察された（図 5）。
これらのことから、これらの再分化植物には、目的の外来性の遺伝子を導入することに成功したと考えられた。次に、PME 遺伝子への変異の導入の有無をCaps 解析を用いて解析した。その結果、解析に用いた全ての個体において、野生型植物と同様のバンドパターンが観察された（図 6）。このことから、今回得られた、全ての形質転換体植物において、PME 遺伝子に変異が導入されていない可能性が示唆された。

図 3 ゲノム編集遺伝子を導入した形質転換体植物の形態
A：現在、再分化中のジャガイモのカルスの写真。黒色のバーはスケールバーを示す。B：獲得できた形質転換体植物であると予想される個体の写真。

図 4 ハイグロマイシン耐性遺伝子を指標とした導入検定の結果
WT では、野生型のジャガイモゲノムをテンプレートとして PCR を行った。P.C. では、ジャガイモに導入した外来性遺伝子をテンプレートとして PCR を行った。数字はサンプル番号を示す。

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図 5 Cas9 遺伝子を指標とした導入検定の結果
WT では、野生型のジャガイモゲノムをテンプレートとして PCR を行った。P.C. では、ジャガイモに導入した外来性遺伝子をテンプレートとして PCR を行った。数字はサンプル番号を示す。

図 6 CAPS 解析の結果
WT では、野生型のジャガイモゲノムをテンプレートとして PCR を行った。P.C. では、ジャガイモに導入した外来性遺伝子をテンプレートとして PCR を行い、制限酵素処理を行わなかったものを電気泳動した。数字はサンプル番号を示す。

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4．考察

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れた（図 3）。次に、得られた再分化植物体からゲノムを抽出し、それらを用いて PCR を行うことで、外本実験では、シャキシャキとした新食感を有する来性遺伝子の導入の有無を解析した。その結果、25ジャガイモを作出することを目的としている。この個体中 21 個体でハイグロマイシン耐性遺伝子およ目的を達成するために、細胞壁の構造および組成にび Cas9 遺伝子に由来すると考えられる PCR 断片の着目した。本研究では、野菜の食感に影響を与える増幅が観察された。このことから、これらの再分化細胞壁成分としてペクチンに注目した。これまでに、植物体には、目的とした外来性遺伝子が導入されて豆類などで、メチル化修飾されているペクチンを多いると考えられた。そこで、外来性遺伝子の導入がく含む場合に、加熱調理時に煮崩れしづらく、硬い観察された再分化植物体のゲノムを用いて CAPS 解食感を示すことが報告されている。このことから、析を行い、PME 遺伝子に変異が導入されたかを解析

ジャガイモ中のメチル化修飾されているペクチンのした。その結果、全ての細分化植物体において、野含量を制御することで、新しい食感を有するジャガ

生型ジャガイモと同様のバンドパターンが観察されイモを作出することができると考えられた。他の植た。 こ の こ と か ら、 こ れ ら の 再 分 化 植 物 体 で は、物種においてペクチンメチルエステラーゼ（PME）PME 遺伝子に変異が導入されていない可能性が示唆という酵素が、メチル化修飾されているペクチンのされた。また、これまでの結果から、高効率なゲノ量を制御していることが報告されている。しかし、ム編集用のプラスミドである pZD-dxCas9 を用いたジャガイモではペクチンメチルエステラーゼをコー

場合でも、4 個の対立遺伝子全てに変異が導入されドする遺伝子（PME 遺伝子）を欠損した変異体は未た 4 アリル変異体を獲得できる確率は、全形質転換だに作出されておらず、どのような表現型を示すの体中の約 25％であることが報告されている。そのかは明らかになっていなかった。そこで、ゲノム編ため、優れた形質を示す PME 遺伝子欠損変異体を集技術である CRISPR/Cas9 システムを用いて、PME獲得するためには、より多くの形質転換体を作出す遺伝子の機能が欠損したジャガイモの作出を試みる必要があると考えられる。そのため、今後も引きた。そのために、ジャガイモのゲノム上に存在する続きジャガイモの形質転換を行い、多くの形質転換PME 遺伝子を探索した結果、2 個の PME 遺伝子がジャガイモを獲得する予定である。

存在することを明らかにした。
これらの結果を基に、ゲノム編集用プラスミド

謝辞StPME -pZD-dxCas9 の構築を行い、このプラスミド

本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公中のゲノム編集用遺伝子カセットをアグロバクテリ

益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼をウム法を用いてジャガイモ品種「さやか」への導入申し上げます。

を試みた。その結果、25 個の再分化植物体が得らDevelopment of potatoes with a new texture through modification of cell wall components

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Development of potatoes with a new texture through modificationof cell wall components
Hiroshi TERAMURA, Mariko OHNUMA, and Fuminori TAKAHASHI
Department of Biological Science and Technology, Faculty of Advanced Engineering,Tokyo University of Science
It has been reported that pulse crops, such as beans and potatoes do not
crumble easily during cooking, and exhibit a hard texture due to a large amountof methylated-modified pectin in their edible parts. Accordingly, in order toproduce potatoes with a new texture, it is necessary to control the content ofmethylated and modified pectin in the potatoes.
To achieve this goal, we modified the structure and composition of the cellwall. In particular, we focused on pectin as a cell wall component that affects
the texture of vegetables. Previous reports have indicated that an enzyme calledpectinmethylesterase (PME ) regulates the amount of methylated pectin in otherplant species. However, in potatoes, a mutant lacking the gene enco ding
pectinmethylesterase (PME gene) has not yet been produced, and it has notbeen clarified as to what kind of phenotype it would exhibit. Therefore, we
attempted to produce potatoes lacking the function of the PME gene using theCRISPR / Cas9 system, which is a technology for genome editing. As a result,
we succeeded in obtaining a transformant potato into which a target foreign
gene was introduced. Next, we performed a CAPS analysis to determine if
mutat ions had been intro duced into the PME gene of these transformantpotatoes. As a result, it was clarified that no mutations had been introduced
into the PME gene, in all of the transformant potatoes.