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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）＜平成 25 年度助成＞

クルクミンによる腸内細菌プロファイルの変化を介する肝がん抑制効果の検討
大谷直子（東京理科大学理工学部応用生物科学科）

要

旨
近年、肥満は糖尿病や心筋梗塞だけでなく、大腸がん、肝がん等、様々ながんのリスクファクター

バイオティックス研究やプレバイオティックス研究につなげていきたいと考えている。
1.

はじめにであることが指摘されている。しかし、その分子肥満は糖尿病や心血管性疾患を増悪させるだメカニズムの詳細は十分には明らかになっていな

けでなく、大腸がん、前立腺がんなど、様々ない。我々は先行研究において、全身性の発癌モデがんのリスクファクターであることが疫学的に示ルマウスを用いて、高脂肪食摂取に伴う肥満によされている。特に脂肪肝肝炎を素地として発症り肝がんの発症が著しく増加することを見出しする肝がんは肥満が重要なリスクファクターであた。興味深いことに、肥満すると、2 次胆汁酸をることが示されている。しかしなぜ肥満が肝がん産生するグラム陽性腸内細菌が増加し、体内の２を促進するのかそのメカニズムは十分に明らかに次胆汁酸であるデオキシコール酸の量が増え、こなっていなかった。私たちはマウスを用いて全身れにより腸肝循環を介して肝臓の間質に存在するでがん遺伝子産物の Ras シグナルを活性化する処

肝星細胞が細胞老化と細胞老化随伴分泌現象を起理をし、高脂肪食を与え肥満させると、肝臓がんこし、肝がん促進的ながん微小環境を形成するこの発症が著しく促進されることを見出した。そしとが肝がん進展の原因のひとつであることを明らて、その発症機構のひとつとして、肥満で増加しかにした。しかし食餌性に増加する腸内細菌に起たグラム陽性腸内細菌の代謝物、デオキシコール因するがんであれば、その腸内細菌を増やさない酸が腸肝循環を介して肝臓に到達し、肝臓の間質ような食品成分を探索し用いることで、がんの予に存在する線維芽細胞の肝星細胞の細胞老化を誘防が可能になるかもしれない。そのような食品成導し、細胞老化を起こした肝星細胞から様々な炎分の候補として私はクルクミンに着目した。クル症性サイトカインやプロテアーゼなどが分泌され、クミンは肝星細胞や腸管上皮に対し抗炎症作用を肝がんに促進的ながん微小環境を形成すること示すことが知られている。そこで、本研究では、が、肝がん進展の原因のひとつであることを明ら

肥満誘導性肝癌誘発実験においてクルクミン投与

かにしたにより肝癌の形成や腸内細菌の構成が変化するかこの現象を「細胞老化随伴分泌現象」Senescence-どうかについて検討した。その結果、クルクミン

associated secretory phenotype, SASP という。こ投与により肝癌の形成率には変化はなかったが、の肝星細胞における SASP 現象は、ヒトの非アル腸内細菌の構成が発がん予防的な腸内細菌の構成コール性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,に変化する傾向があることが示された。今後さらNASH）にともない発症する肝がん組織においてに詳細を検討し、肥満誘導性肝癌を予防するプロも認められ、ヒトにおいても、SASP が肥満誘導1）。細胞老化を起こした細胞に生じるクルクミンによる腸内細菌プロファイルの変化を介する肝がん抑制効果の検討性肝がんの発症に関与すると考えられた。

2-345

クルクミンの調整法と投与法

このように我々の先行研究の結果から、高脂肪クルクミン（ナカライテスク）を 50 度に温めなが食摂取に伴う腸内細菌の変化が結果的に肝がんをら溶媒のプロピレングリコールに溶解し、7 mg/ml促進することが明らかになった。しかし、逆に食のクルクミン溶液を作成した。このクルクミン溶

餌性に増加する腸内細菌に起因するがんであれ液を体重当たり 40μg/g の量になるように、週 3ば、その腸内細菌を増やさないような食品成分を回ゾンデを用いてマウスに経口投与した。上記の探索し用いることで、がんの予防が可能になるか

肥満誘導性肝がん誘発実験の過程で、20 週齢かもしれない。そのような食品成分の候補として私ら 30 週齢の間の 10 週間、クルクミン溶液またははクルクミンに着目した。クルクミンは様々な炎溶媒のプロピレングリコールを投与した。

症作用を抑制することが知られており、肝星細胞2-4

腸内細菌 DNA の調整に対しても、増殖シグナルや炎症シグナルを抑制

クルクミン投与前と解剖時のマウスの糞便をさせるという複数の報告がある 2 , 3 ）。また、腸内約 50 mg 採 取 し、QIAamp DNA Stool Mini Kit

細菌を介して腸内の炎症を抑制するとの報告もあ（Qiagen）を用いて糞便中の腸内細菌 DNA を抽4）ることから 、前述した肥満誘導性肝がんの発症出・精製した。の予防に、クルクミンが有効ではないかと考えた。

2-5

腸内細菌プロファイル解析

そこで本研究では、マウスにおいてクルクミンを腸内細菌の 16SrRNA 遺伝子の V1 ～ V3 領域投与した場合に、肥満誘導性肝がんの形成が抑制を含む領域を PCR で増幅し、次世代シーケンサーされるかどうかについて検討した。また、前述しMiseq（イルミナ社）にて、その領域の塩基配列たようにクルクミンの腸内細菌への影響も報告さを決定しその配列から、クルクミン投与前後の腸れていることから、クルクミン投与により腸内細内細菌の種類を、Qiime ソフトウェアを用いて解菌のプロファイルに変化が認められるかどうかに析・分類した（受託会社に依頼）。PCR 増幅用プラついて検討した。

イマーは以下の配列のものを使用した。16S 27f :2.

方法

2-1マウス日本クレアから成熟齢の C57BL/6 マウス♂♀
を購入して高配し、出産させ仔マウスを実験に使用した。
2-2

肥満誘導性肝がん誘発実験

生 後 ４ ～ ５ 日 の 新 生 仔 マウスの 背 中 皮 膚 に0.5 ％ DMBA（7, 12 - dimethylbenz[a]anthracene）

5’-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG - 3’16S 518r :5’-WTTACCGCGGCTGCTGG - 3’
3.

結果

3-1

肝腫瘍数の解析

クルクミン投与群 6 匹の平均腫瘍形成数は 4. 5 個、コントロール群４匹（溶媒投与群）の平均腫瘍形成数は 5 個であり、両群で有意差はなかった（図 1）。
3-2

腸内細菌プロファイルの解析（アセトンに溶解）50μl を１回塗布し、その後、哺乳動物の多くは腸内細菌と共生状態にあり、離乳前は母親マウスに、離乳後は薬剤を塗布し500 種類以上もの腸内細菌が存在しているといわたマウスに直接、合計 30 週間高脂肪食（D12492,れている。近年、次世代シーケンサーの開発によResearch Diets Inc) または普通食（CE-2, CLEAり、膨大な量の塩基配列情報を短期間に網羅的にJapan Inc）を摂取させ、マウスが 30 週齢に達した明らかにすることが可能になった。腸内細菌も時点でマウスを解剖し肝がんの形成を確認した。

16SrRNA 遺伝子の可変領域の塩基配列から、単46

浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

を PCR にて増幅し、塩基配列を決定した。その配列から Qiime 解析法にて菌を分類し、クルクミ
65N=6N・S

N=4ン投与前後の腸内細菌プロファイルを比較しその変化を検討した。

4

図 2 はクルクミン投与前後のマウス 2 個体に3おける科レベルの腸内細菌のプロファイルを示す。Qiime 解析の結果、興味深いことに、クル2

ク ミ ン 投 与 に よ り、Bacteroidaceae 科（ 図 2 ③、

1

Ａ：14.8 % → 19.7 %、 Ｂ：14.7 % → 17.9 %）、0Ruminococcaceae 科（ 図 2 ⑬、Ａ：7.3 % → 9.3 %、B：6.1%→ 8.5%）、Lachnospiraceae 科（図 2 ⑥、A：

図1

クルクミン投与群とコントロール群における肥満誘導性肝腫瘍数
腫瘍の直径：水色 2mm ～ 5mm、青 2mm 未満

2.0 %→ 4.8 %、B：1.7 %→ 6.7 %）の菌種が A、B
2 個体とも明らかに腸内で占める割合が増加して離できていない菌も分類することが可能になっいた。一方、Rikenellaceae 科（図 2 ④ 13.1%→ 8.8%、ている。今回、クルクミンまたは溶媒を投与しＢ：16.1 % → 8.6 %）、Clostridiales 門 に 属 す る がたマウスの糞便から腸内細菌 DNA を抽出・精製

科レベルまで分類できなかった菌種（図 2 ⑤、A：

し、次世代シーケンサー Miseq（イルミナ社）にて22.1% → 18.7%、B：23.8%→ 19.2%）が明らかに

16SrRNA 遺伝子の可変領域 V1 ～ V3 を含む領域減少していた。今後、明らかに増減があった菌種

図2

クルクミン投与前後おける腸内細菌のプロファイル（科レベル）
腸内細菌の占める割合が 1％程度以上のものを①～⑭に示す。

クルクミンによる腸内細菌プロファイルの変化を介する肝がん抑制効果の検討

47に関しては、塩基配列から詳細を検討し、種レベしても、クルクミン投与により変化する腸内細菌ルまで同定したいと考えている。

を種レベルまで同定し、肥満誘導性肝癌を予防す

4.

考察るプロバイオティックスやプレバイオティックスにつなげる研究を目指したいと考えている。

今回、抗炎症作用が知られるクルクミンの投与により、肥満誘導性肝癌の発症数やその発症

謝辞に関与する腸内細菌のプロファイル変化を検討

本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りましたした。その結果、30 週間のプロトコールの中で公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に心より

最 後 の 10 週 間 クルクミンを 投 与 し た 今 回 の プ

感謝申し上げます。東京理科大学・理工学部・応ロトコールでは、腫瘍形成数に有意な差は認め用生物科学科に着任したばかりの研究室立ち上げなかった。しかし、腸内細菌プロファイルを調の時期に貴財団から研究費を賜り、非常にありがべ た と こ ろ Bacteroidaceae 科 の 菌 種 が ク ル ク

たく有効に使わせていただきました。今後も貴財

ミン投与群で共通して増加していた（ 図 2 ③）。

団のますますの発展をお祈り申し上げますととも

Bacteroidaceae 科はグラム陰性菌であり、我々のに、ご指導ご鞭撻を賜りますよう何卒よろしくお1）

先行研究 の結果から、高脂肪食摂取により肥満願い申し上げます。

させたマウスでは普通食摂取マウスに比べて著しく減少している菌である。クルクミン摂取によ

文り、Bacteroidaceae 科のグラム陰性菌が増加する

1) Yoshimoto S, Loo TM, Atarashi K, Kanda H, Sato S,
Oyadomari S, Iwakura Y, Oshima K, Morita H, Hattori M,
Honda K, Ishikawa Y, Hara E, Ohtani N.
Obesity-induced gut microbial metabolite promotes livercancer through senescencesecretome.
Nature. 2013; 499 (7456) : 97-101.という、高脂肪食摂取と逆の傾向を誘導したことは、肥満誘導性の癌の予防につながる可能性があり興味深い知見である。また今回クルクミン投与により、Ruminococcaceae 科の菌の増加も検出された（図 2 ⑬）。Ruminococcaceae 科の菌は、肥満で増加し発がん作用のある腸内細菌代謝物、デオキシコール酸を減少させる作用のある菌として知られている菌である1, 5 ）。そのような作用のあるRuminococcaceae 科がクルクミン投与により増加したことも興味深い。
以上の結果から、高脂肪食摂取とクルクミンの同時摂取は腸内細菌プロファイルを発がん抑制的なプロファイルに改善させる傾向に導くことが明らかになった。今後さらにクルクミンを長期投与するプロトコールを試み、肝星細胞を含む詳細な組織解析やマウス血中胆汁酸に対する影響も調べていく必要があると思われる。腸内細菌解析に関

献2) Wang ME, Chen YC, Chen IS, Hsieh SC, Chen SS, Chiu
CH. Curcumin protects against thioacetamide-induced
hepatic fibrosis by attenuating the inflammatory response
and inducing apoptosis of damaged hepatocytes.
J Nutr Biochem. 2012; 23 (10) : 1352-66.
3) Lin J, Tang Y, Kang Q, Feng Y, Chen A.
Curcumin inhibits gene expression of receptor for advanced
glycation end-products (RAGE) in hepatic stellate cells invitro by elevating PPARγ activity and attenuating oxidativestress.
Br J Pharmacol. 2012; 166 (8) : 2212-27.
4) Bengmark S.
Gut microbiota, immune development and function.
Pharmacol Res. 2013; 69 (1) : 87-113.2012.
5) Minamida K, Kaneko M, Ohashi M, Sujaya IN, Sone T,Wada M, Yokota A, Hara H, Asano K, Tomita F.
Effects of difructose anhydride III (DFA III) administration
on bile acids and growth of DFA III-assimilating bacterium
Ruminococcus productus on rat intestine.
J Biosci Bioeng. 2005; 99 (6):548-54.

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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

The effect of Curcumin on the profile of gut microbiota
associated with obesity-induced liver cancer development
Naoko Ohtani
Department of Applied Biological Science, Faculty of Science and Technology
Tokyo University of Science
Obesity has recently become more prevalent in most developed countries and isincreasingly recognized as a major risk factor for several common types of cancers. As theworldwide obesity epidemic has shown no signs of abating, better understanding of themechanisms underlying obesity-associated cancer is urgently needed. Although several
events were proposed to be involved in obesity-associated cancer, the exact molecularmechanisms that integrate these events have remained largely unclear. We previously
showed that the long-term high-fat diet (HFD) accelerated development of cancers inmice treated with DMBA, a chemical carcinogen, at neonatal stage. In particular, allmice with HFD for 30weeks developed hepatocellular carcinomas (HCCs), whereas notumors were found in mice fed with normal diet (ND) at 30 weeks’ time point. Dietary
obesity induces alterations of gut microbiota, thereby increasing the levels of a bacterialmetabolite, deoxycholic acid, that cause DNA damage. The enterohepatic circulation of thebacterial metabolites provokes tumor-promoting microenvironment in the liver, particularly
inducing the senescence-associated secretory phenotype (SASP) of hepatic stellate cells,
thus facilitating HCC development. Importantly, intestinal bacterial profile revealed thatPhylum Firmicutes (Gram positive bacteria) was significantly increased, whereas Phylum
Bacteroidetes showed great reduction in the HFD fed mice. Reducing the gram positive
intestinal bacteria by vancomycin treatment efficiently prevented HCC development inobese mice, indicating that increased Gram positive gut bacteria by HFD play a cancerpromoting role.
As a next step, we aimed to search for food materials that prevent obesity-associatedHCC development by changing the profile of gut microbiota. Since curcumin is known tohave an anti-inflammatory effects on intestinal epithelial cells and hepatic stellate cells, inthis study we focused on curcumin to investigate whether curcumin has a role on preventing
obesity-associated HCC development by altering the profile of gut microbiota. We foundthat ten weeks’ feeding of curcumin during the period of thirty weeks’ high fat diet canalter the profile of gut microbiota profile, although the frequency of HCC development
was unchanged. Interestingly, curcumin treatment induced Bacteroidaceae Family which isknown to be reduced in the condition of HFD. Moreover, Ruminococcaceae family, whichis known to reduce the production of secondary bile acid, such as deoxycholic acid, wasfound to be increased by curcumin intake. These findings suggest that curcumin could havea potential to alter the gut microbiota profile to cancer-preventable profile.