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香辛料の細胞癌化に対する抑制効果およびその遺伝子機構の解析

香辛 料 の細 胞癌 化 に対 す る抑制効 果 お よび
その遺伝 子機構 の解 析侯

1.は2.材

じ め に

香 辛料 は古 くか ら利 用 され て,食 生 活 を豊 かにし,多 くの機能 が知 られて きてお り,特 に抗菌 性,

徳興(鹿 児島大学農学部助教授)

料 および実験 方法

2.1細胞培養マ ウス新生 児皮膚細 胞(JB6細胞)は5%牛胎

地 で5%CO、,37°Cで培

抗酸 化性 な どの研 究が 進展 してい る。 最近,香 辛児血 清 を含 むMEM培

料 には発癌 予防 の可能性 が ある ことが 指摘 されて養 した。マ ウス肝癌細 胞Hepalclご7は5%牛胎

いる1>。しか しなが ら,こ れ らの報 告 は動 物個 体児 血 清 を含 む αMEM培

でを用 いた 現象 レベル での研究 が多 く,そ の遺伝 子培養 した。

メカニズ ムは ほ とん ど解明 されてい ない。我 々 は2.2細胞癌 化能の解 析(コ ロニー ア ッセ イ)

遺伝 子工 学お よび細胞 工学 な どの手法 を用 いて,

JB6細胞 を用いて コロニ ーア ッセ イを行 った。

地 で5%CO2,37℃

香 辛料 に含 まれる 「癌 予防因 子」が どの ように,細胞 癌化 実験 は軟寒 天内 にJB6細どの遺伝 子 に影響 を与 え るか検討 し,そ の 「抗癌モ ー タ ーTPA(20ng/m1)を胞 に発癌 プ ロ

加 え て細 胞癌 化効 用」 を遺伝子 レベ ルでの解 明 を試 みて いる。 そを誘導 した。5%CO2,37℃のモデル 系 として,日 本独特 の香辛料 で あるワサ化 細胞 の コ ロニー 数 を計測 した。6‑MITCにで2週間培 養 後癌よビを研究 材料 とした。 ワサ ビの辛 みの成分 であ るる細 胞癌 化抑 制作 用 は各種 濃度 の6‑MITCを添

ア リル イソチ オシア ナー トは微生物 の生育 抑制効

加 した状態 でTPA誘果 を持 ち,食 品 の保存 に使 わ れて いる2)。最 近,

養後 癌化細 胞 コロニー の発生抑制 率で計 測 した。

導を行 い,さ らに2週 間培

沢ワサ ビの水抽 出画 分か ら6一メチ ルスル フ ィニ ル

2.3レ

ヘキ シルイ ソチオ シアナー ト(6‑MITC)とホル ボールエ ステル応 答配列 およ びルシ フェラいうポーター遺伝 子 アッセイ成 分が 単離 ・同定 され て いる3)。この成 分 は沢 ワー ゼ遺伝 子 を導入 したJB6細サ ビの特 有の香 りを構 成す る成分 の一つ であ るが,

ター 遺 伝 子 ア ッ セ イ を行 っ た。各 種 濃 度 の6‑

ワサ ビの辛み成 分の 主成分 では ない。そ の生理 的MITCを

活性 に つい て は胃癌 細 胞MKN‑28のた。6‑MITC無増 殖 抑制4}

胞 を用 い て レポー

添加 し,30分 後 にTPAで24時間処理 し添加 の 細胞 を コ ン トロー ル と し

お よび マウ ス実験腫 瘍の転 移抑制効 果が 報告 された。得 られた細 胞上澄液 をル シフ ェ リン基質 と混てお り5),6‑MITCが合 し,そ れぞ れ の蛍 光強 度 を測 定 し,6‑MITC抗腫 瘍成 分 として期 待 されて いる。 そ こで,本 研究 はワサ ビの6‑MITCののAP‑1転1)細 胞癌化 抑制効 果 および その遺伝 子調節 機構,

2.4RNA抽2)発 癌抑 制酵 素で あ るキ ノンオ キ シ ドレダ クタ

6‑MITCをーゼ(QR)の誘 導効 果 お よびそ の遺伝 子 調節 につい て解 析 を行 った。

写活 性 に対 する阻 害作用 を調べ た。
出お よびRT‑PCR
添加 した培 養細 胞 と無 添加 培 養細胞 か らISOGEN(ニッポンジ ーン)でtotalRNAを抽 出 した 。QR遺伝子 お よびGAPDH遺伝子

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浦 上財 団研 究 報告 書Vol.8(2000)の核酸 配列 はGenBankから検 索 し,PCR用のプ ラ イマ ー を それ ぞれ 設 計 ・合成 し た。RT‑PCRは,まず 逆転 写 酵素 を用 いて42℃,30分 でtotalRNAからcDNAを合 成 した。PCR反あた り,QR遺伝 子 お よびGAPDH遺伝 子 の発物 は2%アガ ロー ス

ゲルで電 気泳動 し,エ チ ジウム ブロマイ ドで染色
後CCDカマ ウス肝臓 癌細 胞Hepalclc7を96‑wellプレ添加 し,さ ら に24時 間培 養 した。6‑
添加 の細胞 を対象組 とした。QR活定 はProchaskaら6)の2.6細を軟寒 天で培 養 し,発 癌 プロ モー ターTPA(20ng/ml)を加 えて細 胞 癌化 を2週 間 誘導 した。

TPA誘

導 時 に同時 に添加 し,さ らに2週 間 培養

顕 微鏡 で計 測 した。 その結果 は図1に 示 してい る。

ー トに蒔 いて24時 間培 養 した。 その後各種 濃度 のMITC無細胞 癌化 抑 制能 の解 析 は コロ ニーした。染 色後 それぞれ の癌化細 胞の コロニ ー数 を性測定

6‑MITCを6‑MITCのア ッセ イ を用 いて行 った。マ ウ ス皮 膚細 胞JB6,さ ら に各種 濃度 の6‑MITCをフ ト(富 士 フ イルム)で 行 った。
2.5QR活胞 癌化 に対 す る抑 制効果8・9)

一 方実 験 区で はメ ラ で写 真 撮 影 ・保 存 した。PCR産物 の 定 量 はImageGaugeソ果 と考察

3.16‑MITCのJB6細応に現 を検 出す る最 適鋳型 量お よび反応 サイ クル数 を検 討 した。得 られ たPCR産3.結性測方法 に従 って行 った。

胞 増殖 の測定(MTTアッセ イ)

ール は1万 細胞 あた り1051個 の癌化 コロニ ーが形成 された の に対 して10μM濃 度の6‑MITC添

加抑 制能 が見 られ た。
3.2AP‑1転

レー トに蒔 いて24時 間培 養 した。 その後各種 濃度の6‑MITCを添加 し,さ らに24時 間培 養 した。

6‑MITC無添加 の細 胞 を対 象組 とし た。細 胞増
方 法 に従 って 行 っ

写 活性 に対 す るわ さびの 抑 制効果8・9)
AP‑1は

転 写因 子c‑Jun/c‑Fosのヘテ ロ 複合体 で ホ ル ボ ー ル エ ス テ ル 応 答 配 列(TPAresponsiveelement)にる。AP‑1はた。

よ り誘 導 された細 胞 コロニーの形成 を濃度依 存的 に強 く抑 制 した。 コン トロ

では215個 しか 形成 されず,か な り強 い細胞 癌化

マ ウ ス肝 臓 癌 細 胞Hepalclc7を96‑wellプ

殖 の 測定 はCamichaelら7)の6‑MITCは,TPAに結合 す る転 写 因 子 で あ細胞 増殖 お よび細胞 分化 に深 く関与する。 そのモ デル系 として,マ ウ ス新生児 皮膚 の図16‑MITCのマウスJB6細 胞癌化に対する抑制効果

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香辛料の細胞癌化に対する抑制効果およびその遺伝子機構の解析

図36‑MITCのHepalclc7細胞増殖の抑制効果

図3に 示 した ように10μM以 上に設定 す る と細胞の死 減す る割合 が急増 す るこ とか ら,1μMの6‑図26‑MITCのAP‑1転

写活性 に対する抑制効果

MITCはJB6細 胞 はTPAで処理 する とAP‑1の 転 写活 性が誘 導 され,細 胞 の トランス フォメー シ ョン(細細胞 に毒 性が な く最 適濃度 と設定 した。

3.46‑MITCに
QRはよるQR活性 の誘導効 果1°)

キ ノンオ キシ ドレダ クター ゼで,肝 臓 第胞癌化)を 引 き起 こす こ とが知 られて い る。 そ こ

二相解 毒酵素 の一っ であ る。 最近,食 品素材 な どで6‑MITCのJB6細に こう した解 毒酵素 の誘導 を促進す る化学物 質が胞 癌化 の抑制 効 果がAP‑1

転写活 性 に関与 するか どうか調べ た。 ホル ボール

見出 されて きてお り,実 際 に動物実験 系 におい て

エス テル応 答配列 お よび ルシ フェラー ゼ遺伝子 をも効果 が認 め られて いる。 この ように食品素 材 に導入 したJB6細よ る第 二相解 毒酵素 の誘導 は癌予防 に直接 関与 し胞 を用 いて レ ポー ター遺 伝子 アッセ イを行 った。 その結果 は図2に 示 してい る。

てい る と考 え られて いる。 そ こで ワサ ビ6‑MITC

6‑MITC無に よる肝臓QR活

添加 の コ ン トロ ー ル に はTPA(20ng/m1)で2.7倍が,6‑MITCののAP‑1転

写 活性 が誘 導 され た

添加 に伴 いAP‑1の 転 写活 性が 濃

度依 存 的 に減 少 した。 即 ち,6‑MITCは存的 にAP‑1転6‑MITCに濃度依写活性 を抑制 した 。 これ らの結 果,よ るJB6細胞癌 化抑 制 の遺伝 子調 節

機 構 として は,6‑MITCがす転写 因子AP‑1の果,6‑MITCがQR酵性 の誘導効 果 を調 べた。 その結
濃 度依 存 的 にマ ウス肝 癌 細胞 の素活 性 を誘 導 し た。1μMの6‑MITC,24‑48時 間 の培 養で細 胞 に対 して毒 性 がな く,最大のQR酵素活 性(約2.4倍)が誘 導 され た(図4)o細 胞癌 化 を 引 き起 こ

活性 をブロ ックす る と考 え られた。
3.3マウ ス肝癌 細胞Hepalclc7に対 す る細胞増 殖抑制 活性1°)6‑MITCは,抗腫瘍 成 分 とし て研 究 され た もので あ り,強 い細 胞毒性 を有 して い る。QR活性誘 導実験 の試 料濃 度 を決定 す るた め にHepalcl
c7に 対 する細胞 増殖抑 制活性 を調べ た。生 細胞 数の測定 は,MTTアッセ イに よ り行 った。 結果 は

図46‑MITCのQR酵素活性の誘導効果

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浦 上財 団研 究 報告 書Vol.8(2000)

図56‑MITCのQRmRNAの3.56‑MITCによ るQRmRNA発

現 量 の誘よるQR酵素 の遺 伝 子 レ

ベ ルで の誘 導機構 を解 析す るた めにRT‑PCR法を用 いて,QR遺濃 度 依 存 的 にQR

誘導 した 。1μMの6‑MITC,12時間の培 養 で細 胞 に 対 し て毒 性 が な く,最 大 のQR
mRNA発

現 量(約3.3倍)をmRNAの

発 現量 とQR酵細胞 増殖 に関与 す る転 写 因子AP‑1の転 写活性 を抑制 し,発 癌 プロモ ーターTPAによる細胞癌化 を阻 害す るとい う遺 伝子機 構 を明 らか

伝 子の発 現 を検出 した。図5に示 した よ う に,6‑MITCはmRNAをした 。 レポ ー タ ー 遺 伝 子 ア ッセ イの 結 果,6‑
MITCは導効 果1°)
さ らに,6‑MITCに誘導効果

誘 導 し た。QRに した。 また,6‑MITCは発癌 抑 制酵 素 として

肝 臓 キノンオ キシ ドレダ クターゼ活性 を強 く誘導し,そ の活性誘 導 は遺 伝子転 写 レベ ルに よる ものと考 え られた 。

謝辞

素 活性 との間 に高 い相関 が得 られ た。 これ ら の結 果,6‑MITCがQR
酵素 の転写 制御 に関与 してい る と考 え られ た。

この研究 を遂行す るに あた り,研 究助成 を賜 りました浦上食 品 ・食 文化振 興財団 お よび 関係各位に心 か ら感謝 す る と共 に貴 財団 の益々 の ご発展 を

4.まとめ

祈念 いた します。

香 辛料 は調味料 だ けではな く,生 体 調節機 能物

また,6‑MITCなどを ご提 供 して下 さ った 東

質 として の用途 も期待 されて い る。本 研究 は 日本

京都 立短期 大学健 康栄養 学科福 家洋子教 授 に謹 んの代 表的 香辛料 であ るワサ ビにっ いて細胞癌 化 にで お礼 申し上 げます。

対 する抑制 効果 お よびその遺 伝子機構 の解 析 を行った。 ワサ ビ6‑MITCは

発癌 プ ロモー ターTPAによ るマ ウ ス新 生児皮 膚細胞 の癌化 を著 し く抑制

文献1)大澤俊 彦:が ん予防食 品の開発,シ ー エムシー(1995)

香辛料の細胞癌化に対する抑制効果およびその遺伝子機構の解析
2)IsshikiKandTokuokaK:Allylisothiocyanateand397)CarmichaelJ,DeGraffWG,GazdarAF,MinnaJD

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信:わさび6‑MITCのkuhinKogyoGakkaishi,43:1092‑1097(1994)4)福
毅:沢家 洋 子,大石 芳 江,岩下 恵 子,小化 の 抑 制 作 用,日野 晴 寛,篠わ さ び の 胃 ガ ン 細 胞 増 殖 抑 制 作 用,日原 和

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家 洋 子,J‑JLi,NHColburn,藤信,福 家洋 子:ワ サ ビ6‑
誘 導 およ びその 転写機

本食品 科学 工学 大会 第47回 大会 講演 集,21

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URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVo1.8(2000)

InhibitionofmouseJB6celltransformationandinductionofNADPH:
quinoneoxidoreductaseby6‑MITC(EutremawasabiMaxim)
De‑XingHOU(DepartmentofBiochemicalScienceandTechnology,FacultyofAgriculture,KagoshimaUniversity)

6‑MITC(6‑methylsulfinylhexylisothiocyanate)ispotentantiproliferativecompo‑
nentsfromwasabi(EutremawasabiMaxim).Weassessedtheeffectsof6‑MITContransformationofmouseJB6cell.Theresultsshowthat6‑MITCcouldinhibitTPA‑
inducedtransformationofJB6P十cellC141inadose‑dependentmanner.Sinceour
previousresultsindicatedthatinducedAP‑1activityisrequiredfortumorpromoter
induced‑transformation,wetestedwhetherinhibitionoftumorpromoter‑induced
transformationby6‑MITCisthroughanAP‑1inhibitionmechanism.Ourresultsfrom
reportergeneassayindicatedthat6‑MITCinhibitedAP‑1activityatthesamedoserangeforinhibitionoftransformation.Theseresultsdemonstratedthat6‑MITChas
inhibitoryeffectsonJB6celltumorpromoter‑inducedtransformationandprovidedthe
basicknowledgeforunderstandingof6‑MITCactionontumorprevention.
Apotentialmechanismofdietaryanticarcinogenesisinvolvestheinductionof
detoxifyingphaseIIenzymessuchasNADPH:quinoneoxidoreductase(QR).This
study,therefore,examinedtheabilityof6‑MITCtoaffectcellularexpressionofQRin
murinehepatomacells.Hepalcic7cellsweretreatedwithvariousconcentrationsof6‑MITC,andthenwereassessedforQRactivity,cellgrowth,andQRmRNAexpression.

6‑MITCinducedQRactivityandQRmRNAlevelsinadose‑dependentmannerattheconcentrationrangeofO.1to1,uM.Asignificantcorrelationbetweentheexpressionof
QRmRNAandthecorrespondingQRactivitywasobserved.Theresultsdemonstrated
thatwasabiiscapableofQRinductioninHepalcic7cellsbypromotingQRmRNA
expression,andsuggestanovelmechanismbywhichdietarywasabimaybeimplicatedincancerchemoArevention.