浦 上財 団 研究 報 告書VoL13(2005)98〈平成16年度〉

細 胞壁 テ クスチ ャー におけ るペ クチ ンメチルエ ス テ ラーゼ
阻害 因子 の分子 遺伝 学 的解析
入船浩平(県立広島大学生命環境学部教授)に関わ るポ リガラク ツロナーゼ 酵素の 阻害 タンパ
1.結言ク(以 下,PGIP)の
植物細 胞壁 の構成 成分で あるペ クチ ン質は,他遺伝 子が クロー ン化 され このPGIPが 抗 菌活性 を有 し植物 細胞 にお け る抵抗 性のセ ルロー ス,リ グニ ン等 と異 な りペ クチ ンメチ

シグナ ル伝 達の重 要 な要 因 となって いる ことが推

ルエ ステラ ーゼ(PME)酵

測 され てい る。本 研究 で は,PMEI遺素群の 働 きによ り可逆伝 子の抗 菌的 に硬軟 化 す る。食 品加 工の 立場 か ら は,PME活性 を調 べる ため,同 遺 伝子 のプ ロモー ター領域の残存 活性が 植物組 織の硬 度保持 や果汁 の濁度,を単離 し,塩 基 配列特性 を明 らか にした。 また,粘度 に著 しい影響 を及ぼす こ とが 知 られ,そ の効

キ ウイ フルー ツ灰 色 カ ビ病 病 原菌 であ るBotrytis

果的 な除去 が課題 とな ってい るL21。近年,こ れ らcinereaよりエ リシター成分 を調整 し,こ れ に対す

PME酵 素 群 の働 きを阻害 す る タンパ ク因 子が キるPMEIの 応 答を遺伝 子発現 レベ ルで解析 した。

ウイ フルー ツ 果実 よ り精製 され構造 が 解析 され

2.材 料 および 方法

た3。 この 阻害 因子の遺 伝子 を高発 現す る組換 え
体作 物 を作 成す るこ とによ り,こ れ まで極め て困

2.1形

質転換細 胞の選抜 と育 成

難 であ っ たPME活 性 の除 去 を内在 的 に行 う こ と(1)導入 ベ クターの構築 と遺伝 子導入:恒 常が で きると期待 される。 例え ば,ジ ュース製造 過的に発現 す るプロモ ー ター(CaMV35S)の

程 にお い て可 溶性 ペ クチ ンは,PME残これ まで に得 てい るPMEI遺 伝子 をつ ない だベ ク

存 活性 に下流 によ り析出沈 殿 しジュー スの濁 度を低下 させ るが,ター(p35S‑PMEI)を精 製 され たPME阻 害 タンパ クの 添加 に よ り濁 度

イ グ ロ マ イ シ ン耐 性)遺 伝 子 を 含 む ベ ク タ ー作成 し,選 抜 マー カー(ハを保持 す る こ とが 可 能で あ るこ とが 示 され てい(pCH)とる。これ らの加 工上の添 加操作 は遺伝 子組換 え体社PDS1000/He)をによ り,内 在的 に より効 率的 に行え る と期待 で きへ導 入 した。導 入条件 は,培 地 を入れ た551nmシる。

用 いて アスパ ラ ガス培 養細 胞

ャ ー レ上 に 広 げ た 培 養 細 胞 約450mgへ 圧 力

本研究 者 らは,最 近 この 阻害因子 の遺伝子 をキウ イフ ルー ツ果実cDNAラ

イブ ラ リー よ り単 離し,報 告 した1。 そ こで本研究 では,こ のPME阻害(PMEinhibitor,以ともにパー テ ィクルガ ン装 置(BioRad下,PMEI)遺伝子 を用いた組換 え細胞 におけ る発現解 析,組 織 の生理 学的

900psi,0.83μg/0.5mgAu/shot,24inch減圧下で1シ ャー レ当た り1シ ョッ トとした。
また,コ ン トロール として,pCHのみ を導入 した形 質転換 体の作 出 も行 った。
(2)形質転換体 の選抜 と同 定:遺 伝 子導入 後

解析 を行 い,実 用化へ 向け ての検討 を行 うもので培 養細 胞 を ハ イグ ロマ イ シ ン100ppmを 含 むMSある。 さ らに,近 年,PMEと培 地上 で育 成 させ,4〜5週

同様 にペ クチ ン代謝

間 後に耐 性株 を選 抜

細胞 壁 テ クスチ ャー にお けるペ クチ ンメ チル エ ステ ラー ゼ 阻害 因fの 分f遺し た。耐 性 株 か らCTAB法
PMEIおでDNAを抽 出 し,よ びハ イグロマ イ シン遺伝 子特異 的 ブラ

液 を 添 加 し,添問 目 毎 に 葉(約100mg)を動 にて増幅 断片 長か ら導入遺伝 子の有無 を確認 しkitを 用 い てtotalRNAをた。

を質転 換細胞 の解析(1)遺PMEIの 発 現 を確 認す るた め,PCRにより確認 され た 形 質 転 換 細 胞5系

統 各α5gを 用 い てRNAquaouskit(Ambion社)に

よ りRNAを 抽 出し,RNAreversetranscriptaseを逆 転写 を行 い,PMEIプ

用 い てDNAへラ イマ ーに よ りRT‑PCRを行った。
(2)酵用いcDNAをPMEI遺回 収 し,RNAqueous
回 収 した 。こ のRNA1μgてTranscriptorfirststrandcDNA

synthesiskit(Roche社)に

伝 子 ベ ル の解 析:形 質 転 換 細 胞 の99
エ リ シ ター

加 後0,3,6,12,24,36,48時

イマー を用 い たPCRを 行い アガロー スゲル電気 泳2.2形

伝 学的 解析成 培 地 に 置 床 し た 。 直 後 に,100,ulのよ り逆 転 写 反 応 を 行 い,得 た 。 これ を も とに 各 時 間 に お ける
伝 子 の 発 現 量 をrealtimePCR法に よ り解

析 し た 。 解 析 に は,STRATAGENE社Mx3000Pを 用 い た 。 ま た,対照 区(H、0処理)とエ リシ ター 処 理 区 そ れ ぞ れ にPolygalacturonaseinhibitorprotein遺伝 子(PGI),beta‑tubulin遺伝 子の 一部をそれ ぞれ キウイ ゲノム よりクロー ン化 しこれ ら

素 レベルの 解析:PME活性 を中和滴 定の 発 現 も 併 せ て 解 析 し た 。PCR条

件 は,95℃法 にて測 定 した。 上記 と同 じ系統 の細 胞約5gか10min.95℃15sec.60℃lmin.を40サ

イ クル で 色ら,粗 タンパ ク液を抽 出 しこれを酵素 液 とした。

素 に は サ イバ ー グ リ ー ン を用 い た 。

基 質に はオ レンジ由来 ペ クチ ンを,測 定に は平 沼
自動 滴定装 置ComtiteCOM‑900を用 いた。活性 測定 方法 は,VanBurenら(1968)に従っ た51。

2.3PMEIの(1)PMEIプ

抗菌 活性 についてま た,上述 の エ リ シ ター 液 は,キcinereaから 調 整 し た 。 菌 株 は,愛か ら供 与 頂 い た 。 調 整 法 は,前

ロモー ター領 域 の単離:キ ウ イ

フル ーツ ゲ ノム よ りDNAを 抽 出 し,数 種 の制 限

3.結

媛 県農業試 験場
報 に 従 っ た 酎。

果 と考 察酵 素 で断 片化 し,こ れ まで に得 たPMEIcDNA断3.1形

片 をプ ローブ にSouthernhybridizationを 行 った。

18シ ャー レ(450mg×18)へ

2.Okb断片 長 を持 つHind皿 制限酵 素処 理 区か ら既ウイ フルー ツ

果 実 に 感 染 性 の あ る 灰 色 カ ビ 病 菌 で あ るBotrytis

質転換細 胞の選抜 と育 成
遺伝 子導 入を行 い,ハ イグ ロマ イシ ン耐性 株194株 を得 た。 また,得知 のPMEI翻 訳 領域 を基 に設計 したprimerを 用 いられ た耐 性株97株 のDNAをてinversePCRを確認 を行っ たと ころ,83株 で導入遺 伝子が 認め ら

行 い,断 片 を回収,selfligation

して,同 遺 伝子 のプ ロモー ター配列の クロ ーン化れた(図1)。

を行った。 得 られた断 片は,pUCI9ベ

効率 は,約2%とク ターに挿その結果,選 抜 効率が84%,組換えな り,こ れまでパ ーテ ィクル ガ

ン法 で多 くの種の培 養細胞 で得 られ てい る組換 え入 し塩基配 列 を決定 した。
配列情報 は,PlantCARE植

用 いて 導入 遺伝 子の物 遺伝子 プロモ ー タ

効率 と比較 して も高 い もの であ った71。

領 域 解 析 ソ フ ト(http://intra.psb.ugent.be:

3.2形

8080/PlantCARE/)に

上記PCRで 導入遺伝 子が確 認 され た形 質転換株(2)PMEI遺よ り解析 した。

伝子 の発 現応 答:無 菌 的に育 成

質転換 細胞の解 析

5株 を 用い て導 入遺 伝子 キ ウ イフ ルー ツ 由来 のしたキ ウイ フルー ッ(Actinidiadeliciosa)実 生株

PMEIが 発 現 して い るか をRT‑PCR手か ら若い葉(長 径約2cm)を認 した。5株 いず れも導入遺 伝子 によ ると推定 さ切 り取 り,カ ルス育法 に よ り確100

浦上 財 団研 究報 告 書VoLl3(2005)

図1P¥iEliit伝
1,H20.2.非子 導 入組 換 えア ス パ ラ ガ ス のPCRに組 換 え 体.3..4.ハよる確認

イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 株.5.Sl7emarker:IamdaU¥.‑1HindlD,6.plasmidvectorp35S・PNIEI

図2PNIEI組れ るPCRバ ンドが 確認 された(図2B)。
マ イシ ン耐 性遺伝 子(pCH)のハ イグロ

みの形 質転換体 および非形質 転換体 を用 いた コン トロー ルでは バ ンドは確認 されな かった(図2B)。

換 え ア ス パ ラ ガ ス細 胞 に お け るPME酵とPJIEI遺1.‑5,PNIEI組

素 活 性(A)伝子の発現

換 え 細 胞,6..7.pCH組

p35S‑PMEIコ

換 え 細 胞,8..9.非組 換 え 細 胞.10.

ン トロ ー ル ベ ク ター

統学上 は類縁 の遠い種 であ るこ とは注 目される。
また,本 研 究の結 果は,未 分化培 養細胞 での結この ことは,導果であ りア スパラ ガス再分化 個体で の分化 の こと入遺 伝子が アス パラ ガス細胞 において 発現 していなる組織 間の特 性 などは現段 階で は未定で ある。

ること を示 唆 している。 この場 合,ア スパ ラガス

目下,組 換 え培 養細 胞を再分 化培地 に置床 し,こゲノム に もPMEI様 の遺伝 子が 存在 する可 能性 もれ らの再 分化 を誘導 中であ る。 これらの解 析は今考 え られ るが培養 細胞 中では極 めて低 い活性 のた後の課題 としたい。

め発 現 は認 め られない もの と考 え られ る。他 方,

3.3PMEIプ

導 入遺 伝子 はCaMV35Sプ

キ ウイ フルー ツゲ ノムDNAをPMEIcDNA中

ロモ ー ターの制 御下 にロモー ター領域 の単離にあ り培養細 胞中 で も強 い発現 を示 したもの と考え

切 断 サ イ トを 持 た な いHind皿 で 断 片 化 し,られた。

PMEIcDNAをまた,上 記 と同 じ材料 か ら抽 出 した酵素液 を用
い てPME活性 を測定 した ところ コ ン トロー ルでプロー ブ にサザ ン法 を行 っ た ところ,約2.Okbの バ ン ドを含 むい くつ かの バ ン ドが得 られた(図3A)。

これ らの断片 は,PMEI遺伝

は,非 形 質転換 体,ハ イグ ロマイ シン耐性遺 伝子

子の プロモ ーター領域 を含 む可能性 があ るため,の み の形 質転 換 体 と も3.5〜4.OPEuの活 性 が認 め

ク ロー ン化 しやす い2.Okbのバ ン ドを ター ゲ ッ トられた のに 対 し,PMEI形質転 体5株 で は,活 性値 を認め られ なかった(図2A)。
これ らの結 果 は,キ ウ イフル ーツ由 来PMEI遺伝子 に よ りアスパ ラ ガス細胞 中で 発現 したPMEIが ア スパ ラ ガスPMEの 活 性 を阻 害 した こ とを示してい る。 これ まで,invitroで は,キ ウ イフルー
ツPMEIタンパ クが 各種植物 由来 のPME活 性 を阻害 す る こ とが 報 告 され て い るが8,本報告 でinvivoにおけ る異種 間の 阻害効 果が 初め て認め られ

図3Y¥fEI遺イゼLシた。 特 に,両 植 物種 は,双 子葉 と単子 葉 という系

増 幅(B)

伝一∫・の キ ウ イ フ ルー ツ ゲ ノム との サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ
ョ ン(A}とP¥1)
1遺 伝 子 断片 のinversePCRによる

細 胞壁 テ クス チ ャー にお ける ペ クチ ン メチ ルエ ス テラ ーゼ 阻害 因fのに電気泳 動 後,2.Okb付 近のDNAを後,inversePCRを回収,ligation

3.4PMEI遺行っ た。その結 果,約1.8kbの増 幅バ ン ドが 得 られ た(図3B)。

分 臼 堂伝 学 的解 析101

伝子 の発現 応答 を調べた。
伝子 の発現応 答対 照 と して 用いたPGIは,これ まで病原菌 の感

これ をク ロー ン化 し塩基配列 を決 定 した 。その染 に応答 し遺伝子発 現が上 昇す るこ とが知 られて結 果,2,0kbの 内,約830bpがPMEI遺伝子 プ ロモ
ー ター領 域で あった 。この配列 を植物 遺伝 子プ ロい るu。 本研 究 において もエ リ シター処理6時 間

モー ター領域 解析 ソフ トで ある"PlantCARE°

上昇 が観 察され た。一方,PMEI遺に

後 に0時 間の約300倍(対 照 区の約600倍)の 発現
伝子 は,0時 問て解析 した ところ,翻 訳開 始点 か ら上 流831pbにか ら48時間 の 問,約4倍

セロ リのPRI病 原菌 抵抗性 遺伝子 プ ロモー ター にが,明 らかな誘 導は 観察 で きず,対 照 区(H,0)

み られ るEIRE(10bp),おとの差 異 は認め られ なか った(図5)。

よび上流438bpに タバ コ

PR2遺 伝子 プロ モー ター にみ られ るBoxWl配(8bp)(エ列リシ ター 応答す る シス配 列)と 相 同性 のあ る配列 が存在 してい た旧 ゜(図4)。

程 度の 範 囲で上 下 したは,少 な くと もPMEIがPGIとこの 結果

菌感 染応 答に 対す

るメ カニ ズムにお いて遺伝 子発現 レベ ルに差が あるこ とを示 して いる。

これ らの菌 応答配列 の存在,お よび,病 原菌 にはPME活 性 を持つ ものが 多い 事実 か ら,本 遺伝

今回 の実験 で は,PMEIは用 いた菌 系統 のエ リ

シター に対 し応 答を示 さなか ったが,今 後,さ ら性 を抑 制す る ばか りで な く病原に,菌 株 の系統 による差 異,胞 子感染 に対す る応

菌由 来 のPMEに 対 す る抑制 活性 が 新た に予 想 さ答性,レ ポー ター遺伝子 を用 いた一過 的発現応 答れた。 そ こで,キ ウイフ ルーツの 主要 な病 害の一性 につ いて も検討 し,PMEIのつ で あ る灰 色 カ ビ病 の 病 原菌 の であ るBotrytis

つ いて総 合的 な検 証 を続 ける必 要があ る と考 えら

cinereaか ら調 整 した エ リ シター 液 に対 す る本遺れる。

子 が 内在PME活

図4PMEI遣
下線部

は.EIRE;タバ コPR‑2遺菌感 染の応 答性 に伝 子 プ ロ モ ー ター 領 域 の 塩 基 配 列

伝子 プ ロモ ー ター に 存 在 す るエ リシ ター 応 答 配 列。

プ ロ モ ー ター の 存 在 す る エ リ シ ター 応 答 配 列 。 点 線 部 は,TATA‑box,太一線 は 翻 訳 開 始 点,矢は,BoxW1:トウ モ ロ コ シ,セ印 は.inversePCRプ

ロ リPR‑1遺伝子

ラ イ マ ー サ イ トを 示す 。

浦 上財 団研 究 報告 書Vol.13(2005)

102

図5PNIEI,PGIお

よ びQ‑tubulin遺伝 子の エ リ シ ター 処 理 後 の発 現 応 答

benzoquinoneinsuspensionculturesofPanaxginsengby

謝辞

本研 究に対 し多大 の こ助 成 を賜 りました浦上 食品 ・食文化振 興財 団に,厚 く御礼 申 し上 げ ます 。

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Moleculargeneticanalysisofpectinmethylesteraseinhibitorgenefromkiwifruit

103

Moleculargeneticanalysisofpectinmethylesteraseinhibitorgenefromkiwi
fruit

KoheiIrifune(DepartmentofLifeSciences.PrefecturalUniversityofHiroshima)

Pectinisamajorconstituentoftheprimarycellwallandthemiddlelamellainhigher
plants.Pectinmethylesterasecatalyzesthedemethylationofesterifiedpectin,whichhasbeen
proposedtocausechangesintissuefirmness.
Pectinmethylesteraseinhibitor(PMEI),whichactsasapowerfulinhibitorproteinof
PMEenzymesofplantorigin,hasbeenreportedfromkiwifruit.Ithasbeenproposedthatthe
physiologicalroleofPMEIistheregulationofcellwalldegradationandfruit‑ripening
processesbyinteractionwithPMEenzymes.Furthermore,theapplicationofPMEIproteins
tofoodtechnologyispotentiallyinteresting,becausePMEcausesmanycommercially
deleteriouseffectssuchasphaseseparationduringjuiceproductionandchangesintissue
firmnessduringfoodprocessing.Here,wereportthemolecularcharacteristicsofthePMEI
genefromkiwifruit.
TransgenicanalysisofasparaguscalliexpressingakiwifruitPMEIgenedrivenbythe
CaMV35SpromoterdemonstratedinvivoinhibitioneffectsofPMEIontheendogenouspectin
methylesterase(PME)activity.
The832bp‑promoterregionofthePMEIgenewasisolatedfromkiwifruitgenomeby
inversePCRmethod,whichhashomologysequenceswiththepathogenresponsiveelements.
EIREandBoxWIoftobaccoPR‑1andparsleyPR‑2genes,respectivelyToelucidatethe
responsibilityofPMEIgenetothepathogen,relativegeneexpressionofPMEIand
polygalacturonaseinhibitor(PGI)byrealtimePCRmethodwasdoneafterelicitortreatment
madefromBotrytissinereawhichcausesgraymolddisease.TherelativeexpressionlevelofthePMEIgenedidnotshowclearresponsibilitytoB.cinerea,althoughthatofPGIshowed
300timeshigherat6hrthanatOhrafterelicitortreatment.
Inconclusion,thekiwifruitPMEIworksasaninhibitortoplantPMEinvivoand
possibilityofapplicationofPMEIproteinorgeneforfoodmaterialswassuggested.