ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化ならびに老化モデルの作製

ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化ならびに老化モデルの作製
田中進・麩谷健介・吉田南海香・澤近美彩

Decidualization of the human endometrial stromal cells and aging models
Susumu TANAKA, Kensuke FUTANI, Namika YOSHIDA and
Misa SAWACHIKA

要

旨

ヒトにおいて胚が着床するためには、子宮内膜に含まれる間質細胞が着床に先んじて脱落膜化する必要がある。実験動物においては胚着床後にのみ脱落膜化が開始されるため、ヒトの脱落膜化の研究を行う際に実験動物は適さない。そのため、脱落膜化の研究はヒト子宮内膜組織より単離された初代培養ヒト子宮
内膜間質細胞を用いて研究が行われてきた。本研究ではヒト子宮内膜間質細胞株である KC02-44D 細胞に対して細胞膜透過性の 8-Bromo-cAMP を用いることで脱落膜化に要する時間を短縮したモデルを作製し、その後の脱分化も確認した。さらに酸化ストレスによる老化モデルを作製した。老化モデルでは脱落膜化マーカーの発現に変化は生じなかった。一方で、老化モデルは炎症性サイトカインを含む細胞老化関連分泌形質の産生・分泌が亢進しており、分泌された細胞老化関連分泌形質が周りの細胞の脱落膜化や胚着床に何らかの影響を与えている可能性が示唆された。
キーワード：子宮内膜、脱落膜化、cAMP、老化

所属：
長崎県立大学看護栄養学部栄養健康学科
Department of Nutrition Science, Faculty of Nursing and Nutrition, University of Nagasaki, Siebold− 39 −

長崎県立大学I

看護栄養学部紀要

背景と目的

第22巻 （2024）

ヒト子宮内膜は月経後の約 2 週間、排卵までの時期に、卵胞からのエストロゲン（E₂）の影響を受け、機能層は厚くなる 1）。排卵後、約 2 日
で黄体が形成され、黄体からのプロゲステロン（P4）の分泌が開始される。その影響を受けて子宮内膜では子宮腺上皮が発達するともに活発に分泌活動を行うようになる。この時、P4 が子宮内膜の間質にも働きかけることで子宮内膜は胚受容のための「脱落膜化」という分化を起こす。
この脱落膜化は主に子宮内膜に含まれる間質細胞（Endometrial Stromal cells, EnSC）で起こり、核の拡大、核小体の増加、細胞質内での脂肪滴やグリコーゲンの蓄積、膜境界に存在する分泌顆粒、ゴルジ体と肥大化した粗面小胞体、さらに線維芽細胞様から上皮細胞様への形態学的な変化が見られる 2, 3）。妊娠が成立しない場合は、は IL15 分泌による子宮ナチュラルキラー細胞の量や分布の制御を行い、本来異物と認識される
受精卵や生育した胚への攻撃を弱める免疫寛容を制御する。それらの結果として、EnSC は胚の着床、胎盤の成長、ならびに妊娠の維持を制御する。脱落膜化に異常が生じると着床障害や流産、妊娠高血圧腎症、胎児発育不全、癒着胎盤などが起こるため、胎児の正常な発育において
EnSC の脱落膜化は非常に重要である 9）。
ヒトでは着床に先立ち EnSC の脱落膜化が起こる（すなわち脱落膜化に胚着床を必要としない）のに対し、実験動物（ラット、マウス、その他の哺乳類）では胚着床後にのみ脱落膜化が開始されるという大きな違いがあり、ヒトの脱落膜化の研究を行う際に実験動物は適さない 10, 11）。これらのことから、ヒト子宮内膜の脱落膜化の研究は、
ヒト子宮内膜組織より単離された初代培養ヒト
EnSC を用いて研究が行われてきた 9）。しかしな

分泌期が 10 〜 12 日間続いた後、子宮内膜は月経を起こす。月経により、子宮内膜の機能層が剥がれ落ち基底層が残存する。この一連のサイ
クルを月経周期と呼び、通常約 28 日間である。
黄体からの P4 分泌が開始された後、ヒト子宮内膜での cAMP レベルの上昇が観察される。単離 し た ヒ ト EnSC に お い て も P4 に 反 応 し て 細
胞内の cAMP レベルが上昇することから、これは主に EnSC での cAMP の上昇を見ているものと考えられる 4）。P4 反応後に EnSC の細胞内で上 昇 が 観 察 さ れ る cAMP は cAMP 依 存 性 プ ロ
テインキナーゼの活性化を介して cAMP 応答配列結合タンパク質（cAMP responsive elementbinding protein, CREB） を リ ン 酸 化 さ せ る 5）。
こ の リ ン 酸 化 さ れ た CREB が CREB 結 合 タ ン
パク質と結合することで脱落膜化のマスターレ
ギュレーターである forkhead box O1（FOXO1）や heart and neural crest derivatives expressed2（HAND2）等の転写制御因子群を活性化し 6）、
そ の 結 果 と し て、Insulin-like growth factor
binding protein 1（IGFBP1）、 プ ロ ラ ク チ ン（PRL）、ならびに interleukin 15（IL15）の産生が起こる 7, 8）。
脱 落 膜 化 の 結 果、EnSC は IGFBP1 に よ っ て
胎盤形成を司る絨毛外栄養膜細胞（Extravillous
trophoblast, EVT）の遊走を制御し、PRL を分泌することで胎児や胎盤に酸素や栄養素を供給するらせん動脈のリモデリングを行う。さらにがら、初代培養ヒト EnSC を脱落膜化させるためには生体内同様、約 2 週間の P4 による刺激が必要であり時間を要する 12, 13）。さらに、患者由来であるため、年齢、経験月経回数の違い、月
経周期中での採取時期の違い等、その反応性に個人差があるといった問題点も含んでいる。
そこで本研究の第一目標として①脱落膜化に要する時間の短縮と②患者個々人のバックグラ
ウンドの違いによる差の２点を克服するため、
P4 刺激後に上昇し脱落膜化を促進させる細胞内
cAMP の上昇に着目し、さらに樹立されたヒト
EnSC 株 KC02-44D14）を用いることで、問題点を克服した脱落膜化モデルの作製を試みた。
一方、元来、妊孕性低下のほとんどは受精卵が原因と考えられてきたが、体外受精時の着床前胚
染色体異数性検査の導入によるデータの蓄積が大きな要因となり、現在では着床不全の約 3 分の
1 以上は母体子宮内膜の受容性（すなわち適切な子宮内膜の脱落膜化）が不十分なことが原因であることが明らかとなっており 15）、「子宮内膜由来の着床不全の解明」が、産科学・婦人科学領域における喫緊の問題となっている。近年、月経を重ねるごとに子宮内膜の基底層に老化 EnSC が残存すること、ならびにそれらと脱落膜化の障害との関係が示されている。老化 EnSC と子宮内膜可塑性の低下、流産等への関与 16）、着床不全への先行 17）、ならびに着床不全との関連も示唆された 18）。ただし、老化 EnSC の子宮内膜機能への− 40 −

ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化ならびに老化モデルの作製

影響は、依然として包括的な理解がなされていない。そこで第二目標として、作製した脱落膜化モデル細胞を用いて、産婦人科領域の喫緊の問題である EnSC の老化モデルの作製を試みた。

II

材料と方法

ル ー プ 6：12 日 間 の E₂、MPA、 な ら び に 500µM 8-Bromo-cAMP 刺激群。グループ 3 の処理にて脱落膜化マーカーの有意な上昇が確認できたことから、これから後はグループ 3 の処理を脱落膜化処理と呼ぶ。
細胞の DAPI 染色と画像処理方法

細胞培養

ヒ ト EnSC 細 胞 株 KC02-44Dを ATCC（Manassas, VA） か ら 購 入 し た。DMEM（4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine, phenol red 含 有 ）（Life Technologies, NY, USA） に 10% fetal
bovine serum（FBS）、ならびに 10 mM HEPES（Life Technologies）を加えた培地（DMEM-FBS）
にて、CO₂ インキュベーター（37℃、5% CO₂）
内 で 100 mm dish に コ ン フ ル エ ン ト（8.8 ×
106 cells）になるまで 3 日おきに培地を交換しながら培養した。コンフルエントになった細胞は実験に応じて 12 well プレートへ 1 well あたり 0.1
× 106 cells を継代した。

6 well プレートに滅菌したカバーガラスを敷き、そこに細胞を播種した。細胞は 6 日間の未処理コントロール群と脱落膜化処理群とした。6日後、培養した細胞を PBS で洗浄した後、ホルムアルデヒド溶液で室温 10 分固定し、メタノー
ル 4℃で 5 分間細胞膜の透水処理を行った。その 後、DAPI-Fluoromount-G で 封 入 を 行 い、 核を DAPI で染色した。染色像は LSM700 共焦点レーザー顕微鏡（カール・ツァイス社 , BadenWürttemberg, Germany） で 取 り 込 み、 未 処 理
群 198 cells、 脱 落 膜 化 処 理 群 44 cells の 細 胞の 核 の 大 き さ を 計 測 し た。 画 像 処 理・ 計 測 はImageJ を用いて行った。

8-Bromo-cAMP による脱落膜化誘導ウェスタンブロッティング法

播種後の KC02-44D 細胞がコンフルエントにな っ た 後、 培 地 を DMEM（4.5 g/L D-Glucose
含有 , phenol red 不含：phenol red に E₂ 様作用が知られるため）に 10% Charcoal stripped（CS）-FBS（活性炭を用いることで血清中に含まれるホルモンを吸着・除去する）、10 mM HEPES（Life Technologies）ならびに 1% GlutaMAX を加えた培地（DMEM/CS-FBS）に変更した。そこに E₂（10-⁸ M）、P4 アナログである酢酸メド
ロキシプロゲステロン（MPA）（10-⁶ M）、ならび に 細 胞 内 の cAMP を 人 為 的 に 上 昇 さ せ る た
めの膜透過性のある cAMP アナログ（8-BromocAMP）19） を 添 加 し た。 培 地 交 換 は 3 日 お きに 行 っ た。6 日 間 の E₂ と MPA 刺 激 の 際 に 0、150、500 µM の 8-Bromo-cAMP を加えることで脱落膜化が起こるかを検討した。脱落膜化へのcAMP の適性濃度（500 µM）を得たのち、条件群として以下の 6 群を用意した；グループ１：6
日間の DMEM/CS-FBS 培地での培養群、グルー
プ２：6 日間の E₂ と MPA のみでの刺激群、グル ー プ ３：6 日 間 の E₂、MPA、 な ら び に 500µM 8-Bromo-cAMP 刺激群、グループ 4： 12 日
間 の DMEM/CS-FBS 培 地 で の 培 養 群、 グ ル ー
プ 5： 12 日間の E₂ と MPA のみでの刺激群、グコントロールならびに脱落膜化処理後の
KC02-44D 細 胞（ 各 8.8 × 106 cells） を 処 置 し、
10 µg の RIPA 可 溶 性 画 分 を SDS-PAGE し た
後、Clear Blot P+ メンブレン（ATTO, Tokyo,
Japan）に転写した。転写後のメンブレン を 0.1%
Tween-20 を 含 む TBS（TBS-T） で 軽 く 洗 浄 した後、Blocking One（ナカライテスク）で 1 時
間室温ブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体反応液（1/1,000 FoxO1（C29H4）Rabbit
mAb #2880（CST, MS, USA）in TBS-T with 5％
Blocking One）中にて 4℃で一晩インキュベートした。次の日に TBS-T で 5 分 3 回洗浄後、二次抗体反応には、1/3,000 HRP Horse Anti-Rabbit
IgG Antibody（VECTOR, PI-1000）in TBS-T
with 5 ％ Blocking One に て 室 温 1 時 間 反 応 させ た。TBS-T で 5 分 3 回 洗 浄 後、Chemi-Lumi
One L（ナカライテスク）を加えて LAS4000 を用いてタンパクバンドを可視化した。バンドの定量は ImageJ を用い、FOXO1 のタンパク量は
ACTB タンパク量を内部標準として補正した。
ACTB の検出には 1/10,000 モノクロナール抗β- ア ク チ ン マ ウ ス 宿 主 抗 体（MERCK, A2228）と 1/3,000 Anti-IgG（H ＋ L）、Mouse、HorsePoly、HRP（VECTOR, PI-2000）を使用した。

14）− 41 −

長崎県立大学

看護栄養学部紀要

残存 EnSC モデル作製

月経後も実際の子宮内膜に残存した EnSC は、
血 中 P4 の 消 失 後 に 脱 落 膜 化 が 解 か れ PRL やIGFBP1 の発現が低下しその後再び次のサイクルで脱落膜化するのか、それとも一旦脱落膜化した
EnSC は戻ることはなく脱落膜化し続けることで周りに影響を及ぼしてしまうのか、を今回作製したモデルで検討した。12 日間の未処理群、12 日

第22巻 （2024）

間の脱落膜化処理群、ならびに 6 日間の脱落膜化
処理後に 6 日間の未処理群を用意した。
Total RNA の抽出 - 逆転写反応 - 定量 PCR

各 処 理 が 終 わ っ た 細 胞（0.4 × 106 KC02-44D
cells/well in 12 well plate） か ら Sepasol®RNA Ⅰ Super G（ ナ カ ラ イ テ ス ク ） を 用 い て
total RNA を抽出した。得られた RNA サンプル

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− 42 −

ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化ならびに老化モデルの作製

を cDNA と す る た め、ReverTra Ace® qPCR
RT Master Mix with gDNA Remover（東洋紡 ,OSAKA, JAPAN） を用いて逆転写反応を行った。 作 製 し た cDNA サ ン プ ル を 用 い て、 脱 落
膜化マーカー等の発現変化を見るため定量 PCRを 行 っ た。Thunderbird SYBR qPCR mix（ 東洋 紡 ） に 5pmol の Forward Primer、5pmolの Reverse Primer（ 表 1）、cDNA サ ン プ ル、な ら び に 純 水 を 加 え、LightCycler96（Roche
Diagnostics KK, Tokyo, Japan） を 用 い て 定 量
PCR を行った。PCR 条件は preincubation（95℃ ,30 秒 ） 後、2 step Amplification（95 ℃ , 5 秒→ 60℃ , 30 秒）を 45 サイクル繰り返し、さらに primer の 特 異 性 の 確 認 と し て melting 反 応（95℃ , 10 秒 → 65℃ , 60 秒 → 97℃ , 1 秒）を行った。各サンプルから得られた各遺伝子の相対値を ddct 法 に て 求 め た。 そ の 際、hypoxanthine
phosphoribosyltransferase 1（HPRT1） を 内 部
標準として使用した。
酸化ストレスによる老化促進＜ 条 件 1 ＞ 既 報 20） に 従 い、 コ ン フ ル エ ン トと な っ た KC02-44D 細 胞（4 × 104 KC02-44D
cells/well in 96 well plate）に対して、DMEMに 200 µM 過 酸 化 水 素 H₂O₂ を 加 え 37 ℃、5%CO₂ で ２ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後、PBS で
洗 浄 し た。 そ の 後、 コ ン ト ロ ー ル は DMEM・
CS-FBS で、脱落膜化処理群は DMEM/CS-FBSに 10-⁸ M E₂，10-⁶ M MPA な ら び に 500 µM
cAMP を加えて培養を継続した。その後、３日おきに同じ培地に交換しながら６日間培養した。
6 日 後、Cellular Senescence Plate Assay Kit SPiDER- β Gal（同仁化学 , Kumamoto, Japan）
を 用 い て 老 化 度 を 測 定 し た。 測 定 に は 2030
Multilabel Reader ARVO X4 （PerkinElmerinc., US-MA, 励 起 波 長 535 nm, 発 光 波 長 580nm）を使用しβ -galactosidase 活性を測定した。
＜条件 2 ＞細胞死が起こらず老化へ進行する条件を検討するため、条件 1 同様に PBS で洗浄
後、0、50、100、ならびに 200 µM H₂O₂ をそれぞれ培地に加え 37℃、5% CO₂ で 24 時間インキュベートした。その後、コントロールは DMEM/CS-FBS で、脱落膜化処理群は DMEM/CS-FBSに 10-⁸ M E₂、10-⁶ M MPA な ら び に 500 µM
cAMP を 加 え て ３ 日 お き に 同 じ 培 地 に 交 換 しながら６日間培養を継続した。処置の終わった− 43 −細胞から total RNA 抽出、逆転写を行い、定量
PCR に供した。
統計解析

統 計 解 析 は IBM SPSS Statistics ver. 29.0
（IBM Corp., NY, USA） を 用 い て 行 っ た。
Shapiro-Wilk の 検 定 を 用 い て 正 規 性 を 見 た。
各実験のコントロール群と処理群間の比較を
Welch の t 検定を用いて行った。すべての値は両側で、統計的有意性は p 値 ＜ 0.05 とし、必要に応じて Bonferroni 法で p 値を補正した。

III

結果

KC02-44D 細胞における cAMP 濃 度の違いによる脱落膜化マーカーへの影響

KC02-44D 細 胞 に 対 し て 6 日 間 の 未 処 理（control） 群、10-⁸ M E₂、10-⁶ M MPA、 な らび に 8-Bromo-cAMP を 0、150、 な ら び に 500µM 加 え て 刺 激 し た（ そ れ ぞ れ 0µM cAMP、
150 µM cAMP、500 µM cAMP） 群 を 用 意 し、cAMP の濃度による脱落膜化の指標として知ら
れ る IGFBP1、PRL、HAND2、 な ら び に IL15の発現量の変化を検討した。さらに内部標準とし て HPRT1 と は 別 に B2M な ら び に EF1A の発現量を確認した。初代培養 EnSC の脱落膜化の 条 件 で あ る 10-⁸ M E₂ な ら び に 10-⁶ M MPA
刺 激 群（0 µM cAMP 群 ） に 対 し て、150 µM
cAMP 群と 500 µM cAMP 群で IGFBP1、PRL、
ならびに HAND2 の有意な発現上昇がみられた（p<0.05, 図 1）。それに対して IL15 では 500 µM
cAMP 群のみ有意な上昇が観察された（p<0.05,
図 1）。 こ れ ら の こ と か ら 500 µM cAMP を 加えることで６日間の刺激でも十分な脱落膜化が誘導されると考えられた。 B2M と EF1A では群間での有意な差は認めなかった（Data notshown）。
脱落膜化処理による核の増大と転写因子 FOXO1の発現

脱落膜化の形態学的な指標である核の増大を
検 討 す る た め、KC02-44D 細 胞 に 対 し て 6 日 間
脱 落 膜 化 処 理（E₂+MPA+500 µM cAMP） を行った後、細胞を DAPI で染色し、核の面積を比較した。その結果、コントロール群に対して脱落膜化処理群で有意に核の大きさが増大した

長崎県立大学

看護栄養学部紀要

第22巻 （2024）

図 1 . cAM P 濃 度 の 違 い に よ る 脱 落 膜 化 マ ー カ ー の 発 現 変 化 .
KC02-44D 細胞に対して 6 日間の 10-8 M E₂と 10-6 M MPA 刺激に加えて cAMP の濃度を変えたものを加え，脱落膜化マーカーの発現量の変化を qPCR にて検討した．*：p < 0.05 by using Welch’s Ttest with Bonferroni correction against control. †: p < 0.05 by using Welch’s T-test
with Bonferroni correction against E₂+MPA without cAMP. IGFBP1: Insulin-like Growth
Factor Binding Protein 1, PRL: prolactin, HAND2: Heart And Neural crest Derivatives
expressed 2, IL15: Interleukin 15, HPRT1: hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, E₂:
estrogen, MPA: medroxyprogesterone acetate.

図 2. 脱落膜化による核の増大（DAPI 染色）と転写因子 FOXO1 の増大
A) KC02-44D 細胞に対して 6 日間脱落膜化処理を行い, 固定後 DAPI にて核染色を行った. 染色像は LSM700 共焦点レーザー顕微鏡で取り込み, ImageJ にて染色された核の面積を計測した. コントロール群で 198 細胞数, 脱落膜化処理群で 44 細胞数を計測した. *: p < 0.05 vs control
11
by using Welch’s T-test.
B) KC02-44D 細胞を 6 日間の脱落膜化処理し, RIPA 可溶性分画を調製, SDS-PAGE により分離した.
メンブレンに転写後, ブロッキング, FOXO1 抗体反応, HRP 標識 2 次抗体反応を行い, 最後にケミルミにて FOXO1 のバンドを検出した. 得られたシグナルは Image J にて解析し, ACTB バン
ド強度で補正した. *: p < 0.05 vs control by using Welch’s T-test.

− 44 −

ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化ならびに老化モデルの作製（p<0.05, 図 2A）。また脱落膜化によってタンパ
ク量が増大する FOXO1 に関しても、ウェスタ
ンブロッティング法にてコントロール群に対して脱落膜化処理群で有意なタンパク量の増大が認められた（p<0.05, 図 2B）。
KC02-44D 細胞における cAMP の有無と脱落膜化処理日数の違いによる発現量の変化

未 処 理（control） 群、E₂ と MPA で 刺 激し た（E₂+MPA） 群、 な ら び に 脱 落 膜 化 処 理（E₂+MPA+cAMP） 群 を そ れ ぞ れ ６、12 日 間
培養することで、cAMP を加えた場合の脱落膜化モデル作製期間の比較を行った。脱落膜化の指標として IGFBP1、PRL、HAND2、ならびにIL15 の発現量を確認した。IGFBP1 では 6 日間
control 群と 6 日間 E₂+MPA 群に対して 6 日間
E₂+MPA+cAMP 群で有意な上昇が再確認されたが（p<0.05）、12 日間まで刺激を延長してもそこからの有意な変化は無かった（図 3）。PRL では 6 日 間 control 群 に 対 し て、6 日 間 E₂+MPA

群と 6 日間 E₂+MPA+cAMP 群で有意な上昇が再確認されたが（p<0.05）、12 日間まで刺激を延長しても同様に 6 日目からの有意な変化は無かった（ 図 3）。HAND2 で は 6 日 間 control 群 に 対して 6 日間 E₂+MPA+cAMP 群で有意な上昇が再確認され（p<0.05）、12 日間の刺激で有意ではないものの 6 日目に比べて逆に低下が認められた（図 3）。生体内ならびに初代培養 EnSC にお
いても HAND2 は P4 刺激直後に高発現し、その後緩やかに減少することが知られるため 20）、同様のことが起こったものと考えられる。 IL15 では 6 日間 control 群と 6 日間 E₂+MPA 群に対して 6 日間 E₂+MPA+cAMP 群で有意な上昇が再確認されたが（p<0.05）、12 日間まで刺激を延長
しても 6 日目に比して有意な変化は無かった（図3）。これらのことから KC02-44D 細胞株において 500 µM cAMP を加えることで 12 日間おかず
とも、６日間の刺激で十分な脱落膜化が誘導されることが確認できた。

図 3 処理日数の違いによる脱落膜化マーカーの発現変化
KC02-44D 細胞に対し，未刺激群を control 群， E₂と MPA 刺激群を E₂＋MPA 群、そこに cAMP を加えたものを E₂+MPA+cAMP 群とし，それぞれ 6, 12 日間培養した後，脱落膜化マーカーの発現量の変化を検討した．バーは HPRT1 で補正した各群の平均値で，エラーバーは各群の標準偏差値である．
＊：p < 0.05 by using Welch’s T-test with Bonferroni correction against 6days control.
†：p < 0.05 by using Welch’s T-test with Bonferroni correction against 6days E₂+MPA
without cAMP. IGFBP1: Insulin-like Growth Factor Binding Protein 1, PRL: prolactin,
HAND2: Heart And Neural crest Derivatives expressed 2, IL15: Interleukin 15, HPRT1:
hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, E₂: estrogen, MPA: medroxyprogesterone acetate.

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看護栄養学部紀要

第22巻 （2024）

図 4 残存モデル作製
KC02-44D 細胞に対し，12 日間の未刺激 (control)群， 12 日間連続で E₂+MPA+cAMP 刺激群，ならびに 6 日間脱落膜化刺激後 6 日間未刺激だった群をそれぞれ培養し，IGFBP1、PRL の発現量の変化を検討した．バーは HPRT1 で補正した各群の平均値(n=4)で，エラーバーは各群の標準偏差値である．＊：p < 0.05 by using Welch’s T-test with Bonferroni correction against control.
† ： p < 0.05 by using Welch’s T-test with Bonferroni correction against 12days
decidualization. IGFBP1: Insulin-like Growth Factor Binding Protein 1, PRL: prolactin,
HPRT1: hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, E₂: estrogen, MPA: medroxyprogesterone
acetate.

KC02-44D 細胞における P4 消失による脱落膜化
細胞の変化＜残存モデル作製＞

月経後も子宮内膜に残存する EnSC は P4 の刺激が無くなることで再び線維芽細胞様に脱分化する（すなわち上皮間葉転換が起こる 21））と考えられるため、今回我々が KC02-44D 細胞にて作製した脱落膜化モデルにおいて同様に脱分化が起こるかを検討した。12 日間未処理（control）
群、12 日間脱落膜化処理群、ならびに 6 日間脱14
落膜化処理後 6 日間未処理群をそれぞれ培養することで、脱落膜化の脱分化を検討した。脱落膜 化 の 指 標 と し て IGFBP1 な ら び に PRL の 発
現 量 を 確 認 し た。IGFBP1 な ら び に PRL で は
control 群に対して 12 日間脱落膜化処理群で有意な上昇が認められた（p<0.05, 図 4）。さらに
12 日間脱落膜化処理群に対して 6 日間脱落膜化− 46 −

処理後 6 日間未処理群で有意な減少が認められた（p<0.05, 図 4）。これらのことから MPA 刺激を解くことで我々の KC02-44D 細胞の脱落膜化モデルでも脱分化が誘導できると考えられた。
KC02-44D 細胞における H₂O₂ 処理による老化への影響

先行研究に倣い 1 時間 H₂O₂ 処理後に脱落膜化処理を行い、老化マーカーである SA- β -gal 量の変化を比較した。未処理群に対して、脱落膜化処
理単独群と H₂O₂ 処理後脱落膜化処理群で有意な上昇が認められたが（p<0.05, data not shown）、
脱落膜化処理単独群と H₂O₂ 処理後脱落膜化処理群との間に差がなかったことから、KC02-44D 細胞に対する 1 時間の H₂O₂ 処理では十分な老化誘導ができていないことが考えられた。

ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化ならびに老化モデルの作製

図 5 酸化ストレス暴露による発現変化
KC02-44D 細胞に対し，24 時間 H₂O₂の濃度を変えたものを加えた後，6 日間 E₂, MPA, ならびに cAMP
刺激(脱落膜化刺激)を加えてそれぞれ培養し，発現量の変化を qPCR にて検討した．バーは HPRT1で補正した各群の平均値で，エラーバーは各群の標準偏差値である．＊：p < 0.05 by using
Welch’s T-test with Bonferroni correction against non-stimulated 6days control. †：p <0.05, 6days decidualization with/without H2O2 by using Welch’s T-test with Bonferroni
correction.
IGFBP1: Insulin-like Growth Factor Binding Protein 1, PRL: prolactin, HAND2: Heart And
Neural crest Derivatives expressed 2, IL15: Interleukin 15, NQO1: NADPH dehydrogenasequinone 1, HMOX: heme oxygenase, SOD1: superoxide dismutase 1, NRF2: NF-E2-related factor
2, KEAP1: kelch like ECH associated protein 1, GSR: glutathione reductase, IL1B:
Interleukin 1 beta, SERPINE: serpin family E member, SCARA5: scavenger receptor class A
member 5, CLU: Clusterin, HPRT1: hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, E₂: estrogen,
MPA: medroxyprogesterone acetate.

そこで 24 時間 H₂O₂ 処理での変化を検討した。
に superoxide dismutase 1 は control 群 と 比 較
未処理群に対して 50 ならびに 100 µM の H₂O₂
し て 脱 落 膜 化 +H₂O₂ 処 理 群 に お い て 有 意 な 増
処理では有意な変化なかったが、200 µM におい
加が観察された（p<0.05, 図 5）。Nuclear factorて激減が観察され（data not shown）、細胞の状
erythroid 2-related factor 2、kelch like ECH
態が悪化していることが示唆された。細胞死のassociated protein 1、 な ら び に glutathione
指標である bcl-2-like protein 1（BCL2L1）はやreductase に脱落膜化処理群と脱落膜化 +H₂O₂
はり 200 µM の H₂O₂ 処理にて増加していたが、処理群との間に有意な差は認められなかった
100 µM での変化はなかった（data not shown）。
（図 5）。またすべてにおける脱落膜化処理群にそのため、100 µM の H₂O₂ 処理により脱落膜化
おいて control 群と比較して増加がみられた（図と老化への影響を検討した。脱落膜化処理によ5）。さらに細胞老化関連分泌形質（Senescenceり脱落膜化指標の IGFBP1、PRL、HAND2、なAssociated Secretory Phenotype、SASP）であら び に IL15 の 増 加 が 観 察 さ れ た が、 脱 落 膜 化る Interleukin 1 beta、serpin family E member+H₂O₂ 処理群との差は観察されなかった（図 5）。 15 1、scavenger receptor class A member 5、それに対して細胞内の抗酸化酵素である
clusterin は、脱落膜化処理群に比べて脱落膜化
NADPH dehydrogenase quinone 1 は 脱 落 膜 化+H₂O₂ 処理群において有意な変化が観察された処理群に比べて脱落膜化 +H₂O₂ 処理群において（p<0.05, 図 5）。の発現量を確認した。
有意な増加が観察された（p<0.05, 図 5）。また他の抗酸化酵素である heme oxygenase ならび− 47 −

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考察

本研究では KC02-44D 細胞株に対して 10-8 Mの E₂、10-6 M の MPA、 な ら び に 500 µM の
8-Bromo-cAMP を用いることで、胚着床に必須の分化である脱落膜化を 6 日間と早期に誘発することができた。8-Bromo-cAMP の添加は脱落
膜化マーカー IGFBP1、PRL、HAND2、ならびに IL15 の有意な上昇を可能とし、本研究の目的の一つである脱落膜化に要する時間の短縮を達成することができた。しかしながら、8-BromocAMP の添加による変化は限られた数の遺伝子発現の観点からしか検討できておらず、網羅的
遺伝子発現解析等で見ていく必要があるだろう。
一方、細胞内の cAMP を人為的に上昇させる薬剤として他にも dibutyryl-cAMP22）やフォルスコ
リン 23） も知られており、今後これらを用いた脱落膜化への影響も検討していきたい。
これまでの研究から、初代 EnSC に対して E₂と MPA で 12 日間処理を行うことで形態学的変化 や IGFBP1 や PRL な ど の 脱 落 膜 化 マ ー カ ーの発現量増加が報告されている 12, 13）。本研究にお い て も KC02-44D 細 胞 に 対 す る E₂+MPA 処
理により脱落膜化マーカーの発現量増加が見られた。一方で、6 日間の E₂+MPA 処理で脱落膜化マーカーの発現量増加はプラトーに達し、それ 以 上 の 上 昇 は 観 察 さ れ な か っ た。P4 に よ り
誘導される脱落膜化は通常 2 〜 3 日ほどで細胞
内 cAMP レ ベ ル を 上 昇 さ せ、PRL の 産 生・ 分
泌を誘導する 24）。そういった意味でも今回使用
し た 8-Bromo-cAMP の 添 加 で は、 人 為 的 な 細
胞 内 の cAMP 経 路 の 活 性 化 は 過 剰 な 反 応 を 見ている可能性がある。KC02-44D 細胞に対して
E₂+MPA+cAMP 処理を 12 日間まで延長したところ、6 日間の処理と比較して HAND2 と IL15の減少が見られた。これらの結果は HAND2 が分泌期初期に P4 に反応してターゲットとなる遺伝子の発現を制御したのち一旦収まるためであり 20, 25）、また、IL15 は HAND2 によって遺伝子発現が直接制御されることに起因すると考えられる。一方、本研究において HAND2 の発現
低 下 に よ る FOXO1、IGFBP1、 な ら び に PRL
遺 伝 子 発 現 の 変 化 は 観 察 さ れ て お ら ず、 別 の制御が働いているものと考えられる。例えば、
P4/ progesterone receptor に よ り 誘 導 さ れ る
homeobox A10（HOXA10） は HAND2 と は 独− 48 −

第22巻 （2024）

立 し、FOXO1 と 協 調 し な が ら IGFBP1 な ら びに PRL の転写制御領域に結合することでそれらの転写を制御しており 26, 27）、今後 HOXA10 の関与も見ていく必要があるだろう。
MPA 刺激の消失によって IGFBP1 と PRL で有意な減少を認めた。これらのことから子宮内膜残存 EnSC と同様に脱落膜化 KC02-44D 細胞における脱分化が可能であると考えられる。
次いで、今回使用した KC02-44D 細胞に対して H2O2 を用いた老化誘発の有無を検討した。
先 行 研 究 を も と に 1 時 間 200 µM の H₂O₂ 処 理を行ったが、未処理群と H₂O₂ 処理群で有意な老化進行の差が認められなかった。このことは、
KC02-44D 細胞（もしかすると EnSC 自体も？）が酸化ストレスに対する強い耐性を持ち、その結果、老化しにくい可能性がある。実際、子宮内膜は 28 日ごとの崩壊や EVT の浸潤による炎症 28） にさらされる等、ストレスフルな環境に置かれており、他の粘膜組織と比べても先に挙げた低酸素耐性等、ストレス耐性が高いことが考えられる。一方で、未処理群に比較して脱落膜化処理群で有意な老化進行が認められた。この
結 果 は、EnSC の 脱 落 膜 化 に よ っ て FOXO1 やIL8 の 発 現 量 が 増 加 し、SA- β -gal 量 が 上 昇 するためであると考えられる 29）。EnSC は脱落膜化によって急性老化を起こすが、これは老化細胞の除去や着床時のリモデリングするために必
要な炎症反応であり 29）、子宮内膜の脱落（月経）には必要な変化と考えられている。
先 行 研 究 の 老 化 誘 導 条 件（1 時 間 の H₂O₂ 処理）では不十分であったため、本研究では 24 時間の H₂O₂ 処理を行った。200 µM の H2O2 では
HPRT1 が減少し、細胞死の指標である BCL2L1も上昇したため、細胞のアポトーシスが起こっており、200 µM は検討には不適当と考えられた。
一方で、100 µM の H2O2 処理で KC02-44D 細胞の老化誘導が可能であると考えた。さらに 100µM の H2O2 処理で SASP の動きも観察されたが、結果の信頼性の意味でも試行回数を増やし再現性を得ることが求められる。
本研究において老化による脱落膜化マーカーに発現変化は生じなかった。そのため、老化を起こした細胞自体は脱落膜化が阻害されていないことが考えられた。一方で、本研究の結果から老化した EnSC は炎症性サイトカインを含む
SASP30）の産生・分泌が亢進している可能性が高ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化ならびに老化モデルの作製

く、分泌された SASP が周りの細胞の脱落膜化や胚着床に何らかの影響を与えている可能性が示唆された。
本論文に関して、開示すべき利益相反関連事項はない。

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