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膜小胞をターゲットにした新たな毒素型食中毒の制御法＜令和 2 年度助成＞

膜小胞をターゲットにした新たな毒素型食中毒の制御法
島村裕子（静岡県立大学 食品栄養科学部）

目の化学物質（ヘテロサイクリックアミン、ビスフェ的ノール A、N - ニトロソジメチルアミン、エタノール

黄色ブドウ球菌（S. aureus ）は、食品中で増殖すおよびグリシドール）を試験に供した。S. aureus 菌る際に毒素（staphylococcal enterotoxin）を産生し、体の遺伝子発現と MVs の性状との関係を明らかに

この毒素を含む食品を喫食することで毒素型食中毒

す る た め に、 試 料 を 添 加 し た brain heart infusionを引き起こす。また、S. aureus をはじめとする病原（BHI）培地で S. aureus （staphylococcal enterotoxin性細菌は、生存に重要な役割を果たす球状の膜構造A（SEA）産生株）を培養し、SEA 産生量および病原因体である膜小胞（membrane vesicles; MVs）を放出子関連遺伝子（RNAIII および ica A）発現量についてする 。この MVs 内には、毒素を含む病原因子が高解析した。

1)

密度に内包されており、放出された MVs が標的となる宿主細胞に接着して侵入することで様々な細胞傷害を引き起こすと考えられている 。S. aureus の2)2．S. aureus 由来 MVs の安定性に対する培養時間の影響

細胞膜から直接毒素が分泌された場合、毒素は拡散

S. aureus を 6、17 および 24 時間で培養し、0.2 µmするため希釈されるが、MVs 中に内包された毒素フィルターで菌体を除去した。得られた培養上清をは、宿主の標的細胞へ濃縮された状態で到達するこ限外濾過し、超遠心（48,600 rpm、3 h）することで、とが予想される。しかし、食環境中における S. aureus

MVs を調製した。得られた MVs の粒子径および 23℃の MVs の存在や機能に関する報告はほとんどなく、における安定性を動的光散乱法および TEM 解析をまた、MVs の放出や MVs への毒素等の病原因子の用いて評価した。

内包に影響を与える食品中の成分について報告はない。そこで本研究では、S. aureus の MVs への毒素等の病原因子の内包およびその病原性に影響を与える成分を食環境中より探索し、その作用機序について解析した。

3．S. aureus 由来 MVs の性状に対する食環境中成分の影響
SEA 産生量および病原因子関連遺伝子発現量を変動させた試料を添加した培地で S. aureus を培養し、MVs を調製した。MVs の性状として、粒子径（動方法的光散乱法）、SEA 内包量（Western blot）および内包タンパク質（SDS-PAGE および nano-LC-MS/MS）

1．S. aureus （菌体）の性状に対する食環境中成分の影響を解析した。また、表皮角化細胞株（HaCaT 細胞）に EGCG および LA を添加して調製した MVs を暴露

緑茶に含まれる（―）-epigallocatechin gallate（EGCG）、し、MVs が誘導する炎症関連遺伝子（IL-1β、IL-6、食品から分離した Lacticaseibacillus 属菌培養上清IL-8、MCP-1 および TNF-α）の発現量の変動につい（菌体なし、以下 LA）および食環境中に含まれる 5 種て調べた。さらに、マウスより調製した脾臓細胞に

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化学物質を添加して調製した MVs を暴露し、炎症現量（Fig. 2）を有意に減少させたが、エタノール関連遺伝子（INF-γおよび IL-6）の発現量の変動におよびグリシドールは増加させた。そこで、以降のついて検討した。なお、動物実験は、静岡県立大学

実験では、菌体の性状に変化が認められた濃度（0.3

法人静岡県立大学における動物実験の指針（承認番mM EGCG、50％ LA、1.0％エタノールおよび 100号 215311）に従い実施した。

mM グリシドール）で S. aureus を培養し、MVs を調製することとした。

結果
2．S. aureus 由来 MVs の安定性に対する培養

1．S. aureus の性状に対する食環境中成分の影響

時間の影響

7 種の試料を添加した BHI 培地で S. aureus を培

異なる増殖段階（培養 6、17 および 24 時間）の養し、SEA 産生量および病原因子関連遺伝子発現量S. aureus の培養上清より MVs を調製し、粒子径を測について解析した。その結果、EGCG および LA は、定したところ、差は認められなかった。一方、培養

SEA 産生量（Fig. 1）および病原因子関連遺伝子発17 時間で調製した MVs では、1 週間後においてもFig. 1 S. aureus の毒素（SEA）産生量に対する食環境中成分の影響(A) EGCG、(B) Lacticaseibacillus 属菌培養上清（LA）、(C) エタノール、(D) グリシドール。Control（0 mM または 0 ％食環境中成分）における SEA 産生量を 1 として相対値で示した。誤差範囲は標準偏差を示す。* p <0.05 vs Control (n=3)。

Fig. 2 S. aureus の病原因子発現に対する食環境中成分の影響(A) EGCG、(B) Lacticaseibacillus 属菌培養上清（LA）、(C) エタノール、(D) グリシドール。Control（0 mM または 0 ％食環境中成分）における遺伝子発現量を 1 として相対値で示した。誤差範囲は標準偏差を示す。* p <0.05 vs Control (n=3)。

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凝集体の割合が低かったことから、安定性が高いこSEA 含有量を調べたところ、EGCG では有意に減少とが示唆された（data not shown）。そこで、以降のし、グリシドールでは増加した（Fig. 4）ことから、実験では、培養 17 時間後の上清から MVs を調製す

菌体の SEA 産生量と MVs 中の SEA 内包量は相関しることとした。

ないことが示唆された。
MVs 中のタンパク質内包量に対する影響を調べた

3．S. aureus 由来 MVs の性状に対する食環境

ところ、EGCG、LA またはエタノール存在下で調製した MVs では、複数の内包タンパク質のバンドが中成分の影響
S. aureus 由来 MVs の粒子経に対する各試料の影減弱し、グリシドールではタンパク質のバンドが増響を調べたところ、グリシドールを添加して調製し強した（Fig. 5）。そこで、各 MVs 中で内包量が減た MVs で は 粒 子 径 が 増 大 し た（Fig. 3）。MVs の少または増加したタンパク質について、nano-LC-Fig. 3 S. aureus 由来 MVs の粒子径に対する食環境中成分の影響。
(A) EGCG、(B) Lacticaseibacillus 属菌培養上清（LA）、(C) エタノール、(D) グリシドール。Control（0 mM または 0 ％食環境中成分）

Fig. 4 S. aureus 由来 MVs の SEA 内包量に対する食環境中成分の影響(A) EGCG、(B) Lacticaseibacillus 属菌培養上清（LA）、(C) エタノール、(D) グリシドール。Control（0 mM または 0％食環境中成分）における SEA 内包量を 1 として相対値で示した。誤差範囲は標準偏差を示す。* p <0.05 vs Control (n=3)。

Fig. 5 S. aureus 由来 MVs の内包タンパク質に対する食環境中成分の影響

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Fig. 6 S. aureus 由来 MVs の炎症誘導に対する EGCG および LA の影響
Control（0 mM EGCG または 0％ LA）における各遺伝子発現量を 1 として相対値で示した。
誤差範囲は標準偏差を示す。* p <0.05 vs Control，** p < 0.01 vs Control (n=3)。

Fig. 7 S. aureus 由来 MVs の INF-γ誘導に対するエタノールおよびグリシドールの影響
Control（0％ エタノールまたは 0 mM グリシドール）における各遺伝子発現量を 1 として相対値で示した。
誤差範囲は標準偏差を示す。n.s.: 有意差なし。

MS/MS を用いて解析したところ、減少したタンパにおいて炎症関連遺伝子の発現量が増加する傾向がク質として EGCG では、staphylocoagulase（血漿凝認められた（Fig. 7）が、グリシドールでは変化が固作用）、delta-aminolevulinic acid dehydratase（溶認められなかった。

血 活 性 に 関 与 ）、LA で は immunoglobulin-binding
protein Sbi（炎症反応誘導）、増加したタンパク質とし総括て、グリシドールでは、lipoprotein（炎症反応誘導）などが同定された。

本研究では、S. aureus 由来 MVs の性状および炎HaCaT 細胞に各 MVs を暴露したところ、EGCG で症誘導に対する食環境中成分の影響について解析

は、MVs により発現が誘導された IL-1βおよび TNF-し、それらが S. aureus の病原因子発現のみならず、αの発現を有意に抑制したが、LA では抑制しなかっMVs 誘導性炎症反応を抑制または増強することを見た（Fig. 6）。EGCG は、MVs 中の病原性タンパク質出した。今後、食環境中成分による MVs の毒性発の内包量を減少させたことで、炎症反応が抑制され現の変動メカニズムを明らかにすることで、MVs をた可能性が示唆された。

ターゲットとした食中毒のリスク低減や制御策の確マウス脾臓細胞に対する炎症誘導能について検討したところ、エタノールを添加して調製した MVs立が期待される。

膜小胞をターゲットにした新たな毒素型食中毒の制御法

謝辞本研究の遂行にあたり、多大なご支援を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上げます。なお、本研究の成果の一部は、日本食品衛生学会第 117 回学術講演会（WEB 開催）
および Microorganisms , 10(3): 574（2022）に公表しました。

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参考文献

1) Gurung, M. et al ., PloS one , 6(11): e27958（2011).
2) Hong, S.W. et al ., Allergy , 66(3): 351-359（2011).

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Novel methods of controlling toxin-type food poisoningby targeting membrane vesicles
Yuko SHIMAMURA
School of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka
Virulence factors, such as staphylococcal enterotoxin A (SEA), are contained
within membrane vesicles (MVs) in the cell membrane of Staphylococcus
aureus . In this study, the effects of the chemicals in food and the environmenton the quantitative and qualitative changes in the components contained in theMVs of S. aureus SEA-producing strains were examined. S. aureus was cultured
in brain heart infusion (BHI) broth supplemented with seven test samples, andSEA production and virulence factor-related gene expression were analyzed.
The results showed that (―)-epigallocatechin gallate (EGCG) andLacticaseibacillus sp. culture supernatant (LA) significantly decreased SEA
production and virulence factor-related gene expression, while ethanol andglycidol significantly increased them. Based on these gene expression patterns,
MVs were prepared with EGCG, LA, ethanol, or glycidol. The addition of glycidolto the culture increased the particle size of the MVs. The amount of SEA in theculture supernatant and the MVs were not correlated. MVs prepared in thepresence of EGCG, LA, or ethanol attenuated multiple cargo protein bands,
while glycidol enhanced protein bands. The expression pattern of inflammationrelated genes in human adult low calcium high temperature (HaCaT ) cells
induced by MVs was different for each test sample. The inclusion components
of S. aureus -derived MVs are selective, are affected by food and environment
components, and may play an important role in the induction of toxicity.