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浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）＜平成 25 年度助成＞

温度依存的に凝集するエラスチンペプチドによる新食品基材の開発
野瀬健（九州大学基幹教育院）

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はじめにエラスチンは、私たちの身体になくてはならないタンパク質で、血管や肺、靭帯などの延び縮みを必要とする部分に多く含まれている1 ）。体内のエラスチンが減少すると、身体の組織が硬くなってしまうことや、動脈硬化などの病気とも関連することが指摘されている。このため、我々が健康図 2. エラスチンの分子中の繰り返し配列
エラスチンの分子内には、疎水性アミノ酸からなる複数の繰り返し配列が存在する３）。

な生活を送り続けるには、コラーゲンとともにエかとなってきた。このアミノ酸配列は図 2 に示す

ラスチンを維持し、増やしていくことが大切と考ように、疎水性アミノ酸の繰り返しにより構成さえられるようになってきた。近年、様々な動物組れていることが、前駆体タンパク質トロポエラス

織からエラスチンが抽出され、健康食品や化粧品チンの塩基配列解析から明らかとなった。我々はとして利用され始めている。一方で、エラスチン

この繰り返し配列に注目し、繰り返し配列中のアはコアセルベーションという可逆的かつ温度依存ミノ酸を別のアミノ酸に置き換えたペプチド・置性の自己凝集活性を持つため（図 1）、バイオ素材換ペプチドを合成したところ、低分子量のペプチ2）としても注目を集めるようになった 。

ドでも体温（37 ℃）付近でコアセルベーションをところで、分子量の大きなタンパク質であるエ示すことを見出した（特願 2013-95991）。天然にラスチンのアミノ酸配列中に含まれる部分ペプチ

は、バリン−プロリン−グリシン−バリン−グリシド断片も同様の自己凝集活性を持つことが明らン（以下 VPGVG と略）という配列が存在しているが、この配列中の 1 番目のアミノ酸であるバリン（Val : V）をフェニルアラニン（Phe : F）に置換し、FPGVG とすることで、低分子化が達成された 4 ）。
この研究において、ペプチド水溶液の温度が室温（25 ℃）から体温（37 ℃）へと上昇することで、ペプチドが水溶液状態から凝集したゲル状の構造を取ることが見出されたため、このゲル化を食品へと応用することを着想した。すなわち、保存、流図 1. エラスチンのコアセルベーション

通時（常温）には溶液状態で存在し、体内に取りエラスチンは温度可逆的に自己凝集を起こす。加熱すると白濁し、その後静置するとコアセルベートを形成するが、いずれも冷却すると元の透明溶液に戻る 3）。

込まれるとゲル化するというものである。もちろん、ペプチドは天然アミノ酸からなる高分子であ温度依存的に凝集するエラスチンペプチドによる新食品基材の開発

り、いわゆるタンパク質と同様に安全に食品とし2.3

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酵素分解抵抗性て用いることができると一般に考えられている。

エラスチンペプチドの酵素分解に対する抵抗

このペプチドを用いることで、例えば、ダイエッ

性 は、 ペプチド 水 溶 液 に 消 化 酵 素（ トリプシン

ト食品における満腹感が得られ腹持ちの良い食品

・（Sequencing Grade Modified Trypsin, Promega）の開発や、ペプチドと脂肪と結合させた複合体をキ モ ト リ プ シ ン（α- Chymotrypsin from bovine

作成しておき、これがゲル化するときに周囲の脂pancreas, Sigma）・エラスターゼ（Elastase, Porcine

質を巻き込むようにすれば脂質の吸収を抑える機Pancreas, High Purity, Crystallized, Calbiochem））

能性食品が得られると考えた。本研究では、これを加え、ブロックインキュベーター（（株）アステック

らのようなペプチドの機能化に取り組んだ結果に製 BI-516S）上で反応させ、ペプチドの分解量をついて紹介する。

UPLC および HPLC で定量することで実施した。

2.

研究方法

2.1

エラスチンペプチドの化学合成

エラスチンペプチドの化学合成は、一般的な37 ℃でペプチド・酵素混合液をインキュベートし、一定時間毎に反応液から一部をとり煮沸、強酸性化処理によって酵素反応を停止させた。この溶液を UPLC にインジェクトしてペプチドの分解量をFmoc - アミノ酸を用いる固相、液相合成法によ追跡した。

り、手動、もしくは全自動合成機（ABI 433A）

2.4 脂質付加エラスチンペプチドの油との反応性により実施した。但し、ペプチド（アミド）結合エラスチンペプチドに脂肪酸（ラウリン酸、ミリの形成には、HBTU（2-（1H-Benzotriazole-1-yl）- 1,スチン酸、パルミチン酸）を結合させたハイブリッ

1, 3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate）/ドペプチドを合成した。これを水溶液とした後、HOBt（ 1-Hydroxybenzotriazole）法 と DMT - MM

この溶液に市販のコーン油（リノール酸、オレイ（4 （- 4, 6 - Dimethoxy-1, 3, 5-triazin - 2 - yl）-4-ン酸、パルミチン酸を含有）を一定量加え、温度

methylmorpholinium chloride）を縮合剤に用いた変化やソニケーション、長時間放置などの後、水方法をそれぞれ用いた。また、溶媒としては、溶液の状態変化を観察した。

NMP（N-Methyl-2-pyrrolidone）のみならず、EtOH（エタノール）や H 2 O なども使用した。ジスルフィド結合の形成反応には、側鎖チオールフリーのペ3.

結果と考察3.1

ペプチド合成プチドを空気酸化することで実施した。合成ペプ

今日、ペプチドの化学合成はほぼ確立された感チドの精製は、逆相 HPLC で行った。純度の確認があるが、実際に数十個のアミノ酸を縮合して純は、分析 HPLC および UPLC/MS により行った。

粋なペプチドを作ることは、それほど容易ではな

2.2

コアセルベーション測定い。しかしながら、本研究で用いるエラスチンペ合成ペプチドの自己凝集能（コアセルベーショ

プチドは、その配列の特徴として疎水性アミノ酸ン能）を測定するため、溶液の濁度を測定した。

である Phe（フェニルアラニン : F）、Pro（プロリ

温度可変セルチャンバーを装着した紫外可視分光

ン : P）、Gly（グリシン : G）、Val（バリン : V）から光度計（Jasco-V660）に各種濃度のペプチドの水主に構成されている。このため、反応性の高い溶液をセットし、時間毎にセルの温度を変化させ、アミノ基、カルボキシル基などをアミノ酸側鎖に同時に濁度の変化を記録した。また、目視による白有しないことから、側鎖保護アミノ酸の使用の回濁を簡易的なコアセルベーションの確認に用いた。

避が可能であり、また、固相合成法を用いた場

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浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）

末端を脱保護した FPGVG を Rink amide MBHAresin（Novabiochem）に 繋 留 し、 縮 合 剤 と し て
DMT - MM を、溶媒として NMP を用いて縮合後ピペリジンで脱保護、というステップを繰り返すことにより、（FPGVG）5 の合成を達成した。通常、
Fmoc -アミノ酸を用いる固相合成法では、合成しようとするペプチドに対して 4 〜 10 当量のアミノ酸が必要となるが、今回のフラグメント合成では 1.1 当量の Fmoc - FPGVG を使用することにより、高効率の合成を可能とした。また、溶媒として E t OH を用いての合成も実施した。
3.2

コアセルベーション測定

調製したペプチドについて、コアセルベーション活性を測定した。コアセルベーションはエラスチンの持つ特徴的な分子自己集合であり、生体内でエラスチンがその前駆体タンパク質トロポエラスチンから生じるのに必要な性質である。エラス
図 3. エラスチンダイマーペプチドの温度依存的コアセルベーション
A（C-(FPGVG）:: （WPGVG）
5）
2, B（C3）
2

チンの疎水性繰り返し配列である VPGVG のポリマーがコアセルベーション活性を示すことが知ら（20 回のれているが、その後の研究で（VPGVG）
20

合、最終脱保護は強酸処理（95％ Trifluoroacetic

繰り返し構造を持つ 100 アミノ酸残基からなる）

acid / H 2 O）のみで可能であるため、合成が比較が、数十 mg /ml の濃度の水溶液としたときにコ的に容易である。本研究でも、一部で経験の浅いアセルベーションを起こすことが確認された。今研究者により手動および全自動合成機を用いた化回の研究では、エラスチンの疎水性繰り返し配列学合成を実施したが、99％以上の純度を持つペプ（FPGVG）
VPGVG を 母 体 と し た（FPGVG）10 、5、チドを短期間のうちに調製可能であった。このた（WPGVG）
3 などにコアセルベーション活性が確認

め、通常のエラスチンペプチドの合成は実験室レ（WPGVG）された。特に、（FPGVG）5 、3 をシステベルにおいて問題無く遂行された。また、エラスインを介してダイマー化した（C-（FPGVG）
5）
2 やチンペプチドは特徴的な繰り返し配列（VPGVG な（C-（WPGVG）
3）
2 は、それぞれ濃度 10 mg /ml おど）を基本構造として有している。これを利用し、

よび 1 mg /ml の濃度においてコアセルベーション

繰り返しのペンタペプチドをあらかじめ合成して5, 6 ）。それぞれを起こすことが観測された（図 3）

おき、ペンタペプチドの縮合を繰り返して必要なのコアセルベーションは約 10 ℃と 30 ℃から開始長さのペプチドを得るフラグメント合成法の開発され、その溶液状態と自己集合状態の相転移温度を行った。今回は、N 末端を Fmoc 基で保護したは約 14 ℃と 47 ℃であった。これらの事実は、こFmoc - FPGVG - OH を合成し、フラグメント合成のエラスチン由来の合成ペプチドがそのアミノ酸の原料とした。Fmoc - FPGVG - OH の合成は全自組成、アミノ酸の数（基本配列の繰り返し数）、分動合成機により実施し、続いて、別に合成した N子構造によって、自在に自己集合温度を変化させ温度依存的に凝集するエラスチンペプチドによる新食品基材の開発

13ることが可能であることを示した。したがって、それらの酵素分解に対するエラスチンペプチドのエラスチンペプチドは食品に利用する時に、任意の抵抗性を調べた（図 4）。主に塩基性のアミノ酸の温度に対して液体とゲル状態を変化させることがC 端側のペプチド結合を加水分解するトリプシンできるユニークな基材となることが確認された。

での消化においては、ペプチドのアミノ酸配列から予想されるように、エラスチンペプチドはほとんど分解を受けなかった。一方で、疎水性アミノ酸であるバリン、フェニルアラニンやトリプトファンのカルボキシ末端側のペプチド結合を加水分解するキモトリプシンは、6 時間の間に約 30％のペプチドを加水分解した。しかしながら、この分解は限定的であった。一方で、エラスチンを分解する酵素エラスターゼは、キモトリプシンよりもペプチド分解能力が高く、6 時間で約 40 ％の、24時間で約 65 ％のエラスチンペプチドを分解した。
そもそも、FPGVG のアミノ酸配列は天然のヒトエラスチンの内部にも存在しており、この部分が加水分解を受けるのは妥当であり、また、ゆっくりと適切に分解されることは食品基材としては相応しい性質であるとも考えられた。それは、分解物がアミノ酸やオリゴペプチドとなり栄養素とも成り得るからである。
一方で、ペプチド溶液温度を室温（25 ℃）から体温（37℃）へと上昇させコアセルベーションを起こし、ゲル化した状態のエラスチンペプチドにおいては、酵素の反応は著しく低下し、ほとんど分解物は生じなかった。これは、ある意味予想された結果ではあるが、ペプチドがゲル状となったため、酵素と基質であるペプチドが出会う頻度が低下したことが原因であるためと推定された。

図 4. エラスチンペプチドの酵素分解上から (FPGVG) 5 をトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼでそれぞれ処理した結果を示す。

3.3

酵素分解抵抗性

3.4 脂質付加エラスチンペプチドの油との反応性
エラスチンペプチドを食品基材として用いる場
合、ペプチドに様々な機能を搭載することにより高機能化を図ることで一層その価値を高めることエラスチンペプチドを食品基材として利用するが可能となる。本研究では、このペプチドが水溶場合、その体内での安定性は一つの有用性の指標性であることから、分子内に炭化水素鎖を導入すとなる。そこで、主な消化酵素の中から、トリプることでペプチドの親水性と炭化水素鎖の疎水性シン、キモトリプシン、エラスターゼを取り上げ、を合わせ持った親媒性の分子を創製できると考え

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浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）

た。炭化水素鎖は、ペプチドのアミノ末端にアミ殿を生じた。このようなハイブリッドペプチドのド結合の形で脂肪酸を導入すると容易に導入が可性質は、油をまとめて沈殿させる機能性物質とし能である。このため、通常のペプチド合成に用いての応用の可能性を示唆した。

る脱水縮合剤により、ラウリン酸、ミリスチン酸、て利用する場合、その体内での安定性は一つの有用パルミチン酸を（FPGVG）5 に導入し、ペプチドと4.

素の中から、トリプシン、キモトリプシン、エラス脂肪酸のハイブリッドペプチドを得た。ペプチドまとめ以上の様に、本研究ではエラスチンペプチドにに対するエラスチンペプチドの抵抗性を調べた（図の合成反応は問題無く進行したが、分子疎水性がついて、合成、コアセルベーション測定、高機能ペプチド結合を加水分解するトリプシンでの消化に大きく、カラムへの吸着性が上昇したため、合成化に関する実験を行った。その結果、ペプチドのら予想されるように、エラスチンペプチドはほとん反応後の逆相 HPLC 精製に通常では C 18 カラムをコアセルベーションを開始する温度が調整可能で性アミノ酸であるバリン、フェニルアラニンやトリ用いるところ、より炭素鎖の短い（疎水性の低い）あることを明らかとするとともに、油を沈殿させチド結合を加水分解するキモトリプシンは、C 8 カラムを用いる必要があった。 6 時間のる新規のペプチド／脂肪酸ハイブリッドペプチド。しかしながら、この分解は限定的であった。一方得られたハイブリッドペプチドは、温度の低いの調製に成就した。これらのエラスチンペプチド

ターゼは、キモトリプシンよりもペプチド分解能力
水には難溶であったが、加温すると溶け均一な溶は、食品工業への応用をはじめ、さまざまな分野約 65％のエラスチンペプチドを分解した。
そもそも、液となった。この溶液は、通常の濁度法によるコでの安全な基材としての応用が期待される。

アセルベーション能の測定においては濁度が上昇
ラスチンの内部にも存在しており、この部分が加水分せず、コアセルベーションを示さなかった。とこっくりと適切に分解されることは食品基材としては謝辞

ろが、水溶液に油（コーン油）を添加すると、まず、それは、分解物がアミノ酸やオリゴペプチドとなり本研究を遂行するにあたり、多大なる研究助成

油 / 水界面を形成するが、その後、超音波を掛けを賜りました公益財団法人浦上食品・食文化振興て懸濁すると白色の沈殿を生じた（図 5）。これは、25℃）から体温（37℃）へと上昇させコアセルベー

財団並びに関係者の皆様に心から御礼を申し上げ

ペプチドのみ、もしくは、ペプチド無し（油のみ）
ラスチンペプチドにおいては、酵素の反応は著しくます。

では見られなかった現象であり、ペプチドが油とた。これは、ある意味予想された結果ではあるが、結合して沈殿を生じたものと考えられた。また、と基質であるペプチドが出会う頻度が低下したこと
ペプチドは油のみには溶解せず、この混合溶液に水を加えソニケーション処理を行うと、同様の沈

献

1) Uitto J., Biochemistry of the Elastic Fibers in Normal
Connective Tissues and its Alterations in DiseasesInvest. J.
Dermatol., 72, 1 (1979)
2) 前田衣織、しなやかな身体とエラスチン、pp. 266, 女性の疾患と美容のための機能性素材の開発 山地亮一監
修 CMC 出版（2014）

油との反応性	 て用いる場合、ペ3) Vrhovski B. et al., Biochemistry of Tropoelastin, Eur. J.
Biochem., 258, 1218 (1998)

により高機能化をが可能となる。本

4) Taniguchi S. et al., Coacervation Properties of Short Elastinderived Pentapeptide Analogues Containing AromaticAmino Acids, Peptide Science 2013, 433 (2014)

ることから、分子プチドの親水性と親媒性の分子を創

プチドのアミノ末
図 5. ハイブリッドペプチドと油の反応

すると容易に導入
水に溶解した 3 mg/ml のハイブリッドペプチド（700μ l）に
図 5.	 
ハイブリッドペプチドと対し 10μ（右）lおよび 20 μ（左）lのコーン油を加えると白チド合成に用いる色沈殿を生じた。
油の反応
スチン酸、パルミ
水に溶解した 3 mg/ml のハイブと脂肪酸のハイブリッドペプチド（700 μl）に対成反応は問題無くし 10 μl（右）および 20 μl（左）ラムへの吸着性がのコーン油を加えると白色沈殿精製に通常では文を生じた。

5) Suyama K. et al., Coacervation Property and Secondary
Structure of Synthetic Dimer Peptides of the Elastin-derive
Pentapeptide Repeat-related Peptide, Peptide Science 2013,
277 (2014)6) Suyama K. et al., Coacervation Property and StructuralAnalysis of Synthetic Dimer Peptides of Aromatic Amino
Acid Containing Elastin-derived Peptides, Peptide Science
2014, in press.

Development of the novel food materials based on elastin-derived peptides possessing temperature-dependent coacervation property

Development of the novel food materials based onelastin-derived peptides possessing temperature-dependent
coacervation property
Takeru Nose
Faculty of Arts and Science
Kyushu University
We conducted synthetic and biochemical studies on elastin-derived peptides in thisstudy and we believe that these can be used for the development of novel food materials
with useful functions. Elastin is a fundamental protein that provides elasticity to the bloodvessels, lungs, and ligaments. A partial pentapeptide of elastin, Val-Pro-Gly-Val-Gly, isconsidered to be one of the important elements for elasticity. In our previous studies, wedeveloped Val-Pro-Gly-Val-Gly-related peptides, referred to as elastin-derived peptides.
(Phe-Pro-Gly-Val-Gly) n and (Trp-Pro-Gly-Val-Gly) n are examples of such a Val-Pro-GlyVal-Gly-related peptides. These peptides can be easily prepared by conventional solid-phase
peptide synthesis. In this study, we carried out the fragment-coupling method by using
H-Phe-Pro-Gly-Val-Gly-OH as a monomer and DMT-MM as a coupling reagent to obtain(Phe-Pro-Gly-Val-Gly) n. DMT-MM can catalyze the coupling reaction in EtOH and H 2O,
which ameliorates the need for hazardous organic solvents such as NMP, DCM, or DMF.
It is advantageous to produce food materials without the use of organic solvents, because
these solvents have residual toxicity. As a result of the synthesis of (Phe-Pro-Gly-Val-Gly) n,
the fragment coupling could be easily performed and the repetitive peptide (Phe-Pro-GlyVal-Gly) 5 was obtained effectively. Furthermore, dimer peptides of (Cys-(Phe-Pro-GlyVal-Gly) n ) 2 and (Cys-(Trp-Pro-Gly-Val-Gly) n ) 2 (n = 3 or 5) were also prepared and theirstrong temperature-dependent coacervation activity was confirmed. These dimer peptides
started coacervation at temperatures lower than the body temperature. This suggests thatthe dimerization of the peptide could move the onset temperature of coacervation to lowtemperature artificially. Moreover, these peptides are moderately digested by digestive
enzymes, particularly by elastase, in the soluble state. However, in the coacervated state,(Phe-Pro-Gly-Val-Gly) 5 showed resistance to enzymatic digestion. This observationsuggests that these peptides can be used as stable food materials that have resistanceto enzymatic digestion. In this study, fatty acid conjugated (Phe-Pro-Gly-Val-Gly) 5 related peptides were also prepared and characterized. The fatty acid conjugated peptide
showed surface activity. When corn oil was added to the aqueous solution of the peptide,the mixed solution was suspended and this promoted the precipitation of a white layer
consisting of the peptide and the oil. This phenomenon showed a new characteristic of thepeptides, which suggested that the peptides can be used as surfactants in food materials. In
conclusion, we developed the elastin-derived peptides as novel food materials with someinteresting characteristics. Our results indicate that the elastin-derived peptides are one ofthe promising food materials that are safe and have high functionality.

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