第26回日本臨床細胞学会関東連合会・特別講演（於：群馬県高崎市、H24.9.8）

中皮腫の病理と細胞診

山口県立総合医療センター病理科・中央検査部

亀井 敏昭

悪性中皮腫 Malignant mesothelioma
アスベスト小体

前胸壁

肺：1360本（湿重量5g）

2

日本におけるアスベスト問題の現状○ 石綿関連疾患は労災補償の対象● 2005年:クボタショックに端を発して環境曝露がクローズアップ○ 2006年:石綿救済法による患者認定（中皮腫、肺癌）○ 2010年：指定疾患の追加（びまん性胸膜肥厚、石綿肺）● 石綿救済法による中皮腫・肺癌の認定には病理学的な資料が必須○ 中皮腫では組織検査が困難なことがあり、細胞診断のみの症例が少なくない● 診断が確実であれば、細胞診断のみでも認定可能なことがある● 細胞診断のみの申請が漸増傾向○ 中皮腫は増加しつつあるが１施設で経験できる症例は多くない（細胞診断の経験が」少ない）○ 細胞診断の確度は一定していない（体腔液の細胞診断は難しい）⇒多数症例に基づく細胞診断の基準が必要⇒分かりやすく再現性のよい基準が望まれる⇒救済を推進する観点からも細胞診断の積極的活用が望まれている●日本肺癌学会 肺癌取り扱い規約委員会
細胞診判定基準改定委員会（秋田弘俊委員長）
中皮腫細胞診評価ワーキンググループ（亀井敏昭グループ長）
検体：胸水、対象：上皮型悪性中皮腫、鑑別疾患：主として肺腺癌
成果の一部：肺癌取り扱い規約第7版（2010年）に細胞所見と付図が収載

日本の石綿輸入量と中皮腫死亡数の推移
2010年より2030年
死亡者数は2～3倍になると予測され、細胞診で遭遇する機会も増えるであろう。

石綿救済法による中皮腫患者の認定状況
平成20年度

平成21年度

平成22年度

認定件数／申請件数 *認定件数／申請件数 *認定件数／申請件数

病理組織診断あり

548/585(94%)

453/504(91%)

479/511(94%)

報告書のみ

381/385(65%)

271/504(54%)

316/511(62%)

標本提出あり167/197(85%)

187/229(82%)

163/193(84%)

細胞診断のみ（組織なし）

14/24(58%)

38/74(51%)

54/71(76%)

報告書のみ

8/24(33%)

17/47(36%)

18/71(25%)

標本提出あり6/12(59%)

21/27(78%)

28/31(90%)* 暫定値
平成22年度 認定された533例中54例は細胞診(とCT画像等)で認定された。
資料：環境再生保全機構石綿健康被害救済部

病理所見と細胞診所見の相関（1）上皮型中皮腫（管状乳頭型）

病理所見と細胞診所見の相関（3）上皮型中皮腫（低分化上皮型）

病理所見と細胞診所見の相関（５）肉腫型中皮腫中皮腫に特徴的とされている所見• 球状・乳頭状集塊• 相互封入像• 窓形成 (window formation)• 細胞相接所見（cell to cell apposition)• hump様細胞質突起• Collagenous stroma を有する細胞集塊• オレンジG好性細胞の出現• 多核細胞出現

悪性中皮腫の特徴的な細胞所見(1)C：相互封入所見

Ａ：球状・乳頭状集塊

Ｂ：相互封入所見

Ｃ：ＣＳ ２型

悪性中皮腫の特徴的な細胞所見(2)Ｄ：窓形成

Ｅ：細胞辺縁不明瞭

Ｆ：多核形成悪性中皮腫の特徴的な細胞所見(3)Ｇ：核の細胞中心性

Ｈ：ﾗｲﾄｸﾞﾘｰﾝ好性

Ａ：オレンジＧ好性中皮腫に認められやすい細胞所見
Ⅰ. 細胞集塊① 球状集塊、乳頭状集塊 （A）② 細胞相互封入所見（B） 15/16=93.7%③ Ⅱ型collagenous stroma（C） 9/16= 56.2%
Ⅱ. 孤在性出現① 細胞相接像、窓形成（D）② 細胞辺縁が不明瞭（E） 15/16=93.7%③ 多核形成が目立つ: （F） 13/16= 81.2%（多核細胞の頻度が20％以上）④ 核は類円形、細胞中心性に位置する（G）
Ⅲ. 出現細胞の細胞質：① ライトグリーン好性、重厚感を示す（H）② オレンジG好性細胞の出現を認める（I）
19/25= 76.0%日本肺癌学会

中皮腫細胞診評価ワーキンググループ(順不同）
責任者： 亀井敏昭
委員：廣島健三、岡 輝明、河原邦光、河合俊明、大林千穂、武島幸男、秋田弘俊、児玉哲郎、畠 榮
辻村 亨、鍋島一樹、平野隆、前田昭太郎
サブグループ委員
責任者：畠 榮
委員：丸川活司、三浦弘守、濱川真治、藤田 勝、片山博徳
佐藤正和、青木 潤、渋田秀美、三村明弘、松本慎二
羽原利幸、山本格士

目 標：

胸水細胞診における中皮腫の細胞診断基準の作成
今までに蓄積されてきた中皮腫細胞所見を基に、上皮型中皮腫200例（212例）、反応性中皮細胞50症例（51例）、肺腺癌（63例）の検証し、胸水細胞診材料で中皮腫と診断するためのクライテリアを確立することによって、世界に通用する中皮腫細胞診断基準を2010～2012年の間に作成する。

検討課題
１．蓄積された中皮腫細胞所見を再検証し、所見用語の統一化と定義について検討する
２．上皮型中皮腫約200症例・反応性中皮細胞約50症例、腺癌例約80例を用いて細胞形態の特徴による診断精度（感度、特異度）を検証する。
３．中皮腫細胞診断基準作成後、科学的根拠を検証する。
４．腺癌細胞や反応性中皮細胞と中皮腫細胞の鑑別根拠を検証する。
５．肉腫型、特殊型中皮腫細胞所見について明らかにする。
６．報告様式について検討し、臨床現場での検査や治療選択に資する。
６．胸水細胞診標本作製法技術、セルブロック作製法を確立する

所見用語の統一と定義、診断基準作成のための評価方法の設定
１．背景（組織球優位、リンパ球優位・リンパ球衛星状配列？、好中球優位など）
２．細胞量（多い、少ない）
３．集塊状形態（球状、乳頭状、平面的、花弁状、collagenousstromaなど）
４．細胞相互関係（相互封入、窓形成、細胞相接所見、hump様細胞突起など）
５．細胞質の形態（ライトグリーン好染性、細胞辺縁の不明瞭化、印環細胞様変化、核近傍重厚感など）
６．核所見（核形不整、腫大、多核化、核の配列、クロマチンなど）
７．その他（ｵﾚﾝｼﾞ好性細胞の出現など）

背景：組織球・リンパ球

リンパ球

衛星状リンパ球配列

集塊2：球状・乳頭状
乳頭状集塊

球状集塊

20個以上の細胞で構成される集塊

集塊３：集塊の大きさの相違（大集塊、小集塊）

大集塊（100個以上の細胞集塊）

小集塊（20個以下の細胞集塊）

相互封入所見１

相互封入所見２（hump 様細胞質突起を有する鋳型細胞）

Hump様細胞質突起は、主として2個の細胞からなるいわゆる相互封入像で、ライトグリーン好染性のコブ状の突起を指す（矢印）。
侵入細胞によって核は押しやられ、細胞質は侵入細胞を取り囲む。侵入細胞の取り残された細胞質がコブ状の細胞質突起として観察される。
日本臨床細胞学会誌 第42巻 第1号、2003年、p10－16

Ⅰ～Ⅲ型のcollagenous stromaを含有する細胞集塊

Ⅰ型

Ⅱ型
Ⅰ型：菲薄で扁平な細胞を少数認めるもの．
Ⅱ型：1～2層の立方状細胞を認めるもの．

Ⅲ型：3層以上の細胞を認める
もの．
Ⅲ型

Type II Collagenous stroma (CS)

acbd

Type II CS （悪性中皮腫）
A． PAS , B． PAS after diastase digestion
C． D2-40,
D． CS is positive for type IV collagen. (immunocytochemistry).

Collagenous stroma（石灰化小体様構造）

石灰化小体様構造

細胞辺縁の不明瞭化発達した微絨毛

細胞質辺縁の性状
悪性中皮腫

微絨毛は細長く全周性に密集して存在

細胞質辺縁の性状
肺腺癌

微絨毛は短く密度も低い

悪性中皮腫 vs 肺腺癌
肺腺癌

悪性中皮腫

悪性中皮腫 vs 反応性中皮悪性中皮腫

反応性中皮悪性中皮腫の細胞形態の特徴
悪性中皮腫

反応性中皮腺癌

出現様式細胞多数（集塊状、孤在性）

細胞少数

症例により様々細胞集塊球状、乳頭状孤在性細胞との移行像

平面的な出現

乳頭状集塊と孤在性細胞の混在

細胞質

辺縁は不明瞭
重厚感を有する（特に孤在性細胞）

辺縁はやや不明瞭
やや重厚感を示す

辺縁は明瞭
空胞状や淡明一部でやや重厚感

結合性

細胞相接像ありhump様細胞突起多い

細胞相接像あり細胞相互封入像は少数

細胞相互封入像あり
hump様細胞突起少ない核

中心性
類円形で均一感
多核細胞(均一感あり）

中心性
軽度の大小不同性
多核細胞

偏在性
核形不整・大小不同性
多核細胞(均一感なし）

その他

ｵﾚﾝｼﾞG好性細胞
Ⅱ型Collagenous
stroma

両者ともに目立たない

両者ともに目立たない（卵巣明細胞腺癌ではⅡ型Collagenous
stromaを認める）

細胞質所見（オレンジG好染性細胞）

細胞質はオレンジGに好染し、核は濃縮しクロマチン構造の不明瞭化を呈する
体腔液検体中に認められたオレンジG好性細胞の検討
佐久間暢夫、亀井敏昭他3名 日臨細胞誌 47(5):351-354,2008

dオレンジG好性細胞（pseudokeratosis）
Orange G(MW452）

Light green （MW691）

オレンジG ＜ エオジン Y＜ ライトグリーン

中皮腫診断に有用な細胞所見
Pleural Cavity

Chest Wall
日本肺癌学会 細胞判定基準委員会
中皮腫細胞診評価WG

背景所見と細胞集塊の出現様式、出現形態• 背景所見（背景の炎症細胞所見）
 リンパ球優位
 組織球優位 好中球優 出現様式（散在出現、集塊出現）
 孤在性
 ２～４個 ５～１０個
 １１～１００個
 １００個以上
 出現形態（細胞集塊の形態）
 球状、乳頭状

細胞集塊の出現様式
悪性中皮腫
肺癌(腺癌）％

孤立性、2-4個、5-10個100個以上

反応性中皮100908070605040302010070403724191624131747160.05

悪性中皮腫

肺癌

2112～45～10
11～100100以上 個反応性中皮腺癌 NS 中皮腫＞反応性中皮
p=0.61p<0.01

１０個以上の集塊を見たら腫瘍性病変を疑う

細胞集塊の出現形態比較
％

球状集塊

乳頭状集塊

10090
80
70
6050403020100

悪性中皮腫
肺癌
反応性中皮

182480110.3

球状乳頭状

腺癌 NS 中皮腫＞反応性中皮
p=0.61p<0.01

中皮腫に特徴的とされている所見• 相互封入像• 窓形成• 細胞相接着• Hump様細胞質突起• Collagenous stroma を有する細胞集塊• オレンジG好性細胞の出現• 多核細胞出現

細胞相互の関係 （窓形成、細胞相接）
％

窓形成

悪性中皮腫
肺癌
反応性中皮1009080706050403020100694728 2515窓形成

腺癌 NS 中皮腫＜反応性中皮細胞相接53p=0.97

p<0.01

細胞相接
腺癌 NS 中皮腫 NS 反応性中皮p=0.56p=0.39

細胞相互の関係 （細胞相互封入、Hump様突起）

相互封入像％
1009080706050403020100

悪性中皮腫
肺癌
反応性中皮3020
4
相互封入
腺癌＜中皮腫 NS 反応性中皮p<0.01

Hump様突起p=0.97802

hump
腺癌＜中皮腫＞反応性中皮p<0.01

p<0.01

collagenous stromaの出現頻度

collagenous stromaの出現は中皮由来であることの根拠となる所見であり中皮腫では、47%の症例で出現し有意な所見といえる。
１標本中に５カ所以上に出現する例は、中皮腫で34%で反応性では見られず中皮腫を鑑別する有意な所見と考える。

腺癌＜中皮腫 ＞ 反応性中皮p<0.01

p<0.01多核細胞出現率の比較％
100919081758070605040302020148100１核
2核

佐久間、亀井らの報告

悪性中皮腫
肺癌
反応性中皮331

1 113核4核1 0 0.4
5核以上

中皮腫 ＞ 腺癌 NS 反応性中皮p<0.01

5核

6核以上

p=0.54核の大きさ別出現率
悪性中皮腫
肺癌
反応性％
10080426040

核の大きさ
腺癌、中皮腫、反応性中皮の核でリンパ球の4倍以上においてに有意差を認めた。
中皮腫の核は、腺癌と反応性中皮細胞の核の中間に位置する。

1935 28

15200573931

進行悪性中皮腫2倍3倍

411739104倍5倍6倍腺癌 反応性中皮肺癌 ＞悪性中皮腫＞ 反応性中皮p < 0.0１

p < 0.0１

２５μ（リンパ球の４倍）
以上の核の出現率

核形不整の比較％

100

整不整8085827060

整403020180

悪性中皮腫

15肺癌

反応性中皮肺癌＞＞悪性中皮腫 NS 反応性中皮不整

p<0.01

P=0.37

中皮腫，腺癌，反応性中皮の核位置の比較
％

核偏在性
核中心性

1001722807760

核中心性40200837823
悪性中皮腫

肺癌

反応性中皮肺癌 ＞＞ 悪性中皮腫 NS 反応性中皮p<0.01

核が細胞膜に接している

p=0.366

腺癌は、中皮腫や反応性中皮細胞に比較し核が偏在傾向にある

中皮腫を鑑別するための有意な所見
悪性中皮腫VS腺癌

悪性中皮腫VS反応性中皮5個以上の細胞集塊NSp<0.01

集塊の形態（球状、乳頭状）

NS

p<0.01

相互封入

p<0.01

NS

窓形成

NS

p<0.01

細胞相節NSNS

p<0.01p<0.01NS

p<0.01collagenou stromaの出現数（5カ所以上）

p<0.01p<0.01多核細胞の出現率（4核以上）

p<0.01p<0.01細胞の大きさ (リンパ球の6倍以上の出現率)

NS

p<0.01核の大きさ (リンパ球の4倍以上の出現率)

p<0.01

0.005

核形不整

p<0.01

NS

核の偏在性

p<0.01

NShump
オレンジG好性細胞の出現数

形態計測
細胞面積

NS

p<0.01

核面積

p<0.01p<0.01

N/C比

p<0.01p<0.03円形度

p<0.01NS

核偏在度

p<0.01

NS

中皮腫判定に有用な所見(P<0.01)
所見分類

特徴所見

①背景ヒアルロン酸様物質④集塊

Collagenous stroma⑤細胞相互hump

⑥細胞質

重厚感

⑥細胞質

オレンジG好性細胞（P<0.05）⑥細胞質

細胞辺縁不明瞭⑦核所見（核数）

核数/細胞数⑦核所見（多核化）

2核以上の出現率⑦核所見（多核配列）

多核の花弁状配列（P<0.05）

悪性中皮腫と肺腺癌の鑑別に有用な所見 (P<0.01)
悪性中皮腫＜肺腺癌

悪性中皮腫＞肺腺癌

相接所見

組織球背景

空胞化

好中球の出現

印環細胞様変化

相互封入

多房性変化

細胞辺縁不明瞭

核形不整

核円形性

４倍以上の核 (P<0.05)

核中心性

粗顆粒状クロマチン

鏡面核配列

偏在する多核核小体 腫大相互封入・圧排像

核中心性

粗顆粒状のクロマチン

細胞質の空胞化

鏡面核配列

反応性中皮細胞と悪性中皮腫の鑑別に有用な所見 (P<0.01)
反応性中皮＞悪性中皮腫

反応性中皮＜悪性中皮腫

単個（孤立散在性）

５個以上の集塊

２～４個の平面的集塊

球状，乳頭状，花弁状

３倍以下の細胞５個以上の平面的集塊

窓形成

４倍以上の細胞の大きさ

単核

空胞化

不規則配列多核

印環細胞様変化

核小体２～３個

多房性変化

単個・単核

窓形成

４倍以上の核 (P<0.05)
核小体 1個共通マーカー
腺癌マーカー

EMA
CA125
Cytokeratin

中皮関連マーカー（AE1/AE3,CK7, CK20）CEABerEP4

MOC31

LeuM1

caｌｒetinin HBME-1
thrombomodulin CK5/6

TTF -1 Napsin A
CD146
反応性中皮と中皮腫の鑑別マーカー

デスミン
GLUT-1

mesothelin

D2-40

desmin

WT-1

ERC

通常法

転写法

使用抗体
抗体名

ﾒｰｶｰ

希釈倍率

抗体名

ﾒｰｶｰ

希釈倍率

CK（AE1+AE3)

日本ﾀｰﾅｰ100Calretinin

ZYMED

希釈済

EMA

Dako100

D2-40

ニチレイ

希釈済

CK7

Dako100

HBME1

Dako50

CK20

Dako50TM

Dako50CA125

Dako50

CK5/6

CHEMICON

100

CEA

ニチレイ

希釈済

Mesothelin

Novocastra

希釈済

BerEP4

Dako100

WT-1

Novocastra

40

MOC31

Dako100

DesminDako100

LeuM1

日本BD

20

CD146

Invitrogen

200

TTF-1

Dako100

GLUT-1Millipore1000

悪性中皮腫腺癌マーカー

CEA

Ber-EP4

TTF-1

LeuM1

MOC31

CA125

共通マーカーEMA

CK（AE1+AE3)

CK7

CK20

悪性中皮腫中皮マーカーCaｌretinin

D2-40

WT-1

CK5/6

HBME-1

TMCD146

DesminGLUT-1

75歳

女性

胸水Calretinin

D2-40

WT-1

CEA

TTF-1CD146

悪性中皮腫と反応性中皮の鑑別が困難な理由• 中皮マーカーによるによるマーカー検索が有効でない。
• 的確に悪性中皮腫と反応性中皮を鑑別するマーカーが少ない。
• 画像診断で体腔液貯留のみで、臨床的に早期と考えられる例では体腔液細胞診で悪性中皮腫に典型的とされる細胞所見が少ない。

材料及び方法
対象・悪性中皮腫症例 自験例、ｺﾝｻﾙﾃｰｼｮﾝ症例
・反応性中皮症例 自験例

85例
62例

染色標本：95％エタノール固定未染色標本
Pap.染色後細胞転写標本
アルシアン青染色後細胞転写標本
染色方法：ENVISION法（DAKO)
一次抗体 ４℃でovernight悪性中皮腫と反応性中皮の鑑別
悪性中皮腫の早期発見および早期中皮腫像の解明には、初回提出の体腔液細胞診で反応性中皮と悪性中皮腫を的確に鑑別することが重要。
使用抗体EMADesmin
CD146
GLUT-1(Dako)(Dako)(Invitrogen)(Millipore)悪性中皮腫と反応性中皮の鑑別(1)
悪性中皮腫（49例） : 反応性中皮（45例）
悪性中皮腫に対する特性

EMA
m-EMA

感度（％） 特異度（％）
9685

2580

m-EMA：細胞膜に強調される陽性像

RM

EMA(+)
m-EMA (-)

RM

EMA(+)
m-EMA(+)

MMEMA(+)
m-EMA(+)

悪性中皮腫と反応性中皮の鑑別(2)悪性中皮腫（24例）:反応性中皮（32例）
悪性中皮腫に対する特性

Desmin(－)

感度（％） 特異度（％）
6381
RM

MM

RM

Desmin(+)

MMDesmin(-)

悪性中皮腫と反応性中皮の鑑別(3)悪性中皮腫（21例）:反応性中皮（22例）
悪性中皮腫に対する特性

感度（％） 特異度（％）

GLUT-1RM

GLUT-1(-)

89

MM

GLUT-1(+)

90MM

GLUT-1(+)

悪性中皮腫と反応性中皮の鑑別(4)悪性中皮腫（35例）:反応性中皮（33例）
悪性中皮腫に対する特性

感度（％） 特異度（％）

CD146

RMCD146(-)

91

MM

CD146(+)

97

MM

CD146(+)

各抗体の染色特性
悪性中皮腫に対する特性

感度（％） 特異度（％）

ｍ-EMA

8580

Desmin(-)

6381

GLUT-1

89

90

CD146

9197

悪性中皮腫と反応性中皮の鑑別ポイント
・m-EMA、Desminともに特異度は75％程度であり、絶対的なマーカーとは言えず、他のマーカーとの併用が望まれる。
・GLUT-1、CD146ともに、感度、特異度ともに高く、鑑別マーカーとして有用である。今後更なる症例の蓄積、検討が必要である。
・悪性中皮腫例では同一標本内に反応性中皮の出現が少なからずみられるため、問題とする細胞を的確に捉えた上で判定を行なう必要がある。誤判定を防ぐためにも、形態学的特徴を十分認識しておくことも重要である。

胸水細胞診 85歳男性

カルレチニン

D2-40

デスミン

CD146

BerEP4

MIB1

Homo delHetero delHomo delHetero delNormal

Control (Macrophages)

NormalＦＩＳＨ結果

Normal pattern
Heterozygous deletion
Homozygous deletion（85M: 7.8%: 3.9%: 88.2%(8/102)(4/102)(90/102)

胸水セルブロック）細胞診断： 悪性中皮腫(上皮型）

悪性中皮腫と反応性中皮の鑑別（文献より）
悪性中皮腫に対する特性

感 度（％）

特異度（％）

ｍ-EMA

86～ 9374～ 80EMA

58～10068～ 91

Desmin (-)

84～ 9085～ 94

GLUT-140～ 91

82～ 93CD146

90～ 9495～100p53

45～ 4798～100IMP33694

Ki67

1688～ 92

p16 FISH59100

胸水・腹水貯留(原因不明)

中皮腫診断のためのフローチャート
免疫染色

細胞診
ヒアルロン酸高値(ｶｯﾄｵﾌ値：10万ng/ml)

細胞診所見①球状集塊、乳頭状集塊、平面的配列、②類円形核、細胞中心性③重厚感を示す細胞質④相互封入所見、細胞相接⑤窓形成 ⑥細胞辺縁不明瞭⑥多核細胞（2核以上）高頻度⑦ｵﾚﾝｼﾞG好性細胞出現⑧collagenous stroma（2型)

中皮ﾏｰｶｰ： calretinin, D2-40, WT1
WT-1, mesothelin, throbomodulin
腺癌ﾏｰｶｰ： CEA, MOC31, BerEP4
TTF1, Napsin A（胸水）MOC31，ER（女性腹水）
共通ﾏｰｶｰ： CK（AE1/3), CAM5.2
EMA, CA125, CK7, CK20

中皮マーカー(＋)
腺癌マーカー（－)

悪性中皮腫
診断確定

中皮マーカー(－）
腺癌マーカー（＋）

腺癌（診断・疑い）ま と め・悪性中皮腫と腺癌、悪性中皮腫と反応性中皮の免疫染色による細胞鑑別のポイントについて報告した。
・細胞形態より鑑別の対象を絞り込み、鑑別に適切な複数の抗体を選択することが重要である。
・悪性中皮腫の診断においては、初回細胞診で悪性中皮腫を疑うことが、早期発見につながる。今後、増加すると考えられる悪性中皮腫の早期発見、および早期中皮腫像の解明のためには、反応性中皮と悪性中皮腫の鑑別を的確に行うことが重要である。

結 語(1)中皮腫診断における体腔液細胞診の意義について言及した。
(2)中皮腫細胞診の特徴と診断のポイントに加えて免疫組織化学的所見についても触れた。
(3)中皮腫細胞と反応性中皮との鑑別が今後重要になることを述べ、いくつかの新しい試みについて紹介した。
(4)今後は、中皮腫の早期診断が重要であり、体腔液細胞診の分野でも、分子生物学的手法などによる確定診断が可能となり、患者のＱＯＬの改善に寄与すべきものと考える。

皆様、ご清聴有難うございました。
第26回日本臨床細胞学会関東連合会学術集会長 杉原 志朗先生
及び座長の労をお取りくださいました小島 勝先生に深謝申し上げます。