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浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）＜平成 23 年度助成＞

運動の抗肥満・抗糖尿病効果を増強・減弱する食品成分の検討— 高脂肪食による骨格筋 AMP キナーゼ活性化の減弱 —林達也（ 京都大学大学院人間・環境学研究科）

緒

時から 4 週間、高脂肪食（5.2 kcal/g, 60% kcal fat,言source: soybean/lard）と普通食（3.6 kcal/g, 12 %骨格筋は体内最大のエネルギー代謝器官であkcal fat, source: soybean）にて飼育し、実験前にり、運動時に生じる筋収縮（contraction）は骨格一晩絶食させた。ラットを頸椎脱臼法にて安楽死

筋代謝を活性化させる強力な生理的刺激である。

さ せ た 後、 滑 車 上 筋（epitrochlearis）を 摘 出 し、運動による代謝促進効果の発現には、筋収縮に既報の単離筋ホルダー 5 ）を用いてクレブス緩衝液反応して急性的に活性化される情報伝達分子 5 ’

中で 80 分間インキュベートした。AMPK を活性AMP-activated protein kinase（AMPK）が制御的化する最大収縮刺激として、インキュベート終了な役割を演じている。これまでの多数の研究に10 分前から、緩衝液を介した電気刺激にて 1 回

よって、骨格筋 AMPK 活性化が、インスリン非10 秒間、1 回 / 分、計 10 回の tetanus 収縮を惹起

依存的糖輸送、インスリン感受性、糖輸送担体

した 6 ）。また、最大下収縮刺激として、インキュGLUT4 発現、脂肪酸酸化、グリコーゲン代謝調

ベート終了 2 分前から 5 Hz の twitch 収縮を惹起

節、転写コアクチベーター PPARγcoactivator 1α

した 6 ）。張力は圧トランスデューサーを用いてリ（PGC1α）を介したミトコンドリア機能活性化なアルタイムでモニターした。インスリン刺激（最ど、抗糖尿病、抗肥満作用を有する多くの生理反大刺激）は、1μM インスリンを含んだ緩衝液で 30。また、分間インキュベートした。筋サンプルは直ちに液骨格筋 AMPK は、メトホルミンやチアゾリジン誘体窒素にて凍結し、Western blot による AMPK導体などの抗糖尿病薬、レプチン、アディポネク

リン酸化状態の定量 5 ）、エネルギー指標（ATP、チンなどの脂肪細胞由来生理活性因子によってもクレアチンリン酸含有量）の定量 7 ）を行った。一活性化され、これらの薬理作用発現に寄与すると部のサンプルは凍結せず、引き続き糖輸送活性測考えられている1, 2, 4 ）。

定（ [ 3 H ] 3-O-methylglucose（3MG）transport）5 ）応に関与することが明らかになった1-3）

本研究の目的は、運動時の AMPK 活性化を指を行った。採血は筋サンプルを摘出する 3 日前に標として、運動の代謝促進作用を高める、あるい尾静脈から行った。また、組織学的解析として、は逆に弱める可能性を持つ食品成分を明らかにす

摘出筋切片のミオシンATPase 染色による筋線維ることである。研究の過程において多くの食品及組成解析とオイルレッド O 染色による脂肪染色面び食品成分を検討したが、本稿では、高脂肪食の積の測定を行った 8 ）。

持つ AMPK 抑制作用に焦点をあてて報告する。

実験 2（運動負荷実験）：実験 1 と同様に、雄性実験方法
実験 1（単離筋実験）：雄性 Wister ラットを、離乳

Wister ラットを離乳時から 4 週間高脂肪食と普通食にて飼育し、実験前に一晩絶食させた。運動負荷として小動物用トレッドミルを用いた持久運

運動の抗肥満・抗糖尿病効果を増強・減弱する食品成分の検討 — 高脂肪食による骨格筋 AMP キナーゼ活性化の減弱 —動（15 %傾斜、速度 19 m/min、1 時間）を実施した。なお事前検討により、このプロトコールが両結23

果群ともに中等強度の運動（血中乳酸濃度 4 mmol/実験１L 未満）となることを確認した。運動直後に頸1.

椎 脱 臼 法 に て 安 楽 死 さ せ、 長 趾 伸 筋（extensor

高脂肪食は筋線維組成を変えずに脂肪含有量を増加させる

digitorum longus : EDL）とヒラメ筋（soleus）を摘

普通食群（control diet group：CD）に比して高出し、実験 1 と同様の解析を行った。また、あわ脂 肪 食 群（high fat diet group：HFD）で は 摂 食せて筋線維のタイプ分類とオイルレッド O 染色に量が多かったが、体重には差がなかった（Fig. 1）。

よる脂肪染色面積の測定を行った。

滑 車 上 筋 の 組 織 学 的 検 討 で は、CDとHFD とデータは平均±標準誤差で示し、平均値の検定の間に筋線維組成に差はなかったが（Table 1、を t 検定または分散分析（ANOVA）及び post hoc

Fig. 2A, B）、 筋 細 胞 内 脂 肪（ intramyocellular解析として Scheffe または Dunn の方法を用いてtriglyceride：IMTG ）の蓄積量を示す脂肪染色総行った。有意水準は 5 %とした。

面積が HFD において大きく、CD に比して 3 倍とFig. 1. Body weight and food intake in rats under CD- and HFD-feeding.
Rats at the time of weaning were fed CD or HFD for 4 weeks. Data
are means ± SE; N = 4-5 per group. * P < 0.05 vs. CD-fed group.
Table 1. Metabolic parameters and fiber type proportions in rats under CD- and HFD-feeding.
Rats at the time of weaning were fed CD or HFD for 4 weeks. Body weight and plasma
parameters were measured at the end of week 4. Muscles were dissected and fiber
type composition was determined with myosin ATPase staining. Data are means ± SE;
N = 7-10 per group.

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Fig. 2. HFD increases intramyocellular triglyceride (IMTG) content in epitrochlearis muscle.
Representative transverse sections of epitrochlearis muscle dissected from CD-fed ( A andC ) and HFD-fed (B and D) rats ( 80× magnification ). A and B, Myosin ATPase staining (pH10.7). Light and dark fibers are type I and IIa, respectively. Fibers with intermediate brightness are type IIb. C and D, Oil Red O (ORO) staining of IMTG. ORO stains neutral lipid(mainly triglycerides) with an orange-red tint, and lipid droplets are seen as distinct spotsof stain. E. Fiber type-specific and total IMTG content, expressed as a percentage of thearea of lipid stained. Data are means ± SE; N = 7 per group. * P < 0.05 vs. CD-fed group.

なっていた（Fig. 2C, D, E）。筋線維タイプ別の脂肪ムを介して行われ、その 1 つはインスリン受容体

染色面積は、タイプ I 及び IIa において HFD で大きを起点とするインスリン依存的糖輸送である。もかったが、タイプ IIb には差がなかった（Fig. 2E）。

う 1 つはインスリン受容体を介さないインスリン

高脂肪食は収縮時の糖輸送活性化と AMPK活性化を減弱させる非依存的糖輸送であり、AMPK の活性化が深く

骨格筋糖代謝の律速段階は、グルコースが細胞これまでに、高脂肪食が骨格筋のインスリン依膜を通過する糖輸送（ glucose transport ）であり、存的糖輸送を障害すること、つまりインスリン抵その本態は、糖輸送担体 GLUT4 の細胞表面への抗性を生じることは多数の報告がある 9 , 10 ）。今回

translocation を介した促進拡散である。骨格筋糖の研究においても、インスリン依存的糖輸送活輸送は主に異なった 2 つのシグナル伝達メカニズ性化が HFD において CD より 38 %減弱していた

2.

関与する 3 ）。

運動の抗肥満・抗糖尿病効果を増強・減弱する食品成分の検討 — 高脂肪食による骨格筋 AMP キナーゼ活性化の減弱 —25（Fig. 3A）。それと同時に、twitch によるインスのリン酸化の程度が AMPK 活性化の指標となる。

リン非依存的糖輸送活性化も、HFD において CD

今回の研究では、twitch、tetanus ともに AMPKより 65%減弱し、tetanus によるインスリン非依存リン酸化を顕著に活性化したが、HFD ではその的糖輸送活性化も 24 %減弱していた（Fig. 3A）。

程度が CD に比して有意に低下していた（Fig. 3B）。

な お、western blot に て 定 量 し た 糖 輸 送 担 体

3.

GLUT4 の含有量は両群間で差を認めなかった（data not shown）。

高脂肪食は収縮時のエネルギー状態を変化させない
AMPK は 細 胞 内 エネルギー 状 態 の 低 下 を 反骨 格 筋 で は AMPK の 急 性 的 活 性 化 に 伴 っ て映して活性化され、細胞の燃料計（cellular fuelインスリン非依存的糖輸送が促進される11, 12 ）。

gauge）として位置付けられる 2 ）。骨格筋において

AMPK はα、β、γサブユニットからなる 3 量体は、筋収縮のみならず低酸素、酸化的リン酸化及で、その酵素活性はαサブユニットに存在する。

び電子伝達系の薬理的阻害、高浸透圧など、エネAMPK の活性化にはαサブユニットの Thr 172 リ

ルギー指標（ATP、クレアチンリン酸含有量）のン酸化（以下 AMPK リン酸化）が重要であり、こ減少をきたす刺激に反応して活性化される 11, 12 ）。

Fig. 3. HFD attenuates contraction-stimulated glucose transport and AMPK phosphorylation
without changing energy status in isolated epitrochlearis muscle.
For contraction, isolated muscles were electrically stimulated to contract at 5 Hz for 2 min(twitch) or tetanically for 10 seconds / min for 10 times (tetanus). For insulin stimulation, isolated muscles were incubated with 1μmol/L insulin for 30 min. Muscles were then subjected
to glucose transport assay (A), western blotting (B), adenosine triphosphate (ATP) assay (C)or phosphocreatine (PCr) assay (D). Data are means ± SE; N =7-26 per group (A), 8-11 pergroup (B), 7-8 per group (C and D). * P < 0.05 vs. CD-fed group. † P < 0.05 vs. corresponding
basal group.

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今回の研究では、ATP 含有量は twitch によってなく、運動強度の指標となる血中乳酸値にも差をHFD、CD ともに変化しなかったが、tetanus に認 め な か っ た（CD : 3.1 ± 0.1 mmol/L, HFD : 3.4

よって HFD で 21 %、CD で 24 %低下し、収縮後± 0.2 mmol/L）。さらに、同様の検討を、長趾伸の含有量に群間差を認めなかった（Fig. 3C）。ま筋と滑車上筋において行ったが、ヒラメ筋の結果たクレアチンリン酸含有量は HFDで13 %少なかっとは異なり、今回採用した運動負荷プロトコール

た が、twitch に よ っ て HFD で 44 %、CD で 46 %では十分な負荷とならず、両方の筋ともに、運動低下、tetanus によって HFD で 54 %、CD で 60 %後の AMPK リン酸化の亢進が認められなかった

低下し、収縮後の含有量に群間差を認めなかった（data not shown）。組織学的検討では、長趾伸（Fig. 3D）。収縮中に発揮される張力は、twitch、筋、ヒラメ筋ともに、CD と HFD との間に筋線維tetanus ともに群間差を示さなかった（data not

組成に差はなく（Table 1）、脂肪染色面積は、すshown）。

べての筋線維タイプにおいて HFD で増加してい実験 2た（Fig. 5）。

高脂肪食はトレッドミル運動時の骨格筋 AMPK活性化と糖輸送活性化を減弱する

考察

我々は、これまでに行った実験で、HFD にお本研究の第 1 のポイントは、生体での運動負荷いてトレッドミル運動時のヒラメ筋の糖輸送活性実験と単離筋を用いた試験管内での電気収縮実験化と AMPK 活性化とに減弱が認められることをが同一の結果（高脂肪食による AMPK 活性化の減明らかにした（Fig. 4）。CD は運動負荷によって弱とインスリン非依存的糖輸送活性化の減弱）をインスリン非依存的糖輸送が非運動時の 3.4 倍に示したことである。単離筋実験を用いることで、増加したが、HFD は 2.9 倍で、CD に比べ 25 %減

生体の運動負荷時にダイナミックに変化する液性弱していた。両群のトレッドミル走行速度に差は因子や神経性因子、血液循環動態の影響を排除しABFig. 4. HFD attenuates exercise-stimulated glucose transport and AMPK phosphorylation
in soleus muscle.
Rats at the time of weaning were fed CD or HFD for 4 weeks, and were exercisedon a treadmill at a moderate intensity for 60 min. Soleus muscle was dissected immediately after exercise. Soleus muscle was also dissected from non-exercised rats.
Muscles were then subjected to glucose transport assay (A) or western blotting (B).
Data are means ± SE; N = 5-9 per group (A) and 13-16 per group (B). * P < 0.05 vs.
CD-fed group. † P < 0.05 vs. corresponding basal group. Adapted from Ref. #8.

運動の抗肥満・抗糖尿病効果を増強・減弱する食品成分の検討 — 高脂肪食による骨格筋 AMP キナーゼ活性化の減弱 —27Fig. 5. HFD increases intramyocellular triglyceride (IMTG) content in EDL and soleus muscles.
Fiber type-specific and total IMTG content, expressed as a percentage of the area of lipid
stained. Data are means ± SE; N = 8-10 per group. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs. CD-fed group.

た状態で収縮実験を行うことが可能となる。しか第 3 のポイントは、今回検討した HFD と CD とし、単離筋実験は生理的条件下での検討ではないの間に体重差がなく、血糖値や血漿トリグリセリため、本研究で生体の運動負荷実験との類似性がド値、筋線維組成、GLUT4 や AMPK の含有量に得られたことの意義は大きい。

差がなかったことである。高脂肪食下での長期飼

第 2 のポイントは、HFD が筋収縮時の AMPK

育は肥満や高血糖をきたすのみならず、GLUT4リン酸化の減弱を示した一方で、エネルギー指や AMPK の含有量の低下を来すことが知られて標には差がなかったことである。これは、HFDいる14 ）。本研究では、若い週齢のラットに対するにおいて、エネルギー状態の変化に関係しない比較的短期間（4 週間）の高脂肪食負荷によって、メカニズム に よ っ て AMPK の 活 性 化 及 び イン

AMPK や糖輸送に影響を及ぼす混乱因子を可能

スリン非依存的糖輸送活性化が減弱したことをな限り少なくして検討した。

意 味 し て い る。AMPK リ ン 酸 化 は、LKB1 や第 4 のポイントは、高脂肪食が、運動とインス

calcium-calmodulin-dependent protein kinase

リンの糖輸送活性化作用をともに減弱させたことkinase（CaMKK）などの上流キナーゼや proteinである。骨格筋は生体のインスリン感受性を規定

phosphatase 2A な ど に よ っ て 調 節 さ れ る が 1 ）、する器官であり、骨格筋におけるインスリン依存現在のところ、HFD がどのようなメカニズムで的糖輸送の減弱は生体の「インスリン抵抗性」を惹

AMPK リン酸化を抑制するのかについては不明

起する15 ）。運動によるインスリン非依存的糖輸送である。Taylor ら13 ）は、in vitro 実験において、の減弱を「運動抵抗性」と呼ぶならば、高脂肪食

長鎖アシル CoA が LKB1 を直接的に抑制し、そは「インスリン抵抗性」と「運動抵抗性」の両方をの結果 AMPK リン酸化が抑制される可能性を報誘導することになる。糖輸送は骨格筋糖代謝の律告している。しかし、HFD の筋細胞内で実際に速段階であり、その障害は単に骨格筋細胞がグル生じている現象がどのようなものなのかは今後のコースを取り込む過程だけではなく、骨格筋糖代解明が必要である。

謝全体の障害を意味している15 ）。骨格筋 AMPK

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はインスリン感受性とも密接に関連しており1- 3 ）、いただきました京都大学医学研究科・田中早津紀

この意味からも高脂肪食が AMPK リン酸化を抑氏、京都大学人間・環境学研究科・清水瑶平氏に制するメカニズムの解明は興味がもたれる。

深謝いたします。

運 動 負 荷 実 験 で は、 ヒラメ 筋 で 運 動 に よ る
AMPK リン酸化の亢進が認められた一方、滑車文上筋と長趾伸筋では認められなかった。これは、

1) Witczak CA, Sharoff CG, Goodyear LJ. 2008. AMPactivated protein kinase in skeletal muscle: from structure
and localization to its role as a master regulator of cellular
metabolism. Cell Mol Life Sci 65:3737-55

今回採用した運動プロトコールでは、滑車上筋と長趾伸筋が運動中に十分に動員されず、ヒラメ筋に比して AMPK リン酸化の程度が小さかったためと考えられる。骨格筋 AMPK は、筋を摘出する際の機械的刺激や血流遮断によってアーチファクトとして活性化されやすく 6 ）、生体の運動負荷実験では非運動群と運動群のリン酸化の差が検出しにくくなる。単離筋実験では、プレインキュベー
ション中に解剖時に生じた AMPK 活性化が沈静化するため、弱い収縮（twitch）による AMPK の活性化であっても十分に検出が可能である 6 ）。
結語
ラット単離筋を用いた電気的収縮実験とラット生体に対する運動負荷実験において、離乳時より4 週間高脂肪食で飼育したラットは、普通食で飼育したラットに比して、骨格筋 AMPK リン酸化とインスリン非依存的糖輸送の活性化が有意に減弱していた。高脂肪食は筋の脂肪含有量を増加させたが、筋線維組成には影響を与えず、筋のエネルギー指標や AMP 発現量、GLUT4 発現量にも影響しなかった。本研究から得られた結果は、高脂肪食がエネルギー状態の変化を介さないメカニズ
ムで骨格筋 AMPK の活性化を減弱し、その結果、運動が本来もたらすはずの代謝促進効果が十分に発揮されない可能性を示唆するものである。
謝辞
本研究を遂行するにあたり貴重な研究助成をいただきました公益財団法人浦上食品・食文化振興財団、そして本研究の実施にあたり多大な貢献を

献2) Hardie DG. 2008. Role of AMP-activated protein kinase
in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett582:81-93) Friedrichsen M, Mortensen B, Pehmoller C, Birk JB,Wojtaszewski JF. 2013. Exercise-induced AMPK activity
in skeletal muscle: role in glucose uptake and insulin
sensitivity. Mol Cell Endocrinol 366:204-14
4) Egawa T, Tsuda S, Oshima R, Goto K, Hayashi T. 2014.
Activation of 5’AMP-activated protein kinase in skeletal
muscle by exercise and phytochemicals. J Phys Fitness
Sports Med 3:55-64
5) Toyoda T, Hayashi T, Miyamoto L, Yonemitsu S, NakanoM, et al. 2004. Possible involvement of the alpha1 isoformof 5’AMP-activated protein kinase in oxidative stressstimulated glucose transport in skeletal muscle. Am J
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11) Hayashi T, Hirshman MF, Fujii N, Habinowski SA, Witters
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運動の抗肥満・抗糖尿病効果を増強・減弱する食品成分の検討 — 高脂肪食による骨格筋 AMP キナーゼ活性化の減弱 —2912) Mu J, Brozinick JT, Jr., Valladares O, Bucan M, Birnbaum
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phosphorylation of AMP-activated protein kinase at
threonine-172 by LKB1/STRAD/MO25. Am J Physiol
Endocrinol Metab 288:E1055-6115) DeFronzo RA. 1988. Lilly lecture 1987. The triumvirate:beta-cell, muscle, liver. A collusion responsible for NIDDM.
Diabetes 37:667-87

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浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）

Modulation of exercise-induced anti-obesityand anti-diabetes properties by food components:
an inhibitory effect of high-fat diet on exercise-stimulated
5’AMP-activated protein kinase in skeletal muscle
Tatsuya Hayashi
Laboratory of Exercise and Sports medicine
Graduate School of Human and Environmental Studies, Kyoto University
High-fat diet (HFD) is an important risk factor that leads to insulin resistance inskeletal muscle. We have demonstrated that HFD feeding for 4 weeks impairs the activationof glucose transport (GT) that is induced by 1 h treadmill running in rat soleus muscle,
accompanied with blunted activation of 5’AMP-activated protein kinase (AMPK). Thisfinding provides the hypothesis that HFD impairs the effect of exercise on GT by reducedmuscle AMPK activation, since AMPK is an important signaling intermediary leading
to exercise-stimulated GT. To investigate this hypothesis, we used an in vitro preparationthat allowed us to contract skeletal muscle in the absence of physiological confounders
including humoral, neural and circulatory conditions. After epitrochlearis muscles wereisolated from sedentary rats that had been fed HFD or control diet (CD) for 4 weeks, themuscles were incubated in Krebs-Ringer buffer containing pyruvate, and then further
incubated in the presence of insulin or electrically stimulated to contract at submaximal ormaximal intensities. Although HFD did not alter the total amount of glucose transporter
4 (GLUT4), insulin-stimulated GT in muscles from HFD-fed rats was 38% lower thanin muscles from CD-fed rats, accompanied with marked increases in intramusculartriglyceride (IMTG). Similarly, contraction-stimulated GT induced by submaximal andmaximal contraction was 65% and 24% lower, respectively, in HFD-fed rats than in CD-fedrats. Correspondently, contraction-induced activation of AMPK was significantly blunted inmuscles from HFD-fed animals, but HFD did not affect muscle phosphocreatine (PCr) andATP contents in contracting muscle. HFD did not affect fiber-type proportions or the total
amount of AMPK, either. Taken together, our findings provide evidence to suggest that
HFD not only elicits muscle insulin resistance at rest, but also evokes impaired activation ofcontraction-stimulated GT, at least in part by attenuating AMPK activation without alteringmuscle energy status during contraction.