ISSN

2432−7204

東海大学紀要 農学部
第 42 巻
2 0 2 3高速液体クロマトグラフィーを用いたアセトアミノフェン
O- 硫酸体とチロシン O- 硫酸体の UV 検出による測定法………………………………………森田千紘・元山優作・谷口玲央真・上田裕人・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田伸……１
バクテリオシン産生乳酸菌で作製したヨーグルト投与による
豚糞便中の多剤耐性菌殺菌効果の検証と豚肉の食味変化………………………………福地雄大・原口梨花・山中猛・中島勇貴・日比友之・大貫琴音
神鷹孝至・森川充実・金子博・中野佑志・石井直行・伊藤正規
浦部一浩・安田伸・石川潤一・石田光晴・木下英樹……９ブドウ ʻ 巨峰 ʼ と ʻ シャインマスカット ʼ における
偽受精胚珠培養および葯培養法を用いた半数体誘導の試み………………………………………………………安田喜一・中村勇揮・廣田真也・松永 涼
鈴木健人・金子 博・富永晃好・八幡昌紀……21

HPLC-UV 検出を用いたアセトアミノフェン硫酸体とチロシン硫酸体の測定法
東海大農紀要 42：１−８（2023）

高速液体クロマトグラフィーを用いたアセトアミノフェン
O- 硫酸体とチロシン O- 硫酸体の UV 検出による測定法
１

２

２

３

森田千紘 ・元山優作 ・谷口玲央真 ・上田裕人 ・木下英樹
小野政輝

１，２

４

４

５

・黒木勝久 ・榊原陽一 ・水光正仁 ・安田伸

１，２

１，２

Determination of Acetaminophen O-sulfate and Tyrosine O-sulfate by Highperformance Liquid Chromatography with UV Detection
Chihiro MORITA, Yusaku MOTOYAMA, Reoma TANIGUCHI, Yuto UEDA, Hideki KINOSHITA,
Masateru ONO, Katsuhisa KUROGI, Yoichi SAKAKIBARA, Masahito SUIKO and Shin YASUDA（Received 30 November 2022；accepted 28 December 2022）
Abstract
We have recently established a method for chemical synthesis of acetaminophen O-sulfate（APAPS）, which was a
PRGL¿HGSURFHGXUHEDVHGRQWKDWXVHGIRUWKHW\URVLQHO-sulfate（TyrS）synthesis. Current study was designed to set up a
simple method to quantitatively determine APAPS and TyrS using high-performance liquid chromatography（HPLC）with UV
detection. In addition to being the target compounds for the chemical synthesis, these two sulfated chemicals were selected as
the metabolites capable of generating from their parent molecules upon Phase-II sulfate conjugation in the body. Under an
isocratic separation with a mobile phase（methanol : water, 40 : 60（v/v））and ODS column, APAPS and TyrS were detectable
at 241 nm with their retention time of 1.70 min and 1.65 min, respectively. Calibration curves using the data from peak area
DQGKHLJKWGHPRQVWUDWHGWKDWWKHGHWHFWLRQDQGTXDQWL¿FDWLRQOLPLWVDIWHUD20-μL injection for APAPS were 2.29-3.55 nM and6.93-10.8 nM, respectively, while those for TyrS were 0.199-0.659μM and 0.602-2.00μM, respectively. Intra- and inter-day
DVVD\SUHFLVLRQFRQ¿UPHGWKDWWKHYDULDQFHVGH¿QHGDVWKHUHODWLYHVWDQGDUGGHYLDWLRQLQWKHLUSHDNDUHDDQGKHLJKWIRU$3$36
were 0.89-4.53%, while those for TyrS were 0.77-7.15%. Collectively, this analytical setting will be a useful tool for estimating
the yields of APAPS and TyrS produced during their chemical synthesis, and possibly for further sulfated metabolite research
as well.

アリルアミンなどのある種の化合物の硫酸化が，結果的

緒 言に発ガン性物質を生じる代謝活性化を引き起こす事例も硫酸化は，細胞質に存在する可溶性の硫酸転移酵素にある（8）．そのため，硫酸化を経て各々の化合物がどのより触媒され，生体内ではステロイドホルモンや神経伝程度不活性化されるのかを精査する代謝物の生理機能に達物質であるカテコールアミン類の恒常性維持だけでな関する研究は不明な部分も多く残っている．

く，生体外異物や薬物の不活性化ならびに排泄を担う主アセトアミノフェン（N-acetyl-p-aminophenol；APAP）

要な薬物代謝反応経路の 1 つとして知られる（1-4）．しは世界で広く用いられる解熱鎮痛薬の 1 つであり（9，かしながら，化合物の硫酸化される位置によっては弱い10），主に肝臓でグルクロン酸体や硫酸体に代謝され，ながらも活性が維持される場合（5-7）や，ヒドロキシ

尿 中 へ と 排 出 さ れ る． 近 年 の 研 究 で は， 吸 収 さ れ た１

東海大学大学院農学研究科

２

東海大学農学部バイオサイエンス学科（現食生命科学科）

３

尚絅大学生活科学部

４

宮崎大学農学部応用生物科学科

５

宮崎大学キャリアマネジメント機構

連絡先：安田伸

e-mail：shin.yasuda@agri.u-tokai.ac.jp
─1─

森田千紘・元山優作・谷口玲央真・上田裕人・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田伸
APAP の20-46% が APAP O- 硫酸体（APAPS）になるこ

メタノールは富士フィルム和光純薬（大阪）より入手しとが報告されている（10）．

た．TLC 用の silica gel 60 F254（1.05554.0001）プレート

チロシン（Tyr）は，必須アミノ酸の一種フェニルア

および silica gel 60（1.05748.0001）プレートは Merck 社

ラニンが肝臓でヒドロキシ化されて生じた後，L-Dopa

より購入した．n- ブチルアルコール，イソプロパノール，

や dopamine などの神経伝達物質に変換されるほか（11），

ギ酸，ニンヒドリン，アセトンはナカライテスク（京タンパク質を構成する主要なアミノ酸としても知られて都）より購入した．本研究では，MilliQ グレードの水をいる．タンパク質結合型の Tyr が翻訳後修飾の過程で硫使用した．

酸 化 さ れ る 一 方 で， 遊 離 体 の Tyr も ま た L-Dopa や
dopamine と同じく硫酸転移酵素 SULT1A3 の基質となっ

装置と HPLC の測定条件
HPLC による APAPS と TyrS の分離検出条件の設定は，て硫酸化され，チロシン O- 硫酸（TyrS）に代謝変換さ移動相に溶解し調製した試料溶液を用いて，既報（17,れることが報告されている（12-14）．
現状では安価で十分量の硫酸化代謝物の入手と続く生19）を一部改良して行った．HPLC システムには，日本物活性などの機能性研究が容易ではない場合も多く，硫分光製の UV 検出器（UV-2075 Plus）とフォトダイオー

酸化代謝物の潜在的な機能性については不明な部分もあ

ドアレイ（PDA）検出器（MD-4010）を備えた LC-2000

る（15）．我々はこれまでに既存の TyrS 合成法（16）をPLUS シ リ ー ズ と ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー シ ス テ ム

参考に APAPS の有機合成法を確立し（17），そこで得（ChromNAV Ver.2）を使用した．即ち，YMC 社製 ODSられた APAPS とその類似化合物を用いて抗酸化活性のカラム，（YMC-Pack ODS-A，内径4.6 mm x 150 mm，粒差異について検証を行ってきた（18）．しかしながら，子径 3μm，細孔径12 nm）を用いた逆相クロマトグラ

APAPS 合 成 時 に 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（thin-layer

フィーによるアイソクラティック溶離法により，移動相

chromatography；TLC）により合成物の有無を確認して（メタノール：水，40：60（v/v））とともに，温度30℃，

いるものの（17），定量性には優れておらず，さらに安

試 料 注 入 量20μL， 流 速0.7 mL/min， 検 出 波 長241 nm

定して高収量の APAPS を得るには未だ課題が残ってい（APAPS），272 nm（TyrS）における UV 検出を行った．

る．そのため，合成の早い段階で各工程における合成物

化合物の真正性を確認する際には，PDA 検出器によりの生成量を少量のサンプルによりモニタリングすること得られる UV 吸収スペクトルを参照した．

ができれば，収量および収率向上のための合成条件の改良が容易となる．

検量線の作成APAPS を移動相に溶解し，1 mM のストック溶液を調そこで本研究では，高速液体クロマトグラフィー（high-performance liquid chromatography；HPLC）を用い製した．その後，最大濃度100μM を等倍ずつ希釈する

た APAPS と TyrS の UV 検出による測定を定量的に行うことにより，異なる濃度（0.0244, 0.0489, 0.0977, 0.195,

ため，汎用的な ODS カラムと水 メタノールを移動相と0.391, 0.781, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100μM） のするアイソクラティック溶離法に基づくシンプルな手法

APAPS 標準溶液を調製した．これらを HPLC に供し，の設計を目的とした．これら 2 つの化学物質は，体内でピーク面積，ピーク高，溶出時間を測定した．これを 3

第 II 相薬物代謝における硫酸抱合時に親分子から生じ

回繰り返した．ピーク面積およびピーク高より y = ax+b

る硫酸化代謝物であり，これまでも有機合成を行っていの直線式を求め，直線性を決定係数（r ）で表した．

2

TyrS を移動相に溶解し，1 mM のストック溶液を調製ることから選択した．

した．その後，最大濃度1,000μM を等倍ずつ希釈する
こ と に よ り， 異 な る 濃 度（1.95, 3.91, 7.81, 15.6, 31.3,

材料および方法

62.5, 125, 250, 500, 1,000μM）の TyrS 標準溶液を調製した．上述の APAPS と同様に 3 回繰り返し測定を行った．

試薬類
TyrS の 標 品（H-Tyr（SO3H）-OH，sodium salt・0.1

検出限界（DL；detection limit）値と定量限界（QL；

H2O（≧98%），K00228）を渡辺化学工業株式会社（広quantitation limit）値は，次の等式（DL = 3.3σ /slope，

島 ） よ り 購 入 し た．APAPS の 標 品（APAPS potassium

QL = 10σ /slope）により算出した．なお，σは標準物質

salt，純度；97.0±1.6%）は，TyrS 合成法（16）に基づを含まないブランク試料の測定値の標準偏差，slope は

いて我々が以前に確立した方法で APAP と硫酸を用いて検出限界付近の 4 測定点における検量線の傾きを表す．

有機合成したものを使用した（17）．HPLC グレードの─2─

HPLC-UV 検出を用いたアセトアミノフェン硫酸体とチロシン硫酸体の測定法に極大吸収波長が認められた．TyrS では263 nm 付近に

日内変動および日間変動率の測定
APAPS（0.195μM と50μM）と TyrS（7.81μM と500μM）

極大吸収波長を認めたものの，本研究では既報に従っての標準溶液をそれぞれ 2 つの異なる濃度で調製した．日272 nm で測定した（20, 21）．ピークの溶出時間から化

内変動率の算出のために，これらを同日中に10 回繰り合物がカラムに保持されにくく溶出時間が短い可能性が返し測定した．日間変動率の算出のために， 3 別日にそ考えられるものの，本条件における APAP の溶出時間はれぞれ10回， 3 回， 3 回の繰り返し測定を行い，各測定

約3.34 min で あ る た め（17）， 少 な く と も APAPS と日におけるデータの平均値を使用した．

APAP は異なる溶出時間にピークとして分離することが可能である．同様に，本条件では TyrS と Tyr についても異なる溶出時間に別のピークとして分離できることを硫酸化代謝物の合成と HPLC による測定
既報（17）に従い，APAP（ 1 g）を予め20分間かけて

確 認 し て い る（data not shown）． 本 HPLC 法 に よ る

少量ずつ濃硫酸（10 mL）と混合し，さらに所定の時間

APAPS と TyrS の検出は，UV 吸収のある混合物が存在

反応後に 2 mL ずつ回収した．次に，回収液を砕氷ととしない場合には有効である．しかしながら，目的化合物

もに水酸化バリウムと炭酸ガス処理により中和した反応や試料によってはピークが他の成分と重なる可能性もあ

液約20 mL を得た．これより100μL を回収し，遠心濃縮るため，その際には移動相の組成など分離溶出条件のさおよび乾固後に等量の移動相に再溶解し，次に1/1,000

らなる検討を必要とする．

となるように希釈後，HPLC に供することで，APAPS
検量線の作成生成物の定量を行った．この実験を 2 回繰り返した．

異なる濃度の APAPS 標準溶液（0.0244-100μM）を 3
回繰り返し測定し，得られたピーク面積（Fig. 2 A）お統計解析
実験結果は，一部を除き， 3 または10回測定時の異なよびピーク高（Fig. 2 B）の平均値より検量線を作成した．

るデータより得た平均値±標準偏差で表した．変動率とその結果，検量線の r にはピーク面積を用いた際のして表す際には，標準偏差を百分率で表した相対標準偏0.9998とピーク高を用いた際の0.9906の両方で高い直線差（%RSD；% of relative standard deviation）値を使用し性が得られた（Table 1）．この時 APAPS の検出限界付近

た．

の低濃度4点（0.0244-0.195μM）における検量線におい22ては，r がピーク面積およびピーク高でそれぞれ0.9994
および0.9997と，低濃度領域でも高い直線性を認めた．

結果および考察

次に，異なる濃度の TyrS 標準溶液（1.95-1,000μM）

近年我々は，Jevons による既存の TyrS 合成法（16）を 3 回繰り返し測定し，得られたピーク面積（Fig. 2 C）

をもとに APAPS の有機合成法を確立した（17）．しかおよびピーク高（Fig. 2 D）の平均値より検量線を作成しながら，TLC による簡易的な APAPS の検出では定量した．その結果，検量線の r にはピーク面積を用いた際性に課題があり（17），収量と収率の向上を図る条件検の0.9996とピーク高を用いた際の0.9929が得られ，両方討を行うためには，少量のサンプルで定量性に優れたで高い直線性が認められた．TyrS の低濃度４点（1.95-

HPLC を導入する必要があった．そこで本研究では，

15.6μM）においては，r がピーク面積およびピーク高

HPLC を用いた APAPS と TyrS の UV 検出による測定法

でそれぞれ0.9948および0.9993と，ここでも高い直線性の確立を行うため，検量線の作成，検出限界および定量

を認めた．

2

2

次に，ブランク試料の測定値と Table 1 に示す検出限

限界値の決定，日内および日間変動率の確認を行うこととした．

界付近の 4 測定点における検量線の情報をもとに，検出分析法の確立と QL はピーク面積でそれぞれ2.29 nM および6.93 nM，限界と定量限界値を算出した．その結果，APAPS の DL
HPLC-UV 検出により0.781μM の APAPS と62.5μM のピーク高ではそれぞれ3.55 nM および10.8 nM であり，

TyrS の標品を個々に20μL ずつ注入してクロマトグラム

これ以上の濃度で検出または定量可能であった（Table

を得た結果，それぞれ1.70 min（Fig. 1 A）および 1.65

2）
．一方，TyrS の DL と QL はピーク面積でそれぞれmin（Fig. 1 B）の溶出時間とともにシングルピークが確

0.659μM および2.00μM，ピーク高ではそれぞれ0.199

認できた．同時に，PDA 検出器により得られた UV 吸

μM および0.602μM であった．我々は，これまで硫酸

収スペクトルを図内に示した．APAPS では241 nm 付近

体の有機合成時に，合成物の有無を TLC 後の UV 検出─3─森田千紘・元山優作・谷口玲央真・上田裕人・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田伸

Fig. 1．HPLC Chromatograms of standards of APAPS（A）and TyrS（B）. A twenty-microliter aliquot of
0.781μM（4.20 ng injection）APAPS or 62.5μM TyrS（356 ng injection）was applied to HPLC.
Detection was performed for APAPS at 241 nm and for TyrS at 272 nm. The retention times for
APAPS and TyrS were 1.70 min and 1.65 min, respectively.

Table 1．Calibration curves of APAPS and TyrS in HPLC analysis.

Range (μM)

Raw Data

Equationr

APAPS

0.0244-100

Peak Areay = 21,571x – 3,737

0.9998Peak Heighty = 1,760x + 2,992

0.9906TyrS

1.95-1,000

Peak Areay = 331.5x + 300.0

0.9996

Peak Heighty = 20.07x + 538

0.99292

Calibration curves with 4 points closer to their detection limit
APAPS

0.0244-0.195

TyrS

1.95-15.6

Peak Areay = 19,509x + 88

0.9994

Peak Heighty = 2,460x + 6

0.9997

Peak Areay = 294.4x + 697.1

0.9948Peak Heighty = 34.59x + 29.65

0.9993x, conc. (μM); y, peak area or height; r , determination coefficient.
2

─4─HPLC-UV 検出を用いたアセトアミノフェン硫酸体とチロシン硫酸体の測定法
またはニンヒドリン呈色により簡便に確認してきた

件 の APAPS と TyrS の 定 量 限 界 は0.04-0.06 ng お よ び（17）．TLC 上のスポットやバンドの濃さを数値化する

3-11 ng であったため，TLC よりも検出感度と定量性のこ と が 可 能 な ImageJ 画 像 処 理 ソ フ ト ウ ェ ア ver 1.53t

面 か ら 優 れ て い る こ と が 確 認 で き た． こ れ ま で に，（NIH）を用いることにより，一定量以上で化合物の検HPLC-UV 検出における APAPS の DL と QL にはそれぞ

量線を半定量的に作成することが可能である．そこで，

れ10μL 測定時に51 ng/mL（0.51 ng）と103 ng/mL（1.03

異なる量の APAPS と TyrS を TLC 上にスポットし，半ng）（22）や，20μL 測定時にそれぞれ0.2μM（1.08 ng）

定量的に検出可能な限界値を先行的に調べた結果，いずと6.4μM（34.4 ng）（23）が報告されている．生体試料

れも1μL スポット時に約70-80 ng 以上の量が必要であっ中に APAPS をスパイクした際と，移動相中に調製し外た（data not shown）．本研究における HPLC-UV 検出条

挿法を基本とした際の検量線における APAPS の DL や

Fig. 2．Calibration curves for APAPS（A, B）and TyrS（C, D）. Calibration curves were drawn by plotting
the data from peak area（A, C）or peak height（B, D）, respectively. Detection was performed for
APAPS at 241 nm and for TyrS at 272 nm. The range of concentration injected for APAPS was
0.0244-100μM, while that for TyrS was 1.95-1,000μM.

─5─森田千紘・元山優作・谷口玲央真・上田裕人・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田伸
QL を単純に比較することはできないものの，本 HPLC-

動率はそれぞれの濃度で4.12-4.53% と2.28-4.31% であっ

UV 検出では十分な感度で定量が可能であることが認めた．同様に，TyrS の日内変動率は，低濃度7.81μM でられた．TyrS においては，イオンペア逆相 HPLC と蛍

2.72-3.24%，高濃度500μM で0.96-1.06% であり，日間変

光発色の組み合わせによる検出において，0.13-19μg/mL

動率はそれぞれの濃度で4.84-7.15% と0.77-3.21% であっ（0.46-66.7μM）（20）または20μg/mL（70.2μM）までのた（Table 3）．これらの結果は，ピーク面積およびピー

濃度範囲で良好な直線性とともに，ピコモルオーダーのク高のいずれの測定データにおいても良好な精度と再現

検 出 感 度 が 報 告 さ れ て い る（21）．本研究における性を示すものであった．

HPLC-UV 法は蛍光法ほどの感度ではないものの，UV
APAPS の合成と HPLC による測定

吸 収 の あ る 混 合 物 が 存 在 し な い 場 合 に は，APAPS とこれまでに我々が行ってきた APAPS と硫酸との反応

TyrS の測定に十分に適用可能であると考えられる．

条件では（17），APAPS 合成時に安定して高収量を得るには未だ課題が残っている．そのため，先行して APAP

日内変動と日間変動率
APAPS と TyrS の測定精度を調べるために，異なる 2

1 g と10 mL の硫酸との反応溶液より経時的にサンプリ

つの濃度において繰り返し測定を行い，得られた値の変ングを行い，本 HPLC 手技を用いて中和後の試液中の動率と相対標準偏差値（%RSD）で表した．その結果，

APAPS 生成量についての情報を得ることとした．本条

本実験条件における 2 化合物の溶出時間は，10 回繰り件では，原料の APAP と生成物である APAPS は異なる

返し測定時の日内変動率として0.22-0.54%， 3 別日にそ

溶出時間にピークとして分離できている（17）．その結れぞれ10回， 3 回， 3 回の繰り返し測定時の日間変動率

果，20分反応よりもむしろ30-60分反応後に APAPS 生成

として0.57-4.25% が示された（Table 3）．APAPS のピー

量が高い傾向にあった．さらに，APAP 1 g 当たりの

ク面積とピーク高の日内変動率は，低濃度0.195μM で

APAPS 生成量を推定値として算出した結果，最大100

2.10-2.18％，高濃度50μM で0.89-2.09% であり，日間変

mg 付近まで合成できていることを確認できた（Fig. 3）．

Table 2．Detection and quantitation limits for APAPS and TyrS determined in HPLC analysis.

Peak Area
DL (μM)
APAPS
TyrS

Peak Height

QL (μM)DL (μM)

QL (μM)

0.00229

0.006930.00355

0.0108(0.0123 ng)(0.0373 ng)(0.0193 ng)(0.0582 ng)

0.659

2.00

0.199

0.602

(3.76 ng)

(11.4 ng)

(1.13 ng)

(3.43 ng)

Data shown in the parentheses indicate the calculated amount of test chemicals
within a 20-μL injection to HPLC. DL; detection limit, QL; quantitation limit.
Table 3．Intra- and inter-day assay precision for APAPS and TyrS determined in HPLC analysis.

Conc.
(μM)
APAPS

0.195
50

TyrS

7.81
500

Intra-day (n=10)
Retention
Time (min)Inter-day (n=3)

Peak Area Peak Height
(AU)
(μV)

Retention
Time (min)Peak Area(AU)

Peak Height
(μV)

4,175

495

1.66

4,244

519

1.71

(0.54)(2.10)(2.18)(4.25)(4.12)(4.53)

1.76

1,094,462

101,827

1.78

1,100,968

101,460(0.32)(0.89)(2.09)(1.01)(4.31)(2.28)

1.63

3,329

288

1.63

3,290

287

(0.38)(2.72)(3.24)(0.613)(4.84)(7.15)

1.93

169,822

10,9601.93

171,270

11,275(0.22)(0.96)(1.06)(0.57)(0.77)(3.21)

Variation (%RSD, as shown in the parentheses) in the intra-day data is shown from the mean of 10
replicated injections. Variation in the inter-day data is shown from the mean of 3 separated days with
10 or 3 replicated injections. AU; arbitrary unit, %RSD; % of relative standard deviation.

─6─

HPLC-UV 検出を用いたアセトアミノフェン硫酸体とチロシン硫酸体の測定法

Fig. 3．Effect of reaction time on the production of APAPS. APAP（1 g）was reacted with 10 mL
sulfuric acid for indicated periods including a 20-min premixture. Data shown represent
estimated amounts of APAPS produced in two independent experiments.

これらの値は，同条件のもと我々が以前報告した際の，まとめ

APAP 1 g と硫酸10 mL とを40分間反応後に分離精製し，最終的に得られた APAPS 91.1 mg（17）に匹敵するもの

以上より，HPLC-UV 検出による本手技が，APAPS とであった．現状では，APAP が硫酸に完全には溶解しにTyrS のクロマトグラムにおける検出ピークの面積と高くく，飽和に近い状態で反応を行っていると考えられる．

さの両方において，定量性，検出感度，実験精度と再現今後はより低濃度の APAP を用いて同様の実験を行い，性の面より，少量サンプルの測定に有用であることを明APAPS の生成量に加えて APAP の検出量とともに反応

ら か に し た． 従 っ て， 本 手 技 が 化 学 合 成 時 に 生 じ るの効率性や進行状況を検証していくこともまた重要である．

APAPS や TyrS の収率の推定や，さらなる硫酸化代謝物

生体内における硫酸化は，これまで異物代謝と不活性の研究においても有益なツールとなることが期待される．

化ならびに排泄の面より注目されてきた . しかしながら，個々のフェノール性化合物の生理活性の増減に硫酸化が謝 辞

どの程度貢献しているのかを定量的に調べることができ
れば , 将来的には硫酸化代謝後の化合物の効能を予測で本研究の一部は，日本学術振興会 JSPS の科研費基盤

きる可能性がある．我々はこれまでに，ナフトール異性研究（C）（JP20K05881）および先進生命科学研究所の体とそれらの硫酸化代謝物を用いて抗酸化活性試験を行

プロジェクト研究の助成を受けて実施されたものです．

うことにより，薬物代謝の過程で硫酸化代謝されても，必ずしも常に活性が低下する訳ではないこと，硫酸化さ要 約れる位置に依存して活性が保持されることを明らかにした（24）．また，硫酸化代謝物のインドキシル硫酸が，

我々は最近，既存のチロシン O- 硫酸体（TyrS）合成

マクロファージの細胞内酸化レベルを亢進し，さらには法を基本としたアセトアミノフェン O- 硫酸体（APAPS）

貪食能を低下させることを報告してきた（25, 26）．硫酸の有機合成法を確立してきた．本研究では，高速液体ク化代謝の生理的意義を明らかにするためにも，硫酸化にロマトグラフィー（HPLC）を用いた APAPS と TyrS のより化合物がどの程度の活性を保持しうるのかを個別に

UV 検出による測定を定量的に行うためのシンプルな手調査することは（15），薬物代謝後の化合物の生理活性法の設計を目的とした．これら 2 つの化学物質は，体内を予測する上でも重要である（27）．従って，APAPS やで第 II 相薬物代謝における硫酸抱合時に親分子から生

TyrS のみならず様々な硫酸化代謝物の生理機能や有効じる硫酸化代謝物であり，これまでも有機合成を行って性について明らかにしていくためにも，収量・収率の面いることから選択した．移動相（メタノール：水，40：で効率の良い硫酸体合成法の設計と導入，続く代謝物レ60（v/v））と ODS カラムを使用したアイソクラティッ

ベルでの機能性研究を力強く推進していくことが重要で

ク溶離では，APAPS が241 nm，TyrS が272 nm で検出可ある．

能であり，保持時間はそれぞれ 1.70 分と 1.65 分であっ─7─

森田千紘・元山優作・谷口玲央真・上田裕人・木下英樹
小野政輝・黒木勝久・榊原陽一・水光正仁・安田伸た．ピーク面積とピーク高のデータを使用した検量線よ11）Fernstrom, J.D. and Fernstrom, M.H., 2007, J. Nutr. 137,

り，それぞれ20μL 注入後の APAPS の検出限界と定量
限界はそれぞれ 2.29-3.55 nM と 6.93-10.8 nM，TyrS の検

1539S-1547S.
12）Sakakibara, Y., Suiko, M. and Liu, M.-C., 1994, Eur. J.
Biochem. 226, 293-301.

出限界と定量限界はそれぞれ 0.199-0.659μM と 0.6022.00μM であった．日内および日間変動率の分析により，13）Suiko, M., Sakakibara, Y., Nakajima, H., Sakaida, H. andLiu, M.-C., 1996, Biochem. J. 314, 151-158.

ピーク面積とピーク高における APAPS の相対標準偏差が 0.89-4.53% で，TyrS が 0.77-7.15% であることが確認

14）Yasuda, S., Idell, S. and Liu, M.-C., 2007, Biochem. J.
401, 497-503.

で き た． 以 上 よ り， 本 手 技 が 化 学 合 成 時 に 生 じ る
APAPS や TyrS の収率の推定や，さらなる硫酸化代謝物

15）Yi, L., Dratter, J., Wang, C., Tunge, J.A. and Desaire, H.,
2006, Anal. Bioanal. Chem. 386, 666-674.

の研究においても有益なツールとなることが期待される．

16）Jevons, F.R., 1963, Biochem. J. 89, 621-624.
17）森田千紘，谷口玲央真，吉田実央，德永祐希，木下

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─8─

豚へのヨーグルト投与による多剤耐性菌殺菌と食味変化
東海大農紀要 42：９−19（2023）

バクテリオシン産生乳酸菌で作製したヨーグルト投与による
豚糞便中の多剤耐性菌殺菌効果の検証と豚肉の食味変化
1

2

3

4

1

1

3

3

3

3

3

3

福地雄大 ・原口梨花 ・山中猛 ・中島勇貴 ・日比友之 ・大貫琴音
神鷹孝至 ・森川充実 ・金子博 ・中野佑志 ・石井直行 ・伊藤正規
3浦部一浩 ・安田伸

1,2,4

5

6

・石川潤一 ・石田光晴 ・木下英樹

1,2,4

9HUL¿FDWLRQRIPXOWLGUXJVWHULOL]DWLRQHIIHFWLQSLJIHFHVDQGFKDQJHLQWDVWHof pork by administering yogurt made with bacteriocin-producing lactic acid bacteria
Yudai FUKUCHI, Rinka HARAGUCHI, Takeshi YAMANAKA, Yuki NAKASHIMA Tomoyuki HIBI, Kotone ONUKI, Takashi
KOTAKA, Atsumi MORIKAWA, Hiroshi KANEKO Yushi NAKANO Naoyuki ISHII, Masanori ITO, .D]XKLUR URABE
Shin YASUDA, Junichi ISHIKAWA, Mitsuharu ISHIDA and Hideki KINOSHITA（Received 30 November 2022; accepted 11 January 2023）
Abstract
Multidrug-resistant bacteria are a global health and development threat. Therefore, in this study, we thought that multidrugresistant bacteria could be killed by bacteriocin-producing lactic acid bacteria and yogurt made from Lactococcus lactis
MBR916 was administered to Berkshire pigs in the late stage of fattening. There was no difference in the total number ofbacteria and the number of colistin sulfate- and enramycin-resistant bacteria in porcine feces between the control group and thetest group. However, the numbers of colistin sulfate-resistant Escherichia coliDQGFROLIRUPEDFWHULDZHUHVLJQL¿FDQWO\ORZHULQ
feces on day 27 of administration in the test group than in the control group（p<0.05）. There were no 3rd generation
cephalosporins-resistant bacteria. Microbiota analysis showed a decrease in the proportion of Bacillota and an increase in the
Bacteroidota in the test group. In the results of the analysis of the meat quality of the loin core, total lipid content was 2.43% in
the control group and 2.54LQWKHWHVWJURXSKRZHYHUWKHUHZDVQRVLJQL¿FDQWGLIIHUHQFH7KHIUHHDPLQRDFLGRIWKHORLQ
core tended to be lower in the test group. The taste analysis using a taste recognition sensor showed a low sourness in the test
group compared with the control group. In the taste test, it was judged that the meat color was light, and the meat-like taste（richness）ÀDYRUWHQGHUQHVVRIWKHPHDWDQGMXLFLQHVVZHUHORZVFRUHVLQWKHWHVWJURXS+RZHYHUWKHWRWDOGHOLFLRXVQHVVZDV
rated high in the test group. These results suggest that the administration of yogurt made from Lactococcus lactis MBR916
may affect the drug-resistant bacteria and intestinal microbiota and may improve meat quality in pigs.

に抗生物質を使用すると薬剤耐性菌が生き残り，増殖す

緒 言ることがあり，近年抗生物質に耐性を示す菌の出現が問現在，家畜に対し疾病治療を目的とした動物用医薬品

題となってきている．耐性菌の中でも複数の抗生物質にや，飼料中の栄養成分の有効利用を目的とした飼料添加耐性を示す「多剤耐性菌」は，人への感染とその拡大が物として抗生物質が与えられている．牛，豚，鶏などの危惧されている．代表的なものとして，メチシリン耐性

家畜は日常的にこれらを投与されている．しかし，家畜

黄色ブドウ球菌（MRSA）やバンコマイシン耐性腸球菌

１

東海大学農学研究科

２

東海大学農学部３

東海大学農学教育実習センター

４

東海大学生命科学研究科

５

宮城県産業技術総合センター

６

宮城大学食産業学類
─9─福地雄大・原口梨花・山中猛・中島勇貴・日比友之・大貫琴音・神鷹孝至・森川充実・金子博
中野佑志・石井直行・伊藤正規・浦部一浩・安田伸・石川潤一・石田光晴・木下英樹（VRE）といった薬剤耐性グラム陽性球菌，次いで，多れる．そこで付加価値の創出のため，投与後の肉質改善剤耐性緑膿菌（MDRP），多剤耐性アシネトバクター

効果についても検証した．

（MDRA）といった薬剤耐性グラム陰性桿菌などがあげられる（1）．

材料および方法

乳酸菌はグラム陽性，カタラーゼ陰性の球菌または桿菌であり，発酵食品での味や食感を向上させるために重使用乳酸菌とヨーグルトの作製要な役割を担っている．プロバイオティック乳酸菌の補MBR916株はオートクレーブ（121℃，15 min）で殺給は，有益な細菌と有害な細菌との間の効果的な微生物

菌した MRS broth（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）

バランスの維持，豚における栄養素消化率の向上，成長を用い，24時間37℃で培養した．さらに同培地，同条件

および免疫調節作用を通して健康へと寄与することが知にて 2 度継代培養した．次いで，本培養液を 2 ％ペプト

られている（2）．離乳子豚への乳酸菌の給餌も抗酸化防

ン添加スキムミルク培地に 2 ％接種で37℃，24時間培養

御機構を改善し，それによって酸化ストレスを改善した

した．さらに同培地，同条件にて 2 度継代培養したものという研究報告（3）のほか，さらに豚肉に対する乳酸をヨーグルト（乳酸菌数9.66 log CFU/g）として本試験

菌の肉質改善効果も報告されている（4）．

に使用した．

乳酸菌の抗菌効果は乳酸をはじめとする有機酸，栄養素の競合および抗菌性物質の生成に寄与する（5）．この豚へのヨーグルト投与試験

ような乳酸菌の様々な機能性の一つとして抗菌物質であ豚への乳酸菌投与試験は，東海大学動物実験委員会でるバクテリオシンの産生があげられる．一般的にバクテの承認を得て，動物実験に関する各種ガイドラインに

リオシンは幅広い pH 範囲で活性があり，熱安定性を持従って実施した（承認番号171098「乳酸菌を用いた多剤

ち，プロテアーゼによって不活性化される特徴を持ち耐性菌の抑制と機能性家畜飼料への応用」）．東海大学農（6），乳酸菌のバクテリオシンは抗生物質および化学的学部農学教育実習センター牧場において2017年 6 月22日

食品防腐剤に対する代替品として注目されている．乳酸に生まれたバークシャー種４頭を用いて試験した． 7 月

菌のバクテリオシンは一般的に真菌類やグラム陰性菌に20日までの28日間を授乳期間とし，離乳後 9 月10日まで

は抗菌活性がなく，主に生産菌と類縁なグラム陽性菌にの52日間，子豚すこやかおよび豚はつらつ（くみあい配抗菌活性を示す．もっとも代表的な乳酸菌のバクテリオ

合飼料くまもとハイパー A EX，ジェイエイ北九州くみシ ン で あ る ナ イ シ ン A は， 米 国 の 安 全 認 証 で あ る

あい飼料，福岡）で飼育後，10月19日まで硫酸コリスチ

GRAS（*HQHUDOO\5HFRJQL]HG$V6DIH）物質として認めらン（2.5ｇ力価 / トン），エンマライシン（3.0 ｇ力価 / ト

れており，世界50か国以上で広く食品保存料として利用

ン），クエン酸モランテル（30.0ｇ力価 / トン）（駆虫剤）

されている．また，日本においても2009年3月2日に食品を含む混合飼料（くみあい配合飼料くまもと B EX，

添加物として指定されている．

ジェイエイ北九州くみあい飼料，福岡）で39日間飼育しLactococcus lactis MBR916（ 以 下，MBR916株 ） は，た（2018年 7 月に硫酸コリスチンの使用は禁止されていハックルベリーより単離されたバクテリオシン産生株でる）．その後，11月14日まで抗生物質添加なしの飼料

ある．以前の研究により，本菌が産生するバクテリオシ（くみあい配合飼料くまもと C EX，ジェイエイ北九州

ンは，抗菌スペクトルが広く，pH，プロテアーゼ（アくみあい飼料，福岡）で26日間飼育後，対照区２頭（去クチナーゼ E）
，熱安定性も非常に高いことを明らかに

勢オス 2 頭），試験区 2 頭（去勢オス 1 頭，メス 1 頭）

している（7）．また，本菌および本菌が産生するバクテに分け，12月11日まで27日間，対照区は混合飼料（くみリオシンは，食品由来の多剤耐性菌を殺菌する効果があ

あい配合飼料くまもと C EX）を2.7 kg/ 日，乳酸菌投与ることを報告した（7）．しかしながら，実際に家畜に投区（以下試験区）は混合飼料に加え，上記の通り作製し与した際の多剤耐性菌の抑制効果については不明である．

たヨーグルトを0.3 kg/ 日を1日2回に分けて与えた．水そこで本研究では，本バクテリオシン産生乳酸菌で作製は自由飲水とした．ナンバリングは対照区の去勢オス 2

したヨーグルトを豚に投与することにより豚糞便中の多頭を 1 番， 2 番とし，試験区では去勢オスを 3 番，メス

剤耐性菌数を減少させることができるかを検証した．まを 4 番とした．肥育後，屠殺場にて屠殺し枝肉を得た．

た，多剤耐性菌対策は社会貢献的意味合いが強く，代替となる家畜飼料を作製したとしても，家畜の生育コスト

豚糞便サンプルの回収が上がるのみで生産者の利益となりえないことが考えら
─ 10 ─

ヨーグルト投与前（ 0 日目），投与16日目および27日

豚へのヨーグルト投与による多剤耐性菌殺菌と食味変化
目の糞便サンプルを直接豚から採取し，50 ml 容ファル

糞便の菌叢解析

コンチューブに回収した．その後，各豚から回収したサ

凍結した糞便サンプルを Novogene Corporation（Beijing,

ンプルを 1 g ずつ15 ml ファルコンチューブに分取し，China）に依頼し，次世代シーケンサーによる16S rDNA

80℃にて冷凍保存した．

の V3-V4領域の配列解析により菌叢解析を行った．

体重測定

肉質の測定および味認識装置による分析

各豚に対しヨーグルト投与を行い， 0 日目， 7 日目，飼養試験終了後にと殺した対照区と試験区の豚肉の16日目，21日目，27日目に体重測定を行った．飼料を豚

ロース芯を 80℃に冷凍保存した．肉質はロース芯（第に与える前に１頭ずつ体重測定を行い，期間増体重を算

4 〜 5 胸椎）を用い全脂質含量測定（解凍 1 日目），脂出した．また，期間増体重を用い飼料要求率を求めた．

肪酸分析（解凍 1 日目），肉色測定（解凍 1 日目と 5 日

期間増体重（ 1 kg 当たりの飼料要求率）は，出荷生体目），ドリップロス（解凍 5 日目），クッキングロス（解重＋期末生体重−期初生体重で，飼料要求率は，期間飼

凍 1 日目のサンプルを80℃で30分間加熱），テクスチャー

料消費量÷期間増体で求めた．

試験（解凍 5 日目），遊離アミノ酸分析（解凍 5 日目）
にて評価した．
また味認識装置による分析では，解凍 5 日目にロース

菌数測定用培地の作製
糞便中の総菌数の測定には GAM 寒天培地（日水製薬，

芯10 g を精秤し，15％エタノール溶液を50 ml 加え，ホ東京）を用いた．GAM および1.5% 寒天を三角フラスコ

モ ジ ナ イ ザ ー で 2 分 間 均 質 化 し た． こ れ を 遠 心 分 離に入れ，オートクレーブで滅菌（115℃，15 min）し，（3,000 rpm，15 min）し，メスフラスコへ濾過した．残渣に75％エタノール溶液を30 ml 加え，また遠心分離

GAM 寒天培地を作製した．
多剤耐性菌用培地には GAM 寒天培地にフィルター滅（3,000 rpm，15 min）して濾過し，15％エタノールで100菌した硫酸コリスチン（8μg/ml）（富士フイルム和光純

ml に定容し，試料溶液とした．本溶液を味認識装置（イ薬， 大 阪 ） と エ ン ラ マ イ シ ン（16μg/ml）（Abcam,ンテリジェントセンサーテクノロジー，神奈川）にて分

Cambridge, England）を添加したものを用いた．

析した．

硫酸コリスチン耐性大腸菌および大腸菌群の菌数測定には，硫酸コリスチン含有 XM-G 寒天培地（日水製薬）

豚肉の食味試験
対照区と試験区に差があるかどうか明らかにするため，を用いた．XM-G 寒天培地を三角フラスコに入れ，オートクレーブで滅菌（115℃，15 min）し，フィルターを通した硫酸コリスチン（8μl/ml）を添加し作製した．

食味試験を行った．嗜好型パネルとして宮城大学の学生
6 名をパネラーとした．解凍 5 日目のロース芯を厚さ3

基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ（Extended-spectrum

mm にスライスし，3 cm × 3 cm に成型し提供した．沸

β-lactamase: ESBL）産生大腸菌および大腸菌群の測定

騰させ，80℃にしたお湯で加熱（1 min）し，各豚肉をに は， 第 3 世 代 セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 薬 剤 で あ る評価した．評価には，食べる前に判断する項目として肉Cefotaxime（バイオメディカルサイエンス，東京）（6.25μg/の香り，肉色を評価した．食べてから判断する項目としml）および &HIWD]LGLPH（東京化成工業，東京）（30μg/ては，やわらかさ（食べ始め），やわらかさ（数回噛んml）を添加した XM-G 寒天培地（日水製薬）を用いた．

だ後），ジューシー感（多汁性），肉の甘味，肉様の味（コク），風味（香りを含む味の総評）の程度，風味（香りを含む味の総合）の好ましさ，脂っぽさ，総合的なお生菌数測定
冷凍保存しておいた豚の糞便サンプル1 g を9 ml の滅−１菌ペプトン水に懸濁し，10 サンプルとした．その後，いしさの計11項目について評価した．試験結果は 5 点法
により点数化し，その平均を求めた．

9 ml の滅菌ペプトン水を用い，適宜段階希釈を行った．
本希釈液を0.1 ml または 1 ml 培地に添加し，37℃で48

統計解析

時間嫌気（総菌数および多剤耐性菌数測定）または好気

統計解析は統計解析用ソフト IBMSPSS Statistics Ver.22

培 養（ 大 腸 菌 お よ び 大 腸 菌 群 ） を 行 っ た． 培 養 後，（New Orchard Road Armonk, NY, USA）用い t 検定およびProtoCOL 3（Synbiosis, Frederick, MD, USA）にて生菌数

Tukey の HSD 検定による有意差検定を行った．各試験をカウントし，サンプル 1 g あたりの生菌数（log CFU/g）において n 数は 3 〜 6 で，P < 0.05を有意差ありとした．

を算出した．
─ 11 ─

福地雄大・原口梨花・山中猛・中島勇貴・日比友之・大貫琴音・神鷹孝至・森川充実・金子博
中野佑志・石井直行・伊藤正規・浦部一浩・安田伸・石川潤一・石田光晴・木下英樹
総菌数と多剤耐性菌数の測定結果および考察

肥育期までの期間中に豚に対し与えていた抗生物質である硫酸コリスチンおよびエンラマイシンの両抗生物質

豚への投与実験
投与前にヨーグルト中にバクテリオシンが産生されてを添加した培地を使用し，耐性菌の菌数を測定した．エい る か を 寒 天 拡 散 法 に よ り 試 験 し た と こ ろ，ンラマイシン耐性菌はガス産生菌が多く観察され，混釈T

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002 に対法ではうまくいかなかったため塗抹法にて行った（Fig. 2A）．

する抗菌活性が確認された（データ未記載）．

総菌数は，抗生物質を添加していない GAM 寒天培地でヨーグルトは混合飼料の上に添加する形で投与したが，測定した．対照区の総菌数は Day0 において9.79±0.18

嗜好性は非常に高く，通常飼料のみの給餌と比較して食log CFU/g，Day14 に て10.38±0.36 log CFU/g， そ し てべ終わる時間も短かった．これはヨーグルトが水分を多Day27 では 9.78±0.05 log CFU/g という結果が得られた．

く含むことや，乳酸が嗜好性を高める一因となったので

硫酸コリスチンおよびエンラマイシン耐性菌数は，はないかと推察された（8, 9）．また，投与期間中，下痢

Day0 において 5.80±0.11 log CFU/g，Day14 にて 6.08±

や体調不調などの症状は観察されずヨーグルトの安全性

0.75 log CFU/g，Day27 では 6.22±0.68 log CFU/g であっも問題ないと考えられた．

た．試験区の総菌数では Day0 において 9.74±0.15 log

豚への投与を行った27日間での増体量は Fig.1 の通り

CFU/g，Day14 にて10.06±0.10 log CFU/g，そして Day27の結果となった．対照区は 1 番で19.5 ㎏， 2 番で22.5 ㎏

では 9.60±0.08 log CFU/g と対照区と殆ど変わらなかっ増体した．試験区の増体量は 3 番で22㎏， 4 番では22.5

た．耐性菌数は，Day0 において 5.93±0.43 log CFU/g，㎏であった．増体量の平均は対照区で21.0 kg，試験区でDay14 にて 7.98±1.34 log CFU/g，Day27 では 6.21±0.70

は 22.2 kg と試験区の方が若干多かったが，投与期間中

log CFU/g であり，Day14 にて少し高い傾向が見られたの飼料要求率は 3.47 および 3.64 と試験区の方が高くが，対照区と試験区の間に有意な差は見られなかった．

なった．これは投与したヨーグルトの量（300 g/day）のそこで耐性菌の一部に対してグラム染色を行ったところ，ためであると考えられる．しかしながら，日本飼養標準

耐性菌のほとんどはグラム陰性の桿菌であったことが分（4）の肥育期（70〜115 kg）の飼料要求率は3.61である

かった（データ未記載）．そのため，大腸菌および大腸

ことや，またスキムミルクは単価それほど高くはないと菌群に着目し以下の実験を行った．

いう点を踏まえ，経営面でそれほど問題となる値ではな
いと考えられた．
140

120

య㔜䠄䟙䠅

100

80

60

1␒

2␒

3␒

4␒

40

20

0
Day0

Day7

Day14

Day20

Fig. 1．サンプル投与後の各群における体重の推移．
1 番， 2 番が対照区， 3 番， 4 番が投与区の個体を示している．

─ 12 ─

Day27

豚へのヨーグルト投与による多剤耐性菌殺菌と食味変化

(A)
11
10

⏕⳦ᩘ䠄log CFU/g䠅

9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Day0

Day14

⥲⳦ᩘ ᑐ↷༊⪏ᛶ⳦ ᑐ↷༊Day27⥲⳦ᩘ ヨ㦂༊⪏ᛶ⳦ ヨ㦂༊(B)
11
10⏕⳦ᩘ䠄log CFU/g䠅

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1
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Day0

Day14
⪏ᛶ⳦ ᑐ↷༊Day27⪏ᛶ⳦ ヨ㦂༊

Fig. 2．豚糞便中の生菌数測定結果．（A）総菌数と多剤耐性菌数，（B）硫酸コリスチン耐性大腸菌
および大腸菌群の生菌数． ＊ : 対照区に対する有意差（p<0.05）．

は有意に抑えられているということがわかった（p <硫酸コリスチン耐性大腸菌の測定
Fig. 2 B にはこれまで家畜の飼料添加物として長年使

0.05）．福田らは，健康な豚糞便中からプラスミド性コ用されてきた硫酸コリスチンに対して耐性を示す大腸菌

リスチン耐性遺伝子（mcr-1）の保有状況を調査したとの測定結果を示した．対照区の耐性菌数は Day0 におい

ころ，80検体中37検体（46.3%）で耐性遺伝子を保有すて6.91±0.13 log CFU/g，Day14 では 6.91±0.13 log CFU/る大腸菌が検出されたと報告している（10）．農林水産g，Day27 においては 7.91±0.22 log CFU/g であり，試験省は専門委員会を開き人へ感染した際のリスクを検討しで は Day0 に お い て 6.87±0.13 log CFU/g，Day14 で はた結果，硫酸コリスチンの飼料添加物として使用するの6.87±0.13 log CFU/g，Day27 においては 6.73±0.22 log

は適切でないと判断し，2018年 7 月に飼料添加物として

CFU/g という結果となり相当数の耐性菌が存在しているの指定を取消し，現在使用を禁止している．柿田らは，ことが明らかになった．また，Day27 においては対照区

2018年 4 月〜2019年 3 月に沖縄県の豚および鶏におけるでは耐性菌が増加していたが，試験区では耐性菌の増加

コリスチン耐性遺伝子の保有実態を調査しところ，コリ─ 13 ─

福地雄大・原口梨花・山中猛・中島勇貴・日比友之・大貫琴音・神鷹孝至・森川充実・金子博
中野佑志・石井直行・伊藤正規・浦部一浩・安田伸・石川潤一・石田光晴・木下英樹
スチン耐性遺伝子（mcr-1，mcr-3，mcr-5）を保有する

し，試験区での割合は Day0 からわずかに増加したのみ

大腸菌および大腸菌群が健康豚の38.1％，食鳥検査で全であった（Fig. 3 C）
．バクテリオシンは類縁菌に対して部もしくは一部廃棄となった鶏の40.8％から分離された抗菌作用を示すことから，試験区の Streptococcus 属のと報告しており（11），使用禁止となった現在でも多く菌は MBR916株の産生するバクテリオシンによって殺菌の大腸菌および大腸菌群が耐性遺伝子を保有したまま存された可能性もある．しかし，実際に腸管内でバクテリ在している可能性が推察される．本試験においてバクテ

オ シ ン が 効 い て い る の は 不 明 で あ る． ま た，

リオシン含有ヨーグルトの投与でコリスチン耐性大腸菌

Megasphaera 属の割合は Day0 以降では大きく減少した．

および大腸菌群の抑制が見られた理由は不明であるが，，乳酸
Megasphaera elsdenii は豚の腸内細菌であり（16）

ヨーグルト投与による腸内 pH の低下，腸内細菌叢の変を酢酸，プロピオン酸，酪酸などの短鎖脂肪酸に変換す化，バクテリオシンなどが考えられる．しかしながら，る重要な細菌である（17）．短鎖脂肪酸は宿主の腸の健バクテリオシンに関しては，本菌の産生するバクテリオ

康に重要な役割を果たすことから，Megasphaera 属は豚シンがグラム陰性菌に作用するかはまだ不明であるため，の健康にとって重要な菌であると考えられる（18）．本

今後実施していく必要がある．

試験では対照区，試験区ともに存在割合が減少したため，
サ ン プ ル 投 与 の 影 響 で は な い と 考 え ら れ， ま た
Megasphaera 属の割合の減少による豚の下痢の症状は確ESBL 産生菌測定
ESBL 産生菌は，感染症治療のため広く使用されてい認されなかった．

る 3 世代セファロスポリン系薬に耐性を示す細菌であり，病院内における集団感染の原因菌となっている．近年，肉質の測定

抗生物質の不適切な使用等により ESBL 産生大腸菌およ

ロース芯の肉質分析では，全脂質含量は対照区2.43％，

び大腸菌群が増えており大きな社会問題となっている

試験区2.54％となり試験区がやや高かった（データ未記（12）．今回の実験では Cefotaxime および &HIWD]LGLPH に載）．ロース芯の脂肪酸組成および筋肉間脂肪，皮下脂

対する耐性菌数を計測したところ，耐性菌は確認されな

肪内層，皮下脂肪外層の脂肪酸組成は有意な差はなかっ

かった．

た（データ未記載）．肉色は，解凍 1 日目では a* 値とb* 値で試験区が，解凍５日目では a* 値が若干低かった
ものの有意な差は見られなかった（データ未記載）．ド菌叢解析
各豚の Day0，Day14，Day27 におけるサンプル1 g か

リップロス，クッキングロスも区間での有意差はなかっら得られた 16S rDNA の配列解析による菌叢解析結果をた（データ未記載）．テクスチャー試験（せん断性）は，Fig. ３に示した．対照区，試験区とともに Bacillota 門の試験区で若干低い値を示したが，こちらも有意差は見ら割合が半数以上閉めていることがわかった．次いでれなかった（データ未記載）．

Bacteroidota 門の割合がどの区でも多かった．対照区，Fig. 4 にはロース芯の遊離アミノ酸含量を示した．有試験区のどちらにおいても Bacillota 門と Bacteroidota 門

意差は見られなかったものの遊離アミノ酸含量は全体的が ９ 割 以 上 を 占 め て お り， 豚 に お い て Bacillota 門 とに試験区の方が低い傾向を示した（Fig. 4 A）
．呈味性別

Bacteroidota 門が多く存在しているという報告と一致しで比較すると，対照区と試験区で旨味系アミノ酸の小計ている（13）．試験区と対照区を比較したところ，試験は0.77μmol/g，0.72μmol/g，甘味系アミノ酸は0.87μmol/g，

区では Bacillota 門の割合が減少し，Bacteroidota 門の割

0.83μmol/g，苦味系アミノ酸は1.93μmol/g，1.62μmol/g

合の増加が顕著であった（Fig. 3 AB）．ただ，他の豚へと試験区の方がやや低い傾向を示した（Fig. 4 B）．

の乳酸菌や酵母の投与研究では，Bacillota 門の割合が増加し，Bacteroidota 門の割合の減少するという報告があ

味認識装置による分析

る（14, 15）
．これに関して，MBR916株で作製したヨー

各区でのロース芯の味認識装置による分析を行ったとグルトがバクテリオシンを含んでいるためなのか，菌体ころ，苦味雑味，渋味刺激，旨味，塩味，苦味，渋味，の特性なのかは不明であるため，今後抗菌試験などを実

旨味コクの項目で対照区と試験区は，有意差は見られな施していく必要がある．

かった（Fig. 5 A）．しかしながら，酸味については，対Bacilli 網の Streptococcus 属では，Day0 では対照区，試験区ともに大きな差はなかったが，Day14 で対照区で照区が3.85，試験区が2.98となり，試験区では酸味が低い傾向が見られた．

の割合が増え，Day27 では対照区での割合がさらに増加
─ 14 ─

豚へのヨーグルト投与による多剤耐性菌殺菌と食味変化(A)

Bacteroidota
Bacteroidota
Bacillota
Bacillota(B)

Bacteroidota
Bacteroidota
Bacillota
Bacillota

ヨ㦂༊

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ヨ㦂༊

ᑐ↷༊

(C)
Bacteroidota

Bacillota

Fig. 3．16S rDNA の配列に基づいた豚糞便中の菌叢解析．（A）個体別の各門の相対的存在量，（B）グループ
別の各門の相対的存在量，（C）グループ別の存在割合。赤：投与区（Day0），青：対照区（Day0），深
緑：投与区（Day14），黄色：対照区（Day14），紫：投与区（Day27），淡緑：対照区（Day27）．

─ 15 ─

福地雄大・原口梨花・山中猛・中島勇貴・日比友之・大貫琴音・神鷹孝至・森川充実・金子博
中野佑志・石井直行・伊藤正規・浦部一浩・安田伸・石川潤一・石田光晴・木下英樹
程度，風味（香りを含む味の総合）の好ましさ，総合的

食味試験
Fig. 5 B には嗜好パネルを用いた味覚試験の結果を示

なおいしさの項目が高く評価された．肉の柔らかさや多した．対照区と比較し，試験区では肉色が淡いと判断さ

汁感の項目は低評価となった．低く評価された理由としれ，肉様の味（コク），風味（香りを含む味の総合）のて，試験区の豚は対照区の豚と比較し，発育が良好で(A)㐟㞳࢔࣑ࣀ㓟ྵ㔞 ȣPROJ

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(B)
(B)
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Fig. 4．ロース芯のアミノ酸含量．（A）各遊離アミノ酸含有量．（B）呈味性別アミノ酸含有量．

─ 16 ─

豚へのヨーグルト投与による多剤耐性菌殺菌と食味変化あったため，筋繊維が強固になった可能性が考えられた

今後，付加価値を見出すためには多くの様々な層のパネ（19）．しかしながら，これらの試験は 6 名の学生で行っルで食味試験を実施していく必要があるだろう．

たため，かなりバイアスがかかっている可能性もある．

(A)
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(B)
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Fig. 5．ロース芯の味覚試験結果．（A）味認識装置による分析結果．（B）嗜好パネルを用いた味覚試験結果．

─ 17 ─

福地雄大・原口梨花・山中猛・中島勇貴・日比友之・大貫琴音・神鷹孝至・森川充実・金子博
中野佑志・石井直行・伊藤正規・浦部一浩・安田伸・石川潤一・石田光晴・木下英樹
Hosoya, Yohsuke Tomosada, Kohichiro Tsukida,

総括

7RPR\XNL$KLPD]X +LVDVKL$VR 0DVDQRUL 7RKQR

本試験は近年，問題となっている多剤耐性菌の増加に

Mitsuharu Ishida, Seiya Makino, Shuji Ikegami, Haruki

対して，バクテリオシン産生乳酸菌により作製したヨー.LWD]DZD2014, Immunobiotic Lactobacillus jensenii as

グルトが有効であるかを豚への投与試験により検討した．

immune-health promoting factor to improve growth

その結果，総菌数および硫酸コリスチンおよびエンラマ

performance and productivity in post-weaning pigs,

イシン耐性数には影響が見られたなかったが，硫酸コリ

BMC Immunol, 15, 24.

スチン耐性大腸菌および大腸菌群数が投与27日目で減少

5 ）6DPVRQ %DUDQ]DQ :D\DK .RVK\ 3KLOLS 2018,

した．腸内細菌叢の変化も見られたためバクテリオシン&KDUDFWHUL]DWLRQ \LHOG RSWLPL]DWLRQ VFDOH XS DQG

自体が効いているかは不明なものの腸内細菌叢のコント

biopreservative potential of fermencin SA715, a novel

ロールにより多剤耐性菌数もコントロールできる可能性

bacteriocin from Lactobacillus fermentum GA715 ofが示唆された．また，食味試験を行ったところ，いくつgoat milk origin, Microb Cell Fact, 17, 125.

かの項目で食味に差が見られ，総合評価では試験区の方6 ）朝倉邦造，光岡知足（編），1997，腸内細菌学，朝倉書店，東京，p346.

が評価が高かった．しかしながら，本試験では農場での出産数の影響で２個体ずつしか使用できなかったため，

7 ）石川潤一，木下英樹，菰田俊一，須田義人，石田光

今後正確なデータを得るためには個体数を増やして再試

晴，2016，乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の験の必要がある．また，本菌が産生するバクテリオシン

検討とプロテアーゼ耐性バクテリオシンの評価，ミが多剤耐性菌に殺菌作用を示したかは不明であるため，ルクサイエンス，65（3），179-190.

今後豚に対してヨーグルトではなく精製したバクテリオ8 ）飯塚悟，金丸芳，横石和也，松長辰司，新居雅宏，

シンを投与する必要もあると考えられる．上記のような

2016，乳酸菌発酵米飼料を活用した「阿波ポーク」

課 題 も あ る も の の， 本 実 験 で は Lactococcus lactis

生産技術の開発，徳島県畜産研究所研究報告第15号，

MBR916菌株で作製したヨーグルトの投与が，豚の腸内25-29.

細菌叢に影響を与え，薬剤耐性大腸菌を減らし，肉質改9 ）森田幹夫，坂代江，清宮恵美，津田和之，真原隆治，

善効果が期待できる可能性が示され今後の研究の進展が2010，納豆残さの添加が豚の健康に及ぼす影響，茨期待される．

城県畜産センター研究報告書第43号 19-25.
10）福田千恵美，薦田博也，川西郁馬，岩下陽子，関和美，渡邉仁，2019，健康豚糞便中のプラスミド性コ

謝辞

リスチン耐性遺伝子保有状況，香川県環境保健研究センター所報，18.

本研究は，公益財団法人伊藤記念財団の支援を受け実11）柿田徹也，岡野祥，加藤峰史，宮平勝人，高良武俊，施致しました．この場を借りて御礼申し上げます．

久場由真仁，仁平稔，喜屋武向子，2021，沖縄県の豚，鶏におけるコリスチン耐性遺伝子保有腸内細菌

引用文献

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3 ）Runjun Dowarah, Ashok Kumar Verma, Neeta Agarwal,

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unveils unique functional capacity of the swine gut.

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14）Donghyun Shin, Sung Yong Chang, Paul Bogere,
KyeongHye Won, Jae-Young Choi, Yeon-Jae Choi, Hak

13, 3.
4 ）Yoshihito Suda, Julio Villena, Yu Takahashi, Shoichi─ 18 ─

Kyo Lee, Jin Hur, Byung-Yong Park, Younghoon Kim,

豚へのヨーグルト投与による多剤耐性菌殺菌と食味変化
Jaeyoung Heo, 2019%HQH¿FLDOUROHVRISURELRWLFVRQWKH

17）Zhang J, Chen X, Liu P, Zhao J, Sun J, Guan W, Johnston

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Dietary Clostridium butyricum induces a phased shift in15）Zhongwei Zhang, Lili Cao, Yan Zhou, Shujin Wang,

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producing bacteria in a weaned piglet model, ACS

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expressed Saccharomyces cerevisiae, BMC, 16（1）,18）Xie M, Chen G, Wan P, Dai Z, Hu B, Chen L, Ou S, Zeng
X, Sun Y, 2017, Modulating effects of dicaffeoylquinic

166.

acids from Ilex kudingcha on intestinal microecology in16）.LP+%%RUHZLF].:KLWH%$6LQJHU566UHHYDWVDQ

vitro, ACS Publications, 65（47）, 10185-10196.

S, Tu ZJ, Isaacson RE, 2011, Longitudinal investigationof the age-related bacterial diversity in the feces of19）田淵賢治，野崎宏，竹本英男，2011，生菌入り混合commercial pigs, Veterinary Microbiology, 153（1-2）,

飼料プリモス 25 添加飼料給与が豚の発育および肉124-133.

質に与える影響，香川畜試報告，46，13-18.

─ 19 ─

東海大農紀要 42：21−32（2023）

ブドウ 2 品種における半数体誘導の試み

ブドウ ʻ 巨峰 ʼ と ʻ シャインマスカット ʼ における
偽受精胚珠培養および葯培養法を用いた半数体誘導の試み
１

１

１

１

１

２

３

３

安田喜一 ・中村勇揮 ・廣田真也 ・松永 涼 ・
鈴木健人 ・金子 博 ・富永晃好 ・八幡昌紀

Methods of pseudo-fertilized ovule culture and anther culture
for induction of haploidy in grapevine ʻKyohoʼ and ʻShine Muscutʼ
Kiichi YASUDA, Yuki NAKAMURA, Shinya HIROTA, Ryo MATSUNAGA,
Kento SUZUKI, Hiroshi KANEKO, Akiyoshi TOMINAGA and Masaki YAHATA（Received 30 November 2022; accepted 11 January 2023）
Abstract
In Japan, grapevineʼs breeding is dependent on tetraploid breeding, and the most of cultivars including diploids have highly
genetically heterozygous. These factors are barriers to strategic breeding and genome analysis. In this study, pseudo-fertilized
ovule culture and anther culture method were performed for production of dihaploids of ʻKyohoʼ and haploids of ʻShine
Muscatʼ6RIW;UD\LUUDGLDWLRQVLJQL¿FDQWO\UHGXFHGJHUPLQDWLRQIHUWLOLW\RIWKH .\RKR DQG 6KLQH0XVFDW SROOHQDW1,500 Gy
and 1,000 Gy, respectively. When the ovules obtained by crossing these pollen grains were cultured on 1/2MS medium
containing 0.5% malt extract, 12 ovules developed into embryoids after a month of culture. Two of these ovules formed callus−1by secondary culture on WM medium containing 4.4 mg・L ]HDWLQ2QWKHRWKHUKDQGZKHQDQWKHUVFROOHFWHGIURPÀRZHU
buds 28 days before full bloom were cultured on NN medium supplemented with 0.25 ppm BA-NAA and 50μM spermine, therate of callus formation after 9 weeks was 80% and 16% for the ʻKyohoʼ and ʻShine Muscatʼ, respectively. SSR analysis of 84
calli of the ʻKyohoʼ and 7 calli of the ʻShine Muscatʼ derived from anther culture revealed that most of the callus was derived
from anther somatic cells, except for 1 callus generated from ʻKyohoʼ. This callus was presumed to be dihaploid with half of
the SSR alleles reduced, but the results of Vitis MYB haplotype analysis suggested that culture variability had occurred.
Although we were not successful redifferentiation into plantlets from the calli in this report, the results provided fundamental
knowledge for producing grape haploids.

成されてきた．その代表的な品種として ʻ 巨峰 ʼ が挙げ

緒 言られ，欧米雑種 ʻ 石原早生 ʼ（四倍体 ʻ キャンベルアー

ブドウ（Vitis spp.）は，ブドウ科のつる性落葉果樹でリー ʼ）と欧州種 ʻ センテニアル ʼ（四倍体 ʻ ロザキ ʼ）のあり，ワインをはじめとする加工原料や生食用の果実と交雑から選抜された四倍体の着色系大粒品種である．そして世界的に重要な果樹の一つである．日本では，生食の優れた品質と栽培特性は，我が国のブドウ産業を70年

用として芳醇で良食味の嚙み切りやすい（果肉崩壊性）

間支えており，ʻ ピオーネ ʼ，ʻ 藤稔 ʼ，ʻ 安芸クイーン ʼ お

果実を有する欧州種（V. vinifera L.）の導入を図ったが，よび ʻ クイーンニーナ ʼ 等の主要品種の中間母本として高温多湿な気候では栽培が困難であった．そのため，欧も利用され続けてきた．しかし，それゆえ日本の大粒系

州 種 と 比 べ て 耐 湿 性 や 耐 病 性 に 優 れ る 米 国 種（V.

品種の育種は高次倍数性に依存しており，遺伝様式が複labrusca L.）との種間交雑により，多くの欧米雑種が育雑であることから戦略的な育種が難しい上，分子生物学

１

東海大学農学部応用植物科学科

２

東海大学農学教育実習センター

３

静岡大学学術院農学領域

連絡先：安田喜一

e-mail: yk964422@tsc.u-tokai.ac.jp
─ 21 ─

安田喜一・中村勇揮・廣田真也・松永涼・鈴木健人・金子博・富永晃好・八幡昌紀
的手法を活用した遺伝解析の障壁となっている．一方，培養することで，半数体の作出に成功している（9）．一ʻ シャインマスカット ʼ は，ブドウ安芸津21号（欧米雑方，葯培養は，減数分裂過程の花粉を含む葯を組織培養

種 ʻ スチューベン ʼ ×欧州種 ʻ マスカット・オブ・アレ

により植物体へ再生させ，雄性配偶子由来の半数体を獲

キサンドリア ʼ）×欧州種 ʻ 白南 ʼ の交雑から育成された得する技術であり，被子植物ではチョウセンアサガオで二倍体の黄緑系品種であり，植物ホルモン処理による無初めて作出が報告された（10）．日本でも，イネ（11），

核栽培で四倍体と同等もしくはそれ以上の果実肥大を示

アブラナ科植物（12），タバコ（13, 14）およびアワ（15）す（1, 2）．また，果皮が比較的薄いものの，裂果性が低等，多くの植物で葯培養法による半数体作出に成功していため，「皮ごと食べられる種なしブドウ」として消費いる．ブドウにおいては，前述のように葯培養の試みは者と市場から極めて高いニーズがあり，品種登録後10年

多くなされているが，偽受精胚珠培養に関する報告はほ以上経過した今でも爆発的に普及・作付面積の拡大が進

とんどなく，軟 X 線照射の花粉への影響や最適な培養んでいる．優れた果実特性をもつ反面，一部の病害に対条件などの基礎的な知見も得られていないのが現状であする罹病性や「かすり症」，「未熟果粒混入症」
，
「果梗部

る．

黒変症」といった生理障害発生等，品種としての改善点

そこで本研究では，日本の優良品種 ʻ 巨峰 ʼ と ʻ シャ

は多く残されている．中間母本として既に利用が進んでインマスカット ʼ のそれぞれの二倍性半数体および半数

おり，ʻ 雄宝 ʼ や ʻ マスカサーティーン ʼ 等の黄緑系品種体作出を目的とし，軟 X 線を照射した花粉を用いた偽のみならず，ʻ ヌーベルローズ ʼ，ʻ スカーレット ʼ，ʻ コ

受精胚珠培養および植物組織培養の効率化に利用される

トピー ʼ および ʻ 富士の輝き ʼ 等の着色系品種の育成に

ポリアミンを用いた葯培養を行った．

寄与している．
前述のように，日本のブドウ育種は ʻ 巨峰 ʼ を中心と材料および方法

した倍数性育種に依存しており，戦略的な育種の障壁となっている．また，ʻ シャインマスカット ʼ は二倍体で植物材料

はあるものの，ヘテロ接合性が高く，後代への目的形質

東海大学農学教育実習センター植栽の ʻ 巨峰 ʼ（［V.

の導入や分子生物学的手法を用いた遺伝解析は容易では

labrusca L. × V. vinifera L.］× V. vinifera L.）および ʻ シャない．これらの打開策の一つとして，半数体の育成が挙インマスカット ʼ（［（V. labrusca L. × V. vinifera L.）× V.

げられる．すなわち，優良な四倍体品種を二倍性半数体）の２品種
vinifera L.］×［V. vinifera L. × V. vinifera L.］にゲノムを減数させ，その中から優良な形質を有するもを供試した．

のを選抜することで，高次倍数性に依存した日本のブドウ育種を二倍体育種に回帰させることが可能であると考

花粉への軟 X 線照射と稔性調査えられる．また，ʻ シャインマスカット ʼ のような優良5 月下旬に，両品種の花穂から開花直前の花蕾を採取

な二倍体品種から半数体を作出することは，ゲノム解析

し，取り出した葯をペトリディッシュ内でシリカゲルとの貴重な材料を提供するとともに，コルヒチン等によるともに同封し，25℃暗所条件で 4 時間程度静置すること

人為的な倍加処理を通して完全なホモ接合の倍加半数体で開葯した．開葯後，プラスチックペトリディッシュ（純系）を作出することで，戦略的育種と育種年限の短（φ90×20 ㎜）ごと SOFTEX SV-100AW/I．I．特型（ソ縮に寄与することが期待される．ブドウにおける半数体

フッテックス（株））内に静置し，目的の照射線量にな作出の試みは，主に葯培養法を用いて国内外で精力的にるように照射時間を算出し， 0 分（0 Gy），22分（500

行われているが，半数体作出の事例はほとんどなく，葯

Gy），44分（1,000 Gy），66分（1,500 Gy）で軟 X 線を照体細胞由来カルスもしくは植物体の獲得にとどまってい射した．照射後すぐに，染色稔性と発芽稔性を調査した．

る（3, 4, 5, 6, 7）．

染色稔性は，アセトカルミン溶液（FUJIFILM Wako）を偽受精胚珠培養は，軟Ｘ線などの放射線を照射して精滴下したスライドグラス上で花粉を染色後，調査花粉数

核を不活化した花粉を用いた交配後，胚珠を培養するこに対する染色花粉数を百分率で算出した．発芽稔性は，とで雌性配偶子由来の半数体の再生を図る技術である．

スライドガラス上の20％ショ糖，1％寒天（FUJIFILM

特に，ウリ科植物ではその技術が確立しており，これまWako）培地上に花粉を付着させ，湿箱に入れて25℃暗でに多くの半数体が得られている（8）．果樹では，カン

所条件で 6 時間静置後，光学顕微鏡下で観察し，調査花

キツ属植物でブンタン ʻ 晩白柚 ʼ に軟 X 線を照射した ʻ 福

粉数に対する花粉管の発芽した花粉数を百分率で算出し原オレンジ ʼ の花粉を交配して得られた不完全な種子をた．調査は 5 反復で行い，JMP（SAS）の HSD-Tukey 多─ 22 ─

ブドウ 2 品種における半数体誘導の試み
重検定を用いて統計処理した．なお，照射前後は温度の滅菌水で 5 分間 3 回洗浄した．滅菌した花穂から花蕾を影響を受けないように氷上で取り扱い，交配まで−40℃切除し，取り出した葯をプラスチックペトリディッシュ

で冷凍貯蔵した．

（φ90×20 ㎜）内の培地上に25葯 / シャーレを等間隔で置床した．2 ％スクロース，0.5％ゲランガム（FUJIFILM
Wako）NN 培地（pH 5.7）（17）を対照区とし，6- ベン

軟 X 線照射花粉を用いた交配と胚珠培養
ʻ 巨峰 ʼ × ʻ 巨峰 ʼ で試験区あたり 3 花穂の計９花穂，

ジルアミノプリン（BA）と 1- ナフタレン酢酸（NAA）

および ʻ シャインマスカット ʼ × ʻ シャインマスカット ʼもしくは 2,4- ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）（ナカラと ʻ 巨峰 ʼ × ʻ シャインマスカット ʼ で試験区あたり 2 花イテスク）を同濃度（0.1 ppm，0.25 ppm，0.5 ppm）で穂の計 8 花穂について，除雄後に軟 X 線を照射した花添加した 6 区，0.25 ppm 区に50μM プトレシン二塩酸塩粉を用いた交配を実施した．交配50〜60日後にすべての標準標品（PTC），スペルミン（SPM），スペルミジン

果実を収穫し，着粒と含核の程度を調査した．果実をエ（SPD）（FUJIFILM Wako），それら 3 種混合の 8 区，計

タノールにディッピング後，0.1％塩化ベンザルコニウ

15区を設けた．ポリアミンは，熱失活を防ぐため，フィム溶液に 5 分間，3 ％次亜塩素酸ナトリウム溶液に 6 分

ルター滅菌後，50℃程度まで冷ました培地へ添加した．

間浸漬することで滅菌し，その後，滅菌水で 5 分間 3 回

培養 9 週後に，実体顕微鏡下で葯の外観とカルス形成を洗浄した．それらの果実から胚珠を取り出し，プラス調査した．反復はなしとした．

チックペトリディッシュ（φ90×20 ㎜）内の 3 ％スク
ロース，0.8％ゲランガム（FUJIFILM Wako）および0.5％

DNA マーカーを用いたカルスの倍数性解析

マ ル ト エ キ ス ト ラ ク ト（Difco Laboratories） を 含 む

ʻ 巨峰 ʼ と ʻ シャインマスカット ʼ の葯培養由来カルス

1/2MS 培地（16）（pH 5.7）上に置床した．培養 1 ヵ月

（継代培養期間最大 6 か月），それぞれ107個体と 3 個体

後に実体顕微鏡下で生育調査を行った．

から安田ら（18）の手法従って改変 CTAB 法（19）によりゲノム DNA を抽出した．すなわち，乳鉢内で液体窒素を用いて凍結・粉砕し，粉砕物を2.0 mL チューブ葯培養
両品種の満開28日前の花穂を採取し，培養まで28日間内で予熱した CTAB 溶液1 mL とメルカプトエタノール

冷蔵保存した（Fig. 1）．花穂を70% エタノールにディッ

10μL を 加 え て 混 和， ブ ロ ッ ク イ ン キ ュ ベ ー タ ー

ピング，0.1% 塩化ベンザルコニウム溶液内で10分間，（PowerBLOCK Shaker, ATTO） で65 ℃，1,500 rpm，30分

0.6% 次亜塩素酸ナトリウム溶液内で15分間攪拌滅菌後，

間振とうした．RNase を 4μL 添加して37℃ 15分間処理

Fig. 1

Flower stage of ʻKyohoʼ（left）and ʻShine Muscatʼ（right）28 days before full bloom day used for antherFXOWXUH7KHIXOOEORRPGD\ZDVGH¿QHGDVWKHGD\ZKHQ80RIWKHÀRZHUVLQWKH¿HOGZHUHLQIXOOEORRPBars = 5.0 cm

─ 23 ─

安田喜一・中村勇揮・廣田真也・松永涼・鈴木健人・金子博・富永晃好・八幡昌紀
後，室温，14,000 rpm， 5 分間遠心分離して得られた上

ブ ド ウ MYB ハ プ ロ タ イ プ 解 析 に は，Kobayashi ら

清について，フェノール / クロロホルムとクロロホルム（22, 23）および Azuma ら（24）の構築した VvMYBA1a/ イソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈（F: 5ʼ-AAAAGGGGGGCAATGTAGGGACCC-3ʼ, R: 5ʼ

殿を実施し，DNA ペレットを TE buffer 50μL に溶解し

-GAACCTCCTTTTTGAAGTGGTGACT-3ʼ），VlMYBA1-2

た． 微 量 分 光 光 度 計（NanoDrop2000c, ThermoFisher（F: 5ʼ-CACCACTTGAA AAAGAAGGTC-3ʼ, R: 5ʼ-TCTTGA

6FLHQWL¿F..）で DNA 溶液の濃度を測定後，2.5 ng・L

TCCAGCTCAGCTAAC-3ʼ），VlMYBA1-3（F: 5ʼ- GGACGT−1に調整して PCR に用いた．ブドウ MYB ハプロタイプ

TAAAAAATGGTTGCACGTG-3ʼ, R: 5ʼ-GAACCTCCTTTT

解析には，対照として葯を採取した 2 品種（野生型），

TGAAGTGGTG ACT）および VlMYBA2（F: 5ʼ-GCTGAG

ʻ ヌ ー ベ ル ロ ー ズ ʼ，ʻ マ ス カ ッ ト ノ ワ ー ル ʼ，ʻ テ レ キ

CATGCTCAAATGGAT-3ʼ, R: 5ʼ-TCCCACC ATATGATGTC

5BBʼ および ʻ クイーンニーナ ʼ の幼葉から同様の方法で

ACCC-3ʼ）を用いた．PCR 反応は，TaKaRa Ex Taq Hot

抽出したゲノム DNA を供試した．

Start Version 5.0μL（TaKaRa），2.0μM F/R primer mixture

Simple sequence repeat（SSR） 解 析 に は，Cipriani らⓇ

1.0μL，Nucleotide free water（Merck）3.0μL お よ び2.5

（20）の構築したマーカーのうち安田ら（21）が選抜しng・μL

た VChr2b（F: 5ʼ-CCTCCTGCGAACAAGTCTGT-3ʼ, R: 5ʼ-

用いて，95℃ 3 分の前処理後，熱変性94℃ 30秒，アニー

GTTGCTGGATTTGTGGAAGG-3ʼ），VChr10b（F: 5ʼ-CCA

リング60℃ 30秒，伸長72℃ 90秒の34サイクル，最終伸TGTCCAACCGA AACAAC-3ʼ, R: 5ʼ-CAGAAATCTCGTGT

長72℃ 5 分で行った．PCR 反応後の産物は， 2 % アガ

CGCTCA-3ʼ）および VChr19a（F: 5ʼ-TGGATTCACCATT

ロース電気泳動後，EtBr で染色して紫外線照射下で可GTCCTCA-3ʼ, R: 5ʼ-CGAGGATACCAACAAGAATGAA-3ʼ）

視化した．

−1

genome DNA 1.0μL の計10.0μL の混合溶液をを用いた．PCR 反応は，GoTaq Green Master Mix 5.0μLⓇ（Promega），2.0 μM F/R primer mixture 1.0μL，Nucleotide
free water（Merck）3.0μL お よ び2.5 ng・μL

−1

結 果

genomeDNA 1.0μL の計10.0μL の混合溶液を用いて，94℃ 3 分

軟 X 線照射花粉を用いた交配と胚珠培養の前処理後，熱変性94℃ 30秒，アニーリング53℃ 35秒，

軟 X 線を照射した花粉の染色稔性は，ʻ 巨峰 ʼ では試

伸長72℃ 35秒の32サイクルで行った．PCR 増幅産物は，

験区間に有意差がなかったのに対して，ʻ シャインマス

20% ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）後，エチジ

カット ʼ においては照射量が少ない試験区で低い稔性をウムブロマイド（EtBr）で染色して紫外線照射下で可視示し，0Gy 照射区で76.2％に対して1,500 Gy 照射区では化した．

82.1% と有意に低かった（Fig. 2，Table 1）．発芽稔性は，Table 1

Effect of acetocarmine staining and pollen germination of the pollen on total
radiation dose of soft X-ray in ʻKyohoʼ and ʻShine Muscatʼ.

Cultivar'Kyoho''Shine Muscat'

Total
radiation dose
（Gy）

Staining

058.2 ax11.2 a500

63.2 a12.6 a1,000

60.8 a11.9 a1,500

60.0 a5.3 b076.2 b

19.3 aPollen fertility（%）
ZyGermination

500

77.0 ab12.0 b1,000

81.4 ab

4.5 c

1,500

82.1 a

4.1 c

z

The number of pollen grain stained by 40% acetocarmine solution /the total number of pollen grains ×100.
y
The number of germinated pollen grain on medium containing with
20% scrose and 1% agar / the total number of pollen grains ×100.
x
Different letters represent significant difference in HSD-Tukey's
multiple range test, 5% level（n = 5）.

─ 24 ─

ブドウ 2 品種における半数体誘導の試み

dShine Muscatb

0 Gy
1,500 Gy
1,500 Gy

Pollen germination

0 Gy

Acetocarmine stainingdKyohob

Fig. 2 Effect of acetocarmine staining and pollen germination of the pollen on soft X-ray irradiation in ʻKyohoʼ and ʻShine Muscatʼ.
Bars = 100μm

両品種で照射量が高い試験区で低い稔性を示し，ʻ 巨峰 ʼだ胚珠のみ，以下の偽受精胚珠培養に供試した．

では1,500 Gy 照射区で5.3％と 0〜1,000 Gy 照射区より有胚珠培養後，多くの胚珠が褐変化し， 1 ヵ月後の調査

意に低い値であった．一方，ʻ シャインマスカット ʼ でにおいて，ʻ 巨峰 ʼ × ʻ シャインマスカット ʼ の1,000 Gy

は500 Gy 照射区で12.0% と0 Gy 照射区の19.3% より有と1,500 Gy 照射区および ʻ シャインマスカット ʼ × ʻ シャ

意に低く，1,000 Gy と1,500 Gy 照射区においてそれぞれインマスカット ʼ から得られた胚珠はすべて褐変化し，4.5％と4.1% とさらに低下した．

その後も変化はなかった（Table 3）．一方，ʻ 巨峰 ʼ × ʻ 巨

これらの花粉を用いた交配を行ったところ，ʻ 巨峰 ʼ

峰 ʼ の500 Gy と1,500 Gy 照射区および ʻ 巨峰 ʼ × ʻ シャイ× ʻ 巨峰 ʼ から 9 花穂中 4 房，ʻ 巨峰 ʼ × ʻ シャインマス

ンマスカット ʼ の500 Gy 照射区からそれぞれ 4 個体（発カット ʼ から 8 花穂中すべて，ʻ シャインマスカット ʼ ×

生率としてそれぞれ6.6%，7.0% および3.7%）の胚様体

ʻ シャインマスカット ʼ から 8 花穂中 4 房の果実が収穫が発生した．これらの胚様体は発生後すぐにガラス化しできた（データ略）．花粉への軟 X 線照射量と着粒，含たため，メスで緑色の組織部をカットした後，4.4 mg・核の程度および着粒した果粒の大きさとの間に一定の関L係性はなかった（Table 2，一部データ略）．これらのう養を行ったところ，ʻ 巨峰 ʼ × ʻ 巨峰 ʼ と ʻ 巨峰 ʼ × ʻ シャ

ち，軟 X 線照射花粉を用いた交配から得られた膨らんインマスカット ʼ の500 Gy 照射区の胚様体からそれぞれ

─ 25 ─

−1

ゼアチンを含む pH 5.7の WM 培地（25）上で二次培安田喜一・中村勇揮・廣田真也・松永涼・鈴木健人・金子博・富永晃好・八幡昌紀
Table 2

The results in the crosses using soft X-ray-irradiated pollen of ʻKyohoʼ and ʻShine Muscatʼ.

Total radiation dose No. ofof soft X-ray
florets
Pollen parent
to pollen（Gy）
crossedNo. ofberriesset

Cross combination
Seed parent'Kyoho''Kyoho''Shine Muscat''Shine Muscat'

z
y

0
500
1,000
1,500
0
0
500
500
1,000
1,000
1,500
1,500
0
500
1,000
1,000

15
21
18
26
31
20
40
29
26
27
34
30
15
15
15
15

8
20
7
20
19
13
26
10
8
23
25
21
13
2
10
4

y
Percentage
Total No. of ovules and seeds
berry set
Developed Extremely
Small
Normalz（%）
ovule
small seed
seed
seed
53.3
28
0
0
0
95.2
61
4
1
2
38.9
8
0
1
0
76.9
57
12
3
1
61.3
50
13
12
1
65.0
21
15
11
2
65.0
79
10
8
4
34.5
29
4
0
1
30.8
17
1
2
1
85.2
87
1
0
0
73.5
65
16
13
1
70.0
53
14
3
5
86.7
29
0
0
1
13.3
7
1
0
0
66.7
34
1
0
2
26.7
13
0
0
0

The number of beriies set / the number of florets crossed × 100.
Long diameter: 0 mm < developed ovule ≦ 1 mm < extremely small seed ≦ 2 mm < small seed ≦ 4 mm < normal seed.

Table 3

Appearances of ovules after a month of pseudo-fertilized ovule culture on 1/2 strength MS medium.

Cross combination
Seed parent

Pollen parent'Kyoho''Kyoho''Shine Muscat''Shine Muscat'z

No. ofovulesused

Total radiation doseof soft X-ray
to pollen（Gy）
500
1,000
1,500
500
1,000
1,500
500
1,000

Appearances of ovules
Browning

Yellowing
Z

61
8
57
108
104
118
7
47

44 （72.1）
7 （87.5）
46 （80.7）
97 （89.8）
104 （ 100）
118 （ 100）
7 （ 100）
47 （ 100）

13 （21.3）
1 （12.5）
7 （12.3）
7 （ 6.5）0 （ 0）
0 （ 0）
0 （ 0）
0 （ 0）

Embryoid
4 （ 6.6）0 （ 0）
4 （ 7.0）
4 （ 3.7）0 （ 0）
0 （ 0）
0 （ 0）
0 （ 0）The numbers in brackets represent percentge.

1 個体ずつカルスが形成された（Fig. 3）．これらのカルと16% であった．本試験で用いたオーキシン 2 種の比スは増殖が乏しく，再分化せずに枯死した．

較において，2,4-D より NAA で総じて高い値を示したが，濃度間には一定の傾向は見られなかった．さらに， 3 種のポリアミンの添加の影響は，SPM 添加区においてそ葯培養と得られたカルスの倍数性解析
両品種とも，培養 5 培養週後から肉眼で観察できるカの前駆体である PTC と SPD 添加区より高い生存率とカルスが発生し，培養 9 週後には葯を覆うほどに旺盛な増

ルス形成率を示し， 3 種混合添加区よりも高かった．最殖を示した（Fig. 4）． 9 週後に調査を行ったところ，一

終的に，ʻ 巨峰 ʼ と ʻ シャインマスカット ʼ の葯培養より，部の試験区を除いて ʻ シャインマスカット ʼ より ʻ 巨峰 ʼ

それぞれ84個体と 7 個体のカルスを獲得できた．

で生存率とカルス形成率が高い傾向にあり，品種間もしʻ 巨峰 ʼ の葯培養由来カルス84個体について， 4 アレ

くは倍数体間差異が存在することが示唆された（Table

ル が す べ て ヘ テ ロ 接 合 で あ る VChr10b で SSR 解 析 を4）．両品種ともに NN BA-NAA 0.25 ppm+SPM で最も高行った．その結果，84個体中78個体で明瞭な増幅バンド

い 生 存 率 と カ ル ス 形 成 率 を 示 し，ʻ 巨 峰 ʼ で は と も にが確認され，そのほとんどで野生型の葉と同様に 4 アレ

80％であり，ʻ シャインマスカット ʼ ではそれぞれ56%

ルが検出されたのに対し， 1 個体（K-1-9-16）のみ 2 ア─ 26 ─

ブドウ 2 品種における半数体誘導の試み

Secondary culture‘Kyoho’ ʹ ‘Shine Muscat’(500 Gy)‘Kyoho’ ʹ ‘Kyoho’(500 Gy)

Ovule culture

Fig. 3

Embryoids after a month of pseudo-fertilized ovule culture on 1/2 strength MS medium and calli generated
from these embryoids after three weeks of secondary culture on MW medium（Yahata et al., 2022）-1
containing 4.4 mg・L zeatin, pH 5.7.
Bars = 2.0 mm

Weeks after culture
3 weeks

5 weeks

7 weeks

9 weeks‘Shine Muscat’dKyohob

1 week

Fig. 4

Callus formation in anther culture of ʻKyohoʼ and ʻShine Muscatʼ on NN medium containing polyamines.
Bars = 1.0 mm

レルに減数していた（Fig. 5，一部データ略）．ʻ シャイ

構築された 4 つの DNA マーカーを用い，MYB ハプロ

ンマスカット ʼ の葯培養由来カルス 7 個体は， 2 アレルタイプ（24,26,27）を調査した（Fig. 6）．その結果，ʻ 巨

がヘテロ接合である VChr2b と VChr19a で SSR 解析を

峰 ʼ で は VvMYBA1a，VlMYBA1-2，VlMYBA1-3 お よ び

行い，すべての個体で野生型の葉と同様に 2 アレルが検

VlMYBA2 のすべてが存在するハプロタイプ A/A/E1/E2で出された．SSR 解析でアレルの減数が確認された K-1-9-

あったのに対し，K-1-9-16 では VlMYBA1-2 のみが検出

16について，果皮色の決定に関与する MYB 遺伝子座でされた（Fig. 7，Table 5）．

─ 27 ─

安田喜一・中村勇揮・廣田真也・松永涼・鈴木健人・金子博・富永晃好・八幡昌紀
Table 4

Effect of addition of plant hormones and polyamines to NN medium on callus formation in anther culture of ʻKyohoʼ and ʻShine Muscatʼ (9 weeks
after culture).
Growing
condition

Cultivarz

Controlx

BA-NAA
0.25 ppm

BA-NAA
0.5 ppm

BA-NAA
0.25 ppmy+ PTC

BA-NAA
0.25 ppm+ SPM

BA-NAA
0.25 ppm+ SPD

BA-NAA
0.25 ppm
+ Tri

6（24）
6（24）
0（ 0）
0（ 0）

6（24）
6（24）
4（16）
0（ 0）

9（36）
6（24）
4（16）
0（ 0）

11（44）
11（44）
10（40）
1（ 4）

20（80）
20（80）
14（56）
4（16）

15（60）
15（60）8（32）1（ 4）

13（52）
13（52）
8（32）1（ 4）BA-2,4-D
0.1 ppm

BA-2,4-D
0.25 ppm

BA-2,4-D
0.5 ppm

BA-2,4-D
0.25 ppm+ PTC

BA-2,4-D
0.25 ppm+ SPM

BA-2,4-D
0.25 ppm+ SPD

BA-2,4-D
0.25 ppm
+ Tri

2（ 8）
0（ 0）
2（ 8）
0（ 0）

4（16）
0（ 0）
4（16）
0（ 0）

2（ 8）
0（ 0）
8（32）
0（ 0）

5（20）
1（ 4）
6（24）
0（ 0）

9（36）
4（16）
8（32）
0（ 0）

6（24）
0（ 0）
6（24）
0（ 0）

8（32）
2（ 8）
10（40）
0（ 0）

w

0（ 0）
0（ 0）
0（ 0）
0（ 0）

Survival
Callus formation
Survival'Shine Muscat'
Callus formation'Kyoho'Growing
condition

Cultivar

BA-NAA0.1 ppm

Survival
Callus formation
Survival'Shine Muscat'
Callus formation'Kyoho'zControl is only NN base medium. Phytohormones and/or polyamines added to the NN medium in other experimental sections are shown.
PTC: 50 μM putrescine, SPM: 50 μM spermine, SPD: 50 μM spermidine, Tri: 50 μM（PTC + SPM + SPD）.
x
Those that maintained a yellowing without browning were considered to be suevival.
w（Number of anthers corresponding to growing conditions / number of anthers used）× 100. 25 anthers were tested for each.
yVChr10bWk

1

2

VChr2b
3

4

5

Ws 6

Wk

VChr19a
8

Ws

6

7

8

1

dShine Muscatb

dKyohob
Fig. 5

7

SSR analyses in the calli obtained from anther culture of ʻKyohoʼ and ʻShine Muscatʼ. M: 100bp ladder, Wk: the leafof ʻKyohoʼ, Ws: the leaf of ʻShine Muscatʼ, 1-5: the calli derived from ʻKyohoʼ, 3: K-1-9-16, 6-8: the calli derived
from ʻShine Muscatʼ7KHFHQWHUHGHOHFWURSKRUHWLFLPDJHZDVVKRWE\WKHVLQJOHOHQVUHÀH[FDPHUD

Fig. 6

Vitis MYB haplotypes at the color locus in ʻKyohoʼ.
（Azuma et al., 2011）─ 28 ─

ブドウ 2 品種における半数体誘導の試み

Fig. 7

Table 5zyPolymorphism detected in 4 MYB-related genes for Vitis MYB haplotype analysis of the leaves of ʻKyohoʼ andthe 5 cultivars, and the callus derived from anther culture of ʻKyohoʼ. M: 100bp ladder, 1: ʻKyohoʼ, 2: ʻShine
Muscatʼ, 3: ʻNouvelle Roseʼ, 4: ʻMuscat Noirʼ, 5: ʻTereki 5BBʼ for stock, 6: ʻQueen Ninaʼ, 7: callus K-1-9-16.

Vitis MYB haplotype analysis of the callus K-1-9-16 derived from anther culture of ʻKyohoʼ, and the leaves of ʻKyohoʼ and the 5 cultivars.

Cultivaror callus

Ploidy
level

Skin
color

'Kyoho'K-1-9-16'Shine Muscat''Nouvelle Rose''Muscat Noir''Teleki 5BB'
'Queen Nina'

4x
z
2x
2x
2x
2x
2x
4x

Black
White
Red
Black
Black
Red

Band pattern
VvMYBA1a
+
−
+
+
+
−
+

VlMYBA1-2
+
+
−
−
−
+
+

VlMYBA1-3+−−
yInsertion（824 bp）
Deletion（155 bp）++

VlMYBA2
+
−
−
−
−
+
−

Vitis MYB
haplotype
A/A/E1/E2
A/A
A/B
A/C
E1/E2
A/A/A/E1

Estimated ploidy based on the result of SSR analysis.
Insertion and deletion in VlMYBA1-3 to distinguish between haplotype B and C（Azuma et al., 2011; Azuma, 2017）.

比較的多くの果実と発達した胚珠を得ることができた．

考 察

花粉の発芽稔性低下と精核不活化との関係は不明である

軟 X 線を照射した花粉の発芽稔性は，照射量の増加

が， 花 粉 へ の ダ メ ー ジ の 指 標 と 考 え れ ば，ʻ 巨 峰 ʼ とに伴って顕著な稔性低下が見られ，ʻ 巨峰 ʼ の1,500 Gy

ʻ シャインマスカット ʼ の偽受精胚珠培養における花粉

照射区，ʻ シャインマスカット ʼ の1,000 Gy と1,500 Gy

への軟 X 線照射量は，それぞれ1,500 Gy と1,000 Gy がでは10% を下回った．一方，軟 X 線照射花粉が種子形適度であると示唆された．軟 X 線照射花粉を用いた交成へ及ぼす影響については，両品種ともに 0 Gy 照射区配から得られた510の胚珠をすべて培養したが，胚様体の果実に種子が少なかったため，明らかにすることがでは 3 試験区12個体（2.4%）であり，二次培養を通してきなかった．カンキツ類のヒュウガナツでは1,000 Gy，カルス形成に至ったものはわずか 2 個体（0.4%）であっ

スイカでは2,000 Gy を超えると花粉の発芽稔性が低下すた．Nakajima ら（30）は，開花前の未受精胚珠培養にることが報告されており（28, 29），ブドウにおいても同

おいて，2,4-D とサイトカイニンであるホルクロルフェ様の影響があると考えられた．また，ブドウは単為結果

ニュロンもしくはチジアズロンを添加した 1/2MS 培地性を有しており，1,000 Gy や1,500 Gy の高い照射量でも上で10% 程度の効率で不定胚形成カルスを発生させて─ 29 ─

安田喜一・中村勇揮・廣田真也・松永涼・鈴木健人・金子博・富永晃好・八幡昌紀
いる．本研究の培養条件は一定で行ったが，ブドウの偽型と同じアレルを有しており，それぞれ四倍体と二倍体

受精胚珠培養からのカルス形成および植物体再生には，の葯体細胞由来であることが明らかとなった．一方，

糖の種類，植物ホルモンおよび培養環境などの詳細な検ʻ 巨峰 ʼ の葯培養由来カルスの 1 個体において，野生型討が必要であると考えられた．

が 4 つのヘテロアレルを有する VChr10b が 2 アレルに葯培養における培地組成間の比較において，オーキシ

減数した．第10染色体のみの解析ではあるものの，このンの種類は 2,4-D よりも NAA で良い結果が得られた．

個体は雄性配偶子由来の二倍性半数体である可能性が示

これまでのブドウの葯培養の報告において，Murayama

唆された．この個体について MYB ハプロタイプ解析を（31）は，V. vinifera を供試し，BA 添加の 1/2MS 培地を

行 っ た と こ ろ， ハ プ ロ タ イ プ E1の 片 方 の 遺 伝 子

基本培地とした 2,4-D と NAA の比較では，カルス形成

VlMYBA1-2 のみが検出される予期せぬ結果が得られた．

に差がないことを報告している．また，Rajasekaran ら

さらなる詳細な解析が必要であるが，MYB 関連遺伝子（32） は，V. vinifera と 台 木 品 種（V. vinifera × V.

が座乗する第 2 染色体の一部で培養変異が生じた可能性

rupestris）を供試し，NN 培地を基本培地とした同様のが あ る と 考 え ら れ た．Prado ら（35） は， 6 品 種 の V.

試験で，NAA よりもむしろ 2,4-D で高いカルス形成率

vinifera の体細胞胚形成からの再分化個体について FCMを報告している．これらの報告と本研究の結果の差異かと SSR 解析を行い，多様な倍数性変異と極めて低い頻ら，植物ホルモンを含む培地組成より種・品種間の遺伝度で SSR アレル内に変異が発生していることを報告し的背景が，カルス形成に大きな影響を及ぼすと示唆されている．さらに，Schellenbaum ら（36）は，SSR およびた． 3 種のポリアミン添加の比較では，SPM で最も高Methylation-sensitive arbitrarily primed−$PSOL¿HGIUDJPHQW

い生存率とカルス形成率を示した．カンキツ類のクレメ

length polymorphism（MSAP−AFLP）により， 2 品種のンティンの葯培養において，PTC と SPD の混合区より

V. vinifera の体細胞胚は SSR アレルを高度に保存していSPD 単独処理で最も高いカルス形成率を示した（33）．

たが，脱メチル化のレベルに多くの変異が生じているこ

また，V. vinifera においても，胚培養ではあるものの，とを明らかにしている．本研究では，最大 6 ヵ月間培養

SPM，PTC，SPD およびカダベリンを用い，これらを添した葯培養由来カルスを供試したため，これらの報告と加したすべての試験区でカルスが誘導され，植物体への同様に一部の DNA 配列に培養変異が生じたと考えられ再分化に成功している（34）．本研究の結果からも，ブる．

ドウの葯培養において培地にポリアミンを添加すること

以上の結果より，偽受精胚珠培養法において，花粉にで，効率的にカルスを誘導できることが明らかとなった．

及ぼす軟 X 線照射の影響および当胚珠培養条件では胚ブドウにおける偽受精胚珠培養は，軟 X 線照射の労力，

様体とカルス形成効率が極めて低いことが明らかとなっ微小な花による高い交配難易度および四倍体や強樹勢にた．また，葯培養法において，オーキシンには NAA を

よる低い着果率に加え，偽単為結果による未受精胚珠か用い，ポリアミンの中でも SPM を添加することがカルらのアポミクシス胚や胚乳核からの三倍体胚などの期待ス誘導効率を向上させることを明らかとなった．ʻ 巨峰 ʼ

しないカルスもしくは胚形成の可能性がある．一方で，の葯培養由来カルスより，培養変異の可能性は否定でき

葯培養は，本研究の手法でも ʻ 巨峰 ʼ で80％のカルス形

ないものの，二倍性半数体に減数したと思われる 1 個体成率を示し，繊細な培養ではあるものの，操作性は胚珠を作出できた．今後，多様な品種に適した葯培養条件の培養より簡便である．また，葯や花糸からの体細胞由来

検討および不定胚形成カルスか否かの確認と早期再分化のカルスもしくは胚発生があったとしても，その選抜は系の確立により，ブドウの半数体作出が期待されると思比較的容易である．そのため，これら 2 つの手法を比較われる．

すると，ブドウの半数体作出のためのカルス誘導は，偽受精胚珠培養法より葯培養の方が効率的であると考えら

謝 辞

れる．
Flow cytometry（FCM）を用いたブドウカルスの倍数

本研究は，科学研究費補助金（JP20K06036）の助成性の確認が容易ではないため，我々はこれまでに SSRを受けて実施した．また，2021年度果樹園芸学研究室専とブドウ MYB 関連遺伝子の DNA マーカーによる倍数

攻生諸君には，COVID-19 感染拡大下の制限ある研究環

性解析を提案している（18）．ʻ 巨峰 ʼ と ʻ シャインマス

境の中で，圃場での試料採集・調整に多大なご協力を頂

カット ʼ の葯培養由来カルスの倍数性を調査するためにいた．ここに記して，深く感謝の意を申し上げます．

SSR 解析を実施したところ，ほとんどのカルスが野生─ 30 ─

ブドウ 2 品種における半数体誘導の試み
anther culture of Vitis vinifera cv. Cabernet-Sauvignon.

要 約

Plant Cell Rep., 5, 377-380.

日本のブドウ品種は四倍体育種に依存しており，二倍5 ）Murayama, T. 1989. Plant regeneration from anther

体品種においてもヘテロ接合性が高いため，戦略的な育

culture of Vitis vinifera via embryogenesis. Plant Tissue

種やゲノム解析の障壁となっている．本研究では，ʻ 巨

Culture Letters, 6, 152-154.

峰 ʼ と ʻ シャインマスカット ʼ の偽受精胚珠培養法と葯6 ）新美善行，1987，ブドウの葯培養における光条件及培養法を行い，それぞれ二倍性半数体と半数体の作出を

び低温処理がカルス形成に与える影響，広島農短大

試みた．ʻ 巨峰 ʼ と ʻ シャインマスカット ʼ の花粉に軟 X

報，8，337-340．

線を照射したところ，それぞれ1,500 Gy と1,000 Gy の照7 ）Rajasekaran, K. and Mullins, M. G., 1979, Embryos and射で顕著に発芽稔性が低下した．それらの花粉を交配しplantlets from cultured anther of hybrid grapevines, J.

て得られた胚珠を0.5％マルトエキストラクト含有のExp. Bot., 30, 399-407.

1/2MS 培地上で培養したところ，培養 1 ヵ月後に12個体が胚様体へと成長し，4.4 mg・L

−18 ）Galazka, J. and Niemirowicz-Szczytt, K., 2013, Review
of research on haploid production in cucumber and other

ゼアチン含有の WM

cucurbits, Folia. Hort., 25, 67-78.

培地上での二次培養により 2 個体がカルスを形成した．
一方，満開28日前の花蕾から採取した葯を0.25ppm BA

9 ）Yahata, M., Yasuda, K., Nagasawa, K., Harusaki, S.,− NAA および50μM スペルミンを添加した NN 培地上

Komatsu, H. and Kunitake, H., 2010, Production of

で 9 週間培養したところ，ʻ 巨峰 ʼ と ʻ シャインマスカッ

haploid plant of ʻBanpeiyuʼ pummelo［Citrus maxima

ト ʼ でそれぞれ80% と16% のカルス形成率を示した．葯

（Burm.）Merr.］by pollination with soft X-Ray-

培養由来 ʻ 巨峰 ʼ84個体と ʻ シャインマスカット ʼ 7 個体

irradiated pollen, J. Japan. Soc. Hort. Sci, 79, 239-245.

の SSR 解析により，ʻ 巨峰 ʼ 1 個体を除いたほとんどの

10）Guha, S. and Maheshiwari, S., 1964, In vitro production

カルスが葯体細胞由来であることが明らかとなった．こof embryos from anthers of Datura, Nature, 204, 497．

の 1 個体は SSR アレルが半数に減少した二倍性半数体11）Niizeki, H. and Oono, K., 1968. Introduction of haploidと推定されたが，ブドウ MYB ハプロタイプ解析の結果

rice plant from anther culture, Proc. Japan. Acad., 44,から培養変異が生じていることが示唆された．本研究で554-557.

は，カルスから植物体への再分化に成功しなかったが，

12）Kameya, T., 1970, Induction of haploid plants from

ブドウの半数体作出のための基礎的な知見を得ることがpollen grains of Brassica, Japan. J. Breeding., 20, 82-87.
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宏・吉永勝一・小澤俊治・三谷宣仁・白石美樹夫・
吉岡美加乃・中島育子・中野正明・中畝良二，2008，15）伴

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21-38．

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峰 ʼ の葯培養由来カルスの DNA マーカーを用いた4 ）Mauro, CI. M., Nef, C. and Fallot, J., 1986, Stimulationof somatic embryogenesis and plant regeneration from

倍数性解析，DNA 多型，30，6-12．
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─ 31 ─

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genetic determinant of skin color variation in Vitis ×

─ 32 ─

紀 要 委 員 会
委 員 長
委
員

川
平
佐

邊
野
藤

隆
将
祐

大
司
介

EDITORIAL COMMITTEE OF PROCEEDINGS
Chairman

Takahiro Kawanabe

MemberMasashi Hirano
Yusuke Sato

Published by
6FKRRORI$JULFXOWXUH7RNDL8QLYHUVLW\
9 1 1 Toroku, Higashi-ku, Kumamoto-shi, Kumamoto,862 8652-DSDQ

東 海 大 学 紀 要
第42巻

農 学 部

2 0 2 3

2023年３月15日発行
発 行 所

東海大学農学部〒862−8652 熊本県熊本市東区渡鹿９丁目−１−１
電話 096（382）−1141

印 刷 所

有限会社ベストプロセス〒862−0920 熊本県熊本市東区月出３丁目２−62
電話 096（284）−1628

PROCEEDINGSOFSCHOOL OF AGRICULTURE
TOKAI UNIVERSITY
Vol. 422 0 2 3

Determination of Acetaminophen O-sulfate and Tyrosine O-sulfate by Highperformance Liquid Chromatography with UV Detection…………… Chihiro Morita, Yusaku Motoyama, Reoma Taniguchi, Yuto Ueda, Hideki Kinoshita,
Masateru Ono, Katsuhisa Kurogi, Yoichi Sakakibara, Masahito Suiko and Shin Yasuda ……１
9HUL¿FDWLRQRIPXOWLGUXJVWHULOL]DWLRQHIIHFWLQSLJIHFHVDQGFKDQJHLQWDVWHof pork by administering yogurt made with bacteriocin-producing lactic acid bacteria………… Yudai Fukuchi, Rinka Haraguchi, Takeshi Yamanaka, Yuki Nakashima Tomoyuki Hibi,
Kotone Onuki, Takashi Kotaka, Atsumi Morikawa, Hiroshi Kaneko Yushi Nakano Naoyuki Ishii,
0DVDQRUL,WR.D]XKLUR8UDEH6KLQ<DVXGD-XQLFKL,VKLNDZD0LWVXKDUX,VKLGD
and Hideki Kinoshita ……９0HWKRGVRISVHXGRIHUWLOL]HGRYXOHFXOWXUHDQGDQWKHUFXOWXUH
IRULQGXFWLRQRIKDSORLG\LQJUDSHYLQHʻKyohoʼ and ʻShine Muscutʼ…………………………………… Kiichi Yasuda, Yuki Nakamura, Shinya Hirota, Ryo Matsunaga,.HQWR6X]XNL+LURVKL.DQHNR$NL\RVKL7RPLQDJDDQG0DVDNL<DKDWD……21