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乳酸菌由来の耐熱性免疫増強成分の同定と加熱耐性プロファイルの解析＜令和元年度助成＞

乳酸菌由来の耐熱性免疫増強成分の同定と加熱耐性プロファイルの解析

松﨑千秋（石川県立大学 生物資源工学研究所）

背景

産生を誘導する因子を明らかにするとともに、加熱温度と免疫誘導活性との相関を明らかにした。

高齢者の易感染性には、加齢による免疫機能の低下が大きく関与している。それゆえ、健康寿命延伸方法に寄与する機能性食品開発へのニーズは高く、特に免疫力を増強する効果について世間の関心が集まっている。

乳酸菌の培養およびリポタイコ酸の精製
乳酸菌 Lactobacillus plantarum JCM1149 および乳酸菌は、発酵乳や漬物、アルコール飲料など発Lactobacillus rhamnosus GGは、de Man-Rogosa-Sharpe

酵食品製造工程において古くから用いられていると培地を用い、30℃で一晩培養した。Apilactobacillus

いう長い食経験ゆえに、日本では安全な食品素材とkosoi は生育に高濃度のフルクトースを必要とするして認知されている。近年、乳酸菌には様々な保健ため、培地に 10％のフルクトースを添加して培養効果を有することが明らかになってきており、免疫した。リポタイコ酸の精製は白石ら 1) の方法にて力を増強するプロバイオティクスに期待が寄せられ行った。乳酸菌培養液を 8,000 g 、30 分間の遠心にている。しかしながら加熱による殺菌を必要とするて集菌した菌体を、0.1 M クエン酸バッファー（pH食品加工工程において、加熱による免疫増強活性の4.7）に懸濁し、ビーズ破砕後、等量のブタノールを加低下は、機能性食品開発を推進する上で大きな障害えて遠心し、水層を回収した。その後 Octyl Sepharoseとなっている。

を用いた疎水性クロマトグラフィーにて分離し、糖ヒトの体内における外界との接点である粘膜面は、ガス交換（肺）や食物吸収（腸管）などの生理およびリン酸基を含有する画分を回収し、凍結乾燥することによって、精製リポタイコ酸を得た。

的機能を担うため、比較的透過性の高い薄い障壁から成り立っている。それゆえ病原性微生物の侵入にマウスパイエル板細胞を用いた IgA 産生誘導

対し、優れた防御機構である粘膜免疫系が発達して活性の測定いる。粘膜免疫系の主役となっているのは、粘膜か１週間予備飼育した８週齢 BALB/cA マウス（オス）ら分泌されるイムノグロブリン A 抗体（IgA 抗体）

よりパイエル板を摘出し、コラゲナーゼ処理によりであり、粘膜面における病原体の排除、毒素の中和パイエル板の免疫細胞を調製した。その免疫細胞などの役割を果たしている。そのため、IgA 産生を1.25 × 106 cells/ml に、 非 加 熱 ま た は 加 熱 処 理

誘導するような乳酸菌は、免疫力増強の機能性を付（70℃、30 分）した乳酸菌（OD600 ＝ 0.01）、また加できる機能性食品素材として期待される。本研究はリポタイコ酸（50 µg/ml）を加え、５日間 37℃、では、IgA 抗体の産生誘導能を有し、かつ耐熱性の5％ CO2 インキュベーターにて培養した後、上清中高い乳酸菌 Apilactobacillus kosoi の、機能性食品開に分泌した IgA 量を ELISA 法にて検出した。

発素材としての可能性を明らかにするため、IgA の36

浦上財団研究報告書

樹状細胞の遺伝子発現誘導

Vol.30（2023）

plantarum L-137 株由来のリポタイコ酸が、耐熱性

4 週齢 BALB/cA マウス（メス）より骨髄細胞を採を有する免疫誘導因子として、報告されている 2)。

集 し、GM-CSF に て 樹 状 細 胞 を 誘 導 し た。6 日 後、乳酸菌の細胞壁成分であるリポタイコ酸は、免疫細autoMACS Pro（Miltenyi Biotec） を 用 い CD11c 抗胞が発現しているパターン認識レセプターである体にて樹状細胞を精製した。得られた樹状細胞（1Toll 様レセプター 2 と 6 に結合する免疫誘導因子で× 10 cells）をリポタイコ酸（50 µg）によって 24あり、乳酸菌のプロバイオティクスのモデル株とし時間刺激後、細胞を回収し、免疫関連遺伝子の発現て知られる Lactobacillus rhamnosus GG においても、解析を行った。

リポタイコ酸が主要な免疫活性成分として報告されて6いる 3)。そこで、Apilactobacillus kosoi 、Lactobacillus

示差走査熱量計による構造変化の解析
示差走査熱量計（Shimazu DSC-60）を用いて、精製したリポタイコ酸 2.0 mg を 100 µl の超純水に溶解した試料を耐圧セルにて測定した。0.5℃/min の昇温条件にて 30℃から 90℃まで測定を行った。

plantarum JCM1149、Lactobacillus rhamnosus GGの乳酸菌体よりリポタイコ酸の精製を行い、そのIgA 産生誘導活性を比較した。

L. plantarum より精製したリポタイコ酸については弱い IgA の誘導が見られ、L. rhamnosus GG より精製したリポタイコ酸については誘導が見られな結果と考察かったのに対し、A. kosoi より精製したリポタイコ酸においては、L. plantarum の 4.7 倍、rhamnosus

乳酸菌 Apilactobacillus kosoi の菌体を用いて、粘GG の 6.2 倍の強い IgA の分泌誘導が認められた（図膜免疫増強に重要な IgA を誘導する効果をマウスパ1b）。また、それぞれのリポタイコ酸中の糖含量をイエル板細胞を用いて評価したところ、高い活性が比較したところ、A. kosoi のリポタイコ酸中の糖含認められ、かつ 70℃、30 分間の熱処理に対し、耐量は、L. plantarum の 1.8 倍、L. rhamnosus GG の熱性を有していた（図 1a）。これまでに Lactobacillus

6.0 倍であり、リポタイコ酸の構造の違いが活性に

図 1 乳酸菌菌体および菌体成分であるリポタイコ酸による IgA 産生の誘導マウスパイエル板細胞と 5 日間、5%CO2 条件下 37℃で共培養し、培養上清中に分泌された IgA 量を比較した。a. 非加熱または 70℃、30 分間加熱した A. kosoi 菌体と共培養。ｂ . 非加熱の A. kosoi , L. plantarum , L. rhamnosus GG のリポタイコ酸と共培養。c. 非加熱または 70℃ 30 分間加熱した A. kosoi リポタイコ酸と共培養。mean ± SE (n = 6). *P <0.05, **P <0.01 vs. saline. Dunnett's multiple comparison test.

乳酸菌由来の耐熱性免疫増強成分の同定と加熱耐性プロファイルの解析影響を与えていることが示唆された。

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ら吸熱が認められ、融点が 54.3℃であった。また、精製後のリポタイコ酸について、IgA 産生誘導活30℃～ 90℃まで 30 分の加熱処理をしたリポタイコ性に対する、加熱の影響を評価したところ、70℃、酸による IgA 産生誘導量を比較したところ、50℃に30 分間の熱処理により IgA 分泌量が 4 分の 1 に低おいて 40％、60℃において 75％の減少が認められ下した（図 1c）。菌体中の共存成分が、リポタイコた。加熱による IgA を誘導する活性の低下に、アシ酸の熱に対する構造の安定性に寄与していたと考えルグリセロール部位の構造変化が影響していることられる。

が強く示唆された。

脂質分子は、疎水性の高いアシルグリセロール構リポタイコ酸による IgA 産生誘導を遺伝子発現レ造を有し、水溶液中で氷点（0℃）から沸点（100℃）

ベルで明らかにするため、免疫応答の際の初動を担の間で相転移が生じ、構造が変化することが知られう樹状細胞を用いてリポタイコ酸による刺激の効果ている。乳酸菌のリポテイコ酸は、グリセリンに 2を解析した。A. kosoi のリポタイコ酸で 24 時間刺つの脂肪酸がエステル結合を介して結合した疎水性激したところ、IL-6 の顕著な発現誘導が認められたのジアシルグリセロール構造と、親水性のグリセ（図 3）。腸管関連リンパ組織において、樹状細胞にロールリン酸ポリマーが、糖残基を介して結合してよる IL-6 の分泌は腸管粘膜からの IgA 分泌を強く誘いる。ジアシルグリセロール構造を有することから、導することが知られている 4)。リポタイコ酸刺激にアシルグリセロール部位の相転移が、IgA 産生誘導よる IL-6 の産生増強が IgA の分泌を促進したことが活性に与えている影響を評価した（図 2）。30℃～予想された。

90℃の DSC 加熱曲線を求めたところ、50℃付近か

図 2 A. kosoi リポタイコ酸の昇温に伴う構造変化と IgA 産生誘導活性との関係
示差走査熱量計を用い、0.5℃/min の昇温にてリポタイコ酸の DSC 加熱曲線を求めた。また、30 ～ 90℃までの各温度で 30 分間加熱したリポタイコ酸を用い、図 1 と同様の方法でマウスパイエル板細胞から誘導される IgA 量を測定した。

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浦上財団研究報告書

Vol.30（2023）

図 3 リポタイコ酸刺激による樹状細胞の遺伝子発現解析
リポタイコ酸にて樹状細胞を刺激し、24 時間後の遺伝子発現を qRT-PCR で解析した。無刺激をコントロールとした。mean ± SE (n = 3). *P <0.05.

まとめ
本研究では、耐熱性のある高い IgA 産生誘導活性を有する乳酸菌 A. kosoi から、活性成分である謝辞
本研究を行うにあたり、多大なご支援を頂きました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に深く御礼を申し上げます。

リポタイコ酸を精製することに成功した。また、A.

kosoi のリポタイコ酸の免疫誘導機序を解析したと

参考文献

ころ、樹状細胞を刺激し IL-6 の分泌を促すことに

1) Shiraishi T et al. 2013. Characterization of aLactobacillus gasseri JCM 1131T lipoteichoic acidwith a novel glycolipid anchor structure. Applied andenvironmental microbiology, 79(10), 3315-3318.
2) Hirose Y et al. 201 0. Lipoteich oic acid s on
Lactobacillus plantarum cell surfaces correlate withinduct ion of interleukin - 12p40 pro duct ion.
Microbiology and immunology, 54(3), 143-151.
3) Claes I J et al. 2012. Lipoteichoic acid is an important
microbe-associated molecular pattern of Lactobacillus
rhamnosus GG. Microbial Cell Factories, 11(1), 161.
4) Sato A et al. 2003. CD11b + Peyer’s patch dendritic
cells secrete IL-6 and induce IgA secretion fromnaive B cells. The Journal of Immunology, 171(7),3684-3690.

よって粘膜における IgA 産生を誘導することを明らかとした。しかしながら、精製後のリポタイコ酸は加熱による耐性が低下した。昇温による構造変化を、示差走査熱量計を用いて解析することにより、耐熱性にはアシルグリセロール部位の構造の安定性が重要であることを明らかとした。今後、加熱を有する機能性食品開発のための重要な知見を得ることが出来た。

Identification and heat treatment of lactic acid bacteria

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Identification and heat treatment of lactic acid bacteria
Chiaki MATSUZAKI
Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

Both live and heat-killed cells of Apilactobacillus kosoi display a strong
ability to induce immunoglobulin A (IgA) secretion in mice. In this study, we
purified an immunostimulant from A. kosoi cells and evaluated its effects.
After purifying lipoteichoic acid using the butanol extraction method, the IgAinducing ability of the purified lipoteichoic acid from A. kosoi was found to be
6.2-fold higher than lipoteichoic acid from the probiotic strain, Lactobacillus
r h a m n o s u s G G . H o w e ve r, t h e h e a t - r e s i s t a n c e o f t h e a c t i v i t y o f p u r i f i e dlipoteichoic acid was remarkably decreased. A determination of the structuralchange of lipoteichoic acid using differential scanning calorimetry revealed
that the impaired activity at 50°
C corresponds to the transition temperature oflipoteichoic acid at 54.3°
C.
To gain insight into the mechanisms of inducing IgA secretion, murine bonemarrow-derived dendritic cells were treated with lipoteichoic acid from A.
kosoi . After a 12 h treatment, IL-6 gene expression was found to be upregulated
considerably, suggesting that IL-6 induced by lipoteichoic acid stimulated IgA
production from B cells in mucosal lymphoid tissue. These findings can be
instrumental in supporting the innovation of functional heated foods.