受賞者講演要旨《農芸化学技術賞》

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ジペプチド発酵技術の開発と工業化

協和発酵バイオ株式会社
はじめに反応を有する酵素として D-Ala-D-Ala ligase（Ddl）［EC 6.3.2.4］

二つのアミノ酸が結合したジペプチドは，構成するアミノ酸を挙げて（Ddl は D-アミノ酸同士ではあるがα-ジペプチド形成と同等の栄養生理機能を持つだけでなく，溶解性や安定性など活性を有していることから），それに類似する構造を持つこと．

で構成アミノ酸より優れた物性を示したり，ジペプチドの構造その結果，最有力候補遺伝子として枯草菌 Bacillus subtilis 168に起因した生理機能を発現するものもあり，その潜在機能の発株由来の機能未知として登録されている ywf  E が見出された．

掘や，多様な機能を持つ新素材として用途開発が進められてい本遺伝子は枯草菌が生産するジペプチド抗生物質バシリシンる．しかしながら一般的にジペプチドの経済的な工業製法はな（bacilysin）の生合成クラスター中に存在するものであった．

く，安価に供給できないことがその進展の大きな障害となって大腸菌で発現した組換え型酵素を用いて活性評価した結果，いた．従来ジペプチドはアミノ酸を原料に保護基の導入，ペプ遊離アミノ酸から ATP 依存的にジペプチドを合成する活性がチド結合形成，保護基の脱離を経る化学合成法（または化学酵確認された．本酵素はその構造的特徴から ATP-dependent素合成法）で生産されており（図 1），その技術の改良と最適化

carboxy/thiol ligase ファミリーに属し，L-アミノ酸のみを基質の結果，ジペプチド誘導体である人工甘味料アスパルテームはに（D-アミノ酸とは反応しない），α-ジペプチドを特異的に合唯一の例外として商業生産されている．しかしながら技術の汎成する（ジペプチド以上のオリゴペプチドは合成しない）と同用性が乏しいため，その他のジペプチドについてこの製法では時に広いアミノ酸に対する基質特異性を有する（図 2）という経済的に製造することは難しい．理想的なジペプチド製法は，全く新規の性質を有することが分かったので，新たに L-アミ二種の無保護のアミノ酸を直接意図する一定の順序で酵素的にノ酸α-リガーゼ：L-amino acid α-ligase（Lal）［EC6.3.2.28］と命結合させることである（図 1）．そこで発酵法を目標としたジペ名した．

プチドの抜本的な製法革新を最終目標として，この新規活性酵

その後本酵素の結晶構造解析が兵庫県立大学との共同研究で素の探索から取り掛かることにした．以下に各論を紹介する．

進められ，基質結合部位を含む構造が明らかになっており 2），

1.

新規ジペプチド合成酵素の探索と単離 1）

新規酵素探索の定石として活性（目的産物の生成）を指標とそれらの情報を利用して変異型酵素を誘導し，合成可能なジペプチドの種類を増やせるような，より望ましい性質を有する酵

するスクリーニングを思い浮かべるが，対象産物のジペプチド素の創出が可能になってきている．

は容易に生分解されるために，細胞を含む試料を用いた活性評

2.

ジペプチド直接発酵法の構築と工業化 3）

価系では感度良く遂行する事は困難であると考えられた．そこ

ジペプチドを構成するアミノ酸は，「発酵法」という技術革でゲノム情報より候補遺伝子を絞り込み，該当遺伝子の組換え新によって安価供給を実現し用途開発を急拡大させた経緯があ型精製酵素を用いることで細胞由来分解活性を排除し，高感度る．いわばジペプチドを取り巻く状況は，発酵法が確立する前に活性を評価する手法を採用した．そこで問題となるのは候補のアミノ酸を思い浮かばせる．そこでジペプチド製法を革新す遺伝子の絞り込みの方法である．目的活性を有する酵素およびべく新たに発見した Lal の酵素活性を活かして最終目標とする

その遺伝子情報が皆無であることから，目的酵素が潜在するとジペプチドの直接発酵プロセスの構築に取り組んだ．

いう前提において，その構造的特微の仮説を設定することで選

前述のアミノ酸発酵によれば微生物は増殖しながらアミノ酸抜することにした．そして以下の三つの条件を設定して机上でを合成できることから，今回発見した Lal の活性を組み合わせの探索を実施した．①既知のペプチド結合形成活性を有する各

れば，ジペプチドが安価な原料（グルコースやアンモニア）か種酵素に共通する反応における ATP 依存性から ATP 結合配ら微生物の増殖・代謝を通じて直接発酵生産できるものと想像列を持つこと，②当然ながら未だ見出されていない酵素のためできる．すなわち従来製法で必須であったアミノ酸を出発原料

機能未知遺伝子として分類されていること，③最も理想に近いとすることはおろか，煩雑な工程操作も不要になりジペプチド

図2
図1

ジペプチドの合成方法（化学合成法，化学酵素合成法）と理想の合成反応（破線部分）

Ywf  E が合成可能なジペプチド
縦軸；生成するジペプチドの N 末側になりえるアミノ酸，横軸；生成するジペプチドの C 末側になりえるアミノ酸．
● で示すジペプチドの生成が確認された．

12《農芸化学技術賞》の生産が一貫した酵素反応すなわち細胞内代謝で完結して生産表1できるということである．しかしながら本想定を単純に実践す

アミノ酸るだけではジペプチドの生成は確認できなかった．そこで種々の考察と検討の結果，ジペプチド発酵を成立させるための必要条件を明らかにした．それは［1］Lal を安定に発現強化させる

受賞者講演要旨
ジペプチドによる Gln および Tyr の物性改善効果ジペプチド

グルタミン
Gln

こと（過剰な強化は生育を悪化また不安定化させる），［2］宿主

アラニルグルタミン
AlaGln細胞のジペプチドの分解活性および取り込み活性を欠失させること（安定なジペプチドの蓄積のため），［3］目的のジペプチドを構成するアミノ酸の供給を適度に強化すること（アミノ酸発安定性53.7

不安定550安定チロシンTyr

酵の育種技術を応用する）である．これら多面的な育種によるアラニルチロシン
AlaTyr

厳密な代謝改変を組み合わせることで，ジペプチドの効率的な直接発酵生産プロセスを構築することができた．しかしながら溶解性（g/L）（水，25℃）

0.62

安定17.8

安定

自社データ

この基本プロセスからスケールアップを進める工業化検討において，新たな課題が見えてきた．それは目的とは別の配列のジ物理化学的な欠点を改善できることが知られており（表 1），特ペプチドの副生が際立ってくる現象であり，これは元々基質特に AlaGln については Gln 成分の液状添加を強く望まれてきた異性が広い Lal の特性を考えれば納得できることでもある（図

医療用の輸液用途として，また米国健康食品市場においては協2）．しかし副生ジペプチドは精製工程で産物と分離除去するこ

和発酵 USA から「SUSTAMINETM」というブランドでスポーとが困難であるため培養工程での低減が望まれた．その対策とツドリンク等，各種飲料用途で販売されている．その他 AlaGln

して宿主細胞内における目的ジペプチドの構成アミノ酸濃度をと AlaTyr の双方において，急速な技術の進展とともに注目を最適に高める集めているバイオ医薬品の製造用途（動物細胞培養用培地）にと同時に副生物を構成するアミノ酸濃度を下げ4）るという繊細で複雑な代謝改変の組合せによる解決法を見出しおいて適性があり需要が増え始めてきている．

た．また生産性向上と副生低減のために特定のジペプチドを能従来技術との製品価格に対するメリットという点では，既存動的に排出できる膜タンパクの遺伝子を探索・同定し，その活の化学合成法に比べて製造コストは 1/10 程度になっていると性強化により目的ジペプチドを優先的に排出する育種方法も確推定され，より使いやすい価格での供給が可能となり，新たな立した 5）．このようにして工業生産スケールでも目的産物を効用途での需要喚起が期待される．

率的に純度高く発酵生産できる生産菌および培養技術を完成で（引用文献）

きた．続く培養液からの単離精製・結晶化に関しては，従来のアミノ酸発酵における精製ノウハウを踏襲し最適化することで，特別な操作・装置を用いることなく低コストで高収率なプロセスを構築できた．現在ジペプチドの発酵法での工業的製造は国内工場（山口事業所）にて実施している．
3.

ジペプチド製品紹介

今回紹介する製品は，アミノ酸単体の物理化学的性質により，その使用が制限されてきたアミノ酸の代表例であるグルタミン（Gln）とチロシン（Tyr）に関して，アラニン（Ala）と連

1）K. Tabata, H. Ikeda & S. Hashimoto: J. Bacteriol., 187, 5195–5202（2005）.
2）Y. Shomura, E. Hinokuchi, H. Ikeda, A. Senoo, Y. J. Saito, H.
Komori, N. Shibata, Y. Yonetani & Y. Higuchi: Protein Sci. 21,707–716（2012）.
3）K. Tabata & S. Hashimoto: Appl. Environ. Microbiol. 73,6378–6385（2007）.
4）M. Hayashi & K. Tabata: Appl. Environ. Microbiol. 79, 3033–3039（2013）.
5）M. Hayashi, K. Tabata, M. Yagasaki & Y. Yonetani: FEMS
Microbiol. Lett. 304, 12–19（2010）.

結させたジペプチドであるアラニルグルタミン（AlaGln）およびアラニルチロシン（AlaTyr）である．Gln および Tyr は水に謝辞Lal の結晶構造解析を行うにあたり，兵庫県立大学

対する溶解度が低く，またさらに Gln は溶液状態での安定性が樋口芳樹先生ならびに研究室の方々にご指導，ご尽力いただき低いため（熱や高低 pH による易分解）使用用途が制限されてました．ここに深く感謝の意を表します．

いる．しかしながらそれらをジペプチドにすることで，前述の