ISSN

Vol. 43

東海大学紀要 農学部

PROCEEDINGSOFSCHOOL OF AGRICULTURE
TOKAI UNIVERSITY

2432－7204

東海大学紀要 農学部
第 43 巻

2 0 2 42

Isolation of polyamide 4-degrading bacteria and the degradation behaviors of polyamide 4

0

2

4

………………………… Ryuhei Karato, Keiko Morikami, Koichiro Tachibana, Masayoshi Honda
Hideki Abe, Seiya Shimoda, Ayaka Hokamura……１

Using Next Generation Sequencers．
………………………………………………… Emori Okamoto, Masaaki Go, Takahiro Kawanabe ……７

生分解性ポリアミド４分解菌の単離とその分解性評価
第四三巻

Identiﬁcation of Variations in Brassica rapa Inbred Lines……………………………………………………唐渡龍平・森上佳衣子・橘弘一郎・本田正義
阿部英喜・下田誠也・外村彩夏……１
Brassica rapa 近交系における次世代シークエンサーを用いた変異の検出………………………………………………………………………岡本慧森・郷正明・川邊隆大……７

二〇二四

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紀

要

委 員 長
委
員

委

川
平
佐

員
邊
野
藤

会
隆
将
祐

大
司
介

EDITORIAL COMMITTEE OF PROCEEDINGS
Chairman

Takahiro Kawanabe

MemberMasashi Hirano
Yusuke Sato

Published by
School of Agriculture, Tokai University871⊖12 Sugido, Mashiki-machi, Kamimashiki-gun, Kumamoto,861⊖2205, Japan

東 海 大 学 紀 要
第43巻

農 学 部

2 0 2 42024年３月15日発行
発 行 所

東海大学農学部〒861－2205
電話

印 刷 所

096
（382）
－1141

有限会社ベストプロセス〒862－0920
電話

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2

熊本県上益城郡益城町杉堂871－12

熊本県熊本市東区月出３丁目２－62

096
（284）
－1628

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東海大農紀要 43：1－６（2024）
生分解性ポリアミド 4 分解菌の単離とその分解性評価

生分解性ポリアミド 4 分解菌の単離とその分解性評価
唐渡龍平

１，
２

・森上佳衣子 ・橘弘一郎 ・本田正義
３４

阿部英喜 ・下田誠也
４

５

・外村彩夏

２，
３

１

Isolation of polyamide 4-degrading bacteria and the degradation behaviors of polyamide 4
Ryuhei KARATO, Keiko MORIKAMI, Koichiro TACHIBANA, Masayoshi HONDA,
Hideki ABE, Seiya SHIMODA, Ayaka HOKAMURA（Received 30 November 2023；accepted 28 January 2024）
Abstract
Polyamide 4（PA4）, which can also be synthesized from biomass, is a biodegradable plastic with excellent physicalproperties. In this study, we isolated PA4-degrading microorganisms from soil samples and examined the degradation behaviorof polyamide 4 by the isolates. In addition, the degradation behavior of P（pyrrolidone-co-caprolactone）was also evaluatedbecause copolymerization with other monomers is expected to improve the thermal and mechanical properties of the polymer.
By screening using MS agar plate medium including PA4 or P
（pyrrolidone-co-caprolactone）, PA4-degrading microorganisms
were isolated. The three isolate strains with a clear zone surrounding colony were identiﬁed and named Pseudomonas sp. TNN6, Pseudoxanthomonas sp. TN-N26 and Pseudomonas sp. TN-N27 based on 16S rRNA analysis.
The weight of PA4 and P（pyrrolidone-co-caprolactone）films, which were cultivated with Pseudomonas sp. TN-N6,
Pseudoxanthomonas sp. TN-N26 and Pseudomonas sp. TN-N27, decreased, and that they showed higher degradability for
copolymer ﬁlms than for PA4 ﬁlms. LC/MS analysis of the supernatant after cultivation of PA4-degrading isolates in this study
detected PA4 monomer and dimer, then it was found that biodegradation by isolates was hydrolyzed the amide bonds of PA4.
In addition, SEM images showed that PA4 biodegradation is expected to occur from the surface.

緒

チックゴミは，海洋においても問題となっており，年言

800万トンものプラスチックゴミが海に流出していると

プラスチックは，化学的および光に強く，軽量で強度の報告もある（2）．海洋プラスチックは，海洋生物の生や耐久性もあり，低コストで大量生産できることから，態系への破壊，海洋環境の悪化や海岸機能の低下に加え，包装や輸送，建設，電子機器や家庭用品，医療現場など，

漁業や観光にも影響を及ぼしている（3，4）．また，近年，さまざまな分野で重要な役割を果たしている．その利便

マイクロプラスチックによる海洋生態系への影響も懸念

性から私たちの生活に欠かせない有機合成高分子材料でされており，世界的な問題となっている（3，4）．こうあるが，エチレンやプロピレンなどのプラスチックの製した状況を背景に開発が進められてきたのが，化石燃料造に使用されるモノマーの大部分は，化石燃料に由来し由来のプラスチックに代わる環境調和型の生分解性プラている．しがたって，一般的に使用されているプラス

スチックである．生分解性プラスチックとは，通常の使

チックのほとんどが埋立地や自然環境で分解することが用状況では一般のプラスチックと同様に使用でき，使用できず，半永久的に残留し，蓄積している（1）．プラス

後は自然界に存在する微生物の働きによって，最終的に

1

東海大学農学部２

熊本県立大学大学院環境共生学研究科

３

熊本県立大学環境共生学部

４

理化学研究所環境資源科学研究センター

５

東京理科大学工学部

連絡先：外村 彩夏

E-mail: inada.ayaka.s@tokai.ac.jp
─1─

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唐渡龍平・森上佳衣子・橘弘一郎・本田正義
阿部英喜・下田誠也・外村彩夏
二酸化炭素と水にまで分解され，自然界の炭素循環サイ

薬工業株式会社），1 % Bactopeptone（Difco）および 0.5%

クルに組み込まれるものである．

NaCl を含む NB 培地（pH7.0）にて培養した．PA4 分解

これまで，生分解性プラスチックの代表的なものとし

菌 の ス ク リ ー ニ ン グ を 行 う た め に，0.15% Na2HPO4・て，ポリ乳酸のようなポリエステル類が多く研究されて12H2O，0.9% KH2PO4，0.02% MgSO4・7H2O，1.5% 寒 天

いる．これらは，比較的安価で大量に生産される汎用プ

お よ び 0.1% trace element solution（9）を 含 む ミ ネ ラ ル

ラスチックに使用する目的で開発されている．一方，ポ（MS）寒天平板培地を作製した．シクロヘキシミドを加リアミド（ナイロン）類は，耐薬品性に優れ，アミド結

えた 0.2% PA4 あるいは 0.2% 共重合体含有の MS 寒天

合間の水素結合により，強靭で，耐熱性・耐薬品性・高平板培地に NB 培地菌体培養液をストリークし，30°Cい機械的特性を有することから，金属代替可能な高機能で培養した．生育したコロニーを用いて，数回この操作なエンジニアリングプラスチックとして発展してきた．

を繰り返し，コロニーの周囲に明瞭なクリアゾーンを形

ポリアミド（PA）はその化学構造のために，一般的に成した菌株を PA4および共重合体分解菌として単離した．

自然環境中で難分解性を示す．しかしながら，PA の中でも，2-ピロリドンを直接の出発原料とする PA4は，生PA4 分解菌の同定

分解性を示すことが報告されており，分解菌として単離した菌の同定を進めるために，16S rRNA 遺伝子のPseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Fusarium sp．およ解析を行った．PA4分解菌のゲノム DNA は，NucleoSpin

び Pseudoxanthomonas sp. が同定されている（5-7）．また，

Mcrobial DNA（MACHEREY-NAGEL）を用いて抽出した．

2-ピロリドンは，グルコースの発酵により生成されるグ

抽 出 し た ゲ ノ ム DNA を 鋳 型 と し て，63f primer（5ʼルタミン酸を経由して得られるγ-アミノ酪酸（GABA）-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3ʼ）および1387r primer

を加熱重縮合することによっても合成可能であり，PA4（5ʼ-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3ʼ），LA taq HS（TaKaRa

はバイオマスプラスチックとしても期待されている（8）．

Bio）を用いた反応により16S rRNA 遺伝子断片を増幅さしかしながら，安価で効率的な生産方法の確立，分解のせた．PCR 増幅産物は，NucleoSpin Gel and PCR Clean-

制御，物性の改善といった課題が存在するために，PA4up（MACHEREY-NAGEL）を用いて精製し，塩基配列の実用化に至っていない．特に実用化に向けて，通常のの解析を行った．得られた16S rRNA 遺伝子の塩基配列

使用時には高機能・高性能を示しながらも，廃棄する際

は，BLAST 検索にて解析を行った．

は易分解性を示すといった分解の制御が必要となり，
PA4の生分解メカニズムの解明が求められる．また，物キャストフィルムの作製性面における課題の解決方法として，他のモノマーとの0.4 g の PA4 あるいは共重合体粉末（2-pyrrolidone :ε共重合化があげられる．そこで本研究では，土壌より-caprolactone = 81.5 % : 18.5 %）を10 mL の2, 2, 2-トリフ

PA4分解菌を単離し，単離した菌の同定および分解性評

ルオロエタノールに溶解し， 1 日静置した．その後，価を行った．さらには，物性面の観点から，2-ピロリド

シャーレへ 5 mL ずつ移し，キムワイプをかぶせ，溶媒

ンと生分解性を有するε-カプロラクトンとの共重合体をを揮発させた．

作製し，共重合体の分解性評価も行った .
分解性試験
PA4および共重合体キャストフィルムを 4-7 mg に切材料および方法

断し，重量を測定した．5 mL の MS 液体培地にそれぞれ1枚ずつ切断したフィルムを加え，分解性試験用の培PA4および共重合体の合成
PA4は，カリウム t-ブトキシドを触媒とした 2-ピロリ地とした．菌株を LB 液体培地に接種して一晩30 ℃でドンの開環重合により合成した．共重合体については，

振とう培養した前培養液を，分解性試験用の培地に50カリウム t-ブトキシドを触媒とした反応により，2-ピロ

μL 接種した．同様に，菌を接種しない培地を用意し，リドン :ε-カプロラクトン = 81.5 % : 18.5 % の共重合体

コントロールとした．分解性試験は30°
C，120 strokes/を合成した .

min，振とう培養にて行い，7日間ごとに，培養液からフィルムを回収し，乾燥したのち，重量を測定した．分
解性試験開始時に対する分解性試験後のフィルムの残存

PA4 分解菌の単離
熊本県にある 2 箇所の野菜圃場の土壌をサンプルとし率を算出した .

て採取し，それらのサンプルを 1 % 肉エキス（極東製─2─

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生分解性ポリアミド 4 分解菌の単離とその分解性評価
sp. TN-N26，No. 27 株を Pseudomonas sp. TN-N27 と名付

培養液上清の LC/MS 分析
分解性試験後の培養液は，4°C，3500 rpm，10分間遠けた．Pseudomonas 属（5）および Pseudoxanthomonas 属

心分離を行い，回収した上清を 0.2μm のフィルターで（7）については，これまでにも PA4分解菌として報告がろ過したのち，-80°
C で急速凍結させ，凍結乾燥を行っされているが，今後，これらの菌株の形態学的観察や生た．乾燥した培養上清 2 mg を20% アセトニトリル水溶

化学的性質について詳細に検討し，さらなる同定を進め

液 1 mL に 溶 解 し，1μL を C18M 2D カ ラ ム（2 mm ×

る必要がある．

150 mm）を用いた LC/MS-2020（Shimazu）にて分析した．カラム温度40°
C，流速 0.2 mL/min，アセトニトリル

PA4分解菌によるキャストフィルム残存率
切断した PA4および共重合体キャストフィルムを加えと水を溶離液とするグラジエントモードにて行った．

た 分 解 性 試 験 用 培 地 に，Pseudomonas sp. TN-N6，
Pseudoxanthomonas sp. TN-N26お よ び Pseudomonas sp.

フィルム表面の SEM 分析
分解性試験後のフィルムにプラズマを照射して前処理

TN-N27 を接種し，分解性試験を行った．PA4 キャストを行い，Quattro SEM（Thermo Fischer Scientiﬁc）にて表

フィルムの分解性試験の結果，試験開始後 7，14，21，

面を観察した.

28日目に回収したフィルムの残存率は，それぞれコント
ロールで91.3%，92.6%，91.9%，91.9%（Fig. 1），TN-N6
株で85.2%，87.5%，81.9%，77.8%（Fig. 1A），TN-N26

結果および考察株で84.0 %，79.0%，75.0%，74.5%（Fig. 1B），TN-N27
株で81.4 %，75.4%，78.7%，76.8% であった（Fig. 1C）．

PA4 分解菌の単離と同定
0.2% PA4 あるいは0.2% 共重合体含有の MS 寒天平板

この結果から，TN-N6 株，TN-N26 株および TN-N27株

培地を用いたスクリーニングの結果，PA4 分解菌としてが PA4 を分解していることがわかる．しかしながら，20株，共重合体分解菌として40株以上を単離した．その7 日目以降は，いずれの菌株においても，わずかながら

うち，PA4および共重合体いずれにおいても明瞭なクリ

PA4フィルムの重量の減少はみられたものの，その分解

アゾーンを形成した 3 株（No. 6 株，No. 26 および No. 27率は大きく変化することはなかった．本研究では，培地株）を選抜し，16S rRNA 解析および分解性試験を行った．

の入れ替えを行わず，同じ培地中で連続的に分解性試験

16S rRNA 解 析 の 結 果，No. 6 株 は，Pseudomonasを行ったため，培地中のミネラル不足や pH の低下によ

plecoglossicida と95%，Pseudomonas taiwanensis と 95%

り細菌の生育が抑えられた可能性がある．また，いずれの 相 同 性 を，No. 26 株 は，Pseudoxanthomonas indica との菌株においても，培養温度 30°
C，120 strokes/min の振96%，Pseudoxanthomonas japonensis と 95% の相同性を，とう条件にて分解性試験を実施したが，それぞれの菌株

No. 27 株

は，Pseudomonas multiresinivorans と 97%，が有する分解酵素の最適温度や最適 pH が異なる可能性

Pseudomonas nitroreducens と 97% の相同性を示した．本も考えられるため，今後，分解試験中における培地の交研究では単離した菌株それぞれについて，No. 6 株を換や培養条件の検討が必要である．

Pseudomonas sp. TN-N6，No. 26 株 を Pseudoxanthomonas

Fig. 1Fig．1．The percentage of PA4 ﬁlm residual ratio degraded by PA4-degrading microorganisms.（A）Pseudomonas sp.
TN-N6,（B）Pseudoxanthomonas sp. TN-N26,（C）Pseudomonas sp. TN-N27. Closed circles, control PA4
ﬁlm; closed triangles, PA4 ﬁlm degraded by PA4-degrading strains TN-N6, TN-N26 or TN-N27.

─3─

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唐渡龍平・森上佳衣子・橘弘一郎・本田正義
阿部英喜・下田誠也・外村彩夏
次に，共重合体キャストフィルムの分解性試験の結果，ンがε-カプロラクトンと共重合することで結晶性が低下

試験開始後 7 ，14，21日目に回収したフィルムの残存率したことや，エステル結合が導入されたことにより，アは，それぞれコントロールで98.1%，100%，96.1%（Fig.

ミド結合間の加水分解性が向上したことが考えられる．

2），TN-N 6 株 で7.7%，9.4%，8.0%（Fig. 2A），TN-N26

本研究では，モノマー組成が 2-ピロリドン :ε-カプロラ

株で5.7 %，7.1%，13%（Fig. 2B），TN-N27 株で 8.5 %，クトン = 81.5 % : 18.5 % の共重合体を用いたが，2-ピロ

6.0%，5.6% であった（Fig. 2C）．いずれの菌株においてリドンの割合が65 %，44 % および35 % の共重合体は，も 7 日目までにほぼすべてのフィルムが分解されていた．

PA4より分解率が高いという研究が報告されている（10）．

この結果より，これらの菌株は共重合体フィルムも分解したがって，PA4 の実用化に向けて，他のモノマーとのできることがわかり，PA4 フィルムよりも共重合体フィ共重合化による物性の改善が考えられるが，様々なモノ

ルムに対してより高い分解能を示した．PA4 より共重合

マー組成の共重合体における分解性評価が今後求められ体に対する分解能が高かったことに関して，2-ピロリド

る．

Fig. 2Fig．2．The percentage of P（pyrrolidone-co-caprolactone）copolymer ﬁlm residual ratio degraded by PA4-degrading

microorganisms.（A）Pseudomonas sp. TN-N6,（B）Pseudoxanthomonas sp. TN-N26,（C）Pseudomonas sp.
TN-N27. Closed circles, control P（pyrrolidone-co-caprolactone）film; closed triangles, P（pyrrolidone-cocaprolactone）ﬁlm degraded by PA4-degrading strains TN-N6, TN-N26 or TN-N27.

一方，共重合体キャストフィルム分解性試験における培分解産物の分析と PA4フィルムの表面観察
PA4 および共重合体の分解機構について検討するため

養液上清には，すべての菌株において，コントロールにに，分解産物の分析を行った．PA4 および共重合体キャは観測されない MW=331 の共重合体由来の分解産物がストフィルム分解性試験における TN-N 6 株，TN-N26

検出された（Fig. 3B）．他にも，MW=261 の物質が検出

株および TN-N 27株の培養液上清を LC/MS にて分析しされたが，帰属できなかった．これらの培養液上清の分た．PA4キャストフィルム分解性試験における培養液上

析結果より，本研究で単離した PA4 分解菌による PA4

清には，すべての菌株において，コントロールには観測および共重合体キャストフィルムの生分解がアミド結合

さ れ な い MW=208 お よ び MW=293 の PA4 由 来 の モ ノ間の加水分解により起こっていることが分かった .

マーおよびオリゴマー分解産物が検出された（Fig. 3A）．

Fig．
3．Compounds detected by LC/MS analysis of the supernatant after cultivation of Pseudomonas
Fig.
3sp. TN-N6, Pseudoxanthomonas sp. TN-N26 and Pseudomonas sp. TN-N27 with MS
medium including PA4（A）or P（pyrrolidone-co-caprolactone）copolymer ﬁlm（B）.

Fig. 3p01-06 hokamura.indd

4

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生分解性ポリアミド 4 分解菌の単離とその分解性評価
次に，分解性試験 7 日目に回収した PA4 キャストフィ

ている部分において小さな穴がいくつも観察でき，分解ルムを SEM により観察した．共重合体キャストフィルが進んでいることがわかった．また，回収したフィルム

ムに関しては，ほとんどのフィルムが目視できないほどについて観察すると，フィルムの重量は減少しているも分解されていたため，SEM による表面観察はできなかっのの，形状は保ったままうすくなっていた．これらのこ

た．TN-N 6 株，TN-N 26株および TN-N 27株による分解とから，PA4の分解は，内部からではなく，表面から起試験後に回収した PA4キャストフィルムの SEM 画像をこっていることが予想された．

Fig. 4 に示す．Fig. 4に示した通り，フィルムが白くなっ

Fig. Fig．
4 4．SEM images of the surface of PA4 film degraded by PA4-degrading

microorganisms.（A）original PA4 ﬁlm,（B）PA4 ﬁlm degraded by Pseudomonas
sp. TN-N6,（C）PA4 ﬁlm degraded by Pseudoxanthomonas sp. TN-N26,（D）PA4 ﬁlm degraded by Pseudomonas sp. TN-N27. The strains were cultivated at
30℃ for 7 days with PA4 ﬁlm.

まとめ

要

約

熊本県の土壌より，PA4 およびその共重合体を分解す

ポリアミド（ナイロン）類は高機能なエンジニアリンる菌として40株以上単離した．それらのうち，3株につグプラスチックとして広く使われている．その中でもポいて，16S rRNA 遺伝子の解析および分解性評価を行っリアミド4（PA4）は，生分解性を有し，原料がバイオた．その結果，PA4 キャストフィルムは表面から分解さマスから合成可能なγ- アミノ酪酸（GABA）であるためれており，加水分解の酵素が関与していることが示唆さ

環境調和型プラスチックとして期待されている．PA4 のれた．PA4 は，環境調和型のエンジニアリングプラス

実用化のためには，使用時は高機能・高性能を示しながチックであり，実用化のためにも今後，分解の制御が求らも，廃棄時には易分解性を示すといった分解の制御がめられる．本研究で単離した分解菌の酵素の同定や様々求められ，PA4 の生分解メカニズムを明らかにする必要な組成の共重合体の分解性評価を行うなどして，詳細ながある．そこで，本研究では土壌より PA4 分解菌を単生分解メカニズムを解明する必要がある．

離し，それらの分解性評価を行うことを目的とした．さ
らに，他のモノマーと共重合することで , 熱的および機謝

械的特性の改善が期待されることから，共重合体の分解辞性も評価した．
0.2 % PA4 あるいは共重合体含有ミネラル寒天培地を本研究は，JSPS 科研費若手研究（JP18K14265）の助成を受けて実施されたものです．

用いてスクリーニングを行い，PA4 分解菌を単離した．
その中で明瞭なクリアゾーンを形成した 3 菌株を選抜し，
─5─

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唐渡龍平・森上佳衣子・橘弘一郎・本田正義
阿部英喜・下田誠也・外村彩夏
16S rRNA 解 析 を 行 い，Pseudomonas sp. TN-N 6，3 ）Jambeck, J. R., Geyer, R., Wilcox, C., Siegler, T. R.,

Pseudoxanthomonas sp. TN-N26，Pseudomonas sp. TN-N27

Perryman, M., Andrady, A., Narayan, R. and Law, K. L.,と命名した．これらの菌株を用いて PA4 および共重合

2015, Science, 347, 768-771.

体キャストフィルムの分解性試験を実施した結果，いず4 ）Thompson, R. C., Olsen, Y.O., Mitchell, R. P., Davis, A.,

れの菌株においてもフィルムの重量減少が確認され，

Rowland, S. J. John, A. W. G., Mcgonigle, D. andPA4フィルムよりも共重合体フィルムに対してより高い

Russell, A., 2004, Science, 304, 838.

分解能を示した．さらに , 分解性試験後の培養液上清を5 ）Yamano, N., Nakayama, A., Kawasaki, N., Yamamoto, N.

LC/MS にて分析した結果，PA4 フィルムを用いた試験

and Aiba, S., 2008, J. polym. Environ., 16, 141-146.

においては，PA4 由来のモノマーおよびオリゴマー分解

6 ）Tachibana, K., Hashimoto, K., Yoshikawa, M. and

産物が，共重合体を用いた試験では共重合体の分解産物

Okawa, H., 2010, Polym. Degrad. Stabil., 95, 912-917.

が検出され，加水分解が起こっていることがわかった．

7 ）Sasanami, Y., Honda, M., Nishiki, H., Tachibana, K.,

これに加えて SEM 観察の結果から，PA4 の分解は，表Abe, H., Hokamura, A. and Yamada, M., 2022, Polym.

面から進むことが予想された .

Degrad. Stabil., 197, 109868, https://doi.org/10.1016/
j.polymdegradstab.2022.109868.
8 ）中山敦好，2010, SENʼI GAKKAISHI（繊維と工業），

引用文献

66, 368-378.
9 ）Kato, M., Bao, H. J., Kang C.-K., Fukui T. and Doi, Y.,

1 ）Barnes, D. K. A., Galgani, F., Thompson, R.C. and

1996, Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 363-370.

Barlaz, M., 2009, Philos. Trans. R. Soc. B, 364, 1985-

10）Nakayama, A., Yamano, N., Kawasaki, N. and1998.
2 ）Geyer, R., Jambeck, J. R. and Law, K. L., 2017, Science

Nakayama, Y., 2013, Polym. Degrad. Stabil., 98, 18821888.

Advances, 3, e1700782. doi: 10.1126/sciadv.1700782.

─6─

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東海大農紀要 43：7－14（2024）

次世代シークエンサーを用いた変異解析

Brassica rapa 近交系における次世代シークエンサーを用いた変異の検出
岡本慧森 ・ 郷正明 ・ 川邊隆大
1

1

1

Identiﬁcation of Variations in Brassica rapa Inbred Lines
Using Next Generation Sequencers.
Emori OKAMOTO, Masaaki GO, Takahiro KAWANABE（Received 30 November 2023 ; accepted 26 January 2024）
Abstract
Single nucleotide polymorphisms（SNPs）and insertion-deletion（In/Dels）are the most abundant genetic variants that are
widely distributed throughout the plant genome, making them versatile DNA markers. Brassica rapa is one of the mostimportant agricultural vegetables grown and consumed worldwide, including the leafy vegetables Chinese cabbage andkomatsuna, the root vegetable turnip, and the oilseed crop Brassica napus. In this study, we performed whole-genome
resequencing of two inbred lines, JKRB-T04（Chinese cabbage）and OSD2（komatsuna）, to identify variants in both lines. A
total of 542,015 SNPs and 200,460 In/Dels were identified, of which 118,519 SNPs and 27,470 In/Dels were JKRB-T04speciﬁc and 268,180 SNPs and 136,718 In/Dels were OSD2 speciﬁc variants. In addition, 60.1 % of the genes annotated in theFast pants reference genome were variants, and there were approximately 3,300 genes with mutations that had a signiﬁcant
impact on gene function in both strains. In addition, the analysis focused on ﬂowering control genes, which are important forbreeding, and revealed the presence of variants in 17 flowering control genes. The large number of SNPs and the In/Dels
dataset identiﬁed in this study will provide a valuable marker resource for genetic and genomic studies of B. rapa.

緒倍加系統である Chiifu-401-42でアブラナ科作物の中で初言めて決定され，約４万種の遺伝子が同定された（2）．そ

アブラナ科（Brassicaceae）には，モデル植物であるの 後， イ エ ロ ー サ ル ソ ン（var. tricolaris） お よ び パ ク

シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）をはじめ，食用

チョイ（var. chinensis）の配列解読が行われている（3）．

となるハクサイやカブ（Brassica rapa），キャベツ，ブこれらのゲノム配列は精度の向上した解析技術により更ロッコリー，カリフラワー，ケール，コールラビ（B.

新されながら，B. rapa の遺伝学的およびゲノム学的研，油糧作物として利用されるナタネ（B. napus）
oleracea）

究のための重要な情報として品種育成や他のアブラナ科といった様々な経済的に重要な農作物が多く含まれていとの比較ゲノム解析に利用されている（4）．DNA マーる（1）．加えて，アブラナ科にはアブラナ属の他にもダカーは，遺伝子型のフィンガープリント，遺伝地図の作

イコン属（Raphanus），ワサビ属（Eutrema）等の野菜や成，QTL（Quantitative Trait Loci）マッピング，association

香辛料として利用されている属も含まれている．キャベ

analysis，DNA マーカーを利用した選抜（MAS:marker-

ツ，ハクサイ，ダイコンは，日本で栽培されている野菜

assisted selection）など，植物の遺伝学および育種学研究のうち全体の生産量の８割を占めている指定野菜に含まのための重要なツールの一つである．これまで，制限酵れており，それらの生産量は野菜の国内生産量12846万

素断片長多型（RFLP），増幅断片長多型（AFLP），単純

トンの約27% を占めている．

配列反復（SSR），挿入／欠失（In/Dels），一塩基多型

B. rapa の全ゲノム配列は2011年にハクサイの半数体
１（SNP）など，数多くの DNA マーカーが植物において開東海大学農学部応用植物科学科

連絡先：川邊隆大

e-mail:kt341178@tsc.u-tokai.ac.jp
─7─

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岡本慧森・郷正明・川邊隆大
発されてきている．特に SNPs および In/Dels は，植物

リファレンスゲノムと比較することにより行った．さらのゲノム全体に広く分布している最も豊富な遺伝的変異に，同定した変異が開花制御遺伝子に与える影響についであることから，DNA マーカーとしての汎用性が高い．

ても解析を行った．

B. rapa においても種皮の色，トライコーム，葉の形態，
開花期などの表現型の同定に SNP を利用した DNA マー

材料および方法カーが開発されている（5，6，7）．近年，ゲノム配列が解読されている種の既知ゲノム配列を参照として，種内植物材料

や近縁種の多数の系統を用いて，次世代シーケンサー

B. rapa 系統 Fast Plants，JKRB-T04と OSD2は25℃の温ショートリードをマッピングし，SNP や In/Dels 等の参室で育成し，明期16時間・暗期8時間で育成した．２週

照配列との違いを検出するリシーケンス解析が行われる

間 生 育 さ せ た 葉 か ら DNeasy Plant Mini kit（Qiagen，

植物が増えており，その情報を利用した DNA マーカーUSA）を用いてゲノム DNA を抽出した．DNA のクオの作成も行われている（8，9）．

リティは 2100 bioanalyzer（Agilent Technologies，USA）

植物は開花に至るまでに栄養成長から生殖成長へと移を用いて確認し，NeoPrep ライブラリー調整システム

行する．栄養成長期に蓄積したエネルギーを子孫繁栄の（illumina，USA）によりライブラリーを作成した．作成

ための生殖成長期に利用するため，開花は植物のライフしたライブリーは NextSeq500（illumina，USA）を用いサイクルの中で重要な発達過程となっている．植物には，てシークエンスを行い，150 bp ペアエンドの配列データ

一定期間の低温にさらされることで開花に至る春化を取得した．

（バーナリゼーション）と呼ばれる現象がある．春化は
冬の寒さに遭遇する前に開花することを防ぎ，春の良好

シークエンスデータの解析

な気象条件下で開花するためのメカニズムである（10，得られた配列データは FastQC（https://www.bioinformatics.

11）．春化はアブラナ科野菜の収穫物の質と量に深く関babraham.ac.uk/projects/fastqc/）を用いてクオリティチェッ

わっており，低温に対する感受性が高いために早く抽だクを行った．トリミングには，Trimgalore!v0.4.5（https://

いや開花が起こると，収量や商品価値の低下に繋がって

github.com/FelixKrueger/TrimGalore） を 用 い て 低 ク オ リ

しまう可能性がある（12）．このことから，アブラナ科

ティのリードを除去した．リードの 5ʼ 末端から14 bp の野菜において開花時期を調節することは育種の重要な目除去，クオリティまたはアダプターのトリミングのため標となっている．近年は，シロイヌナズナを用いた春化

33 bp よりも短いリードの除去，および配列のトリミンの分子機構の研究が盛んに行われ，機能喪失変異体の解グを必要とするアダプター配列のオーバーラップを 3 に

析や遺伝子導入植物の解析から，180以上の遺伝子が開設定して行った．その後，Bowtie 2（18）を用いて，リ

花時期の制御に関与していることが明らかにされている

ファレンスゲノム BrapaFPsc_277_v1.3 にデフォルトの（13，14，15）．これらの遺伝子は，光周期依存経路，春パラメーターでマッピングを行った．SAMtools（19）を化依存経路，低温受容性経路，高温受容性経路，加齢経使 用 し て，Bowtie 2 か ら 得 た SAM 形 式 の マ ッ ピ ン グ

路，自律的経路，ジベレリン依存経路など，開花時期をファイルの処理を行った．BAM 形式への変換，BAM

制御する主要な経路に分類されている（16）．

ファイルのソート後，GATK program（GATK）により変前述のようにアブラナ科野菜において花機構は農業上異箇所の同定を行った（20）．同定した変異の解析には重要な形質であるため開花制御遺伝子の解析は盛んに行

snpEﬀ4.3i（SNPeﬀ）を使用した（21）．リファレンスゲノ

われている（13）．Fast Plants はウィスコンシン大学のムとして用いた BrapaFPsc_277_v1.3 及び，そのアノテー

Paul H. Williams 博士が，実験室内で栽培しやすいよう

ション情報は phytozome（https://phytozome-next．jgi.doe.

早い成長速度や高い種子生産能力，栽培の容易さといっgov/）より入手し，ソフトウェアの操作は，マニュアルた特徴を持つよう開発した矮小化した B. rapa の変種で（http://snpeﬀ.sourceforge.net/SnpEﬀ_manual.html） に 従 っある（17）．このような特徴を持つことから，Fast plants

た．Gene Ontlogy（GO） 解 析 に は agriGO を 使 用 し たと栽培種とのゲノム配列を比較することで農業上重要な（22）．

遺伝子の同定に繋がることが期待される．本研究では，
ハクサイ近交系（JKRB-T04）とコマツナ近交系（OSD2）

PCR による変異の検証

において全ゲノムリシークエンス解析を行い，両系統が見出された変異の内，挿入・欠失の変異の検証を行う

持 つ 変 異（SNPs，In/Dels） の 同 定 を B. rapa Fast Plants

ために，PCR を 94℃ 3 分間の 1 サイクル，94 ℃ 30秒，

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次世代シークエンサーを用いた変異解析
55 ℃ 30秒，72 ℃ 60秒の35サイクル，最終伸長は72 ℃と比較して，変異の同定を行ったところ，JKRB-T04 と3 分間で行った．増幅産物を13% ポリアクリルアミドゲ

OSD2 で そ れ ぞ れ 196,177個 と 345,838個 の SNP が 見 つルで電気泳動し，ゲルを Gelstar 溶液（0.1μl/10ml;Takara

かり，また挿入はそれぞれ 22,534箇所と 76,439箇所見つ

Biomedical, Japan）で染色した．

かり，欠失はそれぞれ 23,072箇所と 78,415箇所であった（Table 3）．77,658個の SNP と，8,962箇所の挿入，9,174
箇所の欠失が 2 系統間で共有されていた．

結果および考察

次に，各変異が存在する部位について，遺伝子領域とJKRB-T04，OSD2 から DNA ライブラリーを作成し，の位置関係に対応させて分類した（Table 1）．JKRB-T04

150 bp 長のペアエンドリードを取得した．低品質のリーにおけるエキソン領域の変異は，36,003個で，変異全体

ドを除去したところ，高品質（Q>25）のリードがそれの5.66%，OSD2 では 86,827個となり，全体の 6.41% をぞれ103,472,345リード，107,584,683リード得られ，これ占めていた．この中で同義変異は JKRB-T04 と OSD2 でらを後の解析に用いることとした．公開されている B．

それぞれ 20,678個，48,944個であり，非同義変異はそれ

rapa Fast Plants リファレンスゲノムにマッピングを行っ

ぞれで 14,970個，32,622個であった．また，イントロン

た と こ ろ，JKRB-T04で は 79,964,611 リ ー ド，OSD2 でにはそれぞれ 45,249個，97,301個の変異が見られ，5ʼ 非は 84,820,124 リードがマップされた（Table 1）．全リー

翻訳領域（5ʼUTR）には 3,812個，12,710個，3ʼ 非翻訳領

ドは，平均リード深度 37×以上，全ゲノムカバレッジ

域（3ʼUTR）には 9,521個，21,877個の変異がそれぞれ存77% 以上でマップされた．また，各染色体の 1 番染色

在していた．JKRB-T04 と OSD2 で遺伝子間領域にそれ体から10番染色体までの個々の平均リード深度は26.2×

ぞれ 153,131個，294,955個の変異が存在し，遺伝子の上を超え，JKRB-T04と OSD2では染色体あたり72％以上

流領域にはそれぞれ 189,683個，423,277個，下流領域はのカバレッジであった（Table 2）．リファレンスゲノム

それぞれ 195,149個，405,969個の変異が確認できた．

Table. 1．Mapping and variant summary of B. rapa inbred lines
Mapping information
Total Raw
Reads

MappedReads

Variant data

Unmapped Fold genome Coveragecoverage(%)
Reads

NonSynonymoussynonymous

Intron

5'UTR

3'UTR Intergenic

Total

JKRB-T04 103,472,345 79,964,611 23,507,734

37.70

77.28

14,97020,67845,249

3,812

9,521

153,131247,361

107,584,683 84,820,124 22,764,559

40.01

78.84

32,622

48,94497,301

12,71021,877294,955

508,409

OSD2

Table. 2．Covered bases, Mean depth of coverage and breadth of coverage of mapped reads in the B. rapa inbred lines
JKRB-T04

OSD2

Chr

Chromosome size (bp)Covered bases (bp)Coverage (%)

Mean Coverage depth

Covered bases (bp)Coverage (%)

Mean Coverage depth

A0130,984,273

22,386,765

72.25

32.29

23,289,975

75.17

36.54

A02

32,762,445

23,770,595

72.55

27.76

24,151,157

73.72

29.44

A03

25,115,505

19,866,989

79.10

26.26

20,121,307

80.12

27.19

A04

21,597,147

16,306,509

75.50

32.36

16,567,652

76.71

32.79

A05

28,488,603

21,084,777

74.01

35.12

21,121,975

74.14

38.84

A06

29,376,280

21,835,613

74.33

39.43

21,998,279

74.88

38.99

A07

27,477,424

20,728,716

75.44

30.35

20,911,375

76.10

32.58

A08

23,189,089

17,466,835

75.32

29.93

17,328,798

74.73

30.14

A09

44,888,295

32,708,293

72.87

39.56

33,354,354

74.31

40.70

A10

19,914,974

15,054,543

75.59

34.92

15,039,754

75.52

34.56

Table. 3．Number of SNPs and In/Dels in the JKRB-T04 and OSD2 withrespect to the Fast plants reference genome
JKRB-T04
vs. Reference

OSD2

Uniquevs. Reference

UniqueSNP

196,177

118,519

345,838

268,180

Insertiion

22,534

13,572

76,43967,477deletion

23,072

13,89878,41569,241

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岡本慧森・郷正明・川邊隆大
挿入と欠失（In/Del）について，各ギャップの大きさ

た． 2 つの系統でも 7 塩基以上の挿入や欠失はまれで，について調べた（Fig. 1）．JKRB-T04で最も頻度が高かっ

各カテゴリーは1.0% 以下であった．しかし， 7 塩基以たのは1塩基挿入で 13,301箇所（29.2%）で，次いで 1

上の挿入と欠失箇所の合計は JKRB-T04 と OSD2 におい

塩基欠失 12,983箇所（28.5%）であった．OSD2 で最もて，挿入ではそれぞれ 1,627箇所と 3,937箇所見つかり，頻度が高かったのは 1 塩基欠失で44,178箇所（28.52%）

欠失はそれぞれ 2,426箇所と 4,900箇所であった．

381
382

F ig． 1 G e no me - wi d e a na l ys es t h e p r op o r t io n of I n/ D e ls i n t h e t w o
Br as s ica inb r ed li n es ．

であり，次いで 1 塩基挿入44,087箇所（28.47%）であっ

383
384

Fig．
1．Genome-wide analyses the proportion of In/Dels in the two Brassica inbred lines.

F ig． 2 G e no me - wi d e a na l ys es t h e p r op o r t io n of S NP s in t h e t wo Br a ss ic a
SNP に つ い て 各 塩 基 置 換 の 頻 度 を 調 べ た と こ ろ，に お い て は，G → A 48,988個（14.2%），次いで C → T

3 8 5JKRB-T04
i n b rで
e d最lもi n多e sく．見 ら れ た 塩 基 置 換 は，G → A

48,826個（14.1%），T → C 46,829個（13.5%），A → G

28,369個（14.5%）， 次 い で C → T 28,321個（14.4%），

46,378個（13.4%）となった．転移の合計は191,021個，T → C 25,517個（13.0%），A → G 25,212個（12.9%） と転 換 の 合 計 は154,817個 で， 転 換 に 対 す る 転 移 の 比 率なった（Fig. 2）．ピリミジン（C，T）間，またはプリン（Ts/Tv）は1.23であった．

（A，G） 間 の 変 異 で あ る 転 移（Transitions） の 合 計 は各変異が近傍の遺伝子に与える効果について snpEﬀ を

107,419個，ピリミジンとプリン間での変異である転換

用いて４段階で予測した（Table 4）．予測される効果は（Transversions）の合計は 88,758個であり，転換に対す（High，Moderate，Low，Modiﬁer）の順に分類され，タる転移の比率（Ts/Tv）は 1.21であった．また，OSD2

ンパク質の機能喪失など該当する遺伝子に与える影響がTable 4．Prediction of variant eﬀects and variant types
JKRB-T04
Impact type386

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Number of eﬀects

OSD2

Number ofvariant genes

Number of eﬀects

Number ofvariant genes

High

613

537

3,519

2,505

Moderate

15,1598,152

35,42315,092

Low

24,534

11,19958,607

18,938Modiﬁer

596,080⊖

1,255,402⊖

─ 10 ─

10

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383
384

F ig． 2 G e no me - wi d e a na l ys es t h e p r op o r t io n of S NP s in t h e t wo Br a ss ic a385

inbr ed lines．

386

次世代シークエンサーを用いた変異解析

Fig．
2．Genome-wide analyses the proportion of SNPs in the two Brassica inbred lines.

高いほど高い効果に分類される．合計 613個と 3,519個

生 じ て い る か を 調 べ た と こ ろ，JKRB-T04 で はの JKRB-T0 4と OSD2 固有の SNPs と In/Dels が「High」

CRYPTOCHROME INTERACTING BASIC-HELIX-LOOP-に 分 類 さ れ， そ れ ら 変 異 を 含 む 遺 伝 子 の 数 は，

HELIX1（CIB1），EMBRYONIC FLOWER2（EMF2），

JKRB-T04 で537個，OSD2 で 2,505個であった．このう

FLOWERING WAGENINGEN（FWA），GIBBERELLIN20-

ち，235個の遺伝子が JKRB-T04 と OSD2 の間で重複し

OXIDASE1（GA20ox1） の 4 遺 伝 子，OSD2 で は SPA1-ていた．中程度の効果を与える「Moderate」に分類され

R E L A T E D 4 （ S P A 4 ）， F L O W E R I N G T I M Eた変異は JKRB-T04 と OSD2 においてそれぞれ 15,159個，CONTROLPROTEINALPHA（FCA），VERNALIZATION

35,423個であり，低効果の「Low」に分類されたものは

INDEPENDENCE4（VIP4），
FLOWERING LOCUS D（FD）

それぞれ 24,534個，58,607個であった．
「Modiﬁer」は遺な ど13個 の 遺 伝 子 に 変 異 が 生 じ て い た（Table 5）．B.

伝子に全く影響を及ぼさないか，その効果が不明なもの

rapa はシロイヌナズナから分岐後，全ゲノム 3 倍体化として分類され，対象となる遺伝子隣接している場合にが起きており，そのためシロイヌナズナの相同遺伝子がは重複して検出される．そのため，同定した変異数より複数個ゲノム中に存在している（2）．この12個の遺伝子も多く検出され，JKRB-T04 と OSD2 においてそれぞれ

は，遺伝子機能喪失など重大な影響を生じさせる変異を

596,080個，1,255,402個に分類された．分類した変異の持つが，それぞれの相同遺伝子には変異が見られないた

中 で，JKRB-T04に お い て ミ ス セ ン ス 変 異 は 15,012個

め，開花時期の表現型が相補されている可能性が考えら（41.9%），ナンセンス変異は 122個（0.34%）であり，れ た． し か し，FWA，SPA4，FCA は ゲ ノ ム 中 に 1 コ

OSD2 ではミスセンス変異は 32,699個（39.9%），ナンセ

ピーしか存在せず，また SPA18 は 2 コピーの遺伝子両

ンス変異は 245個（0.30%）であった．遺伝子機能に影方に変異が生じていた．このことより，これらの遺伝子響を与える変異，つまり，「High」，「Moderate」，「Low」の変異が早期開花する Fast plants と春化を必要とする他に分類された遺伝子の合計は，両系統合わせて 24,587遺の B. rapa 系統との違いをもたらしていると考えられる

伝子に生じており，これは Fast Plants リファレンスゲノ

が，その解明にはさらなる解析が必要である．

ムにおいてアノテーションされている遺伝子である全

SNP および In/Del によって引き起こされる効果「High」

40,492個のうち 60.1％であった．これまでの研究からシに分類された遺伝子について Gene Ontology（GO）解析

ロイヌナズナにおいて約180個の遺伝子が開花時期に影を行ったところ，JKRB-T04では特異的なカテゴリーは響を与えることが知られている（13，16）．そこで，こ見出されなかったが，OSD2では Molecular Function に属れらの相同遺伝子において「High」に分類される変異がするカテゴリーが21個見出され（p<1.0E-10），その中に

─ 11 ─

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岡本慧森・郷正明・川邊隆大
Table 5．Flowering-related genes classiﬁed as High impact in two B. rapa inbred lines

HIGH impact gene

homologous gene

Gene IDin Arabidopsis
thaliana

Brara.A00369.1

Brara.H01197.1

AT4G34530 CIB1 (CRYPTOCHROME INTERACTING Bhlh

Gene ID in Brassica rapa

JKRB-T04

OSD2

Gene namePathway

Brara.C01483.1

Brara.B01566.1, Brara.C01484.1, Brara.J00615.1

AT5G51230 EMF2 (EMBRYONIC FLOWER 2)

Brara.A01546.1⊖

AT4G25530 FWA (FLOWERING WAGENINGEN)

Brara.K00199.1

Brara.A01538.1

AT4G25420 GA20ox1 (GIBBERELLIN 20-OXIDASE 1)

Brara.E01100.1

Brara.D01997.1

AT2G32950 COP1 (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1)

Brara.E01550.1⊖

Brara.F03851.1

Brara.A00065.1, Brara.H01801.1

Brara.B01566.1

Brara.C01483.1, Brara.C01484.1, Brara.J00615.1

Brara.A01919.1⊖

Brara.E00472.1

Brara.D02720.1

VERNALIZATION and
AUTONOMOUS PATHWAYS

AT5G51230 EMF2 (EMBRYONIC FLOWER 2)
AT4G16280 FCA (FLOWERING TIME CONTROL PROTEIN ALPHA)
AT2G44950 HUB1 (HISTONE MONOUBIQUITINATION 1)

Brara.B03928.1

AT5G65060 MAF3 (MADS AFFECTING FLOWERING 3)

Brara.I00649.1

AT5G61150 VIP4 (VERNALIZATION INDEPENDENCE 4)

Brara.G03586.1

Brara.B02317.1, Brara.G03584.1⊖
Brara.G01764.1

Brara.A00255.1

Brara.H01621.1, Brara.K01339.1

PHOTOPERIOD PATHWAY,CIRCADIAN CLOCK, LIGHT
SIGNALING

AT4G39400 BRI1 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1)

Brara.F02378.1

Brara.D00262.1

GIBBERELLIN SIGNALING and
METABOLISM

AT1G53090 SPA4 (SPA1-RELATED 4)

Brara.B03752.1

Brara.C02302.1, Brara.E00518.1

PHOTOPERIOD PATHWAY,CIRCADIAN CLOCK,LIGHT SIGNALING

VERNALIZATION and
AUTONOMOUS PATHWAYSGIBBERELLIN SIGNALING and
METABOLISM

AT1G78440 GA2ox1 (GIBBERELLIN 2-OXIDASE 1)
AT2G45640 SAP18 (SIN3-ASSOCIATED POLYPEPTIDE 18)
AT3G57920 SPL15 (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 15)
AT4G35900 FD (FLOWERING LOCUS D)MERISTEM RESPONSE and
DEVELOPMENT

Table 6．The information of validated genes and primer sequences in two B. rapa inbred lines
Gene ID
JKRB-T04

OSD2

In/Del size

Primer Sequence (5'-3')Brara.B03474

Filamin/ABP280 repeat (Filamin)

Description

20

CAACGGTGGTAAAAAGACTCATCTC ACAACGAGTGACAATTCTTGTTGAA

Brara.E03329

F10A16.22 Protein

26

CCATCCTCCAATATCCTACTGATAAGCTCAAAACCAAATAGAAAACACAC

Brara.J00273

F-box associated ubiquitination eﬀector family protein-related

14

GGATACTTTTCTCGGAATTAACACAGAGATGCAAAGAAGTTTTTCTGAAG

Brara.B01005

Serine/threonine-protein kinase rio//subfamily not named

16

GTTAGAGATCATGAAAAAGCTGACC TCCTCTAATCATCTCTATCCCATGA

Brara.C03289

F-box associated ubiquitination eﬀector family protein-related

19

GATATGATCAAAACATGGCGAGACT GGTTATCTCCTTTATTCTCCTGTTG

Brara.I05136

Plant protein of unknown function (DUF863)

33

ATGTTCTTGTGAATAACGAACCAAC

CAAACAAAACCAAGCTTCCATATAC

Brara.J00384

Domain of unknown function (DUF966)

28

AAGTTCCTTGTCTTCCAAGCTTTCTTATTACTCCCATCTCCGATAATGAA

Brara.A02540

S-locus glycoprotein domain (S_locus_glycop) // D-mannosebinding lectin (B_lectin) // Protein tyrosine kinase (Pkinase_Tyr)

10

GCAGAACTTGTCATCGTTTCTTAACCACTACAACATCAGATCTTCCATCA

Brara.B00274

Protein DR1 homolog

9

TATTCATGGAACAAGTAATCTACCGAAACGTTTACCTTTAGGAAGCAAAG

Brara.E01810

Cyclin-A3-2-Related

9

GTCTCCGACATCTACGAGTATCTTC

ATCTTGAATTGAGACTCTTCAGACC

は GO term ʻpoly saccharide bindingʼ，ʻATP bindingʼ，ʻprotein

Shea らは，ハクサイ近交系のリシークエンス解析を

kinase activityʼ などが含まれていた．これらのカテゴリー

行 い， 得 ら れ た SNP 情 報 か ら 多 く の cleaved ampliﬁedに 属 す る 遺 伝 子 に は，cell wall-associated kinase，Wall-polymorphic sequence（CAPS）マーカーの作成に成功しassociated kinase family protein な ど や Disease resistanceている（8）．今回，我々は系統特異的 SNPs を 2 系統合protein（CC-NBS-LRR class）family，LRR and NB-ARC

計で 386,699個，In/Dels を 164,188箇所同定することと，

domains-containing disease resistance protein な ど，BAK1-

約 3,300の遺伝子において機能喪失をもたらす変異を同interacting receptor-like kinase 1 や cysteine-rich receptor-

定することができた．今後は，これらを利用した DNA

like protein kinase などをコードする遺伝子群が含まれてマーカの開発や，同定した変異を標準系統に戻し交配ないた．

どにより導入することで，その遺伝子の機能解析を行う

見出された変異の検証を PCR 法により行った（Fig．

ことも可能になる．このことから，本研究で得られた

3）．9 bp 以上の In/Del をもつ遺伝子をランダムに10個

データセットは，B. rapa の遺伝学および育種学研究を選定し，Fast Plants とそれぞれの系統を比較したところ，行う際有用な情報となるであろう．

Brara.B01005以外の 9 個の遺伝子において増副産物の泳動パターンにサイズの差が確認できた．
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387

F ig． 3（ A） I dentif ication of the var ia nt a llele using Indel pr imers．

388（ A） T ar get site a nd delet ion siz e． （ B） DNA ba nding patter n of Indel-389

Br ara.C 0 32 8 9 mar k er for d et ect io n of va r ia nt a ll el e． O S D2 ; Br a ss i ca r a p a390

inbr ed line OSD2， FP;Fast pla nts．

次世代シークエンサーを用いた変異解析に変異が存在しており，遺伝子機能に重大な影響のある変異をもつ遺伝子が両系統合わせて約 3,300個あった．
また，育種上重要である開花制御遺伝子に注目して解析したところ，17個の開花制御遺伝子においても変異が存在することが判明した．本研究で同定された多くの
SNPs および In/Dels のデータセットは，B. rapa の遺伝学的およびゲノム学的研究に貴重なマーカーリソースを提供するであろう．

引用文献
1 ）Akter A., Itabashi E., Kakizaki T., Okazaki K., Dennis
E.S., Fujimoto R., 2020, Fron. plant sci. 11, 619417.
2 ）Brassica rapa Genome Sequencing Project Consortium,
2011, Nat. Genet. 43（10）, 1035-1039.

391

3 ）Li P., Su T., Zhao X., Wang W., Zhang D., Yu Y., Bayer

3 9 2Fig．
3．Identiﬁcation of the variant allele using Indel primers.

P.E., Edwards D., Yu S., Zhang F., 2021, Plant（A）Target site and deletion size.
（B）DNA banding pattern of Indel-Brara. C03289 marker
for detection of variant allele. OSD2 ; Brassica rapa
inbred line OSD2，FP ; Fast plants．

謝Biotechnol. J. 19, 966-976.
4 ）Zhang L., Cai X., Wu J., Liu M., Grob S., Cheng F.,
Liang J., Cai C., Liu Z., Liu B., Wang F., Li S., Liu F., Li

辞X., Cheng L., Yang W., Li M.H., Grossniklaus U., Zheng
H., Wang X., 2018, Hortic. Res. 5:50.

本研究を実施するにあたり，貴重なご意見や様々な支援を頂きました京都産業大学生命科学部の河邊昭教授，5 ）Li F., Kitashiba H., Inaba K., Nishio T., 2009, DNA Res.
16, 311-323.

木村成介教授に感謝いたします．また，京都産業大学において次世代シークエンサーによる塩基配列解析を行っ6 ）Rahman M., McVetty P.B., Li G., 2007, Theor. Appl.
Genet. 115, 1101-1107.

てくださった降旗初佳さんに感謝します．

7 ）Zhang J., Lu Y., Yuan Y., Zhang X., Geng J., Chen Y.,

要

Cloutier S., McVetty P.B., Li G., 2009, Plant Mol. Biol.

約5, 553-563.

Single nucleotide polymorphisms（SNPs）および insertion

8 ）Shea D.J., Shimizu M., Itabashi E., Miyaji N., Miyazaki-deletion（In/Dels）は，植物のゲノム全体に広く分布し

J., Osabe K., Kaji M., Okazaki K., Fujimoto R., 2018,ている最も豊富な遺伝的変異であることから，DNA マー

Breeding Sci. 68, 375-380.

カーとしての汎用性が高い．Brassica rapa は，葉菜類の9 ）Li Y., Luo X., Peng X., Jin Y., Tan H., Wu L., Li J., Pei

ハクサイやコマツナ，根菜類であるカブ，油糧作物であY., Xu X., Zhang W., 2023, BMC Genomics 24, 445.

るアブラナなどを含み，世界中で栽培・消費されている

10）Bloomer R.H. and Dean C., 2017, J. Exp. Bot. 68（20）,5439-5452.

農業上重要な野菜のひとつである．本研究では，ハクサイ近交系（JKRB-T04）とコマツナ近交系（OSD2）にお11）Leijten W., Koes R., Roobeek I., Frugis G., 2018, Plants,
7（4）, 111.

いて全ゲノムリシークエンス解析を行い，両系統が持つ変異の同定を行なった．その結果，合計 542,015個の12）Itabashi E., Osabe K., Ryo F., Kakizaki T., 2018, Plant
Cell Rep. 37（1）, 87-101.

SNPs と 200,460箇 所 の In/Dels を 同 定 し， こ の う ち
118,519個 の SNPs， 27,470箇 所 の In/Dels は JKRB-T04

13）Fabio F., de Montaigu A., Coupland G., 2010, Cell 141（3）, 550-550e2.

特 異 的 変 異 で あ り，268,180個 の SNPs，136,718箇 所 のIn/Dels は OSD2 特 異 的 変 異 で あ っ た． ま た，Brassica14）Luo X. and He Y., 2020, J. Integr. Plant Bio. 61（1）,104-117.

rapa Fast Plants においてリファレンスゲノムにおいてア
ノテーションされている遺伝子のうち 60.1% の遺伝子

15）Antoniou-Kourounioti R.L., Zhao Y., Dean C., Howard─ 13 ─

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岡本慧森・郷正明・川邊隆大20）Van der Auwera G.A., Carneiro M.O., Hartl C., Poplin R.,

M., 2021, Front. Plant Sci. 12, 628726.
16）Andrés F. and Coupland G., 2012, Nat. Rev. Genet. 13,

Del Angel G., Levy-Moonshine A., Jordan T., Shakir K.,

627-639.

Roazen D., Thibault J., Banks E., Garimella K.V.,
Altshuler D., Gabriel S., DePristo M.A., 2013, Curr.

17）Lauffer H.B., Lauffer D. Williams P., 2012, Wisconsin

Protoc. Bioinformatics 43:11. 10. 1-11. 10. 33.

Fast Plants Program.
18）Langmead B., Trapnell C., Pop M., Salzberg S.L. 2009,21）Cingolani P., Platts A., Wang le L., Coon M., Nguyen T.,
Wang L., Land S.J., Lu X., Ruden D.M., 2012, Fly 6（2）,Genome Biol. 10（3）, R25.

80-92.

19）Li H., Handsaker B., Wysoker A., Fennell T., Ruan J.,
Homer N., Marth G., Abecasis G., Durbin R., 2009,22）Tian T., Liu Y., Yan H., You Q., Yi X., Du Z., Xu W., Su
Z., 2017, Nucleic Acids Res. 45（W1）, W122-W129.

Bioinformatics 25, 2078-2079.

─ 14 ─

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紀

要

委 員 長
委
員

委

川
平
佐

員
邊
野
藤

会
隆
将
祐

大
司
介

EDITORIAL COMMITTEE OF PROCEEDINGS
Chairman

Takahiro Kawanabe

MemberMasashi Hirano
Yusuke Sato

Published by
School of Agriculture, Tokai University871⊖12 Sugido, Mashiki-machi, Kamimashiki-gun, Kumamoto,861⊖2205, Japan

東 海 大 学 紀 要
第43巻

農 学 部

2 0 2 42024年３月15日発行
発 行 所

東海大学農学部〒861－2205
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印 刷 所

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（382）
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熊本県上益城郡益城町杉堂871－12

熊本県熊本市東区月出３丁目２－62

096
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2024/03/30

10:58:27

ISSN

Vol. 43

東海大学紀要 農学部

PROCEEDINGSOFSCHOOL OF AGRICULTURE
TOKAI UNIVERSITY

2432－7204

東海大学紀要 農学部
第 43 巻

2 0 2 42

Isolation of polyamide 4-degrading bacteria and the degradation behaviors of polyamide 4

0

2

4

………………………… Ryuhei Karato, Keiko Morikami, Koichiro Tachibana, Masayoshi Honda
Hideki Abe, Seiya Shimoda, Ayaka Hokamura……１

Using Next Generation Sequencers．
………………………………………………… Emori Okamoto, Masaaki Go, Takahiro Kawanabe ……７

生分解性ポリアミド４分解菌の単離とその分解性評価
第四三巻

Identiﬁcation of Variations in Brassica rapa Inbred Lines……………………………………………………唐渡龍平・森上佳衣子・橘弘一郎・本田正義
阿部英喜・下田誠也・外村彩夏……１
Brassica rapa 近交系における次世代シークエンサーを用いた変異の検出………………………………………………………………………岡本慧森・郷正明・川邊隆大……７

二〇二四

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