Application NoteGenomics

TapeStation による rAAV DNA の解析
著者

苑 宇哲
遊佐 敬介
内田 和久
神戸大学大学院
科学技術イノベーション研究科
科学技術イノベーション専攻

津本 裕子
アジレント・テクノロジー株式会社
診断・ゲノミクス部門

概要

組換えアデノ随伴ウイルス（recombinant adeno-associated virus、rAAV）はウイルスベクターとして、高効率に遺伝子導入を実施する非常に有用なツールとして近年注目されています。rAAV のゲノム DNA は一本鎖 DNA（single-stranded DNA、ssDNA）で、サイズ確認には一般的に変性ゲルによる電気泳動やキャピラリー電気泳動で実施されますが、精度や時間がかかるといった問題点がありました。

本アプリケーションノートでは、Agilent TapeStation system を用いて rAAV DNA を解析1した例を紹介しています 。High Sensitivity RNA Assay を利用し、変性条件を改変することで迅速で簡便に rAAV DNA のサイズ確認および定量が可能なことを示しています。

方法

rAAV DNA サンプル

rAAV-ZsGreen1 DNA は pAAV-ZsGreen1（Takara Bio 6231）
を PvuII（New England Biolabs R0151）と DraI（New EnglandBiolabs R0129）で制限酵素処理し、フェノール / クロロホルムとエタノール沈殿で精製しました。精製された AAV8-AAT-FIXp とトランスフェクション後 1、2、3 日の VPC2.0 細胞からの rAAV2CMV-ZsGreen1 の粗抽出物、および 1908_rAAV1-CMV-ZsGreen1、
1909_rAAV2-CMV-ZsGreen1、1911_rAAV6-CMV-ZsGreen1
は次世代バイオ医薬品製造技術研究組合から提供されました。
pAAV-ZsGreen1、pHelper および rep-cap plasmid（pRC1、pRC2mi342、pRC6、Takara Bio） を 293T 細 胞（American TypeCulture Collection、Manassas、VA、USA、CRL-3216）へ PEIpro（Polyplus Transfection 101000017）を使用し PEIpro：DNA=1：1の割合でトランスフェクションしました。トランスフェクション後 72 時
間で細胞を Triton X-100 buffer（0.5% Triton X-100、2 mM MgCl2
in phosphate-buffered saline（PBS））で溶解し、タンジェンシャ
ルフローろ過（Spectrum）により容量を 1/8 にし、HiTrap AVB
Sepharose Column（GE Healthcare）で処理をしました。洗浄後、
rAAV は 50 mM glycine-HCl（pH 2.7）に溶出し、CsCl 密度勾配超遠心法（148,500 g、46 h、21 ℃）で精製しました。rAAV
粒子は PBS で透析し、使用まで -80 ℃で保存しました。
電気泳動

DNA の電気泳動には Agilent 4150 TapeStation system（型番G2992AA）と High Sensitivity RNA Assay（型番 5067-5579、5067-5580）を利用しました。サンプルの変性条件以外はアジレン
2トのプロトコル に従いました。1 kb DNA Ladder（New EnglandBiolabs N3232）、High Sensitivity RNA Ladder（型番 5067-5581）
および 50 bp DNA Ladder（New England Biolabs N3236）を分子量マーカーとして使用し、High Sensitivity RNA Ladder の変性はアジレントのプロトコルに従いました。

2

TapeStation、qPCR、ddPCR による定量

TapeStation での定量は TapeStation Analysis software で自動計算された濃度を用い、Sample buffer の変更量に応じて適宜再計算しました。qPCR および ddPCR で使用したプライマーはカスタムで合成しました（Euroﬁns Genomics）。配列は以下の通りです。

Forward primer; 5'-TTCGTGATCACCGGCGAGGGCAT-3'、reverse primer; 5'-CCGTACATGAAGGCGGCGGACAA-3'、probe; [FAM]AACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGC[BHQ1]

qPCR は QuantiTect Probe PCR Kit（Qiagen 204343）およびStepOnePlus system（Thermo Fisher Scientiﬁc）を 使 用 し、PvuII で制限酵素処理した pAAV-ZsGreen1 を 2 倍の希釈系列でスタンダードカーブに使用しました。ddPCR では ddPCR Supermix
for Probes（Bio-Rad 186-3026）、QX200 Droplet Generator（Bio-Rad）および C1000 Touch Thermal Cycler（Bio-Rad）で実施しました。

結果AVortex 1 min

Sample/HS RNA Ladder 2μL

ssDNA のサンプル調製条件とプラスミド由来 rAAV DNA の解析

はじめ に、1 kb DNA Ladder を用 いてssDNA を解析する条件を検討しました。
ssDNA の解析には TapeStation の HighSensitivity RNA assay を利用しました。
アジレントのプロトコルでは、サンプルの1/2 量の High Sensitivity RNA Sample
Buffer をサンプルに加え、72 ℃、3 分でRNA を変性します（Fig. 1A 上図）。この変性条件はキット付属の High Sensitivity
RNA Ladder を変性するのには十分でし
たが、二本鎖 DNA（double-strand DNA、dsDNA）である 1 kb DNA Ladder では十分な分離が得られませんでした。そこ
で、Sample Buffer の量をサンプルと同量にし、変性条件を 75 ℃、5 分に変更したところ、十分な分離がみられ HighSensitivity RNA Ladder とのサイズと一致しました（データ示さず）。よって、以降の TapeStation の解析では Fig. 1A 下
図 の 条 件 でサンプル を調 製しました。
rAAV DNA での変 性 条 件を検 証するため、pAAV-ZsGreen1 を PvuII と DraIで制限酵素処理し、希釈系列を作製しTapeStation で 解 析しました。 制 限 酵
素処理後の DNA は、2,577 bp の rAAVZsGreen1 と 1,194、935、692、192、107、19 bp の pUC ベクター部分の消化断片を含みます。TapeStation の解析で、rAAV-ZsGreen1 の約 2.6 kb の長さに相当するバンドが観察され、rAAV DNA においても改変した熱変性条件で TapeStationで解析が可能なことが示されました（Fig.
1B）。 また、TapeStation で定 量した 濃度は、Qubit での定 量と相 関しており、ssDNA の定量にも TapeStation が利用できることが示唆されました（データ示さず）。

Agilent Protocol (Sample preparation for High Sensitivity RNA Assay)

Heat 72 ℃, 3 min

HS RNA Sample Buffer 1μL

Cool 2 min on ice

Modiﬁed Protocol for ssDNASample

Vortex 1 min

2 μL

Heat 75 ℃, 5 min

HS RNA Sample Buffer 2 μL

B

12Cool 2 min on ice

345[nt]
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500

678[nt]- 6000- 4000- 2000- 1000- 500- 200Lower Marker

Fig. 1 サンプル調製方法と rAAV-ZsGreen1 の解析（A）TapeStation High Sensitivity RNA assay でのサンプル調製方法。上図：アジレントプロトコル、下図：
ssDNA 用に改変したプロトコル（B）rAAV-ZsGreen1 の TapeStation 分析結果。レーン 1：1 kb DNA Ladder（10 ng/µL）、レーン２～ 7：
rAAV-ZsGreen1、濃度は順に 0.11、0.23、0.45、0.68、0.90、1.10 ng/µL、レーン 8：High Sensi-tivity RNA Ladder

緑のバンドは内部標準の Lower Marker（25 nt）を示す。

3rAAV genome
ITR

ITR

rAAV genomerAAV

CGGGCGACC-50

ITR-oligo1-50
1|-5’
GCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGG -3’||100150

GCCCGGGCGB

TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCすることでより明確なバンドが観察されました（Fig. 2C）。これ は、ITR-oligo では熱変性をしない場合でも部分的に直鎖化され、熱変性で完全に直鎖になることを示唆しています。熱変性した 50 bp DNA
Ladder と比較してサイズに相当した移動度であることから、この条件で ITR 構造も効果的に変性できることが示されました。

capsidGGTCGCCCG A CGCCCGGGC

AAV DNA は、両端に GC-rich かつパリンドローム配列で T 型の二次構造をもつITR 配列をもっています（Fig. 2A）。この複雑な構造の ITR も同様の熱変性で解析可能か検証するため、3 種の合成オリゴ、ITR-oligo 1-50 、 ITR-oligo 1-100 、 ITRoligo1-150（Fig. 2 B） を 同 量 の Sample
Buffer と混合後、熱変性（75 ℃、5 分）処理、もしくは未処理で TapeStation のHigh Sensitivity RNA assay で解析しました。熱変性未処理の場合、50、100、150 nt のシグナルは低く、熱変性を実施

AA AA

ITR（inverted terminal repeat）の解析

ITR-oligo1-150

ITR-oligo1-100

T TTC

12

3

45678[nt][nt]- 6000- 4000
1350
916
500
200
150
10050

- 2000- 1000- 500- 200

Lower Marker

Fig. 2 rAAV の構成と合成 ITR の解析（A）rAAV の構成（B）合成 ITR-oligo1-50、ITR-oligo1-100、ITR-oligo1-150 の配列（C）ITR の TapeStation 分析結果。レーン 1：50 bp DNA Ladder（10ng/µL）、レーン 2：ITR-oligo1-50 熱変性なし、レーン 3：ITR-oligo1-50 熱変性あり、レーン 4：ITR-oligo1-100 熱変性なし、レーン 5：ITR-oligo1-100 熱変性あり、レーン 6：ITR-oligo1-150 熱変性なし、レーン 7：ITR-oligo1-150 熱変性あり、レーン
8：High Sensitivity RNA Ladder。ITR の濃度はすべて 10 ng/µL。
緑のバンドは内部標準の Lower Marker（25 nt）を示す。

4

フェノール / クロロホルム抽出および細胞に導入した rAAV DNA の解析

rAAV DNA の解析のため、3 つのサンプ
ル 1 9 08 _rAAV1 - C MV-ZsGr een1 、
1909_rAAV2-CMV-ZsGreen1、 1911_rAAV6-CMV-ZsGreen1 からフェノール /クロロホルム法で rAAV DNA を抽出しました。前述の条件で熱変性した DNA をTapeStation で 解 析した ところ、rAAV
DNA の推定サイズである 2.6 kb のバンドが観察され、また、他のサイズのバンドは見られなかった（Fig. 3）ことから、分解されていない rAAV DNA が抽出されたことが示されました。各サンプル、1908_
rAAV1-CMV-ZsGreen1、1909_rAAV2CMV-ZsGreen1 、 1911_rAAV6-CMVZsGreen1 の TapeStation で計算された濃度は、それぞれ 3.15 ng/µL、3.19 ng/µL、3.19 ng/µL で、qPCR で定量した濃度とほ ぼ 一 致しました（Fig. 3B）。 た だ し、
TapeStation での 定 量 は qPCR に 比 べ
定量推奨濃度範囲が狭いため、サンプル濃度によっては適用できない可能性があります。

A[nt]

1234

10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500

5[nt]

- 6000- 4000- 2000- 1000- 500- 200Lower Marker

B[ng/μL]

6qPCR5TapeStation43210
1908_rAAV1-CMV-ZsGreen1 1909_rAAV2-CMV-ZsGreen1 1911_rAAV6-CMV-ZsGreen1

Fig. 3 フェノール / クロロホルム法により抽出した rAAV DNA の解析（A）抽出した rAAV DNA の TapeStation での分析結果。レーン１：1 kb DNA Ladder（10 ng/µL）、レーン2：1908_rAAV1-CMV-ZsGreen1、レーン 3：1909_rAAV2-CMV-ZsGreen1、レーン 4：1911_rAAV6CMV-ZsGreen1、レーン 5：High Sensitivity RNA Ladder
緑のバンドは内部標準の Lower Marker（25 nt）を示す。
（B）qPCR および TapeStation での 1908_rAAV1-CMV-ZsGreen1、1909_rAAV2-CMV-ZsGreen1、1911_rAAV6-CMV-ZsGreen1 の濃度比較

5さらに、細胞に導入した rAAV DNA の解析のため、トランスフェクション後 1、2、3 日 の VPC2.0 細 胞 からの rAAV-CMVZsGreen1 粗抽出物を DNaseI で処理し、TapeStation で分析しました。2.6 kb の
rAAV-CMV-ZsGreen1 DNA は、導入 1 日目には観察されませんでしたが、2 日と3 日後では粗抽出物の中で 2.6 kb のバンドが検出できました（Fig. 4A）。これらの結果により、TapeStation による解析は、DNA の不純物が含まれている状態であっても rAAV DNA の測定に利用できることがわかりました。
さらに、GOI（Gene of interest）として、血液凝固第 IX 因子（Factor IX-associatedhemophilia、FIX）遺伝子を使用し、rAAVDNA の検証を行いました。血友病 B ま
たはクリスマス病として知られる第 IX 因子関連血友病は、FIX 遺伝子の欠失や機能低下によるもので、血友病 B 患者において、AAV ベクターにより IX 因子を導入することで、IX 因子の血中濃度が維持さ3, 4れたと報告されています 。AAV8 カプ
シドに封入した rAAV8-AAT-FIXp をフェノール / クロロホルムで抽出し、TapeStationで分析したところ、該当 DNA の 3.2 kbのバンドが観察されました（Fig. 4B）。

A1234[nt]
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000500

Lower MarkerB12345[nt]
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500

Lower Marker

Fig. 4 細胞に導入した rAAV DNA および rAAV-AAT-FIX の解析（A）細胞に導入した rAAV2-CMV-ZsGreen1 の TapeStation での分析結果。矢印は 2.6 kb rAAV2-CMV-ZsGreen1 を示す。レーン 1：1 kb DNA Ladder（10 ng/uL）、レーン 2：day1（0.5 × 107 vg/uL）、レーン3：day2（1 × 108 vg/uL）、レーン 4：day3（0.5 × 108 vg/uL）（B）rAAV8-AAT-FIXp の TapeStation での分析結果。矢印は 3.2 kb AAV8-AATFIXp DNA を示す。レーン
1：1 kb DNA Ladder（10 ng/uL）、 レ ー ン 2： 3 ng/uL 1908_rAAV1-CMV-Zs-Green1、 レ ー ン 3 ～5：0.17、0.67、1.7 ng/uL AAV8-AAT-FIXp
緑のバンドは内部標準の Lower Marker（25 nt）を示す。

6

これまでに rAAV DNA は熱処理によりカプシドから抽出できることが報告されてお5り 、より簡便に rAAV DNA の解析を行う
ため、熱処理で抽出した rAAV DNA の検証を TapeStation で行いました。1908_
rAAV1-CMV-ZsGreen1 ベ クター 粒 子 を95 ℃、10 分で熱処理し、AMPure XP ビーズでの精製 / 未精製、さらに比較のためにフェノール / クロロホルム抽出後、精製した も の を TapeStation で 解 析しました（Fig. 5A）。これら 3 種類の抽出方法すべてで 2.6 kb にバンドが観察され、熱処理のみというシンプルな抽出方法でもフェノール / クロロホルム抽出と同様に検出できることが示されました。さらに、熱処理のみで抽出した rAAV DNA の希釈系列を作製し、TapeStation と ddPCR で定量をしました（Fig. 5B、C）。TapeStation で計算された濃度は ddPCR の濃度よりわずかに高い値となりましたが、1 ～ 20 ng/µL の範囲で直線性をもって定量できました。

A1234[nt]
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500

Lower Marker

B[nt]1234567

4000
3000
2000

C30

R² = 0.999325

TapeStation (ng/μL）

熱処理により抽出された rAAV DNA の解析

2015105005Fig. 5 熱処理により抽出した rAAV DNA の解析

10152025ddPCR (ng/μL）（A）各方法で抽出した 1908_rAAV1-CMV-ZsGreen1 の TapeStation での分析結果。レーン 1：1 kb DNA
Ladder（10 ng/µL）、レーン 2：熱処理、レーン 3：フェノール / クロロホルム法で抽出後、AMPure XP
ビーズで精製、レーン 4：熱処理で抽出後、AMPure XP ビーズで精製
緑のバンドは内部標準の Lower Marker（25 nt）を示す。

（B）1908_rAAV1-CMV-ZsGreen の希釈系列の TapeStation での分析結果。レーン 1：1 kb DNA Ladder（10 ng/µL）、 レーン 2 ～ 7：1 ～ 20 ng/µL 1908_rAAV1-CMV-ZsGreen（C）TapeStation と ddPCR における定量値の比較

7

結語

rAAV DNA の分析や品質管理において、サイズや純度、定量は重要な確認事項です。本アプリケーションノートでは、自動電気泳動システムである TapeStation を用い、従来の High Sensitivity
RNA Assay の 熱 変 性 条 件 を改 変することで、ssDNA である
rAAV DNA を効率的かつ正確に、さらに簡便に分析可能であることが示されました。

謝辞

本研究は、国立研究開発法人 日本医療研究開発機構（AMED）の課題番号 JP18ae0201001 の支援を受けました。

参考文献

1. Concise Analysis of Single-Stranded DNA of Recombinant
Adeno-Associated Virus By Automated Electrophoresis
System Yuzhe Y. et al., Human Gene Therapy, Vol. 35,
Issue 3-4, 2024.
2. High Sensitivity RNA SreenTape Assay for TapeStation
Systems Quick Guide, Agilent Technologies, G2991-90121
Rev. B.
3. Gene therapy with adeno-associated virus vector
5-human factor IX in adults with hemophilia B Miesbach
W. et al., Blood, Vol.131, Issue 9, 2018.
4. Long-term safety and efﬁcacy of factor IX gene therapy inhemophilia B Nathwani AC. et al., N Engl J Med, Vol. 371,
Issue 21, 2014
5. Biophysical and ultrastructural characterization of adenoassociated virus capsid uncoating and genome release
Horowitz ED et al., J Virol, Vol. 87, Issue 6, 2013

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