08-03-DNA Ligation Kit-

Ligation high(Code No.:LGK-100)

使用说明书

科研用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目 录[1] 前言.........................................................................................................................1[2] 操作程序.................................................................................................................11．使用方法 ..............................................................................................................12．进行高效连接 ......................................................................................................1[3]

LIGATION HIGH的特征*1 ................................................................................21．优良的连接反应效率 ..........................................................................................2
2．少量液体便可进行反应 ......................................................................................2
3．优良的稳定性 ......................................................................................................2[4]实例.......................................................................................................................3

1．插入连接 ..............................................................................................................3
2． LINKER连接 ...........................................................................................................43．噬菌体连接 ..........................................................................................................54．通过电泳进行确认 ..............................................................................................65．盐浓度的影响 ......................................................................................................7[5] 相关产品一览表.....................................................................................................8【 注意 】
本试剂盒包含的试剂均为研究用试剂，请不要当作诊断和临床试剂使用。
在本试剂盒使用过程中，请务必严格遵守实验室的各项注意事项，注意安全。

2[1] 前言DNA 片段的连接反应是在遗传基因操作实验中的常用操作。在以往的连接反应中，要根据不同的底物设置不同的条件，还要分别添加各自不同的反应组成
成分，比较复杂麻烦。另外，在进行插入连接时，要得到较高的转化效率也十分
困难。
因此，东洋纺公司为了解决此类问题，开发了操作简便而高效的试剂盒。本试剂盒的反应液中包括了所有连接反应所需要的试剂，适用于多种类型的连接反应。另外，本说明书介绍了使用 Ligation high 时的标准结果。

[2] 操作程序
1．使用方法·请将本品保存在-20℃以下环境中。
·在冰上使 Ligation high 融解。将其放置在冰上 5-10 分钟便会自然融解。
·配制准备连接用的 DNA 溶液。
·取 DNA 溶液加入等量至半量的 Ligation high，混匀。
·在 16℃下反应 30 分钟。
·反应完成后，其反应液可以直接使用于转化。

2．进行高效连接·连接效率较低时，使用乙醇沉淀等提纯 DNA。
·要控制反应液量时，可减少 DNA 液体的使用量，和相当于其半量的 Ligationhigh 进行混合。(参照第二页)·注意在活性细胞中添加大量的反应液会降低转化的效率。需要添加大量反应液时，要先用乙醇沉淀等将 DNA 进行浓缩。
·连接效率受盐浓度的影响。要进行高效率的连接反应时，先用不含盐的TE
buffer*1将DNA溶解后再进行连接反应。(参照第 7 页)
*1

10mM

Tris-HCI, pH8.0/1mM EDTA

1

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Ligation high的特征*1

1．优良的连接反应效率
和单独使用 T4 DNA Ligase 相比能获得 50 倍以上的效率。

2．少量液体便可进行反应将等量到半量的 Ligation high 和 DNA 溶液混合使用。

图 1 体积比的不同(DNA 溶液:Ligation high)导致的转换效率的不同

3．优良的稳定性即使反复进行 50 次冻结和融解仍然未见连接效率下降。

稳 定性
图2冻结融解对转化效率的影响

*1本页的实验结果全部是自身连接的结果。自身连接使用和第 7 页相同(用TE buffer溶解)的方法。

垂询电话：021-58794900

2

[4]

实例

1．插入连接(1) 方法·配制在脱磷酸化的 pBluescriptⅡ/BanⅢ(50ng,25fmol)中加入了 pUC18/TaqⅠ
的 1,444bp 片断(5～125ng,5～125fmol)的 DNA 溶液 5μl。
·取 DNA 溶液和等量(5μl)或半量(2.5μl)的 Ligation high 混合，在 16℃条件
下反应 30 分钟。
·取E.coli JM109 的感受态细胞*1在 2μl反应液中进行转化，将其在含有X-Gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养皿上培养，根据其生成的菌落数量推测转化效率。
·使用 T4 DNA Ligase 的 16hr 反应液作对照。
(2) 结果和结论插入物/底物的摩尔比图 3 影响连接反应效率的插入物/底物的摩尔比插入物/底物(摩尔比)0.20.51.05.0Ligation high(容量比 1:1)
52505666

Ligation high(容量比 1:0.5)
6365
6172

T4 DNA Ligase
12212739

表 2 白色菌落的比例（%）·插入物/底物的摩尔比在 1.0 以上时可以得到较好的结果。
*1

转化效率是 1.07×109cfu/μg pBluescriptⅡ3

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2． linker 连接(1) 方法·配制 DNA 溶液在脱磷酸化的 pBluescriptⅡ/HincⅡ(100ng,50fmol)中加入了脱磷酸 EcoRⅠlinker (2.6～130ng,0.5～25pmol)的 DNA 溶液 5μl。
·取 DNA 溶液和等量(5μl)或半量(2.5μl)的 Ligation high 混合，在 16℃条件
下反应 30 分钟。
·取E.coli JM109 的感受态细胞*1在 2μl反应液中进行转化，转化液在含有X-Gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养皿上培养，根据其生成的菌落数量推测转化效率。
·使用 T4 DNA Ligase 的 16hr 反应液作对照。
(2) 结果和结论插入物/底物的摩尔比图 3 影响连接反应效率的插入物/底物的摩尔比插入物/底物(摩尔比)1050
100500Ligation high
(容量比 1:1)
51545754

Ligation high
(容量比 1:0.5)
57656476

表 2 菌落的比例（%）·插入物/底物的摩尔比在 100 以上可以得到较好的结果。
*1

转化效率是 1.07×109cfu/μg pBluescriptⅡ

垂询电话：021-58794900

4T4 DNA Ligase
232438383．噬菌体连接(1) 方法· 配制在λZAPⅡ的 EcoRⅠarm(250ng)中加入 Test lnsert(200ng)
的 DNA 溶液 5μl。
· 取 DNA 溶液和等量(5μl)或半量(2.5μl)的 Ligation high 混合，
在 16℃或 26℃下反应 10 分钟到 1 个小时。
· 取反应液 4μl 和 GIGAPACKⅢ old 进行体内包装，并使其感染 E.coli
XL1-Blue，测量转化效率。
·使用 T4 DNA Ligase 的 16hr 反应液作对照。
(2) 结果和结论
表3噬菌体连接反应中反应条件的影响
（pfu/μg λZAPⅡ）反应条件
16℃×10min
16℃×30min
16℃×60min
16℃×16hr
26℃×10min
26℃×30min
26℃×60min
26℃×16hr

Ligation high(1:1)
2.20×1055.20×105
3.00×106
3.21×106
4.80×105
1.20×106
2.00×106
1.19×106

Ligation high
(1:0.5)
7.68×106
8.32×106
1.15×107
9.35×106
5.12×106
3.20×106
3.84×106
3.56×106

T4 DNA Ligase
2.15×105
3.09×105·反应温度在 16℃到 26℃之间连接反应的效率没有显著的差别。
·反应 30 分钟,显示可以得到充分的连接反应效率。

5

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4．通过电泳进行确认(1) 方法·取λ/Hind Ⅲ的片段(500ng)5μl 和等量(5μl)或半量(2.5μl)的 Ligation high混合，使其在 16℃下进行反应。
·反应结束后，使用乙醇沉淀回收 DNA，在 1%的凝胶中进行电泳。
·使用 T4 DNA Ligase 的反应液作对照。
(2) 结果和结论图 4 连接反应液的电泳条带图·λ/Hind Ⅲ反应 5 分钟即被连接。
注意：·受片段末端形状的影响，有时连接反应较难完成，所以在连接效率较低时，请尝试延长反应时间。
·反应液可以当作电泳的样品，但要得到明显的电泳条带时，请先通过乙醇沉淀进行缓冲液交换。

垂询电话：021-58794900

65．盐浓度的影响
(1) 方法·将 pBluescriptⅡ/ScaⅠ(5ng)溶解在添加了盐(NaCI)的 TE buffer 5μl 中。
·取 DNA 溶液和等量(5μl)或半量(2.5μl)的 Ligation high 混合，在 16℃条件
下反应 30 分钟。
·取E.coli JM109 的感受态细胞*1在 2μl反应液中进行转化，将其在氨苄青霉
素的LB培养皿上培养，根据其生成的菌落数量推测转化效率。
(2) 结果和结论图 5 自身连接的转化效率·如果溶解 DNA 的 buffer 中含有盐，转化效率有可能降低。要获得较高的转化效率时，请将 DNA 溶解在不含有盐的 TE buffer 中。

*1

转化效率是 1.17×109cfu/μg pBluescriptⅡ7

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[5] 相关产品一览表
产品名Code No.

T4 DNA Ligase

LGA-101

λ/HindⅢ digest

DNA-010Competent high E.coli JM109

DNA-900

EcoRⅠ Linker:d(pGGAATTCC)

ECO-801

pUC18 DNA

PUC-018垂询电话：021-58794900

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