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浦 上財 団 研究 報 告書VoL11(2003)

沢 ワサ ビ成分 の細 胞傷 害活 性 を 回避 して, 第2相 解毒
酵素 誘 導 を増 強 す る方法 の 開発

1.はじ め に猟

山

ト化合 物6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocya‑nateのイソチオ シア ネー ト化合 物は動 物の発癌 を予 防す るこ とが知 られ てい る1‑‑4)。この化合物 は① 第2相 解 毒酵素 を誘 導あ るいはそ の誘導 を増 強す る
ことに より,発 癌物 質 を無毒化 し,体 外 に排 出 した り② 第1相 解毒酵 素 を阻害す るこ とが 報告 され

一第2相雄(青 森大学工学部生物工学科教授)

解 毒 酵 素(QR)の影響 を比較検 討 した。

2.結果 と考察

2.16‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateて いる5〜10}。

によるQR活例 えば,ブ ロ ッコ リー に含 まれる スルフ ォラフ

誘 導増 強活 性 と細 胞 傷 害 活 性 に 及 ぼ すNACのQR活性の増 強性 はHepalclc7肝癌 細 胞を もちい てァンは第2相 解毒 酵素で ある グル タチ オ ン転移 酵Prochaska等J)の素(GST)や

う に該 化 合 物 は10〜20μMのキ ノン レダ ク ター ゼ(QR)等の誘方 法 で行 っ た。 図1に 示 す よ
濃 度 でQR活性導 を増強 し,同 時 に第1相 解毒酵 素チ トク ローム

を濃 度依存 的 に増大 し,最 大1.8倍 にまで 増大 しP450を 阻害 す るこ とが報 告 され てい る91。

た。 しか し,80μMでは活 性 が減 少 した。Hou等6)がHepalclc7肝癌 細 胞 を も ち い て6‑

一 方,第2相

解 毒酵 素GSTの誘導 と細 胞 内酸化 ス トレス(細 胞内活性 酸素 産生)と が密接 に関(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateのQR活係 し8.11),イ ソチオ シア ネー ト化 合物 はアポ トー

性 に及 ぼす 影響 を検 討 して い るが,1μMでシスや ネクロー シス を誘 導 し細 胞を傷 害す るこ と3倍 の活性 増大 をみてい る。我 々の実験 では この約が 報告 さ れて い る1°̲.13)。
これ らの こ とよ りイ ソよう な高 い活性 増 大 はみ られず,Hou等

チ オシ アネー ト化合物 の発癌予 防効果 が,自 身の結果 との食 い違い の正確 な理由 は現在不 明で ある

活性 酸素誘 導能 に基づ く細胞傷 害に よ り減弱 す るが,Hepalclc7肝可 能性が 考え られる。の違 いがそ の理 由の一つ であ る可能性が あ る。 彼

抗 酸 化剤 グル タチ オ ンやN一アセ チ ルシス テ イン(NAC)なの実験

癌 細 胞の 培 養 に用 い た培 養 液らの培養液 よ り我 々の培 養液は細 胞 にと り栄養 がどは活 性酸 素 に よる細 胞傷 害 を阻

豊富 で細胞 の増殖 も早か った。 この培養 液の違 い

害 する一 方8.14,l°1,GSTの誘 導増強 を も阻害 す るが両 者の実 験結果 の原 因であ るか どうかにつ いてこ とが知 られ てい る8)。

は今後の検 討 を必 要 とす る。

しか しなが ら,イ ソチオ シアネー ト化合物 の生物 活性 に及 ぼす グル タチオ ンやNAC等

2.26‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateの細胞 傷害活 性の抗 酸化剤 の影響 につ いて詳細 な報告 がほ とん どない。 それで我 々は沢 ワサ ビ成分で ある イソチオ シアネ ー

図2に

示 す よ う に6‑(methylsulfinyl)hexyl

isothiocyanateに は細 胞傷 害活 性が あ り,濃 度に沢ワサビ成分の細胞傷害活性を回避 して,第2相 解毒酵素誘導を増強する方法の開発

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図1Effectof6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateonQRactivity.
Hepalclc7cells(2×10'iwell)weretreatedfor24hat37℃with6‑(methylsulfinyDhesvlisothiocvanate.Theresultsare
representedastheratiosofspecificQRactivitiesinthetreatedculturestothoseofuntreatedcontrols.V"aluesaremeansSDofthree
independentexperiments(eachconsistingofsixwells).Theletterbeloweachtreatmentindicatestheresultsofastatisticalanalysis(P<0.05).

依存 して 傷害 活性 が高 くな り,80μMでは約70%の 細 胞が 傷害 をうけ た。 この 濃度でQR活
約50%ほど阻 害(図1)さ性はれる こ とよ り,該 化

シスで はな くアポ トーシス に基 づ くもの と思 われるが,ア ポ トー シスの指標 であ るDNAの

分解 による ラダー を検 出す るこ とはで きなか った。 他の合物 にた いする 感受性 は細胞傷 害活性 よ りQR活

イ ソチ オシ アネー ト化 合物 も細 胞傷害 活性 を示 し,性の方 が低 い ことがわか る。一方,該 化 合物の 上

その メカニズ ムは化合物 の種類,実 験 に供 した細記細 胞傷害 活性 はMTT法では検 出で きるが,乳胞な どの条件 によ り異 なる12.131。
い くつかの イ ソ酸脱水 酵素 法(細 胞膜が破 壊 され細胞外 に流失 す

チオ シアネー ト化合物 は活性 酸素 を誘 導 し細 胞をる細 胞質の 酵素活性)で は検出す る ことがで きな

傷 害 す るが,こ の 細 胞 傷 害 が グ ル タチ オ ンやい こと より,該 化 合物 による細胞 傷害 はネ クロー

NACなどに よ り阻 害 され るこ とが 報告 され てい図2Effectof6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateoncellviability.
Hepalcic7cells(1‑5×10"/welUweretreatedfor24hat37Cwith6‑(methylsulfinyllhexylisothiocyanate.Theresultsare
representedasreducedMTTvalues.Valuesaremeans±SDoftwoindependentexperiments(eachconsistingofsixwells).Theletter
beloweachtreatmentindicatestheresultsofastatisticalanalysis(P<0.05).

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浦 上 財 団研究 報 告書VoL11(2003)

図3に 示 す よう にNACは5mMまる8・14・15〕。 そ こ で 次 に,我 々 は6‑(methylsulfinyl)
hexylisothiocyanateのNACの細 胞 傷 害 活 性 に及 ぼすによ る細胞 傷害活 性 を阻害 した。10mMで影 響を検 討 した。

を調節 しな いNACで2.36‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateの 細 胞 傷 害 活 性 に 及 ぼ すNACのNACはMTTをはMTT法

還 元 す る の で,生で は なくSRB法

害 活 性 に 及 ぼ すNACの(図3B)。

この 事 は ま た,NACの溶 液のpHを中性 に して も失活 しない こ とを示 し

影 響 を 検 討 す る 前 に,は5,20%のこ の 細 胞 傷 害 活 性 はNAC溶のpH(酸性)によ る 影 響 と 考 え られ る の で,pHを7.5にし たNACで10mMでは 細 胞 の 傷 害 は み られ な か っ た 。

し た と こ ろ,5,液

濃 度6‑(methylsulfinyl)hexylisothi‑
ocyanateに よるQR活
NACの性 の 阻害に及 ぼす

影響高濃 度(80μM)の6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateに よるQR活性 阻害(図1)は

該

化 合物の 細胞傷 害性 に基 づ くか どうかを検討 するためにNACの影響 を検 討 した。 その結 果,NAC

図3EffectsofN‑acetyI‑L‑c}・steine(NAC)on6‑(methylsul且nyl)hexylisothiocyanate‑inducedCFYOtOXICItV.
Hepalclc7cells(5x10'̀welDwerepretreatedfor30minwithNACorpH7.5‑adjustedNACfollowedby24hincubationat37℃with
6‑〔methylsu田nyDhexylisothiocyanate(80μM}.Theresultsarerepresentedas%ofcytotoxicity:(viabilitywithouttreatment‑viabilitywithtreatment)viabilitywiτhouureatment.A:NAC(opencolumn),B:pH7.5‑adjustedNAC(pH7,5NAC)(solidcolumn).
Faluesaremeans±SDofthreeindependentexperiments(eachconsistingofsixwells).Theletterbeloweachtreatmentindicatesthe
resultsofastatisticalanalysis(P<0.05).

活 性 はNACている。
2.4高

細 胞 傷害 活 性 を

示 し た 。NACの検 討

調は細胞傷 害活 性の 阻害が み られた

細 胞 傷

細 胞 を 傷 害 し な か っ たが,5,10mMで節 したNACでっ た 。6‑

細 胞 傷 害 活 性 に つ い て 検 討 し た 。1mM

ま で はHepalclc7癌

はpHは傷害 の回 復は み られ ないが(自 身 の細 胞傷 害活 性 に基 づ く),pH7.5に影響
細 胞 の測定重6〕で 行(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateのNACので濃 度 に依存 して6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanate

沢ワサビ成分の細胞傷害活性を回避して,第2相 解毒酵素誘導を増強するノ∫法の開発
はQR活性 の増 大 をもた ら した。 しか し,QR活性の 測定 はMTTの整)の還元 に基づ く測定法 であ り,

前述 した ようにNACがMTTを還 元す る能力 を持つ こ とか ら,こ の増大 は真 のQR活性 増大 を反映 してい ない ことは明 らかで ある。 このこ とよ り,
NACの影 響の 検討 に はQR活性 の測 定 を本法 以外の 方法 で行 う必 要が ある。

濃 度 に 応 じて6‑(methylsulfinyl)hexyl

isothiocyanateは80μMでQR遺大 した。 しか し,NAC自伝 子 発 現 を増

身はQR遺伝子 発現 を増大 しなか った。
Pinkus等ll1や 中 村等aはNACやンがGSTのグル タチ オ

遺 伝子 発現 や活性 を 阻害す る こと を報告 してい る。 しか しなが ら,我 々の実験 では

2.56‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateのQR遺79

80,uM6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanate

伝子発 現に 及ぼす影響の場 合,NACがQR遺6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateの伝子 発現 を 阻害す る のでは な く反 対 に そ の 活 性 を 増 大 し た(図5A)。

QR活 性 増 強の メカニ ズム を検討 する ために,該NACに化合 物のQR遺現が該 化合物 によ り阻害 されてい た場 合の みでみ

図4に伝子 発現 に及ぼす 影響 を検討 した。

示 す よ う に6‑(methylsulfinyl)hexyl

isothiocyanateは10〜40μMのよるQR遺られ,QR遺範 囲で濃 度依 存

伝 子発 現の 増大 は該 遺伝 子発伝子 発現 が増 大 している場 合 にはみられ ない可 能性 があ る。そ こで,QR遺伝子 の発的 にQR遺伝 子 の発 現 を増 大 した。 そ の増 大 は現 を増 大 す る6‑(methylsulfinyl)hexylisothio‑40μMで未 処置 の約7倍 であ った。 しか しながcyanateの 濃 度40μMにら80μMでは遺伝 子発 現の増 大 はみ られなか っ検討 した。 図5Bに対 す るNACの影響 を示す よ うにpH7.5に 調整 したた。 これ は該化合 物が細 胞 を傷 害 したため と思 わ

NACは10mMでれ る。そ こで,NACで6‑(methylsulfinyl)hexylで はあ るが有 意に 阻害 した。 しか し,lmMでisothiocyanateの 細 胞傷害 を 阻害 した場合,該 化

全 く 遺 伝 子 発 現 を 阻 害 し な か っ た 。6‑合物 はQR遺(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateのQR遺伝子発 現 を増 大す るか どうか を検 討した。 図5Aに示 す よ う に,NAC(pH7.5に

調はQR遺伝 子発 現増大 を わずか

伝子発 現増大 活性 は80μMで

図44.Effectof6‑(methylsulfinyl)hexylisothioc}・anateonQRmRNAexpression.
Hepalcic7cells(10")weretreatedfor24hat37Cwith6‑(methylsulfinyllhexylisothiocyanate.Theresultsarerepresentedasthe
ratiosofQRmRNAlevelsintreatedculturestothoseinuntreatedcontrols,Valuesaremeans±SDoffou1・independentexperiments,
Theletterbeloweachtreatmentindicatestheresultsofastatisticalanalysis(P<O.Oo).

失 われ るが,lmM

は

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浦 上 財団 研究 報 告書VoLll(2003)

図5EffectsofN‑acetyl‑L‑cysteine(NAC)onQRmRNAexpressionby6‑(methylsu1丘nyDhexylisothiocyanate
Hepalclc7cells(106)werepretreatedfor30minwithpH7.5‑adjustedNAC(pH7.5NAC)followedby24hincubationat37℃with6‑(methylsul丘nyl)hexylisothiocyanate(A:80μM,B:40μM).TheresultsarerepresentedastheratiosofQRmRNAlevelsintreatedculturestothoseinuntreatedcontrols.Valuesaremeans±SDoffourindependentexperiments.Theletterbeloweachtreatment
indicatestheresultsofastatisticalanalysis(P<0.05).

NACがそれ を有意 に回復(図5A)するこ とか ら,6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateによる

QR遺 伝 子発 現 の方 が細 胞傷 害活性 よ りNACに現 が増大 して もその 産物の活性 増大 に直接 反映 されない メカニ ズム を解 明す る必要が ある。
3.まとめ

感受性 が低 いこ とが明 らかであ る。
本 実 験 で は6‑(methylsulfinyl)hexylisothio‑cyanateの 細 胞傷 害活性 とQR遺性のNACに

沢 ワ サ ビ 成 分6‑(methylsulfinyl)hexylis()‑

伝子 発現 増大 活

対す る感受性 の違い を明 らかに した。

一 方,今 回の研 究でQR活性 とQR遺伝 子発 現の6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateに対thiocyanateのHepalclc7マ

ウ ス 肝 癌 細 胞 のQR

活 性 及 び そ の 遺 伝 子 発 現 と細 胞 傷 害 に 及 ぼ す 影 響と そ れ らの 活 性 に 及 ぼ すNACの影 響 を 検 討 した 。

6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateはす る感受性 の違 いが明 らかに なった。即 ち,該 化

依 存 的合物 で増大 され たQR遺(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateで伝 子が全 て効率 的に その活性 発現 に結びつ いてい ない。今 後,遺 伝子 の発にQR活性

活 性 は 阻 害 さ れ,まを 増 大

濃 度し た 。80μMの6‑
は そ のた 細 胞 傷 害 が み ら れ た が,沢ワサビ成分の細胞傷害活性 を回避して,第2相 解毒酵素誘導を増強する方法の開発
NACによ り濃 度 依存 的に細 胞傷害 が 回復 した。

Cytotechnol.25:197‑203.(1997).
4)YanoT,YajimaS,VirgonaN,YanoY,OtaniS,

6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateはQR

KumagaiH,SakuraiH,KishimotoMandlchikawaT:

遺 伝 子発 現 を濃 度 依存 的 に増大 す る こ とよ り,
QR活性 の増大 はそ の遺伝 子発現 の増大 に基づ くと考 え られ る。80μMによるQR遺大 の低 下 も同様 にNACにより回復 した。 一方,

伝 子発 現増CancerLett.155:‑‑5‑120,(2000).
5)ProchaskaHJ,Santamaria.aBandTalalayP:ProcNatl
acadSci,LSA.89:2394‑2398.(1992).
6)HouDX.FukudaM。FujiiMandFukeY:CancerLett,
161:195‑200,(2000).

40,uM6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateに よるQR遺7)HouDX,FukudaM.FujiiMandFukeY:IntJMol

伝 子発 現の増 大 は10mMNACでわず か では あるが 有意 に 阻害 されたが,lmMではMed,6:441‑444,(2000).
8)NakamuraY,OhigashiH.MasudaS.MurakamiA.
MorimitsuY,KawamotoY,OsawaT,ImagawaICIand

影 響がみ られ なか った。

UchidaK:CancerRes,60:219‑225.(2000).

本実験 は イソチ オシア ネー ト化合物 が本 来持つ
細 胞傷害 活性 を回避 して,第2相解毒 酵素 活性誘

導 及び その活性 増大 を もた らす 方法 の端緒 を明 ら

9)MaheoK,MorelF.LangouetS.KramerH,LeFerrecE,KettererB,andGuillouzoA:CancerRes,57:3649‑3652,(1997).
10)SingletaryKandMacDonaldC:CancerLett,155:47‑54.

か に した。
謝(2000).

辞11)PinkusR,WeinerLM,andDanielV:Biochem,34:

本研究 にた い し多大 の御助成 を下 さい ました浦
上 食品 ・食文化 振興財 団に厚 く御礼 申 し上 げます。

81‑88.(1995).
12)YuR,MandlekarS,HarveyKJ,lickerDSandKong
AN:CancerRes.64:402‑408,(1998).

付記13)NakamuraY.KawakamiM.YoshihiroA.MiyoshiN'.

本 研 究 は2003年7月22日AnticancerRe‑search(23巻,2003年)に採 用 された。

OhigashiH,KawaiK,OsawaTandUchidaK:JBiolChem,277:8492‑8499,(2002).
14)'̲MayerMandNobelM:ProcNatlAcadSci,USA,91:7496‑7500.(1994).

参考 文献
1)LinJvl.AminA,TrushinNandHechtSS:CancerLett,
74:151‑159,(1993).
2)ZhangY.KenslerTW.ChoCG,PosnerGHandTalalay
P:ProcNatlAcadSci,USA.91:3147‑3150.(1994).
3)FukeY,HagaY,OnoH.NomuraTandRyoyamaK:15)MiyajimaA.NakashimaJ,TachibanaM,NakamuraK,
HayakawaMandMuraiM:JpnJCancerRes,90:565‑570,(1999).
16)SkehanP,StorengR.ScudieroD,MonksA,McMahon
J,VisticaD,WarrenJ.BokeschH,KenneySandBoyd
MR:JNatlCancerInst,82:1107‑1112,(1990).

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URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVolユ1(2003)

DevelopmentofamodalitywhichaugmentsPhase2enzymesby6‑(methylsulfinyl)
hexylisothiocyanatefromwasabithroughavoidingitscytotoxicity

KazUORyoyama(DepartmentofBioscienceandBiotechnology,FacultyofEngineering,AomoriUniversity)

Weexaminedboththeinductionofquinonereductase(QR)by6‑(methylsulfinyl)
hexylisothiocyanateanditscytotoxicityinHepalcic7cells,andcomparedthesensitivityofthesetworesponsestoNAC.QRactivitywasincreasedby6‑(methylsulfinyl)hexyl
isothiocyanateinadose‑dependentmanner.At80uM,thecompoundwassignificantly
toxictocells,buttheresultingQRinhibitionwasdose‑dependentlyovercomebyNAC.
AugmentationofQRactivityby6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanateseemedtobedue
toaugmentedexpressionofQRmRNA,whichwassignificantlyincreasedbythecompound.
InhibitionofQRgeneexpressionwasseenat80,uM,andcouldbeovercomebyNAC.
OptimalinductionofQRgeneexpressionbythecompound(at40,uM)wasslightlybut
significantlyinhibitedby10mMNACbutnotbylmM.Thepresentstudysuggeststhat
inductionofPhase2detoxificationenzymesbyisothiocyanatecompoundsmaybefurther
enhancedbysuppressionoftheirinherentcytotoxicactivity.