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殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析＜平成20年度＞

殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析
古田雅一（大阪府立大学理学系研究科准教授）

1. 緒

言

本研究においては，香辛料の殺菌法としてわが国で広く用いられている過熱水蒸気殺菌と世界的香辛料は雑菌に汚染されている場合が多く，こに利用が拡大している放射線殺菌に着目した。殺れらが殺菌処理を受けた場合，通常は一定の生残菌された香辛料を肉類のハム，ソーセージ加工に菌が存在する。香辛料の利用については食品衛生際して添加する場合を想定し，食品内の微生物の法上規格基準があり，「食肉製品，鯨肉製品，魚増殖の実態について食品衛生検査指針に従って比肉ねり製品を製造する場合 , 香辛料，砂糖及びで較解析すると同時に熱測定法による非破壊的計測

ん粉は，その１ g 当たりの芽胞数が，1,000 以下法の可能性についても検討した。

でなければならない」ため，それらの用途に使用する香辛料の殺菌は不可欠である 1）。殺菌された2.

実験方法

香辛料のなかには一定の損傷菌が存在する可能性

2. 1

香辛料の殺菌効果があり，このような生残菌を含む香辛料を生菌数

わが国で流通している香辛料の中から代表的なが少ない殺菌済み加工食品に添加した場合，予測ものとして市販の未殺菌及び過熱水蒸気殺菌済みしがたい増殖挙動を示す恐れがある。本研究のねの黒コショウ，パプリカ，セージをそれぞれ購入

らいは殺菌処理を受けた香辛料に残存する微生物し，未殺菌の香辛料は大阪府立大学産学官連携機がどのような条件で損傷から回復し，増殖の促進

構放射線研究センターの 60Co ガンマ線照射施設や抑制が起こるのかを詳細に検討し，食品衛生のにおいて 10 kGy までの異なる線量を均質に照射確保に資する知見を得ることにある。

した。

すでに実用化されている香辛料の過熱水蒸気殺未殺菌，過熱水蒸気殺菌，放射線殺菌済みの試菌，放射線殺菌に関する殺菌効果，安全性に関し料 25 g と回収液（0.05％ Tween80，0.1％ペプトては数多くの研究により確立されている 2）。しかン水）250 mL をフィルター付ストマッカー用袋し一部の消費者からは放射線殺菌の安全性や品質に入れ，ストマッカー（サンプル容量 400 mL，について疑問が呈されていることもあり，殺菌法200 ストローク / 分）により２分間ブレンディンの違いによる成分，品質の比較は現在でも研究がグした。得られた試料を食品衛生検査指針に基づ行われている 3）。殺菌後の香辛料の残存菌が食品

き，一般生菌数，大腸菌群，真菌類に属する微生中での異常な増殖挙動によりヒトに害を及ぼさな物コロニー数をそれぞれ，標準寒天平板培地，デいか，という懸念も一部の消費者からは発信されソキシコレート平板培地，ポテトデキストロースているが，実際に検討された研究例は報告者の知平板培地を用いてコロニー計数法により求めた。

る限りみられない。

88

2. 2

浦上財団研究報告書

殺菌処理を受けた微生物の食品中におけVol.17（2009）

2. 3

過熱水蒸気殺菌及び放射線殺菌後の香辛料からの生残微生物の分離及び同定

る増殖挙動解析
未殺菌，過熱水蒸気殺菌済み，放射線殺菌済み

過熱水蒸気殺菌及び放射線殺菌後の香辛料の菌（10 kGy 照射）黒コショウ，パプリカ，セージ種数測定において各平板培地上に現れた抵抗性の高子を調製し，それぞれ 25 g を市販のコーヒーミいと思われる生残菌のコロニーについては，コロルで 15 秒粉砕し，また市販の加熱加工したソーニーの形状に応じて分離培養し，顕微鏡観察を行セージ（95 g ×３袋）を市販のフードプロセッ

い，芽胞形成の有無を調べた。さらに「好気性芽サーで 20 〜 30 秒すりつぶした。これら粉砕した胞形成菌の図鑑」4）などを参考にしながら微生物黒コショウ試料４ g とソーセージ試料 17 g をサ種の同定を試み，BBL クリスタル GP（産業用）ンプル瓶に入れ，良く混合させて 30℃で培養した。 同定検査キット（BD 社製）を用いて可能な限り経日的に一瓶ずつ回収し，前述の方法により一般菌種の同定確認を行った。本製品は個々の菌種の生菌数，大腸菌群，真菌類に属する微生物コロニ持つ代謝酵素系の違いを発光性の生化学基質・酵ー数の変化を測定した。

素 基 質 を 用 い て 簡 単 に 検 出 す る こ と に よ り，
表１

BD BBL クリスタル GP（産業用）同定可能菌種一覧＊

殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析

Bacillus 属細菌に代表される好気性グラム陽性細菌を簡易に同定することを目的に開発されたものである。同定の原理は以下のとおりである。
キットに含まれる容器， ベースに細菌の89用してそれぞれ表 1，表 2 に示す。
BBL クリスタル GP（産業用）同定検査キットを用いたグラム陽性菌の同定手順は以下のとおりである。

けんだく液を添加すると，ベースに含まれる発光分離した芽胞形成菌をソイビーンカゼインダイ

基質が細菌の懸濁液により溶解し，微生物の代謝ジェスト寒天平板培地（SCDA）で 37℃，一晩酵素系により利用・化学分解され，微生物種によ（14 〜 17 時間）培養する。コロニーから適量をり異なる発酵，酸化が生じ，指示薬が反応する。

釣菌し，付属の BBL CRYSTAL ANR, GP, RGP,その結果を比色判定することにより微生物種が同N/H 同定ブロス（図 1）にけんだくする。菌濃度定される。本製品で用いられている基質の一覧とをマックファーランド値 0.5 に調整したのち，容同定可能な微生物の一覧をキットの説明書から引器（ベース）（図 2）に注ぎ，複数の基質のつい表２BBL クリスタル GP（産業用）同定検査キットに用いられている生化学基質・酵素基質

90

浦上財団研究報告書

図１Vol.17（2009）

BBL クリスタル GP（産業用）同定検査キッドに 付 属 し て い る BBL CRYSTAL ANR，GP，RGP，N/H 同定ブロスた蓋（リッド）（図 3）をかぶせて，35 〜 37℃で18 〜 24 時間培養する。それぞれの基質に対応する同定指標となる微生物の代謝機能が存在すれば，培養中に反応し，それぞれ特異的な発色を呈する。
培養終了後，これらの発色パターンをオートリーダー（図 4）で読み取り，コンピュータコードブックにより発色パターンに合致する菌種を検索し，菌種を判定する。
2. 4

放 射 線 照 射 を 受 け た 酵 母， 大 腸 菌，

図２

BBL クリスタル GP（産業用）同定検査キットも付属しているベースペースに菌液を添加し（上図），ベースを傾けながら全ウェル（穴）のなかに菌液を満遍なく充填する（下図）。

Bacillus 属細菌芽胞の増殖回復挙動

けんだく液を希釈して所定の濃度に調整し，その放射線殺菌処理を受けた香辛料からの生残微生ままガンマ線照射に供した。Bacillus 属細菌の栄物の増殖回復挙動についてより詳細な知見を得る

養細胞は購入した芽胞の一部を SCDA 液体培地

た め に， 大 腸 菌（Escherichia coli XL1-Blue），で 37℃一晩培養して発芽増殖させ，上と同様にBacillus subtilis 芽胞（栄研株式会社より購入），ガンマ線照射に供した。

Bacillus megaterium 芽胞（レーベン株式会社よガンマ線照射は 2. 1 と同様，大阪府立大学産学り購入）， 出 芽 酵 母（Saccharomyces cerevisiae

官連携機構放射線研究センター内の 60Co ガンマBY4741）をモデル微生物として用い，60Co ガン線照射プールで行った。Bacillus 属栄養細胞に対マ線照射後の殺菌効果をコロニー計数法で調べる

しては０，0.3，0.6，0.9 kGy のガンマ線を照射し，と共に増殖遅延の状態，すなわち微生物細胞の形

その時の線量率は 3.14 kGy/h であった。Bacillus

状，核酸代謝，膜透過性についてフローサイトメ属芽胞，酵母に対しては 15 kGy まで照射し，そトリー法により解析した。の時の線量率は 7.87 kGy/h であった。

大腸菌は LB 液体培地で 37℃で一晩培養，酵照射後の殺菌効果をコロニー計数法で調べると母は YPD 液体培地で 30℃で一晩培養し，遠心分共に増殖遅延の状態，すなわち微生物細胞の形状，離により菌体を回収した後，〜 107 CFU/mL に核酸代謝，膜透過性についてフローサイトメトリなるように生理食塩水にけんだくしてガンマ線照ー法により解析した。フローサイトメトリーには射に供した。Bacillus 属芽胞は購入した芽胞の水Sysmex 社 製 の BACTANA を 用 い た（ 図 5）。

殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析

図３91

BBL クリスタル GP（産業用）同定検査キットも付属している
リッド
リッドをベースに装着して１分間静置。リッドの表面を下に押して固定した後に逆さまにして 35 〜 37℃で 18 〜 24 時間培養する。

BACTANA においてはチアゾールオレンジで染食品衛生検査指針に基づき，未殺菌の黒コショ

色した細胞を水流に流し，１列になった個々の細ウ，パプリカ，セージの汚染菌数を調べたところ，胞にレーザー光（赤色レーザー：，励起波長は一般生菌，酵母・カビ類ともにすべての試料にお633 nm）を照射したときに細胞から発せられるいて 1 g 当り 104 以上であった（表 3 参照）。一方，蛍光（波長は 650 nm）を調べることで細胞数と過熱水蒸気殺菌後の試料の菌数はすべて 100 個未細胞内の性状を知ることができる。ガンマ線照射満であった。大腸菌群に関しては未殺菌のセージ，した上記微生物をそれぞれの微生物の培養条件にパプリカには菌が検出されたが黒コショウには菌より培養し，1 時間ごとに菌数とレーザー光照射が検出されなかった。加熱水蒸気殺菌済みの試料時に染色細胞内の核酸から発せられる蛍光強度をからはすべて菌は検出されなかった。

測定した。蛍光強度は細胞に含まれる核酸量を表

汚染菌数の変化を調べると，放射線量の増加に伴す。
3. 結果及び考察
3. 1

未殺菌の試料に 60Co ガンマ線を照射したのち，香辛料の殺菌効果

い生残率は低下し，10 kGy 照射後には加工食品への添加の基準である 1 g 当り 1000 個未満のレベルに容易に達することが明らかとなった（表 392

浦上財団研究報告書

図４Vol.17（2009）

オートリーダーによる発色パターンの読み取り
オートリーダー（左上，A）により培養後のリッドの発色パターンを読み取る（右上，B）。陽性となった各検査結果（ネガティブコントロールとして使われた 4A を除く）には，検査の位置にある横の列に対応して，4，2，1 の数値が与えられ，陰性の結果にはいずれも０の数値が与えられる。（右上，B）各縦の列の各陽性結果から与えられた数値を次に合計します。こうして 10 桁の数字，プロファイル番号が得られる（下，C）。この番号をコードブックにより菌種を検索する。
表3

黒コショウ，セージ，パプリカの微生物汚染と殺菌効果

試料

微生物群

殺菌法
Control

Co ガンマ線

過熱水蒸気

60

黒コショウ

一般生菌
酵母カビ
大腸菌群

1.6E+06
1.4E+06
ND

4.1E+02
3.3E+02
ND

1.0E+00
NDND

セージ

一般生菌
酵母カビ
大腸菌群

2.3E+04
5.0E+04
7.0E+03

2.0E+01
2.0E+01
ND

6.0E+01
2.0E+01
ND

パプリカ

一般生菌
酵母カビ
大腸菌群

3.9E+05
4.9E+05
9.9E+00

5.0E+01
5.0E+01
ND

6.0E+01
2.0E+01
ND

それぞれの数値は試料 1 g に含まれる汚染菌数を表す。
図５

BACTANA（シスメックス社製）による微生物のフローサイトメトリーの原理た。黒コショウ，パプリカの一般生菌の生残曲線参照）。それぞれの放射線量における生残率の常は直線に近く，これらの D10 値は約 2 kGy であ用対数値をグラフにプロットし，黒コショウ，パった（図 6，図 7）。一方，セージの一般生菌の生プリカ，セージの生残曲線を求めた（図 6，図 7， 残曲線は，低線量域に肩を持つ，よりシグモイド
図 8）。黒コショウ，パプリカ，セージから得ら型に近いパターンを示した（図 8）。これらの D10

れた生残曲線は，すべて一般生菌は酵母・カビ類

値が既報 4）の Bacillus 属細菌芽胞の D10 値と類似に比べてわずかに放射線抵抗性であることを示ししていることから，今回用いた試料の汚染菌には

殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析

図６6093

Co ガンマ線照射黒コショウの汚染菌の生残曲線
図７

Co ガンマ線照射パプリカの汚染菌の生残曲線

60

Bacillus 属の細菌芽胞が多く含まれている可能性が示唆された。実際にこれらの生残菌の顕微鏡観察の結果，大多数の生残菌が芽胞形成菌であることが判明した。一部の菌について「好気性芽胞形成菌の図鑑」4） および BBL クリスタル簡易同定キットにより菌種の同定を行ったところ Bacillus
licheniformis など Bacillus 属の細菌が多く含まれていることが示された（図 9 参照）。
3.2

殺菌処理を受けた微生物の食品中における増殖挙動解析

図８60

Co ガンマ線照射セージの汚染菌の生残曲線

黒コショウが殺菌処理を受けた場合，通常は一定の生残菌が存在し，前項における検討により明図９60
Co ガンマ線照射黒コショウから分離された芽胞形成菌の顕微鏡写真（× 1000）（左図）。BBL クリ
スタル GP（産業用）同定検査キットによる同定結果
右図中のプロファイル番号 2574062443 を専用 PC プログラムを用いてコードブックにおいて検索した結果，Bacillus subtilis と同定された。

94

浦上財団研究報告書

図1060

図1160

Vol.17（2009）

Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済み黒コショウの生残菌のソーセージ中での増殖（標準寒天培地：一般生菌用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，未殺菌試料，ソーセージのみ

Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済み黒コショウの生残菌のソーセージ中での増殖（ポテトデキストロース培地：酵母・カビ類用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，
未殺菌試料，ソーセージのみらかになったように，これらのなかには細胞膜や菌済み黒コショウ，パプリカ，セージ，さらに未代謝機能に損傷を受けた微生物細胞が存在する可殺菌の試料に 60Co ガンマ線 10 kGy を照射した黒能性がある。さらに加熱，放射線処理など異なるコショウ，パプリカ，セージをコーヒーミルで粉殺菌処理において微生物細胞の損傷状態も異なる砕し，フードプロセッサーですりつぶした市販の可能性があり，このような生残菌を含む香辛料をソーセージと混合して 30℃で培養した。図 10 〜

生菌数が少ない殺菌済み加工食品に添加した場合， 図 18 にそれぞれの試料について培養日数と一般それぞれ予測しがたい増殖挙動を示す可能性があ

生菌，酵母・カビ類，大腸菌群の汚染菌数の増加る。これを検証するため市販の未殺菌及び加熱殺の関係をグラフで示す。

殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析

図12

図 1395

Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済み黒コショウの生残菌のソーセージ中での増殖（デソキシコレート培地：大腸菌群用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，未殺菌試料，ソーセージのみ

60

60
Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済みパプリカ生残菌のソーセージ中での増殖（標準寒天培地：一般生菌用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，未殺菌試料，
ソーセージのみ

今回用いた市販のソーセージからは一般生菌，ジには大腸菌群は存在しないことが示された。

酵母・カビ類，大腸菌群は共にまったく検出され未殺菌の香辛料を粉砕してソーセージと混合しなかったが，経日的にサンプリングして菌数を評た試料については，試料調製時においてすでにそ価したところ，培養と共に一般生菌数，酵母・カれぞれの試料に含まれる香辛料の汚染菌群とそのビ類の菌数は急激に増加し，培養２日後には試料菌数を反映した菌数測定結果が得られた。これら

１ g 当り 108CFU 以上に達した。一方，大腸菌群の菌数はソーセージのみの場合と同様，培養日数に関しては培養 3 日後も菌が検出されず，フードの増加に伴って急激に増加し，培養 3 日後には培プロセッサーによる試料調製時においてソーセー養開始時の 105 倍程度までの菌数に達した。

96

浦上財団研究報告書

Vol.17（2009）

図 1460Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済みパプリカ生残菌のソーセージ中での増殖（ポテトデキストロース培地：酵母・カビ用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，未殺菌試料，ソーセージのみ

図 1560Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済みパプリカ生残菌のソーセージ中での増殖（デソキシコレート培地：大腸菌群用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，未殺菌試料，ソーセージのみ

過熱水蒸気殺菌済み香辛料を含む試料と放射線増殖は培養開始直後から他の香辛料と同様に急速殺菌済み香辛料を含む試料の菌数増加の経日変化に進むのに対し，過熱水蒸気殺菌済みパプリカをを比較すると，黒コショウ，セージの場合，一般含む試料の場合は培養開始後１日後までは生残菌

生菌，酵母・カビ類の菌数増加のパターンには顕の増殖は抑えられ，その後は急速に菌数が増加し，

著 な 差 は な く， 両 者 と も 3 日 後 に は 1 g 当 り

３日後には両者ともほぼ同レベルまで菌数が増加

108CFU 以上のレベルに達した（図 10，図 11，することが明らかになった（図 13，図 14）。大腸

図 16，図 17）。しかしながらパプリカの場合は，菌群については，試料調製時に生残菌が検出され放射線滅菌済みパプリカを含む試料中の生残菌のなかった黒コショウ，パプリカについては過熱水

殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析

図 16

図 17

9760
Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済みセージ生残菌のソーセージ中での増殖（標準寒天培地：一般生菌用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，未殺菌試料，ソーセージのみ

60
Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済みセージ生残菌のソーセージ中での増殖（ポテトデキストロース培地：酵母・カビ用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，未殺菌試料，ソーセージのみ蒸気殺菌，放射線殺菌ともに培養 3 日後も汚染菌られた（図 18）。さらに興味深いことにはパプリは検出されず，それぞれの殺菌処理により完全にカの一般生菌，酵母・カビと同様，過熱水蒸気殺不活化されていることが示された（図 12，図 15）。 菌済み試料の生残菌数の増加は放射線滅菌済み試
一方，未殺菌試料の汚染菌数が 1 g 当り 103CPU

料の生残菌数の増加に比べて緩やかである傾向が以上であったセージについては殺菌後及びソーセ見られた。

ージとの混合試料作成時には生残菌が検出されな以上の結果から過熱水蒸気殺菌，放射線殺菌いかったのに関わらず，培養日数の増加に従って過ずれの処理を受けた黒コショウ，パプリカ，セー

熱水蒸気殺菌，放射線殺菌ともに菌数の増加が見

ジの生残菌はソーセージ中で未処理の菌の増殖レ

98

浦上財団研究報告書

図 18Vol.17（2009）60
Co ガンマ線 10kGy 照射及び過熱水蒸気殺菌済みセージ生残菌のソーセージ中での増殖（デソキシコレート培地：大腸菌群用）
10kGy 照射試料，
過熱水蒸気照射試料，未殺菌試料，ソーセージのみベルを超える増殖は示さないことが確認されたが，パプリカに関しては両者の増殖パターンに若干の違いが生じる可能性が示唆された。過熱水蒸気殺菌と放射線殺菌が菌体に及ぼす損傷は互いに異なる可能性が高く，過熱水蒸気殺菌による損傷に限り，ソーセージ内における回復がパプリカに含まれる何らかの成分により阻害され，これがソーセージ中の菌数増加の遅延につながった可能性がある。このように殺菌済みの香辛料の汚染菌が損傷菌として，ソーセージ中での増殖挙動に変化が見られていたとしても，今回行った実験では，試料から抽出した微生物の増殖に栄養培地を用いてい

図 19

過熱水蒸気殺菌及び放射線殺菌後の黒コショウを含むソーセージ試料からの生残菌のコロニー（標準寒天培地）
上から１段目：10kGy 照射試料，２段目：未殺菌試料，３段目：過熱水蒸気照射試料，４段目：ソーセージのみ
各列の左から１列目は試料調製直後，２列目は培養１日後，３列目は培養３日後，４列目は培養４日後，５列目は培養５日後るために，ストマッカーによる抽出後，培地中で培養している間に損傷が回復してしまう可能性が培養条件，香辛料の種類を変えてさらに検討して高い。したがって，香辛料の殺菌処理による細胞いきたい。

損傷による生残菌の増殖パターンの変化を詳細に

3. 3

過熱水蒸気殺菌及び放射線殺菌後の香辛検討するためには熱測定法などの非破壊的な計測料からの生残微生物の分離及び同定

法 5） も併せて検討する必要があろう。実際，加過熱水蒸気殺菌及び放射線殺菌後の香辛料の菌

熱水蒸気殺菌済み香辛料を含む試料と放射線殺菌数測定において各平板培地上に現れた生残菌のコ済み香辛料を含む試料について 30℃培養下で熱ロニーの形状には大きな差は見られなかった（図測定を行ったが，両者の熱発生のパターンに大き19）。これらのコロニーを適宜分離培養し，顕微な変化は認められなかった。これについては今後， 鏡観察を行ったところ，観察したすべての菌種が殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析

図 20

放射線殺菌済み黒コショウを含むソーセージ試料（２日培養後）から分離された Bacillus
subtilis の顕微鏡写真（× 1000）（ 左図）。BBL クリスタル GP（産業用）同定検査キットによる同定結果
右図中のプロファイル番号 2734463651 を専用 PC プログラムを用いてコードブックにおいて検索した結果，Bacillus subtilis と同定された。

図 21

過熱水蒸気殺菌済み黒コショウを含むソーセージ試料（３日培養後）から分離された Bacillus
licheniformis の顕微鏡写真（× 1000）（左図）。BBL クリスタル GP（産業用）同定検査キットによる同定結果
右図中のプロファイル番号 2774463543 を専用 PC プログラムを用いてコードブックにおいて検索した結果，Bacillus licheniformis と同定された。

99

芽胞形成菌であった。殺菌法の違いによる差は見殺菌との特性の差の有無に関してさらに多くの知られなかった。さらに「好気性芽胞形成菌の図見が得られるものと期待される。

鑑」1） と BBL クリスタル GP（産業用）同定検3. 4

放 射 線 照 射 を 受 け た 酵 母， 大 腸 菌，査キット（BD 社製）を用いて菌種の同定確認を

Bacillus 属細菌芽胞の増殖回復挙動行ったところ Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis

S. cerevisiae, E. coli, B. subtilis 芽胞，B. megateriumが分離された（図 20，図 21）。このことは，過熱芽胞に 60Co ガンマ線を照射したのち，コロニー水蒸気殺菌，放射線殺菌後の生残菌は抵抗性の高カウント法によって得られた生残率を比較すると，い細菌芽胞が多くを占めていることを示している。 既存の分献に示されているように B. subtilis 芽胞
香辛料の汚染菌種の分布は産地や収穫時期の違い（D10 値：2 kGy），B. megaterium 芽胞（D10 値：により変動するため，試料の由来の違いにより含3 kGy）が最も放射線抵抗性であり，E. coli（D10まれる微生物種の放射線抵抗性や熱抵抗性が変動

値：0.1 kGy）が最も放射線感受性であった。興する可能性が高く，上記の結果の再現性が確認で味深いことに S. cerevisiae（D10 値：0.8 kGy）はきるとは限らない。今後これらの検討をさらに深E. coli や Bacillus 属の栄養細胞よりもはるかに放めることにより，放射線殺菌と既存の過熱水蒸気射線抵抗性であった。そこで B. subtilis 芽胞，B.

100

浦上財団研究報告書

図 22Vol.17（2009）

S. cerevisiae における 60Co ガンマ線照射後の培養経過時間とスキャッタグラム，ヒストグラムの変化
図中のそれぞれの線量において上部にスキャッタグラム，下部にヒストグラムを示す。スキャッタグラムの横軸は蛍光強度，縦軸は散乱光強度を示す。ヒストグラムの横軸は蛍光強度，縦軸は細胞数を示す。

図 23 S. cerevisiae における c 線照射後培養時の菌数変化と蛍光強度（FL）平均値変化
上．蛍光強度（FL）平均値変化，下．菌数変化

図 24 E. coli における c 線照射後培養時の菌数変化と蛍光強度（FL）平均値変化
上．蛍光強度（FL）平均値変化，下．菌数変化

megaterium 芽胞を香辛料に含まれる一般生菌のE. coli を大腸菌群のモデルとみなし，それぞれのモデル，S. cerevisiae を酵母・カビ類のモデル，微生物種の照射後の増殖について BACTANA に

殺菌香辛料に残存する微生物の食品中における増殖動態の解析

図 25 B. subtilis 芽胞子における c 線照射後培養時の菌数変化と蛍光強度（FL）平均値変化
上．蛍光強度（FL）平均値変化，下．菌数変化

よるフローサイトメトリーにより検討した。
その結果，微生物の種類によらず増殖開始の直図 264.

101

B. megaterium 芽胞における c 線照射後培養時の菌数変化と蛍光強度（FL）平均値変化
上．蛍光強度（FL）平均値変化，下．菌数変化

まとめ前に核酸量が著しく増加し，染色体 DNA の複製本研究においては，香辛料の殺菌法としてわがが生じていることが示唆された。図 22 に酵母の国で広く用いられている過熱水蒸気殺菌と世界的フローサイトメトリーから得られてスキャッタグに利用が拡大している放射線殺菌に着目し , 殺菌ラム，ヒストグラムの一例を示す。この結果は，された黒コショウ，パプリカ，セージをソーセー

黒コショウ，パプリカ，セージを含むソーセージジ添加した場合の微生物の増殖の実態について殺試料の培養に伴う生残菌の増加パターンが一般生菌処理の違いが増殖に及ぼす影響について検討し菌，酵母・カビ類ともに類似のパターンを示してた。その結果，10 kGy の 60Co ガンマ線照射で十いることとも矛盾しない。

分加工食品に使用可能なレベル（1000 個 /g 未これらのデータから照射後の微生物数の増加と満）まで殺菌できることを確認すると同時に生菌微生物細胞内の核酸量との関係を調べると，未照数が少ないソーセージ中で 30℃で培養した場合，射時に比べ増殖開始の遅れが見られ，同時に核酸３日間で放射線照射後，加熱後の生残菌が未殺菌量増加開始の遅れ，増殖加速度の減少が見られたの生残菌とほぼ同レベルまで増殖することが明ら（ 図 23， 図 24， 図 25， 図 26）。このことからかとなった。ただしパプリカの場合は過熱水蒸気

DNA 損傷によって分裂遅延（細胞周期の進行の殺菌後の生残菌は放射線殺菌後の生残菌に比べ培停止・減速）が生じ，この間に DNA 修復が行わ養初期での増殖が抑制される可能性が示唆された。

れている可能性が示唆された。

この原因としては殺菌法の違いによる菌の損傷状態の差，さらに香辛料に含まれる抗菌成分の関与などが考えられるが，熱測定法による非破壊的計

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浦上財団研究報告書

Vol.17（2009）

測法など新たな実験手法も含めたさらなる検討が全な衛生管理技術の開発に資するものと期待され必要であり，今後の課題としたい .

る。

B. subtilis 芽胞，B. megaterium 芽胞を香辛料に
含 ま れ る 一 般 生 菌 の モ デ ル，S. cerevisiae を 酵

謝母・カビ類のモデル，E. coli を大腸菌群のモデル

本研究を遂行するにあたり，多大な研究助成金とみなし，それぞれの微生物種の照射後の増殖にを賜りました浦上食品・食文化振興財団に心よりついてフローサイトメトリーにより検討した。そ

感謝の意を表しますと共に貴財団の益々のご発展の結果，微生物の種類によらず増殖開始の直前にを祈念申し上げます。

辞

核酸量が著しく増加し，染色体 DNA の複製が生じていることが示唆された。

文

献

これらの検討をさらに進めることにより，微生

１） 古田雅一，橋際正行，香辛料の放射線殺菌をめぐる現況

物細胞の不活化と回復に対する放射線殺菌の持つと今後，ジャパンフードサイエンス，46（9）54-59（2007）．

特性が過熱水蒸気殺菌をはじめとする既存の殺菌

２） 独立行政法人日本原子力研究開発機構「現在取り組むべき食品照射対象に関する調査」報告書 pp.31-32（2006）．

法との対比のなかで明らかになり，これらの基礎

３） Waje, C. K., Kim, Gui-Ran, Jeon, Eun-Ju, Ahn, Jae-Jun

的知見が食品の放射線照射の安全性に対する正しkim, Dong-Gil, Park, Ju-Hwan, Kim, Kyoun-Moon, Kim,

い認識を養うために寄与するものと期待される。
さらに殺菌ストレスを受けた食品添加物と包装材料の汚染微生物の損傷と回復機構に関する基礎的知見が蓄積され，特にこれらの菌が殺菌済み加工食品に混入した場合，どのような食品内の栄養条件が損傷菌の回復に効くのかが明らかになる可能性がある。この条件に基づき，無菌充填包装など殺滅菌を伴う食品加工において，より高品質で安Hyun-Ku, Furuta, M., Kwon, Joong-Ho, Effect of steaming
and irradiation on the quality of dried red pepper（Capsicum annuum L.）, Food Chemistry in press.
４）「好気性芽胞形成菌の図鑑」社団法人日本アイソトープ協会 甲賀研究所５） 古田 雅一，微生物の簡易迅速検出法ならびに同定法の現状と進歩［11］，ミクロカロリーメトリー，防菌防黴 34（７），417-426（2006）．

Analysis of growth behavior of survived microorganisms from decontaminated spices within foods

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Analysis of growth behavior of survived microorganisms fromdecontaminated spices within foods
Masakazu Furuta（Graduate School of Science, Osaka Prefecture University）

The purpose of this study is to investigate the condition of microbial growth recovery
from the damage of killing stresses such as heating and 60Co-gamma irradiation especiallywithin the processed meat products. Black pepper powder treated by each process in whichless than 1000 microbial loads was enumerated by aerobic plate counts was mixed withminced sausage and incubated at 30℃ for several days. Outgrowth of microorganism wasmonitored according to the procedure described by Japanese Food Hygiene Law.
Sausage samples containing the treated black pepper powder showed the similar
microbial growth from less than 1000 CFU/g of the sample to approximately the order of
109 CPU/g of the sample during the incubation at 30℃ , irrespective of gamma-irradiation or
superheated-steam treatment. There were no significant differences between gammairradiation and superheated-steam treatment in outgrowth of the surviving microorganisms
when the treated black pepper or sage was mixed and pulverized with sausage. In casepaprika, growth delay of the super-steamed survivors was observed within 1 day after
incubation. We employed flow cytometry to monitor cell activities including nucleic acidmetabolisms and growth for Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis, andBacillus megaterium after the irradiation stress. These assay revealed that the irradiationstress caused the delay of the time point of growth recovery accompanied with nucleic acidsynthesis according to increasing doses irrespective of the microbial species.