SARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2

SARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2 不活化試験
本製品は体外診断用医薬品ではありません。

方法
[装置]
[試薬]

アプライドバイオシステムズ 7500Fast DX (医療機器届出番号：13B1X10227000001 Thermo Fisher Scientific)
SARS-CoV-2 不活化試薬 Ver.2 (シスメックス)
QuantiTect Probe RT-PCR Kit (QIAGEN)：予備検討で使用
MGIEasy Nucleic Acid Extraction Kit（シスメックス）：予備検討で使用

[材料]

培養細胞株
神奈川県衛生研究所で分離された「SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-020（GenBank: LC528232）」[不活化効果に関する検討 感染価の測定（試験法）]
検体を本品により保存した場合のウイルス (SARS-CoV-2) 不活化能を評価した。

ウイルス液 (107 TCID50/mL※1) 100μLとSARS-CoV-2 不活化試薬 Ver.2またはPBS (対照) 100μLを混合し、室温で10分間6静置した後、反応させた各溶液を103倍から10 倍まで段階希釈したもの 100μLを、等量の細胞を分注した6ウェルずつに接種して1週間培養し、細胞変性が認められたウェル数からウイルス感染価 (TCID50/mL) を評価した。計算にはBehrens-Karber法を用いた。
※1 TCID：Tissue Culture Infectious Dose細胞にウイルスを接種することによって、その50 %でCPE(細胞変性効果;ウイルス感染によって形状が変化した細胞)が観察されるウイルス量である。Behrens-Karber法では、1ウェル中のTCID 50は以下の式で求められる。
Σ-0.5

TCID50 = （最も低い希釈倍率）×（段階希釈した倍率）
Σ = （各希釈段階における細胞変性が認められたウェル数）／（検体数）の総和
図の例では、Σ = 4/4+4/4+3/4+3/4+2/4+1/4+0/4+0/4+0/4=4.250TCID50 = 10 ×104.25-0.5

このとき接種したウイルス液量が50μLであれば、このウイルス液の感染価はTCID50/mL = 103.75 / 0.05 = 2 × 104.75となる。

希釈倍率＜TCID50法 例＞

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JSTL22003B

結果
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10 倍～10 倍希釈した反応液を接種したウェルのうち、細胞変性が認められた数は下表のとおりであった。
この結果をもとにBehrens-Karber法を用いてウイルス感染価 (TCID 50/mL) を求めたところグラフのとおりとなった。
反応液を細胞に接種し室温で10分間静置した試料では、対照（PBS）では感染価が維持されていたのに対し、本品では検出されずSARS-CoV-2 が不活化されていることを確認した。

残存ウイルス感染価（TCID50/mL)

細胞変性が認められたウェル数

SARS-CoV-2 に対する不活化能
106105104103102101100※2 上記TCID50/mLは、すべてのウェルにおいて細胞変性が認められない場合も、計算式により値が算出される。本品も同様であったため、N.D.（NoN.D.※2本品Detection）とした。

PBS
（対照）

■参考データ[予備検討：試験に用いたウイルスRNA濃度に関する検討]試験に用いたウイルスRNA濃度は、過去に実施した以下の検討結果に基づき決定した。
（方法）

不活化試験に使用した107 TCID50 /mLのSARS-CoV-2溶液より、MGIEasy Nucleic Acid Extraction Kitを用いてウイルスRNAを抽出し、アプライドバイオシステムズ 7500Fast DXを用いて国立感染症研究所の病原体検出マニュアル2019-nCoV Ver.2.9.1に準拠して測定した。得られたウイルスRNA濃度を、過去に測定された臨床検体と比較した。

（結果）

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不活化試験に使用した10 TCID50/mLのSARS-CoV-2 溶液より、8.6 × 10 copies/mL（Ct値では13.6相当）のウイルスRNAを検出した。これは社内検討で評価した臨床検体における最も高濃度の検体と同等の数値であり、ほとんどの臨床検体は不活化されることが示された。
不活化試験に使用したウイルスのRNA濃度
8.6 × 109 copies/mL(9.9 log10 copies/mL)[2/2]
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JSTL22003BSARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2

SARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2によるRNA安定性試験
本製品は体外診断⽤医薬品ではありません。

⽅法

SARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2を反応させた各検体を4℃および25℃で7⽇間保存した場合、さらに-80℃で凍結融解を繰り返した場合の、ウイルスRNAの安定性を評価した。
[装置]
[試薬]

アプライドバイオシステムズ 7500Fast (Thermo Fisher Scientific)
SARS-CoV-2 不活化試薬 Ver.2 (シスメックス)
QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)
QuantiTect Probe RT-PCR Kit (QIAGEN)

[検体]
[材料]

⿐咽頭ぬぐい液︓陰性購⼊検体、⿐腔ぬぐい液および唾液︓健常⼈より⼊⼿
SARS-CoV-2 コントロールウイルス︓AccuPlex SARS-CoV-2 Verification Panel - Full Genome (Seracare)[⿐咽頭ぬぐい液試料調製]
陰性購⼊検体をSARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2によく懸濁したものに対し、SARS-CoV-2 コントロールウイルスを35.0×10 copies/mLとなるように添加した。

[⿐腔ぬぐい液試料調製]
滅菌綿棒にて健常⼈の⿐腔内を⼗分にぬぐい、綿棒をSARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2に⼊れてよく懸濁したものに対し、

SARS-CoV-2 コントロールウイルスを5.0×10 3 copies/mLとなるように添加した。
[唾液試料調製]

SARS-CoV-2 コントロールウイルスを濃度が1.5×10 4 copies/mLとなるように添加した唾液に、SARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2を3※2倍量添加して希釈したもの（3倍希釈 5.0×10 copies/mL） を試料とした。
※本品の使⽤⽅法（3mLの試薬に対して唾液を1〜1.5mL添加）に基づき、最⼤量添加した場合を想定して3倍希釈で調製した。

[試験法]
１．4℃および25℃におけるRNA保存安定性
各試料を4℃（冷蔵）および25℃（室温）にて0、2、4、7⽇間保存した後、各試料からQIAamp Viral RNA Mini Kitを⽤いてRNAを抽出し(n=3)、アプライドバイオシステムズ 7500Fastを⽤いてQuantiTect Probe RT-PCR Kitで測定し (2重測定) 、SARS-CoV-2のCt値の変化を確認した。
２．-80℃での凍結融解におけるRNA安定性
唾液試料をー80℃で保存し、室温で融解した。この作業を1、3、5回繰り返した後、各試料からQIAamp Viral RNA Mini Kitを⽤いてRNAを抽出し (n=3)、アプライドバイオシステムズ 7500Fastを⽤いてQuantiTect Probe RT-PCR Kitで測定し (2重測定)、
SARS-CoV-2のCt値の変化を確認した。なお凍結融解0回として凍結前の唾液試料を同様の⽅法で測定し、Ct値を取得した。

Sysmex Corporation Scientific Affairs[1/2]
JSTL22004A

結果
１．4℃および25℃におけるRNA保存安定性
⿐咽頭ぬぐい液、⿐腔ぬぐい液、唾液の各試料を、SARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2を⽤いて4℃および25℃で7⽇⽬まで保管した
場合、各試料におけるSARS-CoV-2のCt値について、0⽇⽬と⽐較したt検定による有意差は認められなかった（p>0.05）。

２．-80℃での凍結融解におけるRNA安定性
唾液試料をSARS-CoV-2不活化試薬 Ver.2を⽤いてー80℃にて1、3、5回凍結融解した場合、SARS-CoV-2のCt値について、凍結前と⽐較したt検定による有意差は認められなかった（p>0.05）。

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Sysmex Corporation Scientific Affairs

JSTL22004A