〔生化学 第８４巻 第１０号，pp.８
２
９―８
３
９，２
０
１
２〕

総

説

熱ショックタンパク質と交差抗原提示機構
鵜 殿

平一郎

これまでの熱ショックタンパク質（HSP）研究の主流は生化学的手法によるものあるいは特定の細胞株を用いた実験系が大多数であったが，遺伝子改変マウスの作製が進むにつれその意義が生体レベルでも明らかにされるようになってきた．HSP は細胞をストレスから防御する，ということがその第一義的な役割だが，免疫系においてはがん抗原やウイ
ルス抗原の抗原プロセシングひいては主要組織適合抗原（MHC）による抗原提示に重要な役割をもつことが示唆されている． 凝集性を帯び始めたタンパク質は HSP に認識され，
抗原プロセシングの過程に組み込まれる．Hsp９０αKO マウス作製とそれを用いた研究により，これまでの「HSP と免疫研究」に確信と前進がもたらされた．遺伝子改変マウスを用いた実験結果と生化学的解析さらには分子イメージングから得られる HSP の免疫系，特に交差抗原提示機構における役割について最新の知見を論述・考察したい．

１． は

じ

め

に

ウイルス抗原，がん抗原，自己抗原を含む全てのタンパ

れた状態になり，次の二つの分解経路に進んでいく．まずエンドソームはカテプシンなどのタンパク質分解酵素を含むリソソームと融合する．これにより抗原は酵素に触れ切

ク質はリボソームで合成されるが，そのうち３％ 近くのタ

断・分解される．できたペプチド断片は MHC クラス II 分

ンパク質は何らかの理由で正常な立体構造がとれない．こ子と結合し続いて細胞膜表面へ移行して CD４＋ T 細胞に提の異常タンパク質は凝集性なので放っておくと細胞死を招示される．これが外来性抗原提示である．この経路では外くため，すぐさまユビキチン化されてプロテアソームで分から取り入れた抗原は細胞質から完全に隔離されている．

解される．分解されてできたペプチドのほとんどはアミノ

他方，エンドソームがリソソームと融合する前に一部の抗酸としてリサイクルされるが，数パーセントが小胞体に入

原は細胞質へ漏出する．この抗原は内在性抗原と同様の運り MHC ク ラ ス I 分 子 と 結 合 し，抗 原 ペ プ チ ド と し て命をたどり，最終的に MHC クラス I 分子により抗原提示CD８＋ T 細胞に提示される１）．これを内在性抗原提示と呼される．これが交差抗原提示，すなわちクロスプレゼン

ぶ．つまり不良品タンパク質の分解・除去過程でできた副テーションと呼ばれる２，３）．

産物が抗原ペプチドとして免疫系を活性化することにな

交差抗原提示はいわゆる抗原提示細胞の中でも樹状細胞る．一方，抗原が抗原提示細胞の外側に存在する場合（こに特徴的な機能であり，次の項目で述べるように免疫学的れを外来性抗原という），貪食という方法で細胞内に取りに非常に重要な意味をもつ．クロスプレゼンテーション機

込まれエンドソームないしファゴソームの中に閉じ込めら構を用いて，in vivo において T 細胞を感作することをク
ロスプライミングといい，その現象自体が報告されたのは岡山大学大学院医歯薬学総合研究科病態科学専攻腫瘍制
御学講座免疫学分野（〒７００―８５５８ 岡山市北区鹿田町二丁目５番１号）
Heat shock protein and antigen cross-presentation
Heiichiro Udono （Department of Immunology, Okayama
University Graduate School of Medicine, Dentistry andPharmaceutical Sciences, ２―５―１ Shikata-cho, Kita-ku,
Okayama７０
０―８
５５８, Japan）

１
９
７０年代に遡る４）．１
９
８
０年代後半には MHC とそこにめり込むように結合した抗原ペプチドの結晶構造が明らかにされ，T 細胞の抗原認識における MHC 拘束性の意味が構造学的に理解されるようになった５，６）．１
９
９
０年代に入り内在性，外来性の抗原提示機構の分子機構が解明されるにつれ，交差抗原提示機構の異様さがますます注目されるようになり，免疫学における最後のミステリーの一つとまで言８３０〔生化学 第８４巻 第１０号

われるようになった．それはエンドソームの中に入った抗原がどのようにして内在性抗原提示経路に入るのか，換言すれば抗原の細胞質へ漏れ出るメカニズムは何かということであり，いまだ十分に解明されないまま今日に至っている．筆者らはこの分子機構に熱ショックタンパク質，それも HSP９０が大きな役割を担っていることを明らかにした．
２． T 細胞プライミングには樹状細胞が必須である
２―１ がん細胞は直接 T 細胞を感作できない
がん細胞は MHC クラス I 分子によりがん抗原ペプチドを提示している．細胞傷害性 T 細胞（感作 CD８＋ T 細胞）
はこれを認識しがん細胞を破壊する．ではナイーブ CD８＋
T 細胞がこれを認識した場合は活性化され，成熟した細胞
傷害性 T 細胞に分化するのであろうか．答えは NO である．この問題はほんの数年前まで論争の種であったが，今では樹状細胞，それも CD８＋樹状細胞がなければ外来性抗原によるナイーブ CD８＋ T 細胞の感作は不可能とされている７）．転写因子 Batf３ 欠損マウスではこの CD８＋樹状細胞が欠損しており，このノックアウト（KO）マウスでは極めて免疫源性の高い腫瘍（正常同系マウスに移植して一旦生着した後に自然退縮する）でも拒絶ができなくなってしまう８）．in vitro での解析の結果，脾臓細胞による抗原のCD４＋ T 細胞への抗原提示は正常だが，CD８＋ T 細胞への抗原提示は消失した．すなわち，外来性抗原の MHC クラ
ス II による抗原提示は正常だが，MHC クラス I による交図１ 交差抗原提示には樹状細胞が必須である．
がん細胞ではがん抗原ペプチドが，またウイルス感染細胞ではウイルス抗原ペプチドが細胞膜表面の MHCI 分子により抗原提示されている．これは内在性抗原のプロセシング機構による．
この抗原ペプチドをナイーブ CD８＋ T 細胞は認識することができるが，その場合はアポトーシスや不応答性 T 細胞に陥り，決して成熟した細胞傷害性 T 細胞には分化できない．一方，がん細胞やウイルス感染細胞が何らかの原因で壊死やアポトーシスに陥った場合，細胞内部に存在する抗原タンパク質が遊離してくる．これを樹状細胞はエンドソーム内に取り込み，さらに抗原の一部は細胞質へ移行する．細胞質に出てきた抗原は内在性
抗原そのものであり，内在性抗原のプロセシング機構により
MHCI 分子により抗原提示される．この場合はナイーブ CD８＋
T 細胞は細胞傷害性 T 細胞に分化する．これは樹状細胞のもつ様々な細胞膜分子により MHC 以外からの副刺激がナイーブ
CD８＋ T 細胞へ入るためである．

差抗原提示機能が消失したことになる８）．この事実は CD
８＋樹状細胞が交差抗原提示に必須であることを示していのエンドソームの pH は高いままであり，CD８−樹状細胞

る．免疫源性の非常に高い腫瘍であっても，それ自体がナのそれは急速に低下していく．これは NOX２（NADPH oxi-＋

イーブ CD８ T 細胞を活性化できるわけではなく，CD８

dase complex）または Rac２欠損細胞で確認された９，１０）．つ樹状細胞の関与が必要ということになる．がん細胞はアポ

まり CD８＋樹状細胞では低分子量 GTPase であ る Rac２はトーシスにより断片化される．また壊死により細胞内タン

NOX２のファゴソーム（エンドソーム）への会合に関与しパク質が外へ湧出する．これらはタンパク質としてのがんており，これが pH の低下防止に一役かっている．一方

抗原を含んでおり，CD８ 樹状細胞に貪食されてエンド

CD８−樹状細胞では Rac１が NOX２の，ファゴソームではソームに入り，細胞質に漏出しプロテアソームで分解されなく細胞膜への会合に関与する．Rac２欠損細胞では NOXてペプチドになり，MHC クラス I 分子へ渡される．この２のファゴソームへの会合がうまくいかないため，ファゴ

過程はすなわち交差抗原提示そのものである．ウイルス感

ソーム中の活性酸素の産生が低下し，また pH も低下す

染細胞の場合も同様のプロセスを経て交差抗原提示に与るる．これにより抗原の分解が促進され，細胞質への漏出の（図１）．

可能性が低くなる．マクロファージの交差抗原提示効率が＋＋低い理由も CD８−樹状細胞のそれと同様である．pH が高２―２ なぜ CD８＋樹状細胞なのか？

い状態に維持されると抗原はリソソーム酵素による分解か

同じ樹状細胞でもなぜ CD８＋樹状細胞は交差抗原提示でら逃れやすくなり，その反面エンドソームから細胞質へ移

両者の貪食効率は

行する確率が高くなる．このような現象を見るにつけ，交同じである．それには初期エンドソームから後期エンド

差抗原提示の本質は抗原の細胞質移行そのものであるといソームさらにはリソソームとの融合までの成熟過程（これうことがより鮮明に理解される．ではその分子機構は一体

は空胞内の pH の低下でモニターできる）が CD８＋樹状細どうなっているのだろうか．

き，CD８ 樹状細胞はできないのか？
−

胞では CD８ 樹状細胞に比較して緩やかなことが関係して−いると考えられている．抗原を取り込んだ CD８＋樹状細胞

８
３
１

２
０
１
２年 １
０月〕

３． 交差抗原提示は HSP９０阻害剤によって完全に抑制されるでも抗原の細胞質移行について研究する方法は存在する．
仮にトランスロコンのような小さな孔から抗原が細胞質へ移行するのであれば，抗原はヒモ状に近い状態になる必要

抗原がエンドソームから細胞質へ移行する際に真っ先にがある．そのままの構造で通過するには小孔は小さすぎる問題になるのは，その通る孔は何かということである．エためである．この仮説を検証するために，筆者らは抗原をンドソームは本来細胞膜に由来するものであり，通常ではパラホルムアルデヒドで固定し in vitro における交差抗原

いかなる孔も存在しないし，簡単に破れて孔が開くような提示実験を行った．その結果，固定したタンパク質抗原でものでもない．免疫学者は大いに悩んだが，共焦点顕微鏡

は抗原提示能が著しく低下し，また細胞質移行が妨げられを巧みに使用した実験においてエンドソーム膜と小胞体膜ていることがわかった（未発表）．すなわち，抗原の小孔が一部交錯する部分が散見され，このことから双方のオル通過時には構造が変化している可能性が高いのである．そガネラは融合し一体となることが考えられた．本来小のようなタンパク質を好んで捕捉するのは HSP の得意技

胞体膜に存在するはずの transporter associated with antigen

である．そこで，特異的阻害剤として認められている複数

processing（TAP）分子がエンドソーム膜にも存在するよの HSP９０阻害剤で樹状細胞を予め処理した後に実験をうに見えるのである．de novo 合成されたタンパク質は翻行った．その結果，濃度依存性にほぼ完全に交差抗原提示

訳と同時に Sec６
１トランスロコン（小胞体膜に存在する分が抑制されることがわかった．用いた阻害剤はゲルダナマ

１
１〜１
５）

子で小孔を形成する）より小胞体の中へ入るが，小胞体内

イシン，ラディシコール，１
７AAG とノボビオシン で あ

腔で凝集性タンパク質に陥った場合にはタンパク質品質管る１７）．前３者は HSP９０の N 末端にある ATP 結合部位を占理機構としてやはり Sec６
１トランスロコンから細胞質側へ拠しシャペロンサイクルを止めてしまう（図２）．一方，逆輸送され，ポリユビキチン化された後にプロテアソーム

ノボビオシンは HSP９０の C 末端に結合しホモ二量体形成

で分解される．この逆輸送に使用されるトランスロコンがを阻害する１８）． これにより HSP９０は仕事ができなくなる．

エンドソーム内抗原の細胞質への漏出にも使用されるとい

次に，樹状細胞による内在性抗原提示にこれらの阻害剤がうのである．しかしながら，この知見が正しいのか否かに及ぼす影響を検討した．その結果，若干の抗原提示抑制はついてはいまだ決着がついておらず，むしろ小胞体ひいてあるものの交差抗原提示の抑制に比較すれば無視できる程は Sec６１を介していない可能性の方が高いとも言われてい度であった．さらに，ユビキチン化反応の最初のステップ

る１６）．この孔に関する分子構成の全貌が明らかになるにはを担当するユビキチン活性化酵素 E１の阻害剤では内在性

もう少し時間を要するだろう．

抗原提示，交差抗原提示の両方が完全に抑制される．ま話を展開する上でいきなりつまずいた感があるが，それた，プロテアソーム阻害剤でも双方の完全阻害が観察され

図２ HSP９０の阻害剤は ATP 結合部位を占拠する．
図はラディシコール（radicicol）が HSP９０の ATP 結合部位に結合した場合を表す．ラディシコールは ATP よりも結合力が強いため，クライア
ントタンパク質の捕捉ができない状態にしてしまう．生理的条件下ではHSP９０に結合した ATP は加水分解されて ADP になり，その後にはずれて再度 ATP が結合できる状態になる．

８３２〔生化学 第８４巻 第１０号

た．HSP９０阻害剤は樹状細胞による抗原の取り込みには

HSP９
０αflox／−ERT２Cre ど う し を 交 配 し て HSP９０αflox／floxERT２

影響を与えないので，阻害剤は恐らく抗原のエンドソーム

Cre を樹立した．ここにタモキシフェン投与を行いマウス

から細胞質への移行を抑制していると考えられた．ところ個体からあるいは細胞から HSP９０α 遺伝子のエクソン９，で HSP９０は細胞膜表面にも存在することが最近示唆され１０を除去するという戦略で臨んだ．当初の予定通りにマている１９，２０）．その場合エンドソームの中にも HSP９０が存在

ウスを作製でき，タモキシフェン投与後１週間以内で脳をしうることになり，細胞質 HSP９０と区別しなければなら除く全ての臓器・細胞で HSP９０α 遺伝子が改変され，１ヶない．そのために，細胞膜非透過性のゲルダナマイシン-

月後には HSP９
０α タンパク質の欠損が確認された．驚いた

FITC（フルオレセインイソチオシアネート）を用いて実ことにマウスは元気にしていたので，今度は HSP９０αflox／flox

験を行った．実際，ゲルダナマイシン-FITC は樹状細胞様マウスを CAGCRE マウス（全身に Cre リコンビナーゼを

株 DC２．
４の細胞表面を染色するので，細胞膜表面に HSP発現）と交配し胎生期から HSP９０α のエクソン９，１０を除

９０が 存 在 す る．ゲ ル ダ ナ マ イ シ ン-FITC は 細 胞 膜 表 面

去することを試みた．その結果マウスは正常に生まれて成HSP９０の機能を抑制するが細胞質 HSP９０は抑制しない．

長速度も全く問題がなかった．唯一，精巣のサイズが小さ

この状況下では交差抗原提示は全く抑制されなかった ．

く精子形成に異常が認められたくらいである．このいわゆ

２１）

つまり HSP９０阻害剤による交差抗原提示の抑制は細胞質

る HSP９０α-null マウスが作製できたことに伴い（図３），HSP９０の機能が抑制されたことが原因ということになる．

実験速度を飛躍的に早めることができた．HSP９
０α＋／−どう４． HSP９
０α コンデイショナル KO マウスの作成
上述のように，交差抗原提示は HSP９０阻害剤により抑制された．これは HSP９０α と HSP９０β のどちらの機能阻害によるのであろうか．これを明らかにするために低分子ヘしを交配し１／４の確率で HSP９０α−／−マウスを獲得できるよ
うになったためである．
５． HSP９０α-null（HSP９０αKO）マウスの交差抗原提示能低下

アピン型 RNA（shRNA）を用いた実験を行った．その結得られた HSP９０α-null マウスを詳しく調べたところ，N果，HSP９０α に対する shRNA が HSP９０β よりも よ り 強 く

末端を認識する抗体を用いても分子量の小さくなった

交差抗原提 示 を 阻 害 し た１７）．よ っ て 交 差 抗 原 提 示 に は

HSP９０α タンパク質分子をウエスタンブロット上で検出す

HSP９０α の関与が大と考えられた．shRNA を用いた実験がる こ と は で き な か っ た が，エ ク ソ ン９，１
０を 欠 損 し た

成功した大きな要因は筆者らが DC２．
４細胞株を用いたこmRNA は容易に検出された．恐らく C 末端の一部を欠損とであった．通常はマウスの骨髄細胞から顆粒球マクロ

する HSP９０はホモ二量体を形成することができず不安定

ファージコロニー刺激因子（GM-CSF）により樹状細胞をなため，翻訳と同時にタンパク質分解を受けてしまうと考誘導して実験に使用する．しか し，こ の 樹 状 細 胞 で はえられる．この HSP９０αKO マウスにシトクローム c を投shRNA の導入効率が十分でなくしたがってノックダウン

与する実験を行った．ご存知のようにシトクローム c は効率が低い．また，DC２．
４細胞株を用いてもレンチウイ

本来ミトコンドリアに存在するタンパク質分子であるが，ルスベクターによる shRNA 導入効率はかなり低く，結局アポトーシス刺激が入ると細胞質へ放出され，カスパーゼ

AMAXA 社のヌクレオフェクター遺伝子導入装置による３の活性化を促す．このシトクローム c をマウス個体に投プラスミドの導入がベストであった．この辺りが樹状細胞

与すると貪食能をもつ細胞に取り込まれる．その中でを用いた shRNA 導入実験の難しさである．しかしながら，

CD８＋樹状細胞のみがアポトーシスを引き起こし，そのた

たった一つの細胞株で得られた事実がどれほど普遍化されめに脾臓内の CD１
１c＋CD８＋細胞の数が減少する２４）．これはるのかが重要である．そこで，HSP９
０α コンディショナル

CD１
１c＋CD８＋樹状細胞のみが交差抗原提示を行うことがで

KO マウスの作製にとりかかった．HSP９０α 欠損状態は間きることと関係する．つまりこのタイプの樹状細胞に限違いなく胎生致死になると予想し，HSP９
０α のエクソン９，

り，取り込まれたシトクローム c はエンドソームから細１０を loxP 配列で挟むように HSP９０α

胞質へ移行するのである．その結果，細胞死を誘導する．

flox／flox

マウスを作製してこれを ER Cre マウスと交配し，HSP９０α

ER Cre を

ここで「おやっ」と思われる方もいると思う．ヒモ状になっ得た．ERT２Cre マウスとはヒトのエストロゲン受容体（ER）て細胞質へ出て来たタンパク質分子がなぜ活性を有していの一部と Cre リコンビナーゼの融合遺伝子を全身に発現さるのか．そこで説明を補足したい．ルシフェラーゼを用いせたトランスジェニックマウスである２２，２３）．タモキシフェ

た過去の実験がある．樹状細胞により取り込まれたルシンがエストロゲン受容体に結合すると同時に細胞内へ入フェラーゼはエンドソームから細胞質へ移行した直後は変り，続いて核内に入って Cre リコンビナーゼが loxP 配列性タンパク質に近い状態だが，HSP９０β の働きで折りたたを認識して loxP に挟まれた領域が除去されるしくみであみが行われ細胞質の中で再び活性を取り戻すことが証明さる．

れている２５）．シトクローム c も同様の過程で本来の構造を

T２

flox／−

T２

８
３
３

２
０
１
２年 １
０月〕

図３ HSP９０α-null（HSP９０αKO）マウスの作製．
（A）ターゲティングベクターの構築と遺伝改変の模式図を表す．
（B）HSP９０αKO マウスの各臓器におけるタンパク質発現の確認．特異的抗体を用いたウエスタンブロット法による．
（C）骨髄細胞から GM-CSF を用いて作製した樹状細胞における HSP９０α, β の発現の確認．特異的抗体を用いたウエスタンブロット法による．

取り戻し機能性分子として細胞死を誘導すると考えられを認識し感作されていれば IFNγ を産生する．HSP９０αKO

る．つまり HSP９０によって細胞質に出て来たタンパク質

マウスに免疫した群では常に正常（WT）マウスの半分のは，折りたたまれて本来の活性を取り戻すものとそのまま

ス ポ ッ ト 数 し か 検 出 さ れ な か っ た（図４左）．一 方，

プロテアソームによる分解系へと運ばれるものに分かれる

TAP１KO 脾臓細胞ではなく DC２．
４細胞に OVA２５７―２６４ ペプチことになる．

ドをパルスしてマウスに投与しておいた実験群では，WT

さて，シトクローム c 投与実験を HSP９０αKO マウスで及び HSP９０αKO マウスはほぼ同数の IFNγ 産生スポットを行ったところ CD１
１c＋CD８＋樹状細胞の減少は完全にキャン呈した（図４右）．つまり抗原ペプチドによる直接抗原提セルされた２１）．すなわち，シトクローム c の細胞質移行が示能は障害されていないと解釈される．以上の結果は，なされていないことを示唆する．この実験系は貪食抗原のHSP９０αKO マウスにおいて交差抗原提示能が低下してい細胞質移行をモニターするのに最適の実験であるが，これることを示し，その分子機構は取り込んだ抗原（タンパクをもって交差抗原提示が低下しているとは言えない．やは質分子）の細胞質移行が障害されていることと結論づけらり，抗原をマウスに投与しこれを認識する CD８ T 細胞のれる．ただし，HSP９０αKO マウスでは IFNγ 産生スポット

数がどうなるのか，ということが免疫学的には重要になっ数が常に５０％ ほどの低下しか認められないことから，残＋てくる．そこで，卵白アルブミン（OVA）を浸透圧ショッりの５０％ は HSP９０β の働きが細胞質移行に関与している

ク法にて導入した TAP１KO 脾臓細胞（TAP１がないので同ことになる．

細胞自体は MHC クラス I で OVA を抗原提示できない）に
紫外線照射しアポトーシスを誘導した．この処置を施したのはアポトーシス細胞が貪食されやすいからである．この６． エンドソーム内抗原の細胞質移行の可視化
HSP９０αKO マウスを用いた実験から，交差抗原提示に

アポトーシス細胞を WT 及び HSP９０αKO マウスに投与し，おいて HSP９０α が関与していることはまずもって間違いな

１週間後に脾臓細胞を取り出し CD８＋ T 細胞を精製していと考えられたが，問題はそれをどう可視化するのか，とOVA２５７―２６４ アミノ酸ペプチドで２
４時間 in vitro で刺激を行いうことである．思案の末，樹状細胞膜と抗原をそれぞれいエリスポット法（T 細胞が産生するサイトカインをサン

別の蛍光色素で染色し，抗原を貪食させて観察するという

ドイッチエライザ法にて検出する方法）にて IFNγ 産生ス

手法をとった．抗原としての OVA を AF６
４７（赤色蛍光）ポットの数を測定した．もし，体内で CD８＋ T 細胞が抗原でラベルし，細胞膜を PKH６７（緑色蛍光）でラベルした．

８
３
４〔生化学 第８４巻 第１０号

P < 0.001
P < 0.001
P < 0.05

図４ HSP９０αKO ではクロスプライミング効率が低下する．
（左）正常マウス（WT）と HSP９０αKO マウスを OVA 導入 TAP１欠損脾臓細胞で免疫する．その１週間後にマウス脾臓細胞を取り出し，OVA 抗原ペプチドで刺激を加えた後，エリスポット法にて IFNγ のスポット数を計測した．HSP９０αKO マウスでは WT の約半分のスポット数しか認められなかった．
（右）正常マウス（WT）と HSP９０αKO マウスを OVA 抗原ペプチドをパルスした DC２．
４細胞株で免疫し，左図と同様にエリスポット法を行った．その結果，両マウスに差は認められなかった．つまりマウス T 細胞の応答性は両マウス間で差がないことになる．

細胞膜のラベルは完全に氷上で行い，膜の可動性を最小限

いを蛍光顕微鏡観察のように識別し，さらにフローサイトに止めた．こうして PKH６７-樹状細胞と予め３
７°
C の溶液

メーターのように蛍光色素分布の違いをもとに細胞集団をに浮遊させた AF６
４７-OVA を混合し，５〜２０分程観察する

分別して行く２６）．ImageStream は細胞どうしの癒合，抗原と，既に５分の段階で緑色のスポット，赤色のスポットがが単に細胞膜に付着しているだけで取り込まれていない細現れてくる．また両者の重なった黄色のスポットも多数観

胞は予め排除し，単一の細胞でかつ抗原を細胞内に取り込察された．エンドソームに取り込まれた OVA はエンド

んだもののみを解析できる．１万個の細胞を取り込み，各ソーム膜（緑色に染まった細胞膜に由来する）と重なって細胞のイメージ像について赤のスポットが優勢なのかある

黄色を呈し，エンドソームから細胞質へ移行した OVA は

いは黄色のスポットが優勢なのかを瞬時に判断し，統計学

赤色で観察されることになる．緑色のスポットは当然的な数値分類の結果を出す（図５）．これによってヒトのOVA を含有していない空のエンドソームである．細胞質

眼で観察するバイアスを排除した．その結果，HSP９
０αKO

へ出てきた OVA のプロテアソームによる分解を抑制する樹状細胞では WT 樹状細胞と比較して赤のスポットが少ために樹状細胞を予めプロテアソーム阻害剤 MG１
１５で処なく，黄色のスポットが多いことが繰り返し観察された．

理しておき，その上で氷上に静置し膜の可動性を抑える．

さらに HSP９０阻害剤で予め樹状細胞を処理しておくと，

そして３
７°
C の AF６
４
７-OVA を添加し５分間貪食させ，ホ赤のスポット数はさらに減少し黄色のスポット数が増加しルマリンで固定する．これを ImageStream という機器にてた２１）．以上の結果はすなわち HSP９０α（HSP９０β も同様に）観察した．ImageStream は細胞形態と色素分布の微妙な違が OVA の細胞質移行に関与していることを示唆してい

８
３
５

２
０
１
２年 １
０月〕

図５ ImageStream による細胞内抗原のイメージ解析．
（A）イメージ解析の原理．OVA を細胞内に取り込んだ樹状細胞のみをピックアップし，蛍光色素のパターン像を読み取る．
（B）上段：OVA がエンドソームから細胞質へ出て来た場合の典型的なイメージ像．下段：OVA がエンドソーム内に留まっている
場合の典型的なイメージ像．
（C）WT マウスと HSP９０αKO マウスの骨髄細胞由来の樹状細胞を用いた実験．HSP９
０α がなければ OVA の細胞質移行が WT に比較して低下する．HSP９０阻害剤ラディシコールで樹状細胞を処理するとさらに低下する．

る．

黄色スポットが観察された．これをさらに HSP９０阻害剤

ここで ImageStream の蛍光観察の z 軸の深さが４µm とで処理すると WT，HSP９０αKO ともに１１〜１２個の赤色ス

かなり厚いことが問題となった．これでは複数個のエンド

ポットと３２個の黄色スポットへと変化した２１）． すなわち，ソームが重なった場合に正確な判定ができなくなる．このOVA の細胞質移行は明らかに HSP９０に依存していること

問 題 を 解 決 す る た め に，z 軸 の 深 さ が０．
３〜０．
４µm の

が観察された（図６）．

BIOREVO（キーエンス，BZ-９０００）を用いて個々の細胞の中の赤と黄色のスポット数を目視にてカウントした（通７． エンドソーム内抗原の細胞質移行の生化学的解析

常の共焦点顕微鏡の z 軸の厚みは平均０．
１〜０．
２µm）
．合

抗原の細胞質移行の可視化ができた以上，生化学的にも

計２，０００個の細胞中の５０，０００個以上に及ぶスポットをカ

これを解析する手段があるはずである．最も簡単なアプ

ウントした．その結果は ImageStream の結果を追認するもローチは抗原の貪食後，樹状細胞を即座に各細胞画分に分のであった．いやむしろより正確な数が把握されたと考え

け，それぞれの画分に含まれる抗原を特異的抗体を用いてられる．それによると，WT 樹状細胞では細胞１個あたり

ウエスタンブロット法で検出することである．しかしなが

平均２６個の赤色スポットと１６個の黄色スポット，一方らこの手法もオルガネラ膜成分を破壊せずに行うことは意

HSP９０αKO 樹状細胞では１６個の赤色スポットと２３個の外と難しい．筆者らは幾種類かの既に存在する細胞分画８３６〔生化学 第８４巻 第１０号

図６ 蛍光顕微鏡を用いた細胞内抗原のイメージ解析．
（A）図５の ImageStream で見られたようなスポットを蛍光顕微鏡（対物 ×１００）で観察し，１個１個のカラーを識別・計測した．
図は DC２．
４細胞株１００個を観察した結果を示す．OVA 貪食５分間で多くのエンドソームは赤色蛍光が優位になっており，OVA の細胞質移行が進んでいることを示す．
（B）（A）の実験をラディシコール処理の有無で行った．その時の DC２．
４細胞１個あたりに認められるスポット数の平均値を求めた．ラディシコール処理により黄色蛍光スポット（OVA はエンドソーム内に留まる）の数が増加し，赤色蛍光スポット（OVA は細胞質へ移行）の数は減少する．ラディシコール処理の有無は黄色及び赤色蛍光スポットの総和に影響を与えない．

キットを用いて同実験を試みた．いずれのキットも基本的である．さらに，樹状細胞を予め HSP９０阻害剤で処理しに細胞質，膜成分，細胞骨格成分に分けることができる．

ておくと会合する OVA の量が有為に低下する．すなわ

その中でエンドソーム膜あるいは小胞体膜の破壊が起こり

ち，抗原の細胞質移行の際，恐らくエンドソーム膜に埋没にくいキットを選別した結果，Caibiochem 社のものが最するような格好で HSP９０と OVA は会合しているのかもしも優れていた．

れない（図７）．

まず OVA 取り込み開始５分で大容量の冷 PBS 緩衝液で次に OVA を含むファゴソームを精製し，ここに HSP９０樹状細胞を浮遊し，それ以後のプロセシングを止める．樹分子を加えることによって外へ遊離してくる OVA を観察

状細胞は予めプロテアソーム阻害剤で処理しておく．こうした．まず０．
８µm のラテックスビーズ（LB）に OVA をして細胞質を回収してくるとすでに多くの OVA が認めら吸着させ，これを LB ごと樹状細胞に貪食させる．そしてれる．そこで HSP９０阻害剤にて樹状細胞を処理すると細スクロースを用いた超遠心分離法にて LB を含むファゴ

胞質 OVA の量は濃度依存的に減少する．一方，膜成分にソームを精製する２７）．これに HSP９０，BSA，緩衝液のみを残存する OVA の量はこれに逆比例して増加する．すなわ

添加し３
７°
C で３
０分インキュベーションする．これを遠ち，細胞質移行が抑制されていることになる．この際小胞心機でファゴソームと上清に分ける．BSA，緩衝液のみで体マーカーである grp９
４，grp７８が細胞質へ遊離していな

は OVA は出てこないが，HSP９０を加えることにより濃度いことを同時に確認する必要がある．もしこれらのタンパ依存性に OVA が出てくるようになる２１）．４°
C では OVA はク質分子が検出されれば膜が壊れていることを意味してお出てこない．また ATP を加えなくても良いようである．

り，その実験結果の信頼性はない．できればカテプシンのさらに外部から加えたのは HSP９０のみであるため，OVA漏出が検出できないくらい上手に行えれば理想である．

の遊離のためには HSP９
０だけで十分と解釈される．しかHSP９０αKO と WT の樹状細胞で細胞分画実験を行った場

し，細胞内では恐らくその他の分子と協調しながら抗原の合，HSP９０αKO では明らかに細胞質 OVA の量が少ないこ引き出しに関与する可能性がある．この実験で大切なこととがわかった．やはり移行速度は遅いようである．もう一は，いわゆるリコンビナント HSP９０にはこの遊離活性がつ大切なことは，貪食された OVA が HSP９０の免疫沈降に低いか，ほとんど検出されないことである．これは恐らくより一緒に落ちてくることである．そこで樹状細胞を膜成

リコンビナント HSP９０（α，β 双方とも）はホモ二量体形

分と細胞質に分けてその後で HSP９０の免疫沈降を行った成率が高くないことが原因ではないかと考えている．筆者

ところ，どうやら膜成分の中で両分子は会合しているよう

らは通常，生きた細胞（マウスがん細胞など）から HSP９
０

８
３
７

２
０
１
２年 １
０月〕

図７ 交差抗原提示における細胞質 HSP９０の関与．
取り込まれた外来性抗原は何らかの機構で構造が変化し，ヒモ状になってトランスロコン様小孔を通過するが，その際細胞質 HSP９０がエンドソーム膜にめり込むように吸着し抗原と結合して細胞質側への引き出しに貢献する．抗原はユビキチン化されてプロテアソームでペプチドへと分解され MHCI により抗原提示される．

を精製して実験に使用している．この場合，精製度が問題

差抗原提示機構に利用されているのかは現時点でわからなになるが HSP９０を予め HSP９０阻害剤で処理しておけばい．しかし，筆者らのデータによれば細胞質へ移行した外OVA の遊離活性が消失するので，シャペロン活性が不可来性抗原は少なくともすぐにはユビキチン化されておら欠であるのは間違いない．

ず，またユビキチン化の最初のステップである E１酵素阻

８． 諸々の事象との整合性について
８―１ 交差抗原提示と ERAD, HSP

害剤でも抗原の細胞質移行は抑制されていない．交差抗原
提示には小胞体成分の関与はあるものの，もしかするとERAD とは別の機構が働いているかもしれない．筆者らは小胞体タンパク質の品質管理機構としての小胞体関連分抗原の細胞質移行過程に HSP９０の関与を認めたが HSP７０

解（ERAD）については特に酵母の系でよく解析がなされの関与については今後慎重に検討する必要があると思われている．小胞体タンパク質の中でも可溶性タンパク質の場

る．

合，その細胞質への逆移送のためには小胞体内腔の分子シャペロン Bip（HSP７０ファミリーに属する）と J-ドメインを有するコシャペロン分子 Jem１p, Scj１p が必須である．

８―２ cdc４８（p９７）と HSP９０の関係はどうなるのか
ERAD における小胞体タンパク質の Sec６
１トランスロコ

さ ら に は E３ユ ビ キ チ ン リ ガ ー ゼ Hrd１p 及 び E２酵 素ンを介した細胞質 へ の 逆 移 送 は Pseudomonas aeruginosaUbc７p の関与も示唆される．Bip は小胞体内腔の凝集性タ

Exotoxin A（Exo A）に よ り ブ ロ ッ ク さ れ る．こ の 時 はンパク質の可溶性を保持するのみでなく，多くのタンパクSec６１を阻害していると考えられた３５）．一方で，交差抗原質の逆移送を促進する．一方，小胞体膜タンパク質の提示が Exo A で抑制されることが明らかになり，この場

逆移送の際にはむしろ細胞質 HSP７０（Ssa１p）と J-ドメイ

合は Sec６１ではなく cdc４
８／p９
７が標的分子であることが示

ンを含むコシャペロン分子 Hlj１p,

Ydj１p が必要であり，

唆された１５）．Exo A の標的分子が何であるかも大切である

さ ら に は E３ユ ビ キ チ ン リ ガ ー ゼ Doa１
０p 及 び E２酵 素が，筆者らは当初この cdc４８／p９
７と HSP９０が会合して外Ubc６p, Ubc７p の関与が指摘される

２
８〜３
０）

．いずれのタンパク来性タンパク質の細胞質移行に関与するのではないかと予質もポリユビキチン化されて初めて細胞質へ移行すると考想したが，免疫沈降の結果，両者の会合を認めることはで

えられ，このポリユビキチン化タンパク質が cdc４
８／p９
７にきなかった．すなわち両分子は別々に独立して機能しておより捕捉されて小胞体から細胞質側へ引きずり出され，り，恐らくは HSP９０の働きで細胞質へ移行しつつある抗２
６S プロテアソームに受け渡しされる ，と考えられてい原が続いてユビキチン化を受け，これが cdc４
８／p９
７によっ

る．これと同様のことが哺乳類細胞の樹状細胞における交て捕捉されるのではないかと考えている３４）．この辺りは抗

３
１〜３
３）

３
４）

８
３
８

〔生化学 第８４巻 第１０号

原の種類によっても経路に多様性の存在することも十分に謝辞
HSP と免疫研究をここまで継続することができたのは，考えられる．

筆者の留学時代の恩師である Dr. Pramod K. Srivastava の永８―３ 交差抗原提示以外のタンパク質の細胞質移行

きにわたる暖かい励ましと当時の仲間達との親密な交流の樹状細胞による交差抗原提示に HSP９０が必須であり，御陰である．心より感謝したい．また，HSP と抗原提示貪食された抗原の細胞質輸送へ関与することを述べてき研究の世界に入ったのは２０００年前後であり，とりわけ筆た．一方で免疫の世界の外に眼を向けると，様々な局面で者が（独）
理化学研究所 RCAI の免疫シャペロン研究チーム

HSP９０によるタンパク質分子の細胞質移行の可能性が指を主宰していた時期とその多くの時期が重なっており，同摘されている．例えば，細胞増殖因子である線維芽細胞増研究チームに在籍し献身的に研究を継続してくれた多くの殖因子 FGF-１／２やジフテリア毒素などは細胞膜受容体にスタッフの方々に心より御礼申し上げたい．

結合した後に受容体依存性にエンドサイトーシスで細胞内に入り，続いて細胞質へ移行してその生理学的機能を発揮
する

文

献

．この細胞質移行に際して HSP９０が必要であるこ

３
６，
３
７）

とが示唆されてきた３８，３９）．またコレラ菌毒素の A１サブユ
ニットの小胞体から細胞質への移送にも HSP９０の関与が認められる．この場合は A１サブユニットと細胞質 HSP９０の直接的な会合が輸送に必須であることが示唆されている４０）．このように見ると HSP９０によるタンパク質分子の細胞質移行という現象は，多くの細胞に普遍的な事象である可能性が高く，樹状細胞の場合はたまたま交差抗原提示に利用されていると考えた方がよさそうである．
９． お

わ

り

に

８節に同研究の今後の進め方に対するヒントがあるかと思われるが，やはりエンドソームに存在するであろう抗原の通過する小孔の分子構造の解明がなされない限り交差抗原提示の研究は終わらない．これは世界中の関係する研究者が取り組んでいるが，なかなか真実がみつからない．もしかしたら小孔は存在しないのかもしれない．何らかの因子がエンドソーム膜にやってきて初めて孔が開くような動的開閉システムの検討も今後必要になってくるかもしれな
い． この開閉機構に HSP９０が関与することも考えられる．
また，本稿を書きながら痛感するのは抗原提示／抗原プロ
セシングという研究分野がいかに敷居が高くなってしまったかということである．今回の筆者らの研究でも HSP９０
αKO マウスの作製と in vitro，in vivo におけるクロスプレ
ゼンテーション効率の定量的解析とシトクローム c 投与
実験，ImageStream と蛍光顕微鏡による抗原可視化，細胞分画と精製ファゴソームを用いた抗原の遊離実験，など極めて多方面での実験が要求され，やりながら辟易する思いであった．しかしとにかく HSP９０α 遺伝子改変マウスの作製ができ，それを用いて初めてクロスプライミングの生体における実験ができた．同遺伝子改変マウスは HSP と免
疫研究を行う上で強力なツールとなることは間違いなく，
今後さまざまな研究にこのマウスが役に立てばよいと願っている．

１）Schubert, U., Anton, L.C., Gibbs, J., Norbury, C.C., Yewdell,
７
４.
J.W., & Bennink, J.R.（２０００）Nature,４
０
４,７
７
０―７
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９,３
６
８―３
７
３.
３）Heath, W.R. & Carbone, F.R.（２００１）Annu. Rev. Immunol.,
１
９,４
７―６
４.
４）Bevan, M.J.（１９７６）J. Exp. Med.,１
４
３,１
２
８
３―１
２
８
８.
５）Bjorkman, P.J., Saper, M.A., Samraoui, B., Bennett, W.S.,
Strominger, J.L., & Wiley, D.C.（１９８７）Nature,３
２
９,５
１
２―５
１
８.
６）Bjorkman, P.J., Saper, M.A., Samraoui, B., Bennett, W.S.,
Strominger, J.L., & Wiley, D.C.（１９８７）Nature,３
２
９,５
０
６―５
１
２.
７）Burgdorf, S., Kautz, A., Bohnert, V., Knolle, P.A., & Kurts, C.
（２００７）Science,３
１
６,６
１
２―６
１
６.
８）Hildner, K., Edelson, B.T., Purtha, W.E., Diamond, M., Matsushita, H., Kohyama, M., Calderon, B., Schraml, B.U., Unanue,
E.R., Diamond, M.S., Schreiber, R.D., Murphy, T.L., & Murphy, K.M.（２００８）Science,３
２
２,１
０
９
７―１
１
０
０.
９）Savina, A., Jancic, C., Hugues, S., Guermonprez, P., Vargas,
P., Moura, I.C., Lennon-Dumenil, A.M., Seabra, M.C., Raposo,G., & Amigorena, S.（２００６）Cell,１
２
６,２
０
５―２
１
８.
１
０）Savina, A., Peres, A., Cebrian, I., Carmo, N., Moita, C., Hacohen, N., Moita, L.F., & Amigorena, S.（２００９）Immunity, ３
０,
５
４
４―５
５
５.
１
１）Gagnon, E., Duclos, S., Rondeau, C., Chevet, E., Cameron, P.
H., Steele-Mortimer, O., Paiement, J., Bergeron, J.J., & Desjardins, M.（２００２）Cell,１
１
０,１
１
９―１
３
１.
１
２）Ackerman, A.L., Kyritsis, C., Tampe, R., & Cresswell, P.
（２００３）Proc. Natl. Acad. Sci. USA,１
０
０,１
２
８
８
９―１
２
８
９
４.
１
３）Guermonprez, P., Saveanu, L., Kleijmeer, M., Davoust, J., Van
Endert, P., & Amigorena, S.（２００３）Nature,４
２
５,３
９
７―４
０
２.
１
４）Houde, M., Bertholet, S., Gagnon, E., Brunet, S., Goyette, G.,
Laplante, A., Princiotta, M.F., Thibault, P., Sacks, D., & Desjardins, M.（２００３）Nature,４
２
５,４
０
２―４
０
６.
１
５）Ackerman, A.L., Giodini, A., & Cresswell, P.（２００６）Immunity,２
５,６
０
７―６
１
７.
１
６）Touret, N., Paroutis, P., Terebiznik, M., Harrison, R.E., Trombetta, S., Pypaert, M., Chow, A., Jiang, A., Shaw, J., Yip, C.,
Moore, H.P., van der Wel, N., Houben, D., Peters, P.J., de
Chastellier, C., Mellman, I., & Grinstein, S.（２００５）Cell, １
２
３,
１
５
７―１
７
０.
１
７）Ichiyanagi, T., Imai, T., Kajiwara, C., Mizukami, S., Nakai, A.,
Nakayama, T., & Udono, H.（２０１０）J. Immunol., １
８
５, ２
６
９
３―
２
７
０
０.
１
８）Marcu, M.G., Chadli, A., Bouhouche, I., Catelli, M., & Neckers, L.M.（２０００）J. Biol. Chem.,２
７
５,３
７
１
８
１―３
７
１
８
６.

２
０
１
２年 １
０月〕

１
９）Tsutsumi, S. & Neckers, L.（２００７）Cancer Sci., ９
８, １
５
３
６―
１
５
３
９.
２
０）Tsutsumi, S., Scroggins, B., Koga, F., Lee, M.J., Trepel, J.,
Felts, S., Carreras, C., & Neckers, L.（２００８）Oncogene, ２
７,
２
４
７
８―２
４
８
７.
２
１）Imai, T., Kato, Y., Kajiwara, C., Mizukami, S., Ishige, I., Ichiyanagi, T., Hikida, M., Wang, J.Y., & Udono, H.（２０１１）Proc.
Natl. Acad. Sci. USA,１
０
８,１
６
３
６
３―１
６
３
６
８.
２
２）Sakai, K. & Miyazaki, J.（１９９７）Biochem. Biophys. Res. Commun.,２
３
７,３
１
８―３
２
４.
２
３）Hikida, M., Casola, S., Takahashi, N., Kaji, T., Takemori, T.,
Rajewsky, K., & Kurosaki, T.（２００９）J. Exp. Med., ２
０
６, ６
８
１―
６
８
９.
２
４）Lin, M.L., Zhan, Y., Proietto, A.I., Prato, S., Wu, L., Heath,
W.R., Villadangos, J.A., & Lew, A.M. （２００８） Proc. Natl.
Acad. Sci. USA,１
０
５,３
０
２
９―３
０
３
４.
２
５）Giodini, A. & Cresswell, P.（２００８）EMBO J.,２
７,２
０
１―２
１
１.
２
６）Sancho, D., Joffre, O.P., Keller, A.M., Rogers, N.C., Martinez,
D., Hernanz-Falcon, P., Rosewell, I., & Reis e Sousa, C.
（２００９）Nature,４
５
８,８
９
９―９
０
３.
２
７）Desjardins, M., Huber, L.A., Parton, R.G., & Griffiths, G.
（１９９４）J. Cell Biol.,１
２
４,６
７
７―６
８
８.
２
８）Fewell, S.W., Travers, K.J., Weissman, J.S., & Brodsky, J.L.
（２００１）Annu. Rev. Genet.,３
５,１
４
９―１
９
１.
２
９）Kabani, M., Kelley, S.S., Morrow, M.W., Montgomery, D.L.,
Sivendran, R., Rose, M.D., Gierasch, L.M., & Brodsky, J.L.

８
３
９
（２
０
０
３）Mol. Biol. Cell,１
４,３
４
３
７―３
４
４
８.
３
０）Nishikawa, S.I., Fewell, S.W., Kato, Y., Brodsky, J.L., &Endo, T.（２００１）J. Cell Biol.,１
５
３,１
０
６
１―１
０
７
０.
３
１）Huyer, G., Piluek, W.F., Fansler, Z., Kreft, S.G., Hochstrasser,M., Brodsky, J.L., & Michaelis, S.（２００４）J. Biol. Chem., ２
７
９,
３
８
３
６
９―３
８
３
７
８.
３
２）Vashist, S. & Ng, D.T.（２００４）J. Cell Biol.,１
６
５,４
１―５
２.
３
３）Han, S., Liu, Y., & Chang, A.（２００７）J. Biol. Chem., ２
８
２,
２
６
１
４
０―２
６
１
４
９.
３
４）Jarosch, E., Taxis, C., Volkwein, C., Bordallo, J., Finley, D.,
Wolf, D.H., & Sommer, T.（２００２）Nat. Cell Biol.,４,１
３
４―１
３
９.
３
５）Koopmann, J.O., Albring, J., Huter, E., Bulbuc, N., Spee, P.,
Neefjes, J., Hammerling, G.J., & Momburg, F.（２０００）Immunity,１
３,１
１
７―１
２
７.
３
６）Wesche, J., Malecki, J., Wiedlocha, A., Skjerpen, C.S., Claus,
P., & Olsnes, S.（２００６）J. Biol. Chem.,２
８
１,１
１
４
０
５―１
１
４
１
２.
３
７）Ratts, R., Zeng, H., Berg, E.A., Blue, C., McComb, M.E., Costello, C.E., vanderSpek, J.C., & Murphy, J.R.（２００３）J. Cell
Biol.,１
６
０,１
１
３
９―１
１
５
０.
３
８）Sandvig, K. & Olsnes, S.（１９８０）J. Cell Biol.,８
７,８
２
８―８
３
２.
３
９）Haug, G., Leemhuis, J., Tiemann, D., Meyer, D.K., Aktories,
K., & Barth, H.（２００３）J. Biol. Chem.,２
７
８,３
２
２
６
６―３
２
２
７
４.
４
０）Taylor, M., Navarro-Garcia, F., Huerta, J., Burress, H., Massey,
S., Ireton, K., & Teter, K.（２０１０）J. Biol. Chem., ２
８
５, ３
１
２
６
１―
３
１
２
６
７.