AJACSオンライン2

NGSデータ検索 (NCBI SRA, ENA, DDBJ, AOEなど)
仲里 猛留
NAKAZATO, Takeru@chalkless
情報・システム研究機構 データサイエンス共同利用基盤施設
ライフサイエンス統合データベースセンター
Database Center for Life Science (DBCLS),
Joint Support-Center for Data Science Research, Research Organization of Information and Systems (ROIS)
撮影
可2020/10/14@オンラインhttps://biosciencedbc.jp/event/ajacs/ajacs83.html

NGSとは?

次世代シーケンサー（NGS）とは-次世代シーケンサ-

次世代シーケンサー-

新型シーケンサ

Illumina HiSeq

PacBio-New-generation Sequencing (NGS)-Next-generation Sequencing (NGS)-

他にmassively parallel DNA sequencing とか…

-

最近は、
High-throughput DNA sequencing (technology)をよく使う印象（略語はNGS）

「次世代」? 「新型」?
ちっとも新しくない「新しい昆虫採集案内」
昭和46年出版
昭和52年改訂いつまでも新大阪
2007年

wikipedia：新大阪駅

1964年
http://centland.jp/merit/何が「次世代」か?

北海道システム社

ABI社

電気泳動式
750 (base/lane) 48/4 lanes= 9kbase

キャピラリ式500 (base/lane) 96 lane
= 48kbaseNGS
2300 (base/seq) 25M seq/run= 15 Gbase

目的別 必要スペック

目的別 機器の選択

Illumina NovaSeq

Oxford Nanopore MinIONNGSのデータベースライフ系データベース：BLASTとPubMed
PubMedBLAST

研究データと公共データベース

登録
塩基配列

データベース

検索システム

GenBank
EMBL
DDBJ

BLAST

登録
MEDLINE
文献

SRA(Sequence Read Archive)NGS データ

SRA Search

SRA:Sequence Read Archive
ちなみに、昔は Short Read Archive

研究データと公共データベース
EMBL-EBI

データ収集

INSDC

ROIS

データ普及・活用

登録されたNGSデータの伸び17P base
1.7京 base※ 数ヶ月で1P base 程度の伸び

https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=announcement

JGA (Japanese Genotype-Phenotype Archive)
Controlled-access データのアーカイブ

登録などはJST NBDCにSRAの検索NCBIのインターフェース

EBIのインターフェース

DDBJのインターフェース

DBCLS SRA 公共NGSデータの検索サイト

http://sra.dbcls.jp/

DBCLS SRA – 詳細表示

データ構造（概略版）

http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/submission_e.html

データ構造（詳細版）

http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/submission.html を改

SRAの検索は意外とツラい目的が多種多様ゲノム、発現解析、エピゲ、メタゲ、...
対象生物種も多種多様
ヒト、マウス、メタゲノム、微生物、...
データベースの構造
study：プロジェクト情報
experiment：個々の実験情報

すべてのメタデータが1つの登録に入っているわけでない

https://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0077910.g001

ワインが飲みたいどれにする?

どうしようかなぁ...

Soleil Hikumo Rouge

名前タイプ

赤ワイナリー 旭洋酒
生産地

山梨

ブドウ品種

ピノノワール＋ベイリーA

製造年

2012年

→ メタデータによる選択

赤で重くないやつ→ 中身のクオリティによる足切りデータ数の推移 – 目的別

TOTAL

データ数の推移 – 機器別論文からの検索

Publication info

data info(SRA)NGSデータを使って論文を出したら他の研究者のデータでも明記してリスペクトを！QC result

疾患からの検索

生物種からの検索

データ解析
概略

NGSデータ解析の流れ
データベース検索
自分でDownload
Quality checkde novo assemble

ゲノム

発現量解析

mapping

SNP検出

NGSデータ解析の流れ（詳細版）
データベース検索
自分でDownload

fastq

Quality check

fastqcfastq

de novo assemble[ゲノムに] [cDNAに]mapping

HISAT2bwa

Kallisto
Salmonsam/bam(Trinity)

ゲノム

発現量解析

StringTie

SNP検出

samtools
GATKvcf

いずれも IGV で可視化

FASTQフォーマット
@DRR001107.1 GEZQ5FO01EEA7F length=77
GCAACATTCAACACATATGTGTTGAATGTTGCACGACGGNGTG...
+DRR001107.1 GEZQ5FO01EEA7F length=77
C@BBBECCECDBBBAAAAA<441111<?@>?=?????44!000...

4行1組

1行目： @ + タイトル
2行目：塩基配列

×数千万
数十億

3行目： + （+ タイトル）
4行目：シーケンスクオリティ

[参考] FASTAフォーマット
塩基配列を表現するフォーマット
>AB084425.1 eel SLC26A6GACCCAAAACTGATAGGTGATGTTCACGTAGTGGC
CATCGCCTGATAGACGGTTTTCGCCCTTTGACGTT
GGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGACTCTGAGTAAA …

1行目： > + タイトル
2行目以降：塩基配列

コマンド例：Quality checkからtrimming
Quality Check$ fastqc --nogroup -o DRR1234567.fastq
コマンド名

おまじない

対象ファイル名

trimming$ trim_galore --paired --illumina --fastqc -o trimmed/
コマンド名pair­end

Illuminaデータ fastqcもかける

DRR1234567.R1.fastq DRR1234567.R2.fastq
対象ファイル名・その1

対象ファイル名・その2

出力先fastqc結果例

コマンド例：mapping/assemble
ゲノムへのmapping$ hisat2-build input_genome.fa genome_index ← index作成$ hisat2 -x genome_index -1 pair1.fastq -2 pair2.fastq
コマンド名index名

対象ファイル名

対象ファイル名-p 24 -S output.sam
CPU数

出力ファイル名

transcriptへのmapping$ salmon index -t transcript.fasta.gz -i index_dir$ salmon quant -i index_dir/ -l A -1 pair1.fastq.gz -2 pair2.fastq.gz-p 8 -o output/ --validateMappings -p 24 -S output.sam

de novo assemble$ Trinity --seqType fq --left pair1.fastq --right pair2.fastq--max_memory 24G --CPU 16

シングルエンド/ペアエンド
シングルエンド
read

300bp
シーケンサにより決まっている長さを読み取る

ペアエンド

1500bp

...

read

300bp

300bp

シーケンサにより決まっている両端の長さを読み取る
元々のリードの長さがわかっていると情報量が増える（特に間にgapが入っている時は）sam/bamフォーマット
(Sequence Alignment/Map Format)

各リードの配列

各リードの名前
mapされた

mapされた場所

各リードのクオリティ

染色体/scaffold （何塩基目）※ その他、マッピングの状況など※ bam は sam をバイナリにしたもの（人間が読めるデータからコンピューター用に変換）（sam だとデータサイズが非常に大きくなるのでbamにして圧縮IGVによる可視化

vcfデータ （variant call format）

染色体/scaffold
変異の場所（何塩基目）

変異のID

referenceの塩基※ この場合、変異のIDとはdbSNPのIDをさしています

リードの塩基遺伝子機能アノテーション
・BLASTで類似性のある遺伝子を検索$ blastx -query Trinity.fasta -db uniprot_sprot.pep-num_threads 8 -max_target_seqs 1 -outfmt 6 > blastx.outfmt6
TRINITY_DN15083_c2_g1_i1
TRINITY_DN15083_c2_g1_i2
498
TRINITY_DN15083_c2_g1_i3
TRINITY_DN15083_c2_g1_i4
TRINITY_DN15083_c2_g1_i5

tr|O22669|O22669_PANGI 99.160
tr|A0A089WZX0|A0A089WZX0_KALFE

11992.884

126701910357
7485874203
12.33e-79
242
267
2.20e-175

tr|Q1KLZ3|Q1KLZ3_9ROSI
tr|I3SIW2|I3SIW2_LOTJA
tr|Q1KLZ3|Q1KLZ3_9ROSI

66
118
148

93
70009513292354
446

1842666201
173

6.90e-31
8.34e-79
2.31e-99

86.36497.45895.270117
238294・hmmerでドメイン検索$ hmmscan --cpu 8 —domtblout
TrinotatePFAM.out Pfam-A.hmm
transdecoder.pep > pfam.log

https://trinotate.github.io/RNA-Seq

AOE (All of Gene Expression)

マイクロアレイなども含めた遺伝子発現データの検索ChIP­Seq

ChIP-Atlas

すでにゲノムにマップして可視化できるようにしたサイトがhttp://chip-atlas.org/

ChIP-Atlas の情報の可視化

サイトにチュートリアルムービーありメタゲノムMicrobeDB.jp

http://microbedb.jp/

SRAへの登録

DRAへの登録

http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/submission.html

データ構造（再掲）

http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/submission.html を改

DRAへの登録フロー
シーケンスデータ（FASTQ or BAM）に加えメタデータ（実験情報）を書いてDDBJに登録

DRAへの登録（Sample）

DRAへの登録（Experiment）

参考リソース参考図書・その1 〜 実験もやる人向け

実験デザイン・サンプルの用意から解析まで

参考図書・その1-2 〜 実験もやる人向け

より新しい（ウェット）実験の書籍も参考図書・その2 〜 解析を詳しく

NGSデータ解析を丁寧に解説。Kindle版あり

参考図書・その2の2 〜 解析を詳しく

NGSデータ解析を今回も丁寧に解説。
非モデル、メタゲなど農学部寄り

参考図書・その2の3 〜 RNA-Seq解析を詳しく

RNA-Seqデータ解析について詳しく解説

参考図書・その2の4 〜 バリアント解析を詳しく

医学部向けデータベース、解析について詳しく解説

参考図書・その3 〜 初心者向け入門書

詳細な解析をひととおり知りたい

NGSハンズオン講習会
JST-NBDC＋東大アグリバイオ

ここのところ毎年やっています
統合TVで録画・公開済

https://biosciencedbc.jp/human/human-resources/workshop/h28-2※「NGS 講習会」でググれ