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アフラトキシン検査チップの開発＜設立 30 周年記念研究助成（平成 27 年度助成）＞

アフラトキシン検査チップの開発
渡慶次

学（北海道大学大学院 工学研究院応用化学部門）

２．免疫分析チップの開発 1)

１．はじめにカビ毒は、経口摂取により急性、慢性毒性あるいアフラトキシン B1 を検査するためには、競合免は発がん性などのリスクのある有害物質である。そ

疫分析法を紙上で実現しなければならい。そこで、の中でもアフラトキシンは、トウモロコシやピー

図 1 に示したデザインの紙チップを試作した。このナッツなどの多くの種類の食品や飼料から汚染事例

チップは、Y 字型の形状をしており、二分岐した流が数多く報告されている。毒性の強さや食品汚染の路の終点がそれぞれコントロールゾーンおよび試験頻度から、アフラトキシン B1（AFB1）は最も重要

ゾ ー ン と な っ て お り、 両 方 に 発 色 基 質 の TMBである。現在、アフラトキシン B1 の検査には、液（3,3',5,5'- テトラメチルベンジジン）が固定化され体クロマトグラフィーや酵素免疫測定法が用いられている。試験ゾーンの上流には、捕捉ゾーンが設けており、検査に時間がかかることや、検査コストがられており、目的物質 -BSA（ウシ血清アルブミン）高いなどの問題点がある。そこで本研究では、簡便複合体が固定化されている。サンプルは、目的物質かつ迅速、安価なアフラトキシン B1 検出用の検査を含む試料に過酸化水素と HRP 標識された抗 - 目的チップの開発を目的とした。具体的には、数 cm サ

物 質 抗 体（HRP 標 識 抗 体 ） を 加 え た も の と し た。

イズの紙上で免疫分析を行う免疫分析チップを開発

HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）は、TMB と過することを目指した。

酸化水素による発色反応の酵素である。このようなサンプルをサンプルゾーンに滴下すると、サンプル

図1

免疫分析チップの概略

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浦上財団研究報告書

は下流で二分岐し、それぞれコントロールと試験

Vol.27（2020）

３．免疫分析チップの改良ゾーンの方向に流れていく。試験ゾーンの方向に流れたサンプル中の HRP 標識抗体の一部は、捕捉ゾー開発した検査チップを実用化するためには、さらンで捕捉されるため、コントロールゾーンと試験に改良して検査性能を向上させる必要がある。図 1ゾーンに到達する HRP 標識抗体の量が変化する。の検査チップの改良すべき点は、相対発色強度のば従って、コントロールゾーンと試験ゾーンとでは発らつきが大きいことである。相対発色強度のばらつ色の程度が異なる。サンプル中の HRP 標識抗体と過きが大きい理由は 2 つ考えられる。1 つは、サンプ酸化水素の量を一定にしておくと、発色の程度は目ルが分岐点で等量分岐せずにコントロールゾーンの的物質の濃度に依存するため、相対発色強度（試験方向に流れやすいということである。捕捉ゾーンにゾーンの発色強度 / コントロールゾーンの発色強度）

は、目的物質 ‐ BSA 複合体が固定化されているたにより目的物質の濃度定量が可能になる。相対発色めに、2 つの流路の流れやすさが異なることが原因

強度は、デジタルカメラで撮影した発色部の画像解だと考えられる。もう 1 つは、コントロールゾーン析により算出した。

および試験ゾーンに固定化されている TMB の発色本研究では、まず目的物質として AFB1 の代わりが、ゾーン内で均一でないということである。固定にビオチン用いて、試作した検査チップの性能を評化されている TMB の一部は、サンプルが流れてく価した。図 2 にビオチンの検量線を示す。ビオチンると流されてしまい、ゾーン内で発色の程度にばら濃度の増加とともに相対発色強度が増加しており、つきが生じてしまう。それが画像解析の際にばらつ開発した検査チップでビオチンの定量分析が可能できを生む要因となっている。

あることが確認できた。次に AFB1 用の検査チップ

このばらつきを生む 2 つの問題を解決するために、を作製し、AFB1 の測定を行った。図 3 に AFB1 の新しいデザインの検査チップを開発した（図 4）。こ検量線を示す。AFB1 の検量線は、ビオチンのものの検査チップは、3 層構造になっており、図 4(a) のに比較すると若干傾きが小さいが、開発した検査ように Z 型に折ることで作製する。1 層目は、パンチップで AFB1 の定量分析が可能であることを確認

チで貫通孔を作製し、2 層目の両端に TMB を固定化できた。検量線から算出した AFB1 検出下限値は、する。3 層目には、捕捉ゾーンが作製されている（図1.31 ng/mL（1.31 μg/kg）となり、食品中の基準4(b)）。図 5 に改良した検査チップの概略を示す。2値（10 μg/kg）以下であり、開発した AFB1 検査チッ層目に吸水パッドを設置することで、サンプルゾープの有用性を示すことができた。

ンに滴下されたサンプルは 3 層目に到達すると、流図2ビオチンの検量線

図3AFB1 の検量線

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アフラトキシン検査チップの開発

図4

図5

改良した検査チップのデザイン改良した検査チップの概略

図6

改良検査チップによるビオチンの検量線路の両端の方向に均等に流れるようになる。また、より、大幅に検査性能を向上させることに成功した。

TMB を 2 層目に固定化することで、TMB がサンプ

また、以前の検査チップに比べて、改良した検査チッルによって流されるのを抑えることができ、発色をプは、サンプルの流れる流路の長さが短くなってお均一にすることができる。

り、そのため測定時間の短縮も同時に実現した。

改良した検査チップの性能を評価するために、ビ本研究では、発色基質に TMB を用いているため、オチンのアッセイを行った。図 6 にビオチンの検量撮影した画像をシアンスケール画像に変換して発色線を示す。図 2 の以前の検査チップによるビオチン強度を算出している。しかし、今後、紙製の検査チッの結果に比較すると、検量線の傾きが大きく、相対プを複数の目的物質の同時測定（多色測定）などへ発色強度のばらつきが小さい。検査チップの改良に応用するためには、単一のカラースケール画像の解10浦上財団研究報告書

Vol.27（2020）

析では濃度定量が困難になることが予想される。本

面の都合上、ここには記載することができなかった研究では、それらを想定して、CIEL*a*b* 色空間を用が、紙チップの洗浄法 3)、TMB の効率的な発色 4)、いた多色解析法を考案し、その有用性も実証した 2)。

HRP の高感度検出 5)、紙チップを用いた食品分析および水分析 6)、作製法の違いによる紙チップの検査

４．おわりに性能評価 7) の成果については、国際学術誌に掲載することができた。また、改良検査チップについては

本研究では、簡便かつ迅速、安価なアフラトキシ特許として出願した。

ン B1 検出用の検査チップの開発を目的として研究を推進した。研究期間内に、目的のアフラトキシン

謝辞

検査チップを開発することに成功し、その成果を本研究に対し、多大なご助成を賜りました公益財

Analyst 誌に掲載することができた。さらに、開発団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上した検査チップの問題点を抽出し、それらの問題点げます。

を解決した改良検査チップを開発した。改良検査チップの性能評価として、アフラトキシンのアッセ

参考文献

イを行う予定であったが、アフラトキシン検出用の

1) L. S. A. Busa et al., Analyst, 141, 6598-6603 (2015).
2) T. Komatsu et al., Analyst, 141, 6507-6509 (2015).
3) S. Mohammadi et al., Anal. Bioanal. Chem., 408,7559-7563 (2016).
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5) L. S. A. Busa et al., Sens. Actuators B, 236, 433-441(2016).
6) L. S. A. Busa et al., Micromachines, 7, 86 (2016).
7) T. Komatsu et al., Anal. Sci., 34, 39-44 (2018).

試薬が研究期間中に製造中止となり、ビオチンのアッセイしかできなかったのは残念であった。しかし、ビオチンの評価結果から、改良検査チップが高い性能を持つことを証明した。改良検査チップを用いたアフラトキシンの評価については、試薬の作製を含めて、今後検討していく予定である。また、紙Development of an aflatoxin test chip

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Development of an aflatoxin test chip
Manabu TOKESHI
Division of Applied Chemistry, Faculty of Engineering, Hokkaido University

Mold poisons (mycotoxins) are poisonous substances that the present risks ofacute toxicity, chronic toxicity, and carcinogenicity upon oral ingestion. Among
mycotoxins, aflatoxin contamination has been reported in various types offoods and feeds, such as corn and peanuts. Due to the strength of its toxicity
and the frequency of food contamination, aflatoxin B1 (AFB1) is the mostimportant of these toxins. Liquid chromatography and enzyme immunoassay
techniques are currently used to implement aflatoxin B1 inspections. However,these methods are problematic, as they require considerable time and result inhigh inspection costs.
In this study, we developed a simple, rapid, and cost-effective microfluidic
paper-based analytical device (μPAD) for AFB1 inspections. The μPADs were
fabricated using photolithography and wax printing to define hydrophilic flow
channels, and consisted of three main elements: the control and test zones,
w here tar get detect ion is per fo r me d, a samp l e i nt r o duct i o n zo ne , and acompetitive capture zone situated between the sample introduction and testzones. A chromogenic substrate, 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine ( TMB) was
deposited at the control and test zones. μPAD surface modification was first
performed at the capture zone via chitosan activation, followed byimmobilization of the BSA-conjugated target compound. The sample solution,
consisting of the target compound, peroxidase-conjugated antibody, and ahydrogen peroxide oxidizing agent was then intro duced into the device.
Competition then occurred in the capture zone, allowing only target-boundperoxidase-conjugated antibody to travel past the capture zone and into thetest zone via capillary action. We successfully demonstrated the good
performance of this competitive immunoassay system, using biotin as a modelcompound, and aflatoxin B1 as a target compound for the practical applicationof this system on μPADs.
Furthermore, we developed an improved μPAD for competitive immunoassay.
This device will be applied to AFB1 detection, in the near future.