報告書

⽜乳及び乳製品はコリン化合物摂取に役⽴つか？

仙台⽩百合⼥⼦⼤学

⼈間学部

健康栄養学科⼤久保剛2022 年 5 ⽉ 13 ⽇

Ⅰ 緒⾔
コリンは、4 級アンモニウムカチオンでメチル基を有する化合物である。コリンは、①
⽣体の細胞膜の構造を維持する上で重要であり、②神経伝達物質のアセチルコリンの前駆物質の役割を担い、③One carbon metabolism いわゆるメチル基の代謝系でメチル基を供給する代謝サイクルにおいて重要な役割を果たし、エピゲノムへの関与が指摘されている。
こ の た め 、 ア メ リ カ で は ビ タ ミ ン 様 物 質 に 分 類 さ れ て い る 。 適 正 摂 取 量 （ AdequateIntake：AI）として成⼈男性 500 ㎎/⽇、成⼈⼥性 425mg/⽇と定められている。特に、胎児や乳児の脳の構築に重要な役割を果たしていることが指摘されている¹⁾ため、妊婦は450 ㎎/⽇、授乳婦は 550 ㎎/⽇と成⼈⼥性よりも摂取量は多く設定されている。⼀⽅、コリン⽋乏を起こすと肝機能障害を引き起こし、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼの上昇が知られている²⁾。
しかしコリンの合成に関して、de novo の合成系はあるが肝臓以外の臓器で殆ど合成することができないため、⾷事摂取で補う必要があるとされている。それにも関わらず、⽇本では、⾷事摂取としてのコリンに関する研究報告は殆どなく、コリンの推奨量はまだ定められていない。
コリン化合物は、⽔溶性物質のグリセロホスホコリン、遊離コリン、脂溶性物質のホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンなどがある。⾷品の中では、⼤⾖、卵、⽜乳に豊富に含まれている。アメリカでは、コリン化合物の摂取を推奨しているため、アメリカ農務省では、USDA Database for the Choline Content of Common Foods がインターネット上に公開されアメリカの主要⾷材に含まれる 6 種類のコリン化合物の含有量が掲載されている。
我々は、既に A ⼤学の⼥⼦学⽣ 19 名と B ⼤学の男⼦学⽣ 17 名に対し、季節変動を考慮して春夏秋冬で各３⽇間、における留め置き法を実施した。その結果、どの季節においても男⼥ともにアメリカの AI に⽐べて 50~60％の摂取量であった(データ未発表)。限界点として、アメリカ⼈と⽇本⼈の⾷⽣活の違いから、70 ⾷材しかデータベースよりコリン含有量が算出できていない。また、アメリカの AI を単純に⽇本⼈にあてはめることは出来ない。しかし、これらを⼗分に考慮しても⽇本⼈はコリン摂取量が不⾜している可能性が⽰唆される。
今回は、乳製品がコリン化合物の補給に役⽴つか検証する。また、コリン摂取とアセチルコリンの関係性に着⽬した。⽇本は、統計的に⾒て不眠⼤国であり、４⼈に１⼈が睡眠に関する不満を抱えていると⾔われている。そこで、睡眠の機能にはコリン作動性細胞が関わっていることが知られているため、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンを豊富に含む⾷品、特に⽜乳を⻑期摂取した時に睡眠にどのような影響を与えるか検証した。

1

Ⅱ 実験
Ⅱ−1

乳製品摂取後の⾎中コリン化合物濃度の変化《被験者》
⼼⾝共に健康な成⼈(⼤学⽣)男性４名・⼥性３名を対象に⾏った。
被験者候補に対してインフォームドコンセントを実施し、了解を得られた実験者候補を今回の実験の被験者とした。
《実験⽅法》
⽜乳（500ml）、ヨーグルト（400ｇ）、チーズ（クリームチーズ 18ｇ✕4 個）摂⾷する。
摂⾷前、摂⾷後 60 分、120 分、180 分後の計 4 回採⾎を実施し、速やかに⾎清を調整し、−80℃にコリン化合物測定時まで凍結保存した。
《コリン化合物の測定》
・サンプル調整
1. ⾎清 10μL に対してメタノール 90μL の割合で抽出する。
2. メタノールに⾎清を⼊れた後に超⾳波処理を５分間⾏う。
3. 10000rpm で 5 分間、遠⼼分離して変性したたんぱく質を除去する。
4. 上清を回収し、これを測定サンプルとする。
⽔溶性コリンの分析条件（LC-MS/MS）・HPLC 条件（⽇⽴ LC2000)
カラム：XBrtdgeBEH HILIC Column、130A、3.5µm、3.5µm
2.1mmX100mm、1/pkg
ウォーターズ製
流速：0.2ml/min、カラム温度：30℃、サンプル温度：10℃、
サンプル注⼊量：5µl
バッファーの組成：
A：0.2mM 酢酸アンモニウム p4.0
B：100%アセトニトリル
分析時間：20min
0 分から 3.2 分：A.18.5％、B.81.5％
3.2 分から 5 分：A.80％、B.20％
5 分から 14 分：A.80％、B.20％
14 分から 14.1 分：A.18.5％、B.81.5％
14.1 分から 20 分：A.18.5%、B.81.5％
バッファーのグラジエント条件
・MS/MS 条件
イオン化モード（ESI/positive)
検出イオンの M/z：コリン 104.1070、ホスコリン 184．0733、GPC258.1101
2

・その他
標品として以下のものを⽤いた。
コリン：Sigma C-7017、Choline Chlorideホスホコリン：Sigma P0378、Phosphosholine chloride calcium salt tetrahydrate
αGPC：⽇油株式会社
校正⽤標品：ギ酸ナトリウム（Burker 社）
分析⽅法：検量線法
脂質性コリンの分析条件（LC-MS）・HPLC 条件（⽇⽴ LC2000）
カラム：CAPCELL PAK C18 ACR、3µm、1.5mml.D.x100mm
⼤阪ソーダ製
流速：0.2ml/min、カラム温度：30℃、サンプル温度：10℃、
サンプル注⼊量：5µl、バッファーの組成：
A：100%アセトニトリル
B：5mM 酢酸アンモニウム pH4.0
分析時間：15min
0 分から 0.5 分：A.95％、B.5％
0.5 分から 2.5 分：A.40％、B.60％
2.5 分から 5 分：A.15％、B.85％
5 分から 8.5 分：A.5％、B.95％
8.5 分から 13.5 分：A.5%、B.95%
13.5 分から 13.6 分：A.95%、B.5%
13.6 分から 15 分：A.95%、B.5%
バッファーのグラジエント条件
内部標準法：標準品とサンプルを 1：19 の⽐率で混合し、内部標準のピーク⾯積より検出された PC の濃度を算出。1mM の標品を使⽤した
ため内部標準品は 50µM になっている。
標準品：PC,Avanti 社製、PC（12：0/12：0）
⽣体に存在していないリン脂質を使⽤。

Ⅱ−２

⽜乳の⻑期摂取による睡眠への影響《被験者》
⼼⾝共に健康な成⼈(⼤学⽣)男性 3 名・⼥性 3 名を対象に⾏った。
被験者候補に対してインフォームドコンセントを実施し、了解を得られた実験者候補
3

を今回の実験の被験者とした。
《実施期間》
2021/10/16〜11/16《実験⽅法》
⽜乳を 200ml/⽇飲み、介⼊期間中は睡眠⽇誌を記録し、就寝時、起床時前半・後半の 3つのアンケートを Google フォームより作成し、睡眠状態(睡眠時間や⼊眠・起床時間など)を検証した。同時に OSA 睡眠調査票 MA 版³⁾によって熟眠感への影響も調べ、正午にアンケートチェックをした。
また、摂取期間中の 1 か⽉間はアクチグラフ（アクチグラフ社製ｗGT3X-BT）を利き⼿とは逆の⼿⾸に装着し活動量を測定した。⼊浴時や都合により装着できない場合は取り外し可能とした。介⼊期間後に回収し、解析ソフト（ActiLife アクチライフ社製）を⽤い⼊眠から起床までをアンケートと照らし合わせながら⼊⼒した。睡眠量と睡眠効率はソフトを⽤いて解析を⾏った。
⼈権の保護及び法令等の遵守への対応
ヘルシンキ宣⾔(2008 年改訂)を遵守して実施し、仙台⽩百合⼥⼦⼤学に設置された倫理審査委員会に承認を得た。研究実施に係る⽣データ類および、同意書などを取り扱う
際は、被験者の秘密保護に⼗分配慮する。研究実施期間において得られた被験者のデータはすべて匿名化したうえで、仙台⽩百合⼥⼦⼤学⼈間学部健康栄養学科・⼤久保研究室において、研究代表者が責任をもって研究終了後、3 年間各種データを保管する。試験の結果を公表する際には、被験者を特定でき情報が含まれないようにした。試験の⽬的以外に、試験で得られた被験者のデータは使⽤しない。
解析⽅法（⼿⾸の活動量計から睡眠量を計測する）ActiLife を使い⼿動で⾏った。

図 1.1(上図)⼿⾸の活動量、図 1.2(下図)⼊浴時の活動量

4

Ⅲ 結果
乳製品摂取後の⾎中コリン化合物濃度の変化

図２）⽜乳摂取後⽔溶性コリン化合物の⾎中濃度の変化

図３）ヨーグルト摂取後⽔溶性コリン化合物の⾎中濃度の変化

図４）チーズ摂取後⽔溶性コリン化合物の⾎中濃度の変化
遊離コリン、ホスホコリンは共に摂取後 120 分後に５μM 程度であるが、有意に⾎中濃度に上昇した。⼀⽅、グリセロホスホコリンに関しては、顕著な変化はみとめら

5⽜乳の⻑期摂取による睡眠への影響
アンケートとアクチグラフの解析から、睡眠時間と睡眠効率を算出した。図２は 1 か⽉の睡眠時間を個⼈別評価したものである。個⼈によって睡眠時間の差が⼤きいが、有意な差は⾒られなかった。昼寝をしている⼈はその⽇の睡眠時間に含めたため、昼寝時間が多いと睡眠時間も多くなっている。
図５の睡眠効率も個⼈の差が⼤きいが有意な差は⾒られなかった。アクチライフの解析
結果、夜の睡眠や⻑い睡眠の睡眠効率は⾼いが、昼寝などの短時間の睡眠効率は低い。そのため、昼寝をしている⼈は昼寝時の睡眠効率と就寝時の睡眠効率の平均を出したため低くなる傾向にあった（図６）。
1 か⽉間を 4 週に分け、1 週⽬は 2021 年 10 ⽉ 18 ⽇から 10 ⽉ 25 ⽇、2 週⽬は 2021
年 10 ⽉ 26 ⽇から 11 ⽉ 1 ⽇、3 週⽬は 2021 年 11 ⽉ 2 ⽇から 11 ⽉ 8 ⽇、4 週⽬は 2021
年 11 ⽉ 9 ⽇から 11 ⽉ 16 ⽇までとした。

800700時間(min)600500400300200100sub3sub4sub5

2021/11/152021/11/13

2021/11/11

2021/11/9

2021/11/7

2021/11/5

2021/11/3

2021/11/1

2021/10/30

2021/10/28

2021/10/26

2021/10/24

sub2

sub6

図５睡眠時間（個⼈）1008060

Sub1

sub2

sub3

sub4

6

sub5

sub6

2021/11/15

2021/11/13

2021/11/11

2021/11/9

2021/11/7

2021/11/5

2021/11/3

2021/11/1

2021/10/30

2021/10/28

2021/10/26

2021/10/24

2021/10/22

2021/10/20

2021/10/18

40
2021/10/16

睡眠効率(％）

Sub1

2021/10/22

2021/10/20

2021/10/18

2021/10/160

図６睡眠効率（個⼈）図７，８，９は睡眠時間を 4 週に分け、さらに男⼥別と合計を出した。結果は⽜乳の⻑期的摂取による睡眠時間の変化に有意な差は⾒られなかった。図 10，11，12 は睡眠効率を細分化させたもので、これも⽜乳の⻑期的摂取による有意な差は⾒られなかったが、⼥性より男性のほうが睡眠効率向上の効果を期待されることが⽰唆された。

睡眠時間（min）

600
500
400
300
200
1000
1週⽬

2週⽬

3週⽬

4週⽬

摂取期間

図７睡眠時間（合計）睡眠時間（min）

600
500
400
300
200
1000
1週⽬

2週⽬

3週⽬

4週⽬

摂取期間

図８睡眠時間（男）睡眠時間（min）

600
500
400
300
200
1000
1週⽬

2週⽬

3週⽬

摂取期間

図９睡眠時間（⼥）
74週⽬

睡眠効率（％）

10095908580
1週⽬

2週⽬

3週⽬

4週⽬

摂取期間
合計

図 10 睡眠効率（合計）

睡眠効率（％）

10095908580
1週⽬

2週⽬

3週⽬

4週⽬

摂取期間
男

図 11 睡眠効率（男）睡眠効率（％）

1009590

85

80
1週⽬

2週⽬

3週⽬

摂取期間
⼥

図 12 睡眠効率（⼥）
84週⽬睡眠⽇誌アンケートから、起床時眠気・⼊眠と睡眠維持・夢⾒・疲労回復・睡眠時間を標準化得点化させたものが図 13,14,15 である。これらも 1 か⽉を 4 週に分け、男⼥別と合計を算出した。結果、起床時眠気は低減され夢⾒もよくなる傾向にあった。疲労回復や睡眠時間は男性のほうが向上しているが、統計的に有意な差は⾒られなかった。
70.0

合計

60.0

標準化得点

50.0

1週⽬

40.0
2週⽬

30.0
20.0

3週⽬

10.0
4週⽬
0.0
起床時眠気

⼊眠と睡眠維持

夢⾒

疲労回復

睡眠時間

図 13 標準化得点（合計）
70.0

男60.0

標準化得点

50.0

1週⽬

40.0
2週⽬

30.0
20.0

3週⽬

10.0

4週⽬

0.0
起床時眠気

⼊眠と睡眠維持夢⾒

疲労回復

睡眠時間

図 14 標準化得点（男）
70.0

⼥

60.0

標準化得点

50.0

1週⽬

40.0
2週⽬

30.0
20.0

3週⽬

10.0

4週⽬

0.0
起床時眠気

⼊眠と睡眠維持夢⾒

疲労回復

図 15 標準化得点（⼥）
9

睡眠時間

図 16 から 21 は活動量計のグラフを解析ソフトであるアクチライフを⽤いて⼿動で睡眠量を計測したものである。判定を⼀定にするため計測は同じヒトが⾏った。

図 16 活動量計・睡眠量の結果 Sub1

図 18

図 17

図 19

活動量計・睡眠量の結果 Sub3

10活動量計・睡眠量の結果 Sub2

活動量計・睡眠量の結果 Sub4

図 20

図 21

活動量計・睡眠量の結果 Sub5

図 22

活動量計・睡眠量の結果 Sub6

⻑期⽜乳摂取試験前後での⽔溶性コリン化合物の変化

11

図 23

⻑期⽜乳摂取試験前後での脂溶性コリン化合物の変化

図 22,23 より⻑期に⽜乳を摂取した時の⾎中コリン化合物の濃度への影響を⾒た結果、⽔溶性コリン化合物ではあまり影響が⾒られず、脂溶性コリン化合物では含油量の多い分⼦量 758、786 のホスファチジルコリンが有意差は認められなかったが、上昇傾向にあった。
Ⅳ 考察
乳製品を摂取することで⼀過的に 5μM 程度と僅かではあるが、⾎中の⽔溶性コリン化合物の濃度が上昇した。また、⽜乳を⻑期摂取した場合も、脂溶性コリン化合物の⾎中濃度が有意差は認めらなかったが増加傾向を⽰した。このことは、⽇常的に乳製品を取り続けると、コリン化合物補給には⼀つの有効な⾷材である可能性が⽰唆された。
⼀⽅、⽜乳を継続的に⻑期摂取している⼈と摂取していない⼈では、睡眠の質が異なるのではないか、⻑期摂取している⼈のほうが睡眠の質が良いのではないかと考えた。巷では、ホットミルクを摂取すると、睡眠に良いとも⾔われている。
今回の結果では、⽜乳に含まれるコリン化合物の⻑期的摂取における睡眠効率に有意な差は⾒られなかったため、⽜乳の⻑期摂取が睡眠効率を上げる直接的な原因になるという結論は得られなかった。しかし、前述の通り、⽜乳を摂取すると僅かな変化ではあるが、⾎中のコリン化合物濃度が上昇する傾向が確認されている。
⽜乳は⾷品であるため、医薬品のような薬効は認められない。このことは、⽜乳の⻑期摂取よりも普段の⽣活リズムの影響の⽅が⼤きいことが⽰唆される。故に、今回のように学⽣を被験者にするよりも、ある程度⽣活リズムの乱れが少ない被験者で実験を⾏うと異なる結果が得られる可能性がある。更に、昼寝などの短時間の睡眠効率は低いため、昼寝
12時の睡眠効率と就寝時の睡眠効率を平均すると値が低くなる傾向にあったことから、昼寝時の睡眠効率を含めない場合では結果が変わる可能性が考えられた。
睡眠⽇誌アンケートからは、起床時眠気は低減され夢⾒もよくなる傾向にあった。⼀
⽅、疲労回復や睡眠時間は統計的に有意な差は⾒られなかった。そして、明確ではないが性差があるように感じられた。男性のほうが睡眠の改善を体感していることから⼥性よりコリン化合物摂取の影響を受けやすいのではないかと考えた。もしくは、⼥性は産褥期にコリン化合物を必要とするため、男性よりも必要量が多く今回の⽜乳だけでは⼗分にコリン化合物を摂取できなかったとも考えられる。このことから、睡眠効率の性差とコリン化合物の摂取について今後も引き続き検証する必要があると考える。
今回は、睡眠効率（⽣理的な変化）に着⽬したところ有意な差は⾒られなかった。しかし、特に⽜乳は⼀過的な摂取でも⻑期摂取でも⾎中のコリン化合物濃度を上昇させる可能性がある。そして、アンケート結果から寝起きや夢⾒などの改善効果が体感されているため、コリン化合物を普段の⾷事から摂取することで活動的になり、健康維持のためにも⼤切である可能性が⽰唆される。
本実験の限界点として、被験者が少ないためｎ数を増やすことが今後の課題になる。
今後も被験者数を増やすことにより詳細な睡眠解析とコリン化合物摂取との関係性を統計的に検証していく必要がある。

Ⅴ 謝辞
本研究を進めるにあたり、東北⼯業⼤学の⾟島彰洋先⽣と⼤堀萌奈さんには、睡眠の解析ソフトや解析⽅法などでお世話になりました。採⾎では仙台⼤学の福⽥伸雄先⽣にお世話になりました。厚く御礼申し上げます。最後に被験者としてご協⼒いただいた皆様にも、⼼より感謝の意を表します。

Ⅵ 参考⽂献1)Nutr Rev.2006,64(4),p197-203.
2)FASEB J.1991,5(7),p2093-8.
3) 脳と精神の医学

1999,10,p401-409

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