2021 年 9 月 16 日

天然核酸に高親和性を示す
人工核酸：アルキニル核酸
富山大学

学術研究部

薬学・和漢系

准教授

千葉 順哉

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新技術（アルキニル核酸）の概要
リン酸ジエステル
人工核酸塩基アルキニルリボース

R = H （アルキニル DNA）
OH（アルキニル RNA）

・ 人工鎖どうしで安定なハイブリッド形成
・ 天然核酸に対しても高い親和性
・ アルキニル RNA / 天然 DNA ハイブリッドが最安定

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DNA

転写

複製

逆転写

RNA

翻訳
Protein

複製セントラルドグマ

人工骨格の介入
バイオテクノロジー

創薬

生命科学
生命系と人工系の接点材料

ナノテクノロジー
3

DNA の化学構造
A

T

GC

核酸塩基
デオキシリボース
リン酸ジエステル

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完全人工 DNA の創成
A*

T*

G*

C*

非天然核酸塩基（水素結合性）
アルキニル
デオキシリボース
リン酸ジエステル

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完全人工 DNA5'-d(T*A*T*T*G*C*T*A*T*T*)/ 3'-d(A*T*A*A*C*G*A*T*A*A*) : アンチパラレル配向
UV-vis スペクトル

Tm 測定 (λ = 303 nm)

10 ˚C48 ˚C

70 ˚C(測定条件：1.0 µM duplex, 10 mM Hepes (pH 7.0), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl)

5'-d(T*D*T*T*G*C*T*D*T*T*)/ 5'-d(D*T*D*D*C*G*D*T*D*D*) : パラレル配向
明確な Tm 値を示さず
6化学量論比5'-d(T*A*T*T*G*C*T*A*T*T*)/ 3'-d(A*T*A*A*C*G*A*T*A*A*)
Job’s plot

化学量論比 = 1 : 1

人工 DNA は二重鎖を形成(測定条件：[全人工 DNA ] = 1.0 µM, 10 mM Hepes (pH 7.0), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl)

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人工 DNA の高次構造の推定5'-d(T*A*T*T*G*C*T*A*T*T*)/ 3’-d(A*T*A*A*C*G*A*T*A*A*)
CD スペクトル
10 ˚C
70 ˚C

CD スペクトルで第 1 コットンが正右巻き二重らせんの構造を示唆(測定条件：1.0 µM duplex, 10 mM Hepes (pH 7.0), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl)

8

人工 DNA と天然 DNA の Tm 値の比較
entry

配列

Tm (˚C)天然 DNA の Tm (˚C)

∆Tm (˚C)

15'-d(T*D*D*T*D*T*D*T*T*D*)

3912+2725'-d(T*D*D*T*G*C*D*T*T*D*)

5131+2035'-d(T*G*D*T*G*C*D*T*C*D*)

6240+2245'-d(T*D*T*T*G*C*T*D*T*T*)/ 3'-d(D*T*D*D*C*G*D*T*D*D*)

4828+20(測定条件：1.0 µM duplex, 10 mM Hepes (pH 7.0), 10 mM MgCl2, and 100 mM NaCl)

天然 DNA よりも強固な二重鎖を形成した理由の考察

天然 A/T 塩基対にはない３点目の水素結合

シアノ基の π スタッキング
9人工 DNA の MacroModel 計算
5'-d(T*C*D*G*)5/3'-d(D*G*T*C*)5

構造上の特徴人工 DNA天然 DNA

幅2.25 nm2 nm

10 塩基分の長さ3.65 nm

3.4 nm

一巻きの塩基数

13 bp

10 bpMacroModel (version 9.3 with OPLS2005)10核酸関連酵素反応への展開
核酸連結反応Template

Template

3′5′3′5′T4 DNA
Ligasenick
連結

5′3′3′5′11一塩基伸長反応

Klenow fragment

A*

TT*

A

G*

CC*

G

アルキニル C-ヌクレオチドは DNA ポリメラーゼに基質として認識された
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アルキニル RNA への展開
PyA*

T*

Base
天然ATと同様な二点水素結合
G*

C*

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r(T*)16 / d(A)1610 ˚C
80 ˚C

測定条件 : [Duplex] = 2 μM,
10 mM HEPES, 10 mM MgCl2,
100 mM NaCl, Ramp rate = 1.0 °C

14(人工 / 天然) 型と (天然 / 天然) 型の比較

人工 / 天然天然 / 天然Duplexes

Tm (°C)r(T*)16 / d(A)1671.0r(T*)16 / r(A)1649.5d(T*)16 / d(A)1640.5r(U)16 / d(A)1639.0d(T)16 / d(A)1648.5

測定条件 : [Duplex] = 2 μM, 10 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, Ramp rate = 1.0 °C
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人工二重鎖の Tm 値

人工 /人工人工 / 天然

Duplexes

Tm (°C)r(T*)16 / r(PyA*)1655.0r(T*)16 / d(PyA*)1634.0d(T*)16 / d(PyA*)1624.5r(T*)16 / d(A)1671.0(再掲)r(T*)16 / r(A)1649.5(再掲)

測定条件 : [Duplex] = 2 μM, 10 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, Ramp rate = 1.0 °C
16従来技術では天然核酸に高い親和性を示す人工核酸として
PNA や BNA (LNA) などが挙げられる。
PNA

BNA

(Peptide Nucleic Acid)(Bridged Nucleic Acid)

・人工核酸鎖どうしのハイブリッドが最安定
・PNA は長鎖で水に難溶性
・BNA は天然 RNA に高い親和性
17新技術の特徴・従来技術との比較• アルキニル核酸は，人工核酸鎖どうしのハイブリッド形成だけでなく，天然核酸鎖との二重鎖形成においても高い親和性を示した。
• アルキニル核酸は，通常の合成機でオリゴマーが得られた。また，いくつかの核酸関連酵素に適用可能であった。
• アルキニル RNA では，人工核酸鎖どうしのハイブリッドよりも，天然核酸鎖 （特に DNA鎖） とのハイブリッドが安定であった。
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想定される用途• 基板上での天然核酸鎖の捕捉・検出• 溶液内での核酸検出・診断• アンチジーン・アンチセンスなどの核酸医薬• 核酸医薬におけるオフターゲット検出技術• モノマーレベルでのポリメラーゼ阻害剤などへの展開
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今後の課題• 膜透過性，細胞内安定性評価• 血中安定性，動態評価• 自己免疫に対する評価• アルキニル RNA の人工塩基 ４ 種達成

20企業への期待• 基板上や溶液内での，核酸検出・診断技術• 核酸医薬や核酸系抗ウイルス剤の評価系• 核酸系材料としての評価系

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：人工核酸• 出願番号 ：特願2020-036320
• 出願人
：富山大学
• 発明者
：千葉順哉，井上将彦，黒崎史大

22産学連携の経歴• 2015年-2016年
JST A-STEP事業 FS 探索タイプに採択「新規クリック反応（スルホニルアジドとチオアミド）を用いる試薬開発」• 2016年-2018年
研究成果有体物提供および試薬の製品化：東京化成工業株式会社にて23

お問い合わせ先
国立大学法人 富山大学
研究推進機構 学術研究・産学連携本部
及川 信三
ＴＥＬ 076－445 －6936
ＦＡＸ 076－445 －6397
e-mail t-sangyo＠adm.u-toyama.ac.jp

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