2022/03/31

報告２−５
報告書

エクソソームの簡便定量法による乳製品の新規機能及び規格の構築

岐⾩⼤学⼤学院
⼯学部

連合創薬医療情報研究科
化学・⽣命⼯学科⽵森洋

1. 要旨エクソソームは細胞から分泌される微細な細胞外⼩胞で、培養細胞上清のみならず、⾎液、⺟乳などに存在しその機能が着⽬されている。しかし、エクソソームのサイズが 100 nm 前
後と⼩さいことに加えて、⽣物種を超えた定量⽅法が存在しないことが、産業応⽤において障壁となっている。
GIF-2250 は⽣細胞特異的な環境応答性の細胞内⼩胞ライブイメージャーである。⼀⽅で、“⽣きているとは⾔えない”エクソソームも染⾊可能である。そこで本研究では、エクソソー
ムを⼤量に含有する⽜乳（ミルク）を原料として、GIF-2250 の標的物質を探索することでエクソソームを染⾊できる機構を解明した。また、GIF-2250 が簡便にエクソソームを定量できることを利⽤し、⽜乳からミルクエクソソームの⼤量・簡便精製法を開発し、その⽣理活性作⽤の探求に役⽴てた。
ミルクエクソソームに⼤量に含有される物質を GIF-2250 の標的物質と想定し蛍光強度で評価した。結果、リン脂質、RNA、NAD+などと反応することが判明した。新鮮及び劣化
ミルクエクソソームで⽐較したところ、GIF-2250 の輝度に違いが観察された。次に、市販の⽜乳からエクソソームを簡便に精製する⽅法を構築した。結果、新鮮な低温殺菌⽜乳にミルクエクソソームの⼤量含有が⽰された。また、エクソソームマーカー(CD9・CD81)量とGIF-2250 の輝度に相関が⽰された。更に⾼温殺菌⽜乳を原料としたヨーグルトから乳酸菌由来と予想される乳酸菌エクソソームも⼤量に精製することもできた。
これらエクソソームの⽣理作⽤を培養細胞でスクリーニングしたところ、抗炎症活性が⾒出せた。我々独⾃の炎症症腸疾患モデルで効果を検証したところ、痔に対して効果が確認できた。以上より、GIF-2250 はミルクエクソソームの簡便定量及び品質評価・管理での利⽤が期待される。今後は GIF-2250 を利⽤した⾷品・化粧品分野でのエクソソーム品質評価
⽅法に対する JIS 規格策定や、新たな臨床検査プローブとしての開発を⽬指す。

1

緒⾔
エクソソームは細胞から分泌される直径 100nm 前後の細胞外⼩胞である。エクソソーム
は、培養細胞上清だけではなく、⾎液、尿、唾液、⽺⽔、⺟乳などの様々な体液から検出・精製することができる 1-4)。エクソソーム膜の主成分は脂質とタンパク質である。膜にはエクソソームマーカータンパク質である CD9、CD81、CD63 というタンパク質が発現している。また、内部にはタンパク質に加えてマイクロ RNA（miRNA）など様々な核酸が含まれている。内部の核酸情報は起源細胞に基づくためエクソソームは細胞間の情報伝達の役割を担っている 1, 5-7)。
エクソソームは近年、ドラッグデリバリーシステム（DDS）として再⽣医療分野での応⽤が期待されている 8)。更に、化粧品分野では抗シワ・肌のバリア機能の強化・傷治癒効果・
抗⽼化作⽤が報告されている 9)。そのため⽪膚再⽣や若返り効果の期待からも注⽬が⾼まっている。しかし、エクソソームはサイズが⼩さいことに加えて、定量の標準的⼿法が存在しないことが産業応⽤への課題となっている。今回はエクソソームとして⽜乳に含まれるミ
ルクエクソソームに着⽬した。
⽜乳にはカゼインというタンパク質がタンパク質の 8 割を占めている 10)。カゼインはセリン残基にリン酸が結合したリンタンパク質である 11)。そのため、カゼインは、分⼦全体としてマイナスの電荷を帯びており、カルシウムイオンと結びつきやすい。⽜乳中ではカルシウムと結合してカルシウム-カゼイン-リン酸複合体の形で存在している。この時、カゼイ
ンのうち⽔溶性の⾼い k-casein の働きでミセルを形成している 12 ,13)。カゼインは安定剤として、不溶性成分が析出することのなく均質な状態を⻑時間保つ役割を果たしている。また、カゼインは等電点が pH4.6 である。等電点下では、⽜乳から容易に分離することも可能であり、酢酸を⽜乳に加えて pH を等電点にすることでカゼインを分離し、余分なタンパク質
を除け、エクソソームを精製できると予想される。
エクソソームの精製は試薬を使った⽅法 14)（Tim4-磁気ビーズ 15)）、超遠⼼ 16,17)、などが挙げられる。これらは、コストが⾼い。例えば超遠⼼であると数千万円の機械が必要であり、試薬や磁気ビーズも購⼊には数⼗万円が必要である。精製済みミルクエクソソームは、市販
では、100μg/mL の濃度が 1mL あたり 3 万円で販売されている。そこで、今回はコストをできるだけ抑え短時間で⼤量精製する⽅法の構築も⽬指した。
岐⾩⼤学では、約 2000 種以上の化合物ライブラリーからメラニン産⽣抑制剤の探索を⾏ってきた。その中でも岐⾩⼤学⼯学部古⽥（分担研究者）が合成した GIF-化合物に、メラニン産⽣抑制および神経保護作⽤を⽰すことが分担研究者の森⽥と共に⾒出した。GIF化合物の作⽤機序を解明するための蛍光化 GIF-化合物として、GIF-2250 の細胞内動態を検討したところ、マウスメラノーマ B16F10 細胞の細胞内⼩胞を可視化できることを⾒出した。⼀⽅、死細胞では細胞内⼩胞を可視化することができなかった。そのため GIF-2250
は⽣細胞特異的であることが判明した。また、その染⾊標的はメラノソームやエクソソーム
及びリソソームを含む後期エンドソーム由来の⼩胞であることが判明した。
2

Figure 1

GIF-2250 の細胞染⾊

Figure 2

GIF-2250 標的⼩胞

そこで本研究では、GIF-2250 の標的物質の解明を⾏った。そして、⽣細胞と異なり“⽣きているとは⾔えない”エクソソームがなぜ光るのかを解明した。GIF-2250 がエクソソームと反応し光ることを利⽤してエクソソームの定量や評価を⽬指した。加えて、GIF-2250 が簡便にエクソソームの定量が可能であることを利⽤して、市販の⽜乳から⽜乳由来エクソ
ソーム（ミルクエクソソーム）の精製⽅法の確⽴を⽬指した。また、このミルクエクソームや偶然⾒出した乳酸菌エクソソームの⽣理作⽤も検討した。
3

以下に GIF-2250 の構造を⽰す。

Figure 3

GIF-2250

研究計画
本研究では、計画書に記載したように２つの⽬標を達成する。
１）新規蛍光化合物の結合標的の同定と社会実装のための応用
２）乳製品中のエクソソームの細胞導入効率と生理作用(病態改善効果)の検証
⽅法
1 蛍光強度測定
GIF-2250 の標的物質を解明するため、マイクロプレートリーダーを⽤いて蛍光強度を測定した。96 well plate (96 Well Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with
Lid FALCON®) に PBS 90 µL/well をベースとし、様々な試薬を 10 µL/well で各 well に⼊れた(n=3)。試薬の終濃度は 10 mM となるように加えた。ここに GIF-2250 を終濃度 3µM となるように加え、Blank には PBS を加えた。EX =490 nm , EM=510~570 nm のフィ
ルターを⽤いて、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。⽤いた試薬は Table１に⽰す。
今後、試薬の名称は略称で⽰す。
Table 1リン脂質・核酸

略称

正式名称

メーカー

PC

3-sn-Phosphatidylcholine, from Egg Yolk

Wako

PS

Phosphatidylserines(soy) (sodium salt)

CAY

PI

L-α-Phosphatidylinositol Sodium Salt from Soybean

ナカライテスクPE

Phosphatidylethanolamine

SRL

略称

正式名称

メーカー

ATP

Adenosine-5'-triphosphate Disodium Salt Hydrate

ナカライテスクfrom Yeast
4

ADP

Adenosine 5'-Diphosphate Disodium Salt

東京化成

AMP

5'-Adenylic Acid

東京化成

Adenosine

Adenosine

東京化成

AdenineAdenine (6-Aminopurine)

Wako

R5P

Ribose-5-phosphate Sodium Salt

ナカライテスクUTP

Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate

SIGMA

GTP

Guanosine-5'-triphosphate Disodium Salt

ナカライテスク

CTP

Cytidine 5'-triphosphate disodium salt

SIGMA

IMP

Inosine 5'-Monophosphate Disodium Salt n-Hydrate,

Wako

from Yeast
dNTPs

dNTP Set, PCR Grade 100mM, 4×100μL

QIAGENNAD+

β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide

ナカライテスク

NADH

β -Diphosphopyridine Nucleotide Disodium Salt,

Wako

Reduced form
2 蛍光強度撮影
0.2 ml 8 連 PCR チューブ(ドームキャップ：カーク）に PBS 90 µL、試薬を終濃度 10 mMになるように 10 µL ⼊れた。ここに GIF-2250 を終濃度 3 µM になるように加え混合し遠⼼した。チューブを ChemiDOC XRS+imaging system（Bio-Rad）を⽤いて撮影し蛍光強度を可視化した。
3-3 細胞培養
マウスメラノーマ由来 B16F10 細胞を 10% の FETAL BOVINE SERUM (FBS) (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA) と 0.6% の ペ ニ シ リ ン - ス ト レ プ ト マ イ シ ン を 含 む
Dulbeccoʼs Modified Eagleʼs Medium (DMEM) (High Glucose) (Sigma-Aldrich）を培地として、5% CO2 存在下 37℃で培養し、トリプシン処理により 2 ⽇毎に新しい Cell Culture
Dish (ASONE Co., Ltd., Osaka, Japan) に移して継代した。
ヒト胎児腎由来 HEK293 細胞を 10% の FBS と 0.6% のペニシリン-ストレプトマイシ
ンを含む DMEM (Low Glucose) (Sigma-Aldric）を培地として、5% CO2 存在下 37℃で培養し、トリプシン処理により 2 ⽇毎に新しい Cell Culture Dish に移して継代した。
RAW264.7 マクロファージは、RPMI 培地(Sigma-Aldrich）（10%⾮動化⾎清）で 5% CO2
存在下 37℃で培養し、トリプシン処理により 2 ⽇毎に新しい Cell Culture Dish に移して継代した。
4 顕微鏡観察5

細胞の蛍光観察は、オールインワン蛍光顕微鏡 BIOREVO BZ-9000 (Keyence, TOKYO,
Japan) で、撮影した。イメージングは撮影した画像を、Imaji J Fiji（https://imagej.nih.gov）
プログラムを使⽤して取得した。全ての画像処理は BZ-ⅡAnalyzer (Keyence, TOKYO,
Japan) プログラムを使⽤して実⾏した。
2250 誘導体は、観察の直前に終濃度 1 µM となるように処理した。
（NAD+上昇による GIF-2250 の輝度）3-3 で培養した B16F10 細胞を播種して⼀晩経過した Glass Bottom Culture Dish GBCD15(ASONE) に GIF-2250 を終濃度 0.5 μM で加え顕微鏡で観察した。次に培地に 2-DeoxyD-glucose（Wako）を 3,500 mg/L となるように加え、培地交換後 3 時間培養した。その後、GIF-2250 を終濃度 0.5μM で加え顕微鏡で観察した。
5 NAD+アッセイ
NAD/NADH Assay Kit-WST （ Dojindo laboratories, Kumamoto, Japan ） を ⽤ い て
NAD+/NADH を測定した。B16F10 細胞を、6 well plate に 5×105cells / well で播種し、5％CO2、37℃条件下で⼀晩培養した。培養後、2-Deoxy-D-glucose 培地に交換して 5％CO2、37℃条件下で 3 時間培養した。その後、トリプシン処理により細胞を回収し、キットのプ
ロトコルに沿って⾏い 450nm の吸光度を測定した。Standard solution の吸光度から検量線を作製し、検量線からサンプルの NADH 量、総量を求めた。NAD+量を総量と NADH 量の差から求め、NAD＋/NADH を算出した。
6 ミルクエクソソームの精製
市販の⽜乳を使⽤しミルクエクソソームを簡単に精製する⽅法を試した。
市販の⽜乳は殺菌が義務付けられている(21)。⽜乳は殺菌⽅法の異なる 12 種と関⽜乳から頂いた⽣乳を使⽤した。使⽤した市販の⽜乳の⼀例を図 4 に⽰す。初めに、⽜乳 500ｍL を
High-Speed Refrigerated Centrifuge CR22GⅢ（HITACHI）で 8,000rpm 60min 遠⼼し、コーヒーフィルターを⽤いて析出した脂質を取り除いた。次に 50mL チューブに移し、酢酸（関東化学株式会社）を総量の 1/100 加え pH を等電点である pH4.6 付近とし、5min 間放置した後、High Speed Refrigerated Centrifuge 6500（KUBOTA）で 8,000×g 20min 遠⼼
し、コーヒーフィルターを⽤いて上清を回収した。0.45μm のポンプフィルター(Sartolab®
BT Vacuum Filtration Units 180A4-E, 0.45 µm Cellulose Acetate, 500 ml)を通し、0.1μm のポンプフィルター(Sartorius Sartolab™ RF Vacuum Filtration Units ,0.1µm polyethersulfone(PES), 500 ml)で濃縮した。0.1μm フィルターを PBS で洗浄した後、PBS 1mL で回収しミルクエクソソームサンプルとした。
(乳酸菌由来エクソソームの精製)

6ヨーグルトから乳酸菌由来のエクソソームを精製した。⾼温殺菌⽜乳を１L ビーカーに
500 ｍL ⼊れた。そこにスーパーケフィアヨーグルトたね菌 Plus(株式会社ロイヤルユ
キ,Tokyo, Japan)を 1 本⼊れて 25℃で 24 時間以上静置した。24 時間静置すると⽜乳が固ま
り出し、固形のヨーグルトが完成した。静置し続けるとヨーグルトとホエイが分離した。その様⼦をに⽰した。ホエイを 50 mL チューブに移し、8,000 rpm で 20 min 遠⼼した。遠⼼
後、余分な脂質を取り除くためにコーヒーフィルターでろ過した。10 ｍL シリンジを使⽤し、ホエイ 10 mL で 1.2 μm(CA)→0.8 μm(CA)→0.45 μm(PES)の順にフィルターろ過を⾏った。使⽤したフィルターは Table 2 に⽰した。ホエイを流した後、フィルターを洗浄するために 2 mL の PBS を流した。フィルター済みの溶液を 0.1 μm、300 K、のフィルタ
ーで 13,000 rpm 10 min、1000 K のフィルターで 5,000 rpm 15 min 遠⼼を繰り返し濃縮した。濃縮後フィルターを 500 μL の PBS で洗浄し、PBS 200 μL で回収した。

Figure 4

使⽤した⽜乳Table 2

使⽤したフィルター

⼤きさと素材

正式名称

メーカー

1.2 μmMinisart® Single use filter unit. Non-

Sartorius

pyrogenic. CA 1.2

biotechCA

stedim

0.8 μmCA

SINGLE USE FILTER UNIT 0.80 μm CA

GVS

0.45 μm

PES

Sterile Syringe Filter33mm Hydrophilic PES

Hawach Scientific0.45 μm
0.1 μmPVDF

Ultrafreer®-MC-VV

Centrifugal

Filters

Merck

Microcon®-300 Centrifugal Filters Biomax®

Merck

Durapore®PDVF 0.1 μm
300 K

PES

300kDa Membrane Polyethersulfone(PES)
membrane 300,000 NMWL
1000 KPES

Vivaspin®20

SARTORIUS

Membrane: 1,000,000MWCO PES
7

7

エクソソーム定量
回収したミルクエクソソームで GIF-2250 の蛍光強度を測定した。

96well plate (96 Well Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid
FALCON®) に PBS 90 µL/well をベースとし、ミルクエクソソームを 10 µL/well で各 wellに⼊れた(n=3)。ここに GIF-2250 を終濃度 3 µM となるように加え、Blank には PBS を加えた。EX=490 nm , EM=510~570 nm の蛍光フィルターを⽤いて、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。検量線は、PBS の希釈率を変えて作成した。
8 ウエスタンブロット解析
電気泳動⽤サンプルを 10%、15%SDS-PAGE ゲルで電気泳動（200 V、33 ｍA 、1 時間）
しタンパクを分離した。泳動後、Trans-Blot® SD semi-dry transfer cell ( Bio-Rad )を⽤いて、メタノールで親⽔処理した PVDF 膜に、ゲル上のタンパク質を 25V、1 時間かけて転写した。PVDF 膜を TBS-T に溶解した 0.5%スキムミルクで 1 時間振盪させてブロッキングを⾏った。1 時間後、TBS-T で 5 分間洗浄した。洗浄後、⼀次抗体 （CD9: Wako； CD81:
Wako )を 20 % Blocking One /TBS-T で抗原抗体反応を⼀晩かけて⾏った。翌⽇、PVDF 膜を TBS-T で 5 分×3 回洗浄した後、⼆次抗体（anti-mouse IgG-HRP）を 20 % Blocking
One /TBS で 1:5000 に希釈した溶液中で、2-3 時間反応させた。2 次抗体反応後、TBS で 5
分×4 回洗浄し、EzWestLumi plus（ATTO Corporation）に浸して発⾊させ、ChemiDOC
XRS+imaging system（Bio-Rad）を⽤いて撮影した。
(タンパク質発現量の数値化)
ウエスタンブロット解析で ChemiDOC XRS+imaging system（Bio-Rad）を⽤いて撮影した後、数値化を⾏った。ChemiDOC XRS+imaging system（Bio-Rad）内の Volume Tools を使⽤した。バンドを Rectangle で囲い Analysis Table で数値を出した。バンドの濃さはメン
ブレンのバックグラウンドの数値を引いて求めた。
9 エクソソーム観察
エクソソーム染⾊試薬には ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red (Dojindolaboratories, Kumamoto, Japan) を⽤いた。初めに、100 µg/mL のミルクエクソソーム(Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan)と精製したミルクエクソソームをそれぞれ 1.5 mL チューブにとり、キット付属の染⾊⽤試薬 Mem Dye-Red 1µL と 2250 終濃度 1 µM を加えた。
プロトコルに従ってミルクエクソソームを染⾊した。2250 で染⾊したエクソソームを、Microscope Cover Glasses Laminillas Cubreobjetos（Deckgläser）にのせて 3-4 と同様に観察した。
10

Fluore HPLC-ゲル濾過解析
8エクソソームの蛍光標識と限外濾過によるサイズ分画の技術を組み合わせたエクソソーム定量法を構築した。概要を Figure 5 に⽰した。また、タイムプログラムを Table 2 に⽰した。

Figure 5

Fluore HPL-ゲル濾過解析機の概要

Table 3

タイムテーブル時間(min)

ユニット

処理命令

数値

0.10

ポンプ

A.Flow

1

0.10

ポンプ

B.Flow0

0.10

RF-10AXL

Emission Wavelength

EM※

0.10

RF-10AXL

Excitation Wavelength

EX※

0.10

SPD-10AVP

Absorption Wavelength

280

0.10

オートサンプラ

Inject-0.10

カラムオーブン

Oven Temp

40

0.10

コントローラ

Start

-

0.10

RF-10AXL

Zero

-

0.10

SPD-10AVP

Zero-

溶離液には 1M Tris HCl pH6.8 を終濃度 10mM、NaCl を終濃度 150mM、EDTA を終濃度
0.25mM になるように dH2O で調整した。
限外濾過システムの流量は 1mL/min、注⼊量は 10 µL で⾏った。
UV-VIS DETECTOR の波⻑を 280nm に設定し、FLUORESCENCE DETECTOR は化合物によって最適な条件に励起/蛍光波⻑を設定した。ExoSparkler の励起/蛍光波⻑である
560/600nm と Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 488) ab150077 (abcam)の励起/蛍光波⻑である 490/520nm に設定した。
11 抗炎症活性（培養細胞）⼀酸化窒素（NO）産出測定
9

培地に含まれる NO 産生量は、NO 産生物の濃度を示す Griess 試薬(19)を用いて測定した。
Griess 試薬は、NO の酸化生成物 NO2 とカップリング反応して 560 nm が吸収極大波長であるジアゾ化合物を生成するため、吸光度の測定により簡易的かつ正確に NO 産生量を測定できる。48-well plate に RAW264.7 細胞を 2×105 個 /well で播種し、18 時間ほど 37 ℃でインキュベートさせた後、Lipopolysaccharide (LPS)（500 ng/mL）（Wako）とエクソソームを含んだ RPMI1640 の無血清培地を 300 µL/well 加えて 12 時間インキュベートした。上清 100 µL
を別のウェルに移し、そこに Griess 試薬を 100 µL 加え 30 分室温で放置した後、Glomax Multi
Detection Syste（Promega, Madison, WI, USA）を用いて 560 nm の吸収極大波長における吸光度を測定した。
12

抗炎症活性（in vivo）

マウスは 8:00-20:00 の明暗サイクルで飼育した。飼料 CE-2(クレア社, 組換え DNA 実験
は（30−041）、動物実験は（2021−155）の承認で実施した。
SIK3-KO :: hSIK3 の変異マウスのうち、約半年たち僅かながら肛⾨が⾚いマウスをマークした。ステロイドとしてプレドニゾロン吉草酸エステル（Kowa, Aichi）を 100 µL 程度を
1 日一回塗布した。また、エクソソーム(10 mg/ml)を 1mg を 1：1 でワセリン(Wako)に混ぜ込
み同様に塗布した。両者の処置は、プレドニゾロン吉草酸エステルへエクソソームを等量混ぜた。1 ヶ⽉間の連続塗布（⼟・⽇は休薬）とし、１ヶ⽉後の⾚みの度合いを評価した（病態進⾏と進⾏抑制）。進⾏抑制と判断された場合も、念のため、さらに１ヶ⽉間の⾮投与期間を設定し、差がないことを確認した。

実験結果
1 リン脂質膜との反応性
GIF-2250 がエクソソームと反応し光るのがなぜか調べるために標的が何かを調べることにした。まず、エクソソームの膜の構成物質であるリン脂質で⼈⼯ミセル（⼩胞）を構築し、そのミセルとの反応性を調べた。プレートリーダーを⽤いて GIF-2250 の蛍光強度を測定しグラフ化した。また、チューブを ChemiDOC XRS+imaging system（Bio-Rad）を⽤いて撮影した。

Figure 4

GIF-2250 のリン脂質反応性

DMSO PBS

10

PC PS

PI

PE

PC:ホスファチジルコリン、PS：ホスファチジルセリン、PI: ホスファチジルイノシトール、
PE: ホスファチジルエタノールアミン
GIF-2250 の PBS のみでの基底蛍光を Figure 8 に⾚線で⽰した。PC、PS、PE(1 mM のミセル)は基底蛍光より輝度が⾼くなったが、PI はそれほど変化が⾒られなかった。中でも、PC 特異性が観察された。なお、DMSO でも蛍光を発するが、100%DMSO を利⽤しているためである。これらから、GIF-2250 はエクソソームのリン脂質膜と反応していると予想した。
2 核酸との反応性
リン脂質は細胞膜の構成成分であり、エクソソーム特異性は説明できない。そこで、エク
ソソーム内部の成分に着⽬した。エクソソーム内部には核酸が含まれている。どんな構造を持つ核酸が、GIF-2250 と反応するのかを調べた。4-1 と同様にプレートリーダーを⽤いて蛍光強度を測定した。
まず、Figure 9 に各種核酸と GIF-2250 の反応性を⽰す。

Figure 9

利⽤した核酸と GIF-2250 のリン脂質反応性

マーク部分が存在すると GIF-2250 は反応する。
ATP, ADP, AMP は基底蛍光より輝度が⾼くなったが、Adenosine, Adenine, R5P は変化が⾒られなかった。リン酸の数が異なる ATP, ADP, AMP には⼤きな差は観察されなかった。次に塩基部分の影響を考える⽬的で UTP, GTP, CTP, IMP を調べた。
11

Figure 9 に⽰したリボースの丸で囲んだ OH が H であるデオキシリボース体は塩基の構造に関係することなくどれも輝度が上昇しなかった。⼀⽅で、リボース体では ATP, GTP,
CTP で輝度が上昇した。よって、リボースの構造が必要であることが⽰唆された。リボー
スの物質間での差は塩基内の構造の NH２に関係していることが予想される(Figure 9)。GIF2250 の標的には、NH2 をもつ塩基、リボース、リン酸の全ての構造を持つことが必要であると考えられた。
3

NAD+
NAD+は塩基、リボース、リン酸の構造を全て持っているため、GIF-2250 と反応すると予想した。NAD＋は酸化還元反応でニコチンアミド部分の構造が変化して NADH となる。
これらの反応性についてマイクロプレートリーダーで調べた。NAD＋と NADH の構造をFigure10 に⽰した。

Figure 5

NAD+ 、NADH の構造と GIF-2250 との反応性

NADH は、340 nm 付近 の紫外域に吸収バンドを持ち、460 nm 付近を中⼼とする⻘⾊
Figure 15 のグラフからも NADH の⾃家蛍光が観察された。⼀⽅ NAD+の蛍光を発する(20) 。
には⾃家蛍光が存在しない。GIF-2250 との反応は、NAD＋では輝度が上昇したが、NADH
では輝度が上昇しなかった。
2-Deoxy-D-glucose(2-DG)による NAD+/NADH の変化
次に細胞内で GIF-2250 と NAD+との反応を調べた。Figure 11 に構造を⽰した 2-DeoxyD-glucose(2-DG)は解糖系を阻害する物質である(21-26)。解糖系が阻害されると NAD+が蓄積して、NADH に変化しなくなる。すなわち、NAD+が増えて NADH が減ることになる。
B16F10 メラノーマ細胞を 2-DG 含有培地で 3 時間培養し、NAD+が増え、NADH が減った状況を作り顕微鏡で観察した。NAD+に反応し、GIF-2250 の輝度が上昇するかを調べた。観察する際は露光時間を統⼀して、露光時間による輝度の差が出ないようにした。

12

2-DG 含有培地で培養後観察したところ、輝度が上昇して粒がはっきりと⾒えるようになった。

Figure 6 2-Deoxy-D-glucose(2-DG)の構造と細胞内代謝
B16F10 メラノーマ細胞を 2-DG 含有培地で 3 時間培養し、NAD+が増え、NADH が減った状況を作り顕微鏡で観察した。NAD+に反応し、GIF-2250 の輝度が上昇するかを調べた。観察する際は露光時間を統⼀して、露光時間による輝度の差が出ないようにした。
2-DG 含有培地で培養後観察したところ、輝度が上昇して粒がより鮮明に検出された(Figure 12)

Figure 7

2-Deoxy-D-glucose による GIF-2250 の輝度上昇

この時、2-DG を加えることで実際に NAD+が増えて NADH が減るという状況あるかを確認するために NAD/NADH Assay Kit-WST を使⽤して NAD+アッセイを⾏った。2-DGを加えて 3 時間培養した細胞では通常の培地で培養した細胞と⽐較して NAD＋/NADH が13

上昇していることが確認された。Figure 13 の NAD+定量によって、Figure 12 の輝度の差がNAD+/NADH に影響したものであると⽰唆された。

Figure 8

NAD+/NADH の変化

⼀⽅、細胞内の NAD+絶対量は必ずしも 2-DG 処理で上昇しないと予想される。そのため、GIF-2250 誘導体のうち、⼩胞特異性が低い化合物との⽐較で検証することにした。まずは、GIF-2250 の構造の内どの部分が NAD+を標的にしているか解明するために、GIF2250 と構造が似た GIF-2264, GIF-2273, GIF-2269 を同様にして B16F10 メラノーマ細胞
を 2-DG 含有培地で 3 時間培養し、NAD+が増え、NADH が減った状況を作り顕微鏡で観察した。

Figure 9

GIF-2264, GIF-2273, GIF-2269 の 2-DG 培地の影響

14

観察の結果、GIF-2264 では輝度の上昇が⾒られたが、GIF-2273, GIF-2269 では輝度の変化は⾒られなかった。そのことから、Figure 14 の⾚丸で⽰した部分が NAD+と反応すると
考えら、実際に GIF-2264 のみが NAD+存在下で輝度上昇が観察された。
4 エクソソームの品質評価
エクソソームの新鮮なものと 1 年経って劣化したもので輝度に変化があるか観察した。
100 µg/mL の市販のミルクエクソソームを GIF-2250 と ExoSparkler で染⾊し、顕微鏡で観察した。

Figure 15

エクソソーム品質評価

緑：GIF-2250、⾚：市販の脂質染⾊剤 ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red では、新鮮・劣化間の差が⾒られなかった。⼀⽅、GIF-2250 では新鮮なエクソソームと⽐べて劣化したエクソソームで輝度が低くなった。
5

ミルクエクソソームの定量
市販ミルクエクソソームを PBS で希釈し、GIF-2250 を加え蛍光強度を測定した。0.03

ng、0.01 ng、0. 3 ng、1 ng、3 ng のミルクエクソソームを GIF-2250 と反応させた。蛍光強度とミルクエクソソーム濃度で検量線を作成した。データのスポットに近似直線を引く
ことができた。

15

蛍光強度
GIF-2250

y = 2630.9x + 2140.3
R² = 0.9987

10000
5000
0

Figure 10
エクソソーム定量

15000

-1

GIF-2250 検量線

1

3

5

濃度 (ng)

6 精製ミルクエクソソームと GIF-2250
市販の⽜乳を酢酸処理、遠⼼、フィルターで回収した。回収したサンプルを GIF-2250 で蛍光強度を測定した。市販の⽜乳は殺菌済みのものである。その殺菌の⽅法も様々な種類がある。今回使⽤した⽜乳は、130℃で 2 秒殺菌する超⾼温瞬間殺菌という⽅法で殺菌した⽜乳と、65℃前後で 30 分程度殺菌する連続式低温殺菌という⽅法で殺菌した⽜乳である。それぞれの殺菌⽅法の⽜乳でミルクエクソソームを精製した。精製したミルクエクソソーム
を GIF-2250 で蛍光強度を調べた。以下に、同じ週に精製したエクソソームの⼀例を⽰す。

Figure 11 ⾼温殺菌⽜乳と低温殺菌⽜乳の GIF-2250 反応性
精製したミルクエクソソームを PBS で 10％希釈して GIF-2250 を加えてマイクロプレー
トリーダーで蛍光強度を測定した。市販ミルクエクソソームは 100 μg/mL である。⾼温
殺菌⽜乳は GIF-2250 の蛍光強度が基底蛍光からほぼ変化がなかった。⼀⽅で、低温殺菌⽜
16

乳では蛍光強度が基底蛍光より⾼かった。また、同じ低温殺菌⽜乳を使⽤しても、消費期限切れのものは通常より輝度が低くなった。このことから、低温殺菌⽜乳且つ新鮮な⽜乳であればミルクエクソソームを⼤量に精製することが可能であると考えた。そのため、今後ミル
クエクソソームを精製する際に使⽤する⽜乳は低温殺菌⽜乳で新鮮な⽜乳とすることにした。その中でもタカナシ低温殺菌⽜乳がエクソソーム含有量が安定したため、以後は本⽜乳を使⽤することにした。

7 精製ミルクエクソソームの解析
ウエスタンブロット解析
GIF-2250 の蛍光強度を測定した精製ミルクエクソソームで CD9、CD81 のウエスタンブ
ロット解析を⾏った。Figure24 のグラフのサンプルと対応させて電気泳動を⾏いウエスタ
ンブロッティングを⾏った。

Figure 18

GIF-2250 蛍光強度と CD9、CD81 の相関

17

WB の写真からバンドの濃さを数値化し、GIF-2250 の蛍光強度と散布図を作成した。また、GIF-2250 の蛍光強度と CD9、CD81 のバンドの濃さの相関係数を Excel の CORREL関数を⽤いて求めた。CORREL 関数の式は以下の通りである。
この時、𝑥̅ と𝑦 は標本平均である。

𝐶𝑂𝑅𝑅𝐸𝐿 𝑋, 𝑌

∑ 𝑥
∑ 𝑥

𝑥̅
𝑥̅

𝑦
∑ 𝑦

𝑦
𝑦

CORREL 関数の結果 CD9 の相関係数は約 0.95、CD81 の相関係数は約 0.92 であった。どちらも正の強い相関があることが⽰唆された。また、散布図から検量線付近にスポットが多く確認された。

Figure 19

GIF-2250 蛍光強度と CD9、CD81 の相関相関係数とグラフより、GIF-2250 の蛍光輝度とエクソソームマーカーである CD9、CD81
量に⾼い相関が⽰された。
(顕微鏡観察)18

相関解析に利⽤したミルクエクソソームを GIF-2250、ExoSparkler で染⾊し蛍光顕微鏡で観察した。ともにエクソソームとみられる粒が確認され、重なりが確認できた。

Figure 20

精製ミルクエクソソームの確認

Fluore HPLC-ゲル濾過解析精製したミルクエクソソーム 10μL を PBS 40μL と HPLC ビーカーに⼊れて、ExoSparkler で染⾊し、HPLC を⾏った。その際タンパク質の溶出位置を調べるために緑蛍
光の 2 次抗体である Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 488)も PBS で 1/1000 希釈したものを 1μL 加えた。

Figure 21

Fluore HPLC-ゲル濾過

エクソソームは 9 分後半から 10 分前半に検出され、タンパク質はエクソソームより⼩さく
エクソソームより後の 11 分付近で検出される。
市販ミルクエクソソームと同じ位置に精製した精製ミルクエクソソームが検出されたことから精製は成功したと結論できる。また、輝度が市販のミルクエクソソームより⾼く、⾼濃度であることも確認された。以上のウエスタンブロット解析、顕微鏡観察、HPLC の結果から、回収したサンプルにミルクエクソソームが⼤量に含有されることが確認された。
19

8 ミルクエクソソーム精製におけるフィルターの重要性
ミルクエクソソームの精製でタンパク質などの不純物を取り除くためにフィルターを何重にかけた。ポンプで⾏うときは、0.45μm(CA)→0.1μm(PES)で⾏っていたが、それだけではタンパク質が全て取り除くことはできていなかった。そこで、1.2μm(CA)→0.8μm(CA)の⼯程を加えることでタンパク質をより取り除こうと考えた。
1.2μm(CA)→0.8μm(CA)の⼯程の有無以外は同様の⽅法で精製したミルクエクソソー
ムを Fluore HPLC にかけることでタンパク質が取り除けているか調べた。エクソソーム 10
μL と PBS 40μL を HPLC ビーカーに⼊れて、ExoSparkler で染⾊し、HPLC 解析を⾏った。

Figure 22

フィルターの重要性

1.2μm(CA)→0.8μm(CA)の⼯程を⼊れることで、Figure 22 の緑⾊で⽰したタンパク質の位置(11.4min あたり)のピークがグレーと⻘⾊を⽐較するとなくなったことが分かる。フィ
ルターをかけることで、タンパク質を減らし、より不純物が少ない⾼精度のミルクエクソソームを精製することができた。
9 ミルクエクソソーム熱変性
ミルクエクソソームを精製する前に⽜乳を 60℃、70℃、80℃で 1 h 処理による熱変性の影響を調べた。まず、それぞれの温度で⽜乳を保温し、その後精製に移った。⽜乳を酢酸処理した後、1.2μm(CA)→0.8μm(CA)→0.45μm(CA)のフィルターを通し 0.1 μm のフィル
20

ターで回収した。その後、精製したミルクエクソソームを GIF-2250 の蛍光強度測定、HPLCで解析した。

Figure 12

熱変性と GIF-2250 蛍光輝度と HPLC-ゲル濾過解析

熱処理の温度が⾼くなるほど、エクソソームは壊れ回収量が減ったため、GIF-2250 の輝度に差が⽣じたと考えられる。（輝度 2000 が基底蛍光）GIF-2250 の蛍光強度と同じく、
HPLC でも確認できた。GIF-2250 と HPLC の結果に相関があるか調べた。HPLC の結果
から積分でピーク⾯積を求めた。また、GIF-2250 と HPLC のピーク⾯積の相関係数を
CORREL 関数で算出した。GIF-2250 と HPLC のピーク⾯積の相関係数は約 0.98 であり、強い正の相関があることが⽰された。
次に、処理なしで精製したミルクエクソソームを精製後に 80℃で１ｈ処理し、エクソソームの熱耐性を調べた。精製後に１ｈ熱処理をすると、ミルクエクソソームが壊れ、量が減っていることが⽰唆された。精製前に熱処理をした⽅が、ミルクエクソソーム量への影響が⼤きかった。また、時間経過によるエクソソームの劣化では、ExoSparkler では⼗分検出できるが、HPLC―ゲル濾過解析では、熱によるシグナル低下が観察された。熱処理は、エク
ソソームそのものの破壊に繋がることが⽰唆された。

Figure 24

精製後

熱処理

10 エクソソームの pH による影響
21エクソソームに対しての pH が影響を調べた。精製したミルクエクソソーム 40μL と
PBS 40μL を 96well plate に⼊れた。そこに、HCl 0.1N, NaOH 0.1N, NaCl 0.1N を 10μL
加えて 1 時間放置した。この時の pH はそれぞれ pH2.2 , pH10.7 , pH6.7 であった。1 時間
後、それぞれ、中和してから GIF-2250 を加えて蛍光強度測定した。プレートから 30μL と
PBS 20μL を HPLC ビーカーに⼊れて ExoSparkler で染⾊し、HPLC を⾏った。
GIF-2250 の蛍光強度測定と HPLC の結果より、エクソソームは pH2〜10 では影響がな
いことが⽰唆された。

Figure 25

pH 変化処理後の GIF-2250 測定と HPLC-ゲル濾過解析

11 乳酸菌由来エクソソーム
ヨーグルトから精製したエクソソームとミルクエクソソームを⽐較するために、GIF2250 解析と Fluore HPLC―ゲル濾過解析と顕微鏡観察を⾏った。
GIF-2250 解析精製したエクソソームを GIF-2250 で蛍光強度を調べた。

22

Figure 26

乳酸菌由来エクソソームと GIF-2250

どの⼤きさのフィルターでも基底蛍光より輝度が⾼くなった。特に、300K で輝度が⾼くなった。
(Fluore HPLC―ゲル濾過)
ヨーグルトから精製したエクソソーム未希釈で ExoSparkler で染⾊し HPLC 解析を⾏った。その際タンパク質の位置を調べるために緑⾊蛍光の 2 次抗体を 1 μL 加えた。ミルク
エクソソームは 1/5 希釈し検出される時間に差があるか調べた。

Figure 13

ヨーグルト（乳酸菌由来）エクソソーム

ヨーグルトから精製したエクソソームは 0.1μm では回収することができなかったが、1000K、300K のフィルターでは回収することができた。ミルクエクソソームは 9.8min 付
近に検出され、ヨーグルトから精製したエクソソームは 1000K: 10.5min 、300K: 10.8minに検出された。ミルクエクソソームより遅く検出されたことから、粒がミルクエクソソーム
より⼩さいことが予想された。
(顕微鏡観察)ヨーグルトから精製したエクソソームを GIF-2250 と ExoSparkler で染⾊し、観察した。

23

Figure 28

乳酸菌由来エクソソーム顕微鏡観察

ミルクエクソソームを観察した際より、エクソソームとみられる粒は⼩さかった。また、ミルクエクソソームと同じように GIF-2250 と ExoSparkler ともにエクソソームとみられる粒が確認され、重なりが確認できた。Fluore HPLC-ゲル濾過と顕微鏡観察の結果と合わせて、ヨーグルトからとったエクソソームの⼤きさはミルクエクソソームより⼩さいことが⽰唆された。
4-12 ウエスタンブロット解析
⾼温殺菌⽜乳、低温殺菌⽜乳、ヨーグルトから精製したエクソソームをウエスタンブロッ
ト解析で CD9、CD81 の発現を調べた。コントロールとして市販ミルクエクソソームを使⽤した。

Figure 29

CD9、CD81 の発現

⾼温殺菌⽜乳、乳酸菌由来エクソソームはバンドが確認されなかった。⼀⽅で、低温殺菌
⽜乳から精製したミルクエクソソームは市販のミルクエクソソームより濃く発現していた。
また、低温殺菌⽜乳からの発酵後のエクソソーム様⼩胞も、CD９および CD８１陰性であった。これらのことから、ヨーグルトエクソソームは乳酸菌が独⾃に放出した⼩胞であり、
ミルクエクソソームの分解物・修飾体ではないと結論した。
4-13 薬効解析
培養細胞
24

GIF-2250 の標的探索を通じて、⽜乳由来の２種類のエクソソーム（ミルクエクソソームと乳酸菌「ヨーグルト」エクソソーム）を⾼濃度で精製することに成功した。また、それらの品質を確認することも可能となった。そこで、これらエクソソームの⽣物活性の検討に移った。まずは、培養細胞で複数の⽣物活性評価を実施した。GIF-2250 の蛍光輝度からの算出で、100 μg/mL の終濃度とした。
差が検出されなかったものとして、
１）メラニン合成、２）脂肪燃焼促進、３）神経細胞の酸化ストレス抑制作⽤は影響が観察されなかった。４）培養軟⾻細胞でのコラーゲン産⽣修飾は、時によって促進に作⽤したが、再現性が乏しく、混⼊物の影響である可能性が否定できない。⼀⽅、エクソソーム研究で広く認知されている５）抗炎症作⽤は、我々も検出できた。特にミルクエクソソームで⾼い抗炎症活性が検出できた。
120
100
80
60
40
20
0

Figure 14

RAW264.7 細胞における NO 産⽣抑制（％）

RAW264.7（マクロファージ）細胞 に 500 ng/mL の濃度で LPS を作⽤させ、１２時間後の培地の NO 量を測定した。その結果、ミルクエクソソーム及びヨーグルトエクソソームを 100 μg/mL（0.01%換算）の濃度で培地へ添加した場合に NO 産⽣抑制作⽤が観察された。また、その活性は GIF-2250 輝度で補正した場合は、ミルクエクソソームの⽅が⾼かった。⽐較対象として、低温殺菌⽜乳を 1%を加えたが、顕著な効果は観察されなかった。
in vivo 評価（１）
次に、モデル動物での薬効確認を⾏うことにした。我々は炎症モデルとして SIK３-KO
マウスを有し、⾃然発⽣（症）の炎症性腸疾患(⼤腸炎)モデルを評価できる。そこで、ミル25

クエクソームをそのまま（1mg/匹/回：40mg/kg/回）朝・晩２回の経⼝投与による炎症を評価した。炎症性腸疾患を確実に誘導するために、デキストランサルフェートを２％濃度で飲料⽔に含有し 3 ⽇間経⼝摂取させた。今回は、体重減少の惹起率・程度で予防効果を検証した。野⽣型マウスでは２％デキストランサルフェートでは、炎症は明確には発症しない。
⼀⽅、SIK３-KO では、ほぼ全てのマウスで炎症が誘導され、体重減少が５⽇後から観察される。この炎症惹起に、ミルクエクソソーム投与は効果を発揮しなかった。また、⾎糖値やインスリン値などの、代謝指標にも影響は観察されなかった。
理由として、1mg/匹/回では⼗分な量とは⾔えない可能性が予想される。特に、⼩腸で分解され、⼤腸まで届いていないと考えられる。
120
100
80

WT

60

SIK3-KO40

SIK3-KO エクソソーム

2000Figure 31

1

2

3

4

5

デキストランサルフェート誘導性腸炎による体重減少

67 (day)（％）３⽇間の処理。

in vivo 評価（２）
炎症性腸疾患モデルでの検証が困難であることから、「痔」のモデルマウスを利⽤するこ
とにした。

26

Figure 32 「痔」のモデルマウス

正常な肛⾨（上）、痔（下）痔のモデルマウスは SIK3-KO に全⾝性に SIK３を僅かながら発現を戻したマウスで、約半年で痔を⾃然に発症する。発症前に肛⾨が少し⾚くなり、その後１ヶ⽉で表⾯が腫れる。
肛⾨が少し⾚くなった状態で、ステロイドを塗布すると発症が抑制される。そこで、ミルク
エクソソーム（１０ｍｇ/ｍL）を同様にワセリン混合 1 : 1 で塗布し、炎症の進⾏の度合いを確認した。
痔の同時（同週齢）発症は未だ条件が確⽴できていないこともあり、半年間飼育を続け、僅かに発症した個体を順次各グループへと振り分けた。なお、飼育中に別のマウスと分ける
ことは⾏わず、同⼀のケージで処理を続けた（雌雄は元々別々であるが、発症までに時間を必要とすることから今回はどちらか⼀⽅に統⼀できなかった）。各グループで５匹を確保し、１ヶ⽉間の処置で病態が進⾏した場合を発症とし、病態が進⾏しなかった個体は未発症と分類した。なお、病態が進⾏しない場合もさらに１ヶ⽉間の経過観察とし、病態が進⾏していないことを確認した。この経過観察期間は処置は⾏っていない。

発症個体数
6
5
4
3
2
1
0

Figure 33 痔を発症しや個体数（各群 5 引き）S+M（Steroid+ミルクエクソソーム）、S+Y（Steroid+ヨーグルトエクソソーム）
ステロイドは痔の発症を抑制できた。また、エクソソーム塗布群も僅かではあるが、病態が進⾏しない個体が観察された。⼀⽅、ステロイド軟膏にエクソソームを混ぜた場合は、病態進⾏を阻⽌できた。エクソソーム中に、ステロイドの作⽤を増強する成分が含まれていると予想された。
27

また、本病態に軟便が伴われていたが下痢の発症には⾄らないため、整調機能は検討しないことにした。

結論
フィルターを使うだけで市販の⽜乳やヨーグルトからエクソソームを濃縮・精製できた。
また、エクソソーム安定化のための⽜乳の調整条件が確認できた。GIF-2250 も輝度を元に機能性エクソソームの定量を⾏い、培養細胞での抗炎症活性ならびにマウス痔モデルに対して病態発症抑制効果を確認できた。今後は、ミルクエクソソームの抗炎症標的の同定により治療効果を明確化する必要がある。
参考⽂献
1) Colombo M, Raposo G, & Thery C (2014) Biogenesis, secretion, and intercellularinteractions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol, 30 : 255289. DOI: 10.1146/annurev-cellbio-101512-122326
2) van der Pol E, Böing AN, Harrison P, Sturk A, Nieuwland R (July 2012). “Classification,functions, and clinical relevance of extracellular vesicles”. Pharmacological Reviews 64 (3):676-705. DOI:10.1124/pr.112.005983. PMID 22722893
3) Keller S, Sanderson MP, Stoeck A, Altevogt P (November 2006). “Exosomes: frombiogenesis and secretion to biological function”. Immunology Letters 107 (2): 102-8.
DOI:10.1016/j.imlet.2006.09.005. PMID 17067686.
4) Spaull R, McPherson B, Gialeli A, Clayton A, Uney J, Heep A, Cordero-Llana Ó (April2019). “Exosomes populate the cerebrospinal fluid of preterm infants with posthaemorrhagic hydrocephalus”. International Journal of Developmental Neuroscience 73:
59-65. doi:10.1016/j.ijdevneu.2019.01.004. PMID 30639393
5) Pegtel DM, Cosmopoulos K, Thorley-Lawson DA et al. Functional delivery of viral
miRNAs via exosomes. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107: 6328-33.
6) Zhang Y, Liu D, Chen X et al. Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial
cell migration. Mol Cell 2010; 39: 133-44.
7) Kosaka N, Iguchi H, Yoshioka Y, Takeshita F, Matsuki Y, Ochiya T. Secretory mechanisms
and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J Biol Chem 2010; 285: 17442-52.
8) Masaharu Somiya, Yusuke Yoshioka, Takahiro Ochiya Drug delivery application of
extracellular

vesicles;insight

into

production,

drug

pharmacokinetics. AIMS Bioengineering, 2017,4(1): 73-92.
9) https://granpro-clinic.com/blog/exosomes
28

loading,targeting,and10) Kunz, C; Lönnerdal, B (1990). "Human-milk proteins: analysis of casein and casein
subunits by anion-exchange chromatography, gel electrophoresis, and specific staining
methods". Am. J. Clin. Nutr. 51 (1): 37‒46. doi:10.1093/ajcn/51.1.37. PMID 1688683
11) 中野 智⽊ 酸性条件下におけるカゼインの熱挙動特性, ミルクサイエンス, 2018, 67
巻, 3 号, p. 186-194, 公開⽇ 2018/12/23, Online ISSN 2188-0700, Print ISSN 1343-0289
12) Farrell HM (1973). "Models for Casein Micelle Formation". Journal of Dairy Science. 56(9): 1195‒1206. doi:10.3168/jds.S0022-0302(73)85335-4. PMID 4593735.
13) Schmidt, D. G.: Association of caseins and casein micelle structure. In Development inDairy Chemistry-1. P. F. Fox, ed. Applied Science Publishers, London, UK. pp. 61-86(1982)
14)https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/exo-prep-exosomes-isolationhnb.asp?entry_id=14501
15) https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0129-7760.html
16)https://www.beckman.jp/resources/reading-material/case-studies/exosomepurification-separation17) https://www.wakenyaku.co.jp/ctg/ls.php?i=177
18) 中林孝和，太⽥信廣 ⾃家蛍光寿命イメージングによる細胞観察
北海道⼤学電⼦科学研究所
19) K. C. Cheng, C. I. Chang, Y. C. Lin, C. I. Liu, Y. C. Zeng, and Y. S. Lin, “Secoiridoids from theseed of gonocaryum calleryanum and their inhibitory potential on lps-induced tumor necrosis
factorandnitricoxide

production,”

Molecules,

vol.

23,

no.

7,

2018,

doi:

10.3390/molecules23071633.
20) Wick, A.N.; Drury, D.R.; Nakada, H.I.; Wolfe, J.B. Localization of the primary metabolic
block produced by 2-deoxyglucose. J. Biol. Chem. 1957, 224, 963‒969.
21) Woodward, G.E.; Hudson, M.T. The effect of 2-desoxy-d-glucose on glycolysis andrespiration of tumor and normal tissues. Cancer Res. 1954, 14, 599‒605.
22) Mukherjee, P.; Mulrooney, T.J.; Marsh, J.; Blair, D.; Chiles, T.C.; Seyfried, T.N.
Differential effects of energy stress on AMPK phosphorylation and apoptosis inexperimental brain tumor and normal brain. Mol. Cancer 2008, 7, 37.
23) https://www.dojindo.co.jp/products/N509/
NAD/NADH 測定キット(Dojindo laboratories, Kumamoto, Japan)
https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/nad-nadh-assay-kit-cbl.asp?entry_id=17200
24) NAD+/NADH アッセイキット（⽐⾊／蛍光）(Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan)25) https://www.funakoshi.co.jp/contents/201233
BioVision 社 NAD+/NADH Quantification Kit (Funakoshi Co., Ltd. ,Tokyo, Japan)

2926) Xiao-Hong Zhu, Ming Lu, Byeong-Yeul Lee, Kamil Ugurbil, and Wei Che In vivo NAD
assay reveals the intracellular NAD contents and redox state in healthy human brain andtheir age dependences Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 3; 112(9): 2876‒2881.
27) Sanosaka M, Fujimoto M, Ohkawara T, Nagatake T, Itoh Y, Kagawa M, Kumagai A,
Fuchino H, Kunisawa J, Naka T, Takemori H. Salt-inducible kinase 3 deficiency
exacerbates lipopolysaccharide-induced endotoxin shock accompanied by increased levelsof pro-inflammatory molecules in mice. Immunology. 2015, 145, 268-78

30