ビタミン D によるサルコペニアの予防・改善の分子基盤の解析
京都府立大学大学院 生命環境科学研究科
分子栄養学研究室
亀井 康富

【序章】
骨格筋は運動・糖取込み・エネルギー代謝に重要であるため、適度な運動・適切な食事によって骨格筋機能を保持することは健康増進に重要である。しかしながら、サルコペニアと呼ばれる加齢や不活動・低栄養・疾患などによる筋萎縮・筋機能低下（図 1）が超高齢社会を迎えた我が国で問題となっている。加齢に伴いサルコペニアの有病率は増加しており、発症すると寝たきりや車いす生活を余儀なくされるなど、生活の質の低下、医療・介護費の増大が生じてしまう。
近年サルコペニアとビタミン D の関係が示唆されている。ビタミン D は脂溶性ビタミン（図2）であり、核内受容体であるビタミン D 受容体を介して遺伝子発現を調節するが、核内受容体を介さない作用も報告されている。体内では骨ホメオスタシスを制御していることがよく知られているほか、骨格筋を含む多くの組織で重要な役割を担っている。ヒト体内のビタミン D の充足・不足の基準は設けられているが、サルコペニアを発症するような高齢者ではビタミン D が不足・欠乏している場合が多い（図 3）。また、血中ビタミン D 濃度と高齢者の活動量や転倒リ
スク、筋力・筋量との関係が示唆されている。さらに高齢者にビタミン D を投与すると筋サイズが増大することも報告されている。しかし、その分子機序についてはよくわかっていない。
我々は筋萎縮を引き起こす重要な因子である転写因子 FOXO1 に着目して研究を行ってきた（図 4）。その過程でビタミン D が FOXO1 を抑制するデータが得られた。すなわちビタミン Dによる筋萎縮の抑制が示唆され、その分子機序解明につながる知見が得られた。本稿ではこれらのビタミン D による FOXO1 の抑制を介した筋萎縮抑制効果の研究結果について報告する。
【第 1 章】
FOXO1 の転写活性を抑制する化合物のスクリーニング
1-1 要旨骨格筋は人体最大の組織であり、運動や糖取込み、エネルギー代謝などの重要な役割を果たしている。低栄養や加齢、寝たきりなどの不活動、がんなどの疾患によって骨格筋が萎縮することが知られている。筋萎縮が生じると、エネルギー消費の減少による肥満や糖取込み能の減少による糖尿病の発症、そして生活の質（QOL）の低下へとつながる。筋萎縮時に骨格筋においてフォークヘッド型転写因子 O1（FOXO1）の発現が増加することが知られており、これによりユビキチ
ン・プロテアソーム系やオートファジーの亢進といったタンパク質分解に関わる遺伝子の発現が増加する。さらに、骨格筋特異的な FOXO1 過剰発現マウスの解析で、骨格筋の減少が観察されている。これらの結果は FOXO1 が筋萎縮を引き起こす原因の一つであることを示しており、その転写活性を抑制することは筋萎縮予防のために有効であると考えられる。そこで本研究では FOXO1
1

の転写活性能を指標とした筋萎縮を抑制する化合物の探索を試みた。
本研究ではレポーターアッセイを用いて FOXO1 の転写活性を測定する独自の実験系を確立した。この実験系を用いて 520 種類の食品・植物等由来の化合物をスクリーニングした結果、数種類の化合物で FOXO1 の転写活性が抑制された。すなわち、これらの化合物は FOXO1 の転写活性の抑制を介して筋萎縮を抑制する可能性があることが示唆された。
1-2 緒言骨格筋はヒトの体重の約 40%を占める人体で最大の組織であり、エネルギー代謝、糖取込み、運動において重要な役割を果たしている。骨格筋の機能はその量や質に依存しており、身体活
動、環境、病態などによって変化する。適切な運動トレーニングや十分な栄養により骨格筋量を維持することはエネルギー消費を増加させ、肥満や糖尿病などの生活習慣病の予防・改善につながる 1), 2)。一方で、寝たきりや不活動、飢餓や加齢などによって骨格筋の萎縮が生じる 3), 4)。その結果、エネルギー消費の減少による肥満や、糖取込みの減少・血糖値上昇による糖尿病の発症、そして生活の質（QOL）の低下へと向かう。超高齢社会を迎えた我が国において、筋萎縮の抑制は健康寿命の延伸の観点から重要である 5), 6)。そのため、生活習慣病の予防や QOL の維持のための骨格筋の萎縮・機能不全の予防法の開発は国民の健康の維持・増進のために重要である。
Forkhead box protein O1 (FOXO1)はフォークヘッド型の転写因子であり、低栄養や不活動、がんなどの病態下などで発現増加することが報告されている 7), 8)。また、骨格筋特異的に FOXO1を過剰発現させたマウスでは顕著な筋萎縮が観察されている 9)。ユビキチンリガーゼの一種である Atrogin 1 や MuRF 1、リソソームタンパク質分解酵素の一種である Cathepsin L など、筋タン
パク質の分解に重要な因子が FOXO1 の標的遺伝子として知られている 10) - 13)。
以上より、FOXO1 は筋萎縮を引き起こす重要な因子であり、その転写活性を抑制することは筋萎縮の抑制に有効であると考えられる。そこで本研究では FOXO1 のレポーターアッセイ（GAL4-FOXO1 レポーターアッセイ）を行い、筋萎縮の予防を目的とした FOXO1 の転写活性を抑制する化合物の探索を行った。FOXO1 に DNA 結合領域の GAL4 を付加すると、FOXO1 自体の転写活性化能をレポーター（ルシフェラーゼ）で測定することができる。GAL4-FOXO1 融合タンパク質を発現するプラスミドと GAL4 認識配列の UAS を付加したルシフェラーゼを発現するプラスミドを HEK293T 細胞に導入すると、UAS に GAL4-FOXO1 融合タンパク質が結合し、FOXO1 の転写活性によってルシフェラーゼが発現する（図 5-1）
。このルシフェラーゼの活性を測定することで FOXO1 の転写活性化能を評価することができる。そのため、ルシフェラーゼ活性を減少させるような化合物は FOXO1 の転写活性を抑制する化合物であるということになる。
本研究では 520 種類の食品・植物由来成分（Sigma Aldrich 社より購入）をスクリーニングし、
FOXO1 の転写活性に対する効果を検討した。

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1-3 方法○ 細胞培養HEK293T 細胞（理研）を使用した。細胞は 10cm dish に播種し、10% FBS と 1% PS を含む
DMEM（ナカライテスク, code 08459-64）を用いて 37℃、5% CO2 中（CO2 インキュベーター）で培養した。
○ トランスフェクション
【試薬の組成】
・プラスミド溶液①
OptiMEM (Life Technologies, cat:31985-070)

500 µlpM FOXO1

2.5 µg

4×UAS TK Luc

2.5 µgph RL-TK

0.2 µg・プラスミド溶液②
OptiMEM

500 µl

Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen, cat:11668-019)

5 µl

プラスミドは pM FOXO1（GAL4-FOXO1 融合タンパク質発現プラスミド）、4×UAS TK Luc（レポーターのホタルルシフェラーゼの上流に GAL4 認識配列である UAS を組み込んだプラス
ミド）、ph RL-TK（常時発現型のウミシイタケルシフェラーゼプラスミド、内部標準用）の本研究室で以前に作製した 3 種類を使用した。溶液①と②を調製し、5 分間室温でインキュベートした。続いて、インキュベート後の①と②を混ぜ合わせ、転倒混和して 20 分間室温でインキュベートした（③）。10cm dish で培養していた細胞の培地をアスピレーターで除去し、OptiMEM 4
mL とインキュベート後の③を加えた。37℃、5%CO2 中（CO2 インキュベーター）で 5 時間培養したのち、白色 96 well plate（cat:MS-8096W）に 1×106 cell / ml の密度で 100 µl/well で再播種した。
○ 食品・植物由来ライブラリー化合物の添加
520 種類の植物・食品成分ライブラリー（薬理・生理活性ライブラリー（植物由来）120 種、天然生理活性物質ライブラリー280 種、食品関連化合物ライブラリー（香料）120 種、Sigma
Aldrich, cat:s990043 シリーズ）を使用した（各化合物は DMSO に 10 mM で溶解済）。各化合物（10 mM）を化合物：DMSO＝2.5 µl：2.5 µl で調製し、調製後の化合物（5 mM）0.465 µl に対しDMEM（10％ FBS、1％ PS）232.5 µl を加え、化合物の終濃度が 10 µM になるように調製した（3 well 分）。各化合物の調製後、96 well plate の培地をアスピレーターで除去し、化合物入りの培地を 75 µl/well で細胞に添加した（終濃度: 10 µM、n=3）。その後 37℃、5% CO2 中（CO2 イン
キュベーター）で 20 時間培養した。

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○ Luc assay
化合物添加 20 時間後に培地を除去し、1×PBS を 10 µl / well を加えた。Dual-Glo® Luciferase
Assay System (Promega, cat: E2920) の Luciferase Reagent を 10 µl / well 加え、10 分間室温でインキュベートした。このとき plate は遮光した。インキュベート後、GloMax NAVIGATOR System GM2010 (Promega)を用いて Luciferase 活性（ホタルルシフェラーゼ活性）を測定した。測定後、内部標準測定用に Dual-Glo® Stop & Glo Reagent を調製した。Substrate：Buffer＝1：100 の割合で 10µl/well の試薬を well の数だけ調製した。Luciferase 測定後の白色プレートに Dual-Glo® Stop &Glo Reagent を 10 µl ずつ加えて軽くゆすり、10 分間室温でインキュベートした。インキュベー
ト後、GloMax NAVIGATOR System GM 2010 (Promega)を用いて Luciferase 活性（ウミシイタケル
シフェラーゼ活性）を測定した。
1-4 結果○ FOXO1 の転写活性を抑制する化合物のスクリーニング
GAL4-FOXO1 レポーターアッセイを用いて FOXO1 の転写活性を抑制する化合物のスクリー
ニングを行った。GAL4-FOXO1 融合タンパク質発現プラスミドを HEK293T 細胞に導入すると、レポータールシフェラーゼ活性の増加が観察された（図 5-2）。これは FOXO1 の転写活性化能によるものであることを示す。本研究では 520 種類の食品・植物由来化合物を用いてスクリーニン
グを行い、レポーター活性が 65％以下の化合物をヒット化合物としたところ、Retinoic acid、
1α,25(OH)2 VD3（図 6）などの化合物がレポーター活性を抑制した。すなわち、これらの化合物
は FOXO1 の転写活性を抑制することが示唆された。
1-5 考察筋萎縮の予防や治療には運動や栄養状態の改善が推奨されているが、薬や特定の成分の摂取による治療法は確立されていない。そこで本研究では筋萎縮を引き起こす重要な因子である転写
因子 FOXO1 に着目し、FOXO1 の転写活性を抑制する化合物のスクリーニングを行った。以前
本研究室で確立した、HEK293T 細胞に GAL4-FOXO1 融合タンパク質発現プラスミド、4×UAS
TK Luc（UAS 結合レポータープラスミド）、ph RL-TK Luc（内部標準用プラスミド）を導入しレポーター活性を測定することで FOXO1 の転写活性を評価する実験系を用いた。GAL4 タンパク質は UAS に結合するため、GAL4-FOXO1 融合タンパク質が UAS 領域に引き寄せられることでFOXO1 の転写活性によりレポーターの発現が誘導される（図 5-1）
。そのため、測定したレポー
ター活性を FOXO1 の転写活性として評価することができる。今回、Retinoic acid、1α,25(OH)2 D3などの化合物がレポーター活性を抑制した（図 6）。すなわち、これらの化合物は FOXO1 の転写活性を抑制することが示唆された。その中でも、Retinoic acid について、前駆体である β-caroteneが筋萎縮誘導条件下で FOXO1 と相同性を有する FOXO3a の核移行及び筋萎縮関連遺伝子
Atrogin 1 の発現増加を抑制する報告がなされている 14)。そのため、今後更なる解析を行いRetinoic acid による筋萎縮抑制効果の検討を行う必要がある。また、1α,25(OH)2 D3（活性型ビタミン D）について、ビタミン D はサルコペニア（加齢性筋萎縮）の予防に効果的であるという疫学的研究報告 15)や、高齢者の多くでの多くでビタミン D が不足・欠乏しているという報告 16)
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がなされているなど、ビタミン D と筋萎縮の関連が示唆されている。しかし、その詳細なメカ
ニズムはよくわかっていない。本研究結果からビタミン D による筋萎縮抑制効果が FOXO1 の抑制を介したものである可能性が考えられる。そこで以降の章では、ビタミン D に着目し、FOXO1 を介した筋萎縮抑制効果について in vitro 及び in vivo での更なる検討を行った。
【第 2 章】
骨格筋萎縮におけるビタミン D の効果
2-1 要約ビタミン D はサルコペニアのような筋萎縮の予防に効果的であることが知られている。また、高齢者の多くで血中ビタミン D（25(OH)D3）濃度が低いことが報告されている。しかしながら、骨格筋や筋細胞におけるビタミン D の作用機序はよくわかっていない。所属する研究室ではこれまでに、活性型ビタミン D が筋萎縮を引き起こす重要な因子である転写因子 FOXO1 の活性を抑制し、Atrogin 1（ユビキチンリガーゼ）や Cathepsin L（リソソームタンパク質分解酵素）などの筋萎縮関連遺伝子の発現を抑制することを見出しており、ビタミン D による筋萎縮抑制のメカニズムの手掛かりを得ている。さらに筋萎縮誘導条件下において活性型ビタミン D は筋タンパク質合成に重要な分岐鎖アミノ酸の異化を抑制した。以上より、ビタミン D は筋萎縮の抑制及び筋タンパク質合成の低下の抑制に重要であることが示唆された。
2-2 緒言骨格筋はヒトの体重の約 40%を占める人体で最大の組織であり、エネルギー代謝、糖取込み、運動において重要な役割を果たしている。骨格筋の機能はその量や質に反映され、身体活動、環境、病態などによって変化する。寝たきりや不活動、飢餓や加齢などによって骨格筋の萎縮が生じる 3), 4)。その結果、エネルギー消費の減少（肥満）や、糖取込みの減少・血糖値上昇（糖尿病）、そして生活の質（QOL）の低下へと向かう。超高齢社会を迎えた我が国において、筋萎縮の抑制は健康寿命の延伸の観点から重要である 5), 6)。そのため、生活習慣病の予防や QOL の維持のための骨格筋の萎縮・機能不全の予防法の開発は国民の健康の維持・増進のために重要である。
Forkhead box protein O1 (FOXO1)はフォークヘッド型の転写因子であり、低栄養や不活動、がんなどの病態下などで発現増加することが報告されている 7), 8)。また、骨格筋特異的に FOXO1を過剰発現させたマウスでは顕著な筋萎縮が観察されている 9)。ユビキチンリガーゼの一種である Atrogin 1 や MuRF 1、リソソームタンパク質分解酵素の一種である Cathepsin L など、筋タン
パク質の分解に重要な因子が FOXO1 の標的遺伝子として知られている 10) - 13)。
ビタミン D は脂溶性ビタミンであり、肝臓で 25(OH)D に、さらに腎臓で 1,25(OH)2 D に代謝される。体内では骨ホメオスタシスを制御していることがよく知られているほか、骨格筋を含む
多くの組織で重要な役割を担っている 5), 17)。ビタミン D 受容体（VDR）は核内受容体型転写因子であり、活性型ビタミン D である 1,25(OH)2 D によって活性化する。サルコペニアを発症する
ような高齢者では VDR の発現が減少すること 15)や、血中ビタミン D が不足・欠乏していること
5、高齢者へのビタミン D 投与で筋線維径の増大が見られる 18) など、ビタミン D と筋萎縮の関16)連が示唆されている。また、我々は 1,25(OH)2 D3 が FOXO1 の転写活性を抑制したことや、筋萎縮誘導条件下の C2C12 筋細胞において FOXO1 の標的遺伝子の発現増加を抑制したこと 19)を見出しており、活性型ビタミン D による筋萎縮抑制効果が示唆された。そこで本研究ではビタミ
ン D による FOXO1 の抑制を介した筋萎縮抑制のより詳細な作用機序を解明するために、培養細胞を用いて筋萎縮抑制作用を調べた。
2-3 方法〇 C2C12 筋細胞
C2C12 筋細胞（理研）を用いた。細胞は 10% FBS と 1% PS を含む DMEM（ナカライテスク,
code 08459-64）を用いて 37℃、5% CO2 中で培養した。
〇 C2C12 筋細胞

デキサメタゾン（DEX）、ビタミン D 代謝物添加実験

C2C12 筋細胞（理研）を用いた。細胞は 12 well plate に播種した。24 時間後に 1% PS を含む
DMEM（ナカライテスク, code 08459-64）に培地を交換し、DEX（ナカライテスク, cat: 1110764）溶液および 1,25(OH)2D3（Cayman Chemical, cat:71820）を添加した（n=6）
。処理濃度は、DEX は 10 µM、1,25(OH)2D3 は 100 nM、1 µM の終濃度になるよう加えた。24 時間後に回収し、遺伝子発現解析に供した。
〇 遺伝子発現解析－RNA 抽出・逆転写（RT）反応・リアルタイム PCR
C2C12 筋細胞を 1×PBS 1 ml で 2 回 wash し、セパゾール (ナカライテスク, cat:09379-97) を 1
ml ずつ well に加え細胞を溶解し、よく懸濁して 1.5 ml チューブに回収した。これらの細胞懸濁液に 200 µl のクロロホルムを添加し、Vortex でよく撹拌した後、遠心分離 (15,000 rpm, 4℃, 10 min)
した。分離した溶液のうち上層（水層）だけを新しいチューブに回収し、そこへ 500 µl のイソプ
ロパノールを添加して転倒混和した後、遠心分離 (15,000 rpm, 4℃,10 min)により total RNA を沈殿させた。上清を除去し、80%エタノールでリンスしてから上清を除去した。約 30 µl の滅菌 MQ 水
で沈殿を溶解し、微量分光光度計・Nano drop Lite (株式会社エル・エム・エス)を用いて total RNA量を測定した。
Total RNA をフラットキャップ PCR チューブで 0.5 µg/6 µl になるよう滅菌 MQ 水で希釈し、そこへゲノム DNA Remover*入り 4×DN Master Mix*を 2 µl 加え、37°C で 5 分間インキュベートした（DNase 処理）。DNase 処理後、5×RT Master Mix*を 2 µl ずつ加え、以下の反応条件（Table 1）で逆転写（reverse transcription:RT）反応を行い、cDNA を作製した。RT 反応後、TE を 90 µl 加え10 倍に希釈した。希釈したサンプル溶液で反応液（Table 2）を調製し、以下の反応サイクル（Table
3）で CFX connect real time PCR system (BioRad)を用いてリアルタイム PCR を行った。反応に使ったプライマーは Table 4 に示す。

*：ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO, cat:FSQ-301）

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〇 C2C12 筋細胞

デキサメタゾン（DEX）、1,25(OH)2D3 添加

アミノ酸解析

C2C12 筋細胞（理研）を用いた。細胞は 10cm dish に播種した。24 時間後に 1% PS を含む
DMEM（ナカライテスク, code 08459-64）に培地を交換し、DEX（ナカライテスク, cat: 1110764）溶液および 1,25(OH)2D3（Cayman Chemical, cat:71820）を添加した（n=3）
。処理濃度は、DEX は 10 µM、1,25(OH)2D3 は 1 µM の終濃度になるよう加えた。24 時間後に 1×PBS 10ml で 2
回 wash した後、1×PBS 10ml を加え細胞をよく懸濁しながら 50 mL チューブに回収する作業を 2回行った。これらの細胞懸濁液を遠心分離 (4,500 rpm, 4℃, 3min)し上清を除去した。残った沈殿に 2.5% スルホサリチル酸を 600 µl 加え、26G の針を付けた 1 mL のシリンジで 30 回程度ピペッ
ティングし破砕した。再び遠心分離 (15,000 rpm, 4℃, 10 min)し、上清を 1.5 mL チューブに移し、-20℃で保存した。その後アミノ酸解析をエスアールエル株式会社に委託した。
2-4 結果○ 1,25(OH) 2D3 はグルココルチコイド誘導性の FOXO1 標的遺伝子の発現増加を抑制する
合成グルココルチコイドであるデキサメタゾン（DEX）は FOXO1 の活性を増加させることが報告されている 20), 21)。そこで C2C12 筋細胞に DEX 及び 1,25(OH)2D3 を添加し 24 時間後の遺伝
子発現変化を調べた。DEX の添加による FOXO1 の遺伝子発現の変化は見られなかったが、FOXO1 標的遺伝子である Atrogin 1 の発現の増加が観察された（図 7）。また 1,25(OH)2D の添加により、VDR の遺伝子発現増加が観察された。1,25(OH)2D3 の添加によって、DEX 誘導性のAtrogin 1 の遺伝子発現増加が抑制された（図 7）。
○ 1,25(OH)2D3 はグルココルチコイド誘導性の BCAA 異化亢進を抑制する
分岐鎖アミノ酸（Branched chain amino acid, BCAA：バリン、ロイシン、イソロイシン）は必須アミノ酸であり、骨格筋のタンパク質を構成する必須アミノ酸の約 35%を占める。BCAA の代謝は身体の外部・内部の環境に適応して調節される。例えば、絶食や激しい運動などで FOXO1 によるタンパク質分解が増加する。そして転写調節因子 PGC1α によって BCAA 分解酵素である
BCAA アミノ基転移酵素（BCAT2）や分岐鎖 α ケト酸脱水素酵素（BCKDHa）が増加し、BCAA
分解が増加する（図 8）。BCAA のうち特にロイシンにはタンパク質合成促進作用が知られる
が、絶食など筋萎縮が生じる状態ではロイシン量が減少するとともにタンパク質合成は減少する。すなわち、BCAA の分解を抑制することにより筋萎縮の抑制が期待される。
そこで C2C12 筋細胞に DEX と 1,25(OH)2D3 を添加し、24 時間後の BCAA 代謝に関わる遺伝子
発現と細胞内アミノ酸量の変化を調べた。図 9 に示すように DEX によって PGC1α、BCAT2、
BCKDHa の発現増加が観察された。そして興味深いことに、これらの発現増加は 1,25(OH)2D3 によって抑制された。さらに細胞内バリン量は DEX によって減少し、有意な差はないものの
1,25(OH)2D3 によって回復した（p=0.051）（図 10）
。

7

2-5

考察

グルココルチコイドの作用はリガンド依存性の転写因子である核内受容体であるグルココルチ
コイド受容体との結合を介して生じる 22)。グルココルチコイドは様々な組織で作用する。骨格筋
における作用において、グルココルチコイドは炎症性疾患などの治療に使用され、タンパク質の異化を促進し、骨格筋の萎縮を誘導することが知られている 23)。またグルココルチコイドによって FOXO1 が活性化することが先行研究において報告されている 20), 21)。図 7 に示すように合成
グルココルチコイドである DEX によって FOXO1 標的遺伝子である筋萎縮関連遺伝子 Atrogin 1の著しい発現増加が観察された。そして DEX 誘導性の Atrogin 1 の遺伝子発現増加は
1,25(OH)2D3 によって抑制された。
BCAA は骨格筋のタンパク質を構成する必須アミノ酸の約 35%を占め、さらに食物中の必須ア
ミノ酸の約 50%を占めるとされる。すなわち、ヒトは大量の BCAA を体内に蓄えている。BCAAの代謝は身体の外部・内部の環境に適応して調節される。例えば、絶食や激しい運動などでFOXO1 によるタンパク質分解が増加するほか、PGC1α によって BCAA 分解酵素である BCAT2や BCKDHa が増加し、BCAA 分解が増加する（図 8）。BCAA のうち特にロイシンにはタンパク質合成促進作用が知られるが、絶食など筋萎縮が生じる状態ではロイシン量が減少するとともにタンパク質合成は減少する。すなわち、BCAA の分解を抑制することにより筋萎縮の抑制が期待される。DEX による筋萎縮誘導条件下で PGC1α 及び BCAT2、BCKDHa の発現の増加が観察された（図 9）。そして DEX 誘導性のこれらの遺伝子の発現増加は 1,25(OH)2D3 によって抑制された（図 9）。また、ロイシン、イソロイシンについては濃度が低く検出することができなかったが、細胞内バリン量は DEX によって減少し、1,25(OH)2D3 によって回復したことが観察された（図 10）。以上の結果より、1,25(OH)2D3 は DEX 誘導性の PGC1α 及び BCAT2、BCKDHa の発現増加を抑制することで BCAA の異化亢進を抑制することが示唆された。骨格筋の量はその合成と分解のバランスによって決定される。合成が大きければ骨格筋の肥大が生じ、一方で分解が大
きければ萎縮が生じる。これまでの結果では 1,25(OH)2D3 の FOXO1 の抑制を介した萎縮抑制作用の可能性を示してきた。しかし今回の結果は 1,25(OH)2D3 が萎縮の抑制だけでなく筋タンパク
質合成の低下を抑制する、すなわち骨格筋の合成と分解の両方にはたらきかけることで筋萎縮を抑制する作用を持つ可能性が示唆された。しかし、先に述べたように今回の結果における細胞内BCAA はバリンのみを示しており、他の BCAA であるロイシン、イソロイシンは濃度が低く、検出することができなかった。今後、収量を増やし、バリンだけでなくロイシン、イソロイシン
も 1,25(OH)2D3 によって DEX による減少が抑制されるか検討する必要がある。
【第 3 章】
骨格筋特異的 FOXO１過剰発現マウスにおけるビタミン D の効果
3-1 要旨FOXO1 は Atrogin 1 などの筋萎縮関連遺伝子を標的としており、低栄養や不活動、様々な病態
下で発現増加し筋萎縮を誘導する。以前に我々が作製した骨格筋特異的 FOXO1 過剰発現マウス
8

（FOXO1-Tg マウス）では顕著な筋萎縮が観察されている。ビタミン D はサルコペニア（加齢性筋萎縮）の予防に効果的であるという疫学的研究報告や、高齢者の多くでビタミン D が不足・欠乏しているという報告がなされているなど、ビタミン D と筋萎縮の関連が示唆されている。しかし、その詳細なメカニズムはよくわかっていない。また、これまでの結果からビタミン D による筋萎縮の抑制のメカニズムとして FOXO1 の抑制を介したものであることが示唆されている。つまりビタミン D が FOXO1 を抑制しているのであれば、ビタミン D が充足した状態の FOXO1-Tg
マウスでは、不足した状態の FOXO1-Tg マウスと比較して筋萎縮、筋機能の低下が抑制されることが予想される。そこで本研究では FOXO1-Tg マウスを低ビタミン D 餌で飼育し、生体においてもビタミン D による FOXO1 の抑制を介した筋萎縮の抑制が生じるかどうか検討した。
3-2 緒言骨格筋はヒトの体重の約 40%を占める人体で最大の組織であり、エネルギー代謝、糖取込み、運動において重要な役割を果たしている。骨格筋の機能はその量や質に反映され、身体活動、環境、病態などによって変化する。寝たきりや不活動、飢餓や加齢などによって骨格筋の萎縮が生じる 3), 4)。その結果、エネルギー消費の減少（肥満）や、糖取込みの減少・血糖値上昇（糖尿病）、そして生活の質（QOL）の低下へと向かう。超高齢社会を迎えた我が国において、筋萎縮の抑制は健康寿命の延伸の観点から重要である 5), 6)。そのため、生活習慣病の予防や QOL の維持のための骨格筋の萎縮・機能不全の予防法の開発は国民の健康の維持・増進のために重要である。
Forkhead box protein O1 (FOXO1)はフォークヘッド型の転写因子であり、低栄養や不活動、がんなどの病態下などで発現増加することが報告されている 7), 8)。また、骨格筋特異的に FOXO1を過剰発現させたマウス（FOXO1-Tg マウス）では顕著な筋萎縮が観察されている 9)。ユビキチ
ンリガーゼの一種である Atrogin 1 や MuRF 1、リソソームタンパク質分解酵素の一種である
Cathepsin L など、筋タンパク質の分解に重要な因子が FOXO1 の標的遺伝子として知られている
10) - 13)。

ビタミン D は脂溶性ビタミンであり、体内では骨ホメオスタシスを制御していることがよく知られているほか、骨格筋を含む多くの組織で重要な役割を担っている 5), 17)。サルコペニアを発症するような高齢者では VDR の発現が減少すること 15)や、血中ビタミン D が不足・欠乏していること 16)、高齢者へのビタミン D 投与で筋線維径の増大が見られる 18) など、ビタミン D と筋萎縮の関連が示唆されている。しかし、その詳細なメカニズムはよくわかっていない。また、これまでに行ってきた実験からビタミン D による FOXO1 の抑制を介した筋萎縮抑制効果が示唆されている（1 章、2 章）。そこで本研究では FOXO1-Tg マウスを低ビタミン D 餌で飼育し、生体における FOXO1 による筋萎縮とビタミン D の関係を調べた。FOXO1-Tg マウスでは顕著な筋萎縮が観察されており 9)、低ビタミン D 餌で飼育したマウスは筋力が低下することが報告されている 24)。ビタミン D が FOXO1 を抑制しているのであれば、ビタミン D が充足した状態の FOXO1Tg マウスでは、不足した状態の FOXO1-Tg マウスと比較して筋萎縮、筋機能の低下が抑制されることが予想される。すなわちビタミン D が充足していれば FOXO1 による筋萎縮は抑制される

9可能性があると考えられる。本実験により、生体内でもビタミン D によって FOXO1 が抑制されているかどうか検討することとした。
3-3 方法
○ 実験動物
以前に作製した骨格筋特異的 FOXO1 過剰発現マウス（FOXO1-Tg マウス、C57BL/6
background）を実験に使用した。このマウスは Human skeletal muscle α-actin プロモーターを用いて骨格筋特異的に FOXO1 を過剰発現させている。コントロールマウスには FOXO1-Tg マウスの同腹仔を用いた。飼育室は 24℃で 12 時間の明暗サイクルに設定し、床敷きは熱乾燥のピュアチップ（清水実験材料）、餌はコントロール群には AIN-93G（日本クレア）、低ビタミン D 群には
低ビタミン D 配合 AIN-93G を使用し、餌と水は自由摂取させた。
○ 群分け
・野生型コントロール群（WT ctr）
・野生型低ビタミン D 食摂取群（WT 低 VD）
・FOXO1-Tg コントロール群（FOXO1-Tg ctr）
・FOXO1-Tg 低ビタミン D 食摂取群（FOXO1-Tg 低 VD）
（n=6）
○ 餌
コントロール餌・・・AIN-93G（ビタミン D 含有量 100 IU/100g）
低ビタミン D 餌・・・低ビタミン D 配合 AIN-93G（ビタミン D 含有量 12.5 IU/100g）○ 実験スケジュール
4 週間各個体を飼育ケージで個飼いし、餌と水を自由摂取させた。実験期間中は摂食量は毎日、体重は 1 週間に 1 度測定した。4 週間後に解剖し、骨格筋（腓腹筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、
大腿四頭筋）、肝臓、腎臓、白色脂肪（精巣上体周囲）、血液を採取した。
○ 遺伝子発現解析 ― RNA 抽出・逆転写（RT）反応・リアルタイム PCR
解剖時に採取した骨格筋（腓腹筋）をマイクロチューブに入れ、液体窒素で凍結させて-80℃で保存した。その凍結切片約 0.5 g を破砕用チューブに入れ、セパゾール（ナカライテスク）1 ml とジルコニアボール（0.5 φ）を加え、破砕機で 5 分間破砕した。組織懸濁液を遠心分離（15,000 rpm,
4℃, 10 min）し、上清を別のチューブに入れた。そこへクロロホルム（ナカライテスク）200 µl を添加し、Vortex でよく撹拌した後、遠心分離（15,000 rpm, 4℃, 10 min）した。分離した溶液のうち上層（水層）だけを新しいチューブに回収し、そこへ 500 µl のイソプロパノール（ナカライテスク）を添加して転倒混和した後、遠心分離（15,000 rpm, 4℃, 10 min）により total RNA を沈殿させた。上清を除去し、80%エタノールでリンスしてから上清を除去した。骨格筋の場合は 100 µl の滅菌超純水で沈殿を溶解し、超微量分光光度計・Nano drop 2000 Lite（株式会社エル・エム・エス）
10を用いて 260 nm の吸光度を測定して Total RNA 量を決定した。
Total RNA をフラットキャップ PCR チューブで 0.5 µg/6 µl になるよう滅菌 MQ 水で希釈し、そこへゲノム DNA Remover*入り 4×DN Master Mix*を 2 µl 加え、37℃で 5 分間インキュベートした（DNase 処理）。DNase 処理後、5×RT Master Mix*を 2 µl ずつ加え、以下の反応条件（Table 1）で逆転写（reverse transcription:RT）反応を行い、cDNA を作製した。RT 反応後、TE を 90 µl 加え 10倍に希釈した。希釈したサンプル溶液で反応液（Table 2）を調製し、以下の反応サイクル（Table
3）で CFX connect real time PCR system(BioRad)を用いてリアルタイム PCR を行った。反応に使ったプライマーは Table 4 に示す。

*：ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO, cat:FSQ-301）○ 血清 25(OH)D3 解析
解剖時に採取した血液を氷上で 1.5 時間置いた後、遠心分離（3,000 rpm, 4℃, 15 min）し、上清（血清）を新しいチューブに回収した。回収した血清中の 25(OH)D3 の測定はエスアールエル
株式会社に委託した。
3-4 結果○ 骨格筋特異的 FOXO1 過剰発現マウスにおける低ビタミン D の影響の解析
FOXO1 は Atrogin 1 などの筋萎縮関連遺伝子を標的としており、低栄養や不活動、様々な病態
下で発現増加し筋萎縮を誘導する。以前に本研究室で作製した骨格筋特異的 FOXO1 過剰発現マ
ウス（FOXO1-Tg マウス）では顕著な筋萎縮が観察されている 9)。また、これまでの結果からビ
タミン D による FOXO1 の抑制が示唆されており、ビタミン D によって筋萎縮が抑制されることが考えられる。そこで FOXO1-Tg マウスを低ビタミン D 餌で飼育し、骨格筋の重量や遺伝子発現の変化を調べ、筋萎縮に対する影響を評価した。摂食量は群間に差は見られず（図 11）、体重については FOXO1-Tg マウスで低値であったが有意な差は無く、低ビタミンン D 餌による影響も見られなかった（図 11）。筋重量は、腓腹筋、前脛骨筋、大腿四頭筋が FOXO1-Tg マウスで有意に軽く、ヒラメ筋では差は見られなかった（図 12）。また、いずれも低ビタミン D 餌による影響は見られなかった。その他の組織（肝臓、腎臓、白色脂肪）の重量には変化は見られなかった。生体におけるビタミン D の充足・不足は血清中の 25(OH)D3 濃度で評価される。採取した血清中の 25(OH)D3 濃度を調べたところ、WT マウス、FOXO1-Tg マウスともに低ビタミン D 餌で飼育した群で有意に低下していた（図 13）。採取した骨格筋（腓腹筋）の遺伝子発現を調べたところ、FOXO1 は FOXO1-Tg マウスで有意に増加しており、VDR はビタミン D の充足・不足に関わらず変化が見られなかった。また FOXO1 の標的である Atrogin 1、Cathepsin L については、
Atrogin 1 は FOXO1-Tg マウスで ctr 餌群に比べ低ビタミン D 餌群で有意ではないがわずかな増加が見られ、Cathepsin L は FOXO1-Tg マウスで有意に増加していたが低ビタミン D 餌による影響は見られなかった（図 14）。

11

3-5 考察FOXO1 は Atrogin 1 などの筋萎縮関連遺伝子を標的としており、低栄養や不活動、様々な病態
下で発現増加し筋萎縮を誘導する。以前に我々が作製した FOXO1-Tg マウスでは顕著な筋萎縮が観察されている 9)。ビタミン D はサルコペニア（加齢性筋萎縮）の予防に効果的であるという疫学的研究報告 15)や、高齢者の多くでの多くでビタミン D が不足・欠乏しているという報告 16)がなされているなど、ビタミン D と筋萎縮の関連が示唆されている。しかし、その詳細なメカニズム
はよくわかっていない。また、これまでの結果からビタミン D による FOXO1 の抑制が示唆されており、ビタミン D による筋萎縮の抑制のメカニズムとして FOXO1 の抑制を介したものである
ことが考えられる。そこで FOXO1-Tg マウスを低ビタミン D 餌で飼育し、生体においてもビタミ
ン D による FOXO1 の抑制を介した筋萎縮の抑制が生じるかどうか検討した。ビタミン D が
FOXO1 を抑制しているのであれば、ビタミン D が不足した状態の FOXO1-Tg マウスではさらなる筋萎縮、筋機能の低下が予想される。FOXO1-Tg マウスで骨格筋重量の低下は見られたものの、
低ビタミン D 餌によって重量の低下は促進されなかった。しかしながら、遺伝子発現の変化を調
べると、筋萎縮関連遺伝子の Atrogin 1 が有意ではないものの低ビタミン D 餌によってわずかに発現が増加していた。また、低ビタミン D 餌で飼育した群は血清中の 25(OH)D3 濃度の低下が見られた（図 13）。すなわち、生体においてビタミン D が欠乏していると FOXO1 による筋萎縮が促進される可能性が示唆された。今回は既報 24)と同様に 1 ヶ月の実験期間で血清中の 25(OH)D3 濃
度の低下が見られた。しかし、その濃度に至るまでどれほどの日数がかかったのかは不明である。
ビタミン D は脂溶性であり、肝臓で脂肪組織に貯蔵されるため、1 ヶ月かかって血清中の 25(OH)D3
濃度が徐々に低下した可能性も考えられる。そのためビタミン D が欠乏した状態の影響を調べるにはさらに長期間の実験を行う必要があると想定される。また次のステップとして FOXO1-Tg マ
ウスにビタミン D を投与し、実際に筋萎縮が抑制されるか調べるべきであろう。
ビタミン D の栄養状態の指標は血清 25(OH)D3 濃度である。サルコペニアを発症するような高齢者では血清 25(OH)D3 濃度が低く、ビタミン D 不足・欠乏状態であることが報告されている 16)。
そのため、十分量のビタミン D を摂取し血清 25(OH)D3 濃度が充足した状態を保つことがサルコ
ペニア予防に重要であるのかもしれない。

表

Table 1 逆転写反応サイクル
37℃ 15 min|
50℃ 5 min|
98℃ 5 min
|
4℃ ∞

12

Table 2 リアルタイム PCR 反応液
試薬

液量Primer Fw (50 µM)

0.06 µl

Primer Rv (50 µM)

0.06µl

THUNDERBIRD SYBR green (TOYOBO)

5 µl

cDNA 溶液 (5 ng/µl)

2.5 µlMQ 水

2.38 µl

Total

10 µl

Table 3 リアルタイム PCR サイクル
95℃ 5 min|
95℃ 10 sec
60℃ 30 sec
×40 サイクル
70℃ 5 sec
Table 4 リアルタイム PCR プライマー配列
Gene

Forward Primer (5'-3')

Reverse Primer (5'-3')36B4GGCCCTGCACTCTCGCTTTCTGCCAGGCAGCGCTTGT

FOXO1

GCGGGCTGGAAGAATTCAAT

TCCAGTTCCTTCATTCTGCA

Atrogin 1

TCGGCAAGTCTGTGCTGGT

CCATCCGATACACCCACATGTCathepsin L

TCTCACGCTCAAGGCAATCA

AAGCAAAATCCATCAGGCCTCVDR

GGCTTCCACTTCAACGCTATGTGCTCGGCCTGAAGAAACCCYP27B1

CATCATGGGCAGAGCACCGTTCACCATCCGCCGTTAGCAACYP24A1

AACAGCACGACACACTGGCAGACTCGGCGAGCCCAGATGCAG

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15

図１

図２

図３

図４

図５−１ GAL4-FOXO1 レポーターアッセイ模式図
pM FOXO1プラスミドより発現したGAL4-FOXO1融合タンパク質がLuc
上流のUAS領域に結合するとFOXO1の転写活性によりLucが発現する。
このFOXO1の転写活性を抑制する食品成分等を探索していく。

＊＊

GAL4

GAL4-FOXO1

図５−２
HEK293T細胞にGAL4-FOXO1、4×UAS TK Lucプラスミドを導入した。20時間培養した。培養後にLuc assayを行った。
n = 3。**p<0.01、平均±SE

Luc activity (% of control)

120
100
80

**

60

**

40
20
0

control

Retinoic acid

1α,25(OH)2 VD3

図６
HEK293T細胞にGAL4-FOXO1、4×UAS TK Lucプラスミドを導入した。
各化合物（10 µM）を添加し20時間培養した。培養後にLuc assayを行った。
n = 3。 **p<0.01、平均±SEDEX

vehicle

FOXO1

VDR
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0

350

***

***
Relative mRNA Levels

Relative mRNA Levels

300
**

**

250
200
150
100
50

0

1,25(OH)2D3

1,25(OH)2D3
Cathepsin L

Atrogin 1
2500

300

***

***
**

***

1500

***

250
Relative mRNA Levels

Relative mRNA Levels

2000

200
150

1000

100

500
0

1,25(OH)2D3
図７

50
0

1,25(OH)2D3

*

図８

***
***

***

***
***

***

*
***

図９
1,25(OH)2D3（100 nM、1 µM）及びDEX（10 µM）を添加し、24時間培養したC2C12細胞のmRNA量をRT-qPCRによって測定した。
n = 3。*p<0.05、***p<0.001、平均±SE*

Valinep=0.051

*

DMSO

DEX

DEX+1,25(OH)2D3

図１０
1,25(OH)2D3（1 µM）及びDEX（10 µM）を添加し、24時間培養したC2C12細胞の細胞内バリン濃度を測定した。
n=3。 *p<0.05、平均±SE

(A)

(B)
***

***
**

*

図１１
WTマウス及びFOXO1-Tgマウスをctr餌あるいは低VD餌で1ヶ月飼育した。（A）各群の摂食量を測定し、1日の摂食量を算出した。（B）実験開始時及び解剖時の各群の体重を示す。
n=6。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、平均±SE腓腹筋 (g)前脛骨筋 (g)

***

***

***

ヒラメ筋 (g)***

大腿四頭筋 (g)
***

***

図１２
1ヶ月間ctr餌あるいは低VD餌で飼育したWTマウス及びFOXO1Tgマウスの各組織重量を測定した。
n=6。 ***p<0.001、平均±SE

***

***

図１３
1ヶ月間ctr餌あるいは低VD餌で飼育したWTマウス及びFOXO1Tgマウスの血清中の25(OH)D3を測定した。
n=6。 ***p<0.001、平均±SE

FOXO1
***

VDR

***

Atrogin 1

Cathepsin L***

図１４
1ヶ月間ctr餌あるいは低VD餌で飼育したWTマウス及びFOXO1-Tgマウスの骨格筋におけるmRNA量をRT-qPCRによって測定した。
n = 4。***p<0.001、平均±SE***