統合データベース講習会 AJACSオンライン2

塩基配列解析のためのデータベース・ウェブツール
2020年10月14日
ライフサイエンス統合データベースセンター (DBCLS)

内藤雄樹

Licensed under CC-BY 4.0©2020 内藤雄樹 (DBCLS)

自己紹介● 内藤 雄樹（ないとう ゆうき）
Twitter: @meso̲cacase

CRISPR direct● ライフサイエンス統合データベースセンター
Database Center for Life Science ＝生命科学データベース研究開発のための機関
東大(柏)と三島の国立遺伝学研究所に間借り
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遺伝子に関するデータベース● 遺伝子名などキーワードで探す● 遺伝子のさまざまなIDとは？
● 塩基配列から遺伝子を探す

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遺伝子に関するデータベース● NCBI トップページ

絞り込み● 検索窓にキーワードを追加していく... AND “Bombyx mori”[Organism]... AND AGO1[Gene Name]... AND patent[Title]● または、Advanced searchに行く

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遺伝子のIDとは？
● Accession Number● RefSeq ID● Gene ID● Symbol (遺伝子名)

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Accession Number● GenBank/ENA/DDBJ 国際塩基配列データベースに登録された塩基配列のID

俗にGenBankのAccession番号と呼ばれることもあるが、正確でない。

● A12345 や AB123456 の形をしている
参考：アルファベットの割り当て→ DDBJ の Preﬁx Letter List

● A12345.1 のようにバージョンを表示

UTRが延長されたりエラーが修正されて A12345.2のようにアップデートされる。

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RefSeq ID● 国際塩基配列データベースに登録された配列をもとにtranscriptごとに1個登録 → RefSeqデータベース
遺伝子の百科事典のようなもの● 選択的スプライシングで生じるvariantには別々のIDが付与されている● NM̲012345.6 の形式をしている

実用上はAccession番号の一種として扱うことができる。

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Symbol, Gene ID● 遺伝子ごとに付与される遺伝子名と番号
慣用名

SymbolGene ID

ヒト Argonaute 1

AGO126523

ショウジョウバエ Argonaute 1

AGO136544

カイコ Argonaute 1

Ago1100124421

シロイヌナズナ Argonaute 1

AGO1841262● Symbolは慣用名と一致しないこともある（ヒトp53→TP53）● 別の生物種で同一のSymbolがついていることもある● Gene IDは生物種と遺伝子を特定できる
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それぞれの関係
ヒト Chr22 (q11)
RefSeq ID:

NM̲001190326
NM̲022720

transcriptごと（塩基配列ごと）

Symbol: DGCR8Gene ID: 54487
遺伝子（locus）ごと

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塩基配列から遺伝子をさがす● NCBI BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/（または BLAST をググる）● UCSC BLAT

http://genome.ucsc.edu/ → Tools / Blat へ（または BLAT をググる）

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遺伝子データベースの検索● 検索ワードが多様（遺伝子名, ID, 遺伝子機能,タンパクのドメイン名, 疾患, 塩基配列,アミノ酸配列, ....）→ 入口が異なる。知らないと探せない● BLAST 等による塩基配列の検索→ 検索が遅い

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ググる
統合遺伝子検索 GGRNA (ぐぐるな)遺伝子名を検索

RefSeqの転写産物
・mRNA (NM̲, XM̲)・ncRNA (NR̲, XR̲)

遺伝子名を検索

Accession番号を検索

塩基配列を検索

塩基配列を検索

塩基配列を検索

アミノ酸配列を検索←何？

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Schaefer et al. (1999) IV. Wilson’s disease and Menkes disease.
Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 276, G311-G314

アミノ酸配列を検索

PCRのプライマー

primer-F:
agctcattactttatcagtgca
primer-R:
tgacgtattcactcttctggtt

McDNA
RT(-)

ある遺伝子に対してRT-PCRをかけようとしたらなぜかバンドが2本・・・
955585341258増幅遺伝子は何か？
予想されるバンドのサイズは？
Licensed under CC-BY 4.0©2020 内藤雄樹 (DBCLS)※架空のデータですPCRのプライマー

2272 - 1892 = 380
2371 - 1892 = 479

マイクロアレイのプローブID

Aﬀymetrix社GeneChipマイクロアレイ
1遺伝子につき25塩基 11箇所のプローブ→「プローブセット」例) 1552311̲a̲at
5mRNA

3...CCCGGGACAGAAGTGCGGCACCAGGGCAGGAGCTGCAGTAG...
AGAAGTGCGGCACCAGGGCAGGAGC ← PM probe
AGAAGTGCGGCAGCAGGGCAGGAGC ← MM probe

これをまとめて１つの値にする

マイクロアレイのプローブIDマイクロアレイのプローブIDGGRNA まとめ
http://GGRNA.dbcls.jp/● 遺伝子をGoogleのように検索● 検索対象はRefSeqの転写産物

RefSeq ID：NM̲*, XM̲* = mRNA
RefSeq ID：NR̲*, XR̲* = ncRNA● さまざまなキーワードに対応● 塩基配列、アミノ酸配列も素早く検索
とくに短い配列の検索が得意● 無償で自由に利用可能

商用利用であっても無償。
利用記録は当センターにおいて機密扱い。

Licensed under CC-BY 4.0©2020 内藤雄樹 (DBCLS)

ゲ

ゲ

ゲ

GGGenome による塩基配列検索
http://GGGenome.dbcls.jp/

ゲ

ゲ

ゲ

GGGenome による塩基配列検索

ゲ

ゲ

ゲ

GGGenome による塩基配列検索

ゲ

ゲ

ゲ

GGGenome による塩基配列検索

ゲ

ゲ

ゲ

GGGenome による塩基配列検索

ゲ

ゲ

ゲ

GGGenome による塩基配列検索

ゲ

ゲ

ゲGGGenome のしくみ
● 分割統治法30 mer / 5ミスマッチ以内

分割すると、どれかは必ず10 mer / 1ミスマッチ以内● 接尾辞配列 (suffix array) ＋ FM-index● インデックスをSSDに置くことにより高速化

漏れのない検索を高速に実行
Licensed under CC-BY 4.0©2020 内藤雄樹 (DBCLS)GGGenome を他のツールから呼び出す● アドレス ＝ 検索クエリ になっている● 結果をさまざまな形式で出力できる
検索例：

http[s]://GGGenome.dbcls.jp/hg38/2/ATAGGACCATA[.txt]
暗号化通信に対応①ヒトゲノムhg38に対し③この配列を検索②最大ミスマッチ・挿入欠失 ＝ 2 でLicensed under CC-BY 4.0©2020 内藤雄樹 (DBCLS)④結果はテキスト(txt) 形式で。

GGGenome を他のツールから呼び出す‘txt’

TTCA-ACAG “query”|||| || | “align”
TTCACACGG “sbjct”====D==X= “edit”

7 “match”
1 “mis”
1 “del”
0 “ins”

GGGenome を他のツールから呼び出す‘bed’

GGGenome
hit trackGGGenome を他のツールから呼び出す‘json’

表計算ソフトから GGGenome 検索= ImportData(D2)

PCRプライマー配列
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表計算ソフトから GGGenome 検索

Licensed under CC-BY 4.0©2017 内藤雄樹 (DBCLS)GGGenome まとめ● ゲノムを高速に検索可能

http://GGGenome.dbcls.jp/

350種の生物種（うち植物は80種）に対応● 短い塩基配列の検索に強い

ミスマッチや挿入欠失が多くても見落としのない検索● 他のツールから呼び出すことができる（REST API）
Googleスプレッドシートの ImportData() 関数
Excel 2013以降の WEBSERVICE() 関数
R、Ruby、Galaxy、ゲノムブラウザ・・・● 無償で自由に利用可能

商用利用であっても無償。
利用記録は当センターにおいて機密扱い。

Licensed under CC-BY 4.0©2020 内藤雄樹 (DBCLS)CRISPR-Cas9 のガイド RNA 設計

PAMに隣接する配列の選択
ガイドRNA
設計支援ツール

CRISPR direct

オフターゲット配列検索

高速で正確な塩基配列検索ツール

Licensed under CC-BY 4.0©2020 内藤雄樹 (DBCLS)GAAGGCAGTCCAGTGAAATG|||| |||| |||| |||||GAAGCCAGTACAGAGAAATG

wordが完全一致せず
BLASTで検索できない

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計
http://crispr.dbcls.jp/
Accession番号

または

塩基配列 を入力
PAM
オフターゲット検索のための生物種 を選択

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

数文字ほど入力すると生物種を検索 できる

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

標的サイトの位置と塩基配列

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

配列に関する情報

制限酵素サイト も

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

ゲノムに何箇所あるか？
20mer

PAM

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NGG

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計
緑：おすすめオフターゲット
サイトが少ない

オフターゲット
サイトが多いCRISPRdirect によるガイド RNA 設計

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

CRISPRdirect によるガイド RNA 設計

CRISPRdirect まとめ
http://crispr.dbcls.jp/● PAMに隣接し、特異性の高い20塩基を選択

ゲノムのほかの領域とは塩基配列が一致せず、標的とする部位とだけ完全一致する配列を選択。特にPAM近傍のseed(12塩基または8塩基) の特異性を重視。

● 大量設計にも対応

ヘルプページにてスクリプトを公開● 多くの生物種に対応

350種の生物種に対応 (GGGenomeと同じ)● 無償で自由に利用可能

商用利用であっても無償。
利用記録は当センターにおいて機密扱い。

Licensed under CC-BY 4.0©2020 内藤雄樹 (DBCLS)

（生物種の追加について）ゲノムが公開されていれば対応します。
ゲノム配列の所在、生物種に関する情報をご連絡ください（項目はヘルプページの一覧を参照）

おまけ

生命科学研究を支える
便利なデータベースやツール
約100個を簡潔に紹介
内藤雄樹／編 実験医学増刊号（羊土社）
今日から使える！ データベース・ウェブ
ツール 達人になるための実践ガイド100

ご清聴ありがとうございました