牛乳・乳製品の摂取に関連したサルコペニア予防作用を有するメタボライトの特定京都府⽴医科⼤学

岡村

内分泌代謝内科学拓郎

【要旨】
超⾼齢社会において、サルコペニアの発症予防は最重要課題である。本研究ではサルコペニア発症リスクが⾼い 2 型糖尿病患者を対象としたコホート研究において、⽜乳を⽇常的に摂取している⼈はそうでない⼈と⽐較し有意に⾻格筋率が⾼く、⾎清メチオニン濃度、フェニルアラニン濃度が⾼かった。さらにマウス筋管細胞を⽤いたメチオニン投与実験では、飽和脂肪酸による筋萎縮作⽤をメチオニンが有意に抑制したことから、⽜乳による抗サルコペニア作⽤にはメチオニンが作⽤している可能性が⽰唆された。
【緒⾔】
超⾼齢社会において、サルコペニアの発症予防は最重要課題である。⼀⽅で、動物実験において Db/Db マウスは筋⾁量の減少および筋⼒の低下、いわゆるサルコペニアを有しており、⾻格筋内での Foxo1 の発現上昇が「サルコペニア」の病態の中⼼であることを申請者は明らかとしている(Okamura T, et al. J Clin Biochem Nutr 2019)。
申請者らが実施しているコホート研究である KAMOGAWA-DM cohort study では 2014年より 1800 名の糖尿病患者、HOZUGAWA study では 2015 年より 300 名の⼈間ドック受診者を対象に簡易型⾃記式⾷事歴法質問(BDHQ)による栄養調査、握⼒測定、体成分分析検
査での⾻格筋量・体脂肪量の評価、⾎清・尿検体保存を実施している。こちらも先⾏研究において、サルコペニアを有する患者は⽜乳・乳製品の摂取量が少ない傾向にあることを明らかにしており、⽜乳・乳製品の代謝産物(メタボライト)が抗サルコペニア作⽤を持つと考えた。申請者は、研究協⼒者(Agilent 社⾼桑裕史⽒・アイスティサイエンス佐々野僚⼀⽒)の独⾃技術である脂質誘導体化法および固相抽出と糖質・有機酸誘導体化法 (Takeo E, et al.
J Biosci Bioeng 2017) を⽤いることにより⾎清・尿からの代謝物の抽出および誘導体化を安定化させる⼿法を開発した。そこで、本研究では登録患者の⾎清および尿中メタボライト(アミノ酸・有機酸・脂肪酸・糖類)をガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC-MS)を⽤いたメタボローム解析で網羅的に定量し、BDHQ における⽜乳・乳製品摂取量と有意な関連を⽰す抗サルコペニアメタボライトを特定する。さらには⾻格筋細胞を⽤いた細胞実験も併せて実施することで、メタボライトの抗サルコペニアメカニズムを明らかにすることを⽬的とし以下の実験を⾏った。
【⽅法】
研究計画 1. 研究計画 1. コホート研究 (KAMOGAWA-DM cohort study・HOZUGAWAstudy)での⽜乳・乳製品の摂取量と関連する⾎清メタボライトの特定KAMOGAWA-DM コホート研究に参加中の平均年齢 72.1 歳の 2 型糖尿病患者 110 名を対象に BDHQ による栄養調査、体成分分析検査での⾻格筋量・体脂肪量の評価を実施したほか、⾎清のアミノ酸・有機酸濃度を測定した。
メタボローム解析：保存⾎清および尿(50μL)の各検体を凍結粉砕後、アミノ酸・有機酸の固相抽出(AISTI 社)にて誘導体化処理後、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)シス

テム(Agilent7890B/5977B) を⽤いて測定する。⽜乳摂取群で増減したメタボライトを統計学的にランキングし選定する。さらには⽜乳・乳製品の摂取量と各種メタボライトの相関係数を求める。
研究計画 2. 研究計画 1 で同定した抗サルコペニアメタボライト投与による筋萎縮抑制の確認研究計画 1 で⽜乳摂取と⾻格筋量の変化に関与していたメタボライトをマウス筋管細胞C2C12 に投与することで、筋管細胞の増⼤、萎縮を確認する。
筋管細胞の増⼤を認めたメタボライト(抗サルコペニアメタボライト)を添加した際の細胞内遺伝⼦発現の変化を Real-time PCR により、ミトコンドリア機能を細胞外フラックスアナライザーにより確認することでサルコペニア予防に関わるメカニズムを明らかにする。
統計解析
⽜乳摂取量の多少で患者を 2 群に分け、2 群間の⾎清アミノ酸・有機酸濃度は t 検定で群間⽐較した。さらに 1 ⽇の⽜乳摂取量と⾎清アミノ酸・有機酸濃度,⾎清アミノ酸・有機酸濃度と⾻格筋指数のピアソンの積率相関係数は JMP ver.14 で算出した。P 値は 0.05 未満で統計学的有意と規定した。
【結果】
1. ⽜乳を習慣的に摂取している⼈はそうでない⼈と⽐較して有意に⾻格筋率が⾼かった
2 型糖尿病患者 111 名(男性: 47 名、⼥性: 63 名)を対象とした。平均年齢は 72.1 歳、平均 BMI は 22.7kg/m2 であり、⽜乳の平均摂取量は 135ml/⽇であった。
表 1. 患者背景

性別(男性/⼥性)

Total(n=111)
47/63

年齢

72.1 (5.3)

体重 (kg)58.9 (11.0)

Body mass index (kg/m2)

22.7 (3.4)

⾻格筋量 (kg)36.5 (7.7)

四肢⾻格筋量 (kg)17.5 (4.0)

⾻格筋指数 (kg/m2)

6.6 (1.0)

⾻格筋率(%)
収縮期⾎圧 (mmHg)

135.9 (14.4)

拡張期⾎圧 (mmHg)

79.8 (10.6)

⾎漿⾎糖 (mg/dL)

108.5 (24.7)

ヘモグロビン A1c (%)

6.1 (0.9)

クレアチニン (mg/dL)

0.84 (0.21)

eGFR (mL/min/1.73m2)

65.2 (13.5)

総コレステロール (mg/dL)

0.7 (0.5)

HDL-コレステロール (mg/dL)

71.8 (23.2)

LDL-コレステロール (mg/dL)

123.8 (30.7)

中性脂肪 (mg/dL)

100.6 (46.0)

エネルギー摂取量 (kcal)

1867.7 (568.7)

タンパク質摂取量 (g/day)

73.5 (25.3)

動物性タンパク質摂取量 (g/day)

30.1 (9.3)

植物性タンパク質摂取量(g/day)

28.6 (10.1)

脂質摂取量 (g/day)

53.9 (19.2)

炭⽔化物摂取量 (g/day)

243.4 (78.5)

普通⽜乳摂取量 (mL/day)

137.3 (123.7)

データは平均値（SD）または数値で表した。eGFR, estimated glomerular filtration rate.
⽜乳を 135ml/⽇以上摂取している⼈を Higher consumption(H)群、135ml/⽇未満摂取の⼈を Lower consumption(L)群と定義すると、それぞれ⼈数は 55 名となった。H 群、L 群
で⾻格筋率を⽐較すると、H 群で有意に⾼値であった(p=0.047)(図 1)。次に、保存⾎清を⽤いてアミノ酸・有機酸濃度を測定した。すると⾎清メチオニン濃度と⾎清フェニルアラニン濃度は L 群と⽐較し、H 群で有意に⾼値であった(メチオニン: H, 10±4 µmol/L, L: 8±4µmol/L, p=0.044; フェニルアラニン: H, 38±10 µmol/L, L: 8±4 µmol/L, p=0.028)。
表 2. ⾎清アミノ酸・有機酸濃度
⾎清アミノ酸・有機酸,

All

Lower consumption

Higher consumption(n=110)of milkof milk(<135ml/day)(≧135ml/day)(n=55)(n=55)µmol/L

p-valueアラニン

267(71)262(72)272(72)

0.553

シュウ酸

55(27)

58(26)

52(26)

0.337

バリン

172(47)174(46)172(48)

0.788

リン酸

3524(686)

3624(694)

3484(682)

0.886

ロイシン

92(26)

92(26)

92(26)

0.978

イソロイシン

44(14)

44(14)

44(14)

0.951

プロリン

96(42)

92(34)

100(50)0.363

グリシン145(49)150(50)140(46)

0.302

コハク酸

12(6)

12(6)

12(6)

0.316

セリン

72(19)

72(20)

72(18)

0.695

スレオニン

71(20)

72(22)

70(18)

0.641

リンゴ酸

7(3)

6(4)

6(2)

0.597

アスパラギン酸

7(4)

6(4)

6(4)

0.992

メチオニン

9(4)

8(4)

10(4)

0.044*

グルタミン酸27(14)

28(16)

28(14)

0.992

フェニルアラニン

41(12)

38(10)

44(14)

0.028*

クエン酸

35(40)

34(36)

36(44)

0.866

リジン

86(58)

88(54)

84(60)

0.807

チロシン

33(18)

30(16)

36(18)

0.172

データは平均値（SD）または数値で表した。*p<0.05(Unpaired t-test).
次に⽜乳摂取量と⾎清アミノ酸・有機酸濃度の⽐例係数を算出したところ、⾎清メチオニン濃度、フェニルアラニン濃度と有意な正の相関を認めた(メチオニン: r=0.209, p=0.031;
フェニルアラニン: r=0.184, p=0.049)。
表 3. 1 ⽇の⽜乳摂取量と⾎清アミノ酸・有機酸濃度の相関係数
アミノ酸および有機酸, µmol/L

rp-value

アラニン

0.062

0.530

シュウ酸

-0.0570.563

バリン-0.013

0.891

リン酸

0.040

0.684

ロイシン

0.021

0.832

イソロイシン

0.006

0.948

プロリン

0.027

0.785

グリシン

-0.040

0.686

コハク酸

-0.105

0.283

セリン

0.017

0.866

スレオニン

-0.057

0.564

リンゴ酸

-0.0630.520

アスパラギン酸

0.047

0.629

メチオニン

0.209

0.031*グルタミン酸-0.0660.500

フェニルアラニン

0.184

0.049*

クエン酸

0.126

0.198

リジン

0.035

0.719

チロシン

0.093

0.342

*p<0.05 (Pearsonʼs correlation).
次に⾻格筋率と⾎清アミノ酸・有機酸濃度の⽐例係数を算出したところ、⾎清バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、リンゴ酸、メチオニン濃度が有意な正の相関を認め(バリン: r=0.205, p=0.034; ロイシン : r=0.261, p=0.007; イソロイシン : r=0.236, p=0.014;
スレオニン : r=0.276, p=0.004; リンゴ酸: : r=0.222, p=0.021; メチオニン: r=0.246,p=0.011)、シュウ酸が有意な負の相関を認めた(r=-0.200, p=0.039)。
表 4. 血清アミノ酸・有機酸濃度と骨格筋指数との相関係数
アミノ酸および有機酸, µmol/L

rp-value

アラニン

0.177

0.069

シュウ酸

-0.2000.039*

バリン

0.205

0.034

リン酸

0.118

0.227

ロイシン

0.261

0.007*

イソロイシン

0.236

0.014*

プロリン

0.250

0.010*

グリシン-0.043

0.663

コハク酸

0.050

0.609

セリン

0.122

0.211

スレオニン

0.276

0.004*

リンゴ酸

0.222

0.021*

アスパラギン酸

0.090

0.356

メチオニン

0.246

0.011*

グルタミン酸-0.0680.488

フェニルアラニン

0.079

0.419

クエン酸

0.155

0.111

リジン

0.164

0.092

チロシン

0.100

0.305

*p<0.05 (Pearsonʼs correlation).

⽜乳摂取量及び⾻格筋率ともに⾎清メチオニン濃度と有意な正の相関を認めた。⽜乳摂取により増加した。以上の結果から、メチオニンが⽜乳摂取による抗サルコペニアメタボライトの⼀つであると考え、研究計画 2 の細胞実験においてメチオニンの抗サルコペニア作⽤を調べた。
2. メチオニンは筋管細胞のミトコンドリア機能を改善することで飽和脂肪酸誘導性筋萎縮を改善する
マウス筋芽細胞 C2C12 を 96-well plates およびフラックスアナライザー専⽤ plate に散布、増殖地で培養(Day-2)、80％コンフルエントとなった時点で分化培地へ変更(Day0)、
Day5 に 200μM パルミチン酸 +10mM, 50mM, 250mM のメチオニンを負荷(Day3)、24時間後(Day6)に下記項⽬を評価した。
RT-PCR にて遺伝⼦発現を調べたところ、筋萎縮関連遺伝⼦(Trim63, Fbxo32, Hdac4,Foxo1)、脂肪酸代謝関連遺伝⼦(Fasn, Scd1)、炎症関連遺伝⼦(Tnfa)はメチオニン投与により有意に低下した。さらに、細胞内のパルミチン酸濃度を調べたところ、メチオニン投与によりパルミチン酸濃度は有意に低下した。また、細胞外フラックスアナライザーによりミトコンドリア機能を調べたところ、メチオニン投与により飽和脂肪酸投与により低下したミトコンドリア機能は有意に上昇した(図 2)。
【考察】
本研究において、⽜乳を⽇常的に摂取している⼈はそうでない⼈と⽐較して、有意に⾻格筋率が⾼かった。さらに⽜乳を⽇常的に摂取している⼈はそうでない⼈と⽐較して、⾎清メチオニン濃度、フェニルアラニン濃度が有意に⾼く、⽜乳摂取量及び⾻格筋率ともに⾎清メチオニン濃度と有意な正の相関を認めた。以上の結果から、メチオニンが⽜乳摂取による抗サルコペニアメタボライトの⼀つであると考え、C2C12 筋管細胞にメチオニンを投与した
ところ、飽和脂肪酸による筋萎縮作⽤を有意に抑制することが明らかとなり、その⼀因としてミトコンドリア機能の改善が作⽤している可能性が⽰唆された。さらには、細胞内の飽和脂肪酸濃度も低下していたことから、メチオニンによるミトコンドリア機能の改善を介した細胞内脂肪酸代謝の亢進により飽和脂肪酸の筋毒性が軽減した可能性も⽰唆された。
本邦において、⾺庭ら[1]が実施した⾃⽴⾼齢者を対象とした⽜乳摂取による介⼊研究において、⽜乳の摂取により有意な⾎中必須アミノ酸濃度の上昇のほか、運動機能の改善を認めている。
分岐鎖アミノ酸以外のアミノ酸の多くは主に肝臓で代謝される⼀⽅で、分岐鎖アミノ酸は主に筋⾁で代謝され、⾻格筋タンパク合成を促進する⼀⽅で、筋タンパク分解を抑制している[2]。分岐鎖アミノ酸であるロイシンを⾼齢者に投与することで⾻格筋タンパク合成が促進することも報告されていることから、分岐鎖アミノ酸は⾻格筋の有効な基質となりサルコペニアの予防に有効である可能性が⾼い。現に本研究においても⾎清中のバリン、ロイシン、イソロイシン濃度は⾻格筋率と有意な正の相関を認めた。
メチオニンは必須アミノ酸の⼀種であり、普通⽜乳中のアミノ酸 1g あたり 27mg 含まれている(⽇本⾷品標準成分表 2020 年版)。メチオニンは動物実験において、⾻格筋中のインスリン様成⻑因⼦-I（IGF-I）の発現を上昇させる⼀⽅、メチオニンが⽋乏すると、筋⾁成
⻑関連遺伝⼦の発現が阻害され、⾻格筋の増⼤が抑制されることが報告されている[3,4]。
さらに既報において、メチオニンはミトコンドリア機能を⾼めることが報告されており、メチオニン添加によりミトコンドリアへのピルビン酸の取り込みと TCA サイクルの活性が促進されることが主因と考えられている[5]。⼀⽅で、メチオニン制限⾷はヒト細胞、酵⺟、動物において抗加齢効果を⽰し、寿命を延⻑させる効果を⽰すことが報告されているほか[6]、動物実験では、体重や脂肪の減少、酸化ストレスの低下、悪性腫瘍の減少、インスリン感受性の上昇、効率的なカロリー燃焼など様々な健康効果が報告されていることから[7]、メチオニンによる健康効果には議論の余地がある。しかしながら、⽜乳⾃体のメチオニン含有量は他のアミノ酸と⽐較しても多いわけではなく、⽜乳摂取に伴う種々の代謝の結果としての体内でのメチオニンの増加は、本研究の細胞実験の結果からもサルコペニアにとっては有⽤な可能性が⾼く、今後さらなる研究が必要である。
本研究の限界として、介⼊試験ではなく横断研究による⽜乳摂取量と⾎清アミノ酸・有機濃度の⽐較のため、因果関係の証明が現時点では困難である。しかしながら、⽜乳摂取の多い群、少ない群で⽐較した際にタンパク摂取量⾃体に有意な差を認めないにも関わらず⽜乳摂取に伴い変化した⾎中メチオニンやフェニルアラニンは決して⽜乳中に多く含まれるアミノ酸ではないことから、⽜乳が消化管に作⽤することでアミノ酸トランスポーターの発現を変化させた可能性が⽰唆された。そのため、⽜乳摂取に伴う消化管における栄養素トランスポーターの変化の確認には、さらなる研究が望まれる。
本研究は⽜乳摂取に伴う⾎液中のアミノ酸・有機酸濃度を測定した初めての研究である。
さらにメチオニンの抗筋萎縮効果を細胞実験で⽰しただけでなく、メチオニンのミトコンドリア機能障害の改善作⽤も明らかとなった。⽜乳摂取に伴い変化した⾎中メチオニンやフェニルアラニンは決して⽜乳中に多く含まれるアミノ酸ではないことから、⽜乳が消化管に作⽤することでアミノ酸トランスポーターの発現を調整している可能性があり、今後のさらなる研究が望まれる。
参考⽂献
[1]

MANIWA R, IWAMOTO M, YAMASAKI M, SHIWAKU K. ⽜乳および乳製品摂取による⾼齢者の介護予防効果に関する研究. ⽇本農村医学会雑誌 2012;61:77‒87.
https://doi.org/10.2185/JJRM.61.77.

[2]

Reitelseder S, Agergaard J, Doessing S, Helmark IC, Lund P, Kristensen NB, et al.
Whey and casein labeled with L-[1-13C]leucine and muscle protein synthesis: effectof resistance exercise and protein ingestion. Am J Physiol Endocrinol Metab 2011;300.
https://doi.org/10.1152/AJPENDO.00513.2010.
[3]

Wen C, Jiang X, DIng L, Wang T, Zhou Y. Effects of dietary methionine on breastmuscle growth, myogenic gene expression and IGF-I signaling in fast- and slowgrowing broilers. Sci Rep 2017;7. https://doi.org/10.1038/S41598-017-02142-Z.

[4]Pettem CM, Briens JM, Janz DM, Weber LP. Cardiometabolic response of juvenile
rainbow trout exposed to dietary selenomethionine. Aquat Toxicol 2018;198:175‒89.
https://doi.org/10.1016/J.AQUATOX.2018.02.022.

[5]

Tripodi F, Castoldi A, Nicastro R, Reghellin V, Lombardi L, Airoldi C, et al.
Methionine supplementation stimulates mitochondrial respiration. Biochim Biophys
ActaMolCellRes2018;1865:1901‒13.

https://doi.org/10.1016/J.BBAMCR.2018.09.007.
[6]

Dong Z, Sinha R, Richie JP. Disease prevention and delayed aging by dietary sulfur
amino acid restriction: translational implications. Ann N Y Acad Sci 2018;1418:44‒55.
https://doi.org/10.1111/NYAS.13584.

[7]

Fang H, Stone KP, Forney LA, Sims LC, Gutierrez GC, Ghosh S, et al. Implementationof dietary methionine restriction using casein after selective, oxidative deletion ofmethionine. IScience 2021;24. https://doi.org/10.1016/J.ISCI.2021.102470.

p= 0.047

LH

図1

図1. ⽜乳摂取量による⾻格筋率の差異
⽜乳を135ml/⽇以上摂取している⼈をHigher consumption(H)群、135ml/⽇未満摂取の⼈をLower consumption(L)群と定義した。
H群、L群で⾻格筋率を⽐較すると、H群で有意に⾼値であった(p=0.047)。

10.0****

100PAPA+MPA
et10+Mm
M
PA et5+M0et mM
250m
M0.0C
trl5****

0.00.0PAe
PA t 1+M 0m
M
PA et+M 50
et m M
250m
M

C
trl0.5**
****

500PA

****

OCR Data800

***
****

0.5

I

C2C12_PA

****

****

1.0PA+M100

****

****

0.5****

PA+MPAe
PA t 1+M 0mMPA et+M 50
et mM
250m
M

1.0****

****

****

OCR (pmoles/min)

15****

1.5**** ********

15020****

CH

C2C12_Tnfa

NCPAPA+Met50mM

600
400
2000l+MPAe
PA t 1+M 0m
M
PA et+M 50
et mM
250m
M

2.0

trl+M
PA
et
10+Mm
M
PA et+M 50
et mM
250m
M

PAG

C2C12_Scd1

PAC
trl+MPA
et
10+Mm
M
PA et
5+M0et mM
250m
M

F

****

1.00PAPACtrl0.0****

0.5**** ********

tr0.5

1.52********

2.0+MPAePA t 1+M 0m
M
PA et+M 50
et mM
250m
M

1.0****

1.5****

C2C12_Fasn

Ctrl********

E

C2C12_Foxo1

2.03

C****

D

C2C12_Hdac4

PA

1.5C
trl

1.0C

C2C12_Fbxo32+MPA
et
10+Mm
M
PA et+M 50
et mM
250m
M

1.5B

PA

C2C12_Trim63

PAA02040

Time (minutes)

6080

図2

図2. メチオニンによるC2C12筋管細胞の筋萎縮抑制効果
Real-time PCRによる遺伝⼦発現の評価 (A) Trim63, (B) Fbxo32, (C) Hdac4, (D) Foxo1, (E) Fasn,(F) Scd1, (G) Tnfa。
(I) 細胞内パルミチン酸濃度(μmol/mg)。(J) 細胞外フラックスアナライザーによるミトコンドリア機能評価。
Met, メチオニン; OCR, 酸素消費速度; PA, パルミチン酸.
t検定によるPA群との⽐較。**, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.