ISOHAIR データ集

1.

2.

3.

4.

ヒトの毛髪を用いた実験例

1

ミトコンドリア DNA の検出

1p53 遺伝子の検出

1MCT118 型検査

2T4 gene 32 protein を用いた PCR 阻害の緩和

3毛髪から得られる DNA 量5

毛髪の部位と DNA 量

5

脱毛後の時間経過と DNA 量

6

PCR 条件6

ヒトの爪を用いた実験例

7

ミトコンドリア DNA の検出

7p53 遺伝子の検出

8

MCT118 型検査

9マウスの体毛を用いた実験例

9ミトコンドリア DNA の検出

9p53 遺伝子の検出

10

マウスの爪を用いた実験例

10

ミトコンドリア DNA の検出および p53 遺伝子の検出
5.

ヒトの毛髪、爪、口腔粘膜を用いた実験例

NIPPON GENE CO., LTD.

1011

1. ヒトの毛髪を用いた実験例
ミトコンドリア DNA の検出
ISOHAIR を用いて、A、B、C 3 人の毛根部 1cm または毛幹部 6cm より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/4 量を使用して、ヒト ミトコンドリア DNA（D ループ領域；280bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
毛 根 部
MABC

毛 幹 部

＜PCR 混合液＞

BTemplate DNA

5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μl

AC

primer (20pmol each/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

H2 O

34.5μl

Total

50μl

＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

98℃ 15 sec.

M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)

55℃ 15 sec.

3% Agarose 2140 cycles

72℃ 30 sec.
72℃

5 min.

p53 遺伝子の検出
ISOHAIR を用いて、毛根部 1cm または毛幹部 6cm より DNA を抽出した。
得られた DNA の 1/4 量を使用して、ヒト p53 遺伝子(exon11)を semi-nested PCR(firstPCR 産物 1296bp、second PCR 産物 265bp) にて増幅し、電気泳動を行った。
＜PCR 混合液＞
secondTemplate DNA

毛幹部毛根部

毛幹部毛根部

firstM

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.25μl

H2 O
Total

50μl

＜first PCR 条件＞
94℃

1 min.

*テンプレートは 5μl を使用した。

98℃ 15 sec.
55℃ 15 sec.

40 cycles72℃ 30 sec.
72℃

5 min.

＜second PCR 条件＞

M: Marker 4 (φX174/Hae Ⅲ digest)

94℃

3% Agarose 21

ヒト p53 遺伝子を増幅した first PCR 産物を用いてサイクルシークエンスを行ったところ、毛根部、毛幹部ともにシークエンスすることができた。

-1-1 min.

98℃ 15 sec.
60℃ 15 sec.
72℃ 30 sec.
72℃

5 min.

*first PCR 産物 1μl をテンプレートとした。

30 cycles

MCT118 型検査
MCT118 座位は、第 1 染色体短腕部末端に位置する 16 塩基を繰り返し単位とするVNTR(variable number of tandem repeat)であり、個人によって繰り返し数が異なることを利用して、法医学資料からの個人識別などに用いられている。
ISOHAIR を用いて、A、B、C 3 人の毛根部 6cm より DNA を抽出した。得られた DNAの 1/4 量を使用して、MCT118 座位を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
MABC＜PCR 混合液＞
Template DNA

5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

H2 O

33.5μl

Total

50μl

＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

94℃ 30 sec.
64℃ 30 sec.

M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)
3% Agarose 21

72℃

2 min.

72℃

5 min.

30 cycles

ISOHAIR を用いて、父、母、子①、子②、他人の各々の毛根部 1cm×2 本より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/4 量を使用して、MCT118 座位を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
他人

父子②子①M＜PCR 混合液＞

母Template DNA5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

H2 O

33.5μlTotal50μl＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

94℃ 15 sec.
66℃ 15 sec.

M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)
3% Agarose 21-2-72℃

2 min.

72℃

5 min.

30 cycles

T4 gene 32 protein を用いた PCR 阻害の緩和
毛髪から抽出した DNA 溶液が、茶褐色や黒色に着色していることがある。これは 15cm以上の長い毛髪の毛先部や脱色された毛髪において特に顕著である。着色の原因物質は毛髪に含まれている色素メラニンであると考えられ、PCR を阻害することが報告されている。
ISOHAIR を用いて、毛髪よりメラニンを多く含むと思われる DNA を抽出した。
既に PCR による増幅が確認されている(Lane 1)反応混合液に、得られた DNA の 1/20量を添加したところ増幅しなかった(Lane 2)。そこで、さらに T4 gene 32 protein を添加したところ増幅した(Lane 3)。
また、得られた DNA をテンプレートとして、ヒト ミトコンドリア DNA(280bp)の PCRを行ったところ増幅しなかった(Lane 4)が、T4 gene 32 protein を添加したところ増幅した(Lane 5)。
M12345

Lane 1:ColE1 をテンプレートとした 900bp の増幅

Lane 2:

Lane 1 + 毛幹部 6cm より抽出した、メラニンを多く含む DNA1/20 量← 900bp

Lane 3:

Lane 2 + T4 gene 32 protein（2μg）

Lane 4:

毛幹部 6cm より抽出した、メラニンを多く含む← 280bpDNA1/20 量をテンプレートとしたヒトミトコ
ンドリア DNA（280bp）の増幅
Lane 5:

Lane 4 + T4 gene 32 protein（2μg）

M: Marker 5 (φX174/HincⅡ digest)
3% Agarose 21＜ColE1 PCR 混合液＞

＜ヒトミトコンドリア DNA PCR 混合液＞

Template DNA (ColE1/Sau96 I digest)

0.1ng

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)4μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

1μl

H2 O

28μl

Total （H2O up to）

40μl

Total

40μl

Lane1

Lane2

Lane3

Lane4

Lane5

ColE1 PCR 混合液

40μl

40μl

40μl

ヒトミトコンドリア DNA PCR 混合液

40μl

40μl

メラニンを多く含む DNA 溶液

0μl

1μl

1μl

メラニンを多く含む DNA 溶液(鋳型)

1μl

1μl

T4 gene 32 protein(0.5μg/μl)

0μl

0μl

4μl

T4 gene 32 protein(0.5μg/μl)

0μl

4μl

H2 O10μl

9μl

5μl

H2 O

9μl

5μl

Total

50μl

50μl

50μl

Total

50μl

50μl

＜PCR 条件＞
94℃＜PCR 条件＞

1 min.

98℃

94℃ 20 sec.
55℃ 20 sec.

1 min.

98℃ 15 sec.
20 cycles

60℃ 15 sec.

72℃ 20 sec.

72℃ 30 sec.

72℃

72℃

5 min.

-3-5 min.

35 cycles

＜参考データ＞
次に、メラニン量と T4 gene 32 protein の添加量の関係について例を示した。
T4 gene 32 protein によるメラニンの PCR 阻害の緩和について前ページで記述したが、T4 gene 32 protein 自身も、過剰量添加することにより、PCR 阻害を引き起こす。
また、メラニン含量が非常に高い場合、T4 gene 32 protein を添加しても、阻害を緩和することができないことが予想される。

M

メラニン 0 ng
T4 gene 32 protein (μg)
0 0.1 0.5 1 2 5 10

メラニン 150 ng
00.1 0.512510

M: Marker 2(λ/Hind Ⅲ・EcoR I double digest)
0.8% Agarose S

メラニン 15 ng
T4 gene 32 protein (μg)
M 0 0.1 0.5 1 2 5 10

メラニン 300 ng
0 0.1 0.5 12

メラニン 600 ng
T4 gene 32 protein (μg)
M 0 0.1 0.51 25 105 10＜ColE1 PCR 混合液＞
Template DNA (ColE1/Sau 96 I digest)

0.1 ng

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

1μl
0, 15, 150, 300, 600 ng

メラニン
T4 gene 32 protein

0, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10μg

H2 OTotal

50μl＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

94℃ 20 sec.
55℃ 20 sec.
72℃

20 cycles

1 min.

-4-毛髪から得られる DNA 量
ISOHAIR を用いて、A、B、C 3 人の毛根部または毛幹部より DNA を抽出し、電気泳動を行った。
個人によって、あるいは同一人物でも毛髪によって DNA 量に差があることが認められた。抽出されてくる DNA 量は、アガロース電気泳動の結果より、毛髪 1 本あたり毛根部では約 0.5μg、毛幹部では、ごく微量で検出できないことから 10ng 以下であると思われる 4)。
Ｍ12345Ｍ6789

Lane 1: A 毛根部 1 cm
Lane 2: A 毛根部 1 cm×5 本
Lane 3: A 毛幹部 6 cm
Lane 4: A 毛幹部 18 cm
Lane 5: A 毛幹部 36 cm
Lane 6: B 毛根部 1 cm
Lane 7: B 毛根部 1 cm×5 本←＊

Lane 8: C 毛根部 1 cm
Lane 9: C 毛根部 1 cm×5 本
M: Marker 2* Lane 1, 2, 7 の下部のバンド（矢印の位置）は RNA である。

(λ/HindⅢ・EcoR I double digest)

0.8％ Agarose S

毛髪の部位と DNA 量
毛幹部から DNA を抽出する際、毛髪の長さが同じでも、部位によって収量に差が認められる。
ISOHAIR を用いて、全長 45cm または 11cm の毛髪の毛根部から 0〜6cm、6〜12cm、12〜18cm、18〜24cm、24〜30cm、30〜36cm、36〜42cm の部位より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/4 量を使用して、ヒト ミトコンドリア DNA（D ループ領域；280bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
毛根部により近い部位の方が増幅量が多く、試料に含まれる DNA が多いと思われる。
全長11cm

全長45cm
0M63642303624301824121861206611 (cm)＜PCR 混合液＞
Template DNA

5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer (20pmol each/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

H2 O

34.5μlTotal50μl＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

98℃ 15 sec.
55℃ 15 sec.
72℃ 30 sec.

M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)

72℃

3% Agarose 21-5-5 min.

40 cycles脱毛後の時間経過と DNA 量
毛髪から回収できる DNA 量は、毛髪が抜けた後、時間の経過とともに徐々に減少していく。
ISOHAIR を用いて、抜いた毛髪の毛幹部 4cm を 76 日、57 日、31 日、0 日放置したものから DNA を抽出した。
得られた DNA の 1/4 量を使用して、ヒト ミトコンドリア DNA（D ループ領域；280bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
脱毛後時間が経っていないものの方が増幅量が多く、回収率が高い、あるいは PCR 阻害物質の溶出が少ないと思われる。
＜PCR 混合液＞

M7657310(日)Template DNA

5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

H2 O

33.5μl

Total

50μl

＜PCR 条件＞
M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)
3% Agarose 2198℃

1 min.

98℃ 15 sec.
60℃ 15 sec.

35 cycles

72℃ 30 sec.
72℃

5 min.

PCR 条件
毛髪から抽出される DNA は非常に微量であるため、再現性の高いデータをとるために
は PCR の反応条件に細かな配慮が必要である。
ISOHAIR を用いて、毛根部 1cm または毛幹部 6cm より DNA を抽出した。得られたDNA の 1/4 量をテンプレートとし、20mer または 30mer のプライマーを用いて、ヒト ミ
トコンドリア DNA（ D ループ領域；280bp）)を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
プライマーを 20mer から 30mer に伸ばすことにより、非特異的な増幅が抑えられた。
＜PCR 混合液＞

M

毛根部

毛幹部

20203030 (mer)＜PCR 条件＞

Template DNA

5μl

94℃

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

98℃ 15 sec.

dNTP mixture (2.5mM each)

4μl

55℃ 15 sec.

20mer primer (20pmol each/μl)

1μl

72℃ 30 sec.

Gene Taq NT (5units/μl)

0.25μlH2 O33.75μl
50μl

Total
Template DNA5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μl

30mer primer-forward (20pmol/μl)

1μl

30mer primer-reverse (20pmol/μl)
M: Marker 5 (φX174/HincⅡ digest)
3% Agarose 211μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.25μl

H2 O

33.75μl
50μl

Total-6-72℃

1 min.

5 min.

40cycles2.ヒトの爪を用いた実験例
ミトコンドリア DNA の検出
ISOHAIR を用いて、A、B 2 人の爪より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/10 量または 1/4 量を使用して、ヒト ミトコンドリア DNA（D ループ領域；279bp）を PCRにて増幅し、電気泳動を行った。
＜PCR 混合液＞
テンプレート量テンプレート量2μl

5μl

M 12341234Template DNA

2μl

5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μl

4μl

primer (20pmol each/μl)

1μl

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

0.5μl

H2 O

37.5μl34.5μl

Total

50μl

50μl

＜PCR 条件＞
98℃

1 min.

98℃ 15 sec.
55℃ 30 sec.
72℃

1 min.

72℃

5 min.

40 cycles

Lane 1: A 爪きりで切った爪をカッターで約 1mm 角に刻んだもの（9.7 mg）
Lane 2: A 爪きりで切った爪をカッターで約 1mm 角に刻んだもの（26.3 mg）
Lane 3: A 爪きりで切ったままのもの（34.0 mg）
Lane 4: B 爪きりで切った爪をカッターで約 1mm 角に刻んだもの（12.5 mg）
M: Marker 5 (φX174/HincⅡ digest), 3% Agarose 21

ISOHAIR を用いて、カッターで約 1mm 角に切った爪 0.5mg、1mg、2.5mg、5mg より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/10 量を使用して、ヒト ミトコンドリア DNA（D ループ領域；279bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
＜PCR 混合液＞

M0.512.55 (mg)Template DNA

2μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer (20pmol each/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μlH2 O

37.5μlTotal50μl＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

94℃ 30 sec.
55℃ 30 sec.
M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)
3% Agarose 21-7-72℃

1 min.

72℃

5 min.

35 cyclesp53 遺伝子の検出
ISOHAIR を用いて、A、B 2 人の爪より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/10 量または 1/4 量を使用して、ヒト p53 遺伝子（exon 10；279bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
＜PCR 混合液＞
テンプレート量テンプレート量

2μ l

5μ l

M 1 2 3 4

1 2 3 4Template DNA

2μl

5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)4μl

4μlprimer (20pmol each/μl)

1μl

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

0.5μl

H2 O

37.5μl34.5μlTotal50μl

50μl＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

94℃ 15 sec.
55℃ 30 sec.
72℃

1 min.

72℃

5 min.

35 cycles

Lane 1: A 爪きりで切った爪をカッターで約 1mm 角に刻んだもの（9.7 mg）
Lane 2: A 爪きりで切った爪をカッターで約 1mm 角に刻んだもの（26.3 mg）
Lane 3: A 爪きりで切ったままのもの（34.0 mg）
Lane 4: B 爪きりで切った爪をカッターで約 1mm 角に刻んだもの（12.5 mg）
M: Marker 5 (φX174/HincⅡ digest), 3% Agarose 21

ISOHAIR を用いて、カッターで約 1mm 角に切った爪 0.5mg、1mg、2.5mg、5mg より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/10 量を使用して、ヒト p53 遺伝子（exon 10；279bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
＜PCR 混合液＞
(mg)

0.5

12.55M

Template DNA

2μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

H2 O

36.5μl

Total

50μl

＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

94℃ 30 sec.
55℃ 30 sec.

M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)
3% Agarose 21-8-72℃

1 min.

72℃

5 min.

35 cycles

MCT118 型検査
ISOHAIR を用いて、カッターで約 1mm 角に切った爪 0.5mg、1mg、2.5mg、5mg および毛髪の毛根部 1cm より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/10 量を使用して、MCT 118 座位を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
毛根部M＜PCR 混合液＞

爪0.512.55(mg)Template DNA

2μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

H2 O

36.5μlTotal50μl＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

94℃ 30 sec.
55℃ 30 sec.

M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)

72℃

3% Agarose 2130 cycles

2 min.

3.マウスの体毛を用いた実験例
ミトコンドリア DNA の検出
ISOHAIR を用いて、マウスの体毛（1〜20mg）より DNA を抽出した。得られた DNAの 1/4 量を使用して、マウス ミトコンドリア DNA（D ループ領域；355bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
＜PCR 混合液＞

M

12510 15

20M(mg)Template DNA

5μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer (20pmol each/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl

H2 O

34.5μlTotal50μl＜PCR 条件＞
98℃

1 min.

98℃ 10 sec.
55℃ 15 sec.
72℃ 30 sec.

M: Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)

72℃

3% Agarose 21-9-5 min.

35 cyclesp53 遺伝子の検出
ISOHAIR を用いて、マウスの体毛（1〜20mg）より DNA を抽出した。得られた DNAの 1/4 量を使用して、マウス p53 遺伝子(intron 4；714bp)を nested PCR にて増幅し、電気泳動を行った。Second PCR の結果のみ掲載した。
＜PCR 混合液＞

M

125101520M

Template DNA
10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer (20pmol each/μl)

1μl

Gene Taq NT (5units/μl)

0. 5μlH2 O
Total50μl＜first PCR 条件＞
98℃

1 min.

*テンプレートは 5μl を使用した。

98℃ 10 sec.
60℃ 15 sec.
M: Marker 4 (φX174/Hae Ⅲ digest)
3% Agarose 21

72℃

1 min.

72℃

5 min.

30 cycles＜second PCR 条件＞
94℃

1 min.

*first PCR 産物 1μl をテンプレートとした。

94℃ 10 sec.
60℃ 15 sec.
72℃

1 min.

72℃

5 min.

30 cycles

4.マウスの爪を用いた実験例
ミトコンドリア DNA および p53 遺伝子の検出
ISOHAIR を用いて、マウスの指 1 本分（先端から 1〜2mm）の爪より DNA を抽出した。得られた DNA の 1/4 量を使用して、マウス ミトコンドリア DNA（D ループ領域；355bp）および p53 遺伝子（intron 4；829bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
M12＜PCR 条件＞

Lane 1:ヒトミトコンドリア DNA(ミトコンドリア DNA)

Lane 2: p53 遺伝子

98℃

M: Marker 5 (φX174/HincⅡ digest)

1 min.

98℃ 10 sec.

3% Agarose 21

55℃ 15 sec.

35cycles72℃ 30 sec.
72℃

5 min.

＜PCR 混合液＞
Template DNA

5μl＜PCR 条件＞

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl(p53 遺伝子)dNTP mixture (2.5mM each)

4μl

98℃

primer (20pmol each/μl)

1μl

98℃ 10 sec.

Gene Taq NT (5units/μl)

0.5μl
34.5μl

60℃ 15 sec.

H2 O

72℃

1 min.

Total50μl

72℃

5 min.

- 10 -

1 min.
30cycles5. ヒト毛髪、爪、口腔粘膜を用いた実験例
ISOHAIR を用いて、毛根部、爪、口腔粘膜より DNA を抽出した。
口腔粘膜は綿棒で採取し、（1）1×PBS で懸濁後に遠心分離した沈殿を使用する方法*１)と、（2）Extraction Buffer に直接綿棒を入れて懸濁したものを使用する方法*2)の二通りで試した。
*1) 頬の内側に綿棒をあて、回転させるようにして 15 秒ほど軽くこすって採取後、1×PBS 300μl に綿棒を入れて懸濁後、遠心(10,000rpm, 5min.)し、ピペットマンにて、上清を除いた沈殿。(肉眼で確認可能)*2) 頬の内側に綿棒をあて、回転させるようにして 15 秒ほど軽くこすって採取後、ISOHAIR の Extraction Buffer 200μl に直接綿棒を入れて懸濁したもの。
[DNA 抽出]
試 料← Extraction Buffer 200 μl *1)← Enzyme Solution 5 μl
← Lysis Solution 8 μl
混合
インキュベート, 55℃, 20 分
← Enzyme Solution 5 μl
混合
インキュベート, 55℃, 10 分
← フェノール／クロロホルム (1:1)
転倒混和, 5 分
11K×g, 室温, 5 分

水 相

200 μl *2)← 3M Sodium Acetate (pH5.2)← Ethachinmate 2 μl
混合
← エタノール 400 μl
11K×g, 室温, 15 分

沈 殿
70％エタノール洗浄
乾燥← TE (pH8.0) 20 μl
DNA 溶液- 11 -*1) 口腔粘膜(2)および綿棒(2)は綿棒が溶液を吸収してしまう為、約 100μl 程減少した。

200 μl*2) 口腔粘膜(2)および綿棒(2)は20 μl

液量が少ない為、水相 85μlに TE 115μl を加え Total 200μl とした。

それぞれの試料から得られた DNA の 1/4 量を使用して電気泳動を行った。

Lane 1:MarkerLane 2:

毛根部 1cm×3 本

Lane 3:

爪 1mm 角×2 個

Lane 4:口腔粘膜（1）

Lane 5:口腔粘膜（2）

Lane 6:

コントロール：綿棒（1）Lane 7:

コントロール：綿棒（2）Lane 8:

ネガティブコントロール

Lane 9:MarkerMarker 1(λ/Hind Ⅲdigest)
0.8% Agarose S

それぞれの試料から得られた DNA 溶液の 1/10 量を使用して、ヒト p53 遺伝子（Exon10；279bp）を PCR にて増幅し、電気泳動を行った。
＜PCR 混合液＞
Template DNA2μl

10×Gene Taq Universal Buffer

5μl

dNTP mixture (2.5mM each)

4μlprimer-forward (20pmol/μl)

1μl

primer-reverse (20pmol /μl)

0.5μl

H2 O

36.5μl

Total

50μl

＜PCR 条件＞
94℃

1 min.

94℃ 30 sec.
55℃ 30 sec.
Marker 5 (φX174/Hinc Ⅱ digest)
3% Agarose 21

実験例は、ニッポンジーン
株式会社ニッポンジーン

72℃

1 min.

72℃

5 min.

35 cycles

ホームページでもご紹介しております。
ホームページ

http://www.nippongene.com- 12 -1μl

Gene Taq NT (5units/μl)