JST

広島大学

新技術説明会4（アグリ・バイオ分野）

シンプル酵素触媒による効率的な有用物質変換

2021年10月5日

広島大学大学院 統合生命科学研究科
生物工学プログラム
准教授 田島 誉久講演内容

低温菌を利用したシンプル酵素触媒による物質変換
・本触媒のコンセプト
・シンプル酵素触媒の基礎的実験
・ポリマー素材等の生産系への適用（3-HPA, 1,3-PD, アスパラギン酸, イタコン酸）

従来の生体触媒

再生可能資源細胞工場

Thermotolerant
enzymes

基礎代謝
Roche社 Biochemical Pathway

副産物

ポリマー素材などの有用物質

欠点 ・低収率
・代謝工学による改変、時には困難なこともある
・培養制御や細胞の取り扱いが複雑

シンプル酵素触媒 –取り扱いが容易–

熱処理
原料

耐熱性酵素

副産物
利点

目的生産物

・高収率、副産物を生じない・酵素を精製することなく、細胞をそのまま反応に利用できる・化学触媒のように扱いが簡単である
・培養した細胞を熱処理するだけなので調製も容易である

低温菌を宿主として利用するシンプル酵素触媒 PSCat
Psychrophile-based Simple bioCatalyst

熱処理

細胞増殖

熱処理

大腸菌

低温菌

失活

失活

低温菌

中温菌

高温菌

温度

低中温性酵素を利用可能とする触媒である。
低温菌

中温菌

高温菌

菌株数

441,799232

遺伝子数148,253

4,451,614

457,902

Genomes OnLine Database (GOLD) 2013.9.

高Shewanella livingstonensis Ac10

至適生育温度：18˚C
30˚C以上で生育できない

南極海水から単離された海洋微生物

OD660

10
10.10.01
Shewanella livingstonensis Ac10(京都大学栗原達夫先生より分譲)

Shewanella frigidimarina DSM12253

18oC
4oC

02040

Time (h)60

Ac10株の増殖

中温の熱処理でシンプル酵素触媒を構築できるのではないか。

80熱処理による基質透過性の検討
各温度（20–70℃）で10分間熱処理後、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。

Ptac

また、触媒を培地に接種して増殖の有無を確認した。
熱処理温度
β-Galactosidase activity(Miller units)

lacZ

Apr

中温の熱処理とクロロホルム処理では同等の活性値を示した。

302010chloroform

Viability
β-Galactosidase activity(Miller units)

HindIII

pHA10-lacZ

400

熱処理時間

SmaI

202030304040

455050555560
607070 (℃)++------

40

熱処理時間には活性の差なし。

30201005min
510min1015min
1520min
20Time (min)30min
3060min60熱処理で低温菌の呼吸活性も失活する
呼吸活性による還元活性の可視的評価
CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride) staining

10 μm0 min

5101530

45℃、10分以上の熱処理により低温菌の呼吸活性が想定通りに失活していることが示された。

大部分の活性は菌体内部に由来する（漏出しない）細胞画分の酵素活性による酵素漏出の評価評価
菌体回収

Ratio of intracellular activities (%)

培養液

洗浄

熱処理 (45oC)

菌体・上清画分の酵素活性を測定

1008060402005min

10min

15min

酵素活性の約86%は菌体内部に由来した。

3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3-HPA) 生産
NADH

H2O

HOVitamin B12glycerol(Waste glycerol:BDF byproduct)

DhaB(glyceroldehydratase)

細胞回収洗浄培養(30時間)

acrylic acid20

3-HPA, Glycerol (mM)

3-HPA, Glycerol (mM)

3-HPA

3-HPA

151050Glycerol020

DhaT(1,3-PDoxidoreductase)

40Time (min)OH

1,3-PDPolymermaterial

反応 (37oC):
35 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0)
20, 50 mM グリセロール
15µM Vitamin B12PSCat 5.6 g dry-cell/L

熱処理
45oC, 15min(12時間後IPTG添加)

NAD+

60
50
4030
20
10060

熱処理

Ac10-Rifr（親株）-+

Ac10-Rifr/pHA12-dhaB （導入株）+3-HPAを収率100%、高生産性(8.85 mmol 3-HPA/g dry cell/h)で生成した。

1,3-プロパンジオール生成:NADH添加により生成量向上
DhaB

H2O

DhaTVitamin B12glycerol

NADH

3-HPA

1,3-PD 生成反応

20 mM glycerol, 15 mM VitaminB12, 5 mM NADH

PSCat 5.6 g dry-cell/L

複数酵素の発現による1-3-PDの生成
NADH 5 mM×4 (計20 mM)

NADH 5 mM
2020 mM formate

15glycerol

103-HPA

501,3-PD
01530Time (min)4560

Metabolites (mM)

Metabolites (mM)

20

1,3-PDNAD+

15
1,3-PD10
50glycerol
3-HPA01530Time (min)4560

1,3-プロパンジオール生成:NADH再生系により完全変換可能
DhaB

H2O

DhaT

Vitamin B12glycerol

3-HPA

補酵素再生系酵素との組み合わせによる1-3-PDの生成

Metabolites (mM)

2520CO2NADH

1,3-PD

NAD+HCOOH

FDH (formateFormatedehydrogenase)Ac10/pHA12-dhaBT-fdh

PSCat 33.5 g dry-cell/L
NADH 無添加 glycerol 20 mM

1,3-PD

3-HPA

151050

1,3-PD

glycerolglycerol
ギ酸 0 mM

3-HPA
ギ酸 20 mM

補酵素無添加で1,3-PDを収率98.5 %で生成した。

廃棄物を資源に変換する
DhaB

H2O

DhaT

Vitamin B12

glycerol

3-HPA

Substrate, Products (mM)

補酵素再生系酵素との組み合わせによる1-3-PDの生成

25

廃グリセロールの変換
1,3-PDO

20150

1,3-PDNAD+

FDH (formatedehydrogenase)

HCOOH
Formate廃グリセロール* 20 mM,
ギ酸ナトリウム 20 mM,
NADH 0 mM,
PSCat 33.5 g dry-cell/L*BDF アルカリプロセス廃グリセロール（グリセロール20 mM, 成分:57.9% (w/w)
グリセロール, 30.2% メタノール, 12.5%脂肪酸, 2.7% 灰分）

10
5CO2NADH

glycerol

3-HPA

Ac10/dhaBT-fdh

廃グリセロールから1,3-PDを高収率（95%）で生成した。

アスパラギン酸生成 –宿主代謝酵素と競合する反応–O
アスパルターゼ

フマル酸

NH2 O

アスパラギン酸OHOHOOH

OH

NH3O

・アスパルテームの原料
・C4 基幹化学品(米国DOE選定の有用化学品に含まれる)

フマラーゼ

OH2OHOOH
OHO
リンゴ酸

熱処理で宿主代謝酵素を失活させることができる

熱処理なし

熱処理 (50℃, 15 min)500

フマル酸（原料）400

アスパラギン酸（目的生産物）

300
200

リンゴ酸（副産物）

10000

12Time (h)34Metabolites (mM)

Metabolites (mM)

500

400収率向上

3002001000

副産物低減
012Time (h)34

宿主の代謝酵素による競合反応を抑制することで副産物生成が低下し、収率向上を実現した

固定化することで連続的な利用が可能である

Aspartate(mM)
600500400
300
200
100002468(%)

10Time (h)1214161820Yield

100755025012345Batch

678910

高収率な変換を繰り返し行うことが可能であった。
T. Tajima* et al., Efficient aspartic acid production by a psychrophile-based simple
biocatalyst, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 42(10), 1319-1324,(2015)

既報との比較

精製酵素Bacillus sp.
AspB
精製酵素

E. coli AspA
高発現株E. coli AspA

シンプル
酵素触媒

E. coli AspA

収率

固定化しない場合との速度変化

Reference

Eupergit C

96.7 %

83.0 %

Fernandez etal, 2012

連続

ポリアクリ
ルアミド

95 %

30.5 %

Tosa et al,
1973

8アルギン酸ナトリウム

73 %87.3 %

Chao et al,
2000

9

アルギン酸
ナトリウム

97.5 %

94.6 %

This Study

反応回数

担体

5イタコン酸の効率的生産
Aspergillus terrus
クエン酸 アコニターゼcis-アコニット酸

cis-アコニット酸
cis-アコニット酸
脱炭酸酵素
(CAD)

TCA cycle
オキサロ酢酸

イタコン酸

イソクエン酸

イタコン酸

細胞質

ミトコンドリア

C5 基幹物質:
コンタクトレンズやニトリル製品などのポリマー素材として有用な化合物

課題： 合成経路が代謝系と競合する合成酵素が異なるオルガネラに分かれている（反応場が分断）

シンプル酵素触媒による高効率生産

クエン酸
OHOOCO2OHOOH

クエン酸

HOOHO

Shewanella frigidimarina DSM12253
Shewanella livingstonensis Ac10OOHOHHOO
OOH

アコニターゼ
cis-アコニット酸(E. coli )cis-アコニット酸
脱炭酸酵素 (CAD)(Aspergillus terrus)

O

イタコン酸

イタコン酸

中温の熱処理で膜透過性を向上させる変換酵素を発現する同一プラスミドを導入した大腸菌と低温菌細胞を用い、熱処理による効果を比較した。
クエン酸

回収
熱処理した細胞懸濁液

培養

Relative itaconic acid productivity (%)

1614

イタコン酸生産

14.2

熱処理なし
熱処理あり

12

熱処理: 45℃, 15 min

10

反応: 28℃, 1 h864

2.7

3.7

20E. coliE.

2.6
S. livingstonesis
livingstonensis
S.

低温性Shewanella属細菌を宿主とした触媒では中温の熱処理により膜透過性を向上させることができる．

熱処理温度の検討

100

CAD活性（粗酵素）

90
1.280
Relative activity (%)

Itaconic acid productivity (g/L/h)

1.5

イタコン酸生成速度

70

0.9

60
50

0.6

4030

0.3020なし 35 40 45 50

0.9
Itaconic acid productivity (g/L/h)

熱処理: 35-45℃, 15 min
反応: 28℃, 1 h

0.8

sediment
supernatant

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2

100.100

なし 35 40 45 50

細胞, 上清による反応のイタコン酸生成速度なし 3540 45 50

熱処理温度 (ºC)
熱処理温度は45℃で生産性が最大であったが，CAD活性は低下した．
また，ほとんどは細胞による反応活性だが，1割程度は上清に漏出した．

繰り返し反応
熱処理: 45℃, 15 min
反応: 28℃

60

Itaconic acid productivity (g/L/h)

クエン酸

50Concentration (mM)

0.7

イタコン酸
cis-アコニット酸

4030
20100010Reaction time (h)20cells without washingcells with washing

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

1st2nd

3thBatch

4th5th

高収率でイタコン酸を生産し，触媒を繰り返して利用することが可能となった．
G. Luo, M. Fujino, S. Nakano, A. Hida, T. Tajima, J. Kato: Accelerating itaconic acid production by increasing
membrane permeability of whole-cell biocatalyst based on a psychrophilic bacterium Shewanella livingstonensis
Ac10, Journal of Biotechnology, 312, 56-62 (2020) doi:10.1016/j.jbiotec.2020.03.003

従来技術とその問題点
既に実用化されているものには、Aspergillus属
細菌や大腸菌を用いた微生物変換法があるが、生産性や収率が低いこと基質の膜透過性等に課題が残されている。

新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術の問題点であった、膜透過性の向上に成功した。
• 従来は膜透過性を向上させるために界面活性剤等の薬剤処理が主であったが、シンプル酵
素触媒では中温加熱処理で可能となった。
• 本技術の適用により、触媒構築の期間の短縮や薬剤を使わないことから、製造コストの削減が期待される。

想定される用途• 本技術の特徴を生かすためには、イタコン酸など幅広い化学品のバイオによる製造に適用することで中温での酵素反応を効率的に行うことが可能となる。
• シンプル酵素触媒のメリットとして、熱処理により競合する宿主の代謝酵素による原料基質等のロスをなくし、基質の膜透過性を向上させることが期待される。

実用化に向けた課題• 現在、変換酵素を活用した高収率なイタコン酸変換が可能なところまで開発済みである。しかし、触媒の固定化による長期利用は未解決である。
• 今後、触媒の安定的利用に関する検討を行う必要がある。

企業への期待• 収率を向上させた効率的な酵素変換を容易に行う手法として、本シンプル酵素触媒は有用であると考えている。
• 微生物や酵素の固定化技術を有する、酵素による変換プロセスを考えている企業との共同研究を希望。

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：低温菌を用いたイタコン酸の製造方法• 出願番号 ：特願2018-124796
• 出願人
：広島大学
• 発明者
：田島誉久、加藤純一、羅宮臨風

お問い合わせ先
広島大学
産学連携推進部 産学連携部門
産学官連携コーディネーター
栁 和裕（やなぎ かずひろ）〒739-8511 東広島市鏡山１丁目３－２
TEL: 082-424-4306 FAX: 082-424-6189
E-mail: yanagi@hiroshima-u.ac.jp