iPS細胞由来NK細胞の遺伝子導入による固形がんに対する抗腫瘍機能の強化
鳥澤勇介、櫻井哲哉、宮田琴子、竹野友理子、山田雅司、木村博信、田村康一
株式会社ヘリオス・神戸研究所
がん免疫細胞療法は新規の治療法として注目されており、血液がんで劇的な治療効果が報告されている。しかしながら、固形がんに対しては治療効果を示すには至っていない。
我々はこれまでに、ヒトiPS細胞からNK細胞を高効率で誘導でき、かつ大量培養が可能な手法の開発に成功している。
そこで本研究では、iPS細胞に遺伝子導入を施すことで、NK細胞の固形がんに対する抗腫瘍作用の強化を試みた。
5つの遺伝子を導入したヒトiPS細胞株を樹立後、分化を誘導することでCD56陽性のNK細胞（eNK細胞: HLCN061）を作製した。iPS細胞に導入した全ての因子はNK細胞においても良好に発現・分泌が維持されていた。今回、これら導入因子についてeNK細胞での機能検証を行った。
eNK細胞に導入した各因子の機能① IL-15の分泌 ⇒ 生存・増殖機能の向上② CCR2B発現 ⇒ がん細胞への遊走能力の向上③ CCL19の分泌 ⇒ 免疫細胞のリクルート機能④ NKG2D発現 ⇒ がん細胞の認識能力の向上⑤ CD16発現 ⇒ 抗体依存性細胞傷害活性の向上

NK添加後4時間(1 ng / mL) IL-15添加の有無によるNK細胞の増殖・生存を評価⑤ CD16② CCR2B④ NKG2D98

iNK (IL15あり)
iNK (IL15なし)
eNK (IL15あり)
eNK (IL15なし)

1.0
0.5

0.0

③ CCL19① IL-151.5123Time [days]

↓eNK
iNK

1 mm
Green + Red

5 mg / mL (10 mM)

iNK

eNK

eNK + RS5049393

7.E+05

3.E+05eNK

02.E+05
1.E+05（がんスフェロイドのGFP強度を経時的に計測）
51015Time [hours]

20iNK25

eNK細胞は、CCL19を分泌する樹状細胞（DC）とNK細胞を共培養することで、免疫細胞のリクルート機能を評価
実験方法
PBMCからCD14陽性細胞をMACSソート
↓Nmab
Cmab

20406080
Time [hours]

100120- 1.0×104 cellsのA549スフェロイド- 3.0×104 cellsのNK細胞を播種- 1 mg / mL anti-NKG2D抗体を添加- 1.0×104 cellsのA549スフェロイド- 3.0×104 cellsのNK細胞を播種- 10 mg / mL Necitumumab (Nmab)を添加- 2.5 mg / mL Cetuximab (Cmab)を添加

iNK+NmabiNK+Cmab

8.E+08⇒ 腫瘍部位への遊走機能が向上(左)iNK、(中)DC、(右)eNKを播種

4.0E+082.0E+08

A549スフェロイドに対する抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）をIncucyteで評価

Total GFP fluorescenceintensity [GCU mm2]

③ CCL19

6.0E+08⑤ CD16

4.E+050

eNK細胞は、CCR2Bに起因するがん細胞塊への遊走能力が強化

eNK
eNK+anti-NKG2D

5.E+050.E+0024H

eNK

8.0E+08⇒ がん細胞認識能力・殺傷能力が向上

6.E+05(-)

1.0E+09

eNK細胞は、NKG2Dに起因するサイトカイン産生・細胞傷害活性が強化

8.E+05

Green + Red Object Area [mm2]CCR２阻害剤：RS504393

iNK

eNK+RS504393
iNK+RS504393

(+)

iNK

MediumMedium+anti-NKG2D

eNK

Nmab
Cmab

eNK+NmabeNK+Cmab050100Time [hours]

8.E+08

Total GFP fluorescenceintensity [GCU mm2]

eNK

IFN-g [pg / mL]

平底の24 well plateの中央に播種

緑色蛍光(がん細胞)かつ赤色蛍光(NK細胞)の領域を経時的に評価(-)

A549に対する細胞傷害活性をIncucyteを用いて評価

anti-NKG2Dなし
anti-NKG2Dあり↓(+)⇒ NK細胞の生存・増殖機能が増強

1.0×104 cellsのA549（肺がん細胞株）を4日間培養してスフェロイドを形成

Incucyteでタイムラプス計測

92

4A549との共培養4時間後の培養液中の炎症性サイトカインの濃度をELISAで評価↓94

eNK細胞は、IL-15の無い環境下で、生存・増殖機能が向上④ NKG2D

蛍光染色したNK細胞(1.0×105 cells)を播種

96900

殺傷能力・生体内持続性・腫瘍部位への浸潤能力を増強
患者さんの免疫細胞も動員し、抗腫瘍効果を強化↓Viability [%]Proliferation rate

100

実験方法

iNK

Cell Viability at Day 42.0

Green：A549-GFP lung cancer cells
Red：NK cells labeled with Vybrant DiD

NK添加後24時間

eNK細胞は、IL-15の分泌機能が強化されているNK細胞に分化を誘導

Total GFP fluorescenceintensity [GCU x µm²]

② CCR2B① IL-15

遺伝子編集iPS細胞

eNK細胞の特徴

6.E+084.E+082.E+086.E+084.E+082.E+085日間、DCへの分化を誘導 (AIM-V + GM-CSF + IL-4)↓

0.E+00

2日間、DCを成熟化 (AIM-V+PGE2+TNFa+GM-CSF+IL-1b+IL-6)

0↓

5 mm

寒天で作製したウェル

緑色蛍光に染色したDC (2×104 cells / well)とNK細胞 (8×105 cells / well)を寒天で作製したウェル内で共培養➔ Incucyteでタイムラプス計測

0.E+0050
100Time [hours]

150

150

CD16の導入により、eNK細胞は抗体併用による細胞傷害活性が増強(0.5% Agar + RPMI1640 + 5% FBS )Green : DC labeled with Vybrant DiO

iNK

まとめeNK

eNK細胞の機能

0H

DC36H

① IL-15の分泌により、生存・増殖機能が向上② CCR2B発現により、がん細胞への遊走能力が向上③ CCL19の分泌により、免疫細胞のリクルートが可能④ NKG2D発現により、がん細胞の認識能力・殺傷能力が向上⑤ CD16発現により、抗体依存性細胞傷害活性が向上

遺伝子導入を施したiPS細胞からNK細胞を誘導することで、従来よりも固形がんに対する抗腫瘍作用を強化したNK細胞の作製が可能
演題名： iPS細胞由来NK細胞の遺伝子導入による固形がんに対する抗腫瘍機能の強化

60H

96H

施設名： 株式会社ヘリオス
氏名： 鳥澤勇介

eNK細胞が分泌するCCL19により、樹状細胞をリクルートできる⇒ 免疫細胞のリクルート機能を獲得

筆頭演者は、株式会社ヘリオスの社員です。