グリーンイノベーション研究拠点形成プロジェクト

平成２７年度～令和元年度私立大学戦略的研究基盤形成支援事業
研

究

成

果

報

告

書

令和 2 年 3 月
学校法人名

名城大学

大学名

名城大学

研究組織名

名城大学ナノカーボン研究センター

研究代表者

平松

美根男

（名城大学理工学研究科）

目 次
はしがき
・・
1
研究プロジェクトに参加した主な研究者、博士研究員
・・
2
研究成果の概要
・・
4
研究成果の詳細
1. ナノカーボン材料を用いたグリーンテクノロジー
1-1 ナノカーボン材料を太陽電池に応用する技術の開発
1-1-1 ナノカーボン・酸化鉄ナノチューブ材料を太陽電池に応用する技術の開発
・・
11
1-2 ナノカーボン材料を燃料電池に応用する技術の開発
1-2-1 燃料電池に応用可能な単層カーボンナノチューブ作製技術の開発
・・
1-2-2 白金ナノ粒子担持ナノグラフェン燃料電池触媒層作製技術の開発
・・
1-2-3 白金ナノ粒子担持カーボンナノウォール電極作製技術の開発
・・
1-2-4 酸化物ナノシートと機能性有機配位子の複合化技術の開発
・・
1-3 ナノカーボン材料をバイオセンサや VOC ガス浄化に応用する技術の開発
1-3-1-1 ナノカーボン材料をバイオセンサに応用する技術の開発(その 1)・・
1-3-1-2 ナノカーボン材料をバイオセンサに応用する技術の開発(その 2)・・
1-3-2 ナノカーボン材料を VOC ガス浄化に応用する技術の開発
・・
1-3-3 ナノカーボン材料の安全性評価技術の開発
・・

2. プラズマ技術を用いたグリーンテクノロジー
2-1 環境センシング及び殺菌浄化技術の開発
2-1-1 プラズマ技術を用いた環境センシング技術の開発
2-1-2 ナノカーボン材料を用いた環境センシング技術の開発
2-1-3 プラズマ技術を用いた難分解物質浄化技術の開発
2-1-4-1 プラズマ技術を用いた高効率殺菌手法の開発（その 1）
2-1-4-2 プラズマ技術を用いた高効率殺菌手法の開発（その 2）
2-1-4-3 プラズマ技術を用いた高効率殺菌手法の開発（その 3）

・・
・・
・・
・・
・・
・・

20
24
28
32

37
43
47
52

59
63
67
71
77
83

2-2 バイオマス燃料用の植物の高効率生長や高効率分解・発酵技術の開発
2-2-1-1 プラズマ技術を用いた植物の高効率生長手法の開発（その 1）
・・ 89
2-2-1-2 プラズマ技術を用いた植物の高効率生長手法の開発（その 2）・・ 93
2-2-2 バイオマス燃料用リグノセルロースの高効率分解技術の開発
・・ 97
2-2-3 バイオマス燃料用アミロースの高効率分解技術の開発
・・ 1022-2-4-1 バイオマス燃料用高効率発酵技術の開発(その 1)
・・ 106
2-2-4-2 バイオマス燃料用高効率発酵技術の開発(その 2)・・ 1102-2-5-1 大気圧プラズマプロセス評価技術の開発(その 1）
・・ 1152-2-5-2 大気圧プラズマプロセス評価技術の開発（その 2）・・ 122総括
今後の展望・・ 127・・ 128

はしがき
本研究プロジェクトは、名城大学で推進してきた 21 世紀 COE プログラム「ナノファクトリ
ー」、総合研究所ナノカーボン研究センター、ならびに、東海広域知的クラスター事業等で遂行してきた独創的なナノカーボン材料技術と先進プラズマ技術の成果を、自然エネ
ルギーを効率よく利用したり、環境を保全したりするための環境調和型の革新的なデバイスや技術（グリーンイノベーションテクノロジー）として発展させ、世界的な研究拠点を形成することを目的とする。この目的を実現するために「ナノカーボン材料を用いたグリーンテ
クノロジー」と「プラズマ技術を用いたグリーンテクノロジー」との 2 つの研究テーマを相乗効果が出るように遂行することで、環境調和型の革新的なデバイスや技術を開発し、現在地球規模での課題となっているクリーンで経済的なエネルギーシステムや健康長寿社
会の実現に貢献することが本研究プロジェクトの社会的意義である。
平成 27 年度は、カーボン太陽電池、燃料電池、バイオ・メディカル・環境分析デバイスへの応用を目指した各種ナノカーボン材料の試作実験、デバイス作製手法の検討及びプラズマによる酵母などの有益菌や植物の高効率成長促進、大腸菌などの高効率殺菌手法、プラズマを用いた環境分析・浄化手法の検討を行った。平成 28 年度は上記ナノカ
ーボン材料の基礎特性の評価、プラズマによる微生物等の成長促進効果と殺菌効果の定量的評価、プラズマを用いた環境分析・浄化手法の基本特性の定量的評価を行った。
平成 29 年度にはナノカーボン材料の基礎特性の改良及び各種デバイスへの応用、プラズマと溶液と細胞との相互作用計測による微生物等の成長促進と殺菌手法、環境分析・浄化手法の改良、中間評価を行った。
平成 30 年度以降は、上記デバイスや技術のさらなる改良、総合評価、実用化のための知見及び技術の集約を行った。

1

研究プロジェクトに参加した主な研究者
研究者名

平松 美根男

坂東 俊治

丸山 隆浩

大脇 健史

才田 隆広

伊藤 昌文
太田 貴之
竹田 圭吾
加藤 雅士
灘井 雅行
小森 由美子
村田 富保
志水 元亨
熊谷 慎也

内田 儀一郎所属・職名

プロジェクトでの研究課題

プロジェクトでの役割

プロジェクトの統括とナノ ナノカーボン材料とプラズ
理工学研究
カーボンプラットフォーム マ技術を用いたグリーン科・教授の開発と応用
テクノロジーの開発
ナノカーボン材料を用い
理 工 学 研 究 ナノカーボン材料を用いたグリーンテクノロジーの科・教授
太陽電池開発開発
ナノカーボン材料を用い ナノカーボン材料を用い理工学研究
た 燃 料 電 池 電 極 材 料 の たグリーンテクノロジーの
科・教授
開発
開発
ナノカーボンと光触媒の ナノカーボン材料を用い理工学研究
ハ イ ブ リ ッ ド 材 料 に よ る たグリーンテクノロジーの科・教授
VOC ガス浄化開発
ナノカーボン材料を用い
理 工 学 研 究 燃料電池用触媒およびデたグリーンテクノロジーの科・准教授
バイスの作製・評価
開発
バイオ燃料用植物・菌成 プラズマ技術とナノカーボ
理工学研究
長促進、ナノカーボンプラ ン材料を用いたグリーン
科・教授
ットホームの開発
テクノロジーの開発
理 工 学 研 究 環 境 浄化 及 び環 境分析 プラズマ技術を用いたグ
科・教授
用プラズマと手法の開発
リーンテクノロジーの開発
理 工 学 研 究 プラズマ装置の性能評価 プラズマ技術を用いたグ
科・准教授
支援リーンテクノロジーの開発
農学研究科・ バイオ燃料用植物・菌の プラズマ技術を用いたグ
教授
成長評価
リーンテクノロジーの開発
ナノカーボン材料を用い薬学研究科・ カーボンナノ材料の安全
たグリーンテクノロジーの
教授
性評価
開発
薬学研究科・ 微生物を用いた環境浄化 プラズマ技術を用いたグ
准教授の評価
リーンテクノロジーの開発
薬学研究科・ プラズマ処理溶液の安全 プラズマ技術を用いたグ
准教授
性評価
リーンテクノロジーの開発
農学研究科・ バイオ燃料製造促進の評 プラズマ技術を用いたグ
准教授
価リーンテクノロジーの開発
ナノカーボン材料を用い
理 工 学 研 究 デバイス化 MEMS 技術のたグリーンテクノロジーの
科・教授
検討
開発
ナノカーボン材料を用い
理 工 学 研 究 リチウムイオン電池材料
たグリーンテクノロジーの科・教授への応用検討開発
2

ナノカーボン材料とプラズ
理 工 学 研 究 プロジェクト全体に関する飯島 澄男
マ技術を用いたグリーン
科・終身教授 助言、指導
テクノロジーの開発
ナノカーボン材料を用い（ 共 同 研 究 機 ㈱名城ナノカ
カーボンナノ材料の品質・
関等）
ーボン・代表たグリーンテクノロジーの生産性向上支援
橋本 剛
取締役
開発
名古屋大学
プラズマ技術とナノカーボ
低温プラズマ プラズマ装置の性能評価
堀 勝
ン材料を用いたグリーン科 学 研 究 セ 支援
テクノロジーの開発
ンター・教授名古屋大学
低温プラズマプラズマ技術とナノカーボ
プラズマ活性溶液評価・
石川 健治
科学研究セ
ン材料を用いたグリーン
表面反応解析支援
ンタ ー・特任
テクノロジーの開発
教授
プロジェクトで採用した博士研究員
理工学研究科・博士
研 究 員 (H28.6.1呉 凖席
30.3.31)
大阪市立大学・准教授(H30.4～現在)
理工学研究科・博士
研 究 員 (H30.6.1R1.9.30)
Vladislav
名古屋大学低温プラ
Gamaleev
ズマ研究センター・博
士 研 究 員 (R1.10.1 ～現在)

プラ ズマ源 の開発 プラズマ技術を用いたとプラズマ及びプロ グリーンテクノロジーのセス評価法の開発 開発

ナノカーボンプロセ ナノカーボン材料とプラスの開発、プラズマ ズマ技術を用いたグリ源の開発と評価ーンテクノロジーの開発

3

研究成果の概要
平成 27 年度からの取り組みにおいて、 118 編の学術論文、7 編の学術図書、952 件の国内・国際学会発表、8 件の特許申請など多くの成果を挙げてきた。(様式 2、13 研究発
表の状況 参照) 例えば、①単層カーボンナノチューブを 300℃以下の低温で作製する技術の実現、②白金担持ナノグラフェンおよび白金担持カーボンナノウォールを用いた
高耐久燃料電池触媒層の実現、③カーボンナノウォール用いた電気化学センサの実現、④カーボンナノウォールの構造制御技術の実現、⑤カーボンナノウォールによる微量有機分子質量分析技術の実現、⑥セルロース分解促進技術の実現、⑦でんぷん分解酵素
アミラーゼ分泌促進技術の実現、⑧アルコール発酵酵母の成長促進技術の実現、⑨大気圧ラジカル処理された活性水、培養液等の生体安全性等に対する評価技術の確立などである。これらの成果により、研究者が 6 件受賞、大学院生らが計 33 件受賞し、研究者が基調講演 5 件、キーノート講演 13 件、招待講演 124 件の合計 142 件の招待講演を受けるなど、本グループの研究成果は国際的にも高く評価されている。また、本期間内に研究代表者は第 11 回(2017 年度)応用物理学会フェロー表彰を受賞している。また、本研究プロジェクト主催の国際ワークショップを１回、2 国間ワークショップを 10 回、グリーン
イノベーションセミナーを 6 回開催し、グリーンイノベーション関連の学術分野の発展に寄与する取組を行った。さらに、これらの成果を企業との共同研究に発展させ、新たな産業形成に寄与すべく実用化に向けた取組も同時に進めている。本研究プログラムでは、１．
「ナノカーボン材料を用いたグリーンテクノロジー」と２．「プラズマ技術を用いたグリーンテ
クノロジー」の２つの研究テーマを相乗効果が出るように、1-1 ナノカーボン・酸化鉄ナノチューブ材料を太陽電池に応用する技術の開発、1-2 ナノカーボン材料を燃料電池に応用する技術の開発、1-3 ナノカーボン材料をバイオセンサや VOC ガス浄化に応用する技術の開発、2-1 環境センシング及び殺菌浄化技術の開発、バイオマス燃料用の植物の高効率生長や高効率分解・発酵技術の開発を遂行してきた。
具体的には、平成 27 年度からの取り組みを通じて、「ナノカーボン材料を用いたグリー
ンテクノロジー」では以下のような成果を達成した。
以下に研究成果の詳細を上記研究の詳細を研究課題番号順に記載する。

4

1. ナノカーボン材料を用いたグリーンテクノロジー
1-1 ナノカーボン材料を太陽電池に応用する技術の開発
1-1-1 ナノカーボン・酸化鉄ナノチューブ材料を太陽電池に応用する技術の開発
グラフェンへの窒素ドープを行い、層あたりの電気伝導性を未ドープに比べ 75%減少
させることに成功した。これらの成果を基にメラミン蒸気圧制御による窒素ドープグラフ
ェンのドーピングサイト制御技術、及び、超高圧ジェットミルと遠心分離を用いたナノ材
料の分散・単離技術を確立した。関連する成果は 7 件の論文として発表され、高い評価を得ている。
グラフェンの透明電極応用における電気伝導性向上を目的として、窒素ドープ以外にボロン原子のドープを試み、電気伝導性の変化を調べた。窒素ドープでは低濃度ドープにより確かな電気伝導性の向上を確認したが、ボロンドープでは電気伝導性が向上する場合と逆に劣化する場合が認められ、確実な制御方法の確立までには及ばなかったが、査読付き国際会議発表論文としてまとめた。酸化物ナノチューブ作製と二次電池電極応用に向けて、酸化鉄ナノチューブ、酸化チタンナノチューブの純度向上、及び新たに酸化バナジウムナノチューブの作製方法を確立した。これらのナノチューブ
材料を活物質として，正極に酸化鉄ナノチューブ、負極に酸化チタンナノチューブを用いたナトリウムイオン電池フルセルの特性を調べ、出力電圧 1.3 V 容量 160mAh/g を達成した。酸化バナジウムナノチューブは、酸化鉄ナノチューブよりも酸化電位が高いことを確認しており、正極に用いることで特性が向上する可能性がある。さらに、電極添
加用導電材料として多層カーボンナノチューブの有効性も確認した。新たなナノカーボ
ン材料として今まで単離できなかった C60 分子内に Gd 原子を取り込んだ Gd@C60(CF)3分子を他大学との共同研究で、単離された状態の磁気特性を調べ、その電子状態を明らかにし、電極材料応用への可能性を追求した。（最終目標：太陽光変換効率 15%以上のナノ材料開発には至らなかったが、ナトリウムイオン電池として適応可能な酸化物ナノチューブ電極（放電容量 100mAh/g 以上）の開発に成功した。(*1-1-1 に対応)
（坂東）

1-2 ナノカーボン材料を燃料電池に応用する技術の開発
1-2-1 燃料電池に応用可能な単層カーボンナノチューブ作製技術の開発
化学気相成長（CVD）法により，燃料電池電極に応用可能な、高密度垂直配向した単層カーボンナノチューブ作製技術を実現した。また、燃料電池電極に適した高比表
面積を有するグラフェンと単層カーボンナノチューブのハイブリッド構造体の作製に向け、酸化グラフェン上への触媒ナノ粒子の高密度担持技術を開発し、露出触媒比表面積 200 m2/g を達成した。これらの成果を基に 300℃程度の低温で単層カーボンナノチ
ューブを作製する技術を確立した。以上の成果を元に、Co や Ir を触媒粒子に用いて、グラフェン上への単層カーボンナノチューブの作製を行い、燃料電池電極への応用を見据えたナノカーボンハイブリッド構造体の作製に成功した。さらに、大きな比表面積をもつポーラスカーボン上へも単層カーボンナノチューブの作製に成功した。関連する
成果は 25 件の論文、2 件の図書として発表され、1 件の招待講演を受けるなど高い評5価を得ている。(中間目標：グラフェン上への触媒担持特性の改良（露出触媒比表面積が７0 m2/g 以上）を達成したが、最終目標：電極比表面積：1000m2/g 以上は未達成)(*1-2-1 に対応)（丸山）
1-2-2 白金ナノ粒子担持ナノグラフェン燃料電池触媒層作製技術の開発
液中プラズマで作製したナノグラフェンのアモルファスカーボン成分除去方法や分散方法等の改善により、白金ナノ粒子担持ナノグラフェンを利用した燃料電池触媒層において 80 m2/g の白金表面積を達成し、液中プラズマを用いたナノグラフェンの製造
ならびに分散技術を確立した。さらに、この白金ナノ粒子担持ナノグラフェンの高電位
負荷サイクルテストを実施したところ、初期の白金の電気化学活性比表面積（ECSA）が半減するまでのサイクル数は 14 万を達成（カーボンブラックの 7 倍）した。関連する成果は 4 件の論文、1 件の図書として発表され、45 件の招待講演を受けるなど高い評価を得ている。（最終目標：電極比表面積 1000m2/g 以上は未達成）(*1-2-2 に対応)（平松、竹田、堀）1-2-3 白金ナノ粒子担持カーボンナノウォール電極作製技術の開発
プラズマ CVD 法で作製したカーボンナノウォールに超臨界化学堆積法を用いて白金ナノ粒子担持を施したカーボンナノウォール電極の高電位負荷サイクルテストを実施したところ、測定開始から 2 万サイクルでは白金の電気化学活性比表面積（ECSA）の減少が見られないことを確認、初期白金 ECSA が半減するまでのサイクル数は 14 万を達成（カーボンブラックの 7 倍）した。これらの成果を基にカーボンナノウォール表面上への白金ナノ粒子の高分散・高速形成技術を確立した。これらの成果は 3 件の論文として発表され、15 件の招待講演、3 件の学生表彰を受けるなど、高い評価を得ている。
(中間目標：触媒耐久性を市販品の 1.5 倍以上を達成したが、最終目標：単セル発電
時の最大負荷電流密度：2 A /cm2 は未達成）(*1-2-3 に対応)（平松、竹田、堀、内田、
Gamaleev）
1-2-4 酸化物ナノシートと機能性有機配位子の複合化技術の開発
有機配位子で表面修飾を行った酸化黒鉛ナノシートにおいて，アルカリ雰囲気下にて 0.9 V vs. RHE の酸素還元開始電位を得た。これらの成果を基に酸化物ナノシートと機能性有機配位子の複合化技術を確立した。これらの成果は 2 件の論文として発表され、6 件の招待講演を受けるなど高い評価を得ている。（中間目標：0.8 V ｖｓ.RHE 以
上の酸素還元開始電位は達成したが、最終目標：電極比表面積 1000m2/g 以上は未達成）(*1-2-4 に対応)（才田、丸山）

1-3 ナノカーボン材料をバイオセンサや VOC ガス浄化に応用する技術の開発
1-3-1 ナノカーボン材料をバイオセンサに応用する技術の開発
カーボンナノウォールの構造制御技術を確立するとともに、電気化学・バイオセンサの電極として有用性を示した。一例として、白金ナノ粒子で修飾したカーボンナノウォ
ール電極を用いた過酸化水素センサを試作し、検出限界 800nM、1-1500µM の直線性
領域を有することを確認した。これらの成果は 13 件の論文として発表され、21 件の招6

待講演を受けるなど高い評価を得ている。また、カーボンナノウォール表面のグルコー
スオキシダーゼ修飾を実施し、カーボンナノウォールを用いたグルコースセンサの開発に着手した。（最終目標：アミノ酸の検出感度 100nM 以下は未達成）(*1-3-1 に対応)
（平松、竹田、熊谷、Gamaleev）
1-3-2 ナノカーボン材料を VOC ガス浄化に応用する技術の開発
ナノカーボン材料と光触媒を組み合わせると、光触媒単独による分解に比べ、トル
エンガス分解効率を高めることができた（3 ﾘｯﾄﾙ 500ppm 濃度で、1 mW/cm²照射下において光触媒単独の減少率は 40ppm/h、組み合わせでは 120ppm/h）。これらの成果を基に可視光応答型光触媒と大気圧プラズマを組み合わせた VOC ガス分解装置を開発した。これらの成果は 2 件の論文として発表され、1 件の招待講演を受けるなど高い評価を得ている。 さらに、光触媒材料を複合化したり、大気圧プラズマを組み合わせた VOC ガス分解装置によって VOC ガス分解機構を調べた。その結果、分解効率を高め目標を達成した（上記条件で 270ppm/h）。また、分解の相乗効果を明らかにし、特許出願した。企業とも連携し、実用化に向けて活動中である。(最終目標：VOC ガスの分解率 99.9%は未達成となったが、270ppm/h の分解効率を達成した。)（*1-3-2 に対応）（大脇）
1-3-3 ナノカーボン材料の安全性評価法の開発
ナノカーボン（単層カーボンナノチューブ）は 14 種のシトクロム P450（CYP）分子種において mRNA 発現量を 50%以上低下させること、その機序の一部に DNA のメチル化が関与することを明らかにした。また、グルクロン酸転移酵素および硫酸転移酵素の発現がわずかに低下すること、さらにグルクロン酸転移酵素活性を低下させることを明らかにした。また、薬物の能動輸送に関わるトランスポーターの発現が変動する可能性が示唆された。ナノカーボンの種類により薬物の吸着が異なることも明らかにした。これ
らの研究成果は、論文（1 件）、国際学会（2 件）、国内学会（2 件）において発表し、ナノカーボンの生体安全性に関わる基礎的情報として評価を得ている。（*1-3-3 に対応）
（灘井）

また、「プラズマ技術を用いたグリーンテクノロジー」では以下のような成果を達成した。
2. プラズマ技術を用いたグリーンテクノロジー
2-1 環境センシング及び殺菌浄化技術の開発
2-1-1 プラズマ技術を用いた環境センシング技術の開発
気液プラズマを用いることで、標準液を用いることで最終目標の 0.1 ㎎/L の Cu の検出に成功した。これらの成果を基に大気圧気液プラズマを用いた食品内微量元素分析装置を開発した。さらに気液プラズマ源を用いた微粒子合成による重金属処理技術を確立した。これらの成果は 2 件の招待講演、1 件の学生表彰を受けるなど高い評価を得ている。(最終目標：Cu 0.1 mg/L は標準液で達成)(*2-1-1 に対応)（太田、平7

松、伊藤）
2-1-2 ナノカーボン材料を用いた環境センシング技術の開発
ナノカーボン材料をバイオセンサに応用する技術開発の成果を基に微量分析技術
として大気圧プラズマにより親水化処理されたカーボンナノウォールによる微量有機分
子質量分析技術を確立した。さらにカーボンプラットフォームを stripping 電極とした重金属の高速析出技術を確立した。また大気圧プラズマ源によるカーボンナノウォールの表面機能化による細胞培養テンプレート等を開発した。これらに関連する成果は 7 件の論文として発表され、32 件の招待講演と 3 件の学生表彰を受けるなど高い評価を得ている。（採択時の付された留意事項「2 つの研究テーマ間の協調性に留意」した成果）(*2-1-2 に対応)（太田、平松、竹田）
2-1-3 プラズマ技術を用いた難分解物質浄化技術の開発
水処理に適した液体滴下型大気圧プラズマ処理装置や液体蒸発型大気圧プラズ
マ処理装置を開発しインジゴカルミン（難分解物質のモデル色素）を 14 分で 100％分解することに成功したが酢酸分解率 99％は未達となった。 (最終目標：酢酸分解率
99％以上は未達) (*2-1-3 に対応)（太田）
2-1-4 プラズマ技術を用いた高効率殺菌手法の開発
脱イオン蒸留水に有機物を添加し、酸素ラジカル処理をすることで、pH を 5.8～8.6の状態で大腸菌を滅菌することに成功した。これらの成果を基に環境中に存在する多剤耐性菌高効率殺菌技術と殺菌特性を有する水耕栽培用有機肥料処理液を開発し、1 件の特許として申請中である。(最終目標：pH を 5.8～8.6 の状態で滅菌を達成) 関
連する成果は 3 件の論文として発表され、7 件の招待講演、4 件の学生表彰を受けるなど高い評価を得ている。また食中毒の原因となる黄色ブドウ球菌毒素溶液を酸素ラジカル処理することで、毒素活性を低下させる可能性を見出し（低下率：RPLSA 法で 2～4 管）、関連する成果は 3 件の論文として発表された。(*2-1-4 に対応) （伊藤、小森、呉、Gamaleev）

2-2 バイオマス燃料用の植物の高効率生長や高効率分解・発酵技術の開発
2-2-1 プラズマ技術を用いた植物の高効率生長手法の開発
大気圧プラズマ源で処理したプラズマ活性水により植物の生長を約 99％（約 2 倍に）促進することに成功した。また大気圧プラズマ源で処理したプラズマ処理土壌により植物の生長を 50％促進することに成功した。プラズマに電界パルスの効果を加えることで60％の成長促進に成功した。これらの成果は 3 件の論文として発表され、6 件の招待
講演、高い評価を得ている。（最終目標：生長促進 30％以上を達成） (*2-2-1 に対応)（太田、伊藤）
2-2-2 バイオマス燃料用リグノセルロースの高効率分解技術の開発
大気圧酸素ラジカル源によるセルロースの前処理で 100％のセルロース分解促進に成功した。また従来報告されているオゾン処理法の 10 倍以上の処理速度を得ることに8

成功した。さらに、アルカリ前処理リグノセルロースに対して大気圧酸素ラジカル処理をすることにより、副産物として生成するエタノール発酵阻害物質バニリンの毒性の低減を可能にし、アルカリ処理稲わらを用いた実験で 500%のバイオエタノール生産促進に成功した。これらの成果は 7 件の論文、1 件の図書として発表され、6 件の招待講演と2 件の賞と 6 件の学生表彰を受けるなど高い評価を得ている。またこれらの成果に基づいたセルラーゼ分解用プラズマ源を開発し、6 件の特許として申請中である。（最終目
標：分解促進 30％以上を達成）(*2-2-2 に対応) (加藤、志水、伊藤、呉、Gamaleev)
2-2-3 バイオマス燃料用アミロースの高効率分解技術の開発
大気圧酸素ラジカル源による菌の処理で、でんぷん分解酵素アミラーゼ分泌を40％促進することに成功した。これらに関する結果は 6 件の論文と 2 件の図書で発表され、招待講演 19 件、１件の優秀論文賞、3 件の学生表彰を受けるなど学術的にも高い評価を得ている。（最終目標：分解促進 30％以上を達成） (*2-2-3 に対応) （伊藤、呉、加藤、志水）2-2-4 バイオマス燃料用の植物の高効率発酵技術の開発
大気圧酸素・酸化窒素ラジカル源によりアルコール発酵酵母の成長を 20％促進することに成功した。一方、エタノール発酵阻害物質バニリン存在下では、酸素ラジカル
処理することで未処理に対して 300％の酵母成長にすることに成功した。これらの結果
は 2 件の論文 2 件の図書で発表され、19 件の招待講演を受けるなど学術的にも高い評価を得ている。（最終目標：成長促進 30％以上達成）(*2-2-4 に対応) （伊藤、呉、
加藤、志水）
2-2-5 大気圧プラズマプロセス評価技術の開発
大気圧プラズマ中の気相中でのラジカル密度の計測法、液中の長寿命活性種密度の計測法、疑似皮膚試料を使った活性種の透過性測定法、殺傷シグナル伝達酵素の計測法などを組み合わせ、各種培養細胞の殺傷メカニズムを解明することで生体安全性等に対する評価技術を確立し、多くの論文で成果を公表した。これらの結果は 37 件の論文と 2 件の図書で発表され、35 件の招待講演と 13 件の学生表彰を受けるなど高い評価を得ている。（大気圧プラズマ、活性水、活性培養液の生体安全性等に対する評価報を確立）（*2-2-5 に対応）（伊藤、呉、村田、竹田、熊谷、石川、Gamaleev）
上記のように、約 5 年間で予定していた研究内容に加え、新たなるデバイス、プロセス技
術や分析評価技術を実現し、2 つの研究テーマ間の協調性に留意した成果も残してきた。
次に、上記項目番号順に詳細な内容を示す。

9

1. ナノカーボン材料を用いたグリーンテクノロジー
1-1 ナノカーボン材料を太陽電池に応用する技術の開発

10

1-1-1

ナノカーボン・酸化鉄ナノチューブ材料を太陽電池に応用する技術の開発—

ナノチューブ状物質の太陽電池・二次電池用電極応用へ向けた基盤研究 —坂 東 俊 治
名城大学

理工学研究科

1. はじめに

18 世紀にはじまった産業革命においては蒸気機関の再生可能エネルギーにかかわる技術開発は，全世界的開発が大きな役割を果たしている．また，近年においに避けて通れない課題であり，研究者が専門分野にとては固体素子による電力制御，つまりトランジスター

らわれることなく学際領域横断的に情報交換，情報発の開発や関連領域の学問発展，青色発光素子による省信を行っている．本研究では，太陽エネルギー利用おエネルギー化は高純度 GaN 結晶成長技術の確立が礎

よび電気エネルギー貯蔵という観点に主眼を置き，ナとなっている．球形炭素クラスターであるフラーレン

ノチューブ状物質を活物質とした有機太陽電池やナ分子は，その特異な構造と電子状態を生かし，活性酸

トリウムイオン二次電池の電極用ナノ材料としての素（一重項酸素）クエンチャーとして注目されている．

性能評価を通じて，応用への可能性を追求した．ナノ

また，フラーレンケージに金属元素を内包した金属内材料としては，希少元素をできるだけ用いないように

包フラーレンがある．C82 ケージの中に金属元素を取する元素戦略を基本路線とした．以下に取り組んだ研

り込んだ金属内包フラーレンの単離は行われている

究課題を示し，各章でその成果を報告する．

が，C60 フラーレンに金属を内包した分子の合成・抽

まず，導電材料となるグラフェンへの異種元素ドー

出は，本研究以前までその成功例はなかった．新奇ナプによる電気伝導性の向上を目指した研究に取り組

ノ炭素材料開発と物性評価という点に立脚し，名古屋

んだ[1,2]．その後，酸化鉄ナノチューブを可視光吸

大学の研究グループと共同で Gd@C60(CF3)3 分子の単離

収材料とした光電変換素子を作製し，可視光領域の分精製を行い，名城大で磁気特性の評価を行った[6]．

光感度特性の評価を行った[3]．電気エネルギー貯蔵

この結果も併せて報告する．

としては，地球上に豊富に存在する元素であるナトリ
ウムを用いたナトリウムイオン二次電池に焦点を絞

2. 多層グラフェンの成長と異種元素ドープ

り，正極材料として酸化鉄ナノチューブ[4]，酸化バ

グラフェンは，Cu 基板上でのメタンの熱分解と炭ナジウムナノチューブ[5] を用いた半電池（ハーフセ素原子の表面拡散を用いる気相堆積法により成長さル）の評価，負極材料として酸化チタンナノチューブ

せた．異種元素として B と N を選んだ．それぞれの元[4]を用いたハーフセルの評価を行った．これらの結素の供給源として，B はフェニルボロン酸，N はメラ果を報告する．

ミンを用い，昇華してグラフェン成長炉にメタンガス

新たな技術の発展や学問領域の展開には，新奇物質とともに導入した．得られた試料を XPS により調べ，の発見，合成，抽出が起点となることが多い．例えば

異種元素ドーピングサイトの定量化を行った．図 1 は

11

B ドープグラフェン，
図 2 は N ドープグラフェンの XPS(edge-oxidized B)，CB-O ボンドを形成する．～187 eV

スペクトルである．

のピークは，C と完全に置き換わったものであり(graphitic B)，空気中に出しても酸素と結合しない．
このように XPS の結果から，B は 2 種類のサイトにドープされることがわかり，これらのドーピングサイトの制御が今後の課題である．
図 2 の N ドープグラフェンでは，N1s スペクトルのピーク分離により，4 つのドーピングサイトが存在す
ることがわかる．1 つは C と完全に置き換わったgraphitic N であり，残り 3 つは原子欠陥を伴ったドーピングサイト（ピロール型，ピリジン型）および，
それらの一部が空気中で酸化した edge-oxidized N(CN-O) に分類される．XPS スペクトルのピーク分離

図１により算定したドーピングサイト別ドープ量とそのB ドープグラフェンの XPS スペクトル．グラフェン成長
温度は 950℃であり，図中の B-120, B-140, B-160 の数
値はフェニルボロン酸の昇華温度を示す．B のドーピング量は，C1s と B1s の積分強度比から求めた．

合計を表１および表 2 に示す．
表 1．ドーピングサイト別 B ドープ量
Samplecode

Graphitic
(at%)

CB-O
(at%)

Total
(at%)

B-120

1.1

10.2

11.3

B-140

0.6

4.8

5.4

B-160

1.0

11.0

12.0

表 2．ドーピングサイト別 N ドープ量
Samplecode

Graphitic
(at%)

CN-O
(at%)

Pyrrolic(at%)

Pyridinic
(at%)

Total
(at%)

N-T1000

0.48

1.65

0

0.01

2.14

N-T950

0.38

1.07

0.02

0.15

1.62

N-T900

0.82

0.77

0.08

0.23

1.90

表 1 の B ドープ量について，合計のドープ量に対す
図２

N ドープグラフェンの XPS スペクトル．図中の記号
N-T1000, N-T950, N-T900 の数値はグラフェン成長温度を示す．メラミンの昇華温度は 200℃である．

る graphitic B が占める割合を求めると，B-120,
B-140, B-160 で，それぞれ ～10 %, ～11 %, ～8 % となり，B-160 試料では若干 graphitic B の割合が低

図 1 の B1s スペクトルより，～191 と ～187 eV にい．このことは，フェニルボロン酸の昇華温度を下げ，ピークが存在することがわかる．～191 eV のピーク

B 原子の供給割合を少なくして B ドープを行った方が，は，原子欠陥を伴って炭素と置き換わった B ドープを原子欠陥が少ない B ドープグラフェンが成長するこ示す．炭素ネットワーク中で，このような原子欠陥をとを示唆する．

伴った B は空気中に出すと即座に酸素と反応し表 2 より N ドープについても同様に合計の N ドープ

12量に対する graphitic N が占める割合を求めると，除去のためのアニーリング効果も含まれる．加熱温度

N-T1000, N-T950, N-T900 で，それぞれ ～22 %, ～は 443, 473, 523, 548, 573 K であり，それぞれの試

23 %, ～43 % となりグラフェン成長温度が低いほう

料コードを NT443, NT473, NT523, NT548, NT573 とが graphitic N の割合が高いことがわかる．さらに，した．これらの試料をアセチルアセトン，Triton

メラミンの昇華温度は 200 ℃で固定しており，メタ

X-100 を用いて水溶液中に分散させ，ITO ガラス上にンの供給量もすべての試料で同じであるため，合計のスピンコートした電極を作製し（図 4 参照），分光感

N ドープ量はほとんど試料に依存しないことになる．

度特性を評価した．

つまり，グラフェン成長温度を下げ Cu 基板表面でのCu 原子の拡散速度を遅くした方が，graphitic N のドーピングが促進されることを示唆する．
図 3 は未ドープグラフェン，B ドープグラフェン(B-140)，N ドープグラフェン (N-T1000) の表面抵抗
図4

プグラフェンよりも表面抵抗が低下することがわか

SEM および TEM 像．左は ITO ガラス上にスピンコートした酸化鉄ナノチューブ (NT473) の SEM像（右下挿入は TEM 像），右は TEM 像である．

る．今後，ドーピングサイトを制御した試料を作製し，

図 5 は，NT573 試料の対極(CE)に対する印加電圧 V

表面抵抗のドーピングサイト依存性を調べる必要がと光誘起電流 I の照射光波長依存性である．この図よある．

り，波長 510 nm の光を照射したときに光誘起電流がの温度依存性である．B や N をドープした方が未ドー大きくなることがわかる．同様なデータを前述したすべての試料について測定し，照射波長ごとに単位時間当たりのエネルギー密度で規格化することにより，光電変換効率(IPCE)を求めた．それらの結果が，図 6 の分光感度特性である．

図 3 表面抵抗の温度依存性．Gr (undope) は，未ドープ
グラフェンである（B-140, N-T1000 は，表１，2を参照）．Gr_ref は文献 1 より引用した．

3. 酸化鉄ナノチューブの分光感度特性と光
電変換効率
酸化鉄のバンドギャップは～2.2 eV であり，
波長 560

図 5 印加電圧 V と光誘起電流 I の照射光波長依存性．
測定は 573 K で熱処理した酸化鉄ナノチューブ
NT573 を用いて行った．

nm 程度の可視光領域の光により HOMO から LUMO への電子励起が可能である．酸化鉄ナノチューブはゾルゲ
ル法により作製した[7]．作製した試料には界面活性

図 6 に示す各試料の分光感度特性を比較すると，剤 F-127 が残存するため空気中での加熱処理により

NT573 試料において波長 510 nm の光照射で最も高い

これ完全に燃焼させた．この熱処理には，格子ひずみ

光電変換効率（IPCE）を示すが，波長 600 nm 以上で13

図 6 熱処理温度の異なる酸化鉄ナノチューブ試料に対する分光感度特性．573 K で熱処理をした
NT573 は波長 510 nm で最も高い光電変換効率を示すが，波長 600 nm 以上の領域で IPCE が急激に劣化している．

図 7 酸化鉄ナノチューブ（NT543）を用いた有機太陽電池の分光感度特性．図中に示した時間は，有機
ペロブスカイトの含侵時間である．含侵時間 10
秒で最もよい光電変換効率を示すことがわかる．

その効率が急激に劣化することがわかる．その他の試ければならないことがわかる．含侵した深さの定量化

料では分光感度特性の線形が変化することなく，熱処が今後の課題として残るが，図 7 には図 6 に示される

理温度の増加とともに IPCE が徐々に増加している．

波長 540nm 付近の光電変換効率のピークはなく，より

XRD を用いた分析により，酸化鉄ナノチューブは熱処短波長側で光電変換効率が高くなっている．いずれに

理温度 543 K まではマグネタイト型の結晶構造を維持しても，酸化鉄ナノチューブを用いて IPCE が 10 % 程するが，熱処理温度を 573 K まで上げるとヘマタイ度（可視光領域）で発電できることを示す結果が得らト型に変化することがわかった．このことが原因で，れた．

長波長領域の光電変換効率が低下したのであろう．長波長領域の太陽光スペクトルを有効に利用するため

4. 金属酸化物ナノチューブを用いたナトリには不具合な結果であり，NT543 試料が最良の特性を

ウムイオン二次電池用電極材料の開発示したことになる．

実験に用いた金属酸化物は，酸化鉄，酸化バナジウ

次に NT543 試料を用いてタンデム型有機太陽電池

ム，酸化チタンであり，それらをナノチューブ状にし（色素増感型）を作製し，その評価を行った．NT543ている．酸化鉄ナノチューブ (Fe-ox-NT) は前章で説

試料を光吸収材料とし，有機金属ハライドペロブスカ

明したゾルゲル法で作製した．酸化バナジウムは五酸（以下，有機ペロブスカイトと略）
イト（CH3NH3PbI3）

化バナジウム粉末を塩化テトラメチルアンモニウム，を含侵させた層を形成した．ホール輸送層としては

水酸化アンモニウムを加え，希硝酸で pH が 2～5 にな

P3HT (poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl)) を用いた．

るように調整し，120，140，160 ℃の 3 種類の温度で有機ペロブスカイトを NT543 層に含侵させるときに，

強攪拌しながら還流して作製した．これらの試料コー

γ-butyrolacton に溶かした有機ペロブスカイト溶

ドを Na-V-O 120, Na-V-O 140, Na-V-O 160 として表液を NT543 層に滴下したのち，0 秒から 300 秒まで待す．酸化チタンナノチューブ (Na-TiO2-NT) は，アナってスピンさせ，含侵させる深さの制御を試みた．こターゼ型二酸化チタン粉末を 10 M の水酸化ナトリウのようにして作製した有機太陽電池の分光感度特性

ム溶液中で強攪拌しながら 160℃で還流して作製した．

の含侵時間依存性を図 7 に示す．

得られたナノチューブ試料を活物質として用い，導図 7 より，光電変換効率は有機ペロブスカイト層の電材料として炭素粉末（もしくは多層カーボンナノチ

含侵深さに強く依存しており，適切な深さで制御しな

14ューブ），テフロン粉末を加え圧縮成型して膜状にし価へ酸化される過程も検出されており，より高い電位たものを白金メッシュに貼り付け，作用極(WE)とした．

で充電が可能であることを示している．V2O5 粉末につハーフセルを組み上げるときの対極（CE）は Pt 線をいても同様な測定を行ったが，図 8 の黒線で示される

用い，電解質液として NaClO4 を ethylene carbonate

ように明瞭な酸化還元波が検出されず，二次電池の活(EC)/ diethylene carbonate(DEC) = 1:1 に溶解した物質としての機能を果たさないことがわかる．

ものを用いた．

図 10 は WE の活物質として酸化チタンナノチューブ

図 8 は，WE の活物質として Fe-ox-NT を用いたときを用いた時の CV 曲線である．酸化鉄ナノチューブ，のサイクリックボルタングラム（CV 曲線）である．

酸化バナジウムナノチューブに比べ，低電位側に酸化波と還元波が検出されており，二次電池の負極材料に

図 8 酸化鉄ナノチューブの CV 曲線
図 10 酸化チタンナノチューブの CV 曲線

図 8 より，Ag/Ag+ 電位を基準にして -0.3 ～ -0.5
適することがわかる．

V に Fe(2+)→ Fe(3+) への酸化電位，-1.5 V 付近に

これら 3 種類の Na イオン貯蔵・放出材料としてのFe(3+)→ Fe(2+) への還元電位があることがわかる．

活物質に対して充放電特性を調べるため，ガルバニッ
クサイクルの測定を行った．図 11(a),(b),(c) はそ― V2O5 / C― Na-V-O 120 / C― Na-V-O 140 / C― Na-V-O 160 / C

V(3+) → V(4+)

れぞれ，Fe-ox-NT（酸化鉄ナノチューブ）, Na-V-O 120
V(4+) → V(5+)（酸化バナジウムナノチューブ）, Na-TiO2-NT（酸化チタンナノチューブ）を作用極（WE），Pt 線を対極(CE)としたハーフセルの充放電特性である．電気容量は，

V(4+) ← V(5+)

酸化バナジウムナノチューブ(Na-V-O 120) が一番大V(3+) ← V(4+)

き く ～ 165 mAh/g を 示 し ， 酸 化 鉄 ナ ノ チ ュ ー ブ(Fe-ox-NT) が ～49 mAh/g, 酸化チタンナノチューブ
図 9 酸化バナジウムナノチューブの CV 曲線．還流温度
120 で作製した Na-V-O 120 試料が最もよい再現性（サイクル特性）を示した．

(Na-TiO2-NT) が ～21 mAh/g である．酸化バナジウ
ムナノチューブで大きな値を示したのは，図 9 の CV

図 9 は WE の活物質として酸化バナジウムナノチュ

曲線で現れたように V の価数が 3 価から 5 価まで変ーブを用いた時の CV 曲線である．
Na-V-O 120, Na-V-O

化したことに対応する．このことを考慮して図 11(b)140, Na-V-O 160 ともに，同様な特性を示したが，の放電曲線の傾きに注目すると，横軸の電気容量がNa-V-O 120 試料のサイクル特性が最も高かった．

～10 ～ 80 mAh/g の領域と ～80 ～ 150 mAh/g の領Fe-ox-NT と異なり，図 9 に示すように V が 4 価から 5域で，曲線の傾きが異なっていることがわかる．前者

15

の 領 域で は V(5+) → V(4+)， 後 者で は V(4+) →V(3+)の価数変化に対応すると考えてよい．目標とす
る電気容量として 500 mAh/g 程度が一つの目安になるため，さらなる容量増加が必要である．
容量増加の試みとして，導電材料を炭素粉末から多Fe-ox-NT
図 12 導電材として多層カーボンナノチューブを用いた場
合と炭素粉末を用いた場合の CV 特性．多層カーボン
ナノチューブを用いると，酸化還元波のピークが明瞭に検出されるようになり，電流値も増加する．

(a)Na-V-O 120 / MWCNT
190 mA/g(b)
Na-V-O 120

1 cycle100 cycle

171ｍA/g (~1C)(c)
Na-TiO2-NT

図 13 Na-V-O 120 / MWCNT ハーフセルの充放電特性のサイ
クル依存性．上図は 100 回までのガルバニックサイク
ル特性，下図は電気容量のサイクル数依存性を示す．

図 11 ハーフセルの充放電特性．(a)，(b), (c) は活物
質 と し て ， そ れ ぞ れ Fe-ox-NT, Na-V-O 120,
Na-TiO2-NT を作用極に用いた．電解質液は NaClO4/ EC / DEC で あ る ． 電 気 容 量 は 約 40 mAh/g(Fe-ox-NT), 165 mAh/g (Na-V-O 120), 21 mAh/g(Na-TiO2-NT) と求められる．

C と Na-V-O 120 / MWCNT で同じである．MWCNT を導電材として用いた方が酸化還元波も明瞭に検出され，電流値も大きくなり，MWCNT を導電材料として用いる

層カーボンナノチューブ (MWCNT) に変え，CV 特性にと特性が改善されることがわかる．

差が出るかを調べた．その結果を図 12 に示す．活物
質と導電材となる炭素材料の混合比は，Na-V-O 120 /16

Na-V-O 120 / MWCNT ハーフセルの充放電特性のサの後 50 サイクル目では，5 サイクル目に比べて電気イクル依存性を負過電流 190 mA/g (～1 C rate) で

容量が 15 % 程度大きくなっている．電極表面に形成調べた．図 13 上図に測定結果，下図に電気容量のサされた不活性層の離脱によるものと考えられる．

イクル依存性を示す．サイクル回数が 10 回程度まで

表 3 Fe-ox-NT / Na-TiO2-NT フルセルの電気容量維持率

は，電気容量の増加がみられる．これは，作用電極内

サイクル数(Cycle)

電気容量(mAh/g)

1

77

5

47

61

50

54

70

での Na イオンの移動パス形成における過渡的な現象であり，その後，緩やかに電気容量は減少していく．
しかし，100 回の充放電を繰り返しても 120mAh/g 程

電気容量維持率(%)の容量を保っており，多層カーボンナノチューブの有効性を示すものといえる．

5. Gd@C60(CF3)3 の磁気特性

正極に酸化鉄ナノチューブ，負極に酸化チタンナノチューブを用いてフルセルを作製し，充放電特性を調

フラーレン分子合成において，最も多く生成される

べた．図 14 は 50 回の充放電を繰り返し，その電気容のは C60 分子であり，単離精製されている．その他に量の変化を記録したものである．1 サイクルから 5 サ

は C70, C76, C82 などの高次フラーレンの単離精製が行イクルの間で大きな電気容量の変化があったが，そのわれ，試料として応用に向けた研究が展開されている．

後の変化はあまりなく，安定した特性を示した．このフラーレンケージの中に金属元素を取り込んだ金属ような容量の変化は電極表面での不活性層形成によ内包フラーレンは，C60 に取り込まれた分子の単離精るものと考えられる．さらなる分析が必要であるが，製には成功しておらず，C82 ケージに取り込まれたナトリウムイオン二次電池の電極用活物質として酸M@C82 分子の単離精製がほとんどである．なぜ C60 分子化鉄ナノチューブと酸化チタンナノチューブが利用に金属元素が取り込まれた M@C60 分子が単離できない可能であることを示す実験結果である．最後に図 14のかは，C60 分子の発見以来大きな謎であった．そのから求めた Fe-ox-NT / Na-TiO2-NT フルセルの電気理由として挙げられていたのは，M@C60 は反応性が高

容量維持率を表 3 にまとめた．1 サイクルから 5 サイ

く，空気中では即座に酸素などと反応してしまい，そクルの間で，40 % 程度の電気容量の減少があり，その構造が壊れてしまうからであるというものであっ
た．したがって，何らかの方法で化学反応性を抑えてしまえば M@C60 の単離ができるものと考えられ，これまで多くの試みがなされてきたが，本研究以前までその成功を見なかった．今回，共同研究を行っている名

図 14 Fe-ox-NT / Na-TiO2-NT フルセルの充放電特性のサイク
ル依存性．図中の黒線で示した特性は 1 サイクル目のものであり，100 mAh/g 程度の電気容量を示すが，2 サイク
ル目で 60 mAh/g 程度まで容量低下するが，その後の変化
はこれほど大きくない．

図 15 Gd@C60(CF3)3 分子模型．赤色の原子がフラーレン
ケージ内にある Gd 原子であり，3 つの CF3 がフラーレンケージと結合している．

17

６. まとめ

古屋大学のグループが CF3 をフラーレンケージに付加することにより Gd@C60(CF3)3 分子（図 15 参照）を単

透明電極材料としてグラフェンに注目し，異種元素離精製することに成功し，名城大でその磁気特性の解ドープ技術の開発を行った．B や N をドープすること明を行った．

により表面抵抗が低下することを示し，透明導電膜へ

図 16 に 273, 100, 20, 10, 4.2, 2 K で測定した磁の異種元素ドープの有効性を示した．太陽電池の受光化曲線を示す．縦軸は飽和磁化の値で規格化し，横軸材料として，波長 560 nm 程度の可視光を吸収する酸は磁場を測定温度で割った値 (H/T)である．測定した化鉄ナノチューブを用い，同波長領域の IPCE としてす べ て の 温 度 に お け る 磁 化 曲 線 は ， J = 7/2 の10 % 程度を実現したが，目標とした 20 % には届か

Brillouin 関数でフィッティングすることができる．

なかった．グリーンテクノロジーに関わるナノ材料開このことは金属内包フラーレンの価数が，発としては，二次電池電極材料への適応が可能かどう

Gd3+@C823-(CF3)3 となっていることを表し，フラーレンかを調べることも重要課題である．そこで資源が豊富

ケージに移動した 3 つの電子は 3 つの CF3 との結合にな Na イオンを用いた二次電池電極用材料としての性使われていることを示している．したがって能評価も行い，Na イオンの吸蔵・放出が可能である

Gd@C82(CF3)3 分子の磁気状態としてフラーレンケージ

ことを示した．このことは各種金属酸化物ナノチューに内包された Gd 原子上にだけ J = 7/2 のスピンがブがグリーンテクノロジーに関わる基盤材料として生き残っていることを示している．Gd@C82 分子では Jの高いポテンシャルを示唆するものである．また，C60= 6/2 に近い磁気状態になっており[8]，これは Gd

ケージに Gd イオンを内包した金属内包フラーレン誘
導体を単離し，J = 7/2 に相当する大きな磁気モーメントをもつことを示した．本テーマ自体はグリーンテ
クノロジー材料とは直接結びつかないが，今まで単離されていない新奇ナノカーボン材料であり，MRI 造影剤などの新たな研究領域への展開が期待できる．

参考文献
１． S. Bandow, T. Yoshida, Appl. Phys. A 123 (12),728-736 (2017).
２． R. Furukawa, Y. Yamamoto, Y. Nabei, S. Bandow,
MRS Advances 4 (3-4), 211-216 (2019).
３． Y. Kosugi, T. Tomiyasu, S. Bandow, MRS Advances
1 (59), 3891-3896 (2016).
４． 原田佳奈，「ナトリウムイオン電池電極用ナノ材料の作製と性能評価」2019 年度・名城大学理
工学部応用化学科卒業論文．
５． 野口翔太，「Na 含有バナジウム酸化物の合成とNa イオン二次電池電極材料としての性能」2019年度・名城大学理工学部応用化学科卒業論文．
６． A. Nakagawa, M. Nishino, H. Niwa, K. Ishino, Z.
Wang, H. Omachi, K. Furukawa, T. Yamaguchi, T.
Kato, S. Bandow, J. Rio, C. Ewels, S. Aoyagi, H.
Shinohara, Nature Communs. 9, 3073 (2018).
７． Y. Kosugi, S. Bandow, J. Inorg. Organomet. Polym.
24 (6), 933–939 (2014).
８． H. Funasaka, K. Sugiyama, K. Yamamoto, T.
Takahashi, J. Phys. Chem. 99, 1826-1830 (1995).

図 16 Gd@C60(CF3)3 固体の磁化曲線．すべての磁化曲線は J =7/2 のブリルアン関数でフィッティングできる．

上の S = 7/2 スピンとフラーレンケージ上に残る S =1/2 スピンが反強磁性的な相互作用をし，スピン量子数が減少するためであると解釈されている．
本研究における成果は，大きな磁気モーメントを持
つ磁性分子が空気中で安定に存在しうることを示し，
分子磁性を用いる MRI 造影剤への応用が考えられる．

18

1-2 ナノカーボン材料を燃料電池に応用する技術の開発

19

1-2-1 燃料電池に応用可能な単層カーボンナノチューブ作製技術の開発— 燃料電池電極用ナノカーボン材料の開発—

丸山 隆浩 1） Aliza Khaniya Sharama1) 岡田拓也 1) 小澤顕成 1) Kamal Prasad Shrama1) 才田 隆広 1）
1）名城大学

1. 緒

理工学研究科言

電子伝導性やガス拡散パスに優れた理想的な電極が燃料電池は燃料を燃やさずに電気を直接取り出せ形成できる。

るため、理論的にも発電効率が高く、有害物の排出も本研究では、燃料電池の電極材料として有望なグ

無く、騒音も少ない。そのため、自動車や定置用コー

ラフェンと SWCNT から成るナノカーボンハイブリッ

ジェネレーション、ポータブル電源などに利用されてド構造体の作製に向け、SWCNT の作製技術の開発を行いる。実用化が進んでいる固体高分子型燃料電池った。特に、SWCNT の低温成長と細径 SWCNT の作製を（Proton Exchange membrane Fuel Cell: PEFC）では、目指した。さらに、実際にグラフェン上への SWCNT 成

水素と酸素を燃料とし、燃料極（負極）において水素長を行い、ナノカーボンハイブリッド構造体の作製をの酸化反応が、空気極（正極）では酸素還元反応が進試みた。

行し、理論上 1.23 V の起電力が生じる。

2. 実験方法

PEFC では、水素酸化、酸素還元反応ともに、触媒2.1 低温成長と細径 SWCNT の成長

金属として過電圧の低い白金もしくは白金合金が使用されている。一方、電極触媒担体は化学的に安定で本研究では、SWCNT 作製にガスソース型のコールド比表面積が大きく、電子伝導性が高く、さらにコストウォール化学気相成長（CVD）装置を用いた（図 1）が安いことが望まれる。そのため、現在流通している[1]。本装置は、我々が独自に開発したもので、ノズ

PEFC ではカーボンブラックが用いられている。しかルを介して原料ガスを基板に供給するため、基板付近

し、PEFC をさらに小型化しコスト低減を図るためにのみ原料ガス圧力を高くすることができる。SWCNT 成は高電流密度化が必要であり、そのためには酸素の供長中もターボ分子ポンプで装置内を排気しており、高給、生成水の排出、およびプロトン伝導の面でより優真空下のクリーンな状態で SWCNT 成長を行うことがれた電極が不可欠である。その材料として、炭素材料できる。また、原料ガス圧力を高精度で制御することの中でも高い比表面積をもつカーボンナノチューブが可能である。本実験では、低温成長用触媒として（Carbon nanotube: CNT）とグラフェンはその有力なRh と Co を、細径 SWCNT 作製用触媒としては Pt と Ir候補である。特に、高密度で配向した単層カーボンナを用い、これらを SiO2/Si 基板上、もしくは、その上ノチューブ（Single-walled carbon nanotube: SWCNT）に形成したアルミナ膜上に堆積し、エタノール蒸気をとグラフェンを組み合わせることで、プロトンおよび原料ガスとして用い、SWCNT 成長を行なった。作製し20

た SWCNT は、ラマン分光、走査電子顕微鏡（SEM）、おしていることが確認できた。高真空ガスソース型CVD

よび透過電子顕微鏡（TEM）観察により評価を行った。

装置を用いることで、エタノールの供給圧力を最適圧力まで低減できたことが、300℃以下での低温成長の実現につながったと考えられる。

図 1 高真空ガスソース型 CVD 装置の構造

2.2 ナノカーボンハイブリッド構造体の作製
通常のコールドウォール型 CVD 装置を用いて、
SWCNT とグラフェンのナノカーボンハイブリッド構造体の作製を行った。高配向性熱分解グラファイト

図2 Rh 触媒から生成したSWCNT のラマンスペクト
ルの(a) 低波数領域と(b) 高波数領域．(c) 成長温度に対する G/Si 比のアレニウスプロット．

（HOPG）からグラフェンを剥離し、SiO2/Si 基板上に塗布したのち、触媒凝集抑制のための酸処理を行った。
その後、グラフェン上に Ir 触媒を堆積し、エタノー

さらに、ラマンスペクトル中のSWCNTのGバンドと500

ル蒸気を原料に用いて SWCNT 成長を行なった。作製しcm-1に存在するSiのフォノンピークの強度比（G/Si比）

た試料はラマン分光、および SEM により評価を行った。

をとり、成長温度に対してアレニウスプロットをとったものを図2(c)に示す。G/Si比は、SWCNT成長量の目

3. 実験結果安となるため、図2（c）のフィッティング直線の傾き

3.1 SWCNTの低温成長からSWCNT成長におけるRh触媒の活性化エネルギーを

図2(a)、 (b)にRh触媒を用いて、エタノール圧力1

おおまかに見積もることができる。その結果、Rh触媒

×10-5 Paで成長を行なった試料のラマンスペクトルの活性化エネルギーは、0.85 eVと非常に小さい値でを示す[1, 2]。(a)が低波数領域、(b)が高波数領域であることがわかった。このような低い活性化エネルギある。成長温度320℃で作製した試料のスペクトルにーが、300℃以下でのSWCNTの低温成長につながったと

おいて、233 cm-1にRBM(Radial Breathing Mode)ピー

考えられる。

クが存在し、また、1590 cm-1付近に現れるGバンドがRhは高価であるため、より安価な金属触媒を用いてG+とG-の２つに分裂して様子が観測された。これらの低温成長を実現することが望ましい。そこで、SWCNT

結果から、Rh触媒からSWCNTが生成していることがわ

成長用触媒として一般に用いられるCoを触媒に用いかった。さらに、エタノール圧力は変化させず、成長てSWCNTの低温成長を行った[3]。図3(a)、 (b)に、エ

温度を270℃に下げて実験を行なったところ、Gバンド

タノール蒸気を原料に用い、成長温度270～370℃におピークの分裂は明瞭ではなかったが、RBMピークが同

いてCo触媒から成長したCNTのラマンスペクトルを示

じ波数に存在しており、270℃においてもSWCNTが成長す。Rh触媒のときと同様、低波数領域にRBMピークが、

21

また、高波数領域にGバンドが存在することから、試みた。

SWCNTが成長していることがわかる。すなわち、Co触

まず、Ptを触媒に用いて、ガスソース型CVD法により、媒を用いて270℃という低温でSWCNTの成長に成功し

SWCNT成長を行った[4]。成長温度を700℃とし、エタた。RBMピークの波数から判断すると、Rh触媒に比べノール蒸気の圧力を最適化することで、直径1 nm程度

ると、直径の太いSWCNTが生成していると思われる。

以下の細径のSWCNTの作製に成功した。図4にラマン分

また、370℃と270℃で成長させたときのSWCNTのSEM

光測定から見積もったPt触媒から生成したSWCNTの直像を図3(c)、 (d)に示す。成長温度370℃のときには、径分布を赤色で示す。直径の算出には、d [nm]=248/

数百nmの長さのSWCNTが蜘蛛の巣状に成長している様

ωRBM [cm-1](d: SWCNT直径、ωRBM: RBMピークの波数)子が観察された。一方、270℃ではSWCNTの生成密度はを用いた[5]。ラマン分光測定では、共鳴条件を満足非常に低く、長さも100 nm以下のものが多かった。ましたSWCNTしか観測にかからないため、波長532、633、

た，生成密度はRh触媒を用いた場合と大差はなかった。

785 nmの3つの励起光のレーザを用いて測定を行った。

以上の結果から、RhとCoを触媒に用いることで270℃

また、比較のため、Co触媒を用いて同じ手法で作製しの低温でSWCNTが成長できることが示された。なお、

たSWCNTの直径分布を黒色で示す。励起波長により、本研究で実現した270℃は、SWCNTの成長温度として報観測されるSWCNTの直径分布は異なるものの、Co触媒

告されている中では最も低い温度である。

の場合、直径が主に1～2 nm程度のSWCNTが分布している様子がわかる。これに対し、Pt触媒を用いて作製したSWCNTの直径は主に0.6～1.1 nmの範囲に分布し、細径のSWCNTが成長している。すなわち、細径SWCNTの作
製にPt触媒が有効であることが示された。

図 3 Co 触媒から生成した SWCNT のラマンスペク
トルの(a) 低波数領域と(b) 高波数領域．
(c)370℃、(d) 270℃で作製した SWCNT の SEM 像．
3.2 細径SWCNTの成長
燃料電池の電極触媒担体に炭素材料を用いる際、比表面積が大きいことは重要な要素の一つである。開端

図4 ラマン分光測定により見積もったPt およびCo触媒から成長した SWCNT の直径分布．使用したレーザの励起波長は、それぞれ(a) 532、 (b) 633 および(c) 785 nm．

処理を行ったSWCNTは1000 m2/g以上の非常に大きな比表面積をもつが、細径化することで、より比表面積を高めることができる。一般に市販されているSWCNTには直径が2～3 nm程度のものが多数含まれる。そこでさらに、細径SWCNTの成長量を増やすため、Irを触媒

本実験では、直径1 nm程度以下の細径SWCNTの作製をに用いたSWCNT成長を行った。Irは周期表上ではPtの22

隣に位置するが、融点が2000℃以上と非常に高いため、に1.1 nm以下であり細径のSWCNTの成長が示唆された。

SWCNT成長中の触媒粒子の凝集が比較的少ないことが期待できる。すなわち、小さい粒径の触媒粒子から細径のSWCNTが成長することが期待できる。Pt触媒と同様、高真空ガスソース型CVD装置を用いて実験を行ったところ、エタノール圧力を最適化することで成長時間60分、成長温度800℃において、図5のSEM像に示されるようにSWCNTが高密度で垂直配向して成長している様子が観察された。また、ラマン分光測定とTEM観察から、Ir触媒から生成したSWCNTは主に直径1.2 nm程度以下の細径のSWCNTであることがわかった[6]。
図 6 Ir を触媒に用いて作製したグラフェン（グラファイトフレーク）
上に成長したSWCNTの(a)SEM
像と(a) 低波数領域と(b) 高波数領域のラマンス
ペクトル．

5.結論
本研究では、燃料電池に応用可能な SWCNT 作製技術の開発を行った。燃料電池の電極材として望まれる比図 5 Ir を触媒に用いて作製した垂直配向 SWCNTの SEM 像．

表面積の大きな炭素材料の開発のため、SWCNT とグラ
フェンのハイブリッド構造体の作製に向けた SWCNT

3.3 グラフェン上へのSWCNTの直接成長

成長技術の開発を行った。その結果、Rh および Co 触

実際にグラフェン上へのSWCNT成長を試みた。HOPG

媒を用いて 300℃以下での低温成長、Pt および Ir 触から剥離したグラフェン上にIr触媒粒子を堆積し、コ媒を用いて細径 SWCNT の成長を実現した。さらに、Irールドウォール型CVD装置を用いてSWCNT成長を試み

触媒を用いることで、HOPG から剥離したグラフェン

た。作製条件は、成長温度800℃、エタノール圧力40 Pa、

上への SWCNT 成長に成功した。

成長時間は60分とした。図6(a)に試料表面のSEM像を示す。グラフェンが数層重なったグラファイトフレー

参考文献

ク上に繊維状の物質が生成している様子が観察され[1] T. Maruyama、 A. Kozawa、 T. Saida、 S. Naritsuka、and S. Iijima : Carbon 116 (2017) 128.
[2] H. Kiribayashi、 T. Fujii、 A. Kozawa、 S. Ogawa、
T. Saida、 S. Naritsuka、 and T. Maruyama : J. Cryst.
Growth 468 (2017) 114.
[3] T. Okada 、 T. Saida 、 S. Naritsuka 、 and T.
Maruyama : Mater. Today Commun. 19 (2019) 51.
[4] T. Maruyama、 H. Kondo、 R. Ghosh、 A. Kozawa、
S. Naristsuka、 Y. Iizumi、 T. Okazaki、 and S. Iijima :Carbon 96 (2016) 6.
[5] A. Jorio、 R. Saito、 J. H. Hafner、 C.M. Lieber、 M.
Hunter、 T. McClure、 G. Dresselhaus、 and M. S.
Dresselhaus : Phys. Rev. B 86 (2001) 1118.
[6] T. Okada 、 T. Saida 、 S. Naritsuka 、 and T.
Maruyama : MRS Advances 4 (2019) 225.

た。この物質に対してラマン分光測定を行った。図6(b)および(c)にこの試料のラマンスペクトルを示す。
それぞれ、532、671および785 nmの3波長のレーザで励起し測定を行っている。グラフェンに由来する2600～2700 cm-1付近の2Dバンドに加え、低波数領域にRBMピークが観測されたことから、グラファイトフレーク
上にSWCNTが成長していることがわかった。また、ラマン分光測定からは、生成しているSWCNTの直径は主23

1-2-2 白金ナノ粒子担持ナノグラフェン燃料電池触媒層作製
平松 美根男 1） 梶川 兼吾 1） 竹田 圭吾 1） Vladislav Gamaleev 1,2)
1）名城大学 理工学研究科
2) 名古屋大学 低温プラズマ科学研究センター

1. 緒

言

液中プラズマ装置の模式図を図1に示す。エタノー

液中プラズマは、水溶液やアルコール等の液体中にルの入ったビーカの上部空気をアルゴンで置換し、ア

高密度のエネルギーを与えてプラズマを発生させる

ルゴン雰囲気中の上部電極とエタノール中の下部電技術で、減圧プラズマと比較すると、装置構成が簡単

極間に交流高電圧を印加することでプラズマを生成であるばかりでなく、高速反応が実現可能で、溶液反した。ナノグラフェンの合成は30分間行い、黒色にな応を活用した新規ナノ材料の合成や新しい処理・加工

ったエタノール溶液は吸引濾過を行った後、黒色物質技術の開発など種々の応用が進められている。このうのみを回収した。図2は、液中プラズマ印加前後のエ

ち、アルコールを原料とした液中プラズマでは、ナノ

タノールと、吸引濾過法を用いて黒色溶液を濾過し、グラフェンの大量合成が可能であり、カーボンブラッ

濾紙（孔径1 µm）上に回収した黒色物質の画像を示す。

クに替わる燃料電池触媒層の安価な供給方法として期待されている[1-4]。
従来の固体高分子形燃料電池では、触媒層として白金粒子を担持したカーボンブラックが用いられてきた。容易に発電特性が得られる一方で、白金が凝集しやすく、耐久性に問題があった。電位サイクル試験では、2 万サイクル程度で白金触媒の電気化学的活性表
面積（electrochemically active surface area, ECSA）
は初期値から半減するほどで、耐久性の改善、あるい

図 1 液中プラズマ装置の模式図[5]。

は、カーボンブラックに替わる白金ナノ粒子の担体の開発が強く望まれている。
本研究では、アルコールを原料とした液中プラズマで合成したナノグラフェンに白金担持を施し、燃料電池触媒層としての特性を評価した。液中プラズマで合成したナノグラフェンのアモルファスカーボン成分除去方法や分散方法等の改善により、耐久性が大幅に改善されることを明らかにした[5]。
図 2 液中プラズマ印加前後のエタノールと、濾紙(孔径 1 µm)上に回収した黒色物質の写真[5]。

2. 実験方法24

液中プラズマ法で合成したナノグラフェンは、後述

じバックグラウンドのピークがほぼ無くなっているするようにアモルファスカーボン成分を含んでいる

ことが分かる。さらに G バンドピークに着目すると、ため、80 ℃の 30% 過酸化水素水で処理することによ

過酸化水素処理前のラマンスペクトルの G ピークのりアモルファスカーボン成分の除去を行った[6]。こ半値幅約 46 cm-1 に対して、約 30 cm-1 まで狭くなってのナノグラフェンを水/エチレングリコール溶液に投いることがわかる。液中プラズマで合成したナノグラ

入し、超音波ホモジナイザーを用いて超音波照射を施

フェンはアモルファス成分を含んでいるが、過酸化水

してナノグラフェン分散液とし、塩化白金酸(H2Cl6Pt)

素水処理によって、効果的にアモルファス成分が除去を原料として液相還元法によりナノグラフェン表面

され、結晶性も改善されていることが確認された。

に白金ナノ粒子の付着を行った。そして、白金担持ナ
ノグラフェンと純水/2-プロパノール/アイオノマーを混合して触媒インクとした。
電気化学評価では、作用電極として回転電極を備えた 3 電極法を用い、触媒インクを回転電極に塗布して、0.1 M の過塩素酸（HClO4）に浸して電気化学測定を行った。走査速度 50 mV/s でサイクリックボンルタンメ
トリ（CV）を測定し、白金触媒の電気化学的活性表面積（electrochemically active surface area, ECSA）を求めた。白金触媒の耐久性の評価は、燃料電池実用

図 3 過酸化水素処理前後のナノグラフェンのラ
マンスペクトル[5]。

化推進協議会(FCCJ)の標準プロトコル「電位サイクル試験」[7]に準拠し、走査:1.0-1.5 V, 2s/cycle の条
件で ECSA の特性変化を調べた。また、作製した触媒
インクを 2 枚のカーボンファイバペーパに塗布し、プ
ロトン導電膜を挟んで 130 ℃、7 MPa で熱圧着して膜-電極接合体（MEA：Membrane Electrode Assembly）とし、燃料電池出力特性の評価を行った。

図 4 白金担持処理前（左）および担持処理後（右）のナノグラフェンの TEM 像[5]。

3. 実験結果
図 3 は、過酸化水素処理前後のナノグラフェンのラ液中プラズマで合成したナノグラフェンは凝集し-1

マンスペクトルを示している。1340 cm の D ピーク、
-1

やすいため、白金担持処理前に十分分散させておく必-11580 cm 付近の G ピーク、1610 cm の D’ショルダ

要があるが、過酸化水素水処理を施してアモルファス-1ーピーク、2700 cm 付近の 2D ピークが観測され、典成分を除去することによりナノグラフェンの親水性型的なナノグラフェンのラマンスペクトルとなってが改善され、水溶媒への分散性が向上する。さらに純いる。また、過酸化水素処理前のナノグラフェンのラ

水/エチレングリコール混合溶媒であれば、96 日以上-1

マンスペクトルに現れている 1000-1700 cm の幅広いの長期間分散状態を保持できることを確認した。図 4

ピーク（縦線ハッチング部）はアモルファスカーボンに、白金担持前後のナノグラフェンの透過型電子顕微成分によるもので、処理後のラマンスペクトルには同鏡(TEM)像を示す。液中プラズマで合成されたナノグ

25

ラフェンのサイズは 10-100 nm であり、塩化白金酸の

図 6 は、液中プラズマを用いて合成したナノグラフ

液相還元でナノグラフェン表面に形成される白金ナ

ェンに白金担持を施した白金担持ナノグラフェンイ

ノ粒子のサイズは 2-5 nm であった。X 線回折スペク

ンクにおける白金の ECSA の電位サイクル試験におけトルからも白金の回折ピークが得られ（データ非表

る推移を表しており、測定開始初期の値で規格化して示）、そこから Scherrer の式を使って求めた白金粒ある。比較のため、白金担持カーボンブラックの場合子のサイズも 3 nm 程度となり、TEM 観察と一致しての ECSA の推移も併せて示している。白金担体カーボいることが確認できた。

ンブラック場合、2 万サイクル後には初期白金表面積

図 5 は、白金担持ナノグラフェンのサイクリックボの約半分である 51%まで減少した。一方、担体にナノンルタンメトリ（CV）曲線を示している。0.05-0.4 V

グラフェンを用いた触媒の場合、2 万サイクル後でも付近に水素脱着ピークと 0.8 V 付近に酸化還元ピー

初期白金表面積の約 80%であり、ECSA が半減するまでクが観測できる典型的な CV 曲線を得た。この赤い領のサイクル数は 14 万で、カーボンブラックの場合の域の面積を求め、白金担持ナノグラフェンの熱重量分7 倍のサイクル数でより優れた耐久性を有しているこ

析により求めた白金の重量を使って得られた白金表とがわかる。

面積は 80 m2/g であった。

図 7 白金担持カーボンブラックと白金担持ナ
ノグラフェンの電位サイクル試験前と 2 万サイ
クルおよび 14 万サイクル後の SEM 像[5]。

図 5 白金担持ナノグラフェンの CV プロファ
イル[5]。

図 7 は白金担持カーボンブラックと白金担持ナノグ
ラフェンの電位サイクル試験前と 2 万サイクルおよび 14 万サイクル後（ナノグラフェンのみ）の SEM 像を示している。白金担持カーボンブラックの電位サイ
クル試験前後の SEM 像を見ると、サイクル試験前の白金粒径が 2-3 nm だったのに対し、2 万サイクル後の白金粒径は 4-6 nm まで凝集していた。一方、白金担
持ナノグラフェンの場合には、2 万サイクル後の白金
図 6 ナノグラフェンとカーボンブラックについて、
白金担持後の電位サイクル試験中の ECSAの推移[5]。

粒径は 4-6 nm、14 万サイクルで 4-6 nm まで凝集していた。
次に、膜-電極接合体(MEA)を構築し、発電特性の評26

価を行った。図 8 に白金担持ナノグラフェン触媒層を確立が求められる。

採用した MEA の電流密度および電力密度を示す。最大
電流密度は 240 mA/cm2、最大電力密度は 52 mW/cm2 と参考文献なった。これは一般的なカーボンブラック触媒層を使[1] T. Hagino, H. Kondo, K. Ishikawa, H. Kano, M.

った標準セル（東陽テクニカ EFC-05-02）の 1/4 程のSekine, M. Hori, Appl. Phys. Express 5, 035101

電流密度であった。今回作製した白金担持ナノグラフ(2012).

ェンの白金担持量は 30 wt%で、一般的な白金担持カ[2] A. Ando, K. Ishikawa, H. Kondo, T. Tsutsumi, K.

ーボンブラックの場合の白金担持量(20-50 wt%)と同Takeda, T. Ohta, M. Ito, M. Hiramatsu, M. Sekine, M.

程度である。ところが、実際の燃料電池としてはカー

Hori, Jpn. J. Appl. Phys. 57, 026201 (2018).

ボンブラック触媒層の場合の 1/4 程度の性能しか得[3] T. Amano, H. Kondo, K. Takeda, K. Ishikawa, M.

られていない。プロトン導電膜と触媒層との密着が悪Hiramatsu, M. Sekine, M. Hori, Jpn. J. Appl. Phys. 57,

いなどと、三相界面が十分に確保できなかった可能性

045101 (2018).

があり、改善の余地がある。

[4] T. Amano, H. Kondo, K. Ishikawa, T. Tsutsumi, K.
Takeda, M. Hiramatsu, M. Sekine, M. Hori, M. Appl.
Phys. Express 11, 015102 (2018).
[5] V. Gamaleev, K. Kajikawa, K. Takeda, M. Hiramatsu,
MDPI C: J. Carbon Research, Special Issue "Plasma
Processing for Carbon-based Materials", 4, 65 (2018).
[6] Y. Feng, G. Zhou, G. Wang, M. Qu, Z. Yu, Chem. Phys.
Lett. 375, 645 (2003).
[7] 新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)固体

図 8 白金担持ナノグラフェン触媒層を採用した MEA の電流密度および電力密度[5]。

高分子形燃料電池実用化推進技術開発基盤技術開発 :「セル評価解析の共通基盤技術」 『セル評価解

4. 結論

析プロトコル』(2014-12), 学校法人大同学園, 学校法アルコールを原料とした液中プラズマを用いて合人立命館, 国立大学法人東京工業大学, 一般財団

成したナノグラフェンに対して、アモルファスカーボ

法人日本自動車研究所

ン成分除去方法や分散方法等の確立により、白金ナノ粒子担持ナノグラフェンを利用した燃料電池触媒層において 80 m2/g の白金表面積を達成し、液中プラズ
マを用いたナノグラフェンの製造ならびに分散技術を確立した。さらに、この白金ナノ粒子担持ナノグラ
フェンの電位サイクル試験を実施したところ、初期の白金の電気化学活性比表面積（ECSA）が半減するまでのサイクル数は 14 万を達成（カーボンブラックの 7倍）した。ところが、燃料電池としての特性はまだまだ不十分で、三相界面の十分な確保など、周辺技術の27

1-2-3 白金ナノ粒子担持カーボンナノウォール電極作製
平松 美根男 1） 竹田 圭吾 1）今井 駿 2) 近藤 博基 3) 石川 健治 3) 堀 勝 3)
1）名城大学 理工学研究科
2) 名古屋大学 大学院 工学研究科
3) 名古屋大学 低温プラズマ科学研究センター

1. 緒

言

媒の探索と、利用する Pt をできるだけ減らし（効率カーボンナノウォール（carbon nanowall）は、シ

よく利用し）て、さらに耐久性を延ばす、という 2 つ

リコンや金属基板に対してほぼ垂直に成長して自己のアプローチがある。カーボンナノウォールは単結晶

組織的に３次元迷路状壁構造を構築する多層グラフ

ではなく、
数 10 nm のグレインから構成されている[3]。

ェンで、主としてメタンと水素の混合ガスを用いたプ

グレインの境界(grain boundary)は化学的に活性でラズマ CVD 法による形成が報告されている[1]。超高あり、Pt 等の金属ナノ粒子を分散させて固定し易く、アスペクト比（数 nm の厚さの多層グラフェンシート

また耐久性も期待できる。本研究では、Pt ナノ粒子

2担持を施したカーボンナノウォール電極にポイントという大きな比表面積、ならびにグラファイトのもつを絞り、電位サイクル試験を実施して耐久性などの評

導電性と化学的安定性が特徴で、電池やキャパシタ、価を行った結果[4,5]について言及する。

が数 10 µm の高さまで成長）やグラムあたり数 100 m

あるいは電気化学センサ・バイオセンサの「電極」としての応用が期待されている[2]。カーボンナノウォ

2. Pt 担持カーボンナノウォールの作製

ールそのものを電荷の授受のための電極として用い

CH4/H2 およびC2F6/H2 の2種類の原料を用いたラジカ

る場合と、金属ナノ粒子や生体分子が主役で、これら

ル注入プラズマCVD[6,7]によりカーボンナノウォーを保持する基材（サポート材料、プラットフォーム）

ルの作製を行った（図1）。C2F6等のフロロカーボンガの役割を担う場合に大別される。実用化に向けては、

スを炭素原料とした場合、大量の水素原子が必要とな応用目的に合わせた構造の最適化や、金属ナノ粒子にるため、炭素源ラジカルと水素原子の供給が独立制御よる表面修飾など機能化付加技術の確立が必要であ可能なラジカル注入プラズマCVD法において容易に適る。カーボンナノウォールの構造制御に関する最近の応可能である[1]。

成果については 1-3-1-1 において別途纏める。後者については、例えば、白金（Pt）ナノ粒子を担持したカーボンナノウォールは、過酸化水素等のセンシングや固体高分子型燃料電池用電極としてカーボンブラッ
クに替わるものとして期待されており、電気化学的評
価に焦点を絞り、有用性を明らかにする。
固体高分子型燃料電池用電極として Pt 担持を施したカーボンブラックがしばしば用いられているが、Pt
粒子が凝集し易く、耐久性の改善が強く求められてい図 1 カーボンナノウォールの製造に用いたラジカル注入プラズマ CVD システムの模式図[7]。

る。実用化に向け、高価な Pt を使わず安価な代替触28

カーボンナノウォール表面へのPtナノ粒子担持は、に貼り付け、0.1 Mの過塩素酸（HClO4）に浸して電気超臨界流体有機金属化学堆積法[8]を用いて行った。

化学測定を行った。走査速度50 mV/sでサイクリック

図2に超臨界流体有機金属化学堆積法の原理を示す。

ボンルタンメトリ（CV）を測定し、Pt触媒の電気化学ヘキサンで希釈した有機白金(CH3C5H4)(CH3)3Ptを超臨的活性表面積（electrochemically active surface

界CO2中に拡散させ、輸送された有機白金が120-170 ℃

area, ECSA）を評価した。Pt触媒耐久性の評価は、燃に加熱された基板表面上で選択的に熱分解されてPt

料電池実用化推進協議会(FCCJ)の標準プロトコル「電ナノ粒子を堆積させる手法で、カーボンナノウォール

位 サ イク ル試 験 」[9] に準拠 し 、走 査:1.0-1.5 V,

膜や高密度カーボンナノチューブ膜など入り組んだ

2s/cycleの条件でECSAの特性変化を調べた。

構造体の奥深くまで1-2 nm程度のPtナノ粒子を高分散で形成可能である[8]。本手法では、ナノドメイン

4. 実験結果

間の境界（grain boundary）などの欠陥において核発電位サイクル試験を実施した際の 0、
8 千、
1 万 5 千、生が起こり易く、数10 nmのグレインから構成されて

2 万サイクルにおいて測定した CV プロファイルを図 3いるカーボンナノウォール表面への高密度・高分散Ptに示す。図の斜線領域の面積から ECSA を求めた。

ナノ粒子の担持に適した手法であり、30分の堆積でカーボンナノウォール表面上に1012 cm-2の密度のPtナノ粒子の形成が可能である。

Pt 担持カーボンナノウォールの電位
サイクル試験中の CV プロファイル（0,8,000,
図 3

15,000, ２0,000 サイクル）[4]。

図 2 超臨界流体有機金属化学堆積法の原理を表す模式図。

3. 評価方法
Pt担持カーボンナノウォール（Pt/CNW）の電気化学
評価は、可逆水素電極とPt電極をそれぞれ参照電極とカウンター電極に用い、作用電極として回転電極を備えた3電極法により行った。Ti基板上に作製したカーボンナノウォール表面にPtナノ粒子を担持させ、カー
Pt 担持カーボンナノウォールの電位
サイクル試験中の ECSA の推移[4]。

図 4

ボンナノウォール膜表面から１%ナフィヨン水溶液を塗布して65 ℃で乾燥させた後、作用電極（回転電極）29図 4 は、カーボンナノウォール表面に担持された Pt

C2F6/H2 の原料を用いて作製したカーボンナノウォの ECSA の電位サイクル試験における推移を表していールについて、同様に Pt ナノ粒子を担持し、電位サる。開始から 8 千サイクルまでは ECSA は上昇し、そイクル試験を実施して耐久性を評価した。図 6 は、の後、2 万サイクルでは 8 千サイクルで得られた ESCA

C2F6/H2 原料を用いて作製したカーボンナノウォールの最大値と比較して 22%の減少に留まっている。カー表面に担持された Pt の ECSA の電位サイクル試験におボンブラックに担持された Pt の ECSA が 2 万サイクル

ける推移を表している。比較のため、CH4/H2 原料を用程度で半減していること[10]と比較すれば、カーボンいて作製したカーボンナノウォールの場合の ECSA のナノウォール表面に担持された Pt は優れた耐久性を変化も併せて示している。CH4/H2 および C2F6/H2 の原料有していることがわかる。

で作製したカーボンナノウォールを、それぞれ、

図 5 は、電位サイクル試験前と 2 万サイクル後におCH4-CNWs および C2F6-CNWs と記し、サイクル試験開始

ける Pt 担持カーボンナノウォール表面の透過型電子

直後の最大値で規格化してある。CH4-CNWs に担持した顕微鏡（TEM）像である[4]。超臨界流体有機金属化学

Pt の ECSA は約 3 万サイクルで半減しているのに対し堆積法によって形成された Pt ナノ粒子の平均サイズて、C2F6-CNWs の場合は ECSA が半減するまでのサイクは 1.6±0.4 nm、密度は 5×1012 cm-2 であったが、2ル数は 14 万（カーボンブラックの場合の 7 倍）となり、より万回の電位サイクル試験後には、Pt ナノ粒子の平均

優れた耐久性を有していることがわかる[5]。

サイズは 1.8±0.7 nm とわずかに増大し、一方密度は2×1012 cm-2 にまで減少した。また、Pt 担持カーボン
ナノウォールのラマンスペクトルは、電位サイクル試
験前と 2 万サイクル後で変化は見られず、カーボンナ
ノウォールそのものについては、電位サイクル試験に対して優れた耐久性を有していることが分かる。

図 6 CH4/H2 および C2F6/H2 の原料で作製したカーボンナノウォールについて、Pt 担持後の電位サイクル試験中の ECSA の推移[5]。

図 7 は、CH4/H2 および C2F6/H2 の原料で作製したカーボンナノウォールのラマンスペクトルを示しており、
2 つのラマンスペクトルは G バンドピークで規格化してある。C2F6/H2 で作製されたカーボンナノウォールのラマンスペクトルは、①G バンドの半値幅が狭く、②D バンドのピーク強度はより大きく半値幅は狭い、という特徴を有している[5]。つまり、C2F6/H2 で作製されたカーボンナノウォールは、より小さなサイズのグ
図 5 電位サイクル試験前後の Pt 担持カーボ
ンナノウォールの TEM 像[4]。

レインで構成されているものの、それぞれのグレイン

30のグラフェンとしての結晶性はより良好であることに適した材料で、特に結晶性の改善により高耐久性のを示唆している。

担持材料となることが確認された。

参考文献
[1]

M. Hiramatsu, M. Hori, “Carbon Nanowalls:
Synthesis and Emerging Applications”, Springer
Verlag, Wien (2010).

[2]

M. Hiramatsu, H. Kondo, M. Hori, “Graphene
Nanowalls”, in New Progress on Graphene Research,
Jian Ru Gong, Ed., Ch.9, 234-260 (2013).

CH4/H2 および C2F6/H2 の原料で作製したカーボンナノウォールのラマンスペクトル（G バンドピーク強度で規格化）[5]。

図7

[3]

K. Kobayashi, M. Tanimura, H. Nakai, A. Yoshimura,
H. Yoshimura, K. Kojima, M. Tachibana, J. Appl.
Phys. 101, 094306 (2007).

以上のように、カーボンナノウォールは多くの結晶[4]S. Imai, H. Kondo, H. Cho, H. Kano, K. Ishikawa, M.

粒界を有しているため、それがアンカーとなって Pt

Sekine, M. Hiramatsu, M. Ito, M. Hori, J. Phys. D:

ナノ粒子を安定して高分散で担持し易く、また、カー

Appl. Phys. 50, 40LT01 (2017).

ボンナノウォールそのものも耐久性に優れており、Pt[5]

S. Imai, H. Kondo, H. Cho, K. Ishikawa, T. Tsutsumi,

担持カーボンナノウォールが電極応用において有用

M. Sekine, M. Hiramatsu, M. Hori, Appl. Phys.

であることを明らかにした。

Express 12, 015001 (2019).
[6]

4. 結論

M. Hiramatsu M. Hori, Jpn. J. Appl. Phys. 45, 5522
(2006).

CH4/H2 および C2F6/H2 を用いたラジカル注入プラズ[7]

S. Kondo, M. Hori, K. Yamakawa, S. Den, H. Kano,

マ CVD 法でカーボンナノウォールを作製し、超臨界流

M. Hiramatsu, J. Vac. Sci. Technol. B26, 1294

体有機金属化学堆積法を用いて白金ナノ粒子担持を(2008).

施した。カーボンナノウォール表面上の白金触媒の耐[8]久性評価として、燃料電池実用化推進協議会(FCCJ)

T. Machino, W. Takeuchi, H. Kano, M. Hiramatsu,
M. Hori, Appl. Phys. Express 2, 025001 (2009).

の標準プロトコルに準拠した電位サイクル試験を実[9]

新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)

施し、白金触媒の電気化学的活性表面積（ECSA）を評

固体高分子形燃料電池実用化推進技術開発基盤

価した。
CH4/H2 系のカーボンナノウォール電極の場合、技術開発 :「セル評価解析の共通基盤技術」 『セ測定開始から 3 万サイクルで白金の ECSA が半減した

ル評価解析プロトコル』(2014-12), 学校法人大同学が、C2F6/H2 系の場合は ECSA が半減するまでのサイク園, 学校法人立命館, 国立大学法人東京工業大

ル数は 14 万（カーボンブラックの場合の 7 倍）とな

学, 一般財団法人日本自動車研究所

り、より優れた耐久性を有していることが示された。

[10] V. Gamaleev, K. Kajikawa, K. Takeda, M. Hiramatsu,

カーボンナノウォールは数 10 nm のグレインから構成

MDPI C: J. Carbon Research, Special Issue "Plasma

されており、結晶粒界（grain boundary）が良好なア

Processing for Carbon-based Materials" 4, 65

ンカーとなって、白金ナノ粒子の高密度・高分散担持(2018).

31

1-2-4 酸化物ナノシートと機能性有機配位子の複合化技術の開発— ビピリジンからなる鉄キレート錯体と酸化黒鉛ナノシートの複合化—
才田 隆広 1）

1）名城大学

1. 緒

丸山 隆浩 4）

理工学研究科言

存在が ORR 活性向上に寄与し、ピリジン型窒素が最固体高分子形燃料電池(PEFC)は、環境低負荷な次世も高い活性を有することも報告されている。[6]

代電源の 1 つとして注目されており、既に定置用や車端的に M/N/C 触媒の ORR に対する活性サイトを述

載用電源として市販化されている。しかし現状では、

べると、ピリジン型にドープされた窒素原子に配位しPEFC の普及は限定的である。PEFC の広範な普及をた原子状の鉄やコバルトである。前述にもあるが、妨げている大きな要因として、その高い販売価格が挙

M/N/C 触媒で用いる大環状金属錯体として鉄フタロげられる。PEFC が高価格となる一因として、貴金属

シアニンが一般的である。しかし、フタロシアニンやである白金を電極触媒として使用している点が挙げポルフィリン自体には、ピリジン環ではなく炭素原子られる。そこで、PEFC の低コスト化を推進すべく、が 1 つ少ないピロールにて構成されている。このため、非白金系触媒の開発が盛んに行われている。なかでも炭素源との還元焼成を行い、鉄原子を内包したままピ

比較的に製造コストも低く触媒活性も高い炭素系材

リジン型の窒素サイトを形成する必要がある。鉄が粒料からなる非白金触媒は、M/N/C 触媒と称され注目を子化してしまうと ORR 活性が落ちるだけでなく、集めている。

PEFC 全体の耐久性を下げることが知られている。しM/N/C 触媒の歴史は古く、1964 年に Jasinski らがコたがって、M/N/C 触媒を合成する上では、精密な焼成

バルトフタロシアニンのアルカリ電解質中での酸素条件検討が必要となる。

還元反応（ORR）に対する触媒活性の発見に遡る。[1]目線を PEFC 用触媒から有機化合物に移すと、ピリ

その後に、鉄やコバルト等を中心金属とした大環状金

ジン型に窒素が導入された六員環をからなる化合物

属錯体（ポルフィリン、フタロシアニン系）などのは多数存在する。代表的な化合物として、2 つのピリ

ORR 用の M/N/C 触媒について広く研究された。[2, 3]ジン環からなるビピリジンがある。このビピリジンは、

その結果、Fe-N4 や Co-N4 などの金属中心構造を持つ

鉄イオンとキレート錯体を形成することが出来る。こ環状化合物を炭素源と混合し、不活性ガス雰囲気下でのため、既存のポルフィリンやフタロシアニンよりも、熱分解することで、高い ORR 活性と安定性がえられ鉄原子とピリジン型窒素の数を制御しやすいと予想ることが知られるようになった。加えて、このようなされる。また、既存の合成手法では、ピリジン型以外

金属含有大環状分子は、グラフェンまたは他の炭素材のサイトにも窒素原子が導入されてしまうが、ビピリ料と複合化させることで ORR 活性が更に向上するこジンを用いることで選択的にピリジン型窒素サイトとが知られている。
また M/N/C 触媒の活性サイトは、を形成できると予想される。そこで本研究では、ピリ

Fe-N 部分であることが示唆され、原子状の鉄である

ジ ン 型 窒 素 を 持 つ 2,2’- ビ ピ リ ジ ン -6,6’- ジ オ ー ル

ことが観察された。[4, 5] 他方、ドープされた窒素の（bpy）を用いて窒素種の制御を試み、窒素のドープ32量の違いによる酸素還元能を評価した。また、鉄配位

いた電気化学測定より算出した。また、電気化学測定

bpy の基材となる炭素材料として高比表面積な酸化黒は、回転電極法にて実施している。ORR 開始電位は、

鉛ナノシート（GOns）を用いた。

回転数 400 rpm における ORR 電流（iORR）から算出し評価した。具体的には、iORR を O2 飽和時の電流値か2. 実験方法

ら Ar 飽和時の電流値を差し引いた値とし、iORR の流

2.1 酸化黒鉛ナノシート(GOns)の合成手順

れ始めを ORR 開始電位（EORR）とした。また 0.5V

酸化黒鉛はハマーズ法に準じて合成した。黒鉛 1.0 g

vs.RHE における Kouteck-Levich プロット（K-L プロ

を硫酸ナトリウム 0.5 g と混合し、0°C に冷やした濃ット）から質量活性を算出した。なお電気化学測定は

硫酸(18 mol L) 23 mL を加えた。過マンガン酸カリウ

60ºC の 0.1 M HClO4 中で全て行った。

ム 3.0 g を温度上昇防止のために冷却しながら少しず

3. 実験結果

つ加え、ガラス棒で２時間撹拌を行った。撹拌終了後、4 日間室内で静置し反応させた。その後、ホットスタ

焼成前後における結晶構造の変化を XRD にて確認

ーラーで加熱しながら 46 mL の超純水を加え、100°Cした。その結果、未還元の試料において 10˚および 20˚で 15 分間加熱し、140 mL の超純水と過酸化水素(30付近に 2,2’-ビピリジン-6,6’-ジオールに起因するピー

mass%)10 mL を加え反応を終了させた。最後に、そのクが観察された。しかし、この回折ピークは還元する反応溶液を吸引濾過しながら 5 mass%の塩酸 500 mL

ことにより消滅したことから 2,2’-ビピリジン-6,6’-ジで洗浄し、室温で十分に乾燥させ、酸化黒鉛を得た。

オールが分解されたと考えられる。また、還元処理後合成した酸化黒鉛 100 mg を三角フラスコに加え、そこに超純水 100 mL を加え超音波処理を 30 分間行った。
その後、10 日間浸とうすることで、酸化黒鉛ナノシート（GOns）コロイド溶液を得た。

2.2 ビピリジン鉄錯体と GOns の複合化
スクリュー管に IPA を入れ、2,2’-ビピリジン-6,6’ジオールと塩化鉄 4 水和物が、モル比で bpy:Fe=1:1になるように加え、30 分間超音波処理を行った。得
られたビピリジン鉄錯体と GOns コロイド溶液を混合し、30 分間超音波処理を行った。得られた溶液を 80°Cのガラス板上に滴下し、完全に乾燥させた。乾燥した粉体を 3%水素流通下 800°C で所定の時間（30 秒もし
くは 1 分間）にて焼成を行った。

2.3 物性および ORR 活性評価
合成した触媒の物性を XRD、XPS を用いて確認した。
ORR 活性評価は、参照極として Ag/AgCl 電極、対極

図１ bpyFe/GO 複合体の XRD パターン。（a）
未還元、（b）800℃で 30 秒の還元処理、（c）800℃で 30 秒の還元処理。

としてカーボンファイバーからなる三極式セルを用

33

には 25˚にピークが出現した。これは還元グラフェンから鉄原子の存在を全ての試料から確認している。こ（rGO）に起因するピークと考えられる。

のため、鉄は、rGO 上に高分散に原子状またはイオン

GOns から rGO への還元は、XPS における C 1s ピ

状にて存在していると推測される。

ークからも確認できる（図 2 参照）。還元前は、GOns
由来の官能基やビピリジン由来の sp3 炭素が多く確認されたが、還元処理後には sp2 炭素が支配的となっていた。このため電子伝導性の観点から考えると、還元
処理時間は 30 秒で十分である可能性がある。

図 3 bpyFe/GO 複合体の XPS における N 1s ピーク。

図 2 bpyFe/GO 複合体の XPS における C 1s ピーク。

他方、窒素原子は、完全にピリジン型だけに制御することは出来なかった（図 3 参照）。しかし、ピロー
ル型や酸化型に起因するピークは極めて少なく、本研
究にて合成した複合体触媒は、bpy と鉄の混合比に依

図 4 800℃30 s で還元処した bpyFe/GO 複合体
触媒のリニアスイープボルタモグラム

らずピリジン型窒素が支配的であると言える。一方で、800℃で 30 s の還元処理を行った試料のリニアスイ

Fe の量が XPS の検出限界以下であったため、Fe の電ープボルタモグラム(LSV)を図 4 に示す。この時の回子状態を観察することは出来なかった。ただし、XRF

34

転数は、400 rpm-2200 rpm の範囲で変化させている。

る。また、bpy:Fe のモル比を変化させ、鉄に配位す

400 rpm 時における LSV から EORR を算出すると、1.04

るビピリジンの数を増やすと ORR 活性が低下する

V であった。この値は、電流値は極微小であるが白金ころも確認している。このため、活性サイトであると同定の EORR である。このため、鉄とビピリジンを鉄原子もしくは鉄イオンの軌道を空けておく必要も複合化させた触媒は、本質的に高い活性を有している示唆された。

可能性が示唆された。一方で、各回転数における 0.55

4. 結論

V での電流値から K-L プロットを作成し、量的な ORR
活性を算出すると 0.236 A g-1 であった。この値は、白ピリジン型窒素をもつビピリジン鉄錯体と酸化黒

金に遠く及ばず、鉄ポルフィリン系の M/N/C 触媒よ鉛ナノシートの複合体を合成し、酸素還元能を評価しりも低い値となった。

た。また bpy:Fe のモル比を変えることにより鉄に対続いて、1 分間 800℃にて還元処理を行った試料のする窒素の量が活性に与える影響を調査した。

LSV を図 5 に示す。

XPS の N 1s スペクトルからピリジン型窒素が支配的であることが確認された。電気化学測定の結果、鉄に対する窒素の量が少ない bpy:Fe=1:1 が最も活性が高くなった。鉄に配位した窒素の量が多くなるにつれ、酸素が吸着できるサイトが少なくなっていくために活性が低くなったと考えられる。

参考文献[1] R. Jasinski, Nature, 201, 1212- 1213 (1964).
[2] 尾崎純一, 今城靖雄, 炭素, 265, 204-212(2014).
[3] G. Liu, X. Li, J.-W. Lee, B. N. Popov, Catal. Sci.
Technol., 1, 207-217 (2011).
[4] H. T. Chung, D. A. Cullen, D. Higgins, B. T. Sneed, E.
F. Holby, K. L. More, P. Zelenay, Science, 357,
479-484 (2017).
[5] L. Li, S. Shen, G. Wei, X. Li, K. Yang, Q. Feng, J.
Zhang, ACS Appl. Mater. Interfaces, 11, 14126-12135(2019).
[6] D. Guo,R. Shibuya,C. Akiba,S. Saji,T. Kondo,J.
Nakamura, Science, 351, 361-365 (2016).

図 4 800℃1 分で還元した bpyFe/GO 複合体触媒の LSV。

30 s にて還元処理を行った試料とは異なり、0.8 V付近から明らかな還元電流が観察された。EORR を算出すると 0.94 V であり、還元時間が延びると EORR
が約 0.1 V 低下した。この時の 0.55 V における ORR
活性を K-L プロットより算出すると、0.587 A g-1 であった。還元処理時間を倍にすることで、0.55 V における質量活性も 2 倍近くまで向上する結果となった。現段階では、還元処理時間の増加により、鉄ビピリジン錯体が rGO 内に埋め込まれたと推測しているが、詳細は不明である。ただし、還元処理時間を
1 分以上とすると活性が低下することも確認してい35

1-3 ナノカーボン材料をバイオセンサや VOC ガス浄化に応用する技術の開発

36

1-3-1-1 ナノカーボン材料をバイオセンサに応用する技術の開発 (その 1)
平松 美根男 1） 竹田 圭吾 1） 東松 真和 2） 近藤 博基 2) 堀 勝 2)
1）名城大学 理工学研究科
2) 名古屋大学 低温プラズマ科学研究センター

1. 緒

言

酸化水素（H2O2）センサ電極に応用してその性能を評

シリコンや種々の金属基板上にほぼ垂直に成長し、価した[4,5]。

相互に支え合って自己組織的に３次元迷路状壁構造となる多層グラフェンは、カーボンナノウォール

2. カーボンナノウォールの構造制御（ carbon nanowall ） や グ ラ フ ェ ン ナ ノ ウ ォ ー ル

CH4/A の 混 合 ガ ス を 用 い た 誘 導 結 合 型 プ ラ ズ マ（ graphene nanowall ）、 カ ー ボ ン ナ ノ フ レ ー ク

CVD[3]により、
700 ℃程度に加熱された Si または SiO2

（carbon nanoflake）と呼ばれ、主としてメタンと水

基板上にカーボンナノウォールの作製を行った。圧力

素の混合ガスを用いたプラズマ CVD 法による形成が15-20 mTorr のもとで、ガスの流量比を変化させるほ報告されている[1]。超高アスペクト比（数 nm の厚さ

か、基板に正バイアスを印加して、基板に到達するイの多層グラフェンシートが数 10 µm の高さまで成長）

オンのエネルギーやフラックスがカーボンナノウォ

やグラムあたり数 100 m2 という大きな比表面積、なールの核発生や成長に与える影響について系統的にらびにグラファイトのもつ導電性が特徴で、スーパー

調べるとともに、Ti ナノ粒子を付着させた SiO2 基板

キャパシタならびに新規電池の電極や細胞培養の基を用いて、金属触媒による核発生促進とそれを利用し材のほか、金属触媒ナノ粒子や酵素等による表面修飾

た構造制御についても検討を行った。

と組み合わせて、電気化学・バイオセンサ電極等へのCH4 と Ar の流量比を変えて 1 時間成長を行ったカー

応用、即ち、プラットフォームとしての新規応用が期

ボンナノウォールの電子顕微鏡（SEM）像を図 1(a)と待されている[2]。実用化に向けては、応用目的に合(b)に示す。典型的なカーボンナノウォールの作製条

わせた構造の最適化や、ナノ粒子や酵素を用いた表面

件（a: Ar/CH4=1）の場合と比べて、Ar の流量が多いの修飾技術・コンフォーマルコーティング・シート間場合（b: Ar/CH4=14）には、壁間隔が狭く、さらに個々への埋め込みといった機能化付加技術の確立が必要のシートには枝分かれが多く確認される。Ar の流量である。

を多くして基板を叩く Ar イオンのフラックスを増加

本研究では、誘導結合型プラズマ CVD 法を用いたカさせることにより核発生が促進されて密度が増加すーボンナノウォールの形成[3]において、プラズマ中る（壁と壁の間隔が狭くなる）が、定常成長時のカーのラジカルやイオンの制御、基板の前処理（金属ナノボンナノウォール表面へのイオン衝撃は 2 次核発生

粒子の付与）など種々の方法で壁間隔や結晶性などのを誘起し、枝分かれの原因となることが分かる。一方

構造制御手法について検討を行った。さらに、カーボ

図 1(c)では、(a)と同じプラズマ条件下で Ti ナノ粒

ンナノウォール表面を白金ナノ粒子で表面修飾し、過子を付着させた基板を用いており、結晶性は維持され

37

たままカーボンナノウォールの壁間隔だけが狭くなしてイオン衝撃を抑えた場合、カーボンナノウォールっていることが分かる。

は形成されなかった。Si や SiO2 基板を用いた場合、立ったグラフェンの核発生に先んじて 10-30 nm 程度の非晶質カーボン層が形成されるが、イオン衝撃のア
シストが無いと炭素源前駆体の基板表面への付着係数が小さくなるため非晶質カーボン層が形成されず、
結果カーボンナノウォールの成長に至らない[3]。Ti
ナノ粒子を付着させた基板を用いた場合（Ti/SiO2 基板）には、基板に正バイアスを印加してイオン衝撃の図 1 カーボンナノウォール膜（1 時間成長）の表面および断面 SEM 像。(a)典型的な成長条件(Ar/CH4=1)、(b)Ar 高流量(Ar/CH4=14)、(c)Ti/SiO2 基板上に形成(Ar/CH4=1)。

アシストを抑えているにもかかわらず、カーボンナノ
ウォールの形成が確認できる。

図 2 カーボンナノウォール膜のラマンスペクトル。
基板バイアス無し(SiO2 基板)、基板バイアスあり(SiO2 基板)、基板バイアスあり(Ti/SiO2 基板)。

図 3
Ti/SiO2 基板を用いてカーボンナノウォールを形成した場合の核発生時の SEM 像（2 分）、および
核発生メカニズムの模式図。

カーボンナノウォールのラマンスペクトルを図 2 に
図 1(c)及び図 2 の結果は、Ti ナノ粒子を基板に付示す。「without bias」と記されたものが典型的なカ

着させた場合、グラフェンの核発生のメカニズムがーボンナノウォールのラマンスペクトルで、グラファ

Si や SiO2 基板上とは異なることを示唆している。図イトに起因する G バンド、欠陥やグレインサイズの小

3 は、Ti/SiO2 基板を用いてカーボンナノウォールをささに起因する D バンド、グラフェンエッジに起因す形成した場合の成長開始 2 分後の SEM 像、および核発

る D’バンドが観察される。カーボンナノウォールは

生メカニズムの模式図を示している。Ti/SiO2 基板を

1 枚の単結晶ではなく、結晶性は悪くないものの小さ用いた場合、カーボンナノウォールと基板界面に非晶なグレインで構成されているため[4]、ラマンスペク

質カーボン層が形成されず、直接ナノグラフェンがトルは平面状グラフェンのそれとは異なり、G バンド

Ti ナノ粒子から核発生している。しかもまず水平方

ピークと同程度がそれ以上の強度となるシャープで向に成長し、その後上方に向きを変えてカーボンナノ

鋭い D バンドピークと D’バンドの肩ピークで特徴付ウォールの成長へと繫がっている。Ti は Si と反応しけられる。一方、基板に正バイアス（+50 V）を印加てシリサイドを作りやすく、基板加熱によって埋もれ

38

てしまうが、表面部分はグラフェン形成の触媒能力を

イオン衝撃や金属ナノ粒子を用いた核発生の制御に有していることが示唆される。

より可能であるが、拡げることは容易ではない。カー

水平なグラフェンは、Ni や Cu 基板を用いて熱 CVD

ボンナノウォールを細胞培養の基材に用いる提案[6]で形成することができるが、プラズマ CVD の場合、基が成されたものの、細胞のサイズに比べてカーボンナ

板へのイオン衝撃の影響で、Ni や Cu 基板上にもカー

ノウォールの壁間隔が小さいため、壁間隔を拡げる技

ボンナノウォールが成長してしまう。しかし、基板に術の確立が望まれる。図 5 はカーボンナノウォール形

正バイアスを印加してリモートプラズマの構造とし成後の後処理によって 10-50 倍程度に広い壁間隔をてイオン衝撃による核発生を抑止することで、Ni や得た例である。過酸化水素水（90℃）浸すことにより、Cu の触媒効果により水平なグラフェンを得ることも基板とカーボンナノウォールの界面に存在するアモ可能である。図 4 は、Ni 基板上に本研究と同じ誘導ルファスカーボン選択的に除去され、カーボンナノウ

結合型プラズマ CVD を用いて 30 秒間成長させた生成

ォールも一緒に剥離したものと考えられる。一方、Ti

物のラマンスペクトルで、リモートプラズマ構造を採を付与した Si 基板上に形成したカーボンナノウォー

用することにより水平なグラフェンも得られること

ルの場合、アモルファスカーボン界面層が存在しないを示している。

ため、同じ溶液処理を行っても変化は見られなかった。

図 4 誘導結合型プラズマを用いて Ni 上に 30 秒形成したグラフェンのラマンスペクトル。上：通常モードで作製したカーボンナノウォール、下：リモート
プラズマモードで作製した水平な多層グラフェン。

図 5 過酸化水素水処理前後のカーボンナノウォー
ルの SEM 像。

3. カーボンナノウォール表面の白金ナノ粒

プラズマ中の炭素源前駆体と水素原子の比はカーボンナノウォールの構造や結晶性、成長速度に影響を子修飾及ぼす。水素原子の割合が増えると結晶性は向上し壁

カーボンナノウォールは単結晶ではなく、数 10 nm

間隔は拡がるが成長速度は小さくなる[5]。炭素源前のグレインから構成されている[4]。グレインの境界

駆体と水素原子の比は、励起方法や圧力に依存すると(grain boundary)は化学的に活性であり、金属ナノ粒

ともに、利用ガスの混合比を変化させることで制御可子や生体分子を固定しやすいため幅広く表面修飾が能であるが、制御可能な壁間隔の領域は大きくない。

可能である。カーボンナノウォールはこれらの担持材

カーボンナノウォールの壁間隔を小さくするのは料（プラットフォーム）として電気化学・バイオへの39幅広い応用が期待できる。白金は水素化、脱水素、酸

図 7 カーボンファイバ上に形成した Pt ナノ粒子修飾処理後カーボンナノウォールの SEM 像（左）、対応する領域の C および Pt の EDX マッピング[7]。

化等の反応に活性を示し、種々の電気化学応用が提案されている。燃料電池電極や電気化学センサ電極として応用するためには、白金の使用量を減らしながらも

4. 過酸化水素(H2O2)センサへの応用

大きな反応面積が得られるよう、ナノメートルサイズ

カーボンナノウォールの電気化学応用に関して、カの粒子として高分散させた状態でカーボンナノウォ

ーボンファイバペーパ上にカーボンナノウォールをール表面に付着させる必要がある。白金ナノ粒子によ成長させて表面積を増大させ、さらに表面を白金ナノるカーボンナノウォールの表面修飾は、塩化白金酸の粒子で修飾して過酸化水素(H2O2)センサ用電極とした

液相還元[7]や超臨界二酸化炭素を利用した化学堆積[7]。図 7 左はカーボンファイバ上に形成した Pt ナノ[8]が有効である。

粒子修飾処理後のカーボンナノウォール/カーボンフ

塩化白金酸(H2Cl6Pt)を原料として液相還元法によァイバの SEM 像である（カーボンファイバの断面）。

りカーボンナノウォール表面に白金ナノ粒子の付着

同右は、対応する領域の C および Pt のエネルギー分を行った。図 6 は白金ナノ粒子でカーボンナノウォー

散型 X 線分析（Energy dispersive X-ray spectroscopy、ル表面を修飾する前後での表面の SEM 像である。5-10

EDX）元素マッピングの結果を示している。カーボン

nm の粒径の白金ナノ粒子が分散されて形成されていナノウォールの先端から根元まで Pt が高分散で形成ることが分かる。超臨界二酸化炭素を利用した化学堆されている。またこれらの白金ナノ粒子が酸化されて積法[8]で得られる Pt ナノ粒子の平均サイズ 1-2 nm

いないことは、X 線光電子分光（X-ray photoelectronと比較して若干大きいが、簡便で実用的な手法である

spectroscopy, XPS）分析により確認された[7]。

ことが実証された。

図 6 塩化白金酸を原料として液相還元法により白金ナノ粒子修飾を施したカーボンナノウォール表面の SEM 像：(a)処理前、(b)修飾処理後。

図 8
Pt-CNW/CFP 電極を用いた典型的なサイクリックボルタモグラム（240μM H2O2 in 0.1M PBS (pH =7.4)）[7]。

３電極法を用いて電気化学評価を行うとともに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS, 0.1 M）中に H2O2 を滴下し、H2O2 の検出能力の評価を行った。図 8 は、白金ナノ粒子で修飾されたカーボンナノウォール/カーボンファ
イバ電極(Pt-CNW/CFP 電極)を３電極法の作用電極に用い、0.1 M PBS（リン酸緩衝生理食塩水,phosphatebuffered saline）(pH=7.4)中に 240 µM の H2O2 を滴下

40

して得られた典型的なサイクリックボルタモグラム

サイクル数の増加に伴ってピーク電流の減少が見らを示している[7]。-2 から-1 V 付近で還元のピークがれるが、これは主として Pt 表面での H2O2 の分解反応見られる。次に、この Pt-CNW/CFP 電極を用い、-1 V

によって液中の H2O2 濃度が減少したことによることにポテンシャルを固定して 100 秒ごとに一定量の過に加え、液を取り替えた直後のピーク電流は十分に回酸化水素水を滴下して電流を測定するアンペロメト

復しないことから、Pt ナノ粒子の凝集やカーボンナリーを行った。図 9 に示すように、10 µM から 1.5 mM

ノウォールからの離脱など電極の劣化も徐々に起この広い領域に亘って良好な線形性が得られている[7]。

っていると考えられる。3000 サイクル後の SEM 観察やラマン測定の結果から推定される電極の劣化の模式図を図 11 に示す[9]。ポテンシャルの印加によりPt 表面での H2O2 の化学反応で OH-が生成され、これがグラフェンの先端方向からエッチングを引き起こすと考えられる。これによってカーボンナノウォールの先端エッジから Pt の凝集が進むと考えられる。

図 9
Pt-CNW/CFP 電極を用いた H2O2 検出における
H2O2 濃度と電流の校正曲線[7]。

図 11 H2O2 検出の分解によって生成される 2 次生成物との反応による Pt-CNW/CFP 電極の劣化のメカニズ
ムを表す模式図[9]。

4. 結論
グラファイトの持つ導電性、化学的安定性、および

図 10
CV 測定において得られたポテンシャル-0.1 V におけるピーク電流の推移を表し[9]。

広い比表面積を有するカーボンナノウォールは、触媒や生体分子の担持材料として優位な構造を有してお前述の H2O2 センサ用電極を CV 測定に繰り返し使用

り、エネルギー・電気化学・バイオ応用に向けたプラ

した場合の反応の変化や電極の劣化について検討をットフォームとして幅広い応用が期待される。カーボ行った。図 10 は、240 µM の H2O2 を含む PBS において

ンナノウォールの構造制御技術を確立するとともに、

Pt-CNW/CFP 電極を用いて 3000 回サイクル CV 測定を

電気化学・バイオセンサの電極として有用性を示した。

行い、ポテンシャル-0.1 V におけるピーク電流の推一例として、白金ナノ粒子で修飾したカーボンナノウ

移を表している[9]。1000 サイクル毎に液を新しいも

ォール電極を用いた過酸化水素センサを試作し、検出のに取り替えている。1000 サイクル毎の推移では、

限界 800 nM、1-1500 µM の直線性領域を有することを41

確認した。一方、白金表面での H2O2 の化学反応により[5]生成される OH-等の 2 次生成物によりカーボンナノウォ

H. Cho, H. Kondo, K. Ishikawa, M. Sekine, M.
Hiramatsu , M. Hori, Carbon, 68, 380 (2014).

ールがエッチングされ、Pt ナノ粒子の凝集など白金[6]

H. Watanabe, H. Kondo, Y. Okamoto, M. Hiramatsu,

ナノ粒子で修飾したカーボンナノウォール電極の劣M. Sekine, Y. Baba, M, Hori, Appl. Phys. Lett. 105,

化のメカニズムについても議論した。

244105 (2014).

グルタミン酸は脳の機能のみならず、脳神経疾患に[7]

M. Tomatsu, M. Hiramatsu, J.S. Foord, H. Kondo, K.

も関与する重要な神経伝達物質であり、脳の機能や脳Ishikawa, M. Sekine, K. Takeda, M. Hori, Jpn. J.

神経疾患の治療法を探るために、脳内のグルタミン酸

Appl. Phys., 56, 06HF03 (2017).

の動態観察が必要とされる。グルタミン酸の検出方法[8]として、酸化酵素と組み合わせて電気化学反応をモニ

M. Hiramatsu, T. Machino, K. Mase, M. Hori, H.
Kano, J. Nanosci. Nanotechnol., 10, 4023 (2010).

タする方法が提案されている。L-グルタミン酸オキシ[9]M. Tomatsu, M. Hiramatsu, H. Kondo, K. Ishikawa,

ダーゼはグルタミン酸の酸化酵素であり、グルタミン

T.i Tsutsumi, M. Sekine, M. Hori, C (Journal of

酸は酸化反応を誘起されて過酸化水素が生成される

Carbon Research) 2019 (MDPI), 5, 7 (2019).

ため、過酸化水素を検出することにより間接的にグル[10] J. Hu, S. Wisetsuwannaphum, J. S. Foord, Faraday

タミン酸を検出することが可能である[10]。本研究でDiscuss. 172, 457 (2014).

開発を行っている過酸化水素センサは、高感度グルタ
ミン酸センサの開発の一環として取り組んでいるものであり、今後は L-グルタミン酸オキシダーゼの固定と組み合わせて、速やかにグルタミン酸センサへの適用可能性を実証していく。さらに、同様の原理は、グルコースセンサへも適用可能であり、グルコースオ
キシダーゼと組み合わせて、グルコースセンサへの適用についても検討を開始した。

参考文献
[1]

M. Hiramatsu, M. Hori, “Carbon Nanowalls:
Synthesis and Emerging Applications”, Springer
Verlag, Wien (2010).

[2]

M. Hiramatsu, H. Kondo, M. Hori, “Graphene
Nanowalls”, in New Progress on Graphene Research,
Jian Ru Gong, Ed., Ch.9, 234-260 (2013).

[3]

M. Hiramatsu, Y. Nihashi, H. Kondo, M. Hori, Jpn. J.
Appl. Phys., 52, 01AK05 (2013).

[4]

K. Kobayashi, M. Tanimura, H. Nakai, A. Yoshimura,
H. Yoshimura, K. Kojima, M. Tachibana, J. Appl.
Phys., 101, 094306 (2007).

42

1-3-1-2 ナノカーボン材料をバイオセンサに応用する技術の開発(その 2)— 生体超分子を用いて合成された触媒ナノ粒子を利用したカーボンナノウォールの合成促進 —
熊谷慎也

1）

竹田圭吾 1) 平松美根男 1）

1）名城大学

1. 緒

理工学研究科言ーション能を持つかご状タンパク質を用いたナノ粒

ナノカーボン材料は、優れた電気的、機械的、化子の合成が報告されている。このかご状タンパク質の学的性質を発揮することから、ナノテクノロジー研究中で有望なものが、アポフェリチンである（図 1）。アにおいて欠かせない材料となっている。ナノカーボン

ポフェリチンは直径 12 nm の球殻状のタンパク質超材料の例としては、カーボンナノチューブ、グラフェ分子であり、内部に 6 nm のキャビティ（空洞）を持

ン、カーボンナノウォール等がある。例えば、カーボ

つ。我々ヒトの血液の中にもこのアポフェリチンは存

ンナノウォールは燃料電池における電極材料として在しており、内部のキャビティに鉄を貯蔵することで用いられており、カーボンナノウォールに触媒ナノ粒

血中の鉄分濃度を保つ役割を果たしている。このキャ子を付着させることで、電池性能が向上することが報

ビティをナノ粒子合成のテンプレートとして用いる

告されている。

ことで、均一な大きさを持つナノ粒子を作製すること

ナノカーボン材料は様々な手法で合成することがが報告されている[1]。これまでにアポフェリチンを用できる。化学気相堆積法、アーク放電、レーザーアブ

いて様々な材料のナノ粒子が合成されており、その触レーション等の手法が用いられる。ナノカーボン材料

媒能を利用した材料合成や[2]、その電気特性を利用しの合成効率を向上させるために、触媒材料が用いられた電子デバイス応用などが報告されている。本研究でてきた。触媒はナノカーボン材料の成長核の生成を促は、このかご状タンパク質アポフェリチンで合成した

進することから、ナノカーボン材料の成長の起点を決

触媒ナノ粒子を用いて、カーボンナノウォールの生成

定しうるともいえる。従って、触媒をナノスケールでを試みたので報告する。

パターニングできれば、ナノカーボン材料をナノスケールで選択的に成長させることが可能になる。しかしながら、触媒材料のナノパターンを従来のトップダウ
ン的な加工手法を用いて作製するのは、容易ではなかった。

図 1 かご状タンパク質フェリチンの模式図。ナノ上記のトップダウン加工手法の一方で、原子・分粒子を内包するアポフェリチンをフェリチンと呼子をナノスケールで積みあげて構造を作り上げるボぶ。
トムアップ的な手法がある。近年、バイオミネラリゼ

43ポテンシャルが遮蔽される。この静電遮蔽距離（Debye長）は、液体中のイオン強度の関数になっており、次式で表される。
𝜖𝜖 𝜖𝜖 𝑘𝑘𝑘𝑘

𝜆𝜆 = � 0 𝑟𝑟2

2𝑒𝑒 𝐼𝐼(1)

ここで、𝜖𝜖0 は真空の誘電率、𝜖𝜖𝑟𝑟 は比誘電率、𝑘𝑘はボルツ
マン定数、𝑇𝑇は絶対温度、𝑒𝑒は電荷素量、𝐼𝐼は溶液のイオン強度である。液体中での静電的な反発を抑制する

図 2 シリコン基板上に吸着した Co3O4 ナノ粒子。

には、この Debye 長を短くするとよい。そこで、

2. 実験方法

MES/Tris バッファを用いて、Co3O4 ナノ粒子を内包す

2.1 触媒ナノ粒子の合成

るアポフェリチンを含む溶液のイオン強度を 100 mM

本研究では、アポフェリチンを用いて合成したに調節した。この条件のもとでは、Debye 長が約 1 nm

Co3O4 ナノ粒子を使用した[3]。走査電子顕微鏡（SEM）となり、静電的な反発を大きく抑制できる[4,5] 。こによる観察像を図 2 に示す。かご状タンパク質部分はのアポフェリチンを含む溶液を表面親水化処理を行SEM では画像化されないため、内包された Co3O4 ナなったシリコン基板上に滴下し、アポフェリチンを吸ノ粒子が白い輝点として観察される。

着させた。その後、リンス、スピンドライを行った。
そして、アポフェリチンを吸着させた基板を SEM で観察した。

2.2 シリコン基板上への触媒ナノ粒子の高密度吸着基板として、熱酸化膜を有するシリコン基板を用いた。このシリコン基板の表面を、非熱平衡大気圧プラ

2.3 プラズマ励起化学気相堆積法によるカーボンナノウ

ズマジェットを照射してクリーニングし、シリコン基

ォールの合成プ ラ ズ マ 励 起 化 学 気 相 堆 積 法 （ Plasma-Enhanced

板表面の親水化を行った。
親水化処理後のシリコン基板に対して、Co3O4 ナノ

Chemical Vapor Deposition: PECVD）を用いて、カーボン粒子を内包するアポフェリチンの吸着を行った。熱酸

ナノウォールの合成を行った[6]。Co3O4 触媒ナノ粒子を化膜を有するシリコン基板を液体中に入れると、表面内包するアポフェリチンを吸着させた基板と、吸着させてでの解離反応の結果、基板表面はマイナスに帯電する。

いない基板を同じ真空チャンバの中に設置した。真空排

一方、アポフェリチンの表面も中性 pH 付近ではマイ気を行い、基板を 600 ℃にまで加熱した。カーボンナノウ

ナスに帯電する。これらのマイナスの表面電荷同士にォールを生成させるため、CH4 および Ar ガスをそれぞれ

よる静電的な反発によって、アポフェリチンのシリコ

22.5 sccm、25 sccm のレートで導入し、プラズマ生成アン

ン基板上への吸着は妨げられることになる。そこで、テナに RF 電力 500 W を加え、誘導結合プラズマを 30 s

アポフェリチンを確実に吸着させるために、静電的な間生成させた。

反発の抑制を行った。
液体中には様々な荷電粒子が存在し、電荷を持つ表面が存在すると、それとは反対の電荷を持った荷電粒子（対イオン）が集積し、表面電荷に起因する静電

44

(a)

(a)

(b)

図 3 シリコン基板上へのフェリチン吸着。(a)バッファ無し、(b) バッファ有り。

(b)

3. 実験結果
3.1 シリコン基板上への触媒ナノ粒子の吸着
Co3O4 ナノ粒子を内包するフェリチンの吸着時における静電遮蔽距離の効果を評価した。結果を図 3 に示す。SEM 観察ではタンパク質部分は観測されないた
め、内包された Co3O4 ナノ粒子のみが白い輝点として観測される。バッファを用いて静電的な反発を抑制したことで、フェリチンの吸着量が著しく向上している(c)

ことが分かる。フェリチンの吸着密度を評価したところ、図 4 に示すように、平均して4 − 5 × 1010 個/𝑐𝑐𝑐𝑐3であった。

シリコン基板上への触媒ナノ粒子の吸着量をさらに増加させるため、フェリチンの複数回吸着を試みた。
一般的にタンパク部分は乾燥することで変質するため、シリコン基板上に吸着したフェリチンが持つ負の
図 5 シリコン基板上へのフェリチン吸着。(a) 吸
着 1 回目、(b) 吸着 2 回目、(c) 吸着 3 回目。
電荷に起因する静電的な反発を抑制できるためである[5]。吸着回数を増やすごとに、図 5 に示すように吸着量が増加した。フェリチンの吸着プロセスを 3 回繰り返したところ、図 6 に示すように、吸着密度は最大で2 × 1011 個/𝑐𝑐𝑐𝑐3 に達した。
3.2 生体超分子由来 Co3O4 触媒ナノ粒子を用いたカーボンナノウォールの合成
図 4 シリコン基板上へのフェリチン吸着密度。

フェリチンの複数吸着を行って Co3O4 触媒ナノ粒

45

(a)

(b)
図 6

吸着回数に対するシリコン基板上へのフェリチン吸着密度。
子の吸着量を増加させたシリコン基板を用いて、カーボンナノウォールの合成を試みた。結果を図 7 に示す。
Co3O4 触媒ナノ粒子を吸着させた基板で、カーボン
ナノウォールが確認された。
その大きさは 50-70 nm である。一方、Co3O4 触媒ナノ粒子を吸着させていない

図 7 プラズマ励起化学気相堆積後の SEM 観察像。

基板では、カーボンナノウォールは観察されなかった。

(a) Co3O4 触媒ナノ粒子あり、(b) Co3O4 触媒ナノ粒

文献 6 によると、触媒を用いない場合、カーボンナノ

子なし。

ウォールの初期成長核が形成されるのに 5 分かかる

参考文献と報告されている。触媒ナノ粒子を用いることで、カ[1] I. Yamashita, K. Iwahori, S. Kumagai, Biochim.

ーボンナノウォールの成長速度がおよそ 6 倍まで増Biophys. Acta 1800, (2010) pp.846-857.

加したといえる。

[2] S. Kumagai, T. Ono, S. Yoshii, A. Kadotani, R.
Tsukamoto, K. Nioshio, M. Okuda, I. Yamashita, Appl.

5.結論

Phys. Exp. 3, (2010) 015101 (3 pages).

触媒ナノ粒子を用いることで、カーボンナノウォ[3] R. Tsukamoto, K. Iwahori, M. Muraoka, I. Yamashita,

ールの成長速度を促進することができた。触媒ナノ粒

Bull. Chem. Soc. Jpn. 78, (2005) pp. 2075–2081.

子を基板上でパターニングすることで、基板上の狙っ[4] K. Yamada, S. Yoshii, S. Kumagai, I. Fujiwara, K.

た位置でカーボンナノウォールを成長させることがNishio, M. Okuda, N. Matsukawa, I. Yamashita, Jpn. J.

可能になる。ナノカーボン材料を用いたバイオセンシ

Appl. Phys. 45, (2006) pp. 4259-4264.

ングなどを作製する上で有効な技術である。

[5] K. Yamada, S. Yoshii, S. Kumagai, A. Miura, Y. Uraoka,
T. Fuyuki, I. Yamashita, Jpn. J. Appl. Phys. 45, (2006)

謝辞

pp. 7549-7553.

かご状タンパク質アポフェリチンは、大阪大学[6] M. Hiramatsu, Y. Nihashi, H. Kondo, M. Hori, Jpn. J.

山下一郎特任教授から提供いただいた。ここに感謝を

Appl. Phys. 52, (2013) 01AK05 (6 pages).

申し上げる。

46

1-3-2 ナノカーボン材料を VOC ガス浄化に応用する技術の開発
大脇 健史 1），飯干 智哉 1)
1） 名城大学

1. 緒

理工学研究科言に分解するため、光触媒にプラズマを組み合わせた場

室内や車室内空間等の浄化または快適性の創出が合の除去効果を評価した。

強く求められている。特に気体の有害物質として揮発性有機化合物（volatile Organic Compounds, VOC）

2. 実験方法の除去が重要である。その除去方法としては、吸着剤

2.1 ナノカーボン材料・光触媒ハイブリッド材料作製およを使用する方法 [1,2]、また、光触媒[3,4]またはプ

び VOC 除去性能評価

ラズマ等[5,6]を利用し分解除去する方法がある。吸ナノカーボン材料である活性炭（AC、活性炭素、着材は、初期には優れた除去性能を示すものの、その関東化学）またはカーボンナノチューブ（CNT、eDIPS

性能は徐々に低下してくる特性を有している。

INK、名城ナノカーボン）[7,8]を酸化チタン粉末

一方、光触媒はふんだんに存在する太陽光または室（ST-01、石原産業）と固形重量比で１：１にて、重内光を利用し、VOC 等の有機分子を酸化分解できる特量がトータル１wt%になるように純水に混ぜ、分散、徴があり、生活部材や建築材に実用化されている。光

攪拌した。その後固形分が 0.1ｇになるようにシャーが酸化チタン等の光触媒に照射されると電子・正孔がレにいれ、乾燥後、１５０℃にて熱処理し均一な薄膜生成し、それらが還元力および酸化力を発現し、表面を得た。評価用の VOC ガスとして、アセトアルデヒドに吸着した VOC を分解する。しかしながら、空気中に（AA）およびトルエン（T）を使用した。除去性能を存在する VOC は ppm 以下の低濃度であり、吸着剤ほど評価するため、5 L テドラバッグを用い、上記の作製の捕集能力はなく、通常の環境では分解には時間を要した試料と共に、乾燥空気を導入し、それぞれ 500ppm

してしまう。また、プラズマによる分解除去では、プになるように濃度調整した。暗所にて 24 時間放置し、ラズマによって生成した酸化活性種が直接 VOC を分

その後 360nm の紫外光を 1 mW/cm²の強度で照射しな解し、脱臭装置に応用されている。しかし、分解力をがら、AA または T の濃度変化をガスクロマトグラフ

高めるためプラズマパワーを大きくすると、同時に有または検知管によって調べた。

害なオゾン等が生成してしまう点もある。

2.2 大気圧プラズマ複合化による VOC 除去性能評価

そこで、本研究では、高速に VOC ガスを分解するこ

VOC ガス浄化をダイナミックに進めるため、光触媒とを目指し、以下の手順で研究を進めた。最初に、吸ハイブリッド材料と大気圧プラズマを組み合わせ、着材としてのナノカーボン材料および光触媒を組みVOC 除去性能を評価した。光触媒には酸化チタン粉末

合わせたハイブリッド材料を作製し、ナノカーボン材（ST-01）を Ti メッシュに担持し光触媒フィルタを作料による VOC の捕集濃縮と光触媒分解による除去能製した。プラズマには DC 型を採用し、図１に示すよの評価を実施した。続いて、VOC ガスをダイナミック

うな評価装置を構築した。図 1 に示すように、40L プ

47

ロピレン容器内に、ファン、プラズマ電極、光触媒フ着・分解に劣った。今回使用したナノカーボン材料のィルタと構成し、発生したプラズマがファンによって比表面積は、約1000m2/gであり、物理吸着能は高いことが予想されるが、それ以外にVOCガスの極性が影響

40L reaction vessel

していることが確認できた。つまり、ナノカーボン材

Fan
AppliedelectrodePowersupplyGlass window

Groundelectrode

料は非極性であるので、疎水性分子除去には有効であ・VOC gas
Monitor・Ozonemonitorることが言える。しかしながら、CNTの吸着性は悪かった。これは、分子の大きさに対して、CNTの内径が小さいためであると推察される[10] 。

Photocatalyst
UV Light source fiter

図 1 光触媒及びプラズマによる VOC 分解評価装置
光触媒に届くように構成した。光条件としては UV 光を 3mW/cm2 の光強度で容器の外からガラス窓を通して
光触媒フィルタに照射した。プラズマ条件として-7.0
kV、 0.3 mA で放電させた。容器内を乾燥空気で置換した後、40ppm になるように AA を注入した。AA 除去
性能は、VOC モニターによって逐次濃度測定することによって評価した。同時に、オゾン濃度測定器(エム
図 2 ハイブリッド材料のアセトアルデヒド吸着・分
解特性

ケーサイエンティフィック、GT-903 )および排ガス分
析計（ホダカ、HT-1300Z）によってオゾン濃度、NOx
濃度も測定した。

3. 実験結果
3.1

ナノカーボン材料・光触媒ハイブリッド材料によるVOC除去効果
ナノカーボン材料・光触媒ハイブリッド材料によるアセトアルデヒドおよびトルエンの除去性能について調べた結果をそれぞれ図2、3に示す。図2より、2種類のハイブリッド材料ともにアセトアルデヒドガ
スを一定量吸着するものの限界があり、光照射によっ

図3て、急速に分解除去できることが分かった。特にAC・また、CNT・光触媒ハイブリッド材料は、光照射下で光触媒ハイブリッド材料は、CNT・光触媒ハイブリッの分解性もAC・光触媒ハイブリッド材料より低かった。

ド材料に比べ、約20倍分解速度は速いことが分かった。

これは、AC・光触媒ハイブリッド材料は粉末混合でまた、図３より、AC・光触媒ハイブリッド材料は、ト

分散性よく混合されていたのに対し、CNT・光触媒ハ

ルエン吸着および分解に優れ、除去能が高いことが分

イブリッド材料では、CNTが繊維上であるため、光触かった[9]。一方、CNT・光触媒ハイブリッド材料は吸媒上に混合された状態で、光吸収も阻害されたと推察

48

ハイブリッド材料のトルエンの吸着・分解特性られる。

分解を合わせた分解効果として説明されている。一方、

3.2 大気圧プラズマ複合化によるVOC除去効果

本研究では、プラズマ放電部と光触媒を分離すること

ナノカーボン材料・光触媒ハイブリッド材料よりによって、上記で説明したように、それぞれの分解効

さらに高速でVOC除去を行うために、大気圧プラズマ果を超える相乗効果が得られている。

を光触媒に組み合わせ、VOC除去効果を調べた。図4には、光触媒および大気圧プラズマの組み合わせ、ま3.3 光触媒および大気圧プラズマ複合化による相乗

たそれぞれ単独で働かせたときの容器内のAAガスの的VOC除去効果の機構
3.2では、光触媒および大気圧プラズマを同時に作

濃度変化を示す。

動させたときの相乗的にアセトアルデヒドガスの分解が速くなることを示した。その相乗効果の機構を調べるため、大気圧プラズマ作動時に加え、光触媒および大気圧プラズマ同時作動時における、プラズマによって発生するオゾンおよびNOxガスの濃度を測定した。
図5および図6に、プラズマ作動時間に伴うオゾンおよびNOxガス濃度の変化を示す。

図4 光触媒およびプラズマ分解に伴うアセトアルデ
ヒドガス濃度変化
図4より、光触媒および大気圧プラズマを同時に働かせたときの分解速度が、光触媒または大気圧DCプラ
ズマそれぞれ単独での分解速度の和より向上していることがわかった。この濃度変化率を式に示すと、-kt[AA] = [AA 0] eとなり、ここで、[AA]は、アセトアルデヒド濃度、[AA
図5 プラズマ作動時間に伴うオゾン濃度の変化0]はアセトアルデヒド初期濃度、ｋは反応速度定数である。光触媒および大気圧プラズマによる分解のｋは、それぞれ0.041、0.020であり、その組み合わせ作動時でのｋ値は0.12となり、明らかに相乗的に分解速度が向上していることが分かった。
これまでにも、光触媒をプラズマ電極表面に固定化したり、プラズマ放電部の中に光触媒を配置し、プラズマから発生する紫外光を利用する方法によってVOC分解が加速することが報告されている[11,12]。こ図6 プラズマ作動時間に伴うNOxガス濃度の変化

れらはプラズマによるオゾン等酸化活性種の生成と

図5より、プラズマ作動時ではオゾン濃度は時間とその活性種によるVOC酸化分解[13]およびプラズマに共に増加していき、数十ppmにまで達しているのに対よって発生した紫外光照射下での光触媒による酸化し、光触媒にUVを照射した場合まったくオゾンは発生

49

NO2 +・O2－→ NO3- + O

しないことが分かる。これらの結果に対し、同時作動
時には、オゾン濃度は大幅に低く抑えられていること

このように、プラズマによって生成した活性種に加え、が分かる。また、図6からもわかるように、NOxの発生

比較的寿命の長いオゾンおよびNOx系の活性種から、においても、プラズマ作動時では時間と共に濃度は増活性が高く寿命が短い・OOH、・Oが光触媒表面で生成加していき、同時作動時には、NOx濃度は大幅に低くされ、これらの活性種によってアセトアルデヒドガス

抑えられている。Maciucaらの研究では[12]では、プの分解が加速されていると考えられる。

ラズマに光触媒を組み合わせると、オゾン濃度は減少
しているもの、プラズマ作動だけの条件に比べ半分程

5.結論度である。一方、本研究では、プラズマ発生部と光触本研究では、VOC 浄化を行うため、ナノカーボンお媒を分離したことにより、プラズマによって発生した

よび光触媒を組み合わせたハイブリッド材料を作製

活性種であるオゾンおよびNOxの分解が光触媒表面にし、VOC 除去能力を調べた。さらに、光触媒に大気圧おいて促進したと推察される。その活性種の反応につプラズマを組み合わせ、ダイナミックな VOC 浄化能力

いて、まずプラズマにより、以下の反応が生じ、様々を調べた。ナノカーボン材料・光触媒ハイブリッド材

な活性種が生成する[13,14]。

料では、
VOC ガスの極性により浄化特性に差異が生じ、O2 + e- → 2O + e-

アセトアルデヒドガスに対してはナノカーボンの種

O2 + O + M → O3 + M (M：雰囲気ガス)類によらず浄化できるのに対し、トルエンガスに対し

N2 + e- → 2N + e-ては活性炭・光触媒ハイブリッド材料では優れた浄化

N + O2 → NO + O

能を有しているのに対し、カーボンナノチューブ・光

NO＋O＋M→ NO2＋M

触媒ハイブリッド材料では浄化能は劣っていること

NO＋O3 → NO2＋O2が分かった。また、大気圧プラズマに光触媒を組み合プラズマのみ作動の時、上記の反応が進み、その中でわせ、ファンによってプラズマによって生成した活性

比較的寿命の長いオゾンおよびNOx(NO, NO2)の濃度が種が光触媒に届く構成にした浄化システムでは、プラ増加していくと考えられる。プラズマ作動に加え、UV

ズマおよび光触媒によるアセトアルデヒドの分解が光を光触媒に照射し光触媒機能も同時に働かせたと相乗的に促進されることが分かった。その相乗的 VOC

きは、さらに以下のような反応が光触媒表面で生じて除去効果の機構として、光触媒上でのオゾン及び NOx

いると考えられる。

ガスのより活性が高い活性種への変換であると考察

光触媒反応として[4]、された。

(TiO2) + hν → h+ + e-

参考文献

e－ + O2 → ・O2－

[1] X. Zhang, B. Gao, A. E. Creamer, C. Cao, and Y. Li,
Journal of Hazardous Materials, 338, 102-123(2017).
[2] X. S. Zhao, Q. Ma, and G. Q. Lu, Energy & Fuels, 12,1051-1054(1998).
[3] K. Hashimoto, H. Irie, and A. Fujishima, Jpn. J. Appl.
Phys. 44, 8269-8285(2018).
[4] Y. Nosaka and A. Nosaka, “Introduction to
Photocatalysis”, Royal Soc. Chem. (2016).
[5] B.M. Penetrante and S.E. Schultheis, Non-thermal
plasma Techniques for Pollution Control, NATO ASI

h+ + H2O → ・OH + H+
オゾンおよび光触媒活性種との反応として[15,16]、・O2－ + O3 → O2 + ・O3－
・O3－ + H2O → ・OH + OH－ + O2
O3 + ・OH → O2 + ・OOH
NOxおよび光触媒活性種との反応として[17]、NO + ・O2－ → NO2- + O

50Series 34, Springer-Verlag (1993).
[6] 水野彰, J. Plasma Fusion Res. 89, 145-151 (2013).
[7] X. Zhao, M. Wang, M. Ohkohchi, and Y. Ando, Jpn. J.
Appl. Phys. 35, 4451-4456 (1996).
[8] J. Zhu, M. Yudasaka, M. Zhang, and S. Iijima, J. Phys.
Chem. B 20, 108, 11317-11320 (2004).
[9] R. Leary and A. Westwood, Carbon, 49, 741-772(2011).
[10] X. Zhao, Y.Liu, S. Inoue, T. Suzuki, R.O. Jones, and Y.
Ando, Phys. Rev. Lett. 92, 125502 (2004).
[11] K. Sekiguchi, A. Sanada, and K. Sakamoto, Catalysis
Communication, 4, 247-252 (2003).
[12] A. Maciuca, C.B. Dupeyrat, and T.M. Tatibouet,
Applied Catalysis B: Environmental, 125, 432-438(2012).
[13] 小野亮、J. Plasma Fusion Res. 87, 302-312 (2011).
[14] Ø. Skreiberg, P. Kilpinen, and P. Glarborg, Combust.
Flame, 136, 501-518 (2004).
[15] K. P. Yu, and G. W. Lee, Appl. Catal. B:
Environmental, 75, 29-38 (2007).
[16] T. Batakliev, V. Georgiev, M. Anachkov, S. Rakovsky,
G. E. Zaikov, Interdiscip Toxicol. 7, 47–59 (1998).
[17] J. Lasek, Y. H. Yu, and J. C.S. Wu, J. Photochem.
Photobiol. C, 14, 29-52 (2013).

51

1-3-3 ナノカーボン材料の安全性評価技術の開発－ナノカーボン材料を薬物輸送体としての生体利用に資する安全性研究－灘井雅行 1） 朝居 祐貴 1) 加藤 美紀 1）
1）名城大学 薬学研究科

1. 緒

言

の体外への排泄を促進する。また、これらの薬物代謝

カーボンナノチューブ (CNT) はダイヤモンドやフ酵素は外来異物などにより機能（酵素活性）が阻害さラーレンなどと同様に炭素同素体のひとつであり、れることや、発現が誘導されることが知られている。

1991 年に飯島によって発見された新規のナノカーボ

薬物代謝酵素の誘導は、転写が亢進することで mRNAンである[1]。CNT は、生体透過性に優れた近赤外線を発現量が増え、タンパク質量が増加し、薬物代謝酵素

吸収することで、発熱し、アポトーシスを誘導するた活性が上昇すると考えられている。一方、併用薬物にめ、この性質を利用して抗腫瘍効果が期待されている

よる薬物代謝酵素活性の阻害は、臨床において散見さ[2]。また、CNT は広い表面積を有し、薬物や抗体等をれる。薬物代謝酵素の阻害や誘導は、投与した薬物の結合させることが可能であるため、標的部位への薬物

血中濃度を変動させ、さらには治療効果の変化や、副輸送担体としても有用とされている[3]。

作用発現を惹起する可能性がある。加えて、薬物代謝

これまでに、生体内に投与された単層カーボンナノ酵素だけでなく、生体内での薬物の輸送に関わる薬物

チュ―ブ (SWCNT)はエンドサイトーシスなどで細胞

トランスポーターの発現量の増加や減少も、生体内で内に取り込まれ、肺、肝臓、脾臓に分布することが明の薬物のクリアランスを変化させ、薬効及び副作用発らかになっている[4,5]。しかし、SWCNT は化学的に安現に影響を及ぼす可能性がある。

定で難分解性であるために、環境および人体への蓄積

一方、ナノカーボンを薬物輸送担体として用いるたが懸念されている。従って、SWCNT を生体内投与した

めには、薬物の吸着および放出をコントロールするこ場合の安全性や生体機能に及ぼす影響を明らかにすとが重要である。これまでにシプロフロキサシンなどる必要がある。

の芳香環を有する薬物は、疎水性相互作用や共有結合

体内に投与された薬物は、主に肝臓で薬物代謝酵素

中のπ電子と CNT のπ電子との間に生じるπ-πスタ

により化学構造が変換される。この過程を代謝と呼ぶ

ッキングにより CNT に吸着すること、また、CNT の種が、代謝は主にシトクロム P450（CYP）が担う第Ⅰ相

類、溶液の pH などの条件を変化させた場合、シプロ

薬物代謝反応と、ウリジン二リン酸-グルクロン酸転

フロキサシンの吸着量が異なることが報告されてい移酵素（UGT）、硫酸転移酵素などが担う第Ⅱ相薬物代る[6,7]。

謝反応があり、これらの薬物代謝酵素は薬物などの生そこで本検討では、ナノカーボンを薬物輸送担体と体外異物の代謝を担うだけでなく、ステロイドホルモ

して臨床応用するために、ナノカーボンが生体機能にンや胆汁酸などの生体内物質の代謝にも関与する。

及ぼす影響について、以下の 4 点を明らかにすること

CYP や UGT は、薬物に極性基を導入することで、薬物を目的に検討した。

52

超 音 波 ホ モ ジ ナ イ ザ ー （ VC-505, Sonics and1．薬物代謝代謝酵素の発現に及ぼす影響
2．薬物代謝酵素活性に及ぼす影響

Materials, Newtown, CT, USA）を使用して SWCNT を

3．薬物トランスポーターの発現に及ぼす影響

1% カルボキシメチルセルロース（CMC）あるいは細胞

4．薬物とナノカーボンの吸着挙動

培養液に分散したが、最大分散濃度は 1.0 mg/mL であった。従って、全てのナノカーボンは、1.0 mg/mL 溶

なお、ナノカーボンとしてカーボンブラック、サッ
カーボール状分子であるフラーレン-C60 およびラグビ

液を調製して、実験に供した。

ーボール状分子であるフラーレン-C70、多層カーボン
2.2

ナノチューブ（MWCNT）も併せて検討した。

SWCNTによる薬物代謝酵素の発現変動

本検討は、名城大学動物実験委員会の承認のもと、実施した。ラット肝細胞は常法に従い作製した。ヒト肝
CNT

ｶｰﾎﾞﾝﾌﾞﾗｯｸ

ﾌﾗｰﾚﾝ-C

60

ﾌﾗｰﾚﾝ-C

細胞（

Inducible-Qualified

Human

Cryohepatocytes, Lot No. 303, Donor No. HFC 476,70

図 1．ナノカーボンの構造

白 人 , 52 歳 , 女 性 , 非 喫 煙 ） は BD Biosciences(Franklin lakes, NJ, USA)から購入した。12ウェル

表 1．ナノカーボンの物理化学的特性
ﾅﾉｶｰﾎﾞﾝ
FH-P-SWCNT

直径(nm)0.881.42

長さ
(µm)

純度
(%)

5-10

>90.0

プレートに播種した肝細胞に100 µg/mL SO-SWCNT分
金属触媒残量(atom.%)
2.32±1.13（鉄）1.03±0.22（ﾆｯｹﾙ）
0.26±0.06（ｲｯﾄﾘｳﾑ）

散液を24時間曝露した。その後、肝細胞からRNeasy
Mini Kit（QIAGEN, Valencia, CA, USA)のプロトコー
ルに従ってtotal RNAを抽出し、RT² First Strand Kit（QIAGEN）を用いてcDNAを合成した。96 well RT2

1.271.42

1-5

EC1.5-PSWCNT

1.002.00

5-10

>99.9

NA

Metabolism : Phase Ⅰ EnzymesもしくはPhase Ⅱ

MWCNT

6-13

2.5-20>98<20,000 ppm

Enzymes, QIAGEN) を用い、リアルタイムPCRを行った。

ｶｰﾎﾞﾝﾌﾞﾗｯｸ

>50

―

>99.0

NA

内在性コントロールには5つのハウスキーピング遺伝

ﾌﾗｰﾚﾝ-C60

0.71

―

>99.9

NA

子から、Ct値の変動の小さい遺伝子を自動選択した。

ﾌﾗｰﾚﾝ-C70

0.80

―

>99.0

NA

SO-SWCNT>90.0

ProfilerNA, not available. *製品データシートより

PCR

array

System(HumanDrug

2.3 ナノカーボンによる CYP 酵素活性の変動
酵素源として用いた50人のドナーからプールされ2. 実験方法たヒト肝ミクロソームは、コーニング（Corning, NY,

2.1 ナノカーボンの分散方法

USA）から購入した。酵素反応は以下のように行った。

FH-P-SWCNT および SO-SWCNT は、名城ナノカーボン

最終濃度が、100 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.4)、（Aichi, Japan）から購入した。これらの SWCNT は鉄

0.1 mg/mL ヒ ト 肝 ミ クロ ソー ム タ ンパ ク 質、 0.1（FH-P-SWCNT）またはニッケルとイットリウム（SO-mg/mL ナノカーボン、NADPH生成系 (最終濃度：2.8 mM

SWCNT）を触媒としてアーク放電方法よって合成されβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ている。カーボンブラック、フラーレン-C60 およびフ

10 mM 塩化マグネシウム、50 mM グルコース-6-リン

ラーレン-C70、MWCNT は、シグマアルドリッチ（St.

酸、10 U グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ) にLouis, MPO, USA）から購入した。

なるよう反応溶液を調製した。基質を添加し、37℃で53インキュベートした後、氷冷したアセトニトリルを加50 mM トリス塩酸緩衝液 (pH7.4)、5 mM 塩化マグネ

えることで反応を終結した。その後、4℃、21,000 g

シウム、25 µg/mL アラメチシン、0.01-0.1 mg/mL ヒ

で10分間遠心分離し、上清をシリンジフィルターに通ト肝ミクロソームタンパク質、0.1 mg/mL ナノカーボ

した。得られた溶液中の代謝物を液体クロマトグラフ

ン、3 mM ウリジン-5’-ジホスホグルクロン酸になる

ィー-タンデム質量分析法 (LC-MS/MS)もしくは高速よう反応溶液を調製した。基質を添加し、37℃でイン液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて定量した。

キュベートした後、3分間煮沸あるいは60% 過塩素酸

LC-MS/MSは、LCとしてProminence (島津製作所,

を添加することで反応を終結した。その後、4℃、Kyoto, Japan) を 、 MS/MS と し て API4000 (SCIEX,

21,000 gで10分間遠心分離し、上清をシリンジフィル

Framingham, MA, USA) を使用した。なお、分析カラ

ターに通した。得られた溶液中の代謝物をLC-MS/MSを

ムはInertsil ODS-3 (3 μm, 2.1×100 mmあるいは用いて定量した。

2.1×50 mm, GL Sciences, Tokyo, Japan) を用いた。

コントロールには分散溶媒である1% CMCを用い、最試料のイオン化はエレクトロスプレーイオン化法で終濃度が0.1%になるように加えた。なお、0.1% CMCは行い、多重反応モニタリングで検出した。HPLCでは、

UGT酵素活性に影響を及ぼさないことを確認した。ま

分析カラムとしてCosmosil 5C18-MS-Ⅱ (5 μm, 4.6

た、反応液中の有機溶媒の濃度は1%以下になるように

×150 mm, ナカライテスク, Kyoto, Japan) を使用実験を行った。

した。
表 3．UGT 酵素反応における基質と代謝物

コントロールには分散溶媒である1% CMCを用い、最終濃度が0.1%になるように加えた。なお、0.1% CMCは基質

CYP酵素活性に影響を及ぼさないことを確認した。ま

β-ｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙ

た、反応液中の有機溶媒の濃度は0.1%以下になるよう

ｾﾛﾄﾆﾝ
ﾌﾟﾛﾎﾟﾌｫｰﾙに実験を行った。
なお、用いた基質と代謝物は以下の通りである。

2.5

表 2．CYP 酵素反応における基質と代謝物
基質
ﾌｪﾅｾﾁﾝｸﾏﾘﾝ
ﾌﾞﾌﾟﾛﾋﾟｵﾝ
ﾊﾟｸﾘﾀｷｾﾙ
ﾄﾙﾌﾞﾀﾐﾄﾞ
S-ﾒﾌｪﾆﾄｲﾝ
ﾃﾞｷｽﾄﾛﾒﾄﾙﾌｧﾝ
ﾐﾀﾞｿﾞﾗﾑ
ﾃｽﾄｽﾃﾛﾝ

最終濃度
（µM）
50
50
30
20
100
20
5
5
50

最終濃度
（µM）
5
100
5

代謝物
β-ｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙ 3-ｸﾞﾙｸﾛﾝ
酸抱合体
ｾﾛﾄﾆﾝｸﾞﾙｸﾛﾝ酸抱合体
ﾌﾟﾛﾎﾟﾌｫｰﾙｸﾞﾙｸﾛﾝ酸抱合体

SWCNTによる薬物トランスポーターの発現変動

ヒト大腸癌由来Caco-2細胞を10 mm ディッシュに代謝物

播種し、100 µg/mL SWCNT分散液（EC1.5-P-SWCNTまた
ｱｾﾄｱﾐﾉﾌｪﾝ
7-水酸化ｸﾏﾘﾝ
水酸化ﾌﾞﾌﾟﾛﾋﾟｵﾝ
6α-水酸化ﾊﾟｸﾘﾀｷｾﾙ
4-水酸化ﾄﾙﾌﾞﾀﾐﾄﾞ
4’-水酸化ﾒﾌｪﾆﾄｲﾝ
ﾃﾞｷｽﾄﾛﾙﾌｧﾝ
1’-水酸化ﾐﾀﾞｿﾞﾗﾑ
6β-水酸化ﾃｽﾄｽﾃﾛﾝ

はSO-SWCNT）を72時間曝露した。その後、2.2に準じて細胞からtotal RNAを抽出し、cDNAを合成した。96
well RT2 Profiler PCR array System (Human Drug
Transporter) を用い、リアルタイムPCRを行った。

2.6 ナノカーボンと薬物の吸着
抗菌薬をpH が異なる0.1 mg/mL ナノカーボン分散

2.4 ナノカーボンによる UGT 酵素活性の変動
液中に溶解し、室温で1時間振とうした後、遠心分離
酵素源として用いた50人のドナーからプールされし、上清中の薬物濃度をHPLCにて測定した。なお、コたヒト肝ミクロソームは、コーニングから購入した。
ントロールとして、CNTの分散に用いた0.01%CMC溶液
酵素反応は基本的には次のように行った。最終濃度が、54

を用いた。CNT 1 gに対する薬物の吸着量はCNT分散液

ヒト肝細胞では 1 遺伝子のみであった。

中およびCMC溶液中の薬物濃度から算出し、Langmuir

次に、SWCNT 曝露によるラット肝第Ⅱ相薬物代謝酵の吸着等温式を用いて解析することにより飽和吸着素の変動を、PCR アレイを用いて網羅的に解析した

量およびLangmuir係数を算出した。

(図 4)。

3. 実験結果
3.1 SWCNTによる薬物代謝酵素の発現変動
SWCNT 曝露によるラット肝第Ⅰ相薬物代謝酵素の変動を、PCR アレイを用いて網羅的に解析した (図 2)。
その結果、CYP やアルデヒド脱水素酵素などの発現が減少したことが明らかとなった。CYP には数多くの分子種が存在し、薬物の代謝に関わっているが、それらの多くは SWCNT 曝露により発現が減少することが示された。
また、
ヒト肝細胞を用いて検討を行った結果（図 3) 、ラット肝細胞と同様に CYP やフラビン含有モノオキ
シゲナーゼの発現低下が認めれた。加えて、アルコー

図 3．SWCNT によるヒト肝第Ⅰ相薬物代謝酵素の発現変

ル脱水素酵素の遺伝子発現も低下した。ヒト肝細胞で動は、CYP 分子種の中でも CYP1A1 や CYP1A2 の発現低下が顕著であった。

図 4．SWCNT によるラット肝第Ⅱ相薬物代謝酵素の発現
図 2．SWCNT によるラット肝第Ⅰ相薬物代謝酵素の発現

変動

変動
その結果、UGTや硫酸転移酵素の一部の発現が低下す
一方で、SWCNT の曝露により遺伝子発現の有意な増る傾向が認められたが、コントロールと比較して1/2加が認められたものは、ラット肝細胞では 3 遺伝子、以下に有意に減少したものは認められなかった。また、55

1遺伝子のみが2倍以上に有意に増加した。従って、第分子種により異なると考えられた。また、UGT1A6 によⅡ相薬物代謝酵素は第Ⅰ相薬物代謝酵素と比較し、り触媒されるセロトニングルクロン酸抱合活性は、

SWCNT曝露による影響が小さいことが示された。

EC1.5-P-SWCNT により減少した。カーボンブラックやフラーレン-C60 やフラーレン-C70 を用いて同様に検討

3.2 ナノカーボンによるCYP酵素活性の変動したところ、SWCNT とは異なる挙動を示したため、ナ

ナノカーボンによる各CYP分子種の残存酵素活性をノカーボンの種類により UGT 酵素活性に与える影響

図5に示した。CYP1A2の指標活性であるフェナセチン

が異なることが示された。

O-脱エチル化酵素活性、CYP2A6の指標活性であるクマリン7-水酸化酵素活性は、コントロールと比較してナノカーボンによる変動は認められなかった。CYP2B6の指標活性であるブプロピオン水酸化酵素活性、CYP2C8の指標活性であるパクリタキセル6α-水酸化酵素活性は、ナノカーボン存在下においても、80%以上の残存活性を維持した。CYP2C9の指標活性であるトルブタ
ミド4-水酸化酵素活性、CYP2C19の指標活性であるSメフェニトイン4’-水酸化酵素活性は、コントロールと比較してナノカーボンによる変動は認められなかった。CYP2D6の指標活性であるデキストロメトルファ
ンO-脱メチル化酵素活性は、SO-SWCNTにより残存活性が60%に減少した。CYP3A4およびCYP3A5の指標活性であるミダゾラム1’-水酸化酵素活性は、SO-SWCNTにより55%に有意に減少した。さらに、CYP3A4およびCYP3A5の他の指標活性として用いたテストステロン6β-水
酸化酵素活性は、SO-SWCNTにより残存活性が75%に減少した。
FH-P-SWCNT、カーボンブラック、フラーレン-C60およびフラーレン-C70は、本研究で検討した全ての酵素活性に対し、影響を及ぼさなかった。
図 5．ナノカーボンによる CYP 酵素活性の変動
CYP3A4/5 (M)はミダゾラム 1’-水酸化酵素活性、
CYP3A4/5 (T)はテストステロン 6 β-水酸化酵素活性の結果を示す。

3.3 ナノカーボンによるUGT酵素活性の変動
ヒト肝ミクロソームを酵素源とした場合、主としてUGT1A1 により触媒されるβ-エストラジオール 3-グ

3.4 SWCNTによる薬物トランスポーターの発現変動

ルクロン酸抱合活性は、FH-P-SWCNT と EC1.5-P-SWCNTにより減少したが、主として UGT1A9 により触媒されEC1.5-P-SWCNT、SO-SWCNTの曝露により、大きな発現るプロポフォールグルクロン酸抱合活性は増加した変動が認められた薬物トランスポーターはほとんどことから、
SWCNT が肝 UGT 酵素活性に及ぼす影響は UGTなかった。従って、SWCNTは薬物トランスポーターよ56

りも薬物代謝酵素に対して影響を与えることが示さ内に投与した際の、肝臓などの臓器における曝露濃度れた。

は不明であり、本研究に用いたナノカーボン濃度はド3.5 ナノカーボンと薬物の吸着

ラッグデリバリーシステムにおける薬物輸送担体と抗菌薬について、異なる pH 条件下での SWCNT ある

してに使用する想定濃度と比較すると非常に高濃度

いは MWCNT への吸着挙動について検討したところ、であることが予想される。今後は実際に生体に投与さ

SWCNT と MWCNT への吸着率に差異が認められる薬物がれうるナノカーボン濃度の決定を含め、使用される濃存在すること、また、吸着は pH の影響を受ける場合

度付近におけるヒト in vitro あるいは in vivo でのがあることが明らかとなった。

更なる検討が望まれる。
（これらの成果は現在投稿中もしくは投稿準備中の雑誌

4.結論

論文の内容の一部に対応する。）

SO-SWCNT は CYP1A2 をはじめとする第Ⅰ相薬物代謝
酵素の発現に影響を与えると考えられるため、SO-

参考文献

SWCNT を薬物輸送担体として臨床応用する際には、第[1] S. Iijima. Nature. 354, 56-58 (1991).
[2] N. W. Kam, M. O'Connell, J. A. Wisdom, H. Dai. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA.102, 11600-11605 (2005).
[3] Z. Liu, A. C. Fan, K. Rakhra, S. Sherlock, A. Goodwin,
X. Chen, Q. Yang, D. W. Felsher, H. Dai. Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 48, 7668-7672 (2009).
[4] J. V. Veetil, K. Ye. Biotechnol. Prog. 25, 709-721 (2009).
[5] S. Yang, W. Guo, Y. Lin, X. Deng, H. Wang, H. Sun, Y.
Liu, X. Wang, M. Chen, Y. Huang, Y. Sun. J. Phys.
Chem. 111, 17761-17764 (2007).
[6] M. C. Ncibi, M. Sillanpaa M, J. Hazard. Mater. 298, 102110 (2015).
[7] H. Li, D. Zhang, X. Han, B. Xing. Chemosphere. 95,
150-155 (2014).

Ⅰ相薬物代謝酵素の発現変動に注意する必要がある
ことが示唆された。一方で、SO-SWCNT は CYP2D6 やCYP3A4/5 酵素活性を弱いながらも阻害することが明らかになったため、影響を評価する際に、薬物代謝酵
素の発現量だけでなく、酵素活性についても注意する必要がある。しかし、酵素活性の阻害作用は FH-PSWCNT では認められなかったため、同じ SWCNT でも物
理化学的性質が異なると及ぼす影響は異なることが明らかになった。さらに、他のナノカーボンでは酵素活性の阻害作用は認められなかったため、ナノカーボ
ンにより生体に与える影響は異なることが示された。
一方で、SWCNT により第Ⅱ相薬物代謝酵素の発現は大きく変動しなかったが、酵素活性を阻害あるいは亢進したため、薬物代謝酵素の違いによっても影響が異なると明らかになった。また、SWCNT に関しては薬物代
謝酵素への影響があると考えられるが、薬物トランスポーターに対してそれほど大きな影響を及ぼさないと示唆された。また、薬物の CNT への吸着は、CNT の種類や溶液の pH の変化により変動するため、ナノカ
ーボンの種類の選択や生体内での pH が吸着量をコントロールする上で重要な要因であることが明らかとなった。
しかし、ナノカーボンを薬物輸送担体としてを生体

57

2. プラズマ技術を用いたグリーンテクノロジー
2-1 環境センシング及び殺菌浄化技術の開発

58

2-1-1 プラズマ技術を用いた環境センシング技術の開発
太田 貴之 伊藤 昌文
名城大学

1. 緒

理工学研究科言を解決するためには小型であり、現地で迅速な元素の物質はすべて元素からできているので、構成する元含有量がわかる装置が求められる。

素の種類と量を決定することはきわめて重要であり、非平衡大気圧プラズマは、大気圧下で生成可能であ

安心・安全な社会を実現するために、環境センシング

るため減圧機構が不要であり、比較的温度上昇が低い

技術の向上は近年ますます重要になっている。例えば、ため冷却機構も不要である。これらのことから装置の鉱山や工場からの排水、電子機器等の廃棄物に含まれ小型化が期待できる。また、高い電子密度を得られ、る金属が土壌や河川、地下水に溶出することにより環

試料の原子化及び発光効率が向上するため、試料の前境が汚染される可能性がある。また、金属元素は人体処理を簡略できる可能性がある。これらの利点から現に対してアレルギー性・催奇性・発癌性を示すものが場での簡易分析が可能になると考えられる。

多く、土壌に溶出した金属元素を吸収した農作物の摂本研究の目的は、非平衡大気圧プラズマを用いた元

取や金属元素を含んだ飲料水の摂取により人体にも素装置の開発を目指し、銅(Cu)の標準溶液を用いた検悪影響を及ぼす危険性がある。このような現状から汚出感度の検討と、様々な分野に応用することを念頭に染源の早期発見と汚染物質の特定が必要不可欠であ

種々の試料の分析を試みた。

る。また食品・農業分野では、農作物の高付加価値化

2. 実験方法

や輸入農産物の差別化などが注目されており、高品質で栄養価の高い農作物の需要が高まっている。高品質

図1及び2に非平衡大気圧プラズマを用いた元素分で高栄養価、かつ大量生産を行うために欠かせないの

析装置の概略図と写真を示す。本装置はプラズマ源とが肥料の存在である。肥料は作物が生育していく上で試料を保持する電極から成り、プラズマ源は電極とガ

必要な元素（ミネラル）を補うことができ、作物の生ス導入管で構成されている。ガス導入管からArガスを育には必要不可欠なものである。しかし、この肥料の流し、プラズマ源と下電極間に9kVの交流電圧を印加

散布量を見極めるのが難しく、過剰もしくは不足な量

すると空気の絶縁破壊が起こり放電する。このとき、であると成長段階で葉や茎が変色・変形などといった試料はプラズマにより原子化される。同時に、その一障害が生じ、正常に育たない恐れがある。この問題を部がプラズマのエネルギーにより励起状態になった解決するために、肥料中の成分分析を迅速に行い定量

後、基底状態に戻るときに発光する。発光波長は試料することが必要となる。

に含まれる元素に固有であるため、この発光スペクト

現在の元素の分析法として原子吸光分析法や ICP

ルを測定することで含有元素の同定と定量が実現さ

発光分光分析法などが挙げられる。これらの装置は大れる。試料元素の発光をレンズで集光し、光ファイバ型で測定試料の前処理が必要などの欠点があり、これから分光器に導入した。

も現地で迅速な測定には向いていない。これらの欠点

59

リングが重要となる。

3. 実験結果

図 8 に植物工場を想定した大気圧プラズマを用いた過剰摂取すると嘔吐や下痢を引き起こす危険性の元素分析装置の写真を示す。試料供給ポンプにより液ある Cu の標準試料溶液をサンプルとして、検出感度

体肥料を流路に供給し、流れている液体肥料に対しての検討を行った。図 3 に、濃度 0.1[ppm]に調整した

大気圧プラズマ照射を行い、元素分析を行った。測定

Cu の標準試料溶液の発光スペクトルを示す。波長

試料として株式会社ハイポネックスジャパンの「ハイ324.8 [nm]と 327.5[nm]に Cu の発光スペクトルが得ら

ポネックス原液」を用いた。ハイポネックス原液は、れ、濃度 0.1[ppm]の分析が可能であることが確認され薄めて使うタイプの液体肥料であり、濃度調整が可能た。図 4 に波長 324.7[nm]の Cu 発光強度の Cu 標準試である。主な成分は、窒素 6%、リン酸 10%、カリウ料溶液の濃度依存性を示す。Cu 濃度にともなって Cu

ム 5%である。本実験では、肥料の三大要素の１つで発光強度が増加することがわかる。発光強度は原子数あり、根や茎を強くし耐病性を高める、開花や結実を密度と比例関係があるため、濃度が大きくなるとプラ促進させるカリウム(K)と、作物中の酵素活性化や光ズマ中の Cu 原子の数が増えたためであると考えられ合成の効率化など作物の生育を助ける働きをするナ

る。Cu 発光強度と濃度の関係から検量線を作成し、トリウム(Na)に注目した。

傾き 6.08[a.u. /ppm]と標準偏差 11.82[a.u.]から統計的

図 9 と 10 のように、液体肥料に含有される Na と Kな相関係数は 0.975、検出限界は 5.8 [ppm]となった。

の発光スペクトルが、それぞれ 588.9 [nm]と 766.7[nm]検出限界は傾きを大きくすること，データのばらつきの発光波長において得られた。また、標準試料溶液をを示す標準偏差を小さくすることで改善できる。

用いて評価した Na と K の相関係数はそれぞれ 0.991

様々な分野に応用することを念頭に種々の試料の及び 0.985 と 1 に近い値となり、検量線の直線性や濃分析を試みた。農作物の高付加価値化や不足しがちな度と発光強度の相関性が強いことを確認することが栄養素を補いたいというニーズから、スーパーマーケ

できた。検出限界は、それぞれ 6.4[ppm]及び 5.4[ppm]ットなどの現場で迅速に元素分析を行い、ミネラル成となり、植物工場を想定した液体肥料の環境モニタリ

分のパッケージ表示を行いたいというニーズがある

ングに十分であることが明らかになった。

ため、高い栄養分を含有するトマトを試料として検討した。図 5 から 7 のように、トマトに含有される Mg、

4. 結論

Ca、K の発光スペクトルが、それぞれ 284.4[nm]、

本研究では、環境・食品・農業等の分野で要求され422.6[nm]、766.7[nm]の発光波長において得られた。
ている作業現場で簡易・迅速に元素が可能な装置の開

原子吸光装置で定量を行ったところ、それぞれの含有発を目指した。装置の小型化や試料の原子化及び発光量は 110[ppm]、60[ppm]、2280[ppm]であり、本装置に効率の向上が期待できる非平衡大気圧プラズマに着より実トマトサンプルを対象とする分析が可能であ目した。

ることを示した。

銅 (Cu)の標準 溶液を 用い て評 価し た結果 、濃度

近年、気温や湿度など作物が成長していく環境を人

0.1[ppm]に検出が可能であった。検出限界は、どの元工的に整え、季節や天候に左右されない生産法として素でも概ね数[ppm]オーダーが実現できることが明ら

植物工場が注目されている。植物工場において、安定かになった。

した供給、収量改善、高品質な作物作りを達成するた

本装置の応用を想定して、トマトや液体肥料の直接めには、植物工場で用いられる液体肥料成分のモニタ分析を行い、応用可能であることを示した。各応用や60

試料に適切な試料保持方法やプラズマの照射条件などを確立することで、測定精度や検出感度を向上させ

発光強度count]

ることができる。

Arガス

400
200

プラズマ源
レンズ

電源：9[kV]

Cu

600

0
310

320
330
波長[nm]

光ファイバ
分光器

試料

340

図 3 濃度 0.1[ppm]の Cu 標準試料溶液の下電極

発光スペクトルPC
図 1 非平衡大気圧プラズマを用いた発光強度[count]

元素分析装置の概略図

Arガス

450
300
150

ファイバ
0

電源へ

プラズマ

0

10

図4

レンズ

20 30 40濃度[ppm]5060

波長 324.7nm の発光強度のCu 標準試料溶液の濃度依存性

電源へ
3000

図 2 非平衡大気圧プラズマを用いた元素分析装置の写

試料あり
試料なし

発光強度[a.u.]

真

2000

マグネシウム284.37[nm]

1000

0
280

282

284
286
波長[nm]

288

図 5 トマトの発光スペクトル(Mg)

61

290

1200
試料あり
試料なし

800
600

発光強度[a.u.]

発光強度[a.u.]

1000

カルシウム
422.57[nm]

400
200
0
420

422

424
426
波長[nm]

428

発光強度[a.u.]

カリウム
766.67[nm]Na(588.91[nm])

600
300
0
400

430

図 6 トマトの発光スペクトル(Ca)

15000

900

450

500
波長[nm]

550

図 9 液体肥料の発光スペクトル(Na)

試料あり
試料なし

10000
アルゴン
763.51[nm]
5000
0
760

762

764
766
波長[nm]

768

770

図 7 トマトの発光スペクトル(K)
図 10 液体肥料の発光スペクトル(K)
集光レンズ

試料供給
ポンプ

大気圧
プラズマ

液体肥料
の流路

図 8 植物工場を想定した元素分析装置の写真

6260

2-1-2 ナノカーボン材料を用いた環境センシング技術の開発
太田 貴之 伊藤 寛納 平松 美根男
名城大学

1. 緒

理工学研究科言

究では、表面支援材料として白金ナノ粒子[1]や白金ナ

近年、医療や農業の分野で非平衡大気圧プラズマをノフラワー[2]等の無機ナノ材料が主に用いられてい用いた応用研究（プラズマによる止血や植物の成長促る。また、LDI-MS へカーボン材料を適用した研究で進等）が盛んに行われている。そこで、生体分子（アは、カーボンナノチューブ[3]等が用いられている。こミノ酸やタンパク質等）の反応を解明することが重要

れらの材料を用いた場合には、表面支援材料のフラグになっている。生体分子の分析手法である質量分析法

メントが現れること、試料の信号に金属イオンが付加（MS）は、生体組織中の複数の生体分子を一度に同（[M+Na]+、[M+K]+）されて検出されることなどの問定でき、プロテオーム解析（タンパク質の機能や構造

題点があり、プロトン付加イオン（[M+H]+）としてを解析する研究）に必須のツールである。質量分析法の検出や支援材料のフラグメントを抑制する必要がでは測定対象分子を脱離/イオン化する必要があるが、ある。

生体試料に対してはイオン化過程におけるダメージ

そこで、SALDI-MS の新規表面支援材料としてカーを抑える必要があるため、ソフトイオン化という手法

ボンナノ材料であるカーボンナノウォール（CNWs）

が用いられる。代表的なソフトイオン化法には、マトを検討した。CNWs は、数層のグラフェンが基板に対リックス支援（MA）レーザー脱離/イオン化（LDI）

して垂直に立つ構造を持ち、照射レーザーの電場の局質量分析法が挙げられる。Fig. 1(a)に MALDI-MS の概在化により試料のイオン化を促進することが期待で略図を示す。MALDI-MS は試料を有機溶媒（マトリきる。また、NWs は 266[nm]近傍に極大吸収波長を持ックス）に混合することで、LDI を促進することがで

ち、レーザーエネルギーを吸収した CNWs から放出きる。タンパク質等の高分子（m/z<10,000）領域までされる電子により試料のイオン化を促進することが測定できるが、有機マトリックス自身による信号が低期待できる

質量領域で観測され（m/z<700）、これらの信号がアミ本研究では、CNWs 基板を表面支援材料として用いノ酸（m/z<250）などの信号と重なり解析が困難になた SALDI-MS の開発を目指した。また、CNWs の親水るという問題があった。

化処理による検出感度向上を試みた。

そこで、本研究では表面支援（SA）レーザー脱離/

2. 実験方法イ オ ン 化 質 量 分 析 法 に 着 目 し た 。 Fig. 1(b) に
SALDI-MS の概略図を示す。SALDI-MS は、表面支援

Fig. 2にSALDI-TOF-MSシステムの概略図を示す。

材料を用いることによって試料の LDI を促進させる

LDI用パルスレーザーとしてNd: YAGレーザー（波ソフトイオン化手法であり、適用する表面支援材料の長：266nm、周波数：30Hz、パルス幅：2ms）を用い

種類や構造によってマススペクトルや測定感度に影た。レーザーエネルギーはNeutral Density（ND）フィ

響を与える。これまでに報告された SALDI-MS の研ルタを用いて調整した。チャンバー内に試料基板を設

63

置し、レーザー照射により基板上の試料を脱離/イオ

Fig. 8 に親水処理した CNWs 基板を用いた試料作製ン化させた。イオン引込み部により印加された負電圧の手順を示す。CNWs の親水処理は大気圧プラズマにによりイオンは飛行時間（TOF）チャンバーに引込まより行った。照射条件は、印加電圧：6kV、Ar ガス：

れる。マイクロチャンネルプレート（MCP）でイオン

1.5sccm、照射時間：30ms、照射距離：5mm とした。

を検出し、その信号をオシロスコープで観測した。

基板上にアルギニン水溶液を塗布し、SALDI-MS 測定

TOFチャンバーにリフレクトロンを設置することにを行った。
Fig. 9 に親水処理した CNWs 基板を用いたアルギニ

より飛行時間の高分解能測定を可能にした。
Fig. 3にシリコン基板上に成膜したCNWsのSEM像

ンのマススペクトルを示す。縦軸は Si（=28m/z）の信を示す。CNWsは誘導結合型プラズマを用いたplasma号強度で規格化した。Table 1 に信号強度と S/N 比に

enhanced chemical vapor deposition（PECVD）法によりついてまとめた。レーザーエネルギー0.60mJ において合成した。実験条件はRF電力：550W、Ar/CH4ガス：

親水処理の有無を比較すると、親水処理によって信号20/50sccm、圧力：23mTorr、成膜温度：720℃、成長強度が約 5 倍程度増大した。親水処理有りにおいてレ

時間1時間[4]であり、高さは約1.5μmであった。

ーザーエネルギーを変化させると、0.13mJ（S/N 比Fig. 4に試料作製の手順を示す。アミノ酸を超純10.1）で信号強度が最も高くなったがノイズも大きく

水に溶解し、溶液の濃度を50mMに調整し、SiとCNWsなった。0.23mJ では高い S/N 比 17.8 が得られたこと

基板上に塗布し大気圧下で乾燥させて使用した。試料から、分析に適切なレーザーエネルギーを調整する必にはアミノ酸のアルギニン、チロシン、グリシンを用

要があることが分かった。また、親水処理ありの基板いた。

を用いた場合、158m/z の位置にアルギニンのフラグ
メントも観測され、測定感度が向上されることを示し

3. 実験結果た。親水処理の効果として OH 基の表面修飾が考えら

Fig. 5 にアルギニン（Arg）のマススペクトルを示す。

れる。Fig. 10 にプロトン付加イオン生成の概略図を示

CNWs 基板を用いた場合、約 175m/z の位置に[アルギす。試料を基板に滴下すると、試料は CNWs 基板表

ニン+H]+として検出できた[5]。112 及び 115m/z の位

面の OH 基と結合する。LDI によってこの OH 基から置に検出された信号は、アルギニンを塗布しない場合

H+が供給されてプロトン付加イオンは生成される。

には検出されていないことからアルギニンのフラグ

プラズマ照射により親水処理を行うことで、CNWs 基

メントであると考えられる[6]。アルギニンを塗布しな板表面に OH 基が多量に付着し、これにより、アルギ

い CNW 基板で、CNWs を構成するグラフェンの炭素

ニンのプロトン付加イオンの生成量が増大し[8]、測定（Cn）由来の信号が 12m/z 間隔で観測された。Si 基板

感度が向上したと考えられる。

を表面支援材料として用いた場合、アルギニンの信号は観測されなかった。以上の結果より、CNWs を表面4. 結論

支援材料に用いることによって質量分析測定ができ

本研究では、CNWs を表面支援材料に適用したることを示した。

SALDI-MS 装置により生体分子の測定と測定感度向チロシン（Tyr）及びグリシン（Gly）のマススペ上を行った。得られた知見は以下のようである。

クトルをそれぞれ Fig. 6、 7 に示す。182 m/z 及び(1) CNWs を表面支援材料に用いた SALDI-MS により76m/z の位置に、それぞれチロシンとグリシンのフラ

アミノ酸の質量分析測定が可能であることが示されグメントが観測された[7]。

た。

64

(2)本手法では、得られた信号は金属付加イオンではな

Oscilloscope
Sampleholder

くプロトン付加イオンとして検出された。

CNWs substrate
Sample(3) CNWs に親水処理を施すことでアルギニンの信号

Micro channel plate（MCP）
Reflectoron

Ion

強度が向上した。これは、アルギニンに付加するプロトンの量が増大したことが考えられる。

Ion extractor Time of Flight (TOF)
electrodechamber
Ionizationchamber

参考文献[1] T. Yonezawa et al., Anal. Sci., 25, 339-346 (2009).

Fig. 2

Nd：YAG laser

ND filter

Schematic diagram of SALDI-TOF-MS system.

1[µm][2] H. Kawasaki et al., J. Phys. Chem., 111, 16278-16283(2007).
[3] S. Xu et al., Anal. Chem., 75, 6191-6195 (2003).
[4] H.

Watanabe

et

al.,

J.

Appl.

Phys.,

51,
400[nm]200[nm]01AJ071-01AJ074(2012).

(a)(b)

Fig. 3[5] R. J. Beuhler et al., J. Am. Chem. Soc., 12, 3990-3999

SEM image of CNWs(a) top view

(1974).
[6] M. W. Forbes et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom.,(b) cross section a view.

18,

1959- 1966 (2007).
Amino acid, Peptide[7] J. Zhao et al., Int. J. Mass Spectrom. 255, 265-278(2006).
[8] T. Yao et al., Int. J. Mass Spectrom., 291, 145−151

sample area(2010).
Ultra pure water

air drying
Sisamplematrix(a)laser

Fig. 4

samplenano material(b)Schematic diagram of (a) MALDI (b) SALDI.

CNWs

Sample preparation.

112 [C5H9N3+H]+
115 [C5H11N2O+H]+

Intensity [arb.units]

laser

Fig. 1400[nm]Sample solution

175 [arginine +H]+

CNWs/Si substrate（arginine drop）
108（C9）120（C10）132（C11）
144（C12）156（C13）168（C14） 180（C15）

CNWs/Si substrate
Si substrate（arginine drop）

100

120
Fig. 5

65

140
160
m/z
Mass spectra of arginine.

180

20

without hydrophilic treatment (0.60 mJ)

with hydrophilic treatment (0.60 mJ)

Intensity [arb. units]106

175[arginine+H]+

158[C6H11N3O2+H]+
with hydrophilic treatment (0.23 mJ)

Fragment of tyrosine= Match with GGYR
119[C8H6O+H]+

with hydrophilic treatment (0.13 mJ)

136[C8H9NO+H]+
182[tyrosine+H]+

50

100
Fig. 6m/z

150

Fig. 920

Mass spectra of Arginine with or withouthydrophilic

Mass spectra of Tyrosine.

Intensity [arb.units]

Table 1 Normalized signal intensity of arginine andsignal-to-noise (S/N) ratios.
Laser energy (mJ)Hydrophilic treatment
Without
With
With
With

76 [Glycine +H]+

50

100
Fig. 7

m/z

150

0.60
0.60
0.23
0.13

S / N ratio

0.18
0.87
1.60
2.80

9.0
6.7
17.8
10.1

plasma treatment

20

Mass spectra of Glycine.

argininearginine arginine
argininearginineargininearginine arginine

OH OH

OH OH OH OHOHOH[arginine+H]+[arginine+H]+

O O

Fig. 10

Fig. 8

Normalized intensity of arginine

Sample preparation with hydrophilic treatment.

66[arginine+H]+ [arginine+H]+[arginine+H]+[arginine+H]+

OH O O O O OH

Production Mechanism of protonated ions.

2-1-3 プラズマ技術を用いた難分解物質浄化技術の開発
太田 貴之 大澤 郁実 木野 裕也
名城大学

1. 緒

理工学研究科言

処理装置の構築を行い、難分解性有機物のモデル物質

近年、湖沼を水道水源とする場所では湖沼に流れ込となる酢酸の分解率向上を目指した。

んだ工業廃水などに含まれる難分解性有機物の存在

2. 実験方法が懸念されている。現在、浄水処理場での汚染水に溶存する有機物の分解には、塩素やオゾンが用いられて図1に本研究で構築した液体滴下型誘電体バリア

いることがほとんどであるが、難分解性有機物は塩素放電装置の概略図及び実際の写真を示す。ポンプよりやオゾンの酸化力によって分解除去することは極め

流量約250[L/h]でくみ上げられた処理液体は、上部のて難しく、また発がん性を指摘されるトリハロメタン

リアクタに連結している漏斗へ流し込まれる。リアクなどの有害物質を生成してしまう可能性がある。そこ

タ内を通過した液体は下部に取り付けられた容器をで、難分解性有機物を分解することができる強い酸化

通り、再びポンプが備え付けられた容器へ戻る。リア

力を有す OH ラジカルや O ラジカルなどの活性酸素をクタ内に発生させた誘電体バリア放電部を、液体が滴用いた新しい水処理法が注目されている。活性酸素を下されるように流れ落ち、分解される仕組みになって用いた促進酸化法のうち、間接方式はオゾンや過酸化いる。図2のようにリアクタ部は、ガラス管にステン

水素、紫外線などを併用することで活性酸素を生成しレス管を挿入し、内部電極とした。この電極に直径て水処理を行う。一方、大気圧プラズマを水に直接照5[mm]の穴を開けることで、ガラス管内にガスを流し射することで活性酸素を生成する直接方式は、活性酸込む構造となっている。また、ガラス管の外側には外素を生成するための化学種を個々に生成する必要が部電極として銅網を巻き付けた。内部電極側を接地し、ないため、ランニングコストの面で長けた方式である。

外部電極側に周波数60[Hz]の交流高電圧を印可した。

低温で扱うことができる大気圧プラズマを用いた難図3に放電の様子を示す。

分解性有機物の分解に関するいくつかの研究が報告

3. 実験結果されている。水中に O₂や Ar などのガスを注入して生濃度 10[mg/L]の 100[mL]インジゴカルミン水溶液を成される気泡内でプラズマを発生させる水中気泡内分解処理した様子を図 4 に示す。空気ガス流量をプラズマや[1]、電界を集中させやすく低電圧でプラズ

2[L/min]、印可電圧を 18[kV]とした。写真からわかる

マを生成することが可能な針電極を使ったものであように、14 分間の処理によりインジゴカルミン水溶

り[2]、プラズマ生成範囲や酸化分解反応領域が狭く分液は無色透明に変化し、分解ができたことがわかる。

解効率が低いといった問題がある。

図 5 に示すプラズマ処理前後の可視吸光スペクト

本研究では、これらの問題を解決するために、広範

ルから脱色率を評価した。インジゴカルミンの最大吸囲にわたってプラズマを生成することができ、十分な

光波長である 610[nm]における吸光度を用いた。図 6

処理範囲を確保できる誘電体バリア放電を用いた水にプラズマ照射による脱色率の時間変化を示す。脱色67

4. 結論率は、脱色率＝(初期吸光度-処理後吸光度)/初期吸光度[%]として求めた。プラズマ処理時間を増加させる

大気圧プラズマ技術を用いて、湖沼に流れ込んだ工と脱色率は大きくなり、処理時間 14[min]でインジゴ

業廃水などに含まれる難分解性有機物浄化技術の開

カルミン水溶液の脱色率が 100[%]、すなわち完全に発を行った。具体的には、処理効率を向上させるため脱色された。プラズマ照射によって水中で生成されたに誘電体バリア放電を基にした様々な処理装置を開

活性種の酸化力により、インジゴカルミンの有機結合発した。モデル物質の一つであるインジゴカルミン水が分解され脱色したと考えられる。

溶液は、14 分間の処理で完全分解できることを示し

次に難分解性有機物の分解を試みた。難分解性有機た。また、通常のオゾンや塩素処理では分解できない物のモデル物質には濃度 50000[ppm]の酢酸を使用し結合力の高い C-C 結合をもつ難分解性有機物の難分た。

解性有機物のモデル物質として、酢酸の分解を試みた。

図 7 にプラズマ処理なしの酢酸水溶液の赤外(IR)吸収スペクトルを示す。循環回数ごとに IR スペク

その結果、プラズマによって OH ラジカルが生成できトルを測定した。図から酢酸(CH₃COOH)に起因するたことにより、C-C 結合を分解できることと、3 回のC-C (1014cm-1)、C-O (1277cm-1)、C=O (1709cm-1)が見

循環処理で酢酸を約 50%分解できることを示した。処られた。循環回数を増やすと IR スペクトル強度が減

理回数を更に増やすことで、分解率が向上できる。

少した。これは、酢酸を蒸発させるための加熱による気化や循環パイプなどに付着したために減少した

参考文献と考えられる。図 8 にプラズマ処理ありの酢酸水溶液[1] 佐藤圭輔、安岡康一、石井彰三、IEEJ Trans. FM、の赤外(IR)吸収スペクトルを示す。図 7 と比較すると、128(2008)401.
[2] 飯島崇文、東芝レビュー、61(2006)40.

IR スペクトル強度の減少量が大きく、この差分がプ
ラズマによって分解された量であることがわかる。図
9 に、C-C 、C-O、C=O 各結合のプラズマによる分解率の処理回数依存性を示す。これらの結果から、3 回循環させることで約 50%分解できることがわかった。

ガ
ス
流

水
流

処理回数を更に増やすことで、分解率が向上することが示唆された。また、酢酸が難分解性有機物である原因である結合力の高い C-C 結合も、通常のオゾンや塩

pump

素処理では分解できないが、プラズマ処理により分解(a) 概略図

できることを明らかにした。これは酸化力と持つ OH

gas（b）実際の写真

図 1 液体滴下型誘電体バリア放電装置の全体図

ラジカルがプラズマにより生成されたことが起因すると考えられる。表 1 に酢酸と OH ラジカルの反応式を示す。酢酸と OH ラジカルが反応すると水や二酸化炭素以外にもギ酸やショウ酸などの副生成物も発生するため、プラズマ処理によって 1050[cm-1]近くでピークが見られた。これらの結果より、プラズマと水が反応することで発生した OH ラジカルや酸素原子などの活性酸素が酢酸を分解したと考えられる。

68

ガス
溶液

100

溶液
シリコン栓

80
脱色率[%]

SUS管（内部電極）

銅網（外部電極）

604020(a) 概略図

00（b）実際の写真

2

12

14

1750

2000

10
8
6
4
処理時間[min]

図 2 液体滴下型誘電体バリア放電装置のリアクタ部
図 6 脱色率の処理時間依存性

吸光度

0.03

0.02

循環前
循環1回目
循環2回目
循環3回目

0.01

図 3 液体滴下型誘電体バリア放電の様子

0
750

1000

1250 1500
波数[cm-1]

図 7 酢酸の IR スペクトル（プラズマ処理なし）

0.03

6分

14 分

吸光度

0分

図 4 プラズマ処理後のインジゴカルミン水溶液の様子

0.02

循環前
循環1回目
循環2回目
循環3回目

0.01

1.2

0[min]
2[min]
4[min]
6[min]
8[min]
10[min]12[min]14[min]

吸光度[a.u.]

1
0.8
0.6

0
750

1000

1250 1500
波数[cm-1]

1750

2000

図 8 酢酸の IR スペクトル（プラズマ処理あり）

0.4
0.2
0
450

500

550
波長[nm]

600

650

図 5 インジゴカルミン水溶液の吸収スペクトルの時間変化

69

60

分解率[%]

50
40

C-C
C-O
C=O

30
20
10
0
1

2
処理回数[回]3

図 9 各結合の分解率の処理回数依存性

表 1 酢酸と OH ラジカルの化学反応⑴ CH3COOH ＋ ･OH→ ･CH2COOH ＋ H2O⑵ CH3COOH ＋ ･OH→ CH3COO･ ＋ H2O⑶ CH3COO･→ CO2 ＋ ･CH3
⑷ O2CH2COOH+ O2CH2COOH→ OHCCOOH ＋ OHCH2COOH⑸ H2O2 ＋ 2HOCH2COOH ＋ O2
→H2O2 ＋ 2OHCCOOH ＋ 2H2O
⑹ H2O2 ＋ HOCCOOH→ HCOOH ＋ CO2 ＋ H2O⑺ H2O2 ＋ 2HOCCOOH ＋ O2
→H2O2 ＋2HOOCCOOH

70

2-1-4-1 プラズマ技術を用いた高効率殺菌手法の開発（その１）— 酸素ラジカル活性水中の高効率殺菌メカニズムの解明—

伊藤 昌文 1）、岩田 直幸 1)、太田 貴之 1)、呉 凖席 1,2）、石川 健治 3)、堀 勝 3）
1）名城大学 理工学研究科、2）大阪市立大学 工学研究科 、3) 名古屋大学 低温プラズマ研究センター

1. 緒

言

源を用いて、ラジカル活性水を調整した。そして、ラプラズマ殺菌は数あるプラズマプロセスの中でもジカル活性水の殺菌効果を評価すると共に、同活性水

盛んに研究されている分野の一つである。プラズマ殺中に生成された活性酸素窒素種の濃度を深紫外吸収菌は、プラズマのエネルギーによって大気や導入ガス

分光法で調査することでその殺菌メカニズムを解明から生成された活性種(ラジカル)が直接 細菌やカビすることで高効率な殺菌手法の開発を目指した。

と反応して不活性化させる場合と、その活性種が液相

具体的には、ラジカル源を用いた液中細菌への殺菌に侵入して新たな化学種となり液中の菌を不活性化

効果の評価、ラジカル照射前後の pH 変動、ラジカル

する場合の 2 つに大別できる。特に液中殺菌はプラズ

活性水中に含まれる各種活性酸素窒素種の濃度調査、マによって生成されるヒドロキシルラジカル(OH•)や

高純度ガスの使用時やガス配管パージによる液中活

過酸化水素(H2O2)などの活性酸素種(ROS : Reactive

性種の濃度や殺菌効果の変動、ラジカル活性水を用い

Oxygen Species)と一酸化窒素(NO·)や亜硝酸イオン

た殺菌における三重項酸素原子(3Pj)の重要性の検討、(NO2-)、硝酸イオン(NO3-)などの活性窒素種(RNS :ESR 法によるラジカル活性水中のフリーラジカルの検Reactive Nitrogen Species)が有害菌に対して殺菌効出などを行い、メカニズムの検討を行った。

果示すことが報告されている。[1,2] これらの強力な化学活性種を生成できる水へのプラズマ活性化処理

2. 実験方法

は水耕栽培、植物工場、水質浄化設備等、医療器具洗2.1 非平衡大気圧ラジカル源

浄、歯科治療などへの応用が期待され、盛んに研究さ本研究では、生成したプラズマからその中に存在すれている。

る中性ラジカルだけをサンプルへ照射するために、非しかしながら、これまでの研究でプラズマ活性水

平衡大気圧ラジカル源(Tough Plasma FPA10, Fuji MFGによる殺菌メカニズムを調査した例は少なく、プラズ

Co., Ltd.)を用いた。[3-7] 本装置は図 1 に示すよ

マ活性水の安全な利用のため、その解明が急務となっ

うに 3 段構造になっており、第 1 段(Discharge part)ている。特に、気相におけるプラズマ中の各因子(中で不活性であるアルゴンとラジカル生成のための酸性ラジカル、陽イオン、電子など)の個々寄与を調査

素ガスを供給し、放電によりプラズマ化する。第 2 段

した例はなく、プラズマ中のどの因子がプラズマ活性(Intermediate part)では、接地電極によりプラズマ

水の殺菌効果生成に重要であるのかは報告されてい中の正イオンと電子を除去し、第 2 段と第 3 段(Nozzle

ない。

Part)の間で経路を曲げることで紫外線・可視光等をそこで、大気圧下においてプラズマから中性ラジカ除去する。以上の構造により、この装置はプラズマ中

ルのみを取り出し照射できる非平衡大気圧ラジカルから酸素ラジカルのみ取り出し、殺菌等における中性71

中性ラジカルの照射条件は、アルゴン (Ar)と酸素ラジカルの寄与を評価することを可能とする。
供給する酸素ガス流量比 O2/(Ar+O2)=0.6%のとき、照(O2) の 混 合 ガ ス の 総 流 量 を 5 slm と し 、 流 量 比射されるラジカルの密度は最大である 1013～1014cm-3

O2/(Ar+O2)を 0.6 %とした。ラジカル出射部からの照になることが先行研究より検証されている。[8-10]

射距離 10 mm の位置にサンプルを設置し、照射時間は
1、 3、 5、 7、 10 min とした。このとき、大気の影響を抑えるためにプラスチックカバーをつけ、Ar
でカバーの中を満たした状態でサンプルに酸素ラジカルを照射した。また、サンプル全体に酸素ラジカルが照射されるようにステージを用いて、スピードは 4mm/s、走査距離は 15 mm として走査した。
中性ラジカル照射後、照射サンプルを適当な倍率まで希釈(101～104 倍)し、希釈を行った大腸菌懸濁液
100 µl を NA 培地に塗布した。大腸菌を塗布した NA
培地を培養棚で 30 ◦C、24 時間培養してコロニーカウ

図 1 非平衡大気圧ラジカル源の構造

ント法により殺菌効果を評価した。
2.2 中性ラジカル照射による大腸菌の液中殺菌
殺菌実験を行う前準備として前培養を行い大腸菌

2.3 深紫外吸収分光法による液相中の活性種濃度ののサンプルを作成した。

測定

前培養の手順は、振とう培養チューブに液体培地

液中の大腸菌に対するラジカル照射による殺菌メ

NB（Nutrient Broth）3 ml を入れ、そこに冷凍保存

カニズムを解明するため、酸素ラジカル活性化によっしておいた大腸菌懸濁液を室温に戻したものから 10て液中に生成される各種活性酸素窒素種の濃度を深µl 入れた後、振とう培養機内で 30 ◦C・250 rpm の条

紫外吸収分光法とフィッティングプログラムによっ件で 17 時間、液体培養を行った。

て求めた。

また、大腸菌を培養するためにΦ90 mm のシャーレ

まず、Φ38 mmシャーレに超純水を3 ml入れ、照射に NA 培地（Nutrient Agar：NA）を作成した。前培養

サンプルとした。

で培養した大腸菌を 5000×g, 3 min の条件で遠心分離

酸素ラジカルの照射条件は、アルゴン (Ar)と酸素を行い、大腸菌（約 3×109 個/ml）を集菌した。集菌(O2) の 混 合 ガ ス の 総 流 量 を 5 slm と し 、 流 量 比

後、培養液を捨て、超純水 3 ml に大腸菌を懸濁し直O2/(Ar+O2)を0.6 %とした。ラジカル出射部からの照射

し、大腸菌懸濁液の原液を作成した。超純水は、

距離10 mmの位置にサンプルを設置し、照射時間は1、Millipore Direct-Q 3UV システムによって水道水を3、 5、 7、 10 minとした。

UV 滅菌・脱イオンすることで得られたもので、25 °C

酸素ラジカル照射後に、3 mlのサンプルを石英キで 18.2 MΩ·cm の抵抗率を示した。原液を超純水で 30

ュベット(S10-SQ-10, GL-Science)に入れ、ダブルビ倍希釈したもの(大腸菌約 1×108 個/ml)を大腸菌懸濁ーム式UV-Vis-NIR分光光度計(SolidSpec-3700DUV)を液とした。0.3 ml の大腸菌懸濁液と 2.7 ml の超純水用いて紫外吸収スペクトルを測定した。測定では、をΦ38 mm シャーレに入れたものを照射サンプル(大150-400 nmの波長範囲を、波長分解能：0.2 nm、スキ

腸菌約 1×107 個/ml)とし、酸素ラジカルを照射した。

ャン速度:120nm/min (中速) の条件で測定した。

72

本測定中、サンプル側のキュベットには測定対象

光度は酸素ラジカル照射時間の増加に伴って、増加しを入れ、参照側のキュベットには何もいれず、空気にていった。また、活性種濃度も、照射時間の増加に伴対するサンプルの紫外透過率を測定した。サンプルのって、H2O2とNO3-の濃度は増加していった。しかし、

紫外透過率T’と超純水の紫外透過率Tを次式のランベNO2-濃度は照射時間5minの点で最大値を迎え、その後、

ルトベールの法則で吸光度Aへ変換する。

照射時間の増加と伴って減少した。この現象は、酸素

A = -Log(T/T’)

ラジカルの照射によってラジカル活性水中に、NO2-と最後に、波長190~340nmの領域の紫外スペクトルか反応する物質濃度が増加し、NO2-がNO3-へと変性した

ら、フィッティングプログラムを用いてH2O2, NO2-,

ことに起因すると思われる。

NO3-のスペクトルへとdeconvolutionし、各活性酸素窒

この結果で興味深いことは、本研究ではArとO2ガス

素種の濃度を求めた。[11,12]のみをラジカル源に導入したにも関わらず、活性窒素
種(NO2-とNO3-)もラジカル活性水中から検出されたこ

3. 実験結果とである。

3.1 超純水中大腸菌への中性ラジカル照射による殺菌効果
図3に超純水中での中性ラジカル照射時間による大腸菌の生菌数を示す。酸素ラジカル照射時間と共に生菌数は減少し、照射時間7分で生菌数は検出限界まで殺菌された。よって、中性ラジカル照射により超純水中で大腸菌は殺菌されることが明らかになった。
3.2 深紫外吸収分光法による液相中の活性種濃度の測定結果
図4(a)に、中性ラジカル照射によって作成されたラジカル活性水の紫外吸光度と、(b)に、そのdeconvolution によって算出されたH2O2, NO2-, NO3-濃図 3 超純水中での中性ラジカル照射時間に対する生菌数度の照射時間依存性を示す。ラジカル活性水の紫外吸

50

0.6
0.4
0.2
0

200

240

280

–

[NO3 ][NO2–][H2O2]

40

300

30
200
20
100

10
0
0

320

400

2

4

6

8

0
10

Irradiation time (min.)Wavelength (nm)(b)
図 4 ラジカル処理水の(a)紫外吸光度と(b)その内部の活性酸素窒素種濃度の照射時間依存性

73[H2O2] (μM)

Irradiation time
10 min
7 min
5 min
3 min
1 min

[NO3–] [NO2–] (μM)

Absorbance (arb. units)

0.8

3.3 中性ラジカル活性化による超純水のpH変動の結射によってOH• とHOO• が超純水中に生成、あるいは、果輸送されることが示唆された。

3.2で報告したように、中性ラジカル照射によって作成されたラジカル活性水中からはNO2-とNO3-といった酸が検出された。ArとO2のみを導入したラジカル源から、これらの活性窒素種が検出されることは不可解であるため、実際に中性ラジカル照射によって、ラジカ
ル活性水のpHが変動するか調査した。
図5に、中性ラジカル照射によって作成されたラジカ
ル活性水のpH変動を示す。ラジカル活性水のpHは、中性ラジカル照射時間の増加に伴って、低下し、10 minのラジカル照射によってpH:3.58まで減少した。このことから、中性ラジカル照射によって、ラジカル活性
水中に酸が生成されていることが裏付けられた。
また、照射時間の増加に伴ってpHがより低下してい

図5 中性ラジカル照射時間に対するラジカル活性水のpH変動

ることから、図3に示した中性ラジカル照射による大腸菌殺菌にpHが関与していることが示唆された。
3.4 中性ラジカル殺菌への導る酸素ガス流量比依存性の結果
図6に、ラジカル源へ導入する酸素ガス流量比
O2/(Ar+O2)を変更した場合の、酸素ラジカル照射による大腸菌の生菌数変動を示す。O2/(Ar+O2) = 0 %では、大腸菌生菌数が最も多く、O2/(Ar+O2)が増加するほど、大腸菌生菌数は減少した。従って、O2/(Ar+O2)が増加するほど、酸素ラジカル照射による殺菌効果も強まったということになる。しかし、この結果は、O2/(Ar+O2)
が0.6の時にピークに達するO(3Pj)密度の振る舞い[6,7]と相関しないため、O(3Pj)が酸素ラジカル照射に

図6 O2/(Ar+O2)に対する酸素ラジカル照射時の大腸菌生菌数

よる大腸菌殺菌において、直接の殺菌因子ではないことを示している。

3.6 SODを用いた酸素ラジカル活性水の殺菌効果の変3.5 ESR法によるラジカル活性水中のフリーラジカル

動結果

の検出

図8に、HOO• を選択的に失活する酵素として知られる

図7に、CYPMPOを溶解した超純水への酸素ラジカル

スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)を溶解した超照射による、ESR解析の結果を示す。明らかに、CYPMPO

純水へ大腸菌を懸濁し、さらに酸素ラジカル照射を行のOH• AdductとHOO• Adductが検出されている。

ったときの、大腸菌生菌数を示す。照射時間が増加す[13,14] このことから、超純水への酸素ラジカル照るにつれ、SODを溶解した場合と、ControlであるBSA

74

を溶解した場合とで、大腸菌生菌数の差が大きくなる

Number of E. coli (CFU/mL)

ことが確認された。常にSOD添加の場合が、BSA添加の場合と比較して大腸菌生菌数が多いことから、SODによってHOO• が消去され、殺菌効果が低下したことが示唆された。これらの結果から、大腸菌を懸濁した超
純水への酸素ラジカル照射による殺菌では、HOO• が
殺菌因子の一つである可能性が高いことが示唆された。
3.7 SODを用いたHOO• Adductシグナルの消失
図9に、SODとCYPMPOを溶解した超純水へ酸素ラジカル照射を行ったときの、ESRシグナルを示す。SODの添加

108
107

BSA
SOD

106
105
104
103

2Log difference102
Detection limit

101
100

0

1

2

3

Irradiation time (min.)によって、図7で確認されたCYPMPOのOH• Adductと

図 8 SOD を溶解した超純水への酸素ラジカル照射による大腸菌生菌数の減少度合い

HOO• Adductのうち、HOO• Adductのシグナルのみがほぼ消失していることが分かる。一方、Controlである
BSAとCYPMPOを溶解した超純水への酸素ラジカル照射
では、OH• AdductとHOO• Adduct検出された。このことから、本実験での、超純水へのSOD添加によって、HOO• が選択的に失活されていることが検証された。
よって、酸素ラジカル照射による大腸菌殺菌に、HOO•が関与している可能性がより高くなった。

Intensity (arb. units)

HOO• adduct

80000
60000
40000
20000
0
-20000-40000-60000-80000OH• adduct図9 超純水へのSOD添加によるHOO• Adductの消失

4. 中性ラジカル照射による液中殺菌メカニ
ズムの検討
3 の実験結果で述べたように、液中大腸菌の中性ラ

3460 3480 3500 3520 3540 3560

ジカル殺菌では、HOO• が殺菌因子である可能性が非Magnetic field (G)

常に高い。そして、HOO• の生成には、ラジカル活性

図7 CYPMPOを用いた場合の、ラジカル活性水のESRシグナ

水から検出された H2O2、NO2-、NO3-などの、長寿命活性ル種が関与している可能性が高い。
まず、H2O2 の生成だが、配管の汚染によってラジカ

75

ル源へ供給された供給された水分子(H2O)が OH• へ解生成される短寿命活性種を特定し、その中でもヒドロ

離させ、その OH• が再結合し、生成された可能性がペルオキシルラジカル(HOO• )がラジカル処理水中の高い。

殺菌因子の 1 つであることを検証した。また、ラジカ

H2O + e-→ H+ + OH•
OH•

+ e-

ル活性水中に生成された各種長寿命活性種を深紫外吸収分光法で定性・定量的に解析することにより、プ+ OH• → H2O2

次に NO2-の生成は、ガス配管に混入した大気(N2)が、ラズマ源に接続された配管中の汚染物質が生成されラジカル源内のプラズマによって N• 原子へ解離されるプラズマとその処理対象に与える影響を調査した。

生成された可能性が高い。以下に、N2 が NO2-に変化す

最後に、それらの結果から中性ラジカルによる大腸菌るまでの経路を示す。

の不活性化メカニズムの考察を行った。その結果、酸N2 + e- → 2N•

素ラジカル処理でも、配管内またはボンベ内の汚染物

N•+ O2 → NO•

質としての N2 により O2NOOH が生成され、NO3- の生成

+ O•

2NO•

+ O2 → 2NO2•

NO•+ NO2•

により pH が低下することから HOO• が生成され、大+ H2O → 2H+ + 2NO2-

腸菌を殺菌している可能性があることが分かった。

なお、3 の実験結果で確認された NO3-は、下記の NO2-

参考文献の変性又は O• か O3 による酸化によって生成された可[1] S. Ikawa, K. Kitano, and S. Hmaguchi : Plasma
Processes Polym., 7 (2010) 33.
[2] S. Ikawa, A. Tani, Y. Nakashima, and K. Kitano : J.
Phys. D: Appl. Phys., 49 (2016) 425401.
[3] M. Iwasaki, H. Inui, Y. Matsudaira, H. Kano, N.
Yoshida, M. Ito, and M. Hori, Appl. Phys. Lett. 92,
081503 (2008).
[4] M. Iwasaki, Y. Matsudaira, K. Takeda, M. Ito, E.
Miyamoto, T. Yara, T. Uehara, M. Hori, J. Appl. Phys.
103, 023303 (2008).
[5] M. Iwasaki, H. Inui, H. Kano, M. Ito, Y. Suzuki, D.
Sutou, K. Nakada, and M. Hori, Jpn. J. Appl. Phys. 47,
3625 (2008).
[6] H. Hashizume, T. Ohta, J. Fengdong, K. Takeda, K.
Ishikawa, M. Hori, M. Ito, Appl. Phys. Lett. 103,
153708 (2013).
[7] H. Hashizume, T. Ohta, T. Mori, S. Isei, M. Hori, M.
Ito, Jpn. J. Appl. Phys. 52, 056202 (2013).
[8] H. Hashizume, T. Ohta, K. Takeda, K. Ishikawa, M.
Hori, M. Ito, Jpn. J. Appl. Phys. 53, 010209 (2014).
[9] H. Hashizume, T. Ohta, M. Hori, M. Ito, Appl. Phys.
Lett. 107, 093701 (2015).
[10] T. Kobayashi, N. Iwata, J.-S. Oh, H. Hahizume, T.
Ohta, K. Takeda, K. Ishikawa, M. Hori, M. Ito, J. Phys.
D Appl. Phys. 50, 155208 (2017).
[11] J.-S. Oh, E. J. Szili, N. Gaur, S.-H. Hong, H. Furuta,
R. D. Short, A. Hatta, J. Photopolym. Sci. Tec. 28,
439-444 (2015).
[12] J.-S. Oh, E. J. Szili, K. Ogawa, R. D. Short, M. Ito, H.
Furuta, A. Hatta, Jpn. J. Appl. Phys. 57, 0102B9(2018).
[13] A. Tani, Y. Ono, S. Fukui, S. Ikawa, K. Kitano, Appl.
Phys. Lett. 100, 254103 (2012).
[14] A. Tani, S. Fukui, S. Ikawa, K. Kitano, Jpn. J. Appl.
Phys. 54, 01AF01 (2015).

能性が高い。
2H+ + 2NO2- + NO3• → 2HNO3 + NO2•
そして、生成された H2O2 と NO2-が反応することで過酸化亜硝酸(ONOOH)となり、ONOOH がもう一度 H2O2 と反応することで過硝酸(O2NOOH)となる。O2NOOH は酸化解離定数(pKa)= 5.9 を持ち、それ以下の pH では HOO•と NO2• となる。[49, 50]
H+ + NO2- + H2O2 → ONOOH + H2O
ONOOH + H2O2 → O2NOOH + H2O
O2NOOH ↔

HOO•+ NO2•(pKa=5.9)

実験結果の(3)で示した中性ラジカル処理による超純水の pH 変動によると、照射時間 1 min の時点で、既に pH が 5.0 付近まで低下しているため、常識によって O2NOOH から HOO• が生成され、大腸菌を殺菌している可能性があることが分かった。

5.結論
本研究では、電気的に中性なラジカルを照射した超純水における殺菌効果の評価とその殺菌メカニズムの解明を行った。特に、スカベンジ酵素と電子スピン共鳴法(ESR 法)を用いることで、ラジカル活性水中に76

2-1-4-2 プラズマ技術を用いた高効率殺菌手法の開発（その２）— ラジカル及びプラズマ処理水によるバイオフィルム形成緑膿菌の殺菌効果、および黄色ブドウ球菌が産生する毒素に対する不活化作用—

伊藤 昌文 1）、小森 由美子 2）、長瀬 智之 1)、Vladislav Gamaleev1,3）
1）名城大学 理工学部 電気電子工学科
2) 名城大学 薬学部 薬学科3)名古屋大学 低温プラズマ研究センター

1. 緒

言

のエンテロトキシンは耐熱性で、通常の調理などによる

近年、複数の薬剤に耐性を示す細菌（多剤耐性菌）

加熱では容易に失活せず、各種タンパク分解酵素に対による感染症が問題になっている。中でも環境常在菌しても抵抗性を示すため、一旦食品・製品が汚染されである緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は耐性化しると不活化や除去は困難である。[5] 本研究では、

やすく、免疫力が低下した人に対して病原性を示す日

2-1-4-1 項で記載した非平衡大気圧ラジカル源を用い、和見病原体であり、緑膿菌による院内感染症は非常に

標準エンテロトキシン溶液に酸素ラジカルを照射し問題視されている。多剤耐性緑膿菌に対しては、各種

た場合の不活化効果を検証した。

抗菌薬が無効な場合が多く、さらにバイオフィルム形

2. 対

成により消毒剤に対しても抵抗性を示すため、感染症

象

対策は非常に困難である。またバイオフィルムは金属本研究ではグラム陰性好気性桿菌の一種で、主に院材料に対して微生物腐食を引き起こす原因となるた内感染の起因菌として知られている緑膿菌を殺菌対

め、工業用配管の材質劣化も問題となっている。[1]

象として用いた。本菌は環境中に広く存在し、土壌や本研究では、プラズマ中に含まれる電気的に中性な水中などに見られる環境菌である。本実験では、ATCC
27853株（BSL 2）を使用した。

活性種（ラジカル）を選択的に照射できる 2-1-4-1 項

緑膿菌は約1～2 µmの大きさで、発育温度は4～42℃、で記載した非平衡大気圧ラジカル源、または新たに開発した特別なガスを必要とせず周りの空気で高密度発育pHは5.6～9.3の範囲となっている。至適温度はなラジカルを発生させることのできる環境大気グロ

37℃前後、至適pHは7.0付近である。一本の鞭毛をもープラズマ源を用い、それぞれの装置で処理した滅菌

ち運動性がある。青緑色のピオシアニンと蛍光色のピ

水の浮遊緑膿菌またはバイオフィルム形成緑膿菌にオベルジンという色素を産生するため、感染部位の膿対する殺菌効果の効果を検証した。

が青緑色となるのが特徴である。本菌は元来、弱毒菌

またヒトの皮膚などに常在する黄色ブドウ球菌

であるため健常者では感染症を起しにくいが、基礎疾（Staphylococcus aureus）が産生する各種エンテロ

患があるなどの原因で抵抗性が低い人や、熱傷などのトキシンは、食中毒や毒素性ショック症候群（Toxic

皮膚障害を受けている人では日和見感染を引き起こ

shock syndrome, TSS）の原因となり、世界各国で食す。そのため病院内での感染が問題視されている。ま品の製造・加工や衛生用品の製造現場での毒素汚染がた多くの抗生物質に対して自然耐性を示すため、化学大規模な事故を引き起こしている。[2-4] ブドウ球菌

療法が困難な場合がある。バイオフィルム形成能も非77

常に高く、一般に緑膿菌感染症治療に使用される主要痢を伴う急激な急性胃腸炎症状を起こす。摂取した毒抗菌薬3種に耐性を示す多剤耐性緑膿菌

素量などの違いにより症状には個人差があるが、まれ（ Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa,に重症化する場合もある。一般には予後は良好で、死MDRP）の増加が報告されている。[6, 7]

亡例はほとんどなく、通常1日か2日間で回復する。

細菌には、それが持つ基本的な性質のために薬剤にエンテロトキシン（SEs）は分子量27,000前後の単対して抵抗性を持つもの（自然耐性）がある。しかし、純蛋白質で、多様なバリエーションが存在し、抗原性本来効果があるはずの薬剤でも使用を繰り返すうちの違いから現在A～L型（SEA～SEL）までが報告されてに耐性を獲得するようになる。薬剤耐性は主に、プラいるが、日本における食中毒事件では、SEAに関連す

スミドを介して遺伝的に伝播することが多く、これにるものが最も多い。[10] 食中毒発症に必要な量は、より耐性を獲得した菌がさらに別の薬剤の耐性を持SEBでは25～50 µg と考えられていたが、加工乳など

つ多剤耐性菌へと変異していくと、薬剤投与による化の事件では200 ng以下のSEAで発症していることも報

学療法が困難となり、感染拡大や症状の重篤化へつな

告されている。

がる可能性がある。耐性化するメカニズムとしては、

3. 実験方法(1)薬剤を分解、不活性化する酵素の産生、(2)薬剤結3.1 環境大気グロープラズマ源[11]合標的分子の構造変化、(3)バイオフィルムの形成、

図１に本実験で用いた環境大気グロープラズマ源(4)薬剤排出機構の亢進、などが挙げられる。

の概略図を示す。図に示す回路によりグローモードの細菌の中には、自身に不利な環境下において、バイ時最大約2.5 kV、2.5 mAの正の高電圧パルスを針電極

オフィルムと呼ばれる構造物を形成するものがある。

に印加することにより、液体表面間の大気中でグロー同一菌群でも菌株により形成の条件やバイオフィル

プラズマを発生させ、脱イオン化滅菌水（DDW）を処

ムの主成分は様々であるが、抗菌薬や消毒薬に抵抗性理した。

を示し、物理的なバリア機能により血清成分や免疫細胞の侵入を防ぐ役割を持つ。バイオフィルム内の菌密度は、懸濁状態の菌と比較しても非常に高いため、病原性を持つ菌は日和見感染等を起こす可能性がある。
医療機器表面や、身近なものではシンクなどの湿潤な環境で発生する可能性があり、人体内でバイオフィル
ムを形成することもある。[8]図1 環境大気グロープラズマ源

黄色ブドウ球菌はヒトの皮膚や粘膜常在菌であり、皮膚の化膿性疾患の原因となるほか、肺炎や心内膜炎

3.2 実験手順（バイオフィルム形成緑膿菌に対する殺などの重篤な感染症を起すこともある。様々な毒素を菌効果）産生することが知られているが、日常的には食中毒や緑膿菌を懸濁したTSB培地（Trypto Soy Broth）に毒素性ショック症候群を引き起こすエンテロトキシ

金属板（SUS304）を37 ℃で24 h 浸漬することにより、ン（staphylococcal enterotoxins, SEs）とその類縁金属板上でバイオフィルムを形成させた。金属板上に毒素（Toxic shock syndrome toxin-1, TSST-1）が問形成しているバイオフィルムだけを回収するため、金題となることが多い。[9] SEsが産生された食品を喫属板をTSB培地から取り出し、生理食塩水で2度洗浄し食すると、約3時間後に激しい嘔気・嘔吐、腹痛、下78

ている。金属板に付着しているバイオフィルムは粘性1）に対してはかなり殺菌効果が弱くなっていることが高く、納豆の糸が引くようにバイオフィルムもねばがわかる。このことから、バイオフィルムは抗菌薬やついて糸を引くような状態になる。この糸を引いた部

防腐剤に対して耐性を持つだけでなく、ラジカルがバ分を完全に取り除いたsample 1と、そのまま残した

イオフィルム内部に侵入することも防ぐことが示唆

sample 2 を実験に用いた。滅菌水に2-1-4-1項の2.1される。

に記載したラジカル源を用いて酸素ラジカルまたは酸化窒素ラジカルを10分間照射し、照射液3.0 mlにバ
イオフィルムが形成した金属板浸し、任意の時間時間
振とうあるいは超音波振動を印加した。振とうしたサ
ンプルにおいては、振とう後に超音波振動により金属板に残った細菌を剥離させた。懸濁液を希釈系列で104 倍まで希釈し、各希釈液を固形培地に塗抹し37℃
図3 バイオフィルム形成細菌（sample 1） に対する
酸素・酸化窒素ラジカル処理滅菌水の殺菌効果

で 24 h 培養した。培養後、コロニーカウント法により殺菌効果を評価した。

4.2 超音波振動印加ラジカル処理滅菌水によるバイ
3.3 実験手順（黄色ブドウ球菌毒素の不活化効果）

オフィルム形成細菌（sample 1）の不活性化

市販のSEA, SEB, SEC, SED, TSST-1, EXT-A, EXT-B

4.1 の実験結果からバイオフィルム形成細菌に対の7種の毒素を使用した。標準毒素を注射用水で16倍してラジカル処理水では効果的な殺菌が出来ないこ

希釈し、酸素ラジカルを5～20分間照射後、図2に示すとがわかったため、殺菌効果向上を目的として超音波ような原理に基づく逆受け身ラテックス凝集法を利振動の印加を試みた。図4 にバイオフィルム形成細菌用したエンテロトキシン検査キット（SET-RPLATM 、TM(sample 1)に対する超音波振動印加酸素・酸化窒素ラ

TM

TST-RPLA 、EXT-RPLA 、デンカ生研製） を使用してジカル処理滅菌水の殺菌効果を示す。超音波振動を印活性を測定した。[12]加することで酸素・酸化窒素ラジカル処理滅菌水の殺菌効果は向上し、特に超音波振動印加酸化窒素ラジカ
ル処理滅菌水の場合は120 分の処理時間でバイオフ
ィルム形成細菌（sample 1）を滅菌基準まで減少させることができた。これは超音波振動によりバイオフィ
ルムが破壊され、漏出した細菌細胞が液中活性種に直図2

逆受け身ラテックス凝集法による黄色ブドウ球菌毒素の測定

接接触することで殺菌されたためと推測される。

4 実験結果4.1 ラジカル処理滅菌水によるバイオフィルム形成細菌(sample 1)の不活性化
図3 にバイオフィルム形成細菌(sample 1)に対する酸素・酸化窒素ラジカル処理滅菌水の殺菌効果を示す。
図からわかる通り、バイオフィルム形成細菌（sample

79

図4 バイオフィルム形成細菌（sample 1）に対する超音波振動印加酸素・酸化窒素ラジカル処理滅菌水の殺菌効果に達したことから、環境大気グロープラズマ処理DDW

4.3 酸化窒素ラジカル処理滅菌水によるバイオフィの方がより殺菌効果が強いことが示唆された。殺菌効動を印加することで、ほとんどのサンプルが滅菌基準

ルム形成（sample 2）の不活性化

果にばらつきがあるが、図6と図7を比較すると、バイ

図5にバイオフィルム形成細菌(sample 2)に対するオフィルム量が多いほど殺菌速度が遅くなっている

超音波振動印加酸化窒素ラジカル処理滅菌水の殺菌ことがわかる。

効果を示す。前項では2 時間の処理でバイオフィルム
形成細菌（sample 1）が滅菌基準まで達したのに対し、バイオフィルム形成細菌（sample 2）に対してはほとんど殺菌効果を示さないことがわかった。この結果か
ら、バイオフィルム量が多いほど殺菌は困難になると考えられる。

図6

超音波振動印加環境大気グロープラズマ処理滅
菌水の殺菌効果図7

超音波振動印加環境大気グロープラズマ処理滅
菌水の殺菌効果

図5 バイオフィルム形成細菌（sample 2）に対する酸化窒素ラジカル処理滅菌水、超音波振動印加
酸化窒素ラジカル処理滅菌水の殺菌効果
4.4 超音波振動印加環境大気グロープラズマ処理滅
菌水の殺菌効果のバイオフィルム量依存性
4.5 紫外吸収分光法による液中活性種計測

図6 にバイオフィルム形成細菌（sample 1、sample

酸化窒素ラジカル処理滅菌水と環境大気グロープ

2）に対する超音波振動印加した環境大気グロープラ

ラズマ処理滅菌水の吸収ピークを図8に示す。200 nm

ズマ処理DDWの殺菌効果、図7 にそれぞれのサンプル付近で希釈なしの酸化窒素ラジカル処理水より50倍のバイオフィルムのみを染色したクリスタルバイオ

希釈のアークプラズマ処理水の方が高い吸光度を示

レットの吸光度を示す。この吸光度は形成されたバイオフィルム量に相当する。同じ培養条件で、殺菌実験に用いるバイオフィルムとバイオフィルム定量に用いるバイオフィルムの2つを用意し、初期バイオフィ
ルム量による殺菌速度の違いを検討した。サンプルはそれぞれ3つずつ(sample 1: a～c、sample 2: A～C)
用意した。まずバイオフィルム形成細菌を環境大気グ
ロープラズマ処理DDWに浸漬して180分間の超音波振80

図9 黄色ブドウ球菌毒素に対する酸素ラジカル
照射時間と毒素活性の変化

5.結論
本研究では、殺菌が困難なバイオフィルム形成細菌に対する殺菌のメカニズムを解明するために、クリス
タルバイオレット染色法によるバイオフィルムの定
量、また紫外吸収分光法によるラジカル処理滅菌水、
図8 酸化窒素ラジカル処理滅菌水と環境大気グロー
プラズマ処理滅菌水の吸収スペクトル

環境大気グロープラズマ処理滅菌水中の活性種計測を行った。これらの結果から、バイオフィルムが形成しており、酸化窒素ラジカル処理水に比べて120～130

された SUS304 に超音波振動を印加することで、バイ倍の濃度の活性種が生成されていることが分かった。

オフィルムのほとんどを剥離できることがわかった。
しかしながら SUS304 上に形成するバイオフィルムの4.6 エンテロトキシンに対する酸素ラジカル照射の量にはばらつきがあり、バイオフィルム量が多いほど影響

殺菌速度は遅くなり、殺菌速度はバイオフィルム量に

標準エンテロトキシン（SEA～SED）、TSST-1、表

依存することが分かった。

皮剥脱毒素（EXT-A、B）の 7 種の毒素に酸素ラジカル

また、紫外吸収分光法による液中活性種計測の結果

を 5、10、20 分間照射後、逆受け身ラテックス凝集反から、同じ時間で処理した酸化窒素ラジカル処理滅菌

応で各毒素溶液が何倍希釈まで反応を示すか測定し水に比べて環境大気グロープラズマで処理した滅菌た。コントロールとして、同じ時間アルゴンガスのみ

水の方が、液中活性種濃度が 2 桁以上高いことが分かを照射した場合と、毒素溶液を 100℃で加熱した場合った。さらに、環境大気グロープラズマは消費電力もの活性を比較した。図 9 に示すように、SEA、SEB、SED、半分程度で Ar や O2 ガスなどの特別なガスを必要としTSST-1、EXT-B に対しては、酸素ラジカル照射は加熱ないことから、コスト面からも効果的な殺菌手法であ処理とほぼ同等またはそれ以上に毒素不活化作用をることが分かった。

示した。特に TSST-1 に対しては、5 分間の酸素ラジ

通常の加熱処理などでは不活化されにくいとされカル照射で活性が急激に低下していた。SEC、EXT-A

る黄色ブドウ球菌エンテロトキシン群（SEs）に対し、に対しても酸素ラジカル照射は時間依存的な作用を酸素ラジカル照射は 100℃加熱処理と同等、もしくは示したが、加熱処理と比較するとその効果は弱かった。

それ以上の効果を示す可能性が示唆された。今回酸素ラジカル照射をした液中に、どのような活性種が存在し、それがどのような機序で SEs に作用したのかは、
今後検討すべき課題である。しかし食品や衛生用品の製造過程で使用される設備や機器などで、高温加熱処理などが困難なものに対するエンテロトキシン汚染防止のためには、簡便で安価、また残留毒性のない手法を開発する必要があり、ラジカルの種類や照射条件

81を変更して、さらに検討を行う必要があると考える。

参考文献[1] 臨床と微生物, Vol.45 No.1 (2018).
[2] 五十嵐英夫, 日本食品微生物学会雑誌, 20, 51-62(2003).
[3] 食品安全委員会, ファクトシート, 平成 23 年 11月 24 日 (2011).
[4] Jacques-Antoine Hennekinne, Marie-Laure De Buyser,
Sylviane Dragacci, FEMS Microbiology Reviews, 36,
815–836 (2012).
[5] 重茂克彦, 食品衛生, 51, 81-91 (2005).
[6] 小栗豊子編, 臨床微生物検査ハンドブック第 4 版,
pp. 303-304, 三輪書店 (2008).
[7] 厚生労働省院内感染対策サーベイランス事業, 公開情報 2018 年 1 月～12 月 年報 (2018).
[8] Christoph A. Fux, Paul Stoodley, Lauanne HallStoodley, J William Costerton, Expert Review of Antiinfective Therapy, 1, 667-683 (2003).
[9] Martin M. Dinges, Paul M. Orwin, Patrick M.
Schlievert, Clinical Microbiology Reviews, 13,
16-34 (2000).
[10] 国 立 感 染 症 研 究 所 , https://www.niid.go.jp/niid/
ja/kansennohanashi/511-aureus.html.
[11] Vladislav Gamaleev, Naoyuki Iwata, Masaru Hori,
Mineo Hiramatsu, Masafumi Ito, Applied Science, 9,3505 (2019).
[12] 五十嵐英夫, イーズ, 22, 栄研化学 (2001).

82

2-1-4-3 プラズマ技術を用いた高効率殺菌手法の開発（その３）— 水耕栽培に適した pH 中性領域での高効率殺菌手法の実現—

伊藤 昌文 1）、太田 貴之 1）、呉 凖席 1,2）、石川 健治 3)、堀 勝 3）
1）名城大学 理工学研究科
2）大阪市立大学 工学研究科
3) 名古屋大学 低温プラズマ研究センター

1. 緒

言

化合物の総称である。また、狭義にはタンパク質を構

2-1-4-1、2-1-4-2 に記載したように、プラズマによ成する 22 種類のα-アミノ酸を指す。従って、α-アってプラズマ活性水中に生成されるヒドロペルオキ

ミノ酸は、人間をはじめとするあらゆる生物の体を構

シルラジカル(HOO•)が、その殺菌因子である可能性が成する基であり、生命活動と深い関わりを持つとされ高いことが分かってきた。 しかしながら、このフリている。[7,8]

ーラジカルは存在している溶液の pH が<4.8 でなけれ以下に、本研究でプラズマ処理の対象となる各種アば、プロトン(H+)とスーパーオキシドアニオンラジカ

ミノ酸とその溶媒となったリン酸緩衝液の化学的構

ル(O2-•)という形に解離してしまう。[1] また、多く造を示す。

の植物生長の適切な pH 値は 5.5～6.5[2]であり、プラズマ活性水を用いた殺菌方法は、水耕栽培などの植物が存在する環境には適していない。
そこで我々は、植物生長を阻害しない pH が 5.5～
6.5 の環境においても、効果的に雑菌を殺菌できる新図 1 本研究で用いた各種アミノ酸とリン酸の化学的構造一覧

しいプラズマ液中殺菌技術の開発に取り組んだ。その結果、ベンゼン環を有する有機化合物を電気的に中性な酸素系ラジカルで処理することによって、上記 pH

2.2 活性化 L-フェニルアラニン溶液を用いた大腸菌

領域でも殺菌効果を生成することを見出した。[3]の殺菌実験

本研究では、ベンゼンを有する化合物であり、有機殺菌実験を行う前準備として前培養を行い大腸菌

肥料の成分の 1 つである L-フェニルアラニン(L-Phe)のサンプルを作成した。

をラジカル源で処理し、大腸菌を殺菌対象とした。

前培養の手順は、振とう培養チューブに液体培地 NB（Nutrient Broth）3 ml を入れ、そこに冷凍保存し2. 実験方法
2.1ておいた大腸菌懸濁液を室温に戻したものから 10 µl

本研究で用いた各種アミノ酸とリン酸の化学的入れた後、振とう培養機内で 30℃・250 rpm の条件で

構造

17 時間、液体培養を行った。

本研究では、有機肥料の成分であるアミノ酸をプラ

また、大腸菌を培養するためにΦ90 mm のシャーレにズマ処理することによって、殺菌効果を付加すること

NA 培地（Nutrient Agar：NA）を作成した。

を目標としている。そもそも、アミノ酸とは、広義に以下に、ラジカル活性 L-フェニルアラニンを用いたはアミノ基とカルボキシル基の両官能基を持つ有機殺菌実験の手順を示す。前培養で培養した大腸菌を83

5000×g, 3 min の条件で遠心分離を行い、大腸菌（約

リン酸緩衝液(200 mM, pH 6.3) 3 ml に大腸菌を懸濁3×109 個/ml）を集菌した。集菌後、培養液を捨て、し直し、大腸菌懸濁液の原液を作成する。原液をリン

リン酸緩衝液(200 mM, pH 6.3) 3 ml に大腸菌を懸濁酸緩衝液で 30 倍希釈したもの(大腸菌約 1×108 個

し直し、大腸菌懸濁液の原液を作成する。原液をリン/ml)を大腸菌懸濁液とする。

酸緩衝液で 30 倍希釈したもの(大腸菌約 1×108 個

酸素ラジカルの照射条件は、アルゴン (Ar)と酸素(O2) の 混 合 ガ ス の 総 流 量 を 5 slm と し 、 流 量 比/ml)を大腸菌懸濁液とした。
酸素ラジカルの照射条件は、アルゴン (Ar)と酸素

O2/(Ar+O2)を 0.6 %とする。ラジカル出射部からの照(O2) の 混 合 ガ ス の 総 流 量 を 5 slm と し 、 流 量 比

射距離 10 mm の位置にサンプルを設置し、照射時間は

O2/(Ar+O2)を 0.6 %とした。ラジカル出射部からの照0~15 min とする。このとき、大気の影響を抑えるた

射距離 10 mm の位置にサンプルを設置し、照射時間はめにプラスチックカバーをつけ、Ar でカバーの中を0～15 min とした。このとき、大気の影響を抑えるた

満たした状態でサンプルに酸素ラジカルを照射する。

めにプラスチックカバーをつけ、Ar でカバーの中をサンプルは、L-トリプトファン(50 mmol/l)か L-チロ

満たした状態でサンプルに酸素ラジカルを照射した。

シン(2 mmol/l)が溶解されたリン酸緩衝液(200 mM,

サンプルは、L-フェニルアラニン(80 mmol/l)が溶解

pH 6.3)の 3 ml をΦ38 mm シャーレに入れたものを照されたリン酸緩衝液(200 mM, pH 6.3)の 3 ml をΦ38 mm

射サンプルとし、酸素ラジカルを照射する。

シャーレに入れたものを照射サンプルとし、酸素ラジ照射後、大腸菌濃度が 1×107 個/ml となるように、照カルを照射した。

射サンプルの一部と置換し、30 ◦C・250 rpm の条件で照射後、大腸菌濃度が 1×107 個/ml となるように、

しばらく振とう培養する。その後、適当な倍率まで希照射サンプルの一部と置換し、30℃・250 rpm の条件

釈(101~104 倍)し、希釈を行った大腸菌懸濁液 100 µl

でしばらく振とう培養した。その後、適当な倍率までを NA 培地に塗布する。大腸菌を塗布した NA 培地を培希釈(101～104 倍)し、希釈を行った大腸菌懸濁液 100

養棚で 30 ◦C、24 時間培養してコロニーカウント法にµl を NA 培地に塗布した。大腸菌を塗布した NA 培地

より殺菌効果を評価する。

を培養棚で 30 ℃、24 時間培養してコロニーカウン
ト法により殺菌効果を評価した。

2.4 活性化した非芳香族化合物溶液/リン酸緩衝液の殺菌実験

2.3 他の芳香族アミノ酸をラジカル活性した場合の殺菌

電気的中性ラジカルと芳香族化合物間の相互作用
で、中性 pH 領域における殺菌効果生成が得られるこ活性
ラジカル活性フェニルアラニンの殺菌活性がラジとを検証するために、ベンゼン環構造を持たない L-

カルとフェニルアラニン間の相互作用から得られる

アラニン溶液、並びに、4.2.5 項まで各アミノ酸の溶

特異的な現象であるかを照査するために、他の芳香族媒として使用したリン酸緩衝液をラジカル源で処理

アミノ酸(トリプトファンとチロシン)をラジカル源

し、その殺菌効果を評価する。
以下に、殺菌実験の手順を示す。前培養で培養したで処理した場合の殺菌活性を評価する。
以下に、ラジカル活性フェニルアラニンを用いた殺大腸菌を 5000×g, 3 min の条件で遠心分離を行い、菌実験の手順を示す。前培養で培養した大腸菌を 5000

大腸菌（約 3×109 個/ml）を集菌する。集菌後、培×g, 3 min の条件で遠心分離を行い、大腸菌（約 3

養液を捨て、リン酸緩衝液(200 mM, pH 6.3) 3 ml に

×109 個/ml）を集菌する。集菌後、培養液を捨て、大腸菌を懸濁し直し、大腸菌懸濁液の原液を作成する。

84

原液をリン酸緩衝液で 30 倍希釈したもの(大腸菌約 1×108 個/ml)を大腸菌懸濁液とする。
酸素ラジカルの照射条件は、アルゴン (Ar)と酸素(O2) の 混 合 ガ ス の 総 流 量 を 5 slm と し 、 流 量 比
O2/(Ar+O2)を 0.6 %とする。ラジカル出射部からの照射距離 10 mm の位置にサンプルを設置し、照射時間は0~15 min とする。このとき、大気の影響を抑えるた
めにプラスチックカバーをつけ、Ar でカバーの中を満たした状態でサンプルに酸素ラジカルを照射する。
サンプルは、L-アラニン(80 mmol/l)が溶解されたリン酸緩衝液(200 mM, pH 6.3)か、有機物が溶解されていないリン酸緩衝液(200 mM, pH 6.3)の 3 ml をΦ38 mm
シャーレに入れたものを照射サンプルとし、酸素ラジカルを照射する。

図2 ラジカル活性フェニルアラニン溶液の殺菌効果

大腸菌濃度が 1×107 個/ml となるように、希釈サン
プルの一部と置換し、30 ◦C・250 rpm の条件でしばら

特に、ラジカル源によって15 min処理されたフェニル

く振とう培養する。その後、適当な倍率まで希釈

アラニン溶液の殺菌効果は、大腸菌懸濁から24時間以(101~104 倍)し、希釈を行った大腸菌懸濁液 100 µl

内に生菌数が検出限界に達するほど強いものであっを NA 培地に塗布する。大腸菌を塗布した NA 培地を培た。また、ラジカル照射時間が5、10、15 minと長く

養棚で 30 ◦C、24 時間培養してコロニーカウント法になるにつれて、大腸菌生菌数の減少速度が上昇していより殺菌効果を評価する。

ることからも、電気的に中性なラジカルとフェニルア
ラニンと反応し、殺菌活性を有した物質が新たに生成

3. 実験結果されていることを示唆している。

3.1 活性化L-フェニルアラニン溶液を用いた大腸菌の殺菌結果

3.2 他の芳香族アミノ酸をラジカル活性した場合の

図2に、ラジカル活性フェニルアラニン溶液に懸濁さ殺菌結果れてからの、大腸菌生菌数の変動を示す。なお、図2

図3に、L-フェニルアラニンとは異なる物質である上部の凡例は、それぞれラジカルによるフェニルアラ

L-トリプトファンやL-チロシンをラジカル処理した

ニンの処理時間を示す。まず、ラジカル処理時間が0場合の殺菌実験の結果を示す。

minの溶液中では、懸濁から240時間経過しても、大腸

ラジカル活性L-トリプトファンとL-チロシンの両菌生菌数が全く減少しなかった。それに対して、ラジ者で、殺菌活性が確認された。

カル源によって5、10、15 min処理されたフェニルア

また、L-フェニルアラニン(80 mmol/l)をラジカル

ラニン溶液中では、振とう培養時間の増加に伴って、源で活性化した場合より、L-トリプトファン(50

大腸菌生菌数が劇的に減少した。

mmol/l)を活性化した場合の殺菌活性が明らかに強力である。このことから、L-フェニルアラニンよりLトリプトファンの方が、ラジカル源から供給される電85

いないことが判明した。

気的中性な活性種との反応速度が高く、殺菌因子の生成確率が高いことが示唆された。

図4 ラジカル活性リン酸緩衝液とL-アラニンの
殺菌効果

4. 結論
図3 ラジカル活性L-トリプトファンとチロシンの殺菌効果

本研究では、作物の生長を阻害せず溶液中の雑菌を殺菌することを目的に、中性 pH 領域において殺菌できる手3.3 活性化した非芳香族化合物溶液/リン酸緩衝液の法の開発した。その結果、多くの植物生長の適切な pH 値

殺菌結果

は 5.5～6.5 領域においてプラズマ液中殺菌を実現する

図 4 に、L-フェニルアラニンとは異なりベンゼン環構造をためには、電気的中性なラジカルと芳香族化合物間の相持たない非芳香族アミノ酸である L-アラニンや、有機物を互作用が重要であることが判明した。特に、L-フェニルア

一切含有しないリン酸緩衝液をラジカル処理した場合のラニンを、電気的中性なラジカルで処理することによって、殺菌実験の結果を示す。

最終目標になっていた中性 pH 領域での大腸菌の 6 桁殺

ラジカル活性 L-アラニンとリン酸緩衝液からは、殺菌活菌に成功した。また、ベンゼン環を有さない L-アラニンや性が確認されなかった。

リン酸緩衝液のみをラジカル処理した場合には殺菌効果

この結果より、ラジカル源から供給された電気的に中性が確認されなかったことから、中性ラジカルと L-フェニルな活性種と L-フェニルアラニン等が持つベンゼン環構造

アラニンが液相中で反応し、殺菌活性を持つ物質 X が生が相互作用を起こし、中性 pH における殺菌活性を持った成されたことが伺える。

新たな物質が生成されることが検証された。

本技術による、殺菌メカニズムの解明のためには、ラジさらに、ラジカル処理されたリン酸緩衝液から殺菌効果

カル処理によって L-フェニルアラニン溶液中に生成されが確認されないことから、これまでに水溶液の大気圧プラた化学種の分析を行うことが必須である。今後は、溶液中ズマ処理によってその生成が報告され、かつ、プラズマ活

成分の分析によって、ラジカル処理フェニルアラニンによ性水による殺菌への寄与も報告されてきた過酸化水素ってもたらされる現象のメカニズム解明に取り組むとともに、-

3(H2O2)、亜硝酸イオン(NO2 )、硝酸イオン(NO )[8-10]と本技術の実用性や安全性を評価していく予定である。

いった比較的長寿命な活性種も、本殺菌に寄与していて86

（これらの成果は様式２の雑誌論文 93 の内容の一部に対応する。本稿は原著論文ではなく、研究成果を解説した報告書である。）

参考文献[1] S. S. Korshunov, J. A. Imlay, Mol. Microbiol., 43,(2002) 95.
[2] N. SHARMA, S. ACHARYA, K. KUMAR, N. SINGH,
O.P. CHAURASIA : J. SOIL WATER CONSERV., 17(2018) 364.
[3] N. Iwata, V. Gamaleev, H. Hashizume, J.-S Oh, T. Ohta,
K. Ishikawa, M. Hori, M. Ito : Plasma Process. Polym.
16 (2019) 1900023.
[4] H. Hashizume, T. Ohta, T. Mori, S. Isei, M. Hori, M.
Ito, Jpn. J. Appl. Phys. 52, 056202 (2013).
[5] H. Hashizume, T. Ohta, K. Takeda, K. Ishikawa, M.
Hori, M. Ito, Jpn. J. Appl. Phys. 53, 010209 (2014).
[6] H. Hashizume, T. Ohta, M. Hori, M. Ito, Appl. Phys.
Lett. 107, 093701 (2015).
[7] W. Sakami, H. Harrington, “Amino acid metabolism”,
Annu. Rev. Biochem. 32, 355-398 (1963).
[8] S. Azad, “Amino acids: Its types and uses”, Int. J. Clin.
Diagn. Pathol. 1, 13-16 (2018).
[9] M. J. Traylor, M. J. Pavlovich, S. Karim, P. Hait, Y.
Sakiyama, D. S. Clark, and D. B. Graves : J. Phys. D.
Appl. Phys., 44 (2011) 472001.
[10] K. Oehmigen, J. Winter, M. Hähnel, Ch. Wilke, R.
Brandenburg, K.-D. Weltmann, and Th. von Woedtke :Plasma Processes Polym., 8 (2011) 904.
[11] N. Iwata, V. Gamaleev, J-S. Oh, T. Ohta, M. Hori, M.
Ito : Plasma Process Polym. 16 (2019) e1900055.

87

2-2 バイオマス燃料用の植物の高効率生長や高効率分解・発酵技術の開発88

2-2-1-1 プラズマ技術を用いた植物の高効率生長手法の開発（その１）— 植物生長と殺菌が同時達成可能なプラズマ照射液肥の開発—

伊藤 昌文 1）、岩田 直幸 1)、太田 貴之 1）、呉 凖席 1,2)、石川 健治 3)、堀 勝 3）
1）名城大学 理工学部 電気電子工学科
2) 現、大阪市立大学 工学研究科
3) 名古屋大学 低温プラズマ研究センター

1. 緒

言

本研究では、ベンゼンを有する化合物であり、有機

近年、非平衡大気圧プラズマの生体応用において、肥料の成分の 1 つである L-フェニルアラニン(L-Phe)

様々な有益な効果が報告され注目が集まっている。例

をラジカル源で処理し、カイワレ大根を生長促進対象としては、がんの選択的不活性化[1-4]や創傷治癒とした。

[5,6]といった医療応用や、作物生長促進[7,8])や有2. 実験方法

害菌の殺菌[9,10]などの農業応用など多岐に渡る。その中でも、非常に強い殺菌効果を持つプラズマ活性水

不織布(M-3II, BEMCOT)3枚をφ90 mmの新円状に切は最も注目されているトピックの 1 つである。 近年

り出し、それらに30 mlの超純水を含ませた。その不の報告によると、プラズマによってプラズマ活性水中

織布をφ90 mmの滅菌ディッシュに入れ、カイワレ大に生成されるヒドロペルオキシルラジカル(HOO•)が、根の発芽場とした。カイワレ大根の種子20個を上記発その殺菌因子であるとされている。[11,12]

しかし芽場の上に置き、人工気象器(BIOTRON, NK system)

ながら、このフリーラジカルは存在している溶液のを用いて、温度・湿度を22 ℃・60 %として、48時間

pH が<4.8 でなければ、プロトン(H+)とスーパーオキ

かけて培養した。その後、大腸菌殺菌時と同じ条件をシドアニオンラジカル(O2-•)という形に解離してしま用いて、80 mmol/lのL-Pheを溶解させたリン酸緩衝液

う。[13] また、多くの植物生長の適切な pH 値は 5.5を、ラジカル源を用いて10分間処理した。ラジカル処～6.5[14]であり、プラズマ活性水を用いた殺菌方法

理の条件は2-1-4-3項の実験と同じである。ラジカル

は、水耕栽培などの植物が存在する環境には適してい

処理完了後、ラジカル活性フェニルアラニン溶液の30ない。

mlを20本のカイワレ大根に与え、人工気象器(BIOTRON,

そこで我々は、2-1-4-3 項に記載したように植物生

NK system)を用いて、温度・湿度を22 ℃・60 %とし長を阻害しない pH が 5.5～6.5 の環境においても、効て、48時間かけて再度培養した。最後に、カイワレ大

果的に雑菌を殺菌できる新しいプラズマ液中殺菌技

根20本の茎長と乾燥重量を測定・平均化し、比較する術の開発に取り組んだ。その結果、ベンゼン環を有すことで、ラジカル活性フェニルアラニン溶液によるカる有機化合物を電気的に中性な酸素系ラジカルで処

イワレ大根への生長促進効果を評価した。

理することによって、上記 pH 領域でも殺菌効果を生

3. 実験結果成することを見出した。

図 1 に L-Phe 含有リン酸緩衝液（コントロール）、それ

本研究では、同溶液によってカイワレ大根等の植をラジカル処理して活性化された L-Phe 含有リン酸緩衝

物生長が促進されるかを検証した。

89

生長を促進することが示唆された。

液の原液、それをリン酸緩衝液で 1.5 倍希釈、2 倍希釈、3 倍希釈、4 倍希釈した溶液によって生長させたカイワレ
大根の一例を写真を示す。
写真から明らかなように、原液でもコントロールより良く成長しており、4 倍希釈まですると生長率が落ちるが、1.5倍希釈で大きく生長が促進していることが分かる。
これらのカイワレ大根の茎長と乾燥重量を測定し、それらをグラフにしたものが図 2 と図 3 である。

図 1 にラジカル活性 L-Phe 溶液によって生長したカイワ
レ大根の写真図 2 にラジカル活性 L-Phe 溶液によって生長したカイ
ワレ大根の茎長(左縦軸)と、ラジカル未処理 L-Phe 溶液
によって生長したカイワレ大根の茎長に対する、処理溶液によって生長したカイワレ大根の茎長比(右縦軸)を示す。
ラジカル未処理の L-Phe 溶液中では、カイワレの平均
茎長は約 18 mm であるのに対し、ラジカル源で 10 min 処
理した L-Phe の溶液中では、カイワレ大根の生長は約25mm(約 1.4 倍)まで上昇した。さらに、ラジカル源で 10
min 処理した L-Phe 溶液を、リン酸緩衝液(pH6.3)を用いて、1.5 倍、2 倍、3 倍、4 倍に希釈し、カイワレ大根に与えたところ、その生長は最大で約 36mm(約 2 倍)にまで促進された。
図 3 に、希釈ではなく、ラジカル処理時間を変更したとき

図2 ラジカル活性フェニルアラニン溶液によるの、L-フェニルアラニン溶液によるカイワレ大根の生長促

カイワレ大根の生長促進度

進実験の結果を示す。
ラジカル処理時間を 7、5、3、2.5 min とした場合でも、カ
イワレ大根の生長は促進された。
さらに、ラジカル処理時間 7、5、3、2.5 min は、4.3.13
項に示した 10 min ラジカル処理 L-フェニルアラニン溶液のそれぞれ 1.5、2、3、4 倍希釈に対応しており、各照射
時間と希釈倍率における生長促進度合いは、互いに近し
いものとなった。
これらの結果より、殺菌効果だけでなく、植物生長促進
効果も、中性ラジカルと L-フェニルアラニン間の相互作用によってもたらされることが示唆された。
図3 ラジカル処理時間を変更したL-フェニルアラニ
ンの生長促進効果

これらの結果より、ラジカル処理された芳香族化合物は、
中性 pH において殺菌効果を有するだけではなく、植物の90

培等の農業現場における新しい殺菌法となりうる。
また、ラジカル源によって 10 min 処理された L-Phe 溶液

しかしながら、図 5 に示すように中性ラジカルと L-フェニ

を、リン酸緩衝液(pH6.3)によって 1.5 倍と 2 倍に希釈し、ルアラニンが液相中で反応し、植物の生長促進能を持つ大腸菌を懸濁して場合の、大腸菌生菌数の変動を図 2 に

物質 X’と殺菌活性を持つ物質 X が生成されたと考えら示す。殺菌速度が減速しているものの、希釈後も幾分かれるが、これらの物質を特定することができなかった。

の殺菌活性は残存していることが分かる。

今後はこれらの物質を特定し、さらに高効率な手法の実現を目指す予定である。
（これらの成果は様式２の雑誌論文 93 の内容の一部に対応する。本稿は原著論文ではなく、研究成果を解説した報告書である。）

図4 ラジカル活性フェニルアラニン溶液を希釈した場合の殺菌活性

4. 結論
本研究によって、有機肥料の成分である L-フェニルアラ
ニンを、電気的中性なラジカルで処理することによって、ラジカル処理 L-フェニルアラニンは、植物生長促進効果
として、未処理のものと比較して 99％（約 2 倍）の生長促進効果を示し、最終目標としていた 30％促進を大幅に更新する結果を示した。
図5 考えられるラジカル処理L-フェニルアラニン
溶液中での反応

また、2-4-1-3 項で記載したように、ベンゼン環構造を持
つ有機物の電気的中性ラジカル処理によって、、2-1-4

参考文献

項での最終目標になっていた中性 pH 領域での大腸菌の6 桁殺菌に成功した。

[1] G. Fridman, G. Friedman, A. Gutsol, A. B. Shekhter, V.

これらの結果から、従来のプラズマ活性水を用いた殺菌

N. Vasilets, A. Fridman : Plasma Process. Polym., 5では不可能とされた中性 pH 環境下で殺菌と生長促進が(2008) 503.

同時に達成できる可能性があることを示しており、水耕栽[2] S. Iseki, K. Nakamura, M. Hayashi, H. Tanaka, H.

91

Kondo, H. Kajiyama, H. Kano, F. Kikkawa, and M.
Hori : Appl. Phys. Lett., 100 (2012) 113702.
[3] H. Tanaka, K. Nakamura, M. Mizuno, K. Ishikawa, K.
Takeda, H. Kajiyama, F. Utsumi, F. Kikkawa, M. Hori :Sci Rep 2016, 6, 36282.
[4] H. Tanaka, M. Mizuno, K. Ishikawa, S. Toyokuni, H.
Kajiyama, F. Kikkawa, M. Hori, Plasma 1 (2018) 150.
[5] S. Kalghatgi, G. Friedman, A. Fridman, A. M. Clyne :Ann Biomed Eng, 38 (2010) 748.
[6] S. Kalghatgi, G. Fridman, M. Cooper, G. Nagaraj, M.
Peddinghaus, M. Balasubramanian, V. N. Vasilets, A. F.
Gutsol, A. Fridman, G. Friedman : IEEE T PLASMASCI., 35 (2007) 1558.
[7] S. Kitazaki, K. Koga, M. Shiratani, and Nobuya
Hayashi : Jpn. J. App. Phys., 51 (2012) 01AE01.
[8] S. Kitazaki, T. Sarinont, K. Koga, N. Hayashi and M.
Shiratani : Curr. Appl. Phys., 14 (2014) S149.
[9] K. Oehmigen, J. Winter, M. Hähnel, Ch. Wilke, R.
Brandenburg, K.-D. Weltmann, and Th. von Woedtke :Plasma Processes Polym., 8 (2011) 904.
[10] P. Lukes, E. Dolezalova, I. Sisrova, and M. Clupek :Plasma Sources Sci. Technol., 23 (2014) 015019.
[11] S. Ikawa, K. Kitano, and S. Hmaguchi : Plasma
Processes Polym., 7 (2010) 33.
[12] S. Ikawa, A. Tani, Y. Nakashima, and K. Kitano : J.
Phys. D: Appl. Phys., 49 (2016) 425401.
[13] S. S. Korshunov, J. A. Imlay, Mol. Microbiol., 43,(2002) 95.
[14] N. SHARMA, S. ACHARYA, K. KUMAR, N.
SINGH, O.P. CHAURASIA : J. SOIL WATERCONSERV., 17 (2018) 364.

92

2-2-1-2 プラズマ技術を用いた植物の高効率生長手法の開発（その２）—大気圧プラズマとパルスパワーを併用した生長促進 —太田 貴之、伊藤 昌文
名城大学

1. 緒

理工学研究科言

孔構造となっており、ガスを拡散させることでガス流

近年、日本は先進国の中でも食料自給率が低いこと

れを均一にしている。また、本プラズマ源は60Hz、8kVが問題となっており、その原因は野菜の生産量と農業の交流電源により電極間に放電を起こし、下部のスリ

就業人口の減少にある。食料自給率の減少を改善する

ットから長さ5mm程度のプラズマ発光部が流出する。

ためには、一人あたりの作物生産量を改善することがパルス電界印加部の詳細を図3に示す。MPC3000S

求められている。

（末松電子製作所）を用いて電極間距離100[mm] の作物生産量を改善するために多くの手法が研究開

アルミ電極間にパルス電界を発生させた。

発されている。プラズマによって生成された活性酸素
及 び 窒 素 種 (Reactive

実験は、カイワレの種子20個に同時刺激を行った。

Nitrogen

また、照射の際カイワレの種子に均等にプラズマを照Species ;RONS)が、植物の生長促進に寄与すると報告射するため、ステージによるスキャンを行った。ステされている[1]-[2]。また、パルス電界を印加すること

ージ速度は2mm/sとし、スキャン1往復で4sとした。さで、担子菌(きのこ類)の発芽や収量改善、被子植物でらに、プラズマ出射部からカイワレの種子までの距離ある単子葉植物網ユリ目のグラジオラス(Gladiolus)のを10mmとなるように調整し、大気下でプラズマ照射

発芽や生育速度改善、トマトやインゲン、レタスを用を行った。

Oxygenand

いた実験など多様な植物でその生長促進効果についカイワレの種子の栽培には人工気象器を用い、温て報告されている[3]-[6]。これらの刺激による生長促

度22℃、湿度60%の一定条件に保った。図4に示すよ進効果は異なると考えられ、異なる刺激を同時に与えうに、栽培一日目はφ90mmのシャーレ内に脱脂綿を敷ることで相乗効果により生長促進効果を向上させる

き30[ml]の水道水を投与し、カイワレを播種した。3可能性がある。

～5日目では茎の湾曲を防ぐために栽培キットを用い本研究では、作物に対して RONS 照射とパルス電界

た。栽培5日目で全てのサンプルの茎の長さを測定し印加の同時刺激により生長促進効果の向上を目指した。生長促進効果を評価するために、未照射のカイワ

た。

レに対する照射後のカイワレの生長変化率を以下の式により求めた。

2.実験方法

生長変化率=(dB-dA)/dA ×100[%]
ここでdAは未照射のサンプルの茎の長さ、dBは照射後図1に示す大気圧プラズマとパルス電界同時刺激のサンプルの茎の長さである。

装置を構築した。図2に示す大気圧プラズマ源の詳細を示す。上部から酸素(0.03[slm])とアルゴン(4.97[slm])

3.実験結果の混合ガス5[slm]を流入させた。プラズマ源内部は多93

図 5 に、パルス電界 0.4[kV/cm]と大気圧プラズマを

数 3 日で発芽率が 100％となった。また、電界強度が3 分間同時照射行った条件における、栽培 5 日目のカ

大きい方が発芽促進される傾向が確認された。

イワレの写真をしめす。左は control の写真であり、レタス葉にパルス電界を印加した結果、光合成からパルス電界と大気圧プラズマを同時照射することに生成される化学エネルギー（植物中の無機栄養物を他より生長促進効果が得られていることがわかる。

の有機化合物に変化させる性質をもつ）の増加が確認

実験は大気圧プラズマ照射時間を 1～5[min]、パルス

されており[3]、これはプラズマの活性酸素種(ROS)に電界印加電界強度を 0.4～0.8[kV/cm]と変化させた。図よる酸化ストレスや活性窒素種(RNS)による施肥効果

6 に大気圧プラズマ照射のみ、図 7 にパルス電界印可とは異なる生長促進のメカニズムであるため、相乗効

のみ、図 8 に大気圧プラズマ照射パルス電界印可の同果が働いていることが示唆された。今後、詳細なメカ

時照射を行ったときのカイワレの生長変化率を示す。

ニズムを解明する必要がある。

図 6 の大気圧プラズマ照射のみのときには、照射時4.結論間の増加とともに生長変化率が増加し、照射時間
3[min]の時に未照射に対し 41[%]の生長促進効果が得

大気圧プラズマとパルス電界の同時照射装置を構られた。さらに照射時間を 4[min]以上に増加させると、築し、カイワレの種子に大気圧プラズマ照射とパルス

生長変化率は減少し、5[min]照射の時に生長変化はほ

電界印可の同時刺激することで生長促進の向上を目

とんど見られなかった。RONS が過剰に照射されたた

指した。
どの刺激手法でも、刺激の増加とともに生長変化率

めに生長抑制されたためであると考えられる。
図 7 のパルス電界印可のみのときには、同様の傾向が増加し、生長促進効果が得られた。さらに刺激を強が得られ、電界強度の増加とともに生長変化率も増加

くすると、生長変化率は減少した。

し、0.8[kV/cm]の時に未照射に対し 56[%]の生長促進

大気圧プラズマ照射のみ及びパルス電界印可のみ効果が得られた。1.0[kV/cm]では、生長変化率が減少を比較すると、弱い印加電界強度で高い生長促進効果

した。パルス電界が大きすぎたために生長抑制されたが得られ、同時刺激による効果が確認できた。パルスと考えられる。

電界印加とプラズマの ROS や RNS による効果は異な

図 8 のように、大気圧プラズマ照射パルス電界印可る生長促進のメカニズムであり、相乗効果が働いていの同時照射を行うと、印加電界強度 0.4[kV/cm]においることが示唆された。

て、同時照射時間 3[min]の時、未照射に対し 62[%]のプラズマやパルス電界における気相中の化学反応プ

生長促進効果が得られた。大気圧プラズマ照射のみ及

ロセスや各刺激による作用機序が明らかになっていびパルス電界印可のみを比較すると、弱い印加電界強ないため、今後解明していく必要がある。

度で高い生長促進効果が得られ、同時刺激による効果

参考文献

が確認できた。また、印加電界強度 0.8[kV/cm] では、
大気圧プラズマ照射時間が長くなる、すなわち同時刺[1] 北崎 訓、林 信哉、信学技報 113(2013) 71.

激が強くなる条件で生長促進効果が見られた。今後、[2] S. Kitazaki, K. Koga, M. Shiratani, N. Hayashi: Jpn. J.

このメカニズムを解明する必要がある。

Appl. Phys., 51 (2012) 01AE01.
[3] 王斗艶、光木文秋、電気学会誌 136(2016) 802.

図 9 及び 10 に、それぞれ電界強度 0.4[kV/cm]及び0.8[kV/cm]におけるカイワレの発芽率の大気圧プラズ[4] 高木浩一、電気学会誌 130(2010) 963.

マ照射時間依存性を示す。ほとんどの条件で、栽培日[5] 犬塚涼介、猪原哲、山部長兵衛、電気学会研究会

94

資料、46 (2008)57.
[6] C.Eing、S.Bonnet、M.Pacher、H. Puchta、and W.Frey、IEEE Trans. Dielect. Elect. Insulation, 16 (2009) 1322.

図 4 カイワレの栽培方法

図 1 大気圧プラズマとパルス電界同時刺激装置の概略図

図 5

栽 培 5 日 目 の カ イ ワ レ (control: 左 、

0.4[kV/cm],3min 同時照射:右)生長変化率 [%]

75

図 2 大気圧プラズマ部の概略図

*

50

*

* : p<0.05
*

*

25
0
-25

0

1
2
3
照射時間[min]45

図 6 生長促進効果（大気圧プラズマ照射）

図 3 パルス電界印加部の概略図

95

100

*

60

*：p<0.05

100

*

80

*
*

*

40

発芽率 [%]

生長変化率 [%]

80

20
0

control
1[min]
2[min]
3[min]
4[min]
5[min]

60
40
20

-20

1

0.8
0.6
0.4
0.2
電界強度 [kV/cm]

001

図 7 生長促進効果（パルス電界印可）

23
栽培日数 (日)45

図 10 発芽率（電界強度 0.8[kV/cm]）

生長変化率 [%]

100
80

0.0 [kV/cm]
0.4 [kV/cm]
0.6 [kV/cm]
0.8 [kV/cm]

*

60
*
*

20
0

*

*

40

0

*: p < 0.05

*
*

*

* *

*

*
* *

*

1
2
3
4
同時照射時間 [min]5

図 8 生長促進効果（大気圧プラズマ照射とパルス電界印可の同時刺激）100

発芽率 [%]

80
60
control
1 [min]2 [min]3 [min]
4 [min]5 [min]

40
20
0
1

2

3
栽培日数 (日)45

図 9 発芽率（電界強度 0.4[kV/cm]）

96

2-2-2 バイオマス燃料用リグノセルロースの高効率分解技術の開発— 酸素ラジカルによる前処理がセルロースの分解を格段に促進する —加藤

雅士 1）、志水 元亨 1）、酒井 杏匠 1）、呉 凖席 2, 3)、 伊藤 昌文 2）
1）名城大学 農学研究科
2）名城大学 理工学研究科
3）大阪市立大学 工学研究科

1. 緒

言

（１）リグノセルロース構造を破壊するための前処理

セルロースは天然で最も豊富なバイオマスである。

の工程、（２）セルロースやヘミセルロースなどの多グルコース単位がβ−1,4 結合で直鎖状につながった糖から酵母等のエタノール発酵をする微生物が資化構造を有し、バイオ燃料、繊維、製紙などの各産業にできる糖類への酵素分解の工程、（３）酵母等によるおいて主要な原料物質である。セルロース分解酵素は、糖からエタノールへの発酵生産の工程である。

例えば植物バイオマスからバイオ燃料を製造するよ

現在までに、多くの生物学的、化学的、物理的な前

うなバイオリファイナリー産業において非常に重要処理方法が開発されている。生物学的前処理では、褐

である[1]。

セルロースの完全分解にはいろいろな

色不朽菌、白色不朽菌などの菌類をセルロース、ヘミ

基質特異性を有する複数のセルロース分解酵素が相セルロース、リグニンの分解に用いるが、分解速度は乗的に作用することが重要である。

一般に遅い。アルカリ処理などの化学的前処理法は広白色不朽菌 Phanerochaete chrysosporium はリグノ範に研究され、頑強なリグノセルロース構造を破壊す

セルロースを完全分解できる生物であり、エンドグル

るのに効果的であることは分かっているものの、環境

カナーゼ、セロビオハイドロラーゼおよび β-グルカナーに悪影響を及ぼす。さらに、使用する化学物質に耐性

ゼなどのセルロース分解酵素を分泌する [2]。 加えて、の装置を必要としたり、中和の作業が必要であったり、銅依存性の多糖モノオキシゲナーゼ（LPMO）を分泌生

コスト面での問題をはらんでいる。最近、オゾン分解

産し、セルロースの分解を促進する [3]。 LPMO のセを利用した方法が研究され、オゾンによる酸化の過程

ルロース分解の促進作用は第二世代のバイオ燃料生が酵素分解を促進することが示された [5]。 しかし産の鍵を握ると考えられている。LPMO とセロビオー

ながら、オゾンは原子状態の酸素より酸化力が弱く、スデヒドロゲナーゼの組み合わせによりセルロース

処理時間に数時間を要し、処理速度が遅いことが問題

鎖の開裂が起こり、新たに生じたセルロース鎖の末端となっている。

にセルロース分解酵素がアクセスしやすくなり、結果

堀らはこれまでに、非平衡大気圧プラズマ技術を基として２から８倍の分解活性の向上が見られること盤として、市販のプラズマ発生装置と酸素アルゴン混が明らかとなっている [4]。

合ガスを用いた酸素ラジカル発生装置を開発していリグノセルロースからのバイオエタノール生産にる [6, 7]。

は３つのステップが存在する。

この酸素ラジカル発生装置は酸化の作用による微生物の殺菌に効果的であることが証明さ97

れており[8, 9]、前述の酵素糖化のための前処理に有2.3 酵素活性測定

効であることが期待された。

酵素（培養上清、CBHI あるいは CBHII）および基質

酸素ラジカル発生装置の前処理法への利用にはい（CMC、MCC、あるいは麦わら）を 0.5 mL の 50 mM 酢

くつかの利点がある。1）オンサイトでのラジカル生

酸緩衝液（pH 4.5）中で 37℃にて反応し、反応終了成が可能であることから、化学薬品の供給や貯蔵の必後、Nanosep centrifugal device (Pall Corporation,

要がないこと、2）常温、常圧での反応が可能なこと、Port Washington, NY, USA) で分画、Flow-through 画

3）高密度の酸素ラジカルによる迅速な反応が可能な分を 100°C、30 分間煮沸処理した。反応液中の還元

こと、4）化学的前処理より環境負荷が小さく、廃液

糖量は dinitrosalicylic acid (DNS)法にて測定した。

も生じないことが挙げられる。

標準曲線はグルコース溶液を用いて作成し、セルラー

本研究では、白色不朽菌 P. chrysosporium の培養

ゼの 1 ユニットは 1 分間に 1 μmol の還元糖（グルコ

上清を酵素剤として用い、カルボキシメチルセルロー

ース当量）を生ずる酵素量と定義した。

ス（CMC）および天然のリグノセルロースとしての麦

CMC および麦わらから生ずる可溶性の反応物は還元

わらの分解に対する、酸素ラジカルによる前処理の効

糖 HPLC 解析システム（島津製作所）にて解析した[10]。

果を詳細に調べることを目的とした。

3. 実験結果
2. 実験方法

3.1 セルラーゼ活性の経時変化と培養上清中の分泌2.1 P. chrysosporium が生産する細胞外タンパク質

タンパク質の同定
結晶性セルロースを含む培地で培養した白色不朽の解析

菌 P. chrysosporium の培養上清のセルラーぜ活性のP. chrysosporium (ATCC 34541; ATCC, Manassas, VA,

経時変化を調べたところ、7 日後に最高値（9.82 U/mL）

USA) は 1.0% 結晶星セルロースを含む Kirk 液体培地となった。図 1 に細胞外タンパク質の 2 次元電気泳動[1.2 g/L ammonium tartrate, 0.05 g/L MgSO4, 0.01のプロファイルを示した。

g/L CaCl2, 0.20 g/L K2HPO4, 1 μg/L thiamine, and1 mL/L trace mineral solution (pH 4.5)] を用いて37°C にて培養した。細胞外タンパク質を 2 次元電気泳動で分離後、 MALDI-TOF/TOF-MS にて解析をした[10]。

2.2 酸素ラジカルによる前処理
2-1-4-1 項で示した非平衡大気圧ラジカル源を用い

図 1．2 次元電気泳動による培養上清タンパク質の解析結果と同定されたタンパク質（右表）てラジカル照射を行った。ガス総流量を 4.97
standard litter per minute (slm)とし、酸素の混合
ガス流量比は酸素原子密度が最大となる 0.6 %とした。

培養上清タンパク質に由来する 32 のスポットが検照射距離は 10 mm とした。CMC (60 mg)、 MCC (60 mg)

出され、そのうち 15 種類のタンパク質が同定された。

あるいは麦わら(60 mg) を 3 mL の蒸留水に懸濁し、結晶性セルロースを含む培地中で同定されたタンパ

20 分間ラジカル照射を行った。

ク質は３つのクラスに分類された。1) セルロース分解に関与する酵素 (spot 3– 8,11– 13)、 2) キシラ

98

ン分解に関与する酵素 (spot 1, 2, 9,10)、たところ、培養上清を用いた場合と同様の反応生成物

3) その他のタンパク質(spot 14,15) (図１右表)であが得られた(図 3). CBHI の場合は酸素ラジカル照射

る。 検出されたタンパク質のうち主要なセルロースにより 1.7 倍、 CBHII の場合は 1.6 倍の促進効果が分解酵素は GH7 family に属する CBHI (図 1; spot 5,6, 11) と GH6 family に属する CBHII (図 1; spot 12)であった。

3.2 培養上清を用いたCMC分解に対する酸素ラジカル
前処理の影響結晶性セルロースを含む培地で 7 日間生育させた見られた。

P. chrysosporium の培養上清を酵素溶液として用い、

図 3．CBHI と CBHII による CMC の酵素分解に対する酸素ラジカル処理の還元糖生成への影響。CBHI（左パネル）、CBHII（右パネル）を使用。

CMC 分解による還元糖の生成に対する酸素ラジカル前処理の影響を調べた。酸素ラジカルによる前処理を行った場合、未処理の場合と比べて還元糖の生産量は顕以上、酸素ラジカル処理がセルロース鎖の開裂を引著に増加した。酵素反応 60 分後の時点では未処理なき起こし、還元末端および非還元末端の数が増えるこ

らびに対照実験（酸素ガス処理）に比べて約 2 倍の還とにより、還元末端に作用するセルラーゼと非還元末元糖が生成していた(図２)。

端に作用するセルラーゼの両方の反応を促進することが示唆された。さらに、ラジカル処理をした CMC のCBHI と CBHII による還元糖生成の促進効果が培養上清を用いた場合(図 2)よりも低いことは、培養上清中に存在する還元末端および非還元末端から作用する
セルラーゼ(CBHI および CBHII) やエンド型のセルラーゼ、LPMO などの他の酵素との相乗効果が起こって

図 2．培養上清を用いた CMC 分解による還元糖生産に対する酸素ラジカル前処理の影響。対照実験としての
酸素ガス処理（左パネル）と酸素ラジカル処理（右パネル）。 各パネルとも実線が処理区、破線が未処理区を示す。

いることを示唆している。

3.3 天然のリグノセルロースとしての麦わらの酵素
分解に対する酸素ラジカル前処理の影響

さらに、分解産物を還元糖 HPLC にて解析したところ、

酸素ラジカル処理および酸素ガス処理（対照実験）

反応時間 60 分の時点で 1.5 mM のセロビオースが検をした麦わらのセルロース、ヘミセルロース、リグニ

出された（Data not shown）。生産量に関しては対照

ン量を定量したところ、酸素ラジカル処理をした麦わ

実験の 2.0 倍であった。結晶性セルロースを用いて同らと対照実験の麦わらの組成に違いがないことが明様の実験を行ったところ、同様の結果が得られているらかとなった（Data not shown）。この結果は、酸素（Data not shown）。

ラジカル処理は麦わら中の分子の分解はするものの、

CBHI と CBHII による CMC の酵素分解に対する酸素

単糖、オリゴ糖や水溶性の低分子芳香化合物などにはラジカル処理の還元糖生成への影響を同様に評価し分解しないことがわかる。麦わらに対するプラズマ照99

射がリグニンの脱重合が起こるとの報告がされている[11]. リグニンの分解産物がセルロース分解酵素

可溶性の生成物を還元糖 HPLC にて分析すると、4.7に影響を及ぼすので、阻害物質を除去するために、麦mM のセロビオースが検出された(図 5)。

わらのプラズマ照射前処理後に水による洗浄のステップが重要である [11]。本研究では、先行研究に倣い、酸素ラジカル処理をした麦わらは水で洗浄して酵素阻害物質を除去しているが[11]、洗浄画分を凍結乾燥して、トリメチルシラン化した後に、ガスクロマト
グラフィー質量分析機（GC-MS）で分析したところ、糖やリグニンの分解物は検出されなかった（Data notshown）。以上の結果は、非平衡常圧プラズマ技術を用いた酸素ラジカル処理は低分子量のリグニン分解
図 5．酸素ラジカル前処理の麦わらの酵素分解産物の解析。実線が処理、破線が未処理を示す。

物を生成しないことを意味している。先行研究では、
本実験（20 分）より長い時間（最長 7 時間）の処理を行なっていたために、阻害物質が生成されたのかも

植物バイオマスの酵素反応の前処理において、化学しれない。

的な処理に比べての酸素ラジカル処理の利点は、化学

酸素ラジカル前処理した麦わらを、洗浄、非洗浄の薬品や有機溶媒を使用する代わりに気体を用いるこ

条件に分け、48 時間の酵素処理した後に、還元糖分とで、濾過や精製、化学薬品の回収、廃液の処理をす析をした。その結果、洗浄、非洗浄の条件ともに、ほる必要がないことである。酸素ラジカル処理はまた、

ぼ同じ還元糖量であることがわかった。

薬品を使用しないため、さらにコストが抑えられる。

この結果に基づき、麦わらの酵素分解に対する酸素ラ

再生エネルギーを用いてプラズマを発生させ、酸素ラ

ジカルの影響を非洗浄の条件で調べることとした。

ジカルの生成プロセスに利用することができれば、よP. chrysosporium 培養上清を用いた 1、6、12、24、り魅力的である。従来の前処理法に比べ、酸素ラジカ

48、および 72 時間の反応では、酸素ラジカル前処理

ル処理法は現在はまだほとんど普及していないが、バにより、それぞれ、 1.4 倍, 1.4 倍, 1.4 倍, 1.5 倍,

イオマスの酸素ラジカル前処理法の持続可能性を十

1.8 倍, および 1.8 倍の還元糖量となった (図 4)。

分に検証することは、非常に重要である。
また、産業利用の観点から、酵素生産のコストを低く抑えることも重要である。一般に、酵素精製のステップは時間がかかり、酵素生産のコストの約 8 割を占めているといわれている [12]。 P. chrysosporium の培養液から得られる上清は、還元末端に作用するセル
ラーゼと、非還元末端に作用するセルラーゼ(CBHI お
よび CBHII)の両方を主たる酵素として含んでいるので、この培養上清を直接利用することにより、酵素精製のプロセスを省くことができるので、大きく酵素利

図 4．麦わらの酵素分解に対する酸素ラジカル前処理の影響用のコストも下げることができる。

100

4.

Leipold F. Appl Biochem Biotechnol. 2011; 165:
1010-23.
[12] Hearn MT, Acosta D. J Mol Recognit. 2001; 14:323-69.
[13] Sakai K, Kojiya S, Kamijo J, Tanaka Y, Tanaka K,
Maebayashi M, Oh JS, Ito M, Hori M, Shimizu M,
Kato M. Biotechnol Biofuels. 2017; 10: 290.
doi:10.1186/s13068-017-0979-6.

結論

本研究では、CMC と麦わらの酵素分解に対する酸素
ラジカル前処理の効果について詳細な解析を行った。
酸素ラジカル処理は 白色不朽菌 P. chrysosporium の培養上清に存在する還元末端側から作用するセルラーゼと非還元末端から作用するセルラーゼとの両方によるセルロースの分解を促進することが明らかとなった。CMC ならびに麦わらを酸素ラジカル処理後に酵素処理をした場合の反応生成物の量は、対照実験の結果と比べて、CMC では 2.0 倍、麦わらでは 1.8 倍のとなった。以上、リグノセルロースの酸素ラジカル処
理は、酵素分解の前処理法として植物バイオマスの有効利用に関して顕著な貢献をすることが期待される。
（本研究で得られた成果は、既に原著論文[参考文献13]にて出版された。本稿は原著論文ではなく、研究成果を解説した報告書である。）

参考文献[1] Sims RE, Mabee W, Saddler JN, Taylor M. Bioresour
Technol. 2010;101:1570-80.
[2] Fushinobu S. Nat Chem Biol. 2014; 10: 88-9.
[3] Hemsworth GR, Johnston EM, Davies GJ, Walton PH.
Trends Biotechnol. 2015; 33: 747-61.
[4] Langston JA, Shaghasi T, Abbate E, Xu F, Vlasenko E,
Sweeney MD. Appl Environ Microbiol. 2011; 77:
7007-15.
[5] Shi F, Xiang H, Li Y. Bioresour Technol. 2014; 179:
444-51.
[6] Inui H, Takeda K, Kondo H, Ishikawa K, Sekine M,
Kano H, Yoshida N, Hori M. Appl Phys Express. 2010;
3: 126101.
[7] Iwasaki M, Matsudaira Y, Takeda K, Ito M, Miyamoto
E, Yara T, Uehara T, Hori M. J Appl Phys 2008; 103:023303.
[8] Hashizume H, Ohta T, Fengdong J, Takeda K,
Ishikawa K, Hori M, Ito M. Appl Phys Lett. 2013; 103:
153708.
[9] Kobayashi T, Iwata N, Oh JS, Hahizume H, Ohta T,
Takeda K, Ishikawa K, Hori M, Ito M. i 2017; 50:
155208.
[10] Shimizu M, Kaneko Y, Ishihara S, Mochizuki M,
Sakai K, Yamada M, Murata S, Itoh E, Yamamoto T,
Sugiyama Y, Hirano T, Takaya N, Kobayashi T, Kato
M. J Biol Chem. 2015; 290: 27914-27.
[11] Schultz-Jensen N, Kádár Z, Thomsen AB, Bindslev H,101

2-2-3 バイオマス燃料用アミロースの高効率分解技術の開発— 大気圧ラジカル処理コウジカビによるアミラーゼ産生促進 —伊藤 昌文 1） 、田中 優太 1) 、後藤 拓也 1)、加藤 雅士 2)、志水 元亨 2)1）名城大学 理工学研究科
2) 名城大学 農学研究科

1. 緒

言

して O(3Pj)照射量に応じて増殖が促進されることも近年、化石燃料の採掘限界が懸念されており、化石報告してきた。[11]

燃料に代わり再生可能エネルギーを利用した循環型

本研究では、プラズマ中に生成されるラジカルのう

社会の形成が注目を集めている。我々は、再生可能エ

ち、電気的に中性な酸素ラジカルに着目し、実験対象

ネルギーの中でも、特にバイオマスを利用したエタノにアミロース分解酵素であるアミラーゼを産生する

ール生成に注目した。バイオエタノールの製造過程はニホンコウジカビ胞子を対象として、酸素ラジカルに

バイオマスを単糖や二糖まで分解する糖化と、糖を酵よるカビの成長促進効果と酵素活性化を検証し、酵素

母に吸収させエタノールを生成する発酵がある。糖化の生産性の向上に向けた研究に取り組んだ。

過程には強酸等を用いた方法と酵素を用いた方法があり、後者は環境への負荷が小さいことが利点である。

2. 実験方法

しかしながら、バイオマスの糖化処理に用いられる酵

2.1 デンプン分解量測定

素の生産性が低く、バイオエタノールの生産コストを寒天培地上に成長しているコウジカビから胞子 10増加させる一つの要因となっている。

mg を電子天秤にて正確に測り取る。マイクロチュー

非平衡大気圧プラズマは低温であるため生体試料

ブにカビ胞子 10 mg と滅菌処理された超純水を用いてや生体組織に直接照射することが可能である。

1 %に調整した界面活性剤 Tween20（Wako 製, Poly

[1.2.3] 近年、医療分野や農業分野において盛んに応

oxyethylene (20) Sorbitan Monolaurate）溶液を 1

用研究がなされている。 [4.5]ｍL 加えたのち、10 倍希釈したものを胞子懸濁液

一般的に外部からの物理的及び化学的なストレス（107CFU/mL 相当）とする。φ35mm のディッシュシャが与えられると、細胞は活性化または不活性化される。

ーレに胞子懸濁液 1 μL を合計 25 箇所に滴下し、乾また、プラズマ中の活性酸素種（Reactive Oxygen

燥させたものを照射サンプルとした。

Species; ROS） や活 性窒 素種 （Reactive Nitrogen

2-1-4-1 項で示した非平衡大気圧ラジカル源を用い

Species; RNS）が細胞の活性化、不活性化に関与しててラジカル照射を行った。ガス総流量を 5 standard

いることが報告されつつある。[6.7.8]

litter per minute (slm)とし、酸素の混合ガス流量

我々はプラズマ中に生成される電気的に中性な酸比は酸素原子密度が最大となる 0.6 %とした。照射距

素ラジカルによるミドリカビ胞子の殺菌効果につい離は 10 mm とした。また、サンプル全体に照射するたて検証した結果、基底状態の酸素原子 O(3Pj)が殺菌因

め 4 mm/s の速度で 16 mm の範囲を前後にスキャン操子であることを報告した。[9.10] また出芽酵母に対作し、サンプル全体に照射できるようにした。大気の102

影響をできるだけなくすために、照射口からサンプル

キットのマニュアルに従い、プラスチック試験管までの空間をプラスチックカバーで覆いアルゴンガに合成基質 N3-G5-CNP の溶液 500 µl とキット付属のスでパージした後、酸素ラジカル照射を行った。照射

酵素溶液 500 µl を加え、撹拌した混合液を 37℃で約

時間は 15, 30, 45 s とした。

5 分間予備加温した。混合液に 40 倍濃縮酵素液（測照射されたサンプルは 300 μL の Tween20 溶液にて定試料）を 100 µl を加え 37 ℃で 10 分間反応させた。

掻き取られた。回収されたサンプルは、Czapek-Dox

反応停止液 2 ml を加え撹拌後、キュベットに反応液

液体培地中で 28 ℃、100 rpm で振盪培養された。培を 800 µl 播種し、分光光度計を用いて波長 400 nm

養後、吸引濾過器を用いて菌体と上澄み液に分離した。

の吸光度を測定した。測定値を式(3.1)に代入しα-

コウジカビによって酵素分泌された上澄み液 200 µL

アミラーゼの活性を算出した。[12]。

を 0.5 %のデンプン水溶液 200 µL と 250 mM のリン酸

<α-アミラーゼ活性算出方法>
α-アミラーゼ活性(U / mL)

緩衝液 100 µL の混合液に加え 1 時間反応させた。反
応後、酵素反応液 100 μL とヨウ素溶液 20 μL をよ= ( Es1 － Eb1 ) × 0.179(1)

く混ぜ、96 well プレートに 100 μL ずつ移し、プレ

ただし、Es1:測定試料の吸光度、Eb1:ブランクの吸光ートリーダーにて 620 nm の波長で吸光度を測定した。

度である。

吸光度とデンプン量の検量線を図 1 に示す。この検量線を用いてアミラーゼ酵素によって分解されたデン2.3 糖化力分別定量測定

プン量を定量化した。

本実験では糖化力分別定量測定キット(キッコーマ
ンバイオケミファ社製)を用いてグルコアミラーゼ・
α-グルコシダーゼの活性を測定した。。
プラスチック試験管に G2-β-PNP 基質溶液 500 µLとβ-グルコダーゼ酵素液 500 µL を加え撹拌した混合液を 37℃で 5 分間予備加温した。混合液に 2.2 より得られた 40 倍に濃縮したコウジカビ抽出液を 100 µl
を加え 37 ℃で 10 分間反応させた。反応停止液 2 mlを加え撹拌後、キュベットに反応液を 800 µl 播種し、分光光度計を用いて波長 400 nm の吸光度を測定した。

図 1 吸光度とデンプン濃度の検量線

測定値を式(2)に代入し酵素液の糖化力を算出した。
プラスチック試験管に PNPG 基質溶液 2 mL を加え

2.2 α-アミラーゼ活性測定
2.1 で得られた上澄み液をバッファー置換用ゲル

37℃で 5 分間予備加温した。混合液に 5.5.2 項より得

濾過カラム(PD10)を用いて培地成分を 50 mM, pH 5.8

られた 40 倍濃縮したコウジカビ抽出液を 100 µl を加のリン酸緩衝液に置換した。置換後の酵素液を遠心濃え 37 ℃で 10 分間反応させた。反応停止液 2 ml を加縮チューブ（Vivaspin）に添加し、遠心分離機を用い

え撹拌後、キュベットに反応液を 800 µl 播種し、分温度 4 ℃,回転速度 3000 rpm で遠心操作を行い 40 倍光光度計を用いて波長 400 nm の吸光度を測定した。

(10 ml→250 µl)まで濃縮した。濃縮した酵素液をα-

測定値を式(3),(4)に代入し酵素液に含まれるグルコアミラーゼ測定キット(キッコーマンバイオケミファ

アミラーゼ・α-グルコシダーゼ活性を算出した。

社製)を用いてα-アミラーゼの活性を測定した。

[13,14,15]103

図3 照射距離15 mmのラジカル照射による細胞数変化

3. 実験結果

3.3 糖化力分別定量測定

3.1 デンプン分解促進効果

図4に示すグルコアミラーゼ活性測定結果では、照射

図2に酸素ラジカル照射時間によるデンプン分解量
測定結果を示す。照射時間15 sにおいて最大値を示し、時間15 sにおいて最大値を示し、未照射に比べて約1.2倍活性が向上した。

未照射に比べて約1.4倍分解量が向上した。その後、一方で、図5に示すα-グルコシダーゼ活性測定結果

照射時間が増加するにつれてデンプン分解量は減少

では、照射時間15 sにおいて最大値を示し、未照射に傾向にあることが示された。

比べて約1.1倍活性が向上した。
照射時間30 s以降のラジカル照射はそれぞれの酵素

3.2 α-アミラーゼ活性測定

活性が減少傾向にあることが示唆された。

図3に酸素ラジカル照射時間によるα-アミラーゼ活性測定結果を示す。照射時間15 sにおいて最大値を示
し、未照射に比べて約1.4倍活性が向上した。その後、照射時間が増加するにつれてα-アミラーゼ活性は減少傾向にあることが示された。

図4 グルコアミラーゼ活性―照射時間依存性

図2 デンプン分解量―ラジカル照射時間依存性

図5 α-グルコシダーゼ活性―照射時間依存性

4.活性化効果の検討
本研究では酸素ラジカル照射においてコウジカビ胞子の活性化効果を検討した。具体的には、酸素ラジカ
ル照射されたコウジカビ胞子を液体培養することで

図3 α-アミラーゼ活性―ラジカル照射時間依存性得られる酵素分泌液の活性への影響を調査した。
アミラーゼ活性によるデンプン分解量では、酸素ラ104

[3] K. Ishikawa, H. Mizuno, H. Tanaka, K. Tamiya, H.
Hashizume, T. Ohta, M. Ito, S. Iseki, K. Takeda, H.
Kondo, M. Sekine, and M. Hori, Appl. Phys. Lett. 101(2012).
[4] Min Ho Kang, Anchalee Pengkit, Kihong Choi, Seong
Sil Jeon, Hyo Won Choi, Dong Bum Shin, Eun Ha
Choi, Han Sup Uhm, Gyungsoon Park, DOI:10.1371 /journal. pone. 0139263 (2015).
[5] N. Hayashi, Y. Yagyu, A. Yonesu, M. Shiratani, Jpn. J.
Appl. Phys. 53, 05FR03 (2014).

ジカル照射時間 15 s において未照射の 1.4 倍となり活性の向上が確認された。また、コウジカビが分泌する 3 種類のデンプン分解酵素群（α-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ）はどれも照射
時間 15 s で最大となり、それぞれ未照射より 1.4 倍,
1.2 倍, 1.1 倍の活性の向上が確認された。α-アミラーゼは不規則にデンプンの糖鎖を切断することができるため、デンプンの分解に対する寄与率が大きいが、グルコースへの変換については、その他の酵素も相乗的に作用しうることから、酸素ラジカル照射がデンプンからグルコースへの変換反応を効率的に促進しうることが示唆された。

5.結論
本研究では、酸素ラジカルに着目し、本研究では、
酸素ラジカルをニホンコウジカビ胞子に照射し、デンプン分解量への影響を検証した。さらに、測定キット
を用いてコウジカビより産生されるデンプン分解酵素群(α-アミラーゼ・グルコアミラーゼ・α-グルコ[6] V Raballand, J Benedikt, J Wunderlich and A von
Keudell1, J. Phys. D: Appl. Phys. 41, 115207(2008).
[7] A. Tani, Y. Ono, S. Fukui, S. Ikawa, and K. Kitano,Appl. Phys. Lett. 100, 254103 (2012).
[8] E. Takai, S. Ikawa, K. Kitano, J. Kuwabara and K.
Shiraki, J. Phys. D: Appl. Phys. 46, 295402 (2013).
[9] H. Hashizume, T. Ohta, K. Takeda, K. Ishikawa, M.
Hori, and M. Ito, Jpn. J. Appl. Phys. 53, 010209(2014).
[10] H. Hashizume, T. Ohta, T. Mori, S. Iseki M. Hori, and
M. Ito, Jpn. J. Appl. Phys. 52, 056202(2013).
[11] H. Hashizume, T. Ohta, M. Hori, and M. Ito, Appl.
Phys. Lett. 107, 093701 (2015).
[12] 白兼孝雄,「日本醸造協会誌」 91 , 889 - 894( 1996 ).
[13] 今井泰彦 「日本醸造協会誌」 91 , 51 - 57 ( 1996 ).
[14] 今井泰彦「日本醸造協会誌」92 , 296 -302 ( 1997 ).
[15] 今井泰彦 「日本醸造協会誌」 90 , 823 -827
( 1995 ).

シダーゼ)それぞれの活性化を検証した。
その結果、酸素ラジカル照射によるコウジカビの酵
素活性化効果の検証を行った。その結果、照射時間
15 s でデンプン分解量は 1.4 倍まで増加し、最終目標である分解促進 30％以上を達成した。
さらに、コウジカビが分泌する各アミラーゼの活性化を検証した結果、α-アミラーゼ活性は 1.4 倍、グルコアミラーゼ活性は 1.2 倍、α-グルコシダーゼ活性は 1.1 倍まで増加し酸素ラジカル照射による酵素活性化効果が明らかとなり、デンプン分解促進効果は
主にα-アミラーゼ活性の向上の効果であることが分
かった。

参考文献
[1] S. Iseki, H. Hashizume, F. Jia, K. Takeda, K. Ishikawa,
T. Ohta, M. Ito, and M. Hori, Appl. Phys. Express 4,116201 (2011).
[2] 高木 浩一, J. HTSJ, Vol. 51, No. 216 (2012).

105

2-2-4-1

バイオマス燃料用高効率発酵技術の開発（その 1）— 大気圧ラジカル処理によるアルコール発酵酵母の増殖促進 —伊藤 昌文 1）、橋爪 博司 2)、小林 潤 1)、岡地 正嗣 1)、加藤 雅士 3)、志水 元亨 3)、堀 勝 2)
1）名城大学 理工学研究科
2) 名古屋大学 低温プラズマ研究センター
3) 名城大学 農学研究科

1. 緒

言

質によって細胞に対する影響も異なると考えられる。

近年では医療分野、農業分野や水産分野においてプ[7] しかしながら、プラズマから生成される活性種がラズマの応用が期待され、盛んに研究され始めている。

液体との相互作用により生成される活性種がどのよ

医療分野においては、プラズマによる止血、血管新生、うな過程を経て、細胞に影響しているかは未だ解明さ臓器癒着防止、細胞増殖等、様々な「治療効果」が期れていない。効果の効率向上や、効果を最適に制御す待され始めている。[1] 農業分野においても微生物のるためにはもちろん、技術の安全性確保の観点からも殺菌、植物の生産性の向上、農作物の鮮度保持にプラ

このメカニズムの解明はプラズマの医療、農業分野へ

ズマの応用が期待されている。[2, 3, 4] 一般的に、の実用化に必要不可欠な喫緊の課題となっている。

外部からの物理的または化学的ストレスが与えられ

本研究では、これらのメカニズム解明に向けて、プることにより細胞の活性化または不活性化などの反ラズマ中に生成されるラジカルのうち、電気的中性な応が起きるとされている。[5] そのため、プラズマに

酸素ラジカルに着目して真核細胞のモデル細胞でもより発生するイオンやラジカル等の反応活性種が生ある出芽酵母細胞を対象として、増殖促進効果、不活体に作用することで上記のような効果の発現が期待性化効果の作用機序の解明に向けた研究に取り組み、されている。プラズマ中に生成される因子の中でも特増殖促進効果を最大限に引き出す検討をした。

に効果が高いとされるのが活性酸素種（Reactive
Oxygen Species, ROS ） や 活 性 窒 素 種 （ Reactive

2. 実験方法

Nitrogen Species, RNS）である。活性酸素は細胞に

2.1 照射距離依存性評価実験
初めに、Φ90 mm のシャーレに Yeast extract

対して酸化ストレスを与えるが、この酸化ストレスを過度に与えると脂質、タンパク質や DNA など生体分子

Peptone Dextrose(YPD）寒天培地上に植菌しておいたレベルで障害を与える。一方、軽度の酸化ストレスを出芽酵母のコロニーを取り出し、振とう培養チューブ

与えた場合には、細胞増殖や生体にとっての防御反応に YPD 液体培地 3 ml に入れた。その後、振とう培養を誘導すると考えられている。[6] 気相中では、これ機で 30℃、250 rpm で 18 時間培養(前培養)を行った。

らの活性種は細胞に直接作用するが、液相では気液界

18 時間液体培養後、培養された酵母懸濁液を遠心分面での反応が起点となり活性種は異なる活性種に変離器(5000×g、25℃、 5 min)で集菌した。集菌後、化して微生物に作用する。また、液体に含まれる物質

培養液を捨て Phosphate Buffered Saline(PBS(-))でによって活性種との反応が異なるため、生成される物

細胞濃度 1×107 cell/ml に調整するよう懸濁して酵

106

母懸濁液を作成した。そこから、PBS(-)で 10 倍希釈

射時間を 15、30、45、60、180、300 秒として、酸素したものをΦ15 mm のシャーレに 3 ml 入れて酸素ララジカル照射を行った。照射後、溶液①、②、③におジカル照射した。2-1-4-1 に示したラジカル源を用い

いては増殖効果を検証するために、24 時間ごとにセて酸素ラジカルを照射した。ラジカル源にはアルゴン

ルカウントを行った。また、全ての溶液において不活(Ar)と酸素 (O2)の混合ガスの総流量を 5 slm とし、性化効果を検証するために、照射後のサンプルを遠心

流量比 O2/(Ar+O2)を 0.6%として供給した。この条件は分離器(5000×g、25℃、10 min)×3 で酵母を集菌し、基底状態の酸素原子が最も多く生成される条件であPBS(-)で照射時の細胞濃度になるよう再懸濁した。そる。[8] ラジカル出射部から試料液面までの距離（照の後、酵母懸濁液を希釈(101～104)行い、懸濁液 100 µl射距離）をは 10、15、20 mm とし、照射時間は照射距

を YPD 寒天培地上に塗布した。寒天培地を培養棚で離 10 mm のときは 10、20、30、40、50 s とし、照射

30℃、48 時間培養してコロニーカウント法により不距離 15 mm のときは、30, 60, 90, 120 s とし、照射活性化効果を評価した。

距離 20 mm のときは、30, 180, 360 s とした。この

3. 実験結果

とき、照射部にカバーを取り付け、サンプルと照射部

3.1 培養時間に対する酵母数の変化

を Ar でパージすることにより大気の影響を少なくし

図1に30秒と5分間、酸素ラジカルを照射したときのた状態でサンプルに酸素ラジカルを照射した。また，

酵母細胞と未照射の場合の培養時間に対する細胞数

サンプル全体に酸素ラジカルが照射されるようにスの変化を示す。これから30秒照射の酵母の増殖率が未テージを用いて、
スピードは 4 mm/s として走査した。

照射のものに比べて細胞数が多く、30秒照射の場合は照射後、遠心分離器を用いて、25℃、5000×g の条件

48時間、未照射の場合は72時間でほぼ増殖限界まで細で 10 分間遠心分離を 3 回実施［(5000×g、25℃、10胞数が増えることが分かった。5分照射は増殖が抑制min)×3 と表記］して酵母を集菌し、PBS(-)で再懸濁され、培養時間72時間でも細胞数は107個以下であっした。その後、セルカウント法による細胞数を計測し、た。培養時間48時間後が増殖率の差が大きくでること

計測結果をもとに 1×103 cell/ml に調整して YPD 液から、この後の実験は培養時間を48時間として行った。

体培地に入れ、72 時間まで浸とう培養機で培養した。
その後、24 時間ごとにセルカウントを行い、増殖効
果を評価した。

2.2 照射溶液依存性評価実験
前培養は 2.1 と同様の方法で培養し、酵母懸濁液を遠心分離器(5000×g、25℃、 5 min)で集菌した。
集菌後、培養液を捨て①PBS(-)、②YPD、③水道水の脱イオンとオートクレーブ滅菌処理（121℃、0.12 Pa
20 min）により作成した Deionized Distilled Water(DDW)で細胞濃度 1×107 cell/ml に調整して酵母懸濁

図1 酵母細胞の培養時間に対する細胞数の変化液を作成した。各溶液で 10 倍希釈したものをΦ15 mmのシャーレに 3ml 入れた。その後、ラジカル源に設置

3.2 照射距離に対する酵母増殖率の変化

し、液面から照射部までの距離を 10 mm と固定して照107

図2に照射距離10, 15, 20 mmにおけるラジカル照射

態の酸素原子（O(3Pj)）照射量としたグラフを示す。

時間に対する酵母細胞の48時間後の増殖率を示す。増酵母が入ったPBS溶液単位体積当たりへの基底状態酸

殖率はラジカル未照射の酵母の48時間インキュベー

素原子照射量は以下の式から算出した。

ト後の細胞数をコントロールとして、それに対するラO(3Pj)照射量/サンプル体積（個/cm3）＝真空紫外吸収

ジカル照射酵母の48時間インキュベート後の細胞数分光法で測定したO(3Pj)密度×ガス流速（cm/s）×出の比を表す。

射口面積（㎝2）×照射時間(s)÷サンプル体積（cm3）

全ての照射距離において増殖促進しており、照射距

図3から6×1016～2×1017 cm-3では増殖、3×1017～1×

離10 mmでは30 s照射で約15%、照射距離15 mmでは45 s

1018 cm-3 では抑制、1×1018 cm-3以上の照射量では不照射では約25%、照射距離20 mmでは約20%の増殖率を活性化が起こっていることが分かる。

示した。照射距離が長くなるにつれて増殖促進に必要以上の結果から、O(3Pj)照射量を制御することで、なラジカル照射時間が長くなることがわかる。また、細胞増殖を制御できる可能性を見出すことができた。

照射距離が短いほど増殖促進から増殖抑制にかかる

また、この結果からPBS中の酵母細胞に酸素原子を照時間が早いことが明らかとなった。

射することで約25％の増殖促進を得ることに成功した。

3.3 PBS、YPD、DDW溶液の違いによる増殖促進・不活性化効果の変化
図4に48時間後の各溶液の照射時間に対する増殖促
進の結果を示す。YPD(酵母用液体培地)とDDW(脱イオン滅菌水)へのラジカル照射ではPBSと比較すると、ラジカル照射による増殖促進効果は小さいことが明ら
図2 照射距離10, 15, 20mmにおけるラジカル照射時間
に対する細胞増殖率（未照射時の細胞数に対する増加率）の変化かとなった。不活性化効果も増殖効果と同様にラジカ
ル照射5 minまでYPDとDDWに懸濁された酵母では増殖効果が確認されなかった。（Data not shown）

図 4 各溶液のラジカル照射時間に対する増殖率
図3 O(3Pj)照射量に対する細胞増殖率の変化
同様な実験を酸化窒素（NOx）ラジカルについても行
図3に図2の実験結果の横軸を下記の手順で基底状

い、NOx の照射によっても同様に増殖効果が得られる

108

靖史, 太田 貴之, “プラズマによる農作物の鮮度保持・加工”, J. Plasma Fusion Res. Vol.90, No.10
587-594 (2014) [6] H. Hashizume, T. Ohta, J.
Fengdong, K. Takeda, K. Ishikawa, M. Hori, M. Ito,Appl. Phys. Lett. 103, 153708 (2013).
[5] 勝木 淳, 矢野 正彦, 光武 和典, 諸冨 桂子, 安部
恵祐, 矢野 憲一, 秋山 秀典, J. Plasma Fusion Res.
Vol.87, No.10 710-714 (2011).
[6] 榮長 裕晴, 吉原 栄治, 松尾 禎之, 淀井 淳司,“酸化ストレスとレドックス制御”, 生物試料分析.
Vol. 32, No4 (2009).
[7] Y. Ryu, Y. kim, J. Lee, G. Shim, H. Uhm, G. Park and E.
Choi, “Effect of Bachground Fluid on the Efficiency ofInactivating Yeast with Non-Thermal AtmosphericPressure Plasma”, PLOS one, Vol 3,6 e66231 (2013).
[8] S. Iseki, H. Hashizume, F. Jia, K. Takeda, K. Ishikawa,
T. Ohta, M. Ito., and Masaru Hori, “Inactivation of
Penicillium digitatum Spores by a High-Density
Ground-State
AtomicOxygen-Radical
SourceEmploying an Atmospheric-Pressure Plasma”， Appl.
Phys. Express. 4, 116201 (2011).
[9] Hiroshi Hashizume, Takayuki Ohta, Masaru Hori, andMasafumi Ito, “ Growth control of Saccharomyces
cerevisiae through dose of oxygen atoms” Applied
Physics Letters Vol. 107, 093701 (2015).

ことが分かった。また、酸素ラジカル照射時とは異なり、DDW 中の酵母に NO ラジカルを照射することで酵母が増殖することが分かった。(Data not shown)しかしながら、増殖率は約 25%と酸素ラジカルと同程度であることが確認された。

4.結論
本研究では、プラズマから生成される電気的に中性な酸素ラジカルと酸化窒素ラジカルに注目し、それらによる出芽酵母細胞の増殖促進または不活性化効果の検証を行った。これらの結果から O(3Pj)の密度と増殖効果に相関があり、主に O(3Pj)が増殖効果に寄与していることが示唆された。また、溶液の種類により増殖および不活性化効果が異なり、PBS に懸濁された出芽酵母のみに酸素ラジカルの効果が顕著にみられることが分かった。さらに酸化窒素ラジカル照射においは PBS 以外に、脱イオン滅菌水（DDW）でも約 25%程
度の増殖促進が確認された。これらのことからラジカルと溶液の種類により、異なる活性種が液中に生成され、それが増殖促進に寄与していることが推測できる
が、活性種の特定には至っていない。
酸素ラジカルまたは酸化窒素ラジカル単独の効果ではプロジェクトで目標としていた 30%以上の増殖率の促進は、PBS,YPD、DDW 中では困難であることが分かった。
（これらの成果は様式 2 の雑誌論文 3 の内容の一部に対応し、既に原著論文[参考文献 9]にて出版された、本稿は原著論文ではなく、研究成果を解説した報告書であ
る。）

参考文献
[1] 浜口 智志，”プラズマ医療におけるプラズマ生体相互作用”，J. Plasma Fusion Res. Vol.87, No.10
695-703 (2011).
[2] 高木 浩一, “プラズマの農業利用”, J. Plasma
Fusion Res. Vol.90, No.9 531-533 (2011).
[3] 高木 浩一, 内野 敏剛, 内田 諭, 小田 昭紀, 佐藤
岳彦, 勝木 淳,“プラズマによる農業応用の基礎”,
J. Plasma Fusion Res. Vol.90, No.9 534-540 (2014).
[4] 清水 一男, 内田 諭, 佐藤 岳彦, 大嶋 孝之, 南谷

109

2-2-4-2 バイオマス燃料用高効率発酵技術の開発（その 2）—酸素ラジカル照射が植物バイオマス由来の発酵阻害物質を低減し、酵母によるエタノール生産を顕著に促進する—加藤雅士 1）、志水 元亨 1）、伊藤 奨 1）、酒井 杏匠 1）、伊藤 昌文 2）
1）名城大学 農学研究科
2）名城大学 理工学研究科

1. 緒

言

バニリンの濃度は、バイオマスの種類や処理方法によリグノセルロースを液体燃料や他の化学製品に変換

り大きく変わることが知られている。バニリンは濃度することは持続可能なエネルギーの獲得と環境保全

依存的に酵母の生育を抑え、発酵を抑制するため、エに重要である [1]。リグノセルロースは主に、セルロ

タノール発酵の阻害物質となりうる。このため、バニース、ヘミセルロース、リグニンからなる。セルロー

リンの毒性がバイオエタノール生産のコスト低減のスとヘミセルロースは酵素分解により、発酵可能な糖足かせとなっている [7]。

に変換できるが、リグニンはリグノセルロース性バイ

陰イオン交換樹脂処理、活性炭処理、硫酸処理、ラッ

オマスの糖化にとってマイナスの働きをしている

カーゼ処理など、リグニン由来のフェノール化合物の[2]。リグニンは高分子のフェノール化合物であるが、無毒化には種々の方法が検討されているが、これらの3 つの単位（ヒドロキシフェニル核（H）、グアイアシ

方法では長い処理時間を必要としたり、廃液を生じてル核（G）、シリンギル核（S））から構成されており、環境に負荷をかけたりしている。さらに、これらの方ランダムにアリルエステル結合、エステル結合、炭素法では、アルカリや酸に耐性の装置、中和の工程、化結合でつながっている [3]。

学物質の回収、廃液処理などを必要とするため、リグリグノセルロースからバイオエタノール生産を行う

ノセルロースを含むバイオマスからの効率の良いエには、一般に 3 つの工程がある：

タノール生産のための環境負荷の低いバニリンの除1）リグノセルロース構造を壊すための前処理工程、2）セルロースや去法の開発が緊急の課題である。

ヘミセルロースなどの多糖の酵素分解による発酵可

2-1-4-1 項で述べたように、当研究グループでは、非能な糖への変換工程、3）糖からエタノールへの発酵

平衡大気圧プラズマ技術を用いた酸素ラジカル発生工程である[4]。前処理は、酵素がセルロースにアク装置の開発に成功している。
2-2-2 項で述べたように、セスし易くすることを目的として、バイオマスの化学

我々はセルロースおよび麦わらへの酸素ラジカル照的、物理的性質を変えるために必要な操作である [5]。

射が、白色不朽菌 Phanerochaete chrysosporium 由来

種々の生物学的、化学的、物理的な前処理法が開発さのセルロース分解酵素による糖化反応の前処理としれてきている [6]。

て非常に有効であることを示した [8]。

バニリンは一般に、草本、軟木、硬木を問わずリグノ本研究では、酵母によるエタノール生産の阻害物質

セルロースから発酵可能な糖を生産する工程での副であるバニリンに対する酸素ラジカル照射の影響を産物である。リグノセルロースの加水分解時における詳細に調べることを目的とした。さらに、稲わらのア110

ルカリ前処理により生ずるリグニン由来のフェノー

清中のエタノールはエタノール測定キット (メガザ

ル物質に対しても酸素ラジカルの影響を調べること

イム

とした。

定した。

2. 実験方法

2.4 アルカリによる前処理と稲わらへの酸素ラジカ

2.1 試薬および実験材料

ル照射

バニリン、バニリン酸、3.4-ジヒドロキシ-5-メトキ

アルカリ処理の前に、稲わらは直径約１mm の粒子とシベンズアルデヒドは和光純薬（大阪）から、2-メトなるようにミルで粉砕した。蒸留水で洗浄し、45°C

キシヒドロキノンは東京化学工業（東京）から、プロ

24 時間の乾燥後、20 g の稲わらを 1N NaOH 溶液 400

トカテク酸はシグマアルドリッチ（セントルイス、米mL に懸濁した。懸濁液を 37°C、24 時間、100 rpm に国）から、プロトカテクアルデヒドはナカライテスクて振盪しながら保温し、さらに 120°C 、60 分間オ（京都）から購入し、酵母の生育阻害剤として使用しートクレーブ処理をした。6 N HCl で中和した後、GC-た。Aspergillus niger 由来のセルラーゼ（比活性MS の定量解析のための内部標準として 50 µM のグリ

29,500 unit/g 主として endo-β-1,4-glucanase とシンを添加した。酸素ラジカルを同様に照射し、実験

β-1,4-glucosidase を含む。）は東京化学工業より入に用いた。

インターナショナル, アイルランド) にて測手した。 稲わらは名城大学附属農場（春日井、愛知）

3. 実験結果で収穫したものを使用した。稲わらは 45℃で 3 時間

3.1 バニリンへの酸素ラジカル照射

乾燥後、ミルで直径約１mm に粉砕した。蒸留水で洗浄

酸素ラジカル照射がバニリンに与える影響を高速

後、45℃で 24 時間乾燥し実験に使用した。

液体クロマトグラフィー(HPLC) と GC-MS で解析した。
酸素ラジカル照射によるバニリンの経時変化を調べ

2.2 酸素ラジカルによる前処理

たところ、処理時間が増加するにつれ、バニリンの量

2-1-4-1 項で示した非平衡大気圧ラジカル源を用いが減少した（Data not shown）。バニリン (5.0 mM)て ラ ジ カ ル 照 射 を 行 っ た 。 ガ ス 総 流 量 を 4.97

は 0.96 mM まで減少し、代わりにバニリン酸 (0.20

standard litter per minute (slm)とし、少量の酸素mM)、プロトカテクアルデヒド(0.14 mM)、プロトカテ（30 sccm）含むアルゴンガスを使用した。照射距離

ク酸 (0.01 mM)、メトキシヒドロキノン(0.03 mM)、は 10 mm とした。バニリン(1.0 mM, 2.5 mM, and 5.0

3,4- ジ ヒ ド ロ キ シ -5- メ ト キ シ ベ ン ズ ア ル デ ヒ ドmM)は 0.25% アセトニトリル(3.0 mL)に溶解し、酸素(0.14 mM)、およびトリヒドロキシ−5–メトキシベンゼ

ラジカル発生装置により酸素ラジカルを照射した。

ンが検出された。また、物質の同定はされていないが、芳香族化合物の 2 量体と思われる物質が同定された

2.3 酵母菌株、生育、エタノール生産(Data not shown)。

酵母 Saccharomyces cerevisiae S288c は独立行政以前の研究より非平衡大気圧プラズマから生じる

法人製品評価技術基盤機構より入手し、1.0 mM, 2.5

活性種が Tyr、Phe、Trp、Cys、Met、Pro、His、Lys、

mM, and 5.0 mM バニリンを含む YPD 培地 (10 g/L

Arg、Gln、Glu、Val、Leu および Ile などのアミノ酸

酵母エキス、 20 g/L ペプトン、 20 g/L グルコー

に対し、酸化やヒドロキシル化を引き起こし、分子量ス) にて、28°C、100 rpm にて振盪培養した。 細胞に変化させることが示されている。特に、窒素や硫黄の増殖は 600 nm の吸光度にてモニターした。培養上

111

を含む化合物や芳香族化合物のように電子豊富な化合物はいろいろな活性種によって選択的に修飾される [9]。さらに、Tyr、 Phe、 Trp、His の芳香環は非平衡大気圧プラズマ照射によりヒドロキシル化され
図１. 酸素ラジカル照射によるバニリンの生育阻害
効果の緩和。酸素ラジカルを 20 分照射したバニリン溶液を酵母の培地に添加し、生育を調べた。

ることが報告されている。Asandulesa ら (2013) はベンジルアルコール、ベンズアルデヒド、塩化ベンジ
ルの芳香環が非平衡大気圧プラズマ照射により脂肪族化合物に変換されることを示している

反対に、酸素ラジカルによって生じた分解産物は、[10]。酸素
酵母に対する毒性がより低いことを示している。さらラジカルによるバニリンの変換や芳香環の開裂の正に、バニリンを分解した際にできる分解産物は、シュ確な機構については十分に解明されていないが、酸素

ウ酸をのぞいてバニリンよりも低い濃度になっていラジカル処理により生じたラジカルがリグニン由来た（Data not shown）。

のフェノール化合物と反応して、環開裂を促進するよ

バニリン非存在下での 16 時間後の培養上清のエタ

うなラジカル種を生成することが考えられた。これら

ノール濃度は 10.4 g/L であったが、1.0 mM、2.5 mM、の結果は、バニリンの酸化、一酸素添加、脱メトキシ

および 5.0 mM のバニリン存在下では、それぞれ 20%、化、脱カルボニル化、2 量体化、芳香環開裂が、酸素66%、および 88% のエタノール生産の阻害が起こってラジカル照射により引き起こされていることを示しいた（図 2）。一方、酸素ラジカル照射をすることによている。

り、1.0 mM、2.5 mM および 5.0 mM バニリン存在で3.2

も、バニリン非存在下の 100%、92% および 83% のエ

酵母の生育、エタノール生産に対する酸素ラジ

タノール生産となっていた.

カル処理の影響
バニリン溶液に対する酸素ラジカル照射の酵母生育に対する効果を調べるために、我々は酸素ラジカル照
射、非照射の条件で、最大 5 mM バニリンを含む YPD
培地で、酵母 S. cerevisiae S288c の生育実験を行なった。 図１はバニリン濃度を変えた酵母の生育曲線を示したものである。バニリンが存在しない場合に

図２.バニリンのエタノール生産阻害効果に対する酸素ラジカル処理の影響

比べ、1.0 mM、2.5 mM および 5.0 mM のバニリンが存在すると、それぞれ 8%、35% および 80%の生育阻害が観察されたが、 酸素ラジカル照射により、それバニリン 5.0 mM の条件では、酸素ラジカル照射にぞれ 105%、104% および 83% の生育となった。

より非照射条件の７倍のエタノール濃度になっていバニリン酸、プロトカテク酸、プロトカテクアルデヒ

た。これらの結果は酸素ラジカル照射がバニリンの酵

ド、メトキシヒドロキノン、3,4-ジヒドロキシ-5-メ

母に対する毒性を低減し、バニリン非存在下の 80％

トキシベンズアルデヒド、 シュウ酸などのバニリンのエタノール収率までに回復させることができるこの分解産物についても生育阻害効果を調べたところ、とを示唆していた。

バニリンが他のどの分解産物よりも阻害効果を有していた（Data not shown）。

112

3.3 アルカリ前処理で生じるリグニン由来のフェノ

るが [11]、酸素ラジカル処理により、0.31 mM までール化合物対する酸素ラジカル処理の影響に低下した。

我々はアルカリで前処理した稲わら懸濁液の酵母

2.5 mMの濃度のp-クマル酸, シュウ酸, 乳酸およ

生育とエタノール生産に対する酸素ラジカル処理のび フルフラールの条件での酵母の生育は、同濃度の影響を調べた。アルカリで前処理した稲わらについて、バニリンの条件での生育に比べ、それぞれ、1.59、1.61、

酸素ラジカル処理、未処理の条件で、総固形物の中の1.62および1.60倍生育が良いことが分かった（Data

セルロース、ヘミセルロース、リグニン、灰分の組成

not shown）。これらの結果は、アルカリ前処理稲わを決定した。アルカリ処理後による稲わらバイオマス

らの酸素ラジカル処理によるバニリンの変換が酵母の重量損失は31.1%であった。酸素ラジカル処理をしの生育とエタノール生産を促進することを意味してていないアルカリ前処理稲わらの固形分のうち、セルいる。

ロースが65.4%、ヘミセルロースが18.2%、リグニンが次に、酵母によるエタノール発酵の促進を評価する

5.5%、であった。酸素ラジカル処理では、アルカリ前ため、酸素ラジカル処理と未処理の条件のアルカリ前処理した稲わらの組成は変化しなかった(Data not

処理済みの稲わらの懸濁液を A. niger 由来のセルラ

shown)。我々は酸素ラジカル処理によりアルカリ前処ーゼで処理し、エタノール発酵に用いる糖を生産した。

理稲わら懸濁液中のバニリンの変換を行った後、HPLC

アルカリ処理した稲わら懸濁液を酸素ラジカル処理とGC-MSで分析を行った（図３左パネル）。

したものを、酵素により加水分解したのち、還元糖
HPLC で解析したところ、グルコース、セロビオース、
セロトリオース、キシロースなどの還元糖の量は、酸化ラジカル処理にかかわらずほぼ同じであった（Datanot shown）。
我々の以前の研究では、酸素ラジカル処理によるセ図３. アルカリ前処理を行なった稲わらに対する酸素ラジカル処理の影響

ルロース骨格の β-1,4-グルコシド結合の切断によるセルロースの断片化が CBH によるセルロース分解をアルカリ処理した稲わらからの可溶性画分には、バニ促進することを報告した[8]。A. niger は主としてエリン(3.32 mM), バニリン酸 (0.13 mM), p-クマル酸

ンド-β-1,4-グルカナーゼとグルコシダーゼを分泌(2.11 mM), t-フェルラ酸 (0.69 mM), シュウ酸

し、CBH は少量しか生産しない。そのため、酸素ラジ(1.13 mM), 乳酸 (0.50 mM), フルフラール (0.02

カル処理が還元糖生産に影響しなかったと考えられmM), and ヒドロキシメチルフルフラール (0.01 mM)る。

が含まれていた。これらの結果は、酸素ラジカル処理

次に、酸素ラジカル照射（20 分）した懸濁液での酵なしでもアルカリ処理だけで、稲わら中のリグニンが母の生育を調べたところ、48 時間後、酸化ラジカル照

バニリン (7.5%), バニリン酸 (0.3%), p-クマル酸

射をした懸濁液では、未照射の懸濁液に比べて、5.8(5.2%), and t-フェルラ酸 (2.0%)に変化することを

倍の生育を示すことが分かった（図３中央パネル）。

意味している。酸素ラジカル処理をすることにより、エタノール生産に関しては、未処理懸濁液に比べ、酸バニリンの濃度は0.69 mM までに低下した（図３左パ素ラジカル処理をした懸濁液では 5.2 倍になっていネル）。さらに、p-クマル酸も酵母の生育阻害剤であた（図３右パネル）。

113

これまでに、多くの生物学的、化学的、物理的な前処

参考文献

理法が開発されている。経済的な理由から、酵素糖化[1] Luo L, van der Voet E, Huppes G. Bioresour Technol.
2010;101:5023-5032.
[2] Zeng Y, Zhao S, Yang S, Ding SY. Curr Opin Biotechnol.
2014;27:38-45.
[3] Anterola AM, Lewis NG. Phytochemistry. 2002;61:221294.
[4] Chen H, Qui W. Biotechnol Adv. 2010;31:556-562.
[5] Singh S, Cheng G, Sathitsuksanoh N, Wu D, Varanasi P,
George A, Balan V, Gao X, Kumar R, Dale BE, Wyman
CE, Simmons BA. Front Energ Res. 2015;2:62.
[6] Wen P, Zhang T, Wang J, Lian Z, Zhang J. Biotechnol
Biofuels. 2019;12:1-10.
[7] Palmqvist E, Hahn-Hägerdal B. Bioresour Technol.
2000;74:17-24.
[8] Sakai K, Kojiya S, Kamijo J, Tanaka Y, Tanaka K,
Maebayashi M, Oh JS, Ito M, Hori M, Shimizu M, Kato
M. Biotechnol Biofuels. 2017;10:1-10.
[9] Takai E, Kitamura T, Kuwabara J, Ikawa S, Yoshizawa
S, Shiraki K, Kawasaki H, Arakawa R, Kitano K. J Phys
D: Appl Phys. 2014;47:285403.
[10] Asandulesa M, Topala I, Pohoata V, Legrand YM,
Dobromir M, Totolin M, Dumitrascu N. Plasma Process
Polym. 2013;10:469-480.
[11] Baranowski JD, Davidson PM, Nagel CW, Branen AL.
J Food Sci. 1980;45:592-594.
[12] Caspeta L, Castillo T, Nielsen J. Front Bioeng
Biotechnol. 2015;3:1-15.
[13] Du B, Sharma LN, Becker C, Chen SF, Mowery RA,
van Walsum GP, Chambliss CK. Biotechnol Bioeng.
2010;107:430-440.
[14] Ito S, Sakai K, Gamaleev V, Ito M, Hori M, Kato M,
Shimizu M. Biotechnol Biofuels. 2020 ;13:18.
doi:10.1186/s13068-020-1655-9.

や発酵に用いるリグノセルロースを調製するために、
アルカリ加水分解が使われているが [12]、その工程の中で、バニリンが酵母にとって毒性のある副産物として生成している [13]。リグノセルロース性バイオマスからのバイオエタノールの工業生産において、酵母細胞は通常バニリンにさらされている。我々の知見によれば、化学的処理と酸素ラジカル処理を組み合わせて行うことにより、酵母細胞によるエタノール生産が大きく改善されるであろう。非平衡大気圧プラズマ技術を応用した酸素ラジカルを使用する処理法は、植物バイオマスをエタノールに変換するのに非常に有望な技術となることが期待される。

4.

結論

本研究では、バニリン分子に対する酸素ラジカル処理の効果を解析した。この処理により、バニリンが別の誘導体に変換され、結果としてエタノール発酵時における酵母に対するバニリンの毒性が軽減されることが明らかとなった。アルカリによって前処理したリ
グノセルロース性バイオマスを酸素ラジカル処理することは、バニリンを各種誘導体に変換し、酵母の生育阻害を抑えることを示した。酸素ラジカル未照射のリグノセルロース性バイオマスに比べ約５倍のエタ
ノール生産促進効果があることが分かった。これにより、バニリン溶液中では酸素ラジカル処理によりプロジェクトで目標としていた 30％の生産促進を大きく上回る 500％の生産促進を達成することができた。これらの発見は、植物バイオマスの酸素ラジカル処理が、バイオエタノール生産プロセスのさらなる進歩に大きく貢献することを確信させてくれるものである。
（本研究で得られた成果は、様式 2 の雑誌論文 115 の一部に対応し、既に原著論文[参考文献 14]にて出版された。本稿は原著論文ではなく、研究成果を解説した報告書である。）

114

2-2-5-1 大気圧プラズマプロセス評価技術の開発（その 1）— 深紫外吸収分光光度計により計測されたラジカル処理水中の長寿命活性種密度と殺菌効果の関係—
伊藤 昌文 1) 、岩田 直幸 1）、呉 凖席 1,2)、石川 健治 3)、堀 勝 3)
1）名城大学 理工学研究科
2) 大阪市立大学工学研究科
3) 名古屋大学 低温プラズマ研究センター

1. 緒

言

そこで、本研究では大気圧下においてプラズマからプラズマ液中殺菌は数あるプラズマプロセスの中

中性ラジカルのみを取り出し照射できる非平衡大気でも盛んに研究されている分野の 1 つである。プラズ

圧ラジカル源(2-1-4-1 参照)[4-5]を用いて、ラジカ

マ殺菌はプラズマのエネルギーによって大気から生ル処理水中を作成した。その後、ラジカル処理水が持成された活性種(ラジカル)が直接 細菌やカビと反応

つ殺菌効果と長寿命 RONS 濃度、pH の最大 30 日間にして不活性化させる場合と、その活性種が液相に侵入及ぶ経時変化を深紫外吸収分光法とコロニーフォー

して新たな化学種となり液中の菌を不活性化する場

ミングユニット、pH メータを用いて測定する。加え合の 2 つに大別できる。特に液中殺菌はプラズマによて、プラズマ中の中性ラジカルがプラズマ処理水作成って生成されるヒドロキシルラジカル(OH∙)や過酸化にどの程度寄与するのか定量的に調査する。

水素(H2O2)などの活性酸素種(ROS : Reactive Oxygen
Species)と一酸化窒素(NO∙)や亜硝酸イオン(NO2-)、硝2. 実験方法酸 イオ ン(NO3-)な どの活 性窒 素種 (RNS : Reactive

2.1 RONS 吸 収 ス ペ ク ト ル デ ー タ ベ ー ス の 作 成 とNitrogen Species)が有害菌に対して殺菌効果示すこ

deconvolution の詳細手順とが報告されている。特に、H2O2、NO2-、NO3-は上記活

本研究では、非平衡大気圧ラジカル源を用いて超純性種の中で比較的長時間存在できることが報告され水を処理し、溶液中に生成された各種長寿命活性酸素ており、かつ、プラズマ処理水による殺菌[1-2]や植窒素種(RONS)の同定と定量を行う。そのための手法と物成長促進[3]に深く関与していることが報告されてして、深紫外吸収分光法とスペクトル deconvolution

いる。

を用いる。そのために、ラジカル(プラズマ)処理によ

しかしながら、これまでの研究でプラズマ処理後のって処理溶液中に生成される各種長寿命 RONS の深紫長寿命活性種の濃度や殺菌効果の経時変化を定量的

外波長領域における吸収スペクトルとその濃度依存に測定した例は少なく、処理からの経時変化で殺菌効性を調査した。測定条件としては、3 ml のサンプル

果がどのように低下するのか定かではない。

を石英キュベット(S10-SQ-10, GL-Science)に入れ、さらに、プラズマ処理によって水中に生成される化

ダ ブ ル ビ ー ム 式 UV-Vis-NIR 分 光 光 度 計

学種はプラズマ中の酸素・窒素活性種(RONS)が主な要(SolidSpec-3700DUV)を用いて深紫外吸収スペクトル因だと考えられているが、実際にプラズマから中性活を測定した。測定では、150-400 nm の波長範囲を、性種のみを抽出して水へ照射し、プラズマ処理水とラ

波長分解能：0.2 nm、スキャン速度:120nm/min (中速)ジカル処理水の類似を調査した例はない。

の条件で測定した。物質の吸収スペクトルとその強さ

115

(吸光度)は物質の濃度と強く関係するため、ラジカル

0.5処理された溶液中のある RONS スペクトルを測定することでその濃度を推定することが可能である。

H2O2
284µM
941µM
2823µM

Absorbance (a. u.)

0.4

プラズマ処理水に生成される主な長寿命 RONS としては、H2O2、NO2-、NO3-が挙げられる。そこで、水道水を UV 滅菌・脱イオン化することで得られた超純水(18.2 MΩ·cm at 25 °C)を用いて、これら 3 つの RONS

0.3

0.2

の標準試薬を適当な濃度まで希釈し、ダブルビーム式

0.1

UV-Vis-NIR 分光光度計(SolidSpec-3700DUV)を用いて
深紫外領域におけるその吸収スペクトルを測定した。

0

上記方法にて、様々な濃度における各種 RONS の深紫

210

240

270

300

330

Wavelength (nm)

外吸収スペクトルを取得し、スペクトル形状と濃度依存性をデータベース化した。例として、図 1(A)に、
H2O2 深の紫外吸収スペクトルの濃度依存性を示す。

2ラジカル処理水RONS3種の足し合わせ

そして、H2O2、NO2-、NO3-を含むプラズマ(ラジカル)

Absorbance (a. u.)

処理水の深紫外吸収スペクトルはこれら長寿命活性種スペクトルの足し合わせとなる。作成した 3 種類のRONS の吸収スペクトルデータベースを基に、ラジカ
ル処理水の吸収スペクトルを成す最適な各 H2O2、NO2-、
NO3- ス ペ ク ト ル ( 濃 度 ) の 組 み 合 わ せ を 予 測

1.875

1.75

ラジカル処
足し合わせスペ(deconvolution)することで、ラジカル処理によって処理溶液に生成された H2O2、NO2-、NO3-の濃度を推定す
る。[6]

2

1.625

-

加えて、過去の研究より、H2O2、NO 、NO3200

のみのスペクトルの足し合わせでは、ラジカル処理水

21

Wavelength (nm)のスペクトルとの(特に、波長 210nm 以下における)形状的不一致が確認される。(図 1(B)の赤点線を参照)

図 1 (A)

これは、元々超純水中に溶存しこの波長領域で吸収をRONS スペクトルデータベースと(B) deconvolution の一例

示す酸素分子(O2aq)がプラズマ処理によって脱気する
ことで生じる。つまり、ラジカル処理水のスペクトル2.2 非平衡大気圧ラジカル源と 3 種類の RONS の足し合わせスペクトル間の誤差か

本実験で使用するラジカル源の詳細な構造や動作

らプラズマ処理によって脱気された O2aq の濃度を推定

原理は、2-1-4-1 や 2-1-4-3 に示された通りである。
本研究では、プラズマ中で生成され生物の生育にすることができる。[7]
本研究では、上記の深紫外吸収分光法と様々な影響を与えるとされる一酸化窒素(NO)ラジカ

deconvolution を用いて、ラジカル処理によって溶液

ル[8-9]の影響に注目し、様々な実験を行った。その中に生成された各長寿命活性種の同定と定量を行う。

ため、ラジカル源に供給する窒素ガス流量比は、ラジカル源から照射される NO ラジカル密度が最大となる

116

(大腸菌約 1×108 個/ml)を大腸菌懸濁液とした。

N2/(N2+O2)=40%とした。[10]保管したラジカル処理水が持つ殺菌効果の経時変化を評価するために、各保管日における処理サンプル

2.3 ラジカル処理水の作成手順
中性ラジカル照射の条件としては、まず処理サンプの 2.7ml とあらかじめ作成しておいた大腸菌懸濁液ルである 100ml の超純水をガラス製ビーカーに入れ、の 0.3ml を混合し、30 ◦C・250rpm の条件で 24 時間 振

同ビーカーの上辺をラジカル源(2-1-4-1 参照)の照射

とう培養を行った。その後、培養サンプルを適当な倍口を設置した。この時の照射距離は 21mm であった。

率まで希釈(101～104 倍)し、希釈を行った大腸菌懸濁

ガス条件は、アルゴン (Ar)、酸素 (O2)、窒素 (N2)

液 100 µl を NA 培地に塗布した。大腸菌を塗布したの混合ガスの総流量を 2 slm、流量比 N2/(N2+O2)を 40 %NA 培地を 30 ◦C の条件で、24 時間培養してコロニーとし、照射時間を 10min とした。このとき、ラジカルカウント法により殺菌効果を評価した。

源から照射されるラジカルが大気に流出することを次に、ラジカル処理水中の RONS 濃度の経時変化を防ぐために、ラジカル源の照射口とサンプル入りビー測定するために、各日数保管されたラジカル処理水中カーの間にガラス製カバーを取り付けた。上記、100mlの各種活性酸素窒素種(RONS)の濃度を深紫外吸収分のラジカル処理水の作製を 6 度繰り返し、合計 600ml

光法とフィッティングプログラムによって求めた。

のサンプルを作成した。

まず、測ガラス製バイアル瓶中で各日数保管された

中性ラジカル照射後、ラジカル処理水を 20ml ずつ

3mlのラジカル処理水とした。0~30日間の保管後に、3ガラス製バイアル瓶に入れ、作製したラジカル処理水

ml の サ ン プ ル を 石 英 キ ュ ベ ッ ト (S10-SQ-10,は 24◦C の温度下で 0、1、3、5、7、14、21、30 日間

GL-Science)に入れ、ダブルビーム式UV-Vis-NIR分光に渡って保管された。この 0~30 日間 保管されたラジ光度計(SolidSpec-3700DUV)を用いて紫外吸収スペク

カル処理水を用いて、殺菌効果、各種長寿命 RONS 濃

トルを測定した。測定では、150-400 nmの波長範囲を、度測定、pH 測定を行った。(詳細は次節に記す。)

波長分解能：0.2 nm、スキャン速度:120nm/min (中速)の条件で測定した。本測定中、サンプル側のキュベッ

2.4 処理水の殺菌効果、RONS 濃度、pH の経時変化

トには測定対象を入れ、参照側のキュベットには何も殺菌実験を行う前準備として前培養を行い大腸菌

いれず、空気に対するサンプルの紫外透過率を測定した。サンプルの紫外透過率T’と超純水の紫外透過率Tのサンプルを作成した。

を次式のランベルトベールの法則で吸光度Aへ変換す

前培養の手順は、振とう培養チューブに液体培地 NBる。

（Nutrient Broth）3 ml を入れ、そこに冷凍保存しA = -Log(T/T’)ておいた大腸菌懸濁液を室温に戻したものから 10 µl(1)入れた後、振とう培養機内で 30 ◦C・250 rpm の条件

最後に、波長190~340nmの領域の紫外スペクトルから、で 17 時間、液体培養を行った。また、大腸菌を培養

フィッティングプログラムを用いてH2O2、 NO2-、 NO3-、

するためにΦ90 mm のシャーレに NA 培地（Nutrient

O2aqのスペクトルへとdeconvolutionし、各RONSの濃度

Agar：NA）を作成した。前培養で培養した大腸菌をを求めた。[7]5000×g, 3 min の条件で遠心分離を行い、大腸菌（約加えて、各保管日におけるラジカル処理水のpH値の3×109 個/ml）を集菌した。集菌後、培養液を捨て、測定には、pHメータ(S220 SevenCompactTM pH/Ion,

超純水 3 ml に大腸菌を懸濁し直し、大腸菌懸濁液のMETTLER TOLEDO)を用いた。

原液を作成した。。原液を超純水で 30 倍希釈したもの

117

3. 実験結果

NO3-が生成され、さらに元々超純水に含まれていた溶

3.1 ラジカル処理水の殺菌効果の経時変化

存酸素O2aqも残存していることが判明した。これらの

図2に0~30日間保管したラジカル処理水が持つ殺菌活性種は、従来のプラズマ処理水でもその生成が報告

効果の経時変化を示す。まず、保管0日目の殺菌効果されている。[11]これらの実験データは、プラズマ処

7は24時間の大腸菌培養によって10 個/mlもの大腸菌

理水における長寿命活性酸素窒素種の生成にプラズを死滅させ、検出限界に到達させるほど強力なものでマ中の中性ラジカルが関与していることを示唆してあることが分かる。さらに、その後の7日間におけるおり、かつ、プラズマとプラズマ中のラジカルだけで保管でも、ラジカル処理水が持つ殺菌効果はほとんど処理した場合の超純水の組成が酷似していることを変化しなかった。次に、保管14日目で、24時間のラジ意味している。

カル処理水を用いた大腸菌培養によって、その生菌数2が検出限界に到達しなかったことが分かる。これは、ラジカル処理から14日ほどで殺菌効果が低下し始め

MeasuredFittedH2O2
NO2NO3O2aq

Absorbance (a. u.)

1.5

ることを示唆している。しかしながら、その後の保管
では、ラジカル処理水の殺菌効果に劇的な変化は確認されなかった。つまり、ラジカル処理水の殺菌効果は、作成から30日ほど経過しても大きく変化しないほど

10.5

安定なものであることが示唆された。

0

Number of E. coli (CFU/mL)

108
Untreated

107

-0.5
210

106
105
10

240

270

300

330

Wavelength (nm)
図3 ラジカル処理水の紫外吸収スペクトル4

103

次に、図4(a)に30日間に及ぶラジカル処理水中の2

H2O2とO2aq濃度, また、(b)にNO2-とNO3-濃度の経時変化

101を示す。結果として、H2O2とO2aq濃度、また、NO2-とNO3-

10濃度の増減傾向は非常に強い相関関係にあり、互いの

100
0

5

20
10
15
Stored time (Day)25

3

生成と消滅に密接に関係していることが示唆された。
例えば、図4(a)に示されたように、H2O2濃度が減少し

図2 ラジカル処理水の殺菌効果の経時変化ている保管期間7~14日目においてO2aq濃度は対照的に増加し、H2O2濃度が増加している保管期間14~30日目に

3.2 深紫外吸収分光法による液相中の活性種濃度のおいてO2aq濃度は対照的に減少している。これらの挙測定結果

動は0~30日目の期間において、ラジカル処理水中の図3(a)に、中性ラジカル照射によって作成されたラH2O2とO2aqが自身の分解によって相方を生成していたジカル活性水の紫外吸収スペクトルを示す。超純水へことを示唆している。また、このH2O2とO2aq濃度間の相のラジカル処理によって、処理溶液からはH2O2, NO2-,

関関係は0~30日の全期間で確認されたわけではない

118

ため、H2O2とO2aq以外にもこれらの濃度変化に影響したとが判明した。すなわち、2-1-4-1の実験結果と同様

活性種の存在が示唆されるが、現在までにその種の特に、ラジカル処理にってもたらされる溶液pHの低下が、定には至っていない。同じように、NO2-濃度が減少しラジカル処理水中の殺菌効果生成に関与しているこている保管期間0~7日目や14~30日目においてとNO3-濃とが示唆された。さらに、ラジカル処理から最大30度は対照的に増加し、NO2-濃度が対照的に増加してい日間保管した場合でも、そのpH値は4.0でほぼ一定でる。(図4の(b))

あったため、各活性酸素窒素種の30日間に及ぶ濃度変化に、ラジカル処理によって処理溶液にもたらされる

1000
H2O2

O2aq

pH 変 動 は 無 関 係 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

7

600

6

400
200

5

0

4

pH

Concentration (μmol/L)

800

3

-200
-400
0

2
5

10
15
20
Stored time (Day)

25

3

1
0

200

-

NO2
Concentration (μmol/L)DI water
RAW

0

-

NO3

5

10
15
20
Stored time (Day)25

3

図5 ラジカル処理水のpH値の経時変化

150

4. ラジカル処理水の経時変化に関する考察

100

図 4 に示されたように、深紫外吸収分光法を用いてラジカル処理水中の組成を分析した結果、H2O2、NO2-、50

NO3-、O2aq が検出された。さらに、図 4 の(A)と(B)より、
H2O2 と O2aq 濃度、 また、NO2-と NO3-濃度の経時変化に

0
0

5

10
15
20
Stored time (Day)25は強い相関関係が確認された。ラジカル処理によるこ3

れら活性種の生成経路と、活性種濃度間の相関関係を明らかにするために各活性種の反応式を以下考察する。

図4 ラジカル処理水中の(A) H2O2とO2aq濃度、(B) NO2-とNO3-濃度の経時変化

まず、ラジカル源に供給された Ar がガスのプラズ
マ化のために印加される高電圧によって準安定状態

さらに、図5に30日間に及ぶラジカル処理水のpH値に励起され、その準安定アルゴン(Ar*)が照射対象での変動を示す。超純水へのラジカル処理によって、超ある超純水(H2O)を解離しヒドロキシルラジカル(OH∙)

純水のpH(未処理時は6.3)が4.0付近まで低下するこを生成することが考えられる。その OH∙同士の反応に119よって H2O2 の生成に至った可能性が高い。そして、30

さらに、保管 14~30 日目では NO2-と NO3-濃度の対照

日間の経時変化によって、H2O2 濃度は O2aq 濃度に対し的な増減が確認され、さらに、その相関関係は保管て対照的に変化している。この結果より、ラジカル処

0~7 日目のものよりさらに強く見受けられる。これは、理からの 30 日の間、H2O2 と O2aq はある反応によって互NO2-が直接 NO3-に変性する式(12)のような反応が上記

いに生成と消滅を繰り返していたことが示唆された。

保管期間において生じたことを示唆している。

しかしながら、H2O2 と O2aq 間の反応に関しては、これ

2H+ + 2NO2− + O2aq → 2H+ + 2NO3−までに詳細な研究がほとんど行われておらず、どのよ

最後に、殺菌因子に関する考察を行う。本研究のラ

うな化学種と反応することで H2O2 と O2aq が互いを生成

ジカル処理水でも NO2-や H2O2 が検出され、かつこれらしていたのかは不明である。そこで、H2O2 との反応物の活性種は 30 日間の保管後でも劇的な濃度減少を示

を X、O2aq との反応物を X‘とし、これら活性種間の相さなかったことから、NO2-や H2O2 が式(13-15)によって関を式(4)として考察する。

過硝酸(O2NOOH)やそれに後続するヒドロペルオキシ(12)

Ar* + H2O → OH + H +Ar(2)

ルラジカル(HOO• )を生成し、大腸菌を殺菌していた

2OH• → H2O2

(3)

可能性がある。さらに、2-1-4-1 でも示したように、

H 2O 2 + X ↔

(4)

ヒドロペルオキシルラジカル(HOO• )の生成には、

O2aq + X’

次に、NO2-と NO3-の生成だが、これらの活性窒素種

pH<4.8 の環境が必要であるが、ラジカル源を用いては一酸化窒素(NO)ラジカルとその酸化反応によって100ml の超純水を 10min 間 処理するとその pH が 4 付生成されることが報告されている[12]。そのため、ラ近まで低下することが確認されたため、今回の殺菌因ジカル源から供給された NO ラジカルが NO2-と NO3-の子が HOO• である可能性は極めて高い。

生成源である可能性が極めて高い。[式(5-6)]

H+ + NO2- + H2O2 → ONOOH + H2O

(13)

(5)

ONOOH + H2O2 → O2NOOH + H2O

(14)

(6)

O2NOOH ↔

(15)

2NO• + O2 → 2NO2•
2NO2•+ H2O → NO2− + NO3− + 2H+

HOO•+ NO2•(pKa=5.9)

さらに、保管 0~7 日目までの期間では、NO2-濃度が上記したラジカル処理水中における各活性種の生成減少する一方で、NO3-濃度は対照的な増加を見せた。

経路とそれら濃度の経時変化に関する反応式を図 6

従って、上記の 7 日間では、以下の式(7-9)によってにまとめる。

NO2-が徐々に NO3-に変化していったことが示唆された+

2H + 2NO

−
2

→ NO•

+ NO2•+ H2O

Radical source
Ar* e-(7)

2NO•+ O2aq → 2NO2•(8)

Gas Phase

4NO2•+ O2aq + 2H2O → 4NO3− + 4H+(9)

Liquid Phase

しかしながら、保管 7~14 日目までの期間では、NO

2

H2O2

ている。その一例として、式(10-11)が挙げられる。

+ H2O → 2H+ + 2NO2−X

H2O2&O2aq

Radical Treatment
Day0-3After Day3れる反応がラジカル処理水中で生じたことを示唆し+ NO2•

H2O2 NO 2

O2NOOHった。これは、保管 7~14 日目では NO2-のみが生成さ

NO•

NO2⋅

O2aq

は、NO2 は増加し、NO3 濃度はほぼ変化せず一定であ+ OH• → H+ + NO2−

H2O2

HOO⋅ X’

-

NO•

NO⋅
O2

H2O2

と NO3-濃度の増減傾向が変化した。上記の保管期間で
-

OH⋅
H2O

NO3-

ONOOH

OH⋅
NO2-

NO⋅ NO2⋅

O2aq
NO⋅

O2aq

NO2NO3- NO2 &NO3

Radical Treatment
Day0-7
Day7-14After Day14(10)

図 6 ラジカル処理水中における各活性種の生成経路(11)とそれら濃度の経時変化

120

(2018).
[8] A. Villalobo, FEBS J. 273, 2329-44 (2006).
[9] M. Du, MM. Islam, L. Lin, Y. Ohmura, Y. Moriyama, S.
Fujimura, Biochem. Mol. Biol. Int. 41, 625-31 (1997).
[10] N. Iwata, V. Gamaleev, J.-S. Oh, T. Ohta, M. Hori, M.
Ito, Plasma Process. Polym. 16, e1900055 (2019).
[11] P. J. Bruggeman, et al., Plasma Sources Sci. Technol.
25, 053002 (2016).

5. 結論
本研究では、電気的に中性なラジカルを照射した超純水における殺菌効果と含有される長寿命活性酸素
窒素種濃度の経時変化を観察した。その結果、殺菌効
果はラジカル処理水作製から 30 日後でも 107 個/mlの大腸菌をほぼ全滅させるほど強力かつ安定なもの
であることが判明した。さらに、深紫外吸収分光法を用いて今回のラジカル処理水を分析したところ、H2O2、NO2-、 NO3-、O2aq が検出された。さらに、これらの地
長寿命活性種はラジカル処理水作製から 30 日の間において、互いに生成と消滅を繰り返していた痕跡が確認された。この長寿命活性種間の反応によってラジカル処理から 30 日後でも、各活性種の濃度は大きく変化せず、これが殺菌効果の安定性を向上させていると考えられる。最後に、プラズマ処理水でもその生成が報告される H2O2、NO2-、 NO3-、O2aq 等の活性種がラジカ
ル処理水からも検出されたことより、プラズマ中のラジカルがプラズマ処理水中の活性種生成において極めて重要な因子であることが、本研究で判明した。
（これらの成果は様式２の雑誌論文 94 の内容の一部に対応する。本稿は原著論文ではなく、研究成果を解説した報告書である。）

参考文献[1] S. Ikawa, K. Kitano, and S. Hmaguchi : Plasma
Processes Polym., 7 (2010) 33.
[2] S. Ikawa, A. Tani, Y. Nakashima, and K. Kitano : J.
Phys. D: Appl. Phys., 49 (2016) 425401.
[3] S. Kitazaki, T. Sarinont, K. Koga, N. Hayashi and M.
Shiratani, Curr. Appl. Phys. 2014, 14, S149-S153[4] M. Iwasaki, H. Inui, H. Kano, M. Ito, Y. Suzuki, D.
Sutou, K. Nakada, and M. Hori, Jpn. J. Appl. Phys. 47,
3625 (2008).
[5] H. Hashizume, T. Ohta, J. Fengdong, K. Takeda, K.
Ishikawa, M. Hori, M. Ito, Appl. Phys. Lett. 103,
153708 (2013). [8] A. Villalobo, FEBS J. 273, 2329-44(2006).
[6] J.-S. Oh, E. J. Szili, N. Gaur, S.-H. Hong, H. Furuta, R.
D. Short, A. Hatta, J. Photopolym. Sci. Tec. 28,
439-444 (2015).
[7] J.-S. Oh, E. J. Szili, K. Ogawa, R. D. Short, M. Ito, H.
Furuta, A. Hatta, Jpn. J. Appl. Phys. 57, 0102B9121

2-2-5-2

大気圧プラズマプロセス評価技術の開発（その 2）— メラノーマ細胞と正常皮膚細胞を用いたラジカル活性溶液の安全性評価—

伊藤 昌文 1）、村田 富保 2）、小川 和馬 1）
1）名城大学 理工学研究科
2）名城大学 薬学研究科

1. 緒

言

本研究では、ラジカル源に供給ガスとして窒素を加大気圧プラズマによる病原性微生物の殺菌効果やえて培養液に対してラジカル照射を行い、調製したがん細胞などに対する死滅効果、止血効果などはプラ

RAM における窒素系ラジカルの影響を検証した。メラ

ズマから生成される因子の中でも活性酸素種（ROS）

ノーマ細胞と正常細胞に対するラジカル活性溶液

や活性窒素種（RNS）などの効果が高いとされている。

（RAM）の細胞死誘導メカニズムの解明を目指し、メ

1、3O（基底状態
具体的には O2（励起状態の酸素分子）

ラノーマ細胞に対する RAM の抗細胞増殖効果を調べ、の酸素原子）O3（オゾン）、OH（ヒドロキシルラジカ

正常皮膚細胞に対する RAM の影響との違いを明らか

ル）、O2―（スーパーオキシド）、HOO（ヒドロぺルオキとし、正常細胞に対する RAM の安全性についても評価

シラジカル）、NO（一酸化窒素）、NO2（二酸化窒素）

した。

等の粒子種による殺菌作用が高いとされている[1]。

2. 実験方法

本研究室では、柑橘類に繁殖するミドリカビ病の一種であるミドリカビ（Penicillium digitatum）胞子

マウスメラノーマ由来の B16F10 細胞は、10%ウシ胎の不活化に関して非平衡大気圧プラズマを用いて行児血清（FBS）を含む Dulbecco’s modified eagleってきた。またプラズマ中においては電子、イオン、

medium (DMEM)を用いて、37 ℃、5% CO₂ 存在下で培

ラジカル、紫外線など様々な因子を含んでおり殺菌因養した。また、継代培養については、細胞密度が 70 %子を特定することが難しい。そこで、電気的に中性なになり次第、0.2％トリプシン-EDTA 液を用いて細胞ラジカルのみを選択的に照射することができる非平の継代を行った。

衡大気圧酸素ラジカル源を用いた殺菌実験を行った

図 1 に示すように、2-1-4-1 に記載したラジカル源[2,3]。その結果、酸素ラジカルの中でも特に基底状に供給ガス(Ar ガスのみ、Ar/ O₂混合ガス、Ar/O2/N2態の酸素原子 O(3Pj)が不活化に大きく寄与している混合ガス)を導入しプラズマを発生させ、出射口からことが明らかとなった[4]。さらに、酸素ラジカル照

電気的に中性なラジカルを選択的に照射した。なお、

射によって分解が困難とされるセルロースの分解促生成されたラジカルが大気中の粒子と反応すること

進についても報告されている[5]。また、酸素ラジカを防ぐために、照射サンプルにプラスチックカバーをルを照射した培養液を用いて皮膚がん細胞であるメ取り付けた。出射口とサンプルの液面までの距離を照ラノーマ細胞を処理すると、酸化ストレスに基づくア射距離とした。出射口よりサンプルの表面積が大きい

ポトーシスが誘導されることが明らかになっている。

サンプルには、均等にラジカルを照射するために、サ

しかし、窒素系ラジカルを培養液に照射した例はなく、ンプルを設置したステージを 4 mm/s で走査した。そ

がん細胞に対する効果も未知である。

して、無血清の DMEM にラジカル照射を行い、照射後122

に終濃度が 10%となるように FBS を添加したものを存率への影響RAM とした。

3.1.1 NOラジカル密度依存性
供給する酸素ガスと窒素ガスの割合を変化させる
ことで窒素ガス流量比N2/(N2+O2)=35%において、NOラ
ジカル密度が最も高くなることが先行研究から明らかとなっている[6]。表１に示す照射条件を用いて、NOラジカル密度とメラノーマ細胞の細胞死の相関性を検証した。図3に測定結果を示す。N2/(N2+O2)=35%でNOラジカル密度が最も高いのに対してRAMで24時間処理したメラノーマ細胞の細胞生存率はN2/(N2+O2)=90%
で最も低くなった。これらの結果から、NOラジカル密図 1 ラジカル活性培養液調整実験系

度のみには依存しないが、N2ガスを多く供給するほど、次に、図2に示すように、96ウェルプレートに細胞

RMNの生存活性抑制効果が強くなることが明らかとなを播種し、37℃で6時間インキュベートした。その後、った。
表1 NOラジカル照射条件

上記の方法で調製したRAM(120µl/well)をウェル中のDMEMと置換し、細胞を一定時間処理した。処理後、ウェ ル か ら 一 定 量 の RAM を 取 り 除 い て 、 MTS 試 薬(Celltiter 96 Aqueous One Solution reagent;
Promega社)の濃度が20%になるようにFBS含有DMEMを加え、37 ℃で1時間インキュベートした。その後、生成した色素性ホルマザン産物の490 nmにおける吸光度をマルチプレートリーダにより測定した。なお、MTS
は生細胞の中でホルマザンに還元される試薬で、ホルマザン産物の490 nmにおける吸光度は、生細胞数に比例する。

図2 ラジカル活性培養液による細胞生存率測定手順

図3 NOラジカル密度と細胞生存率の関係

3. 実験結果

3.1.2 窒素ガス流量比依存性

3.1 窒素系ラジカル添加によるメラノーマ細胞の生上記のように、N2ガスを多く供給して調製したRAMほ

123どメラノーマ細胞の細胞生存率を低下させた。そこで、

RAMががん細胞特異的に細胞生存活性を低下させる

ガス総流量を5slm、O2ガス流量比0.6%と固定し、N2ガか否かを検証するため、正常皮膚細胞NHDF-AdをRAM

スの供給量に応じてArガスの供給量を減らし、表2にで12時間処理した。図5に測定結果を示す。Ar/O2混合

示す条件でラジカル照射を行った。図4に細胞生存率

ガスで調製したRAMの原液及びAr/O2/N2混合ガスで調の測定結果を示す。RAMで12時間処理すると、窒素ガ製したRAMの2倍希釈液は、正常細胞の生存活性に影響

ス流量比N2/(Ar+O2+N2)が高いほど細胞生存率は低くを及ぼさず、メラノーマ細胞のみに対してのみ生存活なった。これらの結果から、酸素ラジカルのみを照射性を低下させた。これらの結果から、RAMはがん特異した場合に比べて、酸素ラジカルと窒素系ラジカルの的に細胞死を誘導することができることが明らかに両方を照射した場合には、相乗効果によって著しい細なった。

胞生存活性の低下が起こることが示唆された。そこで、以降の実験では、N2/(Ar+O2+N2)=70%でRAMを調製し、実験を実施した。
表2 窒素ガス供給量を変化させる際の照射条件

図5 希釈したRAMで処理したメラノーマ細胞(B16F10)と正常皮膚細胞 (NHDF-Ad) の細胞生存率

3.2.2

RAM調製時のラジカル照射時間に依存したメ

ラノーマ細胞の生存活性の低下
Ar ガスのみ、Ar/O2 混合ガスあるいは Ar/O2/N2 混合ガスを導入し、一定時間ラジカルを照射して 3 種類のRAM を調製した。これらの RAM についてラジカル照射
時間に対するメラノーマ細胞の生存活性の変化を調査した。図 6 にラジカル照射時間に対する各種 RAM による細胞生存率を示す。Ar ガスのみで調製した RAM
では照射時間に関わらずメラノーマ細胞の生存率は変 化 し な か っ た 。 一 方 で 、 Ar/O2 混 合 ガ ス ま た は
Ar/O2/N2 混合ガスで調製した RAM では、照射時間が長いほど細胞生存率は低くなり、Ar/O2 混合ガスで調製した場合に比べて Ar/O2/N2 混合ガスで調製した場合の方が細胞生存率の低下がさらに大きくなった。これ
図4 窒素ガスの供給量と細胞生存率の関係

らの結果から、RAM の調製時におけるラジカル照射時

3.2 RAMによる細胞死誘導の検証

間に依存して、RAM がメラノーマ細胞の生存率を低下

3.2.1 RAMによるがん細胞選択的な細胞生存抑制効果

124

5.結論

させることが判明した。

本 研 究 で は 、 Ar/O2 混 合 ガ ス で 調 製 し た RAM とAr/O2/N2 混合ガスで調製した RAM を用いて、B16F10 メ
ラノーマ細胞の生存活性に対する影響を比較し、窒素系ラジカルの細胞死への影響を検証した。まず、ラジカル照射において O2 ガスと N2 ガスの流量比を変化させて NO ラジカル密度と細胞生存率との相関性を検証した結果、細胞生存率は NO ラジカル密度に依存せず、
N2 ガスを多く供給した条件でも低くなった。そこで、より多くの N2 ガスを供給するため、ガス総流量 (5図 6 ラジカル照射時間を変化させ調製した RAM による細胞生存率slm) と O2 ガス流量比 (O2/(Ar+O2)=0.6%) を固定し、Ar ガスに比べて N2 ガスの流量比を上げると、N2 ガス
流量比 (N2/(Ar+O2+N2)) に依存してメラノーマ細胞の3.2.3 メラノーマ細胞に対する RMA の細胞生存低下作

生存率が低下することが判明した。これらの結果から、用の経時変化

窒素系ラジカルと酸素ラジカルが相乗的にメラノーメラノーマ細胞に対する RAM の経時的な細胞生存低マ細胞に対して細胞死を誘導することが示唆された。

下作用を検証した。図 7 に測定結果を示す。Ar ガス

また、RAM の正常皮膚細胞に対する影響を検証するこのみで調製した RAM ではインキュベーション時間にとで、メラノーマ細胞に対して高い殺傷能力を持つ酸

関わらずメラノーマ細胞の生存率は変化しなかった。

素ラジカル活性培養液は、正常細胞を全く殺傷される

一方で、Ar/O2 混合ガスまたは Ar/O2/N2 混合ガスで調ことなく、酸化窒素ラジカル活性培養液でも 2 倍希釈

製した RAM ではインキュベーション時間が長いほどすることで正常皮膚細胞への影響は極めて小さく、安細胞生存率は低くなり、Ar/O2 混合ガスで調製した場

全性が高いことが判明した。

合に比べて Ar/O2/N2 混合ガスで調製した場合の方が抗がん剤を用いたがん治療では、正常細胞に対する細胞生存活性の低下がさらに大きくなった。これらの毒性によって副作用が現れるため、薬剤の容量を決定

結果から、メラノーマ細胞に対して RAM が経時的に細する際に、正常細胞には影響を及ぼさずに、抗がん作胞生存率を低下させることが判明した。

用が発揮できる容量が用いられる。本研究において、皮膚がんの一種であるメラノーマ細胞に対して、酸素ラジカル活性溶液及び酸化窒素ラジカル活性溶液の作用時間や希釈率を調整することで、正常皮膚細胞には影響を及ぼさずに、メラノーマ細胞を選択的に死滅させることに成功したことから、プラズマ活性溶液は人体への安全性を考慮してがん治療に応用できる有用な抗がん治療液になりうることが考えられた。
図 6 RAM で処理したメラノーマ細胞の経時的な細胞生存率

参考文献[1] K. Ishikawa, H. Mizuno, H. Tanaka, K. Tamiya, H.

125

Hashizume, T. Ohta, M. Ito, S. Iseki, K. Takeda, H.
Kondo, M. Sekine, and M. Hori, Appl. Phys. Lett. 101(2012).
[2] H. Hashizume, T. Ohta, Jia Fengdong, K. Takeda, K.
Ishikawa, M. Hori, and M. Ito, Appl. Phys. Lett. 103,
153708 (2013).
[3] S. Iseki, T. Ohta, A. Aomatsu, M. Ito, H. Kano, Y.
Higashijima, and M. Hori, Appl. Phys. Lett. 96,
153704 (2010).
[4] H. Hashizume, T. Ohta, T. Mori, S. Iseki M. Hori, and
M. Ito, Jpn. J. Appl. Phys. 52, 056202(2013).
[5] K. Sakai, S. Kojiya, J. Kamijo, Y. Tanaka, K. Tanaka,
M. Maebayashi, J‑S. Oh, M. Ito, M. Hori, M. Shimizu
and M. Kato, Biotechnol Biofuels 10:290 (2017).
[6] 岡地正嗣, “酸化窒素ラジカル照射による出芽酵
母細胞の増殖効果に関する研究” 平成 29 年度修
士学位論文 (2018).

126

総括
本研究プログラムでは、１．「ナノカーボン材料を用いたグリーンテクノロジー」と２．「プラズマ技術を用いたグリーンテクノロジー」の２つの研究テーマを相乗効果が出るように、
1-1 ナノカーボン・酸化鉄ナノチューブ材料を太陽電池に応用する技術の開発、
1-2 ナノカーボン材料を燃料電池に応用する技術の開発、
1-3 ナノカーボン材料をバイオセンサや VOC ガス浄化に応用する技術の開発、
2-1 環境センシング及び殺菌浄化技術の開発、
2-2 バイオマス燃料用の植物の高効率生長や高効率分解・発酵技術の開発、を遂行してきた。
本報告書ではこれらの成果の一部を項目別に詳細に内容を記載した。
上記に記載した「ナノカーボン材料を用いたグリーンテクノロジー」の研究成果のうち特に優れた研究成果としては、
1-① 単層カーボンナノチューブを 300℃以下の低温で作製する技術を開発した（*1-2-1 に対応）、
1-②白金担持ナノグラフェンおよび白金担持カーボンナノウォールを用いた高耐
久燃料電池触媒層を実現した(*1-2-2&1-2-3 に対応)、
1-③カーボンナノウォール用いた電気化学センサを実現した(*1-3-1&*2-1-2 に対応)
ことなどが挙げられる。
また「プラズマ技術を用いたグリーンテクノロジー」の研究成果のうち特に優れた研究成果としては、
2-①大気圧プラズマ源で処理したプラズマ活性アミノ酸水溶液により植物の生長を約 100％促進すると同時に大腸菌を滅菌（6 桁以上の殺菌）する技術の実
現に成功した(*2-1-4 と*2-2-1 に対応)、
2-②従来技術の 10 倍以上のセルロース分解促進技術を実現した(*2-2-2 に対応)、
2-③アルコール発酵阻害物質存在下で従来技術の 4 倍以上の酵母成長促進技術、
6 倍以上の酵母発酵技術を実現した(*2-2-4 に対応)、
2-④大気圧ラジカル処理された活性水、培養液等の生体安全性等に対する評価技術の確立した（*2-2-5 に対応）ことなどが挙げられる。
上記のように、本研究プロジェクトでは当初の予定していた最終目標を達成した
成果も得られたテーマも多数あり、当初の予定以上の成果を挙げることができた。

127

今後の展望本研究拠点では、16 名の学内研究者と 4 名(内 1 名平成 29 年度退職)の学外研究者の強い連携によって強力な研究基盤の構築がほぼ実現したと考えられる。また、本プロジェクトにより、多数のシーズを産み出すことができ、今後はこれらの技術
を日本の技術として実用化していくことと、さらに新しいシーズの創出をしていく
ことが極めて重要である。
以上のことから、今後の研究方針としては、引き続き研究シーズを産み出す取り組みを継続することに加え、民間企業との共同研究を複数個実施し、最終的にシーズを実用化するような取り組みを強化していく予定である。
その中でもシーズとして大きく期待されるのは、①ナノカーボン材料を燃料電池、二次電池、キャパシタ等の電極や電気化学・バイオセンサの電極、ならびに細胞培養の基材として用いるプラットフォームとしての応用と、②大気圧プラズマによる微生物の活性化制御技術を活用したバイオマス燃料製造プロセスへの応用である。
これらの基盤技術は新しい環境調和型の革新的なデバイスやプロセスの創製に極めて有効であると考えられ、今後は本プロジェクトメンバーを中心に、新たなるデ
バイスやプロセスの創製だけではく、実用化に向けての検討を進めていく。具体的には、2020 年度より名城大学次世代エネルギーマテリアルイノベーションセンタ
ーと名城大学プラズマバイオ応用センターの設立に向けて既に始動しており、これらセンターを中心に次世代の環境調和型の革新的なデバイスやプロセスの開発に取り掛かる予定である。

128