三次元自動灌流培養法による遺伝子導入iPS細胞由来NK細胞（HLCN061）の大量製造方法の開発〇倉知建始、福田隆之、陳宣儒、佐々木薫、清水翔太、稲森雅和
小山直子、伊藤実和子、林里依、香取良介、立田俊也、下地北斗
芦田侑加子、木村寛子、山﨑洋輔、竹野友理子、西垣扶佐子
山田雅司、木村博信、田村康一
株式会社ヘリオス・神戸研究所［背景］
近年がん免疫療法においてNK細胞療法は、高い抗腫瘍性を持ちながら、副作用のリスクが低いことから有望な治療方法として注目を集めている。そのため、iPS細胞を用いたNK細胞製造法も報告され始めている。我々は、固形がんに対する抗腫瘍効果を増強するために遺伝子導入iPS細胞由来NK細胞（HLCN061）を開発している。今回、より安価なOff-the-shelf免疫細胞治療法を目指し、スケールアップ可能な三次元灌流培養法に着目し、従来技術より効率的なiPS細胞由来NK細胞作製技術を確立した。
iPS

HPC

NKNK

濃縮洗浄

分注

凍結保存

LN2

スフェア

分化誘導

分化誘導

拡大培養工程工程（CRF凍結)

保存［方法］
事前に各種工程条件を決定した(図5)後、灌流培養(自動連続培地交換)

遺伝子導入iPS細胞を浮遊細胞用の三次元培養容器に播種し、自動灌流培養装置（図1）で、iPS細胞スフェロイドを形成させた。得

500 mL
培養容器

られたiPS細胞スフェロイドを、三次元培養

3000 mL
培養容器

自動濃縮洗浄システム

三次元培養容器、及び自動還流培養装置(佐竹マルチミクス株式会社)

液体窒素
タンク保存

A-1

る分化誘導を実施し、遺伝子導入iPS細胞由DesignSpace

三次元自動灌流培養装置イメージ

来NK細胞（HLCN061）を作製した（図2）。
A-3

A-2

Raw Data

その後、三次元培養容器からHLCN061を回収し、調製された凍結保存液及びプログラム

A-4

AI解析

フリーザーを用いて、HLCN061を凍結保存しAI解析を用いた凍結保存液組成最適化
iPS細胞スフェア

造血前駆細胞CRF プログラム最適化

NK細胞

図2.遺伝子導入iPS細胞由来NK細胞（HLCN061）iPSC3D
5日
AK03N

* E6***

DM/F12

NK拡大培養14-16日基礎培地 1 + α

基礎培地 2 + α

基礎培地 2 + α

ｂFGF

ｂFGF

SCF

SCF

SCF

Y-27632

Y-27632

Flt3L

Flt3L

IL-15

VEGF165
BMP4 SCF

IL-3

IL-15

CHIR**SB****図3. ダウンストリームプロセス開発

NK分化誘導14-16日HPC分化誘導2日 2日
10日

容器に播種し、各種成長因子及びサイトカイン存在下（図4）で自動灌流培養装置によCRF: Controlled Rate Freezer

https://www.satake.co.jp/

図1.

プログラムフリーザー
凍結処理

自動分注システムた（図3）。凍結保存した細胞は解凍後、各種アッセイ系でその機能を確認した。

（A）

（B）

（C）

IL-7

DM/F12* : DMEM F-12

CHIR** : CHIR99021

E6*** : Essential 6 Medium

SB**** : SB431542

図4. 各工程に必要な成長因子、サイトカイン、低分子化合物概要
各工程に必要な成長因子、サイトカイン、低分子化合物を検討の上決定した。

図7. HLCN061 NKマーカー評価

灌流培養法では、それぞれの工程で必要な成長因子、サイトカイン、低分子化合物を添加し調製した各培地を、自動灌流培養装置で連続的に供給した。

（A）（B）

フローサイトメトリーにより、 NK細胞表面マーカーCD56(A)、（C）

細胞傷害因子グランザイムB（GZB）(B)、及びパーフォリン
NK分化誘導NK拡大培養（ Perforin ） (C) の 発 現 を 確 認 し た 。 測 定 は MACSQuant®

Analyzer 10 Flow Cytometer（ Miltenyi Biotec ）を用いた。

（A）（B）

図6. 3000 mL培養容器を用いた拡大培養細胞密度推移（D）<主要最適化条件>
・灌流条件
・攪拌条件
・分離膜選定佐竹マルチミクス株式会社 https://www.satake.co.jp/（E）

治験薬製造を想定した3000 mL培養容器を用いて、自動灌流培養法を用いてNK細胞の拡大培養を実施した。検討は3回実施し、生細胞密度はNucleoCounter NC-202™（ChemoMetec）で測定した。

図5. 各種工程の最適化検討

表1. 3000 mL培養容器を用いたHLCN061拡大培養収量

各種工程において、事前に検討を実施。(A)自動灌流培養の有用性評価、(B)

図8. A549に対する傷害活性評価

生細胞密度[cells/mL]

総生細胞数[cells](A)HLCN061とA549細胞を共培養し、4時間後にLDH assayを用細胞洗浄液の選定、(C)プログラムフリーザーの有用性評価、(D)iPS細胞スフェ

batch-1

2.81×107

5.62×1010

いて細胞傷害活性を測定した。比較対象にヒト末梢血由来NK細ア形成工程の最適化、(E)凍結保存液の組成決定。(A),(B),(C)は遺伝子導入前

batch-2

2.87×107

5.74×1010

胞（primary NK）を使用し、Cetuximab（抗EGFR抗体）の有無そのiPS細胞で評価、及び最適化を実施し、(D)(E)は遺伝子導入iPS細胞を用いてbatch-3
Ave

2.29×107
2.66×107

4.58×1010
5.31×1010

れぞれの条件で測定した（E/T=3）。(B)更に、用量反応性を確最適化を実施した。(A)の生細胞密度はNucleoCounter NC-200™（ChemoMetec）で測定した。(D)スフェアの粒度分布はMultisizer 4e（Beckman Coulter）を用い測定した。(B)(C)(E)の細胞傷害活性評価はヒト肺胞基底上皮腺癌A549細胞と共培養を実施し、4時間後にLDH assayを用いて評価した。

培養液量2000 mL/容器でNK細胞の拡大培養を実施した結果。回収
時の生細胞密度から総生細胞数（収量）を算出した。

［結果］認するため、 HLCN061とA549細胞を共培養し、4 時間後にLDH
assayを用いて、 E/T比（0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30）それぞれの細胞傷害活性を測定した。

［結論］

三次元灌流培養法により得られたHLCN061は、CD56、グランザイムB、及び我々は、三次元培養法と自動灌流培養法を組み合わせることによパーフォリンを高く発現しており（図7）、高純度のNK細胞をiPS細胞から作製り、細胞傷害活性を有するNK細胞を遺伝子導入iPS細胞から効率的にできる方法を開発した。最大生細胞密度2.0×107 cells/mL以上の濃度を達成しかつ大量に製造する方法を確立した。また、本方法で作製したiPS細佐竹マルチミクス株式会社（図6） 、3000 mL培養容器1基の培養で約5.0×1010 cells/batchのHLCN061を得

胞由来NK細胞は、凍結保存が可能であり、解凍直後も良好な細胞傷ることができた（表1）。また、ヒト肺胞基底上皮腺癌A549細胞に対する細胞傷害活性を示すことから、より安価なoff-the-shelf免疫細胞療法の手害 活 性 を 確 認 し た 結 果 、 凍 結 解 凍 し た HLCN061 は 、 ヒ ト 末 梢 血 由 来 NK 細 胞段として期待される。現在、神戸医療イノベーションセンター（primary NK）と同等もしくは高い細胞傷害活性を示し、且つ、Cetuximabを添（KCMI）において、自動灌流培養装置を導入し（図9）、治験製品製加することで細胞傷害活性の上昇を示した（図8-A）。また、HLCN061は、A549造準備を進めている。

細胞に対し用量依存的な細胞傷害活性を示すことが確認できた（図8-B）。

https://www.satake.co.jp/news/1579.html

図9. 導入した自動灌流培養装
演題名：三次元自動灌流培養法による遺伝子導入iPS細胞由来NK細胞（HLCN061）の大量製造方法の開発

施設名：株式会社ヘリオス・神戸研究所
氏名： 倉知 建始

筆頭演者は株式会社ヘリオスの社員です。