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老人性認知症・運動障害発症に対する機能性食品 / サプリメントの予防効果＜平成 20 年度助成＞

老人性認知症・運動障害発症に対する機能性食品 /サプリメントの予防効果
上原孝（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科）

1.

緒性も有している。また、PDI は植物から高等生物

言まで種を超えて保存されており、生物にとって必神経細胞は虚血ストレスに対して脆弱であり、要不可欠な酵素である。しかしながら、脳梗塞あすみやかに死に至る。脳虚血時にはグルタミン酸るいは老化によって酸化ストレス、とくに NO にの過剰量放出が起こり、細胞内 Ca 2+ 濃度の上昇よるニトロソ化ストレスが負荷されると PDI のとそれに伴う一酸化窒素合成酵素（NOS）の活性触媒部位システイン残基が S – ニトロシル化され化を介した一酸化窒素（NO）の産生が惹起されるることを明らかにしてきた。PDI の S – ニトロシ（図 1）。NO は蛋白質システイン残基チオール基のル化は酵素活性を著しく消失させるために、結果修飾（S – ニトロシル化）を引き起こし、その機能として、ER 内に未成熟な変性蛋白質が蓄積するに影響を与えることが明らかにされつつある。とことになる。その状態が続くといわゆる小胞体ス

くに、細胞内 S – ニトロシル化蛋白質を特異的にトレス と なり、様々な小胞体を起源とした情報伝

1）

2）

達系 す な わ ち UPR : unfolded protein response

や caspase 3）な ど 数 多 く の 基 質 蛋 白 質 が 同 定 さが活性化される。この持続的な UPR の活性化にれ、それらの酵素活性に対する効果や種々の生より、細胞死惹起シグナルが ON となり、アポトー理的あるいは病態発症機構が提唱されている。当シスが誘導され、最終的に神経変性疾患が惹起さ研究室では、脳虚血ストレス抵抗性因子である蛋れることが示唆されている。さらに特筆すべき

白質ジスルフィドイソメラーゼ（ protein-disulfide

ことは、この S – ニトロシル化された PDI（SNO-isomerase; PDI ）が NO により S – ニトロシル化さPDI）は遺伝的な背景を有さない孤発性神経変性れ、酵素活性が消失することを明らかにしてい疾患患者（アルツハイマー病やパーキンソン病）る 。さらにごく最近、新たな S – ニトロシル化蛋の死後脳においてのみ著明に認められたことで白質の網羅的スクリーニング系を開発し、その一つある。したがって、この発見はこれまでに不明でとして癌抑制因子である PTEN の単離同定にも成あった孤発型神経変性疾患発症にニトロソ化スト功している。この PTEN の S – ニトロシル化は脳神レス、とくに PDI の S – ニトロシル化が関与して経系における細胞の生存あるいは死を制御する重要おり、小胞体に機能異常・小胞体ストレスを介しな鍵となっている反応であることを突き止めた 5）。て神経細胞死を惹起するという世界で初めてのコ検出する Biotin-switch 法の開発 以来、Parkin

4）

PDI は 小 胞 体（endoplasmic reticulum; ER）内ンセプトを提唱するに至った（図 1）。

腔に存在し、新生蛋白質のジスルフィド結合形成

細胞内 SNO – PDI の特異的検出法の開発は、孤に関わる酸化還元酵素であり、蛋白質の高次構造発性神経変性疾患に対する早期診断に役立つこと形成に必須である。さらに、PDI は折りたたみ不が期待される。そこで、SNO - PDI を特異的に認

全蛋白質のフォールディングを促すシャペロン活識する抗体の作出を考案したが、S – ニトロシル

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浦上財団研究報告書

基は不安定であり、抗原として不適であった。システインチオール基の酸化修飾には複数の段階があるが、これまでに、液体クロマトグラフィー質量分析（LC - MS）解析から PDI が NO 刺激によっ

Vol.19（2012）

2.

実験方法

2.1 スルホン酸化 PDI 特異的モノクローナル抗体の作出てスルフェン酸（– SOH）、スルフィン酸（– SO2 H）

PDI は N 末端側、C 末端側に 2 か所のチオレを形成することを明らかにしていた（図２）。また、ドキシン様ドメインをもち、それぞれ活性部位と一般に、S – ニトロシル化は可逆的な反応である

される CGHC（Cys-Gly-His-Cys）配列を有していが、一方、最終的にスルホン酸まで酸化されるとる。PDI はこの CGHC 配列に含まれるシステイ安定して存在することが知られている。そこでこン残基のチオール基と基質蛋白質チオール基とののスルホン酸化 PDI の抗体の作出を試み、それ間で結合・解離することにより正しいジスルフィを用いた薬物のスクリーニング系の構築を行うこド結合形成を行う。当研究室では、これらのシスととした。

テイン残基が NO や H 2 O 2 の標的であることを明

図1

PDI の S – ニトロシル化と小胞体ストレスを介した神経変性疾患惹起機構

図2

蛋白質システインチオール基の酸化還元による修飾段階

老人性認知症・運動障害発症に対する機能性食品 / サプリメントの予防効果

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らかにしてきた。そこで、このシステイン残基を体を適用したが、スルホン酸化 PDI を検出する

スルホン酸化したペプチドを抗原とし、抗体のスことができなかった。一方、免疫沈降法に適用クリーニングを試みた。PDI の 2 つのチオレドキしたところ、スルホン酸化 PDI を効率よく pull-シン様ドメイン活性部位とされる CGHC 配列のうdown することが可能であった。SDS – PAGE に

ち N 末端側の Cys を含む 9 アミノ酸からなるペは SDS により蛋白質の非共有結合を解離させてプチドの酸化（– SO3 H 化）型を抗原ペプチドとし、立体構造を変化させる過程が含まれることから、非酸化型をコントロールペプチドとした。これら

本抗体は抗原のアミノ酸配列のみでなく、立体構のペプチドを Morpho Sys 社のファージライブラ造も認識していることが示唆された。したがっリー（HuCAL GOLD ® ）と反応させて候補抗体をて、これ以降の実験は免疫沈降法に本抗体を適選別した。ファージディスプレイ法は、150 億種用し、種々の検討を行った。その結果、野生型類以上のヒト Fab 抗体をコードする DNA をファPDI および PDI の活性部位にあたるチオレドキージに導入し、Fab 抗体ペプチドとファージコーシン様ドメインにあるシステインをセリンに変ト蛋白質とを融合した形で発現させたファージラ

異させた 4 種の変異体（C36/39S、C383/386S、イブラリーに抗原ペプチドを反応させ、結合したC36/39/383/386S）を HEK293T 細胞に強制発現ファージを選別（パニング）するものである。そさせ、H 2 O2 で 6 h 処理後、可溶性画分に対して抗スの後、選別した抗体 DNA を細胞に発現させ、抗ルホン酸化 PDI 抗体を用いて免疫沈降反応を行っ原ペプチドに対する結合性の高いものを ELISAた。その後、免疫沈降物に対して抗 PDI 抗体をで選別（スクリーニング）したところ、10 種のク用いてウエスタンブロット解析を行った。その結ローンを得ることに成功した。これらのうち、シ果、C36/39S お よ び C383/386S 変 異 体 で は 野グナルの高いものを選択し、本研究の対象とし生型の約 1/2 に、C36/39/383/386S 変異体ではた。本抗体は遺伝子組み換えにより人工的に作

ほぼ basal レベルまでシグナルが減弱した。この製したものであり、Fc 領域を欠く F（ab’）2（Fabことから、本抗体がスルホン酸化 PDI を特異的二量体）である。したがって、抗原に特異的であに認識していること、さらにスルホン酸化修飾はる Fab 部分以外の領域を介した非特異的な結合S – ニトロシル化部位と同様に酵素活性に重要な反応を防ぐことができると考えられる。しかし、チオレドキシン様ドメイン中のシステイン残基で免疫沈降法において通常用いられる Protein A 等起きていることが明らかとなった。の担体には抗体の Fc 部位の結合が必要であるた

2.2

Biotin-switch assay（図 3）め、本抗体には適用できない。そこで本研究では、

S – ニトロシル化蛋白質の検出は Biotin-switch

担体として Dynabeads M - 450 Epoxy を用いた。

assay を駆使して行った。下図にその概略を示し

Dynabeads M - 450 Epoxy は磁性を帯びた beads

た。 遮 光 し た 15 ml チ ュ ー ブ に Blocking buffer

であり、強力磁石を使って遠心分離よりも穏やかを予め分注し、そこへインキュベート後のサンプな条件下での分離精製が可能である。また、本担ル全量を移し、50 ℃の恒温槽で 2 0 min インキュ体の表面のエポキシ基は第 1 級アミノ基と共有結ベートした。その間 3 min おきに転倒混和をした。

合を形成し、本抗体の固定化が可能である。

未反応の MMTS を除去するため、– 20℃アセト

本研究を始めるにあたって、まず SDS – PAGEンを 10 ml ずつ加えて – 20℃で 20 min 静置した後、あるいは 2 –メルカプトエタノール非存在下での3000 rpm, 4 ℃, 15 min 遠心分離した。上清を除SDS – PAGE に続くウエスタンブロット法に本抗き、– 20 ℃アセトンで 3 回洗浄した後、アセトン

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浦上財団研究報告書

図3Vol.19（2012）

Biotin-switch assay を利用した抗酸化薬の SNO–PDI 還元能スクリーニング法の概略が完全にきれるまでチューブを倒置した。その後、ーテーター上にて 4 ℃で一晩インキュベートした。

HENS buffer 200 ml でペレット状のサンプルを翌日サンプルを1000 rpm, 4℃, 1 min 遠心分離し、clear solution になるまでピペッティングにより上清をピペットで静かに除いた。Neutralization

溶解させ、新しい 15 ml チューブに移した。そbuffer + NaCl 1 ml で streptavidine-agarose gel

こへ 4 mM Biotin–HPDP 66 ml および Ascorbateを 4 回洗浄した後、上清を完全に除いたサンプル

solution あるいは 50 mM 抗酸化薬を 5 ml 加え、に 4 × laemmli buffer 20 μl を 加 え、5 min 煮 沸遮光、室温条件下 1h インキュベートした。

し、氷冷した。

未反応の Biotin–HPDP を除去するため、– 20 ℃アセトンを 540 μl ずつ加えて – 20 ℃で 20 min 静3.

結果置した後、3000 rpm, 4 ℃, 10 min 遠心分離した。

PDI の酸化がアルツハイマー病やパーキンソン上清を除き、アセトンが完全にきれるまでチュー病などの神経変性疾患発症の形成に関与しているブを倒置した。その後、HENS buffer 450 μl でペことが我々の研究から示唆されたことから、PDIレット状のサンプルを clear solution になるまでピの酸化を抑制する / あるいは酸化した PDI を還元ペッティングにより溶解させた、サンプル溶液のするような抗酸化薬が見出されれば、孤発性神経20 μl を input 用に新しい 1. 5 ml チューブに移し変性疾患の予防や治療に貢献する可能性がある。

た。Input 用サンプルには 4 × Laemmli を 2 0 ml

そこで、抗体を用いたスルホン酸化 PDI 特異的

加 え、5 min 煮 沸 し た。 こ こ で、streptavidine-検出法を利用し、PDI の酸化を特異的に抑制する

agarose gel 30 μl / サ ン プ ル を そ れ ぞれ新しい薬物の探索を行った。

1. 5 ml チ ュ ー ブ に 取 り、5000 rpm, 4 ℃, 1 min でスルホン酸化 PDI の形成の抑制する薬物の抗遠心分離後上清を除き、Neutralization buffer を酸化作用には様々な機構が予想される。具体的に30 μl ずつ加えて懸濁した。サンプル 430 μl には、① 活性酸素種や活性窒素種などのラジカルNeutralization buffer 800 μl を加え、先に用意し種そのものを捕捉することにより PDI の酸化をておいた streptavidine-agarose gel の懸濁液のチュ妨げる、② 可逆的な修飾である S – ニトロシル化ーブにそれぞれ移し、パラフィルムで密閉後、ロをうけた PDI のニトロソチオール基をチオール

老人性認知症・運動障害発症に対する機能性食品 / サプリメントの予防効果

21基に還元する、③スルホン酸より酸化度の比較的H 2 O 2 刺激によるスルホン酸化 PDI 形成を抑制す低いスルフェン酸、スルフィン酸などまで酸化さる抗酸化薬を探索した。

れた PDI を還元する、④（持続的な酸化刺激に対12 種の既知抗酸化薬 A-L について、薬物 A-Iして）細胞内シグナル伝達を介して抗酸化作用を

各 100 μM，J, K 各 10 nM, L 400 μM を 1 h 前 処示す、などの機構が考えられる。本研究では特に、理した HEK293T 細胞に対し 1 mM H 2 O 2 により

H 2 O 2 刺激によるスルホン酸化 PDI を減少させる惹起された PDI のスルホン酸化が抑制されるか抗酸化薬が ① 活性酸素捕捉能を有するか、また否かを検討した。その結果、7 種の薬物 A, C, D,あるいは ② SNO – PDI を還元するか否かを以下のF, H, J, K においてスルホン酸化 PDI が著しく減実験により検討した。

少することがわかった（図 4 および図 5）。

まず、抗スルホン酸化 PDI 抗体を用いて、1 mM

次に、これらの薬物の PDI の酸化を抑制する作（a）

（b）

図4

H 2O2 刺激によるスルホン酸化 PDI 形成を抑制する抗酸化薬のスクリーニング(a) 薬物 A, B, C, D 各100μM，(b) 薬物 E, F, G, H 各100μM,

図5

H 2O2 刺激によるスルホン酸化 PDI 形成を抑制する抗酸化薬のスクリーニング(c) 薬物 I 100μM, J, K 各10 nM, L 400μM

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浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）

用が、活性酸素捕捉能の有無によるものであるかさらに、これらの薬物が S – ニトロシル化され否かを検討した。一部の抗酸化薬（薬物 B, E, F,た PDI を還元するか否かを検討するため、Biotin-G, H, J, K, L）について、その活性酸素捕捉能のswitch Assay に応用してその効果の有無を検討し有無を調べた。ルミノールの過酸化水素との反応た。Biotin-switch Assay では S – ニトロシル化蛋による化学発光を抗酸化薬が抑制すれば、過酸化白質を還元するアスコルビン酸（Asc）の代わり水素を直接捕捉している可能性を間接的に示すこに抗酸化薬で処理した。その結果、薬物 B のみで、とができる。その結果、薬物 E, F, G, H, J でルミ

アスコルビン酸と同程度の還元作用があることがノール反応における化学発光量が著しく抑制され示唆された（図 7）。

た。一方、薬物 B, K ではコントロールとほとんど差がなく、一方、薬物 L はルミノール反応における化学発光量を増大させた（図 6）。

4．考察

PDI のスルホン酸化を抑制する薬物は多く存在

これらのことから、薬物 E, F, G, H, J はその強したが、PDI の S – ニトロシル化を還元する活性力な活性酸素捕捉能により過酸化水素に直接作用を持つ薬物は B のみであった。薬物 C, D, I は未して PDI のスルホン酸化を抑制した可能性が示検討であり、ラジカルスカベンジ能、S – ニトロ

唆された。

シル化 PDI 還元能について今後検討する必要が

図6

図7

ルミノールの過酸化水素との反応による化学発光

Biotin-switch Assay による抗酸化物の S – ニトロシル化 PDI に対する還元作用老人性認知症・運動障害発症に対する機能性食品 / サプリメントの予防効果23ある。ただし、薬物 D は生体内に高濃度に存在し、した特徴を持つ抗酸化薬が見いだされれば、それ中枢神経系においても重要な役割を果たすことがらは S – ニトロソチオール基に直接作用して還元知られる物質であることから、今後臨床応用を視する作用を有する可能性が高いと推定される。

野に入れた際に中枢神経系において「抗酸化薬」

薬物 L は、代表的なラジカルスカベンジャーととしてそのまま投与することには慎重を要する。

して知られているが、過酸化水素により産生した

しかし、生体内における薬物 D 量は老化とともヒドロキシラジカルに対するスカベンジ能を示さに減少するという報告があり、老化に伴う酸化スず、逆にルミノール反応による化学発光量を増加

トレスの増加に対し抵抗性を示す内在性物質であさせた。これに関しては、L 単独ではラジカルスるかもしれない。

カベンジ能を示さないがアスコルビン酸と協働しデータには示さなかったが、アスコルビン酸て強力なラジカルスカベンジ機能を発揮するといは、PDI のスルホン酸化を抑制する傾向がみらう報告があり、これを支持する結果であるかもしれた。したがって、PDI のスルホン酸化を抑制れない。アスコルビン酸と混合した際にラジカルし、かつ S – ニトロシル化 PDI 還元能をもつと推スカベンジ能を発揮するか否かを検討する必要が定される薬物は現段階ではアスコルビン酸が有力あり、効果が認められる場合には、アスコルビンな候補であることは間違いない。アスコルビン酸酸の欠点（中枢神経系への作用を考える場合の欠は IUPAC 命名法ではフランの誘導体と見なして、点、水溶性であることなど）を補い（その場合に（R）– 3, 4 – ジヒドロキシ – 5 –（（S）– 1, 2 – ジヒド

はアスコルビン酸自体にも脂溶性を増す工夫が求ロキシエチル）フラン – 2（5H）– オンと表される

められるが）、強力な抗酸化薬として臨床応用の水溶性物質である。一方、血液脳関門の機能によ可能性があるかもしれない。

り、脳には脂溶性の高い物質のみ移行可能である

今後、PDI の酸化を抑制し、かつ S – ニトロシことが知られている。したがって、中枢神経系にル化 PDI を還元するような抗酸化薬が見いださ

アスコルビン酸を抗酸化薬として応用する場合、れれば、蛋白質の還元を介して神経変性疾患の症脂溶性をもつ構造へ変化させる工夫が必要である状緩和に貢献するかもしれない。と考えられる。
アスコルビン酸が S – ニトロソチオール基を特異的に還元する機構については、最新の報告では
６）

5.

結論

本研究から以下の知見を得た。

その詳細な機構が提唱されている 。それによる

1. スルホン酸化 PDI に対するモノクローナル抗と、S – ニトロソチオールーアスコルビン酸反応体を作出して新規酸化 PDI 評価系を構築し、では、アスコルビン酸の 4 – 位のヒドロキシル基

各種酸化ストレス刺激による PDI のスルホンの O 原子が S – ニトロソチオール基の N 原子を攻酸化を細胞レベルで特異的に検出可能である

撃し、トランス S – ニトロシル化が起きる。O – ニことを明らかにした。

トロソアスコルビン酸は自己分解により、NO と

2. PDI のスルホン酸化は PDI 酵素活性に重要なアスコルビルラジカルアニオン、あるいは亜硝酸2 か所のチオレドキシン様ドメインにあるシスイオンとアスコルビン酸となり、それぞれ再び反テイン残基で起きることを明らかにした。

応に利用されると考えられている。

3. 本実験系を利用して PDI の酸化を抑制する抗アスコルビン酸に類似した構造を持つ、とくに酸化薬のスクリーニングが可能であることがアスコルビン酸の 4 – 位のヒドロキシル基に類似わかった。また、ビオチンスイッチ法や活性24

浦上財団研究報告書

酸素捕捉能測定により、抗酸化物の作用の違Vol.19（2012）討していくことが重要と思われる。

いを明らかにできる可能性を示した。
文

PDI の酸化を活性酸素種自体の産生抑制、あるいはそれらを捕捉する薬物は PDI の酸化を未然に防ぎ、小胞体ストレスを介して発症する孤発性神経変性疾患の予防薬として応用できる可能性がある。また、PDI の酸化や S – ニトロシル化を還元するような抗酸化薬は、前述の疾患の治療に貢献することが期待される。
今後、PDI の酸化を抑制する抗酸化薬を新たに見出していくとともに、その詳細な機構についてさらに検討していく必要がある。また、これら抗酸化薬がパーキンソン病モデル動物に作用し、酸化を抑制して細胞死 / 症状を緩和するか否かを検献

1) Jaffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, Tempst P,Snyder SH. Nat Cell Biol. 2001: 3 (2) : 193-7.
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5) Numajiri N, Takasawa K, Nishiya T, Tanaka H, Ohno K,Hayakawa W, Asada M, Matsuda H, Azumi K, Kamata H,Nakamura T, Hara H, Minami M, Lipton SA, Uehara T.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011;108 (25) : 10349-54.
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Biomol. Chem., 2009;7(9):1954-1962.

Novel screening system for new type of anti-oxidant reagents with a specific antibody

Novel screening system for new type of anti-oxidant reagentswith a specific antibody
Takashi Uehara
Graduate School of Medicine, Dentistry, and Pharmaceutical Sciences
Okayama University
We have demonstrated that protein-disulfide isomerase (PDI), a thioredoxin-related
ER chaperone, functions as a protective protein against apoptotic neuronal cell death
triggered by hypoxia/ischemia. On the other hand, protein quality control is known to bea critical system of intracellular homeostasis. Particularly, misfolded proteins producedin ER lumen are rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Free radicals
including nitric oxide (NO) are known to induce the accumulation of misfolded proteinsin cells. Interestingly, we have found that S-nitrosylation/oxidation of PDI results inprotein misfolding leading to neuronal cell death/sporadic neurodegenerative diseases.
Furthermore, we could detect the S-nitrosylated form of PDI in cells by treatment withnot only NO/glutamate but also in brains manifesting sporadic Parkinson’s or Alzheimer’s
disease. Oxidation of PDI attenuates the enzymatic chaperone and isomerase activities,
leads to accumulation of poly-ubiquitinated proteins, and activated the unfolded protein
response in primary cortical neurons. Hence we speculate that there is a relationshipbetween dysfunction of ER enzyme via oxidation and onset of sporadic neurodegenerative
disorders.
The aim of this study is to establish the assay system to detect oxidized PDI (PDISO 3H) with a specific antibody and to isolate the new type of anti-oxidant derivatives bymeans of this antibody. We initially attempted to isolate the specific monoclonal antibody
that recognizes oxidized domain of PDI. We screened human antibodies that bind to thesynthetic peptide (EFYAPWC (-SO 3 H) GH) using an antibody library displayed in M13
phage by an ELISA assay and then obtained several candidates. Consequently, a clone
could be employed to detect oxidized form of PDI in response to NO and hydrogenperoxide. Thus, we succeeded to establish the specific monoclonal antibody that recognizes
oxidized form of PDI. Then, we examined if several known anti-oxidants prevent theoxidized formation of PDI induced by NO/hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). Some compounds
actually had an ability to attenuate the oxidized formation of PDI by NO/H2O2, however,those were attributed to function as a radical trapper. Interestingly, since a compound
revealed both the inhibition of the oxidized formation of PDI and non-radical trapper
activity, this chemical might be a new type of anti-oxidant which results in the reductionof a particular protein as seen in ascorbate in vitro. Therefore, we are now trying todemonstrate the ability of this compound in cells and in vivo system.

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