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浦 上財 団研 究 報告 書Vol.7(1999)

食 品 が 薬 の 作 用 に 影 響 を 与 え る機 構
一薬 の体内動態 に及 ぼす飲料 物(果 物 ジュース,清 涼 飲料,
嗜好飲料,健 康飲料 な ど)の 効果一

澤

田

康

文(九 州大学大学院薬学研究科教授)

我々 はGFJとP‑gpの目

的

相互 作 用 も薬物 吸 収 の増大化 に関わ ってい るので はない か と考 えた。

「
食べ 物 と薬 の相互 作用 」は薬 の作 用 に影響 すGFJの 薬 物代 謝 の原 因物 質 の一 つ と して フラる重 要な問 題で あ り,医 療現場 での 「医薬品 の適

ボ ノイ ド類 が考 えられて いる。 ケルセ チン,ケ ン

正使 用」 のた めに必須 の情報 とな ってい る。 薬のフェロー ルや ミリセチ ン等 の食 品に含 まれ るフラ

体 内動態 に及 ぼす食べ物 の効果 の機構 に関 して詳

ボノイ ド類 は,ラ ッ トや マウ スにお ける発 ガン性

細 な解析 はあ ま り行わ れてい ない。特 に最近,グ物質 誘導型 の腫瘍 を も阻害 す る効 果 を有 す るこ と

レープ フルー ツジ ュー ス(GFJ)がが報 告 されてい る。一方,こ れ まで に当研究室 で高血 圧治療 薬,

抗 ヒス タ ミン剤,免 疫 抑制剤,睡 眠 薬な どの作用も様 々 なフ ラボノ イ ド類 のP‑gpに 対 す る影響 をを増 強す る ことが報告 され てお り,そ の機構 解析

検討 して いる。 その結果,配 糖 体で は効果 は見 らと薬品情報 の構 築 は焦 眉の急 とな ってい る。 これ

れ ない ものの,ア グ リコンで は濃度依 存的 に ビン

まで,GFJとこれ らの薬 物 との 相互 作 用の 要因

は消 化管 に お け る薬物 代 謝(CYP3A4阻

ク リス チンの排 出機能 を阻害 する ことが示 された。

害)が更 にケ ルセチ ンやケ ンフェ ロール などの フラボ ノ

原 因 で あ る と 報 告 さ れ て き て い る。 一 方,ール類 では,低 濃 度領域 で は排出促進 機能 も見 ら

CYP3A4と薬物 排 出膜輸 送機 構 であ るP糖 蛋 白れる といった二相 性 の効果が確 認 された。 この様質(P‑gp)の

基 質 や 阻害 剤 には かな りの重 複 が見 られ る(Wacher,v.J.etaL,1995)ことか ら,な効果 は,こ れ までに ケン フェ ロー ルのP‑gp機
能 阻 害 に働 く とい っ た 報 告(Sarkar,M.A.,

Chart1.PreparationofgrapefruitandGFJextractionbgseveralorganicsolutions

27

食品が薬の作用に影響を与える機構
1995)やP‑gp機

能 促 進 に 働 く とい っ た 報 告(Phang,J.M.etal.,1993)とも一致す る もの で

腸 管袋 の内側 に薬液 を添 加 し,漏 れで 薬物の量 を
経 時 的 に採取 す る。薬 物 として は,ロ ー ダ ミンある。 従 って,フ ラボ ノイ ド類の 排出機能 蛋 白質

123(Rh123)を

へ の影響 は,非 常 に複雑 であ るが興 味深 い もの で

グラ フィーを用 いて行 った。

あ る。 この様 に,GFJに限 らず,多 くの食 品 に用 いた。定 量 は,液 体 ク ロマ ト

代 謝 実 験:ヒト肝 ミク ロ ソ ー ム あ る い ははP‑gpを 含 め て薬物 との相 互作 用 を引 き起 こし

CYP3A4のうる化合 物が含 まれ てい るこ とが考 え られるた め,

6Q水 酸 化 を測定 す る。吸収 実験 で は トランス ウ

詳細 に検 討す る必要 があ ると考 えられ る。

ェルあ るいはマ ルチデ ィ ッシュ上に培養 し,こ れ

そ こで,GFJに

加 え,オ レン ジ ジュー ス に つ

再 構築 系 を用 いて テ ス トステ ロ ンのらを用 いて経細胞輸 送 あるい は取 り込 み実験 を行

いて も,そ の効 果の 要因 となる成分 の分離 を行 っう。代謝 実験 において は,薬 物 の代謝物 の定量 的た。

及 び定性 的変化 を検 討す る。定量 は,液 体 クロマ

方トグ ラフィー を用 いて行 った。

法ジ ュー ス成分の 分離:ジ ュー スを酢酸 エチル にCaco‑2単 層 膜(小 腸上 皮細 胞 の モデ ル培 養細よ り抽 出 し,水 層 を除 き有 機 層 を乾 固 した。残胞),反 転腸 管及 び単離刷 子縁膜小 胞系 を用い て,さを 精製 水 で 懸濁 し,コ ス モ シル カ ラム(COS‑

各種 薬 物 の腸管 吸収 ・代 謝 に及 ぼすGFJ成

分のmosil75C18‑OPN,NacalaiTesque,Kyoto,

効 果 をス ク リー ニ ング す る。特 に,GFJ成

分 とJapan)に

薬物 の 相互 作用 として着 目すべ きは,P‑gpの付 した。 溶出 には メタ ノール を0か ら

機

100%ま で段 階的 に10%ず つ 増加 させ た ものを用能的 阻害 に よる吸収速 度の変 化 と薬 物の代謝 に関い,11の フラク シ ョン を得 た。得 られ たフ ラクシ

与 す るP450酵 素 群へ の阻 害で あ る。 この点 に焦ョン'を乾 固 し,[3H]ビ

点 を当て,invitro系

を用いバ イオ フラボ ノイ ド

細胞 での取 り込み に及 ぼす各 フラク ションの効果と薬 物 の相 互作 用機 序 を解析 した。P‑gpの 基 質を検 討 した 。効果 のあ ったフ ラクシ ョンを更に シとして報告 され てい るビン ブラスチ ンを用 いた。
Caco‑2細 胞系:Caco‑2細胞 は,ヒ ト大 腸癌 由

ンブ ラ スチ ン のCaco‑2

リカゲル カラム(Silicagel60,Kisselge160,
Geldesilica60,Merck)に付 し精 製 した。溶 出

来の培 養上 皮細胞 で あ り培養 する と共 に分化 し,に は,ヘ キサ ン:ア セ トン系(5:1,3:1,1:

次第 に小腸 としての特性 を獲得 す る継 代培養 細胞1)と ク ロロホ ルム:メ タ ノ ール系(1:1)をで あ り,一 般に消 化管上 皮細胞 モデ ル として用いい,各 溶媒 系で3〜4フられ る実験 系で ある。吸 収実験 で は トラ ンスウ ェラ クシ ョンを得た。 これ らの フラクシ ョンを乾固

用

ラク ションで合計16の フルあ るい はマル チデ ィッシ ュ上 に培 養 し,こ れ ら

し,[3H]ビ

を用 いて経 細胞膜輸 送 あるい は取 り込 み実験 を行

込 みに及 ぼす各 フラク ションの効果 を検討 した。

う。 定量 は,主 と して放 射性化 合物 を輸 送実験 の各 フ ラ ク シ ョン で の 目的 成 分 の 確 認 はTLC

基質 と して用い,放 射活性 の測 定 によ り行 った。
反転 腸管法:ラン ブラ スチ ンのCaco‑2細(silicagel60,F254,MERCK)に

胞 の取 りよ り行 い,展

ットか ら腸管 を取 り出 し,腸 管

開溶 媒 はヘ キ サ ン:ア セ トン系 を用 いた。 目的を反転 させ袋 状 にした もの を用 い る。部 位差 を確

成分 の構 造 決定 は フ ラク シ ョン をCDCI3に 溶 解

認す るた め,胆 管か ら下部10cmず

し,TMSをつ5部 位 に分けて,そ れ ぞれsite1〜5と して検 討 した。各反 転

内 部 標 準 と し500MHzH‑NMR(UNITY‑plus,Varian)に

よ り同定 した 。更 に,

28

GFJあ

浦 上財 団研 究 報告 書Vol.7(1999)

るい は オ レン ジジ ュー スの酢 酸 エ チル抽

出物 にお け る水 層部 分 も[3H]ビ
のCaco‑2細ン ブラ スチ ン

胞へ の取 り込 みに及 ぼす効 果 を検 討

した。

結

果

1.

GFJ,オ

2.Caco‑2細胞で のGFJによるP糖 蛋 白質 に対 す る阻害成分 の同定
2.1GFJのCaco‑2細胞へ の毒性LDHの分泌 はGFJ存在下 で2.78±0.46%,非存在下 で2.92±0.76%であった。 更 に,50%GFJ

存在下,非 存 在下両場 合 と も死細 胞 を示 す トリパ
レンジ ジュース及 びベ ラバ ミルによる ラ ッ ト反転 腸 管 を用 い たRh123排

出2.2Caco‑2細輸送 に対 する阻害 効果
ラ ッ ト反転腸 管を用 い,P糖
あるベ ラ バ ミル,GFJ及ンブルーの染 色率 は5%以

A及 びGFJのび オ レン ジジ ュー スの
排 出輸 送 に

胞 で の[3H]ビン ブ ラス チ ンの経 細胞 的な透過 に及 ぼすシ クロス ポ リン

蛋 白質 の阻害剤 で

酢 酸 エ チ ル 抽 出 物 に よ るRh123の下で あ り,細 胞 の生 存

率 に変化 は見 られ なか った。

効果

Caco‑2細 胞 での[3H]ビンブ ラスチ ンの 管腔

対 す る 効 果 を検 討 した。Site2〜5に お い て,側 膜か らバ ソラテ ラル 側へ の透 過 に及 ぼ すGFJ

Rh123の 排 出 はベ ラバ ミルで 有意 に阻害 され たの効果 を検討 した(Fig.2)。[3H]ビ(Fig.1A)。 ま た,Site4,5にン の 透 過 速 度 は0.019±0.001mL/min/mgpro‑

お い てRhl23のンブ ラス チ排出 はGFJ酢

酸 エ チル抽 出物 で有 意 に阻害 されteinで あ っ た。50%GFJもた(Fig.1B)。

同様 な部 位 にお いて,Rh123の

ス ポ リンAの 存 在 によ り透 過速 度 はそ れ ぞれ0.

排し くは20,uMシ

出 はオ レ ンジジ ュース酢酸 エチ ル抽出物 で有意 に070±0.004,uL/min/mgprotein,0.126±0.004

阻害 され た(Fig.1c)。

μL/min/mgproteinとい ずれ も,そ の阻 害効 果

な り,GFJ及クロ

び シク ロス

はP糖 蛋 白質 の分 布 の多 い消化 管 の下 部 に なる

ポ リンAの 存 在で有 意に増加 した。 細胞 間隙の透につ れて大 き くなった。

過 を示す[14C]マ

Fig.IA

Effectofverapamil(300μM)onRh123(150μM)effluxinratintestineevertedsac.
Mea11±S.E.M(11=5〜7)率P<0.05;掌串P〈0.01

ンニ トー ルの 透過 速度 は,コ?g

食品が薬の作用に影響 を与える機構

Fig.1B

Effectoforangejuice(50%)onRh123(15011)effluxinratintestineevertedsac.
Mean±S.EM(n=3〜5)*Pく0.05;*.p<0.Ol

Fig.1CEffectoforangejuice(50%)onRh123(150μM)effluxinratintestineevertedsac.
:Mean±S.E.11(n=3‐o)*P<O.Oo;

及び シ クロスポ リンAに よる細胞 間隙の透過 の変

ン ト ロ ー ル で は0.035±0.005μL/min/mgpro‑
teinであ っ た 。GFJ及下 で の[14C]マ

び シ ク ロ ス ポ リ ンA存

ン ニ トー ル の 透 過 速 度 は0.028±

在

0.004,uL/min/mgproteinおμL/min/mgproteinでよ び0.040±0.004
あ り,この こ と か らGFJ

化 は無視で きる ことが示 された。
2.3Caco‑12細胞 で の[3H]ビの取 り込 み に及 ぼ すGFJ,グンブ ラス チ ン
レー プ フルー ツの 各部位及 び シクロス ポ リンAの 効 果

30

浦上 財団 研究 報 告書Vo1.7(1999)

こ の と き[3H]ビンブ ラ ス チ ン の初 期 取 り込

みに変 化 はみられ なか った。 この こ とよ り,GFJに よ り:・

で の[3H]ビ

ンブ ラス チ ンのCaco‑2細胞 か らの排 出が特 異的 に阻害 されて いる ことが示 唆 され た。更 に,搾 ったGFJ,アル ベ ド及 び

果皮 な どの グ レー プフル ーツの3つ の異 な る部 分の成 分 によるCaco‑2細胞で の[3H]ビンブ ラス

チ ンの取 り込み に対す る効果 を検 討 した(Table1)。 グ レープ フルー ツのいずれ の部分 の存在 におFig.2EffectofGFJorcyclosporinAonthetranscellular

いて も[3H]ビンブ ラス チ ンの取 り込 み 平衡 値

transport(Apicaltobasolateralside)ofI'HIvinblas‑

は増加 を示 した 。搾 ったGFJとtineacrosstheCaco‑2monolayer
Thetrancportof[3H]einblastine(100nM)wasmeasuredinに依存 して[3H]ビ

theabsence(opencircle)orpresenceof50%GFJ(closed
circle)and20μMcyclosporinA(closedtragle).Eachvalue

アル ベ ドの濃 度

ン ブラ スチ ンの 取 り込 み平

衡 値は増加 を示 し,同 濃 度の場 合 を想 定 しそれ ぞrepresentsthemeanエS.E.M.ofthreeexperiments.Significant

れの効果 を考慮 す ると,こ れ らの成 分の阻害 効果

differencesfromcontrol,*;Pく0.05.

[3H]ビ
に 増

下

加

ン ブ
し,60分

で[3H]ビ

GFJの

ラ ス チ

濃

度 依

ン の 取

り 込 み
に 達

は 濃 度

で 定

常 状

態

ン

ブ ラ

ス チ

ン の 取

り 込

存

的

に 有 意

に 増 加

し(Table1),

依 存

し た 。GFJ存

TablelEffectoforiginalGFJ,differentsectionsofgrapefruitorcyclosporinAontheuptakeof[3H]vilユblastineby

み 平 衡

値

的

は果 皮 〉ア ルベ ド〉搾 ったGFJ(果在であ った。P‑gpには上での コ ン トロール として,[3H]ビ肉)の 順 序よるエ フラ ッ クスを検 討 す る
ンブラ スチンの取 り込 みは20μMシ ク ロスポ リンAの 存 在 によ り有意 に 増加 した。 また,ビ ンブ ラ スチ ン は
CYP3A4の基 質で あ る こ とか ら,GFJ存在,非存在 にお けるCaco‑2細 胞 内で の[3H]ビン ブラ

Caco‑2monolaeer

ス チ ンの代 謝 の有無 を検討 した とこ ろ,GFJ存
在,非 存 在下60分 の取 り込 み 実験 後,Caco‑2細胞 にお け る[3H]ビンブ ラス チ ンの代 謝 は認 め

られなか った。
2.4Caco‑2細胞 での[3H]ビン ブ ラス チ ンの 経細 胞透過 と取 り込み に及 ぼ すGFJの種 々有機溶 媒抽 出物の効 果
GFJの有機 溶媒 抽 出物 に よる[3H]ビンブラ

スチ ンの輸送 に及 ぼす効 果 を検 討 した。[3H]ビンブ ラスチ ンの管腔側 か らバ ソラテ ラル側 への透
過速 度 は0.019±0.001μL/min/mgproteinでUptakeofL3Hlvinblastine(10nM)wasmeasuredinthepres・
onceorabsenceofGFJ,differentsectionsofgrapefruitor⊃yclosporinAat37;C.asdescribedin!㌧laterialsalldMethods

あり,酢 酸 エチ ル,ジ エチルエ ーテル 及び塩化 メチ
レ ンに よ りGFJから抽 出 して 得 られた 抽出 物のEachvaluerepresentsthemean±S.E.M.ofthreeorfourexperi
ments.Thevalueswereexpressedasthepercentofeachcon
trols.Thecontrolcell/mediumratiowas33.8±3.OkL/mgpro
ヒein.Significantdifferencesfromthecontrol.宰;1)<0・05

存在 でそれ ぞれ コン トロー ルの348%,281%及207%に増 加 した(Table2)。

び

管腔側膜か らの31

食品が薬の作用に影響 を与える機構
Tab且e2EffectofseveralorganicextractsofGFJonthetranscellulartransportandsteadystate
uptakeof[3H】villblastinebyCaco・2cells

Transcellulartransportfromap{caltobasolateralsideandapricaluptakeof[3H]vinblastineby
Caco‑2cells≪・eremeasuredinpresenceorabsence(control)ofseeeralorganicextractsfromGFJ,as

describedinMaterialsandMethods.,Eachvaluerepreselltsthemean±S.E.M.ofthreeexperimentsfor
thetransportstudiesandfourexperimelltsfortheuptakestudies,Thevaluesshowllhlparentheses
representthepercentageconlparedwitheachcontrdscomparedwitheachofcontrols.Significant
differencesfromcontrol,';P<0.05.

[3H]ビンブ ラス チ ンの取 り込 み 平衡 値 は,酢る成 分の存在 が示 唆 され た。一方,テ ス トステ ロ酸 エチル,ジ エ チルエ ーテル及 び塩化 メチ レン にンの6β 水酸化 活 性にお ける最 も高 い阻害効 果 は,よ る抽 出物 の存 在 で そ れ ぞ れ コ ン トロー ル のメ タ ノー ル1:!%溶267%,189%及(Fig.3B)。 この 結果 か ら,:・

び150%に 増 加 し た(Table2)。

経細 胞輸送 及び取 り込 み平衡値 の両実験 にお いて,ックス とCYP3A4に出 分画 にお いて観 察 され たに よる エ フ ラ

よる代謝 に対 して最 も強 力

これ ら抽 出物の阻 害効果 の強度 は酢酸 エチル 抽出

な阻 害物質 は異 なってい る と考 えられ る。

物 〉ジエ チルエ ーテル抽 出物 〉塩 化 メチ レン抽出

次 に,こ の60%メ タノー ル溶 出分画 を シリカゲ ル

物 の順で あった。一 方,塩 化 メチ レン抽 出の 水層

カ ラムク ロマ トグラフ ィー を用 いアセ トン:ヘ キ

で は[3H]ビ

サ ン の(5:1),(3:1),(1:1)及ン ブラ スチ ン の取 り込 み量 は コ ン

びクロロホル

トロー ルの133%に 増 加 したが,他 の2種 の有 機

ム・メ タ ノール(1:1)溶溶媒 抽出 の水層で は取 り込み量 に効果 を示 さなか

分 の 分 離精 製 を行 っ た。 これ ら の分 画 を用 いった 。

Caco‑2細 胞 での[3H]ビ

3.P‑gp阻害活性 を有 す るGFJ成 分 の同定

3.1Caco‑2細胞 で の[3H]ビン ブ ラ スチ ンの取 り込 み平 衡値 と ヒ トCYP3A4再構築

液 で溶 出 し,更 な る成

ンブラ スチ ンの取 り込

み 平 衡 値 に 対 す る効 果 を検 討 した と ころ,
Fig.3Cに 示す よう にヘ キサ ン:ア セ トン(3:1)
混液 で溶出 した3,4番 目の分 画に おい て,[3H]

系 によ るテス トス テロ ン6β水 酸化 に及 ぼ

ビ ンブラス チンの取 り込み平 衡値の顕 著 な増加がすGFJ酢

酸 エチ ル抽出物 の効果確認 され た。 また,こ の 分画 に はCYP3A4に酸 エ チ ル抽 出物 を コス モ シル カ

る代謝 阻害効 果 を有 す るもの も含 まれて いる こと

まず,GFJ酢

ラム に付 し,0,10,20,30,40,50,60,70,80,が示 され た(Fig.3D)。

90,100%メて,[3H]ビ

これ らGFJメ

タノー ル での溶 出 し分離 を行 っ た。
タ ノー ル 溶 出分 画 に よるCaco‑2細胞 で の[3H]ビン ブラ スチ ンの 取 り込 み平 衡

値 に及 ぼす阻害 効果 をFig3Aに示 した。 メ タノール60%溶 出分画 存在 下,[3H]ビンブ ラスチ ンの取 り込み 平衡 値 は最 も増 加 し,こ の 分画 中 に
Caco‑2細 胞 の ・:・を介 す る排 出 機能 を阻 害 すよ

この フラク シ ョンにお い

ンブ ラスチ ンの細胞 内取 り込 みの増

加活性 と対 応す る成分 をTLCに

よ り確 認 しながら単一 成分 にな る まで 精製 し,強 いP‑gp機能の阻害効果 を もつ目的成 分 を得 た。
3.2精

製 化合物 のH‑NMR解析

前項 に述 べ た 方法 に従 っ て精製 した化 合物 の
H・NMR解析 を行 い,以 下 に 示す ス ペ ク トル を

32

浦上 財 団研 究報 告 書Vol.7(1999)

Fig.3EffectofcosmQsilcolumnseparatedfractionoftheethylacetateextractofGFJonthesteadey‑stateuptakeof10nML3
HIvinblastinebyCaco・2cellsfor60min(A)andactivityoftestosterone6β・hydroxylationbyhulnanCYP3A4(B)andeffectofsilica‑gelcolumnseparatedfractionofthe60%methanolelutedfractionofGFJextractonthesteade}・‑state
uptakeof10nML3H]vinblastillebyCaco‑2cellsfor60minmin(C)andactivityoftestosterone6β

一hydrox}・lationby

humanCYP3A4(D).
TheethvlacetateextractofGFJwasfractionatedbycosInosilcolumnchromatographyelutedwithOユ020,30,40,50,60,70β0,90and100%methanolsolution.The60%methanolelutedfractionsofGFJethylacetateextractsbycosmosilcolumnwere
fractionatedbysilica‑gelcolumnchromatographywithhexane‑acetone(511.3:land1:1)andChloroforln‑methano1(1:1)
mixedsolution,TheuptakeoflOIIM[3H]vinblastinebyCaco・2cellsfor60minandtheactivityoftestosterone6β一hydroxylationbyhumanCYP3A4wereperformaedasdescribedinMaterialsandMethods.Eachdaterepresentthemean±
S.E.forthreeorfourexperiments.

得 た 。 δ8.13(1H,d,ノ=9.6),7.58(1H,d,ノ=2.3),7.14(1H,S),6.93(1H,d,ノ=1.4),
6.25(1H,d,ノ=9.8),5.58(1H,t,ノ=6.9),
4.93(2H,d,ノ=6.9),3.29(1H,d,ノ=9.2),2.34(4H,brna),1.69(3H,s),1.42(2H,brm),1.17(6H,d,ノ=18.1))。
ら,本こ の ス ペ ク トル の 解 析 結 果 か

成 分 は5[(6,7‑Dihydroxy‑6‑keto‑2‑

octenyl)oxy]psoralen(DHBG)である こ とが明 らか とな っ た(Fig.4)。
3.3LLGPK1細胞 で の[3H]ビンブ ラス チ ンの取 り込 みPKI細に 及 ぼ すGFJ酢

酸 エ チ ル 抽 出 物,DHBG

込 み 量 は 減 少 し(342.322μL/mgproteinvs34.

及 び シ ク ロ ス ポ リ ンAのLLC‑PK1細トラ
胞 で のン ブ ラ ス チ ン の 取 り込 み に 対 す るGFJ

酢 酸 エ チ ル 抽 出 物 とDHBGの(Fig.5A)。LLc‑GA5‑coL300細

胞 に 比 べ て[3H]ビンブラ スチ ンの 取 り

776μL/mgprotein),10μMシ

効 果

胞 及 び ヒ トMDRIcDNAをン ス フ ェ ク ト し たLLC‑GA5‑COL300細
[3H]ビ

Fig.4Chemicalstructuresof6',7'‑dihpdrox}‑bergamottin,ber‑gamottin,FC726.bergaptenandbergaptol

胞 及 びLLC‑GA5‑COL300細存 在 下(370.12±19.20%)と

ク ロス ポ リン の
同 様 に50%GFJ酢

酸 エ チ ル 抽 出 物 存 在 に よ り[3H]ビン ブ ラス チ

ン の 取 り込 み は コ ン ト ロ ー ル と比 較 し191.66±

効 果 を検 討 した16.97%に

胞 で はLLc一μMDHBGの大 き く 増 加 し た(Fig.5B)。
存 在 に よ っ て も,10μMシ

ま た,20
ク ロス33

食品が薬の作用に影響 を与える機構(A)LLC‑PKIcells(B)LLC‑GAS‑COL300cells

Fig.5Effectof50%ethylacetateextractofGFJ.cyclosporinAand6'.7dih}‑droxt‑bergamottinontheuptakeof[3H]
vinblastinebyLLC‑PKIcells(A)andLLGGAa‑COL300cells(B).
ThebothcellswereincubatedinthepresenceorabsenceofethylacetateextractofGFJ.10μMcpclosporinAand20μM6'.
T‑dihy‑droxybergamottin.Incubationtimeci‑as60minandtheconcetrationof[3H]cinblationeras10nl

1.Significant

differencesfromcontrolweredeterminedbyusingStudent'st‑test(';P<O.Oo).Eachdatarespresentthemean±S.E.forthreeorfourexperoments.

ポ リンの 存在 下 と同様 に[3H]ビンブ ラ スチ ンの取 り込 み は コ ン トロ ー ル と比 較 し187.68±
16.05%に 有 意 に増加 した。
3.4DHBGと胞 での[3H]ビ[3H]ビ

フラ ノクマ リン類 による ヒ ト肝

ンブ ラス チ ンの取 り込 み平 衡 値に対す る効 果 を検 討 した。Fig.6Bに 示 す よ うにン ブラス チンの 取 り込 み量 は10μMBG

によって有 意に138±3.33%に上昇 し,6Qヒドロ

ミクロ ソームで のテ ス トス テロ ン6β 水酸

キ シテス トステ ロン生成 は66.8±1.01%減 少 した。

化 及びCaco‑2細GFJ中胞 での[3H]ビンブラ ス

チンの取 り込み 平衡値 に対 する効果
Fig.6Aにに[3H]ビ

示 す よ う に,DHBGのには他 に も多数 の クマ リ ン類 お よ びフ ラ

ノクマ リン(プ ソラ レン)類 の存在 が知 られて い

濃 度依 存 的

ンブ ラス チ ンの取 り込み 平衡 値 は増

るこ とか ら(Tatum,J,H.andBerry,R.E.,
1979),今 回我 々はGFJに加 し,一 方テ ス トステ ロン6β 水 酸化 には減 少がンであ るFc726(Fig.6c),ベ

み られ た。代 謝阻 害 に関 す るDHBGの50%阻

6D)及

濃 度(IC,。)値
DHBG存

は 約0.45μMで在下 で は[3H]ビ

害

あ っ た。10μM

ンブ ラスチ ン の取 り

含 まれ るフ ラノクマ リ
ルガ プ テ ン(Fig.

びベ ル ガ プ トー ル(Fig.6E)の:・

よる排 出輸送 とCYP3A4に果 につ いて検討 を行 った。 これ らの構 造 をFig.3

込 み量 は コン トロ ール と比較 し357±9.44%に 増に示 す。FC726,ベ

加 し,同 濃 度 でCYP3A4のル は いずれ も,濃 度 依存 的 に[3H]ビ

代 謝 はDHBG非存

在 下の場 合か ら90±1.85%減 少 した。
DHBG同

様GFJ中

のCYP3A4代て も(Kan,H。etal.,1998),ヒ

ルガプ テン及び ベル ガプ トー
ン ブラ ス

チ ンの 取 り込 み 平 衡値 の増 加 を示 し,中 で も謝 阻害 物 質として報 告 されて いるベ ルガ モチ ン(BG)にによ る代謝 に及 ぼす効

ついト肝 ミクロ ソー

ムでの テス トス テ ロン6β 水 酸化 及 びCaco・2細FC726が 最 も顕著 な 増加 を示 した。一 方,代 謝阻害 につ いては,FC726,ベ

ルガプ テ ン及 びベ ル

ガ プ トール に よるCYP3A4阻
ぞ れ0.075μM,1μM及

害 のIC5。値 はそ れび>20μMであ った34

浦 上財 団研 究 報告 書Vo1.7(1999)(A)6',7'‑Dihydroxybergamottin(C)FC726(B)Bergamottin(D)Bergapten(E)Bergaptol

Fig.61nhibitoryeffectof6',7㌧dihydroxybergamottin(A).FC726{B).bergamottin(C),bergapten(D)andbergapto1(E)onthe
steady‑stateuptakeof10nM[3HlvinblastinebyCaco・2cellsfor601nin(C.)andtheactivitiyoftestosterone6β

一

hvdroxvlationbvhumanmicrosomalP4503A4(●).
AverticaldottedlineexpressesICAOvalueforCYP3AIinhibitor}・eeffectofeschfuranocoumarince.Eachdatarepresentthe
mean±S.E.forfourexperiments.

て,細 胞 の生存率 に変化 は見 られなか った。

(Table3)04.Caco‑2細胞 での オ レ ンジ ジ ュー ス に よCaco‑2細 胞 によ る[3H]ビンブ ラス チ ンの取るP糖 蛋 白質 に対 す る阻害成 分 の同定 オ

り込 み に及 ぼす オレ ンジジ ュース及び ジュ ース成レンジジ ュースのCaco‑2細分 の有機溶 媒抽 出物の効 果

胞へ の毒性50%オ レ ンジジュー ス存在下,非 存 在下両 場合

Caco‑2細 胞 での[3H]ビンブ ラスチ ンの 取 り

とも死細胞 を示 す トリパン ブルーの染 色率 は5%

込 み は時 間依存 的に増加 し,60分 までに定常 状態

以下 で あ り,LDHのに達 した(Fig.7A)。

分 泌に ついて もGFJ存

在下,非 存在 下で 有意 な変 化 は見 られ なか った。 従 っこの60分 の[3H]ビンブ ラ

スチ ン取 り込 み平衡値 に対す るオ レンジ ジュー ス

35

食品が薬の作用に影響 を与 える機構
Table3ConcentrationoffuranocoumarinsingrapefruitjしliceandIC5。valuesofCYP3A4for
furanocoumarins

6'T‑Dihydroxybergamottin.bergamottinandbergaptenwasquantitatedasdescribedin.11atherial

and:Methods.*;Concentrationofbergapto]andFC736≪‑asdetarminedb}・Bat・er/"akuhinn

(A)

(B)

■

(C)

匿

魎

暫

、

「

Fig.7Effectof50%ethylacetateextractoforangejuiceandcyclosporinAontheuptakeof[3H]vinblastine(A)3‑O‑methylglucose(B)and["C]phenylalanine(C)byCaco‑2cells

,L3H]

.

The['H]vinblastineuptakeexperimentswereperformedintheabsence(opencircle)orpresenceofethy]acetateextractof
orangejuicedilutedtobeequivalentto50%oftheoriginalorangeluicestrength(closedcircle)or10μMcyclosporinA(opentriangle}.Theconcentrationsof[3H]vinblast{me,L3H]3‑0‑methyIglucoseand[14C]phe町lalanine、、・ere10nM,and500nM,

respectively.SignificantdifferencesfromthecontrolwereidentifiedbyusingStudent's'‑test(*;1)〈0.05).Eachvalue

representsthemean±S.E.forthreeorfourexperiments.

の効果 を検討 した 。Table4に

示 す ように,50%

オ レンジ ジュー ス存在 下 では,[3H]ビンブ ラス

Table4Effectoforangejuiceanditsthreeextractsonthe
uptakeof['H]vinblastinebyCaco‑2cells.

チ ンの取 り込 み平衡 値 はコン トロール と比較 して178±5.5%と 有意 に増 加 した。 この ことか ら,オレ ンジジ ュース中 にCaco‑2細胞 での[3H]ビン

ブ ラスチ ンの取 り込 み平衡 値 を増加 させ る成分 が存 在す る ことが考 え られ た。そ こで次 に,オ レン
ジ ジュー ス を酢酸 エ チル,ジ エ チル エ ーテル,
塩 化 メチ レンの3種 の有機 溶媒 で抽 出 し,抽 出 成
分 を用 い同様 の検 討 を行 った。[3H]ビンブ ラス

Uptakeexperimentsof10nML3H]vinblastinebyCaco‑2cellswereperformedinabsenceorpresenceoforangejuiceEach
datarepresentthemean±S.E.offourexperoments.
Significantdifferencesfromcontrol,';P<0.05に分 離 され る成 分 につ いて,Caco‑2細胞でのビチ ンの取 り込 み平衡値 は,コ ン トロー ル と比較 し,ンブ ラスチ ンの取 り込 みに及 ぼす効果 を検 討 した

50%ジ ュース に相 当す る酢 酸エ チル,ジ エチル エと ころ,50%水ーテ ル

ルに対 して100±4.33%と,塩 化 メチ レ ン抽 出物 の存 在 で それ ぞ れ

238±2.8,203±14,198±4.5%といず れ も有 意

な増加 を示 した。特 に,酢 酸エチ ルに よる抽出物によ る効 果は,そ の 中で最 も高か った。
また,オ レンジ ジュー ス酢 酸エ チル抽 出の水 層

層抽出物 の存在 で は,コ ン トロー
な り変 化 は見 られ なかった。 従 って,オ レ ンジ ジ ュー ス中 で[3H]ビンブ ラスチ ンの取 り込 み平衡値 を増加 させ る成分
は酢酸エ チル での抽出 に よりほぼ完全 に有機 層に
抽 出 され た ことが確認 された。

36

浦 上財 団研 究 報告 書Vol.7(1999)

4.4オ

レ ンジジ ュー スの酢 酸 エチ ル抽出 物せよるCaco‑2細胞 で の['4C]フ

ラニ ン,[3H]3‑0一び[3H]ビ

4.5Caco‑2細胞 で の[3H]ビンブラスチンの取 り込 み平衡値 とヒ トCYP3A4再ェニ ル ア構築

メ チル グ ル コー ス及系 に よる テ ス トステ ロ ン6R水 酸 化 に及ンブ ラスチ ンの取 り込 みに 及

ぼ すオ レン ジジ ュー ス酢酸 エチ ル抽 出物
の効 果

ぼす効果
メ チル グオ レン ジジ ュース 中でP‑gp阻 害 効果 を示 す成ン ブラ スチ ンの 取 り込 み

分に ついて詳細 に検 討す るため に,オ レンジ ジュ[14C]フ ェ ニル ア ラニ ン,[3H]3‑0・
ル コー ス及 び[3H]ビ

に及 ぼすオ レン ジジュー スの酢酸 エチ ル抽出物 のース の酢 酸エ チル抽 出物 をコスモ シル カラム に付

効果 を検討 した。[3H]3‑0一 メチル グル コー ス,

し,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100%メ[14C]フ ェニ ルア ラニ ンの取 り込 み にお い て,ール での溶 出 し分 離 を行 った。 これ ら オ レ ンジ

オ レン ジジ ュース 酢酸 エ チル抽 出物 は コン トロ

ジ ュースの メタ ノール溶 出分画 に よるCaco‑2細ー ル と比 較 し て有 意 な 変 化 を 示 さ な か っ た

胞 での[3H]ビ(Figs.7B,c)。

に及 ぼす 阻害効 果 をFig.8Aに一 方,Fig.7Aに

示 す よ う に,

Caco‑2細 胞 で の[3H]ビン ブラス チ ンの取 り込

み は平 衡 値 で,P‑gpの特 異 的 阻 害 剤 で あ る2C

mMシ

クロス ポ リンAと同様 に,オ レ ンジ ジ ュタノ

ンブ ラス チ ンの取 り込 み平 衡 値

ル60,70,80%溶示 した。 メタ ノー

出 分画存在 下,[3H]ビンブラ

スチンの取 り込 み平衡値 に増加 がみ られ,中 で もメタノー ル70%溶 出分画 にお いて最 も顕 著 な効果

ー スの酢 酸エ チル抽出物 で有 意に増加 した。 一方が み られた。 よ って,こ の分 画中 にCaco‑2細その[3H]ビ

のP‑gpのンブ ラスチ ンの取 り込 み初速 度 は胞

排 出機能 を阻害 す る成分 の存在 していオレ ンジジ ュースの酢 酸エ チル抽 出物 及 びシ クロ

るこ とが示唆 され た。一 方,テ ス トステ ロンの6

スポ リンAに

β水 酸化活性 に対 して は,こ れ らメ タノール 溶出より影響 され なか った。 この ことよ り,オ レ ンジジ ュース酢酸 エチ ル抽出物 の効果

フラ ク シ ョン は全 く効 果 を示 さ なか っ た(Fig.

はP‑gpに 対 して特異 的 な[3H]ビ

8A)に

ンブ ラスチ ンの排出機 構の 阻害で ある と考 え られた。

示 した。 メ タ ノール60,70,80%溶

画 存在 下,[3H]ビFig.8EffectofCosmosilcolunln・separatedfractiollsoftheethylacetateextractofGFJonthestesdy‑stateuptakeof10nML3H]vinblastinbyCaco‑2cellsfor60min(A)andontheactivityoftestosterone6β
TheethvlacetateextractofGFJwasfractionatedbyCosmosilcoIumnchromatographyelutedwithO,10,20.30,40,50,60,70,
80,90and100%methanoLTheuptakeof10nM[3H]、'inblastinebyCaco・2ce11sfor601ninandtheactivityoftestosterone
6β一hydroxyIationbyrecombinanthumanCYP3A4wereassayedasdescribedinMaterialsandMethods,Controlvalueof
6β・hydroxytestosteroneformationwas2.89μM.Eachvaluerepresentthemean±S,Eforthreeorfourexperiments.

出分

ンブ ラスチ ンの取 り込 み平衡

一hydroxylat{onbyhumanCYP3A4(B}.

37

食品が薬の作用に影響を与える機構
値 に増 加が み られ,中 で もメタノール70%溶 出分(5:1),(3:1),(1:1)及

画 において 最 も顕著 な な効果が み られ た。 よって,ノール(1:1)溶

この分 画 中にCaco‑2細行 っ た。 これ らの分 画 を用 いCaco‑2細胞 のP‑gpの排 出機 能 を阻害 する成 分の存在 している ことが示唆 され た。
一方,テ ス トステ ロンの6Q水 酸化活 性 に対 してる効果 を検 討 した ところ,Fig.9には,こ れ らメタ ノール溶 出 フラクシ ョンは全 く効

キサ ン:ア セ トン(3:1)混果 を示 さなか った(Fig.8B)。

この結 果 か ら,オ[3H]ビび クロ ロホ ルム ーメ タ

液 で溶出 し,成 分 の分離精製 を胞でのンブ ラス チン の取 り込 み平 衡値 に対 す示す よ うにヘ合液で溶 出 した4番目の溶 出分 画 によ って,[3H]ビン ブラス チンのレ ンジジ ュース中 には,代 謝 には影響 を及ぼ さず

取 り込 み平衡値 が最 も高 くなった。従 って,こ の排出機 構 を特 異的 に阻害 する成分 が含 まれ るこ と

溶 出分 画 におい て,[3H]ビが示唆 され た。

内取 り込みの増 加活性 と対応 する成 分を さらにカ

4.6メ

タ ノール溶 出 分画 の精製 分 離及 び それら分 画 に よ るCaco‑2細胞 での[3H]ビ

ラム で分離精 製 しTLCに

ンブラス チン の細 胞

よ り確認 しなが ら最 終的に2種 の化 合物 を得た。

ンブ ラスチ ンの 取 り込み 平衡値 に及 ぼす

4.7精

効果

カ ラムク ロマ トグラフ ィー によ り得 られ た2種

次 に,最 大 の[3H]ビン ブラ ス チン の取 り込製 化合物 のH‑NMR解の化 合物 の1H‑NMR解析析 を行 い,過 去の 報告 とみ増加効 果 を示 したメ タノール70%溶 出 分画 をシ

一 致 した こ とか ら
,化 合 物1は3,3',4',5,6,

リカ ゲ ル カ ラ ム を用 い アセ トン:ヘ キ サ ン の

7,8‑hexamethoxyflavone(HMF),化

合物2

Fig.9Effectofsilica‑gelcolumn‑separatedfractionsofthe70%methanolCosmosileluateonthestead‑‑stateuptakeofIOnM[3H]villblastinebyCaco‑2sellsfor60min.
TheiO%methanoleluate≪‑asfractionatedbt・silica‑gelcolumnchromatograph}‑kithhexane‑acetone(5:1,3:1,and1:1)

andchloroform・methano1(1:1)mixedsolution.Theuptakeof10nM[3H]einblastinebyCaco‑2cellsfor60minandthe
activityoftestosterone6β・hydroxylationbyrecombinanthumanCYP3A4wereassayedasdescribedinMaterialsand

Methods.Controlvalueof6β

一hydroxytestosteroneformationwas2.89μM.Eachvaluerepresentthemean±Sfourexperiments.

Fig.10Chemicalstructuresof3.4,5.6,7,8,3'.4㌧heptamethoxyflavone(HMF).tangeritinandnobiletin.

.E.forthreeor

38

浦 上財 団研 究 報告 書Vol.7(1999)

ンゲ リチンの方 が顕著 であ るこ とが 示唆 された。

はタ ンゲ リチ ン として同定 され た(Fig.10)。
4.8HMF,タンゲ リチ ンに よる ヒ ト肝 ミク

ロソー ム及び ヒ トCYP3A4再構 築系で のまた,ヒト肝 ミク ロソー ム及 び ヒ トCYP3A4発

現系 を用 い両化 合物 のCYP3A4活性 に対 す る効

テス トステ ロ ン6β水 酸化 とCaco・2細 胞

果 を検 討 した が,い ずれ もほ とん ど変化 を示 さなに よる[3H]ビ

か った。 また,HMF,タンブ ラスチ ンの取 り込 み

Fig.11にHMFとタ ンゲ リチ ン のテ ス トス テ

ロン6β 水酸 化 と[3H]ビン ブラスチ ンの取 り込

み平 衡値 に及 ぼ す効果 を示 した。HMF,タリチ ン とも濃 度依 存的 に[3H]ビンゲ リチ ン同様 の フラ

ボ ン骨 格 を有 し,オ レ ンジジ ュー スに含 まれ るノ

平衡値 に及 ぼす効果

ンゲ

ンブ ラス チ ンの取 り込 み平 衡値 を増加 し,50mM存

在 下 におビレチ ンについ て も同様の 検討 を行 った。[3H]
ビンブラ スチン の取 り込み平 衡値 はHMF,タン

ゲ リチ ンと比 較 し程 度 は低 いが濃 度依存 的 に増 加を示 した。一 方,ヒCYP3A4発ト肝 ミク ロソ ーム 及 び ヒ ト

現系 にお ける テス トス テロ ン6β 水

い て は コ ン ト ロー ル と比 較 し それ ぞ れ578±

酸 化 に 対 して は検 討 し た濃 度 範 囲 で 顕 著 な

15.9%,906±23.63%の

CYP3A4阻増加 を示 した,効 果 は タ

害効 果 は確 認 されなか った。

Fig.11EnhancingeffectofHMF(A),tangeretin(B)andnobiletin(C)onthesteady‑stateuptakeof10nMl3H]vinblastineby
Caco‑?cellsfor60min(1),andinhibitoryeffectontheactivityoftestosterone6/」‑hydroxylationbyhumanliver
microsomes(II)andrecombinanthumanCYP3A4(III).
Verticaldottedlinesrepresenttheconcentrationsofthefuranocoumarinsinorangejuice.Controlvalueofsteady‑stateuptakeof['H]vinblastionn‑as11.0±0.22‑1(kLmgprotein).Controlealuesof6Q‑hydroxytestosteroneformationh}'humanliver
microsomeandhumanCYP3A4were11.5±0.422and2.09±0.0700μM.respectively.Eachvaluerepresentsthemean±S,E.for
fourexperiments.

39

食品が薬の作用に影響を与える機構
4.9LLGPKI及びLLC・GA5‑COL300細お ける[3H]ビ
MDR1のLLC‑PK1及

胞にンブ ラスチ ンの 取 り込 み

量 が 低 く またP‑gpがCYP3A4に

高 発 現 して い る た め,

よる薬物代謝 が低 くP‑gpに よる輸送

関 与 に つ い て検 討 を 行 う た め に,を検 討 する上 で適 切 な系で あ る。P・gpの代 表的びLLC‑GA5‑COL300細

な阻 害剤 で ある シク ロス ポ リンAの 効果 か ら明

胞 を用 い て,[3H]ビンブラ スチ ンの 取 り込 み平衡 値 に対 するHMF,タンゲ リチ ン,ノ ビ レチンの効 果 を検討 した。 そ の結果,LLC‑GA5‑COL300細

胞で は,よる[3H]ビンブ ラス チンの 管腔膜 側 での排 出はCaco‑2細らか な よ うに,P‑gpに

胞 にお いて容易 に検 出可能 であ る(Fig.2及びTable1)。

[3H]ビンブ ラ ス チ ンの 取 り込 み平 衡 値 は,

Caco‑2細 胞 に よる[3H]ビ

HMF>タンゲ リチ ン〉ノ ビレ チンの 順で 有意 には ほ とん どみ られ ず,そ れ はGFJの上 昇 した(Fig.12B)。

一方,LLC‑PK1細胞で は全 く効 果 が見 られ なか った(Fig.12A)。

従 って,

更 に,

ンブ ラスチ ン の代謝
存在 下 において も同様 であ った。
GFJの 存 在 でCaco‑2細胞 に お け る[3H]ビ

これ らの成分,特 にノ ビレチ ンとタ ンゲ リチ ンがンブ ラスチ ンのア ピカル側か ら側基底 膜側 への輸

オ レン ジジ ュー スに よ るP糖 蛋白 質の 阻害 を起送 は有意 な増加 を示 したが,[14C]マ

こ して い るこ とが示 され た。

の輸送 に はGFJに考っ た(Fig.2)。 この こ とか ら,GFJは察の透過 に対 して では な く[3H]ビ
GFJと 薬物 との相 互 作用 は薬 物代 謝 酵素 で あるCYP3A4のンニ トール

よ り有 意な変 化 はみ られ なか

阻 害が 原 因で あ るこ とが 報告 されてい る。 一方,CYP3A4の

基質 と:.の

基 質及

細胞間隙

ンブ ラス チ ンの経細胞 輸送 に影響 を与えて いる と推 察 された。
更 に,[3H]ビ
GFJのンブ ラスチ ンの取 り込 み平衡値 は濃度 依 存的 に増加 した(Table1)。GFJ

び 阻害剤 には,か な りの重複 が見 られ るこ とか ら,によ るCaco‑2細 胞 の生存 率の変 化 はなか った こ

我 々は この相 互作 用 の要 為胞 はCYP3A4のとか ら,GFJのA

発現

効 果 は非特 異 的 な効果 で はな い

B

Fig.12EffectofcyclosprinA.HMF,tangeretinandnobiletinonthesteady‑stateuptakeof30n¥1[3H]vinblastinebvLLGPKl
cells(A)andLLGGA5‑COL300cells(B)for60min.Eachvaluerepresentsthemean±S.E.forthreeorfourexperiments
SignificantdifferenecesfromthecontrolwereidentifiedbyusingStudellt'st‑test(串;P<0.05}.

.

40

浦上 財 団研 究報 告 書Vol.7(1999)

ことが示 された。市 販 されて いるジ ュースに は果セ トン(3:1)溶物組織 か らの成分 も含 まれて いる ことか ら,我 々に 最 もP‑gp阻

は グレー プフル ーツを い くつか の部分 に分離 し,

え ら れ,同

そ れぞ れの[3H]ビ

阻 害 成 分 も含 まれ て い る こ とが 確 認 され た 。 そ こン ブラ スチ ンの輸 送 に及 ぼ

液 で 分 画 し た3,4番

時 に こ れ ら の 分 画 に は,CYP3A4のン ブラス チンの輸 送で,単離 し た 化 合 物 をNMR解に及 ぼす 阻害強 度は,果 皮 〉アルベ ド〉果 肉か ら

GFJ中のP‑gpの搾 った ジュー スの順で あ った(Table1)。

5[(6,7‑Dihydroxy‑6‑keto‑2‑octenyl)oxy]psor‑

す効 果 を検討 した。[3H]ビ

Fukudaらによ り,プ ソラレ ンの ゲ ラニ ルオ キ

シ誘導 体 が フラボ ノイ ド以上 にCYP3A4に対し

強 力な 阻害効果 示す こ とが報 告 された。 これ らの

alenつ

ま

析 し た と こ ろ,

排 出 を 阻 害 す る 成 分 と し てり6',7'‑Dihydroxybergamottin(DHBG)が
P‑gpの

目の 分画

害 効 果 の 高 い 成 分 が 含 ま れ る と考同 定 さ れ た 。 さ ら に,この効 果 が

阻 害 に よ る も の で あ る こ と を 明 ら か とす

化 合物 は酢酸 エチル に より抽 出 されてお り,こ れる た め,MDRIのらがP‑gpをFig.5Aに示 す よ う に,LLGPK1細

胞(親

で は,シ

ク ロ ス ポ リ ン やGFJ抽出 物 の 効 果 は,

阻害 す る可能性 は高 い と考 えられ る。

これ らの 化合 物 の排出 阻害 効果 がGFJによ る排出阻害 効果 と一致 するか ど うか を確認 するた めに発現株 を用 いて検 討 を行 った。

一 切 見 られ な い の に 対 し,MDRIcDNAを

P‑gpと の 効果 を明 らか にす る必 要性 が示 唆 されン ス フ ェ ク ト しP‑gpをた。 そ こで さらに,GFJ中COL300細のP‑gp阻 害成 分の 同

定 及 びそ の 化 合物 のP‑gp及びCYP3A4に

対す

株)

トラ

発 現 さ せ たLLC‑GA5‑

胞 に お い てGFJ酢

酸 エチ ル抽 出 物 存

在 に よ り シ ク ロ ス ポ リ ン と 同 様 に,[3H]ビンブ

る効 果 について検 討 を行 う必 要があ る。そ こで,

ラ ス チ ンの 取 り込 み 平 衡 値 の 有 意 な 増 加 が み ら れ

GFJ中 のP‑gp機

た(Fig.5B)。

従 っ て,GFJ酢に は,P‑gpの阻 害 物 質 が 含 ま れ て い る こ とが 示

能の 阻害活 性 を持 つ化 合物 を同定 す る ことを 目的 と し,同 時 にCYP3A4に対す

酸エ チル抽 出物 中る阻害 効 果 につ いて も検 討 す る こと に よ り,P‑

さ れ た 。 し か し な が ら,LLGGA5‑COL300細gpとCYP3A4機に お け る[3H]ビン ブ ラ ス チ ン の 取 り込 み 平 衡

値 は,50%GFJ酢

酸 エ チ ル 抽 出 物 及 びDHBG

能 に対す る阻害 機構 の違 いの有

無 につ いて検 討を加 えた。
まず,こ のGFJ酢

酸 エ チル抽 出物 に含 まれ る

P・gp阻害成 分 の単離 精製 及 び同定 を行 うこ ととした 。GFJ酢 酸 エチル抽 出物 を メタ ノールー水 系に よ っ て シ ク ロ ス ポ リ ン に 比 べ 約1/3倍

今 回 我 々 が 同 定 し たDHBGは,既にEdward

ら に よ っ て,CYP3A4のィー を用 い て溶 出分画 した。Fig.3Aに 示 す ようて お り(Edwards,D.J.etal.,1996),そに メ タノ ール60%溶 液 に よる溶 出 分画 存 在下,

カ ニ ズ ム はmechanismbasedinactivationかン ブラ スチ ンの 取 り込 み平衡 値 が最 も高 くなっ た。一 方,CYP3A4による代 謝 の阻 害

効果 は,メ タ ノール!:1%溶

出分画 で顕著 だ っ

た。 続い て この メタ ノール60%水 溶液 に よる溶出の上 昇率

し か 示 さ な か っ た(Fig.5B)。

を溶 出液 とした コスモ シルカ ラムク ロマ トグラフ

[3H]ビ

胞

阻害 剤 として同 定 さ れ

生 じ る 消 化 管CYP3A4蛋
CYP3A4に対 す るDHBGのの阻害 メ

阻 害効果 が報 告 されて い る(Schmiedlin‑ren,P.etal.,1997)。
本 化 合物 がら

白 量 の 減 少 で あ り,

従 っ て,

薬 物 代謝 と排 出輸 送 の両 機 能 に対分画 を シ リカ ゲルカ ラムク ロマ トグラフ ィーに付し 阻 害 効 果 を 持 っ て い る こ とが 示 され た 。 こ れ まし,ヘ キサ ンーアセ トン系 及び クロロ ホルムーメ タ

で にDHBG以

外 に もGFJ中か らベ ル ガ モチ ン

ノール系 を溶 出液 として分離 した。 ヘキサ ン:ア

やGF‑1‑1(FC726),GF‑1‑4がDHBGより も強食品が薬の作用に影響を与える機構
力 なCYP3A4代

謝阻 害成 分 と して 同定 され てい

41

FC726を 取 ることがで きなか った と考 え られる。

る(Fukuda,K.eta1.,1997,Kan,1{.etal.,

また,酢 酸 エチ ル抽 出 に よる水 層,メ タノ ー ル1998)。 この様 にDHBGを

含 めベ ル ガ モチ ン,

70%な どのフ ラクシ ョンにベル ガプ トール,ベ ル

ク マ リン化 合 物で あ り自然 界

ガ プテ ンな どの他 の阻害剤 が含 まれてい る可能性

FC726,GF‑1‑4はに広 く分布 して いる(Gray,A.IandWaterman,

が あ り,そ れ らをと らえるこ とが で きなか った と

P.G.,1978)ま考 えられ る。

た,こ れ ら以外 に も多 数 の クマ リ

ン類 お よ び フラ ノ クマ リン(プ ソ ラ レン)類 が特 に,興 味 を引 くのはベ ルガ プ トールの効 果 で,

GFJに

[3H]ビ

よるP‑gp機 能 の阻害 に寄与 して い る可 能

性 も考 え られ る。 そ こで,GFJ中に含 まれ るフラ ノ クマ リ ン化 合 物 で あ るFC726,ベ

ル ガモ チン ブ ラス チ ンの 排 出阻 害 効果(10μM

で270%に 上昇)を 示 したが,代 謝阻 害効 果 は0
か ら20μMま での範囲 ではみ られな かった。 す なン,ベ ル ガ プ テ ン及 びベ ル ガ プ トー ル に よ る

わ ち,ベ ル ガプ トー ルはP‑gpに

CYP3A4に

効 果 を示す こ とが明 らか となった。 この ようにベよる代 謝 と[3H]ビンブ ラス チ ン取のみ特 異的 阻害

り込 み平 衡 値 に及 ぼ す 効果 につ い て 検 証 した

ルガ プ トール はP‑gpの 特異的 な阻 害物質 で あ り,

(Figs.sB〜E)。Caco‑2細癌 化学療 法 におけ る耐 性克服 剤 となる可能性 が あ

胞 に お け る[3H]ビン ブラ スチ ンの取 り込み 平衡 値 はFC726で上昇 し(10μMで6倍

最 も上昇),ベ ル ガモ チ ン,ベルガ プテ ン及 びベ ルガ プ トール の排出阻 害効果 は
DHBGとほぼ同 じ程 度 の能 力 を有 して い る(10

μMで3倍

上昇)こ

とが明 らか となった 。今回使るので,今 後 ベル ガプ トー ルにつ いて この点 に着
目 し更 に検討 を行 う必 要が ある。
オ レ ンジ ジ ュース はGFJのCYP3A代

謝実 験にお いて,多 くの実験者 が代謝 阻害効 果が見 られな い対照 と して用 い て いる。我 々 も,GFJの輸

った ジュー ス中の これ らフラ ノクマ リン類の含量

送 阻害実 験で対 照 として用 いた ところ,オ レン ジ

を測 定 した結 果,DHBG,ベジ ュー ス に もGFJと 同程 度 の[3H]ビル ガ モ チ ン,ベ ル

ガプ トール,ベ ル ガプ テンやFC726の
2,15,40,16μMと濃度 は13,

ベル ガモチ ン以 外 は比 戟的 高

い もので あ った(Table3)。

輸 送阻害 成分が3有 機溶 媒(塩 化 メチレ ン,ジ エ

種チルエ ーテル,酢 酸エ チル)の うち,酢 酸エ チル

類 によ って成 分 の含 有 量 は大 き く異 なる た め,によ りもっ とも抽出 されてい た。 これ と同様 に,様 々なGFJにもち ろんGFJのンブ ラ ス

チ ン排 出 輸送 阻 害能 が見 られ た。 また,GFJのお いて それ ぞれ の成 分の 含有 量 を調 べ る必 要が あ る が,GFJのして,DHBGの

オレ ンジジ ュー スにつ いて もその輸送 阻害成 分 は

相 互作 用 の要 因 と酢 酸エ チルで最 も抽出 され るこ とが明 らか とな っ

み で はな く,こ れ ら フラ ノク マ

た。 しか しなが ら,オ レン ジジュー スには,ジ ヒリン類が 排出阻 害 と代 謝阻害 に寄与 して いる と考

ドロ キシベ ル ガモ チン はGFJほえ られた。 さ ら に,GFJとず(オ レ ン ジ ジュ ー ス:1.11μM,GFJ:12.75の 相互 作 用 の対 象 と

ど含 まれ て お らなる薬物 の種類 に よって も両 阻害機構 の寄 与率 はμM),オ

変 化す る と考 えられ る。

は,他 の 化合物 であ ると考 えられ る。 また,コ ス

最 終 フラ クシ ョン にDHBGと最 も効 果 が高 い

レンジ ジ ュース の輸 送阻 害 の原 因物 質

モ シル カラムで のメ タノール溶 出分画 の効果 では,

FC726の 両化 合物 が存 在 してい た ことがTLCでGFJの 阻 害 成分 が含 まれ る分画 として60%メ タ

確認 され た。我 々は最 終的 にこの両 化合物 の うち

ノー ル分 画で の効 果が 最 も高 か った こ とに対 し発 蛍光 が強か ったDHBGを(Ohnishi,A.etal.,submitted),今

分取,同 定 したた め

回オ レン ジ

42

浦上 財 団研 究 報告 書Vol.7(1999)

ジ ュースで は,70%メ

タノー ル分画 に最 も高 い効

果が 見 られた こ とか ら(Fig.8A),オ
ー スの 方がGFJにレン ジジ ュ比べ 脂溶 性 の高 い化 合物 が輸ロテ アーゼ阻 害剤(サ キナ ビル,リ トナビル)な
どの消 化管 吸収 改 善物 質 と して有 用 であ る と考
えられ る。 また,CYP3A4は阻害 せず,P‑gpを送阻 害成分 として関与 してい る ことが示唆 された。

特異 的に阻 害す る物質 が見い だされた な ら,ガ ン

そ こで,本 研究 では,こ の原 因物質 を特定 する こ

化学 療法 にお ける多剤耐性 克服 剤 として も有 望視とを試み た。興 味深 いこ とに,オ レンジ ジュー ス

されるで あろ う。

に はCYP3A阻

害 活 性 が ほ と ん ど見 られ な い(Fig.8B)。 オ レン ジジ ュー スの酢 酸 エチ ル抽 出

タ ンゲ リチ ン は,オ レ ンジ ジュー ス か らNel‑son(1934)によって タ ンゲ リン油 か ら結 晶 化 さン ブラ スチ ンの初期取 り込

れてい る。 この他,柑 橘系 のジ ュー スに は多 くの

みに は影響 を及ぼ さず,平 衡 値 を有 意 に上 昇 させ

フラ ボノイ ド類 が含 まれて いる。 フラボ ノイ ドにた(Fig.7A)。

また,グ ル コー スや ア ミノ酸(フは,抗 炎症作 用,抗 ア レル ギー作用 な どの薬理作

ェニ ルアラ ニン)の 輸 送 には影響 を与 えなか った

用 を有 して いる ことが報告 されて いる。 また,発(Figs.7B,C)。

基質

ガ ン抑制 作用 等を有 して いるケル セチ ン等 といっ

胞 に はP‑gpが 過 剰 発 現 してた化合 物 も存 在す る。テ トラメ トキシ フラボ ン,

物 の効 果 は,[3H]ビ

で あ り,Caco‑2細ビ ンブ ラ ス チ ンは':.のい るこ とか ら,こ の オ レ ンジ ジュー ス酢 酸エ チ

HMFはSwift(1967)にル抽 出物 によ る効 果 はP・gpに よる[3H]ビ

Tseng(1938)にンブ

よって,ノ ビ レチ ンはよ ってオ レンジ皮油 か ら単離 さラス チ ンの エ フラ ックスシス テムの阻 害に よる もれた 。 これ らの メ トキ シフラボ ンの ジュー ス中のの と考 え られ た。MDR発

現細 胞 株(LLC‑PK1

組成 は産地 や製法 な どによ り様 々であ り,柑 橘 類

及 びLLGGA5‑COL150)を用 い て,HMF及びタン ゲ レチ ン,構 造 類 似体 で あ るノ ビ レチ ンの:・能 に対 す る効果 を検 討 した 結果,確 か にの ジュー スに は様 々な量 や種類 のメ トキシ フラボ
ンが含 まれ る。
以 上結 論 と して,今 回GFJからフ ラ ノ クマ リ

これ らの化合 物 はP‑gp機 能阻 害効 果 を有 して いン類がP‑gpにるこ とが明 らか とな った(Fig.12)。 最近,P‑gp'

可能 性が示 され た。 しか しなが ら,こ れ らは,P‑

以 外 に もMRP3な

gpの みで な くCYP3A4のどの薬剤 排 出 にかか わ る排 出

対す る阻害 剤 と して機 能 して い る

阻害効 果 も有 す る こと

輸送 系 の存在が 示 されてい る(Kiuchi,Y.etal.,が 明 らか となっ た。そ の中 で,bergaptolに1998)。 ビン ブラス チ ンが この様 な輸送 系 に認識ては,CYP3A4のされ るか否か はわか らない が,今 後 この様 な輸送

示 唆 された。 また,オ レ ンジジ ュースか ら見い だ

系につ いて も検 討 を行 って い く必要 は ある と考 え

さ れ たHMF,タられ る。

CYP3A4に本研 究で 見 いだ され たHMF,タノ ビレチ ンはCYP3A代

ンゲ リチ ン,謝 に は一切 効果 を示 さず,

つい

特異 的 な阻 害剤 で あ る こ とがン ゲ リチ ン,ノ ビ レ チ ン は

対 す る阻害 は ほ とん どな く,一 方,

P‑gpに 対 して特 異的 に阻 害 する こ とが 示 唆 された。 その阻 害強 度 は,タ ンゲ リチ ン>HMF>ノ

P‑gpの 様 な排 出機能 の み を阻害 す るよ うな化 合

ビレチンの順 であ った。 また,そ れ らの オ レンジ

物 で ある。 これ らの化合物 は,そ の低 バイオ アベ

ジ ュース中 の濃度 はタ ンゲ リチ ンが最 も高 く,オイ ラ ビ リテ ィーの 原因 の一 つ が消 化管 にお ける

レンジ ジュー ス とP‑gpの 基 質 との相互 作 用 はタ

P‑gpに よる排 出(分 泌)と 考 え られ る免疫 抑 制

ンゲ リチ ンが最 も大 きく寄 与す る ことが 示唆 され剤(シ クロ スポ リン,タ クロ リムス)やHIVプ

た。 これ ら新規P‑gp特異 的阻害 剤 は薬物 の 吸収

食品が薬の作用に影響を与える機構
改善,ガ ン化 学療法 にお ける多剤 耐性克服 剤 と しての有用 性が 示唆 され,今 後更 なる相互 作用 に関(1998)
8)Gray,r1.L,≪'aterman,P.G.,Coumarinsinthe
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する臨床 試験 が必要 であ る と考 えられ る。

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文
1)

献

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2)

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1392,(1930

eoisomersofcalsiumantagonistsehichdiffermarked‑12)Swift,L.J.,TLC‑spectrophotometricanalysisfor

lyintheirpotenciesascalciumblockersareequally

neutralfractionfalvonesinorangepeeljuice,J.Agric.

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13)Tseng,K.F.,Nobiletin.PartL,anoilextractedby(1992)
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4)

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glycoproteinbygrapefruitjuicecomponentsinCaco‑2

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5)

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4)Takanaga,H.,Ohnishi,A.,Yamada,S.,Matsuo,H.,.

Morimoto,S.,Shoyama,Y.,Sawada,Y.,Polymethox‑
ylatedflavonesinorangejuiceareinhibitorofP‑
glycoproteinbutnotcytochromeP4503A4,submit‑
ted.

43

44

URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVol.7(1999)

Biopharmaceuticalanalysisoftheeffectoffruitjuicecontents
onthepharmacokineticsofdrugs
YasufumiSawada(GraduateSchoolofPharmaceuticalSciences,KyushuUniversity)

Thesimultaneousintakeofgrapefruitjuice(GFJ)isknowntoaltertheefficaciesand
pharmacokineticsofvariousdrugssuchasdihydropyridinecalciumblockers,cyclosporin
Aandterfenadine.Ithasbeenreportedthatthemechanismofthisinteractionisproposed
tobeasuppressionofdrugmetabolismbycytochromeP4503A4(CYP3A4),whichis
responsibleforthemetabolismofthesedrugs.While,thestrikingoverlapofsubstratesandinhibitorsbetweenCYP3A4andP‑glycoprotein(P‑gp)wasdiscussedandasaresult,theeffectofGFJcomponentsonP‑gpmaythusbeafactortoincreasethebioavailabilitiesof
drugs.So,weexaminedtheeffectofGFJcomponentsontheabsorptionofdrugsfrom
digestivetracts.
WeinvestigatedtheeffectofGFJandthedifferentsectionsofgrapefruitonthetransportofvinblastine,asubstrateofP‑gp,acrossCaco‑2cells,ahumancolonicadenocarcinomacellline,LLC‑PKIcells,aporcinekidneyepithelialcellline,andLLC‑
GA5‑COL300cells,LLC‑PKIcellstransfectedwithhumanMDRIcDNA.Thesteady‑state
uptakeof[3H]vinblastine([3H]VBL)fromtheapicalsideofCaco‑2cellswassignifi‑
cantlyincreasedinthepresenceofGFJinadose‑dependentmanner.However,theinitial
uptakeof[3H]VBLwasnotaltered.So,itwassuggestedthattheeffluxof[3H]VBL
fromCaco‑2cellsbyP‑gpmightbeespeciallyinhibitedbyGFJ.Moreover,theeffectofthe
threedifferentsectionsofgrapefruit,suchasthefreshgrapefruitjuice,thealbedoandthe
peel,ontheuptakeof[3H]VBLbyCaco‑2cellswasexamined.Thesteady‑stateuptakeof[3H]VBLwasincreasedinthepresenceofallpartsofgrapefruit.SimillarytheeffectoforganicsolventextractsofGFJand6',7'‑dihydroxybergamottin(DHBG),weisolated
inthisstudy,ontheuptakeof[3H]VBLbyLLC‑PKIcellsandLLC‑GA5‑COL300cells.
Theuptakeof[3H]VBLbyLLC‑GA5‑COL300cellswaslowascomparedwithLLC‑PKl
ce11sanditwasincreasedinthepresenceofethylacetateextractsor20μMDHBG.Then,
theeffectofDHBGonthe6R‑hydroxylationoftestosteroneandtheuptakeof[3H]VBL
byCaco‑2cellswereexamined.Theuptakeof[3H]VBLbyCaco‑2cellswasincreased,
whilethe6/3‑hydroxylationoftestosteronewasdecreasedinthepresenceofDHBG.Ithas
alreadyreportedthatDHBG,weisolatedinthisstudy,wasaninhibitorofCYP3A4andtheinhibitoryeffectofDHBGwasduetothedecreaseoftheamountofCYP3A4inthe
digestivetracts.TheseresultsdemonstratethatDHGBpossesstheinhibitoryeffects
bet≪peenonthedrugmetabolismandontheactiveeffluxsystem.

Biopharmaceuticalanalysisoftheeffectoffruitjuicecontentsonthepharmacokineticsofdrugs45
Moreover,weexaminedtheeffectoforangejuice(OJ)onthefunctionofP‑gpand
CYP3A4.Theinitialuptakerateof[3H]VBLbyCaco‑2cellswasnotinhibitedinthe
presenceofethylacetateextractofOJ,howeversignificantlyincreasedthesteady‑state
uptake.Nosignificanteffectonthecell/medium(C/M)ratioof[3H]3‑O‑methylglucose
and[14C]phenylalaninewasfoundascomparedwithcontrol.Whentheextractwas
separatedonaCosmosilcolumn,theelutewith%O%methanolshowedthemostpotent
activitytoincrease[3H]VBLuptake.Furtherseparationwithhexane‑acetone(3:1)
afforded3,3',4',5,6,7,8‑heptamethoxyflavone(HMF)and4',5,6,7,8,‑
pentamethoxyflavone(tangeretin).
HMFandtangeretinwerecontainedinOJandtheyincreasedthesteady‑stateuptake

へof[3H]VBLbyCaco‑2cellsinaconcentration‑dependentmanner.Thesetwomethoxy一

flavonesdidnotinhibit6/3‑hydroxylationoftestosteronecatalyzedbyCYP3A4.While,theethylacetateextractofOJandthesemethoxyflavonesincreasedsteady‑state[3H]
VBLuptakebyLLC‑GA5‑COL300cells,acelllinetransfectedwithhumanMDRIcDNA.
WeconcludedthatthesemethyoxyflavonesenhancedVBLuptakebyspecificallyinhibit‑
ingdrugeffluxviaP‑gp.Theymayhavepotentialasagentsforreversingmultidrug
resistanceorforrecoveringthebioavailabilityofcertaindrugs.