Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

遺伝子増幅検出装置 RD-200 ／リノアンプ CK19 の基礎的評価
関 あ か ね＊1，小 林 万 祐 子＊2，開 文 美＊2，芦 田 衛＊2，吉 本 倫 子＊1，
森 永 哲 郎＊2，伊 藤 美 津 枝＊1，大 東 元 就＊2，沼 田 修 一＊1＊1 シスメックス株式会社 学術本部 学術情報部：神戸市西区室谷 1-3-2（〒 651-2241）＊2 シスメックス株式会社 LS 事業本部 遺伝子検査事業部

要旨OSNA ( One-step Nucleic Acid Amplification；以下，OSNA ) 法とは，専用の可溶化試薬を用いてホモジナイズした
リンパ節中に含まれる標的遺伝子 サイトケラチン 19 ( CK19 ) mRNA を，専用の遺伝子増幅検出装置と試薬を用いて増幅・検出し，リンパ節へのがん転移診断の補助を行う手法である．既存システムである遺伝子増幅検出装置 RD-100i／リノアンプ BC ( シスメックス株式会社；以下，シスメックス ) は現在グローバルに多くの施設で導入され，乳癌領域を中心に運用されている．
今回，各癌腫の臨床的背景にも対応した新システム ( 遺伝子増幅検出装置 RD-200 ／リノアンプ CK19 ( シスメックス ))を発売したため，システムの臨床性能および分析性能の評価を行った．乳癌所属リンパ節を既存システムと新システ
ムの双方で測定し，判定一致率を確認した結果，両システムの臨床性能は同等であることが明らかとなった．加えて，新システムは既存システムに対する市場要望を基にユーザビリティなどを改良し，臨床現場での運用を簡便化，迅速化した．今後は，既存システムに替わる有用なシステムとして活用されることが期待される．
キーワード

OSNA 法 , RD-200, RD-210, リノアンプ CK19, LYNOAMP CK19 E, CK19

■ はじめにに含まれる標的遺伝子 サイトケラチン 19 ( CK19 )mRNA を，専用の遺伝子増幅検出装置と試薬を用いOSNA ( One-step Nucleic Acid Amplification ) 法とは，専て増幅・検出し，リンパ節へのがん転移診断の補助を行う手法である ( 図１)．

用の可溶化試薬を用いてホモジナイズしたリンパ節中遺伝子増幅・検出試薬

摘出
リンパ節

可溶化試薬

法
の
抽出・精製が不要

遺伝子増幅・検出

前処理 (可溶化)

図１．OSNA (One-step nucleic acid amplification) 法
Web 公開日：2018 年 10 月 25 日

1

Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

リノアンプ BC ( シスメックス株式会社；以下，

CK19 ( シスメックス )) を開発し，2018 年 7 月に発売を

シスメックス ) は，まず乳癌所属リンパ節中の CK19

開始することになった．欧州では既に 2017 年 7 月よmRNA 検出試薬として 2008 年に製造販売承認を取り新システムと互換性を有するシステム ( 遺伝子増幅

得し，リンパ節転移診断の自動化，迅速化を達成し検出装置 RD-210 ／ LYNOAMP CK19 E ( シスメックス ))た ( 遺伝子増幅検出装置 RD-100i ( シスメックス；以を発売し，臨床現場での利用が開始されている．

下，RD-100i ) は，2006 年に医療機器として届出 )．

新システムの詳細について，以下に説明する．

その後，大腸癌 ( 2010 年 )，胃癌 ( 2012 年 )，非小
ルに多くの施設で導入され，運用されている．その■ 製品仕様

一方で，各癌種においては異なる臨床背景があるこ

１．試薬の仕様と特徴

細胞肺癌 ( 2015 年 ) に適用を拡大し，現在グローバとから，測定検体数の増加，測定時間の短縮，測定

新試薬の仕様を ( 表１) に示す．

手技の簡便化，ヒューマンエラーの低減などが望ま

リノアンプ CK19 は，120 テスト／箱，開封後の使れており，このようなニーズに対応することもメー

用期間が 2 ヶ月であり，従来品であるリノアンプ BC

カーの責務となっていた．

( 240 テスト／箱，開封後使用期間 1 ヶ月 ) では期間内

このような背景から，既存システム ( RD-100i ／リに使い切ることが難しかった症例数が少ない施設にもノアンプ BC ( シスメックス )) の性能面や，ユーザビ

対応し，多様な運用方法に対応できる試薬構成となっリティの課題を改善した国内用の新システム ( 遺伝子ている．また 2 次元バーコードによる試薬管理機能を増幅検出装置 RD-200；以下，RD-200 ／リノアンプ

搭載したことで，ロット番号入力や凍結融解回数，試表１．既存試薬と新試薬の仕様比較

試薬名
使用目的

貯蔵方法
有効期間
開封後使用期間
包装単位

既存試薬
リノアンプ BC摘出された乳癌，大腸癌，胃癌又は非小細胞肺癌の所属リンパ節中の CK19mRNA の検出( 乳癌，大腸癌，胃癌又は非小細胞肺癌におけるリンパ節転移診断の補助に用いる )新試薬
リノアンプ CK19摘出された乳癌，大腸癌，胃癌所属リンパ節のCK19mRNA の検出( 乳癌，大腸癌，又は胃癌におけるリンパ節転移診断の補助に用いる )-25 〜 -15℃
12 か月
１か月
240 テスト用
CK19 プライマー溶液：720μL×8 本
酵素溶液：450μL×2 本
CK19 陽性コントロール：110μL×4 本
CK19 陰性コントロール：110μL×4 本
キャリブレーターレベル 1：110μL×4 本
キャリブレーターレベル 2：110μL×4 本
キャリブレーターレベル 3：110μL×4 本※2018 年 9 月現在-25 〜 -15℃
12 か月
２か月
120 テスト用 ( LAC-701A )CK19 プライマー溶液：1,400μL×3 本
酵素溶液：450μL×1 本
CK19 陽性コントロール：110μL×3 本
陰性コントロール：110μL×3 本
CK19 キャリブレーター レベル 1：110μL×3 本
CK19 キャリブレーター レベル 2：110μL×3 本
CK19 キャリブレーター レベル 3：110μL×3 本

2Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

薬の残量確認などの管理が自動化され，測定前の準備阻害の影響が小さくなり，測定サンプルのみで既存に要する時間の短縮や入力ミスなどのヒューマンエ

システムと同等の判定ができることが臨床研究におラーの防止にも繋がっている ( 図２)．

いて確認された．そのため新システムでは既存シス

さらに，試薬バイアルについては OSNA 法専用のテムで測定する希釈サンプルを省略し，測定サンプ

自社製バイアルを採用し，従来品の操作性やコンタミ

ルのみで転移陽性／陰性を判定する仕様に変更した．

ネーションのリスクなどの課題を克服している ( 図３)．

新システムではサンプル調製に要していた時間が短性能面では，試薬の組成を見直すことにより，標縮され，簡便性，操作性の向上に加え，検査システ的遺伝子の増幅効率が向上し，課題であった測定時

ム全体の TAT ( Turnaround Time ) の短縮にも繋がっ間の短縮を達成することができた．これに起因して，ている．

新システム用には新たなカットオフ値を設定した．
詳細データについては，後述する．

２．システムの特徴

また操作性や検査時間について，既存システムで

１）省スペース化

は，一部の検体で検体成分由来の遺伝子増幅反応阻

操 作 端 末 は 装 置 内 蔵 の タ ッ チ パ ネ ル と な り，

害が存在することが確認されている ．そのため測

ノートパソコンが不要となった．そのため同時測定サンプルに加えてさらに 10 倍希釈した希釈サン

定検体数が 14 検体に増えたにもかかわらず，設プルも合わせて測定し，判定の参考としていた．一

置スペースは既存システムの RD-100i と比較する

方，新システムでは試薬改良により遺伝子増幅反応とノートパソコン 1 台分削減となっている ( 図４)．

図２．2 次元バーコードによる試薬管理

図３．OSNA 法専用の自社製バイアル「RD サンプルバイアル」

１）

タッチパネル( 操作端末 )

図４．RD-200 の外観

3

Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

またチップ廃棄部は，既存システムの装置側面

トロールの測定データについては施設内の平均値，から新システムでは装置内部へと配置を変更した

2SD，3SD の値が自動で算出，グラフ上に表示さことにより，装置横のスペースの確保が不要となれるため，各項目の測定データの変動から試薬やり，スペースの有効利用が可能となった．

装置の状況の把握が可能である．

２）内部精度管理機能の強化

さらに，新システムでは過去ロット ( 既存シス

内部精度管理画面では，精度管理項目として陽テムでは直前のロットのみ ) の精度管理データが性コントロールの測定データ ( 立ち上がり時間，自動的に装置内に保存されるため，過去データとCK19 mRNA 定量値 ) と検量線の傾き情報がリアの比較なども可能となった ( 図５) ．

ルタイムにグラフ上にプロットされる．陽性コン

図５．内部精度管理画面

4

Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018３）測定時間 ( RD-100i と RD-200 との比較 )⑵．結果

RD-200 では装置の測定時間 ( 測定開始ボタンを

1 ～ 4 サンプルまでのすべてのサンプル数に押してから判定結果が表示されるまでの時間 ) が

おいて RD-200 は RD-100i よりも 5 から 10 分まRD-100i と比較して短縮している．装置間の測定で測定時間が短縮しており，サンプル数が増加

時間を比較した試験結果を以下に示す．

するにつれてその差は大きくなった ( 表２)．4⑴．方法

サンプル測定時では RD-100i と比較して約 10①対象検体：陰性コントロール

分の短縮となった．また，RD-200 では 14 サン②検体数：以下の検体数を各 1 バッチずつ測定

プルを約 30 分以内に測定完了できるため，リ( RD-100i，RD-200 は各 1 台使用 )ンパ節が摘出されてからリンパ節転移検査結果

既存システム：1，2，3，4が報告されるまで約 40 分以内といわれている

新システム

術中迅速診断においてもより多くのサンプルに：1，2，3，4，14

ついて RD-200 1 台で対応可能になると考えられた ( 図６)．

表２．試験結果
検体数
1
2
3
4
14

RD-200
16 分 58 秒
17 分 09 秒
18 分 58 秒
19 分 19 秒
29 分 50 秒

RD-100i
22 分 18 秒
24 分 38 秒
26 分 46 秒
29 分 17 秒−

14
リンパ節個数 個
(

4
3

)

2
RD-2001

RD-100i
0

5

10

15

20

25

30

測定終了時間 (分)図６．RD-100i と RD-200 の測定時間の比較( 注 ) RD-100i/200 における測定時間のみを比較しており，サンプルの前処理 ( リンパ節の破砕，測定サンプルの調製，試薬の準備など ) の時間は含まれません．

5

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■ 臨床性能評価
L：感度の信頼区間 ( 外側 ) の 1/2 の値 ( 95% のと

１．カットオフ値の設定

き 2.5%)

新システムでは試薬組成を見直し，遺伝子増幅効率が変化したため，同一リンパ節から調製した検体を測

TPF：True-positive fraction ( ＝感度 )定した場合に，新システムでは既存システムと比較しG ( 1 －α/2 )：標準正規分布における ( 1 －α/2 )て高値傾向にある．そこでカットオフ値を再設定した．

百分率 ( α=0.05 のとき 0.975 )具体的には，新システムに対して仮のカットオフ値③リンパ節の破砕( カットオフポイント ) を設定し，各カットオフポイ

採取したリンパ節は，直ちにリノアーグで破砕

ントにて既存システムと判定を比較した．既存システ

後，リンパ節可溶化液を調製した．既存システム用

ムとの判定一致率が最も高く，また Receiver Operatingのサンプルとして，リンパ節可溶化液をリノアーグ

Characteristics ( 以下，ROC ) 曲線にて感度および特異度

で 10 倍希釈した「測定サンプル」および 100 倍希

100% の頂点からの距離が最小となるカットオフポイ

釈した「希釈サンプル」を調製した．また同一のリントを，新システムのカットオフ値とした．

ンパ節可溶化液から，新システム用のサンプルとし

１）方法

て，
「測定サンプル」のみを調製した．

①対象検体④ OSNA 法測定

対象検体は，大阪警察病院，北九州市立医療セ各システムの試薬 3 ロットを異なる 3 台の装置

ンター，相良病院，新潟県立がんセンター新潟病に設置し，サンプルは連続 3 回測定した．既存シ院の 4 施設で手術を受けた下記の選択基準を満た

ステムでは，計 9 データのうち中央値であった測

す乳癌患者から取得した乳癌所属リンパ節とした．

定サンプル，およびその対として測定した希釈サ〈選択基準〉

ンプルから得られた判定を採用した．新システム

・乳癌と診断され手術を受ける者

では，計 9 データのうち中央値を測定値として採・ 20 歳以上である者用した． (+)/(++) カットオフ値を設定する場合，・研究参加の同意が得られている者

既存システムでの (+) I 判定は (+) または (++) のい〈除外基準〉

ずれかに分類することができないため，計 9 デー

・乳癌以外の癌が疑われる者

タのうち 1 回以上 (+) I 判定された 14 検体は除外

・過去に乳癌以外の癌に罹患した者

した．

・担当医により，試験への参加が難しいと判断さ⑤データ解析

れた者

新システムでは，カットオフポイントごとに各・下記以外の薬物を術前に投与された者 :検体を判定した．装置 RD-200 の分解能が 1 秒でアンスラサイクリン，5-FU，タキサン，トラスあり，立ち上がり時間が 1 秒変化すると，CK19

ツズマブ，シクロフォスファミド，カルボプラ

mRNA 測定値は約 0.04 log copies/μL 変化すること，チン

また新システムのカットオフ値は既存システムと②検体数同等であると仮定し，(-)/(+) は 25 copies/μL ごと，

CLSI EP24-A2 に準拠し，信頼区間を 95% で有(+)/(++) は 500 copies/μL ごとにカットオフポイン

意水準 (α) 5%，新システムにおける感度および特トを設定した．

異度 (TPF) を 95% と仮定すると，下式より陽性お判定一致率は以下のとおり算出した ( 表３，４)．

よび陰性の必要検体数はそれぞれ 73 検体以上とまた，x 軸を偽陽性率 ( 1- 特異度 )，y 軸を感度と算出された．よって既存システムで判定した場合するグラフに，各カットオフポイントでの値をプに，陽性，陰性ともに 73 検体以上が含まれるよ

ロットし，グラフ左上からの距離を指標としてう，合計 288 検体を収集した．

ROC 解析した．

6

Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018２）結果最小であった． このうち，偽陰性判定を避けるた① (-)/(+) cut-off

め，900 copies/μL をリノアンプ CK19 (-))/(+) カッ
トオフ値として設定した ( 表５，図７)．

900 および 925 copies/μL にて，判定一致率が最高であり，またグラフ左上から ROC 曲線の距離は

表３．(-)/(+) カットオフ値における算出方法

カットオフポイント以上
カットオフポイント未満

新システム

既存システム(++)，(+)，(+) I
a
c

(-)
b
d

判定一致率：(a+d)/(a+b+c+d)×100 [%]表４．(+)/(++) カットオフ値における算出方法
既存システムカットオフポイント以上
カットオフポイント未満

新システム

(++)

(+)，(-)acbd

判定一致率：(a+d)/(a+b+c+d)×100 [%]

表５．各 (-)/(+) カットオフポイントでの既存システムとの比較結果
新システム
カットオフポイント
CK19 mRNA [copy/μL]
判定一致率
陽性 ((+) ，(++)) と陰性 (-)
感度
特異度
ROC 解析
( グラフ左上からの距離 )

875

900

925

950

99.0%

99.3%

99.3%

99.0%

98.9%
99.0%

98.9%
99.5%

98.9%
99.5%

97.8%
99.5%

0.00020.00010.00010.0005100.0

感度 (%)

98.0
カットオフポイント
900および925 copies/µL

96.0

94.0

92.0

90.0

0.0

5.0

10.0

1 -特異度 (%)

図７．新システムを既存システムと比較した場合の ROC 曲線

7

Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018ｉ）(+)/(++) cut-off

２．換算式の設定

14,000 から 14,500 copies/μL および 29,500 か

欧州では，既存システムの CK19 mRNA 測定値を乳ら 30,000 copies/μL の範囲で判定一致率が最高で癌における治療方針の判断基準として利用する動向

あった．このうち，グラフ左上から ROC 曲線

が あ る． 例 え ば 各 セ ン チ ネ ル リ ン パ 節 中 の CK19の距離が小さいのは 14,000 から 14,500 copies/μL

mRNA 測定値の合計から算出する TTL ( Total Tumorであった．よって判定一致率および感度と特異Load ) を治療に活用することを提唱する報告がある２）．

度から算出した ROC 曲線の結果に加え，偽陰

このように既存システムの測定値は臨床応用の例が性判定を避けるため，14,000 copies/μL をリノア

あり，測定値の変化によるユーザーの混乱を避ける

ンプ CK19 (+)/(++) カットオフ値として設定したため，新システムでの測定値を既存システム相当に( 表６，図８)．

変換する換算式を設定した．

表６．各 (+)/(++) カットオフポイントでの既存システムとの比較結果
新システム
カットオフポイント
CK19 mRNA [copy/μL]
判定一致率
強陽性 (+) とその他
感度
特異度
ROC 解析
( グラフ左上からの距離 )13,50014,00014,50015,00029,00029,50030,00030,500

96.7%

97.4%

97.4%

97.1%

97.1%

97.4%

97.4%

97.1%

100.0%
95.8%

100.0%
96.7%

100.0%
96.7%

98.3%
96.7%

98.1%
93.3%

98.6%
93.3%

98.6%
93.3%

98.6%
91.7%

0.00180.00110.00110.00130.00480.00460.00460.0071

100.0

98.0

カットオフポイント

感度 (%)

14,000および14,500 copies/µL
96.0

94.0
カットオフポイント
29,500および30,000 copies/µL

92.0

90.0

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

1 -特異度 (%)

図８．新システムを既存システムと比較した場合の ROC 曲線

8

10.0

Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

カットオフ値 2 点を基準として，検体群を補正す

算値と既存システムを用いた測定値を比較した．

るための換算式を以下のとおり設定した．また新シス

１）方法

テムでの換算値は，新しい単位 cCP/μL を用いて表す．

陰性リンパ節の可溶化液に CK19 mRNA を添
加 し，10 濃 度 ( 2.2 × 102，2.7 × 102，3.2 × 103，

【換算式】

3.7 × 103，4.2 × 104，4.7 × 104，5.2 × 105，5.7

y：新システムで測定した CK19 mRNA 測定値

× 105，6.2 × 106，6.7 × 106 cCP/μL ) のサンプル

y’：CK19 mRNA 換算値を作製した．各サンプルは連続 3 回測定を実施して平均値を算出し，グラフ ( x 軸：既存システム測
定値 [log copy/μL]，y 軸：新システム測定値の換算
値 [log cCP/μL]) にプロットした．

新システムでの測定値を換算式で変換した場合，

２）結果(-)/(+) カットオフ値である 900 copies/μL は 250 cCP/μ各プロットを結ぶ近似直線は y=1.1039x-0.182，相L に，14,000 copies/μL は 5,000 cCP/μL に 変 換 さ れ，

関係数 ( R2 ) は 0.9975 と算出され，新システムを

既存システムと同値である ( 表７)．

用いた測定値の換算値と既存システムを用いた測定値はよく相関した ( 図９)．

この換算式の妥当性を確認するため，同一の検体サンプルを測定し，新システムを用いた測定値の換

表７．カットオフ値の比較

新システム測定値の換算値 [log cCP/μL](+)/(++) カットオフ値(-)/(+)カットオフ値

新システム

既存システム[copy/μL][copy/μL][cCP/μL]

5,000 copies/μL
250 copies/μL

14,000 copies/μL
900 copies/μL

5,000 cCP/μL
250 cCP/μL

8.000
7.000

y=1.1039x-0.182
R2=0.9975

6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000
既存システム測定値 [log copy/μL]

図９．測定結果 (x 軸：既存システム測定値 [log copy/μL]，y 軸：新システム測定値の換算値 [log cCP/μL])9Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

マブ，シクロフォスファミド，カルボプラチン

３．カットオフ値および希釈サンプル省略の妥当性

②検体数

評価
乳癌所属リンパ節を，新たに設定したカットオフ“相関性試験に必要な検体数および承認基準およ値を適用した新システムと，既存システムの双方でび試験方法３）”に記載の判定一致率と検体数の基準測定し，陽性／陰性の判定一致率を評価した．

から，判定一致率の 95% 信頼区間は 0.83-0.95 と算１）方法出たため，判定一致率の閾値を 0.83 と考えた．予備①対象検体

検討における既存システムと新システムの判定一致率

対象検体は，京都府立医科大学，近畿大学，熊から予想一致率を 0.92 とした場合，有意水準 ( α )本市民病院の 3 施設で手術を受けた下記の選択基

5%，検出力 ( 1-β ) 90% で閾値 0.83 を下回らないこ準を満たす乳癌患者から取得した乳癌所属リンパとを検討するために必要な検体数は 146 検体と算出節とした．

された．よって 150 検体を収集した．

〈選択基準〉③リンパ節の破砕・乳癌と診断され手術を受ける者

採取したリンパ節は，直ちにリノアーグで破砕・ 20 歳以上である者

後，リンパ節可溶化液を調製した．既存システム用・研究参加の同意が得られている者の検体として，リンパ節可溶化液をリノアーグで〈除外基準〉

10 倍希釈した「測定サンプル」および 100 倍希釈

・乳癌以外の癌が疑われる者

した「希釈サンプル」を調製した．また同一のリン・過去に乳癌以外の癌に罹患した者

パ節可溶化液から，新システム用の検体として，「測・担当医により，試験への参加が難しいと判断さ

定サンプル」のみを調製した．

れた者④ OSNA 法測定

・下記以外の薬物を術前に投与された者 :各サンプルは 1 回測定した．新システムには新たに定めたカットオフ値を適用した ( 表８，９)．

アンスラサイクリン，5-FU，タキサン，トラスツズ

表８．既存システムでの判定方法
希釈サンプルCK19 mRNA(copies/μL)≧250,<5,000
陽性 (++)< 250
測定サンプルCK19 mRNA(copies/μL)≧カットオフ値(≧250)≧5,000≧250,<5,000<カットオフ値(< 250)<250≧5,000

陽性 (+)
陰性 (-)

陽性 (+) I
陽性 (+) I**：測定サンプルによっては反応が阻害され，測定サンプルのコピー数が 250 copies/μL 未満かつ希釈サンプルのコピー数が 250 copies/μL 以上，もしくは測定サンプルのコピー数が 250 copies/μL 以上 5,000 copies/μL 未満かつ希釈サンプルのコピー数が 5,000 copies/μL 以上となる場合があります．この場
合は，増幅反応阻害検体 ( 増幅反応を阻害するサンプル ) として扱い，RD-100i での判定結果には (＋) I と表示され陽性と判定されます．

表９．新システムでの判定方法
測定サンプルCK19 mRNA(copies/μL)≧カットオフ値(≧900)≧14,000≧900, <14,000

陽性 (++)
陽性 (+)<カットオフ値(< 900)<900

陰性 (-)

10Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

⑤データ解析

２）結果

判定一致率は以下のとおり算出した ( 表 10 )．

陽性／陰性の判定一致率は 94.7% であり，良好

判定一致率：(a+d)/(a+b+c+d) × 100 [%]な結果であった．よって新システムのカットオフ⑥追加測定

値は妥当であり，既存システムと同等の臨床性能であることが明らかとなった ( 表 11 )．

既存システムと新システムで陽性／陰性判定が不一致の場合，各システムで 3 回ずつ追加測定を

３）不一致検体

実施した．

試験結果を詳細に考察するため，立ち上がり時間を検量線に当てはめて低濃度域の測定値も算出した ( 表 12 ) ．

表 10．判定一致率の算出方法
既存システム
陽性
(+)
(+) I

(++)
(++)
(+)
(-)

陽性

新システム

陰性

陰性
(-)

a

b

c

d

表 11．試験結果
既存システム
陽性
(+)
(+) I
0
2
15
4
3
1

(++)
(++)
(+)
(-)

陽性

新システム

陰性

26
1
0

陰性
(-)
0
4
94

表 12．判定不一致検体

検体
番号

測定サンプル
CK19
mRNA
判定[copy/μL]1

3.2×1022
3
4
5
6

2.5×107
82

2.5×1022.5×10
9.5×10
1.7×102
1.7×102
3.9×10-4

(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)

既存システム
希釈サンプル
CK19
mRNA[copy /μL]

判定
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)

6.9×10-3
7.8×10-2
ND*
7.8×10
6.4×101.1
5.3×10-2
7.0×102

(-)
(-)
(+)

*ND：測定時間11分以内に遺伝子増幅が検出されなかった

11

総合
判定
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+) I

新システム
測定サンプル
CK19
mRNA[copy /μL]
1.5×10
8.3×10
4.7×10
9.5×1021.2×103
1.5×103
1.7×103
1.1×102

総合
判定
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)

Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

が検出されたことから，測定再現性の範囲内での検体 1，2，3，4，5 は，追加 3 回測定にて，両試薬ともすべて (-) 判定で一致した．検体 6 は追加

判定不一致であったと考えられる．

3 回測定にて，既存システムで (-) 判定が 3 回，ま４）既存システム (+) I 判定検体の追加考察

た新システムで (+) 判定が 1 回と (-) 判定が 2 回で既存システムで (+) I 判定された 7 検体について，あった．以上 6 検体は測定再現性の範囲内での判追加考察した．試験結果を詳細に考察するため，

定不一致であったと考えられる．

立ち上がり時間を検量線に当てはめて低濃度域の測定値も算出した ( 表 13 )．

検体 7 は追加 3 回測定にて，既存システムで (-)
判定が 3 回，また新システムで (+) 判定が 3 回であっその結果，既存システムで (+) I 判定された 7 検

た．既存システムでは (-) 判定だが，CK19 mRNA体のうち 6 検体が，新システムでも陽性判定であが検出されている．加えて，この症例はリンパ管り，既存システムと比較して遺伝子増幅反応阻害

侵襲が確認されているため，リンパ節転移の可能の影響が小さくなったことが改めて確認できた．

性がある．よって一定量の CK19 mRNA は発現し検体 7 は，追加 3 回測定にて，既存システムでており，測定再現性の範囲内での判定不一致であ(+) I が 2 回と (-) 判定が 1 回，新システムでは (-)

ると考えられる．

判定が 3 回であった．反応阻害作用の強い低コピー数の検体であり，測定再現性が判定に影響を与え

検体 8 は，追加 3 回測定にて，既存システムでたため，判定不一致に繋がったと考えられる．

(+) I が 2 回と (-) 判定が 1 回，また新システムでは (-) 判定が 3 回であったが，すべての測定におい

なお既存システムおよび新システムは，他の関て測定時間内に立ち上がりが見られた．新システ

連する検査結果や臨床症状などと合わせて，医師

ムでもカットオフ値未満ではあるが CK19 mRNA

が総合的に判断することが求められる．

表 13．(+) I 検体の詳細
検体
番号

測定サンプルCK19 mRNA
判定[copy/μL]1

3.6×1032
3
4

2.3×103
2.3×103
1.5×1022.2×102567

1.7×102
3.9×10-4(+)(+)

既存システム
希釈サンプルCK19 mRNA
判定[copy /μL](++)
2.5×105(++)
7.8×103

(+)
(-)
(-)

3.9×104
1.0×103
3.2×102

(++)
(+)
(+)

(-)
(-)

2.5×102
7.0×102

(+)
(+)

12

総合
判定
(+) I
(+) I
(+) I
(+) I
(+) I
(+) I
(+) I

新システム
測定サンプルCK19 mRNA
総合[copy /μL]
判定(++)
1.4×105(++)
4.2×104
7.6×103
3.4×1032.2×103

(+)
(+)
(+)

1.5×103
1.1×102(+)(-)

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■ 分析性能評価

１）方法
①対象検体

診断システムを臨床で使用するにあたり，診断精陰性リンパ節の可溶化液に CK19 mRNA を添加

度を把握し，また精度管理を実施するうえで，製品し，5 濃度 ( 1.6 × 102，2.5 × 102，5.2 × 103，2.8の分析性能を把握することは重要である．そこで× 104，2.4 × 106 cCP/μL ) のサンプルを作製した．

NCCLS ( National Committee for Clinical Laboratory②測定Standards， 米 国 臨 床 検 査 標 準 委 員 会 ) が 発 行 す る

各サンプルは 1 日 4 回 ( 連続 2 回／バッチ，2Clinical and Laboratory Standards Institute ( CLSI ) ガイド

バッチ ) 測定を 20 日間 ( 10 日間／ロット，試薬 2ラインに従い，新システムで検体サンプルを測定し，ロット ) 実施した．

分析性能を評価した ( 表 14 )．

③データ解析
各サンプルの室内再現精度は CLSI ガイドライン
EP05-A3 に従い，ANOVA 法で解析した．

１．室内再現精度 Single-site Precision
同一施設，同一装置，同一オペレーターで測定し２）結果各サンプルの室内再現精度は表 15 のとおり算た場合に生じる再現性を解析した．

出された ．

表 14．各測定値を log cCP/μL 単位で算出した場合の分析性能一覧
結果 (log cCP/μL 単位で解析 )サンプル A (1.6 × 102 cCP/μL) ：CV 8.2%
サンプル B (2.5 × 102 cCP/μL) ：CV 4.9%
サンプル C (5.2 × 103 cCP/μL) ：CV 2.5%
サンプル D (2.8 × 104 cCP/μL) ：CV 1.6%
サンプル E (2.4 × 106 cCP/μL) ：CV 1.0%
室間再現精度 Multi-site Precision (Reproducibility) サンプル A (1.6 × 102 cCP/μL) ：CV 9.2%
サンプル B (2.5 × 102 cCP/μL) ：CV 7.9%
サンプル C (5.2 × 103 cCP/μL) ：CV 3.3%
サンプル D (2.8 × 104 cCP/μL) ：CV 2.3%
サンプル E (2.4 × 106 cCP/μL) ：CV 1.2%
試薬 3 ロットの最大値：0.309 log cCP/μL
バイアス Bias
試薬 3 ロットの最大値：0.889 log cCP/μL
正確性 ( 総分析誤差 ) Accuracy
13 cCP/μL (63 copies/μL)
ブランク上限 Limit of blank (LoB)
56 cCP/μL (240 copies/μL)
定性限界 Limit of detection (LoD)
160 cCP/μL (600 copies/μL)
定量限界 Limit of quantiﬁcation (LoQ)
2.200 log cCP/μL から 8.200 log cCP/μL (160 cCP/μL から 1.6 × 108 cCP/μL)
測定範囲 Measuring range
項目
室内再現精度 Single-site Precision

表 15．室内再現精度
対象検体
サンプル A
サンプル B
サンプル C
サンプル D
サンプル E(cCP/μL)
1.6 × 102
2.5 × 102
5.2 × 103
2.8 × 104
2.4 × 106

CV
(%)

理論値
(log cCP/μL)

8.2
4.9
2.5
1.6
1.0

2.200
2.392
3.712
4.454
6.382

13

室内再現精度 ( 平均値 ± SD)(cCP/μL)(log cCP/μL)
1.1 × 102 - 2.7 × 102

2.058 - 2.425

2.4 × 102 - 4.2 × 102
4.9 × 103 - 7.4 × 103
2.6 × 104 - 3.7 × 104
4.7 × 106 - 6.4 × 106

2.382 - 2.628
3.686 - 3.872
4.422 - 4.567
6.674 - 6.809

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２．室間再現精度 Multi-site Precision ( Reproducibility )( 160，500，1.6 × 103，5.0 × 103，1.6 × 104，5.0

複数の施設，装置，オペレーターで測定した場合

× 104，1.6 × 105，5.0 × 105，1.6 × 106，5.0 × 106，に生じる再現性を解析した．

1.6 × 107，5.0 × 107 cCP/μL ) の CK19 mRNA を添加

１）方法

し，サンプルを作製した．

①対象検体

② 測定

陰性リンパ節の可溶化液に CK19 mRNA を添加

各サンプルは 1 回測定とし，4 日間にかけて測し，5 濃度 ( 1.6 × 10 ，2.5 × 10 ，5.2 × 10 ，2.8

定した．

× 10 ，2.4 × 10 cCP/μL ) のサンプルを作製した．

③ データ解析

2

4

2

3

6

②測定

試薬 3 ロットにて実施し，各 120 データを試薬3 施設で実施し，各施設は異なるオペレーター，

ロットごとに解析した．実測濃度と理論値のバイ

異なる装置で測定した．

アスは CLSI ガイドライン EP09-A3 に従い算出した．

③データ解析

２）結果

各サンプルは 54 回 ( 連続 3 回／バッチ，3 バッ

バイアスは 3 ロットの最大値が 0.309 log cCP/μL

チ／日，2 日間／ロット，3 ロット／施設 ) 測定をであった．

実施した．各サンプルの室内再現精度は CLSI ガイ
ドライン EP05-A3 に従い，ANOVA 法で解析した．

４．正確性 ( 総分析誤差 ) Accuracy
バイアスおよび再現精度から，個々の測定結果に

２）結果各サンプルの室間再現精度は表 16 のとおり算発生しうる理論値からの誤差を解析した．

出された．

１）方法
①対象検体
陰 性 リ ン パ 節 10 検 体 の 各 可 溶 化 液 に 12 濃 度

３．バイアス Bias

( 160，500，1.6 × 103，5.0 × 103，1.6 × 104，5.0

測定範囲の濃度域において，測定結果の期待値に生じる理論値との誤差を解析した．

× 104，1.6 × 105，5.0 × 105，1.6 × 106，5.0 × 106，１）方法

1.6 × 107，5.0 × 107 cCP/μL ) の CK19 mRNA を添加①対象検体

し，サンプルを作製した．

陰性リンパ節 10 検体の各可溶化液に 12 濃度

表 16．室間再現精度
対象検体
サンプル A
サンプル B
サンプル C
サンプル D
サンプル E(cCP/μL)(log cCP/μL)

CV(%)

1.6 × 102

2.200
2.392
3.712
4.454
6.382

9.2
7.9
3.3
2.3
1.2

理論値

2.5 × 102
5.2 × 103
2.8 × 104
2.4 × 10614

室内再現精度 ( 平均値 ± SD)(cCP/μL)(log cCP/μL)
1.6 × 102 - 4.6 × 102
2.7 × 102 - 7.0 × 102
4.7 × 103 - 8.4 × 103
3.0 × 104 - 4.8 × 104
4.1 × 106 - 5.8 × 106

2.213 - 2.659
2.425 - 2.842
3.676 - 3.925
4.472 - 4.685
6.612 - 6.767

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２）結果

②測定
各サンプルは 1 回測定とし，4 日間にかけて測LoD は 56 cCP/μL ( 240 copies/μL ) と算出された．

定した．この測定を試薬 3 ロットにて実施し，各なお測定再現性を考慮し，新システムとしての120 データを試薬ロットごとに解析した．

定性限界は 250 copies/μL を保証する．

③データ解析CLSI ガ イ ド ラ イ ン EP21-A に 従 い， 実 測 濃 度

７．定量限界 Limit of quantification ( LoQ )( log cCP/μL ) の平均値± 3SD と理論値 ( log cCP/μL )１）方法の差として，総分析誤差を算出した．

①対象検体
陰性リンパ節可溶化液に CK19 mRNA を添加し，２）結果

6 濃度 ( 20，40，79，160，320，630 cCP/μL ) のサ

総分析誤差は 3 ロットの最大値が 0.889 log cCP/μLであった．

ンプルを作製し，それぞれ 3 ロットのリノアンプ
CK19 で測定した．
②測定

５．ブランク上限 Limit of blank ( LoB )１）方法

各サンプルは 9 回 ( 連続 3 回／バッチ，3 日間 )①対象検体

測定し，サンプル，試薬ロットごとに解析した．

陰性リンパ節 4 検体の可溶化液を 3 ロットのリ③データ解析

ノアンプ CK19 で測定した．各サンプルは 15 回 ( 連

総分析誤差および精密度の規格を満たす最低濃続 5 回／バッチ，3 日間 ) 測定し，計 60 データを度のサンプルを各試薬ロットの LoQ とし，試薬 3

試薬ロットごとに解析した．各試薬ロットの LoB

ロットの最大値を LoQ とした．

は，CLSI ガイドライン EP17-A2 に記載の classical２）結果

approach にしたがって算出し試薬 3 ロットの最大

LoQ は 160 cCP/μL ( 600 copies/μL ) と算出された．

値を LoB とした．
２）結果

８．測定範囲 Measuring range

LoB は 13 cCP/μL ( 63 copies/μL ) と算出された．

１）方法
①対象検体
陰性リンパ節可溶化液に 9 濃度 ( 160，500，1.6

６．検出限界 Limit of detection ( LoD )１）方法× 103，5.0 × 103，1.6 × 104，5.0 × 104，1.6 ×①対象検体

106，1.6 × 107，1.6 × 108 cCP/μL ) の CK19 mRNA

陰性リンパ節可溶化液に CK19 mRNA を添加し，を添加してサンプルを作製した．

5 濃度 ( 10，16，25，40，63 cCP/μL ) のサンプル②測定を作製し，それぞれ 3 ロットのリノアンプ CK19

各サンプルは連続 3 回測定とし，試薬 3 ロット

で測定した．

で測定した．

②測定③データ解析

各サンプルは 12 回 ( 連続 4 回／バッチ，3 日間 )試薬ロットごとに CLSI ガイドライン EP06-A に測定し，計 60 データを試薬ロットごとに解析した．

従い解析し，理論値と実測濃度の直線性を評価し③データ解析

て，測定範囲を算出した．

各 試 薬 ロ ッ ト の LoD は，CLSI ガ イ ド ラ イ ン

２）結果

EP17-A2 に記載の classical approach に従って算出し，理論値と実測濃度の直線性が確認できた，リノア

試薬 3 ロットの最大値を LoD とした．

ンプ CK19 の測定範囲は 2.200 から 8.200 log cCP/μL( 160 から 1.6 × 108 cCP/μL ) であった．

15

Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

■結 語

また希釈サンプルを省略する仕様である．これらの妥当性は，既存システムとの同等性を評価した臨床

シスメックスは，OSNA 法の新システム ( 装置：

試験にて確認することができた．よって新システム

RD-200，試薬：リノアンプ CK19 ) を開発した．既の臨床性能は十分であることが明らかとなった．

存システム ( 装置：RD-100i，試薬：リノアンプ BC )また検体サンプルを測定した場合の分析性能も評価

からの改良点は表 17 のとおりである．

した．CLSI ガイドラインに従い評価した本分析性能は，

新システムでは，既存システムと比較し，測定が精度管理の参考データとなることが期待される．

迅速で操作性が高く，各癌種での使用方法や施設で以上のとおり，OSNA 法の新システムを開発し，の手術状況にも適用した新システムを構築すること

臨床性能および分析性能を確認した．既存システムができた．また試薬性能の変化に伴う測定値の乖離と同等の臨床性能に加え，既存システムに対する市は，換算式および単位「cCP/μL」を提供することで，場要望を基に，臨床現場での運用を簡便化した．今既存システムとの比較を容易とした．

後は，既存システムに替わる有用なシステムとして新システムでは，カットオフ値を新たに設定し，活用されることが期待される．

表 17．既存システムと新システムの比較

測定時間（装置へのセット〜判定）

既存システム新システム

RD-100i/リノアンプBC

RD-200／リノアンプCK19

2検体測定で24.5分／測定

2検体測定で17分／測定

定性(-)/(+)カットオフ値250 copies/μL

定性(-)/(+) カットオフ値900 copies/μL(+)/(++)カットオフ値5,000 copies/μL(250 cCP/μL)(+)/(++) カットオフ値14,000 copies/μL(5,000 cCP/μL)

分析性能

対象検体

測定サンプル／希釈サンプル

測定可能検体数

最大4リンパ節/測定

試薬の仕様

測定サンプル(希釈サンプル省略)
最大14リンパ節／測定

240テスト／キット

120テスト／キット

開封後有効期限1ヶ月

開封後有効期限2ヶ月
QRコードによる残量管理

ユーザビリティ機能

操作画面内蔵による省スペース化−

内部精度管理の強化
蓋と本体が一体型の試薬容器

16Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

■謝 辞

・病理診断科

臨床検査科長・病理診断科

皆倉愛美

前田ゆかり

先生

先生

共同研究にご協力いただいたご施設
医療法人 創起会

くまもと森都総合病院

・統括副院長乳腺センター 西村令喜・病理診断科

診療部長

有馬信之

地方独立行政法人大阪府立病院機構
先生

大阪はびきの医療センター

先生

・乳腺外科

大阪警察病院
・病理診断科

診療主任

久保田倫代

先生

新潟県立がんセンター新潟病院
部長

辻本正彦

先生

・院長
・副院長

乳腺外科

佐藤信昭

病理診断科

先生

本間慶一

先生

北九州市立医療センター
・乳腺甲状腺外科 主任部長
・病理診断科主任部長

京都府公立大学法人

阿南敬生

田宮貞史

先生

( 施設名 五十音順 )先生

参 考 文 献京都府立医科大学大学院

医学研究科

１) Yoshiya Horimoto. Elucidation of inhibitory effects on

・内分泌・乳腺外科学

講師

阪口晃一 先生

metastatic sentinel lymph nodes of breast cancer during OneStep Nucleic Acid Amplification. Scientific Reports. 2018 ;近畿大学大学院医学研究科
・外科学教室菰池佳史

8, Article number : 7563

乳腺内分泌外科部門

教授

２) V Peg et al. Intraoperative molecular analysis of total tumor

先生

load in sentinel lymph node: a new predictor of axillary status

・病理学講座教授

佐藤隆夫

・病理学講座植田清文

先生

in early breast cancer patients. Breast Cancer Research and先生

Trea. 2013 ; 139 ( 1 ) : 87-93. doi:10.1007/s10549-0132524-z.

社会医療法人博愛会
・副院長

相良病院

病理診断科部長

３) 厚生労働省医薬食品局長 . 薬食発 0120 第 1 号 ( 平成大井恭代 先生

27 年 1 月 20 日 ).

17Sysmex Journal Web Vol.19 No.2 2018

Basic Evaluation of Gene Amplification Detector
RD-200 and LYNOAMP CK19
Akane SEKI*1, Mayuko KOBAYASHI*2, Ayami HIRAKI*2, Mamoru ASHIDA*2, Michiko YOSHIMOTO*1,
Tetsuro MORINAGA*2, Mitsue ITO*1, Motonari DAITO*2 and Shuichi NUMATA*1*1 Scientific information, Scientific Affairs, Sysmex Corporation, 1-3-2 Murotani, Nishi-ku, Kobe 651-2241, Japan*2 Gene Testing Business, LS Business, Sysmex Corporation

SUMMARY
One-Step Nucleic Acid Amplification (OSNA), refers to a method for facilitating diagnosis of lymph nodemetastasis of cancer cells, using a specially designed detector and reagents for amplification and detection of thetarget gene, cytokeratin (CK) 19 mRNA, which may be present in the lymphatic tissue sample homogenized by
the dedicated solubilizing agent. RD-100i gene amplification detector and LYNOAMP BC, the conventional systemusing this method, has already been introduced to a number of institutions around the world, being utilized
mainly in breast cancer-related diagnosis.
Now, with the introduction to the market of a new gene amplification and detection system, RD-200 gene
amplification detector and LYNOAMP CK19, which should be useful clinically in diagnosing many types of cancer,
the clinical performance of this new system and analytical capacities of the new reagent set were evaluated.
Regional lymph nodes of breast cancer were analyzed both with the conventional system and the new system,
and concordance rates were calculated; the results were that both systems were found to be comparable inclinical performance. Furthermore, it was shown that the new system, which was improved in usability inresponse to the market needs arising in relation to the conventional system, facilitated diagnosis with simplified
operation in the clinical setting. The new system is expected to supersede the conventional system as a more
useful means of diagnosis.
Key Words

OSNA, RD-200, RD-210, LYNOAMP CK19, LYNOAMP CK19 E, Cytokeratin 19 (CK19)

18