ダイズ加工食品における鉄成分―その形態と食品加工への影響に関する研究―
増田太郎＊
京都大学大学院農学研究科農学専攻品質科学講座

Iron in the Soy-Derived Foods-Study on the Transition of Iron and Ferritin During theFood Processing of Soybean SeedTaro MASUDA＊
Laboratory of Food Quality Design and Development, Division of Agronomy and Horticultural
Science, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Uji, Kyoto 611-0011

ABSTRACTIron is an essential transition metal for virtually all the living kingdoms. Soybean
seed, which is one of the most major staple crops, contains a large amount of iron.
Thus, it is expected as a candidate for sustainable food-derived iron source. It
is suggested that the iron storage protein ferritin largely contributes to the net
iron content in the seed of soybean. Previously, the author showed that ferritin
is composed of two types of subunits, SFER1 and SFER2, in soybean dry seeds.
In the present study, the author investigated the contribution of ferritin to theiron content of soy-derived processed foods, such as tofu. Ferritin was detected
in many kinds of soy-derived foods except the fermented soy foods. Furthermore,ferritin puriﬁed from the tofu extract was folded properly and formed oligomer,
similar to the structure of native soybean ferritin, indicating that soybean ferritin
was stable during the heat treatment of food processing. Judging from theferritin and iron recovery in the puriﬁcation process, most of the soluble iron wascontained in ferritin oligomer. However, the iron contents of ferritin from tofu wasapproximately 1150 Fe atoms per molecule, while native ferritin oligomer, which
was puriﬁed from dry seeds, contained 2590 atoms. These results suggested thatferritin oligomer was maintained stably and still contained large portion of iron intofu, although partial denaturation induced iron release from ferritin shell during
heat treatment. Soy Protein Research, Japan 18, 58-63, 2015.

＊〒611-001158

京都府宇治市五ヶ庄
大豆たん白質研究

Vol. 18（2015）

Key words : ferritin, iron content, tofu, subunit, elementary analysis
鉄は全ての生物種にとって必須な遷移金属元素であ

2．ダイズフェリチンの精製と検出る．鉄欠乏は最も対策が遅れている栄養素欠乏で，全ダイズ乾燥種子からのフェリチンの精製は，既報

世界で約30億人が貧血をはじめとした鉄欠乏の状態にの手法に従った7）．豆腐（平均重量367 g，水分含量ある1）．鉄欠乏を主因とする貧血の罹患者数は，食糧86.5%）に，抽出用緩衝液（20 mM TrisHCl pH 7.8）

事情の比較的安定した本邦においても女性を中心に多を加え，電動ミキサーで豆腐ゲルを懸濁後，10,000 g,2）く存在しており ，日常の食事由来の効率的な鉄の摂15分の遠心分離により得られた上清を豆腐抽出液とし取が求められている．一般に，食品由来の鉄成分は，た．豆腐抽出液と染み出し液中のフェリチンは，塩ヘム鉄と非ヘム鉄に大別される．ヘム鉄は，動物由来

析，Super Q Toyopearl（東ソー）による陰イオン交の食品に多く含まれ消化吸収性に優れた良好な鉄給源換，Superdex 200pg（GE Healthcare）によるサイズとされている．他方，植物由来の食品に含まれる鉄分排除クロマトグラフィー（SEC）により単一に精製しは非ヘム鉄が大半であり，人体における利用率が低いた．精製過程におけるたん白質の定量はウシ血清アルと考えられている．しかし，一群の非ヘム鉄の中で，ブミン（BSA）を標準試料としたProtein Assay（Bio-鉄貯蔵たん白質フェリチンに内包される鉄（以下，フェRad）により行った．ダイズ乾燥種子，および豆腐作リチン鉄）が，第三の鉄栄養形態として注目されてい製過程におけるフェリチンの検出は，組換え型ダイズ

3）

る ．フェリチンは相同な24個のサブユニットからなフェリチン抗体7）を用いたイムノブロットにより行っる球状の多量体たん白質であり，細胞内における鉄のた．また，各精製段階におけるフェリチンの回収率は，

4）

貯蔵と無毒化に寄与する ．近年，フェリチン鉄が，各試料を適宜希釈した上，上記の抗体を用いたドット

腸管においてヘム鉄，無機鉄とは別経路で高効率に吸ブロットにより算出した．

収されることが報告された5）．
ダイズ種子は，本邦において貴重な食材であり，鉄3．鉄含有量測定含有量についても他の植物由来の食品と比較して上位

ダイズ乾燥種子および種々のダイズ食品の鉄含有量に位置する（食品成分データベース（http://fooddb.

は，乾燥試料を濃硝酸と過酸化水素により湿式灰化しmext.go.jp/））．ダイズ種子における鉄分の多くはフェた後，適宜希釈し，原子吸光分光光度計（AAS-6800,

リチン鉄であるが 6），ダイズ種子を加工する際のフェ島津製作所）を用いて測定した．精製過程のフェリチ

リチンの動態と構造変化，鉄含有量の推移についてはンなどの可溶性試料は，適宜希釈の上，同様に原子吸ほとんど知られていない．本研究では，食品加工時の光法により鉄濃度を決定した．

加熱などがフェリチンたん白質の構造に与える影響と鉄含有量の関係に着目し，検討を行った．

4．円二色性（CD）スペクトル
精製フェリチンのCDスペクトルは，温度管理ユニッ方法

トを装備したJ-720分光偏光計（日本分光）にて測定した．二次構造の推定には波長190-250 nmにおける1．ダイズ試料と豆腐の作製
ダイズ加工食品は，京都府宇治市内の商店で購入しCDスペクトル，熱安定性評価には25-90℃での波長222nmにおけるモル楕円率の変化を測定した．

た．豆腐の作製には，2013年に収穫された品種トヨマサリ乾燥種子を用いた．250 gのダイズ乾燥種子を，結果と考察

1 Lの蒸留水に約20時間室温で浸漬し，吸水した種子を水とともに電動ミキサーで破砕した．そこに2 Lの

1．ダイズ加工食品の鉄含有量とフェリチンの分布

蒸留水を加え，10分間沸騰させたものを絞り，豆乳を本研究で試料とした市販ダイズ食品の鉄含有量を，得た．豆乳を80℃に再加熱後，硫酸カルシウム（5 g/L）

Fig. 1（a）に示した．味噌を除くダイズ加工食品のを添加し，室温にて静置した．ゲル化した部分を型枠

鉄含有量は，乾燥重量100 gあたり6-10 mgであり，他に収め豆腐とし，清澄な上澄み液と豆腐成形過程に浸の植物由来の食品と比較して高い値となっている．次

み出した水分を豆腐浸み出し液とした．に，ダイズ加工食品中のたん白質成分と鉄貯蔵たん白質フェリチンの分布を，SDS-PAGE後のCBB染色，およびイムノブロットにより解析した．イムノブロット

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2．食品中のフェリチンとその構造の結果，フェリチンは，豆乳，おから，豆腐，薄揚げにおいて検出され，納豆，味噌などの発酵食品では未ダイズ加工食品のモデルとして豆腐を選択し，鉄成検出であった（Fig. 1c）．CBB染色の結果から（Fig.

分とフェリチンの挙動を追跡した．豆腐抽出液，およ1b），発酵過程においてフェリチンも他のたん白質とび豆腐染出し液から単一に精製したフェリチンは，乾同様に分解を受けたと考えられる．一方，豆腐，薄揚燥種子由来の物と同様，二種類の構成サブユニットかげなど加熱を伴うダイズ加工食品にはフェリチンが存ら成っていた（Fig. 2a）．精製の最終段階として行っ在し，鉄成分の保持に寄与している可能性が示された．

たSECのチャート（Fig. 2b）より，豆腐抽出液および

(b)
12kDa

1075503782520642(c)
1.
Ok
ara
2.
So
ym
ilk
3.
Tofu
4.
Friedtofu
5.
Natto
6.
M
iso

Iron content (mg/100 g dry matter)(a)123456ckDa
25Fig. 1. Iron contents and ferritin distribution in various soy-derived foods.
(a) Iron contents of soy-derived foods. Error bars indicate S.E. of three independent analyses. (b) ReducedSDS-PAGE analysis of soy-derived food extracts. The gel was stained with Coomassie Brilliant BlueR-250. Lane 1; Okara, lane 2; Soy-milk. lane 3; Tofu, lane 4; Fried tofu, lane 5; Natto, and lane 6; Miso. (c)Immuno blot analysis of soy-derived food extracts. Lane numbers indicate the same samples as the panel(b). Lane C indicates the control load of puriﬁed soybean ferritin.
(a)(kDa) M 1 2 3(b)Tofu Extract

2520Tofu supernatant

A280 (A.U.)

75
50
37rSFER1rHumanHBSA

0204060

80

100Time (min.)Fig. 2. Puriﬁcation of ferritin from tofu.
(a) Puriﬁed ferritin from dry soybean seeds (lane 1), tofu extract (lane 2), and tofu supernatant (lane 3). (b)The elution chart of the size exclusion chromatography. From upper one, the chart indicates tofu ferritinfrom extract, from supernatant, recombinant soybean ferritin, recombinant human H chain ferritin, andbovine serum albumin.
60

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(a)

(b)

4060

80100

Tofu extract

60Tofu supernatant
40rSFER120240200220

Ellipticity (mdeg)

Ellipticity (mdeg)

80

0Temperature (℃)

20-10BSArSFER1-20

Tofu extract-30-20-40-40

Wave length (nm)Fig. 3. CD spectra of puriﬁed ferritin from tofu.
(a) CD spectra of tofu ferritin puriﬁed from extract and supernatant, and recombinant soybean ferritin.
Molar ellipticity in far UV region was recorded by scanning the wave-length from 250 to 190 nm. (b) The
molar ellipticity at a wavelength of 222 nm was taken in the range of 20‒90 ℃ (DT = 0.5 ℃) with anacquisition time of 0.2 s after an equilibration time of 30 s at each temperature step.
Tofu extract

(a)

(b)

800

800

40600

30400

20200

10Fe (μg)

50Fe (μg)

1,000

600
400
200
012312Fe (μg)

Tofu supernatant

(c)
1,000

0434Ferritin (mg)

(d)
300

12.5Fe (μg)

6004007.55100200

2.5123401234Ferritin (mg)10200Fe (μg)

0158000Ferritin (mg)1,0000Fig. 4. Iron and ferritin recovery during the puriﬁcation steps.
(a) and (c) indicate the average iron recovery during the ferritin purification step from tofu extractand supernatant, respectively. Error bars indicate S.E. of three to ﬁve independent analyses. (b) and (d)indicate the iron and ferritin recovery, which was determined by dot blot analyses. In these ﬁgures,
number 1, 2, 3, and 4 mean the following puriﬁcation steps. 1; Crude sample, 2; after salting out anddialysis, 3; after anion exchange chromatography, 4; after size exclusion chromatography (the finalpuriﬁcation step).

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Table 1. Iron contents of puriﬁed ferritin oligomer
Molecular type(Ferritin from)Dry seed
Tofu extract
Tofu supernatant

No. of iron atom per
ferritin oligomer
2,590±143＊
1,148±130
1,000±62.6

Iron content s of puriﬁed ferritin oligomer.
The iron contents of puriﬁed ferritin from dry seed,
tofu extract, and tofu supernatant were calculated
from the protein and iron concentration of eachsample. Values indicate means±SE, and asteriskshows signiﬁcant diﬀerence at p <0.05.
豆腐染出し液より精製されたフェリチンは，未変性ダ
イズフェリチン8），およびヒトH鎖フェリチンと同様の24量体構造を形成していることが示された．
豆腐抽出液および染出し液より精製したフェリチンのCDスペクトルは，組換え型のダイズフェリチン，ヒトH鎖フェリチンと同様，196 nm付近に正のピークと，207と222 nm付近に二つの負の極大を持つαヘリックス構造特有のスペクトルを示した（Fig. 3a）．
従って，煮沸による加熱過程を経た豆腐においても，フェリチンは，その立体構造を保持していると考えられた．
3．フェリチンと鉄の回収率
豆腐抽出液と豆腐作製過程の染出し液に含まれる鉄量は，各々平均807μg，339μgとなった．Fig. 4は豆腐抽出液および染出し液からのフェリチン精製過程における，フェリチンと鉄の回収率を示す．豆腐抽出液に含まれる鉄のうち179μg（回収率24.5%），染出し液の鉄は45.5μg（同13.4%）が純粋なフェリチンと共に

4．フェリチンの熱変性
豆腐抽出液から精製したフェリチンの25℃から90℃までの温度上昇に伴う波長222 nmにおけるモル楕円率の変化をFig. 3bに示した．対照として測定したウシ
血清アルブミンの変性温度は，プロットの変曲点を求めることで66.5±0.159と算出した．一方，組換え型ダイズフェリチンおよび精製豆腐フェリチンでは，90℃までの温度変化でα-ヘリックスの減少は見られるものの，完全な変性には至らないことが示唆された．
ダイズフェリチンが90℃においても完全変性しないという本研究の結果は，筆者らによる示差走査熱量計を用いた植物型フェリチンの熱安定性に関する研究結果と一致する9）．しかし，精製豆腐フェリチンの多量体あたりの鉄含有量が，加熱処理を受けていない天然型フェリチンと比して有意に減少していることから，加熱過程において部分的な構造変化と内部に蓄えられた鉄の放出が起こっていると考えられる．Fig. 3bに示
す，加温に伴うCDスペクトルの変化も，部分的な構造変化の可能性を支持している．
近年，フェリチンが腸管において，ヘム鉄とも無機鉄とも異なる独自の受容体を介した経路より取り込まれることが報告された5）．また，フェリチン鉄はたん白質の外殻に覆われていることから，フィチン酸，ポリフェノールなど鉄吸収に負の影響を与える物質からも隔離されることが期待できる．こうした背景から，食品の製造，調理過程，更には，人体における消化条件でのフェリチンの安定性と鉄含有量の推移に関する研究が不可欠である．また，様々な食品におけるフェリチン鉄の分布とバイオアベイラビリティに関する更なる研究が期待される．

回収された（Fig. 4a, c）．また，ドットブロットでの定量では，精製フェリチンたん白質の回収率はそれぞれ17.3%，8.05%となった（Fig. 4b, d）．
24量体の平均分子量を554,000として計算した精製
フェリチンの鉄含有量は，乾燥種子，豆腐抽出液，染出 し 液 由 来 に つ い て， 各 々 平 均2,590，1,148，1,000
atom/24 merとなった．Table 1に示したように，乾燥種子由来の精製フェリチンの鉄含有量は，豆腐フェリチンより有意に高い値となったが，豆腐抽出液由来と染出し液由来のフェリチン間では多量体あたりの鉄含有量に有意な差は認められなかった．

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要約

本研究では，ダイズ種子とその加工食品の鉄成分に着目し，豆腐をモデルとして食品加工過程における鉄貯蔵たん白質フェリチンの構造変化と鉄含有量の推移を追跡した．豆腐におけるフェリチンは，未変性のダイズ種子フェリチンと同様，二種類の異なる構成サブユニットから成る多量体を形成しており，両者の間に二次構造と高次構造に明確な差は認められなかった．フェリチン24量体を一分子とした場合の鉄含有量は，乾燥種子フェリチンが2,590，豆腐フェリチンが1,148 atom/moleculeとなり，豆腐の加工過程で鉄含有量の減少が認められた．25から90℃までの温度変化に伴うCDスペクトルの推移より，80℃前後からダイズフェリチンの立体構造に部分的な二次構造の揺らぎが生じ，この部分的な変性から内部に蓄えられた鉄の一部が放出される可能性が示された．本研究により，加熱を伴う豆腐製造過程においてもフェリチンたん白質が残存し，可溶性の鉄の大半を保持していることが明らかとなった．

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