Beckman Sequencer使用のための使用のための Sample調整
調整※1 シークエンス反応に使用するテンプレートDNA の最適量は、DNA のタイプにより異なるため、シークエンス反応前にアガロース電気泳動またはOD 値を測定し、濃度を確認する。

DNA template※1
96 ゜C 1 min

直鎖状DNAは必要ない

Cool on ice for 1 min

GC リッチなサンプルは
96 ゜C 3min

（1） テンプレート量（プライマーとの比を考慮するためmol 数で表示）
dsDNA···················100fmol （50～100fmol）
ssDNA·····················50fmol （25～50fmol）
PCR product ···········50fmol （25～100fmol）（2） DNA サイズによるテンプレート量（ng）の換算表

Add Mix culture（total 20 µl）※2
Thermal cycler※3Add 5µl of Stop solution※4vortex
Add 60µl of 100% EtOH
vortexcfg 14,000 rpm for 15 minppt.
Add 200µl of 70% EtOH

Total
Size（kbp）

ng
for25
fmol

ng
for50
fmol

ng
for100fmol

Total
Size（kbp）

ng
for 25fmolng
for 50fmolng
for 100
fmol

0.2

3.3

6.5

13

6.0

100

195

390

0.3

4.9

9.8

20

7.0

115

230

455

0.4

6.5

1326

8.0

130

260

520

0.5

8.1

1633

9.0

145

300

580

1.0

16

33

65

10.0

165

325

650

1.5

24

50

100

12.0

195

390

780

2.0

33

65

13014.0230

4559102.54182165

16.0260520

1040

3.049100

195

18.0

295585

1170

3.5

57115

230

20.0

325

650

1300

4.0

65

130

260

25.0

410

820

1650

4.572145

290

30.0

490

1000

5.080

165

325

40.0

650

1300

1500~
2000★1★1 テンプレートDNA 使用量は、2µg が最大値

cfg 14,000 rpm for 2 minrinseは2回ppt.

※2 Mix culture
Master Mix

Dry for 15 min

2µl～8 µl
1 µl （3.2 pmol）

Primer

Add 30～40µl of SLS （SLSの有効期限は半年）-20℃で１ケ月程度保存可能

DNA template25～100 fmol

dH2OUp to 20 µl※3 Thermal cycler
96 ゜C20 sec

50 ゜C ♡120 sec

60 ゜C

3 min ♡225～35 cycle

4 ゜C♡1 T3, T7, M13-F, M13-Rなどでは45 ゜C 程度が望ましい。
♡2 伸長しにくい場合は長めに設定する。

※4 Stop solution （用時調整）
3M NaAce

2 µl

100mM EDTA

2 µl

Glycogen

1 µl

total

5 µl

Beckman sequencerの基本的な操作方法の基本的な操作方法
分析時間の目安 : 1レーン（レーン（8samples）） / 2hレーン（Sequenceに必要なものに必要なもの•Sample Plate ※1（先がとがっている方のPlate ）•Buffer Plate ※2•dH2O•アクリルアミドゲル•ペーパータオル等※1 SampleをPlateに全量（30～40µl）入れ、mineral oilを1滴入れておく※2 Buffer PlateのSampleと対応するレーンに8滴程度のBufferを入れておく（1レーンに8 Sample未満の場合も、Sampleを入れたレーンにBufferを入れる）

シークエンサーの立立立立ちちちち上上上上げげげげ

CEQ8000とパソコンの電源を入れる（どちらが先でもOK）
ログイン（パスワードを聞いてくるが、Enterをクリック）
CEQ system
Runを開くをクリック（→次のOKをクリック）

S a m p l e ・・・・B u f f e r ・・・・ウ エッテ ィン グ ト レイ セ ット ゲ

Direct controlのタブをクリック

画面中央下のをクリック（→Start をクリック）GOの表示が出る
Sample Access Coverを開けてウエッティングトレイ（手前からBuffer Plate、ウエッティングトレイ、Sample Plate）の水を捨て、ウエッティングトレイとフタをdH2Oですすぎ、Fill LineまでdH2Oを入れる※水にはアクリルアミドが含まれるため、ペーパータオル等に吸わせる

手前にBuffer Plate （切れ込みのある方を右奥）、奥にSample Plateをセットする。Buffer Plateには、白いふたをかぶせる

Sample Access CoverSample Access Coverを閉めて、Loadをクリック
左図青枠のゲルの部分
ゲルの部分をクリック（→次のOKをクリック）GOの表示が出る

ゲル格納部

ル セ ッ ト

ゲル格納部のふたを開けてゲルの筒を起こし、黄色のダミーカートリッジを取って、ゲルをセットする（ゲルカートリッジに付いていたゴムキャップはダミーカートリッジに付ける）
ゲルの筒を倒して、ゲル格納部のふたをする。
instol cartridgeをクリック
Doneをクリック

サ

SET UPをクリック（→次のOKをクリック）ン

Sampleを入れたレーンの部分にSample名を入れていく。

プ

Sample名を入れたレーンの下のをクリックして、LFR-1にする

ル左下のAnalysisタブをクリックの測解析するすべてのレーンを指定してPerform analysisにチェックを入れ、Default Sequence Analysis Parameterにする

定メニューバーよりFile →Save As…を選択
シークエンス名を記入（→次のOKをクリック）

開右上のRun Sample Plates

をクリック

Startをクリックし、サンプルの位置を確認（名前を入力した場所の色が変わる）

始
Displayは消しておく

解をクリック

Analysis Module

メニューバーより File→Open を選択
ダイアログボックスからSample Plate
Results のタブをクリック
サンプルプレートの名前を選択

析OK をクリック
Sample Plate のダイアログボックスが表示され、目的のデータ（位置）をクリック
開きたいデータをクリック

Open をクリック

結解析前Default Sequence Analysis
Parameterにチェックし忘れていたら、Analysis→Analyze→OK
プリントアウト
見たいデータ（画面左）をクリック
Analyzed Data
解析結果を波形で表示

果

Base Sequence
解析結果をテキスト形式にて表示のののの最低これらを見ておくと、トラブルシューティング（流しの横の棚のファイル又は、
http://www.beckmancoulter.co.jp/anote_dload/index_
pro1_CEQ.html ）で判断しやすい。

Raw Data
生データの表示
Current
電流値の表示Voltage
電圧値の表示Compare Tab
データの並び合わせ

Quality Parameters
ベースコールのクオリティーの表示

表

Raw Data は通常20 分前後に未反応
Dye のピークが検出され、そのピークのＹ軸のスケールが100000万前後になります。（エタノール沈殿の場合）

示

電流値は泳動開始後5 分で最大まで上がり、約6～9uA 程流れます。サンプルの濃度が適正でない場合や何らかの不純物が含まれていると抵抗が変わり、電流値が乱れます。電流値が乱れると未反応Dye のピークの検出時間が遅れ、シーケンスが長く読めません。

プ

メニューバーよりFile→Report Format…を選択

リ表示されたダイアログボックスReport Formatよりプリントアウトする項目やプリント用紙の選択

ン ト ア

各項目の詳細なパラメータはOptions…のボタンをクリックし、表示されたダイアログボックスOptionで設定すべての設定が終了したらOK をクリック

ウ

Sample Elements
Result Data
波形データ
Result Output
シーケンスのテキストデータ

ト （（（（ 必要で あれ

Sequence Analysis Result Data
Panes Per Page
波形データを表示する際の1 ページの段落
Approx Bases Per Pane
1 段に表示させる塩基配列(波形)の数ば））））

Auto Scale のチェックを外してMin を0、max を3.5～4.0 ぐらいにすると綺麗にprint out する。
メニューバーよりFile→Exportを選択

デ「Save in」より転送先を、「Save astypes※1」からファイル形式を選択ー「Sample Elements※2」より転送するデータタイプを選択

タ

ダイアログボックス上のExport をクリックのSCF
Text
SEQ

SCF形式で保存したファイルを開く場合、解※1 Save as type について析ソフトを入れておく。解析ソフトは、インター波形データを含む形式
ネットでフリーソフトがダウンロードできる。
すべてのデータをテキスト形式で表示 BioEdit (メーカーさんイチオシ！)、Trace
Viewer、4peaks、Finch TV、Sequence
塩基配列をテキスト形式で表示
Scanner Software v1.0、など

保※2 データのタイプ（SampleElements））
データのタイプ（
ファイル形式によって転送できるデータのタイプには制限があるため、クリアになっている項目より選択しチェックを入れる。CEQ8000 解析ソフトはscf 形式で転送したAnalyzed Data を開くことが出来る（この場合に表示されるデータは波形のデータとテキストデータ）。なおプリントアウトも同じデータのタイプを使用。

存

Raw Data
Raw Data やCurrent など
Result Data
波形データ
Result Output テキスト形式のデータ

S a m p l e ・・・・ B u f f e r ・・・・ ゲ ル を 取取取取 りりりり 出出出出 しししし 、、、、 終 了をクリック（→次のOKをクリック）

RunDirect controlのタブをクリック

画面中央下のをクリック（→Start をクリック）GOの表示が出る

Sample Access CoverSample Access Coverを開けてBuffer PlateとSamplePlateを取り出す。白いふたはsequencerに入れておく
Sample Access Coverを閉めて、Loadをクリック
左図青枠のゲルの部分
ゲルの部分をクリック（→次のOKをクリック）GOの表示が出る

ゲル格納部

ゲル格納部のふたを開けてゲルの筒を起こし、ゲルを取って、黄色のダミーカートリッジをセットする
ゲルの筒を倒して、ゲル格納部のふたをする。
Installed Plugをクリック
パソコン→CEQ8000の順に電源を切る

この他にもCEQ8000には様々な機能があります。
流しの横の棚のプロトコールを参照するか、
http://www.beckmancoulter.co.jp/anote_dload/index_pro1_CEQ.html
からダウンロードしてください。

作成 ： 工学部 応用分析技術系 宮部（内線 3879, e-mail miyabe@tech.eng.kumamoto-u.ac.jp）