1

食品汚染微生物制御のための自殺誘発殺菌法の開発＜平成 20 年度助成＞

食品汚染微生物制御のための自殺誘発殺菌法の開発
土戸哲 明・松 村吉 信・坂 元仁（関西大学化学生命工学部生命・生物工学科）

1.

緒

子伝達系の機能障害のために発生すると推察され

言る活性酸素の 2 次傷害が認められている。この酸

最近の加工食品の殺菌では、品質や栄養価の高化ストレスによる細胞の致死的な自己損傷も広いさを重視したミニマムプロセッシングが採用され意味での自殺誘発に含めることができ、さらに著る傾向にある。そのため、加熱よりも非熱殺菌に期

者らは、これが上述の自己溶菌誘発にも関与する

待がかけられ、さまざまな方法が実用化に向けて可能性を示唆している（未発表）。

1）

検討されている 。本研究でとりあげた自殺殺菌法

本研究では、食品汚染細菌の制御技術としてのはその一つで、微生物自身がもつ自己組織分解能

自殺誘発殺菌法の基盤確立と応用展開を図るたを活性化して自殺させ、簡便で経済的な方法としめ、①対象を枯草菌以外の好気性胞子形成細菌にて利用する新しい試みである 2, 3）。微生物は、自己拡大して自己溶菌誘発法の普遍性を検討するとと構成成分である核酸や細胞壁、細胞膜脂質、タンもに、有効な処理方法・条件を導出し、食品系へ

パク質などを合成するとともに分解する能力をもの適用性を調査すること、②枯草菌をモデルとしち、それらの分解活性は通常、合成との間で作用のて、活性酸素発生による自己損傷誘発の殺菌法のバランスやタイミングが調節されている。しかし、基礎知見を得るため、いくつかの抗酸化系の単独

なんらかのきっかけを与えれば、この制御が乱れ

および多重欠損株のストレス耐性の特性とマイクて分解系が作動し、自己組織の分解が起こる。

ロアレイ解析による遺伝子発現特性を明らかにす

著者らの研究室では、枯草菌を用いた研究で、ること、③それらの欠損株の自己溶菌能を調べ、低温ショックや食品乳化剤の添加、高濃度 1 価

活性酸素発生と溶菌誘発との関係を調査するこカチオンへの曝露が自己分解酵素のオートリシと、を目的に研究を行った。

ン（主に CwlB）の活性を脱制御し、細胞壁分解を得られた成果は多数に及ぶためデータの掲載を引き起こして細胞死をもたらすこと 3, 4）、また高限定し、一部のものは記述に止めたこと、また、温や低温へのショック処理により、細胞がもつ

当初予定していた好熱性細菌についての検討は、YokF エンドヌクレアーゼが活性化して自身の染

低温ショックによる溶菌誘発は認めたものの、そ色体 DNA が分解され、細胞死が誘発されることの要因となる自己溶菌酵素遺伝子の取得のためのを報告している 5）。

形質転換系の構築が最終的に不成功に終わったた

さらに、これまでの我々の研究 6） により、好気条件下での温和な条件での殺菌処理では損傷菌が多く発生し、それらにおいても損傷に起因してこれらの分解系が作動すること、とくに、これらの損傷細胞では、細胞膜損傷に由来する呼吸鎖電

め、報告から除外したことを付記する。
材料および方法

2.
2.1.

使用菌株

主 に、 枯 草 菌 Bacillus subtilis 168 trpC2 を

2

浦上財団研究報告書

使 用 し た。 一 部 の 実 験 で は、Bacillus cereus

Vol.18（2011）

2.4.

NBRC13494、Bacillus megaterium ATCC14581、

電気泳動法によるタンパク質解析とゲノムアレイ解析

B a c i l l u s c o ag u l a n s N B R C 1 2 5 8 3 、 B a c i l l u s

SDS ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 法

licheniformis NBRC12200、 Bacillus pumilus（PAGE）および等電点電気泳動法とこれを組み合

NBRC14367、 Bacillus sphaericus NBRC15095、

わせた二次元電気泳動法を用いた。タンパク質のBacillus circulans NBRC3329、 Geobacillus

検出は Flamingo 染色によった。また、アナテッ

stearothremophilus NBRC12550 も使用した。また、

ク（株）の G 電極法によるタンパク質解析も同社

坂元（未発表）により作製された以下の B. subtilisに依頼して行った。DNA チップによるマイクロ

168 trpC2 由来抗酸化系遺伝子多重欠損株としアレイ解析は、全 RNA を抽出後、タカラバイオて、katA kat E katX（ 以 下 KATs）欠 損 株、sodA（株）に依頼して行った。

sodF yojM（以下 SODs）欠損株、ahpCF ohrA ohrR

2.5.

オートリシン活性の測定

ohrB（以下 ORGs）欠損株、および KATs-ORGs、

枯草菌ペプチドグリカンを調製し、細胞の超音

SODs-ORGs、KATs-SODs-ORGs の各多重欠損株

波破砕液を添加してその OD540 の低下から活性をを使用した。

測定した。活性の 1U は、1 分あたりの OD540 値

2.2.

培養と自己溶菌誘発およびストレス処理

培地は L 培地（pH7.0）を用い、液状食品として、を 1/10 4 低下させる変化量とした。
2.6.

薄層クロマトグラフィーによる脂質分析

本つゆと本つゆ香り白だし（いずれもキッコーマ細胞から Bligh-Dyer 法によって脂質を抽出し、ン株式会社製で 5 倍希釈したもの）も用いた。自二次元薄層クロマトグラフィーにより、展開プ

己溶菌誘発の際は、対数増殖期まで培養した細胞

レートの発色スポットから、検出・同定するととを 0℃への低温ショック（培地の場合、培養液をもに、ImageJ 画像解析ソフトによって定量した。

精製水に、食品の場合は食品中に、10 倍希釈法

2.7.

過酸化脂質量の定量

により冷却）あるいは食品乳化剤添加によって処

細 胞 の リ ゾ チ ー ム 破 砕 液 に つ い て、TBARS理した。乳化剤は、ジグリセリンモノミリスト

Assay Kit（フナコシ）を用い、脂質の過酸化によっ

イルエステル（DG14 ）、ジグリセリンモノパルミて生じるマロンジアルデヒド（MDA）などのチオ

トイルエステル（DG16）、スクロースモノパルミ

バルビツール酸反応物質を指標に定量した。

トイルエステル（SC16）を用いた。ストレス耐性

2. 8.

細胞の酸化還元電位の測定

は、加熱（55℃、5min）と低温（0℃、10min）処理

細胞の破砕液を調製後、その酸化還元電位を東による殺菌効果は平板法により、また過酸化水素

亜ディーケーケー株式会社製のポータブル酸化還（0.2 〜 0.35mM）と t- ブチルヒドロペルオキシド

元電位計 RM-20P を用いて測定した。

（t-BuOOH; 0.35 〜 0.5mM）処理による発育抑制効
果は、自動発育記録培養装置を用いた発育遅延時
間評価 7）によって評価した。
2.3.

溶菌、増殖抑制と生存数の測定

結

3.
3.1.

果

枯草菌および種々の Bacillus 属細菌とG. stearothermophilus の自己溶菌誘発

溶菌と増殖抑制の程度は細胞懸濁液の濁度

枯草菌とその他の種々の Bacillus 属細菌の対数（OD650 ）低下によって評価した。生存数は L 培地

増殖期細胞について、自己溶菌誘発の効果を検討

を用い、寒天平板法あるいは発育遅延解析法 7）

した。誘発処理は、0℃への低温ショック、食品

によって測定した。

乳化剤の DG14 、DG16 、SC16 添加である。その結3

食品汚染微生物制御のための自殺誘発殺菌法の開発

果の代表例として、 図 1 に枯草菌と B. coagulansの細胞の低温ショックによる溶菌の経過を示し、3.2.

枯草菌のストレス耐性における抗酸化系の機能評価

次に、枯草菌の活性酸素発生に基づく自己損傷
殺菌法の基礎知見を得るため、カタラーゼ系、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）系、有機系
活性酸素防御系に関わる主要各抗酸化系遺伝子群欠損株を用い、加熱（55℃、5min）、低温（0℃、10min）、過酸化水素（0.2 〜 0.35mM）、有機系の

t - BuOOH（0.35 〜 0.5mM）への耐性を調査した。
その結果、個々のデータを省略するが、熱耐性については、野生株の 168 と比べて KATs 欠損
図1

枯草菌 168 と B. megaterium の対数増殖期細胞の低温ショックによる溶菌
枯 草 菌 168 ( ○ ) と B. megaterium ( ● ) の 培 養 細 胞 を37℃から 0℃の精製中に 10 倍希釈法で冷却し、30 分保温
後、37℃に戻して濁度を測定した。数値は 3 回の実験の平均値。

株 で は あ ま り 差 が な い も の の、SODs、KATs-

他の細菌を含めた結果を 表 1 にまとめた。この同 様 の 傾 向 が 見 ら れ、 こ の 場 合 の 耐 性 化 は 10

結果から、同じ Bacillus 属であっても種によっ〜 30 倍 程 度 で あ っ た。0.2 〜 0.35mM の 濃 度 範て、また誘発方法によって溶菌効果が異なり、低囲の過酸化水素に対する耐性は、ORGs 欠損株

温処理の効果は枯草菌と B. coagulans で著しく、＞ 168 株 ＞ SODs 欠 損 株 ＞ SODs-ORGs 欠 損 株

B. megaterium でもある程度の効果が認められた。

＞ KATs 欠損株＞ KATs-SODs 欠損株＞ KATs-

乳化剤処理はほぼ広く全般的に効果が見られた

ORGs 欠損株＞ KATs-SODs-ORGs 欠損株の順でが、B. cereus では DG14 や DG16 よりも SC16 で顕

あ り、t - BuOOH の 0.35 〜 0.5mM に お け る 耐 性著であった。好熱性の G. stearothermophilus におでは、KATs-SODs-ORGs 欠損株＞ KATs 欠損株

いても低温処理では顕著な溶菌が観察された。

＞ KATs-ORGs 欠 損 株 ＞ KATs-SODs 欠 損 株 ＞

SODs、KATs-ORGs、SODs-ORGs の 各 欠 損 株
では生存数比で 100 倍あるいはそれ以上に顕著に 耐 性 化 し た。 ま た、 低 温 シ ョ ッ ク 耐 性 で もSODs-ORGs 欠損株＞ 168 株（野生株）＞ SODs 欠
表1
細菌

自己溶菌誘発法による種々の Bacillus 属系細菌に対する溶菌誘発効果

自己溶菌誘発処理 * 1
低温ショックSC16 処理

DG14 処理

DG16 処理

B. subtilis

＋＋＋

＋＋

＋

(＋)

B. cereus

−

＋＋＋

＋

−

B. megaterium

(＋)

＋＋

＋＋

＋＋

B. coagulans

＋＋＋

＋＋

＋＋

＋＋

B. licheniformis

−

＋＋＋

＋＋＋

＋＋

B. pumilus

−

＋＋

(＋)

(＋)

B. sphaericus

−

(＋)

(＋)

−

B. circulans

−

(＋)

＋

(＋)

＋＋＋

ND *2

ND

ND

G. stearothermophilus*1

対数増殖期細胞を処理後 60 min の OD (ODe) の未処理の OD (ODu) に対しての比、R(＝ODe/ODu) の値によって評価〔−： R が 0.9 以上、(＋)：R が 0.7〜0.9、＋：R が 0.5〜0.7、＋＋：R が 0.3〜0.5、＋＋＋：R が 0.3 以下〕

*2

未検討

4

浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

損株＞ ORGs 欠損株の順で、予想外に全欠損株のでは、個々の結果を省略するが、さらに多くの既耐性が最大であった。さらに、この全欠損株は、知の抗酸化タンパク質および未知タンパク質の増t -BuOOH 濃度域 0.35 ～ 0.5mM でどの菌株より加が観察された。

も発育の開始が早かったが、培養の濁度がピーク

そこで、KATs、ORGs、KATs-ORGs、KATs-に達したのち減少する傾向が見られた。野生株とSODs-ORGs の各多重欠損株について、マイクロ比較した各欠損株の耐性化と感受性化についてのアレイ解析による遺伝子発現挙動を調査した。そ傾向を表 2 にまとめた。

の結果、全部で 4,000 あまりの数の遺伝子の転写

こ れ ら の 結 果 か ら、KATs、SODs、ORGs のデータのうち、KATs 欠損株では、転写量が 2 倍

各主要抗酸化系遺伝子群の間で、各ストレス耐性

以上又は 1/2 以下となった遺伝子（転写量変動遺において欠損による相補的な関係があることが明伝子）が 35 個確認された。このうち、鉄輸送に関らかとなった。また、これらの全欠損株におい与する fur レギュロン遺伝子の転写量が減少し、てもなおストレス耐性化が観察されたことから、転写量が 2 倍以上増加した遺伝子は 9 個しか観察

KATs、SODs、ORGs 以外にも補完的な耐性をもされなかった。ORGs 欠損株では、164 個の転写たらす抗酸化系遺伝子群の存在が示唆された。

量変動遺伝子が確認され、とくにアミノ酸、糖、各欠損株の細胞タンパク質量を SDS-PAGE でエネルギー代謝系に関与する遺伝子群やカタラ調査したところ、上記の温度ストレス耐性となーゼ katA（約 5 倍）などの転写量が増加する一方、る KATs-ORGs 欠損株と SODs-ORGs 欠損株におfur レギュロン遺伝子の転写量が減少していた。

いていくつかのバンドが高レベルになっているこ

耐熱性を示した KATs-ORGs 欠損株では、911 個と、しかし全欠損株ではタンパク量の減少がみらの転写量変動遺伝子が確認され、PerR レギュロれた。次に、2 次元電気泳動法で解析した結果、ン遺伝子である mrgA、一般ストレス応答に関与

同様の傾向で高レベルとなるタンパク質スポッする gspA、gsiB、ydaG、yfkM、ysnF や代謝系（アトが多く確認され、たとえば、KATs-ORGs 株でミノ酸（特にシステイン、メチオニン）、糖、脂質、SodA（Mn-SOD）が 10 倍以上、SODs-ORGs 欠損

脂肪酸、エネルギー）に関与する遺伝子群、さら株でσ B レギュロンの構成タンパク質 NadE が 5に 抗 酸 化 系 の カ タ ラ ー ゼ（katA、ydhU、yjqC）、倍以上増加した。G 電極法による 2 次元電気泳動

SOD ホモログ（sodF、yojM）、チオレドキシンに

表2

枯草菌の抗酸化遺伝子欠損株の対数増殖期細胞の種々のストレスに対する耐性

遺伝子欠損

ストレス処理加熱*1

低温ショック * 2

過酸化水素 * 3t - BuOOH * 4

KATs *5

0

0

▼

△

SODs

*6

△

△

▼

▼

ORGs *7

0

0

△

▼

KATs, SODs

△

△

▼

△

KATs, ORGs

△

△

▼

△

SODs, ORGs

△

△

▼

△

KATs, SODs, ORGs

▼

0

▼

△

細胞のストレス耐性は、野生株との比較において、上昇の場合△、下降の場合▼、変化があまりない場合 0 で表示した。
*1*655˚C、5min. *2 0 ˚C、10min. *3 0.1〜1mM. *4 0.05〜0.5mM.
sodA sodF yojM. *7 ahpCF ohr A ohr R ohr B.

*5katA kat E katX.

食品汚染微生物制御のための自殺誘発殺菌法の開発

5

似たドメインを持つ yneN、そして胞子形成期にの活性を調査したところ、これら 3 株間でほぼ同誘導される sigE、sigF、sigG などの転写量が増じであったことから、オートリシン活性の制御因加していた。一方、バイオサーファクタントに関子に相異があると推察し、さらに検討した。2 次

与する surfactin synthetase や核酸代謝系（プリ

元薄層クロマトグラフィーを用いて脂質組成を分ン）に関与する遺伝子群における転写量の顕著な析した結果、カルジオリピンとフォスファチジ減少が観察された。酸化ストレス応答に関与する

ルエタノールアミンのレベルに差はなかったが、Spx レギュロン遺伝子の転写量の変動は微弱であ

フォスファチジルグリセロールは KATs-ORGs 欠

っ た。KATs-SODs-ORGs 欠 損 株 で は、371 個 の損株で顕著に増加しており、また糖脂質のグルコ

転写量変動遺伝子が確認され、特に mrgA、yjqC、

シルジグリセリドが増加する傾向が見られた。

yneN やアミノ酸代謝系（アスパラギン酸、グルタ

抗酸化遺伝子欠損株では発生する活性酸素が多ミン酸、アルギニン、プロリン）の転写量が増加

くなり、脂質の過酸化の程度が大きく、細胞内もする一方、surfactin synthetase や核酸代謝系（プ

酸化されることが推測されたので、過酸化脂質量

リン、ピリミジン）、運動性（鞭毛、走化性）、オと細胞破砕液の酸化還元電位を測定した。KATs-

ートリシンに関与する遺伝子群の転写量が減少し

ORGs と SODs-ORGs の 両 欠 損 株 の 過 酸 化 脂 質ていた。

量は野生株と差がなかったが、酸化還元電位は活性酸素防御系の自己溶菌誘発との関係

図 3 に示すように、KATs-SODs-ORGs 欠損株＞

前項に示したように、多くの抗酸化遺伝子多重

SODs-ORGs 欠損株＞ KATs-ORGs 欠損株＞ 168

欠損株が温度ストレスに耐性化したことから、温株の順であり、多重欠損ほど酸化の程度が上昇し度ショックによる溶菌誘発における抗酸化遺伝子ていることが判明した。

3.3.

欠損の影響を調べた。その結果、調べた KATsORGs と SODs-ORGs の両欠損株の、37℃→ 55℃（5min）→ 37℃の加熱処理と 37℃→ 0℃（30min）→ 37℃の低温ショック処理の双方において、溶菌速度が野生株のそれぞれ、1/1.6 〜 1/3、1/1.4〜 1/2 であることがわかった（図 2）。

A

図3

B

枯草菌 168 とその抗酸化遺伝子多重欠損株の細胞破砕液における酸化還元電位の比較① , 無細胞ブランク試料、② , 野生株、③ , KATs-ORGs 欠損株、④ , SODs-ORGs 欠損株、⑤ , KATs-SODs-ORGs 欠損株．
数値は 2 回の実験の平均値。

以上の結果から、枯草菌の自己溶菌誘発において、抗酸化遺伝子の欠損がおそらくオートリシンの活性制御系に変化を誘起すると推察され、直接
図2

枯草菌 168 の抗酸化遺伝子多重欠損株における加熱 (A) および低温ショック処理 (B) によって誘発した溶菌の速度の比較的あるいは間接的に溶菌を抑制したものと考えられる。

① , 野生株、② ,KATs-ORGs 欠損株、③ ,SODs-ORGs 欠損株
野生株の溶菌速度（加熱では 0.00926 OD650/min, 低温ショッ
クでは 0.0284 OD650/min）を 1 とした相対比で示した。

3. 4.

そこで、次にこれら抗酸化遺伝子欠損による溶細菌の L 培地中で対数増殖期まで発育した細胞

菌能低下の要因を検討した。まず、オートリシン

は、加熱や低温、食品乳化剤の添加の処理によっ

食品系における自殺誘発

上記の結果から、枯草菌など一部の Bacillus 属

6

浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）て自己溶菌を誘発し、ひいては細胞死をもたらす

酸化ストレスとの間に何らかの関係がある可能性

ことが明らかになった。そこで、自殺殺菌の実用を示唆するものと言える。

への可能性を探るため、液体食品に適用してその枯草菌の主要な KATs、SODs、ORGs の抗酸効果を検討した。本つゆと本つゆ香り白だしを対化遺伝子群の欠損株を用いた種々のストレス耐性

象に、枯草菌の低温ショックによる溶菌誘発と細の結果は、無機の過酸化水素、スーパーオキシド

胞死の経過を調べた。その結果、ショック後 37

アニオンラジカル、有機系活性酸素防御系間で相℃加温開始時では溶菌はほとんどみられず、加温

補的あるいは補完的な相互作用の存在を示唆して

30 分後の溶菌率は、本つゆで 38％、白だしではおり、これらの複数の欠損においてはさらにそ71％であった。また、平板法によって求めた死滅

れら以外の補欠的な抗酸化遺伝子群や酸化ストレ

率は、加温開始時で本つゆは 23％、白だしではスの修復遺伝子群の発現が起こることが示され、4.5％と低く、30 分加温後の値は、それぞれ、54

Bacillus 属細菌の抗酸化システムは、かなり複雑％と 33％であった。

かつ高度なネットワーク的制御下にあるものと推4．考察される。調べた KATs-ORGs と SODs-ORGs の察

両欠損株で溶菌速度が低下した事実は、これら補3）

著者ら は、すでに枯草菌の種々の処理による欠的な遺伝子や修復遺伝子が自己溶菌酵素の活性

自己溶菌誘発が、主に自己溶菌酵素のオートリシになんらかの相互作用をもつことを示唆していンによるものであることを示しているが、種々のる。ここで示した活性とその制御系の調査結果

Bacillus 属細菌の低温ショックと食品乳化剤処理には、オートリシンの活性そのものよりも、活性制よる自己溶菌誘発効果が、同じ属でも誘発処理によ御系に影響が現れたことによると推測される。しって、また種によって異なることがわかった。これ

かし、現象的にはそれらの間の因果関係は示唆では、活性化される細胞壁分解酵素の種類やその制御

きても、その詳細は全く不明であり、さらに今後系に違いがあるものと推察される。さらに、基質細検討を進める必要がある。

胞壁の構造の相異による可能性も考えられる。このこの助成研究は、自己溶菌や活性酸素発生の自結果は、実用的には溶菌誘発処理を併用するか、標

己損傷による自殺殺菌法の利用を図ったものであ的細菌によって使い分ける必要があることを示唆しるが、これら自己溶菌と活性酸素の間にも因果関ている。溶菌現象は液状食品の本つゆと本つゆ香り係があることが示唆された。また液体食品におけ白だしにおいても認められた。生存率は、冷却後のる栄養細胞の溶菌と死滅が確認できたものの、実加温開始時でも低かったが、これは平板法による評用上の処理の方法やその最適条件の導出について

価のため溶菌トリガリングの不可逆的な進行が平板

は、今後の検討が必要である。本方法は、一般の上でも起こったためと推察される。

低酸性食品で問題となる細菌胞子には効果がな

著者ら

3, 4）

は、加熱や低温ショックによる枯草

く、栄養細胞を対象とする酸性液体食品の低温加菌の細胞死についても、少なくともその一部にオ

熱殺菌に利用が限定されるが、予備処理や胞子発ートリシンが関与することを報告しているが、こ芽後の 2 次処理法として有効とみられる。

れらの自己溶菌処理時の生存数評価においてカタ
ラーゼを寒天培地に添加したとき、生存数が野生

5.

要

約

株よりも cwlB 欠損株において 2 倍前後高いこと

本研究では、食品汚染微生物制御に対する自己を示した。このことは、自己溶菌酵素の活性化と溶菌誘発殺菌法の応用のための基礎的知見を得る

食品汚染微生物制御のための自殺誘発殺菌法の開発

7ことを目的に検討を行った。具体的には、①対象制御系に相異があるものと推察され、中でもを枯草菌以外の Bacillus 属細菌に拡大し、菌種と脂質組成の変化がその要因の一つとして挙げ

自己溶菌誘発方法の適用性を検討するとともに、られた。

食品系への適用性を調査すること、②枯草菌をモ

5） 液状食品のモデルとして本つゆと本つゆ香り

デルとして、活性酸素発生による自己損傷誘発の白だしを使用し、枯草菌の溶菌誘発と死滅を殺菌法の基礎概念を構築するため、いくつかの抗確認した。

酸化遺伝子群多重欠損株のストレス耐性の特性とこれらの成果は、自己溶菌誘発殺菌法の実用展

合成タンパク質および遺伝子の発現の特性を明ら開のための基礎的知見を提供するもので、今後のかにすること、③それらの抗酸化遺伝子群欠損株

一層の検討が期待される。

の自己溶菌能と特性解析により、活性酸素発生と溶菌誘発との関係を調査すること、である。

謝辞得られた成果の概要は以下のとおりである。

本研究の遂行にあたり、多大な助成を賜りまし

1） 種々の Bacillus 属系細菌の栄養細胞は、低温た財団法人浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼

ショックや食品乳化剤添加処理によって自己申し上げます。また、実験を担当いただいた関西

溶菌を起こした。枯草菌でみられたように、大学大学院工学研究科博士課程前期課程の西願文

この溶菌は必然的に細胞死をもたらし、自殺哉・田中清貴、同化学生命工学部の北郷雄基・寺

殺菌法としての利用が考えられた。

村憲一郎の学生各氏に感謝いたします。

2） これらの Bacillus 属系細菌の溶菌誘発は、処理の方法によって、また種によって異なり、文

とくに低温ショックの溶菌誘発作用は限定的

1) 一色賢司 , 松田敏生（編）: 食品の非加熱殺菌応用ハンド
ブック , サイエンスフォーラム (2001).

であった。
3） 枯草菌 168 の KATs、SODs、ORGs の各抗酸化遺伝子多重欠損株を用い、加熱、低温ショ
ック、食品乳化剤に対する耐性を調査し、これらの遺伝子群の複数の多重欠損ほど加熱と低温に耐性化すること、その要因を発現タン
パク質および遺伝子転写量から解析した結果、機能不明のものも含めて種々の遺伝子の発現が上昇または低下することを認めた。
4） KATs-ORGs と SODs-ORGs の 各 欠 損 株 の 加
熱および低温ショックによって誘発した溶菌が野生株よりも遅いことから、溶菌に活性酸素が関与する可能性が示唆された。オートリ
シン活性は菌株間で差がないことから、活性献2) Tsuchido, T., Kato, Y., Ono, K., and Matsumura: Y. Killingof Bacillus subtilis by cell suicide through autolysis
induction. Biocontrol Sci., 1, 19-24 (1996).
3) 土戸哲明 , 坂元 仁 . 自殺殺菌法の原理と応用 , 食品工
業 , 51, (14), 20-26 (2008).
4) Tsuchido, T., Nishino, T., Kato, Y., and Takano, M.:
Involvement of membrane lipids in cold shock-induced
autolysis of Bacillus subtilis cells. Biosci. Biotechnol.
Biochem., 59, 1636-1640 (1995).
5) Sakamoto, J. J., Sasaki, M., and Tsuchido, T.: Purificationand characterization of a Bacillus subtilis 168 nuclease,
YokF, involved in chromosomal DNA degradation and cell
death caused by thermal shock treatments. J. Biol. Chem.,
276, 47046-47051 (2001).
6) 土戸哲明：殺菌プロセスにおいて発生する損傷菌の生理学的特性 . 日本食品微生物学会雑誌 , 20, 141-149 (2003).
7) Takano, M., and Tsuchido, T.: Availability of growth delay
analysis for the evaluation of total injury in stressed bacterial
population. J. Ferment. Technol., 60, 189-198 (1982).

8

浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

Development of a Method for Killing of Bacteria
Contaminating in Food by Suicide Induction
Tetsuaki Tsuchido, Yoshinobu Matsumura and Jin Sakamoto
Department of Life Science and Biotechnology, Faculty of Chemistry,
Materials and Bioengineering, Kansai University
We carried out this study to obtain fundamental information about the application of amethod of inducing cell autolysis for control of food-borne microorganisms. The outline of
the results obtained were as follows.
1) Cells of different species of bacilli autolyzed after exposure to cold shock and foodemulsifiers. The effects of autolysis induction depended upon the species and themethod used. Geobacillus stearothermophilus cells also markedly autolyzed bycold shock treatement.
2) The effect of autolysis induction varied with the lysis-induction method andbacterial species. In particular, that with cold shock is restricted to some species.
3) By using B. subtilis mutants defective in different multiple gene sets relating tothe oxidative stress, such as KATs (katA, katE, and katX), SODs (sodA, sodF, andyojM), and ORGs (ahpCF, ohrA, ohrR and ohrB), we examined their resistances
to heat, cold shock, and food emulsifiers, and found that many mutants defectivein those genes acquired resistances to heat and cold shock. To know the reason forthese events, we analyzed the levels of both proteins produced and transcripts fromgenes in those mutants by two-dimensional gel electrophoresis as well as microarray methods. As a result, we found that the expression of so many novel genes
was up-regulated, while that of a number of genes was down-regulated.
4) We suggested that the oxidative stress may be involved in the induction of cell
autolysis, since mutants defective in either KATs-ORGs or SODs-ORGs lysed more
slowly than the wild type after exposure to heat and cold shock treatments. These
two mutants possessed the level of autolysin activity similar to that of the wild
type, but different patterns in the cellular lipid composition, suggesting a factor for
explaining the above difference.
5) We tried the autolysis-induction method to apply to liquid foods, Hontsuyu andHontsuyu-Kaori-Shirodashi, and confirmed the lysis and death of B. subtilis cells.
These results offer fundamental information for practical use of the suicide-induction
method and it is expected that further investigation may promise that.