インスリンによる脂肪細胞の数とサイズの制御機構の解明

Clarification of Regulatory Mechanisms for Determining Number and Size of Adipocytes
by Insulin

平成 25 年度
論文博士申請者
伊藤

実 (Ito, Minoru)

指導教員
本島清人

目次
第1章

序論

・・・ 5

第2章

ヒト 白色 脂 肪細 胞で の イ ンス リ ンに よる アポ トー シ ス抑 制作 用及び 脂 肪 滴 形 成 作 用 に お け るCIDEフ ァ ミ リ ー の 役

割

・・・ 9

１ ． 実験方法
1-1.

材料

1-2.

ヒト白色脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化

1-3.

リアルタイム定量 PCR

1-4.

ウエスタンブロット 解析

1-5.

siRNA 解析

1-6.

アポトーシス の解析

1-7.

脂肪細胞数の解析

1-8.

脂肪滴サイズの解析

1-9.

グリセロール放出量の解析

1-10. 統計解析

２ ． 結果2-1.

インスリンによる CIDE ファミリーの発現制御

2-2.

インスリンのアポトーシス抑制作用 に対する CIDE ファミリー

の関与
2-3.

インスリンの脂肪滴形成作用に対する CIDE ファミリーの関与-1-

３ ． 考察
４ ． 小括

第3章

インスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に関わる経路の
探索

・・・ 28１ ． 実験方法
1-1 .

材料

1-2

ヒト白色脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化

1-3

リアルタイム定量 PCR

1-4 .

siRNA 解析1-5 .

ウエスタンブロット解析

1-6 .

アポトーシスの解析

1-7 .

脂肪滴サイズの解析

1-8 .

統計解析

２ ． 結果2-1.

インスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に対する PI3K
の関与

2-2.

インスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に対する Akt
及び JNK の選択的な関与

2-3.

インスリンによる CIDEA の発現制御及びアポトーシス抑制作用に対する Akt1/2 の関与

2-4.

インスリンに よる CIDEC の発現制御及び脂肪滴形成 作用に 対-2-

する JNK2 の関与
2-5.

インスリンによる Akt 及び JNK リン酸化に対する PI3K の関与

３ ． 考察４ ． 小括

第4章

インスリン /JNK2 経路による脂肪 滴サイ ズの増大に関 与する 新規遺伝子の探索・・・ 47１ ． 実験方法
1-1.

材料

1-2.

ヒト白色脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化

1-3.

siRNA 解析1-4.

マイクロアレイ解析

1-5.

Ingenuity pathway analysis

1-6.

リアルタイム定量 PCR

1-7.

ウエスタンブロット解析

1-8.

共焦点免疫蛍光顕微鏡法

1-9.

de novo 脂肪酸合成の解析

1-10. 共免疫沈降法
1-11. 統計解析

２ ． 結果1-1.

インスリン/JNK2 経路により制御される遺伝子の網羅的探索
-3-

1-2.

インスリン/JNK2 経路による SREBP-1c の発現制御

1-3.

インスリンによる脂肪酸合成の亢進に対する JNK2 の関与

1-4.

インスリンによる脂肪酸合成の亢進に対する SREBP-1c の関与

1-5.

インスリンによる SREBP-1 プロセシング及び核内移行に対す
る JNK2 の関与

３ ． 考察４ ． 小括

総括

・・・71

参考文献

・・・73

謝辞

・・・78

-4-

第1章

序論

脂肪組織は単なるエネルギー貯蔵庫として働くばかりでなく、生理状況に応じて種々の内分泌因子（アディポサイトカイン）を産生・分泌し、糖・脂質代謝、動脈壁の恒常性維持に重要な役割を果たしている。その一方で、過食、運動不足
及び遺伝的背景による脂肪蓄積・肥満は 2 型糖尿病、脂質異常症、高血圧、動脈硬化症など生活習慣病の基盤となるリスクファクターである(1)。脂肪組織容量は脂肪細胞のサイズと数によって規定されている(2, 3)。近年、脂肪細胞は肥大化することで悪性化し、アディポサイトカインの分泌異常をきたして、慢性炎症及び糖・脂質代謝異常の惹起に関わることが明らかとなっている(Fig. 1) (4)。しかしながら、脂肪細胞の数の増加や肥大化に関わる分子やシグナル伝達経路は十分には解明されておらず、また肥大化を特異的に抑制する創薬ターゲットも同定されてはいない。従って、脂肪細胞の肥大化を抑制することができれば、種々の肥満関
連疾患の予防又は治療につながる可能性が考えられる。

脂肪細胞の数脂肪細胞のサイズ
アディポカインの産生異常

脂肪組織容量脂肪組織の機能慢性炎症

エネルギーの貯蔵庫アディポカインの分泌

2型糖尿病

糖・脂質代謝の調節

脂質異常症

高血圧
Fig. 1 . 脂肪細胞の肥大化による慢性炎症及び肥満関連疾患の発症-5-インスリン
分子機構は不明

アポトーシス

脂肪滴形成

脂肪細胞の数脂肪細胞のサイズ

脂肪組織容量Fig. 2. インスリンによる脂肪 細胞の数とサイズの増加作用

脂肪組織容量を増大させる強力な生体内ホルモンとしてインスリンが知られている。病態における過剰なインスリンシグナルは、脂肪細胞において、数に影響するアポトーシスを抑制すること、サイズに影響する脂質合成を亢進させることで脂肪組織容量を増大させることが示唆されているが(5, 6)、その分子機構は未だ不明な点が多い(Fig. 2)。
一 方 、 イ ン ス リ ン と 同 様 、 脂 肪 組 織 容 量 を 制 御 す る 分 子 と し て Cell
death-inducing DNA fragmentation factor-α-like effector (CIDE)ファミリータンパク質がある(Fig. 3)。CIDE ファミリータンパク質として CIDEA、CIDEB 及び CIDECが知られている。CIDE ファミリーの発現はそれぞれ異なる組織分布を示すことが知られており、CIDEA はマウスでは褐色脂肪組織(7)、ヒトでは白色脂肪組織に(8)、CIDEB は肝臓及び腎臓に(9, 10)、CIDEC は白色脂肪組織及び褐色脂肪組織に 発 現 が 高 い こ と が 報 告 さ れ て い る (11, 12) 。 CIDE フ ァ ミ リ ー は DNA
fragmentation factor DFF45 と相同性があることから、最初にアポトーシス誘導因子として発見された(10, 13, 14)。その後、CIDE ファミリータンパク質は脂肪滴周-6-

囲に局在し、脂肪分解を抑制することで、脂肪滴形成の亢進に関わる因子である
ことが見出された(15)。また、CIDE ファミリーのノックアウトマウスはいずれも肥満及びインスリン抵抗性になりにくいこと(15)、CIDEA 及び CIDEC の遺伝的多型はそれぞれ肥満及び脂肪萎縮症に関連することから(16-18)、CIDE ファミリーは肥満及びインスリン抵抗性に深く関与する因子であることが明らかにされている。以上のように、CIDE ファミリータンパク質はインスリンと同様、アポトーシスや脂肪滴形成に関与することが分かっているが、脂肪細胞での CIDE フ
ァミリーの役割やインスリンとの関連については不明である。
本研究では、脂肪細胞の肥大化をターゲットとした新たな肥満関連疾患の予防・治療法の可能性を探索するため、ヒト白色脂肪細胞を用いて、インスリンによる脂肪細胞の数とサイズの制御機構を検討した。本研究の経緯として、なぜ、このような脂肪細胞の数とサイズの制御機構という重要な問題が残されたままになっていたのかについて、以下のように考えた。今までの脂肪細胞研究の概要
は、マウス由来 3T3-L1 脂肪細胞株を用いた研究報告が大半を占め、その研究内
容は主に脂肪細胞の分化、糖代謝及びアディポカインの分泌機構に関するものであった。しかし、脂肪細胞の数とサイズの制御機構は未解明であった。その問題点として、以下の 2 点が考えられた。1 つ目は生体から採取されて時間が経過している株細胞では、脂肪細胞の数とサイズの研究には不向きであった可能性が考えられた。2 つ目はより生理的条件に近い初代培養やヒト由来の脂肪細胞を用いた報告はごく少数であり、数とサイズの研究があまり行われていない可能性が考えられた。その理由としては、マウス・ラット等の初代培養は利便性が悪いこと、
ヒト脂肪前駆細胞は購入できるが、脂肪細胞へ分化可能な継代培養数が限られていることや分化誘導してから実験に使用できるようになるまで長期間の時間を要することなどが考えられた。以上のことから、本研究ではヒトにおける生理作-7-

用を調べるため、ヒト白色脂肪細胞を用いて検討を行った。その結果、3T3-L1 脂
肪細胞では起こらないが、ヒト白色脂肪細胞では起こる現象を発見した。すなわ
ち、インスリンによる脂肪細胞数の増加と脂肪細胞の肥大化に CIDE ファミリー
タンパク質が深く関与し、その発現制御メカニズムが細胞数の増加と細胞の肥大化で異なることを見出した。第 2 章ではインスリンによるアポトーシス抑制作用
及び脂肪滴形成作用における CIDE ファミリーの役割を明らかにしたこと、第 3章ではインスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に関わるシグナル経路を同定したこと、第 4 章ではインスリン/JNK2 経路による脂肪滴サイズの増大に関与する新規遺伝子を同定したことについて報告する。

遺伝子名

組織分布
マウス：褐色脂肪組織

CIDEA

ヒト：白色脂肪組織

CIDEC(FSP27)

CIDEB

CIDEC

肥満・インスリン抵抗性に関与 3
ノックアウトマウスは肥満・インスリン抵抗性になりにくい。
CIDEA、CIDECの遺伝的多型は肥満、脂肪萎縮症に関連。

CIDE-CCIDEファミリー

35

112 126

185 21936

112 131

190

43

DNA fragmentation factor DFF45と相同性があり、アポトーシス誘導因子として発見された。

脂肪滴周囲に局在し、脂肪分解を抑制。

白色・褐色脂肪組織

CIDE-Nアポトーシス誘導 1

脂肪滴形成 2

肝臓・腎臓

CIDEB

CIDEA

機能

120 140

199

219
238

アポトーシス

Fig. 3. CIDE ファミリー タンパク質 の特徴

-8-

脂肪滴形成

第2章

ヒト 白色 脂肪 細 胞で のイ ンス リン に よる アポ トー シス 抑 制作 用及
び脂肪滴形 成作用に おける CIDE ファミリーの役割

１．実験方法
1-1. 材 料
DMEM/F-12 (1:1, vol/vol)は Invitrogen (Carlsbad, CA)から購入した。Human
insulin は Novo Nordisk (Bagsværd, Denmark)から購入した。Rosiglitazone は Alexis
Biochemicals (San Diego, CA) か ら 購 入 し た 。 3-Isobutyl-1-methylxanthine,
dexamethasone (Dex), pantothenate 及び anti-β-actin antibody は Sigma (St. Louis, MO)から購入した。Biotin は Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan)から購入した。
FBS は Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel)から購入した。Mouseanti-human CIDEA monoclonal antibody 及び mouse anti-human CIDEC polyclonal
antibody は Abnova Corporation (Taipei, Taiwan)から購入した。

1-2. ヒト白色脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化 (Fig. 4)
インフォームド・コンセントの得られた 6 名の男性患者の皮下脂肪組織由来の
ヒト白色脂肪前駆細胞は Zen-Bio (Research Triangle Park, NC)から購入した。患者は非喫煙者であり、Body mass index の平均値は 27.2 (range 26.4 – 28.4)、年齢の平均値は 41 歳(range 29 – 57)であった。ヒト白色脂肪前駆細胞を 24-well plate に播種し、10% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 及び 0.25 μg/ml
amphotericin B 含有 DMEM/F-12 培地で、37°C、5% CO2 で培養した。細胞をコン
フルエントになるまで培養し、3% FBS, 500 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 μM
Rosiglitazone, 100 nM insulin, 1 μM Dex, 33 μM biotin, 17 μM pantothenate, 100
units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 及び 0.25 μg/ml amphotericin B 含有
-9-

DMEM/F-12 からなる分化培地で 6 日間培養した。 次に、細胞を 3% FBS, 100 nM
insulin, 1 μM Dex, 33 μM biotin, 17 μM pantothenate, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml
streptomycin, and 0.25 μg/ml amphotericin B 含有 DMEM/F-12 からなる維持培地で 5日間培養した。細胞を再度分化培地で 6 日間培養し、その後、維持培地で 2 日間培養した。これらの細胞を分化脂肪細胞としてすべての実験に使用した。培地は
3 日毎に新しい培地に交換した。

Culture/treatment condition
Day

0

6
分化培地

11
維持培地

分化培地

分化培地:
DMEM/F-12
3% FBS, 100 nM insulin, 1 μM dexamethasone
33 μM biotin, 17 μM pantothenate,
500 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine,
1 μM rosiglitazone

17
維持培地

19- Treatments(Starvation, Insulin, siRNA)

Analyses(expression of mRNA by
qPCR, protein by Western
blotting)

凍結ヒト白色脂肪前駆細胞(Zen-Bio)を24-well plateに播種コンフルエントになるまで培養
分化培地に交換し、6日間培養
維持培地に交換し、5日間培養
分化培地に交換し、6日間培養
維持培地に交換し、2日間培養
分化脂肪細胞として、実験に使用

分化脂肪細胞Fig. 4. ヒト白色脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化方法

1-3. リアルタイム定量 PCR
Total RNA の精製及び DNase 処理は RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)
を用いて行った。逆転写反応は Total RNA (100 – 200 ng)及び High-capacity cDNA
reverse transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて行った。定量
PCR は TaqMan gene expression assay system を用いて ABI 7500 Fast (Applied- 10 -

Biosystems)で行った。各遺伝子の TaqMan gene expression assay system は以下に示すものを Applied Biosystems から購入した。CIDEA (Hs00154455_m1), CIDEB(Hs00205339_m1), CIDEC mRNA(Hs00535723_m1)及び 18S (Hs99999901_s1, 内部
標準)。各遺伝子の mRNA 発現量は 18S rRNA 発現量で補正し、コントロールに対する相対比として表した。

1-4. ウエスタンブロット解析
Total cell lysates は 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5%
sodium deoxycholate, 1% NP-40, 0.1% SDS, 50 mM sodium fluoride, 2.5 mM sodium
pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM sodium orthovanadate 及び Complete
protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)含有 lysis buffer を用いて調製した。Cell lysates を 17,800 × g、10 分間、4°C で遠心し、上清を 12.5%
SDS-polyacrylamide gels で 電 気 泳 動 し た 後 、 Immobilon-P membrane (Millipore
Corporation, Bedford, MA)へタンパク質をトランスファーした。Membrane は 5%
BSA/5% skim milk 含有 TBS/0.05% Tween-20 で 1 時間ブロッキングし、CIDEA 或
いは CIDEC に特異的な抗体を用いてオーバーナイト、4°C でインキュベートした。
その後、Horseradish peroxidase anti-mouse secondary antibody (GE Healthcare, Little
Chalfont, Buckinghamshire, UK)を用いて 1 時間インキュベートし、ECL detection
reagents (GE Healthcare)を用いてタンパク質を可視化した。

1-5. siRNA 解析
分化脂肪細胞に Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)を用いて、各 10 nM のControl siRNA (12935-200; Invitrogen), CIDEA siRNA (HSS141577; Invitrogen)或いは
CIDEC siRNA (HSS127223; Invitrogen)をトランスフェクトした。トランスフェクシ- 11 -ョンはアッセイまで 5 日間に 1 度行った。

1-6. アポトーシスの解析
脂 肪 前駆 細胞 を カ バー ガ ラス 上で 培 養 し、 上 述の よう に 脂 肪細 胞 へと 分化させた。アッセイ後、細胞を 2% paraformaldehyde/PBS を用いて 20 分間、室温で固定した。その後、細胞を PBS で 1 回洗浄し、0.2% Triton X-100/0.1% sodium
citrate を用いて 10 分間、on ice で浸透化を行った。浸透化ののち、細胞を Terminal
deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) reaction
mixture を用いて 60 分間、37°C でインキュベートした。次に、細胞を 1 回洗浄し、0.2 μg/ml of 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma)及び 0.1 μg/ml Nile Red(Sigma)/PBS を用いて 5 分間、室温でインキュベートし、その後 3 回洗浄した。
最後の洗浄ののち、細胞を Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL)を用いてスライドガラス上にマウントし、共焦点レーザー顕微鏡(FV500-D; Olympus,
Tokyo, Japan)で可視化した。顕微鏡写真は×20 の倍率で TUNEL は緑、DAPI は青、Nile Red は赤で取得し、ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いてマージさせた。アポトーシスを起こしている脂肪細胞を TUNEL/DAPI/Nile Red により 3 重
染色し、その細胞数をカウントすることでアポトーシス細胞数を定量化した。全脂肪細胞数は下述のように定量化した。結果はランダムな 12 視野における 1000
脂肪細胞数中の TUNEL 陽性脂肪細胞数として表した。TUNEL assay は in situ cell
death detection kit (Roche)を用いて行った。

1-7. 脂肪細胞数の解析
細胞を固定し、上述のように DAPI 及び Nile Red を用いて染色した。 顕
微鏡写真は×20 の倍率で取得した。脂肪細胞数は DAPI/Nile Red により染色され- 12 -

た細胞数をカウントすることで定量化した。結果はランダムな 12 視野における平方ミリメーター中の脂肪細胞数として表した。

1-8. 脂肪滴サイズの解析
細胞を固定し、上述のように Nile Red を用いて染色した。顕微鏡写真は×100 の倍率で取得した。Nile Red により染色された脂肪滴のサイズは ImageJsoftware を用いて定量化した。ランダムな 10 視野における 100 個の脂肪滴を解析した。

1-9. グリセロール放出量の解析
分化脂肪細胞を serum/Dex 不含の維持培地を用いて、インスリン存在下或いは非存在下で 24 時間インキュベートした。その後、培養培地を回収し、free glycerol
reagent (Sigma)を用いて培地中のグリセロール含量を測定した。結果は細胞内タンパク質量で補正し、micrograms of glycerol per milligram of protein として表した。
細胞内タンパク質量は bicinchoninic acid protein assay kit (Pierce, Rockford, IL)を用
いて定量化した。

1-10. 統計解析
統計解析は Unpaired t test を実施した。棄却率 5%未満を有意とした。結果は
3 回の独立した実験の 平均値±標準誤差で表した。

- 13 -

２． 結果2-1.

インスリ ンに よる CIDE ファミリ ーの発現制 御CIDEファミリーがインスリン作用に寄与するかどうかを調べるため、はじめに、
ヒト白色脂肪前駆細胞から分化させた脂肪細胞（以下、ヒト白色脂肪細胞）でイ
ンスリンによるCIDEA、CIDEB及びCIDECの発現変動が認められるか、リアルタ
イム定量PCR法で調べた。インスリンはCIDEA mRNAの発現を時間依存的且つ濃度依存的に低下させ、24時間及び100 nM以上で最大効果を示した(Fig. 5A, B, left
panel)。100 nMインスリンの24時間処置はCIDEA mRNAの発現量を90%減少させた。これとは対照的に、インスリンはCIDEC mRNAの発現を時間依存的且つ濃度依存的に亢進させ、24時間及び100 nMで最大効果を示した(Fig. 5A, B, right panel)。
100 nMインスリンの24時間処置はCIDEC mRNAの発現量を約2倍亢進させた。一方、インスリンはCIDEB mRNAの発現には影響を及ぼさなかった(Fig. 5A, B,
middle panel)。
次に、インスリンによるmRNAの発現変動が認められたCIDEA及びCIDECのタ
ンパク質発現をウエスタンブロット法により調べた。インスリンはCIDEAタンパ
ク質の発現量を低下させ(Fig. 5C, left panel)、CIDECタンパク質の発現量を亢進させた(Fig. 5C, right panel)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞においてインスリ
ンはCIDEAの発現を低下させ、CIDECの発現を亢進させることが明らかとなった。
また、インスリンはCIDEBの発現には影響しないことが明らかとなった。

- 14 -

2.0
1.5
1.0
0.5

**
**

**

12

24

0.0
0

**
36

CIDEB mRNA
Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

CIDEA mRNA

CIDEC mRNA
Relative mRNA levels

A

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

48

0

12

Time (h)

24

36

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

48

- Insulin+ Insulin

****

**

12

24

0

Time (h)

**

36

48

Time (h)24
InsulinFig. 5.

48

1.0
0.5
0.0

2.0

*

1.5

0.5
0.0

Insulin (nM)

24

(h)

- + - +

Insulin

** *

1.0

1
10
10
0
10
00

1
10
10
0
10
00

Insulin (nM)

C

1.5

2.5

1
10
10
0
10
00

** **

2.0

0.
1

**

2.5

0.
1

*

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

0.
1

Relative mRNA levels

B

Insulin (nM)

48

(h)

- + - +

CIDEA

CIDEC

β-Actinβ-ActinDifferential expression of CIDE family genes regulated by insulin in humanadipocytes. A: Time course of insulin-regulated CIDE family gene expression.
Differentiated adipocytes were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium
for 16 hours. Cells were then incubated in serum/Dex-free maintenance medium in thepresence or absence of 100 nM insulin for the indicated times. The mRNA expression
levels of each gene were measured by quantitative real-time PCR, normalized relative to
18S rRNA expression, and shown as mRNA levels relative to zero-time control without
insulin. Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. *, P <0.05; **, P < 0.01. B: Concentration response effect of insulin on CIDE family gene
expression.

Differentiatedadipocytes

werestarvedinserum/Dex/insulin-freemaintenance medium for 16 hours and then incubated in serum/Dex-free maintenance- 15 -

medium in the presence or absence of insulin at the indicated concentrations for 24 hours.
The mRNA expression levels of each gene were measured by quantitative real-time PCR,
normalized relative to 18S rRNA expression, and shown as relative mRNA levels. Data
are presented as means ± SEM of three independent experiments. *, P < 0.05; **, P <0.01. C: Western blotting analysis of CIDEA and CIDEC expression. Differentiatedadipocytes were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 hours.
Cells were then incubated in serum/Dex-free maintenance medium in the presence orabsence of 100 nM insulin for the indicated times. β-Actin served as a loading control.
These experiments were performed three times and the results of one representative
experiment are shown.

2-2.

イン スリ ンの アポト ーシ ス抑制 作 用に対 する CIDE ファミ リー の関与次に、ヒト白色脂肪細胞においてインスリンが無血清培養によるアポトーシスを抑制するかどうかを調べた。脂肪細胞のアポトーシスは TUNEL/DAPI/Nile redの三重染色法により解析した。48 時間の無血清培養を行ったところ、Nile-red で脂肪滴 が 染色 され た 脂肪細 胞の核 クロ マ チン凝 縮及び 断片 化 が DAPI 及 び
TUNEL 染色により観察された(Fig. 6A)。72 時間の無血清培養では、脂肪細胞の数は 18.0% ± 7.7%減少し、6.6% ± 0.6%の脂肪細胞が TUNEL 陽性であった(Fig. 6B)。
インスリンは無血清培養により増加した TUNEL 陽性の脂肪細胞の数を有意に減少させた(Fig. 6B)。通常培養においては、DAPI により染色された細胞核の形態は正常であり、TUNEL 陽性の脂肪細胞の数はごく僅かであった(data not shown)。以上の結果から、インスリンは無血清培養による脂肪細胞のアポトーシスを抑制することが明らかとなった。
- 16 -B

A-- Insulin+ Insulin+
TUNEL positive
adipocytes(/1000 adipocytes)

Insulin

TUNEL

80
70
60
50
40
30
20
10
0
0

DAPI

**

**

48

72

*
24

Time (h)TUNEL/DAPI/
Nile Red

Fig. 6.

Insulin inhibits starvation-induced apoptosis in human adipocytes. A:

Fluorescence microscopy of adipocytes stained with TUNEL, DAPI, and Nile Red.
Differentiated adipocytes were incubated in serum/Dex-free maintenance medium in thepresence or absence of 100 nM insulin for 48 hours. Cells were triple-stained withTUNEL (green), DAPI (blue), and Nile Red (red). TUNEL-positive adipocytes areindicated by the arrowheads. Scale bar, 100 μm. B: Quantification of TUNEL-positive
adipocytes. Differentiated adipocytes were starved in serum/Dex-free maintenancemedium in the presence or absence of 100 nM insulin for the indicated times. Data arepresented as means ± SEM of three independent experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01.

次に、インスリンによる発現変動が認められた CIDEA 及び CIDEC がインスリンのアポトーシス抑制作用に関与するかどうか、siRNA を用いた遺伝子ノックダ
ウン法で調べた。インスリンは無血清培養による脂肪細胞のアポトーシスを抑制
し、このとき CIDEA 発現量の低下を認めた(Fig. 7A, B)。CIDEA siRNA (siCIDEA)- 17 -

を添加した脂肪細胞ではインスリンと同程度に無血清培養によるアポトーシスを抑制していたが、CIDEC siRNA (siCIDEC)添加では無影響であった(Fig. 7A)。また、siCIDEA を添加したヒト白色脂肪細胞ではインスリンによる相加的なアポトーシス抑制作用は認められなかった。siCIDEA 及び siCIDEC により、CIDEA 及び
CIDEC mRNA の発現量はそれぞれ特異的にノックダウンされた(Fig. 7B)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞において、CIDEC ではなく CIDEA が無血清培養によるアポトーシスの重要なファクターであり、インスリンによるアポトーシス抑
制作用には CIDEA の発現低下が寄与することが示唆された。

B

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

Fig. 7.

*

**

+
-

+
-

**

+

+
+
-

**

+
+
-

+
+

CIDEC mRNA

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4

**

**

0.2
0.0

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

+
-

+
-

+

+
+
-

##

**

+
+
-

**

+
+

Relative mRNA levels

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

CIDEA mRNA
Relative mRNA levels

TUNEL positive
adipocytes(/1000 adipocytes)

A

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
##

0.4

**

**

0.2
0.0

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

+
-

+
-

+

+
+
-

+
+
-

+
+

Suppression of CIDEA expression inhibits starvation-induced apoptosis in

human adipocytes. A: Quantification of TUNEL-positive adipocytes. Differentiatedadipocytes were treated with control siRNA (siControl), CIDEA siRNA (siCIDEA), or
CIDEC siRNA (siCIDEC) in maintenance medium for 7 days. Cells were then incubatedin serum/Dex-free maintenance medium in the presence or absence of 100 nM insulin for
48 hours and analyzed for apoptosis. Data are presented as means ± SEM of three
independent experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01. B: Expression analysis of CIDEA
and CIDEC mRNA by real-time PCR. The mRNA expression levels of each gene werenormalized relative to 18S rRNA expression and shown relative to siControl without- 18 -

insulin. Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. **, P <0.01 vs. siControl without insulin; ##, P < 0.01 vs. siControl with insulin.

さ ら に、CIDEA 及び CIDEC が脂肪細胞の数に影響するかどうか、siRNA を用いた遺伝子ノックダウン法で調べた。インスリンを欠乏させた条件で培養した群と比較して、インスリンは脂肪細胞の数を有意に増加させ、このとき CIDEA 発
現量の低下を認めた(Fig. 8A, B, C)。実験は脂肪細胞の分化誘導後から行っていることから、インスリンは脂肪細胞の細胞死を抑制することで細胞数を維持していることが示唆された。これらの培養条件において脂肪前駆細胞の数は変化しなかったことから(data not shown)、インスリンの欠乏は脂肪前駆細胞の細胞死には影
響しないことが示唆された。siCIDEA を添加した脂肪細胞ではインスリンと同程度にインスリン欠乏による脂肪細胞数の減少を回復させたが、siCIDEC 添加では無影響であった(Fig. 8A, B)。siCIDEA 及び siCIDEC により、CIDEA 及び CIDEC
mRNA の発現量はそれぞれ特異的にノックダウンされた(Fig. 8C)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞において、インスリン及び CIDEA は脂肪細胞の数の維持に重要なファクターであり、インスリンによる脂肪細胞の数の維持には CIDEAの発現低下が寄与することが示唆された。

- 19 -

A
siControl

InsulinsiCIDEA

siCIDEC

-

+

500
400

*

300
200
100
0

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

Fig. 8.

*

** *

+
-

- - + - ++ + ++ - - + - - +CIDEA mRNA
Relative mRNA levels

Adipocyte number(/mm2)

C
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC+-

CIDEC mRNA**** ## ****

Relative mRNA levels

B- - + - ++ + ++ - - + - - +InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

4

** **

3

*

2

##

1

**

**

- - + - ++ + ++ - - + - - +0+-

Suppression of CIDEA expression restores insulin deprivation-reduced

adipocyte number. A: Phase contrast microscopy of adipocytes. Differentiated adipocytes
were treated with control siRNA (siControl), CIDEA siRNA (siCIDEA), or CIDEC
siRNA (siCIDEC) in the maintenance medium in the presence or absence of 100 nM
insulin for 15 days. Scale bar, 100 μm. B: Quantification of adipocyte number. Data arepresented as means ± SEM of three independent experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01.
C: Expression analysis of CIDEA and CIDEC mRNA by real-time PCR. The mRNA
expression levels of each gene were normalized relative to 18S rRNA expression andshown relative to siControl without insulin. Data are presented as means ± SEM of three
independent experiments. *, P < 0.05, **, P < 0.01 vs. siControl without insulin; ##, P <0.01 vs. siControl with insulin.
- 20 -

インスリ ンの 脂肪滴形成 作用に対 する CIDE ファミリ ーの関与

2-3.

次に、インスリンによる発現変動が認められた CIDEA 及び CIDEC がインスリンの脂肪滴形成作用に関与するかどうか、siRNA を用いた遺伝子ノックダウン法で調べた。インスリンは脂肪滴サイズを著明に増加させた(Fig. 9A, B)。インスリ
ンよる脂肪滴サイズの増大は siCIDEC により劇的に抑制されたが、siCIDEA では
無影響であった(Fig. 9A, B)。インスリンは脂肪分解の指標であるグリセロール放出量には影響しなかった(Fig. 9C)。siCIDEA はグリセロール放出量に影響しなかったが、siCIDEC はグリセロール放出量を有意に増加させた。siCIDEA 及びsiCIDEC により、CIDEA 及び CIDEC mRNA の発現量はそれぞれ特異的にノックダウンされた(Fig. 9D)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞において、CIDEA ではなく CIDEC が脂肪滴形成に重要なファクターであり、インスリンによる脂肪滴形成作用には CIDEC の発現亢進が関与することが示唆された。

-

Insulin

**

150
100
##

Fig. 9.

##

200
150
100
50
0

0

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

+
-

+ +
+ - +
- -

+

+

D
250

Glycerol release(g/mg protein)

Lipid droplet size
(m2)

C
250

50

siCIDEC+

B
200

siCIDEA++

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

+
-

+ +
+ - +
- -

+
+

CIDEA mRNA
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

**

+
-

##

+ +
+ - +
- -

CIDEC mRNA
Relative mRNA levels

siControl

Relative mRNA levels

A

+
+

2.0

**
1.5
1.0
0.5

##

0.0

InsulinsiControl
siCIDEA
siCIDEC

+
-

+ +
+ - +
- -

+
+

Suppression of CIDEC expression inhibits insulin-induced enlargement of lipid

droplets and increases glycerol release in human adipocytes. A: Fluorescence microscopy- 21 -

of adipocytes stained with Nile Red. Differentiated adipocytes were treated with control
siRNA (siControl), CIDEA siRNA (siCIDEA), or CIDEC siRNA (siCIDEC) in
maintenance medium in the presence or absence of 100 nM insulin for 10 days and thenstained with Nile Red (red). Scale bar, 30 μm. B: Quantification of lipid droplet size.
Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. **, P < 0.01 vs.
siControl without insulin; ##, P < 0.01 vs. siControl with insulin. C: Lipolysis assay.
Glycerol released into the medium over 24 hours was measured after siRNA-mediateddepletion of CIDEA and CIDEC. Data are presented as means ± SEM of three
independent experiments. ##, P < 0.01 vs. siControl with insulin. D: Expression analysisof CIDEA and CIDEC mRNA by real-time PCR. The mRNA expression levels of eachgene were normalized relative to 18S rRNA expression and shown relative to siControl
without insulin. Data are presented as means ± SEM of three independent experiments.
**, P < 0.01 vs. siControl without insulin; ##, P < 0.01 vs. siControl with insulin.

- 22 -

３ ．考察本 章 で は、 ヒ ト 白 色脂 肪 細 胞に お け る イン ス リ ンに よ る CIDEファ ミ リーの発現制御を解析し、インスリンが CIDEAの発現を低下させ、CIDECの発現を亢進させ ることを明らかにした (Fig. 5)。一方、インスリンはCIDEBの発 現には影響しないことを明らかにした 。ヒト白色脂肪細胞において、それぞれのCIDEフ ァ ミ リー タン パ ク 質が イ ン ス リン に よ り別 々 に 制 御さ れ て いる ことを示した報告は今回が初めてである。インスリンは 脂肪細胞分化の代表的な マ ー カ ー 遺 伝 子 で あ る adipocyte fatty acid binding protein (aP2) 及 び
peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) γ mRNAの発現には影響しなかった(data not shown)。aP2はPPAR γの制御下遺伝子でもある。これらの結果から、CIDEA
及びCIDECの発現に対して観察されたインスリンの作用は、インスリンが脂肪細胞分化やPPAR γの直接的な転写活性化に影響した結果として引き起こされたものではないと推察される。最近、インスリンはウシ乳腺上皮細胞においてCIDEAの発現を低下させること(19)、マウス3T3-L1脂肪細胞においてCIDECの発現を亢進させることが報告されている(12)。ヒト白色脂肪細胞における本章の発見は、これらの報告からも支持される。また、ヒトではCIDEA及びCIDECは主に白色脂肪組織において高発現しているが(32, 35, 36)、CIDEBは主に肝臓に高発現していることが報告されている(25, 34)。従って、ヒト白色脂肪細胞においてはCIDEBではなく、
CIDEA 及びCIDECが重要な役割を担っている ことが 予想される 。CIDEA 及 び
CIDECはアポトーシスの誘導因子であり(25, 26)、脂肪滴形成にも関与することが報告されている(30, 35, 37)。CIDEAは様々な状況下で小胞体(20)、核(21)、ミトコ
ンドリア(7)或いは脂肪滴周囲(22)に局在する一方、CIDECは脂肪滴周囲に局在す
ることが報告されている(35, 37)。CIDEA及びCIDECの細胞内局在に関する研究は、
これらタンパク質のアポトーシスや脂肪滴形成などの機能を予測する上で重要で- 23 -

あると考えられる。しかしながら、CIDEタンパク質の局在性は現在のところ不明な点が多く、その解明にはさらなる研究が必要である。
CIDEファミリータンパク質はいずれもアポトーシス及び脂肪滴形成を誘導することから、インスリンのアポトーシス抑制にはCIDEAの発現低下が、脂肪滴形
成にはCIDECの発現亢進が関与する可能性が考えられた。そこで、インスリンのアポトーシス抑制作用にCIDEAの発現低下が寄与するかどうかを調べるため、イ
ンスリンの代わりにsiRNAを用いてCIDEA発現抑制を模倣したところ、siRNAによるCIDEA発現抑制はインスリンと同様に脂肪細胞のアポトーシスを抑制し(Fig. 7)、
インスリン欠乏による脂肪細胞数の減少を回復させた(Fig. 8)。また、インスリンは、CIDEA siRNAと併用した場合でもアポトーシス及び脂肪細胞数に対して相加的な作用を認めなかったことから、インスリン及びCIDEAは同一経路で作用していることが示唆された。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによるアポトーシス抑制作用は、CIDEAの発現低下が関与することが示唆された。
これとは対照的に、siRNAによるCIDEC発現抑制はインスリンの有無によらずアポトーシスに影響しなかった。CIDECの過剰発現は3T3-L1脂肪細胞のアポトーシスを誘導することが報告されているが(26)、インスリンによるCIDECの中程度の発現
亢進はアポトーシスに関与しないのかもしれない。
一方、インスリンの脂肪滴形成にCIDECの発現亢進が寄与するかどうかをsiRNAによるノックダウン法により調べたところ、siRNAによるCIDEC発現抑制はインス
リンによる脂肪滴サイズの増大を著明に抑制し、脂肪分解を亢進させた(Fig. 9)。
以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによる脂肪滴形成作用は、
CIDECの発現亢進が関与することが示唆された。これらの結果は、3T3-L1脂肪細胞において、CIDEC発現抑制が脂肪分解を亢進させ、脂肪滴サイズを減少させるという報告とも一致している(11, 23)。これとは対照的に、CIDEA発現抑制は脂肪- 24 -

分解及び脂肪滴サイズに影響しなかった。CIDEA過剰発現は3T3-L1脂肪前駆細胞の脂肪滴形成を亢進させること(11, 24)、CIDEA発現抑制はヒト白色脂肪前駆細胞の脂肪分解を亢進させることが報告されている(25)。既報と異なる現象が観察された要因の1つとして、脂肪前駆細胞と分化脂肪細胞との違いが考えられる。分化脂肪細胞は大きな脂肪滴を有しており、脂肪分解の基礎レベルが脂肪前駆細胞よりも大きいことが推察される。それ故に、分化脂肪細胞では脂肪分解のバックグラ
ウンドが高いために、脂肪分解の微量な変化が観察されなかった可能性が考えられる。結果的に、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによるCIDEAの発現低下
は、脂肪滴形成に深く寄与しないことが示唆された。
インスリンは一般に生存促進性のホルモンとして知られており(26)、マウス及びラット脂肪細胞においてアポトーシスを抑制することが報告されている(27,28)。本章では、ヒト白色脂肪細胞においても、インスリンがアポトーシスを抑制することを初めて明らかにした(Fig. 6)。インスリンは脂肪細胞の分化(11, 12)、脂肪蓄積及び脂肪滴形成を亢進させるホルモンである(29, 30)。脂肪組織特異的インスリン受容体ノックアウトマウスの報告では、脂肪細胞におけるインスリンシグ
ナルは肥満の進展に重要であることが示されている(31)。故に、脂肪細胞におけるインスリンのアポトーシス抑制作用及び脂肪滴サイズの増大作用は、脂肪組織量の増大に寄与することが推察される。従って、インスリンによる CIDEA の発現低下及び CIDEC の発現亢進は、脂肪細胞のアポトーシス抑制及び脂肪滴形成にそれぞれ選択的に関与し、その結果、脂肪組織量の増大を引き起こすことが推測される(Fig. 10)。

- 25 -

Insulin

CIDEA

CIDEC

Apoptosis

Lipid droplet

Adipocyte no.

Adipocyte size

WAT mass
Fig. 10.

Schematic diagram of insulin action in human adipocytes. Insulin suppresses

apoptosis, at least in part, through downregulation of CIDEA mRNA expression, but
increases lipid droplet formation through upregulation of CIDEC mRNA expression.
Chronic insulin action would increase adipocyte number and size through gene regulationof CIDEA and CIDEC, and increase the mass of WAT in humans. WAT, white adipose
tissue.

- 26 -

４ ．小括１ ） ヒト白色脂肪細胞において、インスリンは CIDEA の発現を低下させ、
CIDEC の発現を亢進させる。 一方、CIDEB の発現には影響しない。
２ ） インスリンのアポトーシス抑制作用には CIDEA の発現低下が、脂肪滴形成作用には CIDEC の発現亢進がそれぞれ選択的に関与する 。

- 27 -

第3章

インスリン による CIDEA 及び CIDEC の発現制御に 関わる経 路の探索

前章では 、インスリンが CIDEA 及び CIDEC の発現 制御に関わり、その発現 制 御が イ ンス リ ンの ア ポト ー シス 抑 制 作 用 及び 脂 肪滴 形 成 作 用 にそ れ
ぞれ 選択 的 に関 与す るこ とを 明 らか にし た (32)。本 章で は 、 インスリンの主
要 な シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 関 わ る キ ナ ー ゼ で あ る Phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K), Akt 及び mitogen-activated protein kinase (MAPK)の阻害剤又は siRNA を用いて、ヒト白色脂肪細胞でのインスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に関わる経路を探索した。

１．実験方法
1-1. 材 料
DMEM/F-12 (1:1, vol/vol)は Invitrogen (Carlsbad, CA)から購入した。Human insulin
は Novo Nordisk (Bagsværd, Denmark) か ら 購 入 し た 。 Rosiglitazone は Alexis
Biochemicals (San Diego, CA) か ら 購 入 し た 。 3-Isobutyl-1-methylxanthine,
dexamethasone (Dex), pantothenate 及び anti-β-actin antibody は Sigma (St. Louis, MO)から購入した。Biotin は Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan)から購入した。
FBS は Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel)から購入した。Wortmannin,
PI-103, API-2, U0126, SP600125 及び SB203580 は Calbiochem (San Diego, CA)から購入した。Mouse anti-human CIDEA monoclonal antibody (H00001149-M01)及びmouse anti-human CIDEC polyclonal antibody (H00063924-B01P) は Abnova
Corporation (Taipei, Taiwan) から購 入し た 。 Anti-Akt, anti-phospho-Akt (Ser473),
anti-phospho-Akt (Thr308), anti-c-Jun N-terminal kinase (JNK), anti-phospho-JNK 及び- 28 -

anti-phospho-c-Jun antibodies は Cell Signaling Technology (Beverly, MA)から購入した。

1-2. ヒト白色脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化 (Fig. 4)
ヒト脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化は上述(第 2 章、1-2)のように行った。

1-3. リアルタイム定量 PCR
リアルタイム定量 PCR は上述 (第 2 章、1-3)のように行った。各遺伝子のTaqMan gene expression assay system は以下に示すものを Applied Biosystems から購入した。CIDEA (Hs00154455_m1), CIDEC (Hs00535723_m1), Akt1 (Hs00178289_m1),
Akt2 (Hs00609846_m1), Akt3 (Hs00178533_m1), JNK1 (Hs00177083), JNK2 mRNA
(Hs00177102_m1)及び 18S rRNA (Hs99999901_s1)。

1-4. siRNA 解析
siRNA 解析は上述(第 2 章、1-5)のように行った。分化脂肪細胞に Lipofectamine
RNAiMAX (Invitrogen)を用いて、各 10 nM の Control siRNA (12935-110; Invitrogen),Akt1 siRNA (12935-001 Duplex1; Invitrogen), Akt2 siRNA (12937-40 Duplex2;
Invitrogen), Akt3 siRNA (HSS115177; Invitrogen), JNK1 siRNA (12936-42 Duplex1;
Invitrogen)或いは JNK2 siRNA (12936-44 Duplex1; Invitrogen)をトランスフェクト
した。トランスフェクションはアッセイまで 5 日間に 1 度行った。

1-5. ウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析は上述 (第 2 章、1-4)のように行った。細胞可溶化
液 の上清を 10% – 15% SDS-polyacrylamide gels で電気泳動した後、Immobilon-P- 29 -

membrane (Millipore Corporation)へタンパク質をトランスファーした。Membrane
は 5% BSA 含有 TBS/0.05% Tween-20 で 1 時間ブロッキングし、CIDEA, CIDEC, Akt,phospho-Akt (Ser473), phospho-Akt (Thr308), JNK 及び phospho-JNK に特異的な抗体を用いてオーバーナイト、4°C でインキュベートした。その後、Horseradish
peroxidase anti-mouse secondary antibody 或いは Horseradish peroxidase anti-rabbit
secondary antibody (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)を用いて 1
時間インキュベートし、ECL detection reagents (GE Healthcare)を用いてタンパク質を可視化した。

1-6. アポトーシスの解析
アポトーシスの解析は 上述(第 2 章、1-6)のように 行った。細胞のマウント
は ProLong Gold Antifade Reagent (Invitrogen)を用いて行い、細胞の可視化は共焦点レーザー顕微鏡(LSM 700; Carl Zeiss, Jena, Germany)を用いて行った。

1-7. 脂肪滴サイズの解析
脂肪滴サイズの解析は 上述(第 2 章、1-7)のように 行った。顕微鏡写真は×63の倍率で取得した。

1-8. 統計解析
統計解析は Unpaired t test を実施した。棄却率 5%未満を有意とした。結果は
3 回の独立した実験の 平均値±標準誤差で表した。

- 30 -

２ ．結果2-1.

インスリ ンに よる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に 対する PI3K の関与

インスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御が PI3K を介するかどうか、
PI3K の阻害剤である Wortmannin 及び PI-103 を用いて調べた。Wortmannin 及び
PI-103 はインスリンによる CIDEA の発現低下及び CIDEC の発現亢進の双方を濃度依存的に抑制した(Fig. 11A, B)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞におけるイ
ンスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御は PI3K を介することが明らかとなった。

A

CIDEA mRNA

CIDEC mRNA
3.5

1.2
1.0

##
##

0.8
##

0.6
0.4
0.2

**

0.0

Insulin (100 nM)
Wortmannin (nM)

B

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

1.4

3.0

2.0
1.5

0.5

- + + + +- - 30 100 300

Insulin (100 nM)
Wortmannin (nM)

##

1.0
0.8

##

0.6

**

0.2

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels**- + + + +- - 30 100 300
CIDEC mRNA

4

1.2

*

3
2
##

1
0

0.0

PI-103 (μM)

##

0.0

1.4

Insulin (100 nM)

##

1.0

CIDEA mRNA

0.4

**

2.5

- + + + +- - 0.2 0.6 2

Insulin (100 nM)
PI-103 (μM)

- + + + +- - 0.2 0.6 2

Fig. 11. PI3K inhibitors block the regulation of both CIDEA and CIDEC expression by
insulin. A and B: Concentration – response effect of PI3K inhibitors on CIDEA and- 31 -

CIDEC mRNA expression. Differentiated adipocytes were starved in serum/Dex/insulinfree maintenance medium for 16 h. Cells were then treated with wortmannin or PI-103 at
the indicated concentrations for 30 min followed by stimulation with or without 100 nM
insulin for 24 h. The mRNA expression levels of CIDEA and CIDEC were measured byquantitative real-time PCR, normalized relative to 18S rRNA expression, and are shown
as relative mRNA levels. Data are presented as means ± SEM of three independent
experiments. *, P < 0.05, **, P < 0.01 vs. control without insulin; ##, P < 0.01 vs. control
with insulin.

2-2.

インスリ ンに よる CIDEA 及び CIDEC の発現制 御に 対する Akt 及びJNK の選択的 な関与

次に、インスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に Akt 及び MAPK 経路
が 寄 与 す る か ど う か 、 Akt1 、 Akt2 及 び Akt3 の 阻 害 剤 で あ る API-2 (33) 、
MAPK/Extracellular signal-regulated kinase (ERK) 阻 害 剤 で あ る U0126 、 c-Jun
N-terminal kinase (JNK)阻害剤である SP600125 或いは p38 阻害剤である SB203580
を用いて調べた。API-2 はインスリンによる CIDEA の発現低下を濃度依存的に抑制したが、CIDEC の発現亢進には影響しなかった(Fig. 12A)。各種 MAPK 阻害剤
はインスリンによる CIDEA の発現低下には影響しなかったが、SP600125 はイン
スリンによる CIDEC 発現亢進を抑制した(Fig. 12B)。U0126 及び SB203580 は
CIDEC の発現に影響しなかった。また、SP600125 はインスリンによる CIDEC 発
現亢進を濃度依存的に抑制した(Fig. 12C)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御は、それぞれ Akt 及び JNKを選択的に介することが明らかとなった。

- 32 -

A

CIDEC mRNA

CIDEA mRNA
5

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

1.4
1.2
1.0
#

0.8

##

0.6
0.4

*
*

0.2
0.0

API-2 (μM)

2
1

Insulin (100 nM)

API-2 (μM)

CIDEA mRNA
Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4

**

0.2
0.0

- + + + +- - 0.3 3 30

CIDEC mRNA

1.4

2.5
2.0

*

1.5
1.0

##

0.5
0.0

- + + + +U0126 (10 μM) - + - SP600125 (10 μM) - - + SB203580 (20 μM) - - - +Insulin (100 nM)

C

**

3

0

- + + + +- - 0.3 3 30

Insulin (100 nM)

B

4- + + + +- - + - SP600125 (10 μM) - - + SB203580 (20 μM) - - - +Insulin (100 nM)

U0126 (10 μM)

CIDEC mRNA
Relative mRNA levels

6
5

**

4
3
#

2

#

1
0

Insulin (100 nM)
SP600125 (μM)

- + + + +- - 1 3 10

Fig. 12. The Akt inhibitor API-2 and the JNK inhibitor SP600125 selectively block
regulation of CIDEA and CIDEC expression by insulin, respectively. A: Concentration –response effect of the Akt inhibitor on CIDEA and CIDEC mRNA expression.
Differentiated adipocytes were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium
for 16 h. Cells were then treated with API-2 at the indicated concentrations for 30 min
followed by stimulation with or without 100 nM insulin for 24 h. B: Effects of the
MAPK inhibitors on CIDEA and CIDEC mRNA expression. Differentiated adipocytes- 33 -

were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h. Cells were thentreated with 10 μM U0126, 10 μM SP600125, or 20 μM SB203580 for 30 min followed
by stimulation with or without 100 nM insulin for 24 h. C: Concentration – response
effect of the JNK inhibitor on CIDEC mRNA expression. Differentiated adipocytes werestarved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h. Cells were then treatedwith SP600125 at the indicated concentrations for 30 min followed by stimulation withor without 100 nM insulin for 24 h. The mRNA expression levels of CIDEA and CIDEC
were measured by quantitative real-time PCR, normalized relative to 18S rRNA
expression, and are shown as relative mRNA levels. Data are presented as means ± SEM
of three independent experiments. *, P < 0.05, **, P < 0.01 vs. control without insulin; #,P < 0.05, ##, P < 0.01 vs. control with insulin.

2-3.

インスリ ンに よる CIDEA の発現 制御及びア ポトーシ ス抑制作用 に対
す る Akt1/2 の関与

インスリンによる CIDEA の発現制御に対する Akt の特異的な関与をより詳細に検証するため、Akt1 siRNA (siAkt)、Akt2 siRNA (siAkt2)及び Akt3 siRNA (siAkt3)を用いた検証を行った。siAkt1、siAkt2 或いは siAkt3 の単一処置はインスリンによる CIDEA の発現低下に影響しなかった(Fig. 13A)。これとは対照的に、siAkt1/2の併用処置はインスリンによる CIDEA の発現低下を 61%回復させた(Fig. 13B)。
siAkt1/3 或いは siAkt2/3 は CIDEA の発現に影響しなかった。各 siRNA は Akt1、Akt2 及び Akt3 mRNA の発現量をそれぞれ特異的にノックダウンさせた(Fig. 13C)。
さらに、siAkt1/2 はインスリンによる CIDEA タンパク質の発現低下を抑制した(Fig. 9D, E)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによる
CIDEA の発現低下は Akt1/2 を介することが明らかとなった。
- 34 -A

B

CIDEA mRNA

-Insulin+Insulin

3.5

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

CIDEA mRNA

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
##

0.5

**

0.0
siControl (nM)

10

-

-

10

siAkt1 (nM)siAkt2 (nM)siAkt3 (nM)

C

-

-

siAkt2 (nM)siAkt3 (nM)**siControl (nM) 20

-

-

10

10

-

10

10

-

10

-

10

siAkt3 (nM)

-

-

10

10

siAkt1 (nM)siAkt2 (nM)

Akt2 mRNA-Insulin+Insulin

Relative mRNA levels

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

20

-

-

-

10

10

-

10

-

10

-

siControl (nM)siAkt1 (nM)

1010siAkt2 (nM)siAkt3 (nM)

20

-

-

-

10

10

10

-

10

E
siControl siAkt1/2

CIDEA
β-Actin

-

+

-

+

-Insulin+Insulin

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

-

siControl (nM)siAkt1 (nM)

1010siAkt2 (nM)siAkt3 (nM)

20

-

-

-

10

10

10

-

10

10
10

-Insulin+Insulin
Relative protein levels

D
Insulin

Akt3 mRNA-Insulin+Insulin

2.5

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

siControl (nM)siAkt1 (nM)##-

Akt1 mRNA
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

-Insulin+Insulin

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

#

*

siControlsiAkt1/2

Fig. 13. Depletion of both Akt1 and Akt2 enhances insulin-reduced CIDEA expression. A– C: Differentiated adipocytes were treated with control siRNA (siControl), Akt1 siRNA(siAkt1), Akt2 siRNA (siAkt2), and/or Akt3 siRNA (siAkt3) in maintenance medium for
7 days. Cells were then starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 hfollowed by stimulation with or without 100 nM insulin for 24 h. The mRNA expression
levels of CIDEA (A and B), Akt1, Akt2, and Akt3 (C) were measured by quantitative
real-time PCR, normalized relative to 18S rRNA expression, and are shown as relative
mRNA levels. Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. **,P < 0.01 vs. siControl without insulin; ##, P < 0.01 vs. siControl with insulin. D: Western- 35 -

blot analysis of CIDEA protein expression. Differentiated adipocytes were treated with
control siRNA or Akt1/2 siRNA in maintenance medium for 7 days. Cells were thenstarved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h followed by stimulation
with or without 100 nM insulin for 48 h. β-Actin served as a loading control. Theseexperiments were performed three times and the results of one representative experimentare shown. E: Quantification of protein expression levels of CIDEA. The protein
expression levels of CIDEA were normalized relative to β-Actin protein expression andare shown as relative protein levels. Data are presented as means ± SEM of three
independent experiments. *, P < 0.01 vs. siControl without insulin; #, P < 0.01 vs. 10 nM
siControl with insulin.

第 2 章でインスリンのアポトーシス抑制作用に CIDEA の発現低下が関与することが明らかとなったことから(32)、次に、インスリンのアポトーシス抑制作用に対する Akt の寄与を調べた。siAkt1/2 はインスリンによるアポトーシスの抑制を解除した(Fig. 14A, B)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによるアポトーシス抑制作用は Akt1/2 を介することが明らかとなった。

2-4.

イ ン ス リ ン に よ る CIDEC の 発 現 制 御 及 び 脂 肪 滴 形 成 作 用 に 対 す る
JNK2 の関与

インスリンによる CIDEC の発現制御に対する JNK の特異的な関与をより詳細に検証するため、JNK1 siRNA (siJNK1)及び JNK2 siRNA (siJNK2)を用いた検証を行った。JNK3 は中枢特異的に発現しているため(34)、検討は行わなかった。siJNK1は CIDEC の発現には影響しなかったが、siJNK2 及び siJNK1/2 はインスリンによる CIDEC の発現亢進を抑制した(Fig. 15A)。各 siRNA は JNK1 及び JNK2 の発現- 36 -

A
siControlsiAkt1/2-

Insulin

+

-

+

TUNEL

TUNEL
/DAPI
/Nile RedB
TUNEL positive adipocytes(% of total adipocytes)-Insulin
20##+Insulin

15
10
5

**

0

siControlsiAkt1/2

Fig. 14. Depletion of both Akt1 and Akt2 restores insulin-reduced apoptosis. A:
Fluorescence microscopy of adipocytes stained with TUNEL, DAPI, and Nile Red.
Differentiated adipocytes were treated with control siRNA (siControl) or Akt1/2 siRNA(siAkt1/2) in maintenance medium for 7 days. Cells were then incubated inserum/Dex-free maintenance medium in the presence or absence of 100 nM insulin for
48 h. Cells were triple-stained with TUNEL (green), DAPI (blue), and Nile Red (red).
TUNEL-positive adipocytes are indicated by the arrowheads. Scale bar, 50 μm. B:
Quantification of TUNEL-positive adipocytes. Data are presented as means ± SEM ofthree independent experiments. **, P < 0.01 vs. siControl without insulin; ##, P < 0.01 vs.
siControl with insulin.

- 37 -

量をそれぞれ特異的にノックダウンさせた(Fig. 15B)。さらに、siJNK2 はインスリンによる CIDEC タンパク質の発現亢進を抑制した(Fig. 15C, D)。
第 2 章でインスリンの脂肪滴形成作用に CIDEC の発現亢進が関与することが明らかとなったことから(32)、次に、インスリンの脂肪滴形成作用に対する JNKの寄与を調べた。siJNK2 はインスリンによる脂肪滴の肥大化を著明に抑制したが、siJNK1 は無影響であった(Fig. 16A, B)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによる CIDEC の発現亢進及び脂肪滴形成作用は、JNK1 ではなく
JNK2 を介することが明らかとなった。

A

CIDEC mRNA
-Insulin+Insulin

Relative mRNA levels

6
5

**

**

4
3

§§

##

2
1
0

siControl (nM)10-

siJNK1 (nM)

-

10

-

-

10

siJNK2 (nM)

B

20

-

-

10
10

JNK1 mRNA-Insulin+Insulin

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

siControl (nM)
siJNK1 (nM)
siJNK2 (nM)

-Insulin+Insulin

2.5

Relative mRNA levels

2.5

Relative mRNA levels

JNK2 mRNA

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

-

10

-

-

10

-

20

-

10

10
10

siControl (nM)
siJNK1 (nM)
siJNK2 (nM)

10-

Insulin
CIDEC

β-ActinsiControl

siJNK2

-

-

+

+

10

-

D
Relative protein levels

C

-

10

20

-

10
10

-Insulin+Insulin
2.5

**

2.0
1.5
1.0

##

0.5
0.0

siControl

siJNK2

Fig. 15. Depletion of JNK2, but not JNK1, attenuates insulin-induced CIDEC expression.
- 38 -

A and B: Differentiated adipocytes were treated with control siRNA (siControl), JNK1
siRNA (siJNK1), and/or JNK2 siRNA (siJNK2) in maintenance medium for 7 days. Cells
were then starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h followed bystimulation with or without 100 nM insulin for 24 h. The mRNA expression levels of
CIDEC (A), JNK1, and JNK2 (B) were measured by quantitative real-time PCR,
normalized relative to 18S rRNA expression, and are shown as relative mRNA levels.
Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. **, P < 0.01 vs.
siControl without insulin; ##, P < 0.01 vs. 10 nM siControl with insulin; §§, P < 0.01 vs.
20 nM siControl with insulin. C: Western blot analysis of CIDEC protein expression.
Differentiated adipocytes were treated with control siRNA or JNK2 siRNA in
maintenance medium for 7 days. Cells were then starved in serum/Dex/insulin-freemaintenance medium for 16 h followed by stimulation with or without 100 nM insulin
for 48 h. β-Actin served as a loading control. These experiments were performed threetimes and the results of one representative experiment are shown. D: Quantification ofprotein expression levels of CIDEC. The protein expression levels of CIDEC werenormalized relative to β-Actin protein expression and are shown as relative protein levels.
Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. **, P < 0.01 vs.
siControl without insulin; ##, P < 0.01 vs. 10 nM siControl with insulin.

- 39 -

A-

Insulin+siControl

siJNK1siJNK2

Lipid droplet size ( m2)

B
400
300

-Insulin+Insulin

**

200
##

100
0
siControl

siJNK1siJNK2

Fig. 16. Depletion of JNK2, but not JNK1, inhibits insulin-induced enlargement of lipid
droplets. A: Fluorescence microscopy of adipocytes stained with Nile Red and DAPI.
Differentiated adipocytes were treated with control siRNA (siControl), JNK1 siRNA(siJNK1), or JNK2 siRNA (siJNK2) in maintenance medium in the presence or absenceof 100 nM insulin for 15 days and then stained with Nile Red (red) and DAPI (blue).
Scale bar, 30 μm. B: Quantification of lipid droplet size. Data are presented as means ±SEM of three independent experiments. **, P < 0.01 vs. siControl without insulin; ##, P< 0.01 vs. siControl with insulin.
- 40 -

2-5.

インスリ ンに よる Akt 及び JNK リン酸化に 対する PI3K の関与

Akt 及び JNK が PI3K の下流シグナルかどうかを確かめるため、Akt 及 び
JNK リン酸化に対する PI3K 阻害剤の影響を調べた。30 分間の インスリン処置により、Akt Ser473、Akt Thr308 及び JNK リン酸化が著明に 誘導 さ れた(Fig. 17A)。インスリンによる Akt 及び JNK リン酸化は、wortmannin 或 い
は PI-103 のいずれでも阻害さ れた(Fig. 17B)。さらに、API-2 及び SP600125
は、それぞれインスリンによる JNK 及び Akt リン酸化に影響しなかった こと か ら、Akt 及び JNK の 活性化 は互いを 必要としないことが示唆された (Fig.
17C, D)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによる Akt
及 び JNK リン酸化は PI3K を介することが明らかとなった。

B

A
Insulin (min)

0

10

30

Insulin120

pAkt (Ser473)

Wort

PI

- + - + - +pAkt (Ser473)

pAkt (Thr308)

pAkt (Thr308)

Akt
Akt
pJNK
pJNK
JNK
JNK

C

InsulinD

API-2- + - +

Insulin

pJNK

pAkt (Ser473)

JNK

Akt

SP

- + - +

Fig. 17. PI3K inhibitors block both Akt and JNK phosphorylation induced by insulin. A:
Time course of insulin-induced Akt and JNK phosphorylation. Differentiated adipocytes
were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h followed by- 41 -

stimulation with or without 100 nM insulin for the indicated times. B: Effects of PI3K
inhibitors on insulin-induced Akt and JNK phosphorylation. Differentiated adipocytes
were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h. Cells were thentreated with 0.2 μM wortmannin (Wort) or 2 μM PI-103 (PI) for 30 min followed bystimulation with or without 100 nM insulin for 30 min. C: Effects of the Akt inhibitor on
insulin-induced JNK phosphorylation. Differentiated adipocytes were starved inserum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h. Cells were then treated with 30
μM API-2 for 30 min followed by stimulation with or without 100 nM insulin for 30 min.
D: Effects of the JNK inhibitor on insulin-induced Akt phosphorylation. Differentiatedadipocytes were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h. Cells
were then treated with 10 μM SP600125 (SP) for 30 min followed by stimulation with orwithout 100 nM insulin for 30 min. Akt Ser473, Akt Thr308, and JNK phosphorylation
were determined by Western blot analysis. Total Akt and total JNK served as a loading
control. Arrowheads indicate the 54-kDa isoform of JNK. These experiments were
performed three times and the results of one representative experiment are shown.

- 42 -

３． 考 察前章では、インスリンが CIDEA 及び CIDEC の発現制御に関わり、そ の
発現 制 御が イン ス リ ンの ア ポト ーシ ス 抑 制作 用 及び 脂肪 滴 形 成作 用 にそ れ
ぞれ選択的に関与することを明らかにし た(32)。本章では、ヒ ト白色脂肪細胞における インスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に関わ るシ グ
ナル経路に関する初めての証拠を提供した。はじめに、PI3K 阻害剤を用いた検討により、 インスリンによる CIDEA の発現低下及び CIDEC の発現亢
進 は PI3K を介することを明らかにした (Fig. 11)。インスリンによる CIDECの発現亢進 が PI3K を介することは、マウス 3T3-L1 脂肪細胞での報告とも一致してい る(35)。
次に、インスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御に PI3K の主要な下流シグナルである Akt 及び MAPK が寄与するかどうか、それぞれの選択的な阻害剤を用いて 調べた。 インスリンによる CIDEA の発現制御は ERK、JNK 及び p38 ではなく、Akt を介すること(Fig. 12)、さらに、Akt1、Akt2
及 び Akt3 のアイソフォームのうち、Akt1/2 を介すること が明らかとなった(Fig. 13)。このことから、Akt1 及び Akt2 は、インスリンによる CIDEA の発 現 制 御 に 対 し 、 重 複 し た 役 割 を 担 う こ と が 考 え ら れ た 。 さ ら に 、 Akt1/2
はインスリンによるアポトーシス抑制に関与することが明らかとなった(Fig. 14)。これらの結果と同様に、Akt1/2 の発現抑制は胸腺細胞のアポトー
シスを亢進させることが報告されている (36)。以上の結果から、インスリ ン/Akt1/2/CIDEA 経路はアポトーシス抑制に関与することが示唆された。
一方、インスリンによる CIDEC の発現制御は Akt、ERK 及び p38 では な
く 、JNK を介すること(Fig. 12)、さらに、JNK1 及び JNK2 のアイソフォー
ム の う ち 、JNK2 を 介 す る こ と が 明 ら か と な っ た (Fig. 15)。 さ ら に 、JNK1- 43 -

で はなく JNK2 がインスリンによる脂肪滴形成に関与することが初めて明らかとなった(Fig. 16)。以上の結果から、インスリン /JNK2/CIDEC 経路は 脂肪滴形成に関与することが示唆された。JNK2 は HeLa 細胞に おいて脂肪滴の恒常性維持に関わること が報告されている(37)。また、JNK1+/- JNK2+/+
ではなく JNK1+/- JNK2-/-表現型マウスが肥満及びインスリン抵抗性になりにくいことが報告されている (38)。これらの結果から、 JNK2 は肥満又は イ
ンス リン 抵 抗性 の よ うな 脂質 関 連疾 患 の 進展 に寄 与 する こ と が推 察さ れ る。
本章では、インスリンによる JNK リン酸化が PI3K を介することを明らかに し たが 、ヒ ト 白 色脂 肪 細胞 での そ の よう な 報告 は今 回 が 初め て であ る
(Fig. 17)。インスリンが PI3K を介して Akt 及び JNK を活性化させることは 、
他 の 細 胞 で は 既 に 報 告 さ れ て い る (39-41)。 本 章 で は 、 ヒ ト 白 色 脂 肪 細 胞 において、 インスリン/PI3K の下流に Akt 及び JNK シグナル 経路があり、それ ぞ れが PI3K 下流で分岐していること を明らかにした。CIDEA 及び CIDEC
は 、PI3K 下流で分岐した Akt1/2 及び JNK2 シグナル 経路 を介してインスリ
ンに よ り別 々に 制 御 され て おり 、そ れ 故 に 、 そ れぞ れ イ ン ス リン に よる ア
ポト ー シス 抑制 作 用 及び 脂 肪滴 形成 作 用 に選 択 的に 寄与 す る こと が 推測 され る(Fig. 18)。

- 44 -

Insulin
Human adipocyte

IR

PI3K

Akt1/2

JNK2

CIDEA

CIDEC

Apoptosis

Lipid droplet

Fig. 18. Hypothesis of insulin signaling pathways associated with the regulation of
CIDEA and CIDEC expression in human adipocytes. The regulation of CIDEA and
CIDEC expression by insulin is mediated by PI3K signaling. However, the insulin
signaling pathway involved in the regulation of CIDEA and CIDEC diverges into
different

pathwaysdownstream

of

PI3K.

Akt1/2

mediates

insulin-induced

downregulation of CIDEA, whereas JNK2 mediates insulin-induced upregulation of
CIDEC. The insulin regulation of CIDEA and CIDEC via different signaling pathways
would contribute separately to insulin-induced anti-apoptosis and lipid droplet formationin human adipocytes.

- 45 -

４ ．小括1)

ヒト白色脂肪細胞において、 インスリンによる CIDEA 及び CIDEC の発現制御はいずれも PI3K を介する。

2)

そ の 制 御 に 関 わ る シ グ ナ ル 経路 は PI3K 下 流 で 分 岐 し て お り 、 CIDEAの発現制御は Akt1/2、CIDEC の発現制御は JNK2 を介する。

3)インスリン/Akt1/2 経路はアポトーシスに関与する。

4)インスリン/JNK2 経路は脂肪滴形成に関与する。

- 46 -

第4章

インスリン /JNK2 経 路による脂 肪滴サイ ズの増大に 関与する 新規遺伝子の探 索前章では、 脂肪滴サイズ増大に関わる CIDEC の発現がインスリン /JNK2
経路により制御されることを明らかにし た(42)。本章では、脂 肪滴サイズの増大メカニズムをより詳細に明らかにするため、CIDEC 以外にも他の脂肪滴形成に関わる遺伝子がインスリン/JNK2 経路により制御されるかどうかをヒト全ゲノムマイクロアレイ解析及び Ingenuity pathway analysis (IPA)により網羅的に探索した。

１．実験方法
1-1. 材 料
DMEM/F-12 (1:1, vol/vol)は Invitrogen (Carlsbad, CA)から購入した。Human insulin
は Novo Nordisk (Bagsværd, Denmark) か ら 購 入 し た 。 Rosiglitazone は Alexis
Biochemicals (San Diego, CA) か ら 購 入 し た 。 3-Isobutyl-1-methylxanthine,
dexamethasone (Dex), pantothenate 及び anti-β-actin antibody は Sigma (St. Louis, MO)から購入した。Biotin は Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan)から購入した。
FBS は Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel)から購入した。Anti-sterol
regulatory element binding protein-1 (SREBP-1) antibody (H-160, sc-8984)は Santa
Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から購入した。Anti-JNK2 antibody は Cell
Signaling Technology (Beverly, MA)から購入した。

1-2. ヒト白色脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化 (Fig. 4)
インフォームド・コンセントの得られた 6 名の男性患者(Fig. 2 で使用)及び 6 名- 47 -

の女性患者(Fig. 1, 3 – 6 で使用)の皮下脂肪組織由来のヒト白色脂肪前駆細胞はZen-Bio (Research Triangle Park, NC)から購入した。6 名の男性患者は非喫煙者であり、Body mass index の平均値は 27.2 (range 26.4 – 28.4)、年齢の平均値は 41 歳(range
29 – 57)であった。6 名の女性患者は非喫煙者であり、Body mass index の平均値は27.9 (range 25.7 – 29.9)、年齢の平均値は 40 歳(range 29 – 52)であった。ヒト脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化は上述(第 2 章、1-2)のように行った。

1-3. siRNA 解析
siRNA 解析は上述 (第 2 章、1-5)のように行った。分化脂肪細胞に Lipofectamine
RNAiMAX (Invitrogen)を用いて、各 10 nM の Control siRNA (12935-114; Invitrogen),
JNK1 siRNA (12936-42 Duplex1; Invitrogen), JNK2 siRNA (12936-44 Duplex1;
Invitrogen)或いは SREBP1 siRNA (HSS110187)をトランスフェクトした。トランス
フェクションはアッセイまで 5 日間に 1 度行った。

1-4. マイクロアレイ解析
3 回 の 独 立 し た 実 験 か ら 調 製 し た RNA を そ れ ぞ れ 等 量 ず つ 混 合 し 、
two-color マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 (Agilent whole-human genome 4×44K array
platform; Agilent Technologies, Santa Clara, CA)に使用した。遺伝子発現プロファ
イルの比較解析は GeneSpring GX 11.5.1 (Agilent Technologies)を用いて行った。
フィルタリングにより変動遺伝子のリストを作成した(Flag: detected; Filter byexpression: signal intensity > 80; fold change > 1.2)。さらに、階層的クラスター分析
により発現プロファイルの類似した遺伝子を集めて系統樹を作成した(uncentered
Pearson correlation, average linkage method)。

- 48 -

1-5. Ingenuity pathway analysis (IPA)
Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com)を用いて、選択した遺伝子群が関与する 細胞機能及び上流転写調節因子を予測した。

1-6. リアルタイム定量 PCR
リアルタイム定量 PCR は上述(第 2 章、1-3)のように行った。各遺伝子のTaqMan gene expression assay system は以下に示すものを Applied Biosystems から購入した。ATP citrate lyase (ACLY; Hs00982738_m1), acetyl-CoA carboxylase 1 (ACC1;
Hs01046047_m1), fatty acid synthase (FAS; Hs00188012_m1), CIDEC mRNA
(Hs00535723_m1)及び 18S rRNA (Hs99999901_s1)。Sterol regulatory element binding
protein-1c (SREBP-1c) mRNA のプライマー及びプローブ配列は以下の通りであった(forward primer, 5' CCATGGATTGCACTTTCGAA 3'; reverse primer, 5' CCAGCATA
GGGTGGGTCAAA 3'; probe, 5' TATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGC 3')。

1-7. ウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析は上述 (第 2 章、1-4)のように行った。細胞質及 び
核抽出液の調製は NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagent kit (Thermo
Fisher Scientific, Waltham, MA)を用いて行った。細胞質抽出液(15 μg)及び核抽出液(5 μg)を 7.5% – 10% SDS-polyacrylamide gels で電気泳動した後、Immobilon-P
membrane (Millipore Corporation, Bedford, MA)へタンパク質をトランスファーした。
Membrane は 5% BSA 含有 TBS/0.05% Tween-20 で 1 時間ブロッキングし、SREBP-1,
JNK2 或いは β-actin に特異的な抗体を用いてオーバーナイト、4°C でインキュベートした。その後、Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody (GEHealthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)を用いて 1 時間インキュベートし、- 49 -

ECL detection reagents (GE Healthcare)を用いてタンパク質を可視化した。

1-8. 共焦点免疫蛍光顕微鏡法
細 胞 を 上 述 (第 2 章、1-6)の よ う に 固 定 ・ 浸 透 化 し た 。 浸透化後、細胞をImage-iT FX Signal Enhancer (Invitrogen)を用いて 30 分間、室温でブロッキングし、
polyclonal SREBP-1 antibody (H-160, 2 μg/ml)を用いて overnight、4°C でインキュベートした。次に、細胞を Alexa-488-conjugated goat anti-rabbit IgG を用いて 1 時間、室温でインキュベートし、0.2 μg/ml DAPI/PBS を用いて 5 分間、室温でインキュベートした。その後、細胞を 3 回洗浄したのち、ProLong Gold Antifade Reagent(Invitrogen)を用いてスライドガラス上にマウントし、共焦点レーザー顕微鏡(LSM
700; Carl Zeiss, Jena, Germany)で可視化した。顕微鏡写真は×63 の倍率で SREBP-1
は緑、DAPI は青で取得し、ZEN software (Carl Zeiss)を用いてマージさせた。

1-9. de novo 脂肪酸合成の解 析
分化脂肪細胞を serum/Dex/insulin 不含維持培地で 16 時間インキュベートした
後、100 nM インスリンを添加し、24 時間反応させた。さらに、細胞を 1.5 μCi/ml[1-14C]-acetate (New England Nuclear, Boston, MA)及び cold acetic acid (500 μM)含有の同様の培地を用いて 2 時間、37°C でインキュベートした。 その後、細胞を15% KOH/ethanol を用いて可溶化した後 、細胞懸濁液を 2 時間、85°C でインキュベートすることでアルカリ加水分解した。次に、石油エーテルを添加し、上層の非極性の脂質成分を抽出・除去した。次に、塩酸を添加したのち、石油エーテ
ルを添加し、極性の脂質成分(fatty acids)を回収し、乾固した。乾固物をメタノー
ルで溶解し、ULTIMA Gold MV scintillation cocktail (PerkinElmer, Waltham, MA)を添加して、放射線量を液体シンチレーションカウンター(Packard Instrument Company,- 50 -

Meriden, CT)で測定した。結果は nanomoles of fatty acid per hour per milligram ofprotein として表した。

1-10. 共免疫沈降法
共免疫沈降法は Catch and Release Reversible v2.0 Immunoprecipiation System(Millipore Corporation)を用いて行った。細胞を 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM
NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM
β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 µg/ml leupeptin, 50 μM MG-132 及び 1 mM
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)含有 Lysis buffer を用いて可溶化した。可溶性
画分のタンパク質(500 μg)を JNK2 に特異的な抗体を用いて overnight 、4°C でインキュベートし、免疫沈降物をウエスタンブロット法により解析した。

1-11. 統計解析
統計解析は Unpaired t test を実施した。棄却率 5%未満を有意とした。結果は
3 回の独立した実験の 平均値±標準誤差で表した。

- 51 -

２ ．結果1-1.

インスリン /JNK2 経 路により制 御される 遺伝子の網 羅的探索

インスリン/JNK2 経路により特異的に制御される遺伝子を網羅的に探索するため、ヒト全ゲノムマイクロアレイ解析を行った。インスリン、siJNK1/インスリン及び siJNK2/インスリン添加群で発現が 1.2 倍以上変動した遺伝子について、階層的クラスター分析を行った。興味深いことに、各群はそれぞれ異なる遺伝子発現
プロファイルを示した(Fig. 19A)。インスリン添加群で発現が亢進した 3,152 遺伝子のうち、455 遺伝子が siJNK2/インスリン添加群で特異的に発現が低下した(Fig.
19B)。また、インスリンで発現低下した 3,032 遺伝子のうち、361 遺伝子が siJNK2/インスリン添加群で特異的に発現が亢進した(Fig. 19C)。これらの遺伝子群(455 及
び 361 遺伝子)はインスリン/JNK2 経路により特異的に制御される遺伝子群である
ことが示唆された。
次に、IPA を用いて、インスリン/JNK2 経路により特異的に発現制御される 816
遺伝子が関与する細胞機能を調べた。インスリン/JNK2 経路は脂質代謝に関わる遺伝子の発現を主に制御し(Table. 1)、8 遺伝子は脂質代謝カテゴリーのトリグリセリド合成に有意に関与することが判明した(z-score < -2; Table. 2)。さらに、肝細胞における脂肪酸合成のマスターレギュレーター転写因子として知られる Sterol
regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1, SREBF1)がこれら遺伝子の主要な転写調節因子であることが予測された(z-score -4.119; Table. 3)。対照的に、インスリ
ン/JNK1 経路により特異的に発現制御される 868 遺伝子では、これらの機能カテゴリーを示さなかった。以上の結果から、インスリン/JNK2 経路は脂質代謝に関わる遺伝子の発現を主に制御することが明らかとなった。

- 52 -A

B
siJNK1/insulin

siJNK2/insulin

745

1,891

3,097

168
418

455
2,111

InsulinC
siJNK1/insulin

siJNK2/insulin

894

1,953

2,732
142

450

361
2,079
InsulinsiJNK1/insulin

siJNK2/insulin-1.60Insulin+1.6

Fold change (Log2)

Fig. 19. Global analysis of gene expression regulated by insulin/JNK1- orinsulin/JNK2-dependent pathways. A: Hierarchical cluster analysis of upregulated or
downregulated genes. Differentiated adipocytes were treated with control siRNA(siControl), JNK1 siRNA (siJNK1), or JNK2 siRNA (siJNK2) in maintenance medium
for 7 days. Cells were then starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for
16 h followed by stimulation with or without 100 nM insulin for 24 h. Fold changes were
calculated using changes in gene expression in siJNK1 or siJNK2 with insulin comparedto siControl with insulin (siJNK1/insulin or siJNK2/insulin), and insulin compared to- 53 -

control (Insulin). Expression values are presented as Log2 scale using different
gradations of red for genes upregulated by ≥ 1.2-fold, and blue for genes downregulatedby ≥ 1.2-fold. B and C: Venn diagram illustrating overlapping upregulated (↑) and/or
downregulated (↓) genes in siJNK1/insulin (blue), siJNK2/insulin (green), and insulin(red). Lists of siJNK2-specific insulin-response genes (yellow regions) were integrated
into the IPA (Tables 1 – 3).

Table. 1. Top five bio-functions of genes regulated by an insulin/
JNK2-dependent pathway analyzed by Ingenuity Pathway Analysis.
Molecular and Cellular Functions
Category

p-value1

Lipid Metabolism

3.84E-09-1.64E-02

2

Small Molecule Biochemistry

3.84E-09-1.64E-02

3Cellular Growth and Proliferation

6.52E-08-1.37E-02

4

Vitamin and Mineral Metabolism

1.68E-07-1.37E-02

5Cellular Development

1.55E-06-1.56E-02

Table. 2. Functional annotation of genes regulated by an insulin/JNK2-dependent pathway.

Category

FunctionsAnnotation

p-Value

Predicted
Activation
State

Regulation
z-scoreMolecules

Lipid
Metabolism

Synthesis of
triacylglycerol

8.38E-05

Decreased-2.005

AGPAT6,FASN,LPL,
NR1H3,PLIN2,PPARG,
SCD,SREBF1

Table. 3. Predicted transcription regulator of genes regulated by an insulin/JNK2-dependent pathway.
Transcription
Regulator

SREBF1

Foldchange-1.499Predicted
Activation
State

Inhibited

Regulation
z-score-4.119- 54 -

p-value ofoverlap

Target molecules in dataset

1.22E-12

AACS,AARS,ACACA,ACACB,ACLY,ACSS2,ALDOC,DBI,DHCR7,ELOVL6,FASN,FDPS,G6PD,IDI1,
IMMT,INSIG1,IRS2,LDLR,LPL,
LSS,MVD,NR1H3,NSDHL,PPARG,
SCD,SREBF1,TMEM97

1-2.

インスリン /JNK2 経 路による SREBP-1c の発現制御

SREBP-1 は SREBP-1a 及び SREBP-1c のアイソフォームが存在するが、脂肪細胞では SREBP-1c の発現量が多いことが知られている(43)。そこで、SREBP-1c の発現がインスリン/JNK2 経路により制御されるかどうかをリアルタイム定量 PCR法で調べた。インスリンは SREBP-1c mRNA の発現を時間依存的且つ濃度依存的且つに亢進させ、24 時間及び 100 nM で最大効果を示した(Fig. 20A, B)。

B

SREBP-1c mRNA
- Insulin+ Insulin

**

*

1.5

**

1.0

**

3.0

Relative mRNA levels

2.0

**

0.5

*

2.5

**
*

2.0
1.5
1.0
0.5

12

24

36

0.
1

0

48

Time (h)

Fig.

20.

Insulinincreases

10
00

0.0

0.0

10
10
0

Relative mRNA levels

SREBP-1c mRNA

1

A

Insulin (nM)

SREBP-1c

mRNA expression

in

a

time-

and

concentration-dependent manner. A: Time course of insulin-regulated SREBP-1c mRNA
expression.

Differentiatedadipocytes

werestarvedinserum/Dex/insulin-freemaintenance medium for 16 h and then incubated in serum/Dex-free maintenancemedium in the presence or absence of 100 nM insulin for the indicated times. B:
Concentration – response

effectofinsulinon

SREBP-1c

mRNA expression.

Differentiated adipocytes were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium
for 16 h and then incubated in serum/Dex-free maintenance medium in the presence orabsence of insulin at the indicated concentrations for 24 h. The mRNA expression levels- 55 -

of SREBP-1c were measured by quantitative real-time PCR. Data are presented as means± SEM of three independent experiments. * P < 0.05, ** P < 0.01.

次に、インスリンによる SREBP-1c の発現制御に対する JNK の寄与を調べた。
JNK 阻害剤 SP600125 はインスリンによる SREBP-1c の発現亢進を濃度依存的に抑制した(Fig. 21A)。siJNK1 は SREBP-1c の発現に影響しなかったが、siJNK2 はインスリンによる SREBP-1c の発現亢進を抑制した(Fig. 21B)。各 siRNA は JNK1及び JNK2 mRNA の発現量をそれぞれ特異的にノックダウンさせた(Fig. 21C)。さらに、SREBP-1 は前駆体 SREBP-1 タンパク質(pre-SREBP-1; ～125 kDa)及び活性型である核型 SREBP-1 タンパク質(n-SREBP-1; ～68kDa)が存在することが知られているため、双方の発現をウエスタンブロット法により調べた。インスリンはpre-SREBP-1 及び n-SREBP-1 タンパク質の双方の発現を顕著に亢進させたが、siJNK2 はこれを顕著に抑制した(Fig. 21D)。siJNK2 は JNK2 タンパク質の発現量を特異的にノックダウンさせた。以上の結果から、SREBP-1c の発現はインスリ
ン/JNK2 経路により制御されることが明らかとなった。

- 56 -

A

B

12-Insulin+Insulin

810Relative mRNA levels

**

8
6
4

##

2

##

0

Insulin (100 nM)
SP600125 (μM)

**

6
4

##

2
0

-

C

+ + + +
- 1 3 10siControl siJNK1 siJNK2

JNK1 mRNAJNK2 mRNA-Insulin+Insulin

2.5

Relative mRNA levels

SREBP-1c mRNA

-Insulin+Insulin

2.5

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

SREBP-1c mRNA

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

siControl siJNK1 siJNK2

siControl siJNK1 siJNK2

D+-

pre-SREBP-1 protein+

Cytoplasmic extracts

pre-SREBP-1
JNK2
β-actin
Nuclear extracts

n-SREBP-1

16

Relative protein levels-

Insulin**

14

n-SREBP-1 protein-Insulin+Insulin

6

Relative protein levels

siControl siJNK2

12
10
8
6

##

4
2

-Insulin+Insulin

**

5
4
3
#

2
1
0

0

siControl

siJNK2siControl

siJNK2

Fig. 21. Depletion of JNK2, but not JNK1, attenuates insulin-induced SREBP-1c
expression. A: Concentration – response effect of the JNK inhibitor on SREBP-1c mRNA
expression.

Differentiatedadipocytes

werestarvedinserum/Dex/insulin-freemaintenance medium for 16 h. Cells were then treated with SP600125 at the indicatedconcentrations for 30 min followed by stimulation with or without 100 nM insulin for 24
h. Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. ** P < 0.01 vs.
control without insulin; ## P < 0.01 vs. control with insulin. B and C: Effects of JNK1 or- 57 -

JNK2 depletion on mRNA expression of SREBP-1c (B), JNK1, and JNK2 (C).
Differentiated adipocytes were treated with control siRNA (siControl), JNK1 siRNA(siJNK1), or JNK2 siRNA (siJNK2) in maintenance medium for 7 days. Cells were thenstarved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h followed by stimulation
with or without 100 nM insulin for 24 h. Data are presented as means ± SEM of three
independent experiments. ** P < 0.01 vs. siControl without insulin; ## P < 0.01 vs.
siControl with insulin. D: Western blot analysis of pre-SREBP-1 (~125 kDa) andn-SREBP-1 (~68 kDa) protein expression in cytoplasmic and nuclear extracts,
respectively. β-actin served as a loading control. An arrowhead indicates the 54-kDa
isoform of JNK2. These experiments were performed three times and the results of one
representative experiment are shown. The expression levels of each protein werenormalized relative to β-actin protein expression and are shown as relative protein levels.
Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. ** P < 0.01 vs.
siControl without insulin; # P < 0.05, ## P < 0.01 vs. siControl with insulin.

1-3.

インスリン による脂 肪酸合成の 亢進に対 する JNK2 の関与

肝細胞においては、 インスリンは SREBP-1c を介して その標的遺伝子である ACLY、ACC1、FAS 及び SCD1 などの脂肪酸合成関連酵素の発現 を 誘
導し 、de novo 脂肪酸合成を亢進させることがよく知られてい るが、JNK2がこの経路に関与するかどうかは知られていない (Fig. 22) (44)。

- 58 -

Glucose

Fatty acidインスリン
Citrate脂肪酸合成に関わる
中心的な転写因子

Acetyl-CoA

SREBP-1cMalonyl-CoA
Fatty acyl-CoA

TriglycerideFig. 22. 肝細胞におけるインスリンによる de novo 脂肪酸合成亢進作用

そ こ で、 インスリン /JNK2 経路が脂肪酸 合成に関わる酵素 で ある ACLY、
ACC1、FAS 及び SCD1 の発現制御に関与するかどうかを調べた。インスリ
ン は ACLY、ACC1、FAS 及び SCD1 mRNA の発現を顕著に亢進させた (Fig.
23A)。siJNK1 は ACLY、ACC1、FAS 及び SCD1 の発現に影響しなかったが、
siJNK2 は イ ン ス リ ン に よ る こ れ ら 遺 伝 子 の 発 現 亢 進 を 減 弱 さ せ た (Fig.
23A)。次に、de novo 脂肪酸合成に対する JNK2 の関与を調べた。インスリン は de novo 脂肪酸合成を顕著に亢進させたが、 siJNK2 はこれを抑制した(Fig. 23B)。siJNK1 は de novo 脂肪酸合成に影響しなかった。 以上の結果から、インスリンによる脂肪酸合成関連酵素の発現亢進及び de novo 脂肪酸合成の亢進は、JNK2 が関与することが明らかとなった。

- 59 -

AC C 1 mR N A

14+Insulin

12
10

**

8
6
##

4
2

FAS mR N A

7+Insulin

6
5
4

**
##

3
2
1
0

0

siControl siJNK1

siJNK2

SCD1 mRNA-Insulin-Insulin

7+Insulin

6
5

**

4
3

##

2
1

siJNK2+Insulin

7
6
5

**
#

4
3
2
1
0

0

siControl siJNK1-Insulin
8

Relative mRNA levels-Insulin
Relative mRNA levels

Rel at i ve m RNA l evel s

AC LY mR N A

Relative mRNA levels

A

siControl siJNK1

siJNK2siControl siJNK1

siJNK2B-Insulin

Fatty acid synthesis(nmol/h/mg protein)50+Insulin

**

40
30
20

##

10
0

siControl

siJNK1siJNK2

Fig. 23. Depletion of JNK2, but not JNK1, attenuates insulin-induced upregulation of
SREBP-1c target genes and increase of fatty acid synthesis. A: Effects of JNK1 or JNK2
depletion on SREBP-1c target gene expression. Differentiated adipocytes were treatedwith control siRNA (siControl), JNK1 siRNA (siJNK1), or JNK2 siRNA (siJNK2) inmaintenance medium for 7 days. Cells were then starved in serum/Dex/insulin-freemaintenance medium for 16 h followed by stimulation with or without 100 nM insulinfor 24 h. The mRNA expression levels of each gene were measured by quantitative
real-time PCR. Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. **P < 0.01 vs. siControl without insulin; ## P < 0.01 vs. siControl with insulin. B: Analysis
of fatty acid synthesis. Data are presented as means ± SEM of three independent
experiments. ** P < 0.01 vs. siControl without insulin; ## P < 0.01 vs. siControl withinsulin.

1-4.

インスリン による 脂 肪酸合成 の 亢進に対 する SREBP-1c の 関 与

肝細 胞にお いては 、SREBP-1c は標 的 遺伝子 であ る ACLY、ACC1、FAS
及 び SCD1 などの脂肪酸合成関連酵素の発現 を誘導し、de novo 脂肪酸合 成- 60 -

を亢 進させることがよく知ら れてい るが(44)、脂肪細胞における SREBP-1cの作用は明らかではない。そこで、ヒト白色脂肪細胞において、SREBP-1cが脂 肪 酸合 成関 連 酵 素の 発 現制 御及 び 脂 肪酸 合 成に 寄与 す る かど う かを 調
べた。SREBP-1 siRNA (siSREBP-1)は、インスリンによる ACLY、ACC1、FAS
及 び SCD1 の発現亢進を減弱させた (Fig. 24A)。さらに、siSREBP-1 はイ ン
スリンによる de novo 脂肪酸合成の亢進を減弱させた (Fig. 24B)。これらの結 果 か ら、 イ ン ス リ ン に よ る脂 肪 酸 合 成 関 連 酵 素の 発 現 亢 進 及 び de novo
脂肪酸合成の亢進は、 SREBP-1 が関与することが明らかとなった。

2.5
2.0

#

1.5
1.0
0.5

siControl

siSREBP1

SREBP-1c mRNA

#

1.5
1.0
0.5

+Insulin

6
5
4
3
2
1

**

6

+Insulin

5
4

#

3
2
1
0

siControl

siSREBP1-Insulin

4**+Insulin3210siControl

siSREBP1

siControl

siSREBP1

C-Insulin

7

Relative mRNA levels

2.0

SCD1 mRNA-Insulin

7+Insulin

**

0.0

0.0

B

-Insulin

2.5

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels+Insulin**

FAS mRNA
Relative mRNA levels-Insulin

3.5
3.0

ACC1 mRNA
Relative mRNA levels

ACLY mRNA-Insulin50

Fatty acid synthesis(nmol/h/mg protein)A

40+Insulin

**

30
##

20
10
0

0

siControl

siSREBP1

siControl

siSREBP1

Fig. 24. Depletion of SREBP-1 attenuates insulin-induced upregulation of lipogenic
enzymes and fatty acid synthesis. A and B: Effects of SREBP-1c depletion on expressionof lipogenic enzymes. Differentiated adipocytes were treated with control siRNA(siControl), or SREBP-1 siRNA (siSREBP-1) in maintenance medium for 7 days. Cells
were then starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium for 16 h followed bystimulation with or without 100 nM insulin for 24 h. The mRNA expression levels of- 61 -

lipogenic enzymes (A) and SREBP-1c (B) were measured by quantitative real-time PCR.
Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. ** P < 0.01 vs.
siControl without insulin; # P < 0.05 vs. siControl with insulin. C: Analysis of fatty acidsynthesis. Data are presented as means ± SEM of three independent experiments. ** P <0.01 vs. siControl without insulin; ## P < 0.01 vs. siControl with insulin.

1-5.

イ ン ス リ ン に よ る SREBP-1 プ ロ セ シ ン グ 及 び 核 内 移 行 に 対 す る
JNK2 の関与

SREBP-1 の活性は細胞内局在に依存すると考えられている(45)。SREBP-1 は
pre-SREBP-1 として合成され、小胞体膜上に局在する。この pre-SREBP-1 はCoatomer protein II 小胞に結合してゴルジ装置へと移行し、そこで 2 段階の切断(プロセシング)を受ける。遊離した活性型の n-SREBP-1 は核へと移行し、自身と標的遺伝子の転写を調節することが知られている。そこで、SREBP-1 の細胞内局在性をウエスタンブロット法及び共焦点免疫蛍光顕微鏡法により調べた。1 時間のインスリン処置により、細胞質画分の pre-SREBP-1 タンパク質量は低下し、核画分の n-SREBP-1 タンパク質量は亢進した(Fig. 25A)。siJNK2 はインスリンによる
核内 n-SREBP-1 タンパク質量の亢進を抑制した(Fig. 25A)。SREBP-1 の著明な染色像はインスリンを添加した脂肪細胞の核で主に観察されたが、siJNK2 はこれを抑制した(Fig. 25B)。同様の条件で、非免疫 IgG では蛍光染色像が検出されなかったことから、SREBP-1 の染色シグナルは特異的であったと考えられた(data notshown)。以上の結果から、インスリンによる SREBP-1 プロセシング及び核内移行の誘導は JNK2 を介することが明らかとなった。
最後に、JNK2 がどのように SREBP-1 のプロセシング及び発現制御に関与するのかを知るため、 JNK2 が SREBP-1 とタンパク質複合体を形成する- 62 -

A

n-SREBP-1 protein

siControl siJNK2Cytoplasmic extracts

-

+

-

+

-Insulin+Insulin

10

Relative protein levels

Insulinpre-SREBP-1
JNK2
β-actin
Nuclear extracts

n-SREBP-1

**
8
6
4
2

##

0

siControl

B

siControl
Insulin-siJNK2

siJNK2++SREBP-1

SREBP-1/DAPI

DIC

Fig. 25. Depletion of JNK2 inhibits insulin-induced SREBP-1 cleavage processing andnuclear translocation. A: Western blot analysis of pre-SREBP-1 and n-SREBP-1 protein
expression in cytoplasmic and nuclear extracts, respectively. Differentiated adipocytes
were treated with control siRNA (siControl) or JNK2 siRNA (siJNK2) in maintenancemedium for 7 days. Cells were then starved in serum/Dex/insulin-free maintenancemedium for 16 h followed by stimulation with or without 100 nM insulin for 1 h. β-actin- 63 -

served as a loading control. An arrowhead indicates the 54-kDa isoform of JNK2. Theseexperiments were performed three times and the results of one representative experimentare shown. The protein expression levels of n-SREBP-1 were normalized relative toβ-actin protein expression and are shown as relative protein levels. Data are presented asmeans ± SEM of three independent experiments. ** P < 0.01 vs. siControl without
insulin; ## P < 0.01 vs. siControl with insulin. B: Confocal immunofluorescencemicroscopy of adipocytes stained with SREBP-1 (green) and DAPI (blue). Scale bar, 30
μm.

かど う かを 共免 疫 沈 降法 及 びウ エス タ ン ブロ ッ ト法 によ り 調 べた 。 興味 深いことに、30 分間インスリンを処置した細胞から調製した 可溶化液にお いて、pre-SREBP-1 タンパク質 は JNK2 タンパク質 と共免疫沈降した(Fig. 26)。
この結果は、JNK リン酸化が 30 分間のインスリン処置により亢進するという前章の結果からも支持される。 Normal IgG を用いたコントロール実験では 、このような 共免疫沈降は観察されなかった。以上の結果から、JNK2 はインスリンに反応して、 pre-SREBP-1 と相互作用することが示唆された。

IP:

IgG

JNK2

LysatesInsulin

-

-

-

+

+

WB: pre-SREBP-1
WB: JNK2

Fig. 26. JNK2 associates with the precursor forms of SREBP-1 in response to insulin.
Differentiated adipocytes were starved in serum/Dex/insulin-free maintenance medium
for 16 h followed by stimulation with or without 100 nM insulin for 30 min. Endogenous- 64 -

JNK2 protein from cell lysates was immunoprecipitated with JNK2 antibody, followed
by immunoblots with SREBP-1 and JNK2 antibodies as indicated. An arrowhead
indicates the 54-kDa isoform of JNK2. These experiments were performed three times
and the results of one representative experiment are shown.

- 65 -

３ ．考察
本章で は 、 ヒ ト白 色脂肪細 胞にお いて 、インス リン /JNK2 経路によ り特異的 に 制御 され る 遺 伝子 の 網羅 解析 に 関 する 初 めて の証 拠 を 提供 し た。 マ
イクロアレイ解析及び IPA により、インスリン/JNK2 経路は主に脂質代謝に 関 わる遺伝子の発 現を制御すること が 明らか となった(Fig. 19; Tables 1,2)。さらに、肝細胞における脂肪酸合成のマスターレギュレーター であり、
脂肪 肝 やイ ンス リ ン 抵抗 性 など の様 々 な 病態 に 関与 する こ と が 知 ら れ て い
る SREBP-1 が(44, 46)、 インスリン/JNK2 経路により 制御される遺伝子の主
要な転写調節因子であることが予測された(Table 3)。そこで、SREBP-1 の-1a 及び1c のアイソフォームのうち、脂肪細胞で発現量の多い SREBP-1c の発現制御について調べたところ、インスリン/JNK2 経路は SREBP-1c の発現亢進に関与することが明らかとなった(Figs. 20, 21)。インスリンによる SREBP-1c の発現及び活性は、肝細胞では Akt、Protein kinase A、Protein kinase C 及び Insulin-induced gene-2 などの経路により制御されることが知られている(47-51)。これらの知見から、インス
リンは様々な細胞状況に依存した個々のシグナル経路を介して、SREBP-1c の発現を制御することが示唆された。
次 に 、siRNA を用いた JNK2 の遺伝子ノックダウン法により、 インスリンによる脂肪酸合成関連酵素の発現亢進及び de novo 脂肪酸合成の亢進は、
JNK2 が関与することが 初めて 明らかとなった(Fig. 23)。また、SREBP-1 は肝細胞での作用と同様に、ヒト白色脂肪細胞においても脂肪酸合成関連酵
素の発現誘導及び de novo 脂肪酸合成の亢進に関与することが明らかとなっ た(Fig. 24)。以上の結果から、ヒト白色脂肪細胞において、インスリン/JNK2 経路は SREBP-1c 及びその標的である脂肪酸合成関連酵素の発現亢
進を介して、de novo 脂肪酸合成の亢進に寄与することが示唆された (Fig.
- 66 -

Insulin
Human adipocyte

IR

PI3K

Akt1/2

JNK2

CIDEA

CIDEC

Apoptosis

Lipid droplet

SREBP-1c
ACLY, ACC1, FAS, SCD1
脂肪酸合成

Fig. 27. ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによる de novo 脂肪酸合成に関与する新規 JNK2/SREBP-1c 経路

27)。本 章で の ヒト 白色 脂 肪細 胞に お け るイ ン スリ ン /JNK2/SREBP-1c 経 路の作用と 類似して、H292 細胞では、JNK/SREBP-1 経路が Keratinocyte growth
factor に よ る 脂 肪 酸 合 成 関 連 酵 素 の 発 現 誘 導 に 関 わ る こ と が 報 告 さ れ て いる(52)。
次 に、SREBP-1 の活性は細胞内局在に依存すると考えられていることから(45)、
SREBP-1 の 細 胞 内 局 在 変 化 を 調 べ た と こ ろ 、 JNK2 は イ ン ス リ ン に よ る
SREBP-1 プロセシング及び核 内移行に関与することが明らかとなった (Fig.
25)。以上の結果から、JNK2 はインスリンによる SREBP-1 のプロセシング
及び発現亢進の双方に関与することが示された。 SREBP-1 のプロセシング
及び発現制御メカニズムに関する更なる知見を得るため、JNK2 と SREBP-1の相互作用を調べたところ、 JNK2 はインスリンに反応して、 pre-SREBP-1と相互作用することが判明した (Fig. 26)。これまでの ヒト細胞を用いた 報 告- 67 -

か ら 、n-SREBP-1 は SREBP-1c 遺伝子プロモーター上に存在する SRE を 介した オ ート レギ ュ レ ーシ ョ ンの 機構 に よ り、 自 身 の 発現 を 調 節す る こと が報告されている(53)。このことから、SREBP-1 プロセシングの亢進は核内のn-SREBP-1 タンパク 質量を増加 させ、その結果、SREBP-1c の発現を亢進 させることが考えられる。また、インスリンはラット肝細胞においてpre-SREBP-1c のリン酸化を促進 することにより、SREBP-1c のプロセシ ン
グを亢進させること や(54)、ERK、JNK 及び p38 MAPK が SREBP-1a をリン酸 化 することが報 告 されている (55)。 以上の 知見から、JNK2 は SREBP-1a
或いは SREBP-1c の活性を直接刺激し、そのプロセシング及び核内移行を亢進させることにより、インスリンによる SREBP-1c の発現制御に寄与することが推測された (Fig. 28)。
前章では、JNK2 はインスリンによる CIDEC の発現亢進及び脂肪滴の肥大 化 に 関 わ る こ と を 示 し た (42)。 本 章 で は 、 JNK2 は イ ン ス リ ン に よ る
SREBP-1c の発現亢進及び脂肪酸合成の亢進に関わることを示した。そこで、転写因子 SREBP-1 が CIDEC の発現制御に関与す るかどうかを調べたとこ
ろ 、siRNA による SREBP-1 の発現抑制はインスリンによる CIDEC の発 現
亢進に影響しなかった (data not shown)。このことから、SREBP-1 は CIDECの発現制御に関与しないことが示唆された。 CIDEC の安定化はトリグリセ
リ ド 合 成 及 び 脂 肪 滴 形 成 と 関 連 す る こ と が 報 告 さ れ て い る (56)。 従 っ て 、
JNK2 による脂肪滴サイズの 制御は、少なくとも部分的には SREBP-1c に よる de novo 脂肪酸合成とそれに付随する CIDEC の発現制御により 調節されていると推定される 。また、JNK2/SREBP-1c 経路の de novo 脂肪酸合成に対する寄与は部分的であったことから、JNK2 による脂肪滴サイズの制御は 、他 の脂肪生成 経路 も関与している 可能性が 推察される 。
- 68 -

Insulin
JNK2

pre-SREBP-1c
プロセシング
Cytosol
Nucleusn-SREBP-1c

核内移行
n-SREBP-1c
転写調節
mRNA

SRE

SREBP-1c

Fig. 28. ヒト白色脂肪細胞における JNK2 による SREBP-1c の発現制御メカ
ニズムの仮説- 69 -

４ ．小括1)

ヒト白色脂肪細胞において、インスリン/JNK2 経路は脂質代謝関連遺伝
子の発現を主に制御する。

2)

インスリン/JNK2 経路の新規制御遺伝子として SREBP-1c が見出され た 。

3)

JNK2/SREBP-1c 経路はインスリンによる脂肪酸合成の亢進に関与する。
これは脂肪滴サイズの増大メカニズムの一部と考えられ る。

- 70 -

総括
第 2 章では、ヒト白色脂肪細胞におけるインスリンによる CIDEA 及 び
CIDEC の 発 現 制 御 を 同 定 し 、 イ ン ス リ ン の ア ポ ト ー シ ス 抑 制 作 用 に は
CIDEA の発現低下が、脂肪滴形成作用に は CIDEC の発現亢進がそれぞれ選
択的 に関 与す るこ と を明 らか に し た (32)。第 3 章で は、 イ ンス リン によ る
CIDEA 及び CIDEC の発現制御に関わる シグナル経路は PI3K 下流で分岐して お り、CIDEA の発現制御は Akt1/2、CIDEC の発現制御は JNK2 を介することを明らかに した (42)。さらに、イン スリン /Akt1/2 経路はアポトーシ スに関与し 、イン スリ ン /JNK2 経路は脂肪 滴形成に 関与す るこ とを明ら かにし た 。第 4 章では 、インスリン/JNK2 経路は脂質代謝関連遺伝子の発現を主に制御することを明らかにし、注目すべき新規制御遺伝子として、
SREBP-1c が見出され た(57)。さらに、JNK2/SREBP-1c 経路はインスリンによる脂肪酸合成の亢進に関与することが明らかとなった。
本研究では、インスリンによるヒト白色脂肪細胞の数の増加（アポトーシスの抑制）と脂肪細胞の肥大化（脂肪滴形成、サイズの増大）に CIDEA と CIDEC が選択的に関与し、その発現制御は PI3K 以降のシグナルで分岐し、それぞれ Akt1/2、
JNK2 を介することが明らかとなった(Fig. 29)。また、本研究でヒト白色脂肪細胞においてインスリンによる肥大化（サイズの増大）に関わる特異的な経路として
JNK2/CIDEC 並びに JNK2/SREBP-1c が見出された。肥満及びその後の関連疾患の予防・治療においては、言うまでもなく食事・運動療法がベースとなり余剰エネ
ルギーを作らないことが重要である。しかし一方で、数のシグナルとは分岐した肥大化特異的シグナルのみを選択的に阻害するという手法ができれば、慢性炎症を惹起する悪性脂肪細胞を良性脂肪細胞へと質的に変化させ、肥満関連疾患の予防または治療に役立てることができるかもしれない。本知見からの創薬への展望- 71 -

として、今後、JNK2 の阻害剤または SREBP-1c の発現抑制剤の開発が期待される。
今後は本研究を in vivo へと発展させ、より生理的な条件下におけるインスリンによる脂肪細胞の数とサイズの制御機構を調べる必要がある。現在のところ、本研究においてヒト白色脂肪細胞で観察された現象が、他の動物種由来の脂肪細胞でも観察されるかどうかは不明である。そのため、まずマウス或いはラットなどの初代培養脂肪細胞を用いて、ヒト白色脂肪細胞と同様の現象が観察される動物種を同定することが必要と考えられる。その上で、それら動物種における遺伝子
ノックアウト、ノックダウン或いはキナーゼ特異的阻害剤などの手法を用いて、
in vivo におけるインスリンによる脂肪細胞の数とサイズの制御機構を調査することが必要となるであろう。

インスリン

PI3K

JNK2

Akt1/2
CIDEA

CIDEC

SREBP-1c

アポトーシス

脂肪滴形成

脂肪細胞の数脂肪細胞のサイズ
脂肪組織容量Fig. 29. インスリンによる脂肪細胞の数とサイズの制御機構の仮説- 72 -

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Y.,Murakami K., J Lipid Res, 54, 1531-1540 (2013)- 77 -

謝辞
本研究をまとめるにあたり、御懇意なるご指導、御鞭撻を賜りました明治
薬科 大 学生 化学 教 室 教授

本島清人

博士 に 深甚 なる 感 謝 の意 を 表し ます。

ま た 、有 益な 御 助 言と ご 指導 を賜 り ま した 明 治薬 科大 学 衛 生化 学 教室 教
授

石井

一行

博士、生体 分子学教室 教授

長浜正巳

博士 に深く感謝

申し上げます。

本研究に際し、多大な御支援と発表の機会を頂きました キョーリン製薬ホールディングス株式会社

山下 正弘

社長、杏 林 製 薬 株 式 会 社

宮下 三朝

社長に深甚なる感謝の意を表します。

ま た 、多 大の 御 支 援と 御 指導 を賜 り ま した 杏 林製 薬株 式 会 社 新 薬 創製 セ
ンタ ー 長村上浩二

博 士 、薬理第一研究部 長一博 士、 薬理 第 一 研究 部
井出博 士、 薬理 第 一 研究 部

薬理 第 一研 究部

智広

主 任研 究 員

博士、薬理第二研究部 長

薬 理一 研 究 グル ー プ

薬 理二 研 究グ ルー プ

永澤

栗山

和彦

赤坂

ゆ にけ

道明

石山

順

課長 、

課 長 に 深く 感 謝い た

しま す 。ま た、 本 研 究の 遂 行に あた り 、 多く の 薬理 研究 部 の 皆様 に 、御 助
言、補佐をしていただき深く感謝いたします。

最 後 に本 論文 作 成 にあ た り、 かげ な が ら応 援 、支 えて く だ さい ま した 両
親 、妻に感謝いたします。

- 78 -

主論文目録1. Differential roles of CIDEA and CIDEC in insulin-induced anti-apoptosis and lipid
droplet formation in human adipocytes.
Ito M., Nagasawa M., Hara T., Ide T., Murakami K., J Lipid Res., 51, 1676-1684(2010).

2. Differential regulation of CIDEA and CIDEC expression by insulin via Akt1/2- andJNK2-dependent pathways in human adipocytes.
Ito M., Nagasawa M., Omae N., Ide T., Akasaka Y., Murakami K., J Lipid Res., 52,
1450-1460 (2011).

3. A novel JNK2/SREBP-1c pathway involved in insulin-induced fatty acid synthesis in
human adipocytes.
Ito M., Nagasawa M., Omae N., Tsunoda M., Ishiyama J., Ide T., Akasaka Y.,
Murakami K., J Lipid Res., 54, 1531-1540 (2013).

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- 79 -

2. Unsaturated FAs prevent palmitate-induced LOX-1 induction via inhibition of ER
stress in macrophages.
Ishiyama J., Taguchi R., Akasaka Y., Shibata S., Ito M., Nagasawa M., Murakami
K., J Lipid Res., 52, 299-307 (2011).

3. Suppression of FoxO1/cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha-like
effector A (Cidea) axis protects mouse beta-cells against palmitic acid-induced
apoptosis.
Omae N., Ito M., Hase S., Nagasawa M., Ishiyama J., Ide T., Murakami K., Mol
Cell Endocrinol., 348, 297-304 (2012).

4. 脂肪細胞における CIDE タンパクの役割.
伊藤

実, 永澤

道明,

細胞, 11 月号, 24-27 (2012 年).

- 80 -

主査及び副査名
明治薬科大学大学院薬学研究科における論文博士審査では、下記の先生方に主査及び副査をしていただいた。

主査

明治薬科大学教授

本島

清人

博士

副査

明治薬科大学教授

石井

一行

博士

副査

明治薬科大学教授

長浜

正巳

博士

- 81 -