温泉科学（J. Hot Spring Sci.），72，60-73（2022）

原著

三重県産天然物を用いた薬湯開発におけるゼブラフィッシュ生体安全性評価
中山寛子1）2），相馬明弘3），坂上 実4），Nguyen Thanh Thao3），
松岡いづみ1），西村訓弘1）2），島田康人2）5）6）*（令和 4 年 8 月 11 日受付，令和 4 年 10 月 14 日受理）

Safety evaluation using zebrafish embryos inthe development of medicinal baths using natural
products from Mie Prefecture
Hiroko Nakayama1）2）, Akihiro Souma3）, Minoru Sakagami4）,
Nguyen Thanh Thao3）, Izumi Matsuoka1）, Norihiro Nishimura1）2）
and Yasuhito Shimada2）5）6）*
Abstract
Addition of various natural products or extracts to hot springs or bath water so thatthe fragrance may have a relaxing effect or beautify the skin is becoming widely common.  
However, the functionality and safety of these so-called “medicinal baths” are mostly based on
empirical evidence and have been scientifically proven only for a few products.  In this study,
as part of the development of new medicinal baths for use in an upcoming resort complex in
Mie Prefecture, we conducted a biological safety evaluation, using zebrafish embryos.
Zebrafish is a common model animal for in vivo safety evaluation and has been used toinvestigate various chemical substances and medicines in accordance with OECD guidelines.  
We evaluated the safety of medicinal baths, a combination of several extracts of natural
products from Mie Prefecture, using an OECD-compliant method (TG236) with some modifications.  The test baths were exposed from the blastula stage, (5 hours after fertilization) for
三重大学大学院地域イノベーション学研究科 〒514-8507 三重県津市栗真町屋町 1577．1）Mie University
Graduate School of Regional Innovation Studies.
2）
三重大学次世代創薬ゼブラフィッシュスクリーニングセンター 〒514-8507 三重県津市栗真町屋町
1577．2）Mie University Zebrafish Drug Screening Center. *Corresponding author：E-mail shimada.
yasuhito@mie-u.ac.jp
3）
ロート製薬株式会社 〒544-0012 大阪市生野区巽西 1-8-1．3）Rohto Pharmaceutical Co., Ltd.
4）
株式会社モクジ 〒519-2176 三重県多気郡多気町長谷 64．4）Mokuji.
5）
三重大学大学院医学系研究科統合薬理学分野 〒514-8507 三重県津市江戸橋 2 丁目 174．5）Department
of Integrative Pharmacology, Mie University Graduate School of Medicine.
6）
三重大学先端科学研究支援センターバイオインフォマティクス部門 〒514-8507 三重県津市栗真町屋町
1577．6）Department of Bioinformatics, Mie University Advanced Science Research Promotion Center.
1）60

第 72 巻（2022）

三重県産天然物を用いた薬湯開発におけるゼブラフィッシュ生体安全性評価

72 hours, and the effects on viability, teratogenicity, and growth (development) were analyzed.  
As a result, out of 98 kinds of medicinal water (hot water extracts of natural products) andthree kinds of aromatic distilled water, 91 (90%) showed no toxicities.  However, some of thearomatic distilled waters were found to be toxic in their undiluted state, indicating that adilution of more than 1/100 is necessary to ensure safety.  Interestingly, 5% of the medicinal
baths, especially those containing seaweed extracts, showed pigmentation inhibiting effects,
suggesting they may have whitening effects.
Key words : natural products, herbal bath, mist, regional vitalization

要旨

様々な天然物あるいはそれらの抽出物を温泉や風呂水に添加し，香りによるリラックス作用や美肌などを期待することが日常的となっている．しかし，これらのいわゆる「薬湯（季節風呂など）」の機能性や安全性については経験則に基づくものがほとんどであり，科学的に証明されたものは少ない．今回私たちは三重県内に新規開設する複合リゾートの温浴施設に用いる
新たな薬湯開発の一環として，ゼブラフィッシュ受精卵を用いた生体安全性評価を行なったので報告する．
ゼブラフィッシュは生体（in vivo）安全性評価の主要なモデル動物であり，OECD ガイド
ライン化され，様々な化学物質や医薬品の安全性評価に用いられている．今回，三重県産天然物の抽出物を複数組み合わせた薬湯の安全性評価を，OECD 法（TG236）を一部改変した方法を用いて行なった．受精 5 時間後の胞胚期から試験薬湯を 72 時間曝露し，生存率・催奇性・成長（発生）への影響について解析した．その結果，98 種類の薬湯（天然物の温水抽出液）
および 3 種類の芳香蒸留水のうち，91 種類（90%）には異常を認めなかった．しかし，一部の芳香蒸留水には未希釈の状態では毒性が認められ，安全性を担保するためには 100 倍以上の希釈が必要であることが明らかとなった．また興味深いことに，5% の薬湯，特に海藻類の抽出物を含む薬湯には色素沈着阻害作用が認められ，美白作用の存在が示唆された．
キーワード：天然物，ハーブ湯，ミスト，地域活性化
発表した学会名：日本温泉科学会第75回大会，2022年9月8日/第28回日本未病学会，2021年11月20日

1． 緒

言

日本では古来より様々な疾患の治療や健康促進を期待し，入浴の際浴槽に温泉成分や薬草などを入れる習慣がある．近年では温浴施設等において薬湯浴剤を入れることが日常化している．しかし，いわゆる薬湯として利用できる天然物は薬機法「医薬品，医療機器等の品質，有効性及び安全性の確保等に関する法律」および原材料区分（厚生労働省例示通知）の定めによる「専ら医薬品を除くもの」でなければならない．また，昌蒲や柚子のように古くから親しまれてきたもの以外にも各地
域特有の天然物が入浴時に用いられている．
私たちは現在，三重県に新規開設する複合リゾート施設（2021 年予定，VISON, 三重県多気町）の温浴施設で用いる新規薬湯の開発を行っている．三重大学とロート製薬株式会社が連携し，薬草畑や身近に採取できる薬草を活用し，季節ごとに様々な三重県産の天然物を組み合わせた薬湯レシピを考案し，利用者のストレス軽減・健康増進を期待している．しかし，これまでにない組み合わせを行うことにより潜在的な副作用が顕在化する可能性がある．これらの新規薬湯の安全性評価には，マウスなど齧歯類動物を用いた方法が理想的ではあるが，コスト・試験期間・動物愛護の面から現実的ではなく，代替法としての培養細胞を用いた試験系もその検出力に限界がある．
この解決策として，今回ゼブラフィッシュを用いた生体安全性評価試験（Zebrafish Embryo
61中山寛子，相馬明弘，坂上 実，Nguyen Thanh Thao，松岡いづみ，西村訓弘，島田康人

温泉科学

Acute Toxicity Test ; ZFET）を提案した．ZFET はマウスなど哺乳類動物あるいはその受精卵を用いた安全性試験と同等以上の感度が担保されており，初期は医薬品やそのシード化合物の安全性評価に用いられていた（Nishimura ら，2015，Inoue ら，2016）．OECD ガイドライン（TG236）化後（Busquet ら，2014）は，環境学（Golovko ら，2021）や食品科学（Egloff ら，2018），繊維学（Kawada
ら，2019）など幅広い分野にて用いられている．ゼブラフィッシュを用いることにより，コスト・時間の短縮・動物愛護の順守に加え，マウス・ラットでは不可能な規模のサンプル数を検討することができる．今回，私たちは大量の薬湯候補の安全性を検討する必要性から，薬湯評価に特化した改訂型 ZFET を施行したので報告する．

2． 方
2．1

法

試料調製

実際の浴槽に，試験天然物を添加した際に抽出される成分をイメージして，試験天然物（0.04-5 g）
を不織布袋に詰め 40 度の温水（2 L）にて振盪はせずに 5 時間抽出し，試験薬湯とした．試験天然物の量は抽出後試料（薬湯）の色・香りを参考に決定した．香り付けに使用予定の芳香蒸留水サンプルは該当する植物の枝葉から水蒸気蒸留法で抽出したもの（宮川森林組合，三重県多気郡大台町）
を使用し，薬湯に対し 10% 濃度で添加した．抽出したサンプルは 0.22 µm フィルター（Millex）で濾過滅菌し 4℃保存（短期）あるいは－80℃保存（長期）した．
2．2

ゼブラフィッシュ飼育および採卵野生型（AB 系統；Zebrafish International Resource Center, Eugene, OR, USA より入手）を用いた．ゼブラフィッシュは，標準的な運用ガイドラインに従って当施設で飼育された．すべての動物実験は，日本の動物福祉法（環境省）および国際的なガイドラインに準拠して行った．
2．3

安全性試験

OECD（Organization for Economic Co-operation and Development）の Test Guideline 236：Fish
Embryo Acute Toxicity Test（Busquet ら，2014）を一部変更した試験を施行した．胞胚期（受精後 5 時間）20 個（TG236 記載）を選別し各薬湯内にて 72 時間飼育，表現型を観察し顕微鏡画像撮影を行った．この際，コントロールは一般的なゼブラフィッシュ受精卵の飼育水である 0.3×
Danieau’s solution（17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.18 mM Ca（NO3）2, 0.12 mM MgSO4, and 1.5 mM
HEPES buffer, pH 7.6）および天然物抽出に用いた水にて飼育し，両者とも全く異常が認められないことを確認した．
2．4

顕微鏡撮影

蛍光顕微鏡 BZ-X700（キーエンス社）あるいは HD Lite 1080P（Tucsen Photonics）を搭載した
実体顕微鏡 SMZ 745T（ニコン社）で撮影した．

3． 結
3．1

果

安全性評価について

通常の ZFET 試験では毒性の判断基準が「生死」であるが，これはあくまで化学物質を対象とした基準であり，今回の試験薬湯のような安全性が高いと予想されるサンプル評価にはより詳細な
62

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三重県産天然物を用いた薬湯開発におけるゼブラフィッシュ生体安全性評価

判断基準が必要と考えた．そこで 101 種類の試料に対し，「⓪ 正常」，「① 形態異常はないが孵化遅延など発生の遅れが認められた（30% 以上の個体に認められた場合）」，「② 明らかな形態異常（催奇性）を示した（30% 以上の個体に認められた場合）」，「③ 発生が進まず初期で死亡した（試験個体の生存率が 50% 以下）」の 4 カテゴリを設定し，試験を行った．試験結果を Table 1 に示す．これらの典型的な画像を Fig. 1 に示す．異常を認めた①～③の合計は 11 種類（約 10%）であり，このうち深刻な問題のある②③は 3 種類（3%），残り 91 種類には大きな問題は認められなかった．
異常を認めた試料の内訳を Table 2 に示す．
異常を認めた薬湯の半分近く（5/11）に芳香蒸留水が添加されていた．芳香蒸留水はミストなどによく用いられる水溶性抽出物である．そこで芳香蒸留水原料の安全性を決定するために，Table
2 で使用した 3 種類の芳香蒸留水に対して ZFET 試験を行った．その結果，100～1000 倍希釈が必須であることが明らかとなった（Fig. 2）．芳香蒸留水は温水抽出ではなく水蒸気抽出を行っており抽出力が高い．従来薬湯として用いられているヒノキやクロモジでも過剰な抽出により，安全性に問題が生じる可能性が指摘された．
3．2

色素沈着阻害作用を認めた試料

今回の試験では予想されていなかった結果の 1 つとして，一部（5 種）の薬湯に色素沈着抑制作用を認めた．典型例および該当する薬湯を Fig. 3 に示す．5 種のうち 1 つ（コメヌカ＋ヒノキ芳香蒸留水）は発生障害を起こしたが，残り 4 つはゼブラフィッシュに特徴的な縞模様（稚魚の段階では黒点）の数が少ないのみで，その他の安全性に関連する異常は認められなかった．

4． 考

察

新設する複合リゾートの温浴施設では三重県産のさまざま天然物を組み合わせた 72 種類の薬湯を 5 日毎に変更し提供することを予定しており，今回それらの母数として合計 101 種類の安全性試験を行った．その結果，90% の組み合わせには問題がなかったが，残りの 10% には何らかの異常を認める結果となった．特に芳香蒸留水は通常のミストとしての利用に加え，薬湯への応用を期待していたが，そのまま使うのではなく 100 倍以上の希釈が必要なことが明らかとなった．以下に毒性を示した薬湯成分についての考察を述べる．
4．1 「③ 発生が進まずに初期で死亡した」試料
最も安全性に問題がある試料と考えられた．今回試験した範囲では「コメヌカ＋ヒノキ玉＋ヒノ
キ芳香蒸留水」の組み合わせだけであった．今回試験した類似の組み合わせ「コメヌカ＋ヒノキ芳
香蒸留水」は「① 孵化したが発生が遅れ」に，「コメヌカ＋菊の花＋ヒノキ芳香蒸留水」では異常を認めなかったことから，「ヒノキ玉＋ヒノキ芳香蒸留水」の過剰なヒノキ抽出物の負荷により毒性が強くなったと考えられた．ヒノキにはヒノキチオール・ヒノキオール・α カジノール・α ピネ
ンなどのヒノキ特有の香り成分が含まれており，香りによるリラックス気分を期待して薬湯に用いられている．その一方，α ピネンはシックハウス症候群の原因物質の 1 つとされており，今回の試験結果の原因である可能性が考えられた．ヒノキチオールおよびヒノキオールは強力な抗菌・抗真菌作用が有名だが，この作用機序は主に細胞膜の代謝障害であり（Morita ら，2007），ゼブラフィッ
シュの発生にも悪影響を及ぼしたと考えられる．ヒトではヒノキ玉およびヒノキ抽出物による毒性報告は非常に少ない（細野ら，1997）が，「適量」が存在する可能性が示唆された．

63

中山寛子，相馬明弘，坂上 実，Nguyen Thanh Thao，松岡いづみ，西村訓弘，島田康人
Table 1

64

Results of zebrafish embryo acute toxicity test.

温泉科学

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三重県産天然物を用いた薬湯開発におけるゼブラフィッシュ生体安全性評価
Table 1Results of zebrafish embryo acute toxicity test.

65中山寛子，相馬明弘，坂上 実，Nguyen Thanh Thao，松岡いづみ，西村訓弘，島田康人
Table 1

66

Results of zebrafish embryo acute toxicity test.

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三重県産天然物を用いた薬湯開発におけるゼブラフィッシュ生体安全性評価
Table 1Results of zebrafish embryo acute toxicity test.

67中山寛子，相馬明弘，坂上 実，Nguyen Thanh Thao，松岡いづみ，西村訓弘，島田康人

Fig. 1

温泉科学

Representative phenotypes of abnormal larvae.

Table 2

List of samples with abnormal phenotypes.

4．2 「② 形態異常を示した」試料
前項よりも毒性は低かったが，正常な発生ができなかった点では決して無視できない結果である．2 種類の試験薬湯が該当したが，このうち「ショウブの葉＋ハッカ」については，今回試験した「ショウブの葉＋ヨモギ」「ショウブの根＋ハッカ」では異常を認めなかったことから，ショウブ・
ハッカ単体ではなく両者の組み合わせが毒性を示したと考えられた．ショウブの葉にはアサロンが含まれており，ゼブラフィッシュにおいて心臓発生障害・不整脈が報告されている（Shang ら，
2020）．ハッカにはメントールを主に，ピネン，カンフェン，リモネンなどの精油成分が含まれて68

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三重県産天然物を用いた薬湯開発におけるゼブラフィッシュ生体安全性評価

Fig. 2 Zebrafish embryo acute toxicity test (ZFET) for diluted
aromatic distilled water samples.

Fig. 3Samples with reduced pigmentation.

おり，これらの相乗あるいは相加効果が問題だと考えられた．
ダイダイには，果皮にフロクマリン類，酸味成分のクエン酸，d-リモネン，ベルガプテン，β-カ
リオフィレン，ヘスペリジン，シネフリン等，数多くの化合物を含んでいる．これらのうち，シネ
フリンは生薬の麻黄（エフェドラ）に含まれる成分（エフェドリン）と類似の構造をもっており，
交感神経・副交感神経混合型興奮作用を有している．この成分を加工したものが「シトラス」とい69

中山寛子，相馬明弘，坂上 実，Nguyen Thanh Thao，松岡いづみ，西村訓弘，島田康人

温泉科学

う名称でアメリカではダイエット用の健康食品として使用されているが，エフェドラと同様の作用を示すことから，血管新生を阻害する副作用報告（Kim ら，2015）も出ている．また，フロクマリ
ンおよびリモネンは皮膚刺激および光毒性が報告されており（Raquet ら，2014，Kim ら，2013），実験の飼育環境において，概日リズムと同じようにインキュベーター内飼育でライトを点けていたた
めどちらかの作用が出た可能性も考えられた．
そこで，薬湯に使用予定の柑橘類中のクマリン類（ソラレン，ベルガプテン，キサントトキシン，
イソピムピネリンの 4 成分）量を分析した（Table 3）．International Fragrance Association の基準を参考にすれば 15 ppm 以下であれば光毒性は問題ないとされている．どのサンプルも＜15 ppm
もしくは不検出という結果となり，当初危惧されていたクマリン類による毒性発現の可能性は否定された．

Table 3

Amount of coumarone extracted (ppm) when 1 g of sample is suspended in 1 L of water.

1） 薬湯の水量を 20,000 L（20 t）と仮定した場合の光毒性の懸念がある試料量
2） 安全係数として今回使用した柑橘類より 20 倍の濃いクマリン類が付着した柑橘類を使用して煎じた場合の光毒性の懸念がある試料量70

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三重県産天然物を用いた薬湯開発におけるゼブラフィッシュ生体安全性評価

4．3 「①形態異常はないが孵化遅延など発生の遅れが認められた」試料
約 7% がこの結果となった．これらのうち，前述のヒノキに関連するものが複数認められた．ヒ
ノキは古来より慣習的に薬湯として用いられているが，「4-1．
【③ 発生が進まずに初期で死亡】した試料」でも考察したように，「過ぎたるは及ばざるが如し」，やはり適量が存在する可能性が示唆された．
このほかにも，「スギナ」および「ヤマザクラ葉＋スギナ」については，共通するスギナが毒性発現に関与していると考えられた．スギナにはアルカロイドのエキセチンとニコチン・サポニンの1 種であるエキセトニン，フラボノイドのイソクエルシトリン，グルテオリン，エキセトロンが含まれている．特にエキセチンには強い抗真菌作用や家畜への中毒作用が報告されており，ゼブラ
フィッシュにおいても毒性を有した報告がある（Liu ら，2018）．
「キクの花＋ツワブキの葉」では，キクの花に含まれるルテオニンが，不整脈や心室性期外収縮といった副作用報告（Milosević-Djordjević ら，2011）もあることからこの成分が発生を遅らせたものと考えられる．「セリ」は春の七草として食用に，また薬湯料として用いられており脂溶性成
分が湯に溶け出して血液循環をよくして，リウマチ，神経痛，血圧降下の効果があるとされている．
ゼブラフィッシュの皮膚には人間のような角質層がなく，稚魚期には鱗の形成も未熟であるため，
脂溶性成分による刺激が強いのではないかと考えられた．
4．4

色素沈着阻害を示した試料

今回の試験系では安全性を評価するのが主目的であったが，予想外の展開として，5% の試料で色素沈着阻害作用を確認した（Fig. 3）．ゼブラフィッシュ受精卵は受精後 48 時間から色素沈着が開始する．評価時期である受精後 100 時間の段階では，卵黄嚢を中心に，黒色色素細胞が増加し，Fig. 3（正常）に示すような黒点が発生する．すでに様々な研究者がこのゼブラフィッシュの色素沈着を利用して，チロシナーゼ阻害薬などいわゆる美白研究を行っており（Belleri ら，2018），著
者らのグループもセラミドの色素沈着阻害作用に関する報告をしている（Kagotani ら，2020）．色素沈着阻害作用を認めた薬湯にはワカメ，チャ（茶）の抽出物が含まれており，過去の研究からワカメに含まれるフコキサンチン（Shimoda ら，2010）やフコイダン（Wang ら，2017），茶のカテ
キン（Kim ら，2015）が作用を発揮していると考えられた．また「コメヌカ＋ヒノキ芳香蒸留水」にも色素沈着抑制がみられ，他のヒノキ芳香蒸留水を使った組み合わせではその傾向が見られないことから，コメヌカが作用していると考えられた．コメヌカは古来より肌に良いとされているが，培養細胞系などでメラニン合成を阻害することが報告されており（Chung ら，2009），本試験でも同様のメカニズムが存在すると考えられた．

5． 結

語

我々は新たな薬湯開発の一環として，様々な天然物または天然物を組み合わせた試料について，
ゼブラフィッシュを用いた生体安全性試験（ZFET）を行った．その結果，大半の試料は安全であったが，一部体によいものとして知られる天然物も組み合わせ次第で毒性を呈することが明らかとなった．今後，毒性を示した全ての試料に対してより低濃度の試験を行い 50% 致死濃度（LC50）を算出することを計画している．試験対象が天然物であるため，サンプリング時期・抽出時期・混合時期などにより，化学成分の含有量が異なる可能性や，ZFET の試験期間が 72 時間と通常の入浴では考えられないレベルで長く，またマウス胎児試験に相当する非常に感度の良い試験系である
ため（Inoue ら，2016），毒性を過大評価している可能性は高い．しかし入浴施設，特にリゾート71中山寛子，相馬明弘，坂上 実，Nguyen Thanh Thao，松岡いづみ，西村訓弘，島田康人

温泉科学

施設の入浴施設での利用者数・バラエティの多さを考えると，感度が高すぎる試験を実施し安全性を担保した薬湯を提供することは決して行き過ぎた対策ではないと考える．もちろん，魚類と人間の間のギャップは常に頭に入れておく必要があり，今後，実際の運営上での利用者（ヒト）における異常反応，特に皮膚症状のモニタリングを行っていく計画である．
また，ゼブラフィッシュ試験系は複数成分の組み合わせ時の安全性評価ツールとして利用できる．
本技術は薬湯評価のみならず，複数の機能性食品を組み合わせたサプリメント・調理法開発，複数の医薬品を組み合わせた合剤開発における最初の安全性評価に適用できると考えている．
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