医薬品共結晶の微量探索法開発ならびに製剤学的応用

Development of Exploring Method in a Trace Amount for Pharmaceutical Cocrystals andApplication for Active Pharmaceutical Ingredient

平成 30 年度
論文博士申請者
前野

祐介（Maeno, Yusuke）

指導教員
深水

啓朗

目次

1. 緒言 ............................................................................................................................................................1
1.1 結晶形態の探索...................................................................................................................................1
1.2 新たな結晶形態である共結晶...........................................................................................................4
1.3 本研究の概要.......................................................................................................................................7
2. 共結晶の微量探索法開発 ........................................................................................................................8
2.1 概要 ......................................................................................................................................................8
2.2 ガラスプレート疎水化材料検討.....................................................................................................10
2.3 ナノスポット法の最適化と自動化 .................................................................................................15
2.4 CAF 共結晶の探索スクリーニング .................................................................................................18
2.5 ナノスポット法の有用性と今後の展開 .........................................................................................26
2.6 小括 ....................................................................................................................................................28
3. 共結晶の物性評価及び製剤学的応用 ..................................................................................................29
3.1 概要 ....................................................................................................................................................29
3.2 共結晶の探索スクリーニングと APAP-TMG の物性評価 ..........................................................31
3.3 APAP-TMG の結晶構造と格子エネルギー ....................................................................................35
3.4 APAP-TMG 共結晶の製剤学的特性評価 ........................................................................................40
3.5 APAP-TMG 共結晶の製剤学的有用性 ............................................................................................50
3.6 小括 ....................................................................................................................................................52
4. 総括 ..........................................................................................................................................................53
5. 謝辞 ..........................................................................................................................................................54

6. 実験の部 ..................................................................................................................................................55
6.1 共結晶の微量探索法開発.................................................................................................................55
6.2 共結晶の物性評価及び製剤学的応用 .............................................................................................61
7. 引用文献 ..................................................................................................................................................66

1. 緒言1.1 結晶形態の探索
医薬品が上市されるためには，有効性及び安全性の確保が必要である．加えて品質はこれらを 担 保す るた め の重 要な 要 件の 一つ で あり ，製 剤 ある いは 構 成成 分で あ る 原 薬（ active
pharmaceutical ingredient: API）及び添加剤等を適切な手法を用いて評価することが重要である．
一般的に，医薬品は他業種製品と比較して上市までの成功確率が低く，かつ長い開発期間を要するため，費用を抑えつつも効率的な開発が求められる 1)．低分子化合物については，複数の化合物を短時間・多種類かつ系統的に合成可能な技術であるコンビナトリアルケミストリーをはじめとする新たな創薬技術の発展により，探索段階において薬効の高い化合物を効率的に見出すことが可能となってきている．一方 Faller らは，米国 Food and Drug Administration（FDA）に承認された医薬品原薬の特性を調査した結果，1983 年以前と比較して疎水性の高い化合物の割合が増加していることを報告している 2)．特に近年では，原薬の水に対する溶解性（溶解度，溶解速度）の問題が重要視されている 3)．経口製剤において原薬の溶解性低下は吸収性の低下に直結するため，溶解性改善が開発のためのボトルネックとなることもある．また，溶解性以
外にも物理化学的安定性，吸湿性といった化合物に応じた物性改善が必要な場合もある．物性改善は原薬及び製剤の両側面から検討され，原薬においては微細化や結晶形態の変更がその手段として用いられる．原薬の結晶形態の変更は，原薬自体の化学構造を変化させる必要が無く，開発の比較的早期の段階，即ち複数の化合物の中から開発化合物を絞り込む段階で検討される場合が多い．
結晶形態には，フリー体のほか，共結晶（cocrystal），塩，和物（水和物：疑似多形・溶媒和物）及びそれらの結晶多形が知られている（図 1-1）．一つの化合物に対して 1 種類の結晶形1しか存在しないことは稀であり，現在市販されている医薬品のうち，約 70%に結晶多形・疑似多形が存在すると言われている 4)．結晶の形成過程は主に結晶核の発生と結晶成長に分けられ，試料溶液の濃度，温度，結晶化速度等，様々な要因が関係することから，結晶形態の探索時は各要因を網羅的にスクリーニングする必要がある．結晶形スクリーニングを専門に受託している SSCI（現 Albany Molecular Research, Inc.）の報告によると，受託した 230 化合物の実に 90%で結晶多形及び疑似多形が見出されていることから，スクリーニング実施の重要性は明白である 5) ．スクリーニングにより存在しうる結晶形を可能な限り把握できれば，最適な物性を持つ
結晶形態の選定に寄与できるだけでなく，製造部門に対して堅牢な製造プロセス確立のための有用な情報を与えられる．製造の再現性や保存安定性の観点から，一般的に結晶形は熱力学的エネルギーの低い最安定形を選択することが多い．しかしながら，探索段階のような開発初期においては，合成プロセスが最適化されていないため，高額な原薬製造費となり，かつ合成量も限られてしまう．この時期には薬効・薬理試験などの有効性，安全性の確認に原薬の多くが消費されてしまい，物性評価ならびに結晶形態の探索に十分な原薬量を確保することが困難である．近年の分析装置の発展により，原薬の微量かつ高速な評価が可能となってきており，物性研究が早期から着手できるようになってきている．一方，適切な結晶形態の選択については，
可能性のある結晶形態を網羅的に検討するほど原薬使用量は比例して増加し，その評価にも時間と労力を消費することになる．そのため，原薬消費量の少ない効率的な探索法を確立することが非常に重要である．

2

図 1-1 結晶形態の分類 参考文献 18)改変
A: 原薬（API），B: コフォーマー，対イオン，溶媒
1 から 4 は，双方の結晶形が混在している領域を表す

3

1.2 新たな結晶形態である共結晶
結晶形態としての共結晶という概念は比較的最近になって取り入れられたものであり，注目を集めている．具体的に，塩や結晶多形と同様，共結晶化によりに融点，溶解度，溶解速度，
物理化学的安定性やバイオアベイラビリティの向上例が多数報告されている 6)-14)．このため，共結晶は結晶中に原薬と対イオンを含む塩，溶媒や水を含む和物に加え，重要な結晶形態の一つとして認識されつつある．現に共結晶製剤として海外ではレクサプロ®（ルンドベック），エ
ントレスト®（ノバルティスファーマ）が，国内ではスーグラ®（アステラス製薬）が上市されている．また，臨床試験入りしている共結晶製剤も散見されているほか 15),16) ，The WorldIntellectual Property Organization (WIPO) データベースに登録された共結晶に関する特許件数が増加傾向にあることから 17)，今後も共結晶製剤上市の増加が予想される（図 1-2）．共結晶の定義は，一定の化学量論比を有する 2 種類以上の分子がイオン結合以外の相互作用を形成する
結晶性の固体で，単純な塩あるいは溶媒和物ではないものとするのが一般的になりつつある（図1-1）18)．共結晶中の原薬と相互作用を形成する分子は cocrystal former（coformer: コフォーマー）と呼ばれ，それらの分子間相互作用は主に水素結合や π-π 相互作用である．
しかし Steiner らは，中性子線を用いた構造解析より，温度によって水素結合を介して相互作用する分子間のプロトンの位置が変化することを報告している 19)．そのため，共結晶と酸から塩基へプロトン移動する塩とを明確に区別することは困難であると考えられている．加えて，図 1-1 の 1，2，4 の領域のように，対イオンや溶媒分子が加わることで複雑な結晶形態を形成する可能性も考えられる．しかし，医薬品開発を行う企業においては，科学的な見解だけではなく，規制当局による結晶形態としての共結晶の申請（薬事）上の位置づけにも配慮しなければならない．共結晶の取り扱いに関するガイドラインについては，これまで欧米各局において積極的に整備が進めら4れてきた（表 1-1）．2011 年から 2013 年にかけて FDA より共結晶の取扱いに関するドラフト
ガイダンスが発出され，共結晶は審査上，製剤中間体（drug product intermediate）であると定義された．その後研究者らの間で議論となり 18)，2015 年には European Medicines Agency（EMA）
よりリフレクションペーパー20)が出され，欧州においては共結晶を塩と同等に扱うことが公示された．これを受けて再度 FDA から 2016 年に修正版のガイダンス案，2018 年に最終版 21)が発出され，欧米ともに共結晶を結晶形態の一つとして取り扱うことで見解が一致した．しかし，
EMA においては，有効性及び安全性を総合的に考慮し，物性の異なる塩や共結晶が有効成分として「同じ」か「異なる」か区別されるのに対し，FDA においては，一律して塩は「異なる」
有効成分であると定義されているため，塩と共結晶を明確に区別することが求められている．
即ち，分光学的な評価法をはじめとする適切な物性評価を通じて，塩と共結晶の区別を行う必要がある．本邦においても規制当局からの共結晶に対する見解の表明が望まれている 22)．

図 1-2 共結晶に関わる特許件数の推移 17)5表 1-1 共結晶医薬品の FDA ガイダンスと EMA リフレクションペーパー比較 23)
EMA リフレクション
ペーパー（2015）

FDA 改訂ガイダンス（2018）

定義

2 種類以上の分子で構成される結晶性物質

化学量論的な構成比の 2 種
またはそれ以上の成分により，イオン結合以外で結晶格子を構成する均一な結晶

2 種類以上の分子によって結晶格子が構成される結晶性物質

組成

原薬と中性ゲスト分子

活性成分とコフォーマー

活性成分とコフォーマー

結晶格子の
相互作用

非イオン性

非イオン性

非イオン性

審査上の区分

製剤中間体

原薬の形態
（結晶多形や溶媒和物，塩
と同列）

原薬の形態
（溶媒和物に近い存在）

溶媒和物との関係―

溶媒和物は広義の共結晶の一部

共結晶は広義の
溶媒和物の一部―

共結晶はコフォーマーが，単体で室温において固体

共結晶はコフォーマーが揮発性でない特殊例

コフォーマーの
役割

添加剤

試薬*

―

共結晶と塩との
区別

重要

影響は限定

重要

想定される工程

製剤工程（混合等）が中心

原薬工程（晶析等）が中心―

原薬マスター
ファイル登録

なし

可能性あり

―

既承認医薬品の共結晶化

後発医薬品（ANDA）

有効性・安全性により後発品か新有効成分か判断

後発医薬品（ANDA）

FDA ガイダンス（2013）*：共結晶形成のプロセスにより異なる

6

1.3 本研究の概要(1) 共結晶の微量探索法開発
医薬品開発初期段階への適用を目的とし，使用する原薬量を極限まで低減させた共結晶探索
スクリーニング手法であるナノスポット法を新たに開発した．本手法によりナノグラムスケー
ルでのスクリーニングが実現可能であることから，手法の構築及びモデル原薬を用いた共結晶探索への適用検討を行った．

(2) 共結晶の物性評価及び製剤学的応用
モデル原薬を用いた一般的な共結晶の探索スクリーニングを実施した．探索スクリーニングによって得られた新規結晶性複合体について種々の物性評価を行い，共結晶であることを明らかとした．共結晶化によるモデル原薬の物性改善，即ち打錠特性や味覚の改善といった製剤学的応用の可能性について検証を行った．

7

2. 共結晶の微量探索法開発
2.1 概要医薬品共結晶の開発においては，原薬単独と比較して物性の改善が期待される適切なコフォーマーを選択しなければならない．また，共結晶の調製法は複数存在し，スラリー法，冷却法，
貧溶媒法，蒸発法に代表される溶液から調製する手法と，原薬とコフォーマーを粉末の状態で混合粉砕する手法（grinding 法）に大別される．これらの調製法によって共結晶の形成が左右されるため，適切な手法を選択する必要がある 24)-26)．しかし，新たな結晶形態の探索スクリー
ニングにおいては，結晶多形や塩のように従来から適用されている結晶形態であっても「標準」といえる手法は確立されていない．共結晶に限らず，探索スクリーニングにおいて最も注意すべきことは，新規の結晶形を見逃さないことである．したがって，共結晶探索時には医薬品として使用実績のある添加剤を中心とする多種類のコフォーマーについて検討することに加え，様々な結晶化条件についても試行する必要があるため，必然的に試験数が増加することになる．
特に探索から開発初期の原薬は一般的に合成量が少なく，物性研究に使用できる量が極めて限られていることから，効率のよいスクリーニング方法が望まれている．そのような背景の中，例えば，検討数を低減させる手段として，原薬と複数のコフォーマーをまとめて粉砕する
cocktail grinding method27)や，COSMO-RS28)と呼ばれる計算科学のツールを用いて，実験計画の段階でコフォーマーを絞り込む手法 29)などが報告されている．また，近年の分光器の発展により短時間かつ高感度にスペクトル検出が可能となり，マルチウェルプレートを使用した結晶多形，塩，共結晶スクリーニングの手法も報告されている 30)-33)．ここで用いられる評価法は，IR，
ラマン分光法及び粉末 X 線回折測定（powder X-ray diffractometry: PXRD）に代表される分光学的手法である．

8本研究では，微量かつ効率の良い新規な探索スクリーニング法の開発を目的として，マイクロシリンジにより微少容量の試料溶液をガラスプレート上に滴下した後，析出した微細な結晶を顕微ラマン分光法にて評価するナノスポット法を開発した（図 2-1）34)．モデル原薬として共結晶を形成しやすい化合物として知られるカフェイン（CAF）を用い，これまでに報告されている CAF の共結晶 35)-41)を参考にしてナノスポット法の実用性を評価した．

図 2-1 ナノスポット法の概要図

92.2 ガラスプレート疎水化材料検討
顕微ラマン分光法で評価を行う際，一塊の析出物として測定対象が集積すれば検出は容易となる．マイクロシリンジを用いて滴下した液滴の接触角が大きい，即ちガラスプレート表面に対する接触面が小さくなるほど液滴乾燥後に一塊の析出物として得やすくなると考え，接触角が最大となるガラスプレート表面の疎水化処理試薬の選定を行った．炭化水素系及びフッ素系
疎水化試薬を用いてガラスプレート表面の疎水化処理を行った後，代表的な溶媒を滴下した．
液滴の接触角を測定した結果を表 2-1 に，それぞれの外観を図 2-2 に示す．水，メタノール（MeOH）及びジメチルスルホキシド（DMSO）に対する接触角は，トリクロロオクタデシル
シラン（TCODS）で処理したものが最も大きく，エタノール（EtOH）に対する接触角は Novec™
1720 のそれが最も大きかった．TCODS は，分子内の疎水部分を構成する炭素鎖が C18 と1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン（HMDS）及びジメチルジクロロシラン（DMDCS）より長く，高い疎水性を有することから接触角が増大したと考えられる．また，ガラス表面に存在しているシラノール基を効果的にマスキングすることを目的として，炭化水素系の疎水化試薬を組み合わせて塗布したが，接触角に著明な向上は認められなかった（表 2-1）．大きな接触角を示した DMSO は多くの化合物に対する良溶媒として汎用される反面，スポットした際に液滴が自然乾燥しないことから，操作性を考慮して選択肢から除外した．本研究では，液滴が速やかに乾燥し，試料である CAF を溶解する EtOH を選定し，その接触角が最大となるフッ素系疎水化試薬 Novec™ 1720 を選択した．
疎水化処理を行ったガラスプレートに，マイクロシリンジを用いて CAF の 1 mg/mL の EtOH
溶液を 100 nL 滴下し，室温環境下で静置して乾燥させた．析出した結晶の偏光顕微鏡写真を図2-3 に示す．炭化水素系の疎水化試薬を用いた場合，スポット後の液滴が乾燥過程で複数に分裂10する様子が認められた．スポットする容量を少なくし，最初に形成される液滴の径を小さくしても，その程度に著明な改善は認められなかった．一方，フッ素系試薬である Novec™ 1720 で処理したガラスプレート上では，スポットした液滴が速やかに収縮し，一塊の結晶が得られた．
一般的に，フッ素系疎水化試薬は炭化水素系疎水化試薬よりも表面張力（表面自由エネルギー）を低下させやすい 42)．ただし，この一般則が当てはまらない例も多く，液体の表面張力と固体の表面自由エネルギーの構成成分が近いほど，接触角が低下しやすい（ぬれやすい）ことが経験則として知られている．表面自由エネルギーの構成成分は主に van der Waals 力と水素結合力から成り，EtOH 及び Novec™ 1720 のそれらが異なるため，Novec™ 1720 が液滴を収縮させる
ために効果的であったと考えられる．
ここで，疎水化処理によるガラスプレート表面の形状の違いを検証するため，原子力間顕微鏡（atomic force microscopy: AFM）測定を行った．TCODS+HMDS，Novec™ 1720 ともに疎水化処理を施したことにより，未処理のガラスプレート表面に存在する凸凹がマスクされ，撥水性あるいは撥油性が向上したものと考えられた（図 2-4）．TCODS+HMDS と Novec™ 1720 による処理を比較した際，平面の平均的な粗さを表すラフネスは TCODS+HMDS 処理の方が小さかったものの，突起のような構造の形成が認められたことから，最大高低差を表す Rmax はNovec™ 1720 処理の方が小さく，平坦であることが示唆された（表 2-2）．
以上の結果より，EtOH を溶媒として用いたとき，フッ素系疎水化試薬である Novec™ 1720を用いることが適切であることが確認された．

11

表 2-1 疎水化処理で得られた接触角の測定結果（°）
H 2O

EtOH

MeOH

DMSO

TCODS

113.1

39.3

42.3

81.0

DMDCS

103.1

33.0

37.0

76.3

HMDS

85.3

16.7

18.4

39.5

TCODS+HMDS
TCODS+DMDCSDMDCS+HMDS

109.4
105.0
95.3

41.1
34.2
24.9

36.7
41.7
22.9

80.4
79.7
65.6

Novec™ 1720
Glass (control)

107.2
18.5

48.6
-

37.6
-

43.4
21.4
- : could not evaluate.

図 2-2 疎水化処理を行ったガラスプレート上の液滴の外観

12図 2-3 疎水化処理したガラスプレート上における析出物の偏光顕微鏡写真13

表 2-2 AFM 測定結果
測定範囲：20×20 μm#1#2
Novec™ 1720
TCODS+HMDS
未処理

roughness (nm)

7.99

7.26

Rmax (nm)

89.3

116

roughness (nm)Rmax (nm)

0.913
182

1.09
277

roughness (nm)

1.10

1.26

Rmax (nm)

45.8

35.7

#1, #2 は同一ガラスプレート上の異なる部位における測定
roughness: 表面における平均の粗さ
Rmax: 表面における最大高低差

(a)

(b)

(c)

図 2-4 AFM 測定結果
(a) Novec™1720，(b) TCODS+HMDS，(c) 未処理

14

2.3 ナノスポット法の最適化と自動化(1) スポット試料の濃度検討
ラマンスペクトルが取得できる最少の試料量を見出すことを目的として，試料濃度の検討を行った．Novec™ 1720 を用いて疎水化処理を行ったガラスプレートに，マイクロシリンジを用いて CAF 単独あるいはコフォーマー単独の 0.002 mg/mL（= 0.1 ng/50 nL），0.02 mg/mL（= 1 ng /50 nL）及び 0.2 mg/mL（= 10 ng/50 nL）EtOH 溶液をそれぞれ 50 nL 滴下し，室温環境下で静置して乾燥させたものを観察した（図 2-5）．0.002 mg/mL においては，ほとんどの条件
で析出物を視認することが困難であった．続いて 0.02 mg/mL においては，一部の化合物で析出物を視認することはできたものの，結晶形評価が可能な強度を有するラマンスペクトルは得られなかった．最後に，0.2 mg/mL において，結晶形の評価に十分な強度のラマンスペクトルが取得できたことから，スポットする試料濃度を 0.2 mg/mL（理論値で 10 ng 相当）に設定した．

15

図 2-5 Novec™1720 で処理したガラスプレート上における析出物の偏光顕微鏡写真

16

(2) スポットの自動化
ナノスポット法での試料スポットの自動化を検討するために，自動分注装置である SPOTMASTER®を使用して試料を滴下した．手動及び自動スポットで得られた結晶の比較を図 2-6に示す．自動スポットにおいても，マイクロシリンジを用いた手動スポットと同等のスポットが形成され，どちらも同様の結晶の集積構造が認められた．SPOT MASTER®の 1 回のスポットに要する時間は 30 秒程度であり，マイクロシリンジを用いた手動スポット操作に比較して，大幅な時間短縮が達成された．

(a)

(b)

図 2-6 スポット方法による結晶の比較(a) マイクロシリンジによる手動スポット，(b) SPOT MASTER®による自動スポット

17

2.4 CAF 共結晶の探索スクリーニング
ナノスポット法を適用することで共結晶が形成されるか，検証を行った．まず，文献 35)-41)を参考に比較対象である既知の標準共結晶を調製し，PXRD 測定を行った．結果，調製した標準共結晶の PXRD パターン（図 2-7 桃色）が各共結晶の単結晶 X 線構造解析結果からシミュレートした PXRD パターン（図 2-7 橙色）と一致したことを確認し，いずれも標準共結晶が得られたと判断した．
続いて CAF 単独の溶液，10 種のコフォーマー（表 2-3）単独の溶液及び CAF とコフォーマ
ー混合溶液についてナノスポット法を適用した．得られた結晶の偏光顕微鏡写真（図 2-8）及び顕微ラマンスペクトルを取得した．ラマン測定結果の代表例を図 2-9 に，その他の測定結果を図 2-10 に示す．図中の On plate はナノスポット法を用いて調製した結晶のラマンスペクトル，
Cocrystal (Ref.) は標準共結晶のラマンスペクトル，Mixture (On plate) は CAF 及びコフォーマー
混合溶液から得た結晶のラマンスペクトルを表す．CAF と 2,5B の組合せ（以下，CAF-2,5B のように記載する）では，図 2-9a 赤点線で示した 650，750 及び 1300-1400 cm−1 付近に標準共結晶に特徴的なピークが認められ，混合溶液の結晶から得たラマンスペクトルと波数が一致し，
ナノスポット法により共結晶が形成されたと判断した．CAF-4B においては 1200-1400 cm−1 付
近に，CAF-1,2N においては 800-900 及び 1600-1700 cm−1 付近に標準共結晶に特徴的なピークが認められ，それぞれ混合溶液の結晶から得たラマンスペクトルと波数が一致し，同様に共結晶が形成されたと判断した（図 2-9b, c）．このことから，ナノスポット法を適用することでも共結晶を形成させることができ，超微量で共結晶探索スクリーニングを行える可能性が示唆された．一方，CAF-M1，CAF-C，CAF-Ad，CAF-O，CAF-G，CAF-2B では，混合溶液の結晶から得たラマンスペクトル中に標準共結晶に特徴的なピークが認められず，共結晶を形成しなかっ18

たと判断した（図 2-10）．また，図 2-10f の 2B 単独，CAF-M2 では液滴乾燥後においてラマンスペクトルが得られなかった．
以上の結果を共結晶報告例 35)-41)と比較し，表 2-4 に示す．今回のスクリーニングでは溶媒として EtOH を用いて評価を行い，CAF-2,5B，CAF-1,2N 及び CAF-4B で共結晶形成を確認した．
共結晶報告例のうち EtOH を用いて共結晶を調製した条件は CAF-2,5B 及び CAF-1,2N の 2 条件
であり，それ以外の組み合わせについては EtOH 以外の溶媒を用いて共結晶を調製していた．
このことから，ナノスポット法を適用することで共結晶を形成する組み合わせを確かに検出することが可能であり，手法を実証できたと判断した．CAF-4B における結果の不一致について
は，今回の結晶化方法と報告されている調製方法に違いがあるためであると考えられる．共結晶形成のヒット率を向上させるためには，他の溶媒の適用や CAF とコフォーマーの化学量論比の検討が必要となる．図 2-2，表 2-1 に示した通り，溶媒によって接触角が変わってくることから，疎水化試薬と試料溶媒の最適な組み合わせを考慮することにより，広範な調製条件の適用が期待できる．

表 2-3 使用したコフォーマーと略称
化合物名

略称

Adipic acid

Ad

Citric acidC

Glutaric acid

G

Maleic acid

M1

Malonic acid

M2

Oxalic acidO

1-hydroxy-2-naphthoic acid

1,2N

2,5-dihydroxybenzoic acid

2,5B

Salicylic acid2B

4-hydroxybenzoic acid

4B

19

(a)
CAF
2,5B

X 線強度 (cps)

CAF, 2,5B PM
CAF-2,5B 標準共結晶
CAF-2,5B simulated pattern
simulated pattern

(b)
CAF
4B

X 線強度 (cps)

CAF, 4B PM
CAF-4B 標準共結晶
CAF-4B simulated pattern
simulated pattern

(c)
CAF

X 線強度 (cps)

1,2N
CAF, 1,2N PM
CAF-1,2N 標準共結晶
CAF-1,2N simulated pattern
simulated pattern
図 2-7 (a) CAF-2,5B，(b) CAF-4B，(c) CAF-1,2N の PXRD パターン
PM: CAF 及び各コフォーマーの物理的混合物 (physical mixture)20図 2-8 CAF，各コフォーマー及び CAF とコフォーマー混合物の偏光顕微鏡写真「CAF+コフォーマー」の記載は，CAF とコフォーマー混合溶液を乾燥させたときに得た析出物

21

Raman Intensity(a)Raman Intensity(b)Raman Intensity(c)

図 2-9 (a) CAF-2,5B，(b) CAF-4B，(c) CAF-1,2N の偏光顕微鏡画像及びラマンスペクトル22

Raman Intensity

Raman Intensity

Raman Intensity

(a)

(b)

(c)

23

Raman Intensity(d)Raman Intensity(e)Raman Intensity(f)

図 2-10 (a) CAF-M1，(b) CAF-C，(c) CAF-Ad，(d) CAF-O，(e) CAF-G，(f) CAF-2B のラマン
スペクトル

24

表 2-4 スクリーニング結果まとめ

コフォーマー

ナノスポット法

既報の結晶化溶媒

2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5B)✔

1-hydroxy-2-naphthoic acid (1,2N)✔

4-hydroxybenzoic acid (4B)✔

・アセトニトリル

Maleic acid (M1)―・クロロホルム／メタノール混液
・ジクロロメタン

Citric acid (C)―・メタノール／ニトロメタン混液

Adipic acid (Ad)―・アセトニトリル

Oxalic acid (O)―・クロロホルム／メタノール混液
・アセトニトリル

Glutaric acid (G)―・クロロホルム

Salicylic acid (2B)―・アセトニトリル

Malonic acid (M2)―・クロロホルム／メタノール混液・エタノール・メタノール・アセトニトリル・エタノール・メタノール・アセトニトリル✔：共結晶を形成した―：共結晶を形成しなかった25

2.5 ナノスポット法の有用性と今後の展開今回用いた顕微ラマン分光法は，微細試料の測定が可能であるという利点を有する反面，顕微鏡で試料に焦点を合わせる必要があることから，測定所要時間が他の手法に比べて長いという欠点を有する．しかし，微量かつ多条件を試行可能なナノスポット法を適用することで，ナノグラムスケールの試料検出及び共結晶探索に成功した．
極微量での物性評価が可能となった昨今では，少量多条件のスクリーニングを効率的に行うために自動化が必須要件となってきている．Nagapudi らが用いた resonant acoustic mixing 装置
によるスクリーニング 33)は高い成功率とスケールアップの容易性という点で優れているものの，著者の手法と比較して 1 条件あたり 6 mg と圧倒的に消費量が多い．加えて音響共振エネルギーを利用した物理的な混合であるため，化合物に応じて加速度と混合時間の検討が必要となる．
また，結晶化スクリーニングシステムを利用した Luu らの報告 31)においては，自動化されているものの，PXRD での評価であるため， 1 条件あたり使用量として 1 mg 程度が限界であると推定される．更に Goyal らは，著者と同様，検体消費量を低減させることを目的として，マイクロ流路を用いた微量の共結晶スクリーニングを実施している 43)．彼らは，本手法と同じ CAF
をモデル原薬とし，EtOH を結晶化溶媒としてスクリーニングを実施したとき，CAF-2,5B，
CAF-1,2N において共結晶が得られたと報告している．著者の手法では彼らの結果に加えてCAF-4B でも共結晶が得られており，これは乾燥条件などの結晶化操作の違いによるものと推(1) 彼らが 1 条件あたり 5 μg
察される．
加えて，
ナノスポット法では Goyal らの手法と比較して，の試料量を必要とするのに対し，著者の手法では 1 条件あたり 10 ng とより少量で検討可能である点，(2) ガラスプレートとして市販の疎水化試薬で処理した汎用のスライドガラスを用いており，調達や調製が容易である点で優れた手法であると考えられる．また，スクリーニング26

の自動化を目標として使用した SPOT MASTER®は 10 ~ 2000 nL の範囲で分注が可能な装置である．eXtended Core Module（Symyx, CA, USA）44)やその他の自動分注装置を用いた結晶スクリー
ニングはいくつか報告例があるものの 45)，SPOT MASTER®のように nL オーダーで分注可能な装置を用いて共結晶スクリーニングを実施した例はこれまでに無い．本研究では原薬とコフォーマーを予め混合した溶液のみで検討を行ったが，SPOT MASTER®で自動化することでスポッ
ト位置が正確に制御できるため，原薬溶液を先にスポットして超微量の薬物結晶が多数配列したプレートを作成し，様々なコフォーマー溶液を後からスポットすることもできる．または，
薬物結晶に対して後から他の結晶化溶媒のみをスポットするなどの選択肢も考えられ，結晶多形の探索にも有用である．その他，インクジェットプリンターの自動分注機能を利用した原薬ポリマーの固体分散体スクリーニングへの適用例も報告されており 46)，効率的な分注法と検出法の組み合わせにより，ナノスポット法と同様に微量物性評価に関する更なる発展が期待できる．
さらに，低波数（low frequency: LF）領域のラマン分光測定法のような新たな検出法を適用することで，探索スクリーニングにおける検出効率が向上する可能性も考えられる 47)．LF ラマン
分光法で得られるスペクトルは結晶の格子振動に由来することから，結晶形に特異的な情報が得られるという特徴がある 48)．LF ラマン分光法を用いた結晶多形の識別や，結晶形の転移モニタリングについても報告されており，本法においても原薬結晶形態の変化，即ち共結晶形成を
感度良く検出できる可能性を有している 49)-52)．

27

2.6 小括
ナノスポット法の構築により，試料溶液の濃度として 0.2 mg/mL，即ち 1 条件あたり 10 ng での探索スクリーニングが可能となった．理論的には 1 μg の原薬量で 100 種類の条件が試験可能であり，原薬量の確保が困難な医薬品開発初期の段階から本手法が適用できる．実際の開発における結晶形態探索時には，原薬とコフォーマーの化学量論比や，実製造条件を想定した結晶
化溶媒種の検討も必要となるが，これらを網羅的に実施したとしても新規共結晶探索に十分適用可能な手法である．さらに本手法は，共結晶のような新規の結晶形態（結晶多形，塩及び溶媒和物を含む）の探索に限らず，微量の物性評価にも応用できると考えられる．

28

3. 共結晶の物性評価及び製剤学的応用
3.1 概要本研究のモデル原薬として用いたアセトアミノフェン（パラセタモール，N-アセチル-p-アミ
ノフェノール: APAP）は解熱鎮痛薬として広く用いられている（図 3-1）．本化合物は，経口製剤として投与したとき，体内での吸収過程を理解するために用いられる biopharmaceutics
classification system（BCS）53) の class III に分類される高い水溶解度と低い膜透過性を有する化合物である 54) ．結晶形は安定形の form I のほか，準安定形の form II，form III が確認されている（form I: monoclinic, P21/n , form II: orthorhombic, Pcab, form III: Pca21）55)-59)．このほか，擬似多形（水和物）として一水和物，三水和物が知られている．さらに，アセトアミノフェンはこれまでいくつかの共結晶が報告されており，4,4'-ビピリジン，N,N'-ジメチルピペラジン，ピペ
ラジン，N-メチルモルフォリン，モルフォリン 60) ，2,4-ピリジンジカルボン酸 61)及びテオフィ
リン 62)などがコフォーマーとして用いられている．
アセトアミノフェンは打錠成形性に乏しいことから，その改善例としてシュウ酸（OXA）との共結晶（APAP-OXA）が既に報告されている 63)．しかしシュウ酸には刺激性が強く，取り扱
いにくいという問題がある．既にシュウ酸塩として上市されている医薬品も存在するが，開発段階においてシュウ酸の毒性が議論になることも多い 64),65)．そこで本研究では，より実用的なアセトアミノフェン共結晶の探索を目的とし，医薬品として使用実績のある添加剤，あるいは
医薬品原薬との共結晶形成が報告されているコフォーマーについて，振動型ボールミルを用いた grinding 法によるスクリーニングを実施した．Grinding 法は，粉砕処理により固体同士に機械的エネルギーを加えて共結晶を調製する手法であり，有機溶媒を使用しない調製法としてグリーンケミストリーの観点からも注目されている 66) ．

29

表 6-1 に示す 29 種類のコフォーマーを用いた grinding 法による新規共結晶探索スクリーニン
グの結果，PXRD，IR ならびに熱測定により，APAP とトリメチルグリシン（TMG）の組合せ
で新規な結晶性複合体（APAP-TMG）を見出した（図 3-1）．トリメチルグリシンはテンサイなどの植物や，カニ，エビなどの水産物に多く含まれ，自然界に広く存在する化合物である 67),68)．また，特許としては，既にエパルレスタット-トリメチルグリシン共結晶が報告されている 69)．トリメチルグリシンはサプリメントとして，あるいは食品の甘味料や化粧品の保湿剤として使用されているため，安全性の観点からもシュウ酸よりも優れた添加剤になる可能性がある 68)．そこで APAP-TMG と APAP-OXA 共結晶の圧縮成形性，及び薬物の溶出特性について評価し，それらの製剤学的特性を比較した．更に，アセトアミノフェンは苦味を感じる薬物であることから，著者は化学的に味覚を評価・数値化できる味認識装置 70)に着目し，共結晶化に
より苦味マスキングが可能か検証を行った 71)．

APAP

TMG

OXA

分子量

151.16117.1590.03

融点

169~172°C

301~305°C

189.5°C

構造式

図 3-1 APAP，TMG，OXA の化学構造と融点303.2 共結晶の探索スクリーニングと APAP-TMG の物性評価
APAP を原薬として，全 29 種の添加剤をコフォーマーとして用いた．APAP 及び各コフォー
マーの化学量論比が 1 : 1 となるよう秤量し，乳鉢上で物理的に混合した試料を物理混合物（physical mixture: PM）とした．この試料を振動型ボールミルにて更に粉砕混合し，粉砕混合物（ground mixture: GM）とした．APAP，コフォーマー，PM 及び GM を PXRD にて評価し，GM の PXRD パターン中に新規回折ピークを認めた場合，新規結晶性複合体が得られたと判断した．探索スクリーニングの結果，唯一 APAP と TMG の GM において PXRD パターン中に新規回折ピークを認めた．そこで，APAP と TMG の新規結晶性複合体について詳細な物性評価を行った．まず，PXRD を用いて APAP-TMG における化学量論比の推定を行った．APAP と TMGの化学量論比が 1 : 1，1 : 2，2 : 1 となるよう秤量したのち PM 及び GM を調製し，PXRD を測定した結果を図 3-2 に示す．APAP と TMG の GM (1 : 2)，即ち TMG 過剰の場合，図 3-2 青点
線で示した 15°，23°及び 25-26°付近の TMG に由来する回折ピークが認められ，APAP と未反応の TMG の残存が示唆された．逆に，APAP 過剰の GM (2 : 1) の場合は図 3-2 黒点線で示した
16°及び 27°付近の APAP に由来する回折ピークが認められ，APAP の残存が示唆された．一方，
APAP と TMG の GM (1 : 1) については APAP 及び TMG 由来の回折ピークは認められず，新たな回折パターンのみ確認されたことから，新規結晶性複合体中の化学量論比は 1 : 1 であると考えられた．続いて，熱重量測定（thermogravimetry: TG）を行い，揮発性成分の確認を行った（図3-3）．結果，重量減少が認められたのは TMG 及び APAP と TMG の PM (1 : 1) であった．TMGの重量減少は 13.19%であり，一水和物の場合の理論値は 13.33%であることから，保管時に一水和物へ転移し，測定時の加熱により水分子が揮発し，無水物へ変化したと考えられた．APAPと TMG の PM (1 : 1) においても同様に，TMG 由来の水分子の揮発が引き続き確認された．

31

APAP と TMG の GM (1 : 1) ではこれらの重量減少が観察されなかったことから，振動型ボール
ミルによる粉砕処理により TMG と APAP が結晶性複合体を形成するために，TMG 中の水分子が気化したものと推察された．また，示差走査熱量測定（differential scanning calorimetry: DSC）
における APAP と TMG の PM (1 : 1) の 135.5°C に認められる吸熱ピークは APAP と TMG の共融，APAP と TMG の GM (1 : 1) の 174.0°C に観察される吸熱ピークは結晶性複合体の融解に由来するものと考えられた（図 3-4）．APAP の融点である 170°C は APAP と TMG の GM (1 : 1) では 174.0°C へとシフトしたことから，APAP よりも新規結晶性複合体の方が熱力学的に安定であることが示唆された．最後に，IR を用いて結晶性複合体形成に伴う構造変化の推定を行った
APAP の IR スペクトル中に認められた 1609 及び 1649 cm−1 の吸収ピーク，（図 3-5）．
及び TMGの IR スペクトル中に認められた 1612 cm−1 の吸収ピークは，APAP と TMG の GM (1 : 1) では
1623 cm−1 にシフトした．このことから，1600-1650 cm−1 の領域（図 3-5 赤枠）に特徴的な吸収を持つアミドカルボニル基に由来する分子間水素結合のネットワークに変化が生じていると考
えられた．

32

APAP
TMG

GM (1 : 1)
GM (1 : 2)
GM (2 : 1)
5

15

10

20

25

30

2theta (deg.)

図 3-2 APAP，TMG の PXRD 回折パターン

APAP
TMG

重量変化率 (%)

X 線強度 (cps)PM (1 : 1)

-13.19%-3.07%

PM (1 : 1)

GM (1 : 1)
40

50

60

70

80

90

100

Temperature (°C)

図 3-3 APAP，TMG の TG 重量変化

33

110

120

35

APAP

吸熱方向 (mW)

TMG
135.5°C
PM (1 : 1)
174.0°C
GM (1 : 1)
40

120

80

160

200

240

280

320

Temperature (°C)

図 3-4 APAP，TMG の DSC サーモグラム

APAP

TMG

透過率 (%T)

PM (1 : 1)

GM (1 : 1)

1800

1600

1400

1200

1000

Wavenumber (cm-1)

図 3-5 APAP，TMG の IR スペクトル

34

800

600

3.3 APAP-TMG の結晶構造と格子エネルギー得られた APAP と TMG の新規結晶性複合体の結晶形態を分類するため，単結晶を調製し，X線結晶構造解析を行った．APAP 及び TMG を化学量論比 1 : 1 となるよう秤量し，アセトン／
メタノール混液（2：1）中に溶解して 5°C にて静置し，単結晶を得た．単結晶 X 線構造解析の結果を図 3-6a, b 及び表 3-1 に示す．表 3-1 に示した R 因子（final R indices）は，実測データから求められる構造因子 Fobs と解析から得られたモデル構造に基づく構造因子 Fcalc の一致度を表す指標であり，0.10 以下であれば精密化がうまく行われたと判断できる．結果，R1 は 0.0287 であり，0.10 を十分下回っていることから，解析は精度よく収束していると判断した．新規結晶性複合体の空間群は Pna21 であり，APAP と TMG の分子間（O2H∙∙∙O3=C9, 2.635 Å）ならびにAPAP 同士の分子間（C7=O1∙∙∙HN1, 2.880 Å）で水素結合を形成していた（図 3-6c, d）．APAPと TMG の分子間に水素結合が確認されたことから，結晶形態の定義を参照し，この新規結晶性複合体は共結晶であると判断した．また，この結晶構造から計算した理論的な PXRD パター
ンは，APAP と TMG の GM (1 : 1) の PXRD パターンと完全に一致した（図 3-7）．PXRD パターンの一致は結晶形が同一であることを意味していることから，grinding 法によっても APAP
及び TMG がそれぞれ過不足や分解することなく固体状態で共結晶化し，溶媒を用いて調製した単結晶の構造と同一の共結晶を形成していることが確認された．

35

表 3-1 Crystallographic Data and Structure Refinement Parameters.
APAP-TMG 共結晶
structural formula(C8H9NO2) (C5H12NO2)

formula weight268.31crystal system

orthorhombic

space group

Pna21

T (K)

120

a (Å)

8.321(3)b (Å)

15.772(6)c (Å)

10.422(4)

α (°)

90

β (°)

90

γ (°)

90
3

V (Å )

1367.8(9)Z4ρcalc (g/cm )1.303

μ (mm )

0.097

independent reflections

3137 [R (int) = 0.0377]

final R indices [I > 2σ (I) ]R1 = 0.0287, wR2 = 0.0684

R indices (all data)

R1 = 0.0324, wR2 = 0.0706

goodness-of-fit

1.058

reflections collected

14831

3

-1

36

(a)

(b)

(c)

(d)
2.635 Å図 3-6 APAP-TMG 共結晶の立体構造(a) ORTEP 図（楕円の中に各原子が 50%の確率で存在する位置を表す）(b) 単位格子あたりのパッキング様式(c) 水素結合ネットワーク（緑：APAP，橙：TMG，水線：水素結合）(d) APAP と TMG 間の分子間水素結合を点線で示した

37

(a)

(b)

図 3-7 APAP-TMG の PXRD パターン(a) 結晶構造から計算，(b) APAP と TMG の GM (1 : 1) 実測

続いて，APAP，TMG 及び APAP-TMG 共結晶の熱力学的安定性を比較することを目的とし，古典力学計算ツール Forcite を用いた格子エネルギーの算出を行った．APAP-TMG 共結晶及びその構成成分である APAP ならびに TMG ついて，それぞれの格子エネルギー（ELATT）を算出し，その差を ΔELATT (kJ/mol) で表した．
ΔELATT (kJ/mol) =（共結晶の ELATT）–（共結晶各構成成分の ΣELATT）
計算の結果，APAP は-1549.075 kJ/mol，TMG は無水物として-17.930 kJ/mol（共結晶中に水分38

子を含まないため，無水物として取り扱った），APAP-TMG 共結晶は-1774.446 kJ/mol という値が得られた（表 3-2）．これらの値を上式に代入すると，ΔELATT は-207.441 kJ/mol であった．
格子エネルギーが低いほど安定な結晶構造であることを意味しており，ΔELATT が負の値である
APAP-TMG 共結晶は，APAP と TMG よりも熱力学的に安定であり，共結晶が形成されることは妥当であると言える 72)．

表 3-2 各構造パラメータと格子エネルギー
APAP form I

TMG
anhydrate73)

TMG
monohydrate74)

APAP-TMG
共結晶

Crystal system

monoclinic

orthorhombic

orthorhombic

orthorhombic

Space group

P21/c

Pnma

Pbca

Pna21

a (Å)

12.833

14.544

9.431

8.321

b (Å)

9.315

6.859

11.43815.772

c (Å)

7.086

6.131

13.01810.422

α (°)

90

90

90

90

β (°)

115.6

90

90

90

γ (°)

90

90

90

90

-1549.075-17.930-722.384-1774.446

Lattice energy (kJ/mol)

39

3.4 APAP-TMG 共結晶の製剤学的特性評価
本項では，APAP-TMG 共結晶の製剤学的特性を評価し，既報の APAP-OXA 共結晶と比較を行った．APAP-TMG 共結晶と APAP-OXA 共結晶の粒子径や粒度分布が大きく異なる場合，以下評価を行った打錠特性や溶解速度を正しく比較できない可能性がある．そこで，両者の粒子径を測定し，同等性を確認した．APAP-TMG 共結晶及び APAP-OXA 共結晶について画像式乾式粒度分布測定を行ったところ，APAP-TMG 共結晶と APAP-OXA 共結晶の粒度分布及び粒子径（d10，d50，d90）はほぼ同じであり，打錠特性や溶解速度には大きな影響がないことを確認した（図 3-8，表 3-3）．

表 3-3 乾式粒度分布測定結果
APAP

TMG*

OXA

APAP-TMG
共結晶

APAP-OXA
共結晶

d10

12.71

163.8

8.59

9.09

7.306

d50

28.86

342.6

28.66

23.61

19.3

d90

61.29

594.3

72.11

45.53

47.14

sample粒子径 (μm)*：測定中に潮解が認められた

40

(a)

(b)

図 3-8 乾式粒度分布測定結果(a) APAP-TMG 共結晶，(b) APAP-OXA 共結晶

41

(1) 打錠特性
APAP，APAP-TMG 共結晶及び APAP-OXA 共結晶それぞれの錠剤（素錠）を成形し，モンサ
ント硬度計を用いて硬度を測定した（n = 10）．APAP 単独の場合，成形性が悪くほとんどの試料がモンサント硬度計に錠剤をセットする過程で崩壊してしまい，硬度試験の実施は困難であった．一方，共結晶化することで APAP-TMG 共結晶及び APAP-OXA 共結晶いずれも硬度は大幅に改善され，APAP-TMG 共結晶は APAP-OXA 共結晶とほぼ同等の硬度を有していることが明らかとなった（表 3-4，図 3-9）．

表 3-4 APAP-TMG 共結晶，APAP-OXA 共結晶，APAP の硬度試験及び見かけの溶解速度

硬度 (kg)K´ (cm-2∙min-1)

APAP-TMG 共結晶

APAP-OXA 共結晶

APAP

11.6±1.5

13.0±1.4

N.D.

2.94±0.34×10-4

2.62±0.29×10-4

2.48±0.25×10-4

APAP-TMG 共結晶

APAP-OXA 共結晶

APAP

図 3-9 各錠剤の外観(2) 見かけの溶解速度
見かけの溶解速度を算出するため，溶出試験を行った．溶解速度評価用ディスクに充填した
APAP，APAP-TMG 共結晶及び APAP-OXA 共結晶それぞれを溶出試験機に投入し，経時的に溶出液を採取した．紫外可視分光光度計を用い，採取した液中の APAP 含量を求めて見かけの溶42解速度 K’を算出した．溶解速度評価用ディスクを用いており，測定試料の表面積が一定であると見なせるため，以下の Noyes-Whitney の式で表される表面積 S は定数として扱った．
dC / dt = K´ S (Cs – C)
ここで， dC/dt は溶解速度，K´は見かけの溶解速度，S は表面積，Cs は原薬の溶解度，C は
時間 t における原薬（アセトアミノフェン）濃度を表す．シンク条件（Cs>>C）が成立するとし，Cs – C≒ Cs と近似した．
結果，図 3-10 に示す溶出挙動が確認され，それぞれのプロットの傾きから算出した K´から，
APAP-TMG 共結晶は APAP 単独及び APAP-OXA 共結晶と比較して，同等かあるいは僅かに溶
解速度の向上が認められた（表 3-4）．APAP は BCS class III に分類される水溶解度の高い原薬であること，TMG は水への溶解度が 13.66 mol/L（= 1.6 g/mL）と非常に高い化合物であることから，APAP-TMG 共結晶では高い硬度と速やかな薬物溶出の両立が実現した．

43

■ APAP-TMG 共結晶▲ APAP-OXA 共結晶◆ APAP

図 3-10 溶出試験結果(3) 味覚評価（苦味マスキング）
味認識装置（TS-5000Z）は表 3-5 に示す電極を搭載しており，疑似的な味覚として定量的に表現することができる．まず，各電極を基準液に浸してベースライン Vr をとり（図 3-11①），測定する試料溶液を電極と反応させたときのセンサー出力 Vs を測定する（図 3-11②）．その後，基準液で洗浄したときのセンサー出力 Vr’を測定する（図 3-11③）．このとき，最初にセンサーが試料溶液と反応したときの基準液との出力差 Vs – Vr が相対値，即ち「先味（食品を口に含んだ瞬間の味）」として表現される．また，基準液で洗浄したときの出力差 Vr’ – Vr がchange of membrane potential by adsorption（CPA）値，即ち「後味（食品を飲み込んだ後に残る
持続性のある味）」として表現される 75) ．
APAP-TMG の評価を行う前に，APAP が装置のセンサーと反応するか確認を行った．APAPの濃度特性を評価した結果，1.0 mg/mL を超える濃度から，9 本の電極センサーのうち，苦味雑44

味，渋味刺激，旨味及び塩味を示す電極 C00，AE1，AAE 及び CT0 において相対値の明確な応答が認められた．一方，CPA 値に関しては応答が認められなかったことから，APAP は強い後味は持たないと考えられた（図 3-12，表 3-5）．
APAP 単体で十分な応答が見られたことから，APAP 及び TMG 共存下で味覚評価を行った．
基準液の値を 0 として，値が 0 を上回った味覚項目に「味がある」と判定し，それらの味覚を青四角で示した（図 3-13a）．TMG の添加量を次第に増加していくと，甘味及び旨味が顕著に増加した．図 3-13a で「味がある」と判定した項目について，ヒトが感じられる味覚の差を 1目盛りで表したときのレーダーチャートを図 3-13b に示す．APAP に TMG を添加することで，ヒトは甘味と旨味における味覚の差を感じられることが示唆された．続いて，甘みと旨味，渋味と苦味における味覚の二次元散布図を図 3-14 に示す．甘味と旨味においては TMG の添加量が多くなるほど味覚は強くなる傾向が認められ（図 3-14a），苦味と渋味においては TMG 濃度
依存的にどちらも応答が小さくなり，TMG 添加による苦味抑制効果が期待できる結果となった（図 3-14b）．

45

表 3-5 電極と該当する味覚
電極名

相対値 （先味）

CPA 値 （後味）

BT0

塩味，苦味

塩酸塩の苦味AN0

塩味，酸味，苦味アミノ酸系の苦味（コク）AC0

塩味，酸味，苦味
雑味，苦味（苦味雑味）
雑味，渋味（渋味刺激）
肉，お茶等の旨味場合によっては甘味（旨味）

医薬品系，カルシウム系苦味（塩基性苦味）カルシウム系苦味（塩基性苦味）ビール，コーヒー等の苦味（酸性苦味）
お茶，ワイン等の渋味
（渋味）
豆類の旨味
場合によっては甘味（旨味コク）

CT0

塩味

なし

CA0

酸味

なし

GL1

甘味

なし

C00
AE1
AAE

図 3-11 味認識装置の測定原理
株式会社インテリジェントセンサーテクノロジー Web サイトより抜粋

46

センサー出力 (mV)(a)

濃度 (mg/mL)

センサー出力 (mV)(b)

濃度 (mg/mL)
図 3-12 APAP の濃度特性(a) APAP の相対値濃度特性，(b) APAP の CPA 値濃度特性

47

(a)

(b)

□ APAP-control□ APAP + 0.0225 M TMG□ APAP + 0.045 M TMG□ APAP + 0.09 M TMG□ APAP + 0.18 M TMG□ APAP + 0.36 M TMG

図 3-13 APAP と各濃度の TMG 共存下の味覚評価結果
APAP-TMG 共結晶は APAP + 0.09 M TMG に相当する

48

(a)

(b)

図 3-14 味覚の二次元散布図(a) 旨味と甘味，(b) 苦味と渋味
図中の BTN は TMG を意味する

49

3.5 APAP-TMG 共結晶の製剤学的有用性
アセトアミノフェンは水素結合ドナー・アクセプター双方を有していることから，共結晶検討のモデル原薬としてこれまで多くの共結晶が見出されてきた．アセトアミノフェン-テオフィ
リン共結晶のようにどちらも原薬として用いられる有用な共結晶も存在するが 62)，シュウ酸や
1,4-ジオキサンのように刺激性のある化合物や International Council for Harmonisation of TechnicalRequirements for Pharmaceuticals for Human Use（ICH）ガイドラインで許容限度値が規定されている溶媒の使用も見受けられ 76)，必ずしも実用的なコフォーマーや溶媒種が選択されているとは言えない．特にシュウ酸は組織刺激性があり，シュウ酸カルシウム塩として腎毒性を示すことが広く知られている 64),65)，基本的に，医薬品として販売を想定するような場合，候補となる
コフォーマーには使用実績のある添加剤のほか，米国において使用上の安全性が認められている化合物が登録された Generally Recognized As Safe（GRAS）や Everything Added to Food in the
United States（EAFUS）を参考に選ばれる 9),77)．その中でトリメチルグリシンは，ホモシスチン尿症の治療として古くから用いられている化合物であり，動物への投与でも 25 年という長期にわたって安全であることが確認されており，有望かつ実用的な新規医薬品添加剤の一つであると言える 78),79)．さらに，トリメチルグリシンは保湿作用を持つため，サプリメントのみならず化粧品用途としても用いられている 68)．そのため，外用薬として使用されるような原薬とトリメチルグリシンの共結晶を見出すことができれば，原薬の薬効と保湿作用を併せ持つ結晶形態として展開が期待できる．
APAP-TMG 共結晶の打錠特性は，APAP と比較して大幅に向上し，APAP-OXA 共結晶と同等の硬度を示した．これまでに，圧縮成形性が向上した共結晶は APAP-OXA 共結晶のほか，カフェイン-没食子酸メチル 80)，アセトアミノフェン-テオフィリン，アセトアミノフェン-ナフタレ

50

ン，アセトアミノフェン-フェナジン 63)各共結晶が報告されている．特に Karki らは，APAP form
I よりも成形性に優れる form II が形成する平面構造に着目し，クリスタルエンジニアリングの観点から共結晶中でも平面構造を形成することを期待してコフォーマーを選定している 63)．
APAP-TMG 共結晶については平面構造が認められなかったものの，上述の通り APAP と比較して圧縮成形性が大幅に改善した．一般的に，結晶多形など同じ化学構造でも結晶中のパッキン
グ様式が結晶多形間で異なれば，濡れ性や溶解速度，打錠特性が変わることから 81)，APAP から APAP-TMG 共結晶へとパッキング様式が変化したことでエネルギー的な安定性や結晶面に影響を与えたものと考えられる．
APAP-TMG の味覚評価では，APAP に TMG を添加することで，甘味，旨味について明確な味覚の変化が認められた．APAP の苦味に関しても，数値が低下する傾向が認められた．アセ
トアミノフェンは水溶液中で解離しない中性の化合物であるため，本研究で用いた味覚評価の手法ではセンサー出力の変化量が小さく，実際のヒトの味覚では苦味マスキング効果を感知できないことも十分に考えられる．しかし，トリメチルグリシンが甘味と旨味を有することから，
コフォーマーとしての用途に加え，他の原薬に適用した場合の苦味マスキング効果も期待できることが明らかとなった．

51

3.6 小括
本研究において，grinding 法による APAP の新規共結晶探索スクリーニングを行ったところ，
APAP と TMG の組み合わせにおいて新規結晶性複合体を見出すことに成功した．単結晶 X 線解析により，この新規結晶性複合体は共結晶であると判断した．APAP-TMG 共結晶の立体構造と APAP form I のそれを比較すると，共結晶化により水素結合様式が変化しており，IR の結果から予想されたアミドカルボニル基の環境変化が裏付けられた．
また，APAP と TMG の共結晶化による APAP の打錠特性の改善に成功した．実際の製造工程
では，原薬に賦形剤や滑沢剤などを添加する必要があり，APAP-TMG 共結晶の製品化では改めて製剤処方を検討する必要がある．しかし，共結晶化による打錠特性の改善で製造及び流通時の硬度が保たれ，口腔内で速やかに溶解する錠剤の設計が可能になると考えられる．
苦味マスキングの手法として，従来から製剤機械を用いたコーティング剤の被覆処理などの物理的方法 82)，β-シクロデキストリンを用いた包接体を形成する化学的方法 83)，甘味剤の添加のような官能的方法 84) などが開発されてきた．今回の味認識装置を用いた評価の結果，
APAP-TMG 共結晶は APAP の持つ味覚を変化させる可能性を示した．このことから，味覚改善効果を有するコフォーマーを用いた共結晶化は，苦味マスキングにおけるこれまでにない化学的手法の一つになり得ることが示唆された．
以上の結果より，TMG は OXA と比較してより安全で，APAP と共結晶化することによってAPAP の物理化学的性質を改善するのみならず，味覚という官能的な性質を変化させることができる有望なコフォーマーであると考えられる．

52

4. 総括本研究では，新規共結晶の探索手法ならびに共結晶化による物性改善に着目し，共結晶の微量探索法の開発及び共結晶の物性評価，製剤学的応用について検討を行った．
「2 共結晶の微量探索法開発」では，共結晶の探索スクリーニングにおける原薬消費量を極限まで低減したナノスポット法を新たに開発し，ナノグラムスケールでの共結晶探索を可能にした．本手法の構築により，原薬量の十分な確保が困難な医薬品開発初期段階において，少量で多条件の試験が可能な共結晶探索法としての有用性を示した．
「3 共結晶の物性評価及び製剤学的応用」では，アセトアミノフェンの共結晶探索スクリー
ニングにより，トリメチルグリシンとの組み合わせにおいて新規結晶性複合体を見出した．種々の評価を通じてアセトアミノフェンとトリメチルグリシンの新規結晶性複合体の化学量論比，分子間相互作用を明らかにした．また，結晶構造解析より，この新規結晶性複合体は共結晶であることを明らかにした．アセトアミノフェン-トリメチルグリシン共結晶の製剤学的有用性を評価することで，特許の観点から，新たな結晶形の発見という新規性に加え，結晶形の制御による味覚改善という進歩性も示すことができ，新たな錠剤設計の指針を示した．
以上の研究は，原薬が有する結晶形の選択肢を最大限に広げ，最適な物性を有する原薬及び医薬品の創出に貢献できるものと考える．

53

5. 謝辞本研究に際し，終始熱心なご指導と的確なご助言を賜りました明治薬科大学 分子製剤学研究室 深水啓朗教授に深謝致します．
本論文作成に際し，多大なるご指導，ご助言を賜りました明治薬科大学 有機合成化学研究室
高取和彦教授ならびに同 薬品製造化学研究室 齋藤望教授に深く感謝の意を表します．
本研究を始めるきっかけを与えて下さいました日産化学株式会社 大塚正史博士に深く感謝致します．また，研究活動に対して多大なるご支援を賜りました日産化学株式会社 物質解析研究部長 横山達朗氏，同部 吉田明広氏に感謝致します．
最後に，支えてくれた両親，帰宅する私を毎日笑顔で迎えてくれる家族に感謝します．

54

6. 実験の部
6.1 共結晶の微量探索法開発
6.1.1 試薬
モデル原薬として CAF を用い，スクリーニングには 10 種のコフォーマーを用いた．それぞれの化学構造式を図 6-1 に示す．
検討に使用した溶媒はトルエン，MeOH，EtOH，DMSO（富士フイルム和光純薬株式会社）
であり，疎水化試薬として，HMDS， TCODS（東京化成工業株式会社）及び DMDCS（シグマアルドリッチ ジャパン合同会社），Novec™ 1720（スリーエム ジャパン株式会社）を用いた（図 6-2）．シリンジ疎水化試薬には HY-Kit（DataPhysics Instruments GmbH）を用いた．使用した試薬はすべて特級である．

55

caffeine (CAF)salicylic acid (2B)

oxalic acid (O)4-hydroxybenzoic acid (4B)

maleic acid (M1)malonic acid (M2)glutaric acid (G)citric acid (C)adipic acid (Ad)1-hydroxy-2-naphthoic acid
(1,2N)

2,5-dihydroxybenzoic acid
(2,5B)

図 6-1 カフェイン及びコフォーマーの化学構造

1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane(HMDS)

trichlorooctadecylsilane(TCODS)

図 6-2 炭化水素系疎水化試薬の化学構造

56

dimethyldichlorosilane(DMDCS)

6.1.2 ガラスプレートの疎水化材料検討(1) ガラスプレートの疎水化の検討
ガラスプレートは，75 mm × 25 mm，厚み 1 mm のスライドガラスを用いた．
1) 炭化水素系疎水化試薬i) ガラスプレートをそれぞれ HMDS，TCODS 及び DMDCS に 3 分間浸漬し，取り出したガラスプレート全体を過剰量のトルエンで洗浄して風乾した．ii) 同様に過剰量のMeOH でガラスプレートを洗浄し，40°C で 30 分間減圧乾燥した．
疎水化試薬 2 種類を組み合わせた場合は，i) の後にガラスプレートを別の疎水化試薬に 3 分間浸漬し，取り出したガラスプレート全体を過剰量のトルエンで洗浄して風乾した．続いて ii) の操作を行った．
2) フッ素系疎水化試薬
ガラスプレートをスピンコーター（Opticoat MS-A100，ミカサ株式会社）に設置し，ガラスプレート中央に Novec™ 1720 をおよそ 1.5 mL 滴下した．500 rpm で 5 秒間，1000 rpm で 30 秒間スピンコートし，取り出したガラスプレートを 100°C で 30 分間常圧乾燥した．

(2) ガラスプレートの評価
1) 接触角測定
HY-Kit を用いてマイクロシリンジ（7000.5KH，Hamilton Company，USA）を疎水化した． (1) で疎水化処理を施したガラスプレート上に，疎水化処理を施したマイクロシ
リンジを用いて 4 種類の溶媒（水，MeOH，EtOH，DMSO）をそれぞれ 300 nL 滴下し

57

た．これらの液滴を，デジタルマイクロスコープ（Dino-Lite Pro 2 Premier, AnMo
Electronics Corporation）に搭載されているソフトウェア Dino Capture 2.0 を用いて θ/2法による接触角を求めた．
2) 原子力間顕微鏡 （AFM）
疎水化処理したガラスプレートについて，AFM（Dimension Icon，ブルカージャパン
株式会社）
を用いて，
単結晶 Si をプローブとし，バネ定数約 3 N/m，共振周波数約 80 kHz
にて 20×20 nm における表面特性を評価した．

6.1.3 ナノスポット法の最適化と自動化
Novec™ 1720 で疎水化処理を行ったガラスプレートに，滴下位置の目安となる 2 × 2 mm のス
ケールを印刷したエーワン ラベルシール（品番 28791，スリーエム ジャパン株式会社）をプ
レートの裏側に貼付した（図 6-3）．予め疎水化試薬で疎水化処理したマイクロシリンジを用いて，CAF，2,5B，4B，O，及び Ad の 0.002 mg/mL（= 0.1 ng/50 nL），0.02 mg/mL（= 1 ng/50 nL）
及び 0.2 mg/mL（= 10 ng/50 nL）EtOH 溶液をそれぞれ 50 nL 滴下した．滴下時の様子は目視が困難であったため，デジタルマイクロスコープ（Dino-Lite Pro 2 Premier, AnMo Electronics
Corporation）を用いて観察した．溶液を滴下したガラスプレートは，室温環境下で静置して 24時間乾燥させ，結晶を得た．
析出した結晶を，顕微ラマン分光分析装置（Lab RAM ARAMIS，株式会社堀場製作所）を用い，レーザー波長 633 nm で評価した．
試料スポットの自動化は，SPOT MASTER®（武蔵エンジニアリング株式会社，図 6-4）を用
い，疎水化処理したガラスプレート上に 50 nL 滴下した．

58

図 6-3 2 × 2 mm スケールのフィルムシート模式図

図 6-4 SPOT MASTER®の全体図
武蔵エンジニアリング株式会社 Web サイトより抜粋

6.1.4 CAF 共結晶の探索スクリーニング
文献 35)-41)を参考にして比較対象となる標準共結晶調製し，PXRD 装置（Mini-Flex，株式会社
PXRD の回折パターンは CuKα 線源を用い，電圧 30 kV，リガク）
を用いて共結晶形成を確認した．
電流 15 mA，回折角の範囲 5–35°，スキャンスピード 4° min–1 で取得した．代表的な共結晶の調製法を次に示した．CAF-2,5B 標準共結晶：CAF と 2,5B の化学量論比が 1 : 1 かつ全量 100 mg

59

となるよう，それぞれ 55.75 mg と 44.25 mg 秤量し，両者を 5 mL の EtOH 加えて溶かした．窒
素気流下で溶媒を除去し，CAF-2,5B 標準共結晶を得た．CAF-4B 標準共結晶：CAF と 4B の化
学量論比が 1 : 1 かつ全量 100 mg となるよう，それぞれ 58.44 mg と 41.56 mg 秤量し，両者を 5 mLのアセトニトリルに加えて溶かした．窒素気流下で溶媒を除去し，CAF-4B 標準共結晶を得た．
CAF-1,2N 標準共結晶：CAF と 1,2N の化学量論比が 1 : 1 かつ全量 100 mg となるよう，それぞれ 50.79 mg と 49.21 mg 秤量し，両者を 5 mL の EtOH に加えて溶かした．窒素気流下で溶媒を除去し，CAF-1,2N 標準共結晶を得た．
カルボン酸 10 種（2B，O，4B，M1，M2，G，C，Ad，1,2N，2,5B）をコフォーマーとして，
CAF との化学量論比 1 : 1 で 0.2 mg/mL の EtOH 溶液を調製し，Novec™ 1720 で疎水化処理した
ガラスプレート上に疎水化処理したマイクロシリンジを用いて 50 nL 滴下した．溶液を滴下したガラスプレートは，室温環境下で静置して 24 時間乾燥させ，結晶を得た．別に，CAF 及び
コフォーマーについても各 EtOH 溶液を調製し，同様の操作で結晶を得た．析出した結晶及び各標準共結晶について，偏光顕微鏡（Nikon ECLIPSE E600W，株式会社ニコン）による撮像及び顕微ラマンスペクトル測定（レーザー波長：633 nm）を行った．

60

6.2 共結晶の物性評価及び製剤学的応用
6.2.1 試薬APAP（東京化成工業株式会社），TMG（富士フイルム和光純薬株式会社）及び OXA（富士フイルム和光純薬株式会社）の化学構造を図 3-1 に示す．また，スクリーニングを実施した 29
種類のコフォーマー一覧を表 6-1 に示す．参考文献 85)を基に，分子量 500 以下，常温で固体の化合物から，第 17 改正日本薬局方 通則 30「水に極めて溶けにくい」及び「水にほとんど溶けない」を除き，経口・注射・歯科外用及び口腔内用で使用実績のあるものを選定した．参考文
献 65)を基に分子量 500 以下，常温で固体の化合物から選定した．試薬はすべて試薬特級を用いた．

表 6-1 スクリーニングに使用したコフォーマー
CompoundMw

ethyl vanillin85)
sodium oleate85)
d-camphor85)
dl-camphor85)
xylitol85)
85)
D-xylose
calcium glycerophosphate85)

166.17304.45152.24152.24152.15150.13210.14

calcium gluconate monohydrate85)
sodium gluconate85)
creatinine85)
saccharin85)
85)
D-sorbitol
sorbic acid85)
taurine, 2-aminoethanesulfonic acid85)
thymol 85)
nicotinamide85)
urea85)hydroquinone85)
benzethonium chloride85)
pyrogallol86)

448.39218.14113.12
183.19182.17112.13125.15150.22
122.1360.06
110.11448.09126.1161

Supplier
東京化成工業株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
東京化成工業株式会社
東京化成工業株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
東京化成工業株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
東京化成工業株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社

Compoundisophthalic acid87)
87)

Mw
166.14phthalic acidtrimethylglycine, betaine88)
sarcosine88)
nicotinic acid88)

166.14117.1589.09
123.11isonicotinamide88)
3,5-dinitrobenzoic acid89)
galactaric acid65)
N-methylglucamine65)

122.12212.12210.14195.21

Supplier
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルム和光純薬株式会社
東京化成工業株式会社
東京化成工業株式会社

6.2.2 共結晶の探索スクリーニングと APAP-TMG の物性評価(1) 共結晶の探索スクリーニング
APAP 及び表 6-1 の各コフォーマーを化学量論比 1 : 1 かつ全量が 250 mg となるようにそれぞれ秤量し，メノウ乳鉢で約 30 秒間混合した（PM）．このうち約 150 mg を振動型ボールミル（Mixer/Mill 5100, SPEX SamplePrep）にて 30 分間混合粉砕した（GM）．APAP，各コフォーマ
ー，各 PM 及び各 GM の PXRD の回折パターンは，Rigaku Miniflex（株式会社リガク）の CuKα線源を用い，電圧 30 kV，電流 15 mA，回折角の範囲 5–35°，スキャンスピード 4° min–1 で取得した．

(2) APAP-TMG の物性評価
1) 粉末 X 線回折
APAP-TMG の化学量論比を推定するため，(1) と同様にして APAP と TMG の化学量論比が 1 : 1，1 : 2 及び 2 : 1 となる PM 及び GM を調製した．APAP，TMG，各 PM 及び各 GM の PXRD の回折パターンは，Rigaku Miniflex（株式会社リガク）の CuKα 線源を用い，電圧 30 kV，電流 15 mA，回折角の範囲 5–35°，スキャンスピード 4° min–1

62

で取得した．
2) 赤外吸収スペクトル
APAP，TMG，PM (1 : 1) 及び GM (1 : 1) の IR スペクトルは，ATR ユニット
（Dura-samplIR II, Smiths Detection Group Limited）を装填した FT/IR-4100（日本分光株
式会社）
を用いて取得した．いずれも波数の範囲は 4000–650 cm-1，波数分解能は 4 cm-1，
積算回数は 16 回とした．
3) 熱分析
DSC は DSC 8230（株式会社リガク）を用い，アルミパンに 3 mg をとり密封した試料を窒素雰囲気下（100 mL/min），昇温速度 5°C min-1 にて測定した．TG は TG-8120（株式会社リガク）を用い，アルミパンに試料をとり昇温速度 5°C min-1 にて測定した．

6.2.3 APAP-TMG の結晶構造と格子エネルギー(1) APAP-TMG の単結晶 X 線構造解析
APAP 及び TMG を化学量論比 1 : 1 で全量を 700 mg となるよう，それぞれ 394.36 mg と305.64 mg 秤量した．両者をアセトン／メタノール混液（2：1）に溶かし，5°C で 24 時間静置して単結晶を得た．この結晶を用いて SMART 1000 CCD（ブルカージャパン株式会社）にて単結晶 X 線構造解析を行い，構造を決定した．
(2) 格子エネルギー算出
得られた結晶構造を基に，Materials Studio 6.0（アクセラリス株式会社，現 BIOVIA）のモジュールである Forcite（古典的分子力場計算ツール）を用い，Condensed-phase Optimized Molecular
Potentials for Atomistic Simulation Studies（COMPASS）力場で格子エネルギー（ELATT）を計算し63

た．同様に APAP，TMG それぞれの ELATT を算出し，合計の差を ΔELATT（kJ/mol）で表し，熱力学的安定性について評価した．

6.2.4 APAP-TMG 共結晶の製剤学的特性評価
6.2.2 (1) と同様に操作して，APAP-TMG 及び APAP-OXA の各 GM (1 : 1) を調製した．
各 GM (1 : 1) の粒子径の同等性評価には，画像式乾式粒度分布測定装置（Morphologi G3，スペクトリス株式会社）を用いた．試料の分散圧力 0.8 bar，分散圧力時間 20 ms とし，顕微鏡倍率
50 倍下で粒子数 50000 個を自動計測した．得られた結果から d10，
d50 及び d90 (μm) を算出した．

(1) 打錠特性
6.2.2 (1) と同様に操作して，APAP-TMG 及び APAP-OXA の各 GM (1 : 1) を調製した．各 GM(1 : 1) 約 200 mg を直径 8 mm の打錠用臼に充填し，圧力 0.8 t/cm2，1 分間かけて錠剤を成形した．モンサント型錠剤硬度計を用いて得られた錠剤 10 個について硬度を測定した．

(2) 見かけの溶解速度
6.2.2 (1) と同様に操作して，APAP-TMG 及び APAP-OXA の各 GM (1 : 1) を調製した．各 GM(1 : 1) 約 200 mg を溶解速度の評価用ディスクに充填し，圧力 1 t/cm2，1 分間かけて試料を成形した．各ディスクを溶出試験機のベッセル底部に設置し，パドル法にて溶出試験を実施した．
試験液にはイオン交換水を用い，液量 900 mL，温度 37.0°C，パドル回転数 50 rpm で試験を行った．開始 5，10，15，20 及び 30 分後に溶出液を採取し，孔径 0.45 μm のメンブランフィルタ
ーで濾過したものを試料溶液とした．紫外可視分光光度計（V-630iRM，日本分光株式会社）を64

用いて 244 nm における APAP の吸光度から APAP の濃度（mol/L）を算出し，作図した直線の
傾きからみかけの溶解速度定数 K´を算出した．

(3) 味覚評価（苦味マスキング）
味認識装置（TS-5000Z，株式会社インテリジェントセンサーテクノロジー）を用い，APAP
APAP の濃度特性を評価するため，
APAP が 0.001，
及び APAP-TMG の味覚評価を行った．まず，
0.003，0.01，0.03，0.1，0.3，1.0，3.0，10.0 mg/mL の 10 mM KCl 溶液を調製し，測定を行った．
1.0 mg/mL を超える濃度から APAP が電極 C00，AE1，AAE 及び CT0 に応答することを確認し，続いて APAP に TMG を添加して味覚評価を行った．APAP 及び TMG を表 6-2 に示す種々の割合で秤量し，10 mM KCl に溶かして全量を 200 mL とし，試料溶液とした．

表 6-2 味覚評価の実験計画
sample name

APAP (g)APAP (mol/L)

TMG (g)

TMG (mol/L)

0

-

0

-

0

-

0.52720.02251.05430.45

2.10860.09

APAP+0.18M TMG

4.21730.18

APAP+0.36M TMG

8.43450.36

blank (10 mM KCl)
APAP control
APAP+0.0225M TMG
APAP+0.045M TMG
APAP+0.09M TMG

2.8

0.09

65

7. 引用文献
1) Paul S. M., Mytelka D. S., Dunwiddie C. T., Persinger C. C., Munos B. H., Lindborg S. R., Schacht
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66

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