薬剤性 肝障 害発 症に 関与する反応性代謝物の解明手法に関する研究
Studies for Identification of Reactive Metabolites Related toDrug-Induced Liver Injury

令和 4 年度
論文博 士申請者
長 直樹 (Cho, Naoki)

目次
緒言 .................................................................................................................... 5
1

第一章: BBR の新 規 反応性代謝物の同定 .................................................. 7

1.1 序論 .............................................................................................................. 7
1.2 方法 .............................................................................................................. 71.2.1

試薬及び材 料 ......................................................................................... 7

1.2.2

1’,6-Dihydroxy BBR の合成 ................................................................... 8

1.2.3

肝ミクロソ ーム にお ける代謝生成物の検出 ........................................ 9

1.2.4

発現系ミク ロソ ーム を用いた解析 ....................................................... 91.2.5

阻害実験 ............................................................................................... 10

1.2.6

LC-MS/MS を用 いた 代謝物 の解析 ...................................................... 11

1.2.7

HPLC を用い た代 謝 物の解 析 .............................................................. 11

1.2.8

統計解析 ............................................................................................... 12

1.3 結果 ............................................................................................................. 12
1.3.1

ヒト肝ミク ロソ ーム における 1’-hydroxy BBR の代謝 ....................... 12

1.3.2

ヒト肝ミク ロソ ーム における 1’,6-dihydroxy BBR の代謝 ................. 14

1.3.3

1’-Hydroxy BBR か ら 1’,6-dihydroxy BBR への代謝に関与する CYP 分

子種の 同定 .................................................................................................. 19
1.3.4

1’,6-Dihydroxy BBR から反応性代謝物への代謝における CYP 分子種の関与 ......................................................................................................... 20
1.4 考察 ............................................................................................................. 22
1.5 小括 ............................................................................................................. 24
2

第 二章: 1’,6-Dihydroxy BBR から生 成す る反応 性代謝 物と 肝 障害発 現との関連 性 ..................................................................................................... 25

2.1 序論 ............................................................................................................. 25
1

2.2 方法 ............................................................................................................. 252.2.1

試薬及び材 料 ........................................................................................ 25

2.2.2

実験動物 ............................................................................................... 25

2.2.3

薬物代謝酵 素誘 導マ ウス肝ミクロソームの調製 ............................... 25

2.2.4

マウス肝ミ クロ ソー ムにおける BBR 代謝活性の測定 ...................... 26

2.2.5

マウスへの BBR 投 与及び生体試料の採取 ......................................... 26

2.2.6

BBR 及び代 謝物 の測 定 ........................................................................ 27

2.2.7

血中濃度-時 間曲 線下面積 (AUC) の算出 .......................................... 282.2.8

マウス血漿 中 の ALT 活性の 測定 ........................................................ 28

2.2.9

統計解析 ............................................................................................... 28

2.3 結果 ............................................................................................................. 28
2.3.1

マウス肝ミ クロ ソー ムにおける BBR 代謝に及ぼす CYP 誘導剤投与の影響 ......................................................................................................... 28
2.3.2

マウスにお ける BBR 及び水酸化代謝物の血中動態に及ぼす CYP 誘

導剤前 処置 の影 響 ...................................................................................... 29
2.3.3

マウスにお ける BBR 投与後の肝機能に及ぼす CYP 誘導剤前処置の影響 ............................................................................................................. 31
2.3.4

BBR 投与マウ スの 肝におけ る GSH 付加体の生成に及ぼす CYP 誘導剤前処 置の 影響 .......................................................................................... 31
2.4 考察 ............................................................................................................. 32
2.5 小括 ............................................................................................................. 35
3

第 三章: ヒ ト に お け る BBR 肝 障 害発 現 に 関与 す る 反応 性 代 謝 物の 解 明.................................................................................................................... 36

3.1 序論 ............................................................................................................. 36
3.2 方法 ............................................................................................................. 362

3.2.1

試薬及び材 料 ........................................................................................ 36

3.2.2

実験動物 ............................................................................................... 36

3.2.3

In vivo 試験 ........................................................................................... 37

3.2.4

In vitro 試験 ........................................................................................... 38

3.2.5

BBR 及び代 謝物 の定 量 ........................................................................ 39

3.2.6

In vivo における 薬物 動態解析 ............................................................. 39

3.2.7

In vitro におけ る速 度論解析 ................................................................ 40

3.2.8

網羅的代謝 物探 索 ................................................................................ 40

3.3 結果 ............................................................................................................. 41
3.3.1

ヒト肝キメ ラマ ウス における BBR の血漿中薬物濃度推移 .............. 41

3.3.2

ヒト肝キメ ラマ ウス における BBR の網羅的代謝物探索 .................. 43

3.3.3

ヒト及びマ ウス 肝ミ クロソームにおける BBR の水酸化代謝速度 ... 47

3.4 考察 ............................................................................................................. 48
3.5 小括 ............................................................................................................. 52
4

総括 ............................................................................................................. 53

5

謝辞 ............................................................................................................. 54

6

参考文献 ..................................................................................................... 553

略 語一覧
ABT

1-Aminobenzene triazole

AIBN

Azobisisobutyronitrile

ALT

Alanine aminotransferase

AUC

Area under the time-concentration curve

BBR

Benzbromarone

CLint

Intrinsic clearance

CYP

Cytochrome P450

DEX

Dexamethasone

DILI

Drug-induced liver injury

DBBQ

2,6-dibromo-p-benzoquinone

DBH

2,6-dibromohydroquinone

ESI

Electrospray ionization

GSH

Glutathione

KCN

Ketoconazole

LC-MS/MS

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

MBI

Mechanism based inhibitor

MPT

Mitochondrial permeability transition

MRM

Multi reaction monitoring

NBS

N-bromosuccinimide

PB

Phenobarbital

PCN

Pregnenolone 16α-carbonitrileTA

Tienilic acid

TK-NOG

NOD/Shi-scid IL2 receptor gamma–null mice expressing a herpes
simplex virus type-1 thymidine kinase transgene4

緒言
薬剤性 肝障 害 (Drug-induced liver injury、DILI) は、中毒性と特異体質性に分類される。中毒 性 DILI は、原因薬物の投与量に依存し、高用量の原因薬
物を服用することにより高確率で発症する。また、動物実験による中毒性
DILI の再現が可能 で ある。一方、特異体質性 DILI は、動物実験による再現が困難である。また 、特異 体質性 DILI の発症頻度は非常に低く、多くの患者に使用されて初め て明ら かとなる 1) 。DILI の発症メカニズムとして、肝臓に取り込まれた薬物 や薬物 代謝酵素 cytochrome P450 (CYP) を介し生成する代謝物によるミトコ ンドリ ア毒性や胆汁排泄の阻害、免疫反応等が知られている 2) 。また、薬物 や併用 薬が肝細胞内の核内受容体に作用し、CYP 誘導を介した毒性代謝物の 生成量 増加やアポトーシス誘導、脂質代謝異常を引き起こすことが、特異体 質性 DILI の発症に関与することも知られている 3) 。中でも、CYP を介し薬 物から 生成する反応性に富む代謝物 (反応性代謝物) は、中毒性と特異体質性 の DILI の多くでその関与が知られている 4) 。薬物服用
後、肝臓に おいて生 成する 反応性代謝物は、核酸やタンパク質と共有結合し、細胞障害を誘発する こと で DILI 発 症の最初のステップを担う 4) 。
医薬品 上市 後の DILI 発 症リスクを低減するため、医薬品開発段階の候補
化合物選択において 、反応 性代謝物の評価が盛んに行われている 5) 。広く行われる反応性代謝物 の評価 手法は、glutathione (GSH) トラッピング試験及び共 有結合試 験 であ る 。GSH トラッピン グ試験は、反 応性代 謝物が生体内 のGSH によ る抱合反 応 を 受 け 解毒 さ れる 機序を利用し たもの である。反応 性
代謝物はその化学的 不安定 性から直接的に検出することが困難である。そこ
で、GSH 存在下で候 補化合 物を肝細胞画分を用いて代謝させ、生成する反応
性代謝物を安定な GSH 付加体とし て検出することで、in vitro で反応性代謝物の評価が可能とな る 6) 。共有結合試験では、放射性同位体標識した候補化
5

合物を肝細胞、肝ミ クロソ ーム画分あるいは肝 S9 画分を用いて代謝させ、反応性代謝物とタン パク質 の共有結合量を測定する 5) 。これら GSH トラッ
ピング試験及び共有 結合試 験の結果と、臨床推定用量を考慮することにより上市後の DILI 発症 リスク を予測す る手法が報告されている 7),8) 。しかし、いずれも DILI 発症リ スクの 低い開発候補化合物の選択に有用な手法ではあるが、ヒトにおける特 異体質 性 の DILI の 発症原因となる反応性代謝物の解明手法としては十分で はない 。
高尿酸 血症 治療 薬 benzbromarone (BBR) は、DILI を誘発する薬物として知られている。BBR は、作用時間が長く、1 日 1 回の服用で良好な血中尿酸
値のコントロールが 可能で 、特にア ロプリノールでは効果が不十分あるいは禁忌の患者に有用で ある 。し かし、BBR の副作用として重篤な肝障害が報告されたことをきっか けに 9)-12) 、ヨーロッパなど多くの市場で販売が中止された 13) 。BBR による DILI は 単純な用量依存性が無く、服用開始から発症までに数週間以上を要す る。ま た、この BBR による DILI の欧州における推定発症確率は 17000 分 の 1 と低 い 13) 。そのため、BBR による DILI は特異体質が原因と考えられてい る 14) 。近年、BBR の反応性代謝物の生成についていく
つかの知見が報告さ れてい る が 15)-18) 、ヒトにおけ る DILI の発症原因となる
反応性代謝物は明ら かとな っていない。そこで本研究では、BBR をモデル薬物として、ヒトにお ける DILI の発 症原因となる反応性代謝物を解明することを目的とした。

6

1

第一章: BBR の新 規 反応性代謝 物の同定 19)

1.1

序論

BBR か ら CYP3A4 に よ り 生 成 す る 主 要 代 謝 物 の 一 つ で あ る 1’-hydroxy
BBR は、高い CYP 活性を 有する三次元培養したヒト肝癌由来 FLC-4 細胞に
お いて細 胞毒性を 示 す こと が 報告されている 20),21) 。また、その細胞毒性は細胞内の GSH を枯 渇させ ることで 増強する。このことから、1’-hydroxy BBRが代謝されて生成する反応性代謝物が細胞毒性の原因となる可能性が考えられる。
そこで本章では 、1’-hydroxy BBR から反応性代謝物が生成するかを明らかにするため、1’-hydroxyBBR を GSH 存在下、ヒト肝ミクロソームで代謝させることで、反応性代 謝物 を GSH 付加体として検出することを試みた。
1.2
1.2.1

方法
試薬及 び材 料

BBR、1’-hydroxy BBR 及び 6-hydroxy BBR は鳥居薬品 (東京) より供与されたものを用いた。Tienilic acid (TA) は Cayman (Ann Arbor、MI) より購入した。1-Aminobenzotriazole (ABT) 及び ketoconazole (KCZ) は Sigma Aldrich(St. Louis、MO) より 購入し た。GSH は和光純薬工業 (大阪) より購入した。
その他の試薬につい ては全 て市販のものを用いた。プールドヒト肝ミクロソ
ームは BD Gentest (Woburn、MA) より購入した。ヒト CYP 分子種を発現させた昆虫細胞発現系 ミクロ ソーム (CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、
CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 及び CYP3A4) は BD Gentest より購入した。CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、CYP2C9 及び CYP3A4 は NADPH-CYP
oxidoreductase を、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19 及び CYP2E1 は NADPH-CYP
oxidoreductase 及び cytochrome b 5 を共発現させたものである。

7

1.2.21’,6-Dihydroxy BBR の合成

1’,6-Dihydroxy BBR は Locuson et al. (2004) の方法に従い 22) 、6-hydroxy
BBR より 4 段階で合 成した (Scheme 1)。まず、6-hydroxy BBR に triethylamine(3 当量) 存在下、acetyl chloride (3 当量) を作用させ、水酸基をアセチル基で保護した。続いて、 ラジカ ル開始剤として azobisisobutyronitrile (AIBN) (0.5当量) を 用い 、N-bromosuccinimide (NBS) (1.2 当量) によりベンジル位である 1’位を臭 素化 した 。次 に cesium acetate (2 当量) により 1’位をアセトキシ基へと置換した。最 後に、potassium carbonate (5 当量) を用いた塩基性条件
で全てのアセチル基 を脱保 護した。組成生物を、シリカゲルカラムクロマト
グラフィー (chloroform:methanol=97:3) により精製することで、目的とする
1’,6-dihydroxy BBR を総収 率 20%で得た。合成した 1',6-dihydroxy BBR の構
造は、核磁気共鳴ス ベクト ル ( 1 H-NMR) および liquid chromatography-tandem
mass spectrometry (LC-MS/MS) により同定した。 1 H NMR (CDCl 3 ): δ 7.93 (s,2H)、7.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H)、6.93 (d, J = 1.8 Hz, 1H)、6.71 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz,
1H)、4.96 (q, J = 6.6 Hz, 1H)、1.56 (d, J = 6.6 Hz, 3H)。LC-MS/MS: m/z = 453,
455, 457 (1:2:1) [M-H] - .

Scheme 1. Scheme for the Synthesis of 1’,6-dihydroxy BBR.
8

1.2.3

肝ミク ロソ ーム にお ける代 謝生成物の検出

100 µM 1’-hydroxy BBR または 100 µM 1’,6-dihydroxy BBR を基質とし、5mM GSH、100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) 及びプールドヒト肝ミ
クロソーム (0.4 mg/mL) 存在下、37ºC で 1 分間プレインキュベーションした後に 1 mM NADPH を添 加し代謝反応を開始した (最終反応液量 60 µL)。
反応溶液を 60 分間 インキ ュベーションした後、氷冷した 10% hydrochloric
acid (25 µL) を添加 するこ とにより代謝反応を停止し、12000 × g で 15 分間
遠心分離後、得られ た上清 (30 µL) を測定試料とした。
1.2.4

発現系 ミク ロソ ーム を用い た解析

1’-Hydroxy BBR か ら 1’,6-dihydroxy BBR への代謝反応については、100 µM
1’-hydroxy BBR、100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4)、0.1 mM EDTA、発現系ミクロソーム (10 pmol CYP/mL) を含む溶液を 37ºC で 1 分間インキュベーションし、予 め 3 分間のプレインキュベーションを行った NADPHgenerating system (2 mM glucose-6-phosphate、4 mM MgCl 2 、 0.5 mM NADP⁺、1
U/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase) を 添 加 す る こ と で 代 謝 反 応 を 開 始した (最 終反 応液 量 125 µL)。反応溶液を 40 分間インキュベーションした後、氷冷した acetonitrile (50 µL) を添加することにより代謝反応を停止した。
これを 12000 × g で 15 分間 遠心分離した後、得られた上清 (100 µL) を測定試料とした。ミクロ ソーム 濃度及び反応時間は、代謝物の生成量に直線性が認められる範囲内で 設定し た。
1’,6-Dihydroxy BBR から GSH 付加体への代謝反応においては、実験方法
1.2.3 と 同 様 に 行 い 、 プ ー ル ド ヒ ト 肝 ミ ク ロ ソ ー ム の 代 わ り に 50 pmol
CYP/mL 発 現系 ミク ロソー ムを用い、反応時間は 30 分とした。

9

1.2.5阻害実 験

1.2.5.1

TA が 1’-hydroxy BBR から 1’,6-dihydroxy BBR への代謝に及ぼす影響CYP2C9 選択的阻 害剤で ある TA は mechanism-based inhibitor (MBI) であるため 23) 、あらかじ め TA を NADPH 存在下プールドヒト肝ミクロソームにおいて代謝させた溶 液へ基 質溶液を添加することで代謝反応を行った。すな
わち、10 µM TA を NADPH-generating system 存在下、プールドヒト肝ミクロ
ソーム (1 mg/ml) と 37ºC で 0、20 または 60 分間インキュベーションし (反応溶量 25 µL)、そこへ基 質溶液 225 µL (100 µM 1’-hydroxy BBR、100 µM
potassium phosphate buffer [pH 7.4]、1 mM EDTA 及び NADPH generating systemを含む溶液) を添 加 し代謝 反応を開始した。40 分間のインキュベーションの後、氷冷した acetonitrile (200 µL) を添加することにより代謝反応を停止した。これを 12000 × g で 15 分間遠心分離した後、得られた上清 (100 µL) を
測 定試 料とし た 。 結 果 は 阻 害剤無 添加 時 の 1’,6-dihydroxy BBR 生成速度を100%として示した 。
1.2.5.2

ABT 及び KCZ が 1’,6-dihydroxy BBR からの GSH 付加体生成に及ぼす影響
CYP 分子種非選択 的阻害 剤であ る ABT は mechanism-based inhibitor (MBI)であるため 24) 、あ ら かじめ ABT を NADPH 存在下プールドヒト肝ミクロソームにおいて代謝させた溶液を基質溶液へ添加することで代謝反応を行った。すなわち、100 µM ABT を NADPH 存在下、プールドヒト肝ミクロソー
ム (4 mg/ml) と 37ºC で 30 分間インキュベーションした溶液 (10 µL) を、基質溶液 90 µL (100 µM 1’,6-dihydroxy BBR、5 mM GSH、100 µM potassium
phosphate buffer [pH 7.4] 及び 1 mM NADPH を含む溶液) へ添加し代謝反応を開始した。反応溶 液を 30 分間のインキュベーションした後、氷冷した 10%10hydrochloric acid (40 µL) を 添加することにより代謝反応を停止した。これを12000 × g で 15 分間 遠心分 離した後 、得られた上清 (30 µL) を測定試料とした。結果は阻害剤無 添加時 の各生成物の生成速度を 100%として示した。
CYP3A 阻害剤であ る KCZ は 25) 、基質と同時に添加した (最終濃度 2.5 µM)。
代謝反応は実験方 法 1.2.3 と同様に行い、反応時間は 30 分とした。結果は阻害剤無添加時の各生 成物の 生成速度を 100%として示した。
1.2.6

LC-MS/MS を用 いた 代謝物 の解析

1’-Hydroxy BBR の代 謝物及 び 1’,6-dihydroxy BBR から生成した GSH 付加体の構造解析、なら びに GSH 付加体の定量解析は LC-MS/MS により行った。
HPLC 装 置は L-2160U 型ポ ンプ及 び L-2200 型オートサンプラー (以上全て
日立製作所、東京) を使用 した。カラムは TSKgel ODS-100Z (5 µm、2.0 mm
× 150 mm、東ソー 、東京) を 使用した。カラム温度は室温、流速は 0.2 mL/minとした。移動相は溶 離液 A (0.1% formic acid) と溶離液 B (0.1% formic acid 含
有 acetonitrile) の混 合溶媒 を用いた。グラジェント条件は次のように行った:
0-10 分 25-30% B、10-22 分 30-90% B、22-24 分 90% B、24-24.5 分 90-25%
B、24.5-30 分 25% B。質量分 析装置は amaZon SL-CPT1 (Bruker Daltonics K.K.、
Billerica、MA) を使 用し、 イオン化モードは electrospray ion negative (ESI- )mode とし た。Ion spray voltage は 3500 V とし、dry temperature は 180ºC とした。定量測定は多重 反応モ ニタリング (multi reaction monitoring、MRM) により得られたピーク 高さを 用いた。GSH 付加体 M1、M2 及び M3 について、それぞれ m/z 716→443、m/z 744→437 及び m/z 778→471 をモニタリングし
た。
1.2.7

HPLC を用い た代 謝 物の解 析

1’,6-Dihydroxy BBR の定量解析は HPLC により行った。HPLC 装置は L6000 型ポ ンプ 、AS-2000 型 オートサンプラー、L-4000 型 UV 検知器、D-2500
11

型クロマトデータ処 理装置 （以上全て日立製作所）、UNI-3 ノイズ/ベースク
リーン (ユニ オン 、群馬) を用いた。分析カラムは CAPCELL PAK C18 UG120(5 µm、4.6 mm I.D.×25 cm、資生堂、東京) を用いた。移動相には 0.1% formic
acid 及び acetonitrile を 82:58 (v/v) の割合で混合したものを用いた。流速は0.9 mL/min とし、 検 出波長 は 240 nm とした。
1.2.8

統計解 析

得られたデータ は Scheffe’s F test により多重比較検定を行った。この統計
計算は Excel 統計 ソ フト Statcel 3 (オーエムエス、東京) により行った。
1.3
1.3.1

結果
ヒト肝 ミク ロソ ーム におけ る 1’-hydroxy BBR の代謝

1’-Hydroxy BBR か ら GSH 付加体が生成するかを明らかにするため、GSH
存在下、1’-hydorxy BBR をプールドヒト肝ミクロソームにおいて代謝させた
ところ、GSH 付加体 は検出 されず、質量電荷比 m/z 453、455 及び 457 を示
す 生 成 物 が NADPH 依 存 的 に 認 め ら れ た (Figure 1-1)。 こ の 生 成 物 は 1’hydroxy BBR よりも 16 Da 大きい m/z 値を示すことから、1’-hydroxy BBR が水酸化された代謝物 である と考えられた。また、合 成した 1’,6-dihydroxy BBRと カ ラ ム 保 持 時 間 (16.6 min) 及 び マ ス ス ペ ク ト ル が 一 致 し た こ と か ら(data not shown)、こ の代謝 物 は 1’,6-dihydroxy BBR であると推定された。

12

Figure. 1-1. Formation of oxidation product of 1’-hydroxy BBR in human liver
microsomes. (A) LC-MS analysis, monitored at m/z 455, of incubation mixture of1’-hydroxy BBR and pooled human liver microsomes without NADPH g.s. (top),that with NADPH g. s. (middle), and a synthetic standard of 1’,6-dihydroxy BBR(bottom). (B) ESI-MS spectra and (C) structure of the dihydroxy BBR generated
from 1’-hydroxy BBR. HLM, human liver microsomes; NADPH g.s., NADPH
generating system.

13

1.3.2

ヒト肝 ミク ロソ ーム におけ る 1’,6-dihydroxy BBR の代謝

1’,6-Dihydroxy BBR から GSH 付加体が生成するかを明らかにするため、
1’,6-dihydroxy BBR を GSH 存在下プールドヒト肝ミクロソームにおいて代謝させたところ、3 種の生 成 物 M1、M2 及び M3 が認められた (Figure 1-2)。
M1 は、NADPH 依存 的な生 成量の増加が認められた。M2 の生成は NADPH
非依存的であった 。M3 の生成は NADPH 依存的であった。M1 及び M2 はミクロソーム非添加時 にも生 成が認められた (data not shown)。また、M2 及びM3 は、それぞれの クロマ トグラム上においてカラム保持時間の異なるピーク (M2’及び M3’) が認め られ た。M1、M2 及び M3 はいずれも、臭素原子を2 つ含む イオンに特 徴的な 強度比 1:2:1 の三重線を示し、それぞれ三重線中
央の質量電荷比は m/z 716、m/z 744 及び m/z 778 を示した (Figures 1-3, 1-4
and 1-5)。M1 は、m/z 716 を 示すことから、1’,6-dihydroxy BBR から C 2 H 4 O が脱離し、GSH が結合 した構 造を示すと推定された。また、M1 は MS 2 フラグ
メント中に GSH 中 の S-C 結合開裂に由来する m/z 443 を示したことから、GSH 付加体であると 推定さ れた。さらに、MS 3 データより、M1 はベンゾフ
ラン環の 1-ヒ ドロ キ シエチ ル基を GSH が置換した構造を示すことが推定された (Figure 1-3)。M2 は、m/z 744 を示すことから、1’,6-dihydroxy BBR からヒドロキシ基が脱離 したも のに GSH が結合した構造を示すと推定された。
また、M2 の MS 2 フ ラグメ ント中の m/z 471 は、GSH の S-C 結合開裂に由来すると考えられた。さらに 、MS 3 データに m/z 409 を示したことから、1’-ヒ
ド ロキシ基 を GSH が 置 換 した構造を示すことが推定された (Figure 1-4)。
M3 は、m/z 778 を示 すこと から、1’,6-dihydroxy BBR がさらに水酸化された
ものに GSH が結 合 した構 造を示すことが推定された。また、M3 の MS 2 フ
ラグメント中の m/z 471 は GSH の脱離に由来すると考えられた。さらに、
MS 2 フラグメント中 の m/z 584 より、GSH はジブロモベンゼンに付加してい14ると考えられたが、 詳細な GSH 付加位置については推定することが出来なかった (Figure 1-5)。一方 、M2 及 び M3 のカラム保持時間の異なるピーク(M2’及び M3’) は 、 それぞ れ M2 及び M3 と同じ MS スペクトルを示した(data not shown)。ま た、M2 及び M3 は 1’位炭素及び GSH 部位に 2 つの不斉炭素を有することか ら、M2’及び M3’はそれぞれ M2 及び M3 のジアステレ
オマーであると考え られた 。

Figure 1-2. Total ion chromatograms targeted m/z 716 (A), m/z 744 (B), and m/z
778 (C) of the incubation mixture of 1’,6-dihydroxy BBR and GSH in pooledhuman liver microsomes.

15

Figure 1-3. (A) ESI-MS spectra and (B) hypothetical structure of a GSH adductof BBR metabolite, M1.

16

Figure 1-4. (A) ESI-MS spectra and (B) hypothetical structure of a GSH adductof BBR metabolite, M2.

17

Figure 1-5. (A) ESI-MS spectra and (B) hypothetical structure of a GSH adductof BBR metabolite, M3.

18

1.3.31’-Hydroxy BBR か ら 1’,6-dihydroxy BBR への代謝に関与する CYP 分
子種の 同定9 種のヒト CYP 分 子種発 現系ミクロソームを用いて 1’-hydroxy BBR を代謝し、1’,6-dihydroxy BBR の 生成速度を測定したところ、検討した CYP 分子
種 の 中 で CYP2C9 発 現 系 が 最 も 高 い 値 を 示 し た (0.27 pmol/min/pmol CYP,
Figure 1-6A)。また 、プ ールド ヒト肝ミクロソームにおける 1’,6-dihydroxy BBRの生成は、CYP2C9 選択的 阻害剤で ある TA により 78.5%阻害された (Figure
1-6B)。

Figure 1-6. Identification of CYP isozymes involved in the formation of 1’,6dihydroxy BBR from 1’-hydroxy BBR. (A) Formation of 1’,6-dihydroxy BBR
from 1’hydroxy BBR in recombinant CYP isozymes. (B) Effect of TA on theformation of 1’,6-dihydroxy BBR from 1’-hydroxy BBR in pooled human liver
microsomes. Data are expressed as mean with S.D. of triplicate experiments. n.d.,
not detected (detection limit of the HPLC method being 0.065 pmol/min/pmol CYP).
TA, tienilic acid. **P < 0.01, compared to the value of TA (-) sample without
preincubation.

19

1.3.41’,6-Dihydroxy BBR から反応性代謝物への代謝における CYP 分子種の関与

GSH 付加体 M1 及 び M3 の生成が NADPH 依存的であったことから、ヒト
肝ミクロソームにお ける M1 及び M3 の生成に CYP が関与する可能性が考えられた。そこで、非選択 的 CYP 分子種阻害剤である ABT を用いて検討を行った。プールドヒ ト肝ミ クロソームにおける M1 及び M3 の生成は、ABT
濃度依存的に阻害さ れた (Figure 1-7A)。このことから、ヒト肝ミクロソームにおける M1 及び M3 の生成には CYP が関与することが示唆された。次に、発現系ミクロソーム におけ る M1 及び M3 の生成量を測定した。M1 の生成は、検討した全ての CYP 分子種に おいて認められた (Figure 1-7B)。一方、
M3 の生成につい て は、検 討した全ての CYP 分子種の中で CYP3A4 発現系が最も高い値を示し た (Figure 1-7B)。また、プールドヒト肝ミクロソームにおける M3 の生成 は 、CYP3A4 阻害剤 KCZ により 88.0%阻害された (data notshown)。

20

Figure 1-7. Identification of CYP isozymes involved in the formation of M1 andM3 from 1’,6-dihydroxy BBR. (A) Effect of ABT on the formation of M1 and M3
from 1’,6-dihydroxy BBR in pooled human liver microsomes. (B) Formation of M1(left) and M3 (right) from 1’,6-dihydroy BBR in recombinant human CYP isozymes.
Data are expressed as mean with S.D. of triplicate experiments. ABT, 1aminobenzotriazole. *P < 0.05 and **P < 0.01, compared to the value of control.

21

1.4

考察

本 章 で は 、 ヒ ト 肝 ミ ク ロ ソ ー ム に お い て 1’-hydroxy BBR か ら 1’,6dihydroxy BBR の生 成を介 し複数の反応性代謝物が生成することを明らかとした。また、各代謝 過程に は、CYP による代謝と非酵素的な反応が関与していることを明らかと した 。1’-Hydroxy BBR は、平面培養と比較し著しく CYPの発現が増加する三 次元培 養細胞において細胞毒性を示し、その細胞毒性は
GSH の枯渇により増 強する 21) 。従って、三次元培養細胞において認められた 1’-hydroxy BBR による 細胞毒性は、1’-hydroxy BBR から 6 位の水酸化を介して生成する反応 性代謝 物が原因であった可能性が考えられた。
GSH 付加体 M1 は非酵 素条 件及び CYP により、M2 は非酵素条件により
1’,6-dihydroxy BBR から生 成した。反応機構として、M1 はまず 2 位の 1-ヒドロキシエチル基が 水酸基 へイプソ置換されると考えられた (Figure 1-8A)。
この反応は、p-hydroxybenzyl alcohol から置換基の formaldehyde としての脱離を伴う CYP によ る p-hydroquinone への代謝反応と類似する 26) 。その後、
ケト-エノール互変異 性によ り生成するラクトンの炭素 2 への GSH のチオール基の求核攻撃がフ ラン環 の開環を引き起こし、平衡反応と共鳴安定化により M1 が生成すると 考えら れた。M2 については、6 位水酸基からの電子供
給が 1’位における脱 水を引 き起こし、炭素 1’へ GSH のチオール基が求核攻撃することで生成す ると考 えられた (Figure 1-8B)。
GSH 付加体 M1 及 び M2 の前駆体である反応性代謝物は 1’,6-dihydroxy
BBR から上記機構に より非 酵素的に生成することから、1’,6-dihydroxy BBRの生成量はこれら反 応性代 謝物の生成量と正に相関すると考えられる。また、
1’,6-dihydroxy BBR は BBR を投与したヒト尿中で検出されている 27) 。従って、ヒトにおける 1’,6-dihydroxy BBR の血中や尿中濃度を測定することで、GSH 付加体 M1 及び M2 へ変換される反応性代謝物のヒト生体における生成22

量の推定が可能と考 えられ た。
本検討 にお いて 、GSH 存在下、1’-hydroxy BBR をヒト肝ミクロソームを用いて代謝させた際 に GSH 付加体 M1、M2 及び M3 はいずれも検出されなか った。こ の理由 と し て 、 ヒト肝ミクロソームを用いた代謝反応条件では、
1’-hydroxy BBR か ら 1’,6-dihydroxy BBR への水酸化と更なる GSH の付加とい う多段階 反 応が 十 分 に 進 行せず 、GSH 付加体の生成量 が 検出感度以下 となったことが考えら れた 。こ のように、BBR のような多段階の水酸化代謝反応を介して生成する 反応性 代謝物の GSH 付加体を、肝ミクロソームを用いた GSH トラッ ピン グ試験 において 検出するためには、多段階代謝における各中間代謝物を反応 基質と して用いる必要があることが示唆された。

Figure 1-8. Proposed mechanism for the formation of M1 (A) and M2 (B) from
1’,6-dihydroxy BBR.

23

1.5

小括

ヒト肝 ミク ロソ ーム におい て 1’-hydroxy BBR から 1’,6-dihydroxy BBR の生成を介し複数の反 応性代 謝物が生成することが示された。また、1’-hydroxy
BBR から 1’,6-dihydroxy BBR への代謝には CYP2C9 が、1’,6-dihyrdroxy BBR
か ら複 数の反 応 性 代 謝 物 へ の変換 には 、 CYP 及び 非酵 素的 な反応 が関与 していることが示され た (Figure 1-9)。

Figure 1-9. Formation of reactive metabolites from 1’-hydroxy BBR in
human liver microsomes. NE, Non-enzymatic reaction. RM, Reactive metabolite.

24

2

第二 章: 1’,6-Dihydroxy BBR から生成 す る反応性 代謝物 と肝 障害発現 との関連性 28)2.1

序論

近年、医薬品開 発段 階では認められなかった反応性代謝物による肝障害を齧歯類で再 現す る試 みが 行われている 29)-31) 。それらの研究では、齧歯類へ
dexamethasone 等の 薬物代 謝酵素誘導剤を前処置し、薬物投与後の反応性代謝物の生成を促進す ること で肝臓における曝露量を増加させ、肝障害を誘発している。そこで 本 章では、BBR の主要代謝酵素である CYP2C 及び CYP3Aの発現を誘導する CYP 誘導剤を前処置したマウスへ BBR を投与することで、第一章 で見 出さ れた反 応性代謝 物の生成とマウスにおける肝機能の関連性を明らかにするこ とを目 的とした。
2.2
2.2.1

方法
試薬及 び材 料

BBR、1’-hydroxy BBR、6-hydroxy BBR 及び 1’,6-dihydroxy BBR は第一章と同じものを用いた 。Phenobarbital (PB)、dexamethasone (DEX)、は和光純薬
工 業 よ り 購 入 し た 。 Pregnenolone 16α-carbonitrile (PCN) は Toronto researchchemicals (Toronto、ON、CAN) より購入した。その他の試薬については全て市販のものを用いた 。
2.2.2

実験動 物

ICR 系 雄性マウス (6~7 週齢) は日本 SLC (静岡) より購入した。動物には
水及び固形飼料を自 由に摂 取させ、絶食の場合は水のみを自由に摂取させた。
本研究は、実験動物 の取り 扱いガイドラインに従って行われ、千葉大学動物実験委員会において 承認さ れた (承認番号：動 27-141、動 28-65)。
2.2.3

薬物代 謝酵 素誘 導マ ウス肝 ミクロソームの調製

薬物代 謝酵 素誘 導剤 として は、マウス肝において CYP3A 及び CYP2C を25

誘導する PB、PCN 及び DEX を用いた 32),33) 。それぞれの誘導剤を corn oil に溶解し、PB 及び DEX は 60 mg/kg/day、PCN は 100 mg/kg/day で 4 日間腹腔内投与を行った (投 与容 量 5 mL/kg)。誘導剤最終投与の 24 時間後、肝臓を摘 出 し た 。 肝 組 織 切 片 を 細 切 し た 後 、 肝 重 量 の 4 倍 量 の 1.15% potassium
chloride 溶 液を加え 、氷 冷下 でホモジナイズした。このホモジネートを 9000
× g、4ºC で 20 分 間遠心分 離し、得られた上清を 105000 × g、4ºC で 1 時間超遠心分離した。得ら れた沈 殿 を 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) に再懸濁してミクロソ ーム画 分とした。得られたミクロソームのタンパク質濃度は、DC Protein Assay Kit II (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を用いて定量
した。
2.2.4

マウス 肝ミ クロ ソー ムにお ける BBR 代謝活性の測定

100 µM BBR を基質 とし 、0.1 mM EDTA、100 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4) 及びマウス 肝ミク ロソーム (0.4 mg/mL) と 37ºC で 1 分間プレイン
キ ュベーシ ョンし た 後 に 、 予 め 3 分間のプレインキュベー ションを行った
NADPH-generating system を 添加することで代謝反応を開始 した (最終反応
液 量 125 µL)。 反 応 溶 液 を 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 、 氷 冷 し た
acetonitrile (50 µL) を添加 することにより代謝反応を停止した。これを 12000
× g で 15 分間遠心分 離し、上清を孔径 0.45 µm のフィルターでろ過し、測定
試料 (10 µL) とした 。ミク ロソーム濃度及び反応時間は、代謝物の生成量に直線性が認められる 範囲内 で行った。
2.2.5

マウス への BBR 投 与及び生体試料の採取

BBR は 0.5% carboxymethylcellulose 溶液に懸濁し、マウスに単回経口投与
した (投 与容 量 10 mL/kg)。BBR の投与量はマウスにおける BBR の半数致死量が 805 mg/kg で あ ること から (ユリノーム Ⓡ 錠

医薬品インタビューフォ

ーム、2011)、その 約 半分で ある 400 mg/kg とした 34) 。PB (60 mg/kg/day)、26

PCN (100 mg/kg/day) 及び DEX (60 mg/kg/day) を 4 日間腹腔内投与し、最終投与 24 時間後に BBR を経口投与した。マウスは BBR 投与の約 12 時間前から絶食させた。BBR 投与 1 時間前並びに投与後 1、3 及び 6 時間に尾静脈から採血し、血漿を分 離した 。最終採血後、速やかに麻酔下で肝臓を摘出した。
採取した試料は−80ºC で凍結保存した。
2.2.6

BBR 及び代謝物 の測 定

各マウスから得 られ た血 漿 2 µL に methanol (2 µL)、acetonitrile (48 µL) 及
び精製水 (48 µL)を 添加し 、混 合した後、12000 × g で 15 分間遠心分離した。
上清を孔径 0.45 µm のフィ ルターでろ過し、測定試料 (10 µL) とした。
各マウスから得 られ た肝臓 (約 400 mg) に肝重量の 2 倍量の超純水を加え、Micro Smash MS-100R (TOMY、東京) を用いてホモジネートにした。ホモジネート (700 µL) と同量の acetonitrile を加えて混合し、12000 × g で 15分間遠心分離後、得 られた 上清 (1000 µL) を減圧下で蒸発乾固させた。これに 1% formic acid (500 µL) 及び酢酸エチル (1000 µL) を加えてよく混合した後、760 ×g で 5 分 間遠心 分離した。その後、酢酸エチル層を回収し、減圧下 で 蒸 発 乾 固 さ せ た 。 こ れ に 0.1% formic acid と 0.1% formic acid 含 有acetonitrile を 9:1 で 混合し た溶媒を 加えて溶解した。その後、上清を孔径 0.45µm のフィルターで ろ過し 、測定試料 (10 µL) とした。
測定試料中の BBR 及び代謝物の測定は LC-MS/MS により行った。HPLC
装置は L-2160U 型 ポ ンプ及 び L-2200 型オートサンプラー (以上全て日立製
作所) を 使用 した 。 カラム は TSKgel ODS-100Z (5 µm、2.0 mm × 150 mm、東ソー) を 使用 した。カラム 温度は室温、流速は 0.2 mL/min とした。移動相は溶離液 A (0.1% formic acid) と溶離液 B (0.1% formic acid 含有 acetonitrile) の混合溶媒を用いた 。グラジ ェント条 件は次のように設定した：0-10 分 25-30%
B、10-22 分 30-90% B、22-24 分 90% B、24-24.5 分 90-25% B、24.5-30 分
27

25% B。質 量分析装 置は amaZon SL-CPT1 (Bruker Daltonics K.K.) を使用し、イオン化モードは ESI- mode とした。Ion Spray Voltage は 3500 V とし、drytemperature は 180ºC とした 。BBR 及び各代謝物の測定は Multiple Reaction
Monitoring (MRM) で 行 っ た 。 MRM transition は 次 の よ う に 設 定 し た ： m/z
423→251 (BBR)、 m/z 439→395 (1’-hydroxy BBR)、 m/z 439→251 (6-hydroxy
BBR)、m/z 455→411 (1’,6-dihydroxy BBR)、m/z 716→443 (M1)、m/z 744→437(M2)、m/z 778→471 (M3)。
2.2.7

血中濃 度-時 間曲 線下 面積 (AUC) の算出

マウス にお ける BBR 及び代謝物の AUC 0-6hr は台形法により算出した。
2.2.8

マウス 血漿 中 の ALT 活性の測定

マウス 血漿 中 alanine aminotransferase (ALT) 活性は、トランスアミナーゼ
CII-テ ストワコー (和光純 薬工業) を用いて測定した。
2.2.9

統計解 析

2 群比較検 定は、Student’s t test により行った。多群間比較検定は、TukeyKramer test または Steel test により行った。この統計計算は Excel 統計ソフト
Statcel 4 (オーエム エ ス) により行った。
2.3
2.3.1

結果
マウス 肝ミ クロ ソー ムにお ける BBR 代謝に及ぼす CYP 誘導剤投与の影響

マウス肝におけ る BBR 代謝に対する CYP 誘導剤の影響を明らかとするた
め、CYP 誘導剤を処 置した マウスから得られた肝ミクロソームを用いて BBR
代謝活性を比較した 。BBR から 1’-hydroxy BBR への代謝活性は、PCN 処置
群及び DEX 処置群 が溶媒 処置群（コントロール群）と比較して有意に高値を示し、それぞれ 1.8 倍及 び 2.8 倍であった (Figure 2-1)。BBR から 6-hydroxy
BBR への代謝活性は 、PB、PCN 及 び DEX 処置群がいずれもコントロール群28と比較して有意に高 値を示 し、それぞれ 2.1 倍、3.3 倍及び 1.6 倍であった。
一方、BBR から 1’,6-dihydroxy BBR への代謝活性は、DEX 処置群のみがコ
ントロール群と比較 して有 意に高値を示し、4.0 倍であった。

Figure 2-1 Formation of 1’-hydroxy BBR, 6-hydroxy BBR and 1’,6-dihydroxy
BBR from BBR in liver microsomes of mice treated with inducers. Data areexpressed as mean with S.E. (n = 3/group) of duplicate determination. *P < 0.05,**P < 0.01, and ***P < 0.001 compared to the value of the control (Student’s ttest).
2.3.2

マウス にお ける BBR 及び水酸化代謝物の血中動態に及ぼす CYP 誘
導剤前 処置 の影 響

マウスにおける BBR 代謝に対する CYP 誘導剤前処置の影響を明らかとす
るため、BBR 及び代 謝物の 血漿中濃度推移を解析した。Figure 2-2 に、BBR、
1’-hydroxy BBR、6-hydroxy BBR 及び 1’,6-dihydroxy BBR の血漿中濃度推移を示す。BBR の血 漿 中濃度 は、全ての CYP 誘導剤前処置群においてコント
ロール群と比較して 低値を 示した。この結果から、CYP 誘導剤前処置によりBBR 代謝が亢進した と考え られた。一方、CYP 誘導剤前処置群における 1’hydroxy BBR 及び 6-hydroxy BBR の血漿中濃度は、コントロール群と同等か低い値を示した。ま た、コ ントロール群及び CYP 誘導剤前処置群における29

1’,6-dihydroxy BBR の血漿 中濃度の 関係性については、一定の傾向は認められなかった。得られ た血漿 中濃度推移から BBR 及び 1’,6-dihydroxy BBR のAUC を算出 した。BBR 投与 後 6 時間までの BBR の AUC は、全ての CYP 誘
導 剤 前 処 置 群 が コ ン ト ロ ー ル 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 値 を 示 し た 。 1’,6Dihydroxy BBR の AUC については 、DEX 前処置群がコントロール群と同程度の値を示し、PB 及 び PCN 前処置群はコントロール群と比較して有意でないものの低値を示し た (Table 2-1)。

Figure 2-2 Plasma concentration-time profiles for BBR (A), 1’-hydroxy BBR(B), 6-hydroxy BBR (C) and 1’,6-dihydroxy BBR (D) after administration of
BBR in mice pretreated with inducers. Data are expressed as mean with S.E.

Table

2-1 AUC 0-6hr(µMhr)

of

BBR

and

1’,6-dihydroxy

BBR after

administration of BBR in mice pretreated with inducers. Data are expressed asmean ± S.E. **P < 0.01 compared to the value of the control (Tukey-Kramer test).

30

2.3.3

マウス にお ける BBR 投与後の肝機能に及ぼす CYP 誘導剤前処置の影響

BBR 投与 1 時間前 の血漿 中 ALT 活性は全てのマウスにおいて正常値 ( <40 IU/L) を示した 。BBR 投与後、DEX 前処置群において ALT 活性が上昇し、BBR 投与後 1-6 時間 のいず れにおいても正常域を超え、BBR 投与後 3 時間
において最高値 (114.9 ± 40.2 IU/L) を示した。一方、PB 及び PCN 前処置群
はコントロール群と 同様 に BBR 投与後のいずれの時間においても ALT 活性は正常値であり、ALT 活性 の上昇は認められなかった (Figure 2-3)。

Figure 2-3 Plasma ALT activities before and after administration of BBR inmice pretreated with inducers. Data are expressed as mean with S.E. *P < 0.05
compared to the value at 1-hr before BBR administration (Pre) of each group (Steeltest).
2.3.4

BBR 投与 マウ スの 肝におけ る GSH 付加体の生成に及ぼす CYP 誘導
31

剤前処 置の 影響
BBR 投与後 6 時間 に おける肝組 織中の GSH 付加体を測定した。第一章で検出された GSH 付 加体の うち、M2 のみがマウスの肝試料において検出された。DEX 前処置群に おけ る M2 の生成量は、有意ではないもののコントロー
ル群と比較して高値 を示し た。一方、PB 処置群における M2 の生成量は、コントロール群と比 較し低 値を示した。また、PCN 処置群では、コントロー
ル群との差異は認め られな かった (Figure 2-4)。

Figure 2-4 Formation of GSH adduct in the livers after administration of BBR
in mice pretreated with inducers. Data are expressed with S.E.
2.4

考察

本章で は、DEX を前 処置したマ ウスにおいて、BBR 投与後に血漿中 ALT
活性の上昇及び肝臓 中の GSH 付加体 M2 の増加が認められた。また、DEX
前処置マウスにおい て、肝 ミクロソーム中の BBR から 1’,6-dihydoxy BBR の生成量が顕著に増加 した。一方、PB 及び PCN 投与群では、血漿中 ALT 活性の上昇及び肝臓中 M2 量の 増加は認められなかった。これらより、マウスへの DEX 前処置 によ り BBR の 1’位及び 6 位の水酸化に続き非酵素的に生成する反応性代謝物の 曝露量 が増加することで、マウスにおける肝機能障害が生じた可能性が考え られた 。
32

ヒ ト に お け る BBR か ら 1’,6-dihydroxy BBR へ の 代 謝 に は CYP3A4 とCYP2C9 が関与す る 19),20) 。BBR の代謝に関与するマウス CYP 分子種は同定されていないが、マ ウス CYP3A 及び CYP2C の発現を誘導する DEX を前処置することにより 32) 、in vivo にお ける BBR の代謝が亢進し、1’,6-dihydroxy
BBR 並び に GSH 付 加体 M2 の前駆体の反応性代謝物の生成が亢進したと考えられた。GSH 付加 体 M2 の前駆体の反応性代謝物は、1’,6-dihydroxy BBRから非酵素的に生成 するた め (第一章)、血漿中の 1’,6-dihydroxy BBR 濃度は
M2 の前駆体の反応 性代謝 物の生成量の指標になると考えられた。しかし、DEX 前処置 マウ スの BBR 投与後 6 時間の肝臓における GSH 付加体 M2 量はコントロールマウ スの 約 5 倍を示したのに対し、1’,6-dihydroxy BBR の血
漿中曝露は両マウス 間で明 確な差異が認められなかった。したがって、血漿中の 1’,6-dihydroxy BBR 濃度から肝臓における反応性代謝物の生成量を推測することは難しいと 考えら れた。さらに、BBR 投与後 6 時間の肝臓における 1’,6-dihydroxy BBR の濃度もコ ントロールマウスと DEX 前処置マウスを
含 む 全 て の 誘 導 剤 前 処 置 マ ウ ス で 差 異 が 認 め ら れ な か っ た こ と か ら (datanot shown)、生体に おけ る 1’,6-dihydroxy BBR から M2 の前駆体の反応性代謝物への変換及び GSH の付加反応には、非酵素的反応だけでなく、肝臓に発現する何らかの酵 素が関 与し、その酵素が DEX 前処置マウスにおいて誘導されていた可能性 が考え られた。
DEX、PCN 及 び PB を前処置した全てのマウスにおいて、コントロール群と比較して BBR の 血漿中 濃度の低下が認められたことから、BBR の代謝が亢進したと考えられ た。しかし、誘 導剤を前処置したいずれのマウスにおいても BBR の水酸化 代謝物 及び GSH 付加体 M2 の血漿中曝露量は、コントロール群と同等かそれ 以下で あった。特に、PB 及び PCN については肝臓中のGSH 付加 体 M2 もコ ントロ ール群と同等かそれ以下であった。この結果は、
33

PB 及び PCN がマウ スにお いて CYP だけでなくグルクロン酸抱合酵素の発現を誘導すること 35),36) 、及 び BBR のヒドロキシ体及びジヒドロキシ体がグ
ル クロン 酸抱合さ れ る こと と 関係していると考えられた 37),38) 。すなわち、
PB 及 び PCN の 前 処 置 に よ り 、 BBR 投 与 後 の マ ウ ス 生 体 内 に お け る 1’hydorxy BBR、6-hydroxy BBR 及び 1’,6-dihydroxy BBR のグルクロン酸抱合代
謝が亢進し、PB 及 び PCN による CYP の発現誘導を介した水酸化代謝物及び GSH 付加体 M2 の 生成亢 進がマスクされた可能性が考えられた。
薬物による細胞毒性の機序の一つとしてミトコンドリア膜透過性遷移(mitochondrial permeability transition: MPT) が知られている。BBR を代謝させ た肝ミク ロソー ム 溶 液 を 単離したミトコンドリアへ曝露することで MPT
を 生 じ る が 、 CYP 阻 害 剤 に よ り 肝 ミ ク ロ ソ ー ム 中 に お け る 1’,6-dihydroxy
BBR の生成を阻害す ること で、MPT が抑制されることが報告されている 39) 。
ま た、MPT は様 々 な 薬 物 の反応性 代謝物により生じることが知られている40)-42)42)。1’,6-dihydroxy BBR は第一 章において非酵素により反応性代謝物に変換されることが示 された ことから、1’,6-dihydroxy BBR から非酵素により生成する反応性代謝 物が、 肝細胞中のミトコンドリアと共有結合し MPT を引き起こすことが 、BBR による肝細胞毒性の機序の一つとして考えられた。
本章で は、 薬物 代謝 酵素を 誘導したマウスへ BBR を単回投与することで肝機能の低下が認め られた 。Wistar-Imamichi ラットにおいても、BBR を反復投与することで、alkaline phosphatase 活性が上昇し、休薬によりその所見が回復する 34) 。また 、buthionine sulfoximine を前処置し生体内 GSH を枯渇さ せ た マ ウ ス に BBR を 50 mg/kg 経 口 投 与 す る こ と で 、 マ ウ ス 血 清 中 のaspartate transaminase 活性 が有意に増加することも報告されている 16) 。これ
ら より、BBR はマ ウ ス 及 びラッ トのい ずれにおいて も肝機 能低下を引き 起
こすポテンシャルを 有して おり、反復投与による長期曝露、GSH の枯渇並び34

に薬物代謝酵素誘導 により 肝臓への反応性代謝物の曝露が増加する事が、肝機能低下の原因とな り得る と考えられた。
2.5

小括

薬物代 謝酵 素の 誘導 剤とし て DEX を前処置したマウスに BBR を経口単回投与することで、肝機能 の低下が認められた。また、肝機能マーカーと肝臓中 GSH 付加体 M2 の生成 量に関連性が見出された。従って、BBR の 1’位
及 び 6 位が 水酸化 さ れ た 後に非酵素に より生成する反応性 代謝物がマウス
において肝障害を引 き起こ す可能性が示唆された。

35

3

第三 章: ヒ トに お け る BBR 肝 障害 発 現 に関 与 する 反 応 性代 謝物 の 解明
37)

3.1

序論

BBR は、第一章で 新 規に同定された 1’位及び 6 位の水酸化を介して生成する反応性代謝物以 外に、ベンゾフラン環の酸化により生成するエポキシド
や、酸化 的脱ハロゲ ン化に より生成するキノン体、イプソ置換を介して生成
す る 2,6-dibromo-p-benzoquinone (DBBQ) 及 び 2,6-dibromohydroquinone(DBH) といった複数 の反応 性代謝物が報告されている 15)-18) 。これら反応性
代謝物は in vitro 試験系や 実験動物において生成が認められているが、ヒト
生体内での生成に関 する報 告はない。そこで本章では、ヒト由来の肝細胞を有するヒト肝キメラ マウス を用いることで、ヒト生体内で生成する反応性代
謝物を予測すること を目的 とした。
3.2
3.2.1

方法
試薬及 び材 料

BBR は、Sigma Aldrich より購入した。1’,6-Dihydroxy BBR は第一章と同じものを用いた。1’-Hydroxy BBR、6-hydroxy BBR、2,6-dibromo-p-benzoquinone(DBBQ) 及 び 2,6-dibromohydroquinone (DBH) は慶應義塾大学薬学部大江知之博士より恵与され たもの を用いた。プールドヒト肝ミクロソーム及び ICR
マウスの肝ミクロソ ームは 積水メディカル (東京) より購入した。その他の試薬については全て 市販の ものを用いた。
3.2.2

実験動 物

TK-NOG マウス (NOD/Shi-scid IL2 receptor gamma–null mice expressing aherpes simplex virus type-1 thymidine kinase transgene) 及びヒト肝キメラマウ
スは、実 験動物中央 研究所 末水洋志博士により作製されたものを用いた。ヒ
ト肝キメラマウスの 作製方 法を以下に示す。
36

ヒ ト 凍 結 肝 細 胞 に は 、 35 歳 ア ジ ア 人 男 性 由 来 の 凍 結 肝 細 胞 (lot
HUM4122B、Lonza、Switzerland) を用いた。ヒト凍結肝細胞は、OpotiTHAW
Hepatocyte Isolation Kit (積水メディカル) を用い 37ºC で融解した。トリパン
ブ ル ー 色 素 排除 試 験 法 に よ り 生 細胞 率 が 80%以 上で あ る こ とを 確 認 した 肝細胞をマウスへの移 植に供 した。
ヒ ト 肝 キ メ ラ マ ウ ス は 、 TK-NOG マ ウ ス を 用 い 、 既 報 に 従 っ て 作 製 し た43),44)。すな わち 、7 週齢の 雄性 TK-NOG マウスに 6 mg/kg の ganciclovir を腹腔内投与し、2 日及 び 10 日 後にそれぞれ 6 及び 50 mg/kg の ganciclovir を再投与した。最初の ganciclovir 投与 の 18 日後、血清 ALT 活性が 240 IU/L を超
えて上昇したマウス へ、1.1-1.5 x 10 6 cells のヒト肝細胞を脾臓内投与した。
ヒト肝細胞への置換 率は、Hasegawa et al. (2011) の手法に従い、作製したヒト 肝キメラ マ ウス の 血 清 中 ヒト アルブミ ン濃度から 算出し た 45) 。本試験では 95%以上の肝置換 率を示 した 15-16 週齢のヒト肝キメラマウスを用いた。
コントロールマウス として 、12-13 週齢の TK-NOG マウスを用いた。BBR を投与していないヒト 肝キメ ラマウス試料 (ブランク試料) の採取には、ヒト肝置換率が 50-60%のヒ ト肝キメラマウスを用いた。ヒト肝キメラマウスの作製、マ ウス への 薬 物投与 及び生体試料の採取は、千葉大学 (承認番号：動1-369) 及び実験動 物 中央研 究所 (承認番号：17017A) の動物実験委員会により承認された方法に て行っ た。
3.2.3

In vivo 試験

BBR を 0.5% methylcellulose (5 mL/kg) に溶解し、20 mg/kg で肝キメラマ
ウス及びコントロー ルマウ ス (各 2 匹) へ単回経口投与した (第 1 回投与)。
投与後、0.5、1、2、4、7 及 び 24 時間後に頸静脈から血液を採取した。また、BBR 投与後 7-24 時間の畜 尿を採取した。1 週間の休薬後、再度 BBR を 20
mg/kg 経口投与し た (第 2 回投与)。投与 2 時間後に、麻酔下で開腹し、採血37

及び肝摘出を行った 。採 取された血液は速やかに遠心分離し、上清を血漿として採取した。採取 された 試料は−80ºC で凍結保存した。
BBR 及 び 3 種 の 主 代 謝 物 (1’-Hydroxy BBR、 6-hydroxy BBR 及 び 1’,6dihydroxy BBR) の 血漿中 濃度解析には、第 1 回投与後に得られた血漿を用いた。検 量線サンプ ルの調 製にはブランク試料を用いた。各個体から得られた血漿 5 µL を、methanol (5 µL) 及び 120 µL の 0.5 µg/mL N-phenylanthranilic
acid 含有 acetonitrile 溶液 (120 µL) と混合し、2080 × g で 10 分間遠心分離
後、上清を MultiScreen Ⓡ PTFE membranes (Merck Millipore) でろ過した。ろ過後、等量の超純水 と混合 したものを分析試料とした。
網羅的代謝物探 索に は、第 1 回投与後に採取した尿及び第 2 回投与後に採取 した血漿 及 び肝 組 織 を 用 いた。 BBR を投与してい ないヒ ト肝キメラマ ウ
スにおけるデータ取 得には ブランク試料を用いた。2 個体の血漿各 30 µL を混合し、10% hydrochloric acid (60 µL) を添加した。尿についても同様に、2個体の尿各 20 µL を 混合し 、10% hydrochloric acid (40 µL) を添加した。肝組
織は、3 倍 量の生理食 塩水で ホモジナイズした後に、各個体 15 µL を混合し、10% hydrochloric acid (30 µL) を添加した。各混合溶液を 12000 × g で 10 分
間遠心分離後、上清 を分析 試料とした。
3.2.4

In vitro 試験

BBR (0.05-70 µM)、1’-hydroxy BBR (1-100 µM) または 6-hydroxy BBR (0.150 µM) を基質 とし 、100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) 及び肝ミク
ロソーム (0.125 mg/mL のヒト肝 ミクロソーム又は 0.25 mg/mL のマウス肝ミクロソーム) 存 在 下、1 mM の NADPH を添加し代謝反応を開始した (最終反応液量 100 µL)。BBR 及び 1’-hydroxy BBR では 10 分間、6-hydroxy BBR
では 20 分間 37ºC でインキ ュベーションした。インキュベーション後、50 µLの反応溶液を、氷 冷 した acetonitrile (100 µL) へ添加し、そこへ 0.5 µg/mL N38

phenylanthranilic acid 含有 acetnitrile 溶液 (50 µL) を添加し混合した。混合物を 2080 × g で 15 分 間遠心 分離後、得られた上清を上記と同様にろ過し、2倍量の 0.1% formic acid と混合したものを測定試料とした。
3.2.5

BBR 及び代謝物 の定 量

In vivo 及び in vitro 試験から得 られた試料における BBR 及びその代謝物(1’-hydroxy BBR、6-hydroxy BBR 及び 1’,6-dihydroxy BBR) の濃度は、LCMS/MS を用いて定 量した 。LC-MS/MS は Xevo TQ-S (Waters、MA) を使用
した 。分析カラム は CAPCELL CORE PFP (2.7 µm、2.1 mm × 50 mm、Waters)を使用した。カ ラム 温度 は 40ºC、移動相は溶離液 A (0.1% v/v formic acid)と溶離液 B (acetnitrile) の混合溶媒を用い、流速は 0.5 mL/min とした。グラジエント条件 は次 のよう に設定した：0-4 分 5-40% B、4-4.1 分 40-95% B、
4.1-5 分 95% B、5-5.1 分 95-5% B、5.1-5.5 分 5% B (BBR、6-hydroxy BBR 及
び 1’-hydroxy BBR)、0-3.5 分 5-70% B、3.5-3.6 分 70-95% B、3.6-4.5 分 95%
B、4.5-4.6 分 95-5% B、4.6-5.5 分 5% B (1’,6-dihydroxy BBR)。MS 条件は次のように設定し た：ESI- mode、Capillary=1 kV、Source Temperature=150ºC、Cone Gas Flow=150 L/hr 、 Desolvation Gas Flow=1000 L/hr 、 Collision Gas
Flow=0.18 mL/min、Nebulizer Gas Flow=7.00 bar。定量測定は MRM で行い、MRM transitions (Cone V、Collision eV、分析対象) は次のように設定した：
m/z 420.95/248.94 (56、30、BBR)、m/z 436.94 / 249.01 (22、30、1’-hydroxy
BBR 及び 6-hydroxy BBR)、m/z 452.94 / 249.01 (76、32、1’,6-dihydroxy BBR)、
212.17 / 92.14 (2、34、N-phenylanthranilic acid)。
3.2.6

In vivo にお ける 薬物 動態解析

血中濃度推移解 析は 、Phoenix WinNonlin Ver.8.2 (Certara) を用い、消失半
減期 (t 1/2 )、血中濃 度 曲線下 面積 (AUC inf 及び AUC 0-last ) を求めた。最高血中濃度 (C max ) 及び最 高血中 濃度到達時間 (t max ) は実測値より求めた。
39

3.2.7In vitro におけ る速 度論解析

肝ミクロソームに おけ る 1’-Hydroxy BBR 及び 6-hydroxy BBR から 1’,6dihydroxy BBR の生 成反応 は、simple Michaelis-Menten kinetic model を用いて
解 析 し た 。 BBR か ら 6-hydroxy BBR の 生 成 反 応 は 、 non-Michaelis-Menten
kinetic model を用い て解析 した。これら model の選択は、the Nomenclature
Committee of the International Union of Biochemistry の手法に従った 46) 。各パ
ラメーター (最大 速 度定数 V max 、ミカエリスメンテン定数 K m 及び阻害定数
K i ) は、Phoenix WinNonlin ver.8.2 を用いて算出した。肝ミクロソーム代謝固有クリアランス (CLint ) は V max を K m で除することで算出した。BBR から
1’-hydroxy BBR への CLint は、ヒト 及びマウス肝ミクロソーム代謝反応におけ る 基質 濃度-代 謝 生 成 物 濃 度の 関係 が 直線 を示 す範 囲に お ける 傾き から 算
出した。
3.2.8

網羅的 代謝 物探 索In vivo 試験に おい て 得た網羅的代謝物探索用の分析試料は、LC-quadrupole
time-of-flight Mass Spectrometer (QTOF6530、Agilent Technologies、CA、USA)を用いて測定した。分析カ ラムは、ZORBAX Eclipse Plus C18 Rapid Resolution
HD (1.2 µm、2.1 mm × 100 mm、Agilent Technologies) を使用した。カラム温
度は 40ºC、移動相は 溶離 液 A (0.1% [v/v] formic acid) と溶離液 B (acetonitrile)の混合溶媒を用い、 流速は 0.3 mL/min とした。グラジエント条件は次のよ
うに設定した：0-15 分 10-70% B、15-16 分 70-90% B、16-19 分 95% B、1920 分 95-10% B、20-22 分 10% B。MS 条件は次のように設定した：ESI- mode、
Range 90-1200 m/z、Scan Rate 1.00 spectra/sec、Gas Temperature 280ºC、Gas
Flow 10 L/min、Nebulizer 50 psig、Sheath Gas Temperature 350ºC、Sheath Gas
Flow 7.5 L/min、VCap 3500、Nozzle Voltage 1000V、Fragmentor 100。
得られたデータ は MassHunter Metabolite ID B. 04.00 (Agilent Technologies)40を用いて解析した。 ブラン ク試料と BBR を投与したマウスから得られた試料のデータを比較し 、代謝 物を抽出した。BBR、1’-hydroxy BBR、6-hydroxy
BBR、1’,6-dihydroxy BBR、DBBQ 及び DBH は標品を用いて確認した。また、既知の GSH 付加体 及びそ れらがメ ルカプツール酸経路により代謝され生成する代謝物について は、精 密質量から算出される m/z 値と、臭素原子を 2 つ分子に含むことに由 来する 特徴的な MS スペクトルから確認した。また、既報の GSH 付加体に ついて は、BBR または 1’,6-dihydroxy BBR 50 µM を GSH(5 mM) 存在下 0.4 mg/mL ヒト肝ミクロソーム中で代謝させた試料を用い、カラム保持時間が一 致する ことを確認した。DBH の GSH 付加体については、
その化学構造から DBBQ 溶液 (10 µg/mL) と GSH 溶液 (1 mM) の混合により生成すると考えら れたこ とから、その混合溶液を用いて確認した。ヒト肝キ メラマウ ス及び コ ン ト ロ ールマウス間における代謝物生成量の比較には、各試料のクロマトグ ラムに おける代謝物の peak area を peak intensity として用いた。Peak area 1000 以下を検出限界とした。
3.3
3.3.1

結果
ヒト肝 キメ ラマ ウス におけ る BBR の血漿中薬物濃度推移

BBR を 経口投与 後 、 ヒ ト肝キ メラマ ウス及びコン トロー ルマウス間に お
いて BBR、1’-hydroxy BBR、6-hydorxy BBR 及び 1’,6-dihydroxy BBR の血漿中濃度推移に差異が 認めら れた (Figure 3-1)。ヒト肝キメラマウス 2 個体における BBR の C max 及び AUC inf の平均値は、それぞれコントロールマウスの1.2 倍及び 1.7 倍と、やや 高い値を示した (Table 3-1)。6-Hydroxy BBR のヒ
ト肝キメラマウスに おける C max 及び AUC 0-24h の平均値は、コントロールマ
ウスと比較しそれぞ れ 0.35 及び 0.43 倍であった (Table 3-2)。一方、1’-hydroxy
BBR の C max 及び AUC 0-24h は、ヒト肝キメラマウスにおいて、コントロール
マウスと比較しそれ ぞれ 6.9 倍及び 11 倍と、非常に大きい値を示した。1’,641

Dihydroxy BBR は 、コント ロールマウスと比較し、ヒト肝キメラマウスにおいてそれぞれ 2.1 倍 及び 2.6 倍であった。ヒト肝キメラマウスにおける BBRと水酸化体の AUC 比 (BBR: 1’-hydroxy BBR: 6-hydroxy BBR) は、コントロールマウスにおけ る AUC 比と大きく異なっていた (1:1.2:0.7 vs. 1:0.2:2.8)。

Figure 3-1 Plasma concentration-time profiles for BBR (A), 1’-hydroxy BBR(B), 6-hydroxy BBR (C) and 1’,6-dihydorxy BBR (D) in humanized-liver mice(n =2) and control mice (n =2) after oral administration of BBR.

Table 3-1 Pharmacokinetic parameters of BBR in humanized-liver mice (n=2)
and control mice (n=2) after oral administration of BBR.

Cmax (μg/mL)

Humanized-liver
#1
#2
13.54
12.16

#1
10.07

#2
11.66

AUCinf (μg・ h/mL)
Tmax (h)t1/2 (h)

32.89
0.5
2.21

21.35
0.5
2.02

15.36
0.5
2.72

31.27
0.5
4.94
42

ControlTable 3-2 Pharmacokinetic parameters of BBR metabolites in humanized-liver
mice (n=2) and control mice (n=2) after oral administration of BBR.

6-Hydroxy
BBR

Cmax (μg/mL)
AUCinf (μg・h/mL)

Tmax (h)Cmax (μg/mL)
1'-Hydroxy
AUCinf (μg・h/mL)
BBR
Tmax (h)Cmax (μg/mL)
1',6-Dihydroxy
AUCinf (μg・h/mL)
BBR
Tmax (h)3.3.2

Humanized-liver
#1
#2
4.68
3.94

#1
10.9

#2
13.98

22.51
1.00
3.81
40.25
7.00
0.4
3.91
4.00

56.26
0.50
0.42
3.46
1.00
0.12
1.52
7.00

48.32
1.00
0.57
3.29
1.00
0.19
1.5
2.00

21.98
1.00
3.03
37.2
4.00
0.24
3.88
4.00

Control

ヒト肝 キメ ラマ ウス におけ る BBR の網羅的代謝物探索

ヒト肝キメラマウ スの血 漿、尿及び肝臓において全 26 種、コントロール
マウスにおいて全 19 種の 代謝物が検出された (Table 3-3、Figure 3-2)。
いずれの試料においてもベンゾフラン環の酸化により生成するエポキシ
ドの GSH 付加体は 検出さ れなかったものの、GSH 付加体から更にメルカプ
ツール酸経路により 代謝さ れ生成する Cys 付加体 (A1 及び A1’)、Cys-Gly 付
加体 (met12) 並びに N-acetyl-Cys 付加体 (NAC BBR、NAC BBR’及び NAC
BBR’’) が検出 され た。ま た、A1、A1’、met12 及び NAC BBR はヒト肝キメ
ラマウスの血漿中に おいて 検出されたものの、コントロールマウスでは A1
及び met12 のみが検 出され 、それらの生成量はヒト肝キメラマウスの 10 分の 1 以下であった (Figure 3-2)。
1’位及 び 6 位 の 水 酸 化 を介 して 生成 す る反 応性 代謝 物の 付 加体 とし て、
1’,6-dihydroxy BBR の 1’位水酸基 が GSH に置換された M2 及びそのメルカ
プツール酸経路によ り生成 する代謝物 (met2、met10 及び met11)、並びに 1’,6dihydroxy BBR が更 に水酸 化され生 成する反応性代謝物の GSH 付加体 (M3)がヒト肝キメラマウ スにお いて検出された。met10 及び met11 は 2 つの不斉炭素原子を有すると 考えら れ 、そのカラム保持時間が近いことから、ジアス
43テレオマーの関係に あると 考えられた。一方、これら代謝物のうち、コント
ロールマウスでは、met10 及び M3 のみが検出された。血漿及び肝臓中の M3
生成量はヒト肝キメラマウスとコントロールマウスで大きな差異はなかったものの、尿にお け る M3 及び met10 の生成量は、コントロールマウスと比較しヒト肝キメラマ ウス で 10 倍以上高値を示した (Figure 3-2)。
その他 の反 応性 代謝 物とし て、DBH の GSH 付加体及び脱ブロモ体の GSH
付 加体が 報告され て い るが 15),18) 、 ヒト肝キメラマウス及びコントロールマ
ウスのいずれの試料 におい ても検出されなかった (data not shown)。
その他 代謝 物と して 、ヒト 肝キメラマウス特異的に水酸化 BBR のグルク
ロン酸抱合体 (met5) が検出された。また、1 つの炭素原子と 2 つの水素原子が BBR 及び水酸 化 BBR から脱離し生成する代謝物 (met13、met14 及びmet16) が 両マ ウ ス に お い て 検 出 され た もの の 、そ れ ら原 子 が脱 離 した 部位の特定には至らなか った。
以上の 結果 より 推定 された ヒトにおける代謝経路を Figure 3-3 に示した。

44

Table 3-3 BBR and its metabolites observed in plasma, urine and liver extracts
from humanized-liver mice and control mice. The peak IDs were given in theretention time (RT) order. M3, M2, A1 and NAC BBR were added to names used inprevious articles 16),19) , respectively.

Peak ID RT (min)
1
5.77
2
5.90
3
6.25
4
6.40
5
6.59
6
6.83
7
7.62
8
7.64
9
7.69
10
7.91
11
7.96
12
8.34
13
8.65
14
8.85
15
8.90
16
9.18
17
10.12
18
10.62
19
10.63
20
10.69
21
10.85
22
11.20
23
11.54
24
11.86
25
13.20
26
14.03
P
15.25

Name
met1
M3
met2
M2
met3
met4
met5
met6
A1
met7
A1'
met8
met9
met10
1',6-diOH BBR
met11
met12
met13
met14
NAC BBR
NAC BBR'
NAC BBR''
1'-OH BBR
6-OH BBR
met15
met16
BBR

Assignment
Dihydroxy glucuronide
Trihydroxy, gultathione adductHydroxy, cysteine adductHydroxy, gultathione adduct
Dihydroxy glucuronide
Trihydroxy
Hydroxy glucuronide
Trihydroxy, reduction
Cysteine adductHydroxy glucuronide
Cysteine adduct
Reduced, cysteine-glycine adductHydroxy glucuronide
Hydroxy, N-acetyl cysteine adduct
1',6-Dihydroxy
Hydroxy, N-acetyl cysteine adduct
Cysteine-glycine adduct
Loss of CH2
Hydroxy, loss of CH2
N-acetyl cysteine adductN-acetyl cysteine adductN-acetyl cysteine adduct1'-Hydroxy
6-Hydroxy
Hydroxy sulfate
Loss of CH2
Benzbromarone

45

FormulaExact Mass
C23 H20 Br2 O11
629.937
C27 H29 Br2 N3 O12 S
776.984
C20 H17 Br2 N O6 S
556.914
C27 H27 Br2 N3 O10 S
742.978
C23 H20 Br2 O11
629.937
C17 H12 Br2 O6
469.900
C23 H20 Br2 O10
613.942C17 H14 Br2 O6
471.916C20 H17 Br2 N O5 S
540.919C23 H20 Br2 O10
613.942
C20 H17 Br2 N O5 S
540.919C22 H22 Br2 N2 O6 S
599.957
C23 H20 Br2 O10
613.942C22 H19 Br2 N O7 S
598.925
C17 H12 Br2 O5
453.905
C22 H19 Br2 N O7 S
598.925
C22 H20 Br2 N2 O6 S
597.941
C16 H10 Br2 O3
407.900
C16 H10 Br2 O4
423.895
C22 H19 Br2 N O6 S
582.930
C22 H19 Br2 N O6 S
582.930
C22 H19 Br2 N O6 S
582.930
C17 H12 Br2 O4
437.910
C17 H12 Br2 O4
437.910
C17 H12 Br2 O7 S
517.867
C16 H10 Br2 O3
407.900
C17 H12 Br2 O3
421.915

Figure 3-2 Peak intensity of BBR and its metabolites detected in plasma (A),urine (B) and liver (C) in humanized-liver mice and control mice.

Figure 3-3 Proposed metabolic pathways of BBR in humanized-liver mice.
Metabolites detected only in humanized-liver mice are underlined.
46

3.3.3

ヒト及 びマ ウス 肝ミ クロソ ームにおける BBR の水酸化代謝速度

BBR か ら 1’,6-dihydroxy BBR への各水酸化代謝速度をヒト及びマウス肝ミクロソームを用いて解析した。ヒト及びマウス肝ミクロソームにおけるBBR から 6-hydroxy BBR へ の代謝活性は、基質濃度の増加に伴い上昇し、高濃度域で低下した (data not shown)。この結果は、BBR が CYP2C9 に対して強い阻害作用を示す ことか ら 22) 、CYP2C9 による BBR から 6-hydroxy BBRへの代謝が BBR 自身によ り阻害されたためと考えられた。ヒト肝ミクロソームにおける BBR の 6 位 水酸化反応の代謝固有クリアランス (CLint ) は、1’位水酸化と比較し て 2.5 倍 高かった (Table 3-4)。一方、マウス肝ミクロソー
ムにおける BBR の 6 位水酸化反応の CLint は、1’位水酸化の 40 倍と著しく高かった。また、6-Hydroxy BBR の 1’位水酸化及び 1’-hydroxy BBR の 6 位水酸化反応の CLint は、ヒ ト肝ミクロソームにおいてそれぞれ 6.25 及び 1.40
µL/min/mg で あ っ た の に 対 し 、 マ ウ ス 肝 ミ ク ロ ソ ー ム に お い て は そ れ ぞ れ1.32 及び 15.47 µL/min/mg であった。以上より、BBR の 1’位炭素及び 6 位炭素の水酸化、並 びに 1’-hydroxy BBR の 6 位炭素の水酸化及び 6-hydroxy BBRの 1’位炭素の水酸 化 に関す る CLint には、ヒトとマウスの肝ミクロソーム間において大きな差異 が認め られた。
Table 3-4 Kinetic parameters for hydroxylation of BBR and metabolites in liver
microsomes
Human

1'-Hydroxylationof BBR
6-Hydroxylationof BBR
1'-Hydroxylationof 6-hydroxy BBR
6-Hydroxylationof 1'-hydroxy BBR

Mouse

Km
(uM)

Vmax
(pmol/min/mg)

Ki

CLint
(uL/min/mg)

Km
(uM)

Vmax
(pmol/min/mg)

Ki

CLint
(uL/min/mg)

-

-

-

30.02

-

-

-

7.56

4.75

356.9

170.44

75.14

2.31

694.8

207.69300.78

1.08

6.75

-

6.25

6.23

8.24

-

1.32

38.86

54.39

-

1.4

5.68

87.87

-

15.47

47

3.4

考察

本 章に おいて、BBR を 経口投与後の薬 物動態がヒト肝キメ ラマウス及びコントロールマウス間で大きく異なることが示された。両マウスにおけるBBR 及び水酸化代謝 物の AUC 比より、コントロールマウスでは 6 位水酸化が BBR の主要代 謝 経路で あり、一 方、ヒト肝キメラマウスでは 1’位水酸化及び 6 位水酸化が同 程度 BBR の代謝に寄与すると考えられた。肝ミクロソームを用いた検討に おいて 、1’位水酸化の CLint に対する 6 位水酸化の CLintが、マウスでは 40 倍 であっ たのに対し、ヒトでは 2.5 倍であったことから、マウスでは 1’位水 酸 化体に 比較して 6 位水酸化体の生成が優位であるのに対し、ヒト ではそ の 差が小 さいことが示唆された。この結果は、in vivo において認められた両マ ウスに おける薬物動態の差異とよく一致していた。ヒトにおける BBR、1’-hydroxy BBR 及 び 6-hydroxy BBR の AUC 比は、BBR 代謝の slow eliminator を 除く 9 例の健常 人において、1:0.9:0.7 である 47) 。本章では、体表面積換算で ヒト臨 床用量と同等の投与量で BBR をマウスへ経口投与しており、その 時 のヒト 肝キメラマウスにおける BBR、1’-hydroxy BBR 及
び 6-hydroxy BBR の AUC 比は 1:1.2:0.7 と、ヒトにおける AUC 比と類似していた。従って、ヒ ト肝キ メラマウスはヒトに近似した BBR の動態特性を示すことが示唆され た。
マウスの血漿、尿 及び肝 臓中の代謝物探索において、BBR のベンゾフラン
環の酸化及び 1’位 及 び 6 位の水酸化により生成する反応性代謝物の付加体が検出された。これ ら反応 性代謝物の付加体は、ヒト肝キメラマウス由来試料においてコントロ ールマ ウスと比較し高い生成量を示したことから、マウスへ移植したヒト肝 細胞内 において生成したと考えられた。また、これら反
応性代謝物の生成は 第二章 における結果及び Wang らの報告において、マウス におけ る肝機能 の 低 下と 関 連性があることが示唆されている 16),28) 。従っ48

て、ヒトにおいても これら BBR の反応性代謝物が生成することで肝機能の低下に関与する可能 性が考 えられた。なお、本検討ではヒト肝キメラマウス
における肝機能マー カーの 測定を行わなかったが、体表面積換算でヒト臨床用量と同等の用量で ヒト肝 キメラマウスへ BBR を単回投与したことから、
本条件では肝機能低 下は起 きていないと考えられる。ヒト肝キメラマウスにおいて BBR による 肝障害 を再現す るためには、反復投与による反応性代謝
物 の長期曝 露 、GSH の 枯 渇 並びに薬 物 代謝酵素誘導 により 肝臓への反応 性
代謝物の曝露を増加 させる 必要がある。
本章では、ヒト肝 ミクロ ソームにおける BBR から 1’,6-dihydroxy BBR への代謝生成に至る、 各水酸 化反応の CLint を評価した。BBR の 6 位水酸化は
1’位水酸 化の 2.5 倍 高かっ たのにも関わらず、1’-hydroxy BBR の 6 位水酸化は 6-hydroxy BBR の 1’位水酸化の 4.5 倍低かった。また、1’-hydroxy BBR の6 位水酸化反応の K m 値は、BBR の 6 位水酸化反応の K m 値の 8.2 倍高く、BBR の 6 位水酸 化 に関与 する酵素 (CYP2C9) 20) に対する基質親和性は 1’位が水酸化されること で著し く低下した。この結果は、BBR のベンゾフラン環の 2 位の置換基のか さ高さ に依存して CYP2C9 への基質親和性が低下することから 22) 、1’-hydroxy BBR は 2 位のヒドロキシエチル基による立体障害
により CYP2C9 への 親和性 が低下したと考えられた。以上より、ヒト肝において BBR は主に 6 位が水 酸化され、その後更に 1’位が水酸化されることにより、1’,6-dihydroxy BBR が生成すると考えられた。従って、6 位水酸化体の生成量が多い個体 におい ては、更なる 1’位水酸化と非酵素反応を介し、反応性代謝物の生成量 が増加 する可能性が考えられた。
健常人における BBR の薬物動態には大きな個体差があり、マイナーな薬物動態パターンとし て 2 つのタイプ (タイプ 1 及びタイプ 2) が報告されている。タ イプ 1 では 、BBR、1’-hydroxy BBR 及び 6-hydroxy BBR の血中濃度49

は一般健常人と比較 し高値 を示す。一方、タイプ 2 では、BBR 及び 1’-hydroxy
BBR の血 中濃度は高 値を示 すが、6-hydroxy BBR の血中濃度は低い 47),48) 。
また、CYP2C9 活性 低下の 原因とな る遺伝子変異 Ile359Leu (CYP2C9*3) をホ
モ で有 するヒ ト (CYP2C9*3/*3) では、 遺伝子 多型を 有し な い野生 型のヒ ト(CYP2C9*1/*1) と比 較し高 い BBR 及び 6-hydroxy BBR の血中濃度を示す 49) 。
CYP2C9*3/*3 のヒト において BBR 投与後 6 時間までの 6-hydroxy BBR の血中濃度が CYP2C9*1/*1 のヒトと比較し低値を示すことは、CYP2C9*3/*3 がBBR の 6 位水酸化 活性を 低下させる遺伝子多型であることと一致する。しかし、その後 CYP2C9*3/*3 のヒトにおける 6-hydroxy BBR の血中濃度は増加し続け、投与後 24 時間ま での C max 及び AUC が CYP2C9*1/*1 のヒトを超える 49) 。これらの報 告のよ うに、タイプ 1 の BBR の薬物動態パターンを示すヒトや CYP2C9*3/*3 の遺伝子多型を保有するヒトでは、6-hydroxy BBR の生成量が高くなるこ とで 、更なる 1’位水酸化代謝を介し生成する反応性代謝物 の曝露量 が増加 し 、DILI 発症の リス クが高くなる可能性 が考えられた。
尚、数少な い BBR に よる DILI 症例の中で、Marukawa らが報告した 46 歳男
性における劇症肝炎 亜急性 型 の 1 例では、BBR 投与後 24 時間において BBR
及び 6-hydroxy BBR の血中 濃度が健常男性と比較しそれぞれ 7 倍及び 13.5
倍高値を示してい た 50) 。本 症例に おいて、1’-hydroxy BBR や 1’,6-dihydroxy
BBR の血 中濃度の情 報は無 いが、BBR による重篤な肝障害の発生機序として 6-hydroxy BBR の 曝 露 増加を引 き起こす代謝異常が関与している可能性が考えられた。
ヒト肝キメラマウ スにお いて、thalidomide や diclofenac から生成する反応
性代謝物の GSH 付加体が 検出できることが報告されている 44),51) 。本章では、
ヒト肝キメラマウス へ BBR 投与の僅か 2 時間後に採取された試料中において複数の反応性代謝 物の GSH 付加体が検出された。また、検出された GSH50付加体のうち M2 及び M3 はそれぞれ 2 及び 3 段階の水酸化代謝反応を経て生成する反応性代謝 物の GSH 付加体であった。一方、第一章において、1’hydroxy BBR を 反応 基質と し GSH 存在下ヒト肝ミクロソームを用いて代謝させた際、GSH 付 加 体 M2 及 び M3 は生成量が少ないため、検出限界以下となった。このように 、ヒト 肝キメラマウスは、in vitro 評価では検出困難な多段階代謝反応により生成する反応性代謝物の有無を評価するツールとして有用と考えられた。 更に、 ヒト肝キメラマウスがヒトにおける BBR と代謝
物の AUC 比を再現 したこ とや、ヒト特異的な代謝物の検出にも活用できる
こ とから 44),51) 、ヒ ト 肝キ メラマウスは反応性代謝物に限らず様々な薬物のヒトにおける代謝物 評価に 有用と考えられる。しかし、ヒト肝キメラマウスの 活用時 には注 意点 が ある 。 ヒトにおける 1’-hydroxy BBR 及び 6-hydroxy
BBR の T max は、そ れぞ れ 11.4 時間及び 9.5 時間と、差異が殆ど認められていないのに対し 47) 、ヒト 肝キメラ マウスにおける 1’-hydroxy BBR 及び 6hydroxy BBR の T max はそれ ぞれ 4-7 時間及び 0.5 時間と、6-hydroxy BBR の最高血中濃度に達す る時間 が非常に早かった。この結果は、マウス肝ミクロ
ソームにおいて BBR の 6 位水酸化 活性が非常に高かったことから、ヒト肝キメラマウスの肝臓 に残存 するマウス肝細胞に存在する代謝酵素が BBR の6 位水酸化 に寄与 し たこと が原因である可能性が考えられた。このようなヒト肝キメラマウスに 残存す るマウス肝細胞の影響を除くため、ヒト肝キメラ
マウスにおける肝置 換率と 投与化合物の CLint の相関を利用することで、肝置換率 100%のヒト 肝キメ ラマウスにおける CLint を推定することが可能であることが報告され ている 43) 。従って、本研究における BBR の 6 位水酸化活性のようなマウス肝における代謝活性が高い代謝反応をヒト肝キメラマ
ウスを用いて評価す る際は 、ヒト肝 キメラマウスに残存するマウス肝細胞の影響を考慮する必要 がある と考えられた。
51

3.5

小括

ヒト肝 キメ ラマ ウス は、ヒ トと同様の BBR 及び水酸化代謝物の血中曝露比を示したことから 、ヒト に近似した BBR の動態特性を有することが示唆された。また 、ヒト 肝キメ ラマウスにおける 1’位及び 6 位の水酸化並びにベンゾフラン環のエポキシ化を介し生成する反応性代謝物の付加体の生成量がコントロールマウ スと比 較し高かったことから、これら反応性代謝物はヒト肝キメラマウスに 生着し たヒト肝細胞において生成したと考えられた。従って、これら反応性 代謝物 がヒト生体内においても生成し、DILI 発症に関与する可能性が考えら れた。

52

4

総括
本 研究 では、DILI 発 症 の原因となる反応性代謝物を同定する手法を検討するため、BBR を モ デル化 合物として研究を行った。その結果、BBR の中間代謝物の 1’,6-dihydroxy BBR を有機合成し、それを基質として GSH 存在
下肝ミクロソーム中 で代謝 させることで、新規反応性代謝物の存在を明らかとした。また、マウ スに CYP 誘導剤を前処置し、BBR 投与後のマウス肝における新規反応性代 謝物の 曝露量と肝機能を評価することで、新規反応性代謝物が肝機能低下に 関与す ることを示唆した。更に、ヒトと同様の BBR 動態 特性を有 す るヒ ト 肝 キ メ ラマウ スにお いて、BBR 投与後に採取した試 料における代謝物を網 羅的に 探索することで、生体内に生着したヒト肝細胞において生成する BBR の反応性代謝物を明らかとした。これらの検討により、BBR の 1’位及び 6 位の水 酸化を介して生成する反応性代謝物が、BBR による DILI 発 症に関与 する可 能性が示唆された。
本研究 で用 いた 一連 の手法 は、DILI が報告されている BBR 以外の上市済
み医薬品の原因特定 にも有 用と考えられる。また、開発中の医薬品候補についても、従来の反応 性代謝 物評価方法に加え、中間代謝物を反応基質としたGSH トラッピング 試験や 、CYP 誘導剤前処置マウスにおける肝機能評価、
ヒ ト肝キメ ラマウ ス に お け る 網羅的代謝 物探索を行うことで 、DILI 発症に繋がる反応性代謝物を生成し得る医薬品候補の選択回避に繋がると考えられる。今 後、DILI 発 症に繋 がる反応性代謝物の特定が迅速化することで、より安全な医薬品の使 用及び 新規開発に繋がることが期待される。

53

5

謝辞
本 研究 に終 始懇 篤 な る ご 指導と ご鞭撻を賜りました明治薬科大学 薬剤学

研究室 小林カオル 教授に 心より厚 く御礼申し上げます。
論 文作 成に 際し 、 ご 指 導 とご助 言を賜りました主査の明治薬科大学 医療分子解析学研究室 植沢芳広教授、副査の明治薬科大学 薬物動態学研究室
花田和彦教授ならびに明治薬科大学 薬化学研究室 山中正道教授に厚く御礼申し上げます。
本研究 の機 会を 与え て頂き 、多大なご指導とご助言を賜りました千葉大学
千葉寛名誉教授に心 より感 謝の意を表します。
1’,6-Dihydroxy BBR の有機合成に際し、ご指導とご助言を賜りました千葉
大学 髙山廣光名誉教授ならびに国際医療福祉大学薬学部 小暮紀行講師に
感 謝申し上 げ ます 。 BBR の代謝物 をご 恵与いただい た慶應 義塾大学薬学 部
大江知之准教授に厚 く御礼 申し上げます。ヒト肝キメラマウスを用いた研究に関するご指導とご 助言、マウスの作製及び動物実験に多大なご尽力を賜りま した実験 動物中 央 研 究 所 末水洋志博士ならびに神村秀隆博士に深く感謝
申し上げます。本研 究の遂 行に際し、ご指導とご助言を賜りました東北大学
大 学院 秋田英 万教 授 に 御 礼 申し上げます。本研究の実験にご協力頂きました吉田美菜様に感謝 致しま す。
本研究 の遂 行に あた り特段 のご便宜を賜りました Meiji Seika ファルマ株
式 会社 研究開 発本 部 黒 沢 亨 本部長に心より厚く御礼申し上げます。また、本研究の計画から完成に至るまでにご理解とご協力賜りました加藤和彦部
長、伊藤富美課長、 宮田敦 徳課長に深く感謝致します。
最後に 、これまで筆 者を支えてくれた両親に感謝するとともに、本研究に専心できるように終 始協力 してくれた家族に感謝します。

54

6

参考文献

1) U.S. Food and Drug Administration, “Guidance for Industry, Drug-Induced
Liver Injury, Premarketing Clinical Evaluation,” 2009.
2) Weaver R. J., Blomme E. A., Chadwick A. E., Copple I. M., Gerets H. H. J.,
Goldring C. E., Guillouzo A., Hewitt P. G., Ingelman-Sundberg M., Jensen K.
G., Juhila S., Klingmuller U., Labbe G., Liguori M. J., Lovatt C. A., Morgan P.,
Naisbitt D. J., Pieters R. H. H., Snoeys J., van de Water B., Williams D. P., Park
B. K., Nat. Rev. Drug Discov., 19, 131-148 (2020).
3) Shehu A. I., Ma X., Liver Res., 2, 173-179 (2018).
4) Park B. K., Kitteringham N. R., Powell H., Pirmohamed M., Toxicology, 153,
39-60 (2000).
5) Thompson R. A., Isin E. M., Ogese M. O., Mettetal J. T., Williams D. P., Chem.
Res. Toxicol., 29, 505-533 (2016).
6) Takakusa H., Masumoto H., Makino C., Okazaki O., Sudo K., Drug. Metab.
Pharmacokinet., 24, 100-107 (2009).
7) Miyaji Y., Makino C., Kurihara A., Suzuki W., Okazaki O., Bioanalysis, 4, 263269 (2012).
8) Sakatis M. Z., Reese M. J., Harrell A. W., Taylor M. A., Baines I. A., Chen L.,
Bloomer J. C., Yang E. Y., Ellens H. M., Ambroso J. L., Lovatt C. A., Ayrton A.
D., Clarke S. E., Chem. Res. Toxicol., 25, 2067-2082 (2012).
9) van der Klauw M. M., Houtman P. M., Stricker B. H., Spoelstra P., J. Hepatol.,
20, 376-379 (1994).
10) Wagayama H., Shiraki K., Sugimoto K., Fujikawa K., Shimizu A., Takase K.,
Nakano T., Tameda Y., J. Hepatol., 32, 874 (2000).
11) Suzuki T., Suzuki T., Kimura M., Shinoda M., Fujita T., Miyake N., Yamamoto
55

S., Tashiro K., Nihon Shokakibyo Gakkai Zasshi, 98, 421-425 (2001).
12) Arai M., Yokosuka O., Fujiwara K., Kojima H., Kanda T., Hirasawa H., Saisho
H., J. Gastroenterol. Hepatol., 17, 625-626 (2002).
13) Lee M. H., Graham G. G., Williams K. M., Day R. O., Drug Saf., 31, 643-865(2008).
14) 厚生労働省, “重 篤副 作用疾患別対応マニュアル, 薬物性肝障害,” 2019.
15) Kitagawara Y., Ohe T., Tachibana K., Takahashi K., Nakamura S., Mashino T.,
Drug Metab. Dispos., 43, 1303-1306 (2015).
16) Wang H., Feng Y., Wang Q., Guo X., Huang W., Peng Y., Zheng J., Chem. Res.
Toxicol., 29, 2145-2152 (2016).
17) Wang K., Wang H., Peng Y., Zheng J., Drug Metab. Dispos., 44, 607-615 (2016).
18) Wang H., Wang W., Gong B., Wang Z., Feng Y., Zhang W., Wang S., Peng Y.,
Zheng J., Drug Metab. Dispos., 47, 1281-1290 (2019).
19) Cho N., Kobayashi K., Yoshida M., Kogure N., Takayama H., Chiba K., Drug
Metab. Pharmacokinet., 32, 46-52 (2017).
20) Kobayashi K., Kajiwara E., Ishikawa M., Oka H., Chiba K., Biopharm. Drug
Dispos., 33, 466-473 (2012).
21) Kobayashi K., Kajiwara E., Ishikawa M., Mimura H., Oka H., Ejiri Y., Hosoda
M., Chiba K., Drug Metab Pharmacokinet., 28, 265-268 (2013).
22) Locuson C. W. 2nd, Wahlstrom J. L., Rock D. A., Rock D. A., Jones J. P., Drug
Metab. Dispos., 31, 967-971 (2003).
23) Lopez-Garcia M. P., Dansette P. M., Mansuy D., Biochemistry, 33, 166-175(1994).
24) Emoto C., Murase S., Sawada Y., Iwasaki K., Drug Metab. Pharmacokinet., 20,351-357 (2005).
5625) Newton D. J., Wang R. W., Lu A. Y., Drug Metab. Dispos., 23, 154-158 (1995).
26) Ohe T., Mashino T., Hirobe M., Drug Metab. Dispos., 25, 116-122 (1997).
27) De Vries J. X., Walter-Sack I., Voss A., Forster W., Ilisistegui Pons P., Stoetzer
F., Spraul M., Ackermann M., Moyna G., Xenobiotica, 23, 1435-1450 (1993).
28) Yoshida M., Cho N., Akita H., Kobayashi K., J. Biochem. Mol. Toxicol., 31(2017).
29) Somchit N., Wong C. W., Zuraini A., Ahmad Bustamam A., Hasiah A. H., Khairi
H. M., Sulaiman M. R., Israf, D. A., Drug Chem. Toxicol., 29, 237-253 (2006).
30) Sasaki E., Iwamura A., Tsuneyama K., Fukami T., Nakajima M., Kume T., Yokoi
T., Toxicol. Lett., 232, 79-88 (2015).
31) Takai S., Oda S., Tsuneyama K., Fukami T., Nakajima M., Yokoi T., J. Appl.
Toxicol., 36, 35-47 (2016).
32) Corcos L., Drug Metab. Dispos., 20, 797-801 (1992).
33) Xie W., Barwick J. L., Downes M., Blumberg B., Simon C. M., Nelson M. C.,
Neuschwander-Tetri B. A., Brunt E. M., Guzelian P. S., Evans R. M., Nature,406, 435-439 (2000).
34) 鳥居薬品株式会 社, “医薬品インタビューフォーム ユリノーム錠,” 2011.
35) Chen C., Staudinger J. L., Klaassen C. D., Drug Metab. Dispos., 31, 908-915(2003).
36) Viollon-Abadie C., Lassere D., Debruyne E., Nicod L., Carmichael N., Richert
L., Toxicol. Appl. Pharmacol., 155, 1-12 (1999).
37) Cho N., Suemizu H., Kamimura H., Ohe T., Ito F., Akita H., Kobayashi K.,
Drug Metab. Pharmacokinet., 47 (2022).
38) Wu H., Peng Y., Wang S., Wang K., Zhao X., Jiang F., J. Chromatogr. B. Analyt.
Technol. Biomed. Life Sci., 911, 122-132 (2012).
5739) Shirakawa M., Sekine S., Tanaka A., Horie T., Ito K., Toxicol. Appl. Pharmacol.,288, 12-18 (2015).
40) Haouzi D., Lekehal M., Moreau A., Moulis C., Feldmann G., Robin M. A.,
Letteron P., Fau D., Pessayre D., Hepatology, 32, 303-311 (2000).
41) Masubuchi Y., Suda C., Horie T., J. Hepatol., 42, 110-116 (2005).
42) Pessayre D., Fromenty B., Berson A., Robin M. A., Letteron P., Moreau R.,
Mansouri A., Drug Metab. Rev., 44, 34-87 (2012).
43) Kamimura H., Ito S., Chijiwa H., Okuzono T., Ishiguro T., Yamamoto Y.,
Nishinoaki S., Ninomiya S. I., Mitsui M., Kalgutkar A. S., Yamazaki H.,
Suemizu H., Xenobiotica, 47, 382-393 (2017).
44) Kamimura H., Ito S., Nozawa K., Nakamura S., Chijiwa H., Nagatsuka S.,
Kuronuma M., Ohnishi Y., Suemizu H., Ninomiya S., Drug Metab. Dispos., 43,
309-316 (2015).
45) Hasegawa M., Kawai K., Mitsui T., Taniguchi K., Monnai M., Wakui M., Ito
M., Suematsu M., Peltz G., Nakamura M., Suemizu, H., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 405, 405-410 (2011).
46) Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NCIUB),
Biochem. J., 213 (1983).
47) de Vries J. X., Walter-Sack I., Ittensohn A., Weber E., Empl H., Gresser U.,
Zollner, N., Clin. Investig., 71, 947-952 (1993).
48) Walter-Sack I., de Vries J. X., Ittensohn A., Weber E., Eur. J. Clin. Pharmacol.,39, 577-581 (1990).
49) Uchida S., Shimada K., Misaka S., Imai H., Katoh Y., Inui N., Takeuchi K.,
Ishizaki T., Yamada S., Ohashi K., Namiki N., Watanabe H., Drug Metab.
Pharmacokinet., 25, 605-610 (2010).
5850) Marukawa Y., Oishi N., Mizukoshi E., Tsuji T., Yamashita T., Kaji K.,
Nakamoto Y., Kaneko S., Kanzo, 45, 354-359 (2004).
51) Yamazaki H., Suemizu H., Mitsui M., Shimizu M., Guengerich F. P., Chem. Res.
Toxicol., 29, 1903-1911 (2016).

59