課題番号研究課題名：27指1101：効果的で安全な個別化医療を目指した新規抗HIV薬の薬物動態解析と薬理遺伝学的検討
主任研究者名 ：土屋亮人（国立国際医療研究センター病院 エイズ治療・研究開発センター）
分担研究者名 ：濱田哲暢（国立がん研究センター研究所 臨床薬理研究分野）
増田純一（国立国際医療研究センター病院 薬剤部）
キーワード ：抗 HIV 療法、薬物血中濃度、薬物髄液中濃度、薬物代謝酵素、薬物トランスポータ、薬理遺伝学
研究成果：
1. 研究の内容
本研究は、近年、抗 HIV 療法（ART）で用いられている新規インテグラーゼ阻害剤の血中濃度を測定し、薬物血中濃度とそれに関与する薬物代謝酵素や薬物トランスポータの遺伝子多型との関連性を解析している。また、血漿中および髄液中のインテグラーゼ阻害剤 3 剤の濃度を測定する系を新たに開発した。
2. 研究結果（1）抗 HIV 薬の薬物動態と薬物動態・薬力学関連遺伝子の多型に関する研究
遺伝子解析研究に係る倫理委員会にて「効果的で安全な個別化医療を目指した新規抗 HIV 薬の薬物動態解析と薬理遺伝学的検討（ART PGx）」として承認（承認番号：NCGM-A-000243-00、承認日：平成 27 年 9 月 10 日）。臨床必要上測定したドルテグラビル（DTG）血中濃度を解析したところ、当センターにおける日本人 HIV 患者のトラフ値の平均は 630ng/ml と健康成人の平均 730ng/ml とほぼ同等であった（n=11）。しかしながら、最低値が 26ng/ml、最高値が 1375ng/ml と大きな個人差があった。また、最高血中濃度付近にも個人差が見られ、高値のグループが存在していた。今後、解析予定の SNPs は薬剤血中濃度の高低値に影響を及ぼす可能性のある薬物トランスポータ ABCB1 1236
C>T（rs1128503）、2677 G>T/A（rs2032582）、3435 C>T（rs1045642）、4036 A>G（rs3842）および ABCG2 421 C>A（rs2231142）などである。
（2）抗 HIV 薬の血中および髄液中濃度測定に関する研究
インテグラーゼ阻害剤である DTG、RAL、EVG の血漿中および髄液中濃度の測定系の開発を LC-MS/MSを用いて行った。血漿もしくは髄液 20 µl にアセトニトリルを添加して除蛋白し、内部標準物質（IS）として RAL-d3 を加えた。測定条件は XBridge C18 カラム（50 mm x 2.1 mm i.d., particle size 3.5µm）に 0.1%ギ酸を含むアセトニトリル/水（7:3, v/v）を移動相として流速 0.2 ml/min で 5 分間流した。
マススペクトロメータは陽イオンエレクトロスプレーを用い、検出質量は RAL が m/z 445→361、
DTG が m/z 420→277、EVG が m/z 449→345、
IS が m/z 448→364 とした。測定範囲は血漿が 5–1500 ng/mL、髄液が 1–200 ng/mL、同時および日差再現性は血漿が精度 12.9%以内、正確度 100.0±12.2%以内、髄液が精度 12.3%以内、正確度 100.0±7.9%以内であった。
（3）抗 HIV 薬の薬物動態と有効性および副作用に関する研究
当院において DTG を含む抗 HIV 療法を開始し、DTG 血漿中濃度を測定した日本人 HIV 患者を対象として、薬歴や検査値を電子カルテにより後方視的に調査した。その結果、副作用が出現した症例は必ずしも血中濃度が高値ではなかった。悪心、頭痛、下痢、などが全体の 1 割ほどにみられたが、いずれの症例も G1 程度で数日後には症状の改善がみられた。トラフ値が低値の患者において、消化管機能障害が疑われ、抗 HIV 薬の吸収が低下している可能性が考えられた。経管栄養の調整、NSTの介入により消化管吸収の改善がみられ、DTG の血中濃度の上昇がみられた。抗精神病薬を服用する患者において、ART をプロテアーゼ阻害剤（リトナビル（RTV）ブースト）から DTG へ変更したところ治療継続が困難となった症例を経験した。CYP の影響が少ない DTG へ変更したことで、抗精神病薬の効果が減弱したと考えられた。
3. まとめこれらの結果から、本研究で得られた成果を基に、インテグラーゼ阻害剤血中濃度の個人差の原因として、薬物代謝酵素や薬物トランスポータの遺伝子多型解析を行うことで更なる個人差の要因解析が可能になると期待される。

Study ID: H27-designated 1101
Title: Pharmacogenetic analysis of drug-metabolizing enzymes and drug transporters associated withpharmacokinetics of antiretroviral drugs for personalized medicine
Project Leader: Kiyoto Tsuchiya, AIDS Clinical Center, National Center for Global Health and Medicine
Project Partner: Akinobu Hamada, Department of Clinical Pharmacology, Fundamental Innovative Oncology
Core, National Cancer Center Research Institute
Junichi Masuda, Department of Pharmacy, National Center for Global Health and Medicine
Key Words: antiretroviral therapy; plasma drug concentration; cerebrospinal fluid drug concentration;
drug-metabolizing enzyme; drug transporter; pharmacogenetics; pharmacogenomics
Outcomes:
1. Overall
This study analyzed correlations between drug concentration levels in plasma and genomic polymorphisms
in the drug transporters by measuring plasma concentration of dolutegravir (DTG). Furthermore, our researchgroup newly developed a simultaneous analyzing liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) method for the determination of DTG, raltegravir (RAL) and elvitegravir (EVG) in plasma andcerebrospinal fluid (CSF).
2. Results
1) A study of plasma and CSF concentrations of an antiretroviral drug and genomic polymorphisms ofdrug-metabolizing enzymes and drug transporters
Plasma samples were collected at various times from HIV-1 positive patients who were taking DTG 50mg
once a day, and were used to measure the plasma concentration of DTG by liquid chromatography-massspectrometry (LC-MS). As a result, mean of 24 hours concentrations after taking DTG (C24h) was 630 ng/ml,
and among individuals, the minimum C24h was 26 ng/ml, and the maximum was 1375 ng/ml (n=11). Twooutliner with maximum plasma concentration (Cmax) in patients were observed. We are planning to performthe genotyping of allelic variants of ABCB1 1236 C>T (rs1128503), 2677 G>T/A (rs2032582), 3435 C>T(rs1045642), 4036 A>G (rs3842) and ABCG2 421 C>A (rs2231142).
2) A study of LC-MS/MS assay for the simultaneous analysis of DTG, RAL and EVG in human plasma andCSF
A simple sample treatment procedure and sensitive LC-MS/MS methods were developed for thesimultaneous quantification of HIV-1 integrase inhibitors: DTG, RAL and EVG in human plasma or CSF.
Plasma or CSF samples (20 µL each) using raltegravir-d3 as the internal standard (IS) were deproteinized withacetonitrile. Chromatographic separation was achieved on an XBridge C18 column (50 mm x 2.1 mm i.d.,particle size 3.5 µm) using acetonitrile/water (7:3, v/v) containing 0.1% formic acid as the mobile phase at aflow rate of 0.2 mL/min. The run time was 5 min. The mass spectrometer was operated in positiveelectrospray ionization. The mass transitions were m/z 445→361 for RAL, m/z 420→277 for DTG, m/z 449→345 for EVG, and m/z 448→364 for the IS. The calibration curves for all drugs were linear in the range of 5–1500 ng/mL for plasma and in the range of 1–200 ng/mL for CSF. The intra- and inter-day precision andaccuracy for all drugs in plasma were <12.9% for coefficient of variation (CV) and within 100.0±12.2% foraccuracy. The intra- and inter-day precision and accuracy for all drugs in CSF were <12.3% for CV and within
100.0±7.9% for accuracy.
3) A study of pharmacokinetics of an antiretroviral drug and efficacy and side effects
Nine of 92 HIV-1 patients who were treated with DTG-containing regimens had mild adverse events (nausea,headache, and diarrhea), which were not related to the plasma concentrations of DTG. One HIV-1 patientwith gastrointestinal disturbance who changed tube feeding increased the plasma concentration of DTG. On
the other hand, DTG-containing regimen reduced the efficacy of antipsychotic treatment in HIV-1 patient.
3. In Summary
Our results speculate that genomic polymorphisms of drug transporters is expected to analyze causal factorsthat are responsible for individual differences of integrase inhibitor plasma concentrations.

平成27年度 国際医療研究開発費 27指1101 土屋班 研究報告書

効果的で安全な個別化医療を目指した新規抗HIV薬の薬物動態解析と薬理遺伝学的検討
研究の概要

方法

抗HIV療法で用いられているインテグラーゼ阻害剤の血中濃度を測定し、薬物血中濃度とそれに関与する薬物代謝酵素や薬物トランスポータの遺伝子多型との関連性を解析する。

ドルテグラビル（DTG）血中濃度を測定し、トラフ値の個人差と副作用の出現について解析した。
また、新たに血漿中および髄液中のインテグラーゼ阻害剤3剤（ラルテグラビル（RAL）、エルビテグラビル（EVG）、DTG）の濃度を測定する系を開発した。

ドルテグラビル血中濃度のトラフ値（服薬24時間後）
Pt. No.

トラフ値 (ng/mL) VL (copies/mL) CD4 (cells/μL)

併用薬

1881

ND

449

RPV

2910

ND

617

TDF

326

ND

256

FTC/TDF

434

ND

490

RPV

5809

ND

1103

ABC/3TC

6802

ND

359

ABC/3TC

7105<20111

FTC/TDF

7354<20254

FTC/TDF

8294

28000

63

ABC/3TC

8728

2500

201

FTC/TDF

81375

2200

286

FTC/TDF

Mean±SD630±44

健康成人

730±36結果1
臨床必要上測定したDTG血中濃度を解析したところ、当センターにおける日本人HIV患者のトラフ値の平均は630ng/mlと健康成人の平均730ng/mlとほぼ同等であった（n=11）。しかしながら、最低値が26ng/ml、最高値が1375ng/mlと大きな個人差があった。
また、副作用が出現した症例は必ずしも血中濃度が高値ではなかった。悪心、頭痛、下痢などが全体の1割 ほ どにみら れた が 、いずれ の 症例 も G1程 度で数日後には症状の改善がみられた。

DTGの副作用結果2
RAL、DTG、EVGの血漿中および髄液中濃度の測定系の開発をLC-MS/MSを用いて行った。血漿もしくは髄液20 µlにアセトニトリルを添加して除蛋白し、内部標準物質（IS）としてRAL-d3を加えた。測定条件はXBridge C18カラム（50 mm x 2.1 mm i.d., particle
size 3.5 µm）に0.1%ギ酸を含むアセトニトリル/水（7:3, v/v）を移動相として流速0.2 ml/minで5分間流 し た 。 マス ス ペク トロ メ ー タは 陽 イ オン エレ クトロ
スプレーを用い、検出質量はRALがm/z 445→361、DTGがm/z 420→277、EVGがm/z 449→345、ISがm/z 448→364 と し た 。 測 定 範 囲 は 血 漿 が 5–1500
ng/mL 、 髄 液 が 1–200 ng/mL 、 同 時 お よ び 日 差
再 現 性 は 血 漿 が 精 度 12.9% 以 内 、 正 確 度
100.0±12.2%以内、髄液が精度12.3%以内、正確度100.0±7.9%以内であった。

RAL、DTG、EVGのMRMクロマトグラム

まとめ** P<0.01* P<0.05

本研究で得られた成果を基に、インテグラーゼ阻害剤血中濃度の個人差の原因として 、薬物代謝酵素や薬物トランスポータの遺伝子多型解析を行うことで更なる個人差の要因解析が可能になると期待される。

平成27年度 国際医療研究開発費 27指1101 土屋班 研究報告書（分担 土屋亮人）

抗HIV薬の薬物動態と薬物動態・薬力学関連遺伝子の多型に関する研究
研究の概要

研究方法
ド ル テ グ ラ ビ ル 50mg を 1 日
1 回 服 用 中 の HIV 患 者 の血漿から高速液体クロマトグラフィー質量分析器（LCMS）にてドルテグラビル血中濃度を測定した。

Plasma dolutegravir concentration (ng/ml)

抗HIV薬の血中濃度に関与する薬物代謝酵素および薬 物 ト ラ ン ス ポータ の 患 者
個々の遺伝子多型を解析し、血中濃度との相関を検討する。

ドルテグラビル血中濃度（のべ109検体）
6000
5000
40003000
2000
100000246810121416Time after dose (h)18202224ドルテグラビル血中濃度のトラフ値（服薬24時間後）
Pt. No.

トラフ値 (ng/mL) VL (copies/mL) CD4 (cells/μL)

併用薬

1881

ND

449

RPV

2910

ND

617

TDF

326

ND

256

FTC/TDF

434

ND

490

RPV

5809

ND

1103

ABC/3TC

6802

ND

359

ABC/3TC

7105<20111

FTC/TDF

7354<20254

FTC/TDF

8294

28000

63

ABC/3TC

8728

2500

201

FTC/TDF

81375

2200

286

FTC/TDF

Mean±SD630±44

健康成人

730±36

結果
遺伝子解析研究に係る倫理委員会にて「効果的で安全な個別化医療を目指した新規抗HIV薬の薬物動態解析と薬理遺伝学的検討（ART PGx）」として承認（承認番号：NCGMA-000243-00、承認日：平成27年9月10日）。

臨床必要上測定したドルテグラビル血中濃度を解析した結果、日本人HIV患者（のべ11検体）のト ラ フ 値 の 平 均 は 630ng/mlと健康成人の平均730ng/ml と ほ ぼ 同 等 であった。しかしながら、最低値が26ng/ml、最高値 が 1375ng/ml と 大 き な個人差があった。また、最 高血 中濃度 付近にも個人差が見られ、高値の例が存在していた。

まとめ
今後、薬剤血中濃度の高低値に影響 を及ぼす薬物トランスポータの遺 伝 子 多 型 を 解 析 する予定である。

平成27年度国際医療研究開発費（27 指1101土屋班）研究報告書（分担増田）抗HIV 薬の薬物動態と有効性および副作用に関する研究
研究概要
新規抗HIV 薬の服薬状況、薬物血中濃度、臨床症状、検査値等から薬物動態への影響について確認することを最終目的とし、有効性や副作用などとの関連性を解析する。

日本人HIV患者におけるドルテグラビル血中濃度の検討
当院における日本人HIV患者のDTG血中濃度と文献値を比較した。
当院の日本人HIV患者において、ウイルス量は十分コントロールされていたが、DTGのトラフ値に大きな個人差がみられた。副作用が出現した症例は必ずしも血中濃度が高値ではなかった。
悪心、頭痛、下痢、などが全体の1割ほどにみられたが、いずれの症例もG1程度で数日後には症状の改善がみられた。

黄色点：副作用の見られた症例

抗HIV薬の吸収阻害が疑われウイルス量の低下が遷延した一例
トラフ値でIC90を下回る症例がみられたが、ウイルス量は検出限界未満だった。
トラフ値が低値の患者において、消化管機能障害が疑われ、抗HIV薬の吸収が低下している可能性が考えられた。
経管栄養の調整、NSTの介入により消化管吸収の改善がみられ、DTGの血中濃度の上昇がみられた。

Ritonavir boosted PIからDTG へのキードラッグ変更により抗精神病薬の調整に難渋した症例
ART変更後（FPV/r→DTG）により、不眠・悪夢・食欲低下の訴えが多く認められるようになった。抗精神病薬の調整を行ったが症状の改善に乏しかったため、ARTを戻したところ症状の改善が見られた。CYP阻害作用を有するRTVによりCYPで代謝される抗精神病薬の血中濃度が上昇していたが、CYPの影響が少ないDTGへ変更したことにより、抗精神病薬の効果が減弱し、治療継続が困難となったと考えられた。

まとめ
日本人HIV患者におけるDTGの有効性と忍容性が示唆された。DTGは吸収や代謝において大きく影響を受ける可能性がある。引き続きデータを収集し、どのような因子が抗HIV薬の血中濃度に影響を及ぼすのかについて検討する必要がある。

平成27年度 国際医療研究開発費 27指1101 土屋班（分担研究者 濱田哲暢））研究報告書

HIV薬の血中および髄液中濃度測定に関する研究目的
インテグラーゼ阻害剤は、ウィルス増殖に必要な酵素の働きを阻害する画期的なHIV感染症治療薬であり、ラルテグラビル（RAL）、ドルテグラビル（DTG）及びエルビテグラビル（EVG）が国内にて承認されている。
患者はウィルス増殖抑制のため、有効血中濃度を維持することが必要であり、服薬アドヒアランスが重要である。
また、HIVの髄液中移行は深刻なエイズ脳症を引き起こす可能性があるが、髄液の採取が難しいうえに、髄液中濃度が低いため高感度測定が必要である。
そこで、類似化合物である3剤について同条件で測定可能な系を構築した。

Raltegravir
MW : 444.42

NOH

N
H
OH

O

O

FF

O

N
NH

O

Dolutegravir
MW : 419.38

CH3CH3HOO

Elvitegravir
MW : 447.88 ClF

H
N

CH3H
N

CO2H
F

ヒト髄液中安定性の検討

O

試料処理法
髄液
Sample Plasma 20 μL

Sample Cerebrospinal
flud 60 µL (CSF 20 µL +Acetonitrile 40 µL)

Acetonitrile 400 μL（Internal Standard :RAL-d3 5 ng/mL）

Acetonitrile 60 μL（Internal Standard :RAL-d3 10 ng/mL）i

Mix with a vortex mixer
Centrifuge
10,000×g, 10 min, 4°C

RAL

Mix with a vortex mixer
Centrifuge
5,000×g, 5 min, 4°C

Supernatant 60 μL
Transfer to 96-well collec on plate

Supernatant 80 μL
Transfer to 96-well collec on plate

Water 40 μL

Water 40 μL

Injec on into LC-MS/MS system
1 uL

l 4 °Cまたは-80 °Cで24時間保存した結果、RALは安定であったが、EVG及びDTGは不安定であった。
l 前処理後試料中（アセトニトリルを含む。保存温度：4℃）においては、全ての化合物について安定であった。

Injec on into LC-MS/MS system
2 μL

Accuracy（%）

血漿DTG

EVG

120.0120.0

120.0

100.0

100.0100.080.080.0

RAL 前処理 後試料

60.0

RAL 4℃保存
40.0

RAL -80保存

20.00.0

DTG 前処理後試料

60.0

DTG 4℃保存
40.0

DTG -80保存

20.0024Time（hour）

0.0

Accuracy（%）

ON N

N
H
H3C

NAccuracy（%）

CH3 CH3O

H CH3 OO

H3C80.0
EVG 前処理後試料

60.0

EVG 4℃保存40.0

EVG -80保存

20.0

024Time（hour）

0.0024Time（hour）

Stability for RAL, EVG and DTG (200 ng/mL each) in Cerebrospinal fluid血漿ならびに髄液中の3薬剤分析バリデーション結果と検量線

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：27指1101
研究課題名：効果的で安全な個別化医療を目指した新規抗HIV薬の薬物動態解析と薬理遺伝学的検討
主任研究者名：土屋亮人
論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

タイトル

発表者

学会名

場所

年月

該当なし

学会発表

HIV感染症領域における薬物相互作用

増田純一

日本病院薬剤師会
東北ブロック第5回
学術大会/第70回医 山形
薬品相互作用研究会シンポジウム

薬物間相互作用について

増田純一

第2回抗HIV療法ブ
ラッシュアップセ 大阪ミナー

2015年10月

大木桜子、土屋亮人、林田庸第29回日本エイズ
日本人HIV患者におけるドルテグラビル血中 総、増田純一、
学会学術集会・総 東京
濃度の検討
潟永博之、菊池会
嘉、和泉啓司郎、岡慎一

2015年11月

佐藤麻希、早川Ritonavir-boosted PIからDolutegravirへの第29回日本エイズ
史織、増田純
キードラッグ変更により抗精神病薬の調整に学会学術集会・総 東京一、柳川泰昭、難渋した症例
会
和泉啓司郎

2015年11月

大内麻由、山根
ヒト血漿及び髄液中のラルテグラビル、ドル 尚恵、土屋亮
日本薬学会第136年
テグラビル及びエルビテグラビルのLC-MS/MS 人、潟永博之、横浜会
による同時分析法の開発
岡慎一、濱田哲暢

2016年3月

2015年6月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

注目の新薬トリーメク（ドルテグラビルナト
増田純一、岡慎
リウム・アバカビル硫酸塩・ラミブジン配合
診断と治療
一錠）
特許取得状況について※出願申請中のものは(

発明名称

場所年月日

Vol.104, No.1,2016年1月
115-119)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国