細胞間脂質モデル充填構造の解析および新規経皮薬物送達キャリアの開発

Analysis of Packing Structure of Intercellular Lipid Model and Development of Novel
Transdermal Drug Delivery Carriers

令和 5 年度
論文博士申請者
寺山涼子 (Terayama, Suzuko)本文中の用語は以下のように略記した.

BAA: 4-biphenylacetic acid

CAPB

: cocamidopropyl betaine

CER: ceramide ADS ((2S, 3R)-2-(2-hydroxyhexadecanoyl)-aminooctadecane-1,3-diol)

CHOL: cholesterol

CPP: critical packing parameter

DLGL: sodium dilauramidoglutamide lysine

DLS: dynamic light scattering

DPG: dipropylene glycol

DSC: differential scanning calorimetry

DW: distilled waterEE: encapsulation efficiencyHex: hexagonal structures

LHSB: lauryl hydroxysultaineLM: lipid model

MEL: mannosyl erythritol lipidMTT: 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide

OD: optical density

Ort: orthorhombic structures

PA: palmitic acid

PDI

: polydispersity index

PXRD: powder X-ray diffraction

SAXS: small-angle X-ray scattering

SDS: sodium dodecyl sulfate

SLEC: sodium laureth-6 carboxylate

SLES: sodium laureth sulfate

TDDS: transdermal drug delivery system

TEM: transmission electron microscopy

WAXD : wide angle X-ray diffraction

目次

緒言 ................................................................................................................................ 4
第一章：細胞間脂質モデル (LM) の作製と充填構造の評価 ...................................... 7
第一節 LM の熱特性の評価 ....................................................................................... 10
第二節 LM の充填構造の評価 .................................................................................... 19
第三節 LM の応用 ...................................................................................................... 28
第四節 小括 ................................................................................................................. 35
第二章：新規 TDDS キャリアの開発.......................................................................... 36
第一節 ベシクルの調製と特性評価 ........................................................................... 39
第二節 ベシクル中の CHOL の影響 ......................................................................... 47
第三節 DMC vesicle の有用性評価 ............................................................................. 53
第四節 小括 ................................................................................................................. 65
総括 .............................................................................................................................. 66
実験の部....................................................................................................................... 67
引用文献....................................................................................................................... 76
謝辞 ……………………………………………………………………………………………… 83
論文目録 ………………………………………………………………………………………… 84

緒言
皮膚はその面積が約 1.5～2.0 ㎡に及ぶ人体において最大の臓器である1)2). 皮膚は外部環境から生体を守るために重要な役割を果たしており, ウイルスや化学物質などの外的刺激に対する防御を行う一方で体内からの水分の損失を防ぐなど, 生体の恒常性を維持するためのバリアとして機能している. また皮膚はその表面積の大きさから薬物吸収のために有望な部位である.2) 皮膚を経由する薬物投与は経口投
与や皮下注射に比べ非侵襲的であり, 投与の容易さから患者の受容性が高く, 標的部位への直接アクセスが可能であるなどの利点がある.3)4) しかし薬物が皮膚のバ
リ ア を透 過 する 必 要が あり , これが 経 皮 薬 物 送達 シ ステ ム (Transdermal drugdelivery system : TDDS) の課題となっている.5)
皮膚は表皮, 真皮および皮下組織から成るが, 主にバリア機能を担うのは皮膚の最外層である厚さ 10～20 μm の角層である. 角層ではケラチンタンパク質で満ちた角層細胞の間を細胞間脂質が埋めている, いわゆるレンガ・モルタル構造をとっている （Fig. 1）.6)7) 細胞間脂質はセラミド, コレステロール, 遊離脂肪酸, コレステ
ロールエステル, スクワレン, トリグリセリドなどから構成され, これらの脂質の層が皮膚バリアの本体だと考えられている. また細胞間脂質は親水部と疎水部を周期的に繰り返すラメラ構造を形成しており, さらにラメラ構造と直行する充填構造
は格子間距離の異なる 3 種の構造を形成するとされている. そしてこの充填構造が物質の透過あるいは肌のバリア機能に重要な役割を果たす.2)8)9)10)
また, 薬物が表皮を透過する際の主なルートとしては角層を通る経角層経路と毛4

包や汗腺, 皮脂腺などを通る経付属器官経路に区別できる (Fig. 1). しかし付属器官は皮膚上で占める面積が小さいため, 経角層経路が主な吸収経路だとされている.
経角層経路はさらに角層細胞を通る経細胞経路および細胞間脂質部分を通る細胞間経路に細分化され, このうち細胞間経路が現在多くの薬物の透過経路だと考えられている.2)

角層細胞

細胞間脂質
経付属器官経路

経角層経路

角層

薬物

顆粒層

毛

汗腺

表皮
有棘層
基底層

↓真皮、

経細胞経路

細胞間経路

皮下組織

Fig. 1 皮膚の構造と薬物の経皮吸収経路.

皮膚からの薬物吸収を促進するためには細胞間脂質を含む角層のバリア機能を克服する必要がある. そのために電気や熱, 超音波などの外的エネルギーや角層に微小孔を形成するマイクロニードルを利用する物理的経皮吸収促進手法 3)5)や, あ
るいは各種の浸透促進剤を用いる化学的経皮吸収促進手法 2)11)12)が開発されてきた.
浸透促進剤としては Azone やテルペン, 脂肪酸, 脂肪酸エステル, 界面活性剤が知られており, 多くは細胞間脂質に作用し脂質の流出や流動化を引き起こすことでバリアを克服している.11)12) また構造中に薬物を内包することができるリポソームや
5

ニオソームなどのベシクル, ミセル, デンドリマーなどが TDDS における有効なナノキャリアとして研究が進められている.4)13) 一方でこれら経皮吸収促進手法が損傷した皮膚に対して病変の悪化をもたらすことがないように手法自体の刺激性, 毒性, 安全性を検討することが重要である.
以上のことから本研究では経皮吸収型製剤の最適設計のために細胞間脂質の構
造解析および TDDS キャリアの開発の二面から研究を進めた.
第一章では, 細胞間脂質を模したモデルを作製した. 物性評価を通じて脂質組成
比と脂質充填構造との関係を明らかにすることを試み, さらにモデルの応用法を検討した.
第二章では, 安全な TDDS キャリアの開発を目的としてベシクルを作製し, 物性評価と有用性の検討を行った.

6

第一章：細胞間脂質モデル (LM) の作製と充填構造の評価
細胞間脂質の主成分はコレステロール, 遊離脂肪酸およびセラミドでありこれらの成分が周期的な層状構造を持つラメラ構造を形成している. ラメラ構造は長周期と短周期の 2 種類をとり, また横方向の配列では, 広角 X 線回折 (WAXD) により
格子間距離の異なる Orthorhombic 構造 (Ort) や Hexagonal 構造 (Hex) , Liquid 相な
どの充填構造が観測されている (Fig. 2).9)10)14) これまでの研究でヒトの皮膚の Ortを形成する脂質の含有量が経皮水分蒸散量と相関すること15)や, アトピーや魚鱗癬
の患者の角層では健常な角層に比べて Hex の増加が見られていること16)17)など, 肌のバリア機能と Hex/Ort 構造比に関係があることが示唆されている.

(A)

水

長周期ラメラ構造

短周期ラメラ構造(B)
0.41 nm0.41 nm0.37 nm0.46 nm0.46 nm0.41 nm

Orthorhombic

Hexagonal

構造 (Ort)

構造 (Hex)

Liquid 相Fig. 2 細胞間脂質がとる (A) ラメラ構造 (B) 炭化水素鎖の充填構造 の模式図.

7これらの充填構造の形成やバリア機能に対して細胞間脂質の組成が果たす役割について, これまでヒト, ブタおよびマウスの皮膚あるいはそれらから単離した細胞間脂質を用いて多くの研究がなされており, セラミド 14)18), 遊離脂肪酸 7)14), コレ
ステロール19)20)などの成分脂質の影響が示唆されてきたが全容はまだ解明されていない. これは皮膚が多種の成分を含んでおり，その解析が困難であることがひとつの理由である. また 2009 年より EU では化粧品の原料における動物実験が禁止されるなど, 動物皮膚に代わる代替法が求められている.21)
これらの解析の難しさや供給面での問題を解決するために細胞間脂質を構成す
る代表的な脂質のみで角層細胞間脂質モデル (LM) が作成され, 充填構造や熱特性などが研究されてきた.22)23) LM はまた, 浸透促進剤や界面活性剤などの添加剤による細胞間脂質への影響について知見を深めるのにも使われている.24)25) 特に界面活性剤による皮膚からの脂質の溶出は角層の状態を変化させ皮膚へのダメージに繋がる26)27)ため, 界面活性剤と細胞間脂質との相互作用を調べることには大きな意
味がある. しかし界面活性剤による脂質溶出が細胞間脂質の充填構造に与える影響については十分に知られていない.
LM の多くはコレステロール, 遊離脂肪酸およびセラミドで作られるが, 成分脂質の種類や組成比によってその物性は異なる. 特にセラミドはその構成要素である
スフィンゴイド塩基と脂肪酸の組み合わせによって複数のサブクラスに分かれて
おり28)29)各種のセラミドを用いて LM が調製されてきた. これまでの研究ではセラ
ミド AP (N-(α-hydroxyoctadecanoyl)-phytosphingosine) を用いた LM で調製時の温度8や水和条件が脂質膜の構造に影響を与えること 30 ) やセラミド NP (N-lignoceroylphytosphingosine) を用いた LM で脂質組成比によって脂質同士の相互作用が変化す
ること31)などが報告されている. また複数成分からなる細胞間脂質の特性を LM で再現するにあたって, ラメラ構造や熱挙動, Hex/Ort 比の観点からヒトの角層と近し
い LM が開発されてきた.22)32) 本研究ではセラミド ADS を用いたヒト角層と近しい
Hex/Ort 比を取る LM32)を採用した. このモデルにおいて調製時の温度や水和条件がラメラ構造に影響すること33)や, セラミド組成比増加時の小角 X 線散乱 (SAXS) お
よび WAXD での相挙動観察34)が報告されているものの, コレステロールや遊離脂肪酸の減少が充填構造に及ぼす影響は明らかでなかった. またコレステロールの増加が LM のラメラ構造の形成および Ort の形成を促進することが報告されているが,コレステロールの影響を定量的に調べた研究は多くない.35)
したがって本章では, まず LM 中の脂質組成比が LM の充填構造に及ぼす影響を検討し, 特にコレステロールの減少を定量的に評価した. 次に LM の応用方法の検討として各種の界面活性剤による脂質溶出が充填構造に及ぼす影響について調べた.

9

第一節 LM の熱特性の評価
Fig. 3 に示したコレステロール (CHOL), パルミチン酸 (PA) およびセラミド
ADS (CER) の各脂質を用いて, ヒト角層と近しい Hex/Ort 比を取ることが知られている CHOL/PA/CER=13.9/59.6/26.5 (mol %) の比率の LM を作製し, 基準のモデ
ル (LMSTD) とした. LMSTD から CHOL, PA あるいは CER の配合割合を変化させた
脂質減少モデルを作製し, それぞれ LMCHOL-1-4, LMPA-1-4 および LMCER-1-4 とした. それぞれの脂質の組成比を Table 1 に示す.

(B)

(A)

(C)

Fig. 3 (A) CHOL, (B) PA, (C) CER の構造.

10

Table 1 LM の脂質組成比.

Lipid component (mol%)
CHOL

PA

CER

LMSTD

13.9

59.6

26.5

LMCHOL-1

12.2

60.8

27.0

LMCHOL-2

10.4

62.0

27.6

LMCHOL-3

7.5

64.0

28.5

LMCHOL-4

5.5

65.4

29.1

LMPA-1

14.9

56.7

28.4

LMPA-2

16.3

52.7

31.0

LMPA-3

17.3

49.8

32.9

LMPA-4

18.2

47.1

34.7

LMCER-1

14.4

61.8

23.8

LMCER-2

14.9

63.7

21.4

LMCER-3

15.7

67.3

16.9

LMCER-4

17.1

73.1

9.8

11

まず LM の熱特性を分析するため示差走査熱量測定 (DSC) を行った. 各種 LM,
各脂質単独あるいは脂質混合物の DSC の結果を Fig. 4 に示す.

(B)

(A)

LMSTD
Tｍ

T2

T3

CHOL

T4

LMCHOL-1

PA

LMCHOL-2
LMCHOL-3
LMCHOL-4

LMPA-1

CER

T3

LMPA-2

CER+CHOL

LMPA-3
LMPA-4
CER+PA
LMCER-1

T3

LMCER-2
CHOL+PA

LMCER-3
LMCER-4

Fig. 4 LM, 各脂質単独あるいは脂質混合物の DSC 結果.
(A) LMSTD, LMCHOL, LMPA および LMCER の吸熱挙動. (B) 脂質あるいは脂質混合物の吸熱挙動.

12

DSC の結果, LMSTD は 59.0℃ (Tｍ), 68.5℃ (T2), 83.5℃ (T3) に 3 つの吸熱ピークを示した. CHOL が減少すると 89℃付近に新たな吸熱ピークが生じた (T4). また PAが減少すると LMPA の T3 ピークは高温側に遷移した. 一方で CER の減少により T3のピーク強度は弱まり, LMCER-4 では消滅した. それぞれの吸熱ピークの結果をTable 2 にまとめた.

Table 2 LM の吸熱ピーク.

~55℃

55-62℃

62-75℃

75-89℃

89-95℃

95℃～

T1 (℃)Tm (℃)T2 (℃)

T3 (℃)

T4 (℃)

T5 (℃)

LMSTD

59.0

68.5

83.5

LMCHOL-1

60.3

70.0

84.6

LMCHOL-2

59.1

68.3

84.4

89.2

LMCHOL-3

59.2

68.9

84.1

89.4

LMCHOL-4

59.8

71.4

83.7

89.8

LMPA-1

59.1

68.4

84.2

LMPA-2

58.9

67.8

85.3

LMPA-3

59.0

69.3

87.1

LMPA-4

58.8

68.5

86.9

LMCER-1

59.2

67.9

79.5

LMCER-2

59.2

67.1

78.9

LMCER-3

59.2

66.1

76.8

LMCER-4

59.1

64.5

CHOL

46.2

PA

63.6

CER
CER+CHOL

97.0, 103.3, 114.3
52.6

73.8

CER+PA

60.9

CHOL+PA

61.3

70.8, 74.8

13

115.4
83.5

91.1

メインピークである Tm は 3 つの脂質成分が作る結晶構造由来のピークと考えられている.22) 結晶構造を形成するのには PA が必要であるが,14) 本研究で PA が減少
すると Tm のピークが減少したことからも妥当だと考えられる. また, 脂質単独あるいは脂質混合物の吸熱ピーク (Fig. 4B) は, 脂質混合物が成分脂質である CHOL,
PA, CER とは異なる吸熱ピークを持つ共融混合物を形成していることを示している.
これらの吸熱ピークをもとに考えると, CHOL の減少により生じた 89℃付近のピー
ク (T4) は CER ＋ PA の 共 融 混 合 物 由 来 の ピ ー ク と 推 測 で き る . ま た T2 は
CER+CHOL もしくは CER＋PA の共融混合物, あるいは PA 単独の構造由来のピー
クである. CHOL が減少すれば CER＋PA の共融混合物が支配的になるため, T2 の相
転移温度が高温側に移動したと推測される. また, PA が減少すれば CER+PA が減少する一方で CER+CHOL の割合が増え, CER が減少すれば CER+CHOL および
CER+PA の共融混合物のピークが小さくなると考えられるため, PA の減少により高温側に遷移し CER の減少と共に弱まる 84℃付近のピーク (T３) は CER＋PA の共融混合物由来のピークと推測できる. 本研究では温度変化時の SAXS ピークを測定していないためラメラ構造の変化を断定することはできないが, T2 は長周期ラメラ,
T3 は短周期ラメラの変化に関連している可能性があり, T4 はまた別の周期性を持つ
ラメラ構造由来のピークである可能性がある.36)

14

T2 から T4 の吸熱ピークをもたらす LM 中の構造についてさらに詳しく調べるた
め, LMSTD, LMCHOL-4, LMPA-4, LMCER-4 の各サンプルを 25-120℃まで加熱しながら連続的にラマンスペクトル測定を行った. LMSTD の各温度でのラマンスペクトルを Fig.
5 に示す.

1062

1097

1128

2847

2881

25℃

25℃

30℃

30℃

40℃

40℃

50℃

50℃

60℃

60℃

……

……

120℃

120℃

Fig. 5 LMSTD の 25℃から 120℃におけるラマンスペクトルと特徴的ピーク.

LM は 1062, 1097, 1128, 2847, 2881 cm-1 に特徴的なピークを示した. これらのピークは炭化水素鎖の C-C 骨格振動に関連しており, 1062 および 1128 cm-1 のピーク
はトランス構造に, 1097 cm-1 のピークはゴーシュ構造に対応している.37)

15

ここで, LM のトランス-ゴーシュ構造の比率を計算するため

I1097/(1062+1128) =I1097

I1062 + I1128の値を導入した. I1062, I1097 および I1128 は 1062, 1097 および 1128 cm-1 付近で測定されたラマンピーク強度である. I1097/(1062+1128)値が高いほど構造中でゴーシュ構造が支配的な傾向を示し, 炭化水素鎖が無秩序な状態である傾向を示す.38)39)40)
また 2847 cm-1 のピークは CH2 対称伸縮振動, 2881 cm-1 のピークは CH2 非対称伸縮振動にそれぞれ由来し, その強度比は脂質鎖のコンフォメーション状態を表す指標となる. 本研究では

I2881/2847 =

I2881
I2847

の値を導入した. I2847 および I2881 は, 2847 および 2881 cm-1 付近で測定されたラマ
ンピーク強度である. I2881/2847 値が減少するほど充填構造の秩序が乱れている状態を表している.37)38)39)41) LMSTD, LMCHOL-4, LMPA-4, LMCER-4 それぞれの I1097/(1062+1128)値および I2881/2847 値の温度による推移をグラフ化し, DSC の結果と比較した (Fig. 6).

16

(A)

(B)

I2881/2847

I2881/2847

I1097/(1062＋1128)

I1097/(1062＋1128)

(C)

(D)

I2881/2847

I2881/2847

I1097/(1062＋1128)

I1097/(1062＋1128)

Fig. 6 (A) LMSTD, (B) LMCHOL-4, (C) LMPA-4, (D) LMCER-4 を 25-120℃まで加熱したときのI1097/(1062+1128)および I2881/2847 の推移 (上段) と DSC による吸熱ピーク (下段) との比較. 色のついた背景部分は T2-T4 の吸熱ピークの温度範囲.

17一定温度まで加熱すると LMSTD では 70-90℃，LMCHOL-4 では 60-95℃，LMPA-4 では 60-100℃，LMCER-4 では 60-70℃に I1097/(1062+1128)が大きく増加し, I2881/2847 が大きく減少する傾向があった. すなわちこの温度範囲で充填構造の乱れが生じたことがわ
かる. そしてこの充填構造の乱れを生じた温度範囲は DSC の結果の T2-T4 までの相転移温度と一致した. 一方で, DSC の結果においてすべての LM は約 59℃に吸熱ピーク (Tｍ) を示すが, そのときの I1097/(1062+1128)および I2881/2847 に変化はなかった. 以
上のことから, T2-T4 の吸熱ピークは炭化水素鎖の無秩序化および充填構造の乱れに対応していることが示唆された.
また, LMCER-4 では結晶構造が完全に融解し液晶状態になるまでの温度が LMSTDと比較して顕著に低下する一方で, LMCHOL-4 および LMPA-4 では相転移終了時の温度の低下は見られなかった. このことから細胞間脂質が複数の脂質を含み共融混合物からなるドメインを複数持っていることが, 温度に対する肌の安定性に寄与しているのではないかと推察される.

18

第二節 LM の充填構造の評価
次に LM の充填構造を詳しく調べるため, 粉末 X 線回折 (PXRD) 測定を行った.
Fig. 7 に LMSTD の PXRD プロファイルを示す.

2.41
LMSTD

2.67

LMCHOL-1
LMCHOL-2
LMCHOL-3
LMCHOL-4
LMPA-1
LMPA-2
LMPA-3
LMPA-4

LMCER-1
LMCER-2
LMCER-3
LMCER-4

Fig. 7 LMSTD, LMCHOL, LMPA および LMCER の PXRD プロファイル.

S=2.41 nm-1 および S=2.67 nm-1 の二つのピークはそれぞれ炭化水素鎖充填構造における 0.41 nm および 0.37 nm の格子間距離に対応するピークであり, Hex およびOrt の存在を示している. 一方で Liquid 相では S=2.17 nm-1 (格子間距離 0.46 nm) 付
近にブロードなピークが得られる.14） Watanabe らはピーク面積から, LM 中の Ort に対する Hex の比率である RHex/Ort 値を次のように定義した.32)

19

RHex/Ort=(S2.41–2×S2.67) / 3
S2.67

S2.41 および S2.67 はそれぞれ S=2.41 nm-1 および S=2.67 nm-1 の回折ピークの積分強度である. 分母は Ort に由来する見かけの面積, 分子は Hex に由来する見かけの面積を示す. 2×S2.67 は S=2.67 nm-1 の回折ピークの面積における Ort の見かけの面積を意味する. S2.41 には Ort および Hex 両方に由来するピークが含まれるため, Watanabe
らは S2.41 から 2×S2.67 を引いている. RHex/Ort の値が大きいほど, LM 中の Hex の割合が大きいことを示している.
脂質組成比が充填構造に及ぼす影響について調べるため, LMSTD および脂質減少モデルの PXRD 測定を行い, LM 中の各脂質の組成比と RHex/Ort との相関性をプロットした (Fig. 8). その結果, CHOL 組成比の増加に伴い LM の Hex 構造比は減少し,そこには高い逆相関関係があることがわかった. 一方, PA は Hex 構造比には寄与しないものと考えられ, CER 組成比と Hex 構造比との間には緩やかな相関性があった.

20

(A)

(B)

(C)

Fig. 8 LM 中の (A) CHOL, (B) PA および (C) CER の組成比と RHex/Ort の相関.

21

そこで CHOL に着目し, LMSTD および CHOL 減少モデルの SAXS 測定を行った.
結果を Fig. 9 に示す.

0.221

A
LMCHOL-4
0.223
A
B

LMSTD

Fig. 9 LMSTD および LMCHOL-4 の SAXS プロファイル.
A のピークは結晶性 PA 由来, B のピークは結晶性 CHOL 由来のピーク.

LMSTD では S=0.223 nm-1, LMCHOL-4 では S=0.221 nm-1 付近の散乱ピークが観察されており, これはそれぞれ 4.48 nm および 4.53 nm のラメラ周期の形成を示している. さらに LMCHOL-4 の 4.53 nm のピークは LMSTD に比べ増大しており，CHOL 量が減少することでラメラ構造に変化があることがわかった. CHOL が豊富な状態では CHOL 周辺の炭化水素鎖に変化が起きて短いラメラ周期をとるものと考えられる. また S=0.239 nm-1 (ラメラ周期 4.18 nm) のショルダーピークは Ort と Hex とは異なる充填構造を持つ相だと考えられている.36)

22

さらに各脂質減少モデルにおける CHOL, PA および CER の組成比と I1097/(1062+1128)
および I2881/2847 の値との相関をプロットした (Fig. 10).

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(F)

Fig. 10 CHOL 組成比と (A) I1097/(1062+1128), (B) I2881/2847 との相関. PA 組成比と(C) I1097/(1062+1128), (D)I2881/2847 との相関, CER 組成比と (E) I1097/(1062+1128), (F) I2881/2847 との相関.

23

CHOL が減少すると I1097/(1062+1128)値は増加傾向にあった. すなわちゴーシュ構造
比が増加し脂質構造の充填の秩序が乱れる傾向にあった. また PA および CER が減
少すると充填の秩序が強くなった. CHOL および CER 脂質量と I2881/2847 値の相関性は低く, CH2 伸縮振動には CHOL および CER 量は大きな影響を与えないと考えられるが, PA が減少すると I2881/2847 の値も減少傾向にあり, 横方向の秩序は乱れる傾向にあった.

コレステロールはリン脂質が作るゲル相の秩序を乱し液晶相を秩序化する二面的な作用が知られている.42)43)44) またリン脂質を主成分とする生体膜にコレステロールを添加すると, コレステロールの硬いステロール骨格がリン脂質の脂肪酸鎖の間に挿入されることで膜透過性や流動性が低下することが知られているが, 液晶状態をとるホスファチジルコリンとゲル相をとるジパルミトイルホスファチジルコ
リンにそれぞれコレステロールを加えると膜透過性に異なる影響を与えた.45) 一方
で Ohki はセラミドにホスホコリンがエステル結合した構造をとるスフィンゴミエ
リンとコレステロールが相互作用し, コレステロールの減少で膜流動性が向上する
ことを確かめた.46) さらに, 本研究や超長鎖セラミドを用いた研究 35)においてセラ
ミドとパルミチン酸は結晶相を作るが, コレステロールが増加することによって流動化ではなく秩序化が促進された. これらのことからコレステロールの流動化・秩序化の作用は混合する脂質によって異なり, 脂質の親水基の構造や炭化水素鎖の飽和度などが影響を与える可能性が考えられる. 本研究においては, CER および PA と共に作られる LM 中で CHOL は秩序化に寄与していると考えられた.

24

また Tamai らは，飽和ジアシルホスファチジルコリン (CnPC，n=14-18) が作るリ
ン脂質二分子膜構造にコレステロールが与える影響を検討した. n≤ 17 の場合二分子膜の疎水鎖領域の厚さのほうがコレステロール分子の疎水部分よりも短くなり, コ
レステロール周辺の炭化水素鎖は疎水性不一致を最小限にするため伸びきった状態を取る. 一方, C18PC の場合, 二分子膜の疎水鎖領域の厚さの方がコレステロール
分子の疎水部分よりも長いため, コレステロールが膜中に取り込まれると二分子膜の中央部分に空隙が生じリン脂質の炭化水素鎖の末端部分が折れ曲がった構造をとるとしている.47)48)
本研究で用いた CER は C18/C16, また PA は C16 である. 以上のことから, LM 中の
CHOL 量の違いにより LM は Fig. 11 に示すモデルのような構造を取ると推定した.

25

CHOL

PA

CHOL rich model

CER

CHOL poor model

4.53nm

4.48nm

Low fluidity

High fluidity

0.41 nm0.41 nm0.37 nm0.41 nm

Orthorhombic 構造

Hexagonal 構造

Fig. 11 CHOL 減少時の LM の充填構造模式図.

CHOL 量と RHex/Ort は高い逆相関の関係にあったことから, LM 中の脂質が不足したとき以下のような構造変化が起きていると考えられる. CHOL が減少すると CERと PA の共融混合物に由来する構造が生じる. この構造ではゴーシュ構造が増加しており LM の充填の秩序は小さくなっている. このとき LM は Hex を取る傾向が強
いため，流動性は増加している. 一方で LM 中の CER が減少すると相対的に CHOLの比率が大きくなることから, CHOL が脂肪酸鎖と秩序的な構造を作りゴーシュ構
造比は減少する. 同様に PA が減少するとゴーシュ構造比は減少する. PA の減少に従って I2881/2847 の値も減少傾向にあったため, 横方向の秩序は乱れる傾向にあるこ

26

とがわかった. ただし PA 量と RHex/Ort との間には相関性はなく (Fig. 8), また LMPA4 の PXRD の結果では格子間距離 0.46 nm を示す S＝2.17 nm-1 付近のブロードなピークが確認された (Fig. 7). これらのことから, PA が減少した時には Hex ではなく
Liquid 相が生じやすい傾向にあると考えられる.

27

第三節 LM の応用
LM はまた, 動物やヒト皮膚を用いた実験の代替法としての応用が考えられる.
よって本研究で作製した LM の性質が皮膚の代替として適切か検討するため, LMとヒト三次元培養表皮モデル (表皮モデル) を比較した. 表皮モデルは正常なヒト
表皮と近似の構造を持ち, 角層, 顆粒層, 有棘層, 基底層を形成している.
本研究の脂質モデルは 96 ウェルプレート上に薄膜状で作製したため界面活性剤
溶液を滴下して溶出した脂質を得ることができた. まず LMSTD および表皮モデルに5 種類の界面活性剤および蒸留水 (DW) を滴下し, 30 分後に上清に溶出した脂質をHPLC によって定量した. 界面活性剤は一般的に洗浄剤として用いられるもののう
ちアニオン性界面活性剤として SDS, SLES, SLEC を, 両性界面活性剤として CAPB
および LHSB を選択した. 結果を Fig. 12 に示す.

28

(A)

LMSTD

(C)

(B)

表皮モデル

(D)
LMSTD

表皮モデル

Fig. 12 界面活性剤添加 30 分後の (A) LMSTD から溶出した PA 量, (B) 表皮モデルから溶出した
PA 量, (C) LMSTD から溶出した CHOL 量, (D) 表皮モデルから溶出した CHOL 量. (Data areexpressed as the mean ± SD, n=4)29

LMSTD および表皮モデルから溶出した CER は検出限界以下であった．
また PA の溶出量はLMSTD：LHSB>SDS>CAPB>SLES>SLEC>DW
表皮モデル：CAPB>LHSB>SDS>SLES>SLEC>DW

CHOL の溶出量はLMSTD：LHSB>CAPB>SLES>SLEC>SDS>DW
表皮モデル：LHSB>CAPB>SDS>SLES>SLEC>DWとなった. CHOL および PA において界面活性剤の種類ごとの溶出傾向が LMSTDと表皮モデルで類似した結果となったことから, LMSTD は角層からの脂質溶出評価
系に応用が期待できると考えられる.

30

さらに, LMSTD に界面活性剤を添加して 10-120 分静置したのちに上清中の脂質溶出量を定量した. そしてモデル中に含まれる脂質量と流失した脂質量の比をとり脂質流失率を算出したところ, 界面活性剤の添加により LM から各脂質が時間依存的に溶出することが示された (Fig. 13).

(A)

(B)

(C)

Fig. 13 LMSTD に界面活性剤を添加したときの(A) CHOL, (B) PA および (C) CER の溶出率.
(Data are expressed as the mean ± SD, n=4)31

脂質ごとで比較すると, すべての活性剤が PA をもっとも溶出させた一方, CER の溶出率は低いという結果になった. また界面活性剤ごとに比較すると, PA, CHOL お
よび CER のすべての脂質について脂質溶出率は LHSB で最も高く, SLEC で最も低い傾向があった. 一般的にアニオン性界面活性剤は刺激性が高いとされるが, 本研
究では SDS および SLES に比べて SLEC は脂質溶出率が低かった. Endo らは SLECが SDS および SLES に比べて角層への吸着量が少ないことを報告しており,49) これは SDS や SLES のスルホ基が持つ高い電子求引性の影響が考えられる. これが脂質の溶出にも関係している可能性がある.

32

次に PXRD を用いて LMSTD の構造変化を評価した. 界面活性剤滴下後の LMSTD
では時間依存的に RHex/Ort が増加していた. 30 分後, 60 分後, 120 分後の脂質溶出率とRHex/Ort をプロットしたところ, PA および CHOL の溶出率と RHex/Ort の間には相関性がみられた (Fig. 14).

(A)

(B)

(C)

Fig. 14 LMSTD からの(A) CHOL, (B) PA および (C) CER の溶出率と RHex/Ort の相関.

33

本研究では界面活性剤の作用により CHOL が流出するとその量に応じて LＭ中のHex が増加することが観察された. これは Fig. 11 に示したように CHOL の減少に
より LM の構造が Hex に傾くためと考えられる. さらに CHOL の流出率と RHex/Ort
値の間には高い相関性が見られた. また本実験では PA の溶出率と RHex/Ort 値の間にも相関性が見られたが, RHex/Ort 値と PA 組成比の間には相関性がなかったため (Fig.
8B), PA だけが溶出するとき溶出率と Hex 構造比に相関は起こらないと考えられる.
一方で PA と CHOL の溶出の傾向は非常に似通っている (Fig. 12) ため, 界面活性剤を添加することで PA と CHOL の両方が同様に溶出する. すると CHOL の溶出による Hex の増加が起き, その結果見かけ上 PA の溶出率と Hex 構造比に相関性があるように見えるのだと考えられる. また CER は溶出量が少ないため構造変化に及ぼす影響が小さいと推測される.
以上のことから界面活性剤を添加した LＭの RHex/Ort 値を測定することで界面活性剤の脂質溶出能を推定することができると考えられる. 界面活性剤は細胞間脂質を溶出させ角層の保水能力を奪うなど皮膚へのダメージを与えることが知られている 26)27)が, 当 LM を用いて脂質溶出による皮膚へのダメージが簡易的に測定できると期待される.

34

第四節 小括CHOL/PA/CER からなる LM において CHOL 量と RHex/Ort 値が高い逆相関の関係を持つことを定量的に確かめた. CHOL は生体膜と同様に LM 中でも流動性に重要な役割を果たしていることが明らかとなった. これらの発見は皮膚のバリア機能におけるコレステロールの重要性に新たな知見を与えるものである. 近年では損傷した
皮膚バリアの修復のためセラミドや角層脂質を含むリポソームの開発が検討されている50)51)52)が, 今後は損傷皮膚へのコレステロールの補充などのアプローチも期待される.
また作製した LMSTD は界面活性剤に対して表皮モデルと類似の脂質溶出傾向を示した. 一般的に両性界面活性剤は皮膚への刺激が小さいとされている53)54)が, 本
実験では CAPB および LHSB は SDS 以上に CHOL や PA を流出させることが示された. また LMSTD からの CHOL および PA の溶出率と RHex/Ort 値の間には相関性があった. すなわち RHex/Ort 値を測定することで各種の界面活性剤による脂質溶出が評価できる. さらに, RHex/Ort 値の測定は, 皮膚へのダメージを評価する簡易的手法であると考えられる. 以上のことから本研究によって開発された脂質溶出能の評価は invivo での皮膚刺激試験に代わる代替手段として有用であり, 皮膚ダメージに繋がる
脂質溶出を簡便かつ短時間で測定できる手段は皮膚疾患の研究やスキンケア製品の開発などに応用が期待できる.

35

第二章：新規 TDDS キャリアの開発
角層の細胞間脂質は体外への水分の損失を抑制して乾燥を防ぎ, また外部環境からの物質の侵入を抑制するなどの皮膚バリア機能に重要な役割を担っている一方で, そのバリア機能の高さから薬物や有効成分の透過を困難にしている.5) そのた
めバリア機能を克服し皮膚浸透性を向上させることを目的として薬物の細胞間脂質経路の通過を促進する技術が数多く研究されており, そのひとつがベシクル製剤
である.3)12) ベシクルとは両親媒性物質が形成する二分子膜小胞体であり内部の液相に水溶性物質を, さらに二分子膜内部に疎水性物質を保持できることから薬物のキャリアとして用いられる.55)56) リン脂質から形成されるベシクルはリポソーム,57)
ノニオン界面活性剤により形成されるベシクルはニオソーム 58)と呼ばれており, 医薬品・香粧品・食品・化成品などの幅広い分野で応用されている.4)13)59)
さらに近年では, 薬物送達の効率を高めるためにトランスファーソーム, エトソ
ームそしてトランスエトソームなどの超変形ベシクルが経皮における薬物送達キャリアとして研究されている.60)61) これらの超変形ベシクルは膜を形成するリン脂質と, 膜の柔軟性を向上させるエッジアクティベイター, 及びエタノールなどで構成されている.61)62) 弾性のある二重膜を持つこれらのベシクルはリポソームよりも高度に変形可能であり, 自身の直径よりもはるかに小さな細胞間脂質経路を通って薬物の透過性を向上させることができる. 63)64)65)66) しかし, エッジアクティベイタ
ーとして用いられる界面活性剤は高濃度では毒性を示し, またエタノールは皮膚毒
性や刺激性をもたらす可能性がある.62)67) そのため特にアトピー性皮膚炎患者など

36

の皮膚疾患を抱えた患者への薬物送達キャリアの設計を行う際には, 薬物送達能力とともにナノキャリアそれ自体の毒性や安全性を検討することが重要である.67)68)
以上のことから本研究では安全性の高いキャリアとしての新規ベシクル開発を行うにあたって, 細胞間脂質成分あるいは保湿剤として用いられる生体適合性の高い原料を用いた.
ベシクル形成のための両親媒性物質としてまずジラウロイルグルタミン酸リシ
ン Na (DLGL) を選択した. DLGL とは 2 つのラウロイルグルタミン酸 Na を塩基性
アミノ酸リシンで連結させジェミニ型にしたアニオン性両親媒性化合物である(Fig. 15A). DLGL は生分解性や生体適合性にすぐれ, 保湿効果や有効成分の皮膚浸透促進効果があることから化粧品に広く使用されている.69)70)71) DLGL は単独では安定なベシクル形成が困難であるが, Fujii らはクエン酸存在下でコアセルベーション法によって DLGL ベシクルを作製することに成功し, またコレステロールがベシクルの安定性を高めることを明らかにした.72) しかしこのベシクルの肌バリア機能への影響は深く検討されていない. またこのベシクルの製法には細かい pH 調整が必要であり, 調製されたベシクルは低温での安定性が低いという課題点があった.
そこで本研究では, マンノシルエリスリトールリピッド (MEL) を用いて簡易にベシクルを作製し, 安定性を向上させることを試みた.
MEL とは Pseudozyma 属酵母が生産するノニオン性界面活性剤に分類されるバイオサーファクタントであり, マンノースの 4 位および 6 位のアセチル基の位置と数により MEL-A, B, C, D に分類される.73)74)75) MEL は皮膚バリア機能の向上,76) 抗37

菌,77) 親水性化合物の皮膚透過性向上78)などの効果を持つ高機能な両親媒性物質であり, 遺伝子導入キャリアとしても研究が進んでいる.79) 本研究では C6 がアセチル化された MEL-B を用いた (Fig. 15B). MEL-B は水と混合すると直径 10～20 μm の巨大リポソーム (ラメラ相, Lα 相) を形成する80)が, 水への溶解性が低いため水系
処方に配合すると沈殿や凝集が生じ, 調製方法には工夫が必要であった.
本研究では DLGL と CHOL が形成するベシクルに新たに MEL-B を組み合わせ安
定なベシクルを作製し,その皮膚透過性を評価することで, TDDS キャリアとしての有用性を検討した. さらに, 化学的にダメージを与えた表皮モデルへこのベシクルを適用し, ベシクルが皮膚バリアに与える回復効果を検証した.

(A)

(B)

Fig. 15 (A) DLGL および (B) MEL-B の構造.

38

第一節 ベシクルの調製と特性評価
まず DLGL，CHOL および MEL-B の三成分が作る会合体の安定性を検討した.
DLGL, MEL-B および CHOL の合計濃度を 2wt%に固定して各成分の比率を変化させたベシクル溶液 L1～L23 を作製した (Fig. 16A). 試料の分散には多価アルコールであるジプロピレングリコール (DPG) を用いた. 試料の組成を Table 3 に示す. さらにベシクル溶液の安定性を検討するため 5℃, 室温 (RT) および 50℃で 1 ヶ月保管したサンプルの安定性を評価し DLGL/MEL-B/CHOL の相図を作製した. 結果をFig. 16B に示す.

39

(A)

(B)

Fig. 16 (A) L1 から L23 までの各サンプルの DLGL/MEL-B/CHOL の比率. (B) 各サンプルの 1 ヶ月保管後の変化. ■: 5°C, RT および 50°C で透明液体, ▲: 5°C, RT および 50°C で白色沈殿, ◆: RT
および 50°C で白色沈殿, 5°C でゲル化, ●: 5°C で白色沈殿, および 50°C で沈殿を生じない白色
半透明液体, 〇: 5°C, RT および 50°C で沈殿を生じない白色半透明液体, ×: 5°C, RT および 50°C
で CHOL の分離. 灰色の背景は 5°C, RT および 50°C で性状に変化のない単分散ベシクルを生じる範囲を示す.

40

Table 3 DLGL, MEL-B および CHOL の三成分からなるベシクル溶液の組成.

Name

DLGL (%, w/w)

MEL-B (%, w/w)

CHOL (%, w/w)

DPG (%, w/w)

L1

2.000

0.000

0.000

10.000

L2

1.600

0.400

0.000

10.000

L3

1.600

0.200

0.200

10.000

L4

1.600

0.000

0.400

10.000

L5

1.200

0.400

0.400

10.000

L6

1.000

1.000

0.000

10.000

L7

1.000

0.000

1.000

10.000

L8

0.800

0.800

0.400

10.000

L9

0.800

0.400

0.800

10.000

L10

0.800

0.200

1.000

10.000

L11

0.666

0.666

0.668

10.000

L12

0.500

1.000

0.500

10.000

L13

0.500

0.500

1.000

10.000

L14

0.400

1.600

0.000

10.000

L15

0.400

1.200

0.400

10.000

L16

0.400

0.800

0.800

10.000

L17

0.400

0.400

1.200

10.000

L18

0.200

1.600

0.200

10.000

L19

0.200

0.800

1.000

10.000

L20

0.000

2.000

0.000

10.000

L21

0.000

1.600

0.400

10.000

L22

0.000

1.000

1.000

10.000

L23

0.000

0.000

2.000

10.00041

DLGL 単体 (L1) および DLGL と MEL-B を混合した溶液 (L2, L6, L14) では低温下と高温下のいずれにおいても安定な透明溶液を生じた. しかし DLGL と CHOL のみの溶液 (L4, L7) は安定性が低く沈殿が析出した. さらに 5℃で 1 ヶ月保管したと
ころ液全体がゲル状に固まった. このゲルは室温で保管すると再び液状に戻ったた
め低温下における CHOL の溶融状態の変化によるものと考えられる. また MEL-B
は水への溶解性が低いため MEL-B のみの溶液 (L20) および MEL-B と CHOL のみの溶液 (L21, L22) では調製直後から沈殿が生じた. DLGL, MEL-B および CHOL の三成分を含む溶液では白色半透明液体が生じ, L3, L5, L8, L11, L12, L15, L18 では 1
ヶ月保管後 5℃, RT, 50℃すべての温度で沈殿は生じなかった. これらの溶液のうちCHOL を 40％以上含むものでは 5℃で 1 ヶ月保管後沈殿が生じ (L9, L10, L13, L16,
L19), 60％以上含むものでは 5℃, RT, 50℃すべての温度で沈殿が生じた (L17).
CHOL 分子は水に溶解しないため, CHOL のみを含み DLGL および MEL-B を含まない溶液では CHOL の分離が生じた (L23).

42

また各サンプルの粒子径, 多分散指数 (PDI) およびゼータ電位を測定した. 結果
を Table 4 に示す.

Table 4 L1 から L23 までの各サンプルの粒子径, PDI およびゼータ電位.

NameParticle size (nm)

PDI

Zeta potential (mV)

L1

1154.0 ± 418.38

0.819-29.7 ± 3.14

L21122.0 ± 358.62

0.823-41.1 ± 5.24

L3

140.5 ± 2.87

0.274

-58.1 ± 3.54

L4

134.4 ± 0.97

0.179

-59.2 ± 1.43

L5

168.2 ± 0.90

0.223

-62.0 ± 2.43

L61051.0 ± 502.17

0.772-18.0 ± 11.99

L7

172.2 ± 0.85

0.096

-14.1 ± 3.73

L8

151.4 ± 1.05

0.234

-59.6 ± 1.31

L9

213.4 ± 0.90

0.134

-67.9 ± 1.30

L10

204.6 ± 1.47

0.177

-37.2 ± 3.88

L11

193.8 ± 0.58

0.157

-67.5 ± 1.13

L12

117.5 ± 0.33

0.206

-23.8 ± 0.90

L13248.5 ± 4.63

0.264

-40.6 ± 0.24

L14708.2 ± 74.74

0.667-16.2 ± 6.75

L15

88.6 ± 0.68

0.370

-29.7 ± 3.16

L16

222.5 ± 0.90

0.208

-46.7 ± 0.29

L17291.8 ± 2.79

0.294

-40.9 ± 0.50

L1872.1± 5.45

0.420

-34.5 ± 4.08

L19

223.8 ± 5.05

0.402

-42.7 ± 1.23

L20

484.5 ± 8.51

0.363

-82.0 ± 0.46

L21608.1 ± 11.47

0.378-47.2 ± 3.45

L22482.3 ± 6.84

0.438

-46.9 ± 3.35

L23

-

-

-

-: L23 は CHOL の分離が生じたため測定不可能であった.

43

ベシクルの安定性にはゼータ電位が大きく影響しており静電的安定化のためにはゼータ電位が｜30｜mV 以上が必要とされている.81) また PDI は製剤中の粒子サ
イズの均一性を反映する. PDI が高いほど粒子径のばらつきは大きく, PDI が 0.2 以
下であればサイズ分布が均一であることを示す.82)83) DLGL 単体 (L1) の平均粒子径は 1154.0 ± 418.38 nm, PDI が 0.819 であったが CHOL を添加した L4 および L7 ではそれぞれ平均粒子径が 134.4 ± 0.97 および 172.2 ± 0.85 nm, PDI が 0.179 および 0.096となった. これは CHOL の添加により単分散ベシクルを形成したためと考えられ
る.72) DLGL と MEL-B からなる透明溶液 (L2, L6, L14) ではそれぞれ平均粒子径が1122.0 ± 358.62, 1051.0 ± 502.17, 708.2 ± 74.74 nm, PDI が 0.823, 0.772, 0.667 であり,単分散の小粒径ベシクルではなくミセルや巨大なベシクルが多分散していると考
え ら れ る . ここに沈殿を生じない範囲でコレステロールを添加すると粒子径70nm~200 nm の単分散ベシクルを生じた (L3, L5, L8, L11, L12, L15, L18). 各温度で1 ヶ月保管しても性状の変化を起こさない単分散ベシクルを安定ベシクルと定義し,Fig. 16B 中の灰色の背景で示した. また, 安定ベシクルを各温度で 1 ヶ月保管した後の粒子径, PDI, ゼータ電位を測定した (Table 5).

44

Table 5. 安定なベシクルの 1 ヶ月後の物性.

Particle size (nm)

PDI

Name

5℃

RT

50℃

5℃

RT

50℃

L3

198.9 ± 14.29

162.9 ± 11.49

167.2 ± 7.00

0.364

0.296

0.304

L5

182.2 ± 8.12

191.4 ± 3.16

185.8 ± 1.79

0.252

0.282

0.269

L8

185.4 ± 5.92

177.6 ± 12.07

162.6 ± 2.69

0.33

0.266

0.214

L11

207.2 ± 3.84

202.4 ± 1.70

189.2 ± 9.24

0.206

0.212

0.235

L12

141.6 ±3 .29

125.7 ± 0.22

135.8 ± 0.61

0.224

0.195

0.168

L15

128.7 ± 2.68

97.6 ± 8.57

85.9 ± 3.32

0.381

0.312

0.288

L18

99.5 ± 16.67

207.2 ± 59.62

101.1 ± 17.22

0.305

0.306

0.290

Zeta potential (mV)
Name

5℃

RT

50℃

L3

-28.2 ± 5.70

-51.7 ± 11.16-54.1 ± 7.06

L5

-50.4 ± 2.78

-55.3 ± 2.13

-34.6 ± 1.35

L8

-28.6 ± 2.25

-59.0 ± 2.74

-53.0 ± 1.77

L11

-56.4 ± 1.19

-42.6 ± 1.98

-44.3 ± 1.48

L12

-54.5 ± 0.66

-46.1 ± 0.68

-34.3 ± 4.28

L15

-14.2 ± 0.81

-16.9 ± 5.27

-20.9 ± 2.46

L18

-9.4 ± 2.33

-15.7 ± 1.80

-23.2 ± 4.73

L3, L5, L8, L11, L12 は 1 ヶ月の保管によって粒子径が増加傾向にあったがベシクルの会合による巨大ベシクルの発生は起きなかった. L15, L18 ではゼータ電位の絶対値の低下が起きておりベシクルの凝集が起きていると考えられた. 粒子径, PDI,
ゼータ電位の値のバランスを考慮して L12 (DLGL:MEL-B:CHOL=1:2:1) を安定なベシクルであると判断し, DMC 121 vesicle と呼称し以後の検討に用いた. DMC 121
vesicle の粒子径は 117.5 ± 0.33 nm, PDI は 0.206, ゼータ電位は-23.8 ± 0.90 mV であり, 安定かつ均一なベシクルであった.

45

また DMC 121 vesicle を透過型電子顕微鏡 (TEM) で観察したところ, 二重膜が多重に重なったマルチラメラベシクル構造を有している 50-300 nm の粒子の存在を確認することができた (Fig. 17). この粒子径は DLS 測定で得られたデータに対応し,ベシクルがナノメートル領域にあることを示した.

Fig. 17 DMC 121 vesicle の TEM 観察写真.

46

第二節 ベシクル中の CHOL の影響
上記で観察された通り, DLGL と MEL-B のみの混合溶液は PDI が 0.667-0.823 の多分散溶液であったが CHOL の添加によって単分散ベシクルが生じた. ベシクル形
成におけるコレステロールの影響をさらに検討するため DMC 121 vesicle の組成中の CHOL 濃度を 0.0-1.5%まで変化させ, 各溶液の粒子径, PDI, ゼータ電位および濁度を測定し, ラマンスペクトルを取得した. 結果を Table 6 および Fig. 18 に示す.

Table 6 DMC 121 vesicle 中の CHOL 量を 0.0 to 1.5%まで変更したときのベシクルの物性.

CHOL concentration (%)

0.0

0.1

0.25

0.4

Particle size (nm)1345.0 ± 1220.63

1085.0 ± 815.18

92.1 ± 5.87

116.5 ± 4.62

PDI

0.725

0.903

0.397

0.438

Zeta potential (mV)

-38.3 ± 3.48

-19.4 ± 3.56

-40.6 ± 3.37

-24.7 ± 2.50

CHOL concentration (%)

0.5

0.75

1.0

1.5

Particle size (nm)125.2 ± 1.63

239.3 ± 7.26

210.2 ± 2.75

246.0 ± 6.51

PDI

0.434

0.504

0.427

0.473

Zeta potential (mV)

-61.4 ± 3.50

-56.7 ± 0.38

-73.0 ± 1.89

-57.8 ± 0.76

47

(A)

(B)

(C)

Fig. 18 DMC 121 vesicle 中の CHOL 量を 0.0 to 1.5%まで変更したときのベシクルの (A) 外観,(B) 濁度, (C) I2888/I2852 の変化.

48

CHOL 濃度が 0.0%では透明溶液だったが, CHOL を 0.25%加えると青みがかった
半透明溶液となり, CHOL 含有量の増加に伴い白濁が生じたが沈殿は起きなかった(Fig. 18A). また CHOL 濃度 0.0%および 0.1%溶液では粒子径はそれぞれ 1345.0 ±1220.63, 1085.0 ± 815.18 nm であったが CHOL を 0.25%加えると 92.1 ± 5.87 nm となった. すなわち DLGL と MEL-B の混合ミセルが CHOL を 0.25％までミセル化し凝集体を形成するが, さらに CHOL を添加すると単分散ベシクルに変化したと考えられる. また CHOL 含有量が 0.5%を超えると濁度が急激に増加した (Fig. 18B)．
また, ベシクルの二重膜の流動性の指標として I2888/I2852 の値を導入した. I2852 お
よび I2888 は 2852 および 2888 cm-1 付近で測定されたラマンピーク強度である.
I2888/I2852 値が低いほど流動的になっている状態を表している 37)38)39)41). I2888/I2852 はCHOL の増加にともなって減少した (Fig. 18C). すなわち CHOL 含有量が増加する
ほど膜の流動性が増加し, 柔軟な膜を持つ小胞が形成されたと考えられる.

以上のことから本研究におけるベシクル形成について考察した.
両親媒性物質の分子集合体形成の指標として臨界充填パラメーター (CPP) がある. CPP=V/(a0 lc)で表され, a0 は親水基の断面積, V は疎水基の体積, lc は疎水基の鎖
長 で あ る . CPP<1/3 の と き は 球 状 ミ セ ル , 1/3<CPP<1/2 の と き は 棒 状 ミ セ ル ,1/2<CPP<1 のときはベシクル (二分子膜), CPP＝1 のときは平板状ラメラ, CPP>1 のときは逆ミセルをそれぞれ形成しやすい.84)85)86) また一方でイオン性の異なる二種の界面活性剤を混合したとき, 分子集合体形成の傾向は単体の界面活性剤を混合した際とは異なる集合体形成を行う傾向が知られており, Wang らはノニオン界面活49

性剤にアニオン界面活性剤を混合すると平板状ラメラの曲率に変化が起きてベシクルを形成することを報告している.87) また Imura らはノニオン界面活性剤である
MEL-A に両性イオン性のリン脂質である DLPC を混合して両者が作る分子集合体を観察した. MEL-A は CPP>1 の逆コーン型を取る一方で DLPC は CPP＝1 のシリンダー型を取るが, 両者を混合すると小粒径のマルチラメラベシクルが生じた.88) す
なわち CPP の異なる二種の界面活性剤を混合するとき, 形成される分子集合体は単体の分子集合体形成とは異なる傾向を持つ.
本研究で用いた MEL-B は CPP＝1 に近いシリンダー型の界面活性剤であるため単独で大きなラメラ相 (Lα) に自己組織化される.73) 一方で DLGL は CPP が小さく正の曲率を持ちやすいコーン型の界面活性剤である 70)71)ため, 両者を混合することでベシクル形状を取りやすい CPP を持つ会合体が生じたのではないかと考えられる. また DLGL:CHOL が 1:1 のとき MEL-B 含有量が多いほど粒子径が小さくなる傾向があった (L9, L11, L12, L15, L18). ニオソームは疎水性が高まるにつれ平均サ
イズが減少することが知られている. 89)90) 同様に, 3 つのカルボキシル基を持ち高い水溶性を有している DLGL に比べて疎水性の高い MEL-B の割合が増えるにつれ,
ベシクル内部の疎水鎖同士の相互作用が高まり粒子径の減少が起きたと推測される.
また CHOL がリポソームやニオソームに取り込まれ膜の柔軟性を高め安定性を向上させることはよく知られており, いくつかの界面活性剤は CHOL 存在下でのみ
ベシクルを形成する.44)81)91) これは CHOL が持つ強直なステロイド骨格がリン脂質

50などの炭化水素鎖と疎水性相互作用することで疎水性部の凝集力を高めて球状の集合体を形成するためと考えられており 81)92), 本研究においても CHOL が DLGL お
よび MEL-B が作る疎水性二重膜中で炭化水素鎖と疎水性相互作用することで安定な小粒径のベシクルを形成したと考えられる.

51

以上のことから本研究において得られたベシクル形成の模式図を Fig. 19 のように推定した.

DLGL

MEL-B

CHOL

DMC vesicle

Fig. 19 ベシクル形成の模式図.

52

第三節 DMC vesicle の有用性評価
ベシクルの薬物送達キャリアとしての可能性を検討するため, DMC 121 vesicle に
疎水性薬物の含有を試みた. モデル薬物として鎮痛消炎薬として用いられるフェル
ビナク (4-biphenylacetic acid：BAA) を用いて BAA 含有 DMC 121 vesicle (DMC-BAA)を調製した. コントロールには BAA を溶解した DPG 溶液 (DPG-BAA) を用いた.
DMC-BAA および DPG-BAA の粒子径, PDI およびゼータ電位を Table 7 に示した.
DMC-BAA の粒子径, PDI およびゼータ電位は DMC 121 vesicle と変化なく, BAA の
含有はベシクルの物性に影響を及ぼさないことが明らかとなった.

Table 7 BAA 含有 DMC 121 vesicle およびコントロール溶液の組成および物性.

DLGL

MEL-B

CHOL

DPG (%,BAA (%,

SampleZeta potential
Particle size (nm)

PDI
(mV)

(%, w/w)(%, w/w)(%, w/w)

w/w)

w/w)

DMC-BAA

0.5

1.0

0.5

10.0

0.1

114.5 ± 1.43

0.186

-41.8 ± 3.06

DPG-BAA

0.0

0.0

0.0

10.0

0.1

1133.0 ± 511.37

0.804-21.0 ± 6.47

53

さらなる特性評価のため, DMC-BAA および DPG-BAA を用いて BAA のカプセル
化効率 (EE) の算出および薬物放出試験を行った. その結果, EE は DPG-BAA で15.8 ± 0.70％だったのに対して DMC-BAA では 65.0 ± 0.35％であり, BAA がベシクル内に封入されたことが示された. また DMC-BAA および DPG-BAA の薬物放出試
験の結果を Fig. 20 に示す. DMC-BAA は DPG-BAA と比較し 60 min まで有意に薬物放出を抑えたが, 5 時間後には DMC-BAA, DPG-BAA ともに薬物の累積放出率は90％を超えた. ベシクル中の CHOL 量が薬物の保持や薬物放出性に影響を与えることが知られており,93)94) DMC ベシクルの EE や徐放性の向上のためには CHOL 量の調整が有効であると考えられる.

Fig. 20 DMC-BAA および DPG-BAA の薬物放出試験結果. (Data are expressed as the mean ± SD,
n=3, *: p<0.05, T-test)54

さらに DMC-BAA の薬物送達キャリアとしての有用性を検討するため, DMCBAA および DPG-BAA を用いて BAA のヘアレスマウス皮膚透過試験を行った. 結
果を Fig. 21 に示す. DMC-BAA は DPG-BAA よりも BAA の皮膚透過性が高いことが明らかとなった. またそれぞれの透過速度 (Flux) を算出したところ DMC-BAA
では 2.62 ± 0.35 (µg/cm2/h) であり, DPG-BAA の Flux である 0.62 ± 0.08 (µg/cm2/h) の4 倍以上となった. 以上のことから DMC 121 vesicle は疎水性薬物の皮膚透過を向上
させることが明らかとなった.

Fig. 21 DMC-BAA および DPG-BAA の皮膚透過試験結果. (Data are expressed as the mean ± SD,
n=4)

55

次に, DMC 121 vesicle が薬物透過を向上させる機構について検討した. 薬物が皮膚に浸透する際, 疎水性の高い化合物は細胞間経路を通るとされている.2)12) また浸透促進剤は, 細胞間脂質のパッキングを破壊して皮膚のバリア性を乱すことで薬物の浸透性を向上させると考えられている.5)25)95) そこで DMC 121 vesicle が細胞間脂質に与える影響について検討するため, LMSTD に等量の DMC 121 vesicle あるいはDPG 溶液 (DPG aq) を添加し, PXRD およびラマン分光法を用いて LMSTD の充填構
造の変化を観察した. Table 8 および Fig. 22 にその結果をまとめた.

Table 8 LMSTD に添加したサンプルの組成と PXRD 分析およびラマン分析の結果.
DLGL (%,

MEL-B (%,

CHOL (%,DPG (%,

w/w)

w/w)

w/w)

w/w)

DPG aq

0.0

0.0

0.0

DMC 121 vesicle

0.5

1.0

0.5

Sample56

RHex/OrtI1097/I1062+I1128

10.0

0.53 ± 0.024

0.14 ± 0.0049

10.0

0.62 ± 0.039

0.16 ± 0.0008

(A)

＊

(B)

＊

Fig. 22 DMC 121 vesicle および DPG aq を添加した LMSTD の RHex/Ort および I1097/(1062+1128). (Dataare expressed as the mean ± SD, n=3, *: p<0.05, T-test)57

PXRD 測定の結果, DMC 121 vesicle を添加した LMSTD では DPG aq を添加した
LMSTD と比較し RHex/Ort が増加していた. Hex 構造比の増加は LMSTD の流動性の増加を表している. またラマンスペクトルから LMSTD のトランス-ゴーシュ構造比である I1097/(1062+1128)の値を算出すると DMC 121 vesicle を添加した LMSTD では DPG aq を添加した LMSTD と比較し I1097/(1062+1128)値が増加していた. すなわち LMSTD 中のゴー
シュ構造比が増加し脂質の充填構造の秩序がより乱れる傾向にあった.
さらに DMC 121 vesicle および DPG aq を添加した LMSTD を SAXS で測定した結果を Fig. 23 に示した.

0.21
0.24

0.43
0.47

0.65
0.71

Fig. 23 DMC 121 vesicle および DPG を添加した LMSTD の SAXS プロファイル.

SAXS 測定の結果, DMC 121 vesicle と DPG aq を添加した LMSTD の両方でラメラ
周期が 4.62 nm のラメラ構造に由来する S1＝0.21, S2=0.43, S3=0.65 の散乱ピークと,ラメラ周期が 4.24 nm のラメラ構造に由来する S1＝0.24, S2=0.47, S3=0.71 の散乱ピ

58

ークが観察された. これらは以前の研究により充填構造の異なる 2 種の短周期ラメ
ラ構造と考えられているが,36) DMC 121 vesicle と DPG aq でラメラの周期性に異なる影響はなかった.
以上のことから, DMC 121 vesicle は角層の細胞間脂質に作用しその横方向の充填構造を乱し薬剤の浸透を促進している一方で, ラメラ構造に大きな影響は与えないものと考えられる.
これまでに肌のバリア機能と Hex/Ort 構造比の関係が研究されており, バリア機
能は Ort 比が高いほど向上することが示唆されている.15)16)17) すなわち DMC 121
vesicle が肌のバリア機能を破壊し, その結果皮膚透過性が向上している可能性が考えられた. そのため続く研究にて DMC 121 vesicle と皮膚ダメージの関係について
検討した.

59

DMC 121 vesicle の皮膚への作用を評価するため, SDS で損傷させた表皮モデルを作製した. このダメージ表皮モデルに DPG aq および DMC 121 vesicle を添加し 24
時間インキュベートした後に MTT アッセイにより算出した細胞生存率に基づいて皮膚修復効果を評価した. 手順を Fig. 24 に, 結果を Fig. 25 に示す.

Human skin model

Damaged (25 µL of 1% SDS, 5 min)Washed and 50 µL
DPG aq wereappliedWashedWashed and 50 µL
DMC 121 vesicle
were applied

Incubated at 37 ℃ for 24 h

MTT assay

Negativecontrol

SDS-treated

DPG-treatedFig. 24 表皮モデルのダメージ皮膚修復試験手順.

60

DMC-treated

(A)Negative-control

SDS-treated

DPG-treated

DMC-treated(B)

Fig. 25 表皮モデルのダメージ皮膚修復試験結果. (A) 外観 (B)細胞生存率. (Data are expressed as
the mean ± SD, n=3)

61

SDS 処理を行わず培養した Negative-control の表皮モデルは MTT 反応によって生存率が良好であることを示す青色を示した. 一方で SDS 処理を行ったのちに培養した SDS-treated の表皮モデルでは青色の呈色が大きく減り, SDS 処理が細胞の生存率を下げることが明らかであった. しかし SDS 処理後に DMC 121 vesicle を添加した細胞では SDS 処理を行わなかった Negative-control と同程度まで生存率が上昇した. SDS 処理後に DPG aq を加えた DPG-treated も生存率は上昇したが 60％にとどまっていた. これらの結果から, DMC 121 vesicle は明らかに細胞生存率を向上させる
高い能力を持っていた．
SDS は角層に吸着し角質細胞を変性させるほか, 細胞間脂質を溶出させ, これらの効果が角層のバリア能力を破壊する.26)27) 通常の皮膚刺激においては SDS などの刺激性物質が角層を通過して角質細胞の下部である角化細胞に損傷を与えること
で炎症カスケードが起き, さらに深部の細胞で膨張が起こるとされている.96) 表皮
モデルを用いた試験では炎症カスケードの初期段階である角質細胞の損傷を生存率により測定することで刺激性の有無を判定できる. 本研究で添加した DMC 121
vesicle は SDS によってバリア機能が減少した表皮モデルの細胞生存率を上昇させた. 薬物の皮膚透過性を向上させる TDDS 技術のひとつは Azone やテルペン, 脂肪
酸, 脂肪酸エステル, 界面活性剤などの透過促進剤を用いることである.5)12) しかし
これらの透過促進剤は角層の脂質と相互作用し充填構造を破壊, すなわちバリア機
能を乱すことで経皮吸収を増強するため, 使用後に皮膚バリア機能が迅速に回復しなければ肌へ刺激を与えることになる.2)97) 一方で本研究において開発した DMC

62

121 vesicle は, LM との相互作用の結果から透過促進剤と同様に脂質の横方向の充填構造を乱す一方で, ダメージを与えた表皮モデルの細胞死を防ぐ働きがあることが皮膚回復試験の結果から明らかとなった.
以上の結果から推定される SDS による皮膚刺激と表皮モデルのバリア機能回復機構の模式図を Fig. 26 に示した. 一般的な皮膚刺激試験においては SDS を添加・洗浄後に 24 時間インキュベートする間にすでに浸透していた SDS が下部へ拡散し細胞にダメージを与えるが, 本研究では洗浄後に添加した DMC 121 vesicle がそのダメージを抑制した. これは, DMC 121 vesicle はセラミド様の構造を持つ MEL-B や細胞間脂質成分である CHOL を含むことなどから角層細胞間隙に容易に浸透し, ラメラ構造を形成しバリア機能を回復させ, それ以上のダメージを防いだためではな
いかと推測される. また, DMC 121 vesicle が CHOL の働きによって柔軟な二重膜を獲得したことが角層の間隙に変形して入り込むことに貢献しているのではないかと考えられる. 経皮吸収に用いられるナノキャリアに求められる特性のひとつは角層をそのまま通過できる適切な変形性を有することである.98) DMC 121 vesicle はこの適切な変形能を有するものと考えられた. 今後の課題として, DMC 121 vesicle の優位性における CHOL の働きについて調査するために, CHOL を含む他キャリアとの比較が必要であると考えられる.

63

(A)

(B)

+ DMC 121
vesicleFig. 26 DMC 121 vesicle によるダメージ回復機序の模式図. (A)通常の皮膚刺激における炎症カスケード. (B) ダメージ皮膚修復試験の模式図.

64

第四節 小括
本研究では安全な TDDS キャリアの開発を目的として生体適合性の高い原料を用いた新規なベシクルを調製した.
DLGL は生体適合性が高いがベシクルの安定性に欠け, MEL-B や CHOL は皮膚バリア機能に影響を与えるが水への溶解性が低く製剤への配合が難しいという問題点があった. しかし本研究により DLGL, MEL-B および CHOL の三成分を用いること で 安 定 か つ 分 散 性 の 良 い ベ シ ク ル の 形 成 が 確 認 さ れ た . DLGL:MELB:CHOL=1:2:1 の割合で作製した均一な DMC 121 vesicle は TEM 測定によりマルチ
ラメラベシクルであることが明らかとなった. DMC 121 vesicle は細胞間脂質との相互作用によって疎水性薬物の皮膚透過性を向上させると考えられるが角層バリアを破壊せず, むしろダメージを受けた表皮モデルの細胞生存率を向上させた.
その安定性と薬物の皮膚透過性の向上効果に加え, 皮膚バリアに対するポジティ
ブな効果から, DMC 121 vesicle は皮膚疾患患者への薬物送達キャリアとして有用なアプローチになると考えられる.

65

総括
経皮吸収型製剤の設計において皮膚バリアである細胞間脂質の理解は重要である. そこで本研究では細胞間脂質モデルを用いて脂質組成が充填構造に与える影響を検討し, さらにバリア機能を破壊しない新規の薬物送達キャリアの開発を試みた.
第一章では, LM を作製し皮膚バリアに影響を与える充填構造比と CHOL 含有量との関係を見出し, 皮膚バリア機能保全における CHOL の役割に新たな知見を示した. また LM が表皮モデルを用いた皮膚刺激試験の代替となりうる可能性を見出した.
第二章では, CHOL を含みその補給源となる安定なマルチラメラベシクルの作製に成功し, そのベシクルが皮膚のバリア機能を保持したまま薬物の皮膚透過性を向上させることを明らかにした.
今回得られた知見は皮膚外用剤の評価や設計における新規手法として応用可能であり, 皮膚疾患の治療法に有益な技術を提供すると期待できる.

66

実験の部
試薬および試料
脂質(2S, 3R)-2-(2-hydroxyhexadecanoyl)-aminooctadecane-1,3-diol (セラミド ADS: CER)
は TAKASAGO INTERNATIONAL CORPORATION (Tokyo, Japan) から購入した. コ
レステロール (CHOL) は FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (Osaka, Japan)
から購入した. パルミチン酸 (PA) は Acidchem International Sdn. Bhd. (Pulau Pinang,
Malaysia) から購入した.

界面活性剤
一般的に皮膚洗浄用に用いられる界面活性剤を用いた. 以下に記した界面活性剤
を終濃度 5%になるように調整した. アニオン型界面活性剤として Sodium dodecyl
sulfate (SDS, Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan), Sodium laureth sulfate (SLES, Kao
Corporation, Tokyo, Japan) と Sodium laureth-6 carboxylate (SLEC, New Japan ChemicalCo., Ltd., Osaka, Japan)を用いた. 両性界面活性剤として Cocamidopropyl betaine(CAPB, MIYOSHI OIL & FAT CO., LTD., Tokyo, Japan) および Lauryl hydroxysultaine(LHSB, Kao Corporation, Tokyo, Japan) を用いた.
ベシクル形成用の両親媒性物質として用いた Pellicer L-30 溶液 (29 wt% DLGL)は Asahi Kasei (Tokyo, Japan) から購入した. Ceramela HG (100% MEL-B) は TOYOBO
Co. Ltd (Osaka, Japan) から購入した. Dipropylene glycol (DPG) は Kanto Chemical(Tokyo, Japan) から購入した.

67

細胞間脂質モデル (LM) の作製
LM の組成比は Watanabe らの方法に準拠し, ヒト角層と類似する Hex/Ort 構造比を持つことが知られている CHOL/PA/CER=13.9/59.6/26.5 (mol %) とした.32) 脂質混合物をクロロホルム/メタノール混液 (2:1, v/v) に溶解し, 16 mg/mL の脂質溶液を作製した. この脂質溶液を 96 ウェルガラスプレートに 200 µL/ウェルずつ分注し, 32℃
で溶媒を乾燥させた. この処理を 5 回繰り返し，16 mg/ウェルの薄膜を調製した. 薄膜に水を 100µL 添加し 120℃で 30 分加熱した後, 冷却して 200 µL の水を加え 20 時
間水和させたものを標準の細胞間脂質モデル (LMSTD) とした. LMSTD から CHOL,
PA あるいは CER の配合割合を変化させた脂質減少モデルをそれぞれ LMCHOL-1-4,
LMPA-1-4 および LMCER-1-4 とした. 熱挙動測定に用いた脂質混合物は 2 種類の各脂質を等量ずつ混合して 16 mg とし, クロロホルム/メタノール混液に溶解して溶媒を乾燥させた後, 水を 100 µL 添加し 120℃で 30 分加熱後冷却して 200 µL の水を加え
20 時間水和させて作製した.

DSC 測定LM および脂質の熱挙動は示差走査熱量計 (DSC, Thermo plus EVO2, Rigaku,
Tokyo, Japan) で測定した．脂質サンプル (2-3 mg) をアルミニウム製の sealed pan に入れ, 5℃/min で 20℃から 120℃まで加熱した.

ラマンラマンスペクトルの取得
各 ラ マ ン ス ペ ク ト ル は プ ロ ー ブ 型 ラ マ ン 分 光 計 (All-In-One Raman System,

68

MarqMetrix Inc., Seattle,USA) を用いて測定した. 測定は照射レーザー波長 785 nm,
レーザー出力 450 mW, 露光時間 2 s, 積算回数 5 回の条件で行った. 連続測定を行う場合はホットステージ (Linkam Scientific Instruments Ltd., Surrey, UK) 上で LM を25℃から 120℃まで 5℃/min で加熱しラマンスペクトルを取得した. 得られたスペ
クトルは GRAMS/AI™ (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, US) を用いてベース
ライン処理を行った. 算出した各値は 3 回測定の平均値とした.

LM の X 線回折解析
LM 内の充填構造の変化を評価するために粉末 X 線回折測定 (PXRD) を行った.
サンプルは Si 製の無反射板サンプルホルダーに試料をマウントし, 25℃で測定を行った. 測定には MiniFlex600 (Rigaku, Tokyo, Japan) を用いた. 2θ 側測定範囲は 5-35°,
ステップサイズ 0.02°, スピード 4°/min, X 線の管電圧 40 kV, 管電流 15 mA, 線源 Cu
Kα の条件で測定した. 算出した各値は 3 回測定の平均値とした.
LM の小角 X 線散乱 (SAXS) プロファイルは UBE Scientific Analysis Laboratory,Inc.で取得した. またベシクルの SAXS プロファイルは Tokyo Metropolitan Industrial
Technology Research Institute で取得した. X 線の管電圧 40 kV, 管電流 30 mA, 線源
Cu Kα の条件で測定した. ここで Bragg の式より散乱ベクトル S=1/d= (2/λ) sin θ で表され, d は格子間距離, 2θ は散乱角, λ は X 線の波長である.

LM およびヒト三次元培養表皮モデルからの脂質溶出
LMSTD に 5％界面活性剤 300 µL を滴下し, 32℃で 30-120 分間静置した. 上清 200

69

µL に含まれる脂質を HPLC により定量し, 界面活性剤による脂質溶出量を算出した. また LM に含まれる脂質量と流失した脂質量の比をとり脂質流失率を算出した．
ヒト三次元培養表皮モデルからの脂質溶出量測定には LabCyte EPI-MODEL 24(Japan Tissue Engineering Co., Ltd., Aichi, Japan) を用いた. 面積あたりの適用量が LMへの適用量と同じになるように 5％界面活性剤 492 µL を表皮モデルに滴下した.
32℃で 30 分間静置したのち上清 200 µL を HPLC により定量し, 界面活性剤による脂質溶出量を測定した. 測定にはそれぞれ 4 つのサンプルを用いて行い平均値を算出した.
また界面活性剤添加後の上清はナイロンメンブレンフィルター (TORAST Disc,
Shimadzu GLC Ltd., Tokyo, Japan) により不純物を除去した.
HPLC 測定装置は Shimadzu LC-20AD (Shimadzu, Kyoto, Japan)，ポンプ (LC-20AD),
カラムオーブン (CTO-20A), 紫外吸光度検出器 (SPD-20AV) を使用し, データ解析システムには Lab Solutions を用いた. カラムは Inertsil ODS-3 (5µm) 4.6×250 mm(GL science Inc., Tokyo, Japan) を用いた. 移動相はアセトニトリル (0.125%酢酸) :メ
タノール＝80:20 (v/v) を用いた. 流速, 吸収波長, カラムオーブンの温度はそれぞれ 0.8 mL/min, 210 nm, 40℃とした.

ベシクルの調整および安定性の評価
DLGL, MEL-B および CHOL の合計が 2 wt%になるようにさまざまな比率で測り取った. DLGL, MEL-B および CHOL を分散剤である DPG に加え 85℃に加熱し, 均一に溶解したものを油相とした. DPG は総量の 10 wt％に固定した. 85℃に加熱した70

精製水に油相を加えホモミキサー (T. K. HOMOMIXER MARK II Model 2.5, PRIMIX
Corporation, Hyogo, Japan) で 4500 rpm で 5 分攪拌した. 攪拌後, 室温まで静置しサンプル L1～L23 とした. サンプルをガラス瓶に入れ 5℃, 室温, 50℃で保管し, 調整
直後/1 ヶ月後の状態を目視で観察した. 沈殿やゲル化などの性状の変化が起きていない場合を安定性が良好であると判断し, その結果により三角相図を作成した．

ベシクルの物性測定
ベシクルの粒子径, PDI およびゼータ電位は, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern
Panalytical, Malvern, UK) を使用して動的光散乱法により測定し 3 回測定の平均値
を得た.

濁度測定
ベシクル溶液の濁度は Mondal らの方法に基づき, マイクロプレートリーダーSH
1200Lab (CORONA ELECTRIC Co.,Ltd., Ibaraki, Japan) を用いて 500 nm の光学密度を測定し 3 回測定の平均値を得た.99)

TEM 観察ベ シ ク ル サ ン プ ル の 形 態 観 察 は 透 過 電 子 顕 微 鏡 (Transmission Electron
Microscope：TEM, HT7700, HITACHI, Tokyo, Japan) を用いた. サンプルをグリッド上に滴下しリンタングステン酸でネガティブ染色処理を行った後観察を行った.

BAA 含有ベシクルの調製

71

ベ シ ク ル 中 に 封 入 す る モ デ ル 薬 物 と し て 4-biphenylacetic acid (BAA, Tokyo
Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan) を用いた. BAA を含むベシクル (DMCBAA) は油相に 0.1%の BAA を添加することで調製した. またコントロールとして
BAA 含有 10％DPG 溶液を作製した (DPG-BAA). 水相には 25 mM リン酸塩緩衝液を用いた. BAA を含有したベシクルの評価のために, 粒子径およびゼータ電位測定が実施された.

BAA 含有ベシクルのカプセル化効率
BAA 含有ベシクルのカプセル化効率 (EE, %) は全薬物から含有されていない薬物画分を差し引くことによって決定された.100)101)
0.5 mL のサンプルを分子量カットオフ (MWCO) 12,000-14,000 Da の透析バッグ(Visking tubing, Japan Medical Science, Osaka, Japan) に入れ, この透析バッグを 20 mLのレシーバー溶液 (50 mM リン酸塩緩衝液, pH7.4) をいれた遠沈管に入れ, 3500 rpm
で 15 分間遠心分離を行った. HPLC によりレシーバー溶液中の BAA 含有量を定量した. EE (%) は以下の式で算出した.

EE%= [(Total amount of BAA-amount of released BAA)/ Total amount of BAA] ×100

測定は 3 回行いその平均値を得た.

薬物放出試験
BAA 含有ベシクルの薬物放出試験は MWCO 12,000-14,000 Da の透析バッグを用いて行った. サンプル 2 mL を透析バッグに入れ 50 ｍL のレシーバー溶液 (50mmol

72リン酸塩緩衝液, pH7.4) 中に浸漬した. レシーバー溶液は 32℃に保ち連続的に攪拌した. 一定の時間間隔でアリコートを取り出し, 等量のリン酸塩緩衝液で置換した.
HPLC により採取したレシーバー相の BAA 含有量を定量した. 測定は 3 回行いその平均値を得た.

皮膚透過試験
皮膚透過試験は Fujii らの条件に準拠し無限系で行った.72) ヘアレスマウス皮膚
(Laboskin®, Hos:HR-1, 7weeks, Hoshino Laboratory Animals, Inc., Ibaraki, Japan) をフラ
ンツ拡散セル (有効拡散面積：2.0 cm2) にセットした. レシーバー相は 32℃の 50
mM リン酸塩緩衝液 (pH7.4) で満たされた. ドナー空間に 2000 µL の試料を添加し,ドナーコンパートメントを密閉した. 一定の時間間隔でアリコートを取り出し, 等
量のリン酸塩緩衝液で置換した. 採取したレシーバー相はナイロンメンブレンフィ
ルター (TORAST Disc, Shimadzu GLC Ltd., Tokyo, Japan) により皮膚残渣を除去後,
HPLC にて BAA 濃度を測定した. 各サンプルについて皮膚から透過した累積薬物量 (µg/cm2) を時間の関数としてプロットした. 定常状態での薬物の皮膚透過速度(Flux, J) (µg/cm2/h) はグラフ直線部分の傾きとして算出された. 測定は 4 回行いその平均値を得た.

BAA の HPLC 分析
BAA は HPLC 分 析 に よ り定 量した . HPLC 測 定 装 置は Shimadzu LC-20AD(Shimadzu, Kyoto, Japan)，ポンプ (LC-20AD), カラムオーブン (CTO-20A), 紫外吸光73

度検出器 (SPD-20AV) を使用し, データ解析システムには Lab Solutions を用いた.
カラムは Inertsil ODS-3 (5 µm) 4.6×250 mm (GL science Inc., Tokyo, Japan) を用いた.
移動相はアセトニトリル:水:リン酸＝500:500:1 (v/v)を用いた. 流速, 吸収波長, カ
ラムオーブンの温度はそれぞれ 1.6 mL/min, 254 nm, 40℃とした.

DMC 121 vesicle のダメージ皮膚への作用
ベシクルによるダメージ皮膚修復試験は, OECD Test guideline 439 (OECD, 2013)
および Morita らの方法を改良して行った 76). ヒト三次元培養皮膚モデル (表皮モデル; LabCyte EPI-MODEL 24) (Japan Tissue Engineering Co., Ltd., Aichi, Japan) は 1％(w/v) SDS (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) を 25 µL 塗布し, 5 分間静置することによりダメージを与えた. PBS で十分に洗浄した後, 各サンプル (50 µL) を塗布し,37℃, 5% CO2, 90%RH 以上の環境下で 24 時間インキュベートした. インキュベート
後 の 細 胞 を 0.05% (w/v) MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium
bromide) を含むアッセイ培地で 37 ℃, 5% CO2, 90%RH 以上の環境下で 3 時間培養した. MTT は真核細胞のミトコンドリア内の脱水素酵素の基質となり, 青色のホル
マザンを生成する. 生細胞の数に比例してホルマザン色素が生成される. ホルマザ
ンをイソプロパノールで抽出し, 抽出液の吸光度をマイクロプレートリーダーSH
1200Lab (CORONA ELECTRIC Co.,Ltd., Ibaraki, Japan) により測定した. 測定値 (A)は以下の式に従って算出した.

A = [Abs570 - Abs650] - [Absi570 - Absi650]

74ここで、Abs570 は 570 nm で測定した検体の吸光度, Abs650 は 650 nm で測定した検体の吸光度, Absi570 は 570 nm で測定したイソプロパノールの吸光度, Absi650 は
650 nm で測定したイソプロパノールの吸光度である.細胞生存率 (Cell Viability) は以下の式に従って算出した.

Cell Viability (%) = (As/An) × 100

ここで As はサンプルの平均測定値, An は Negative-control の平均測定値である.
各サンプルの吸光度は 3 回測定の平均値とした.

統計処理
データは平均値 ± S.D.で表し, p 値は 2 群の比較のために Student's t-test によって算出された. p 値が 0.05 より小さいとき統計的に有意であると判断した.

75

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謝辞
本研究を進め, また本論文を作製するにあたって終始熱心なるご指導を頂いた明治薬科大学分子製剤学研究室の深水啓朗教授に深く感謝の意を表します.
本論文の作成に際して細部にわたるまで多大なるご鞭撻を賜りました主査の明治薬科大学薬剤学研究室の小林カオル教授, 副査の医療製剤学研究室下川健一准教授ならびに薬剤情報解析学研究室鈴木陽介講師に厚く御礼を申し上げます.
本論文の作成に際して懇切なるご助言をいただきました明治薬科大学薬化学研究室の山中正道教授に心より感謝いたします.
研究の機会を与えて頂き, さまざまなご支援をいただきました株式会社ミロットの皆さま, また研究の実施に際し多大なるご協力をいただきました明治薬科大学分
子製剤学研究室の皆さまに深く感謝いたします.
本研究の遂行にあたり日々の議論を通じて多くの示唆をいただきました株式会
社ミロット研究開発部の西野次長, 福田敏夫顧問, 小松亜衣氏に御礼申し上げます.
本研究の礎を築かれた株式会社資生堂の藤井美佳博士に敬意を表すとともにご助言に対し深く御礼申し上げます.
最後に, これまで支え協力してくれた家族に心より感謝します.

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論文目録

本学位論文の内容は下記の論文に基づく.
1) Terayama S., Goto Y., Fukami T., Amount of cholesterol in intercellular lipid models inversely
correlates with hexagonal structure ratio in packing structures. Chem. Eng. Sci., 259, 117814 (2022).
2) Terayama S., Tamura R., Fukami T., Novel vesicles composed of gemini-type amphiphiles, glycolipid
biosurfactants, and cholesterol improve skin permeability of anti-inflammatory drugs and restore
viability of damaged 3D-cultured skin J. Drug Deliv. Sci. Technol., 84, 104499 (2023).

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