活性型がん遺伝子 BRAF によるストレス適応応答制御機構の解明と治療への応用
Regulation Mechanisms of Stress Response by Oncogenic BRAF

平成 26 年度入学
永澤 生久子 (Nagasawa, Ikuko)

指導教員
冨田 章弘

目次
序章 ................................................................................................................................. 1
1. がん化とストレス適応応答機構 .............................................................................. 1
2. Integrated Stress Response (ISR) .......................................................................... 1
3. 活性型がん遺伝子 BRAFV600E ................................................................................. 3
4. 選択的 BRAF 阻害剤 vemurafenib ....................................................................... 3
5. Vemurafenib による ISR 活性化の報告 .................................................................. 4

本論 ................................................................................................................................. 5
研究目的 ...................................................................................................................... 5
第一章

BRAF 阻害剤 vemurafenib による Integrated stress response (ISR)
活性化機序の解析とその意義 ........................................................................ 6

第一節 BRAF 阻害剤は BRAFV600E 変異型細胞株において ISR を活性化する ....... 6
第二節

BRAF 下流 MEK-ERK シグナルと Akt シグナルは、vemurafenib による
ISR 活性化に関与しない ............................................................................ 8

第三節

Vemurafenib は GCN2 を介して ISR 活性化を引き起こす ..................... 10

第四節

PERK 及び小胞体ストレスは vemurafenib による短時間における ISR
活性化に関与しない ................................................................................. 12

第五節

Vemurafenib による ISR に制御される遺伝子の解析.............................. 17

第六節

ATF4 ノックダウンは vemurafenib による細胞増殖阻害を増強する ...... 19

第二章

Vemurafenib による ISR に対する選択的阻害剤の探索.............................. 21

第一節 mTOR 阻害剤及び PI3K 阻害剤はストレスの種類非選択的に ATF4 発現誘導を抑制する ........................................................................................ 21
第二節

AT9283 は vemurafenib による ATF4 発現誘導を選択的に抑制する ...... 25

第三節

AT9283 は vemurafenib によって誘導されるアミノ酸代謝の恒常性を維持するための応答を抑制する ...................................................................... 28

第四節

AT9283 は vemurafenib と併用することで相乗的に細胞死を誘導する... 30

第三章 活性変異型 BRAFV600E による ISR 制御機構の解析......................................33
第一節

BRAFV600E 変異型細胞における BRAF ノックダウンはストレスに誘導される ATF4 発現を抑制する ...................................................................33

第二節

BRAF ノックダウンが ATF4 mRNA 及び uORF に与える影響の検討 ....36

第三節

BRAFV600E 変異型細胞株における BRAF ノックダウンは mTOR シグナル及び翻訳開始因子のリン酸化レベルを抑制する .......................................38

第四節

BRAFV600E 変異型細胞株における vemurafenib の 24 時間処理は
mTOR シグナル及び ATF4 発現を抑制する .............................................42

第五節 mTOR シグナルの阻害は GCN2 を介した ATF4 発現誘導を抑制する ....44
第六節

BRAF は mTORC1 及び GCN2 と結合し、mTOR はストレス依存的にBRAF との結合が増加する .......................................................................46

結語 ...............................................................................................................................49
実験項 ............................................................................................................................55
参考文献 ........................................................................................................................65
謝辞 ...............................................................................................................................71
Supplementary Data ....................................................................................................73

序論

1. がん化とストレス適応応答機構
がんの発生はがん遺伝子の変化の集積に起因し、がん遺伝子の変異や増幅による増殖・生存シグナルの異常な活性化は、現在のがん治療において重要な治療標的である。一方、腫瘍組織は酸素やグルコース、アミノ酸等の栄養素が不十分な特徴的な微小環境にさらされているため、がん化した細胞がそのようなストレス環境下において増殖及び生存を維持するためには、積極的なストレス適応応答機構の活性化が重要である 1)。従って、がん細胞のストレス適応応答を理解し、制御することは有用ながん治療法として期待されるが、その詳細な分子機序はあまり明らかにされていない。特に、がん化を引き起こすドライバーがん遺伝子と代謝ストレス適応応答機構の研究は、これまで切り分けて研究が進められ、がん遺伝子によるストレス適応応答の制御メカニズムは明らかではない。そこで本研究では、新たながん治療戦略の分子基盤として、治療標的として重要ながん遺伝子
BRAF と多様なストレスに対して応答する Integrated stress response (ISR) に焦点を当て、これらを結びつける分子機序を明らかにすることを研究目的とした。

2. Integrated Stress Response (ISR)
Integrated stress response は様々なストレスから細胞を守るために機能する重要なス
トレス適応応答機構である。ISR はストレスセンサー分子である eukaryotic initiation
factor 2α (eIF2α) キナーゼの活性化、eIF2αのリン酸化、そして activation transcription
factor 4 (ATF4) の発現上昇の順で誘導される。ISR の活性化は様々なストレスに関わる
病態に関与することが報告されており、がん細胞も ISR の活性化によって腫瘍内の劣悪なストレス環境に適応し、生存及び増殖を維持することが報告されている 2-4) (図 1)。
現在までに、哺乳類における eIF2α キナーゼとして、protein kinase-like endoplasmic
reticulum (ER) kinase (PERK)4)、general control nonderepressible 2 (GCN2)3)、protein
kinase double-stranded RNA-dependent (PKR)5)及び heme-regulated inhibitor (HRI)6)の 4 種類が同定されている。各 eIF2αキナーゼはそれぞれ異なるストレスを感知して活1

性化することが知られ、その典型例として、PERK は小胞体ストレス、GCN2 はアミノ酸の枯渇、PKR はウィルス感染、HRI はヘムの欠乏をストレスとして感知する。活性化
した eIF2αキナーゼは eIF2αの 51 番目のセリンをリン酸化し、これにより細胞内の全体的なタンパク質翻訳が抑制される。その一方で mRNA の 5’-untranslated region (5’UTR) に upstream open reading frame 配列を有する ATF4 は選択的に翻訳が促進され、発現量が上昇する 7, 8)。ATF4 は転写因子として働き、タンパク質の折りたたみや、アミノ酸の生合成及び代謝、レドックス代謝等に機能するタンパク質の転写を促進すること
で、細胞のストレス適応に寄与する 9-11)。

Integrated Stress Response (ISR)
StressVirus infection
Heme deficiency

eIF2α kinases

HRI P

ER stress

PKR P PERK P

Amino acidstarvation

GCN2 P
eIF2α P
ATF4

Stress-related genes
Protein folding
Amino acid import and metabolism
Autophagy
Redox/Detoxification

Adaptation to Stress condition
図 1. Integrated Stress Response は多様なストレスに応答し、ストレス環境下における細胞生存に寄与する。

2

3. 活性型がん遺伝子 BRAFV600E
がん遺伝子の異常な活性化は、現在のがん治療において重要な治療標的であり、これま
でにオンコジェニックシグナルを阻害する多数の薬剤が承認され、今もなお開発が進められている。例えば、EGFR (epidermal growth factor receptor)、KRAS (V-Ki-Ras2
kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog)、及び BRAF (V-Raf murine sarcoma
viral oncogene homolog B) 等のがん遺伝子の変異や増幅は、各がんの特徴となり、それに合わせた阻害剤を選択することで、高い治療効果を得ることに貢献している 12)。
活性型がん遺伝子 BRAFV600E はがん全体の 8%に認められ、メラノーマでは 50%、甲状腺乳頭がんでは 30-70%、卵巣がんでは 30%、大腸がんでは 10%の割合で認められる

BRAFV600E は 600 番目のアミノ酸残基のバリンがグルタミン酸へ置換することで、13-15)。

本来 BRAF の活性化に必要な 599 番目のスレオニンと 602 番目のセリンのリン酸化を模倣し、Ras 非依存的な恒常的活性化により野生型 BRAF に比べ 500 倍のキナーゼ活性を保持すると考えられている 16)。BRAF は mitogen-activated protein kinase (MEK) をリン酸化し、MEK は mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated
kinase (MAPK/ERK) をリン酸化することで細胞増殖及び生存シグナルを伝達する 17)。
活性変異型 BRAF によって MEK-ERK シグナル経路が恒常的に活性化され、がん細胞の増殖が促進される。

4. 選択的 BRAF 阻害剤 vemurafenib
BRAF 阻害剤 vemurafenib (商品名 Zelboraf) は V600 変異を有する BRAF キナーゼ
を選択的かつ強力に阻害することで、がん細胞の増殖を抑制することで抗腫瘍効果を発揮することから、BRAF V600 変異を有するメラノーマに対する治療薬として開発された18)。Vemurafenib は BRAF 変異型メラノーマ患者の治療において奏効率 60-80%の非常に高い治療効果が報告されているが 19)、完全にがん細胞を死滅させることはできず、最終的には vemurafenib の作用から免れたがん細胞が再び増殖する。また、再増殖したが3

ん細胞が獲得する vemurafenib 耐性の分子機序として、MEK1 変異や neuroblastoma
Ras viral oncogene homolog (NRAS) 変異等による増殖シグナルの再活性化が明らかとそのため、2015 年には vemurafenib に MEK 阻害剤である cobimetinib
なっている 20, 21)。
(商品名 Cotellic) の併用療法が承認され、治療効果の改善が報告されている 22)。しかし、さらなる変異やバイパスシグナルによる増殖シグナルの再活性化が繰り返され、根本的な解決には至っていない。そこで、最初の vemurafenib 治療の効果を増強させる標的分子や、耐性を獲得した細胞に有効な標的分子の発見が期待されている。

5. Vemurafenib による ISR 活性化の報告
近年、vemurafenib が BRAF 変異型メラノーマ細胞において ISR を活性化させることが報告された 23, 24)。ISR は先に述べたようにストレス環境下における細胞生存に重要な
ストレス適応応答機構であることから、ISR が vemurafenib の治療効果を向上させる標的分子として注目されている。しかし、先行研究の報告では vemurafenib による ISR 活性化の分子機序及び vemurafenib の薬理効果における意義についてもあまり明らかにされていなかった。そこで、本研究では活性変異型 BRAF による ISR 制御機構解明の足がかりとして、はじめに vemurafenib が誘導する ISR の分子機序について検討することと
した。

4

本論

研究目的

本研究では、活性型がん遺伝子 BRAF によるストレス適応応答機構 Integrated stressresponse (ISR) の制御メカニズムの解明に基づいて、ストレス適応応答を標的とした新
しいがん治療戦略の分子基盤を築くことを研究目的とした。これまでの研究では、活性型がん遺伝子は増殖・生存シグナルの制御が話題の中心にあり、一方、がん細胞の代謝スト
レス適応応答に関しても下流で働くストレス関連分子や代謝経路の解析が精力的に行われてきた。今回新たに、がん細胞における代謝ストレス適応応答の制御機構をがん遺伝子の機能と関連付けることは、がんの幅広い研究分野に重要な知見を与えることができると考えられる。さらに、BRAF 阻害剤 vemurafenib を用いた解析を行うことで、実際の臨床における治療効果を改善することに役立つ標的分子を見出すことが期待できる。本
研究により、これまで以上に、がんの代謝ストレス適応応答を標的とする治療戦略の重要性を提示できるものと考えられる。
第一章では、vemurafenib による ISR 活性化の分子機序とその意義について検討し、第二章では vemurafenib に誘導される ISR に対する選択的阻害の探索を行い、その有用性を評価した。最後に、第三章では活性変異型 BRAF の新たな機能として，ATF4 の発現を制御するメカニズムの解析を行った。

5

第一章

BRAF 阻害剤 vemurafenib によるIntegrated stress response (ISR) 活性化機序とその意義

第一節

BRAF 阻害剤は BRAFV600E 変異型細胞株において ISR を活性化する

これまでに BRAF 阻害剤 vemurafenib は、BRAFV600E 変異型メラノーマ細胞株において ISR を活性化させることが報告されていたため 23, 24)、我々は BRAF 変異と ISR 活性化の関係性について検討した。BRAFV600E を発現するメラノーマ細胞株 A375 と野生型
BRAF (BRAFWT) を発現するメラノーマ細胞株 SK-MEL-2 及び MeWo を用いて、
vemurafenib を処理した時の薬剤感受性及び ISR 活性化の指標となる eIF2αのリン酸化
及び ATF4 発現誘導について検討した。A375 細胞は vemurafenib に対し高い感受性を示し、それに比べて SK-MEL-2 及び MeWo 細胞では vemurafenib 処理による細胞増殖
阻害作用は認めなかった (Fig. 1A)。これらの細胞株に vemurafenib 10 µM を 4 時間処理した時の ISR 活性化についてウェスタンブロッティング法により検討したところ、
A375 細胞では vemurafenib 処理による顕著な eIF2αのリン酸化と ATF4 発現の誘導を認め、一方で SK-MEL-2 及び MeWo 細胞ではそれらの誘導は非常に弱かった (Fig. 1B)。
A375 細胞と同様に、BRAFV600E を発現し、vemurafenib に対し高い感受性を示す他の
BRAFV600E 変異型メラノーマ細胞株 G-361、WM-115、SK-MEL-1 及び BRAFV600E 変異型大腸がん細胞株 HT-29 においても、vemurafenib 処理によって eIF2αのリン酸化及びATF4 発現が誘導された (Fig. 1C 及び 1D)。これらの結果より、vemurafenib は
BRAFV600E 変異型細胞株選択的に、4 時間以内に ISR 活性化を引き起こすことを明らかとした。また、
他の選択的 BRAF 阻害剤 dabrafenib も vemurafenib と同様に、
BRAFV600E
変異型メラノーマ細胞株に対して細胞増殖阻害作用を示し、A375 及び G-361 細胞において 4 時間以内に ISR を活性化させることを見出した (Fig. 1E-1G)。

6

0.1

1.0

10.0

100.0

A375

75

G-361

50

WM-11525

SK-MEL-1
0.0

0.1

1.0

10.0

125
100

Cont.
VEM

Cont.
VEM

Cont.
VEM
1 10

VEM
1 10

VEM
1 10

HT-29
VEM
1 10

MeWo (BRAFWT)

50

A375 (BRAFV600E)

25
100.0

G

125
100

HT-29

75

A375

50

G-361

25
0.0

0.0

0.1

1.0

10.0

Dabrafenib (µM)

100.0p-eIF2α (S51)eIF2α
WM-115ATF4SK-MEL-1
RPL7

A375

G-361

HT-29

DAB

DAB

DAB

0.1 1

0.1 1

0.1 1

VEM

10.0

VEM

1.0

Cont.

0.1

Cont.

0.0

VEM

0.0

Cont.

Cell viability (% of control)

1 10

WM-115 SK-MEL-1

SK-MEL-2 (BRAFWT)

75

0

VEM

p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

Dabrafenib (µM)

F

G-361

VEM

100.0

Vemurafenib (µM)

0

D A375
Cont.

HT-29

Cont.

0.0

p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

Cont.

0.0

Vemurafenib (µM)

0

A375

Cont.

A375 (BRAFV600E)

250SK-MEL-2 MeWo

MeWo (BRAFWT)50

BRAFV600E

BRAFWT

SK-MEL-2 (BRAFWT)

75

100

Cell viability (% of control)

E

100

125

Cell viability(% ofCell viability(%control)of control)

C

B

125

Cont.

Cell viability(% ofCell viability(% control)of control)A

Figure 1. BRAF 阻害剤は BRAFV600E 変異型細胞株において ISR を活性化する(A, E) SK-MEL-2、MeWo 及び A375 細胞を図中に示す濃度の vemurafenib (A) またはdabrafenib (E) で 48 時間処理し、細胞生存率を MTT アッセイ法により測定した (±SD, n=3)。(B) SK-MEL-2、MeWo 及び A375 細胞を vemurafenib (VEM, 10 µM) で 4
時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(C, F)
BRAFV600E 変異型細胞株を図中に示す濃度の vemurafenib (C) または dabrafenib (F) で
48 時間処理し、細胞生存率を ATP アッセイ法により測定した (±SD, n=3)。(D, G)
BRAFV600E 変異型細胞株を vemurafenib (1 または 10 µM) (D) または dabrafenib (DAB,
1 µM) (G) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析し
た。
7

第二節

BRAF 下流 MEK-ERK シグナルと Akt シグナルは、vemurafenib による
ISR 活性化に関与しない

Vemurafenib による ISR 活性化に BRAF 下流の MEK-ERK シグナルが関与しているのか検討した。A375 細胞に MEK 阻害剤 trametinib を 4 時間処理したところ、
vemurafenib 処理時と同様に MEK 及び ERK のリン酸化が抑制されたが、eIF2αのリン酸化及び ATF4 発現誘導は認められなかった (Fig. 2A)。Trametinib と vemurafenib の併用においても、trametinib 処理は vemurafenib に誘導される ISR 活性化に影響を与えなかった (Fig. 2B)。他の BRAFV600E 変異型細胞株である G-361 及び BRAF 野生型細胞株である SK-MEL-2 においても、trametinib による MEK-ERK シグナル阻害によるISR 活性化は認められなかった (Fig. 2C)。
BRAF のもう一つの主要な下流シグナル分子である Akt のリン酸化についても検討したが、vemurafenib 処理による Akt のリン酸化の変動は、ERK のリン酸化のように一律
ではなく、細胞株及び vemurafenib の濃度によって異なる反応を示した (Fig. 2D)。これらの結果より、vemurafenib による ISR 活性化に MEK-ERK 及び Akt シグナル経路は関与しないと考えた。

8

B

A375
TRA
0.1 1 10VEM

p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
p-MEK

Cont. VEM

TRA
p-eIF2α (S51)- + -+(S217/S221)(Y204/T202)(Y204/T202)

MEK
p-ERK

Cont.

VEM

SK-MEL-2- 1 10 - 1 10 - 1 10 VEM

G-361

eIF2α
ATF4
p-ERK

(Y204/T202)

MEK
p-ERK

ERK
RPS3

ERK
RPL7

VEM

VEM

1 10

Cont.

G-361

Cont.

A375

1 10

WM-115 SK-MEL-1
Cont.

ERK
RPL7

G-361

TRA
p-eIF2α (S51)

eIF2α
ATF4
p-MEK

(S217/S221)

D

C

A375

VEM
1 10

Cont.

Cont.

A

VEM
1 10

p-ERK (Y204/T202)
ERK
p-Akt (S473)
Akt

Figure 2. BRAF 下流 MEK-ERK シグナルと Akt シグナルは、vemurafenib による ISR
活性化に関与しない(A) A375 細胞を trametinib (TRA, 0.1, 1 または 10 nM) または vemurafenib (VEM, 10µM)で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(B)A375 細胞を trametinib (1 nM) 単独または、vemurafenib (10 µM) と併用して 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(C) G-361 及びSK-MEL-2 細胞を trametinib (1, 10 nM) または、vemurafenib (10 µM) と併用して 4時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。 (D)BRAFV600E 変異型細胞株を vemurafenib (1 または 10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。

9

第三節 Vemurafenib は GCN2 を介して ISR 活性化を引き起こす

Vemurafenib による ISR 活性化に関与する eIF2αキナーゼを同定するため、これまでに知られている 4 種の eIF2αキナーゼそれぞれに対する siRNA を用いたノックダウン実験を行った。その結果、A375 及び HT-29 細胞において、アミノ酸飢餓センサー分子である GCN2 のノックダウンにより vemurafenib による eIF2αのリン酸化及び ATF4 発現誘導が抑制されることを見出した (Fig. 3A 及び Supplementary Fig. S1A: alternative
siRNA)。これに対して、他の eIF2αキナーゼである PERK、PKR 及び HRI のノックダ
ウ ン は vemurafenib に よ る ISR 活 性 化 に 影 響 を 与 え な か っ た (Fig. 4A 及 び
Supplementary Fig. S1B-S1D)。ただし、HRI のノックダウンは、異なる配列の 2 種のsiRNA を用いても他の eIF2αキナーゼに比べて十分なノックダウン効率が得られなかった。
Vemurafenib 処理により GCN2 の活性化が誘導されるのか、GCN2 活性化の指標となる 899 番目のスレオニンのリン酸化を解析した 25-27)。その結果、用いた BRAFV600E 変異型細胞株全てにおいて、vemurafenib 10 µM の処理による GCN2 Thr899 のリン酸化誘導を認めた (Fig. 3B)。さらに、vemurafenib 処理による ISR 活性化の経時的変化を検討したところ、A375 及び G-361 細胞において vemurafenib 10 µM の処理より 1 時間後には GCN2 及び eIF2αのリン酸化が生じ、それに続いて 4 時間後から ATF4 の発現誘導が起こり、その後 ATF4 発現量は徐々にベースラインへ戻ることを認めた (Fig. 3C)。
次に、転写因子として働く ATF4 の核における発現誘導を蛍光免疫染色法により検討した。A375 細胞において、核における ATF4 発現は vemurafenib 10 µM を 6 時間処理することで増加し、この発現増加は GCN2 のノックダウンにより抑制され、PERK のノックダウンでは抑制されなかった (Fig. 3D)。これらの結果より、vemurafenib は
BRAFV600E 変異型細胞株において GCN2 の活性化を介して ISR 活性化を誘導することを明らかとした。
10

C

A375
VEM

Time (h)HT-29

D

p-GCN2 (T899)
GCN2
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

A375
Cont.
GCN2

Cont.

- 1 4 8 16 24

GCN2

PERK

G-361
VEM

- 1 4 8 16 24

A375

5

VEM
PERK

Cont.
VEM

p-GCN2 (T899)
GCN2
RPL7

A375

GCN2
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

siRNA Cont.

WM
SK-115 -MEL-1 HT-29
Cont.
VEM

-

A375 G-361

Cont.
VEM

-

B

Cont.
VEM

GCN2
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

VEM

ATF4 mean intensity

siRNA

Cont.

Cont.
VEM

A

4
3

ATF4

2

Nucleus

1

siRNA

Merge

siControl siGCN2

siPERK

VEM

Figure 3. Vemurafenib は GCN2 を介して ISR 活性化を引き起こす(A) A375 及び HT-29 細胞に GCN2 に対する siRNA を導入した後、vemurafenib (VEM,
10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。
(B) BRAFV600E 変異型細胞株を vemurafenib (10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(C) A375 及び G-361 細胞を vemurafenib(10 µM) で図中に示す時間でそれぞれ処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(D) A375 細胞に GCN2 または PERK に対する siRNA を導入した
後、vemurafenib (10 µM) で 6 時間処理した。細胞を固定後、ATF4 に対する抗体を用いて染色した。棒グラフは、コントロール siRNA を導入条件下、薬剤未処理におけるATF4 シグナルの intensity を 1 とした時の各条件における核における ATF4 シグナルのintensity を示した (±SD, n=3)。

11

第四節

PERK 及び小胞体ストレスは vemurafenib による短時間における ISR 活性化に関与しない

先行研究において、vemurafenib による ISR 活性化には小胞体ストレスセンサー分子である PERK の活性化が関与することが提唱されていたため、我々も vemurafenib 処理と小胞体ストレス及び PERK の関与について検証を行った。しかし、A375、G-361 及びWM-115 細胞において、PERK をノックダウンしても vemurafenib による eIF2αのリン酸化及び ATF4 発現誘導は抑制されなかった (Fig. 4A 及び Supplementary Fig. S1B:
alternative siRNA)。さらに、PERK 選択的な阻害剤 GSK2656157 を用いた検討を行った結果、2DG 10 mM 処理条件下においては GSK2656157 0.1 µM の処理により PERKの活性化 (高分子量へのバンドシフト) 及び ISR 活性化の抑制を認めたが、vemurafenib
10 µM 処理条件下においては GSK2656157 を処理しても ISR の活性化は抑制されなかった (Fig. 4B)。また、小胞体ストレスに対する応答のマーカー分子である glucose-

regulated protein 78 (GRP78) のプロモーター活性をレポーターアッセイ法 28, 29)により測定したところ、小胞体ストレスを誘導する 2DG 及び tunicamycin 処理条件下では明らかな GRP78 のプロモーター活性の上昇を認めたのに対し、vemurafenib 処理条
件下ではそのような上昇は認めなかった (Fig. 4C)。GRP78 及び GRP94 タンパク質発現についても vemurafenib 処理条件下において増加しないことを確認した (Fig. 4D)。
次に、マイクロアレイを用いて、A375 細胞における vemurafenib、2DG またはtunicamycin 処理時の遺伝子発現変動を解析した (Fig. 4E 及び Supplementary Table1)。クラスタリング解析の結果、vemurafenib と 2DG 及び tunicamycin 間で共通して変動したプローブは全体の一部分に限られていた。全ての条件で共通して発現上昇を認めた 114 プローブセットに対し、Gene Ontology (GO) 解析を行った結果、このクラスタ
ーにはアミノ酸の生合成に関わる遺伝子が多く含まれていることが示唆された (Table 1
及び Supplementary Table S2)。一方、2DG 及び tunicamycin 処理による小胞体ストレ12

ス負荷時に発現上昇した 207 プローブセットに対し GO 解析を行った結果、小胞体に関連する遺伝子が上位にエンリッチしていた (Table 2 及び Supplementary Table S3)。これらの結果より、vemurafenib を短時間で処理した BRAFV600E 変異型細胞株では、小胞体ストレス及び PERK の活性化は誘導されないことが示唆された。

13

A

A375
Cont.
VEM
siRNA

PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

B

-

A375

PERK

Cont. 2DG VEM- + -+ -+ - + -+ -+ - + -+ -+

A375

12

10

10

8

8

6

6

4

4

2

2

GRP78-Luc activity(relative to control)

WM-115p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

C 12

0

G-361

Cont. 2DG VEM Cont. 2DG VEM

GSK2656157

E

-

G-361
WM-115Cont. VEM Cont. VEM

1 1 VEM
3 3 VEM
1010 2DG TM
Control VEMCont.
2DG TM
VEM

0

G-361

D

A375

G-361
GRP94
GRP78

KDEL
RPS3
1 1 VEM
3 3 VEM
1010 2DG TM
Control VEMCont.
2DG TM
VEM

3.00
2.00
1.00
0.00
-1.00
-2.00
-3.00

A375
2DG
TM
VEM
207 probes

114 probes

14

Figure 4. PERK 及び小胞体ストレスは vemurafenib による短時間における ISR 活性化に関与しない(A) BRAFV600E 変異型細胞株に PERK に対する siRNA を導入した後、vemurafenib (VEM,
10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。
(B) BRAFV600E 変異型細胞株に GSK2656157 (0.1 µM) を 1 時間前処理し、その後 2DG(10 mM) または vemurafenib (10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェス
タンブロット法により解析した。(C) A375 及び G361 細胞に pGRP78pro 160-Luc を導入した後、vemurafenib (1, 3 または 10 µM)、2DG (10 mM) または tunicamycin (TM,
1 µg/ml) で 18 時間処理し、GRP78 プロモーター活性をレポーターアッセイ法により測定した (±SD, n=3)。(D) A375 及び G361 細胞を vemurafenib (10 µM)、2DG (10 mM)または tunicamycin (1 µg/ml) で 18 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロ
ット法により解析した。抗 KDEL 抗体は GRP78 及び GRP94 を検出する。(E) A375 細胞に vemurafenib (10 µM)、2DG (10 mM) または tunicamycin (1 µg/ml) を 6 時間処理し、精製した RNA を用いてマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った。薬剤未処理の条件に対し 2 倍以上の発現上昇または 2 分の 1 以下の発現低下を認めた 395 プローブ
について、クラスター解析を行った。

15

Table 1. A375 細胞における vemurafenib、2DG または tunicamycin 処理時に共通して発現上昇を認めた 114 プローブセットに対する GO 解析結果
Rank *
Category
1
SP_PIR_KEYWORDS
2
GOTERM_BP_FAT
3
GOTERM_BP_FAT

Termamino-acid biosynthesis
GO:0008652~cellular amino acid biosynthetic process
GO:0009070~serine family amino acid biosynthetic process

PValueFDR †3.05E-06 3.61E-03
4.02E-06 6.22E-03
1.62E-05 2.51E-02*上位 3 terms を記載した (全ての解析結果は Supplementary Table S2 を参照)。
†FDR, false discovery rate.

Table 2. A375 細胞における 2DG または tunicamycin 処理時に共通して発現上昇を認めた 207 プローブセットに対する GO 解析結果
Rank *
Category
1 SP_PIR_KEYWORDS
2 GOTERM_CC_FAT
3 GOTERM_CC_FAT

Term
endoplasmic reticulum
GO:0005783~endoplasmic reticulum
GO:0044432~endoplasmic reticulum part

PValueFDR †3.05E-11 3.82E-08
4.88E-11 6.13E-08
2.20E-09 2.76E-06*上位 3 terms を記載した (全ての解析結果は Supplementary Table S3 を参照)。
†FDR, false discovery rate.

16

第五節 Vemurafenib による ISR に制御される遺伝子の解析

A375 細胞における vemurafenib 処理条件下における遺伝子発現変動のうち、GCN2ATF4 経路によって制御される遺伝子をマイクロアレイ解析により探索した。GCN2 ま
たは ATF4 をノックダウンした A375 細胞を、vemurafenib 10 µM で 6 時間処理し、精製した RNA をマイクロアレイ解析に用いた。クラスタリング解析の結果、vemurafenib
処理によって変動する大部分の遺伝子は、GCN2 または ATF4 のノックダウンによる影響を受けなかった (Fig. 5A 及び Supplementary Table S4)。それらの中には、キナーゼ
シグナルやアポトーシス制御に関与する JUN, MCL1 及び CDC41EP3 等の遺伝子が含まれていた。Vemurafenib 処理によって発現上昇し、GCN2 または ATF4 のノックダウンによって発現が抑制された 22 プローブには、セリンの生合成及び代謝に関与する遺伝子、phosphoserine aminotransferase 1 (PSAT1)、phosphoserine phosphatase (PSPH)、
cystathionine-β-synthase (CBS) 及び cystathionine-γ-lyase (CTH) が含まれていた(Fig. 5A 右、影付きの遺伝子)30, 31)。これらの遺伝子は ATF4 による転写制御を受けることが報告され 32, 33)、さらにこれらの遺伝子がコードするセリン生合成及び代謝を触媒する酵素は、近年がん細胞の増殖における重要性が示唆されている 34, 35)。実際に、BRAFV600E
変異型細胞株において vemurafenib を 8 から 24 時間処理することで PSAT1、PSPH、
CBS 及び CTH のタンパク質発現量が増加することを認めた (Fig. 5B)。以上の結果より、
BRAFV600E 変異型細胞株において vemurafenib 処理によって活性化した GCN2-ATF4 経路の下流では、アミノ酸の生合成、特にセリンの生合成及び代謝が増強されることが示唆
された。

17

A
A375
siCont.
VEM siGCN2
siATF4

PSAT1
PSPH
CBS
CTH
RPL7

Cont.
VEM

- 4 8 16 24

G-361 WM-115 HT-29
Cont.
VEM

Time (h)

A375
VEM

Cont.
VEM

3.00
2.00
1.00
0.00
-1.00
-2.00
-3.00

B

22 probes

PSAT1
PSPH
CBS
CTH
RPL7

CBS
SLC7A11
CEBPG
ASNS
PSAT1
SARS
PSAT1
ATF3
NUPR1
VLDLR
CAMTA2
GPX8
PIGC
PSPH
PSPH
CTH
UHRF1BP1
CBS
ALDH1L2
CHAC1
RAB39B
JDP2

Figure 5. Vemurafenib による ISR に制御される遺伝子の解析(A) A375 細胞に GCN2 または ATF4 に対する siRNA を導入した後、vemurafenib (VEM,
10 µM) で 6 時間処理し、精製した RNA を用いてマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った。コントロール siRNA 導入後、薬剤未処理条件に対し vemurafenib 処理条件において 2 倍以上の発現上昇または 2 分の 1 以下の発現低下を認めた 563 プローブについて、クラスター解析を行った。右に示した 22 プローブの遺伝子名のうち、セリンの生合
成及び代謝経路に関与する遺伝子名を影付きで示した。(B) BRAFV600E 変異型細胞株を
vemurafenib (10 µM) で図中に示す時間でそれぞれ処理したライゼート (左: A375) ま
たは 24 時間処理したライゼート (右: G-361 及び WM-115) を調製し、ウェスタンブロ
ット法により解析した。

18

第六節

ATF4 ノックダウンは vemurafenib による細胞増殖阻害を増強する

Vemurafenib による ISR 活性化が細胞増殖に与える影響について、ATF4 をノックダ
ウ ンす るこ とで 検討した 。 ATF4 に対 す る siRNA を 導 入し た A375 細 胞で は 、vemurafenib 処 理 に よ る ATF4 発 現 誘 導 が 効 果 的 に 抑 制 さ れ た (Fig. 6A 及 び
Supplementary Fig. S2A: alternative siRNA)。ATF4 をノックダウンした A375 細胞を
vemurafenib 10 µM で 24 時間処理し、その後、細胞を播き直して vemurafenib 不含有培地で 7 日間培養した。形成したコロニーを観察したところ、ATF4 のノックダウンのみ
では細胞増殖能に大きな影響を与えず、vemurafenib 処理のみでは薬剤未処理の細胞に比べて細胞増殖がおよそ 60%に抑制された (Fig. 6B 及び Supplementary Fig. S2B:
alternative siRNA)。ATF4 のノックダウンと vemurafenib を共処理した細胞では、薬剤
未 処 理 の 細 胞 に 比 べ て 細 胞 増 殖 が お よ そ 30% に ま で 抑 制 さ れ た (Fig. 6B 及 び
Supplementary Fig. S2B)。この結果より、vemurafenib による GCN2 を介した ISR の活性化は vemurafenib の作用に対し細胞防御に働くことが示唆された。一方で、GCN2に対するノックダウンでは vemurafenib に対する感受性の増強は認められなかった(Fig. 6C)。この正確な原因は明らかではないが、GCN2 ノックダウンでは ATF4 下流の転写プログラムが完全に抑制されず、vemurafenib に対する感受性化作用が減弱したと考えられる。実際に GCN2 のノックダウンでは ATF4 のノックダウンに比べ、vemurafenib に誘導される ATF4 発現の抑制効果が弱いことを認めた (Fig. 6D)。従って、
vemurafenib に対する感受性の増強には強い ATF4 の抑制が必要と考えられる。
ATF4
ノックダウンによる vemurafenib の細胞増殖阻害作用の増強は、他の BRAFV600E 変異型
メラノーマ細胞株 G-361 においても同様に観察された (Supplementary Fig. S2C 及び
S2D)。

19

Colony area(relative to control)

0.4
0.2

C

A375

Cont.

1.2

VEM

siATF4siATF4ControlCont.

siCont.
siControl

siATF4siATF4siCont.
siControl

0.0

VEM
VEM

A375

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

ControlCont.

siGCN2
siGCN2

p-GCN2 (T899)
GCN2
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4

- 4 8 - 4 8 - 4 8

0.6

siControl
siCont.

VEM (time, h)0.8

siGCN2
siGCN2D

A375
siCont. siGCN2 siATF4

A375

1.0

siCont.
siControl

p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

VEM

Colony area(relative to control)

PERK

Cont.

1.2

siCont.

p-GCN2 (T899)
GCN2

A375

siATF4siRNA

B

siCont.

A375
Cont. VEM

siGCN2A

VEM
VEM(long exposure)

RPS3

Figure 6. ATF4 ノックダウンは vemurafenib による細胞増殖阻害を増強する(A) A375 細胞に ATF4 に対する siRNA を導入した後、vemurafenib (VEM, 10 µM) で
4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(B, C) A375
細胞に ATF4 (B) または GCN2 (C) に対する siRNA を導入した後、vemurafenib (10µM) で 24 時間処理し、細胞を 6 ウェルプレートに播き直し、薬剤不含有の培地で 7 日間培養した。形成したコロニーをクリスタルバイオレットで染色し、ウェルごとのコロニ
ー面積を棒グラフに示した (±SD, n=3)。(D) A375 細胞に GCN2 または ATF4 に対する
siRNA を導入した後、vemurafenib (VEM, 10 µM) で 4 または 8 時間処理したライゼー
トを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。

20

第二章

Vemurafenib による ISR に対する選択的阻害剤の探索

GCN2 を介した ISR の活性化は vemurafenib の細胞増殖阻害作用に対して細胞保護的に働いたことから、ISR が vemurafenib の治療効果を向上させる新たな治療標的として有用であると考えた。そこで、vemurafenib による ISR 活性化を選択的に抑制する低分子化合物を探索することとした。

第一節 mTOR 阻害剤及び PI3K 阻害剤はストレスの種類非選択的に ATF4 発現誘導を抑制する

Vemurafenib による ISR を阻害する低分子化合物の探索リソースとして 355 種のキナーゼ阻害剤ライブラリーを用いて、ATF4 蛍光免疫染色法によるスクリーニングを行った。
A375 細胞に vemurafenib 10 µM と各キナーゼ阻害剤 2 µM を 6 時間共処理した後、細胞を固定し核内における ATF4 発現を蛍光免疫染色により検出した。コントロールに
対し vemurafenib 処理によって上昇した ATF4 の intensity を 100%とし、各キナーゼ阻
害剤を共処理した時の ATF4 intensity をグラフに示した (Fig. 7A)。355 種のキナーゼ阻害剤の中には、ATF4 発現を vemurafenib よりもさらに誘導するもの、逆に抑制するものが含まれていた。特に ATF4 発現を強く抑制したキナーゼ阻害剤には、mammaliantarget of rapamycin (mTOR) 阻害剤や phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase(PI3K) 阻害剤が多く含まれていた (Fig. 7A)。次に、それらの mTOR 及び PI3K 阻害剤の中から、AZD8055、PP242、BEZ235、PI-103 及び ZSTK474 の ATF4 発現抑制作用のストレス選択性を検討した。A375 細胞にそれぞれの阻害剤または PERK 阻害剤
GSK2656157 と vemurafenib、2DG、tunicamycin または L-histidinol (アミノ酸飢餓を
ミミックするヒスチジン誘導体) を処理した時の ATF4 発現を蛍光免疫染色法により検出した結果、GSK2656157 は PERK 誘導性の ATF4 発現 (2DG 及び tunicamycin) に選21

択的な阻害作用を示したのに対し、mTOR 及び PI3K 阻害剤は全てのストレッサー処理
条件下において ATF4 発現誘導を抑制した (Fig. 7B 及び 7C)。
ただし、
特に vemurafenib、
2DG 、 L-histidinol 処理 に よ る ATF4 発 現誘 導 が強 く 抑え られ 、そ れ に比 較 してtunicamycin 処理による ATF4 発現誘導はやや弱く抑制される傾向を認めた。これらの
mTOR 及び PI3K 阻害剤は、mTOR シグナルを強力に阻害することでタンパク質翻訳を抑制し、ATF4 の発現誘導を阻害したものと考えられる。以上より、mTOR 及び PI3K 阻
害剤は vemurafenib による ATF4 発現誘導を強く抑制したものの、vemurafenib に選択的な作用ではなかったため治療薬の候補には適していないと考えた。

22

800

60

700
600
500
400

2.0

100%

1.5
1.0
0.5
0.0

Cont.
VEM

300
200

ATF4 mean intensity(% of vemurafenib treatment)

2.5

ATF4 mean Intensity(relative to Cont.)

ATF4 mean intensity(% of vemurafenib treatment)

A

40
20
0
-20

-60
-80

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55

100
0355 Kinase inhibitors
1
8
15
22
29
36
43
50
57
64
71
78
85
92
99
106
113
120
127
134
141
148
155
162
169
176
183
190
197
204
211
218
225
232
239
246
253
260
267
274
281
288
295
302
309
316
323
330
337
344
351

-100
-200

mTOR inhibitor
PI3K inhibitor
AT9283

-40

B

Cont.

AZD8055 PP242

BEZ235

PI-103

ZSTK474

GSK

Normal

VEM

2DG

αATF4

TM

HIS
A375
120

PI3K inhibitor

ATF4 mean Intensity(% of control)

100
80

VEM

mTOR inhibitor

60
40

2DG

20

TM

0

HIS

-20
-40

Cont.

AZD8055

PP242

BEZ235

23

PI-103

ZSTK474

GSK(PERK inhibitor)

Figure 7. mTOR 阻害剤及び PI3K 阻害剤はストレスの種類非選択的に ATF4 発現誘導を抑制する(A) A375 細胞に各キナーゼ阻害剤 (2 µM) と vemurafenib (VEM, 10 µM) を 6 時間共処理し、細胞を固定後、ATF4 に対する抗体を用いて染色した。グラフは横軸に 355 種のキナーゼ阻害剤を示し、縦軸に vemurafenib 処理によって上昇した ATF4 シグナルのintensity を 100%とした時の各キナーゼ阻害剤処理条件下における ATF4 シグナルのintensity を示した。黒色で示した棒グラフは mTOR 阻害剤、グレー色で示した棒グラ
フは PI3K 阻害剤、赤色で示した棒グラフは AT9283 (第二節参照) を示した。(B) A375
細胞に AZD8055、PP242、BEZ235、PI-103、ZSK474 (全て 2 µM) または GSK2656157(0.1 µM) と vemurafenib (10 µM) を 6 時間共処理し、細胞を固定後、ATF4 に対する抗体を用いて染色した。棒グラフは、各ストレッサーのみを処理した時の ATF4 シグナルの intensity を 100%とした時の各キナーゼ阻害剤処理条件下における ATF4 シグナルのintensity を示した (±SD, n=3)。

24

第二節

AT9283 は vemurafenib による ATF4 発現誘導を選択的に抑制するスクリーニングを行ったキナーゼ阻害剤の中で mTOR 阻害剤や PI3K 阻害剤と同様に
vemurafenib による ATF4 発現誘導を強く抑制する阻害剤として、janus kinase (JAK)
2/3 阻害剤として知られる AT9283 が含まれていた (Fig. 7A 及び Fig. 8A)。AT9283 は、
2DG、tunicamycin 及び L-histidinol 処理によって誘導される ATF4 発現は抑制せず、
vemurafenib 処理によって誘導される ATF4 発現を強く抑制した (Fig. 8B)。AT9283 の各ストレス条件における eIF2α キナーゼ及び eIF2αのリン酸化に与える影響を検討した
結果、AT9283 は vemurafenib 処理によって誘導される GCN2 のリン酸化を選択的に抑制し、L-histidinol 処理による GCN2 の活性化及び 2DG と tunicamycin 処理による
PERK の活性化は抑制しなかった (Fig. 8C)。AT9283 による vemurafenib 誘導性のATF4 発現抑制作用は 10 nM から 1 µM にかけて濃度依存的に生じ、さらに dabrafenib
による GCN2 を介した ISR も同様に抑制することを認めた (Fig. 8D)。以上より、
AT9283は BRAF 阻害剤 vemurafenib 及び dabrafenib によって誘導される ISR を選択的に抑制する ISR 阻害剤であると考えられる。

25

A

AT9283Chemical Formula: C19H23N7O2
Molecular Weight: 381.44

VEM

2DG

TM

HIS

-

140

ATF4 mean intensity(% of control)

VEM

2DG

VEM

2DG

TM

HIS

TM

HIS

120

αATF4

AT9283

B
+

100

A375

C

A375
Cont. VEM 2DG TM

AT9283
p-GCN2 (T899)

80
60
40
20
0

HIS

AT9283

G-361
Cont. VEM 2DG TM

HIS- +- +- +- +- + - +- +- +- +- +

GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

D

Cont.
AT9283

p-GCN2 (T899)
GCN2
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

-

VEM

-

Cont.

-

DAB

A375

p-GCN2 (T899)
GCN2
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

G-361

26

Figure 8. AT9283 は vemurafenib による ATF4 発現誘導を選択的に抑制する(A) AT9283 の構造、化学構造式及び分子量を示した。(B) A375 細胞に AT9283 (0, 0.1,
0.2, 0.5 または 1 µM) と vemurafenib (VEM, 10 µM)、2DG (10 mM)、tunicamycin (TM,
1 µg/ml) または L-histidinol (HIS, 2 mM) を 6 時間共処理し、細胞を固定後、ATF4 に対する抗体を用いて染色した。棒グラフは、各ストレッサーのみを処理した時の ATF4 シ
グナルの intensity を 100%とした時の各濃度の AT9283 処理条件下における ATF4 シグ
ナルの intensity を示した (±SD, n=3)。(C) A375 及び G-361 細胞株に AT9283 (1 µM)と vemurafenib (10 µM)、2DG (10 mM)、tunicamycin (1 µg/ml) または L-histidinol (2mM) を 4 時間共処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。
(D) A375 及び G-361 細胞株に AT9283 (0, 0.01, 0.1 または 1 µM) と vemurafenib (10µM)、または dabrafenib (DAB, 1 µM) を 4 時間共処理したライゼートを調製し、ウェス
タンブロット法により解析した。

27

AT9283 は vemurafenib によって誘導されるアミノ酸代謝の恒常性を維持する

第三節

ための応答を抑制する

Vemurafenib、AT9283 及びそれらの共処理によって変動する遺伝子発現についてマイクロアレイ解析を用いて検討した。A375 細胞に vemurafenib 10 µM と AT9283 1 µM をそれぞれ単独または併用して 6 時間処理し、精製した RNA をマイクロアレイ解析に用いた。クラスタリング解析の結果、vemurafenib 処理によって発現が上昇した遺伝子の
うち、AT9283 の共処理によって 112 プローブの発現が強く抑制され、130 プローブの発現が中程度に抑制された (Fig. 9A 及び Supplementary Table S5)。これらのプローブセットに対し、GO 解析を行った結果、112 プローブセットのクラスターにはアミノ酸のト
ランスポーター活性に関わる遺伝子が多く含まれていることが示唆され、130 プローブ
セットのクラスターにはアミノ酸の生合成に関わる遺伝子が多く含まれていることが示唆された。(Supplementary Table S6 及び S7)。さらに、Gene Set Enrichment Analysis(GSEA) の結果、アミノ酸の枯渇状態に発現上昇する遺伝子が vemurafenib 単独処理に対して AT9283 を併用することで、抑制されることが示唆された (Fig. 9B)。AT9283 はvemurafenib が誘導するアミノ酸代謝の恒常性を維持するための応答を抑制すると考え
られる。

28

A
A375

2.00
1.33
0.67
0.00
-0.67
-1.33
-2.00

AT
VEM
VEM + AT112 probes

B

130 probes

KRIGE_AMINO_ACID_DEPRIVATIONPENG_LEUCINE_DEPRIVATION_UP

Figure 9. AT9293 は vemurafenib によって誘導されるアミノ酸代謝の恒常性を維持するための応答を抑制する(A) A375 細胞に vemurafenib (VEM, 10 µM) と AT9283 (AT, 1 µM) をそれぞれ単独または併用して 6 時間処理し、精製した RNA を用いてマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った。Vemurafenib 単独処理条件に対し、AT9283 の併用によって 1.5 倍以上の発現上昇または 0.75 倍以下の発現低下を認めた 432 プローブについてクラスター解析を行った。(B) 全 54675 プローブのうち、vemurafenib 単独処理条件または vemurafenibと AT9283 の共処理条件のどちらかにおいてシグナル強度 50 未満のものを除去した
17737 プローブを用いて GSEA 解析を行った。

29

第四節

AT9283 は vemurafenib と併用することで相乗的に細胞死を誘導する

AT9283 が vemurafenib の薬理作用に与える影響を検討した。A375 細胞において、
vemurafenib または dabrafenib に AT9283 を併用して 16 時間処理した結果、それぞれの単独処理に比べ、相乗的なカスパーゼ 3/7 活性の上昇を認めた (Fig. 10A)。さらに、
A375 及び G-361 細胞において、vemurafenib または dabrafenib に AT9283 を併用した
結果、アポトーシスの指標となる poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) の切断の増加を認めた (Fig. 10B)。これらの結果より、vemurafenib 及び dabrafenib に AT9283 を併用することで、相乗的にアポトーシスが誘導されることが示された。次に、アポトーシス
誘導の結果として、これらの薬剤の併用による細胞増殖への影響を検討した。A375 及びG-361 細胞において vemurafenib と AT9283 を 16 時間共処理し、その後細胞を播き直して 96 時間培養した。Vemurafenib 単独の処理ではコントロール条件に対しておよそ80%まで細胞が再増殖したのに対し、AT9283 の併用によってその増殖が強く抑制された(Fig. 10C)。また、同様に vemurafenib と AT9283 を 16 時間共処理し、その後細胞を播き直して 7 日間 (A375) または 14 日間 (G-361) 培養することで形成したコロニーを観察した場合にも、これらの薬剤の併用による相乗的な細胞増殖阻害効果を認めた (Fig.
10D)。以上より、AT9283 は vemurafenib 及び dabrafenib による ISR を選択的に抑制し、細胞死を誘導する新しい薬剤として有用と考えられる。

30

A

14.0
12.0

Caspase 3/7 activity(relative to control)

12.0

A375

A375

10.0

10.0

AT9283
0
10
30
100

8.0

8.0

6.0

6.0

4.0

4.0
2.0

2.0

0.0

0.0

Cont.

1

3
VEM

B

Cont.

10

0.1

0.3
DAB

1

VEM
Cont.

AT9283PARP
cleaved PARP
RPS3

-

-

3

-

10

Cont.

-

-

DAB

A375

PARP
cleaved PARP
RPS3

C

G-361

A375

120.0

100.0

80.0

80.0

60.0

60.0

40.0

40.0

20.0

20.0

Cell regrowth(% of control)

100.0

Cont.

AT9283

AT9283
0
10
30
100

0.0

0.0

D

G-361

120.0

Cont.

1

3
VEM
VEM
3

1

Cont.

10

10

Cont.

1

3
VEM

1

VEM
3

30

100
A375

G-361

31

10

10

Figure 10. AT9283 は vemurafenib と併用することで相乗的に細胞死を誘導する(A) A375 細胞に vemurafenib (VEM, 1, 3 または 10 µM) または dabrafenib (DAB, 0.1,
0.3 または 1 µM) と AT9283 (0, 10, 30 または 100 nM) を 16 時間共処理し、カスパー
ゼ 3/7 活性を測定した (±SD, n=3)。(B) A375 及び G-361 細胞に vemurafenib (3 または 10 µM) または dabrafenib (1 µM) と AT9283 (30 または 100 nM) を 16 時間共処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(C) A375 及び G-361
細胞に vemurafenib (1, 3 または 10 µM) と AT9283 (0, 10, 30 または 100 nM) を 16 時
間共処理した後、細胞を播き直した。薬剤不含有の培地で 96 時間培養した後、細胞生存率を ATP アッセイ法により測定した (±SD, n=3)。(D) A375 及び G-361 細胞に
vemurafenib (1, 3 または 10 µM) と AT9283 (30 または 100 nM) を 16 時間共処理した後、細胞を 6 ウェルプレートに播き直し、薬剤不含有の培地で 7 日間 (A375) または 14
時間 (G-361) 培養した。形成したコロニーをクリスタルバイオレットで染色した。

32

第三章 活性変異型 BRAFV600E による ISR 制御機構の解析

第三章では、活性変異型 BRAF そのものの機能に焦点を当て、活性変異型 BRAF がス
トレス応答シグナルの中でどのような役割を果たしているのか明らかにすることを目指した。そこで、はじめに BRAF のノックダウンが ISR シグナルに与える影響について検
討した。

第一節

BRAFV600E 変異型細胞における BRAF ノックダウンはストレスに誘導される
ATF4 発現を抑制する

はじめに、BRAFV600E 変異型メラノーマ細胞株である A375 及び G-361 と、BRAF 野
生型メラノーマ細胞株 SK-MEL-2 及び MeWo を用いて、BRAF のノックダウンによる
ISR への影響を検討した。各細胞株に BRAF に対する siRNA を導入した後、ストレッサ
ーとして L-histidinol、dabrafenib、vemurafenib、tunicamycin または thapsigargin(Ca2+-ATPase 阻害剤) で 4 時間処理し ISR シグナルに対する影響を解析した。その結果、A375 及び G-361 細胞では、BRAF のノックダウンによって GCN2 の活性化を誘導する L-histidinol、dabrafenib 及び vemurafenib 処理による ATF4 発現誘導が抑制された (Fig. 11A 及び Supplementary Fig. S3: alternative siRNA)。同細胞株において、
PERK の活性化を誘導する tunicamycin 及び thapsigargin 処理条件下では、BRAF ノ
ッ ク ダ ウ ン に よ っ て ATF4 発 現 誘 導 が 部 分 的 に 抑 制 さ れ た (Fig. 11A 及 び
Supplementary Fig. S3: alternative siRNA)。これらの条件下において、GCN2 またはPERK のリン酸化は BRAF ノックダウンによってやや変動したが、下流の eIF2αのリン酸化は維持されていた。一方、BRAF 野生型細胞株である SK-MEL-2 及び MeWo 細胞
では、いずれのストレッサー処理条件下においても BRAF のノックダウンによる ATF4
発現誘導への影響を認めなかった (Fig. 11B)。以上より、BRAFV600E 変異型メラノーマ細33

胞株では活性変異型 BRAF によって ISR における ATF4 発現誘導が正に制御されていることが示唆された。

34

A

G-361 (BRAFV600E)

A375 (BRAFV600E)
Cont. HIS DAB VEM Cont. TM

-

-

-

TG

- + - + - + - +- +- +siCont. ++ + +siBRAF+ + + +

p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4

-

-

-

-

Cont. HIS DAB VEM Cont. TM

TG+ - + - + - + - + - + - + - +- +- +- + - +- +- +BRAF
p-ERK (Y204/T202)
ERK
RPS3

B

SK-MEL-2 (BRAFWT)Cont. HIS TM

-

-

-

MeWo (BRAFWT)

TG-

siCont. ++ + +siBRAF+ + + +

p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4

-

-

-

-

Cont. HIS TM

TG+ - + - + - + - +- +- +- +BRAF
p-ERK (Y204/T202)
ERK
RPS3

Figure 11. BRAFV600E 変異型細胞における BRAF ノックダウンはストレスに誘導される
ATF4 発現を抑制する(A, B) A375、G-361、SK-MEL-2 及び MeWo 細胞に BRAF に対する siRNA を導入した
後、L-histidinol (HIS, 2 mM, SK-MEL-2 のみ 20 mM)、dabrafenib (DAB, 1 µM)、
vemurafenib (VEM, 10 µM)、tunicamycin (TM, 1 µg/ml, SK-MEL-2 のみ 10 µg/ml) ま
たは thapsigargin (TG, 300 nM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブ
ロット法により解析した。

35

第二節

BRAF ノックダウンが ATF4 mRNA 及び uORF に与える影響の検討

BRAF のノックダウンが ATF4 mRNA 発現レベルに影響を与えるのか real-time RTPCR 法により検討した。A375 細胞において、L-histidinol、dabrafenib、vemurafenib、
tunicamycin または thapsigargin 処理によって上昇した ATF4 mRNA レベルは BRAF
ノックダウンによって低下した。(Fig. 12A 及び Supplementary Fig. S4A: alternative
siRNA)。しかし、Fig. 11A で認めた BRAF ノックダウンによる ATF4 タンパク質の発現抑制のストレス毎のパターンとは相違があった。一方、SK-MEL-2 細胞では BARF ノッ
クダウンによる ATF4 mRNA レベルへの影響は認められなかった (Fig. 12A 及びSupplementary Fig. S4A: alternative siRNA)。
ATF4 mRNA のタンパク質コード領域 5’ 側には二つの small upstream open reading
frames (uORFs) が存在し、非ストレス条件下では uORF 上の翻訳が生じるため ATF4タンパク質は産生されず、ストレス条件下選択的に下流の ATF4 ORF における翻訳が促進される 7, 8)。そこで、BRAF ノックダウンが ATF4 uORF に与える影響について、ルシフェラーゼ遺伝子上流に ATF4 の二つの uORF 配列 (uORF1 及び uORF2) を組み込んだプラスミドを用いたレポーターアッセイ法 36)により検討した。はじめに、A375 細胞において、L-histidinol、dabrafenib、vemurafenib、tunicamycin または thapsigargin 処理によって ATF4 uORF ルシフェラーゼシグナルは上昇し、それぞれ GCN2 またはPERK の阻害剤 (GZD824: GCN2 阻害剤、GSK2656157: PERK 阻害剤) の処理によって抑制されることを確認した (Fig. 12B 上段)。次に、BRAF ノックダウンによる ATF4
uORF に対する影響を検討したが、どのストレッサー処理条件においても BRAF ノック
ダウンによる ATF4 uORF ルシフェラーゼシグナルの変化は認められなかった(Fig. 12B
下段 及び Supplementary Fig. S4B: alternative siRNA)。これらの結果より、BRAFV600E
変異型細胞における BRAF ノックダウンによる ATF4 発現抑制の主となる機序は、ATF4mRNA レベル及び uORF とは異なると考えた。
36

ATF4 mRNA level(relative to siCont./Cont.)

A

3.5

A375 (BRAFV600E)

9.0

ATF4 mRNA

8.0

3.0

SK-MEL-2 (BRAFWT)
ATF4 mRNA

7.0

2.5

6.0

2.0

5.0

1.5

4.0
3.0

1.0

2.0

0.5

1.0

0.0

0.0

Cont.

HIS

DAB

VEM

siCont.

B

5’

TM

TG

Cont.

siBRAF

AUG

uORF1

HIS

siCont.

TM

TG

siBRAF

AUG

AUG

uORF2

Luciferase

3’

A375

ATF4 uORF-Luc activity(relative to Cont.)

5.0

16.0
14.0

4.0

12.0
10.0

3.0

8.0
2.0

6.0
4.0

1.0

2.0

0.0

0.0

Cont.

HIS

ATF4 uORF-Luc activity(relative to siCont./Cont)

DMSO

DAB

VEM

Cont.

GZD824

6.0

14.0

5.0

12.0

TM

TG

DMSO

GSK

10.0

4.0

8.0

3.0

6.0

2.0

4.0

1.0

2.0

0.0

0.0

Cont.

HIS

siCont.

DAB

VEM

siBRAF

Cont.

TM

siCont.

TG

siBRAF

Figure 12. BRAF ノックダウンが ATF4 mRNA 及び uORF に与える影響の検討(A) A375 及び SK-MEL-2 細胞に BRAF に対する siRNA を導入した後、L-histidinol(HIS, 2 mM, SK-MEL-2 のみ 20 mM)、dabrafenib (DAB, 1 µM)、vemurafenib (VEM,
10 µM)、
tunicamycin (TM, 1 µg/ml, SK-MEL-2 のみ 10 µg/ml) または thapsigargin (TG,
300 nM) で 4 時間処理し、精製した RNA を用いてリアルタイム RT-PCR 法により ATF4mRNA レベルを測定した。(B) 上段: A375 細胞に ATF4 uORF 配列を組み込んだレポー
タープラスミド pRL-TK pGL3 Luc hATF4 UTR を導入した後、(A) と同様のストレッ
サーと GCN2 阻害剤 GZD824 (200 nM) または PERK 阻害剤 GSK2656157 (GSK, 300nM) を 18 時間共処理し、レポーターアッセイを行った (±SD, n=3)。下段: A375 細胞に pRL-TK pGL3 Luc hATF4 UTR と BRAF に対する siRNA を導入した後、(A) と同様のストレッサーを 18 時間処理し、レポーターアッセイを行った (±SD, n=3)。
37

第三節

BRAFV600E 変異型細胞株における BRAF ノックダウンは mTOR シグナル及び翻訳開始因子のリン酸化レベルを抑制する

ATF4 の mRNA レベルはストレス条件下において 2 から 5 倍程度上昇するが (Fig.
12A)、タンパク質発現量は数十倍の強度で増加する (Fig. 11)。このことから ATF4 発現量の変動にはタンパク質の翻訳制御の影響力が大きいと考え、BRAF ノックダウンによって ATF4 の翻訳制御に変化が生じているのか検討した。
まず、BRAFV600E 変異型細胞において BRAF のノックダウンが細胞内の全体的なタンパク質翻訳に影響するのか、ピューロマイシンの取り込みを指標として検討した。その結果、A375 及び G-361 細胞において BRAF ノックダウンによるピューロマイシン取り込
みの変化は認めなかった (Fig. 13A 及び Supplementary Fig. S5A)。さらに、L-histidinol
または thapsigargin を 4 時間処理した場合においても、ピューロマイシン取り込みに顕著な変化は認められず、各条件における ATF4 発現量の増減とは相関しなかった (Fig.
13A 及び Supplementary Fig. S5A: alternative siRNA)。従って、BRAFV600E 変異型細胞における BRAF ノックダウンによる ATF4 発現誘導の抑制は、細胞内の全体的な新規タンパク質合成の抑制によるものではないと考えた。
次に、アミノ酸代謝調節とタンパク質翻訳制御に関与する mTOR シグナル経路に対す
る BRAF ノックダウンの影響を検討した。BRAFV600E を発現する A375 及び G-361 細胞
では、BRAF ノックダウンにより L-histidinol 処理条件下 70kDa ribosomal protein S6
kinase 1 (p70 S6K) 及び ribosomal protein S6 (S6) のリン酸化レベルが低下した (Fig.
13B 及び Supplementary Fig. S5B: alternative siRNA)。
また、
A375 細胞において BRAF
ノックダウン条件下、dabrafenib または vemurafenib を処理した場合には、dabrafenib
及び vemurafenib 処理によって p70 S6K 及び S6 のリン酸化レベルが低下したが、BRAFのノックダウンによってさらに低下した (Supplementary Fig. S5C)。一方で、野生型
BRAF を発現する SK-MEL-2 及び MeWo 細胞では、L-histidinol 処理によって p70 S6K
38

及び S6 のリン酸化レベルの低下を認めたが、BRAF ノックダウンによる mTOR シグナ
ルへの影響は認めなかった (Fig. 13B)。
さらに、mTOR シグナルの下流で働く翻訳開始因子に対する BRAF ノックダウンの影
響について検討した。
タンパク質の翻訳開始因子 eukaryotic translation initiation factor(eIF) の複合体形成は、vemurafenib に対する感受性を規定する因子の一つであることが報告されている 37)。この報告では vemurafenib による BRAF 阻害が eIF4E と eIF4G の結合を低下させることで翻訳活性を抑制することが示されていた。そこで、BRAFV600E 変
異型細胞株における BRAF ノックダウンが eIF4E と eIF4G の結合に影響を与えるのか検討した。BRAF をノックダウンした A375 細胞に L-histidinol または thapsigargin を処理した後、eIF4E が認識するキャップ構造を結合したビーズを用いて eIF4E コンプレックスを精製し、eIF4G の結合量を解析した。しかし、BRAF ノックダウンによる eIF4G
及び eIF4E のもう一つの結合パートナーである 4EBP1 との結合量の変化は認めなかった (Supplementary Fig. S5D)。
そこで、BRAF ノックダウンが翻訳開始因子の活性化に重要なリン酸化レベルに与える影響について検討を行った 38)。その結果、BRAFV600E 変異型細胞株である A375 及びG-361 細胞では、BRAF ノックダウンによって eIF4B のリン酸化が強く抑制された (Fig.
13B 及び Supplementary Fig. S5B: alternative siRNA)。また、ストレッサーとして
dabrafenib または vemurafenib を用いた場合には、eIF4B のリン酸化は BRAF 阻害剤の処理によってやや抑制されたが、BRAF ノックダウン条件下の方が強く抑制された(Supplementary Fig. S5C)。一方、BRAF 野生型細胞株である SK-MEL-2 及び MeWo 細胞では、BRAF ノックダウンによる eIF4B のリン酸化の抑制は認めなかった (Fig. 13B)。

39

A

G-361

A375
Cont. HISTG

TG

+ - + - + - + - + - +

A375

(kDa)

(kDa)

225
150

225
150

102

102

76

76

52

52

38
31

38
31

24

24

17
12

17
12

RPS3

ATF4
BRAF
RPS3

B

Puromycin

Puromycin

siCont. + - + - + siBRAF - + - + - +Cont. HISBRAFV600E
A375
Cont. HIS

G-361
TG

siCont. + - + - + siBRAF - + - + - +BRAF

BRAFWT

Cont. HIS

SK-MEL-2
TG+ - + - + - + - + - +p-mTOR (S2448)
mTOR
p-p70 S6K (T389)
p70 S6K
p-S6 (S235/S236)
p-S6 (S240/S244)
S6
p-4EBP1 (S65)
4EBP1
p-eIF4G (S1108)
eIF4G
p-eIF4E (S209)
eIF4E
p-eIF4B (S422)
eIF4B
eIF4A
p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
ATF4
RPS3
40

Cont. HISTG

+ - + - + - + - + - +MeWo
Cont. HISTG

+ - + - + - + - + - +Figure 13. BRAFV600E 変異型細胞株における BRAF ノックダウンは mTOR シグナル及び翻訳開始因子のリン酸化レベルを抑制する(A) A375 及び G-361 細胞に BRAF に対する siRNA を導入した後、L-histidinol (HIS, 2mM)、または thapsigargin (TG, 300 nM) で 3.5 時間処理し、そのまま培地中に
puromycin (最終濃度 1 µg/ml) を添加し、30 分インキュベートした。その後、ライゼー
トを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。ポジティブコントロールとして
A375 細胞に cycloheximide (CHX, 50 mg/ml) と puromycin を 30 分間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(B) A375、G-361、SK-MEL-2 及
び MeWo 細胞に BRAF に対する siRNA を導入した後、L-histidinol (A375, G-361 及び
MeWo: 2 mM, SK-MEL-2: 20 mM) または thapsigargin (300 nM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。

41

第四節

BRAFV600E 変異型細胞株における vemurafenib の 24 時間処理は mTOR
シグナル及び ATF4 発現を抑制する

Vemurafenib による BRAF のキナーゼ阻害が BRAF のノックダウンと同様の現象を引き起こすのか検討した。A375 細胞に vemurafenib を 24 時間処理した後、L-histidinol
または thapsigargin を 4 時間処理した。その結果、vemurafenib を 24 時間処理することで p70 S6K 及び S6 のリン酸化レベルが低下し、L-histidinol 処理による ATF4 発現誘導が強く抑制され、thapsigargin 処理による ATF4 発現誘導は部分的に抑制された。このことから、BRAF のキナーゼ活性が mTOR シグナルの制御に重要であり、また ATF4
発現誘導にも重要であることが示唆された。

42

A375
Cont. HIS TG
Vemurafenib (10 µM, 24 h)

BRAF- + - + - +G-361
Cont. HIS TG- + - + - +p-ERK (Y204/T202)
ERK
p-mTOR (S2448)
mTOR
p-p70 S6K (T389)
p70 S6K
p-S6 (S235/S236)
p-S6 (S240/S244)
S6
P-4EBP1 (S65)
4EBP1

p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

Figure 14. BRAFV600E 変異型細胞株における vemurafenib の 24 時間処理は mTOR シ
グナル及び ATF4 発現を抑制する
A375 及び G-361 細胞に vemurafenib (10 µM) を 24 時間処理した後、L-histidinol(HIS, 2 mM) または thapsigargin (TG, 300 nM) を 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。

43

第五節 mTOR シグナルの阻害は GCN2 を介した ATF4 発現誘導を抑制する

mTOR シグナルが ATF4 発現誘導に関与しているか mTOR 阻害剤である PP242 を用いて検討した。A375 及び SK-MEL-2 の両細胞において、PP242 処理により mTOR、p70
S6K、S6 及び eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 (4EBP1) のリン酸化の低下を認めた (Fig. 15A)。これらの細胞に L-histidinol 処理条件下、PP242を共処理した結果、L-histidinol によって誘導された GCN2 及び eIF2αのリン酸化が抑制され、ATF4 発現誘導も強く阻害された。それに比較して thapsigargin 処理条件下、
PP242 を共処理した場合、thapsigargin によって誘導された PERK 及び eIF2αのリン
酸化レベルに顕著な抑制は認められなかったが、ATF4 発現誘導は部分的に抑制された(Fig. 15A)。PP242 は mTOR 複合体 1 (mTORC1)と mTOR 複合体 2 (mTORC2) の両方を阻害するが、rapamycin 及びそのアナログは mTORC1 のみを阻害する 39)。A375 細胞に、rapamycin または everolimus を L-histidinol または thapsigargin と併用して処理した結果、PP242 と同様に L-histidinol 処理と併用した場合にのみ、GCN2 と eIF2αのリン酸化抑制、及び ATF4 発現誘導の阻害を認めた (Fig. 15B)。
これらの結果より、PERK を介した ATF4 発現誘導に比べ、GCN2 を介した ATF4 発
現誘導において mTORC1 シグナルの活性がより重要であることが示唆された。
mTORC1 シグナル阻害による ATF4 発現抑制は、BRAFV600E 変異型細胞において認められた BRAF ノックダウンによる ATF4 発現抑制のストレスの違いによる抑制強度のパターンと一致していたことから (Fig. 11A)、BRAF ノックダウンによる ATF4 発現抑制は
mTORC1 シグナルの抑制を介して生じた可能性が高いと考えられる。ただし、mTOR 阻
害剤処理条件下ではタンパク質翻訳に強い影響力をもつ 4EBP1 のリン酸化が抑制(4EBP1 の活性化) されている一方、BRAF のノックダウンでは 4EBP1 のリン酸化は抑制されていないといった相違点もあることから、mTORC1 シグナルの抑制以外にも翻訳開始因子等が関与して ATF4 の発現抑制が生じていると考えられる。

44

A

A375
Cont. HIS TG
PP242 (1 µM)

p-mTOR (S2448)
mTOR
p-p70 S6K (T389)
p70 S6K
p-S6 (S235/S236)
p-S6 (S240/S244)
S6
P-4EBP1 (S65)
4EBP1- + - + - +SK-MEL-2
Cont. HIS TG- + - + - +p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

B

A375
Cont.

Rapamycin (100 nM)
Everolimus (100 nM)

p-mTOR (S2448)
mTOR
p-p70 S6K (T389)
p70 S6K
p-S6 (S235/S236)
p-S6 (S240/S244)
S6
P-4EBP1 (S65)
4EBP1

HIS

TG

- + - - + - - + - - + - - + - - +p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

Figure 15. mTOR シグナルの阻害は GCN2 を介した ATF4 発現誘導を抑制する(A) A375 及び SK-MEL-2 細胞に PP242 (1 µM) と L-histidinol (HIS, A375: 2 mM, SKMEL-2: 20 mM) または thapsigargin (TG, 300 nM) を 4 時間共処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(B) A375 細胞に rapamycin (100 nM)
または everolimus (100 nM) と L-histidinol (2 mM) または thapsigargin (300 nM) を
4 時間共処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。

45

第六節

BRAF は mTORC1 及び GCN2 と結合し、mTOR はストレス依存的に BRAFとの結合が増加する

BRAF と mTOR の直接的な相互作用について検討した。HEK293T 細胞に、FLAG タ
グ付き野生型 BRAF (BRAFWT) または変異型 BRAFV600E を一過性に過剰発現させ、抗FLAG 抗体を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物に含まれるタンパク質について解析したところ、mTOR、p70 S6K 及び 4EBP1 が BRAF と共沈されることを見出した (Fig.
16A)。さらに、GCN2 及び GCN2 との相互作用が既に報告されている general control ofamino acid synthesis 1-like protein 1 (GCN1L1)40) の共沈も認めた (Fig. 16A)。これらの分子との結合において、野生型 BRAF と変異型 BRAFV600E の間で顕著な差は認めなかった。mTOR が形成するコンプレックスには regulatory associated protein of mTOR
complex 1 (Raptor) を含む mTORC1 と raptor independent companion of mTOR
complex 2 (Rictor) を含む mTORC2 が知られている 39)。BRAF が mTORC1 またはmTORC2 のどちらと結合するのか、Raptor と Rictor との結合量を比較することで検討した。インプットの Raptor 及び Rictor のバンド強度に対して、BRAF の免疫沈降サン
プルでは Raptor のバンド強度の方が Rictor よりも明らかに強く、このことから BRAFと主に結合するのは mTORC1 であることが示唆された (Fig. 16B)。
さらに、BRAF と mTOR 及び GCN2 の相互作用におけるストレス応答性について
A375 細胞を用いて検討した。A375 細胞に変異型 BRAFV600E を一過性に過剰発現させ、L-histidinol または thapsigargin 処理を行った後、抗 mTOR 抗体または抗 GCN2 抗体

を用いて免疫沈降を行った。その結果、mTOR と BRAF の結合は L-histidinol 処理条件
下において増加し、thapsigargin 処理条件下においてはそれらの結合量はコントール条件と変わらなかった (Fig. 16C)。一方、GCN2 と BRAF の結合は、コントール及び各ス
トレス条件いずれにおいても同程度に認められた (Fig. 16C)。以上より、BRAF はアミ46

ノ酸飢餓様のストレス依存的に mTORC1 とのコンプレックス形成を増加させることが示唆された。

47

A

B

HEK293T
IP-FLAG
Input

HEK293T
Input
IP-FLAG(FLAG-tag)

p-mTOR (S2448)
mTOR
p-p70 S6K (T389)
p70 S6K
p-S6 (S235/S236)
p-S6 (S240/S244)
S6
P-4EBP1 (S65)
4EBP1

mTOR
p70S6K
4EBP1

GCN2
GCN1L1GCN2GCN1L1BRAF

BRAF

BRAFV600E

RaptorRictorC

BRAFV600E

FLAG

FLAG

MEK

MEK

p-ERK (Y204/T202)
ERK(FLAG-tag)

A375
IP: IgG mTOR IgG GCN2

BRAF
GCN2

BRAF
mTOR
FLAG-BRAFV600E
FLAG
Mock -BRAFV600E

A375

mTOR
p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4

Input

BRAF
FLAG
RPS3

Figure 16. BRAF は mTORC1 及び GCN2 と結合し、mTOR はストレス依存的に BRAFとの結合が増加する(A, B) HEK293T 細胞に FLAG タグ付き野生型 BRAF (BRAFWT) または変異型 BRAF
(BRAFV600E) を過剰発現させたライゼートを調製した。抗 FLAG 抗体を用いた免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法により解析した。(C) A375 細胞に FLAG タグ付き変異型
BRAF (BRAFV600E) を過剰発現させた後、L-histidinol (2 mM) または thapsigargin (300nM) を 4 時間処理したライゼートを調製した。抗 mTOR 抗体または抗 GCN2 抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法により解析した。

48

結語

本研究は、BRAF 阻害剤 vemurafenib による Integrated stress response (ISR) 活性化機序の解析及び活性変異型 BRAF による ATF4 発現制御メカニズムの解析を行い、活性型がん遺伝子 BRAF による ISR 制御の新たな分子基盤を明らかにした。
はじめに我々は、BRAF 変異型細胞株は vemurafenib に応答して、GCN2 の活性化を介した eIF2αのリン酸化及び ATF4 発現誘導を誘導することを明らかにした。この時、vemurafenib による ISR の活性化は BRAF の主要な下流シグナルである MEK-ERK 経路の阻害とは関係なく誘導されることを見出した。実際のがん患者の治療において
vemurafenib を単回投与した時にはその血中濃度はおよそ 10 µM に達することから 19)、
今回我々が見出した vemurafenib による ISR の活性化は臨床においても非常に重要な知見となり得る。それに加えて、我々は GCN2 を介した ATF4 の発現誘導が vemurafenibの作用に対して細胞防御に働くことを見出した。
GCN2 はアミノ酸の枯渇に応答して活性化することから、vemurafenib 処理による
GCN2 の活性化誘導は vemurafenib が細胞にアミノ酸代謝の変化を引き起こすことを示唆している。実際に、これまでに BRAF 変異型メラノーマ細胞株において vemurafenibの長期間処理によって酸化的リン酸化が亢進し、エネルギー源としてグルタミンに依存するようになる代謝リプログラミングが惹起されることが報告され、これがvemurafenib に対する薬剤耐性に寄与すると提唱されている 41-43)。これらの報告に一致して、我々の結果においても GCN2-ATF4 経路の活性化は vemurafenib に対する抵抗性に寄与することが示唆された。GCN2 を介した ATF4 発現誘導は、その下流でアミノ酸の生合成及び代謝、オートファジーの誘導に関与する遺伝子の発現を上昇させることが知られている 2, 9-11)。我々の検討においても、vemurafenib による GCN2-ATF4 経路の下流では、セリンの生合成及び代謝経路が亢進することが認められた。また、vemurafenib
及び PLX4720 (前臨床における vemurafenib 誘導体) が BRAF 変異型メラノーマ及び大腸がん細胞においてオートファジーを誘導し、vemurafenib に対する耐性を獲得することも報告されている 24, 44)。今後、vemurafenib による代謝リプログラミングにおける49

GCN2 を介した ISR の役割を検証することは興味深く、vemurafenib の治療効果を向上
させる上で重要な情報を与えるものと考えられる。
ISR を活性化させる eIF2αキナーゼとして小胞体ストレスに応答する PERK も GCN2と同じように代謝ストレスに対する適応応答において重要な分子である 4, 45, 46)。先行研究において、vemurafenib または PLX4720 は BRAF 変異型メラノーマ細胞株において小胞体ストレス誘導することで PERK を活性化し、それによって ISR を誘導することが提唱されていた 23, 24)。我々の行った PERK に対する siRNA 及び低分子阻害剤を用いた検討では、vemurafenib の比較的短時間の処理条件においては小胞体ストレスの誘導及び PERK の活性化は観察されなかった。我々の結果と矛盾なく、先行研究においてもPLX4720 による eIF2αのリン酸化及び ATF4 発現は 4 から 6 時間以内に誘導されることが示され、一方で PERK の活性化は 24 から 48 時間に誘導されることが示されている24)。このことから、vemurafenib によって短時間に活性化される ISR は GCN2 を介しており、先行研究で示されている低濃度の vemurafenib の持続的な処理は PERK を介した
ISR を活性化させると推測される。実際に、我々は vemurafenib 及び PLX4720 を 1 µM
で A375 細胞に処理し続けると、48 時間後に PERK 活性化による ISR の誘導が生じることを確認した (Supplementary Fig. S6A)。しかしこれらの薬剤は 10 µM では療法とも 4 時間以内に GCN2 を介した ISR の活性化を誘導し、10 µM で 48 時間の処理を行っても PERK の活性化による ISR の誘導は観察されなかった (Supplementary Fig. S6B
及び S6C)。従って、vemurafenib による ISR の活性化機序は処理濃度及び時間に依存して変わり得ると考えられる。
さらに、先行研究では vemurafenib による ISR が細胞生存に寄与するという報告と細胞死の誘導に働くという報告があり、ISR の細胞運命における役割については曖昧であった 23, 24)。このように相反する現象が示されているのは、ストレス適応応答の二相性シグナルが関与していると考えられる。ATF4 は通常はストレス適応に必要な遺伝子の転写活性を上昇させ、細胞の生存に寄与するが、持続的なストレス条件下ではストレス適応を50

達成できずアポトーシスの誘導へ移行することが知られている 47)。このことから BRAF
阻害剤が誘導する細胞防御に働く GCN2 を介した ISR と後期に誘導される ISR それぞれの細胞運命における役割及び切り替えの分子メカニズムについてさらなる検討が必要である。

興味深いことに、我々は活性変異型 BRAFV600E が mTORC1 シグナルを制御すること
で、GCN2 を介した ATF4 発現誘導を正に制御することを見出した。我々の結果から、
vemurafenib による BRAF の阻害は、処理後 4 時間の時点では MEK-ERK シグナル経路に対しては有効だが、ATF4 の発現を制御する機能に対してはその阻害効果が及ばず、かえって ISR の活性化を誘発すると考えられる。実際に vemurafenib の 24 時間の処理
や BRAF のノックダウンでは両機能が抑制されたように、活性変異型 BRAFV600E は
MEK-ERK シグナル経路に加え、mTOR シグナルを介したストレス適応応答の制御も行う、二面性の機能を有することが明らかとなった。
mTORC1 シグナル経路がアミノ酸代謝を調節することは多くの研究報告から示されており、一般にアミノ酸の枯渇状態は mTORC1 活性を低下させ、オートファジーを誘導することでアミノ酸供給が促進されることが知られている 48)。確かに BRAF 野生型細胞株では L-histidinol 処理条件下 mTOR の下流シグナル分子である p70 S6K 及び S6 のリ
ン酸化レベルが低下した。しかし、BRAF 変異型細胞株では L-histidinol 処理による
mTOR シグナルの低下は認めず、BRAF のノックダウンによって mTOR シグナルの抑制を認めた (Fig. 13B)。このように活性変異型 BRAFV600E は、本来であればアミノ酸飢餓ストレスによって抑制される mTORC1 の活性を増強していることが示唆された。さらに我々の結果は、BRAF がストレス依存的に mTORC1 と直接的に相互作用することを示した。これまで mTOR は PI3K-Akt 経路からシグナルが伝達されると考えられているが、活性変異型 BRAF と mTOR のコンプレックス形成により、活性変異型 BRAF がmTOR を介して直接的にアミノ酸代謝に影響を及ぼすことが示唆された。実際に、これ51

をサポートする先行研究の報告として、活性変異型 BRAF を発現する細胞ではミトコン
ドリアにおける酸化的リン酸化が亢進し、細胞内の代謝システムが変化していることが示されている 41)。我々が見出したように、GCN2 による ATF4 発現誘導が活性変異型
BRAF に依存していることからも、BRAF 変異型細胞ではアミノ酸代謝やストレス適応
応答のコンテクストが大きく変化し、それらが活性変異型 BRAF のコントロール下に置かれている可能性がある。今後、がんの発生や進展において活性変異型 BRAF によるス
トレス適応応答制御、特に ATF4 の発現制御がどのように寄与しているのか研究を行う
ことは非常に興味深いと考えられる。

このような変異型 BRAF の二面性の機能は、BRAF を標的としたがん治療の効果に影響を与えることが予想される。実際に、我々は ISR の活性化が vemurafenib の作用に対して細胞防御に働くことを示した。その解決策の一つとして、AT9283 と vemurafenibの併用療法は BRAF の増殖シグナルとストレス適応応答の両機能を抑制することによって合成致死を導く治療法として期待できる。
AT9283 は骨髄腫の治療薬として開発されている Aurora キナーゼ及び JAK の阻害剤であり 49, 50)、これまでに第二相臨床試験まで実施されている 51-55)。ISR 阻害剤のスクリーニングを行ったキナーゼ阻害剤ライブラリー中には AT9283 以外に複数の Aurora キ
ナーゼ阻害剤及び JAK 阻害剤が含まれているが、それらの阻害剤による ISR の抑制は認められなかった。従って、AT9283 による ISR 阻害作用は Aurora キナーゼや JAK 以
外の未だ同定されていない標的分子の阻害を介していると推測され、GCN2 に直接的に結合して活性化を阻害する機序と GCN2 の活性化を制御する上流分子を阻害する機序のどちらかが考えられる。現時点では AT9283 の詳細な作用メカニズムは明らかではないが、遺伝子発現解析において観察された、vemurafenib と AT9283 の共処理によって強く発現が抑制された 112 プローブセットの各遺伝子を詳細に解析することで AT9283 の分子機序につながる情報が得られる可能性がある。
52

また、vemurafenib と AT9283 の併用による細胞死誘導作用は、vemurafenib の変異型 BRAF に対する高い選択性と、AT9283 の vemurafenib 誘導性 ISR に対する選択性によって BRAF 変異型のがん細胞に特異的に発揮されることが期待できる。これまでに同様に vemurafenib によるアミノ酸代謝のリプログラミングを阻害する治療戦略として、
vemurafenib とオートファジー阻害剤 hydroxychloroquine の併用による治療効果の増強が BRAF 変異型メラノーマ及び大腸がん細胞を用いた in vitro 及び in vivo で報告されている 24, 44)。AT9283 はそれらの成果以上により選択的に vemurafenib の治療効果を改善できる可能性があり、今後 in vivo における併用療法の有効性の確認を行うことが重要である。

以上、本研究では活性変異型 BRAFV600E によるストレス適応応答の新たな制御機構を明らかにし、それに基づいた治療戦略の有用性について見出した。本研究の成果は、BRAFを標的としたがん治療法の改善に貢献できるだけでなく、活性変異型 BRAF によるがんの発生や進展の分子機構の新たな理解にもつながるものである。今後、さらに詳細ながんのストレス適応応答機構が明らかになり、それに基づいた優れたがん治療薬が創生されることを期待したい。

53

54

実験項

細胞培養及び試薬
A375 (CRL-1619), SK-MEL-2 (HTB-68), MeWo (HTB-65), G-361 (CRL-1424), WM-115(CRL-1675) 及 び SK-MEL-1 (HTB-67) 細 胞 は American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA) より購入した。これらのメラノーマ細胞株及び HT-29 細胞はRPMI1640 (和光純薬工業, 大阪) に 10% ウシ胎児血清 (ニチレイバイオサイエンス, 東京) と 100 µg/ml カナマイシン (明治製菓ファルマ, 東京) を添加した培地で、5% CO2、37℃条件下で培養した。Vemurafenib、dabrafenib、trametinib、GSK2656157、GZD824、
PP242、rapamycin、everolimus 及び AT9283 (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA)は dimethyl sulfoxide (DMSO) に溶解して用いた。2-deoxy-D-glucose (2DG; SigmaAldrich, St Louis, MO, USA) 及び L-histidinol (Sigma-Aldrich) は滅菌蒸留水に溶解し、tunicamycin (ナカライテスク, 京都) 及び thapsigargin (和光純薬工業) は DMSO に溶解して用いた。

細胞生存率の測定
A375 (3 × 103 cells/well)、SK-MEL-2 (1 × 104 cells/well)、MeWo (8 × 103 cells/well)、
G-361 (6 × 103 cells/well) 、WM-115 (8 × 103 cells/well) 及び SK-MEL-1 (1 × 104
cells/well) 細胞をそれぞれ 96 ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、各細胞に図中に示した濃度の vemurafenib または dabrafenib を処理し、48 時間培養した。細胞生存率は CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega, Madison, WI, USA)を用いて細胞内 ATP 量から算出した。MTT アッセイ法では、薬剤処理後の細胞に MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (Sigma-Aldrich) を添加し、3 時間培養した。生成したホルマザンを DMSO で溶解し、吸光度 (OD525 nm/650 nm)を測定して細胞生存率を算出した。細胞生存率は薬剤未処理のコントロール条件に対する割合 (%) で示した。

55

ウェスタンブロット解析
細胞のライゼートは SDS lysis buffer (2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol,
62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8) を用いて調製した。ライゼート中のタンパク質濃度は、BioRad protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) を用いて定量した。タンパク質はSDS-PAGE によって分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを 4%
スキムミルク TBS-T (0.1% Tween-20, 150 mM NaCl, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.6) でブロッキングを行い、4% スキムミルク TBS-T で希釈した各一次抗体液に浸して 4℃で一晩反応させた。
一次抗体を反応させたメンブレンを TBS-T で洗浄後、4%スキムミルク TBST で希釈した二次抗体 ECL Anti-Rabbit IgG , HRP linked whole antibody, NA934V ま
たは ECL Anti-mouse IgG, HRP linked whole antibody, NA931V (GE healthcare,
Pollards Wood, UK) と室温で 1 時間反応させた。
再度 TBS-T で洗浄後、Western Lightning
plus ECL (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) を用いて各タンパク質のバンドを検出した。
本研究で用いた一次抗体をメーカー毎に以下に示した。
Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)

Phospho-eIF2α (Ser51) (D9G8) XP Rabbit mAb #3398
ATF-4 (D4B8) Rabbit mAb #11815
MEK1/2 (D1A5) Rabbit mAb #8727
Phospho-MEK1/2 (Ser217/221) (41G9) Rabbit mAb #9154
p44/42 MAPK (Erk1/2) (137F5) Rabbit mAb #4695
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP Rabbit mAb #4370
Akt (pan) (11E7) Rabbit mAb #4685
Phospho-Akt (Ser473) Antibody #9271
GCN2 Antibody #3302
PKR (D7F7) Rabbit mAb #12297
56

mTOR Antibody #2972
Phospho-mTOR (Ser2448) Antibody #2971
p70 S6 Kinase Antibody #9202
Phospho-p70 S5 Kinase (Thr389) (108D2) Rabbit mAb #9234
S6 Ribosomal Protein (5G10) Rabbit mAb #2217
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) Antibody #2211
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser240/244) Antibody
4E-BP1 (53H11) Rabbit mAb #9644
Phospho-4E-BP1 (Ser65) (174A9) Rabbit mAb #9456
Raptor (24C12) Rabbit mAb #2280
Rictor (53A2) Rabbit mAb #2114
eIF4G (C45A4) Rabbit mAb #2469
Phospho-eIF4G (Ser1108) Antibody #2441
eIF4E (C46H6) Rabbit mAb
Phospho-eIF4E (ser209) Antibody #9741
eIF4B Antibody #3592
Phospho-eIF4B (Ser422) Antibody #3591
eIF4A (C32B4) Rabbit mAb #2013
PARP (46D11) Rabbit mAb #9532
Cleaved PARP (Asp214) (D64E10) XP Rabbit mAb #5625
Ribosomal Protein L7a (R225) Antibody #2403
Ribosomal Protein S3 (D50G7) XP Rabbit mAb #9538
Abcam (Cambridge, UK)

Anti-EIF2S1 antibody [EIF2a] ab5369
Anti-GCN2 (phospho T899) antibody [EPR2320Y] ab75836
57

Anti-PERK antibody ab65142
Anti-EIF2AK1 antibody [EP6587] ab151745
Anti-Phosphoserine Aminotransferase antibody ab154055
Anti-Phosphoserine phosphatase antibody ab96414
Enzo life Sciences (Farmingdale, NY, USA)

KDEL, mAb (10C3)

Sigma-Aldrich

Monoclonal Anti-CBS, antibody produced in mouse, clone 3E1, WH0000875M1
Monoclonal Anti-CTH, antibody produced in mouse, clone S51, SAB1403711
Anti-FLAG M2 Monoclonal Antibody F-3165
Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)

Raf-B (F-3) sc-55522


New East Biosciences

B-Raf (V600E) 26039


Kerafast (Boston, MA, USA)

Anti-Puromycin (3RH11) mAb EQ0001

siRNA による発現ノックダウン
細胞に各分子に特異的な siRNA を Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, USA) を 用 い て ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し た 。 ON-TARGETplus
SMARTpool siRNA (GE Healthcare) は最終濃度 20 nM、Silencer Select siRNA (Thermo
Fisher Scientific) は最終濃度 5 nM で用いた。siRNA のトランスフェクションから 48
時間後、薬剤処理等の実験を行った。
本研究で用いた siRNA を以下に示した。


ON-TARGETplus SMARTpool siRNA58

GCN2 (EIFAK4): L-005314-00
PERK (EIFAK3): L-004883-00
PKR (EIFAK2): L-003527-00
HRI (EIFAK1): L-005007-00
ATF4: L-005125-00
BRAF: L-003460-00
Silencer Select siRNA

GCN2 (EIFAK4): s54068
PERK (EIFAK3): s18102
PKR (EIFAK2): s11185
HRI (EIFAK1): s25823
ATF4: s1702, s1703
BRAF: s2080

ATF4 蛍光免疫染色細胞を 4% パラホルムアルデヒドで 15 分間固定し、PBS で洗浄後、0.3% Triton X-100
in 4% BSA-PBS で 1 時間ブロッキングを行った。その後、1% BSA-PBS で 400 倍に希釈した抗 ATF4 抗体 (#11815, CST) と一晩反応させた。PBS で洗浄後、1% BSA-PBS
で 500 倍に希釈した二次抗体 Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, AlexaFluor488 conjugate (A11034, Thermo Fisher Scientific) と室温で 1 時間反応させた。PBS で洗浄
後、Hoechst33342 (Thermo Fisher Scientific) を用いて細胞の核を染色した。ATF4 の蛍光シ
グナルは IN Cell Analyzer 6000 (GE healthcare) により検出し、IN Cell Developer Toolbox
software (GE Healthcare) を持いて核における ATF4 intensity を算出した。

59

GRP78 レポーターアッセイ
A375 (2 × 105 cells/well) 及び G-361 細胞 (3 × 105 cells/well) をそれぞれ 6 ウェルプレートに播種し、一晩培養した。Firefly ルシフェラーゼを含む pGRP78pro160-Luc プラ
スミドと内部標準 renilla ルシフェラーゼを含む pRL-CMV を 500：1 で混合してLipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) を用いて細胞にトランスフェクション
した。トランスフェクションから 6 時間後、細胞を 96 ウェルプレートに播き直し、一晩培養した後、vemurafenib、2DG または tunicamycin を 18 時間処理した。Dual-Glo
Luciferase Assay System (Promega) を用いて、renilla ルシフェラーゼシグナル強度に対する firefly ルシフェラーゼシグナル強度を測定した。

マイクロアレイ発現解析
細胞のトータル RNA は RNeasy RNA purification kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) を用いて抽出した。RNA のクオリティは 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa
Clara, CA, USA) 及び RNA 6000 Nano LabChip kit を用いて確認し、マイクロアレイ
は Affymetrix GeneChip Human genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa
Clara, CA, USA). を用いて行った。マイクロアレイ発現データは RMAExpress 1.0.5 を用いて Robust Multichip Average (RNA) 法により正規化し、検出されたシグナル値が50 未満のプローブは全て固定値 50 として解析に用いた。コントロール条件に対してシグナル値が 2 倍以上で検出されたプローブを発現上昇、1/2 以下で検出されたプローブを発現減少と定義した。クラスタリング解析は Cluster 3.0 software を用いて行い、Java
TreeView を用いて可視化した。Gene Ontology 解析は DAVID (National Institute ofAllergy and Infectious Diseases, NIH, Bethesda, MD, USA) を用いて行った。

60

コロニー形成アッセイ
各条件の処理を行った細胞を 6 ウェルプレートに播き直し (A375: 1 × 103 cells/well, G361: 2 × 103 cells/well)、薬剤不含有培地で 7 日間 (A375) または 14 日間 (G-361) 培養
した。コロニーはメタノールで固定後、0.4% クリスタルバイオレットを用いて染色した。
コロニーの面積は ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) を用いて定量した。

Real-time RT-PCR
細胞のトータル RNA は RNeasy RNA purification kit (Qiagen) を用いて抽出した。各サンプルにおける ATF4 及び GAPDH の mRNA 発現レベルは、SuperScriptⅢ Platinum
SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (Thermo Fisher Scientific) 及び Chromo4 realtime PCR thermocycler (Bio-Rad) を用いて測定した。PCR に用いたプライマーを以下に示した。
ATF4_forward: 5’- cctgtcctccactccagatc-3’
ATF4_reverse: 5’- cactgagggatcatggcaac-3’
GAPDH_forward: 5’-aaggtgaaggtcggagtcaa-3’
GAPDH_reverse: 5’-aatgaaggggtcattgatgg-3’

ATF4 uORF レポーターアッセイ
A375 細胞を 10 cm 培養ディッシュに視野 80%の細胞密度で用意した。Firefly ルシフェ
ラーゼを含む pATF4uORF-Luc プラスミドと内部標準 renilla ルシフェラーゼを含む
pRL-TK を 4：1 で混合し、Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) を用いて細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから 6 時間後、細胞を 12 ウェル
プレートに 1 × 105 cells/well で播き直し、一晩培養した。この時、BRAF ノックダウンの影響を検討する際には siRNA をトランスフェクションした。
翌日、細胞に L-histidinol、
vemurafenib、dabrafenib、tunicamycin、thapsigargin、GZD824 または GSK2656157
61

をそれぞれ図中に示した条件で 18 時間処理した。Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega) を用いて、renilla ルシフェラーゼシグナル強度に対する firefly ルシフェラ
ーゼシグナル強度を測定した。

Puromycin 取り込みを指標とした新規タンパク質合成の測定
細胞内における新規タンパク質の合成は、puromycin の翻訳中ペプチドへの取り込み量を指標として測定した。
細胞のライゼートを調製する 30 分前に培地中に最終濃度 1 µg/mlの puromycin を添加し、インキュベートした。抗 puromycin 抗体を用いたウェスタンブ
ロット解析により、puromycin の取り込み量を検出した。

BRAF の過剰発現
pFLAG-BRAF プラスミド (#40775) は Addgene (Cambridge, MA, USA) より購入し、これを鋳型として QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies)を用いて pFLAG-BRAFV600E プラスミドを作製した。プラスミドは Lipofectamine 2000
(Thermo Fisher Scientific) を用いて細胞にトランスフェクションした。

抗 FLAG 抗体を用いた免疫沈降
pFLAG-BRAF (野生型) プラスミドまたは pFLAG-BRAFV600E プラスミドを導入した
HEK293T 細胞を冷却した PBS で洗浄後、Protease inhibitor cocktail (P8340, SigmaAldrich) と Phosphatase inhibitor cocktail (P5726 及び P0044, Sigma-Aldrich) を加えた IP lysis buffer (1% TritonX-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH
7.4) を用いて懸濁し、10,000 rpm、4℃で 10 分間遠心分離した。上清に Anti-FLAG M2
Affinity Gel (Sigma-Aldrich) を添加し、回転させながら 4℃で 2 時間反応させた。ビーズを IP lysis buffer を用いて 1 ml/チューブで 3 回洗浄し、さらに Wash buffer (150 mM
NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) を用いて 1 ml/チューブで 1 回洗浄した。Wash buffer
62

に溶解した 3×FLAG Peptide (Sigma-Aldrich) と 4℃で 1 時間反応させることで結合タンパク質を溶出し、100℃加温下 5×SDS lysis buffer を用いて SDS 化サンプルを調製した。

タンパク質の免疫沈降
細胞を冷却した PBS で洗浄後、Protease inhibitor cocktail (P8340, Sigma-Aldrich) とPhosphatase inhibitor cocktail (P5726 及び P0044, Sigma-Aldrich) を加えた IP lysis
buffer を用いて懸濁し、10,000 rpm、4℃で 10 分間遠心分離した。上清に Normal Rabbit
IgG Control (AB-105-C, R&D systems, Minneapolis, MN, USA )、IgG 抗 mTOR 抗体(#2972, CST) または抗 GCN2 抗体 (#3302, CST) をライゼート液量の 1/100 量で添加し、回転させながら 4℃で一晩反応させた。翌日、Dynabeads Protein G (Thermo Fisher
Scientific) を 50 µl/チューブ添加し、回転させながら 4℃で 1 時間反応させた。その後、
IP lysis buffer を用いて 1 ml/チューブで 4 回洗浄し、100℃加温下 SDS lysis buffer を用いてタンパク質を溶出した。

7mGTP アフィニティ精製
細胞を冷却した PBS で洗浄後、Protease inhibitor cocktail (P8340, Sigma-Aldrich) とPhosphatase inhibitor cocktail (P5726 及び P0044, Sigma-Aldrich) を加えた IP lysis
buffer を用いて懸濁し、10,000 rpm、4℃で 10 分間遠心分離した。上清に 7-methyl-GTP
sepharose beads (GE healthcare) を添加し、回転させながら 4℃で 2 時間反応させた。
ビーズを IP lysis buffer を用いて 1 ml/チューブで 3 回洗浄後、100℃加温下 2×SDS lysis
buffer を用いて結合タンパク質を溶出した。

ATF4 蛍光免疫染色法を用いたキナーゼ阻害剤スクリーニング
355 種のキナーゼ阻害剤を含む Kinase Inhibitor Library (z88022, Selleck Chemicals)
63

をスクリーニングに用いた。A375 細胞を 96 ウェル平底黒色ウェル/透明ボトムプレート(353219, Corning, Big Flats, NY, USA) に 8 × 103 cells/well で播種し、一晩培養した。
細胞に各キナーゼ阻害剤を最終濃度 2 または 20 µM で vemurafenib 10 µM と 6 時間共処理した。その後、ATF4 蛍光免疫染色を行い、各キナーゼ阻害剤の ATF4 発現抑制作用を評価した。

カスパーゼ 3/7 活性の測定
A375 細胞を 96 ウェルプレートに 5 × 103 cells/well で播種し、一晩培養した。翌日、
vemurafenib、dabrafenib 及び AT9283 をそれぞれ図中に示した条件で 16 時間処理した。カスパーゼ 3/7 活性は Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) を用いて測定した。カスパーゼ 3/7 活性化は薬剤未処理のコントロール条件に対する割合で示した。

細胞再増殖率の測定
A375 (5 × 103 cells/well) 及び G-361 (8 × 103 cells/well) 細胞を 96 ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、vemurafenib 及び AT9283 をそれぞれ図中に示した条件で
16 時間処理した。各条件の 1 ウェルあたりの細胞を 18 倍に希釈し、新しい 96 ウェルプ
レートに播種し、96 時間培養した。細胞数は CellTiter-Glo luminescent cell viability
assay (Promega) を用いて細胞内 ATP 量から算出した。細胞の再増殖率は薬剤未処理のコントロール条件に対する割合 (%) で示した。

64

参考文献

1)

Cairns RA, Harris IS, Mak TW: Regulation of cancer cell metabolism. Nat Rev

Cancer, 11, 85-95 (2011).
2)

Harding HP, Zhang Y, Zeng H, Novoa I, Lu PD, Calfon M, Sadri N, Yun C, Popko B,
Paules R, Stojdl DF, Bell JC, Hettmann T, Leiden JM, Ron D: An Integrated StressResponse Regulates Amino Acid Metabolism and Resistance to Oxidative Stress.

Molecular Cell, 11, 619-633 (2003).
3)

Ye J, Kumanova M, Hart LS, Sloane K, Zhang H, De Panis DN, Bobrovnikova-Marjon
E, Diehl JA, Ron D, Koumenis C: The GCN2-ATF4 pathway is critical for tumour cell
survival and proliferation in response to nutrient deprivation. EMBO J, 29, 20822096 (2010).

4)

Harding HP, Zhang Y, Bertolotti A, Zeng H, Ron D: Perk is essential for translational
regulation and cell survival during the unfolded protein response. Molecular Cell, 5,897-904 (2000).

5)Nakamura T, Furuhashi M, Li P, Cao H, Tuncman G, Sonenberg N, Gorgun CZ,
Hotamisligil GS: Double-stranded RNA-dependent protein kinase links pathogen
sensing with stress and metabolic homeostasis. Cell, 140, 338-348 (2010).

6)

Chen JJ: Regulation of protein synthesis by the heme-regulated eIF2alpha kinase:relevance to anemias. Blood, 109, 2693-2699 (2007).

7)

Vattem KM, Wek RC: Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNAtranslation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 11269-11274 (2004).

8)

Lu PD, Harding HP, Ron D: Translation reinitiation at alternative open reading
frames regulates gene expression in an integrated stress response. J Cell Biol, 167,
27-33 (2004).

9)

Kilberg MS, Shan J, Su N: ATF4-dependent transcription mediates signaling ofamino acid limitation. Trends in endocrinology and metabolism: TEM, 20, 436-443(2009).

10)

Rzymski T, Milani M, Pike L, Buffa F, Mellor HR, Winchester L, Pires I, Hammond E,
Ragoussis I, Harris AL: Regulation of autophagy by ATF4 in response to severe
hypoxia. Oncogene, 29, 4424-4435 (2010).

11)

B'Chir W, Maurin AC, Carraro V, Averous J, Jousse C, Muranishi Y, Parry L, Stepien
G, Fafournoux P, Bruhat A: The eIF2alpha/ATF4 pathway is essential for stressinduced autophagy gene expression. Nucleic acids research, 41, 7683-7699 (2013).

12)

Pagliarini R, Shao W, Sellers WR: Oncogene addiction: pathways of therapeutic
response, resistance, and road maps toward a cure. EMBO reports, 16, 280-296(2015).

13)

Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, Teague J, Woffendin H,
Garnett MJ, Bottomley W, Davis N, Dicks E, Ewing R, Floyd Y, Gray K, Hall S,
Hawes R, Hughes J, Kosmidou V, Menzies A, Mould C, Parker A, Stevens C, Watt S,

65

Hooper S, Wilson R, Jayatilake H, Gusterson BA, Cooper C, Shipley J, Hargrave D,
Pritchard-Jones K, Maitland N, Chenevix-Trench G, Riggins GJ, Bigner DD, Palmieri
G, Cossu A, Flanagan A, Nicholson A, Ho JW, Leung SY, Yuen ST, Weber BL, Seigler
HF, Darrow TL, Paterson H, Marais R, Marshall CJ, Wooster R, Stratton MR, Futreal
PA: Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature, 417, 949-954 (2002).
14)

Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, Sartore-Bianchi A, Arena S, Saletti P, De
Dosso S, Mazzucchelli L, Frattini M, Siena S, Bardelli A: Wild-type BRAF is required
for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. Journal ofclinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 26,5705-5712 (2008).
15)

Kimura ET, Nikiforova MN, Zhu Z, Knauf JA, Nikiforov YE, Fagin JA: Highprevalence of BRAF mutations in thyroid cancer: genetic evidence for constitutive
activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid
carcinoma. Cancer research, 63, 1454-1457 (2003).

16)

Mercer KE, Pritchard CA: Raf proteins and cancer: B-Raf is identified as amutational target. Biochimica et biophysica acta, 1653, 25-40 (2003).

17)

Montagut C, Settleman J: Targeting the RAF-MEK-ERK pathway in cancer therapy.

Cancer letters, 283, 125-134 (2009).
18)

Tsai J, Lee JT, Wang W, Zhang J, Cho H, Mamo S, Bremer R, Gillette S, Kong J,
Haass NK, Sproesser K, Li L, Smalley KS, Fong D, Zhu YL, Marimuthu A, Nguyen H,
Lam B, Liu J, Cheung I, Rice J, Suzuki Y, Luu C, Settachatgul C, Shellooe R,
Cantwell J, Kim SH, Schlessinger J, Zhang KY, West BL, Powell B, Habets G, Zhang
C, Ibrahim PN, Hirth P, Artis DR, Herlyn M, Bollag G: Discovery of a selective
inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl

Acad Sci U S A, 105, 3041-3046 (2008).
19)

Flaherty KT, Puzanov I, Kim KB, Ribas A, McArthur GA, Sosman JA, O'Dwyer PJ,
Lee RJ, Grippo JF, Nolop K, Chapman PB: Inhibition of mutated, activated BRAF inmetastatic melanoma. The New England journal of medicine, 363, 809-819 (2010).

20)

Lito P, Rosen N, Solit DB: Tumor adaptation and resistance to RAF inhibitors. Nature

medicine, 19, 1401-1409 (2013).
21)

Sun C, Wang L, Huang S, Heynen GJ, Prahallad A, Robert C, Haanen J, Blank C,
Wesseling J, Willems SM, Zecchin D, Hobor S, Bajpe PK, Lieftink C, Mateus C,
Vagner S, Grernrum W, Hofland I, Schlicker A, Wessels LF, Beijersbergen RL,
Bardelli A, Di Nicolantonio F, Eggermont AM, Bernards R: Reversible and adaptive
resistance to BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Nature, 508, 118-122 (2014).

22)

Larkin J, Ascierto PA, Dreno B, Atkinson V, Liszkay G, Maio M, Mandala M, Demidov
L, Stroyakovskiy D, Thomas L, de la Cruz-Merino L, Dutriaux C, Garbe C, Sovak
MA, Chang I, Choong N, Hack SP, McArthur GA, Ribas A: Combined vemurafenib66and cobimetinib in BRAF-mutated melanoma. The New England journal of medicine,
371, 1867-1876 (2014).
23)

Beck D, Niessner H, Smalley KS, Flaherty K, Paraiso KH, Busch C, Sinnberg T,
Vasseur S, Iovanna JL, Driessen S, Stork B, Wesselborg S, Schaller M, Biedermann T,
Bauer J, Lasithiotakis K, Weide B, Eberle J, Schittek B, Schadendorf D, Garbe C,
Kulms D, Meier F: Vemurafenib potently induces endoplasmic reticulum stressmediated apoptosis in BRAFV600E melanoma cells. Science signaling, 6, ra7 (2013).

24)

Ma XH, Piao SF, Dey S, McAfee Q, Karakousis G, Villanueva J, Hart LS, Levi S, Hu
J, Zhang G, Lazova R, Klump V, Pawelek JM, Xu X, Xu W, Schuchter LM, Davies MA,
Herlyn M, Winkler J, Koumenis C, Amaravadi RK: Targeting ER stress-induced
autophagy overcomes BRAF inhibitor resistance in melanoma. The Journal of clinicalinvestigation, 124, 1406-1417 (2014).
25)

Romano PR, Garcia-Barrio MT, Zhang X, Wang Q, Taylor DR, Zhang F, Herring C,
Mathews MB, Qin J, Hinnebusch AG: Autophosphorylation in the activation loop is
required for full kinase activity in vivo of human and yeast eukaryotic initiation
factor 2alpha kinases PKR and GCN2. Molecular and cellular biology, 18, 2282-2297(1998).

26)

Padyana AK, Qiu H, Roll-Mecak A, Hinnebusch AG, Burley SK: Structural basis for
autoinhibition and mutational activation of eukaryotic initiation factor 2alphaprotein kinase GCN2. J Biol Chem, 280, 29289-29299 (2005).

27)

Berlanga JJ, Santoyo J, De Haro C: Characterization of a mammalian homolog of the
GCN2 eukaryotic initiation factor 2alpha kinase. European journal of biochemistry /FEBS, 265, 754-762 (1999).
28)

Saito S, Furuno A, Sakurai J, Sakamoto A, Park HR, Shin-Ya K, Tsuruo T, Tomida A:
Chemical genomics identifies the unfolded protein response as a target for selective
cancer cell killing during glucose deprivation. Cancer research, 69, 4225-4234 (2009).

29)

Saito S, Furuno A, Sakurai J, Park HR, Shin-ya K, Tomida A: Compound C prevents
the unfolded protein response during glucose deprivation through a mechanism
independent of AMPK and BMP signaling. PloS one, 7, e45845 (2012).

30)

Locasale JW: Serine, glycine and one-carbon units: cancer metabolism in full circle.

Nat Rev Cancer, 13, 572-583 (2013).
31)

Amelio I, Cutruzzola F, Antonov A, Agostini M, Melino G: Serine and glycine
metabolism in cancer. Trends Biochem Sci, 39, 191-198 (2014).

32)

Adams CM: Role of the transcription factor ATF4 in the anabolic actions of insulin
and the anti-anabolic actions of glucocorticoids. J Biol Chem, 282, 16744-16753(2007).

33)

Seo J, Fortuno ES, 3rd, Suh JM, Stenesen D, Tang W, Parks EJ, Adams CM, Townes
T, Graff JM: Atf4 regulates obesity, glucose homeostasis, and energy expenditure.

67

Diabetes, 58, 2565-2573 (2009).
34)

Possemato R, Marks KM, Shaul YD, Pacold ME, Kim D, Birsoy K, Sethumadhavan S,
Woo HK, Jang HG, Jha AK, Chen WW, Barrett FG, Stransky N, Tsun ZY, Cowley GS,
Barretina J, Kalaany NY, Hsu PP, Ottina K, Chan AM, Yuan B, Garraway LA, Root
DE, Mino-Kenudson M, Brachtel EF, Driggers EM, Sabatini DM: Functional
genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer.

Nature, 476, 346-350 (2011).
35)

Locasale JW, Grassian AR, Melman T, Lyssiotis CA, Mattaini KR, Bass AJ, Heffron
G, Metallo CM, Muranen T, Sharfi H, Sasaki AT, Anastasiou D, Mullarky E, Vokes
NI, Sasaki M, Beroukhim R, Stephanopoulos G, Ligon AH, Meyerson M, Richardson
AL, Chin L, Wagner G, Asara JM, Brugge JS, Cantley LC, Vander Heiden MG:
Phosphoglycerate dehydrogenase diverts glycolytic flux and contributes tooncogenesis. Nat Genet, 43, 869-874 (2011).

36)

Tsukumo Y, Tsukahara S, Furuno A, Iemura S, Natsume T, Tomida A: TBL2
Associates With ATF4 mRNA Via Its WD40 Domain and Regulates Its Translation
During ER Stress. Journal of cellular biochemistry, 117, 500-509 (2016).

37)

Boussemart L, Malka-Mahieu H, Girault I, Allard D, Hemmingsson O, Tomasic G,
Thomas M, Basmadjian C, Ribeiro N, Thuaud F, Mateus C, Routier E, Kamsu-Kom
N, Agoussi S, Eggermont AM, Desaubry L, Robert C, Vagner S: eIF4F is a nexus ofresistance to anti-BRAF and anti-MEK cancer therapies. Nature, (2014).

38)

Silvera D, Formenti SC, Schneider RJ: Translational control in cancer. Nat Rev

Cancer, 10, 254-266 (2010).
39)

Tennant DA, Duran RV, Gottlieb E: Targeting metabolic transformation for cancer
therapy. Nat Rev Cancer, 10, 267-277 (2010).

40)

Sattlegger E, Hinnebusch AG: Separate domains in GCN1 for binding protein kinase
GCN2 and ribosomes are required for GCN2 activation in amino acid-starved cells.

Embo j, 19, 6622-6633 (2000).
41)

Haq R, Shoag J, Andreu-Perez P, Yokoyama S, Edelman H, Rowe GC, Frederick DT,
Hurley AD, Nellore A, Kung AL, Wargo JA, Song JS, Fisher DE, Arany Z, Widlund
HR: Oncogenic BRAF regulates oxidative metabolism via PGC1alpha and MITF.

Cancer cell, 23, 302-315 (2013).
42)

Hernandez-Davies JE, Tran TQ, Reid MA, Rosales KR, Lowman XH, Pan M,
Moriceau G, Yang Y, Wu J, Lo RS, Kong M: Vemurafenib resistance reprograms
melanoma cells towards glutamine dependence. Journal of translational medicine, 13,
210 (2015).

43)

Baenke F, Chaneton B, Smith M, Van Den Broek N, Hogan K, Tang H, Viros A,
Martin M, Galbraith L, Girotti MR, Dhomen N, Gottlieb E, Marais R: Resistance to
BRAF inhibitors induces glutamine dependency in melanoma cells. Molecular

68

oncology, 10, 73-84 (2016).
44)

Sueda T, Sakai D, Kawamoto K, Konno M, Nishida N, Koseki J, Colvin H, Takahashi
H, Haraguchi N, Nishimura J, Hata T, Takemasa I, Mizushima T, Yamamoto H,
Satoh T, Doki Y, Mori M, Ishii H: BRAF V600E inhibition stimulates AMP-activatedprotein kinase-mediated autophagy in colorectal cancer cells. Scientific reports, 6,
18949 (2016).

45)

Hetz C, Chevet E, Harding HP: Targeting the unfolded protein response in disease.

Nat Rev Drug Discov, 12, 703-719 (2013).
46)

Ma Y, Hendershot LM: The role of the unfolded protein response in tumour
development: friend or foe? Nat Rev Cancer, 4, 966-977 (2004).

47)

Clarke HJ, Chambers JE, Liniker E, Marciniak SJ: Endoplasmic reticulum stress inmalignancy. Cancer cell, 25, 563-573 (2014).

48)

Kim J, Kundu M, Viollet B, Guan KL: AMPK and mTOR regulate autophagy throughdirect phosphorylation of Ulk1. Nature cell biology, 13, 132-141 (2011).

49)

Howard S, Berdini V, Boulstridge JA, Carr MG, Cross DM, Curry J, Devine LA, Early
TR, Fazal L, Gill AL, Heathcote M, Maman S, Matthews JE, McMenamin RL,
Navarro EF, O'Brien MA, O'Reilly M, Rees DC, Reule M, Tisi D, Williams G, Vinkovic
M, Wyatt PG: Fragment-based discovery of the pyrazol-4-yl urea (AT9283), a
multitargeted kinase inhibitor with potent aurora kinase activity. Journal of

medicinal chemistry, 52, 379-388 (2009).
50)

Dawson MA, Curry JE, Barber K, Beer PA, Graham B, Lyons JF, Richardson CJ,
Scott MA, Smyth T, Squires MS, Thompson NT, Green AR, Wallis NG: AT9283, apotent inhibitor of the Aurora kinases and Jak2, has therapeutic potential in
myeloproliferative disorders. British journal of haematology, 150, 46-57 (2010).

51)

Arkenau HT, Plummer R, Molife LR, Olmos D, Yap TA, Squires M, Lewis S, Lock V,
Yule M, Lyons J, Calvert H, Judson I: A phase I dose escalation study of AT9283, asmall molecule inhibitor of aurora kinases, in patients with advanced solid
malignancies. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical

Oncology, 23, 1307-1313 (2012).
52)

Dent SF, Gelmon KA, Chi KN, Jonker DJ, Wainman N, Capier CA, Chen EX, Lyons
JF, Seymour L: NCIC CTG IND.181: phase I study of AT9283 given as a weekly 24hour infusion in advanced malignancies. Investigational new drugs, 31, 1522-1529(2013).

53)

Moreno L, Marshall LV, Pearson AD, Morland B, Elliott M, Campbell-Hewson Q,
Makin G, Halford SE, Acton G, Ross P, Kazmi-Stokes S, Lock V, Rodriguez A, Lyons
JF, Boddy AV, Griffin MJ, Yule M, Hargrave D: A phase I trial of AT9283 (a selective
inhibitor of aurora kinases) in children and adolescents with solid tumors: a Cancer
Research UK study. Clinical cancer research : an official journal of the American

69

Association for Cancer Research, 21, 267-273 (2015).
54)

Hay AE, Murugesan A, DiPasquale AM, Kouroukis T, Sandhu I, Kukreti V, Bahlis NJ,
Lategan J, Reece DE, Lyons JF, Sederias J, Xu H, Powers J, Seymour LK, Reiman T:
A phase II study of AT9283, an aurora kinase inhibitor, in patients with relapsed or
refractory multiple myeloma: NCIC clinical trials group IND.191. Leukemia &lymphoma, 57, 1463-1466 (2016).
55)

Vormoor B, Veal GJ, Griffin MJ, Boddy AV, Irving J, Minto L, Case M, Banerji U,
Swales KE, Tall JR, Moore AS, Toguchi M, Acton G, Dyer K, Schwab C, Harrison CJ,
Grainger JD, Lancaster D, Kearns P, Hargrave D, Vormoor J: A phase I/II trial of
AT9283, a selective inhibitor of aurora kinase in children with relapsed or refractory
acute leukemia: challenges to run early phase clinical trials for children withleukemia. Pediatric blood & cancer, (2016).

70

謝辞

本研究に際し、終始熱心なご指導を賜りました公益財団法人がん研究会・がん化学療法センター・ゲノム研究部 冨田章弘部長に心より感謝致します。日々の研究生活において様々な面でご支援くださいましたゲノム研究部の國政和宏博士、岡本有加博士、研究助手の櫻井純子さん、塚原里美さん、谷優理さん、池田千佳さん、小井土大さんに感謝申し上げます。また、がん化学療法センターの他の研究部及び洗浄室の皆様にも支えていただ
き、充実した研究環境で 3 年間過ごさせていただきました。
外部機関における研究の遂行に際し、大学の事務手続き等をサポートしてくださいま
した本学生薬学教室 小山清隆教授、分析化学教室 鈴木俊宏准教授に深く感謝申し上げます。本論文の作成にあたりご助言を賜りました本学衛生化学教室 石井一行教授、生化学教室 紺谷圏二教授に感謝致します。
最後に、毎日毎日誰よりもそばで支えてくれた家族に心より感謝致します。

平成 29 年 3 月

71

永澤 生久子Supplementary Data

A
siRNA

GCN2
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

A375
Cont.

VEM

Cont.

VEM

-

-

-

-

PKR

siRNA

PERK

A375
Cont.

VEM

Cont.

VEM

-

-

-

-

Cont.

PKR

HT-29

Cont.

VEM

Cont.

VEM

-

-

-

-

D

HT-29

siRNA

HRI
ATF4
RPL7

p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

siRNA

A375

p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

C
siRNA

B

HT-29

-

VEM

-

Cont.

-

VEM

siRNA

-

HRI
RPL7

A375

HT-29

Cont.

VEM

Cont.

VEM

-

-

-

-

Cont.

VEM

Cont.

VEM

-

-

-

-

p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPL7

Supplementary Figure S1. Vemurafenib による ISR 活性化は、GCN2 ノックダウンによって抑制され、他の eIF2αキナーゼのノックダウンでは抑制されない
A375 及び HT-29 細胞に GCN2 (A)、PERK (B)、PKR (C) または HRI (D) に対する
siRNA を導入後、vemurafenib (10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェス
タンブロット法により解析した。異なる配列の siRNA (Silencer Select, Thermo Fisher
Scientific 社) を用いている場合は siRNA の名前の後に_a と記載した。

73

VEM

0.4

Cont.

siATF4#2
siATF4_a2

VEM

VEM

VEM
G-361

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4

ControlCont.

siATF4siATF40.0

siGCN2
siGCN20.2

siCont.
siCont.

G-361

Cont.

siATF4#1
siATF4_a1

siCont._asiControl

ControlsiATF4_a2
siATF4#2

0.0

siATF4_a1
siATF4#1

0.2

siCont._asiControl

Colony area(relative to control)

0.6

siATF4siATF4D

0.8

siGCN2
siGCN2

G-361
Cont.
VEM

1.0

siCont.
siCont.

ATF4
RPS3

A375

1.2

Colony area(relative to control)

PERK
p-eIF2α (S51)eIF2αp-GCN2 (T899)
GCN2
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

A375

siCont.

p-GCN2 (T899)
GCN2

siRNA

Cont.

siGCN2siRNAC

B
siATF4_a2 siATF4_a1 siCont._a

A375
Cont.
VEM

siATF4

A

VEM

VEM

Supplementary Figure S2. ATF4 ノックダウンは vemurafenib による細胞増殖阻害を増強する(A) A375 細胞に ATF4 に対する 2 種の siRNA をそれぞれ導入した後、vemurafenib(VEM, 10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(B) A375 細胞に ATF4 に対する 2 種の siRNA をそれぞれ導入した後、vemurafenib (VEM, 10 µM) で 24 時間処理し、細胞を 6 ウェルプレートに播き直して
7 日間培養した。形成したコロニーをクリスタルバイオレットで染色し、ウェルごとのコロニー面積を棒グラフに示した (±SD, n=3)。本 Figure における実験は、Figure 6とは異なる配列の siRNA (Silencer Select) を用いて行い、siRNA の名前の後に_a と記載した。(C) G-361 細胞に GCN2 または ATF4 に対する siRNA をそれぞれ導入した
後、vemurafenib (VEM, 10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブ
ロット法により解析した。(D) G-361 細胞に GCN2 または ATF4 に対する siRNA をそれぞれ導入した後、vemurafenib (VEM, 10 µM) で 24 時間処理し、細胞を 6 ウェルプ
レートに播き直し 14 日間培養した。形成したコロニーをクリスタルバイオレットで染色し、ウェルごとのコロニー面積を棒グラフに示した (±SD, n=3)。
74

A375 (BRAFV600E)
Cont. HIS DAB VEM

-

-

-

TM

p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4

-

-

-

TG

- + - + - +- +siCont. ++ + +siBRAF+ + + +-

G-361 (BRAFV600E)
Cont. HIS DAB VEM

TM

TG+ - + - + - + - + - + - +- +- +- + - +- +BRAF
p-ERK (Y204/T202)
ERK
RPS3

Supplementary Figure S3. BRAFV600E 変異型細胞における BRAF ノックダウンはストレスに誘導される ATF4 発現を抑制する
A375 及び G-361 細胞に BRAF に対する siRNA を導入した後、L-histidinol (HIS, 2 mM)、dabrafenib (DAB, 1 µM)、vemurafenib (VEM, 10 µM)、tunicamycin (TM, 1 µg/ml) ま
たは thapsigargin (TG, 300 nM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブ
ロット法により解析した。本 Figure における実験は、
Figure 11 とは異なる配列の siRNA(Silencer Select) を用いて行った。

75

ATF4 mRNA level(relative to siCont./Cont.)

A

3.5

A375 (BRAFV600E)

SK-MEL-2 (BRAFWT)

9.0

ATF4 mRNA

ATF4 mRNA

8.0

3.0

7.0

2.5

6.0

2.0

5.0

1.5

4.0
3.0

1.0

2.0

0.5

1.0

0.0

0.0

Cont.

HIS

DAB

VEM

siCont.

Cont.

TG

siBRAF

B
ATF4 uORF-Luc activity(relative to siCont./Cont.)

TM

HIS

TM

siCont.

TG

siBRAF

A375 (BRAFV600E)
6.0

14.0

5.0

12.0
10.0

4.0

8.0

3.0

6.0

2.0

4.0

1.0

2.0

0.0

0.0

Cont.

HIS

siCont.

DAB

VEM

siBRAF

Cont.

TM

siCont.

TG

siBRAF

Supplementary Figure S4. BRAF ノックダウンが ATF4 mRNA 及び uORF に与える影
響の検討(A) A375 及び SK-MEL-2 細胞に BRAF に対する siRNA を導入した後、L-histidinol(HIS, 2 mM, SK-MEL-2 のみ 20 mM)、dabrafenib (DAB, 1 µM)、vemurafenib (VEM,
10 µM)、
tunicamycin (TM, 1 µg/ml, SK-MEL-2 のみ 10 µg/ml) または thapsigargin (TG,
300 nM) で 4 時間処理し、精製した RNA を用いてリアルタイム RT-PCR 法により ATF4mRNA レベルを測定した。(B) 上段: A375 細胞に ATF4 の 2 つの uORF 配列を組み込んだレポータープラスミド pRL-TK pGL3 Luc hATF4 UTR と BRAF に対する siRNAを導入した後、(A) と同様のストレッサーを 18 時間処理し、レポーターアッセイを行った (±SD, n=3)。
本 Figure における実験は、
Figure 12 とは異なる配列の siRNA (Silencer
Select) を用いて行った。

76

A

G-361

A375
Cont. HISTG

siCont. + - + - + siBRAF - + - + - +Cont. HISTG

+ - + - + - + - + - +(kDa)

Puromycin

225
150
102
76
52
38
31
24
17
12

ATF4
BRAF
RPS3

B

A375
Cont. HIS

G-361
TG

siCont. + - + - + siBRAF - + - + - +BRAF
p-mTOR (S2448)
mTOR
p-p70 S6K (T389)
p70 S6K
p-S6 (S235/S236)
p-S6 (S240/S244)
S6
P-4EBP1 (S65)4EBP1Cont. HISTG

+ - + - + - + - + - +D

A375
Cont. HIS

eIF4G
eIF4E
4EBP1

IP: 7mGTP

eIF4G
eIF4E
4EBP1
ATF4
BRAF

Input

C

A375
Cont. DAB VEM

siCont. + - + - + siBRAF - + - + - +BRAF
p-mTOR (S2448)
mTOR
p-p70 S6K (T389)
p70 S6K
p-S6 (S235/S236)
p-S6 (S240/S244)
S6
P-4EBP1 (S65)
4EBP1

p-eIF4G (S1108)
eIF4G
p-eIF4E (S209)
eIF4E
p-eIF4B (S422)
eIF4B
eIF4A

p-eIF4G (S1108)
eIF4G
p-eIF4E (S209)
eIF4E
p-eIF4B (S422)
eIF4B
eIF4A

p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
ATF4
RPS3

p-GCN2 (T899)
GCN2
PERK
ATF4
RPS3

77

TG

siCont. + - + - + siBRAF - + - + - +Supplementary Figure S5. BRAFV600E 変異型細胞株における BRAF ノックダウンは
mTOR シグナル及び翻訳開始因子のリン酸化レベルを抑制する(A) A375 及び G-361 細胞に BRAF に対する siRNA を導入した後、L-histidinol (HIS, 2mM)、または thapsigargin (TG, 300 nM) で 3.5 時間処理し、そのまま培地中に
puromycin (最終濃度 1 µg/ml) を添加し、30 分インキュベートした。その後、ライゼー
トを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(B) A375 及び G-361 細胞に BRAF
に対する siRNA を導入した後、L-histidinol または thapsigargin で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(C) A375 細胞に BRAF に対す
る siRNA を導入した後、dabrafenib (1 µM) または vemurafenib (10 µM) で 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(D) A375 細胞にBRAF に対する siRNA を導入した後、L-histidinol (HIS, 2 mM) または thapsigargin(TG, 300 nM) で 4 時間処理したライゼートを調製した。7-methyl-GTP セファロースビ
ーズを用いて eIF4E コンプレックスを精製し、ウェスタンブロット法により解析した。
Figure S5A-S5C における実験は、Figure 13 とは異なる配列の siRNA (Silencer Select)を用いて行った。

78

A375
VEM

A

B

PLX4720

Time (h) 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48+ ++ +GSK2656157

PERK- - - -

- -

A375
VEM

Time (h)p-GCN2 (T899)

p-GCN2 (T899)

GCN2

GCN2

PERK

p-eIF2α (S51)p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3

eIF2α
ATF4

GRP94
GRP78

KDEL
RPS3

- 4 24 48

C

A375
VEM PLX4720

p-GCN2 (T899)- 1 10 1 10

GCN2
PERK
p-eIF2α (S51)
eIF2α
ATF4
RPS3
Supplementary Figure S6. GCN2 及び PERK の活性化は vemurafenib の処理濃度及び時間に依存する(A) A375 細胞に GSK2656157 (0.1 µM) を 1 時間前処理し、その後 vemurafenib (VEM,
1 µM) または PLX4720 (1 µM) で 24 または 48 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(B) A375 細胞に vemurafenib (10 µM) を 4、24 ま
たは 48 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。(C)A375 細胞に vemurafenib (1 または 10 µM) または PLX4720 (1 または 10 µM)を 4 時間処理したライゼートを調製し、ウェスタンブロット法により解析した。

79

Supplementary Table S1. Figure 4E のシグネチャーに用いた 395 プローブセット
Probe Set ID
1553972_a_at
1554148_a_at
1554462_a_at
1554777_at
1555355_a_at
1555673_at
1555788_a_at
1555963_x_at
1555968_a_at1558027_s_at
1558080_s_at
1562367_at
1563808_at
1564494_s_at
1569086_at
200598_s_at200599_s_at
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200670_at
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200799_at
200800_s_at
200825_s_at
200920_s_at
200921_s_at
200935_at
200969_at
201008_s_at
201009_s_at
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201289_at
201340_s_at
201565_s_at
201694_s_at201896_s_at
201983_s_at
202014_at
202061_s_at
202062_s_at
202064_s_at
202146_at
202147_s_at
202375_at
202431_s_at
202454_s_at
202557_at
202558_s_at
202581_at
202655_at
202656_s_at
202672_s_at
202719_s_at
202720_at
202721_s_at
202722_s_at
202769_at
202770_s_at
202841_x_at
202842_s_at
202846_s_at
202858_at
202886_s_at
202949_s_at
202986_at
203164_at
203165_s_at

Gene Symbol
CBS
SLC33A1DNAJB9ZFP42ETS1KRTAP2-3 /// KRTAP2-4
TRIB3
B3GNT7--LOC101060511 /// PRKAB2DNAJC3
C15orf54
MCF2L
P4HB
LOC100287177
HSP90B1 /// MIR3652
HSP90B1 /// MIR3652
WARS
P4HB
XBP1
ATF4
HSPA1A /// HSPA1B
HSPA1A /// HSPA1B
HYOU1
BTG1
BTG1
CALR
SERP1
LOC101060503 /// TXNIP
LOC101060503 /// TXNIP
LOC101060503 /// TXNIP
DUSP1
PJA2
BHLHE40
CYR61
ENC1
ID2
EGR1
PSRC1
EGFR
PPP1R15A
SEL1L
SEL1L
SEL1L
IFRD1
IFRD1
SEC24DMYC
ERBB3
HSPA13
HSPA13
HSPA1A /// HSPA1BMANFSERTAD2
ATF3
TES
TES
GFPT1
GFPT1
CCNG2
CCNG2
OGFR
DNAJB9
LOC100505991 /// PIGC
U2AF1
PPP2R1B
FHL2
ARNT2
SLC33A1
SLC33A1

Probe Set ID
203252_at
203279_at
203313_s_at
203343_at
203438_at
203439_s_at
203455_s_at
203574_at
203624_at
203665_at
203675_at
203725_at
203821_at
203827_at
203971_at
203989_x_at
204014_at
204140_at
204159_at
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204203_at
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204351_at
204379_s_at
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204595_s_at
204597_x_at
204642_at
204897_at
204926_at
205047_s_at
205048_s_at
205168_at
205193_at
205194_at
205239_at
205266_at
205289_at
205290_s_at
205463_s_at
205481_at
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206034_at
206085_s_at
206101_at
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206163_at
206170_at
206175_x_at
206332_s_at
206552_s_at
206569_at
206662_at
206765_at
207219_at
207629_s_at
208003_s_at
208025_s_at
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208394_x_at
208499_s_at
208612_at
208658_at
208763_s_at
208786_s_at
208813_at

Gene Symbol
CDK2AP2
EDEM1
TGIF1
UGDH
STC2
STC2
SAT1
NFIL3
AKAP17A
HMOX1NUCB2GADD45A
HBEGF
WIPI1SLC31A1
F2R
DUSP4
TPST1
CDKN2CBACH1CEBPG
PMAIP1PMAIP1
KLF7
S100P
FGFR3
FGF2
STC1
STC1
S1PR1
PTGER4
INHBA
ASNS
PSPH
DDR2
MAFF
PSPH
AREG /// AREGB
LIF
BMP2
BMP2
PDGFA
ADORA1TUFT1CCNA1ANKRD1SERPINB8
CTH
ECM2
PTX3
MAB21L1ADRB2ZNF222
IFI16
TAC1
IL24
GLRX
KCNJ2
ZFP69B
ARHGEF2NFAT5HMGA2TNFAIP8ESM1DNAJC3PDIA3PDIA4TSC22D3
MAP1LC3B
GOT1

80

Probe Set ID
208937_s_at
208965_s_at
208966_x_at
209099_x_at
209101_at
209205_s_at
209212_s_at
209230_s_at
209276_s_at
209294_x_at
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209409_at
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209435_s_at
209457_at
209610_s_at
209682_at
209765_at
209822_s_at
209850_s_at
209921_at
210002_at
210105_s_at
210405_x_at
210512_s_at210592_s_at210596_at
210705_s_at
210762_s_at
210764_s_at210970_s_at
210999_s_at
211048_s_at211936_at
212110_at
212233_at
212472_at
212501_at
212622_at
212623_at
212660_at
212724_at
212810_s_at
212811_x_at
212935_at
212948_at
212985_at
213182_x_at
213206_at
213348_at
213425_at
213506_at
213836_s_at
213844_at
213988_s_at
214014_at
214581_x_at
214658_at
214724_at
215243_s_at215767_at
216268_s_at
216449_x_at
216450_x_at
216894_x_at
217127_at
217168_s_at
217678_at
217823_s_at

Gene Symbol
ID1
IFI16
IFI16
JAG1
CTGF
LMO4
KLF5
NUPR1
GLRX
TNFRSF10B
DDIT3
TMED7 /// TMED7-TICAM2
GRB10
PATZ1
ARHGEF2
DUSP5
SLC1A4
CBLB
ADAM19VLDLR
CDC42EP2SLC7A11GATA6FYNTNFRSF10B
VEGFA
SAT1
MAGT1
TRIM5
DLC1
CYR61
IBTK
GRB10
PDIA4
HSPA5
SLC39A14
MAP1B
MICAL2
CEBPB
TMEM41B
TMEM41B
PHF15
RND3SLC1A4SLC1A4
MCF2L
CAMTA2APBB2CDKN1CGOSR2
CDKN1C
WNT5A
F2RL1
WIPI1
HOXA5
SAT1
CDC42EP2TNFRSF21
TMED7 /// TMED7-TICAM2DIXDC1GJB3
ZNF804A
JAG1
HSP90B1
HSP90B1
CDKN1CCTH
HERPUD1
SLC7A11
UBE2J1

Probe Set ID
217824_at
217825_s_at
217826_s_at
217853_at
217858_s_at
217966_s_at
217967_s_at
217996_at
217997_at
217999_s_at
218000_s_at
218050_at
218145_at
218251_at
218296_x_at
218358_at
218421_at
218615_s_at
218651_s_at
218681_s_at
218696_at
218856_at
218974_at
219010_at

Gene Symbol
UBE2J1UBE2J1UBE2J1TNS3ARMCX3
FAM129A
FAM129APHLDA1PHLDA1PHLDA1PHLDA1
UFM1
TRIB3
MID1IP1
MSTO1 /// MSTO2P
CRELD2
CERK
TMEM39A
LARP6SDF2L1
EIF2AK3TNFRSF21
SOBP
C1orf106

Probe Set ID
224899_s_at
225033_at
225090_at
225133_at
225163_at
225182_at
225278_at
225284_at
225316_at
225436_at
225442_at
225527_at
225621_at
225634_at
225666_at
225807_at
226034_at
226084_at
226101_at
226135_at
226150_at
226181_at
226206_at
226275_at

Gene Symbol
MAGT1
ST3GAL1
SYVN1KLF3
FRMD4A
TMEM50B
LOC101060511 /// PRKAB2DNAJC3
MFSD2A
ABHD17C
DDR2
CEBPG
ALG2
ZC3HAV1
TMTC4
AJUBA
DUSP4
MAP1B
PRKCE
UHRF1BP1
PPAPDC1B
TUBE1
MAFK
MXD1

Probe Set ID
230659_at
230722_at
230728_at
230746_s_at
230836_at
230972_at
231202_at
231798_at
231828_at
231894_at
231944_at
232068_s_at
233557_s_at
233764_s_at
233888_s_at
233955_x_at
235122_at
235142_at
235191_at
235230_at
235311_at
235341_at
235589_s_at
235775_at

219256_s_at

SH3TC1226321_at

LYSMD3235939_at

219270_at

CHAC1

226390_at

STARD4236606_at

219371_s_at
219390_at
219534_x_at
219600_s_at
219910_at
219990_at
220012_at
220038_at
220266_s_at
220892_s_at
221050_s_at
221489_s_at
221553_at
221559_s_at
221577_x_at
221778_at
221841_s_at
221865_at
222235_s_at
222412_s_at

KLF2
FKBP14
CDKN1CTMEM50B
FICD
E2F8
ERO1LB
C8orf44-SGK3 /// SGK3
KLF4
PSAT1
GTPBP2
SPRY4
MAGT1
MIS12
GDF15
JHDM1D
KLF4
C9orf91
CSGALNACT2
SSR3226425_at
226722_at
226725_at
226743_at
226750_at
226886_at
226925_at
227027_at
227033_at
227038_at
227052_at
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227220_at
227236_at
227404_s_at
227405_s_at
227443_at
227484_at
227561_at
227627_at

237411_at
237435_at
238009_at
238430_x_at
238478_at
238575_at
238729_x_at
239451_at
239825_at
240421_x_at
242727_at
242943_at
243160_at
244070_at
244841_at
35147_at
36711_at
37028_at
38037_at

222444_at

ARMCX3227755_at

222450_at
222690_s_at
222710_at
222907_x_at
223054_at
223059_s_at
223062_s_at
223070_at
223195_s_at
223196_s_at
223209_s_at
223314_at
223412_at
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223541_at
224233_s_at
224325_at
224367_at
224516_s_at
224657_at
224822_at
224833_at
224839_s_at

PMEPA1
TMEM39A
AMIGO3 /// GMPPB
TMEM50B
DNAJB11
FAM107B
PSAT1
SELK
SESN2
SESN2
VIMP
TSPAN14KBTBD7
COG3
HAS3
MSTO1
FZD8
BEX2
CXXC5
ERRFI1
DLC1
ETS1
GPT2

227997_at
228033_at
228038_at
228121_at
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228482_at
228497_at
228499_at
228574_at
228635_at
228745_at
228846_at
229285_at
229332_at
229453_at
229717_at
229817_at
229838_at
230031_at
230075_at
230261_at
230265_at
230493_at

CLIP4
FAM20CSLFN5
SLFN11
LARP1B
GFPT1
ACPL2
GFPT1
PDIA3
SGMS2
--ZNF697
NFXL1
TSPAN2EGR1FZD8LURAP1L
SRGAP1
DDR2
C8orf44-SGK3 /// SGK3OTTHUMG00000178878 ///RP11-214C8.5
IL17RD
E2F7
SOX2
TGFB2
C17orf51
CDRT4 /// TVP23C-CDRT4SLC22A15PFKFB4
TMTC2
PCDH10SGTB
MXD1RNASELHPDL
PDIA3AMIGO3 /// GMPPB
ZNF608NUCB2HSPA5RAB39B
ST8SIA4--SHISA2

81

Gene Symbol--BNC2
FKBP14--ST8SIA4ANKRD9ALDH1L2
NOG
PSMD5-AS1
SARS
ERO1LB
TLR4
MON1B
LARP1BSRGAP1CXXC5HIVEP3ZBTB8A
LINC00662
PLCXD2
FKBP14DNAJC3--TMTC2OTTHUMG00000175830 ///RP1-228H13.5
OTTHUMG00000183927 ///RP11-248J18.2
ADAMTS6--SOX5SLFN5BNC2OSBPL6SAV1----SAV1
ARL5B
ST8SIA4--SYNE1
SEC24A
MCF2L
MAFF
PPP1R15A
HBEGF

Supplementary Table S2. A375 細胞における vemurafenib、2DG または tunicamycin
処理時に共通して発現上昇を認めた 114 プローブセットに対する GO 解析結果
Annotation Cluster 1
Category
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FAT
KEGG_PATHWAY
GOTERM_MF_FATGOTERM_BP_FAT
INTERPROINTERPROSP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FAT
KEGG_PATHWAY
GOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
SP_PIR_KEYWORDS

Enrichment Score: 3.1748107799632934
Term
amino-acid biosynthesis
GO:0008652~cellular amino acid biosynthetic process
GO:0009070~serine family amino acid biosynthetic process
GO:0009309~amine biosynthetic process
GO:0046394~carboxylic acid biosynthetic process
GO:0016053~organic acid biosynthetic process
GO:0030170~pyridoxal phosphate binding
GO:0070279~vitamin B6 binding
pyridoxal phosphate
GO:0009069~serine family amino acid metabolic process
hsa00260:Glycine, serine and threonine metabolism
GO:0019842~vitamin binding
GO:0006563~L-serine metabolic process
IPR015421:Pyridoxal phosphate-dependent transferase, major region, subdomain 1
IPR015422:Pyridoxal phosphate-dependent transferase, major region, subdomain 2
Aminotransferase
GO:0008483~transaminase activity
GO:0048037~cofactor binding
GO:0016769~transferase activity, transferring nitrogenous groups
hsa00270:Cysteine and methionine metabolism
GO:0044271~nitrogen compound biosynthetic processtransferase
disease mutation

Count %
PValue FDR
5 5.81 3.1E-06 3.6E-03
6 6.98 4.0E-06 6.2E-03
4 4.65 1.6E-05 2.5E-02
6 6.98 3.9E-05 6.1E-02
7 8.14 8.9E-05 1.4E-01
7 8.14 8.9E-05 1.4E-01
5 5.81 1.1E-04 1.3E-01
5 5.81 1.1E-04 1.3E-01
5 5.81 1.4E-04 1.7E-01
4 4.65 2.4E-04 3.8E-01
4 4.65 2.5E-04 2.4E-01
6 6.98 3.3E-04 4.0E-01
3 3.49 6.1E-04 9.3E-01
4 4.65 7.9E-04 9.8E-01
3 3.49 1.2E-03 1.5E+00
3 3.49 3.6E-03 4.1E+00
3 3.49 4.2E-03 5.0E+00
6 6.98 5.8E-03 6.9E+00
3 3.49 8.4E-03 9.9E+00
3 3.49 8.4E-03 7.7E+00
6 6.98 1.9E-02 2.5E+01
6 6.98 7.2E-01 1.0E+02
5 5.81 9.2E-01 1.0E+02

Annotation Cluster 2
Category
INTERPROGOTERM_MF_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATEnrichment Score: 3.0802395199484254
Term
IPR011700:Basic leucine zipper
GO:0003700~transcription factor activity
GO:0006366~transcription from RNA polymerase II promoter
GO:0006351~transcription, DNA-dependent
GO:0032774~RNA biosynthetic process

Count %
PValue FDR
6 6.98 4.4E-09 5.4E-06
13 15.12 1.5E-03 1.8E+00
5 5.81 2.5E-02 3.2E+01
5 5.81 4.9E-02 5.4E+01
5 5.81 5.1E-02 5.6E+01

Annotation Cluster 3
Category
INTERPROGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FAT
SP_PIR_KEYWORDS

Enrichment Score: 3.037309190281408
Term
IPR011700:Basic leucine zipper
GO:0008134~transcription factor binding
GO:0003712~transcription cofactor activity
GO:0003714~transcription corepressor activity
GO:0016564~transcription repressor activity
repressor

Count %
PValue FDR
6 6.98 4.4E-09 5.4E-06
11 12.79 1.1E-04 1.3E-01
7 8.14 6.4E-03 7.6E+00
4 4.65 2.9E-02 3.1E+01
5 5.81 5.8E-02 5.2E+01
5 5.81 1.1E-01 7.6E+01

Annotation Cluster 4
Category
SMART
INTERPROINTERPRO
UP_SEQ_FEATURE
UP_SEQ_FEATURE
GOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATEnrichment Score: 2.5496812863907072
Term
SM00338:BRLZ
IPR004827:Basic-leucine zipper (bZIP) transcription factor
IPR011700:Basic leucine zipper
domain:Leucine-zipper
DNA-binding region:Basic motif
GO:0008134~transcription factor binding
GO:0046983~protein dimerization activity
GO:0030528~transcription regulator activity
GO:0003700~transcription factor activity
activator
GO:0010557~positive regulation of macromolecule biosynthetic processtranscription regulation
GO:0031328~positive regulation of cellular biosynthetic process
GO:0009891~positive regulation of biosynthetic process
Transcription
GO:0010604~positive regulation of macromolecule metabolic process
GO:0045449~regulation of transcription
GO:0006350~transcription

Count %
PValue FDR
8 9.30 1.7E-09 1.5E-06
8 9.30 3.3E-09 4.1E-06
6 6.98 4.4E-09 5.4E-06
9 10.47 2.3E-08 3.1E-05
7 8.14 6.7E-05 8.9E-02
11 12.79 1.1E-04 1.3E-01
11 12.79 1.7E-04 2.1E-01
17 19.77 1.1E-03 1.3E+00
13 15.12 1.5E-03 1.8E+00
9 10.47 1.7E-03 2.0E+00
10 11.63 3.5E-03 5.2E+00
18 20.93 4.7E-03 5.4E+00
10 11.63 4.7E-03 7.1E+00
10 11.63 5.2E-03 7.7E+00
18 20.93 5.8E-03 6.7E+00
11 12.79 6.6E-03 9.8E+00
22 25.58 6.8E-03 1.0E+01
18 20.93 1.6E-02 2.2E+01

82

8 9.30
15 17.44
8

9.30

2.7E-02 3.5E+01

GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FAT

GO:0043565~sequence-specific DNA binding
dna-binding
GO:0045935~positive regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic
acid metabolic process
GO:0051173~positive regulation of nitrogen compound metabolic process
GO:0006355~regulation of transcription, DNA-dependent
GO:0051252~regulation of RNA metabolic process
GO:0045941~positive regulation of transcription
nucleus
GO:0010628~positive regulation of gene expression
DNA binding
GO:0003677~DNA binding
GO:0003702~RNA polymerase II transcription factor activity
GO:0006357~regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
GO:0045893~positive regulation of transcription, DNA-dependent
GO:0051254~positive regulation of RNA metabolic process

8
15
15
7
26
7
5
17
4
7
5
5

9.30
17.44
17.44
8.14
30.23
8.14
5.81
19.77
4.65
8.14
5.81
5.81

3.2E-02
3.5E-02
4.2E-02
5.0E-02
5.2E-02
5.6E-02
5.7E-02
6.1E-02
1.0E-01
1.3E-01
1.9E-01
1.9E-01

GOTERM_BP_FAT

GO:0045944~positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter

4

4.65

2.6E-01 9.9E+01

GOTERM_MF_FATGOTERM_BP_FAT

GO:0016563~transcription activator activity
GO:0006955~immune response

4
5

4.65
5.81

2.9E-01 9.9E+01
4.1E-01 1.0E+02

Annotation Cluster 5
Category
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATEnrichment Score: 2.4281875387113985
Term
GO:0034976~response to endoplasmic reticulum stress
GO:0030968~endoplasmic reticulum unfolded protein response
GO:0034620~cellular response to unfolded protein
GO:0006984~ER-nuclear signaling pathway
GO:0051789~response to protein stimulus
GO:0006986~response to unfolded protein

GOTERM_MF_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FAT

83

2.1E-02 2.3E+01
2.6E-02 2.7E+01

3.9E+01
4.3E+01
4.8E+01
5.5E+01
4.7E+01
5.9E+01
5.0E+01
5.4E+01
7.4E+01
8.8E+01
9.6E+01
9.6E+01

Count %
PValue FDR
5 5.81 1.9E-05 2.9E-02
3 3.49 4.4E-03 6.6E+00
3 3.49 4.4E-03 6.6E+00
3 3.49 1.2E-02 1.7E+01
4 4.65 1.4E-02 2.0E+01
3 3.49 4.4E-02 5.1E+01

Supplementary Table S3. A375 細胞における 2DG または tunicamycin 処理時に共通して発現上昇を認めた 207 プローブセットに対する GO 解析結果
Annotation Cluster 1
Category
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATEnrichment Score: 9.8279940194613
Term
endoplasmic reticulum
GO:0005783~endoplasmic reticulum
GO:0044432~endoplasmic reticulum part

Count %
PValue FDR
26 18.84 3.1E-11 3.8E-08
31 22.46 4.9E-11 6.1E-08
18 13.04 2.2E-09 2.8E-06

Annotation Cluster 2
Category
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATEnrichment Score: 5.153622478248857
Term
GO:0043067~regulation of programmed cell death
GO:0010941~regulation of cell death
GO:0042981~regulation of apoptosis
GO:0043065~positive regulation of apoptosis
GO:0043068~positive regulation of programmed cell death
GO:0010942~positive regulation of cell death
GO:0006917~induction of apoptosis
GO:0012502~induction of programmed cell deathCount %
PValue FDR
25 18.12 5.4E-08 8.9E-05
25 18.12 5.8E-08 9.6E-05
24 17.39 1.9E-07 3.2E-04
15 10.87 1.5E-05 2.5E-02
15 10.87 1.6E-05 2.7E-02
15 10.87 1.7E-05 2.8E-02
10 7.25 1.5E-03 2.5E+00
10 7.25 1.6E-03 2.6E+00

Annotation Cluster 3
Category
UP_SEQ_FEATURE
GOTERM_CC_FAT
INTERPROGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_MF_FATEnrichment Score: 4.421621764568182
Term
short sequence motif:Prevents secretion from ER
GO:0005788~endoplasmic reticulum lumen
IPR000886:Endoplasmic reticulum, targeting sequence
GO:0048770~pigment granule
GO:0042470~melanosome
GO:0005509~calcium ion binding

Count %
PValue FDR
9 6.52 8.7E-09 1.3E-05
10 7.25 1.5E-08 1.8E-05
7 5.07 1.3E-06 1.7E-03
5 3.62 5.8E-03 7.0E+00
5 3.62 5.8E-03 7.0E+00
9 6.52 5.5E-01 1.0E+02

Annotation Cluster 4
Category
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_MF_FATEnrichment Score: 4.304943010210572
Term
GO:0009891~positive regulation of biosynthetic process
GO:0031328~positive regulation of cellular biosynthetic process
GO:0051173~positive regulation of nitrogen compound metabolic process
GO:0010557~positive regulation of macromolecule biosynthetic process
GO:0045935~positive regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic
acid metabolic process
GO:0010604~positive regulation of macromolecule metabolic process
GO:0045893~positive regulation of transcription, DNA-dependent
GO:0051254~positive regulation of RNA metabolic process
GO:0045944~positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
GO:0045941~positive regulation of transcription
GO:0010628~positive regulation of gene expression
GO:0006357~regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
GO:0006355~regulation of transcription, DNA-dependent
GO:0051252~regulation of RNA metabolic process
GO:0045449~regulation of transcription
GO:0016563~transcription activator activity

Annotation Cluster 5
Category
GOTERM_MF_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
UP_SEQ_FEATURE
GOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_MF_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_CC_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
SP_PIR_KEYWORDS
UP_SEQ_FEATURE
UP_SEQ_FEATURE
GOTERM_BP_FATEnrichment Score: 3.5292991624377303
Term
GO:0008083~growth factor activity
growth factor
GO:0007167~enzyme linked receptor protein signaling pathway
signalsignal peptide
GO:0005615~extracellular space
GO:0044421~extracellular region part
GO:0005125~cytokine activity
Secreted
GO:0005576~extracellular region
disulfide bondglycoprotein
disulfide bondglycosylation site:N-linked (GlcNAc...)
GO:0007166~cell surface receptor linked signal transduction

GOTERM_BP_FAT84Count %
PValue FDR
23 16.67 6.5E-08 1.1E-04
22 15.94 2.3E-07 3.8E-04
21 15.22 3.8E-07 6.3E-04
21 15.22 4.9E-07 8.0E-04
19 13.77 4.4E-06

7.4E-03

22
15
15
13
16
16
18
27
27
32
6

1.4E-02
7.8E-02
8.5E-02
1.1E-01
1.3E-01
1.8E-01
2.0E-01
4.9E+00
6.5E+00
3.3E+01
9.9E+01

15.94
10.87
10.87
9.42
11.59
11.59
13.04
19.57
19.57
23.19
4.35

8.3E-06
4.7E-05
5.1E-05
6.8E-05
7.6E-05
1.1E-04
1.2E-04
3.0E-03
4.1E-03
2.4E-02
2.9E-01

Count %
PValue FDR
14 10.14 1.3E-09 1.8E-06
11 7.97 3.1E-08 3.9E-05
15 10.87 1.1E-06 1.8E-03
42 30.43 9.1E-05 1.1E-01
42 30.43 1.1E-04 1.5E-01
17 12.32 1.1E-04 1.4E-01
19 13.77 6.1E-04 7.6E-01
8 5.80 1.6E-03 2.1E+00
23 16.67 3.7E-03 4.5E+00
28 20.29 4.2E-03 5.1E+00
33 23.91 6.8E-03 8.2E+00
42 30.43 2.2E-02 2.5E+01
30 21.74 2.4E-02 3.0E+01
39 28.26 4.8E-02 5.1E+01
22 15.94 9.5E-02 8.1E+01

Annotation Cluster 6
Category
GOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATEnrichment Score: 3.244644324816071
Term
GO:0031988~membrane-bounded vesicle
GO:0031982~vesicle
GO:0016023~cytoplasmic membrane-bounded vesicle
GO:0031410~cytoplasmic vesicle
GO:0044433~cytoplasmic vesicle part

Count %
PValue FDR
15 10.87 1.8E-04 2.2E-01
16 11.59 2.9E-04 3.7E-01
14 10.14 4.6E-04 5.8E-01
15 10.87 6.2E-04 7.7E-01
7 5.07 4.0E-03 4.9E+00

Annotation Cluster 7
Category
GOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FATGOTERM_CC_FAT
SP_PIR_KEYWORDS

Enrichment Score: 3.220602837686791
Term
GO:0044432~endoplasmic reticulum part
GO:0042175~nuclear envelope-endoplasmic reticulum network
GO:0005789~endoplasmic reticulum membrane
GO:0031301~integral to organelle membrane
GO:0012505~endomembrane system
GO:0031300~intrinsic to organelle membrane
GO:0030176~integral to endoplasmic reticulum membrane
GO:0031090~organelle membrane
GO:0031227~intrinsic to endoplasmic reticulum membrane
Signal-anchor

Count %
PValue FDR
18 13.04 2.2E-09 2.8E-06
11 7.97 9.6E-05 1.2E-01
10 7.25 3.2E-04 4.0E-01
7 5.07 4.7E-04 5.9E-01
17 12.32 5.0E-04 6.2E-01
7 5.07 1.2E-03 1.4E+00
4 2.90 6.4E-03 7.7E+00
18 13.04 6.4E-03 7.7E+00
4 2.90 1.5E-02 1.7E+01
4 2.90 5.7E-01 1.0E+02

85

Supplementary Table S4. Figure 5A のシグネチャーに用いた 563 プローブセット
Probe Set ID
1552648_a_at
1552798_a_at1553055_a_at
1553972_a_at
1553994_at
1553995_a_at
1554980_a_at
1555673_at
1555832_s_at1555968_a_at
1556773_at
1557458_s_at
1558027_s_at
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201010_s_at
201041_s_at
201107_s_at
201108_s_at
201109_s_at
201148_s_at
201149_s_at
201150_s_at
201170_s_at
201289_at
201324_at
201325_s_at201340_s_at201341_at
201367_s_at
201368_at
201369_s_at
201416_at
201417_at
201464_x_at
201465_s_at201466_s_at
201565_s_at
201566_x_at
201631_s_at
201695_s_at
201739_at
201829_at
201830_s_at
201860_s_at
201920_at
201983_s_at
202006_at
202067_s_at
202068_s_at
202081_at
202132_at
202134_s_at
202146_at
202147_s_at
202241_at
202283_at
202391_at
202431_s_at
202437_s_at
202464_s_at

Gene Symbol
TNFRSF10A
TLR4
SLFN5
CBS
NT5E
NT5E
ATF3
KRTAP2-3 /// KRTAP2-4
KLF6----SHB
LOC101060511 /// PRKAB2
LINC00622
SAMD11
LINC00326
C15orf54
MAT2A
MCL1
MCL1
MCL1
PHC2
LOC101060503 /// TXNIP
LOC101060503 /// TXNIP
LOC101060503 /// TXNIP
DUSP1
THBS1
THBS1
THBS1
TIMP3
TIMP3
TIMP3
BHLHE40
CYR61
EMP1
EMP1
ENC1
ENC1
ZFP36L2ZFP36L2ZFP36L2
SOX4
SOX4
JUN
JUN
JUN
ID2
ID2
IER3
PNP
SGK1
NET1
NET1
PLAT
SLC20A1
EGFR
PTPN12
LDLR
LDLR
IER2
WWTR1
WWTR1
IFRD1
IFRD1
TRIB1
SERPINF1
BASP1
MYC
CYP1B1PFKFB3

Probe Set ID
202478_at
202479_s_at
202497_x_at
202498_s_at
202499_s_at
202565_s_at
202644_s_at
202663_at
202664_at
202672_s_at202693_s_at202695_s_at
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202770_s_at
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202912_at
202949_s_at
202969_at
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202976_s_at
202986_at
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203759_at
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203879_at
203921_at
203989_x_at
204011_at
204014_at
204015_s_at
204032_at
204140_at
204197_s_at
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204255_s_at
204337_at
204351_at
204363_at
204396_s_at
204401_at
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204435_at
204451_at
204470_at
204595_s_at
204596_s_at
204597_x_at
204657_s_at
204689_at
204695_at

Gene Symbol
TRIB2
TRIB2
SLC2A3SLC2A3SLC2A3SVIL
TNFAIP3
WIPF1
WIPF1
ATF3
STK17ASTK17ACCNG2
CCNG2
LOC100505991 /// PIGC
U2AF1
ADM
FHL2
DYRK2
RHOBTB3RHOBTB3
ARNT2
CHSY1
MYO1E
GPRC5AKIAA0040
IFIT1
ALDH1A3
ST3GAL5
SH2B3
ETV5
ETV5
HES1
HES1
IQGAP2EPHA2
ZEB2
INPP5F
DIO2
DIO2
ST3GAL4HBEGF
PIK3CD
CHST2
F2R
SPRY2
DUSP4
DUSP4
BCAR3
TPST1
RUNX3
RUNX3
CEBPG
VDR
VDR
RGS4
S100P
F3
GRK5
KCNN4
FOSL1
NUPL1
FZD1
CXCL1
STC1
STC1
STC1
SHB
HHEX
CDC25A

86

Probe Set ID
204696_s_at
204913_s_at
204914_s_at
204915_s_at
204933_s_at
204948_s_at
204967_at
205015_s_at
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205097_at
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205932_s_at
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207754_at
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208510_s_at
208650_s_at
208651_x_at
208711_s_at

Gene Symbol
CDC25A
SOX11
SOX11
SOX11
TNFRSF11B
FST
SHROOM2
TGFA
TGFA
GNE
ASNS
PSPH
SLC26A2
CIITA
FGF1
MOK
DDR2
MAFF
PSPH
AREG /// AREGBLIF
TFAP2CTFAP2C
BMP2
BMP2
SMAD3
HOXB2
HS3ST1
SMURF2
CYP1A1
ROR1
LOC101060353 /// PDE4DIPMSX1
ANKRD1
WT1
CTH
ECM2
EGR3
PTX3
ADRB2
TLR3
PTHLH
FOXD1
ANK3
F2RL1
ZNF365
AJAP1
ETV1
IL24
ZMYM5
KCNJ2
IL11
ST8SIA4IL11
POU3F2
FST
SMTN
PITX2
SLC4A7
ARHGAP12
LOC100996477 /// RASSF8METTL7A
ANK3
MALT1
ESM1
FRMD4A
PPARG
CD24
CD24
CCND1

Probe Set ID
208712_at
208763_s_at
208891_at
208892_s_at
208893_s_at
208944_at
208960_s_at
209034_at
209037_s_at

Gene Symbol
CCND1
TSC22D3
DUSP6
DUSP6
DUSP6
TGFBR2
KLF6
PNRC1
EHD1

Probe Set ID
212845_at
212906_at
212942_s_at
212948_at
212981_s_at
213056_at
213113_s_at
213142_x_at
213281_at

Probe Set ID
219634_at
219682_s_at
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220012_at
220014_at
220144_s_at
220272_at
220892_s_at
220945_x_at

Gene Symbol
CHST11TBX3
SLCO4A1ERO1LB
PRR16
ANKEF1BNC2PSAT1MANSC1221060_s_at

TLR4

213338_at
213413_at
213462_at
213506_at
213664_at
213721_at
213722_at
213848_at
213849_s_at
214014_at
214023_x_at
214056_at
214057_at
214451_at
214581_x_at
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215037_s_at
215704_at
215933_s_at
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216268_s_at
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217061_s_at
217127_at
217173_s_at
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217875_s_at
217911_s_at
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217967_s_at
217996_at
217997_at
217998_at
217999_s_at
218000_s_at
218113_at
218211_s_at
218273_s_at
218276_s_at
218284_at
218303_x_at
218326_s_at
218530_at
218647_s_at
218651_s_at
218691_s_at
218692_at
218807_at
218856_at
219010_at
219049_at
219250_s_at

Gene Symbol
SAMD4AGRAMD1B
KIAA1199
CAMTA2
FAM115A /// LOC100294033
FRMD4B
SLC43A3
GSAP
JUN
CTA-204B4.6 ///OTTHUMG00000172354
TMEM158
STON1
NPAS2
F2RL1
SLC1A1
SOX2
SOX2
DUSP7
PPP2R2B
CDC42EP2
TUBB2B
MCL1
MCL1
TFAP2BTNFRSF21
TM4SF1
BCL2L1FLGHHEX
RHOBTB3
SLC2A14 /// SLC2A3
JAG1
CD24
PTPN12
ETV1
ETV1
CTH
LDLR
SLC7A11PMEPA1
BAG3
FAM129A
FAM129APHLDA1PHLDA1PHLDA1PHLDA1PHLDA1
TMEM2
MLPH
PDP1
SAV1
SMAD3
KRCC1
LGR4
FHOD1
YRDC
LARP6
PDLIM4SYBUVAV3TNFRSF21
C1orf106CSGALNACT1
FLRT3209039_x_at

EHD1

213310_at

209099_x_at
209101_at
209230_s_at
209286_at
209287_s_at
209288_s_at
209324_s_at
209325_s_at
209357_at
209383_at
209386_at
209387_s_at
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209457_at
209493_at
209604_s_at
209655_s_at
209656_s_at
209682_at
209771_x_at
209772_s_at
209782_s_at
209803_s_at
209822_s_at
209850_s_at
209884_s_at
209946_at
210017_at
210018_x_at
210095_s_at
210198_s_at
210355_at
210511_s_at
210612_s_at210692_s_at
210762_s_at
210764_s_at210845_s_at211258_s_at
211506_s_at
211559_s_at
211756_at
211924_s_at
212096_s_at
212148_at
212298_at
212419_at
212423_at
212434_at
212444_at
212445_s_at
212448_at
212458_at
212665_at
212715_s_at

JAG1
CTGF
NUPR1
CDC42EP3
CDC42EP3
CDC42EP3
RGS16
RGS16
CITED2
DDIT3TM4SF1
TM4SF1
ANK3
DUSP5
PDZD2
GATA3
TMEM47
TMEM47
CBLB
CD24
CD24
DBP
PHLDA2VLDLR
CDC42EP2SLC4A7
VEGFC
MALT1
MALT1
IGFBP3
PLP1
PTHLH
INHBA
SYNJ2
SLC43A3
DLC1
CYR61
PLAUR
TGFA
IL8
CCNG2
PTHLH
PLAUR
MTUS1
PBX1
NRP1
ZCCHC24ZCCHC24
GRPEL1
GPRC5ANEDD4LNEDD4LSPRED2
TIPARPMICAL3221215_s_at221276_s_at
221489_s_at
221752_at
221773_at
221864_at
221911_at
222088_s_at
222108_at
222150_s_at
222221_x_at
222449_at
222450_at
222572_at
222582_at
222847_s_at
222853_at
223062_s_at
223159_s_at
223195_s_at
223196_s_at
223204_at
223264_at
223314_at
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223704_s_at
224325_at
224341_x_at
224606_at
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224797_at
224822_at
224959_at
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224990_at
225048_at
225163_at
225167_at
225168_at
225186_at
225188_at
225189_s_at
225202_at
225220_at
225278_at
225283_at
225316_at
225436_at
225442_at
225450_at
225457_s_at
225459_at
225544_at
225548_at

RND3

219270_at

CHAC1

225569_at

LOC100996668 /// ZEB1
CBS
SYNJ2
DNMBP

219361_s_at
219371_s_at
219522_at
219563_at

AEN
KLF2
FJX1
LINC00341

225582_at
225619_at
225626_at
225685_at

RIPK4
SYNC
SPRY4
SSH1
ELK3
ORAI3
ETV1
SLC2A14 /// SLC2A3AMIGO2GSAP
EHD1
PMEPA1PMEPA1PDP1PRKAG2
EGLN3
FLRT3
PSAT1
NEK6
SESN2
SESN2
FAM198B
MESDC1TSPAN14
HAS3
TRIM6
DMRT2
FZD8
TLR4
KLF6
ERRFI1
ARRDC3DLC1SLC26A2
SLC26A2
SMIM14
PHF10
FRMD4A
FRMD4A
FRMD4A
RAPH1
RAPH1
RAPH1
RHOBTB3
SNHG8 /// SNORA24
LOC101060511 /// PRKAB2ARRDC4
MFSD2A
ABHD17C
DDR2AMOTL1
LINC00263 /// PP7080
AMOTL1TBX3LOC100996628 /// SHROOM3
CTA-204B4.6 ///OTTHUMG00000172354
ITPRIPSLAIN1PAG1
CDC42EP3

212724_at
212764_at
212816_s_at
212828_at
212838_at

87Probe Set ID
225842_at
225864_at
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225946_at
225975_at
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226490_at
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226498_at
226612_at
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227940_at
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228141_at
228304_at
228353_x_at
228359_at
228400_at
228402_at
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228461_at
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225842_at
228737_at
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229431_at
229576_s_at
229674_at
229817_at
230075_at
230082_at

Gene Symbol
PHLDA1
FAM84B
TP53INP1
LOC100996477 /// RASSF8
PCDH18DUSP4
RNF145PRKCE
ZNF436ZNF436
UHRF1BP1
SLC25A37
MAFK
JDP2
CHST11
FAM89A /// MIR1182
NHSL1
FLT1
FLT1
UBE2QL1
MALAT1
FAM20C
SLFN5
LRCH1
DSC2
SPRED1
FST
ACPL2
NEDD4LNFATC2YPEL2PLD6--ZNF697
INHBA
C16orf52 /// LOC101060634
VGLL3
FZD8
FAM43A
LURAP1L
NT5E
SMURF2DDR2STAMBPL1
STAMBPL1
SOCS3
LOC339803
IL17RD
SOX2
GPX8
RBM43
UBASH3BUBASH3B
LOC100996628 /// SHROOM3ZBED3NFATC2
SH3RF3NANOS1
PCDH10TOX2
FAM84B--SLC14A1
WNK4
RFXAP
TBX3
SERTAD4
ZNF608RAB39B---

Probe Set ID
230083_at
230102_at
230112_at
230261_at
230296_at
230383_x_at
230493_at
230494_at
230660_at
230720_at
230721_at
230746_s_at
230795_at
230820_at
230836_at
231034_s_at
231040_at
231183_s_at
231202_at
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231779_at
231817_at
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231899_at
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231984_at
232060_at
232068_s_at
232113_at
232181_at
232861_at
234192_s_at
234994_at
235074_at
235086_at
235109_at
235122_at
235191_at
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235277_at
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235521_at
235563_at
235698_at
236219_at
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236599_at
237465_at
238430_x_at
238462_at
238587_at
238623_at
238689_at
238729_x_at
238949_at
239058_at
239835_at
241371_at
241612_at
242005_at
242455_at
242794_at
242931_at
242943_at
243462_s_at
244439_at
244764_at
266_s_at

Gene Symbol
USP53
ETV5

42067
ST8SIA4
C16orf52 /// LOC101060634
SLFN5
SHISA2
SLC20A1SERTAD4
RNF182
C16orf52 /// LOC101060634------ST8SIA4------ALDH1L2--TNFRSF10A
IRAK2
USP53
PSMD5-AS1
SARS
ZC3H12C
ERO1LB
MTAP
ROR1
TLR4
--PPARGC1B
PDP2
GKAP1
TMEM200A
SPRED1THBS1ZBED3HIVEP3
LINC00662
SHC4
AMOTL1SERTAD4
HOXA3
GPRC5A
ZFP90
SLC35G1
GPR110--USP53SLFN5UBASH3BUBASH3B--GPR110SAV1
RNF145FOXC2KBTBD8TNFRSF10A
FOXD3
LOC100506377
POU3F2MAML3LONRF3
ST8SIA4--SPRED1
HIVEP3
CD24

88

Probe Set ID
36711_at
38037_at
39549_at

Gene Symbol
MAFF
HBEGF
NPAS2

Supplementary Table S5. Figure 9A のシグネチャーに用いた 432 プローブセット
Probe Set ID
1552274_a t
1552275_s _a t
1552309_a _a t
1552329_a t
1553055_a _a t
1553167_a _a t
1553708_a t
1553764_a _a t
1553768_a _a t1553972_a _a t
1554007_a t
1554014_a t
1554015_a _a t
1554020_a t
1554195_a _a t
1554239_s _a t
1554520_a t
1554867_a _a t
1554980_a _a t
1555772_a _a t
1555788_a _a t
1555832_s _a t
1556348_a t
1557078_a t
1557094_a t
1558256_a t
1559220_a t
1559258_a _a t
1559861_a t
1560477_a _a t
1569642_a t
200628_s _a t
200629_a t
200670_a t
200799_a t
200800_s _a t
200802_a t
200920_s _a t
200921_s _a t
201050_a t
201085_s _a t
201266_a t
201289_a t
201383_s _a t
201397_a t
201464_x_a t
201465_s _a t
201559_s _a t
201565_s _a t201746_a t
201761_a t
201996_s _a t
202014_a t
202034_x_a t
202068_s _a t202081_a t
202146_a t
202147_s _a t202148_s _a t202237_a t
202238_s _a t202241_a t
202342_s _a t202376_a t
202386_s _a t202558_s _a t202581_a t
202623_a t
202672_s _a t202710_a t

Gene Symbol
PXK
PXK
NEXN
RBBP6
SLFN5
SEPSECS
LINC00525
AJUBA
DCBLD1CBS--CHD2 /// LOC100507217
CHD2 /// LOC100507217
BICD1
C5orf46
ZADH2
LOC100996810 ///LOC283861
PRR16
ATF3
CDC25ATRIB3KLF6HEATR1SLFN5ANXA8 /// LOC100996760/// LOC101060462
LINC00662
OTTHUMG00000158107 ///RP5-1157M23.2
CXorf61OTTHUMG00000020270 ///RP11-342C23.4
SAMD11
F2R
WARS
WARS
XBP1
HSPA1A /// HSPA1B
HSPA1A /// HSPA1B
SARS
BTG1
BTG1
PLD3
SON
TXNRD1
CYR61
NBR1
PHGDH
JUN
JUN
CLIC4
ID2
TP53
MTHFD2SPEN
PPP1R15A
RB1CC1
LDLR
IER2
IFRD1
IFRD1
PYCR1
NNMT
NNMT
TRIB1
TRIM2
SERPINA3
KIAA0430
HSPA13
HSPA1A /// HSPA1B
EAPP
ATF3
BET1

Probe Set ID
202719_s _a t202720_a t
202730_s _a t202731_a t
202769_a t
202770_s _a t202848_s _a t202888_s _a t
203002_a t
203286_a t
203288_a t
203313_s _a t203438_a t
203439_s _a t203445_s _a t203474_a t

Gene Symbol
TES
TES
MIR4680 /// PDCD4MIR4680 /// PDCD4
CCNG2
CCNG2
GRK6
ANPEP
AMOTL2
RNF44
KIAA0355
TGIF1
STC2
STC2
CTDSP2IQGAP2

Probe Set ID
208067_x_a t
208370_s _a t
208610_s _a t
208671_a t
208693_s _a t
208712_a t
208735_s _a t
208763_s _a t
208868_s _a t
208869_s _a t
208916_a t
208937_s _a t
208960_s _a t
208961_s _a t
208997_s _a t
208998_a t

203542_s _a t

KLF9209034_a t

PNRC1

203543_s _a t203574_a t
203627_a t
203640_a t
203665_a t203699_s _a t203752_s _a t

KLF9
NFIL3
IGF1R
MBNL2
HMOX1
DIO2
JUND

209101_a t209102_s _a t
209184_s _a t
209185_s _a t
209205_s _a t
209216_a t
209217_s _a t

CTGF
HBP1
IRS2
IRS2
LMO4
WDR45
WDR45

203896_s _a t

PLCB4209230_s _a t

NUPR1

203989_x_a t

F2R

209304_x_a t

GADD45B

204004_a t

PAWR

209305_s _a t

GADD45B

204203_a t

CEBPG

209357_a t

CITED2204285_s _a t

PMAIP1

209383_a t

DDIT3204286_s _a t
204334_a t
204351_a t
204394_a t
204396_s _a t
204411_a t
204547_a t
204569_a t
204602_a t
204664_a t
204881_s _a t
204948_s _a t
205017_s _a t
205018_s _a t
205022_s _a t
205047_s _a t
205048_s _a t
205167_s _a t
205168_a t
205194_a t
205234_a t
205415_s _a t
205486_a t
205523_a t
205524_s _a t
205655_a t205807_s _a t
206085_s _a t
206101_a t
206343_s _a t
206376_a t
206460_a t
206898_a t
206961_s _a t
207219_a t
207233_s _a t
207528_s _a t
207574_s _a t
207629_s _a t
207782_s _a t
207980_s _a t

PMAIP1KLF7S100P
SLC43A1
GRK5
KIF21BRAB40B
ICK
DKK1
ALPP
UGCG
FST
MBNL2
MBNL2
FOXN3
ASNS
PSPH
CDC25C
DDR2
PSPH
SLC16A4ATXN3TESK2HAPLN1
HAPLN1
MDM4
TUFT1
CTH
ECM2
NRG1
SLC6A15
AJAP1
CDH19
MED20
ZFP69BMITF
SLC7A11
GADD45B
ARHGEF2
PSEN1
CITED2209435_s _a t
209479_a t209610_s _a t
209611_s _a t
209682_a t
209822_s _a t
209864_a t
209921_a t
209946_a t
210095_s _a t
210105_s _a t
210405_x_a t
210511_s _a t
210512_s _a t
210513_s _a t
210587_a t
210757_x_a t
210764_s _a t
211458_s _a t
211527_x_a t
211538_s _a t
211559_s _a t
211947_s _a t
211962_s _a t
212099_a t
212143_s _a t
212148_a t
212444_a t
212501_a t
212508_a t
212593_s _a t
212594_a t212614_a t
212722_s _a t
212723_a t
212761_a t
212793_a t
212810_s _a t
212811_x_a t
212816_s _a t
212870_a t

ARHGEF2
CCDC28A
SLC1A4SLC1A4
CBLB
VLDLR
FRAT2
SLC7A11VEGFC
IGFBP3FYN
TNFRSF10B
INHBA
VEGFA
VEGFA
INHBE
DAB2
CYR61
GABARAPL1 /// GABARAPL3
VEGFA
HSPA2
CCNG2
PRRC2CZFP36L1RHOBIGFBP3
PBX1
GPRC5A
CEBPB
MOAP1
MIR4680 /// PDCD4MIR4680 /// PDCD4
ARID5BJMJD6JMJD6TCF7L2DAAM2SLC1A4SLC1A4
CBS
SOS2

89

Gene Symbol
UTY
RCAN1
SRRM2
SERINC1GARS
CCND1CTDSP2
TSC22D3GABARAPL1GABARAPL1
SLC1A5
ID1
KLF6
KLF6
UCP2
UCP2

Probe Set ID
212914_a t
212948_a t
212956_a t
213002_a t
213225_a t
213436_a t
214390_s _a t
214437_s _a t214447_a t
214452_a t
214992_s _a t
215058_a t
215253_s _a t
215501_s _a t
215623_x_a t
215789_s _a t215945_s _a t
216037_x_a t
216417_x_a t

Gene Symbol
CBX7
CAMTA2
TBC1D9MARCKS
PPM1B
CNR1
BCAT1
SHMT2
ETS1
BCAT1
DNASE2
DENND5B
RCAN1
DUSP10
SMC4
AJAP1
TRIM2
TCF7L2HOXB9Probe Set ID
222157_s _a t
222200_s _a t222408_s _a t
222632_s _a t222790_s _a t
222816_s _a t222982_x_a t
223062_s _a t
223195_s _a t
223196_s _a t
223199_a t
223218_s _a t
223309_x_a t
223310_x_a t
223475_a t
223674_s _a t223803_s _a t
223974_a t
223982_s _a t

Probe Set ID
226461_a t
226559_a t
226649_a t
226725_a t
226842_a t
226847_a t
227052_a t
227140_a t
227234_a t
227443_a t
227452_a t
227488_a t
227561_a t
227563_a t
227626_a t
227628_a t
227719_a t
227978_s _a t
227990_a t

Gene Symbol
HOXB9
IER5L
PANK1
SLFN5
FBXL20FST--INHBA
LOC100132815
LURAP1L
LINC00511 /// LINC00673
MIR503 /// MIR503HG
DDR2
FAM27E3
PAQR8
GPX8
SMAD9
ZADH2
SLU7

228121_a t

TGFB2224367_a t224559_a t224565_a t224566_a t224569_s _a t224570_s _a t224571_a t
224572_s _a t224606_a t

Gene Symbol
WDR48
BSDC1
YPEL5
LZTFL1RSBN1ZCCHC2
SLC38A2
PSAT1
SESN2
SESN2
MKNK2
NFKBIZPNPLA8PNPLA8CRISPLD1
CDC42SE1ZCCHC10DLGAP1-AS2
PNPLA8OTTHUMG00000178019 ///RP11-199F11.2
BEX2
MALAT1
MIR612 /// NEAT1
MIR612 /// NEAT1
IRF2BP2
IRF2BP2
IRF2BP2
IRF2BP2
KLF6216997_x_a t

TLE4

224185_a t

217127_a t
217168_s _a t
217678_a t
217783_s _a t217906_a t
217966_s _a t
217967_s _a t
218004_a t
218041_x_a t

CTH
HERPUD1
SLC7A11YPEL5KLHDC2
FAM129A
FAM129A
BSDC1
SLC38A2

228188_a t
228402_a t
228582_x_a t
228716_a t
228842_a t
228993_s _a t229009_a t
229163_a t
229338_a t

FOSL2
ZBED3
MALAT1THRB--BBIP1
SIX5
CAMK2N1
LOC100289361
OTTHUMG00000018458 ///RP11-152N13.5
LOC645638
VEPH1
RAB39BF2RL2
HAPLN1
GPCPD1--LINC00511 /// LINC00673--ALDH1L2
SEPSECSTNFRSF10A
PSMD5-AS1
SARS
RALGPS2SLITRK6KLHL5SLITRK6SYTL2OTUD5MTHFD2
MIR612 /// NEAT1
ILF3-AS1
PHF17
INPP4B
LOC254128
LINC00662
LOC100506295
ARHGEF2
FSBP /// RAD54B
OTTHUMG00000175830 ///RP1-228H13.5
ASAP1
LARP6
LOC100288911
LOC100288911
SLFN5
GLYCTK--RAB39B
LOC100996592

218145_a t

TRIB3224657_a t

ERRFI1229388_a t

218168_s _a t
218177_a t
218178_s _a t
218234_a t
218251_a t
218274_s _a t
218437_s _a t
218603_a t
218651_s _a t
218692_a t
218769_s _a t
219014_a t
219062_s _a t
219270_a t
219312_s _a t
219344_a t
219371_s _a t
219470_x_a t
219691_a t
219716_a t
219944_a t
220301_a t
220436_a t
220892_s _a t
220924_s _a t
221050_s _a t
221250_s _a t
221478_a t
221479_s _a t
221563_a t

ADCK3CHMP1B
CHMP1B
ING4
MID1IP1ANKZF1LZTFL1
HECA
LARP6
SYBU
ANKRA2PLAC8ZCCHC2CHAC1
ZBTB10SLC29A3
KLF2
CCNJ
SAMD9
APOL6
CLIP4
CCDC102B
LOC441402
PSAT1
SLC38A2GTPBP2
MXD3
BNIP3LBNIP3LDUSP10224783_a t
224785_a t
224826_a t
224839_s _a t
224917_a t
224990_a t
225056_a t
225207_a t
225239_a t
225327_a t
225344_a t
225442_a t
225496_s _a t
225527_a t
225796_a t225804_a t225807_a t
225842_a t
225864_a t
225882_a t
225974_a t
226001_a t
226012_a t
226022_a t
226066_a t226103_a t
226135_a t
226140_s _a t
226157_a t
226181_a t

UBALD2UBALD2GPCPD1GPT2
MIR21 /// VMP1
SMIM14
SIPA1L2
PDK4
MIR612 /// NEAT1
FAM214A
NCOA7
DDR2
SYTL2
CEBPG
PXK
CYB5D2AJUBAPHLDA1
FAM84B
SLC35B4
TMEM64KLHL5ANKRD11
SASH1
MITF
NEXN
UHRF1BP1
OTUD1
TFDP2
TUBE1

229566_a t
229759_s _a t
230075_a t
230147_a t
230204_a t
230492_s _a t230795_a t
230812_a t
231013_a t
231202_a t
231730_a t
231775_a t
231828_a t
231894_a t232112_a t
232176_a t232297_a t232481_s _a t232914_s _a t233933_s _a t
234976_x_a t
234989_a t
235014_a t
235024_a t
235046_a t
235132_a t
235191_a t
235282_a t
235595_a t
235846_a t

221565_s _a t

CALHM2226189_a t

ITGB8235939_a t

221577_x_a t
221686_s _a t
221735_a t
221765_a t221805_a t
221841_s _a t
221865_a t
221884_a t222108_a t

GDF15
RECQL5
WDR48
UGCG
NEFL
KLF4
C9orf91
MECOM
AMIGO2226218_a t
226231_a t
226267_a t
226316_a t
226352_a t
226360_a t
226423_a t
226425_a t
226456_a t

IL7R
PAWR
JDP2
RBM26
JMY
ZNRF3
PAQR8
CLIP4
RMI2

236533_a t
236565_s _a t
236656_s _a t
236657_a t
238430_x_a t
238518_x_a t
238653_a t
238695_s _a t
238766_a t

90

Probe Set ID
Gene Symbol
238909_a t
S100A10239825_a t--241682_a t
KLHL23241808_a t
ZC2HC1A
242458_a t
RALGPS2
243_g_a t
MAP437028_a t
PPP1R15A
41644_a t
SASH1
48825_a t
ING464883_a t
MOSPD2
AFFX-Da pX-3_a t --AFFX-r2-Bs -da p-5_ ---91

Supplementary Table S6. A375 細胞において vemurafenib 処理によって発現上昇し、AT9283 の共処理によって発現低下を認めた 112 プローブセットに対する GO 解析結果
Annota ti on Cl us ter 1
Ca tegory
GOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
UP_SEQ_FEATURE

Enri chment Score: 2.7505244585078428
Term
GO:0015175~neutra l a mi no a ci d tra ns membra ne tra ns porter a cti vi ty
GO:0015171~a mi no a ci d tra ns membra ne tra ns porter a cti vi ty
GO:0005275~a mi ne tra ns membra ne tra ns porter a cti vi ty
GO:0006865~a mi no a ci d tra ns port
GO:0015179~L-a mi no a ci d tra ns membra ne tra ns porter a cti vi ty
GO:0015837~a mi ne tra ns port
GO:0046942~ca rboxyl i c a ci d tra ns port
GO:0015849~orga ni c a ci d tra ns port
GO:0015804~neutra l a mi no a ci d tra ns port
GO:0015807~L-a mi no a ci d tra ns porta mi no-a ci d tra ns port
topol ogi ca l doma i n:Extra cel l ul a r

Count %
PVa l ue FDR
4 4.65 1.0E-04 1.2E-01
5 5.81 1.3E-04 1.6E-01
5 5.81 3.1E-04 3.8E-01
5 5.81 4.5E-04 6.5E-01
4 4.65 6.1E-04 7.5E-01
5 5.81 1.2E-03 1.8E+00
5 5.81 2.8E-03 3.9E+00
5 5.81 2.8E-03 4.0E+00
3 3.49 3.1E-03 4.4E+00
3 3.49 3.7E-03 5.3E+00
3 3.49 8.7E-03 1.0E+01
8 9.30 9.2E-01 1.0E+02

Supplementary Table S7. A375 細胞において vemurafenib 処理によって発現上昇し、AT9283 の共処理によって中程度の発現低下を認めた 130 プローブセットに対する GO
解析結果
Annota ti on Cl us ter 1
Ca tegory
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FAT
KEGG_PATHWAY
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS
SP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FATGOTERM_BP_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FATGOTERM_MF_FAT
INTERPROSP_PIR_KEYWORDS
GOTERM_BP_FAT
SP_PIR_KEYWORDS

Enri chment Score: 5.735871894552304
Term
a mi no-a ci d bi os ynthes i s
GO:0008652~cel l ul a r a mi no a ci d bi os yntheti c proces s
GO:0009309~a mi ne bi os yntheti c proces s
GO:0006563~L-s eri ne meta bol i c proces s
GO:0009069~s eri ne fa mi l y a mi no a ci d meta bol i c proces s
GO:0009070~s eri ne fa mi l y a mi no a ci d bi os yntheti c proces s
hs a 00260:Gl yci ne, s eri ne a nd threoni ne meta bol i s m
GO:0046394~ca rboxyl i c a ci d bi os yntheti c proces s
GO:0016053~orga ni c a ci d bi os yntheti c proces s
pyri doxa l phos pha teSeri ne bi os ynthes i s
GO:0044271~ni trogen compound bi os yntheti c proces s
GO:0006564~L-s eri ne bi os yntheti c proces s
GO:0048037~cofa ctor bi ndi ng
GO:0030170~pyri doxa l phos pha te bi ndi ng
GO:0070279~vi ta mi n B6 bi ndi ng
GO:0019842~vi ta mi n bi ndi ng
IPR015421:Pyri doxa l phos pha te-dependent tra ns fera s e, ma jor regi on,s ubdoma i n 1
a cetyl a ti on
GO:0006790~s ul fur meta bol i c proces s
di s ea s e muta ti on

92

Count %
PVa l ue FDR
8 21.05 1.8E-14 2.1E-11
8 21.05 2.8E-11 3.9E-08
8 21.05 8.0E-10 1.1E-06
5 13.16 2.0E-09 2.8E-06
6 15.79 4.0E-09 5.6E-06
5 13.16 9.6E-09 1.3E-05
6 15.79 2.5E-08 2.0E-05
8 21.05 7.5E-08 1.0E-04
8 21.05 7.5E-08 1.0E-04
5 13.16 6.0E-06 6.8E-03
3 7.89 1.1E-05 1.2E-02
8 21.05 1.1E-05 1.5E-02
3 7.89 1.7E-05 2.4E-02
6 15.79 2.0E-04 2.3E-01
4 10.53 2.3E-04 2.7E-01
4 10.53 2.3E-04 2.7E-01
4 10.53 3.0E-03 3.4E+00
3

7.89

3.3E-03 3.7E+00

11 28.95
3 7.897 18.42

2.4E-02 2.4E+01
3.2E-02 3.6E+01
8.1E-02 6.2E+01