1

新薬候補物質の選定ならびに最適化を加速する物性評価プラットフォームの開発
Analytical Platform Development of Physicochemical Properties for Accelerated Drug
Selection and Optimization

令和 4 年度
論文博士申請者
竹内 祥子 (Takeuchi, Shoko)

1目次
諸言 ........................................................................................................................................ 4
第一章：経口固形製剤を志向した低分子化合物の溶解度の良好な化合物の選定ならびに構造最適化のための固体状態を考慮した溶解度測定法の構築 ................................... 9
序論 .................................................................................................................................... 9
結果と考察........................................................................................................................ 12
固体状態を考慮した溶解度測定法の構築 ................................................................ 12
溶解度と脂溶性との相関解析 ..................................................................................... 14
溶解度と分子構造パラメータとの相関解析 ................................................................ 16経口吸収性との相関解析 ............................................................................................ 18
小括 1 ............................................................................................................................... 20
第二章：経口固形製剤を志向した低分子化合物の開発初期段階での水和物形成リスク
ならびに無水物/水和物の安定的に存在する領域を示した相図作成法の構築.............. 21
序論 .................................................................................................................................. 21
結果と考察........................................................................................................................ 24
無水物と 0.5 水和物、1 水和物の物性評価 ............................................................... 24
動的水蒸気吸着測定と長期高湿度下保存による水和物の探索スクリーニング ...... 27
効率的な水和物探索ならびに相図作成法の構築 .................................................... 29
異なる温度領域でのスラリー実験による無水物と水和物の相図作成 ...................... 32
小活 2 ........................................................................................................................... 34
第三章：新しい創薬モダリティに対する開発初期段階での安定性評価ならびに配列最適化法の構築 .......................................................................................................................... 35
序論 .................................................................................................................................. 352

結果と考察........................................................................................................................ 38
MS を用いたマウス筋肉ホモジナイズ液における sgRNA の切断部位の特定 ......... 38
ピンポイント修飾した sgRNA の安定性評価 .............................................................. 43
5’ならびに 3’末端に異なる修飾を施した sgRNA の安定性評価 ............................ 45
Cas9 との相互作用を介した sgRNA の安定性評価 ................................................... 47
小活 3 ........................................................................................................................... 49
総括 ...................................................................................................................................... 49
謝辞 ...................................................................................................................................... 50
実験の部 .............................................................................................................................. 51
掲載論文 .............................................................................................................................. 60
参考文献 .............................................................................................................................. 613

諸言
低分子医薬品は、投与の容易性や確実性、コストの観点で開発初期から主に経口剤として開発される 1, 2。経口投与された低分子化合物が生体内の特定の作用部位に到達し、その薬理効果を発揮するためには、小腸からの吸収が必要となる。小腸からの薬物吸収速度は、低分子化合物の消化管内での溶解度と膜透過性を掛け合わせて算出されるた
め 3, 4、難水溶性や低い膜透過性は経口吸収性の低下やばらつきの原因となる 4, 5。
疾患標的の受容体や酵素に対して高い親和性を有する化合物の探索に伴い、化合物の分子量および脂溶性は増加する傾向にあり、その結果として溶解度は低下する傾向がある 6。実際、承認された医薬品の約 40%が、医薬品開発段階の候補化合物の約 70%が難水溶性化合物である。このような化合物では、難水溶性が原因で低吸収性や吸収性のばらつきを引き起こす可能性があり、開発上の課題となる 5, 6。難水溶性化合物の溶解性改善方法として、非晶質固体分散体やナノクリスタルなどの可溶化製剤技術が適用されるが 7, 8、製剤開発の期間やコスト、安定性、製造性などの観点から、開発上のリスクが高くなる 9。そのため、高い溶解度を有する低分子化合物の構造最適化や、良好な溶解性を示す開発候補化合物の選定が重要となる。また、探索研究や開発研究が適切に方向づけられるために、溶解度と実際の経口吸収性との関連を明らかとし、吸収過程に課題のある低分子化合物を排除するためのクライテリアを設定することも重要である。
低分子化合物は、固体状態において様々な結晶構造を取り、結晶構造の違いにより溶解性や安定性、打錠成形性などの物性が異なる 10, 11, 12。これらの物性の違いは経口吸収性や製剤物性、製造性、有効期限にも影響するため、合理的な製剤設計と製品の品質管理の観点から、開発候補化合物の最適な結晶形を探索することが望ましい (図 1)。
4一般的に、低分子化合物は、原薬や製剤の保存中ならびに製剤工程中において水と接触する機会が多いため、水和物は重要な溶媒含有結晶と位置付けられている。水溶
液中では、水和物は無水物より溶解度が低い傾向にあるため、特に難水溶性化合物の開発においては、高湿度下の保存や造粒過程での水和物の転移による溶出挙動や吸収率への影響にも十分留意しなければならない 13, 14, 15。そのため、開発初期段階から、
水和物と無水物の物性を把握し、微量でかつ効率的な水和物形成リスク評価系を確立することが求められる 16。水和物を探索するスクリーニングの方法としては、一般的には溶液晶析や動的水蒸気吸着測定、高湿度下による保存などが挙げられるが 17, 18, 19, 20、これらの分析法だけで水和物形成リスクを十分に評価できているとは言えない。
無水物と水和物が平衡状態にある際の水分活量は、平衡水分活量と呼ばれている。この数値と比較して、溶液中の水分含量や空気中の湿度が大きい場合は水和物が形成され、小さい場合は無水物が形成される。このことから、適切な水分活量を制御することで、優先的に結晶化する無水物もしくは水和物の領域を見出すことができる 21, 22, 23。このような無水物と水和物が安定的に存在する領域を示した相図は、堅牢な製造プロセスの確立のための有用な情報となる。

5

図 1 結晶形態の分類ならびに結晶形態が及ぼす物理化学的性質

6低分子医薬品は、経口投与が可能という利便性やコストパフォーマンス、免疫毒性が少ないといったメリットがある。また、低分子化合物は小さい分子量のため受動拡散により血液脳関門を通過でき、中枢疾患領域に対する有効な治療手段となりうることが期待されている 24。最近では、核酸を標的とした遺伝子制御 25 やタンパク質を標的したタンパク質
分解 26 など、従来には無い特徴を有した低分子化合物が開発されており、低分子創薬の可能性が広がりつつある。そのため、日米での直近 5 年間の承認品目数のうち、依然として 60%前後は低分子医薬品が占めている。一方で低分子化合物の創薬ターゲットの枯渇化により、低分子医薬品の創薬創出の難易度が高まっており、従来の低分子医薬品ではアプローチの難しかった創薬標的に作用する抗体やタンパク質、核酸などの新しい創薬モダリティが注目を浴びている。これらの創薬モダリティは、臨床段階で製造および安全性、薬物送達、有効性を原因とした開発中止が大半であるため 27、開発の早い段階であるリード選択ならびに最適時に物理化学的性質を把握した上で、製造適合性や安定性、不純物特性、薬効、安全性などの開発妥当性を評価する必要がある。しかしながら、これ
らは低分子化合物と比較して分子量が高く、構造も複雑なため、安定性などの物理化学的性質が異なる (図 2)。従来の低分子医薬品の確立された物性評価法では、適切に評価できないため、これらの創薬モダリティに適した物性評価法の確立が求められている。
本研究では、経口固形製剤として適した低分子化合物と新規創薬モダリティの新薬候
補物質に対する、より的確な選定ならびに効率的で合理的な最適化を可能とする分析プ
ラットフォームの構築に取り組んだ。

7

図 2 新薬における創薬モダリティの変遷

8

第一章：経口固形製剤を志向した低分子化合物の溶解度の良好な化合物の選定ならびに構造最適化のための固体状態を考慮した溶解度測定法の構築
序論
溶解度は、kinetic solubility (動力学的溶解度)と thermodynamic solubility (熱力学的溶解度)の 2 つに分類され、これらは”同じ溶解度”といわれているものの、測定原理および物理化学的エネルギー状態が異なるために異なる溶解度を示す 5。Kinetic solubility
は、Dimethyl sulfoxide (DMSO)などの有機溶媒に高濃度に溶解させた少量の化合物溶
液を測定溶媒に添加し、析出させて測定した溶解度である。一方、thermodynamic
solubility は、固体粉末の試料から浸とうによって得られた平衡状態における溶解度である。一般的に、kinetic solubility では粉末の固体状態を DMSO によって溶液状態にして測定しているため、結晶格子を崩す過程が含まれていない。また、測定媒体への DMSO
化合物溶液の添加時に即座に化合物が析出することから、溶液から結晶が析出する際には準安定形の方が先に結晶化するという Ostwald の法則により、析出物が非晶質または準安定形晶となるため、kinetic solubility は thermodynamic solubility より高い数値を示
す (図 3)。このため、kinetic solubility を指標とすると見誤った構造最適化ならびに候補
化合物の選定に繋がり、難溶解性に起因した吸収率低下のリスクを正確に見極めることができない 28, 29。開発リスクを的確に評価するためには、開発初期段階における低分子化合物の固体状態を考慮した thermodynamic solubility の評価が重要となる。
溶解度と関連性の高い分子構造パラメータは、脂溶性や芳香環数、分子量などが報告されているが 30, 31, 32 、それらの多くは様々な疾患領域における一般薬の kinetic
9

solubility を用いた相関解析から得られた結果である。Kinetic solubility は、結晶格子の崩壊過程を考慮していないため経口薬として適切な物性を有する、溶解性の良い化合物を構造最適化する上では、kinetic solubility を用いた相関解析から得られた結果は必ずしも適切ではない。また、既知の分子構造パラメータは、幅広い疾患を対象とした一般薬を用いた解析結果から得られており、癌疾患や中枢神経疾患、消化器疾患などの特定の疾患領域を対象とした合成化合物へ適用するには限界がある。さらに、溶解度と経口吸収性との相関解析の結果から、化合物の経口吸収性を予測することは、より的確な構造最適化や候補化合物の選定に繋がる。
本章の研究では、抗腫瘍性低分子化合物 (計 75 化合物)の固体状態を考慮した溶解度測定による、より精度の高い、溶解度に優れた分子構造パラメータの特定、ならびに得られた溶解度による経口吸収性の予測を目的とした。

10

図 3 Kinetic solubility と thermodynamic solubility の比較図

11

結果と考察固体状態を考慮した溶解度測定法の構築
本手法は、粉末 X 線回折測定と熱分析測定、粉末からの溶解度 (thermodynamic
solubility)測定から成る探索的な物性評価である。粉末 X 線回折測定は、試料量 7 mg を用いて低分子化合物の結晶性ならびに結晶形を評価する。非破壊測定のため、使用後の試料は熱分析測定と溶解度測定にて再利用可能である。結晶性は溶解度へ影響するといわれており、低結晶性の化合物や結晶と比較して規則的な分子配列を持たない非晶質化合物は高い溶解性を示す。このため、これらの化合物は結晶構造に起因した溶解度を示さないことから、分子構造パラメータと溶解度との相関研究から排除した。
熱分析測定は、熱に対する重量変化ならびに吸熱の評価によって、溶媒含有結晶を特定することができる。結晶構造に溶媒が含まれている場合、化合物構造を基に形成される結晶構造に起因した溶解度を示さないため、低結晶性ならびに非晶質化合物同様に、不適切なデータとして本研究から排除した。
溶解度測定に関しては、測定溶媒には胃と小腸の消化管液を模した水溶液を用いており、投与動物や投与条件を反映した水溶液を適用することで、より高い精度で経口吸収性を評価できる。また、胃や小腸における化合物の安定性も評価できるため、胃内において化学的に不安定な化合物の場合は、腸溶製剤可の可否判断の基となるデータとなる。このため、将来的な製剤設計の指針に繋がる知見も得られる。ヒトにおける経口吸
収性や食事による経口吸収性への影響も評価できるため、早期に臨床試験での経口吸
収性のばらつきなどの懸念を見出すこともできる。
熱分析については、軽量かつ高純度、フラットな構造のアルミパンを使用することで、12優れた熱伝導率と均等な温度分布による高感度化が可能となった。さらに最適に配置された熱電対を有する、堅牢で汎用性の高い Differential Scanning Calorimetry (DSC)センサーを導入したメトラートレド株式会社製の機器を採用した。また、このシステムでは試料の融解に伴う重量の増減を防止することで天秤が安定化し、高精度の重量測定が可能である。このアルミパンと分析機器の導入により、少量化に成功した。溶解度測定では、
Mini-uni prep というシリンジ不要のフィルター一体型ろ過バイアルならびに Ultra Fast
Liquid Chromatography (UFLC)を導入することで、少量化かつ効率化を実現した。以上の検討によって、探索段階で非常に限られた量しか入手できない化合物に対して、少量でかつ効率的に評価することのできる固体状態を考慮した溶解度測定法を構築した。

13

溶解度と脂溶性との相関解析
溶解度は一般的に脂溶性に依存するため 11, 12、溶解度と物質の親水性と疎水性を判断するパラメータとして知られる Log DpH7.4 (オクタノール‐水分配係数)との相関を調べた
ところ、Log DpH7.4 ≤ 1 の低分子化合物は良好な溶解性を示し、3.5 < Log DpH7.4 では難溶
解性の化合物のみが認められた (図 4a)。一方、1 < Log DpH7.4 ≤ 3.5 の領域において、溶
解度は脂溶性に非依存的であり、脂溶性を低下させるという既存の溶解度の改善アプロ
ーチでは解決できないことが示唆された。また、Log DpH7.4 ≤ 1 ならびに 3.5 < Log DpH7.4 の領域では、分子の脂溶性が溶解度の支配要因と考えられた。図 4 において、緑色ならびに黄色、赤色のデータは各々Log DpH7.4 ≤ 1 ならびに 1 < Log DpH7.4 ≤ 3.5、3.5 < Log DpH7.4の化合物に相当する。
計算値である cLog P (非荷電状態のオクタノール‐水分配係数)と溶解度との相関解析
では、Log DpH7.4 ほどの明瞭な相関は認められず、特に低溶解度の領域では、Log DpH7.4の方が溶解度を明確に区分した (図 4b)。Log DpH7.4 とは、解離による分子の脂溶性の変化を考慮に入れた血液や組織の pH である pH7.4 での Log P の実測値である。溶解度で使用する緩衝液の pH は、生体内を模倣した pH7.4 であるため、生理的 pH 付近における解離性官能基の荷電状態を考慮した実測値 Log DpH7.4 の方が、粉末からの溶解度と相関性も高く、指標としても有用と判断された。

14

(a)

(b)

n=39 (低結晶性や⾮晶質、溶媒含有結晶の化合物を除いた数)
図 4 溶解度との相関解析結果 (a) Log DpH7.4, (b) cLog P

15溶解度と分子構造パラメータとの相関解析
1 < Log DpH7.4 ≤ 3.5 の低分子化合物について、脂溶性以外に溶解度に影響を与える
分子構造パラメータを探索するため、溶解度と相関性がある分子構造パラメータと報告されている分子量とトポロジカル極性表面積、芳香環数、水素結合能を表した水素結合ア
クセプターとドナーの数との関係性を調べた。分子量とトポロジカル極性表面積について
は、相関性は認められなかったが、芳香環数ならびに水素結合数の増加に伴って溶解度が低下する傾向にあった (図 5a, b)。溶解度の対数を用いた場合の相関係数としては、
芳香環数とは-0.48、水素結合ドナーアクセプター数とは-0.60 と負の相関にあり、P 値も0.05 以下で有意に相関があることが示唆された。芳香環には炭素芳香環とヘテロ芳香環が存在するが、いずれとも総芳香環数と比較して良好な相関は得られなかったため、総芳香環数による平面性の高さが溶解度に影響を与えていると示唆された。また、芳香環数が 2 以下ならびに水素結合ドナーとアクセプター数の合計が 8 以下であれば高い溶解性の化合物の構造最適化に繋がる可能性が示唆された。一般的に芳香環数の増加に伴う分子の高い平面性が、分子間の π-π スタッキングを強くし、強固な結晶のパッキングを生み出すと言われている 33, 34。また、水素結合数の増加によって強い分子間相互作用が増えることでより高い結晶格子エネルギーを有した結晶構造に繋がる 35, 36, 37。以上のことから、今回のデータセットの結果から溶解度は芳香環数や水素結合ドナーアクセプター数が影響しており、化合物の平面構造による π-π スタッキングおよび水素結合が関与しているのではと推察された。溶解度を向上するためには、一般的な親水性置換基を導入する
方法よりも、平面性や分子間相互作用を崩壊させる最適化が有用と考えられた。

16

(a)

(b)

n=26 (低結晶性や⾮晶質、溶媒含有結晶の化合物を除いた数)
図 5 溶解度との相関解析結果 (a) 芳香環数, (b)水素結合ドナーとアクセプター数の合計

17経口吸収性との相関解析
経口吸収性の優れた低分子候補化合物の選択や構造最適化を目指して、本手法で得られた溶解度による経口吸収性の予測性を調べた。ラットの経口吸収率は、絶食下 0.1
mg/kg で静脈内投与、ならびに絶食下 1 mg/kg で経口投与をした際の 8 時間までの血漿中濃度を Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)で測定することで算出した。
一般的に、良好な経口吸収性といわれている経口吸収率 40%を基準として溶解度との相関解析を行ったところ、日本薬局方溶出試験第 2 液 (JP2)で 10 μg/mL 以上、もしくはラット絶食下の生体内を模した試験液である胆汁酸グリコケノデオキシコール酸(Glycochenodeoxycholic acid, GCDC)含有 JP2 では 100 μg/mL 以上の化合物において良好な経口吸収率 40%以上を示した (図 6a, b)。また、溶解度の対数を用いた場合の相関係数としては、JP2 における溶解度とは 0.70、GCDC 含有 JP2 における溶解度とは 0.60と正の相関にあり、P 値も 0.05 以下で有意に相関があることが示唆された。これらの結果から、固体状態を考慮した溶解度測定は、薬物の生体内における経口吸収率を in vitro
から予測する可能な系として判断した。

18

(a)

(b)

n=20 (膜透過性・代謝不良な化合物を除いた数)
図 6 溶解度と経口吸収性との相関解析結果 (a) JP2 における溶解度, (b) GCDC 含
有 JP2 における溶解度

19

小括１
実測値 Log DpH7.4 は、計算値 cLog P よりも低分子化合物の創薬上重要な物理化学的性質とされている溶解度に大きな影響を与えていることが認められた。また、1 < Log
DpH7.4 ≤ 3.5 の範囲においては、芳香環数と水素結合数が良好な溶解度の化合物の構造最適化において重要なパラメータであることが示唆され、従来で報告されている分子構造
パラメータよりも、癌疾患領域に特化したより精度の高い分子構造パラメータを見出した。
溶解度とラットの経口吸収性の相関が明らかとなり、本研究で確立した独自の固体状態を考慮した溶解度測定は、経口薬として適した開発化合物選択ならびに効率的な製剤設計戦略の指針に繋がる。現在本手法は、化合物のロット管理や固体物性評価、経口薬として developability の良好な化合物の選定や構造最適化など、創薬の幅広い分野において重要な役割を担っており、各社本手法を応用している。

20

第二章：経口固形製剤を志向した低分子化合物の開発初期段階での水和物形成リスクならびに無水物/水和物の安定的に存在する領域を示した相図作成法の構築序論
水和物は、水と低分子化合物が相互作用することで形成される結晶のことであり、低分子医薬品は原薬ならびに製剤として製造工程や保存中に水と接する機会が多いため、水和物は溶媒含有結晶の中でも重要な結晶として位置づけられる。一般的に水和物は水に対する溶解度と溶解速度は無水物と比較して低く、経口吸収性も低くなると報告されている 13, 14, 15。近年の新薬候補化合物の難水溶性化に伴い、保存中や製造工程中における水和物の転移は、溶解性や安定性、経口吸収性に影響を与えるため、開発を断念せざるを得ないリスクを伴う。そのため、創薬初期段階から効率的かつ網羅的に水和物形成リスクを見極め 16、保存中の空気中の湿度や製造工程中の溶液における水分含量に対して、安定的に無水物と水和物が存在する相を特定することが重要となる。
無水物から水和物への形成は式 (1)で表すことができ 13, 38、無水物と水和物が平衡状態にあるときは、平衡定数 Kh は最終的には式 (2)で表現される (図 7)。平衡定数 Kh (Kh= a [H2O]-m 平衡水分活量)は、溶液中の水分含量や空気中の湿度における水分活量が、平衡水分活量と同じ数値の場合は無水物と水和物は平衡状態となる。この値より大きい
場合は水和物が形成され、小さい場合は無水物が形成される。また、平衡水分活量は温度によって変化するため、水和物と無水物の安定性も温度に依存的となる。一般的な晶析方法である加熱後の冷却においては、無水物と水和物の安定相が温度によって変化する。そのため、確実で安定な結晶形の晶析において、温度による相図への影響を調べ
21

ることが、効率的な晶析条件の制御に有用な情報となる。無水物と水和物の安定領域を決定する手法として、水分含量の異なる水-有機溶媒混液中でのスラリー法が報告されており、この手法は単に安定相の決定だけでなく、水和物形成のリスク評価に有用とされている。
Inhibitor of Apoptosis Protein (IAP)拮抗薬 T-3256336 は、抗腫瘍性低分子化合物として開発されており 39、無水物および 0.5 水和物、1 水和物が結晶形として存在する (図 8)。
開発形は無水物であり、0.5 水和物は溶液からの晶析もしくは水溶液中 (水分含量：
100% v/v)のスラリー実験では見出されず、水が過飽和状態になったメチル-t-ブチルエー
テル溶液でのスラリー実験という特殊な条件下でしか得られなかった。
本章の研究では、T-3256336 を用いて、偶然的にしか得られなかった 0.5 水和物の晶析条件と無水物と水和物の安定相の領域を見出すため、探索的な水和物形成のリスク評
価ならびに相図作成法を構築した。

22

図 7 水和物形成の原理

図 8 IAP 拮抗薬 T-3256336 の化学構造式23

結果と考察無水物と 0.5 水和物、1 水和物の物性評価
いずれの結晶形も特徴的な粉末 X 線回折パターンを示し、熱分析の結果から水和物
に関しては、水和物の水分含量から計算して求めた理論値とほぼ同等の水分含量が含まれていることが明らかとなった (図 9, 10)。ラマン分光では、分子の振動状態を反映する
ため、結晶構造における水素結合状態が違うと、異なるラマン分光スペクトルが得られる。
無水物および 0.5 水和物、1 水和物は C=O の伸縮運動のバンド (1650～1800 cm-1)において、いずれも特徴的なスペクトルを示し、各々の結晶の水素結合状態が異なることが示唆された (図 11)。また、この範囲における C=O の伸縮運動のバンドに基づいた結晶形
識別は、微量の試料で大量のサンプル数の、非破壊ならびに非接触で迅速かつ効率的な測定ならびに解析が可能と考えられた。
単結晶構造解析の結果から、0.5 水和物においては単位格子に含まれる 1 分子あたり、0.5 分子の水が含まれており、熱分析の結果と一致していた。無水物と比較したところ、
0.5 水和物の結晶構造は大きく構造が異なるため、0.5 水和物への転移が起こりにくいと推察された (図 12)40。

24

図 9 IAP 拮抗薬 T-3256336 の粉末 X 線回折パターン

(a)

(b)

図 10 IAP 拮抗薬 T-3256336 の熱挙動 (a) 熱重量測定の結果, (b) 示差走査熱量測
定の結果

25

(b)

(a)

図 11 IAP 拮抗薬 T-3256336 のラマン分光スペクトル (a) 200-1800 cm-1 の範囲, (b)1500-1800 cm-1 の拡大図

図 12 IAP 拮抗薬 T-3256336 の単結晶構造解析 (a) 無水物, (b) 0.5 水和物

26

動的水蒸気吸着測定と長期高湿度下保存による水和物の探索スクリーニング
一般的な水和物探索スクリーニングとして知られる動的水蒸気吸着測定、ならびに高湿度下による保存を行った 17, 18, 19, 20。無水物を 25°C で湿度を 5 から 95%RH の環境においたときの吸湿性を調べたところ、重量減少に大きな変化が見られなかったことから、
無水物はこの条件下では水を吸湿する性質はなく、かつ水和物へ転移しないことが明らかとなった (図 13)。動的水蒸気吸着測定は恒量に達する時間が早く、湿度にさらしている測定時間 (約 24 時間)も短いため、水和物への転移が認められなかったと考えられた。
長期間で高湿度下に保存する方が水和物へ転移する可能性は高いと考えられたため、異なる湿度下で長期間保存し、転移が起こるかを調べた。長期間保存する試料としては
水和物へ転移しやすいように比表面積を上げ、結晶性を低下させた凍結乾燥品の無水物を用いた。結果として 25°C/93%RH の 14 日間保存において、無水物から 1 水和物への転移が認められたものの、0.5 水和物は確認されなかったため、動的水蒸気吸着測定や長期高湿度下での保存方法と比べて、より効率的な水和物の形成を見出す手法が必要と示唆された (図 14)。

27

図 13 IAP 拮抗薬 T-3256336 の無水物の動的水蒸気吸着測定

図 14 IAP 拮抗薬 T-3256336 凍結乾燥品の 25°C/93%RH 保存品の粉末 X 線回折パ
ターン28

効率的な水和物探索ならびに相図作成法の構築
溶媒媒介転移は、溶液中で溶解度の差に基づき転移する現象で、準安定形結晶が溶解すると共に安定形結晶の結晶核が発生して成長することにより転移が進行しやすいと報告されている。固体状態では転移が起こらなかったため、より効率的な水和物探索法として、水分含量の異なる水-アセトン混液中でのスラリー法を採用した。水分活量値を網羅的に設定するため、0 から 1 までを 0.1 刻みになるように水分含量を設定し、スラリー実
験時には転移しやすいように種晶を添加した。
化合物が過飽和の状態の 0～100% v/v の異なる水分含量の水-アセトン混液に、無水物と 0.5 水和物、1 水和物の種晶を添加し、25°C で攪拌した後にラマン分光を用いて結晶形を確認した。従来このような網羅的な条件、かつ大量の試料量が必要ということで、初期段階で入手可能な非常に少量の化合物量に対して、本検討を実施することは困難であった。しかし、今回はラマン分光と併用することで、開発初期段階での微量で効率的な無水物と水和物の安定領域の決定や水和物の探索を可能とした (図 15)。その結果、水分含量 7.5% v/v において無水物から 0.5 水和物への転移が認められた (表 1)。溶液からの冷却晶析もしくは水溶液中 (水分含量：100% v/v)のスラリー実験では、晶出が確認されなかった 0.5 水和物が、本検討により見出されたことから、探索的な水和物のスクリーニングとしても適用可能と判断された。
水分活量を 100 倍にした数値が平衡相対湿度に相当するため 17、スラリー実験で 1 水
和物への転移が認められた水分含量 8.0% v/v は水分活量で 0.74 に相当する 41, 42。そのため、理論的には湿度 74%以上の保存下で 1 水和物へ転移すると考えられた。しかし、高湿度下での安定性試験においては、転移速度を早めるため、凍結乾燥により、比表面29積を上げ、結晶性を低下させたにも関わらず、25°C/75%RH 保存においてはほとんど 1
水和物への転移は認められなかった。固体状態での転移については、水の結晶格子へ移動、さらに結晶構造の変化を伴うため、スラリー実験における無水物から水和物への転移での活性化エネルギーと比べると、固体状態における転移では、大きな活性化エネル
ギーが必要なため転移しなかったと推察された。

30

図 15 異なる水分含量におけるスラリー実験の概要図
表 1 25°C におけるスラリー実験で得られた結晶形

31

異なる温度領域でのスラリー実験による無水物と水和物の相図作成
高温下における薬物と水の間で形成される水素結合力の減弱により、高温下では水和物の形成により高い水分含量が必要となるため 16, 41、無水物と水和物の安定相は温度によって変化すると報告されている。そのため、結晶化プロセスで一般的に用いられる加熱後の冷却による晶析で無水物を得られる条件を見出すには、温度による安定相の影響を調べる必要があるため、異なる温度でのスラリー実験を行い、安定相を調べた。その結果、温度が高くなるにつれて、無水物から水和物への転移における水分含量は高くなる傾向にあり、各々の結晶形が安定的に存在する相を見出した (図 16)。その結果、加熱後からの冷却による晶析では、水分含量を 1.0% v/v 以下の水-アセトン混液で確実に無水物が得られると判断した (図 16 の点線部分に相当)。

32

図 16 T-3256336 の無水物と水和物の相図 (点線は水分含量 1% v/v に相当)

33

小括 2
異なる水分含量の水-アセトン混液におけるスラリー実験で、無水物と水和物の相図を作成し、無水物の安定相が確認された。また、溶液からの冷却晶析や高湿度下での安定性試験などの水和物探索のスクリーニングにより確認されなかった 0.5 水和物が、本手法によって見出された。温度上昇に伴って水和物への転移における水分量は高くなる傾向にあり、加熱後の冷却によって無水物が得られる溶媒条件を見出した。よって、異なる水
分含量の水-有機溶媒混液におけるスラリー実験は、無水物/水和物の相図作成法としては最適であり、探索的な水和物スクリーニングへの応用も可能と判断した。また、製造工程における晶析溶媒の変更や晶析温度の条件検討において、有用な情報提供という観点から、本手法の適用が期待される。現在、本手法は網羅的に探索可能な水和物形成分析法として、結晶形選定時のスキームに導入されている。

34

第三章：新しい創薬モダリティに対する開発初期段階での安定性評価ならびに配列最適化法の構築
序論
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Associated Proteins
9 (CRISPR-Cas9)はゲノム配列の任意の場所を削除や置換、挿入することができる新しい
遺伝子改変技術であり、近年では遺伝子の変異が原因の病気やがんなどの難病に対しても開発が進んでいる 43, 44, 45, 46。主に、がんや感染症や閉塞性動脈硬化症、パーキンソン病、のう胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、筋ジストロフィーなどの疾患が
CRISPR-Cas9 による治療の対象となっている 47, 48。CRISPR-Cas9 は single guide RNA(sgRNA)と Cas9 から構成されており、sgRNA は認識配列を含む CRISPR RNA (crRNA)
領域と、Cas9 と結合する trans-activating crRNA (tracrRNA)領域からなる約 100 塩基のRNA である (図 17)。デリバリー技術にはアデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベク
ターや lipid nano particle (LNP)などの非ウィルスベクターが良く知られており 49、CRISPRCas9 の技術をヒトへ応用するには、キャリアが細胞内部に送り込まれ、細胞質内においてキャリアに含まれる DNA や RNA から Cas9 と sgRNA が確実に発現される必要がある。
一般的に 1 本鎖 RNA は細胞質や血漿のような生体液に存在するリボヌクレアーゼに対して不安定であり 50、特に未修飾の 1 本鎖 RNA はリボヌクレアーゼによって即座に分解される。従って、細胞や in vivo での効率的な遺伝子編集のためには RNA の反応性の高い 2’ヒドロキシ基への修飾が望まれる。従来では、20 塩基程度の核酸では様々な修飾パターンの核酸を用いて網羅的にランダムに修飾を最適化していた。しかし、sgRNA のよ
うな 100 塩基と長い核酸に対して、従来法であるランダムスクリーニングによる修飾や Cas9
35

と相互作用する部位からの特定などの手法を適用することは 51, 52, 53、いずれも修飾する部位が多く、かつトライアンドエラーで非常に非効率的であり、合理的とはいえない。また、修飾部位が多くなると修飾核酸の特性によってはタンパク質やターゲット配列との相互作用に影響を与え、活性の低下に繋がる可能性がある 54, 55。近年の新しい修飾アプローチ
法の研究として、20 塩基程度の siRNA の血漿中における切断プロファイルを取得、その部位にピンポイント修飾することで血漿中での安定性改善が報告されている 56。
本 章 で は 、 生 体 液 に お い て sgRNA の ピ ン ポ イ ン ト で 切 断 さ れ る 部 位 を Mass
Spectrometry (MS)で特定し、切断部位へのピンポイント修飾によって sgRNA を安定化するという新しい修飾アプローチ法を考案した。

36

図 17 CRISPR-Cas9 の構造

37

結果と考察MS を用いたマウス筋肉ホモジナイズ液における sgRNA の切断部位の特定
マウス筋肉ホモジナイズ液にデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対するマウスエクソン 51
を標的とした crRNA を有する MmDmdEx51 と称した sgRNA (図 18)を添加し、その分解挙動を HPLC-UV で確認したところ、いくつかの分解物が確認された (図 19)。本実験では、最終的には MS を用いて sgRNA の分解物の分子量が同定できるように、ホモジナイ
ズ液へ添加する sgRNA 量を網羅的に検討し、最適な添加量を決定した。さらに、優先的に切断される部位を特定するため、比較的長い鎖の分解物が得られるように HPLC-UV
で分解物の長さを確認し、インキュベート時間を最適化した。ホモジナイズ液という煩雑物に含まれた分解物の分析であるため、得られる MS スペクトルは複雑で解析も困難となる。
この課題を解決するために Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight
Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS)と Liquid Chromatography-Quadruple Time of Flight
Mass Spectroscopy (LC-QTOF-MS)のコンビネーション分析を行った。
本実験で得られた分解物を MALDI-TOF MS で評価したところ分解物の分子量は、本体の sgRNA とされる m/z = 32000 に加えて、10000 と 13000、19000、22000 付近であった (図 20)。MALDI は、マトリックスと呼ばれるイオン化促進剤と試料を混合してサンプル調製し、照射されたレーザーの大部分はマトリックスが吸収するため、比較的破壊されやすい分子種でも壊れないようにイオン化することができ、ソフトなイオン化と呼ばれている。
そのため、100 Da から 100 kDa までの分子種を壊すことなく、大部分が 1 価のイオンとして生成される 57。一方で、大きな分子種になるとイオンのフラグメンテーションや数多くの同位体ピークによりブロードなピークとして検出されるため、正確な分子量を特定すること38

は難しくなる。実際に MALDI-TOF MS で観測された分解物の正確な分解物数の同定は可能であったが、マススペクトルについてはピーク幅が広く、ブロードで正確な分解物の分子量を決定することはできなかった。
そこで、多価イオン質量スペクトルからデコンボリューションにより正確な核酸の分子量を特定することができる LC-QTOF-MS 測定を行ったところ 58、MALDI-TOF MS の結果から得られた分解物の数と大まかな分子量情報を基に、分解物の分子量は 10683.5 と13348.3、19372.7、22037.1 と特定できた (図 21)。配列から分子量計算を行ったところ、
41C/42A と 68C/69A 間で切断されていることが明らかとなった。また、他のターゲット配列の sgRNA を用いて同様の実験を実施したところ、41C/42A と 68C/69A 間で切断されており、41C/42A と 68C/69A 間での切断部位は、どのターゲット配列であっても一般的に切断されやすいことが示唆された (図 22)。

39

図 18 MS による切断部位特定実験に用いた sgRNA 配列

図 19 マウス筋肉ホモジナイズ液とインキュベート後の sgRNA の HPLC クロマトグラム(a) blank (PBS), (b) sgRNA, (c) マウス筋肉ホモジナイズ液, (d) マウス筋肉ホモジナイズ
液とインキュベート後の sgRNA40

図 20 マウス筋肉ホモジナイズ液とインキュベート後の sgRNA の MS スペクトラム (a)マウス筋肉ホモジナイズ液, (b) マウス筋肉ホモジナイズ液とインキュベート後の sgRNA

図 21 マウス筋肉ホモジナイズ液とインキュベート後の sgRNA の LC-QTOF-MS におけるデコンボリューション計算による各スペクトラムの分子量41図 22 分解物の分子量から推定された切断部位

42ピンポイント修飾した sgRNA の安定性評価
RNA は、化学修飾を施すことにより安定化すると報告されている 59, 60。一般的には
2’O-Methyl (2’OMe)修飾が、安定性と標的転写物への結合親和性を高める手段としてよく用いられている 61。一方で、sgRNA に 2’OMe 修飾のようなバルキーな置換基を導入す
ると、遺伝子編集効率へ影響するため 59、2'Fluoro (2’F)修飾の適用の報告数も多い 62。
また、Locked Nucleic Acid (LNA)や DNA も安定化と薬効発現の両立が可能な修飾とされている 63。そこで、切断部位とされている 41C と 68C の反応性の高い 2’ヒドロキシ基に対して、異なる修飾体 2’OMe と 2’F、LNA、DNA を導入し (図 23)、安定性の改善効果
を未修飾体と比較して評価した。分析には、通常用いられる電気泳動法ではなく、定量性ならびに正確性、再現性の観点から Size Exclusion Chromatography (SEC)-UV 法を用いた 64。移動相に界面活性剤を用いることで、sgRNA と生体試料由来のタンパク質との相互作用を除去することが可能であった。結果としては、2’OMe < F < DNA < LNA の順に sgRNA の安定化が認められた (図 24)。マウス筋肉ホモジナイズ液とインキュベートしたピンポイント修飾体 sgRNA を抽出したところ、41C/42A と 68C/69A 間で切断した分解物とは異なる分解物の分子量が確認され、41C/42A と 68C/69A 間はピンポイント修飾によってヌクレアーゼによる分解を免れたことも示唆された。

43

(a)

(b)

図 23 ピンポイント修飾をした sgRNA 配列 (a) ピンポイント修飾を施した塩基の位置,(b) 切断部位に施した修飾核酸の種類

図 24 ピンポイント修飾を施した sgRNA の安定性の結果

44

5’ならびに 3’末端に異なる修飾を施した sgRNA の安定性評価
5’ならびに 3’末端に異なる修飾を施した sgRNA において、ヒト細胞での細胞内のヌク
レアーゼ耐性による遺伝子編集効率の向上が報告されている 65。末端から逐次的に加水分解するエキソヌクレアーゼから保護するためにアンチセンスや siRNA では、2’OMe と
Phosphorothioate (PS)末端修飾の組み合わせが良く用いられており、この修飾の組み合
わせは 2’OMe 単独の末端修飾よりも安定化を劇的に促進する 65, 66 。しかしながら、sgRNA の 5’ならびに 3’末端修飾がヌクレアーゼによる分解の耐性にどれくらい寄与しているのかについては、未だ解明されていない。そこで、マウス筋肉ホモジナイズ液における 5’ならびに 3’末端に 2’OMe または、2’OMe-PS 修飾を導入した sgRNA の安定性を比較した (図 25)。本実験では原液のマウス筋肉ホモジナイズ液を用いた際には、全く安定性の差が認められなかった。これは原液のマウス筋肉ホモジナイズ液に含まれるリボヌク
レアーゼ濃度が高かったためと考え、安定性の明確な違いを評価するために、マウス筋
肉ホモジナイズ液を希釈して使用した。いずれも末端未修飾体よりは安定化の向上は認められたが、ピンポイント修飾した sgRNA と比べると安定化の効果は小さかった (図 26)。
ピンポイント修飾は sgRNA の安定化において効果的なアプローチ法であると考えられた。

45

図 25 5’ならびに 3’末端に異なる修飾を施した sgRNA 配列

図 26 5’ならびに 3’末端に異なる修飾を施した sgRNA の安定性の結果

46

Cas9 との相互作用を介した sgRNA の安定性評価
Cas9 は sgRNA の約 20 塩基と広範囲にわたって 2’ヒドロキシ基を介して相互作用しており 53、相互作用している sgRNA の塩基部分は Cas9 によってヌクレアーゼによる分解か
ら保護されている 65。マウス筋肉ホモジナイズ液における Cas9 による 5’ならびに 3’末端に 2’OMe-PS 修飾を導入した sgRNA の安定化を評価したところ、Cas9 存在下では劇的に安定化されていた (図 27)。CRISPR-Cas9 は、DNA や RNA が封入されたキャリアを介して細胞内へ導入される。細胞へ導入後、細胞質内で DNA や RNA から sgRNA や Cas9が強制発現され、sgRNA と Cas9 の複合体の形成後に、標的 DNA の切断など遺伝子編集が行われる。細胞質内での Cas9 との複合体形成後は、sgRNA は Cas9 との複合体形成によるヌクレアーゼによる分解を免れるため、sgRNA については重厚な修飾は不要であり、ピンポイント修飾によるアプローチ法は、遺伝子編集効率や Cas9 との相互作用の維持の観点から、最適な sgRNA の安定化法であることが示唆された。

47

(mean ± SD; n = 2)
図 27 Cas9 存在下での sgRNA の安定性の結果

48

小括 3
CRISPR-Cas9 の sgRNA の安定化を目指して、優先的に切断される部位を MS によって世界で初めて特定した。切断部位はターゲット配列に依存しない、共通の切断部位であり、切断部位にピンポイント修飾を施したところ、未修飾 sgRNA と比較して劇的に安定性が改善された。また、一般的に知られている 5’や 3’末端の修飾による安定化の度合い
や Cas9 との複合体形成後のヌクレアーゼによる分解の保護を考慮すると、ピンポイント修飾法は、遺伝子編集効率や Cas9 との相互作用に影響を与えない、非常に効果的な修飾方法と示唆された。以上のことから、従来のランダムスクリーニングやタンパク相互作用部
位からの修飾方法とは異なり、合理的でかつ効果的であり、sgRNA の安定性を最大限に改善し、CRISPR-Cas9 の遺伝子編集効率の向上する手段として有用と判断した。

総括
本研究では、経口固形製剤を志向した低分子化合物の良好な経口吸収性が期待される分子構造パラメータを特定し、網羅的な水和物探索法を構築した。次世代モダリティ領域を対象とした物性評価分析プラットフォームを通して、高機能で優れた候補品選定ならびに合理的な最適化アプローチ法を見出した。現在、低分子化合物と抗体の物性評価は標準化されており、ペプチドについては低分子化合物の物性評価法を応用することで評価できることも、近年明らかとなってきた。核酸医薬や遺伝子治療の市場規模は今後高成長が予測されるため、本研究の成果は、有望な新薬候補の選定の効率化、ならびに
革新的な医薬品創出の加速化に、大いに貢献することが期待できる。

49

謝辞
本研究に終始懇篤なるご指導とご鞭撻を賜りました明治薬科大学 薬学部分子製剤学
研究室 深水啓朗教授に深く感謝いたします。
論文作成に際し、ご指導とご助言を賜りました主査の明治薬科大学 薬化学研究室
山中正道教授、副査の明治薬科大学 医療製剤学研究室 下川健一准教授ならびに明治薬科大学 生体機能分析学研究室 月村考宏講師に厚く御礼申し上げます。
本研究の遂行にあたり特段のご便宜を賜りました武田薬品工業株式会社の Analytical
Development の Seyfried Birgit 所長に心より厚く御礼申し上げます。本研究の計画から完成に至るまで多くの激励とともにご指導を賜りました武田薬品工業株式会社の Analytical
Development Japan の池田幸弘所長に深甚なる感謝の意を表します。溶解度との相関研究ならびに IAP 拮抗薬の水和物の研究の推進にあたり議論を通じて有益なるご教示を賜りました武田薬品工業株式会社の山本克彦主席研究員ならびに小嶌隆史アソシエイトサ
イエンティフィックフェローに厚く御礼申し上げます。また、sgRNA 研究の完成まで多大なるご指導ならびにご助言を賜りました武田薬品工業株式会社の松本悟主席研究員ならびに見城江利也主任研究員、辛島正俊所長に深謝いたします。研究にあたり貴重な T3256336 原薬をご提供いただきました武田薬品工業株式会社の橋本健太郎主席研究員に謹んで御礼申し上げます。そして、本研究の実施にあたり日常の業務を通じてさまざまなご支援を頂きました武田薬品工業株式会社 Analytical Development の研究員の皆様に御礼申し上げます。最後に、これまで筆者を支えてくれた両親に感謝するとともに、本研究に専心できるように終始協力してくれた夫 研太と毎日元気を与えてくれた息子 惺志に感謝します。
50

実験の部
試料と調製
固体状態を考慮した溶解度測定法に用いた T 番号ならびに TAK 番号化合物は、全て武田薬品工業株式会社における化学研究所で合成した化合物であり、他の抗腫瘍性
低分子化合物は富士フィルム和光純薬株式会社ならびにシグマアルドリッチ、東京化成
工業、Tocris Bioscience 社から購入した。IAP 拮抗薬 T-3256336 は、武田薬品工業株式
会社における化学研究所で合成した化合物を用いた。sgRNA は、全て GeneDesign 社で合成したものを用い、Streptococcus pyogenes 由来の Cas9 は組換え大腸菌で発現させ、精製することで調製した 67。C57BL/6 マウス (6-8 週齢)の筋肉ホモジナイズ液は、マウスの腓腹筋とサーモフィッシャーサイエンティフィック社製の T-PER tissue protein extraction
reagent を混合し、遠心によって調製した。こちらの動物実験は、湘南アイパークにある武田薬品工業株式会社の動物実験委員会で承認された手順 (00020603)に従って実施した。
本研究で使用した溶媒および試薬は、富士フィルム和光純薬株式会社の試薬特級あるいは HPLC グレードであった。

固体物性を考慮した溶解度測定
粉末 X 線回折測定には RINT Ultima IV (リガク株式会社製)を用い、測定条件として
は、線源: Cu-Kα 線 (λ=1.5418 Å)、管電流: 50 mA、管電圧: 40 kV、スキャンスピード:
6°/min、走査角 (2θ): 2-35°として測定した。試料から得られた粉末 X 線回折パターンから試料板および散乱光による成分を除去した後、結晶成分に由来する回折ピーク面積51

(Ic)および無晶成分に由来する面積 (Ia)を Hermans 法により波形解析して算出し、下式に基づいて結晶化度を求めた 68, 69。
結晶化度 = Ic/(Ic+Ia) x 100
演算においては、日間差と個人差などによる影響を除くために自動結晶化度算出ソフ
トウェアを用い、各検体の結晶化度を求めた 70。
熱分析測定では、熱重量測定として、TGA/DSC1 (メトラートレド株式会社製)を用い、昇温速度: 5°C/min、測定雰囲気: 窒素ガス (20 mL/min) 、温度範囲: 30～300°C として測定した。示差走査熱量測定として DSC 1 (メトラートレド株式会社製) を用い、測定条件
は昇温速度: 5°C/min、測定雰囲気: 窒素ガス (20 mL/min)、温度範囲: 30～300°C として測定した。
溶解度測定は、化合物約 0.4 mg を Mini-UniPrep (PVDF、0.45 μm、Whatman 社製)に秤量し、測定溶媒 0.4 mL を加えて、37°C で 18 時間インキュベートして測定した。測定溶
媒には日本薬局方溶出試験第 1 液 (pH1.2, JP1)と日本薬局方溶出試験第 2 液 (pH7.4,
JP2)、20 mM グリコケノデオキシコール酸 (Glycochenodeoxycholic acid, GCDC)を含有した JP2 液を用いた。インキュベート後、Mini-UniPrep にてろ過を行い、ろ液を試料溶液とした。また、各試料約 0.5 mg を精密に秤り、アセトニトリルに溶解して 5 mL とし、標準溶液とした。試料溶液および標準溶液を UFLC に注入し、それぞれの溶液から得られたピーク面積をもとに溶解度を算出した。UFLC 条件は下記として実施した。

52

機器: Prominence UFLC (島津製作所株式会社製)
カラム: YMC-UltraHT Pro C18 (粒子径: 2 μm、カラムサイズ: 2.0 mmφ×30 mm) (ワイエムシィ株式会社製)
移動相 A: 蒸留水/50 mmol/L 酢酸アンモニウム溶液/アセトニトリル = (8/1/1, v/v/v)
移動相 B: 50 mmol/L 酢酸アンモニウム溶液/アセトニトリル = (1/9, v/v)
カラム温度: 40°C
流量: 0.7 mL/min
注入量: 5 μL
検出: 波長 UV230-280 nm
グラディエントプログラム：
時間 [分]

B 濃度 [%]

0
0.1
1.6
2.9
2.91

5
5
95
95
5

Kinetic solubility 測定
Kinetic solubility は析出法によって評価した 71, 72。化合物を 10 mM DMSO になるように溶解させ、メルクミリポア株式会社製の 96 well plate に 5 μL DMSO 化合物
溶液を添加し、さらに 245 μL の測定溶媒を加えた。25°C で 24 時間インキュベー
トし、ろ過後 HPLC 測定を行った。

53

Log DpH7.4 測定
pH7.4 におけるオクタノール/水分配係数である Log DpH7.4 はウォーターズ株式会
社製の紫外可視分光検出器を有した Alliance 2795 HPLC system を用いて、HPLC 法によって評価した 73。

ラット PK 試験
PK パラメータは、SD-JCL ラット (8 週齢)を用いたカセットドージングによって取得した 74, 75。イソフルランの大腿静脈投与による麻酔後、静脈内投与では 10 化合物 0.1 mg/kg、経口投与では 10 化合物 1 mg/kg で絶食下において実施した。投与
後 8 時間まで、尾静脈からヘパリンと共にパスツールピペットで血液を採取した。
血漿中の薬物濃度を Sciex API3000 (エービー・サイエックス株式会社製)を搭載した島津製作所株式会社製の HPLC 装置 (LC-MS)を用いて測定した。カラムにはジーエルサイエンス株式会社製 Inertsil C8 (粒子径: 5 μm、カラムサイズ: 2.1 mmφ×33mm)、移動相にはアセトニトリル/10 mM ギ酸アンモニウム溶液 = (15/85, v/v)を用い、流速 0.2 mL/min として測定時間 8 分で測定した。

動的水蒸気吸着測定
DVS-1 (Surface Measurement Systems 社製)により、試料 10 mg を用いて 25°C、5%RH
刻みで 5-95% RH における吸着・脱着等温線を測定した。

54

ラマン分光測定
Raman Work Station (Kaiser Optical Systems 社製)を用いて、測定条件: 顕微モード、
光源: NIR レーザー785 nm、レーザー出力: 100 mW、分解能: 4 cm-1、照射時間: 3 秒、積算回数: 2 回として測定した。

スラリー実験による相図作成
水分量が 0～100% v/v の水-アセトン混液に過剰量の化合物を添加し、5°C もしくは25°C、40°C で 3 日間攪拌後、19000 rpm、10 分間遠心した。得られた上清 500 μL に無水物と 0.5 水和物、1 水和物の結晶形を種晶として添加し、5°C もしくは 25°C、40°C において懸濁状態で攪拌した。1 週間攪拌後の懸濁液を 19000 rpm、10 分間遠心し、遠心後の沈殿物の結晶形を、ラマン分光によって確認した。

単結晶 X 線結晶構造解析
株式会社リガク社製 R-AXIS RAPID とグラファイトで単色化した Cu-Kα 線源を用いて単結晶 X 線回折測定を行った。N–H や O–H 水素結合原子の位置を結晶に当てた X
線の回折線の強度のフーリエ変換によって計算した結果から、求めた。非水素結合ならびに水素原子は、それぞれ異方性温度因子、等方性温度因子を riding model でそれぞれ適用した。直接法による初期構造の発生および精密化は SHELXL-97 を用いて、その他の構造計算は、リガク株式会社製 Crystal Structure を用いた 76。

55

sgRNA の HPLC-UV 測定
HPLC-UV 条件は下記として実施した。

機器: Prominence UFLC (島津製作所株式会社製)
カラム: DNAPac™ RP (粒子径: 4 μm、カラムサイズ: 3.0 mmφ×100 mm) (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)
移動相 A: 200 mM 酢酸トリエチルアンモニウム溶液
移動相 B: アセトニトリル
カラム温度: 40°C
流量: 0.4 mL/min
注入量: 10 μL
検出: UV260 nm
グラディエントプログラム：
時間 [分]

B 濃度 [%]

0
4
34
44
49
60

5
5
90
90
5
5

56

MALDI-TOF MS 測定
測定試料は 50 μM になるように Tris-EDTA で希釈した。0.5 μL の 40 mM クエン酸水
素二アンモニウムを含んだ 3-ヒドロキシ-2-ピリジンカルボン酸をマトリックスとして用いて、1μL の試料を混合し、試料プレートに滴下ならびに乾燥し、試料スポットを調製した。質量分析測定ではレーザーの照射・積算回数は 70000 ショット/スペクトラムに設定し、加速電圧は 19 kV、分子量測定範囲は 8-40 kDa に設定した。

LC-QTOF-MS 測定
LC-QTOF-MS による分子量分析は、ウォーターズ株式会社製の MS 検出器 Xevo G2XS QTOF を搭載した Ultra HPLC を使用した。イオン化条件はネガティブモード、測定範
囲 m/z: 500-3500、乾燥ガス温度： 120°C、キャピラリー電圧： -1.5 kV、コーン電圧： 90
V、コーンガス流量： 123 L/h、窒素ガス流量： 796 L/h とした。操作やデータ解析には
MassLynx ソフトウェアを用い、核酸の分子量は MaxEnt デコンボリューションアルゴリズムを使用した。LC 条件は下記として実施した。

57

機器: Prominence UFLC (島津製作所株式会社製)
カラム: ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 (粒子径: 1.7 μm、カラムサイズ: 2.1
mmφ×50 mm) (ウォーターズ株式会社製)
移動相 A: 5% メタノール含有 240 mM ヘキサフルオロイソプロパノール/7 mM トリエチ
ルアミン溶液 (pH 7.0)
移動相 B: 100% メタノール含有 240 mM ヘキサフルオロイソプロパノール/7 mM トリエ
チルアミン溶液
カラム温度: 40°C
注入量: 7 もしくは 10 μL
グラディエントプログラム：
時間 [分]

流量 [mL/min]

B 濃度 [%]

0
5
5.2
6.2
6.4
7.4

0.2
0.2
0.4
0.4
0.2
0.2

10
80
100
100
10
10

58

sgRNA の安定性試験
sgRNA をマウス筋肉ホモジナイズ液と混合し、島津製作所株式会社製の Prominence
UFLC system を用いて、インタクト株式会社製の Intrada SEC (粒子径: 3.0 μm、カラムサイ
ズ: 4.6 mmφ×250 mm)によってサイズ排除クロマトグラフィーで測定した。0.2 mL/min の流速で、移動相に 0.1%ポリソルベート 80 を含んだ 10 mM のリン酸バッファーを使用した。
LC 機器の界面活性剤の除去のために、蒸留水/アセトニトリル/テトラヒドロフラン/メタノー
ル = (1/1/1/1, v/v/v/v)で洗浄後、50%アセトニトリル溶液で洗浄した。

59

掲載論文
Nakashima S., Yamamoto K., Arai Y., Ikeda Y., Chem. Pharm. Bull., 61, 1228–1238(2013).
Takeuchi S., Kojima T., Hashimoto K., Saito B., Sumi H., Ishikawa T., Ikeda Y., Chem.
Pharm. Bull., 63, 858–865 (2015).
Takeuchi S., Yamamoto M., Matsumoto S., Kenjo E., Karashima M., Ikeda Y., J.
Chromatogr. B, 1192, 123149 (2022).

60

参考文献
1. Colombo P., Sonvico F., Colombo G., Bettini R., Pharm. Res., 26, 601–611 (2009).
2.

Helliwell M., Taylor D., Prof. Nurse., 8, 313–317 (1993).

3.

Lipinski C. A., J. Pharmacol. Toxicol. Methods., 44, 235–249 (2000).

4.

Stegemann S., Leveiller F., Franchi D., de Jong H., Lindén H., Eur. J. Pharm. Sci., 31,
249–261 (2007).

5.

Lipinski C. A., Lombardo F., Dominy B. W., Feeney P. J., Adv. Drug Deliv. Rev., 46,
3–26 (2001).

6.

Waring M. J., Arrowsmith J., Leach A. R., Leeson P. D., Mandrell S., Owen R. M.,
Pairaudeau G., Pennie W. D., Pickett S. D., Wang J., Wallace O., Weir A., Nat. Rev.
Drug Discov., 14, 475–486 (2015).

7.

Baghel S., Cathcart H., O'Reilly N. J., J. Pharm. Sci., 105, 2527–2544 (2016).

8.

Junghanns J. UAH., Müller R. H., Int. J. Nanomed., 3, 295–309 (2008).

9.

Sugano K., Okazaki A., Sugimoto S., Tavornvipas S., Omura A., Mano T., Drug Metab.
Pharmacokinet., 22, 225–254 (2007).

10. Brittain H. G., Grant D. J. R., Myrdal P. B., “Polymorphism in Pharmaceutical Solids,”
Part IV, Chap. 12, 2nd eds. by Brittain H. G., Marcel Dekker, New York, 2009.
11. Byrn S. R., Annu. Rep. Med. Chem., 20, 287–294 (1985).
12. Haleblian J. K., J. Pharm. Sci., 64, 1269–1288 (1975).
13. Stahl H. P., “Towards Better Safety of Drugs and Pharmaceutical Products,” ed. byBraimar D. D., Elsevier; North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1980, pp. 265–280.
14. Franklin S. J., Younis U. S., Myrdal P. B., J. Pharm. Sci., 105, 1914–1919 (2016).
15. Khankari R. K., Grant D. J. W., Thermochim. Acta, 248, 61–79 (1995).
16. Variankaval N., Lee C., Xu J., Calabria R., Tsou N., Ball R., Org. Process Res. Dev.,
11, 229–236 (2007).
17. Krzyzaniak J. F., Williams G. R., Ni N., J. Pharm. Sci., 96, 1270–1281 (2007).
18. Guillory J. K., “Generation of polymorphs, hydrates, solvates, and amorphous solids,”
ed. by Brittain H. G., Marcel Dekker; New York, 1999, pp. 183–226.
19. Griesser U. J., “The importance of solvates,” Chap. 8, ed. by Hilfiker R., Wiley-VCH,
Weinheim, 2006, pp. 211–257.
20. Giron D., Goldbronn C., Mutz M., Pfeffer S., Piechon P., Schwab P., J. Therm. Anal.
Calorim., 68, 453–465 (2002).
61

21. Zhu H., Yuen C., Grant D. J. W., Int. J. Pharm., 135, 151–160 (1996).
22. Zhu H., Grant D. J. W., Int. J. Pharm., 139, 33–43 (1996).
23. Wen H., Wang C., Sun C. C., Cryst. Growth Des., 19, 5471–5476 (2019).
24. Mikitsh J. L., Chacko A. M., Perspect. Medicin. Chem., 6, 11–24 (2014).
25. Schneider-Poetsch T., Chhipi-Shreshta J. K., Yoshida M., J. Antibiot., 74, 603–616(2021).
26. Sakamoto K. M., Kim K. B., Kumagai A., Mercurio F., Crews C. M., Deshaies R. J.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98, 8554–8559 (2001).
27. Makurvet F. D., Medicine in Drug Discov., 9, 100075 (2021).
28. Lipinski C. A., “Pharmaceutical profiling in drug discovery for lead selection,” ed. byBorchardt R. T., Kerns E. H., Lipinski C. A., Thakker D. R., Wang B., AAPS Press,
Arlington, Virginia, 2004, pp. 93–125.
29. Saal C., Petereit A. C., Eur. J. Pharm. Sci., 47, 589–595 (2012).
30. Ali J., Camilleri P., Brown M. B., Hutt A. J., Kirton S. B., J. Chem. Inf. Model., 52, 420–428 (2012).
31. Ritchie T. J., Macdonald S. J. F, Young R. J., Pickett S. D., Drug Discov. Today, 16,
164–171 (2011).
32. Thomas V. H., Bhattachar S., Hitchingham L., Zocharski P., Naath M., Surendran N.,
Stoner C. L., El-Kattan A., Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 2, 591–608 (2006).
33. Cheng A., Merz K. M., J. Med. Chem., 46, 3572–3580 (2003).
34. Lovering F., Bikker J., Humblet C., J. Med. Chem., 52, 6752–6756 (2009).
35. Di L., Fish P. V., Mano T., Drug Discov. Today, 17, 486–495 (2012).
36. Leach A. G., Jones H. D., Cosgrove D. A., Kenny P. W., Ruston L., MacFaul P., Wood
J. M., Colclough N., Law B., J. Med. Chem., 49, 6672–6682 (2006).
37. Schultes S., de Graaf C., Berger H., Mayer M., Steffen A., Haaksma E. E. J., de Esch I.
J. P., Leurs R., Krämer O., Med. Chem. Commun., 3, 584–591 (2012).
38. Qu H., Louhi-Kultanen M., Kallas J., Int. J. Pharm., 321, 101–107 (2006).
39. Hashimoto K., Saito B., Miyamoto N., Oguro Y., Tomita D., Shiokawa Z., Asano M.,
Kakei H., Taya N., Kawasaki M., Sumi H., Yabuki M., Iwai K., Yoshida S., Yoshimatsu
M., Aoyama K., Kosugi Y., Kojima T., Morishita N., Dougan D. R., Snell G. P.,
Imamura S., Ishikawa T., J. Med. Chem., 56, 1228–1246 (2013).
40. Roy S., Quiñones R., Matzger A. J., Cryst. Growth Des., 12, 2122–2126 (2012).
6241. Sokolova E. P., Morachevskii A. G., Vestn. Leningr. Univ. Fiz. Khim., 3, 110–115(1967).
42. Gölles F., Monatsh. Chem., 92, 981–991 (1961).
43. Hsu P. D., Lander E. S., Zhang F., Cell, 157, 1262–1278 (2014).
44. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P. D., Wu X., Jiang W.,
Marraffini L. A., Zhang F., Science., 339, 819–823 (2013).
45. Mali P., Yang L., Esvelt K. M., Aach J., Guell M., DiCarlo J. E., Norville J. E., Church
G. M., Science., 339, 823–826 (2013).
46. Jinek M., East A., Cheng A., Lin S., Ma E., Doudna J., Elife., 2, e00471 (2013).
47. Tian X., Gu T., Patel S., Bode A. M., Lee M. H., Dong Z., NPJ Precis. Oncol., 3, 8
(2019).
48. Papasavva P., Kleanthous M., Lederer C. W., Mol. Diagn. Ther., 23, 201–222 (2019).
49. Wang H. X., Li M., Lee C. M., Chakraborty S., Kim H. W., Bao G., Leong K. W., Chem.
Rev., 117, 9874–9906 (2017).
50. Whitehead K. A., Langer R., Anderson D. G., Nat. Rev. Drug Discov., 8, 129–138(2009).
51. Finn J. D., Smith A. R., Patel M. C., Shaw L., Youniss M. R., van Heteren J., DirstineT., Ciullo C., Lescarbeau R., Seitzer J., Shah R. R., Shah A., Ling D., Growe J., Pink
M., Rohde E., Wood K. M., Salomon W. E., Harrington W. F., Dombrowski C., Strapps
W. R., Chang Y., Morrissey D. V., Cell rep., 22, 2227–2235 (2018).
52. Mir A., Alterman J. F., Hassler M. R., Debacker A. J., Hudgens E., Echeverria D.,
Brodsky M. H., Khvorova A., Watts J. K., Sontheimer E. J., Nat. Commun., 9, 2641
(2018).
53. Yin H., Song C. Q., Suresh S., Wu Q., Walsh S., Rhym L. H., Mintzer E., Bolukbasi M.
F., Zhu L. J., Kauffman K., Mou H., Oberholzer A., Ding J., Kwan S. Y., Bogorad R.
L., Zatsepin T., Koteliansky V., Wolfe S. A., Xue W., Langer R., Anderson D. G., Nat.
Biotechnol., 35, 1179–1187 (2017).
54. Mook O. R., Baas F., de Wissel M. B., Fluiter K., Mol. Cancer Ther., 6, 833–843 (2007).
55. Song X., Wang X., Ma Y., Liang Z., Yang Z., Cao H., Mol. Ther. Nucleic Acids., 9,242–250 (2017).
56. Turner J. J., Jones S. W., Moschos S. A., Lindsay M. A., Gait M. J., Mol. Biosyst., 3,
43–50 (2007).
57. Kirpekar F., Nordhoff E., Kristiansen K., Roepstorff P., Lezius A., Hahner S., Karas M.,
Hillenkamp F., Nucleic Acids Res., 22, 3866–3870 (1994).

63

58. Banoub J. H., Newton R. P., Esmans E., Ewing D. F., Mackenzie G., Chem. Rev., 105,
1869–1915 (2005).
59. Watts J. K., Deleavey G. F., Damha M. J., Drug Discov. Today., 13, 842–855 (2008).
60. Hassler M. R., Turanov A. A., Alterman J. F., Haraszti R. A., Coles A. H., Osborn M.
F., Echeverria D., Nikan M., Salomon W. E., Roux L., Godinho B. M. D. C., Davis S.
M., Morrissey D. V., Zamore P. D., Karumanchi S. A., Moore M. J., Aronin N.,
Khvorova A., Nucleic Acids Res., 46, 2185–2196 (2018).
61. Kenski D. M., Butora G., Willingham A. T., Cooper A. J., Fu W., Qi N., Soriano F.,
Davies I. W., Flanagan W. M., Mol. Ther. Nucleic Acids., 1, e5 (2012).
62. O’Reilly D., Kartje Z. J., Ageely E. A., Malek-Adamian E., Habibian M., Schofield A.,
Barkau C. L., Rohilla K. J., DeRossett L. B., Weigle A. T., Damha M. J., Gagnon K. T.,
Nucleic Acids Res., 47, 546–558 (2019).
63. Wahlestedt C., Salmi P., Good L., Kela J., Johnsson T., Hökfelt T., Broberger C.,
Porreca F., Lai J., Ren K., Ossipov M., Koshkin A., Jakobsen N., Skouv J., Oerum H.,
Jacobsen M. H., Wengel J., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97, 5633–5638 (2000).
64. Goetz H., Kuschel M., Wulff T., Sauber C., Miller C., Fisher S., Woodward C., J.
Biochem. Biophys. Methods., 60, 281–293 (2004).
65. Hendel A., Bak R. O., Clark J. T., Kennedy A. B., Ryan D. E., Roy S., Steinfeld I.,
Lunstad B. D., Kaiser R. J., Wilkens A. B., Bacchetta R., Tsalenko A., Dellinger D.,
Bruhn L., Porteus M. H., Nat. Biotechnol., 33, 985–989 (2015).
66. Behlke M. A., Oligonucleotides, 18, 305–319 (2008).
67. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E., Science.,
337, 816–821 (2012).
68. Hermans P. H., Weidinger A., J. Appl. Phys., 19, 491–506 (1948).
69. Ikeda Y., Ban J., Ishikawa T., Hashiguchi S., Urayama S., Horibe H., Chem. Pharm.
Bull., 56, 1406–1411 (2008).
70. Yamamura S., Momose Y., Int. J. Pharm., 212, 203–212 (2001).
71. Hoelke B., Gieringer S., Arlt M., Saal C., Anal. Chem., 81, 3165–3172 (2009).
72. Komura H., Kawahara I., Shigemoto Y., Matsuda K., Ano R., Murayama Y., Moriwaki
T., Yoshida N. H., Yakugaku Zasshi, 125, 121–130 (2005).
73. Masumoto K., Takeyasu A., Oizumi K., Kobayashi T., Yakugaku Zasshi, 115, 213–220(1995).
74. He K., Qian M., Wong H., Bai S. A., He B., Brogdon B., Grace J. E., Xin B., Wu J., Ren
S. X., Zeng H., Deng Y., Graden D. M., Olah T. V., Unger S. E., Luettgen J. M., Knabb
R. M., Pinto D. J., Lam P. Y. S., Duan J., Wexler R. R., Decicco C. P., Christ D. D.,
Grossman S. J., J. Pharm. Sci., 97, 2568–2580 (2008).
6475. Nagilla R., Nord M., McAtee J. J., Jolivette L. J., J. Pharm. Sci., 100, 3862-3874 (2011).
76. Sheldrick G. M., Acta Crystallogr. A., 64, 112–122 (2008).

65