ISSN 2436-7362

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35 37・ 39

Listeria monocytogenes

Lactobacilllus casei

Clostridium perfringens

  44・46・ 48

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

・・・・・・・・・50

Campylobacter jejuni
市川拓磨，平山和宏

・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 53（東京大学農学部獣医公衆衛生学教室）

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・55

 

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・57





・・・・・・・・・・・・・・・・・・・59

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熟成中のナチュラルチーズにおける Listeria monocytogenes の増殖制御に関する研究
川本 柊志郎*梶川 揚申**

五十君 靜信*（*東京農業大学大学院応用生物科学研究科, **東京農業大学農芸化学科）
Ⅰ．目的

うに接種し，チーズの熟成温度や冷蔵温度を考慮しListeria monocytogenes は低温増殖性，酸や塩にて 4℃，10℃で保存した後，経時的に pH，水分活性，

対する高い抵抗性を持つ通性嫌気性の食中毒菌でL. monocytogenes の生菌数を計測した．また，各チー

ある．この食中毒の原因食品は多岐にわたり，中でもズから MRS 寒天培地を用いて乳酸菌を分離し，各乳

ソフトタイプのナチュラルチーズが原因食品として多酸菌の培養上清を L. monocytogenes 混釈 BHI 寒天数報告されており，この理由として原料や製造中のク培地に滴下し，形成される阻止円から抗菌活性を評

ロスコンタミネーションで増殖した本菌を加熱殺菌せ価した．

ずに摂取することが挙げられる．一般的に食品中のpH や水分活性は微生物の増殖に影響を与えることがⅢ．結果，考察，結論

知られており，加えてチーズ中では乳酸菌の代謝産先行研究と同様に L. monocytogenes はカマンベー

物によって他の微生物の増殖を抑制されている．しか

ルでは菌数の増加が見られ，ダナブルーでは減少がし，このような微生物の増殖抑制作用があるにも関わ確認された．チーズの物性の計測結果，カマンベー

らず実際には本菌による食中毒事例は発生している．

ルでは pH と水分活性は増殖可能域を示し，特に pH

そ こ で ， 五 十 君 ら は ナ チ ュ ラ ル チ ー ズ に L.

は増殖至適 pH である pH 7 に近い値であった．一方

monocytogenes を接種し生菌数の計測から増殖挙動

ダナブルーは pH が増殖可能域ではあったが至適かを評価したところチーズごとに減少，増加と傾向が異らは離れており，水分活性は増殖可能域を下回ってなることを明らかにした．この増殖挙動の違いはチーいた．また，各チーズから分離した乳酸菌の培養上清ズの物性や構成する微生物によるものだと考えられるからは抗菌活性が確認された．これらの結果から，主ため，チーズの物性として pH と水分活性の計測，分に異なる増殖挙動を示した要因として pH や水分活

離した乳酸菌による抗菌活性の評価が必要である．

性は関与していることが示唆された．加えて，菌数のそこで本研究の目的をチーズの物性と構成する乳酸

減少には乳酸菌の代謝産物による影響が考えられる．

菌 に よ る 抗 菌 活 性 か ら L. monocytoge が 異 な る

しかし，増殖が確認されたカマンベールからも抗菌活増殖挙動を示した要因を明らかにすることとした．

性を示す乳酸菌が分離されたことや，pH や水分活性によって静菌作用が予想される中ダナブルーでは大Ⅱ．材料と方法
供試菌株として臨床株である L. monocytogenes
ScottA 株，4456 株を使用し，ナチュラルチーズはソフトタイプのカマンベールとダナブルーを用いた．
ScottA 株と 4456 株の混合菌液をカマンベールに
4.0×103cfu/g，ダナブルーに 4.0×105cfu/g になるよ幅に菌数が減少したことから各チーズ中の微生物の相互作用や代謝産物などの検討が必要であると考えられる．

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Exploration of factors that involve in growth behavior of Listeria monocytogenes
in ripening natural cheese
SHUJIRO KAWAMOTO, AKINOBU KAJIKAWA and SHIZUNOBU IGIMI
Department of Applied Bioscience, Graduate School of Tokyo University of Agriculture, Tokyo
Listeria monocytogenes (LM) is a facultative anaerobic bacterium, which has been known as a food poisoning
pathogen occasionally found in natural cheese. The source of contamination is usually unpasteurized milk. LM
could propagate and survive in the dairy products throughout fermentation and ripening steps. Since pH, water
activity (Aw), and the metabolites of lactic acid bacteria (LAB) in cheese could affect the growth of
microorganisms, these factors are important for control of the food poisoning pathogen. Previous studies haverevealed that the growth behavior of LM depend on type of cheese. The aim of this study is to find the factors bycomparing growth behavior of LM in different type of cheese. Camembert and Danish Blue were inoculated withLM, then pH, Aw, and CFU of LM was measured. The results showed that pH and Aw of Camembert were in
acceptable range for LM to grow. On the other hand, the pH of Danish Blue was too low to grow, Aw was below
the acceptable range, and the number of LM decreased. In addition, antibacterial activity was detected in theculture supernatant of LAB isolated from each cheese. From these results, it was suggested that pH, Aw, and LAB
were involved in the different growth behavior of LM. Since these factors are considered to have only
bacteriostatic effects. additional factors are also suggested for the bactericidal effects.

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乳酸菌 Lactobacilllus casei IGM394 の酸化ストレス
耐性メカニズムに関する研究
楢木 真吾*

梶川 揚申*

佐々木 泰子**五十君 靜信*(*東京農業大学応用生物科学部農芸化学科応用微生物学研究室，**

明治大学農学部 農芸化学科発酵食品学研究室)

Ⅰ. 背景

Ⅲ. 結果, 考察

乳酸菌の酸素に対する応答は非常に多様性に富み,変異株の中で静置条件に比較して好気条件により生株によるその応答の違いは酸素の毒性や生物の適応能育能が低下したのは, H2O2 分解酵素 NADH ペルオキ

力を理解する上で興味深いばかりでなく, 応用の面からシダーゼ遺伝子を欠損させた Δnpr のみであった. また,重要な課題である. 乳酸菌を食品等の製造に用いる際

好気条件下で野生株および他の変異株培養液からはは, 酸素に対する応答を解析・制御することが機能性やH2O2 が全く検出されなかったのに対し, Δnpr 培養液から生産性の向上, 安定化をもたらす重要な要因となる. まは約 1000 µM の H2O2 が検出された結果から, H2 O2 のた, 遺伝子組換え技術の発達により, 一部の乳酸菌で消費は全て Npr に依存している可能性が示唆された. こは異種遺伝子を導入・発現させることが比較的容易になの蓄積した H2O2 が Δnpr の生育を阻害していると考え,ってきており, 組換え乳酸菌を用いた機能製剤への利好気条件下での培養液にカタラーゼを添加したところ,用など医療分野への応用研究も開始されている. 本研

カタラーゼの濃度依存的に生育が回復した, このことか

究で使用する Lactobacillus casei IGM394 は好気環境

ら, Δnpr は酸素消費 に伴って発生する H2O2 を分解で下で非常に良好な生育を示す乳酸菌であり, 腫瘍抑制

きず, その蓄積した H2O2 により菌体がダメージを受ける効果を示すなどの高い免疫賦活能力を持つ菌株である.

ため, 生育能が低下したことが示唆された.

今後の応用研究を行う上で, 本菌株の酸化ストレス耐性

次に, 各変異株の H2O2 耐性能を評価した. H2O2 を添メカニズムを明らかにすることは重要である. このような加した培地で培養を行い, 24 時間後の菌体 濁度を測背景から, 乳酸菌 Lactobacillus casei IGM394 の酸化ス定した. その結果, Δnpr はやはり野生株よりも耐性能がトレス耐性メカニズムの解明を目的とし，抗酸化因子の低 下 し て い た い が , 転 写 制 御 因 子 で あ る organic

遺伝子欠損株の作出, ストレス耐性の評価を行った.

hydroperoxide transcriptional regulator 遺伝子を欠損させた ΔohrR は野生株よりも高い耐性能を示した. この高

Ⅱ. 材料と方法

い耐性能と H2O2 消費能に相関があるかを検討するた

二重交叉法により L. casei IGM394 の NADH oxidase

めに, 野生株, Δnpr, ΔohrR の H2O2 消費能を測定した.

などの様々な酸化ストレス耐性関連遺伝子の欠損を行

その結果, ΔohrR は野生株よりも高い消費能を示し, こい, 変異株を作出した. 得られた変異株に対して, 静置の高い H2O2 消費能が H2O2 存在下での生育能の高および好気培養での生育能評価や, 過酸化水素耐性さに寄与していることが示唆された. 以上のことから, L.

の検討を行った.

casei IGM394 にとって H2O2 消費は必須な過程であり,かつ他の遺伝子で相補できないことが明らかになった.

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Functional analysis of oxidative stress tolerance mechanisms in
Lactobacillus casei IGM394
SHINGO NARAKI*, AKINOBU KAJIKAWA*, YASUKO SASAKI** andSHIZUNOBU IGIMI* **Department of Agricultural Chemistry, Faculty of Applied Biosciences, Tokyo university of Agriculture, Tokyo**

Department of Agricultural Chemistry, Faculty of Agriculture, Meiji university, Kawasaki
The facultative anaerobic bacterium Lactobacillus casei IGM394 is used as a host for drug delivery systems,

and it exhibits the same growth rate under aerobic and anaerobic conditions. L. casei strains carry several genes thatfacilitate oxygen and reactive oxygen species (ROS) tolerance in their genomes, but their complete functions havenot been uncovered. To clarify the oxygen and ROS tolerance mechanisms of L. casei IGM394, we constructed many
deficient mutants targeting genes that confer oxidative stress resistance. Significantly decreased growth and high
H2O2 accumulation were observed in the NADH peroxidase gene-mutated strain (Δnpr) compared with the findingsin the wild type. The H2O2 degradation capacity of Δnpr revealed that NADH peroxidase is a major H2O2-degrading
enzyme in L. casei IGM394. Interestingly, ΔohrR, a mutant deficient in the organic hydroperoxide regulator,
exhibited higher H2O2 resistance than the wild-type strain. Increased Npr expression and H2O2 degradation ability
were observed in ΔohrR, further supporting the importance of Ohr protein to ROS tolerance mechanisms. The othermutants did not exhibit altered growth rates, although some mutants had higher growth in the presence of oxygen.
From these results, it is presumed that L. casei IGM394 has multiple oxygen tolerance mechanisms and that the lossof a single gene does not alter the growth rate because of the presence of complementary mechanisms. Contrarily,
the H2O2 tolerance mechanism is solely dependent on NADH peroxidase in L. casei IGM394.

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

食品中でのClostridium perfringensの芽胞挙動及び増殖挙動の評価
伊藤 正弥*

梶川 揚申**

五十君 靜信**(*東京農業大学大学院農学研究科, **東京農業大学応用生物科学部農芸化学科)

Ⅰ.

はじめに

Ⅲ.

結果と考察

Clostridium perfringensは偏性嫌気性の食中毒菌で一般的に用いられている芽胞形成条件により得られあり，この細菌は高温や紫外線などの様々なストレスにた芽胞の耐熱性は低く80℃以降の生育が確認できな耐性のある芽胞という構造を取ることで過酷な環境下かったため耐熱性芽胞の形成はされなかった. 経日的においても生存が可能である. この細菌を原因としたに温度ストレスを与える条件により得られた芽胞は加熱

食中毒は主にカレーやシチューといった深鍋により調処理前と比較して菌数は減少したが100℃においても理される大量調理食品内で起こるため，食中毒件数は生育が確認された.そのため経日的に温度ストレスを与少ないが1件当たりの患者数が非常に多い. そのためえることにより耐熱性芽胞の形成に成功した. シチュー

食中毒原因の細菌部門では毎年1位から3位に位置し添加実験においては添加1時間後に菌数が減少した.

ており，この食中毒への対策が重要視されている.食品

その後，菌数の減少は見られず，食品内の温度が増を加熱した際にこの菌は一般的な細菌とは異なり耐熱殖可能域に入ると菌数は増加した. 78℃に固定した増性の芽胞を形成することで生存し，発芽を経て食品内殖挙動試験では加熱処理後2時間は菌数が減少したの 温 度 が 下 が る と と も に 増 殖 す る . し か し ， C.

が，その後菌数の変化はなかった. したがって芽胞液

perfringensは他の芽胞形成菌のように芽胞の形成が容に易熱性芽胞と耐熱性芽胞が混在しているためシチュ

易ではなく，特定の培養条件を用いて形成した芽胞のー内の温度により易熱性芽胞が死滅し，菌数が減少し多くは熱に弱い易熱性の芽胞である. 易熱性芽胞はていると示唆された.

100℃数分で死滅してしまうため，C. perfringens芽胞を評価するためには耐熱性芽胞の形成が必須であり，過去の研究では耐熱性芽胞を用いての議論がされていない.したがって本研究では，実際に食中毒の原因となっている耐熱性芽胞の作成を試み，得られた耐熱性芽胞を用いて食品に添加後，食品内の温度変化による芽胞の挙動及び増殖挙動を評価することを目的とした.
Ⅱ.

材料と方法

一般的に用いられている芽胞形成条件及び温度スト
レスを経日的に与える方法により得られた菌体培養液
をグラム染色し，芽胞形成を確認した. その後，調製した菌体培養液を様々な温度に30分間供し，CFU により生菌数を測定し耐熱性評価とした. 耐熱性芽胞の形
成後，80℃のシチューにヒートショックを行った芽胞液を加え温度調節を行い1時間ごとに生菌数を測定した.
また，菌数減少の原因を調べるためシチュー内の温度を78℃に固定し1時間ごとに生菌数を測定した.

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Evaluation of spore behavior and proliferation of Clostridium perfringens in food
MASAYA ITO*, AKINOBU KAJIKAWA** and SIZUNOBU IGIMI***Department of Agricultural Chemistry, Graduate school of Tokyo University Agriculture, Tokyo**Department of Agriculture, Tokyo University of Agriculture, Tokyo
Clostridium perfringens is an obligately anaerobic food poisoning bacterium, which can survive in harshenvironments by forming spore resistant to various stresses such as high temperature. Food poisoning caused by C.
perfringens occurs mainly in large-scale cooked foods. So, the number of food poisoning cases is small, but the numberof patients per case is very large. Therefore, countermeasures against this food poisoning are regarded as important.
However, C. perfringens is not easy to form heat-resistance spores in laboratory. Therefore, in this study, heat-resistantspores were formed. After preparation, it is added to food and evaluated. The spore formation was confirmed by Gramstaining the cell culture obtained by the general spore formation conditions and the method of applying temperaturestress over time. Then, the prepared cell culture solution was subjected to various temperatures for 30 minutes, and theviable cell count was measured by CFU to evaluate the heat resistance. Then, heat-shocked spore solution was added toa stew to control the temperature and fixed, and the viable cell count was measured every hour. Heat-resistance spores
were formed only by the method of applying temperature stress. In the stew addition experiment, the number of bacteria
decreased after 1 hour. After that, the number of bacteria didn’t decrease, and the number of bacteria increased when
the temperature in the food entered the proliferative range. It was suggested that since the spores contains heat-resistantspores and heat-sensitive spores, the heat-sensitive spores are killed by the temperature in the stew.

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

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シロイヌナズナにおけるアルミニウムストレス下での根系構造のナチュラルバリエーション解析
多井 紫織 小山 博之 小林 佑理子（岐阜大学応用生物科学部生産環境科学課程植物細胞工学研究室）
要 旨：植物の土壌ストレス環境への適応機構の一つとして根系構造が注目されている. 本研究では Alストレス下でのシロイヌナズナの根系構造のナチュラルバリエーション解析を行い, アルミニウム(Al) 耐性機構の解明を目的とした.
主根長および側根形成関連形質の７形質で根系構造を評価した. その結果, Al ストレスに応答する根系構造には幅広い
ナチュラルバリエーションが存在することが明らかとなった. そこでは, Al 耐性系統の示す根系構造応答は感受性系統の示す応答よりも多様であることが示唆された. さらに, GWAS により検出された複数の側根形成関連遺伝子座と主根伸長関連遺伝子座はそれぞれ異なっていたことから, それらの形質は別の機構によって制御されていることが推察された.

キーワード：根系構造, 酸性土壌, アルミニウム耐性, ナチュラルバリエーション, GWAS

Ⅰ. はじめに

Ⅱ.材料と方法

植物の生存のためには生育環境への適応が不可欠

ゲノムワイドな一塩基多型（SNPs：single nucleotideである. 世界の耕作地に広く分布する酸性土壌は作

polymorphisms）が整備されているシロイヌナズナ野

物の生育を阻害する不良土壌であり, 酸性土壌にお生系統 86 株および, Al 耐性遺伝子機能欠損株（KO：ける作物の生産性向上は世界的な育種課題である.

knock out）9 系統（almt1, stop1, als3, mate, trx1, trm28,

また, 近年では植物の土壌ストレス環境への適応機

nrt1.1, gs1;2.1;3, gdh1gdh2 ）を用いた. 無菌寒天栄養構のひとつとしてストレスに応答する根系構造の形

培地に各系統約 30 粒を播種し, 培地シャーレを立て成が注目されている. 従来の研究より, 酸性土壌の主かけて無菌的に栽培した. 4 日間の初期栽培後, 系統

要ストレスであるアルミニウム（Al）に対する作物の毎に生育の揃った 5 個体を無菌寒天栄養培地±AlCl3

感受性品種では, 主根長が阻害される一方, 耐性品種

900 µM に移植し, 12 日間栽培した. 2 日毎に植物体のは様々な Al 応答性の根系構造を示すことが明らかと写真を撮影し, 十分なバリエーションが確認できたなっている 1, 2. これまでの Al 耐性機構は主根長評価

移植後 8 日の植物について根系構造を評価した. EZ-によって明らかにされてきた部分が多く, Al 応答性根

Rhizo を用いた画像解析により主根長, 側根数, 総側系構造とその分子制御機構の知見は乏しい. そこで根長を獲得し, さらにそれら値から平均側根長, 総側

本研究では, Al ストレス下で根系構造が関与する新規

根長割合, 側根密度, 総根長を算出した. これらの７Al 耐性機構の解明を目的とし, モデル植物であるシ

つの形質値を用いて, R による階層的クラスタリング

ロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いて Al スト

および GWAS を実施した.

レス下での根系構造のナチュラルバリエーション解析および, ゲノムワイド関連解析（GWAS：genomewide association study）を行った.

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Ⅲ. 結果と考察
野生株 86 系統の Al ストレス下における 7 つの形

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Ⅳ. 結論
栄養欠乏等の土壌ストレスと同様に Al ストレス下質値を用いて, 根系構造をクラスタ解析により分類においても根系構造形成が耐性に関与することが考した. その結果, 野生系統は主根が短く側根の生育もえられた. Al ストレス応答性根系構造のナチュラルバ

小さい群（クラスタ 1 と 3）, 短い側根と長い主根をリエーションが存在したことから GWAS を行った.

示す群（クラスタ 4）, 短い主根と長い側根を示す群

その結果, 主根伸長と側根形成は異なる遺伝子座で（クラスタ 6）, 全ての生育量が多い群（クラスタ 7）

制御されており, 根系構造形成には複数の遺伝子座など, 7 つのクラスタに分類された. このように Al スが関与しており, 複雑に制御されていることが示唆

トレス下での根系構造には, 幅広いナチュラルバリ

された.

エーションが存在することが明らかとなった.
次に, 野生株 86 系統と従来の初期主根長評価で Al
感受性を示した KO 9 系統について, 7 つの形質の相対値でクラスタ解析を行った. その結果, 供試系統は10 のクラスタに分類された. クラスタ 9, 10 に分類された系統は主根長が短く, そこには全ての Al 感受性
KO も分類された. よって, 同グループ野生系統もまた感受性であること, そしてその根系構造形成には
それら Al 耐性関連遺伝子が関連することが示唆された. 一方, 従来の初期主根長評価によって耐性とされた野生系統群は複数の異なるクラスタに分類された.
このことから, 耐性系統の Al 応答性根系構造形成は感受性系統のそれよりも遺伝的に多様であり, 複数の新規 Al 耐性遺伝子によって制御されることが示唆された.
また, GWAS により各形質に関連する複数の遺伝電子座が推定された．4 つの主根伸長関連 SNPs は特異的であったが, 側根形質関連 SNPs の多くは複数の側根形質間で重複していた. 従って, 主根伸長と側根形成は異なる遺伝子座により制御されていることが強く示唆された.

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Natural variation of root system architecture under aluminum stress in
Arabidopsis thaliana
SHIORI TAI, HIROYUKI KOYAMA and YURIKO KOBAYASHI

Gifu University, Faculty of Applied Biological Science, Agriculture and Environmental Science, Laboratory of Plant Cell
Technology, Gifu

Aluminum of a major stress in acid soil inhibits root growth. Root system architecture (RSA) is thought to be associatedwith Al tolerance. In this study, we conducted natural variation analysis and genome-wide association study (GWAS) for
RSA formation under Al stress in Arabidopsis thaliana. We used 86 Arabidopsis accessions with genome-wide single
nucleotide polymorphisms (SNPs) and 9 knock-out (KO) lines of Al tolerant genes. Healthy five individuals of 4-d-old
seedlings of each line were transplanted to a sterile agar medium with and without AlCl3. After 8 days, the RSA was evaluatedby image analysis using EZ-Rhizo, in which seven traits of taproot length, number of lateral roots, total lateral root length,
average lateral root length, total lateral root length ratio, lateral root density and total root length were obtained. Hierarchicalclustering and GWAS for these traits were performed by R. The cluster analysis revealed that there are wide range of naturalvariations in the RSA under Al stress. We found that short taproot groups included the previous Al-sensitive KO lines andvarious high-growth groups included previous Al-tolerant accessions. These results suggested that multiple Al tolerance genes
other than the known Al tolerance genes may contribute to form the RSA responding to Al. In addition, GWAS detected many
significant SNPs associated with the seven traits. The four SNPs associated with the taproot length were distinct from that of
the lateral root traits. On the other hand, most of the SNPs associated with lateral root traits overlapped each other.

References
1. FAMOSO, AN., CLARK, RT., SHAFF, JE., CRAFT, E., MCCOUCH, SR., KOCHIAN, LV. : Development of a novel
aluminum tolerance phenotyping platform used for comparisons of cereal aluminum tolerance and investigations into rice
aluminum tolerance mechanisms. Plant Physiol. 153, 1678–1691, 2010.
2. BUSHAMUKA, VN., A4 - ZOBEL, RICHARD, W., VNA-B.: Maize and Soybean Tap, Basal, and Lateral Root Responses
to a Stratified Acid, Aluminum-Toxic Soil. Crop Sci. v. 38, no. 2 , 416-421, 1998.

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Vol. 51 No.2, 2021

フルオロキノロン系抗菌薬投与による Campylobacter jejuni の
薬剤耐性誘導
市川

拓磨

平山 和宏

（東京大学農学部獣医公衆衛生学教室）

Ⅰ. 目的・背景現在，薬剤耐性菌の蔓延が公衆衛生上問題となって見られたコロニーをカウントした．

おり，対策が必要とされている．こうした薬剤耐性菌の発生の原因の背景に，畜産現場での抗菌薬の使用がⅢ. 結果挙げられる．食中毒菌として知られるCampylobacter

抗菌薬投与前では，どの群もいずれのフルオロキノ

jejuni においても養鶏場等でのフルオロキノロン系抗ロン添加培地にも発育が見られなかった．C群，L群で菌薬耐性菌が報告されており，中には医療用フルオロ

は，実験期間を通して，抗菌薬無添加の培地上でのみ

キノロンとの交差耐性が見られるケースもある．このコロニーが発育し，フルオロキノロン添加培地では発ような耐性菌制御のためには，家畜体内での耐性菌の育が見られなかった．一方，H群では，オフロキサシ

動向を知る必要があるが，生体内でフルオロキノロン

ン投与2日目の糞便中の菌数が大幅に減少し，どの培耐性を誘導した報告は非常に少ない．そこで本実験で地上でも発育が見られなかった．しかし，5日目では無は，無菌マウスにC. jejuniを定着させた後フルオロキノ

添加培地およびオフロキサシン添加培地で発育が見

ロン系抗菌薬であるオフロキサシンを投与し，薬剤耐

られ，9日目にはシプロフロキサシン添加培地でも発性を誘導できるか試験した．

育が見られるようになった．

Ⅱ. 方法

Ⅳ.考察/ 結論

24 週齢の雌無菌マウス9 頭を実験に用いた．定着

今回L群とC群では，耐性菌が出現しなかったことかさせる菌株としてC. jejuni JCM2013株を，投与抗菌薬

ら，耐性菌誘導には一定濃度以上の抗菌薬による選択としてオフロキサシンを用いた．マウスは，投与抗菌圧が必要なことがうかがえた．一方，H群では，抗菌薬の濃度によりControl（C），Low dose（L），High dose

薬投与により菌数が大幅に減少したが，耐性を持った（H）の3群に分けた．全群にC. jejuni を経口投与し，菌が生き残ったことで，マウス腸内に耐性菌が定着し定着確認後，オフロキサシンを5日間飲水投与した．投たと推測される．また，オフロキサシンを投与した結与濃度は，L群で5mg/L，H群で50mg/L とした．実験期

果，別のフルオロキノロンのシプロフロキサシンに交間中，抗菌薬投与から2, 5, 7, 10, 12日でマウスの糞便差耐性を持つことが確認された．これは，畜産現場でをサンプリングした．サンプルを段階希釈したものをのフルオロキノロン系抗菌薬使用の結果，医療用フル

３種類のMH培地（5%馬脱線血，5%馬脱線血＋8mg/L

オロキノロンに対する交差耐性が獲得されることをオフロキサシン，5%馬脱血+４mg/L シプロフロキサ

実験的に再現していると考えられる．

シン）に接種し，42℃微好気環境で培養して培地上で

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Administration of fluoroquinolones induces resistant Campylobacter jejuni in mice
TAKUMA ICHIKAWA and KAZUHIRO HIRAYAMALaboratory of Veterinary Public Health, Faculty of Agriculture, The University of Tokyo, Tokyo
Antibiotic resistance (AMR) is a serious public health problem worldwide and one of the causes for emergence of AMR is
uncontrolled usage of antibiotics on livestock. However, information on how
bacteria gain resistance against antibiotics in vivo is limited. In this study, we administered ofloxacin,a registered fluoroquinolone for chickens, to gnotobiotic mice colonized with Campylobacter jejuni and monitored theemergence of AMR.
We divided germfree mice into three groups, Control (C), Low dose (L) and High dose (H).
Mice were monoassociated with C. jejuni JCM2013 and administered ofloxacin in drinking water for 5 days. Doses ofofloxacin were 5 mg/L in group L and 50 mg/L in group H. We collected fecal samples at 2, 5, 7, 9 and 12 days after the firstday of ofloxacin administration.
Samples were serially diluted and inoculated on MH agar containing 5 % defibrinated horse blood without antibiotics, with 8
mg/L ofloxacin or with 4 mg/L ciprofloxacin. The media were incubated for 48 h under microaerobic conditions at 42 ℃.
In group L and C, colonies were only observed on antibiotic-free plates. In group H, the population of C. jejuni wassignificantly decreased right after antibiotic treatment, but colonies were formed on both ofloxacin and ciprofloxacin agar 5days of ofloxacin administration and thereafter.
The present study suggested that the administration of ofloxacin induces resistant C. jejuni against not only to the antibiotics
administered but also other fluoroquinolones.

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発酵米糠による DSS 誘発腸炎の腸管外合併症の改善効果
Jahidul Islam

Afifah Zahra Agista

大崎 雄介

駒井 三千夫

白川 仁(東北大学大学院農学研究科栄養学分野)
Ⅰ.目的
米糠は精米時の副産物であるが，必須アミノ酸，

伝子のmRNA発現量を定量RT-PCR法で解析しビタミン，食物繊維，γ-オリザノール，イノシトー

た．

ルなどを豊富に含み，健康機能性が高いことが知られている．しかし，精米後，短時間で劣化するこⅢ. 結果と，特有の匂いがあることなどから，十分に活用

飼育期間を通じて，FRB群のDAI値は他二群に比されていない．我々は米糠の高度利用を目的とし

べ低値を示した．また，血清IL-6，TNF-αはFRB群て，麹カビと乳酸菌による2段階の発酵により，フで有意な低下が観察された．さらに，大腸，小腸，

レーバーや健康機能性を向上させた発酵米糠

肝臓，筋肉，海馬における炎症性サイトカイン（FRB）を開発した．これまで，FRB は生活習慣

mRNA量はFRB群において有意に低下した．これ

病モデル動物における血圧上昇抑制やインスリンらの結果より，FRBは腸炎の抑制とともに，EIMの

1

抵抗性の改善作用 ，サルコペニアモデルにおいて，筋萎縮の抑制作用2 を示すことを報告してきた．
さらに，デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発大腸炎モデルマウスにおいて，FRBの給餌により，腸炎の発症抑制効果が観察された3．炎症性腸疾患
では，腸炎のほかに，肝障害，サルコペニア，神経炎症など腸管外合併症（EIM）が高頻度で見られる．
本研究では，DSS誘発大腸炎のEIMに対するFRB給餌の影響を解析した．
Ⅱ. 方法
C57BL/6Nマウス（10－12週齢，雌）にコントロー
ル食（Con），10%未発酵米糠食（RB），10%発酵
米糠食（FRB）を7日間給餌した後，1.5% DSS溶液
を飲水として4日間与えて大腸炎を誘発し，その後，12日間，精製水を与えて，炎症を回復させた．この炎症誘発－回復のサイクルを計4回繰り返し，64日間飼育した．飼育期間中，体重，DAI（disease activity
index;下痢と血便で評価）を測定した．飼育終了後，血清を採取し，炎症性サイトカインをELISA法で測定した．また，各臓器を採取し，炎症性関連遺発症を抑制する活性をもつ可能性が示唆された．

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Fermented rice bran supplementation mitigates chronic colitis-associatedextraintestinal manifestations in mice
JAHIDUL ISLAM, AFIFAH ZAHRA AGISTA, YUSUKE OHSAKI, MICHIO KOMAI andHITOSHI SHIRAKAWA
Laboratory of Nutrition, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai
Patients with inflammatory bowel disease (IBD) have higher incidence of extraintestinal manifestations (EIM) likeliver disorders, sarcopenia, and neuroinflammation. Fermented rice bran (FRB), generated from rice bran (RB), isrich in bioactive compounds and exhibits anticolitis activity. However, its role in EIM prevention is still unclear.
Here, for the first time, we investigated whether EIM in female C57Bl/6N mice is attenuated by FRB supplementation.
EIM was induced by repeated administration of 1.5% dextran sulfate sodium (DSS) in drinking water (4 d) followedby drinking water (12 d). Mice were divided into 3 groups-control (AIN93M), 10% RB, and 10% FRB. FRB
ameliorated relapsing colitis andinflammation on muscle by significantly lowering proinflammatory cytokines Tnfα and Il-6 in serum and advanced glycation end product-specific receptor (Ager) in serum and muscle when comparedwith the RB and control groups. As FRB reduced aspartate aminotransferase levels and oxidative stress, it might
prevent liver disorders. FRB downregulated proinflammatory cytokine and chemokine transcripts in hippocampus
responsible for neuroinflammation and upregulated mRNA expression of G protein coupled receptors (GPRs), Gpr41
and Gpr43, in small and large intestines, which may explain the FRB mediated protective mechanism. Hence, FRB
can be supplemented to prevent IBD-associated EIM.
References
1. ALAUDDIN, M., SHIRAKAWA , H., KOSEKI, T., KIJIMA, N., ARDIANSYAH,A., BUDIJANTO, S., ISLAM,J., GOTO, T. & KOMAI, M. ; BMC Complement. Altern. Med., 16, 442. 2016.
2. RUSBANA,T.B., AGISTA,A.Z., SAPUTRA,W.D., OHSAKI,Y., WATANABE, K., ARDIANSYAH,A.,
BUDIJANTO,S., KOSEKI,T., ASO,H., KOMAI,M. & SHIRAKAWA,H. : Nutrients, 12, 2409. 2020.
3. ISLAM,J., KOSEKI,T., WATANABE, K., ARDIANSYAH,A., BUDIYANTO,S., OIKAWA,A., ALAUDDIN,
M., GOTO, T., ASO,H., KOMAI,M. & SHIRAKAWA,H. : Nutrients, 9, 747. 2017.

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Vol. 51 No.2, 2021

ヒト腸内細菌によるフコイダン分解メカニズムの解明
鈴木 錠

大坪 和香子（東北大学農学研究科動物資源化学分野）
I．目的【菌叢解析】

オキナワモズクを構成する硫酸化多糖オキナワ

糞便から抽出した DNA の 16S rRNA 遺伝子の V3-

モズクフコイダンは，有益性が報告されているヒV4 領域の次世代シーケンス解析は，株式会社生物

ト腸内細菌の増殖促進効果（プレバイオティクス

技研の委託により実施した．

効果）が期待されるが（昨年度本学会において有川らが報告），その分解機作は不明である．本研

III．結果および考察

究では集積培養液から単離した Bacteroides 属細菌

オキナワモズクフコイダンを唯一の炭素源としを用いて，オキナワモズクフコイダンの資化・増て添加したヒト腸内細菌の集積培養液を BBE 寒殖特性およびオキナワモズク摂取後の糞便中の増天培地に接種したところ，Bacteroides ovatus を含殖について検証を行った．

む Bacteroides 細菌株が複数単離された．
このうち，
B. ovatus D2 株の資化試験では，オキナワモズクフ

II．材料と方法

コイダンをはじめ，複数種の単糖，オリゴ糖，糖ア【材料・培地】

ルコール，多糖の資化性を有することが知られた．

本研究で使用したヒト糞便は，「東北大学大学院

さらに，オキナワモズクフコイダンを唯一の炭素

農学研究科ヒトを対象とする研究に関する倫理委源として与えた D2 株の培養上清中フコイダンが員会」の承認を受けて採取，使用した．オキナワモ

半分程度資化されたことが TLC の結果から示唆さズクフコイダン粉末は株式会社サウスプロダクトれた．しかし，本研究で調査した Bacteroides 属菌のご厚意により提供を受けた．Bacteroides 属細菌

株のオキナワモズクフコイダンの資化増殖性は，の単離・培養には市販 BBE 培地，GAM 培地およ他の糖と比較すると微少であったため，腸管内にび Bacteroides 属細菌用半合成培地（Martens, 2005）

おいて当該細菌が単独でオキナワモズクフコイダを使用した．

ンを資化している可能性は低いと考えられた．一【資化試験】

方，オキナワモズク摂取前後の糞便中の細菌叢解

Bacteroides 属細菌株の増殖は，嫌気・37 ºC にお析では，Bacteroides 属の存在比が 2 倍以上に増えける 660 nm の吸光度の増加により評価した．フコていたことから，我々の in vitro 実験において見出

イダンの資化性は，薄層クロマトグラフィー（TLC） されたオキナワモズクフコイダンによる本属細菌
により，既知濃度のフコイダン溶液および培養液の増殖効果を支持する結果となった．以上の結果

上清を 3 時間展開後，発色試薬を噴霧し，150 ℃でから，ヒト腸管内におけるオキナワモズクフコイ

3 分間加熱後に出現した各スポットについて，ダンの資化には，Bacteroides 属細菌が関与していImage J により発色強度を測定し，検量線からフコると考えられる．

イダン濃度（％）を求めた．

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無菌生物

J. germfree life gnotobiol.

Elucidation of fucoidan degradation mechanism by human intestinal bacteria
JO SUZUKI and WAKAKO IKEDA-OHTSUBO
Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai
Fucoidan, indigestible polysaccharides derived from brown seaweeds, has been known for its modulatory functionof intestinal microbiota. This study aims to clarify the mechanism how human intestinal microbiota degrad fucoidan
extracted from Japanese seaweed Okinawa mozuku (OM fucoidan), which has previously shown to enhance thegrowth of potentially beneficial human gut bacteria in enrichment batch cultures (Arikawa et al, 53th JAGG, 2020).
These bacteria included Lachnobacteriaceae and multiple species of the genus Bacteroides. Here, we isolated
Bacteroides ovatus strain D2 and additional strains of Bacteroides species from an enrichment culture of human fecal
bacteria supplemented with OM fucoidan. We investigated growth properties of the strain D2 and found that thestrain can utilize a wide range of sugars including OM fucoidan. While the maximum OD660 of the culture of strain
D2 grown on OM fucoidan was much lower than that of those grown on mono- and oligosaccharides, thin-layer
chromatography of the culture supernatants showed that the strain utilized approximately ~50% OM fucoidan in themedium. 16S rRNA gene (V3-V4 region) Illumina MiSeq sequencing of fecal samples from an individual, who
temporality consumed Okinawa mozuku as a daily side dish, have shown that ingestion of OM fucoidan increases
the proportion of bacterial species of the genus Bacteroides in fecal microbiota by a factor of two. Our current findings
collectively support that Bacteroides species are involved in the degradation OM fucoidan degradation in humanintestinal tracts.

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Vol. 51 No.2, 2021

ケルセチン代謝菌‟Bacterium 19-20”のヒトフローラマウスに
及ぼす影響
田村 基*

平山 和宏**(*農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部門,**

東京大学大学院農学生命科学研究科)

Ⅰ. 目的

Ⅲ. 結果

ケルセチンは，主要なフラボノイドの一つであり，そ

盲腸内容物のケルセチンとケルセチン代謝物イソラムの健康促進効果が注目されている．腸内細菌は，ケル

ネチン濃度は，ケルセチン代謝菌投与群（QHF）で低い

セチンの代謝に重要な役割を果たしており，例えばケ傾向が観察された．肝臓の脂質含有量は，QHF 群が CHF

ルセチンは，Flavonifractor plautii などの腸内細菌によ群よりも有意に低値を示した(P<0.05)．内臓脂肪重量は，って分解される．ヒト糞便から分離したケルセチン代

QHF 群で有意に低値を示した(P<0.05)．QHF 群では，盲謝菌“Bacterium19-20”は，F. plautii とホモロジーの高い

腸内容物の酪酸とプロピオン酸濃度が有意に高値を示

腸内細菌である．Bacterium 19-20 の投与が，無菌マウした．

スにヒトの腸内菌叢を移植したヒトフローラマウスに及ぼす影響を検討した．

Ⅳ. 考察
ケルセチン代謝菌は，盲腸内容物のケルセチン濃度をⅡ. 方法低下させたことから，消化管内でケルセチンを分解しヒトフローラマウスに 0.05%ケルセチン添加ペレッている可能性が示唆された．一方，QHF 群は，対照群

ト食を 4 週間給餌した．ケルセチン代謝菌投与（QHF）

にて，肝脂質含有量が低く，内臓脂肪重量も有意に低群のマウスには，変法 GAM 平板培地で 37℃，2 日間値を示したことから，ケルセチン代謝菌は宿主の脂質嫌気培養した”Bacterium 19-20”を Nutrient broth No. 2

代謝に影響を与えていることが示唆された．また，QHFに懸濁した菌液(約 2.2×107 CFU)を月，水，金の週に 3群は，対照群に比べて盲腸内容物の酪酸やプロピオン

回，合計 11 回経口投与した．対照（CHF）群のマウス

酸濃度が有意に高かったが，今回試験に用いたケルセには，菌を含まない Nutrient broth No. 2 を経口投与しチン代謝菌は，酪酸産生能を持っていたため，ヒトフ

た．飼育試験終了後解剖を行い，ケルセチン分析を行

ローラマウスの腸内で酪酸産生を増加させたのかもしうとともに，血漿脂質の測定，肝脂質含有量測定，小れない．ケルセチン代謝菌はヒトフローラマウス腸内

腸・大腸の遺伝子発現解析，内臓脂肪重量測定，盲腸でケルセチンを代謝し，ケルセチン量を低下させると内容物の短鎖脂肪酸測定等を行った．

ともに，脂質代謝にも影響を及ぼしている可能性が考えられた．

(会員外共同研究者:農研機構食品研究部門; 中川博之，堀幸子，猪瀬篤子)

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Effects of quercetin-metabolizing bacterium “Bacterium 19-20” on humanmicrobiotaassociated mice
MOTOI TAMURA* and KAZUHIRO HIRAYAMA***Food Research Institute, The National Agriculture and Food Research Organization, Tsukuba** Laboratory of Veterinary Public Health, Graduate School of Agricultural and Life Sciences,
The University of Tokyo, Tokyo
Much attention has been focused on health promoting effects of quercetin. We examined the effect of administration ofquercetin-metabolizing bacteria (Bacterium 19-20) on humanmicrobiota-associated mice.

Human microbiota-associated mice were fed a pelleted diet with 0.05% quercetin for 4 weeks. Mice in the quercetinmetabolizing bacteria (QHF) group were orally administered about 2.2×107 CFU of quercetin-metabolizing Bacterium 1920 in a Nutrient broth No. 2 three times a week. Mice in the control (CHF) group were orally administered a Nutrient broth
No. 2 without bacteria. We measured plasma and cecal quercetin, plasma lipids, liver lipid content, gene expression levelsof the small and large intestine, visceral fat weight, and short-chain fatty acid concentration of the cecal contents.
Quercetin-metabolizing bacteria decreased the quercetin and its metabolite concentrations in the cecal contents, suggestingthat quercetin may be degraded in the gastrointestinal tract. In contrast, the quercetin-metabolizing bacteria significantly
increased the butyrate and propionate concentration in the cecal contents compared to control group. Because the quercetinmetabolizing bacterium used in this study are butyrate-producing bacterium, it may have increased butyrate production in
the intestines of human microbiota-associated mice. QHF group had significantly lower visceral fat weight and liver lipid
content than the CHF group. Quercetin-metabolizing bacteria may metabolize quercetin in the gut of human microbiotaassociated mice and may also affect lipid metabolism.
(Non-member collaborators: Hiroyuki Nakagawa, Sachiko Hori, Atsuko Inose. Food Research Institute, The National
Agriculture and Food Research Organization）

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J. germfree life gnotobiol.

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

CONTENTS
REVIEW
Plant root system architecture response to adapt various soil environments –adaptation to acid soil as a special interest case………………………………………............................................... 27
SCIENTIFIC PROCEEDINGS OF THE JAPANESE ASSOCIATION
Gut microbiota after gastrectomy in rat: the relationship between body weight loss and dysbiosis
Taisuke Takagi et al. ………………………………………………………………………………………………………......... 37
Generation of antibodies with different isotypes and their binding property between GALT from small and large
intestine Hiraku Okada et al. …………………………………………………………………………………........... 39
Exploration of factors that involve in growth behavior of Listeria monocytogenes in ripening natural cheese
Shujiro Kawamoto et al. ………………………………………………………………………………………………….......... 44
Functional analysis of oxidative stress tolerance mechanisms in Lactobacillus casei IGM394
Shingo Naraki et al. ………………………………………………………....……………………………………………………46
Evaluation of spore behavior and proliferation of Clostridium perfringens in food Masaya Ito et al. ....……………. 48
Natural variation of root system architecture under aluminum stress in Arabidopsis thaliana
Shiori Tai et al. .............................................................................................................................................................… 50
Administration of fluoroquinolones induces resistant Campylobacter jejuni in mice
Takuma Ichikawa et al. ................................................................................................................................................... 53
Fermented rice bran supplementation mitigates chronic colitis-associated extraintestinal manifestations in mice
Jahidul Islam et al. ……………………………………………………………………………………………………………..... 55
Elucidation of fucoidan degradation mechanism by human intestinal bacteria Jo Suzuki et al. ……………....………. 57

Effects of quercetin-metabolizing bacterium “Bacterium 19-20” on human microbiota-associatedmice Motoi Tamura et al. ………………………………………………………………………………......….. 59
GUIDELINE FOR AUTHORS
Guideline for authors ……………………………………………………………………………............................... 61