ISSN 2436-7362

Vol. 53
No. 2
2023
J. germfree life gnotobiol.

無菌生物Vol. 53, No. 2 Dec. 1 2023

編集委員会

立

神

谷

茂

白

川

仁

大

﨑
刷

子

刷

所

共

事

務

所

日本無菌生物ノートバイオロジー学会〒210-0821

印

敬

印

株

式

会

社

神奈川県川崎市川崎区殿町 3 -25-12

公 益 財団 法 人 実 験 動 物 中 央 研 究 所 内
小倉

智幸（おぐらTEL （044）201-8520

ともゆき）

内線1325

FAX （044）201-8521
発行所

杏林大学医学部感染症学講座
大㟢敬子（おおさきたかこ）

JOURNAL OF GERMFREE LIFE AND GNOTOBIOLOGY
Vol. 53, No. 2 Dec. 1 2023
Editorial and Publications Committee
SHIGERU KAMIYA MD PhD
HITOSHI SHIRAKAWA PhD
TAKAKO OSAKI PhD
Japanese Association of Germfree Life and Gnotobiology
c/o Tomoyuki Ogura
Central Institute for Experimental Animals
3-25-12 Tonomachi, Kawasaki-ku, Kawasaki, 210-0821 Japan
TEL +81-44-201-8520extension1325
FAX +81-44-201-8521
E-mail jagg@ciea.or.jp
Department of Infectious Diseases
Kyorin University School of Medicine
Dr Takako Osaki

総

説

23

クローン病における腸管線維化と腸内細菌の関連
今井

仁＊，＊＊

津川

仁＊＊＊

鈴木

秀和＊＊

西崎

泰弘＊

穂積

勝人＊＊＊

（＊東海大学医学部健康管理学，＊＊東海大学医学部消化器内科学，＊＊＊東海大学医学部生体防御学）
要

旨：炎症性腸疾患のうちクローン病は線維性の腸管狭窄を起こすことが知られている．近年，抗

TNF-α抗体を中心とした新規分子生物学的製剤の登場により，急性期での炎症のコントロールは比較的可能になってきた．しかし，そうした薬剤に反応しない線維化に至った腸管病変については，外科手術や内視鏡的な拡張術のみ行われているのが現状であり，再発の多さが課題となっている．最近，メタゲノム解析技術の進歩から疾患特異的な腸内細菌叢が注目されている中，クローン病に特徴的な腸内細菌として腸管粘膜上皮に接着し上皮細胞内に侵入する Adherent-invasive Escherichia coli（AIEC）という細菌が新たに発見された．この細菌の保菌者では術後の再狭窄が発生しやすいとの報告がなされ，今後の新たな治療
ターゲットとしても注目されている．この総説では，クローン病における AIEC と腸管線維化に関する知見と今後の展望について紹介する．
キーワード：炎症性腸疾患，クローン病，腸管狭窄，線維化，Adherent-invasive Escherichia coli（AIEC）

2 ．腸内細菌叢と腸管線維化

１ ．クローン病における腸管線維性狭窄
炎症性腸疾患（Inflammatory bowel disease； IBD）

近年，メタゲノム解析技術の著しい進歩により，腸は主に潰瘍性大腸炎（Ulcerative colitis； UC）とクロー

管内には多種多様で無数の細菌が定着し，直接，あるン病（Crohn’s disease； CD）を指す難病指定疾患であいはその代謝産物が免疫系を介して宿主の健康維持にる．どちらも明らかな病因は同定されておらず，環境寄与し，腸内細菌叢の変容（dysbiosis）が様々な疾患

要因，遺伝要因などが複雑に混在し発症に至るとされと関係していることが明らかになってきた．IBD におている．2010年以降，IBD に対して抗 TNF-α抗体を中いても腸内細菌叢の大きな変容が知られている 6 ．で心とする炎症性サイトカインを狙った生物学的製剤がは，IBD における dysbiosis は，腸管内炎症の原因であ新規に登場し，従来のステロイド療法ではコントール

るのか，結果であるのか．この疑問に対して，Kamada

できなかった急性期の病態も大幅に改善できるようにらは無菌マウスに IBD 患者の腸内細菌を定着させる手なった．しかし，CD は腸管の全層炎症を特徴とする法を確立し，同マウスの腸管では炎症を惹起する遺伝疾患で，腸管合併症の頻度も高い．中でも，小腸病変

子発現の亢進を見出し，さらに IL-10ノックアウト無菌を有する症例は，診断から10年の間に約50％程度が瘻

マウスに CD 患者の便を移植すると腸炎が悪化するこ孔や狭窄といった合併症を起こすことが知られておりとを報告している 7 ．このことから，dysbiosis が宿主

1，狭窄・瘻孔だけでなく，出血や膿瘍なども含め，全である患者の免疫能や病態に影響を与えている可能性

CD 患者のうち約半数が診断から10年以内に手術適応が示唆される．

2となっている ．しかし，術後の再狭窄のリスクは高3

く ，また狭窄部に対する内視鏡的拡張術は，本邦の4

データにおいても短期成績は良好だが ，長期成績では
5

CD の腸管線維性狭窄は，特に回腸末端に好発し，慢性炎症による組織損傷の修復に伴い発生するとされているが，慢性炎症を惹起・持続する要因の存在が示唆

再狭窄の頻度が約 2 - 3 年で50％となっている ．このされた．1998年，CD の腸管から，粘膜上皮に接着侵

ように，CD の腸管線維性狭窄は，薬物治療では改善入する能力を有する接着性侵入性大腸菌（Adherent-

しにくく，治療に難渋する病変としてとらえられておinvasive Escherichia coli； AIEC）の分離に成功した報り，新たな治療戦略が望まれている．

告が欧州よりあり 8 ，さらには線維性狭窄の好発部位である回腸末端から特に高頻度で検出されることが続け24

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

て報告された 9 ．この報告を受け，韓国10やブラジル 11

いことも示されている．さらに，AIEC が上皮細胞へなど世界各国でも分離されることが分かり，さらに，の接着侵入に使用する FimH と呼ばれる Type1線毛の12

小児の症例でも保菌の存在が明らかになった ．その保先端にある付着因子を標的とした FimH antagonist も菌率は，国々で程度の差はあるが，おおよそ20-40％前

注目されている18．ヒト CD 腸管生検組織を用いた ex後と推測される．一方で，CD の腸管線維性狭窄の発vivo の検討では，FimH antagonist が AIEC の接着侵症率が約40％で，かつ AIEC が分離同定されやすい回入の阻害能を有することが示され，現在，小化合物製

腸末端に好発する点を踏まえ，筆者らは，AIEC が腸剤として欧米で臨床試験が進められている19．近年，本管の慢性炎症を持続させ腸管線維化に寄与する可能性

邦でも注目されている IBD に対する糞便移植療法におを検討した．その結果，AIEC を感染させたマウスにいても，腸内細菌叢へのドラスティックな変化を考慮

軽微な慢性炎症を付加すると腸管線維化が明確に増悪

すれば，線維化を誘導する AIEC を減少させる可能性

13

することが示された ．そして，この現象は AIEC の表もあり，検討の余地がある．

面抗原のうち flagellin を介し，他の臓器の線維化との筆 者 ら も，AIEC の 長 期 感 染 マ ウ ス モ デ ル に て，相関が示されている IL-33/ST2 signal に依存すること

AIEC に対する特異的な IgA 抗体が誘導されること，

13も示された ．さらに，血清中の flagellin 抗体（anti-

この抗体は非病原性大腸菌と AIEC を識別し，かつ，

CBir1 flagellin）が健常人や UC に比して CD 患者で上AIEC の粘膜上皮細胞への接着侵入を阻害することを14昇しており ，特に合併症のある CD において著明に上報告している20．現在この抗体のモノクローナル抗体を昇することが報告されている15．一方で，実臨床での作出し，保菌者の診断・抗 AIEC 治療へと臨床応用に

AIEC 保菌者のエビデンスは乏しく，わずかに入院率つなげていきたいと考えている．

10が高い傾向にあるという程度であったが ，2023年になり興味深い報告がなされた．CD の腸管狭窄の手術検

3 ．結語

体で AIEC 保菌の有無を調べ， 6 か月後の術後再狭窄

現在，CD に対する治療薬が分子標的薬を中心に次々の頻度を内視鏡で調べたコホート研究の結果，AIECと開発されており，ますます急性期の治療成績は向上

保菌者の方が術後再狭窄のリスクが高いことが示されしていくと考える．一方で，先述の通り現状では腸管

16た ．この報告により，AIEC の存在が CD の病態に明線維性狭窄に対する治療成績はまだ改善の余地が多い．

確に影響すること，中でも，腸管線維化に関与するこCD 患者の QOL を考慮すれば，今後は，CD の治療方とが強く示唆された．これらの知見は，「肝硬変におけ針はいかに活動期を抑え込むかに注視するのみならず，る肝炎ウイルス」のように，臓器線維化における原因（の線維性狭窄を予測し，早く診断して治療を行い，真の1 つ）が同定されたとも考えられ，今後の治療展開に

mucosal healing を達成することを加味したものにしておいて大きな進歩となるかもしれない．IL-33 signal 阻

いかなければならない．そのためには，例えば，常に害，AIEC を狙った単細菌治療や flagellin に対する特腸内細菌に暴露されている腸管という特殊な環境下で異的な治療などの展望が期待される．

の線維化のメカニズムを深く理解すること，腸管内ガ

実際に世界では，AIEC を治療標的としたいくつか

スと隣り合わせの中での正確な画像診断が問われるこのプロジェクトがすでに進行している．EcoActive™

と，副作用を減らした抗線維化治療を実現するかなど，と呼ばれるバクテリオファージを用いた in vivo の検討

課題も多い．その中でも，今回述べた AIEC の研究はでは， 1 回投与では効果が乏しかったが複数回投与に大きなブレイクスルーになる可能性を秘めている．腸17

よって AIEC 感染腸炎マウスの改善が見られた ．これ

管線維性狭窄は今後ますます研究の発展が期待されるは健常マウスの投与での安全性と dysbiosis の誘導がな分野となっていると考える．

Vol. 53 No. 2, 2023

25

Association of intestinal fibrosis and gut microbiota in Crohn's disease
JIN IMAI*,**, HITOSHI TSUGAWA***, HIDEKAZU SUZUKI**,YASUHIRO NISHIZAKI* and KATSUTO HOZUMI****Department of Clinical Health Science, Tokai University School of Medicine, Isehara**Department of Gastroenterology, Tokai University School of Medicine, Isehara***Transkingdom Signaling Research Unit, Division of Host Defense Mechanism, Tokai
University School of Medicine, Isehara
Crohn's disease is known to cause fibrotic intestinal stenosis. By use of novel molecular biologicalagents, mainly anti-TNF- α antibodies, the control of the acute phase of inflammation has become
relatively achievable. However, for lesions with prominent fibrosis that do not respond to such agents,
only surgical or endoscopic dilatation has been performed, and recurrence is still a common problem.
Recently, advances in metagenomic analysis have focused attention on disease-specific gut microbiota
and the Adherent-invasive Escherichia coli (AIEC), which adheres to the intestinal mucosal epithelium
and invades the mucosa, has been found as a characteristic bacteria of Crohn 's disease. It has beenreported that postoperative intestinal fibrosis is more likely to occur in carriers of AIEC, and it is also
considered to be a new therapeutic target in the treatment of Crohn's disease. This review will tidy up
their knowledge and present the prospects for intestinal fibrosis in Crohn's disease.

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26

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

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TARGAN,S., R., LANDERS, C., J., YANG, H., LODES, M., J., CONG, Y., PAPADAKIS, K., A.,
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STEFANESCU, C., WILS, P., SEKSIK, P., LE, BOURHIS, L., BEZAULT, M., SAUVANET, P.,
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27

Vol. 53 No. 2, 2023

第56回

日本無菌生物 ノ ー ト バ イ オ ロ ジ ー 学 会 総 会（承前）The Fifty-sixth Annual Meeting of
The Japanese Association of Germfree Life and Gnotobiology
January 21-22, 2023
IseharaPresident Makoto Onizuka

会

長

鬼

会

期

2023年（令和 5 年） 1 月21日（土）・22日（日）会場

東海大学・松前記念講堂・オンライン開催併用

塚

真

仁

28
一

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.
般演

題

セッションⅠ
座長

高

橋

志

達

（ミヤリサン製薬株式会社）

1 ．陽圧完全密閉式個別換気ラックを使用した無菌マウスの飼育����������������������� 30
石倉知征，松田正史（国立研究開発法人理化学研究所生命医科学研究センター（IMS））
2 ．新生仔の鼻腔炎症が腸内細菌叢に及ぼす影響������������������������������ 32
浅野妃南＊，三島由祐子＊＊，大﨑敬子＊＊＊，石井さなえ＊＊（＊杏林大学大学院保健学研究科，＊＊杏林大学保健学部臨床検査技術学科，＊＊＊杏林大学医学部感染症学）
3 ．発酵小麦ふすまの摂取は糞便中の短鎖脂肪酸を増加させ DSS 誘発性大腸炎の改善する ����������� 35
Afifah Zahra Agista，大崎雄介，駒井三千夫，白川仁（東北大学大学院農学研究科栄養学分野）
4 ．造影 X 線検査による無菌コモンマーモセットの盲腸の形態評価 ��������������������� 37
井上貴史（実験動物中央研究所マーモセット医学生物学研究部）
5 ．新しいブタ用アイソレーターの特長と Germ-Free マイクロミニピッグの解剖学的評価 ����������� 39
大竹正剛（静岡県畜産技術研究所中小家畜研究センター）

29

Vol. 53 No. 2, 2023
一

般

演

題

セッション II
座長

鬼

塚

真

仁

（東海大学）

6 ．炎症性腸疾患における病原性共生菌への IgA 応答と臨床応用����������������������� 41
今井

仁＊，＊＊，穂積勝人＊＊＊（＊東海大学医学部健康管理学，＊＊東海大学医学部消化器内科学，＊＊＊東海大学医学部生体防御学）
7 ．腸内細菌叢の攪乱による攻撃行動特性の比較������������������������������ 43
花輪球太＊，渡邉己弦＊＊，三上克央＊＊（＊東海大学医学部医学研究科先端医科学，＊＊東海大学医学部総合診療系精神科学）
8 ．異なる脂肪酸の摂取条件が食品抗原を介した免疫応答に与える影響�������������������� 45
吉村美和，津田真人，細野朗（日本大学生物資源科学部食品生命機能学研究室）
9 ．薬剤耐性プラスミドの接合伝達に対するフラボフォスフォリポールの活性評価��������������� 47
工藤逸美＊，＊＊，岡健太郎＊＊，高橋志達＊＊（＊酪農学園大学獣医学群食品衛生学ユニット，＊＊ミヤリサン製薬株式会社研究開発本部研究部）
10．酪酸による T 細胞を介した抗腫瘍免疫応答の誘導 ��������������������������� 49
山田裕貴，丹羽みずほ，北原秀悟，岡健太郎，林（ミヤリサン製薬株式会社研究開発本部）

篤史，高橋志達30

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

陽圧完全密閉式個別換気ラックを使用した無菌マウスの飼育
石倉

知征

松田

正史

（国立研究開発法人理化学研究所生命医科学研究センター（IMS））

Ⅰ．目的

よって判定した．

当研究センターでは2005年から重度の免疫不全マ
ウス飼育に伴い，ビニールアイソレーターを導入した．その後，腸内細菌が健康や寿命に深く関わっていることが明らかになってきたことから，無菌マウ

Ⅲ．結果，考察，結論①無菌マウスの飼育維持
無菌 C57BL/6NJcl の飼育の結果， 3 ヶ月間，鏡検スやノトバイオートマウスを用いた研究への需要がおよび培地検査の何れも無菌状態を維持できた．

高まり，2010年から無菌マウスの維持管理を，2014②無菌マウスの繁殖，維持

年から無菌マウス作製をセンターの支援業務に導入

無菌 C57BL/6NJcl メス 1 匹；オス 1 匹の交配の結している．無菌マウスは誰でも簡単に維持管理でき

果，初産は 7 匹出産後，全て喰殺したが， 2 産目でるものではなく，無菌環境を維持するためにはビニー

は 7 匹出産， 6 匹（メス 3 匹，オス 3 匹）が離乳ま

ルアイソレーター等の飼育器材が必要となる．それで成長した．

らを扱うためには十分な技術習得期間が必要である．

無菌 MCH（ICR）/Jcl（ 2 腹）を妊娠期でケージ

そこで無菌マウス飼育維持の技術的な問題を軽減でに収容し， 1 腹：11匹出産，11匹離乳（メス 8 匹，きないかと考え，ビニールアイソレーターに代わる

オス 3 匹）， 1 腹：12匹出産，12匹離乳（メス 8 匹，無菌マウスの飼育方法の検討を行った．

オス 4 匹）と産仔すべて離乳まで成長した．
試験開始から 6 ヶ月間，計10ケージ全てにおいて

Ⅱ．材料と方法

無菌状態を維持できた．

無菌マウス（C57BL/6NJcl，MCH（ICR）/Jcl（日本試験の結果，飼育，繁殖に問題なく，ビニール

本クレア株式会社））を陽圧完全密閉式個別換気ラッアイソレーターを使用しない無菌マウスの飼育維持

ク（テクニプラスト・ジャパン株式会社）と過酸化方法の 1 つとなりうることがわかった．従来のビ

水素ガス殺菌装置付きバイオクリーンベンチを用い

ニールアイソレーターを用いる方法と比べて作業効て飼育（ 1 回 / 週のケージ交換）及び繁殖試験を行っ率の面での煩雑さなど改善点はあるが，従来法の技

た．無菌状態の確認はケージ交換時におけるグラム術未習得者にとっての代替法として有用であると考染色した新鮮糞便の顕微鏡検査（鏡検）及び 1 回 /えられる．

月の無菌検査（鏡検および培地による培養検査）に

Vol. 53 No. 2, 2023

31

Breeding of germ-free mice using an Individually Ventilated Caging System
TOMOYUKI ISHIKURA and MASASHI MATSUDA
RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, Yokohama
We introduced vinyl isolators for breeding of severely immunodeficient mice in 2005.
Since then, the demand for research using germ-free (GF) mice and gnotobiotic (GB) mice increased, we
started management of breeding GF mice and GB mice in 2010. Furthermore, we introduced generated
GF mice into our support services in 2014.
Vinyl isolators have been generally used for breeding GF mice and GB mice. However, handling vinyl
isolators requires long-term training and experience. Therefore, we examined a combination of an
Individually Ventilated Caging System (IVC) and a clean bench with hydrogen peroxide gas sterilizer as
an alternative to breeding GF mice using vinyl isolators.
We maintained and bred 10 cages of GF mice (C57BL/6N Jcl and MCH (ICR) / Jcl (CLEA Japan)) in
IVC and changing cages in a clean bench weekly.
In all 10 cages, no microbiological contamination occurred for 6 months.
The results of this study suggest that this method is effective as one method of breeding GF mice,although there are still improvements to be made.

32

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

新生仔の慢性鼻腔炎症が腸内細菌叢に及ぼす影響
浅野

妃南＊

大﨑

敬子＊＊＊

石井

さなえ＊＊

（＊杏林大学大学院保健学研究科，＊＊杏林大学保健学部臨床検査技術学科，＊＊＊杏林大学医学部感染症学）
要

旨： 腸内細菌叢が免疫，代謝，神経系を介し宿主と相互作用する脳 - 腸 - 免疫連関が注目されている．

成体マウスを用いた先行研究では，慢性鼻腔炎症が嗅球の萎縮と神経炎症に加え，特に雄マウスにおいて
腸内細菌叢のディスバイオ―シスを起こすことを見出した．このことから，慢性鼻腔炎症が脳 - 腸 - 免疫
連関に影響すると考えた．そこで本研究では，腸内細菌叢が形成される授乳期に慢性鼻腔炎症を起こすと腸内細菌叢は変化するのか，その変化は成体まで持続するのかを明らかにすることを目的とした．生後 7
日齢から週 2 回ずつ 3 週間，雌雄マウスの両側鼻腔にリポ多糖を投与し，慢性鼻腔炎症モデルとした．全投与終了後に離乳し，離乳直後の 4 週齢と，成体まで成長した10週齢の時点で，糞と盲腸便の16S rRNA
メタゲノム解析を行った．その結果，授乳期の慢性鼻腔炎症により雌雄とも腸内細菌叢は変化したが，その変化は成体までは持続しなかった．
キーワード：慢性鼻腔炎症，脳 - 腸 - 免疫連関，新生仔，腸内細菌叢

Ⅰ．背景と目的に 2 回ずつ 3 週間（P7, P10, P14, P17, P21, P24），雌雄

近年，腸内細菌叢が免疫，代謝，神経系を介して宿マウスの両側鼻腔にリポ多糖（LPS）もしくは生理食

主と相互作用し，脳機能にも影響を及ぼすという，脳 -塩水を投与し，慢性鼻腔炎症モデル及び対照群とした．

1

腸 - 免疫連関が注目されている ．例えば，腸内細菌叢

投与開始から 1 週間毎に体重を測定し，体重の変動をの乱れがうつ病などの精神疾患に関与する．また，慢調べた．最終投与終了直後の 4 週齢と成体まで成長し性鼻腔炎症の患者では，うつ病や不安障害などの精神た10週齢の時点で組織学的解析と，糞と盲腸便を用い疾患のリスクが高まり，慢性鼻腔炎症マウスは不安をた腸内細菌叢の16S rRNA メタゲノム解析を行った．

示すことから，慢性鼻腔炎症が脳 - 腸 - 免疫連関に影響

同様の実験を 3 回繰り返した．新生仔は個体識別が困

して，脳機能を低下させる可能性が考えられる．先行

難なため，投与期間中は雄の saline 投与群と雌の LPS研究では，鼻腔炎症を起こした成体マウスでは，末梢投与群，雄の LPS 投与群と雌の saline 投与群の 2 グルー

2炎症細胞が脳に浸潤し神経炎症を起こすこと ，慢性鼻3腔炎症を起こすと嗅球が萎縮すること ，そして特に雄プに分け，それぞれ母マウスを 2 匹ずつ入れて飼育した．

マウスにおいて腸内細菌叢のディスバイオーシスが起
こること 4 を示した．腸内細菌叢は，出生時から形成さⅢ．結果

れ始め，母親や環境の影響を受けて確立される．そこ

組織学的解析の結果，LPS 投与終了後， 4 週齢の時で，本研究では，腸内細菌叢の形成に重要な時期であ点で，雌雄とも嗅上皮中に好中球や単球が浸潤し，炎る授乳期に慢性的に鼻腔炎症を起こすと，新生仔の腸症性サイトカインの発現が見られたため，同程度に鼻内細菌叢は変化するのか，また，変化した場合，それ腔炎症が起きていたことを確認した．10週齢になるまは成体に成長するまで持続するのかを明らかにするこでに，鼻腔炎症はほぼ回復した．

とを目的とした．

体重測定の結果，授乳期間中は雌雄とも処置による体重の違いは見られなかった．しかし，離乳後，雌雄Ⅱ．対象と方法

ともに saline 投与群に比べて LPS 投与群では体重が低

C57BL/6マ ウ ス を 使 用 し た． マ ウ ス の 場 合， 生 後くなった．雄の LPS 投与群では10週齢になるまで体重3 - 4 週間までが授乳期であるため，生後 7 日齢から週が有意に低いままだったが，雌では 6 週齢で saline 投33Vol. 53 No. 2, 2023
与群に追いつき，差が見られなくなった．
bray-curtis および jaccard 指数を用いて細菌叢のβ多様性解析を行った結果， 4 週齢の糞と盲腸便において雌雄差，処置差が有意に見られた．しかし， 1 回目の
実 験 で は， 同 じ 母 マ ウ ス の 元 で 飼 育 し て い た 雄 のsaline 投与群と雌の LPS 投与群，雌の saline 投与群と雌の LPS 投与群のβ多様性がそれぞれ類似しており，母マウスによる差である可能性が考えられた（Figure1）．そこで， 2 回目， 3 回目の実験では，毎週マウスを入れ替えて，母マウスによる差が生じないように飼育した．その結果，母マウスの影響を均等化しても，β多様性で雌雄差，処置差がともに見られた（Figure 2）．
具体的に，どの細菌が変化していたのかは現在解析中である．さらに，10週齢まで成長したマウスの糞と盲腸便のβ多様性においては，雌雄差は見られたものの処

Figure 2 Analysis of microbiota from cecal contentsof mice at 4 wks by principle component analysis(PCA) based on Jaccard dissimilarities after equalizing
the influence of the mother.

置差は見られなかった．
Ⅳ．考察
授乳期間中は仔マウスの体重に差が見られなかったことから，母マウスからの栄養は saline 投与群と LPS
投与群に同様に与えられたと考えられる．それにも関わらず，離乳後には，saline 投与群に比べて LPS 投与
群では体重が低かったため，自力での摂食量が減少したと推測される．また，母マウスの影響を均等化した実験群においても，離乳直後の saline 投与群と LPS 投
与群において腸内細菌叢のβ多様性に有意差が見られたため，新生仔の慢性鼻腔炎症は腸内細菌叢を変化させることが示唆された．

Figure 1 Analysis of microbiota from cecal contentsof 4 groups of mice at 4 wks by principle component
analysis (PCA) based on Jaccard dissimilarities before
equalizing the influence of the mother.

Ⅴ．結論
授乳期に慢性的に鼻腔炎症を起こすと，母マウスから同様に栄養が与えられていたにも関わらず，雌雄とも腸内細菌叢が変化したが，大人になるまではその変化は持続しなかった．

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Chronic nasal inflammation during lactation period induces transient dysbiosis
of gut microbiota in mice
HINAMI ASANO*, TAKAKO OSAKI*** and SANAE HASEGAWA-ISHII***Faculty of Health Sciences, Kyorin University School of Medicine, Tokyo**Graduate School of Health Sciences, Kyorin University, Tokyo***Depertment of Infectious Discases, Kyorin University School of Medicine, Tokyo
Patients with chronic nasal inflammation have a higher risk for psychiatric disorders, and it becomes
clearer that depression is associated with dysbiosis of gut microbiota. Thus, we speculated that chronic
nasal inflammation might perturb the gut microbiota, leading to psychiatric disorders. Our previous
study indicated that adult male, but not female, mice with chronic nasal inflammation changed thecomposition and abundance of gut microbiota. To address the question of whether chronic nasal
inflammation induces dysbiosis of gut microbiota even in the lactation period, baby mice received
intranasal administration of saline or LPS twice a week for 3 weeks (P7, P10, P14, P17, P21, P24), andwere weaned at P24. Their gut microbiota were analyzed just after weaning (4-week-old) and at 10-weekold to examine whether potential dysbiosis would last during life if it happens in the lactation period.
Body weight was measured once a week during the experiments. In the lactation period, the body weight
was similar in saline- and LPS-treated mice in male and female groups, suggesting that breast milk wasgiven similarly to all mice. However, the beta diversity of the gut microbiota changed in LPS-treatedmale and female mice just after weaning. After weaning, the increase in body weight in saline-treatedmice was larger than in LPS-treated mice. At 10-week-old, the beta diversity of gut microbiota was notdifferent between saline- and LPS-treated mice. Thus, chronic nasal inflammation induced transientdysbiosis of gut microbiota even in the lactation period, but it can return to normal during development.
Keywords: Gut-brain axis, chronic nasal inflammation, lactation period, gut microbiota

References

1. CLEMENTE, J.C., URSELL, L.K., PARFREY, L.W. & KNIGHT, R.: Theimpact of the gut
microbiota on human health: an intergrative view, Cell, 148, 1258-1270, 2021.
2. ASANO, H., HASEGAWA-ISHII, S., ARAE, K., OBARA, A., LAUMET, G., DANTZER, R. &SHIMADA, A.: Infiltration pf peripheral immune cells into olfactory bulb in a mouse model of acutenasal inflammation, J. Neuroimmunol., 368, 577897, 2022.
3. HASEGAWA-ISHII, S., SHIMADA, A. & IMAMURA F.: Neuroolastic change in the olfactory bulb
associated with nasal inflammation in mice, J. Allergy Clin Immunol., 143, 978-989, 2019.
.
MISHIMA,Y., OSAKI T., SHIMADA, A., KAMIYA, S. & HASEGAWA-ISHII, S.: Sex-dependent4
differences in the gut microbiota following chronic nasal inflammation on adult mice, Sci Rep., 11(1),4640, 2021.

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Vol. 53 No. 2, 2023

発酵小麦ふすまの摂取は糞便中の短鎖脂肪酸を増加させ DSS
誘発性大腸炎の改善する
Afifah Zahra Agista

大崎

雄介

駒井

三千夫

（東北大学大学院農学研究科栄養学）

Ⅰ．背景
小麦ふすま（WB）は，世界で 2 番目に生産量の多白川

仁

給水を 9 日間行った．飼育終了後，マウスを解剖し，炎症のパラメータを測定した．

い穀物である小麦の製粉産業における副産物である．
食物繊維を多く含むことが知られており，生物学的利Ⅲ．結果

用能が低い一因となっている．WB の健康機能性を向FWB は WB と比較して総フェノール含量，ACE 阻上させるためにテンペスターター（Rhizopus oligosporus

害 活 性，DPPH ラ ジ カ ル 消 去 活 性 が 上 昇 し て い た．

等）を用いた発酵を行った．我々の以前の研究で，米FWB 摂取により，体重減少が抑制され，DAI（disease

ぬかの発酵物では，デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）

activity index，下痢と血便で評価）値が減少した．ま誘発性大腸炎の改善能が向上した．本研究は小麦ふす

た，糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）含有量の増加が観

まと米ぬかの生理活性物質の類似性を参考にして，発察された．さらに，FWB 摂取は，大腸の抗菌ペプチド，

酵小麦ふすま（FWB）が DSS 誘発性大腸炎モデルマ

Il-17および Il-22 mRNA レベルを増加させた．これら

ウスの病状に与える影響を調査することを目的とした．

の結果より，FWB は大腸炎を改善し，その作用は腸内細菌が産生する SCFA による腸内の Th17細胞の調節

Ⅱ．方法

を介している可能性が示唆された．

C57BL/6N 雄マウス（11週齢，25匹）を 3 群に分け，
コ ン ト ロ ー ル 食（n ＝ 8 ），10 ％ WB 食（n ＝ 8 ），（会員外共同研究者： Chien Yushan（簡妤珊）*，小関

10％ FWB 食（n ＝ 9 ）を給餌した．試験食を 4 日間拓也 **；* 東北大学大学院農学研究科栄養学専攻，** 山

給餌し，続いて試験食給餌および DSS（飲水中 3 ％）形大学農学部）

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Dietary supplementation of fermented wheat bran alleviates DSS-induced colitis
in mice by increasing fecal SCFA content
AFIFAH ZAHRA AGISTA, YUSUKE OHSAKI,MICHIO KOMAI and HITOSHI SHIRAKAWA
Laboratory of Nutrition, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai[Introduction]
Wheat bran (WB) is a by-product of the milling industry of wheat. It is known for its high content of
dietary fiber, which contributes to its low nutritional bioavailability. Fermentation with Tempe starter(Rhizopus oligosporus etc.) was conducted to improve WB's nutritional quality. Fermentation increased
rice bran capacity in ameliorating dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis. Considering thesimilarities between wheat bran and rice bran bioactive compounds, this study also aimed to investigate
whether FWB can prevent the onset of DSS-induced colitis in a mouse model.
[Method]
Twenty-five mice (11-week-old C57BL/6N male mice) were divided into three groups. The first group
was fed with the control diet (n=8), the second group received a 10% WB-supplemented diet (n=8), andthe last group a 10% FWB-supplemented diet (n=9). The diet treatment was given for 4 days before DSS(3% in drinking water) was given. Simultaneous DSS and diet treatments were continued for another 9days before mice were euthanized.
[Results]
Fermentation increased WB total phenolic content, elevates WB’s ACE inhibitory and DPPH radical
scavenging activities. FWB prevented mice body weight loss and reduced their disease activity index.
FWB supplementation also increased the fecal short-chain fatty acid (SCFA) content. Furthermore,dietary FWB increased the colonic mRNA levels of Il-17 and Il-22 along with regulating anti-bacterial
peptides, suggesting that the colitis-ameliorating effect of FWB was achieved via the regulation of Th17
cells in the intestine by the gut microbiota-produced SCFA.
(Non-member collaborators：Chien Yushan*, Takuya Koseki**. *Laboratory of Nutrition, Graduate
School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai,**Faculty of Agriculture, Yamagata
University, Tsuruoka)

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Vol. 53 No. 2, 2023

造影 X 線検査による無菌コモンマーモセットの盲腸の形態評価井上貴史（実験動物中央研究所マーモセット医学生物学研究部）

Ⅰ．目的

麻酔下でバルーンカテーテルを用いて経肛門投与し，無菌霊長類を用いた腸内微生物叢研究の展開をめざ

投与後に経時的に腹部の X 線撮影を行った．

して，我々はアイソレーター内での飼育・取り扱いに適する小型の霊長類種のコモンマーモセットにおいて

Ⅲ．結果，考察

無菌動物の作出とその研究応用のための技術開発を進

無菌マーモセットと通常飼育（コンベンショナル）

めている．これまでに，妊娠個体の準備からビニール個体において X 線造影検査を実施した．その結果，注

アイソレータ（VI）内での無菌環境下での帝王切開に腸法と経口投与法のいずれにおいても，無菌検査陰性

よる産仔獲得から人工哺育，育成までの技術を確立し，の個体ではコンベンショナル個体と比較して右下腹部培養検査で生菌が検出されない無菌マーモセット個体の大腸上部の盲端部が拡大して小腸が頭側に変位しての作出に成功している（第55回総会にて報告）．そこで，いる像が観察された．このことから，無菌維持個体に作出された無菌マーモセットの特性解析として，無菌

おいて盲腸〜結腸上部が拡大しており，無菌げっ歯類

げっ歯類で特徴的は盲腸の拡大が無菌マーモセットでと同様の特性が認められることが示唆された．無菌認められるかどうかの検討を行った．

げっ歯類では，腸内細菌叢による発酵が起こらないため食物繊維が盲腸内で滞留し水分を含んで膨潤するた

Ⅱ．方法

め盲腸が拡大すると考えられ，腸内細菌の定着により無菌マーモセットを非侵襲的に無菌状態を維持した

盲腸が縮小することが知られている．野生のマーモ

ままで盲腸の形態を評価する方法として X 線造影検査

セットは樹液・樹脂を採食するが，これらは盲腸で発を試みた．無菌維持のため VI 内のマーモセットを X

酵されることが知られている．飼育下のマーモセット

線撮影することとし，VI 外の上部にポターブル X 線照においても盲腸が発酵の場として機能していることが射装置を設置し，底面に受像器（カセッテ）を設置す考えられることから，無菌マーモセットの盲腸拡大はることでアイソレータ越しに撮影を行った．造影剤に無菌げっ歯類と同様の機序で生じることが推察された．

はヨード系のガストログラフィン®

を用い，注腸（経肛門投与）と経口投与の両方法による消化管造影を行っ（会員外共同研究者：岡原則夫，菊池理加，佐々木えり

た．造影剤投与前に12時間以上の絶食処置を施し，経か；実験動物中央研究所マーモセット医学生物学研究

口投与法ではカテーテルにより胃内投与，注腸法では

部）

38

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Contrast enhanced X-ray imaging of the cecum in germ-free common marmosets
TAKASHI INOUE
Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki
Germ-free nonhuman primates (NHPs) are expected to play a critical role in translational microbiome
research. We have been developing technologies for the generation and research application of germ-freecommon marmosets, small NHPs suitable for rearing and handling in an isolator. To date, we havegenerated germ-free marmosets with no viable organisms detected in culture tests (reported at the 55th
Annual Meeting). Here, we developed methods for evaluating the size of the cecum to investigate
whether germ-free marmosets have enlarged cecum, one of the major characteristics of germ-freerodents. Contrast-enhanced radiography acceptable for live animals was performed on the animals insterile isolators. After fasting for 12-20 hours, animals were administered Gastrografinan ®
intragastrically or transanally under anesthesia. Abdominal radiography was performed through aflexible film isolator using a computed radiography system. X-ray images of germ-free marmosets byboth intragastric and transanal administration methods showed an expansion of the blind end of theupper part of the large intestine in the right lower abdomen, indicating the cecal enlargement. The cecal
diameter predictively measured from the images of germ-free marmosets was significantly larger thanthat measured in conventional marmosets. In germ-free rodents, it is considered that the lack offermentation by the intestinal microbiota causes swelling of the cecum by dietary fiber with water. Wild
marmosets are known to forage gum from trees and obtain nutrition by fermentation in the cecum. Thatsuggests the cecal enlargement observed in germ-free marmosets occurred by similar mechanisms.
( Non - member collaborators: Norio Okahara, Rika Kikuchi, Erika Sasaki. Central Institute forExperimental Animals, Kawasaki)

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新しいブタ用アイソレーターの特長と
Germ-Free マイクロミニピッグの解剖学的評価
大竹正剛（静岡県畜産技術研究所中小家畜研究センター）

Ⅰ . 目的

ターに移動させ，γ線滅菌飼料（50kGry），オートクレー

近年，先端医療等を含めた医学研究でのブタの利用

ブ滅菌水（127℃ 2 時間）および EOG 滅菌資材にて無にニーズが高まっている．今後異種移植等において，菌的に飼育した．さらに2.5か月齢時に長期飼育アイソ

ブタの利用に高度に微生物制御された環境が求められレーターに移動させ，13か月齢まで飼育した．飼育ブることが予想される．しかし産業利用を目的としたブ

タは目標到達時に安楽殺し，体重，体格，臓器重量おタの長期無菌飼養管理技術は，未だ確立されていない．

よび組織学的検索を行った．なお対照区は通常環境下

そこで本研究では長期無菌飼育可能なブタ用アイソで飼育した MMP とし，無菌評価は 2 週から 1 か月毎

レーターを開発するとともに，格段に小さいミニブタに直腸や糞等から滅菌綿棒にて採材し，TGC，HIF，であるマイクロミニピッグ（MMP）を用いて実証試験

CM および PDA 培地で20℃および37℃下で14日間培養を行った．

し確認することとした．

Ⅱ．材料と方法

Ⅲ．結果と考察

ブタ用アイソレーターは発育ステージごとに 3 種類

無菌評価では試験期間を通して菌は認められなかっ作製した．蘇生アイソレーターは，硬質塩化ビニル製

た．13か月齢の無菌 MMP の体重（n ＝ 2 ）は14.7㎏おで薬液槽を具備し，摘出した子宮から無菌的に子ブタよび15.5㎏であり，対照区18.2±2.0㎏（n ＝ 3 ）に比べを娩出できる構造とした．若齢飼育アイソレーターは，低値を示したが体格に大きな差は認められず，概ね正

硬質塩化ビニル製で加温機能を有し若齢ブタを飼育で常に成長したと考えられた．剖検では盲腸の肥大化以きる構造とした．長期飼育アイソレーターは，ケージ外は特に異常は認められず，臓器重量は消化管が対照

2（体重15㎏を 2 頭飼育できる面積（0.72m /H × 2 ））を区に比べ高値を示し盲腸で著しい傾向にあった．組織

載せた基台を軟質ビニルで被覆した構造とした．アイ

学的評価では，対照区に比べ盲腸粘膜の細胞浸潤が少ソレーターは，過酢酸製剤（ダイヤパワー FP；三菱ガ

なく腸壁に菲薄化傾向が観察されたが，その他に異常ス化学（株））および亜塩素酸製剤（アクロファインは認められなかった．

Pro8000；（株）ジック）を用いて滅菌し，クリーンブー
ス（Class10,000）内にて運用した．実証試験では，ま（会員外共同研究者：佐藤剛司＊＊，塩谷聡子＊，伊神悠ず交配後110日目のメス MMP から子宮を摘出して蘇生

祐＊，金森健太＊＊＊，網野信＊＊，柴田昌利＊；＊静岡県畜

アイソレーター内に導入し，無菌的に子ブタを娩出し産技術研究所中小家畜研究センター，＊＊日商産業（株），

蘇生させた．次に蘇生子ブタを若齢飼育アイソレー＊＊＊

静岡県中部家畜保健衛生所）

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Anatomical evaluation of the germ-free microminipig using a novel long-term
pig rearing isolator
MASAYOSHI OTAKE
Shizuoka Prefectural Research Institute of Animal Industry, Swine and Poultry ResearchCenter, Kikukawa
The aim of this study is to evaluate the anatomical characteristics of the germ-free microminipigs
MMP() with the novel isolators for long-term rearing of pigs. Three types of isolators were generated foreach developmental stage and sterilized by spraying with a peracetic acid or a chlorite solution. Female
MMP were mated with natural insemination, and delivered at 110 days gestation via hysterectomy. For
hysterectomy, the uterus was cut from the sow under an anesthesia and introduced into a resuscitation
isolator, a hard plastic, through the germicidal trap and the piglets were delivered surgically from uterus.
The piglets were transferred from the resuscitation isolator to a nursing isolator, hard plastic, and rearedfor 2.5 months. After rearing a nursing isolator, the piglets were transferred to a long -term rearing
isolator, consisted with a stainless-steel cage enclosed in a soft vinyl chamber, and continued rearing
until 13 months of age. For sterility evaluation, samples were taken periodically and incubated in four
different media for 14 days. Two MMPs were successfully reared in the isolators under a sterile
environment until 13 months of age. The germ-free MMPs weighed 14.7 kg and 15.4 kg, respectively.
Furthermore, the germ-free MMPs tended to have larger the caecum than pigs raised in a normal
environment. In summary, we have succussed to generate a novel pig rearing isolator and rear the germfree MMPs for a long period of time.

41

Vol. 53 No. 2, 2023

炎症性腸疾患における病原性共生菌への IgA 応答と臨床応用＊今井（ 東海大学医学部健康管理学，＊＊仁＊ , ＊＊

穂積勝人＊＊＊

東海大学医学部消化器内科学，＊＊＊

東海大学医学部生体防御学）

Ⅰ．目的，背景
メタゲノム解析の進歩により，近年数々の消化器疾患とその病態に関連が示唆される病原性共生菌 pathobiont が報告されている．pathobiont は健常人にも分離され，その病原性は宿主や周囲に環境に依存する．このような pathobiont に対する宿主の免疫応答は充分に解明されておらず，どのような機序で共生に至ってしまうかは大きな課題である．我々はこれまで，クローン病（CD）の回腸末端から約40％の割合で分離される侵襲性接着性大腸菌（AIEC： adherentinvasive E．coli）に注目し，マウスモデルにて AIEC 定着が持続炎症を惹起し腸管線維化につながることを報告している 1 ．そこで，この AIEC の持続感染マウスモデルを用いて pathobiont に対する宿主免疫応答の一端として IgA 反応性を検討した．
Ⅱ．材料と方法
抗菌薬で前処置した SPF マウスに AIEC の代表株である LF82株，対照として病原性を有さない一般大腸菌 HS 株を経口投与する．10週まで毎週，糞便を採取し，IgA 分画を分離し LF82株に対する IgA 結合細菌率を flowcytometry で評価する．そして，AIEC の病原性抗原の変異 LF82株（∆ fimH，∆ fliC，∆ ompA，∆ ompC）を用いて，認識する AIECの病原性抗原を同定する．また，ヒト大腸粘膜細胞 Caco-2を用いて，抗 AIEC-IgA 抗体による AIEC の侵入性の阻害効
果を評価する．
Ⅲ．結果，結語
抗菌薬前処置 SPF マウスに LF82株を長期感染させると，同マウスの糞便中に LF82株に結合する IgA が 2 週目以降に急激に産生され持続した．さらに，この AIEC 感染で産生される IgA は一般大腸菌株には反応せず，AIEC に特徴的な抗原のみを認識することが分かった．一方，病原性を有しない一般大腸菌 HS 株は，LF82株と同様にマウスに持続定
着はするものの，IgA 応答を誘導しなかった．そして，誘導された抗 AIEC-IgA 抗体は LF82株の Caco-2への侵入を阻害することが in vitro にて示された．本研究により，同じ大腸菌でも pathobiont と非病原性細菌株では宿主の IgA 応答が異なることが示された．さらに，pathobiont により誘導される IgA 抗体は病原性の有無を識別できることが分かった．
今後は，この IgA 応答の違いを用いた臨床応用の可能性を検討していく．

42

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

IgA response to pathobiont in inflammatory bowel disease and its clinicalapplication
JIN IMAI*,** and KATSUTO HOZUMI****Department of Clinical Health Science, Tokai University School of Medicine, Isehara,**Department of Gastroenterology, Tokai University School of Medicine, Isehara,***Department of Immunology, Tokai University School of Medicine, Isehara[Introduction]
A new category of bacteria, called pathobionts, that promotes disease only when host genes orenvironmental conditions are altered, has been identified. A pathotype of Escherichia coli, namely
adherent-invasive E. coli (AIEC), is known as a potential pathobiont associated with Crohn’s disease(CD). The colonization by AIEC exacerbates intestinal inflammation and fibrosis in murine colitis
models1. However, Details of the immune response of the host and pathobiont are not yet known.
[Methods]
Specific pathogen-free (SPF) mice were pre-treated with a cocktail of antibiotics and then colonizedeither by an AIEC strain LF82 or a commensal E. coli strain HS. The specificity of IgA was evaluated by
flowcytometry. LF82 ∆fimH, ∆fliC, ∆ompA, and, ∆ompC mutant strains were used to determine theantigen specificity of induced IgA. The function of IgA was assessed by in vitro bacterial invasion assay
using a human colonic epithelial cell line Caco-2.
[Results]
We found that AIEC, but not commensal E. coli, colonization induced IgA production in mice. The
induced IgA selectively bound to AIEC strains but not to commensal E. coli strains. Induced IgA
recognized surface antigens of AIEC LF82, including fimbriae and outer membrane proteins. Also, we
found that AIEC-specific IgA limits the invasion of the AIEC LF82 to the colonic epithelial cells.
[Conclusion]
These results suggested that IgA, induced by the persistent colonization by AIEC, offers the protection
to the host by inhibiting invasion of the pathobionts to the colonic epithelial cells.

Reference

1. IMAI, J., KITAMOTO, S., SUGIHARA, K., NAGAO - KITAMOTO, H., HAYASHI, A.,
MORHARDT, T., L., KUFFA, P., HIGGINS, P., D., R., BARNICH, N. & KAMADA, N. : Flagellinmediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis. Mucosal
Immunology, 12, 632-643, 2019.

43

Vol. 53 No. 2, 2023

腸内細菌叢の攪乱による攻撃行動特性の比較
花輪

球太＊

渡邉

己弦＊＊

三上

克央＊＊

（＊東海大学医学部医学研究科先端医科学，＊＊東海大学医学部総合診療系精神科学）

Ⅰ．目的
脳と腸は液性因子や自律神経系，免疫系の伝達経路

内細菌叢を攪乱し，宿主の攻撃行動特性への影響を観察した．

を介して双方向的な情報伝達を行っており，脳腸相関と呼ばれている．これまでの研究では，腸内細菌叢はⅡ．材料と方法

迷走神経などの神経系経路や免疫担当細胞による免疫

全てのマウスは母体妊娠時からアイソレータ内で飼学的経路に関与していることが解明されてきており，育した． 6 週齢時に常在腸内細菌叢マウスにアミノグ

腸内細菌叢 - 腸 - 脳軸として知られている．生体は，有リコシド系抗菌薬，ストレプトマイシンを自由飲水で害なストレス刺激に暴露されたとき，視床下部 - 下垂

計 6 日間投与した．抗菌薬投与終了後，ストレプトマ

体 - 副腎軸と交感神経系を活性化して体内の恒常性をイシン投与マウス群とストレプトマイシン非投与マウ維持する．視床下部 - 下垂体 - 副腎軸の発達には，遺伝ス群で攻撃行動特性を比較した．アイソレータ内で，的要因のみならず生後の環境要因も深く関与している．

ソーシャルインタラクション法を使用し，攻撃行動特

我々の研究では，Specific-pathogen-free マウスおよび性を評価した．

無菌マウスを用いた研究で，出生直後の腸内細菌叢の構成が成長後のストレス反応に影響を与えていること

Ⅲ．結果，考察，結論を明らかにした．このような研究成果を踏まえて，腸ストレプトマイシン投与群マウスとストレプトマイシ

内細菌叢がストレス反応性だけでなく宿主の精神活動

ン非投与群マウスではそれぞれ攻撃行動特性は観察さや行動自体に影響を及ぼしていると仮説を立て，活動れなかった．ストレプトマイシン投与群マウスの腸内細性や不安症状，攻撃性を標的にアイソレータ内で無菌菌では，好気性菌数は有意に減少し，ストレプトマイシ

マウス群と常在腸内細菌叢群の行動解析を行なった．

ンの抗菌効果は示されたが，全菌数では有意差を認め

結果は，無菌マウスは，常在腸内細菌叢マウスと比較なかった．主な腸内細菌の減少は Enterobacteriaceae

し，多動性や不安症状，攻撃性が増強した．これらのであった．本実験では，ストレプトマイシンを使用した

結果は，腸内細菌叢は多動性や攻撃性，不安症状に影

腸内細菌叢の攪乱によって，宿主の攻撃行動特性への響を与えることを示唆した．

影響を認めなかった．抗菌薬の投与週齢やターゲット

以上の研究成果から，後天的な影響による腸内細菌叢の乱れは，宿主の行動特性に影響を与えるのかという問題提起となった．本実験では，抗菌薬を用いて腸となる菌の相違によって，攻撃行動特性に影響を与える可能性が示唆された

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

Comparison of aggressive behavior characteristics by dysbiosis of commensal gut
microbiota
KYUTA HANAWA*, NATSURU WATANABE** and KATSUNAKA MIKAMI***Department of Medical Science, Graduate School of Medicine, Tokai University, Isehara,**Department of Psychiatry, Tokai University School of Medicine, Isehara[Introduction]
In our study, we found that the gut microbiota immediately after birth affects the stress response inmice. Based on these results, we hypothesized that the gut microbiota influences the host's mental
activity and behavior in addition to stress reactivity, and conducted a behavioral analysis. As a result, it
was suggested that the gut microbiota may affect hyperactivity, aggression, and anxiety. In this study, weused antibacterial agents to dysbiosis the gut microbiota and then observed the effects on host aggressive
behavior characteristics.
[Methods]
All mice were housed in sterile isolators from the time of maternal pregnancy. At 6 weeks of age,commensal gut microbiota mice were administered an aminoglycoside antibiotic streptomycin, with freedrinking water for a total of 6 days. After administration of antibiotics, aggressive behavior
characteristics were compared between streptomycin - treated and non - streptomycin - treated mice.
Observations of aggression behavior were made in a sterile isolator and used the social interaction
method.
[Result and discussion]
Aggressive behavior characteristics were not observed in both streptomycin-treated mice and nonstreptomycin-treated mice. In the gut microbiota of streptomycin-treated mice, the number of aerobic
bacteria decreased significantly, indicating the antibacterial effect of streptomycin, but there was no
significant difference in the total number of bacteria. The most decreased bacteria wrerEnterobacteriaceae. In this experiment, dysbiosis of the gut microbiota using streptomycin did not affecthost aggressive behavior characteristics. It was suggested that the age of antibiotic administration anddifferences in target bacteria may affect aggressive behavior characteristics.

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Vol. 53 No. 2, 2023

異なる脂肪酸の摂取条件が食品抗原を介した免疫応答に与える影響
吉村

美和

津田

真人

細野

朗

（日本大学生物資源科学部食品生命機能学研究室）

Ⅰ．目的

た．また，各実験群のマウスの PP，SPL，MLN 細胞の

近年，食物アレルギー患者が増加している．食事摂T 細胞フェノタイプ（CD3＋CD4＋CD45RBloCD69hi，CD3＋

取する栄養素に注目した場合，必須脂肪酸の経口摂取

CD4＋CD62LloCD44hi）をフローサイトメトリーにより解析

によって炎症性脂質メディエーターが産生され 1 型アした．また，各実験群のマウスの血中 mouse mast cell

レルギーが誘導される．脂肪酸組成の違いによってア

protease-1（mMCP-1）を腸管マスト細胞の脱顆粒のマー

レルギー発症に影響があると考えられるが，その作用カーとして測定した．

機序については明らかにされていない．そこで，本研
究では食餌組成の違いが食物アレルギーに及ぼす影響に関与する抗原特異的応答や炎症反応においてどのような影響があるのかを検討した．

Ⅲ．結果，考察，結論
卵白食を摂取した 3 つの実験群間では，腸管マスト細胞の脱顆粒について解析したところ，mMCP-1量が対照
食に比べ魚油配合食で有意に減少，対照食に比べコーン

Ⅱ．材料と方法

油配合食で有意に増加した．OVA と共培養した組織の培

卵アレルギーモデルである卵白オボアルブミン（OVA）

養上清中の IL-4量は，SPL において対照食に比べ魚油配特異的 T 細胞受容体トランスジェニック OVA23-3マウ

合食で有意な減少が見られ，PP，MLN 細胞でも魚油配スを用いた．魚油・コーン油不含の対照食（ 0 ％），魚

合食で IL-4産生量が減少傾向だった．すべての細胞（PP，油配合食（2.4％），コーン油配合食（2.4％）の実験群そSPL，MLN）の 活 性 化 T 細 胞（CD4＋CD45RBloCD69hi，

れぞれにおいて，食物アレルギーの誘導を行う卵白食群

CD4＋CD62LloCD44hi）
発現はコーン油配合食，魚油配合食，とカゼイン食群を設定した．異なる脂肪配合比率の高脂対照群の順に高値を示す傾向が見られた．

肪食（カゼイン食）を，それぞれ 4 週間自由摂取させ，以上のことから，魚油の摂取によりマスト細胞の脱その後さらに，それぞれの脂肪配合比率にてカゼイン食顆粒抑制が誘導されること，また，活性化 T 細胞の発または卵白食を 2 週間投与する実験系に分け，自由摂取

現は対照群に比べ増加したが，IL-4産生量が対照食にさせた．卵白食による OVA 食餌抗原の感作の影響を解比べ抑制されたことから，Th2への分化抑制が示唆さ析するために，各実験群のマウスより小腸パイエル板

れた．異なる脂肪酸の摂取は腸管内での脂肪酸代謝に（PP），脾臓（SPL），腸間膜リンパ節（MLN）を採取・も影響を与えている可能性があり，腸内環境因子にも調製し，OVA（ 1 mg/mL）と72時間共培養し，培養上注目した解析を行っている．

清中のサイトカイン（IL-4）量の測定（ELISA 法）を行っ

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

The composition of dietary fatty acids alter intestinal immune responses induced
by dietary antigen
MIWA YOSHIMURA, MASATO TSUDA and AKIRA HOSONO
Department of Food Bioscience and Biotechnology, College of Bioresource Sciences, Nihon
University, Fujisawa
In this study, we investigated the effects of different composition of dietary fatty acids on antigenspecific immune responses and inflammatory responses involved in food allergy. Ovalbumin (OVA)specific T cell receptor transgenic OVA23-3 mice were used as a model of food allergy. Mice were fed
ad libitum an experimental casein-based diet containing either fish oil (n-3 rich) or corn oil (n-6 rich) orcontrol without fish oil and corn oil for 4 weeks, and then these groups were further divided into two
experimental groups which were fed either an egg-white based diet (to induce food allergy) or a caseinbased diet for 2 weeks. Peyer's patches (PP), mesenteric lymph nodes (MLN), and spleen (SPL) werecollected and co-cultured with OVA (1 mg/mL) for 72 hours. The amount of cytokine (IL-4) in theculture supernatant was measured by ELISA. T cell phenotypes from each tissue were measured using
flow cytometry. Blood samples were collected and measured mouse mast cell protease-1 (mMCP-1), a
marker of intestinal mast cell degranulation using ELISA.
There was a significantly lower level of mMCP-1 in serum of fish oil diet group compared to control
group suggesting suppression of degranulation of intestinal mast cells. In addition, fish oil group had anincreased activated T cells but reduced IL-4 production from PP, MLN, and SPL cells compared tocontrol group. These findings suggest oral intake of fish oil suppress the differentiation of Th2 cells infood allergy.

47Vol. 53 No. 2, 2023

薬剤耐性プラスミドの接合伝達に対するフラボフォスフォリポールの活性評価
工藤

逸美＊，＊＊

木村 淳一郎＊
高橋 志達＊＊

福田 昭＊
臼井 優 *

岡健太郎＊＊（＊酪農学園大学 獣医学群 食品衛生学ユニット，＊＊ミヤリサン製薬株式会社 研究開発本部 研究部）

Ⅰ．背景

達が抑制されるのかを in vitro で評価した．さらに糞便

薬剤耐性（AMR）は One Health で制御すべき公衆の16S メタゲノム解析及び GC-MS メタボロミクス解析

衛生上の重要な課題である．薬剤耐性遺伝子（ARGs）

を組み合わせ，FV が菌叢に与える影響を評価した．最の水平伝達は，薬剤耐性菌（ARB）の伝播・拡散の主後に FV の接合伝達阻害作用の機序解明のため，網羅

要なメカニズムであり，中でも ARGs がコードされた的に転写物を評価する RNA シーケンス（RNA-seq）

プラスミドの接合伝達は菌種を超えて高頻度に起きる解析を FV 存在下，非存在下で実施した．

ことが報告されている．フラボフォスフォリポール
（FV）は日本を含む諸外国において豚，鶏，牛などのⅢ．結果，考察，結論

生産性を向上させる目的で抗菌性飼料添加物として指獣医療で使用頻度の高い DOXY 単体投与区で TC 耐

定されているが，細菌の接合伝達阻害作用を併せ持つ性大腸菌の分離率は顕著に上昇したが，FV を併用したことが報告されている．本研究では，実際の畜種の腸区においてその分離率は対照区と同程度であり，TC 耐

管内において，FV が ARB/ARGs の制御に有用である性に寄与する遺伝子である tetA のコピー数も培養法とか否かを調査するとともに，糞便中の菌叢と代謝物の同様の動態を示した．一方，分離された TC 耐性大腸

動態を明らかするために，豚を用いた in vivo 試験を実菌自体に対する FV の接合伝達阻害作用は，プラスミ

施した．

ドのレプリコン型によってその作用の程度が異なった．
16S メタゲノム解析及び GC-MS 解析の結果，FV 投与

Ⅱ．材料と方法

区に特徴的な細菌（Megasphaera や Streptococcus 属細菌）

供試豚は，酪農学園大学附属農場で肥育された三元が検出され，これらの細菌と複数の代謝物が相関して交雑種（LWD）20頭を用いた．試験区分として，対照区，

変動していることを明らかにした．また RNA-seq 解析

ドキシサイクリン（DOXY）単体投与区，FV 単体投の結果，プラスミドの複製に関与している酵素である

与区，DOXY 及び FV 併用区を設け，平均体重及び性

リラクサーゼをコードする traI 遺伝子の発現量が FV別が等しくなるように 5 頭ずつ配分した．抗菌性物質

曝露により有意に減少していた．以上より，FV は実際は指定された最大濃度を使用した．飼養36日目より出の畜種の腸管内においてプラスミドに依存する ARGs

荷直前150日目まで経時的に糞便を採取し，糞便中のテの拡散を阻害している可能性が示された．

トラサイクリン（TC）耐性大腸菌の菌数および ARGs
を，それぞれ培養法と qPCR により定量した．また分（会員外共同研究者：臼井優，福田

離した TC 耐性大腸菌が実際に FV の存在下で接合伝

酪農学園大学

食品衛生学ユニット）

獣医学群昭，木村淳一郎；

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

The dynamic changes of antimicrobial-resistance bacteria and fecal microbiome
using flavophospholipol as the feed Additives.
HAYAMI KUDO*,**, JUNICHIRO KIMURA*, AKIRA FUKUDA*, KENTARO OKA**,
MOTOMICHI TAKAHASHI** and MASARU USUI**Department of Health and Environmental Sciences, School of Veterinary Medicine, Rakuno
Gakuen University, Ebetsu,**Research Department, R&D Division, Miyarisan Pharmaceutical Co., Ltd., Saitama[Background]
Flavophospholipol (FV) is an antimicrobial that is used as a feed additive for poultry, piglets, andcattle in some countries. FV was known to have an inhibitory effect on bacterial cell wall synthesis as
well as on plasmid transfer harboring antimicrobial resistance genes (ARGs). To clarify whether the useof FV can reduce the ARGs transfer in the animal intestine, in vivo experiment was performed in thepresence of doxycycline (DOXY), belonging to the tetracycline (TC) class.
[Methods]
Pigs were equally and randomly divided into 4 experimental groups (Control group, DOXY group, FVgroup, and FV-DOXY group) with 5 pigs per pen. The fecal samples from each group of pigs werecollected before and after antimicrobial treatment. The number of TC-resistant E. coli and tetA genes infecal samples was quantified using culture methods and qPCR, respectively. In addition, intestinal
microbiota and their accompanying metabolite were analyzed by 16S rRNA sequencing and GC-MS
analysis.
[Results]
DOXY alone sufficiently induced TC resistance, while FV combined with DOXY did not alter
detection levels in both ARB (TC-resistant E. coli) and ARG (tetA gene) as well as the non-treated control
group. Moreover, FV in-feed partially increased the generally recognized beneficial bacteria.
[Conclusion]
These results suggested that using FV in - feed could be one possible solution to address thedissemination of plasmid-mediated ARGs.

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Vol. 53 No. 2, 2023

酪酸による T 細胞を介した抗腫瘍免疫応答の誘導
山田

要

裕貴

丹羽

みずほ

北原

秀悟

岡

健太郎

（ミヤリサン製薬株式会社 研究開発本部）

林

篤史

高橋

志達

旨：Clostridium butyricum MIYAIRI588（CBM588）は酪酸産生菌の一種で，免疫調節作用や抗炎症作用を有している．近年，腸内細菌が免疫チェックポイント阻害剤（ICI）の効果に影響を与えることが明らかにされつつあり，CBM588もがん患者における ICI の治療効果を高める可能性が示唆されている．しかし，CBM588が抗腫瘍免疫応答に及ぼす正確なメカニズムは不明である．本研究では，CBM588の産生する主要代謝物である酪酸に着目し，酪酸が抗腫瘍免疫応答に及ぼす影響を検証した．その結果，in vitroと in vivo どちらにおいても，酪酸はマウス T 細胞からの IFN-γや TNF-αなどのサイトカイン産生を誘導することが分かった．また酪酸は，他の免疫細胞を介してではなく，T 細胞に直接作用することでこれらのサイトカインの産生を誘導することが示された．以上のことから，CBM588が産生する酪酸が宿主の免疫応答を活性化し，抗腫瘍効果をもたらす可能性が示唆された．
キーワード：腫瘍，腫瘍免疫，腸内細菌，酪酸，T 細胞

I．背景と目的

CBM588が抗腫瘍免疫に及ぼす影響を検証することを免 疫 チ ェ ッ ク ポ イ ン ト 阻 害 剤（ICI：Immune
Checkpoint Inhibitors）は，抗腫瘍免疫応答を改善する目的とし，CBM588の主要代謝産物である酪酸と抗腫
瘍免疫についてマウスを用いて検討した．

ことにより抗腫瘍効果を示すが，奏効率が10-40％程度に留まることが治療上の課題となっている．近年，特定の腸内細菌や腸内細菌由来代謝産物が ICI の治療効果に影
1-4）

II．材料と方法
SPF 環境下で飼育した 7 - 8 週齢の C57BL6/N マウス．例から脾細胞を単離し，抗マウス CD3/28抗体刺激下にえば，腫瘍モデルマウスに Bifidobacterium pseudolongumて，様々な濃度の酢酸ナトリウム，酪酸ナトリウム，あるいは Akkermansia muciniphila を ICI と併用投与する

乳酸ナトリウムを添加し 3 日間培養した．その後，免

1-2）

．

疫細胞の変化をフローサイトメーターで解析した．培

Bifidobacterium pseudolongum は自身が産生した代謝物

養上清中のサイトカインは ELISA で測定した．また，であるイノシンが CD4陽性 T 細胞を活性化することで，酪酸の T 細胞への直接的な影響を確認するため，CD4

また，Akkermansia muciniphila は樹状細胞からの IL-12あるいは CD8陽性 T 細胞を脾細胞から単離し，同様の産生を誘導し CD4陽性 T 細胞を活性化することで，そ試験を実施した．次に，マウス生体内での酪酸の効果の効果を示すと考えられている．Clostridium butyricumを確認するため，マウスに滅菌水もしくは，酪酸のプ

MIYAIRI588（CBM588）は主要代謝産物である酪酸やロドラッグであるトリブチリン（ 3 g/kg）を 3 日間経菌体成分を介して宿主の免疫応答に影響を与えること口投与した後，脾臓中の IFN-γ産生細胞をフローサイが知られているが，2022年に米国にて実施された，転トメーターで解析した．

響を及ぼすことが次々と明らかとなりつつあると，その治療効果が高まることが報告されている移性腎細胞がん患者を対象とした ICI との併用療法による医師主導第Ⅰ相臨床試験の結果が報告された 5 ）．

III．結果と考察

この試験では CBM588と ICI を併用投与することによ

CBM588の産生する主要な有機酸である酪酸，酢酸，

り，ICI 単独投与と比べ，無増悪生存期間が有意に延長

乳酸がマウス脾細胞へ与える影響を確認したところ，される可能性が示唆された．しかしながら，その詳細

酪酸で刺激した場合のみ IFN-γ及び TNF-αの産生がな作用メカニズムは不明である．そこで本研究では，有意に増加し，その産生量は刺激した酪酸の濃度の上

50

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

昇に伴い増加した．加えて，これらのサイトカインのIFN-γ及び TNF-α産生性の CD8陽性 T 細胞の割合が主要な産生細胞をフローサイトメーターで解析したと有意に増加した．

ころ，IFN-γ産生性の CD4陽性 T 細胞及び CD8陽性 T

本研究では，in vitro および in vivo において，酪酸が細胞の割合が有意に増加した．次に，酪酸の T 細胞へ

T 細胞からの IFN-γ及び TNF-αの産生を誘導することの直接的な作用を検証するため，マウス脾細胞からが示された．これらの結果から，CBM588は自身の産CD4陽性 T 細胞と CD8陽性 T 細胞を単離し，酪酸で刺生する酪酸を介して T 細胞からの IFNγ - や TNF-αの激後にフローサイトメーターで解析した．その結果，産生を促進することで，ICI の治療効果を高める可能性

IFN-γ産生性の CD4陽性 T 細胞及び CD8陽性 T 細胞が示唆された．今後は CBM588の培養上清や菌体成分の割合が有意に増加したことから，酪酸は T 細胞に直を用いた抗腫瘍免疫応答を検討し，さらなる作用機序

接作用し，IFN-γの産生を誘導することが示された．

を解明していくことが必要である．

さらに，マウス生体内における酪酸の作用を検証するため，マウスに滅菌水あるいはトリブチリンを 3 日間

IV. 結論経口投与し，脾臓における免疫応答をフローサイトメー

酪酸は CD4陽性 T 細胞及び CD8陽性 T 細胞に直接ターで解析した．酪酸は経口投与をするとその大部分

作用し，これらの細胞からの IFN-γと TNF-αの産生をが消化管で吸収されてしまうことから，酪酸のプロド

誘 導 す る こ と が 明 ら か と な っ た． こ の 結 果 か ら，

ラックであるトリブチリンを実験に用いた．その結果，

CBM588は酪酸を介して ICI の治療効果を増強する可コントロール群と比較し，トリブチリン投与群では能性が示唆された．

Vol. 53 No. 2, 2023

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Butyrate promotes the anti-tumor immune response in mice
YUKI YAMADA, MIZUHO NIWA, SYUGO KITAHARA, KENTARO OKA,
ATSUSHI HAYASHI and MOTOMICHI TAKAHASHI
Research and Development Division, Miyarisan Pharmaceutical Co., Ltd., Saitama[Background]
Clostridium butyricum MIYAIRI588 (CBM588), a strain of butyrate-producing bacteria, possesses
immunoregulatory and anti-inflammatory properties. Studies have shown that the gut microbiome and its
metabolites affect the efficacy of immune checkpoint inhibitors (ICIs), and it is suggested that CBM588
may also enhance the therapeutic efficacy of ICIs in cancer patients. However, little is known about the
precise mechanism of CBM588 on the antitumor immune response.
[Methods]
1) Splenocytes isolated from C57BL6/N mice were cultured with various concentrations of acetate,butyrate, lactate for three days under anti-CD3/28 stimulation. The production of IFN-γ/ and TNF-α
were analyzed by flow cytometry and ELISA. 2) To confirm the direct effect of butyrate on CD4 andCD8 positive T cells, sorted CD4 or CD8 positive T cells were stimulated with butyrate and immune
cells were analyzed. 3) Tributyrin, which elevates the concentration of butyrate in the gut, wasadministered to mice daily for three days, and cytokines production was analyzed.
[Results]
1) The frequency of IFN-γ in the splenic T cells was significantly increased when stimulated withbutyrate. 2) Both CD4 and CD8 positive T cells, not other immune cells, in the splenocyte significantly
increased the frequency of IFN-γ in response to butyrate. 3) Tributyrin treatment significantly increased
the frequency of IFN-γ and TNF-α in CD8 positive T cells.
[Conclusion]
Here, we demonstrated that butyrate promotes the antitumor immune response in mice. Given that
CBM588 can produce a robust amount of butyrate, we speculate that butyrate produced by CBM588
may activate the host immune response, resulting in antitumor effects.
Keywords:Tumor, Tumor immunity, Microbiota, Butyrate, T cell

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TRENT, J., TAKAHASHI, M., OKA, K., HIGASHI, S., KORTYLEWSKI, M., HIGHLANDER, S.K.
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53

Vol. 53 No. 2, 2023

原 稿 執 筆 要 綱
1 ．一般演題の演者と共同発表者は本学会員とします．未入会の方は本学会事務所へ入会申込をしてください．無菌生
物学・ノートバイオロジーに関する新しい知見を有する研究で，未発表のものに限ります．本誌への掲載の可否は編集委員会の審査を経て決定します．編集委員会は加除修正を行うことがあります．掲載論文等の著作権は，本学会に帰属し，当該論文の全部または一部を本学会が認めたネットワーク媒体，その他の媒体において，任意の言語
で，掲載，出版（電子出版を含む）できるものとします．
2 ．原著・総説については英文 Guideline for Authors B をご参照ください．
注1

電子データを下記アドレス宛にお送りください．
日本無菌生物ノートバイオロジー学会事務所
jagg@ciea.or.jp

注2

略語（abbreviation）は初出のところに「略さない語」full term をお示しください．

例）
1 ．演 題 気管支喘息への肺炎マイコプラズマ感染の影響
2 ．発表者 蔵田 訓 田口晴彦＊ 大㟢敬子 花輪智子 米澤英雄 神谷 茂
3 ．所 属 （杏林大学医学部感染症学講座，＊同保健学部免疫学）
4 ．和文要旨（400字）
肺炎マイコプラズマ感染は気管支喘息の増悪因子の……
5 ．キーワード（ 5 項目）
気管支喘息，肺炎マイコプラズマ，無菌マウス，動物モデル，……
6 ．和文抄録 （2000字）
Ⅰ．目的（はじめに，背景，……）
Mycoplasma pneumoniae（M. pneumoniae）は学童から青年……
Ⅱ．材料（対象）
実験動物として BALB/c マウス（雄， 5 週齢）と IQI 系……
Ⅲ．方法
感作初日に M. pneumoniae M129株を超音波により……
Ⅳ．結果
BALB/c マウスの血清中 OVA 特異的 IgE 濃度は……
Ⅴ．考察
M. pneumoniae 菌体抗原による感作は……
Ⅵ．結論
M. pneumoniae ノートバイオート肺炎モデルの肺内サイトカインの検討より……
Ⅶ．謝辞
7 ．表，図・写真（ 5 点以内） Table 1．Figure 1．……とし，本文中に入る場所を示してください。タイトル，説明および表・図中の文字は英語にしてください。図・写真は，中の文字をふくめ，そのままオフセッ
ト印刷できる原図にしてください。カラー印刷も可。
8 ．英文演題 The effect of Mycoplasma pneumoniae infection on asthma model in mice
9 ．英文発表者（フルネーム，大文字） SATOSHI KURATA, HARUHIKO TAGUCHI*, TAKAKO OSAKI, TOMOKOHANAWA, HIDEO YONEZAWA and SHIGERU KAMIYA
10．英文所属 Department of Infectious Diseases, Kyorin University School of Medicine, Mitaka*Department of Immunology, Faculty of Health Sciences, Kyorin University, Hachioji
11．英文抄録（250 words）
Mycoplasma pneumoniae infection is known as one of the factors deteriorating asthma.……
12．英文キーワード（5項目）
Keywords: asthma, Mycoplasma pneumoniae, germfree mouse, animal model...

54

無菌生物 J. germfree life gnotobiol.
13．引用文献 References は引用順に番号をつけ，本文の引用場所に右肩付けとする．著者（全著者名，大文字），
表題，雑誌・図書の名称（イタリック），巻数（太字），頁数（最初と最後），年の順に記載する．
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83, 1992.
3 ．SAKAGAMI, T., FUKUDA, Y., TAMURA, K., TANIDA, N. & SHIMOYAMA, T.: Does Helicobacter pylori
promote gastric carcinogenesis? J. germfree life gnotobiol., 31, 25­26, 2001. (in Japanese)
14．連絡先 〒181-8611 東京都三鷹市…… 蔵田 訓
15．TEL（0422）47-…… 内線……
16．FAX（0422）44-……
17．E­mail kurata@……

3 ．倫理指針：ヒトを対象とした研究は「ヘルシンキ宣言」（World Medical Assembly，1964年，2013年追加），人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針に従って行われ，動物を用いた研究は「実験動物の飼養および保管
ならびに苦痛の軽減に関する基準」（平成18年環境省告示第88号）に従って行われ，倫理委員会等で承認されたものでなければならない．

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Vol. 53 No. 2, 2023

Guideline for Authors
A. Annual meeting proceedings
I. Proceeding manuscripts (oral presentations)
1. Authors and all co­authors must be members of the Japanese Association of Germfree Life and Gnotobiol­ogy (JAGG). Papers submitted for review must convey new unpublished findings from studies in germfree
research or gnotobiology. Manuscripts are accepted for publication following review by the Editorial andPublications Committee. Please prepare manuscripts according to the instructions below, with reference tothe printing sample available through our website.
2. Manuscripts are accepted in both English and Japanese. However, in the case of Japanese papers, the infor­
mation carried in the title page, abstract, and key words must also be duplicated in English. All titles and legends
to tables, figures, and photos, as well as the reference list must be prepared in English regardless ofwhether the papers are prepared in English or Japanese.
The title page of the manuscript should carry manuscript title, name of authors and affiliations, postal ad­
dress, zip code, phone, fax, and e­mail address of the corresponding author.
Begin the manuscript on page two, starting with abstract (within 250 words), five key words, and text (2000words), in the order of: I) Objective (or Introduction), II) Materials (or Subjects), III) Methods, IV) Results,
V) Discussion, VI) Conclusion, VII) Acknowledgments (if any), References, and a maximum of 5 figures,tables, or photos in total.
3. An electronic copy in MS­Word format, tables and figures may be incorporated into the Word file, submitted
as separate Excel or PowerPoint files, or as jpg, pct, eps, or tif images adjusted to actual printing size. Tables
and figures should each be numbered consecutively in Arabic numerals (Table 1, Figure 1), with a title fortables and descriptive legends for figures. The location of tables and figures in the text should be indicated in
the margin of the typescript. Each table and figure should be printed on a separate sheet of paper. The manu­
scripts in the journal are generally printed in black and white. However, if the authors prefer color printing of
figure (s) in the manuscript, additional page charge will be added.
4. Abbreviations must be preceded by the full term at first mention. Use standard units of measure such as: m,
cm, mm, μm, nm, l, ml, μl, kg, g, mg, μg, ng, pg.
5. References should be cited in the text using superscript Arabic numbers, in order of appearance. In the refer­ence list, the references should be numbered, followed by authors (all authors in full, all capitals), title, journalname (italicized, abbreviated according to Index Medicus), volume (boldface), page numbers (first andlast), and year of publication.
Example:1. TAGUCHI, H., TAKAHASHI, M., YAMAGUCHI, H., OSAKI, T., KOMATSU, A., FUJIOKA,Y. &KAMIYA, S.: Experimental infection of germfree mice with hyper­toxigenic enterohaemorrhagic
Escherichia coli O157:H7, strain 6. J. Med. Microbiol., , 336­343, 2002.
2. LINDAHL, G., HEDEN, L­O. & STENBERG, L. : Streptococcal IgA receptors. In: Molecular
recognition in host-parasite interactions, Edited by KORHONEN, T. K., MAKELA, P. H. & HOVI,
T. New York, Plenum Press, pp.77­83, 1992.
3. SAKAGAMI, T., FUKUDA, Y., TAMURA, K., TANIDA, N. & SHIMOYAMA, T.: Does Helicobacter pylori promote gastric carcinogenesis? J. germfree life gnotobiol., , 25­26, 2001. (in Japanese)
6. Manuscripts should be sent by E­mail to jagg@ciea.or.jp.
7. Copyright of manuscripts accepted for publication will become the property of the Japanese Association ofGermfree Life and Gnotobiology (JAGG).
8. The JAGG retains the right to publish accepted manuscripts in part or full in any network or other media
recognized by the Association, in any language (including electronic publishing).
B. Original articles and reviews
I. Original articles
1. Submission of manuscripts to this journal is limited to members of the Japanese Association of Germfree Lifeand Gnotobiology (JAGG) or the International Association for Gnotobiology (IAG), based on material pre­sented at the annual meeting of the JAGG or International Symposium for Gnotobiology.
2. Papers submitted as original articles must convey unpublished findings and conclusions of note from innova­
tive studies capable of contributing to the development of germfree research or gnotobiology.
3. Acceptance of manuscripts for publication will be judged by the Editorial and Publications Committee andreferees.
4. Orginal articles must be prepared in English throughout, in accordance with the instructions for proceeding
manuscripts above, with the exception that there is no limitation in word count or number of tables, figuresand photos.

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無菌生物 J. germfree life gnotobiol.

II. Reviews
1. Reviews are accepted in either English or Japanese as invited papers as a rule, to be prepared in accordancewith instructions for oral presentation manuscripts.
C. Ethical guidelines
Study protocol must have obtained approval by an appropriate institutional Ethics Committee. Studies on humansubject must also conform to the provisions of the Declaration of Helsinki (as revised in Brazil 2013, Ethical
Guidelines for Clinical Research 2015 Ministry of Health, Labour and Welfare Public Notice 415), and the Eth­ical Guidelines for Epidemiological Research. Animal studies must conform to the Standards for the Rearing,
Housing, and Alleviation of Pain of Experimental Animals (2006 Ministry of the Environment Public Notice 88).
Compliance with these guidelines must be stated within the text of original articles.

CONTENTS
REVIEW
Association of intestinal fibrosis and gut microbiota in Crohn’s disease
Jin Imai et al.

23

SCIENTIFIC PROCEEDINGS OF THE JAPANESE ASSOCIATION
Breeding of germ-free mice using an Individually Ventilated Caging System
Tomoyuki Ishikura et al.

30

Chronic nasal inflammation during lactation period induces transient dysbiosis of gut microbiota in mice
Hinami Asano et al.

32

Dietary supplementation of fermented wheat bran alleviates DSS-induced colitis in mice by increasing fecal SCFA content
Afifah Zahra Agista

35

Contrast enhanced X-ray imaging of the cecum in germ-free common marmosets
Takashi Inoue

37

Anatomical evaluation of the germ-free microminipig using a novel long-term pig rearing isolator
Masayoshi Otake

39

IgA response to pathobiont in inflammatory bowel disease and its clinical application
Jin Imai et al.

41Comparison of aggressive behavior characteristics by dysbiosis of commensal gut microbiota
Kyuta Hanawa et al.

43

The composition of dietary fatty acids alter intestinal immune responses induced by dietary antigen
Miwa Yoshimura et al.

45

The dynamic changes of antimicrobial-resistance bacteria and fecal microbiome using flavophospholipol as the feed Additives.
47
Hayami Kudo et al.
Butyrate promotes the anti-tumor immune response in mice
Yuki Yamada et al.

49

GUIDELINE FOR AUTHORS
Guideline for authors

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