コモンマーモセット及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスを用いた臨床薬物動態予測
Prediction of Clinical Pharmacokinetics Using Common Marmoset
and Hu-liver TK-NOG Chimeric Mice

令和 5 年度
論文博士申請者
松本 渉吾(Matsumoto, Shogo)目次
緒言 .................................................................................................................... 7
1

第一章: コモンマーモセットを用いたヒト PK パラメータ予測及び毒性
試験動物種としての有用性評価 ................................................................ 10

1.1 序論 ............................................................................................................. 10
1.2 方法 ............................................................................................................. 10
1.2.1

試薬 ....................................................................................................... 101.2.2

実験動物及び実験試料 ......................................................................... 101.2.3

投与及び試料採取 ................................................................................ 11

1.2.4

LC-MS/MS 分析 .................................................................................... 11

1.2.5

PK 解析 ................................................................................................. 12

1.2.6

SSS 手法によるヒト CLtot 及び Vd 予測 .............................................. 13

1.2.7

Wajima アプロ―チによるヒト T 1/2 予測 .............................................. 13

1.2.8

Valsartan の in vitro 代謝評価 ............................................................... 14

1.3 結果 ............................................................................................................. 15
1.3.1

血漿中濃度及び PK パラメータ ........................................................... 15

1.3.2

SSS 手法及び Wajima アプローチによるヒト CLtot 、Vd 及び T 1/2 予測……………………………………………………………………………….. 17

1.3.3

Valsartan の in vitro 代謝物の動物種差 ................................................ 18

1.3.4

Valsartan 経口投与後の 4-Hydroxyvalsartan の血漿中濃度 .................. 20

1.4 考察 ............................................................................................................. 21
1.5 小括 ............................................................................................................. 25
2

第二章: ヒト化肝臓 TK-NOG マウスを用いた補正 PBS 手法によるヒト
CLh 予測 ...................................................................................................... 262

2.1 序論 ............................................................................................................. 26
2.2 方法 ............................................................................................................. 26
2.2.1

試薬 ....................................................................................................... 26

2.2.2

実験動物及び実験試料 ......................................................................... 27

2.2.3

fu,p 及び Rb 評価 .................................................................................. 28

2.2.4

In vitro 代謝活性評価 ............................................................................ 29

2.2.5

投与及び試料採取 ................................................................................ 31

2.2.6

LC-MS/MS 分析 .................................................................................... 32

2.2.7

PK 解析 ................................................................................................. 34

2.2.8

SSS 手法によるヒト CLh 予測 .............................................................. 34

2.2.9

補正 PBS 手法によるヒト CL h 予測 ..................................................... 34

2.2.10

予測精度解析 ..................................................................................... 35

2.3 結果 ............................................................................................................. 36
2.3.1

fu,p 及び Rb ........................................................................................... 36

2.3.2

In vitro 代謝活性 ................................................................................... 37

2.3.3

血漿中濃度及び PK パラメータ ........................................................... 39

2.3.4

SSS 手法及び補正 PBS 手法によるヒト CLh 予測 ............................... 41

2.4 考察 ............................................................................................................. 45
2.5 小括 ............................................................................................................. 49
3

第三章: コモンマーモセット及びヒト化肝 臓 TK-NOG マウスと汎用動物
種とのヒト PK パラメータ予測精度比較 ................................................. 50

3.1 序論 ............................................................................................................. 50
3.2 方法 ............................................................................................................. 50
3.2.1

試薬 ....................................................................................................... 50
33.2.2実験動物 ............................................................................................... 50

3.2.3

投与及び試料採取 ................................................................................ 50

3.2.4

LC-MS/MS 分析 .................................................................................... 51

3.2.5

PK 解析 ................................................................................................. 51

3.2.6

SSS 手法によるヒト CLh 及び Vd 予測 ................................................ 51

3.2.7

ヒト化肝臓キメラマウスを用いた SSS 手法によるヒト Vd 予測 ..... 52

3.2.8

コモンマーモセットを用いた SSS 手法によるヒト CLh 及び Vd 予測……………………………………………………………………………….. 52

3.2.9

予測精度解析 ........................................................................................ 52

3.3 結果 ............................................................................................................. 53
3.3.1

血漿中濃度及び PK パラメータ ........................................................... 53

3.3.2

SSS 手法によるヒト PK パラメータ予測 ............................................ 55

3.3.3

ヒト PK パラメータ予測精度比較 ....................................................... 59

3.4 考察 ............................................................................................................. 60
3.5 小括 ............................................................................................................. 64
4

総括 ............................................................................................................. 64

5

謝辞 ............................................................................................................. 65

6

参考文献 ..................................................................................................... 66

4

略語一覧
AAFE

Absolute average fold error

ACN

Acetontrile

AUC

Area under the plasma concentration time curve

BW

Body weightcKO

Conditional knock-out

CL

Clearance

CLh

Hepatic clearance

CLr

Renal clearance

CLtot

Total clearance

CYP

Cytochrome P450

C max

Maximum plasma concentration

DMSO

Dimethyl sulfoxide

EM

Extensive metabolizer

FDA

Food and Drug Administration

HPLC

High performance liquid chromatography

ICH

International Council for Harmonisation of TechnicalRequirements for Pharmaceuticals for Human Use

LC-MS/MS

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LW

Liver weight

MRM

Multiple reaction monitoring

MRT

Mean residence time

PBS

Physiologically based scaling

PK

Pharmacokinetics
5

PM

Poor metabolizer

POR

P450 oxidoreductase

QTOF

Quadrupole time-of-flight

RI

Replacement index

SSS

Single species scaling

TK-NOG

NOD/Shi-scid IL2 receptor gamma–null mice expressing a herpes
simplex virus type-1 thymidine kinase transgene

UGT

UDP-glucuronosyltransferase

uPA/SCID

Urokinase-type plasminogen activator / severe combind
immunodeficient

Vd

Volume of distribution

6

緒言
創薬研究においてヒトにおける薬物動態 (Pharmacokinetics, PK) パラメー
タ (以下、ヒト PK パラメータ) の予測は、開発化合物の選定、毒性試験並び に 第 I 相 臨 床 試 験 の 設 計 に 大 き く 貢 献 す る 1) 。 中 で も 、 ク リ ア ラ ン ス(Clearance, CL) 及び分布容積 (Volume of distribution, Vd) は生体における薬物曝露量を規定する重要な因子であるため、予測の意義は大きい。
ヒト PK パラメータの予測手法は経験的予測手法と理論的予測手法に大別され、前者には実験動物の in vivo PK パラメータに基づくアロメトリックス
ケーリング手法 (以下、アロメトリー手法 ) が、後者にはヒト試料を用いた
in vitro-in vivo extrapolation 手法や生理学的薬物速度論モデリング＆シミュ
レーション手法 があ る。 2011 年の米国 研究製薬工業協 会に よる大規模な ヒ
ト PK パラメータ予測手法の比較調査によると、CL 及び Vd ともに、後者と比較して前 者によ る 予測精度が やや優 れ ていること が報告 さ れている 2)-3) 。
アロメトリー手法とは、ヒトを含む様々な動物種の間に認められる、体重と 基 礎 代 謝 量 等 の 生 理 学 的 諸 量 と の 相 関 関 係 (い わ ゆ る ア ロ メ ト リ ー 則 )をヒト PK パラメータ予測に利用する手法であり、古くから実践されてきた
4)。また、近年では動物種間の肝血流量や組織容積の違い、化合物の分子量や 血漿 タ ン パ ク非 結 合 形 分 率 (fu,p) 等 で 補正 す る 改 良型 ア ロ メト リ ー 手法も開発され、予測精度が向上しつつある。例えば、 CL についてはラット、イヌ及びサルから得られたアロメトリックスケーリング指数 (以下、スケー
リング指数) をラット及びヒトの fu,p で補正する Fraction Corrected Intercept
Method 手法が、Vd についてはラット、イヌ及びサルの生理学的な組織容積、組織中非結合形 分率及びヒト fu,p を利用する Oie-Tozer 手法が高い予測精度を有することが報告されている 5) 。しかしながら、これらの予測手法はいず
7

れも 3 種の実験動物から得た in vivo PK パラメータを利用する手法であるため、数多くの化合物について使用できる方法ではない。一方、単独動物種によるヒト PK パラメータ予測手法である Single Species Scaling (SSS) 手法も検討されており、ラット、イヌまたはサルを用いた SSS 手法の中では、サルを用いた場合に CL 及び Vd を良好に予測できることが報告されている 6) 。
しかし近年、抗体医薬品や核酸医薬品を中心にヒト特異性が高いバイオ医薬品の研究開発が活発となり、ヒトとの相同性の高いサルの需要が高 まってい
るため、入手が非常に難しい という課題がある 7)-8) 。
創薬研究は ターゲットバリデーション 、化合物最適化及び毒性試験の 3 つのフェーズから成り、このうち、化合物最適化フェーズは数百 から数千もの化合物の中から開発化合物を選抜するための最も期間を要するフェーズである。PK 評価の観点では、良好な代謝安定性や膜透過性等を有する化合物を取得するために、in vitro 及び in silico のハイスループットスクリーニング評価を実施し、次に、マウスやラット等のげっ歯類を用いた in vivo のスクリーニング PK 評価を実施する。その後、数個の有望な化合物に絞られた段階でイヌやサル等の非げっ歯動物種を用いた in vivo PK にて、ヒト PK パラ
メータ予測を行うことが一般的である。しかしながら、イヌやサルを用いた評価はマウスやラットと比較して入手に掛かる時間やコスト、必要合成量等の観点でスループット性が低い。このため、イヌやサルを利用した予測精度の高い手法 によりヒト PK パラメータを予測し、それらを比較しながら化合物最適化を行うことは現実的ではない。したがって、高いスループット性を有しつつ、単独動物種で 良好な ヒト PK パラメータ予測精度を有する新規動物種が求められている。
日米 EU 医薬品規制調和国際会議 (ICH) M3 の非臨床安全性評価ガイドラ8インによると、反復投与毒性試験においては、原則としてげっ歯類に加えて非げっ歯類を用いることが推奨されている 9) 。毒性試験においては、想定される投与経路を介して化合物及び主要代謝物が十分に生体に曝露された状
況にて毒性を明らかにする必要があるため、数百 mg/kg 単位の高用量 を 投与することも珍しくなく、非げっ歯類を用いた評価に必要な合成コストや準備期間が膨大となる 。したがって、イヌやサルと比較して小型な非げっ歯類
動物種を毒性試験に供する妥当性を主張することができれば、化合物最適化
フェーズから迅速かつ安価に毒性試験へと移行することができると考えられる。
以上の背景より、本研究では、近年 薬物動態研究への活用が期待されているコモンマーモセット及びヒト化肝臓キメラマウスについて、単独動物種によるヒト PK パラメータ予測精度を 評価するとともに、主要代謝物曝露の観点から毒性試験への適合性を検討し、化合物最適化フェーズにおいて有用な動物種であるかを検討した。

9

第一章: コモンマーモセット を用いたヒト PK パラメータ予測及び 毒性

1

試験動物種としての有用性 評価
1.1

序論

コ モ ン マ ー モ セ ッ ト (Callithrix jacchus) は 医 薬 品 の 薬 理 評 価 や 毒 性 評 価に利用される小型の霊長類であるが 、ヒト PK パラメータ予測研究における使用例は限 られてい る 10) 。本章では 、 コモンマー モセット が 高血圧治 療薬
Valsartan の毒性試験に利用されていることに着目し 、複数の サルタン系化合物をモデル化合物として 、ヒト PK パラメータ 予測精度を検証するとともに主要代謝物曝露の観点から Valsartan が毒性試験に供されたことについての妥当性を評価した。
1.2
1.2.1

方法
試薬

モデル化合物である Valsartan、Eprosartan mesylate、Losartan potassium 及び Telmisartan は、東京化成工業 (東京) から購入した。4-Hydroxyvalsartan は、Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX, USA) から購入した。その他の試薬
及び溶媒は分析用及び HPLC グレードを使用した。
1.2.2

実験動物及び実験試料

コモンマーモセットは日本クレア株式会社 (東京) より提供を受けた。本
研究に供したコモンマーモセットは Cytochrome P450 (CYP) 2C19 アイソザ
イムにおいて、p.[Leu7Phe, Leu254Ser, Ile469The] のヘテロ接合型アミノ酸配列を有しており、Extensive Metabolizer (EM) 表現型と Poor Metabolizer (PM)
表現型の中間の代謝活性を示す。
Sprague-Dawley ラ ッ ト 肝 細 胞(R3000.H15) 、 ビ ー グ ル 犬 肝 細 胞(D1000.H15A) 及 び カ ニ ク イ ザ ル 肝 細 胞 (P2000.H15) は 積 水 メ デ ィ カ ル 株
10

式会社 (東京) から購入した。また、ヒト肝細胞 (HC2-19) は積水メディカ
ル株式会社 (東京) より入手した。コモンマーモセット肝細胞は、雄性コモ
ンマーモセットより採取した肝臓を、Worthington Hepatocyte Isolation System(Worthington Biochemical Co., Ltd., Lakewood, NJ, USA) を用いて単離することにより取得した。
1.2.3

投与及び試料採取

コモンマーモセット への薬剤投与及び血液試料採取は、日本クレア株式会
社 (プロトコル番号 58-023YBF) 及び Meiji Seika ファルマ株式会社 (承認 号
C2021-008-0) の 動 物 実 験 倫 理 委 員 会 で 承 認 さ れ た プ ロ ト コ ル に 従 っ て 実 施した。
単回静脈内投与試験 (雄性、N=2 または N=3) においては 、 モデル化合物
4 種を 1%Tween80 及び 8% Dimethyl sulfoxide (DMSO) 含有生理食塩水に溶解し、 フリー体としてそれぞれ 0.2 mg/2.5 mL/kg となるように混合した上で尾静脈より カクテル 投与した。その後、10、30 分、1、2、4、8 及び 24 時間
後に大腿静脈 から血 液 を採取した 。 単回 経口投与試験 (雄性 、 N=1) では 、
0.1%Tween 80 及び 0.5%Sodium carboxymethylcellulose 水溶液にて懸濁した
Valsartan を 30 mg/10 mL/kg で投与した 後、15、45 分、2、4、8 及び 24 時間に大腿静脈から血液を採取し た。採取した血液 はヘパリン添加後、1200 × g
で 10 分間遠心分離 し、血漿試料として-20℃以下で保存 した 。
1.2.4

LC-MS/MS 分析

血漿試料 (5 µL) に、内部標準物質である Zonisamide を含む Acetonitrile(ACN) 溶液 (20 µL) を添加後、混合 し、遠心分離を行った。次に 、上清 (10µL) をポリプロピレン製バイアルに移し 、等量の Milli-Q 水を加え 、分析試
料とした。
11

液体クロマト グラフ ィー質量分析 法 (Liquid Chromatography-tandem Mass
Spectrometry, LC-MS/MS) 分析は、API QTRAP 5500 トリプル四重極質量分
析 計 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) と 連 結 し た Shimadzu
Nexera UHPLC シス テム (島津製作 所 , 京都) を用い て ネガ ティブ イ オン化
モードにて実施した。カラム (CAPCELL CORE ADME, 2.7 µm, 2.1 mm I.D.×50
mm, 大阪ソーダ, 大阪) は 40℃に保ち 、移動相は 0.1%ギ 酸水溶液 (A) 及びACN (B) とした。流速は 0.4 mL/min に設定し、 グラジエント 条件 (B%) は
次のように 設定した ： 0-0.5 分 20%、0.5-3.0 分 20-90%、3.0-3.5 分 90%、
3.5-5.0 分 20%。 標 的 分 析 物 の 検 出 と 定 量 は 、 Multiple Reaction Monitoring(MRM) モ ー ド で 行 っ た 。 最 適 化 さ れ た MRM transition は 、 Valsartan 、Eprosartan、Losartan、Telmisartan、4-hydroxyvalsartan 及び Zonisamide で、それぞれ m/z 434.1→179.0、m/z 423.2→379.1、m/z 421.1→179.1、m/z 513.2→469.2、
m/z 450.1→350.0 及び m/z 211.0→119.0 であった。
定量 値 は 、分 析 物 質 /内部 標 準 物 質 の ピ ーク 面 積 比を 用 い た 線形 回 帰 分析に よ り 決 定 し た 。 LC-MS/MS デ ー タ は 、 Analyst version 1.6.3 (AB SCIEX,
Framingham, MA, USA) を用いて処理した。
1.2.5

PK 解析

単回 静脈内投与後 の血漿中濃度推移 は 2-compartment モデルを用いて解析し た 。 す な わ ち 、 血 漿 中 濃 度 -時 間 推 移 曲 線 下 面 積 (Area under the plasma
concentration time curve, AUC) 、CLtot 、Vd 及び 平均滞留時間 (Mean residencetime, MRT) を 、 以 下 の 式 に よ り 計 算 し た 。 解 析 に は 、 Phoenix WinNonlin
software version 8.1 (Certara USA, Inc., Princeton, NJ, USA) を利用した。
C = A × exp (-α × t) + B × exp (-β × t)

(1-1)

k21 = (A × β + B × α) / (A + B)

(1-2)
12

k12 = α + β - k21 – α × β / k21(1-3)

AUC = A / α + B / β(1-4)

CLtot = Dose / AUC(1-5)

Vd = [Dose / (A + B)] × (1 + k12 / k21)

(1-6)

MRT = Vd / CL tot(1-7)

ここで、Dose は 投与量、C は血漿中濃度 、t は投与後 の時間であり、A、 B、
α 及び β は 2-compartment モデルにおけるマクロ PK パラメータである 。また、k21 及び k12 は 中心コンパートメントと末梢コンパートメント 間の 移行
速度定数である。
1.2.6

SSS 手法によるヒト CLtot 及び Vd 予測

ヒトにおける CLtot 及び Vd 予測値 は以下の式により計算した。
CLtot,human,pred = CL tot,marmoset × (BW human / BW marmoset ) ^ a(1-8)

Vd human,pred = Vd marmoset × (BW human / BW marmoset ) ^ b(1-9)

ここ で BW human と BW marmoset は ヒト 及 びコ モ ン マ ー モセ ッ トの 標 準種 体 重(それぞれ、70 kg 及び 0.35 kg） を示す。スケーリング指数 a 及び b は、
Hosea et al. (2009) の報告をもとに、固定指数 (a=0.75, b=1.0) を用いた 11) 。
1.2.7

Wajima アプロ―チによるヒト T 1/2 予測

T 1/2,human,pred は、静脈内投与後の 2-compartment モデルの β 相 (消失相） から推定した。Wajima et al. (2004) は、 濃度軸と時間軸をそれぞれ定 常状態濃度 (C ss = Dose/Vd) 及び MRT によって正規化した場合 に、異なる動物種であ っ ても血 漿中濃度 推移を 重ね 合わせる ことができ る と 報告 し ている 12) 。
本手法を式 (1-1) の基本的な 2-compartment モデル式に適用すると 、式 (110) のように変換される。

13

C pred =A × (C ss,human /C ss,marmoset ) × exp (-α × (MRT marmoset /MRT human,pred ) × t) +B × (C ss,human /C ss,marmoset ) × exp (-β × (MRT marmoset /MRT human,pred ) × t)

(1-10)

こ こ で 、 C pred は 動 物 種 間 で 共 通 の 予 測 血 漿 中 濃 度 を 示 し 、 C ss,human 及 び
MRT human,pred はヒトにおける定常状態濃度及びヒト MRT 予測値を 示す。β ×(MRT marmoset /MRT pred ) は、ヒトにおける β (β human,pred ) に相当するため 、消 失相における T 1/2,human,pred は以下のように算出することができる 。
β human = β marmoset × (MRT marmoset /MRT pred ) (1-11)
T 1/2,human,pred = Ln (2) /β human,pred
1.2.8(1-12)

Valsartan の in vitro 代謝評価

William’s E 培地 (Thermo Fisher Scientific) に溶解した Valsartan を、24 well
プレートにてラット 、イヌ、コモンマーモセット、カニクイザル及びヒト肝細胞 (4 × 10 6 cells/mL、1.0 mL/well) に最終濃度 100 µmol/L (1%ACN) で添加し、37℃、5％CO 2 及び 95％相対湿度 の条件で緩やかに振 とうしながら 4
時間インキュベートした。その後 、 氷冷 ACN 4.0 mL を加えて反応を終了させ、3000 × g で 10 分間遠心分離後 、上清を窒素気流下で蒸発 濃縮した。濃縮後の残渣を 25％ACN 水溶液 150 µL と混合し 、分析試料とした。
分析には、LC-四重極飛行時間 (Quadrupole time-of-flight, QTOF) -MS シス
テム(QTOF6530, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) を使用した 。

カ ラ ム (ZORBAX Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD, 1.2 µm, 2.1 mm
I.D.×100 mm, Agilent Technologies) は 40℃に保 ち、移動相は、0.1%ギ酸水溶
液 (A) 及び 0.1%ギ酸 ACN 溶液 (B) とした。流速は 0.3 mL/min とし 、グ ラ
ジ エ ント条件 (B%) は次のように設定し た : 0-18 分 15-50%、 18-19 分 5090％、19-23 分 90％。溶出液の UV 吸光度について は、210-400 nm の波長範14

囲を有するダイオードアレイ検出器を用いてモニターし 、ダイオードアレイ
検出器のデータから 、基準波長 360 nm、波長 254 nm の UV クロマトグラムを抽出 した。各動物種における Valsartan の代謝 物生成プロファイルは 、4 時
間イン キュ ベー ト 後 の 分析 試料の UV クロマ トグ ラム から 反応開 始直 後の分析試料 の UV クロマトグラムを差し引くことによ り評価し た。また、コ モ
ンマーモセットとヒトの主要代謝物である 4-Hydroxyvalsartan の生成は 、その保持時間を 4-Hydroxyvalsartan 標準品 と比較することで確認し た。ポジテ
ィ ブ 及 び ネ ガ テ ィ ブ イ オ ン 化 モ ー ド に よ る マ ス ス ペ ク ト ル 分 析 は 、 m/z 901000 のスキャン範囲 、スキャンレート 1.00 spectra/s で行い、装置とスキャ
ン源のパラメータは 次の通りであった: ガス温度 350℃、ガス流量 10 L/min、
ネブライザー50 psig、シースガス温度 350℃、シースガス流量 7.5 L/min、
VCap3500、ノズル電圧 1000 V、フラグメント 100。
1.3
1.3.1

結果
血漿中濃度及び PK パラメータ

Valsartan、Eprosartan、Losartan 及び Telmisartan は 、単回静脈内投与後 、二相性の推移で血漿中より消失しており 、それぞれ異なる消失速度を有していた (Figure 1-1) 。これらの血漿中濃度データより、2-compartment モデルに基づき Valsartan、Eprosartan、Losartan 及び Telmisartan の PK パラメータを算出したところ 、CL はそれぞれ 3.1、9.8、23.8 及び 25.6 mL/min/kg、Vd はそれぞれ 0.22、0.32、0.47 及び 9.96 L/kg であった (Table 1-1) 。

15

Figure 1-1 Plasma concentrations of the 4 model compounds after intravenous
administration to common marmosets. The marker correspondence is as follows:
eprosartan (open circle), losartan (closed circle), telmisartan (open diamond) andvalsartan (closed diamond). Data points are mean of two or three animals and error
bars represent SD.

Table 1-1 Observed pharmacokinetic parameters of the 4 model compounds
after intravenous administration to common marmosets.

Compoundβ(hr-1)

Eprosartana

0.48 ± 0.13b

Losartan

K12

K21

-1

(hr )

(hr-1)

0.31 ± 0.10

0.55 ± 0.15

AUC
CLtot
(µg*hr/mL) (mL/min/kg)
0.34 ± 0.03

9.8 ± 1.0

Vd
(L/kg)

MRT(hr)

0.32 ± 0.07

0.54 ± 0.11

0.78

0.26

0.82

0.14

23.8

0.47

0.33

Telmisartana

0.10 ± 0.03

1.78 ± 0.35

0.23 ± 0.06

0.13 ± 0.02

25.6 ± 3.2

9.96 ± 5.07

6.30 ± 2.43

Valsartana

0.22 ± 0.04

0.12 ± 0.07

0.24 ± 0.06

1.08 ± 0.14

3.1 ± 0.4

0.22 ± 0.06

1.18 ± 0.15

aMean ± SD from three animalsb

Mean of two animals

16

1.3.2

SSS 手法及び Wajima アプローチによる ヒト CLtot 、Vd 及び T 1/2 予測モデル化合物のヒト CLtot 及び Vd は式 (1-8, 1-9) により 予測した。その結果、Figure 1-2 及び Table 1-2 に示すように、全てのモデル化合物につい て、
ヒト CLtot 及び Vd の予測値は、実測値の 2 倍誤差以内であった。 次に、式(1-10, 1-11, 1-12) により T 1/2 を予測した結果、Eprosartan を除く全てのモデル化合物で 、予測誤差は 2 倍以内であった。

Figure 1-2 Relationships between observed and predicted human CL tot (A), Vd(B) and T 1/2 (C) values obtained by SSS method and Wajima approach. The
marker correspondence is as follows: eprosartan (open circle), losartan (closed
circle), telmisartan (open diamond) and valsartan (closed diamond).
17

Table 1-2 Human PK parameters predicted by SSS method and Wajima
approach from common marmoset PK datasets.
Predicted human value
CompoundValsartan
Eprosartan
Losartan
Telmisartan

CLtot(mL/min/kg)
0.83
2.6
6.34
6.81

Vd
(L/kg)
0.22
0.32
0.47
9.96

MRT
(hr)
4.4
2
1.2
24.4

T1/2
(hr)
11.8
5.5
3.3
26.8

Observed human value a
CLtot
Vd
T1/2b
(mL/min/kg)(L/kg)
(hr)
0.49
0.22
9.5
1.9
0.18
1-2
8.1
0.45
2.1
8.4
5.3
17.7 - 22.6

aObsereved human PK values were taken from Flesch et al. (1997), Tenero and Bottorff (1998, 1999), Lo et al.
(1995) and Kirsten et al. (1998), and Stangier et al. (2000a, b) for compounds Valsartan, Eprosartan, Losartan andTelmisartan respectively 13)-19).
b
T1/2 in the terminal phase following intrvenous administration.

1.3.3

Valsartan の in vitro 代謝物の動物種差

Valsartan とラット肝細胞をインキュベートすると 、保持時間 12.6 分に大きなピーク (M2) が観察され、次いで保持時間 14.2 分にピーク (M3) が観察された (Figure 1-3A) 。これら 2 つのピークはともに 選択 イオンモニタリ
ングで m/z 612.26 (ポジティブイオン化モード、[M+1] + ) 及び 610.25 (ネガティ ブ イオン化 モード イオン 、 [M-1] - ) にて検出されたことか ら 、同じ 精密 質
量 611.25 を有する グルクロン酸抱合体であると考えら れた。イヌ 肝細胞におけるバルサルタン代謝物の生成は比較的少なかったが 、代謝パターンはラット肝細胞と同様であり、イヌの in vitro においても M2 が主要代謝物であると考えられた (Figure 1-3B) 。サル肝細胞では、ほぼ同量の M2 及び M3 が観察された (Figure 1-3D) 。ラット 、イヌ及びサルで認められた Valsartan の2 つのグルクロン酸 抱合体は、コモン マーモセット 及びヒト においても認められた (Figure 1-3C, 3E)。一方、ラット 、イヌ 及びサル とは 異なり 、コモン
マーモセット及びヒト 肝細胞では、 保持時間 10.1 分に最大のピークである
M1 が認められた。
さらに 、コモンマーモセットとヒトの M1 のマススペクトル を解析したと
18

ころ、 フラグメントパターン が一致し、 親化合物である Valsartan よりも 16
Da 大きい m/z 452 ([M+1] + ) のフラグメントが生じていた (Figure 1-4B, 4C) 。
このとき、Valsartan に特徴的な m/z 352 のフラグメント は親化合物と M1 ピークの両方で認められていた ため、オキソペンタン部位が代謝部 位であることが示唆された (Figure 1-4A, 4B, 4C) 。
UV クロマトグラムにおける 4-Hydroxyvalsartan 標準品の保持時間 は、コ
モンマーモセットおよびヒト肝細胞で生成した M1 の保持時間と一致したことから 、M1 が 4-Hydroxyvalsartan である と考えられた (Figure 1-3C, 3E, 3F) 。

Figure 1-3 UV chromatograms of the incubation mixture from rat (A), dog (B),marmoset (C), cynomolgus monkey (D), human (E) hepatocytes andsynthesized 4-hydroxyvalsartan (F). Chromatograms at 0 hr were subtracted fromthose at 4 hr.
19

Figure 1-4 Mass spectrometric characterization of valsartan and M1 found in
the incubation mixture from marmoset (A, B) and human hepatocytes (C). Mass
spectra were obtained by scanning the HPLC eluate between retention times of 16.2
min for valsartan (marmoset sample) and 10.0 and 10.2 min for M1 (marmoset andhuman samples) (see Figure 1-3).

1.3.4

Valsartan 経口投与後の 4-Hydroxyvalsartan の血漿中濃度

コ モ ン マ ー モ セ ッ ト に Valsartan 30 mg/kg を 単 回 経 口 投 与 し た と き 、 4Hydroxyvalsartan は Figure 1-5 に示す血漿中濃度推移 を示し 、最大血漿中濃度 (C max ) は 355 ng/mL であった。

20

Figure1-5

Plasmaconcentrationof

4-hydroxyvalsartan

after

oral

administration of valsartan in common marmoset. The dashed line shows the
C max of 4-hydroxyvalsartan when valsartan is administered at the clinicallyeffective dose (Iriarte et al., 2007).
1.4

考察

本章では、コモンマーモセットを用いた SSS 手法により Valsartan を含む
4 種のサルタン系化合物の ヒト CLtot 及び Vd を 2 倍誤差以内で予測できることを明らかにした。ヒト PK パラメータ予測研究においては、一般に 2 倍誤差以内の予 測精度は 良好である とみなさ れる ため 20) 、本手法が有用で あると考えられた 。
ヒトにおいて Valsartan、Eprosartan 及び Telmisartan は未変化体としての胆汁排泄が主要な消失経路であり、 Valsartan では CYP2C9 が、 Telmisartan では UDP-glucuronosyl transferase (UGT) 1A3 が一部代謝に関与していることが報告されている 21)-22) 。また、Losartan は CYP3A 及び CYP2C9 を介して活性代謝物の E3174 に変換され る 23)-24) 。本研究に供した 4 種の化合物のヒ ト
21CLtot 及び Vd の値 はそれぞれ 0.49~8.4 mL/min/kg、0.22~5.3 L/kg の幅広い範囲であった。以上より、主要消失経路が胆汁排泄であり、広範な PK パラメータを有するサルタン系化合物 のヒト CLtot 及び Vd は、 コモンマーモセッ
トを用いることにより 良好に予測できることが 示された。こ の結果は、多くの類縁体の PK パラメータ を比較評価する必要がある最適化フェーズにおけるコモンマーモセットの有用性を示唆している 。
本研究 では Wajima アプロ―チによるヒト T 1/2 の予測も試 みた。アロメト
リー手法と Wajima アプローチの統合によるヒト血漿中濃度 予測については 、
ヒト化肝臓 キメラマ ウス では報 告されて いるものの 25) 、コモンマーモ セットでの報告は今回が初めてである 。検討の結果、Eprosartan を除く 3 つの化合物において予測誤差は 2 倍以内であり、本手法によりヒト T 1/2 を良好に予測できることが明らかになった 。
今回はスクリーニング in vivo PK 評価に 汎用される カクテル 静脈内投与 を実施した 。カクテル投与 (Cassette dosing や N-in-1 dosing とも呼ばれる) は 、
数化合物から最大で数十化合物の混合溶液を 一個体に投与し、血漿や尿試料中の各化合物を分離定量する手法である 26) 。近年では、質量分析技術の向上によって少量の試料でも定量が可能となり、かつ複数の研究グループによって カ ク テ ル 投 与 に よ り 得 ら れ た PK パ ラ メ ー タ と 個 別 投 与 に よ り 得 ら れ た
PK パラメータがよく相関することが報告され ていることもあり、 多数の化合物を対象とする化合物最適化フェーズ において汎用されつつある 27)-28) 。
今回、各モデル 化合物のコモンマーモセットにおける 肝取り込みや 排泄トラ
ン ス ポ ー タ ー 、 代 謝 酵 素 と の 定 量 的 な 親 和 性 情 報 は 限 ら れ て い た が 、 0.2
mg/kg と い う 低 用 量 で の 静 脈 内 投 与 に お い て は 薬 物 間 相 互 作 用 が 生 じ て いないことを仮定し、試験を実施した 。
22

本章ではコモンマーモセットが in vitro 及び in vivo ともに Valsartan のヒトにおける 主要代謝物である 4-Hydroxyvalsartan を生成する貴重な動物種であることも明らかにした。コモンマーモセットと 同じく非ヒト霊長類である
カニクイザルで認められない代謝物をコモンマーモセットにて検出すること が で き た 理 由 は 明 ら か で な い が 、 同 様 の 知 見 は 、 Sodium-glucose
cotranspoter 2 の選択的阻害剤である YM543 の代謝においても 報告されている 29) 。すなわち、YM543 の経口投与後、YM543 の 5-ヒドロキシアズレン 20-O-β-グ ル ク ロ ン 酸 抱 合 体 が ヒ ト 化 肝 臓 キ メ ラ マ ウ ス 、 コ モ ン マ ー モ セット及びヒト で検出されたが、マ ウス、ラット、ゴールデンハムスター、モルモット、ウサギ、ビーグル犬、アカゲザル及びカニクイザル の血漿および尿からは検出されなかった。このように、薬物動態研究にて汎用されるカニク
イザルにおいてもヒトとは異なる代謝特性を示すこともあり、ヒトと類似した代謝特性を示す可能性がある動物としてコモンマーモセットを用いた検討を行う意義は 大きいと言える。
その他の代謝物について は以下のように考えられる。Valsartan の医薬品承認データパッケージ によると、[ 14 C]標識 Valsartan をラット肝細胞とインキュベートすると、Valsartan のアシルグルクロニドが主な代謝物 として生成することから 30) 、本研究で観察された M2 はアシルグルクロニドである と考えられた。また、Huskey et al. (1993) は、ラット、イヌ、サル及び ヒトの肝ミクロソームを用いて、3 種類のビフェニルテトラゾール含有アンジオテンシ
ン II 受容体拮抗薬のテトラゾール N-グルクロン酸抱合体 の生成を報告している 31) 。このことから、M3 は Valsartan のビフェニルテトラゾール N-グ ル
クロン酸抱合体 であると考えられた。なお、Soars et al. (2001) はコモンマ ー
モセットの肝及び腎ミクロソームを用いて広範囲な化合物のグルクロン酸
23

抱合による代謝 試験を行った結果、コモンマーモセットが ヒトのグルクロン酸抱合代謝 の代替動物モデルとなり得る ことを結論づけ ている 32) 。
2008 年に FDA より発出された 「Guidance for Industry – Safety Testing ofDrug Metabolies (通称 MIST ガイダンス) 」によると、臨床における用法用量を決定づける大規模臨床試験の前には、医薬品の主要代謝物 (総曝露の 10%以上を占める代謝物と定義) の安全性を非臨床動物にて確認する必要があると記載している 33) 。[ 14 C]標識 Valsartan を用いたヒトマスバランス試験では、単回経口投与後の血漿中総放射能の約 11%を 4-Hydroxyvalsartan が占め
ることから

34)

、 本 来 で あ れ ば 臨 床 試 験 の 前 に 実 験 動 物 に お け る 4-

Hydroxyvalsartan の 曝 露 量 が 確 認 さ れ る べ き で あ っ た 。 し か し な が ら 、Valsartan 承認時には MIST ガイダンスは 発出されていなかった ため、コモン
マーモセットにおける 4-Hydroxyvalsartan の曝露量は検討されていなか った 。
今回、Valsartan を 30 mg/kg 単回経口投与 した場合に C max として 355 ng/mLの 血 漿 中 曝 露 を 達 成 し て お り 、 こ れ は Valsartan を 臨 床 有 効 用 量 (80-160
mg/day) で 投 与 し た 被 験 者 に お け る 4-Hydroxyvalsartan の C max 25 ～ 380
ng/mL に匹敵している 35) 。以上より、コモンマーモセットは ヒトの主要代謝物を質 的及び量 的に評価可能な動物種であると考えられた。
現在のところ、コモンマーモセットは毒性試験に て汎用されている動物種
ではないが、上述の ヒト主要代謝物 曝露の観点以外 にも、生理学的な特徴 や
免疫学的な特徴がヒトに類似していること が報告されて いる 36) 。また、カ ニ
クイザルと同様に、種特異性が高いバイオ医薬品の評価にも利用 された例がある 37) 。加えて、コモンマーモセットは高い 繁殖能力を有し、かつ 成体で約350 g 程度と小型であることからも 、創薬における実験動物 としての価値が高いと考えられる。カニクイザルと比較し た場合には毒性試験動物として の24

歴 史 が浅く、利用機会 、プロ トコルの整備、規制当局への受け入れ実績 等、様々な面で課題があるが 38) 、今後、コモンマーモセット を用いた毒性研究実
績の蓄積やデータベース構築により、創薬研究への活用が加速することが 期
待される。
1.5

小括

コモンマーモセット を用いることにより 、Valsartan を含む 4 種のサルタン系化合物のヒト PK パラメータ を高い精度で予測することができた 。また 、
コモンマーモセットはヒトと同様の Valsartan 代謝パターン を有し、かつ経口投与後にヒトと同じ主要代謝物の 曝露が一定量認められることから 、毒性試験への供試が妥当であった と考えられた。これらの結果は、コモン マーモ
セットが化合物最適化フェーズにて有用な動物種である可能性を示している。

25

第二章: ヒト化肝臓 TK-NOG マウスを用いた補正 PBS 手法 によるヒト2

CLh 予測
2.1

序論

ヒト化肝臓キメラマウスとは免疫不全マウスに肝障害を誘発させた後 、ヒト肝細胞を移植し、 生着させたモデルマウスである 39)-40) 。ヒト化肝臓キメ
ラマウスを用いた SSS 法によるヒト CL 予測については 、良好な予測精度を示す幾つかの報告がある 41)-43) 。しかし 、ヒト化肝臓キメラマウスの作製過程においてマウス肝細胞を完全に除去することは困難であり 、残存したマウ
ス肝細胞内の酵素による薬物代謝活性がヒト CL の予測精度を低下させることが課題と 考えられている 41)-43) 。そこで本研究では、この課題を克服する
ために 補正 PBS (Physiologically Based Scaling) 法の開発を試みた。
2.2
2.2.1

方法
試薬

本研究で使用したモデル化合物 、カクテル構成 、化合物の物理化学的特徴、
ヒト PK パラメータ及び主要代謝酵素 を Table 2-1 に示す 44) 。Acetaminophen、
Diclofenac 、 Glyburide 、 Ibuprofen 、 Itraconazole 、 Ketanserin 、 Ketoprofen 、Lamotrigine 、 Moxifloxacin hydrochloride 、 Nicardipine chloride 、 Phenytoin 、Repaglinide、Telmisartan、Tolbutamide 及び Verapamil chloride は東京化成工業から購入した。Antipyrine、Clonazepam、Midazolam 及び Probenecid は富 士
フイルム和光 (大阪) から購入した。Dapsone、Pefloxacin mesylate、S-warfarin
及び Zaleplon は、それぞれ Toronto Research Chemicals (Toronto, Canada) 、
MedChemExpress (South Brunswick Township, NJ, USA) 、 Cayman Chemical(Pittsfield Charter Township, MI, USA) 及び Key Organics Limited (London, UK)から購入した。Cilomilast は、Christensen et al. (1998) の方法に従って Meiji
26

Seika ファルマ株式会社 医薬研究所 創薬化学研究室にて合成した 45) 。これらの化合物 のヒトにおける主要 消失 臓器は肝臓であるが、Moxifloxacin 及びKetoprofen についてはそれぞれ 21.9％及び 30.0％の尿中排泄 (fe urine ) が認められている。その他の試薬 及び溶媒 については 、分析用 及び HPLC グレードを使用した。

Table 2-1 Cassette-dose cocktail groups, physicochemical properties, reported
human pharmacokinetic parameters and metabolic enzymes in humans of the
24 model compounds.
CocktailGroup

CompoundAcetaminophen
Cilomilast
Diclofenac
Midazolam
Nicardipine
Zaleplon
Ibuprofen
Itraconazole
Ketanserin
Moxifloxacin
Repaglinide
Verapamil
Clonazepam
Pefloxacin
Phenytoin
Probenecid
Telmisartan
Tolbutamide
Antipyrine
DapsoneGlyburide
Ketoprofen
Lamotrigine
S-Warfarin

1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4

Physicochemical
properties a
LogP

pKa

0.91
3.9
4.26
3.97
3.56
1.53
3.84
7.31
3.61
-0.51
3.95
5.04
3.15
0.26
2.15
2.44
6.13
2.30
1.22
1.27
3.79
3.61
1.93
2.74

Acid/9.5
Acid/2.3
Acid/4.0
Base/6.2
Base/8.1
NeutralAcid /4.9
Base/3.9
Base/7.3
Acid/5.5, Base/9.5
Acid/3.7
Base/9.7
NeutralAcid/5.5, Base/9.5
Acid/8.5
Acid/3.5
Acid/3.6
Acid/4.3
NeutralBase/2.4
Acid/4.3
Acid/3.9
Base/5.9
Acid/5.6

Human pharmacokinetic
parameters b
CLtotVdfe urine(mL/min/kg) (L/kg) (%)
5.0
1.0
3.0
0.50
0.23
1.0
3.5
0.22
1.0
5.3
1.1
0
11
1.00
1.0
16
1.3
0
0.82
0.15
1.0
5.1
7.4
0
6.7
3.9
0.8
2.4
1.4
21.9
7.8
0.35
1.5
18
3.7
8.3
0.88
2.9
1.0
2.0
1.5
5.0
0.37
0.25
2.0
0.25
0.13
12.0
8.4
5.3
1.0
0.21
0.12
0
0.64
0.77
3.8
0.48
0.83
10.0
0.82
0.08
0
1.6
0.13
30.0
0.60
1.1
7.0
0.05
0.11
1.3

Human Metabolic Enzymes

UGT1A, CYP2E1, Sulphotranseferase
CYP2C8, UGTCYP2C9, UGT2B7, UGT1A9CYP3A4, UGTCYP3A4, CYP2C8, CYP2D6
Aldehyde Oxidase, CYP3A, UGTCYP2C9, CYP2C19, UGT2B7
CYP3A4
Aldo-keto reductase
UGTs, Sulphotranseferase
CYP2C8, CYP3A4, UGTCYP3A4CYP3A, N-acetyltransferase
CYP1A2CYP2C9, CYP2C19
UGTs
UGT1A3, UGT1A1
CYP2C9CYP3A, CYP2Cs, CYP1A2
CYP2C9, CYP3A4, N-acetyltransferase
CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4UGT2B7UGT1A4, UGT2B7
CYP2C9aCalculated using Jchem for Excel (ChemAxon, Budapest, Hungary).

b

Data are taken from Varma et al. (2010) 44), except for Vd of lamotrigine (Incecayir and Agabeyoglu 2006) 46) and phenytoin (Lund et al. 1974)47), andCLtot and Vd of S-warfarin (Abernethy et al. 1991) 48).

2.2.2

実験動物及び実験試料

雄 性 ICR マウス (Jcl:ICR) は日本クレア株式会社にて自家繁殖させ 、8〜
9 週齢 (体重 34.1〜39.2 g) にて使用した。ヒト化肝臓 TK-NOG マウスは 既
報に従 い作製した 49)-50) 。すなわち、7 週齢の雄性 TK-NOG (NOD/Shi-scid IL2
27

receptor gamma–null mice expressing a herpes simplex virus type-1 thymidine
kinase transgene) マウスに、6 mg/kg の Ganciclovir を腹腔内注射し、さらに、2 日後及び 10 日後に 、それぞれ 6 及び 50 mg/kg の Ganciclovir を追加 投与した。初回の Ganciclovir 投与から 18 日後、血清アラニンアミノトランスフェ
ラーゼ値が 240 IU/L 以上に上昇したマウスに 、ヒト肝細胞 (1.1〜1.5 × 10 6個) を脾臓内投与 した。マウス血清中のヒトアルブミン濃度を測定し 、ヒト
肝 細 胞 の 置 換 率 (Replacement Index, RI) を 求 め た 51) 。 本 研 究 で は RI が68.7~95.0％のヒト化肝臓 TK-NOG マウス (16～17 週齢 、体重 15.0～21.8 g)を使用した。
ICR マ ウ ス プ ール 肝 細 胞 (MPCH1000) 及び ヒ ト プ ー ル肝 細 胞 (HPCH2050) は積水メディカル株式会社から購入した。
2.2.3

fu,p 及び Rb 評価

fu,p 及び血液/血漿濃度比 (Rb) を評価するために、ICR マウスより血液を採取し血漿を得た。ヒト血漿は株式会社ケー・エー・シー (京都) より健 康
成人ヒトプール 血漿 (PLA008100) 購入した。ヒト化肝臓 TK-NOG マウス血
漿は、RI が 80%前後のヒト化肝臓キメラマウス 3 匹より 取得した 。ヒト血液は、Meiji Seika ファルマ株式会社健常者血液提供制度規定に基づき 取得した。
fu,p 評価に際して、 ヒト化肝臓 TK-NOG マウスの血漿量が限られていたため、希釈法により求めた。すなわち、血漿 原液をリン酸緩衝 食塩水 (pH7.4)
で 5 倍 希 釈 し た 後 、 各 6 化 合 物 か ら 構 成 さ れ る 化 合 物 カ ク テ ル (各 100µg/mL) を添加し、 最終濃度 1.0 µg/mL (1%DMSO) とした。この希釈血漿試料について、分子量カットオフ値 8000 の Rapid Equilibrium Dialysis device(Thermo Fisher Scientific) を用いて 、37℃で 4 時間、リン 酸緩衝食塩水 に対28して平衡透析を実施した。平衡透析後、希釈血漿側とリン酸緩衝食塩水 側の試料を分取し、 LC-MS/MS 分析に供した。
希 釈 血漿 に お け る タ ン パ ク非 結 合 形 分 率 (fu,d) は 、 平 衡 透 析 後 の希 釈血漿側濃度に対するリン酸緩衝食塩水 側濃度の比として算出した。次いで、fu,pを以下の式 (2-1) により計算した 52) ：fu,p = (1 / d) / [1 / d + (1 / fu,d) – 1]

(2-1)

ここで、d は血漿希釈倍率 5 である。
ヒトにおける Rb は健康成人男性の新鮮血液を用いて評価した。 ヒト化肝臓キメラマウス の血液量が限られていたため、ヒト化肝臓キメラマウス における Rb は ICR マウスと等しい と仮定し、ICR マウス の新鮮血液を用いて評価した 。ICR マウス 及び健康成人の 新鮮血液に各種 カクテル 溶液を最終濃度
100 ng/mL (1%ACN) で添加した後、37℃で 15 分間インキュベートし、 遠心
分離 (1500×g, 4℃, 5 分) することにより 血漿試料を取得 した。並行して、新鮮血液を同条件で遠心分離することにより取得したコントロール 血漿に 、各種カクテル 溶液 を最終濃度 100 ng/mL (1%ACN) で添加し、37℃で 15 分間イ
ンキュベートした血漿試料を 用意した。それぞれの血漿試料を LC-MS/MS 分
析に供し 、得られたピーク面積比 (血漿 添加試料ピーク面積 /血液添加試料ピーク面積) を Rb とした。
2.2.4

In vitro 代謝活性評価

In vitro 代謝活性評価では、各種カクテル溶液を Williams’E 培地 (Thermo
Fisher Scientific) に溶解した後、最終濃度 1 µmol/L (0.1%DMSO, 0.9% ACN)
で ICR マウス 肝細胞及びヒト肝細胞 と混合し、37℃、5%CO 2 及び 95%相 対湿度の条件で緩やかに振とうしながらインキュベートした。ただし、Itraconazole は強力な CYP3A 阻害作用を有すことから 53) 、他の化合物の代謝29

を阻害する可能性を回避するために単独でインキュベートした。化合物の最適な肝細胞濃度は個々の化合物の消失速度に依存するため、予備検討によりTable 2-2 のように決定した。ただし、インキュベート時間は最大でもマウス
及びヒト肝細胞でそれぞれ 60 分及び 180 分とした。代謝反応は、インキュベート試料を氷冷した内部標準物質含有 ACN に移すことにより終了させ、
その後 、遠心分離 (1500×g, 4℃, 5 分) した上清を LC-MS/MS 分析に供した。
化合物の in vitro 代謝活性 (CL invitro ) は次の式 (2-2) により計算した。
CLinvitro (mL/min/10 6 cells) = kel (min -1 )/hepatocyte density (10 6 cells/mL)(2-2)

ここで、消失速度定数 kel は MS Excel 2016 (Microsoft Corp., Redmond, WA,USA)

にて 、 対 数 換 算し た 経 時 的 な基 質 濃度 推 移 を 線 形回 帰 した と き の傾きとした。なお、最大インキュベート時間においても基質濃度が 10%減少しない場合には、今回の試験系において代謝活性が検出限界以下であったとして、基質濃度が 10%減少した場合の CLinvitro を計算した 54) 。

30

Table 2-2 Hepatocytes cell density used for metabolic stability study.

CompoundCocktailGroupaHepatocytes density (×10 6 cells/mL)
ICR mice
Human

Acetaminophen

1

1

7

Antipyrine

4

2

7

Cilomilast
Clonazepam
DapsoneDiclofenac
Glyburide
Ibuprofen
Itraconazole

1
3
4
1
4
2
-

1
2
2
1
2
0.25
0.25

2
5
5
0.5
5
0.5
0.5

Ketanserin
Ketoprofen
Lamotrigine

2
4
4

1
2
2

0.5
5
7

Midazolam

1

0.05

2

Moxifloxacin

2

1

5

Nicardipine

1

0.05

0.5

Pefloxacin
Phenytoin
Probenecid
Repaglinide
S-Warfarin
Telmisartan
Tolbutamide
Verapamil
Zaleplon

3
3
3
2
4
3
3
2
1

2
2
2
0.25
2
2
2
0.25
1

7
5
5
0.5
7
7
5
0.5
7

a

Itraconazole was incubated alone to avoid CYP3A mediated drug interactions.

2.2.5

投与及び試料採取

ICR マウス及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスへの薬剤投与並びに血液 採 取は、日本クレア株式会社 (申請番号 169) 及び Meiji Seika ファルマ株式会社(承 認 番 号 C2018-027-0) の 動 物 実 験 倫 理 委 員 会 で 承 認 さ れ た プ ロ ト コ ル に従って実施した。
モデル化合物は 、1％Tween80 と 10％DMSO 含有生理食塩水に溶解し 、フリー体として 0.2 mg/5 mL/kg の用量で尾静脈よりカクテル静脈内投与した。
31

血液採取時間は 、事前検討の結果を 踏まえて以下のように設定した。尿試料は投与後 24 時間までの自然排尿を採取した。
(Cocktail group 及び血液採取時間)
Cocktail group 1: 5, 15, 30 min, 1 and 2 hr
Cocktail group 2: 5, 30 min, 1, 2 and 4 hr
Cocktail group 3: 5, 30 min, 1, 4 and 8 hr
Cocktail group 4: 5, 30 min, 1, 4, 8 and 24 hr
なお、 ヒト化肝臓 TK-NOG マウスにおいては 、カクテル 1 及び 2 投与群個体の最終採血後に 1 週間の washout 期間をおいてから同一個体に カクテル 3
及び 4 を投与した。全ての採血 及び採尿 が終了した後、試験に供したヒト化
肝臓 TK-NOG マウスの肝重量を測定した 。採取した血液は ヘパリン添加後、1200 × g で 10 分間遠心分離 することで血漿試料 とし、-20℃以下で保存し た。
また、 尿及び肝臓試料も同様に保存した。
2.2.6

LC-MS/MS 分析

In vitro 及び in vivo 試験より得た試料中の化合物濃度は 、LC-MS/MS により測定した。すなわち、血漿または尿 試料に Imipramine 及び Valsartan (それぞれポジティブイオン化モード用及びネガティブイオン化モード用の内部標準物質) を含む ACN を添加後、 混合し、遠心分離を行った。次に、 上清をポリプロピレン製バイアル に移し、等量の Milli-Q-水と 混合して カラムに注入した。 LC-MS/MS 分析は、Shimadzu Nexera UHPLC システム (島津製作所) と API QTRAP 5500 トリプル四重極質量分析計 (Thermo Scientific) を用いて分析した。カラムは ACQUITY UPLC BEH C18 column (1.7 µm, 2.1mm
I.D.×50 mm, Waters, Milford, MA) 、CAPCELL CORE ADME (1.7 µm, 2.1 mm
I.D.×50 mm, 大阪ソーダ) または CAPCELL PAK INERT ADME-HR (3.0 µm,
32

2.0 mm I.D.×50 mm, 大阪ソーダ) を使用した。各化合物の HPLC 条件、イオン化モード、モニターイオンは Table 2-3 に示した。

Table 2-3 LC-MS/MS analysis conditions of the 24 model compounds andinternal standards.
CompoundAcetaminophen
Antipyrine
Cilomilast

Ionization mode

Parent ion
m/z

Product ion
m/z

HPLC

[M + H]+

152.0

93.0

Conditiona(2)[M + H]

+

189.0

104.0

(1)

[M - H]

-

342.3

214.3

(1)

[M + H]

+

315.9

270.0

(1)

Dapsone[M + H]

+

249.1

156.0

(1)

Diclofenac[M + H]+

296.0

214.0

(1)

Glyburide[M + H]+

494.0

169.0

(1)

Ibuprofen[M - H]

-

205.2

160.9

(3)

[M + H]

+

705.3

392.3

(1)

[M + H]

+

396.2

189.1

(1)

[M + H]

+

255.1

105.0

(1)

[M + H]

+

256.1

144.9

(1)

[M + H]

+

325.9

291.1

(1)

[M + H]

+

402.2

261.2

(1)

[M + H]

+

480.1

315.0

(1)

[M + H]

+

334.3

233.1

(1)

[M + H]

+

253.2

182.1

(1)

[M + H]

+

286.1

202.0

(1)

[M + H]

+

453.2

230.2

(1)

[M + H]

+

515.4

289.1

(1)

[M + H]

+

271.1

74.0

(1)

Clonazepam

Itraconazole
Ketanserin
Ketoprofen
Lamotrigine
Midazolam
Moxifloxacin
Nicardipine
Pefloxacin
Phenytoin
Probenecid
Repaglinide
Telmisartan
Tolbutamide[M + H]

+

455.2

165.2

(1)

S-warfarin[M - H]

-

307.1

160.9

(1)

Zaleplon[M + H]+

306.1

236.0

(1)

Imipramine[M + H]+

281.3

86.2

-

Valsartan[M - H]-

434.1

179.0

-

VerapamilaFormic acid aqueous solution (0.1% v/v) was used as the mobile phase in gradient systems:(1) concentrations of acetonitrile were set to 5%, 5-50%, and50-90% during 0-0.5, 0.5-2.5, and 2.5-3.0 min, respectively, with the CAPCELL CORE
ADME column;(2) concentrations of acetonitrile were set to 0% and 0-90% during 0-1.5 and 1.5-3 min,respectively, with the ACQUITY UPLC BEH C18 column; and(3) concentrations of methanol were set to 30-90% during 0-1 min in the CAPCELL PAKINERT ADME-HR column.

33

2.2.7PK 解析

ICR マウス及び ヒト化肝臓 TK-NOG マウスにおけるモデル化合物の血漿中濃度推移は、Phoenix WinNonlin software version 6.4 (Certara USA, Inc.) を用いて、non-compartment モデルにより 解析した。CLtot は、次式 (2-3）に従い、投与量 (Dose) を AUC で除することにより算出した。モデル 化合物の腎排泄が 24 時間以内に完了したと仮定し 、腎クリアランス (CLr ) は、尿 中に回収された化合物の累積量 (A urine ) を AUC で除するこ とにより 算出した
(式 2-４)。また、fe urine (%) は投与量に対する A urine として計算した 。肝クリ
アランス (CLh ) は、腎排泄が唯一の肝外排泄経路であると仮定して 、観察された CLtot から CLr を差し引くことで算出した (式 2-5) 。
CLtot = Dose / AUC(2-3)

CLr = A urine / AUC(2-4)

CLh = CL tot – CLr

(2-5)

2.2.8

SSS 手法によるヒト CLh 予測

ICR マウス及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスにて計算された CLh (CL h,animal )から、 次式 (2-6) に よりヒト CLh 予測値 (CL h,human,pred ) を計算した。
CLh,human,pred = CL h,animal × (BW human / BW animal ) ^ a (2-6)
ここで、BW animal は各動物種の標準 体重 (ICR マウス、ヒト化肝臓 TK-NOG
マウス及び ヒトで、 それぞれ 0.038、0.020 及び 70 kg) を示 す。スケーリン
グ指数 a 及び b は Sanoh et al. (2015) の報告に従い、各動物種における、 24
種のモデル化合物のスケーリング指数の平均値を使用した 55) 。
2.2.9

補正 PBS 手法によるヒト CL h 予測式 (2-5) にて計算されたヒト化肝臓 TK-NOG マウスにおける CLh について 、 肝 重 量 あ た り の 固 有 ク リ ア ラ ン ス (CL h,int,chim , mL/min/g liver) を well34

stirred モデルに従い、下式 (2-7) により求めた 。
CLh,int,chim =Q h,chim ×CL h,chim /[fu,p chim /Rb chim ×(Q h,chim – CLh,chim )]×(LW chim /BW chim )(2-7)

ここで、LW chim はヒト化肝臓 TK-NOG マウスの肝臓重量 (1.6~2.4 g liver /15~21 g BW) を示す。ヒト化肝臓 TK-NOG マウスの肝血流量 (Q h,chim ) は、
ICR マウスの肝血流 量 (90 mL/min/kg) に等しいと仮定した 56)-57) 。また、Rbについても 2.2.3 に記載の通り、 ICR マウスにおける Rb に等しい と仮定した。
ヒト化肝臓 TK-NOG マウスの肝蔵には 宿主マウスの肝細胞が一部 残存している。そこで、マウスとヒト の肝細胞 代謝活性 CLinvitro と RI を用いて、ヒト化肝臓 TK-NOG マウスにおけるヒト肝細胞成分のみの肝固有クリアランス (CL h,int,human , mL/min/g liver) を下式 (2−8, 2-9) より 求めた 。
CLh,int,chim = CL h,int,mice + CL h,int,human =(1-RI)×CL h,int,human ×(CL invitro,mice /CL invitro,human ) + RI×CL h,int,human(2-8)

CLh,int,human = CL h,int,chim /[(1-RI)×(CL invitro,mice /CLinvitro,human ) + RI](2-9)

したがって、ヒト CLh 予測値 (mL/min/kg) は、下式 (2-10) で与えられる 。
CLh,human,pred =[Q h,human ×fu,p human /Rb human ×CL h,int,human ×(BW human /LW human )] /[Q h,human + fu,p human /Rb human ×CL h,int,human ×(BW human /LW human )](2-10)

ここで、LW human 及び Q h,human はヒトにおける肝臓重量 (1800 g liver/70 kg BW)及び肝血流量 (20.7 mL/min/kg) である 56) 。
2.2.10 予測精度解析
SSS 手法及び補正 PBS 手法によるヒト CLh の予測精度は、予測値が実 測
値の 2 倍または 3 倍以内の誤差範囲に 収束する確率を評価するとともに、35

以下の絶対平均予測誤差 (Absolute Average Fold Error, AAFE) を下式 (2-11)
により計算した 58) 。
AAFE = 10 Σ | log10(predicted value / Observed value) | / N(2-11)

ここで、N はモデル化合物数である。
2.3
2.3.1

結果
fu,p 及び Rb

ICR マウス、ヒト化肝臓 TK-NOG マウス及びヒトの fu,p 及び Rb を Table
2-4 に 示 し た 。 最 も fu,p が 低 い 化 合 物 は 共 通 し て Itraconazole で あ り 、Acetaminophen 及び Antipyrine はいずれの動物種においても、 fu,p がほぼ 1であった。Cilomilast、Ibuprofen、Ketoprofen 及び S-warfarin における ICR マ
ウスの fu,p はヒトにおける fu,p の 10 倍以上であったが、こ れらの 化合物では ICR マウスと比較して、ヒト化肝臓キメラマウス における fu,p がヒト fu,pに近い値であった。
モ デ ル 化 合 物 の ICR マ ウ ス に お け る Rb は 0.7 (Ibuprofen) か ら 1.77
(Moxifloxacin) であり、ヒトにおける Rb は 0.58 (Ibuprofena 及び Tolbutamide)から 1.35 (Lamotorigine) であった。 ICR マウス とヒトとで Rb に大きな差は
なかった。

36

Table 2-4 fu,p and Rb of the 24 model compounds in ICR mice, Hu-liver TKNOG mice and humans.
CompoundAcetaminophen

fu,p

Rb

ICR mice a Hu-liver TK-NOG mice a Humana
0.979
1c
1c

ICR mouse b Humana
1.22
1.28

1c
0.04060.122
0.455
0.00450.00200.00580.0004

0.777

0.99

0.97

Cilomilast
Clonazepam
DapsoneDiclofenac
Glyburide
Ibuprofen
Itraconazole

1c
0.150
0.134
0.594
0.02020.01010.05050.00030.01030.165
0.417
0.00260.00110.00280.0005

0.82
1.17
1.20
0.70
0.74
0.70
0.96

0.98
0.99
1.12
0.66
0.65
0.58
0.71

Ketanserin
Ketoprofen
Lamotrigine

0.08470.134
0.854

0.06260.01700.712

0.02970.0073
0.466

1.30
0.76
1.47

0.81
0.64
1.35

Midazolam0.05820.04220.01820.87

0.82

Moxifloxacin

0.649

0.554

0.713

1.77

1.33

Nicardipine

0.00180.00290.00250.90

0.82

Pefloxacin
Phenytoin
Probenecid
Repaglinide
Telmisartan
Tolbutamide
Verapamil
S-Warfarin
Zaleplon

0.723
0.260
0.340
0.01520.01140.105
0.0879
0.191
0.607

0.451
0.146
0.12000.00650.00360.01740.134
0.018
0.77200.604
0.127
0.07360.00400.00440.02140.103
0.0091
0.469

1.40
1.15
0.80
1.04
0.72
0.68
1.12
0.81
1.05

1.25
0.78
0.65
0.61
0.69
0.58
0.91
0.77
1.15

AntipyrineaMean of two experiments.

b

Single experiment with pooled blood.

c

Experimentally measured values (1.16–1.28) were estimated to 1.

2.3.2

In vitro 代謝活性

マウス及びヒト肝細胞における代謝活性 並びに ヒト化肝臓 TK-NOG マウ
スの RI を Table 2-5 に示した。マウス肝細胞においては 、Nicardipine の CLinvitro
が 1,924 µL/min/10 6 cells と最も大きく、次いで Midazolam、Verapamil が大きかった。ヒト肝細胞 においても Nicardipine が最も高い CLinvitro を示したが、その値は 141 µL/min/ 10 6 cells と、マウスにおける値 の 1/10 であった 。他 の化合物に関してもヒト肝細胞における代謝活性はマウスと比較して低く、37

Moxifloxacin は 120 分インキュベートしても初期濃度からの減少が 10%未 満
であり (<0.18 µL/min/10 6 cells) 、Antipyrine、 Lamotrigine 及び Pefloxacin は
180 分 イ ン キ ュ ベ ー ト し て も 初 期 濃 度 か ら の 減 少 は 10% 未 満 で あ っ た(<0.08 µL/min/10 6 cells) 。そこで 、Moxifloxacin、Antipyrine、Lamotrigine 及
び Pefloxacin の CLinvitro 比の算出には、ヒト肝細胞において インキュベート
後に初期濃度 が 10%減少したと仮定した 場合の 値を用いた。マウスとヒトとの CLinvitro 比 (マウス/ヒト) は 0.5 (Diclofenac) から 63.3 (Probenecid) の範囲であった 。RI 値は 81.2%から 95%の高い値であった。

Table 2-5 CL invitro determined using ICR mice and human hepatocytes, and RIof Hu-liver TK-NOG mice.
CompoundCLinvitro (uL/min/10 6 cells)a
ICR mice
Human

Acetaminophen

6.2

Antipyrine

4.3

Cilomilast
Clonazepam
DapsoneDiclofenac
Glybride
Ibuproen
Itraconazole

7.4
1.9
1.1
25.1
8.3
18.8
58.4

Ketanserin
Ketoprofen
Lamotrigine

22.5
4.8
0.6

Midazolam

472

Moxifloxacin

7.1

Nicardipine

1924

Pefloxacin
Phenytoin
Probenecid
Repaglinide
Telmisartan
Tolubutamide
Verapamil
Warfarin
Zaleplon

3.4
1.6
7.6
34.0
2.5
4.8
174.8
1.2
11.3

CLinvitro Ratio(ICR mice/Human)

RIb
(%)

19.7

87.3

<0.08
3.7
0.3
0.2
49.8
2.9
15.2
9.6

53.8

95.0

2.0
7.1
6.6
0.5
2.8
1.2
6.1

87.3
87.3
95.0
87.3
95.0
81.2
81.2

25.0
4.6

0.9
1.0
7.5

81.2
95.0
95.0

52.7

87.3

<0.18
141

39.4

81.2

13.7

87.3

c

42.5
1.8
63.3
2.1
5.7
3.3
8.4
2.7
11.3

87.3
87.3
87.3
81.2
87.3
87.3
81.2
95.0
87.3

0.3
c

<0.08c
9.0
c

<0.08
0.9
0.1
16.0
0.4
1.5
20.8
0.4
1.0

a

Mean of two experiments.

b

Mean of three Hu-liver TK-NOG micec

The detection limit for substrate reduction was used for the calculation of CL invitro ratio.

38

2.3.3

血漿中濃度及び PK パラメータ

ICR マウス及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスにおけるモデル化合物の血 漿
中 濃 度 は 単 相 性 あ る い は 二 相 性 で 減 少 し た (Figure 2-1) 。 ヒ ト 化 肝 臓 TKNOG マウスでは約半数のモデル化合物が ICR マウスと類似した血中濃度推移を示した が、Antipyrine、Cilomilast 及び Probenecid など一部の化合物の血漿中濃度は ICR マウスより緩やかに消失した。一方、ヒト化肝臓 TK-NOG
マウスにおける Lamotrigine、Tolbutamide、S-warfarin の血漿中濃度は、ICR
マウスと比較して急速に消失した。
血漿中濃度 推移をモデル解析することにより 得られた CLtot を Table 2-6 に示した。CLtot は幅広い範囲であり、ICR マウスでは 0.4 mL/min/kg (S-warfarin)~ 94.9 mL/min/kg (Midazolam) であり、 ヒト化肝臓 TK-NOG マウス では 1.2
mL/min/kg (S-warfarin, Tolbutamide) ~ 96.1 mL/min/kg (Verapamil) であった。
また、ICR マウスおよびヒト化肝臓 TK-NOG マウスにおける大多数の化合物の fe urine は 4.0%未満であったが、 ICR マウスでは Moxifloxacin (4.5%) 、
Dapsone (5.0%) 及び Lamotrigine (18.2%) で、ヒト化肝臓 TK-NOG マウスでは、Probenecid (4.8%) 、Moxifloxacin (5.4%) 、lamotrigine (8.4%) 、Pefloxacin(10.7%) 及び Ketoprofen (15.2%) で fe urine がやや高かった。

39

Figure 2-1. Plasma concentrations of the 24 model compounds after
intravenous administration to ICR mice (open circle) and Hu-liver TK-NOG
mice (solid circle). Each point represents mean ± SD of three experiments or themean of two experiments.
40

Table 2-6 Observed CL tot and fe urine of 24 model compounds after intravenous
administration to ICR and Hu-liver TK-NOG mice.
CompoundCLtot (mL/min/kg)
ICR mice
Hu-liver TK-NOG miceAcetaminophen

47.2 ± 0.4

25.3 ± 4.7

Antipyrine

28.6 ± 0.7

20.2 ± 9.5

ICR mice0c

fe urine (%)
Hu-liver TK-NOG mice
2.6

± 1.7

0.1

0.5

± 0.4

c

0.1
0.2
3.4
0.2
0.04
1.2

± 0.1
± 0.0
± 1.2
± 0.2
± 0.00± 0.8

bCilomilast
Clonazepam
DapsoneDiclofenac
Glyburide
Ibuprofen
Itraconazole

11.9 ± 4.2
12.8 ± 1.5
3.9 ± 0.3
16.2 ± 5.5
13.3 ± 2.2
5.9 ± 0.7
29.3 ± 9.1

3.6 ± 2.1
19.6 ± 5.3
6.8 ± 0.6
13.2 ± 3.4
5.3 ± 3.6
7.4 ± 1.3
44.3 ± 5.6

00.1 ± 0.1
5.0 ± 1.3
0.02 ± 0.00

Ketanserin
Ketoprofen
Lamotrigine

49.6 ± 8.6
3.2 ± 0.3
1.6 ± 0.1

90.1 ± 5.5
3.3 ± 0.3
10.1 ± 0.8

0.2 ± 0.1
3.3 ± 2.3
18.2 ± 8.7

Midazolam

94.9 ± 11.3

72.8 ± 28.9

Moxifloxacin

51.0 ± 5.0

63.3 ± 17.50c
4.5 ± 3.8

Nicardipine

84.4 ± 10.4

56.0 ± 7.9

Pefloxacin
Phenytoin
Probenecid
Repaglinide
Telmisartan
Tolbutamide
Verapamil
S-Warfarin
Zaleplon

39.4 ± 5.5
7.9 ± 1.5
26.1 ± 4.3
50.0 ± 13.6
9.3 ± 4.0
0.8 ± 0.1
77.1 ± 7.9
0.4 ± 0.1
90.3 ± 5.8

42.5 ± 5.0
4.4 ± 0.9
9.8 ± 3.7
28.3 ± 2.7
41.3 ± 7.8
1.2 ± 0.3
96.1 ± 8.0
1.2 ± 0.3
59.4 ± 17.30c
1.0 ± 0.6
0.02 ± 0.00

0c
15.2
8.4

0c
± 20.3
± 3.3

5.4

0c
± 2.2

10.7
0.9
4.8
0.1
2.8
0.2
0.8
0.1

0c
± 3.6
± 0.2
± 4.1
± 0.1
± 0.8
± 0.1
± 0.5
± 0.1

c

0
1.7 ± 1.7
1.7 ± 1.3
0.1 ± 0.10c
3.4 ± 1.2
0.1 ± 0.1
0.2 ± 0.1
0.8 ± 0.6
0.01 ± 0.00

0caMean ± SD from three animals.

b

Mean of two animals.

cLess than detection limit.

2.3.4

SSS 手法 及び補正 PBS 手法によるヒト CLh 予測

ICR マウスおよび ヒト化肝臓 TK-NOG マウスにおける CLh は 、式 (2-3, 24, 2-5) から求めた。SSS 手法によるヒト CLh の予測値 は、ICR マウス及び ヒ
ト化肝臓 TK-NOG マウスともに、 半数の化合物では実測値の 2 倍以内であった (Figure 2-2A, 2B 及び Table 2-7 ) 。ICR マウスでは 、Antipyrine (7.1 倍)、
Probenecid (18.1 倍) 及び Moxifloxacin (4.0 倍) をはじめとした複数化合物でヒト CLh が過大 予測されて おり、逆に、Telmisartan (6.1 倍)、Lamotorigine (2.8倍) 及び Ketoprofen (2.4 倍) でヒト CLh は過小 予測されていた。ヒト化肝臓
TK-NOG マウスでは、ICR マウスにおいて観察されたこれらの 外れ値のうち、
41

Antipyrine (4.2 倍) 、Proenecid (5.5 倍) 及び Moxifloxacin (4.2 倍) が過大予測されており、Ketoprofen (3.1 倍) が過小予測されていた 。
次に、ヒト化肝臓 TK-NOG マウスで得られた値から、補正 PBS 手法 によりヒ ト CLh 予測した (Figure 2-3) 。その結果、SSS 手法により過大予測していた Antipyrine (2.1 倍) 、Proenecid (1.2 倍) 及び Moxifloxacin (2.1 倍) について、 ヒト CL h の予測精度 が向上した。SSS 手法及び 補正 PBS 手法を用いた予測では 、2 倍以内の誤差範囲に 収束する確率 がそれぞれ 54.2%及び 58.3%、
AAFE は 2.0 及び 1.8 であった (Table 2-8)。

Figure 2-2. Relationships between observed and predicted human CL h values
using SSS method in ICR mice (A) and Hu-liver TK-NOG mice (B).

42

Figure 2-3. Relationships between observed and predicted human CL h values
using corrected PBS method for Hu-liver TK-NOG mice.

43

Table 2-7 Observed and predicted human CL h values using SSS method in ICR
and Hu-liver TK-NOG mice and corrected PBS method in Hu-liver TK-NOG
mice.

CompoundObserved human CLh(mL/min/kg)a

ICR mice

Predicted human CLh (mL/min/kg)
Hu-liver TK-NOG mice

SSS method

SSS method

corrected PBS method

Acetaminophen

4.85

5.0

2.5

2.3

Antipyrine
Cilomilast
Clonazepam
DapsoneDiclofenac
Glyburide
Ibuprofen

0.62
0.50
0.87
0.43
3.47
0.82
0.81

3.0
1.3
1.4
0.39
1.7
1.4
0.62

2.1
0.37
2.0
0.68
1.3
0.54
0.75

1.3
0.23
3.7
1.1
2.3
0.66
0.91

Itraconazole
Ketanserin
Ketoprofen

5.10
6.65
1.12

3.1
5.3
0.33

4.6
9.3
0.29

7.5
12.8
0.29

Lamotrigine

0.56

0.14

0.94

1.1

Midazolam

5.30

10.1

7.5

2.9

Moxifloxacin

1.87

5.2

6.2

3.9

Nicardipine
Pefloxacin
Phenytoin
Probenecid
Repaglinide
Telmisartan
Tolbutamide
Verapamil
S-Warfarin

10.9
1.90
0.36
0.22
7.68
8.32
0.21
16.5
0.05

9.0
4.1
0.83
2.8
5.3
1.0
0.09
8.2
0.04

5.8
3.9
0.45
1.0
2.9
4.1
0.12
9.8
0.12

8.5
2.5
0.84
0.18
3.7
8.3
0.28
17.2
0.13

Zaleplon

16.00

9.6

6.1

8.9

a

Quoted from Varma et al. 2010 except for S-warfarin (Abemethy et al, 1991).

44

Table 2-8 AAFE and the percentage of predicted CL h values within two- or
three-fold error of the 24 model compounds using SSS and corrected PBS
methods.

Compound

ICR mice
SSS method

Within 2-fold error (%)

50.0

54.2

58.3

Within 3-fold error (%)

79.2

83.3

91.7

AAFE

2.2

2.0

1.8

2.4

Hu-liver TK-NOG mice
SSS method corrected PBS method

考察

本章では、補正 PBS 手法を用いることによりヒト化肝臓 TK-NOG マウス
を用いてヒト CL h を良好に予測できることを明らかにした。特に、SSS 手法
で過大予測していた Antipyrine、Moxifloxacin 及び Probenecid の予測精度が大幅に向上し、本手法がこれまで課題とされてきたマウス残存肝細胞 による
ヒト CLh の過大予測 を克服しうることが示された。
本研究に供した 24 種のモデル 化合物は ヒトにおいて主に肝臓での代謝あ
るいは胆汁排泄 により消失する が、fe urine の結果 から、ヒト化肝臓 TK-NOG
マウスにおいてもその 特性はほぼ一致していると考えられた 。しかしながら、
Moxifloxacin 及び Ketoprofen のヒト fe urine が 21.9％及び 30.0％であるのに対し、ヒト化肝臓 TK-NOG マウスではそ れぞれ 5.4％及び 15.2％と低く、腎排泄についての差異が認められた。これらの化合物は、ICR マウスにおいても、
fe urine が 4.5%及び 3.3%と低いことから 、 ヒト化肝臓 TK-NOG マウスで認められた低い fe urine は宿主マウスの腎機能が 反映された結果と考えられた。
ICR マウス及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスにモデル化合物を単回静脈内した結果、ICR マウスとヒト化肝臓 TK-NOG マウス間 で血漿中濃度推移が明確に異なる化合物 が複数存在した。例えば、Antipyrine と Probenecid は ICR
45

ヒト化肝臓 TK-NOG マウスと比較して ICR マウスで血漿中濃度が低かった 。
これは、ヒト肝細胞と比較してマウス肝細胞で CLinvitro 大きかった こと によると考えられる 。興味深いことに Cilomilast では CLinvitro に大きな差がないにも関わらず、ヒト化肝臓 TK-NOG マウスで血漿中濃度が高かった。この原 因 は fu,p の 違 い に よ る 可 能 性 が あ る 。 す な わ ち 、 ICR マ ウ ス に お け る
Cilomilast の fu,p は 0.150 である一方で、ヒト及びヒト化肝臓 TK-NOG マウ
スにおける fu,p はそれぞれ 0.010 及び 0.041 と低い 。このことから、 ヒト化
肝臓 TK-NOG マウスで は Cilomilast の fu,p が低いために 組織への移行が小さく、血漿中曝露が高 いと考えられた。
ヒト化肝臓キメラマウスを用いた SSS 手法によるヒト PK パラメータ予
測の先行研究として、本研究で用いたヒト化肝臓 TK-NOG マウスとは異なる、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子組み換え重度免疫不全マウス (uPA/SCID マウス) にヒト肝細胞を定着させた PXB マウス ®
による研究 報告がある 41)-43) 。しかし、これらの報告において、Diazepam な
どのいくつかの化合物について 、SSS 手法ではヒト CL が 過大予測 されることが示 されており、その原因として 宿主のマウス残存肝細胞 活性の存在 が考えられている。この課題を克服するため の取り組みとして、Nakayama et al.
(2020) は、RI が 31%～95%の異なるヒト化肝臓キメラマウスを 用いて検討を行った 59) 。すなわち、Diazepam を含む複数のモデル化合物について、 invivo PK 試験より CL h,int を算出し、RI との関係を線形回帰することにより、
RI が 100%の場合の CLh,int を外挿し、この値を ヒト CLh,int と同一であると仮定する方法である。この手法は 幾つかの化合物で予測精度を向上させたものの、RI の変化が CL h,int に大きな影響を及ぼす ような化合物 では予測が困難であり、課題が残されてい た。今回、補正 PBS 法を用いることにより、宿主
46

のマウス残存肝細胞活性 による ヒト CLh の過大評価を克服したことは、ヒ ト
化肝臓キメ ラマウ ス を用いたヒ ト CLh の予測精度 の向上 に 大きく貢献 すると期待される。
本研究で提案する補正 PBS 手法は、ヒト化肝臓 TK-NOG マウスより得られた肝重量当たりの固有クリアランスがマウス肝細胞由来成分とヒト肝細胞由来成分に分離できると 仮定し、マウスとヒトとの in vitro 肝細胞代謝比とヒト肝置換率とで補正することによりヒト由来成分の肝固有クリアラン
ス の み を 推 定 す る 新 規 手 法 で あ る 。 こ の 手 法 に お い て は 、 ヒ ト 化 肝 臓 TKNOG マウスの CLh,int がヒト CLh,int と同一であることを 前提としている が、
これは、ドナーとなるヒト肝細胞の薬物代謝関連 酵素の タンパク発現量 が宿主マウスに移植 しても有意に変化しないことから 60) 、妥当な前提といえる 。
また、マウスに 移植したヒト肝細胞 の過形成により ヒト化肝臓 TK-NOG マ
ウスの肝臓 は 通常の マウスの肝 臓と比較 して 肥大化 している ため 57) 、肝 重
量あたりの CL h,int (mL/min/g liver) をヒトに外挿すること が適切であると考えられ た。
今回、補正 PBS 手法により Antipyrine、Moxifloxacin 及び Probenecid のヒ
ト CLh を良好に予測することができたが 、Clonazepam のヒト CLh の予測値
は 2 倍の誤差範囲を上回った。この原因は明らかではないが、CLinvitro 比 (マウス/ヒト) は 7.1 であり、補正 PBS 手法において CLinvitro 比による補正をしない場合と比較して予測精度が改善していたため、マウス残存肝細胞活性の一部は補正されたと考えられた (Data not shown) 。ヒトにおいて Clonazepam
やその代謝物である 7-Amino-clonazepam の血漿中濃度には個体差があり、その原因として CYP3A 及び N-Acetyltransferase 2 (NAT2) の表現型が関係していることが報告されている 62) 。CYP3A 発現量が低い ヒト や NAT2 の Slow47

acetylator が一定数存在することから、ヒトにおける CL h 報告値が低く、予測値との乖離を生ん だ可能性も 考えられ る。
注目すべきこととして、 今回、 補正 PBS 手法によって過大予測が改善 された化合物の多くは 、ヒト CLh が 3 mL/min/kg より小さかった 。これは、CLhが小さい化合物では 肝固有クリアランス が律速段階 となることから 、マウス
由来成分の CL h,int による影響を受け やすいことと整合している。逆に、ヒト
CLh 値が 3 mL/min/kg より大きい化合物の予測値はすべて 2 倍以内の誤差であった。また、Acetaminophen、Nicardipine 及び Midazolam は、それぞれ 19.7、13.7 及び 52.7 という大きな CLinvitro 比を有していたが、CLh が大きく、肝血流律速に近いため、 CLinvitro 比補正によ るヒト CLh 予測値への影響は少なかった。このように 、律速段階の観点からも、補正 PBS 法は 共存するマウス肝細胞活性を合理的に補正することができる画期的な手法であると考えられた。なお、Diazepam は今回のモデル化合物には含まれていな いが、ヒト CLh
が 0.38 mL/min/kg と、3 mL/min/kg よりはるかに少なく、マウスとヒト肝細胞の CLin vitro 比は 38 であることが報告されている 43) 。したがって、補正 PBS
法は Diazepam についても過大予測を 大幅に改善させることができると 期待される。
補正 PBS 法の欠点は、化合物 の CLinvitro 比の決定が不可欠 なことである。
今回、Antipyrine、 Lamotorigine、Moxifloxacin 及び Pefloxacin ではヒト肝細胞における実質的な CLinvitro 値が得られなかったため 、 暫定的に検出限界値を用いた CLinvitro 比を使用せざるを得なかった。従来の in vitro システムでCLinvitro 値を信頼性高く得られないよう な極めて代謝安定性 が高い 化合物 については、 肝細胞リレー法 62) により補 正 PBS 手法の欠点を回避できる と 考えられる 。この方法では、化合物を肝細胞と インキュベート した上清を 一定
48

時間後に新しい肝細胞に曝露することを繰り返すことで、肝細胞と化合物との長時間インキュベートを可能としている。また、マウス線維芽細胞との共培養により 長時間の肝細胞代謝 活性の維持を可能とする HepatoPac ® が開発されており、低クリアランス化合物の CLinvitro 算出が可能となるという報告もある 63) 。
最 近 、 Uehara et al. (2022) は マ ウ ス 肝 細 胞 特 異 的 に P450 oxidoreductase(Por) を コ ン デ ィ シ ョ ナ ル ノ ッ ク ア ウ ト し た ヒ ト 化 肝 臓 TK-NOG マ ウ ス(Por cKO Hu-liver TK-NOG マウス) を作製した 64) 。このマウスでは、マウスの残存肝細胞における マウス CYP 酵素による 代謝機能が消失して いる 。このため、このマウスを用いることにより、マウス CYP 酵素に起因する ヒト
CLh の過大予測を回避できることが期待される 。しかしながら、CYP 以外の
薬物代謝酵素は残存していることから、これら代謝 酵素によって消失する化合物については 補正 PBS 手法を用いることが望ましいと考え られる。
2.5

小括

ヒト化肝臓 TK-NOG マウスを用いることにより、主に肝臓より消失する化合物 のヒト CL h を良好に予測することができた。特に 、ヒトと比較してマウス肝細胞における代謝活性が高 く 、かつクリアランス が低い化合物については、本研究で提案する補正 PBS 手法により予測精度が大きく向上することが明らかになった。
通常、化合物最適化フェーズにおいて は、代謝安定性の高い低 クリアラン
ス化合物の取得を目指すことから、 補正 PBS 手法のように、マウスとヒトとの間に代 謝活性 差 がある化合 物であ っ ても ヒト CLh を良 好に予測す ることができる 手法 は非常に有用であると考えられた。

49

第三章: コモンマーモセット 及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスと汎用動物

3種とのヒト PK パラメータ 予測精度 比較
3.1

序論

コモンマーモセット及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスの有用性をさらに検討するため、第二章で使用した 24 種のモデル化合物を用いて 、ラット及びイヌによるヒト PK パラメータの予測精度とコモンマーモセット 及びヒト化
肝臓キメラマウスによるヒト PK パラメータの 予測精度 を比較した。
3.2
3.2.1

方法
試薬

第二章で用いた 24 種のモデル化合物 (Table2-1) を研究に供した。
3.2.2

実験動物

雄性 Sprague-Dawley ラット (Jcl:SD) は日本クレア株式会社にて自家繁殖させ、6 週齢 (体重約 250 g) にて使用した。雄性ビーグル犬は Meiji Seika ファ ル マ 株 式 会 社 に て 飼 育 し て い る 個 体 (5-8 歳 齢 , 体 重 約 10 kg, ブ リ ー ダー：オリエンタル酵母株式会社 ) を使用した。
3.2.3

投与及び試料採取

ラット及び イヌへの薬剤投与並びに血液採取は Meiji Seika ファルマ株式会 社 の 動 物 実 験 委 員 会 に て 承 認 さ れ た プ ロ ト コ ル に 従 っ て 実 施 し た (承 認
番号 C2019-051 及び C2020-014) 。
両動物への薬剤投与は、Table 2-1 に示す構成の薬剤を混合したカクテル 溶
液を単回静脈内 投与すること により実施した。投与媒体は、 1％Tween80 及び 10％DMSO 含有生理食塩水とし、 投与用量は、 ラットへの投与 ではフリー体として 0.2 mg/5 mL/kg、イヌへの投与ではフリー体として 0.05 mg/2.5
mL/kg または 0.1 mg/2.5 mL/kg とした。
50

血液採取時点について、ラットでは以下のように設定した。
(ラットにおける Cocktail group 及び血液 採取時間)
Cocktail group 1: 5, 15, 30 min, 1, 2 and 4 hr
Cocktail group 2: 5, 30 min, 1, 2, 4 and 8 hr
Cocktail group 3: 5, 30 min, 1, 4, 8 and 24 hr
Cocktail group 4: 5, 30 min, 1, 4, 8 and 24 hr
イ ヌ における血液採取時点は、カクテル グループ に依らず 、 5、15、30 分 、
1、2、4、6、7、24 時間とした。また、両動物において、投与 後 24 時間以内の自然排尿 を採取した。採取した血液は ヘパリン添加後 、1200×g で 10 分間
遠心分離することで 血漿試料とし、-20℃以下で保存 した 。また、尿試料 についても同様に保存した。
3.2.4

LC-MS/MS 分析

血漿中のモデル化合物濃度は、 2.2.6 に記載した方法により定量した。ただし、使用機器として 2.2.6 に加え、ACQUITY UPLC I-Class 及び Xevo TQS 質量分析計 システム (Waters) を使用した。各化合物の HPLC 条件、イオン化モード及びモニターイオンは Table 2-3 に示した通りである。
3.2.5

PK 解析

ラット及びイヌ にお けるモデル化合 物の 血漿中濃度 を 、2.2.7 に従い解 析
した。
3.2.6

SSS 手法によるヒト CLh 及び Vd 予測

ラット及びイヌにおいて計算された CLh (CL h,animal ) 及び Vd (Vd animal ) から、次式 (3-1, 3-2) よりヒト CLh 予測値 (CL h,human,pred ) 及びヒト Vd 予測値(Vd human,pred )を計算 した。
CLh,human,pred = CL h,animal × (BW human / BW animal ) ^ a
51

(3-1)

Vd human,pred = Vd animal × (BW human / BW animal ) ^ b(3-2)

ここで、BW は各動物種の標準体重 であり、ラット、イヌ及びヒトで、それ
ぞれ 0.25、10 及び 70 kg とした 。スケーリング指数 a 及び b は Sanoh et al.
(2015) の報告に従い、各動物種における、 24 種のモデル化合物のスケーリ
ング指数の平均値を使用した 55) 。
3.2.7

ヒト化肝臓キメラマウスを用いた SSS 手法によるヒト Vd 予測

2.3.3 にて得ら れた血漿中濃度推移を non-compartment モデルにより解析することでヒト化肝臓 TK-NOG マウス における Vd を算出し、式 (3-2) によりヒト Vd を 予測 した。ヒト化肝臓 TK-NOG マウスにおける標準体重は 0.020
kg とし、スケーリング指数 b は全モデル化合物の平均値を用いた。
3.2.8

コモンマーモセットを用いた SSS 手法によるヒト CLh 及び Vd 予測

コモンマーモセットを用いた SSS 手法によるヒト PK パラメータ予測結 果については、Matsumoto et al. (2021) の文献値を引用した 65) 。予測手法を要約すると、PM 表現型コモンマーモセットに 24 種のモデル化合物をカクテル単回 静脈内投与 (0.1 または 0.2 mg/kg) し、血漿中濃度推移を得た。得られた血漿中濃推移を non-compartment モデルにより解析することで、CLtot 及
び Vd を算出した。また、 24 時間までの尿中排泄を評価し、 CLr 及び CLh を得た。CLh 及び Vd より、式 (3-1, 3-2) を用いてヒト CL h 及び Vd を予測した。この時、コモンマーモセットの標準体重としては 0.35 kg を使用し、スケーリング指数 a 及び b は全モデル 化合物の平均値を用い た。
3.2.9

予測精度解析

ヒト CLh 及び Vd 予測精度は、予測値が実測値の 2 倍または 3 倍の 誤差範囲に収束する確率 と AAFE により評価した。

52

3.3
3.3.1

結果
血漿中濃度及び PK パラメータ

ラット及びイヌにおけるモデル化合物の血漿中濃度は単相性あるいは二相性で減少した (data not shown) 。また、non-compartment モデルにより PK
パラメータを計算した結果、Table 3-1 及び Table 3-2 に示す結果が得られた。
CLtot は 幅 広 い 範 囲 で あ り 、 ラ ッ ト で は 0.2 mL/min/kg (S-warfarin) ~ 116.7
mL/min/kg (Midazolam) であり、 イヌ では 0.1 mL/min/kg (Tolbutamide) ~ 35.7
mL/min/kg (Verapamil) であった。 また、 Vd について、ラットでは 0.2 L/ kg(Tolbutamide) ~ 10.0 L/kg (Itraconazole) で あ り 、 イ ヌ で は 0.3 L/ kg(Tolbutamide) ~ 21.5 L/kg (Verapamil) の範囲であった。fe urine について は、 ヒト fe urine とは異なり、ラットにおいて Lamotrigine (約 23%) が、イヌにおいて Probenecid (約 71%) が高かった 。

53

Table 3-1 Observed CL tot and fe urine values of the 24 model compounds after
intravenous administration to Rat and Dog.
CLtot (mL/min/kg)

Compoundfe urine (%)

SD rataBeagle dog b

SD rataBeagle dog b

Acetaminophen

41.8 ± 6.6

11.8

4.2 ± 0.30cAntipyrine

6.2 ± 1.2

9.0

1.7 ± 1.0

0.21

Cilomilast

18.2 ± 4.5

0.15

0c

0.21

Clonazepam

25.3 ± 8.7

17.8

0.11 ± 0.06

0.04

Dapsone9.0 ± 1.4

2.2

1.5 ± 0.4

5.6

Diclofenac

12.8 ± 2.8

2.00.42 ± 0.31

0.2

Glyburide

8.9 ± 1.3

1.1

0.02 ± 0.01

0.10

Ibuprofen

7.5 ± 0.6

2.4

0.18 ± 0.24

0.11

Itraconazole

67.2 ± 13.3

8.8

0.01 ± 0.01

0.02

Ketanserin

3.2 ± 0.7

34.7

0.06 ± 0.07

0.19

Ketoprofen

1.1 ± 0.1

2.1

2.4 ± 1.7

3.9

Lamotrigine

1.6 ± 0.3

8.5

22.6 ± 11.8

0.92

Midazolam116.7 ± 8.2

15.2

0c

0c

Moxifloxacin

65.6 ± 12.4

4.7

4.6 ± 1.6

6.6

Nicardipine

107.3 ± 5.4

25.9

0.01 ± 0.01

0.02

Pefloxacin

26.2 ± 5.2

6.2

7.7 ± 0.6

2.9

Phenytoin

26.7 ± 18.7

6.8

0.45 ± 0.41

1.3

Probenecid

71.8 ± 8.80.76

1.0 ± 0.7

71.1

Repaglinide

14.3 ± 1.9

1.10.01 ± 0.01

0.08

Telmisartan

7.4 ± 0.5

14.4

0.02 ± 0.01

0.04

Tolbutamide

0.23 ± 0.02

0.10

0.51 ± 0.05

2.8

Verapamil

82.4 ± 28.0

35.7

0.45 ± 0.32

0.35

S-Warfarin

0.20 ± 0.04

0.81

0.07 ± 0.02

0.08

Zaleplon

40.2 ± 4.9

23.0

0.13 ± 0.03

0.13

a

Mean ± SD from three animalsb

Mean of two animals.

cLess than detection limit.

54

Table 3-2 Observed Vd values of the 24 model compounds after intravenous
administration to Rat, Dog and Hu-liver TK-NOG mice.
CompoundVd (L/kg)
SD rataBeagle dog b

Hu-liver TK-NOG mice a

Acetaminophen

1.2 ± 0.2

1.1

0.82 ± 0.22

Antipyrine

0.89 ± 0.1

0.71

1.0 ± 0.19

Cilomilast

0.59 ± 0.1

0.29

0.25 ± 0.09

Clonazepam

2.0 ± 0.4

1.6

3.2 ± 0.58

Dapsone3.7 ± 0.31.8

1.9 ± 0.31

Diclofenac

1.7 ± 0.5

0.65

0.33 ± 0.04

Glyburide

2.2 ± 0.1

0.42

0.12 ± 0.04

Ibuprofen

0.35 ± 0.1

0.28

0.25 ± 0.03

Itraconazole

10.0 ± 1.1

8.6

1.9 ± 0.44

Ketanserin

0.43 ± 0.02

3.3

6.6 ± 1.4

Ketoprofen

0.84 ± 0.3

0.60

0.20 ± 0.02

Lamotrigine

2.4 ± 0.1

1.4

3.0 ± 0.30

Midazolam

2.5 ± 0.3

0.79

2.3 ± 0.53

Moxifloxacin

4.2 ± 0.6

4.8

3.5 ± 1.1

Nicardipine

5.0 ± 0.6

4.4

2.1 ± 0.35

Pefloxacin

7.5 ± 4.7

3.1

3.7 ± 0.80

Phenytoin

1.8 ± 0.4

1.1

1.1 ± 0.09

Probenecid

1.4 ± 0.8

0.44

0.46 ± 0.05

Repaglinide

1.0 ± 0.1

0.65

0.66 ± 0.10

Telmisartan

4.8 ± 0.5

4.4

2.5 ± 1.5

Tolbutamide

0.17 ± 0.01

0.26

0.13 ± 0.01

Verapamil

3.9 ± 1.4

21.5

4.9 ± 1.3

S-Warfarin

0.35 ± 0.04

0.82

0.39 ± 0.08

Zaleplon

1.3 ± 0.1

1.3

1.0 ± 0.22

aMean ± SD from three animalsb

Mean of two animals.

3.3.2

SSS 手法 によるヒト PK パラメータ予測

3.2.6 に従いラット及びイヌを用いてヒト CLh を予測した結果 を、Figure 31A, 1B 及び Table 3-3 に示 した。ラットでは 2 倍誤差以内に収束する確率は37.5%であり、Probenecid では約 42 倍過大予測していた。イヌでは 2 倍誤差55

以内の確率が 54.2%であり、最大で Repaglinide を約 17 倍過小予測していた。
ラット、イヌ及びヒト化肝臓キメラマウスを用いて SSS 手法により ヒト
Vd を予測した結果を、Figure 3-2A, 2B, 2C 及び Table3-4 に示した。ラットでは 2 倍誤差以内に収束する確率は 45.8%であり、Ketanserin では約 21 倍過小
予 測 し て い た 。 イ ヌ で は 2 倍 誤 差 以 内 の 確 率 が 58.3%で あ り 、 最 大 で Swarfarin を約 4 倍過大予測していた。ヒト化肝臓キメラマウス では 2 倍誤差
以内の確率が 83.3%であり、最大で Itraconazole を約 7 倍過大予測していた。

Figure 3-1. Relationships between observed and predicted human CL h values
using SSS method in Rat (A) and Dog (B).

56

Figure 3-2. Relationships between observed and predicted human Vd value s
using SSS method in Rat (A), Dog (B) and Hu-liver TK-NOG mice (C).

57

Table 3-3 Observed and predicted CL h values using SSS method in Rat and Dog.
CompoundObserved human CLh(mL/min/kg)a

Predicted human CLh (mL/min/kg) by SSS method
SD ratBeagle dog

Acetaminophen

4.9

5.2

4.8

Antipyrine

0.62

0.79

3.6

Cilomilast

0.50

2.4

0.06

Clonazepam

0.9

3.3

7.1

Dapsone

0.43

1.2

0.83

Diclofenac

3.5

1.7

0.79

Glyburide

0.82

1.2

0.46

Ibuprofen

0.81

0.97

0.95

Itraconazole

5.1

8.8

3.5

Ketanserin

6.6

0.42

13.9

Ketoprofen

1.1

0.14

0.80

Lamotrigine

0.6

0.2

3.4

Midazolam

5.3

15.2

6.1

Moxifloxacin

1.9

8.2

1.8

Nicardipine

10.9

14.0

10.4

Pefloxacin

1.9

3.1

2.4

Phenytoin

0.36

3.5

2.7

Probenecid

0.22

9.3

0.04

Repaglinide

7.7

1.9

0.45

Telmisartan

8.3

1.0

5.8

Tolbutamide

0.21

0.03

0.04

Verapamil

16.5

10.7

14.3

S-Warfarin

0.05

0.03

0.33

16.0

5.2

Zaleplona

Quoted from Varma et al. (2010)

44)

9.2
48)

except for S-warfarin (Abemethy et al, 1991) .

58

Table 3-4 Observed and predicted Vd values using SSS method in Rat, Dog andHu-liver TK-NOG mice.
Predicted human Vd (L/kg) by SSS method

Observed human Vd(L/kg)a

SD ratBeagle dog

Hu-liver TK-NOG miceAcetaminophen

1.0

0.50

0.57

0.60

Antipyrine

0.77

0.38

0.37

0.73

Cilomilast

0.23

0.25

0.15

0.20

Clonazepam

2.9

0.85

0.86

2.2

Dapsone

0.83

1.6

0.96

1.4

Diclofenac

0.22

0.74

0.34

0.20

Glyburide

0.08

0.95

0.22

0.07

Ibuprofen

0.15

0.15

0.15

0.13

Itraconazole

7.4

4.2

4.5

1.1

Ketanserin

3.9

0.18

1.7

4.8

Ketoprofen

0.13

0.36

0.31

0.13

Lamotrigine

1.1

1.0

0.73

2.1

Midazolam

1.1

1.1

0.41

1.6

Moxifloxacin

1.4

1.8

2.5

2.7

Nicardipine

1.0

2.1

2.3

1.3

Pefloxacin

1.5

3.2

1.6

2.5

Phenytoin

0.52

0.75

0.58

0.80

Probenecid

0.13

0.57

0.23

0.33

Repaglinide

0.35

0.44

0.34

0.40

Telmisartan

5.3

2.0

2.3

1.9

Tolbutamide

0.12

0.07

0.14

0.07

Verapamil

3.7

1.7

11

3.2

S-Warfarin

0.11

0.15

0.43

0.27

1.3

0.57

0.65

CompoundZaleplona

44)

Quoted from Varma et al. (2010) , except for Vd of lamotrigine (Incecayir and Agabeyoglu 2006)

0.73
46)

and phenytoin (Lundet al. 1974)47)

3.3.3

ヒト PK パラメータ予測精度比較

ヒト化肝臓 TK-NOG マウス、ラット、 イヌ及びコモンマーモセットの 単独動物種を用いたヒト CLh 及び Vd の予測結果を Table 3-5, 6 に示した。CLh
予測精度はヒト化肝臓 TK-NOG マウス (補正 PBS 手法) 及びコモンマーモ
セットで高く、AAFE はそれぞれ 1.8 及び 2.0 であり、2 倍誤差以内に収束する確率はともに 58.3%であった。ラット及びイヌにおけるヒト CLh 予測についての AAFE は低く、それぞれ 3.4 及び 2.7 であった。Vd 予測精度について59

もヒト化肝臓 TK-NOG マウス及びコモンマーモセットで高く、AAFE はと もに 1.6 であり、2 倍誤差以内に収束する確率は 83.3 及び 70.8%であった。Vd
予測精度については、ラット及びイヌにおいても比較的高く、AAFE はそれ
ぞれ 2.2 及び 1.8 であった。

Table 3-5 AAFE and the percentage of predicted CL h values within two- or
three-fold error of the 24 model compounds using SSS and corrected PBS
methods.
CompoundSD ratBeagle dog

Hu-liver TK-NOG miceCommon marmoset

SSS method

SSS method

corrected PBS method

Allometoric scaling exponets

0.64

0.53

0.65

0.72

-

Within 2-fold error (%)

37.5

54.2

58.3

54.2

58.3

Within 3-fold error (%)

50.0

58.3

70.8

83.3

91.7

AAFE

3.4

2.7

2.0

2.0

1.8

Table 3-6 AAFE and the percentage of predicted Vd values within two- or threefold error of the 24 model compounds using SSS methods.

CompoundSD ratBeagle dog

Common marmoset

Hu-liver TK-NOG mice

SSS method

Allometoric scaling exponets

0.85

0.67

0.87

0.95

Within 2-fold error (%)

45.8

58.3

70.8

83.3

Within 3-fold error (%)

79.2

87.5

95.8

95.8

AAFE

2.2

1.8

1.6

1.6

3.4

考察

本章では、ヒト PK パラメータ 予測に汎用される動物種であるラット及びイヌと、コモンマーモセット及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスについて、単独動物種によるヒト CLh 並びに Vd の予測精度を比較し た。その結果、CLh
及び Vd ともにコモンマーモセット及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスによる予測精度が高いこと が明らかになった。
60

本研究では 実験 データを示していないが、24 種のモデル化合物のうち 15
種 の 化合物 について は 、サル (カニク イ ザル及びア カゲザル ) における PK
パラメータ が報 告されてお り、サルを用いた SSS 手法によるヒト CLtot 及びVd 予測精度がコモンマーモセットと同程度である ことを明らかにしている
65)。また、本研究と同様に肝 代謝消失型のモデル化合物 30 種を用いて動物

種間の SSS 手法によるヒト PK 予測精度を比較した Miyamoto et al. (2017) の報告によると、CLtot と Vd の予測精度は ヒト化肝臓キメラマウスとサルで類似しており、かつ、ラット と比較して 予測精度が高かった 42) 。同様に、Sawada
et al. (2021) は野生型マウスとヒトとで CLtot に種差がある 16 種のモデル化合物を用いてヒト CLtot 予測精度を評価した結果、ヒト化肝臓キメラマウス
及びサルで 同等の予測精度 であることを報告し ている 43) 。以上より、本研究で示されたコモンマーモセット及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスを用いたヒト CLh 及び Vd 予測精度は、汎用動物種の中で最も高い予測精度を有するサルを用いた SSS 手法に匹敵することが示唆された。
SSS 手法は非常に簡便な方法であるが、スケーリング指数については議論の余地がある。Hosea et al. (2009) は、基礎代謝量や心拍出量といった生理学的的因子が 0.75 という固定指数によって動物種間をスケーリングできるという報告 66) に基づき、CL のスケーリング指数を 0.75 に設定している。しかし、クレアチニンクリアランス等、複数の生理的因子のスケーリング指数
は必ずしも 0.75 ではないことから、Mahmood et al. (2010) はスケーリング指数として 0.75 を妄信すべきではないと主張している 67) 。Sanoh et al. (2015)は、ヒト化肝臓キメラマウスを用いた SSS 手法による ヒト CLtot 予測研究にて、スケーリング指数の 平均値が 0.814 となることを報告し、ヒト化肝臓キ
メラマウスが通常マウスとは肝重量や肝臓の構成が異なることがスケーリ
61ング指数に影響を及ぼ していると考察した 55) 。また、Tess et al. (2020) は、
サルを用いたヒト CLh 予測に関して、Valsartan を含む 27 種の酸性および双性イオン性化合物について、スケーリング指数 0.75 と比較して 0.50 という低いスケー リング指 数で良好な 予測精度 を示したこ とを報告 している 68) 。
本研究では、ヒト PK パラメータを予測するための最適なスケーリング指数
は動物種により異なる可能性があ るという考えのもと、Sanoh et al. (2015) と同様に個々の化合物のスケーリング指数の平均値を使用した。この方法では、
個 々 の化合物についてヒト実測値を予測し得るスケーリング指数を算出 し 、全ての化合物のスケーリング指数を平均した値をあらためて個々の化合物に適用している。なお、本研究の化合物セットについてスケーリング指数
0.75 を採用した場合におい ても、ヒト化肝臓 TK-NOG マウスを用いた SSS手法による ヒト CLh 予測精度は、AAFE が 2.0 と低値であり 、2 倍及び 3 倍
誤差以内の割合 もそれぞれ 54.2%及び 79.2%と、 良好な予測精度が再現されることを確認している 。
SSS 手法とは異なり、補正 PBS 手法の場合は 生理学的因子に基づきヒトCLh を 予 測 す る こ と か ら 、 ス ケ ー リ ン グ 指 数 に 関 す る 議 論 を 回 避 で き る 。
Nakayama et al. (2019) 及び Yoshida et al. (2021) は、ヒト化肝臓キメラマウ
スにおける CL h,int はヒトにおける CL h,int と同一であると 仮定 し、スケーリン
グ指数を使用しない PBS 手法 (補正なし PBS 手法) の有用性を提唱している 69)-70) 。本研究は、このコンセプトに in vitro 代謝活性比とヒト肝置換率の補正を加えることで予測精度の向上を達成した。
SSS 手法を用いたヒト Vd 予測に関しては、ヒト化肝臓キメラマウス及びコモンマーモセットで良好 な精度で 予測できることが明らかにな った。また、
いずれの動物種を用いた場合にも ヒト Vd の予測は ヒト CLh の予測と比較し62

て高い精度 であることが明らかになった。これは、 Vd が化合物の持つ親油性、イオン化率、極性表面積や水素結合ドナー数等の動物種に依存しない物
理化学的性質に支配されていることが要因であると推察される 71) 。
本研究に用いた 24 種のモデル化合物では、コモンマーモセットとヒト化
肝臓 TK-NOG マウス間でほぼ同程度か、ややヒト化肝臓キメラマウスで高いヒト CLh 予測精度が得られた。両動物種にはそれぞれ特徴があるため、ヒトクリアランスを予測する化合物の特性に合わせて動物種を選択すべきである。具体的には、まずは 化合物の消失経路を考慮する。化合物が腎排泄型の場合は、一般にマウスと比較してサルを用いたアロメトリー手法の予測精度が高いた め 72) 、コモンマー モセット を用いたク リアラン ス予測が適 切と考えられる。一方、肝代謝 消失型ならば、本研究で示すようにヒト化肝臓キ
メラマウスでやや予測精度が優れている ことから、ヒト化肝臓キメラマウスを用いたクリアランス予測が適切と考えられる 。しかし、肝外代謝 のある化合物の場合にはヒト化肝臓キメラマウスによる予測精度が低下する可能性があるため、注意が必要である 42) 。また、化合物の代謝に関与する酵素 の種類を考慮することも必要である。コモンマーモセットやカニクイザルのCYP2C19 には薬物の代謝能力に大きく影響する遺伝子多型が あり 73) 、表現
型の異なる個体を用いることにより、クリアランスの予測精度に影響を与える可能性がある 65) 。また、ヒト化肝臓キメラマウスは、単一ドナーの肝細胞を移植する ことにより作製する ことから、ドナーとなる肝細胞の性質を反映
す る可能性 がある 74) 。先行研究では それ ぞれ 異なる ドナーの 肝細胞を移 植したヒト化肝臓キメラマウス を用い ているものの、同様に良好なヒト PK 予
測精度を示しており、ドナーによる違いが予測精度に与える影響は少ないと
考 え られる。しかし 、ヒト化 肝臓キメラマウスを用いて予測する場合に は 、63

薬物代謝酵素の遺伝子多型の有無などのドナーの背景情報は把握しておくべきであろ う。
3.5

小括

コモンマーモセット及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスは、ヒト PK パラメー
タ予測に汎用される ラット及びイヌと比較してヒト CLh 及び Vd 予測精度が高く、サルに匹敵する予測精度であること が明らかになった。これらの動物
種はイヌやサルと比較して 小型であることから、化合物最適化フェーズにおいて課題となる大量の化合物合成を必要としないという 利点がある。これらの結果より、コモンマーモセット及びヒト化肝臓 キメラ マウスは、化合物最適化フェーズにおいて ヒト PK パラメータを予測する動物種として非常に有用であることが示された。

4

総括
本研究では、コモンマーモセット及びヒト化肝臓 TK-NOG マウスを用いた単独動物種によるヒト PK パラメータ 予測手法が、汎用動物種を用いた 予測手法と同等以上の予測精度であることを明らかにした。また、これら動物
種はヒトにおける代謝物推定にも期待できることが示された。
本研究の成果は、創薬における化合物最適化を促進するとともに、毒性試
験並びに第Ⅰ相臨床試験計画の立案に有用な情報を提供することにより、医薬品開発の効率化に貢献するものと考えられる。

64

5

謝辞
本研究に終始懇篤なるご指導とご鞭撻を賜りました明治薬科大学 薬剤学

研究室 小林カオル教授に 心より厚く御礼申し上げます 。
論文作成に際し 、 ご指導とご助言を賜りました主査の 明治薬科大学 薬物動 態 学研究室 花田和彦教授 、副査の明治薬科大学 臨床薬学部門 レギュ ラ
トリーサイエンス研究室 前田英紀教授並びに明治薬科大学 薬物治療学研
究室 髙橋雅弘講師 に厚く御礼申し上げます。
本研究に際して多大なご指導とご助言を賜りました公益財団法人実験動物中央研究所 神村秀隆博士に深く感謝申し上げます。
Cilomilast を合成し、ご恵与頂いた Meiji Seika ファルマ株式会社 医薬研
究 所 創薬科学研究室 （現 製薬研究所 創薬研究室 ）の皆様に厚く御礼申し上げます。
本研究の実験にご協力頂きました末松裕実様、菅原由紀子様並びに長直樹様に感謝致します。
本研究の遂行にあたり特段のご便宜を賜りました Meiji Seika ファルマ株
式 会 社 研究開発本部 黒沢亨 本部長に心より厚く御礼申し上げます。ま た 、本研究の計画から完成に至るまでにご理解とご協力賜りました 土屋敏行部長、加藤和彦部長、 伊藤富美課長、 宮田敦徳課長に深く感謝致します。
最後に、これまで筆者を支えてくれた両親に感謝するとともに 、本研究に専心できるように終始協力してくれた 家族に感謝致します。

65

6

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