アトピー性皮膚炎患者皮膚マイクロバイオームの新たなディスバイオーシスの機序-Delftia acidovorans の Staphylococcus epidermidis に対する増殖抑制効果New Mechanism of Dysbiosis in Skin Microbiome of Patient with AtopicDermatitis - Inhibitory Activity of Delftia acidovorans against theGrowth of Staphylococcus epidermidis 平成 30 年度入学

大久保友隆

( O h k u b o , To m o t a k a )アトピー性皮膚炎 (AD: Atopic dermatitis) は、増悪と寛解を繰り返す瘙痒のある湿疹を主病変とする慢性皮膚疾患である。AD の瘙痒は過剰な免疫応答によって惹起され、この過剰な免疫応答には皮膚上にマイクロバイオームとして常在する微生物が関与することがある。
ヒトの皮膚上には多種多様な細菌、真菌およびウイルスがマイクロバイオームを構成しており、抗菌ペプチドの産生や恒常的な皮膚免疫の誘導を促進することで外来の病原微生物の皮膚への侵入を阻止している。しかし、
AD 患者皮膚ではマイクロバイオームのバランスの破綻、即ちディスバイオーシスが生じている。寛解期では、Staphylococcus epidermidis を含む
Coagulase negative Staphylococci (CNS) が優位となり高い多様性が維持
さ れ る が 、 増 悪 期 で は S . a u re u s の 相 対 占 有 率 の 上 昇 に 伴 い C N S が 排 除 さ
れ る こ と で 多 様 性 が 著 し く 低 下 す る 。 S . a u re u s は ス ー パ ー 抗 原 や フ ェ ノール可溶性モジュリンなどの毒素を産生することなどで炎症応答を誘導するほか、プロテアーゼを介して皮膚バリア機能を傷害することで AD の症状を増悪させるため、皮膚マイクロバイオームのバランスを適正化することで AD の炎症を制御することが可能であると考えられる。当研究室では、AD 患 者 の 網 羅 的 な 皮 膚 マ イ ク ロ バ イ オ ー ム の 解 析 か ら 、ClassBetaproteobacteria に属する Delftia acidovorans が AD 患者病変部に特異的な細菌であることを見出している。
本研究では、D. acidovorans が AD 患者のマイクロバイオームのディスバイオーシスに関与していると考え、本菌が CNS の代表菌種である S.
epidermidis の増殖に与える影響とその機序を明らかにした。
I. D. acidovorans 細胞外分泌物質の S. epidermidis に対する増殖抑制作用
D. acidovorans 由 来 の 培 養 上 清の熱処理画分 (Heat-treated CS) は
S. epidermidis に対して増殖抑制作
用 を 示 す 一 方 で 、 S . a u re u s の 増 殖を抑制しなかった (Fig. 1) 。この結果 はD.

acidovorans

がS.

epidermidis の増殖を抑制する物質を産生することを示唆している。

Fig. 1 D. acidovorans heat-treated CS のS. epidermidis に対する増殖抑制作用

II. D. acidovorans の TCA 回 路 依 存 的 な ROS 産 生 を 介 し た S.
epidermidis に対する増殖抑制作用
D.

acidovoransの S. epidermidis に対する増殖抑制作用の作用機序を明らかにするため、
RNA-seq により D.
acidovorans 培養上
清 存 在 下 で の S.
Fig. 2 D. acidovorans 培養上清の存在化における S. epidermidis の遺伝子発現変動

epidermidis の網羅的な遺伝子発現解析を行なった。S. epidermidis の解糖系や TCA 回路に関連する遺伝子群の発現上昇が認められた (Fig. 2) 。
D. acidovorans heattreated

CSのS.

epidermidis に対する増殖抑制作用は TCA 回路の 阻 害 剤 で あ るMalonic acid (MA) の添加によって低下した(Fig. 3) 。 以 上 の 結 果 かFig. 3 D. acidovorans heat-treated CS の TCA 回路を介した
S. epidermidis に対する増殖抑制作用

ら D. acidovorans が S. epidermidis の TCA 回路を介して増殖を抑制していることが示唆された。
TCA 回路由来の電子供与体は呼吸鎖を活性化し、ROS 産生を亢進させる。D. acidovorans heat-treated CS によって S. epidermidis の ROS 産生量が上昇し、この ROS 産生誘導作用は MA によって阻害された。これらの結果から、D. acidovorans heat-treated CS が TCA 回路を介して S.
epidermidis の ROS 産生を誘導すると考えられ た 。 ま た 、D.
acidovorans

heat-treated CS に よ る S.
epidermidis に対する増殖抑制作用は、ラジカルスカベンジャーである

Fig. 4 D. acidovorans heat-treated CS の ROS を介した
S. epidermidis に対する増殖抑制作用

N-acetyl-L-cysteine (NAC) の添加により阻害された (Fig. 4) 。以上の結果から D. acidovorans が S. epidermidis の TCA 回路依存的な ROS 産生を誘導することで、S. epidermidis の増殖を抑制することが示唆された。
III. D. acidovorans のアルカリストレスを介した S. epidermidis に対する増殖抑制作用
D.

acidovorans

heat-treated CS は培養に使用した培地と比較してアルカリ性を示した。また、D.
acidovorans

heat-treated CS の pH を中性化することで、Fig. 5 D. acidovorans heat-treated CS の S. epidermidis
に対する増殖抑制作用における pH の影響

その S. epidermidis に対する増殖抑制作用が部分的に阻害された (Fig. 5) 。細菌の代謝物の中でアルカリ性を示す物質としてアンモニアがある。ゲノムデータベースを用いた解析から、D. acidovorans のゲノム中にアンモニアの産生に関与するグルタミン、アスパラギン代謝経路に関連するグルタミナーゼやアスパラギナーゼなどの酵素をコードする遺伝子群が存在することが明らかとなった。また培地と比較して D. acidovorans heat-treated CS ではアンモニアが高濃度であった。さらに D. acidovorans heat-treated CS と同等のアンモニア濃度に調整した培地が D. acidovorans heat-treated CS と同等の pHを示した。以上の結果から、D. acidovorans heat-treated CS のアルカリ化には、D. acidovorans が産生するアンモニアが関与していることが示唆された。
D. acidovorans heat-treated CS と同等の pH に調整したアンモニア溶

液は D. acidovorans
heat-treated CS と同様にS.

epidermidis に 対 する増殖抑制作用を示した。またアンモニ
ア 溶 液 に よ り 、S.
Fig. 6 アンモニア溶液の S. epidermidis に対するepidermidis の ROS 産生が増殖抑制作用における TCA 回路と ROS の影響誘導された。さらにアンモニア溶液の S. epidermidis に対する増殖抑制作用が D. acidovorans heat-treated CS と同様に MA や NAC の存在下において阻害された (Fig. 6) 。以上の結果から、D. acidovorans heat-treated
CS がアンモニア由来のアルカリストレスを介して S. epidermidis の TCA回路依存的な ROS 産生を誘導し、その増殖を抑制することが示唆された。
総括
本研究では、AD 患者の皮膚上から検出される D. acidovorans がアルカリストレスを介して TCA 回路依存的に ROS 産生を誘導することで S.
epidermidis の増殖を抑制することを明らかにした。また、皮膚マイクロバイオー
ム中におけるアルカリ化に関与する細菌が S . a u re u s と S .
epidermidis のバラン
Fig. 7 本研究から推定されるマイクロバイオームの破綻におけるスの破綻を導き、AD のD. acidovorans の関与増悪に関与する可能性が示唆された(Fig. 7)。
今後の研究展開皮膚マイクロバイオームのディスバイオーシス が AD の 増 悪に関与することは 明 ら か で あFig. 8 AD 患者から分離された Citrobacter koseri のゲノム解析る。マイクロバイオームは多種多様な微生物で構成されているため、特定の菌種のみならずマイクロバイオーム全体として理解するべきである。例
え ば 、 申 請 者 は A D 患 者 か ら 分 離 し た C i t ro b a c t e r k o s e r i の ゲ ノ ム 解 析 から、本菌のゲノム中に aerobactin などの毒性因子の産生に関連する遺伝子群が存在することを明らかにしている (Fig. 8) 。今後、こうした物質の産 生 を 介 し て C . k o s e r i が S . e p i d e r m i d i s や S . a u re u s に 与 え る 影 響 を 明らかにすることで皮膚マイクロバイオームのディスバイオーシスの機構についての統合的な知見が得られることが期待される。

<参考文献>1 ) O h k u b o T . , M a t s u m o t o Y. , C h o O . , O g a s a w a r a Y. , S u g i t a T. ,M i c ro b i o l R e s o u r A n n o u n c . , 9 , e 0 1 2 2 8 - 2 0 ( 2 0 2 0 )2 ) O h k u b o T . , M a t s u m o t o Y. , C h o O . , O g a s a w a r a Y. , S u g i t a T. , P L o S
One., 16, e0253618 (2021)
3 ) O h k u b o T . , M a t s u m o t o Y. , O g a s a w a r a Y. , S u g i t a T. , B i o c h e m B i o p h y sR e s C o m m u n . , 5 8 8 , 1 0 4 - 11 0 ( 2 0 2 2 ) .