Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006. p. 105 110

連載「微生物資源の保存技術講座」

第2回

Vol. 22, No. 2Ｎ２糸状菌類の簡便で安全な凍結保存法
岡田

独立行政法人理化学研究所

バイオリソースセンター

元
微生物材料開発室〒351‑0198

埼玉県和光市広沢 2‑1

Cryopreservation methods for filamentous fungi:
Simple and safety techniques
Gen Okada
Microbe Division / Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center
2-1 Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198, Japan

1．はじめにに述べる器具は必要に応じて適当な容器に入れ，乾熱

筆者は主として子嚢菌類と子嚢菌系不完全菌類，さらに一部の異担子菌類，担子菌系不完全菌類，接合またはオートクレーブ滅菌する．さらに，無菌操作はクリーンベンチなどで行う．

菌類の菌株保存に携わってきたが，担子菌類の代表格であるハラタケ類や凍結保存が極めて困難な鞭毛菌類

2．凍結保存法についてはその経験がほとんどない．そのため，本

1）培養

稿では糸状菌類全般に関する菌株保存の解説はできな

糸状菌類に限ったことではないが，千差万別の種やいが，幸いなことに，凍結保存，凍結乾燥，L-乾燥，株ごとにできるだけ適した培養方法を用いることが肝流動パラフィン重層などの微生物株の代表的な長期要である．実際にはなかなか難しいことであるが，以保存法については既に優れた解説がある（Kirsop ＆下に，一般的な要点や特殊な例を列記し，参考として

Doyle，1991; Malik，1992; 根井，1977；農林水産省供したい．

農林水産技術会議事務局 , 農林水産省農業環境技術

・凍結保存は菌糸のみで増殖する菌群にも適用可能だ

研 究 所，1987；Simione ＆ Brown，1991; Smith ＆が，分散能力のある胞子や耐久性のある厚膜胞子なOnions，1994）．詳細については，必要に応じてこれどを可能な限りつくらせるに越したことはない．こらをご覧いただきたい．

れに適した培地や培養条件を検討することが，凍結本稿では，胞子（分生子や子嚢胞子など）を形成せ保存の成否に直結する重要なポイントの一つであず，菌糸のみで生育する高等菌類（子嚢菌類，担子る．

菌類，不完全菌類）や接合菌類の長期保存法として簡・培地は一般的に寒天培地が多用され，合成培地より便かつ信頼性があり，さらに通常の研究施設で実施可も天然培地（オートミール寒天培地，コーンミール

能な凍結保存法について，筆者が会得したこつや工夫

寒天培地，ジャガイモ寒天培地，麦芽寒天培地など）を含めた基本技術を紹介したい．胞子を多数形成するの方が適している．

糸状菌類にのみ適用可能で，郵送が容易な凍結乾燥や・好稠性菌類に対しては糖などを多量に添加しL-乾燥（坂根ら，1996）の技術は，酵母や細菌などのた 培 地 を 用 い る こ と は 当 然 で あ る が， 例 え ば，他の微生物群で用いられているものと基本的に同じな（アナモルフはので，その紹介は「微生物資源の保存技術講座」（岡）では培地に対する厳密な管理が要求根 , 2006）の他項などに譲ることとする．なお，以下される．すなわち，本種に対しては M60Y などの寒天培地の表面を完全に乾かす必要があり，干からE-mail: okada@jcm.riken.jp

びる寸前になった斜面培地上部にのみ閉子嚢殻をつ─ 105 ─糸状菌類の凍結保存法

岡田 元

くる（他の部位では胞子発芽や菌糸生育さえみられ成についてさまざまな報告があるが，以下にいくない）．干からびかけた培地を常備できない場合は，つかのカルチャーコレクションにおける使用例を示斜面培地やシャーレ（後者の場合は滅菌した紙箱に入れる）をバッチ式真空乾燥機で様子を見ながら急す．
CBS: 10％グリセロール; −135℃/LN2（Gams

速乾燥させるとよい．

.,

1998）

・培地に滅菌した天然基質を添加し（基質添加後に培ATCC: 10％グ リ セ ロ ー ル，5％DMSO；−150℃/

地を滅菌することも多い），菌を生育させた後に，LN2（Alexander

その基質ごと定法により凍結保存すると生残性が上1991）がることがある．基質が胞子形成を誘導したり，そIMI/CABI: 10％ グ リ セ ロ ー ル; LN2（Smith ＆れ自体が保護剤の役目を果たしたりするのであろう．基質としては，植物の茎，葉，種子などさまざ., 1980; Simione ＆ Brown，Onions，1994）
IFO/NBRC: 10％グリセロール＋ 5％トレハロース;

まなものが考えられる．

−80℃/LN2

・培養期間の目安は一概には言えないが，筆者はコ

JCM: 10％グリセロール/DMSO ＋ 5％トレハロース;

ロニーがシャーレ全面に広がる少し前までには保存−80℃/LN2処理を行うように心がけている．種によっては，菌

筆者はトレハロースぬきの 10％グリセロールと糸がシャーレの蓋の隙間からはみ出るほど生育が10％DMSO を長年使用してきたが，5％トレハロー

旺盛なものもある．このようなものを含む複数株のスの保護効果を聞き（中桐

保存処理を同時に行う場合は，汚染を防ぐために添加している．当初はどの保護剤がよいか分からず，アルコール綿などでクリーンベンチをこまめに除菌10％のグリセロールと DMSO の 2 本立てで凍結保存清掃することはもちろんであるが，準備段階からを始め，そのまま現在に至っているというのが本音で昭，私信），数年前より培養プラスチックシャーレを 1 枚ずつパラフィルムある．しかし，取り扱った菌群は限られているもの（Parafilm M）などでシールし，シャーレの大きさの，ほとんどの場合（ハラタケ類の一部はうまく凍結にあったポリプロピレン容器やスチロール容器に入保存できない），どちらの保護剤でも問題なく保存でれて培養するなどの配慮が必要である．さらに，株きている．また，少例ではあるが，以下の菌種/菌株ごとの生育度合いを確認しながら，同程度の速度ので，保護剤により顕著な保護効果の差が見られたこと

株を選んで保存する．生育の遅い菌に関しては，コは大変興味深い：ロニーがシャーレ全面に広がる前であっても，あまJCM 13154,JCM 13541（10％グリセり古くならない適当な時期を見はからって保存処理

ロールで生残；10％DMSO で死滅）;sp.

すべきである．長期培養するとむしろ活きが悪くな

JCM 11504，り，保存性が低下することを経験しているため，筆DMSO で生残；10％グリセロールで死滅）．この様に，者の場合は最長でも 1 ヶ月半程度の培養を目安とし簡単な組成の 2 種類の保護剤を用いるだけでも，死滅ている．このような生育の極めて遅いものでは，菌の危険を減らす大きな効果が得られる場合がある．

sp．JCM 11505（10％をできるだけシャーレ全体に広げて接種すれば十分な量の保存材料が得られる．

3）手順と関連情報① 10％グリセロールと 10％DMSO を必要な本数の凍2）保護剤（凍害防止剤）

結チューブ（Nunc 363401, 容量 1.8 m ，インナー① 10％（v/v）グリセロール＋ 5％（w/v）トレハロー

キャップ式; Nunc A/S，Roskilde，Denmark）にス水溶液（トレハロース：商品名 とれはのいのち，1 m ずつ無菌的に分注する．

（株）林原，岡山）をメディウム瓶や試験管などに凍結チューブの蓋の形状に関しては，アウター分注し，オートクレーブ滅菌する（以下，特に言及

キャップ型の方が汚染し難いと思われるが，Nunc

しない限り，10％グリセロールと略記）．

社の製品に関しては，インナーキャップ型の方がネ② 10％（v/v）ジメチルスルホキシド＋ 5％（w/v）

ジやシリコンパッキンの具合がよいと思われる．操

トレハロース水溶液を同様に調製する（以下，同様

作性が総合的に優れていると判断し，筆者はインに，10％DMSO と略記）．

ナーキャップ型を使用している．

保護剤は凍結保存にとって極めて重要である．組─ 106 ─IFO/NBRC では保護剤を凍結チューブに分注しMicrobiol. Cult. Coll. Dec. 2006Vol. 22, No. 2ステンレス棒（ステンレスチューブ内側の棒）先端が鋭利なステンレスチューブ菌糸と（厚膜）胞子
菌糸のみ

ミクロスパーテル

1
凍結チューブ

32

コロニー

打ち抜いた
コロニーディスク
(直径約6mm)

1

10% glycerol +10% DMSO +5% trehalose
5% trehalose

4
保護剤への十分な浸漬(4℃, 数時間)) → 凍結 （-80℃）
図1

糸状菌類の凍結保存： コロニーパンチ法
作業手順： 1/1' → 2 → 3 → 4 と進む．
ED

図3
DA&B

B

A

Transfertube（Spectrum Laboratories, Inc.,
Rancho Dominguez, CA, USA）
ポリプロピレン製，直径 6 mm のコルクボーラー様で，オートクレーブ滅菌の繰り返しが可能（最下段は 5 回オートクレーブ滅菌したもの）．

C

図2

糸状菌類の凍結保存（コロニーパンチ法）に用いる器具の一例
A：先端が鋭利なステンレスチューブ，B：ステンレス棒（ステンレスチューブ内側の棒），C：ミクロスパー
テル，D：コロニーディスクを凍結チューブに移動した後の糸状菌コロニー，E：凍結チューブ用のステンレス製ラック．

リセロールを添加した適当な寒天培地で菌を培養し，コロニー外縁をストローで打ち抜いたものを凍結チューブに直接入れて凍結する方法を紹介している．しかし，筆者の経験では，彼も述べているように浸透圧の関係で生育の悪い株もあり，全てに適用た後，オートクレーブ滅菌して使用しているが，この点に関しては，利用者の都合に合わせて材質劣化できる方法ではない．
② 適当な状態に生育した菌株のコロニーを，先端をなどの事前検討後に自由に選択すればよい．

鋭利にしたステンレスチューブで打ち抜く（コロHoffman（1989; Malik, 1992，WFCC Technical

ニーパンチ法； 図 1‑1，図 2‑D）．白金耳やメスなInformation Sheet No. 5 を参照）は 5％（w/v）グ

どを用いて適当な大きさのコロニー片を切り出して─ 107 ─糸状菌類の凍結保存法

岡田 元である．

A③ ミクロスパーテルを用いて（図 1‑2，図 2‑C），保護剤 1 m 入りの凍結チューブに打ち抜いたコロニーディスクを 5 枚程度入れる（寒天培地の厚さの目安： 直径 9 cm シャーレに 20 m 程度の培地をまいた厚さ）．キャップをしっかり閉め，保護剤を菌体に馴染ませるために手で数回激しく振る．コロ
ニーディスクが保護剤に完全に浸っていることを確認し（図 1‑3），適当なラックに並べる（図 2‑E）．
なお，保護剤の項で述べたように，筆者は 10％グリセロールと 10％DMSO の 2 種類の保護剤を各菌株に対して用いている（ミクロスパーテルは保護剤ごとに使い分ける）．凍結チューブにおける保護剤の簡便識別には，クライオカラーコード（色つきキャップカバー，Nunc A/S）が便利である（図1‑3）．
④ コロニーディスクの入った凍結チューブをラックごと，4℃に数時間（オーバーナイトすることもある）静置し，保護剤を菌糸や胞子にできるだけ浸透させる（図 1‑4）．
⑤ −80℃の作業用ディープフリーザーに予め入れた発泡ポリスチレン（発泡スチロール）容器（厚さ

図 4 凍結保存に用いる容器の一例
A: 発泡ポリスチレン容器，厚さ約 4 cm，B: BICELL ‑Bio Freezing Vessel（日本フリーザー（株），東京），C:
Mr. Frosty ‑ NALGENE Cryo 1℃ Freezing Container（Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA）．

約 4 cm）に，凍結チューブをラックごと入れ（図4‑A），蓋を閉めて凍結する（冷却速度の詳細は不明）．数時間放置し，完全に凍結したら，凍結チュー
ブを保存用の−80℃ディープフリーザーや液体窒素タンク（約−170℃の気相）に移し替え，長期保存もよい．コロニーより打ち抜いたディスク（以下，に備える．当然ながら，停電対策，液体窒素の供給，コロニーディスクと略記）がステンレスチューブ内凍結標品のバックアップについても十二分に配慮しに入ってしまった場合は，対になったステンレス棒なくてはならない．

で押し出す（図 1‑1'，図 2‑A, B）．なお，成書では④，⑤の行程においては，発泡ポリスチレン容活きのよいコロニー周辺部（菌糸の先端）を打ち抜器の代わりに，市販の簡便緩慢凍結保存容器（冷却くように書かれているが，筆者の経験では，より成速度は−0.6℃/min 程度と思われる）の BICELL -熟して分生子などの胞子や厚膜胞子を多く形成してBio Freezing Vessel（日本フリーザー（株），東いる内側の部分も保存した方がよい（図 1）．Nishii

京；図 4‑B）や Mr. Frosty - NALGENE Cryo 1℃＆ Nakagiri（1991）も卵菌類（現在では菌類からFreezing Container（Nalge Nunc International除外されている）に関して同様に報告している．

Corp., Rochester, NY, USA; 図 4‑C）を使用してもステンレスチューブやコルクボーラーの代替え品

よい．その場合，凍結チューブを容器に入れ，指として，形状の良く似た直径 6 mm，ポリプロピレ示書に従って保護剤の浸透や予備冷却を行った後ン製の Transfertube（Spectrum Laboratories, Inc.,に，−80℃作業用ディープフリーザーで凍結する．

Rancho Dominguez, CA, USA; 図 3）がお勧めであなお，本稿では述べないが，鞭毛菌類などの保存がる〈http://www.spectrapor.com/1/3/8.html〉．コ

難しい菌群については，プログラムフリージングす

ロニーが緻密で硬いものにもほぼ問題なく使えるでる必要があろう．

あろう．本来は使い捨てであるが，オートクレーブ滅菌を 5 回繰り返しても何ら変化なく，再利用可能─ 108 ─Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006

12Vol. 22, No. 2

い場合は冷蔵庫（4℃）で保存して，数日以内に指定3培地に移植する．
凍結解凍標品の開封は以下の手順で行う: 1）チューブのキャップがしっかり閉まっていることを確認し，チューブ表面，特にキャップのパッキン部をアルコール綿（70％消毒用エタノール）で殺菌する; 2）輸送中にチューブ内が陽圧になる場合があるので，念のため乾熱滅菌ガーゼや脱脂綿などでパッキン部を覆い（アルコール綿は使用しない），無菌環境下でキャップを

図 5 凍結解凍標品の梱包手順
1：キャップパッキン部をパラフィルムで巻く．
2：ビニール袋に入れる．
3：エアーキャップ（プチプチ・エアパッキン）で包む．

徐々にゆるめる．この時，チューブ内の保護剤が噴出してしまったら，再度キャップを硬くしめ，アルコー
ル綿でパッキン部を再度殺菌し，アルコール分を蒸発させた後に，キャップを開ける; 3）コロニーディスクをミクロスパーテルで取り出し，指定培地に移植して4）復元培養する．

凍結標品を取り扱う場合は専用手袋を着用し，素手や軍手などでは行わない．また，液体窒素タンクから3．おわりにの取り出しに際しては，気相保存の場合でも念のためフェイスマスクをつけて行う．

ひとことに糸状菌類と言っても，分類，系統，生態，生理などの観点からみて実にさまざまなものがあ

急速解凍する装置としては湯浴が一般的だが，筆る．我々に身近な麹菌などは保存が容易なものが多い

者は汚染防止のため，凍結チューブの径に合ったアが，植物や動物などに寄生・共生する菌類は培養や保ルミブロックを装着したドライバスを使用している．

存が困難なものが普通である．また，たとえ培養できコロニーディスクが 5 枚入った凍結チューブの場合，ても，性状を変えずに長期保存することは容易ではな

40℃，4 分程度で解凍している．ディスク枚数が少ない．本稿で紹介した糸状菌類の簡便凍結保存法は初歩いチューブでは解凍時間を短くし，氷粒が消失した時的な内容であるが，読者自らがいろいろな局面に対応点で終了する．

しながら改良し，その技術や経験を菌株同様に後世に凍結保存における微生物の生残の可否は，凍結条件受け継いでいただきたい．不幸にも死滅した株は二度だけでなく，解凍条件も深く関与していると思われとは生き返らないが，我々が微生物の性質をよく理解る．解凍温度は 35 40℃が一般的であるが，Nishii ＆すれば，同じような環境から同じ種を再分離できるこ

Nakagiri（1991）は卵菌類において，IFO でそれまでともある．保存技術や機器の開発と共に，多様な自然用いられた条件（40℃，3 分）よりは，30℃，5 分の環境もできるだけ維持したいものである．本講座が微方が復元率は高かったと報告している．
彼らはその後，生物株保存に従事する方々にとって多少なりとも役立同じ解凍条件を担子菌類などにも適用している．てば，筆者らにとって望外の喜びである．

当然，培養の項で述べたように，復元時の培養条件にも十分注意する必要がある．
また，初回の復元チェッ

謝

クの時期は，その凍結標品が死滅している可能性もあることを考慮し，あまり遅くならない方がよい．

辞
的確な情報や助言を終始いただいた中桐昭

博 士（（ 独 ）製 品 評 価 技 術 基 盤 機 構 ）， な ら び にTransfertube に関する情報やサンプルをご提供いた5）凍結解凍標品の輸送と開封

だいた Dr. Gerald Bills（Merck Sharp ＆ Dohme de

上述の手順で作製，解凍した糸状菌類の凍結解凍標España）に感謝いたします．

品を郵送する方法（Ito, 1993; コロニーディスク 2 枚を 10％グリセロールで保存したもの；図 5）が極めて文有効である．国内のみならず，海外にも航空便で送る

Alexander, M., Daggett, P.M., Gherna, R., Jong, S.,

ことができる．1 週間程度は解凍された状態で問題なく保つことができ，もしも到着後に直ちに復元できな─ 109 ─

献Simione, F. ＆ Hatt, H. (1980). American Type
Culture Collection Methods. I. Laboratory Manual糸状菌類の凍結保存法

岡田 元

on Preservation: Freezing and Freeze-drying asof oomycetous fungi in liquid nitrogen. IFO Res.

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─ 110 ─