福岡県保健環境研究所年報第38号，76－80，2010

資料
ペットボトル詰め緑茶（清涼飲料水）の製品白濁苦情に係る細菌学的検討
江藤良樹・市原祥子・濱崎光宏・村上光一・竹中重幸
堀川和美・進藤知美*1・池田加江*2・梅崎武彦*2
ペットボトル詰め緑茶の白濁苦情を受け、製造業者への立ち入り調査を実施した。業者が保管していた苦情品（開封済み）からは、Pantoea agglomerans が分離された。しかし、既に開封されていたため、白濁の原因菌とは断定できなかった。さらに調査を続けたところ、Ultra-high temperature 殺菌前の調合済み緑茶から6.6×104 /ml の細菌が検出された。このことから、製造ラインの細菌汚染が疑われた。また、製品を充填する前の空のペットボトルの洗浄液に Mycobacterium 属菌が認められたことなどから、製造施設の十分な消毒が行われていなかったことが推測された。
さらに、陽圧管理されている充填室は、非操業中には落下細菌・落下真菌はいずれも検出されなかったが、操業中には落下細菌・落下真菌が確認された。落下細菌、及び、落下真菌が製品に混入すると、白濁・異物混入の原因になる恐れがある。以上のことから、製造ラインの細菌汚染の予防、製造施設の十分な消毒実施、及び操業時の充填室内の落下細菌数・落下真菌数の抑制策が必要であると考えられた。
［キーワード：白濁苦情、緑茶、ペットボトル、細菌汚染］② 細菌数、及び大腸菌群検査

１ はじめに
平成21年に、県内の同一製造業者が製造したペットボトル

細菌検査は、標準寒天培地を用い37℃で24時間培養した。

詰め緑茶において異臭味及び白濁苦情が 4 件発生したこと

大腸菌群は、ダーラム管入りLB培地を用いて37℃で24時間から、製造業者への立ち入り調査を実施した。この業者が製培養した。原料茶葉については、生理食塩水にて 10 倍にし造したペットボトル詰め緑茶の製品白濁の起因菌について、た後、1 分間ストマッキング処理し、試料液とした。また、今回、詳細な細菌学的検討を実施したので、資料としてまと耐熱性菌の細菌数を調べるため、100℃、10 分間、加熱処理めた。

したものを同様に試料液とした。また、苦情品から分離された菌株と同じ性状の菌を検索する為に、生育した菌を釣菌し、２ 方法
２・１

グラム染色、嫌気条件下での培養等を実施した。
検体③

落下細菌数、及び、落下真菌数検査

原料茶葉 3 件、工場内の拭き取り材料 5 件、苦情品（開落下細菌数、及び、落下真菌数検査は、「弁当及びそうざ封済み）1 件、参考品（未開封製品）3 件、殺菌前緑茶 1

いの衛生規範について」（昭和54年6月29日付環食第161号）件、及びペットボトル洗浄液 3 件を検査した（表1）。また、に準じ実施した。また、苦情品から分離された菌株と同じ性工場内の 6 地点において、操業時、及び、非操業時に落下状の菌を検索する為に、生育した菌を釣菌し、グラム染色、細菌と落下真菌の検査を実施した。

嫌気条件下での培養等を実施した。
④２・２①

顕微鏡観察

細菌検査

製品緑茶は、原液 50 mlを 3000 回転/分で 20分間遠心後培養検査（苦情品）の沈渣を使用しグラム染色後に観察した。また、原料茶葉は、標準寒天に検体 10 μl を塗抹し、35℃で一晩培養した。
生育した菌を釣菌し、生化学性状試験及び遺伝子検査（16S

滅菌超純粋水を用いて製造と同じ条件で抽出し、遠心(3000rpm、20分間）で得られた沈査をグラム染色に用いた。

rRNAの遺伝子塩基配列決定）による菌種の同定を実施した。
福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）*1 福岡県保健衛生課*2 南筑後保健福祉環境事務所

３結果

３・１
①―76―

細菌検査結果培養検査（苦情品）

No. 10 の苦情品（白濁品・開封済）から、通性嫌気性の緑茶を詰めるペットボトルを洗浄するラインから採取

グラム陰性桿菌が分離された。分離菌の 16S rRNA 遺伝子した洗浄液（No. 13、14、15）の細菌数を測定（35℃、24塩基配列決定、及び、生化学性状検査にて Pantoea agglo-時間）したところ、細菌数は1 未満/ml であり、大腸菌群meransであることが明らかとなった。

は陰性であった（表5）。ところが、30℃で7日間培養を行ったところ、これらの検体で菌の生育が確認された。これ②らの一部を釣菌し、生育した菌株の16S rRNA 遺伝子の塩

細菌数、及び大腸菌群検査

苦情品と同一ロットである No. 11の参考品（正常品・未基配列を一部決定した結果、次亜タンク内水 (No. 13) と開封）と、No. 9 の参考品は、細菌数は 1 未満/ml、大腸リンサー液 (No. 15) のから分離された菌はMycobacterium

菌群は陰性であり細菌は検出されなかった（表2）。No. 1属であることが明らかとなった。

4から No. 3 の原料茶葉の細菌数を測定した結果、4.9×10～1.5×105 /gであった。また、100℃ で 10分間の加熱処理③落下細菌数、及び、落下真菌数検査
工場内の落下細菌・落下真菌について、操業時と非操業時後の細菌数は、2.5×10 ～7.5×10 /g であった（表3）。
工場内の拭き取り検査の結果、充填室内（No.4、5、6、8）に検査を実施したところ、表6 のような結果が得られた。非の細菌数は少なく、また、大腸菌群は検出されなかった（表操業時の充填室内（A-2～A-5）は、操業時に比べ落下細菌・4）。一方で、充填室の周辺の床（No. 7）から、1400/床面真菌数が少なかった。一方で、操業時には、少数ではあるが2cm 当たりの細菌数（14000 /ml）と、大腸菌群が検出され落下真菌が確認された。落下細菌のプレートより釣菌した

た。また、拭き取り材料の細菌数を測定したプレートより、263 集落の細菌の性状検査を実施したが、苦情品から分離さ94 集落を釣菌し性状検査を実施したが、苦情品から分離された Pantoea agglomerans と同じ性状（通性嫌気性グラムれた菌と同じ通性嫌気性を示すものは無かった。

陰性桿菌）を示す菌は検出されなかった。

製品製造時（2010年5月6日）に採取した ultra-high temperature (UHT) 殺菌前緑茶 (No. 12) の細菌数を測定した④顕微鏡観察4

結果、6.6×10 /mlと高い菌量であり、また、大腸菌群につNo. 11 の参考品（正常品・未開封）と、No. 9 の参考品いても陽性であった(表5)。釣菌した細菌の 83%（96株中80の遠心沈査を、グラム染色後に検鏡したところ、多数の細菌株）は、通性嫌気性のグラム陰性桿菌であり、その一部の菌像が観察された（図1、図2-1）。また、No. 11 の参考品にの 16S rRNA 遺伝子塩基配列を決定した結果、苦情品からついては、走査型電子顕微鏡にて観察を行ったところ、同様分離された菌と同じ Pantoea 属菌も存在していた。しかしに多数の細菌像が観察された（図2-2）。また、緑茶茶葉をながら、No.12 を UHT 殺菌しペットボトルに詰めた No.

製造と同じ条件で実験的に抽出し、グラム染色を行ったとこ

16 は、細菌数は 1 未満/ml、大腸菌群は陰性であった。

ろ、No.2 のみ少数の細菌像が観察された。また、6.6×104

表1 検査検体一覧と検査項目
検査項目
番号

検体名

種別
採取日

細菌数

大腸菌群

No.1

煎茶AH

原料茶葉

No.2

煎茶AGO

原料茶葉

No.3

煎茶AG

原料茶葉

○

No.4

B-1 充填機ノズル（充填室内）

拭き取り○

No.5

B-2 リンサーノズル（充填室内）

拭き取り○

○

No.6

B-3 充填機囲い扉の取っ手（充填室内）

拭き取り○

○

No.7

B-4 充填機出口付近床

拭き取り

No.8

B-5 キャッパー上部（充填室内）
清涼飲料水 緑茶拭き取り○
2010年2月8日

2010年2月16日

No.9
参考品
No.10 清涼飲料水 苦情品緑茶（白濁品）
苦情品
No.11 清涼飲料水 苦情品緑茶（同一ロット正常品） 参考品
No.12 調合タンク内水（調合終了後緑茶）
殺菌前緑茶
No.13 次亜タンク内水No.14 リンサー液（その1）○
苦情品のロット（No10、11）に使用
○

○

○

○

○

○

○

2010年5月12日

開封済み

○

○

○

○

○

○

次亜塩素酸ナトリウム 0.2 ppm○

次亜塩素酸ナトリウム 10～20 ppm
次亜塩素酸ナトリウム 0.2 ppm

ﾍﾟｯﾄﾎﾞﾄﾙ洗浄液

○

○

参考品

○

○

A-1

PETホッパー上落下細菌・真菌

A-2

充填室解放部付近①（充填室内）

落下細菌・真菌

A-3

充填室解放部付近②（充填室内）

落下細菌・真菌

A-4

リンサー上部（充填室内）

落下細菌・真菌

キャッパー上部（充填室内）

落下細菌・真菌

A-6

キャップホッパー上部

落下細菌・真菌未開封品○

No.15 リンサー液（その2）No.16 製品サンプル（2 L)

A-5

未開封品（2010年2月16日製造）○

ﾍﾟｯﾄﾎﾞﾄﾙ洗浄液
ﾍﾟｯﾄﾎﾞﾄﾙ洗浄液

備考

落下細菌数
落下真菌数

未開封品(No.12をUHT殺菌後に充填)○

操業時
2010年2月16日○○

充填室内は陽圧管理

非操業時
2010年3月4日○

充填室内は陽圧管理○

充填室内は陽圧管理○―77―

充填室内は陽圧管理

/mlの細菌数であったUHT殺菌前緑茶 (No. 12) を UHT 殺子塩基配列を決定した結果、苦情品から分離された菌と同じ菌しペットボトルに詰めた製品であるNo. 16 は、グラムPantoea 属菌も存在していた。このことから、UHT 殺菌染色で多数の細菌像が確認された。

機の故障や操作ミスにより製品に生菌が混入した可能性も否定できない。

４

操業時、非操業時の落下細菌数・落下真菌数を測定した

考察

No. 10 の苦情品（白濁品・開封済）より、Pantoea aggl-が、その結果、操業中は空気中に浮遊する細菌・真菌が増omerans（通性嫌気性のグラム陰性桿菌）が分離された。し加していた（表6）。この工場の充填室は陽圧管理されたク

かし、既に開封されていた事や、苦情申立者が口を付けて飲リ―ンルームだが、操業中は充填前のペットボトルが充填室んでいた為、本菌と製品白濁との因果関係は明確ではない。の壁の流入口から高速で流入している。この流入口のからのNo. 11 の参考品（苦情品と同一ロットの正常品・未開封）

微生物汚染対策が十分でないため、充填室外部の細菌・真菌から細菌は分離できなかったが、グラム染色及び電子顕微鏡がペットボトルともに流入している可能性も十分考えられで多数の細菌像が観察された（図2-1、図2-2）。確認の為に、る。操業中の充填室内の落下細菌数、及び、落下真菌数を最他社が製造したペットボトル詰め緑茶について、同様の操作小限に抑える工夫を行わなければ、耐熱性細菌や真菌の製品で観察を行ったが細菌像はほとんど観察されなかった。このへの混入が、今後も起こる可能性も否定できない。

ことから、苦情品と同一ロットの製品は殺菌前にかなりの菌今回、0.2ppm 次亜塩素酸ナトリウムを含むペットボト量が存在していたと考えられた。また、苦情品が製造された

ル洗浄用のリンサー液 (No.13、No15) からMycobacterium

約半年後に製造された製品（No. 9）についても、No. 11属菌が分離された。Mycobacterium 属菌の一つである M.と同様に、多数の細菌像が観察された（表2、図2-1）。この

tuberculosis を殺菌するには、1000ppm の塩素濃度が必要ことから、製造ラインの細菌汚染は半年以上の間、継続してである1)ことから、分離菌は0.2ppm の次亜塩素酸ナトリウいたものと推測された。また、原料茶葉による汚染の可能性ムを含むリンサー液では殺菌されず、生育が可能であったも考えられる為、実験的に原料茶葉から製造と同じ条件で抽と考えられる。この工場では、リンサー液は次亜塩素酸ナ出しグラム染色を行ったが、観察された細菌は少数であったトリウムを含むため細菌は生育出来ないと考え、洗浄作業（表3）。苦情品に使用されていた茶葉の細菌量が、他と比等は一切行われていなかった。

べ多いことは無かったことから、細菌汚染は茶葉が原因では以上の結果より、今後は、製造ラインの洗浄の徹底や、無く、茶葉抽出以降の製造工程に原因があると推測された。

操業時の充填室内の落下細菌数・落下真菌数の抑制するた

さらに、UHT 殺菌前の調整済み緑茶（No.12）の細菌数はめの対策が急務である。また、製造ラインの細菌汚染を管6.6×104 /ml と高い値であったことから、加熱抽出以降の製理する為に、調整済み緑茶（UHT殺菌前）の細菌数測定を造工程の装置・タンクなどの洗浄・管理が不十分であり細菌製造バッチ毎に行うよう助言した。この指標を用いて細菌が繁殖していると考えられた。

数を低く抑えることで、品質の安定的な向上につながるだ

製造する環境中に苦情品からの分離菌と同じ菌が存在す

ろう。

るか確認するために、落下細菌検査、及び、拭き取り検査で生育した計 357 集落を釣菌し、通性嫌気性のグラム陰性桿文献菌をスクリーニングしたが、苦情品より分離された菌と同じ

1) Rutala WA et al.: Inactivation of Mycobacterium tubercul

性状の菌は検出されなかった。一方で、UHT 殺菌前緑茶（№osis and Mycobacterium bovis by 14 hospital disinfectants.,12）より釣菌した細菌の 83%（96株中80株）は、通性嫌気性

Am. J. Med., 91, 267S-271S, 1991のグラム陰性桿菌であり、その一部の菌の 16S rRNA 遺伝―78―

表2 苦情品及び参考品の検査結果
番号

検体名

細菌数（/ml）

大腸菌群

遠心処理後
グラム染色aNo.9

清涼飲料水
緑茶（コントロール）1未満

陰性多数の菌を観察
(図1)

No.10

清涼飲料水
苦情品緑茶（白濁品）

1.3×106

NTbNTb

No.11

清涼飲料水
苦情品緑茶（同一ロット正常品）

1未満

陰性多数の菌を観察(図2-1)

a : 濃縮のために3000回転/分で20分間遠心を行った。

図1 遠心濃縮後の清涼飲料水 緑茶（コントロール）のグラム染色像

b : 未実施

図2-1 遠心濃縮後の苦情品緑茶（同一ロット正常品）のグラム染色像

図2-2 遠心濃縮後の苦情品緑茶（同一ロット正常品）のSEM像―79―

表3 原料茶葉の細菌検査結果
細菌数（/g）
番号

未処理

100℃、10分

遠心処理後グラム染色 a

検体名

No.1

煎茶AH

4.9×104

2.5×10

観察されず

No.2

煎茶AGO

9.7×104

3.5×10

少数の細菌を観察

No.3

煎茶AG（白濁苦情品に使用）

1.5×105

7.5×10

観察されずa : 濃縮のために3000回転/分で20分間遠心を行った。 b : 未実施

表4 拭き取り検査結果番号

検体名

細菌数（/ml）

大腸菌群

No.4

B-1

充填機ノズル（充填室内）

3陰性

No.5

B-2リンサーノズル（充填室内）

1陰性

No.6

B-3

充填機囲い扉の取っ手（充填室内）

45

陰性

No.7

B-4

充填機出口付近床

14000

陽性

No.8

B-5

キャッパー上部（充填室内）

19陰性

表 5 製造時(2010 年 5 月 6 日)に採取した検体の検査結果
検体名

番号

細菌数（/ml）
35℃、48 時間

30℃、7 日間

大腸菌群

遠心処理後
グラム染色 aNo.12

調合タンク内水（調合終了後緑茶）

6.6×10 4≧300

陽性

多数の菌を観察No.13

次亜タンク内水

1 未満

3陰性

観察されず

No.14

リンサー液（その 1） 10～20 ppm

1 未満6陰性

観察されず

No.15

リンサー液（その 2） 0.2 ppm

1 未満

139

陰性

観察されず

No.16

製品サンプル（2 L)

1 未満

1 未満

陰性

多数の菌を観察a : 濃縮のために 3000 回転/分で 20 分間遠心を行った

表6 落下細菌数・落下真菌数の検査結果
番号

検体名

落下細菌数（/5分） a

落下真菌数（/20分） a

操業時

非操業時

操業時

非操業時

A-1

PETホッパー上

31

2

4

A-2

充填室解放部付近①（充填室内）

41未満

1未満b1未満A-3

充填室解放部付近②（充填室内）

271未満

1未満

1未満

A-4

リンサー上部（充填室内）

21未満

11未満
bA-5

キャッパー上部（充填室内）

31未満

1未満

1未満

A-6

キャップホッパー上部

31未満

11未満

a : シャーレ3枚の平均値 b : 3枚のシャーレのうち1枚で真菌の生育が観察された―80―