アルツハイマー病関連遺伝子 TREM2 の発現を制御するスプライシング因子の同定

Identification of Splicing Factors that Regulate the Expression of
the Alzheimer’s Disease-Associated Gene TREM2

平成 30 年度入学
柳津茂慧（Yanaizu, Motoaki）

指導教員
紀

嘉浩

目次
1. 略語 .................................................................................................................. 1
2. 序論 .................................................................................................................. 32-1認知症とアルツハイマー病 ....................................................................... 3

2-2

AD を特徴づけるアミロイドベータとタウタンパク質 ........................... 4

2-3

AD の原因遺伝子と感受性遺伝子 ............................................................ 5

2-4

AD 感受性遺伝子 TREM2 ........................................................................ 8

2-5

TREM2 の機能と病理学的意義 ................................................................ 92-6

本研究課題の概要 .................................................................................... 11

3. 材料と方法 ..................................................................................................... 13
3-1

プラスミドの作製 .................................................................................... 13①

TREM2 ex3-spminigene の作製 .......................................................... 13②

CDS TREM2 の作製 ............................................................................ 14③

各生物種における TREM2 ex2-4minigene の作製 ............................. 14④

キメラ minigene の作製 ....................................................................... 15⑤

TREM2 スプライスバリアントの作製 ................................................ 17⑥

RNA 結合タンパク質発現ベクターの作製 .......................................... 183-2細胞培養 .................................................................................................. 18

3-3

スプライシングアッセイ......................................................................... 19①

プラスミドの導入 ................................................................................ 20②

small interfering RNA の導入 .............................................................. 20③

RNA の抽出と cDNA の作製 ............................................................... 21

3-4

SDS-PAGE とウエスタンブロット ........................................................ 213-5

蛍光免疫染色 ........................................................................................... 243-6

蛍光活性化セルソーティング（Fluorescence-activated cell sorting:FACS） .............................................................................................................. 24
3-7

RNA 免疫沈降 ......................................................................................... 25

3-8

統計解析 .................................................................................................. 26

4. 結果 ................................................................................................................ 27
4-1

TREM2 exon 3 の選択的スプライシング制御因子の探索 ..................... 27

4-2

CELF2 は TREM2 タンパク質の発現量を減少させる .......................... 29

4-3

CELF1, CELF2 は TREM2 の intron 領域に作用し TREM2 タンパク質の発現量を減少させる ...................................................................................... 32
4-4

TREM2 exon 3 の選択的スプライシングは種特異的である ................. 33

4-5

CELF1, CELF2 は TREM2 intron 3 に作用し、exon 3 の挿入を阻害す

る................................................................................................................. 35

4-6

Exon 3 欠損型 TREM2 は、分泌型タンパク質として発現する ............ 38

5. 考察 ................................................................................................................ 39
5-1

AD 新規関連分子としての CELF1 と CELF2 ........................................ 39

5-2

TREM2 exon 3 のスプライシング制御に対する CELF1 と CELF2 の機能の違い ............................................................................................................ 41
5-3

TREM2 の RNA プロセシング制御における種差の違いがもたらすミク

ログリアの機能への影響 .................................................................................. 42
5-4

ミクログリアに発現する AD 感受性遺伝子の RNA プロセシングの意義................................................................................................................. 43

5-5

Exon 3 欠損型 TREM2 mRNA は分泌型タンパク質として発現する ... 44

5-6

総括 .......................................................................................................... 45

6. 謝辞 ................................................................................................................ 47
7. 引用文献 ......................................................................................................... 48
8. 図表 ................................................................................................................ 58

1.

略語

AD: Alzheimer’s disease
APOE: Apolipoprotein E
APP: Amyloid precursor protein
A: Amyloid beta
CELF1: CUGBP Elav-like family member 1
CELF2: CUGBP Elav-like family member 2
CHX: Cycloheximide
DAM: Disease-associated microglia
DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DMSO: Dimethyl sulfoxide
EV: Empty vector
eQTL: Expression quantitative trait loci
FBS: Fetal bovine serum
FTDP: Frontotemporal dementia with parkinsonism
GFP: Green fluorescent protein
HRP: Horseradish peroxidase
MAPT: Microtubule-associated protein tau
NHD: Nasu-Hakola disease1

NMD: Nonsense-mediated mRNA decay
PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis
PAR-CLIP: Photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking andimmunoprecipitation
PBS: Phosphate buffered saline
PFA: Paraformaldehyde
PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetatepre-mRNA: precursor mRNA
PTC: Premature termination codon
PVDF: Polyvinylidene difluoride
RBP: RNA-binding protein
RIPA: Radioimmunoprecipitation
RT-PCR: Reverse-transcription PCR
SDS: Sodium dodecyl sulfate
siRNA: small interfering RNA
sTREM2: soluble TREM2
TPM: Transcripts per million
TREM2: Triggering receptor expressed on myeloid cells 2
TYROBP: TYRO protein tyrosine kinase-binding protein

2

2.

序論

2-1

認知症とアルツハイマー病

認知症は、一度正常に発達した記憶能力や判断能力といった認知機能が後天的に障害されることで、日常生活・社会生活に支障をきたす状態のことをいう。主として、加齢が大きな発症リスク因子とされており、世界的に患者数が増加傾向にある。
認知症の発症原因は、脳卒中による脳血管の障害や脳震盪などの物理的障害に起因する場合と、前頭側頭型認知症やレビー小体型認知症、アルツハイマー型認知症などの神経変性疾患に起因する場合がある。認知症患者の約 60%から 80%がアルツハイマー型認知症に起因すると考えられている 1)。
アルツハイマー型認知症は、1906 年にアロイス・アルツハイマーによって報告された疾患である。単にアルツハイマー病（Alzheimer’s disease: AD）と呼ばれることもあり、以下 AD と表記する。アルツハイマーが診察した患者の死後脳には、老人斑と呼ばれる沈着物と神経原線維変化が観察された。現在でもこの 2 つの病理学的変化によって AD が特徴づけられる。後の研究によって老人斑はアミロイドベータ（amyloid beta: A）によって形成され 2) 3) 4) 5)、神経原線維変化は過剰にリン酸化されたタウタンパク質の凝集と線維化によって形成されていることが分かった 6)7) 8) 9)

。両者は AD 患者の脳で見られる神経細胞死や脳萎縮に大きく関与しているとされている。

3

2-2

AD を特徴づけるアミロイドベータとタウタンパク質Aはアミノ酸程度のペプチドで、細胞膜貫通型タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（Amyloid precursor protein: APP）が細胞外領域においてセクレターゼによる切断を受けた後、細胞膜リン脂質内で-セクレターゼによって切断され産生される（図 1）。この経路はアミロイド産生経路とされるが、一方、-セクレタ
ーゼ切断部位よりも細胞膜に近い部位で-セクレターゼによる切断を受けた場合
は、sAPPが産生される。これは非アミロイド産生経路と呼ばれる（図 1）。は
-セクレターゼの切断部位に応じてアミノ酸残基数が異なる分子種を産生するが、主にアミノ酸残基が個（40）と個（42）の分子種を産生する。は単量体（モノマー）として生成された後、個以上のモノマーが重合し低分子オリゴマーを形成する。やがてプロトフィブリルなどの高分子オリゴマーを形成する。さらに凝集が進むとアミロイド線維化し、老人斑と呼ばれるシミのような形態になる（図1）。
タウタンパク質は、microtubule-associated protein tau (MAPT)遺伝子によってコードされる。タウは主に中枢神経系の神経細胞に発現し、微小管に結合して重合や安定化を制御する。MAPT の遺伝子変異は振戦や動作の遅延など（パーキンソニズ
ム）を伴う家族性前頭側頭型認知症（FTDP）の発症原因遺伝子である 10)。その後、
FTDP 患者の脳の細胞内に過剰にリン酸化されたタウタンパク質の細胞内封入体が観察され、これが神経原線維変化の主成分であることが明らかになった。FTDP

4

以外の神経原線維変化を示す疾患は、AD の他、進行性核上性麻痺、大脳基底核変性症などがあり、これらをまとめてタウオパチーと称する。

2-3

AD の原因遺伝子と感受性遺伝子AD は、遺伝要因によって発症する家族性 AD と、明確な遺伝性が認められない
孤発性 AD に分類される 11)。家族性 AD は、全 AD のうち約 1%を占めるとされており、AD の殆どは孤発性 AD である。
家族性 AD は、APP、Presenilin-1 (PSEN1)、Presenilin-2 (PSEN2)に遺伝子変異が認められている 12) 13) 14) 15) 16) 17) 18)。家族性 AD の原因遺伝子の変異は共通してAの産生や産生比率を増加させる。家族性 AD の原因となる APP の変異は、-セクレターゼと−セクレターゼによって切断される部位の近傍や A配列内に存在する。例えば、スウェーデン変異は、−セクレターゼ切断部位の近傍に存在し、−セ
クレターゼの切断を促進させる変異で、結果として Aの産生が増加する。一方、A配列内に存在する変異は、Aの凝集性を変化させる変異である。例えば、Arctic
変異や British 変異はアミロイド繊維の形成を促進させる変異である 19) 20)。PSEN1と PSEN2 は、-セクレターゼの活性中心タンパク質である。PSEN1 と PSEN2 の
変異は Aの産生増加や分子種の産生比を変化させる遺伝子変異である 21)。特に、PSEN1 に は 現 時 点 で 300 を 超 え る 変 異 が 見 つ か っ て い る（https://www.alzforum.org/mutations/psen-1）。

5一方、AD 患者の殆どを占める孤発性 AD 患者では APP、PSEN1、PSEN2 に変異が認められないが、脳内で Aの凝集が観察される。孤発性 AD の発症年齢は 70～80 歳であるのに対して、家族性 AD の発症年齢は 40～50 歳代である。これは

APP、PSEN1、PSEN2 の遺伝子変異によって早期に Aの蓄積が始まるからであると考えられている。さらに Aの凝集は AD 患者特異的であること、家族性 AD と孤発性 AD とでは同じ症状を示すことから、Aの凝集が AD の発症に大きく関与していることが示唆される。大規模な脳イメージング研究から、AD 発症の 10～20
年前に Aの蓄積が始まり、その後タウの蓄積、脳の萎縮と続き、臨床症状の発現へと続くことが分かり、この経過は孤発性 AD と家族性 AD で共通する。このことから、の蓄積が最初期の病変としてそれ以降の病変の引き金となり AD 発症に至るという「アミロイドカスケード仮説」が古くから提唱されている。一方、凝集過程の中間体である Aオリゴマーが強い神経毒性を示すことが報告されており 22)、ADにおける神経変性は Aオリゴマーが主要な役割を有していることが示唆されてきた。その後、家族性 AD 患者から独特な APP の変異（Osaka 変異）が同定された。この患者の脳内では老人斑がほとんど形成されておらず、Aオリゴマーが多く

23)形成されていた。これらの知見は、AD の発症には繊維状の Aではなく Aオリゴ
マーが強く関与しているという、「オリゴマー仮説」が提唱されるきっかけとなった。

6

アミロイド仮説やオリゴマー仮説に基づき、Aの凝集抑制や分解作用を志向した
AD の根治的治療に繋がる医薬品の開発が多数試みられてきたが、治験での明確な成功例がない。この点に関しては、Aの異常が疾患発症過程の早期に既に進展済みであるため、臨床症状が生じる時期では Aを標的とした治療の介入は遅い可能性が指摘されている。従って、治験の失敗がただちにアミロイドカスケード仮説・オ
リゴマー仮説を否定するわけではないものの、孤発性 AD の発症や進行に関わる A
以外の因子が注目される背景となった。
孤発性 AD の発症や進行に関わるリスク因子は多方面から検討されており、疫学研究では運動 24)や食事 25)、睡眠 26)などの生活習慣、さらに糖尿病などの基礎疾患が発症や進行のリスク因子であることが示されていることから、孤発性 AD は様々な要因が複合的に組み合わさって発症する多因子疾患であると考えられている。孤発性 AD では明確な家族歴が示されないものの、遺伝的要因が 58~79%程度を占めると推定されている 27)。International Genomics of Alzheimer’s Project（IGAP）や、
The Alzheimer's Disease Sequencing Project（ADSP)、UK バイオバンクなどには多くの AD 患者のゲノム情報が収集されている。このような大規模なゲノム情報の解析によって AD 感受性遺伝子が同定されている。現在までに、大規模なメタ解析
からは 30 以上の AD 感受性遺伝子座が同定されている 28) 29)。特に、孤発性 AD の発症リスクの増大に最も影響を与える遺伝子として Apolipoprotein E（APOE）がある 30)。APOE には2、3、4 の 3 つの対立遺伝子（アリル）があり、3 がメジ

7ャーアリルである。最も頻度の高い3/ 3 を基準にすると、オッズ比は3/ 4 で 3.2
倍、4/ 4 で 14.9 倍となる 31)。

2-4

AD 感受性遺伝子 TREM2

Triggering receptor expressed on myeloid cells 2（TREM2）は、破骨細胞やマク
ロファージのような免疫細胞に受容体タンパク質として発現する。また、脳内では中枢神経系グリア細胞のひとつであるミクログリアにおいて高い発現量が認められる。TREM2 は、V 免疫グロブリンの細胞外ドメイン（IgV）と、細胞膜貫通ドメ
イン、そして細胞内領域から成る。TREM2 はシグナル伝達アダプター分子である
TYRO protein tyrosine kinase-binding protein (TYROBP)と複合体を形成して機能している。つまり、TREM2 がリガンドと結合すると、TYROBP を介して下流にシグナルが伝達される（図 2）32)。

TREM2 の遺伝子変異は病的骨折と若年性認知症を主徴とした希少疾患である那須ハコラ病（Nasu-Hakola disease: NHD）の発症原因となる。一方、孤発性 AD 患者のエクソームシークエンス解析によって、TREM2 exon 2 に位置する rs75932628のレアバリアントが健常群と比較して孤発性 AD の発症リスクを約 4 倍に高めることが明らかとなった 33)。これは孤発性 AD の発症に強い相関がある遺伝子として

APOE に次ぐ 33) 34)。このレアバリアントは、アミノ酸配列における 47 番目のアル
ギニンをヒスチジンに置換させることから、R47H と表記することが多い。また、

8

NHD の原因となる TREM2 の変異は TREM2 タンパク質の発現喪失を惹き起こすが、R47H 多型は、TREM2 タンパク質の発現に影響しない。

2-5

TREM2 の機能と病理学的意義

TREM2 が AD 感受性遺伝子であり、脳内ではミクログリアで高い発現量が認められることから、ミクログリアにおける TREM2 の役割が注目されている。TREM2は Aオリゴマーと結合する他 35)、細胞外に存在するリン脂質やアニオン性脂質を認識する機能がある 36)。これらの脂質は、凝集した A周辺に存在する。つまり、凝集した Aの周辺にミクログリアが集まることができるのは TREM2 が脂質を認識するセンサータンパク質としての役割があるためであると考えられている。実際に、AD 患者のミクログリアは、凝集した A周辺に集まっている 37)。一方、R47H
では、脂質の認識機能やリガンドとの結合機能が損なわれる 36) 38)。その結果、R47Hを有する AD 患者のミクログリアは凝集した A周辺に集まっていない 37)。また、
TREM2 の リ ガ ン ド で あ る APOE や 低 比 重 リ ポ タ ン パ ク 質 （ Low density
lipoprotein: LDL）は、R47H だと結合が低下することが示されている 38) 35)。このように、TREM2 の AD 感受性多型は、TREM2 タンパク質の機能低下を惹き起こす（図 2）。
一方、TREM2 の発現がミクログリアの機能レベルを調節し、その結果 AD の病態生理に影響することが示唆されている。AD モデルマウスに TREM2 を過剰発現

9させると、AD モデルマウスのミクログリアの一部の転写産物の発現が正常化し、AD の一部の症状が改善される 39)ことから、TREM2 には AD の病態生理を制御する役割があることが示唆される。また、AD や筋萎縮性側索硬化症（ALS）の進行、または加齢に伴って現れる疾患関連ミクログリア（Disease-associated microglia:
DAM）の存在が報告された 40)。DAM は 2 段階を経て誘導される。1 段階目では、ミクログリアに恒常的に発現する遺伝子（P2RY12、TMEM119、CSFR1、CX3CR1）の発現低下が見られる。そして、2 段階目では TREM2 の発現上昇が認められる。

Trem2 欠損マウスでは DAM への移行過程が 1 段階目で停止する。つまり、DAMの誘導には TREM2 の発現上昇が必須であると考えられている 40)。
上記のように、TREM2 の機能や病理学的意義は AD との関連で最も精力的に検討されているが、最近では、AD やミクログリア以外との関連にも注目されている。
例えば、肥満条件下で肥大した脂肪組織の周辺に存在するマクロファージである
lipid-associated macrophage（LAM）は、TREM2 の発現によって転写産物の発現パ
ターンやエネルギー代謝、脂質異化が制御される。Trem2 欠損マウスでは、LAMの機能阻害を示し、その結果、脂肪細胞の肥大化や高コレステロール血症、インス
リン代謝異常を惹き起こす 41)。
また、腫瘍微小環境における TREM2 の役割も明らかにされている。腫瘍微小環境に存在する単球やマクロファージの一部には、免疫反応に関する機能が抑制されており、腫瘍の成長を促進してしまうことが知られている。そのような細胞のマー

10カー分子の一つとして TREM2 が同定されている。TREM2 は、腫瘍微小環境中に放出される脂質等を認識し、その結果、T 細胞の機能不全を抑制する働きを有することが示唆されている 42) 43)。
以上のように、TREM2 は AD の病態生理を修飾する中心的な分子である。また、
マクロファージや脂肪細胞など、中枢以外に存在する細胞の機能制御因子としての側面もある（図 3）。このように、TREM2 の機能と、その病理学的な意義に関しては様々なことが明らかにされてきているが、TREM2 自体の発現がどのように制御されているかについては知見が乏しい。

2-6

本研究課題の概要

私は、修士課程在籍時に TREM2 の発現量が自身の exon 3 の選択的スプライシ
ングによって調節されることを見出している 44)。スプライシングは、DNA から転写された pre-mRNA の intron が切り出され、exon 同士が繋がる過程のことを指す（図 4）。この時、特定の配列がスプライシングの過程で mRNA に挿入されたり、あるいはｍRNA から排除されたりすることがあり、これを選択的スプライシングという（図 4）。選択的スプライシングによって一つの遺伝子から異なる配列を持った複数の mRNA が産生され、その結果、タンパク質の多様性が生まれる。

TREM2 exon 3 がスキップした mRNA は exon 4 の途中に終止コドンが生じる。
この終止コドンは premature termination codon（PTC）として認識される。その結11

果、exon 3 がスキップした mRNA は、mRNA 品質管理機構の一つであるナンセン
ス変異依存 mRNA 分解機構（nonsense-mediated mRNA decay: NMD）の標的となり、分解され易くなる（図 5）。つまり、NMD で分解されていたために、これまでに exon 3 の選択的スプライシングが発見されなかったものと考えられる。さらに、exon 3 の挿入が促進されると、TREM2 タンパク質の発現量が増加し、exon 3 のス
キップが促進されると TREM2 タンパク質の発現量が減少することを見出している（図 5）。

44)

一般的に、選択的スプライシングはスプライシングを行う主要な分子複合体であるスプライソソームに加え、種々の RNA 結合タンパク質（RNA-binding protein:RBP）も関与する 45) 46)。従って、TREM2 exon 3 の選択的スプライシングは、何らかの RNA 結合タンパク質による制御下にあると考えられ、その RNA 結合タンパ
ク質は、TREM2 を介してミクログリア・マクロファージなどの細胞機能を調節する可能性がある。そのような分子は AD を始めとする TREM2 関連疾患の病態修飾因子として機能することも期待できる。そこで、本研究では TREM2 exon 3 の選択的スプライシング制御因子の同定を目的とした。

12

3.

材料と方法

3-1

プラスミドの作製

全長ヒト TREM2 minigene と TREM2 ex2-4 minigene は私が修士課程在籍時に作製したものを使用した 44)。また、クローニングに使用したプライマーの配列は、
表 1 に記載した。本研究で使用したプラスミドは、すべて DNA シークエンス解析を行った。
① TREM2 ex3-spminigene の作製

TREM2 ex3-sp minigene の 作 製 の た め に 、 ま ず は p3xFLAG-CMV-7.1(Sigma-Aldrich)を鋳型に PCR で増幅させた 3xFLAG タグ配列を、TREM2
cDNA に お け る シ グ ナ ル ペ プ チ ド の 下 流 に 挿 入 し 、 pcDNA3.1-hygro(Invitrogen)にクローニングした（FLAG-tagged TREM2）。次いで、fgTREM2Fw と fgTREM2-Rv を用いて TREM2 intron 2 から intron 3 までのゲノム断片
を PCR で増幅した。さらに、fgTREM2-Fw2 と fgTREM2-Rv2 を用いて FLAGtagged TREM2 における exon 3 の配列を、TREM2 intron 2 から intron 3 までのゲノム配列に置換した後、pCMV-FRT ベクター44)の NheI/NotI サイトにク
ローニングし、TREM2 ex3-sp minigene とした。

13

② CDS TREM2 の作製
THP-1 細胞の cDNA ライブラリーを鋳型に、TREM2-ex1-5’UTR-Fw と nestTREM2-ex5-Rv を用いて nested PCR を行った。次に nested PCR 産物を鋳型に NheI-TREM2-ex1-Fw と NotI-TREM2-ex5-Rv2 を用いて TREM2 タンパク質をコードする領域を PCR で増幅し、NheI と NotI で切断後、pCMV-FRT ベ
クターの NheI/NotI サイトにクローニングした。
③ 各生物種における TREM2 ex2-4minigene の作製
は じ め に 、 各 生 物 種の 細 胞 （ ウ シ と ブ タは 食 用 肉 ） か ら MagExtractor(TOYOBO)を使用してゲノム DNA を抽出した。次に、各生物種のゲノム DNA
を鋳型に nest プライマーを用いて intron 2 から intron 4 の領域を PCR で増幅した。そして nested PCR 産物を鋳型に制限酵素認識配列が付加されたプライ
マーを用いて TREM2 exon 2 から exon 4 のゲノム断片を増幅した。
アフリカミドリザル（Chlorocebus sabaeus） Trem2 (Cs Trem2)の exon 2 から exon 4 の断片は、COS-7 細胞のゲノム DNA を鋳型にした。マウス（Musmusculus） Trem2 (Mm Trem2)の exon 2 から exon 4 の断片は Neuro2a 細胞のゲノム DNA を鋳型にした。マーモセット（Callithrix jacchus） Trem2（Marm

Trem2)の exon 2 から exon 4 の断片は、HSCj-110 細胞（JCRB 細胞バンク）の
ゲノム DNA を鋳型にした。チンパンジー（Pan troglodytes） Trem2 （Chimp

Trem2）の exon 2 から exon 4 の断片は、HSP-239 細胞（JCRB 細胞バンク）

14のゲノム DNA を鋳型にした。ブタ（Sus scrofa domesticus） Trem2 (Pig Trem2)の exon 2 から exon 4 及びウシ（Bos taurus） Trem2 (Cow Trem2)の exon 2 から exon 4 の断片は、それぞれ市販の食用肉からゲノム DNA を抽出し、これを鋳型とした。各生物種のゲノム断片は、制限酵素で消化した後、pEGFP-C1 ベ
クター（Clontech）の BglII/SalI サイトにクローニングした。
④ キメラ minigene の作製
キメラ minigene 1 から 4 におけるヒト及びマウス由来の TREM2 のゲノム断片は、ヒト TREM2 ex2-4 minigene 及びマウス Trem2 ex2-4 minigene を PCRの鋳型とした。さらに、後述するように 3 つの断片を PCR で作製し、NEBuilder
HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs)を用いて各断片を
1 ステップで繋げた。その後、BclI と SalI 認識配列が付加されたプライマーを用いて exon 2 から exon 4 までの領域を増幅し、BclI と SalI で消化した後、
pEGFP-C1 ベクターの BglII/SalI サイトにクローニングした。
キメラ minigene 1：BclI-moTrem2-ex2-Fw と hmTREM2-ex2-int2-Rv でマウス Trem2 exon 2 を増幅し、hmTREM2-ex2-int2-Fw と hmTREM2-int2-ex3-Rv
でヒト TREM2 intron 2 を増幅し、hmTREM2-int2-ex3-Fw と SalI-moTrem2ex4-Rv でマウス Trem2 exon 3 から exon 4 までを増幅した。
キメラ minigene 2：BclI-TREM2-Fw と hmTREM2-hex2-mint3-Rv でヒト

TREM2 exon 2 から exon 3 までを増幅し、hmTREM2-hex2-mint3-Fw と15

hmTREM2-mint3-hex4-Rv でマウス Trem2 intron 3 を増幅し、hmTREM2mint3-hex4-Rv と SalI-TREM2-Rv でヒト TREM2 exon 4 を増幅した。
キメラ minigene 3：BclI-moTrem2-ex2-Fw と hmTREM2-ex3-Rv でマウス

Trem2 exon 2 から exon 3 までを増幅し、hmTREM2-ex3-Fw と hmTREM2ex4-Rv でヒト TREM2 intron 3 を増幅し、hmTREM2-ex4-Fw と SalI-moTrem2ex4-Rv でマウス Trem2 exon 4 を増幅した。
キメラ minigene 4：BclI-TREM2-Fw と hmTREM2-hex2-mint2-Rv でヒト

TREM2 exon 2 を増幅し、hmTREM2-hex2-mint2-Fw と hmTREM2-mint2hex3-Rv でマウス Trem2 intron 2 を増幅し、hmTREM2 mint3-hex3-Rv でヒト

TREM2 exon 3 から exon 4 までを増幅した。
キメラ minigene 5 と 6 におけるヒト及びマウス由来の TREM2 のゲノム断片
は、キメラ minigene 3 とマウス Trem2 ex2-4 minigene を PCR の鋳型とした。
さらに、後述するプライマーで 2 つの断片を PCR で作製し、BclI-moTrem2 ex2-と SalI 認識配列が付加されたプライマーを用いて exon 2 から exon 4 までの領域を増幅し、BclI と SalI で消化した後、pEGFP-C1 ベクターの BglII/SalI
サイトにクローニングした。
キメラ minigene 5：キメラ minigene 3 を PCR の鋳型とし、EGFP-C1-Fw とhmTREM2-phint3-Rv3 でマウス Trem2 exon 2 からヒト TREM2 intron 3 の途
中まで増幅した。また、マウス Trem2 ex2-4 minigene を鋳型に hmTREM2-

16

phint3-Fw3 と SV40pA-seq-Rv でマウス Trem2 intron 3 の途中から exon 4 ま
での配列を増幅した。
キメラ minigene 6：マウス Trem2 ex2-4 minigene を PCR の鋳型とし、EGFPC1-Fw と hmTREM2-phint3-Rv4-new でマウス Trem2 exon 2 から intron 3 の途中までを増幅した。また、キメラ minigene 3 を鋳型に hmTREM2-phint3Fw4-new と SV40pA-seq-Rv でヒト TREM2 intron 3 の途中からマウス Trem2
exon 4 までの配列を増幅した。BclI-PCR で 6 つのキメラ minigene におけるヒト及びマウス由来の TREM2 のゲノム断片は、該当する配列を PCR で増幅した後、一つに繋がった断片を PCR で増幅し、pEGFP-C1 ベクターの BglII/SalI
サイトにクローニングした。
⑤ TREM2 スプライスバリアントの作製
FLAG-tagged TREM2 dE3 と FLAG-tagged TREM2 dE4 は、FLAG-tagged
TREM2 を鋳型に、dE3 の場合は NheI-TREM2-ex1-Fw と TREM2-dE3-Rv、TREM2-dE3-Fw と NotI-TREM2-ex5-Rv を用いて 2 つの断片を作製し、dE4 の場合は NheI-TREM2-ex1-Fw と TREM2-dE4-Rv、TREM2-dE4-Fw と NotITREM2-ex5-Rv を用いて 2 つの断片を作製した。その後 2 つの断片を鋳型として、制限酵素認識配列が付加されたプライマーを用いて PCR で増幅し、PCR
産物を NheI と NotI で消化し、pCMV-FRT ベクターの NheI/NotI サイトにク
ローニングした。

17

⑥ RNA 結合タンパク質発現ベクターの作製
本研究で使用したすべての RBP の cDNA は、pEGFP-C1 ベクターにクローニングされている。ヒトに由来する CELF1 から CELF4 は、pSecDK ベクターにクローニングされたもの 47)を PCR の鋳型とし、BamHI-CELF1-Fw と XhoICELF1-st-Rv を使用して増幅し、pEGFP-C1 の BglII/SalI サイトにクローニン
グした。CELF2 から CELF4 も同様の方法で作製した。MBNL142 の発現コンス
トラクトは既に作製済みのものを使用した 48)。また、ヒトに由来する TDP-43
は、ヒト cDNA ライブラリーを PCR の鋳型とし、BamHI-hTDP43-Fw と XhoIhTDP43-st-RV を使用して作製した。その他の RNA 結合タンパク質の cDNA
は、FAMTOM3 cDNA クローン 49)、またはマウス cDNA ライブラリーを鋳型として PCR で増幅し、pEGFP-C1 ベクターの BglII/SalI サイトにクローニン
グした。

3-2

細胞培養

Flp-In システムに対応した HEK293 (Thermo Fisher Scientific)に 0.45 g の
pOG44 と 0.05 g の全長ヒト TREM2 minigene を導入した後、62.5 ng/mL のhygromycin B (Thermo Fisher Scientific)で選別し、限界希釈法で単一細胞から増殖した細胞株を樹立した 44)。HEK293 (RCB1637, Riken BRC)、Neuro2a (#CCL-131,
ATCC)、RAW264.7 (#91062702, ECACC)、HeLa (RCB0007, Riken BRC)、全長ヒ18ト TREM2 minigene 安 定 発 現 細 胞 は 、 10% ウ シ 胎 児 血 清 （ FBS ） と 1%
penicillin/streptomycin （ Thermo Fisher Scientific ） が 添 加 さ れ た Dulbecco’s
modified Eagle’s medium (Thermo Fisher Scientific)で 5% CO2 存在下、37℃で培養した。THP-1（RCB1189, Riken BRC）は、GultaMAX が既に添加された RPMI
(Thermo Fisher Scientific) に 10% FBS 、 1% penicillin/streptomycin 、 2mercaptoethanol (Wako)を後から添加し、5% CO2 存在下、37℃で培養した。ここまで述べた細胞は、10 cm ディッシュ (日本ジェネティクス)で維持した。ヒト不死化 ミ ク ロ グ リ ア （ #T0251, Applied Biological Materials ） は 、 10% FBS 、 1%
penicillin/streptomycin が 添 加 さ れ た Prigrow III medium (#TM003, Applied
Biological Materials)でコラーゲンがコートされた T25 フラスコ（#G299, Applied
Biological Materials）を用いて 5% CO2 存在下、37℃で培養した。Cycloheximide(Wako)は 10 mg/ml になるように DMSO (Sigma)で調製した。THP-1 では 100
g/ml で 6 時間、HEK293 は 50 g/ml で 6 時間それぞれ処理した。

3-3

スプライシングアッセイ

HEK293 及び、全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞は遺伝子導入の前日に0.1% (w/v) gelatin (Wako)でコートされた 12-well plates (日本ジェネティクス)に
播種した。

19

① プラスミドの導入
Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific)を用いて 0.02 g の minigeneと 0.48 g の EGFP 融合 RNA 結合タンパク質発現ベクターを同時に導入した。

② small interfering RNA の導入
全 長 ヒ ト TREM2 minigene 安 定 発 現 細 胞 に 対 し て は 、 Lipofectamine
RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)を用いて 30 M の siRNA を導入し、72時間後に 50 g/ml の CHX を添加し、さらに 6 時間培養した後、細胞を回収した。THP-1 に対する siRNA の導入には、まず、導入前日に 24-well plates (日本ジェネティクス)に 100 ng/ml の Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)存在
下、THP-1 を播種した。そして Lipofectamine RNAiMAX を用いて 20 M の
siRNA を導入し、72 時間後に 100 g/ml の CHX を添加し、さらに 6 時間培養した後、細胞を回収した。使用した siRNA (ニッポンジーン)の配列は、以下の通りである。
siCELF1: GCUCAAACGUUCGAAGAAUTT,
siCELF2: CCACCUUCCACAGGAAUUUTT
いずれも 19mer (RNA) + TT となっている。

20

③ RNA の抽出と cDNA の作製
Total RNA は、NucleoSpin RNA kit (TaKaRa)を用いて抽出・精製した。Total
RNA を鋳型に、Revertra-- (TOYOBO)を用いて逆転写反応を行い、cDNA を得た。この時、Random primer と Oligo dT (20)をプライマーとして用いた。また、Total RNA の量はサンプル間で同一とした。
スプライシングパターンは、cDNA を鋳型に Blend-Taq-plus- (TOYOBO)または、Ex-Taq (TaKaRa)を用いて reverse-transcription PCR (RT-PCR)を行い、PCR 産物をアガロースゲル (pH Japan または invitrogen 製 pure agarose)またはポリアクリルアミドゲル（ePAGEL, ATTO）を用いた電気泳動で分離し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド（Genesee Scientific Corporation）で染色することで検出した。複数の PCR サイクルを検討し、バンド強度が飽和しない
PCR サ イ ク ル 数 を 決 定 し た 。 電 気 泳 動後 の ゲ ル 写 真 は Luminograph III(ATTO)で撮影した。バンド強度は CSAnalyzer (ATTO)で定量した。各電気泳動に用いたゲルの種類は図の説明文に記載した。スプライシングアッセイに使用したプライマーの配列は表 2 に記載した。

3-4

SDS-PAGE とウエスタンブロット

遺伝子導入から 72 時間後に細胞を回収し、2 % SDS を含む PBS を加え、超音波で破砕し、全細胞破砕液とした。BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific)

21

とプレートリーダーで全細胞破砕液に含まれるタンパク質の濃度を測定した。その後、サンプル間でタンパク質の量が揃うように全細胞破砕液を加え、さらに 2mercaptoethanol を含む SDS サンプルバッファーを加えた。最後に、95℃で 5 分間
ボイルし、泳動サンプルを作製した。12 %のポリアクリルアミドゲルで SDS-PAGEを行い、タンパク質を分離した。その後、ニトロセルロースメンブレン（BioRad）
または PVDF メンブレン（GE healthcare）にタンパク質を転写した。スキムミル
クでブロッキングを行い、抗体が希釈されたスキムミルクでメンブレンを 4℃で一晩反応させた。一次抗体を反応させたメンブレンは、0.1 %ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート（Wako）を含む PBS（PBS-T と表記する）でメンブレ
ンを 10 分間洗浄することを 3 回繰り返した。その後、二次抗体が希釈されたスキムミルクでメンブレンを室温で 1 時間反応させた。1 時間後、PBS-T でメンブレンを洗浄し、Immobilon Forte Western HRP（Millipore）で発色した。メンブレンはLuminograph III で撮影し、CSAnalyzer で定量した。
培養上清のタンパク質の検出は以下の方法で行った。まず、0.5 g の発現ベクターを 12-well plates に播種された HEK293 に導入した。導入から 72 時間後に無血清培地に交換し、さらに 6 時間培養した。その培養上清を回収し、トリクロロ酢酸（Wako）と 10 %デオキシコール酸ナトリウムをそれぞれ 1/10 量となるように加え、-80℃で 1 時間インキュベートした。融解後、16,100 x g で 15 分間遠心した。
上清を除去し沈殿物を 700 l の氷冷アセトンで洗浄し、さらに 16,100 x g で 5 分

22

間遠心することを 2 回繰り返した。その後、チューブの蓋を開け、その上からラップを被せ、37℃で 30 分間インキュベートすることで沈殿物を乾燥させた。乾燥後、2-mercaptoethanol を含む SDS サンプルバッファーを加え 95℃で 5 分間加熱しながら沈殿物を溶かし、泳動サンプルとした。SDS サンプルバッファーを加えた際に溶液が酸性に傾いた場合には、5 N NaOH を極少量加え、中性とした。
細胞膜タンパク質の分画は、文献 50)の方法を参考に行った。まず、6-well plates
で培養した全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞を protease inhibitor (Roche)が添加された PBS で懸濁し、-80℃で 1 時間インキュベートし、その後室温で融解することを 3 回繰り返した。その後、16,100 x g で 25 分間遠心した。遠心後の上清を細胞質画分とした。上清回収後の沈殿物を、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1mM EDTA、1% Triton X-100（pH 7.5）、protease inhibitor で構成されたバッファーに懸濁し、超音波で破砕した。破砕後、16,100 x g で 25 分間遠心し、遠心後の上清を膜画分とした。それぞれの画分のタンパク質の濃度を BCA protein assay kit で測定した。泳動サンプルの作製方法、SDS-PAGE とウエスタンブロット、シグナルの検出の手順は上記と同様である。
本研究で使用した一次抗体及び二次抗体は表 3 に一覧としてまとめた。

23

3-5

蛍光免疫染色全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞と THP-1 は、それぞれチャンバースラ
イド（WATSON）で培養した。細胞は室温で 30 分間 4 % PFA (Wako)で処理することで固定した。固定後、PBS で希釈した 0.1 % Triton-X で 5 分間室温で振盪し、膜透過を行った。次に 5 % スキムミルクで 30 分間ブロッキングを行った後、スキムミルクで希釈した一次抗体を 4℃で一晩反応させた。次の日、一次抗体の反応液を除去し、PBS を加え 10 分間振盪することにより洗浄した。これを 3 回繰り返した。洗浄後、蛍光標識二次抗体をスキムミルクで希釈し、遮光条件下、室温で 1 時
間反応させた。1 時間後、上記と同様の方法で固定細胞を遮光しながら洗浄した。
封入剤は DAPI が添加されたものを使用した（VECTOR LABORATORIES）。細胞の蛍光画像は共焦点顕微鏡で撮影した（LSM710; Carl Zeiss）。抗体の情報は表 3 に
記載した。

3-6

蛍光活性化セルソーティング（Fluorescence-activated cell sorting: FACS）

全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞を 0.1 % (w/v) gelatin でコートした 6
cm ディッシュに播種し、EGFP 融合 CELF2 発現ベクターを Lipofectamine 3000
(Thermo Fisher Scientific)を用いて導入した。導入から 72 時間後、トリプシンで細胞を剥がし、10 % FBS と 1 % penicillin/streptomycin が添加された DMEM で懸濁後、細胞をセルストレイナー（FALCON）に通した。GFP の蛍光に基づき、cell

24sorter MA900 (SONY)で細胞を分取した。分取時のパラメーターは機器の取り扱い
説明書に従った。

3-7

RNA 免疫沈降

RNA 免疫沈降は文献 51)を参考に行った。THP-1 を 6-well plates に播種し、100
ng/ml の PMA で処理した。1 well あたり 1 mL の 1 % PFA (4 % PFA を PBS で希釈)を加え 10 分間室温で処理し、架橋をした。10 分後、1 well あたり 1.5 M グリシ
ンを 0.2mL 加え 5 分間処理し（この時、1 分半に一度 plate を揺らす）PFA を不活化した。その後、PBS で 3 回洗浄し、細胞を回収した。そこへ 0.1 U/l の SUPERase
In RNase inhibitor (Thermo Fisher Scientific)と protease inhibitor (Roche)が添加された RIPA バッファー600 L に懸濁し、超音波を当てて破砕した。破砕は、30 秒
間超音波処理後、氷上で 1 分間静置することを 6 回繰り返した。破砕後の細胞溶解液を 16,100 x g で 15 分間遠心し、遠心後の上清を回収した。上清に Dynabeads
protein A (Thermo Fisher Scientific)を加え、4℃で 1.5 時間処理した（プレクリア）。
プレクリア後の産物のうち、1/10 量を input として回収した。残りは事前に抗CELF2 抗体または rabbit IgG を結合させた Dynabeads protein A で 4℃条件下、回転機で一晩インキュベートし、免疫沈降させた。 インキュベート後の上清はunbound として回収した。次に、ビーズを終濃度がそれぞれ 1 M NaCl、1 M Ureaが含まれた RIPA バッファーで 3 回洗浄した。洗浄後、一部の Dynabeads を分取

25

し、SDS サンプルバッファーを加え 95℃で溶出させ、SDS-PAGE とウエスタンブ
ロットで免疫沈降の有無を確認した。免疫沈降の有無の確認後、残りの Dynabeadsに終濃度がそれぞれ 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、1% SDS、1 mM EDTA、50 mM
2-mercaptoethanol で構成されたバッファーを加え、70℃で 1 時間脱架橋反応を行った。脱架橋後、フェノール/クロロホルムを用いて RNA を抽出し、さらにNucleoSpin RNA kit で RNA を精製した。この RNA を鋳型に逆転写を行い、cDNAを合成し、RT-PCR を行った。電気泳動後のゲルは Luminograph III で撮影した。

3-8

統計解析

本論文中に掲載されているすべてのグラフは、R (version 3.6.1, https://www.rproject.org/)を用いて作成した。統計解析は、EXCEL 統計（株式会社エスミ）を用いて行った。グラフ中のエラーバーは標準偏差、黒点はそれぞれのデータの値を表している。2 群のデータは、対応のある t 検定あるいは Welch の t 検定を実施した。
3 群のデータは、一元配置分散分析後にテューキー検定を実施した。p 値は各グラフに記載した。

26

4.

結果

4-1

TREM2 exon 3 の選択的スプライシング制御因子の探索

まず初めに、制御候補因子の選定を行った。本研究課題で制御候補因子とした
RBP は、ミクログリアに発現する RBP であり（表 4）、AD 以外の神経疾患と関連があるものも含まれている。例えば、 fused in sarcoma (FUS)や heterogeneous

nuclear ribonucleoprotein a1（HNRNPA1）、Matrin 3（MATR3）は家族性筋萎縮症
側索硬化症（ALS）で遺伝子の変異が認められている 52) 53) 54)。また、TDP-43 は、

TAR DNA binding protein（TARDBP）にコードされる RBP で、ALS 患者における変性した神経細胞の細胞質に見られる封入体に蓄積していることが知られている 55) 56)。この他にも、muscleblind-like splicing regulator 1（MBNL1）の機能障害
は、筋強直性ジストロフィータイプ 1 患者の症状を特徴づける 57)。このように、疾患との関連が示唆されている RBP などを候補とし、これら 34 の候補 RBP が GFP
融合タンパク質として発現するベクターを用意した。RBP は MBNL1 と PTBP1 を除き、マウス由来の RBP である。これに加え、スプライスパターンの検出に使う
minigene を作製した。minigene とは、任意の遺伝子の exon と intron を含むゲノ
ム断片がクローニングされた発現ベクターのことを指し、細胞に導入されるとスプライシングが生じるため、選択的スプライシング制御機構の研究において多用される。本研究では、全長 TREM2 タンパク質をコードし、intron を含む全長ヒト TREM2
minigene と RBP 発現ベクターを HEK293 に共発現させ、全長ヒト TREM2

27

minigene における exon 3 のスプライスパターンを検出した（図 6）。ここで、スプ
ライスパターンの検出方法を図 7 に示す。まず、細胞から total RNA を抽出する。
これには mRNA が含まれているので、抽出した RNA を鋳型に逆転写酵素によってcDNA を得ることができる。そして、cDNA を鋳型に任意のプライマーを用いてPCR を行う。PCR 産物を電気泳動で分離し、バンドパターンを可視化することでスプライスパターンを検出する。

TREM2 exon 3 のスプライスパターンは、いくつかの RBP によって変化した。
Hnrnpa1、Ewsr1、Pcbp1、Pcbp2 は、exon 3 のスキップを促進させた。一方、PTBP1や Tial1 は exon 3 の挿入を促進させた（図 8）。コントロールでは exon 3 のスキップの割合が 4.8 %であり、この数字から増加する場合に比べ、減少する場合は数値の変化が小さく、コントロールとの差を明瞭に検出することが困難であると考えた。
そのため、本研究ではより明瞭な exon 3 のスキップを促進する RBP に注目した。
このうち、exon 3 のスキップを最も強く促進していた Celf1 と Celf2 に注目した（図 8）。この２つの分子におけるそれぞれの一塩基多型が AD のゲノムワイド関
連解析で検出されていること 58) 59) 、CELF1 はヒト脳の皮質に存在する細胞のう
ち、ミクログリアに豊富に発現していること 60)、さらに、CELF2 は AD 患者の嗅内野に存在する細胞のうち、ミクログリアに豊富に発現すること 61)が報告されており、AD やミクログリアとの関連が期待できると考えた。そこで制御候補因子として以下では主にヒト由来の CELF1 と CELF2 に焦点を当てた。CELF1 と CELF2 は28

CELF（CUGBP Elav-like family member）ファミリーに属する RBP である。そこ
で、パラログ間での exon 3 のスプライシングへの影響を検討するため、CELF3 とCELF4 を発現するベクターを作製した。全長ヒト TREM2 minigene とヒト CELF
タンパク質を共発現させたところ、CELF1 と CELF2 で exon 3 のスキップが生じ、CELF3 では exon 3 のスキップが若干生じていた（図 9A）。一方、CELF4 は exon
3 のスプライシングに影響しなかった（図 9A）。さらに、全長ヒト TREM2 minigeneを用いた実験に加え、 TREM2 exon 2 から exon 4 の minigene（TREM2 ex2-4
minigene）でも同様の実験を行った。その結果、CELF1 と CELF2 は exon 3 のス
キップを促進させた（図 9B）。以上より、TREM2 exon 3 は CELF1 と CELF2 によってスキップが促進することが明らかとなった。また、TREM2 ex2-4 minigene
でも exon 3 のスキップが促進されたことから、CELF1 及び CELF2 は exon 2 からexon 4 のゲノム配列に働きかけ、exon 3 のスキップを誘導することが示唆された。

4-2

CELF2 は TREM2 タンパク質の発現量を減少させる

私は修士課程在籍時に TREM2 タンパク質の発現量は、exon 3 がスキップすると減少し、exon 3 の挿入が促進されると増加することを見出した 44)。そのため、CELF1 と CELF2 による TREM2 exon 3 のスキップの促進は、TREM2 タンパク質の発現量の減少を惹き起こすと考えられる。そこで、全長ヒト TREM2 minigene を
CELF1 または CELF2 とともに HEK293 に導入し、TREM2 タンパク質の発現量をウエスタンブロットで検出した。その結果、CELF1 は有意な変化ではないものの
29

TREM2 タンパク質を減少させる傾向にあり、CELF2 は TREM2 タンパク質の発現量を有意に減少させることが分かった（図 10A）。CELF1 と CELF2 に加え、TREM2タンパク質の発現量に対する TDP-43 の影響を検討した。TDP-43 は CELF1、
CELF2 同様に UG の２塩基が豊富に存在する配列に結合することから 62) 63) 64) 65)、TREM2 タンパク質の発現量に対して CELF1、CELF2 と同様の影響を与える

66)

可能性がある。しかし、TDP-43 は TREM2 exon 3 のスプライスパターンに影響せず、TREM2 タンパク質の発現量も TDP-43 による影響を受けなかった（図 10B）。
次に全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞または THP-1 に CELF2 を導入し、TREM2 タンパク質の蛍光強度を免疫染色で観察した。CELF2 が導入された細胞では、周辺の細胞に比べて蛍光強度が減少した（図 11）。最後に、CELF2 による
TREM2 タンパク質の有意な発現量の減少は CELF2 が導入された細胞で生じることを示すために、全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞に EGFP 融合 CELF2 発
現ベクターを導入し、セルソーターで GFP 陽性または陰性の細胞をそれぞれ分取した後、TREM2 タンパク質の発現量の変化をウエスタンブロットで確認した。その結果、CELF2 が導入された細胞では TREM2 タンパク質の発現量が減少していた（図 12）。
TREM2 タンパク質には、膜結合型と分泌型が存在する 67)。ここまでの結果で示した TREM2 タンパク質がどちらのアイソフォームかを検討するために、全長ヒト

TREM2 minigene 安定発現細胞を細胞質画分と膜画分に分画した。さらに、培養上

30

清中の TREM2 タンパク質の分子量を検出した。その結果、全長 TREM2 タンパク質は膜画分に検出され、培養上清中における TREM2 は、30～40kDa にかけてかすかに検出された（図 13 図 13A）。つまり、膜結合型 TREM2 は明瞭なバンドとして検出されるが、分泌型 TREM2 はスメア状に検出されることがわかった。次に、CELF2 が膜結合型 TREM2 の発現量を減少させるかを検討した。全長ヒト TREM2
minigene を CELF2 とともに HEK293 に共発現させ、膜画分と細胞質画分に分画し、TREM2 タンパク質の発現量を確認した。その結果、細胞膜画分におけるTREM2 タンパク質の発現量が CELF2 によって減少した（図 13B）。つまり、CELF2は膜結合型 TREM2 の発現量を減少させることが示された。
最後に、CELF1 と CELF2 の発現抑制時における THP-1 内在性 TREM2 exon 3のスプライスパターンの変化を検討した。NMD による分解のため、THP-1 内在性TREM2 における exon 3 のスキップした mRNA の検出は特に困難である。そこで、
siRNA に加え、NMD の阻害剤である cycloheximide（CHX）で処理し、内在性

TREM2 exon 3 のスプライスパターンを検出した。その結果、内在性 TREM2 exon
3 のスキップは、CELF1、CELF2 の同時ノックダウンにより抑制された（図 14A）。
全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞でも同様の結果であり、CELF2 単独のノックダウンまたは CELF1 と CELF2 の同時ノックダウンで有意差があった（図14B）。以上の結果より、CELF1 と CELF2 は exon 3 のスプライシングを調節し、TREM2 タンパク質の発現量を減少させる RBP であることが示唆された。

31

4-3

CELF1, CELF2 は TREM2 の intron 領域に作用し TREM2 タンパク質の発現量を減少させる

CELF1 と CELF2 は mRNA の翻訳制御や安定性にも関与することが知られている 68) 69)。つまり、CELF1 や CELF2 による TREM2 タンパク質の発現量の減少は、
exon 3 のスプライシング制御に限らず、mRNA の安定性や翻訳効率の変化に起因する可能性が考えられる。この可能性を検討するために、intron を含まない TREM2
cDNA 発現ベクター（CDS TREM2）を作製し検討した。その結果、TREM2 タン
パク質の発現量に変化は見られず、CELF による制御は intron あるいは intron の
プロセシングが必要であることが示唆された（図 15）。従って、CELF1 と CELF2は TREM2 exon 3 の選択的スプライシングの制御を通して TREM2 タンパク質の発現量の減少に関与する可能性が考えられた。そこで、TREM2 intron 2 と intron
3 を含み、exon 3 のみがスプライシングを受ける minigene（TREM2 ex3-sp minigene）
を作製し、CELF1 と CELF2 による exon 3 のスプライスパターン及び TREM2 タ
ンパク質の発現量の変化を検討した。TREM2 ex3-sp minigene は CELF1、CELF2によって exon 3 のスキップが促進され（図 18A）、さらに TREM2 タンパク質の発現量は減少した（図 18B）。これらの結果から、CELF1 と CELF2 は TREM2 exon
3 の選択的スプライシングの制御を介して TREM2 タンパク質の発現量の減少を惹き起こしていることが考えられた。

32

4-4

TREM2 exon 3 の選択的スプライシングは種特異的である

次に TREM2 exon 3 の選択的スプライシングの保存性について検討した。まず初めにマウス（Mm Trem2）とアフリカミドリザル（Cs Trem2）のそれぞれの Trem2
exon 2 から exon 4 の minigene を作製し、HEK293 にそれぞれの minigene を導入
し、ヒト TREM2 exon 3 のスプライスパターンと比較した。アフリカミドリザル

Trem2 ではヒトの場合と同様に exon 3 のスキップが生じたが、マウス Trem2 ではスキップしなかった（図 17A）。そこで、内在性 Trem2 でも同様の結果であるかを確認するために、内在性 Trem2 を発現するマウスマクロファージ細胞株 RAW264.7で検討したが、exon 3 のスキップは見られず、これは CHX を添加した場合でも同様の結果であった（図 17B）。マウス Trem2 minigene の PCR 産物には、intron 4の一部を保持したバンドが含まれていた。これは、exon 4 上流の選択的 3’スプライ
ス部位によってスプライシングされたことで産生されたものである 70)（図 17C）。
また、ヒト TREM2 とアフリカミドリザル Trem2 の exon 3 は CELF1、CELF2 によってスキップが促進されたが、マウスではそのような変化は生じなかった（図18A）。マウス Trem2 exon 3 の選択的スプライシングの有無を明確にするために、
上記のマウス Trem2 の minigene とマウス由来 Celf1 または Celf2 をマウス神経芽細胞腫 Neuro2a に共導入し、生物種のバックグラウンドを揃えた上で exon 3 のス
プライスパターンを検出した。しかし exon 3 のスプライスパターンに変化は見られなかった（図 18B）。マウスでは exon 3 の選択的スプライシングが生じていない33

ことから、TREM2 exon 3 の選択的スプライシングは霊長類特異的である可能性がある。そこで、exon 3 の選択的スプライシングがどの生物種で保存されているかを検討した。チンパンジー（Chimp Trem2）、マーモセット（Marm Trem2）、ウシ（CowTrem2）、ブタ（Pig Trem2）のそれぞれの生物種における Trem2 の exon 2 からexon 4 までの minigene を作製し、exon 3 のスプライスパターンを検出した。その結果、チンパンジーTrem2、マーモセット Trem2 では exon 3 の選択的スプライシ
ングが生じており、これは CELF2 で促進された（図 19A）。また、ウシ Trem2 は
僅かではあるがコントロールで exon 3 のスキップが生じており、CELF2 で促進された（図 19B）。ウシ Trem2 の exon 2、3、4 が挿入されたバンドのひとつ上に検出された PCR 産物では、intron 2 の一部を含んでいた。一方、ブタ Trem2 では exon
3 の選択的スプライシングは生じておらず、ブタ Trem2 minigene と CELF2 の共発現時でも exon 3 のスキップは見られなかった（図 19B）。これらの結果から、exon 3 のスプライシングには種間の差があること、TREM2 exon 3 が選択的 exon
である場合には、その選択的スプライシングが CELF2 によって共通に制御されることが考えられた。

34

4-5

CELF1, CELF2 は TREM2 intron 3 に作用し、exon 3 の挿入を阻害する

ヒト TREM2 exon 3 で見られる選択的スプライシングがマウスでは保存されていないことから、両種のキメラ minigene を作製することで CELF1 と CELF2 による

TREM2 exon 3 の選択的スプライシング制御機構を推測することができると考えた。
そこで 4 つのキメラ minigene を作製した。
キメラ minigene 1 は、マウス Trem2 の intron 2 がヒトの配列に置換された
minigene である（図 20 図 20A）。キメラ minigene 1 はコントロール（EV）で exon
3 のスキップが生じた。これは、ヒト intron 2 の配列が exon 3 のスキップを促進することを示唆している。また、CELF1 は exon 3 のスキップを減少させた。この結果から、ヒト intron 2 に CELF1 の応答領域があることが示唆された。一方、CELF2ではコントロールと比較して変化はなかった。キメラ minigene 1 の結果から、CELF2 による exon 3 のスキップの促進はヒト TREM2 intron 2 の配列だけでは十分でないことが示唆された。
キメラ minigene 2 はヒト TREM2 の intron 3 がマウスの配列に置換された
minigene である（図 20 図 20B）。これは exon 2、3、4 が連結した PCR 産物の他に、以下の通りの複雑なスプライス産物を示した。一番長い PCR 産物は、exon 4
上流に位置するマウス Trem2 特異的な選択的 3’スプライス部位でスプライシングされた PCR 産物で、intron 3 の末端部を含む。一方、一番短い PCR 産物は、exon
4 の最初の 74 塩基が欠損した PCR 産物であった。これは、隠れたスプライス部位

35

がキメラ化によって活性化された結果であると考えられた。しかしながら、キメラ
minigene 2 では CELF との共発現時でも exon 3 のスキップが生じなかった。つまり、ヒト TREM2 intron 3 は、exon 3 の選択的スプライシングに必要な領域である
ことが示唆された。
キメラ minigene 3 は、マウス Trem2 の intron 3 がヒトの配列に置換された
minigene である（図 20 図 20C）。コントロール（EV）では exon 3 のスキップは
わずかであった。同条件のキメラ minigene 1 の結果から、ヒト TREM2 intron 2 はexon 3 の選択的スプライシングに必要な配列を含む可能性がある。さらに、キメラ
minigene 3 は、コントロールと比較して CELF2 による exon 3 のスキップの促進が見られた。
キメラ minigene 4 は、ヒト TREM2 intron 2 の配列がマウスに置換された
minigene である（図 20）。キメラ minigene 4 もキメラ minigene 3 と同様のスプラ
イスパターンを示した。キメラ minigene 3 と 4 は、両方ともヒト TREM2 intron 3を含んでいる。つまり、CELF2 による TREM2 exon 3 のスキップは intron 3 を介して生じることが示唆された。また、キメラ minigene 3, 4 の両者は、intron 2 がマウス由来であるため、exon 3 のスキップが効率的でないことが考えられた。
ここまでのキメラ minigene を用いた検討によって、CELF は TREM2 intron 3に作用することが示唆された。そこで、ヒト TREM2 intron 3 を前半と後半に分け、それぞれをマウス Trem2 intron 3 に置換させたキメラ minigene 5、6 を作製

36

し CELF の応答性を示す領域を推測した。キメラ minigene 5 はヒト intron 3 の前半部を有する（図 21A）。マウス Trem2 exon 4 が伸長したスプライス産物が検出された。また、CELF1、CELF2 との共発現時では exon 3 のスキップは生じなかった。一方、ヒト intron 3 の後半を有するキメラ minigene 6 は、CELF1 とCELF2 によってわずかではあるが、キメラ minigene 3 と同様に exon 3 のスキップが生じた(図 21B）。この結果から、CELF1 と CELF2 はヒト TREM2 intron 3の後半部に応答領域が存在し、この領域を介して TREM2 exon 3 のスキップを惹
き起こすことが示唆された。
次に、CELF2 と TREM2 pre-mRNA の結合を検討するために、RNA 免疫沈降を行った。RNA 免疫沈降とは、目的の RBP に対する抗体による免疫沈降で RBP を濃縮し、RBP に結合した RNA を解析する実験手法である（図 26）。まず、細胞をホルムアルデヒドで処理し、RNA と RBP を架橋させる。次いで、架橋された RNARBP 複合体を超音波で破砕し、RNA を断片化する。そして、目的の RBP に特異的な抗体が付いた磁気ビーズを使って RNA-RBP 複合体を免疫沈降する。尿素と SDSを含む洗浄液でビーズを洗浄した後、脱架橋を行い、磁気ビーズから RNA を抽出し逆転写によって cDNA を得る。最後に cDNA を鋳型に PCR を行い RBP と premRNA との結合を評価する。本研究では CELF2 と結合している TREM2 pre-mRNA
を解析対象とした。内在性 TREM2 及び CELF2 を発現する THP-1 を実験材料とし、抗 CELF2 抗体で免疫沈降を行った（図 23A）。その後、免疫沈降物由来の cDNA

37

を用いて、TREM2 exon 3 から exon 4 における領域を PCR によって増幅させた結果、増幅産物が検出された（図 23B）。これらの結果から、CELF2 は TREM2 intron
3 に作用して exon 3 の選択的スプライシングを制御し、細胞内で実際に intron 3 領
域の RNA と結合することが示唆された。

4-6

Exon 3 欠損型 TREM2 は、分泌型タンパク質として発現する

TREM2 exon 3 がスキップした mRNA は、exon 4 の途中に終止コドンが生じる（図 24A）。TREM2 タンパク質の構造と照らし合わせると、exon 3 がスキップした場合、膜貫通ドメインを欠く TREM2 が産生される可能性がある。従って、exon
3 がスキップした mRNA は、すべてが NMD で分解されるわけではなく、一部のmRNA が NMD による分解を逃れた場合、新規の分泌型タンパク質として発現する可能性がある。そこで、exon 3 がスキップしたアイソフォームが発現する可能性を検討するために、exon 3 欠失変異体に 3 x FLAG を付加した発現ベクターを作製し、HEK293 に一過性に導入後、培養上清中のタンパク質を FLAG 抗体で検出した。その結果、exon 3 がスキップしたアイソフォームの発現は 30～40kDa 付近に
スメア状のシグナルとして検出された（図 24B）。従って、exon 3 欠損型 TREM2は分泌型タンパク質として発現する可能性が考えられた。

38

5.

考察

従来の TREM2 に関する研究は、TREM2 自体の機能解析が主体であった。
TREM2 がミクログリアやマクロファージなどの機能を調節することが示されており、TREM2 の機能と病理学的な意義が注目されている。しかし、TREM2 の発現制御に関わる検討は不足している。そこで、exon 3 のスプライシング制御因子を同定することで TREM2 の発現制御因子に関する知見を得ることができると考えた。
そして、本研究では TREM2 と CELF2 との分子的相互作用と、種間による TREM2の発現制御の違いを明らかにした 71)（図 25）。

5-1

AD 新規関連分子としての CELF1 と CELF2

CELF1 と CELF2 は CELF ファミリーに属し、スプライシングや翻訳を制御する
RBP である 72) 73) 68) 74)。本研究では CELF1 と CELF2 が TREM2 exon 3 のスプラ
イシング制御因子であることが示唆された。ただし、CELF2 が TREM2 のタンパ
ク質発現を抑制するのに対し、CELF1 の効果は明瞭ではなかった。CELF1 は幾つかの AD 関連遺伝子の発現制御因子として機能することが報告されている。転写因子 MEF2A や C/EBPは、CELF1 の発現上昇によって発現量が増加する 75) 76)。
MEF2A や C/EBPはミクログリアやマクロファージに発現しており、興味深いことに MEF2A の発現は DAM で抑制されている 40) 77) 78)。さらに、C/EBPの発現量が AD 患者の脳で増加しており 79)、これは炎症促進性の遺伝子の発現を増加させる
39

と考えられている 80)。また、CELF1 における AD 感受性多型は、染色体上の CELF1
近傍の遺伝子の発現量を変化させる量的形質遺伝子座（expression quantitative trait
loci: eQTL）であると考えられている 58) 81) 82)。実際にこの多型が遺伝子の発現制御にどれほどの効果を発揮しているのかは不明だが、CELF1 および近傍の遺伝子発現状況を同時に変化させることを介して AD の病態に影響を与えている可能性が考えられる。

CELF2 の一塩基多型が AD 感受性因子であることが報告されている 59)。この多型の効果は APOE 4 アリルの保有状態に依存することから、CELF2 が AD 病態において APOE と関連する分子経路に影響することが考えられる。CELF2 による ADに関連した遺伝子のスプライシング制御は、本研究で明らかにした TREM2 遺伝子
以外にもタウタンパク質をコードする MAPT 遺伝子で報告されている。CELF2 は

MAPT exon 2 と exon 10 のスキップを促進させるが、このスプライシング制御に
CELF1 は関与しない 83)。MAPT exon 10 の選択的スプライシングは、タウタンパ
ク質における微小管結合部位の繰り返し数が異なるアイソフォーム 3 リピートタウ
および 4 リピートタウ）の産生に繋がる。タウオパチーの一種である FTDP-17 はMAPT の遺伝子変異を原因とするが、既知の変異の中には intron に位置し exon 10のスプライスパターンを変化させるものが知られている。即ち、exon 10 のスプラ
イシング異常はそれ自体で神経変性疾患を引き起こし得る。

40

AD において認められる各種の TREM2 の発現量の変化に CELF2 がどの程度影響しているか、また AD 患者で CELF2 の機能に変化が生じているかについては不明であるが、CELF2 が TREM2 exon 3 と MAPT exon 10 のスプライシングに作用し、その結果、Aやタウタンパク質の凝集に影響を与える可能性が考えられることから、CELF2 が AD の病態修飾因子として機能するか否かは今後の興味深い検討
課題である。

5-2

TREM2 exon 3 のスプライシング制御に対する CELF1 と CELF2 の機能の違い

CELF1 と CELF2 はウラシル（U）とグアニン（G）が豊富に存在する配列を認識する 63) 65) 66)。従って、両者は RNA プロセシングにおいて同様の効果を発揮することが考えられる。しかし、TREM2 exon 3 のスキップに対する効果は CELF1 より CELF2 の方が強く、TREM2 タンパク質の発現量の減少は CELF2 によって生じた。さらに、キメラ minigene 1 を用いた実験では、exon 3 のスキップに対して
CELF1 と CELF2 は異なる結果を示した。またキメラ minigene 3 や 4 を用いた実験では、exon 3 のスキップは CELF1 より CELF2 の方が僅かではあるが促進された。これらの結果から、CELF1 と CELF2 の機能に違いがあることが示唆される。
CELF1 と CELF2 は GU が豊富に存在する配列に結合するが、そのような配列は
pre-mRNA 上に頻繁に出現すると考えられる。従って、CELF による GU-rich な標的配列への結合は、CELF 単独よりも CELF とそれ以外の複数の RBP の相互作用
41によって特定されていると考えられる。つまり、TREM2 exon 3 の選択的スプライ
シングに対して CELF1 と CELF2 が異なる効果を示したのは、協働する RBP の違いに起因する可能性がある。あるいは、CELF1 と CELF2 のいずれかが GU-rich 以
外の配列に結合している可能性も否定できない。そこで、PAR-CLIP 法などを用いて核酸とタンパク質の相互作用をより詳細に検討することが今後の検討課題の一
つである。

5-3

TREM2 の RNA プロセシング制御における種差の違いがもたらすミクログ
リアの機能への影響

本研究では TREM2 exon 3 の選択的スプライシング制御が種特異的であることを明らかにした。AD 脳のミクログリアにおける TREM2 の関与には種差があることが示唆されている。例えば、DAM は当初 AD 患者と AD モデルマウスの両者でその存在が示唆された。その後、AD モデルマウスにおける DAM ではミクログリ
ア恒常的遺伝子の発現が低下しているが、AD 患者では上昇していることが示されている 84)。つまり、ミクログリアの機能に対して TREM2 が深く関与することが各動物種で共通する一方で、その機能制御機構は動物種間で異なることが考えられる。
また、ミクログリアは Aの貪食を行う一方で、その機能亢進は組織の慢性的な炎症を惹き起すことから、AD の病態生理に対して二面性を示すことが示唆されている。TREM2 がミクログリアの機能調節因子であることを鑑みると、TREM2 の発

42

現制御因子がミクログリアの機能に影響を与える可能性がある。本研究では CELF2による TREM2 exon 3 のスプライシング制御を介したミクログリアの機能への影響を検討していない。TREM2 exon 3 の選択的スプライシングはマウスで保存されていないので、マウスを用いた検討はできないことになる。ヒト由来のミクログリ
アを用いることが望ましい反面、ミクログリアが脳内に存在する以上、侵襲性の観点からヒトミクログリアの入手には制約がある。そこで、ヒト iPS 細胞から誘導したミクログリアや 85)、末梢血単球から GM-CSF と IL-34 の 2 種類のサイトカイン
によって初期化を経ずに作製したミクログリア様細胞 86)を研究材料とすることが代替手段として考えられる。

5-4

ミクログリアに発現する AD 感受性遺伝子の RNA プロセシングの意義

AD 感受性遺伝子の RNA プロセシング制御の意義は、CD33 を例に説明できる。

CD33 は脳内ではミクログリアに高く発現し、AD 感受性多型と連鎖不平衡にある多型が CD33 exon 2 のスキップを促進させることが明らかになっている 87)。Exon
2 のスキッピングはミクログリアの貪食能を促進し、その結果 Aの量が減少する。CD33 exon 2 の選択的スプライシングは RBP である SRSF1 と PTBP1 が制御88)している 89)。これらの知見から、RNA 結合タンパク質による AD 感受性遺伝子のRNA プロセシングの変化がミクログリアの機能を変化させ、その結果 AD の病態
生理に何らかの影響を及ぼすことがあり得る。一般的に、RNA 結合タンパク質は43

多数の遺伝子の RNA プロセシングの制御を担う。また、CD33 や TREM2、APOEなどの AD 感受性遺伝子の多くはミクログリアに発現し 70)、免疫機能に関与することが考えられる。そのため、CELF2 は TREM2 以外にも AD 感受性遺伝子の RNA
プロセシングを制御している可能性がある。従って、CELF2 による AD 感受性遺伝子の RNA プロセシング制御の有無を検討することは今後の検討課題である。

5-5

Exon 3 欠損型 TREM2 mRNA は分泌型タンパク質として発現する

TREM2 は 5 つの exon を有しており、すべて使用されると細胞膜貫通型の全長
TREM2 タンパク質が産生される。一方、脳脊髄液中に可溶型 TREM2（soluble
TREM2: sTREM2）が発現することが報告されている 90)。sTREM2 は、mRNA の翻訳後、メタロプロテアーゼ ADAM によって切断されて産生される 91) 92) 93) 94)。興味深いことに、sTREM2 は AD 患者の脳脊髄液中で検出され、脳脊髄液中のsTREM2 の量が認知機能の低下及び軽度認知障害や AD の進行と相関することから 95)、AD のバイオマーカーとなる可能性が示唆されている。Exon 3 が欠損した
TREM2 タンパク質の発現はこれまでに検討されていなかったが、本研究ではTREM2 exon 3 が欠損した場合、新規の分泌型タンパク質として発現する可能性を提示した。新規分泌型タンパク質は、従来の sTREM2 と IgV ドメインを共通に持
つが、C 末端の配列が異なる。このタンパク質が実際に生体で発現するかは不明である。Exon 3 がスキップした mRNA は NMD によって分解されるが、NMD の活

44

性は細胞の種類や細胞周辺の環境によって異なることが示唆されている 96)。従って、一部の mRNA は分解されず、分泌型タンパク質として発現する可能性がある。実際に AD 患者で NMD の活性が低下しているか否かは不明であるが、AD 患者のミクログリアや死後脳などを材料として、exon 3 を欠いた TREM2 タンパク質発現の有無を検討すること、さらにその機能を検討することは今後の課題である。また、TREM2 exon 4 は膜貫通領域をコードしているため 67)、sTREM2 は exon 4 の選択的スプライシングによっても産生される 97)。ヒトの全 sTREM2 のうち、約 25%がexon 4 の選択的スプライシングによって産生されると見積もられている 98)。従って、exon 4 のスプライシング因子は、sTREM2 の産生を調節する因子であり、ADの発症や進行に関与する。TREM2 exon 4 のスプライシング制御因子を同定することも今後の課題の一つとして挙げられる。

5-6

総括

本研究では、TREM2 の種特異的な選択的スプライシング制御因子として CELF2を同定した。TREM2 が関与する疾患において、TREM2 が各種疾患の病態生理に与える影響は疾患によって異なる。従って、TREM2 の発現を促進あるいは抑制させる制御因子はどちらも各種疾患の文脈で意義がある。本研究では TREM2 の発現制御に関わる因子として CELF2 を同定したが、CELF2 を阻害することで TREM2の機能向上が期待できる。また、近年、AD の病理学的特徴に付随した RNA プロ

45

セシング制御の変化が示唆されている。本研究で明らかになった知見は TREM2 の発現制御やミクログリア・マクロファージの機能制御の観点から AD における RNA
プロセシング制御の意義を解明する端緒となる可能性がある。さらに、exon 3 の動物種特異的な選択的スプライシングが TREM2 の新規分泌型タンパク質の発現に繋がることが示唆された。今後、TREM2 の RNA プロセシングが AD の病態とどのように関連するのかを、ヒト由来の実験材料を用いることで明らかになることが期
待される。

46

6.

謝辞

本研究に際し、終始ご懇篤なご指導を賜りました紀嘉浩准教授（本学バイオイン
フォマティクス研究室）に心より感謝致します。また、本論文の作成にあたり、貴重なご助言を賜りました紺谷圏二教授（本学生化学研究室）、長浜正巳教授（本学生
体分子研究室）、ならびに佐藤準一教授（本学バイオインフォマティクス研究室）に深く感謝致します。
本研究に関する実験において様々な面でご支援くださいました元売睦美さん、佐藤美奈子さん、織田由香さん、五嶋葉月さんに感謝申し上げます。また、バイオイ
ンフォマティクス研究室の諸先輩・諸後輩方にも支えていただき、充実した研究生
活を過ごさせていただきました。この場を借りて感謝申し上げます。
上記に挙げた方々の他にも、共同研究者や本学の教職員の皆様など多方面の方のご支援・ご協力によって研究を遂行する事ができました。また、博士課程 1 年時に日本薬学会長井記念薬学研究奨励金にご支援いただきましたことで研究に集中することができました。この場を借りて御礼申し上げます。
最後に、私の意志を常に尊重し、いつもそばにいて背中を押し続け、最後まで支えてくれた家族に最大限の謝意を示します。

47

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C., Liu Z., Deczkowska A., Keren-Shaul H., David E., Zmora N., Eldar S. M., Lubezky N.,
Shibolet O., Hill D. A., Lazar M. A., Colonna M., Ginhoux F., Shapiro H., Elinav E., Amit I.,

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W., Bersano T., Bono H., Chalk A. M., Chiu K. P., Choudhary V., Christoffels A.,
Clutterbuck D. R., Crowe M. L., Dalla E., Dalrymple B. P., de Bono B., Della Gatta G., di
Bernardo D., Down T., Engstrom P., Fagiolini M., Faulkner G., Fletcher C. F., FukushimaT., Furuno M., Futaki S., Gariboldi M., Georgii-Hemming P., Gingeras T. R., Gojobori T.,
Green R. E., Gustincich S., Harbers M., Hayashi Y., Hensch T. K., Hirokawa N., Hill D.,

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Kawasawa Y., Kelso J., Kitamura H., Kitano H., Kollias G., Krishnan S. P., Kruger A.,
Kummerfeld S. K., Kurochkin I. V., Lareau L. F., Lazarevic D., Lipovich L., Liu J., Liuni S.,
McWilliam S., Madan Babu M., Madera M., Marchionni L., Matsuda H., Matsuzawa S., Miki
H., Mignone F., Miyake S., Morris K., Mottagui-Tabar S., Mulder N., Nakano N., Nakauchi
H., Ng P., Nilsson R., Nishiguchi S., Nishikawa S., Nori F., Ohara O., Okazaki Y., Orlando
V., Pang K. C., Pavan W. J., Pavesi G., Pesole G., Petrovsky N., Piazza S., Reed J., Reid J. F.,
Ring B. Z., Ringwald M., Rost B., Ruan Y., Salzberg S. L., Sandelin A., Schneider C.,
Schönbach C., Sekiguchi K., Semple C. A., Seno S., Sessa L., Sheng Y., Shibata Y., Shimada
H., Shimada K., Silva D., Sinclair B., Sperling S., Stupka E., Sugiura K., Sultana R.,
Takenaka Y., Taki K., Tammoja K., Tan S. L., Tang S., Taylor M. S., Tegner J., Teichmann
S. A., Ueda H. R., van Nimwegen E., Verardo R., Wei C. L., Yagi K., Yamanishi H.,
Zabarovsky E., Zhu S., Zimmer A., Hide W., Bult C., Grimmond S. M., Teasdale R. D., Liu
E. T., Brusic V., Quackenbush J., Wahlestedt C., Mattick J. S., Hume D. A., Kai C., SasakiD., Tomaru Y., Fukuda S., Kanamori-Katayama M., Suzuki M., Aoki J., Arakawa T., Iida J.,
Imamura K., Itoh M., Kato T., Kawaji H., Kawagashira N., Kawashima T., Kojima M., Kondo
S., Konno H., Nakano K., Ninomiya N., Nishio T., Okada M., Plessy C., Shibata K., Shiraki
T., Suzuki S., Tagami M., Waki K., Watahiki A., Okamura-Oho Y., Suzuki H., Kawai J.,
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Letenneur L., Moron F. J., Rubinsztein D. C., Eiriksdottir G., Sleegers K., Goate A. M.,
Fievet N., Huentelman M. W., Gill M., Brown K., Kamboh M. I., Keller L., BarbergerGateau P., McGuiness B., Larson E. B., Green R., Myers A. J., Dufouil C., Todd S., Wallon
D., Love S., Rogaeva E., Gallacher J., St George-Hyslop P., Clarimon J., Lleo A., Bayer A.,
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Razquin C., Pastor P., Mateo I., Owen M. J., Faber K. M., Jonsson P. V., Combarros O.,
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Bennett D. A., Harris T. B., Fratiglioni L., Holmes C., de Bruijn R. F., Passmore P.,
Montine T. J., Bettens K., Rotter J. I., Brice A., Morgan K., Foroud T. M., Kukull W. A.,
Hannequin D., Powell J. F., Nalls M. A., Ritchie K., Lunetta K. L., Kauwe J. S., Boerwinkle
E., Riemenschneider M., Boada M., Hiltuenen M., Martin E. R., Schmidt R., Rujescu D.,
Wang L. S., Dartigues J. F., Mayeux R., Tzourio C., Hofman A., Nothen M. M., Graff C.,
Psaty B. M., Jones L., Haines J. L., Holmans P. A., Lathrop M., Pericak-Vance M. A.,
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Deming Y., McKenzie A., Raj T., Renton A. E., Budde J., Smith A., Fitzpatrick A., Bis J. C.,
DeStefano A., Adams H. H. H., Ikram M. A., van der Lee S., Del-Aguila J. L., Fernandez M.
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57

8. 図表Constructs
TREM2-ex3-sp minigene

CDS TREM2

マウスTrem2 ex2-4 minigene

アフリカミドリザルTrem2 ex2-4 minigene

チンパンジー Trem2 ex2-4 minigene

マーモセット Trem2 ex2-4 minigene

ウシ Trem2 ex2-4 minigene

ブタ Trem2 ex2-4 minigene

キメラ minigene 1

キメラ minigene 2

キメラ minigene 3

キメラ minigene 4

キメラ minigene 5

キメラ minigene 6

EGFP-fused human CELF1
EGFP-fused human CELF2,
mCherry-fused human CELF2
EGFP-fused human CELF3
EGFP-fused human CELF4
EGFP-fused human TDP-43
FLAG-tagged TREM2
FLAG-tagged TREM2 dE3

FLAG-tagged TREM2 dE4

表 1

primerfgTREM2-Fw
fgTREM2-Rv
fgTREM2-Fw2
fgTREM2-Rv2
TREM2-ex1-5'UTR-Fw
nest-TREM2-ex5-Rv
NheI-TREM2-ex1-Fw
NotI-TREM2-ex5-Rv2
nest-moTrem2-int1-Fw
nest-moTrem2-int4-Rv
BclI-moTrem2-ex2-Fw
SalI-moTrem2-ex4-Rv
nest-csTrem2-int1-Fw
nest-csTrem2-int4-Rv
BamHI-csTrem2-ex2-Fw
SalI-csTrem2-ex4-Rv
nest-Chimp-Trem2-Fw
nest-Chimp-Trem2-Rv
BclI-Chimp-Trem2-ex2-Fw
SalI-Chimp-Trem2-ex4-Rv
nest-Marmoset-Trem2-Fw
nest-Marmoset-Trem2-Rv
BclI-Marmoset-Trem2-ex2-Fw
SalI-Marmoset-Trem2-ex4-Rv
nest-Cow-Trem2-Fw
nest-Cow-Trem2-Rv
BclI-Cow-Trem2-ex2-Fw
SalI-Cow-Trem2-ex4-Rv
nest-Pig-Trem2-Fw
nest-Pig-Trem2-Rv
BspEI-Pig-Trem2-ex2-Fw
SalI-Pig-Trem2-ex4-Rv
hmTREM2-ex2-int2-Fw
hmTREM2-ex2-int2-Rv
hmTREM2-int2-ex3-Fw
hmTREM2-int2-ex3-Rv
hmTREM2-hex2-mint3-Fw
hmTREM2-hex2-mint3-Rv
hmTREM2-mint3-hex4-Fw
hmTREM2-mint3-hex4-Rv
hmTREM2-ex3-Fw
hmTREM2-ex3-Rv
hmTREM2-ex4-Fw
hmTREM2-ex4-Rv
hmTREM2-hex2-mint2-Fw
hmTREM2-hex2-mint2-Rv
hmTREM2-mint2-hex3-Fw
hmTREM2-mint2-hex3-Rv
EGFP-C1-Fw
hmTREM2-phint3-Rv3
hmTREM2-phint3-Fw3
SV40pA-seq-Rv
EGFP-C1-Fw
hmTREM2-phint3-Rv4-new
hmTREM2-phint3-Fw4-new
SV40pA-seq-Rv
BamHI-CELF1-Fw
XhoI-CELF1-st-Rv
BclI-CELF2-Fw2
SalI-CELF2-st-Rv
BamHI-CELF3-Fw
XhoI-CELF3-st-Rv
BamHI-CELF4-Fw
XhoI-CELF4-st-Rv
BamHI-hTDP43-Fw
XhoI-st-hTDP43-Rv
TREM2-SP-Flag-Fw
TREM2-SP-Flag-Rv
TREM2-dE3-Fw
TREM2-dE3-Rv
NheI-TREM2-ex1-Fw
NotI-TREM2-ex5-Rv
TREM2-dE4-Fw
TREM2-dE4-Rv

sequence (5' to 3')
GTGGAGGTGCTGGCAGGTGAGTGGGCAGTGGCTGC
CTGCCAGCACCTCCACCAGGACCTTCCTGAGGGTG
CTCCAAGGAGCCTCTTGGAAGGAGAAATCCCCTTCTTCCAAGAGGCTCCTTGGAGAGACAAGAAGGCAGAGACGAGATCTTGCACAAGGCACTCTGCTTCTGCCCTGTCCAATATTCAGAAGTTGTCAGGTGTTCTTACC
AAAAGCTAGCATGGAGCCTCTCCGGCTGCTCATCTAAAAGCGGCCGCTCACGTGTCTCTCAGCCCTGGCACTATGCTCCCTGCACTCCTGGAACTGCTT
ATCGCTCCCCCCATCCATGCCCAATGTCCCAAAAAATGATCACTGTCCCAAGCCCTCAACACCACG
AAAAAAGTCGACCAGTGAGGATCTGAAGTTGGTGCCC
AGAGCAAGTGTTCAATGCGTATTTGGTAAATGAA
CCTGCCAAGTCCACCTTCGATTGGCTGTGCTCTCC
AAAAGGATCCCTGTCTGGAGCCCACAACACCACAG
AAAAAAGTCGACCTGGCAGAGTTTGGAGCTGGTGC
AGGTCACTGCACAGAGCAAGTGTTCAATGCGTATTTGCCCAGTCCACCCTTGATGGCTGTGCTCTCCAAGAAAAATGATCACTGTCCGGAGCCCACAACACCACA
AAAAAAGTCGACCTGGCAGAGTTTGGAGCTGATACTGGTAAATGAAGAAGTGAATGAATGTCTCCTCC
CTCATTGCCACCTCCCATTTCTGCCCAGTCCACCCAAAAATGATCACTGTCCGGAGCCCACAACACCACA
AAAAAAGTCGACCTGGCAGAGTTTGGAGCTGGTGCTAGTAGGCGTTCAATAAACACGTGGTGCAGTGAA
TCACTCAGCGCCTCTCTGCCCCACCTCTCCGCCCCAAAAATGATCACTGTCCCGGGCGCACAACACCACA
AAAAAAGTCGACCTGTCAGAGTTTGGAGCTGGTAA
TCTGTCTCTTTTGTTCAGTGACCACTTGGTAAGTG
AAGTCCTCACTCAGGCCCTCTCGCCCCACCTCGCTAAAAATCCGGACTGTCCCGGGCACACAACACCTCG
AAAAAAGTCGACCTGTCAAGGTTTGGTCCTGGTCATGCTGGAGGGTGAGTGGGCAGTGGCTGCCTCTCTG
TGCCCACTCACCCTCCAGCACCTCCACCAGTACTT
CTCCCATAGACCCTCTAGATGACCAAGATGCTGGAATCTAGAGGGTCTATGGGAGGCAGAGCCATGAGCCTCCAGGTACAGTAGTGGTCCCTTCTTAGACCCCCTACCACTACTGTACCTGGAGATGCTGTGCTCCACATCTTTCCAAGGAGCCTCTTGGAAGGAGAAATCCCCT
AGGCTCCTTGGAAAGAGGAGGAAGGTGGTAGGCTATCCAGGTACAGCGATGGGTCTTTCCTAAAACCCGTGACCCATCGCTGTACCTGGAGGTGCTGTGTTCCAC
TCTCTCCAAGGAATCAAGAGACCTCCTTCCCACCC
CTCTTGATTCCTTGGAGAGACAAGAAGGCAGATGG
TGCTGGCAGGTGAGTACACAGTAGCTGGGTGCACCTGTACTCACCTGCCAGCACCTCCACCAGGACCTTC
CTATTACAGACCCCCTGGATCACCGGGATGCTGGACCAGGGGGTCTGTAATAGACAAACCATGAGGTCACCATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
GAGCTCTTCCAAGCAGAGATCTGGGGGTCTTAGCTATCTCTGCTTGGAAGAGCTCATCGGGGAAATGGAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGC
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
CTGGTCCTACCAATGACATAAGATGCTGTGGTGATTATGTCATTGGTAGGACCAGAATCAGTTCTGACTG
AATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGC
AAAAGGATCCATGAACGGCACCCTGGACCACCCAG
AAAACTCGAGTCAGTAGGGCTTGCTGTCATTCTTCAAAAATGATCAATGAACGGAGCTTTGGATCACTCAAAAAAAGTCGACTCAGTAAGGTTTGCTGTCGTTTT
AAAAGGATCCATGAAGGAGCCGGATGCCATCAAGC
AAAACTCGAGTCAGTAGGGCCGGTTGGCATCCTTA
AAAAGGATCCATGTATATAAAGATGGCCACGTTAG
AAAACTCGAGTCAGTACGGGCGATTGGCGTCTTTG
AAAAAGGATCCATGTCTGAATATATTCGGGTAACCAAAAACTCGAGCTACATTCCCCAGCCAGAAGACTTCCGGAGCCCACATGGACTACAAAGACCATGACGGT
GTCTTTGTAGTCCATGTGGGCTCCGGACAGCTCTG
GGAGGTGCTGGCAGGAGCCTCTTGGAAGGAGAAATCTTCCAAGAGGCTCCTGCCAGCACCTCCACCAGGAAAAAGCTAGCATGGAGCCTCTCCGGCTGCTCATCTAAAAGCGGCCGCTCAACCAGTCCCTGCTTCCAGGGGCACAGCATCTCCAGGGCTGAGAGACACGTGAAGG
ACGTGTCTCTCAGCCCTGGAGATGCTGTGCTCCAC

本研究で使用したクローニング用 PCR プライマーの一覧
58

targetfl-TREM2 minigene
TREM2 ex3-sp minigene
endogenous human TREM2
endogenous moTrem2
TREM2 ex2-4 minigene
マウスTrem2 ex2-4 minigene
アフリカミドリザルTrem2 ex2-4 minigene
チンパンジー Trem2 ex2-4 minigene
マーモセット Trem2 ex2-4 minigene
ウシ Trem2 ex2-4 minigene
ブタ Trem2 ex2-4 minigene
キメラ minigenes

endogenouse Srsf6

表 2

primerhTREM2-ex2-sp-Fw
hTREM2-ex4-sp-Rv

sequence (5' to 3')
CTTGTGGCTGCTGTCCTT
GATGTGTCCCTGGCTTCTG

moTrem2-ex2-Fw2
moTrem2-ex4-Rv2
EGFP-C1-Fw
TREM2-ex4-Rv
EGFP-C1-Fw
SalI-moTrem2-ex4-Rv
EGFP-C1-Fw
SalI-csTrem2-ex4-Rv
EGFP-C1-Fw
SalI-Chimp-Trem2-ex4-Rv
EGFP-C1-Fw
SalI-Marmoset-Trem2-ex4-Rv
EGFP-C1-Fw
SalI-Cow-Trem2-ex4-Rv
EGFP-C1-Fw
SalI-Pig-Trem2-ex4-Rv
EGFP-C1-Fw
TREM2-ex4-Rv
SalI-moTrem2-ex4-Rv
Srsf6-ex2-Fw
Srsf6-ex4-Rv

GGGTGTCATGTACTTATGACGCCTTGAAGCACTGGCTGCAAGAAACTTGCTCAG
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
CTGGCAGAGTTTGGAGCTGATACCCTGGGTCATGG
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
AAAAAAGTCGACCAGTGAGGATCTGAAGTTGGTGCCC
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
AAAAAAGTCGACCTGGCAGAGTTTGGAGCTGGTGC
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
AAAAAAGTCGACCTGGCAGAGTTTGGAGCTGATACCATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
AAAAAAGTCGACCTGGCAGAGTTTGGAGCTGGTGC
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
AAAAAAGTCGACCTGTCAGAGTTTGGAGCTGGTAACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
AAAAAAGTCGACCTGTCAAGGTTTGGTCCTGGTCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
CTGGCAGAGTTTGGAGCTGATACCCTGGGTCATGGAAAAAAGTCGACCAGTGAGGATCTGAAGTTGGTGCCCGTACGGTTTCGTGGAGTTCGAGGACTCCCGGGATG
CGCCTATGGCTTGTTCTTGGCTTATCTTCAATAAG

本研究におけるスプライシングアッセイに使用したプライマーの一覧

59

primary antibodies
goat polyclonal anti-TREM2
goat polyclonal anti-Lamin B
goat polyclonal anti-HSP60
mouse monoclonal anti-GFP
mouse monoclonal anti-Mac-2BP
mouse monoclonal anti-CUGBP1mouse monoclonal anti-GAPDH
mouse monoclonal anti-DDDDK tag
rabbit monoclonal anti-APP
rabbit monoclonal anti-CELF2

SourceR&D
santa cruz
santa cruz
santa cruz
santa cruz
santa cruz
MBL
MBL
abcam
abcam

Identifier
AF1828
sc-6217, M-20
sc-1052, N-20
sc-9996, B-2
sc-374541, E-8
sc-20003, 3B1
M171-3, 3H12
M185-3L, FLA-1
ab32136ab186430

secondary antibodies
Donkey Anti-Goat IgG H&L preadsorbed (HRP)
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP)
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed (HRP)
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor® 488) preadsorbed

Source
abcam
abcam
abcam
abcam
abcam
abcam

Identifierab97110ab97120ab6789ab97040ab6721
ab150133

表 3

本研究で使用した抗体の一覧

60

Gene
CELF1
CELF2
CELF4
DDX5
DDX17
EWSR1
HNRNPA1HNRNPABHNRNPCHNRNPFHNRNPH1HNRNPLHNRNPU
MATR3
MBNL1
PCBP1
PCBP2
PTBP1
QKI
RBM14
RBM38
SAM68
SRSF2
SRSF3
SRSF5
SRSF6
SRSF7
SRSF9
SS18
STAU1
TIAL1
TARDBP
FUS
YBX1

表 4

human microglia ex vivo human monocyte ex vivo
61.75
35.31
101.23
62.23
0.54
0.03
486.81
189.34307.47
166.73
79.25
66.28
39.57
34.74
45.46
43.89
36.30
33.92
66.72
76.92
312.00127.94
78.98
87.91
60.08
44.17
43.12
24.41
71.08
61.98
163.23346.52
94.14
186.38
77.28
81.67
56.22
18.17
28.30
12.22
28.67
42.23
31.70
55.03
179.05
95.73
66.04
36.90
234.11138.49
87.36
41.89
75.39
36.98
44.82
86.17
28.98
15.77
24.91
21.99
44.67
23.03
34.35
20.71
55.70
37.43
24.13
41.75

本研究で使用した RBP のヒトミクログリアとヒト単球における発現量

RNA シークエンスによる TPM の値 Gosselin et al., Science., 2017 のデータセットから抜粋

61

図 1

アミロイド産生経路と非アミロイド産生経路

AD 患者の脳内では、セクレターゼとセクレターゼと呼ばれる２つの酵素によって APP が切断されて生じる Aが過剰に産生されている。単量体のは自己凝集を繰り返し、老人斑が形成される。一方、非アミロイド産生経路では、セクレターゼとセクレターゼによって切断され、P3 と呼ばれるペプチドが産生される。

62

図 2

正常型 TREM2 と AD 感受性多型を有する TREM2 の主な違い

TREM2 は TYROBP と会合して細胞膜に発現する。細胞外における IgV ドメインに
APOE や LDL、Aオリゴマーなどが結合する。がリガンドと結合すると
TYROBP を介して下流へシグナルが伝達される。一方、AD 感受性多型は IgV ドメイ
ンをコードする領域に存在する。この多型によって生じるアミノ酸置換（R47H）は、リガンドとの結合が低下する。その結果、下流へのシグナル伝達が減弱する。R47H はTREM2 タンパク質の発現量に影響しない。

63

図 3

TREM2 の機能と病理学的意義

TREM2 の機能と病理学的意義は近年 AD の文脈で盛んに研究されている。特に、ADの進行、または加齢に伴って発現する disease-associated microglia (DAM)は、TREM2の発現量の上昇によって特徴づけられる。また、肥満やがんといった中枢神経系以外の組織でも TREM2 の機能と病理学的意義が検討されており、TREM2 が単球・マクロファージ・ミクログリアの機能制御における中心的な遺伝子であることが示唆されてい
る。

64

図 4

スプライシングと選択的スプライシング

DNA は遺伝情報がコードされている exon と遺伝情報がコードされていない intron に分断されている。DNA から転写された pre-mRNA は、intron が切り出され、exon 同士が繋がる。この過程をスプライシングという（上段）。また、ある特定の exon が選択的に使用されると、一つの遺伝子から複数の mRNA が産生されることとなり、その結
果、タンパク質に多様性が生まれる。選択的スプライシングは 5 種類の様式が知られている。このうち、カセット型が最も多いと考えられている（下段）
。

65

図 5

TREM2 exon 3 の選択的スプライシングによって引き起こされる Nonsensemediated mRNA decay (NMD)

TREM2 は 5 つの exon を有しており、すべての exon が使用されると exon 5 に終止コ
ドンが生じ、その結果、全長 TREM2 タンパク質が発現する。一般に、スプライシングの過程では、exon と exon のつなぎ目に exon junction complex (EJC)が形成される。その後、細胞質での翻訳時に EJC が取り除かれる。正常な mRNA では、EJC が除去された後に翻訳が終結する。一方、exon 3 の選択的スプライシングによって exon 4 の途中に premature termination codon (PTC)が生じた mRNA は、PTC で翻訳が終結するた
め、EJC が残存する。これが NMD の標的として認識される合図となり、mRNA が分解される。その結果、全長 TREM2 タンパク質の発現が低下する。Cycloheximide (CHX)
は、翻訳阻害剤であるが、NMD 阻害剤としても用いられている。

66

図 6

TREM2 exon 3 の選択的スプライシング制御因子の探索方法

全長ヒト TREM2 minigene と候補 RBP を HEK293 に共発現させた。細胞内で全長ヒト TREM2 minigene における exon 3 の挿入の程度は、候補 RBP によって変動する可能性がある。全長ヒト TREM2 minigene 中の矢印は、exon 3 のスプライスパターンを検出するために用いたプライマーセットを表す。

67

図 7

スプライシングアッセイの手順① 任意の処理をした細胞を回収し、RNA を抽出する。この RNA には、rRNA、tRNA、
mRNA などが含まれている（Total RNA）。Total RNA 中に含まれる mRNA を鋳型に逆転写酵素を用いて逆転写を行うと、mRNA に相補的な DNA（cDNA）を得ることができる。
② cDNA には選択的スプライシングが生じた mRNA が含まれている。つまり、cDNA
を鋳型に標的領域を増幅するプライマーを用いて PCR を行い、電気泳動で PCR 産物を分離することでスプライスパターンを検出することができる。今回は、図中の式によって、exon 3 のスキップの割合を算出した。

68

図 8

候補 RBP による TREM2 exon 3 のスプライスパターンの変化

PCR 産物をアガロースゲルで電気泳動した。泳動図の下に記載された数字は、TREM2 exon 3 がスキップした PCR 産物の割合の定量値である。EV は空ベクターを表している。今回は EV と pcDNA3.1 をコントロールとした。

69

図 9

CELF1 と CELF2 は TREM2 exon 3 のスキップを促進させる

A) PCR 産物をアガロースゲルで電気泳動した。左の泳動結果における exon 3 がスキップした PCR 産物を定量し、グラフにした。エラーバーは標準偏差を表している。グラフの黒点は各データの値を表している（n=3、テューキー検定で解析した）。
B) 左の図の矢印はスプライシングアッセイに用いたプライマーセットを示している。PCR 産物はアガロースゲルで分離した。

70

図 10 TREM2 タンパク質の発現量は CELF によって減少するA) 全長ヒト TREM2 minigene と EGFP 融合タンパク質を HEK293 に共発現させた時の TREM2 タンパク質の発現量をウエスタンブロットで検出した。EGFPLacZ はコントロールとして、Lamin B はローディングコントロールとしてそれぞれ使用した。エラーバーは標準偏差、グラフの黒点は各データの値を表している（n=7、テューキー検定で解析した）。
B) EV は空ベクターである。グラフのエラーバーは標準偏差、黒点は各データの値を示している（n=4、Welch の t 検定で解析した）。
71

図 11

CELF2 が導入された細胞では TREM2 が減少する

A) 全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞に EGFP 融合 CELF2 を導入した後、TREM2 を Alexa 568 で染色した。核は DAPI で染色した。矢印は EGFP 融合
CELF2 が導入された細胞を指している。スケールバーは 10 m である。
B) mCherry 融合 CELF2 を THP-1 に導入後、TREM2 を Alexa 488 で染色した。
矢印は mCherry 融合 CELF2 が導入された THP-1 を指している。スケールバ
ーは 10 m である。

72

図 12 CELF2 が導入された細胞では TREM2 タンパク質の発現量が減少する
蛍光活性化セルソーティングで EGFP-CELF2 が導入された細胞と導入されていな
い細胞を分取した。右の箱ひげ図のうち、データの対応関係を線で結んだ。同一の細胞から GFP 陽性または陰性の細胞を分取したので、対応のある t 検定で解析した。n=6。

73

図 13 CELF2 は細胞膜結合型 TREM2 タンパク質の発現量を減少させる
A) 左から、全細胞破砕液、細胞質画分、膜画分、培養上清、の順番で泳動した。
APP は膜画分のマーカー、Mac-2BP は培養上清のマーカーとしてそれぞれ使用した。培養上清で検出された TREM2 のシグナルはアスタリスク（＊）で示している。50 kDa 付近及びそれ以上のバンドは非特異的なバンドであると考えられる。
B) 左から、細胞質画分、膜画分、の順番で泳動した。GAPDH は細胞質画分のマーカーとして使用した。

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図 14 CELF の発現抑制は TREM2 exon 3 のスキッピングを部分的に回復させる
A) THP-1 に siRNA を導入後、CHX で処理した。RT-PCR 産物をポリアクリルア
ミドゲルで検出した。
B) 全長ヒト TREM2 minigene 安定発現細胞に siRNA を導入後、CHX で処理した。RT-PCR 産物をポリアクリルアミドゲルで検出した。エラーバーは標準偏差、グラフ中の黒点は各データの値を示している（n=3、テューキー検定で解析
した）。

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図 15 intron を含まない TREM2 コンストラクトは CELF1、CELF2 によって制御されない上の図は Intron を含まない、TREM2 タンパク質発現ベクター（CSD TREM2）の模式図である。下の図は、CDS TREM2 と CELF を HEK293 に同時に導入し、TREM2 タンパク質の発現量をウエスタンブロットで検出した。グラフ中のエラー
バーは標準偏差、黒点は各データの値を示している（n=6、テューキー検定で解析
した）。

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図 16

CELF による exon 3 のスキッピングが TREM2 タンパク質の発現量の減少を惹き起こすA) TREM2 intron 2 と intron 3 を含み、exon 3 のみがスプライシングを受ける
minigene を作製した（TREM2 ex3-sp minigene, fg: FLAG）。この minigene と CELF
を HEK293 に同時に導入し、exon 3 のスプライスパターンを検出した。PCR 産物
をポリアクリルアミドゲルで分離した。矢印はスプライシングアッセイに使用したプライマーセットの位置を表している。グラフ中のエラーバーは標準偏差、各デー
タの値は黒い点で表されている（n=4、テューキー検定で解析した）。
B) A と同様に HEK293 に遺伝子を導入し、TREM2 タンパク質の発現量の変化を検出した。グラフ中のエラーバーは標準偏差、各データの値は黒い点で表されている（n=5、テューキー検定で解析した）。

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図 17

TREM2 exon 3 の選択的スプライシングはマウスで保存されていないA) ヒト TREM2 (Hs TREM2)、アフリカミドリザル Trem2 (Cs Trem2)、マウス Trem2 (Mm

Trem2)のそれぞれの exon 2 から exon 4 のゲノム断片をクローニングし、exon 3 のスプラ
イスパターンを比較した。矢印はスプライシングアッセイに使用したプライマーセットを示している。PCR 産物をポリアクリルアミドゲルで分離した。
B) 内在性マウス Trem2 を発現する RAW264.7 に DMSO (D)、CHX (C)を処理し、exon 3 のスプライスパターンを検出した。Trem2 が増幅された PCR 産物をポリアクリルアミドゲ
ルで、Srsf6 が増幅された PCR 産物はアガロースゲルでそれぞれ分離した。

C) マウス Trem2 exon 2 から exon 4 の領域の PCR 産物には、intron 4 の一部が含まれていた。これは、exon 4 の選択的 3’スプライス部位（赤字）によってスプライシングされたことで産生されたものである。これまでのところ、ヒト TREM2 ではそのようなスプライス部位が使用された PCR 産物は検出されていない。

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図 18 ヒト TREM2 とアフリカミドリザル Trem2 の exon 3 は CELF による制御を受けるA) ヒト、アフリカミドリザル、マウスのそれぞれの exon 2 から exon 4 の minigeneと CELF を HEK293 に同時に導入し、exon 3 のスプライスパターンを検出した。PCR 産物はアガロースゲルで分離した。
B) マウス Trem2 ex2-4 minigene とマウス Celf をマウス神経芽細胞腫 Neuro2a に同時に導入し、生物種のバックグラウンドを揃えたが、exon 3 のスキップは見られなかった。

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図 19

TREM2 exon 3 の選択的スプライシングには種特異性がある

A) HEK293 にチンパンジーTrem2 (Chimp Trem2)、マーモセット Trem2 (Marm Trem2)
それぞれの exon 2 から exon 4 までの minigene と空ベクターまたは CELF2 を同時に導入し、exon 3 のスプライスパターンを検出した。PCR 産物はアガロースゲルで分離した。グラフ中のエラーバーは標準偏差、各データの値は黒い点で表されている（n=3、Welch の t 検定で解析した）。
B) ウシ Trem2 (Cow Trem2)、ブタ Trem2 (Pig Trem2)それぞれの exon 2 から exon 4 の
minigene を作製し、両種の exon 3 のスプライスパターンを検討した。PCR 産物をア
ガロースゲルで分離した。
ウシ Trem2 で検出された 1000bp 付近の PCR 産物は、
intron2 が 137bp 含まれていた。
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図 20

ヒトとマウスのキメラ minigene を用いた CELF 応答領域の推測

A) ~D)マウスに由来する配列は黒で表し、ヒトに由来する配列は赤で表している。キメ
ラ minigene 1 は、マウスの intron 2 がヒトの配列に置換されている。キメラ minigene
2 はヒトの intron 3 がマウスの配列に置換されている。キメラ minigene 3 はマウスのintron 3 がヒトに置換されており、キメラ minigene 4 はヒトの intron 2 がマウスに置換されている。矢印はスプライシングアッセイに使用したプライマーセットを表している。PCR 産物をアクリルアミドゲルで分離した。SD は標準偏差である（n=4、テューキー検定で解析した）。

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図 21 ヒト TREM2 intron 3 の後半部には CELF に応答する領域が含まれているA) マウス Trem2 intron 3 の後半部に存在する選択的 3’スプライス部位によるスプライス産物が検出された。
B) コントロール（EV）では exon 3 がごくわずかにスキップしていたが、CELF に
よって exon 3 のスキップが促進された。
矢印はスプライシングアッセイに使用したプライマーセットの位置を表している。

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図 22 RNA 免疫沈降の概略
本研究で用いた磁気ビーズは、抗 CELF2 抗体と Dynabeads を混合し、4℃で回転させることで作製したビーズである。そこへ内在性 CELF2 と TREM2 を発現する
THP-1 の細胞破砕液を加え、免疫沈降により CELF2 を濃縮した。その後、磁気ビーズから RNA を抽出すると、CELF2 に結合した RNA を得ることができる。本研究で行った RNA 免疫沈降は、免疫沈降物を NaCl と Urea が含まれた洗浄液で洗い、細胞破砕後の RNA-タンパク質間結合を極力低減させ、細胞内での RNA-タン
パク質間結合の検出を試みた。

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図 23 RNA 免疫沈降による CELF2 と TREM2 pre-mRNA との結合の検討
A) 内在性 CELF2 と TREM2 を発現する THP-1 を抗 CELF2 抗体で免疫沈降し、ウエスタンブロットで確認した。
B) RNA 免疫沈降物から cDNA を作製し、矢印で示すプライマーセットで PCR を
行った。

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図 24

exon 3 欠損型 TREM2 タンパク質の発現の検討

A) 3 x FLAG が付加された TREM2 欠失変異体を作製した。exon 3 がスキップした mRNAは、exon 4 の途中に premature termination codon (PTC)が生じるので、NMD の標的となる。exon 4 は TREM2 の膜貫通ドメインをコードしているので、exon 3 がスキッ
プすると細胞外に分泌されることが予想される。図における SP は signal peptide、TMは transmembrane、In は Intracellular、灰色は 3 x FLAG の挿入位置を表す。
B) cDNA を HEK293 に導入後回収した培養上清を濃縮し、泳動サンプルを調整した。
Mac-2BP はローディングコントロールである。

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図 25 CELF2 による TREM2 exon 3 の選択的スプライシングを介した TREM2
発現制御

TREM2 はヒトとマウスともに 5 つの exon を有し、すべての exon が挿入されると全長 TREM2 が発現する。本研究では、TREM2 の発現を制御するスプライシング
因子として CELF2 を同定した。CELF2 は exon 3 のスキップを促進させ TREM2タンパク質の発現を低下させるが、この制御機構はマウスなどの一部の動物種で保存されていなかった。また、exon 3 の選択的スプライシングは、新規 TREM2 アイ
ソフォームの発現を誘導することが示唆された。

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