全身性エリテマトーデス患者におけるベリムマブの適正使用に向けた
臨床薬学的検討
Clinical Pharmaceutical Research for the Appropriate UseofBelimumab

inPatients

with

Systemic

Lupus

Erythematosus

令和 2 年度入学
吉島

千 智 （ Yo s h i j i m a , C h i s a t o ）目次【序論】 ............................................................... 1【第 1 章】成人 SLE 患者におけるベリムマブの単一指標による有効性の検討 ..................................................... 7
1.

背景・目的....................................................... 7

2.

方法 ............................................................. 9

2.1 データベースと検索戦略 ...................................... 9
2.2 採択基準と除外基準 ........................................ 10
2.3 アウトカム指標 .............................................. 11
2.4 スクリーニングとデータ抽出 ................................. 11
2.5 論文の質とバイアスリスクの評価 ............................ 11
2.6 データ解析 .................................................. 11
3.

結果 ........................................................... 12

3.1 検索結果 .................................................... 12
3.2 採択した試験の特徴 ........................................ 15
3.3 論文の質とバイアスリスクの評価 ............................ 20
3.4 メタ解析 ..................................................... 21
4.

考察 ........................................................... 24

5.

小括 ........................................................... 27【第 2 章】SLE 患者における血漿中ベリムマブ濃度の測定及び評価................................................................ 28
背景 ............................................................... 28
第 1 節 UHPLC-MS/MS を用いたヒト血漿中ベリムマブ濃度の定量法の確立 ..................................................... 31
1.

目的 ........................................................... 31i

2.

方法 ........................................................... 31

2.1 試薬 ......................................................... 31
2.2 サロゲートペプチドの選択 .................................. 32
2.3 ストック溶液と標準溶液の調製 .............................. 32
2.4 前処理 ...................................................... 33
2.5 測定機器の条件............................................. 34
2.6 定量法のバリデーション ..................................... 35
2.7 ベリムマブの長期安定性 .................................... 36
2.8 SLE 患者検体中のベリムマブ濃度の測定 .................. 37
2.9 データ解析と統計方法 ...................................... 37
3.

結果 ........................................................... 38

3.1 サロゲートペプチドの選択 .................................. 38
3.2 マススペクトルとクロマトグラムの特徴 ....................... 39
3.3 バリデーション結果 .......................................... 40
3.4 ベリムマブの長期安定性 .................................... 43
3.5 SLE 患者の血漿中ベリムマブ濃度の測定 .................. 44
4.

考察 ........................................................... 45

5.

小括 ........................................................... 48

第 2 節 SLE 患者における血漿中ベリムマブ濃度の評価 .......... 49
1.

目的 ........................................................... 49

2.

方法 ........................................................... 49

2.1 研究デザイン ................................................ 49
2.2 血漿中ベリムマブ濃度の測定 ............................... 50
2.3 統計解析 .................................................... 50
3.

結果 ........................................................... 51
ii

3.1 患者特徴 .................................................... 51
3.2 血漿中ベリムマブ濃度 ...................................... 52
3.3 血漿中ベリムマブ濃度と投与量の関連性 ................... 54
4.

考察 ........................................................... 55

5.

小括 ........................................................... 59【総括】 ............................................................. 60
謝辞 ............................................................... 62
引用文献 ........................................................... 63

iii

【序論】
全身性エリテマトーデス（SLE: systemic lupus erythematosus）
は、自己抗体や免疫複合体が臓器に沈着することによって炎症性の臓器障害が起こる慢性の自己免疫疾患である。1) 様々な臓器に障害が起こるが、重症度や障害が起こる臓器は患者ごとに大きく異なる。2)
SLE 治療のゴールは、疾患活動性のコントロール、臓器障害の予防及び治療薬による有害事象を最小限にすることである。3) SLE の標準治療 に は 、 グ ル コ コ ル チ コ イ ド や ヒ ド ロ キ シ ク ロ ロ キ ン （HCQ:hydroxychloroquine）、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs:
steroidal
る。

4)anti-inflammatory

non-drugs） 、 免 疫 抑 制 薬 が 使 用 さ れ

SLE の治療薬として承認された初の抗体医薬品のベリムマブ

は、標準治療で効果不十分な SLE に対して、世界各国で承認されている。3,5,6) 本邦では、2017 年 9 月に承認された。7) ベリムマブは、B リ ンパ球刺激因子（ BLyS: B lymphocyte stimulator ）を標的とした、ヒト免疫グロブリン（Ig:immunoglobulin）G1λモノクローナ

ル 抗 体 で あ る 。BLyS は 、B 細 胞 活 性 化 因 子 （BAFF :B

activating

tumor

necrosisfactor）としても知られ る 腫瘍壊死因子（TNF:

cellfactor）スーパーファ ミリーに 属するサ イトカインである 。

BLyS は 、SL E 患 者 で 過 剰 発 現 す る こ と が 明 ら か に なっ て お り 、 SLEの潜在的に重要な治療ターゲットである。8,9) ベリムマブの分子式は、C6358H9868N1728O2008S44 であり、分子量は約 147,000 と、高分子の医薬品である。現在、ベリムマブは静脈内注射製剤と皮下注射製剤が存在する。体重 60 kg の患者における薬剤費は、初回負荷投与を含む静脈内投与と皮下投与では年間約 120 万円、継続投与時における静脈内投与では年間約 100 万円である（表１）。SLE の治療におい1

て、ベリムマブは標準治療に追加して投与するため、標準治療薬の薬
剤費や通院費などを含めると、ベリムマブを使用した SLE 治療のコストは高額となる。

表 1

ベリムマブの薬剤費（体重 60 kg の患者で算出）
単回投与量

1 ヶ月

6 ヶ月

12 ヶ月

静脈内注射製剤（初回負荷投与含む）

10 mg/kg（600 mg）

投与 3 回
249,240 円

投与 8 回
664,640 円

投与 14 回
1,163,120 円

静脈内注射製剤（継続投与時）10 mg/kg（600 mg）

投与 1 回
83,080 円

投与 6 回
498,480 円

投与 12 回
996,960 円

皮下注射製剤

200 mg

投与 4 回
99,992 円

投与 24 回
599,952 円

投与 48 回
1,199,904 円

ベリムマブ投与量・投与方法
静脈内注射製剤 ：10 mg/kg、0、2、4 週、その後 4 週ごとに静脈内投与
皮下注射製剤：200 mg を 1 週間ごとに皮下投与
厚生労働省の薬価基準収載品目リスト（令和 5 年 12 月 20 日適用）を基に、ベンリスタ点滴静注用 120 mg 16,616 円、ベンリスタ皮下注 200 mg
シリンジ 24,998 円で計算

現在の SLE 治療ガイドラインでは、ベリムマブの投与を強く推奨はし て い な い 。2023 年 に 更 新 さ れ た 欧 州 リ ウ マ チ 学 会 （EULAR:
European alliance of associations for rheumatology ）の推奨では、HCQ 単独又は HCQ とグルココルチコイドを併用しても治療
反応性がない患者と、グルココルチコイドの漸減ができない患者に対して使用を考慮する 2nd line の治療となっている。10) 例外として、皮膚や関節などに広範囲に病変を有する重症例では、1st line として考慮される。また、英国リウマチ学会のガイドラインでは、ベリムマ
ブは中等度又は重度の疾患活動性を有する患者及び他の治療法に
2

反応性がない場合に使用すべきであるとされている。6) これらのガイ
ドラインの推奨を言い換えると、ベリムマブは重症の患者や既存の治療法で効果が不十分な患者にとって、希望の選択肢となる。
ベリムマブの開発段階の臨床試験では、中等度から重度の SLE 患者を対象に、標準治療に加えてベリムマブ又はプラセボを投与して、有効性、安全性と薬物動態の評価が行われた。11-13) ベリムマブ群
で治療反応が得られた患者が有意に多かったという結果からベリム
マブの有効性が認められ、安全性も忍容性が認められた。一方で、治療に対する患者反応には幅が認められ、治療効果が得られない患者が約半数存在するという課題が明らかになった（図１）。しかし、承認前の臨床試験では、治療効果の得られた患者と得られなかった患者における血中ベリムマブ濃度や患者背景の違いは明らかになっていない。ベリムマブの薬剤費は高額であり、漫然としたベリムマブの継続投与は避ける必要がある。一方で、ベリムマブの投与中止や投与量変更に関する研究は限られている。これらの課題から、効果的なベリムマブの使用方法に関する研究と、それらの結果に基づくベリ
ムマブの適正使用が求められる。

図 1

第Ⅲ相試験における SRI４レスポンダー率3適正使用に向け、治療効果を評価する指標が重要になる。ベリムマ
ブの第Ⅲ相試験では、複合指標が使用された。複合指標は、限られたサンプルサイズで群間の差を検出でき、治療効果を総合的に評価可能であることが利点である。一方で、非常に複雑で評価に時間を要する
こと、構成指標である単一指標の臨床的重要性が異なることが欠点である。そのため、個々の患者におけるベリムマブの適正使用を推進するためには、日常的に用いられる臨床的な単一指標が、ベリムマブの有効性を評価することが可能であるかを明らかにする必要がある。
また、適正使用を推進する方法の１つとして、抗体医薬品の治療薬
物モニタリング（TDM: therapeutic drug monitoring）がある。現
在承認されている抗体医薬品の中では、抗ヒト TNFαモノクローナル抗体であるインフリキシマブが、適正使用に関する研究が最も進んでいる。血清インフリキシマブ濃度と治療効果の間に有意な相関が認められており、血清中インフリキシマブトラフ濃度を一定の濃度以上にすることにより、臨床効果が高まることが明らかになっている。14) さらに
インフリキシマブでは、導入期と維持期における TDM の有用性についてのランダム化比較試験が実施された。15) 血清中インフリキシマブ濃度を測定し、その測定結果によってインフリキシマブの投与量を変更
する TDM 実施群と、医師の判断によりインフリキシマブの投与量を変更する TDM 非実施群において、アウトカムを比較した結果、治療導入
期では、30 週における臨床寛解率は、TDM 実施群と非実施群の間で有意な差は認められなかった。16) 一方、治療維持期では、観察期間
52 週中、悪化することなく疾患コントロールが可能であった患者数は、
TDM 実施群で有意に多く認められた。17) この試験は、現時点で抗体医薬品の TDM について検討した唯一のランダム化比較試験であり、
4

抗体医薬品の TDM の有用性が示唆されている。抗体医薬品では、医薬品によって抗薬物抗体（ADA: anti-drug antibody）の出現率、
クリアランスや分布容積などの薬物動態パラメータが異なること

18,19)が報告されているため、医薬品ごとに個体内変動や個体間変動の有無を明らかにし、血中濃度と有効性及び安全性の関連についての検討を行い、TDM の必要性を評価することが重要である。
ベリムマブにおいても、TDM の導入により、さらに効果的な薬物治療を実現できる可能性がある。しかし、ベリムマブの TDM の有用性を評価するためには、有効性の評価と薬物動態の両側面において課題がある。有効性の評価の面では、承認前の臨床試験では複合指標が使用されたことから、臨床現場で使用される単一指標によりベリムマブの有効性を評価することが可能であるかは、明らかでない。薬物動態の面では、血中ベリムマブ濃度の定量法と臨床応用に関する報告は限られているため、個々の患者の血中ベリムマブ濃度の推移と個体間差は不明である。
本研究では、ベリムマブの TDM の有用性を評価することを目的とし、有効性の評価と薬物動態の両面から、ベリムマブの TDM の実施における課題の解決を試みた。第 1 章では、成人 SLE 患者におけるベリム
マブの臨床現場で用いられる単一指標による有効性の検討として、メタ解析を行った。第 2 章では、SLE 患者における血漿中ベリムマブ濃度の測定及び評価をするために、超高速液体クロマトグラフ－タンデ
ム 型 質 量 分 析 計 （UHPLC-MS/MS:

ultra-highperformanceliquid chromatograph-mass spectrometry）を用いたヒト血漿中
ベリムマブの定量法を確立した。さらに、確立した定量法を用いて、SLE 患者における血漿中ベリムマブ濃度の測定を行い、血漿中ベリム
5

マブ濃度と患者間における血漿中ベリムマブ濃度の相違を評価した。
これらの臨床薬学的視点からの検討により、実臨床におけるベリムマ
ブの適正使用と治療効果の向上への貢献を目指した。

6

【第 1 章】成人 SLE 患者におけるベリムマブの単一指標による有効性の検討 20)1. 背景・目的
現在、SLE の疾患活動性を測定するための指標は複数報告されているが、ゴールドスタンダードとされる指標はない。21) ベリムマブの第Ⅱ 相 試 験 で は 、 単 一 指 標 のSLEDiseaseActivity

Index（SLEDAI）のベースラインからのスコア減少率が主要評価項目として評価された。患者全体を対象とした解析では統計学的に有意な差は認められず、抗核抗体や抗 ds-DNA 抗体が陽性の、臨床的に疾患活動性が活発な血清学的陽性患者では、ベリムマブ群で有意な改善が認められた。この結果を受け、第Ⅲ相試験では血清学的陽性患者を対象に、3 つの指標から構成された複合指標の SLE Responder Index（SRI）4 が作成され、主要評価項目として評価された。22) SRI4 は 3つの指標から構成されており、次の 3 つの単一指標の基準を全て満たす人を SRI4 レスポンダーと定義した:

1）SLEDAI スコアがベースラ

インから 4 ポイント以上減少、2）British Isles Lupus Assessment
Group Index（BILAG）の臓器ドメインスコアが新規の増加なし、3）
Physician Global Assessment（PGA）スコアの悪化なし（ベースラ
インから 0.3 ポイント以上の悪化なし）。23) SLEDAI は、過去 10 日
間の疾患活動性を評価する指標で、8 つの臓器系に関する臨床所見
24 項目（臨床検査値（補体値（C3、C4）、抗 ds-DNA 抗体、血小板減少や白血球減少など）、精神症状、血管炎、関節炎、蛋白尿や発疹など）がそれぞれ点数化され、105 点満点で評価する。24,25) BILAG
は、重症度に応じた治療方針の決定を目的とした指標で、臓器系病変7

ごとに 101 項目の重症度を分類することが特徴である。26) 一般的全身症状と 7 つの臓器病変について、それぞれ、評価までの 1 ヶ月間の活動性をさらに前の 1 ヶ月間と比較することで、改善傾向、変化なし、悪化、新規出現のいずれかを判定し、重症度のカテゴリーA（重症）～E（既往及び症状なし）に分類する。PGA は医師による患者の全般的疾患活動性の 評価指標で、0-3 点（0：なし、1：軽度、2：中等度、3：重 度 ） の 段 階 に 分 け た 1 0 c m の V i s u a l A n a l o g u e S c a l e （ VA S ） を使用する。27) 臓器病変の悪化がなく、医師の視点からも疾患活動性の悪化がない全身疾患活動性の改善を評価できる指標として、SRI4が作成された。第Ⅲ相試験以降、血清学的陽性患者を対象に、臨床試験が実施されたため、現在、ベリムマブは血清学的陽性患者を対象に投与することとなっている。しかし、血清学的陽性患者の単一指標における有効性は明らかではない。
また、現時点における国内外のガイドラインでは、効果指標として
SRI4 を推奨する記載はない。英国リウマチ学会のガイドラインでは、疾患活動性の評価指標である SLEDAI を推奨している。また、臓器損
傷 の 評 価 に は 、BILAG
collaboratingや

systemicclinics/American

lupus

collegeofinternationalrheumatology

damage index for systemic lupus erythematosus（SDI 又はSLICC/ACR damage index）、生活の質の評価には、short-form
36 health survey（SF-36）を推奨している。6) EULAR では、疾患
活動性の評価では SLEDAI、PGA、European consensus lupus
activity measurement（ECLAM）、臓器障害の評価では、BILAG、
SDI の使用が推奨されている。1,4) 本邦のガイドラインでは、各国で使用が推奨された指標について言及しているが、特別、推奨する指標
8

は記載されていない。7) SLE の疾患症状は複雑であることから、評価指標も複雑なものが多いが、SLEDAI は単純かつ簡便な指標であると本邦のガイドライン

7)に記載されており、本邦では指定難病の基準としても使用される。日常診療では、各国の SLE ガイドラインに記載がある単一指標や臨床検査値などから総合的に治療効果が評価されているため、臨床現場で使用される指標における有効性の評価は、TDMの有用性を評価する際の臨床現場や患者の負担軽減に繋がることから重要である。
以上の背景より、本研究では、各国の SLE ガイドラインで推奨され、日常診療でも使用される単一指標を用いて、血清学的陽性患者におけるベリムマブの有効性を明らかにすることを目的とした。その解析には、実施時点における一定の結論を導くための定量的で信頼性の高い方法であり、その結果はガイドラインにおける根拠としても使用されている 28) メタ解析の手法を用いて評価を行った。

2. 方法
本研究は、The preferred reporting items forreviews
た。

29)

and

systematic

meta-analysis（PRISMA）2020 に 従 い 、 実 施 し

本 プ ロ ト コ ル は 大 学 病 院 医 療 情 報 ネ ッ ト ワ ー ク （UMIN:

university hospital medical information network）に登録した（UMIN 試験 ID: UMIN000052846）。

2.1 データベースと検索戦略
C o c h r a n e L i b r a r y （ C E N T R A L ） 、 P u b M e d 、 医 中 誌 We b で 、SLE に対してベリムマブが投与された臨床試験を網羅的に検索した。
9

検索語は、（belimumab or Benlysta） and （SLE or systemic
lupus erythematosus） and （RCT or Randomized controlled
trial or （randomized and controlled））とした。検索実施期間は2021 年 12 月 1 日までとし、言語制限は行わなかった。
さらに、ClinicalTrials.gov で、ベリムマブに関するランダム化比較 試 験 （RCT：randomized

controlled

trial） を 検 索 し た 。

ClinicalTrials.gov で確認された臨床試験番号を PubMed でハンドサーチをした。

2.2 採択基準と除外基準解析に用いた論文の採択基準は以下とした。1）プラセボを対照とした RCT、2）SLE と診断された患者（18 歳以上）かつ血清学的陽性患者を対象としている、3）ベリムマブを介入薬としている（投与経路は問わず）、4）SLE 症状の改善を単一指標で評価している。
除外基準は以下とした。1）介入試験以外の試験デザイン、2）レビュ
ーや症例報告、レター、研究プロトコルなどの原著論文以外の論文、3）
データの記載がない論文、4）小児を対象とした臨床試験、5）ループス
腎炎患者を対象とした試験、6）単回投与試験。ループス腎炎の患者
では、評価指標が異なるため除外基準とし、単回投与試験は長期投与におけるベリムマブの有効性を確認することを目的としたため、除外基準にした。
対照群は、標準治療に加えて、プラセボを投与していることを想定した。SLE の治療には、国によっては適応外使用を含め、様々な薬が使用される可能性が考えられたため、標準治療薬の詳細な設定は行わなかった。
10

2.3 アウトカム指標
疾患活動性や臓器障 害、生活の 質の 単一指標である SLEDAI、
BILAG、PGA、ECLAM、SDI、SF-36 の改善とした。

2.4 スクリーニングとデータ抽出
論文のスクリーニング及びデータ抽出は、採択基準と除外基準に基づいて、2 人で独立して行った。スクリーニング及びデータ抽出中に 2
人の間に意見の相違が生じた場合、第三者の介入により相違点を解決した。データは、採択基準と除外基準を満たした各論文から抽出した。
抽出したデータには、著者、研究名、出版年、臨床試験番号、ベリムマ
ブの投与量と投与経路、ベリムマブ群と対照群の患者数、各試験における患者の適格性基準、研究が実施された国、人種、研究期間、評価
指標、評価指標を達成した患者数を含めた。また、論文の質の評価及びバイアスリスクの評価に関する情報も抽出した。

2.5 論文の質とバイアスリスクの評価
Jadad スコア 30) を用いて、臨床試験の研究の質を評価した。また、
Cochrane risk of bias tool for randomized trials（RoB2）31)
で、バ イ ア スリ ス クを評 価 し た。RoB2 で評 価 し た結 果 は、Risk-ofbias VISualization（robvis）32) で視覚化した。

2.6 データ解析
国際的に承認されている用量（点滴静注用製剤 10 mg/kg 又は皮下 注 用 製 剤 200mg） を 投 与 し て い る 患 者 の み で 解 析 を 行 っ た 。

SLEDAI では、少なくとも 4 ポイント以上改善した患者の人数で評価11

した。BILAG と PGA では、スコアの悪化が認められなかった患者の人数で評価した。
メタ解析は、the Cochrane Collaboration Review Manager
software（RevMan 5.4）を使用して行った。統計方法は、MantelHaenszel 法を使用した。異質性は I2 値を基にして評価を行い、解析方法の選択をした。I2 値 ≤50 で異質性なしと考え、固定効果モデル

を使用、50 < I2 値では異質性を考慮して、ランダム効果モデルを使
用した。

3. 結果
3.1 検索結果作成した検索式を用いて、各種データベースを検索したところ、
Cochrane library（CENTRAL）で 168 報、PubMed で 131 報、医中 誌 We b で 1 3 報 の 計 3 1 2 報 が 検 索 さ れ た （ 図 2 ） 。 加 え て 、ClinicalTrials.gov で 82 個の臨床試験が確認できた。82 個の臨床試験のうち、SLE 患者を対象にベリムマブを投与した RCT は 20 個であった。20 個の臨床試験番号（ClinicalTrials.gov Identifiers）
を PubMed で検索したところ、87 報が検索された。
全 399 報 から、PMID（PubMed

UniqueIdentifier）を基に 、

114 報 を 重 複 の ため 除外 し た。最 初の ス クリ ーニ ングではタイト ル とア
ブストラクトを基に、重複やプロトコルなどの理由で 175 報を除外した。
残った 110 報を、全文を基に採択を行うために取得を試みたところ、 1報が入手困難のため取得できなかった。次のスクリーニングでは、取得できた 109 報の適格性（採択基準・除外基準）を評価し、その結果、
12

98 報を除外した。除外した理由の内訳は、レビュー、レター、研究プロ
トコルや会議録のため 66 報、研究デザインで 18 報、複数の臨床試験の結果を統合していた又はサブグループ解析によりランダム化が崩れていたため 14 報であった。最終的に、採択基準を満たした 11 報を採択した。11-13,33-40)

13スクリーニング

研究の同定データベースと研究登録による新たな研究の特定データベースによる特定
Cochrane library （n = 168）
PubMed （n = 131）
医中誌 （n = 13）

スクリーニング前に除いた論文
重複（n = 114）
自動化ツールによって不適格とマークされた論文（n = 0）
他の理由のために除いた論文（n = 0）臨床試験番号のハンドサーチ（n = 87）

スクリーニングした論文（n = 285）

除外した論文（n = 175）取得のために探した論文（n = 110）

取得できなかった論文（n = 1）

採択適格性を評価した論文（n = 109）

図 2

除外した論文レビュー、レター、プロトコル、会議録、要約（n = 66）
研究デザイン（n = 18）
臨床試験結果の統合（n = 14）

レビューに含んだ論文（n = 11）

システマティックレビュー/メタ解析に含んだ論文の採択過程

143.2 採択した試験の特徴
本研究では、8 つの臨床試験の、11 報の論文 11-13,33-40) を採択した（表 2）。全ての研究は、中等度から重度の SLE 患者を対象にしており、標準治療に加えてベリムマブ又はプラセボ（生理食塩液）を投与していた。標準治療には、グルココルチコイド、免疫抑制薬、HCQ の単独もしくは併用が含まれた。ベリムマブは、BLISS-SC13) のみ皮下注射で投与されていたが、他の臨床試験では、点滴静脈内注射で投与されていた。承認用量（静脈内注射製剤 10 mg/kg、皮下注射製剤
200 mg）以外の投与を行った用量反応試験 11,12,34,39) も論文の採択基準を満たしたが、メタ解析には承認用量を投与した群の結果のみを使用した。患者の採択条件は、スクリーニング時のSafetyof

Estrogen in Lupus Erythematosus National Assessment SLE
Disease Activity Index（SELENA-SLEDAI）スコアの基準が異な っ た 。 B A S E 3 5 ) と B E AT- L U P U S 3 6 ) で は 、 S E L E N A - S L E D A I の基準はなく、この 2 つの臨床試験以外では、SELENA-SLEDAI が 4
ポイント以上、6 ポイント以上、8 ポイント以上と基準に違いが認められた 。 ま た 、 B E AT- L U P U S 3 6 ) は 、 リ ツ キ シ マ ブ を 投 与 し て い た 患 者 を対象にしており、SLE の診断基準が英国リウマチ学会の基準を使用してい る とい う 点が 異なった。研究実施国 と人種に 関しては、第Ⅱ相試
験34,39)、BLISS-NEA37,38,40)、及び EMBRACE33) を除いて、10 か国 以上の 国で 実施さ れ、 人種 も 様々で あっ た。 Tanaka らに よる
2 報の論文 37,38) は、中国、韓国、及び日本の 3 か国で行われた臨床試験の BLISS-NEA から、日本人患者のデータを抽出したサブグル
ー プ 解 析 で あ り 、 Ta n a k a

201937) で は 、 日 本 人 に お け る SRI4、

SLEDAI、PGA、BILAG、ステロイド量の減量、安全性などを報告し、
15

Ta n a k a 2 0 2 0 3 8 ) で は 、 臓 器 に 着 目 し 、 臓 器 ご と の 有 効 性 を 報 告 し てい た 。BLISS-NEA の 結 果 を 解 析 で 使 用 す る 際 に は 、 可 能 な 限 り
Zhang 201840) の論文の結果を使用し、Zhang 2018 に記載がなく、Ta n a k a ら の 論 文 に の み 記 載 が あ る 指 標 は Ta n a k a ら の 論 文 の 結 果 を使 用 し た 。 第 Ⅱ 相 試 験 で は 、2 報 の 論 文

34,39)

が採択された。

Ginzler 201434) は、第Ⅱ相試験の結果も報告していたが、第Ⅱ相試験後 7 年間の追跡調査を行った結果を主に報告していたため、解析に は Wa l l a c e 2 0 0 9 3 9 ) の 結 果 を 主 に 使 用 し た 。 上 記 の 通 り 、 臨 床 試
験からの重複がないようにデータを抽出して解析を行った。また、評価
時点は、全ての論文で 52 週における結果の記載があったため、52 週
時点の結果を解析に使用した。

16

表 2 レビューに含んだランダム化比較試験の特徴
NCT 番号
00071487

研究名
第Ⅱ相試験

著者
出版年
Wallace 2009 39)

試験実施
人種
国
米国、カナ 白人 70.1%
ダ
アフリカ系アメリカ人 23.6%

Ginzler 2014 34)

同上

同上

ベリムマブ群*
投与量
人数
IV
111
10 mg/kg
111
4 mg/kg114
1 mg/kg

対照群*
人数
113

患者採択基準
ACR 基準で SLEと診断され、疾患活動性を有する患者（スクリーニング時の SELENA–SLEDAI 4 ポイント
以上）

研究
期間（週）
52

Jadad
スコア
4

00424476

BLISS-52

Navarra 2011 11)

13 か国 †

アメリカ先住民32.3%
白人 26.5%
アフリカ系アメリカ人 3.5%
アジア人
37.8%

IV
10 mg/kg
1 mg/kg

290
288

287

ACR 基準で SLEと診断され、疾患活動性を有する患者（スクリーニング時の SELENA–SLEDAI 6 ポイント
以上）

52

5

00410384

BLISS-76

Furie 2011 12)

19 か国‡

アメリカ先住民
12.6%
白人 69.5%
アフリカ系アメリカ人 14.4%
アジア人 3.4%IV
10 mg/kg
1 mg/kg

273
271

275

ACR 基準で SLEと診断され、疾患活動性を有する患者（スクリーニング時の SELENA–SLEDAI 6 ポイント
以上）

76

5

17

01345253

BLISS-NEA

Zhang 2018 40)

IV
10 mg/kg451

226

ACR 基準で SLEと診断され、疾患活動性を有する患者（スクリーニング時の SELENA–SLEDAI 8 ポイント
以上）

52

5

Tanaka 2020 38)

3 か国（中 データなし§
国、韓国、
日本）
日本（サブ 同上
グループ
解析）
同上
同上

Tanaka 2019 37)01484496

BLISS-SC

Stohl 2017 13)

30 か国#

データなし§

SC
200 mg/kg

556

280

ACR 基準で SLEと診断され、疾患活動性を有する患者（スクリーニング時の SELENA–SLEDAI 8 ポイント
以上）

52

4

01705977

BASE

Sheikh 2021 35)

33 か国**

データなし§

IV
10 mg/kg

2001

2002

ACR 基準で SLE と診断された患者

52

5

No registration

BEATLUPUS

Shipa 2021 36)

英国

白人 57.7%
アフリカ系アメリカ人 11.5%
南アジア人
11.5%
中国人 5.8%
その他 13.5%IV
10 mg/kg

26

26

英国リウマチ学会の基準を満たし、
従来の治療で効果不十分のためにNHS Englandguideline および英国のガイドラインに従ってリツキシマブの投与を受ける予定だった患者

52

5

18

NCT01632241

EMBRACE

Ginzler 2022 33)

6 か国（ブ
ラジル、コ
ロンビア、
フランス、
南 ア フ リカ、 英 国、
米国）

アフリカ系黒人またはアフリカ系アメリカ人
97.3%
混血 2.7%IV
10 mg/kg

331

165

ACR 基準で SLEと診断され、疾患活
動性（スクリーニン
グ時の SELENA–SLEDAI 8 ポイント以上）を有し、黒人と自認している患者

52

5*：すべての試験において、介入群には標準治療に加えてベリムマブが投与され、対照群には標準治療に加えてプラセボ（生理食塩水）が投与された。標準治療には、グルココルチコイドおよび/または免疫抑制剤および/または抗マラリア薬が含まれた。
†：アルゼンチン、オーストラリア、ブラジル、チリ、コロンビア、香港、インド、韓国、ペルー、フィリピン、ルーマニア、ロシア連邦、台湾‡：オーストリア、ベルギー、カナダ、コスタリカ、チェコ共和国、フランス。ドイツ、イスラエル、イタリア、メキシコ、オランダ、ポーランド、プエルトリコ、ルーマニア、スロ
バキア、スペイン、スウェーデン、英国、米国（出典：ClinicalTrials.gov ID NCT00410384）#：アルゼンチン、オーストリア、ベルギー、ブラジル、ブルガリア、チリ、コロンビア、クロアチア、チェコ、デンマーク、フランス、ドイツ、ハンガリー、イタリア、日本、マレーシア、メキシコ、フィリピン、ポーランド、ポルトガル、ルーマニア、ロシア連邦、セルビア、シンガポール、スペイン、スウェーデン、台湾、タイ、ウクライナ、英国、
米国（出典：ClinicalTrials.gov ID NCT01484496）**：米国、アルゼンチン、オーストラリア、ブラジル、ブルガリア、カナダ、チリ、コロンビア、クロアチア、チェコ、エストニア、香港、ハンガリー、インドネシア、イタリア、
韓国、リトアニア、マレーシア、メキシコ、ニュージーランド、ペルー、フィリピン、ポーランド、ポルトガル。ルーマニア、ロシア連邦、セルビア、スロバキア、スペイン、
スイス、台湾、タイ、ウクライナ§：人種についての言及はなし、登録された患者の国と患者数、割合は記載されていた
NCT：National Clinical Trial、IV： 静 脈 内 投 与 、intravenous injection、SC： 皮 下 投 与 、subcutaneous injection、SLE： 全 身 性 エ リ テ マ ト ー デ ス、systemic lupus
erythematosus、SELENA-SLEDAI：Safety of Estrogen in Lupus Erythematosus National Assessment SLE Disease Activity Index、ACR：アメリカリウマチ学会、American College of Rheumatology

193.3 論文の質とバイアスリスクの評価
採択した論文の Jadad スコアは、8 つの臨床試験のうち、6 つは 5点、2 つは 4 点と良好であった（表 2）。この高い Jadad スコアは、全ての研究において、臨床試験のデザインの質が高いことを示す。一方、RoB2 によるバイアスリスクの評価では、バイアスリスクが示唆された（ 図 3） 。 本 研 究 に 含 ま れ た 11 報 の 論 文 の う ち 、 全 体 的 な リ ス ク（Overall）では High が 6 報、11,33,36-38,40) Some concerns が 1
報、13) Low が 4 報 12,34,35,39) と評価された。

図 3

RoB2 によるバイアスリスクの評価

5 つの評価ドメイン（D1）ランダム化のプロセスから生じるバイアス、（D2）意図した介入からの逸脱によるバイアス、（D3）結果データの欠落によるバイアス、（D4）結果の測定におけるバイアス、（D5）報告された結果の選択におけるバ
イアスと全体評価ドメインにおけるバイアスを評価。
各ドメインリスクに対して、緑：低リスクオブバイアス（low risk of bias）、
黄：懸念あり（some concerns）、赤：高リスクオブバイアス（high risk ofbias）の 3 段階で評価。

20

アウトカムデータの欠落（D3）は、試験期間が長く、試験中の脱落患者 数 が 多 い 試 験 が 複 数 あ っ た た め 、 バ イ ア ス リ ス ク は High が 4
報、

11,33,36,40)

Some concerns が 4 報 12,13,37,38) と評価され、Low は 3 報 34,35,39) のみであった。また、報告の選択（D5）では、日本 人 の デ ー タ を 抽 出 し た サ ブ グ ル ー プ 解 析 で あ る Ta n a k a ら の 2
報37,38)が、人種の選択的報告に該当し、バイアスリスクが High という評価になった。

3.4 メタ解析
メタ解析を行う前に、各論文における評価指標を確認した（表 3）。
当初、メ タ解析を 計画し てい た ECLAM は報告し た論文が なく、SDI は報告した論文が 1 報のみであり、解析ができなかった。SF-36
は 3 報 あ っ た が 、 Wa l l a c e

200939) で は 平 均 値 ± 標 準 誤 差 、Navarra 201111) では最小二乗平均 値±標準誤差、Furie 201112)
では平均値のみが報告されており、解析ができなかった。

21

表 3
試験名

各論文における評価指標
著者
出版年

SLEDAI BILAG PGA ECLAM SDI

SF36

Wa l l a c e
●
●
●
2009
Phase Ⅱ
Ginzler
2014
NavarraBLISS-52
〇
〇
〇
●
2011
Furie
BLISS-76
〇
〇
〇
●
2011
Zhang
〇
2018
BLISSTa n a k a
■
〇
〇
NEA
2019
Ta n a k a
■
■
2020
Stohl
BLISS-SC●
2017
SheikhBASE〇
2021
B E ATShipa
●
LUPUS
2021
Ginzler
EMBRACE〇〇〇2022○：データを使用●：データの記載はあるが、連続変数と二値変数、標準偏差の記載なし、
若しくは、スコアの評価基準が異なるため、統合できず■：データの記載はあるが、試験重複のため、統合には使用せず
SLEDAI：the SLE disease activity index、BILAG：British isles
lupus
assessment
group
index、PGA：
physicianglobalassessment、ECLAM：European
consensus
lupus
activity
measurement、SDI：systemic lupus international collaborating
clinics/American college of rheumatology damage index for
systemic lupus erythematosus、SF-36：short-form 36 healthsurvey22

メタ解析の結果、SLEDAI スコアにおいて、対照群と比較して、ベリ
ムマブ群で有意に SLEDAI スコアが 4 ポイント以上減少した患者が多か っ た （relative

risk

[RR]

1.28,

95%confidence

interval[CI] 1.16 to 1.40; p < 0.00001）（図 4A）。この解析に異質性は認められなかった。

図 4

単一指標におけるベリムマブの有効性評価（A）SLEDAI スコアの 4 ポイント以上の低下（B）BILAG の悪化なし（C）PGA の悪化なし
SLE： 全 身 性 エ リ テ マ ト ー デ ス 、systemic lupus erythematosus、
SLEDAI：the SLE Disease Activity Index、BILAG：British Isles
Lupus
Assessment
Group
index、PGA：
PhysicianGlobalAssessment、CI： 信 頼 区 間 、confidence interval、M-H：MantelHaenszel 法、Mantel-Haenszel method

23

SLEDAIは 、SLEDAIと そ れ を 改 訂 し た

SLEDAI-2K、

SELENA-SLEDAI という複数のバージョンが存在する。今回の解析に組み込まれた 4 つの論文では、Ginzler ら 33) は SLEDAI-2K ス
コアを、他の 3 報 11,12,40) では、SELENA-SLEDAI スコアを使用していた。
BILAG では、BILAG 1A/2B ドメインスコアで悪化なしの患者が、対照群と比較して、ベリムマブ群で有意に多かった（RR 1.10, 95%
CI 1.03 to 1.17; p = 0.005）（図 4B）。PGA の悪化なし（ベースラ
インから 0.3 ポイント以上の増加なし）の患者は、ベリムマブ群で有意に多かった（RR 1.12, 95% CI 1.05 to 1.20; p = 0.0005）（図4C）。BILAG と PGA の解析においても、有意な異質性は認められな
かった。

4. 考察
各国の SLE ガイドラインで推奨され、日常診療でも使用される単一指標を用いて、血清学的陽性患者におけるベリムマブの有効性を明らかにすることを目的として、メタ解析を行った。本研究は、日常診療で使用される SLEDAI、BILAG や PGA といった単一指標に焦点を当てて、ベリムマブの有効性を評価した初めてのメタ解析である。その結果 、 血 清 学 的 陽 性 の 成 人 SLE 患 者 に お い て 、3 つ の 単 一 指 標（SLEDAI、BILAG、PGA）で、ベリ ムマブ群で有意な改善が認められた。現在までのメタ解析を行った研究

41,42)

では、複合指標と限られた単一指標（SLEDAI、SF-36）における有効性評価、安全性につい て 、 メ タ 解 析 が 行 わ れ て き た 。 S F - 3 6 は 、 Wa l l a c e
242009 とNavarra 2011 の 2 報のみで、著者に連絡を取り、論文に記載のない数値を使用し、解析を行っていた。41) 複雑で評価に時間がかかる複合指標だけでなく、臨床現場で使用される単一指標でも有効性が認められたという今回の結果は、臨床現場において、血中ベリムマブ濃度と臨床効果の関連の評価する際に、患者や臨床現場への負担を軽減することが可能であり、臨床的に意義が大きいと考える。
本研究では、SLEDAI に複数のバージョンがあることと、それによる解析結果への潜在的な影響について、考慮する必要がある。本研究のメタ解析には、2 種類のバージョンの SLEDAI を評価指標とする論文
が 採 択 さ れ た 。SLEDAI は 、1992 年 に 開 発 さ れ た 評 価 指 標 で あ
る 。

25)

現 在 ま で に 、 様 々 な 改 訂 が 行 わ れ 、SLEDAI-2K

SELENA-SLEDAI が 開発された。24,43)といずれの改訂版も、過去

10 日間の疾患活動性に基づいた、105 ポイント満点のスコアの評価指標であり、持続的な疾患活動性は、発疹、脱毛、粘膜潰瘍の観点から評価する。44) この 2 つの改訂版は、SELENA-SLEDAI は、客観的若しくは主観的所見のいずれか一方のみが存在した場合でもスコアがつくが、SLEDAI-2K では、客観的所見と主観的所見が一致した場合にのみスコアがつくという点が大きく異なる。20) SLEDAI の 2 つの改訂版は、初版の SLEDAI との相関が確認されており、他の研究では同等に扱われている。45) しかし、本研究では、SLEDAI-2K を使用した
1 報 33) の論文では、ベリムマブとプラセボの間で有意な差は認められておらず、本研究の結果を、SLEDAI-2K を使用して有効性を評価す
る臨床現場に適用する際には、慎重に評価する必要がある。
また、試験ごとに異なる、参加者の人種や生物学的製剤の既往による影響についても、考慮する必要がある。本研究には、実施地域が限25

られた臨床試験や、特定の人種に着目したサブグループ解析、他の生物学的製剤の投与をベリムマブ投与前に行っていた臨床試験のような特徴のある論文が含まれた。人種については、EMBRACE33) では、
Black African ancestry を対象にしていた。また、BLISS-NEA では、アジア地域の中国、韓国、日本の 3 か国で試験を行い、3 報の論文で結果が記載されていた。37,38,40) BLISS-NEA の日本人データの み を 抽 出 し た Ta n a k a ら の 論 文 3 7 ) で は 、 3 か 国 分 の 結 果 を 報 告 した Zhang 201840) の論文に記載がなかった BILAG と PGA の結果が 記 載 さ れ て い た た め 、 B I L A G と P G A の メ タ 解 析 に は Ta n a k a ら の論文に記載の結果を使用した。SLE では、疾患の重症度及び有病率における人種差が報告されており、非白人集団では、有病率が高く、疾患重症度が高い傾向にある。33,37) 他の生物学的製剤の投与に関しては、リツキシマブで治療された患者にベリムマブを投与した臨床試験 36) が本研究に含まれた。他の生物学的製剤による治療歴がベリム
マブの有効性に及ぼす影響については、まだ検討されていない。しかし、ベリムマブの開発段階における臨床試験では、他の生物学的製剤の投与による影響がある可能性を考慮し、患者の適格性基準には、「試験参加前に、生物学的製剤の使用歴がないこと」が含まれた。今回、これらのバックグラウンドの特徴が異なる試験による影響を、感度分析で確認したが、各論文による結果への影響は認められなかった。
しかし、本研究にはいくつかの限界点がある。1 点目は、各研究における脱落率が高く、4 つの試験 11,33,36,40) では、20%を超えていたことである。今回、採択基準を満たした試験は、52 週間から 76 週間と比較的長期間の試験であったため、試験期間の長さが、高い脱落率の一因となっている可能性がある。2 点目は、対象患者の疾患重症度が全26

ての試験で、中等度から重度であったことである。従って、今回の結果
を、軽度の SLE 患者に適用することは難しい。最後に、各試験において、標準治療薬の投与量変更は可能であったため、標準治療の増減とアウトカムの関連性について明らかにできなかったことも限界点となる。
標準治療に関しては、ベリムマブの追加投与によるグルココルチコイドの用量節減の可能性が、今回のシステマティックレビューに含まれた臨床試験及び観察研究で確認されている。46,47) 他の標準治療薬の用量節減の可能性も、今後明らかにする必要がある。

5. 小括
本研究では、疾患重症度が中等度から重度かつ、血清学的陽性の
成人 SLE 患者に、標準治療に加えてベリムマブを投与することにより、
SLE ガ イ ド ラ イ ン で 推 奨 さ れ 日 常 診 療 で も 使 用 さ れ る 単 一 指 標 の
SLEDAI、BILAG、PGA における基準を達成できる患者が有意に増加することが明らかになった。臨床現場において、血中ベリムマブ濃度と臨床効果の関連を評価する際に、患者や臨床現場への負担軽減に繋がる結果が得られた。

27

【第 2 章】SLE 患者における血漿中ベリムマブ濃度の測定及び評価

背景
ベリムマブは、第Ⅲ相試験の結果を基に、母集団薬物動態解析が行われた。48,49) 母集団薬物動態解析により算出された個体間変動の薬
物動態パラメータでは、全身クリアランス、中心分布容積、末梢分布容積の個体間変動は緩やかであり、シミュレーション結果から、患者間における定常状態での血中ベリムマブトラフ濃度の差は約 1.5 倍である
ことが報告された。48,49) また、ベリムマブの血中濃度と臨床効果の関連は、承認前の臨床試験において、定常状態の平均血清中ベリムマブ
濃度と臨床効果（SRI や 52 週における SELENA-SLEDAI のベースラインからの変化）の間に有意な関連は認められなかった。48) 血中ベ
リムマブ濃度の変動と臨床効果との関連は、承認前の限られた背景を有する患者において報告されているのみであり、実臨床の SLE 患者における報告は限られている。実臨床では、様々な併存疾患、併用薬、疾患活動性を有する患者に投与を行うため、ベリムマブの血中濃度の変動と臨床効果が臨床試験とは異なる可能性があり、ベリムマブを投与する患者個人における特性を考える必要がある。
ベリムマブの母集団薬物動態解析では、個体間変動は小さいことが報告されたが、他の抗体医薬品では、実臨床における個体内・個体間変動についての研究が進んでいる。セツキシマブとリツキシマブで、血中濃度の個体間変動が報告され、50,51) アダリムマブとインフリキシマ
ブでは、投与を継続した患者において、ADA の出現により血中濃度が低下する個体内変動が報告されている。52) 関節リウマチの治療に用いられる複数の抗体医薬品では、薬物動態の変動要因について、性28

別や C 反応性蛋白、体重、ADA の存在などが報告されている。53) また、薬物動態の変動要因の１つとして、代謝経路における個体差が挙げられる。抗体医薬品の代謝経路は、免疫グロブリンの代謝と同様の経路と考えられている。現在までの研究により、抗体医薬品の代謝経路 と し て 、 標 的 媒 介 性 薬 物 消 失 （TMDD:

target-mediateddrugdisposition）や、IgG の代謝に関与する新生児 Fc 受容体（FcRn:
neonatal Fc receptor）を介したリサイクリング機構が報告されている。54-57)
医薬品の血中薬物濃度を評価するためには、定量法が必要となる。
抗体医薬品の血中濃度測定は、免疫学的測定法が標準的な手法とされている。58) ベリムマブの血清中濃度は、臨床試験及び母乳中移行性について検討した研究において、免疫学的測定法を使用して定量されている。48,59) ベリムマブの第Ⅰ相試験、第Ⅱ相試験では、ペルオキ
シダーゼ標識マウスモノクローナル抗ヒト IgG 抗体を使用し、ペルオキ
シダーゼの反応による色素の吸光度を測定する酵素結合免疫吸着測定法が使用された。49) 第Ⅲ相試験では、ウサギ抗ベリムマブポリクローナル抗体を添加した後、ルテニウム錯体の電解酸化、還元による発光 の 検 出 を 可 能 と す る 標 識 で あ る S U L F O - TA G で 標 識 し た ヤ ギ 抗 ウ
サ ギ 抗 体 を 添 加 し て 、 プ レ ー ト に 電 気 を 流 し て S U L F O - TA G の 光 を 測定する電気化学発光法が使用された。49) 第Ⅲ相試験で使用された電気化学発光法は、酵素結合免疫吸着測定法と比べ、バックグランドノ
イズが小さく、高感度で広大なダイナミックレンジを持つという利点がある。60) 抗体医薬品の定量における免疫学的測定法は、一般的に、感度が高く、短時間で測定が可能という優れた特性を持つ。一方で、抗体医薬品の定量における免疫学的測定法の課題として、抗薬物抗体
29

による干渉を受けることや、特異性が低く、内因性免疫グロブリンによる 交 差 反 応の 影 響を 受 け る こ と 、濃 度 範 囲 が 狭 い こ と な どが ある。

50,61,62)

近年、特異性が高い液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS/MS）を用いた抗体医薬品の定量に関する研究が増加しており、複数の抗体
医薬品の同時定量法も報告されている。50,58,62,63) 抗体医薬品は分子量が大きく、そのまま LC-MS/MS で測定することは困難であるため、
in silico 解析により、抗体医薬品のトリプシン消化物の中から、ヒト生体内に存在しない抗体医薬品特有の配列（ユニークペプチド）を探索し、その中から、測定対象のペプチド（サロゲートペプチド）を決定して、LC-MS/MS で測定を行う。LC-MS/MS 法では、一般的にトリプシン
消化過程とサロゲートペプチドの精製過程を含むため、トリプシンによる酵素反応時間を必要とするが、LC-MS/MS は特異性が高く、幅広い濃度で測定可能であり、ADA や交差反応という免疫学的測定法の課題の解決が可能である。ベリムマブにおける TDM の有用性を評価するためには、特異性が高く、様々な患者の幅広い血中ベリムマブ濃度に対応可能な定量法が必要である。
そこで、UHPLC-MS/MS を用いたヒト血漿中ベリムマブ濃度の定量法を確立し、実臨床においてベリムマブが投与された SLE 患者の血漿中ベリムマブ濃度と患者間の相違を評価した。

30

第 1 節 UHPLC-MS/MS を用いたヒト血漿中ベリムマブ濃度の定量法の確立 64)
1. 目的
本研究では、UHPLC-MS/MS を用いた血漿中ベリムマブの定量法を確立し、フルバリデーションを行った。さらに、確立した定量法の臨床適応性を評価するため、ベリムマブを投与した SLE 患者の血漿中ベ
リムマブ濃度が測定可能か、検討を行った。

2. 方法
2.1 試薬ベリムマブの標品（ベンリスタ®点滴静注用 120 mg）はグラクソ・スミ
スクライン株式会社（London, UK）から購入した（製造番号: FP6J1C） 。 内 部 標 準 物 質 （IS） は 、 サ ロ ゲ ー ト ペ プ チ ド
DLLLFPHHALSPWGR のプロリンを 13C-及び 15N-で標識化した安定 性 同 位 体 標 識 ペ プ チ ド と し 、AnyGen（Buk-gu,

Gwang-ju,

Korea）で合成されたもの を購入した。ウシ肺由来の ア プロチニ ンはSigma-Aldrich（St.Louis,

USA）から購入した。その 他の高純度試薬（ヒト血清アルブミン、ギ酸、28%アンモニア溶液、りん酸、メタノール）は富士フイルム和光純薬株式会社（Osaka, Japan）から購入した 。 P r o t e i n Wo r k s e X p r e s s D i r e c t D i g e s t キ ッ ト 、 9 6 ウ ェ ル 固 相
抽出プレート（Oasis PRiME MCX µElution plate, 30 µm）及び
9 6 ウ ェ ル コ レ ク シ ョ ン プ レ ー ト は Wa t e r s

Corporation（Milford,

MA, USA）から購入した。検量線及び Quality Control（QC）に使用するブランク血漿は、健康なボランティアから採取した。ボランティアには、本研究の科学的目的について事前に説明を行い、研究への参31

加について、全てのボランティアから書面によるインフォームドコンセントを取得した。この研究は、明治薬科大学の研究倫理審査委員会によって承認された（承認番号：202220）。

2.2 サロゲートペプチドの選択
ベ

リ

ム

マ

ブ

の

配

列

を

NCBI

proteindatabase（ h t t p s: / / w w w. n c b i . n l m . n i h . g o v / p r o t e i n ） で 検 索 し た 。 検 索 し た
ベ

リ

ム

マ

ブ

の

配

列

を

、StandardProtein

BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） に 入 力 し 、 デ ー タ
ベース UniProtKB/Swiss-Prot（swissprot）を使用して、タンパク質レベルでベリムマブと類似の構造を持つ生体内物質を検索した。
BLAST で検出された類似構造の生体内物質とベリムマブのアミノ酸
配 列 の 類 似 性 を 、 E x PA S y の タ ン パ ク 質 配 列 用 S I M - A l i g n m e n t
To o l （ h t t p s : / / w e b . e x p a s y. o r g / s i m / ） を 用 い て 確 認 し 、 ア ミ ノ 酸 配列の異なる部分を特定した。その後、類似構造の生体内物質のアミノ酸配列とベリムマブのアミノ酸配列を比較し、アミノ酸配列の異なる部分に着目した。ベリムマブのアミノ酸配列が類似構造と異なる部分をト
リプシン消化（トリプシンはリジン及びアルギニンのカルボキシル末端（C 末端）側でタンパク質を切断）した際に生成するペプチドをリストアップした。これらのペプチドを BLAST で検索して、ユニークペプチドを探索し、サロゲートペプチドを決定した。

2.3 ストック溶液と標準溶液の調製
検量線用ストック溶液と QC 用ストック溶液はそれぞれ、ベンリスタ®
点滴静注用 120 mg を超純水 1.5 mL で溶解し、80 mg/mL に調製
32

し た 。IS は

2%ヒ ト 血 清 ア ル ブ ミ ン 生 理 食 塩 水 溶 液 で 溶 解 し 、

10 µg/mL に調製した。ウシ肺由来アプロチニンは、超純水で溶解し、10 mg/mL に調製した。全てのストック溶液は、-80℃で保存した。
ベリムマブの検量線用標準液は、アプロチニンを添加したブランク血漿（10 µg/mL, 1000: 1 v/v）で検量線用ストック溶液を希釈して作成した 。検 量線標 準液の 濃 度 は、0、2、5、10、20、50、200、500、750 µg/mL とした。QC 用標準液は、アプロチニンを添加したブランク
血漿（10 µg/mL, 1000: 1 v/v）で QC 用ストック溶液を希釈して作成 し た 。QC 用 標 準 液 の 濃 度 は 、 定 量 下 限 （Lower
quantification（LLOQ） ） 、 低 濃 度 QC（low

limit

of

QC） 、 中 濃 度 QC

（mid QC）、高濃度 QC（high QC）サンプルが、それぞれ 2、6、60、600 µg/mL とした。

2.4 前処理2.4.1 トリプシン消化
ト リ プ シ ン 消 化 は 、 P r o t e i n Wo r k s e X p r e s s D i r e c t D i g e s t K i t
を使用し、3 ステッププロトコルで行った。
① タンパク質の変性：検量線サンプル/QC サンプル/患者サンプル
50 µL と IS 10 µL、消化バッファー60 µL をボルテックスで混合し、80℃のブロックヒーターで加熱した。
② トリプシン消化：消化バッファー50 µL とトリプシン 30 µL を加えて混合し、45℃で 120 分間消化反応を行った。
③ 消化停止：消化停止液 5 µL を加え、45℃で 15 分加熱後、10℃、3000 rpm の条件で 15 分間遠心分離を行った。

33

2.4.2 固相抽出
分析対象物を分離するため、遠心分離後の上澄み液を固相抽出した。固相抽出は、Oasis PRiME MCX µElution plate を使用した。
全 て の 固 相 抽 出 過 程 は 9 6 - w e l l p o s i t i v e p r e s s u r e u n i t （ Wa t e r s ）を使用して行った。
上澄み液 150 µL と 4%リン酸溶液 150 µL を混合し、固相抽出プ
レートに 280 µL を入れた。その後、2%ギ酸水溶液 200 µL で洗浄を行い、1.25%アンモニア･95%メタノール溶液 50 µL で 96 ウェルプレ
ートに溶出した。それぞれのサンプルは、超純水 50 µL で希釈して、オートサンプラー用バイアルに入れた。

2.5 測定機器の条件
ベリムマブは、超高速液体クロマトグラフ（Nexera X2 LC system）とトリプル四重極質量分析計（LCMS-8040）で構成される UHPLCMS/MS（Shimadzu,

Kyoto,

Japan） で 定 量 し た 。 カ ラ ム は 、A C Q U I T Y U P L C ® C S H T M C 1 8 （ Wa t e r s , 1 . 7 µ m , 2 . 1 × 5 0 m m ）を使用し、カラム温度は 40℃に設定した。オートサンプラー内温度は、10℃に設定した。移動相は、A 相（水相）：0.1%ギ酸水溶液、B 相（有機相）：0.1%ギ酸･アセトニトリル溶液を使用した。グラジエント条件は、9 分で A 相の割合を 5%から 95%に増加させ、2 分間平衡化を行った（表 4）。流速は 0.3 mL/min とし、注入量は 20 µL にした。

表 4

グラジエント条件

時間（分）
A （%）
B （%）

0
95
5

0.5
95
5

7
65
35

9
5
95

11
95
5

A：0.1%ギ酸水溶液、B：0.1%ギ酸･アセトニトリル溶液
34

エレクトロイオンスプレー法で測定を行い、イオン化条件は以下とした： 脱溶 媒管（desolvationline）温度 250℃、ヒートブロック温度

400℃、ネブライザーガス流量 3.0 L/min、ドライイングガス流量 15.0
L/min、衝突誘起解離（CID: Collision Induced Dissociation）
ガス圧力 17 kPa。質量分析計は、LabSolutions LCMS software（Shimadzu）を使用して、Multiple Reaction Monitoring（MRM）
モードで分析した。MRM 分析は、CID ガスとしてアルゴンを使用した。
Q1 pre-bias、Q2 のコリジョンセル、Q3 pre-bias の MS/MS トラン
ジションと電圧は、それぞれ、サロゲートペプチドはポジティブイオンモ
ードで、m/z 880.2（2+）→ m/z 1157.3、−20 V、−40 V、−48 V、
IS はポジティブイオンモー ドで、m/ z 886.2（2+）→ m/z 1169.4、−20 V、−43 V、−30 V とした。Dwell time は、サロゲートペプチド
及び IS ともに、0.10 s とした。

2.6 定量法のバリデーション
本 定 量 法 は 、 ア メ リ カ 食 品 医 薬 品 局 （FDA：theDrug Administration） の Bioanalytical

US

Food

and

M e t h o d Va l i d a t i o n

Guidance for Industry（以降、FDA ガイダンスと記載する）65) に従って、フルバリデーションを行った。
日内・日間変動（測定内・測定間の変動）の真度・精度は、1 回の測定内で評価し、日間変動の真度・精度は、異なる 3 回の測定間で評価をした。1 回の測定では、異なる濃度の 9 点の検量線とブランクに加えて、LLOQ、low QC、mid QC、high QC を各 6 サンプルずつ測定した。QC サンプルは、日内では検量線と同じブランク血漿を用いて調製し、日間では、異なるブランク血漿を用いた。選択性は、6 名の健康35

なボランティアから採取したブランク血漿サンプルを用いて評価した。
回収率とマトリックス効果は、固相抽出段階における回収率とマトリック
ス効果を評価した。ベリムマブはトリプシン消化後に 50%メタノール溶液を用いて、low QC、mid QC、high QC の濃度に希釈した。その後、3 つの異なる手順を行った：（1）固相抽出、（2）遠心エバポレート後、固相抽出を行ったブランク血漿の抽出液で再溶解、（3）遠心エバ
ボレート後、1.25%アンモニア・95%メタノール溶液で再溶解。回収率は（1）と（2）の比較により、マトリックス効果は（2）と（3）の比較により求めた。回収率とマトリックス効果は、異なる 6 名の健常人の血漿サン
プルを用いて、low QC、mid QC、high QC を測定し、評価した。凍結融解安定性は、low QC と high QC を各 3 サンプルずつ、凍結融解を 3 サイクル行い、安定性を評価した。24 時間オートサンプラー内
安定性は、low QC と high QC を各 3 サンプル用いて評価した。

2.7 ベリムマブの長期安定性
ヒト血漿におけるベリムマブの安定性を評価した。本検討は、FDA
ガイダンスを参考に、以下の基準で評価を行った。
ヒト血漿及びプロテアーゼ（トリプシン、プラスミン、カリクレイン）阻害薬のアプロチニン（10 µg/mL, 1000:1 v/v）を添加したヒト血漿におけるベリムマブの長期安定性を評価した。ベリムマブのストック溶液
をヒト血漿及びアプロチニンを添加したヒト血漿で 40 µg/mL に希釈した後、室温、4℃、-20℃、-80℃で保存した。ヒト血漿におけるベリム
マブの安定性は、1、7、30 日目に測定を行い、評価した。アプロチニ
ンを添加したヒト血漿におけるベリムマブの安定性は、1、7、30、90、
135 日目に測定を行い、評価した。それぞれ、1 回に 3 サンプルずつ
36測定し、1 日目のベリムマブ濃度と比較をして、残存率を計算した。安
定性は、3 サンプル中、少なくとも 2 サンプルの濃度が±15%以内であることを、安定の定義とした。

2.8 SLE 患者検体中のベリムマブ濃度の測定
大分大学医学部附属病院で、ベリムマブの静脈内投与を受けている2 名の SLE 患者から、血液サンプルを採取した。血液サンプルは、エチ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 （ E D TA ） 抗 凝 固 剤 が 入 っ た チ ュ ー ブ に 採 取 し 、
4℃、3500 rpm で 5 分間遠心分離を行い、血漿を分取した。分取した血漿に、アプロチニン（10 µg/mL, 1000:1 v/v）を添加した。血漿サ
ンプルは、測定まで-80℃で保存した。各血液サンプルは、血漿中ベリ
ムマブのトラフ濃度を測定するため、定期来院時のベリムマブ投与前に採血を行った。各患者から、合計 6 つの血液サンプルが収集された。
本研究プロトコルは、明治薬科大学の研究倫理審査委員会及び大分大学医学部附属病院の倫理委員会によって承認された（承認番号：201919、1628）。両患者は、本研究の科学的目的について、事前に説明を受け、研究への参加について書面による同意を行った。

2.9 データ解析と統計方法
検量線は、LabSolutions LCMS software を用いて、サロゲート
ペプチドと IS のピーク面積比を計算し、重み付き回帰分析（1/x）を行った。

37

3. 結果3.1 サロゲートペプチドの選択
ヒトには存在しない 9 つのユニークペプチドが in silico 解析で特定された（表 5）。

表 5

in silico 解析で得られたサロゲートペプチドの候補と特徴

軽鎖
又は
重鎖

位置

配列

軽鎖

2028

VTCQGDSLR

軽鎖

6190

軽鎖

91112

重鎖

1-19

重鎖

2438

重鎖

2959

重鎖

6067

FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCSSRDSSGNHWV
FGGGTELTVLGQPKQVQLQQSGAEVKKPGSSVRASGGTFNNNAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPMF
GTAK

Cys

Met

N 末端
Gln,
Glu

配列
一致性

9

有

無

非該当

89%
（8/9）

30

有

無

非該当

96%
（29/30）

22

無

無

非該当

93%
（12/15）

19

無

無

該当

94%
（17/18）

15

無

無

非該当

73%
（11/15）

31

無

有

該当

95%
（19/20）

8

無

無

非該当

86%
（6/7）

アミノ酸
長さ

YSQNFGRVAITADEST
85%
GTASMELSS
20 無
有
非該当
（17/20）LR
69%101- DLLLFPHHA
重鎖
15 無
無
非該当
115
LSPWGR（9/13）Cys（C） ： シ ス テ イ ン 、Met（M） ： メ チ オ ニ ン 、Gln（Q） ： グ ル タ ミ ン 、Glu（E）：グルタミン酸
配列一致性：クエリー配列とデータベース上のヒット配列の配列一致度
重鎖

6887

9 つのペプチドから、還元アルキル化が起こりやすいシステイン、酸化反応が起こりやすいメチオニン、ピログルタミル化が起こりやすい N
末端のグルタミンとグルタミン酸を含むペプチドは、反応性が高く、測38

定値に影響を与える可能性があるため、除外した。残った 4 つのペプチドから、UHPLC-MS/MS でトリプシン消化物を測定した際にピーク形状が良好であった DLLLFPHHALSPWGR をサロゲートペプチドとした（図 5）。このペプチドは、ベリムマ ブ H 鎖の 101-115 番目に位置するペプチドで、分子量は約 1760 であった。IS は、サロゲートペプチ
ド の 安 定 同 位 体 標 識 ペ プ チ ド で あ る 、DLLLFP*HHALSP*WGR（P*：13C5H915NO2）とした。

図 5

UHPLC-MS/MS で測定した際のユニークペプチドのクロマトグラム

3.2 マススペクトルとクロマトグラムの特徴
エレクトロスプレー法で、サロゲートペプチドと IS の[M+2H]2+イオ
ンが生成した。サロゲートペプチドと IS のプリカーサーイオンとプロダ
ク ト イ オ ン は 、 そ れ ぞ れ 、m/z

880.2（2+） →m/z

1157.3、m/z

886.2（2+）→ m/z 1169.4 であった。UHPLC-MS/MS で 測定した
39

クロマトグラムにおいて、サロゲートペプチドと IS のピークはともにブラ
ンク血漿サンプルでは認められなかったが、LLOQ、QC、患者サンプ
ルでは鋭いピークが認められた（図 6）。サロゲートペプチドと IS の保
持時間は約 5.2 分で、全測定時間は試料注入から 11 分であっ た。

図 6

サロゲートペプチドと IS の UHPLC-MS/MS クロマトグラム

上から順に、ブランクサンプル（健常人ボランティアの血漿）、LLOQ サンプル
（2 µg/mL）、 high QC サンプル（600 µg/mL）、SLE 患者の血漿サンプ
ル（40.8 µg/mL）
UHPLC-MS/MS： 超 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ － タ ン デ ム 型 質 量 分 析 計 、ultra-high performance liquid chromatography with tandemm a s s s p e c t r o me t r y. I S ： 内 部 標 準 物質 、 i n t e r n a l s t a n d ar d ; L L OQ ：定 量 下 限 、lower limit of quantitation. QC： quality control.
SLE：全身性エリテマトーデス、systemic lupus erythematosus.

3.3 バリデーション結果
検量線範囲の 2-750 µg/mL における決定係数（r2）は、0.9988 以
上 で あ っ た 。LLOQ の 日 内 ・ 日 間 の 真 度 は 、 そ れ ぞ れ 102.4%107.8%、105.3%で、FDA ガイダンスで推奨される±20%以内であ40った（表 6）。QC における測定内の真度は、low QC、mid QC、highQC

が そ れ ぞ れ 、 91.2%-107.1%、92.2%-110.5%、91.6%-

108.6%、測定間の真度は、low QC、mid QC、high QC がそれぞれ、98.5%、99.4%、100.6%であった。QC における真度は、FDA ガ
イダンスで推奨される基準を満たした。LLOQ の日内・日間の精度[%
coefficient of variation（CV）]は、7.8%-12.7%と 10.7%であった。QC における測定内の精度は、low QC、mid QC、high QC がそれぞれ、3.5%-9.1%、2.0%-4.6%、2.7%-3.3%、測定間の精度は、
low QC、mid QC、high QC がそれぞれ、9.3%、8.3%、7.4%であった。真度と同様、精度も FDA ガイダンスにおける基準の範囲内であった（LLOQ は±20%以内、他の QC は±15%以内）。

表 6

日内・日間変動のバリデーション結果
血漿中ベリムマブ濃度（µg/mL）

日内変動
平均濃度
1
（µg/mL）
真度（%）
精度（%CV）
平均濃度
2（µg/mL）
真度（%）

LLOQ
2

Low QC
6

Mid QC
60

High QC
600

2.09

6.43

66.3

651.4

104.7

107.1

110.5

108.6

11.5

9.1

2.0

3.0

2.05

5.47

57.7

549.8

102.4

91.2

96.2

91.6

12.7

3.5

2.9

3.3

精度（%CV）
平均濃度
3（µg/mL）
真度（%）

2.16

5.84

55.3

600.0

107.8

97.3

92.2

100.0

精度（%CV）

7.8

4.6

4.6

2.7

105.3

98.5

99.4

100.6

10.7

9.3

8.3

7.4

日間変動
真度（%）
精度（%CV）

LLOQ：定量下限、QC：quality control、CV：変動係数41

選択性の評価は、健康なボランティア 6 名から採取した血漿を用いて行った。その結果、サロゲートペプチドと IS のピークは認められなかった（図 7）。

図 7

健常人 6 名の血漿を使用したサロゲートペプチドの選択性の評価

QC サンプルの固相抽出段階におけるサロゲートペプチドの回収率とマ ト リ ッ クス 効 果 の 範 囲 は、30.1%-63.1%、51.2%-119.8%であった（表 7）。回収率は低 かったが、IS で補正した回収率は 91.5%114.3%で、再現性が認め られた。マトリックス効果 は、 high QC でイ
オンサプレッションが確認されたが、IS で補正したマトリックス効果は96.9%-108.4%であった。
凍結融解安定性の真度は 85.2%-113.6%、24 時間オートサンプラ
ー内安定性の真度は 103.3%-114.1%と良好であった。

42

表

7

血漿中ベリムマブ濃度の固相抽出における回収率とマトリックス

効果
血漿中ベリムマブ濃度（µg/mL）
Low QC
6

Mid QC
60

High QC
600

35.7（33.2-37.3）

32.2（29.6-34.2）

28.5（28.1-28.8）

110.0（107.9-111.3）

103.5（102.1-104.3）

93.7（90.1-101.0）

マトリックス効果［%、平均（範囲）］

98.8（97.4-101.5）

92.5（90.8-94.2）

93.0（92.0-94.8）

IS で補正した
マトリックス効果［%、平均（範囲）］

105.4（104.7-106.8）

100.0（97.9-102.2）

103.7（101.2-106.3）

回収率
回収率［%、平均（範囲）］
IS で補正した回収率［%、平均（範囲）］
マトリックス効果

QC：quality control

3.4 ベリムマブの長期安定性
ベリムマブの長期安定性試験の結果、ヒト血漿におけるベリムマブの安定性は 7 日目に全保存条件（室温、4℃、-20℃、-80℃）で 85%を下回った（図 8A）。血漿中の消化酵素による影響が考えられたため、プロテアーゼ阻害薬のアプロチニンを添加して、再度、長期安定性の評価を行った。アプロチニンを添加したヒト血漿におけるベリムマブの安定性は、-20℃と-80℃では 90 日目まで、室温と 4℃では 30 日目
まで 85%以上を維持し、安定であった（図 8B）。アプロチニンを添加することにより、ベリムマブの安定性が向上した。

43

図 8 ヒト血漿、および、アプロチニンを添加したヒト血漿におけるベリムマブの安定性（A）ヒト血漿におけるベリムマブの安定性（B）アプロチニン添加ヒト血漿におけるベリムマブの安定性
保存条件：室温、4℃、 -20℃、-80℃で 7、30、90、135 日間保存
データは、平均値±SD で表示

3.5 SLE 患者の血漿中ベリムマブ濃度の測定
確立した定量法を用いて、2 名の SLE 患者の血漿中ベリムマブのト
ラ フ 濃 度 を 測 定 し た 。 患 者 1 は 、30 代 女 性 で 、 ベ リ ム マ ブ 10.14
mg/kg（1 回投与量 800 mg）を静脈内投与されていた。患者 2 は、
40 代女性で、ベリムマブ 10.13 mg/kg（1 回投与量 800 mg）を静脈内投与していた。全ての測定における血漿中ベリムマブ濃度は、検量線の範囲内であった（図 9）。患者 1、2 の血漿中ベリムマブのトラフ濃度の平均値及び標準偏差（mean ± standard deviation（SD））は、それぞれ、162.9 ± 24.7 µg/mL、40.5 ± 11.7 µg/mL であり、大きな相違が認められた。

44

図 9

SLE 患者 2 名の血漿中ベリムマブ濃度の経時的推移

ベリムマブを点滴静脈内投与した SLE 患者 2 名の血漿中ベリムマブのトラフ濃度を測定した（各患者 6 点）

4. 考察
本研究では、UHPLC-MS/MS を用いて、血漿中ベリムマブ濃度を測定する定量法を確立し、FDA ガイダンス 65) に基づいてフルバリデーションを行った。さらに、ベリムマブを投与した SLE 患者 2 名の血漿中ベリムマブ濃度を測定し、臨床適応性の確認を行った。
ベリムマブのサロゲートペプチドを決定するために、in silico 解析
で候補となった 4 つのユニークペプチドを UHPLC-MS/MS を用いて測定した。4 つのユニークペプチドから、2 つのユニークペプチドが
UHPLC-MS/MS で検出され、DLLLFPHHALSPWGR は、他の候補ペプチドと比較して、ピークが鋭く、形状が良好であったため、サロ45

ゲートペプチドとした。さらに、このペプチドは、ヒトの生体内物質との類似性が 69%と、他のペプチドと比較して低く、ヒト血漿中のベリムマ
ブの定量に適していた。バリデーション項目の 1 つである選択性の評
価では、サロゲートペプチドと IS のピークは、6 名の健康なボランティ
アの血漿では認められなかった。一方で、ベリムマブを投与した 2 名のSLE 患者の血漿では、サロゲートペプチドが認められた。これらのことから、今回サロゲートペプチドとした DLLLFPHHALSPWGR は、ヒト血漿中ベリムマブ濃度の定量に適したペプチドだと考える。今回の検討では、SLE 患者の血漿における選択性の評価は行っていないが、生体内に存在しないユニークペプチドをサロゲートペプチドとしている
ため、ベリムマブを投与していない SLE 患者では、健常人と同様に、
サロゲートペプチドのピークは検出されないと考える。
本定量法は、UHPLC-MS/MS を用 いて、ヒト血漿中のベリムマブ
濃度を定量する初の方法である。一方で、現在までに血中ベリムマブ
濃 度 の 定 量 法 と し て は 、 免 疫 学 的 測 定 法 が 使 用 さ れ て き た 。
Struemper らの臨床試験における血中濃度の報告では、電気化学発
光免疫測定法を用いていた。48) また、Saito らのベリムマブの母乳中移行性についての症例報告では、酵素免疫測定法を用いていた。59)
今回用いた LC-MS/MS 法は、免疫学的測定法における課題を解決することが可能であり、特異度が高く、幅広い濃度範囲を測定することが可能という利点がある。LC-MS/MS を用いた定量法の課題としては、一般的に、トリプシン消化など、前処理に時間がかかることが挙げられる。トリプシン消化にかかる時間は、使用するトリプシン消化キット
や試薬、分析対象物によって異なるが、他の抗体医薬品の定量法では、
4-15 時間の消化時間であった。50,61,63,66) 一方、本定量法のトリプ
46

シン消化時間は 2 時間であった。さらに、本定量法は固相抽出法を用いることにより前処理の短時間化を目指した結果、希釈や固相抽出を含めても前処理に要する時間は 4 時間と、簡便な定量法が確立できた。
本定量法のバリデーション結果は、FDA ガイダンスにおける基準の範囲内であった。65) 長期安定性においては、ベリムマブのヒト血漿中における安定性は、7 日目に 85%を下回った。この結果から、トリプシンを含む血漿中のプロテアーゼによって、ベリムマブが分解されていると考えられた。そのため、プロテアーゼ阻害薬のアプロチニンを添加した。アプロチニンを添加したヒト血漿におけるベリムマブの安定性
は、 -80℃において、30 日目で 92.9%-101.3%、90 日目で 83.0%93.3%と、安定性の改善が認められた。-80℃における安定性は、90日目でも、3 サンプル中 2 サンプルは 85%以上の安定性が保たれていたが、3 サンプル中 1 サンプルは、安定性が 85%を下回ったことから、患者検体を測定する際には、30 日以内に測定することとした。
確立した定量法を用いて、2 名の SLE 患者、各 6 サンプルの血漿中ベリムマブ濃度を定量したところ、全てのサンプルの血漿中ベリムマ
ブ濃度は、検量線 2-750 µg/mL の範囲内であった。ベリムマブの臨床試験結果を基にした薬物動態解析で算出された、静脈内投与製剤の 反復投与 時の 血清 中ベリ ムマ ブの 最小血清 中濃 度（Cmin）は 56µg/mL、最大血清中濃度（Cmax）は 313 µg/mL、皮下投与製剤の反復 投 与 時のた。

48,49)

Cmin は

97µg/mL、Cmax は

108µg/mL で あ っ

今回の患者検体における血漿中ベリムマブ濃度の定量結果と、ベリムマブの承認前における臨床試験を基にした薬物動態解析の結果から、本定量法は、ベリムマブを投与する患者の、ほぼ全ての血漿中ベリムマブ濃度（Cmin、Cmax）を定量することが可能であると考47

えられる。
今回、血漿中ベリムマブ濃度を定量した 2 名の患者間で、血漿中濃
度に大きな差が認められた。本研究までに、他の抗体医薬品における血中濃度の個体差の要因として、性別や体重、ADA、血清アルブミンが報告されている。53) しかし、ベリムマブについては、承認前の臨床試験の結果を基にした母集団薬物動態解析では、血中 IgG 濃度と全身クリアランスの正の相関、血中アルブミン濃度とクリアランスの負の相関が報告され、全身クリアランス、中心分布容積、末梢分布容積の個体間変動は緩やかであることが報告されたが、実臨床における血中濃度の個体差の有無や、個体差に影響する因子、血中濃度と有効性の関連についての報告は限られている。そのため、本研究で示唆された
血漿中ベリムマブ濃度の個体差について、より明らかにする必要性が
ある。

5. 小括
特異度が高い UHPLC-MS/MS による血漿中ベリムマブ濃度の定量法を確立し、フルバリデーションを行った。本定量法を使用して、ベリムマブを投与した 2 名の SLE 患者の血漿中ベリムマブ濃度を測定したところ、大きな個体差が認められた。

48

第 2 節 SLE 患者における血漿中ベリムマブ濃度の評価

1. 目的
本研究の対象薬であるベリムマブについて、現在、薬物動態に関する報告は、承認前における臨床試験での母集団薬物動態解析のみで、実臨床における血漿中ベリムマブ濃度の個体内変動及び個体間変動の有無については、報告が限られている。しかし、第 2 章の第 1 節において、ベリムマブを投与した SLE 患者 2 名の血漿中ベリムマブのト
ラフ濃度は、大きな個体間変動が認められた。
本研究では、実臨床においてベリムマブを投与する複数の SLE 患者を対象に、ベリムマブの血漿中トラフ濃度を測定し、その推移と患者間での相違を評価するための、単施設前向き研究を行った。さらに、
ベリムマブの投与量から血漿中ベリムマブ濃度を予測することが可能であるかを検討するため、ベリムマブの投与量と血漿中ベリムマブ濃度の関連性を評価した。

2. 方法
2.1 研究デザイン
対象患者は、2021 年 10 月から 2022 年 12 月の間に大分大学医学部附属病院で、ベリムマブの点滴静脈内投与を行った SLE 患者とした。2021 年 10 月以前からベリムマブを投与、継続していた患者と、
2021 年 10 月から 2022 年 12 月の間に新たにベリムマブによる治療を開始した患者が含まれた。全ての患者は、ベリムマブの点滴静注用製剤 10 mg/kg を初回、2、4 週とその後 4 週ごとに投与された。ベリ49

ムマブの投与量は、投与時の体重で決定したが、医師の裁量で増量・減量は可能とした。定期来院時のベリムマブ投与前に採血を行い、血漿中ベリムマブのトラフ濃度を測定した。
本研究は、明治薬科大学の研究倫理審査委員会、大分大学医学部附属病院の倫理委員会の承認を得た（承認番号：201919、1628）。
全ての患者は、研究参加前に、研究目的・研究内容の説明を受け、文書によるインフォームドコンセントを取得した。

2.2 血漿中ベリムマブ濃度の測定
血漿中ベリムマブ濃度は第 2 章第 1 節で確立した UHPLC-MS/MS法による定量法を用いた。64) ベリムマブの定量下限は、2 µg/mL であった。定量法における安定性試験の結果から、血漿サンプルは、プ
ロテアーゼ阻害薬のアプロチニンを添加して、-80℃で保存し、1 ヶ月以内に測定した。

2.3 統計解析
カテゴリー変数は、例数とパーセンテージで示し、連続変数は、平均 値 と 標 準偏 差 （SD） 又 は中 央 値 と四 分 位 範 囲 （IQR： 第 一 四分 位
（Q1）－第三四分位（Q3））で示した。血漿中ベリムマブ濃度の個体内変動は、変動係数（CV%）で評価した。
血漿中ベリムマブ濃度とベリムマブの投与量の関連性を評価するた
め、Graph Pad Prism 8（GraphPad Software, La Jolla, CA,USA）で血漿中ベリムマブ濃度と投与量の散布図を作成した。

50

3. 結果3.1 患者特徴
本研究には、13 名の SLE 患者が含まれた（表 8）。13 名中 10 名
は、試験を開始した 2021 年 10 月以前にベリムマブの投与を開始していた。3 名は、2022 年にベリムマブの投与を開始した。全ての患者は、SLE と診断され、標準治療のみでは疾患コントロールが困難であった
ため、標準治療に加えて、ベリムマブが投与された。ベリムマブの投与量は、9.75-10.64 mg/kg であった。血液サンプルの採取回数は、平均 9.6 回、範囲は 1-13 回であった。

表 8

患者特徴

性別

男性/女性

2/11
84.6

女性割合（%）
年齢（歳）
中央値（Q1-Q3）

40（35-51）

体重（kg）
中央値（Q1-Q3）

51.8（47.0-58.1）

BSA（m2）
中央値（Q1-Q3）

1.51（1.46-1.61）

ベリムマブ投与量（mg/kg）
平均値（SD）

9.87（0.45）

CRP （mg/L）
中央値（Q1-Q3）

0.8（0.5-1.2）

アルブミン（g/dL）
中央値（Q1-Q3）

4.04（3.79-4.28）

BSA：体表面積、CRP：C 反応性蛋白、
Q1：第一四分位数、Q3 第三四分位数、SD：標準偏差51

3.2 血漿中ベリムマブ濃度
血漿中ベリムマブのトラフ濃度の経時的推移を初回測定日から 365
日後までプロットした（図 10）。初回測定日からの観察日数は、平均355.2 日で、範囲は 3-767 日であった。全ての血漿中ベリムマブのト
ラフ濃度は、検量線の範囲内であった。血漿中ベリムマブのトラフ濃度の 平均 値 ±SD は 、79.3±49.8µg/mL、 中 央 値 と IQR は 、63.4（41.9-108.9） µg/mL であった。血漿中ベリムマブのトラフ濃度の最小値は 13.8 µg/mL、最大値は 211.2 µg/mL であった。今回の測定において、血漿中ベリムマブのトラフ濃度の最小値と最大値では、10倍以上の大きな個体間変動が認められた。

図 10

患者ごとの血漿中ベリムマブ濃度の経時的推移52血漿中ベリムマブのトラフ濃度が最も低かった患者では、平均濃度±SD が 44.6±14.8 µg/mL であった。一方、血漿中ベリムマブのト
ラフ濃度が最も高かった患者では、平均濃度±SD が 170.0±16.6µg/mL で あ っ た （ 図 11） 。 血 漿 中 ベ リ ム マ ブ 濃 度 の 個 体 内 変 動 のCV%の範囲は、9.7%-35.7%であった。CV%が 30%以上であった 3名の患者では、血漿中ベリムマブのトラフ濃度が低く、その他の患者では、CV%の範囲は、9.7%-20.4%であった。

図 11

患者ごとの血漿中ベリムマブ濃度の変動

533.3 血漿中ベリムマブ濃度と投与量の関連性
単回の投与量（mg）と血漿中ベリムマブのトラフ濃度の平均値、単回の体重当たりの投与量（mg/kg）と血漿中ベリムマブのトラフ濃度の平均値の関連性をそれぞれ評価した（図 12）。

図 12

平均血漿中ベリムマブ濃度と投与量の関連性（A） ベリムマブ投与量（mg）と平均血漿中ベリムマブ濃度の関連性（B） ベリムマブの体重当たりの投与量（mg/kg）と平均血漿中ベリムマブ
濃度の関連性

関連性の評価では、ベリムマブの投与開始 4 回以内で定常状態に達していないと考えられた患者 2 名と、期間中に投与量を変更した患者 1 名を除外して、10 名の結果を用いた。
単回の投与量（mg）、単回の体重当たりの投与量（mg/kg）と血漿中ベリムマブのトラフ濃度の平均値の間には、いずれも関連性は認められなかった。承認用量である 10 mg/kg を投与しても、血漿中ベリム
マブ濃度に大きな幅が確認された。

54

4. 考察本研究では、実臨床における SLE 患者の血漿中ベリムマブ濃度の推移と患者間での相違を評価した。その結果、血漿中ベリムマブのトラ
フ濃度の個体内変動は小さく、個体間変動は大きいことが明らかになった。また、ベリムマブの投与量と血漿中ベリムマブのトラフ濃度の間に関連性は認められなかった。本研究は、実臨床における SLE 患者の血漿中ベリムマブのトラフ濃度を評価した最初の研究である。
今回、測定を行った患者サンプルにおける血漿中ベリムマブ濃度の平均トラフ濃度は、79.3
13.8-211.2µg/mL、中央値は 63.4

µg/mL、範囲はµg/mL で、これまでに報告された値より平均値で 10µg/mL ほど高かった。37,48,67) 他の報告された血中ベリムマブ濃度と比較すると、濃度が高い患者が複数人認められたことが、本研究における血中ベリムマブ濃度の特徴であると言える。ベリムマブは、第Ⅱ相試験で、ベリムマブ 20 mg/kg の投与を行ったが、有効性と安全性ともに、他の投与量群（1 mg/kg、4 mg/kg、10 mg/kg）と比較して、有意な差は認められなかった。68) 一方で、他の抗体医薬品であるア
ニフロルマブやセツキシマブでは、高用量で有害事象の増加が報告されている。69)

そのため、血中濃度の大きな差が認められた実臨床において、血中ベリムマブ濃度と有効性や安全性との関連が認められないかについては、さらなる検討が必要であると考えられる。
本研究で観察された大きな個体間変動は、代謝経路の個体差によるものである可能性がある。さらに、現在までに報告されている血漿中ベ
リムマブのトラフ濃度と、本研究で測定したトラフ濃度との差は、TMDD や IgG の代謝に関与する FcRn を介したリサイクリング機構といった、代謝経路の個体差によるものである可能性が考えられる。また、55

他の血中濃度の変動要因としては、体内からの消失率を増加させることが報告されている ADA の出現が報告されている。19,58)
T MDD に つ い て は 、 ベリ ム マ ブ は 、 BLyS に よっ て媒 介さ れる 代 謝
経路が 示唆さ れてい る 。 4 9 ) ベリ ムマ ブの 臨床試験では、 BLyS の 血中濃度の中央値が、1.31ng/mL と報告された。48) Elbirt らの研究では 、 健 常 人 に お け る 平 均 血 清 中 B Ly S 濃 度 ± S D は 、 0 . 3 2 ± 0 . 9 6
ng/mL、SLE

患 者 で は 、3.37±3.73

ng/mL）と報告さ れ た。70)

ng/mL（ 範 囲 ：0.3-22.6

血 中 BLyS 濃 度 は 、 健 常 人 と 比 較 し て

SL E 患者で高い が 、い ずれの 報告におい ても、血中 BLyS 濃度 はベ
リムマブの血中濃度よりも低く、モル濃度で換算しても、ベリムマブよりも数桁低い 。したが って、 BLyS に よる ベリ ムマ ブの 薬物動態への 影響
は 小 さ い と 言わ れ て い る 。 4 9 ) BLyS と ベ リ ムマ ブ が 結合 し て でき る 免
疫複合体は、主に脾臓の食細胞による Fcγ受容体（FcγR）依存性のメカニズムを通じて除去される。71) また、FcγR の遺伝子型が、免疫複合体のクリアランスに大き な影響を与えることが示唆されている。

72)

さらに、SLE では、疾患活動性に応じて、FcγR の発現率が変化し、免疫複合体のクリアランスに影響を与えることが示唆されている 。7 3 ) こ れらの FcγR の 個体差の 報告から、血中 BLyS 濃度は 、ベリムマブの血中濃度に比べて低いが、血中ベリムマブ濃度の個体差の原因にならないと、断言することはできないと考える。また、SLE の疾患活動性により FcγR の発現率が変化することから、患者個人の疾患
活動性の変化が血漿中ベリムマブ濃度に影響する可能性がある。
今回確認された血漿中ベリムマブ濃度の個体間変動の原因は、FcRn を介した抗体リサイクリング機構が大きく関係していると考える。
抗体医薬品の薬物動態に対する FcRn の影響はまだ研究段階であり、56

不明な点が多くある。55) しかし、抗体医薬品は IgG と競合して FcRnに結合し、血液中にリサイクル（再循環）されることが明らかになっている 。 7 4 ) こ の Te r n a n t ら に よ る 報 告 は 、 I g G の ア ロ タ イ プ に よ っ て 、 イ ン
フリキシマブの半減期が大きく異なることを示した。半減期が大きく異なった原因として、IgG の抗体の CH1 ドメインに位置するアロタイプである G1m3 と G1m17 の組み合わせに応じて FcRn に対する親和性が変化し、抗体医薬品の FcRn への結合に影響を与えることが示唆されている。日本人では、G1m3 ホモ、G1m17 ホモ、G1m3/G1m17 ヘテ
ロがそれぞれ、2.0%、76.1%、21.9%を占めると報告されている。75)
一 方 、 フ ラ ン ス の 研 究 で は 、G1m3

ホ モ 、G1m17

ホ モ 、

G1m3/G1m17 ヘ テ ロ は そ れ ぞ れ 、51．8%、9.4%、38.8%で あ り 、
人種内及び人種間で差が認められたと報告されている。76) IgG1 だけではなく、IgG の人種差については世界を対象とした研究があり、人種によってアロタイプが大きく異なることが報告されている。

77)

本研

究で測定した血漿中ベリムマブ濃度が一部の患者で高く、以前報告された 血中濃 度と異 なってい たこと は、IgG の遺伝的多 型が関与し 、FcRn によるリサイクリング機構が個体間変動に関与している可能性が考えられる。
他の抗体医薬品で体内動態への影響が報告されている ADA につ
いては、第Ⅲ相試験の BLISS-52 と BLISS-76 において、抗ベリム
マブ抗体の発現率は 0.7%（参加患者 563 名中 4 名）と報告された。

9)

さらに、アジア人を対象とした第Ⅲ相試験の BLISS-NEA では、抗ベリムマブ抗体の発現率は 0.2%（参加患者 470 名中 1 名）であると報告された。40) 本研究では、ADA の測定は行っていないが、ベリムマブの ADA の発現率は低く、個体内変動及び個体間変動の原57

因である可能性は低いと考えられる。
抗体医薬品では、上記のようなクリアランスの個体差だけでなく、分
布容積についても考慮する必要がある。抗体医薬品の分布容積は、全血漿量以上かつ、全血漿量と細胞外液との和以下であると言われている。他の抗体医薬品では、体重以外の要因による分布容積の増加が検討され、トシリズマブの母集団薬物動態解析では総蛋白の増加による分布容積の低下とアルブミンの増加による分布容積の増加が報告された。53) 一方、ベリムマブでは、母集団薬物動態解析で、体重による分
布容積の増加が報告されたが、体重以外の要因による分布容積の変動は明らかになっていない。49)

今後の研究により、明らかになることが期待される。
また、今回対象となった 13 名の患者は、併存疾患や併用薬が、承認前の臨床試験より幅広いことも、血中ベリムマブ濃度に幅が認められた要因と考えられる。抗体医薬品のインフリキシマブでは、併用薬のメトトレキサートによる動態の変化が報告されている。78) 一方で、ベリ
ムマブでは、臨床試験において、HCQ とグルココルチコイドの併用による影響は認められなかったものの、他の併用医薬品による影響は検討されていない。今後、他の併用医薬品による影響については検討が必要であると考えられる。
本研究では、ベリムマブの投与量から、血漿中ベリムマブのトラフ濃度を予測可能であるかを検討するため、ベリムマブの投与量と血漿中
ベリムマブのトラフ濃度の関連性を評価した。その結果、単回の投与量（mg）と血漿中ベリムマブのトラフ濃度の関連性は認められなかった。
さらに、体重あたりの投与量（mg/kg）と血漿中ベリムマブのトラフ濃度も関連性は認められず、同じ用量（10 mg/kg）を投与しても、患者ごと58

に大きく血漿中ベリムマブのトラフ濃度が異なった。このことから、投与量から血漿中ベリムマブ濃度を予測することは困難であることが明らかになった。承認用量に従って投与しても、血漿中ベリムマブのトラフ濃度が大きく異なることから、ベリムマブの血中濃度測定の有用性が示唆された。
本研究の限界点は、サンプルサイズが小さいことが挙げられる。サン
プルサイズが小さいことが、血漿中ベリムマブ濃度と投与量の関連性が認められなかった原因である可能性が否定できない。しかし、少数の患者でも、最長 767 日と長期にわたって血漿中ベリムマブ濃度を測定し、個体内変動及び個体間変動の有無を評価できたことは、本研究の意義と考える。

5. 小括
実臨床でベリムマブを投与した SLE 患者における血漿中ベリムマブ
濃度のトラフ濃度を評価した結果、個体内変動は小さく、個体間変動が大きいことが明らかになった。また、ベリムマブの投与量と血漿中ベ
リムマブ濃度の関連性は認められず、投与量から血漿中ベリムマブ濃度を予測することは困難であることが明らかになった。このことから、患者個々における血漿中ベリムマブ濃度を測定することの有用性が示唆
された。

59

【総括】
本研究では、臨床薬学的視点から、ベリムマブの適正使用と治療効
果の向上に向けて、TDM の有用性を評価することを目的に、有効性の評価指標と薬物動態の側面から、TDM の実施における課題の解決を目指し、研究を行った。
第 1 章では、メタ解析による単一指標におけるベリムマブの有効性を評価した結果、ガイドラインで推奨される複数の単一指標（SLEDAI、
BILAG、PGA）におけるベリムマブの有効性が明らかになった。臨床現場においては、指標を用いた評価に加え、臨床所見や検査値を評価し、総合的に疾患活動性が評価されるが、複合指標だけでなく、単一指標でも有効性が認められたことは、臨床現場でベリムマブの血中濃度と有効性の関連を評価する際の、臨床現場や患者の負担軽減に繋がりうるという点で、意義が大きい。
第 2 章では、UHPLC-MS/MS による特異性が高い血漿中ベリムマ
ブ濃度の定量法を確立した。次に、確立した定量法を用いて、ベリム
マブが投与された SLE 患者の血漿中ベリムマブ濃度を測定し、血漿中ベリムマブ濃度に大きな個体間変動が存在することが明らかになった。ベリムマブの投与量と血漿中ベリムマブ濃度の関連性が認められず、投与量から血漿中ベリムマブ濃度の推測が困難であること、承認用量である 10 mg/kg を投与しても、血漿中ベリムマブ濃度が大きくばらつくことから、血漿中ベリムマブ濃度測定の有用性が示唆された。本研究で対象となった SLE 患者は 13 名と少ないが、1 年以上の長期にわたり経時的に血中濃度を測定することで、個体内変動が小さく、個体間変動が大きいという新たな知見を得ることができた。
本研究は、実臨床におけるベリムマブの有効性と血漿中トラフ濃度60に関する新たな知見を臨床現場に提供することができたと考える。今後、実臨床における血漿中ベリムマブ濃度と有効性、安全性や患者背景の関連を検討することにより、ベリムマブにおける TDM の有用性を明らかにすることで、ベリムマブの適正使用の推進及び治療効果の向上に大きく貢献することが可能となる。

61

謝辞

本研究に際し、終始ご懇篤なご指導、ご鞭撻を賜りました
大学 薬剤情報解析学研究室

明治薬科

大野 恵子 教授に厚く御礼申し上げ、謹んで感謝いたします。

本論文を作成するにあたり、貴重なご助言ご指導を賜りました

明治

薬科大学 薬物動態学研究室 花田 和彦 教授、明治薬科大学 薬理学
研究室 野澤 玲子 准教授、明治薬科大学 生体機能分析学研究室
月村 孝宏 講師に深く感謝いたします。

本研究を進めるにあたり、多くのご協力をいただきました
医学部附属病院

薬剤部の伊東

弘樹

教授、田中

遼大

大分大学
准教授、

小野 寛之 学士、大分大学医学部 内分泌代謝・膠原病・腎臓内科学講座の柴田 洋孝 教授、尾崎 貴士 助教に厚く御礼申し上げます。

研究活動を行うにあたり、様々なご助言とご助力を賜りました明治薬科大学 薬剤情報解析学研究室 鈴木 陽介 講師、小田 絢子 助手、研究室の皆様に深く感謝申し上げます。

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J.,

Cai

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Study

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of

W. ,

Group.,

Freimuth

BiologicaW. f o r

theActivity

andNeutralizing

Anti-B-

Lymphocyte Stimulator ( BLyS) Monoclonal Antibody:
A

Phase

I

Trial

in

Patients

with

SystemicLupus

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