薬剤性肝障害発症に 関与す る反応性代謝物の解明手法に関する研究
Studies for Identification of Reactive Metabolites Related to Drug-Induced LiverInjury

令和 4 年度 論文 博 士申請 者 長 直 樹 (Cho, Naoki)

薬剤性肝障害 (Drug-Induced Liver Injury, DILI) は、非臨床試験での発症の予測が困難であり 、多くの 患者に使用されて初めて明らかとなる。これまでに報告されている多 くの DILI 症例 において、薬物代謝酵素 cytochrome P450(CYP) に よ り 薬 物 か ら 生 成 し た 反 応 性 に 富 む 代 謝 物 (反 応 性 代 謝 物 ) の 関与が知られている 。反応性 代謝物は、核酸やタンパクと共有結合し細胞障害を誘発することで DILI 発 症の最初のステップを担う。そのため、DILI の発症原因となる反応性 代謝物 を同定することは、医薬品の研究開発において重要な課題である。そ こで、 ヒトにおける DILI の発症原因となる反応性代謝物の解明が求められ るが、 未だ確立した手法は無い。
高尿酸 血症 治療 薬 benzbromarone (BBR) は、稀に死に至る可能性のある重篤な肝障害を引き起 こすこ とが知られている。複数の反応性代謝物の存在が報告されているが、 ヒトに おける DILI の発症原因となる反応性代謝物は明らかとなっていない 。そ こで本研究では、BBR をモデル薬物として、ヒトにおける DILI の発症 原因と なる反応性代謝物を非臨床試験により解明することを目的とした。
第 一章

BBR の 反応 性 代 謝物の同定 1)

生体内 で生 成す る反 応性代 謝物の多くは、肝臓内に 5～10 mM という高濃度で存在する glutathione (GSH) による抱合反応を受け、解毒される。そのため、薬物の反応性代 謝物 を in vitro で解析する方法の一つとして、反応性代謝物を GSH によっ てトラ ップし、安定な GSH 付加体として検出する方法が広く用いられている 。
こ れ ま で に BBR の 主 要 代 謝 物 の 一 つ で あ る 1’位 水 酸 化 体 (1’-HydroxyBBR) が 、in vitro 試 験にお いて代謝を介した細胞毒性を示し、その細胞毒性は GSH の枯渇 によ り増強 すること が報告されている。そこで、肝障害の原因となり得る反応性 代謝物 が 1’-hydroxy BBR から生成するかを明らかにするため、GSH 存在下 、1’-hydroxy BBR をヒト肝ミクロソーム (HLM) と反応させたが、GSH 付加 体は検 出されず、6 位が水酸化された 1’,6-dihydroxy BBRの生成が認められた 。そこ で、1’,6-dihydroxy BBR から反応性代謝物が生成するかを明らかにす るため 、1’,6-dihydroxy BBR を 合成し、GSH 存在下、HLMと反応させたところ 、GSH 付加体 M1、M2 及び M3 の生成が認められた。
次に、各 反応 に関 与 する CYP 分子種を、CYP 発現系ミクロソーム及び CYP特異的阻害剤を用い て同定 した。1’-Hydroxy BBR から 1’,6-dihydroxy BBR への代謝は主に CYP2C9 によ り触媒されることが明らかとなった。また、1’,6dihydroxy BBR か ら M1 の生成は複数の CYP 及び非酵素条件により、M2 の生成は非酵素条件に より 、M3 の生成は CYP3A4 により触媒されることが明らかとなった。
以上よ り、1’-hydroxy BBR からの 1’,6-dihydroxy BBR の生成を介し複数の反応性代謝物が生成 するこ とが示された。また、各代謝過程には、CYP による代謝と非酵素的な 反応が 関与していることが示された (Fig. 1)。従って、1’-hydroxy BBR から 生成す る反応性代謝物が、肝細胞毒性発現に関与する可能性が示唆された。

Fig.1. BBR の 1’位 及 び 6 位水 酸 化 を 介 し た 新 規 代 謝 活 性 化 経 路

第二章

1’,6-Dihydroxy BBR か ら生 成 する 反応 性 代謝 物 と 肝障 害発 現 と の関 連性 2)
BBR は CYP3A4 によ り 1’-hydroxy BBR へ代謝されることが知られている。
また、第一章での検 討によ り 1’-hydroxy BBR から 1’,6-dihydroxy BBR へ変換され反応性代謝物 が生成 されるまでの反応に CYP の関与が示された。そこで、1’,6-dihydroxy BBR から生成する反応性代謝物が生体内で肝障害発症に関与するかを明ら かにす るため、3 種の CYP 誘導剤を前処置したマウス（ICR、雄、7 週令）に BBR を投与し、反応性代謝物の生成が肝機能に及ぼす影響について検討 を行っ た。
まず、 マウ スに おい て 1’,6-dihydroxy BBR の生成量を増加させる CYP 誘導剤を探索するため 、phenobarbital (PB)、pregnenolone16ߙ-carbonitrile (PCN)
及 び dexamethasone (DEX) を 投 与 し た マ ウ ス か ら 調 製 し た 肝 ミ ク ロ ソ ー ムを用い BBR を代 謝 させた 。その結果、PB、PCN 及び DEX 投与群の肝ミク
ロソームにおける 1’,6-dihydroxy BBR の生成量は、コントロール群と比較し、それぞれ約 1.2 倍、2.0 倍及び 4.0 倍であった。次に、in vivo における CYP
誘導剤による BBR の代謝 亢進効果を検討するため、PB、PCN 及び DEX を前投与したマウス へ BBR を 400 mg/kg 経口投与し、BBR の血漿中薬物動態を解析した。その結 果、PB、PCN 及び DEX 前処置マウスにおける BBR の血漿中濃度-時間曲線 下面積 (AUC) は、oil 前処置マウス (コントロール) のそれぞれ約 18%、11%及び 24%と 、BBR 代謝の亢進が認められた。そこで、
BBR 投与 6 時 間後 の肝臓 における GSH 付加体と 肝機能検査値を解析した。
その結果、肝臓 にお いて M2 が検出され、その生成量は、コントロールと比較し、PB、PCN 及び DEX 処置マ ウスでそれぞれ約 0.34 倍、1.3 倍及び 5.2倍であった。また、血漿 中 alanine amino transferase (ALT) 活性は、DEX 前処置マウスでのみ、BBR 投与前と比較し有意に上昇した (Fig. 2)。

ALT Activity (IU/L)

150

Before BBR
After BBR

P<0.01B
Hepatic GSH Adduct M2(control as 1)

A
1251007550250oil

PBPCN86420DEXoil

PB

PCN DEX

Fig. 2. BBR 投 与 後 の血 漿 中 ALT 活 性 (A)、 及 び 肝 に お け る M2 生 成 量 (B)以上よ り、 マウ スへ の DEX 前処置により、BBR から 1’,6-dihydroxy BBR
へ の 代 謝 と それ に 続 く M2 の 前駆 体 で ある 反 応性 代謝 物 の 代謝 生 成が 亢進し、肝障害を引き起 こす可 能性が示唆された。
第 三章

ヒトに おけ る BBR 肝障害 発現に関与する反応性代謝物の解明 3)

BBR に関しては、1’位及 び 6 位の水酸化を介して生成する反応性代謝物以外に、ベ ンゾフラン 環が酸 化され生成するエポキシドや、酸化的脱ハロゲン化 に よ り 生 成 す る キ ノ ン 体 、 イ プ ソ 置 換 を 介 し て 生 成 す る 2,6-dibromo-pbenzoquinone (DBBQ) 及び 2,6-dibromohydroquinone (DBH) といった複数の反応性代謝物が報告 されて いる。これら反応性代謝物は in vitro 試験系や非臨床動物実験におい て生成 が認められているが、ヒト生体内での生成は明らかとなっていない 。そこで 本章では、ヒト生体内で生成する反応性代謝物を明らかにするため、肝臓 の 95%以上がヒト由来肝へ置換されたマウス (ヒト肝キメラマウス) を 用い検 討を行った。
ヒト肝 細胞 を移 植し たマウ スは、様々な薬物でヒトと同様の薬物代謝プロファイルを示す有用 なツー ルとして知られている。そこでまず、TK-NOG マウス (コ ント ロー ル 、雄、12-13 週齢) 及び TK-NOG マウスの内因性肝細胞をヒト肝細胞に置換 したマ ウス（ヒト肝キメラマウス、雄、15-16 週齢）へ
BBR を 20 mg/kg 経 口 投与し 、BBR、主要代謝物 1’-hydroxy BBR 及び 6-hydroxyBBR の薬物動態パ ラ メータ とヒト既報値 4) を比較した。その結果、BBR 及び代謝物の AUC 比 (BBR: 1’-Hydroxy BBR: 6-Hydroxy BBR) は、コントロールにおいて 1: 0.2: 2.8 であ ったのに対し、ヒト肝キメラマウスでは 1: 1.2: 0.7であった。ヒト肝 キ メラマ ウスにおける BBR 及び代謝物の AUC 比が、ヒトにおける AUC 比 (1: 0.9: 0.7) とよく一致したことから、ヒト肝キメラマウ
スはヒトにおける BBR の薬物動態を再現すると考えられた。
次に、BBR を投与 し たヒト肝キメラマウスの血漿、肝臓、尿を用いて、生体内における GSH 付加体 の解析を 行った。その結果、BBR の 1’位及び 6 位の水酸化を介して生 成する 複数の GSH 付加体（M2 及び M3 を含む）と、ベンゾフラン環への GSH 付加体が検 出された。ベンゾフラン環への GSH 付加体の前駆体 (反応 性 代謝物) は、過去の報告より、ベンゾフラン環が酸化されたエポキシドと推 定され た。これら反応性代謝物の GSH 付加体とその更なる代謝物は、コン トロー ルと比較し、ヒト肝キメラマウスの組織中において高い生成量を示し たこと から、マ ウスへ移植したヒト肝細胞においてこれら反応性代謝物が生 成した と考えられた。
以上よ り、1’位及 び 6 位の水酸化並びにベンゾフラン環のエポキシ化を介し生成する反応性代 謝物が in vivo 環境内のヒト肝細胞において生成したことから、これら反応 性代謝 物はヒト生体内においても生成し、DILI 発症に関与すると考えられた (Fig. 3)。
Fig. 3.ヒ ト 生 体 内 に お け る BBR の 反 応 性 代 謝 物 の 推 定 生 成 経 路

総括
本研究では、BBR の新規 反応性代謝物を同定し、その反応性代謝物のヒト生体内における生成 と DILI 発症へ の関与を示唆した。これにより、本研究で 用いた一 連の手 法 が 、DILI 発症原因 となる反応性代謝物 の同定に有用であることを示した。
本研究 の成 果は 、開 発中の 候補医薬品や上市済みの医薬品による DILI の発症原因となる反応 性代謝 物の同定の迅速化に繋がるものであり、より安全な医薬品の開発に貢 献でき ると考えられる。
《 参考文献 》
1) Cho N., Kobayashi K., Yoshida M., Kogure N., Takayama H., Chiba K., DrugMetab. Pharmacokinet., 32, 46-52 (2017).
2) Yoshida M., Cho N., Akita H., Kobayashi K., J Biochem. Mol. Toxicol., 31,e21946 (2017).
3) Cho N., Suemizu H., Kamimura H., Ohe T., Ito F., Akita H., Kobayashi K.,
Drug Metab. Pharmacokinet., 47, 100467 (2022).
4) De Vries JX., Walter-Sack I., Ittensohn A., Weber E., Empl H., Gresser U.,
Zollner N., Clin. Invest., 71, 947-952 (1993).