カラスタケ（Polyozellus multiplex）からのアルツハイマー病治療薬の探索
Search for anti-Alzheimer’s Disease Drugs from Fruiting bodies, Polyozellus multiplex

令和 3 年度入学
中林 祥子 (Nakabayashi, Shoko)

指導教員
高取 (木下) 薫

目次
序論 ................................................................................................................................... 1
第 一 章 キノコ ......................................................................................................... 1
第 二 章 アルツハイマー型認知症 ............................................................................ 6
第 一 節 アルツハイマー型認知症の現状 ............................................................. 6
第 二 節 アミロイドカスケード仮説に基づく薬剤開発 ....................................... 8
第 三 節 低分子化合物......................................................................................... 10
第 四 節 A の分解の促進 .................................................................................. 12
第 五 節 食品摂取による認知症の予防 ............................................................... 14
本論 ................................................................................................................................. 16
本研究の目的 .............................................................................................................. 16
第 一 章 キノコ子実体抽出エキスの作製と A 凝集抑制活性の評価 .................. 18
第 二 章 カラスタケ MeOH 抽出エキスからの抗 AD 活性化合物の探索........... 22
第 一 節 カラスタケ (Polyozellus multiplex) ........................................................ 22
第 二 節 カラスタケ MeOH 抽出エキスから A凝集抑制活性を指標とした活性化合物の分離・精製 ............................................................................................ 25
第 三 節 化合物の構造解析 ................................................................................. 27

第 四 節 A 凝集抑制活性試験........................................................................... 41
第 五 節 BACE 1 阻害活性試験 .......................................................................... 47
第 六 節 ヒト神経芽細胞腫 SH-SY5Y 細胞を用いた Aによる毒性の軽減効果................................................................................................................................. 50
結語 ................................................................................................................................. 54
実験項 ............................................................................................................................. 56
参考文献 ......................................................................................................................... 70
謝辞 ................................................................................................................................. 80

Figure 一覧
Figure 1.

Whittaker’s five kingdoms system ··············································· 1

Figure 2.

Structures of boletopsin C and polyozellic acid································· 3

Figure 3.

Isolated compounds from mushroom Hericium erinaceus ···························· 4

Figure 4.

Structures of hypoxylonol C and daldiquinone ································· 5

Figure 5.

Structures of approved anti-AD drugs ··········································· 7

Figure 6.

Amyloid cascade···································································· 9

Figure 7.

Structures of tramiprosate and ALZ-801········································ 10

Figure 8.

The illustrated three mechanisms of amyloid peptides ························ 12

Figure 9.

Amyloid cascade and purpose of this research ································· 17

Figure 10.

Th-T Method and Principle for Detecting AFibril ··························· 19

Figure 11.

Method of Th-T assay ····························································· 19

Figure 12.

The morphological characteristic of fruiting bodies P. multiplex ················ 22

Figure 13.

Isolated compounds from P. multiplex ························································· 24

Figure 14.

Isolation procedure of P. multiplex MeOH extract····························· 26

Figure 15.

The structure of Comp. 1: polyozellin ·········································· 27

Figure 16.

The structure of Comp. 2: kynapcin-12 ········································· 29

Figure 17.

The structure of Comp. 3: NSC617425 ········································································ 31

Figure 18.

HMBC Correlations for part of Comp. 4: cycloleucomelone in CD3OD ··· 33

Figure 19.

The structure of Comp. 4: cycloleucomelone ·································· 34

Figure 20.

HMBC Correlations for part of Comp. 5: Bl-V in DMSO-d6··························· 35

Figure 21.

The structure of Comp. 5: Bl-V ·················································· 36

Figure 22.

The structure of Comp. 6: succinic acid ········································ 37

Figure 23.

HMBC Correlation of Comp. 7: protocatechuic acid in DMSO-d6 ················ 39

Figure 24.

The structure of Comp. 7: protocatechuic acid································· 39

Figure 25.

Structures of isolated Comp. 1–11··············································· 42

Figure 26.

Structure-Activity Relationship of Comp. 1–11 ······························· 44

Figure 27.

Site-specific inhibitory proposed of A42 aggregation by (+)–taxifolin ····· 45

Figure 28.

Structure of kaempferol ··························································· 45

Figure 29.

Theory of BACE1 assay ·························································· 47

Figure 30.

Method of BACE1 assay ························································· 48

Figure 31.

Method of protective effect on SH-SY5Y against A toxicity assay ········ 51

Figure 32.

Cytotoxicity of Comp. 1–7 on SH-SY5Y cells································· 52

Figure 33.

Protective effects of seven compounds on SH-SY5Y cells against A

toxicity ······························································································· 53
Figure 34.

Isolation Procedure of P. multiplex MeOH extract ···························· 63

Table 一覧
Table 1.

Classification of fungi ·································································· 2Table 2.

A aggregation inhibitory activities of 55 kinds each of CHCl3 and MeOH extracts

for a total of 110 extracts ·············································································21
Table 3.

13

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 1 in DMSO-d6 ········································28

Table 4.

13

Table 5.

13

Table 6.

13

Table 7.

13

Table 8.

13

Table 9.

13

Table 10.

A aggregation inhibitory activities of Comp. 1–11 ······························43

Table 11.

BACE1 inhibitory activities of Comp. 1–11 ········································49

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 2 in DMSO-d6 ········································30
C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 3 in CD3OD ···························32
C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 4 in CD3OD ···························34
C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 5 in DMSO-d6 ········································36
C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 6 in DMSO-d6 ········································38
C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 7 in DMSO-d6 ········································40

略語一覧
A

amyloid betaAc

acetylAChacetyl choline

AD

Alzheimer’s Disease

APP

Amyloid precursor proteinsAPPsecretory APP

BACE1

-site APP cleaving enzyme 1

Calcd.

calculated

C. C.

column chromatography

CHCl3

chloroform

DMSO

dimethyl sulfoxide

EIelectron ionization

ESI

electrospray ionization

ext.

extract

FAB

fast atom bombardment

FBS

fetal bovine serumFr.

fraction

HMBC

heteronuclear multiple quantum bond spectroscopy

HMQC

heteronuclear multiple quantum coherence spectroscopyHRhigh resolution

insol.

insoluble part

NMR

nuclear magnetic resonance

MeOH

methanolMS

mass spectrometry

ODS

Octadecyl silylated silica gel

r. t.

room temperature

Si.

Silica gel

Th-T

Thioflavin T

序論
第 一 章 キノコ

生物の世界は，1969 年に Whittaker によって，モネラ界 (Monera)，原核生物界(Protoctista)，植物界 (Metaphyta)，菌界 (Fungi)，動物界 (Metazoa) の 5 界説が提唱され，菌界は植物界と動物界とは異なった界として扱われた．植物は生産者，動物は消費者，菌類は還元者として位置づけられ，3 者が相互に結びつき合って生態系の物質の循環が行われている (Figure 1).1)

Figure 1. Whittaker’s five kingdoms system.

菌類の定義は，有核で，光合成色素を欠き栄養生殖で，有性あるいは無性的に繁殖する生物群で，多くの場合，糸状で分岐する栄養体で構成され，胞子を形成し，細胞壁はキチンあるいはセルロースからなる生物である.2)
菌類は菌糸という糸状の構造からなる．この菌糸が広く蔓延している状態をカビと呼んでいる．菌の種類によっては，カビの状態のものが，ある特別な時期になると，肉眼で判断できるほど大型の特別な器官，すなわち子実体を作る．この子実体を一般的にキ1

ノコと呼んでいる．子実体は，子嚢菌の一部と担子菌によって形成され，森林などにおいては担子菌の帽菌網に属するものが豊富に生息している.3) Hibbett らは，菌類の分類体系を提唱し，7 つの門と 4 つの亜門に分け，このうち子実体を形成する子嚢菌と担子菌類を二核菌亜界に分類した (Table 1).4)

Table 1. Classification of fungi.
界

亜界

門

亜門

(Kingdom)(Subkingdom)(Phylum)(Subphylum)

菌界

二核菌亜界

子嚢菌門

(Fungi)(Dikarya)(Ascomycota)
担子菌門(Basidiomycota)
ツボカビ門(Chytridiomycota)
ネオカリマスティクス菌門(Neocallimastigomycota)
コウマクノウ菌門(Blastocladiomycota)
微胞子虫門(Mycrosporidia)
グロムス菌門(Glomeromycota)
ケカビ亜門(Mucoromycotina)
ハエカビ亜門(Entomophthoromycotina)
トリモチカビ亜門(Zoopagomycotina)
キックセラ亜門(Kickxellomycotina)2

担子菌は子嚢菌についで多く，産生する二次代謝産物には他の菌類にみられない特徴があるが，その 1 つとして高等植物に似てシキミ酸経路が発達していることが挙げられる．例えば，担子菌門に属しているキノコ子実体のクロカワ (Boletopsis leucomelas) より単離された boletopsin C は，シキミ酸経路で生合成される terphenyl 化合物で，受容体型チロシンキナーゼの一種である血管内皮細胞増殖因子受容体 (Vascular Endothelial
Growth Factor Receptor-2, VEGFR2) 阻害活性が報告されている.5) 同じくカラスタケ(Polyozellus multiplex) より得られた polyozellic acid 等の p-terphenyl 類もシキミ酸経路
で生合成される二次代謝産物である (Figure 2).6)

Figure 2. Structures of boletopsin C and polyozellic acid.

また，キノコ子実体からはイソプレノイド経路で生合成される二次代謝産物も多く，
マンネンタケ(Ganoderma lucidum) に含まれるトリテルペン類である ganoderic acid

は，抗腫瘍効果に加え,7) 抗 HIV,8) 抗高血圧，血管新生阻害,9) 免疫調整,10) 抗アンドロ
ゲン，抗 HBV，抗酸化作用11) が報告されている．また，トリテルペン以外にもセスキテルペンやステロイドも多くみられ,12) 酢酸-マロン酸経路で生合成されるポリアセチ
レンもみられる．
カワラタケ (Trametes versicolor) の菌糸体から抽出された多糖とタンパク質複合体からなる krestin は副作用の少ない抗腫瘍薬として開発され，1976 年から 2018 年まで
胃，直腸，結腸，小細胞肺がんに対して使用されていた．また，チョレイマイタケ(Polyporus umbellatus) の菌核は生薬、猪苓として用いられ，利尿作用，抗脂肪肝作用，

3

抗腫瘍作用，血小板凝集増強作用が知られている．冬虫夏草は主に昆虫に菌が寄生し，さらに子実体が形成されたものの総称である．その 1 種であるツクツクボウシタケ(Isaria sinclairi) から単離された myriocin をもとに構造を変換した fingolimod は，臨床で多発性硬化症に対して使用されているが，リンパ球の細胞表面上の S1P1 受容体に作用し免疫抑制作用を発揮することが明らかとなっている. 13-15)また，生薬では猴頭として知られるヤマブシタケ (Hericium erinaceus) から神経軸策の伸長や神経伝達物質の合成促進等に関与するタンパク質である神経成長因子 (nerve growth factor, NGF) 誘導活性を有する化合物探索の結果, 活性成分として hericenone D や erinacine C が報告されている (Figure 3).16-18) このように，キノコ類は多様性に富んだ構造を有する種々の二次代謝産物を産生している．しかしながら，その生物学的意義やその制御機構，ならびにそれらに関与する多くの疑問は未だ解明されていない．以上のことから，独特の二次代謝産物を産生するキノコ子実体は研究材料としての有用性があるといえる.

Figure 3. Isolated compounds from mushroom Hericium erinaceus.
a: hericenone D from fruiting bodies, b: erinacine C from mycelium.

このような背景から当研究室ではキノコ子実体を用いた生物活性成分の探索研究を行っており, これまでにクロコブタケ (Hypoxylon truncatum) から血管新生阻害活性をもつ benzo[j]fluoranthene 類の hypoxylonol C や, チャコブタケ (Daldinia concentrica)から HUVECs 増殖抑制活性を有する naphthoquinone 類の daldiquinone 等を報告している (Figure 4).19-21) そこで, 本研究においても未開拓な薬用資源であるキノコ子実体

4

を研究材料として研究に着手することとした.

Figure 4. Structures of hypoxylonol C and daldiquinone.

5

第 二 章 アルツハイマー型認知症
第 一 節 アルツハイマー型認知症の現状

認知症とは，一度正常に発達した知的機能が後天的な脳の器質的障害により持続的に低下し，日常生活や社会生活に支障をきたす状態と定義される神経変性疾患である．
認知症の症状は，中核症状と行動・心理症状の2つに分かれ，中核症状は記憶障害，見当識障害，失認・失語・失行，実行機能障害といった脳の器質障害によって引き起こされる症状であり多くの認知症患者でみられる．行動・心理症状は不安，不眠，暴言，暴力，拒否，徘徊，幻覚などの中核症状によって引き起こされる二次的な症状であり，性格や心理状況が原因となって起きる．認知症の症状がおこる疾患の内訳は，アルツハイ
マー型認知症 (Alzheimer’s disease: AD)，血管性認知症，レビー小体型認知症で全体の9割を超え，その中でも AD が最も頻度が高い.22)
WHO が 2021 年に発刊した Global status report on the public health response to dementiaによれば，AD の有病者数は男女ともに，年齢とともに徐々に増加し続けており，2019
年には世界で 5520 万人と推定されている.23) 日本国内においても「平成 26 年度日本
における認知症の高齢者人口の将来推計に関する研究」によると全国の AD 患者数は2025 年に 466 万人になると推計され, 2040 年までに 550 万人，2060 年には 600 万人に上ると推定されており,24) 世界および日本における AD 患者数は増加の一途を辿ることが予想されている. AD 患者数の増加に伴い，必要とされる社会的コストも増大している．社会的コストには医療費や介護費だけでなく，家族や近親者が無償で行うケ
アであるインフォーマルケアコストも経済的な影響として見込まれており, AD に関する全世界の社会負担額は 2019 年では 1.3 兆米ドルで，2030 年には 2.8 兆米ドルに増加すると予想されている．さらに，介護者の生産性の低下や若年性認知症の患者の早期退職など社会や患者をとりまく家族にとっても大きな影響を及ぼす．また，認知症の重症度も経済的負担の増加への重要な要因であり，軽度の認知症では 16,000 米ドル，中6

度の認知症では 27,000 米ドル，重度の認知症では 36,000 米ドルであり, 1) これらのコストを下げるためにも AD の予防または重症化を防ぐ新規 AD 治療薬の開発ニーズ
はさらに高まっている.
一般的な AD 治療薬は認知症の中核症状の改善を目的としており，日本ではしばら
くの間，アセチルコリンエステラーゼ阻害薬 (acetylcholinesterase inhibitor, AChEI) である donepezil (Eisai), rivastigmine (Novartis) および galantamine (Janssen) と NMDA 型
グルタミン酸受容体阻害薬 (NMDA-type glutamate receptor inhibitor) である memantine(Daiichi Sankyo) の 4 種類の AD 治療薬が承認されていた (Figure 5)．しかしながら
これら薬剤の効能はいずれも症状の進行抑制であり、疾患そのものの進行抑制ではな
いため根本的治療薬の開発が求められている．

Figure 5. Structures of approved anti-AD drugs.

7

第 二 節アミロイドカスケード仮説に基づく薬剤開発

AD の病理的特徴としては，大脳皮質を中心に神経細胞の脱落と，脳実質に出現する
老人斑 (senile plaque, SP) ならびに神経原線維変化 (neurofibrillary tangle, NFT) がみられる．老人斑はアミロイド  (amyloid  A) から構成されており,25) 正常状態ではA は分解酵素であるネプリライシン (neprilysin, NEP) や脳の免疫細胞であるミクロ
グリアによって消失していくが，何らかの原因により過剰蓄積が起こることで，老人斑が形成され最終的に AD を発症すると考えられている．AD の発症機序は解明されてはいないが, Aが発症カスケードの最上流にあるというアミロイドカスケード仮説は有力とされている (Figure 6).26) Aは amyloid precursor protein (APP) と呼ばれる 1
回膜貫通型の前駆体タンパク質の部分断片であり, 細胞膜に存在するプロテアーゼ
(-secretase, BACE1) によって細胞外領域を切断され，次に細胞膜に存在するプロテアーゼ(-secretase) によって細胞膜内で切断されることによって産生，分泌される.27-29)
そして細胞外で様々な経路において分解を受ける．したがって secretase 活性の制御やA分解経路の活性化は AD 治療戦略として重要であると考えられている.30)
抗 A抗体製剤であるaducanumab (Biogen/Eisai) は，可溶性 oligomer や不溶性 fibrilと結合することで Aβ の沈着を低下させるヒトモノクローナル抗体製剤であり，アミ
ロイドカスケード仮説が臨床的に有用であることを証明した.31,32)
2 つの第 III 相臨床試験の結果でも, aducanumab を投与することで amyloid plaqueの減少が有意に示されており，初めての根本的治療薬として 2021 年 6 月 7 日に米国食品医薬品局 (Food & Drug Administration, FDA) より承認を受けた.33,34) さらに可溶
性 A 凝集体である protofibril と結合することで protofibril や amyloid plaque を減少させるヒト化 IgG1 モノクローナル抗体製剤である lecanemab (Biogen/Eisai ) が,35)2023 年 1 月 6 日に FDA より迅速承認を受け，日本国内においても2023 年 9 月
25 日に厚生労働省より承認を得た.

8

抗 A抗体製剤は初めての根本的治療薬となり，国内においても広く AD 患者に普及することが望まれているが，投与出来る対象患者は認知機能が正常と認知症の中間状態である軽度認知障害または軽度の認知症であり，早期の AD 患者のみが対象となり，中等度または重度 AD 患者の治療ニーズは残る．また，投与条件として，脳内のアミロイドの蓄積の有無をアミロイド PET もしくは脳脊髄液 Aを測定し確認する必要がある．しかしながら，現在のアミロイドPET が実施できる施設数は待機患者数に比べ十分な数であるとは言えず，待機時間や待機患者が現れることが予想されており，設備などの早急な対応が求められている．さらに抗体製剤は薬価が低分子化合物の製剤に比べ高額であるため，大幅な医療費増大の懸念が考えられる．

Figure 6. Amyloid cascade.

9第 三 節 低分子化合物

これまで様々な AD 治療薬の開発が行われているにもかかわらず期待できる臨床効
果が得られた薬剤は少ないが, AD 治療薬の開発を困難にしている原因の 1 つとして，血液から脳への物質輸送を制御する生体内バリア機能である血液脳関門 (blood brain
barrier, BBB) の存在が挙げられる. BBB では脳微小血管内皮細胞がバリア機能の中核をなし，脳の活動に必要な栄養素を選択的に輸送しているが，その一方で中程度または高分子量の薬剤の脳への送達は著しく制限している．一般的に，受動拡散により BBB
を通過して脳内に到達できる薬剤は分子量 450 未満の低分子で，脂溶性かつ水素結合
数 6 個以下という特性を有するものに限定される.36) 既に承認されている AChEI である donepezil, rivastigmine および galantamine は，いずれも分子量 198 から 380 で
あ り ， 水素 結 合 数 は 5 個 以 下 であ る . AD 治療 薬 の開 発 の 過 程 で見 い だ さ れ た
tramiprosate は，分子量 238 の海藻に含まれる硫酸化合物であり GABA 類似化合物である. A42 の 16 (Lys), 28 (Lys), 23 (Asp) に結合することにより A42 をモノマーの状態で安定化させ, oligomer と fibril amyloid の凝集を抑制することで，Aの沈着を軽減
し神経保護効果を示す.37-40) Tramiprosate のプロドラッグである ALZ-801 は (Figure 7),
AD 発現リスクが 3–12 倍程度高い APOE 4 型遺伝子保有者である APOE 4/4 または 3/441) を有する早期 AD 患者を対象とした第 2 相試臨床試験において，血漿 ptau 181 のレベルを下げ，海馬萎縮を抑え，認知機能をベースラインから向上させ,42) 認
知機能改善へ向けて期待出来る経口投与製剤である．

Figure 7. Structures of tramiprosate and ALZ-801.

10また前述の通り，受動拡散により BBB を通過して脳内へ到達できる薬剤は限定的であるため，効率的な BBB の通過を実現するドラッグデリバリーシステム (drug delivery
system, DDS) の開発は求められている． DDS の開発は，脳微小血管内皮細胞の内部を通 過 す る 経 路 (transcellular route) ， 脳 微 小 血 管 内 皮 細 胞 の 隙 間 を 通 過 す る 経 路(paracellular route) 等，多くの研究が行われている. DDS 研究の発展に伴い, BBB の通過が難しいと考えられていた化合物の脳内への輸送が期待出来る．

11

第 四 節 A の分解の促進

Aは，AD では多量に産生され、シナプスや記憶の機能障害を引き起こす. 一方で，A は正常な脳においても生涯を通じてシナプス活動中に少量が放出されており，低濃度では神経伝達と記憶に対してポジティブな調節機能を示すことや,43) 抗菌および抗真菌作用も報告されている．Aの抗菌活性のメカニズムとして (1) 細菌の細胞膜と相互作用して膜破壊を誘導,44,45) (2) 細菌によって内在化されタンパク質凝集を引き起こ
す,46,47) (3) タンパク質の立体配座を変化させてタンパク質の機能を破壊することが報
告されており48) (Figure 8)，A は脳の保護機能と損傷機能の両方を持つペプチドとして，その役割の解明が進められている．

Figure 8. The illustrated three mechanisms of amyloid peptides in antimicrobes activities,
which are membrane disruption and cell lysis, protein aggregations, protein conformation
change and function lost.49)

12脳内の Aは，健常人では II 型の膜貫通ペプチダーゼである NEP による分解やミ
クログリアによる貪食, BBB からの排出輸送機構により，クリアランス系と A産生
系のバランスが保たれているが-AD 症例では NEP 活性の低下，ミクログリアの炎症型への変化，BBB からの排出輸送機構の破綻や遺伝的要因による Aの産生量の増加などによって，クリアランス系がA産生系よりも相対的に小さくなることで，脳内の Aが除去されずに蓄積するNEP の活性化や排出輸送経路に着目した薬剤開発が進めば，Aの生理的意義についても副次的に明らかになる可能性がある．
また，Aβ の沈着の低下を初めて臨床試験で証明した抗 A抗体製剤が広く処方されることによって，Aの生理的意義の知見が更に深まるものと考える．

13

第 五 節 食品摂取による認知症の予防

AD を含めた認知症の治療は未だ十分ではないことから，予防に関する日常的な取り組みとして，有酸素運動，脳のトレーニング，健康的な食習慣にも注目が集まっている．
食品摂取は認知症のリスクに関連し予防の標的であると考えられており，食事・食品と認知症や AD のリスクに関する前向き観察研究が報告されている．アルコール飲料は，大量の飲酒は認知症リスクの上昇と関連が報告されているが，比較的少量の飲酒は認知症リスク低下との関連を示す報告もある.56) アルコール飲料の 1 つであるワインは，少量から中等量のワイン摂取で認知症や AD リスクの減少との関連が報告されているが，その他の生活習慣などの多くの因子が関連しており結論は出ていない.57)
食品では，抗酸化ビタミンなどを含む野菜や果物は，認知症や認知機能低下のリスク減少との関連が報告されており,58,59) 魚や魚油に含まれるオメガ- 3 系多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸 (EPA) やドコサヘキサエン酸 (DHA) は，認知症やAD の発症リスク減少と関連し，さらに APOE 4 保有者において認知機能低下との防御的関連が報告されている.60) 摂取食品の炎症インデックスについても，その値が高い
ことが軽度認知障害や認知症発症リスクの上昇と関連することが報告されている.65) また，日本人では，大豆・大豆製品，野菜，海藻，牛乳・乳製品の摂取が多く，米の摂取が少ない食事パターンは全認知症，AD，血管性認知症のリスク減少と関連している.64)
飲料では，ミルクや乳製品は，認知症や AD を含む高齢者の認知機能低下リスク軽減との関連が報告されている.61) 緑茶やコーヒーは，摂取と認知症リスクの減少の関連が報告されているが，長期のフォローアップを伴う大規模研究が望まれる.62,63)
生薬ウコンの主成分であるクルクミンでは，生体利用効率を上げたクルクミン(Theracurcumin®) を用いた非認知症者を対象とするランダム化比較試験で，認知機能改善とともにアミロイドとタウの減少を示唆する画像所見が報告された.66)
柑橘類の 1 種である河内晩柑に含まれる auraptene は，その抗炎症作用により認知14

機能の改善効果が報告され，愛媛県の産官学が連携し、中高年者が無理なく飲めるサイズ (125 mL) に必要量の auraptene を含有させた果汁飲料の開発が行われた．果汁飲料
は医薬品よりも安価で簡易に摂取出来るため，多くの中高年者に対して認知症予防を期待出来る.67-69)

15

本論
本研究の目的序論で記述したように, 我が国では認知症患者の急増が深刻な問題となっており治療の必要性も高まっていくと考えられている. 以前より処方されている 4 種の認知症治療薬の効能はいずれも症状の進行抑制であり，疾患そのものの進行抑制ではないため根本的治療薬の開発が求められていた. 2023 年に承認を取得した抗 A抗体製剤である
lecanemab は，アミロイドカスケード仮説が臨床的に有用であることを証明した根本的治療薬であり，国内において今後広く AD 患者に普及することが期待されているが，対象患者が早期 AD 患者に限定されることや，検査および薬剤費の観点から問題は残る．安価で安全性および有効性が担保された, AD の発症機序に基づく根本的な治療法の開発は，依然として望まれている．
このような背景から, 当研究室では AD 治療薬の一次スクリーニングとして A凝集抑制活性に注目して研究を行っている. また, キノコはシキミ酸経路，酢酸–マロン酸経路，イソプレノイド経路などの生合成経路が発達しており，他の生物種にはないユニークな二次代謝産物を数多く産生し，古くから生理活性についても注目されている点を考慮すると，新たな生理活性物質を見出せる可能性が高いと考えられる. そのため, A
凝集抑制活性物質を見出すために当研究室保有のキノコ子実体抽出エキスのランダムスクリーニングを行い, 活性の認められているカラスタケ (Polyozellus multiplex) 子実
体 MeOH 抽出エキスからのアルツハイマー病治療薬の探索を目的として研究を遂行することとした (Figure 9)．

16

Figure 9. Amyloid cascade and purpose of this research.

17

第 一 章 キノコ子実体抽出エキスの作製と A 凝集抑制活性の評価

研究試料はキノコ子実体を対象とした．先行研究において，当研究室の荒幡らは当研究室で保有する 55 種のキノコ子実体 (SYM-1–SYM-55) について A凝集抑制活性スクリーニングを行った．すなわち，キノコ子実体は，形態学的な種の同定を行い，乾燥した後，粗く粉砕した．その後, CHCl3 と MeOH で順次抽出し, 55 種のキノコ子実
体 CHCl3 抽出エキスと 55 種のキノコ子実体 MeOH 抽出エキス, 合計 110 種のキノコ子実体抽出エキスを調製した．調製した 110 種のキノコ子実体抽出エキスの A凝集抑制活性の評価は，内木らの開発した Thioflavin-T (Th-T) 法を用いて行い,70) その結果，38 種の抽出エキスに A凝集抑制活性を見出した.
Aは7 - 13 nm の緩やかならせん構造をもった線維であり，線維は規則的に配列し，ひだ状の シート構造を形成し，この構造が何層にも積み重なることにより 1 本の細線維が形成される. Th-T は単体では 446 - 450 nm 付近の励起光を照射してもその構造上にある 2 つの環を結ぶ単結合を軸として回転し，速やかにエネルギーを緩和するので蛍光は発さない．しかし，溶液中の A線維の シート構造に存在する結合部位に特異的かつ可逆的に結合することによりこの回転が立体障害により抑制されることで共役系が固定され, 480 - 490 nm 付近で蛍光を発する. A線維の産生量と Th-T の蛍光強度が比例関係にあることが明らかにされており, Th-T の特性を利用することで A
線維の産生量を測定することができる (Figure 10). 71-73)
また, Aは APP から A42, A40 などのアミノ酸残基数の異なる Aが生成され、A42 は A40 に比べ凝集性や毒性が高いことが知られている．今回行った Th-T 法では, A42 と A40 のどちらの Aを用いた場合でも活性評価の結果に差が認められなかったこと70) A40 の方がより扱い易く, 価格が安価であることの理由より，実験に用いる A は A40 とした．

18

Figure 10. Th-T Method and Principle for Detecting AFibril.

本試験では, A40 の溶液にサンプルを溶解して 24 時間重合反応を行った．サンプルを添加しない A40 の溶液も同時に調製して重合反応を行い, Th-T を用いて両者の蛍光強度を比較することにより, Aの凝集率を算出した (Figure 11)

Figure 11. Method of Th-T assay.

19

また, A 凝集抑制活性を有する化合物として myricetin などの flavonoid, tannic acidや congo red など複数の化合物が報告されているが，本研究ではポジティブコントロールとして myricetin を使用した.75-78)
本研究では A凝集抑制活性を見出された 38 種のエキスのうち，十分なエキス量があり化合物探索が可能な SYM-9 カラスタケ (Polyozellus multiplex）MeOH 抽出エキスに着目して研究を行うこととした (Table 2). 79)

20

Table 2. A aggregation inhibitory activities of 55 kinds each of CHCl3 and MeOH extracts fora total of 110 extracts.
Sample Nameextract

Sample Name

CHCl3
SYM-1

extract

Sample Name

CHCl3
SYM-29
MeOH

CHCl3
SYM-2

CHCl3

CHCl3
SYM-3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3
SYM-55

MeOH

MeOH

CHCl3

SYM-28
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-41

MeOH

CHCl3
SYM-14

CHCl3
SYM-54MeOH

SYM-27
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-40

MeOH

CHCl3
SYM-13

CHCl3
SYM-53

MeOH

SYM-26
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-39MeOH

CHCl3
SYM-12

CHCl3
SYM-52

MeOH

SYM-25
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-38MeOH

CHCl3
SYM-11

CHCl3
SYM-51

MeOH

SYM-24
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-37

MeOH

CHCl3
SYM-10

CHCl3
SYM-50

MeOH

SYM-23
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-36

MeOH

CHCl3
SYM-9

CHCl3
SYM-49MeOH

SYM-22
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-35

MeOH

CHCl3
SYM-8

CHCl3
SYM-48MeOH

SYM-21
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-34

MeOH

CHCl3
SYM-7

CHCl3
SYM-47MeOH

SYM-20
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-33

MeOH

CHCl3

CHCl3
SYM-46MeOH

SYM-19

SYM-6

MeOH

CHCl3
SYM-32

MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-45

MeOH

CHCl3

CHCl3
SYM-5

MeOH

CHCl3

SYM-18MeOH

CHCl3
SYM-44

SYM-31
MeOH

CHCl3
SYM-4

MeOH

MeOH

SYM-17
MeOH

CHCl3

CHCl3
SYM-30

MeOH

extract

SYM-43
MeOH

SYM-16
MeOH

Sample Name

CHCl3

SYM-15
MeOH

extract

SYM-42MeOH

MeOH

Extracts exhibited inhibitory activity against A aggregation were highlighted in tinted pale redand bold font.

21

第 二 章 カラスタケ MeOH 抽出エキスからの抗 AD 活性化合物の探索
第 一 節 カラスタケ (Polyozellus multiplex)

カラスタケ (Polyozellus multiplex) はヒダナシタケ目イボタケ科 (Thelephoraceae)
カラスタケ属に属し，全体はハボタン状またはマイタケ型で，高さ 10-20 cm，径 1030 cm ほどで，表面は黒色を呈し，表面はなめらかである．下面は灰白色から灰青色
で，低いしわひだを帯び，肉は薄く肉質は弾力に富む．ヒジキ臭を有し，乾かすと臭いはより強くなる．胞子は無色でいぼを帯びており, 4-6 m の大きさを有する．秋の針葉樹林もしくは広葉樹林に群生または孤生する．日本・韓国・北アメリカに分布し，可食である (Figure 12).80)

Figure 12. The morphological characteristic of fruiting bodies P. multiplex.

現在までにカラスタケからは，テルフェニル化合物およびベンゾフラン化合物が単離報告されている (Figure 13). 当研究室の金子は，カラスタケ acetone 抽出エキスより polyozelline , polyozelline B, MeOH 抽出エキスより NSC617425, CHCl3 及び MeOH
抽出エキスより新規化合物 2’,3’,5’,6’-tetraacetoxy-4,4’’-dihydroxy-p-terphenyl, CHCl3 抽

22

出 エ キ ス よ り 新 規 化 合 物 2’,3’,5’-triacetoxy-4,4’’,6’-trihydroxy-p-terphenyl を 単 離 した.81) 永澤は，acetone 抽出エキスより新規化合物 polyozellic acid, acetone adduct frompolyozellic acid を単離した.82) また，石倉は，クロカワ (Boletopsis leucomelas) より単離報告のあるテルフェニル誘導体の Bl-V をカラスタケ MeOH 抽出エキスから初めて単離した.83) カラスタケのエキス及び成分に関する生物活性の報告として, MeOH
エキスにヒト胃癌細胞に対する増殖阻害活性,84) polyozellin, thelephoric acid, kynapcin-9,
12, 13, 24, 28 にプロリルエンドペプチダーゼ (prolyl endopeptidase, PE) 阻害活性が報告されている.85-88) また，主成分である polyozellinに対する報告は多く, RAW264.7

細胞 (マウス由来マクロファージ細胞株) において SAPK/JNK 及び NF-B の活性化と誘導される LPS を抑制することで NO 産生阻害作用を有すること,89) HT-29 細胞において TNF- 誘導性 IL-8 と MMP7 の阻害作用を有すること,90) ヒト骨髄白血病
細胞株においてキノンレダクターゼ, グルタチオンS-トランスフェラーゼといった解毒酵素の誘導作用を有することが報告されている.91) また，グルタミン酸で処理をされた HT22 細胞 (マウス由来の海馬神経細胞株) に対し, Ca2+ 流入，細胞内活性酸素産生，脂質過酸化を抑制することで細胞死を減らし，神経保護作用を示した．さらにグ
ルタミン酸によって引き起こされた Bid や Bcl-2 の発現レベルの抑制を抑え, アポ
トーシス誘導因子の発現, MAPK タンパク質のリン酸化も抑制することで，神経細胞死に関連する様々なタンパク質の転写に影響を与えることが示唆された.92)

23

Figure 13. Isolated compounds from P. multiplex.

24

第 二 節カラスタケ MeOH 抽出エキスから A凝集抑制活性を指標とした活性化合物の分離・精製

乾燥重量 734.0 g のカラスタケを粗く破砕したものを，室温で CHCl3 で一昼夜 3 回
抽出した後，MeOH で同様に 3 回抽出した．減圧下で溶媒を留去し，MeOH 抽出物
75.0 g を得た．MeOH 抽出物の A凝集抑制活性評価を行ったところ，10 g/mL でのA 凝 集 阻 害 活 性 は 25.1% で あ っ た ． MeOH 抽 出 物 を さ ら に silica gel column
chromatography (Si. C. C.) で段階的勾配 (CHCl3-MeOH; 100:1, 75:1, 50:1, 20:1, 10:1）を用いて分画し，7 つの画分 Fr. A–G と不溶性の画分 Fr. H を得た．これら画分 Fr. A–H の，A 凝集抑制活性を評価した (A: 3.18 g, 49.0%; B: 5.80 g, 78.3%; C: 1.52 g, 59.3%; D: 0.31
g, 34.5%; E: 4.50 g, 30.3%; F: 33.50 g, 22.5%; G: 1.56 g, 14.7%; H: 23.91 g, 14.5%)．Fr. F が比較的活性が高く量も多い画分であるため Si. C. C. を用いて分離を進め，5 つの画分
Fr. F1–F5 を得た．これら画分 Fr. F1–F5の，A 凝集抑制活性を評価し (F1: 0.12 g, 25.3%;
F2: 0.17 g, 32.5%; F3: 2.20 g, 14.2%; F4: 3.07 g, 9.8%; F5: 18.70 g, 13.9%), 活性が高く量も多い画分である Fr. F3, F4 について Sephadex LH-20 column chromatography (Sephadex
LH-20 C. C.), octadecylsilyl column chromatography (ODS C. C.), Chromatorex COOH silica
gel column chromatography (COOH C. C.)，分取 HPLC を用いて分離，精製を行った結果,
7 種の化合物 Comp. 1 (15.8 mg), Comp. 2 (33.0 mg), Comp. 3 (5.6 mg), Comp. 4 (12.0 mg),Comp. 5 (9.1 mg), Comp. 6 (13.6 mg), Comp. 7 (3.5 mg) を単離した (Figure 14)．

25

Figure 14. Isolation procedure of P. multiplex MeOH extract.

26

第 三 節 化合物の構造解析
Comp. 1
Comp. 1 は dark green amorphous として得られた. positive HRFABMS において観測された分子イオンピーク m/z: 438.0585 [M]+ (calcd for C22H14O10, 438.0579) より分子式は
C22H14O10 であることが明らかとなった. また, 13C-NMR (DMSO-d6) より観測されたシグナルが 11 種のみであったことから, Comp. 1 は分子内に対称性を持つ二量体構造であることを推測した. 1H-NMR (DMSO-d6) より観測された H 2.53 (6H, s) のシグナルお
よび 13C-NMR より観測された C 20.3 (CH3) および C 168.4 (C) のシグナルから 2
つのアセチル基の存在が, H 7.15 (2H, s) と H 7.15 (2H, s) のシグナルから, 2 つの1,2,4,5-四置換ベンゼンの存在が推測された. 分子量および部分構造から, Comp. 1 はすでにカラスタケからの単離報告のある polyozellin ではないかと推測した. 1H-NMR お
よび 13C-NMR のデータを polyozellin の文献値と比較したところ一致したため, Comp.
1 は polyozellin と同定した (Figure 15) (Table 3).83,93)

Figure 15. The structure of Comp. 1: polyozellin.

27

Table 3.

13

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 1 in DMSO-d6.
Polyozellin83)

Comp. 1

PositionC

typeH (J in Hz)

C

type

1, 10

105.8

CH

7.16 (2H, s)

105.7

CH

2, 9

143.3

C

143.4

C

3, 8

147.0

C

147.1

C

4, 7

98.9

CH

98.4

CH

4a, 6a

150.3

C

150.3

C

5a, 5b

137.0

C

136.9

C

12, 11

130.7

C

130.7

C

10a, 12b

112.8

C

112.7

C

10b, 12a

116.7

C

116.6

C

CH3CO

20.3

CH3

20.2

CH3

CH3CO

168.4

C

168.3

Cc

7.16 (2H, s)

2.54 (6H, s)

28

H (J in Hz)
7.15 (2H, s)

7.15 (2H, s)

2.53 (6H, s)Comp. 2
Comp. 2 は colorless amorphous として得られた. positive HREIMS において観測された分子イオンピーク m/z: 433.0892 [M+Na]+ (calcd for C22H18NaO8, 433.0899) より分子式は C22H18O8 であることが明らかとなった. また, 13C-NMR (DMSO-d6)より観測されたシグナルが 9 種のみであったことから, Comp. 2 は分子内に対称性を持つ二量体構造であることを推測した. 1H-NMR (DMSO-d6) より観測された H 1.92 (6H, s) のシグナルお
よび 13C-NMR より観測された C 20.0 (CH3) および C 168.4 (C) のシグナルから 2
つのアセチル基の存在が, H 7.04 (4H, d, J = 8.6) と H 6.78 (4H, d, J = 8.6) のシグナルから 1,4-二置換ベンゼンの存在が推測された. また, H 8.38 (2H, brs) および H 9.47 (2H,brs) のシグナルから 2 種類, 計 4 つの水酸基の存在が推測された. 分子量およびNMR データより推測された部分構造から, Comp. 2 はすでにカラスタケからの単離報
告のある kynapcin-12 ではないかと推測した. 1H-NMR および 13C-NMR のデータをkynapcin-12 の文献値と比較したところ一致したため,Comp. 2 は kynapcin-12 と同定した (Figure 16) (Table 4).81,94)

Figure 16. The structure of Comp. 2: kynapcin-12.

29

Table 4.

13

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 2 in DMSO-d6.
kynapcin-1281)

Position

C

1, 1”

123.2

C

2, 6, 2”, 6”

131.0

CH

3, 5, 3”, 5”

114.8

CH

4, 4”

156.6

1’, 4’

type

Comp. 2

H (J in Hz)

C

type

H (J in Hz)

123.2

C

7.07 (4H, d, J = 8.5)

131.0

CH

7.04 (4H, d, J = 8.6)

6.80 (4H, d, J = 8.5)

114.8

CH

6.78 (4H, d, J = 8.6)

C

156.6

C

122.5

C

122.5

C

2’, 3’

141.3

C

141.4

C

5’, 6’

133.1

C

133.1

C

CH3CO

19.9

CH3

20.0

CH3

CH3CO

168.3

C

168.4

C

OH

1.93 (6H, s)

1.92 (6H, s)

8.38 (2H, brs)

8.38 (2H, brs)

9.46 (2H, brs)

9.47 (2H, brs)

30

Comp. 3
Comp. 3 は pale brown amorphous として得られた. positive HRESIMS において観測された分子イオンピーク m/z: 449.0843 [M+Na]+ (calcd for C22H18NaO9, 449.0849) より分子
式は C22H18O9 であることが明らかとなった. また, 1H-NMR (CD3OD)より観測された
H 1.92 (3H, s) と H 1.93 (3H, s) のシグナルおよび 13C-NMR (CD3OD) より観測された
C 20.0 (CH3), C 20.0 (CH3), C 168.4. (C) と C 168.4 (C) のシグナルから 2 つのアセチル基の存在が推測された．次に, H 6.79 (2H, d, J = 8.5), H 7.07 (2H, d, J = 8.5) のシグナ
ルから 1,4-二置換ベンゼンの存在が, H 6.50 (1H, dd, J = 8.1, 2.0), H 6.67 (1H, d, J = 2.0),
H 6.74 (1H, d, J = 8.1) から 1,2,4-三置換ベンゼンの存在が, H 8.41 (2H, brs), H 8.92 (2H,brs),H 9.46 (1H, brs) のシグナルから 5 個の水酸基の存在が推測された. 分子量および部分構造から, Comp. 3 はすでにカラスタケからの単離報告のある NSC617425 ではないかと推測した. 1H-NMR および 13C-NMR のデータを NSC617425 の文献値と比較したところ一致したため, Comp. 3 は NSC617425 と同定した (Figure 17) (Table 5).81)

Figure 17. The structure of Comp. 3: NSC617425.

31

Table 5.

13

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 3 in CD3OD.
NSC61742581)

Position

C

1

123.3

C

2

117.3

CH

3

144.3

4

type

Comp. 3

H (J in Hz)

C

type

H (J in Hz)

123.3

C

117.5

CH

C

144.6

C

144.3

C

144.6

C

5

114.9

CH

6.74 (1H, d, J = 8.1)

114.8

CH

6.74 (1H, d, J = 8.1)

6

120.7

CH

6.50 (1H, dd, J = 8.1, 2.0)

121.0

CH

6.50 (1H, dd, J = 8.1, 2.0)

1’

122.3

C

122.3

C

2’

132.8

C

132.8

C

3’

132.8

C

132.8

C

4’

122.0

C

122.1

C

5’

140.1

C

141.3

C

6’

140.1

C

141.3

C

1”

123.0

C

123.6

C

2”, 6”

130.7

CH

7.05 (2H, d, J = 8.5)

131.0

CH

7.07 (2H, d, J = 8.5)

3”, 5”

114.5

CH

6.79 (2H, d, J = 8.5)

114.2

CH

6.79 (2H, d, J = 8.5)

4”

156.2

C

156.5

C

CH3CO

168.0

C

168.4

C

168.0

C

168.4

C

20.0

CH3

1.93 (3H, s)

20.0

CH3

1.92 (3H, s)

20.0

CH3

1.94 (3H, s)

20.0

CH3

1.93 (3H, s)

CH3CO

OH

6.67 (1H, d, J = 2.0)

6.67 (1H, d, J = 2.0)

8.36 (2H, brs)

8.41 (2H, brs)

8.91 (2H, brs)

8.92 (2H, brs)

9.44 (1H, brs)

9.46 (1H, brs)

32

Comp. 4
Comp. 4 は brown amorphous として得られた. positive HRESIMS において観測された分子イオンピーク m/z: 361.0312 [M+Na]+ (calcd for C18H10NaO7 361.0324) より分子式は C18H10O7 であることが明らかとなった. また, 1H-NMR (CD3OD) より観測された H
7.05 (1H, s)と H 7.35 (1H, s) のシグナルから 1,2,4,5-四置換ベンゼン，また，H 7.25 (2H,d, J = 8.5) と H 6.79 (2H, d, J = 8.5) のシグナルから 1,4-二置換ベンゼンの存在が推測された．13C-NMR (CD3OD) より観測された C 177.4 (C) と C 181.5 (C) にカルボニル基の炭素原子由来と考えられる 2 本のピークが観察された．分子量および Figure 18に示したような HMBC 相関から明らかになった部分構造から, Comp. 4 はカラスタケと 同 じ イ ボ タ ケ 科 の ク ロ カ ワ (Boletopsis leucomeras) か ら の 単 離 報 告 の あ る
cycloleucomelone で は な い か と 推 測 し た . 1H-NMR お よ び

13

C-NMR の デ ー タ を

cycloleucomelone の文献値と比較したところ一致したため, Comp. 4は cycloleucomeloneと同定した (Figure 19) (Table 6).81,95) カラスタケからの cycloleucomelone 単離報告は初めてである．

Figure 18. HMBC Correlations for part of Comp. 4: cycloleucomelone in CD3OD.

33

Figure 19. The structure of Comp. 4: cycloleucomelone.

Table 6.

13

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 4 in CD3OD.
Cycloleucomelone95)

Comp. 4

Position

C

1

181.8

C

181.5

C

2

154.7

C

154.4

C

3

119.3

C

119.7

C

4

177.6

C

177.4

C

4a

155.7

C

155.3

C

5a

152.5

C

152.8

C

6

99.3

CH

99.3

CH

7

149.1

C

149.4

C

8

146.9

C

147.1

C

9

106.3

CH

106.5

CH

9a

115.5

C

115.3

C

9b

118.4

C

118.2

C

1’

123.8

C

123.4

C

2’, 6’

133.5

CH

7.17 (2H, d, J = 8.5)

133.4

CH

7.25 (2H, d, J = 8.5)

3’, 5’

115.4

CH

6.78 (2H, d, J = 8.5)

115.5

CH

6.79 (2H, d, J = 8.5)

4’

157.4

C

157.8

C

type

H (J in Hz)

7.05 (1H, s)

7.31 (1H, s)

34

C

type

H (J in Hz)

7.05 (1H, s)

7.35 (1H, s)Comp. 5
Comp. 5 は pale brown amorphous として得られた. positive HRESIMS において観測された分子イオンピーク m/z: 447.0694 [M+Na]+ (calcd. for C22H16NaO9, 447.0692) より分子
式は C22H16O9 であることが明らかとなった. また, 1H-NMR (DMSO-d6) より観測された H 2.01 (3H, s) と H 2.44 (3H, s) のシグナルおよび 13C-NMR (DMSO-d6) より観測された C 20.0 (CH3), C 20.1 (CH3), C 168.3 (C) および C 168.4 (C) のシグナルから 2 つのアセチル基の存在が, H 7.06 (1H, s) と H 7.06 (1H, s) のシグナルから 1,2,4,5-四置換
ベンゼンの存在が, H 6.80 (2H, d, J = 8.5) と H 7.06 (2H, d, J =8.5) から1,4-二置換ベン
ゼンの存在が推測された. また, HMBC の相関から Figure 20 に示す部分構造が考えられた. 分子量および部分構造から, Comp. 5 はカラスタケからの単離報告のある Bl-V
ではないかと推測した. 1H-NMR および 13C-NMR のデータを Bl-V の文献値と比較したところ一致したため, Comp. 5 は Bl-V と同定した (Figure 21) (Table 7).81)

Figure 20. HMBC Correlations for part of Comp. 5: Bl-V in DMSO-d6.

35

Figure 21. The structure of Comp. 5: Bl-V.

Table 7.

13

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 5 in DMSO-d6.
Bl-IV81)Comp. 5

Position

C

1

127.6

C

127.6

C

2

135.6

C

135.7

C

3

120.7

C

120.7

C

4

137.4

C

137.5

C

4a

142.9

C

142.9

C

5a

149.9

C

150.0

C

6

98.4

CH

98.5

CH

7

147.0

C

147.2

C

8

142.7

C

142.5

C

9

106.1

CH

106.2

CH

9a

112.6

C

112.6

C

9b

117.4

C

117.5

C

1’

123.0

C

123.1

C

2’, 6’

131.2

CH

7.07 (2H, d, J = 8.5)

131.3

CH

7.06 (2H, d, J = 8.5)

3’, 5’

114.7

CH

6.80 (2H, d, J = 8.5)

114.8

CH

6.80 (2H, d, J = 8.5)

4’

155.0

C

155.3

C

CH3CO

20.0

CH3

2.02 (3H, s)

20.0

CH3

2.01 (3H, s)

20.2

CH3

2.45 (3H, s)

20.1

CH3

2.44 (3H, s)

168.1

C

168.3

C

168.3

C

168.4

C

CH3CO

type

H (J in Hz)

7.08 (1H, s)

7.08 (1H, s)

36

C

type

H (J in Hz)

7.06 (1H, s)

7.06 (1H, s)Comp. 6
Comp. 6 は colorless amorphous として得られた. negative HRESIMS において観測された分子イオンピーク m/z: 117.0189 [M−H]− (calcd. for C4H5O4, 117.0188) より分子式は
C4H6O4 であることが明らかとなった. また, 1H-NMR (DMSO-d6)より観測された. H 2.40
(4H, s) のシグナルから 2 つのメチレン基が, 13C-NMR (DMSO-d6)より観測された C
173.6 (C), C 173.6 (C) のシグナルから 2 つのカルボニル基の存在が推測された. 分子
量および部分構造から, Comp. 6 は succinic acid ではないかと推測した. 1H-NMR および 13C-NMR のデータを succinic acid の文献値と比較したところ一致したため, Comp.
6 は succinic acid と同定した (Figure 22) (Table 8).96) カラスタケからの succinic acid の単離報告は初めてである．

HO

O

O

OH

Figure 22. The structure of Comp. 6: succinic acid.

37

Table 8.

13

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 6 in DMSO-d6.
succinic acid96)

Position

C

COOH

173.5

C

CH2

28.8

CH2

OH

type

Comp. 6

H (J in Hz)

2.42 (4H, s)
12.21 (2H, brs)

C

type

173.6

C

28.8

CH2

H (J in Hz)

2.40 (4H, s)
12.15 (2H, brs)

38

Comp. 7
Comp. 7 はcolorless amorphousとして得られた. HREIMS において観測された分子イ
オンピークm/z: 150.0265 [M]+ (calcd. for C7H6O4, 154.0266) より分子式は C7H6O4 である
ことが明らかとなった. また, 1H-NMR (DMSO-d6)より観測された H 6.76 (1H, d, J = 8.0),
H 7.26 (1H, dd, J = 8.0, 1.7) および H 7.31 (1H, d, J = 1.7) のシグナルから1,2,4-三置換ベンゼンの存在が, 13C-NMR (DMSO-d6)より観測された C 167.5 (C)のシグナルからカルボニルの存在が推測された. また, HMQC, HMBC の相関からFigure 23 に示す構造が考えられた. 以上より, Comp. 7 は protocatechuic acid ではないかと推測した. 1H-NMR および 13C-NMR のデータを protocatechuic acid の文献値と比較したところ一致したため,Comp. 7 は protocatechuic acid と同定した (Figure 24) (Table 9).96)

Figure 23. HMBC Correlation of Comp. 7: protocatechuic acid in DMSO-d6.

O
HO

7

1

2

3

OH

4

6

OH

5

Figure 24. The structure of Comp. 7: protocatechuic acid.

39

Table 9.

13

C- and 1H-NMR spectral data of Comp. 7 in DMSO-d6.
protocatechuic acid96)

Position

C

1

121.7

C

2

116.5

CH

3

144.9

4

Comp. 7
C

type

121.9

C

116.6

CH

C

144.9

C

150.0

C

150.0

C

5

115.1

CH

6.76 (1H, d, J = 8.0)

115.1

CH

6.76 (1H, d, J = 8.0)

6

121.8

CH

7.27 (1H, dd, J = 8.0, 2.0)

121.8

CH

7.26 (1H, dd, J = 8.0, 1.7)

7

167.3

C

167.5

C

type

H (J in Hz)

7.32 (1H, d, J = 2.0)40

H (J in Hz)

7.31 (1H, d, J = 1,7)

第 四 節 A 凝集抑制活性試験

カラスタケより得られた p-terphenyl 類 Comp. 1–5 および Comp. 6, 7 の 7 種について (Figure 25), Th-T 法による A 凝集抑制活性を評価，検討した．その結果, Comp. 1–
5 において濃度依存的な A 凝集抑制活性が確認された．それぞれの IC50 は Table 10の表に示した値であり, Positive Control である myricetin (IC50 9.9 M) より強い活性を示した. さらに，A 凝集抑制活性の発現において重要とされる構造的な特徴を明確にするために，研究室保有のカラスタケ由来の p-terphenyl 化合物 (Comp. 8–11)，すなわ
ち thelephoric acid (8), polyozellic acid (9), acetone adduct from polyozellic acid (10), 11,12(methylenedioxy)polyozellic acid acetate (11) についても A 凝集抑制活性を検討した(Figure 25)．その結果, Comp. 8–11 においても濃度依存的な A 凝集抑制活性が確認された (Table 10)．これらの結果より構造活性相関 (Structure-Activity Relationship, SAR) を検討した (Figure 26)．1 つ目として，カテコール構造が活性発現に重要であることが考えられた．カテコール構造が 2 つある化合物である Comp. 1, 3 および Comp. 8–10 と，
カテコール構造が 1 つでもさらに C4, C4’ または C4’’ 位にフェノール性水酸基が存在する化合物である Comp. 2, 4, 5 は，フェノール性水酸基をすべてアセチル化した
polyozellin 誘導体である Comp. 11 に比べ活性が高い傾向がみられたため，その構造が重要であることが示唆された．

41

OH

HO

HO

OH

O

4'' OH

OH

4 OH

OH

O

HO
HO

O

O
O

O

HO

O

O

HO

O

HO

O

O

O

O
Comp. 1polyozellin (1)Comp. 2kynapcin-12 (2)

4' OH

O

Comp. 3
NSC617425 (3)

4' OH

OH

HO

O

O

O
HO

OH

HO

O

O
O

O

HO

HO

O

O

OH

O
Comp. 4
cycloleucomelone (4)Comp. 5
Bl-V (5)Comp. 6
succinic acid (6)

OH
OH
O

O

O
OH

HO

OH

O

OH

O

HO
OH

O

HO

HO

O

O

O

HO
Comp. 7
protocatechuic acid (7)Comp. 8thelephortic acid (8)Comp. 9polyozellic acid (9)

O
OH

O
O

O
O

OH

HO
HO

O

O

O

O
O

O

OH

O

O

O
O

O

Comp. 10acetone adduct from polyozellic acid (10)Comp. 11
11,12-(Methylenedioxy)polyozellic acid acetate (11)Figure. 25. Structures of Comp. 1–11.

42

Table 10. A aggregation inhibitory activities of Comp. 1–11.
MaterialA aggregation IC50 (M, n=3)

a

1

0.615

2

6.76

3

6.45

4

2.17

5

3.61

6

>100

7

>100

8

12.62

9

1.29

10

1.96

11

21.61

myricetina

9.997)

inhibitor IVb>10097)Myricetin was used as a positive control for the inhibitory activity of Aaggregation.

b

Inhibitor IV was used as a positive control for BACE1 inhibitory activity.

43

Figure. 26. Structure-Activity Relationship of Comp. 1–11.

佐藤ら98) によると, (+)–taxifolin のような catechol-type flavanonol において, B 環上のカテコール構造が酸化されて o–quinone が形成され, これがA42 のシート領域に組み込まれている 16(Lys) と 28(Lys) と共有結合することにより付加体を形成し, A42
凝集体を不安定化させたことを報告している (Figure 27). このことからもカテコール
構造が A凝集抑制活性に大きく寄与することは支持される．今回A凝集抑制活性を見出したComp. 1–5 および Comp. 8–10 もカテコール構造を有するため，カテコール
構造が酸化され o-quinone を形成しA42 のシート領域に組み込まれている 16(Lys)と 28(Lys) と共有結合することにより分子間 シートの形成を阻害している可能性が考えられる. o-quinone が存在する Comp. 9 は，p- quinone が存在する Comp. 8 と比べ活性が高い傾向が示唆されるが，さらなる検討が必要である．またAの凝集過程は，モノマーから凝集核を形成する核形成過程と，形成された凝集核から線維が連鎖的に伸長するアミロイド繊維伸長過程からなると考えられているが，Hanaki らは, C4’’ にフェ
ノール性水酸基を有した非カテコール構造をもつ kaempferol (Figure 28) が A 42 の凝集段階における伸長相を阻害する可能性について報告しており,99) フェノール性水酸基44の存在も A凝集抑制活性に寄与したことが示唆された．

Figure 27. Site-specific inhibitory proposed of A42 aggregation by (+)–taxifolin .98)

OH
HO

O
OH
OH

O

kaempferol

Figure 28. Structure of kaempferol.
また，検討の2つ目として，カテコール構造を含むが p-terphenyl 構造を持たない
Comp. 7 は活性を示さなかったことより，活性発現には p-terphenyl 構造を有することも重要であることが示唆された．
福原らは，フラボノイド系抗酸化物質であり Aの凝集抑制作用が報告されている
カテキンの立体構造を平面に固定化した誘導体を合成し，固定化をすることで電子供与基が導入され，抗酸化作用が増強したことを報告している100) また，増田らは芳香環な
らびに不飽和カルボニル構造を持つ非カテコール型ポリフェノールであるクルク
ミンがA42 の 19(Phe), 20(Phe) を中心とした芳香環同士の スタッキングにより45

分子間シート領域に挿入されることで, A42 の凝集抑制の可能性を報告している101)
それらの先行研究の結果を考えると, Comp. 1, 4, 5 および Comp. 8–11 も, 1 つまたは 2つのフラン環を有しているため構造が平面となっており，それによって活性発現が高まった可能性が示唆される．フラン環が 2 つの構造を持つ Comp. 1 および Comp. 9, 10
は，フラン環が 1 つの構造である Comp. 4, 5 に比べ活性が高い傾向が示されたことか
らも，立体構造が平面であることの重要性が考えられる．Comp. 11 はフラン環が 2 つの構造であるが, Comp. 1 および Comp. 9, 10 と比べ活性が高くなく，フェノール性水酸基の存在の重要性が示唆された．
AD 患者の脳内には，アミロイド繊維からなる老人斑が形成され大脳皮質に沈着しているが，アミロイド繊維の形成過程で活性酸素の発生が報告されており,102) 酸化ストレスが神経細胞毒性や血管障害の原因の 1 つと考えられている．また，脳内では恒常性維持のために脳内免疫細胞であるミクログリアが常に機能している．このミクログロア
は AD 患者の脳内で沈着する Aの貪食除去を担っているが，加齢に伴いミクログリ
アによるAの貪食除去機能は低下し，さらに炎症が惹起され症状の進行が加速することが報告されている103-105) また1 型ミクログリアは pro-inflammatory 作用を有し，過剰な活性化により神経障害を引き起こすが,106) これに対し, 2 型ミクログリアは
anti-inflammatory 作用を有し，組織修復や神経保護作用を示す.107) これらミクログリアのバランス (M1/M2) が脳内環境の恒常性維持に重要であるが,106,108,109) 加齢に伴いミクログリアは炎症型の M1 型に変化し, AD 患者の病態を悪化させる．このようなこと
から脳内の抗酸化ならびに抗炎症作用は AD 病の創薬ターゲットの 1 つとして考えられている．多くのカテコール構造を含む化合物においても抗酸化ならびに抗炎症作用が報告されている110,111) ことから，カテコール構造が AD 治療薬開発において重要な構造であることが示唆され，カテコール構造を含む Comp. 1–5 および Comp. 8–10 についてもAD 治療薬のシード化合物として期待出来る．

46

第 五 節 BACE 1 阻害活性試験
序論で記述したように, Aは APP の部分断片であり, BACE1 と -secretase によって切り出されることによって産生，分泌されることより, BACE1 の働きを阻害することで Aの産生を抑制することが期待出来る．そのため，カラスタケから得られた
化 合 物 の BACE1 阻 害 活 性 を BACE1 蛍 光 共 鳴 エ ネ ル ギ ー 移 動 (Fluorescence
Resonance Energy Transfer, FRET) assay を用いて検討した.112)

Figure 29. Theory of BACE1 assay.

本活性評価は蛍光 donor (D) である rhodamine 誘導体 (Rh) と消光性 acceptor (A)である quencher の 2 種類の fluorophore により修飾された Swedish 変異体に基づく
ペプチド鎖を基質として用い, BACE1 により切断された基質が発する蛍光を測定することで BACE1 阻害活性を算出することができる (Figure 29). すなわち, 近接する Dの蛍光スペクトルと A の励起スペクトルに重なりがある場合, D に励起光を照射すると D の励起エネルギーが双極子間相互作用を経て A へ移動することで D の蛍光が消光される現象を一般に FRET と呼び,113,114) 本活性評価系における D, Rh の励起光である 530–545 nm の光を BACE1 によって切断されていない基質に照射しても Rhの蛍光はこの FRET により消光されている. 一方, この基質が BACE1 によって切断47

されると Rh と A である quencher が近接しなくなることから FRET による消光が起こらないため, BACE1 によって切断された基質に 530–545 nm の励起光を照射すると Rh が蛍光を示す.

Figure 30. Method of BACE1 assay.

こ の よう な 原 理 に 基 づき 384 well 黒 色プ レー ト に試 料 の DMSO 溶 液 またはDMSO と BACE1 の基質溶液を混和し, BACE1 溶液を添加した後 1 時間後に 590 nm
における蛍光を測定した (Figure 30).112,115) BACE1 により切断された基質の増強される
蛍光強度は基質の分解率に比例することから, 測定によって得られた蛍光強度を用いて阻害活性を算出した. ここで, 本アッセイの positive control は -Secretase Inhibitor
IV (IC50 0.015 M) を用いた.116,117)
カラスタケより得られた p-terphenyl 類 Comp. 3–5 と Comp. 6, 7 および研究室保有のComp. 10, 11 について BACE1 阻害活性試験を行った．その結果, Comp. 4 およびComp. 10 で弱いながら濃度依存的な BACE1 阻害活性が確認された．それぞれの IC50

48

は Table 11 の表に示した．Comp. 1, 2 および Comp. 8, 9 の BACE1 阻害活性は Chon
らによって報告されている値を示した. 118)

Table 11. BACE1 inhibitory activities of Comp. 1–11.
Materiala

BACE1 IC50 (M, n=3)

1

3.0892)

2

15.7992)

3

>100

4

66.62

5

>100

6

>100

7

>100

8

3.5092)94.7892)

10

34.49

11

>100

myricetina

2.8118)

inhibitor IVb

0.01597)

Myricetin was used as a positive control for the inhibitory activity of Aaggregation.

b

Inhibitor IV was used as a positive control for BACE1 inhibitory activity.

Chon らによると, Comp. 1, 2 および Comp. 8, 9 の BACE1 阻害活性は，化合物がBACE1 を非競合的に阻害することを報告している.118) そのため，今回新たに活性を見出した Comp. 4 および Comp. 10 についても，同じ p-terphenyl 化合物であるため,
BACE1 を非競合的に阻害することが考えられる.
今回，既報の BACE1 阻害活性体を含め, Comp. 1, 2, 4 および Comp. 8–10 の 6 種の化合物で BACE1 阻害活性があることが分かった．これら 6 種の化合物は, BACE1 阻
害活性とあわせて A凝集抑制活性もみられたため，それら両方の活性を示す化合物であることを見出した．

49

第 六 節 ヒト神経芽細胞腫 SH-SY5Y 細胞を用いた Aによる毒性の軽減効果

前項では A凝集抑制活性試験において，カラスタケより得られた p-terphenyl 化合物に A凝集抑制活性が認められたので，次にヒト神経芽細胞腫 SH-SY5Y 細胞を用いてAの毒性を軽減する効果の検討を行った．
SH-SY5Y 細胞はヒト脳の神経芽細胞腫由来の細胞株であり，脳神経細胞モデルとして用いられる. Retinoic acid などにより分化させることで細胞増殖が停止すると共に神経突起を伸長し，より神経細胞らしい形態へと分化するが,119) 今回は 2 次スクリーニ
ングとして Aの毒性を軽減する効果を簡便に検討出来るように, SH-SY5Y 細胞を分化させないプロトコルとした．また, A40 では十分な細胞毒性が認められなかったため，
本試験においては A42 を用いた．本試験の positive control は，当研究室で Aの毒性を軽減する効果を報告しているサボテン科植物由来サポニンの chichipenoside B を用いた.74)今回行った試験の手順概要は以下の通りである．

1. Phenol red および 10% FBS 含有の DMEM/F12 (1:1) 培地を用いて SH-SY5Y 細胞を 1.0×104 cell/cm2 および 1 mL/well で 12-well plate に播種した．
2. 72 時間経過後，ウェル内の培地を完全に吸引したのち, phenol red 非含有, 2% FBS
含有の DMEM/F12 (1:1) 培地を用いてサンプルと A42 を目的の濃度となるように希釈した培地を 900 L/well で添加した．
3. 24 時間経過後，ウェル内の培地を 1.5 mL マイクロチューブに移し換え，新たに
phenol red 非含有, 2% FBS 含有の DMEM/F12 (1:1) 培地を 500 L/wellで添加した．続けて, Cell Counting Kit-8® 試薬 (WST-8試薬) を各ウェルに 50 L ずつ添加した．
3 時間後，各ウェルの培地を 1.5 mLマイクロチューブに移し換え, 1000×g, 4 °Cで 5 分
間遠心処理を施したのち, 96 ウェルプレートに分注し，吸光度を測定した (450 nm)．以
上の手順に従って，カラスタケより得られた p-terphenyl 類 Comp. 1–5 および Comp. 6,50

7 の 7 種について Aの毒性から神経細胞を保護する効果を評価した (Figure 31)．

Figure 31. Method of protective effect on SH-SY5Y against A toxicity assay.

はじめに活性を評価するサンプル Comp. 1–7 について, SH-SY5Y 細胞への毒性を検討した (Figure 32)．各化合物について SH-SY5Y 細胞が 80% 以上の細胞生存率を示す濃度で A42 による神経細胞毒性を軽減する効果の検討を行った．その結果，最も強いA凝集抑制活性が見られた Comp. 1 は SH-SY5Y 細胞への毒性が認められた. Comp.
2–7 ではそれぞれ 25 M, 12.5 M, 25 M, 12.5 M, 50 M, 50 M が細胞に毒性を与えない濃度であった．
次に, A42 で処理を行わないコントロール群の生存率を 100% としたところ, 10 Mの A42 で処理を行った群はその生存率が約 30% 程度まで低下した．そこで, 10 Mの A 42 と Comp. 1–7 それぞれを同時添加した後に SH-SY5Y 細胞を 24 時間培養した結果, Comp. 2–5 において，細胞生存率が有意に改善し, Comp. 2–4 は濃度依存的であった (Figure 33). Comp. 2–5 は p-terphenyl 構造と C4, C4ʹ または C4ʹʹ にフェノール

51

性水酸基を有しており，この構造は A40 凝集抑制活性だけでなく，神経保護効果の発現にも重要であることが示唆された. p-terphenyl 構造の重要性については，カテコール
構造を含むが p-terphenyl 構造を持たない Comp. 7 は活性を示さなかったことからも支持された.

Figure 32. Cytotoxicity of Comp. 1–7 on SH-SY5Y cells.
Cont. indicates the control group (cells in the absence of Comp. 1–7). Values are expressed asmean ± SD, n=3.

52

Figure 33. Protective effects of seven compounds on SH-SY5Y cells against A toxicity.
Cont. indicates the control group (cells in the absence of A and comp. 1–7). A indicates thegroup treated with 10 M A but no Comp. Statistical significance was analyzed using one-way
ANOVA followed by Dunnett’s test. Values are expressed as mean ± SD, n=3, **p < 0.01, ***p <0.001 as compared with A. PC-4 is chichipenoside B.

53結語
本論文はカラスタケ MeOH 抽出エキスから AD 治療薬の探索というテーマの研究を通して A凝集抑制活性と BACE1 阻害活性ならびに SH-SY5Y 細胞に対する Aの毒性を軽減する効果を有する化合物について述べた.120)
本論では合計 110 種のキノコ子実体抽出エキスから A 凝集抑制活性を有する 38
種のエキスが見出され，そのうちカラスタケ MeOH 抽出エキスに着目し, A 凝集抑制
活性を指標に成分探索を行い, 7 種の化合物（Comp. 1–7）の単離とその構造解析について 述 べ た ． Comp. 1–7 は そ れ ぞ れ polyozellin (1), kynapcin-12 (2), NSC617425 (3),cycloleucomelone (4), BI-V (5), succinic acid (6), protocatechuic acid (7) と 同 定 し た .
Cycloleucomelone(4) と succinic acid (6) はカラスタケからの単離報告は初めてである．

次いで，これらの化合物ならびに研究室で保有をしていた 4 つの p-terphenyl 化合物（thelephoric acid (8), polyozellic acid (9), acetone adduct from polyozellic acid (10), 11,12(methylenedioxy)polyozellic acid acetate (11)）について A 凝集抑制活性について検討したところ，9 種の p-terphenyl 化合物で活性を見出した．従来の知見をふまえて構造活性相関について考察した結果, p-terphenyl 構造とカテコール構造を 2 つまたはカテコール構造と C4, C4’ または C4’’ 位にフェノール性水酸基を有していることが重要な条件であることが示唆された．あわせて, BACE1 阻害活性についても検討を行った．その結果, すでに活性の報告がされていた Comp. 1, 2 および Comp. 8, 9 以外に Comp. 4
および Comp. 10 の濃度依存的な BACE1 阻害活性を明らかにした．Comp. 1, 2, 4 および Comp. 8–10 の 6 種の化合物は, A凝集抑制活性とあわせて BACE1 阻害活性もみられたため，それら両方の活性を示す化合物であることを見出した．
次に，カラスタケより単離した 7 種の化合物の SH-SY5Y 細胞に対する Aの毒性を軽減する効果についても検討したところ, p-terphenyl 構造を 2 つもしくは p-terphenyl
構造と C4, C4ʹ または C4ʹ’ にフェノール性水酸基を有した Comp. 2–5 において A40

54

凝集抑制活性だけでなく，神経保護効果を明らかにした．これらの結果は, Comp. 2–5 が，脳内に A42 が沈着した後の神経細胞に対する保護効果を示すことにより, AD 症状を示した患者に対する治療薬として開発される可能性を示唆している．また, Comp. 2–5
は A40 の凝集も阻害したことから, AD や軽度認知障害の予防薬としての開発も期待される．また, Comp. 2 は, A凝集抑制活性の他に BACE1 阻害活性と神経保護効果も有する，複数活性を示す化合物として見出すことに成功した．アミロイドカスケード仮説に基づくこれまでの研究によると, AD 治療の可能性が報告されている化合物のほとんどは, A凝集抑制活性か BACE1 阻害活性のどちらかに限られており，両者の間に関係は見つかっていない．そのため，異なる作用機序で AD を阻害する可能性のある化合物が得られたことは興味深いといえる．また, Comp. 1 には SH-SY5Y 細胞に対する毒性が見られたため，その毒性を軽減させるための修飾基の付加が必要かもしれない．
近年, AD 患者数が増加し続けているために, 安価で安全性が高く, かつ根本的な治療や予防において有効な抗 AD 薬の開発が期待されている. Lecanemab のような抗A抗体製剤が承認され, AD 患者に対する根本的治療が期待されるが，対象症例が限定されていることや大幅な医療費増大の懸念はあり，低分子治療薬の開発への期待は引続き残るものと考える．
本研究で得られた知見や結果が今後の天然物化学や AD 治療薬の創薬の発展に寄与できることを願い結語とする.

55

実験項
使用機器および試薬

本研究では下記の機器, 試薬を使用した.
＜構造解析用機器＞
・赤外吸収スペクトル (IR): FT-IR Nicolet iS5, Thermo Scientific
・紫外吸収スペクトル (UV): Genesys 10S UV-vis, Thermo Scientific
・核磁気共鳴スペクトル (NMR):JNM-LA 500 型スペクトロメータ (1H-NMR: 500 MHz, 13C-NMR: 125 MHz), 日本電子
EC-500 型スペクトロメータ (1H-NMR: 500 MHz, 13C-NMR:125 MHz), 日本電子
ケミカルシフト値は 値で示し, NMR 測定に際しては DMSO-d6, CD3OD を測定溶媒とした． 1H-NMR および 13C-NMR における化学シフトの基準値については，それぞれの溶媒に由来するシグナルの化学シフト値 (DMSO-d6, H 2.49 ppm, C 39.5 ppm;
Pylidine-d5: CD3OD: H 3.30 ppm, C 49.0 ppm) を基準値とした. また, カップリング定数
は hertz (Hz) で示し, 分裂パターンは s (singlet), d (doublet), t (triplet), br (broad), dd (double
doublet), m (multiplet) で各シグナルを示した.
・質量分析 (MS): JMS-700, JEOL・NMR サンプルチューブ (5×7 inch): Wilmad Lab Glass, 関東化学
＜NMR 測定溶媒＞
・DMSO-d6: dimethyl sulfoxide- d6, 99.9% D with 0.03% TMS, 関東化学
・CD3OD: methanol- d4, 99.8% D with 0.03% TMS, 関東化学

56

＜分離用機器＞
・カラムクロマトグラフィー用シリカゲル
シリカゲル: Silica Gel 60N (球状, 中性) (63-201 m), 関東化学
ODS: ODS-A-12 nm S-75 m AA12S75, YMC Group
LH-20: Sephadex LH-20, GE Healthcare, Uppsala, Sweden
COOH: Chromatorex COOH MB100-75/200 (100 m; Fuji Silysia Chemical Ltd., Aichi,
Japan)・薄層クロマトグラフィー (TLC):
Silica Gel 60 F254 (順相), Merck
RP-18 F254s (逆相), Merck
・高速液体クロマトグラフィー (HPLC)
ポンプ: Jasco PU-2080 Plus
検出器: Jasco UV-2075 Plus
カラム:
Inertsustain C18 column (10 × 250 mm; GL Sciences Inc., Tokyo, Japan)
Senshu Pak PEGASIL Silica SP100 (10 × 250 mm; Senshu Scientific Co., Ltd.)
Inertsustain phenyl 5 m column (10 × 250 mm; GL Sciences Inc., Tokyo, Japan)
・海砂 (300-600 mm): 富士フィルム和光製薬
・パラフィルム: PARAFILM 4in×125 ft, エル・エム・エス
・ろ紙: ADVANTEC
・凍結乾燥機: PDU-1100, EYELA

57

＜分離用試薬＞
・酢酸エチル (一級): 富士フィルム和光製薬
・クロロホルム (一級): 関東化学
・メタノール (一級): 富士フィルム和光製薬
・硫酸 (特級): 富士フィルム和光製薬＜A凝集抑制活性試験用機器および器具＞
・エッペンドルフチューブ: 0.5 mL, 1.5 mL: TOHO Treff Lab・コーニング管: IWAKI (15 mL, 50 mL, 100 mL)・ディスポーザブルシリンジ: TERUMO (10 mL, 50 mL) および JMS (100 mL)・シリンジフィルター: Millex-GP (後継品: SLGPR33RB)
・マイクロピペット: ピペットマン, GILSON
・蛍光プレート: 96F Nontreated Black Microwell Si, Thermo Scientific・インキュベーター: Fine 小型インキュベーター FF-10, 東京硝子器械・ローテ―ター: Mini Disk Rotor BC-710, BIO CRAFT
・蛍光プレートリーダー: Synergy HTX Multi-Mode Reader, Bio Teck・ボルテックス: MS3 digital, IKA
・プレートミキサー: Micro Plate Mixer NS-P, ASONE
・pH メーター: pH METER D-13, HORIBA＜A凝集抑制活性試験用試薬＞
・DMSO (生化学用): 富士フィルム和光製薬
・25%アンモニア水 (一級): 富士フィルム和光製薬

58

・Aペプチド Amyloid-protein (Human, 1-40) 0.56 mg/vial, ペプチド研究所
・KH2PO4: 富士フィルム和光製薬
・glycine (特級): 富士フィルム和光製薬
・Thioflavin-T: 富士フィルム和光製薬
・標準緩衝液(フタル酸 pH 標準液) pH 4.01: 富士フィルム和光製薬
・標準緩衝液(中性リン酸 pH 標準液) pH 6.85: 富士フィルム和光製薬
・myricetin: 東京化成工業＜A の毒性神経細胞を保護する効果の検討用機器および器具＞
上記の A凝集抑制活性試験用に加え，
・Pipet-Aid XP2: Drummond
・T75 tissue culture flask: TPP
・ディスポーザブルピペット: IWAKI (5 mL, 10 mL) および VWR (50 mL)
・12-well cell culture plate: FALCON (Product Number: 353043)
・96-well cell culture plate: FALCON (Product Number: 353072)＜A の毒性神経細胞を保護する効果の検討用試薬＞
上記の A凝集抑制活性試験用に加え，・SH-SY5Y: American Type Culture Collection (ATCC, 本学分析化学研究室より拝受)・FBS: Thermo Fisher Scientific

59

・HEPES, L-glutamine, DMEM/F12 (1:1): Thermo Fisher Scientific
・HEPES, L-glutamine, no phenol red DMEM/F12 (1:1): Thermo Fisher Scientific・PBS (-): 富士フィルム和光純薬
・0.53 mM EDTA 含有 0.05% トリプシン: nacalai tesque・Penicillin-Streptomycin, Liquid: Thermo Fisher Scientific・AペプチドAmyloid -protein (Human, 1-42) 0.55 mg/vial (ペプチド研究所)
・Cell Counting Kit-8: DOJINDO・LDH Cytotoxicity Detection Kit: TaKaRa＜BASE1 試験用機器および器具＞
・BACE1 FRET Assay Kit, Red (P2985, Thermo Fisher Scientific, USA)・-secretase inhibitor IV (Sigma-Aldrich, USA)

＜ソフトウエア＞
・GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, USA)60

カラスタケ成分
Extraction and isolation

Dried and fractured fruiting bodies of P. multiplex (734.0 g) were extracted three times each with
CHCl3 and MeOH at room temperature. The MeOH extracts were evaluated for their inhibitory
activity against A aggregation with an A aggregation rate of 25.1% at 10 g/mL. The MeOH
extract (75.0 g, 25.1%) was further fractionated by Si. C. C. using a stepwise gradient (CHCl3MeOH; 100:1, 75:1, 50:1, 20:1, 10:1) to yield seven fractions (A–G) and an insoluble fraction(H). Fractions A–H were evaluated for their inhibitory activity against A aggregation at 10
g/mL (A: 3.18 g, 49.0%; B: 5.80 g, 78.3%; C: 1.52 g, 59.3%; D: 0.31 g, 34.5%; E: 4.50 g, 30.3%;
F: 33.50 g, 22.5%; G: 1.56 g, 14.7%; H: 23.91 g, 14.5%).
Fraction F (33.50 g, 22.5%) was further fractionated by Si. C. C. using a stepwise gradient(CHCl3-MeOH; 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1) to yield five fractions (F1–F5). Fractions F1–F5 were
evaluated for their inhibitory activity against A aggregation at 10 g/mL (F1: 0.12 g, 25.3%; F2:
0.17 g, 32.5%; F3: 2.20 g, 14.2%; F4: 3.07 g, 9.8%; F5: 18.70 g, 13.9%).
Fraction F3 (2.20 g, 14.2%) was further fractionated by a Sephadex LH-20 with CHCl3-MeOHacetone (1:1:1) to yield six fractions (F3a–F3f) and an insoluble fraction (fraction F3g). Fractions
F3a–F3g were evaluated for their inhibitory activity against A aggregation at 10 g/mL (F3a:72.2 mg, 28.5%; F3b: 324.2 mg, 25.9%; F3c: 1.42 g, 5.1%; F3d: 262.7 mg, 18.9%; F3e: 18.4 mg,
23.2%; F3f: 15.8 mg, 5.6%; F3g: 35.8 mg, 5.6%). Fraction F3f was obtained as polyozellin (1,15.8 mg).
Fraction F3c (1.42 g, 5.1%) was subjected to four chromatography steps: (1) ODS C. C. with
MeOH-H2O (50:0, 100:0), (2) COOH. C. C. with CHCl3-MeOH (50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 0:100),(3) preparative HPLC by ODS C. C. eluted with MeOH-H2O (45:55) to obtain NSC617425 (3) (5.6mg, tR 8.0 min) and kynapcin-12 (2) (33.0 mg, tR 11.2 min), (4) preparative HPLC by ODS C.

61

C. eluted with MeOH-H2O (5:5) to obtain Bl-V (5) (9.1 mg, tR 11.2 min), and (5) preparative
HPLC by ODS C. C. eluted with MeOH-H2O (2:8) to obtain succinic acid (6) (13.4 mg, tR 8.0
min).
Fraction F3d (262.7 mg, 18.9%) was subjected to three chromatography steps: (1) Sephadex LH20 with CHCl3-MeOH-acetone (1:1:1), (2) COOH. C. C. with CHCl3-MeOH (50:1, 0:100), and(3) ODS C. C. with MeOH-H2O (80:20, 100:0) to obtain protocatechuic acid (7, 3.5 mg).
Fraction F4 (3.07 g, 9.8%) was fractionated by Sephadex LH-20 with CHCl3-MeOH-acetone(1:1:1) to yield eleven fractions (F4a–F4k) and an insoluble fraction (F4l). Fractions F4a–F4l
were evaluated for their inhibitory activity against A aggregation at 10 g/mL (F4a: 499.3 mg,
52.2%; F4b: 779.6 mg, 43.0%; F4c: 305.0 mg, 43.2%; F4d: 120.2 mg, 39.1%; F4e: 590.1 mg,
35.3%; F4f: 158.9 mg, 25.7%; F4g: 227.6 mg, 11.7%; F4h: 73.3 mg, 9.1%; F4i: 36.2 mg, 5.4%;
F4j: 19.3 mg, 13.7%; F4k: 18.1 mg, 6.1%; F4l: 546.8 mg, 12.8%). Fractions F4g and F4h (300.9mg) were fractionated by Sephadex LH-20 with CHCl3-MeOH-acetone (1:1:1) to obtain
cycloleucomelone (4, 12 mg) (Figure 34).

62

Figure 34. Isolation Procedure of P. multiplex MeOH extract.

63

スペクトルデータ

Comp 1: polyozellindark green amorphous; IR (ATR) 3438, 3292, 1745, 1629, 1613, 1221 cm−1; positive HRFABMS
m/z 438.0585 [M]+ (calcd for C22H14O10, 438.0579). 1H- and 13C-NMR (DMSO-d6): see Table 3.

Comp 2: kynapcin-12
colorless amorphous; IR (ATR) 3356, 1719, 1612, 1525, 1460, 1424, 1369, 1217 cm−1; positive
HRESIMS m/z 433.0892 [M+Na]+ (calcd for C22H18NaO8, 433.0899). 1H- and 13C-NMR (DMSOd6): see Table 4.

Comp 3: NSC617425
pale brown amorphous; IR (ATR) 3446, 3343, 1761, 1749, 1524, 1427, 1372, 1231 cm−1; positive
HRESIMS m/z 449.0843 [M+Na]+ (calcd for C22H18NaO9, 449.0849). 1H- and 13C-NMR(CD3OD): see Table 5.

Comp 4: cycloleucomelone
brown amorphous; IR (KBr) 3270, 1680, 1635, 1602, 1566, 1518, 1480, 1340, 1298, 1028 cm−1;
positive HRESIMS m/z 361.0312 [M+Na]+ (calcd for C18H10NaO7, 361.0324). 1H- and 13C-NMR(CD3OD): see Table 6.

Comp 5: Bl-V
pale brown amorphous; IR (ATR) 3155, 1766, 1612, 1470, 1371, 1211, 1022 cm−1; positive
HRESIMS m/z 447.0694 [M+Na]+ (calcd for C22H16NaO9, 447.0692). 1H- and 13C-NMR (DMSOd6): see Table 7.

64Comp 6: succinic acidcolorless amorphous; IR (ATR) 2931, 2647, 2544, 1689, 1417, 1309, 1200 cm−1; negative
HRESIMS m/z 117.0189 [M−H]− (calcd for C4H5O4, 117.0188). 1H- and 13C-NMR (DMSO-d6):
see Table 8.

Comp 7: protocatechuic acidcolorless amorphous; IR (ATR) 3436, 2961, 2924, 1682, 1610, 1445, 1288, 1166 cm−1; HREIMS
m/z 154.0265 [M]+ (calcd for C7H6O4, 154.0266). 1H- and 13C-NMR (DMSO-d6): see Table 9.

65

Th-T assay

Similar data were previously obtained for A40 and A42 using both test conditions, and thus A40
was used in this study.38 Th-T assays of extracts, fractions, and isolated compounds were
performed using thioflavine-T (FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Ltd., Japan) and A40
(Peptide Institute, Japan). The aggregation of A was evaluated using a slight modification of the
Th-T method developed by Naiki and co-workers.35 In brief, 80 L of 50 mM sodium phosphatebuffer containing 100 mM NaCl at pH 7.4 was aliquoted into a 0.5 mL tube, followed by theaddition of 10 L of each test sample that was dissolved with DMSO. Then, 10 L of A40 (250
M in 0.02% NH4OH) was added to the tube so that the final concentration was A40 25 M,
respectively. All procedures were performed on ice. The resultant solution was incubated at 37 °C
for 24 h, and then mixed with 300 L of 5.0 M Th-T in 5.0 mM Gly-NaOH buffer at pH 8.5.
The mixture was transferred to black 96-well plates at 100 L per well and then gently vortexedfor 30 min. Fluorescence intensity was measured at 440 nm excitation and 485 nm emission usinga Synergy HTX Multi-Mode Reader (BioTek, USA). The A aggregation rate was calculated by
the following equation: A aggregation rate (%) = (S – B)/(C – B) × 100, where C is thefluorescence intensity of a DMSO control (assay buffer, 25 M A40, and DMSO containing notest sample) after 24 h of incubation, B is the fluorescence intensity of a blank (assay buffer, 25M A 40, and DMSO containing no test sample) without incubation, S is the fluorescenceintensity of the tested samples (assay buffer, 25 M A40, and DMSO containing test sample)
after 24 h of incubation. Myricetin (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Japan) was used as apositive control. The IC50 values were calculated by GraphPad Prism version 5.02 (GraphPad
Software, USA).

66

BACE1 FRET assay

BACE1 assays were performed using the BACE1 FRET assay kit, Red (Thermo Fisher Scientific,
USA).39 9 L of test sample, 9 L of 750 nM BACE1 substrate (Rh-EVNNLDAEFK-Quencher
in 50 mM ammonium bicarbonate), and 9 L of BACE1 enzyme (1 U/mL) were mixed on black
384-well plates and incubated for 1 h at room temperature. Fluorescence intensity was measured
at 540 nm excitation and 590 nm emission using a Synergy HTX Multi-Mode Reader (BioTek,
USA). The BACE1 inhibition rate was calculated by the following equation: BACE1 inhibition
rate (%) = [1 – {(S – S0) – (B – B0)/(C – C0) – (B – B0)}] × 100, where C is the fluorescence of a
DMSO control (enzyme, substrate, and assay buffer with DMSO) after 1 h of incubation, C0 is
the fluorescence of the DMSO control at 0 h after incubation, B is the fluorescence of a no-enzyme
control (substrate and assay buffer with DMSO) after 1 h of incubation, B0 is the fluorescence ofthe non-enzyme control at 0 h after incubation, S is the fluorescence of the tested samples (enzyme,
sample solution, and substrate) after 1 h of incubation, and S0 is the fluorescence of the tested
samples at 0 h after incubation. -secretase inhibitor IV (Merck, Germany) was used as a positive
control. The IC50 values were calculated by GraphPad Prism version 5.02 (GraphPad Software,
USA).

67

Protective effect on SH-SY5Y against Atoxicity assay

Each compound was dissolved in DMSO. The final DMSO concentration in the culture medium
was 0.1%. The assay was conducted in Type I collagen-coated 96-well cell culture plates (Nippi
Inc., Tokyo, Japan), and 9.6 × 103 cells/well were seeded. After incubation for 72 h, the medium
was removed. Each test sample and 250 M A42 in 0.02% NH4OH (final concentration of A42:
10 M) was added in DMEM/F12 medium containing 2% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100
g/mL streptomycin. After incubation for 24 h at 37 °C in 5% CO2, cell viability was determinedusing the Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan). The plate was incubated for 3 h at
37 °C in 5% CO2, then the absorbance at 450 nm was measured using the Synergy HTX MultiMode Reader while blank wells containing no-cells, no-A42 peptides, and test samples were also
prepared and measured at 450 nm in the same manner. The relative cell viability was calculatedby the following equation: relative cell viability (%) = (S – BS)/(C – BC) × 100, where C is theabsorbance at 450 nm of DMSO control (9.6 × 103 cells/well, 10 M A42, and DMSO containing
no test samples), S is the absorbance at 450 nm of DMSO control (9.6 × 103 cells/well, 10 MA42, and DMSO containing test sample), BC is the absorbance at 450 nm of DMSO control (nocells, no A42 peptide, and DMSO containing no test samples), BS is the absorbance at 450 nm of
DMSO control (no cells, no A42 peptide, and DMSO containing test samples), each absorbancewas measured in the same procedure.

68

Cell culture

Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were purchased from ATCC and cultured in Dulbecco’s
modified Eagle’s medium/Ham’s F-12 medium (DMEM/F12) supplemented with 10% fetal
bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin, 100 g/mL streptomycin and 15 mM HEPES. The cells
were cultured and maintained in T75 flasks at 37 °C in 5% CO2.

Fungal Material

P. multiplex was collected on Mt. Mizugaki in Yamanashi Prefecture, Japan. A voucher specimen(PM-2018) was deposited in Sep. 2018. Species identification was confirmed by one of theauthors (K. Koyama).

69

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79謝辞
本研究を行うにあたり, 終始懇篤な御指導ならびに, 有益なる御助言を賜りました本
学生薬学研究室 髙取 (木下) 薫教授に深く感謝申し上げます. 本論文作成にあたり,ご指導ならびに御助言を賜りました，主査の本学薬品製造化学研究室 齋藤望教授, 副
査の本学機能分子化学研究室 杉山重夫教授, 並びに本学薬化学研究室 横屋正志准教
授に深謝の意を表します. 本研究を遂行するにあたりご指導いただいた本学生薬学研
究室 佐々木寛朗講師に感謝の意を表します.
生物活性試験を行うにあたり，御指導ならびに御助言を頂きました本学分析化学研究室 小笠原裕樹教授，小池伸講師に厚く御礼申し上げます．
また，本研究にご協力いただきました藤原恒司博士, 平林俊太朗修士に感謝の意を表します. MS ならびに各種 NMR スペクトルを測定して頂きました本学機器分析センター, 小関珠美助教, 山田聖子助教に感謝いたします.
そして，いつも励まし，支えて下さいました家族，本学生薬学研究室の皆様に感謝いたします.

令和 6 年 3 月

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