課題番号：29指1034
研究課題名：糖尿病創薬シーズ探索に資する長鎖非コードRNAの機能解明
主任研究者名 ：長沼 孝雄
分担研究者名 ：該当なし
キーワード ：長鎖非コード RNA、転写制御、代謝調節、肝臓、ホルモン・栄養シグナル
研究成果：
本研究は、糖尿病に対する新たな創薬シーズ探索に資するために、肝臓におけるホルモン・栄養応答性長鎖非コード RNA （lncRNA）の代謝調節への機能的役割を解明することを目的としている。本
年度は、申請者が発見した lncRNA の 1 つである Lnc-FR1 の代謝調節に関わる機能的役割について検討を行ったので報告する。
①肝細胞における Lnc-FR1 の遺伝子転写促進機能の同定
Lnc-FR1 は、マウス初代培養肝細胞におけるグルカゴン-cAMP 応答性と GCN5-CITED2 モジュール依存性、マウス肝臓における絶食応答性を指標に取得したホルモン・栄養応答性 lncRNA の 1 つであり、核内局在を示すことから遺伝子転写の制御に機能することが示唆された。Lnc-FR1 が遺伝子転写の制御に機能することを明らかにするために、肝細胞において機能喪失実験ならびに機能獲得実験を行った。CRISPRi により Lnc-FR1 をノックダウンしたところ、ゲノム上近傍に存在するアルギニントランスポーターCatX 遺伝子の発現抑制が確認された。また、CRISPRa を用いて Lnc-FR1 を強発現させたところ、CatX 遺伝子の発現促進が確認された。これらの結果から、Lnc-FR1 が CatX 遺伝子の転写促進に寄与していることが明らかになった。
次に、Lnc-FR1 による遺伝子転写制御の全貌を明らかにするために、Lnc-FR1 ノックアウトマウスから初代培養肝細胞を単離し、DNA マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を行った。それから、
Lnc-FR1 ノックアウトで発現が 50％以下に減少する遺伝子群を抽出し、in silico によるパスウェイ解析を行ったところ、Lnc-FR1 ノックアウトでは“metabolic pathway”というパスウェイに分類される遺伝子が高く変動し、その中には糖新生やアミノ酸異化などの酵素遺伝子が含まれていた。定量的 PCR 法で検証したところ、Lnc-FR1 ノックアウト肝細胞では G6pc、Pck1 といった糖新生系酵素遺伝子の発現ならびに Hal、Sds といったアミノ酸異化酵素遺伝子の発現が共に減少していた。これらの結果から、
Lnc-FR1 は CatX の遺伝子転写の促進だけでなく糖新生やアミノ異化といった絶食応答を担う酵素群の遺伝子転写促進にも関わることが明らかになった。
②肝細胞における Lnc-FR1 による代謝調節に関わる機能的役割の同定
肝細胞における Lnc-FR1 による代謝調節に関する機能的役割について検討した。Lnc-FR1 による CatX遺伝子の転写促進が、CatX のアルギニントランスポーター活性を変化させ、細胞内へのアルギニンの取り込みを促進していることを明らかにするため、アルギニン依存的に活性化することが知られている mTORC1 シグナルをリードアウトとすることで CatX による細胞内へのアルギニンの取り込みを検出した。アミノ酸飢餓状態にした肝細胞へのアルギニンの添加により、mTORC1 の活性化を反映して
S6K、S6、4E-BP1 タンパク質のリン酸化が認められたが、CRISPRi による Lnc-FR1 ノックダウン肝細胞ではコントロール細胞に比べて S6K、S6、4E-BP1 タンパク質のリン酸化の減弱が見られた。この結果は、Lnc-FR1 ノックダウンによる CatX 遺伝子の発現抑制を介して細胞内へのアルギニンの取り込みが減少していることを示しており、このことから Lnc-FR1 は CatX 遺伝子の転写を促進し、その発現を増加させることでアルギニントランスポーター活性を強め、細胞内へのアルギニンの取り込みを促進していることが明らかになった。

Subject No.

：29 指 1034

Title

：Functional analysis of long noncoding RNAs that contribute to exploring new drug
seeds for diabetes

Researchers ：Takao Naganuma
Key word：Long noncoding RNA, transcriptional regulation, metabolic regulation, liver,hormone / nutrient signals：
Abstract
This research aims to elucidate the functional roles of hormone and nutrient responsive longnoncoding RNAs (lncRNAs) involved in metabolism regulation in the liver to contribute toexploring new drug seeds for diabetes. Herein, we report about the functional roles involved in themetabolic regulation of Lnc-FR1 which is one of the lncRNAs discovered by us.
①Functional roles involved in gene transcriptional regulation by Lnc-FR1 in hepatocytes
Lnc-FR1 is one of hormone and nutrient responsive lncRNAs obtained by using glucagon-cAMPresponsiveness and dependency on GCN5-CITED2 module in mouse primary hepatocytes andfasting responsiveness in mouse liver as indicators. It is suggested that Lnc-FR1 functions toregulate gene transcription as it localized to the nucleus. To clarify that Lnc-FR1 is involved in theregulation of gene transcription, we performed the loss-of-function and gain-of-function
experiments in hepatocytes. CRISPR-mediated knockdown of Lnc-FR1 reduced the argininetransporter CatX transcript levels, which CatX is one of the genes surrounding the Lnc-FR1 locus
in the mouse genome. In addition, CRISPR-mediated activation of Lnc-FR1 increased the CatXtranscript levels. These results revealed that Lnc-FR1 promoted the CatX gene transcription.
Next, to clarify the whole picture of gene transcriptional regulation by Lnc-FR1, we performed theisolation of primary hepatocytes from Lnc-FR1 knockout mice and the comprehensive gene
expression analysis with DNA microarray. Then, we extracted a group of genes whose expression
decreased to less than 50 % by Lnc-FR1 knockout and performed the pathway analysis in silico. Asa result, we found that Lnc-FR1 knockout fluctuated highly the genes classified as "metabolicpathway" in Lnc-FR1 containing enzyme genes such as gluconeogenesis and amino acids
catabolism. The validation by quantitative PCR method of DNA microarray data indicated that
Lnc-FR1 knockout decreased the expression of gluconeogenic enzyme genes such as G6pc, Pck1
and expression of amino acids catabolic enzyme genes such as Hal, Sds in hepatocytes. This result
revealed that Lnc-FR1 is also involved in promoting gene transcription of enzymes responsible forfasting responses such as gluconeogenesis and amino acids catabolism.
②Functional roles involved in metabolic regulation by Lnc-FR1 in hepatocytes
We investigated the functional role of regulating metabolism by Lnc-FR1 in hepatocytes. To clarify
whether Lnc-FR1-mediated the promotion of CatX gene transcription alters the argininetransporter activity of CatX and promotes the arginine uptake into cells, we utilized the mTORC1
signals as readout, which is known that arginine activates the mTORC1 signals. In hepatocyte
under the amino acids starved condition, CRISPR-mediated knockdown of Lnc-FR1 attenuated thephosphorylation of S6K, S6, 4E-BP1 protein which reflects the arginine dependent activation ofmTORC1 signals compared with control cells. This result suggested that Lnc-FR1-mediated thepromotion of CatX gene transcription alters the arginine transporter activity of CatX andpromotes the arginine uptake into cells.

29指1034

糖尿病創薬シーズ探索に資する長鎖非コードRNAの機能解明

平成29年度 研究報告要旨
本研究は、糖尿病に対する新たな創薬シーズ探索に資するために、肝臓におけるホルモン・栄養応答性長鎖非コードRNA（lncRNA）の代謝調節への機能的役割を解明することを目的としている。本年度は、申請者が発見したlncRNAの1つである
Lnc-FR1の代謝調節に関わる機能的役割について検討を行い、以下のことを明らかにした。
①Lnc-FR1がCatX遺伝子の転写を促進することを明らかにした。
②Lnc-FR1はCatXの遺伝子転写の促進だけでなく糖新生やアミノ異化といった絶食応答を担う酵素群の遺伝子転写促進にも関わることが明らかになった。
③Lnc-FR1はCatX遺伝子の転写を促進し、その発現を増加させることでアルギニントランスポーター活性を強め、細胞内へのアルギニンの取り込みを促進していることが明らかになった。

絶食応答の分子機構の解明は代謝疾患ならびに寿命を制御する鍵となる→新規糖尿病開発のための重要課題である

肝臓におけるホルモン・栄養応答性lncRNAの同定の流れ

肝臓におけるホルモン・栄養応答性lncRNAの例

ホルモン・栄養シグナルに応答しGCN5-CITED2モジュールによって発現が制御されるlncRNAは、絶食応答に関与するのでは？
→糖尿病に対する新たな創薬シーズになるのではないか？

Lnc-FR1は、絶食応答を担う酵素群の遺伝子転写促進に関わる

Lnc-FR1は、CatX遺伝子の転写を促進する

WT
Lnc-FR1664320cAMP:

0－+cAMP:－

Lnc-FR1 CRISPRa

Lnc-FR1

CatX
8
Relative expression

Relative expression

9Control

Lnc-FR1 CRISPRi

+CatX

100

1675

1250

825

400cAMP:

cAMP:

－+－+

Lnc-FR1によるCatX遺伝子の転写促進は、細胞内へのアルギニン摂取を促進する

Lnc-FR1ノックアウトにより発現変動する
代謝関連遺伝子の例
G6pc
2.0 down
糖新生
Pck1
2.3 down
アミノ酸異化HalSds

3.0 down
2.0 down

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：29指1034
研究課題名：糖尿病創薬シーズ探索に資する長鎖非コードRNAの機能解明
主任研究者名：長沼孝雄
論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

タイトル

発表者

学会名

場所

年月

該当なし

学会発表

絶食応答性長鎖ノンコーディングRNAの代謝長沼孝雄
調節における役割の解明

第32回日本糖尿病・肥満動物学会 名古屋
年次学術集会2018年2月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国