キノコ子実体からのアルツハイマー病治療薬の開発

Development of anti-Alzheimer’s Disease Drugs from Fungal Fruiting Bodies

令和元年度入学増田 優紀 (Masuda, Youki)

目次

序論
第 1 章

創薬における新規薬用資源としてのキノコ子実体 .................................... 4

第 2 章

アルツハイマー病の発症機序に基づいた治療薬の開発 ........................... 12

第 3 章

本研究の目的........................................................................................... 24

本論
ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキスからの抗 AD 活性化合物の探索 ..... 26

第 1 章
第 1 節

キノコ子実体抽出エキスの作成と Ab 凝集抑制活性の評価................ 26

第 2 節

キノコ子実体ヌメリアイタケとそれに関連する報告 ........................... 30

第 3 節

ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキスからの化合物の分離・精製 .......... 32

第 4 節

単離物の構造決定 ................................................................................ 36

第 5 節

ヌメリアイタケ由来 meroterpene 類の抗 AD 活性と構造活性相関の検討......................................................................................................................... 59

ニンギョウタケ MeOH 抽出エキスからの meroterpene 類の探索 .......... 64

第 2 章
第 1 節

キノコ子実体ニンギョウタケとそれに関連する報告 ........................... 64

第 2 節

ニンギョウタケ MeOH 抽出エキスの分離・精製 ............................... 66

第 3 節

単離物の構造決定 ................................................................................ 68

2

結語 ............................................................................................................................ 86

実験項......................................................................................................................... 88

参考文献 ..................................................................................................................... 99

謝辞 .......................................................................................................................... 116

3

序論
第 1 章

創薬における新規薬用資源としてのキノコ子実体

人間の歴史において天然物は医薬品や健康食品, 化粧品等として利用されてきたことから, 人類の営みと天然物は切っても切り離すことができない密接な関係にあるといえる.1-4) その中でも, 新たな医薬品を生み出す創薬の現場では古くから身近にある動植物を薬として用いていたことから, その有効成分であるに天然物に注目した研究が行われてきた. 18世紀後半の有機酸の抽出・分離から近代の天然物化学が始まって以来，
19 世紀には現在まで鎮痛薬として医療現場で使用されている morphine が生薬アヘンから見出され, 20 世紀に入ると微生物由来の医薬品シード化合物の探索を行なう先駆けとなった抗菌薬 penicillin G が発見された. 5,6)

Figure 1 Structures of avermectin B1a and artemisinin.

これらの研究が契機となり創薬の現場において天然物がより盛んに研究されるようになったことで, 2015 年には駆虫薬 ivermectin のリード化合物 avermectin B1a を発見した大村らとマラリア治療薬 artemisinin の開発に携わった Tu らがノーベル医学生理学賞を受賞するに至った (Fig. 1). Ivermectin は土壌より採集された放線菌 Streptomyces
avermitilis から単離された駆虫活性をもつ macrolide 化合物である avermectin B1a を

4

リード化合物として活性の増強や副作用の軽減等の構造最適化を経て開発され, オン
コセルカ症等の治療薬として使用されている. 7,8) また, artemisinin はキク科 Artemisia
annua より単離された cadinane 型 sesquiterpene であり, 強い抗マラリア活性を示しながらも副作用が少なかったことから多くのマラリア患者の治療に用いられた. 9) これらの例を含めた 1981 年から 2019 年 9 月までに開発された医薬品について Newman
らが調査を行ったところ, 全体の約 50％, 低分子のみに注目した場合であれば 70％もの割合の医薬品が天然物に由来する 化合物で構成されており, 天然資源や天然物に由来することが明らかとなっている.10) さらに, これまでに開発された低分子医薬品において, 天然資源に由来する医薬品が占める割合は 1980 年代後半にピークを迎えて以降, 減少傾向にあったが, 2010 年以降は増加傾向に転じていることが示されている. 10)
したがって, これまでの創薬において天然物は重要な役割を担っており, 今後もその重要性は依然として変わらないことが推測される.
このように創薬において天然物が貢献し続けることができた理由として，多彩な構造とそれに付随する特異的な生理活性を有する, 新規性に富んだ化合物を天然資源が数多く供給してきた点が挙げられる. 先に挙げた avermectin B1a の酢酸–マロン酸経路によって生合成される複雑な 16 員環マクロライド構造や, artemisinin の cadinane 骨格の一部が切断され高度に酸化された peroxide 構造はユニークな構造の一例であり, こ
れらは興味深い生物活性を示すことが明らかにされてきた. 11,12) Feher らの報告によれ
ば, 天然物は合成した化合物に比べて多様な構造を有していることから, 合成化合物ライブラリーとは異なるケミカルスペースを占有しており, 上市された医薬品の多彩な構造は天然物に由来することが示されている.13) また, 新たな医薬品を開発するにあた
り天然物に由来する多様な構造をデータベース化し, それらのデータベースを用いて医薬品シード化合物の構造展開の効率化を図る研究もなされている. 14,15) つまり, 天然

5物の構造や生理活性の多様性が医薬品の開発に恩恵をもたらしてきたことは言うまでもなく, 今後も天然物による新規ケミカルスペースの拡充が期待されている.

Figure 2

Traditional approach to find new compounds.

従来, 天然資源由来の医薬品を創出するにあたり，医薬品またはそれらのシード化合物の探索は身近に存在する入手しやすい天然資源を中心に行われてきたが，これらの天然資源の探索研究が進むにつれ，徐々に新規医薬品シード化合物を得ることが難しくなった (Fig. 2).2-4) それゆえに, 従来法による天然物からの医薬品の開発はコストに対して新規医薬品シード化合物の取得効率が悪いとされ, 創薬の現場においては コンビナトリアルケミストリーにより構築された合成化合物ライブラリーを用いたハイスルー
プットスクリーニング (high-throughput screening, HTS) の導入を機に天然物からの創薬研究は積極的に行われなくなった. この理由のひとつとして，採集しやすく, かつ構造決定や活性評価を行うのに十分な量の化合物が得られるような天然資源は研究されつ
くされてしまったことが挙げられる. さらに, それらの天然資源から新規化合物を発見できたとしても極めて産生量が少ないマイナー成分の可能性が高く, 構造展開研究や詳細な活性発現機序の検討を行うことはおろか十分な構造や生理活性の検討を行うことすらできないと予想される. また, 2030年までに達成することを目指した国際目標である持続可能な開発目標 (Sustainable Development Goals, SDGs) の中には海洋資源や陸上資源, それらを用いた消費や生産の形態に関する目標が存在する. 16) しかしながら,

6

有益なマイナー成分の増量や工業的利用の目的で大量の天然資源を使用することはSDGs の中のこれらの目標に反しており, 生態系の変化を引き起こすことも否定できない.
ここで, 視点を変えて探索研究を行うだけの量が確保できると推測される海外の多様性に富んだ未開拓資源に着目するも, 生物の多様性の保全, 生物の多様性の持続可能な利用と遺 伝資源の 利用から 生じた利 益の公 正で衡平な 配分 (Access and Benefit
Sharing, ABS) を目的とした生物多様性条約 (Convention Biological Diversity, CBD) や
ABS に基づいた名古屋議定書の発効により状況が一転した.17-19) すなわち, これらの発効により遺伝資源や関連する伝統的知識を利用して創薬研究を行うことで利益を得た
場合, その資源や伝統的知識を提供した国の資源および知識を有する原住民とその地域社会に利益を配分することが要求されるようになった. たとえ基礎研究が目的であったとしてもこれらは適用されるため, 海外の未開拓資源へ容易にアクセスできないことから国内の新規薬用資源の開拓は早急に対応すべき課題となった.20)
近年, 新規薬用資源の開拓の一環としてキノコ子実体に着目した研究が展開されてきた. 一般にキノコ子実体とは担子菌や子嚢菌に分類される真菌類が形成した肉眼でも判別できる程の大型の有性胞子形成器官を指し, これらを形成する菌類は胞子が発芽して菌糸体となり, その菌糸体が分化して子実体を形成した後, 再び胞子となる生活環を有する.21-27) このようなキノコが特徴的な生活環を有することの生物学的意義やその制御機構, それに対する二次代謝産物の関与等の多くの疑問は未だに解明されておらず, 現在も生物学的な研究が多く展開されている.28-31) また, 生活環における菌糸体と子実体のように異なる形態間では産生する二次代謝産物も異なることが知られており,22,23,32) これらの一例として生薬では猴頭として知られるヤマブシタケ (Hericium
erinaceus) の成分探索研究が挙げられる. ヤマブシタケの子実体から神経軸策の伸長や神経伝達物質の合成促進等に関与するタンパク質である神経成長因子 (nerve growth7

factor, NGF) 誘導活性を有する化合物の探索を行ったところ, 酢酸–マロン酸経路とイ
ソプレノイド経路の複合経路で生合成される meroterpene 類である hericenone D をはじめとした hericenone 類が見出された (Fig. 3a).33-35) ここで, 更なる活性評価のためのin vivo 試験を行うにあたり, より多くの hericenone 類の供給が必要であったことからヤマブシタケ菌糸体の培養による hericenone 類の生産を試みた. その結果, 菌糸体より得られた NGF 誘導活性化合物は hericenone 類ではなく labdane 型 diterpene 類である erinacine C をはじめとした erinacine 類であったことから (Fig. 3b), キノコ子実
体は菌糸体と異なる生合成遺伝子が発現して異なる二次代謝産物を産生していることが示されている.36-39)

Figure 3 Isolated compounds from mushroom Hericium erinaceus.
a: hericenone D from fruiting bodys, b: erinacine C from mycelium.

さらに, 一般に糸状菌などの真菌類ではシキミ酸経路が発達していないとされているが, キノコ子実体からはしばしばシキミ酸経路で生合成される二次代謝産物が得られることが報告されている. 例えば, カラスタケ (Polyozellus multiplex) 子実体から単離されたプロリルエンドペプチダーゼ (prolyl endopeptidase, PE) 阻害活性を有する
polyozellin, 血 管 新 生 阻 害 活 性 を 有 す る polyozellic acid や ク ロ カ ワ (Boletopsis
leucomelas) 子実体より得られた受容体型チロシンキナーゼの一種である血管内皮細胞
増殖因子受容体 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2, VEGFR2, KDR) 阻害活性を有する boletopsin C 等の p-terphenyl 類がシキミ酸経路で生合成されるキノコ子実体

8由来の化合物である (Fig. 4).40-43) これらのことから, これまでに盛んに研究されてきた
糸状菌の二次代謝産物とは異なる, 独特の二次代謝産物を産生するキノコ子実体は研究材料としての有用性があるといえる.

Figure 4 Structures of polyozellin, polyozellic acid and boletopsin C.

古くからキノコ子実体が経験的に食品や生薬として利用されてきたことは言うまでもないが, このような長い歴史があるにもかかわらず二次代謝産物の研究がなされたものはほんの一部にすぎない. すなわち, キノコ子実体を形成する菌類は全世界に 14万種以上も存在すると推計されているがこれまでに命名がなされた種はわずか 1 万程
度であり, 命名された種の中でも二次代謝産物に関する研究が遂行されたのはほんの10％程度しかない.22,23,44,45) このようにキノコ子実体特有の二次代謝産物が獲得できる可能性があるにもかかわらず積極的に研究されてこなかった理由として, 研究を行うのに十分な量のキノコ子実体を，容易にかつ安定して得られなかったことが挙げられる.
これに対して分離や分析に関する技術の発展により従来よりも少量で研究が行える現在においてキノコ子実体は未開拓資源であり, ユニークな構造の新規化合物を取得できる見込みがある. また, 糸状菌で用いられているような生合成研究を介した遺伝子工9

学的な手法や有機合成等の発展により，懸念材料である有用な単離物の安定供給の問題についても複数の選択肢をもって解決し得ると予想される.46-47) すなわち, 従来よりも少量のキノコ子実体を用いた探索研究を行い, 獲得した新規活性化合物の構造を解明することで全合成による供給が可能である. また, 新規活性化合物の構造から生合成経路を推定し, 生合成研究を展開することで生合成遺伝子を解明することができる.3,4,46)
その結果から, morphine や artemisinin の生産にも利用されているように, 生合成遺伝
子を酵母, 大腸菌や糸状菌に異種発現させることで必要な量の新規活性化合物やその骨格を有する生合成中間体を得ることもできる.46-49) このことから, 詳細な活性評価および活性の発現機構の解明や構造展開研究のような創薬研究だけでなく, 二次代謝産物の生物学的意義に関する研究にも新規活性化合物を用いることができる.
さらに, 古くから様々な効能をもつことで重宝され, 霊芝とも呼ばれるマンネンタケ(Ganoderma lucidum) お よ び そ の 近 縁 種 や , 昆 虫 , ク モ お よ び 菌 類 に 寄 生 す る
Ophiocordyceps sinensis をはじめとしたキノコ子実体の総称である冬虫夏草等は経験的に有効性が確認されてきた.21-23) これにより, 現在もこれらのキノコ子実体や利水作用を有し五苓散などの処方に使用される猪苓や茯苓などの菌核が重要な生薬として用いられていることからキノコ子実体の薬理活性も注目されている.1,4) また, これまでにキノ コ 子 実 体 か ら は シ イ タ ケ (Lentinula edodes) 由 来 の b-glucan を 主 成 分 と す る
lentinan, 菌糸体からはカワラタケ (Trametes versicolor) 由来のタンパク質-多糖を主成分とする polysaccharide-Kureha (PSK) やスエヒロタケ (Schizophyllum commune) 由来の
b-glucan を主成分とする sizofiran が抗悪性腫瘍剤として開発されている.21-23) これらのことからキノコ子実体由来の有用な化合物が新規医薬品シード化合物となり得る可能性が示されている. このような背景から当研究室ではキノコ子実体を用いた生物活
性成分の探索研究を行っており, これまでにクロコブタケ (Hypoxylon truncatum) 子実体から血管新生阻害活性をもつ benzo[j]fluoranthene 類の hypoxylonol C や, チャコブ

10

タケ

(Daldinia concentrica) 子 実 体 か ら

HUVECs 増 殖 抑 制 活 性 を 有 す る

naphthoquinone 類の daldiquinone 等を報告している (Fig. 5).50-52)

Figure 5 Structures of hypoxylonol C and daldiquinone.

以上のことから, キノコ子実体からの医薬品シード化合物の探索研究を展開することは, 単に創薬による産業的な利益や人々の健康的な生活の確保だけでなく, 天然物化
学や基礎生物学の発展や CBD および SDGs に記されているような生態系の保護, 持続可能な利用の推進と生物多様性の損失阻止への貢献も見込まれる. そこで, 本研究においても未開拓な薬用資源であるキノコ子実体を研究材料として研究に着手すること
とした.

11

第 2 章アルツハイマー病の発症機序に基づいた治療薬の開発

アルツハイマー病 (Alzheimer's disease, AD) は認知症の一種で, 認知症患者の約60％が罹患していると推計されている神経変性疾患である.53) AD の病理学的特徴として, 患者の脳にてアミロイド b (amyloid b, Ab) が凝集・沈着した老人斑 (senile plaque,SP) と過剰リン酸化タウタンパク質 (tau protein, tau) の凝集体を主要構成要素とする神経原線維変化 (neurofibrillary tangle, NFT) が観察されることが報告されている.54-58) また, AD の症状は一般的な認知症と同様に記憶障害, 人格変化や遂行機能障害等を指す
中 核 症 状 と 徘徊 や 暴 言・ 暴 行 など の 行 動症 状や 不 眠 や 被 害妄 想 な どの 周 辺 症状
(Behavioral and Psychological Symptoms of Dementia, BPSD) の 2 種類の症状から構成されている.59) これらの症状により AD 患者とその看護や介護に従事する患者の家族,
医療従事者や介護従事者との間での意思疎通が困難であり, ケアを受ける側だけでなく提供する側の負担も大きいことから, AD 患者への医療および介護における状況の改善は社会的に重要な課題とされている.60-65)
AD に関する疫学調査も行われており, AD のリスク因子に関する疫学調査の結果についてメタ解析を行ったところ, 全世界における AD のリスク因子は加齢を最大とし,身体活動不活発や喫煙, 低教育歴等が挙げられている.63,66-70) また, WHO が 2020 年に発刊した Global status report on the public health response to dementia によれば世界の認知症患者の人口は 2020 年では 5520 万人と推定されており，2030 年までに 7800 万人，2050 年までに 1 億 3900 万人に到達すると予測されており,71) Alzheimer's Disease
International が 2015 年に報告した調査の結果と比較すると, 認知症患者数の増加速度
は上方修正されている.70,72,73) 日本においても平成 29 年度高齢者白書によると全国の認知症患者は 2012 年に 462 万人と推計され, 2030 年までに 730 万人，2050 年には1016 万人に上るとされており,74) 世界および日本における認知症患者数, そして AD
患者数は増加の一途を辿ることが予想されている.70,71,73,74) さらに, AD 患者数の増加に12

付随して医療費や介護費の増加による経済的影響も見込まれており, AD に関する全世界の社会負担額は 2020 年では 1.3 兆米ドルで, 2050 年には 2.8 兆米ドル必要となるといわれている.72) つまり, AD は患者個人だけでなく社会や経済においても大きな影響を及ぼす疾患であり, 新規 AD 治療薬のニーズが大いにあることは明白である.

Figure 6 Structures of approved anti-AD drugs, AChEIs and NMDA-type glutamate receptor
inhibitor.

ここで日本における従来の AD 治療薬に注目すると, アセチルコリンエステラーゼ阻害薬 (acetylcholinesterase inhibitor, AChEI) の donepezil (Eisai), rivastigmine (Novartis)
お よ び galantamine (Janssen) の 3 種 類 と NMDA 型 グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 阻 害 薬(NMDA-type glutamate receptor inhibitor) の memantine (第一三共) の合計 2 系統, 4 種類の AD 治療薬しか承認されていない (Fig. 6). また, これらの AD 治療薬は症状の進行を遅らせる対処療法にすぎず, 現時点で根本的な治療法が存在しないことから
AD の治療満足度と薬剤の貢献度は共に低い割合を示し続けている.75) 近年, このようにアンメットメディカルニーズだけが存在する状況を打破するために従来の AD 治療
薬とは異なる作用機序の AD 治療薬の開発が盛んに行われてきた. その中でも生体内

13分子であるため比較的安全性が高く, かつ標的分子に対する高い特異性を有するモダリティの抗体は特に注目されており,76-78) その開発の一例として 2021 年 6 月に米国
食品医薬品局 (Food and Drug Administration, FDA) より条件付き迅速承認を取得した
aducanumab (Eisai/Biogen) が挙げられる. しかしながら, 臨床試験において aducanumabの高濃度投与による副作用が確認された点や, 認知機能の改善がなされたのか不明である点を考慮すると, AD 治療薬としての安全性や有効性の証明が不十分である.79)

Figure 7

Dynamic biomarkers of the Alzheimer’s pathological cascade.80)

また, AD の発症年齢は約 80 歳，発症の前段階である軽度認知障害 (mild cognitive
impairment, MCI) を き たす 年齢 は 約 70 歳 とさ れ てい る が, ポジ ト ロン 断層 撮 影(positron emission tomography, PET) を用いた追跡の結果から Ab や tau 凝集体の蓄積は約 50 歳の時点で始まっていることが解明されている (Fig. 7).80) この Ab および
tau 凝集体の蓄積開始から MCI 発症までの期間は preclinical AD とされており, この期間に治療を開始することが望ましいとされていることや貧困層に AD 患者が多いこともふまえると, 安価であることは新規 AD 治療薬において必須条件といえるだろ14

う.70,80) このことから, 前述したニーズにも応えつつ治療満足度や薬剤の貢献度の向上を図るためにも, 安価で安全性が高く AD の発症機序に基づいた根本的な AD 治療薬の開発は急務といえるだろう.

Figure 8 Mechanism of AD based on amyloid cascade hypothesis.

根本的な AD 治療薬の開発を遂行するためには AD の発症機序について理解するべきであるが, 現時点では AD の明確な発症機序は解明されていない. その中でも,AD の発症機序において最も有力とされている仮説が Hardy らによって提唱されたア
ミロイドカスケード仮説である (Fig. 8).81) この仮説によれば, アミロイド前駆体タン
パ ク (amyloid precursor protein, APP) か ら b-secretase (b-site APP cleaving enzyme 1,
BACE1) と g-secretase に よ り 40 残 基 前 後 の ア ミ ノ 酸 に よ っ て 構 成 さ れ る Ab
monomer が切り出される段階と, その切り出された Ab monomer が Ab oligomer やAb fibril へ凝集する段階の 2 つの段階が AD の発症において重要とされている. これらの段階を経て産生した Ab が関与してシナプス毒性を示すことで AD が発症するとされており,82,83) この仮説が支持される理由としては先に述べた病理所見と遺伝学的な根拠が挙げられる (Fig. 9). すなわち, 家族性 AD (Familial Alzheimer Disease, FAD)の原因遺伝子に関する研究において, Ab の中でも高い凝集能および強い毒性を有するとされている Ab42 の産生量を増加させる Swedish 変異や, Ab42 の凝集能の増強を誘15発する Iowa 変異, Dutch 変異や Italian 変異などの変異を有すると FAD を発症す
る.84-86) 一方, Ab42 の産生量を減少させる Icelandic 変異は AD 発症を遅延させることが報告されており,87) これらの報告から Ab が AD の発症において重要である根拠としている. ここで, AD の発症機序において重要な役割を担い, かつ根本的な AD 治療薬を開発するにあたって標的となり得る Ab を産生する段階と Ab が凝集する段階に注目すべきである.

Figure 9 Sequence of Ab and mutation related to FAD.

先ず Ab を産生する段階において, シナプスの形成や修復を担う 1 回膜貫通型のⅠ型膜タンパク質である APP を切断する過程に 2 種のアスパラギン酸プロテアーゼが関与しており, これらを標的とすることで Ab の産生を制御できることが予測される.88) すなわち, 細胞膜外で APP の N 末側を切断するⅠ型膜貫通型タンパク質のBACE1, および脂質二重膜内で APP の C 末側を切断し 40 残基のアミノ酸により構成される Ab40 と, 42 残基のアミノ酸により構成される Ab42 をはじめとした Ab の
アミノ酸残基数を決定する g-secretase が治療薬開発の標的となり得る.89-91) そして, こ
れらの制御により大半を占める Ab40 や高い凝集能と強い毒性を有する Ab42 の産生量を減少させることで,92) AD の症状が進行しなくなると推測される. ここで, 2 つの標的分子の特性を考慮すると様々な組織の発生過程において増殖や分化などを制御して細16

胞運命を決定する Notch 経路にも関与し, 50 以上の基質が存在することが知られていることから基質特異性も高くない g-secretase は標的として不適といえる.93) つまり,根本的な AD 治療薬の開発において g-secretase よりも BACE1 を標的とする方がよ
り良いと予想されることから, BACE1 による APP の切断機序に着目した. 2 つのアスパラギン酸, Asp32 および Asp228 を触媒部位として有する BACE1 は, 至適 pH が4−5 であることからリソソームなどの酸性細胞小器官に局在しており,89) この至適 pH
において活性型 BACE1 は APP を取り込めるようにポケットの構造が大きく開き,
かつポケット内部の形状も APP 選択的な形状をとっている.94) 一方で pH が 7 以上の場合において BACE1 はポケットが閉じて非活性型となり, 活性部位に APP を取り込むことができなくなる. また, pH が 4 以下においても BACE1 は非活性状態となるが先の非活性型とは異なり, BACE1 のポケットの形状は維持したまま APP 切断時に要するポケット内の水分子が減少することで BACE1 が非活性となる. このことから, BACE1 阻害活性の発現機序において単にポケットに入り込む, またはポケットの形状を変化させることで阻害するだけでなく, pH を変化させることも有効であることが挙げられる.
続いて, 生体内における Ab の産生場所について焦点を当てると, 近年の研究によれば Ab 産生は脳内の神経細胞だけでなく肝臓のマクロファージを中心とした末梢でも行われ, 産生した Ab が細胞外に放出されることが報告されている.92,95,96) 放出された Ab は血液脳関門 (Blood Brain Barrier, BBB) における脳血管内皮細胞に発現している終末糖化産物受容体 (Receptor for Advanced Glycation End Products, RAGE) による脳血管内皮細胞への Ab の取り込みを介して脳内へ輸送されることが示唆されており,
95,97)

Ab が末梢で産生されたとしても脳内に影響を及ぼす可能性がある. この末梢, 特に肝臓で産生された Ab の AD 発症における寄与度は解明されていないものの, AD
治療薬の創薬において今後とも注目すべき点である. 最近の報告によれば, 既に安全性

17

と体内動態が確認されている医薬品から新たな薬効を見出すドラッグ・リポジショニン
グ (drug repositioning, DR) を用いた AD 治療薬の探索により見出された脂質異常症の治療薬である probucol を用いることで, 肝臓における Ab 産生量を抑制できることが示唆されている (Fig. 10).98,99) これらの研究の結果を受けて, 現在オーストラリアにて
ヒトでの臨床試験が進められており,100) この臨床試験の内容によっては今後の AD 治療薬の開発におけるモダリティの選択や薬物伝達システム (Drug Delivery System, DDS)の構築への大きな貢献が期待される.

Figure 10 The structure of probucol.

ここで Ab に焦点をあてると感染症により惹起された炎症組織のマクロファージにおいて Ab の産生が誘導されることからも Ab は抗菌および抗真菌を役割とした分子であると推測されている.96,101,102) しかしながら, Ab は多くの三次構造を有することが知られており, 神経保護作用やグルコース恒常性等の三次構造の多様性に起因する
様々な生理活性が報告されていることから,103-105) 本来の役割は未だに明らかとされていない. このような生理活性を有する分子は一般に速やかに除去されることが知られており, 脳内の Ab も通常は 40 残基程度のペプチドを基質とするプロテアーゼのネ
プリライシン (neprilysin, NEP) による速やかな分解や BBB からの排出輸送機構により, クリアランス系と Ab 産生系のバランスをとっている.106-108) 一方で AD 患者は老化による NEP 活性の低下, BBB からの排出輸送機構の破綻や遺伝的要因による Ab4218

産生量の増加等の様々な要因によって, Ab42 産生系よりも Ab42 のクリアランス系が相対的に小さくなり, それによって脳内の Ab42 が除去されずに蓄積する. 84-86,109-110)

Figure 11

Toxic and non-toxic conformations.115)

Figure 12 Proposed mechanism of stabilizing the radical species derived from Ab42.115)

この蓄積した Ab42 は細胞外だけでなく RAGE などの受容体, 膜チャネルやエンド
サイトーシスにより細胞内へ移行し, 細胞内外で重合核を形成して凝集する.93,111) すな
わち, random coil，a-helix や b-sheet 等の様々な二次構造を形成する中でも b-sheet を形成した Ab42 monomer には Gly25-Ser26 付近にターン構造を有する非毒性配座と,Glu22-Asp23 付近にターン構造を有する毒性配座が存在する (Fig. 11).112-114) このうち
毒性配座における Glu22-Asp23 付近のターン構造により Tyr10 と Met35 が近接することで，Met35 の側鎖が Tyr10 のフェノキシラジカルにより酸化およびラジカル化さ19

れる (Fig. 12).114-117) そして C 末の Ala42 が Met35 に近接することで Met35 の硫黄
ラジカル安定化を経て Ab42 monomer が重合核を形成する. ここから核重合モデルに従った Ab42 の凝集が開始され, Ab42 oligomer を経て Ab42 fibril を形成する経路の onpathway と Ab42 protofibril を形成する off-pathway の 2 つの経路からそれぞれ凝集体を形成する.118-120) これらの過程で生じた酸化ストレスや凝集体によって誘発された
物理的なストレス等による複合的なストレスが, 最終的に神経細胞の死滅へと誘導するとされている.93,121-123) このことから, Ab が凝集する過程が AD の発症機序において重要な役割を担っているとされ, Ab の凝集機序における重合核形成段階の酸化やラジカル化が創薬における標的となり得ることが予想される.

Figure 13 Structures of BACE1 inhibitors from natural resources.

ここまで AD の発症において寄与度が大きく, AD 治療薬の開発において標的となり得る段階を中心に AD の発症機序について述べてきたが, これらをふまえて既知の天然物由来 BACE1 阻害活性や Ab 凝集抑制活性を有する化合物とそれらの特徴および活性発現の機序に焦点を当てることとした. 先ず, BACE1 阻害活性を有する化合物として Fig. 13 に示したホンダワラ属の藻類であるウスバノコギリモク (Sargassum
serratifolium) か ら 単 離 報 告 さ れ た meroterpene 類 の sargahydroquinoic acid やAspergillus terreus 由来の meroterpene 類である asperterpene B 等が挙げられ, いずれ
も docking study によれば Asp32 や Arg235 と phenol 由来の水酸基やカルボニル基

20の水素結合や Thr232 や Tyr71 とカルボニル基の p-p 相互作用などが阻害活性の発現において重要と推測されていた. 124,125)

Figure 14 Structures of Ab aggregation inhibitors from natural resources.

次に, Ab 凝集抑制活性を有する化合物の例としてフルーツや赤ワイン等の様々な食品 に 含 ま れ る flavonoid の myricetin や シ ソ 科 由 来 の phenylpropanoid で あ るrosmarinic acid 等が報告されており (Fig. 14), 126-129) これらの化合物の特徴として抗酸化活性またはラジカル除去活性を有することや平面性をもつことが挙げられる.130,131)
これらの化合物の Ab 凝集活性の発現機序として, 主に以下の 2 つが有力とされている．すなわち, 1 つ目は重合核の形成段階における酸化およびラジカル化の阻害による重合核の形成阻害であり, 2 つ目は核重合モデルに従った重合段階における Ab 分子
間の b-sheet 領域への挿入による重合阻害という発現機序である．また, AD 患者の
BPSD に対して有効とされている抑肝散の処方にも含まれ,132) 生薬名, 釣藤鈎の基原植物であるカギカズラ (Uncaria rhynchophylla) 由来の ursane 型 triterpene 類である

21

uncarinic acid C も Ab 凝集抑制活性が報告されている (Fig. 14b).133,134) この化合物の活性発現において 28 位のカルボニル基が Ab を構成するアミノ酸の塩基性残基とイオン結合を形成することで重合核形成や重合阻害が示唆されており, 27 位に結合している ferulic acid ユニットの平面性だけでなくカルボニル基の存在も重要とされている.
これらのことから BACE1 阻害活性および Ab 凝集抑制活性を有する化合物の重要な特徴としてカルボニル基を有することや抗酸化活性を有すること等が予想された. 当研究室では天然資源からの抗 AD 活性化合物の探索研究を行っており, これまでにイ
ヌガヤ (Cephalotaxus harringtonia) 由来の amentoflavone 型 biflavonoid である 2,3dihydro-6-methylginkgetin の BACE1 阻 害 活 性 や ウ ツ ロ ベ ニ ハ ナ イ グ チ (Boletinus
asiaticus) 子 実 体 由 来 の meroterpene 類 の asiaticusinol C 等 を 報 告 し て い る (Fig.
15).135,136)

Figure 15 Structures of 2,3-dihydro-6-methylginkgetin and asiaticusinol C.

以上のことから, BACE1 および Ab の凝集を標的とした天然物からの AD 治療薬の開発はアンメットメディカルニーズ (Unmet Medical Needs) に応え, さらにAD 患者

22

の QOL を向上するだけでなく, その家族や医療従事者の身体および精神の健康への貢献も期待される. また, これにより経済的損失の減少および AD の病態の解明にも寄与するだけでなく経済的ならびに学術的な意義も有することから, 本研究において
BACE1 および Ab 凝集を標的とした AD 治療薬の創薬研究に着手することとした.

23

第 3 章本研究の目的

ここまでに述べたように天然物は人智を超えた構造および生理活性の多様性を有することから, 創薬において天然資源からの医薬品シード化合物の探索は有用な手段といえる. また, 従来の天然物創薬における懸念材料であった活性を有する新規化合物の獲得率の低下や, CBD および ABS による海外資源の利用制限についても国内の未開拓資源を開拓することで解決できると推測される. これらの中でもキノコ子実体は生活環に起因する独特な化合物を産生する点や, 古くから生理活性についても注目されている点を考慮すると, 特に有用な新規薬用資源になり得ることが予想される. そこで,
本研究ではキノコ子実体に着目した研究を行うこととした.
他方, AD はその症状に由来する患者, 家族および介護者の大きな負担, 患者数の増
加や経済的損失等の様々な社会的な問題を引き起こしているにもかかわらず, 従来のAD 治療法は対症療法であり, 薬剤貢献度や治療満足度は低い状況にある. これらのことから安価で安全性および有効性が担保された, AD の発症機序に基づく根本的な治療法の開発が急務である. AD の発症機序として有力視されているアミロイドカスケード
仮説によれば, APP から BACE1 および γ-secretase により Ab が切り出される段階と, Ab が凝集する段階の 2 つの段階が AD の発症が重要とされている. このことか
ら BACE1 阻害活性および Ab 凝集抑制活性を標的として探索研究を行うこととした.
このようにキノコ子実体からの AD 治療薬の創薬研究を展開することは人々の健康的な生活の確保をはじめ, 天然物化学や基礎生物学の発展および AD の発症機序の解明, CBD および SDGs に記されているような生態系の保護, 持続可能な利用の推進と生物多様性の損失阻止等の社会的意義も十分に有するといえる. 以上の背景より,「キノコ子実体からのアルツハイマー病治療薬の開発」を目的として研究を遂行することとした (Fig. 16).

24

Figure 16

The purpose of this research.

25

本論
第 1 章

ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキスからの抗 AD 活性化合物の探索

第 1 節

キノコ子実体抽出エキスの作成と Ab 凝集抑制活性の評価

本研究の目的である AD 治療薬のシード化合物となり得るキノコ子実体由来の天然
由来化合物を得るために, 先ずはキノコ子実体抽出エキスを調製し, その中から Ab 凝集抑制活性を有するものを選定することが必須である. そこで, 当研究室で保有する
55 種のキノコ子実体 (SYM-1–SYM-55) について形態学的な種の同定を行い, 乾燥した後, 粗い粉末へと粉砕した. 抽出エキスの一般的な調製法は MeOH で抽出, 調製した MeOH 抽出エキスについて, H2O と AcOEt で分配するなどして得られた画分を種々のカラムクロマトグラフィーで分離する. 一方, 当研究室ではあらかじめ CHCl3と MeOH で順次抽出を行うことで分配操作を省略し, 簡便かつ効率的にカラムクロマ
トグラフィーでの分離へ移行できる利点がある.42,43,52,136) このような理由から本手法を用いて, キノコ子実体の粗い粉末を CHCl3 と MeOH で順次抽出し, 各エキスを調製した. すなわち, 55 種のキノコ子実体 CHCl3 抽出エキスと 55 種のキノコ子実体
MeOH 抽出エキス, 合計 110 種のキノコ子実体抽出エキスを得ることができた.
調製した 110 種のキノコ子実体抽出エキスの Ab 凝集抑制活性の評価は, 比較的簡便に多くの試料を評価することができる点を考慮して Thioflavin-T (Th-T) 法を参考にし, 一部改変した手法で行うこととした.137,138)26

Figure 17 The structure of Th-T and theory of Th-T assay.

Th-T 法とは donor (D) である N,N-dimethylaniline ユニットと acceptor (A) である
benzothiazole ユニットからなる分子ローター色素 Th-T を用いて Ab fibril 形成の有無
および Ab fibril 量の生化学的な定量を行うことができる活性評価系である (Fig.
17).139-144)

すなわち, Ab fibril 非存在下において Th-T の励起波長である 446–450 nmの光照射を Th-T に対して行っても D-A 間を結ぶ単結合を軸として分子内回転により速やかに基底状態へとエネルギーが緩和される. 一方, Ab fibril 存在下では Ab fibril
中のクロス b-sheet 構造上に存在する特異的結合部位に可逆的に結合することで立体障害により分子内回転が抑制され, 先と同様の励起光を照射すると 480–490 nm に蛍光を発して緩和される.

Figure 18 Method of Th-T assay.

27このような原理をもとに, 試料の DMSO 溶液または DMSO, phosphate buffer および
Ab40 を混和し, 24 時間 37℃で約 1 rpmで撹拌したものに Th-Tを添加して 96 well プ
レートに分注した (Fig. 18).145) このプレートを遮光下で 30 分間混和した後に蛍光プ
レートリーダーで蛍光強度を測定し, 得られた蛍光強度から Ab 凝集率を算出した. その際, Ab42 と Ab40 を比較すると Ab40 の方がより扱い易く, 価格が安価であること,
どちらの Ab を用いた場合でも活性評価の結果に有意な差が認められなかったことの2 点の理由から本研究に用いる Ab は Ab40 とした. また, Ab 凝集抑制活性を有する化合物として myricetin などの flavonoid, tannic acid や congo red など複数の化合物が報告されているが, 多くの文献で用いられおり, 安定して購入できる点から Positive
Control (Pos. Cont.) は myricetin を使用することとした.126-129)
110 種のキノコ子実体抽出エキスを最終濃度 (concentration, conc.) が 10 µg/mL となるように調製した試料の DMSO 溶液について, 先に述べた Th-T 法を用いて Ab 凝集抑制活性の評価を行った結果を Table 1 に示した. キノコ子実体抽出エキスの選定において Ab 凝集率が 30%以下の抽出エキスを活性ありとして判定した結果, 13 種のキノコ子実体 CHCl3 抽出エキスと 25 種のキノコ子実体 MeOH 抽出エキス, 合計 38
種のキノコ子実体抽出エキスに活性が認められた. Ab 凝集抑制活性が確認されたキノコ子実体抽出エキスの中でも成分探索の報告が比較的少なく, CHCl3 抽出エキスおよび
MeOH 抽 出 エ キ ス の 両 方 に 活 性 を 有 す る SYM-53 ヌ メ リ ア イ タ ケ (Albatrellus
yasudae) に着目した.

28

Table 1

Ab aggregation inhibitory activities of 55 kinds each of CHCl3 and MeOH extracts

for a total of 110 extracts.
Sample Nameextract

Sample Name

CHCl3
SYM-1

extract

Sample Name

CHCl3
SYM-29
MeOH

CHCl3
SYM-2

CHCl3

CHCl3
SYM-3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3

CHCl3
SYM-55

MeOH

MeOH

CHCl3

SYM-28
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-41

MeOH

CHCl3
SYM-14

CHCl3
SYM-54MeOH

SYM-27
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-40

MeOH

CHCl3
SYM-13

CHCl3
SYM-53

MeOH

SYM-26
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-39MeOH

CHCl3
SYM-12

CHCl3
SYM-52

MeOH

SYM-25
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-38MeOH

CHCl3
SYM-11

CHCl3
SYM-51

MeOH

SYM-24
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-37

MeOH

CHCl3
SYM-10

CHCl3
SYM-50

MeOH

SYM-23
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-36

MeOH

CHCl3
SYM-9

CHCl3
SYM-49MeOH

SYM-22
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-35

MeOH

CHCl3
SYM-8

CHCl3
SYM-48MeOH

SYM-21
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-34

MeOH

CHCl3
SYM-7

CHCl3
SYM-47MeOH

SYM-20
MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-33

MeOH

CHCl3

CHCl3
SYM-46MeOH

SYM-19

SYM-6

MeOH

CHCl3
SYM-32

MeOH

MeOH

CHCl3
SYM-45

MeOH

CHCl3

CHCl3
SYM-5

MeOH

CHCl3

SYM-18MeOH

CHCl3
SYM-44

SYM-31
MeOH

CHCl3
SYM-4

MeOH

MeOH

SYM-17
MeOH

CHCl3

CHCl3
SYM-30

MeOH

extract

SYM-43
MeOH

SYM-16
MeOH

Sample Name

CHCl3

SYM-15
MeOH

extract

SYM-42MeOH

MeOH

Extracts exhibited inhibitory activity against Ab aggregation were highlighted in tinted pale redand bold font.

29

第 2 節キノコ子実体ヌメリアイタケとそれに関連する報告

本研究に用いることとした SYM-53 と仮称したヌメリアイタケ (Albatrellus yasudae)
は, DNA 配列データを用いた分子系統解析等の結果を基にした分類に従うと担子菌門,
ハラケ綱, ベニタケ目, ニンギョウタケモドキ科のニンギョウタケモドキ属に分類され,146) 環境省のレッドリストによれば絶滅の危険が増大している種である絶滅危惧 II類にカテゴリー分けされている.147) ヌメリアイタケは松類の根から養分を得ることで共生する外生菌根菌であることから, 秋頃の日本および中国雲南省の松類と広葉樹が混在する雑木林に群生することが知られおり, 146) 本研究で用いたものも 2015 年 9 月に山梨県の雑木林にて採集された. また, ヌメリアイタケの形態学的な特徴として濃青
藍色で粘性を有する直径約 2–7 cm の円形または丸山形の子実体や白色で孔口の小さい管孔柄を形成すること, 柄が中心性である等が挙げられ, 146) これらをもとに形態学的な種の同定を行った (Fig. 19).

Figure 19 The morphological characteristic of fruiting bodys A. yasudae.146)

30

Figure 20 Structures of grifolin and grifolic acid.

ニンギョウタケモドキ属のキノコ子実体の主たる二次代謝産物として, grifolin や
grifolic acid 等の酢酸–マロン酸経路で生合成される orsellinic acid ユニットとイソプ
レノイド経路で生合成される prenyl ユニットから構成される meroterpene 類が報告されており (Fig. 20),148-159) ヌメリアイタケについても同様の報告がされている.160,161)
報告された meroterpene 類の大半が油状物質であり, 探索研究がなされている画分もほぼ低極性画分である点を考慮すると, 酸化反応等の代謝により grifolin や grifolicacid 誘導体で極性がより高い化合物は見逃されている可能性が高いことが推測された. また, これらの meroterpene 類は抗菌活性, 148) 抗酸化活性,152) 腫瘍細胞の増殖抑制活性 159) 等の多彩な活性を有するにもかかわらず, 抗 AD 活性に関する報告は 1
報のみであることから, 抗 AD 活性を示す meroterpene 類の探索研究を行う余地があるといえる.161)
以上, ヌメリアイタケの抽出エキスについて高極性画分に焦点を当てた成分探索を行うことで抗 AD 活性を示す meroterpene 類を見出すことが可能であると期待した.
また, このような探索研究によりヌメリアイタケの有用な新規 meroterpene 類の構造決定を行うことで，後に化合物を大量に必要になった際に合成などの手法で化合物をえることがきたいできる．したがって，絶滅危惧 II 類にカテゴリー分けされるような希少な試料を増量目的で大量に採集する必要がなくなる. このようなことも踏まえて
今回, ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキスについて成分探索を行うこととした.

31

第 3 節ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキスからの化合物の分離・精製

乾燥重量 354.8 g のヌメリアイタケを Lot. No.1: 138.5 g と Lot. No. 2: 216.3 g に分割し, それぞれ粗く粉砕したものを CHCl3 で室温で一昼夜, 3 回抽出した後, 次いで
MeOH で同様に抽出し, 減圧下で溶媒を留去し，ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキス
Lot. No.1 から 18.6 g, Lot. No. 2 から 20.0 g を得た. このうち, ヌメリアイタケ MeOH
抽出エキス Lot. No.1 18.6 g (Ab aggregation rate: 40.6%, conc. 100 µg/mL) について silica
gel column chromatography (Si. C. C., CHCl3–MeOH–H2O) を用いて 6 つの画分 Fr. A–Fに分画した (Fig. 21). これらの画分の Ab 凝集抑制活性評価を行なったところ, Fr. A–Eに活性が認められた (Ab aggregation rate Fr A: 19.4%, Fr. B: 14.1%, Fr. C: 16.8%, Fr. D:
29.0%, Fr. E: 30.9%, Fr. F: 63.5%, conc. 100 µg/mL). そこで先ずは, Fr. A–E の中で最も強い Ab 凝集抑制活性を示した Fr. B について Si. C. C. および octadecylsilyl column
chromatography (ODS C. C.) を用いて分離, 精製を行った結果, 2 種の化合物 6 (63.8 mg)と 7 (69.3 mg) を単離した. また, TLC において類縁体である可能性が高いスポットを含む Fr. A と極性の高い新規類縁体の単離が見込める Fr. D についても同様に Si. C.
C., ODS C. C., 分取 HPLC を用いた分離を行った. その結果, Fr. A からは 2 種の化合物 2 (2.7 mg), 10 (1.5 mg), Fr. D からは 3 種の化合物 1 (19.0 mg), 3 (1.4 mg), 4 (1.4 mg)を単離した．

32

Figure 21 Flowchart of A. yasudae MeOH extract Lot. No. 1.

33

続いて Lot. No. 1 において単離および構造解析に至らなかったその他の meroterpene
類を得ることでより詳細な構造活性相関を検討することが出来ると考え，ヌメリアイタ
ケ MeOH 抽出エキス Lot. No. 2; 20.0 g (Ab aggregation rate: 44.5%, conc. 10 µg/mL) につ
いて Si. C. C. (CHCl3–MeOH–H2O) を用いた分離を行った (Fig. 22). その結果得られた
6 つの画分 Fr. A–F についてヌメリアイタケ MeOH 抽出エキス Lot. No. 1 の分離の際と同様に Ab 凝集抑制活性評価を行なったところ, Fr. A–E に活性が認められた (Abaggregation rate Fr A: 63.3%, Fr. B: 36.6%, Fr. C: 19.1%, Fr. D: 40.1%, Fr. E: 43.2%, Fr. F:
86.9%, conc. 10 µg/mL). ここで, ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキス Lot. No. 2 の分離
目的が meroterpene 類を単離して詳細な構造活性相関を検討することであるため, 得られた画分の中でも TLC 上で先の抽出エキスでは単離に至らなかったスポットと類似のスポットが確認された Fr. A および Fr. B について分離を進めることとした. 先ず Fr. A に つ い て Chromatorex COOH silicagel column chromatography (Chromatorex
COOH C. C.), ODS C. C. および分取 HPLC を用いて分離, 精製を行ったところ, 1 種の化合物 9 (2.1 mg) を単離した. Fr. B についても同様に Chromatorex COOH C. C.,
Sephadex LH-20 column chromatography (Sephadex LH-20 C. C.), ODS C. C. および分取
HPLC による分離を行い, 2 種の化合物 5 (2.9 mg) および 8 (2.6 mg) を単離し, ヌメリ
アイタケ MeOH 抽出エキス Lot. No. 2 から合計 3 種の化合物を得ることに成功した.
以上より, ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキス Lot. No.1 と Lot. No. 2 から合計 10 種の化合物を得るに至った.

34

Figure 22 Flowchart of A. yasudae MeOH extract Lot. No. 2.

35

第 4 節単離物の構造決定

1 は Brown oil として得られ，HREIMS より分子式 C24H34O5 (m/z: 402.2401 [M]+) を与え, 不飽和度 (degree of unsaturation, DU) は 8 であった. UV スペクトルでは 205,
214, 252 および 306 nm に極大吸収を示し, IR スペクトルにおいて 3363, 2970, 2918
および 1631 cm−1 に吸収が観測されたことから水酸基とカルボニル基の存在が示唆された.
1

H-NMR のスペクトルデータより, 3 つのオレフィン由来のプロトン dH 5.00 (1H, td,

J = 6.5, 0.8 Hz, H-2’), dH 5.07 (2H, m, H-6’, H-10’), 4 つのメチル基由来のプロトン dH 1.66
(3H, d, J = 0.8 Hz, H-12’), dH 1.575 (3H, s, H-13’), dH 1.579 (3H, s, H-14’), dH 1.77 (3H, d, J =0.8 Hz, H-15’), 4 つのメチレン由来のプロトン dH 2.01 (8H, m, H-4’, H-5’, H-8’, H-9’), 低
磁場シフトしたメチル基由来のプロトン dH 2.47 (3H, s, 2-CH3), メトキシ基由来のプロ
トン dH 3.94 (3H, s, 4-OCH3) と低磁場シフトしたメチレン由来のプロトン dH 3.38 (2H,d, J = 6.5 Hz, H-1’) のシグナルがそれぞれ観測された. 1 の 1H-NMR のスペクトルパタ
ーンはヌメリアイタケ等のニンギョウタケモドキ属キノコ子実体からすでに単離報告がなされている grifolic acid (7) のスペクトルパターンと類似していたことから, grifolicacid と同様に orsellinic acid ユニットとイソプレン単位 3 個からなる prenyl ユニットから構成される meroterpene 類であると予想した.150)
また, 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 スペクトルデータより，1 本のカルボニル
炭素 dC 175.7 (C-7), 9 本の sp2 第 4 級炭素 dC 149.98 (C-4 または C-6), dC 149.95 (C-6
または C-4), dC 135.3 (C-5), dC 135.2 (C-3’), dC 135.0 (C-7’), dC 131.6 (C-2), dC 131.3 (C-11’),
dC 126.7 (C-3), dC 107.4 (C-1), 3 本のオレフィン由来の炭素 dC 124.3 (C-10’), dC 124.0 (C6’), dC 122.8 (C-2’), 5 本のメチレン炭素 dC 39.7 (C-4’, C-8’), dC 26.7 (C-9’), dC 26.5 (C-5’),
25.4 (C-1’), 5 本のメチル炭素 dC 25.7 (C-12’), dC 17.8 (2-CH3), dC 17.7 (C-13’), dC 16.2 (C15’), dC 16.0 (C-14’) とメトキシ基由来のメチル炭素 dC 60.6 (4-OCH3), 合計 23 本のシ

36

グナルが観測された (Table 2). 1 の 13C-NMR スペクトルパターンも1H-NMRと同様に
7 のスペクトルパターンと類似していたため，1 と 7 の 1 次元 NMR の比較を詳細に行った結果, 1 の prenyl ユニットは酸化修飾されていない可能性が高いことが推測された. さらに，7 と比べて OCH3 が１つ多い構造であることが推測された．そこで，二次元 NMR を用いた詳細な解析を行ったところ 1H-1H COSY および HMBC 相関より prenyl ユニットは推定した構造と同様の構造であることが明らかとなった (Fig. 23).
しかしながら, orsellinic acid ユニットの構造決定に関する相関は HMBC より 2-CH3から C-1, C-2, および C-3 への相関と 4-OCH3 から C-4 または C-6 (dC 149.95 or
149.98) への相関, H-1’ から C-2, C-3 および C-4 または C-6 への相関が得られのみであり, これらの相関だけでは orsellinic acid ユニットにおける 1 位，5 位，6 位の置換基の配置の決定には至らなかった．

Figure 23 HMBC (blue arrows) and 1H-1H COSY (red bonds) correlations of 1.

これまでの解析結果から得られた推定構造を考慮すると, orsellinic acid ユニットにおける 1 位, 5 位, 6 位の置換基の配置は 1 位のカルボン酸をメチル化することで決定することができると予想した. すなわち, 1 位のカルボン酸をメチル化することで導入したメトキシ基のメチルプロトンとの NOESY 相関によりメチルエステルの位置が決定できること, 1 位のカルボン酸と 6 位の水酸基のプロトンが水素結合を形成することで HMBC 相関により 6 位が水酸基であることが決定できることから, orsellinic acid
ユニットにおける置換基の配置が決定できると仮説を立てた. そこで, 本仮説を証明す37

るために 1 の 7 位のカルボン酸を TMS ジアゾメタンによりメチル化を行い, 得られた 1 のメチル化体を 1a として 1 と同様に各種スペクトルデータの解析を行うこととした.
1a は brown oil として得られ, HREIMS より分子式 C25H36O5 (m/z: 416.2562 [M]+) を与えたことからメチル化が成功していることが確認された. 次に 1a と 1 の 1 次元
NMR のスペクトルデータの比較を行ったところ, 1a のスペクトルにおいてメトキシ基に由来するシグナル dH 3.95 (3H, s), dC 52.2 と水素結合形成しているプロトンに由来するシグナル dH 11.42 (1H, s) が観測され, これらのスペクトルデータからもメチル化が成功していることが支持された.

Figure 24 HMBC (blue arrows), 1H-1H COSY (red bonds), and NOESY (green dashed arrows)
correlations of 1a.

1a のメチル基が導入さ れた位置 の確認とメ チル化体を合 成する目的 であっ た
orsellinic acid ユニットの置換基の配置を決定するために 1a について 2 次元 NMRを用いた検討を行った (Fig. 24). HMBC スペクトルにおいて, orsellinic acid ユニットにおいて新たに観測されたメトキシ基に由来すると思われるメチルプロトン (dH 3.95) から C-7 への HMBC 相関が観測されたことから 1 位のカルボン酸がメチル化されていること, 同様に HMBC スペクトルにおいて dH 11.42の 6-OH のプロトンのシグナ
ルから C-6 への相関, dH 2.47 の 2-CH3 から C-1, C-2 と C-3 への相関, dH 3.94の4OCH3 から C-4 への相関, dH 3.38 (d, J = 6.5 Hz) のH-1’ から C-2, C-3 と C-4 への相関38

がそれぞれ観測されたこと，さらに，NOESYスペクトルより 4-OCH3 と H-1', 2-CH3 とH-1' および 7-OCH3 の間に相関が認められたことからとから 1a の orsellinic acid ユ
ニットの置換基の配置は 1 位がメチルエステル, 5 位および 6 位が水酸基であることが証明された.
以上，1a の構造を Fig. 25 の通りに決定したことから, 1 の orsellinic acid ユニットの置換基の配置は 1 位がカルボン酸, 5 位および 6 位が水酸基であると決定した. 以
上， 1 の構造を Fig. 25 に示した構造と決定し, 1 および 1a は新規化合物であったことから 1 を scutigeric acid, 1a を scutigeric acid methyl ester とそれぞれ命名した.

Figure 25 Structures of scutigeric acid methyl ester (1) and scutigeric acid (1a).

39

Table 2

NMR Spectroscopic Data for 1 and 1a (400 MHz for 1H, 100 MHz for 13C in CDCl3)
scutigeric acid (1)scutigeric acid methyl ester (1a)PositiondC

dH (J in Hz)

1

107.4

C

108.9

C

2

131.6

C

130.0

C

3

126.7

C

126.3

C

b

type

dC

type

dH (J in Hz)

4

149.95

C

148.9

C

5

135.3

C

135.3

C

6

149.98

Cb

149.0

C

7

175.7

C

172.3

C

1'

25.4

CH2

3.38 d (6.5)

25.4

CH2

3.36, d (6.4)

2'

122.8

CH

5.00 td (6.5, 0.8)

123.0

CH

4.99, t, (6.4)

3'

135.2

C

135.0

C

4'

39.7

CH2a

39.7

CH2c

2.01, m

5'

26.5

CH2

a

2.01 m

26.5

CH2

c

2.01, m

6'

124.0

CH

5.07 m

124.0

CH

7'

135.0

C

135.2

C

8'

39.7

CH2a

39.7

CH2c

2.01, m

9'

26.7

CH2

a

2.01 m

26.7

CH2

c

2.01, m

10'

124.3

CH

5.07 m

124.4

CH

11'

131.3

C

131.3

C

12'

25.7

CH3

1.66 d (0.8)

25.7

CH3

1.68, s

13'

17.7

CH3

1.575 s17.7

CH3

1.58, s

14'

16.0

CH3

1.579 s16.0

CH3

1.57, s

15'

16.2

CH3

1.77 d (0.8)

16.2

CH3

1.76, s

2-CH3

17.8

CH3

2.47 s

17.9

CH32.38, s4-OCH360.6

CH3

3.94 s60.5

CH3

3.91, s52.2

CH3

3.95, s2.01 m2.01 m

7-OCH36-OH

5.07, m5.07, m11.42, sa,b,cAssignments may be interchanged due to overlapping of signals.

40

2 は brown oil として得られ, positive HRFABMS より分子式 C24H30O7 (m/z: 431.2079[M+H]+) を与え, DU は 10 であった. UV スペクトルは 200 , 222 および 271 nm に極大吸収を示し, IR スペクトルにおいて 2931, 1740 および 1646 cm−1 に吸収が観測されたことから水酸基とカルボニル基の存在が示唆された.
1 と同様に 2 の 1H-NMR のスペクトルパターンは grifolic acid (7) のスペクトルパ
ターンと類似していたことから,150) 2 も orsellinic acid ユニットと prenyl ユニットから構成される骨格を有する meroterpene 類であると推測した. そこで, 2 と 7 の

1

H-

NMR のスペクトルデータの比較を行ったところ, 2 のスペクトルデータにおいて
orsellinic acid ユニットの芳香族プロトン dH 6.21 (1H, s, H-3), 芳香環の磁気異方性効果
により低磁場シフトしたメチルプロトン dH 2.45 (3H, s, 2-CH3) と prenyl ユニットの中でも芳香環に隣接することから磁気異方性効果により低磁場シフトしたメチレンプロ
トン dH 3.41 (2H, d, J = 6.6 Hz, H-1’) のシグナルが観測された. また, メトキシ基由来のメチルプロトン dH 3.92 (3H, s, 7-OCH3) のシグナルが観測されたことと 2 が得られた画分の極性から 2 の orsellinic acid ユニットの構造は 7 の orsellinic acid ユニットのカルボン酸がメチルエステルとなった構造であることが予想された. 他方, 2 の prenyl
ユニット部の1H-NMR の化学シフト値を 7 のそれと比較すると，7 では 3 つ観測されていたオレフィンプロトンが， 2 においては 1 つ消失し, dH 5.25 (1H, t, J = 6.6 Hz,H-2’) と dH 5.70 (1H, s, H-10’) の 2 つのシグナルしか認められなかった. また, 7 の1HNMRにおいて確認されていた prenyl ユニットの 4 つのメチル基に由来するシグナルについても, 2 のスペクトルデータでは dH 1.47 (6H, s, H-12’, H-13’) と dH 1.79 (3H, s, H15’) の 3 つのメチル基に由来するメチルプロトンのシグナルしか観測されず, 2 のprenyl ユニット上のメチル基の数は 3 つであることが示唆された. さらに, 2 のスペ
クトルデータでは低磁場シフトしたプロトン dH 7.76 (1H, s, H-8’) のシグナルが新たに41

得られたことから 2 の prenyl ユニットは 7 よりも高度に酸化修飾されている可能性が示唆された.
次に 2 の 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 スペクトルデータについても同様に
7 のスペクトルデータとの比較を行ったところ, orsellinic acid ユニットのスペクトルはほぼ一致したことから orsellinic acid ユニットの構造は先に推定した構造であることが支持された (Table 3). 続いて 2 の prenyl ユニットについて解析を行ったところ, 2 のスペクトルデータにおいてメチル基に由来するシグナルが 1 つ消失し, 新たにカルボ
ニル炭素 dC 170.1 (C-14’) のシグナルが観測された. 1H-NMR の解析から prenyl ユニ
ットにおける3つのメチル基の数ついても13C-NMRで確認したところ, メチル炭素 dC
16.0 (C-15’) と他のシグナルに比べて増強されたメチル炭素 dC 31.9 (C-12’, C-13’) のシ
グナルが確認されたことから先で述べた推測が支持された. また, 2 のスペクトルデー
タにおいて sp2 第 4 級炭素 dC 148.3 (C-9’), オレフィン由来の炭素 dC 135.9 (C-8’) と
第 4 級炭素 dC 71.2 (C-11’) の 3 つのシグナルが低磁場シフトしていることが認められた. 以上のことをふまえて, ニンギョウタケモドキ属のキノコ子実体から単離報告されている prenyl ユニットが酸化された meroterpene 類の酸化修飾のパターンから
cristatic acid や cristatinと同様に 14 位のメチル基が酸化されて環状構造を形成していることが予測された.149) さらに, MS より得られた情報, 13C-NMR, DEPT90 および
DEPT135 より観測されたカルボニル炭素 dC 170.1 (C-14’) のシグナル, これまでに報告されているキノコ子実体の構造および推定生合成経路等を考慮すると Ganoderma
theaecolum から単離報告された (±)-ganotheaecolumol E のようにメチル基が酸化された後に閉環し，ラクトン環を形成した Fig. 26 に示すような構造であると推定した.162)
しかしながら, prenyl ユニットにおいて推定構造のような 5 員環ラクトンを有する天然物は報告例が少ないため詳細な検討する必要があること,162-166) 一次元 NMR では推42

定構造の 9 位と 10 位のオレフィンの幾何異性を決定することができないことの 2
点から更なる解析を行うこととした.

Figure 26 HMBC (blue arrows), 1H-1H COSY (red bonds) and NOESY (green dashed arrows)
correlations of 2.

前述の 2 つの問題を解決して 2 の構造決定および完全帰属を行うために二次元
NMR を用いた詳細な解析を行ったところ, Fig. 26 に示した 1H-1H COSY, HMBC および NOESY 相関が得られたことから推定構造が支持される結果となった. 特に prenyl
ユニットにおいて H-1’ と H-2’, H-4’ と H-5’, H-5’ と H-6’ の間にそれぞれ 1H-1H
COSYの相関が認められ, HMBC スペクトルより H-4’ から C-2’ と C-3’ へ, H-6’ から C-4’, C-5’, C-7’, C-8’ と C-14’ へ, H-8’ から C-7’, C-9’ と C-14’ へ, H-10’ から C8’, C-9’ と C-11’へ, H-12’ および H-13’ から C-10’ と C-11’ へHMBC相関が認められたことから 2 の推定構造に上の 5 員環ラクトン構造についても証明された. 9 位と10 位のオレフィンの幾何異性についても検討したところ, NOESYスペクトルより H-8'と H-12' および H-13' の間に相関が確認されたことから, 9 位と 10 位のオレフィン
は E 体であると決定した. 以上のことから 2 の構造を Fig. 27 に示した構造と決定し,2 は新規化合物であったことから albatrelactone methyl ester と命名した. また, 2 の構造は推定生合成経路を加味すると抽出時や分離の際に用いた MeOH が 7 位のカルボキシ基と反応することで得られた artifact であることが示唆された.

43

Table 3 NMR Spectroscopic Data for 2 (400 MHz for
1
H, 100 MHz for 13C in CDCl3).
albatrelactone methyl ester (2)PositiondC

dH (J in Hz)

type

1

105.2

C

2

140.8

C

3

111.3

CH

4

159.0

C

5

111.8

C

6

162.6

C

7

172.6

C

1'

21.9

CH2

3.41 d (6.6)

2'

122.8

CH

5.25 t (6.6)

3'

136.7

C

4'

38.9

CH2

2.05 t (7.4)

5'

25.2

CH2

1.71 quin (7.4)

6'

24.7

CH2

2.31 t (7.4)

7'

134.8

C

8'

135.9

CH

9'

148.3

C

10'

120.2

CH

11'

71.2

C

12'

31.9

CH3

1.47 s

13'

31.9

CH3

1.47 s

14'

170.1

C

15'

16.0

CH3

1.79 s

2-CH3

24.2

CH3

2.45 s

7-OCH351.8

CH3

3.92 s

6-OH

6.21 s

7.76 s5.70 s12.08 sFigure 27 The structure of albatrelactone methyl ester (2).

44

3 は brown oil として得られ, negative HRESIMS より分子式 C23H28O7 (m/z: 415.1762[M−H]−) を与え, 2 と 3 の分子式における差はメチル基 1 つ分であった．UV スペク
トルは 214, 230, 260, 297 nm に極大吸収を示し, IR スペクトルにおいて 3315, 3135,
2945, 1698 および 1682 cm−1 に吸収が観測されたことから水酸基とカルボニル基の存在が示唆された.
3 と 2 の 1H-NMR および 13C-NMRのスペクトルパターンはほとんど差異がないことから, 2 と同に prenyl ユニットに 5 員環ラクトン構造を有する meroterpene 類であると推測した. また, 3 と 2 の 1H-NMR および 13C-NMRのスペクトルデータの比較を行ったところ, 2において観測されていたメトキシ基に由来するシグナル dH 3.92 (3H, s, 7OCH3), dC 51.8 (7-OCH3) が 3 のスペクトルデータでは消失していた. メトキシ基の有無以外の差が認められなかったことから 3 の構造は Fig. 28 に示したように 2 の7位のメチルエステルがカルボン酸となった構造であることが推定された.

Figure 28 HMBC (blue arrows), 1H-1H COSY (red bonds) and NOESY (green dashed arrows)
correlations of 3.

3 の構造決定および完全帰属を行うために 1H-1H COSY, HMBC および NOESY
による詳細な検討を行った結果, それぞれ Fig. 28 に示した相関が認められたことか
ら 3 の推定構造が支持された. すなわち, 2 の構造解析と同様に 1H-1H COSY および HMBC より prenyl ユニットにおける 5 員環ラクトン構造を示す相関が確認され,9 位と 10 位のオレフィンの幾何異性も同様に NOESY 相関から E 体であると決定45

した. 以上のことから 3 の構造を Fig. 29 に示した構造と決定し, 3 は新規化合物であったことから albatrelactone と命名した.

Figure 29 The structure of albatrelactone (3).
Table 4 NMR Spectroscopic Data for 3 (500 MHz for
1
H, 125 MHz for 13C in DMSO-d6).
albatrelactone (3)PositiondC

dH (J in Hz)

type

1

110.8

C

2

138.6

C

3

107.2

CH

4

155.9

C

5

110.4

C

6

158.5

C

7

170.1

C

1'

21.9

CH2

3.12 d (6.8)

2'

124.8

CH

5.18 t (6.8)

3'

131.6

C

4'

38.5

CH2

2.18 t (7.4)

5'

25.1

CH2

1.71 quin (7.4)

6'

24.0

CH2

2.31 t (7.4)

7'

131.6

C

8'

139.9

CH

9'

144.9

C

10'

123.0

CH

11'

68.7

C

12'

30.1

CH3

1.47 s

13'

30.1

CH3

1.47 s

14'

170.1

C

15'

15.7

CH3

1.71 s

2-CH3

23.4

CH3

2.40 s

46

5.88 s

7.36 s5.41 s4 は brown oil として得られ, negative HRESIMS より分子式 C23H34O6 (m/z: 405.2278[M−H]−) を与え, DU は 7 であった. UV スペクトルは 214, 230, 260 および 297 nm に極大吸収を示し, IR スペクトルにおいて 3370, 3200, 2956 および 1682 cm−1 に吸収が観測されたことから水酸基とカルボニル基の存在が示唆された.
1 と同様に 4 の 1H-NMR のスペクトルパターンは grifolic acid (7) のスペクトルパ
ターンと類似していたことから,150) 4 も 7 と同様の骨格をもつ meroterpene 類である
ことが予想された. これまでの解析と同様に 4 の 1H-NMR のスペクトルの解析と 7の 1H-NMR のスペクトルデータとの比較を行ったところ, orsellinic acid ユニットに由来するシグナルは良好な一致を示したことから, 4 の orsellinic acid ユニットの構造は
7 の orsellinic acid ユニットと同一の構造であることが示唆された. 一方で prenyl ユ
ニットに着目すると, 7 のスペクトルデータにおいて 3 つ確認されていたオレフィン
プロトンが 4 においては 1 つ消失しており, 新たに低磁場シフトしたメチンプロト
ン dH 3.02 (1H, ddd, J = 10.3, 5.7, 1.5 Hz, H-10’) が認められた. また, 磁気異方性効果に
より低磁場シフトしたメチレンプロトン dH 3.10 (2H, d, J = 6.9 Hz, H-1’) のシグナルと,それとカップリングしたオレフィンプロトン dH 5.19 (1H, t, J = 6.9 Hz, H-2’) のシグナ
ルが得られたこと, 高磁場シフトした2 つのメチルプロトンのシグナル dH 1.03 (3H, s,
H-12’) および dH 0.97 (3H, s, H-13’) が観測されたことから, 4 の構造は Fig. 30 に示したように 7 の prenyl ユニットにおいていずれかのオレフィンがエポキシドを経由した酸化開裂によってジオールへと変換された構造であることが推定された.159,167,168)

Figure 30 HMBC (blue arrows) and 1H-1H COSY (red bonds) correlations of 4.

47

4 の 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 スペクトルデータについても同様に解析および 7 のスペクトルデータとの比較を行ったところ, orsellinic acid ユニットに由来
する 4 のスペクトルは 7 のものと良い一致を示したことから orsellinic acid ユニットの構造は先の推定どおりであることが支持された (Table 5). 次に，4 の prenyl ユニットについて検討したところ, 7 のスペクトルでは観測されていた sp2 第 4 級炭素のシ
グナルとオレフィン由来の炭素のシグナルがそれぞれ 1 本ずつ消失し, 4 において新たに低磁場シフトしたメチレン基由来の炭素 dC 77.1 (C-10’) のシグナルと第 4 級炭素
dC 71.6 (C-11’) のシグナルの 2 本のシグナルがそれぞれ認められた. また, 7 のスペク
トルと比べて prenyl ユニットの 2 本のメチル基に由来する炭素のシグナル dC 26.3
(C-12’) および dC 24.5 (C-13’) が低磁場シフトしていたことから 1H-NMR の解析結果より得られた推定構造が支持された.
推定した 4 の構造を決定し, 完全帰属を行うために 1H-1H COSY および HMBC を用いた解析を行ったところ, それぞれ Fig. 30 に示した相関が認められ, 4 の 10 位および 11 位のジオール構造が明らかとなった. すなわち, HMBCスペクトルにおいて dH
1.03 の H-12’ から C-10’ (dC 77.1) と C-11’ (dC 71.6) へ，dH 0.97 のH-13’ から C-10’と C-11’ へのHMBC相関が観測され, 1H-1H COSY より H-8’ と H-9’, H-9’ と H-10’の間に相関が確認されたことから 4 の構造は先に推定したように prenyl ユニット 10’
位と 11’ 位にそれぞれ水酸基を有するジオール構造であると決定した. これらのスペ
クトルデータの解析で平面構造を決定したものの, 10’ 位の水酸基の立体化学について検討しなければならないこと, ジオール構造を有する既知 meroterpene 類の立体化学
は旋光度の比較による決定しかなされておらず,159,167,168) 信頼度に疑問が残ることの 2
点から 10’ 位の水酸基の絶対立体配置の決定を旋光度の比較以外の手法で試みること
とした.

48

Table 5 NMR Spectroscopic Data for 4 (500 MHz for
1
H, 125 MHz for 13C in DMSO-d6)10’,11’-dihydroxygrifolic acid (4)PositiondC

dH (J in Hz)

type

1

110.5

C

2

138.5

C

3

107.1

CH

4

155.8

C

5

110.8

C

6

164.1

C

7

173.3

C

1'

21.9

CH2

3.10 d (6.9)

2'

124.1

CH

5.19 t (6.9)

3'

132.3

C

4'

39.9

CH2

1.88 t (7.7)

5'

26.3

CH2

1.99 m

6'

123.6

CH

5.09 t (6.8)

7'

135.0

C

8'

36.6

CH2

5.87 s1.85 m2.14 m

9'

29.0

CH2

1.24 m1.60 m

10'

77.1

CH

11'

71.6

C

12'

26.3

CH3

1.03 s

13'

24.5

CH3

0.97 s

14'

16.0

CH3

1.54 s

15'

16.0

CH3

1.70 s

2-CH3

23.4

CH3

2.40 s49

3.02 ddd (10.3, 5.7, 1.5)

そこで, 4 が光学活性化合物であるか検討するために 4 の旋光度および電子円二色性 (electronic circular dichroism, ECD) の測定を行ったところ, 旋光度が [α]19D −17.5 と負の値を示したことから 4 は光学活性を有することが明らかとなったものの, ECD の測定においてスペクトルデータが得られなかった. ここで 4 の ECD スペクトルが得られなかった原因として 10’ 位の水酸基の吸収が測定溶媒の MeOH の吸収と重なることや MeOH 中でのコンホマーの安定性をはじめとする複数の要因が存在することが推測された. しかし, ECD スペクトルが得られたとしてもデータの比較により立体化学を決定することができるような類似構造を有する化合物が存在しないことから,
159,167,168)

4 の ECD スペクトルによる 10’ 位の水酸基の絶対立体配置の決定は断念した．また，4 の収量が 1.4 mg と少ないことから (R)- および (S)- MTPA ester へ誘導して絶対立体配置を決定する改良 Mosher 法169,170) や diol を benzoate へ誘導して励起
子キラリティー法で決定する dibenzoate 法171-173) の適用も厳しいことから, 少量でも非経験的に立体化学を決定できる手法を検討することにした.

Figure 31 Method of ICD.178)

50

そこで, 4 が diol である点を利用して光学活性なゲスト分子とホスト分子が錯体を形成し, ゲスト分子の立体化学に誘起されて ECD スペクトルが与えられることでゲ
スト分子の絶対配置を決定する，誘起円二色性 (induced circular dichroism, ICD) の 1 つ
で あ る dimolybdenum 法 *1 を 用 い る こ と と し た (Fig. 31).174-180) こ の よ う に
molybdenum (Mo) 錯体を形成することで diol のコンホマーの安定化を図りつつ, Mo
錯体の発色団としての機能による Cotton 効果の検出波長の長波長シフトが見込める.
さらに, dimolybdenum 法を用いるメリットは µg 単位の diol にも適用可能である点
や,174) 得られた ECD スペクトルから励起子キラリティー法に準じた絶対立体配置の決定も行うことができる点が挙げられ, 4 の立体化学の検討において最適であると推測された. 以上のことから, dimolybdenum 法を用いた 4 の測定と得られた ECD スペク
トルから励起子キラリティー法*2 に準じた絶対立体配置の決定を試みた. 181-184)

Figure 32

ECD spectrum for 4 induced by Mo2(OAc)4.

Dimolybdenum 法に則り DMSO 中で 4 と dimolybdenum (II) tetraacetate を混和して調製した試料について ECD の測定を行ったところ 357 nm 付近に負の Cotton 効果
De −0.05, 305 nm 付近に正の Cotton 効果 De +0.03 が観測されたことから, これらの結果 に 基づ いて 励起 子キ ラ リテ ィー 法に 準じ た立 体 化学 の検 討を 行っ た (Fig. 32).
Dimolybdenum 法において信頼性の高い Cotton 効果は 300 nm より長波長側に観測さ51

れることが知られており, 電気遷移モーメントが右回りのねじれである正の励起子キ
ラリティーをなす場合は 350 nm 付近に負の Cotton 効果, 300 nm 付近に正の Cotton
効果が得られることが報告されている. 174-180) そして, 逆に電気遷移モーメントが左回りのねじれである負の励起子キラリティーをなす場合は同様の波長において符号の反転した Cotton 効果を示す. このことから, 4 は電気遷移モーメントが右回りのねじれ
で正の励起子キラリティーをなすことから 4 の 10’ 位の水酸基の絶対立体配置は Sであると決定した. 以上のことから 4 の構造を Fig. 33 に示した構造と決定し, 4 は新規化合物であったことから 10’,11’-dihydroxygrifolic acid と命名した.

Figure 33

The structure of 10’,11’-dihydroxygrifolic acid (4).

52

5 は brown oil として得られ, 1H-NMR のスペクトルパターンは 2 および 3 のスペ
クトルパターンと類似していたことから, 5 も orsellinic acid ユニットと prenyl ユニットからなる meroterpene 類であると予想した. これまでの解析と同様に 5 の 1H-NMRのスペクトルの解析と 3 の 1H-NMR のスペクトルデータとの比較を行ったところ,
orsellinic acid ユニットに由来するシグ ナルは 良好な一致を示 したことか ら 5 のorsellinic acid ユニットの構造は 3 と同一の構造であることが示唆された. 他方, prenyl
ユニットにおいて 5 では新たに低磁場シフトしたプロトン dH 4.87 (1H, d, J = 8.7 Hz, H10’) のシグナルが確認され, 8’ 位のプロトン dH 6.85 (1H, d, J = 1.3 Hz, H-8’) と 9’ 位のプロトン dH 5.57 (1H, brd, J = 8.7 Hz, H-9’) と思われるシグナルも高磁場シフトしていた. また, 3 では等価に観測されていた 12’ 位と 13’ 位に由来するメチル基のプロ
トンが 5 においては dH 1.76 (3H, s, H-12’) および dH 1.79 (3H, d, H-13’) とそれぞれ非等価に観測された. これらのことから 5 は 3 の 9’ 位と 10’ 位のオレフィンが 10’
位と 11’ 位へ転位した構造と推測した (Fig. 34).163,185)

Figure 34

HMBC (blue arrows), 1H-1H COSY (red bonds), and NOESY (green dashedarrows) correlations of 5.

次に 5 の 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 スペクトルデータについても同様に
3 のスペクトルデータとの比較を行ったところ, orsellinic acid ユニットにおける化学シ
フト値がほぼ一致したことから， orsellinic acid ユニットの構造は 3 と同じであることが支持された (Table 6). 続いて prenyl ユニットについて解析を行ったところ, 3 にお53

いて観測されていた 11’ 位の第 4 級炭素のシグナルが消失し, 5 では新たに低磁場シフトしたメチン炭素 dC 78.5 (C-9’) の存在が認められた. また, 12’ 位と 13’ 位に由来するメチル炭素 dC 25.8 (C-12’), dC 18.5 (C-13’) もそれぞれ非等価に観測されていることから先の推定構造が支持された.
そこで, 二次元 NMR の詳細な解析を行ったところ Fig. 34 に示した DQF-COSY,
HMBC および NOESY 相関が得られたことからも 5 は 3 の 9’ 位と 10’ 位のオレフィンが 10’ 位と 11’ 位へ転位した構造であることが支持された. 特に prenyl ユニットでは DQF-COSYにおいて H-8’ と H-9’, H-9’ と H-10’ の間にそれぞれ相関が認められた. さらに，HMBCスペクトルにおいて H-6’ から C-4’, C-5’, C-7’, C-8’ と C-14’
へ, H-8’ から C-6’, C-7’, C-9’ と C-14’ へ, H-9’ から C-7’, C-8’, C-10’ と C-11’ へ, H10’ から C-9’, C-11’, C-12’ と C-13’ へ, H-12’ から C-10’, C-11’ と C-13’ へ, H-13’ から C-10’, C-11’ と C-12’ への HMBC 相関がそれぞれ認められたことから 5 は 3 の9’ 位と 10’ 位のオレフィンが 10’ 位と 11’ 位へ転位した構造と決定した. 以上， 11の構造は Fig. 35 に示したような新規化合物であることを明らかにした.

Figure 35 The structure of albatrelactone (5).

54

Table 6

NMR Spectroscopic Data for 5 (500 MHz

1

for H, 125 MHz for 13C in DMSO-d6).
albatrelactone (5)PositiondC

dH (J in Hz)

type

1

104.6

C

2

142.1

C

3

111.4

CH

4

159.9

C

5

111.8

C

6

163.4

C

7

175.5

C

1'

21.9

CH2

3.38 d (6.7)

2'

122.8

CH

5.23 t (6.7)

3'

136.5

C

4'

38.9

CH2

2.06 t (7.4)

5'

25.3

CH2

1.66 quin (7.4)

6'

24.4

CH2

2.22 t (7.4)

7'

134.0

C

8'

147.7

CH

6.85 d (1.3)

9'

144.9

CH

5.57 brd (8.7)

10'

78.5

CH

4.87 d (8.7)

11'

118.5

C

12'

140.7

CH3

1.76 s

13'

25.8

CH3

1.79 s

14'

174.6

C

15'

16.0

CH3

1.78 s

2-CH3

24.2

CH3

2.50 s55

6.22 sまた, 6–10 の 5 種の既知化合物は各種スペクトルデータの比較により、それぞれ
grifolin (6),153) grifolic acid (7),150) grifolic acid methyl ester (8),161) 9’-keto-grifolic acid (9),161)(R)-bis-2-hydroxy-1-methoxy neogrifolin (10),161) と同定した (Fig. 36)。さらに, 得られた
meroterpene 類の中でも 2 や 3 のような鎖状の prenyl ユニットにおいて 5 員環 ラ
クトンを有する天然物は希少であることに着目し, これらの生合成経路についてこれまでの報告もふまえて考察を行ったところ 2 および 3 は 7 を前駆体として 9’ 位と 14’ 位の酸化を経て生合成されることが示唆された.163-167,185) すなわち, 先ず 7 の9’ 位が酸化されることでケトンである 9 へと変換され, 次に 9 の 14’ 位のメチル基が酸化されてカルボン酸に変換される. そして, 9 の 14’ 位がカルボン酸へ変換された meroterpene 類が 9’ 位のケトンが水酸基へと変換されると同時に閉環すること
で 5 となり, 5 の 10’ 位および 11’ 位のオレフィンの 9’ 位および 10’ 位への転位を経て 2 および 3 の 5 員環ラクトンが生合成されると推定した. 本研究において14’ 位のメチル基が酸化されてカルボン酸に変換された meroterpene 類を単離するには至らなかったことから, 9 の 14’ 位がカルボン酸へ変換された meroterpene 類の探索は今後の研究課題のひとつといえる.

56

Figure 36

Isolated compounds from A. yasudae.

57dimolybdenum 法*1
光学活性を有する diol と dimolybdenum (II) tetraacetate を DMSO 中で混和するとin situ で diol との配位子交換が起こり, diol の立体化学に応じて a 型もしくは b 型のキラルな molybdenum (Mo) 錯体を形成することを利用した ICD の一種.180)

励起子キラリティー法*2
一般に励起子相互作用によるキラリティーを ECD で検出することで非経験的に絶対立体配置を決定する手法である.181-184) すなわち, 分子内の互いに不斉位置に 2 つの等価な発色団が存在する場合, 光の吸収による励起状態がそれぞれの発色団の間で非局在化できる状態を励起子と表し, この励起子が互いに相互作用することで起こる励起子相互作用により励起エネルギーの準位が 2 つに分裂する Davydov 分裂が生じる.
ECD スペクトルにおいて, この分裂によるエネルギー準位差に相当する波長差のそれ
ぞれの位置に等しい強度で符号の相反する 2 つ Cotton 効果が観測されることが知られており, これらの 2 つの符号の異なる Cotton 効果は分裂型 Cotton 曲線と称されている. 一般に分裂型 Cotton 曲線における符号は電気遷移モーメントのねじれに基づく
励起子キラリティーの符号により決定されおり, 2 つの発色団の電気遷移モーメントが右回りのねじれである正の励起子キラリティーをなす場合, 長波長側の第 1 Cotton 効
果が正, 短波長側の第 2 Cotton 効果が負である正の分裂型 Cotton 曲線が得られる. 逆に 2 つの発色団の電気遷移モーメ ントが左回りのねじれ, つまり負の励起子キラリ
ティーをなす場合, 長波長側の第 1 Cotton 効果が負, 第 2 Cotton 効果が正である負の分裂型 Cotton 曲線が観測される. これらの分裂型 Cotton 曲線は先に述べた発色団の励起子相互作用に基づくものであり, 以上の理論から非経験的に絶対立体配置を決定することができる.

58

第 5 節ヌメリアイタケ由来 meroterpene 類の抗 AD 活性と構造活性相関の検討

先ず, ヌメリアイタケより得られた meroterpene 類 (1–4, 6–10) および 1 の構造決定の際に得られたメチル化体 1a の合計 10 種について, Th-T 法による Ab 凝集抑制活性試験を行った. その結果, 6, 8 および 9 以外の meroterpene 類において濃度依存的な Ab 凝集抑制活性が確認され, それぞれの IC50 は Table 7 の表に示した値であった. この中でも特に新規 meroterpene 類の 1 は Pos. Cont. である myricetin (IC50 9.9µM) と同程度の強い活性を有することが明らかとなった. これらの結果より構造活性
相関 (Structure-Activity Relationship, SAR) を考察すると, orsellinic acid ユニットの 7 位がカルボン酸であること, prenyl ユニットが酸化修飾されていないことの 2 つが Ab
凝集抑制活性の発現において重要であることが推測された. すなわち, 特に良好な活性を示した 1 と他の meroterpene 類の構造および IC50 を比較するとカルボキシ基がメ
チルエステル化された 1a や側鎖が酸化修飾された meroterpene 類の Ab 凝集抑制活性は一様に減弱していることが見て取れる. 先行研究においても同様の傾向が報告されていることからもカルボキシ基の存在と酸化修飾されていない prenyl ユニットが重要であることは支持されるが,161) Ab 凝集抑制活性の発現の条件について信頼性を担保するためには, 今後より多くの meroterpene 類との SAR の検討を行う等の更なる実験を行う必要がある.
ま た , meroterpene 類 の 活 性 の 発 現 機 序 に つ い て も 考 察 し た と こ ろ , こ れ ら の
meroterpene 類が有する可能性のある抗酸化活性やラジカル除去活性が関与していることが示唆された. これは Ab が凝集する過程において Ab monomer が b-sheet 構造を形成し, 112-114) かつ Glu22-Asp23 付近にターン構造を有する毒性配座をとることでTyr10 と Met35 が近接し, Tyr10 の phenoxy radical が Met35 の側鎖の酸化およびラジカル化を引き起こすステップが存在しており, 118-120) メロテルペン類はこの Met35 の側鎖の酸化およびラジカル化を阻害することで Ab 凝集抑制活性を発現していると予59

想される. この仮説が支持される理由として SAR の検討により得られた Ab 凝集抑制活性の発現における重要条件と辻褄が合うこと, 161) これまでに orsellinic acid ユニットと prenyl ユニットからなる meroterpene 類において抗酸化活性やラジカル除去活性の報告があることと,152) これまでに報告されている Ab 凝集抑制活性を有する低分子化合物が抗酸化活性やラジカル除去活性を併せ持っていること等が挙げられる.130) こ
れらの活性発現の機序についても, 今後 meroterpene 類の抗酸化活性やラジカル除去
活性の有無の検討を始めとした追加研究を行うことで Ab 凝集抑制活性の発現機序を証明するべきである.

Table 7 Ab aggregation and BACE1
inhibitory activity of compounds 1–10 and
1a. (IC50 µM)
Ab
BACE1
aggregation
1

6.6

1.6

2

40.7

10.9

3

51.4

10.5

4

53.3

34.4

5

nd

nd

6

161)

6.1

161)

1.4

>100

7

20.3

8

>100

161)

nd

>100

161)

nd

161)

nd

9
10

12.3

1a

50.3

>100

myricetin

9.9

2.8186)

Inhibitor IV

>100

0.015

60

次に, 近年の報告によれば抗 AD 薬のシード化合物として単一の抗 AD 活性をもつ化合物よりも, 複数の抗 AD 活性を有する化合物の方が適していることが示唆されており, 実際にこの仮説に則ってデザインされた化合物の合成もなされている.187,188) そ
こで, AD 発症において重要な APP から Ab を切り出す役割を担う BACE1 を標的としてヌメリアイタケから得られた meroterpene 類の BACE1 阻害活性を BACE1 蛍光共鳴エネルギー移動 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) assay を用いて検討することとした (Fig. 37).189)

Figure 37

Theory of BACE1 assay.

本活性評価は蛍光 donor (D) である rhodamine 誘導体 (Rh) と消光性 acceptor (A)である quencher の 2 種類の fluorophore により修飾された Swedish 変異体に基づく
ペプチド鎖を基質として用い, BACE1 により切断された基質が発する蛍光を測定することで BACE1 阻害活性を算出することができる. すなわち, 近接する D の蛍光スペ
クトルと A の励起スペクトルに重なりがある場合, D に励起光を照射すると D の励
起エネルギーが双極子間相互作用を経て A へ移動することで D の蛍光が消光される現象を一般に FRET と呼び,190,191) 本活性評価系における D, Rh の励起光である 530–
545 nm の光を BACE1 によって切断されていない基質に照射しても Rh の蛍光はこの FRET により消光されている. 一方, この基質が BACE1 によって切断されると61

Rh と A である quencher が近接しなくなることから FRET による消光が起こらない
ため, BACE1 によって切断された基質に 530–545 nm の励起光を照射すると Rh が蛍
光を示す.

Figure 38

Method of BACE1 assay.

こ の よ う な 原理 に 基 づ き 384 well 黒 色プ レー ト に 試 料 の DMSO 溶 液 ま たは
DMSO と BACE1 の基質溶液を混和し, BACE1 溶液を添加した後 1 時間後および 3
時間後に蛍光プレートリーダーで蛍光強度を測定した (Fig. 38).136,189) BACE1 により切断された基質の増強される蛍光強度は基質の分解率に比例することから, 測定によって得られた蛍光強度を用いて BACE1 阻害率の算出を行った. ここで, 本アッセイのPos. Cont. は b-Secretase Inhibitor IV (IC50 0.015 µM) を用いることとした.192,193)
ヌメリアイタケより得られた meroterpene 類 (1–4, 6, 7) および 1a の合計 7 種について先に述べた BACE1 阻害活性試験を行ったところ, 1a 以外の meroterpene 類に濃度依存的な BACE1 阻害活性を見出し, それぞれの IC50 は Table 7 の表に示した値であった. この中でも特に新規 meroterpene 類の 1 と 7 はこれまでに BACE1 阻害活性が報告されている天然物の中でも比較的強い活性を有することが明らかとなった.
先と同様に得られた結果より SAR を考察すると, Ab 凝集抑制活性の発現の条件と同62

様に orsellinic acid ユニットの 7 位がカルボン酸であること, prenyl ユニットが酸化修
飾されていないことの 2 つが BACE1 阻害活性の発現においても重要性が高いことが示唆された. すなわち, 特に良好な活性を示した 1 および 7 と他の meroterpene 類の構造および IC50 を比較すると, Ab 凝集抑制活性の SAR の際と同様に, カルボン酸のメチル化や側鎖の酸化修飾がなされた meroterpene 類の BACE1 阻害活性は減弱する傾向にあった. これまでの知見から BACE1 阻害活性の発現においてカルボニル基の存在が重要であることが挙げられていたが,124,125) 本研究において得られた BACE1阻害活性の発現条件は, 単にカルボニル基ではなくカルボン酸でなければならないことが推測された. このことと meroterpene 類の性質を考慮するとメロテルペン類のBACE1 阻害活性の発現機序は, 一般的な BACE1 への結合部位と異なる位置に結合することで活性が発現する等の従来の化合物と異なる可能性がある. これについても同様に BACE1 阻害活性の発現において重要とされる構造的な特徴や発現機序を明確にするために多くのメロテルペン類との SAR の検討, Lineweaver-Burk プロットやDixon プロットによる阻害形式の確認やドッキングスタディ等の更なる実験を行うべきである.124,194-198)

63

第 2 章ニンギョウタケ MeOH 抽出エキスからの meroterpene 類の探索

第 1 節

キノコ子実体ニンギョウタケとそれに関連する報告

ヌメリアイタケより抗 AD 活性化合物として meroterpene 類が得られたことから,
meroterpene 類についてより詳細な SAR を検討するためにヌメリアイタケと同じニンギョウタケモドキ属に分類されるニンギョウタケ (Albatrellus confluens) に着目した.
先に述べたようにニンギョウタケは DNA 配列データを用いた分子系統解析等の結果を基にした分類に従うと, 担子菌門, ハラケ綱, ベニタケ目, ニンギョウタケモドキ科のニンギョウタケモドキ属に分類される.146) ヌメリアイタケと同様に松類の外生菌根菌であることから, ニンギョウタケも秋頃の松類等の針葉樹林に群生するが, ニンギョ
ウタケは日本を含めた北半球と広範囲に分布するためヌメリアイタケよりも入手が容易である.146) また, ニンギョウタケの形態学的な特徴として, 20 cm 以上にもなる大形
で無毛の扇形またはヘラ状の肉厚な子実体や, 白色またはクリーム色で孔口の小さい
垂直性の管孔柄を形成すること, 傘の横や中心から外れてつく柄等が挙げられ,146) これらをもとに 2018 年 9 月に山梨県で採集されたニンギョウタケの形態学的な種の同定が行われた (Fig. 39).

Figure 39

The morphological characteristic of fruiting bodys A. confluens.146)

64

ニンギョウタケモドキ属の中でも最も成分探索に関する報告の多いニンギョウタケの主成分は, ヌメリアイタケと同様に orsellinic acid ユニットと prenyl ユニットから構成される meroterpene 類である. 148-160) ニンギョウタケについても成分探索研究の報
告は低極性画分の探索を行ったものに偏っており, 高極性画分に含まれる新規
meroterpene 類は見逃されている可能性が高いことが推測された. さらに, ヌメリアイ
タケとニンギョウタケは種が異なるため代謝のパターンも異なることが予想されることから, ニンギョウタケから得られる二次代謝産物の修飾パターンも異なる可能性が高く, ヌメリアイタケからは得られない修飾パターンの新規 meroterpene 類をニンギ
ョウタケから単離することができると推定した. 以上のことから, 高極性画分の新規
meroterpene 類を単離・構造決定し, 抗 AD 活性のより詳細な SAR を検討することを目的としてニンギョウタケ MeOH 抽出エキスからの meroterpene 類の探索を行うこ
とにした.

65

第 2 節ニンギョウタケ MeOH 抽出エキスの分離・精製

乾燥重量 436.0 g のニンギョウタケを粗く粉砕し, CHCl3 で一昼夜, 室温で 3 回抽出した後, 次いで EtOAc, MeOH の順で同様に抽出し, 減圧下で濃縮してニンギョウタ
ケ MeOH 抽出エキスを 30.7 g (Ab aggregation rate: 51.8%, conc. 10 µg/mL) を得た. この
ニンギョウタケ MeOH 抽出エキスについて Si. C. C. (CHCl3–MeOH–H2O) を用いて 5
つの画分 Fr. A–E に分画し, これらの画分の Ab 凝集抑制活性評価を行なったところ
Fr. A–D に活性が認められた (Ab aggregation rate Fr. A: 42.3%, Fr. B: 6.4 g, 41.0%, Fr. C:
19.0%, Fr. D: 54.9%, Fr. E 81.9%, conc. 10 µg/mL) (Fig. 40). その中でも Ab 凝集抑制活性を示し, かつ TLC 上で meroterpene 類と推定されるスポットが確認された Fr. A–Cの分離を進めることとした. 先ず, Fr. A について Sephadex LH-20 C. C., Chromatorex
COOH C. C. および ODS C. C. を用いて分離, 精製を行った結果, 2 種類の化合物 6(2.1 g) と 17 (36.1 mg) を単離した. 続いて Fr. B および Fr. C についても同様に
Sephadex LH-20 C. C., Chromatorex COOH C. C., Si. C. C., ODS C. C. および分取 HPLC
を用いた分離を行い, Fr. B からは 6 種の化合物 7 (22.3 mg), 11 (9.3 mg), 15 (2.6 mg), 16(1.1 g), 18 (8.1 mg), 20 (0.5 mg), Fr. C からは 4 種の化合物 12 (4.2 mg), 13 (1.7 mg), 14(0.8 mg), 19 (2.6 mg) を単離し, ニンギョウタケ MeOH 抽出エキスから既にヌメリアイ
タケから単離した化合物 6 及び 7 に加え, 化合物 11–20 の合計 12 種の化合物を単離することに成功した.

66

Figure 40 Flowchart of A. confluens MeOH extract.

67

第 3 節単離物の構造決定

11 は colorless oil として得られ, 1H-NMR のスペクトルパターンは grifolin (6) のス
ペクトルパターンと類似していたことから, 11 も orsellinic acid ユニットと prenyl ユ
ニットのからなる meroterpene 類であると予想した. そこで, 11 と 6 の 1H-NMR のスペクトルデータの比較を行ったところ, 11において orsellinic acid ユニットの芳香環
プロトン dH 6.23 (2H, s, H-1, H-3), orsellinic acid ユニット上の芳香環の磁気異方性効果
により低磁場シフトしたメチルプロトン dH 2.20 (3H, s, 6-CH3) と prenyl ユニットの中でも芳香環に隣接することから磁気異方性効果により低磁場シフトしたメチレンプロ
トン dH 3.38 (2H, d, J = 7.0 Hz, H-1’) が観測された. これらのことから 11 の orsellinicacid ユニットの構造は 6 と同様に orsellinic acid のカルボン酸が脱炭酸することで産生する orcinol 構造を有することが推測された. 他方, 6 において prenyl ユニット上のオレフィンプロトンは 3 本のシグナルが観測されていたのに対し, 11 においては dH
5.26 (1H, tq, J = 7.0, 0.8 Hz, H-2’) と dH 5.12 (1H, m, H-10’) の 2 本のシグナルが確認されたのみであった. また, 6 において確認されていた prenyl ユニット上の 4 つのメチ
ルプロトンのシグナルのうち, 14’ 位のメチルプロトンのシグナルが 11 では dH 1.16
(3H, s, H-14’) と高磁場シフトしていたこと, さらに, メチレンプロトンが 6 よりも 1
つ多く, 合計 5 つのメチレンプロトン dH 2.03 (1H, m, H-4’), dH 2.02 (1H, m, H-9’), dH
1.46 (2H, m, H-5’, H-8’), dH 1.42 (1H, m, H-6’) のシグナルが観測された. これらのことから 11 は, prenyl ユニットに水酸基が導入された, 既知化合物である grifolinol が脱炭酸したような構造と推測した (Fig. 41).154)

68

Figure 41

HMBC (blue arrows) and DQF-COSY (red bonds) correlations of 11.

次に 11 の 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 スペクトルデータについても同様に 6 との比較を行ったところ, orsellinic acid ユニットにおける化学シフト値はほぼ一致したことから， orsellinic acid ユニットの構造は 6 と同じ orcinol であることが支持された (Table 8). 続いて 11 の prenyl ユニットについて解析を行ったところ, 6 において観測されていた 6’ 位と 7’ 位のオレフィン炭素のシグナルが消失し, 11 では
新たにメチレン炭素 dC 41.3 (C-6’) と第 4 級炭素 dC 73.1 (C-7’) のシグナルが認められた. このdC 73.1の第 4 級炭素の化学シフト値と分子式から考えると, この炭素に新たに水酸基が結合していることが推測された．
そこで, この水酸基の位置を決定するために二次元 NMR の詳細な解析を行ったところ, Fig. 41 に示した DQF-COSY, および HMBC 相関が得られたことから水酸基は7’ 位に結合していると推定した. 特に prenyl ユニットにおいて DQF-COSY より H1’ と H-2’, H-4’ と H-5’, H-5’ と H-6’, H-8’ と H-9’, H-9’ と H-10’ の間にそれぞれ相関が認められた. さらに，HMBCスペクトルにおいて H-4’ から C-2’, C-3’, C-5’, C6’ と C-15’ へ, H-5’ から C-3’, C-6’ と C-7’ へ, H-6’ から C-4’, C-5’, C-7’, C-8’ とC-14’ へ, H-8’ から C-6’, C-7’, C-9’, C-10’ と C-14’ へ, H-9’ から C-7’, C-8’, C-10’ とC-11’ へ, H-14’ から C-6’, C-7’ と C-8’ への HMBC 相関がそれぞれ認められたことから 11 の prenyl ユニットにおいて 6’ 位と 7’ 位のオレフィンが開裂して 7’ 位に69

水酸基が導入された構造と決定した. 以上， 11 の構造は Fig. 42 に示したような新規化合物であることを明らかにした.

Figure 42

The structure of 11.

Table 8 NMR Spectroscopic Data for 11 (500 MHz
for 1H, 125 MHz for 13C in CDCl3)
11
PositiondC

dH (J in Hz)

1

109.0

CH

2

137.5

C

3

109.0

CH

4

154.8

C

5

110.6

C

6

154.8

C

1'

22.1

CH2

3.38 d (7.0)

2'

122.1

CH

5.26 tq (7.0, 0.8)

3'

138.3

C

4'

40.0

CH2

2.03 m

5'

22.0

CH2

1.46 m

6'

41.3

CH2

1.42 m

7'

73.0

C

8'

41.5

CH2

1.46 m

9'

22.7

CH2

2.02 m

10'

124.4

CH

5.12 m

11'

131.8

C

12'

25.7

CH3

1.68 d (0.9)

13'

17.7

CH3

1.61 d (0.7)

14'

26.7

CH3

1.16 s

15'

16.2

CH3

1.80 d (0.8)

2-CH3

21.1

CH3

2.20 stype

70

6.23 s6.23 s12 は colorless oil として得られ, 11 と 12 の 1H-NMR および 13C-NMRのスペクト
ルパターンが類似していたことから, 12 も orsellinic acid ユニットと prenyl ユニットのからなる meroterpene 類であると予想した (Table 9). そこで, 11 と 12 の NMR のスペクトルデータの詳細な比較を行ったところ, prenyl ユニットにおいて両者のスペク
トルデータが良好な一致を示したことから, 12 も 11 と同様に prenyl ユニットに 7’位に水酸基が導入された構造であると推測した. また, orsellinic acid ユニットについても同様に比較したところ, 11 において観測されていた等価な 1 組の芳香族プロトン,
sp2領域に等価なメチン炭素と第 4 級炭素のシグナルが，12 では 2 つの芳香族プロトン dH 6.25 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-1), dH 6.20 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-3)，sp2 領域に2 本のメチ
ン炭素 dC 109.7 (C-1), dC 101.0 (C-3) および 2 本の第 4 級炭素 dC 154.3 (C-2), dC 155.3(C-4) のシグナルがそれぞれ観測された. また, 12 において, 11よりもより高磁場シフ
トした芳香環に隣接するメチレンプロトン dH 3.28 (2H, d, J = 6.7 Hz, H-1’) と低磁場シフトしたメチレン炭素 dC 25.1 (C-1’) のシグナルがそれぞれ確認された. このことから
orcinol 構造が存在するものの, 対称性が失われていることから orcinol の置換様式はgrifolin (6) のような置換様式ではなく neogrifolin (16) のような置換様式であると推定した. つまり, 12 の prenyl ユニットは 16 の 7’ 位に水酸基が導入された構造と推定
した (Fig. 43).

Figure 43

HMBC (blue arrows) and DQF-COSY (red bonds) correlations of 12.

ここで 12 の推定構造を決定するために, 11 の構造解析と同様に DQF-COSY および HMBC による詳細な検討を行った結果, それぞれ Fig. 42 に示した相関が認められ71

た. このことから 16 の prenyl ユニット上の 7’ 位に水酸基が導入された構造である
12 の推定構造が支持された. 以上のことから 12 の構造は Fig. 44 に示したような新規化合物であることを明らかにした.

Figure 44

The structure of 12.

72

Table 9

NMR Spectroscopic Data for 12 (500 MHz

1

for H, 125 MHz for 13C in CDCl3)
12
PositiondC

dH (J in Hz)

1

109.7

CH

2

154.3

C

3

101.0

CH

4

155.3

C

5

117.9

C

6

138.5

C

1'

25.1

CH2

3.28 d (6.7)

2'

122.4

CH

5.13 m

3'

137.1

C

4'

40.0

CH2

2.01 m

5'

22.1

CH2

1.46 m

6'

41.4

CH2

1.42 m

7'

73.1

C

8'

41.5

CH2

1.46 m

9'

22.6

CH2

2.02 m

10'

124.4

CH

5.12 m

11'

131.8

C

12'

25.7

CH3

1.68 s

13'

17.7

CH3

1.61 s

14'

26.7

CH3

1.16 s

15'

16.2

CH3

1.80 s

6-CH3

20.1

CH3

2.23 stype

73

6.25 d (2.3)

6.20 d (2.3)

13 は colorless oil として得られ, 1H-NMR のスペクトルパターンは neogrifolin (16)のスペクトルパターンと類似していたことから, 13 も orsellinic acid ユニットと prenyl
ユニットのからなる meroterpene 類であると予想した. そこで, 13 と 16 の 1H-NMRのスペクトルデータの比較を行ったところ, orsellinic acid ユニットのスペクトルデータ
は良好な一致を示したことから 13 は 16 と同様に orcinol 構造を有することが推測された. 一方, 16 において prenyl ユニットのオレフィンプロトンのシグナルは 3 つ
観測されていたが, 13 では 1 つ消失しており, 新たにエキソメチレンに由来すると考えられる非等価なプロトン dH 4.85 (1H, brs, Hz, H-14’), dH 5.00 (1H, brs, H-14’) および低磁場シフトしたメチンプロトン dH 4.04 (1H, dd, J = 7.4, 4.9 Hz, H-6’) のシグナルが観測された. また, 16 において確認されていた prenyl ユニットの 4 つのメチルプロトンのシグナルのうち 14’ 位のメチルプロトンのシグナルが 13 では消失していたことが確認された. ここからニンギョウタケモドキ属のキノコ子実体から単離されている既知 meroterpene 類の生合成をふまえ, 159) 13 の prenyl ユニットは 16 の 6’ 位と 7’ 位のオレフィンが 7’ 位と 14’ 位に転位して 6’ 位に水酸基が導入された構造と予測した (Fig. 45).

Figure 45

HMBC (blue arrows), DQF-COSY (red bonds) and NOESY (green dashed arrows)
correlations of 13.

次に 13 の 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 スペクトルデータについても同様に 16 と比較したところ, orsellinic acid ユニットのスペクトルは 1H-NMR のスペクトルと同様に良い一致を示したことから orsellinic acid ユニットの構造は先の推定構造で74

あることが支持された (Table 10). 続いて 16 の prenyl ユニットについて解析を行ったところ, 16 において観測されていた 6’ 位と 7’ 位のオレフィン炭素および 14’ 位のメチル炭素のシグナルがそれぞれ消失し, 13 では新たにsp2 領域にメチレン炭素 dC
109.65 (C-14’), 第 4 級炭素 dC 151.5 (C-7’) および低磁場シフトしたメチン炭素 dC 75.2
(C-6’) のシグナルの存在が認められた. 以上のことから, 先に推定した6’ 位に水酸基，
7-14’位にエキソメチレンを有する構造が 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 のスペ
クトルデータからも支持された.
そこで 13 の推定構造を明らかにするために二次元 NMR を用いた詳細な解析を行ったところ, HMQC スペクトルにおいてエキソメチレンに由来すると考えられた非等価なプロトン dH 4.85 (1H, brs, H-14’) と, dH 5.00 (1H, brs, H-14’) のそれぞれのシグナル
から sp2 メチレン炭素 dC 109.65 (C-14’) に相関が得られたことからエキソメチレンを有することが支持された. さらに DQF-COSY, HMBC および NOESY を用いた詳細な構造解析を行ったところ, Fig. 45 に示した相関がそれぞれ観測されたことからも推定構造が支持された. 中でも prenyl ユニットにおいて DQF-COSY スペクトルにおいてH-4’ と H-5’, H-5’ と H-6’, H-8’ と H-9’, H-9’ と H-10’ の間にそれぞれ相関が認められた. また, HMBC スペクトルより H-4’ から C-2’, C-3’, C-5’, C-6’ と C-15’ へ, H-5’
から C-3’, C-4’, C-6’ と C-7’ へ, H-6’ から C-4’, C-5’, C-7’, C-8’ と C-14’ へ, H-8’ から C-6’, C-7’, C-9’, C-10’ と C-14’ へ, H-9’ から C-7’, C-8’, C-10’ と C-11’ へ, H-14’
から C-6’, C-7’ と C-8’ への相関がそれぞれ得られた. さらに NOESY より H-6’ とH-14’, H-8’ と H-14’ の間にそれぞれ相関が確認されたことから, 13 の prenyl ユニットにおいて 7’ 位と 14’ 位にエキソメチレンが存在し, 6’ 位に水酸基を有する構造と決定した. 以上, 13 の平面構造は Fig. 46 に示したような新規化合物であることを明らかにしたが, 水酸基の立体化学については今後決定する必要がある.

75

Table 10

NMR Spectroscopic Data for 13 (5001

MHz for H, 125 MHz for 13C in CDCl3)
13
PositiondC

dH (J in Hz)

type

1

109.67CH

6.25 d (2.3)

2

154.2

C

3

100.9

CH

4

155.2

C

5

117.9

C

6

138.5

C

1'

25.1

CH2

3.28 d (6.8)

2'

122.6

CH

5.13 tq (6.8, 1.2)

3'

136.9

C

4'

35.9

CH2

6.19 d (2.3)

2.06 m2.08 m

5'

33.5

CH2

1.61 m1.67 m

6'

75.2

CH

7'

151.5

C

8'

31.5

CH2

4.04 dd (7.4, 4.9)

1.94 dt (15.0, 7.8)
2.09 m

9'

26.6

CH2

2.13 m

10'

124.0

CH

5.12 tq (6.9, 1.3)

11'

132.0

C

12'

25.7

CH3

1.68 d (1.3)

13'

17.7

CH3

1.61 s14'

109.65CH2

4.85 brs
5.00 brs

15'

16.3

CH3

1.80 d (1.2)

6-CH3

20.1

CH3

2.22 sFigure 46

The structure of 13.

76

14 は colorless oil として得られ, 1H-NMR のスペクトルパターンは grifolic acid (7)のスペクトルパターンと類似していたことから, 14 も orsellinic acid ユニットと prenyl
ユニットのからなる meroterpene 類であると予想した. そこで, 14 と 7 の 1H-NMRのスペクトルデータの比較を行ったところ, prenyl ユニットは良好な一致を示したことから, 14 は 7 と同様に修飾されていない farnesyl 構造を有することが推測された. また, orsellinic acid ユニットについてもほぼ差異が確認されなかったことから, 14 のorsellinic acid ユニットの構造も 7 と同様に orsellinic acid であることが推測されたが.
orsellinic acid の芳香族プロトンが１つ少なく，置換基の存在が示唆された．これらのシ
グナル以外に 14 は化学的に等価で磁気的には非等価な AA'XX' スピン系の 2 つの芳香族プロトン dH 6.82 (2H, dd, J = 6.9, 2.0 Hz, H-3’’, H-5’’) および dH 7.25 (2H, dd, J =6.9, 2.0 Hz, H-2’’, H-6’’) のシグナルが観測されたことから, 軸対称を有する p-置換ベンゼンの存在が示唆された.
次に 14 の 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 スペクトルデータについても同様に 7 との比較を行ったところ, prenyl ユニットのスペクトルは同様に良好な一致を示したことから prenyl ユニット構造は先の推定が支持された (Table 11). 続いて 14 と7 の orsellinic acid ユニットについて比較を行ったところ, 14 において高磁場シフトした sp2 領域の第 4 級炭素 dC 149.2 (C-4) と低磁場シフトしたカルボニル炭素 dC 195.6(C-7) のシグナルが観測された. また, 14 では sp2 領域に HMQC でそれぞれ 2H 分のプロトンのシグナルと相関のあった2 本のメチン炭素 dC 115.4 (C-3’’, C-5’’), dC 127.6(C-2’’, C-6’’) のシグナルが確認されたことから先に予想した p-置換ベンゼンの存在が支持された. 以上のことから Fig. 47 に示した構造と推定したものの, このような
orsellinic acid ユニットと 4-hydroxybenzene ユニットがカルボニル基を介して架橋した
構造は天然物において珍しい構造であるから置換基の配置および架橋の有無について，
以下詳細に検討した.199)

77

Figure 47

HMBC (blue arrows), DQF-COSY (red bonds) and ROESY (green dashedarrows) correlations of 14.

すなわち，14 のDQF-COSY, HMBC および ROESY を用いた詳細な構造解析を行ったところ Fig. 47 に示した相関がそれぞれ観測されたことから prenyl ユニットの構造は支持された. また, orsellinic acid ユニットと 4-hydroxybenzene ユニットについては DQF-COSY において H-2’’ および H-6’’ と H-3’’ および H-5’’ の間にそれぞれ相関が認められ, HMBC において H-5 から C-4 と C-6 へ, 6-CH3 から C-1, C-5と C-6 へ, H-1’ から C-1, C-2, C-6, C-2’ と C-3’ へ, H-2’’ および H-6’’ から C-3’’
および C-5’’と C-4’’ へ, H-3’’ および H-5’’ から C-2’’ および C-6’’, C-4’’, と C1’’ への相関がそれぞれ得られた. さらに, ROESY より H-5 と 6-CH3 の間に相関が確認されたものの, 従来の meroterpene 類に比べて確認された HMBC 相関が少なく,これらの情報だけではカルボニル基を介して架橋した構造を有することの証明や C-3
および C-7 の化学シフトの帰属は困難であった. ここで, 得られた HMBC 相関が少なかった原因を orsellinic acid ユニットと 4-hydroxybenzene ユニットの 2JCH および
3

JCH が他の meroterpene 類のものに比べて小さく, 従来の HMBC の測定条件である

JLR= 8.0 Hz では検出できていない可能性が高いと推測した. このことから測定条件を
JLR = 6.0 Hz へと変更して HMBC を測定することで従来よりも小さい値の 2JCH および 3JCH を検出して推定構造の証明および化学シフトの帰属を試みることとした. そ78

の結果, HMBC (JLR = 6.0 Hz) から新たに H-5 から C-1, C-3 と 6-CH3 への相関, H2’’ および H-6’’ から C-7 への相関が得られたことから, これまでの報告もふまえて C-3 および C-7 の化学シフトの帰属に至った. さらに, HMBC の測定条件を JLR= 2.0 Hz へと変更して 4 結合先の相関を観測することでカルボニル基を介して架橋した構造を証明できると予想して HMBC (JLR = 2.0 Hz) の測定を行ったところ, H-2’’
および H-6’’ から C-3 への相関が得られたことから 14 のカルボニル基を介して架橋した構造が支持された. 以上のことから 14 の構造は Fig. 48 に示したような新規化合物であると推定した.

Figure 48

The structure of 14.

79

Table 11

NMR Spectroscopic Data for 14 (500 MHz

1

for H, 125 MHz for 13C in CDCl3)
14
Position

dC

1

107.7

C

2

163.6

C

3

113.22

C

4

149.2

C

5

113.26

CH

6

140.4

a

C

7

195.6

C

1'

21.6

CH2

3.49 d (7.2)

2'

120.3

CH

5.36 tq (7.2, 1.1)

3'

140.2

a

C

4'

39.7

CH2b

2.12 m

5'

26.2

CH2

2.15 m

6'

123.4

CH

5.09 m

7'

135.9

C

8'

39.6

CH2b

1.97 t (7.5)

9'

26.7

CH2

2.13 q (7.5)

10'

124.3

CH

5.08 m

11'

131.4

C

12'

25.7

CH3

1.67 d (1.1)

13'

17.63

CH3c

1.59 s

14'

16.4

CH3

1.60 s

15'

16.1

CH3

1.84 brs

1’’

128.7

C

2’’

127.6

CH

7.25 dd (6.9, 2.0)

3’’

115.4

CH

6.82 dd (6.9, 2.0)

4’’

156.7

C

5’’

115.4

CH

6’’

127.6

CH

6-CH3

17.67

dH (J in Hz)

type

CH3

6.25 d (2.3)

6.82 dd (6.9, 2.0)
7.25 dd (6.9, 2.0)
c

a,b,c

2.45 sAssignments may be interchanged due to overlapping of signals.

80

15 は colorless oil として得られ, 1H-NMR のスペクトルパターンは neogrifolin (16)のスペクトルパターンと類似していたことから, 15 も 16 と同様に orsellinic acid ユニ
ットと prenyl ユニットのからなる meroterpene 類であると推測した. そこで, 15 と 6の 1H-NMR のスペクトルデータの比較を行ったところ, orsellinic acid ユニットのスペ
クトルデータはほぼ一致したことから, 15 の orsellinic acid ユニットの構造は 16 と同様の構造であると予想した. 続いて prenyl ユニットについて同様に比較したところ,
16 において観測されていた 1’ 位のメチレン基のプロトンと 2’ 位のオレフィンに由来するプロトンのシグナルが 15 のものでは消失していた. また, 15 では 16 において確認されなかった 3 つの低磁場シフトしたプロトン dH 3.03 (1H, dd, J = 15.2, 9.5 Hz,H-1’), dH 3.09 (1H, dd, J = 15.2, 8.6 Hz, H-6’), dH 4.66 (1H, dd, J = 7.4, 4.9 Hz, H-6’) のシグ
ナルが新たに認められ, 15’ 位のメチル基に由来するプロトン dH 1.30 (3H, s, H-15’) のシグナルが高磁場シフトしていた. 以上の内容とこれまでの報告を考慮すると, 15 の構造は 16 の 2’ 位と 3’ 位のオレフィンがエポキシ化され, そのエポキシドの開裂に伴い 2’ 位と 6 位の水酸基が閉環した 2,3-dihydrobenzofuran 構造を有すると予測した.
しかしながら, 16 が 2,3-dihydrobenzofuran 構造となった既知 meroterpene 類である
(9S,10R)-6,9-epoxy-10-hydroxyneogrifolin (20) のスペクトルと 15 のものを比較しても一致しなかった.159) ここで orsellinic acid ユニットにおいて grifolin (6) のように軸対称な置換様式の orcinol 構造も 2,3-dihydrobenzofuran 構造の形成により対称性が失われる点をふまえると，15 の構造のorsellinic acid ユニットに結合したプレニル基の位置
は, 16 タイプではなく 6 タイプであることが推測され, さらに prenyl ユニットにおいて 2,3-dihydrobenzofuran 構造を形成した可能性が示唆された. このことから，後の解析において 16 ではなく 6 とのスペクトルデータの比較を行いながら解析を進めるこ
とにした.

81

次に 15 の 13C-NMR, DEPT90 および DEPT135 スペクトルデータについても同様に比較を行ったところ, orsellinic acid ユニットは 1 位に由来する sp2 メチン炭素 dC
103.0 (C-1) および sp2 領域に 4 位の炭素と考えられる第 4 級炭素 dC 151.9 (C-4) のシグナルが高磁場シフトし, 6 位に由来する第 4 級炭素 dC 161.4 (C-6) のシグナルが低磁場シフトしていることが確認された (Table 12). 15 の prenyl ユニットについても同様に解析を行ったところ, 6 において観測されていた 2’ 位と 3’ 位のオレフィンに由来する 1 組の炭素のシグナルがそれぞれ消失し, 15 では新たに低磁場シフトしたメチ
ン炭素 dC 89.5 (C-2’) と低磁場シフトした第 4 級炭素 dC 73.7 (C-3’) のシグナルが観測された. さらに, 1’ 位のメチン炭素 dC 27.1 (C-1’) と 15’ 位のメチル炭素 dC 22.9 (C15’) のシグナルの低磁場シフトと, 4’ 位のメチレン炭素 dC 36.8 (C-4’) および 5’ 位のメチレン炭素 dC 21.9 (C-5’) のシグナルの高磁場シフトがそれぞれ観測された. 以上のことから, Fig. 49 に示した推定構造が支持された.

Figure 49

HMBC (blue arrows) and DQF-COSY (red bonds) correlations of 15.

そこで，15 の推定構造の証明と完全帰属を行うために DQF-COSY および HMBCを用いた詳細な構造解析を行ったところ, Fig. 49 に示した相関がそれぞれ観測されたことから推定構造が支持された. 特に DQF-COSY より H-1’ と H-2’, H-4’ と H-5’,
H-5’ と H-6’ の間にそれぞれ相関が認められた. また, HMBC より H-1 から C-3, C-5,
C-6 と 2-CH3 へ, H-3 から C-1, C-4, C-5 と 2-CH3 へ, H-1’ から C-4, C-5, C-6, C-2’ とC-3’ へ, H-2’ から C-4, C-5, C-1’, C-3’, C-4’ と C-15’ へ, H-4’ から C-2’, C-3’, C-6’ とC-15’ へ, H-5’ から C-3’, C-4’, C-6’ と C-7’ へ, H-15’ から C-2’, C-3’ と C-4’ へ, 2-

82CH3 から C-1, C-2 と C-3 へ, 3’-OH から C-2’, C-3’, C-4’ と C-15’ への相関がそれぞれ観測された. これらの相関から 15 は 6 が 2,3-dihydrobenzofuran 構造を形成した構造であると決定した. 以上のことから 15 の構造は Fig. 50 に示したような新規化合物であることを明らかにした.

Figure 50

The structure of 15.

83

Table 12

NMR Spectroscopic Data for 15 (5001

MHz for H, 125 MHz for 13C in CDCl3)
15
Position

dC

1

103.0

CH

2

139.6

C

3

108.4

CH

4

151.9

C

5

109.7

C

6

161.4

C

1'

27.1

CH2

dH (J in Hz)

type
6.24 s6.14 s3.03 dd (15.2, 9.5)
3.09 dd (15.2, 8.6)

2'

89.5

CH

3'

73.7

C

4'

36.8

CH2

4.66 dd (9.5, 8.6)

1.51 ddd (15.3, 9.4, 4.5)
1.60 m

5'

21.9

CH2

2.07 m2.17 m

6'

124.0

CH

5.13 m

7'

135.7

C

8'

39.7

CH2

1.94 t (7.1)

9'

26.6

CH2

2.05 q (7.1)

10'

124.2

CH

5.08 tq (7.1, 1.2)

11'

131.5

C

12'

25.7

CH3

1.67 d (1.2)

13'

17.7

CH3

1.59 s

14'

16.0

CH3

1.62 s

15'

22.9

CH3

1.30 s

2-CH3

21.5

CH3

2.24 s

6-OH

4.66 brs

3’-OH

1.83 brs

84

また, 16–20 の 5 種の既知化合物は各種スペクトルデータの比較により, それぞれ
neogrifolin (16),150) confluentin (17),200) grifolic acid methyl ether (18),150) (S)-17-hydroxyl18,20-ene-neogrifolin (19),159) (9S,10R)-6,9-epoxy-10-hydroxyneogrifolin (20)159) と同定した(Fig. 51).

Figure 51 Isolated compounds from A. confluens.

85

結語
本論文はキノコ子実体からの AD 病治療薬の開発というテーマの研究を通してキノ
コ子実体の新規薬用資源としての有用性とそこで得られた Ab凝集抑制活性と BACE1阻害活性を有する天然由来化合物の AD 治療薬のシード化合物について述べたものである.201)
本論の第 1 章では合計 110 種のキノコ子実体抽出エキスから Ab 凝集抑制活性を有する 38 種のエキスを見出した. その中でも, 抗 AD 活性を有する新規 meroterpene
類を探索する目的でヌメリアイタケ MeOH 抽出エキスに着目し, Ab 凝集抑制活性を指標に成分探索を行ったところ, 4 種の新規化合物と 1 種の推定新規化合物を含む合計 10 種の meroterpene 類を単離するに至った. 得られた meroterpene 類の中でもalbatrelactone methyl ester (2) や albatrelactone (3) のような鎖状 prenyl ユニットに 5 員
環 lactone を有する構造は生合成的にも珍しい構造であり, このような構造を有する天
然物の生合成経路や生物学的な二次代謝産物の産生意義の解明への展開が期待される結果である. 次いで, これらの meroterpene 類 について Ab 凝集抑制 活性およ び
BACE1 阻 害 活 性 に つ い て 検 討 し た と こ ろ , 両 活 性 に 新 規 meroterpene 類 で あ る
scutigeric acid (1) に強い活性を見出した. 従来の知見をふまえて SAR について考察した結果, 両活性の発現において orsellinic acid ユニットの 7 位がカルボン酸であることと prenyl ユニットが酸化修飾されていないことの 2 つが重要な条件であることが示唆された. さらに, 活性の発現機序についても考察したところ Ab 凝集抑制活性については meroterpene 類の抗酸化活性やラジカル除去活性が関与し, BACE1 阻害活性の発現には meroterpene 類の多くの生体成分と容易に相互作用する特徴に由来するものであると推測した. このように，Ab 凝集抑制活性および BACE1 阻害活性という複数の活性を有する，すなわち異なる作用機序で AD を阻害する可能性のある化合物群が得られたことは非常に興味深いといえる. 今後, 作用機序の解明や構造最適化等の更なる86

創薬研究への展開の余地が大いにあることから, 全合成や生合成経路の解明を介した
遺伝子工学的な手法による必要量の供給が課題である.
本論の第 2 章では第 1 章で得られた meroterpene 類のより詳細な SAR の検討を行うために同じ属に分類されるニンギョウタケ MeOH 抽出エキスに着目し, 同様に詳
細な成分探索を行ったところ, 5 種の推定新規化合物とヌメリアイタケから得られた化合物と重複する 2 種の既知化合物を含む合計 12 種の meroterpene 類を単離するに至った. ここで, 推定ではあるものの高極性画分から新規 meroterpene 類が得られたことは, キノコ子実体が未開拓薬用資源として有用であることを裏付ける結果といえるだ
ろう. 今後の課題として詳細な構造解析を行ったうえで抗 AD 活性と SAR の検討を行うべきである.
近年, 薬用資源の枯渇や生物多様性条約により海外の薬用資源へのアプローチが難化し, 新規医薬品シード化合物となり得る天然物を見出すことは容易ではない. このような状況下において新規薬用資源の開拓の一環としてキノコ子実体に着目した研究を遂行した結果, ユニークな構造や多様な活性を有する新規化合物を見出すことができた点は, 新規薬用資源としてのキノコ子実体の有用性をより強く支持する結果となった. また, AD 患者数が増加し続けているために, 安価で安全性が高く, かつ根本的な治療や予防において有効な抗 AD 薬の開発は急務である. ここで, 今後検討すべき課題
は大いにあるものの, キノコ子実体から複数の抗 AD 活性を有する新規 meroterpene
類が得られたことは今後の AD 治療薬の創薬の一助となる可能性があることを示している. 以上, 本研究で得られた結果が今後の天然物化学や AD 治療薬の創薬の発展に寄与することを願い結語とする.

87

実験項
使用機器および試薬

General Experimental Procedures.
IR spectra were recorded with a Thermo FT-IR Nicolet iS5 spectrophotometer (Thermo Fisher
Scientific Inc., MA, USA). UV spectra were recorded with a Thermo GENESYS 10S UV-Vis
spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA). Optical rotation was determinedwith a Horiba SEPA-300 polarimeter (Horiba Ltd., Kyoto, Japan). ECD measurements werecarried out on a Jasco 820 spectropolarimeter (Jasco Co., Tokyo, Japan). 1H NMR and 13C NMR
spectra were measured with a JEOL JNM-ECS 400 MHz (JEOL Ltd., Tokyo, Japan), a JEOLJNM-ECZ 500 MHz (JEOL Ltd., Tokyo, Japan) and JEOL JNM-ECA 500 MHz (JEOL Ltd.,Tokyo, Japan) spectrometer using tetramethylsilane as the internal standard. EIMS and FABMS
spectra were measured with a JEOL JMS-700 spectrometer (JEOL Ltd., Tokyo, Japan). ESIMS
spectra were measured with a JEOL JMS-T100LC spectrometer (JEOL Ltd., Tokyo, Japan).
Column chromatography was performed using silica gel 60N (63–210 µm; Kanto Chemical,
Tokyo, Japan), ODS silica gel YMC-GEL ODS-A (75 µm; YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan) and
Chromatorex COOH silica gel (100 µm; Fuji Silysia Chemical Ltd., Aichi, Japan). Preparative
HPLC was performed on a SSC-3461 equipped with a SSC-5410 UV detector at 254 nm or 280
nm (Senshu Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan) and a Jasco PU-2080 Plus equipped with a Jasco
UV-2075 Plus UV detector at 254 nm (Jasco Co., Tokyo, Japan). The HPLC columns were an
Inertsustain C18 column (10f × 250 mm; GL Sciences Inc., Tokyo, Japan), a Senshu Pak
PEGASIL Silica 4251-N (10f × 250 mm; Senshu Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan), a Senshu
Pak PEGASIL Silica SP-100 (10f × 250 mm; Senshu Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan) and a
Chromatorex COOH SPS100-5 (10f × 250 mm; Fuji Silysia Chemical Ltd., Aichi, Japan).

88

第 1 章ヌメリアイタケ MeOH 抽出エキスからの抗 AD 活性化合物の探索

Th-T Assay.
Th-T assays of extracts, fractions, and isolated compounds were performed using thioflavine-T(FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Ltd., Japan) and Ab40 (Peptide Institute, Japan). The
aggregation of Ab was evaluated using a slight modification of the Th-T method developed by
Naiki and co-workers.26 In brief, 80 µM of 50 mM sodium phosphate buffer containing 100 mM
NaCl at pH 7.4 was aliquoted into a 0.5 mL tube, followed by the addition of 10 µL of each test
sample that was dissolved with DMSO. Then, a 10 µL solution of Ab40 (250 µM in 0.02%
NH4OH) was added to the tube so that the final concentration was 25 µM of Ab40, respectively.
All procedures were performed on ice. The resultant solution was incubated at 37 °C for 24 h,and then mixed with 300 µL of 5.0 µM Th-T in 5.0 mM Gly-NaOH buffer at pH 8.5. The mixture
was transferred to black 96-well plates at 100 µL per well and then gently vortexed for 30 min.
Fluorescence intensity was measured at 440 nm excitation and 485 nm emission using a Synergy
HTX Multi-Mode Reader (BioTek, USA). The Ab aggregation rate was calculated by thefollowing equation: Ab aggregation rate (%) = (S – B)/(C – B) × 100, where C is the fluorescenceintensity of a DMSO control (assay buffer, 25 µM Ab40, and DMSO containing no test sample)
after 24 h of incubation, B is the fluorescence intensity of a blank (assay buffer, 25 µM Ab40, andDMSO containing no test sample) before 24 h of incubation, S is the fluorescence intensity of thetested samples (assay buffer, 25 µM Ab40, and DMSO containing test sample) after 24 h ofincubation. Myricetin (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Japan) was used as a positive control.
The IC50 values were calculated by Prism (version 5.02; GraphPad, USA).

89

Fungal Material.
Fruiting bodies of Albatrellus yasudae were collected in Yamanashi Prefecture, Japan, in
September 2015. Species identification was confirmed by K. Koyama and a voucher specimen(AY-2015) was deposited at the Department of Pharmacognosy and Phytochemistry, Meiji
Pharmaceutical University.

Extraction.
Total weigh 354.8 g of dried and fractured mushrooms of A. yasudae was separated Lot. No.1:
138.5 g and Lot. No. 2: 216.3 g respectively, and Lot. No.1 and Lot. No. 2 were extracted threetimes each with CHCl3 and MeOH at room temperature. As a result of Th-T assays, the MeOH
extract showed inhibitory activity against Ab aggregation (Ab aggregation rate Lot. No. 1: 27.9%
at 100 µg/mL, Lot. No. 2: 44.5% at 10 µg/mL).

90

Isolation of the MeOH extract Lot. No. 1.
The MeOH extract Lot. No. 1 (18.6 g, 27.9% at 100 µg/mL) was fractionated by Si. C. C. with
CHCl3–MeOH–H2O (70:10:1, 50:10:1, 30:10:1, 6:4:1) to yield six fractions and fractions A–F
showed inhibitory activity against Ab aggregation at 100 µg/mL (Fr. A: 2.3 g, 19.4%; Fr. B: 0.9
g, 14.1%; Fr. C: 0.6 g, 16.8%; Fr. D: 1.4 g, 29.0%; Fr. E: 1.3 g, 30.9%; Fr. F: 2.4 g, 63.5%).
Fraction A (2.3 g, 19.4%) was subjected to ODS C. C. with MeCN–H2O (6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0)
to give seven fractions (Fr. A1–A7). Fraction A2 (54.7 mg) was subjected to preparative HPLC
eluted with CHCl3–MeOH (150:1) to obtain 2 (2.7 mg, tR 13 min). Fraction A4 (61.3 mg) was
subjected to two chromatography steps: (1) Si. C. C. with n-hexane–acetone (10:1, 7:1, 5:1, 3:1,
2:1, 0:1) and (2) preparative HPLC eluted with MeOH–H2O (95:5) to obtain 10 (1.5 mg, tR 42
min).
Fraction B (0.9 g, 14.1%) was fractionated by three chromatography steps: (1) ODS C. C. with
MeOH–H2O (8:2, 10:0), (2) ODS C. C. with MeCN–H2O (7:3, 8:2, 10:0), and (3) Si. C. C. with
CHCl3–MeOH (100:0, 100:1, 0:100) to obtain 5 (63.8 mg) and 6 (69.3 mg).
Fraction D (1.4 g, 29.0%) was fractionated by ODS C. C. with MeCN–H2O (4:6, 5:5, 6:4, 7:3,
8:2, 9:1, 10:0) to yield six fractions (Fr. D1–D8). Fraction D2 (75.4 mg) was subjected to two
chromatography steps: (1) Si. C. C. with CHCl3–MeOH (50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 0:100) and (2)preparative HPLC eluted with MeOH–H2O (5:5) to obtain 3 (1.4 mg, tR 23 min) and 4 (1.4 mg,
tR 30 min). Fraction D6 (127.7 mg) was fractionated by preparative HPLC eluted with CHCl3–
MeOH (100:1) to obtain 1 (19.0 mg, tR 10 min).
Although, Fr. C and Fr. E showed Ab aggregation inhibitory activity, any compound was not
obtained.

91Isolation of the MeOH extract Lot. No. 2.
The Lot. No.2 MeOH extract (20.0 g, 44.5% at 10 µg / mL) was fractionated by Si. C. C. with
CHCl3–MeOH–H2O (100:1:0.1, 75:1:0.1, 50:1:0.1, 25:1:0.1, 15:1:0.1, 10:1:0.1, 7.5:1:0.1, 5:1:0.1,
3:1:0.1, 6:4:1, 0:1:0) to yield five fractions (Fr. A–F), and Fr. A–E showed Ab aggregation
inhibitory activity at 10 µg/mL (Fr. A: 0.6 g, 63.3%; Fr. B: 4.3 g, 36.6%; Fr. C: 1.8 g, 19.1%; Fr.
D: 1.4 g, 40.1%; Fr. E: 2.3 g, 43.2%; Fr. F: 7.0 g, 86.9%).
Fraction A (0.6 g, 63.3%) was chromatographed on Chromatorex COOH C. C. with n-hexane–
acetone (50:1, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 0:1) to yield five fractions (Fr. A1–A5). Fraction A3(13.5 mg) was subjected to preparative HPLC eluted with MeOH–H2O (95:5) to obtain 9 (9.3 mg,
tR 17.4 min).
Fraction B (4.3 g, 36.6%) was chromatographed on Chromatorex COOH C. C. with n-hexane–
acetone (10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1, 0:1) to yield five fractions (Fr. B1–B5). Fraction B5 (727.3 mg)
was subjected to Sephadex LH-20 C. C. with a solvent system consisting of CHCl3–MeOH–H2O(6:4:1) to yield four fractions (Fr. B5-A–B5-D). Fraction B5-B (273.7 mg) was separated by ODS
C. C. using a solvent system consisting of MeOH–H2O (7:3, 8:2, 9:1, 10:0) to afford eightfractions (Fr. B5-B1–B5-B8). Fraction B5-B2 (15.9 mg) was fractionated by preparative HPLC
eluted with MeOH–H2O (75:25) to obtain 5 (2.9 mg, tR 21.1 min). Fraction B5-B4 (15.4 mg) was
fractionated by preparative HPLC eluted with MeOH–H2O (8:2) to obtain 8 (2.6 mg, tR 18.1 min).
Although, Fr. C–E showed Ab aggregation inhibitory activity, any compound was not obtained.

92

The spectral data of novel meroterpenoids.
Scutigeric acid (1): brown oil; UV (MeOH) lmax (log e) 205 (4.45), 214 (4.49), 252 (3.83), 306(3.46) nm; IR (ATR) nmax 3363, 2970, 2918, 1631 cm–1; 1H and 13C NMR see Table 2; HREIMS
m/z 402.2401 [M]+ (calcd for C24H34O5, 402.2406).
Albatrelactone methyl ester (2): brown oil; UV (MeOH) lmax (log e) 200 (4.16), 222 (4.23), 271(4.26) nm; IR (ATR) nmax 2931, 1740, 1646 cm–1; 1H and 13C NMR see Table 3; pos. HRFABMS
m/z 431.2079 [M+H]+ (calcd for C24H31O7, 431.2070).
Albatrelactone (3): brown oil; UV (MeOH) lmax (log e) 214 (4.11), 230 (4.21), 260 (4.11) 297(3.76) nm; IR (ATR) nmax 3315, 3135, 2945, 1698, 1682 cm–1; 1H and 13C NMR see Table 4; neg.
HRESIMS m/z 415.1762 [M-H]- (calcd for C23H27O7, 415.1757).
10’,11’-Dihydroxygrifolic acid (4): brown oil; [α]19D −17.5 (c 0.09, MeOH); UV (MeOH) lmax
(log e) 214 (4.11), 230 (4.21), 260 (4.11) 297 (3.76) nm; IR (ATR) nmax 3370, 3200, 2956, 1682
cm–1; 1H and 13C NMR see Table 5; neg. HRESIMS m/z 405.2278 [M-H]- (calcd for C23H33O6,
405.2277).
Dehydroxyalbatrelactone (5): brown oil; [α]18D −3.3 (c 0.2, MeOH); UV (MeOH) lmax (log e) 214(4.11), 230 (4.21), 260 (4.11) 297 (3.76) nm; ECD (MeOH) lmax (De) 212 (-0.78), 246 (0.32), 261(0.28), 281 (0.21) nm; 1H and 13C NMR see Table 6.

93Methylation of 1.
TMS-diazomethane (150 µL, ca. 5.39 µmol, ca. 0.6 M in n-hexane solution, Tokyo Chemical
Industry Co., Ltd., Japan) was added to a solution of 1 (6.7 mg, 16 µmol) in MeOH (1 mL) at
room temperature. The reaction mixture was allowed to stir for an additional 40 min after whichtime MeOH was added dropwise until the solution became colorless. The reaction mixture wasthen concentrated in vacuo to a residue that was purified by two chromatography steps: (1) silica
gel column chromatography with CHCl3–MeOH (50:1, 0:1) and (2) preparative HPLC eluted with
MeOH to yield 1a (1.1 mg, tR 10 min).
Scutigeric acid methyl ester (1a): brown oil; UV (MeOH) λmax (log ε) 205 (4.65), 265 (3.85)
nm; IR (ATR) νmax 3481, 2923, 1653 cm–1; 1H and 13C NMR see Table 2; HREIMS m/z
416.2562 [M]+ (calced for C25H36O5, 416.2563).

Absolute configurations of the 1,2-diol functionalities.
According to the published procedure, mixtures of 4 (0.3 mg, 0.75 µmol) and Mo2(OAc)4(Sigma-Aldrich Co. LLC.; 0.21 mg, 0.51 µmol) were subjected to ECD measurement atconcentrations of 0.1 mg/mL. The ECD spectra were observed immediately after mixing. The
absolute configurations of 1,2-diol functionalities were defined by the exciton chirality CD
method.
ECD (c 0.2 µM, DMSO) lmax (De) 276 (−0.03), 305 (+0.03), 357 (−0.05) nm.

94

BACE1 FRET Assay.
BACE1 assays were performed using the BACE1 FRET assay kit, Red (Thermo Fisher
Scientific, USA). 9 µL of test sample, 9 µL of 722 nM BACE1 substrate (Rh-EVNNLDAEFKQuencher in 50 mM ammonium bicarbonate), and 9 µL of BACE1 enzyme (1 U/mL) were mixedon black 384-well plates and incubated for 3 h at room temperature. Fluorescence intensity wasmeasured at 540 nm excitation and 590 nm emission using a Synergy HTX Multi-Mode Reader(BioTek, USA). The BACE1 inhibition rate was calculated by the following equation: BACE1
inhibition rate (%) = [1 – {(S – S0) – (B – B0)/(C – C0) – (B – B0)}] × 100, where C is thefluorescence of a DMSO control (enzyme, substrate, and assay buffer with DMSO) after 3 h ofincubation, C0 is the fluorescence of the DMSO control at 1 h after incubation, B is thefluorescence of a no-enzyme control (substrate and assay buffer with DMSO) after 3 h ofincubation, B0 is the fluorescence of the non-enzyme control at 1 h after incubation, S is thefluorescence of the tested samples (enzyme, sample solution, and substrate) after 3 h of incubation,and S0 is the fluorescence of the tested samples at 1 h after incubation. The IC50 values were
calculated by Prism (version 5.02; GraphPad, USA).

95

第 2 章ニンギョウタケ MeOH 抽出エキスからの meroterpene 類の探索

Fungal Material
Fruiting bodies of mushroom Albatrellus confluens were collected in Yamanashi Prefecture,
Japan, in September 2018. Species identification was confirmed by one of K. Koyama and avoucher specimen (AC-2018) was deposited at the Department of Pharmacognosy andPhytochemistry, Meiji Pharmaceutical University.

Extraction
Dried and ground fruiting bodies of mushroom A. confluens (436.0 g) were extracted two times
each with CHCl3, EtOAc and then MeOH at room temperature, and these extracts were evaluatedby Th-T assays. As a result of this assay, the MeOH extract showed Ab aggregation inhibitory
activity (Ab aggregation rate 51.8% at 10 µg/mL).

Th-T Assay
These schemes were the same as chapter 1.

96Isolation
The MeOH extract (30.7 g, 51.8%) was fractionated by Si. C. C. with CHCl3–MeOH–H2O(100:1:0.1, 75:1:0.1, 50:1:0.1, 25:1:0.1, 15:1:0.1, 10:1:0.1, 7.5:1:0.1, 5:1:0.1, 3:1:0.1, 6:4:1, 0:1:0)
to yield five fractions (Fr. A–E), and Fr. A–D showed Ab aggregation inhibitory activity at 10µg/mL (Fr. A: 2.8 g, 42.3%; Fr. B: 6.4 g, 41.0%; Fr. C: 3.0 g, 19.0%; Fr. D: 2.2 g, 54.9%; Fr. E:
7.1 g, 81.9%).
Fraction A (2.8 g, 42.3%) was subjected to Sephadex LH-20 C. C. with CHCl3–MeOH–H2O(6:4:1) to give four fractions (Fr. A1–A4). Fraction A3 (271.0 mg) was chromatographed on
Chromatorex COOH silica gel column with n-hexane–acetone (50:1, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1,
3:1, 0:1) to yield five fractions (Fr. A3-A–A3-E), 17 (36.1 mg) was isolated from Fr. A3-B.
Fraction A4 (2.4 g) was subjected to ODS C. C. with MeOH–H2O (7:3, 8:2, 9:1, 10:0) to afford
6 (2.1 g).
Fraction B (6.4 g, 41.0%) was subjected to Sephadex LH-20 C. C. with a solvent system
consisting of CHCl3–MeOH–H2O (6:4:1) to yield four fractions (Fr. B1–B4). Fraction B3 (1.7 g)
was dissolved with MeOH, and fraction B3-A (1.6 g), MeOH soluble part, was chromatographed
on Chromatorex COOH silica gel column with n-hexane–acetone (50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1,
3:1, 0:1) to afford six fractions (Fr. B3-A1–B3-A6). Fraction B3-A4 (99.4 mg) was separated by
ODS C. C. using a solvent system consisting of MeOH–H2O (7:3, 8:2, 9:1, 10:0) to give five
fractions (Fr. B3-A4-A–B3-A4-E). Fraction B3-A4-C (9.2 mg) was fractionated by preparative
HPLC eluted with CHCl3–MeOH–H2O (400:2:0.1) to obtain 15 (2.6 mg, tR 16.4 min) and 20 (0.5mg, tR 17.3 min). Fraction B3-A4-D (17.2 mg) was fractionated by preparative ODS HPLC eluted
with MeCN–H2O (9:1) to give 18 (8.1 mg, tR 20.1 min).

97

Fraction B4 (3.5 g) was chromatographed on Chromatorex COOH silica gel column with nhexane–acetone (15:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1, 0:1) to afford five fractions (Fr. B4-A–B4-E), oneof which was grifolin (Fr. A4-B, 869.2 mg). Fraction B4-D (2.0 g) was separated by ODS C. C.
using a solvent system consisting of MeOH–H2O (7:3, 8:2, 9:1, 10:0) to give five fractions (Fr.
B4-D1–B4-D5), 16 (1.1 g) was isolated from fraction B4-D4. Fraction B4-D2 (42.8 mg) was
subjected to preparative ODS HPLC eluted with MeCN–H2O (6:4) to obtain 11 (9.3 mg, tR 20.3
min). Fraction B4-D3 (546.2 mg) was fractionated by Si. C. C. with n-hexane–acetone (10:1, 7:1,
5:1, 3:1, 0:1) to afford 7 (22.3 mg).
Fraction C (3.0 g, 19.0%) was subjected to Sephadex LH-20 C. C. with CHCl3–MeOH–H2O(6:4:1) to yield four fractions (Fr. C1–C4). Fraction C3 (701.7 mg) was separated by ODS C. C.
using a solvent system consisting of MeOH–H2O (4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1, 10:0) to afford six
fractions (Fr. C3-A–C3-F). Fraction C3-D (50.2 mg) was fractionated by preparative
Chromatorex COOH HPLC eluted with CHCl3–MeOH–H2O (350:10:0.5) to obtain 19 (2.6 mg,
tR 15.0 min), 12 (4.2 mg, tR 16.2 min), 13 (1.7 mg, tR 18.2 min) and 14 (0.8 mg, tR 28.4 min).

The spectral data of novel meroterpenoids
11–15: colorless oil; 1H and 13C NMR see Table 8–12.

98

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115

謝辞
本研究の遂行にあたり, 指導教官として終始多大なご指導を賜った明治薬科大学 生
薬学研究室 小山清隆名誉教授, 高取 (木下) 薫教授に深謝いたします.
本論文の作成にあたり, 適切なご助言を賜りました主査の明治薬科大学 薬品製造化
学研究室 齋藤望教授, 副査の明治薬科大学 機能分子化学研究室 杉山重夫教授, 並びに明治薬科大学 微生物学研究室 松本靖彦准教授に深謝の意を表します. また, 初年度に在籍させていただき, 多くのご助言をいただいた明治薬科大学 薬品物理化学研究室
高波利克教授のご厚情にお礼申し上げます. 本研究を遂行するにあたりご指導いただ
いた明治薬科大学 生薬学研究室 佐々木寛朗講師, 城西大学 生物有機化学研究室 鎌内等助手に感謝の意を表します.
本研究を遂行するにあたり, 立体化学の検討のご指導をいただきました明治薬科大
学 薬品物理化学研究室 野地匡裕准教授, 並びに明治薬科大学 薬品物理化学研究室
林賢講師, 活性評価においてお力添えいただいた明治薬科大学 バイオインフォマティ
クス研究室 佐藤準一教授, 明治薬科大学 バイオインフォマティクス研究室 紀嘉浩准教授に感謝の意を表します.
本研究にご協力いただきました藤原恒司博士,

共に研究を行った平林歩修士, 橋本

拓実修士, 並びに古谷雅貴氏に感謝の意を表します. MS ならびに各種 NMR スペクトルを測定して頂きました本学機器分析センター, 小関珠美助教授, 山田聖子助手に感謝いたします.
そして，いつも励まし，支えて下さいました祖母，両親，本学生薬学研究室の皆様に感謝いたします.
令和 4 年 3 月
増田優紀

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