が ん 制 御 タ ン パ ク 質 PICT1 の リ ボ ソ ー ム 生 合 成 に お け る 機 能 解 析Functional Analysis of the Cancer-Associated Protein PICT1 inRibosome Biogenesis

平 成 31 年 度 入 学

宮 尾 宗 太 郎 (Miyao, Sotaro)

タンパク質合成装置であるリボソームの 細胞内形成は、細胞の生存や増殖にとって不可欠な生体プロセスである。リボソーム生合成は、 核小体において 200 種類以上の制御タンパク質が、厳密に秩序だった機能を果たしながら進行する。一般にリボソーム生合成は、増殖速度が活発ながん細胞において亢進が認められる。一方、この過程に異常が生じた細胞では、核小体ストレス応答が誘発され、がん抑制因子 p53 の活性化を介して細胞増殖の停止やアポトーシスが引き起こされる。
リボソームの形成過程においては、核小体で一次転写産物として生成した長鎖の rRNA 前駆体が、複数のヌクレアーゼによる作用を受けて段階的に成熟する。この RNA プロセシングの過程で主要な役割を果たすヌクレアーゼ複合体として、3-5エキソヌクレアーゼ活性を有する RNA エキソソームが知られている。RNA エキソソームは、2 個の触媒サブユニット（RRP6、DIS3）を含んだ合計 11 個のサブユニットから形成され、細胞内における様々な RNAの分解やプロセシングに機能している。また、核内で機能する RNA エキソソームに必須の補助因子として、RNA ヘリカーゼ MTR4 が存在する。MTR4には、さらに多様なコファクターやアダプターが結合し、これによって RNAエキソソームのヌクレアーゼ活性や基質選択性が制御されている。

近年、出芽酵母のリボソーム生合成因子 Nop53 が Mtr4-エキソソーム複合体と相互作用し、この複合体を rRNA 前駆体の特定部位に導くアダプターとして機能していることが報告された。1)。興味深いことに、Nop53 のヒトにおける相同分子は PICT1 と呼ばれる既知タンパク質であった。PICT1 は、核小体ストレス応答に関連した細胞増殖制御因子として知られ、臨床研究においては、がんの予後マーカーとして注目されている分子であった。しかし、ヒト細胞における PICT1 と MTR4 の機能的関連やリボソーム生合成における機能は不明である。そこで本研究では、PICT1 と MTR4-エキソソームの相互作用が、ヒト細胞のリボソーム生合成において果たす機能を解析し、rRNA 前駆体プロセシングと細胞増殖制御の接点において、PICT1 が果たす役割を解明することを目的とした。
1. ヒ ト PICT1 と MTR4-エ キ ソ ソ ー ム の 相 互 作 用 解 析は じ め に 、 ヒ ト 細 胞 に お い て 、 PICT1 とMTR4-エ キ ソ ソ ー ム と が 結 合 す る 可 能 性 について検証した。Flp-In T-REx-293 細胞において、FLAG タグを付加した MTR4 またはRRP6 を発現させ、共免疫沈降法による結合解析を行った。その結果、予想に従って、
FLAG-MTR4 （Fig. 1A）および FLAG-RRP6（Fig. 1B）が、内在性 PICT1 と結合すること

Figure 1. MTR4- エ キ ソ
ソ ー ム と PICT1 の 結 合 解 析が確認された。
2. ヒ ト PICT1 の リ ボ ソ ー ム サ ブ ユ ニ ッ ト 形 成 に お け る 役 割
酵母 Nop53 は、リボソーム生合成の過程で、rRNA 前駆体のプロセシングに機能するタンパク質である 1) 。そこで、ヒト細胞においても、PICT1 がリボソームサブユニット の形成に 機能してい る か 検 討 す る こ と に し た 。 Flp-In TREx-293 細胞において、siRNA を用いてPICT1 をノックダウンした後、ショ糖密度勾配遠心法により 分離した細胞質リボソームを、RNA の吸光度を指標に検出した（Fig. 2）。その結果、60S リボソーム

Figure 2. PICT1 の リ ボ ソ ー ム
サブユニット形成における役割の形成因子として知られる WDR74 のノックダウンと同様に、PICT1 のノックダウンにおいても 60S リボソームを示すピークの減少が認められた。このことから、ヒト細胞において、PICT1 が 60S リボソームの形成機構に関与していることが示唆された。
3.ヒ ト PICT1 の rRNA 前 駆 体 プ ロ セ シ ン グ に お け る 役 割Figure 3. PICT1 の rRNA 前 駆 体 プ ロ セ シ ン グ に お け る 役 割

リボソームを構成する 18S、5.8S および 28S rRNA は、長鎖前駆体 RNA（47S pre-rRNA）の部分配列としてはじめに転写される。47S pre-rRNA には 4 カ所のスペーサー領域（5’-ETS、ITS1、ITS2、3’ETS）が含まれるが、これらの領域は複数のヌクレアーゼの作用により段階的に切除され、成熟rRNA が形成される（Fig. 3A）。このようにして前駆体 RNA から形成された
rRNA のうち、5.8S および 28S rRNA は 60S サブユニットに、そして 18SrRNA は 40S サブユニットにそれぞれ組み込まれる。この一連の過程において、MTR4-エキソソームは、5-ETS (01-A0)フラグメントの分解、18S rRNA

の 3 末端形成、および 5.8S rRNA の 3末端形成の段階でそれぞれ機能している。また酵母では、5.8S rRNA の 3 末端形成段階へと Mtr4-エキソソームをリクルートするアダプターとして、Nop53 の機能が示されている 2) 。そこ
で、ヒト細胞の rRNA 前駆体プロセシングにおいて PICT1 の機能を検証するために、PICT1 をノックダウンし、rRNA 前駆体のスペーサー領域に特異的なプローブを用い、ノーザンブロッティング解析を行った（Fig. 3B）。その結果、PICT1 のノックダウンにより、5.8S rRNA 形成の直前の中間体である 12SRNA の蓄積が観察された。さらに予想外の結果として、12S 中間体よりも上流に位置する 32S 中間体 RNA にも蓄積が認められた。このこと から、ヒトPICT1 は、5.8S rRNA の形成に至る RNA プロセシング経路において、上流と下流の異なる 2 つの段階で機能していることが示唆された。
4. PICT1 の AIM 配 列 が MTR4 と の 結 合 お よ び rRNA 前 駆 体 プ ロ
セシングにおいて果たす機能

Figure 4. PICT1 の AIM 配 列 が MTR4 と の 結 合 お よ び rRNA 前 駆 体 プ ロ セ
シングにおいて果たす機能

酵母 Nop53 において、Mtr4 との相互作用に重要な共通配列として、AIM（Arch-Interacting-Motif）と呼ばれるアミノ酸配列が報告された
1) 。この配列は、ヒト PICT1 においてもよく保存されていた（Fig. 4A）。

そこで、ヒト PICT1 の AIM 配列にアミノ酸置換を導入した 3 種類の変異体（D90A、L86A/F87A、L86A/F87A/D90A）を作成した。これらの変異

型 PICT1 を Flp-In T-REx-293 細胞に発現させ、内在性 MTR4-エキソソームとの結合を共免疫沈降法により解析した（Fig. 4B）。その結果、PICT1 の AIM
配列変異は、MTR4 やエキソソーム構成タンパク質（RRP6、RRP4）との結合能に、著しい低下をもたらした。次に、これらの PICT1 変異体を HeLa 細胞にて一過的に発現させ、rRNA 前駆体プロセシングへの影響をノーザンブロッティングにより解析した（Fig. 4C）。その結果、これらの細胞では、PICT1のノックダウンと同様に、12S 中間体 RNA の蓄積が確認された。しかし、ノックダウンで見られた 32S 中間体 RNA の蓄積は認められなかった。そこ
で、内在性 PICT1 をノックダウンした細胞に、野生型または AIM 変異型のPICT1 をトランスフェクションし、ノックダウン 効果の回復について検討した（Fig. 4D）。その結果、PICT1 の AIM 配列変異体は、32S 中間体 RNA の蓄積を解消することはできたが、12S 中間体 RNA の蓄積は解消されなかった。これらの結果から、PICT1 が関与する 2 つのプロセシング過程のうち、AIM 配列と MTR4-エキソソームとの相互作用は、12S 中間体から 5.8S rRNAが形成する段階のみに必要であると考えられた。
5. PICT1 お よ び MTR4 の 核 小 体 ス ト レ ス 応 答 に お け る 役 割
PICT1 は、MDM2-p53 経路に依存した核小体ストレス応答機構において、制御因子の一つとして機能している。PICT1 の減少は核小体ストレス応答を促進し、p53 タンパク質の蓄積やアポトーシスを引き起こすことが知られている 2)。そこで、PICT1 の減少と同様に、MTR4 の減少が p53 タンパク質の蓄積を誘導するかを検討した。その結果、大腸がん由来 HCT116 細胞（Fig. 5）および骨肉Figure 5. PICT1 お よ び
MTR4 の ノ ッ ク ダ ウ ン に よ るが ん 抑 制 因 子 p53 へ の 影 響

腫由来 U2OS 細胞において、MTR4 または PICT1 をノックダウンした場合には、p53 の蓄積が認められた。しかし、RNA エキソソームの触媒サブユニットである RRP6 または DIS3 のノックダウンでは、そのような効果が認められなかった。以上の結果から、核小体ストレス応答における p53 経路の活性化は、RNA のプロセシング機能そのものではなく、PICT1 と MTR4 の物理的相互作用により制御されているのではないかと 考えられた。
総括
本研究では、ヒト細胞において PICT1 が AIM 配列依存的に MTR4-エキソソームと相互作用することを示した 3) 。また、この相互作用は、12S 中間体RNA が 5.8S rRNA へと成熟するプロセシングに重要であると考えられた。
また、PICT1 は 32S 中間体 RNA のプロセシングにも機能していたが、 この過程では AIM 配列の機能を必要としないことから、12S 中間体 RNA のプロセシングとは異なる機序で PICT1 が機能していると考えられた。また、ヒトなどの多細胞生物では、核小体ストレスによる細胞増殖の制御 機構において、
PICT1 と MTR4 の相互作用が p53 量の調節に関与していると考えられた。
このことは、MTR4-エキソソームと PICT1 の分子間相互作用が、がん治療の新たなターゲットになりうる可能性を示している。
《参考文献》
1 ) T h o m s T. , T h o m s o n E . , B a ß l e r J . , G n a d i g M . , G r i e s e l S . , H u r t
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2) Sasaki M., Kawahara K., Nishio M., Mimori K., Kogo R.,
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Biochem Biophys Res Commun ., 637, 203-209 (2022).