クライオ電子線トモグラフィー法を用いたシヌクレイノパチー病態機構の解明
In situ visualization of synucleinopathy-associated pathogenesis
by cryo-electron tomography
所属機関：東京都医学総合研究所 代表研究者氏名：樽谷 愛理
研究期間：2022 年 4 月 1 日～2023 年 3 月 31 日
滞在研究機関： Institute of Neuropathology, University Medical Center Göttingen
Göttingen, 37077, Germany
共同研究者等： Prof. Rubén Fernández-Busnadiego

Synucleinopathies are a subset of neurodegenerative diseases characterized by a-synuclein (a-syn) aggregates inneurons and/or glial cells. In Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies, a-syn accumulates in neuronal cellbodies and neurites as Lewy bodies and Lewy neurites, while in multiple system atrophy, a-syn is observed as glial
cytoplasmic inclusions in oligodendrocytes. Distribution and spreading of these a-syn pathologies have been reported to
be closely correlated with clinical symptoms. A possible mechanism to explain this intracerebral expansion of a-synpathology is prion-like propagation, in which a-syn aggregates self-amplify and spread in the brain. Although themolecular mechanism of prion-like propagation is poorly understood, numerous reports of experimental a-synaggregation and propagation in vitro and in vivo support this hypothesis. Recently, it has also been proposed that theclinicopathological diversity in synucleinopathies can be explained by the formation of structural polymorphisms of
a-syn aggregates. In this study, I performed in situ visualization of neurons differentiated from embryonic stem cells by
cryo-electron tomography and establishment of a-syn aggregation model in differentiated neurons to clarify themechanism of a-syn aggregation in different cell types.

研究目的

かにすることを目的として、胚性幹細胞から分化しアルツハイマー病やパーキンソン病等の神経変性た神経細胞及びオリゴデンドロサイトのクライオ電疾患患者脳では、疾患ごとに特徴的な異常型タンパ

子線トモグラフィー法による解析、及びこれらの細ク質病変が神経細胞やグリア細胞で観察される。異胞を用いたa-syn 凝集モデルの確立を行う。

常型タンパク質病変の脳内分布と広がりは臨床症状と強く相関することが示されている。異常型タンパ

研究経過

ク質がプリオンのように自己増殖し、細胞間伝播す

米国の共同研究先より供与された遺伝子改変型ヒるプリオン様伝播は、この病変拡大を説明するメカト胚性幹細胞(H9-NGN2 細胞, Fig. 1a)についてドキニズムとして提唱され、実験的に証明されている。

シサイクリン存在下における神経細胞誘導を行った。

さらに、異常型タンパク質病変を構成する病因タンNGN2 の過剰発現により、10 日前後で H9-NGN2 細パク質はアミロイド様線維に構造変化しており、そ胞が MAP2 陽性の神経細胞に分化することを確認しの構造多型が同一プロテイノパチー内の臨床病理学た(Fig. 1b)。まず、これらの分化した神経細胞をポリ的多様性に関与すると考えられる。本研究では、aオルニチン/ラミニンコーティングした Au もしくはシヌクレイン(a-syn)の蓄積を特徴とするシヌクレイシリコン(SiO2)メンブレングリッド上で培養した。数ノパチーの病態形成に寄与する細胞環境因子を明ら週間の培養後、SiO2 グリッド上においてより高い生

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - -リン酸化a-syn 陽性細胞は検出されなかった。
分化し- - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- -た神経細胞のイムノブロット及び質量分析により- - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - -a-syn 発現量がヒト脳に比べて低く、その発現量は分----------------------------------------

化開始から経時的に増加することが明らかとなった。

- - - - - - - - -- - - - - - - -- -- - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - -そこで分化から 30 日経過した神経細胞に線維化----------------------------------------

a-syn を添加し、リン酸化a-syn 陽性凝集体が形成さ----------------------------------------れるかを検討した。線維化a-syn の添加から 14 日で----------------------------------------

はリン酸化a-syn 陽性細胞は観察されなかったが、添-------------------------------------

加から 30 から 45 日後にリン酸化a-syn 陽性細胞が観---------------------------------------察された。しかしながら、凝集体を保持する細胞数が少なく観察標的としては不十分であることから、a-syn を一過性に発現させた神経細胞を用いて同様の実験を行った。GFP-a-syn を発現する神経細胞にFig. 1 Electron microscopy sample preparation using線維化a-syn を添加すると、添加から 4 日後にリン酸differentiated neurons from H9-NGN2 cells a. Image of化a-syn 陽性細胞が検出され、添加から 14 日後におH9-NGN2 before differentiation. Scale bar, 300 μm. b.

いても GFP シグナル及びリン酸化a-syn が検出されImageafterた。よって SiO2 グリッド上の神経細胞に GFP-a-syn

doxycycline-induced differentiation. Scale bar, 300 μm. c.

を発現させ、2 日後に線維化a-syn の添加を行った。

Culture of differentiated neurons on a SiO2 TEM grid.

線維化a-syn の添加から 14 日後のグリッドを凍結し、Scale bar, 50 μm. d. Lamella from differentiated neurons

クライオ蛍光顕微鏡を用いた観察を行った。その結by focused ion beam milling. Scale bar, 3 μm.

果、神経細胞体及び突起において、GFP 陽性のパン

ofdifferentiatedneurons

10daysクタが多数見られた。免疫組織染色により、これら存率が確認された(Fig. 1c)。よって神経細胞を培養しのパンクタがリン酸化a-syn 陽性であることが確認た SiO2 グリッドを Vitrobot により瞬間凍結した。さされた。よって今後は、これらの GFP 及びリン酸化らに、凍結グリッド上の神経細胞体を標的部位とし、a-syn 陽性パンクタを標的とした FIB 試料の作製及クライオ収束イオンビーム(FIB)走査型電子顕微鏡を用いたグリッド試料の加工を行った。これにびクライオ電子顕微鏡による連続傾斜像の撮影、よりクライオ電子線トモグラフィー観察に適した----------------------------------------

厚さである 100-200nm 程の FIB 試料を得た(Fig.
1d)。これらの FIB 試料の連続傾斜像(-45 度から---- ----------------------------------+45 度)はクライオ電子顕微鏡を用いて撮影され、----------------------------------------

得られた二次元像を基に三次元像(トモグラム)を再構築した。その結果、神経細胞を構成する主要------なオルガネラである核、ミトコンドリア、ゴルジ----------------------------------------体、リボソーム、微小管等が観察された(Fig. 2)。
次に H9-NGN2 細胞から分化した神経細胞におけ--------------------------- -----------

るa-syn 凝集をクライオ電顕トモグラフィー法によ----------------------------------------

り観察するために、a-syn 凝集モデルの確立を行った。

----------------------------------------

大量培養した大腸菌からリコンビナントヒト野生型------------------------------------------------------------------------------------------------------------ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - -及び変異型 A53Ta-syn を精製し、37 度における 5 日間の震盪により線維化a-syn を調製した。
これらを細胞内でa-syn 凝集を誘導するシードとし、分化開始後Fig.

2

Cryotomographicslices

obtainedfrom

14 日目の神経細胞へ添加した。しかしながら、線維differentiated neurons from H9-NGN2 cells. Scale bar,

化a-syn の添加から 14 日後の免疫組織染色において200 nm.

三次元再構築を行い、神経細胞内a-syn 凝集に寄与す

GFP-a-syn が凝集体を形成し、これらを標的としたるオルガネラ及び細胞内環境を明らかにする。さらFIB 試料作製によりa-syn 凝集体を可視化できるこに、オリゴデンドロサイトの株化細胞及び遺伝子改とを示唆する。
同様のパンクタが線維化a-syn の添加

変型ヒト胚性幹細胞から分化したオリゴデンドロサによりオリゴデンドロサイト内で形成される場合にイトを用いたa-syn 凝集モデルの確立を行い、神経細は、神経細胞とオリゴデンドロサイトにおける細胞胞とオリゴデンドロサイトにおける細胞環境の違い環境の比較が可能になり、細胞内で形成されたa-synがa-syn 凝集に与える影響について、比較検討を行う。

凝集体の構造学的、生化学的性質の違いを検討する。

考察

研究の発表

H9-NGN2 細胞から分化した神経細胞体から得ら

誌上発表れたトモグラムにおいて多数のオルガネラが確認さ

1.「クライオ電子線トモグラフィ法を用いた神経変れ、同様のアプローチが神経細胞内に蓄積するa-syn性 疾 患 の 病 態 解 明 」 樽 谷 愛 理 、 Rubén

凝集体及び細胞環境の観察に有用であることが示さ

Fernández-Busnadiego、 医学のあゆみ Vol. 283,れた。また GFP-a-syn が線維化a-syn の添加により2022. 12. 24

リン酸化a-syn 陽性のパンクタを形成したことは、