REVIEW（平成１９年度学術奨励賞受賞論文）

ゴナドトロピン刺激による Leydig 細胞の増殖を支える分子機構
白石 晃司
宇部興産中央病院泌尿器科といわれているが［５，６］，本稿では LH/hCG 刺激に伴はじめにう LH レセプターを介した Leydig 細胞の増殖機構につ
LH/hCG は Leydig 細胞においてテストステロン合成

いて概説する．

を促すリガンドとして中心的な役割を担う．LH/hCGの除去によりテストステロン合成の低下およびそれに関

LH/hCG は Leydig 細胞を増殖させる

与する細胞内小器官の減少や細胞の萎縮が生じ［１］，Leydig 細胞自体がアポトーシスにて消失する［２］こLH/hCG の投与により Leydig 細胞の分化増殖が促進とから，LH/hCG は Leydig 細胞の機能維持やその生存されることは以前より知られていたが［７，８］，LHに必須の分子である．思春期および成人において精子形

レセプターの活性化が Leydig 細胞の増殖に関与するこ成および男性化の維持に有効な血中テストステロン濃度とは LH レセプターの不活性変異により Leydig 細胞のを維持するためには，個々の Leydig 細胞による十分なhypoplasia をきたし，活性型変異により hyperplasia を分泌のみならず，その細胞数の絶対的増加が必要となる．

きたすことより明らかとなった［９］．さらに GnRH のしかし精巣内で分化増殖を活発に繰り返している細胞はノックアウトつまり LH の除去により Leydig 細胞数は圧倒的に精細管内の精細胞であり，in vivo では細胞内

１０％程度まで減少すると報告され［１０］，LH レセプター

増 殖 シ グ ナ ル の 代 表 で あ る extracellular signal regu-のノックアウトにより Leydig 細胞の hypoplasia を生じ

lated kinase（ERK）の活性化も主に精細胞に認められ，ることも確認されている［１１，１２］．また報告例は少な

分化増殖を行う Leydig や Sertoli 細胞の割合は比較的少いものの，リガンドである LHβサブユニットの構造異ないため［３］，増殖という観点からの Leydig 細胞の研常を認めた患者の精巣生検像でも Leydig 細胞の十分な究については未解明な点が多い．

５］ことから，LH レセプター
増殖は認められない［１３―１Hardy らはラット Leydig 細胞の成熟段階を progeni-からのシグナルが Leydig 細胞の増殖に重要な役割を担

tor, immature, mature に分類し［４］，以後 primary cul-

うことがわかってきた．ラット Leydig 細胞 primary cul-

ture を用いた増殖因子や細胞動態的研究が盛んに行われture（以下ラット Leydig 細胞）において hCG 刺激にてるようになった．また in vivo の研究については Leydig［３H］チミジンアッセイにて ERK 依存性に細胞増殖が生細胞の由来は何か，胎生期から大人にいたる発達過程の９］．また immature
じる［１
６―１

どの時期に分化増殖が生じるのかなどを調べるべく eth-

り未分化な progenitor

ane―１，２―dimethyl

sulphonate（EDS）投与や下垂体摘Leydig 細胞に比べ，よLeydig 細胞の方が増殖活性が高

い［１
６］
．

除ラットなどを用いた細胞動態的研究が散見されるが，増殖にいたる細胞内シグナル伝達に関する研究は非常に

LH/hCG による Ras および ERK の活性化

少ない．FSH, Leukemia inhibitory factor（LIF）, inter（IL―６）, platelet-derived growth factor（PDGF），
leukin―６

Mitogen activated protein kinase （MAPK）の代表，transKit ligand, insulin-like growth factor―１（IGF―１）的分子である ERK（それぞれ分子量４４および４２kDa の

forming growth factorα（TGFα），TGFβ, androgen, thy-

ERK１と ERK２）は哺乳類のほとんどすべての細胞に恒roid hormone などが Leydig 細胞の分化増殖に関与する

常的に発現しており，さまざまな growth factor の刺激により細胞増殖にかかわる分子として，もっとも研究さ

連絡先：白石晃司，山口大学大学院医学系研究科泌尿器科学
分野
〒７
５
５―８
５
０
５ 山口県宇部市南小串１―１―１
TEL :０
８
３
６―２
２―２
２
７
５
FAX :０
８
３
６―２
２―２
２
７
６
E-mail : sirakkkay@aol.com

れている．多くの細胞で は ERK は epidermal

growthfactor（EGF）レセプターに代表されるチロシンキナー
ゼ型レセプター（receptor tyrosine kinase；RTK）の下流で活性化され，細胞質内または核内でその下流の分子

日本生殖内分泌学会雑誌（2008）13 : 9-15

9

白石

晃司

に作用する．基本的にはリン酸化されたチロシンがいく

GPCR と共役した G タンパクとは別の分子ファミリー

つかのアダプター分子や酵素と SH２および SH３ドメイとして Rap,ンを介してドッキングする（Shc―Grb２―Sos 複合体など）

small G タンパクに分類される．GTP アーゼによる翻訳

（図１）
［２
０］
．G タンパク共役型レセプター（G protein

後脂質修飾の違いにより H―, K―, N―Ras などのアイソ

receptor；GPCR）刺激による ERK の活性化

フォームが存在するが，われわれはマウスおよびラットについてはβ２アドレナリンレセプターなどを中心に研Leydig 細胞においてタンパクレベルでは K―および N―

究が進められ，LH レセプターについても顆粒膜細胞のRas の存在を確認した．また Ras のドミナントネガティ

cell line［２１］および primary culture［２
２，２
３］
，また

ブ変異体の overexpression により ERK の活性化が抑制

Leydig 細胞の cell line［２０，２４］および primary culture

０細胞にて報告されている［２４］．
されることは，MA―１―coupled

Rho,

Rab,

Ran および Arf などとともに［１６，２５］にて ERK が活性化されることが報告されている．Rasの活性化に続きMAPK kinase kinase（MAPKKK）

LH レセプターから Ras の活性化へである Raf，MAPK kinase（MAPKK）である MEK，そして ERK の活性化へとカスケードが進む（図２）．Ras

Ras 活性化に伴う ERK 活性化へのカスケードは癌細も 広 義 に は G タ ン パ ク と 称 さ れ る が７回 膜 貫 通 型

胞のみならず正常細胞においても普遍的に保存されている細胞増殖に関する主なシグナル経路である．Ras のア
イソフォームに関係なく不活性型 Ras である GDP 結合型を活性型である GTP 結合型へ変換するのが Ras グア
ニンヌクレオチド交換因子（Ras guanine nucleotide exchange

factors；RasGEFs）で，その逆の負の調節因子

が Ras GTP アーゼ活性化タンパク（Ras GTPase activating proteins；RasGAPs）である［２
６，２
７］
（図３）
．LH/
hCG 刺激により EGF レセプターへのトランス活性化が生 じ る が，そ の 際 の RasGEFs の１つ に Sos（son―of―
sevenless） が含まれることは容易に理解できるが ［２０］（図２，３），LH/hCG 刺激による内因性の経路による Rasの活性化が RasGEFs の活性化によるものか RasGAPs の
図１

図２

10

０細胞における hCG または EGF 刺激による Shc のリン酸化
MA―１
（活性化）
（A）および Shc/（Grb２）/Sos complex の形成（B）．IB :immunoblot, IP : immunoprecipitation．
（文献２０より改変）．

不活性化によるものかは不明である．代表的な RasGEFs

LH/hCG 刺激による Ras―ERK の活性化経路：関与が証明された経路，：考えられうるが介在する分子が不明であったり Leydig 細胞では証明されていない経路．

図３

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.13 2008

である Ras―GRFs および Ras―GRPs はタンパクレベルで

Ras 活性を調節する Ras―guanine nucleotide exchange factors．
（Ras―GEFs）と Ras―GTPase activating proteins（Ras―GAPs）
下線はラットおよびマウス Leydig 細胞において存在が確認されている分子．

ゴナドトロピン刺激による Leydig 細胞の増殖を支える分子機構

は Leydig 細胞では確認されておらず，RasGAPs の１つである GAP１IP４BP は MA―１０およびラット Leyidg 細胞でその存在を確認できたが LH/hCG 刺激や細胞増殖との関連は認められなかった．Gαs/adenylyl

cyclase/cAMP 経

０における内因性の Ras および ERK の活性化
路が MA―１にもっとも関与する［２４］（図２）．細胞内 cAMP 上昇に引き続く Ras―ERK の活性化は非常に複雑であり，細胞およびリガンド特異的である［２８］が，一般的には PKA
経路と cAMP によって直接活性化されるグアニンヌク
レ オ チ ド 交 換 因 子 で あ る Epac（exchange protein di-

図４

MA―１
０細胞における GAP１m wild―type（GAP１mWT）または GAP１m
double mutant（R３７
９C, R６２
９C）（GAP１mmutant）の overexpression
による Ras および ERK 活性への影響．Ras 活性は GST―Raf１を用いた K―Ras の pull―down assay, ERK 活性 は anti―phospho―
ERK１/２による immunoblot を行った．
WT : wild type, mutant : R３７
９C, R６２
９C double mutant

図５

hCG 刺 激 に よ る GAP１m の translocation. GFP―GAP１mwild―type７
９C, R６２
９C）（GAP１mWT）または GFP―GAP１mdouble mutant（R３０細胞に overexpresion．
（GAP１mmutant）を MA―１
矢印：細胞膜，矢頭：ゴルジ体

rectly activated by cAMP）経路が重要な役割を果たす
０］（図２）．活 性 化 さ れ た Epac が Ras と は 別 の［２
８―３
small G タンパクである Rap１を活性化することは有名
であり，Rap１も Ras と共通のエフェクターをもつことが多く，その活性化も細胞の分化増殖などの重要な生理０細胞およびラット作用に関与する．われわれは MA―１
Leydig 細胞において Rap１が活性化されることをその下流のエフェク タ ー で あ る RalGDS を 用 い た pull―down
アッセイにて確認しているが，Epac 経路を選択的に活
９］では活性化されない性化する８CPT―２Me―cAMP［２ことより，Leydig 細胞において Rap１の活性化が Epac
経路であるかどうかは不明である（図２）．また Epac０およびラット Leydig 細胞においてタンの存在は MA―１
パクレベルで確認しているが，同様に８CPT―２Me―cAMPによる刺激において ERK の活性化も認めらず［１６，２４］，Epac の overexpression にても Ras および ERK の活性は影響されないため，Leydig 細胞における cAMP―Epac 経路の存在は不明である．
mLeydig 細胞における Ras 活性を制御する GAP１GAP１m は RasGAP の１つ で あ り，inositol１, ３, ４, ５―
tetrakisphosphate（IP４）に結合し，EGF による刺激で PI
３ kinase 依 存 的 に 膜 移 行 す る こ と が 知 ら れ て い る

活性化された Ras の過活動を制御している可能性があ

０細胞およびラット Leydig 細胞におい
［３
１，３
２］
．MA―１

る．この translocation も PKA 依存性であり（図５），LH

０細胞に GAPて内因性の GAP１m の発現を認めた．MA―１/hCG 刺激による Gαs/adenylylmcyclase/cAMP 経路の活１ 野生型を overexpression したところ hCG 刺激に伴う性化により Ras の活性化と不活性化が同時に生じ，巧Ras および ERK の活性化は抑制され，IP４に結合できな

妙にその活性化が制御されていることが示唆された．ない変異体（R３
７９C,

R６
２９C）を作成し overexpression しお，Ras の活性化については cAMP を介する内因性の経たところ逆に Ras および ERK の活性化の亢進を認めた路以外に以下に述べるトランス活性化の関与も重要であ０細 胞 に お い て Ras（図４）．す な わ ち GAP１m は MA―１

る．

m

GAP として作用していると考えられた．一方で，GAP１

が hCG 刺激（EGF 刺激でも同様）に伴い Ras が活性化

Src とその活性化される場所である形質膜（H―, K―Ras）やゴルジ体（N―Ras）に translocation す る こ と か ら（図５），GAP１m は非受容体型チロシンキナーゼは細胞の増殖，分化およ

REVIEW

11

白石

晃司

びアポトーシスにおけるシグナル伝達において重要で，ず恒常的に発現している不活性な増殖因子前駆体がメタなかでも Src family kinases（SFKs）はその代表である．

ロプロテアーゼにより切断され細胞外へ遊離する結果とゴナドトロピン刺激により卵巣での Src 活性は亢進し，して生じる［３９］（図２）．このようなトランス活性化に

Src ノックアウト雌マウスは卵胞発育不全と排卵障害をより１つの刺激によるシグナル伝達系の範囲は大幅に広きたし不妊となる［３３］．また Src は FSH 刺激に伴うラッがり，きわめて多様な刺激に応答することが可能となる．

ト granulosa 細胞の分化において中心的な役割を担う

EGF―like growth factor のみならずチロシンキナーゼ型［３４］．Src, Lck, Fyn, Lyn および Yes が含まれ，N 末端

レセプターのリガンドであるインスリン，IGF―１，VEGF，のユニークドメインに続き共通した SH２，SH３といった

PDGF レセプターなどは，β２―アドレナリン，μ―オピオ

タンパク複合体の形成に重要なドメインとキナーゼドメ

イドレセプターなどもトランス活性化に関与しているこ

インを有する．Leydig 細胞には Src［３５，３６］，Fyn おとが報告されている［４１］．われわれは hCG/LH 刺激に

よび Yes［３７］がタンパクレベルで確認されている．MA

対する ERK の活性化においてトランス活性化が存在す―１０細胞に Fyn の活性変異型でなく野生型を overexpres-

るか否かを確認するため，Pierce らの方法を改良し［４０］sion し た だ け で Ras お よ び ERK の 活 性 化 を 認 め た

異なる Leydig 細胞を培養する co―culture の実験系を確［２０］．そのように Src は細胞増殖と関連が深く，Leydig

立した［４
２］
（図６）
．LH レセプターをもつ MA―１０細胞

細胞においても Ras の上流で機能していることは報告

０細胞（いずれもマウス由来の Leydig cellともたない I―１

されていたが［２０，３５］，EGF 刺激よりもむしろ LH/hCGline）を同じプレート上で培養し同時に hCG 刺激を行

０細胞では Fyn）の活性刺激においては強い Src（MA―１

うと，LHR をもたない I―１０での細胞内でのイベントは化を認めた［３７］．さらに Src のインヒビターである PP２０細胞からの何らかの juxtacrine または autocrine
MA―１

やドミナントネガティブ Fyn にて LH/hCG による ERK作用によるものと考えられる．それぞれ異なる分子量のの活性化は強く阻害されるのに対し，EGF 刺激によるタグをつけた ERK（myc―ERK および GFP―ERK）を発ERK の活性化は影響を受けなかったことより［１
６，２
０］
，

現させることにより ERK の活性化がどちらの細胞由来

Leydig 細胞における Src（Fyn）は LH/hCG による内因０細胞に EGFR を発現するこであるかを区別できる．I―１

性つまり cAMP―PKA を介するシグナル伝達系および以とによりその ERK 活性は増強し，EGFR のインヒビター

下に述べるトランス活性化において重要であることが示である AG１４
７８や，I―１０細胞にドミナントネガティブ Shc

唆された．cAMP―PKA―Csk 経路がさまざまな細胞におを overexpression することにより強力にその活性が阻

いて Src を活性化する経路として報告されているが，MA

０細 胞 か ら の害されることから，ドナーであ る MA―１―１０およびラット Leydig 細胞においては証明できなかっ

EGF―like growth factor の放出が考えられた．さらに単た．LH/hCG による Gp/１１の活性化が Src（Fyn）の活

０細胞の EGFR をノックダウ
培養で siRNA により MA―１性化に関与しているが［３７］（図２），その活性化にいた

ンした状態で hCG 刺激を行うと ERK の活性は７０％程度

る詳しい経路や Src（Fyn）が Ras を活性化する機序にまで抑制されたことより，LH レセプターからの EGF

ついては，Leydig 細胞においては不明である．

レセプターへのトランス活性化の存在が示唆された．このトランス活性化にも Src が重要な役割を果たしている

GPCR と RTK の cross―talk：トランス活性化
トランス活性化は，GPCR から RTK へまたは RTK から GPCR へのシグナルが Ras―ERK 経路などを活性化させるための別の切り替え過程であり［３
８，３
９］
，この細
胞外を経由するという斬新なシグナル伝達系についての研究が autocrine/paracrine のみならず癌の増殖などの研究に貢献してきたことは明らかである．GPCR の刺激により主に Gβ/γ および Gi/o の活性化され細胞膜に結合した前駆体からの EGF―like growth factor の遊離が引き起こされ（図２），その結果，RTK へのトランス活性０］．この現象は，化が生じることが知られている［３８―４一般的には転写翻訳を介した新規なタンパク合成は伴わ

12日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.13 2008

図６

Co―culture の模式図（文献４２より引用）

ゴナドトロピン刺激による Leydig 細胞の増殖を支える分子機構

ことが知られている［４３］．ドミナントネガティブ Fyn
を MA―１０細胞に発現させた場合は I―１０細胞の ERK 活性０細胞に発現させた場合はそが抑制されるのに対し，I―１の ERK 活性に影響を与えなかったことより，Leydig 細胞においても Src のトランス活性化における関与が示された．
図７

まとめ，展望以上より LH レセプターの活性化がゴナドトロピンに

hCG 投与（１００単位皮下注射後２時間）による in vivo でのラット（３５週齢）Leydig 細胞における ERK の活性化（免疫染色）．
矢印：リン酸化 ERK 抗体陽性の Leydig 細胞．連続切片にてこれ
らの細胞が３beta―hydroxysteroid dehydrogenase 陽性であることを確認した．

よる Leydig 細胞の増殖に重要であることは明らかであるが，その複雑なシグナリング経路は解明され始めたば

た，EGF―like growth factor

以外にも hCG 投与にてかりである．これら in vitro の実験では serum starva-

Leydig 細胞を介した IL―１などの炎症性サイトカインのtion を半日行った後に hCG にて刺激を行うが，実際 in分泌が生じ［４７］，co―culture 系でもレシピエント細胞

vivo では血中 LH 値は数十分間隔でのパルス状の変動を０細胞に EGF レセプターを発現させなくてもである I―１

認め，その絶対値にも日内変動が存在する．しかし低容ERK の活性化はわずかに認められることから，EGF―like

量の hCG/LH の存在下で培養し同様に hCG 刺激を行っ

growth factor 以外の因子の分泌も予想される．hCG/LHて も 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た．３
５週 齢 Sprague―Dawley

刺激により Leydig 細胞からさまざまな細胞の増殖分化

ラットに hCG１００単位を皮下注射すると，２時間から１２にかかわる因子の分泌が生じ，Sertoli 細胞や精細胞へ時間にかけて Leydig 細胞に ERK の活性化が認められた作用しうると考えられる． hCG の投与量， タイミング，（図７）．Leydig 細胞の細胞動態は germ cell ほど顕著で間隔などの検討により，以前は無効といわれた男性不妊はないが，LH のパルス状分泌や日内変動により ERK症に対する hCG を用いた治療も，単独または他の薬剤の活性化および引き続いて生じる細胞分裂や増殖因子のなどとの組み合わせおよび対象患者の選択により，十分分泌を常に繰り返し，以上述べてきたような細胞内のイに再検討される余地はあると考えられる．LH の構造異ベントやトランス活性化は実際に in vivo でも生じてい常［４８］や LH 分泌に伴う LH レセプターの発現パターる考えられる．トランス活性化については当初 Leydig

ンなどの分子生物学的機序も明らかにされつつあり

細胞の増殖における juxtacrine/autocrine という観点か［９，４
９］，hCG/FSH の自己注射が可能となりホルモンら研究を進めたが in vivo では当然精巣内の他の細胞に療法に対するコンプライアンスが改善した現在［５０］，も paracrine/endocrine 的 に 作 用 し う る．EGF―like

性腺機能低下症や男性更年期のみならず Leydig 細胞を

growth中心とした男性不妊症治療の今後の展開が期待される．

factor の分泌は造精機能の発現維持において非常に重要である．これらは EGF, heparin―binding EGF,
TGFα, amphiregulinm, betacellulin および epiregulin と謝

辞ともにファミリーをなし，共通のレセプターに作用する．

執筆の機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理EGF, TGFαおよび amphiregulin の triple null mutation

事長，武谷雄二教授ならびに広報理事，峯岸 敬教授に御礼をきたしたマウスにおいても造精機能は温存されていた申し上げます．またヒトおよびラットを用いた研究の機会をことより［４４］，細胞の生存増殖に必須の因子は機能的与えてくださいました内藤克輔教授（山口大），ならびに inに重複した分子の存在により，さまざまなストレスに対

vitro での実験の機会を与えてくださいました Mario Ascoli

する傷害を免れていると考えられる［４５］．hCG を含め教授（University of Iowa）に感謝いたします．

さまざまな刺激により何が分泌されるかということにつ０およびラット Leydig 細いては研究中であるが，MA―１

引用文献

胞では RT―PCR にて，これらすべての EGF―like growth
factor の発現を認めた．一方，精巣を構成するすべての細胞に EGF が overexpression された場合にはむしろ造精機能は低下することから［４６］，その発現の局在，量およびタイミングについては今後の検討課題である．ま１．Wing TY, Ewing LL, Zirkin BR（１９８４）Effects of luteinizing
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