質の高いゲノム編集マウス作製を支援する KOnezumi、DAJIN の開発
久野朗広

筑波大学

はじめに解剖学発生学研究室インを自動化するWebツールであるデザインに関して、具体的な課

CRISPR-Cas9システムは、遺伝り、質の高いゲノム編集実験の設題として以下の3つが挙げられる。

子改変の歴史において画期的な変計をサポートする。また、
DAJINは、1. 目的の遺伝子ノックアウトを得革をもたらした。実験動物学領域

ロングリードシークエンサーを使るために切断もしくは切除するにおいても例外ではなく、高度に発用して、高精度な遺伝型解析を行うべきエクソンの選定、2. 切断対象達した胚操作技術と組み合わされためのツールである。目的のゲノムのゲノム領域のための最適なガイた結果、従来では考えられないほど編集動物を得るためのツールとしドRNAの設計、3. 作製されたノッ

迅速かつ簡便にゲノム編集動物をてKOnezumiおよびDAJINを活用すクアウトマウスの遺伝型を確認す作製することが可能となった。

ることで、ゲノム編集動物を用いたるためのジェノタイピングプライ研究の質を担保することができるマーの設計、である。これらを正と期待している。

確にデザインすることは、ノック新たなゲノム編集技術の開発ならびにゲノム編集効率の向上とアウトの信頼性の保証、ならびにいった分野において、日本からも多くの独自の研究成果が報告されKOnezumi：簡便かつ信頼性の産出したノックアウトマウスのている。しかし、この記事の主な高いノックアウトデザインを提供

遺伝型解析に欠かせない。これま焦点は、ゲノム編集技術を適用すするWebツールでに、これらの課題に対して多くる「前後」の過程にある。ゲノム

遺伝子ノックアウトマウスは、のソフトウェアやウェブツールが編集を行う「前」には、目的の編生体内での特定遺伝子の機能調査開発されているが、3つの事項すべ集結果を得るための質の高いゲノに用いられる基盤的なツールであてを勘案するためには、それぞれム編集デザインの計画が必要となる。現在ではCRISPR-Cas9システのツールを個別に使用する必要がる。また、ゲノム編集の「後」には、ムがその簡便さと汎用性の広さにあった。さらに、一部のツールは作製された動物が想定された通りより、ノックアウトマウスの生成

高度なプログラムスキルを要求すの遺伝子変異を持っているかどうにおける一般的な手法として位置るため、そもそも利用が難しいもかの確認として、遺伝型解析が行づけられている。CRISPR-Cas9をのもあった。そのため、ノックアわれる。

筆頭とするゲノム編集技術の進展

ウトを誘導する信頼性の高いデザ

これらゲノム編集の「前後」のによって、これまでノックアウトインの実現は困難であった。

過程は、多くの課題と困難があマウスの作製経験がなかった研究る。ゲノム編集技術自体が持つ固者・技術者がこの分野に参入するノックアウトデザインの全自動作有の問題点に対応するため、研究ハードルが下がったと言える。し製ツール「KOnezumi」の開発者は常に新しいアプローチを模索

かし、特定の遺伝子をノックアウ

筑波大学動物資源センターは、している。このような背景の中で、トするための適切なゲノム編集戦

これらの課題を解決するための

本稿では私たちが開発している略を考えることは、依然として遺WebサービスKOnezumiを公開しツール、「KOnezumi」（Kuno et al.,

伝子工学に詳しい専門家の知識やている（https://www.md.tsukuba.

2019）および「DAJIN」（Kuno et

経験が必要とされており、これがac.jp/LabAnimalResCNT/al., 2022）を紹介したい。

ノックアウトマウス作製の大きな

KOanimals/konezumi.html）（図1）。

障壁となっていた。

KOnezumiのとくに注目すべき特KOnezumiは、ノックアウトマウ
ス作製に特化したゲノム編集デザ
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ノックアウトマウス作製におけ徴は、その利用の簡便さとノック質の高いゲノム編集マウス作製を支援するKOnezumi、DAJINの開発

両端を切除するノックアウト方法

遺伝型解析技術

まず、KOnezumiの使用方法はにおいて極めて重要である。ジェ

CRISPR-Cas9による「意図しな非常に簡単である。利用者は上記

ノタイピングプライマーに関しい変異」の導入のサイトにアクセスをし、興味のては、電気泳動のバンドサイズに筑波大学生命科学動物資源センある遺伝子名（複数遺伝子可）を基づき、ホモとヘテロを区別する

ターでは年間約150の遺伝子改変入力するだけで、残りの作業はすための3種類のプライマー情報がマウス系統を作製しており、そのべてKOnezumiが自動で行う。ゲ提供されている。また、エクソン多くをCRISPR-Cas9によるマウス

ノムブラウザからの配列取得、ガ除去後のmRNA配列が提示され、受精卵に対するゲノム編集によっイドRNAの設計、ジェノタイピン

ナンセンスコドン介在的mRNAて行っている。しかし近年、標的グプライマーの設計といった煩雑分解（nonsense mediated mRNA

ゲノム領域におけるCas9のDNAな手順を、利用者が個別に実行すdecay：NMD）によって分解され二本鎖切断の修復過程によってる必要はない。これがKOnezumiる可能性があるのかを確認するこ「意図しない変異」が誘導されるのもっとも大きな特徴である。とができる。

場合が相次いで報告されているアウトの信頼性の高さにある。

もう一つの特徴は、信頼性の高KOnezumiは、ノックアウトマ（Kosicki et al., 2018など）。実際に、いノックアウト戦略を提供する点ウスを高い信頼性で作製するため著者らは当施設で作製されたゲノにある。遺伝子ノックアウトの方の実用的な選択肢となる。2023年

ム編集マウスのゲノム解析に取り法には多くのバリエーションが10月現在、公開開始の2018年から組む中で、ゲノム編集によって生存在するが、KOnezumiはとくに累計で3万回のご利用を頂いていじる「意図しない変異」が想像をノックアウトの確実性を重視しる。現在は約1万2000遺伝子に対応超える頻度で検出されることに気て、標的エクソンの両端を切断すしているが、今後、ノックアウトがついた。標的ゲノム領域においる戦略を採用している。そして、デザインの構築が可能なすべてのてデザイン通りの編集が施された「どのエクソンを標的とするか」と遺伝子をカバーする予定である。

マウスは、実際には10匹中1～3匹いう重要な判断基準についても、もし利用者の興味のある遺伝子が程度であり、その他は何らかの「意国際マウス表現型解析コンソーシ

現状対応していない場合でも、ほ図しない変異」を持っていた。こアム（IMPC）の公開情報をベース

かに興味のある遺伝子についての「意図しない変異」は小さい挿入・に最適な選択を行っている。これ

KOnezumiのレポートを参照する

欠失もあれば、1 kbを超える大型により、任意のエクソンを選択すことで、ノックアウトデザインのの変異も生じていた。そして従来るよりも信頼性の高いノックアウ構築における勘所がつかめるのでの遺伝型解析技術である電気泳動トが期待できる。

はないかと考えている。

法、サンガーシークエンサー、次世代シーケンサーでは、このようなKOnezumiのレポート
レポートの結果は5つのカテゴ

DAJIN：ナノポアロングリード

大小さまざまな「意図しない変異」

シークエンサーを用いた高精度なを見落とし、遺伝型を誤判定するリーに分かれており、それぞれ遺伝子情報やノックアウト戦略の概要、gRNAの候補一覧、ジェノタイ
ピングプライマーの候補一覧、切断されるエクソンの配列、そして切断後のmRNA配列が詳細に記載されている。
とくに実務上有用なのは、ジェノタイピングプライマーの候補一覧と切断後のmRNA配列である。これらの情報は、エクソンのLABIO 21 JAN. 202423

リスクが避けられなかった。のエラー率を勘案しつつ、正確に今後の展望

アレルを分類できる機械学習モデ

著者らの研究においては、論文「意図しない変異」を捉えるためルを組んだ。これによって1塩基出版がゴールではなく、実際に利のロングリードシークエンサーの変異から構造多型までのアレルの用されることが重要となる。その活用網羅的な検出が可能となった。ナ点で、KOnezumiのように誰もが上述のとおり、ゲノム編集にノポアシークエンサーのリード利用できるWebツールは目的を満よって生じた「意図しない変異」を、アレルごとに分類するこの機たしている。一方で、KOnezumiのはランダムに起こり、かつ、その械学習モデルを、アレルを一網「打対象となる遺伝子数はおよそマウ影響の範囲は一塩基置換から構造尽」に検出することからDAJINとス全遺伝子数のおよそ半分程度多型までまったく予想ができな名付けた（図2）。

であり、その増加が望まれていることや、エンハンサー領域のアノい。そこで著者らはこれらの変異を網羅的に捉えるために、ロング多サンプル処理が可能とする実用テーションを勘案する、といったリードシークエンサーを活用する例

ゲノム編集デザインにおける最新ことを考えた。ロングリードシー

DAJINはDNA抽出およびPCRの知見を取り込めていない。さらクエンサーには代表的なものとしができればあとはナノポアシーに、マウス以外の生物種に対しててナノポアシークエンサーおよびクエンサーにかけるだけであり、もKOnezumiのアプローチを拡張

PacBioがあるが、導入コストが低結果は1日程度で完了する。また、してほしいという要望もある。こいナノポアシークエンサーを用いPCRによるDNAバーコード付与れらの更新を行うことが今後の課ることとした。ナノポアシークエによって一回のシークエンスにお題である。

ンサーは、DNAを一分子ずつ小さいて100匹程度の遺伝型解析が可一 方 DAJ I N に お い て は 、な穴（ナノポア）に通し、各塩基能であり、およそ1匹あたり1,000KOnezumiと異なり、現状では利が通過するときの電流変化を検円程度のコストとなる。そのため、用が簡単ではないという点が最大知してDNAの塩基配列を解読す

短時間かつコストパフォーマンスの欠点である。深層学習を用いてるシークエンサーである。著者らに優れたハイスループットスクいることから、使用できるPCはは複数個体にバーコードするためリーニングが可能であると考えて基本的にグラフィックボードを搭に、まずPCRアンプリコンを作製いる。実際に著者らはDAJINを用載したものに限られ、OSもLinuxし、これに対してナノポアシークいて近交系マウス8系統のHr遺伝が前提である。そのため、PCに慣エンサーを用いることで、およそ子ノックアウトマウスの遺伝型解れた利用者しか導入することがで10 kbまでの標的ゲノム領域にお析に取り組み、2回のシークエンスきない、という点で改善の必要がいて1塩基解像度で遺伝型を決定で116匹分の遺伝型解析を3日程度ある。著者らはDAJINをより簡単することができるようになる。

で完了することができた（Tamariに、より汎用的なPCにインストー

et al., 2023）。ナノポアシークエン

ルできるように、深層学習ではな深層学習を組み合わせた遺伝型解サーとDAJINの組み合わせによっいアルゴリズムでアレルを分類す析技術「DAJIN」の開発て、従来では現実的に不可能なほる、
DAJIN2の開発に取り組んでいナノポアシークエンサーによっどの時間と労力が必要であったる（https://github.com/akikuno/て広範囲なゲノム領域の配列を解ワークフローが現実のものとなっ

DAJIN2）。DAJIN2は手持ちのラッ読できるようになった一方で、ナている。

プトップに簡単にインストールすノポアシークエンサーは塩基決定において誤りが多いという欠点があった。そこで著者らはナノポアシークエンサーのシミュレーショ
ンリードを教師とした深層学習を用いて、ナノポアシークエンサー

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質の高いゲノム編集マウス作製を支援するKOnezumi、DAJINの開発ることができ、最新のナノポアフAnalysis（Nakamae & Bono, 2023）

ローセルR10.4にも対応している。

といった独創的なツールが報告さ今後、ナノポアシークエンサーをれている。このようなゲノム編集含めたロングリードシークエン実験をサポートするツールを組みサーの普及が加速することを勘案合わせることで、貴重な動物資源し、DAJIN2も一層その利用価値をを有効に活用しつつ、より精密で高めていきたい所存である。

質の高い研究を行う一助となれば幸いである。

おわりに
本稿では著者らが開発に携わる「KOnezumi」および「DAJIN」を紹介した。一方で、本邦においてゲノム編集技術に関する研究は非常に活発に行われており、バイオインフォマティクスを活用した報告も多くなされている。有名なところではガイドRNAの配列特異性をレポートするCRISPR-Direct（Naito et al., 2015）や、最近ではゲノム編集後に起こりうる意図しない表現型を予測するDANGER

引用文献
Kosicki, M., Tomberg, K., & Bradley, A.
(2018). Repair of double-strand breaks
induced by CRISPR-Cas9 leads to large
deletions and complex rearrangements.
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Kuno, A., Ikeda, Y., Ayabe, S., Kato, K.,
Sakamoto, K., Suzuki, S. R., Morimoto, K.,
Wakimoto, A., Mikami, N., Ishida, M., Iki,
N., Hamada, Y., Takemura, M., Daitoku,Y., Tanimoto, Y., Dinh, T. T. H., Murata,K., Hamada, M., Muratani, M., … Mizuno,S. (2022). DAJIN enables multiplex
genotyping to simultaneously validate
intended and unintended target genome
editing outcomes. PLoS Biology, 20 (1),e3001507.

Kuno, A., Mizuno, S., & Takahashi, S.
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Naito, Y., Hino, K., Bono, H., & Ui-Tei,
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Nakamae, K., & Bono, H. (2023). DANGER
analysis: risk-averse on/off-targetassessment for CRISPR editing withouta reference genome. Bioinformatics
Advances, 3 (1), vbad114.
Tamari, T., Ikeda, Y., Morimoto, K.,
Kobayashi, K., Mizuno-Iijima, S., Ayabe,S., Kuno, A., Mizuno, S., & Yoshiki, A.
(2023). A universal method for generatingknockout mice in multiple genetic
backgrounds using zygote electroporation.
Biology Open , 12(9). https://doi.
org/10.1242/bio.059970（日動協ホームページ、LABIO21
カラーの資料の欄を参照）

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