イネ「双極葉」突然変異体を用いた植物地上部の分枝様式の進化機構の解明
Elucidation of evolutionary mechanism of shoot branching pattern
Using the adaxial-abaxial bipolar leaf mutants in rice
（日本植物生理学会推薦）

代表研究者 秋田県立大学 佐藤（永澤）奈美子

Akita Prefectural UniversityNamiko Satoh-Nagasawa

伊藤純一

The University of Tokyo

Jun-ichi Itoh

秋田県立大学 永澤信洋

Akita Prefectural University

Nobuhiro Nagasawa

Kumamoto University

Hidehiko Sunohara

協同研究者 東京大学

熊本大学

春原 英彦

The branching pattern found in the oldest plant fossils is bifurcated branching, which produces meristems equivalent
to each other. On the other hand, the main angiosperm branching mode is uniaxial branching in which the main axis
meristem and the lateral meristem have different identities. This suggests that plants, which were originally composed
only of qualitatively equivalent meristems, have evolved to have qualitatively different meristems.
Applicants have initially focused on and analyzed rice axial-abaxial bipolar leaf (abl) mutants as mutants with anabnormal pattern formation in the shoot apical meristem. As a result, it has become clear that "bipolar leaves" are causedby two adjacent and equivalent meristems formed during rice development. Thus, the ABL gene may be a key gene that
contributed to the diversification of meristem identities that occurred during plant evolution.
In this study, we first identify multiple rice ABL genes, analyze their functions, and elucidate their interactions toclarify the molecular genetic mechanism of "bipolar leaf" formation in rice. Furthermore, in order to consider theevolutionary roles of the ABL genes, we analyzed the function of the ortholog of the ABL gene in Marchantia polymorphawhich have different body plan from rice.

研究目的に形成される 2 つの隣り合った同等な分裂組織によ最古の植物化石にみられる分枝様式は、互いに同って生じることが明らかになってきた。つまり、ABL等な分裂組織が生じる二叉分枝である。一方、主な遺伝子は、植物進化の過程で起こった、分裂組織の被子植物の分枝様式は、主軸の分裂組織と側芽の分アイデンティティーの多様化に寄与した鍵遺伝子の裂組織が異なるアイデンティティーを持つ単軸分枝可能性がある。

である。これは、元来質的に同等な分裂組織のみで本研究では、まず、イネ ABL 遺伝子を複数同定し構成されていた植物が、進化の過程で、質的に互い機能解析、相互作用の解明を行うことで、イネにおに異なる分裂組織を持つようになったことを示唆しける「双極葉」形成の分子遺伝学的メカニズムを明ている。

らかにする。さらに、イネと体制の異なる植物種に申請者らは、adaxial-abaxial bipolar leaf (abl)おいて、ABL 遺伝子のオルソログの機能解析を行い、突然変異体について、当初、茎頂分裂組織のパターその進化上の役割について考察することを目的とすン形成機構に異常のある突然変異体として注目し、る。

解析してきた。その結果、「双極葉」は、発生の途中

研究経過

る、SCARECROW transcription factor family protein とまず、表 1 に本奨学寄付金申請時に明らかになって

Mps One Binder Kinase Activator-like 1A をコードする

いた「双極葉」突然変異体の特徴について示す。こ遺伝子のそれぞれエキソンあるいはエキソン／イン

こで明らかなように、abl4〜abl6 変異体の原因遺伝トロンの境界領域にアミノ酸置換につながる塩基置子が明らかになっていなかったため、申請者らは、換が起こっていた。

まず、ABL4〜ABL6 遺伝子の同定を試みた（下記項目

さて、abl4 変異体オリジナルアリルは 2016 年に同1）。次に、ABL 遺伝子間の相互関係を明らかにする定されたが、2018 年には、別のアリルが発見された。

ため、各変異体の形態観察を行って対照をとりつつ後者のアリルでは、Mps One Binder Kinase Activator-二重突然変異体における「双極葉」の形成頻度や形

like 1A の開始コドン直前の位置に塩基置換が起こっ態、SAM の形態観察を行った（下記項目 2）。
さらに、ていた。そのため、ABL4 遺伝子の発現調節に異常がABL2 遺伝子に関しては、下流あるいは協同で機能す出るのではないかと考え、野生型とこのアリルにおる遺伝子を明らかにするため、サプレッサー／エンける ABL4 遺伝子の発現を real-time PCR 法を用いてハンサースクリーニングを行った（下記項目 3）。最比較した。その結果、該当アリルでは、SCARECROW後に、イネと体制の異なる植物としてゼニゴケを選transcription factor family protein をコードする遺伝子択し、ABL 遺伝子のオルソログの有無を調査し、変の発現量は野生型と変わりがなく、Mps One Binder異体や過剰発現個体を作成した（下記項目 4）。

Kinase Activator-like 1A をコードする遺伝子の発現が野生型より有意に低いことが明らかになった。また、

Table1 Characteristics of ABL genes

Abl1

abl2

abl3

abl4

abl5
abl6

「双極葉」の遺伝性／

ABL 遺伝子が1A をコードする遺伝子は、植物体の分裂組織以外の分化時期と数アリルの有無コードするタンパク質部分でより高い発現が見られた。この遺伝子がどの

第4葉優性／有ヒスチジンカイネース

ようなしくみで茎頂分裂組織から分化する葉のパタⅢ

変異体名

興味深いことに、Mps One Binder Kinase Activator-likeーン形成に関わっているのか、さらなる解析が必要

第4葉（まれに第1～3葉）
栄養生長初期、複数枚栄養生長初期、複数枚栄養生長初期、複数枚生殖生長期、複数枚劣性／無クラス

HD-ZIP劣性／無LSMタンパク質である。なお、abl3 変異体の原因遺伝子である LSM1遺伝子も、分裂組織よりも葉身において高い発現が見られた。

劣性／有遺伝子未単離劣性／無遺伝子未単離劣性／無遺伝子未単離

in situ hybridization 法による発現解析が成功したのは、ABL1 および ABL2 遺伝子であった。ABL1 遺伝子は茎頂分裂組織から分化したばかりの葉の先端や伸長、抽出した葉の表皮細胞でパッチ状に、発現していた。ABL2 遺伝子は茎頂分裂組織内および新しい葉の向軸側表皮細胞、分げつの分裂組織での発現が1. 遺伝子未単離の ABL 遺伝子の同定と mRNA 発現見られた。ABL3 および ABL4 遺伝子は組織特異的発解析、タンパクの細胞内局在性の調査現をしていないためである可能性が高いと考えてい

ABL 遺伝子の分子レベルでの機能を推測するため、るが、in situ hybridization 法では発現解析できなかっ従来の DNA マーカーを用いた遺伝子マッピングとた。したがって、ABL3 タンパク質および ABL4 タ

ともに、次世代シ―ケンシングデータを利用してンパク質と蛍光タンパク質 sGFP との融合タンパク

ABL4〜ABL6 遺伝子の同定を試みた。

質を形質転換体に作らせるためのコンストラクショ

ラフマッピングの結果、ABL4 遺伝子は、第 3 染ンを行った。

色体の 71cM〜100cM に、ABL5 遺伝子は、第 12 染色体の 12.3cM〜47.2cM に、ABL6 遺伝子は、第 6 染2. ABL 遺伝子同士の二重突然変異体の解析や abl 突色体の 5.1cM〜51cM に座乗していることが明らか

然変異体内での他の ABL 遺伝子の発現解析になった。上記領域について、abl4 変異体オリジナ

ABL 遺伝子間の相互関係を明らかにするため、二ルアリルホモ個体ゲノムの次世代シーケンスデータ

重突然変異体における「双極葉」の形成頻度や形態、を確認したところ、ABL4 遺伝子座乗候補領域内にあSAM の形態観察を行い、各突然変異体の形態と比較した。
abl2、abl3、abl4 変異についての 3 種類の二重変異体について外観観察や内部構造観察を行ったところ、イネと体制が異なり、かつ、形質転換などが可能な実験植物であるゼニゴケについて、ABL 遺伝子のオルソログの機能を調査することとした。

それぞれ、abl2 abl3 二重変異体は矮性で栄養生長初ABL1 は植物のヒスチジンカイネースタンパク質、期に複数枚の双極葉を形成する abl3 変異体と、abl2

ABL2 はクラスⅢ HDZIP タンパク質、ABL3 は LSM

abl4 二重変異体は矮性で栄養生長初期に複数枚の双タンパク質のアミノ酸配列情報を入手し、系統樹を極葉を形成するのに加えて、不規則な位置に分裂組描いた。その結果、 ABL1〜ABL3 については、ゼニ織を形成する abl4 変異体と、abl3 abl4 二重変異体はゴケにおいてオルソログがそれぞれ 2、1、1 個存在abl4 変異体と区別がつかなかった。したがって、イすることが明らかになった。

ネの体制を制御する際、ABL2、ABL3 および ABL4 遺遺伝子の機能を知るため、解析方法の常套手段で伝子は、ABL4→ABL3→ABL2 の順に上位/下位の関係ある CRISPR-Cas9 システムを用いて上記 4 遺伝子の性を持ちながら機能していることが明らかになった。 変異体作成を行った。また、ゼニゴケが二叉分枝す
今後、各突然変異体内での他の ABL 遺伝子の発現る植物であることから、上記 4 遺伝子の過剰発現個を調査することで、この知見を確認する。また、Abl1、体が二叉分枝しなくなるといった表現型を取る可能

abl5 および abl6 変異を含む二重変異体の作出と解析性があると考え、35S プロモーターおよび Elongationを行う。

Factor プロモーターを用いて作成した。
こちらについては、現在解析中であり、ここに結3. サプレッサー／エンハンサーの単離（abl2）果を載せることができない。

ABL2 遺伝子の下流あるいは協同で機能する遺伝子を同定するため、サプレッサー／エンハンサー考察スクリーニングを行った。abl2 突然変異体は劣性ホABL 遺伝子は、茎頂分裂組織内で発現し、葉の分モ個体に稔性があるため、劣性ホモ個体に変異源処化パターンに関わっていると予想していたが、実際理を行い、その後代で「双極葉」表現型が消失するに茎頂分裂組織内で発現していることが明らかにな表現型回復系統を探索した。

ったのは、ABL2 遺伝子のみであった。このことは、2018 年には約 300 系統、2019 年に約 200 系統の茎頂分裂組織と葉原基の間では情報のやり取りが行

M2 をスクリーニングした。通常は abl2 変異体の約われており、それが乱れることで双極葉が生じると50%で双極葉や葉序異常といった異常が見られる。

考えられた。つまり、その情報のやり取りは、イネスクリーニングでは、異常の見られる確率が 25%以の茎頂分裂組織付近で余分な分裂組織が分化するこ下になっていたものをサプレッサー候補、90%以上とを防ぐのに必須なものであるということになる。になっていたものをエンハンサー候補としてスクリその他の実験項目に関しては、解析が道半ばのたーニングした。その結果、前者の M2 約 300 系統かめ考察は難しい。

らは、2 系統のサプレッサー候補に加え、2 系統のエンハンサー候補が得られた。これらの系統は後代の研究の発表

表現型分離比についても確認済みであり、今後は、口頭発表

すでに交配済みの材料の後代のスクリーニングとDNA 抽出、後代の分離調査などを行い、次世代シー

1. 菊地美希・岡本理沙・山﨑荘・春原英彦・永澤

ケンサーでゲノム配列を読むことで遺伝子同定を行信洋・我彦廣悦・佐藤(永澤)奈美子、イネの葉う。後者の M2 約 200 系統からも 6 系統のサプレッ

分化パターン制御における Oryza sativa

サー候補が得られた。それらについては、2021 年に後代の分離比を確認したり、遺伝子同定のために必要な交配を行ったりする。

Smith-like1 遺伝子の機能推定、東北植物学会、R1.12.15
2. 佐藤理絵・春原英彦・我彦廣悦・永澤信洋・佐4. イネと体制の異なる植物（ゼニゴケ）におけるABL 遺伝子オルソログの機能解析

藤（永澤）奈美子、なぜ adaxial-abaxialbipolar leaf 2 変異体で双極葉が形成される

本育種学会、R2.3.28のか?、東北植物学会、R1.12.15
3. 菊地美希・岡本理沙・山﨑荘・春原英彦・我彦

ポスター発表廣悦・永澤信洋・佐藤（永澤）奈美子、イネのシュート形成における Oryza sativa Smith-like 1

4.

1. 山﨑荘・菊地美希・春原英彦・我彦廣悦・永澤

遺伝子機能の解析、日本育種学会、R2.3.28

信洋・佐藤(永澤)奈美子、極性異常の葉を形成

佐藤理絵・春原英彦・伊藤純一・我彦廣悦・永澤するイネ adaxial-abaxial bipolar leaf 4 変

信洋・佐藤（永澤）奈美子、イネ adaxial-abaxial

異体の解析 、東北植物学会、R1.12.15

bipolar leaf 2 変異体を用いた異所的メリステム
分化抑制機構についての分子遺伝学的解析、日