生細胞内 small RNA イメージングのための RNA 結合性低分子蛍光プローブの創製
Design of RNA-Binding Fluorescent Probes for Small RNA Imaging in Living Cells（日本分析化学会推薦）

代表研究者 東北大学

西澤精一

協同研究者 清華大学

童 愛軍

Tohoku University

Seiichi NISHIZAWA

Tsinghua University

Aijun TONG

We have developed synthetic fluorescent probes for intracellular delivery analysis of small interfering RNAs(siRNAs). The probes are based on peptide nucleic acids that are conjugated with thiazole orange (TO) and pyrene totheir C- and N-termini, respectively. The probe is able to selectively bind to 3’-overhanging two nucleotides of target
siRNAs, and the binding is accompanied by a significant light-up response due to intercalation of the TO moiety into thedouble-stranded regions near overhangs. The affinity-labeling of siRNAs with the probe facilitates fluorescence imagingof cellular uptake of polymer-based carriers encapsulating the siRNAs (polyplexes) through endocytosis and subsequent
sequestration into lysosome. In addition, flow cytometric measurements reveal that the monitoring of the probe
fluorescence inside the cells is successfully applicable to the analysis of the polyplex disassembly. In contrast to typicalmethods using fluorophore-labeled siRNAs, the present probe does not compromise the siRNA silencing activity, and isapplicable to the analysis of both cellular uptake and the intracellular disassembly of the polyplexes. The use of theprobe thus allows a more detailed and quantitative analysis of the siRNA delivery process, which would be very usefulfor siRNA-related study.

研究目的

なかでも緑色蛍光蛋白質（green fluorescent protein:

ここ 15 年程の間に、RNA が関与する新規な遺伝GFP）を用いた蛍光プローブの開発は代表的なアプ

子発現調節機構の発見が相次ぎ、RNA は、ポストゲローチで、細胞内シグナル伝達因子やセカンドメッノム時代の生命科学研究における重要な研究対象とセンジャー、細胞内蛋白質相互作用などの可視化がなっている。なかでも RNA 干渉 1)はその代表的な遺報告されている。しかしながら、細胞内の RNA イ

伝子発現調節機構で、 siRNA2),3) （ small interfering

メージングを可能とする技術のハードルは高く、例RNA）と呼ばれる 19-21 塩基長の RNA 二重鎖が細胞えば、siRNA を標的とする場合、専ら蛍光色素修飾

質内でタンパク質と複合体を形成することで、相補に基づく手法に依存している 4)-7)。従って、siRNA の的な塩基配列を有するメッセンジャーRNA を分解、蛍光色素修飾を不要とするイメージング法を開発すタンパク質への翻訳を阻害する。そのため、siRNAることで、本来の siRNA 活性・機能をより反映したは癌などの難治性疾患に対する画期的な治療薬とし動態解析が可能となり、siRNA 関連研究において極て期待されている。現在、実用化の課題とされていめて有用な解析手法になると期待できる。

るのが siRNA を標的組織・細胞へ輸送するデリバリ

以上のような学術的背景に基づき、本研究では、ーシステムの構築であり、それと同時に、そのデリRNA 結合性の低分子蛍光プローブを開発、これに基バリー過程を精密かつ定量的、簡便に評価しうるイ

づく細胞内 RNA イメージング法の開発を試みる。

メージング・解析技術の開発が不可欠となる。

ここでは、特に siRNA に標的を絞って研究を遂行し、近年の細胞内イメージング技術の進展は著しく、siRNA 選択的な結合機能とシグナリング機能を有す

る蛍光プローブの分子デザインを新たに提案するとれは、ピレンと TO が分子内スタッキング構造をとともに、細胞内での siRNA 可視化機能を評価するこるため、TO 部位の非特異的な相互作用が抑制されるとで、方法論としての基礎と有用性を実証することためで、加えて siRNA と結合する際には、ピレン部を試みた。

位が 3’末端の塩基対とスタッキングするキャッピング効果が協同的に働いた結果と考察している（誌上

研究経過と考察発表 1: Chem. Commun., 2015, 51, 1421-1424.）。

（1）プローブ設計と結合機能の評価
siRNA は 20 塩基長程度の二重鎖 RNA で、3’末端（2）siRNA デリバリー解析に 2 塩基オーバーハング構造を有することが、他のPy-AA-TO を siRNA のアフィニティーラベル化

小分子 RNA には見られない構造上の特徴である。

剤（非共有結合に基づくラベル化剤）として利用し、本研究では、この 2 塩基オーバーハング構造に着目

デ リ バ リ ー 解 析 を 試 み た 。 こ こ で は 、 siGL2 とすることで、可逆的かつ高選択的な siRNA 結合能をPy-AA-TO を等量混合した緩衝溶液中にポリマー有する蛍光プローブを設計・合成した。

ベースのキャリアを添加することで、Py-AA-TO と具体的には、オーバーハング 2 塩基の認識のためsiRNA の錯体をキャリアに内包した。この複合体のにペプチド核酸（PNA）を用い、その PNA 骨格 C溶液を HeLa (ヒト子宮頸がん) 細胞の培地へ添加し、末端側に蛍光色素チアゾールオレンジ（TO）を連結3 時間後蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞質にしたもので、siRNA に対する light-up 型の蛍光プロ

Py-AA-TO の蛍光シグナルが輝点状に観測された。

ーブとして機能しうることが分かった（Figure 1:

これはエンドサイトーシスで取り込まれた複合体がAA-TO）。しかし、ここでは PNA 骨格と TO とを連エンドソーム内にトラップされた状態であると考え結するアルキル鎖長を制御することでプローブ機能られる。この小胞は時間が経つと酸性化が進み、やの最適化を進めたが、その結合選択性は十分ではながてリソソームへ融合することが知られている。実く、細胞内解析へ適用することはできなかった。こ

際、本系においてもリソソーム染色剤との共染色実れは、TO 部位が RNA 二重鎖と非特異的に相互作用験から、プローブのシグナルの大部分がリソソームすることに起因する。と重なっていることを確認した。また、プローブの以上の結果を踏まえて、プローブ機能の改良を検シグナルは細胞質全体には見られず、複合体に由来討した結果、PNA 骨格の N 末端側にピレンを連結すする輝点状の蛍光シグナルのみが観測された。一方、ることで、siRNA に対する結合選択性を飛躍的に改蛍光色素（Alexa647 ）を修飾した siRNA を用いて良できることを見出した（Figure 1: Py-AA-TO）。こ対照実験を行うと、Alexa のシグナルは細胞質全体に観測されたことから、siRNA の一部はこの時間スケールでは既に細胞内全体に放出されていることが分かった。これらの結果から、Py-AA-TO は siRNA/キャリア複合体、つまり、キャリアに内包されている siRNA を選択的に可視化していることが分かった。
この性質は、細胞内取り込みや放出を定量する際に極めて有用で、蛍光色素修飾した siRNA を利用する従来法では困難な解析が可能となる。例えば、汎用されるフローサイトメトリーを用いて、siRNA/キャリア複合体を取り込んだ細胞数を評価する場合、蛍光色素を修飾した場合では蛍光色素が複合体から放出された後も、siRNA の状態に関わらず光り続けているため、siRNA の細胞内取り込みは解析できる
ものの、その後の siRNA 放出過程を評価することはFig. 1 Chemical structures of fluorescent probes
developed in this study.

できない。一方、本プローブを用いて、細胞内取り込み量の経時変化（〜20 時間）を評価したところ、プローブのシグナルが観測される細胞数が徐々に減ともに、長波長解析に対応できる蛍光プローブの開少していくことが分かった。この結果は複合体が解発を進めており、これらの改良型プローブを用いる

消するにしたがって、プローブが siRNA から解離し、ことで、より低濃度の siRNA 細胞内デリバリー解析

蛍光シグナルがオフになったためであると考えられや個体レベルでの生体（in vivo）イメージング 9)へのる。実際、プローブのシグナル減少の半減期はおよ適用が可能になると期待できる。

そ 1-2 時間と見積もられ、類似のキャリアで報告されている値 8)に近い。従って、本プローブを用いれ参考文献

ば、siRNA の細胞内取り込みだけでなく、その放出

1.

A. Fire, S Xu, M. K. Montgomery, S. A. Kostas, S. E.

（あるいは複合体の解消）も簡便に解析することがDriver, C. C. Mello: Potent and speciﬁc genetic

可能である（誌上発表 2: Anal. Sci., 2015, 31, 315-320.）。

interference

また、デュアルルシフェラーゼアッセイにより、double-stranded

RNAinCaenorhabditis elegans, Nature, 391, 806-810, 1998.

siRNA のサイレンシング活性を評価した結果、本プ
ローブでアフィニティーラベル化した siGL2 を導by

2.

P. D. Zamore, T. Tuschl, P. A. Sharp, D. P. Bartel:

入した時の活性は、siGL2 単体の活性と同程度であRNAi:った。これは siRNA がキャリアから放出されるとプATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23

ロ ー ブ が 速 や か に 解 離 する た め 、 イ ン タ ク ト なnucleotide intervals, Cell, 101, 25-33, 2000.

siRNA が細胞内に輸送されたためと考えられ、本プ

3.

ローブによるラベル化は RNAi 活性に影響を与えなRNA

directs

theS. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin,
K. Weber, T. Tuschl: Duplexes of 21–nucleotide

いことが示唆された。

RNAs mediate RNA interference in cultured

以上のように、本プローブを用いた解析では、本mammalian cells, Nature, 411, 494-498, 2001.

来の siRNA 活性を殆ど損なうことなく一連の細胞内デリバリー過程を可視化・評価することができる。

double-stranded

4.

Y.-L. Chiu, A. Ali, C.-Y. Chu, H. Cao, T. M. Rana:

共有結合を介した蛍光色素のラベル化に基づく従来

Visualizing a correlation between siRNA localization,のイメージング手法とは異なり、医薬として本来のcellular uptake, and RNAi in living cells, Chem.

構造と機能を維持した siRNA のデリバリー過程をBiol., 11, 1165-1175, 2004.

可視化できる点に、本手法の本質的な価値がある。

5.

A. Järve, J. Müller, I.-H. Kim, K. Rohr, C. MacLean,G. Fricker, U. Massing, F. Eberle, A. Dalpke, R.

（3）プローブ機能の改良

Fischer, M. F. Trendelenburg, M. Helm: Surveillance

上 述 し た よ う に 、 Py-AA-TO で ラ ベ ル 化 し た
siRNA をキャリアに取り込ませることで、生細胞内of siRNA integrity by FRET imaging, Nucl. Acids

へのデリバリー挙動を可視化することができる。しRes., 35, e124, 2007.

かし、解析可能な siRNA 導入濃度は 200 nM 程度

6.

A. S. Wahba, F. Azizi, G. F. Deleavey, C. Brown, F.とやや高く、オフターゲット効果などが起こりにく

Robert, M. Carrier, A. Kalota, A. M. Gewirtz, J.

い、より低濃度の siRNA を解析できる必要がある。

Pelletier, R. H. E. Hudson, M. J. Damha:

本研究では、より低濃度の siRNA を可視化するた

Phenylpyrrolocytosine

め に 、 プ ロ ー ブ の 結 合 力の 改 良 を 進 め た 結 果 、as an unobtrusivebase

Py-AA-TO の PNA 骨格の C 末端に塩基性アミノ酸でmodification for monitoring activity and cellular

あるリシンを複数連結することで、標的 siRNA へのtrafficking of siRNA, ACS Chem. Biol., 6, 912-919,

結合選択性を維持したまま、結合力を大幅に改良で2011.

きることを見出した。具体的には、リシンを 6 個連

7.

Y. Kamiya, A. Ito, H. Ito, M. Urushihara, J. Takai, T.

結したもので、その結合力（解離定数 Kd = 150 nM）

Fujii, X. Liang, H. Kashida, H. Asanuma: Selective

はリシンを持たない Py-AA-TO（Kd = 5,900 nM）とlabeling of mature RISC using siRNA carrying比較して一桁向上した。
現在、プローブの結合力の改良をさらに進めるとfluorophore-quencher pair, Chem. Sci., 4, 4016-4021,
2013.

8.

C. A. Alabi, K. T. Love, G. Sahay, T. Stutzman, W. T.

4.

S. Nishizawa: Design and Synthesis of DNA- andYoung, R. Langer, D. G. Anderson: FRET-labeled

RNA-binding Ligands for Gene Detection, 6thsiRNAInternational Symposium on NanoBio Molecular

probesfortracking

assemblyandAssembly,

disassembly of siRNA nanocomplexes, ACS Nano, 6,DepartmentofChemistry,Yonsei

University, Seoul, Korea, January 2015.
6133-6141, 2012.
9.

5.

西澤精一：RNA 結合リガンドの合成と分析化学

H. Hong, Y. Zhang, W. Cai: In vivo imaging of RNA

的応用、第 13 回化学系若手研究者セミナー、東interference, J. Nucl. Med., 51, 169-172, 2010.

北薬科大学、2014 年 9 月.

研究の発表

誌上発表

口頭発表

1.

1.

2.

西澤精一： 核酸結合リガンドによる RNA 検出

Teramae: Synthetic fluorescent probes capable ofと細胞内イメージング、日本分析化学会第 64 年

selective recognition of 3'-overhanging nucleotides

会、九州大学伊都キャンパス、2015 年 9 月.

for siRNA delivery imaging, Chem. Commun., 51,

西澤精一：核酸結合リガンドによる DNA・RNA

1321-1424, 2015.

センシングと細胞内イメージング、第 86 回化学

3.

T. Sato, Y. Sato, K. Iwai, S. Kuge, S. Nishizawa, N.

2.

T. Sato, Y. Sato, K. Iwai, S. Kuge, N. Teramae, S.

センサ研究会、仙台市情報・産業プラザ、2015

Nishizawa:年 8 月.

Delivery by Peptide Nucleic Acid-based Probe, Anal.

西澤精一：核酸結合リガンドによる DNA・RNA

Sci., 51, 315-320. 2015.

検出と細胞内イメージング、第 13 回ホスト・ゲ
スト化学シンポジウム、東北大学川内キャンパ
ス、2015 年 6 月.

Fluorescence

ImagingofsiRNA