東海大学海洋研究所研究報告第 31 号（2010）1 − 8 頁

Bull. Inst. Oceanic Res. & Develop., Tokai Univ.（2010）, 31, 1 − 8

水族館飼育下イルカにおけるDNA マーカーによる親子鑑定法の開発
北夕 紀 1）・猪 子 英 俊 1）・椎 名隆 1）・田 中

彰 2）Development of Newly Paternity Test Method for Dolphins Using Microsatelliteand MHC-DQB Markers
Yuki F. Kita1）, Hidetoshi Inoko1）, Takashi Shiina1） and Sho Tanaka2）

Abstract
The father-offspring relationship of captive dolphins is sometimes difﬁcult to assess : observationof females during pregnancy is limited and the biological fathers generally remain unknown. To prevent
such dolphins from inbreeding, analyses on genetic information of captured dolphins are important topreserve their inherited genetic diversity. The genetic data management based on DNA analysis of familial
relationships among aquariums is now becoming an important tool for determination of the inherited variety,relationships and the kinship states between the individuals in populations under inbreeding pressure.
In this paper, in order to develop a simple paternity test method using microsatellite and newly
designed MHC class II DQ beta（MHC-DQB）marker, we performed polymorphism analysis, population
genetic analyses and parentage test using 20 dolphins including four pedigrees. As a result, six to ten
microsatellite alleles and 14 MHC-DQB alleles were identiﬁed from the polymorphism analysis. From thegenetic and statistical evaluation, the MHC-DQB marker was found to be more informative for paternity test
than the microsatellite markers. Namely, the likelihood of the paternity using only four microsatellite markers
were 94.12 ％ to 99.88 ％ but when adding MHC-DQB polymorphic information the likelihood of the paternity
was improved from 98.46 ％ to 99.98 ％ . Therefore, this method combined the microsatellite and MHC-DQB
markers will be useful genetic tool for the paternity test.

1） 東海大学医学部基礎医学系分子生命科学〒 259-1143

神奈川県伊勢原市下糟屋 143

Department of Molecular Life Science Tokai University School of Medicine, 143 Shimokasuya Isehara Kanagawa
259-1143, Japan2） 東海大学海洋学部海洋生物学科〒 424-8610

静岡県静岡市清水区折戸 3-20-1

Department of Marine Biology, School of Marine Science and Technology, Tokai University, 3-20-1 Orido Shimizu
Shizuoka 424-8610, Japan（2009 年 10 月 22 日受付／ 2009 年 10 月 31 日受理）2

北 夕紀・猪子英俊・椎名 隆・田中 彰

緒言

域内の MHC クラスⅠ亜領域，MHC クラスⅡ亜領域にそれぞれ位置する（Shiina et al.，2009）．オキゴンド

水族館では，複数のイルカ雌雄を限られた空間で飼

ウ MHC 領域の遺伝子構成は HLA-DP に相当する遺育する場合が多い．この環境下にて繁殖がおこなわれ伝子座を除けば，ヒトとよく類似する（Kulski et al.,

たとき，母子関係は出産時の様子，育児行動の観察に

2002； Shiina et al., Unpublished data）．これら MHC

よって容易に確認することが可能であるが，父子関係

遺伝子はこれまでに調べられている脊椎動物にて高は推測の域を出ない場合がある．一方，生物保全の場

度な遺伝的多型性を示し，先に記したヒト MHC，6 遺としての役割を期待されている水族館では，飼育個体

伝子座において合計 3600 を超える対立遺伝子（アリの近親交配による近交弱勢を回避することは極めて重ル），鯨類と比較的近縁であるウシでは MHC，4 遺伝要である．したがって，個体に負担をかけずに簡便で子座（class I，DRB3，DQA，DQB ）において合計 303

信頼性の高い父子鑑定法を確立する必要がある．このアリルがそれぞれ見出されている（猪子 2000；http :/場合，ゲノム DNA は健康診断時に採血された血液，/www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ ； http ://www.ebi.ac.uk/

皮膚の粘膜組織および糞便から抽出可能なことから，

ipd/mhc/index.html）．したがって，ハンドウイルカ

塩基配列に刻まれている個体間の差異を検出し，それについても MHC 遺伝子の遺伝的多型性が備わっていを親子鑑定に用いる手法が好ましいと考えられる．

ることが期待される．この場合，各鯨種について比較

ゲノム DNA を用いた親子鑑定の手段の一つとし的解析が進められており，かつ他 MHC 遺伝子のようて，マイクロサテライト法が挙げられる．マイクロサ

な遺伝子重複の認められない MHC クラスⅡ DQ beta

テライト配列とはゲノム配列に散在する GT や GCT遺伝子（MHC-DQB ）が多型解析や親子鑑定に最適であのような 2 〜 5 塩基の短い塩基配列を１単位として，ると考えられる（Hayashi et al., 2003； Hayashi et al.,

これが複数回繰り返される反復配列のことである．繰

2006）．

り返し回数の違いが個体間に観察されること，すなわ

これまでに水族館にて飼育されているハンドウイル

ち多型性に富み，かつメンデルの法則に従って遺伝す

カ 1 家系，6 個体について 3 種類のマイクロサテライ

るため，親子鑑定には極めて好都合な DNA マーカー

トマーカーを用いた親子鑑定法が報告されているが，である（後藤・上田 2001）．鯨類では Scholoterer et

その信頼性については触れられていない（Sumiyamaal.（1991）が 11 種の鯨類からマイクロサテライトマー

et al, 2008）．また，マイクロサテライトマーカーとカーを設定した最初の報告から，これまでに 80 種類

MHC 遺伝子マーカーを組み合わせた手法による父子

以上のマイクロサテライトマーカーが開発され，各鯨鑑定法はヒトでは一般的であるが（太田 2004），他生

種にて多型解析が進められている（Amos et al., 1993；

物種での報告は認められない（Krutzen et al.，2004；

Buchanan et al., 1996； Palsboll et al., 1997； Richard

Sumiyama et al., 2008）．そこで本研究では , 父親候et al., 1997； Shinohara et al., 1997； Valsecchi et al.,補を含む飼育環境下のハンドウイルカ 2 家系，ハン1997）．

ドウイルカとハナゴンドウを両親に持つ 2 家系の 17

一方，遺伝的多型性を有すると期待される DNA

頭ならびに非血縁個体 3 頭，合計 20 頭より抽出したマーカーとして，主要組織適合遺伝子複合体（Major

ゲノム DNA を供試材料として，4 種類の既知マイク

Histocompatibility Complex； MHC）遺伝子が挙げら

ロサテライトマーカー（MS-D08，MS-D14，MS-D18，

れる．MHC とは異物由来の外来性ペプチドを T 細MS-D22： Shinohara et al，1997）ならびに MHC-DQB

胞受容体に抗原提示する白血球抗原を規定する遺伝マーカーを用いて多型解析を実行し，これら少数の子領域であり，この領域には MHC クラスⅠ分子とDNA マーカーによる親子鑑定への有効性ならびに信MHC クラスⅡ分子の 2 種類の分子を規定する MHC

頼性について明らかにしたので，これについて報告す遺伝子群が位置する．すなわち，ヒトの場合 3 個のる．

MHC クラスⅠ分子を規定する MHC クラスⅠ遺伝子

材料および方法座（HLA-A, HLA-B, HLA-C ），MHC クラスⅡ分子を規定する MHC クラスⅡ遺伝子座（HLA-DR, HLA-DQ,

HLA-DP ）が抗原提示に直接的関連を示し，MHC 領

供試材料
ゲノム DNA サンプルは，新江ノ島水族館，横浜・

イルカにおける DNA マーカーによる親子鑑定法

八景島シーパラダイス，南知多ビーチランドにて飼育

3

マイクロサテライトマーカーを用いた多型解析法

管理されている父親候補を含むハンドウイルカ 2 家系

マイクロサテライトマーカーには，4 種類のハンド（家系 1 と家系 4），ハンドウイルカとハナゴンドウを

ウイルカ用マイクロサテライトマーカー（MS-D08，

両親に持つ 2 家系（家系 2 と家系 3）の計 17 頭ならびにMS-D14，MS-D18，MS-D22： Shinohara et al., 1997）

非血縁個体 3 頭から得た．その内訳は，ハナゴンドウを用いた．Taq ポリメラーゼには，Gold Taq（Applied

2 頭，ハンドウイルカ 16 頭，ハナゴンドウとハンドウ

Biosystems）を使用した．PCR 増幅には，GeneAmp

イルカのハイブリッド 2 頭である（Fig. 1）．それらの

PCR System 9700（Applied Biosystems）を 用 い て，

血液より既知のフェノールクロロホルム法にて抽出し既報の条件にしたがって PCR 増幅させた（Shinohara

たものを実験に用いた．

et al., 1997； Sumiyama et al., 2008）．その後，得られた PCR 産物を ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer

Fig. 1 Four pedigrees using in this study. White squares and circles indicate bottlenose dolphin male andfemales, black squares and circles indicate risso s dolphin male and females and gray squares andcircles indicate hybrids between bottlenose dolphin and risso s dolphin.

4

北 夕紀・猪子英俊・椎名 隆・田中 彰（Applied Biosystems）に よ り 電 気 泳 動 し，Gene

列 決 定 に は，ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer

Mapper ソフトウェアを用いて PCR 産物の DNA 断（Applied Biosystems）を用いた．なお１個体あたり片長を決定した．得られたアリルについては PCR 産

16 個のサブクローンの塩基配列を決定した．また，物の DNA 断片長に基づいて，114 塩基の DNA 断片

ハンドウイルカより得られたアリルを Tutr-DQB* ，長が決定された場合，アリル 114 のように表記した．

ハナゴンドウより得られたアリルを Grgr-DQB* とそれぞれ表記した．

MHC-DQB マーカーにおける多型解析法
MHC 遺伝子のうち，よく解析されており，かつイ

遺伝子解析法ルカと比較的近縁であるウシとヒツジの MHC-DQB

塩 基 配 列 決 定 後 の 一 般 的 な 遺 伝 子 解 析 に は，

遺 伝 子 の 塩 基 配 列（accession numbers : AJ249717

Sequencher 4.1（Gene Codes Co.）や GENETYX-MAC

and AJ249896）にならい，エクソン 2 を含む 357 塩基Ver. 11（Software Development Co.）， 公 的 デ ー タ（bp）を増幅させる PCR プライマー（DQB02P ： 5 −ベースに公開されている塩基配列との類似性解析に

TGTTACTTCACCAACGGGAC−3 ，（DQB08P ： 5

は，BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）−AAAGAAGCCAAAGGCACGAG−3 ）を設計した．

をそれぞれ用いた．アリル頻度，多型性の指標であPCR 増幅には，Taq ポリメラーゼ ExTaq（TaKaRa）

るヘテロ接合度の計算には CERVUS Ver. 2.0（http:/を使用し，96℃，3 分間の熱変性の後，熱変性：96℃，/helios.bto.ed.ac.uk/evolgen/cervus/details.html），

30 秒間；アニーリング：60℃，30 秒間；伸長反応：

親子鑑定に対する有用性の指標である多型情報含有

72℃，1 分間の工程を 30 サイクル実行し，最終伸長値（Polymorphic Information Contents : PIC），

反応として 72℃，4 分間の反応をおこなった．PCR

父親でないオスが否定される確率である平均排除率

産 物 の サ ブ ク ロ ー ニ ン グ は pGEM-T Easy Vector（Mean Exclusion Chance : MEC）， 任 意 の 2 個 体 が（Promega）のプロトコールにしたがっておこない，

異 な る 遺 伝 子 型 を 有 す る 確 率 で あ る 識 別 能 Power得られたサブクローンならびに PCR 産物の塩基配of Discrimination : PD）の 計 算 に は Parentage Test

Table 1 Allele frequency（AF）of four microsatellite（MS）markers and MHC-DQB gene for a 20 captive
dolphins.

5

イルカにおける DNA マーカーによる親子鑑定法

http://www3.kmu.ac.jp/legalmed/DNA/ppl3.html）をは 0.767（MS-D14）〜 0.848（MS-D08），MEC 値は 0.597

それぞれ用いた．なお供試材料とした 20 サンプルは（MS-D14）〜 0.725（MS-D08），PD 値は 0.928（MS-D14）

ハンドウイルカとハナゴンドウとのハイブリッド個体〜 0.966（MS-D08 および MS-D22）といずれのマーカーを含むことから，これらサンプルを同一集団として計も高い値を示した（Table 2）．

算した．

MHC-DQB マーカーにおける多型情報
MHC-DQB 遺伝子のエクソン2 を含む 357 bp にお父子鑑定法
父 子 鑑 定 に は，P a r e n t a g e T e s t（ h t t p : / /ける多型解析をおこなった結果，合計13 種類のハンドウ

www3.kmu.ac.jp/legalmed/DNA/parent.html）

イルカMHC-DQB（Tutr-DQB）アリル（Tutr-DQB*01〜を用い，Essen-Moller（1938）の父権肯定確率の判定基*13 ： Accession numbers AB302044 〜 AB302056）

準に照らし合わせた．本研究では，Essen-Moller 値がな ら び に 1 種 類 の ハ ナ ゴンド ウ MHC-DQB（Grgr-99.8 ％ 以上を 父親と判定できる（Deﬁnite father），

DQB*01）アリルが同定された．公的データベース

99.0 ％ 〜 99.7 ％ を 極 め て 父 親 ら し い Extermelyに登録されている塩基配列との類似性解析の結果，father），95.0 ％ 〜 98.9 ％ を 非 常 に 父 親 ら し い

Tutr-DQB*10 は既知の塩基配列（AB164221）と Grgr-（Highly likely father），90.0 ％ 〜 94.9 ％ を 父 親 ら

DQB*01 は（AB164222）と 一 致 し た が， そ の 他 のしい（Likely father），90.0 ％ 未満を 父親ではない

MHC-DQB アリルは新規に同定されたものであった．

（Not father）として父親候補と定義付けた．

結同定された 14 種類のアリルのうち，最も頻度の高いアリルは，Tutr-DQB * 09 であり，それらのアリ

果

ル頻度は 0.150 であった（Table 1）．ヘテロ接合度はマイクロサテライトマーカーにおける多型情報
マ イ ク ロ サ テ ラ イ ト マ ー カ ー 4 種 類（MS-D08，
MS-D14, MS-D18，MS-D22）における多型解析の結果，0.938，PIC 値は 0.889，MEC 値は 0.793，PD 値は 0.981
であり，いずれの値とも 4 種類のマイクロサテライト
マーカーよりも高い値を示した（Table 2）．

10, 6, 9, 10 種類のアリルがそれぞれ同定された（Table
1）．各マーカーにおける最も頻度の高いアリルは，マイクロサテライト多型と MHC-DQB 多型に基づく

MS-D08 がアリル 114，MS-D14 がアリル 140，MS-D18

父子鑑定がアリル 85，MS-D22 がアリル 129 であり，それぞれマイクロサテライトマーカーならびに MHC-DQBのアリル頻度は 0.225（MS-D08）〜 0.275（MS-D14）でマーカーにおける多型情報から，これら 5 マーカーはあった（Table 1）．これらアリル数とアリル頻度からいずれとも多型性に富み，かつ親子鑑定に有効である算出される，多型性の指標であるヘテロ接合度は 0.800と考えられた．そこで，これらのマーカーを用いて実（MS-D14 および MS-D18）〜 0.900（MS-D08）と極めて際に父親候補を含む 4 家系における父子鑑定を実施し高い値を示した．また親子鑑定の指標となる PIC 値

た（Fig. 1，Table 3）．

Table 2 Statistical results for the genetic analyses of four MS markers and the MHC-DQB gene of 20 captive
dolphins. R shows allele range. H（O）and H（E）show observed and expected heterozygosities,
respectively. PIC, MEC and PD show polymorphic information contents, exclusion chance andpower of discrimination, respectively.

Locus

Allele Num.

R

H（O）

H（E）

HW E

PI C

M EC

PD

D08

10

110-132

0.850

0.885

0.872

0.848

0.725

0.966

D14

6

136-148

0.800

0.818

0.778

0.767

0.597

0.928

D18

9

74-95

0.800

0.851

0.729

0.809

0.664

0.950

D22

10

117-140

0.850

0.882

0.702

0.845

0.722

0.966

MHC-DQB

14

-

0.938

0.921

0.351

0.889

0.793

0.981

Table 3 Four MS maker and MHC-DQB gene typing for 20 captive dolphins include four families. Bold letters indicate polymorphisms inherited frommothers and fathers. Black labels are individuals judged father each families.
6
北 夕紀・猪子英俊・椎名 隆・田中 彰

イルカにおける DNA マーカーによる親子鑑定法

7

まず，父親候補が 1 頭に限られている家系 2 と家値，PD 値はいずれも既知のハンドウイルカ用マイク

系 3 において，マイクロサテライトマーカーのみの

ロサテライトマーカーよりも高い値を示した（Table

父子鑑定の場合，MHC-DQB マーカーを含めた父子

2）．また，マーカー数を 4 種類に揃えた場合の 5 通鑑定の場合ともに，Essen-Moller（EM）値が 99.87 ％りの組み合わせ、すなわち組み合わせ 1（MS - D08，

以上（父親と判定できる）の信頼度の高い判定が得らMS - D14，MS - D18, MS - D22），組み合わせ 2（MS - D08,

れた（Table 3）．一方，3 頭の父親候補を有する家系

MS - D14，MS - D18，MHC -DQB ）， 組 み 合 わ せ 3

1 において，父親候補 B ， D ，および E の EM 値

（MS - D08，MS - D14，MS - D22，MHC -DQB ），組み合はマイクロサテライトマーカーのみの場合、それぞわ せ 4（MS - D08，MS - D18，MS - D22，MHC -DQB ），れ 99.39 ％ ，< 90.00 ％ および 98.78 ％ であったのに対組 み 合 わ せ 5（MS - D14，MS - D18，MS - D22，MHC -して，MHC-DQB マーカーを含めた場合，それぞれDQB）の父権肯定確率を算出したところ，マイクロサ

99.88 ％ ，< 90.00 ％ および < 90.00 ％ であった．した

テライトマーカーのみの組み合わせ 1（94.12 ％ ：父親

がって、 D と E は父親候補から除外され， B を父らしい〜 99.88 ％ ：父親と判定できる）よりも，MHC親であると判定した．同様に家系 1 よりもさらに複とマイクロサテライトマーカーを含む組み合わせ 2，

雑な家族構成を示す家系 4 の場合においても，母子関

3,4 および 5（95.05 ％ ：非常に父親らしい〜 99.98 ％ ：係が S と T に対する父親は Q ，母子関係が T と父親と判定できる）の方が高い値を示した．さらに，

U に対する父親は R ，母親不明，子が R に対する

組み合わせ 1 の父権肯定確率に対して，これに MHC -父親は P であるとそれぞれ判定することができた．

DQB マーカーを含めた場合，98.46 ％（極めて父親ら考察しい）〜 99.98 ％（父親と判定できる）と極めて信頼度の高い判定が得られた（Table 3）．とりわけ，家系 4

本論文では，まず MHC クラスⅡ遺伝子の 1 つでの P は 94.12 ％ から 98.46 ％ と、大幅な信頼性の改善

ある MHC-DQB 遺伝子を特異的に増幅する PCR 系が見られた . したがって，MHC-DQB マーカーは父子を開発したとともに，飼育下 20 頭のイルカを用いて，鑑定のための優れた DNA マーカーであるとともに，

MHC-DQB マーカーならびにマイクロサテライトマー

既知の母子間および父子間に多型の矛盾は認められカーを用いた多型解析を実施した．その結果，計 14

なかったこと，複数の父親候補から 1 頭の父親を選択

種類の MHC-DQB アリルが同定された．4 種のマイク

しうることから，この少数のマイクロサテライトマー

ロサテライトマーカーにおけるアリル数は 6 〜 10 種

カーと MHC-DQB マーカーによる親子鑑定精度は極類であったのに対して，MHC-DQB 遺伝子はそれらめて高く，飼育頭数の限られる環境下にて今後の有用の 1.4 〜 2.3 倍の高い値を示したことから，高度な多型な手法の一つになると考えられた．

性を有することが明らかとなった（Table 2）．一般的鯨類の遺伝学的解析による個体識別や親子鑑定おに信頼性のある親子鑑定を行うには，親から子に対よび血縁解析は，水族館における近交弱勢を回避する

立遺伝子が遺伝すること，新生児でも検査可能であるのみならず，野生下においても集団内の血縁関係を正こと，遺伝子頻度やハプロタイプ頻度のデータベー

しく理解する上で必須である．しかしながら，報告さスが整っていること，突然変異が起こらないこと，高れているマイクロサテライトマーカーは，複数の鯨種

度な多型性を示すことなどの要件を満たす遺伝形質をに渡り 80 種程度存在するものの，それらの中には多使用することが必要である．親子鑑定や個体識別に使型性に乏しいものや，種の枠を超えて使用できないも用する遺伝形質は，ヘテロ接合度，PIC 値（多型情報のもあり，DNA マーカー選定が困難であると共に，

含有値），MEC 値（父子関係を否定できる確率），PD

DNA マーカー数の絶対数は少ないと考えられる．ま値（二者が異なる遺伝子型になる確率）など対立遺伝

た，各研究機関がそれぞれ異なる DNA マーカーを使

子数や遺伝子頻度から算出される遺伝情報量が検査用することにより多型情報の共有が難しいという問題

結果に大きな影響を及ぼし，いずれも高い値を示すもある．これらの問題を解消するためにも，ヒトではことにより，より精度の高い父権肯定確率および否既に用いられているように脊椎動物で極めて高度な多定確率が得られる（太田 2004）．本解析にて，MHC-

型性を有する MHC 遺伝子を DNA マーカーの 1 つとDQB マ ー カ ー の 示 す ヘ テ ロ 接 合 度，PIC 値，MEC

して含めることが必要である．今後，各 MHC 遺伝子

8北 夕紀・猪子英俊・椎名 隆・田中 彰

領域における DNA マーカーが複数開発され，国内のsociety of wild bottlenose dolphins（Tursiops sp.）

水族館で多型情報が共有されることにより，各鯨類のin Shark Bay, Western Australia. Mol. Ecol., 13,

遺伝的多様性の比較はもとより，種の保全に役立てる

1975-1990.

ことが可能である．さらには，これらの多型情報から

Kulski J. K., Shiina T., Anzai T., 1 , Kohara S. and H.

病気になりやすい個体，なりにくい個体の選別や，近Inoko（2002）：Comparative genomic analysis of the

交弱勢を回避するための交配個体の選別，および繁殖

MHC : the evolution of class I duplication blocks,に有利な個体の選別が可能になることが期待される．

diversity and complexity from shark to man.

謝辞Immunol. Rev., 190, 95-122.
太田正穂（2004）：法医学への応用．猪子英俊・笹月健

この研究を行うにあたり貴重なサンプルを提供して

彦・十字猛夫（監修），輸血検査学．講談社，181-185.

くださった新江ノ島水族館，横浜・八景島シーパラダ

Palsboll, P. J., Berube, M., Larsen, A. H. and H.

イス，南知多ビーチランドの方々に心より感謝の意を

Jorgensen（1997）：Primers for the ampliﬁcation

表したい．

of tri- and tetramer microsatellite loci in baleen

引 用 文 献whales. Mol. Ecol., 6, 893-895.
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