REVIEWAkt シグナル活性化と Hippo シグナル抑制による早発卵巣不全患者の新たな不妊治療法の開発
河村 和弘
聖マリアンナ医科大学

産婦人科学/生殖医療センター

受精にて児の産出に成功した報告がある［ ， ］．また，はじめにヒト卵巣皮質より卵子幹細胞を回収し，重症免疫不全マ
卵巣内には卵子の源となる原始卵胞が存在する．原始ウスに移植して卵子を作成したという報告もある［］．

卵胞は胎生期に形成され，その数はピークに達し約

しかし，こられの方法により作成された卵子を不妊治療万個となる．しかし，出生後に原始卵胞数は増加せず，に用いるには多くの生物学的な検証が必要である．また，加齢とともに減少する．思春期の頃には数十万個の原始倫理的にも十分な議論が必要であり，実際に臨床応用さ卵胞が存在しているが，第れるまでには相当な時間を要すると考えられる．

減数分裂前期の休止期にあり，休眠した状態で卵巣内に保存されている．月経発来

われわれは，POI 患者の卵巣に残存している卵胞を人以降は最大 ， 個/周期の原始卵胞が活性化され，休為的に活性化し，卵胞を発育させて卵子を得 る 方 法

眠状態から脱し発育を開始する．卵巣内の残存原始卵胞（IVA ;数が ， 個以下になると，定期的な卵胞の活性化が停れわれが開発した IVA について，その分子基盤ととも止して卵胞のリクルートが起こらなくなるため，発育卵に概説する．

in vitro activation）を開発した．本稿では，わ胞が認められなくなる．その結果，発育卵胞の顆粒膜細胞より分泌されるエストロゲンが欠乏するため子宮内膜原始卵胞の人為的活性化の増殖が起こらず，同時に排卵も起こらなくなり，黄体］．

休眠した状態で卵巣内に保存されている多数の原始卵早発卵巣不全（POI ; primary ovarian insufficiency）

胞のうち，一部の選択されたものが定期的に何らかのトでは，卵巣内の卵胞が急激に減少し， 歳未満で残存卵リガーとなる刺激を受けて活性化する．最近われわれと胞数が ， 個以下となり閉経となる［

他のグループは，卵胞活性化を制御する機構 と し て由来のプロゲステロン産生がなくなり閉経となる［］．染色体・遺―kinase（PI K）―Akt―Forkheadbox

伝子異常，自己免疫疾患，医原性（卵巣手術，化学療法，Phosphoinositide

放射線療法）などが原因として知られているが，原因不O （Foxo ）シグナル経路が重要な役割を果たすことを明のものも多い［ ， ］．卵巣性の無月経となるため，．PTEN 欠損マウスは胎生致死で明らかにした［ ― ］

下垂体由来のゴナドトロピン（FSH，LH）は高値となあるが，PTEN の卵子特異的な欠損マウスでは，原始卵る．POI の最も有効な治療法は提供卵子を用いた体外受胞が自発的に活性化して一斉に卵胞発育が開始する．そ精胚移植であり，自らの卵子で妊娠することは非常に困の結果，卵巣は腫大し多数の発育卵胞が認められるよう難である．しかし，本邦では提供卵子を得ることは難しになるが，卵巣内の原始卵胞プールは早期に枯渇してしく，希望する者の多くは海外に渡って提供卵子による治まい， 週齢ですでに卵巣内に卵胞を認めず，ヒトの POI療を受けているのが現状である．

．Foxo 欠 損 マ ウ ス もに 似 た 表 現 型 を 呈 す る［ ― ］

POI の患者が自らの卵子で妊娠するためには，卵子のPTEN 欠損マウスと全く同様の卵胞の自発的活性化と産生を再生する必要がある．例えば，体細胞より iPS（in-POI に類似した表現型を最終的に呈する［ ］．卵巣内duced pluripotent stem cell）細胞などの万能細胞を誘の卵胞が原始卵胞のみで構成されている生後導し，始原生殖細胞を経て卵子を作り出す方法が考えら

ウス卵巣を用いて，PTEN 抑制剤および PI K 活性化剤れる．実際，マウスでは iPS 細胞から卵子を作成し体外で一過性に処理したところ，PTEN，Foxo 遺伝子欠損

連絡先：河村和弘，聖マリアンナ医科大学産婦人科学〒 ―神奈川県川崎市宮前区菅生 ― ―TEL ： ― ―（内線）
FAX： ― ―E-mail：kazuhironanami@gmail.com

日目のマ

マウスと同様に，原始卵胞が活性化して発育を開始した［ ］．また，良性卵巣腫瘍の患者の摘出卵巣の正常部分を用いて作製した卵巣断片に対して，PTEN 抑制剤による一過性処理を行うことで，原始卵胞が活性化されるこ

日本生殖内分泌学会雑誌（2015）20 : 15-1815河村和弘

Hippo 䝅䜾䝘䝹ᢚไ
Akt 䝅䜾䝘䝹άᛶ໬༸ᕢ⤌⧊෾⤖ಖᏑ༸ᕢ⓶㉁⤌⧊ᇵ㣴᥇༸⭡⭍㙾ୗ༸ᕢ⮬ᐙ⛣᳜⭡⭍㙾ୗ༸ᕢ᦬ฟయእཷ⢭⬇⛣᳜

図IVA の概要

日目のマウス卵巣にと，PTEN による PI K―Akt 経路の抑制が解除されるか，PTEN 抑制剤および PI K 活性化剤による卵胞活性化をまたは PTEN の抑制作用を上回る PI K―Akt 経路の活性行った後，成体マウスの腎皮膜下に移植した．成体マウ化が生じる．Foxo は核内で細胞周期を停止して原始卵スの卵巣を摘出して内因性ゴナドトロピンレベルを上昇胞が活性化するのを抑制しており，そこに PI K―Akt 経させ，さらに FSH を投与して卵胞発育を促進させたと路のシグナルが伝わると Foxo は核外移行してその機能ころ，移植後 日目に排卵前卵胞まで発育し，hCG 投を失う．その結果，休眠状態にあった原始卵胞が活性化

与により成熟卵子を得ることができた．この成熟卵子をすると考えられる．現在のところ，多数の原始卵胞の中用いて体外受精を行い，胚を偽妊娠マウスに移植したとから一部の活性化する原始卵胞が選択される機構についころ，正常な児を得ることに成功した［ ］．この手法ては不明である．とも示した［ ］．さらに，生後で得られた成熟卵子に対して，代表的なインプリング遺伝子である Igf r，Lit ，H 遺伝子のメチル化解析を行っIVA の臨床応用たところ，正常な遺伝子刷り込みを有しており，紡錘糸を含めた構造上の異常も認められなかった［ ］．われPOI 患者に対する自らの卵子による不妊治療として，われはさらに，上記のヒト卵巣断片に対して PTEN 抑

これまで種々のホルモン療法，排卵誘発などが行われて制剤による原始卵胞の活性化を行い，重症免疫不全マウきたが，その効果は限定的であり，新たな不妊治療法のスの腎皮膜下に移植した．マウスの卵巣を摘出して内因開発が待たれていた．われわれは動物実験にて IVA の性ゴナドトロピンレベルを上昇させ，さらに FSH を投安全性を十分確認した後，この技術を臨床応用して POI与して卵胞発育を促進させたうえで，ヒト原始卵胞が排患者が自らの卵子で妊娠できる新たな不妊治療を，倫理卵前卵胞に到達すると考えられる委員会の承認と患者の同意の下に行った（図ヵ月後に，腎皮膜下）［ ］．に移植した卵巣を摘出した．PTEN 抑制剤処理を行った本法の有効性・安全性に関しては他のグループも追試に卵巣に多数の大きな胞状卵胞を認め，成熟した卵子を得より確認している［ ］．IVA による POI 患者の不妊治ることができた［ ］．

療は以下の手順により実施する．

これらの知見から，卵巣内の原始卵胞は，phosphataseA）腹腔鏡下卵巣摘出：with TENsin homology deleted in chromosome

患者への侵襲を最小限にし，次の卵巣移植手術に備え（PTEN）による PI K―Akt 経路の抑制により活性化が停て術後の腹腔内癒着を最小限にするため，腹腔鏡下手術止し休眠した状態にあると考えられる．この状態で未だによりに卵巣摘出を行う．移植部位は卵管漿膜下として不明の活性化シグナルが選択された原始卵胞に作用する

おり，卵巣摘出時の止血の際には卵巣および卵管にパ

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次卵胞が IVA により発育したと考えられ，ワーソースのダメージが及ばないよう留意する．

していたB）卵巣組織凍結，残存卵胞組織検査：

そのメカニズムの解明を行った．さまざまな探索を行い，摘出した卵巣から髄質を除去し，卵胞が局在している最終的に Hippo シグナルの関与を見い出した．

皮質部分のみとする．卵巣皮質組織の約 ％を固定してHippo シグナルは細胞の増殖や生存を制御しながら臓薄切標本とし，組織学的検索を行って残存卵胞の有無を器の大きさを規定する重要な細胞内シグナルであり，細確認する．必要に応じて卵巣を凍結保存する．凍結方法

胞同士の接着の障害や細胞骨格の変化により不活性化すとしてはガラス化法を用いている．

．通常はエフェクタータンパクである YAP
る［ ― ］

C）卵巣皮質組織培養：（Yes-associated

卵巣皮質組織を〜protein）は Hippo シグナルによりリンmm 大の小断片に細切し，cell酸化され細胞質内に存在しているが，Hippo シグナルがculture insert 上に静置し，PTEN 抑制剤および PI K 活抑制されると，YAP は非リン酸化型となり核内へ移行性化剤を用いて 時間培養を行う．

し，核内転写因子である TEAD と共役して CCN 成長因D）卵巣自家移植：子などを産生し，細胞増殖や血管新生などが起こる［ ，培養終了後に卵巣組織を十分に洗浄し，腹腔鏡下に卵］．IVA では，卵巣を〜mm 大に細切するため，巣移植を行う．移植部位としては，血流が豊富で経腟超

この Hippo シグナルの抑制が起こり顆粒膜細胞が増殖

音波により観察しやすく採卵手技が容易である卵管漿膜して卵胞が発育すると想定した．
マウスおよびヒトの顆粒膜細胞における Hippo シグ下を選択している．

ナル関連遺伝子の発現を調べたところ，すべての HippoE）卵胞発育モニター，体外受精胚移植：
卵巣移植後は，ホルモン検査（LH, FSH, E ）および関連遺伝子が発現していた．また，卵巣の小断片化によ週間毎に調べる．

り Hippo シグナルが抑制され，顆粒膜細胞における YAP

適宜エストロゲン補充下に rFSH/hMG による卵巣刺激の核内移行と，引き続く CCN 成長因子の増加が認めらを行う．卵胞が発育した際には，通常の体外受精と同様れた．一方，CCN 成長因子は卵巣組織培養下で，卵巣の方法で採卵可能である．成熟卵子が得られた場合は，断片化と同様の媒精または顕微授精により受精させる．長期間の低エスた．これまで，細胞骨格のトロゲン状態により，着床に重要な子宮環境が不良であHippo シグナルを抑制することが報告されていた［ ，ることが多いため，胚をガラス化法によりいったん凍結］．われわれは，マウス卵巣の断片化により，一時的保存する．融解胚移植は十分なホルモン補充周期下に子なアクチンの重合が起こり，Hippo シグナルが抑制され宮の状態を詳細に確認したうえで行う．

ることを示した．以上から，卵巣小断片化による経腟超音波検査を行い，卵胞発育を約次卵胞の発育を促進する作用を示しつであるアクチンの重合が次卵

論文公表時の成績を以下に示す．POI 患者 名（平均胞発育の分子機序として，卵巣の小断片化によりアクチ年齢 ．± ．歳，平均無月経期間 ．± ．年）に卵巣ン重合が起こり， その結果 Hippo シグナルが抑制され，摘出を行い，組織学的検査により 名で残存卵胞が確認

YAP の核移行が起こり，CCN 成長因子が産生され卵胞できた．移植後/ 名に卵胞が発育し，/ 名に成が発育する機構が考えられた．

熟卵子を採卵することができた．組織学的検査にて残存卵胞を認めなかった 名に対しても IVA を施行したが，すべての症例でおわりに年間の観察期間中に卵胞発育を認めな
名はわれわれの開発した IVA が適応となるのは，残存卵妊娠初期に流産となったが， 名は順調に妊娠が経過し，胞が存在する POI 患者である．しかし，残存卵胞の存それぞれ ， g の男児， ， g の女児を出産した［ ］．

在を摘出卵巣の組織学的検査以外に判断できる優れた方かった．

名に胚移植を行い，名が妊娠した．

法はない．実際，これまでの卵巣を摘出し組織検査を行っ

Hippo シグナル抑制による 次卵胞発育誘導た患者のうち，半数近くの POI 患者で残存卵胞を認めなかった．そこで現在，残存卵胞の有無を判定すること

ヒトの原始卵胞は，排卵前卵胞まで発育するにはヵが可能な血中バイオマーカーの同定とその超高感度測定月の期間を必要とする［ ， ］ことから，IVA 後の卵法の確立を目指し研究を進めている．このバイオマー

胞発育は卵巣移植後カー測定により，術前に適応を確定することができるとヵ月を経過してから起こると予測していた．しかし，移植後ヵ月以内に発育した症例が期待している．

複数認められ，その原因として原始卵胞のみならず残存REVIEW17河村和弘

謝辞

本研究は日本学術振興会（科学研究費補助金基盤研究 B：，新学術領域研究：，科学研究費基金挑戦的萌芽研究：），喫煙科学研究財団，武田科学振興財団の援助を受けました．

引用文献．Macklon NS, Fauser BC（）Aspects of ovarian follicle
development throughout life. Horm Res ,- .
．Coulam CB, Stringfellow S, Hoefnagel D（）Evidence
for a genetic factor in the etiology of premature ovarianfailure. Fertil Steril,- .
．Nelson LM（）Clinical practice. Primary ovarian insufficiency. N Engl J Med,- .
．De Vos M, Devroey P, Fauser BC（）Primary ovarianinsufficiency. Lancet,- .
．Hayashi K, Ogushi S, Kurimoto K, Shimamoto S, Ohta H,Saitou M（）Offspring from oocytes derived from invitro primordial germ cell-like cells in mice. Science,- .
．Hayashi K, Saitou M（）Generation of eggs frommouse embryonic stem cells and induced pluripotent stemcells. Nat Protoc ,.
．White YA, Woods DC, Takai Y（）Oocyte formation
by mitotically active germ cells purified from ovaries ofreproductive-age women. Nat Med ,- .
．Reddy P, Liu L, Adhikari D Rajareddy S, Shen Y, Du C,Tang W, Hämäläinen T, Peng SL, Lan ZJ, Cooney AJ,Huhtaniemi I, Liu K（）Oocyte-specific deletion of Ptencauses premature activation of the primordial follicle pool.
Science,,- .
．John GB, Gallardo TD, Castrillon DH（）Foxo is a
PI K-dependent molecular switch controlling the initiationof oocyte growth. Dev Biol,- .
．Adhikari D, Liu K（）Molecular mechanisms underlying

18

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.20 2015

the activation of mammalian primordial follicles. Endocr
Rev ,- .
．Castrillon DH, Miao L, Kollipara R, Horner JW, DePinho
RA（）Suppression of ovarian follicle activation in miceby the transcription factor Foxo a. Science,- .
．Li J, Kawamura K, Cheng Y, Liu S, Klein C, Liu S, Duan
EK, Hsueh AJ（）Activation of dormant ovarian follicles
to generate mature eggs. Proc Natl Acad Sci USA,.
．Kawamura K, Cheng Y, Suzuki N, Deguchi M, Sato Y,Takae S, Ho CH, Kawamura N, Tamura M, Hashimoto S,Sugishita Y, Morimoto Y, Hosoi Y, Yoshioka N, Ishizuka
B, Hsueh AJ（）Hippo signaling disruption and Akt
stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc
Natl Acad Sci USA,.
．Adhikari D, Gorre N, Risal S, Zhao Z, Zhang H, Shen Y,Liu K（）The Safe Use of a PTEN Inhibitor for theActivation of Dormant Mouse Primordial Follicles andGeneration of Fertilizable Eggs. PLoS One, , e.
．McGee EA, Hsueh AJ（）Initial and cyclic recruitmentof ovarian follicles. Endocr Rev ,- .
．Pan D（）Hippo signaling in organ size control. Genes
Dev ,- .
．Halder G, Johnson RL（）Hippo signaling : growth control and beyond. Development, - .
．Hergovich A（）Mammalian Hippo signalling : a kinase
network regulated by proteinprotein interactions. Biochem
Soc Trans ,- .
．Holbourn KP, Acharya KR, Perbal B（）The CCN family of proteins : structure-function relationships. Trends
Biochem Sci,- .
．Sansores-Garcia L, Bossuyt W, Wada K Yonemura S, Tao）Modulating F-actin organizaC, Sasaki H, Halder G（tion induces organ growth by affecting the Hippo pathway. EMBO J ,.
．Fernandez BG, Gasoar P, Bras-Pereira C, Jezowska B, Rebelo SR, Janody F（）Actin-Capping Protein and theHippo pathway regulate F-actin and tissue growth in Drosophila. Development,.