研究フロンティア（平成２３年度学術奨励賞受賞論文）

ヒト卵巣顆粒膜細胞における GnIH の生理作用
大石元１，２），矢野哲１），武谷 雄二１），筒井 和義３），
George E. Bentley４），Peter CK Leung２）
１）東京大学医学部産科婦人科
２）British Columbia 大学産婦人科
３）早稲田大学教育・総合科学学術院生物学教室
４）カリフォルニア大学バークレイ校 Helen Willis Neuroscience Institute

はじめにヒトあるいは霊長類では GRP１４７および RFRP―３が視床下部で同定されているが，その機能は明らかになって脊椎動物の生殖腺の発達と機能は，ゴナドトロピンのおらず，生理的意義も不明である［１１，１２］．今回われ放出を刺激する脳ホルモンであるゴナドトロピン放出ホ

われは性腺での GnIH の局所作用に着目し，ヒト卵巣顆ルモン（GnRH）が視床下部ニューロンより分泌される粒膜細胞における RFRP―３の局在と直接的な生理作用をことにより，正に制御されている．一方で生殖腺刺激ホ明らかにした．

ルモンを抑制する脳ホルモンの存在は長く不明であったが，２０００年にゴナドトロピンの放出を抑制する新規の脳ヒト卵巣顆粒膜細胞における RFRP―３とホルモンである GnIH がウズラの視床下部より単離同定

その受容体の発現され，GnIH（gonadotropin-inhibitory hormone）と名付けられた［１］．

体外受精を受ける患者の同意を得たうえで，採卵時に鳥類においては下垂体のゴナドトロピン放出を抑制す得られる黄体化顆粒膜細胞の初代培養系を用いた．RT―るニューロペプチドとして同定された一方，哺乳類ではPCR 法およびウエスタンブロッティング法により黄体GnIH の同族ペプチドとして RFRP―３（RF―amide related４７化顆粒膜細胞での RFRP―３とその受容体である GPR１peptide―３）が同定されており中枢神経系や性腺での発の発現を確認した（図２）．

現が報告されているが，その機能は不明である［２］．

また正常ヒト卵巣組織切片で免疫組織染色を行い，顆４７が同定されている
また RFRP―３の受容体として GPR１４７の局在を認めた．
粒膜細胞での RFRP―３および GPR１

［３］．

GPR１４７は顆粒膜細胞層に局在し一部莢膜細胞層にも存

GnIH の作用点として視床下部 GnRH ニューロンの抑在しており，発育卵胞および黄体で発現していた．一方制，下垂体前葉のゴナドトロピン分泌細胞の抑制，性腺で，RFRP―３は発育卵胞と黄体の顆粒膜細胞層で発現をでの直接的な抑制作用などが報告されている［４］．GnIH認めた（図３）．両者ともに卵胞期後期の成熟卵胞からの生殖腺抑制作用は，視床下部での GnRH あるいは下黄体期での発現を認め，顆粒膜細胞層で両者が共在して垂体レベルでのあるいはゴナドトロピン放出の抑制が最おり，局所での作用が予想された．

も寄与する因子であると考えられているが，性腺でのGnIH および GnIH 受容体の局在が明らかになったこと

ヒト顆粒膜細胞での RFRP―３の作用．
から GnIH の局所作用の関与もありうる（図１）［５―８］哺乳類では RFRP―３のラット精巣あるいはマウス卵巣でヒト生殖における RFRP―３系の機能を明らかにするたの直接作用が報告されており，どちらの報告でもステロめに，体外受精患者から得たヒト黄体化顆粒膜細胞の初イド合成が抑制され，生殖機能抑制に働くものと考えら

期 培 養 系 を 使 用 し た．RFRP―３とともに８―Br―cAMP，れている［９，１０］．

Forskolin，FSH または LH を添加し，プロゲステロン生合成量および細胞内 cAMP 濃度と StAR（steroidogenic

連絡先：大石 元，東京大学医学部産科婦人科〒１１３―８６５５ 東京都文京区本郷７―３―１
TEL：０３―５８００―８６５７FAX：０３―３８１６―２０１７
hooishi-tky@umin.ac.jp

acute regulatory protein）の発現量の変 化 を そ れ ぞ れ
ELISA 法と Real Time qPCR 法にて測定したところ，
FSH，LH，Forskolin にて誘導されたプロゲステロン生合成，細胞内 cAMP 濃度，StAR の発現量は RFRP―３処

日本生殖内分泌学会雑誌（2012）17 : 21-25

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大石元他

図１

性腺における RFRP―３の作用
本研究では GnRH と同様に性腺での局所的な生理作用をもつ可能性を検討した．

プロゲステロン合成系における７の作用点
RFRP―３/GPR１４以上の仮説を明らかにするために，)黄体化顆粒膜細胞において GPR１４７を siRNA 法にてノックダウンし（図７），*RFRP―３の受容体拮抗剤である RF９を添加したところ（図８），RFRP―３によるフォルスコリンまたはゴナドトロピンで刺激されたプロゲステロン生合成の抑制が解除されることが示された．さらに GPR１４７に会合する G 蛋白蛋 i サブユニットの阻害剤である百日咳毒素にて前処理したところ，同様に RFRP―３によるプロゲステロン生合成の上昇抑制作用が阻害された（図９）．
４７によってプロゲステロン合成系が負RFRP―３/GPR１に制御されており，その機序はゴナドトロピンによるアデニルサイクラーゼの活性化を抑制することによるものであることが明らかとなった．
４７の発現の制御については，不明な点
RFRP―３/GPR１が多い．GPR１４７の発現量はフォルスコリンおよびゴナ
図２

ヒト黄体化顆粒膜細胞における RFRP―３と GPR１
４７ドトロピンの処理により変化せず，また RFRP―３処理での発現（A）２人の別々の患者由来の細胞から得た細胞での発現を RT―PCR により検出．

ゴナドトロピン受容体の発現レベルも変化しなかった．

（B）顆粒膜細胞のタンパク抽出液の GPR１４７の発現をウエスタンブロッティングにより検出．

通型受容体であり，そのシグナルは受容体より下流で作

GPR１４７とゴナドトロピン受容体は G 蛋白共役７回膜貫用し，アデニルサイクラーゼの活性調節に収束しているものと予想された（図１０）．

理によって抑制された（図４―６）．８―Br―cAMP で誘導した場合および無刺激状態では，RFRP―３による抑制作まとめ用は認められなかった．以上より RFRP―３の作用は G 蛋
白共役受容体である GPR１４７および G 蛋白αサブユニッ

われわれはヒト GnIH である RFRP―３はヒト卵巣におトを介して，アデニルサイクラーゼを抑制的に制御していて顆粒膜細胞に特異的に発現し，受容体である GPRいることが予想された．

１４７を介してゴナドトロピンのシグナル伝達系を抑制す

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.17 2012

ヒト卵巣顆粒膜細胞における GnIH の生理作用

図３図４

生殖年齢女性の卵巣を用いた RFRP―３および GPR１４７の免疫染色RFRP―３によるヒト黄体化顆粒膜細胞でのプロゲステロン生合成の抑制（n＝５）
異なるアルファベットは p＜０．
０５を示す．
（Tukey test）
図６

RFRP―３によるヒト黄体化顆粒膜細胞での細胞内 cAMP 濃度の抑制（n＝５）

図５

RFRP―３によるヒト黄体化顆粒膜細胞での StAR mRNA の抑制（n＝５）ることを明らかにした．RFRP―３は GPR１４７に特異的に結合し，G 蛋白αi サブユニットを活性化させアデニルサイクラーゼを抑制することにより，ゴナドトロピン刺激で上昇した cAMP 濃度と StAR 発現を減少させ，プロゲステロン生合成を抑制するものと考えられる．

図７

GPR１
４７ノックダウンによる RFRP―３のプロゲステロン生合成抑制作用の解除（n＝５）

研究フロンティア

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大石

図８

元他

RFRP―３アンタゴニスト RF９投与による RFRP―３のプロゲステロン生合成抑制作用の解除（n＝５）
非アミド化 RFRP―３投与では RFRP―３でみられる抑制効果を認めない．

図９

G 蛋白蛋 i サブユニットの阻害剤である百日咳毒素での前処理による，RFRP―３のプロゲステロン生合成抑制作用の解除（n＝５）

４７の作用点図１
０ ゴナドトロピンのシグナル伝達系と RFRP―３/GPR１

ヒト顆粒膜細胞でのステロイド合成の制御に RFRP―３が関与している可能性が示唆された．今後ヒト RFRP―３

引用文献

が生体内で卵胞発育や性ステロイド合成に対してどのような生理的作用をもつのかを明らかにする必要がある．
当研究は研究施設での研究倫理審査により承認されたうえで施行されている．
謝辞

本稿は２０
１
１年度に日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものである．本稿の執筆の機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長 苛原 稔先生，
第１６回学術集会会長 宮本 薫先生，ならびに広報理事 筒井和義先生に感謝いたします．

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.17 2012

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