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U P L O A D
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I

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C

H

E

M

I

C

A

2008 Dec e m b e rVOL.

ホットスタート法対応・色素入り Taq Master Mix

Quick TaqTM HS DyeMix
100bp DNA Ladder
Loading Quick® 100bp DNA Ladder
Quick TaqTM HS DyeMix
a本誌p.1に詳細記事がございます。

CAMPAIGNCELL APPLICATIONS, INC.

ヒト皮膚系細胞、頭髪毛乳頭細胞30%OFFキャンペーン

HOT ITEM
部位特異的変異導入キット

KOD -Plus- Mutagenesis Kit

も
私に ！
た
でき

ライフサイエンス実験シリーズ Vol.7

PCR実戦技術編（3）HOT ITEM
siRNA / shRNA Gene Silencers

TECHNICAL REVIEW『KOD FXを用いた植物ライセートからの直接PCR』

みんなの広場
実験のコツ、失敗・成功談「ペレットバラバラ法」
実験川柳特集8

INFORMATIONBMB2008 バイオテクノロジーセミナーのご案内
カルナバイオサイエンス社製品お取り扱い中止のご案内

L

S

92

No.92.qx 08.11.4 19:02 ページ 1

ホットスタート法対応・色素入り Taq Master Mix

Quick TaqTM HS DyeMix
Taqマスターミックス（ホットスタート法対応）です。色素入りで、そのまま電気泳動可能。
Quick TaqTM HS DyeMixは、Taq DNA polymeraseを含む2×マスターミックス（ホットスタート法対応、電気泳動色素入り）です。
鋳型DNAとプライマーを入れるだけで直ちにPCRを実施することができ、反応溶液をそのまま電気泳動解析に供することができます。
抗Taq抗体がマスターミックスにあらかじめ混合されており、ホットスタート効果により、特異性の高い、高効率な増幅が期待できます。
コロニーダイレクトPCR解析などに最適です。

特長1 2×プレミックス（色素入り）
・2×マスターミックスであり、プライマーを加えるだけで便利にご使用いただけます。色素（BPB）入りなので、PCR後にそのままゲルにアプライ可能です。

特長2 優れたPCR性能

・Quick TaqTM HS DyeMix＊＋ Primers＋ PCR-grade water＊Quick TaqTM HS Dye Mixは2×濃度に調製されています。

・最 適 化 さ れ た バ ッ フ ァ ー 組 成 に よ り 、従 来 の T a q D N A
polymeraseに比べPCR性能が向上しています。

特長3 ホットスタートPCR対応
・抗Taq DNA polymerase抗体によるホットスタート法を採用しており、高い感度と特異性を示します。

サンプル（DNA溶液、大腸菌コロニーなど）

PCR（ホットスタート法）

特長4 高い保存安定性
・凍結融解30回、4℃保存3ヶ月間において安定性を確認しています。

そのまま電気泳動

特長5 コストパフォーマンス良好
・安価な価格帯に設定されていることから、気軽に高効率なPCRを行うことができます。

実施例1 ヒトβ-globin（3.6kb）の増幅
ヒトゲノムDNA（50 ng）を鋳型として、
β-globin 3.6 kbをターゲットに増幅を行いました。反応は、それぞれの試薬の至適条件に従って実施しました。その結果、3を除くすべての試薬において、増幅が認められましたが、Quick TaqTM HS DyeMixにて増幅を行ったものが最も増幅量が多く、良好な結果でした。

M

1

2

3

4

5
鋳型 : ヒトゲノムDNA 50ng / 50 μl反応
M：1kb Ladder
1： Quick TaqTM HS DyeMix
2： A社 ホットスタート法対応Taq Master Mix
3： B社 Taq Master Mix
4： C社 ホットスタート法対応Taq DNA polymerase
5： C社 Taq Master Mix

3.6 kbForward Primer : GGTGTTCCCTTGATG T AGCACA
Reverse Primer : A CATGTATTTGCATGGAAAACAACTC※終濃度0.2μMで使用

2008

92

1

No.92.qx 08.11.4 19:02 ページ 2

実施例2 ヒトp53遺伝子（2.9 kb）の増幅
ヒトゲノムDNA（50 ng）を鋳型として、比較的増幅の難しいとされるヒトp53遺伝子（2.9 kb）の増幅を実施しました。その結果、Quick TaqTM HS DyeMixを用いた場合、最も高効率、かつ特異性の高い結果を得ることができました。また、ホットスタ
ート法を用いなかった場合（レーン3および4）、特異性及び感度の低下が見られました（Quick TaqTM HS DyeMixはホットスタート法に対応しています）。

1

M

2

3

4

＜増幅条件＞

2.9 kb

鋳型 : ヒトゲノムDNA 50ng / 50 μl反応

94℃

2 min.

M：1kb Ladder
1： Quick TaqTM HS DyeMix
2：ホットスタート法対応rTaq DNA polymerase
3： rTaq DNA polymerase
4： C社 Taq Master Mix

94℃

30 sec.

60℃

30 sec.

68℃

3 min.

40 cycles

Forward Primer : AATGGATGAT T TGATGCTGTCCC
Reverse Primer : ATAAGAGCTCCCAAGACT TAG※終濃度0.2μMで使用

実施例3 コロニーダイレクトPCRを用いたインサートチェック
500 bpのインサートを有するプラスミドpTA2を形質転換した大腸菌DH5αのコロニーをサンプルとして、ベクター上に設計したプライマーを用いてPCRを行いました。その結果、インサートサイズに応じた明瞭なバンドを得ることができました。本試薬は、コロニーダイレクトPCRにおいても、力を発揮することが分かりました。

チップなどを使用。
好ましくはクリスタ
ルチップを用いる。

菌体を持ち込みすぎないのがコツ。
（菌が見えない程度でOK）

そのままPCR溶液へ

PCR

レプリカ作製
PCR溶液

1

M

2

3

4

5

N

M

800 bp300 bpM：100bp DNA Ladder
1：コロニー（インサート＋）
2：コロニー（インサート−）3：コロニー（インサート＋）
4：コロニー（インサート＋）
5：コロニー（インサート＋）
N：ネガティブコントロール
M：100 bp DNA Ladder＜増幅条件＞
94℃

2 min.

94℃

30 sec.

62℃

30 sec.

68℃

1 min.

25 cycles

Forward Primer : CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
Reverse Primer : AGCGGA T AACAAT T TCACACAGGAAAC※終濃度0.2μMで使用

品

名

包

Quick TaqTM HS DyeMix

装

保存温度

Code No.

-20℃

DTM-101

装保存温度

Code No.

価

10回用

-20℃

TAK-101¥12,000

250U×1本-20℃

TAP-201¥9,500100μl×1本-20℃

TCP-101¥16,000＊

1.25ml×2本（100回用）

価

格¥9,800*50 μlで反応した場合の反応回数を記載しています。

品

名

高効率TAクローニングキット

TArget CloneTM
rTaq DNA Polymerase（Mg別添タイプ）
ホットスタート用抗Taq抗体

anti-Taq high

包

2

格

2008

92

No.92.qx 08.11.4 19:02 ページ 3

念
発売記 ーンペキャン

100bp DNA Ladder
of f
%
®
0
Loading Quick 100bp DNA Ladder 4■期間：2008年12月1日〜2009年2月27日［ご注文分］

ご好評の100bp DNA Ladder がリニューアルして、よりバンドが明瞭になりました。
本製品は、電気泳動用の100bp ラダーマーカーです。色素別添タイプと泳動用色素（BPB、Orange G）があらかじめ混合された
Ready-to-useタイプ（Loading Quick®）から、選択いただけます。

特長1 明瞭なバンド
DNA濃度（ng/5μl）＊2

・薄くなりがちな100bp、200bpのバンドまで確実に視認できるようになりました。また、全体のバンド強度のバランスを整えることにより、従来品に比べより判別しやすくなりました。

特長2 DNA濃度の推定が容易
・各バンドのDNA量が厳密に調整されているので、バンド強度の比較により、サンプルのDNA量をある程度推定することが可能です。

1,500bp10

1,000bp
900bp
800bp
700bp

10
10
10
10

600bp

10

＊1

特長3 高いコストパフォーマンス

500bp

30

400bp

10

300bp

10

200bp

15

100bp

25

・100回用14,000円と大変お買い得です。

特長4 色素別添、色素入りから選択可能
・通常の色素別添タイプと色素混合タイプ（Loading Quick®）から、選択いただ
けます。
本リニューアルに伴い、従来品（Code No.DNA-030X、＊1 500bpのバンドは強調されています。
＊2 Loading Quick® 100bp DNA Ladder については、（ng/6μl）となります。

DNA-030XX5, DNA-130, DNA-130X5は、終売とな
ります。

品

名

100bp DNA Ladder＊

Loading Quick® 100bp DNA Ladder＊＊

保存温度

Code No.

通常価格

キャンペーン価格

100回用×1本-20℃

DNA-035¥14,000¥8,400（100回用×1本）
×5

-20℃

DNA-035X5¥56,000

対象外

100回用×1本-20℃

DNA-135¥14,000¥8,400（100回用×1本）
×5

-20℃

DNA-135X5¥56,000

対象外

包装＊6×Loading Dye（BPB、Orange G）が添付されている色素別添タイプです。
＊＊色素（BPB、Orange G）があらかじめ混合されている色素混合タイプです。

品

保存温度

Code No.

価-20℃

DNA-031¥20,000

1kb DNA Ladder

300回用×1本-20℃

DNA-032¥22,000

Loading Quick® 50bp DNA Ladder

100回用×1本-20℃

DNA-133¥19,000

100回用×1本-20℃

DNA-131¥15,000

Loading Quick 200bp DNA Ladder

2008

装

100回用×1本®

名

包200bp DNA Ladder

92

3

格

No.92.qx 08.11.4 19:02 ページ 4

価格を変更しております。
現在の情報は、お問い合わせいただきますようお願いいたします。

CELL APPLICATIONS, INC.

ヒト皮膚系細胞、頭髪毛乳頭細胞
30%OFFキャンペーン
ヒト皮膚系細胞と頭髪毛乳頭細胞、及び培地を対象に30%OFFにてご提供します。

期間：2008年12月1日〜2009年2月27日（ご注文分）
CELL APPLICATIONS, INC. は、様々な正常細胞、Total RNA、抗体をご提供
しております。今回、キャンペーンとして、ヒト皮膚系細胞、頭髪毛乳頭細胞、及び関連商品を30%OFFにてご提供させていただきます。これらの細胞は、皮膚の発生・分化、皮膚疾患、紫外線の影響、及び発毛・育毛等の実験にご利用いただける初代細胞です。
CELL APPLICATIONS, INC.のWeb Siteがリニューアルされ、見やすくなりました。ぜひご覧ください。〈 http://cellapplications.com/ 〉
ヒト頭髪毛乳頭細胞

装

CodeNo.

通常価格

キャンペーン価格

ヒト表皮角化細胞（HEK）凍結細胞

品

名

adult

包

1vial

CA10205a￥88,000￥61,600

ヒト表皮角化細胞（HEK）凍結細胞

fetal

1vial

CA10205f￥88,000￥61,600

ヒト表皮角化細胞（HEK）凍結細胞

neonatal

1vial

CA10205n￥72,000￥50,400

ヒト表皮角化細胞（HEK）Total Kit

adult

1kit

CA102K05a￥120,000￥84,000

ヒト表皮角化細胞（HEK）Total Kit

fetal

1kit

CA102K05f￥120,000￥84,000

ヒト表皮角化細胞（HEK）Total Kit

neonatal

1kit

CA102K05n￥104,000￥72,800

ヒト表皮メラニン細胞（HEM）凍結細胞

neonatal

1vial

CA10405n￥87,000￥60,900

ヒト表皮メラニン細胞（HEM）凍結細胞

neonatal, blackdonor

1vial

CA104B05n￥94,000￥65,800

ヒト表皮メラニン細胞（HEM）Total Kit

neonatal

1kit

CA104K05n￥122,000￥85,400

ヒト表皮メラニン細胞（HEM）Total Kit

neonatal, blackdonor

1kit

CA104BK05n￥129,000￥90,300

ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）凍結細胞

adult

1vial

CA10605a￥47,000￥32,900

ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）凍結細胞

fetal

1vial

CA10605f￥85,000￥59,500

ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）凍結細胞

neonatal

1vial

CA10605n￥70,000￥49,000

ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）Total Kit

adult

1kit

CA106K05a￥83,000￥58,100

ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）Total Kit

fetal

1kit

CA106K05f￥122,000￥85,400

ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）Total Kit

neonatal

1kit

CA106K05n￥106,000￥74,200

ヒト頭髪毛乳頭細胞（HFDPC）凍結細胞

adult

1vial

CA60205a￥137,000￥95,900

ヒト表皮角化細胞基本培地

500ml

CA130500￥14,000￥9,800ヒト表皮角化細胞増殖培地（基本培地＋添加剤）

500ml

CA131500￥20,000￥14,000

ヒト表皮角化細胞カルシウムフリー基本培地

500ml

CA132500￥14,000￥9,800ヒト表皮角化細胞カルシウムフリー増殖培地（基本培地＋添加剤）

500ml

CA133500￥21,000￥14,700

ヒト表皮メラニン細胞基本培地

500ml

CA134500￥14,000￥9,800ヒト表皮メラニン細胞増殖培地（基本培地＋添加剤）

500ml

CA135500￥23,000￥16,100

ヒト皮膚線維芽細胞基本培地

500ml

CA115500￥12,000￥8,400ヒト皮膚線維芽細胞増殖培地（基本培地＋添加剤）

500ml

CA116500￥23,000￥16,100

ヒト頭髪毛乳頭細胞増殖培地（基本培地＋添加剤）

250ml

TMTPGM-250￥18,000￥12,600※1.Total Kitには、各細胞1vial,各細胞用増殖培地、サブカルチャー試薬セット（A）（CA090K）が含まれます。細胞1vialには、5×105cellsが含まれます。サブカルチャー試薬
セット（A）には、ハンクス緩衝液、トリプシン-EDTA溶液、
トリプシン中和液が各100ml含まれます。
※2.保存温度は、細胞:液体窒素、培地、サブカルチャー試薬セット（A）:-20℃です。TMTPGM-250は、4℃と -20℃になります。
※3.本細胞は、HIV、HBV、HCV、
マイコプラズマ、酵母、真菌陰性が確認されています。

4

2008

92

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 5

部位特異的変異導入キット

KOD -Plus- Mutagenesis Kit

ントセ ル
コンピテ
で

とセット
得に！
さらに お

KOD -Plus- を用いたInverse PCR法に基づく部位特異的変異導入キットです。幅広い変異導入が可能です。
本製品は、KOD -Plus-の高い正確性を活かした、Inverse PCR法に基

一口メモ

づく部位特異的変異導入キットです。Inverse PCR法では、プラスミドを鋳型として、逆向きに設定したプライマーを用いてPCRを行い、プラスミ
ド全周の増幅を行います。その際、導入したい変異や挿入配列を付加したプライマーを用いることにより、様々な変異を導入することができます。
本製品には、形質転換までに必要な全ての試薬および詳細なプロトコールが含まれています。

●KOD -Plus-は、
KOD DNA polymeraseに、
常温で活性を抑える2種類の抗体を加えたホットスタート対応型高正確性
PCR用酵素です。Taq DNA polymeraseの約80倍の正確性（fidelity）
を有し、正確性を要するPCRに最適です。
メチル化されたDNAを基質として切断●制限酵素Dpn Ⅰは、します。通常のメチラーゼを発現している大腸菌（JM109
やDH5α）
から得られたプラスミ
ドは、Dpn Ⅰサイトがメチル化されており、本酵素を用いて選択的に分解することができます。

特長1 幅広い変異導入に対応
・Inverse PCR法の採用により、数bpの置換、挿入、欠失のみでなく、数10bpの挿入（Tagの導入）や数100bpの欠失等にも対応可能です。また、特定部位のアミノ酸を20
種類のアミノ酸に置換するなどのアミノ酸点変更ライブ
ラリーの作製（Saturation Mutagenesis）も可能です。
Substitution

Deletion

Insertion

図1．置換、欠失、及び挿入の各変異導入プライマー設計例

特長2 確実な変異導入
・最大95％ の変異導入効率が得られます。また、KOD-Plus-の採用、およびPCRサイクル数を最小限に設定するなど条件の最適化により、2nd-site mutation（目的とする変異以外の変異）が入る可能性を最小限にしています。
最長約11kbのプラスミドで変異導入を確認済みです。

特長3 簡単プロトコール＊・本製品では、PCR産物のSelf-ligationを、KinaseとLigaseを同時に反応させて行います。従って、PCR
Primerのリン酸化は不要です。また、形質転換まで3ステップの簡単なプロトコールとなっています（図2）。
図2．KOD -Plus- Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法による変異導入フロー＊特許出願中装

保存温度

Code No.

価

KOD -Plus- Mutagenesis Kit*

20回用

-20℃

SMK-101￥38,000

Competent high DH5α 関連商品

100μl×10本

液体窒素、-20℃

DNA-903￥17,000

1セット

液体窒素、-20℃

SMK101/DNA903

品

名KOD -Plus- Mutagenesis DH5α Set**

包格￥52,250 5%OFF* 本製品には、以下の試薬が含まれています。KOD -Plus-, 10x Buffer for iPCR, 2mM dNTPs, Dpn Ⅰ, T4 Polynucleotide Kinase, Ligation
high, Control Plasmid, Control Primer #1, Control Primer #2.
**KOD -Plus- Mutagenesis DH5α Set（Code No.SMK101/DNA903）は、KOD -Plus- Mutagenesis Kit（￥38,000→￥36,100）とCompetent high DH5α（￥17,000→￥16,150）のセット販売です。

2008

92

5

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私 にも
！
できた

ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

P C R 実 戦 技 術 編（3）本シリーズは、市販のノウハウ本や実施例集ではカバーできなかったようなライフサイエンス実験のコ
ツなどについて、弊社研究員の実験ノートなども参考に、生の事例を交えながら紹介させていただいています。前々号から、最もリクエストの多かったPCR関連技術を更に深くご紹介する目的で、「PCR実戦技術編」をお届けしています。
前号では、Sリーダーから難問が出題され、その問題をめぐって、A子さんとライバルのN代さんの間でバトルの予感が漂っていましたが…。
皆さんも、是非、前号で2人の考えた解答を確認してから、本号を読み進めてください。

題
の課 ト
号
ス
前
ジェ
イ
ダ

●課題：次に示す発現ベクターのSD（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンの間にある余分な塩基を、なるべく簡単な方法を用いて取り除き、連結してください。

〈条件〉
この図に示した¡SD配列と開始コドン（ATG）の間の塩基数を5〜6塩基にすること。 ¡本プラスミド中には、
Eco RV, PstⅠ, SphⅠ, Bam HⅠの配列は¡使用できる方法は以下のとおり。
ここに示したサイト以外は存在しません。
・各制限酵素での切断
・KOD DNA polymerase＊を用いる平滑化
・T4 DNA Ligaseによる結合＊5 →3 DNA polymerase活性と・PCR（任意の場所にプライマーを設計可能）
3 →5 Exonuclease活性を有しています。
・T4 Polynucleaotide Kinaseを用いるDNAのリン酸化
図1

図2

！
注意！

A子さんの解答

上の二人の解答には間違いが含まれている可能性があります。

図3

発現プラスミドの部分配列

N代さんの解答

今までの登場人物

本シリーズは、弊社ウェブサイト
（http://www.toyobo.co.jp/bio）の「実験お助けコーナー」でご覧いただけます。

N代さん
A子さん
Sリーダー
冷静沈着なライフ 今年入社4年目 今年入社3年目になる研究員サイエンスグルー になる研究員（A子さんのライバル）
プのリーダー

S本さん
アシスタント

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

1No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 7

1

ポリメラーゼの進む道

様々な実験に用いられるDNAポリメラーゼですが、意外とその性質をよく理解せずに使われている方もいらっしゃるのではないでしょうか？ 今回は、DNAポリメラーゼを中心に、その原理と応用について解説いたします。

1-1 DNA配列の末端によく付いている5'や3'って何の数字？
ポリメラーゼ関連の説明を読んでいると5'や3'などという数字が頻繁にでてきます。この数字に何の意味があるのかと思われた方も多いのではないでしょうか？
この数字は主に核酸の方向性を示すために付けられています。
核酸は、塩基、糖（[デオキシ]リボース）、及びリン酸が長く繋がった構造を持ちます。その中で、ヌクレオチド間の結合の方向性に大きく関与しているのは、（デオキシ）リボースであり、その結合を仲介しているのがリン酸基です。RNAに用いられているリボースを例に挙げると、
この糖は5単糖（ペントース）であり、それら5DNAつの炭素には1'から5'という番号（塩基にも番号が付いているため、区別するために「'」をつけて表現します）が振られています。
リボースは、その2'、3'、5'の位置にOH基を有していると表現されます。DNAに用いられているデオキシリボースでは、2'のOHがH（デ[無い]オキシ[酸素]）になっています。どちらの糖においても3'と5'のOH基が連結に用いられています。
この連結反応を触媒する酵素がDNAポリメラーゼです。図4

Hに、DNAの連結反応を示します。基本的にこの反応は、DNAの3'末端に存在するOH基の酸素の電子が、dNTPの5'OHに結合したα位のリン酸基を攻撃する、いわゆる「求核反応」です。その

図4 DNAポリメラーゼの触媒する反応：求核反応

反応によって、DNAは5'から3'末端側に向かって伸長します。この反応は原理上、逆へは決して進行することはありません。

1-2 サンガー法（ジデオキシ法）を用いるシーケンス法はポリメラーゼの性質を利用している
dNTPの3'のOHがHになったddNTP（ジデオキシNTP）は、
多くのDNAポリメラーゼによって通常のdNTPと区別無くDNAの3'末端に取り込まれます。しかし、このddNTPが取り込まれたTemplate DNA

DNAの3'末端はOH基を持たないため、伸長反応はこの段階でストップしてしまいます。よって古くから、ddNTPはDNAポリメ
ラーゼの阻害剤として知られていました。
この阻害剤の利用方法をいち早く見出したのが、Frederic
Sangerでした。DNAポリメラーゼの反応溶液に微量のddNTPを添加すると、ddNTPはランダムに取り込まれ、様々な所で伸長の止まった産物が生じます。この反応をそれぞれの塩基種について行い、1baseの違いが見分けられる電気泳動法を用いて分離し、ラジオアイソトープなど指標にして検出することにより、DNA配列を知ることができます（図5）。これがいわゆるサンガー法（ジデオキシ法）1)の原理であり、この方法は現在一般的に用いられているシーケンサーにも使われています。
現在のシーケンス解析では、4種類の蛍光色素で標識された
ddNTPを用いて一度に反応させることができるようになったた

図5 サンガー法によるシーケンスの原理

め、以前のように巨大なゲル板を作る必要もなくなったため、と

論文1)が発表された1977年当時、既に60歳に近かったことにても便利になりました。また自動で分析した結果がコンピュータ
ーに出力されるため、全くこの原理を意識せずにシーケンス解析

なります。ちなみに、この論文の筆頭著者はSanger博士です。
見習いたいものです。

を行うことが可能です。皆さんはいかがでしょうか？
ところで、Sanger博士は「核酸の塩基配列の決定」に関して、

1) F. Sanger, S. Nicklen and A.R. Coulson, DNA

1980年に2度目のノーベル化学賞を受賞しています（1度目はsequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.

「インスリンの構造研究（ ペプチドの配列決定 ）」1958年 ）。
Sanger博士は1918年生まれですので、有名なシーケンス法のNatl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977)

2 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
できた

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 8

1-3 DNAを削る活性いろいろ
通常DNAポリメラーゼには、DNAを末端から削る活性を有しているものが多く存在します。この削る活性（エキソヌクレアー

た部分は、ポリメラーゼ活性によって埋めることができませんので、細かい修復には使えない活性であるといえます。

ゼ活性）は5'→3'の活性と3'→5'の活性の2種類が知られています。これらの活性のうち、5'→3'活性はDNA複製時のラギング鎖

5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有するPCR酵素としてはT a q D N A p o l y m e r a s e な ど が あ りま す 。T a q D N Aの合成に用いられた岡崎フラグメントなどのRNAプライマーを

polymeraseのこの活性は、リアルタイムPCRで用いられる

分解する活性として、3'→5'活性はDNA合成時の塩基の取り込
みエラーの修復に関わる活性として進化してきたものと考えられ

TaqMan®プローブを分解する用途などに応用されています。一方、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するPCR酵素としてはています。
これらの原理はDNA合成の機構（図4）を考えると良く理解で

KOD DNA polymeraseなどがあり、この活性のおかげでこの酵素はTaqの数十倍という高い正確性を発揮することが可能にきます。例えば、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性によって削られなっています。

1-4 制限酵素消化末端の平滑化
3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて制限酵素切断末端の平滑化が可能です。この用途には従ないかなどと思いがちですので、気をつけてください。
また、
制限酵素処理した5'末端にはリン酸基が残っていますが、

来、T4 DNA polymeraseを用いることが多かったのですが、KOD DNA polymeraseも強い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性

時々、このリン酸基がポリメラーゼを用いる平滑化によってどのようになるのか心配される方がいるようです。図6を見ていたを有しており、効率よくDNA末端を平滑化することができるた
め、最近頻繁に用いられるようになりました。

だくと一目瞭然ですが、5'のリン酸基は全く影響を受けませんので、ご安心ください。

平滑化には、図6に示すようにポリメラーゼ活性と3'→5'エキ
ソヌクレアーゼ活性が関与します。しかしここで、「では、平滑化された後の末端は3'→5'エキソヌクレアーゼ活性で削られないの？」という疑問が湧き上がってくるかも知れません。確かにその通りで、平滑化された後も多少ですが末端は削られているようです。ただし、dNTPが存在する限りにおいてポリメラーゼ活性と平衡状態が成立しているため、それほど大きく削られることはなく、ほとんどの末端は平均して平滑化されていると考えられます。
逆に、dNTPが存在しない場合は、大きく末端が削られるということになりますので注意が必要です。ですから、T4やKOD
DNA polymeraseを用いて末端平滑化を行う場合、dNTPsを最初に入れることを忘れないようにしなくてはなりません。時々、3'突出部分を削るだけなのでdNTPは入れなくても良いのでは

図6 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼによる末端平滑化の原理

1-5 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性の無いポリメラーゼでは？
1-4に示したように、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する
DNAポリメラーゼによってDNA末端を平滑化することができ

ノイズの原因となるため、一般的にこの5'→3'エキソヌクレアー
ゼ活性を欠失させた酵素が用いられているようです。

ます。
それなら、5'突出末端を埋めるだけであれば、「Taq DNA
polymeraseなどの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性の無い酵素も使用できるのでは？」と思われる方もいらっしゃるかも知れま
せん。しかし、そううまくはいきません。多くのDNAポリメラーゼ
はターミナルトランスフェラーゼ活性を有しているため、3'末端に1塩基（多くの場合アデニン）の付加が起こってしまいます。この活性を逆手に取ったのが、いわゆるTAクローニング法です。
このターミナルトランスフェラーゼ活性は、当然、KOD DNA
polymeraseなどにも存在するのですが、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性によって平滑化されるため、見かけ上は、この活性が無いようにみえます。
さらに、Taqなどの酵素は5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有していますが、この活性はそれほど高くないため、大きな問題とはならないようです。しかし、シーケンス解析などを行う際には、

図7 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を示さないポリメラーゼによる末端平滑化
の原理

私 にも
！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

3No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 92

実戦−その3−

A子さんとN代さんはT社バイオ研究所のライフサイエンス試薬開発グルー
プの研究員です。先ほどからなにやら、Sリーダーの前で火花を散らしているようです。実は、つい先ほど2人に問題が出され、その解答がSリーダーに提出されたところなのです（表紙参照）。

2-1 A子さんの落とし穴
2人の解答を見終わったSリーダーは、まずA子さんに向かって、DNA鎖の伸長反応を化学式で書いてみるよう指示しました。最初から自信がなかったのかA子さんはビクビクしているようです。そして、反応式を描いていたA
子さんは自分のミスにハタと気づきました（図4参照）。DNA鎖が3'側から5'側へ向かって伸長することはまずありません。よって、A子さんのような実験（図2）を行うと、逆に頭の部分が削られてしまうことになります。
A子さんは、いつもDNAの方向性を考えると頭が混乱してしまいます。しかし、今回のように化学反応を頭の中で考えることで方向性について理解しやすくなることに気づきました。
隣で、N代さんは涼しい顔でやり取りを見ています。

2-2 N代さんの落とし穴
次はN代さんの番です。N代さんの平滑化の考え方には特に問題は無いようです（図3）。
しかし、Sリーダーからは、「この前の失敗の反省が生かされていなのでは？」という言葉が投げかけられました。前回、N代さん
は、考え方は正しかったのですが、クローニングしたORF中に致命的な制限酵素サイトが含まれていたのでした。クローニングされた後の断片の配列を確認しなかったN代さんのケアレスミス
でした。
その時、
「もしかして、まさか！…」という思いがN代さんの脳裏をかすめました。そして、恐る恐る出来上がった配列を確認してみました。
そして気づきました。あろうことか、SD配列の直下にライゲー
ションによって予期せぬ開始コドン(ATG)ができているではありませんか！ 確かに、その下流には今回のORFに由来する開始コ

図8 N代さんの方法でできるクローン

ドンはありますが、SD配列直下の開始コドンの方が優先的に用いられ、フレームのずれたタンパク質が主にできてしまうことになります（図8）。

ワンポイントアドバイス ①
今回の例では、思わぬところに開始コドンが生じてしまうというミスでしたが、その他にも気づいてみたら思わぬサイトが生じてしまっていたという話もよく聞きます。以下に、ありがちなミスを列挙します。

①は今回のN代さんの失敗、②はC末端にタグなどを付加した場合に起きがちな失敗、③は様々な予期せぬ機能を持ったサイトができてしまうという失敗です。この③は、タンパク質にリンカーを介してタグ配列を付加するような場合には特に注意が必要です。システインサイトができて、発現させたタンパク質が2量体化したという笑い話などもあるようですので、ご注意を！

4 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
できた

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 10

2-3 種明かしてプラスミド全体を増幅します。その後、増幅産物をリン酸化しさて、今回の解析例ですが、どのようなものだったのでしょう

た後に（最初にプライマーをリン酸化しておくことも可能）、ライか？ 以下、Sリーダーの示した一例です。

ゲーション反応（ 環状化 ）を行い、その環状化したプラスミド

最も簡単な方法の一つはインバースPCRを用いる方法です。

DNAを用いて大腸菌を形質転換します。この方法を用いると、インバースPCRとは本来図9に示すように、部分配列しか分かっ

比較的簡単に欠失変異体を作製することができます。ポイントは、ていないようなDNAの周辺配列を解析する方法の一つです。具

高正確性PCR酵素を用いることです。でないと、当然予期せぬ

体的には、環状DNAの一領域から外に向かってプライマーを設

変異（PCRエラー）が導入されますし、増幅末端にAが付加され計し、環状化したDNA全体を増幅するのが特徴です。そのPCRるため、環状化させることができません。

産物を解析することで遺伝子全体の配列が分かるという仕組み

ところで、インバースPCRはかなり単純な方法なのですが、様々な試薬を用いる必要があるため、弊社ではインバースPCRです。

法 を 用 い る 部 位 特 異 的 変 異 導 入 キット『 K O D - P l u s Mutagenesis Kit (Code No. SMK-101)』を開発しました。
このキットには、図10にはない、鋳型プラスミドを消去する仕組
みなども組み込まれているため、簡便に変異導入実験を行うことができます。この方法については、次号で詳しく説明する予定ですが、この方法は配列置換や配列挿入などにおいても力を発揮する方法です。
図11にインバースPCR法を用いる今回の解答例を示します。
方法は、欠損させたい領域を挟んで背中合わせにプライマーを

図9 インバースPCRによる未知遺伝子の解析

この方法の、環状化DNAから先の工程を応用することによって、変異導入実験を容易に行うことが可能なのです。以下、インバースPCR法を用いるデリーションミュータント（欠失変異体）の作製方法について説明します。
まず、図10に示すように、プラスミド上の欠失させたい配列を挟んで背中合わせにプライマーを設計します。その後、KOD-Plus-(Code No. KOD-201)などの高正確性PCR酵素を用い

図11 インバースPCRを用いる今回の解答例

設計し、図10のように増幅した後、再環状化します。今回の場合、
SD配列と開始コドンの間を5〜6塩基にするということでしたので、図11のPrimer FとRに示すようなプライマーを設計すると良いと考えられます。この場合も、接合部に開始コドンができな
いように気をつけてください。
プライマーの設計法は、通常のPCRプライマーの設計方法に従えば問題ありません。注意点としては、ベクターの大きさによってはPCR効率が低くなってしまうことです。ですから、あまりに
図10 インバースPCR法を用いる欠失変異体の作製も大きなベクターを用いなくてはならないときは、まずは目的遺伝子を小さなベクターにサブクローニングしておいて、変異導入を行った後に、大きなベクターに移し変えるような対策が必要な場合もでてきます。
（a 配列置換と挿入については、次号にてご紹介いたします）

私 にも！
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5No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 11

KOD FX活 動 報 告 3.

クルードサンプルからのPCR（2）KOD FXは、難しい配列のPCRや、
クルードサンプルからのPCRなどにおいて力を発揮する高成功率PCR酵素です。
先月は、血液を直接サンプルとして用いるPCR【プロトコール＃1】KOD FXの基本反応条件法ご紹介しました。そこで今回は、最近、トランスジ
試薬添加量(μl)終濃度ェニックマウスなどの解析で頻繁に行われるマウス
2×PCR buffer for KOD FX
25
1×テールをサンプルとしたPCRについて検討を行い
10
0.4 mM each
2mM dNTPs
1.5
0.3 μM
10pmol/μl Primer #1
ました。この方法を用いることによって、煩雑な
1.5
0.3 μM
10pmol/μl Primer #2
Genomic DNA : 〜200 ng/50μl
DNAの精製なしで、高効率にマウステールからのPlasmid DNA : 〜50 ng/50μl
X
Template DNA
cDNA: 〜200 ng（RNA相当量）/50 μl
PCRが可能になります。
また今回、増幅産物の制
クルードサンプル : 〜2 μl
限酵素処理についても検討を行いました。
Y
PCR grade water
KOD FX（1.0 U/μl）
Total

1
1.0 U / 50 μl
50（μl）●マウステールの前処理方法
2ステップサイクル

アルカリ溶解法

マウス
テール（約3mm）

マイクロ
チューブへ

1

2

3ステップサイクル

ステップダウンサイクル
50 mM NaOH 180μl添加
Vortexにて良く攪拌3

95℃・10 min.
※プライマーのTm値が73℃未満の場合は、3ステップサイクルで行います。

1M Tris-HCl（pH8.0） 20μl添加
Vortexにて良く攪拌4

遠心（12,000 rpm, 10 min.）【PCR、制限酵素切断条件】
Primer F :5'-CCACAGAATCCAAGTCGGAACTCTTG-3' （26 mer）
Primer R :5'-GTAGCAGTGGTGGTATTATACATGGTG-3'（27 mer）

上清0.5〜2μlをPCR反応液に添加（マウステールは完全には溶解しません）

ターゲット :Mouse membrane glycoprotein（Thy-Ⅰ）gene〈M10246〉（約2.6kb）

5

上記プライマーを用い、2ステップサイクル（伸長時間2.5min、
30サイクル、※熱アルカリ溶液の取り扱いに十分ご注意ください。

サンプル0.5μl使用）
にてPCRを実施しました。
また、増幅された溶液（未精製）10μlに様々な制限酵素を1μl（約10 U）添加し、37℃、1時間の条件で図12 アルカリ溶解法フロー

切断を行いました。

●結果
従来、マウステールを用いる遺伝子解析では、Proteinase K処理、及びエタノール沈殿などを用いて精製したDNAを用いることが多く、サンプルの調製に大変な時間を要していました。しかし、今回の検討によって、KOD FXを用いること
でアルカリ溶解法などの簡便な方法で調製したクルードなサンプルを用いても効率よく増幅できることが示されました。
また、本方法によって増幅したPCR産物は、少なくとも今回試した制限酵素においては精製なしでそのまま制限酵素によって切断可能であることが分かりました。
KOD FXは、夾雑物による阻害に大変強いという特性を有しており、今回の例以外に、植物ライセートや酵母などのサンプルにおいても良好な増幅結果が得られています。
TaqベースPCR酵素

KOD FX
M

A社高効率
PCR酵素

M

M

1

2

3

4

M

PCR産物
M

（n=2）
M: 1kb Ladder Marker

1 μl（約10 U）

Total

11 μl

M: 1kb Ladder Marker

図13 マウステールライセートを用いたPCRの結果

私 にも
！
できた

10 μl

制限酵素

1 : 未消化
2：XhoⅠ
3：Eco RV
4：PstⅠ
5：SacⅠ

2.6 kb6 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ【PCR産物（未精製）の制限酵素処理】

5

B社LongPCR酵素

図14 PCR産物の制限酵素消化結果⇒

37℃、60 min

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 12

2-4 次なるSリーダーからの課題
それにしても、今回の課題も2人にとってかなり勉強になったようです。今まであまり意識せずに行ってきた実験も、今回のことで原理を考えてから実行するようになるはずです。と、そこへSリーダーから次なる課題のメールが届いたようです。

●大腸菌のDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）を発現するベクターがあります。そのDHFRのN末端にタグ配列を付加するにはどのようなプライマーを設計すれば良いですか？
〈条件〉¡インバースPCR法を用いること。
¡タグのアミノ酸配列は以下のとおり。
Leu-Ⅰle-Arg-Arg-Ⅰle（L-Ⅰ-R-R-Ⅰ）

DHFR

タグは開始コドンの隣りに挿入すること。
¡発現は大腸菌で行います。
図15 DHFR発現ベクター

この課題を見て、A子さんは、インバースPCR法の原理を忠実に頭の中で再現しつつ、プライマーを思い浮かべているようです。一方、N代さんは、タグのアミノ酸配列を、真剣に見つめています。
悩んだ結果、A子さんは、図16のようなプライマーを設計しました。タグの部分は、コドン表を眺めつつ適当に対応する配列を入れたようです。一方、N代さんはコドン表と何やらインターネットの画面をにらみながら、タグのアミノ酸配列に相当する部分の配列を念入りに決定しているようです。結局、N代さんは図17のようなプライマーを設計しました。N代さんのプライマーはA子さんのプライマーとは何やら少し異なるコンセプトで設計されているようです。

図16 A子さんの解答

図17 N代さんの解答（ループで示してある部分をプライマー中央に挿入）

2人の解答を見た瞬間、またしてもSリーダーのメガネが突然ぎらりと輝きました。
その横で、アシスタントのS本さんはなにやら胸騒ぎがしています。
「もしかして…また思わぬ罠が仕掛けてあるのではないか？」と。
さて、皆さんならば、どのようなプライマーを設計しますか？
みなさんも2人の解答が正しいかどうかを、吟味してみてくだ

研究所の周りは、既に晩秋かさい。
【注意：2人の解答には間違いが含まれている可能性がら初冬の気配が漂い始めていありますので、上の図を実験の参考にはしないでください。
】

ます。では、次回お会いしましょう。

2人の解答の解説は、次号「PCR実戦技術編（4）」でお届けする予定です。

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

7

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 13

KOD FXでクルードサンプルを鋳型に用いる
場合、何かコツや注意点はありますか？

インバースPCRを用いる変異導入に向くPCR
酵素はどうようなものですか？

KOD FXは、
クルードサンプルに対し高い耐性を示しま
すが、増幅が見られない場合はサンプル量を少なくする
方向で検討します。また、2ステップサイクルよりも3ステップサイクルの方が安定した結果が得られる場合があります。

この方法に必要なPCR酵素の特性として、①高正確であること、②平滑末端産物を生成すること、及び③高効率であることを挙げることができます。この観点から最も適している酵素として、KOD -Plus-（Code No. KOD201）やKOD -Plus- Ver.2（Code No. KOD-211）
を挙げることができます。
「KOD -Plus- Mutagenesis（Code No. SMK-101）」
は、KOD -Plus-を用いる部位特異的変異導入キットで、変異導入に必要な試薬がすべて添付してあるため、とても簡単に変更導入実験を行うことができます。
また、KOD FX (Code No. KFX-101)もKOD -Plusに比べて正確性は低い（KOD -Plus-及びKOD -PlusVer.2はTaq DNA polymeraseの約80倍、KOD FXは約10倍）ですが、上記すべての条件は満たしていますので、本用途に用いることが可能です。

また、サイクル数は通常30サイクルで十分増幅が得られますが、ターゲット長やサンプルによっては、増幅が低下する場合があります。このような場合には、35〜40サ
イクル程度までサイクル数を増やすことで良好な結果が得られることがあります。
さらに、今回ご紹介したようにクルードサンプルを直接PCR反応に持ち込む場合、Proteinase KやSDSなどが含まれる処理液を用いないように注意してください。これ
らの成分の活性が残っていると、PCR酵素などが不活性化されてしまいます。

KOD FXをマルチプレックスPCRに応用したいのですが、コツはありますか？
プライマーを等モルで添加した場合、どちらかの増幅産物が増幅しすぎてしまうことがあります。その場合、添加するプライマー量の比を検討してください。一般的には、増幅の悪かった方のプライマー量を1.5倍程度に増やし、サイクル数を少なくする方向で検討することで良好な結果が得られることがあります。

関連製品紹介品

名用KOD -Plus-

装

Code No.

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KOD-201￥30,000

格〃

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8 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ（さらに高効率）（Hot start可能）

磁性分離（磁性スタンド）TA Cloning vector
〃

私 にも
！
できた

（KOD専用）No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 14

本製品はすでに販売を中止しております。

siRNA / shRNA Gene Silencers

ヒト、マウスそれぞれ2万種類以上そろえております。この度、shRNAが加わりました。
Santa Cruz Biotechnology 社では、ヒト、マウスそれぞれ2万種類以上のプリメイドsiRNA(small interfering RNA)をご提供
しております。これらは推定されている、タンパク質をコードする遺伝子の約99%に相当します。また、ターゲット遺伝子発現抑制を確認するための抗体、RT-PCR Primer Set、
トランスフェクション試薬、コントロールsiRNAなど、実験をサポートする試薬類も取りそろえております。
更に、この度、shRNA（short hairpin RNA）の販売を開始いたしました。ぜひ、遺伝子抑制実験にSanta Cruz Biotechnology
社のsiRNA、及びshRNAをお役立てください。

B

A
132 K

A
← ICAM-1

90 K

B

55 K

43 K

← Actin

図1. ICAM-1 siRNA（m）（Code No.SASC29355）実施例

図2. p53 siRNA（h）（Code No. SASC29435）実施例<ウェスタンブロット法にて解析＞
Lane A : トランスフェクションを行っていないRAW 264.7細胞
Lane B : ICAM-1siRNA（m）をトランスフェクションしたRAW 264.7細胞
抗ICAM-1抗体（SASC1511）, 抗Actin 抗体（SASC1616）で検出<蛍光免疫法にて解析＞
A : トランスフェクションを行っていないHeLa細胞
B : p53 siRNA（h）をトランスフェクションしたHeLa細胞
抗p53 抗体（SASC6243）で検出●Santa Cruz Biotechnology社製品検索コーナーにて様々な検索ができるようになりました。

1

弊社ウェブページ（www.toyobo.co.jp/bio）

2「Santa Cruz Biotechnology」バナー

3

製品検索

製品名、カタログ番号だけでなく、遺伝子名、NCBI GENE ID などでも検索可能です。是非、お試しください。

品

名

包

装

保存温度

Code No.

価

格siRNA Gene Silencer [10μM]

50〜100回用-20℃

各種￥47,000

Control siRNA-A [10μM]

10〜20回用-20℃

SASC37007￥14,000

Control siRNA（Fluorescein Conjugate）-A [10μM]

10〜20回用-20℃

SASC36869￥20,000

siRNA Transfection Reagent

0.3ml

4℃

SASC29528￥26,000

siRNA Dilution Buffer

1.5ml

4℃

SASC29527￥1,000siRNA Transfection Medium

20ml

4℃

SASC36868￥2,000shRNA Plasmid

20μg

-20℃

各種

￥97,000

Control shRNA

Plasmid-A

20μg

-20℃

SASC108060￥16,000

shRNA Plasmid Transfection Reagent

0.2ml

4℃

SASC108061￥14,000

shRNA Plasmid Transfection Medium

20ml

4℃

SASC108062￥2,000Control Antibody [200μg/ml]※

1ml※

4℃（一部-20℃）

各種￥49,000

RT-PCR Primer[10μM]

20μl

-20℃

各種

￥5,000※※一部例外がございます。カタログ、Web site にてご確認いただきますよう、お願いします。

14

2008

92

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 15『KOD FXを用いた植物ライセートからの直接PCR』
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 杉山 明生
はじめ に『KOD FX』は、様々な優れた特性を有するPCR酵素『KOD DNA Polymerase』をベースに開発された高性能PCR試薬です。
本酵素は、優れた「増幅成功率」、「増幅効率」、「伸長性」を示し、幅広いPCRにおいて確実にPCR産物を得ることができます。特に、本酵素では、クルードなサンプルを鋳型に用いた場合においても、高いPCR成功率を示し、確実な結果を期待することができます。
今回は、このクルードサンプルに強い特長を活かして、植物サンプルのライセート（抽出液）から直接ターゲットの増幅を行った実施例をご紹介します。

方法

1. 植物ライセート（抽出液）の調製
植物サンプルからのライセートは、文献［Biotechniques. 19:394（1994）］に従って、図1に示す方法にて調製しました。本
方法では、植物組織は完全に溶解しませんが、緑葉を用いた場合には、溶液が緑色となり、植物由来成分が抽出されていることが確認できます（図2）。但し、抽出液の核酸濃度は吸光度からは測定できませんでした。
植物葉（3 mm角程度1枚）、精米1粒↓ ←Buffer A 100 μl↓ 95℃ 10 min.
↓ Vortexにて良く攪拌
上清1μlをPCR反応液に添加〈Buffer A：100mM Tris-HCl（pH9.5）/1M KCl/10mM EDTA〉

左：イネ葉
右：精米

図1．ワンステップ法による植物ライセートの調製方法

図2．ワンステップ法で処理した植物サンプル

2. PCR反応（1）各種植物サンプルライセートからの直接PCR
PCR反応は、1.で調製したライセートを鋳型に、KOD FXを用いて、以下の条件にて実施しました。また、イネ葉から
MagExtractorTM -Plant Genome-（Code No.:NPK-501）を用いて調製した精製DNAも同様にPCRに供しました。
Template:

抽出液 1 μl あるいは精製DNA 10 ng / 50 μl Reaction

Target:ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit（rbcL）の1.3kb

Primer seq.:

Primer#1 :5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3 （トマト＆タバコ用）
Primer#2 :5'-AAGCAGCAGCTAGTTCCGGGCTCCA-3 （トマト＆タバコ用）
Primer#1 :5'-ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC-3 （イネ用）
Primer#2 :5'-AAGCTGCGGCTAGTTCAGGACTCCA-3 （イネ用）
・PCRサイクル※1

・反応液組成Autoclaved, distilled water

10 μl

94℃, 2 min.

2×PCR buffer for KOD FX

25 μl

98℃, 10 sec.

2mM dNTPs

10 μl

68℃, 1.5 min.※2

10pmol /μl Primer #1

1.5 μl10pmol /μl Primer #2

1.5 μlライセートあるいは精製DNA

1 μl

KOD FX （1.0U/μl）

1 μl

Total

30 cycles※1 プライマーのTm値が73℃未満の場合は、3ステップのサイクルをお薦めします。
※2 1 min./kbを目安にしてください。

50 μl

また、比較のためTaqベースの他社PCR酵素を用いて、取扱い説明書推奨の条件にてPCRを実施しました。
（2）タバコ葉ライセートからの直接PCR（Long Target）
次に、本方法とKOD FXを用いて長鎖のターゲットの増幅を試みました。反応液組成は、（1）と同様で、以下のPrimerを用
2008

92

15

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 16

いました。PCRサイクルは、94℃ 2min.→（98℃ 10sec. 65℃ 30sec. 68℃ 1min./kb）×35cyclesで行いました。
Template:

タバコ葉抽出液 1 μl / 50 μl Reaction

Target:Nicotiana tabacum ribulose-1,5 bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit

Prime:

Primer#1 :5 -TCCCCTTTGCTGACCTGGTAAGATTC-3 （2.2kb）

N-methyltransferase（rbcmtT）〈U35619.1〉の2.2kb及び4.6kb
Primer#2 :5 -GATAAAAGCCACCTCTCAAGCCCAAG-3 （2.2kb）
Primer#1 :5 -CGGTAAAGCCAGGAATTGTACCAGAAGG-3 （4.6kb）
Primer#2 :5 -GGAAGATAATGGTGGCCTCAATCAAAGG-3 （4.6kb）

結果及び考察（1）各種植物サンプルライセートからの直接PCR
増幅後、PCR産物を1％アガロースゲルに3 μlアプライして解析を行いました（図3）。その結果、KOD FXでは、
トマト、タ
バコ、イネの葉、および精米の全てのライセートサンプル及び精製DNAから、明瞭な1.3kbの増幅を認めることができました。
一方、比較に用いたTaqベースの他社PCR酵素では、精製DNAを用いた場合には増幅がみられましたが、ライセートをサンプルとした場合は全く増幅が認められませんでした。
なお、KOD FXを用いるPCRにおいて、サンプルとしてPCR反応へ添加するライセート量としては、1μlが最適で、2μl以上添加すると阻害を受ける傾向がみられました。
A社高効率PCR酵素 B社Long PCR酵素（Taqベース）（Taqベース）

KOD FX
1

2

3

4

5

M

1

2

3

4

5

M

1

2

3

4

5
4.6 kb
2.2 kb
1：トマト葉
2：タバコ葉3：イネ葉
4： 精米
5：イネ精製ゲノムDNA
M：1kb DNA ラダー

1.3 kb図4. タバコ葉ライセートからの直接PCR（Long Target）

図3. 各種植物サンプルライセートからの直接PCR（2）タバコ葉ライセートからの直接PCR（Long Target）
増幅後、PCR産物を1％アガロースゲルに5μlアプライして解析を行いました（図4）。その結果、2.2kb 及び4.6bkの比較的大きなターゲットにおいても明瞭なバンドを得ることができました。
なお、本増幅では、30サイクルでは不十分で、35サイクルが必要でした。増幅効率に優れたKOD FXでは、通常、30サイクル
で十分な増幅が得られますが、クルードサンプルを用いた長鎖の増幅で増幅産物が得られない場合は、35〜40サイクル程度までサイクル数を増やすことが有効であると考えられました。

まとめ
以上の検討から、クルードサンプルでのPCR増幅に向くKOD FXを用いることで植物サンプルの遺伝子解析が簡便化できることが示されました。
一般的に、植物組織にはポリサッカライドやポリフェノールが多く含まれるため、組織を粉砕した後、CTAB/フェノクロにて処理す
る等、DNA抽出には大変煩雑なステップが伴います。今回の検討でご紹介した簡易抽出法と、KOD FXを組み合わせることにより、それらの作業を省略することができ、特にサンプル数が多い場合などにおいては、格段の効率化が期待できます。是非一度、お試しく
ださい。
品名および内容
KOD FX
KOD FX（1U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX
2mM dNTPs

包

装

保存温度

Code No.

200U×1本［200回用＊］-20℃

KFX-101（200U×1本）
×5［1,000回用＊］-20℃

KFX-101X5

価

格￥35,000￥140,000＊50 μl反応を行った時の反応回数を表示しています。
※KOD FXで増幅されたDNA断片は平滑化されているため、通常のTAクローニングはできません。TArget Clone™ -Plus-をお使いください。

品

名

高効率TAクローニングキット

TArget Clone™ -Plus-

装

保存温度

Code No.

価

10回用

-20℃

TAK-201￥16,000

包

16

格

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No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 17

皆様の日々の研究の中で、「こうやったら実験がうまくいった。皆この方法を使えばいいのに…」とか、逆に「あの方法には、実は○○○という欠点が潜んでいる。他の人が失敗しないように、伝えたいのだけれど…」といった思いを他人と共有したいという潜在的な要望をお持ちの方は意外と多くいらっしゃるのではないかと思います。このコーナーは、そのような皆様の事例を掲載させていただくことで、今まで共有できなかった情報を共有することを目的とします。

「ペレットバラバラ法」

ペンネーム希望：ぽんぽんさん

1．
5mLマイクロチューブで細胞やらタンパクやらを回収する手順の中で「崩れにくいペレット」にお目にかかることは多々あることと思います。ピペッティングをするのが面倒なとき。ペレットが小さくてピペッティングではロスしそうなとき。ボルテックスしてもほぐれないとき。この方法は、そんなときに役にたつかもしれません。
準備する物は、チューブ立て（ただし、アルミラックのようなものではなく、一般的に売られているプラスチック製でカラフ
ルなチューブが埋まるような形のチューブ立てです：図参照）。それと、崩したいペレットの入ったチューブです。方法はいたって簡単！ まず、崩したいペレットに各々の実験系で使うbufferを加えて蓋をパチン。しっかり閉まっていることを確認し、洗濯板のイメージでとんがった方を下にしてピペット立ての上で「ゴリゴリ」と動かすだけ！左から右へ横一回で（5×16のチュー
ブ立ての場合）大抵ほぐれます。ボコボコしたもので色々試してみましたが、チューブ立てが一番きれいに崩れました。
「ゴリ
ゴリ」するときに力を入れすぎるとチューブに傷がつくので要注意。それほど押し付けなくてもOKです。
今まで、試したものは色々あります。フローサイトメトリー

1.5mlマイクロチューブ
or 1.5ml遠心管に伴う細胞の懸濁。ミニプレップのとき、大腸菌をバッファー

ペレットに懸濁するときにも大活躍しています。ピペッティングだとエゴリ ゴリ

アロゾルでピペットマンが汚染されそうですが、
これならその心配はありません。しっかり崩れてくれますし、サンプルが多いときにはチップの節約になります。少ない細胞サンプルから核タンパクを抽出する際にも使えます。細胞が少ないときはピペッティングでもロスしそうで怖いので、ペレットにはなるべく触らずに崩せるとロスがありません。マイクロチューブだけではなくて、15mL遠沈管でも応用できます。オートピペッターで混ぜるには量が少なすぎるし、
ピペットマンだと奥まで届き難いとき、同じようにゴリゴリするとペレットがきれいに崩れてくれますよ。一度お試しあれ。
編集部からのコメント：前回のkssxさんの『簡単！細胞バラバラ法』の第2弾という感じの方法ですね。確かに、固まったペレットを、ロスを少なく、
きれいにほぐすのは大変な場合があります。この手のチューブ立ては、必ず研究室にいくつかは転がっていると思いますので、皆様、是非一度お試しください。

実験川柳特集 8
本コーナーは、弊社ウェブサイト（www.toyobo.co.jp/bio）「読者のコーナー」で最新の作品を確認いただけます。
【句評】 電気泳動での失敗ですね。私は、翌朝やりっぱなしだったことに気付いたことがあります。週末でなくて本当に良かったです…。

●ぽんぽんさんのコメント：時々やってしまいます。タイマーは必需品。
【句評】私も最近衰えを感じます。大腸菌の旺盛な生命力にあやかりたいものです。

【句評】工夫の精神がなければ研究はうまくいかないものです。でも、TOYOBOの試薬は取説どおりバンバンつかってくださいね。

●NRさんのコメント： Sequenceは4分の1量系まで減らせます、経費削減。

⇒弊社ウェブサイト（読者のコーナー＞ご投稿コーナー）からご投稿、投句いただけます。
http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/reader/contribute/index.html
採用になった方には、
図書カード（実験のコツ、
失敗・成功談：￥10,000、
実験川柳：￥2,000）をご進呈いたします（詳しくはサイトをご覧ください）。奮って投稿・投句ください。
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No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 18●BMB2008バイオテクノロジーセミナーのご案内
下記の日程で、BMB2008バイオテクノロジーセミナーにて発表を行います。最近得られた、興味深い知見を中心としたセミナーですので、ふるってご参加いただきますよう宜しくお願いいたします。
日時：12月9日（火） 12:00 -13:00
会場： 第3会場 （神戸ポートピアホテル 南館 1F 大輪田B）
セミナー番号：1BT3「 極限環境微生物、その酵素の用途展開 -PCRへの応用- 」
司会：桂木 信裕（東洋紡績 （株）ライフサイエンス事業部）
1）12:00−12:05

ご挨拶2）12:05−12:35｢極限環境微生物の利用：超好熱菌と南極微生物について｣：
今中 忠行（立命館大学

3）12:35−12:55

生命科学部

生物工学科

教授）

｢KOD DNA polymeraseの進化と用途展開｣：
杉山 明生（東洋紡績（株）敦賀バイオ研究所

リーダー）●カルナバイオサイエンス社製品お取り扱い中止のご案内
カルナバイオサイエンス社キナーゼ製品について、2008年9月19日（金）のご注文分をもちまして、弊社でのお取り扱いが中止となりました。長らくのご利用、大変ありがとうございました。

NOTICE TO PURCHASER :LIMITED LICENSE●PCR関連商品のラベルライセンスについての詳細は、弊社ウェブサイト
（www.toyobo.co.jp/bio）をご覧ください。

●本ページ掲載の試薬類は全て一般研究用の目的にのみ販売しており、医薬品、診断用医薬品、化粧品、食品用等には使用できませんので、十分ご注意ください。誤用による事故については、当社は一切の責任を負いません。
●本ページ掲載商品にには消費税は含まれておりません。実際のご購入価格については弊社代理店へお問い合わせください。
●本ページ中の略号：毒 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
劇 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
危 印は消防法に基づく危険物です。

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