１分子蛍光分光による光合成タンパク質の光捕集機構の解明
Study of Light-Harvesting Mechanism of Photosynthesis Protein by Single-Molecule
Fluorescence Spectroscopy

代表研究者

東北大学

柴田 穣

Tohoku University

Yutaka SHIBATA

協同研究者

名古屋大学

野口 巧

Nagoya University

Takumi NOGUCHI

A novel cryogenic optical-microscope system was developed. In the developed system, the objective lens is set
inside of the cryostat adiabatic vacuum space. Being isolated from the sample when it was cooled, the objective lens
was maintained at room temperature during the cryogenic measurement. Therefore, the authors were able to use acolor-aberration corrected objective lens with a numerical aperture of 0.9. The lens is equipped with an air vent forcompatibility to the vacuum. The system was applied to the fluorescence spectroscopy of single isolated photosystem I
complexes at 90 K. The fluorescence, assigned to be emitted from a single photosystem I trimer, showed an intermittent
fluctuation called blinking, which is typical for a fluorescence signal from a single molecule.

研究目的てきた。PS I は巨大な光合成タンパク質であり、一通常の溶液の分光測定では、たくさんの溶質分子つの複合体あたり約 100 個の葉緑素クロロフィルが集まった集団としての系からの応答の平均値が測（Chl）分子を結合している。室温では、これらの定される。分光学的に１つの分子（粒子）からの蛍Chl 分子が吸収したフォトンエネルギーは極めて高光や散乱を検出する単一分子（粒子）分光を行うこ

速に電荷分離反応に使われるため、蛍光の量子収率とで、集団での平均化を完全に排除して通常の分光は非常に低い。低温にすることで電荷分離反応の収測定では得られない様々な情報を取得できるように率は下がり、次第に蛍光強度も高くなる。これまでなる。例えば、分子の吸収スペクトルや蛍光スペクの PS I の１分子分光の研究例では、蛍光収率が高くトルのピーク波長が、その分子の局所的な環境変化なる液体 He 温度以下での測定がほとんどであった。の結果として変化するスペクトル拡散と呼ばれる現単一 PS I 分子の蛍光スペクトルに反映される揺らぎ象が単一分子分光法により測定されている。また、のダイナミクスが、温度上昇とともにどのように変蛍光強度がランダムに明滅を繰り返す blinking と呼化するかは興味深い。そこで、本研究では液体窒素ばれる現象も単一分子の蛍光を測定したときにしば温度よりも高い温度での単一 PS I の蛍光スペクトルしば見られる。blinking も、色素分子の環境の揺らぎの振る舞いを明らかにすることを目指した。と関係していると考えられるが、その機構はまだよ

単一分子分光を実現するためには、低温で使用可

く分かっていない。このように分子環境の揺らぎの能な顕微鏡を用いる。従来の低温顕微鏡では、対物ダイナミクスなど確率的に起こる事象の観測に、１レンズの開口数(Numerical Aperture, NA)が 0.6 を超え

分子分光測定は非常に強力な手段となる。

ることは困難であった。例えば、クライオスタット

植物の光合成タンパク質 Photosystem I（PS I）にの外側に長作動距離タイプの対物レンズを設置する

おいても、１分子分光の研究例がいくつか報告され従来の方式（Fig. 1 左下）では、NA は概ね 0.6 を超Fig. 1. Comparison of cryogenic microscope systems between previous and the present methods.
えることはなかった。また、クライオスタットの内側に反射型の対物レンズを設置した場合（Fig. 1 左上）でも、作動距離の大幅な短縮は可能なものの構造が単純な単レンズの対物レンズを使用するため、解能が低下するという問題があった。これに対しては、サンプルホルダとコールドヘッドを柔軟な銅製のメッシュで繋ぐようにし、また液体窒素流路にス多くの場合 NA<0.6 であった。NA を大きくできないテンレス製の重りを挿入して振動を機械的に低減さことは、空間分解能が低く抑えられるだけでなく、せることにより、解決した。他にも、サンプルホルサンプルからの蛍光の集光効率も低くなってしまう

ダを固定するステージが冷却とともに収縮してサンことから、本研究で実現を目指した低温での光合成プル位置が移動するという問題があった。ステージ

タンパク質の１分子分光を行う上では致命的な欠点を熱膨張率がきわめて小さい石英製に改め、また熱であった。
本研究では、クライオスタットの断熱真空槽内に対物レンズを設置した新しい方式（Fig. 2 右）の極低収縮が収まるまで 2-3 時間待ってから測定を始めるようにすることで、この問題も克服した。

温顕微鏡を開発した。この方式によって、作動距離シアノバクテリア Synechocystis PCC 6803 から精を大幅に短縮することが可能となり、大きな NA の製した PSI trimer は、共同研究者の名古屋大学野口対物レンズを採用できるようになった。~10 torr の巧教授グループから頂いた。25 mM MgCl2 、0.4高真空中で使用するため、レンズに挟まれた空間のmM(0.02%w/v) n-dodecyl β-D-maltoside( β -DM) 、 5

空気を抜くための空気孔のある特注の対物レンズをmM アスコルビン酸ナトリウムを含む pH7.5 20 mM-5使っている。このような工夫をしたことで、極低温での顕微鏡として初めて NA0.9 を実現できた。検出器 は 、 本 助 成 金 で 購 入 した イ メ ー ジ ン グ 分 光 器

Tricine-NaOH 緩衝液で Chl 濃度が 20 µM となるように希釈した。この溶液にさらに緩衝液を加えて測定（MS2004i、SOL instruments）に結合した液体窒素冷する濃度にまで希釈し、遠心分離器で凝集体を沈殿

却 CCD（PyLoN:100BR eXelon, Princeton Instruments）させサンプルとした。サンプル溶液 2-3 µl を、直径を使用し、感度の高い１分子蛍光測定に最適な測定

10 mm、厚さ 0.3 mm の石英ガラス基板２枚の間に真システムとなっている。

空グリースを塗布したテフロン製のリングを挟んで封入した。

研究経過
開発した装置を実際の実験に用いるには、いくつかの課題を克服する必要があった。サンプル冷却に１分子分光測定を行う準備として、濃度の異なる
PSI trimer 溶液の蛍光顕微鏡画像を取得し、PSI trimerは連続的な液体窒素のフローを用いているが、フロの分散の様子を確認した。測定した濃度は、700 pM、ーのためのポンプの振動がサンプルに伝わり空間分

70 pM、7 pM である。励起は、HeNe レーザーの 633nm の波長で行い、レーザー強度はサンプル上で 100

光スペクトルのピーク位置が Chl 分子周囲の環境変µW である。

化に応じて時間とともにジャンプする様子が報告されている。本研究でも、レーザーを１つの PS I trimer位置に固定して連続して蛍光スペクトルを測定し、その時間発展を追跡した。２つの単一 PS I trimer についての結果を、Fig. 3 に示す。Fig. 3 (A-2)、(B-2)のイメージは、各時間における蛍光スペクトルを示しており、1 s 積算の蛍光スペクトルが 120 本並んでいる。Fig. 3 (A-1)、(B-1)に示したのは、測定した 120s 間の平均の蛍光スペクトルである。試料温度は 90K であった。低温において、PSI から放出される蛍光は、数個の red Chl と呼ばれる PS I に特有の Chl分子からのものであることが知られている。red Chlとは、通常の Chl の蛍光波長 680-690 nm よりも顕著に長波長にシフトした 730 nm 付近に蛍光を示す Chlのことである。おそらくタンパク質内で Chl 分子が二量体や三量体を形成していることにより、吸収、蛍光波長が長波長シフトしていると考えられている。
Fig. 3 に示した二つの分子では、どちらも red Chl からの蛍光が見られる。
Fig. 3 (A)に示した分子では、蛍光強度がランダムに強くなったり弱くなったりする blinking と呼ばれる現象が見られた。一方 Fig. 3 (B)の分子では、蛍光強度は時間的にほぼ一定で blinking は見られない。
Fig. 3 (A-1)の蛍光スペクトルを詳しく見ると、0-40 s

Fig. 2. Concentration dependence of fluorescenceでは蛍光強度が減少し、50-60、80-90、110 s あたり

images of PS I trimer.

ではほとんど蛍光を放出していなかったことがわか

Fig. 2 に各濃度で得られた典型的な蛍光画像を示す。各画像における蛍光強度のスケールは濃度ごとに異なる。700 pM では、画像全体から蛍光信号が検出されているが、70 pM では蛍光信号はまばらとなり、7 pM ではスポット状の輝点が見られるようになった。本測定に使用した顕微鏡システムの光軸方向の空間分解能がおよそ 1.3 µm であることを考慮すると、溶液の濃度が 7 pM のときには 10 µm×10 µm の観測領域に平均で 0.6 個の分子が検出されると見積もることができる。こうした見積もりと Fig. 2 に示された蛍光画像の濃度依存性の測定から、7 pM のサンプルで観測されているスポット状の輝点一つ一つは単一の PSI trimer に対応していると結論付けた。
先行研究では、1.4 K における単一 PSI trimer の蛍る。0-40 s においては、ある程度の蛍光強度があることから、PSI trimer のうち、1 つもしくは 2 つのmonomer が発光しているのかもしれない。また、蛍光が消光する時間幅には規則性がなく、1-数 10 s まで様々であった。このような blinking は、蛍光タン
パク質 Green Fluorescent Protein や半導体量子ドットまで、様々な系で観測されている。色素の構造変化などの原因が提案されているが、その機構の詳細はまだ分かっていない。また、blinking は１分子からの発光に特有の現象で、逆説的に blinking が観測されたことにより今回の実験で得られた蛍光が１分子からの発光であることが支持された。今回のように、光合成の反応中心タンパク質１分子を、低温で測定して blinking が観測されたのは、私の知る限りにおいて初めてのことである。

測されている明状態では、red Chl から P700+へのエネルギー移動効率が低い状態にあり、励起状態は消光されることなく蛍光が放出される。一方、蛍光が消光している暗状態では、red Chl から P700+へのエネルギー移動の効率が高くなり蛍光は消光される。
単一分子条件でない時間分解蛍光分光測定からは、
red Chl から P700+ へのエネルギー移動の速度は6.1-360 ps であると報告されている。ただし、この値はあくまで分子集団での平均値である。今回の実験のように、一つ一つの PS I 分子に着目するとエネルギー移動速度が時間的に揺らいでおり、上で述べたような blinking の原因となっているのではないかと考えている。
明状態と暗状態の間を行き来させる要因は、タンパク質のコンフォメーション変化であると推察している。より低い 1.4 K においては、Chl とアミノ残基や水分子との水素結合の開裂と生成によって、スペクトル拡散を引き起こすコンフォメーション変化が起きると考察されていた。測定を行った~90 K では、Fig. 3. Typical time-dependences of single PS I
fluorescence spectra.

より大きなコンフォメーション変化が生じているのかもしれない。コンフォメーション変化によって red
Chl から P700+へのエネルギー移動を媒介する Chl の吸収波長が変わることで、P700+へのエネルギー移動考察
単一の PSI trimer の蛍光において、blinking が観測効率が劇的に変化する、という機構を現在のところ考えている。

された原因について考える。PSI trimer と同じように開発した極低温顕微鏡は、開口数が大きいため高多数の Chl が結合した光捕集タンパク質の LHC I にい空間分解能で顕微画像を取得可能である。そのたおいても、蛍光の明滅が観測されている。このタンめ、細胞内の異なる蛍光スペクトルを示す Chl 成分

パク質に固有のエネルギートラップによる消光が原の分布を明らかにする研究にも強力なツールとなる。

因であると考察されている。ただし、LHC I の１分

このような方向の研究も既に開始しており、実際に子分光測定は、室温での測定であった。また、LHC I

単細胞の光合成生物において、その細胞内の異なるは光捕集タンパク質であり、PSI のような光誘起電蛍光波長を持つ Chl 成分の分布を空間分解して検出荷分離反応は起こらない。

できることを実証した。今後は、生きた細胞を対象今回の測定をおこなった励起光強度 100 µW におにした研究も展開して行きたい。

いては、PSI の反応中心 P700 は常に酸化された P700+として存在していると考えられる。また、P700+は励研究の発表

起エネルギーを非常に高効率に消光するクエンチャ

口頭発表ーとして機能することが知られている。P700+の吸収

1.

柴田 穣、超高速分光と理論解析の融合でここまスペクトルは red Chl の蛍光スペクトルと重なりがで分かってきた光合成系の光捕集過程, 東北大大きいので、red Chl から P700+へのフェルスター型学多元研ミニシンポジウム「物理化学的手法をのエネルギー移動が起こっていると考えられている。

活用した生命科学研究の新展開」、2012 年 1 月

以上のようなことから、本研究で初めて見出された

24 日、東北大学 （招待講演）

PS I の blinking は、以下のような状況により引き起こされていると考えている。red Chl からの蛍光が観2.

柴田 穣、高い空間分解能を有する極低温光学顕微鏡の開発, 「光合成初期過程器官の時間・空間

10 月 28-10 月 30 日、京都国際会館

分解分光」第一回公開シンポジウム、2012 年 3月 13 日、立命館大学
3.

6.

柴田 穣、西 俊輔、川上 恵典、沈 建仁、Thomas村 裕史、柴田 穣、新しく開発した極低温顕微

Renger 、 Possible non-photochemical quenching

鏡による光化学系Ｉの１分子蛍光分光, 第 53 回

mechanism within photosystem II core complex（日日本植物生理学会年会、2014 年 3 月 18-20 日、

本語タイトル：光化学系 II コア複合体での非光富山大学

化学的消光の可能性）, 日本生物物理学会第 50
4.

浪江 慶祐、加藤 渉、中西 華代、野口 巧、福7.

Ahmed Ali、柴田 穣、長尾 遼、野口 巧、福村 裕

回年会、2012 年 9 月 22-9 月 24 日、名古屋大学

史 、 Dedicated comparison of light-harvesting柴田 穣、西 俊輔、川上 恵典、沈 建仁、Thomasdynamics between the cyanobacterial and the higher

Renger、植物型光合成反応中心の光捕集過程：

plant photosystem II, 第 53 回日本植物生理学会年

構造情報に基づく理解２, 日本物理学会 2013 年会、2014 年 3 月 18-20 日、富山大学

年会、2013 年 3 月 26-29 日、広島大学

8.

田原 一輝、河原 弘典、浪江 慶祐、井上 名津子、長尾 遼、加藤 祐樹、鞆 達也、柴田 穣、ポスター発表福村 裕史、菓子野 康浩、野口 巧、光合成タン

1.

Keisuke Namie, Wataru Kato, Hiroshi Fukumura,

パク質と金属ナノ粒子による水素発生人工光合Yutaka

成ナノデバイスの開発, 第５回光合成学会年会、

Shibata,Developmentofcryogenic

2014 年 5 月 30-31 日、近畿大学

microspectroscopy system with numerical apertureof 0.9 applicable to biological systems. 7th Asian2.

Photochemistry Conference 2012, November 12-15,

誌上発表

2012, Osaka, Japan.

1.

Keisuke Namie, Tomofumi Chiba, Mizu Kajihara,

Study of Cell-Differentiation and Assembly ofWataru Kato, Hiroshi Fukumura, Yutaka Shibata,Photosynthetic Proteins during Greening of Etiolated

Application

cryogenic

Zea mays Leaves Using Confocal Fluorescencemicrospectroscopy system with numerical aperture

Microspectroscopy at Liquid-Nitrogen Temperature,ofBiochim. Biophys. Acta, 1827, 520-528 (2013).

0.9

toof

the

home-built

photosyntheticorganisms.

16thInternational Photosynthesis Congress, August 11-16,
3.

Yutaka Shibata, Shunsuke Nishi, Keisuke Kawakami,
Jian-Ren Shen, Thomas Renger, Photosystem II does

Yutaka Shibata, Ahmed Ibrahim Ali Mohamed,

not possess a simple excitation energy funnel:

Shunsuke Nishi, Keisuke Kawakami, Jian-Ren Shen,time-resolved

Ryo Nagao, Takumi Noguchi, Hiroshi Fukumura,theory, J. Am. Chem. Soc. 135, 6903-6914 (2013).
3.

fluorescence

spectroscopy

meets

Yutaka Shibata, Wataru Katoh, Tomofumi Chiba,

photosystem II: a combination of time-resolved

Keisuke Namie, Norikazu Ohnishi, Jun Minagawa,fluorescence spectroscopy and microscopic theory.

Hanayo Nakanishi, Takumi Noguchi, and Hiroshi

16th International Photosynthesis Congress, August

Fukumura, Development of a novel cryogenic

11-16, 2013, Saint Louis, USA.

microscope with numerical aperture of 0.9 and its

柴田 穣、加藤 渉、黄化葉緑化過程の顕微分光

application to photosynthesis research, Biochim.

観察のための極低温高空間分解能顕微鏡の開発,Biophys. Acta, 1837, 880-887 (2014).

第 52 回日本植物生理学会年会、2012 年 3 月 16-18
5.

2.

2013, Saint Louis, USA.

Thomas Renger, Light-harvesting dynamics in

4.

Yutaka Shibata, Wataru Kato, and Yukari Tahara,4.

柴田穣, 光合成系の光捕集過程を構造に立脚

日、京都産業大学

して理解する：理論と実験の融合で見えてきた柴田 穣、浪江 慶祐、千葉 知史、梶原 瑞、加こと, 日本物理学会誌, in press, (2014).

藤 渉、福村 裕史、開口数 0.9 の極低温光学顕微

5.

柴田穣，加藤渉，浪江慶祐, 開口数 0.9 を持つ極鏡の開発とその植物細胞内色素イメージングへ

低温顕微鏡の開発, 分光研究, 63 巻, 3 号, in pressの応用, 日本生物物理学会第 51 回年会、2013 年(2014).