<<まえがき >>膜機能分子構造 の柔軟性 と分子間直接相互作用 による動的機能修飾の解析

一 リガ ン ド投与 による代謝型 グル タミン酸受容体細胞内領域の二 量体構造 の動的変化 一

Ligand‐ induced rearrangement Of the intracellular dimeric cOnformation of

metabotrOpic glutallnate receptorla.

(日 本生理学会推薦 )代 表研 究者

自然科 学研 究機構・ 生理 学研 究所

久保義弘

National lnstitute fOr Physio10gical Sciences YoshihirO Kubo
共 同研 究 者

自然科 学研 究機構 ・ 生理 学研 究所

立山充博

National lnstitute for Physiological Sciences
自然科 学研 究機構 ・ 生理 学研 究所

藤原祐 一郎National lnstitute fOr Physio10gical Sciences<<英 文 サ マ リー

Michihiro Tateyama

Yuichiro Fuiiwara>>

The dimeric cOnformation ofthe metabOtropic glutamate receptor la(mGluRl)is a key
deterlninant Of the downstreanl signaling,since crysta1lographic analysis has shOwn

that glutamate stabilize the active state of the dilneric cOnfOrmation of theextracellular dOmain,

We investigated the ligand̲induced dillneric rearrangement of

the cytOplaslrnic dOmain by analyzing the fluorescence resonance energy transfer(FRET)signa1 0btalned from the plasma membrane,where ligands interact with themGluRla, using a total internal reflection field llnicroscOpy system.

Intersubunit

FRET efficiency was altered within 9 s after glutamate application,while intrasubunit

FRET efficiency was not changed.

The effect was dependent on glutamate

concentration,inhibited by lnGluRl antagonists and reprOduced by polyvalent cations,

ca2+and Gd3+,which are known tO activate lnGluRlao We therefOre cOnclude thatligand̲induced rearrangement of the extracellular dilneric cOnfOrmatiOn leads tO
intracellular dirneric rearrangement without altering the respective monomericconformations.

<<本文>>

研究 目的代謝型グル タミン酸受容体 1型 (mGluRl)は 、脳 の様 々な部域 に発現 している受容体で、この遺伝子 を破壊 したマ ウスは、海馬や小脳 のシナプス伝達効率 の可塑 的変化 の異常 と、空 間記憶や運動学習等 において行動異常 を示す ことが知 られて いる。この ことか ら、mGluRlは 、記 憶 の鍵 を握 る重要な分子 として注 目されてきた。
近年、mGluRlの 細胞外領域 の一 部分 の結晶 を用いた X線 構造解析 によ り、2つのサ ブユニ ッ トが会合 しホモニ 量体 として構成 されている こと、それぞれ のサ ブユニッ トはグ ローブ状 の構造 を してお り、グル タミン酸結合 によ リグ ローブが閉 じるよ うに細胞外領域 の構造が変化す る ことが明 らか にされた。ところで、代謝型受容体 のシ
グナル伝達 は、い うまで もな く細胞 内 において G蛋 白質 を活性 化す る ことによ りひきお こされ る。そのため、mGluRlの シグナル伝達機構 を理解す るためには、細胞外領域 の構造変化 に伴 って起 こる細胞 内領域 の構造変化 を知 る ことが必要であるが、この点は未解決であった。特 に、ひ とつのサ ブユニ ッ ト内で構造変 化 がお こるのか、それ とも、2つ のサ ブユニ ッ ト間の配置が変化す るのか とい う点 については、知見がなかった。そ こで、我 々は、光 ラベル を用いた膜機能分子 の動的構造変化解析 という最先端 の手法 を用 いて この問題 にアプ ローチ した。
研究経過
異色 の蛍光物質問で、距離が近 いほど、エ ネルギーの受 け渡 し (FRET(FluorescentResonance Energy Transfer)効 率 )が 大 き くな る ことが物理化学的 に知 られている。
我 々 は、mGluRlの リガ ン ド投与 による構造変化 を、FRET効 率 の変化 として捉 えlは この あた り)。
まず、遺伝子工学的に、mGluRlの 細胞 内領域 の様 々な箇所 に、シアン色 の蛍光る ことを計画 した (I蛋 白CFP、もしくは黄色 の蛍光蛋 白YFP、 も しくはその両方 を付加 し、 この分子 をHEK293細 胞 に発現 させた。一般的 に、膜蛋 自ではあって も、細胞 に強制発現 させた
場合、膜 上に存在す るばか りでな く細胞 内 に貯留す る。我 々の 目的は、リガ ン ド投与に伴 うFRETの 変化 を測定す る ことなので、細胞 内 に貯留す る分子 の放 つ蛍光 は、変化分 を薄めて しまうバ ックグラウ ン ドとなる。当初、この点 について考慮 しないまま行 っていた、通常 の光学 システム によ り細胞全体 か ら発せ られ る蛍光 を測光 していた実験 では、信頼できる FRET効 率 の変化 は検 出できなか った。そ こで 、次 のステップ として、エバ ネセ ン トフィール ド顕微鏡 を導入 して、全反 射時 に漏れ 出 るいわ ゆるエバ ネセ ン ト光 によ り細胞膜上 に存在す る分子 のみ を照 明 し発す る蛍光 を測 光する ことに した。 リガ ン ド投与 に伴 う FRET効 率 の変化 を解析 した ところ以下 の知見が得 られた (図2は この あた り)。

(1)細 胞 内ル ー プ1に CFPも しくは YFPを 付加 した コンス トラク トを用 いた実験 では、 グル タミン酸 投与 によ り、FRET値 が下がる。すなわち、受容体活性化 に伴 い、2量 体サ ブユニ ッ トの細胞内ル ー プ 1は 相 互 に遠 ざかる。

(2)細 胞 内ル ー プ2に CFPも しくは YFPを 付加 した コンス トラク トを用いた実験 では、 グル タミン酸投与 によ り、FRET値 が上がる。すなわち、受容体活性化 に伴 い、2量 体サ ブユニ ッ トの細胞 内ル ー プ 2は 相 互 に近 づ く。

(3)ひ とつのサ ブユニ ッ トの細胞内ル ー プ2と C端 細胞内領域 にそれぞれ CFPとYFPを 付加 した コンス トラク トを用 いた実験 では、グルタミン酸投与 によ り、FRET値 は変化 しな い。すなわち、受容体活性化 に伴 い、ひ とつのサブユニ ッ トの内部 では
明 らかな構造 変化 は起 こ らない。
これ らの知見か ら、 リガン ド投与 によ り mGluRlの 細胞内領域 においては、個 々のサ ブユニ ッ トの構造が変化する とい うよ りは、2つ のサ ブユニ ッ ト間 の配置がずれ、回転等 を伴 って変化す る ことが示唆 され、この動 きがG蛋 白質 の活性化 を引き起 こすと考 え られた (図3は この あた り)。

さ らに、ル ー プ2にCFP/YFPを 付加 した コンス トラク トをもち いて、ア ゴニストである DHPGの 作用を見た ところ、グル タミン酸 の場合 と同様な変化 を示 した。
また、FRET変 化 /グ ルタミン酸濃度 の プ ロ ッ トが、競合的アンタゴニ ス ト (s)‐MCPGに よっては右側 にシフ トし、非競合的アンタ ゴニス ト CPCCOEtに よっては下側 に下がる。 とい う結果が得 られた。 これ らの結果は、我 々が測 定 している

FRET効 率 の変化が、受容体 の機能 を反 映す るものである ことを裏付 ける と共 に、CFP/YFP付 加 mGluRlが 正常な蛋 白質構造 を保 っている ことを示 している。
ところで、我 々 は以前、下流 の反応 を指標 として、グルタミン酸 のみ な らず Ca針 、Gd3+な どの細胞外多価 陽イオ ンによって も mGluRlが 活性化 され る ことを発表 した。その後 、Gd3+の 結合部位が、結晶構造解析 によって、グル タミン酸結合部 位や 、我 々の 同定 した Ca2+感 受性 の決定 に重 要な部位 とは異な る、2つ のサ ブユニ ッ ト間の負電荷 を持 つ アミノ酸 に富む領域 に明確 に同定 された。我 々 は、この部位が機能的に重 要である ことを、点変異体 の解析 によ り明 らか に した。今 回、ル ー プ 2の コン
ス トラク トによ り、細胞外 の Ca2■ ゃ Gd3+がmGluRlの 構造変化 を確か に引き起こす ことが確認 された。Gd3+は 、脳脊髄液 中 に存在 しないが、 これ らの結果 を考えあわせ ると、Gd3+の 作用 を模倣す る生理 的物質が脳 に存在 している可能性 を示唆 して いるよ うにも思われ る。
考察ゲ ノム プ ロ ジ ェ ク トが完 了 し、今後 は、ゲ ノム の コー ドす る個 々の 蛋 自 の 構 造 と機能 を解 析 して い く こ とが 求 め られ て い る。そ のため 、蛋 自 の 結 晶 を用 いて 行 う、 いわゆ る構 造解 析 が精 力 的 に進 め られ て い るが 、膜機能 蛋 自 の 場 合 は結 晶化 が容 易 でな い
た め 一 般 に極 めて 困難 で あ る。 また 、結 晶化 した構 造 を知 るだ け で は、動 態 に 関す る
情報 が 欠如 して いるた め、リアル タイム で 、生 きた 細胞 にお け る 膜機 能 蛋 自 の 動 的構
造 変化 を解 析 す る研 究 手法 が切望 され て きた。 FRET法 によ る水 溶液 中 の 蛋 白構造
変 化 の解 析 は、既 に確 立 され て い るが 、生細 胞 で 受容体 蛋 白に適 用 し成 功 した 例 は、極 めて 少 な い。 我 々 の研 究 は 「生細 胞 にお け る膜機 能 蛋 自分 子 の動 的構 造 変化 の リアル タイ ム測 定」 を確 立 した点 にお いて 意義 が あ る と考 えて い る。 ポ ス トゲ ノム の時 代 に、蛋 自 の構 造 と作動 原 理 を探 って い くた め に、構 造 生 物学 的 ア プ ロー チ を相 補うも の と して 、 大 きな 期待 が持 て るか らで ある。

研 究発表
口頭 発 表1.Yoshihiro Kubo;

Regulation mechanisms and structural rearrangements

of rnetabotropic glutamate receptor." Young Researcher l」

mami Forum(TOkyO,2004)

2.立 山充 博 、 阿部秀樹 、久 保 義 弘 ; Ligand― induced rearrangement ofthe
intracellular dimec conforlnation of rnetabotropic glutarnate receptorla:

Insights from a FRET stu(し " 第 81回 日本 生理 学 会大 会 (札 幌、 2004)

3.立 山充 博 、 阿部秀樹 、 中 田康 裕 、斉藤 修 、久保 義弘 ; Ligand― inducedrearrangement ofthe dilneric conformation of rnetabotropic glutamate

receptorla" 第 27回 日本神経科学 大 会 (大 阪、2004)

4.藤 原祐 一 郎 、久保義 弘;

Density dependent changes pfthe pore properties ofP2X2receptor channel."シ ンポ ジ ウム 「Structure and function ofionchannels」

第 77回 日本 生 化 学 会大 会 (横 浜 、2004)

誌 上発 表1. llIIchihiro Tateyama, Hideki Abe, Hiroyasu Nakata, Osamu Saitoh andYoshihiro Kubo

Ligand― induced rearrangement of the intracellulardimeric conforllnation of metabotropic glutalllate receptorla." Nature
Structural&1/1olecular Bi01ogy ll,637‐ 642(2004)

2.Yuichiro Fuiiwara,and Yoshihiro Kubo;Density Dependent Changes of

the Pore Properties of P2X2 Receptor Channel." 」ournal of Physiology 558,

31‐43(2004)

3.立 山充博、久保義弘 ;「 リガ ン ド投与 による代謝型 グル タミン酸受容体 細胞内領域 の二 量体構造の動的変化」

細胞 工学 23,1062‐ 1063(2004)

ここで 本文終わ り。以下 に、Figuresと そ の英文 の説明を示 します。

グルタミン酸(―)

グルタミン酸 14)

FRET効 率Fig。 1

FRET効 率く0utline of detection Of stmctllral rearrangements by changes of FRET emciency.

When the distance between two fluorescent proteins is changcd,a change ofFRET
efflciency occurs.

Thereforc,two subunits ofdimcric mGluRl were labcled with CFP(gray Circlc)and YFP(whtte circle)reSpectivcltt and the FRET efflciency was monttored.

2つ のサブユニットのループ 1同 士

2つ のサフユニットのル ープ 2同 士

1つ のサブユニット内のの ループ 1と 2

卜Ш 饂 Ｌ100■me● )

Fig。 2■me〈 S)

Glutamate‐ induced FRET changes of CFP/YFP labeled mGluRl.

(Upper paneD PositiOn in mGluRl offluoresncent labels,CFP and YFP.(LowerpaneD FRET efflciency recordings.Both data with and without application ofglutamate are shown静止 状態活性 化状態)打ギ1̲
Fig。 3CilutamateⅢ induced rearrangement Ofthe intracellular dimeric conformation ofmGluRl
A schematic drawing Of dilneric llnGluRl on the rnembrane 100ked up froln cytoplasmicside.

Circles shOw seven transmembrane regions.

region l,2 and the lst cytoplasIInic loop.
and the 2nd cytoplasllnic 100p.

Gray color shOws transmembraneBlack co10r shows transmembrane region 3,4