形態パターンのゆらぎを生み出すエピジェネティクな変化
Morphological fluctuation influenced by environmental conditions throughmodification of epigenetic factors（日本動物学会推薦）
代表研究者 東京工業大学

田中 幹子

Tokyo Institute of Technology

Mikiko TANAKA

Emus possess vestigial wings with a single digit, but the mechanisms of how wing skeletal elements have been
extremely reduced remain unclear. Here we investigated the developmental mechanisms of reduction of the emu wing.
Examination of twelve adult emu wings revealed that there is a great range of individual variation in the skeletal pattern.
We also found that the dynamic expression pattern of the BMP antagonist Gremlin1 (Grem1) in limb buds, which is
critical for autopodial expansion, was consistent with the digital pattern of emu, chicken and zebra finch. Furthermore,in emu, variation among individuals was observed in the width of Grem1 expression in forelimb buds. Our results
suggest that the signalling system that regulates the dynamic expression of Grem1 in the limb bud contributes
substantially to variations in avian digital patterns.

研究目的

研究経過

一般的に、動物の形態パターンは、遺伝的ネット

複雑な自然界に目を向けると、指パターンに“ゆらワークで固定されていると思われているが、自然界ぎ”を起こしている要因の候補は無数にある。そこで、

では後天的環境要因に適合した発生プログラムの変本研究では、既知の指パターン形成遺伝子ネットワ化に起因した形態パターンのゆらぎが見られることークを起点として、この遺伝的に固定されたシステがしばしばある。

ムに“ゆらぎ”を与える要因を探ることとした。遺伝多くの鳥類の前肢は 3 本の指からなるが、草原な子ネットワークにゆらぎをもたらす前提の１つとしどに棲息するエミューは、前肢に 1 本の指しかもたて、遺伝子発現をオンにするエンハンサーが潜在的ないとされていた。しかし、エミューの成体の骨パに活性な状態（poised 状態）になっている状態を挙ターンを観察したところ、同一種内にもかかわらず、げることができる。そこで、鳥類の指パターン形成前肢の指パターンにはバリエーションがあることが遺伝子がゲノム上で poised 状態で存在しうるのかわかった。これは、エミューの指パターンは、遺伝について、ニワトリ胚の前肢芽を用いた ChIP シー的な要因に加えて、後天的な因子により決定されるケンス解析によって調べることとした。Hamburger

ことを示している。そこで本研究課題では、エミュ

Hamilton stage (HH) 20 (Hamburger and Hamilton,ーの指パターンに着目し、指パターンに“ゆらぎ”を1951) のニワトリ (Gallus gallus) 胚 39 匹、および、惹起する要因を明らかにすることを目的として研究

HH 27 のニワトリ胚 12 匹から切り出した前肢芽を行った。の 第 3 指 領 域 を そ れ ぞ れ p300 抗 体 、 お よ び
H3K27ac 抗体で免疫共沈降した。その後、 SOLID

5500 で シ ー ケ ン ス し た デ ー タ を 50 bp 単 位 で伝子断片をクローニングし、 発現パターンを解析しUCSC (https://genome.ucsc.edu) の Galgal4 ゲノム配た。その結果、肢芽での Grem1 の発現パターンが、列にマッピングした。今後、リード数が全細胞抽出

それぞれの鳥類の四肢骨格パターンと対応している液のリード数に比べて３倍以上、各領域のリード数ことが明らかとなった。マウス胚を使った研究では、が全ゲノムのリード数の平均値の３倍以上、かつ、四 肢 の パ タ ー ン 形 成 を 制 御 す る

各領域のリード数/全細胞抽出液のリード数の統計

SHH/GREM1/AER-FGF システムとよばれるフィー

値が p＜e∧-4 の領域を「ピーク」とよぶこととする。

ドバックループが (Benazet et al., 2009)、指原基の量

指パターン形成に関与することが知られている既知を制御することで、指の数を制御するとされているの遺伝子のエンハンサーについて、HH20 で poised(Lopez-Rios et al., 2012; Scherz et al., 2004; Verheyden

状態にあり、HH27 で活性状態にあるピークを探索

and Sun, 2008; Zeller, 2010; Zuniga et al., 1999)。

した。その結果、マウスやニワトリの肢芽の前後軸SHH/GREM1/AER-FGF システムは、SHH を分泌すパターン形成にかかわることが知られる Gremlin1

る ZPA (zone of polarizing activity) 領域と FGF を分(Grem1) の転写開始点から 40 kb 下流にある肢芽泌する AER (apical ectodermal ridge) という 2 つのシ特異的エンハンサー領域 (Vokes et al., 2008) におい

グナルセンターからなる。Gremlin1 (Grem1) は、こて、HH20 では p300 の結合が HH27 では p300 のの 2 つのシグナルセンター間でシグナルをリレーし、結合と H3K27 のアセチル化のピークが確認された

BMP シグナルを阻害することで細胞増殖を活性化ことから、poised されているエンハンサーの候補とするという役割がある (Nissim et al., 2006; Panman et

した。

al., 2006; Zuniga et al., 1999)。肢芽の伸長が終わると、次に、Grem1 の肢芽での発現の一部が、H3K27 のGrem1 の発現は抑制されるため、BMP シグナルがメチル化によって poised している可能性を検証す

上昇し、指原基の軟骨凝集が開始する (Nissim et al.,

るために、ヒストントリメチル化酵素の Ezh2 の酵

2006; Panman et al., 2006; Zuniga et al., 1999)。我々の素 活 性 斑 で あ る SET ド メ イ ン を 欠 損 さ せ た

結果は、BMP 活性のレベルが指パターンのバリエー

Ezh2ΔSET 発現コンストラクトをニワトリ胚前肢芽ションを生み出すとする説 (Lopez-Rios et al., 2012;に導入することとした。Ezh2ΔSET の強制発現は、Scherz et al., 2004) を支持することとなった。さらに、ニワトリ胚の神経管において、正常な Ezh2 の結合エミューの前肢芽では、Grem1 の発現領域の幅の個が阻害されて、H3K27 のトリメチル化が阻害される体間での差 (1.570 ± 0.642, mean ± s.d., n=5) は、ニワことが報告されている (Akizu et al., 2010)。HH14 のトリの前肢芽での差 (0.716 ± 0.150, mean ± s.d., n=6)

ニワトリ胚の予定前肢芽領域に Ezh2ΔSET コンスと比べて、著しく大きいということが明らかとなっトラクトを導入し、28 時間後の HH20 に到達したた (Fig. 2)。これらの結果は、初期肢芽での Grem1胚を固定し、Grem1 の発現を検証したところ、Grem1の発現領域が後側に広がる様子が確認された (Fig.
1)。これらの結果から、Grem1 の前肢芽での発現そのもの、もしくはその上流の遺伝子の発現を制御するゲノム領域の機能が H3K27 の修飾が変わることによって、変化しうることが示唆された。
次に、ニワトリ胚、ゼブラフィンチ胚 (Taeniopygiaguttata) 、 お よ び 、 エ ミ ュ ー 胚(Dromaiusnovaehollandiae) の肢芽における Grem1 の発現を比較した。まず、それぞれの鳥類から Grem1 の遺Fig. 1 Expression of Grem1 in chicken
forelimb buds electroporated with Ezh2ΔSET.

の発現パターンが、鳥類の種間のみならず、種内で2.

Benazet, J.D., Bischofberger, M., Tiecke, E.,の指パターンのバリエーションも反映していること

Goncalves, A., Martin, J.F., Zuniga, A., Naef,を示唆していた。

F., Zeller, R., 2009. A self-regulatory system
of interlinked signaling feedback loopscontrols mouse limb patterning. Science 323,
1050-1053.
3.

Hamburger, V., Hamilton, H., 1951. A seriesof normal stages in the development of thechick embryo. J. Morph. 88, 49-92.

4.

Lopez-Rios, J., Speziale, D., Robay, D., Scotti,M., Osterwalder, M., Nusspaumer, G., Galli,A., Hollander, G.A., Kmita, M., Zeller, R.,

Fig. 2 Expression of Grem1 in forelimbbuds of emu embryos at stage 25.

2012. GLI3 constrains digit number bycontrolling both progenitor proliferation and考察

BMP-dependent exit to chondrogenesis.

本研究では、鳥類の指パターンと初期肢芽でのGrem1 の時空間的な発現パターンが対応している

Developmental cell 22, 837-848.
5.

Nissim, S., Hasso, S.M., Fallon, J.F., Tabin,

こ と を 示 し た 。 さ ら に 、エ ミ ュ ー の 前 肢 芽 で のC.J., 2006. Regulation of Gremlin expression

Grem1 の発現は、成体の骨格パターンとも対応してin the posterior limb bud. Developmental

いた。マウス胚では、肢芽全体に Grem1 を強制発

biology 299, 12-21.

現させることで BMP シグナルを抑制すると、指は6.

Norrie, J.L., Lewandowski, J.P., Bouldin,

伸長し、前後軸方向に広がった多指になることが示

C.M., Amarnath, S., Li, Q., Vokes, M.S.,されている(Norrie et al., 2014). 肢芽においては、

Ehrlich, L.I.R., Harfe, B.D., Vokes, S.A.,Grem1 の発現が低下することにより、間充織細胞の2014. Dynamics of BMP signaling in limb

増殖が停止し、軟骨へと分化し始める(Lopez-Rios etbud mesenchyme and polydactyly.

al., 2012; Pickering et al., 2018)。本研究の成果は、鳥Developmental biology 393, 270-281.

類の指パターンは、Grem1 によってシグナルのリレ

7.

Panman, L., Galli, A., Lagarde, N., Michos,ーが行われる SHH/Gremlin1/AER-FGF フィードバ

O., Soete, G., Zuniga, A., Zeller, R., 2006.

ックループによって制御されており、種間のみならDifferential regulation of gene expression in

ず、種内での指パターンのバリエーションは、初期

the digit forming area of the mouse limb bud

肢芽での Grem1 の発現パターンとして認識されう

by SHH and gremlin 1/FGF-mediated

る こ と を 示 唆 し て い た (Kawahata et al., underepithelial-mesenchymal signalling.

revision)。

Development 133, 3419-3428.
8.

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