分子動力学シミュレーションによるタンパク質ドメイン運動の解析
近藤 寛子, 沖本 憲明, 森本 元太郎, 泰地 真弘人
東大 新領域, 理研 ASI
h_kondo@gsc.riken.jp
概要： 近年、X 線結晶構造解析や NMR による解析から、多くのタンパク質においてリガンド結合状態と非結合状態の間の構造の違いが明らかになってきた。このような構造変化は、これまで 2 つの典型的なモデルによって説明されてきたが、その生体内での振る舞いは未だ明らかにされていない。
そこで我々は、総計 1 マイクロ秒以上の分子動力学シミュレーションを行い、リガンド結合に伴うタンパク質の自由エネルギー地形の変化を解析することを試みた。計算対象には、実験的に構造変化のメカニズムが異なると理解されている２種類のタンパク質を選択した。その結果、これらタンパク質のリガンド結合に伴う構造変化は、アポ状態の構造の揺らぎとリガンド結合に伴う相互作用が共同的に働くことで引き起こされることが示唆された。

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背景と目的タンパク質の構造はリガンド分子の結合により多様に変化することが知られており、この構造変2

方法
本研究では、以下の 2 種類のタンパク質を対象として解析を行った。

化はタンパク質の機能と密接に関係している。そ・Lysine/arginine/ornithine-binding protein (LAO)のため、このメカニズムを理解することは生命科

・Maltose-binding protein (MBP)

学において非常に重要であるといえるだろう。

両タンパク質はバクテリアのペリプラズムにおい

現在、このようなリガンド結合に伴う構造変化て物質の輸送に関わっており、2 つのドメインとに対して 2 つの典型的なモデルが提唱されている。

それらをつなぐヒンジ部分から構成される。LAO

1 つは pre-existing equilibrium dynamics（以下、は、アポ体とホロ体の結晶構造解析からその構造pre-existing model）であり、もう 1 つは induced- fit

変化のメカニズムは pre-existing model であると考model である（図 1）。前者においては、タンパクえられているのに対し 1、MBP は NMR による解質の構造変化は主にゆらぎによって起こり、リガ析などから induced-fit model であると考えられてンドの結合は構造の安定化のみに寄与する。一方、

いる 2。

後者のモデルでは、リガンドの結合が構造変化を積極的に引き起こすとする。
しかしながら、実験から構造の遷移経路を知る

LAO, MBP ともにアポ体およびホロ体の結晶構造が得られていることから、以下の流れで解析を行った。

ことは困難であるため、実際の生体内での構造変① 構造変化のダイナミクスを調べるために、結晶化については明らかになっていない。そこで本研構造を含む 4 種類の初期構造から MD シミュレー

究では、分子動力学（MD）シミュレーションを用ションを行い、得られたトラジェクトリに対していてその構造変化のメカニズムを解析することを主成分分析（PCA）を行った。

目的とする。

② アンブレラサンプリングにより自由エネルギー地形を計算。アンブレラサンプリングで用いる構造空間の座標軸として、LAO では上位 2 主成分軸（PCA1, PCA2）を用い、MBP では計算量の問題などから第一主成分軸のみを用いた。また、各点のアンブレラポテンシャル Vi は、j 番目の主成分軸（固有ベクトル）Xj における各構造 r の主成分の値に対して式 (*) を用いて計算した。
Vi 

図1

構造変化のモデル

1k  r  X j  i, j 2  *
2 j

各点 1 ns 程度のシミュレーションを、アポ体、ホまた、本研究からはアンブレラサンプリングのロ体合わせて LAO では約 1000 本、MBP では 70

結果が初期構造に大きく依存するという問題点も本程度行った。

明らかになった。

全ての MD シミュレーションにはソフトウェア
AMBER 8.0 を使用した。

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結果
MD シミュレーションでは、両タンパク質ともに、アポ体の結晶構造から始めたものは open state付近、ホロ体のものは closed state 付近でほぼ安定に存在していた。また、アポ体の結晶構造にリガンドを付加したものでは open state から closed stateへの遷移がみられた。これらのトラジェクトリに対する PCA の結果、上位 2 主成分軸は LAO, MBPともにドメインの開閉運動およびツイスト運動をそれぞれ表していた。
図 2 LAO の自由エネルギー地形および構造変化の模式図

ここで得られた軸をもとにアンブレラサンプリングを行った結果は以下の通りである。
【 LAO 】 アポ体、ホロ体ともに、アンブレラ

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まとめ

サンプリングの結果得られた自由エネルギー地形

本研究では、タンパク質のドメイン運動の解析において結晶構造付近が最安定構造となっていた。

として LAO 及び MBP の構造とエネルギーに関す

また、アポ体の安定構造としては open state の他にる解析を行った。

新規の構造である semi-closed state が存在していた。

アンブレラサンプリングから得られた結果は定こ れ ら の こ と か ら 、 LAO で は open state と

性的には実験結果に一致しており、今回対象としsemi-closed state の間の広い領域でリガンドが結合た 2 種類のタンパク質では、アポ状態の構造の揺する可能性が示唆された。

らぎとリガンド結合に伴う相互作用が共同的に働

LAO は実験的には pre-existing model であると考えくことによって構造変化が引き起こされることがられていたが、pre-existing model と induced-fit示唆された。

model の複合的な経路（図 2; ②, ③）に加え、完全

しかしながら、本研究では大規模な系にアンブな induced-fit の経路（図 2; ①）も存在することがレラサンプリングを適用する際の問題点も残され示唆された。ている。今回用いた手法は計算量が大きく、また構造サンプリングとしてはまだ不十分である。今【 MBP 】

アンブレラサンプリングの結果は、LAO と同様、アポ体、ホロ体ともに自由エネルギ

後はこれらの問題点を考慮し、新たな手法についても検討したい。

ー地形において結晶構造付近が最安定状態となっていた。またアポ体では、結晶構造よりもやや閉じた部分（semi-open state）およびホロ体の結晶構造付近（semi-closed state）にも安定状態が存在していた。
semi-closed state のエネルギーはやや高く、安定な状態がほぼ open sate 付近に限られていること、及び MD の結果を考慮して、MBP ではリガンドの結合が構造変化に大きく寄与していることが示唆された。

参考文献[1] Oh, B. H. et al., “Three-dimensional structures ofthe periplasmic lysine/arginine/ornithine-binding
protein with and without a ligand”, J. Biol. Chem.,
268, 15, 11348-11355, 1993
[2] Millet, O. et al., “The energetic cost of domain
reorientation in maltose-binding protein as studied
by NMR and fluorescence spectroscopy”, PNAS,
100, 22, 12700-12705, 2003