アドレナリン受容体のシグナル選択性の構造基盤
Structural basis of adrenergic receptor signaling
所属機関：清華大学代表研究者氏名：豊田 洋輔
研究期間：2021 年 5 月 1 日～2022 年 4 月 30 日
滞在研究機関： School of Medicine, Tsinghua UniversityBeijing, 100084, China
共同研究者等： Prof. Brian K. Kobilka

10-point Times New Roman and about 200 words in length.
The α1A-adrenergic receptor (α1AAR) belongs to the family of G protein- coupled receptors that respond toadrenaline and noradrenaline. α1AAR is involved in smooth muscle contraction and cognitive function. Here, we present
three cryo-electron microscopy structures of human α1AAR bound to the endogenous agonist noradrenaline, its selectiveagonist oxymetazoline, and the antagonist tamsulosin, with resolutions range from 2.9 Å to 3.5 Å. Our active and inactive
α1AAR structures reveal the activation mechanism and distinct ligand binding modes for noradrenaline compared withother adrenergic receptor subtypes. In addition, we identified a nanobody that preferentially binds to the extracellularvestibule of α1AAR when bound to the selective agonist oxymetazoline. These results should facilitate the design of more
selective therapeutic drugs targeting both orthosteric and allosteric sites in this receptor family.

研究目的

βARs に比べ αARs の立体構造に関しては報告例がアドレナリン受容体は７回膜貫通型の G タンパク少なく、2019 年以降、活性型 α2AAR-Go [3]、不活性質共役受容体（GPCR）の一種であり、ホルモンであ型 α2AAR [4]、活性型 α2BAR-Gi/o [5]、不活性型 α2CARるアドレナリンや神経伝達物質であるノルアドレナ[6]が報告されたものの、α1AR に関しては、2022 年

リンが結合することにより、細胞内の三量体 G タンの不活性型 α1BAR の構造 [7] のみである。

パク質と共役し交感神経を調節する。アドレナリン

そこで我々は今回、クライオ電子顕微鏡を利用す

受容体(AR)には α1ARs (α1A, α1B, α1D; 主に血管平滑筋ることにより、活性型および不活性型 α1AAR の 3 種に存在、Gq/11 共役)、α2 ARs (α2A, α2B, α2C; 主に中枢神類 の 新 規 構 造 を 決 定 し た （ Toyoda et al. Nature

経に存在、Gi/o 共役)、βARs (β1, β2, β3; 主に心臓や肺Commun., 2023）。選択的作動薬であり鼻粘膜充血除に存在、Gs 共役)の計９分子種（サブタイプ）あり、去剤として市販されているオキシメタゾリン、あるそれぞれ異なる G タンパク質と共役し異なるシグナ

いは内因性リガンドであるノルアドレナリンが結合ル経路を活性化する。これらのうち、β2AR が最も良した２種類の活性型構造、および低血圧や前立腺肥く研究されており、申請者の留学先指導教官である大症の治療薬として利用されている拮抗剤タムスロ

Kobilka 博士らにより 2007 年に拮抗剤が結合した不シンが結合した不活性型の構造である。これらの構活性型 β2AR の構造 [1]、2011 年に作動薬が結合した

造情報により、α1AAR を標的としたより選択的な医活性型 β2AR-Gs 複合体の構造 [2] が報告されている。 薬品の開発が期待される。
これらの成果により Kobilka 博士は 2012 年のノーベル化学賞を受賞している。スタンフォード大学の教授に加え、2012 年より清華大学の客員教授も併任している。

研究経過

昆虫細胞 Spodoptera frugiperda (Sf9) に α1AAR を発現させ、界面活性剤による可溶化や FLAG タグなどを用いて精製した。さらに α1AAR を安定化させるた

a$FWLYHĮ1AAR(oxymetazoline)

め、近年 Kruse 研究室らにより確立された合成ナノ

Nb29

c

$FWLYHĮ1AAR(noradrenaline)

e ,QDFWLYHĮ1AAR(tamsulosin)

Nb29

ボディ（単一ドメイン抗体、Nb）ライブラリー [8]を基に、Nb が細胞表面に発現した出芽酵母を磁気ビ

detergent Į1AAR
micelleĮ1AARーズによる Magnetic-activated cell sorting（MACS）や
蛍 光 標 識 に よ る Fluorescence-activated cell sortingĮ1AAR

miniGsqminiGsq（FACS）によりスクリーニングした。作動薬（オキNb6

シメタゾリン）または拮抗薬（タムスロシン）が結合した異なる状態の α1AAR 精製標品を用い、立体構造選択的なナノボディの選別を行った結果、Nb29 がboxymetazoline

Nb29d

Nb29

noradrenaline

ftamsulosin

オキシメタゾリン結合型の α1AAR を選択的に認識し、オキシメタゾリンの結合を強めることが推測された。その分子メカニズムを調べるため、α1AAR とExt

Į1AAR(active)

Į1AAR(active)

Į1AAR(inactive)

Nb29 の複合体を形成させ、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析を行ったところ、Nb29 が α1AAR の細胞外領域を認識していることが判明した。しかしなInt

miniGsqminiGsqNb6

がら、分解能が不十分であり、特に細胞内側の α1AARの構造が不安定であった。α1AAR は Gq タンパク質と共役するが、GPCR-Gq 複合体は GPCR-Gs 複合体や GPCR-Gi/o 複合体に比べ不安定であることが多く、代替として、改変体である miniGsq を用いた構造決定が近年報告されている [9]。miniGsq は mini-Figure 1: The cryo-EM density maps and structure
models of the Nb29-α1AAR-miniGsq complexes
bound to the agonists oxymetazoline (a and b) andFig1
noradrenaline (c and d), and α1AAR-Nb6 complex
bound to the antagonist tamsulosin (e and f).

Gs（Gs タンパク質の動的領域を削除した縮小変異体）の C 末端 α5 helix を Gq タンパク質の C 末端 α5の膜貫通領域（transmembrane; TM）5 と 6、および細helix と置換した改変体である。我々は検討の結果、

胞内第 3 ループを別の GPCR に移植し、Nb6 と複合

Nb29-α1AAR-miniGsq 複合体として、オキシメタゾリ体を形成させることにより、ニューロテンシン受容ンあるいはノルアドレナリンが結合した二つの活性体 NTSR1 やソマトスタチン受容体 SSTR1 の不活性型 α1AAR のクライオ電子顕微鏡構造を、それぞれ 2.9型構造をクライオ電子顕微鏡により決定している。

Å と 3.5 Å の分解能で得た (Figure 1a-d)。

我々はこれを応用し、α1AAR へ Nb6 のエピトープをそれと並行し、不活性型の α1AAR の構造決定にも導入した α1AAR-kOR キメラ変異体を作製し、α1AAR-取り組んだ。不活性型 GPCR は、活性型 GPCR-G タ

Nb6 複合体として、タムスロシンが結合した不活性ンパク質複合体に比べて分子量が小さいため、クラ型 α1AAR のクライオ電子顕微鏡構造を 3.3 Å の分解

イオ電子顕微鏡に比べ X 線回折による結晶構造解析能で得た (Figure 1e, f)。

が主流である。細胞膜外ループ領域への融合タンパ

活性型および不活性型 α1AAR の構造を比較した結ク質の挿入や立体構造認識抗体を用いた結晶化が汎果、活性型では TM 6 が外側に 14.5 Å 移動していた

用されており、我々も融合タンパク質を挿入した(Figure 2a)。その他、膜貫通 helix 3、5、7 が内側に微

α1AAR 変異体や、合成 Nb ライブラリーから選別し移動しており、これらの構造変化により、α1AAR とた別のナノボディを用い、結晶化およびクライオ電miniGsq の C 末端 α5 helix との結合が促進された。

子顕微鏡による不活性型 α1AAR の解析を試みたもの

一方、不活性型 α1AAR では Nb6 による膜貫通 helix 6の、構造決定には至らなかった。最終的に、2021 年の固定が認められた。

末に bioRxiv に投稿された κ-オピオイド受容体（kOR）

続いて３種類のリガンド結合状態を比較したのキメラ変異体による手法を用いた [10]。この手法(Figures 1b, d, f and 2b)。内在性リガンドであるノル

では、kOR を不活性型に固定するナノボディ Nb6 のアドレナリンに対し、オキシメタゾリンではアミノエピトープ（抗原認識部位）である kOR の細胞内側基がイミダゾール環に置換しており、α1AAR のフェactive (oxymetazoline), active (noradrenaline), inactive (tamsulosin)aECL2bの複合体の構造を比較することにより、G タンパク
tam

ECL2

TM7TM6近く、これに対し、
β2AR-Gs では Gs の C 末端 α5 helixが β2AR の TM5 の方向へ向いており、α2AAR-Go でF312
TM7oxyH8⤴

c Nb29-Į AR-oxymetazoline
1Ad

G タンパク質のアミノ酸配列の違いが関係していることが分かった。

TM770

H103

D102

TM2TM3Y100

は Go の C 末端 α5 helix がその中間に位置していた。
これらの相互作用の違いには、各々の受容体および

Į1AAR-miniGsq
Į2AAR-Go,AR*Rȕȕ2AR-Gs

CDR3

ECL2Q167では miniGsq の C 末端 α5 helix が α1AAR の TM7 に⤴

70

質共役の選択性を調べた (Figure 2d)。α1AAR-miniGsq

TM2TM3TM1

最後に我々は α1AAR-miniGsq、α2AAR-Go、β2AR-Gs考察

R166(E180

本研究により、内在性リガンドであるノルアドレ

TM6

R101F308

H8miniGsq

oxyF312

合した活性型の構造、および拮抗薬タムスロシンがĮ

TM7ナリン、または選択的作動薬オキシメタゾリンが結結合した不活性型の構造を決定し、α1AAR に特徴的

Figure 2: a, Comparison of α1AAR between active andinactive states. b, Comparison of ligand-binding pockets ofAR.(oxymetazoline),c, Nb29 bindingsites.
d, Superimposition
theα1Aactiveactive(noradrenaline),inactive of(tamsulosin)
binding interfaces of α1AAR-miniGsq complex with
ECL2ba3SN6)
α2AAR-Go (PDB ID: 7EJ0) and β2AR -Gs (PDB ID:F862.64
complexes. The receptors are usedECL2for alignment.

なリガンド認識機構が明らかとなった。また、本研
究では細胞外領域を認識するナノボディ Nb29 を見出し、α1AAR の活性を特異的にアロステリック調節する構造基盤を示した。また、α1AAR-miniGsq 複合体と、α2AAR-Go 複合体、β2AR-Gs 複合体の構造を比較

TM3

ニルアラニン 312TM1の側鎖とより強くπ-π相互作用することにより、G タンパク質共役のサブタイプ選TM7していることが分かった。
このフェニルアラニン残択性を示唆する結果を得た。以上により、アドレナ⤴

TM270

TM7TM6 および α2ARs 間で保存されている一方、基は α1ARs9F3127.39
βARs ではアスパラギンである。この他、α1AAR に
H870

⤴
特徴的なアミノ酸であるメチオニン
292 やバリンĮ AR-miniGsqc Nb29-Į AR-oxymetazoline
1A1A

AR*Rȕ
ȕ2AR-Gsd Į2AAR-Go,
185 が作動薬の選択性に寄与していることが分か
ECL2CDR3った。一方、タムスロシンが結合した不活性型の構H10370
Q167 D102

TM7Y100

TM3

TM2リン受容体の主要なサブタイプ（α1、α2、β）の活性型および不活性型の構造が揃ったことになり、これらの知見は、低分子薬のみならず、アロステリック調節薬や抗体医薬の効果的な設計に寄与することが期待される。

造では、フェニルアラニン 312 の側鎖による蓋が開R166いており、作動薬が結合しているオルソステリック(7.32TM6R101
部位から細胞外前庭部（extracellular vestibule）に亘
E180ECL2F308

参考文献

1.

りタムスロシンが結合し、TM 7 を僅かに外向きへĮ広げていた。
oxyH8of an engineered human β2-adrenergic G protein-F3127.39
TM7

次に、Nb29 が作用機構について調べた。Nb29 は
α1AAR の細胞外第二ループ（ECL2）や TM7 を主にCherezov, V., et al., High-resolution crystal structure

coupled receptor. Science, 2007. 318.
2.

Rasmussen, S.G., et al., Crystal structure of the β2認識し、相補性決定領域（complementary-determinedadrenergic receptor-Gs protein complex. Nature,region; CDR）1-3 の内、最も長い CDR 3 が細胞外前2011. 477(7366): p. 549-55.

庭部に結合することにより、TM7 を内向きに安定化していることが分かった (Figure 2c)。このようなTM7 の内向きへの安定化によるポジティブアロステ
リック調節機構は、ムスカリン性アセチルコリン M2受容体のポジティブアロステリック調節薬である
LY2119620 が結合した構造においても報告されており、α1AAR でも同様の作用機序が示唆された。

3.

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eabj5347.

4.

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6.

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研究の発表

Recognition and Subtype Selectivity of α2C

口頭発表
なし

Adrenergic Receptor. Cell Rep, 2019. 29(10): p.
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7.

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(*These authors contributed equally to the work,289-296.
9.

誌上発表

Nehmé, R., et al., Mini-G proteins: Novel tools forstudying GPCRs in their active conformation. PLoS
One, 2017. 12(4): p. e0175642.

#Correspondence)023-39310-x

https://doi.org/10.1038/s41467-