ト ピ ック ス

核移植技術とミトコンドリア遺伝病
Oregon National Primate Research Center, Oregon Health & Science University

立花 眞仁，Shoukhrat Mitalipov!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

ミトコンドリア遺伝子の遺伝的浮動と配偶子系列遺はじめに核移植技術は，遺伝子改変動物の作成や畜産分野で大伝子治療きく貢献してきた．一般に，核移植技術は核遺伝子の操母系遺伝であるミトコンドリア遺伝子の世代間の伝搬作を想起させるが，核移植を行うということは同時に細については，未だすべてが解明されている訳ではない．

胞質を置換することでもある．細胞質には種々の細胞小あるミトコンドリア病の家系図の例を図器官およびミトコンドリアが存在し，ミトコンドリアに一の保因者カップルから健児，罹患児が出生することははミトコンドリア固有の遺伝子（ミトコンドリア DNA :珍しくなく，また，世代を飛び越えて発症することもあmtDNA）が存在する．われわれのグループでは，核移る．メンデルの遺伝形式によりある程度頻度を把握でき植技術をミトコンドリア置換の技術と位置づけ，さまざる核遺伝子の遺伝性疾患とは異なり，ミトコンドリア病

まな研究を行っている．事実，近年われわれが報告したの出生前の遺伝カウンセリングは困難をきわめている．

紡錘体置換法（Spindle transfer : ST 法）［１，２］は，ミ

この理由としては，i）多くのミトコンドリア病は正常

トコンドリア病の伝搬を回避する配偶子系列遺伝子治療と変異体が混在するヘテロプラスミー （Heteroplasmy）

法 と し て 考 慮 さ れ て い る（http : //www.hfea.gov.uk/

を呈し，変異体の割合が発症と重症度に相関する，ii）

６３７２．html）［に示すが，同］．この稿では，核移植技術を用いたミ配偶子形成過程におけるボトルネック効果（germline

トコンドリア置換から派生する基礎研究，臨床応用に向bottleneck）等により，個々の卵子は種々の程度のヘテけた検討や今後の展望などを紹介する．

ロプラスミーをもち，かつ，予測不能である iii）細胞分裂に伴うミトコンドリア遺伝子の不均衡配分，等が挙．i）ii）に関して具体例を挙げると，３０％げられる［４，５］ヘテロプラスミーの母親からの卵子は非常にワイドレン

図42

ミトコンドリア病の家系図（例）あるミトコンドリア病の家系図の伝搬の予測は非常に困難である．

日本生殖内分泌学会雑誌（2013）18 : 42-46

例を示す．世代間，同胞間においてミトコンドリア病の発症はランダムであり，TOPICS

図ミトコンドリア病における着床前遺伝子診断
ミトコンドリア病患者に対する着床前遺伝子診断の概要を示す．母親のヘテロプラスミーは個々の卵子のヘテロプラスミーを反映しないため，個々の胚において検査を行うことによって，mutation load の低い胚を選別することが狙いである．しかし，診断に用いた一部のサンプルが正確に残りの胚，および胎児のへテロプラスミーを反映することが大前提である．

ジなヘテロプラスミーを示すことが知られる．ヘテロプナー（ミトコンドリア病患者の卵子を想定）の mtDNA

ラスミーの割合がない，または低い卵子が受精に寄与し持ち込みを最小限にとどめるための技術であるが，逆にた場合，児は健常児もしくは保因者となるが（男児の場大量の細胞質とともに置換することによって意図的にヘ合は次世代へ引き継ぐことはない），逆に変異体の割合テロプラスミー卵子を作成することも可能である．そこが高率である卵子が受精に寄与した場合には，児はミトで，われわれは遺伝背景の異なるアカゲザル（Indian &）．そこで，近年

Chinese Macaque）を用いてほぼ５０％のヘテロプラス

急速に臨床応用が拡大している着床前遺伝子診断（Pre-

ミー卵子を作成し，以後の胚発育に伴うヘテロプラス

implantation genetic diagnosis : PGD）が胚の選別に有ミーの変化を分割期の割球間，胚盤胞期の内細胞塊と栄．これは図用であるとの報告がなされている［６，７］養外胚葉，胚性幹細胞，胎児および次世代の卵子を検討に示すように，卵子におけるヘテロプラスミーが胚発生した．核遺伝子と同じ由来の mtDNA を resident mtDNAから胎児に至るまで保たれ，かつ，分割期胚の割球であとし，導入された細胞質由来の mtDNA を alien mtDNAれ，胚盤胞期の栄養外胚葉であれ，診断に用いた一部のとし，alien細胞が残りの胚のヘテロプラスミーを正確に反映するこ（図コンドリア病に罹患してしまう（図mtDAN の割合の変化を定量的に検討した）．まず５０％の細胞質を置換した卵子を定量したととが前提となっている．しかし，ヒト着床前期胚におけころ，ほぼ５０％のヘテロプラスミーが確認できた．分割

る検討は非常に限られたサンプルサイズであり［期の胚に関しては，］，細胞期，細胞期，および細胞マウスモデルにおいて相反するデータも報告されている期胚の割球をすべて分離し各割球のヘテロプラスミーを［個々の胚毎に定量した．興味深いことに，胚の発育に伴っ］．もちろん，患者が変異体のみをもつホモプラスミー（Homoplasmy）である場合には適応外となる．
そこで，われわれは図における疑問に答えを出すべ

く，霊長類を用いた検討を行った［］．ST 法は，核ドて割球間のヘテロプラスミーの差は増大し，細胞期には同一胚からの割球間においてすでに７０％もの差を認める胚が存在した．この結果は，診断に用いられる割球がトピックス

43

TOPICS

図われわれが提唱する New bottleneck
霊長類モデルにおける５０％のヘテロプラスミー卵子を用いた検討から，分割期と胚盤胞期ともに胎児のヘテロプラスミーを反映せず，卵子のもつヘテロプラスミーは次世代（卵子）を介さずともドラマチックにシフトすることが示された．このことから，着床前遺伝子診断では，最終の胎児におけるヘテロプラスミーを正確に把握することは困難であること示唆される．

残りの胚のヘテロプラスミーを反映しないことを示唆しいた検討よりも，胚盤胞期の栄養外胚葉を用いた PGDた．元来，着床期後までミトコンドリア及び mtDNA のの方が診断に有用であると示唆された．

複製は起こらず，卵子形成過程で蓄えられた非常に大量

ところが，５０％ヘテロプラスミー胚から胚性幹細胞をのミトコンドリアが胚分割において分配されつつ初期胚樹立したところ，われわれの予想に反してすべての細胞の発生に必要な ATP を産生すると考えられる． しかし，株が resident か alien mtDNA 優位に大きくシフトしてresident か alien mtDNA が選択的に破壊もしくは増幅いた．さらに，In vivo の検討として胚移植を行い，maleされている可能性も否定できないため，割球を分離せず，と female の胎児を採取しすべての臓器を検討したとこ

そのままの分割期胚も定量を行ったが，それらは細胞，ろ，こちらも予想に反して female 胎児は９４％，male 胎細胞期すべてで元の５０％を保持してい児は約２６％のヘテロプラスミーを呈していた．しかも，た．つまり，割球間の差は一方の mtDNA の選択的破壊各臓器間で若干の差は認めたものの，分割期胚で認めたや増幅によるものではなく，不均等配分に起因することような大きな差は認めなかった．In vitro の胚においてが確認できた．次に胚盤胞期胚を用いて，内細胞塊と栄個々の割球（細胞）は種々の程度のヘテロプラスミーを養外胚葉に分離して定量を行ったところ，双方でほぼ呈しているが，平均は元の５０％を保っていると考えられ５０％のヘテロプラスミーを確認できた．つまり，バイオたため，胎児においてもそれぞれの細胞起源（胚葉由来

プシーに用いた栄養外胚葉は，胎児を形成する内細胞塊の違い）によって臓器間にヘテロプラスミーのばらつきのヘテロプラスミーおよび，元の卵子におけるヘテロプが認められても，平均では５０％を示すことを予想していラスミーを反映していた．この結果から，分割期胚を用たわれわれにとっては非常にショッキングなデータで細胞および44

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013

TOPICSあった．この事象を説明できるエビデンスを探したところ，マウスにおける倍体補完キメラにおける胚性幹細胞由来のマウスを作成する実験系において興味深い報告．マウスにおいて胎児を形成する起源細を認めた［１０］胞は通常個か個，多くて個という非常に少ない

Founder cell から成っており，この数は顕微注入された胚性幹細胞の数に依存しなかった．つまり，われわれの体を形作る大元の Founder cell が内細胞塊のほんの，個の細胞である場合，われわれの結果は合理的であると推察でき，分割期であろうが胚盤胞期であろうが PGD
では児のヘテロプラスミーを予測することが困難と考えられた．われわれはさらに，female 胎児の卵巣から卵子を回収し，個々の卵子（次世代とみなして）も検討したが，平均９４％の alien mtDNA をもった female の個体から，実にバラエティ豊かな（〜９０％）ヘテロプラスミー卵子が形成されていることが確認で き，や は り
germline には卵子形成過程に bottleneck と思われるメカニズムによる劇的なヘテロプラスミーの変化が存在することが霊長類でも確認された．図するもうにわれわれが提唱

つの Bottleneck を示す．われわれの検討か

ら germline（次 世 代）を 介 さ ず と も，intra-generation

図

組織適合性胚性幹細胞樹立法と遺伝子継承
上から細胞融合法，Direct reprogramming 法および，核移植法を示す．変異ミトコンドリアを排除した組織適合性胚性幹細胞の樹立は，現在のところ核移植法が最も有力な方法である．

でミトコンドリアのドラマチックなシフトが起こりえることが示された．残念ながらサルの疾患モデルが存在しないため，今回の検討は遺伝背景の異なる

つの wild

ミトコンドリア病の体細胞遺伝子治療と核移植

type mtDNA を混合することによって行われた．ゆえに，

前述の ST 法は児を出生以前に治療する配偶子系列遺ヒトの胚発育において，変異体の mutation load が保た伝子治療であり，残念ながら，すでにミトコンドリア病れるような別のメカニズムの存在も否定はできないが，を発症した患者に対するニーズには答えられない．そこ

少なくともこのような検討は臨床応用前に行われていてで登場するのが組織適合性胚性幹細胞の臨床応用であしかりで，現在行われている PGD に対する再検討が必る．ミトコンドリア病の予後不良は周知の事実と思われ要であると筆者は考えている．そこで，われわれの開発るが，特に心合併症の併発はミトコンドリア病の予後にした ST 法がミトコンドリア病の伝搬防止法として挙げ大きな影響を与える．ある報告によれば，心合併症を伴られる．いかに胚発育の過程でミトコンドリアの不均等うミトコンドリア病患者の１６歳時の生存は１８％と非常に配分が生じても ST 法で患者卵子から持ち込まれると考．しかるに，変異ミトコンドリアを排低率である［１１］えられる％以下の変異ミトコンドリアが，通常疾患発除した組織適合性胚性幹細胞を樹立し，心筋細胞への分症に必要とされる６０％以上のヘテロプラスミーに帰着す

化誘導，治療応用が可能であれば，患者の予後改善に寄ることは物理的に考えにくく，事実，再構築した卵子，与するのではないかと考えられる．図胚，胚性幹細胞，および出生したアカゲザルにおいても織適合性胚性幹細胞の樹立方法を示した．細胞融合によキャリーオーバーは％以下であった．ST 法で生まれる方法はミトコンドリアの問題以前に，核遺伝子の倍数た産仔の追跡調査では，児の健康に問題はなく，加齢に性の異常が生じるために臨床応用は考慮されない．また，伴うヘテロプラスミーの変化も認めていない．ヒト卵子

Direct reprogramming による induced pluripotent stem

における実現可能性も示された今［cell（iPS 細胞）は体細胞のミトコンドリアをそのまま］，ST 法がより確実な変異体の排除に有用であると推察する．に現在可能な組受け継ぐため，変異体の割合が低い細胞をドナーに選別

トピックス

45

TOPICSする術がないかぎり，変異 mtDNA の排除は不可能である．対して，体細胞核移植ではミトコンドリアはドナー卵子によってほぼ置換されることになり，しかも体細胞からのそれとは異なり，加齢や酸化的ストレスにより影響を受けたミトコンドリアではなく，卵子由来の Pristine なミトコンドリアである．つまり，体細胞核移植が今のところこのニーズに答える唯一の方法と考えられる．われわれはすでに霊長類モデルにて体細胞核移植か．
ら組織適合性胚性幹細胞の樹立に成功している［１２］われわれは以後も検討を続けているが，その分子生物学的類似性からヒト卵子を用いた核移植においてもわれわれの技術が応用可能なのではないかと考えている．

おわりに
昨今，遺伝子治療という言葉を耳にする機会が増えて９００を超える臨床試験が，世界中でさいている．実に１，まざまな疾患に対して，さまざまな治療法で行われている．上記の体細胞遺伝子治療に関しては，未だ核移植を用いたヒト組織適合性幹細胞が樹立されていないので，技術確立が目下の課題である．これに対し，ST 技術は確立されているものの，配偶子系列遺伝子治療自体，未だに認可されたものは存在しない．さらなるエビデンスの蓄積が必要ではあるが，われわれの技術が患者家族に提供されるよう早期のクリニカルトライアルの開始が望まれる．

46

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013

引用文献
．Tachibana M, et al（２０１３）Towards germline gene therapy
of inherited mitochondrial diseases．Nature ４９３, ６２７-６３１.
．Tachibana M, et al（２００９）Mitochondrial gene replacementin primate offspring and embryonic stem cells．Nature ４６１,３６７-３７２.
．Callaway E（２０１２）UK sets sights on gene therapy in eggs.
Nature ４８１, ４１９.
．Gropman AL（２００１）Diagnosis and treatment of childhood
mitochondrial diseases. Curr Neurol Neurosci Report １,１８５-１９４.
．Jenuth JP, Peterson AC, Fu K, Shoubridge EA（１９９６）Random genetic drift in the female germline explains therapid segregation of mammalian mitochondrial DNA．Nat
Genet １４, １４６-１５１.
．Poulton J & Bredenoord AL（２０１０）１７４th ENMC international workshop : Applying pre-implantation genetic diagnosis to mtDNA diseases : implications of scientific advances
１９-２１ March ２０１０, Naarden, The Netherlands. Neuromuscular disorders. NMD ２０, ５５９-５６３.
．Steffann J, et al（２００６）Analysis of mtDNA variant segregation during early human embryonic development : a tool
for successful NARP preimplantation diagnosis. J Med
Genet ４３, ２４４-２４７.
．Dean NL, et al（２００３）Prospect of preimplantation genetic
diagnosis for heritable mitochondrial DNA diseases. Mol
Human Reprod ９, ６３１-６３８.
．Lee H-S, et al（２０１２）Rapid Mitochondrial DNA Segregationin Primate Preimplantation Embryos Precedes Somatic andGermline Bottleneck. Cell Reports １, １０.
１０．Wang Z & Jaenisch R（２００４）At most three ES cells contribute to the somatic lineages of chimeric mice and ofmice produced by ES-tetraploid complementation. Devel
Biol ２７５, １９２-２０１.
１１．Scaglia F, et al（２００４）Clinical spectrum, morbidity, andmortality in １１３ pediatric patients with mitochondrial
disease. Pediatrics １１４, ９２５-９３１.
１２．Byrne JA, et al（２００７）Producing primate embryonic stem
cells by somatic cell nuclear transfer. Nature ４５０, ４９７-５０２.