研究フロンティア（令和元年度学術奨励賞受賞論文）

卵胞直径の拡大で可能となる顆粒膜細胞のレチノイン酸合成がLH 受容体発現を誘導
川合 智子 ）, Hoque SAM ），JoAnne S. Richards ），島田 昌之 ））広島大学大学院統合生命科学研究科）Department of Molecular&Cellular Biology, Baylor College of Medicine

み Lhcgr 発現が誘導されるのか，これを制御する因子やはじめに分子機構は解明されていない．
卵分泌因子の作用で顆粒膜細胞は細胞分裂を開始し，われわれは，DNA マイクロアレイを用いた経時的な卵の周りに顆粒膜細胞が層状に構成された二次卵胞が形網羅解析から，排卵前卵胞の顆粒膜細胞で発現が有意に成される．二次卵胞では，顆粒膜細胞に FSH 受容体が上昇する遺伝子群に着目し，ADH/ALDH family 遺伝子発現し，FSH の作用を受けることでミトコンドリアが群を同定した．これらの遺伝子群は，連動して機能する活性化される．ミトコンドリア活性に依存して，顆粒膜ことで食物から摂取されるビタミン A（レチノール）を細胞ではエネルギー ATP が合成され，顆粒膜細胞はさRA へ変換する．血中のビタミン A 濃度が低い，もしく）

らに増殖していく ．この間に卵胞直径も拡大し，卵胞は，高い症例では卵胞発育異常を呈する割合が高いこと

内では卵胞腔が形成され，顆粒膜細胞は卵を覆う卵丘細から，FSH によって合成された RA は正常な排卵前卵胞胞と卵胞膜を裏打ちする顆粒膜細胞に分化する．両者の形成に重要な役割を担っていると考えた．

違いは，顆粒膜細胞でのみ LH 受容体（Lhcgr）が高発現することで，この発現が排卵を可能にする．

卵胞発育過程のマウス卵巣において，RA の合成と分解に関わる遺伝子群の経時的な発現解析を行った結果，排卵前卵胞への発育には，卵胞直径の拡大とエストロeCG 刺激により排卵前卵胞の顆粒膜細胞では RA 合成酵ゲン（E ）合成が重要と知られている．それに加えて素の発現が有意に上昇するが，RA 分解酵素の発現は有われわれは，FSH により血中のビタミン A から顆粒膜意に低下することが示された．RA 合成酵素阻害剤（細胞で合成されるレチノイン酸（RA）が LH 受容体のMP）を eCG や hCG を投与する時にマウスへ同時投与発現に機能する新たな因子であることを明らかにした．

し，排卵への影響を調べた結果，eCG との同時投与が卵胞発育期に RA 合成系を阻害させても E 合成に異常排卵数を有意に低下させた．さらに，卵巣形態と卵胞発は認められなかったことから，RA が誘起する何らかの育期のマーカー遺伝子への影響を調べた結果，卵巣形態仕組みが Lhcgr 発現の制御に重要と考えられた．本稿でに変化は認められなかったが，顆粒膜細胞の Lhcgr 発現は，なぜ，卵胞直径の拡大が顆粒膜細胞における Lhcgrが有意に低下した．また， MP と eCG 投与 時間後に発現に重要なのか？そのメカニズムを解明するために，hCG を投与した時，排卵期特異的な遺伝子発現も有意

顆粒膜細胞の増殖過程におこる RA 合成機構と顆粒膜細に低値を示すことがわかった．これらの表現型は，離乳胞の分化機構に着目して取り組んだ研究を紹介する．

後からビタミン A 欠乏飼料を給餌したマウスにおいても同様に観察された．すなわち，ビタミン A 欠乏飼料

RA の新規合成が顆粒膜細胞の機能変化に果たす役割

により低ビタミン A 状態のマウスは，発情期の長期化により内因性の排卵刺激では排卵が不十分であるが，こ排卵前卵胞へと発育する過程では，FSH により E がれは顆粒膜細胞の Lhcgr 発現が有意に抑制されており，合成され，FSH との相乗作用で顆粒膜細胞 の 増 殖 やその標的遺伝子で排卵に必須な Areg や Ptgs2の発現がLhcgr 発現を促進すると考えられている．しかし，どの低値であることに起因していた．そのため，過剰排卵処ような仕組みにより十分発達した卵胞の顆粒膜細胞での理を行っても排卵数は低いままであり，排卵した成熟卵

連絡先：川合智子，広島大学大学院統合生命科学研究科〒 ―東広島市鏡山 ― ―TEL ： ― ―FAX： ― ―E-mail：tss ＠hiroshima-u.ac.jpの数が有意に少なく，成熟卵であっても胚盤胞期胚への発生率が低かった ）．以上の結果から，顆粒膜細胞で RAが合成されることも，LH 受容体が高発現する排卵前卵胞形成に必須と考えられた．

日本生殖内分泌学会雑誌（2020）25 : 21-23

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川合智子

他

週齢メスマウスの卵巣を用いた体外培養試験において，RA 単独処理は Lhcgr 発現を誘導できなかったのにRA 合成機構の違いと卵胞直径の拡大がLH 受容体発現を誘導する仕組み

対し，FSH と testosterone（T）を添加した培養液へのレチノール添加は，その濃度依存的に Lhcgr 発現が誘導

卵による RA 合成機構の違いが，どのように顆粒膜細された．さらに，RA 合成酵素の抑制剤添加は濃度依存胞の機能変化，とくに Lhcgr 発現の制御機構に影響して的にその発現を抑制した．レチノールを高濃度で添加すいるのかを明らかにするため，Lhcgr プロモーター領域ると，この Lhcgr 発現の上昇効果が抑制されたことから，を調べた．Lhcgr は，FSH により誘起される転写因子 SP）

RA の機能には作用濃度も重要と示唆された ．と SF が制御すると報告されている．また，FSH により cAMP 合成に伴って活性化する PKA が，上述の転写卵丘細胞と顆粒膜細胞における RA 合成機構の違い因子を介して Lhcgr の転写活性と遺伝子発現を 倍以上上昇させることも報告されている．しかし，Lhcgr のプ卵丘細胞では，排卵前卵胞においても LH 受容体が高ロモーター活性試験において，FSH により直ちにプロ発現しないことから，卵胞発育期の顆粒膜細胞と卵丘細モーター活性が上昇するのに対して，実際に遺伝子発現胞における RA 合成・分解酵素の発現，複数コピーの RAが誘導されるまでには 時間以上という長時間を要す応答配列が組み込まれ，その下流に LacZ をレポーターる．これらのことから，これら転写因子以外の時間軸を遺伝子として繋いだトランスジェニックマウスを用いた制御する因子の働きが必要と示唆された．

RA 活性測定の比較解析を行った．eCG 投与により，卵RA は核内で RA 受容体に結合し，プロモーター領域

丘細胞では RA 合成酵素の上昇割合が顆粒膜細胞と比較の RA 応答配列を介して転写因子として直接的に，もしして低く，また，顆粒膜細胞で検出された RA 分解酵素

くは，RA 受容体を介して他の転写因子や転写開始複合の有意な低下が認められず，その結果，LacZ 活性が変体と相互作用することで間接的に遺伝子発現を制御す化しないことがわかった．つまり，eCG 刺激を受けた

る．Lhcgr プロモーター領域において，転写因子 SP は，各卵胞内細胞では，RA の合成機構が異なっており，そC と G の配列に富む CpG アイランドと呼ばれる DNA

れが Lhcgr 発現の違いを生み出している可能性が示唆さ領域に結合する．CpG アイランドは DNA メチル化の標れた．

的となるため，メチル化されると SP が結合できなくな卵丘細胞と顆粒膜細胞は，卵からの距離が異なる．卵る結果，遺伝子発現が抑制される．Lhcgr 発現が低い JARと顆粒膜細胞を共培養すると，Lhcgr の高発現が抑制さ細胞株ではこの領域が高メチル化されていること，Lhcgrれるとの報告から，われわれは，卵分泌因子の濃度低下

発現が高い MCF 細胞ではこの領域のメチル化割合が低が Lhcgr 発現を含む排卵刺激への応答獲得に重要と仮説いことから，CpG アイランドの DNA 脱メチル化が Lhcgrを立て，顆粒膜細胞と卵の共培養実験と卵丘細胞・卵複の発現時間に影響を与えていると推察した．

合体（COC）に SMAD 阻害剤を添加する実験を行い，そこで，RA が Lhcgr 発現を制御するメカニズムを解卵が RA 合成機構と Lhcgr 発現に与える影響を調べた．

明するため，各卵胞ステージの顆粒膜細胞から DNA を

顆粒膜細胞を卵と共培養した時，RA 合成酵素の発現回収し，Lhcgr プロモーター領域におけるシトシンのメが有意に低下し，RA 分解酵素の発現が有意に上昇するチル化をバイサルファイトシークエンス法で解析した．

結果，RA 活性が有意に抑制された．また，FSH＋T に初期胞状卵胞から回収した顆粒膜細胞では，CpG アイより誘導された Lhcgr 発現は，共培養した卵の数依存的ランドのシトシンが ％以上メチル化されていたが，排に減少した．一方，COC の体外培養系に SMAD 抑制剤卵前卵胞では約 ％にまで低下した．体外培養系においを添加すると，RA 分解酵素の発現に変化は認められなても FSH によるメチル化割合の低下が検出され，このかったが，RA 合成酵素の発現は有意に上昇し，RA 活脱メチル化は，卵と共培養することで有意に抑制された）性も有意に上昇することが明らかになった ．これらのが，RA を添加すると有意に回復することもわかった．

結果から，顆粒膜細胞の増殖は卵胞直径を拡大させ，そ一方，COC の卵丘細胞では，排卵前卵胞においても Lhcgrれにより卵分泌因子の濃度が低下することが，LH 受容プロモーター領域のメチル化割合は高いまま維持されて体発現をはじめとする顆粒膜細胞の機能変化を制御していたが，SMAD 抑制剤もしくは RA で処理した時，プロいると考えられた．

モーター領域の脱メチル化と Lhcgr 発現が有意に上昇した ）．RA で処理した COC の卵丘細胞では，黄体関連遺伝子の発現も有意に上昇しており，顆粒膜細胞様に変化

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.25 2020

卵胞直径の拡大で可能となる顆粒膜細胞のレチノイン酸合成が LH 受容体発現を誘導

図

卵胞直径の拡大で可能となる顆粒膜細胞のレチノイン酸合成が LH 受容体発現を誘導する分子メカニズムしている可能性が考えられた．以上のことから，卵胞発する顆粒膜細胞の脱メチル化異常が関係している可能性

育期における卵胞直径の拡大は，卵による RA 合成機構が考えられた．本研究から，ART の卵巣刺激法におけの差異を生み出し，それが顆粒膜細胞の DNA メチル化る卵の影響を考慮した卵胞直径の基準は，質の高い成熟を引き起こすこと，この仕組みが LH 受容体が発現する卵を得るために重要と示唆され，現在は，卵胞発育期の排卵前卵胞の形成に重要（図顆粒膜細胞で起こる脱メチル化の詳細な制御メカニズム）であることが明らかになった．

を解明する研究に取り組んでいる．

まとめ

引用文献

ART の卵巣刺激法では，卵胞直径が排卵刺激をスタートする基準とされている．しかし，トランスクリプトーム解析から，PCOS 病態の顆粒膜細胞では RA 合成やSMAD シグナル伝達経路に関与する遺伝子の発現異常が報告されている．また，卵胞発育期の初期段階で Lhcgrが高発現した時，顆粒膜細胞の早期黄体化が起こり，排卵異常を呈するとの報告もある．さらに，年齢が高くなると卵の質が低下し，卵分泌因子も減少する．そのため，若い女性の卵巣刺激法と比較して卵胞発育がうまくいかない理由の．Hoque SAM, Kawai T, Zhu Z, Shimada M（）Mitochondrial Protein Turnover Is Critical for Granulosa Cell Proliferation and Differentiation in Antral Follicles. J Endocr Soc,： - .
．Kawai T, Yanaka N, Richards JS, Shimada M（）De
Novo-Synthesized Retinoic Acid in Ovarian Antral Follicles
Enhances FSH-Mediated Ovarian Follicular Cell Differentiation and Female Fertility. Endocrinology,：.
．Kawai T, Richards JS, Shimada M（）The Cell TypeSpecific Expression of Lhcgr in Mouse Ovarian Cells :Evidence for a DNA-Demethylation-Dependent Mechanism.
Endocrinology,：.

つに，卵による RA 合成機構の差異が制御研究フロンティア

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