実験動物ニュース

Vol. 60

3No. 1

実験動物感染症の現状

マウスノロウイルス
池郁生

独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター実験動物開発室

要

約

マウスノロウイルス（MNV）は 2003 年に RAG2/STAT1 両遺伝子欠損マウスから分離報告された新しいウイルスである。MNV は，マウスの病原体としてと，ヒトのノロウイルスのモデルとしての 2 点から注目されている。マウス病原体としては，一部の免疫不全系統で致死性である一方で，ほとんどの健康なマウスでは感染しても無症状である。しかしながら MNV の環境安定性は高く，また持続感染する例が多い。現在，国内での汚染状況の把握が進行中であり，多くの動物実験施設で MNV 感染が見つかっている。帝王切開や胚移植で清浄化が可能である。病原性研究の進展，検査体制の整備や汚染状況を見ながら，微生物コントロールの対象とすべきか議論されている。ヒトのノロウイルスのモデルとしての MNV は，感染マウスでヒトのような急性胃腸炎を示さないが，ノロウイルス属で唯一 MNV が細胞培養で増殖可能であること，ヒトノロウイルスとの物理性状の類似性，潰瘍性大腸炎やクローン病といった多因子性疾病のコントリビューターとしてなど様々な観点から急速に研究が進んでいる。

1．病原体：マウスノロウイルス Murine norovirus（MNV）（科名：カリシウイルス科，属名：ノロウイルス属）．症状：無症状，死亡
a．形態・ゲノム構造・タンパク質
ほぼ球状の正 20 面体でエンベロープを欠く。1 本鎖のプラス鎖 RNA（サイズ：7.4 kbp）で，3’ 末端にポリＡを有し，5’ 末端には RNA の感染性に必須な分子量 14.3 kDa の VPg と呼ばれるタンパク質が共有結合する。3 つの ORF が存在する。ゲノムの 5’ 側に非構造タンパク質が，3’ 側に構造タンパク質がコードされている。分子量約 60 kDa のカプシドタンパク
質 1 種類が主要構造タンパク質（VP1）である。VPgとは別に分子量 22 kDa のタンパク質（VP2）がビリオン中に存在すると考えられている。ピコルナウイ
ルスと相同性を有する非構造タンパク質として，ヘリカーゼ，プロテアーゼ，RNA 依存性 RNA ポリメラーゼが知られている。
b．増殖
細胞質内で増殖し，感染細胞内には 2 種の主要なプラス鎖 RNA が検出される。ゲノムサイズの RNAは非構造タンパク質の mRNA として，サブゲノムサ
イズの RNA はカプシドタンパク質と 3’ 末端の小さな ORF の mRNA として機能する。非構造タンパク質はポリプロテインとして翻訳され，ウイルスのプロテアーゼにより開裂し成熟した各種非構造タンパク質となる。ゲノムサイズの 2 本鎖 RNA が存在することから，ネガティブ鎖を介して複製が行なわれるものと考えられている。
c．培養
MNV はマウスの樹状細胞およびマクロファージ系細胞でよく増殖する。マウスマクロファージ系腫
瘍細胞株である RAW264 細胞および RAW264.7 細胞に感染させて増殖させることができる。
d．株
MNV では，多数のウイルス株が世界各地で分離されている（MNV-1，MNV-2，MNV-3，MNV-4，S7など）。ノロウイルス属には，ヒトのノロウイルス（NV）のほか，ブタノロウイルス，ウシノロウイル
スが知られ，VP1 遺伝子の塩基配列を基にしたホモロジー解析で 5 つの genogroup（GI 〜 GV）に分けられる。MNV の分離株はすべて GV に属する。
e．物理化学的性状・不活化法
MNV は環境安定性が高いと言われる。これは，室温で 14 日保存した糞便から MNV を RT-PCR で検出

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実験動物ニュース可能なことからも推察される。一方，MNV は，カリシウイルス科のネコカリシウイルス（ベジウイルス属）と異なり，70% エタノール感受性が高く，瞬時に感染価が減少する。紫外線による不活化も有効である。
2．感染様式
a．感受性動物種
MNV はマウスだけが感受性動物とされている。ヒトのノロウイルス（NV）のほか，ブタ，ウシでもノロウイルスが知られているが，動物種間における交差感染の報告はない。自然免疫の機能不全マウスにおいて致死的な感染を起こす。肺，肝臓，脾臓，小腸などでウイルスは増殖し，病理組織学的には肝炎，間質性肺炎，腹膜炎，胸膜炎などが認められる。
b．地理分布アメリカやヨーロッパなど世界中のマウスが高頻度に汚染されており，2005 年に報告された北米の研究 施 設 を 対 象 と し た 調 査 で は 約 22% の マ ウ ス がMNV 抗体陽性であった。国内のマウスの調査結果においても，本ウイルスの感染が確認されている。
c．伝播経路
糞便中に排出されたウイルスが経口感染する。不顕性感染例でも腸管や腸間膜リンパ節では長期間感染が持続し，ウイルス排出は感染後 8 週間以上続くことが報告されている。MNV は同居によって容易に感染が成立する。マウス系統によって各臓器における MNV 核酸量に差がみられる。MNV の垂直感染の報告はない。
d．感染率および致死率
日 本 国 内 に お け る MNV の 汚 染 状 況 は 調 査 が 始まったばかりであるが，今までの報告によるとコンベンショナル施設における MNV 感染率は高いと予想される。一方，長年に渡って多くの感染マウスが飼育されてきたにも関わらず，特定の自然免疫系の欠損マウスを除いて病原性を示唆する報告はほとんどない。以上の知見に基づけば，実験マウスコロニーで感染個体が発見されても，淘汰やクリーニング等の緊急対応は一般に不要と考えられる。今後，汚染状況や病原性に関する情報を集積しつつ，各施設の用途に合わせた対応方針を慎重に検討していくことが必要である。
e．感染経過Manuel, C.A. らの報告によると，4 週齢の ICR マ
ウスを用いた同居感染実験の報告では，同居 2 週目
ですべてのマウスの糞便が RT-PCR で MNV 陽性，同Vol. 60

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居 4 週目にすべてのマウスで抗 MNV 抗体陽性であった。MNV 汚染床敷を用いた 4 週齢の ICR マウス感染実験でも，遅くとも 10 週目には RT-PCR で MNV陽性，12 週目に抗 MNV 抗体陽性という。MNV 感染マウスは 3 か月以上ウイルス核酸の糞便からの排泄が持続する。
f．病理
免疫学的に正常な野生型マウスでは臨床的変化は軽微である。ウイルス株によりすぐに排除されるもの，持続するものがある。腸管膜リンパ節，腸管，脾臓などでウイルスは増殖する。病理組織学的変化は概して軽微とされる。
g．病原性
通常，本ウイルスによるマウスの感染は不顕性である。ヌードマウスや scid マウスなどの T 細胞や B細胞が欠如している免疫不全マウスでも不顕性感染となる。一方，STAT1 欠損マウスや IFN αβγレセプター欠損マウスなどのインターフェロン系自然免
疫の不全マウスは本ウイルスに高い感受性を示し，脳炎，肺炎，肝炎を伴う致死的感染となることが報告されている。
h．診断
臨床的な診断は困難である。ELISA あるいは IFAによる抗 MNV 抗体産生や，RT-PCR による MNV ゲノムの検出により検査が可能である。MNV 感染マウ
スでは持続感染例が多く，また糞便中で MNV は比較的安定であるので，検査個体が抗 MNV 抗体陽性あるいは RT-PCR 陽性であった場合，同一系統の個体も MNV 陽性であること，そして抗 MNV 抗体陽性個体のケージから採取した糞便が RT-PCR で MNV陽性となることも多い。
i．実験への影響
インターフェロン系機能に異常があるマウスでは，臨床症状を現し死亡率も高いため，本ウイルスを排除する必要がある。一方，通常のマウスにおける不顕性感染例で MNV が実験成績に影響を及ぼしたとの報告は少ない。しかし，MNV がマクロファージで増殖することから，マクロファージ機能やインターフェロン応答，特に腸管免疫系を解析する実験では問題となる可能性がある。また，以下の感染モデルの項で述べるように，炎症性大腸炎やクローン病のモデルで MNV が憎悪因子となる報告がある。MNV に関する論文は，ここ 2009 年頃から爆発的に増えている
ため，今後も MNV が実験へ影響する報告がなされる可能性があり，継続的な情報収集が必要である。

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3．感染制御 / 予防a．バイオセーフティ
一部の免疫不全マウスで病原性が確認されていることから，MNV はバイオセーフティレベル 2 に分類されている（下記の 5．d 項参照）。今後，国内での検査体制の整備や汚染状況の把握が進み次第，国立大学法人動物実験施設協議会が策定した「実験動物の授受に関するガイドライン」および「感染動物実験における安全対策」への追加も検討される予定であるが，現時点では未決定である（上記 2．d 項も参照のこと）。
b．清浄化方法
MNV 感染マウスからのウイルス排除には，帝王切開や胚移植が有効である。
4．検査方法a．分離
一 般 に 糞 便 等 か ら ウ イ ル ス 分 離 を 行 う 際 は，RAW264 系細胞が用いられる。
b．抗体検査精製 MNV や組換え抗原を用いた抗体検査（ELISA，IFA）が実用化されているが，市販の診断キットはない。日本チャールス・リバー株式会社モニタリングセンターでは MFI 法による血清検査を請け負っている。
c．PCR
盲腸内容物や糞便などから MNV の核酸を検出する RT-PCR 法が実用化されている。MNV 陽性検体が入手できる場合は自家検査も可能である。実験動物
中央研究所 ICLAS モニタリングセンターに RT-PCR検査を依頼することができる。
d．組織病理学
免疫染色により，腸間膜リンパ節や脾，小腸，肺などのマクロファージ・単球・小腸上皮細胞に MNV抗原が検出される。
5．感染実験
a．感染症モデル炎 症 性 大 腸 炎：Helicobacter bilis 感 染 マ ウ ス にMNV を共感染させると大腸の病理組織学変化が憎悪する。
ク ロ ー ン 病： ク ロ ー ン 病 感 受 性 遺 伝 子 で あ る
ATG16L1 を低レベルで発現させたマウスはパネート
細 胞 の 抗 菌 ペ プ チ ド 分 泌 産 生 に 異 常 が 生 じ る が，Vol. 60

No. 15MNV はこのマウスに持続感染し，パネート細胞にイン タ ー フ ェ ロ ンγや 腫 瘍 壊 死 因 子αと い っ た proinﬂammatory サイトカイン遺伝子発現を誘導し，デキストラン硫酸ナトリウム投与に反応して腸に潰瘍を起こすことから，クローン病様症状発症のコントリビュータとして働くのではないかと言われる。
b．封じ込めレベル
国立感染症研究所では MNV について，病原体のバイオセーフティレベル（BSL），感染実験の動物バイオセーフティレベル（ABSL）ともにレベル 2 としている。
謝辞
本ウイルスの日本における研究はまだ中途にあり，本項記述には，久和茂先生（東京大学），遠矢幸伸先生（日本大学），國田智先生（筑波大学），後藤一雄
先生（帝京大学），片山和彦先生（国立感染症研究所），山田靖子先生（同），酒井宏治先生（同），高木弘隆先生（同）など多くの研究者の講演 ･ 意見を参考にした。著述については文献欄に記載したが，学会発表等については記載していない。皆さん，色々とありがとうございました。
主要文献· Karst, S.M. et al. 2003. STAT1-dependent innate
immunity to a Norwalk-like virus. Science 299: 1575–1578.
· Hsu, C.C. et al. 2006. Persistent infection with andserologic cross-reactivity of three novel murine
noroviruses. Comp. Med. 56: 247–251.
· Henderson, K.S. 2008. Murine norovirus, a recently
discovered and highly prevalent viral agent of mice. Lab.
Anim. (NY) 37: 314–320.
· Manuel, C.A. et al. 2008. Soiled-bedding sentinel
detection of murine norovirus 4. J. Amer. Assoc. Lab.
Anim. Sci. 47: 31–36.
· Goto, K. et al. 2009. Molecular detection of murine
norovirus from experimentally and spontaneously
infected mice. Exp. Anim. 58: 135–140.
· 久和 茂．2009．マウスにおけるマウスノロウイ
ルス感染症．Labio21 38: 6–8.
· 後藤一雄．2009．わが国の実験用マウスにおけるマウスノロウイルスの汚染状況．Labio21 38: 9–13.
· 遠矢幸伸．2003．カリシウイルスと感染症．獣医微生物学第二版（見上 彪監修），文永堂出版，東京．