寄附講座

研究報告

1 設置部⾨⾦沢医科⼤学 総合医学研究所 プロジェクト研究センター

寄附研究部

2 寄附講座の名称
産婦⼈科微⽣物・がん免疫研究部
Division of Gynecology and Obstetrics Research for Microbiology and Cancer
immunology
3 設置期間
平成 31 年 4 ⽉ 1 ⽇〜令和 5 年 3 ⽉ 31 ⽇（4 年間）
4 担当教員名及び職名
教授

笹川助

⼿齋藤 まゆみ

⾮常勤講師
5寿之

伊藤俊広

寄附講座の研究の概要
研究課題
1. ⽇本における真の⾼リスク HPV 型の決定と Tissue Tropism 解析：HPV ワクチンの効果と検診への応⽤
2. ⼦宮頸部⾼度上⽪内病変に対する薬物焼灼法の開発；治療抵抗性因⼦の解析、宿主免疫応答との関連性
3. ⼦宮頸癌に対する BCG-CWS がん免疫療法の開発；その免疫学的作⽤機序の解明（1）⽇本における真の⾼リスク HPV 型の決定と Tissue Tropism 解析；HPV ワクチンの効果と検診への応⽤
⼦宮頸部 HPV 感染はごくありふれたもので、⼥性の約 8 割は⽣涯に⼀度は経験するとされる。感染の 9 割は⾃然に消退し、その⼀部、およそ 1000 ⼈に 1 ⼈ぐらいが⼦宮頸癌になるという⾃然史が明らかになっている(1)。多くの⼥性で HPV が排除されるのは感染宿主に誘導される免疫が重要な役割を果たしている（1, 3, 4）。
特定の HPV が癌を誘発するため（1, 2）、欧⽶先進国では、⼥⼦に対する HPV 感染予防ワクチンの普及や HPV 検査を⼀次検診として⽤いる⼦宮頸がん検診法の導⼊が進んでおり（9,14）、⼦宮頸がんは撲滅可能な癌になりつつある。2019 年 1 ⽉の第 114 回 WHO 理事会において⼦宮頸癌撲滅の戦略が可決された。しかし、⽇本では⼦宮頸がん検診受診率やHPV ワクチン接種率の低迷が続いており、最近の 20-30 年で若い⼥性の⼦宮頸癌罹患率や死亡率は増加傾向にあり(7, 9, 14)、その対策が⼗分なされているとはいえない。このまま⾏くと先進国の中で⼦宮頸癌の最も多い国になる可能性がある。
我々は、本研究部開設前に杏林⼤学と共同研究において、⾼感度で特異性に優れた HPV検査法として Uniplex E6-E7 PCR”法を開発した(８)。この⽅法は 13 タイプの⾼リスク型、11 タイプの⾼リスク候補型、および 15 タイプの低リスク HPV 型を検出できる⽅法であり、ほぼすべての⾼リスク型および⾼リスク候補型を検出できる点では世界初の⽅法である。また既存の低リスク型の半数以上を検出できる。当講座では、基本的にはこの⽅法をもちいて⼦宮頸部擦過細胞あるいは組織切⽚中の HPV 型を決定している。研究の第１の⽬的は、⽇本の⼦宮頸癌を誘発する真の⾼リスク型を明らかにすること。第２の⽬的として、癌化には関連しないとされる低リスク型や⾼リスク候補型の HPV の局在とその意義を明らかにすることである。第３の⽬的は、上記の研究結果から得られたデータをもとに、がん発⽣を予防する HPV 感染予防ワクチンの効果と HPV 検査を⼦宮頸癌検診に⽤いた場合の有効性を予測することである。
液状細胞診（LBC）検体中の HPV 型を解析結果から単独 HPV 型陽性の症例の解析や組織中の HPV 型を Microdissection 法で同定したところ、⾼リスク HPV 型のうち、HPV35型以外はほぼすべて癌で検出されたが、同時に HPV53,66, 67, 69, 70, 82 型など 6 つの⾼リスク候補型も検出された。したがって、⽇本⼈の⼥性性器癌の⾼リスク HPV 型の定義に修正が必要であると思われた。同様の解析を⼦宮頸部や腟の前がん病変（CIN2/3 またはVAIN2/3）にまで広げたところ、前がん病変でも⾼リスクまたは⾼リスク候補型が陽性であったが、低リスク HPV 型が単独型として検出されることはなかった(7,11,16,19)。
さらに⼦宮頸部と腟において頻度の⾼い HPV 型を⽐較したところ、⼦宮頸部では⾼リスク型 HPV が多く検出されるが⾼リスク候補型や低リスク型は少なく、腟ではすべての HPV型が均等に検出される傾向がみられた（11, 16）。組織中の HPV 型を Microdissection 法で解析したところ、腟組織のうち⾼グレード病変（VAIN2/3）や腟癌のほぼすべてに⾼リスクまたは⾼リスク候補型で陽性であったが、低リスク型はほぼすべて陰性であり、低リスク型は、ほぼ正常 (vaginitis)か軽度異常病変（VAIN1）にしか検出されなかった(16)。低リスク
HPV 型は無害であることが検証され、多くは腟壁に感染することも明らかになった。
次に⼦宮頸癌症例のうち、LBC 検体で HPV が陰性であった症例と HPV 型が複数陽性の多重型感染症例について Molecular mapping 法で解析したところ、HPV 陰性癌の半数が陽性となり、多重 HPV 型陽性例はすべて単独の HPV 型が陽性であった（19）。この結果か
ら、１病変から１HPV 型が検出されるという Quint らの仮説が証明された。さらに興味深いことには、細胞検体で HPV 陰性だったが Molecular mapping 法で陽性になった症例のHPV 型を調べたところ、ほとんどが HPV16, 18 型であり、残りは⾼リスク候補型の HPV67,82 型であった(19)。この結果から、LBC 検体を⽤いた場合にほとんどの⾼リスク型は検出できるが、HPV16, 18 型の⼀部は検出できないことが判明した。そこで、HPV16, 18 型のE1, E2 領域をカバーする PCR 法を独⾃に開発して解析したところ、それらの HPV 陰性癌症例では、HPV16,18 型の E1, E2 遺伝⼦領域に⽋損があった。したがって、細胞診で陰性であった HPV16, 18 型症例は HPV-DNA がヒトの遺伝⼦内に組み込まれている可能性が考えられた。ヒト遺伝⼦に組み込まれた HPV-DNA は⾃⼰複製されることはないためコピー数が少なくなり、また LBC 検体では HPV が検出できない可能性がある。⼀⽅、HPV陰性癌のうち⾼リスク候補型陽性の症例では E1-E2 領域の⽋損は⾒られなかった。これらの HPV 型は、単に市販の HPV 検査では検出できないタイプであったため陰性とされた(19)。
以上の結果を総合すると、HPV ワクチンの予防効果を 100％と仮定すれば、現在実施されている HPV16,18 型感染を予防する２価、４価 HPV 感染予防ワクチンでは、⽇本⼈の⼦宮頸癌の約 65%が予防できること、今年４⽉から認可される９価ワクチンでは約 88%の癌発⽣を防⽌できると考えられた。⼀⽅、⼦宮頸癌検診に HPV 検査を⽤いる場合には、現⾏の 13-14 タイプの⾼リスク HPV 型のみならず、HPV53, 67, 69, 70, 82 型など⾼リスク候補型を含めた 19 タイプを検出できる検査法の開発が理想と考えられた。また、がん組織における遺伝⼦組み込みを考慮すれば、がん検診には感度の⾼い HPV 検査を⽤いる必要もあると思われる。⾼感度の⾼リスクおよび⾼リスク候補型 HPV を検出できる検査を⼦宮頸がん検診に⽤いることにより、精度の⾼い検診が可能になるだろう。
腟上⽪には低リスク型から⾼リスク型までさまざまな HPV 型が感染すること、⼦宮頸部に⽐べ、腟では HPV53, 66, 73 型などの⾼リスク候補型や HPV81,90 型など低リスク型HPV による感染が多いことが明らかになった（11, 16）。⼦宮頸癌の 65%が HPV16, 18 型感染であった(７)が、腟癌では⾼リスク、⾼リスク候補型などが各１例ずつ陽性となり（16）、
腟では HPV16, 18 型が主な原因ではなかった（16）。この結果から、⼦宮頸部の SCJ1 に感染しやすい HPV や腟に感染しやすい HPV など、HPV ごとに Tissue tropism が異なる可能性がある。共同研究者である⼤河⼾らの研究では、⾼リスク型 HPV16,18,52 型（Alpha-7, 9）が陽性の⼦宮頸部病変を有する患者の細胞診検体から Koilocyte を伴う細胞は検出されないが、⾼リスク型でも HPV56 やそのグループ（Alpha-5）の⾼リスク候補型；
HPV53,66 型陽性の細胞診検体から Koilocyte が検出された（1２）。Koilocyte は扁平上⽪の分化過程で発⽣する細胞変性（cytophasic）所⾒であり、Koilocyte を伴う病変は HPV粒⼦が産⽣される HPV 感染初期病変と考えられるが、Koilocyte を伴わない病変はより未分化な細胞よりなる前がん状態の病変と考えられる。前者は主に扁平上⽪領域、後者はsquamocolumnar junction (SCJ)に多く存在する幹細胞に感染した場合に発⽣すると考えられている。したがって、HPV16, 18, 52 型は多くは⼦宮頸部内側に存在する SCJ に感染するが HPV56 型などの⾼リスク HPV 型はより腟に近い扁平上⽪領域に感染しやすいのかもしれない。
我々の調査で 20 歳代に発⽣した⼦宮頸癌のすべてが HPV16 型または HPV18型陽性であったが、それら以外の⾼リスク HPV 型は患者の年齢があがるほど陽性率が増加する傾向がみられた（7）。HPV 型毎に Tissue tropism が異なり、その差が悪性度を決定するする可能性がある。すなわち、HPV16, 18 の発癌は HPV ウイルス産⽣を伴わない感染パターンをとりやすく、CIN1 をスキップした DeNovo 発癌のパターンをとる可能性があるが、他の⾼リスク型による発癌は、これまで考えられてきたような CIN1、CIN2, CIN3 の順に進⾏する多段階発がんのパターンをとると思われる。HPV16,18 型による発癌は癌化までの速度が速いため、若い⼥性の⼦宮頸癌で多く発⾒されるが、腟癌は⾼齢者に多い病気であるが、それも Tissue Tropism 仮説によって説明できるだろう。
（2）⼦宮頸部⾼度上⽪内病変に対する薬物焼灼法の開発；治療抵抗性因⼦の解析、宿主免疫応答との関連性
⼦宮頸部⾼度上⽪内病変（CIN2/3 または HSIL）は⼦宮頸癌の前癌病変である。この疾患の治療として⼦宮頸部円錐切除術が選択される。この⽅法で⼦宮は温存されるが、その合併症として流早産、低出⽣体重児出産、帝王切開など周産期合併症の増加が危惧されている。
⼦宮頸癌発⽣の若年化が進むなか、20-30 歳代⼥性の前癌病変も急増しており未婚時に発症して上記⼿術を受ける患者が増えている。このような患者では妊孕性に影響を与える円錐状切除術はできるだけ避けたい。そこで我々は、CIN2/3 の治療に蛋⽩変性剤であるフェノールやトリクロール酢酸などを⽤いた⼦宮頸部 Chemical peeling 療法を応⽤した無⼿術治療法を開発した。現在までフェノール療法は 500 例以上に試み、⾼度前癌病変の CIN2 はほぼすべて、CIN3 は 80％以上の奏効率であった。⼿術追加 CIN３症例は難治性症例であり、本治療後に浅い円錐状切除術を併⽤した。その結果、本治療を実施したすべての症例で、ほぼ早産率をゼロ（１例のみ３５週で出産）に導くことに成功した。しかし、治療開始から完治するまでの期間は、CIN2 で数か⽉から 1 年、CIN3 では半年から 2 年であり、治癒まで時間がかかることが⽋点である。現在、治癒までの期間をより短縮でき、かつ全⾝性の副作⽤が少ない TCA 療法に変更した。これまでのところ TCA 療法に重篤な合併症はなく、妊娠への影響もみとめていない。
フェノール療法で難治性の（治癒までの期間が⻑い）症例の原因を調査したところ、免疫不全、⾼グレード病変、VAIN 合併、HPV16, 18 型や⾼リスク候補型 HPV 陽性、⼤きい病変が単変量解析で関連する因⼦であった。免疫不全症例を除いた多変量解析では、⾼グレード病変、受動・能動喫煙が治療抵抗性に関連する独⽴因⼦であった（論⽂準備中）。現在、TCA 療法の効果についても同様の解析を⾏っている。
（3）⼦宮頸癌に対する BCG-CWS がん免疫療法の開発；その免疫学的作⽤機序の解明
⼦宮頸がんの原因が HPV 感染であり、ウイルスは異物として認識されるため、免疫療法が最も効きやすい疾患と考えられる（3, 4）。当科で治療した 103 例の⼦宮頸癌のうち、13例に BCG-CWS ワクチン接種を⾏い、⾮接種群 90 例と予後を⽐較した。BCG-CWS は治療開始前あるいは治療開始早期から接種した。その結果、COX hazard model 解析ではHazard ratio: 0.21, p=0.008 by the Cox model となり、本療法により⻑期予後は明らかに改善された（20）。著効例には、脳転移を伴う stage-4 症例や明らかな⾻盤リンパ節転移の症例が含まれ、これらの症例は現在まで５年以上⽣存している。本治験終了後２か⽉で肺に転移した１症例では、本治療を再開し、さらに⼿術、抗がん剤治療を併⽤したところ６年間⽣存した。無病⽣存の４症例について免疫組織染⾊を⾏ったところ、全例で癌組織周辺に多数の CD4, CD8 リンパ球の浸潤がみられた。⼦宮頸癌では、⼀般にがん組織の周囲に多数の免疫抑制性 T リンパ球（Treg）などが集まっているという報告があるが、本治療の有効例では Treg は少なかったが、無効例では Treg と CD20＋リンパ球（B リンパ球）の増加（Th2 優位パターン）を伴っていた。この結果は、Treg による免疫抑制のみならず、Th2優位の免疫環境が予後を不良にすると思われた。また BCG 無効例のうち２例は治療開始後も喫煙をやめなかった症例であり、がん治療中の禁煙も重要と思われた。現在、がん免疫治療として、免疫チェックポイント阻害薬が注⽬されているが、古典的ながん免疫療法である本療法が⼦宮頸癌に有効であることを⽰すことができた（20）。本療法は安価ながん免疫療法として、今後。多くの患者に恩恵をもたらす可能性がある。
現在、有効性のメカニズムを明らかにするため、BCG 接種後の NK 活性や HPV16E6 蛋⽩に対する Cytotoxic T Lymphocyte (CTL)活性化について免疫学的解析を⾏っている。現時点の解析では、⼦宮頸癌患者で術後５年間再発のない症例では、２種類以上の HPV16,18E6 ペプチドに反応する CD４＋（ヘルパーT）、CD8＋T（キラーT）リンパ球の活性化が観察されている。今後は、⼦宮頸がん以外の婦⼈科がんについて BCG-CWS 療法の有効性を検証したいと考えている。

本研究の基礎となる論⽂と寄附講座期間中に発表した論⽂（発表時期順に掲載）
１．

笹川寿之. 特集 HPV ワクチン；HPV 感染から⼦宮頸癌発⽣までの⾃然史. ⽇本産科婦⼈科学会雑誌

２．

Acta Obst, Gynecol. Jp. Vol．61,

ll97− 1205，2009.

Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: aretrospective cross-sectional worldwide study. Silvia de Sanjose, Wim G V Quint,
Laia Alemany, Toshiyuki Sasagawa

et al.

Lancet Oncol. 11: 1048‒56, 2010.

３．

笹川寿之. ⼦宮頸癌に対するがん免疫療法, ⽯川医報 3.16, 53-57, 2011４．

Toshiyuki Sasagawa, Hiroaki Takagi, Satoru Makinoda. Immune responses
against human papillomavirus (HPV) infection and evasion of host defense incervical cancer. J Infect Chemother. 18:807–815, 2012

５．

Zhang Sheng, Hiroshi Minato, Toshiyuki Sasagawa, Satoko Nakada, ErikoKinoshita, Nozomu Kurose, Takayuki Nojima, Satoru Makinoda. Detection ofhigh-risk human papillomavirus subtypes in cervical glandular neoplasia by insitu hybridization. Int J Clin Exp Pathol. 6(10): 2168–2177, 2013.

６．

Toshiyuki Sasagawa, Toshiyuki Maehama, Kazuhisa Ideta, Takuya Irie.

Population-Based Study for Human Papillomavirus (HPV) Infection in Young
Women in Japan: A Multicenter Study by the Japanese Human Papillomavirus
Disease Education Research Survey Group (J-HERS). Journal of Medical
Virology 88:324–335, 2016.
７．

Jinichi Sakamoto, Shoji Kamiura, Kaori Okayama, Mitsuaki Okodo, Takeo
Shibata, Yasuhiro Osaka, Satoko Fujita, Emi Takata, Hiroaki Takagi, Masahiro
Takakura, Toshiyuki Sasagawa. Single type infection of human papillomavirus
as a cause for high-grade cervical intraepithelial neoplasia and invasive cancerin Japan. Papillomavirus Research 6, 46‒51, 2018８．

Mitsuaki Okodo, Kaori Okayama, Koji Teruya, Toshiyuki Sasagawa.

UniplexE6/E7 PCR method detecting E6 or E7 genes in 39 human papillomavirus types.

J Med Virol. 90:981‒988, 2018.
９．

Toshiyuki Sasagawa, Toshiyuki Maehama, Yasuhiro Osaka, Jinichi Sakamoto,Takeo Shibata, Satoko Fujita, Masahiro Takakura, Hiroaki Takagi. Comparisonof the digene hybrid capture 2 and Roche cobas 4800 HPV tests for detection ofCIN2+ in a referral population in Japan. J Med Virol. 90:972‒980, 2018.

１０． Takeo Shibata, Benjamin J. Lieblong, Toshiyuki Sasagawa, Mayumi Nakagawa.
The Promise of Combining Cancer Vaccine and Checkpoint Blockade forTreating HPV-Related Cancer. Cancer Treat Rev. 78: 8–16, 2019
１１． Zhang S, Saito M, Yamada S, et al. The prevalence of VAIN, CIN, andrelated HPV genotypes in Japanese women with abnormal cytology.

J. Med.

Virol. 92(3): 364, 2020
１２． Okodo M, Okayama K, Teruya K, et al. Koilocytic changes are not elicited byhuman papillomavirus genotypes with higher oncogenic potential. J. Med. Virol.
2020 Mar19
１３． Okayama K, Kimura H, Teruya K, et al. Correlation between Human
Papillomavirus Codetection Profiles and Cervical Intraepithelial Neoplasia inJapanese Women. Microorganisms. 8(12): 1863, 2020
１４． Kuroki H, Sakamoto J, Shibata T, Takakura M, Sasagawa T.

Comparison of

Aptima and hybrid capture-2 HPV tests and Pap test in the referral populationin Japan. J. Med. Virol. 93(8): 5076,2021.
１５． Takeo Shibata, Mayumi Nakagawa, Hannah N. Coleman, Sarah M. Owens,William W. Greenfield, Toshiyuki Sasagawa, Michael S. Robeson, II. Evaluationof DNA extraction protocols from liquid-based cytology specimens for studying
cervical microbiota. PLoS One. 16(8): e0237556. Published online 2021 Aug
30. doi: 10.1371/journal.pone.0237556, 2021

１６． Zhang S, Saito M, Okayama K, et al. HPV Genotyping by Molecular Mapping ofTissue Samples in Vaginal Squamous Intraepithelial Neoplasia (VaIN) andVaginal Squamous Cell Carcinoma (VaSCC). Cancers (Basel). 13(13): 3260, 2021
１７． Shibata T, Shah S, Evans T, et al. Expansion of Human Papillomavirus-Specific
T Cells in Periphery and Cervix in a Therapeutic Vaccine Recipient Whose
Cervical High-Grade Squamous Intraepithelial Lesion Regressed. FrontImmunol. 12: 645299, 2021
１８． Okayama K, Sasagawa T, Teruya K, et al. Profiles of Human Papillomavirus
Detection of the Multinucleated Cells in Cervical Smears. Microorganisms. 9(8):1575, 2021
１９． Sakamoto J, Saito M, Zhang S, Takakura M, Takagi H, Sasagawa T.
Determination of human papillomavirus type in archival tissue specimens ofinvasive cervical cancer using molecular mapping and E6/E7-based polymerase
chain reaction. PLoS One. 17(4): e0265996, 2022
２０． Shibata T, Takata E, Sakamoto J, Shioya A, Yamada S, Takakura M, Sasagawa
T.A retrospective study of immunotherapy using the cell wall skeleton of
Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG-CWS) for cervical cancer.
Medicine(Baltimore).

MD.0000000000032481.

2022

Dec30;101(52):e32481.

doi:10.1097/