東京大学教養学部体育学紀要 (1994). 1〜 5

伸 張刺激 に対す る培養 細胞 の応答
そ の 1 形 態 と配 向
新 井 秀 明 ・ 山 下 雅 道 *・ 跡 見順 子
東京大学教養学部体育学研究室*文 部省宇宙科学研究所宇宙基地利用研究室
RcspOnses oF Culturcd Ccll to Strctch Slmulation
I. Morpho10gy and OrtntatiOn

Hidcaki Arai,Masamichi Yamashita*and YoHko Atomi
Depl. ot Sports Sciences, (bllege of Art and ScieDc€s,Tbe Universiry of Tokyo* IDstiture of Space aod dstronautic€l ScienceAbstract

The responses of culrured myoblasl L6 to uoidirectional stretch stimulation wereinvestigated. Cells plated on silione rubber membrane with high deosity coating of type I
collagen thal were subjected ro unidirecrional stretch stimulation oriented parallel ro rhis
direction. (-'ells plated oo the silicone membra[e tbal *ere nor subjected lo st.elch
slimulalion also orienled partially. Cells plated on normal c(rer glass with low densiry ofcollagen did not orient. Cl)llagen seems t() plav mrior role in lhis myoblast t.6 orienli ion_

新井緒

山下

跡見(SILASTIC MIIX 4‑4210 medical glade Elastomer,

言生体 内 の組 織・ 細胞 はそ の機 能 と形 態 が密 接 な関係 にあ る と考 え られ る。筋 をは じめ とす る動的な負荷 のかか る組 織・ 細胞 では ,構 造・ 形態 が重Dow Corning)と 重合剤を混 ぜ 合わせた混合液 を型に流 し込み 50℃ で 1日 重合 させ ることによ り
シ リコンデ ィッシュを作成 した。このデ ィッシュ要 で あ ろ う。細胞 の形 態 を決め てい るの は細胞骨格 と呼ばれ る タンパ ク繊維 の複 雑 な網 目構造 で ある。細胞 骨格 は ,細 胞 の運 動や筋 の 収縮 な ど生物にはあ らか じめ支柱 の ステン レス棒を埋 め込んでお い た。 このステンレス棒はホルダー部 を介 してパル スモー ターで駆動 され る微動 ステー ジに連結した (F ig.2)。 5極 のパル スモー ター (VEXTA,,にとつて基本的で重要な役割をはたす。また,細胞内での ミトコン ドリアの移動 ,最 近ではmRN
A輸 送 .及 び タンパ ク質 の合成 にも細胞骨格が関係 してい ることが報告 され ている(1,3,5)。
筋は力を発揮す る方向に配列 し機能す るがそのPX533卜 A)の 回転 をウォームギヤ (30山 )及 び ボールネ ジ (ピ ッチ lШ )に より微動 ステージの運動 (1ス テ ップ移動量0.066un)に 変換 した。パル スモー ターの回転の制御 はワンボー ドマ イク ロ

配向が起 こる機構 は解 つていない。細胞に対する機械的 な刺激がどの よ うに感受 され ,ど の ようなコン ピュー ター (CPU:Z80,CTC使 用 )により行な った。制御 プ ログラムはアセンプ ラ言語

形態的な応答を とるかは ,興 味 のもたれ る問題である。 Vandenburghら (12)は シ リコン膜 を用 いた
細胞刺激装置 を作成 し,鶏 胚筋芽細胞 か ら融合 さによ り記述 した。
シ リコンデ ィッシュには ,高 圧蒸 気滅菌後 に コ
ラーゲ ン コー トを行な った。 ラット尾部 か ら酸抽出 した コ ラー ゲ ン溶液 (2 mg/ml, lmM HCI)せた筋管細胞では一定方向の伸張刺激 が0.35Ш /hの速度 では筋が伸張方向に配向 したことを報 告 している。
生体内 での機能・ 生理反応 を細胞 レベ ルで解明
す る目的で細胞培養法が よく用 い られ るが ,通 常の器材 では機械的 な刺激を与えることは 困難 である。我 々は伸張刺激が筋llII胞 を含む細胞 の形態形

2mlを シ リコンデ ィッシュに注ぎ ドライヤーで乾燥 させた。 この後 PBSで 3,4回 洗 つた。伸張刺激の 有無 にかかわ らず シ リコン膜 上には高濃度 の コラー ダ ン コー トを行なった。通常行なわれる低濃度の コラー グ ン コー トをしたカパ ー グラスを対照 とした。

成 にかかわる機構 を明らかにする目的で ,独 自に伸張可能なシ リコン膜 上でlll胞 培養 し細胞 に対 して一 定 の方向 に伸張刺激を与えることがで きる装置を開発 した。 このシ ステ ムで は シ リコ ン膜 が0.lon程 度 の厚 さで あ る ので 免疫組織 学的解析,が可能である。
本研究では ,ま ず始 めに ,伸 張刺激 した細胞の形態変化 ,お よび細胞骨格 の応答を調べ た。
方1法
シリコン樹脂製細胞培養デ ィッシュ と伸張装置
培養fIE胞 に対 して伸張刺激を与えるためには仲縮可能 で生物 毒性 の無 い培養基質 である必要がFig。

12細胞培養シ リコン樹脂製細胞堵養デ ィッシュ,ある。また,培 養 の経過を倒 立顕微鏡 で観察 し免疫llE胞 組織学的研究 も行な うことので きる必要があ る。以上のことか ら,シ リコン樹脂を用 いて底部 が非常に薄い (約 0.lm)デ ィッシュ (2.5cn×2.5cul)を 作成 した (F ig.1)。 シ リコン溶液,培養にはラット由来筋芽細胞株 L6細 胞を用 いた。培養時の細胞密度は 3× 104cellS/cfで あ った。培養液は ,10°/Oウ シ胎児血清を含むダルベ ッコ変成イー グル培地 (DMEM)で あ り,培 養は37℃ ,C02イ ンキュベ ーター内 で行な った。細伸 張 刺 激 に 対 す る培 養 細 胞 の 応 答l18浮 遊液 を注 い だ 後 ,10分 後 に ス トレ ッチ を始め16時 間 後 に終 了 した。 伸張刺激 を与 えた細胞 は組織 学 的解 析用 にホル マ リン固定 した。総伸張 量は4 Ellで あ り,仲 張速度 は0.25ロ ロ/hで あ った。

胞骨格が収縮方向へ配列 していて機能的な構造をとつている。その機能が機械的刺激に関係す るよ
うなfII胞 にた い しては ,機 械的刺激は ,そ の構造をつ くり維持 する こ とに関係す ることが考え られる(2)。 機械的刺激がf4H胞 の配向や分化にお よばす影響が ,最 近になってさまざまな細胞 (骨 格筋細胞 ,心 筋細胞 ,血 管内皮 fII胞 ,骨 芽細胞 ,繊維芽細胞 )に つ いて研究 されてきてい る (7,8,9,10,11)。

本研究では ,高 濃度 の コ ラー グ ン コー トを行な
つたシ リコン膜 上の細胞は伸張方向に配向 した。
アクチ ンフ ィラメン トも伸張方向 に配向 した。この配向は高濃度の コラーグン コー トを行なったシリコン膜上で あれば伸張刺激を与えない場合 に もFig.2 装置 の概念図

3

組織学的解析
細胞骨格を構成するアクチンフ ィラメン トの検出には ロー ダ ミン結合 フ ァロイジン を用 いた。核の染色 には ,DAPI(4',6 dianidino‑2‑phenylindole)を 用 い た。
結果― グラ
通常の コラーゲ ン コー トを行な ったカノ｀
ス上では ,f41胞 は よく伸展 しス トレスフ ァイパ ーがはっ き り見 られた。 高濃度 の コラーゲ ン コー ト
シ リコン膜上 の細胞はそれに比べ ,細 長 い形態をとり針状 の突起を出す ものが多かった (F ig.3)。
カパ ー グラス上のfII胞 では全体 的な配向 も局所的な配向 も見 られなかった。それに対 し,高 濃度 のコラーゲ ン コー トを行なったシ リコン膜 上の細胞では配向が見 られた。 この配向は ,伸 張刺激を与えなかった細胞 では局所的に見 られたのがその方向はラン ダムであ った。 これに対 して,伸 張刺激を与えた細胞では多 くが伸張 した方向 に配向 した(F ig.4)。 核 に関 しては,細 胞 の長軸方向に向くものの極端な形態の変化は見られなかった(Fi

局所的に見 られた。 これに対 しコラーゲ ン コー トが低濃度の場合には伸張速度が同一であ るにもかかわ らず高濃度 の とき と比較 して配 向の程度が小さかつた (デ ー タ不掲載)。 これ らのことか ら
細胞 の配向には コラー グンの有無 が大き く影響 してい ると考え られ る。 高濃度 の コラーゲ ン コー ト上の細胞は接着部分 の コラー ダ ン繊維 を引っ張 つ,て配 向させ ,他 の細胞はその配向の影響 を受 けると考 えられ る (4)。 伸張刺激は直接的には コ ラー
ゲ ンを配向させ ,そ の向きに沿 って細胞が伸展あるいは移動す ることが推察 され る。本研究の結果
か ら,細 胞外基質 (extraceHular matrix;ECM)の 変化に関 して,細 胞 の配向 とアクチンフィラメン トは密接な関係にあると示唆 され る。先行研究 では ,ア クチ ンフ ィラメン トの変化 の後細胞の配向が起 こってい る (9)。 今後 ,中 間径 フ ィラメン ト,微 小 管の応答 .及 びそれぞれの時間的変化を調べ る必要が あ る。
血 管内皮細胞 の血流による剪断力に対す る応答に関する先行研究では ,コ ンフルエ ン トでな い内皮細胞は機淑 的な刺激に対 し反応を示 しに くいことが報告 されてい る(7)。 本研究で用いた筋芽細胞 の細胞株では,コ ンフル エ ン トで な くても伸張g.3)。

刺激に反応 した。 細胞間 の相互作用は細胞 の配向に関 して必ず しも必要 ではない と考え られる。適考

当な ECMが 無い場合 に細胞間 の相互作用が配向を起 こす のに十分であるか調べ る必要がある。

察
生 体 内 にあ る細 胞 は ,そ の機 能 と形態 は密接 な関係 にあ る と考 え られ る。 た とえば筋細胞 では細機械的な刺激を受容す るのは ,細 胞膜上の EC
Mレ セプターであると考え られ る。糖 タンパ クの跡見山 ド新井・
釧﹁ｌｒヽ︑Ｗヽ電．

´︑争■ ■

髯 メ午ノヽ

I,1■.

「ｑ・︼１１Цヽ■′︐

ヽ「くθ
4il. =￨‐ 寺
゛‐‐

￨̀む

インテ グ リン類は ,ECMと アクチ ンフ ィラメントとの結合を仲介す る膜貫通 型連結 タンパ クである。細胞 に与えられる機械的刺激は直接的 にはこの ECM― イ ンテグ リン ー細胞骨格 を通 して伝えられ ると考え られ る (6)。 細胞接着 に関係す る E
CM及 びインテグ リン類は ,接 着に限 らず細胞のを縦よ
卜 でに
一真 Ｉ
コ写 Ｐンを Ａゲ激Ｄ
一刺 ヽ
ラ張 を
コ伸 ＞の のＣ度問
濃 時 Ａ︐高 ＜ ︒と は ンす＞ ＞ チわ
Ｂ Ｄ ク表アを︐ ｍＡ︐
Ｃ 一ｕ＜ ＜ Ｆ０５上 ｏりはス６ よ 一
ラ Ｌ にバグ株 ン ︒
一胞 ジ たバ細 イ し力 芽 口出た妨 ″嫌つ行＞合 ぞを Ｄ結 れ
卜 ンそ︐一Ｃ ミ ヽ
コ＜ ダ をン 上 一＞

グ 膜 口Ｄ一ン ︒
ラ コた Ｂ︐
コリ え ＜の シ加 Ａ
度た にＮ
濃 つ向 Ｄ
低行方り

Fig.3

本研究 では ,シ リコンを コー トす るのにラッ ト
尾部 か ら抽出 した I型 コラーグ ンを用 い た。本結果に よれば コ ラーグ ン濃度により配向の程度 に影響 が出る と考 え られるので ,今 後濃度 の影響 を調べ る必要がある。また ,心 筋では コ ラー ゲ ンよりもラ ミニ ンが適 してい るとい う報告 もあ り(8),増殖・ 分化にも関与 してい る(6)の で ,機械的刺激 との関係 でその役割 に興味 が もたれる。
シ リコン膜 の ような伸張性 の膜上 での細胞 の伸張刺激は ,接 着 に関与す る因子 への刺激 の他 に細胞膜 へ の刺激 ももた らす と考 えられる。細胞膜

直接機械 的刺激が伝わる部分に関係す るので ,コラーダ ン以外 のフ ィプ ロネ クチン,ポ リリジ ン
人 エペ プチ ドなどの細胞培養用基質 で も検討す る

上の Na― Kポ ンプ ,イ オ ンチャネル ,ホ スホ リパーゼ ,GTP結 合 タンパ クに変化をもたらす ことも考えられる。伸張性 の膜 をもちいた研究では細胞膜 の変化 と大きな形態の変化は避 けられな いこ予定 である。

,とか ら,Wangら は ,ECM分 子を結合 させた磁性体に磁場をかけることでインテグ リン ー細胞骨格に局所的に刺激を加 える方法をとつている (13)。

,必要がある。今後 ,伸 張刺激 に対 す る応答を形態だけでな くタンパ ク質 ,遺 伝子 レベルで解析す る

参考文献
1 人dams,ヽ
isolated froコ

osin‑12J.T D Po‖ ard Prop1lsion of organelles
Acantha口 oeba along actin filallents by myヽature

322:,54‑166, 1986

Alberts, 3 , D

Bray . J

Lewis ,Raff , K

Roberts.J D latson(中 村桂子・ 松原議一監修)II胞 の分子生物学 第 2版

1細 胞の進̀ヒ伸 張 刺 激 に 対 す る培 養 /11胞 の 応 答イ ・」―Fig.4 高濃度 の コラーダ ン コー トを行 つたシ リコン膜上の筋芽細胞株 L6。 伸張刺激を与えなか つた(A,B)細 胞 と16時 間の伸張刺激を縦方向に与えた細胞 (C,D)。 ロー ダ ミン結合 フ ァロ
イジンに よりF― アクチン (A,B)を 検 出 し、位相差顕微鏡 により位相差像 (B,D)を 観察 した。パ ーは200umを 表わす。

3. ,tiler, l. D. T[e ricrot0brle as ar intracentlar ‑619 1988
eD[iDe. Sci. r!. 256(2):{2-{3. 198?.
1: Vandeabtrgh, ll llechanical forces and their second
4. lay. E. D. Collateo and other ratrir 6lycorroteirs iD
量eSSengers in sti■ ]lating cell ̀=o■ th in vitro A口 J
erbryoSeaesis. In : Cell Biolory of Irtrac€llrlar
Physio1 262(Regtlatory :● tegrative Coll, Physio1 3!):llatrix., €dited by f. D. lay. 2!d ed. Pleru. Press. ller
R 060‑366 1992
YorL, 1991,!. {19-162.
12. Vandenburrl, ll. H., P. l(6rlisc!. Lonlirrdioal srorrh
5. [esteth, J, E-, l. F. Pryre. IaleratioD h€tre€n rl-l{l,oI sleletal .rorrbes itr vit.o i! a Ber hori2o0ral
ribosores ald the crtosleleroL Siocher. J. 2?7:l-10.
recharical cell srit!litor. I! Vitro Cell. Dev. Biol.
1991.
25:60?-616, 1989.
6. Uynes, R. 0. I[teSrirs : Yersatility, llodrlatior, and 13. laag. li,. J. P. Bttler., D. I. Ilsber. Ileciano$ansSigralirt ir Cell ldhesioD. Cell. 69:ll-25, 1S92.
ductior across rhe cell s0rface ard throu8h the cytos7. llasodr. ll.. (. trjira.r. Crlt!red endtlerial cells
keletor. Science. 260:1124-ll2?, 1993.
respond to fluid shear stress. In: DeveloD.ertal
Cardiolot, : llotD[ogeoesis ard funclion., edited by [.
B. Clark. , I, Talao. llourt (isro, XY, Futura Publishi0s,1390, D.325-336.

8. Saruel, J. t., [. ll. Varderbrrsh. llec[aricallyi!d!ced oaien!atioD of adult rat cardiac ryocytes invitro. In vitro Cell. Der. 8iol. 26:905-9U, I990.

9. Shirinsly, !/. P.,l. S. lntoiov., N. G. Birrhov.,,{.
V. Sobolevsly., Y. l. Rora0ov., [. V. Xabaeva., G. li.
lntonova., V. I. Sriraov. Uechano-clerical contr0loI hrran endothelirr ori€ntatior aad size. J. Cell Biol.
l09r 331-339. 198S.
10. Vandetrbur8h, ll. fl. I coNDrterized oecIa0ical cell
stirtlator for tiss0e.ulture: Dffects o! skeletal
nrscle 0rSatrotenesis. Itr Vitro Cell. Dev. Biol. 24r60S