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2004〔ニューテクノロジー〕 227
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第50巻 10号 50巻10号
2004年〔プロテオミクスの現状と将来〕

プロテオミクスの現状と将来
─国立がんセンターにおける試み─
Strategy of the Cancer Proteomics Project in National Cancer Center山 田哲

司Tesshi YAMADAにタンパク質が実際に機能するためには，細胞内のはじめに特定の部位に局在し，複数のタンパク質が複合体を形成する必要がある（図１）。例えばがん遺伝子のヒトゲノム解読の完了が宣言され，完全にポストひとつである b-catenin タンパク質は細胞接着分子ゲノム時代となった。ヒトゲノムの全情報が自由にcadherin と結合し，その裏打ちタンパク質として働誰でも机上のパーソナルコンピューターから取り出く場合と，転写因子 T-cell factor/Lymphoid enhancerせる時代である。がんは点突然変異，遺伝子増幅，factor と結合し，核内で転写活性化因子として働く欠失などの塩基配列の変化（ジェネティックな変場合で機能が異なる１）。このように遺伝子の機能異化）あるいは塩基配列の変化を伴わないメチル化な常に伴いダイナミックに変化するさまざまなタンパ

どのエピジェネティックな変化によるいくつかのがク質の発現量，細胞内局在，翻訳後修飾，他のタンん遺伝子あるいはがん抑制遺伝子の機能異常が蓄積

パク質との相互作用などが，がんの発生や浸潤・転することによって起こる疾患であることは，今日ほ移，治療抵抗性などの実際の病態を引き起こすものぼ間違いないと考えられている。事実 1980 年代後と考えられる。またこうしたタンパク質の特性が分半から 1990 年代にかけて，遺伝子解析技術の急速子治療の標的となると考えられる。

な進歩に伴い，実際のがんで蓄積している遺伝子変プロテオーム（proteome）とはゲノム（genome）化が多数同定されてきた。しかしヒトゲノムプロから派生した言葉であり２），特定の細胞・組織・器ジェクトの終了によって，自動的にがんの発生，浸官でゲノムに制御され，特定の条件下で発現される潤・転移，治療抵抗性などのメカニズムが明らかにタンパク質全体をさし，プロテオームを対象とするなり，治療法が開発されることにはならない。ヒトが持つ遺伝子のほぼすべての塩基配列が同定されたといっても，これはすべての単語を網羅した辞典を手に入れたに過ぎない。分厚い英和辞典があればシェークスピアが解読できるとは誰も思わない。
約３万弱あると推定されているヒトの遺伝子から
alternative splicing に よ っ て お そ ら く 数 十 万 種 のmRNA が作られる。mRNA からペプチド鎖が形成された後も特定のプロテアーゼによる切断，リン酸化，糖鎖付加などの翻訳後修飾，ユビキチン化やSUMO 化に伴い生じる分解にて多種多様に変化したタンパク質が生じ，量が変化する（図１）。さら

図１ プロテオームの複雑性

国立がんセンター研究所
化学療法部・腫瘍プロテオミクスプロジェクト

Chemotherapy Division and Cancer Proteomics Project,
National Cancer Center Research Institute(5-1-1 Tsukiji, Chuo-ku, Tokyo)〠 104−0045 東京都中央区築地 5-1-1

（1）

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モダンメディア 第50巻 10号 2004年〔プロテオミクスの現状と将来〕学問がプロテオミクス（proteomics）である。特にとして，同研究所の地下 1 階のフロアーのほぼ全体タンパク質の機能や疾病との関わりを明らかにするを改修して，新たに設けられた部署である。研究所

プロテオーム研究が注目を集めている。本稿では国の 化 学 療 法 部 や 病 理 部 と 密 接 に 連 携 し て，立がんセンター研究所において行われている臨床応

A m e r s h a m Biosciences 社

用を目指したプロテオーム研究について中心に紹介

dimensional difference gel electrophoresis） 法 に よする。

る定量性の高い２次元電気泳動（図２），Ciphergenの 2D-DIGE（t wo-社のプロテインチップシステムを用いた低分子タン

Ⅰ．国立がんセンター研究所腫瘍プロテオミ
クスプロジェクトの開設

パク質とペプチドのプロファイリング（図３），免疫沈降法やビアコアを用いたタンパク質複合体の解明，免疫組織染色によるスクリーニングをロボット化

プロテオームを網羅的に解析する手段は cDNAした独自のモノクローナル抗体作製システムなどを用マイクロアレイ技術にて画期的に進歩した遺伝子発いて，がんの発生，浸潤・転移などの病態の分子機現解析に比べれば，かなり不十分である。特に多数構解明，治療標的分子の同定，がんの早期診断・病の遺伝子の変異が蓄積し，複雑なゲノム異常を来し態診断に有用な腫瘍マーカーの開発などを目的に研た進行がんのプロテオーム解析は非常に困難である

究 を 行 っ て い る（http://www.ncc.go.jp/jp/nccri/

ことが予測される。そこで近年急速に進歩した質量

divisions/p03prms/p03prms.html）。

分析などのプロテオーム解析技術を改良し，これま

Ⅱ．2D-DIGE 法

でがん克服新 10 カ年戦略などで蓄積されたがんのゲノムの異常に関する知見を分子創薬や診断法の開発に結びつけるため，国立がんセンター研究所では検出波長の異なる蛍光色素（Cy3 と Cy5）で標識

平成 13 年 4 月より厚生労働省が実施するメディカ

した 2 種のタンパク質を混和し，2 次元ゲルで分離・ル・フロンティア戦略のうち，「タンパク質科学研定量するタンパク質発現解析法である。ダイナミッ

究によるがん対策・創薬等推進事業」を担当し，医クレンジが広く，高感度である蛍光色素の一般特性

薬品副作用被害救済・研究振興調査機構（現・独立に加え，2D-DIGE 法では Cy3 で標識したタンパク行政法人医薬品医療機器総合機構）と共同研究を行質を内部コントロールに用いることで格段に 2 次元うこととなった。腫瘍プロテオミクス・プロジェク電気泳動の定量性と再現性が向上している。われわト（Cancer Proteomics Project）はこの事業の中心

れはこの 2D-DIGE 法に改良を加え，統合的なプロ

図２

2D-DIGE 法による２次元電気泳動（2）モダンメディア 第50巻 10号 2004年〔プロテオミクスの現状と将来〕 229

テオーム発現解析システムを構築している。本シスに含まれるタンパク質の同定のためのゲルの切り出テムの特徴は，しはほぼ自動化している（図５）。ゲルからタンパ

上記の内部コントロールの使用により再現性と定量性に優れること，ゲル間の比較ク質そのままを抽出することは困難であるが，トリが半自動的に高速で行えること，

１日 24 検体をプシンなどの酵素を用いゲル内でタンパク質を断片処理でき，ハイスループット化に対応していること化し，ペプチドとしてならゲルから容易に回収できなどである。高感度な蛍光色素標識法を用いればる。 得 ら れ た 複 数 の ペ プ チ ド の 質 量 を 主 と し てレーザーマイクロダイゼクションにて得られたよう

MALDI-TOF 型の質量分析機（matrix-assisted laser

な微量のタンパク質も 2D-DIGE にて解析可能であdesorption/ionization time-of-flight mass３）

spectrometry）にて測定し（図６），ゲノム情報な２次元電気泳動では高分子・疎水性のタンパク質どに基づいて作製されたタンパク質データベースとや発現量の低いタンパク質の発現解析は困難である

照 合 し， 同 定 す る 方 法 を PMF（peptide massが（図４），遺伝子発現解析では得られなかったよfingerprinting）法と呼ぶ６）。

る 。

うな鳥瞰的な所見が得られることがあきらかになっ

Ⅲ．液体クロマトグラフィーと質量分析（liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS））によるプロテオーム

た４）。また高分子タンパク質の検出を向上させるために１次元目の泳動にアガロースゲルを使用した報告もある５）。２次元電気泳動で観察されるスポット

図４にあるような２次元電気泳動法の問題点のうち，特に従来解析が困難であった細胞膜受容体などの疎水性部分を持つタンパク質，高分子タンパク質を解析でき，またタンパク質の同定までの全過程をほぼ自動化できる技術が LC-MS である。今後のプロテオーム解析の中心技術になっていくものと思われる。この方法ではトリプシンなどの消化酵素で粗精製のタンパク質混合物を断片化し，生じたペプチドフラグメントを通常複数種類のカラムを用いた多次元のクロマトグラフィーで分離し，直接 ESI 型の質量分析機（electrospray ionization mass spectrom-

図３ Ciphergen 社のプロテインチップシステムを用いた低分子タンパク質とペプチドのプロファイリングetry）にて解析する。酵素消化にてさまざまなタン

図４ 2D-DIGE 法による 2 次元電気泳動の問題点

（3）

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図５ ロボット化したゲル内消化システムと PMF 法によるタンパク質同定

Quality of life や予後の改善に必須であることは論を待たない。そのため多数の被験者からがん罹患者を効率よくスクリーニングできるがん検診技術の開発と整備が国民から強く要望されている。国立がんセンターでは平成 16 年２月よりがん予防・検診研究センターを開設し，既存のがん検診方法の検証と新しいがん検診技術の開発を行っている。
がん予防・検診研究センターでは従来の放射線やエコー，内視鏡などに加えて，PET（positron emission tomography）
図６によるがん検診を行っている。しかし施設と機器に

MALDI-TOF 型の質量分析機

膨大な経費がかかるため，がん検診の目的で PETパク質の物理化学的な性状をすべて均一にして網羅が全国的に普及するかどうかは現時点では不明であ的に解析することから，ショットガン法とも呼ばれる。一方，血液中の腫瘍マーカーは，どこの病院やている。特に微小なカラムを用い，nl/min レベル診療所でも容易に検体が採取できることから，大多の低流速で液体クロマトグラフィーから直接質量分数の被験者のスクリーニングに有利である。自己採７）

血などによるがん診断キットも市販されるように析機に資料を導入することで，高感度が得られる 。

なってきたが，その有用性は不明である。

従来 LC-MS 法は定量性に問題があったが，安定同位体による代謝標識８）

現在腫瘍プロテオミクスプロジェクトはがんの早や ICAT（isotope-codedaffinity tag）法による化学標識

９）

期診断のための腫瘍マーカー開発に特に力を入れてを行うことで，定いる。腫瘍マーカーといえば，CEA（carcinoembry-量的な解析も可能となった。

onic antigen）や CA19-9 のように治療効果の判定

Ⅳ．プロテインチップ法による腫瘍マーカー開発

や，再発の発見など限られた範囲で臨床に有用であるが，がんの早期発見には，前立腺がんにおけるPSA（prostatic specific antigen）10）以外に有用なマー進行がんの治療は現在利用可能な医療技術では困カーはないというのが今までの常識であった。しか難な場合が多く，高感度な検出方法を用いて微少のし こ の 医 学 常 識 が 最 近 崩 れ つ つ あ る。 米 国 のがんを発見し，早期に治療を開始することが患者のCiphergen 社のプロテインチップシステム（図３）（4）モダンメディア 第50巻 10号 2004年〔プロテオミクスの現状と将来〕 231と Correlogic 社が開発したアルゴリズムを用いた

れわれは膵がん細胞株を免疫源として，本システム多変量解析を用い，米国 NCI と FDA の共同で行わを用いた大規模なスクリーニングで，膵がん患者血れている Clinical Proteomics Project は治癒可能性

清と高率に反応する新しい８種の新規モノクローナの高い Stage I の早期症例を含め，100％に近い正診ル抗体を選択した。これらの抗体パネルを用いた血率で卵巣癌が診断できたと報告している。この

漿のタンパク質アレイで膵がん患者の 98 例中 73 例

成果は米国のマスコミに大きく取り上げられ（図（74.4 ％） が 陽 性 を 示 し た が， 健 常 人 に お い て も７），注目を浴びているが，チップの消耗品が高価9.7％が陽性を示した（第 62 回日本癌学会総会記であり，またピークの解析ソフトが市販されていな事）。膵がんは進行して発見された場合著しく予後かったため，国内では少数例を用いた散発的な研究が不良であり，早期発見の効果的な戦略が重要であしか行われていなかった。われわれはピーク同定のる。治癒率を向上させるためには，現時点ではある独自のアルゴリズムを開発し，またロボットシステ程度の偽陽性があっても検出率を向上させる必要がムによる分画法を改良し，わずか 20ll ほどの血漿ある。本方法は偽陽性が高く，現状ではそのままで（血清）から約 1,000 の低分子タンパク質とペプチはがん検診には使えないが，膵がん患者の高い検出ドを検出することができるようになっている。

率を示し，今後重要な診断法の 1 つになる可能性が11）ある。

Ⅴ．ロボット化したモノクローナル抗体作製システムとタンパク質アレイ

Ⅵ．その他のプロテオーム解析技術

96 穴マイクロタイタープレート内でアレイ化し組織の凍結切片に直接レーザーをあて，レーザーた小さな組織切片に対し，免疫染色を迅速に行えるが照射された局所にあるタンパク質の質量を MAL-ロボットシステムを独自に開発した。がんの浸潤部

DI-TOF MS で測定する方法が行われている。プロや患者血清と反応する多数の抗体を分離し，病態のテオームの結果で肺癌の組織型や予後を判定できた診断やスクリーニングへの応用を検討している。わと報告されている 12）。

図７ プロテインチップに関する米国マスコミの報道（5）

232モダンメディア 第50巻 10号 2004年〔プロテオミクスの現状と将来〕

in linkage of laser microdissection and two-dimensionalgel electrophoresis as a cancer proteomic study tool.

おわりにProteomics. 3（9）: 1758-1766. 2003 Sep.
４）Seike M., et al.: Proteomic analysis of intestinal epithelial

バイオテクノロジーの基礎研究の領域では近年急

cells expressing stabilized b-catenin. Cancer Res. 63（15）:4641-4647. 2003 Sep.

速な技術革新が行われ，cDNA マイクロアレイ法な

５）Oh-Ishi M., et al.: Preparative two-dimensional gel

どのトランスクリプトーム技術や本稿で述べたプロ

electrophoresis with agarose gels in the first dimension
for high molecular mass proteins. Electrophoresis. 21（9）:テインチップ法，質量分析法，抗体・タンパク質マイクロアレイ法などのプロテオーム技術の臨床応用

1653-1669. 2000 May.
６）Henzel W.J., et al.: Protein identification: the origins ofが期待されている。またバイオインフォマティクス

peptide mass fingerprinting. J Am Soc Mass Spectrom. 14の技術が進歩し，一見特異性のないように思われる数値データからも，診断に有用な情報が引き出せる（9）: 931-942. 2003 Sep.
７）Kaji H., et al.: Lectin af finity capture, isotope-coded

可能性がでている。われわれはこれらの新技術を単

tagging and mass spectrometr y to identify N-linked
glycoproteins. Nat Biotechnol. 2003 Jun; 21（6）: 667-672.
Epub 2003 May 18.

なる基礎研究に終わらせないことが責務であると感じている。邦人がノーベル賞をとったことを機会

８）Oda Y., et al.: Accurate quantitation of protein expressionに，日本独自の画期的なプロテオーム解析によるがand site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S
A. 96（12）: 6591-6596. 1999 Jun 8.

ん診断法を開発したいと思う。モダンメディア読者

９）Gygi S.P., et al.: Quantitative analysis of complex proteinであられる全国の病院臨床検査部の皆様からの協力

mixtur es using isotope-coded af finity tags. Nat
Biotechnol. 17（10）: 994-999. 1999 Oct.

で，この目標を達成できればと願う。

文10）Soderdahl D.W., and Hernandez J.: Prostate cancer
screening at an equal access tertiary care center: its im-献pact 10 years after the introduction of PSA. ProstateCancer Prostatic Dis. 5（1）: 32-35. 2002 Mar.

１）Hirohashi S., and Kanai Y.: Cell adhesion system andhuman cancer morphogenesis. Cancer Sci. 94（7）:11）Petricoin E.F., et al.: Use of proteomic patterns in serum
to identify ovarian cancer. Lancet. 359（9306）: 572-577.

575-581. 2003 Jul.
２）Wasinger V.C., et al.: Progress with gene-product2002 Feb 16.
12）Yanagisawa K., et al.: Proteomic patterns of tumour

mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.
Electrophoresis. 16（7）: 1090-1094. 1995 Jul.

subsets in non-small-cell lung cancer. Lancet. 362（9382）:433-439. 2003 Aug 9.

３）Kondo T., et al.: Application of sensitive fluorescent dyes（6）