N2O 除去細菌のハイスループット識別・分離手法の開発
北海道大学大学院工学研究院

石井聡

１．はじめに一酸化二窒素（亜酸化窒素；N2O）は二酸化炭素（CO2）の約 300 倍の温室効果を持つと言われており、その排出量は近年急増している。畜産廃棄物や農耕地、化学工場、焼却施設、廃水処理施設などが主な N2O 排出源と見積もられている。N2O は硝化（NH4+  NO2-  NO3-）や脱窒（NH4+  NO3-  NO2- NO  N2O  N2）等の微生物呼吸の産物あるいは副産物として生成される。
N2O の発生を低減するためには、これらの N2O 生成プロセスを抑制するか、発生した N2O を除去することが有効である。脱窒の一部である N2O 還元反応（N2O+ 2H+ + 2e−  N2 + H2O）を利用することで N2O 除去を行うことができる 1。
本研究の最終目標は、窒素含有廃水の処理過程から N2O 発生を低減させることである。我々は、従来の硝化脱窒法に代わる新規処理システムとして嫌気性アンモニア酸化（Anaerobic ammonium oxidation; anammox）反応を利用して、廃水窒素を処理することを考えている。Anammox 反応は、以下の化学式（NH4++ NO2-  N2 + 2H2O）で表される微生物呼吸である。廃水中に含まれる窒素はアンモニア態が多いので、Anammox 反応を利用するためにはアンモニア態窒素を亜硝酸態窒素に変換する必要がある。部分硝化（Partial nitrification; PN）は硝化の一部であり、アンモニア酸化反応（NH4+  NO2-）を担うが、副産物として N2O が発生する。PN-anammox 反応からの N2O 発生量は、硝化脱窒反応からの N2O 発生量と比べると少ないが、今後の地球温暖化防止の観点から、さらなる N2O 発生低減化が望まれる。
以上の背景より、本研究では、まず①PN 反応における N2O 発生の由来（硝化 vs. 脱窒）を特定し、次いで②N2O 発生低減化に向けて N2O 除去微生物を同定し、そして③ハイスループット識別・分離を行うことを目的とした。

－ 117 －P

２．実験方法２−１．廃水処理リアクター
図１に示すようなバッチ式リアクター（sequencing batch reactor: SBR）を構Effluent tank
400 mm

築した。リアクター内に活性汚泥に由来する好気性 PN グラニュール（図２）をPLC入れ、下部からの曝気により撹拌した。
基質として用いた人工下水には 600 mg
N/L の NH4+と 200 mg TOC/L の酢酸が含まれている。好気性 PN グラニュール

Influenttankの特性およびリアクター運転条件の詳細
は Song et al. (2013) 2 に記した。

400 mmPAirP

２−２．化学分析
各種イオン（NH4+、NO2-、NO3-）はイオンクロマトグラフィー（DX-100、ダFlow meter

図１．本研究に用いた SBR の概略図

イオネクス）で測定した。酢酸濃度は全炭素濃度として TOC 分析装置
（TOC-5000A、島津製作所）で求めた。
N2O 発生量はガスモニタリング装置（INNOVA 1442 photoacoustic fieldgas-monitor, Air Tech Instruments）で測定した。N2 発生量は、N のマスバランスから計算した。

図２．本研究に用いた好気性 PN グラ
ニュールの写真。バーは 10 mm を示す。

２—３．同位体分析
発生した N2O の分子内同位体比（N2O isotopomer）をガスクロマトグラフィーおよび質量分析装置（MAT252 system, Thermo Fisher Scientific）で測定した 3, 4。N2O は N=N=O という非対称の構造を取っている。中央および末端の N原子をそれぞれ Nα および Nβ と呼ぶ。Nα および Nβ における δ15N を式(1)より求め、その差（Site preference; SP）を式(3)により計算することによって、N2Oが硝化由来か脱窒由来かを推定することができる 5。

－ 118 －

δ15N = [ (Rsample/Rreference) − 1] × 1000 (‰)(1)

R = 15N/14N(2)

SP = δ15Nα − δ15Nβ(3)２−４．微生物群集構造解析
好気性 PN グラニュール内の微生物群集構造を解析するため、グラニュールから DNA を採取し、16S rRNA 遺伝子を対象としたクローンライブラリ解析を
Ishii et al. (2011) 1 の方法に従って行った。
２−５．遺伝子発現解析
好気性 PN グラニュール内の硝化および脱窒関連遺伝子の発現を解析した。
グラニュールを経時的に採取し、ただちに RNA 抽出した。硝化および脱窒関連遺伝子（表１）を対象とした定量的 PCR を行うとともに、一酸化窒素還元酵素遺伝子（norB）の配列を次世代シーケンサーで解読した。
表１．本研究で用いた PCR プライマー
Target
16S rRNA(total bacteria)

Primer namePrimer Sequence (5'-->3')
Eub338ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
Eub518ATTACCGCGGCTGCTGG
amoA1F
GGGGTTTCTACTGGTGGT
amoA
amoA2R
CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
m-cd3AF
AACGYSAAGGARACSGG
nirS
m-R3cdGASTTCGGRTGSGTCTTSAYGAA
nirK from
nirK_166FGTWCCSGGTCCGGTYGTRCG
Nitrosomonas spp. nirK_665R TCRTTGGGWCCRGCRTTGAC
norB2
GACAARHWVTAYTGGTGGT
norB
norB6
TGCAKSARRCCCCABACBCC
nosZ_FCGYTGTTCMTCGACAGCCAG
nosZ
nosZ_1622R CGSACCTTSTTGCCSTYGCG

ReferenceFierer et al. (2005) 6Rotthauwe et al. (1997) 7
Kandeler et al. (2006) 8Cantera and Stein (2007) 9Casciotti and Ward (2005) 10Kloos et al. (2001) 11Throback et al. (2004) 12２−６．Flow cytometory and fluorescence activated cell sorting
N2O 還元細菌をハイスループットに採取するため、N2O 還元条件で増殖する細菌を細胞分裂阻害剤の使用により伸張させ、非伸張細胞と Flow cytometer（JSAN）解析によって識別することを試みた。識別後の伸張細胞はFluorescence activated cell sorting（FACS）により、一細胞ずつ分取し、培地で培養した。実験条件の設定のため、まずは大腸菌を用いて条件を検討した。

－ 119 －

３．結果と考察
３−１．廃水処理リアクターからの N2O 発生
本研究で用いた廃水処理リアクターは PN 反応を行うことを目的としている。
図３に示すように、SBR サイクル（4 h）において、NH4+が酸化され、NO2-が生成していることがわかる。4 h 後には NH4+:NO2-はほぼ 1:1 となるため、後段に Anammox 反応につなげることが可能になる。
N2O は SBR サイクル初期（0-20 min）に発生したのち減少し、その後再び増加した。SBR サイクル初期には N2 発生も多く見られたが、SBR サイクル後半ではほとんど見られなかった。SBR サイクル初期には亜硝酸の減少も見られることから、亜硝酸を基質とする脱窒（NO2-  NO  N2O  N2）が起こっていると考えられる。図には示していないが、SBR サイクル初期には酢酸（TOC）が減少し、20 分ほどで枯渇する。酢酸は脱窒の電子供与体として働くので、酢酸の減少は脱窒によって起こったと考えられる。
600

Concentrations (mg N L-1)

500

Total dissolved N400NH4+300200NO2-10001 0N2501001500.8200

N2O (liquid)

2500.60.40.20N2O (gas)N2050100150200250Time (min)図３．廃水処理リアクターにおける NH4+、NO2-、N2O および N2 濃度の経時変化
３−２．廃水処理リアクターから発生した N2O の起源
廃水処理リアクターから発生した N2O について、同位体分析を行ったところ、－ 120 －

N2O 発生量に関わらず、SP 値は 5〜11‰と安定していることが明らかになった（図４）。脱窒に起因する N2O の SP 値は 0‰、硝化に起因する N2O の SP 値は33‰と報告されている 5 ので、今回の結果から計算すると、廃水処理リアクターから発生した N2O の 2〜3 割は硝化起源で、残りの 7〜8 割は脱窒起源であると推定された。

d15Nd18OSPN2O conc

15N, 18O and SP (‰)

40300202000100-20-40203060120240

N2O concentration (ppm)

400600Time (min)図４．廃水処理リアクターから発生した N2O の同位体分析結果
３−３．好気性 PN グラニュール内の微生物群集構造
次いで、好気性 PN グラニュール内の微生物群集構造を 16S rRNA 遺伝子を対象としたクローンライブラリ解析によって明らかにした（図５）。その結果、好気性 PN グラニュールを構成する微生物の多くは Rhodocyclales 目とPseudomonadales 目に属する細菌であることが明らかになった。両者ともよく知られた脱窒細菌である。一方で、PN 反応を担うアンモニア酸化細菌（AOB）として Nitrosomonadales 目に属する細菌が検出された。この AOB は系統学的に Nitrosomonas eutropha という高濃度の NH4+が存在する環境で優占する種に近縁であった（図６）。

－ 121 －図５．好気性 PN グラニュールにおける微生物群集構造
87
99

84

Nitrosomonas oligotropha Nm45 [FR828478]
Nitrosomonas sp. Nm47 [AY123810]
Nitrosomonas ureae Nm10 [FR828472]
Nitrosomonas aestuarii Nm36 [FR828476]
Nitrosomonas marina Nm22 [FR828473]

Freshwater clone [AJ003775]
Arctic ocean clone [AF216675]
Soil clone [U62885]
Nitrosospira tenuis Nv1 [AJ298746]
99
Nitrosospira briensis C-128 [M96396]
Nitrosospira multiformis ATCC 25196 [NC_007614]
75
Nitrosomonas sp. Nm143 [AY123794]
Nitrosomonas cryotolerans Nm55 [AF272423]
PN aerobic granule clone Bac02f3
98
99
Nitrosomonas eutropha C91 [NC_008344]
99
Nitrosomonas europaea ATCC 19718 [NC_004757]
Nitrosomonas halophila Nm1 [FR828475]
92 Nitrosomonas nitrosa Nm90 [FR828477]
Nitrosomonas sp. Nm148 [AY123792]
100
Nitrosomonas sp. Nm58 [AY123799]
Nitrosomonas communis Nm2 [AJ298732]
Nitrosococcus oceani ATCC 19707 [NC_007484]
0.02 substitutions/site
71
94

図６．好気性 PN グラニュールから検出された AOB の系統学的位置－ 122 －３−４．好気性 PN グラニュールにおける硝化・脱窒遺伝子の発現解析
N2O 同位体分析によって、廃水処理リアクターから発生する N2O の多くは脱窒由来であることが明らかになった。また、群集構造解析から、好気性 PN グラニュール内には Rhodocyclales 目と Pseudomonadales 目に属する脱窒細菌が存在することが明らかになった。では、実際にどの脱窒細菌が N2O 生成、N2O除去に関与しているのであろうか？この疑問に答えるために、我々は遺伝子発現解析を行った。NO 還元酵素（=N2O 生成酵素）の遺伝子を網羅的に解析した
結果、SBR サイクルの前半と後半では異なる脱窒細菌が働いていることが明らかになった（図７）。前半に活発に働いていた脱窒細菌は Rhodocyclales に近い細菌であることがわかった。前半は N2O 還元も起こっていることから、

Rhodocyclales 脱窒細菌は N2O 還元除去にも関与していると推察された。以上の結果より、N2O 還元細菌として Rhodocyclales 脱窒細菌を分離することを以降の実験目標とした。

100%
10090%90

Proportion (%)

80%8070%7060%6050%5040%4030%3020%2010%
100%00010102020303045456060120120180180233233

Time (min)図７． NO 還元酵素遺伝子配列の発現割合の経時的変化。
白抜きの棒グラフは Rhodocyclales 脱窒細菌の割合を示す。

－ 123 －

３−５．FACS 分取条件の検討
非伸張細胞を区別できることを確認した

液
シース

溶

サンプル

溶

Flow cytometry によって伸張細胞と液（図８）。しかしながら、FACS によって一細胞ずつ培地に分取したところ（図９）、非伸張細胞に比べて伸張細胞の回収率（＝培地で増殖したウェル数／分取したウェル数）は極めて低かった。この理由として、細胞分裂阻害剤の添加がその後側方散乱
レーザー光

前方散乱の細胞増殖に影響した可能性が考えられ振動源た。

検出器・帯電-+コンピュータ-

非伸張細胞-

カウント数-

伸張細胞-

廃液

前面散乱
コレクション（マルチウェルプレート）

図８．Flow cytometry による伸張細胞

図９．FACS による一細胞分離と非伸張細胞の区別

４．結論①

PN 反応を利用した廃水処理リアクターから発生する N2O は主に脱窒に起因することが明らかになった。

②

N2O 除去に関与しているのは Rhodocyclales に属する脱窒細菌であると示唆された。

③

FACS を用いて N2O 除去細菌の分離に向けて実験条件の検討を行ったが、－ 124 －

細胞分裂阻害剤の影響により細胞の回収が困難であるとの結論に至った。
今後は細胞分裂阻害剤の種類や濃度を検討して、N2O 除去細菌のハイスループット分離を成功させたいと考えている。
謝辞
本研究は、北海道大学大学院工学研究院の岡部聡教授、佐藤久准教授、宋延軍氏、平野麗子氏、Lashita Rathnayake 氏、ならびに東京工業大学大学院総合理工学研究科の吉田尚弘教授、豊田栄准教授、Tumendelger Azzaya 氏の協力を得て行われた。
本研究は、公益財団法人 JFE21 世紀財団 2012 年度技術研究助成により行われた。記して感謝の意を表す。
参考文献
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－ 126 －