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SPECIAL REVIEW
極限環境微生物とその利用
立命館大学 生命科学部 教授 今中 忠行

生物の分類発や産業プロセスへの応用が期待できることである（4）。

生物を分類する基準として、永らく①形や大きさなどの形態学的われわれは、鹿児島県小宝島の硫気坑から100℃でも生育でき基準と、②基質や生産物など代謝的特徴をふまえた生理学的基準がる超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1（図2）

用いられてきたが、遺伝子工学の発展をもとに16S rRNA（真核生を分離し、多くの耐熱性酵素に物では18S rRNA）などの特定遺伝子の塩基配列を比較する③遺ついて検討してきた。ここでは、伝学的基準が採用され現在に至っている。現在のすべての生物は耐熱性DNAポリメラーゼの利細菌、始原菌、真核生物の3つのドメインに分けられる（図1）（1）。

用について述べてみたい。

もちろん細菌、始原菌は原核生物であり、始原菌から真核生物が進化してきたと考えられている。また生命の源流は超好熱菌であり一般的に高温、嫌気的条件下で生育する特徴をもつ。
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図2. Thermococcus kodakaraensis
KOD1の電子顕微鏡写真┷Ⳟ㢦⦼ẗ⹰㢦┷ᰶ⏍∸⢋Ⳟ㢦䝋䜧䝛䝱䝦䝎䜽

ポ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応（PCR）法 の 開 発
シータス社のK. MullisがPCR法を開発（5）してから四半世紀が経った。簡単に遺伝子の特定領域を100万倍以上に増幅できる⣵Ⳟ䜴䝭䝤㝟ᛮⳞ䝛䝱䝊䜮䝔䜳䝊䝮䜦䝙䝭䝠䝔䜳䝊䝮䜦䜻䜦䝒䝔䜳䝮䜦

この技術は、微量遺伝子の検出など生命科学の研究に不可欠な技ጙཋⳞ⥫Ⰵ㟸◪㯜⣵Ⳟ
Desulfurococcus
Thermotoga Pyrodictium術であるだけでなく、法医学、親子鑑定、環境中の微生物モニタリン

Sulfolobus

グ、食品工場での雑菌汚染の早期発見など応用面でも幅広く利用さ

Thermofilum
ThermoproteusPyrobaculum
Pyrococcus, Thermococcus
Methanothermus
Methanothermobacter
Archaeoglobus

れている。彼はこの業績が認められて1993年にノーベル賞を受賞している。PCR法の概略を示したのが図3である。①まず95℃程度の高温で二本鎖DNAを一本鎖に解離（変性）させ、②その後55〜60℃でプライマー（別途化学合成した相補的オリゴヌクレオチド）

Methanopyrus

Aquifex㉰ይ⇍Ⳟ
図1.

Halobacterium
Halococcus
Methanoplanus
1 Methanocaldococcus Methanosarcina
Methanospirillum
2 Methanotoris
3 Methanothermococcusを結合させ（このプロセスを「アニーリング」という）、③最後に60〜72℃でDNA鎖の伸長反応が進む。この3つの工程を25〜30回繰り返すことにより試料DNAを指数関数的に増幅させることができる。厳密にいえば、両末端が整った目的一本鎖断片が生じるのは2サイクル目を終了した時点であり、3サイクル目から目的二本鎖断全生物の進化系統樹片が指数関数的に増えることになる。最終的に電気遊動で単一バンドが目視できるまでに増幅（100倍以上）されることになる。

好熱菌の発見開発当初は大腸菌のDNAポリメラーゼが使われていたが、高温処1980年代前半、ドイツのK. Stetterらを中心に100℃以上でも理が含まれているためサイクル毎に酵素を添加する必要があった。

生育する微生物が分離された（2）。その後も高温環境で生育する

この煩雑さから逃れるために、耐熱性のDNAポリメラーゼが利用さ微生物の分離が続けられているが、これらは既存の好熱菌よりさられるようになったのである。
PCRをうまく行うためには、サイクル数、温度、時間、プライマー、に高い温度域で生育することから超好熱菌（hyperthermophile）緩衝液など、それぞれについて最適な条件を検討する必要がある。と呼ばれている。
現在、超好熱菌とは、一般に90℃以上で生育する微生物、あるいはおおよその指標として、DNA増幅が認められない場合には、アニー至適生育温度が80℃以上の微生物として定義されている。すでにリング温度を下げる、反応時間を延ばす、熱変性時間を長くするな

この定義に当てはまる微生物は100種以上分離・同定されており、どの方法が有効である。
一方、目的のDNA以外の非特異的な増幅が認められる場合には、122℃が今までの生育最高温度として報告されている（3）。

アニーリング温度を上げる、合成時間を短くする、プライマーのデザ

超好熱菌は、二つの観点からとくに注目を集めている。一つは2013

超好熱菌が進化系統樹の源流に位置するので、生物進化の流れをインを変更する（繰り返し配列を避ける）などの方法が有効である。

理解するために重要であること。もう一つは、それらが生産するタン

これらの方法でも改善が認められない場合には、緩衝液中のMgイ

パク質が高い耐熱性あるいは好熱性を示すという点で、従来の酵素オン濃度を変化させる（1〜6mM）とよい結果が得られる場合がと比べて広い温度範囲で長期間使用可能なことから、新しい技術開ある。

3

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されることが判明した。そこで、赤色の3つの遺伝子部分のみを連

1st cycle

2nd cycle
primers

結させた（2つのエンドヌクレアーゼ部分を除去した）ポリメラーゼ

3rd cycle遺伝子を構築し、以後の実験に供した。この遺伝子を宿主である大腸菌内でクローニングし、大量発現させた後、菌体を破砕し、高温処

template

95䁯C

理をすれば、ほとんどのホストたんぱく質は熱変性して沈殿し、耐熱

denature

性のポリメラーゼは溶解したままなので、精製が容易である。このあとイオン交換カラムクロマトグラフイーにかければ、ほぼ純品の酵

55䁯C

annealing

72䁯Celongation

素が得られる。

4th cycle

Transcription
5010 bp(DNA polymerase)

intein-11080 bp

intein-2
1608 bp

Translation

図3．PCR法の実際
Protein splicing

DNAポリメラーゼの種類
PCRは優れた遺伝子増幅方法であるが、前述のように増幅が認められない、あるいは非特異的増幅などのトラブルはもちろんのEndonuclease I

こと、反応速度や正確性などにおいて改善すべき点も多く残され

KOD polymerase Endonuclease II

図4．KOD1株のDNAポリメラーゼ遺伝子ている。
反応条件の至適化だけでなく、酵素であるDNAポリメラーゼをKODポリメラーゼについて、PCRに使う場合の諸特性を他の市改良する試みも多くなされてきた。PCR用酵素として使用されてい販されている酵素と比較したのが図5である。本酵素は、より長く、るDNAポリメラーゼは、細菌由来のPolⅠ型酵素と、始原菌由来より速く伸長反応が進み、最も忠実度が高い（正確な）という三冠王DNAポリメラーゼを含むα型酵素に大きく分けることができる。の酵素であることが明らかになった（10，11）。

Taq DNAポリメラーゼに代表されるPolⅠ型酵素は、DNA合成
Pyrococcus属

活性が高いが、校正機能としての3'→5'エキソヌクレアーゼ活性が<20 bp<20 bp由来酵素A

Pfu

ない場合が多く、増幅の際の正確性に問題がある。

Processivity (Bases/Reaction)

300 bpKOD

α型酵素は強い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有しており、正0100

200

300400

確な増幅反応をおこなえるが、一般的に伸長活性は低い場合が多い。
Taq

したがって目的に応じた酵素の使用が望ましい。

61

Pyrococcus属

Extension efficiency (Bases/sec)

23

由来酵素A

25

Pfu

138

KOD

KOD1株の耐熱性DNAポリメラーゼとその特性

050

100

150

200

好熱菌の酵素なら耐熱性が高いはずであると考え、シータス社がTaq

Thermus aquaticus のポリメラーゼをTaqポリメラーゼとしてPyrococcus属

1.16

由来酵素A最初に商品化した。しかしこのTaqポリメラーゼは伸長反応の速度Pfuは速いが、エキソヌクレアーゼ活性が低いため校正機能が弱く、忠KOD実度（正確性）が悪いという欠点がある。そこでThermusよりさらKOD-Plus

キア）に属するPyrococcus furiosusの酵素（Pfuポリメラーゼ）

Mutation frequency (%)

0.150.090に高温（90℃以上）で生育する超好熱菌が探索され、始原菌（アー7.390.632468

図5．KOD DNAポリメラーゼのPCRにおける性能比較が商品化された。この酵素は、Taqポリメラーゼと比較して、耐熱性は高く忠実度も良いのだが、合成速度が遅いという欠点があった。

DNAポリメラーゼの立体構造

そこで私たちは、新たに超好熱菌を自然界から分離し、より良質のポリメラーゼを探索することにした。鹿児島県小宝島の硫気坑かKODポリメラーゼの結晶が得られたので、X線回折によりこのら超好熱性始原菌を分離し、Thermococcus kodakaraensis

立体構造を決定した（図6）（12，13）。ポリメラーゼ活性領域を示KOD1と名付けた（6，7）。本菌のDNAポリメラーゼ（KODポリメしたのが図7である。活性中心は3つのアスパラギン酸で構成されラーゼ）遺伝子の構造（8）を図4に示す。ポリメラーゼ構造遺伝子ており、その近傍にはリジンやアルギニンの正荷電アミノ酸が壁をの中にin frameで2つのインテインが含まれていた（9）。この遺伝成している。DNA合成反応の基質は負荷電のヌクレオシド三リン酸子が転写・翻訳されて大きなポリペポチドが合成され、自発的に折りであるから、正荷電の壁の方へ容易に近づくことができ、局部的にたたまれた際にタンパク質スプライシングが起こり、2つのエンド基質濃度が高くなるために、反応が早く進むのであろう。エキソヌクヌクレアーゼが生じる。その時に、ポリメラーゼ部分（3つの赤色のレアーゼ活性領域を示したのが図8である。この図のフォークポイペプチド部分）が自動的に連結され正常なKODポリメラーゼが生成

ントには7つのアルギニン残基がある。他の同種酵素で7つあるも

4

2013

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SPECIAL REVIEWのはまだ見つかっていない。DNAは当然負に荷電しているから、正ホットスタートPCRに荷電しているアルギニンとはうまく認識し合って長いDNA合成が通常のPCRを行うと、最初の昇温時にどうしてもミスマッチプラ可能になっているものと考えられる。またこのアルギニンの一つをイマーのアニーリングやプライマーダイマーが生じてしまい、目的他のアミノ酸に置換すると忠実度が低下するので、正確性も7つの外のDNA断片が増幅されることがある。そこで、最初の昇温時にアルギニン残基のお陰であろう。また酵素の立体構造に基づいて、DNAポリメラーゼの活性をマスクし、高温になってからPCRがスタポリメラーゼ活性と校正機能の協働作用を論じることができるのもートするようにすれば、上述の問題を回避することができる。これが構造生物学の利点であろう（14）。

ホットスタートPCRである（図9）。
Denaturation

Temperature
profile䜘䠃䠂䠂୒ಶ

Extension
AnnealingἪ䛵௧୕䛱⠾༟䛱ቌᖕ䛭䛓䜑䚯䛙䛴᪁Ἢ䛱䜎䜐䚮のᏄ㚯ᏽ䚮≚⨝ᤒᰕ䚮⎌ሾ䝦䝏䝃䝮䝷䜴䚮㣏ဗ䛴㞟Ⳟỗ᯹᳠ᰕ䛰䛯䛒DNA polymerase䛭䛓䜑䚯
activity profile

Mismatch primer
annealing
Primer-dimerformation

Normal PCR䜘ቌᖕ䛟䜑䛥䜇䛱ᚪこ䛭䛈䜑䛴䛒⪇⇍ᛮ㓕⣪

Exact primer
annealing

Hot start PCR⌟ᅹ䚮ୠ⏲୯䛭ᕰ㈅䛛䜒 Hot start PCR prevents undesirable extension
ይビ䜘༡䛝䛬䛊䜑䚯from inspecific annealing
図6．KOD DNAポリメラーゼの立体構造
図9．ホットスタートPCRの特性

われわれはまず抗DNAポリメラーゼ モノクローナル抗体を作製し、その中から酵素活性を阻害する抗体を選択することにした。
まず精製したKODポリメラーゼを用いてマウスを免疫し、その脾臓細胞（抗体を生産することができるが、増殖し続けることができない）と、抗体は作れないが増殖し続けることができる癌細胞を融合させ、抗体産生能力があり増殖することができるハイブリドーマを16株得た（15）。それぞれが独自のモノクローナル抗体を産生するので、それらがポリメラーゼ活性を阻害するかどうかを調べた。特に阻害度が強力な2種の抗体が得られたので、それらについてエピトープ解析を行った。すなわち、抗体が抗原タンパク質のどの位置に結合しているのかを調べたのである。3G8抗体はDNAポリメラーゼ活性を示す保存領域に結合し、βG1抗体は3'→5'エキソヌクレアーゼ活性の保存領域に結合することが明らかになった。2つの抗体を同時に添加すると、低温域ではポリメラーゼ活性をほぼ完全に阻害し、

図7．KOD DNAポリメラーゼのポリメラーゼ領域

高温域になるとマウス由来のタンパク質であるため熱変性してポリメラーゼからはずれて酵素活性が回復する（図10）。商品化したキット（KOD-Plus-）には、これらのモノクローナル抗体が添加されている。

3 →5 エキソヌクレアーゼ DNAポリメラーゼ
ドメイン
ドメイン

DNAポリメラーゼ

DNAポリメラーゼ（活性型）
熱DNAポリメラーゼ（不活性型）
反応液中で混合

モノクローナル抗体

モノクローナル抗体（変性物）

図8．KOD DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ領域
図10. ホットスタートPCRにおけるモノクローナル抗体の役割

20135

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KOD FXの凄さ
KODポリメラーゼの特性はいろいろな人からも指摘されてきた。例えば理化学研究所の林崎氏は、いろいろな生物種の遺伝子を紙に浸み込ませたDNA bookを作られたが、そこからPCRで遺伝子増幅できるのはKODポリメラーゼだけであるといわれた。また感染症研究所で出されている病原菌の検出マニュアルの中で、わざわざKODポリメラーゼでPCRを行うように記載されている例もある。さらには最近では、高性能PCR試薬としてKOD FXが開発され、東洋紡（株）から発売されている。その特徴は、①高い成功率、②抜群の増幅効率、③優れた伸長性（増幅可能鎖長）、④高い正確性、である。さらにこの酵素は、血液、マウステールライゼート、植物抽出液などの天然試料についてDNAを抽出することなく、そのままPCRにかけることが可能である。また通常はDNAを抽出しがたい酵母やカビなどのコロニーPCRも簡単に行え
るし、GC含量が90％以上のプライマーを使用してもPCRが可能である。このような特徴は他の酵素では不可能であるため、多検体試料を高速処理するために必要な自動化などの場合には、その有用性が際立つことであろう。
実施例につきましては、オンラインUpload vol.99をご覧ください

参考文献
1） 工学系のための生化学

左右田健次・今中忠行・谷澤克行

編著

化学同人

2012

2） Stetter K：Nature, 300, 258-260（1982）
3） Takai K, Nakamura K, Toki T, Tsunogai U, Miyazaki M, Miyazaki J, Hirayama H, Nakagawa S, Nunoura T,
Horikoshi K：Prod. Natl. Acad. Sci. USA, 105（31）, 10949-10954（2008）
4） 跡見晴幸、今中忠行：生化学 75, 561-575（2003）
5） Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H： Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 51（Pt 1）,263-273（1986）
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9） Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T：Nucleic Acids Res., 26, 4409-4412（1998）
10）Nishioka M, Mizuguchi H, Fujiwara S, Komatsubara S, Kitabayashi M, Uemura H, Takagi M, Imanaka T： J.

Biotechnol., 88, 141 -149（2001）11）Imanaka T, Takagi M：J. Chin. Inst. Chem, Engrs. 32, 277-288（2001）
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14）Kuroita T, Matsumura H, Yokota N, Kitabayashi M, Hashimoto H, Inoue T, Imanaka T, Kai Y： J. Mol. Biol.,
351, 291-298（2005）15）Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T：J. Biochem., 126, 762-768（1999）

経歴
1967年 大阪大学工学部醗酵工学科卒業
1969年 同大学院工学研究科醗酵工学専攻修士課程修了
1969年 同大学院工学研究科醗酵工学専攻博士課程中退
1973年 工学博士
1989年 大阪大学工学部教授
1996年 京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻教授
2004〜2005年 第46次南極地域観測隊員
2008年 京都大学名誉教授（現職）2008年 立命館大学生命科学部生物工学科教授（現職）日本醗酵工学会斉藤賞、日本生物工学会論文賞、日本生物工学会生物工学賞、有馬啓記念バイオイ
ンダストリー協会賞、日本化学会賞、環境バイオテクノロジー学会賞受賞、紫綬褒章受章
アメリカ微生物学アカデミーフェロー、20期・21期日本学術会議会員、日本化学会フェロー

62013