ALK-IHC 精度管理プログラム
External Quality Assessment (EQA) Program for Lung Cancer, part 2. ALK-IHC

Phase Ⅱ（地域がん診療連携拠点病院）報告書
2017 年 5 月 17 日

ALK-IHC 精度管理プログラムの目的
肺癌診療において、進行期非小細胞肺癌の患者が確実に EGFR と ALK の分子診断を受けられるよう求められている。ALK 融合遺伝子は IHC 法、FISH 法、RT-PCR 法の少なくとも２つ以上の方法で確認することが勧められており、FISH 法は Abbott Vysis® ALK Break Apart FISH プローブキットがクリゾチニブのコンパニオン診断薬として承認され（6,520 点）、多くが検査センター行われている。一方、IHC 検査はスクリーニングとして位置づけられ、高感度法を用いて院内で行う施設が増加しつつある。とくに、2014 年 9 月 1 日にアレクチニブ（中外、アレセンサ®）のコンパニオン診断薬としてニチレイ ヒストファイン ALK iAEP®キットが保険適用(2,700 点)となり、院内実施が進むものと思われる。しかしながら、同じ ALK 阻害剤であっても、コンパニオン診断の選択に差異があることや、検査の手技や実施のタイミングなど、病理診断の現場では少なからず混乱がある。ALK 融合遺伝子肺癌は非小細胞癌の 2－5％と高頻度ではないものの、いずれの分子標的薬も高い治療効果をあげており、病理医は治療対象患者を確実に拾い上げる責任を担っていると考えられる。このような背景から、ALK-IHC 検査精度を担保する早急な施策の必要性は、肺癌診療に関係する病理医および臨床医の共通認識である。そこで、日本肺癌学会および日本病理学会は共同してワーキンググループを組織し、がん診療拠点病院など検査件数の多い施設を対象とした精度管理プログラム（ALK-IHC 精度管理プログラム）を立ち上げた。この外部評価は、それぞれの施設における ALK-IHC の妥当性を確認することで、陽性症例で引き続いて行われる FISH 法による再検を通じて、適切な ALK 陽性患者の治療選択に結びつけることを目的としている。
これまで、この精度管理プログラムを立ち上げるに当たって委員内の施設での検討を行うとともに採点基準を作成し、都道府県がん拠点病院を対象とした精度管理プログラムを施行した（Phase I, 都道府県がん拠点病院）。これら結果をもとに対象を全国の地域がん拠点病院 345 施設に phase II として拡大した。それぞれの phase ごとの結果を以下に示す。

実施方法
概要: 50 腫瘍（予備 3 腫瘍）を含む 3 枚（ALK-1、 ALK-2、ALK-3）の未染スパイラルアレイ標本を配布し、それぞれの施設で ALK タンパクを染色その陽性反応を評価、エクセルシート（評価結果記入シート）に記入し返却した。ALK-1 のスライドには 18 腫瘍、ALK-2 には 17 腫瘍、ALK-3 には 15 腫瘍および予備 3腫瘍が含まれていた。HE との対比にあたっては、それぞれの virtual slides が用意されており、日本病理学会
病理情報ネットワークセンターで参照可能とした。
評価の基準︙ ALK IHC の一義的な役割は FISH を行うかどうかのスクリーニングあり、下表に従い，”対象腫瘍/症例を FISH 検査に回すかどうか” で評価した。スコアリング方式ではそのための基準を確立するための根拠に乏しいことやスコア標準例を設けることが難しいからである。
判定区分

判定の定義

FISH 検査を行う

FISH 陽性となる可能性が極めて高い、もしくは FISH による確認が必要。

FISH 検査を行わない

FISH 検査が陽性となる可能性はない、もしくは無視できる程度に低い。

染色方法: ALK-IHC については、アレクチニブに対してのニチレイ ALK iAEP キットがコンパニオン診断薬となっているが、クリゾチニブについては Abbott/Vysis ALK break apart FISH のみがコンパニオン診断薬であり、日本肺癌学会から声明（https://www.haigan.gr.jp/modules/bulletin/index.php?page=article&storyid=83）が発表されているように ALK-IHC の方法については保険当局に柔軟な対応が呼びかけられている。また、ALK-IHC の目的
は FISH による確認が必要な症例の抽出であり、方法を比較/検討することはこのプログラムの趣旨とは異なる。そのため本プログラムにおいては ALK-IHC の方法についての規定を設けなかった。その免疫染色によりALK-FISH に回す症例の抽出が妥当であるかどうかの精度をみるものである。
期間: 一般に未染標本を作成してから免疫染色を完了する期間として推奨されているのは 3 週間とされている。そこで、準備・輸送に一週間かかることから 2 週間以内に染色を施行し、3 週間以内に結果を事務局まで返送することとした。

評価方法
それぞれの腫瘍は、ワーキンググループ委員内で事前に染色を各施設で施行・評価し，コンセンサスを得た判定結果（標準）あらかじめ設けてある。また、陽性腫瘍については FISH 法やその他の方法で出来る限り遺伝子変異についても検証した。その標準をもとに陽性強度や標本の状態により基準点が設けてあり、一定の基準内にあればその染色・評価は妥当であると評価した。基準外であれば改善に向けての方策やコメントを添付した。

参加施設
Phase I
各ワーキンググループ委員より分担によりメールによって 45 施設にプログラムへの参加を打診した。その結果は以下のとおりである。
参加29 施設（64%）（1 施設で 2 種類の染色方法を実施されており 2 施設として数えた）

不参加 16 施設（36%）
不参加 16 施設のうち、ALK 染色院内実施検討中

4 施設

ALK 染色は外注

8 施設

回答なし

4 施設

Phase II345 施設（地域がん診療連携拠点病院 344 施設+自主参加 1 施設）に郵送による書面にてプログラムへの参加を打診した。その結果は以下のとおりである。
参加

82 施設（24%）

不参加

263 施設（76%）そのうち、回答あり

84 施設（全体の 24%，不参加の 32%）

（ALK 染色は外注による不参加 36 施設：全体の 10%，不参加の 14%）
回答なし

179 施設（全体の 52%，不参加の 68%）

なお、3 施設においては、未染標本 を送付したが、3/15/2017 現在においても染色、およびその評価の返答がなかったため、この解析からは除外した。

結果
染色手段
自動免疫染色装置

86 施設（77%）

用手法

21 施設（19%）

記載なし

4 施設（4%）

染色方法
体外診断用医薬品（ALK iAEP キット）

36 施設（32%）

それ以外

49 施設（59%）

記載なし

４施設（4%）

一次抗体としての ALK のクローン
5A4

85 施設（77%）

D5F3

19 施設（17%）

ALK-1

2 施設（2%）

その他

１施設（4%）

記載なし

4 施設（4%）

その組織コアごとの結果を以下に示す。

最終評価評価基準内であった施設（評価点数 -10 点以上）:

74 施設 (67%)

評価基準以下であった施設 （評価点数 -15 点以下）:

37 施設 （33%）

若干の改善を要するとした施設 （評価点 -15 点）:

12 施設 (11%)

早急な改善を要するとした施設（評価点 -20 点以下）:

24 施設 (22%)

全体の分布としては以下のとおりであった。
Number of values

111

Minimum-195

25% Percentile-15Median-5

75% Percentile0Maximum

0Mean-17.07

Std. Deviation

33.76

Std. Error

3.204

Lower 95% CI of mean-23.42

Upper 95% CI of mean-10.72

評価基準内であった施設には評価標準との結果とともに、特異度・感度ともに十分であったことが記載された評価書を送付した。Phase II においては評価基準以下であった施設には、改善点を記載した評価書を送付するとともに、とくに大きく評価基準を下回った 10 施設に関しては、要望に応じて染色標本を送付いただいてどのような点が問題となったのかについて個別に評価し、考えられる改善点を挙げ、返答した。その一例を以下に示す。

A 病院の場合
評価シートで再評価し、問題点を抽出したのち、メールにてそれらをまとめて報告した。

まとめ
1. これまで、精度管理が必要と考えられてきたが、実施母体がなく問題であった。しかしながら、経済的な裏付けのない有志グループでの試みではあったが、82 施設に状況を評価することができた。染色がうまく行っている施設ではその方法の妥当性が確認され、評価基準以下の施設では問題を指摘することができた。
2. 作成したスパイラルアレイでは腫瘍細胞の消失は最小限にとどまり、切片（ALK1～ALK3）、組織コア（1～16）による特定の傾向は見出されなかった。
3. 染色方法によって一定の傾向が見受けられた。
a. ニチレイ ヒストファイン ALK iAEP キットを用いている施設は評価が良好であった。
b. D5F3、ロシュ BenchMark XT は過染傾向があり、過大評価される組織コアもあった。
c. 5A4 でライカ製染色機器を用いて通常プロトコール（Bond ポリマーシステム）で染色すると、検出増幅が不十分で過小評価される施設が多かった。少なくともライカには検出増感系が不十分であることを認知する必要がある。
d. ALK-1 の使用施設は染色がうまく行っていなかった。
4. ALK-IHC による陽性反応は一般に明瞭であるが、まれにあるごく弱い反応の場合、見過ごされる場合があった。
5. ALK 染色自体の問題ではなく，ALK iAEP 染色キットの添付文書に基づいて ALK 染色陽性例をALK break apart FISH 不要と判断された施設が一部にあり、一般的に受け入れられている ALK 検査アルゴリズムの違いを生じることがわかった（下記参照）。

6. Ventana Benchmark での染色ではスライドガラスによっては、辺縁部のコアに十分に試薬が届かないことがあり、他院未染標本を用いて BenchMark で染色する際には注意する必要があることがわかった。

7. 今回は染色強度の基準を作ることが難しいため、FISH を施行するか否かという視点で評価していただいたが、IHC 陰性でも組織像によって FISH を施行すると考えた施設もあり、より明確な基準が必要であった。

展望
これらのことから、至適化条件決定のためのコントロールスライド（ALK 陽性肺癌細胞株 H2228, ALK 陰性肺癌細胞株 A549）を希望者に配布することにした。また、日本肺癌学会，日本病理学会のホームページで公表されている「肺癌における ALK 免疫染色プラクティカルガイド」を染色、評価に役立ててもらうことにした。
特に、5A4 でライカ染色機を通常プロトコールで用いている場合は、広く感度が足りないことを通知する必要を感じた。
今後、どの施設でも肺癌に対する ALK 染色に対する精度管理を続けていけるような、支援事業体系の構築の必要性があり、日本精度管理機構への円滑な移行が期待される。

ALK-IHC 精度管理ワーキンググループメンバー
日本肺癌学会・日本病理学会合同 ALK-IHC 精度管理ワーキンググループ委員
羽場 礼次（香川大学医学部附属病院病理部）
畑中 豊（北海道大学病院コンパニオン診断研究部門）
福岡 順也（長崎大学大学院医歯薬学総合研究科医療科学専攻病態病理学分野）
石川 雄一 （公益財団法人がん研究会がん研究所病理部）
南 優子 （国立病院機構茨城東病院胸部疾患・療育医療センター病理診断科 ）野口 雅之 （筑波大学診断病理学）
大林 千穂（奈良県立医科大学病理診断学講座）
酒井 康裕 （神戸大学医学部附属病院病理診断科）
武島 幸男 （広島大学大学院医歯薬保健学研究院病理学研究室）
蔦 幸治（国立がん研究センター中央病院臨床検査部）
谷田部 恭（愛知県がんセンター中央病院遺伝子病理診断部）
坂下信悟（筑波大学診断病理学）