研究フロンティア（平成 年度学術奨励賞受賞論文）

ラット子宮間質細胞の脱落膜化における Calreticulin の役割
吉江 幹浩，草間 和哉，田村 和広，山崎梨沙香，立川 英一
東京薬科大学薬学部内分泌・神経薬理学教室の品質管理や細胞内カルシウムイオン濃度の恒常性維持はじめにに関与する［］．また，Calreticulin は，小胞体以外に着床は，受精卵の胞胚（胚盤胞）への正常な発育とそも存在しており，細胞接着，免疫反応にも関わり，そのれに協調した子宮側の受け入れ準備（胞胚受容能の獲得）機能は多岐にわたる［ ， ］．本研究では，ラット着床の完了とともに着床ウィンドウと呼ばれる限られた期間周辺期子宮における Calreticulin の発現解析を行い，特内で起こる［に子宮間質細胞の脱落膜化における役割について検討し］．着床部位では，血管透過性の高進，胎盤形成の基盤となる内膜間質細胞の脱落膜化といったた．

ダイナミックな変化が起こる．ラットやマウスなどの齧歯類では，着床胚を取り囲む子宮間質細胞が増殖・分化

着床周辺期の子宮における Calreticulin の発現し，脱落膜が形成される．これら妊娠の成立に不可欠なラットでは，交配後，腟栓が確認された日を妊娠

胞胚受容能の獲得，着床，ならびに脱落膜化は，卵巣ス日テロイドホルモンの作用により厳密に調節されている．

目とすると，受精卵は妊娠

これまでに，さまざまな遺伝子改変動物を用いた解析かの日の深夜に起こる着床に不可欠な卵巣からの少量のら着床や脱落膜化に関わる多数の因子が明らかとなって

E サージにより胞胚と子宮内膜は活性化され，通常妊いる［娠］．その一方，ヒトにおける着床や脱落膜化の日目までに胞胚となり，こ日目に着床する．本研究では Wistar-今道系ラット

詳細な分子メカニズムは，ヒト妊卵を取り扱う倫理的なを用い，着床前の妊娠問題や動物種による脱落膜と胎盤の形成プロセスの種差日目の子宮における Calreticulin の発現・局在を調べたにより，依然として不明な点が多い．妊娠の原点である（図着床とその周辺時期に起こる子宮内の変化を調節してい床前と比較して着床後の妊娠る分子機構を解明することは，その生理学的現象の理解（図だけでなく，新たな不妊治療法の進歩といった臨床的ろ，妊娠ニーズにも結びつく可能性がある．

細胞に Calreticulin が発現していたのに対し，着床後のわれわれは，これまでにヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化に関わる細胞内シグナル伝達機構に着目し，細胞内妊娠，日目と着床後の妊娠，）．子宮内 Calreticulin タンパク質の発現量は，着日目に顕著に増加したA）．また，各妊娠日における局在を検討したとこ，，日目の子宮では，主に腺上皮，管腔上皮日目では着床胚を取り囲む脱落膜細胞に強い発現がみられた（図B）．

セカンドメッセンジャーである cyclic adenosine monophosphate（cAMP）を介するシグナル伝達経路の新た

着床遅延子宮における Calreticulin 発現な仲介因子として Exchange protein directly activated］．一連

妊娠子宮において着床後に Calreticulin の発現上昇がの研究では，Epac サブタイプのうち Epac をノックダみられたため，着床と Calreticulin の発現との関係につウンした際に発現が著しく減少するタンパク質としていて着床遅延モデルを用いて検討した（図Calreticulin を同定し，培養ヒト子宮内膜間質細胞の脱デルでは，妊娠by cAMP（Epac）の重要性を報告してきた［）．このモ日目に卵巣摘除（OVX）した後，プ落膜化や腺細胞の成熟における役割を明らかにした［ ，ロゲステロン（P ， mg/day）を数日間，連日投与す］．Calreticulin は，レクチン様シャペロンタンパク質ることにより，着床を人為的に遅延させ，さらに β―エとして知られており，主に小胞体内の新生糖タンパク質

ストラジオール（E ，連絡先：吉江幹浩，東京薬科大学薬学部内分泌・神経薬理学教室〒 ―東京都八王子市堀之内―
TEL/FAX： ― ―E-mail : yoshie@toyaku.ac.jpng）の投与により任意に着床を誘起することができる［］．OVX のみを行った対照群（Control）と OVX ラットに P を連日投与した群（OVX＋P ，着床遅延状態）では，腺上皮と管腔上皮細胞でCalreticulin の発現が確認された（図A，B）．一方，P

日本生殖内分泌学会雑誌（2015）20 : 35-40

35

吉江幹浩

他

AB
Calreticulin

Relative level(Calreticulin/ -actin)

5Day 3Day 5ଵᒷ঱ຜ*৑ସᏣ঱ຜ

4ଵᒷ঱ຜ

৑ସ
Ꮳ঱ຜ

3

 P

2Day 7Day 910Day 3 Day 5 Day 7 Day 9ା෫ᶦ

Calreticulin

ା෫ᶦ-actin൓૳Ⴭା෫৐図൓૳Ⴭା෫৏

ラット着床周辺期子宮における Calreticulin の発現（A）妊娠 ， ， ， 日における子宮内 Calreticulin 発現（ウェスタンブロット，デンシトメトリー解析）．＊p＜ ．
（vs. Day）．

（B）各妊娠日における Calreticulin の免疫染色像．

OVXOVX + P4/E2‫ق‬ା෫ාକ‫ك‬

OVX + P4ABDCDା෫ᶦ൓૳Ⴭ಍ཝ̭P図൓૳Ⴭ಍ཝ

着床遅延モデルを用いた Calreticulin 発現の解析
交配後，妊娠 日目に卵巣切除術（OVX）を行い，プロゲステロン（P ； mg/day）を連日投与（妊娠 〜 日目）し，着床遅延状態とした．着床を誘起するため， βエストラジオール（E ； ng）を妊娠 日目に投与した．妊娠 日目に子宮を回収し，Calreticulinの免疫組織染色を行った．
（A）OVX のみ．
（B）OVX 後，P を連日投与（着床遅延状態の子宮）．
（C）OVX 後，P を連日投与し，さらに E を投与（着床を誘起した子宮）．
（D）図 C の拡大図．

連日投与後，E を投与して着床を誘起した群（OVX＋P

Calreticulin 発現に対する卵巣ステロイドの効果/E ）では，着床胚を取り囲む脱落膜細胞で Calreticulinの明らかな発現がみられた．このことから，妊娠子宮に通常の妊娠時や着床遅延状態から E 投与により着床

おいて Calreticulin は，卵巣ステロイドの制御下で起こを誘導した子宮において Calreticulin 発現の亢進が認める胞胚の着床が起点となり，その発現が増加することがられたが，卵巣ステロイドが直接的にその発現上昇に関判明した．

与している可能性もある．そこで，妊娠していないラットを OVX し，内因性の卵巣ステロイドを消失させた状36

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.20 2015

ラット妊娠初期子宮における Calreticulin の発現と脱落膜化との関係

Relative level(Calreticulin/ -actin)

1.5用が必須であるものの，着床後に起こる Calreticulin 発

Calreticulin

現への直接的な卵巣ステロイドの関与は否定された．

1.0

偽妊娠ラットの人為的脱落膜化におけるCalreticulin発現

0.5

次に，われわれは，着床に伴って起こる子宮間質細胞0の脱落膜化と Calreticulin 発現との関係について人為的ContE2P4P4 / E2

脱落膜化モデルを用いて検討した（図Calreticulin）．これは，精管結紮した雄との交配により偽妊娠ラットを作製し，胞-actin胚受容能を獲得した偽妊娠

Calreticulin 発現に対する卵巣ステロイドの効果することで，胞胚の非存在下で脱落膜化を誘導すること

図

非妊娠ラットを OVX し，術後 週間目から P（ mg）を 日間連日投 与 し，E （ ng）を単回投与した． 日間の P だけを連日投与した群と E のみを単回投与した群も設けた．投日目の子宮にゴマ油を注入ができるモデルである［ ］．偽妊娠日目にゴマ油（図中 Oil）を注入し， 時間経過した子宮角では，Calreticulinの顕著な発現が脱落膜細胞でみられ（図与 日目から 時間後に子 宮 を 摘 出 し，Calreticulin のタンパク質発現を解析した（ウエスタンブロット，デンシトメトリー解析）．

A），その発現量は，ゴマ油を処置していない対照群に比べ有意に高かった（図B）．これらの結果から，着床部位における Calreticulin 発現の上昇と子宮間質細胞の脱落膜化が況下で，上記実験と同用量の P と E を単独または共処置し， Calreticulin 発現に対する影響を検討した（図密接に連関していることがさらに示された．

）．

Calreticulin の発現量は，E 単独投与でやや減少する傾子宮間質細胞の向であったが統計的な有意差はなく，また，P 単独，Ereticulin の役割

脱 落 膜 化 に お け る Cal-/P 併 用 投 与 も Calreticulin の 発 現 に 影 響 を 及 ぼ さ なかった（図）．よって，着床には卵巣ステロイドの作

着床部位で発現が亢進する Calreticulin の機能についBA
Control

Control Oil

Oil
Calreticulin-actin൓૳Ⴭ಍ཝRelative level(Calreticulin/ -actin)

250 m1.6*1.20.80.40

図Calreticulin

ControlOil

人為的脱落膜化誘導モデルを用いた Calreticulin 発現の解析
偽妊娠 日目の子宮（片子宮角）にゴマ油（Oil）を注入し，脱落膜化を誘導した．Oil 注入後，た．なお，片方の子宮角はオイルを処置しない Control とした．
（A）Calreticulin の免疫組織染色像．

日目に子宮を回収し（B）ウェスタンブロット，デンシトメトリー解析．＊p＜ ． ．

研究フロンティア

37

吉江

幹浩

他

B
Cell viability

siRNA:
Calreticulin-actin(Ratio vs. Cont siRNA䠅
䠅A

1.5
10.50ContsiRNA

CalreticulinsiRNAC0.8

Calreticulin
siRNA

0.6

*0.4

D
Relative level(Calreticulin/ -actin)

CalreticulinsiRNA0.8*0.60.40.2

Control

1.20

MPA +db-cAMP

MPA +db-cAMP

MPA + db-cAMP
Cont
siRNA

Calreticulin
siRNA

1.0

Control

EConnexin43#
Cont siRNA

1.4

Calreticulin
siRNA

0.8

*0.60.40.20.0

図Cont siRNA

1.00.20

Dtprp
#

1.2

#
(Dtprp/Gapdh)(Prl/Gapdh)

Relative level

1.0Cont siRNA

Relative level

Prl1.2Control

培養子宮間質細胞のMPA +db-cAMP
脱落膜化における Calreticulin の役割

ラット子宮より単離した間質細胞に Calreticulin siRNA をトランスフェクションし，酢酸メドロキシプロゲステロン（MPA； nM）とジブチリル cAMP（db-cAMP； ．mM）を 日間処置した．
（A）siRNA 導入細胞における Calreticulin タンパク質発現．
（B）細胞生存率．
（C）脱落膜化マーカーの発現（リアルタイム RT-PCR）．＃p＜ ． vs. Cont siRNA（Cont），＊p＜． vs. Cont siRNA（MPA＋db-cAMP）（D，E）コネキシン の発現B）．Calreticulin 発現を siRNA にてノッて検討するため，ラットより単離した子宮間質細胞になかった（図Calreticulin siRNA を導入した．siRNA の導入により Cal-クダウンした後，脱落膜化刺激として酢酸メドロキシプ

reticulin タンパク質の発現量が減弱すること（図ロゲステロン（MPA）と cAMP アナログ（ジブチリルA）を確認した． また， Calreticulin 発現のノックダウンは，cAMP）を共処置し本実験期間内において子宮間質細胞の生存率には影響しるプロラクチン（Prl ）［ ］と decidual/trophoblast prolac-38

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.20 2015

日間培養後，脱落膜マーカーであラット妊娠初期子宮における Calreticulin の発現と脱落膜化との関係

tin-related protein（Dtprp）［ ］の mRNA 発現を調べた．

子宮上皮細胞に強い Calreticulin 発現がみられたが，詳siRNA）でみられる脱落膜化

細な着床機構における Calreticulin の役割については，その結果，対照群（Cont

刺 激 に よ る Prl と Dtprp の mRNA 発 現 の 上 昇 が，Cal-今後のさらなる検討が必要である．

reticulin 発現のノックダウンにより有意に抑制された（図C）．次に，細胞間ギャップジャンクションの構成因子であり脱落膜の形成に関わるコネキシン

今回，われわれは，着床後に起こる間質細胞の脱落膜化とともに発現が増加する Calreticulin が，脱落膜細胞（Cx ）への分化に重要な役割を担うことを明らかとした．Cal-の発現について検討した．マウス子宮間質細胞においてreticulin 発現の抑制がどのように脱落膜マーカーの発現

Cx 発現をノックアウトすると，ギャップジャンクショ誘導を阻害したのか，そのメカニズムについては現在，ンの崩壊による脱落膜組織内での血管形成が阻害され脱検 討 中 で あ る が，興 味 深 い こ と に Cx 発 現 は，Cal-落膜化に異常をきたすことやヒト子宮内膜間質細胞でのreticulin のノックダウンにより減弱した．Calreticulin

Cx 発現の脱落膜化への関与［ ］が報告されている．

欠損マウスの線維芽細胞では，Cx 発現量が低下してラット子宮間質細胞に MPA とジブチリル cAMP を処置いることが報告されており［ ］，今回の結果とも合致すると対照群では，Cx タンパク質の発現上昇が起こっする．ホメオボックス遺伝子の Hoxa は，子宮内膜のたが，Calreticulin のノックダウンは，これを抑制した．Hoxa
発達や胞胚受容能に関する転写因子である［ ］D）．さらに，ギャップジャンクションの形成を示

欠損マウスは着床と脱落膜化が阻害されて不妊となる

す細胞膜への Cx の斑点状集積も Calreticulin のノックが，Hoxa 欠 損 マ ウ ス の 子 宮 間 質 細 胞 に お い て Cal-ダウンにより阻害された（図E）．このことから，着reticulin 発現が減少している［ ］．これらの知見は Cal-床後の子宮間質細胞で発現が亢進する Calreticulin は，reticulin の脱落膜化における役割の重要性を支持する知Cx の発現を介して脱落膜化細胞への分化誘導に関与

見 で あ る．そ の 一 方，こ れ ま で 報 告 さ れ て き た Cal-することが示唆された．

reticulin の小胞体シャペロン機能，カルシウムイオンの（図恒常性維持，細胞接着，免疫機能など多彩な役割と脱落おわりに膜化との関連性についても明らかにしていきたいと考えている．

本 研 究 で は，ラ ッ ト 着 床 周 辺 期 子 宮 に お け る Cal-

以上，本研究によりラット妊娠初期子宮において着床

reticulin の発現と子宮間質細胞の脱落膜化における役割

後の内膜間質細胞で発現が亢進する Calreticulin が，脱）妊娠子宮において Calreticulin は落膜形成過程に関与する因子であることが示唆された．

について検討し，着床部位で発現が増加すること，）胞胚の有無にかかわらず脱落膜化に伴い発現が誘導されること，）培養

子宮間質細胞の Calreticulin 発現を抑制すると invitro脱落膜化が阻害されることを明らかにした．ラットで見られた着床部位（脱落膜）における Calreticulin 発現の増加が，ヒトの脱落膜でもみられるのかについては不明

謝辞

本稿は，平成 年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものである．本稿を執筆する機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長 苛原 稔
教授，第 回学術集会会長 北脇 城教授，ならびに本誌編集委員長 筒井和義教授に心から感謝申し上げます．

であるが，ヒトの子宮内膜腺細胞と間質細胞におけるCalreticulin の発現していること，オナガザルでは，非妊娠子宮や妊娠子宮の非着床部位と比較して着床部位で引用文献

Calreticulin が高発現していることが 報 告 さ れ て い る［ ］．また，マウスでは，着床周辺部位で発現が上昇すること，Calreticulin のアンチセンスオリゴ DNA を子宮内に投与すると着床が阻害されることが報告されている［ ］．この報告は，Calreticulin と着床との関係を推察するものである．われわれは，ヒト子宮内膜腺上皮細胞株を用いて，着床関連因子として知られる白血病抑制因子（LIF）［ ， ］とシクロオキシゲナーゼ［ ］の発現に Epac を介した Calreticulin 発現が関与することを報告した［］．ラットにおいても着床前の子宮では．Dey SK（）Implantation. Adashi EY, Rock JA, Rosenwaks Z（eds）Reproductive endocrinology, surgery and technology, Lippin-cott-Raven Publishers, New York, pp.
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吉江幹浩

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