研究フロンティア（令和元年度学術奨励賞受賞論文）

光応答性 CRISPR/Cas システムを用いたマウス子宮における胚着床の in vivo 制御髙尾 知佳 ，），升田 博隆 ），佐藤 守俊 ），丸山 哲夫 ））岡山大学大学院医歯薬学総合研究科）慶應義塾大学医学部産婦人科学教室）東京大学大学院総合文化研究科

つオフターゲット効果の減弱も期待できる画期的なシス

はじめにテムである．
年，画期的なゲノム編集システム CRISPR―Cas

子宮は月経周期毎に時間的ダイナミックな変動する組が報告されて以来，瞬く間にこの技術は広まり現在まで織で，とくに着床期には受精卵が着床するための最適な世界中の研究室で利用されている．CRISPR―Cas シス

時期である implantation window が存在し，さまざまなテ ム は， bp の single-guide RNA（sgRNA）を 用 い てホルモンやサイトカインの動態により制御されている ）．

ゲ ノ ム 上 の 狙 っ た DNA 配 列 を 切 断 す る Cas 酵 素 に

この時期に自由に Cas を誘導できれば時空間特異性を本鎖 DNA の破壊が生じて非相同性末端結合もった制御が可能となり，女性生殖器の生殖能さえも光よって，あるいは相同性組換えを起こす ，）（図）．Cas の誘導照射により時間的制御が可能になると考えられた．本研方法には，プラスミド DNA や蛋白質 Cas を導入する

究では，この光 Cas システムが実際に Cas として機能方法やラパマイシンなどの薬剤を用いて，時間的に誘導するのか，さらにはマウス胚着床を制御することが可能）する方法が知られている ．しかしながら，Cas は DNAかについて検討を行うことにした．

切断活性が常に On であり，発現するコントロールは可能だったとしても分解能力には限界があり，Cas の On/方法

Off を制御することはできなかった．そのため sgRNAが非特異的に結合し，別の標的を破壊するオフターゲッ

光 Cas システムが実際に機能するかについて，子宮）ト効果も問題となっている ．そのため薬剤などの侵襲体癌細胞株 Ishikawa（IK）細胞に上皮マーカーであるもなく，狙った組織や時間での時空間的なゲノム編集にEpCAM プロモーター Ep―Pr を挿入した Luciferase 誘導は限界があった．しかしながら，年，共著者の佐藤細胞株として IK―Ep―Pr 細胞を作製した．この EpCAM

守俊教授の研究室より青色 LED 光照射により Cas の発プロモーターに対し特異的な sgRNA（sgProm）と対照現を制御可能な光応答性 CRISPR/Cas システム（以下群のコントロール sgRNA（sgCtrl ）を作製した．In vitro

光 Cas ）が報告された ，）．光 Cas システムとは二分割

検討では IK―Ep―Pr 細胞に光 Cas プラスミドと sgPromした不活化 Cas 蛋白質に N 末端および C 末端側断片にまたは sgCtrl をトランスフェクションし， 時間後に光スイッチ蛋白質である Magnet システム（pMag およ青色光（±nm； ． Wm− ）を 時間照射し，Lu-び nMag）を連結し，青色光を照射すると Magnet の結ciferase 活性を確認した．in vivo 検討では免疫不全マ合に伴い，断片化 Cas も互いに近接して結合し活性化

ウスに IK―Ep―Pr 細胞とマトリゲルの混合ゲルを皮下移

Cas となり DNA 切断活性を回復し，標的配列を切断で植し，きるようになる．さらに光照射をやめると Magnet は結system（IVIS）で Luciferase 活性を確認した後，腫瘍内―週間後腫瘍形成を in vivo

D/ D imaging

合力を失い，Cas は元の不活化 Cas 断片に戻り，DNAまたは腹腔内に光 Cas プラスミドと sgProm を in vivo）．このように光 Cas は光照射のトランスフェクションし， 時間青色光で照射した後，切断活性を失う（図みで Cas の発現や消失を非侵襲的に自在に操れて，か連絡先：髙尾知佳，岡山大学大学院医歯薬総合研究科〒 ―岡山市北区鹿田町 目 番 号
TEL ： ― ―FAX： ― ―E-mail：ttakao＠okayama-u.ac.jp

IVIS で Luciferase 活性を検出した．
光 Cas 胚着床モデルを作るために，着床期に特異的に発現し，着床を制御するleukemia inhibitory factor（LIF）に対する gRNA（sgLif ）を作成した．交配確認後，ICR
雌マウス ．dpc に光 Cas プラスミドに加えて sgLif あ

日本生殖内分泌学会雑誌（2020）25 : 17-2017髙尾知佳他

図従来の CRISPR/Cas と光 Cas の違い
点の明らかに異なる部分は，従来法では Cas は分解消失するまでその活性を維持し続けるが，光 Cas の場合，照射をやめることにより光スイッチ蛋白質の結合が外れるため，Casも断片化し，不活化することである．

IK―Ep―Pr 細胞による光 Cas を用いた in vitro 検討
EpCAM プロモーター特異的な sgRNA（sgProm）を導入し光を照射すると Luciferase 活

図性が抑制されていることがわかる．

るいは sgCtrl を腹腔内投与し，（±nm；― ．dpc に青色 LEDら，in vitro で光 Cas は機能することがわかった．

−Wm ）をマウス全体に 時間照射した． ．dpc で LIF の発現を確認し， ．dpc で着床数を

光 Cas

検討

検討した．さらにレスキュー実験として，sgLif 投与群の LED 照射前にリコンビナント LIF（recLIF）を子宮次に IK―Ep―Pr 細胞を用いて in vivo 腫瘍マウスを作内へ投与し， ．dpc で着床数の検討を行った．

製し，その腫瘍内または腹腔内へ，先ほどと同様に光 Cas

光 Cas

スフェクションした．青色光照射後，Luciferin を腹腔プラスミドと sgProm または sgCtrl を in vivo トラン検討内投与し，IVIS で Luciferase 活性を確認した（図光 Cas が in vitro で実際に Cas として機能をするか）．

その結果，腫瘍内および腹腔内両者ともに Luciferase 活について検討するため，EpCAM プロモーター搭載の Lu-性が抑制されていることが確認できた（図ciferase 活性をもつ IK―Ep―Pr 細胞に光 Cas プラスミド

結果より，in vitro および in vivo ともに光 Cas が機能と sgProm または sgCtrl をトランスフェクションし，することが明らかとなった．

青色光照射後 Luciferase 活性を確認した．図）．以上のに示すように，Ctrl では Luciferase 活性は維持されていたが，Ep-光 Cas 着床モデル

CAM プロモーター特異的な sgRNA を導入した細胞では著しく Luciferase 活性が抑制されていた．このことか18日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.25 2020

これらの検討を踏まえ，光 Cas で制御される胚着床光応答性 CRISPR/CAS システムを用いたマウス子宮における胚着床の in vivo 制御

図

図

K―Ep―Pr 細胞による腫瘍に対する光 Cas を用いた in vivo 検討のシェーマ

腫瘍マウスに対する光 Cas を用いた in vivo 検討
光 Cas および sgRNA を腫瘍内または腹腔内投与し光照射によりともに Luciferase 活性が抑制された．

モデルの作製を行った．このモデルを作製するにあたり，日目および ．日目に子宮を採取し Lif 発現および着床

マウ ス の implantation window に 匹 敵 す る 時 期 に 発 現数を検討した．この際，妊娠コントロール群を sgCtrlピークを迎え，着床を制御することがすでに知られてい＋青色光照射群および sgLif ＋青色光非照射群とし，る Lif 遺伝子を標的遺伝子とした．Lif のコンディショナ

ノックアウト群を sgLif ＋青色光照射群とした． ．日

ルノックアウトマウスでは脱落膜化形成ができないこと

目のマウス子宮を調べた結果，妊娠コントロール群で強）から，着床不全になることが知られている ．さらに，い LIF 発現が認められたが，LED 照射を行ったノック

Lif 分泌ピーク前日に Lif 阻害剤を腹腔内投与することアウト群では LIF の発現が減少した（data not shown）．

で，着床が阻害されることもすでにわかっている ）．光さらに， ．日目のマウス子宮内胎児数では，妊娠コン

Cas を用いてこれらと同様の結果が得られるか検討をトロール群に比較してノックアウト群では，その数が有行った．実際の光 Cas 胚着床モデル作製の流れを図意に減少した（妊娠コントロール群① sgCtrl/LED ＋：に示す．交配後プラグチェックした日を ．日目とし，．

．± ． ，② sgLif/LED−： ．± ． ，ノックアウ日目に光 Cas および sgLif あるいは sgCtrl を腹腔内投ト 群 sgLif/LED ＋： ．± ．（各 々 n＝与する． ― ．日目に青色光を下部全体から照射し， ．

トロール①，妊娠コントロール② vs. ノックアウト群，），妊 娠 コ ン

研究フロンティア

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髙尾知佳

他

図光 Cas による in vivo 胚着床モデル作製のシェーマ

謝各 p＜ ． ）．
次に，Lif は分泌タンパク質であることから，sgLif によるノックアウトマウスがリコンビナント Lif（recLif）
によりレスキ ュ ー で き る か を 検 討 す る た め，図のシェーマに加え，青色光照射直前に PBS 投与群（KO―辞

本稿は，令和元年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものです．本稿を執筆する機会を与えてくださいました，日本生殖内分泌学会理事長 緒方勤教授，第 回学術集会会長 市川智彦教授ならびに本誌編集委員の先生方に心から感謝申し上げます．

PBS）と recLIF 投与群（KO―recLIF）を作製し， ．日目の着床数を検討した．結果として，recLIF 投与により sgLif 群による着床数の減少がキャンセルされ，妊孕能が回復した（KO―PBS 群：± ． ，KO―recLIF 群：． ± ． ，p＜ ． ）．

終わりに本研究では，光 Cas を用いて in vivo 胚着床モデルの作製に成功した．明らかに機能がわかっていた Lif を用いることで，光 Cas の有用性が証明できた．このモデルで明らかとなったことは，青色光の生体組織透過性が不確かであるなか，光 Cas は感度が高いことから子宮への外部光源照射で結果が得られたことである．光 Casは Cas で問題になっている DNA 切断活性の持続性を短く制御できることから，オフターゲット効果に関する問題も低減できるかもしれない．また，今回は腹腔内投与での結果であるが，子宮にかかわらずさまざまな組織での応用を考えると静脈投与法を用いることも可能である．今後これらの手法を用いてこれまで明らかとなっていなかった着床関連の遺伝子解析や implantation window での重要性などを非侵襲的かつ時空間的に解析することが可能となるだろう．また，本執筆者は PA―Casと同じ光遺伝学手法を用いたテトラサイクリン誘導発現系 TRE―PA―Cre（光応答性 Cre―loxP システム）マウスの開発 ）にも携わっており，今後，さまざまなゲノム編集や遺伝子改変システムが光遺伝学とともに進歩することを期待している．

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日本生殖内分泌学会雑誌

引用文献

Vol.25 2020

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． ． .