REVIEW

マウス加齢卵におけるテロメア長の解析山田（福永） 朝子，浜谷 敏生，山田 満稔，久慈 直昭，吉村 𣳾典
慶應義塾大学医学部産婦人科学教室

しかし，いずれの卵においても加齢の背景にある分子生

はじめに物学的メカニズムは不明な点が多い．
ヒト女性の妊孕性は３０歳代半ばで急激に低下することが知られている．この原因は，残存卵子数の減少や，子． Tert とテロメア

宮内膜着床能の低下なども考えられるが，卵の質の低下

テロメアは染色体末端にある TTAGGG 配列の繰り返］．たとえ生殖補助医療し構造で，染色体の末端を DNA 分解や染色体同士の融（Assisted Reproductive Technology : ART）を行ったと合から守っている．テロメラーゼは，テロメアの伸長，しても加齢による妊孕性の低下を避けることはできない

維持に関わる逆転写酵素であり，Terc と呼ばれる鋳型

が，若年健康女性から提供されたドナー卵を用いて体外RNA と逆転写酵素活性を有する Tert タンパクを内在す

受精―胚移植を行った場合は，年齢に関係なく高い出産

る．体細胞においてはテロメラーゼ活性は非常に低いた率が得られることが分かっている［が主要な要因と考えられる［］．この事実は，め，テロメアは細胞分裂を繰り返すことにより短縮し，

母体の加齢に伴い卵細胞そのものが加齢することを示し

やがて Hayflick limit に達するとアポトーシスを起こすているが，加齢による卵の質的な低下の背景にある分子．一方で，卵は第［７，８］

生物学的メカニズムは不明な点が多い．そこで母体加齢ン期）で長期間休止しているため，テロメアは短縮しなと排卵後加齢というふたつのモデルを用いて，卵子の加いと考えられてきた．しかし，若齢マウス由来および加齢変化に関してテロメラーゼ活性とテロメア長，ミトコ

齢マウス由来の卵を比較した網羅的発現解析の結果ではンドリアと酸化ストレスに焦点を置き解析することとし

母体加齢卵において Tert の発現低下が示唆され［た．

また，ヒト卵でもテロメアには長短があり着床前期胚に減数分裂の前期（ディプロテ］，

おけるフラグメンテーションの出現に関連があることが背景．そこで，卵における TERT タン
報告されている［１０］パクの発現，テロメラーゼ活性，テロメア長が，母体加．卵子における

つの加齢―母体加齢と排卵後加齢―

卵の加齢には「母 体 加 齢（maternal aging）」と「排齢および排卵後加齢によりどのように変化するかについて解析した．

卵後の加齢（post ovulatory aging）」がある．いずれの卵の加齢においても，胚発育が悪化し母体の妊孕能は低．酸化ストレスとミトコンドリア機能低下

下する．母体加齢は母体年齢の加齢に伴うものと定義さ体細胞において加齢は酸化ストレスを増大させる重要

れ，「reproductive aging」や「排卵前の加齢」と言われなリスク因子であり，卵巣の加齢においても酸化ストレることもある．一方，排卵後加齢は排卵後の卵が受精せスの関与が想定されている．活性酸素種（Reactive Oxy-

ずに卵管内（in vivo），または体外（in vitro）で一定

gen Species : ROS）の多くがミトコンドリアで産生さ時間経過した状態と定義され［］，排卵後一定期間経れ，細胞損傷やアポトーシスに関与する［１１］だけでな

過すると受精率および妊娠率が急激に低下することが知く，ミトコンドリア・ゲノムを損傷しミトコンドリア機．臨床上，前者は人工授精が遅れた場られている［４―６］能を低下させ，さらに酸化ストレスを増大させ，細胞老合に，後者は体外受精で精子侵入が認められず遅れて顕．また，マウス
化を引き起こすと考えられている［１２］

微受精をする場合などに考えねばならない問題である．

の卵を過酸化水素に暴露して人為的に酸化ストレスを加連絡先：浜谷敏生，慶應義塾大学医学部産婦人科学教室〒１６０―００１６ 東京都新宿区信濃町３５
TEL ：０３―５３６３―３８１９
FAX：０３―３２２６―１６６７
E-mail：toshiohamatani@z３.keio.jp

えると，その後の胚発生が障害されたとする報告［１３］や，アポトーシスの指標となる胚のフラグメンテーショ
ンが増加する［１４］という報告もあり，卵の加齢にミトコンドリア機能低下や酸化ストレスが重要な働きをして日本生殖内分泌学会雑誌（2013）18 : 5-10

5

山田（福永） 朝子

他

いることが示唆される．われわれが以前に行った若齢卵成した cDNA は SYBR Green Realtime PCR Masterと母体加齢卵を比較したマイクロアレイの解析の結果にMix（Toyobo）および ABI Prism ７７００ Sequence Detec-

おいても，母体加齢卵ではミトコンドリア機能および酸

tion System（Applied BioSystems）に供し，qPCR によ

化ストレス，DNA メチル化，染色体の安定性に関わる

る Tert 遺伝子の発現解析を行った．Gapdh を内部コン

遺伝子群の発現が低下していた［トロールとして対照に用いた．

］．

一方，排卵後の卵の加齢では，酸化ストレスの増加によるミトコンドリア機能障害と細胞内 Ca２＋制御機構の．免疫組織染色による Tert 遺伝子のタンパクレベル

変化が胚発育悪化の重要な要因となっている可能性が示
唆されている．Takahashi らは，新鮮卵と比較して，in

の発現解析
検体を

％パラホル ム ア ル デ ヒ ド に て 固 定 し た 後

vivo・in vitro 排卵後加齢卵はいずれにおいても，酸化５％ Triton に調整したリン酸緩衝整理食塩水（PBS）に，０．

ストレスの増加，ミトコンドリアの機能低下および ATPにて透過処置を行い，産生の低下が認められ，これらの卵を受精させると Caてブロッキングを行った後，抗 TERT 抗体にて抗原標

オシレーション波形が変化しており，胚発育が悪化する識した．さらに蛍光色素標識した．そこで母体加齢卵および排と述べている［３，１５，１６］を可視化した．核は４’,６-diamidino-２-phenylindole（DAPI）

卵後加齢卵における酸化ストレス（ROS 濃度）についにて染色し，共焦点レーザー顕微鏡にて観察した．

％ウシ胎児血清を含む PBS に次抗体を用い，抗原て検討を行った．
．テロメラーゼ活性の解析

材料・方法

Telomerase PCR ELISA kit（Roche Diagnostics）を用いて，PCR-based telomeric repeat amplification proto-．若齢マウス未受精卵および母体加齢卵の採取と排卵
後加齢卵の作成〜

col（TRAP）assay により in vitro でテロメア伸長反応を行い，ELISA 法にてテロメラーゼ酵素活性を測定し週齢の C５７BL/６J 系統のマウス（若齢マウス）

た．

および４２〜４８週齢のマウス（生殖年齢末期，母体加齢マウス）に妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG ; pregnant．酸化ストレスの解析

mare serum gonadotropin）を５ IU 腹腔内投与し，その若齢卵，母体加齢卵および排卵後加齢卵における酸化４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG ; human

ストレスを測定するために，細胞透過性があり，活性酸

chorionic gonadotropin）を５ IU 腹腔内投与して過排卵素によって酸化されることで蛍光色素を発する dihy-

刺激を行った．未受精卵の採取は標準プロトコールにdroethidium（HEt ）を５０ μM 添加した M２培地（ Em-

従った［１７］．hCG 投与１４時間後（排卵直後）に採卵し，bryoMax M２ Medium Powdered with phenol red ;得られた卵をそれぞれ若齢卵および母体加齢卵とした．

Millipore）中 で３７℃，

また，排卵後加齢卵については，

点レーザー顕微鏡にて観察した．

〜

週齢の若齢マウ％ CO２で１５分 間 培 養 し，共 焦スに過排卵刺激を行い，hCG 投与して１４時間後に採卵したのちに，３７℃，％ CO２で時間培養した卵を invitro 排卵後加齢卵とし，hCG 投与後２３時間後（排卵後時間）に採卵した卵を in vivo 排卵後加齢卵とした．

．テロメア長の解析
２０〜４０個のマウス卵をつのサンプルとして QIAmp

DNA micro Kit（Qiagen）を用いてゲノム DNA を抽出し，qPCR を用いてテロメア長を計測した．内部コント．定 量 的 リ ア ル タ イ ム PCR に よ る Tert 遺 伝 子 のmRNA レベルの発現解析

ロールとしてシングルコピー遺伝子である３６B４を対照に用いた．

Tert に対して定量的リアルタイム PCR（quantative re-さらに個々の卵子におけるテロメア長を計測するた

verse transcription-polymerase chain reaction ; qPCR）

め，QFISH（Quantitative Fluorescent in situ hybridiza-により mRNA レベルでの発現解析を行った．別々のマtion）法を行った．卵の染色体をスライドグラス上に展

ウスより採卵したうち形態良好な卵１０個を選んでつの開し，Peptide Nucleic Acid（PNA）probe（Telomere

つ以上のプールを作成しPNA FISH kit/Cy３, DAKO, Glostrup, Denmark）をテ

た．PicoPure RNA Isolation Kit（Arcturus）を用いて

ロメア領域にハイブリダイズし，共焦点レーザー顕微鏡

サンプルより mRNA を抽出し，cDNA を合成した．合にて観察した．

サンプルとし，各群について

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013

加齢卵におけるテロメア短縮機構

表結テロメラーゼの発現・活性およびテロメア長の解析結果
Tert RNATERT タンパクテロメラーゼ活性（qRTPCR）（免疫染色）（TRAP）（qPCR）（qFISH）
↓

テロメア長

母体加齢卵

↓

↓

↓

↓

in vivo 排卵後加齢卵

↓

→

→

→

→

in vitro 排卵後加齢卵

↓

→

→

→

→

↓
→

有意に低下
有意な変化なし

果（表 ）． Tert の発現およびテロメラーゼ活性の比較
若齢マウス卵と母体加齢卵および排卵後加齢卵における Tert の mRNA 発現量を qPCR にて観察した．母体加
５２±０．
１２）は若齢
齢卵における Tert の mRNA 発現（０．
マウス卵（１．
００±０．
１３）に比較して有意に減少し（P ＜０．
０５ ），マイクロアレイの結果とほぼ一致した．また，排卵後加 齢 卵 に お け る Tert の mRNA 発 現 は，in vivo
（０．
２８±０．
２３）お よ び in vitro（０．
２２±０．
０５）で 新 鮮 卵０５ ）．
と比較して有意に減少した（P ＜０．
次に抗 TERT 抗体を用いた免疫染色を行い，TERT タ
ンパクの発現レベルおよび局在を観察した．TERT タン
パクは，若齢卵では細胞膜近傍に強い局在を認めたが，母体加齢卵では TERT タンパクの発現自体が著明に低下し，斑状に欠損するなどの不規則なパターンを示した．

図

一方で排卵後加齢卵では，若齢卵と比較して明らかな蛍光強度の減少は観察されなかったが，母体加齢卵と同様に斑状欠損が認められた（図）．

平均テロメア長を計測した．結果，加齢マウス卵のテロ

TRAP 法により，テロメラーゼ酵素活性を測定した．

５２±０．
１７）は若齢卵（１．
００±０．
２８）に比べてメア長（０．

００±０．
２４）と比較しテロメラーゼ酵素活性は若齢卵（１．

有意に短縮していた（P ＜０．
０５ ）．一方排卵後加齢卵の４５±０．
０９）では有意に低下した（P ＜て母体加齢卵（０．

１３±０．
４６）および in vitro（１．
０６
テロメア長は in vivo（１．

０．
０５ ）．一方で，排卵後加齢卵（in vivo＝０．
５７±０．
０４，

±０．
３７）であり，若齢卵に比較して有意な変化を認めな

７７±０．
２３）では有意なテロメラーゼ酵素活
in vitro＝０．

かった．

性低下はみられなかった（N.S．
）．

さらに，個々のレベルで卵子のテロメア長の計測するため，QFISH 法を行った．結果，平均の蛍光強度は若．酸化ストレスの比較

４３３）と比較して母体加齢卵（７，５７９）で減少
齢卵（１４，

若齢卵，母体加齢卵，排卵後加齢卵の酸化ストレスを傾 向 を 示 し て お り，一 方 で 排 卵 後 加 齢 卵（in vivo＝測定した．結果，若齢卵では，蛍光色素を示さなかった

１２，
４０７，in vitro＝１１，７９１）では若齢卵と比較してほぼ４±２．
４％（２１/６７），排（０/４８）が，母 体 加 齢 卵 で は３０．

同様の蛍光強度を示した．

１±１９．
０％（４９/５９），
卵後加齢卵では in vivo 加齢卵で８３．
７±７．
５％（５７/５９）と有意に増加
in vitro 加齢卵では９５．

考

察

０５ ）．
した（P ＜０．
．テロメア長短縮と卵の質的な低下
加齢によるテロメア長の短縮が卵子の質の低下に寄与．テロメア長の比較
サンプルとしてゲノム DNA

するかどうかは，未だ議論があるところである．これまサンプルについて qPCR を用いてで極体生検および分割期胚の割球生検の結果，異数性の２０〜４０個のマウス卵をを抽出し，それぞれ

REVIEW7

山田（福永） 朝子

他

あるヒト卵ではテロメア長が短縮しているという報告［１８］や，フラグメンテーションを示す初期胚でテロメ
ア長が短縮していた［１０］という報告があるものの，テロメア長が短い卵子は発生能に劣るという直接的なエビデンスは未だ提示されていない．今回のわれわれの結果
から，母体加齢卵では若齢卵に比較してテロメア長が短縮することが明らかとなった．この結果は母体加齢により卵でのテロメア長短縮が引き起こされ，結果的に減数分裂過程における染色体の不分離につながり，ひいては妊孕性の低下につながる可能性が示唆される．一方で，排卵後加齢卵においてはテロメア長の短縮は認められなかった．このことから，排卵後加齢卵ではテロメア長によらない別のメカニズムで質的な低下が起こっていることが示唆された．
図．テロメラーゼ酵素活性の低下
加齢による卵子異数性染色体異常率の上昇を説明する仮説として，two hit theory が知られている．哺乳類の胎児期のすべての卵母細胞は第減数分裂の前期後半）細胞分裂によるテロメア長の短縮［２１］．

これまで卵の形成過程において，卵母細胞はほとんど分裂しないで第減数分裂前期で停止していると考えら（ディプロテン期）で休止するが，そのディプロテン期れてきた．しかし近年 Oogonial Stem Cell（OSCs）の以前に相同染色体間にキアズマが形成され染色体の組み，出生後あらたに卵原細胞から体存在が報告され［２２］

替えが起こる．胎児期にキアズマの形成不全による染色

細胞分裂により生じる卵の存在の可能性が示唆されてい体の組み替え効率の低下が起こっていてより不分離が起る．この場合は体細胞分裂に依存して母体加齢卵におけきやすい状況が存在する（first hit）
．若齢卵子では染色るテロメア長の短縮が引き起こされると予想される．今体分離機構が十分に機能するが，second hit として加齢後のさらなる報告が待たれるところである．

卵子では第減数分裂中期の段階で染色体分離機構が十）テロメラーゼ活性の低下

分に働かず，微小管のキネトコアの結合不全や張力の不テロメラーゼ欠損マウスでは世代を経るごとに，卵の均衡などを引き起こし染色体不分離を招くとされている

テロメア長が wild type に比較して短縮する［２３］こと．テロメラーゼは，生殖細胞においてテロメア長の［１９］が報告されており，テロメラーゼ活性の低下がテロメア伸張に関わるのみならず減数分裂時の染色体の組み替え

長の短縮に寄与していることが考えられた．さらに，テや染色体接合維持，分離機構に重要な役割を果たしていロメラーゼ欠損マウスでは，wild type に比較して，卵，第ることが知られており［２０］減数分裂前期で長く，紡錘体ののテロメア長短縮を認めるのみならず［２４］

停止していることに加えて排卵シグナルを受けて減数分

形態異常が多く観察される［２３］ことも報告されており，裂を再開した際にテロメラーゼによる防御機構が十分働

加齢に伴う染色体異常の増加と関与していることが示唆

かず，母体加齢卵における染色体の異数性をはじめとしされた．

たさらなる質的な低下を招いているのかもしれない．一）活性酸素

方排卵後加齢卵子は第体細胞においては，活性酸素による直接的な DNA 損

減数分裂をすでに終了して第減数分裂中期の状態で加齢が進んでおり，この間テロメ傷によって，テロメア長が短縮することがこれまでに報

ラーゼ酵素活性に有意な変化を認めなかったことから，．卵巣では，抗酸化物質を摂取し続告されている［２５］

テロメア長や染色体不分離などとは異なるメカニズムでけたマウスでは，摂取しなかったマウスに比較して卵巣卵の発生能低下が起こっている可能性がある．

のテロメラーゼ活性が高く，また卵巣のテロメア長も長かった［２６］という報告がある．また，ミトコンドリア．テロメア短縮のメカニズムの機能を低下させることで酸化ストレスを与えられたマ

母体加齢卵におけるテロメア長短縮のメカニズムは次

ウスの胚は，フラグメンテーションが多く，テロメア長の種類が考えられる．

8

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013も短縮した［２７］と報告されている．しかしながら，今加齢卵におけるテロメア短縮機構

回われわれの研究結果では，酸化ストレスが多かった排卵後加齢卵のテロメア長は短縮していなかったことから，短期間の酸化ストレスのみではテロメア長の短縮メ
カニズムを説明できない．一方，母体加齢マウスでは排卵にいたるまでの期間が長くなり，加齢によって卵におけるテロメラーゼ活性が低下し，加えて酸化ストレスの
長期間の蓄積も加わることで，テロメアを維持できずに短縮する可能性が考えられた（図

）
．

おわりに
卵形成過程では卵母細胞はほとんど分裂をしないにもかかわらず，卵は母体加齢によってテロメア長が短くなることが明らかとなった．母体加齢による Tert の発現およびテロメラーゼ活性の低下がテロメア長の短縮に寄与することで，卵の質的低下に関与している可能性が示唆された．一方で排卵後加齢卵ではテロメア長は変わらず，別の機序による質的低下が起こっていることが考え
られた．

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