TR-NRS-010

SPEEDIA

2023/05/19

SPEEDIA によるジチオカルバメート系農薬の分析Ⓡ【はじめに】【試薬】

ジチオカルバメート系農薬は、野菜や果樹用の殺菌剤として広く使用されています。この農薬は金属イオンが結合した錯体構造を有しており、水や有機溶媒に溶けにくく、直接分析する事は困難とされています。厚生労働省から通知されている個別試験法 1）では、アルカリ性
EDTA 溶液でジチオカルバメート系農薬を水溶性のナトリウム塩にした後、ヨウ化メチルで誘導体化し、その生成した誘導体化物を測定する方法が示されています。
また、ホクレン農業協同組合連合会からジチオカルバ
メート系農薬迅速分析法 2）3）4）5）6）（以下迅速分析法）が報告されています。
これは QuEChERS 法を基に溶媒転溶を行う事を特徴としたスクリーニングに有用な迅速試
験法です。
このアプリケーションでは抽出は迅速分析法を採用し、膜ろ過法 (SPEEDIA 法)で精製する事によって、マトリックスを効率的に除去し、簡易・迅速に食品中のジチオカ
ルバメート系農薬が分析可能な方法を提案します。
今回は、りんご、みかん、いちごにおける添加回収試験を n= 5 で実施し、真度（回収率）と併行精度について評価を行いました。

農薬標準品
チラム
システイン-EDTA 溶液で 200 ppm に調製
マンネブ
システイン-EDTA 溶液で 200 ppm に調製
プロピネブ システイン-EDTA 溶液で 20 ppm に調製
試薬
アセトニトリル (残留農薬・PCB 試験用)
塩化ナトリウム
無水硫酸マグネシウム
L-システイン塩酸塩一水和物※3エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物
水酸化ナトリウム
ヨウ化メチル塩酸【試験内容】
試料： りんご、いちご、みかん (システインEDTA 溶液※1 を試料量と同量加え磨砕均一化したもの)
対象農薬 ： チラム【測定装置】
LC-MS/MS 測定条件
LC-MS/MS
分析カラム
オーブン温度
注入量
溶離液
流速移動相条件（測定物質は誘導体化物であるジメチルジチ
オカルバミン酸メチル（以下 DMDC））

マンネブ（測定物質は誘導体化物であるエチレンビス
ジチオカルバミン酸ジメチル（以下 EBDC））

プロピネブ（測定物質は誘導体化物であるプロピレンビ
スジチオカルバミン酸ジメチル（以下 PBDC））

前処理法 ： 抽出 迅速分析法に準拠（P.2 参照）
精製 膜ろ過法 (SPEEDIA 法)
併行試験数： n = 5
添加濃度 ： 0.01 ppm
検量線※2 ： 6 点 絶対検量線
0.25、1.25、2.5、12.5、25、40 ppb

イオン化法
スプレー電圧測定モード

LC : Vanquish (Thermo Fisher)
MS : TSQ Quantis (Thermo Fisher)
Cadenza CD-C18 長さ 150 mm、
内径 2 mm、粒子径 3 μm (Imtakt)
40 ℃
みかん 1 μL
りんご、いちご 2 μL
A 液 5 mM 酢酸アンモニウム水溶液
B 液 メタノール0.25 mL/min (0～23 min、34～35 min)
0.30 mL/min (23 min～34 min)B 液 2% (0.1 min) →5 min→50%→15 min→98% (6 min) →0.1 min→2% (6.9 min)
H-ESI (Positive)
1000 V (Positive)
Timed-SRM モード【結果】
りんご、いちご、みかんを用いてチラム、マンネブ、プロピネブの添加回収試験を行いました。
妥当性試験のガイドライン 7）の目標値である『真度：70～120%、併行精度（RSD）：<25%』を全ての作物と農薬の組み合わせで満たしており、良好な結果が得られました（表 1）。
精製工程は SPEEDIA の膜ろ過 STEP のみであり、短時間での前処理が可能である事が示されました。
※2 検量線は蒸留水およびシステイン-EDTA 溶液各 10 g を50 mL 遠沈管に秤量し、そこへ農薬標準品を 1000 ng 添
加した溶液を実試料と同様に操作し、得られた抽出液を適宜希釈して調製した。
※3 ジチオカルバメート系農薬の酸化を防ぐため添加する。

※1 L-システイン塩酸塩一水和物 50 g とエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物 50 g を約 800 mL の水に溶かし、12 mol/L 水酸化ナトリウム溶液で pH 9.6～10.0に調整した後、水を加えて 1000 mL に調製した。

-1-

TR-NRS-010【前処理フロー】※操作方法の詳細は弊社の HP にて動画を掲載しておりますので以下のリンクからご覧ください。

http://www.miuraz.co.jp/e_science/products/speedia.html
抽出20 g 秤量（試料 10 g 相当）+ 農薬標準液添加
6 mol/L 塩酸を pH 6.5 付近になるよう加え混和（今回の pH 実測値 りんご pH 6.9、みかん pH 6.7、いちご pH6.9）ヨウ化メチル 60 μL を加え混和
振とう 10 分間+ アセトニトリル 10 mL
振とう 5 分間+ 塩化ナトリウム 2 g+ 無水硫酸マグネシウム 4 g
手で激しく振とう 1 分間
遠心分離 (2,330×g、10 分間)

精製

前処理時間：30 分/20 検体

膜ろ過カートリッジに水 0.8 mL を添加
STEP
1

膜ろ過カートリッジに抽出液 1.0 mL を添加し混合
遠心分離 (1,490×g、10 分間)
ろ過液 0.45 mL をバイアルに分取
アセトニトリル 0.55 mL 添加し 1 mL に定容
LC-MS/MS 測定(最終試料濃度 0.25 g/mL 相当、農薬濃度 2.5 ppb)
誘導体化後、-

S

誘導体化後、

Mn

DMDC＆EBDC として-

ニッケルビス--CH2NH-C-S－
MnxZnyCH2NH-C-S－ x--

2SS

マンゼブ

SSCH2NH-C-S－Zn－S-C-N(CH3)2CH2NH-C-S－Zn－S-C-N(CH3)2SS-

フェルバム

S
(CH3)2N-C-S－Ni

測定する農薬マンネブ--S--

CH2NH-C-S
CH2NH-C-S

S(CH3)2N-C-S－Fe
3-

プロピネブ

ジネブ

-

チラム--Zn

S

S
S(CH3)2N-C-S－ S-C-N(CH3)2-S
S
CH3－S-C-NHCH2-CH-HN-C-S －Zn n

CH2NH-C-S
CH2NH-C-S-

ジラム

PBDC として測定する農薬S-(CH3)2N-C-S－Zn
2

EBDC として測定する農薬--S-

DMDC として測定する農薬

誘導体化後、-誘導体化後、ポリカーバメート

この部分がアルカリ溶液中で EDTA によって Na 塩となり、その後ヨウ化メチルによって、メチル基(-CH3)に変換される。

-2-TR-NRS-010【回収試験結果】
表１ 各作物における農薬添加回収試験結果 平均回収率と RSD (n = 5)

化合物名
DMDC
EBDC
PBDC

りんご
回収率
RSD
(%)
(%)

9995894.26.62.3

みかん
回収率
RSD
(%)
(%)

91
76
72

2.62.01.0

いちご
回収率
RSD
(%)
(%)

9981932.31.62.5【補足データ】
メチル誘導体化時（塩酸添加後）の pH の違いによる誘導体化効率を検討し、その結果を図 1 に示しました。塩酸添加後 pH 6.3 であったサンプルのピーク面積を 100%として、各化合物の割合を算出しました。
DMDC、EBDC、PBDC ともに pH 8 以上になると誘導体化効率が大きく低下しました。また EBDC、PBDC は pH 3程度になると大きく低下し始め、アルカリ側に比べると酸性側の方が影響は少なく、なだらかな曲線になりました。
一方で DMDC は pH 5 程度からすでに誘導体化効率が著しく低下し始めました。そのため誘導体化後 DMDC として測定するチラム、ジラム、ニッケルビス、フェルバムについてはメチル化時の pH 調整が特に重要です。
安定した誘導体化を行うため、pH 6.5 付近（pH 5.5～7.5）となるよう塩酸添加量を調整してください。

図 1 塩酸添加後の pH の違いによるピーク面積の割合【参考文献】
1) 厚生労働省：食品に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法 第 3 章 -個別試
験法-（通知試験法）、ジチオカルバメート試験法（農作物及び畜水産物）
2) 石渡智、関口博史：農作物中ジチオカーバメート系農薬の迅速分析法の検討、第 110 回日本食品衛生学会、講演要旨集、P.63(2015)3) 石渡智、関口博史：農作物中ジチオカーバメート系農薬の迅速分析法の検討（第二報）、第 111 回日本食品衛生学会、講演要旨集、P.63(2016)4) S.Ishiwata,S.Imai：Simplified Method for the Determination of Dithiocarbamates in Agricultural Products by LCMS/MS,12th European Pesticide Residue Workshop, Programme & Book of Abstracts, P.130-131(2018)5) 安藤孝、小西賢治、市来弥生、佐々野僚一、今井沙紀、杉立久仁代、穴沢秀峰、坂真智子、関口博史、石渡智：ジチオカルバメート迅速スクリーニング法の開発、第 41 回農薬残留分析研究会、講演要旨集、P.221-226(2018)6) S.Ishiwata：Rapid analysis method for determination of dithiocarbamate fungicides in agricultural products via liquid
chromatography-tandem mass spectrometry, The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies,
Abstract ID 3415135(2021)
7) 食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性ガイドライン、平成 22 年 12 月 24 日 食安発 1224 第 1 号-3-