No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 6

私 にも
！
できた

ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

P C R 実 戦 技 術 編（3）本シリーズは、市販のノウハウ本や実施例集ではカバーできなかったようなライフサイエンス実験のコ
ツなどについて、弊社研究員の実験ノートなども参考に、生の事例を交えながら紹介させていただいています。前々号から、最もリクエストの多かったPCR関連技術を更に深くご紹介する目的で、「PCR実戦技術編」をお届けしています。
前号では、Sリーダーから難問が出題され、その問題をめぐって、A子さんとライバルのN代さんの間でバトルの予感が漂っていましたが…。
皆さんも、是非、前号で2人の考えた解答を確認してから、本号を読み進めてください。

題
の課 ト
号
ス
前
ジェ
イ
ダ

●課題：次に示す発現ベクターのSD（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンの間にある余分な塩基を、なるべく簡単な方法を用いて取り除き、連結してください。

〈条件〉
この図に示した¡SD配列と開始コドン（ATG）の間の塩基数を5〜6塩基にすること。 ¡本プラスミド中には、
Eco RV, PstⅠ, SphⅠ, Bam HⅠの配列は¡使用できる方法は以下のとおり。
ここに示したサイト以外は存在しません。
・各制限酵素での切断
・KOD DNA polymerase＊を用いる平滑化
・T4 DNA Ligaseによる結合＊5 →3 DNA polymerase活性と・PCR（任意の場所にプライマーを設計可能）
3 →5 Exonuclease活性を有しています。
・T4 Polynucleaotide Kinaseを用いるDNAのリン酸化
図1

図2

！
注意！

A子さんの解答

上の二人の解答には間違いが含まれている可能性があります。

図3

発現プラスミドの部分配列

N代さんの解答

今までの登場人物

本シリーズは、弊社ウェブサイト
（http://www.toyobo.co.jp/bio）の「実験お助けコーナー」でご覧いただけます。

N代さん
A子さん
Sリーダー
冷静沈着なライフ 今年入社4年目 今年入社3年目になる研究員サイエンスグルー になる研究員（A子さんのライバル）
プのリーダー

S本さん
アシスタント

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

1No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 7

1

ポリメラーゼの進む道

様々な実験に用いられるDNAポリメラーゼですが、意外とその性質をよく理解せずに使われている方もいらっしゃるのではないでしょうか？ 今回は、DNAポリメラーゼを中心に、その原理と応用について解説いたします。

1-1 DNA配列の末端によく付いている5'や3'って何の数字？
ポリメラーゼ関連の説明を読んでいると5'や3'などという数字が頻繁にでてきます。この数字に何の意味があるのかと思われた方も多いのではないでしょうか？
この数字は主に核酸の方向性を示すために付けられています。
核酸は、塩基、糖（[デオキシ]リボース）、及びリン酸が長く繋がった構造を持ちます。その中で、ヌクレオチド間の結合の方向性に大きく関与しているのは、（デオキシ）リボースであり、その結合を仲介しているのがリン酸基です。RNAに用いられているリボースを例に挙げると、
この糖は5単糖（ペントース）であり、それら5DNAつの炭素には1'から5'という番号（塩基にも番号が付いているため、区別するために「'」をつけて表現します）が振られています。
リボースは、その2'、3'、5'の位置にOH基を有していると表現されます。DNAに用いられているデオキシリボースでは、2'のOHがH（デ[無い]オキシ[酸素]）になっています。どちらの糖においても3'と5'のOH基が連結に用いられています。
この連結反応を触媒する酵素がDNAポリメラーゼです。図4

Hに、DNAの連結反応を示します。基本的にこの反応は、DNAの3'末端に存在するOH基の酸素の電子が、dNTPの5'OHに結合したα位のリン酸基を攻撃する、いわゆる「求核反応」です。その

図4 DNAポリメラーゼの触媒する反応：求核反応

反応によって、DNAは5'から3'末端側に向かって伸長します。この反応は原理上、逆へは決して進行することはありません。

1-2 サンガー法（ジデオキシ法）を用いるシーケンス法はポリメラーゼの性質を利用している
dNTPの3'のOHがHになったddNTP（ジデオキシNTP）は、
多くのDNAポリメラーゼによって通常のdNTPと区別無くDNAの3'末端に取り込まれます。しかし、このddNTPが取り込まれたTemplate DNA

DNAの3'末端はOH基を持たないため、伸長反応はこの段階でストップしてしまいます。よって古くから、ddNTPはDNAポリメ
ラーゼの阻害剤として知られていました。
この阻害剤の利用方法をいち早く見出したのが、Frederic
Sangerでした。DNAポリメラーゼの反応溶液に微量のddNTPを添加すると、ddNTPはランダムに取り込まれ、様々な所で伸長の止まった産物が生じます。この反応をそれぞれの塩基種について行い、1baseの違いが見分けられる電気泳動法を用いて分離し、ラジオアイソトープなど指標にして検出することにより、DNA配列を知ることができます（図5）。これがいわゆるサンガー法（ジデオキシ法）1)の原理であり、この方法は現在一般的に用いられているシーケンサーにも使われています。
現在のシーケンス解析では、4種類の蛍光色素で標識された
ddNTPを用いて一度に反応させることができるようになったた

図5 サンガー法によるシーケンスの原理

め、以前のように巨大なゲル板を作る必要もなくなったため、と

論文1)が発表された1977年当時、既に60歳に近かったことにても便利になりました。また自動で分析した結果がコンピュータ
ーに出力されるため、全くこの原理を意識せずにシーケンス解析

なります。ちなみに、この論文の筆頭著者はSanger博士です。
見習いたいものです。

を行うことが可能です。皆さんはいかがでしょうか？
ところで、Sanger博士は「核酸の塩基配列の決定」に関して、

1) F. Sanger, S. Nicklen and A.R. Coulson, DNA

1980年に2度目のノーベル化学賞を受賞しています（1度目はsequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.

「インスリンの構造研究（ ペプチドの配列決定 ）」1958年 ）。
Sanger博士は1918年生まれですので、有名なシーケンス法のNatl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977)

2 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
できた

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 8

1-3 DNAを削る活性いろいろ
通常DNAポリメラーゼには、DNAを末端から削る活性を有しているものが多く存在します。この削る活性（エキソヌクレアー

た部分は、ポリメラーゼ活性によって埋めることができませんので、細かい修復には使えない活性であるといえます。

ゼ活性）は5'→3'の活性と3'→5'の活性の2種類が知られています。これらの活性のうち、5'→3'活性はDNA複製時のラギング鎖

5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有するPCR酵素としてはT a q D N A p o l y m e r a s e な ど が あ りま す 。T a q D N Aの合成に用いられた岡崎フラグメントなどのRNAプライマーを

polymeraseのこの活性は、リアルタイムPCRで用いられる

分解する活性として、3'→5'活性はDNA合成時の塩基の取り込
みエラーの修復に関わる活性として進化してきたものと考えられ

TaqMan®プローブを分解する用途などに応用されています。一方、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するPCR酵素としてはています。
これらの原理はDNA合成の機構（図4）を考えると良く理解で

KOD DNA polymeraseなどがあり、この活性のおかげでこの酵素はTaqの数十倍という高い正確性を発揮することが可能にきます。例えば、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性によって削られなっています。

1-4 制限酵素消化末端の平滑化
3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて制限酵素切断末端の平滑化が可能です。この用途には従ないかなどと思いがちですので、気をつけてください。
また、
制限酵素処理した5'末端にはリン酸基が残っていますが、

来、T4 DNA polymeraseを用いることが多かったのですが、KOD DNA polymeraseも強い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性

時々、このリン酸基がポリメラーゼを用いる平滑化によってどのようになるのか心配される方がいるようです。図6を見ていたを有しており、効率よくDNA末端を平滑化することができるた
め、最近頻繁に用いられるようになりました。

だくと一目瞭然ですが、5'のリン酸基は全く影響を受けませんので、ご安心ください。

平滑化には、図6に示すようにポリメラーゼ活性と3'→5'エキ
ソヌクレアーゼ活性が関与します。しかしここで、「では、平滑化された後の末端は3'→5'エキソヌクレアーゼ活性で削られないの？」という疑問が湧き上がってくるかも知れません。確かにその通りで、平滑化された後も多少ですが末端は削られているようです。ただし、dNTPが存在する限りにおいてポリメラーゼ活性と平衡状態が成立しているため、それほど大きく削られることはなく、ほとんどの末端は平均して平滑化されていると考えられます。
逆に、dNTPが存在しない場合は、大きく末端が削られるということになりますので注意が必要です。ですから、T4やKOD
DNA polymeraseを用いて末端平滑化を行う場合、dNTPsを最初に入れることを忘れないようにしなくてはなりません。時々、3'突出部分を削るだけなのでdNTPは入れなくても良いのでは

図6 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼによる末端平滑化の原理

1-5 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性の無いポリメラーゼでは？
1-4に示したように、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有する
DNAポリメラーゼによってDNA末端を平滑化することができ

ノイズの原因となるため、一般的にこの5'→3'エキソヌクレアー
ゼ活性を欠失させた酵素が用いられているようです。

ます。
それなら、5'突出末端を埋めるだけであれば、「Taq DNA
polymeraseなどの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性の無い酵素も使用できるのでは？」と思われる方もいらっしゃるかも知れま
せん。しかし、そううまくはいきません。多くのDNAポリメラーゼ
はターミナルトランスフェラーゼ活性を有しているため、3'末端に1塩基（多くの場合アデニン）の付加が起こってしまいます。この活性を逆手に取ったのが、いわゆるTAクローニング法です。
このターミナルトランスフェラーゼ活性は、当然、KOD DNA
polymeraseなどにも存在するのですが、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性によって平滑化されるため、見かけ上は、この活性が無いようにみえます。
さらに、Taqなどの酵素は5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有していますが、この活性はそれほど高くないため、大きな問題とはならないようです。しかし、シーケンス解析などを行う際には、

図7 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を示さないポリメラーゼによる末端平滑化
の原理

私 にも
！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

3No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 92

実戦−その3−

A子さんとN代さんはT社バイオ研究所のライフサイエンス試薬開発グルー
プの研究員です。先ほどからなにやら、Sリーダーの前で火花を散らしているようです。実は、つい先ほど2人に問題が出され、その解答がSリーダーに提出されたところなのです（表紙参照）。

2-1 A子さんの落とし穴
2人の解答を見終わったSリーダーは、まずA子さんに向かって、DNA鎖の伸長反応を化学式で書いてみるよう指示しました。最初から自信がなかったのかA子さんはビクビクしているようです。そして、反応式を描いていたA
子さんは自分のミスにハタと気づきました（図4参照）。DNA鎖が3'側から5'側へ向かって伸長することはまずありません。よって、A子さんのような実験（図2）を行うと、逆に頭の部分が削られてしまうことになります。
A子さんは、いつもDNAの方向性を考えると頭が混乱してしまいます。しかし、今回のように化学反応を頭の中で考えることで方向性について理解しやすくなることに気づきました。
隣で、N代さんは涼しい顔でやり取りを見ています。

2-2 N代さんの落とし穴
次はN代さんの番です。N代さんの平滑化の考え方には特に問題は無いようです（図3）。
しかし、Sリーダーからは、「この前の失敗の反省が生かされていなのでは？」という言葉が投げかけられました。前回、N代さん
は、考え方は正しかったのですが、クローニングしたORF中に致命的な制限酵素サイトが含まれていたのでした。クローニングされた後の断片の配列を確認しなかったN代さんのケアレスミス
でした。
その時、
「もしかして、まさか！…」という思いがN代さんの脳裏をかすめました。そして、恐る恐る出来上がった配列を確認してみました。
そして気づきました。あろうことか、SD配列の直下にライゲー
ションによって予期せぬ開始コドン(ATG)ができているではありませんか！ 確かに、その下流には今回のORFに由来する開始コ

図8 N代さんの方法でできるクローン

ドンはありますが、SD配列直下の開始コドンの方が優先的に用いられ、フレームのずれたタンパク質が主にできてしまうことになります（図8）。

ワンポイントアドバイス ①
今回の例では、思わぬところに開始コドンが生じてしまうというミスでしたが、その他にも気づいてみたら思わぬサイトが生じてしまっていたという話もよく聞きます。以下に、ありがちなミスを列挙します。

①は今回のN代さんの失敗、②はC末端にタグなどを付加した場合に起きがちな失敗、③は様々な予期せぬ機能を持ったサイトができてしまうという失敗です。この③は、タンパク質にリンカーを介してタグ配列を付加するような場合には特に注意が必要です。システインサイトができて、発現させたタンパク質が2量体化したという笑い話などもあるようですので、ご注意を！

4 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
できた

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 10

2-3 種明かしてプラスミド全体を増幅します。その後、増幅産物をリン酸化しさて、今回の解析例ですが、どのようなものだったのでしょう

た後に（最初にプライマーをリン酸化しておくことも可能）、ライか？ 以下、Sリーダーの示した一例です。

ゲーション反応（ 環状化 ）を行い、その環状化したプラスミド

最も簡単な方法の一つはインバースPCRを用いる方法です。

DNAを用いて大腸菌を形質転換します。この方法を用いると、インバースPCRとは本来図9に示すように、部分配列しか分かっ

比較的簡単に欠失変異体を作製することができます。ポイントは、ていないようなDNAの周辺配列を解析する方法の一つです。具

高正確性PCR酵素を用いることです。でないと、当然予期せぬ

体的には、環状DNAの一領域から外に向かってプライマーを設

変異（PCRエラー）が導入されますし、増幅末端にAが付加され計し、環状化したDNA全体を増幅するのが特徴です。そのPCRるため、環状化させることができません。

産物を解析することで遺伝子全体の配列が分かるという仕組み

ところで、インバースPCRはかなり単純な方法なのですが、様々な試薬を用いる必要があるため、弊社ではインバースPCRです。

法 を 用 い る 部 位 特 異 的 変 異 導 入 キット『 K O D - P l u s Mutagenesis Kit (Code No. SMK-101)』を開発しました。
このキットには、図10にはない、鋳型プラスミドを消去する仕組
みなども組み込まれているため、簡便に変異導入実験を行うことができます。この方法については、次号で詳しく説明する予定ですが、この方法は配列置換や配列挿入などにおいても力を発揮する方法です。
図11にインバースPCR法を用いる今回の解答例を示します。
方法は、欠損させたい領域を挟んで背中合わせにプライマーを

図9 インバースPCRによる未知遺伝子の解析

この方法の、環状化DNAから先の工程を応用することによって、変異導入実験を容易に行うことが可能なのです。以下、インバースPCR法を用いるデリーションミュータント（欠失変異体）の作製方法について説明します。
まず、図10に示すように、プラスミド上の欠失させたい配列を挟んで背中合わせにプライマーを設計します。その後、KOD-Plus-(Code No. KOD-201)などの高正確性PCR酵素を用い

図11 インバースPCRを用いる今回の解答例

設計し、図10のように増幅した後、再環状化します。今回の場合、
SD配列と開始コドンの間を5〜6塩基にするということでしたので、図11のPrimer FとRに示すようなプライマーを設計すると良いと考えられます。この場合も、接合部に開始コドンができな
いように気をつけてください。
プライマーの設計法は、通常のPCRプライマーの設計方法に従えば問題ありません。注意点としては、ベクターの大きさによってはPCR効率が低くなってしまうことです。ですから、あまりに
図10 インバースPCR法を用いる欠失変異体の作製も大きなベクターを用いなくてはならないときは、まずは目的遺伝子を小さなベクターにサブクローニングしておいて、変異導入を行った後に、大きなベクターに移し変えるような対策が必要な場合もでてきます。
（a 配列置換と挿入については、次号にてご紹介いたします）

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

5No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 11

KOD FX活 動 報 告 3.

クルードサンプルからのPCR（2）KOD FXは、難しい配列のPCRや、
クルードサンプルからのPCRなどにおいて力を発揮する高成功率PCR酵素です。
先月は、血液を直接サンプルとして用いるPCR【プロトコール＃1】KOD FXの基本反応条件法ご紹介しました。そこで今回は、最近、トランスジ
試薬添加量(μl)終濃度ェニックマウスなどの解析で頻繁に行われるマウス
2×PCR buffer for KOD FX
25
1×テールをサンプルとしたPCRについて検討を行い
10
0.4 mM each
2mM dNTPs
1.5
0.3 μM
10pmol/μl Primer #1
ました。この方法を用いることによって、煩雑な
1.5
0.3 μM
10pmol/μl Primer #2
Genomic DNA : 〜200 ng/50μl
DNAの精製なしで、高効率にマウステールからのPlasmid DNA : 〜50 ng/50μl
X
Template DNA
cDNA: 〜200 ng（RNA相当量）/50 μl
PCRが可能になります。
また今回、増幅産物の制
クルードサンプル : 〜2 μl
限酵素処理についても検討を行いました。
Y
PCR grade water
KOD FX（1.0 U/μl）
Total

1
1.0 U / 50 μl
50（μl）●マウステールの前処理方法
2ステップサイクル

アルカリ溶解法

マウス
テール（約3mm）

マイクロ
チューブへ

1

2

3ステップサイクル

ステップダウンサイクル
50 mM NaOH 180μl添加
Vortexにて良く攪拌3

95℃・10 min.
※プライマーのTm値が73℃未満の場合は、3ステップサイクルで行います。

1M Tris-HCl（pH8.0） 20μl添加
Vortexにて良く攪拌4

遠心（12,000 rpm, 10 min.）【PCR、制限酵素切断条件】
Primer F :5'-CCACAGAATCCAAGTCGGAACTCTTG-3' （26 mer）
Primer R :5'-GTAGCAGTGGTGGTATTATACATGGTG-3'（27 mer）

上清0.5〜2μlをPCR反応液に添加（マウステールは完全には溶解しません）

ターゲット :Mouse membrane glycoprotein（Thy-Ⅰ）gene〈M10246〉（約2.6kb）

5

上記プライマーを用い、2ステップサイクル（伸長時間2.5min、
30サイクル、※熱アルカリ溶液の取り扱いに十分ご注意ください。

サンプル0.5μl使用）
にてPCRを実施しました。
また、増幅された溶液（未精製）10μlに様々な制限酵素を1μl（約10 U）添加し、37℃、1時間の条件で図12 アルカリ溶解法フロー

切断を行いました。

●結果
従来、マウステールを用いる遺伝子解析では、Proteinase K処理、及びエタノール沈殿などを用いて精製したDNAを用いることが多く、サンプルの調製に大変な時間を要していました。しかし、今回の検討によって、KOD FXを用いること
でアルカリ溶解法などの簡便な方法で調製したクルードなサンプルを用いても効率よく増幅できることが示されました。
また、本方法によって増幅したPCR産物は、少なくとも今回試した制限酵素においては精製なしでそのまま制限酵素によって切断可能であることが分かりました。
KOD FXは、夾雑物による阻害に大変強いという特性を有しており、今回の例以外に、植物ライセートや酵母などのサンプルにおいても良好な増幅結果が得られています。
TaqベースPCR酵素

KOD FX
M

A社高効率
PCR酵素

M

M

1

2

3

4

M

PCR産物
M

（n=2）
M: 1kb Ladder Marker

1 μl（約10 U）

Total

11 μl

M: 1kb Ladder Marker

図13 マウステールライセートを用いたPCRの結果

私 にも
！
できた

10 μl

制限酵素

1 : 未消化
2：XhoⅠ
3：Eco RV
4：PstⅠ
5：SacⅠ

2.6 kb6 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ【PCR産物（未精製）の制限酵素処理】

5

B社LongPCR酵素

図14 PCR産物の制限酵素消化結果⇒

37℃、60 min

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 12

2-4 次なるSリーダーからの課題
それにしても、今回の課題も2人にとってかなり勉強になったようです。今まであまり意識せずに行ってきた実験も、今回のことで原理を考えてから実行するようになるはずです。と、そこへSリーダーから次なる課題のメールが届いたようです。

●大腸菌のDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）を発現するベクターがあります。そのDHFRのN末端にタグ配列を付加するにはどのようなプライマーを設計すれば良いですか？
〈条件〉¡インバースPCR法を用いること。
¡タグのアミノ酸配列は以下のとおり。
Leu-Ⅰle-Arg-Arg-Ⅰle（L-Ⅰ-R-R-Ⅰ）

DHFR

タグは開始コドンの隣りに挿入すること。
¡発現は大腸菌で行います。
図15 DHFR発現ベクター

この課題を見て、A子さんは、インバースPCR法の原理を忠実に頭の中で再現しつつ、プライマーを思い浮かべているようです。一方、N代さんは、タグのアミノ酸配列を、真剣に見つめています。
悩んだ結果、A子さんは、図16のようなプライマーを設計しました。タグの部分は、コドン表を眺めつつ適当に対応する配列を入れたようです。一方、N代さんはコドン表と何やらインターネットの画面をにらみながら、タグのアミノ酸配列に相当する部分の配列を念入りに決定しているようです。結局、N代さんは図17のようなプライマーを設計しました。N代さんのプライマーはA子さんのプライマーとは何やら少し異なるコンセプトで設計されているようです。

図16 A子さんの解答

図17 N代さんの解答（ループで示してある部分をプライマー中央に挿入）

2人の解答を見た瞬間、またしてもSリーダーのメガネが突然ぎらりと輝きました。
その横で、アシスタントのS本さんはなにやら胸騒ぎがしています。
「もしかして…また思わぬ罠が仕掛けてあるのではないか？」と。
さて、皆さんならば、どのようなプライマーを設計しますか？
みなさんも2人の解答が正しいかどうかを、吟味してみてくだ

研究所の周りは、既に晩秋かさい。
【注意：2人の解答には間違いが含まれている可能性がら初冬の気配が漂い始めていありますので、上の図を実験の参考にはしないでください。
】

ます。では、次回お会いしましょう。

2人の解答の解説は、次号「PCR実戦技術編（4）」でお届けする予定です。

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

7

No.92.qx 08.11.4 19:03 ページ 13

KOD FXでクルードサンプルを鋳型に用いる
場合、何かコツや注意点はありますか？

インバースPCRを用いる変異導入に向くPCR
酵素はどうようなものですか？

KOD FXは、
クルードサンプルに対し高い耐性を示しま
すが、増幅が見られない場合はサンプル量を少なくする
方向で検討します。また、2ステップサイクルよりも3ステップサイクルの方が安定した結果が得られる場合があります。

この方法に必要なPCR酵素の特性として、①高正確であること、②平滑末端産物を生成すること、及び③高効率であることを挙げることができます。この観点から最も適している酵素として、KOD -Plus-（Code No. KOD201）やKOD -Plus- Ver.2（Code No. KOD-211）
を挙げることができます。
「KOD -Plus- Mutagenesis（Code No. SMK-101）」
は、KOD -Plus-を用いる部位特異的変異導入キットで、変異導入に必要な試薬がすべて添付してあるため、とても簡単に変更導入実験を行うことができます。
また、KOD FX (Code No. KFX-101)もKOD -Plusに比べて正確性は低い（KOD -Plus-及びKOD -PlusVer.2はTaq DNA polymeraseの約80倍、KOD FXは約10倍）ですが、上記すべての条件は満たしていますので、本用途に用いることが可能です。

また、サイクル数は通常30サイクルで十分増幅が得られますが、ターゲット長やサンプルによっては、増幅が低下する場合があります。このような場合には、35〜40サ
イクル程度までサイクル数を増やすことで良好な結果が得られることがあります。
さらに、今回ご紹介したようにクルードサンプルを直接PCR反応に持ち込む場合、Proteinase KやSDSなどが含まれる処理液を用いないように注意してください。これ
らの成分の活性が残っていると、PCR酵素などが不活性化されてしまいます。

KOD FXをマルチプレックスPCRに応用したいのですが、コツはありますか？
プライマーを等モルで添加した場合、どちらかの増幅産物が増幅しすぎてしまうことがあります。その場合、添加するプライマー量の比を検討してください。一般的には、増幅の悪かった方のプライマー量を1.5倍程度に増やし、サイクル数を少なくする方向で検討することで良好な結果が得られることがあります。

関連製品紹介品

名用KOD -Plus-

装

Code No.

価

高正確PCR途

200U×1本包

KOD-201￥30,000

格〃

200U×1本

KOD-211￥32,000

KOD FX

高成功率PCR

200U×1本

KFX-101￥35,000

KOD Dash

インサートチェック

250U×1本

LDP-101￥25,000

Blend Taq®

正確性の不要なPCR全般

250U×1本

BTQ-101￥19,000

Blend Taq® -Plus-〃

250U×1本

BTQ-201￥21,000

ReverTra Ace -α-®

高効率逆転写100回用

FSK-101￥53,000

Ligation high Ver.2

高効率Ligation

750μl×1本

LGK-201￥22,000

MagExtractor™ -PCR & Gel Clean up-

DNA断片の精製

200回用

NPK-601￥28,000

MagExtractor™ -mRNA-＋
Poly（A）
RNAの精製

5回用

NPK-801F￥43,000

T4 Polynucleotide kinase

DNAのリン酸化

1,500U×1本

PNK-111￥15,000

rATP

リン酸化の基質50μmoles/0.5ml

ATP-111￥15,000

E. coli Alkaline Phosphatase
MagExtractor™ -PlasmidMagical Trapper
TArget Clone™
TArget Clone™ -PlusCompetent high JM109
Competent high DH5αCompetent Quick DH5α脱リン酸化

100U×1本

BAP-111￥15,000

プラスミドの精製

500回用

NPK-301￥33,000

1個

MGS-101￥38,000

10回用

TAK-101￥12,000

10回用

TAK-201￥16,000

高効率形質転換

0.1ml×10本

DNA-900￥17,000

高効率形質転換

0.1ml×10本

DNA-903￥17,000

サブクローニング用

0.1ml×20本

DNA-913￥29,000

KOD -Plus- Ver.2

8 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ（さらに高効率）（Hot start可能）

磁性分離（磁性スタンド）TA Cloning vector
〃

私 にも
！
できた

（KOD専用）