研究フロンティア

着床期特異的蛋白 glycodelin による子宮内膜腺上皮細胞の増殖機能制御
太田 邦明１），２），丸山 哲夫１），内田
森田 峰人２），吉村 泰典１）浩１），小野 政徳１），荒瀬透１），長島隆１），青木 大輔１），

１）慶應義塾大学医学部産婦人科学教室
２）東邦大学医療センター大森病院産科婦人科学教室

はじめにれており，当研究室でもこれまでに子宮内膜腺上皮におけるグリコデリンのさまざまな働きを報告してきた［１

近年の不妊症に対する生殖補助医療の技術進歩は顕著であるが，受精率の飛躍的向上に比べ妊娠率はやや横ば―３］．
グリコデリンは，約２８kDa の球状分泌糖タンパク質
protein １４いを呈している．その主因は，ヒト着床の技術的向上おであり，当初胎盤から抽出され，placentalよび分子機構の解明が，受精と比して立ち遅れている点（PP１４）と名付けられた．その後，子宮内膜腺，子宮頸にあると考えられる．

管腺，卵管，卵巣，乳腺，精漿など生殖領域中心に認めヒト受精卵および子宮内膜の研究は，実験マテリアルられることが明らかとなった．グリコデリンは付帯する入手における倫理的な制約が避けられない．一方，マウ糖鎖によって，いくつかのアイソフォーム（グリコデリスなどの実験動物では，着床の形態様式がヒトとは異な，グリコデリン―S［精ン―A［子宮内膜腺上皮，羊水など］る部分が少なくない．これらのことから，ヒト着床研究，グリコデリン―C［卵漿］，グリコデリン―F［卵胞液］は，そのアプローチすら困難である．しかし，ヒトの子丘細胞］）が存在し，糖鎖部分を認識する受容体の違い

宮内膜の研究は，着床やその後の妊娠維持における分子などが，組織毎のグリコデリンの生物学的活性を規定し機序にとどまらず，再生を繰り返す特異な分化組織といていると考えられるようになっている．とくに，精子側う観点からも，生命科学の研究対象として大変魅力的での受容体に関する解明は進んでいる［４］．ただし，残ある．

念ながら子宮内膜腺上皮に発現するグリコデリン（グリ着床（implantation）とは胚が子宮壁の一定部位に定コデリン―A）に対する受容体はいまだ同定されていな

着し，子宮内膜上皮を通って内膜内部に侵入して胚の発いため，着床におけるグリコデリンの細胞内シグナル伝育の準備を始める現象である．ヒトにおいて，受精成立達経路には不明な点が多く残されている．

後，卵管内で桑実胚となった卵は，妊娠５日目までに胞これらアイソフォームのなかで，われわれはとくに子胚を形成し，子宮内膜には胚を受け入れることができる

宮内膜腺におけるグリコデリン（グリコデリン―A）の一定の受容期が存在し，この限られた期間が implanta-子宮内膜での働きに関して報告をしてきた．グリコデリ

tion window と呼ばれ胞胚の受容と侵入を可能にする．

ンは，子宮内膜腺上皮において卵巣ステロイドホルモン

この時期の子宮内膜は増殖分化して着床の準備を整えによって分泌期中期（LH＋４）に誘導され，分泌期後る．このような胞胚の受容能獲得と着床誘起に役割をも期（LH＋１０）に発現ピークを迎えるという時間的に特つ分子として，卵巣ステロイドにより制御される母体（子徴的な発現パターンを有するタンパク質である［５］．

宮）側の leukemia inhibitory factor（LIF），cyclooxyge-

その発現パターンはまさに implantation window に一致

nase―２（COX―２）代謝産物などが同定されている．一している．実際にいくつかのグループから，着床不全患

方，グリコデリンは，着床機構の研究において着床成立

者ではグリコデリンの発現が implantation window より時に特異的に発現が上昇する子宮因子として解析が行わ遅れ，分泌期後期の局所発現および血中濃度は正常者と比して低いという報告をしている［６，７，８］．この

連絡先：太田邦明，慶應義塾大学医学部産婦人科学〒１６０―８５８２ 東京都新宿区信濃町３５TEL :０３―３３５３―１２１１（代）FAX :０３―５３６３―３５７８E-mail : kuniman@wc4.so-net.ne.jp

ことはグリコデリンが着床に機能的に関与していることを示唆しており，当研究室でも in vitro でグリコデリンの着床促進効果を明らかにしている［３］．
今回，われわれはグリコデリンの発現が，子宮内膜腺

日本生殖内分泌学会雑誌（2008）13 : 43-47

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太田邦明

他

上皮に対して分化のほかに，分泌期の子宮内膜の増殖は増殖期に比較すると抑制されていることから，グリコデリンを介した子宮内膜の増殖抑制作用について検討を行った［９］．

方法

本研究においては，ヒト子宮内膜腺上皮由来 Ishikawa
細胞株に蛍光蛋白 EGFP で標識したグリコデリン遺伝子をリポフェクション法によって遺伝子導入することで，細胞内にグリコデリンを強制発現させた EGFP―glycodelin 発現細胞（EGFP―Gd 群）を，またコントロールとしては，蛍光蛋白 EGFP のみをリポフェクション法によって Ishikawa に強制発現させた EGFP 単独発現細胞（EGFP 群）を作成した．これらを用いて２群の細胞増殖曲線作成，MTS 法，フローサイトメトリーによる

図１

グリコデリンの増殖抑制効果
Ishikawa（２×１０５cell）に対して EGFP と EGFP―glycodelin を遺伝子導入し，４８時間まで培養し増殖効果を検討した．
＊P＜０．
０５ versus EGFP（ANOVA and unpaired t―test）

細胞周期解析を行った．また RT―PCR 法を用いて，細胞周期関連の mRNA 発現量の変化を検討した．

Ishikawa に非プロゲステロン誘導性にグリコデリンの発現を報告してきた．今回，これらの方法とは別に，ググリコデリンによる子宮内膜腺上皮細胞への増殖抑リコデリン遺伝子を直接的に遺伝子導入したものを今回制効果の解析で使用した．
図１に示すように EGFP―Gd 群は，グリコデリンが発分泌期の正常子宮内膜には，プロゲステロンに誘導さ現すると２４時間以降は Ishikawa の増殖を抑制した．まれるようにグリコデリンが発現している．また，今回使た，今回用いたリポフェクション法を用いた場合でも，用している Ishikawa においてもプロゲステロンによっ

遺伝子導入効率に EGFP 群と差が出るために（図２A），てグリコデリンを発現し，われわれも，これまでにヒスより定量化をはかるために，蛍光強度を指標にフローサトン脱アセチル化酵素阻害剤を使用することでイトメーターによって発現陽性細胞のみをそれぞれ選別

図２44

グリコデリンの増殖抑制効果
A：Ishikawa に EGFP と EGFP―glycodelin を遺伝子導入し，２４時間後にフローサイトメトリーによってそれぞれの発現陽性細胞群と発現陰性細胞群を選別した．
４時間，４８時間後の増殖効果を検B：後に発現陽性細胞（７×１０３cell）のみを再培養し，MTS 法にて２討した．
＊P＜０．
０１ versus EGFP（Wilcoxon rank sum test）

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.13 2008

着床期特異的蛋白 glycodelin による子宮内膜腺上皮細胞の増殖機能制御した後に細胞を再培養し，MTS 法によって細胞増殖能群と高発現群に分けて，ヘキスト３３３４２染色によって細を検討したところ，図２B で示すように４８時間以降は胞周期解析を行った．すると，EGFP 群における低発現Ishikawa の増殖を抑制した．

群と高発現群では細胞周期解析には差が認められなかったが，EGFP―Gd 群においては，高発現群ではさらにそグリコデリンによる細胞周期停止作用の細胞周期の進行が G１期で停止していることが確認された．

グリコデリンによる直接的な子宮内膜腺上皮細胞に対する増殖抑制効果が示されたことから，そのメカニズム細胞周期関連因子の検討を解明するために，EGFP 発現陽性細胞と EGFP―Gd 発現陽性細胞のみを前述のようにフローサイトメーターを細胞は G１→S→G２→M 期からなる細胞周期を制御用いて選別し，それぞれに対して生細胞の状態でヘキスさせることにより増殖をする．細胞周期制御にはサイクト３３３４２染色を施し，フローサイトメーターを用いて細リンおよびサイクリン依存性キナーゼ（Cyclin Depend-胞周期解析を行った．

ent Kinase ; CDK）と呼ばれるタンパク質が必須である．

図３A,B に示すように，EGFP 群では典型的細胞周期また，それらを阻害する CDK 阻害因子も存在し，細胞カーブを描いているにもかかわらず EGFP―Gd 群では G周期制御はきわめて複雑な機構である．われわれは，G１期に細胞が蓄積しており，DNA 合成の行われている１→S 期への進行を阻害している CDK 阻害因子である

S 期に進行できないことが確認された．

p１６，p２１，p２７に 着 目 し，EGFP 群 と EGFP―Gd 群 の そ

さらに，グリコデリンの発現量による細胞周期に対すれぞれに対して RT―PCR を施行した．すると，グリコる影響を検討した．図３C に示すように，細胞内においデリンが発現している EGFP―Gd 群では優位に発現が認て EGFP と EGFP―Gd の発現量と蛍光強度は相関するこめられた．つまり，本研究において，グリコデリンが子とから，蛍光強度を指標にそれぞれの群において低発現

宮内膜腺上皮細胞で発現すると細胞周期回転を G１→S

図３

グリコデリンの細胞周期停止効果
８時間後に生細胞の状態で Hoechst３
３３４２にて染色しフロー
A,B：Ishikawa に EGFP と EGFP―glycodelin を遺伝子導入し，２４，４サイトメトリーによってそれぞれの発現陽性細胞群の細胞周期解析を検討した．
＊P＜０．
０５ versus EGFP（ANOVA and unpaired t―test）
C,D：EGFP と EGFP―glycodelin の発現量を EGFP の蛍光強度を指標に，高発現群と低発現群においてそれぞれの細胞周期解析を検討した．
＊P＜０．
０５ versus EGFP（ANOVA and unpaired t―test）

研究フロンティア

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太田邦明

他

図４

グリコデリンによる CDK 阻害因子の発現誘導効果
８時間後にフローサイトメトリーによっ
A,B：Ishikawa に EGFP と EGFP―glycodelin の遺伝子導入４て陽性細胞のみを選別し，RNA を抽出し，RT-PCR 法により p１６，p２１，p２７の発現を検討した．
＊P＜０．
０５ versus EGFP（Wilcoxon rank sum test）

期において阻害する p１６，p２１，p２７を発現させるために増殖が抑制されることが確認された．
（図４A，B）

この問題に対して，上記に紹介した基礎研究で，グリコデリンがヒト子宮内膜腺上皮の胚に対する接着・浸潤能を補助している可能性が導き出されていると考えている．着床不全症例に対する治療法開発として，これらグまとめ

リコデリンを含めたヒト着床機構のより詳細な解析を基グリコデリンはこれまでに，免疫能，増殖抑制能，分化誘導能についてさまざまな知見が得られてきた．われ盤とした，従来のホルモン療法以外のパラダイムシフトが期待される．

われはヒストン脱アセチル化阻害剤を用いて卵巣ステロイドホルモン非依存性にグリコデリンを発現誘導するこ文

献とに成功し，ヒト子宮内膜腺癌細胞株 Ishikawa の形態的・機能的分化，そして運動能亢進を引き起こすこと，さらには着床初期における胚接着の促進効果を報告して．
いる［１―３］
今回，われわれは Ishikawa にグリコデリンを遺伝子導入させたグリコデリン強制発現モデルを用い，グリコデリンの発現により，発現量依存性に子宮内膜腺上皮細胞の増殖能が抑制されることを見いだした．さらにその増殖抑制のメカニズムが細胞周期に関与しており，細胞周期回転抑制因子の発現量に関与した結果のメカニズムであることを明らかにした［９］．
IVF―ET など生殖補助医療技術の発達は目覚ましいが，生産率に代表される成績は平均２０％以下と依然低いままで，改善はみられていない．この状況で形態良質胚の移植を繰り返しても妊娠に至らない難治性着床障害症例の存在がクローズアップされてきた．着床障害を原因とする不妊患者の大半は内分泌学的治療に対して不応性であり，治療法の開発にはまったく新しい観点からのアプローチが不可欠である．

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日本生殖内分泌学会雑誌

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