特集

アルギニンを利用した化合物の可溶化と分散
平野

篤

アルギニンはタンパク質を構成するアミノ酸の一つでさせて溶解度を変化させるだけでなく，凝集などを引きあり，図 1 に示すような構造をもつ．側鎖にはグアニジ起こし，溶解度という概念がそもそも成立しない状態にニウム基と呼ばれる S 電子を有する平面構造がある．こ系を遷移させる可能性もある．の官能基は塩基性であるため正に帯電している．した以上の問題点が解決すれば，溶解度や添加剤による可がって，アルギニンは塩基性アミノ酸である．構造から溶化効果を熱力学的に記述かつ理解することが可能にな読み取れる物理化学的な特徴はその程度かもしれない．

る．対象物質である溶質が飽和溶解した時のモル分率を

しかし，アルギニンを溶液へ「混ぜる」と，ただそれだ水中と添加剤溶液中でそれぞれ xZ，xa とすると，対象物けでさまざまな効果を発揮する．タンパク質の凝集抑制，質を水中から添加剤溶液中へ移した場合の移相自由エネ

カラムからのタンパク質の溶出，難水溶性分子の可溶化，ルギー（'Gtr）は次のように表すことができる．

さらにはカーボンナノチューブの分散など，「可溶化」「分散」といったキーワードを中心に多分野でアルギニンは'Gtr

RT ln( xa / xw ) | RT ln(Sa / Sw ) 

利用されている．本稿では，分子の可溶化に関する物理

ここで R は気体定数，T は絶対温度である．溶質が希化学の基礎的な考え方を土台に，アルギニンの応用例を薄な場合には溶解度 SZ，Sa を用いて上式のように表現最新の知見を交えながら紹介する．

することも可能である．移相自由エネルギーは液相中に溶解度の基礎おける溶質の標準状態における標準ギブス自由エネルギー差であるが，ここで述べる標準状態とは溶質が純溶溶解度の測定や解析を考えるとき，対象物質が低分子質状態（モル分率が 1）であるにもかかわらず無限希釈化合物であるかタンパク質のような高分子であるかといと同じ状態にある（溶媒分子に囲まれている）という仮う点に留意することがまず重要である．低分子化合物で想状態のことである．つまり，極端な 2 つの状態が共存あれば系は多くの場合容易に平衡に達する．ただし，固するという奇妙な状態である．溶解度を熱力学的に考え相成分には複数の結晶やアモルファスを過渡的に含む場

るに当たっては，標準状態をこのように仮定している点合があり，その場合には系はもっとも溶解度が低い固相に注意が必要である．このようにして求めた移相自由エに対して平衡化する．一方で高分子，特にタンパク質のネルギーは対象物質に対する添加剤の可溶化効果を熱力

場合，固相成分の形態だけでなく，液相成分にも注意す学的に表しており，可溶化効果の定量的な議論が可能にる必要がある．タンパク質は構造変化しやすく系が不安なる．

定であることが多いからだ．構造変化は平衡状態を遷移タンパク質の凝集抑制
アルギニンはタンパク質の凝集抑制に効果的である．
変性剤によって変性したタンパク質を希釈によって元のネイティブ状態に戻すリフォールディングを行う際に，希釈液にアルギニンを共存させると，リフォールディン
グ収率が高まることが知られている．この研究は 1991
年に Buchner らによって報告された封入体からのタンパク質のリフォールディングが始まりである 1)．その後，アルギニンの効果に関する数多くの研究から，アルギニンはリフォールディング中間体の凝集を抑制することに

図 1．アルギニンと化合物 1–4 の化学構造
著者紹介268

よってミスフォールディングを低減し，リフォールディ

国立研究開発法人産業技術総合研究所ナノ材料研究部門 (PDLOKLUDQRD#DLVWJRMS

生物工学

第93巻

タンパク質溶液の理解と制御
ング収率を高めるとするモデルが提案された 2)．

ター系列と呼ばれる順番でよく知られている．これはホタンパク質溶液を加熱するとタンパク質は熱変性を起フマイスター系列が塩の表面張力増加率と相関することこして凝集することがある．溶液中へアルギニンを共存の帰結である．アルギニン（通常はアルギニン塩酸塩）させると，このようなタンパク質の熱凝集が抑制されるも溶液の表面張力を例外なく増加させる 2)．しかしアルことを 2002 年に Shiraki らが報告した 3)．アルギニンはギニンの可溶化能力はこのようなネガティブな効果を凌タンパク質の変性温度を下げないことから，凝集反応に駕するため顕在化するのである．

おける中間体を不安定化することで凝集を抑制していると考えられる．

カラムからのタンパク質の溶出

アルギニンが有するこのようなタンパク質の凝集抑制

芳香環をリガンドにもつカラムからタンパク質を溶出効果の理解のために，アルギニンとタンパク質の相互作するのにもアルギニンは有用である．近年，マルチモー用をアミノ酸残基に立脚して理解する試みがなされていダルカラムクロマトグラフィと呼ばれる複数の官能基をる．$UDNDZD らは式（1）を用いて，アミノ酸 13 種類のリガンドにもつカラムを用いてタンパク質の精製を行う

4)

アルギニン溶液への移相自由エネルギーを測定した ．

手法が注目されている 7)．ただし，マルチモーダルカラ

アルギニンはトリプトファンやチロシンといった芳香族

ムクロマトグラフィではタンパク質の吸着に複数の相互アミノ酸を特に安定化させたが，その他の疎水性アミノ作用を利用することから，タンパク質がカラムへ強固に酸にはあまり効果がなかった．つまり，アルギニンには吸着して溶出が困難な場合も多い．最近筆者らは上述の芳香環に対する安定化効果を有するわけである．対照にアルギニンと芳香環の相互作用に基づき，芳香環をリガはタンパク質変性剤であるグアニジンが用いられ，疎水ンドにもつマルチモーダルカラムクロマトグラフィから性アミノ酸を含む多くのアミノ酸を安定化させることがタンパク質を効率的に溶出するためにアルギニンを利用示された．このようにアルギニンは数少ない特定の疎水できることを実証した．

性残基（すなわち芳香族アミノ酸残基）のみを安定化さ用いた担体は図 1 に示した 3 種類であり，1 は陰イオせるため，タンパク質に対する変性作用がないにもかか

ン性，2 は陽イオン性，3 は中性といった電気的性質をわらずリフォールディング中間体や熱変性状態のタンパ有するリガンドで修飾されている．抗体やウシ血清アルク質の凝集を抑制するものと考えられる．ちなみに，アブミンを 1 または 2 で修飾した担体を充填させたカラムルギニンの誘導体であるアルギニンメチルエステル，アから溶出する際にアルギニンを用いることで溶出量が改

ルギニンエチルエステル，アルギニンアミドなどはアル善された．分子動力学計算を用いた解析から，1 とアルギニンよりも凝集抑制効果が高い．アルギニンの側鎖だギニンの相互作用には静電相互作用が支配的であり，付けでなく，アミノ酸骨格部分も多少なりともその効果に加的にアルギニン側鎖との相互作用（S–S 相互作用や疎5)水性相互作用）が働いていることが示唆された 8)．2 と寄与するようだ ．
疎水性の高い物質の水中での溶解度は溶液の表面張力

アルギニンの相互作用には S–S 相互作用，疎水性相互作に強く依存することが知られている．溶液の表面張力は用のほか，水素結合などのさまざまな相互作用が総合的塩濃度の増加や温度低下によって増大する．疎水性界面に働いていることを示す結果が得られている．3 で修飾は水と水素結合を形成することが困難であるため表面エした担体を充填させたカラムからのタンパク質の溶出にネルギーが高い．塩の添加などによって溶液の表面張力もまたアルギニンが有効であることが知られている 9)．

が大きくなれば，疎水性界面の表面エネルギーはさらに3 の担体をバッチ法でウシ血清 J- グロブリンの吸着試験高くなる．表面張力よって生じる自由エネルギーはシンを行ったところ，アルギニン存在下では吸着が劇的に低プルに書けば下した 10)．タンパク質変性剤であるグアニジン塩酸塩や'G

AJ 6)

尿素では吸着力の低下があまり顕著ではなく，リシンでは効果がまったくなかったことからもアルギニンの特殊と表現できる ．ここで A は疎水性界面の面積であり，性が際立つ．アルギニンの誘導体であるアルギニンメチは溶液の表面張力である．高濃度の塩溶液中ではタンパルエステルはさらに効果的に吸着力の低下を引き起こしク質の溶解度が低下すること（塩析）が知られているが，た．この結果は先述したタンパク質凝集抑制効果と共通

塩の種類によるタンパク質の溶解度の差異はホフマイスする点である 5)．

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表 1．1 M アルギニン溶液への移相自由エネルギー

図 2．アルギニンとエチルガレートの相互作用．結合の安定構造として A と B の 2 つが見いだされた．アルギニンのグアニジニウム基とエチルガレートの芳香環が近接している．

低分子化合物の可溶化

化合物

移相自由エネルギー

カフェ酸
アルキルガレート
クマリン
トリプトファン
チロシン
フェニルアラニン
核酸塩基

N-PRON-PRON-PRON-PRON-PRON-PRO
1– N-PROが正に荷電するとアルギニンのグアニジニウム基の正のアルギニンが有する芳香環の安定化効果を難水溶性の電荷との反発力によって，核酸塩基は不安定化すると考芳香族化合物の可溶化へ適用する研究を筆者らは 2008

えられる．中性条件下でのデオキシリボ核酸の融解温度年頃に始めた．これまでにクマリンやアルキルガレート，は高濃度のアルギニン存在下で低下することがわかってカフェ酸といった低分子の芳香族化合物のほか，ヘテロいるが 14)，この効果は以上で述べたアルギニンと核酸塩

芳香環を有する核酸塩基のアルギニンによる可溶化も実基との相互作用に起因すると考えてよいだろう．参考ま証している．

でに，表 1 に代表的な化合物の移相自由エネルギーを示

アルキルガレートは図 1 の 4 に示す構造の化合物であした．

るが，さまざまな長さのアルキル鎖を用意することがで可溶化原理

きる．1 M のアルギニン溶液中に対するアルキルガレー
ト（n ）の移相自由エネルギーを測定した

アルギニンの可溶化効果は間違いなく側鎖の構造に起ところほとんど一定であった．この結果はアルギニンが因する．特に末端のグアニジニウム基が可溶化に働いてアルキルガレートの芳香環と相互作用することによっていることが実験や分子動力学計算から示唆されている．

11)

可溶化に導いていることを示している ．一方で塩化ナ

それではどのような原理によってアルギニンのグアニジトリウムを加えるとアルキル鎖の長さに従って移相自由ニウム基が可溶化に効いているのだろうか．その理解のエネルギーが増加した．この結果は，先述の表面張力（）ためにはグアニジンの溶液中での物性が役立つかもしれの増加による界面エネルギーの上昇という考え方で理解ない．Mason らは X 線小角散乱や分子動力学計算からできる．つまり，アルキル鎖が長いほど疎水性界面（A）グアニジンの周囲の水分子の構造を報告している 15)．グが広いため，自由エネルギーがより大きく増加することアニジンはアルギニンのグアニジニウム基と同様に平面が原因である．アルギニンとアルキルガレートの相互作構造を有しているが，平面の直上と直下は脱水和してい用に関する自由エネルギーとコンフォメーションの情報ることを彼らは提案している．つまり，グアニジンの表を得るために，分子動力学計算を用いてアルギニン 1 分面は意外にも疎水性を有しているのである（ただし，平子とアルキルガレート 1 分子の間の結合の自由エネル面の縁に相当する領域は十分に水和し，親水性を示してギーを計算した．最安定状態ではアルギニンのグアニジいる）．このようなグアニジンの表面の疎水性がアルギニウム基が芳香族化合物の芳香環と相互作用することがニンにも備わっていると考えられる 16)．アルギニンのグ明らかになった（図 2）12)．

アニジニウム基の表面の疎水性部分が化合物の芳香環とアルギニン水溶液への移相自由エネルギーを核酸塩基疎水性相互作用することで可溶化が起きるわけである．

（アデニン，グアニン，シトシン，チミン，ウラシル）

なお，グアニジニウム基は正電荷を有しているため，グに対して調べたところ，中性条件下ではアデニンがもっアニジニウム基と芳香環の間にはカチオン -S 相互作用とも大きく，溶液中で安定化しやすいことが明らかにが働いている可能性も十分あるということは留意すべきなった

13)．ただし，酸性条件下で核酸塩基がプロトネーであるだろう．

ションするとアルギニンは可溶化ではなくむしろ析出させることも明らかになった．したがって，ヘテロ芳香環

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べたところ，アルギニンのグアニジニウム基がカーボンカーボンナノチューブの分散

ナノチューブの表面近傍にもっとも多く存在することが以上で見てきたように，アルギニンの側鎖のグアニジ明らかになった（図 3）．このようにアルギニンは低分子ニウム基は芳香環と相互作用することが明らかとなっ化合物やタンパク質の可溶化だけでなく，カーボンナノた．このような相互作用は芳香環を多く持つ高分子やナチューブのような芳香環を有するナノ構造体の分散にもノ構造体にも適用可能であると考えられる．本項ではア有用であることが明らかになった．

ルギニンのホモポリペプチド（アミノ酸のホモポリマー）

実際にアルギニン残基を多く有しているニワトリ卵白であるポリアルギニンを用いてカーボンナノチューブをリゾチームはカーボンナノチューブの分散に有効であ分散した例を紹介する．カーボンナノチューブのようなる 18)．リゾチームがカーボンナノチューブへ吸着するこ

数 QP 以上にもなる構造体は，分子間力によって一度接とによって分散が可能になるわけであるが，吸着にはア触すると熱運動によっては容易に解離できずに不可逆にルギニン残基の寄与が大きいと考えられる 20)．筆者らは凝集する．このようなコロイドの場合，溶液中で孤立しグアニジンなどのタンパク質変性剤を共存させるとリゾた状態は「溶解」ではなく「分散」として表現するほう

チームがカーボンナノチューブから解離してカーボンナが正しい．

ノチューブが再凝集する知見を得ている 21)．さらに最近

タンパク質を使ったカーボンナノチューブの分散に関しては 2006 年頃から活発に行われるようになった17)

カーボンナノチューブへのリゾチームの吸着がアルギニ．

ン溶液中である程度抑制されることを予備的な実験によ

特に，塩基性タンパク質には特異な分散効果が観察されり見いだしている．リゾチームのアルギニン残基と溶液ることから

18)，塩基性アミノ酸とカーボンナノチューブの相互作用は興味深い．言うまでもなくタンパク質とカーボンナノチューブの相互作用はアミノ酸残基の種類だけでなくタンパク質の三次構造にも依存する．した中のアルギニンが置換することで吸着の抑制または脱着が起きているのではないかと考えている．
タンパク質の高濃度化剤としての可能性

がってアミノ酸残基とカーボンナノチューブの相互作用最後に，本特集にも関連するタンパク質の高濃度化にを純粋に評価するためには，ホモポリペプチドを用いるついて触れたい．ネイティブ状態のタンパク質を高濃度ことが得策である．に溶解させるためにアルギニンを使用することは可能でポリアルギニンとポリリシンを用いてカーボンナノあるだろうか．結論から言えば，高濃度化の可否はタンチューブを分散させたところ，ポリアルギニンには高いパク質の表面構造に依存する，というのが私見である．

19)．わずかではあるが，5 残基の本項で述べたようにアルギニンが相手にするのは基本的ポリアルギニンにおいても分散効果が認められた．分子に芳香環である．したがって表面が親水性・荷電性アミ動力学計算を用いてカーボンナノチューブに結合したポノ酸残基に富むタンパク質にはアルギニンの効果が原理

リアルギニンのコンフォメーションと動径分布関数を調的に期待できない．アルギニンが高濃度化に効くとすれ分散効果が観察された

図 3．カーボンナノチューブと相互作用する 15 残基のポリアルギニンの動径分布関数（A）と代表的なコンフォメーション（B）．
アルギニン残基のグアニジニウム基がカーボンナノチューブ表面に近接している．

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ば，表面がトリプトファン，チロシン，フェニルアラニ構成要素に持つ化合物の溶液中での物性が今後さらに詳ンなどの芳香族アミノ酸残基に富んだ疎水性の高いタン細に理解されることが望まれる．

パク質であるだろう．生物学的製剤，特に抗体医薬を高濃度化するための手段として，別項で述べられるように主に限外ろ過が用いられている．限外ろ過を行うとタンパク質濃度が不均一になり局所的に高くなる．このような局所的な高濃度状態を安定に保持するために，アルギニンを使用することが可能かもしれない（本特集，荒川ら）．
おわりに
アルギニンは芳香環との親和性が高く，分子の可溶化に有効である．芳香環に対する界面活性剤と言うこともできるかもしれない 16)．本稿で見てきたように，この原理を使用すれば，低分子化合物からナノ構造体まで幅広
いスケールの対象物の溶解・分散やカラムクロマトグラ
フィにおける溶離が可能である．今後アルギニンの応用例はさらに発展すると考えられる．Shiraki らのグループは最近アルギニンが抗体などのタンパク質溶液の粘度を低下させることやポリスチレン表面へのタンパク質の吸着を抑制することを発見している  ．これらの背後にも上記のメカニズムがあると考えられる．アルギニンがタンパク質を構成する 20 種類のアミノ酸の一つとして利用されてきたこと，アルギニンが他のアミノ酸と違って好塩菌の適合溶質に使用されていないことなど，

文献  %XFKQHU - DQG 5XGROSK 5 Nat. Biotechnol. 9  
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生物学的な意味も含めてアルギニンそしてアルギニンを

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