No.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 6

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！
できた

ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

P C R 実 戦 技 術 編（2）本シリーズは、市販のノウハウ本や実施例集ではカバーできなかったようなライフサイエンス実験のコ
ツなどについて、弊社研究員の実験ノートなども参考に、生の事例を交えながら、紹介させていただいています。前号から、最もリクエストの多かったPCR関連技術をさらに深くご紹介する目的で、「PCR実戦技術編」をお届けしています。
前号では、Sリーダーから難問が出題され、その問題をめぐって、A子さんとライバルのN代さんとのバトルの予感が漂っていましたが…。
皆さんも是非、前号で2人の設計したプライマー配列を確認してから、本号を読み進めてください。

題
の課 ト
号
ス
前
ジェ
ダイ

●A子さんの課題：
平滑末端クローニング法を用いてHuman β-Actin cDNAのC末端欠損変異体を作製しなさい。

それぞれに求められる実験スキーム●N代さんの課題：
TAクローニングの手法を用いてHuman G3PDH cDNAのC末端欠損変異体を作製しなさい。

図1

前号の2人への課題

図2・3に、A子さんとN代さんの設計したPCRプライマーを示します。皆さんならどういうプライマーを設計しますか？
ヒント①Damメチラーゼの認識配列は「GATC」で、XbaⅠ
はその影響を受けます。
②ORFの配列を再確認！

図2

！
注意！

A子さんの設計したPCRプライマー（β-actin遺伝子）

上の二人の解答には間違いが含まれている可能性があります。

図3

N代さんの設計したPCRプライマー（G3PDH遺伝子）

今までの
登場人物

本シリーズは、弊社ウェブサイト
（http://www.toyobo.co.jp/bio）の「実験お助けコーナー」でご覧いただけます。

N代さん
A子さん
Sリーダー
冷静沈着なライフ 今年入社4年目 今年入社3年目になる研究員サイエンスグルー になる研究員（A子さんのライバル）
プのリーダー

S本さん
アシスタント

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できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

1No.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 7

遺 伝 子 組 換 え 実 験 の 落とし 穴 い ろ い ろ1

PCRやその周辺技術が発達し、本当に様々な実験ができるようになりました。しかし、原理をきちんと考えて実験しないと、思わぬ失敗をしてしまうことがあるようです。今回は、その中でも陥りがちな実験の『落とし穴』についてご紹介しようと思います。

1-1 サイトあれども切り出せず
制限酵素を発現している細菌は、同じサイトを認識しメチル化する制限メチラーゼを発現して自身のDNAを保護しています。

メチル化され、XbaⅠは阻害されてしまいます。この他にも、Aat
Ⅰ（認識サイト：AGGCCT）やBan Ⅲ（認識サイト：ATCGAT）な

このような菌に、メチル化を受けていないファージのDNAなどがど、様々な酵素において、同様に前後の配列によってはメチル化

侵入するとバラバラに切断を受けてしまうというわけです。これがいわゆる「制限現象」です。ただ、日常の実験ではこのようなサイトが生成され、切断の阻害が起こります。制限酵素のメチル化による阻害に関しては、弊社総合カタログ2008/2009の3-

制限系を有する菌を用いることは無いので、特に困っている方は少ないと思います。

41ページに詳しい表が載っていますので、一度ご確認ください。
また、メチル化の阻害を受けない制限酵素もありますので、あわ

一方、通常の組換え実験に用いるJM109やDH5αなどのほせてチェックしてみてください。

とんどの大腸菌に発現しているDamメチラーゼやDcmメチラー
ゼに関しては注意が必要です。DamメチラーゼはGATCサイトのアデニンのN6を、DcmメチラーゼはCCWGG（W：A or T）サイトの2番目のシトシンのC5をメチル化します（図4）。よって、
これらのメチル化によって切断を阻害される制限酵素が存在することに注意しなくてはなりません。
例えば、Damメチラーゼの認識サイトと同じGATC配列を認識するMboⅠは、一般的な組換え実験で用いられる大腸菌で調製されたプラスミドのGATCサイトを切断することができませ

図4 Dam、Dcmメチラーゼのメチル化サイト

ん。また、認識配列のコア部分にDamメチラーゼの認識サイトを含むBclⅠ（認識サイト：TGATCA）も100%切断を阻害されてしまいます。同様に、Dcmメチラーゼの認識サイト：CCWGGを認識するEcoRⅡも一般的な大腸菌から調製されたプラスミドを切断することができません。しかし、このような制限酵素はマルチクローニングサイトなどに用いられることはありませんし、あまり問題になることは少ないといえます。
最も注意が必要なのはXba Ⅰなどの制限酵素です。例えば、

XbaⅠの認識サイトはTCTAGAであり、一見、メチラーゼの認識
サイトがないように思われます。そこが落とし穴です。このサイトの前にGA、もしくは後にTCの配列がくるとDamメチラーゼの認識サイトができてしまいます。実際に、このサイトは図5のようにⅠ
図5 切断阻害を受けるXbaⅠサイト

1-2 できるかな？ ライゲーション
DNAの各塩基間の結合はリン酸ジエステル結合であり、切断を一方、T4 DNAリガーゼなどのライゲーション反応は、ATPの受けた場合、リン酸基は5'末端か3'末端のどちらかにくることにエネルギーを用いる制限酵素反応の逆反応のようなものであなります。制限酵素で切断を受けたDNAの末端は、NciⅠなどの特殊なものをのぞいて、ほとんどの場合5'末端にリン酸基、3'末り、反応が成立するにはDNA断片の5'末端にリン酸基が存在することが必須条件です（図6）。

端に水酸基がくることが分かっています（図6）。

図6 制限酵素、
ライゲーションにおけるリン酸基の行方

2 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
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前号〔PCR実践技術辺（1）〕でご紹介しましたが、脱リン酸化

No.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 8

された制限酵素サイトや通常のプライマー（リン酸化されていない）で増幅されたPCR産物は、5'末端にリン酸基が存在しない

クローニングを行うと効率が向上しますが、それは2本鎖DNAの両側が連結されるためであると考えられます。

ためDNAリガーゼで結合することができません（図7a）。しかし、どちらか一方でもリン酸基が存在すると、2本鎖のうちの片方がまた、制限酵素切断末端をポリメラーゼを用いて平滑化することがありますが、5 突出でも3 突出でも、その時にリン酸基が削連結され、さらに大腸菌に導入された後、大腸菌の修復機能が働られてしまうことはありません（図7d）。

いてもう片方の結合も形成されます（図7b、c）。脱リン酸化されたベクターへのインサートの挿入やTAクローニングなどがこのリン酸基の位置や平滑化反応の方向性は、混乱しやすいですので、この際に一度確認しておくことをお薦めします。

例になります。ちなみに、リン酸化されたPCR産物を用いてTA

図7 様々なDNA末端でのDNAの結合様式、及びリン配基の挙動

1-3 PCR産物の効率的な加工方法は？
PCR産物の末端がリン酸化されていないことから生じる平滑末端クローニングにおけるトラブルに関しては、前号〔PCR実践

物は全くメチル化を受けていないため、メチル化の影響は考慮す
る必要はありません。クローニングする際のベクター切断の参考

技術編（1）〕でご紹介させていただきました。それに加えて、DNA末端の制限酵素サイトの切断性などにしてください。

も気になるところです。実際、制限酵素に

表1 制限酵素対応表

よっては、末端サイトの切断性が極端に低くなるものも存在するようで注意が必要です。通常は、1塩基程度の余分な配列をプ
ライマーの5'末端に付加することで解決することが多いようですが、2塩基以上必要な制限酵素もあるようです。表1に、代表

Ⅰ

Ⅱ
Ⅰ

Ⅱ
Ⅰ
Ⅴ

的な制限酵素の情報をまとめましたので、Ⅲ参考にしてください。
また、両端を効率的に同時に切断したいⅠ
Ⅰとか、コンパーチブルサイト（切断面が同一配列で連結可能なサイト）などを知りたⅠ

いなどの要望もあるかと思いますので、表

Ⅰ

Ⅰ

Ⅰ

に加えさせていただきました。ちなみに、コンパーチブルサイト同士で連結したサイ

Ⅰ

Ⅰ

Ⅰ

Ⅰ

トは、再切断できなくなるので注意してく
ださい。

Ⅰ

Ⅰ

また、この表にはDam・Dcmメチラーゼの影響に関しても載せていますが、PCR産

以上

私 にも
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3No.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 9

実戦−その2−

2

A子さんとN代さんはT社バイオ研究所のライフサイエンス試薬開発グルー
プの研究員です。今週2人は、わき目も振らずせっせと実験を行っています。
そういえば、2人にはSリーダーから難問が課せられているのでした（本シリー
ズ前号、もしくは本号表紙の前号の課題ダイジェスト参照；本シリーズは弊社
ウェブサイトhttp://www.toyobo.co.jp/bioでご覧いただけます）。

2-1 A子さんの落とし穴
2人とも注文していたプライマーが到着するとすぐに実験を開での切断がうまくいっていないようです。その横でN代さんはそ知らぬ顔でゲルからインサートを切り出しています。

始しました。
2人はまずそれぞれのcDNAが挿入されたプラスミドクローン

よく調べると、A子さんが作製したクローンのXbaⅠサイトはを鋳型として、高正確性PCR酵素：KOD -Plus-を用いて目的配Damメチラーゼの認識サイトが生じるような配列になっていまし列を増幅しました。その結果、少し無理のあるプライマーでしたた（図9）。しかも、ご丁寧に配列の両側にそのサイトが仕込まれが、鋳型がプラスミドということもあり、きれいに増幅することがていたようです。A子さんは、一般的な大腸菌株（DH5α）を用できました。その後、2人はその増幅産物を、それぞれ平滑末端

いてプラスミド調製を行っていましたので、このサイトは明らかにクローニングとTAクローニングのプロトコール（前号参照）にメチル化を受けているはずです。A子さんは、図9に示すBACT-

従って指定されたプラスミドにサブクローニングを行いました

R2のようなプライマーを設計する必要があったのです。A子さ（図8）。

んは、自分の無知さ加減にしばし自己嫌悪に陥ってしまいました。

TM

Ⅰ
Ⅰ

Ⅰ

図9 A子さんの実験の落とし穴とプライマーの改変案

しかし、転んでただで起きるA子さんではありません。彼女はこの状態からすぐにリカバーできる方法を考え出しました（図10）。A子さんの考え出した方法は、今回得られたプラスミドを鋳型として、インサート確認用のプライマー（ベクター上に設計）を用いて増幅を行い、その増幅産物を制限酵素処理した後、発現ベクターにつなぎかえるというものです。PCR産物はメチル化などの修飾を受けていないので、メチル化サイトがあっても問題なく切り出すことができるのです。この場合、もう一度PCRエ
図8 A子さんとN代さんの戦略
Ⅰ

Ⅰ

Ⅰ

翌日、2人はPCRを用いてインサートの有無を確認すると、その増幅産物を使ってそのままシーケンス確認まで済ませてしまいました。2人の手際はたいしたものです。

Ⅰ
Ⅰ

今日は、先日から培養しておいた大腸菌から目的プラスミドを精製し、指定のあった制限酵素を用いてインサートを切り出し、発ⅠⅠ現ベクターにインサートを移し変える予定です。
Ⅰ

午後、インサートの切り出しをしていたA子さんが浮かない顔をして暗室から出てきました。目的の位置にバンドが無いのです。
ワンカットは入っているようですが、明らかにどちらかの制限酵素

4 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

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図10 A子さんの新戦略

ⅠⅠNo.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 10

ラーが無いかをシーケンスにより確認しなければならず、インサートは結局発現ベクターから切り出すことができなくなってしまうのですが、少なくともタンパク質発現実験はできるはずです。

ワンポイントアドバイス ①前後の配列によって認識配列にメチル化サイトが生じてしまい、切断が阻害されてしまう制限酵素には気をつけましょう。弊社総合カタ
ログ2008/2009 p3-41にそのリストが掲載されていますので、是非一度ご確認ください。
一方、PCR産物は当然ながら何の修飾も受けていませんので、PCR-RFLP実験などを行う場合には心配無用です。

2-2 N代さんの落とし穴

図12 N代さんの落ちた落とし穴

実を言うと、N代さんは学生時代に今回のA子さんと同様の失あろうことか、N代さんの増幅した遺伝子のORF中にXbaⅠサ

敗を経験したのでした。
それを考慮して、今回N代さんは終止コドンから3塩基も離れイトがあったのです（図12）。N代さんはDamメチラーゼサイト

た場所にXbaⅠサイトを設計したのです。N代さんに与えられたのことに気を奪われて最も基本的なチェックを怠ってしまったの問題にも、Damメチラーゼのメチル化サイト（GATC）が数多くでした。ゲルからDNAを切り出すときも、全く気づきませんでし

仕掛けられていました。しかも、終止コドンの直近はともかく、た。当然、N代さんのクローニングした断片には終止コドンがなく、

XbaⅠサイトを1つ離した場合も、2つ離した場合もXbaⅠサイ

その後に偶然終止コドンがでてくるまでベクターの配列が翻訳さトの前後のどこかに必ずGATC配列ができるようになっていまし

れた変なタンパク質として発現されたのでした。分子サイズがおた。N代さんは、Sリーダーの仕込んだ落とし穴の巧妙さに少しビかしいはずです。

ックリしてしまいました。
「天然の配列の中に、こんなサイトがあ

実は、A子さんは同様なミスを過去におかしたことがあり、今回、自分の配列に加えてN代さんの配列についても組換え後にできるなんて・・・・」（図11）。

る配列についてシミュレーションしていました。A子さんは、N代Ⅰさんのミスに気づいていたのです。メチル化サイトには気づきませんでしたが。
結局、N代さんは、図12に示したようなプライマー（G3PDHR2）を作り直しました。このプライマーは、上流側のXbaⅠサイトに変異を入れて、XbaⅠサイトが潰れるようになっています。
この勝負引き分けといったところでしょうか。

ワンポイントアドバイス ③
NcoⅠやNdeⅠなど、開始コドン（ATG）
を認識サイトに含む制限酵
素は、開始コドン付近でDNAを切り出す場合に重宝することが多いです。特に、Nde Ⅰは2番目のアミノ酸に左右されることなくサイトを設計できるので、便利です。
図11 N代さんの回避した落とし穴

その後、N代さんは一気にタンパク質発現実験まで終えてしまいました。しかし、発現させたタンパク質の分子量が少し変でワンポイントアドバイス ④

す。
。。

プライマーへの変異は、なるべくプライマーの5 側に導入する必要があります。それは、3 側に近すぎるとミスマッチによってポリメラーゼが作用しにくくなるという理由と、3 →5 Exonuclease活性（校正活性）のあるポリメラーゼの場合はこのミスマッチが校正されてしまう可能性があるという理由からです。
ですから、図12のRプライマーのように3 末端付近に変異を導入する場合は、考えられる限り3 末端から離して設計する必要があります。少なくとも4〜5塩基以上は離して設計した方が無難です。

ワンポイントアドバイス ②
組換え後のDNAの配列はきちんと調べておきましょう。特に、制限酵素サイトはきちんと調べておかないと大変なことになることがあります。また、DNAの接合部に思わぬ配列が形成されていることもト
ラブルの元になるようですので、気をつけて。

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5No.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 11

KOD FX活 動 報 告 2.

クルードサンプルからのPCR

最近、細胞などを直接サンプルとして用いるPCR法が注目を集めているようです。そこで今回は、様々なクルードサンプルを直接用いるPCRについて、高成功率PCR酵素『KOD FX』を用いて調べた結果をご紹介します。
KOD FXは、高いPCR成功率を念頭において開発されたPCR酵素です。特に、クルードサンプルやGC含量の偏ったテンプレートからの増幅に力を発揮します。正確性はTaqの約11倍程度です。

【プロトコール＃1】KOD FXの基本反応条件
試薬
添加量(μl)2×PCR buffer for KOD FX
25102mM dNTPs
1.5
10pmol/μl Primer #1
1.5
10pmol/μl Primer #2

Y1
1.0 U / 50 μl
50（μl）PCR grade water
KOD FX（1.0 U/μl）
Total●培養細胞を用いた直接PCRの検討
動物細胞の培養が盛んに行われていますが、それらの細胞から抽出したDNAを鋳型としてPCRを行うケースもしばしば生じるようです。ここでは、そのような場合を想定して、培養細胞をそのまま鋳型にしてPCR可能
かどうかについて検討を実施しました。
PCRは、基本条件に準じ、図13に示したプライマーを用いて行いました。サンプルとしては、ヒト細胞株（Jurkat細胞）の培養液（2×104cells 相当）を直接反応系に添加し、ボルテックスミキサーにて攪拌後、2ス
テップサイクルの条件で増幅を行いました。その結果、
1.3〜8.5 kbまでの断片を増幅することができました（図14）。

Genomic DNA : 〜200 ng/50μl
Plasmid DNA : 〜50 ng/50μl
cDNA: 〜200 ng（RNA相当量）/50 μl
クルードサンプル : 〜2 μl

XTemplate DNA

終濃度
1×
0.4 mM each
0.3 μM
0.3 μM

2ステップサイクル＊

3ステップサイクル

ステップダウンサイクル ＊●血液を用いた直接PCRの検討＊プライマーのTm値が73℃未満の場合は、3ステップサイクルをお薦めします。

EDTA採血したヒトの血液を直接鋳型として、上記同様の条件を用い、PCRを行いました。その結果、KOD
FXを用いることで、1〜4 μlまで血液を添加したもの
すべてで1.3 kbの増幅を認めることができました。一
方、A社のPCR酵素を用いた検討でも増幅は認められましたが、4 μl添加において明らかな増幅阻害がみられました。それとは対照的に、KOD FXを用いた場合には、血液量に従って増幅量が増加することが確認できました。このことは、KOD FXが、血液の阻害をほとん
ど受けていないことを示唆するものと考えられました（図15a）。
次に、2 μlの血液サンプルを用いて、長い断片の増幅を行いましたが、8．
5 kbまでの明瞭な増幅を確認することができました（図15b）。

〈β-globin 1.3 kb〉
Primer F: 5' -TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC-3
Primer R: 5' -CCAGGATTTTTGATGGGACACG-3〈β-globin 3.6 kb〉
Primer F: 5' -GGTGTTCCCTTGATGTAGCACA-3
Primer R: 5' -ACATGTATTTGCATGGAAAACAACTC-3〈β-globin 8.5 kb〉
Primer F: 5' -TGATAGGCACTGACTCTCTGTCCCTTGGGCTGTTT-3
Primer R: 5' -ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA-3
図13 プライマーリスト

(a)

B社高効率
PCR酵素

A 社高効率･

KOD FXは、
これらの他にマウステールライセートを用いるようなPCRにおいても威力を発揮することが調べられています（Q&A参照）。

C社LongPCR酵素

KOD FX 高正確性酵素 （Taqベース）（Taqベース） Taq DNA Pol.
M

1

2

3

M

1

2

3

M

1

2

3

M

1

2

3

M

1

2

3

M

1.3 k b

KOD FX

A 社高効率･
高正確性酵素(b)

M1 A B C M2

8.5 k b
3.6 k b8.5 k b
3.6 k b

1.3 k b(n =2)<Sample>Jurkat細胞：2×104cells

図14 培養細胞を直接用いたヒトゲノムDNAの増幅

6 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

M：1 kb Ladder Marker<Sample>1：Whole blood 1μl
2：Whole blood 2μl
3：Whole blood 4μl

KOD FX

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できた

1.3 k bM 1：1 kb Ladder Marker
M 2：
λ/Hin d Ⅲ Marker<Sample>Whole blood 2μl

図15 血液を直接用いたヒトゲノムDNAの増幅

No.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 12

2-3 次なるSリーダーからの課題
その後、2人は何とか課題をやり終えることができました。それにしても、今回の課題は2人にとってかなりの教訓になりました。
と、そこへSリーダーからのメールが届いたようです。添付ファイルを開いてみると次なる課題でした。

●次に示す発現ベクターのSD（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンの間にある余分な塩基を、なるべく簡単な方法を用いて取り除き、連結してください。
条件： ¡SD配列と開始コドン（ATG）の間を5〜6塩基にすること。

Ⅴ

Ⅰ

Ⅰ

¡使用できる方法は以下のとおり。
・各制限酵素での切断
・KOD DNA polymerase*を用いる末端の平滑化
・T4 DNAリガーゼによる結合
・PCR（任意の場所にプライマーを設計可能）

図16 発現プラスミドの部分配列

・T4 Polynucleotide Kinaseを用いるDNAのリン酸化＊5'→3' DNA polymerase活性と3'→5'Exonuclease活性を有しています。

¡上図に示したEco RⅤ、PstⅠ、SphⅠ、Bam HⅠの認識配列は、ここに示したサイト以外は存在しません。

A子さんとN代さんはこの課題を見て、制限酵素処理後に何らかの方法で連結することで最も簡単に課題を達成できるのではないかと考えたようです。確か、KOD DNA polymeraseは5'→3' DNA polymerase活性と3'→5'Exonuclease活性を有しているのでDNAの末端を平滑化でき、平滑化したサイト同士は直接連結できるはずです。
A子さんは、3'とか5'とか、DNAの方向性を考えるといつも混乱してしまうようで、質問用紙を上下逆さに見たりしています。一方、N代さんは、この質問を見切ったのか、不敵な笑みを浮かべています。結局、2人は以下のような方法を考え出しました（図17、18）。2
人の方法では、確かにSD配列と開始コドンの間は5〜6塩基になるようです。
Ⅰ
Ⅴ

Ⅰ
Ⅰ

Ⅰ

Ⅴ

Ⅰ

Ⅰ

Ⅰ
Ⅰ

Ⅴ

Ⅴ

Ⅰ

図17 A子さんの解答

Ⅰ

図18 N代さんの解答

2人の解答を見た瞬間、またしてもSリーダーのメガネがきらりと輝きました。
その横で、アシスタントのS本さんはなにやら胸騒ぎがしています。
「もしかして…、この解答には思いもかけない罠が仕掛けてあるのでは？」と。そしてS本さんは、なんとなく、2人が選択しなかったPCRとT4 Polynucleaotide kinaseを用いるのではないかと思いました。
さて、皆さんなら、どのようみなさんも2人の解答が正しいかどうかを、吟味してみてくだな方法を用いますか？ では、さい。
【注意：2人の解答には間違いが含まれている可能性が

次回お会いしましょう。

ありますので、上の図を実験の参考にはしないでください。
】

2人の解答の解説は、次号「PCR実戦技術編（3）」でお届けする予定です。

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できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

7

No.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 13

KOD FXを用いてクルードサンプルから増幅する場合、どのような注意点がありますか？

KOD FXの正確性はどの程度ですか？
Taq DNA polymeraseの約11倍です。増幅産物の末端は平滑化されています。よって、PCR産物は直接TAクローニングすることはできません。専用のTArget CloneTM-Plus-（Code No. TAK-201）を用いることによって、高効率にTAクローニングすることが可能です。

KOD FXは、培養細胞、血液、マウステールライセートなど、様々なクルードサンプルを用いるPCRへ応用することが可能です。その際の注意点としては、サンプルを持ち込み過ぎないことが重要です。液量としては、反応液
50 μlに対して最大5 μl、好ましくは2 μl程度にすることで良好な結果を得ることができます。

ちなみにKOD -Plus-とKOD -Plus- Ver.2の正確性はTaqの約80倍であり、こちらの方がクローニング用途には適しています。

マウステールの増幅では、適切な方法で前処理したものを用いることが好ましいといえます。一般的には、Proteinase Kを用いる方法で処理することが多いのですが、クルードサンプルに強いKOD FXでは、アルカリ溶
解法を用いて簡便に作製したライセート上清を用いることも可能です。

KOD FXに用いるプライマーの注意点を教えてください。
KOD FXに限らず、KOD -Plus-やKOD -Plus- Ver.2の場合も同様に、アニーリング温度はプライマーのTm値-5〜10℃程度を目安にします。よって、2ステップサイクルやステップダウンサイク
ルの場合、プライマーのTm値は少なくとも73℃程度は必要です。

●マウステールライセートの調製方法（アルカリ溶解法）
マウステール約3 mm↓ ←50 mM NaOH 180 μlを加え、Vortexにて良く攪拌
95℃, 10 min. インキュベート↓ ←1M Tris-HCl（pH8.0） 20 μlを加え、Vortexにて良く攪拌
12,000 rpm, 10 min. 遠心↓
上清回収↓
0.5〜2 μlをPCR（50 μl）へ

2ステップサイクルやステップダウンサイクルはクルードサンプ
ルを用いるPCRや10kbを超える長いターゲットの増幅に有効であることが分かっています。
また、特に長いターゲット（＞10kb）の場合に用いるプライマ
ーは、脱塩グレードのものではスメアや非特異増幅が見られる場
合があるため、少なくとも、カートリッジ精製やHPLC精製グレードのものを使用する必要があります。

※本方法ではマウステールは完全には溶解しません。
※熱アルカリ溶液の取扱いに十分ご注意ください。

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8 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ（さらに高効率）（Hot start可能）

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〃

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！
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（KOD専用）