納豆菌(Bacillus subtilis var.
natto)によるイチゴの灰色かび病に対する抑制効果
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日本植物病理學會報 = Annals of the Phytopathological Society of Japan00319473
橋本,俊祐
河村,郁恵
中島,雅己
阿久津,克己日本植物病理學會
78巻2号
p. 104-107
2012年5月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センター
Tsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council
Secretariat

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日植病報 7
8:104‑107(2012)]
pn.J.Phytopatho.
l7
8:104‑107(2012)

短 報納豆菌 (Bαcillu
ssubtilisvar.仰 tto) によるイチゴの灰色かび病に対する抑制効果
橋本俊祐 1 ・河村

郁 恵 1・中島雅己 l持・・阿久津克己 1

ABSTRACT，S人KAWAMURA，I
人NAKAJIMA，M.1*andAKUTSU，K.1(2012).Suppressiv
eeffectsofsomeisolateso
fBacillus
HASHIMOTO
抑 制lisvar.natめagainstgraymoldo
fstrawberry.]pn.
].Phytopatho.
l7
8:1
04‑1
07.

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(Receiv
edSeptember28，2011;Accept
edNovember1，2011)B
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aymold，straw
berryKeywords:biologicalcontrol，

バイオコントロール技術の導入により，化学農薬の使用を以上のことから ，B.subtilisに属する納豆蕗には植物病容削減することができ，薬剤耐性菌の発生抑制などが期待されの防除に利用できる可能性があり，かつ食品由来の微生物でる.しかしバイオコントロール資材が利用されるかどうかあることから安全で消費者に受け入れられやすい妨除が可r
化学殺菌剤に替わる安全な方能になると考えられた.これまでに筆者らは納立菌がカンキ法である j と 消 費 者 に 受 け 入 れ ら れ る か に も 影 響 さ れ るツ緑かび病，イチゴ炭痘病，キュウリ褐斑病に対し抑制効果

は，その防除効果のみならず，(ChalutzandDrob，y 1998). 細菌，酵母，糸状菌を含む食品微を示すことを報告しているが(橋本ら， 2010a・2010b)，こ生物と呼ばれる徴生物は，歴史的にパン，リンゴ酒，ビール，れらの他に納豆菌による植物病害の防除に関する研究報告

ワインなどの特殊な食品や飲物を製造する場合， または天然はない.本研究では，市販の納豆から分離された納立直株を防腐剤として発酵果物・野菜・肉・日用品に利用されており，バイオコントロール・エージェントの候補として用いこのような有益な微生物は通常安全であるとみられ，消費者ゴの灰色かび病に対する抑制効果を調査した.に長く受け入れられてきた. これまでに食品微生物を用いたバイオコントロールとしては供試菌株

イチ

本試験では， 5種の市販納豆からそれぞれ単一チーズ製造に用いる培養スコロニーを分離・培養後，細爵河定検査用キット API50CH

ターターから分離された B
acillus仰 zyloliqu
抑ciensC06がモモ(ピオメリュ一社製)および納車製造試験(木内ら， 1987)にのポストハーベスト濡筈である灰星病を効果的に抑制したこ

よって同定された納立菌 (B.subtilisvar.仰 tto)5株 (No.1~とが報告されている (Zhoueta，.
l2008).日本の代表的な食品5) をバイオコントロール・エージェントの候補として用い

llussubtilisvar.natto) を挙げるこ
微生物の 1つ に 納 豆 菌 恒 例i010b). 納豆分離株 No.1~ 5の滅菌水怒潟液た(橋本ら， 2とができる.納豆菌は日本人が普段から口にしている身近なをT
rypticasesoy寒天 (TSA) 平板培地 (DIFCO社製)に塗細菌であることから，大きな抵抗感を感じることのない微生布し， 280Cの恒温器で培養後， 40Cの冷蔵庫で培養した.

物である.さらに納車菌が属している B.subtilisには，トマト試験の際には， TSA平板培地を用いて 280Cで 24時間前培やイチゴの灰色かび病やうどんこ病などの横物病害の生物的養した納立分離株を Trypticasesoy液体 (TSB)培地 (DIFCO防除手段として生物農薬に用いられている種類も含まれてい社製)に怒濁し， 280C，100rpmで 24時間接とう培養を行っる (ボトキラー水和剤，インプレッション水和剤)た.振とう培養後，遠心分離 (3000g，10分間， 240C) によ

3000
393茨城県稲敷郡阿見町 3‑21‑1) IbarakiUniversityCollegeofAgricu
lture，
3‑
21‑
1Ami，
Inashiki，lbaraki300‑0393，]
apan*Correspondingauthor(Email:mnakaji@mxi.
bar
aki.
ac.
jp)

1茨城大学農学部(干句骨]pn.
].
り培地成分を除き，滅菌水に懸濁し，分光光度計を用いて懸16.
0

潟液を ODω0=1.0に調整した.

14.
0

対崎培養試験灰色かび病菌 (Botryti
scinerea) は薬剤感

12.
0

受性の異なる TR3491 (ベノミル感受性，イプロジオン感受E100繍uR‑1 (ベノミル耐性，イプロジオン感受性)， TV335性)， I(ベノミル耐性，イプロジオン耐性)の 3菌株を供試した.

1.0 X 105個 Imlに調整した B.cinereaの分生子懸濁液 100μiをPotatosucrose寒 天 (PSA) 平板培地(ジャカ、、イモ 200g，スクロース 20g， 寒 天 15g， イ オ ン 交 換 水 1000mI)に広げ ， 培 地 上 の 3ヵ 所 に 滅 菌 ペ ー パ ー デ ィ ス ク ( 径 5mm，ADVANTEC) を置床し，そこへ納豆蕗懸濁液 5μlを稿下した.対照、区では滅菌水を滴下したペーパーディスクを置床した.これを 25Cで 2日間培養し，阻止帯長(納豆菌コロニー0先端から阻止帯先端までの長さ)を測定した.その結果，供1052012・ロTR349‑1IuR‑1[JτV335

車 8.0
言 6.04.
02.
00.
0No1町NO.2NO.3No.
4No.5

納主主菌株

第 1図 PSA 培地における対的培養 2 B後の納豆菌 (Bacillu
sar.natto)5株 (No.1~ No.5) による灰色かびsubtilisv
Botrytiscinerea) の生脊盟寄.
病菌 (試したすべての納宣菌処理区において明瞭な阻止帯が認められ， No.2株は最も大きな閉止帯を形成した(第 1関，第2関 A). また，阻止帯付近の B.cinereaの萄糸体を光学顕微鏡 (OLYMPASBH2) を用いて観察したところ，すべての納糾

豆菌処理区で菌糸先端部の膨張や菌糸内容物の鵡出が認められ(第 2国 B) ，菌糸細胞壁に対する合成阻害か，あるいは分解作用が関与している可能性が考えられた

これまでに.抑 制lisは環状ペプチド抗生物質Iturin，A
納豆菌の属する B
Surfactinなどの抗菌物質を産生することが明らかにされている (Gueldnereta，.
l1988;日iraokaeta，.
l1992) 抗真菌リボ

ur・
inAは，酵母菌 (Saccharomycescerevisiae) の細ペプチドIt
胸 膜 を 損 傷 す る こ と (Thimoneta，.
l1995;Maget‑DanaandPeypoux，1994;Maget心anaandPtak，1990)，またアカパンカ

持培養 2 日後の納豆菌 (Bacillus
第 2図 PSA 培地における対 lar.natto)No.2株による灰色かび病議 (Botrytissubtilisvcinerea)菌糸体の生脊限寄 A:灰色かび病菌の生育阻:生脊阻止帯付近の灰色かび病菌糸体の光学顕止帯， B
微鏡写真 (x200倍)，黒矢印:菌糸先端総胞の膨張，自矢印:菌糸先端紹胞の内容物漏出Neurostoracrassa) の菌糸細胞壁の合成を組害すること
ビ (009) が報告されている.これらのことから，納(村山ら， 2納豆菌懸濁液の代わりに滅菌水を用いた区を設定した.納豆.cinereaに 対 す る 菌 糸 伸 長 抑 制 効 果 に立分離株が示した B

菌 処 理 24時間後に PSA培 地 で 6 日間培養した B.cinerea菌rinA による菌糸体の細胞膜損傷及び細胞壁合成阻害は， Itu

糸体プラグ(径 5mm) を葉上に接種し，水を張ったプラスが関与している可能性が考えられた.今後，納豆分離株のチックトレーに置床して前述と問様に人工気象器内に維持I
tur・inA産生・分泌について謂査を進める予定である

した.接種 4日後に病斑径を測定し，納豆蔵による灰色かび

納豆菌のイチゴ植物体上における灰色かび病!こ対する抑病に対する抑制効果を調査した.試験は各処理区あたり 1複制効果納豆菌によるイチゴ植物体上における灰生かび病(3小葉)を用いて， 5反復で行った.その結果，納豆分に対する抑制効果について，前述の灰色かび病菌 3菌株を供離 株 の う ち No.2株処埋援における抑制効果が最も高く，試し，培土(スーパーミックス A) でポット(径 9cm) 栽培

TR349‑1を接種した場合の病斑長が対照区で 9.
8土 0.5mmにした 2~3 週齢のイチゴ植物(品種:さちのか)の 2 番目に.
3土 0.3mmであった(第 3図，対して No.2株処理区では 5新しい複葉を用いて調査した.滅菌水を注いだコニカノレビー

uR‑lおよび TV335を用いた接種試験においても第 4図). I

100mI)の口をパラフィルムで覆い，中央に霞径 1mm
カー (同様の傾向が認められ， NO.2株によるイチゴ葉上での灰血程度の穴を開けた後にイチゴ複葉の葉柄を挿し，実験に供試かび病に対する抑制効果が確認された.

脚立1.0) をイチゴ複葉に 5ml噴した.納豆菌懸濁液 (OD

次に，イチゴ植物の花器における No.2株の灰色かび病に2霧処理した後，これらをどニール袋で覆い， 250C，明期 1対する抑制効果を調査した. No.2株の懸潟液を開花 1日後時間/暗期 12時間の人工気象器内で維持した.対照として，のイチゴ花器に 3ml噴霧し風乾させた後，ピニーノレ袋で、種106

日本植物病理学会報第 78巻 第 2号 平 成 2
4年 5月

第 5凶
イチゴ楽における納豆菌 (Bacillussubtilisvar.
ηαtto)No.
2株の!噴霧処理による灰色かび病に対する抑制効果 A:

第 3関

イチゴ花器における納豆菌 (Bacilll
俗 subtili句var.natto)
No.
2株の噴霧処理による灰色かび病に対する抑制裁j巣.
A:No.2株噴霧処理区， B:対照区

No.2株噴霧処理 I
R. B:対照区.
した.花器での発病程度は，指数 0:未発病， 1:花器の 25
14.
0%以下の菌叢， 2:花器の 50%程度の菌叢， 3:花器全体に菌12.
0叢， 4:花器の腐敗の基準で評価した.

10.
0

擢病花器における分生子形成に対する抑制効果について
は，花器 li悶当たりの分生子形成数を下記の方法で算出してt脳
銀察
同 6.
0

評価した.各処理区の花器を水 2m!中でボルテックスミキ

4.
0サーを用いて 1分間懸濁し，懸i勾液中に含まれる分生子数を2.
0

血球計算盤を用いて測定した.試験は各処理区当たり開花した 1花器を持つ 3株の苗を用い， 3反復で行った.試験の結0.
0NO.
1No.
24No.

NO.
3

NO.
5

対照区

果，対照区における供試花はすべてが発痛し，接種後 4 8と納豆菌株処理区

第 4図 納 豆 菌 (Bacillu
ssubtilisv
ar.natto)51
朱(No.1~ No.5)をi噴霧処理したイチゴ葉における灰色かび病の病斑進展.闘中のパーは標準誤差を示す

6日で発病指数 3以上を示した花数は 9花中それぞれ 7花と8花であった.一方， No.2株処理区では 1花のみであり，対照、区に比べて発病程度は有意 (P<0.
05) に低かった(第 5I}'SI，第 1表).また，接種 6日後に花器に形成された B.cinerea

い， 25C，明期 12時間/暗期 12時間の人工気象器内で維持4分生子数を測定したところ，対照区では 44.
0X 10個/花器した.対照として，納豆菌懸潟液の代わりに滅龍水を噴霧しであったが，NO.2株処理区では 10.
3X 104倍/花器であり，た処理肢を設けた.処理 24時間後に B.cinereaTR3491の分対照区に比べて有意 (P<0.
05) に低い値を示した.イチゴ0i閲1m!
) を 2m!噴霧接種した後，前述生子懸渇液(1.0X 1植物において灰色かび病躍の主要な感染部伎であり，発病後と同様に人工気象器内で維持した.接種 4 8後
， 6日後に発に第二次感染源となる分生子が大量に形成される花器で¥病程度，また 6日後に花器 1鵠当たりの分生子形成数を測定

No.2株による顕著な抑制効果が認められた.以上の結果か0時

6Bacillussubtilisvar.natto) No.2株の噴霧処理によるイチゴ花器における灰色かび病抑制効果
第 1表 納豆菌 (接種後日数4B

発病指数 a) 加花数

試験 IR

供試花数

No.2処理区
対照区

34O

1971O1OO9Ol1613*有意:位 c)

6臼

発病指数代表値 b)2No.2処理区

935OO11

対照区9OO1174有意性持a) 発病指数はそれぞれ 0:未発病， 1:花器の 25%以下の菌叢， 2:花器の 50%程度の菌叢， 3:花器全体に一蔚議， 4:花器の腐敗b) 中央値を玉沢すc)Mann‑Whitneyの U検 定 に よ り * は 5%水準で、有意差あり

1072012

おいて灰色かび病の発生を抑制する効果を有すことが示さ

610N

￡ぷεL
コι

れ，有用なバイオコントロール・エージェントに成り得る可105能性が示唆された.また，本研究ではバイオコントロール・104。 10エージェントの候補として納豆菌 5株のみを用いたが，さら3口ま話円に多種類の納豆菌株を用いることにより，より抑制効果の高102い株が選抜される可能性も考えられる.

101
引用文献OO4128NO.
2
株噴霧処理後 8数第 6図肋)
イチゴ葉上に噴霧した納豆萄 Cnaubtilisv紅 :BacillussNo.2株の生息密度推移.

朱はイチゴ植物の花器において灰色かび病の発病
ら， No.21

1998)
.B
.(
iologicalc
fpost
harv
est
Chalutz，
E.an
dDrobontrolo，
yS
lant
‑
MicrobeIiologicalControdisease.
lnP.
lnteractionsandBu
ykendall，Lp.1
50‑
170，Marcel.D(Boland，G.，.，edsふ p.
JKNewYork.
Dekker，
2006).B
ttachment，ubtili
sa.(Demoz，T.B.andKorsten，Lacillu
ssnditsmodeocolonization，andsurv
iv
alonavocadoflower
saf8‑
74.
ndrotpathogen.Biol.Control
37:6actiononsteme
eillyrrenfale，.
L.
， C.
C.，Puseyostello，C，E.
，AGueldner.C.，R，C，P，R
EG.andCulter.，Himmelshbach，D.
S.，Crumley
Rぷ， CoxR.X，，，
1988).IntifungalsolationandidentificationofiturinsasaH.
G.(acillusiologicalcithB
peptidesiontrolofperchbrownr
otwnb
Agric.
FoodChem
3
6:
3
66‑
370.
subtilis..
J
2010a).納豆菌 (Bacillus
橋本俊祐・中島雅己・阿久津克己 (subtilis) によるイチゴ炭療病とキュウリ褐斑病に対する抑総病報 7
6:2
18. (談要)制効果. 日i2010b).納豆橋本俊祐・立吉野芳太郎・中島雅己・阿久津克己 (ubtilis) を用いた植物病容のバイオコントロー
Bacilluss
菌 (ルについて. El植病報 76:40. (議要)ningo1992).M.a10fa
HiraokaH.，AnoTndS
hodaM.(olecu
larc
iosynthesi
soi
popeptideantibi
‑
gener
es
pon
sibleforthrb
fthel
Bioeng
75(5)
:
323‑
326.
Ferm.
oticsindsurfactin..
turinaJ
1987).
木内 幹・悶谷直俊・ジョコ スヲスチョ・舟根和美 (市販納豆麹の分離と伺定.食総研報 50:18‑21.
1994).I
1assofpecialc
Maget心aturins，asna，R.andPeypoux，E(hysicochemicalipopeptides:bpore‑formingliological 昌nd poxicology8properties.T7:151‑
174.
1990)
.I
i
popeptides:interac‑
Maget
心andPtak，M.(turinlna，R.andycosubti
li
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tion
so
fm
4‑
40.
ono
layers.B
iochim.B
iophys.A
cta.1
023:3
mixedm2009) 抗真菌ワポペプチドを村山肇子・工藤俊輔・近藤久王室 (
7:41‑
47.
分泌する新規土壌細菌.関東学院大学工総研報 3阪口義広・百町満朗・杖 82003).B
acillussubtilis
3浩二・ JII根 太 (IK‑1080 のマルハナパチへの付表方法とトマト灰色かび病の防除効果 日植病報 6
9:94‑101.
1995).Eeypoux，E，
Wallach，ichel，Gffec
tof.
，PThimon，LndM.(].aor
phologyandmem‑
tur
inA，onmipopeptideantibiotic，ithelltr
astructureoeastc
icrobiol.Lett.
braneufyells. FEMSM06.
1288:10112008). Developmento
f.E.，Schneider，K.an
dLi，X.
Z.(Zhou，Tontrollinggentsf
romforc
biocontrolaoodmicrobiali
solatesfructicola.
eachbrownr
yMoniliniafpost‑harvestpotcausedb
Int.
].Ficrobiol.126:180‑
185.
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句および第ニ次感染源となる分生子の形成を抑制する効果を有すことが示された
朱のイチゴ葉上における生息密度No.2*:

No.2株のイチゴおける定着性を調査した. No.2株 の 懸 潟 液 (OD6∞=1. 0) を，栽培 2~3 週間後のイチゴ箇の葉面上に 5m! 噴霧

50C，明期 12時間/時期 12時間の人工し，風乾させた後， 22日に葉を直径 1cm気象器内で維持した.処理後 0，4，8，1
のりーフパンチャーで打ち抜きリーフディスクを滅蕗水1m!中で 1分間撹狩した.懸濁液を希釈した後， 100μiの各希釈液を TSA培 地 に 広 げ 370Cで 15時開培養した.培地上;こ形成されたコロニー数から葉における No.2株の生息密度を算出した.試験は 3株の商を用い，各調査段において各商品の葉から 3枚のリーフディスクを打ち抜いて調査した.なお，未接種のイチゴ苗葉面上における B.抑 制lisの菌筏度は検出

20c2未満)であった.試験の結果，処理 O限界以下 (fcmu/
日後から 1.
8X 12臼後にかけて No.2株の生息密度は 304cfu!
2から 12を推移し，イチゴ葉上で安定的にcm05c
fcm.4X 1u/維持されていることが明らかとなった(第 6図).また，試2日開でイチゴ葉における No.2株処濯による験を遂行する 1影響は観察されなかった.本試験では，花器における No.2株の定着伎の評価は行わなかったが，これまでにマルハナパ
芯1チにより運搬された B.抑 制 的 I080が訪花 21B後まで増殖することが報告されており(田口ら， 2003)，また， Demoz2006) はアボカド花上で β.subtilisがアボカド
andKorsten(の花の雌ずい表面に定着できることを報告していることから，本試験においても花器において NO.2株が定着している可能性が高く，抑制要因の 1つとなっていると考えられる
以上の結果から， No.2株はイチゴ植物の葉および花器にPowered by TCPDF (www.tcpdf.org)

日