実エンドウの莢のオートクレーブ抽出物による血清脂質改善効果

稲

垣

佳

映

目次
頁
第 1 章 序論

1

1-1 食品廃棄物の低減に向けて

1

1-2 食品廃棄部分の生理活性

31-3 実エンドウ（Pisum sativum L.）の莢についての研究6

第 2 章 本研究の構成

8

第 3 章 実エンドウの莢の生理的効果やその特性

10

3-1 実験方法

101) 実エンドウの莢のオートクレーブ抽出物（AE）の調製と組成分析

102) ラットの飼育と解剖

103) 血糖値，血清中脂質，肝臓中脂質の測定

144) 糞便中脂質と胆汁酸含量の測定

145) AE 及び AE 由来食物繊維のリパーゼ活性の測定

156) AE 及び AE 由来食物繊維のコレステロール吸着作用の測定

167) FISH 法による bifidobacteria の検索

178) bifidobacteria 菌株の培養

189) 統計処理20

3-2 結果211) AE の調製と組成分析

21i2) AE 摂取がラットの成長に及ぼす影響

213) 血糖値，血清中脂質，肝臓中脂質に対する AE の影響

244) 糞便中脂質と胆汁酸含量に対する AE の影響

245) AE 及び AE 由来食物繊維がリパーゼの活性に与える影響

296) AE 及び AE 由来食物繊維のコレステロール吸着作用

317) FISH 法による bifidobacteria の検出

318) AE の bifidobacteria 菌株に対する増殖促進効果

31

第 4 章 考察

35

引用文献

41

謝辞

52

ii

第1章 序論
1-1 食品廃棄物の低減に向けて
野菜や果物の種，皮，切れ端は，日常的にゴミとして環境に廃棄されてきた。しかし，これらの試料は食物繊維やポリフェノールが多く含まれ1-13)，加工の方法を工夫することでヒトに役立つ製品として利用することができる。このような天然資源の消費を抑制し，環境への負荷を低減する循環型社会の形成の施策の1つとして，平成12年に食品リサイクル法（農林水産省・環境省）が施行された14)。その趣旨は「食品の売れ残りや食べ残しにより，又は食品の製造過程において大量に発生している食品廃棄物について，発生抑制と減量化により最終的に処分される量を減少させるとともに，飼料や肥料等の原材料として再生利用するため，食品関連事業者（製造，流通，外食等）による食品循環資源の再生利用等を促進する。」である。
食品を製造する段階で廃棄されている部分は，主に飼料や肥料，油脂や油脂製品，エタノ
ール，メタン，炭化製品（燃料及び還元剤としての用途）として再生利用されている。しかし，再生利用の取り組みにもかかわらず，食品由来の廃棄物等は平成 25 年度において，約2,800 万トンであり，うち可食部分と考えられる量（いわゆる食品ロス）は，約 630 万トンと推測されている 15)。
食品ロスを減らすため，業種別（食品製造業，食品卸売業，食品小売業，外食産業）に再生利用等実施率が設定され，平成 27 年 7 月にはこれらの目標値が改正された 16)。特に食品製造業については，これまで 85%の目標値であったのに対し，平成 31 年度までに 95%と設定された。また，消費者庁では食品ロス削減のための「食品のムダをなくそうプロジェ

1

クト」が起ち上げられ，「消費者庁のキッチン」として野菜の茎や皮を使った料理レシピも掲載されている 17)。すなわち，これまで以上に食品廃棄物の再利用や工夫が必要と考えられる。

2

1-2 食品廃棄部分の生理活性
食物繊維やポリフェノールの生理活性に着目し，廃棄部分の機能性を検討した研究は，
ここ数年増え続けている。以下に，廃棄部分の食物繊維やポリフェノールに着目した研究
論文を紹介する。
ピーナッツの皮を用いた研究では，食物繊維やポリフェノールが小腸でのコレステロー
ル吸収を抑制し，血清及び肝臓コレステロールの低下と糞便胆汁酸排泄を促進することが報告されている1,2)。また，その皮に含まれるエピカテキンは，胆汁酸ミセルへのコレステ
ロール溶解性を下げる3)。
玉ねぎの皮は，盲腸内pHを低下させ，短鎖脂肪酸量を増やすことにより腸内細菌叢を改善させ4)，特にケルセチンは，ヒトにおいて2型糖尿病により上昇したLDLコレステロール
濃度を下げる5)。
イチゴの搾りかすに含まれるポリフェノールの1つであるプロアントシアニジンは，腸内短鎖脂肪酸を増加させるとの報告がある7)。
柑橘類の果皮による報告は多く，温州みかん果皮のエタノール抽出物は，2型糖尿病における高血糖や脂肪肝を改善し8)，柑橘類に含まれるフラボノイド類のヘスペリジンやナリンギンは血清や肝臓脂質の上昇を抑制する9,18,19)。柑橘類に関する脂質改善効果のメカ
ニズムの1つとしては，フラボノイド類とperoxisome proliferator-activated receptor（PPAR）ファミリーの関連性が明らかにされてきた10,11,20,21)。
野菜や果物の皮や茎といった廃棄部分には食物繊維も多く含まれる。リンゴ搾りかすの
食物繊維は，腸内で酢酸やプロピオン酸のような短鎖脂肪酸を増加させ，腸内環境を改善

3

する12)。食物繊維は，水溶性食物繊維（Soluble Dietary Fiber；SDF）と不溶性食物繊維（Insoluble Dietary Fiber；IDF）に分類される。特にSDFは，糞便中のトリグリセリドやコレステロールなどの糞便脂質の排泄を促す13,22,23)。グアガム，ペクチンといったSDF
は，腸を刺激することにより糞便脂質を排泄させ，結果として肝臓での3-hydroxy-3-

methylglutaryl coenzyme A（HMG-CoA）リダクターゼや7α-hydroxylase（CYP7A1）の活性を誘発することによりコレステロール合成や胆汁酸合成を促進することが明らかにされている24-26)。
一方，IDFは，糞便のカサを増すことにより糞便量を増加させる26)。さらに，イナゴマ
メのIDF中に結合しているポリフェノールには，血清脂質改善効果も報告されている27)。

IDFのヘミセルロースは植物の細胞壁に多く存在するが，小麦に含まれるヘミセルロース
は，エムデン-マイヤーホフ経路28)を通じてプロピオン酸や酢酸のような短鎖脂肪酸の生産を活発にし，胆汁酸の吸収と代謝を変え，LDLレセプターを活性化することで肝臓のコレステロール合成を阻害する29)。
また，食物繊維やポリフェノールの体内での影響には，肝臓でのコレステロール合成阻
害だけでなく，腸内での膵リパーゼ活性阻害13)やコレステロールの吸着活性30)による糞便への脂質排泄促進がある。さらに腸管からのコレステロール吸収を抑制する30-33)ことで，糞便脂質排泄を促進する結果，血中及び肝臓のコレステロール値が低下する。
廃棄部分に含まれる難消化性糖質の中にはbifidobacteriaが好んで利用するオリゴ糖があり，シコクビエのふすまに含まれるキシロオリゴ糖は，bifidobacteria増殖促進効果34)を有4

し，Bifidobacterium bifidum MB107 やBifidobacterium bifidum MB109のような

bifidobacteriaは腸内のコレステロールを資化することも明らかにされている35)。
以上，述べたように食品廃棄物中に含まれる食物繊維やポリフェノールは，血中及び肝臓
脂質低下効果や bifidobacteria 増殖促進効果を示し，健康補助食品としての可能性を持つことから，これらを含む廃棄物をヒトに活用することができれば，ヒトの健康だけでなく廃棄物の減少につながると考えられる。

5

1-3 実エンドウ（Pisum sativum L.）の莢についての研究
実エンドウは，マメ科のエンドウ（Pisum sativum L.）が完熟前に収穫されるやわらかい豆であり，その種子はグリンピース（Green-peas）と呼ばれる 36)。実エンドウは日本中で多く生産されており，消費されている。2014 年における農林水産省の作物統計調査の報告によると，収穫量は 6,700 トンである 37)。
実エンドウの莢は種子を覆い，種子中の子葉や胚軸を保護する役割を持つ 38)。さらに莢
には，タンパク質，デンプンや食物繊維のような多糖類，ビタミン，カルシウムや銅，亜鉛，鉄，マンガン，カリウム，マグネシウムのようなミネラルも存在し 38-40)，生理活性成分であるプロトカテク酸やクマル酸のようなポリフェノールも含まれている 38)。
実エンドウは，糞便への胆汁酸排泄を促し，肝臓では HMG-CoA リダクターゼや LDL
レセプターの活性を促進する結果，血漿コレステロール濃度を低下させる 41)。また，実エンドウのタンパク質は，胆汁酸合成の律速酵素である CYP7A1 の発現量を増やすことで胆汁酸合成や糞便への胆汁酸排泄を促し，さらに胆汁酸排泄を補償するため，Sterol

regulatory element-binding protein 2（SREBP-2）や HMG-CoA リダクターゼ，LDL
レセプターの遺伝子発現量を増加させる 42)。
前述したようなコレステロール低下効果の報告以外にも新たな品種開発のための実エン
ドウの部分別によるミネラル量の測定 39)についても報告されている。
多くの場合，実エンドウを食品として食べるのは中身の種子（グリンピース）の部分であり，周りの莢はあまり食べられることはない。さらに実エンドウの廃棄率は 55％であり，廃棄される割合は半分以上を占める。よって，年間収穫量と廃棄率から考えると，年6

間約 3,700 トンが廃棄されていると推測される。このように，一般的にはヒトに食されることのない莢であるが，種子が成長する段階において疾病や病原体から種子を守る保護機
能に加えて，活発な光合成をすることにより，種子の成長に必要なエネルギー源を合成する場としての役割も担っている 43)。即ち，莢にはタンパク質と食物繊維やデンプンなどの多糖類が含まれて，ビタミンやミネラルも豊富である 39,40)。莢の半分以上は食物繊維であり，多く検出されるキシロースはキシランやキシログルカン，セルロースと強く結合しているキシロガラクチュロナン由来である。さらに不溶性食物繊維の糖組成は，ほとんどがグルコースとキシロースであり，少量のガラクトースも含む 44)。グルコースやキシロース
は，多数結合することにより，キシランやキシログルカンを構成する。また，これまでの報告から莢に含まれる食物繊維は，ヒト糞便中の bifidobacteria 増殖促進効果を有する 45)
ことが知られており，キシロオリゴ糖が bifidobacteria の成長を強めることから活性の本
態は，キシロオリゴ糖であると推測される。ヘミセルロースはプロピオン酸や酢酸のような短鎖脂肪酸を生産することにより，コレステロール合成を阻害する 29)。実エンドウの莢
には，ポリフェノールであるフラボノイド配糖体とフェノール酸が含まれ，それらは抗酸化活性を持つ 46)。このように実エンドウの莢の抗酸化活性は，確認されている 46)が，摂取した場合のヒトや動物に対する生理活性は調べられていない。実エンドウの莢に含まれる食物繊維やポリフェノールが体内で健康増進に効果的な生理活性作用を示せば，これまで廃棄されていた莢の再利用に道が開かれると考え，実エンドウの莢を研究材料とした。

7

第 2 章 本研究の構成
本研究の目的は，実エンドウの莢の有効利用である。第 1 章に示したように実エンドウの莢の活性は報告されているが，摂取した場合のヒトや動物に対する影響については報告がない。
これまでの研究で，実エンドウの莢から Prosky 法 47)によって抽出した食物繊維を用いて動物実験を行った。食物繊維を 1%と 3%含有する飼料群を設定し，ラットに摂取させると Control 群と比較して 3%飼料群において有意な血清コレステロール濃度低下と糞便
中胆汁酸量の増加を認めた（稲垣佳映，平成 22 年度修士論文）。さらに，先行研究の野菜の非可食部分から抽出した食物繊維の bifidobacteria 増殖促進効果のスクリーニングにおいて実エンドウの莢由来の食物繊維は，bifidobacteria 増殖促進効果を有した 45)。これらの報告は，実エンドウの莢由来の食物繊維がラットの血清脂質改善と腸内のbifidobacteria 増殖促進効果を有する可能性を示している。
本研究の目的である食品由来の廃棄物の有効利用と実エンドウの莢のもつ生理活性を発揮させ，食品へと応用するためには Prosky 法 47)では時間もコストもかかりすぎる。そのため，莢から食物繊維とポリフェノールを同時に抽出できてかつ Prosky 法 47)よりも短時間で抽出できるオートクレーブ抽出法を用いて試料を調製した。48)。
まず，実エンドウの莢の凍結乾燥物と莢のオートクレーブ抽出物（Autoclaved

Extract；AE）の組成を分析した結果 48)，AE は食物繊維とポリフェノールが両方含まれ，中でも SDF は莢の凍結乾燥物に比べ，多く含有していた。そこで，この AE を添加した飼料をラットに与えた。実験では，体重変化や臓器重量，糞便重量，血清・肝臓・糞8

便中脂質を測定した 48)。実験の結果，AE 群では有意な血清中脂質低下と糞便中総脂質排泄量の増加が認められた。
その原因を追究するために in vitro で AE や AE 中の SDF（AE-SDF），AE 中の IDF（AE-IDF）を用いてリパーゼ活性の阻害やコレステロール吸着活性の検討を行った 48)。
リパーゼ活性の阻害は，食物繊維やポリフェノールの両方で報告がある 13,49)。また実エン
ドウの莢のメタノール抽出物でリパーゼ活性の阻害作用が報告されていることから 50)，本
研究では AE と AE からメタノール抽出でポリフェノールを除いた AE（AE which

Removed Polyphenol；AERP）及び AE-SDF で検討を行った 48)。その結果，全ての試料においてリパーゼ活性の阻害が認められた。
さらに，コレステロール吸着活性に関しては，AE 及び AE-IDF で有意な吸着活性が認められた。リパーゼ活性の阻害作用と同様にコレステロールの吸着活性については，食物
繊維やポリフェノールでいくつか報告されている 30-33)。
先行研究で実エンドウの莢の食物繊維は，bifidobacteria 増殖促進効果を有する 45)ことから，さらに AE の bifidobacteria 増殖促進効果を検討するためにラットの盲腸内容物を用いて FISH 法により実験を行った。その結果，AE は bifidobacteria 増殖促進効果を有することが明らかとなり，bifidobacteria の種類によってその効果が異なるかどうかの検討も加えた。
これらの結果に基づいて，体内において生理的活性を示した食品廃棄物である実エンド
ウの莢が，新規な健康補助食品として活用できる可能性を検討した。

9

第 3 章 実エンドウの莢の生理的効果やその特性

3-1 実験方法
1) 実エンドウの莢のオートクレーブ抽出物（AE）の調製と組成分析 48)
実エンドウ『ウスイ』（Pisum sativum L.）は，JA 和歌山から購入した。実エンドウから種子を取り除いた後，莢を凍結乾燥後に粉砕して篩にかけ，0.5 mm 以下のサイズの粒子を集めた。さらに，粉末にした凍結乾燥莢 100 g に 2 L の蒸留水を加えて 120℃，30
分オートクレーブ抽出した後，抽出液をろ紙（Advantec, No.1）で濾過した。濾液を再び凍結乾燥し，ミキサーで粉砕し，これを AE とした。

AE の構成成分を，還元糖は DNS 法 51)，タンパク質は Lowry 法 52)，総脂質は Folch
法 53)，食物繊維は Prosky 法 47)，ビタミン C はヒドラジン法 54)を用いて測定した。
総ポリフェノールはフォリンチオカルト法 55)で測定し，標準物質として没食子酸（gallicacid）を用いたため，データは全て没食子酸当量で表した。
タンパク質の測定の際，Lowry 法 52)で使用するフォリンチオカルト試薬がポリフェノールにも反応するため得られたタンパク含量から総ポリフェノール含量を差し引いた。

2) ラットの飼育と解剖 48)
4 週齢の Sprague-Dawley（SD）系雄性ラットと市販の固形飼料である CE-2 は，日本クレア（東京）より購入した。精製飼料については，オリエンタル酵母工業株式会社（東京）より購入した。精製飼料に混合した AE は第 3 章 3-1 の実験方法の 1)で調製したものを用いた。CE-2 での 3 日間の予備飼育の後，精製飼料での飼育は 28 日間行った。

10

動物実験は，神戸女子大学動物研究倫理委員会の承認を経て，神戸女子大学動物室利用
内規に従って行った。ラットは，温度 23 ± 1℃, 湿度 50 ± 1%, 明暗周期 12 時間サイクル（7:00 a.m.オン, 7:00 p.m.オフ）の条件下で，個別ケージにて飼育した。予備飼育終了
後，Table 1 に示すように 3 群に分けた。

AIN-93G56)を基準とした飼料を Control 食とした。一方，高ショ糖の摂取で，ラットの血中脂質濃度が上昇することが報告されている 57)。そこで本研究では，ポジティブコン
トロールとしてスクロース 25%とした飼料を HS（High Sucrose）食とし，さらに HS 食に AE を 3%添加した HS＋AE 食を設定した。HS 食及び HS+AE 食のスクロース及びAE は Control 食のコーンスターチと置き換えて飼料の成分調整を行った。AE をセルロ
ースではなくコーンスターチと置き換えたのは，試料分析結果から AE 中に 50%以上の還元糖が含まれ，食物繊維は 10%程度であったためである（後述）。
水と飼料は自由摂取とし，体重と飼料摂取量は週 3 回測定した。また，解剖 4 日前から糞便重量を測定し，採取した。
解剖は 18 時間絶食の後，29 日目に行った。本研究は，2011 年にペントバルビタール
ナトリウム（66 mg/kg）の単独麻酔で開始したが，それ以後，本剤の単独投与による麻酔は不適切との報告があったため 58)，2013 年以降はイソフルランとペントバルビタールナ
トリウム（50 mg/kg）の併用投与に切り替えた。麻酔下で腹部大静脈より採血し，3,000

rpm，15 分間遠心分離を行い，血清を得た。脱血後，臓器（肝臓と盲腸）と生殖器周囲脂
肪を摘出し，秤量した。肝臓は，重量を測定し，肝臓脂質測定用として生理食塩水 20 mLに懸濁した。

11盲腸は内容物を均一にした後，pH メーター（堀場製作所，D-21）で直接盲腸内 pH の測定を行った。盲腸内容物 0.2 g をクリーンベンチ内で外部からの細菌の混入に注意して滅菌スパーテルで採取し，1.8 mL の嫌気性検体希釈液に懸濁した。残りの内容物も取り除き，生理食塩水 20 mL に溶解し，残った盲腸壁の重量を測定した。
血清，肝臓，盲腸内容物は分析を行うまで‐20℃で冷凍保存した。解剖前に採取された糞便は，105℃で 17 時間，乾燥させた後，重量を測定し糞便乾燥重量と糞便中水分含量を求めた。その後，乾燥糞便はミルで粉砕し，測定時まで‐20℃で保存した。

12

Table 1. Composition of the diets [w/w (%)]
ControlHS

HS + AE

Casein

20.0

20.0

20.0

α-Cornstarch

52.9

37.9

34.9

Corn oil

7.0

7.0

7.0

Sucrose

10.0

25.0

25.0

Cellulose

5.0

5.0

5.0

AIN93 mineral mixture a

3.5

3.5

3.5

AIN93 vitamin mixture a

1.0

1.0

1.0

L-Cysteine

0.3

0.3

0.3

Choline bitartrate

0.25

0.25

0.25

Tert-butylhydroquinone

0.00140.00140.0014

AE

0.0

0.0

3.0

a: The mineral and vitamin mixtures were prepared according to the AIN-93G formula.56)
HS: High sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods, HS＋AE: HS containing AE.

133) 血糖値，血清中脂質，肝臓中脂質の測定 48)
血清と肝臓は‐20℃で冷凍保存したものを用いた。血糖値，血清トリグリセリド及び総コレステロール濃度の測定は，それぞれの市販のキット（Glucose CⅡ Test Wako，

Triglyceride E-Test Wako，Total Cholesterol E-Test Wako，和光純薬工業株式会社，大阪）を用いた。
肝臓は，総脂質の抽出を Folch 法 53)に準じて前処理し，得られた総脂質を秤量した後，t-butanol : methanol : triton X-100（50:25:25，容積比）に溶解した。肝臓のトリグリ
セリド，総コレステロール濃度はそれぞれのキットの手順に従って測定した。

4) 糞便中脂質と胆汁酸含量の測定 48)‐20℃に保存した乾燥糞便中の総脂質量を Folch 法 53)に従って抽出した。得られた脂質は，肝臓と同様に t-butanol : methanol : triton X-100（50:25:25，容積比）に溶解した。トリグリセリド，コレステロールの定量はそれぞれのキットの手順に従って行った。
胆汁酸の分析は，乾燥糞便 100 mg にエタノール 15 mL を加え，熱水中で 1 時間還流を行った後，35 mL の遠心管に上澄みのエタノール画分を集め，窒素ガスで乾固した。これを 3 回繰り返した後，集めたエタノール画分を別のガラス試験管に移し変えるため，蒸留水とエタノールの 1：4 の割合の溶液で洗浄し，溶液は窒素ガスで乾固した。乾固した残渣を 2 mL ずつのエタノール／蒸留水／へプタン／ジエチルエーテル（1 : 1 : 1 : 1，容量比）に分配し，へプタン／エーテル層を分離して蒸発乾固した。これを 2 回繰り返した
後，再び窒素ガスで乾固した。2 N NaOH 1.5 mL と蒸留水 0.5 mL を加えて溶解し，

14

123℃，240 min でオートクレーブ処理により，脱抱合を行った。石油エーテル 4 mL，ヘキサン 4 mL を順に加え，攪拌後に石油エーテル層とヘキサン層の中性脂肪を取り除いた。その後，2 N HCl で pH を酸性にしてジエチルエーテルで抽出を 2 回行い，蒸留水で4～5 回水洗した。遠心分離（3,000 rpm, 1 min）により，完全に水層とエーテル層を分離した後，エーテル層を窒素ガスで乾固した。これをメタノール 200 μL に溶かし，胆汁酸測定用とした。胆汁酸測定には，TBA テストワコー（和光純薬工業株式会社，大阪）を使用した。

5) AE 及び AE 由来食物繊維のリパーゼ活性の測定 48)
ブタ膵臓由来のリパーゼ（膵リパーゼ）（ナカライテスク，京都），タウロコール酸ナトリウム（TCA‐Na）（和光純薬工業株式会社，大阪），NEFA C Test Wako（和光純薬工業株式会社，大阪），その他の試薬も全て特級のものを和光純薬工業及びナカライテスク
株式会社から購入した。リパーゼの基質は，トリオレイン（和光純薬工業株式会社，大阪）を用いた。酵素反応には，①AE，②AERP，③AE-SDF の 3 種類の試料を添加してリパーゼ活性に及ぼす影響を調べた。
リパーゼ活性は，トリオレインから遊離するオレイン酸の割合を測定することにより示した 13)。基質溶液のエマルジョンは，タウロコール酸ナトリウム（0.83 mg/mL）を溶解させた 0.01 M トリス‐塩酸緩衝液（pH 7.4）3 mL とトリオレイン 160 mg を混合して5 分間×2 回の超音波処理を行った。さらに 3 mL のタウロコール酸ナトリウム含有トリ
ス‐塩酸緩衝液を加え，同様に超音波処理により完全にトリオレインを緩衝液に撹拌させ15た。この反応液 2 mL に 0.1 mg/mL の膵リパーゼを 0.2 mL（0.108 U）加えて 37℃，

30 分間反応させた。遊離してきたオレイン酸は，NEFA C-Test Wako を用いて測定した。

①AE，②AERP，③AE-SDF を基質溶液に加えるときは，それぞれ 40 mg，80 mg になるように混合し，再び超音波処理によって基質溶液を懸濁した。

6) AE 及び AE 由来食物繊維のコレステロール吸着作用の測定 48)
タウロコール酸ナトリウム，卵黄由来ホスファチジルコリン，塩化ナトリウム，リン酸ナトリウム，コレステロール，その他の試薬（和光純薬株式会社，大阪）は全て特級を使用した。コレステロールミセル溶液は，タウロコール酸ナトリウム 6.6 mM，卵黄由来ホスファチジルコリン 0.6 mM，塩化ナトリウム 132 mM，リン酸ナトリウム 15 mM，コ
レステロール 0.5 mM を 24 時間，37℃で超音波処理することにより調製した 30)。AE-

SDF， AE-IDF は，Prosky 法 47)に従って抽出した。本研究の試料分析結果によると，AE
1 g に対して AE-SDF は約 100 mg，AE-IDF は約 50 mg が含まれていた。そこでコレス
テロールミセル溶液 7 mL には，AE を①1,000 mg，②2,000 mg，AE-SDF を③100

mg，④200 mg，AE-IDF を⑤50 mg，⑥100 mg の 6 種類を混合し，37℃，2 時間保温
し，続いて 8,400 rpm，10 分間，遠心分離して，上清をろ紙（size < 1.6 μm ;GF/A, GE
ヘルスケア・ジャパン株式会社，東京）で濾過した後，濾液中のコレステロール量は，Cholesterol E Test Wako を用いて測定した。

16

7) FISH 法による bifidobacteria の検出 48)
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（Fluorescent In Situ Hybridization; FISH）法
は，分子生物学的方法の 1 つであり，染色体・細胞・組織などから核酸を抽出することなく，形態を保持したまま核酸の特定部位に相補的な蛍光標識プローブをハイブリダイゼー
ションさせて検出する方法である 59)。本研究では，bifidobacteria や clostridia の rRNA
配列に反応する特異的 DNA オリゴヌクレオチドを cyanin3 (Cy3)で修飾したプローブを用い，また全ての菌を計測するため，DAPI（4’,6-diamidino-2-phenylindole）を併用した。DAPI は，DNA に対して強力に結合するため，菌の種類を問わず染色することができる。先行研究では，莢由来食物繊維を含む培地で bifidobacteria の増殖が認められた 45)
ため，本研究では AE 摂取ラットの盲腸内容物中でも bifidobacteria の増殖が起こるのか検討した。
実験材料はラット盲腸内容物を用いた。プローブは Bifi53 と Erec482 を用いた 60,61)。
微生物の総数の計測は DAPI 染色（同仁化学研究所，熊本）を用いた。菌特異的 16S

rRNA に対応した DNA オリゴヌクレオチドに Cy3 を結合させたプローブは Sigma 社（USA）から購入した。

FISH 法による同定は，高田らの方法を改変して行なった 59)。盲腸内容物 0.2 g は，嫌気性検体希釈液 1.8 mL に懸濁した溶液とガラスビーズ 5 g が入った滅菌済み遠心管の中に入れ，9 倍量の PBS（Phosphate buffered saline）溶液と撹拌した後，ろ紙（Whatman，No.1）で濾過して一晩放置した。濾液は 3 倍量の PFA

17

（Paraformaldehyde）溶液を加え，ボルテックスミキサーでよく混和した後，マイクロチューブに小分けにして‐80℃に保存した。保存溶液 10 μL を MAS コートスライドガラス（松浪硝子工業株式会社，大阪）上に広げた。室温で 1 時間，40℃で 15 分間乾燥させた後，10 分間 96%エタノールに浸漬した。ハイブリダイゼーション溶液 10 μL をスラ
イドガラス上の乾燥した盲腸内容物溶液に添加し，カバーガラスを載せた。ハイブリダイ
ゼーションは，15～20 時間，40℃で加湿チャンバー内で行った。終了後，スライドガラ
スを洗浄溶液（50 mM NaCl，4 mM Tris-HCl，0.02 mM EDTA）中に浸漬した。カバーガラスが自然に外れるのを待った後，カバーガラスを外し，スライドガラスを 20 分間保持した。スライドガラスを蒸留水に浸漬し，40℃で乾燥させた。DAPI 溶液の 4 μL
を，スライドガラス上に滴下し，カバーガラスをのせた。市販のマニキュア（ニトロセル
ロースによる接着作用）でカバーガラスの縁をシールした後，顕微鏡で観察した。顕微鏡
は，U-REL-T 装置と組み合わせた BX53 蛍光顕微鏡（オリンパス，東京）を用いた。蛍光ラベルされた細菌数の測定は，数計測ソフト WinProof ver.6.4（三谷商事，大阪）を用いた。測定中の退色を防止するために蛍光退色防止剤（BIOTIUM，USA）を用い，15
視野観察した。計算は総菌数に対する bifidobacteria 及び clostridia の比を求めた。

8) bifidobacteria 菌株の培養
B. bifidum JCM 1254（JCM1254 株）と B. longum subsp. infantis JCM 1222
（JCM1222 株）及び B. longum subsp. longum JCM 1217（JCM1217 株）は，理化学研究所バイオリソースセンター筑波研究所より購入した。培養に用いる培地には，ペプト

18

ンと酵母エキスを使用し，培地に混合する抽出物は第 3 章 3-1 の実験方法の 1)で調製したAE を用いた。PY 培地はペプトンと酵母エキスを等量含む培地であるが，前培養では 1%
PY 培地を用い，本培養では 0.5% PY 培地へ AE が 0.5%となるように混合した。本培養を行う際にポジティブコントロールとして 0.5% PY 培地に既知のプレバイオティククス
であるラクツロースを 0.5%含む培地を調製した。菌の生育による急激な pH の低下を抑え，菌の死滅を防ぐために，培地に含まれる糖の濃度を低く設定した。

JCM1254 株と JCM1222 株及び JCM1217 株について，まず前培養を行った後，その中から一定量を採取し，本培養培地に添加して培養を行った。具体的には，濁度標準懸濁液である McFarland 62)の中から McFarland 2 と同程度の濁度となるように加える菌量を調製し，本培養開始時 0 時間の菌数が毎回ほぼ一定となるようにした。こうして調製した
菌液は bifidobacteria の菌数として 1 mL 当たり 104 個前後に相当する。bifidobacteria 培
養のための操作は嫌気的条件下で行うため，グローブボックス内に窒素ガスを充填して行った。グローブボックス内の残存酸素濃度は oxygen gas meter OX-94G（理研計器株式会社，東京）を用いて測定した。嫌気培養はガスパック嫌気システム（BD，USA）を用いて行った。各菌株の前培養は，JCM1254 株，JCM1222 株ともに 37℃，48 時間の嫌気培養を行い，本培養も同条件で嫌気培養を行った。

bifidobacteria の増殖を促進する効果の有無を調べるため，本培養を行った際の各菌株の増殖率を次のようにして比較した。本培養開始 0 時間と終了時の菌数を求めるため，それぞれの培養液を GAM 寒天培地（日水製薬株式会社，東京）に塗布して，同条件の嫌気培養を行い，コロニーカウントを行った。増殖率は，培養終了時の菌数を培養開始時の菌19

数で割ることで求めた。ポジティブコントロールとして用いたラクツロースによる増殖率と比較して有意に増加した場合，AE は特異的増殖促進効果を持つとした。

9) 統計処理
全ての実験結果は 3 回以上行い，平均値±標準偏差で示した。凍結乾燥莢と AE の試料分析及び bifidobacteria 各菌株に対する増殖促進効果については t-検定を用い，その他全ての結果は 3 群間で比較するため，Tukey 検定を用い，有意水準 5%とした。統計解析ソ
フトは，SPSS Version 21（IBM SPSS 21, Inc. USA, 2012）を使用した。

20

3-2 結果
1) AE の調製と組成分析
実エンドウの莢には，食物繊維やポリフェノールが含まれている 38-40,48)ことが知られている。多くのフェノール化合物は，多糖類やタンパク質に結合し 63)，それらを酵素法で抽出すると収量に 100 倍の差があるのに対し 38)，オートクレーブ抽出は，安定した収量を得ることが可能である(32.5±0.07 g/100g) 48)。さらにオートクレーブ抽出では酸やアル
カリ，有機溶媒を使用することなく食物繊維やポリフェノールを同時に得ることができる
ため，のちの食品への展開にも適している。以上のことから実エンドウの凍結乾燥莢をオートクレーブ抽出し，抽出液を凍結乾燥させて AE の組成を分析した（Table 2）。凍結乾燥莢と AE を比較すると，AE では AE-IDF とポリフェノールが有意に減少したが，AE-

SDF は有意に増加した。還元糖やタンパク質，脂質，シトステロール量には有意差はなかった。

2) AE 摂取がラットの成長に及ぼす影響
AE を摂取することが，体重増加量や臓器重量に影響するかどうかを調べた。飼育期間
中，全ての群で下痢は観察されなかった。体重変化は Fig.1 に示すように 3 群の間に有意差は認められなかった。また飼料摂取量，肝臓重量，盲腸重量に関しても有意差は認められなかった。結果より AE は，体重増加や臓器重量に影響を与えないことが明らかとなった。

21

Table 2. The composition of lyophilized pea pods and AE
Components

Lyophilized pea pod

AE

Reducing sugar

335.0 ± 52.3

528.8 ± 89.3

Protein

51.6 ± 5.9

32.5 ± 12.0

Total lipids

33.3 ± 23.1

12.0 ± 2.1

Sitosterol

0.4 ± 0.1

1.1 ± 0.3

Polyphenol (mg of GAEa)

114.4 ± 0.4

17.6 ± 14.0*

Vitamin C

1.8 ± 0.1

0.2 ± 0.2*

Soluble dietary fiber

8.1 ± 0.7

91.7 ± 0.8*

Insoluble dietary fiber

292.0 ± 7.3

48.7 ± 1.8*
(mg / g dry matter)

Values are means ± SD (n=3). T test was conducted.
*Asterisk indicated significance, compared with lyophilized pea pod (p＜0.05).
AE: Autoclaved extract of pea pods.
a: Gallic acid equivalence.

22

Body weight ( g )

400
300
start
200
100
0
5

6

7

8

9

Age (week)
ControlHS

HS＋AE

Fig.1. Effect of AE on the body weight gain.
Body weight of each group was weighed three times a week.
Values are mean ± SD.
(Control group : n=5, HS group : n=5, HS+AE group : n=5.)
HS: high sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods, HS+AE: HS containing AE.
Start: It is a day which began to take the experimental diet.

233) 血糖値，血清中脂質，肝臓中脂質に対する AE の影響
AE が血糖値，血清中脂質，肝臓中脂質に影響を与えるかを調べた。血糖値（Fig. 2）は，3 群間（Control 群，HS 群，HS+AE 群）での有意差は認められなかった。血清中のトリグリセリド濃度（Fig. 3）は HS 群と比較して HS+AE 群で有意に低下し，総コレス
テロール濃度（Fig. 4）は HS 群と比較して HS+AE 群と Control 群で有意に低下した。
肝臓の総脂質量（Fig. 5），トリグリセリド量（Fig. 6），総コレステロール量（Fig. 7）に関して 3 群間の有意な差は認められなかった。結果から，AE は血糖値や肝臓中脂質には影響を与えないが，血清中脂質には影響を与えることが明らかとなった。

4) 糞便中脂質と胆汁酸含量に対する AE の影響
血清中脂質が低下した要因として，AE による糞便中の脂質や胆汁酸の排泄促進が推測されるため糞便中の脂質含量と胆汁酸量を調べた（Table 3）。AE の摂取によって糞便量，水分量（%）に 3 群間の差はなかった。糞便中総脂質量（mg）は，HS 群と比べ

HS+AE 群では有意に増加した。さらに，糞便全体を占める総脂質量（%）も HS 群に比べ，有意に増加した。Control 群と比較してトリグリセリド量（%）も有意に増加したが，コレステロール量（%）は増加傾向を示した。また，胆汁酸排泄量（μg）には有意な差は認められなかった。この結果から，HS+AE 群では糞便中総脂質排泄量が増加したことが明らかとなった。

24

Serum glucose (mg / dL)

200

150

100

50

0
ControlHS

HS+AE

Serum triglyceride (mg / dL)

Fig.2. Effect of AE on serum glucose levels.
Values are mean ± SD (n = 5).
Tukey’s test was conducted.
HS: High sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods,
HS＋AE: HS containing AE.

150

*

100

50

0
ControlHS

HS+AE

Fig.3. Effect of AE on serum triglyceride levels.
Value are mean ± SD (n = 5).
Tukey’s test was conducted. *Asterisk denotes significance at p < 0.05.
HS: High sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods,
HS＋AE: HS containing AE.
25

Serum cholesterol (mg / dL)

120

*

*

80

40

0
ControlHS

HS+AE

Fig.4. Effect of AE of pea pods on serum cholesterol levels.
Values are mean ± SD (n = 5).
Tukey’s test was conducted. *Asterisk denotes significance at p < 0.05.
HS: High sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods,
HS＋AE: HS containing AE.

Total lipid contents (mg / g of liver)

60

40

20

0
ControlHS

Fig.5. Effect of AE on total lipid contents of liver.
Value are mean ± SD (n = 5).
Tukey’s test was conducted.
HS: High sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods,
HS＋AE: HS containing AE.

26

HS+AE

Triglyceride contents (mg / g of liver)

80

60

40

20

0
ControlHS

HS+AE

Total cholesterol contents (mg / g of liver)Fig.6. Effect of AE on triglyceride contents of liver.
Values are mean ± SD (n = 5).
Tukey’s test was conducted.
HS: High sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods,
HS＋AE: HS containing AE.

5
4
3
2
1
0
ControlHS

Fig.7. Effect of AE on total cholesterol contents of liver.
Values are mean ± SD (n = 5).
Tukey’s test was conducted.
HS: High sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods,
HS＋AE: HS containing AE.
27

HS+AE

Table 3. Effect of AE on the feces profile.
GroupsFeces profile
ControlHS

HS+AE

Fecal wet weight , g/3 day

6.87±1.34

6.85±1.86

6.64±0.90

Fecal water contents, % of wet weight

22.4±3.44

21.43±7.80

20.07±3.21

Total bile acid , µg/3 day

236±96.2

168±57.2

178±45.9

Total lipid , mg/3 day

356±93.0 ab

319±80.5 a

488±117 b

Total lipid, % of wet weight

5.21±1.08 ab

4.73±0.81a

7.55±2.24b

Triglyceride, % of wet weight

0.45±0.13a

0.58±0.15ab

0.69±0.08b

Cholesterol, % of wet weight

0.33±0.07

0.43±0.14

0.62±0.23*

Values are mean ± SD (n = 5).Tukey’s test was conducted.
Different superscript means significance (p＜0.05.).
*p value versus control was p=0.059.
HS: high sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods, HS＋AE: HS containing AE.

285) AE 及び AE 由来食物繊維がリパーゼの活性に与える影響
ラットを使った in vivo の実験では，HS+AE 群は HS 群に比べて有意に血清脂質が低下した（Fig. 3）。さらに，HS+AE 群の糞便中総脂質量が増加した（Table 3）。これらの結果
から AE による血清脂質低下の要因は，腸内でのリパーゼ活性阻害によるトリグリセリドと AE によって吸着されるコレステロールの糞便への排泄量が増加するためと予想し，リ
パーゼ活性阻害及びコレステロール吸着力の in vitro における実験を行った。酵素反応系でAE 無添加と AE 添加を比べて，添加によってリパーゼ活性が低下した。AE，AERP，AESDF をそれぞれ 40 mg 添加した場合，全ての試料においてリパーゼ活性阻害（%）に有意差は認められなかった。しかし，80 mg 添加した場合では AE 40%，AERP 70%，AE-SDF

60%の有意なリパーゼ活性阻害が認められた（Fig. 8）。また，AERP で活性阻害は上昇したため，ポリフェノールはリパーゼ活性阻害を有していないと考えられる。結果から，AEはリパーゼ活性阻害があり，その要因の主な成分はポリフェノールではなく AE-SDF であることが示唆された。

29

Lipase activity inhibition ( % )

100
80

AE

AERP

60
40

AE-SDF

*
*
*

20
0
0

40

80
(mg / 6mL)

Fig. 8. Effect of AE on lipase activity in vitro.
Inhibition of lipase activity was determined as the reduction of activity induced by AE.
Experiments were repeated more than three times.
*Asterisks denote significant differences versus 0 mg/6 mL (p < 0.05).
AE: Autoclaved extract of pea pods, AERP: AE which removed polyphenol,
AE-SDF: Soluble dietary fiber from AE.

30

6) AE 及び AE 由来食物繊維のコレステロール吸着作用
in vitro のコレステロール吸着実験では，コレステロール添加溶液の AE 無添加と比べて，AE 2,000 mg 添加によってミセル中のコレステロール量が有意に減少した。さらに

AE-SDF では有意な減少はみられなかったが，AE-IDF 100 mg 添加ではコレステロール
量は，有意に減少した（Fig. 9）。
結果から AE はコレステロール吸着作用があり，その主な成分は AE-IDF であると考えられた。

7) FISH 法による bifidobacteria の検索
盲腸内の bifidobacteria と clostridia の菌数において AE の摂取によって HS+AE 群のbifidobacteria が総菌数に占める割合は，HS 群よりも有意に増加した（Table 4）。一方，
clostridia の総菌数は減少傾向を示した。
結果から，AE は bifidobacteria 増殖促進効果を有することが明らかとなった。

8) AE の bifidobacteria 菌株に対する増殖促進効果7)の実験結果から，AE は盲腸内で bifidobacteria の増殖を促進することが明らかとなった。そこで，bifidobacteria 菌株の種類によって AE の増殖促進効果に違いが見られるのかどうか in vitro で検討した（Table 5）。今回は，ヒトの腸内に存在する B. bifidum

JCM 1254 と B. longum subsp. infantis JCM 1222, B. longum subsp. longum JCM 1217
を用いて増殖促進が見られるかどうか検討した（Table 5）。

31

ポジティブコントロールとしたラクツロースに対し，AE は JCM1254 株で有意な増殖促進を示した。しかし，JCM1222 株，JCM1217 株には有意な増殖促進を示さなかった。この結果から AE は特定の bifidobacteria 菌種に対して増殖を促進することが明らかになった。

32

Cholesterol adsorption ( % )40
AE

AE-SDF

AE-IDF

30

*

20

10

*

0
0

1,000
100
50

AE
AE-SDF
AE-IDFAE 2,000
AE-SDF200
AE-IDF100(mg / 7 mL)

Fig.9. Effect of AE on cholesterol adsorption in vitro.
A cholesterol micellar solution was prepared, and cholesterol adsorption experimentswith AE, AE-SDF, or AE-IDF were conducted.
*Asterisks denote significant differences versus 0 mg/7 mL (p < 0.05).
AE: Autoclaved extract of pea pods, SDF: Soluble dietary fiber from AE,
IDF: Insoluble dietary fiber from AE.

33

Table 4. Effect of AE on Bifidobacteria and Clostridia in the cecum
Cy3/DAPIGroupsControlHS

HS + AE

Bifidobacteria

0.186±0.046a

0.178±0.050a

0.239±0.053b

Clostridia

0.234±0.056

0.223±0.050

0.215±0.043

Values are mean ± SD (n=3/group). Tukey’s test was conducted.
Different superscript means significance (p＜0.05).
Cy3/DAPI: Bifidobacteria or Clostridia / Total microbiota
HS: High sucrose, AE: Autoclaved extract of pea pods,
HS＋AE: HS containing AE.

Table 5. Effect of AE on the growth Bifidobacterium longum JCM1217 andBifidobacterium infantis JCM1222, Bifidobacterium bifidum JCM1254.
Growth rate*
JCM 1217

JCM 1222

JCM 1254

Lactulose3.3±2.5

114.6±103.1

24.2±10.5aAE

10.7±18.5

34.0±58.9

295.6±162.4b*The number of bacteria after incubation / the number of bacteria before incubation.
Tukey’s test was conducted.
Different superscript means significance (p＜0.05).
AE: Autoclaved extract of pea pods.

34

第 4 章 考察
本研究の目的は，実エンドウの莢を有効利用し，さらに莢のオートクレーブ抽出物が新規な健康補助食品として活用できるか検討することにある。そのため AE 摂取による健康増
進効果についてラットを次の 3 群に分けて実験を実施し，検討した。AIN-93G を基準とした飼料を与えた群を Control 群とし，血清脂質を上昇させる高ショ糖（HS）食を与えたラットの HS 群と HS 食に AE を添加した HS+AE 群の 3 群を設定した。

AE は糖分析の結果ではグルコースを 90%含んでいることから，グルコースで構成された難消化性多糖のレジスタントグルカン（RGM）の論文 63)と飼料添加濃度について比較した。ヒトの場合，RGM の下痢を引き起こす最大無作用量は，0.9 g/kg BW であると報告され，さらに RGM 5％の添加では，1 匹のラットが死亡し解剖すると盲腸の肥大が見られた。ラットの RGM の最大無作用量は，体重から考え 0.3 g/300 g（ラットの平均体重）と64)計算できる。ラットは 1 日当たり平均 30 g の飼料を摂取するため，AE 3%の添加では 1 日
当たり 0.9 g の AE を摂取している。この量は前述の RGM の最大無作用量より多く，約 3倍量である。しかし，他の報告では試料の添加量が食物繊維やポリフェノール単体の添加では 0.1～1%5,8)，抽出物のような混合物では 3～10%1,4,6)と幅広く設定され，いずれも下痢は起こしていない。本研究では，試料分析の結果から AE は食物繊維だけでなく，還元糖や様々な物質が含まれている混合物であり，ポリフェノールもわずかであるが含まれていた。
飼料 100 g 当たりの AE 添加量を 3%としたのは，食物繊維同様にポリフェノールの過剰摂取は下痢を引き起こすことが知られている 65)ことや AE が精製成分ではなく混合物であることを考慮したからである。

35

実験期間中，全ての群で体重変化や飼料摂取量に関して差はなく，また下痢も起こらなかった。さらに解剖時には生殖器周囲脂肪，肝臓，盲腸の重量及び盲腸内 pH に関しても有意差は認められなかった。
本研究で，血清トリグリセリドとコレステロール濃度は HS 群と比べて HS+AE 群では有意に上昇が抑制されていた。食物繊維は，糞便として総脂質や胆汁酸を排泄することで結果として血中脂質を低下させる 22,25)。本研究では，HS 群に比べて HS+AE 群の糞便中胆汁酸排泄量は差がなかったが，糞便中総脂質排泄量は有意に増加した。この結果から，血清脂質濃度は糞便中総脂質排泄量の増加によって低下したと考えられる。しかし，糞便中のト
リグリセリド量と総コレステロール量には有意な増加は認められなかった。そのため，糞便中の総脂質量，トリグリセリド量，総コレステロール量を糞便重量当たりの割合（%）で表し，再び 3 群間の比較を行った。その結果，糞便中トリグリセリド量（%）は Control 群と比べて HS+AE 群で有意に糞便重量当たりの含量が増加を示した。さらに，糞便中総コレ
ステロール量（%）は，Control 群に比べて HS+AE 群で糞便重量あたりの含量が増加傾向（p=0.059）を示した。このことから AE による血清中脂質の上昇抑制は，糞便からの排泄と関わりがあることが示唆された。
リパーゼは，トリグリセリドを加水分解するため，活性が阻害されると糞便中へのトリグ
リセリド量は増加すると推測されることから AE によるリパーゼ活性阻害作用について検討した。試験管内のリパーゼ活性阻害実験で，AE-SDF と AERP では，AE を添加していないリパーゼ活性と比べて 40%以上の活性阻害を示した。この結果より活性阻害のメカニ
ズムは明らかではないが，リパーゼ活性阻害は AE よりも AERP の方が高く，食物繊維が36関係すると考えられた。AERP が，リパーゼ活性阻害を示した理由として AE 中の食物繊維の中でも含有量の高い AE-SDF の濃度が相対的に上昇したことによると考えられる。

SDF やポリフェノールは，リパーゼ活性阻害を持つという報告がある 13,49)。Slanc らは，
実エンドウ（Pisum sativum）の莢のメタノール抽出物が試験管内でリパーゼ活性阻害を示
し，抽出物からポリフェノールを取り除いた後の抽出物はコントロールと比べて活性阻害が 40%未満であったと報告している 50)。実エンドウ（Pisum sativum）を含む全ての植物
は，フェノール酸を含んでおり 63)，莢にもポリフェノールが含まれているが，AERP で活性阻害を持ったことから AE 中のポリフェノールはリパーゼ活性阻害を示さないと示唆された。その理由としてオートクレーブ抽出によってポリフェノール骨格が壊れ，構造が変化したことが考えられる 66)。
食物繊維，特に SDF やポリフェノールはコレステロールや胆汁酸塩を沈殿させることが報告されている 30-33)。本研究では，試験管内で AE はコレステロールを吸着した。第 3 章

3-1 の実験方法の 6)のコレステロール吸着作用の実験では，2,000 mg の AE によって 30%
以上のコレステロールが吸着された。また，AE-IDF 100 mg がコレステロールを有意に吸着したため，AE-IDF がコレステロールを吸着していると推測した。一般的には水分を含んだ SDF の粘りによってコレステロールを吸着する 68)が，本研究では AE-IDF が有意なコレステロール吸着活性を示したことから，AE-IDF はコレステロール排泄を促進すると考えられる。
オートクレーブ処理によって大麦や小麦ふすまに含まれるアミノ酸やグリコシル化合物の含量は変化する 68,69)。また，脱穀大麦はオートクレーブしていないサンプルに比べてオ37

ートクレーブしたサンプルで相対粘度が増加する 68)。このことにより，今回の実験でも AE-

IDF でコレステロール吸着作用がみられたのはオートクレーブによって AE-IDF の粘性も増加したのではないかと考えられる。
今回の実験では，SD ラットは 1 日に平均として 30 g の実験食を摂取しており，ラット
が AE を 1 日 0.9 g 摂取すると，AE- SDF は 90 mg，AE-IDF は 45 mg を摂取していることになる。In vitro の実験で AE-IDF がコレステロールを有意に吸着した結果と比較す
ると，不十分な量であるが，AE の摂取を継続することで腸管内の AE-IDF がコレステロールを吸着することにより糞便中へ排泄することができると考えられる。
また，本研究で，3 群を比較して体重や飼料摂取量に有意差は認められなかった。これらの結果から AE が成長や飼料摂取に影響を与えないと言える。
第 3 章 3-2 の実験結果の 1)から AE は植物ステロールの 1 つであるシトステロールを含んでいることが明らかになった。シトステロールは Pisum sativum の種子と莢に含まれることが報告されている 70)。植物ステロールやスタノールは，腸でのコレステロール吸収を阻害することによって血中や肝臓のコレステロール低下をもたらすことが証明されており，

β-シトステロール（0.4 mM）は，腸溶液モデルでコレステロールの溶解度を 43%低下させることができる 71)。AE 1 g にはシトステロールがおよそ 1 mg 含まれ，この量は 2.5 mMに相当するため，腸管内のコレステロールの溶解度は低下し，糞便中へのコレステロール排泄は増加すると推測される。しかし，HS+AE 群の糞便中総コレステロール排泄は有意な増加を示さなかったため，シトステロールの関与は少ないと考えられる。

38

AE は，盲腸内の bifidobacteria を増加させる働きを持つ。bifidobacteria は，ヒトの健康に有益であることが知られており，bifidobacteria によって血清コレステロールが低下するとの報告もある 72)。AE の糖分析の結果では，キシロースが得られた（2.5±0.61 mg/g）。
キシロオリゴ糖は，プレバイオティクス活性を持つことが示されている 33)。また，in vitroの実験で bifidobacteria は，コレステロールを添加した培地においてコレステロールを資化することにより，培地中のコレステロール濃度の低下をもたらしている 35)。この実験で血清コレステロール濃度が低下したにもかかわらず，糞便中総コレステロール量が有意に増加しなかったのは，bifidobacteria がコレステロールを炭素源として資化したと推測される。
これまでの結果から，AE が混合物であるため血清中脂質低下の特異的な因子を特定することは難しい。また，この実験では肝臓中脂質量や糞便中胆汁酸量には有意な差は得られなかった。そのため，AE による HMG-CoA リダクターゼの阻害や CYP7A1 活性による胆汁酸生成への影響については調べなかった。

AE のポリフェノール含量は，凍結乾燥莢と比べて減少したが，AE-SDF 含量は 10 倍以
上も増加した。一方，同じように凍結乾燥莢で動物実験を行ったが，脂質低下効果は得られなかった（データは示さず）。このことから，実エンドウの莢はオートクレーブ抽出をする
ことにより，生物学的活性を持つと考えられる。しかし，前述のように実エンドウの莢にはポリフェノールが含まれており，ポリフェノールには今回の実験同様にリパーゼ活性阻害やコレステロール吸着活性を持つものも存在する 30,31,68)。今回の実験では，120℃，30 分
でオートクレーブ抽出を行ったため，ポリフェノールの構造が変化して様々な活性を示さなくなったと考えられる。実エンドウの莢の食物繊維とポリフェノールの 2 つの活性を上39

手く引き出すには，今回のオートクレーブ抽出よりも両方を効率よく抽出できる時間と温度の検討が必要である。
本研究で，実エンドウの莢のオートクレーブ抽出物は，血清中のトリグリセリドや総コレ
ステロール濃度をコントロールすることができる活性を持つことを明らかにした。さらに，
糞便への総脂質やトリグリセリドの有意な排泄増加，有意ではないが総コレステロールの排泄を増加させ，盲腸内容物中で bifidobacteria の増殖を引き起こすことも明らかとなった。
以上の結果から，実エンドウの莢のオートクレーブ抽出物は新規な健康補助食品として活用できる可能性があると考えられる。

40

引用文献

1) Tamura T, Inoue N, Shimizu-I A, Tadaishi M, Takita T, Arai S and Mura K: Serumcholesterol reduction by feeding a high-cholesterol diet containing a lowermolecular-weight polyphenol fraction from peanut skin.
Biosci Biotechnol Biochem 76: 834-837, 20122) Shimizu-I A, Udagawa H, Kobayashi-H K, Mura K, Tokue C, Takita T and Arai S:
Hypocholesterolemic effect of peanut skin and its fractions: A case record of rats fed
on a high-choesterol diet. Biosci Biotechnol Biochem 73: 205-208, 2009.
3) Tamura T, Inoue N, Ozawa M, Shimizu-I A, Arai S, Abe N, Koshino H and Mura K:
Peanuts-skin polyphenols, procyanidin A1 and epicatechin - (4β→6) - epicatechin(2β→O→7, 4β→8) - catechin, exert cholesterol micelle-degrading activity in vitro.
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謝辞
学位論文をまとめるにあたり多くのご指導とご支援を賜りました，
神戸女子大学大学院家政学研究科の堀田久子教授に謹んで感謝の意を表します。
本論文をご精読いただき，数々のご助言とご指導を賜りました小倉
嘉夫教授に深謝いたします。
本論文に関して様々なご助言を頂きました，山本勇教授に心より感謝いたします。
また，堀田研究室の院生はじめ学生の皆さん，実験動物の世話や解剖，試料の分析など，多くのご協力に心より感謝いたします。

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