臨床微生物検査の基礎～検体採取から報告まで～

2019.7.25 JANIS説明会
国立感染症研究所 戸山庁舎

株式会社マイクロスカイラボ
柳沢英二

検体の採取法・保存

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採取時の注意点①検体の採取時期・採取法
・抗菌化学療法開始前。
・患者に十分説明し最良の検体が採取できるよう協力を求める。
・検体量は適量（出来るだけ多く）採取する。
②抗菌化学療法治療中の患者・出来るだけ24時間以上中止して採取する。
・中止不可能の場合は血中濃度が一番低い時採取する。
③常在菌の混入、消毒薬の混入を避ける。

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・採取時の注意点④検体の乾燥をさける。
・滅菌生理食塩水、滅菌蒸留水を数滴滴下する。
・検体量が少ない場合は、直接培地に塗布する。
・綿棒は輸送用培地に入れる。
⑤嫌気性菌の存在を疑う場合は、専用容器を使用する。
⑥エチレンオキサイドガスで滅菌した容器は使用しない。

咽頭検体・採取は難しく検査結果の精度を左右する。
・舌を押し下げ咽頭が見える状態にして採取。
・扁頭部両側と咽頭後部及び滲出液の認める領域を採取。
・高濃度のリゾチームがあるため採取後輸送培地に入れる。

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喀痰検体
・早朝起きがけに採取するのが望ましい。
・うがいをし食物の混入を避ける。
・唾液の混入が少ない膿性痰を提出する。
・喀痰が出にくい患者は、生理食塩水や高張食塩液の超音波ネブライザーによるエアロゾル吸引を行う。

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Miller & Jones の分類
Ｍ１：唾液、完全な粘性痰
Ｍ２：粘性痰の中に膿性痰少量が含まれる
Ｐ１：膿性部分が１／３以下の痰
Ｐ２：膿性部分が１／３から２／３の痰Ｐ３：膿性部分が２／３以上の痰

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血液検体
・採血部位は70%イソプロピルアルコールもしくは70%エチルアルコールで清拭後、10%ポビドンヨード溶液などで消毒する。
・クローズン採血が望ましい。
・嫌気ボトルには空気を絶対入れないよう考慮する。
・血液量は取り扱い説明書の範囲内を添加する。

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消毒-1. キャップの消毒
ゴム栓部分の保護キャップです。
ゴム栓部分は無菌ではありません。
消毒が必要です。

ゴム栓の保護キャップです。
ゴム栓は無菌ではありません。
消毒が必要です。

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消毒-2. アルコール

皮脂・蛋白汚れを取りながら消毒します。

消毒液が乾燥するまで待ちます。

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消毒-3. ポビドンヨード

針の穿刺部位を中心として外側に向かって消毒します。

消毒液が乾燥するまで待ちます(1～2分)。

1112近年推奨されている血液培養時の皮膚消毒薬
ポピド
ンヨード

ヨード
チンキ

クロル
ヘキシ
ジンア
ルコール

Malaniらによる4つの研究2)3)4)6)

△

○

○

CUMITECH血液培養検査ガイドライン

△

○

○

米国感染症学会（Infectious Diseases
Society of America：IDSA）

△

○

○

推奨

英国保健省(Department of health；DH)の英国版のケア・バンドル

パッケージ化されたア
ルコール含有皮膚消毒薬キット◎Y’s Letter Vol.3 No.10
Published online 2010.06.17

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採 血

血液20～30mlを異なる部位（例えば左右の腕）から採血します。
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尿検体
女性
・消毒綿で尿道口付近よりはじめ、陰唇部から外側へと拭き取る。
・その後滅菌水で２～３回拭う。
・排尿しながら中間の尿を滅菌コップにとる。
男性
・包皮を十分に後返させ亀頭部を露質出させる。
・尿道口付近を消毒綿で拭う。
・その後滅菌水で２～３回拭う。
・排尿しながら中間の尿を滅菌コップにとる。
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便検体• 洗浄し乾燥した清潔な便器に直接排便する。
• 水洗トイレを使用する場合は、水に浮かぶ専用シートなどを使用する。
• 膿粘血部分があればその部分を採取する。
• 水様便はスポイトで吸引して採取する。
• 海外渡航者はその旨を明記する。
• 直接採取より自然排便がより望ましい。

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検体の保存・輸送時の注意点①指定された温度で保存・輸送する。
・検体は室温保存しない・冷蔵保存が原則（血液ボトル・髄液、淋菌・赤痢アメーバを疑う場合は例外）②検体が漏れない容器を用いる。
③綿棒の軸が木製なものは淋菌、結核菌、ウイルスに有害なので避ける。

検体の保存・輸送時の注意点④輸送培地を使用する。
Cary-Blair培地⇒糞便の輸送
Stuart培地⇒淋菌の輸送
Amie培地⇒咽頭粘液、耳鼻科材料⑤スワブは空気を含むので嫌気性菌が死滅する。

検体採取後の保存状態による違い
E.coli （BTB寒天培地） 材料：尿検体採取直後検体を室温で6時間放置後

尿の保存条件による大腸菌の菌数

0h
室温 25℃

冷蔵 4℃

4h

9h

12h

24h

36h

検体の保存採取後指定された温度に速やかに保存する
室温
・血液、髄液、淋菌、髄膜炎を疑う検体
冷蔵・上記以外

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部位別主な起炎菌

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主な感染症と起炎菌①
疾 患 名

主な起炎菌

急性気道感染症
・因喉頭炎
・扁頭炎
・急性気管支炎

化膿レンサ球菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌
モラクセラ・カタラーリス（ブランハメラ）
インフルエンザ菌

慢性気道感染症
・慢性気管支炎・気管支拡張症
・慢性呼吸器疾患の二次感染

肺炎球菌、黄色ブドウ球菌
モラクセラ・カタラーリス（ブランハメラ）
インフルエンザ菌
緑膿菌

肺実質感染症・肺炎・肺化膿症

肺炎球菌、黄色ブドウ球菌
モラクセラ・カタラーリス（ブランハメラ）
インフルエンザ菌、肺炎桿菌、カンジダ
マイコプラズマ

胆道感染症
・胆のう炎
・痰管炎

腸球菌
大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、バクテロイデス属
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主な感染症と起炎菌②
疾 患 名

主な起炎菌

皮膚軟部組織感染症
・毛嚢炎
・癤、癤腫瘍
・伝染膿痂診・丹毒、蜂巣炎、化膿性爪囲炎
・慢性膿皮炎、瘭疽

表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌
プロピオニバクテリウム属

リンパ管（節）炎

化膿性レンサ球菌

皮下膿瘍、汗腺炎、感染性粉瘤

黄色ブドウ球菌、化膿性レンサ球菌
ペプトストレプトコッカス属プロピオニバクテリウム属

腸管感染症
・腸炎

サルモネラ菌、腸炎ビブリオ、下痢原性大腸菌
カンピロバクター属
入院： MRSA、C. difficile、緑膿菌、K. oxytoca

黄色ブドウ球菌、化膿性レンサ球菌
カンジダ、カビ24

主な感染症と起炎菌③
疾 患 名

主な起炎菌

外科領域感染症・乳腺炎、肛門周囲膿瘍

ブドウ球菌属
大腸菌
ペプトストレプトコッカス属
バクテロイデス属・外傷、手術創などの表在性二次感
染

黄色ブドウ球菌、大腸菌、プロテウス属、緑膿菌

耳鼻咽喉科感染症
・急性化膿性中耳炎
・急性副鼻腔炎

肺炎球菌、化膿性レンサ球菌、黄色ブドウ球菌
モラクセラ・カタラーリス（ブランハメラ）
インフルエンザ菌

・慢性化膿性中耳炎の急性増悪
・慢性副鼻腔炎

黄色ブドウ球菌、インフルエンザ菌、緑膿菌
各種嫌気性菌（ペプトストレプトコッカス属、バクテロイデス属など）
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主な感染症と起炎菌④
疾 患 名

主な起炎菌

眼科感染症
・眼瞼炎、麦粒腫、眼瞼膿腫・涙嚢炎、瞼板腺炎

表皮ブドウ球菌属、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌
化膿性レンサ球菌
インフルエンザ菌

歯科・口腔外科領域感染
・歯周組織炎、歯冠周囲炎
・顎炎

各種口腔レンサ球菌
ペプトストレプトコッカス属、プレボテラ属
ポルフィロモナス属

尿路感染症
・腎盂腎炎（単純性）
・膀胱炎（単純性）

腐生ブドウ球菌
大腸菌、肺炎桿菌、プロテウス属・尿道炎

淋菌、クラミジアトラコマティス

産婦人科感染症
・子宮附属器炎、子宮内感染・バルトリン腺炎、膣炎

B群溶血レンサ球菌
大腸菌、肺炎桿菌、カンジダ
ペプトストレプトコッカス属、バクテロイデス属
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塗抹検査

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鏡検所見の推定菌
菌

名特徴Streptococcus pneumoniae

ランセット型のグラム陽性双球菌
菌体周囲に莢膜を認める

Streptococcus pyogenes

グラム陽性球菌で数個の連鎖がみられる

Staphylococcus spp.

塊状のグラム陽性球菌

Moraxella spp.

グラム陰性双球菌が白血球内貪食像として観察されるNeisseria spp.

グラム陰性双球菌が白血球内貪食像として観察される

Candida spp.

多くはグラム陽性に染色される
酵母及び仮性菌糸が観察される

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鏡検所見の推定菌
菌名

特徴

腸内細菌

グラム染色で菌体が薄く染まる
特にKlebsiella spp.は莢膜が見られる

ブドウ糖非発酵
グラム陰性桿菌

グラム染色で菌体が濃く染まる
緑膿菌は莢膜様物質を認めることがある

Haemophilus spp.

グラム陰性球状または小桿菌が混在する

Nocardia spp.

弱抗酸性のフィラメント状で分岐する菌

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材料中の生態情報●急性炎症・好中球主体の所見●慢性炎症・単核細胞（リンパ球、マクロファージ）主体の所見●アレルギーの関与
・好酸球、肥満細胞、シャルコーライデン結晶●ウイルス感染・単核細胞、線毛上皮細胞多数の所見●誤嚥性肺炎・多数の好中球と扁平上皮細胞の混在●治療効果の判定

30

急性炎症31グラム陰性双球菌

32

慢性炎症33

アレルギーの関与（好酸球）

34

好酸球（ギムザ染色）35

アレルギーの関与（シャルコーライデン結晶）36誤嚥性肺炎37

治療効果の判定

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白血球の有無から推定できる微生物
便に白血球を認める
・Enteroinvasive E. coli
・Shigella spp.
・Salmonella spp.
・Campylobacter spp.
・Staphylococcus aureus
・Entameba histolytica

便に白血球を認めない
・Vibrio cholerae・Vibrio parahaemolyticus
・Rotavirus
・Cryptosporidium

同定検査

40

41

42

主な同定キット

シスメックス（アピシリーズ）

シスメックス（ラビットID32)

BD（クリスタル）

43薬剤感受性検査

44

薬剤感受性試験の方法
1. 拡散法(diffusion method)・ディスク法2. 希釈法(dilution method)
・寒天平板希釈法(agar dilution)
・微量液体希釈法(micro dilution)
3. E-test

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臨床効果の解離とその原因
・感染局所で抗菌薬濃度が不十分
・複数菌による感染症
・β-ラクタマ－ゼ産生菌の共存（常在菌も含めて）・耐性菌の選択的増加
・バイオフィルムの形成・報告した細菌が真の原因菌でない
・不適切な抗菌化学療法など

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微生物検査の自動分析装置

日水ライサス

ベックマンコールター

BDフェニックス

栄研DPS192 iX

47

結果報告書48

抗酸菌検査報告書

49

一般細菌検査報告書

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一般細菌検査中間報告コメントの一例
血液培養は現在のところ（3日間）陰性です。
一般細菌の結果は最終報告ですが、真菌の結果は現在検査中です。
嫌気性培養の結果は後日ご報告致します。
検出された〇〇菌はESBL産生が疑われます、追加試験を実施し確定次第報告致します。
検出された〇〇菌はAmpC β-ラクタマーゼ産生が疑われます、追加試験を実施し確定次第報告致します。
現在のところ菌の発育は見られません、最終結果は後日報告致します。
菌種名は後日報告致します。

51

一般細菌検査最終報告コメント一例
・採取後長時間経過した検体のため結果は参考にして下さい。
・検体量が不足のため、結果は参考にして下さい。
・検体は乾燥のため、結果は参考として下さい。乾燥により死滅しますので、滅菌生食を少量入れ乾燥を避けてください。
・Geckler分類 1群：上皮細胞＞25、好中球＜10検体ですので培養結果は参考にして下さい。
・Miller＆Jonesの分類 P3:膿性痰で膿性部分が2/3以上の検体です。
・グラム染色で〇〇を推定する菌が多数観察されます。
・感染を疑う炎症像を認めますが、抗菌薬の影響からか、起炎菌と思われる有意な細菌は観察されません。
・検出されたS. aureusは、CLDM誘導耐性試験が陽性なためリンコマイシン系薬は無効です。
・検出されたH. influenzaeは、β-ラクタマーゼ産生菌のためペニシリン系薬は無効です。
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一般細菌検査最終報告コメント一例
・好気性培養ボトル、嫌気性培養ボトル両方から菌が検出されました。
・検出されたP. aeruginosa（緑膿菌）は、ムコイド物質を産生しているため、抗菌薬による治療効果が得られない場合があります。
・検出されたC. difficileは、毒素産生菌です。病院内感染にご注意ください。
・腸内フローラの発育が認められませんでした。菌交代現象の可能性があります。抗菌薬の使用にご留意下さい。
・多剤耐性アシネトバクターが検出されました。病院内感染にご注意下さい。
・多剤耐性緑膿菌は、5類感染症 基幹定点施設で届出が必要です。

53

抗酸菌検査中間報告コメント一例
・培養の結果は、後日ご報告します
・21日まで陰性です。42日まで継続培養を実施します。
・4週まで陰性です。8週まで継続培養を実施します。
・塗抹検査陽性のため培養を56日まで延長します。
・遺伝子検査陽性のため培養を56日まで延長します。
・培養陽性ですので感受性検査をお勧め致します。
・雑菌汚染のため再処理を実施しました。本日より42日間培養を実施致します。

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抗酸菌検査最終コメント一例
・Miller＆Jonesの分類 M2：粘性痰の中に膿性痰が少量の検体のため、結果は参考にして下さい。
・長期間保存した検体では結果は参考にして下さい。
・塗抹検査陽性のため56日目まで培養を延長しましたが、抗酸菌の発育は認められませんでした。
・結核は、2類感染症として届出が必要です。
・TB-PCR（菌株）が『陽性』のため、DDH検査は省略します。

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国内で過去に報告がない薬剤耐性菌
菌

名Streptococcus pyogenes

Streptococcus agalactiae
Streptococcus Pneumoniae
Staphylococcus aureus

薬剤名

感受性

MIC値

PCG

S 以外

＞0.12μｇ/ｍL

ABPC

S 以外

＞0.25μｇ/ｍL

CTX

S 以外

＞0.5μｇ/ｍL

VCM

S 以外

＞1μｇ/ｍL

LZD

S 以外＞2μｇ/ｍL

VCM

S 以外＞1μｇ/ｍL

LZD

S 以外＞2μｇ/ｍL

VCM

S 以外＞1μｇ/ｍL

LZD

S 以外＞2μｇ/ｍL

VCM

R≧16μｇ/ｍL

上記の薬剤耐性菌を検出した場合は再検検査に加え、研究機関での確認をお願いする。

JANIS資料を一部改変

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国内での報告が比較的稀な薬剤耐性菌
菌

薬剤名

感受性

MIC値

MEPM

I,R

≧0.5μｇ/ｍL

CTX

I,R

≧1μｇ/ｍL

VCM

耐性†≧16μｇ/ｍL†

TEIC

I,R

≧16μｇ/ｍL

LZD

R≧8μｇ/ｍL

VCM

I≧4～8μｇ/ｍL

TEIC

I,R

≧16μｇ/ｍL

LZD

R≧8μｇ/ｍL

VCM

I,R≧16μｇ/ｍL

1IPM/CS
MEPM

R≧16μｇ/ｍL≧16μｇ/ｍL

2AMK

耐性†

≧32μｇ/ｍL†

3

CPFX
LVFX

R

≧4μｇ/ｍL≧8μｇ/ｍL

名

Streptococcus Pneumoniae(髄液検体）Enterococcus faecalisEnterococcus faecium

Staphylococcus aureus
Staphylococcus coagulase
negative(CNS)

多剤耐性アシネトバクター属(右の全ての条件を満たすこと）
検出した施設において再検査による確認をして下さい†は感染症発生動向調査の基準に準拠しています。

JANIS資料を一部改変

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ご清聴ありがとうございました。
私たちの後ろには助かりたい患者さんがいます。

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