8新潟がんセンター病院医誌

特集：各診療科におけるがん治療あるいはがん診療技術の進歩

胃癌における腹腔洗浄細胞診の精度向上の取り組み
Molecular Detection Approach to Improve the Accuracy ofPeritoneal Washing Cytology for Gastric Cancer
會澤雅 樹番 場

藪 崎竹 生裕中 川松木悟

淳

Masaki AIZAWA，Hiroshi YABUSAKI，Atsushi MATSUKI，
Takeo BAMBA and Satoru NAKAGAWA
要旨
局所進行胃癌に対する根治切除後の再発形式は腹膜播種が最も多い。病変から腹腔内に癌細胞が拡散して腹膜播種が形成されるため，腹腔洗浄細胞診陽性は各種の進行度分類において遠隔転移と定義される。細胞診はPapanicolaou染色下の形態診断で診断するが，日常診療では細胞診陰性であっても術後の腹膜播種再発を多く認めるのが現状である。細胞診の検出率の向上を目指し免疫染色やRT-PCRを併用する当院の取り組みを概説する。

はじめに2001～2007年の全国胃癌登録症例の予後調査結果 1 ） におけるStage（胃癌取り扱い規約第13版）別の術後 5 年疾患特異的生存率（ 5 Y-DSS）を図 1 に示す。系統的所属リンパ節郭清の定型化，術後補助化学療法の確立によりにより治療成績が向上し，Stage IA，IB，II胃癌の 5 Y-DSS中央値はそれぞれ99.0％，93.2％，79.9％である。一方，Stage IIIA，I I I B，I V の 5 Y- D S S 中 央 値 は そ れ ぞ れ 6 2 . 2 ％，41.2％，20.1％で未だ改善が必要であり，術後再発症例数の集計結果（表 1 ）では，pT 3 ，pT 4 における腹膜播種再発が全再発の半数を占めている。胃癌治療ガイドライン第 5 版ではpStage II，III胃癌に対し根治手術後の補助化学療法として 1 年間のS 1 内服を行うことが推奨されていたが 2 ），近年にpStage
IIIに対する術後S 1 +Docetaxel（DS）療法のS 1 単独療法に対する優位性がランダム化第III相試験によって示された 3 ）。本試験における再発頻度の群間比較
では，血行性転移とリンパ節転移の頻度はDS群で優位に低下していたが，腹膜播種は両群で最も多い再発形式であり，DS群の頻度は低下していたものの有意差は得られなかった。局所進行胃癌に対する治療成績向上には，根治切除後の腹膜播種再発の防止が重要である。

Ⅰ

腹腔洗浄細胞診について

胃癌術後の腹膜播種再発は，主病変から腹腔内に散布された遊離癌細胞の着床，増殖により発生すると考えられている。腹腔洗浄細胞診陽性（CY 1 ）例の予後は不良で，主要なTNM分類（胃癌取り扱い規約，UICC，AJCC）においてCY 1 はM 1 と定義される。腹腔洗浄細胞診について，胃癌取り扱い規約には「cT 1 を除く癌手術の開腹直後に，腹水がある場合は腹水を，ない場合は生理食塩水を腹腔内に注入し，Douglas窩より洗浄液を採取して病理検査室に提出する。癌細胞を認める場合はCY 1 ，疑陽性（suspicious）はCY 0 とする。原発巣切除として胃切除が行われた場合，CY 1 であれば遺残度はR 1とする。」と明記されている。CY 1 はPapanicolaou染
色によるClass分類のClass Vに相当し，Class V以外はCY 0 となる（図 2 ）。近年は腹膜播種の存在診断を目的に行う審査腹腔鏡が普及しており，腹腔洗浄細胞診が同時に行われることが一般的である。迅速診断の所用時間は40分程度である。
しかしながら前述の通りCY 0 に相当するStage III

新潟県立がんセンター新潟病院 消化器外科
Key words：胃癌（Gastric cancer），腹腔細胞診（Peritoneal cytology），バイオマーカー（Biomarker），免疫組織染色（Immunohistochemistry），逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction），癌胎児性抗原（Cearcinoembryonic antigen）

第 60 巻図19

第 1 号（2021 年 3 月）

全国胃癌登録症例予後調査（2001～2007年）におけるStage 別の 5 年疾患特異的生存率
取り扱い規約第13版，OS：全生存，DSS疾患特異的生存

表1

JGCA：胃癌

全国胃癌登録症例予後調査（2001～2007年）における壁深達度（pT），再発形式別の再発症例数

再発形式

pT 1

pT 2

pT 3

pT 4

合計

腹膜播種

152

1,507

5,230

857

7,769

血行性転移

406

1,929

1,838

340

4,526

リンパ節転移

177

766

1,032

223

2,218

局所再発

126

520

627

101

1,378

再発部不明

119475

846

199

1,641

合計

980

5,197

9,573

1,720

17,532

図2

Papanicolaou染色を用いた細胞診左：Class V（CY 1 ），右：Class III（CY 0 ）10

新潟がんセンター病院医誌

胃癌のR 0 切除後再発の中で腹膜播種は最も多く，細胞診において遊離癌細胞を検知できていないことが課題である。当科ではDouglas窩と胃の近傍である左横隔膜下の 2 ヵ所で洗浄細胞診を行い，いずれかが陽性の場合はCY 1 としている。

Ⅱ

免疫染色について抗体を用いて標本中の抗原を検出する組織化学的手法で，通常は二次抗体を用いた間接法が行われる。特異的一次抗体を利用して抗原を検出し，一次抗体と同一宿主の標識二次抗体を結合させ，抗原の局在を顕微鏡下で観察することが可能である。臨床では組織検体の蛋白発現量の評価に用いることが多いが，細胞診においても施行可能である。ただし，一次，二次抗体それぞれに反応時間が必要であり，検査に時間を要する。
胃癌の腹腔洗浄細胞診においては腫瘍細胞と非腫

図3

図4

免疫染色陽性の腫瘍細胞

瘍細胞（腹膜中皮細胞や血球）との鑑別に有用である。Papanicolaou染色における疑陽性の細胞が腫瘍細胞に特有の抗原を発現する場合は，腫瘍細胞であることが特定し得る。腫瘍細胞マーカーとしてはCEAや上皮細胞構成蛋白が用いられる。胃癌細胞のCEA発現頻度は比較的低く，検出率を向上させるために抗CEA抗体と抗上皮細胞蛋白抗体の 2 種類を併用することが多い。
当院ではCEA抗体，上皮細胞抗原の一つである
Moc-31抗体を用いた免疫染色（図 3 ）を行っている。当院を含む国内のいくつかの癌専門施設では既にCY判定に免疫染色を併用する総合診断を日常臨床業務で運用しており，当院の診断フローチャートを図 4 に示す。迅速診断によるCY判定を行い，後日の免疫染色結果より，CY 0 症例のうちCEAまたはMoc-31の陽性細胞が形態上異型細胞と断定し得る場合は細胞診陽性としている。

左：CEA染色，右：Moc-31染色Papanicolaou染色によるCY判定に免疫染色を併用する総合診断

第 60 巻Ⅲ

11

第 1 号（2021 年 3 月）

R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n
Polymerase Chain Reaction（RT-PCR）法について

RNAサンプルを鋳型として逆転写酵素（reversetranscription）を用いて相補的DNAを合成し，プライマーを用いて特定の塩基配列のDNAを人工的に増幅して検出する方法である。標的蛋白をコードする腫瘍細胞内のmRNAを数コピーの量から検出可能である。比較的短時間での診断が可能で，用途は異なるが現在流行中のCOVID-19ウイルスの検出に用いられ診断の第一線を担っている。
当院ではCEA mRNAの塩基配列を認識する複数のプライマーを用いたSemi-nested PCRを行って腹腔洗浄細胞診のサンプル中のCEA発現細胞を検出し，腫瘍細胞の存在診断の参照としている。

Ⅳ C
 Y判定に免疫染色，RT-PCR法を併用する有効性について
当院症例における後方視的検討の結果を以下に示す。対象は2010～2013年の腹腔洗浄細胞診を施行した手術症例とし，術前化学療法施行例は除外した。
背景と腫瘍関連因子，手術所見について表 2 に示す。当科では腹腔洗浄細胞診の適応をcT 3 （SS）以表2深としており，腫瘍肉眼型Type 3 / 4 ，pT 4 がそれぞれ半数を占めている。CY判定，免疫染色併用，RT-PCR法併用における細胞診の陽性率はそれぞれ，19.5％，25.3％，32.8％であった（表 3 ）。R 0 またはR 1 切除となった222例の生存曲線を図 5 に示す。
CY 0 （N=210），CY 1 （N=12）症例の 3 年全生存率（ 3 Y-OS） は そ れ ぞ れ78.0 ％，30.7 ％ で 有 意 差（p<0.001） を 認 め た。CY 0 か つ 免 疫 染 色 陽 性 例（N=12）の 3 Y-OSは60.6％で，免疫染色陰性例と比較して有意に（p=0.016）予後不良であった。CY 0
かつRT-PCR陽性（N=27）例の 3 Y-OSは48.8％でRTPCR陰性例と比較し有意に（p<0.001）予後不良であった。CY 0 症例（N=210）の予後因子について多変量解析を行ったところ，免疫染色陽性は独立した予後規定因子ではなかった（表 4 ）が，RT-PCR陽性は独立した予後規定因子であった（表 5 ）。
各群の再発を集計したところ（表 6 ），CY 1 の再発症例は 8 例でそのうち 7 例が腹膜播種であった。
CY 0 かつ免疫染色陽性例の再発，腹膜播種再発はそれぞれ 4 例， 3 例で，CY 0 かつRT-PCR陽性例の再発，腹膜播種再発はそれぞれ10例，6 例であった。
免疫染色，RT-PCR法の併用によってCY 0 症例の中から腹膜播種再発高リスク症例が選別し得ることが示唆された。RT-PCR法は免疫染色よりも感度が高

当院症例の検討における患者背景と腫瘍関連因子

背景・腫瘍関連因子

症例数

性別

男性／女性

210／83

年齢（歳）中央値（範囲）69（27－91）

肉眼的腫瘍型

Type 0 ／ 1 ， 2 ／ 3 ， 4

34／99／160

組織型

分化型／未分化型

163／130

pT

1／2／3／4

45／50／44／154

pN

0 ／ 1 ／ 2 ／ 3 ／x

99／56／49／82／ 7

M

0／1

243／500／1

282／11

腹膜播種 P

0／1

260／33

手術術式

幽門側胃切除／胃全摘／非切除163／113／17

腫瘍の遺残 R

0／1／2

210／12／71

肝転移

H

表3

CY判定，CY＋免疫染色，CY＋PCRにおける細胞診陽性率

細胞診判定

Papanicolaou染色（CY） Papanicolaou染色＋免疫染色

Papanicolaou染色＋定性PCR

陰性

236219197

陽性（CYに対しての増減）

57（ 0 ）

74（＋17）96（＋39）25.3（＋5.8）

32.8（＋13.3）

陽性率（CYに対しての増減） 19.5（ 0 ）12

新潟がんセンター病院医誌

図5

表4

CY判定，CY＋免疫染色，CY＋PCRにおける細胞診判定と全生存曲線

OS：全生存CY 0 症例（210例）における多変量生存解析，腹腔洗浄細胞診の免疫染色を共変量に含む

共変量

症例数

HR（95％ CI）

有意差

pT 4

82

2.942（1.028－8.422）

p＝0.04

pN 2 - 3

65

2.583

（1.089－6.129）

p＝0.03肉眼型 Type 4102.377（0.850－6.644）

p＝0.09腹腔洗浄細胞診 免疫染色（＋）

122.637（0.956－7.275）

p＝0.06

表5

CY 0 症例（210例）における多変量生存解析，腹腔洗浄細胞診のPCRを共変量に含む

共変量

症例数

HR（95％ CI）

有意差

pT 4822.761（0.971－7.853）

p＝0.05pN 2 - 365

2.605（1.105－6.139）

p＝0.03肉眼型 Type 4101.914（0.699－5.246）

p＝0.21

腹腔洗浄細胞診 PCR（＋）

273.130（1.436－6.823）

p＝0.004

表6CY判定，CY＋免疫染色，CY＋PCRにおける細胞診と再発

3 Y-RFS： 3 年無再発生存率

細胞診判定

症例数

3 Y-RFS

再発数

腹膜播種再発数（％）

CY 021081.7％3112（5.7）

CY 0 ，免疫染色（－）
CY 0 ，免疫染色（＋）

198
1283.4％53.0％

27
49 （4.5）
3 （25.0）

CY 0 ，PCR（－）
CY 0 ，PCR（＋）

183
2785.7％50.0％21106 （3.3）
6 （22.2）

CY 1

1218.2％87 （58.3）

第 60 巻く，より多くの再発症例を抽出できているが，腹膜以外の再発症例が少なからず含まれており，必ずしも腹腔内遊離癌細胞を検出した結果ではなかった可能性が示唆された。

Ⅴ

臨床運用の現状について免疫染色，RT-PCR併用の特性について図 6 に示す。免疫染色では特異性が担保し得るが，感度が低く，診断に数日を要するため迅速診断には不適である 4 ）。RT-PCR法は感度が高く迅速診断が可能だが，分子発現の細胞特異性が評価できず偽陽性が問題となる 5 ）。近年に定量RT-PCRを併用する手法が報告された 6 ）が，判定のCut off値が確立されていない。
当院では，Papanicolaou染色によるCY判定と免疫染色を併用する総合診断（図 4 ）を通常診断として運用し，定性RT-PCRと定量RT-PCR（2013年以降）の結果を報告書に記載し参考情報としている。

図6Ⅵ13

第 1 号（2021 年 3 月）

免疫染色とPCRを併用した場合の長所と短所

展望と課題

今後は当院の定量RT-PCRの施行症例の蓄積を待って，腹膜播種再発予測に最適なCut off値を評価する予定である。定量によりRT-PCR法の特異性を改良できれば，より感度が高く迅速な補助診断となり得る。
現在のガイドライン治療においては術後腹膜播種再発高リスク症例に対する治療オプションがないた
め，一律に全身化学療法レジメンを用いた補助化学療法を行わざるを得ない。胃癌の腹膜進展に特化した治療法として腹腔内注入を併用する化学療法レジメンが期待されるが，先進医療制度下でのランダム化第III相試験 7 ） では全身化学療法に対する優位性が証明されず，抗腫瘍薬の腹腔内注入は未だ保険未収載となっている。
診断精度の向上とともに高リスク症例に対する治療の開発が今後の課題である。

参考文献1 ）Katai H, Ishikawa T, Akazawa K, et al: Five-year survival
analysis of surgically resected gastric cancer cases in Japan: aretrospective analysis of more than 100,000 patients from thenationwide registry of the Japanese Gastric Cancer Association（2001-2007）. Gastric Cancer. 21（1）: 144-154. 2018.
2 ）日本胃癌学会：胃癌治療ガイドライン2018年 1 月改訂
第 5 版．P32 E補助化学療法．金原出版．2018．
3 ）Yoshida K, Kodera Y, Kochi M, et al: Addition of docetaxel
to oral ﬂuoropyrimidine improves efﬁcacy in patients with StageIII gastric cancer: Interim analysis of JACCRO GC-07, arandomized controlled trial. J Clin Oncol. 37（15）: 1296-1304.
2019.
4 ）Benevolo M, Mottolese M, Cosimelli M, et al: Diagnostic andprognostic value of peritoneal immunocytology in gastriccancer. J Clin Oncol. 16（10）: 3406-3411. 1998.
5 ）Virgilio E, Giarnieri E, Rosaria M, et al: Gastric cancer cell inperitoneal lavage fluid: a systematic review comparing
cytological with molecular detection for diagnosis of peritoneal
metastases and prediction of peritoneal recurrences. Anticancer
Res. 38（3）: 1255-1262. 2018.
6 ）Nakanishi K, Kanda M, Umeda S, et al: The level of SYT13and CEA mRNAs in peritoneal lavages predict the peritoneal
recurrence of gastric cancer. Gastric Cancer. 22（6）: 1143-1152.
2019.
7 ）Ishigami H, Fujiwara Y, Fukushima R, et al: Phase III trial
comparing intraperitoneal and intravenous paclitaxel plus S-1
versus cisplatin plus S-1 in patients with gastric cancer withperitoneal metastasis: PHOENIX-GC trial. J Clin Oncol. 36（19）: 1922-1929. 2018.