No.122

高性能 SEC カラム TSKgel® UP-SW Aggregate について
─目

次─

ページ
1. はじめに1

2. TSKgel UP-SW Aggregate の基本特性

12 - 1. 充塡剤の特性

12 - 2. 較正曲線と分離性能

12 - 3. 溶離液の塩濃度の影響

32 - 4. 測定流速の影響

42 - 5. カラムの耐久性

5

3. 分析例

63 - 1. 抗体の熱処理生成凝集体の分析

6

3 - 2. IgM の分析

7

3 - 3. 核酸の分析

8

4. おわりに東ソー株式会社

8

1．はじめに

2．TSKgel UP-SW Aggregate の基本特性
2-1．充塡剤の特性

抗体医薬品に用いられるモノクローナル抗体は、製造、保存、輸送時に生じる凝集体が副作用を引き起こす場合

表 1 に TSKgel UP-SW Aggregate の充塡剤の特性・があることから、品質管理において、サイズ排除クロマ

カラム仕様及び抗体の分離に用いられている既存トグラフィー（SEC）での分析が行われています。二量UP-SW シリーズのカラムとの比較を示します。TSKgel

体以上の凝集体は免疫反応を惹起する可能性が示唆されUP-SW Aggregate は、細孔径 30 nm シリカゲル表面にていることから、抗体医薬品の品質管理では高分子量不ジオール基を導入した粒子径 3 μm の充塡剤を充塡した純物として定量評価することが定められています。

カラムです。既存の UP-SW シリーズのカラムに比べ大きい細孔を有し、抗体の凝集体の分離に適しています。

更に凝集体の四量体、六量体などの多量体を定量分析することにより凝集体の生成機序を明らかにすることも重要となってきています。
今回、凝集体の分離を主目的とする高性能 SEC カラ
ム TSKgel UP-SW Aggregate を商品化いたしました。
本稿では TSKgel UP-SW Aggregate の基本特性と分離例を紹介いたします。
表1充塡剤、カラムの特性
製品名

TSKgel UP-SW Aggregate

TSKgel UP-SW3000

TSKgel UP-SW2000

カラムサイズ

4.6 mm I.D. × 30 cm, 15 cm

4.6 mm I.D. × 30 cm, 15 cm

4.6 mm I.D. × 30 cm, 15 cm

基材

シリカゲル

シリカゲル

シリカゲル

官能基

ジオール

ジオール

ジオール

粒子径

3 μm

2 μm

2 μm

細孔径

30 nm

25 nm

12.5 nm分子量測定範囲

10 ～ 2,000 kDa

10 ～ 500 kDa

5 ～ 100 kDa

用途抗体（凝集体）の高分離分析

抗体（二量体 / 単量体 / フラ抗体（フラグメント）、ペプチグメント）の高分離分析

ド、オリゴ核酸の高分離分析

2-2．較正曲線と分離性能

示 し ま す。TSKgel UP-SW3000 及 び TSKgel UP-SW

TSKgel UP-SW Aggregate、TSKgel UP-SW3000 及2000 はチログロブリンの二量体以上が細孔内に浸透でび TSKgel UP-SW2000 を用いて測定した標準たんぱく

きずに排除され V0 に溶出されています。一方、細孔径質混合試料のクロマトグラムを図 1 に示します。また、の大きい TSKgel UP-SW Aggregate は二量体も細孔内各 ピ ー ク の 分 離 度（R） を 表 2 に 示 し ま す。TSKgelに浸透し三量体以上（凝集体）と分離されています。

UP-SW Aggregate はチログロブリン二量体（ピーク 1’）

標準たんぱく質による較正曲線の比較を図 3 に示しと単量体（ピーク 1）、及びチログロブリン単量体（ピーます。分子量 300,000 以上の範囲では、TSKgel UP-SW

ク 1）とγ- グロブリン二量体（ピーク 2’）の分離度がAggregate が他のカラムに比べ較正曲線の傾きが緩や他のカラムに比べ高く、高分子量たんぱく質の分離に適かであり、より良好な分離が得られることが示唆されましていることが分かります。同一カラム、同一条件でチす。

ログロブリン試料を測定したクロマトグラムを図 2 に
─1─541UV 280 nmA)

22’1’3TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
54B) 1’213

TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

2’54C)
41’

1623

TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

2’8101214 min

図1標準たんぱく質のクロマトグラム

表2標準たんぱく質ピークの分離度（R）の比較
カラム〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｃ）TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：0.35 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25 ℃
注入量：10 μL
試 料：1. チログロブリン，640,000 Da（1’. チログロブリン二量体）
2. γ- グロブリン，155,000 Da（2’.γ- グロブリン二量体）
3. オブアルブミン，47,000 Da
4. リボヌクレアーゼ A, 13,700 Da
5. p - アミノ安息香酸，137 Da

R（ピーク 1’/1） R（ピーク 1/2’） R（ピーク 2’/2） R（ピーク 2/3） R（ピーク 3/4） R（ピーク 4/5）

TSKgel UP-SW Aggregate

1.58

2.23

1.73

2.17

2.48

6.48

TSKgel UP-SW3000

1.08

2.11

2.21

3.33

3.48

10.34

TSKgel UP-SW2000

─

1.68

1.71

3.08

3.15

15.13

UV 280 nm

33

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

A)

2
TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

B)

1C)
4

図252367

TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
89min

チログロブリンのクロマトグラム〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｃ）TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム
流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料：チログロブリン
ピーク 1. 凝集体 , 2. 二量体 , 3. 単量体
─2─

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW2000（4.6 mm I.D. × 30 cm）

7

TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
1’6

TSKgel UP-SW Aggregate
1（4.6 mm I.D. × 30 cm）

2’log M

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

25＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム

3＋ 0.05 % アジ化ナトリウム443速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL

TSKgel UP-SW2000
2

流試

5

TSKgel UP-SW3000（1’. チログロブリン二量体）

TSKgel UP-SW Aggregate
1図346810

料：1. チログロブリン，640,000 Da
2. γ- グロブリン，155,000 Da

12（2’. γ- グロブリン二量体）

min

3. オブアルブミン，47,000 Da
4. リボヌクレアーゼ A，13,700 Da

標準たんぱく質による較正曲線

5. p - アミノ安息香酸，137 Da

2-3．溶離液の塩濃度の影響るために、低い塩濃度では残存シラノール基とのイオン排SEC で適切な測定を行うためには、充塡剤と測定物質の除効果により、早く溶出します。一般に、静電的相互作用間で生じる相互作用（静電的、疎水的相互作用など）を抑は塩濃度が高いほど抑制されることから、溶離液中の硫制する必要があります。シリカゲルを基材とする TSKgel

酸ナトリウム濃度が高くなるにしたがい、溶出が遅くな

UP-SW Aggregate を用いる分析では、充塡剤の表面に残り、100 mmol/L 以上でほぼ一定の溶出時間となります。

存するシラノール基とたんぱく質との間に生じる静電的相

一方、溶離液の pH よりも pI の高いチトクロム C（pI互作用（イオン排除、イオン吸着）を、適切な塩濃度の10.1）及びリゾチーム（pI 11.2）は、溶離液中で正に荷溶離液を用いることで、抑制することが重要となります。

電するため残存シラノール基との静電的相互作用によ

図 4 に 20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）り、充塡剤への吸着現象を引き起こします。溶離液中のを用い、硫酸ナトリウムの塩濃度を変化させた場合の標準硫酸ナトリウム濃度が高くなるにしたがい、溶出が早くなたんぱく質の溶出挙動を示します。溶離液の pH よりも等り、150 mmol/L 以上でほぼ一定の溶出時間となります。

電点（pI）の低い、チログロブリン（pI 4.5）
、γ- グロブ

また、ジニトロフェニル（DNP）- L - アラニンのようリン（pI 5.1）、ウシ血清アルブミン（pI 4.9）及びβ- ラに疎水部を有する化合物は、溶離液中の塩濃度が高くなクトグロブリン（pI 5.2）は、溶離液中で負に荷電しているにしたがい、疎水的な吸着により溶出が遅くなります。
〈測定条件〉

14

カラム：TSKgel UP-SW Aggregate
チログロブリン

溶出時間（min）

1210

ウシ血清アルブミン＋ X mmol/L 硫酸ナトリウム

β- ラクトグロブリン＋ 0.05 % アジ化ナトリウム

チトクロムC8リゾチーム
DNP-L- アラニン

64（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

γ-グロブリン

050100150200

速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL

250

Na 2 SO 4 濃度（mmol/L）

図4

流

硫酸ナトリウム濃度のたんぱく質の溶出時間への影響
─3─

2-4．測定流速の影響

理論段数が得られています。このように、たんぱく質を測定流速による理論段数への影響は、充塡剤の粒子径分離する場合、測定流速を低くすることによりカラム効や測定物質の分子サイズ等に依存することが知られてい率が向上し、より高い分離能を得ることができます。

ます。分子量の異なる 2 種類のたんぱく質（ウシ血清ア

図 6 に TSKgel UP-SW Aggregate によるモノクロー

ル ブ ミ ン：Mw 66,500、 リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ A：Mw

ナル抗体二量体と単量体の分離能の流速依存性を示しま13,700） 及 び 低 分 子 化 合 物 p - ア ミ ノ 安 息 香 酸（Mwす。測定流速を遅くすることにより、カラム効率が向上

137）を用いて測定流速の影響を確認しました（図５）。

し、モノクローナル抗体二量体と単量体の分離能が高く

p - アミノ安息香酸は測定流速が高くなるほど、理論なっています。

段数が高くなっています。p - アミノ安息香酸は拡散係

また、図 7 に測定流速と圧力損失の関係を示します。

数が大きく、測定流速が低くなると拡散による拡がりに

TSKgel UP-SW Aggregate（30 cm カラム）は、標準流より理論段数が低下します。一方、分子量の大きいたん速（0.35 mL/min）では 10 MPa 以下の低い操作圧で使ぱく質では、測定流速が低くなるほど理論段数が高くな用することができます。

る傾向を示し、分子量が大きいほど、より低流速で高い〈測定条件〉

60000

カラム：TSKgel UP-SW Aggregate（4.6 mm I.D. × 30 cm）

50000

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム

理論段数

40000

+ 0.05 % アジ化ナトリウム30000

流速：0.05 ～ 0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

20000

温度：25 ℃0

注入量：10 μL

ウシ血清アルブミン
リボヌクレアーゼA
p - アミノ安息香酸

10000

0.00.1

0.20.3

試料：ウシ血清アルブミン，66,500 Da
リボヌクレアーゼ A，13,700 Da
p - アミノ安息香酸，137 Da

0.4

流速（mL/min）

図5

流速の理論段数への影響〈測定条件〉

3.6カラム：TSKgel UP-SW Aggregate（4.6 mm I.D. × 30 cm）

分離能（二量体／単量体）

3.4

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

3.2＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム

3＋ 0.05 % アジ化ナトリウム

2.8
2.6

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

試

2.2

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

流速（mL/min）

図6

速：0.05 ～ 0.35 mL/min

注入量：10 μL

2.42

流流速の分離能への影響

─4─

料：モノクローナル抗体（ヒト）〈測定条件〉

12

カラム：TSKgel UP-SW Aggregate（4.6 mm I.D. × 30 cm，15 cm）

圧力損失（MPa）

10

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

4.6 mm I.D. × 30 cm

8＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム4.6 mm I.D. × 15 cm＋ 0.05 % アジ化ナトリウム6

流速：0.05 ～ 0.35 mL/min

温度：25 ℃

4200.00.1

0.2

0.3

0.4

流速（mL/min）

図7

流速と圧力損失の関係

2-5．カラムの耐久性

化合物の p - アミノ安息香酸の溶出挙動により確認しました。各カラムサイズで充塡剤 3 ロットについて確認し4.6 mm I.D. × 15 cm）で試料を最大使用流速下（30 cmた結果を図 8、9 に示します。両カラムとも 500 回注入

カラムは 0.35 mL/min、15 cm カラムは 0.50 mL/min）

した後でもカラム性能に顕著な変化は見られず、良好なで連続注入した場合のカラムの耐久性について、低分子耐久性を示しています。

120120100100
理論段数維持率（%）

溶出容量維持率（%）

TSKgel UP-SW Aggregate（4.6 mm I.D. × 30 cm、8060
Lot.A
Lot.B

408060
Lot.A
Lot.B

40

Lot.C
200100200300

400

Lot.C
20500

注入回数

図80100200300400500

注入回数

カラムの安定性（連続注入：30 cm カラム）

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW Aggregate（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム
流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料：チログロブリン，γ- グロブリン，オブアルブミン，リボヌクレアーゼ A，p - アミノ安息香酸＊カラム性能の確認は p - アミノ安息香酸で行った。

─5─120100100
理論段数維持率（%）

溶出容量維持率（%）

1208060
Lot.A
Lot.B

408060Lot.A
Lot.B

40Lot.C20

図90100200300
注入回数400Lot.C
20500

0100200300
注入回数400500カラムの安定性（連続注入：15 cm カラム）

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW Aggregate（4.6 mm I.D. × 15 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：0.50 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25 ℃
注入量：5 μL
試 料：チログロブリン，γ- グロブリン，オブアルブミン，リボヌクレアーゼ A，p - アミノ安息香酸＊カラム性能の検査は p - アミノ安息香酸で行った。

3．分析例

め、生成した凝集体の分子サイズに関する情報を得るこ

3-1．抗体の熱処理生成凝集体の分析と が で き ま せ ん。 し か し な が ら、 細 孔 径 の 大 き い

TSKgel UP-SW Aggregate お よ び TSKgel UP-SW

TSKgel UP-SW Aggregate では、生成した凝集体が細3000 を用いて、モノクローナル抗体を熱変性して生じ孔内に浸透して溶出します。TSKgel UP-SW Aggregateる凝集体の測定を行いました。クロマトグラムを図 10

では、クロマトグラムに示されるように、熱処理時間がに示します。TSKgel UP-SW3000 では、熱変性により長くなるとともに、分子サイズの大きい凝集体が増加し生成した凝集体が細孔内に浸透せず、V0 に溶出するたていることがわかります。

A)

B)

UV 280 nm

UV 280 nm凝集体

凝集体

二量体7

図 1091113

二量体

単量体

単量体

1517min

7911131517min

抗体凝集体の経時変化〈測定条件〉カラム：Ａ）TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：40 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）＋ 400 mmol/L 過塩素酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：0.20 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25 ℃
注入量：10 μL
試 料：モノクローナル抗体＊反応条件：70 ℃（2 時間），73 ℃（2 時間），77 ℃（2 時間），80 ℃（2 時間）
─6─3-2．IgM の分析に重なって溶出しています。一方で、TSKgel UP-SW

TSKgel UP-SW Aggregate、TSKgel UP-SW3000 及Aggregate では、IgM の凝集体と単量体の分離が向上

び TSKgel UP-SW2000 にて IgM（分子量 900 kDa の 5しています。このように、測定対象物の分子サイズに対量体免疫グロブリン）を測定したクロマトグラムの比較して適切な細孔径のカラムを選択することで、より精密を図 11 に示します。TSKgel UP-SW3000 及び TSKgelな分析を行うことが可能です。

UP-SW2000 では、IgM の凝集体が単量体ピークの前端

2UV 280 nm

1TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

A)

1
TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

B)
12

TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

C)
4

図 11567min

IgM のクロマトグラム〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｃ）TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：40 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）＋ 400 mmol/L 過塩素酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム
流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料：IgM
1. 二量体，2. 単量体

─7─

3-3．核酸の分析

SW Aggregate は 100 塩基対以上の分子サイズ領域におTSKgel UP-SW Aggregate、TSKgel UP-SW3000 及

いて、他の UP-SW カラムに比べてピーク間隔が広く、び TSKgel UP-SW2000 にて DNA マーカーを測定した良好な分離を示します。

クロマトグラムの比較を図 12 に示します。TSKgel UP-〔Size〕

12510050

UV 280 nm75A)

200
175150250
125 10030075400500B)

bp

25 bp

50

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

25 bp

200
250100175300150400125500

TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
755025 bp

図 12300
250200175150125100755025

TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

C)
7500
400911131517min

DNA マーカーのクロマトグラム〈測定条件〉カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｃ）TSKgel UP-SW Aggregate（3 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）＋ 300 mmol/L 塩化ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム
流速：0.2 mL/min

検出：UV 260 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料：DNA Ladder

4．おわりにのみならず、IgM や長鎖核酸等の分子サイズの大きい

以上、TSKgel UP-SW Aggregate について概説しま

物質について精密分析を行うことが可能です。

した。本カラムを使用することで、抗体の凝集体の分布─8─※ “TSKgel” は東ソー株式会社の登録商標です。

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