抑制回路を介したコリン作動性ニューロンによる覚醒脳の動作制御機構

惣谷和広
RIKEN・BSI・大脳皮質回路可塑性研究チーム
平成26年2月24日月曜日
電気通信大学脳科学ライフサポートセンターセミナー

本日のトピック
1. イントロダクション～局所神経回路網解析と方法論～
2. 大脳皮質一次視覚野ニューロンの方位（傾き）選択性について

3. 抑制回路を介したコリン作動性ニューロンによる覚醒脳の動作制御機構

本日のトピック
1. イントロダクション～局所神経回路網解析と方法論～
2. 大脳皮質一次視覚野ニューロンの方位（傾き）選択性について

3. 抑制回路を介したコリン作動性ニューロンによる覚醒脳の動作制御機構

神経系のスケールシステム

局所神経回路網ニューロン
シナプス分子(Chuchland and Sejnowski, The Computatinal Brain. 1992)

局所神経回路解析の必要性（シンプル生理学 貴邑 冨久子、 根来 英雄より）

電気生理学的計測法
Single-cell recording とMulti-cell recording

Hubel, DH, Eye,brain and vision,
Scientific American Library, 1988

Buzsaki et al., Nature Neurosci., 2004
Jiang B et al., Neuron, 2010

その他、ＥＥＧ，ＭＥＧなども

二光子レーザー走査型顕微鏡を使って、シナプス機能探求から局所神経回路網探求へ

3μm

30μm
30μm

Sohya K, et al., J Neuroscience, 2007

神経機能探索に用いられるツールシステム

局所神経回路網

Two photon laser
scanning microscopy
ニューロン
シナプス分子(Modified from Grinvald A, PNAS, 2005)

一光子励起と二光子励起蛍光イメージング法の原理（共焦点ピンホールなどの必要性）

ジャブロンスキー模式図

一光子励起顕微鏡模式図>300kW
100fs = 10-13s
ジャブロンスキー模式図

二光子励起顕微鏡模式図
松崎政紀, 河西春郎. 細胞工学, 2007

励起法の違いによる励起領域の比較
Two-Photon

One-Photon

Warren R Zipfel, et al. Nature Biotechnology, 2003

励起法の違いによる蛍光ビーズのX-Z断層像の比較

Matsuzaki M, et al., J Neurophysiol., 2008

多光子顕微鏡の特徴
1.励起波長がSingle Photonの約n倍⇒2Photonは約2倍、3Photonは約3倍の励起波長1-1.波長が長いということは、標本による励起光の散乱が少なく励起光が標本深部まで達する。
1-2.励起波長が長くUV光の様な光毒性的ダメージが低い。
⇔但し、熱的なダメージは有り。
1-3.励起光と蛍光の波長差が大きく分離が容易。

多光子顕微鏡の特徴
2.一つの分子に複数の光子が同時に当たる確立は極めて低い
2光子吸収が起きる確率は1光子吸収の1億分の1以下
2-1.光子密度の高い対物LENSのピント面でしか励起が起こらない。
2-1-1.励起光による標本の空間的ダメージが少ない。
2-1-2.光刺激や体積計測等の励起光の空間分解能を必要とするApplicationに最適。

Two-Photon

多光子顕微鏡の特徴
3.標本深部観察性能に優れる（近赤外波長＋空間分解能）励起・標本での励起光散乱が少ない。
・対物レンズピント面以外の余分な蛍光が少ない。

二光子レーザー走査型顕微鏡を使って、シナプス機能探求から局所神経回路網探求へ

3μm

30μm
30μm

Sohya K, et al., J Neuroscience, 2007

本日のトピック
1. イントロダクション～局所神経回路網解析と方法論～
2. 大脳皮質一次視覚野ニューロンの方位（傾き）選択性について

3. 抑制回路を介したコリン作動性ニューロンによる覚醒脳の動作制御機構

大脳皮質一次視覚野ニューロンの方位選択性活動電位

Hubel, DH, Eye,brain and vision,
Scientific American Library, 1988

視覚刺激提示時間

方位（傾き）選択性の形成メカニズムモデル
a. Excitatory Convergence Modelb. Biased Inputs Modelc. Cross-Orientation Inhibition Model

d. Iso-Orientation Inhibition Model

Etc…

遺伝子改変動物を用いた
in vivo 二光子励起機能的Ca2+イメージング法
細胞の活動Changes in [Ca2+］i

fura-2 AM細胞種の同定GABAニューロン

EGFP, Venus

アストロサイト

Sulforhodamine 101 (SR101)

興奮性ニューロン(GAD67-GFP knock-in mice)(VGAT-Venus mice/rat)

No GFP & No SR101

遺伝子改変動物を用いた
in vivo 二光子励起機能的Ca2+イメージング法

Visual Stimulus Generator & Image Acquisition

マウス大脳皮質一次視覚野における興奮性ニューロンとGABAニューロンの方位選択性の違い
深さ160μmのマウス大脳皮質視覚野

興奮性ニューロンの光反応の例

GABAニューロンの光反応の例－⊿F/F
白：興奮性ニューロン 緑：GABAニューロン
赤：アストログリア
縦桃縞は光刺激時間を黒矢印は刺激の種類を示す。
Sohya et al., 2007

マウス大脳皮質一次視覚野における興奮性ニューロンとGABAニューロンの方位選択性の違い
a. 興奮性ニューロンの OSI分布

c. 両ニューロンのOSI分布の比較
K-S test, p<0.001

b. GABAニューロンの OSI 分布

マウス大脳皮質一次視覚野をGABAニューロンの配置とニューロン活動から解析を行う。

60μm

マウス大脳皮質一次視覚野ニューロンの配置

マウス大脳皮質一次視覚野GABAニューロンの配置解析法

視覚応答を示すGABAニューロンには、固まって配置するものがある。

マウス大脳皮質一次視覚野GABAニューロンの配置解析法(GABAニューロンクラスター空間の見積）

acb30μmマウス大脳皮質一次視覚野GABAニューロンの配置解析法(GABAニューロンクラスター空間と機能解析へ向けて）マウス大脳皮質一次視覚野GABAニューロンクラスター空間と興奮性ニューロンの方位選択性の関係

マウス大脳皮質一次視覚野
GABAニューロンクラスター空間内の抑制入力

マウス大脳皮質一次視覚野
GABAニューロンクラスター空間内の抑制入力

マウス大脳皮質一次視覚野
GABAニューロンクラスター空間内の抑制入力マウス大脳皮質一次視覚野
GABAニューロンクラスター空間内の抑制入力

マウス大脳皮質一次視覚野
GABAニューロンクラスター空間内の抑制入力

まとめ 1
1、マウス大脳皮質一次視覚野神経回路網内において、GABAニューロンは、興奮性ニューロンよりも方位選択性が鈍い。
2、マウス大脳皮質一次視覚野神経回路網内には、視覚応答を示すGABAニューロンの密度が高い空間が存在する。
3、視覚応答を示すGABAニューロン密度と興奮性ニューロン方位選択性強度には、相関関係がある。
4、視覚応答を示すGABAニューロンの密度が高い空間内に存在する興奮性ニューロンは、視覚応答を示すGABAニューロンの密度が高い空間外に存在する興奮性ニューロンよりも多くの抑制性入力を受け取っている。

本日のトピック
1. イントロダクション～局所神経回路網解析と方法論～
2. 大脳皮質一次視覚野ニューロンの方位（傾き）選択性について

3. 抑制回路を介したコリン作動性ニューロンによる覚醒脳の動作制御機構

覚醒下の遺伝子改変ラットを用いた
in vivo 二光子励起機能的Ca2+イメージング法の開発
覚醒ラットの保定装置全体像

保定中の覚醒ラットの様子（理化学研究所 動物実験計画承認済み・承認番号H22-EP082 ）覚醒下の遺伝子改変ラットを用いた
in vivo 二光子励起機能的Ca2+イメージング法の開発
覚醒ラットの状態を二光子レーザー走査型顕微鏡と同期させてモニターする。
pupil

lateral sidein vivo 二光子レーザー励起機能的Ca2+イメージング画像

front sidevisual stimuli

Excitatory Neuron
GABAergic Neuron
Astrocyte

Depth 172μm

覚醒時と麻酔時におけるラット大脳皮質一次視覚野内の興奮性・GABAニューロンの視覚応答

覚醒時と麻酔時におけるラット大脳皮質一次視覚野内の興奮性・GABAニューロンの視覚応答

脳の主なコリン作動性ニューロン回路
The basal forebrain contains two groups of cholinergic neurons:
1- The medial septal group (medial septal nucleus and vertical diagonal band: ms and vdb)
that project cholinergic axons to the hippocampus and parahippocampal gyrus
2- The Nucleus Basalis group (nucleus basalis, substantia innominata and horizontal
diagonal band: bas, si, hdb) that project cholinergic axons to all parts of the neocortex,
parts of limbic cortex and to the amygdala (Woolf, 1991; Woolf, 1996).
In rodents the nucleus basalis magnocellularis (NBM) is the equivalent of Meynert nucleus in theprimates.
The cholinergic pontomesencephalon neurons (laterodorsal tegmental and pedunculopontine tegmental
nuclei: ldt and ppt) project onto hindbrain, thalamus, hypothalamus and basal forebrain.

the nucleus basalis magnocellularis: NB電気刺激時におけるマウス大脳皮質一次視覚野内の興奮性・GABAニューロンの視覚応答

the nucleus basalis magnocellularis: NB電気刺激時におけるマウス大脳皮質一次視覚野内の興奮性・GABAニューロンの視覚応答

ColinergicGABA

the nucleus basalis magnocellularis: NB電気刺激時におけるマウス大脳皮質一次視覚野内の興奮性・GABAニューロンの視覚応答

光によって神経細胞を刺激する(Zhang F et al. Nature Reviews Neuroscience 2007)

コリン作動性ニューロンChR2刺激時におけるマウス大脳皮質一次視覚野内のニューロンの膜電位変化

nFS

III/IIInFS
FSnFS

FSIVArroyo S, et al., J Neuroscience., 2012

コリン作動性ニューロンChR2刺激時におけるマウス大脳皮質一次視覚野内のGABAニューロンの視覚応答

コリン作動性ニューロンChR2刺激時におけるマウス大脳皮質一次視覚野内のニューロンの視覚応答

コリン作動性ニューロンChR2刺激時におけるマウス大脳皮質一次視覚野内のニューロンの膜電位変化

DHβE: dihydro-β-erythroidine hydrobromide(antagonist selective for non-α7 nicotinic receptors)
MLA: methyllycaconitine citrate(antagonist selective for α7 nicotinic receptors)

まとめ 2

共同研究者
RIKEN・BSI・大脳皮質回路可塑性研究チーム
津本 忠治
蝦名 鉄平
木村 塁
Yin Shu-ting
Jiang Bin
Sarihi Abdolrahman
Seyed Javad Mirnajafizadeh
Mir Shahram Safari
尾関 宏文
山田 麻紀
米野 久栄
服部 美穂
RIKEN・BSI・
認知判断モデルユニット
加藤英之玉川大学脳科学研究所
礒村 宜和
木村 梨絵
群馬大学大学院医学系研究科
柳川 右千夫金子 涼輔

謝辞
北海道大学電子科学研究所
根本 知己 先生

基礎生物学研究所
松崎 政紀 先生

九州大学大学院医学系研究科
大木 研一 先生
名古屋大学大学院医学系研究科
山中 章弘 先生
京都大学大学院医学系研究科
今吉 格 先生

鳥取大学大学院医学系研究科
畠 義郎 先生
亀山 克郎 先生

RIKEN・BSI・平瀬研究ユニット
平瀬 肇 先生
高田 則雄 先生

RIKEN・BSI・細胞機能探索チーム
宮脇敦史 先生

群馬大学大学院医学系研究科
安田 浩樹 先生