Trace Nutrients Research 30 : 41−43（2013）

原著

かき肉エキスのアセトアミノフェンによる肝障害抑制作用の検討
春松槙，福田卓，松井博之，松田芳和（日本クリニック㈱・中央研究所 ）＊Study of oyster extract on acetaminophen-induced hepatic damage
Shin Harumatsu, Suguru Fukuda, Hiroyuki Matsui, Yoshikazu Matsuda
Central Research Institute, Japan Clinic Co., Ltd.

Summary
Glutathione is found in various tissues and plays an important role in terms of anti-oxidant effects and drug metabolism. In a previous study, we reported that oyster extract enhanced glutathione in rat hippocampus.
Acetaminophen has been extensively used as an analgesic. However, it has been reported that an overdose of it
caused serious hepatic damage. Therefore, the aim of this study was to determine whether oyster extract inhibits
hepatic damage due to acetaminophen.
In serum, the administration of oyster extract tended to suppress up-regulation of AST and ALT with acetaminophen. In liver, the administration of oyster extract increased total glutathione. In addition, it suppressed the downregulation of glutathione with acetaminophen.
These results indicate that oyster extract inhibits hepatic damage due to acetaminophen.

グルタチオンはグルタミン酸，システイン，グリシンか馴 化 さ せ た ラ ッ ト を 体 重 に よ り Control 群，OE 群，らなるトリペプチドであり，生体が有する主要な抗酸化物

APAP 群，APAP + OE 群 の 4 群 に 分 け，Control 群 と質である。その細胞内濃度は比較的高く維持されており，APAP 投与群に滅菌蒸留水を，OE 群と APAP + OE 群に抗酸化作用だけで無く，薬物などの解毒にも大きく関わっ

500 mg/kg 量の OE（日本クリニック㈱）を AM9：00 に 7ている 。

日間，ゾンデにより強制経口投与した。またアセトアミノ1）

アセトアミノフェン（APAP）は解熱鎮痛薬として幅広

フェン肝障害では摂食状態が障害の程度に影響を与えるた

く使用されており，適正な使用量であれば非常に安全な薬

め，投与 7 日目の夕方に飼料を抜き，一晩絶食を行った。

剤である。しかし過剰に摂取すると重篤な肝障害を起こすことが報告されている 。APAP による肝障害はラットな
2）アセトアミノフェン肝障害モデル
APAP（Sigma Aldrich）を 42℃に温めた滅菌生理食塩

どでも再現が出来ており，肝障害の原因としてグルタチオ水に溶解して APAP 投与液を作成した。絶食をかけた次ンの枯渇が報告されている 。
3）

われわれはこれまでに，かき肉エキス（OE）の投与にの日，AM9：00 より作成した APAP 投与液を APAP 群とよりラットの腎臓および海馬でグルタチオンが増強するこAPAP + OE 群に 400 mg/kg 量で腹腔内投与し，アセトとを示してきた 。そこで本実験では OE の APAP に対アミノフェン肝障害モデルを作成した。Control 群と OEする肝障害抑制作用を検討した。

群には 42℃に温めた滅菌生理食塩水を腹腔内投与した。

4）

投与後 6 時間後にジエチルエーテル（和光純薬工業㈱）で実験方法

麻酔をかけ，腹腔内動脈より血液を採取した。採取した血液はセパラピットチューブ（㈲フチガミ器械）に入れ，血動物清を得た。また，肝臓は冷却した PBS で灌流後，液体窒

5 週齢の Sprague-Dawley 系雄ラット（清水実験材料

素で凍結後－20℃で各項目の測定まで保存した。

㈱）を購入し，1 週間馴化させたものを実験に用いた。
ラットは一般的な環境下で飼育を行い，MF 飼料（オリエ

血液パラメーター
血清 AST，ALT および LDH は酵素法（JSCC 標準化

ンタル酵母工業㈱）と水道水を自由摂食，飲水させた。

所在地：京都市右京区太秦開日町10-1（〒616-8555）＊― 41 ―

対応法）によりそれぞれ測定を行った（㈱ファルコバイオ

Table 2 GST activity and DNA fragmentation in liver.

システムズ）。

GST(mM/min/g tissue)
Control
8.41 ± 2.95
APAP
5.90 ± 1.84
OE
6.79 ± 1.64
OE + APAP
5.91 ± 2.08
Values are means ± S.D.

DNA fragmentation(vs. control)
1.00 ± 0.53
1.29 ± 0.73
0.86 ± 0.49
1.13 ± 0.62group

肝臓総グルタチオン量の測定
凍 結 し た 肝 臓 を 5 ％ SSA 溶 液 に 入 れ， ホ モ ジ ェ ナ イ
ザーで破砕した。破砕後，蒸留水で 5 倍に希釈し 8000 × g，4℃，10 min 遠心した。遠心後上清を回収し，総グルタチオン量測定サンプルとした。総グルタチオン量の測定はGlutathione quantification kit（ ㈱ 同 人 化 学 ） を 用 い て行った。

肝臓中総グルタチオンにおいては Fig. 1 に示したように，Control 群と OE 群を比較して，OE の投与により有意な肝臓中総グルタチオンの増加が認められた。また，

肝臓 Glutathione-S-transferase 活性の測定

APAP 群においては Control 群と比較して有意に肝臓中総凍結した肝臓をリン酸緩衝液（0.1 M リン酸緩衝液，2グルタチオン量が低下していた。しかし，OE を投与した

mM EDTA，pH 7.0）に入れ，ホモジェナイザーで破砕しAPAP + OE 群では減少した肝臓中総グルタチオン量が有た。10000 × g，4 ℃，15 min で 遠 心 後 上 清 を 回 収 し，意に回復していた。

Glutathione-S-transferase（GST）活性測定サンプルとし

c4.00た。GST 活 性 の 測 定 は Glutathione-S-transferase kita

Liver total glutathione(μmol/g tissue)（Sigma Aldrich）を用いて行った。
肝臓 DNA の断片化の測定
凍結した肝臓をリン酸緩衝液（50 mM リン酸緩衝液，120 mM NaCl，10 mM EDTA，pH 7.4） に 入 れ， ホ モ
ジェナイザーで破砕した。13000 × g，20 min，4℃で遠心し上清を肝臓 DNA 断片化サンプルとして用いた。DNA
断片化の測定は cell death detect kit（Roche）を用いて行った。
統計解析

a3.00

b2.00

1.00

0.00

全ての結果は 2 元配置分散分析により検定後，有意であった場合に Fisher’s PLSD により群間の検定を行った。
有意水準は p ＜ 0.05 とした。

実験結果

Control

APAP

OE

OE+
APAP

Fig. 1 The amount of total glutathione in liver.
Values are means ± S.D.
Different letters show significant differences at p ＜ 0.05
by two-factor factorial ANOVA followed by Fisher’sPLSD.

考Table 1 に示したように，有意な差は認められなかった

察が Control 群と比較して APAP 群で血清 AST，ALT の増 加 傾 向 が 認 め ら れ た。 し か し，OE を 投 与 し た

APAP は通常使用する場合は非常に安全性の高い薬とAPAP + OE 群 で は APAP に よ り 増 加 し た 血 清 AST，考えられているが，高用量の処方や常用などにより肝臓にALT を減少させる傾向を示した。血清 LDH については障害を起こす場合がある。APAP の代謝には主に 3 つのどの群においても有意な差は認められなかった。

経路があることが知られており，一つはグルクロン酸によ

Table 1 Serum AST, ALT, and LDH concentrations.

る抱合，もう一つは硫酸による抱合である。硫酸により抱group
AST (U/L)
Control
190 ± 40
APAP233 ± 96
OE
216 ± 62
OE ＋ APAP
188 ± 46
Values are means ± S.D.

ALT (U/L)
40 ± 1168 ± 3943 ± 852 ± 11

合された APAP は血中に放出され，腎臓で尿として排出さLDH (U/L)
3784 ± 781
3581 ± 1663
4501 ± 1632
4501 ± 1632

れる。また，グルクロン酸に抱合された APAP もほとん
どが硫酸抱合と同様に尿として排出され，一部が胆汁に排出される。そして 3 つ目の経路は CYP2E1（CytochromeP450 2E1）による代謝であり，APAP による肝障害の原因はこの 3 つ目の経路であると言われている。APAP5, 6）

また，Table 2 に示したように肝臓中 GST 活性および肝の CYP2E1 による代謝産物である NAPQI（N-acetyl-p-臓 DNA の断片化については APAP および OE 投与によbenzoquinone imine）は非常に反応性の高い物質であり，る影響は認められず，各群に有意な差は認められなかった。

細胞内のタンパク質や核酸に結合することで細胞を破壊し― 42 ―

強い肝障害を引き起こす。この NAPQI を解毒するために至らなかったことが考えられる。血清 LDH についてもは GST とグルタチオンが必要であり，GST は NAPQI にALT，AST と同様に肝障害の指標として用いられるが，グルタチオンを抱合させる。これにより無毒なメルカプ同様の理由で差が認められなかったと考えられる。

ツール酸に NAPQI を変化させ，体外に排出する。この反以上の結果は OE が APAP による肝障害を抑制する可応には十分なグルタチオンの存在量が重要となっており，能性を示し，OE の継続的な飲用により APAP をより安グルタチオンが枯渇すると NAPQI を解毒することが出来全に服用できる可能性を示した。

ない。これらのことより APAP による肝障害を抑制する

今後は，本実験ではあまり肝障害の強くない条件下で試ためにはグルタチオンを増やすことが効果的であることが験を行ったが，血中パラメーターに変化が認められるよう考えられる。

な APAP の影響が強い条件下または，変動を受けやすい

本実験の結果より OE は肝臓の総グルタチオン量を増強パラメーターの検討も行う必要があると思われる。また，する作用があることが示され，APAP 投与により起こる

上記に記したように APAP の解毒には別の経路も存在しグルタチオンの減少を抑制することが示された。われわれていることから，グルクロン酸および硫酸抱合への OE のはこれまでに腎臓および海馬で OE 単独投与における総グ影響も検討するべきと考えられる。また，依然として OEルタチオン量の増強を示していたが，肝臓についてそのよによるグルタチオン増強の機序が不透明である。そのため，うな結果は得られていなかった。肝臓はさまざまな物質のOE によるグルタチオンの合成，分解，放出，流入への影解毒に重要な組織であるため，肝臓での OE による総グル響を検討していきたいと考えている。

タチオン量の増強は有害物質の解毒，それによる肝臓保護

参考文献に非常に有用であると考えられる。グルタチオンを増強させる物質として N- アセチルシステイン（NAC）が報告されている 7）。NAC はグルタチオンの構成物質であるシ1）Wu G, Fang YZ, Yang S, Lupton JR, Turner

ステインを供給することでグルタチオンを増強させると考ND.(2004) Glutathione Metabolism and Its Implica-えられている。OE にはシステインの材料となるタウリン

tions for Health. J. Nutr. 134(3): 489-92.などの硫化アミノ酸が含まれている。しかし，飼料から摂2）James LP, Mayeux PR, Hinson JA.(2003) Acetamin-取する硫化アミノ酸量に対して，投与した OE 中の硫化ア

ophen-induced hepatotoxicity. Drug. Metab. Dispos.

ミノ酸量は極めて少ない。そのためグルタチオンの増加に

31(12): 1499-506.

は OE 内に含まれる硫化アミノ酸による増加の可能性は低3）Acharya M, Lau-Cam CA.(2010) Comparison of theいと思われる。このことから，何らかの物質がグルタチオ

protective actions of N-acetylcysteine, hypotaurine

ンの増加に関与している可能性があると思われる。本実験

and taurine against acetaminophen-induced hepato-の結果では肝障害の指標である血清 ALT，AST においてtoxicity in the rat. J. Biomed. Sci. 17 Suppl. 1: S35

APAP による増加傾向と OE による減少傾向が認められ4）福田卓，春松槙，松井博之，松田芳和（2012）かき肉たが，有意な差は認められなかった。APAP による肝障エキスによるラット海馬中総グルタチオン増強効果

害はしっかりとした用量依存性が認められることがわれわ

微量栄養素研究 29：106-109.

れの予備検討でも分かっている（data not shown）。その

5）Ben-Shachar R, Chen Y, Luo S, Hartman C, Reed M,

ため APAP 投与によりわずかな肝障害を示したものの，

Nijhout HF.(2012)The biochemistry of acetamino-

APAP の投与量が少なかったために，有意差が認められ

phen hepatotoxicity and rescue: a mathematical

るような AST，ALT の上昇に至らなかったと考えられる。

model. Theor. Biol. Med. Model. 9: 55.

GST 活性においても各群において有意差が認められな

6）Bessems JG, Vermeulen NP.(2001) Paracetamol

かった。前述したように GST は APAP の代謝産物である(acetaminophen)-induced toxicity: molecular andNAPQI のグルタチオン抱合に必要な酵素であるが，このbiochemical mechanisms, analogues and protective

結果から肝臓においては OE および APAP による GST 活

approaches. Crit. Rev. Toxicol. 31(1): 55-138.

性の制御は起こらないことが示された。また肝臓 DNA の7）Lauterburg BH, Corcoran GB, Mitchell JR.(1983)

断片化については，APAP は肝臓障害を起こす時にアポ

Mechanism of action of N-acetylcysteine in the

トーシスとネクローシスを起こすことが知られている 。

protection against the hepatotoxicity of acetamino-8）

そこで肝臓障害の程度を測定するため，肝臓 DNA の断片

phen in rats in vivo. J. Clin. Invest. 71(4): 980-91.

化を測定したが，各群ともに有意な差は認められなかった。

8）Tripathy D, Grammas P.(2009) Acetaminophen in-

この結果は APAP による肝障害があまり強くなかったた

hibits neuronal inflammation and protects neurons

めに，はっきりと差が認められるような DNA の傷害まで

from oxidative stress. J. Neuroinflammation. 6: 10.

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