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Flexible KOD DNA polymerase

KOD FX
KOD FXは、高正確性PCR酵素KOD DNA polymeraseをベースに開発された高性能PCR試薬です。高い「増幅成功率」、「増幅効率」、および「伸長性」を示すことから、'07/5月の発売以来、多くの先生方から、「 他のPCR酵素では増えなかったターゲットが簡単に増えた！」との声を多く頂いております。
今回は、KOD FXを更に効果的かつ幅広くお使い頂くために、これまでに頂いたご質問に対して、実施例をお示ししながら解説致します。

1

KOD FXの最大の特長は何ですか？ また、KOD -Plus-とはどのように使いわけたらよいですか?

1

以下に、弊社が販売しているPCR酵素の中でのKOD FXの位置付けに関する一覧表をお示しします。
表から、KOD FXの増幅成功率、増幅効率、及びGCリッチなサンプルの増幅において、KOD FXが格段に高い性能を示すことがお分かりいただけると思います。
表1．東洋紡のPCR酵素におけるKOD FXの位置付け

正確性
P
CRがう
まくいかずに困っている︒︵幅広いPCRで力を発揮︶

伸長性

増幅効率

（ロング性能）

（収量）

★★★★

高正確性
PCRをしたい

増幅成功率

ＧＣリッチ
サンプル

増幅末端

伸長時間
（/kb）

ホットスタート

KOD FX （Taqの約１１倍） ★★★★★

★★★★★★

★★★★★★

★★★★★★

平滑末端

１min.

○

KOD DNA
Polymerase

★★

★★

★★

★★★★

平滑末端

３０sec.

ー★★★★

★★★★

★★★

★★★★

平滑末端

１min.

○

★★★★

★★★★

★★★★

★★★★

平滑末端

１min.

○

★★★★★

★★★★★

★★★★

★★★

A付加あり

１min.

ー★★★★★

★★★★★

★★★★★

★★★

A付加あり

１min.

○★★★★★

★★★★★

★★★★

★★★★

A付加あり

３０sec.

ー

KOD -PlusKOD -PlusVer.2
Blend Taq®

高効率でBlend Taq®
汎用PCRを-Plusしたい
KOD Dash®

★★★★★
（Taqの約５０倍）★★★★★★
（Taqの約８０倍）★★★★★★
（Taqの約８０倍）★★
（Taqの約３倍）★★
（Taqの約３倍）★★
（Taqの約３倍）

実験1に示しましたように、KOD FXは、GCリッチなターゲットに対し抜群の増幅性能を示すことが特長です。

◆実験1◆ GC richターゲットの増幅ターゲット：ヒト IGF2R遺伝子[NM̲000876] 8.9kb

また、高い増幅成功率を示し、Long PCRのみでな（GC含量約90%の領域を含む遺伝子）

く、普段のルーチンPCRにおいて確実にPCR産物をプライマー配列：
F primer:5 -TCCCGCTCCGTCTCCACCTCCGC-3
R primer:5 -CAGGGCGGTTTGCTTCTCAGCAATAGA-3

取得したい場合にも力を発揮します。
なお、伸長性に関しては、ヒトゲノムDNAを鋳型とした場合、KOD -Plus- の最大増幅鎖長が約

鋳型：ヒトcDNA（HeLa Total RNA50ng相当 ）/ 50μl反応系
PCRサイクル：94℃ 2min.

12kbに対して、KOD FXでは、最大約24kbと、約298℃ 10sec.

倍の鎖長を増幅できることを確認しています。

68℃ 8min.

30 cycles

一方、正確性（Fidelity）の点においては、KOD※他社酵素については、製品添付のプロトコールに従い30サイクルにて実施しました。

-Plus-及びKOD -Plus- Ver.2の方がさらに高い正M1 1 2 3

確性を示しますので、より正確性を必要とする用途には、KOD-Plus-もしくはKOD -Plus- Ver.2のご使用をお薦めします（⇒Q3参照）。

8.9kb※KOD -Plus- Ver.2は、正確性はKOD -Plus-の性能を保ちつつ 、さらに増幅成功率を高めたPCR酵素ですが、増幅成功率はKOD FXが勝ります（表1）。

89154 5 6 7 M2

M1: 1kb DNA ラダー
1: KOD FX
2: A社汎用PCR酵素（Taqベース）
3: B社Long PCR酵素（Taqベース）
4: C社GCrich対応高正確性酵素
5: D社GCrich対応Long PCR酵素Ⅰ
6: E社GCrich対応Long PCR酵素Ⅱ
7: F社高効率Long PCR酵素
M2: λ/ Hin dⅢ digest

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細胞培養液などのクルードサンプルを直接鋳型として使用することはできますか？
可能です。サンプル適応力の高いKOD FXは、夾雑物を含むサンプルに対しても高い増幅成功率を示します。実験2は、Jurkat細胞の細胞懸濁液を直接PCR反応液に添加して増幅を試みた例ですが、8.5kbまでの増幅が確認できました。
また、ここではお示ししておりませんが、培養細胞以外のさまざまなクルードサンプルから、直接増幅可能であることを確かめています。
クルードサンプルの場合、最大2μlを50μlのPCR反応系に添加して実施すると良い結果が得られます。

◆実験2◆ 培養細胞を鋳型とした直接PCR

1 2 3 4 5 6 M

ターゲット：ヒトβ-globin 領域1.3kb、3.6kb、8.5kb
プライマー配列：
1.3kb F primer: 5'-TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC-3
1.3kb R primer: 5'-CCAGGATTTTTGATGGGACACG-3
3.6kb F primer: 5'-GGTGTTCCCTTGATGTAGCACA-3
3.6kb R primer: 5'-ACATGTATTTGCATGGAAAACAACTC-38.5kb F primer: 5'-TGATAGGCACTGACTCTCTGTCCCTTGGGCTGTTT-38.5kb R primer: 5'-ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA-38.5kb
3.6kb
1.3kb

鋳型：Jurkat細胞 2×104cells/50μl反応系（RPMI/10%FCSに懸濁した1×104/μlの細胞を2μl使用）

1, 2: ヒトβ-globin 1.3kb
3, 4: ヒトβ-globin 3.6kb
5, 6: ヒトβ-globin 8.5kb
M: λ/Hin d Ⅲ digest

PCRサイクル：94℃ 2min.
98℃ 10sec.
68℃ 3min./kb

3330 cycles

PCR増幅時の正確性はどのくらいですか？また、クローニング目的に使用できますか？
KOD FXのPCRエラーによるミス塩基の取り込み頻度（エラーPCRエラー率率）は、実際にシーケンシングにて解析した結果、144,535塩基
KOD -Plus-中、わずか19塩基でした。この正確性は、Taqや他社Long PCR用酵素の約10倍優れている値です（右図）。従って、クローニング

KOD FX
Pfu DNA Polymerase
A社Long PCR用試薬目的にも十分使用することが可能です。

Taq DNA Polymerase

実験3は、実際に、真核細胞における最も長いmRNAの一つで020あるヒトジストロフィン（DMD）遺伝子をクローニングすべく、遺伝子の全長13.5kbのPCR増幅を試みた例です。ここでのPCR産物をplasmidにクローニングし、配列の確認を行ったところ、5クロー

401001206080
Mutation Frequency（×10-5）140160〈PCRエラー率の測定方法〉各酵素にてヒトゲノムDNAを鋳型にβ-globin領域2.4kbの増幅を行い、PCR産物をTAクローニング後、96クローンをピックしてシーケンシングを行い、配列の確認を行いました。

ン中の1クローンでPCRエラーのないクローンを取得することができました。
また、KOD FXを用いて増幅したPCR産物は、KOD -Plus-などと同様に末端が平滑化されていることに注意する必要があります。そのままではTAクローニングすることはできません。専用のTAクローニングキット「TArget Clone™ -Plus-」を用いることによりKOD
FXのPCR産物を直接TAクローニングすることが可能です。
M1 1 2 3 M2

◆実験3◆ ヒトジストロフィン（DMD）遺伝子13.5kbの増幅ターゲット：ヒトジストロフィン（DMD）遺伝子[ NM̲004006.1]

13.5kb

13.5kb

プライマー配列：F primer:5'-GTCGGCCTTGTTGGCCTACTGGAGCAATAAAGTTTGAAGAACTTTTACCAGG-3'
R primer:5'-GACGGCCTATGTGGCCACAACACGAAATAATGTCCAAATTAATTATGC-3'（下線部はplasmidへのクローニングの際に使用したSfi Iサイト）
鋳型：ヒトcDNA（Human Adult Skeletal Muscle total RNA 50ng相当 ）/ 50μl反応系

M1: 1kb DNA ラダー
1: 30サイクル
2: 35サイクル
3: 40サイクル
M2: λ/Hin d Ⅲ digest

PCRサイクル：94℃ 2min.
98℃ 10sec.
68℃ 14min.

30 or 35 or 40 cycles

以上、ここでご紹介しましたように、KOD FXはとにかく高い増幅成功率を示しますので、PCR増幅で問題を抱えれられている方はもちろん、PCRに安心感を得たい方は、是非一度お試しください。
品名および内容
KOD FX
KOD FX（1U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX
2mM dNTPs
高効率TAクローニングキット

TArget Clone™ -Plus-

保存温度

Code No.

価200U×1本［200回用＊］-20℃

KFX-101￥35,000（200U×1本）
×5［1,000回用＊］-20℃

KFX-101X510回用-20℃

TAK-201

包装格￥140,000￥16,000＊50μl反応を行った時の反応回数を表示しています。
※KOD FXで増幅されたDNA断片は平滑化されているため、通常のTAクローニングはできません。TArget Clone™ -Plus-をお使いください。

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