No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 12

Emerald Lucを用いたスプリットルシフェラーゼによるタンパク質相互作用検出系の構築とGPCRリガンドスクリーニングアッセイへの応用
株式会社Probe X 三浦 研二
はじめ にルシフェラーゼリポーターアッセイは、in vitroアッセイ、セルベースアッセイ、in vivoイメージングなどに幅広く応用可能な基盤技術として発展を続けています。東洋紡が販売するEmerald Lucリポーターアッセイシステムは、発光強度が強くしかも長時間安定な発光を得ることができる特長があります。このたび、ProbeXではこのEmerald Lucを用いたスプリットルシフェラーゼによるタンパク質相互作用検出システムを開発し、販売を開始しました。スプリットルシフェラーゼとは、ルシフェラーゼ分子を2つの分子に分割（スプリット）し活性を失わせたものです。それらが再会合すると活性が復元することを利用し、時空間レベルでタンパク質相互作用を検出することができます。
1. Emerald Lucを用いたスプリットルシフェラーゼの構築
スプリットルシフェラーゼを構築する場合は、β-ガラクトシダーゼのような他のタンパク質相補型システムと異なり、スプリット位置に重なりを持たせることが必要であることが知られています。しかし、強い発光を得るための最適な切断位置については詳細な知見がありませんでした。そこで、ProbeXではEmerald Lucについて種々の切断位置でスプリットした分子を作製し、網羅的な解析を行いました（文献1）。N-末端側分子として、1から406番目のアミノ酸までの分子をはじめとして一つずつアミノ酸を伸ばして、1から417番目のアミノ酸までの12種類の長さの異なる分子を発現する遺伝子を構築しました。また、C-末端側分子として、389番目のアミノ酸からC-末端までをはじめとして、やはり一つずつアミノ酸の長さを変えて413番目までのアミノ酸からC-末端までの25種類の長さの異なる分子を
Emerald Luc-N
1- 406FKBP

1- 407FKBP

1- 417発現する遺伝子を構築しました。そして、相互作

Emerald Luc-C12⛸㢦

FKBP× 25⛸㢦ධ䛬䛴⤄䜅ྙ䜕䛡䛭⣵⬂හ䛱ᑙථ

FRB

389 - 542

FRB390 - 542

用するタンパク質として、N末端側分子とFKBP、C末端側分子とFRBの融合タンパク質を発現するDNAをそれぞれ作製しました。これらの全てFRBの組み合わせ全300通りをHEK293細胞にトラ

413 - 542

ンスフェクションし、ラパ マイシン 刺 激によりFKBPとFRBの相互作用を惹起し、スプリットルシフェラーゼが会合して示す発光強度を測定しました（図1）。その結果、N末端側1−415アミノ酸（ 以後Emerald Luc-Nとします）C末端側394−542アミノ酸（以後Emerald Luc-Cとし䝭䝕䝢䜨䜻䝷FKBPFRBます）の組み合わせが最も強い発光を与えることⓆකEmerald Luc-N

Emerald Luc-C්ఌྙ䛝䛥Emerald Lucがわかりました（図2）。
このEmerald Luc-NとEmerald Luc-Cのそ
れぞれについて、目的のタンパク質との融合タンパク質を発現させるベクターを構築しました（図図1．Emerald Lucのスプリット位置の評価系3）。これらを用いることにより、様々なタンパク質の相互作用を検出する系を構築することがで
きようになりました。

図2．Emerald Luc各種スプリット位置の組合せによる発光量（文献1より引用）

12EF1䃇
䝛䝱䝦䞀䝃䞀

Emerald Luc-N MCS

EF1䃇䝛䝱䝦䞀䝃䞀MCS

Emerald Luc-C

Myc+HisSV40
䜬䝷䝓䝷䜹䞀Amp(r)ori

V5 +HisSV40
䜬䝷䝓䝷䜹䞀

Amp(r)

ori

図3．スプリットルシフェラーゼ融合タンパク質発現用DNAコンストラクト

2013No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 13

2. GPCRリガンドアッセイ系への応用
GPCRは様々な生体内のシグナル伝達に関与し、創薬の標的分子として注目を集めています。GPCRは細胞外ドメインにリガンドが結合すると細胞内ドメインにβ-アレスチンが結合しシグナルが伝達されます。ProbeXでは、このGPCRとβ-アレスチンの相互作用とスプリットルシフェラーゼを組み合わせたGPCRリガンドアッセイ系を構築しました（文献1）。図4に示すように、目的とするGPCRのC末端にEmerald Luc-Cを融合した遺伝子、およびβ-アレスチンのN末端にEmerald Luc-Nを融合した遺伝子を作製して、両者を同時に細胞内に発現させます。この細胞にリガンドを添加すると、GPCRとβ-アレスチンの相互作用によりスプリットルシフェラーゼが再会合し、発光がおこります。SSTR2についてのアッセイ系を構築し、リガンドとしてソマトスタチンを添加したところ、濃度に対して用量依存性の曲線を描くことができました（図5）。また、抗体組織染色法により分子の分布を調べると、リガンド刺激前のGPCR＋Emerald
Luc-C分子は細胞膜に、
Emerald LucN＋β-アレスチン分子は細胞質にそれぞ

䝮䜰䝷䝍

㻪㻳㻦㻵
䝮䜰䝷䝍

れ分布していましたが、リガンド添加により細胞質にあったEmerald Luc-N＋β-ア
レスチンは細胞膜に集まることが観察さ䃈㻐䜦䝰䜽䝅䝷㻑れました。また、その後、GPCRが細胞質に移行することも観察されました（図6）。

䃈㻐䜦䝰䜽䝅䝷㻑Ⓠක㻨㼐㼈㼕㼄㼏㼇㻃㻯㼘㼆㻐㻦

これはルシフェラーゼ融合タンパク質を利用したアッセイ系がGPCR-β-アレスチン複合体の生体内の挙動を反映していることを示唆しています。

㻨㼐㼈㼕㼄㼏㼇㻃㻯㼘㼆㻐㻱
図4．スプリットルシフェラーゼを用いたGPCRリガンドアッセイ

SSTR2᯹Ⰵ

図5．SSTR2に対するソマトスタチンの用量反応曲線（文献1より引用）䃈㻐䜦䝰䜽䝅䝷᯹Ⰵ䝁䝢䝌䜽䝃䝅䝷῟ຊ๑䝁䝢䝌䜽䝃䝅䝷῟ຊᚃ

図6．ソマトスタチン添加によるSSTR2とβ-アレスチンの局在変化（文献1より引用）

3. ハイスループットスクリーニング系への応用
このGPCRリガンドアッセイ系をハイスループットスクリーニング（HTS）に適用するため、発光試薬とアッセイプロトコールの開発をおこないました。より高いS/B比を得るため、持続的に強い発光を可能とする試薬を東洋紡の協力を得て開発しました。す
なわち、スプリットルシフェラーゼは、その発光強度に対する添加成分の影響が野生型ルシフェラーゼとは異なるため、スプリットルシフェラーゼ専用に成分調整を行ったSPLIT GLOW Cell Assay Reagentを開発しました。本試薬の発光は90分以上持続し（図7）、多数の検体を処理する場合でも、プレート内およびプレート間のバラツキを抑えることができます。また、96ウェルプレートに対応したプロトコールの最適化を行いました。この結果、ADBR2およびSSTR2のリガンドアッセイ系においていずれも、Z'が0.75以上となり、HTSに適用できることが示唆されました（表1）。

201313No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 14

図7．SPLIT GLOW Cell Assay Reagentの発光持続性表1．スプリットルシフェラーゼを用いたGPCRリガンドアッセイの性能

シグナル値
平均

標準偏差

CV（%）

Z

SSTR2

陰性
陽性

1,072
87,300

132
6,344

12.3
7.30.77

ADRB2

陰性
陽性

51047,433

67
3,318

13.1
7.00.78

4. ProbeXのスプリットルシフェラーゼタンパク質相互作用アッセイ系

表2．ProbeXのGPCRリガンドアッセイ用安定発現細胞株

サービス
ProbeXでは種々のGPCRについてリガンドアッセイ用安定発現細胞株をご用意しております（表2）。ほとんどの細胞でS/B比は40以上となっており安定的にアッセイを行っていただけます。その他のGPCRについても、ProbeXにて安定発現細胞株の作製を受託いたします。また、GPCR-リガンドアッセイ系以外にも、Hif1αおよびHif1βの会合のような細胞質タンパク質同士の相互作用検出などで実績があります。ご希望のアッセイ系を作製いたしますので、是非ご相談ください。

GPCRClass

ADCYAP1R1
ADRA2AADRB2
AGTR1
AGTRL1
CCKBR
EDG1
EDG3
ENDRA
ENDRB
OPRM1
SSTR2

Gs
Gi
Gs
Gq
Gi
Gq
Gi
Gi
Gq
Gq
Gi
Gi

S/B
ARRB1

ARRB2

42.8
−
74.4
271.0
117.2
−
47.5
−
107.2
45.2
982.2
166.8

−
11.8
71.9
9.8
90.5
46.0
32.4
41.9
44.5
46.2
52.1
105.5

おわりに
ルシフェラーゼによる発光をリポーターとする検出系は、蛍光をリポーターとする検出系と異なり励起光を必要とせず、また長波長の光を利用できることから、in vivoイメージングにも適しています。ProbeXではスプリットルシフェラーゼタンパク質
相互作用アッセイをin vivoイメージングに適用する取り組みも行っています。今後も本アッセイ系は多様な分野での活用が期待されています。

文献

1. N.Misawa, A.K.M. Kafi, M. Hattori, K. Miura, K. Masuda and T. Ozawa, Anal.

Chem., 82, 2552-2560（2010）

お問合わせ先株式会社 ProbeX
東京都文京区本郷4丁目1番4号 コスモス本郷ビル4F
tel：03-5842-3204
mail：info@probex.jp

142013