No.116

高性能 SEC カラム TSKgel® UP-SW3000 について

─目

次─
ページ

1. はじめに1

2. TSKgel UP-SW3000 の基本特性

1

2 - 1. 充塡剤の特性

1

2 - 2. 較正曲線と分離特性

1

2 - 3. 溶離液塩濃度のたんぱく質溶出挙動への影響

3

2 - 4. 測定流速の影響

5

2 - 5. 試料負荷量及び試料注入量の影響

7

2 - 6. カラム外（配管）での拡がりの影響

8

2 - 7. カラムの耐久性

10

2 - 8. 充塡剤のロット間差

11

2 - 9. TSKgel G3000SWXL との比較

12

2 - 10. 市販 UHPLC 用 SEC カラムとの比較

13

3. 応用例

15

3 - 1. 抗体医薬品の精密分析

15

3 - 2. 抗体パパイン消化物の分離例

16

4. おわりに

東ソー株式会社

16

1．はじめに

2．TSKgel UP-SW3000 の基本特性
2-1．充塡剤の特性

抗体医薬品に用いられるモノクローナル抗体は、製造・保存、或いは輸送時に生じる二量体を含めた凝集体が副表 1 に TSKgel UP-SW3000 の充塡剤の特性・カラム

作用を引き起こす場合があることから、品質管理におい仕様及び抗体の分離に用いられている既存 SW タイプて、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）での分離分析のカラムとの比較を示します。TSKgel UP-SW3000 は、が行われています。既存カラムの TSKgel G3000SWXL は

細孔径 25 nm のシリカゲル表面にジオール基を導入し本目的に多用されておりますが、より高い分離能と短時た粒子径 2 μm の充塡剤を充塡したカラムです。既存の

間 SEC 分析が求められています。今回、粒子径 2 μm

SW タイプのカラムに比べ高い分離性能を示し、抗体のの高性能 SEC カラム TSKgel UP-SW3000 を商品化いた二量体と単量体の分離に適しています。

しました。本稿では、TSKgel UP-SW3000 の基本特性と分離例を紹介いたします。

表 1：充塡剤の特性・カラムの仕様
本カラム

既存カラム

TSKgel UP-SW3000
カラムサイズ

4.6 mm I.D. × 30 cm

4.6 mm I.D. × 15 cm

TSKgel UltraSW Aggregate

TSKgel SuperSW mAb HR

TSKgel G3000SWXL

7.8 mm I.D × 30 cm

7.8 mm I.D. × 30 cm

7.8 mm I.D. × 30 cm

基材

シリカゲル

シリカゲル

シリカゲル

シリカゲル

官能基

ジオール

ジオール

ジオール

ジオール

粒子径

2 μm

3 μm

4 μm

5 μm

細孔径

25 nm

30 nm

25 nm

25 nm

排除限界分子量800 kDa

2,500 kDa（推定）800 kDa

800 kDa

分子量測定範囲

10 〜 500 kDa

10 〜 2,000 kDa

10 〜 500 kDa

10 - 500 kDa

用途

抗 体（ 二 量 体 / 単 量 抗 体（ 二 量 体 / 単 量 抗体（凝集体）の高 抗 体（ 二 量 体 / 単 量 一般的なたんぱく質，
体 / フ ラ グ メ ン ト ） 体）の高速分析
分離分析体）の高分離分析
抗 体（ 二 量 体 / 単 量の高分離分析
体）の高分離分析

2-2．較正曲線と分離特性した理論段数を示します。粒子径の小さい TSKgel UP-

TSKgel UP-SW3000、TSKgel SuperSW3000

SW3000 は、他のカラムに比べ理論段数が高いことがわ（4 μm）及び TSKgel G3000SWXL（5 μm）の標準たんかります。

ぱく質を測定したクロマトグラムの比較を図 1 に、標図 3 に TSKgel UP-SW3000、TSKgel SuperSW3000、

準たんぱく質による較正曲線の比較を図 2 に示します。

及び TSKgel G3000SWXL で分離したモノクローナル抗

同 じ 細 孔 特 性 を 有 す る TSKgel UP-SW3000、TSKgel

体のクロマトグラムの比較を、表 3 に各溶出ピークのSuperSW3000 及び TSKgel G3000SWXL は、チログロブ

分離度（R）の比較を示します。粒子径の小さい TSKgel

リンの二量体以上が細孔内に浸透できずに排除され V0

UP-SW3000 は他のカラムに比べ分離度が向上しているに溶出し（図 1）、較正曲線は同等の傾きを有していまことが分かります。

す（図 2）。また、表 2 にリボヌクレアーゼ A を試料と

─1─

〈測定条件〉
4

カラム：A）TSKgel UP-SW3000

5（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

1
2
1’

2

1’

2

5

＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム5＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム3
TSKgel G3000SWXL（5 μm，7.8 mm I.D. × 30 cm）

2’

3

溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）

TSKgel SuperSW3000（4 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

4

1’
C）

図1

（5 μm，7.8 mm I.D. × 30 cm）

3

2’

1

C）TSKgel G3000SWXL，

5

4

1

B）

（4 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

2’

A）

UV 280 nm

B）TSKgel SuperSW3000

3

9

7

11

13

流

速：A，B）0.35 mL/min，C）1.0 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

A，B）マイクロセル，C）標準セル

min

標準たんぱく質のクロマトグラムの比較

注入量：10 μL
試料：1．チログロブリン，640,000 Da（1' チログロブリン 二量体）
2．γ - グロブリン，155,000 Da（2' γ - グロブリン 二量体）
3．オブアルブミン，47,000 Da
4．リボヌクレアーゼ A，13,700 Da
5．p- アミノ安息香酸，137 Da

表2

カラム性能の比較（理論段数）
カ

ラ

ム

粒

A）TSKgel UP-SW3000

子径

理論段数（リボヌクレアーゼ A）

2 μm

45,625B）TSKgel SuperSW3000

4 μm

24,419C）TSKgel G3000SWXL

5 μm

18,325〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000

7（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
TSKgel SuperSW3000
6（4 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
TSKgel G3000SWXL，（5 μm，7.8 mm I.D. × 30 cm）

5

溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム

log M

4

3

流

速：A，B）0.35 mL/min，C）1.0 mL/min

温度：25 ℃

検

出：UV 280 nm
A，B）マイクロセル，C）標準セル

注入量：10 μL

2

試料：1．チログロブリン，640,000 Da（1' チログロブリン 二量体）

1

4

6

8

10

12

2．γ - グロブリン，155,000 Da

14（2' γ - グロブリン 二量体）

溶出容量 [mL]

図2

3．オブアルブミン，47,000 Da
4．リボヌクレアーゼ A，13,700 Da

標準タンパク質による較正曲線の比較

5．p- アミノ安息香酸，137 Da

─2─

〈測定条件〉
カラム：A）TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
B）TSKgel SuperSW3000（4 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
C）TSKgel G3000SWXL（5 μm，7.8 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：A，B）0.35 mL/min，C）1.0 mL/min
温 度：25 ℃
検 出：UV 280 nm
A，B）マイクロセル，C）標準セル
注入量：10 μL
試 料：マウス - ヒト キメラ モノクローナル IgG
1．三量体，2．二量体，3．単量体，4．フラグメント

UV 280 nm

TSKgel UP-SW3000（2μm，4.6 mmI.D. × 30 cm）

TSKgel SuperSW3000（4 μm，
4.6 mmI.D. × 30 cm）

TSKgel G3000SWXL（5 μm，
7.8 mmI.D. × 30 cm）

3

5

7

9

min

図3

モノクローナル抗体のクロマトグラムの比較

表3

モノクローナル抗体ピークの分離度（R）の比較
カラム

粒子径

R（ピーク 1/2）

R（ピーク 2/3）

R（ピーク 3/4）

A）TSKgel UP-SW3000

2 μm

5.02

3.50

2.70

B）TSKgel SuperSW3000

4 μm

2.16

1.53

1.19

C）TSKgel G3000SWXL

5 μm

2.56

1.73

-

2-3．‌溶離液塩濃度のたんぱく質溶出挙動へのな吸着により溶出が遅くなります。一方、溶離液の pH

影響

よりも等電点（pI）の高いチトクロム C（pI 10.1）及び適正な SEC 測定を行うために、充塡剤と測定物質とリゾチーム（pI 11.2）は、溶離液中で正に荷電しているの間で生じる相互作用（静電的、疎水的相互作用など）ため、残存シラノール基との静電的相互作用により、充を抑制する必要があります。シリカゲルを基材とする

塡剤への吸着現象を引き起こします。図 5 にりん酸緩衝

TSKgel UP-SW3000 は、充塡剤の表面に残存するシラ

液の濃度と塩基性たんぱく質のピーク面積の関係を示し

ノール基とたんぱく質との間に生じる静電的相互作用

ます。塩基性たんぱく質であるチトクロム C やリゾチー（イオン排除、イオン吸着）を、適切な塩濃度の溶離液

ムは、りん酸緩衝液の濃度が低い場合、充塡剤への吸着を用い抑制することが重要となります。図 4 にりん酸緩によりピーク面積の低下が認められます。りん酸緩衝液

衝液（pH 6.7）の濃度を変化させた場合の標準たんぱく

濃度が高くなるにしたがいピーク面積は上昇し、りん酸質の溶出挙動を示します。溶離液の pH よりも等電点（pI）

緩衝液濃度が 150 mmol/L 以上でほぼ一定のピーク面積の低い、チログロブリン（pI 4.5）、γ - グロブリン（pI 5.1）

を示しました。ピーク形状は、りん酸緩衝液濃度が高く

及びオブアルブミン（pI 4.6）は、溶離液中で負に荷電なり、静電的な吸着が抑制されるため、テーリングのピーしているために低い塩濃度では、残存シラノール基とのク形状が改善され良好なピーク形状を示すようになりま

イオン排除効果により、早く溶出します。一般に、イオす。このように、塩基性たんぱく質を測定するには、一ン排除効果は、塩濃度が高いほど抑制されることから、

定以上のイオン強度の溶離液を用いる必要があります。

りん酸緩衝液の濃度が高くなるにしたがい、溶出が遅図 6 に示すように、りん酸緩衝液、りん酸緩衝液に硫れ、100 mmol/L 以上でほぼ一定の溶出時間となります。

酸ナトリウムを添加した溶離液を用いた場合、前述した

また、DNP-L- アラニンのように疎水部を有する化合物

ように一定以上のイオン強度となるように溶離液の塩濃は、りん酸緩衝液の濃度が高くなるにしたがい、疎水的度を調整することにより、静電的な吸着を抑えて一定の─3─

ピーク面積を得ることができます。りん酸緩衝液の場合、一定のピーク面積を得ることができます。りん酸緩衝液

200 mmol/L、りん酸緩衝液に硫酸ナトリウムを添加し濃度が高いほど、硫酸ナトリウムの濃度が低い溶離液でた溶離液では、りん酸緩衝液の濃度により異なりますが、一定のピーク面積を得ることができます。

100 mmol/L 〜 150 mmol/L の硫酸ナトリウムの添加で〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶出時間［min］

溶離液：X mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：10 μL（レオダイン 8125）
試料：表中に記載

りん酸緩衝液濃度（mmol/L）

図4

りん酸緩衝液濃度の溶出時間への影響〈測定条件〉

ピーク面積（mV×秒）

2500

カラム：TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）

2000

溶離液：X mmol/L

1000
500
0

りん酸緩衝液（pH 6.7）

＋ 0.05 % アジ化ナトリウム

1500

流

速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：10 μL（レオダイン 8125）
試
0

100

200

料：表中に記載300

りん酸緩衝液濃度（mmol/L）

図5

りん酸緩衝液濃度のピーク面積への影響

2000

1500

ピーク面積（mV×秒）

ピーク面積（mV×秒）

2500

1000

500

0

1500
1000
500

0

100

200

0

300

塩濃度（mmol/L）

図6

2000

0

100

200

塩濃度（mmol/L）

溶離液塩濃度のピーク面積への影響
流 速：0.35 mL/min
検 出：UV 280 nm（マイクロセル）
温 度：25 ℃
注入量：10 μL（レオダイン 8125）
試 料：A）チトクロム C、B）リゾチーム〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：X mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ X mmol/L Na2SO4
─4─

300

2-4．測定流速の影響

theoretical plate：理論段高さ）の関係を示します。p-分子量の異なる 2 種類のたんぱく質（牛血清アルブミ

アミノ安息香酸は、何れの粒子径においても測定流速がン；BSA：Mw 66,500、 リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ A：Mw

高くなるにしたがい HETP が小さくなり、カラム効率

13,700）及び低分子化合物 p- アミノ安息香酸（Mw 137）が向上しています。一方、たんぱく質では、測定流速がを用いて測定流速の理論段数への影響を確認しました

高くなると HETP が大きくなる傾向を示し、分子量が（図 7）。p- アミノ安息香酸は、測定流速が高くなるほど大きい（分子サイズが大きい）たんぱく質ほど顕著なカ理論段数が高くなっています。p- アミノ安息香酸は拡散

ラム効率の低下が認められます。充塡剤の粒子径が小さ

係数が大きく、測定流速が低くなると拡散による拡がり

い TSKgel UP-SW3000 では、測定流速の HETP への影により理論段数が低下します。一方、分子量の大きいた

響が小さく、測定流速を高くした場合のカラム効率の低んぱく質では、測定流速が低くなるほど理論段数が高く下を抑えることができ、粒子径の大きい充塡剤が充塡さなる傾向を示し、分子量が大きいほど、より低流速で高れたカラムに比べ、高速分析に有利であると言えます。

い理論段数が得られています。このように、たんぱく質

図 10 に測定流速を高くして標準たんぱく質を測定したを分離する場合、測定流速を低くすることによりカラム

クロマトグラムを示します。測定流速を 0.50 mL/min

効率が向上し、より高い分離を得ることができます。図にすることにより 5 min の分析時間で良好な分離を得る

8 に示すようにγ - グロブリンの二量体と単量体の分離ことが可能となります。また、図 11 に測定流速と圧力も低流速になるほど向上しています。図 9 に TSKgelの関係に示します。TSKgel UP-SW3000（30 cm カラム）

UP-SW3000（粒子径 2 μm）と TSKgel SuperSW3000（粒は、標準流速（0.35 mL/min）では 35 MPa 以下の低い

子 径 4 μm） の 流 速 と HETP（Height equivalent to a

操作圧で使用することができます。

〈測定条件〉

70,000

カラム：TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）

60,000

溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム50,000

理論段数＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム40,00030,000

出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

試

BSA（66,500 Da）

10,000p- アミノ安息香酸，137 Da

p-アミノ安息香酸（137 Da）

0

0.1

0.2

0.3

料：BSA，66,500 Da
リボヌクレアーゼ A，13,700 Da

リボヌクレアーゼA（13,700 Da）

0.4

流速［mL/min］

図7

速：0.02 〜 0.38 mL/min

検注入量：10 μL（レオダイン 8125）

20,0000

流流速が理論段数に及ぼす影響─5─

〈測定条件〉

3.2

カラム：TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

3.0

溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウムR（二量体/単量体）

2.8＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム

2.6

2.4

速：0.02 〜 0.38 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：10 μL（レオダイン 8125）
試

BSA

2.2

2.0

流

料：BSA，
ヒトγ - グロブリン（ポリクローナル）

γ-グロブリン

0

0.1

0.2

0.3

0.4

流速
［mL/min］

図8

流速と分離度 R（二量体 / 単量体）の関係

4 μm

2 μm

30

30

TSKgel SuperSW mAb（4 μm，4.6 mm I.D. × 15 cm）

25

HETP［μm］

HETP［μm］

25
20
15
10

BSA

20

リボヌクレアーゼ A
p-アミノ安息香酸

15
10
5

5
0

TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 15 cm）

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0

0.6

0

0.1

図9

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

流速［mL/min］

流速［mL/min］

粒子径が異なる SEC カラムの流速と HETP の関係〈測定条件〉
4

カラム：TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 15 cm）

5

溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）

12A）0.35 mL/min＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム3＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム

1’

UV 280 nm

2’
5

4
2

1’

速：A）0.35 mL/min，B）0.50 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：5 μL（レオダイン 8125）

B）0.50 mL/min
1

流

試

3

料：1．チログロブリン，640,000 Da（1' チログロブリン 二量体）
2．γ - グロブリン，155,000 Da

2’（2' γ - グロブリン 二量体）
3．オブアルブミン，47,000 Da

0

図 10

1

2

3

4

5

6

4．リボヌクレアーゼ A，13,700 Damin

5．p- アミノ安息香酸，137 Da

高流速条件での標準たんぱく質の分離─6─

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000

30（4.6 mm I.D. × 30 cm，4.6 mm I.D. × 15 cm）

圧力損失［MPa］

溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム20＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム流

速：0.025 〜 0.59 mL/min

温度：25 ℃

10

0

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

流速［mL/min］

図 11

流速と圧力の関係

2-5．試料負荷量及び試料注入量の影響

cm カラムの場合は 70 〜 100 μg）。
BSA、リボヌクレアーゼ A 及び p- アミノ安息香酸の負

アミノ安息香酸を用いて、4.6 mm I.D. × 15 cm カラム及び荷量が、それぞれ 2 μg、1.5 μg 及び 0.01 μg となるよう

4.6 mm I.D. × 30 cm カラムの試料負荷量について確認しまに各試料を調製し注入容量の理論段数への影響について確した。試料注入量は、15 cm カラムで 5 μL、30 cm カラム

認しました。図 13 に各カラムでの注入容量と理論段数ので 10 μL として測定しました。図 12 に各カラムでの試料関係を示します。15 cm カラム、30 cm カラムとも試料注

負荷量と理論段数の関係を示します。15 cm カラムの場合、入量 2 μL まで殆ど理論段数の低下は認められませんでし

BSA で負荷量 50 μg 以上、リボヌクレアーゼ A で負荷量たが、2 μL 以上では注入量の増加とともに理論段数が低37.5 μg 以上で理論段数の低下が認められました。30 cm

下し、15 cm カラムでは、注入量 5 μL、30 cm カラムでは、

カラムでは、BSA で負荷量 100 μg 以上、リボヌクレアー

注入量 10 μL で 10 〜 15 % 程度の理論段数低下が認められ

ゼ A で負荷量 70 μg 以上で極端な理論段数の低下が認めました。TSKgel UP-SW3000 では、15 cm カラムで注入量られました。このことから、標準タンパク質の負荷量は、

5 μL 以下、30 cm カラムで注入量 10 μL 以下での使用を

カラム長さ 15 cm 当り 35 〜 50 μg 程度と考えられます（30

お勧めします。

30000

60000

20000

40000

理論段数

理論段数

牛血清アルブミン（BSA）、リボヌクレアーゼ A 及び p-

20000

10000

0
0.00010.01

100.0001100

負荷量（μg）

図 12

0.01

1

100

負荷量（μg）

試料負荷量と理論段数の関係〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 15 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：0.35 mL/min
検 出：UV 280 nm（マイクロセル）
温 度：25 ℃
注入量：Ａ）5 μL，B）10 μL（レオダイン 8125）
─7─

60000

20000

40000

理論段数

理論段数

30000

20000

10000

0

0
0.01

0.1

1

10

100

0.01

注入量（μL）

図 13

0.1

1

10

100

注入量（μL）

試料負荷量の影響（注入容量）〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 15 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

2-6．カラム外（配管）での拡がりの影響りました。カラム -UV セル間の配管の長さを変更した

TSKgel UP-SW3000 は、粒子径が小さく配管等のカ場合も配管の長さが長くなるにしたがい徐々に理論段

ラム外での拡がりにより、カラム本来の性能が得られな数の低下が認められ、長さ 40 cm（約 5.31 μL）の配管

い場合があります。インジェクションバルブ - カラム間、を使用した場合、理論段数が約 10% 程度低下しました。

及びカラム -UV セル間の配管での拡がりの理論段数へ

一方、内径 0.25 mm の配管を使用した場合（図 14、15の影響について確認しました。インジェクションバルブ

の◯，△，□）、配管の長さが長くなるにしたがい内径- カラム間、若しくはカラム -UV セル間の配管について、0.13 mm の配管と同様に理論段数が低下する傾向を示

それぞれ内径 0.13 mm, 及び内径 0.25 mm の PEEK 配管

しますが、内径 0.13 mm の配管を使用した場合に比べ、の長さを変えて、たんぱく質、低分子化合物の理論段数

インジェクションバルブ - カラム間の配管径の差異によを測定しました。図 14 にインジェクションバルブ - カ

り 5 〜 10% 程度、カラム -UV セル間の配管径の差異でラム間の配管長さの理論段数への影響を示します。また、

15 〜 20% 程度の理論段数低下が認められました。この図 15 にカラム -UV セル間の配管長さの理論段数への影

ように、TSKgel UP-SW3000 のカラム性能を得るため

響を示します。インジェクションバルブ - カラム間に内には、装置の配管径を 0.13 mm 以下とし、インジェクショ

径 0.13 mm の配管を用いた場合（図 14、15 の●，▲，■）、

ンバルブ - カラム間の配管の長さを 20 cm 以下、カラム

配管の長さが長くなるにしたがい徐々に理論段数の低下-UV セル間の配管の配管長さを 30 cm 以下で使用するが認められましたが、長さ 25 cm（約 3.32 μL）の配管ことをお勧めします。

を使用した場合の理論段数の低下は、約 10% 程度とな

─8─

15 cm カラム

30000

30 cm カラム

60000

理論段数

40000

理論段数

20000

10000

20000

0

0
0

10

20

30

0

10

配管長（cm）

図 14

20

30

配管長（cm）

カラム外容量の影響（カラム入口側配管）〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 15 cm）、Ｂ）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：A）5 μL、B）10 μL＊カラム出口側配管：0.13 mm I.D. × 30 cm

15 cm カラム

30000

理論段数

40000

理論段数

20000

10000

0

20000

10

20

30

40

0

50

配管長
（cm）

図 15

30 cm カラム

60000

10

20

30

40

配管長
（cm）

カラム外容量の影響（カラム出口側配管）〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 15 cm）、Ｂ）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：A）5 μL、B）10 μL＊カラム入口側配管 :0.13 mm I.D. × 15 cm

─9─

50

2-7．カラムの耐久性

カラムサイズで 3 ロットの充塡剤について確認しました

TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 15 cm, 4.6 mmI.
D. × 30 cm) について試料を連続注入した場合のカラム

が、いずれの場合も 500 回注入した後でもカラム性能に顕著な変化は見られませんでした。

の耐久性試験を行いました。

TSKgel UP-SW3000 は従来のカラムと比べて充塡剤の粒子径が小さいため、溶離液に含まれる不溶性物質や時間以上送液を停止する実験を 5 回繰り返し、p- アミ

試料中の夾雑物がカラムの入口に蓄積しやすく、性能のノ安息香酸を用いてカラム性能（溶出時間、理論段数）

低下を引き起こす場合があります。分析カラムの入口側を確認しました。各カラムの最大使用流速（15 cm カラにガードカラムを取り付け、適宜交換することにより、

ムは 0.50 mL/min、30 cm カラムは 0.35 mL/min）で実

分析カラムの劣化を防いで長期間安定した測定を行うこ施しました。結果を図 16、17 に示します。それぞれのとができます。

120

120

100

100
理論段数維持率（％）

溶出時間維持率（％）

標準たんぱく質混合試料を 100 回連続注入した後、6

80

60

40

20

80

60

40

0

100

200

300

400

20

500

0

100

注入回数

図 16

200

300

400

注入回数

カラムの連続注入試験（15 cm カラム）

〈測定条件〉カ ラ ム：TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 15 cm）
溶 離 液：200 mmol/L リン酸緩衝液（pH 6.7）＋ 0.05 % アジ化ナトリウム流速：0.50 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注 入 量：5 μL
注入間隔：10 min（試料 ①→②→③→④）（100 回注入後送液を 6 時間以上停止）
注入回数：500 回（100 回連続注入 5 回）
試料：①チログロブリン（1.5 g/L），γ - グロブリン（1.5 g/L），オブアルブミン（1.5 g/L），
リボヌクレアーゼ A（1.5 g/L），p- アミノ安息香酸（10 mg/L）②チログロブリン（1.5 g/L），β - ラクトグロブリン（1.5 g/L），DNP-L- アラニン（20 mg/L）③γ - グロブリン（1.5 g/L），チトクロム C（1.5 g/L），DNP-L- アラニン（20 mg/L）④ウシ血清アルブミン（1.5 g/L），リゾチーム（1.5 g/L），DNP-L- アラニン（20 mg/L）

─ 10 ─

500

120

100

100
理論段数維持率（％）

溶出時間維持率（％）

120

80
60
40
20

80
60
40
20

0

100

200

300

400

500

0

100

200

注入回数

図 17

300

400

500

注入回数

カラムの連続注入試験（30 cm カラム）

〈測定条件〉カ ラ ム：TSKgel UP-SW3000（4.6 mmI.D. × 30 cm）
溶 離 液：200 mmol/L リン酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 0.05% アジ化ナトリウム流速： 0.35 mL/min
検
出： UV 280 nm（マイクロセル）
温度：25 ℃
注 入 量：10 μL
注入間隔：15 min（試料 ①→②→③→④）（100 回注入後送液を 6 時間以上停止）
注入回数：500 回（100 回連続注入 5 回）
試料：①チログロブリン（1.5 g/L），γ - グロブリン（1.5 g/L），オブアルブミン（1.5 g/L），
リボヌクレアーゼ A（1.5 g/L），p- アミノ安息香酸（10 mg/L）②チログロブリン（1.5 g/L），β - ラクトグロブリン（1.5 g/L），DNP-L- アラニン（20 mg/L）③γ - グロブリン（1.5 g/L），チトクロム C（1.5 g/L），DNP-L- アラニン（20 mg/L）④ウシ血清アルブミン（1.5 g/L），リゾチーム（1.5 g/L），DNP-L- アラニン（20 mg/L）

2-8．充塡剤のロット間差

ト間でピーク形状、溶出位置に大きな差は見られず、ロッ

図 18 に異なるロットの充塡剤を用いて標準たんぱく
質混合試料を測定したクロマトグラムを示します。ロッ

ト間差が小さく製造安定性が高い充塡剤であることが分かります。
〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）

Lot.F

溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウムUV 280 nm

Lot.E＋ 0.05 % アジ化ナトリウム

Lot.D

Lot.C

流

速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試

Lot.B（1' チログロブリン二量体）

2．γ - グロブリン，155,000 Da

Lot.A
3

料：1．チログロブリン，640,000 Da

5

7

9

11

13

（2' γ - グロブリン

min

二量体）

3．オブアルブミン，47,000 Da

図 18 標準たんぱく質のクロマトグラム（充塡剤ロット間差）

─ 11 ─

4．リボヌクレアーゼ A，13,700 Da
5．p- アミノ安息香酸，137 Da

2-9．TSKgel G3000SWXL との比較度（R）が得られています。また、図 20 にモノクロー抗体医薬品の SEC 測定では、抗体の二量体と単量ナル抗体のクロマトグラムを示します。ガンマグロブリ

体の分離だけでなく、単量体とフラグメントの分離にン製剤と同様に二量体と単量体で良好な分離が得られてついてもより高い分離度が要求されています。TSKgel

いるだけでなく、単量体とフラグメントも良好な分離

G3000SWXL を 2 本 接 続 し た カ ラ ム 系 と TSKgel UP-を示しています。表 4 に各ピークの分離能を示します。

SW3000（30 cm カラム、1 本）を用いて、ガンマグロ

このように、既存カラム（TSKgel G3000SWXL）に比べブリン製剤、及びモノクローナル抗体の分離を比較し1/2 の測定時間でたんぱく質の高分離分析が可能です。

ました。図 19 にガンマグロブリン製剤のクロマトグ（TSKgel UP-SW3000 本来のカラム性能を得るためには、

ラ ム を 示 し ま す。TSKgel UP-SW3000 で は、TSKgel

配管やインジェクションバルブでの拡がりを小さくする

G3000SWXL に比べ、1/2 の測定時間で同等以上の分離必要があります。）

3

単量体
単量体

TSKgel G3000SWXL（5 μm，7.8 mm I.D. x 30 cm × 2）

A）

2

UV 280 nm

UV 280 nm

二量体

二量体

2

4

1
TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

B）

図 19

TSKgel G3000SWXL（5 μm，7.8 mm I.D. × 30 cm × 2）

1

A）

R = 2.35

03

R = 2.05

5

10

15

20

B）

min

0

ガンマグロブリン製剤の分離比較

図 20

TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

4
5

10

15

20

min

モノクローナル抗体の分離比較〈測定条件〉〈測定条件〉

カラム：A）TSKgel G3000SWXL

カラム：A）TSKgel G3000SWXL（5 μm，7.8 mm I.D. × 30 cm × 2）
B）TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム流 速：A）1.0 mL/min，B）0.35 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25 ℃
注入量：10 μL
試 料：‌マウス - ヒト キメラ モノクローナル IgG
ピーク 1．三量体，2．二量体，3．単量体，4．フラグメント（5 μm，7.8 mm I.D. × 30 cm × 2）
B）TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム流速：A）1.0 mL/min，B）0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試

表4

料：ヒトγ - グロブリン、ポリクローナル

モノクローナル抗体ピークの分離度（R）
カラム

カラムサイズ（mm I.D. × cm）

R（ピーク 1/2）

R（ピーク 2/3）

R（ピーク 3/4）

Ａ）TSKgel G3000SWXL × 2

7.8 × 30 ＋ 7.8 × 30

1.60

3.63

1.77

4.6 × 30

2.16

5.02

2.56

Ｂ）TSKgel UP-SW3000

─ 12 ─

2-10．市販 UHPLC 用 SEC カラムとの比較

UP-SW3000 と市販 UHPLC 用 SEC カラムの標準たんぱ

SEC カラムにおいて高い分離性能を得るためには、

く質による較正曲線を示します。
TSKgel UP-SW3000 は、

充塡剤に必要な因子が 2 つあります。図 21 に示す 1．

チログロブリン（Mw 640,000）からオブアルブミン（Mw充塡剤の粒子径、2．充塡剤の細孔特性です。充塡剤の47,000）の分子量範囲で較正曲線の傾きが緩やかになっ

粒子径を小さくした場合、理論段数が高くなり分離性能ています。標準たんぱく質のクロマトグラムでは、図が向上しますが、カラム圧力が高くなるため、高耐圧の23 に示すようにγ - グロブリン（ピーク 2）近傍のピーシステムで測定する必要があります。一方、充塡剤の細クの間隔が広くなっており、抗体の分離に適している

孔容積を大きくして較正曲線の傾きを緩やかにすることことがわかります。TSKgel UP-SW3000 と市販 UHPLC

で、異なる分子量の物質の溶出時間の差が大きくなり、

用 SEC カラムを用いてモノクローナル抗体を分離した

分離性能が向上します。しかし、一般に、充塡剤の細孔

クロマトグラムを図 24 に、溶出するピークの分離能を容積が大きくなると充塡剤の強度が低下し、操作圧が上

表 5 に示します。市販 UHPLC 用 SEC カラムに比べモがります。TSKgel UP-SW3000 は、充塡剤の粒子径とノクローナル抗体の三量体 / 二量体 / 単量体の分離能が細孔容積を最適化することにより、高いカラム性能でカ高くなっています。また、単量体とフラグメント間で良ラム操作圧の低減を実現しています。図 22 に TSKgel

好な分離を示しています。

1．充塡剤の粒子径2．充塡剤の細孔特性
細孔容積を大きくする

粒子径を小さくする
理論段数の向上（＝較正曲線の傾きを緩やかにする）

ピーク間隔
が広がる

カラム圧力
の増大

分子量

分子量

較正曲線

較正曲線

溶出容量

図 21

充塡剤の
強度が低下

溶出容量

粒子径：大

分離度：小

細孔容積：小

粒子径：小

分離度：大

細孔容積：大SEC カラムの分離性能を決める 2 つの因子

─ 13 ─

分離度：小
分離度：大

〈測定条件〉

7

カラム：TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 15 cm）

－ 1’

6

市販 UHPLC 用 SEC カラム－1（1.7 μm，4.6 mm I.D. × 15 cm）－ 2’

溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）

－2

5

＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム

－3
4

l2M

＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム－4

流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：5 μL3

試2

料：1．チログロブリン，640,000 Da（1' チログロブリン 二量体）

－5

TSKgel UP-SW3000

2．γ - グロブリン，155,000 Da（2' γ - グロブリン 二量体）

市販UHPLC用SECカラム

3．オブアルブミン，47,000 Da

1
2

図 22

3

4

5

6

4．リボヌクレアーゼ A，13,700 Damin

5．p- アミノ安息香酸，137 Da

標準たんぱく質による較正曲線の比較

3

2

4

5

1

A）

1’

3
TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

2’

UV 280 nm

UV 280 nm

2

4
5

1
2
1’

3

5

9

11

13

2

3
市販UHPLC用SECカラム

4 （1.7 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

B）

min

4

図 23

4
1

市販UHPLC用SECカラム（1.7μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

7

TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

A）

3

2’

B）

1

標準たんぱく質のクロマトグラムの比較

図 24

5

6

7

8

min

モノクローナル抗体の分離比較〈測定条件〉〈測定条件〉

カラム：A）TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
B）市販 UHPLC 用 SEC カラム（1.7 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム流 速：0.35 mL/min
検 出：UV 280 nm（マイクロセル）
温 度：25 ℃
注入量：10 μL（レオダイン 8125）
試 料：1．チログロブリン，640,000 Da（1' チログロブリン 二量体）
2．γ - グロブリン，155,000 Da（2' γ - グロブリン 二量体）
3．オブアルブミン，47,000 Da
4．リボヌクレアーゼ A，13,700 Da
5．p- アミノ安息香酸，137 Da

カラム：A）TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
B）市販 UHPLC 用 SEC カラム（1.7 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）
＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：10 μL（レオダイン 8125）
試料：マウス - ヒト キメラモノクローナル IgG
ピーク 1．三量体、2．二量体、3．単量体
4．フラグメント─ 14 ─

表5

モノクローナル抗体ピークの分離度の比較
カラム

R（ピーク 1/2）

R（ピーク 2/3）

R（ピーク 3/4）

Ａ）TSKgel UP-SW3000

2.16

5.02

2.56

Ｂ）市販 UHPLC 用 SEC カラム

1.64

4.66

2.57

3．応用例

下げることにより二量体のピークの前後に溶出する不純3-1．抗体医薬品の精密分析

物ピークが分離されました。また、表 6 に抗体の四量体

長さ 30 cm のカラムを用いて測定流速を遅くしてモから単量体及びフラグメントの各ピークの分離度を示しノクローナル抗体の精密分析を行った例を図 25 に示します。低流速での測定により分離度が向上し、抗体の精ます。測定流速が 0.35 mL/min では二量体のピークは 1

密分析が可能である事がわかります。

本のみ観察されましたが、測定流速を 0.05 mL/min に〈測定条件〉
2

3

カラム：TSKgel UP-SW3000

4UV 280 nm（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.7）

1

4

5

6

UV 280 nm

732＋ 0.05 ％ アジ化ナトリウム
8

9

min

4

B）0.05 mL/min

5

35

42

49

56

63

図 25

低流速条件での高分離分析

表6

モノクローナル抗体ピークの分離度
流流速：A）0.35 mL/min，B）0.05 mL/min

検出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃

注入量：10 μL（レオダイン 8125）

1

28＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウムA）0.35 mL/min

5

速

試

料：マウス - ヒト キメラモノクローナル IgG
ピーク 1．四量体、2．三量体、3．二量体、4．単量体、5．フラグメントmin

R（ピーク 1/2）

R（ピーク 2/3）

R（ピーク 3/4）

R（ピーク 4/5）

A）0.35 mL/min

0.88

2.20

5.07

2.52

B）0.05 mL/min

1.49

3.51

7.00

3.34

─ 15 ─

3-2．抗体パパイン消化物分離例ています。また、パパイン消化の過程を TSKgel UP-

IgG（ マ ウ ス ） の パ パ イ ン 消 化 物 で の TSKgel UP-

SW3000 のクロマトグラムで図 27 に示します。IgG 単

SW3000 と市販 UHPLC 用 SEC カラムのクロマトグラ

量体のピークが消化時間とともに小さくなっていく一ムの比較を図 26 に示します。TSKgel UP-SW3000 では、方、フラグメントの F.（ab'）
2、Fc 及び Fab のピークが分子量が近接したフラグメントの Fc や Fab が分離され大きくなっています。

消化時間

intactIgG

Fabintact IgG

0 min
15 min30 min60 min
120 min

Fab

TSKgel UP-SW3000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

A）

intactIgG

Fc＋Fab
2
F
（ab’
）

6

図 26

7

8

FC
F
（ab’
）
2

市販UHPLC用SECカラム（1.7 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

B）

5

UV 280 nm

UV 280 nm

Fc
F
（ab’
）
2

9

10

11

12

min

6

抗体パパイン消化物の分離比較

図 27

7

8

9

〈測定条件〉

カラム：A）TSKgel UP-SW3000

カラム：TSKgel UP-SW3000
試（1.7 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

検

出：UV 280 nm（マイクロセル）

温度：25 ℃料：‌マウスモノクローナル IgG のパパイン消化試料（消化時間 0 〜 120 分）

溶離液：200 mmol/L りん酸緩衝液（pH 6.5）
速：0.35 mL/minmin（4.6 mm I.D. × 30 cm）

B）市販 UHPLC 用 SEC カラム

流

11

IgG のパパイン消化過程のクロマトグラム〈測定条件〉（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

10＊他の測定条件は図 23 と同じ

注入量：5 μL（レオダイン 8125）
試料：‌マウスモノクローナル IgG のパパイン消化試料（消化時間 30 分）

4．おわりに/ フラグメントの高分離を短時間で達成することが可能

以 上、 粒 子 径 2 μm の 高 性 能 SEC カ ラ ム で あ るです。また、粒子径が小さく測定流速上昇による理論段TSKgel UP-SW3000 について概説しました。システム数の低下が小さいことから、測定流速を高くしてハイスのカラム外容量に留意し、TSKgel UP-SW3000 を用い

ループット分析を行うことが可能です。

ることにより既存カラムに比べ、抗体の二量体 / 単量体
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※ “TSKgel”は東ソー株式会社の登録商標です。

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