実験動物ニュース

Vol. 60

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実験動物感染症の現状

マウス肝炎ウイルス山田靖子
国立感染症研究所

要動物管理室約

マウス肝炎ウイルスは過去のものではない！
1960 年代より，日本の実験動物界の先達の諸先生方が，国内 SPF 動物の確立に努力された。その当時の実験用マウスにはマウス肝炎ウイルス（MHV）の感染が高い確率で認められ，MHV は最も排除すべき病原体の一つであった。現在では SPF マウスが普及し，他の SPF 対象の感染症と同様に，MHV も国内の実験動物から排除されるだろうと考えられた。しかし，期待に反して，今だに MHV の根絶に至っていない。国内の実験動物生産業者では汚染の報告はほとんどなく，また管理が行き届いた動物実験施設でも汚染の頻度はかなり低くなっている。一方，微生物モニタリングなどの管理を行っていない動物実験施設では汚染が潜在化している可能性があり，MHV の汚染状況は二極化していると考えられる。

1．ウイルス

現在，実験動物で汚染が確認されるのは，主に腸管系に感染するタイプである。このタイプは病原性が弱く，免疫機能が正常な成熟マウスでは不顕性感染が多い。免疫が正常なマウスでは症状や剖検所見が乏しいため，抗体検査で初めて汚染を知ることが多い。しかし，免疫不全マウスでは長期に渡って感染が持続し，衰弱して死に至る。幼仔では下痢を起こし，死に至る場合もある。

MHV はコロナウイルス科に属するエンベロープを有する positive strand 1 本鎖の RNA ウイルスである。
ウイルスゲノムは約 30 kb と非常に大きく，7 〜 8 本ある mRNA は nested set というコロナウイルス独特のユニークな構造を持つ。コロナウイルスという科名
は，ウイルス粒子表面に特徴的なスパイク状の構造蛋白があり，これが太陽のコロナに似ていることか
3．感受性動物
ら命名された。2002 年に発生した新興感染症 SARSの病原体がいち早くコロナウイルスと同定されたのMHV はマウスにのみ感染する。多くのマウスのは，電顕写真でこのスパイクが認められたからであった。構造蛋白は Spike（S），Envelope（E），Membrane系統は MHV に高感受性であるが，SJL は抵抗性であNucleocapsid（N）で，Hemagglutinin-esterase（HE） る。 マ ウ ス 体 内 に お け る MHV の 受 容 体 は murine（M），
carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1
蛋白は株によって有無が異なる。非構造蛋白が複数あるが，2 つの RNA polymerase が含まれる。
（mCEACAM1）というイムノグロブリンスーパーファミリーに属する蛋白であることが判明している。SJLが抵抗性であるのは，この蛋白が高感受性のマウス2．株と病原性系統と異なるため，MHV との結合が著しく低下することによる［1］。
マウス「肝炎」ウイルスという名前から肝臓の病
ラットのコロナウイルスは唾液腺涙腺炎ウイルス
気 と 思 っ て い る 人 が 多 い か も し れ な い。 し か し，MHV には多くの株があり，肝臓，脳，腸管など様々 （SDAV）であるが，抗体は MHV と交差する。MHVな臓器に感染する。病原性に関しても，非常に強いの抗原で検出されるラットの抗体は抗 SDAV である。
ものから弱いものまでさまざまである。強毒なもの
脳に指向性のある MHV 株を実験的にラットに脳内接種すれば増殖は可能であるが，自然界の MHV 感は微量のウイルスの侵入でも数日で死に至るが，弱受性動物はマウスに限定される。
毒なものは軽症で経過する。

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4．感染経路主に腸管系に感染するタイプは，ウイルスは糞便中に排出され，同一ケージ内の動物に容易に経口感染する。また，筆者は，汚染された糞塊や床敷が飛散することにより，隣接のケージに感染が容易に広がることを経験している。飼育ケージや飼育室空調排気ダクトのフィルターダストから，PCR によりウイルス遺伝子が検出されることも報告されている［2，3］。
マウス由来材料を接種する動物実験では，MHVに汚染した材料を接種したマウスで汚染が発生する可能性がある。例えば，ES 細胞は MHV に汚染されていても細胞変性を起こすことなく持続感染することが報告されているので，汚染に気付かずに接種してしまう事例もあるであろう［4］。
5．検査法
1）抗体
MHV の汚染検出方法で最も一般的なのは抗体検査である。免疫機能が正常であれば，感染した動物は 1 〜 2 週間で抗体を産生し，この抗体はかなり長期に渡って血清中に存在する。血清中の抗体を検出することにより，マウスが感染していたかを知ることが出来る。取りこぼしが少ないので，汚染のスク
リ ー ニ ン グ に は 最 も 有 効 で あ る。 最 も 一 般 的 な
ELISA 法のキットが市販されている。ELISA 法によるスクリーニングで陽性反応を示した場合，蛍光抗体法（IFA）などで確定診断する必要がある。
2）ウイルス分離
感染初期でまだ充分に抗体が産生されていない動物や免疫機能が不全な動物では，汚染を抗体検査では検出できない。このような場合は，ウイルスそのもの，またはウイルス遺伝子を検出する必要がある。
感染性ウイルスを検出するにはウイルス分離を行う。
日本では MHV 感受性細胞として DBT 細胞が使われている。MHV が細胞に感染すると細胞同士が融合し巨細胞を作るので，検体を DBT 細胞に撒いて巨細胞が出現するか，で判定する。マウスが感染後，感染性ウイルスを検出できる時期と材料は限定されるので，ウイルス分離は汚染検出というより，分離したウイルスをその後の研究に使うということを目的とする場合が多い。
3）PCR
自然感染では腸管系に感染するタイプが多いので，Vol. 60

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糞便を材料とした PCR が有効である。プライマーについて，論文［5］で示したセットは非特異的な反応が出ることがあるので，論文［6］で示した N 蛋白コード領域全域を増幅するセットを推奨する。Ｎ蛋白の遺伝子配列を比較することで，株の同定がある程度可能となる［3，6］。また，MHV は RNA ウイルスであるため変異が起こりやすい。汚染が始まってから検出までの期間が短ければ遺伝子配列はほぼ同一であるが，汚染期間が長いと同じ汚染源であっても複数の検体間で遺伝子配列に相違が認められる場合がある。そのような場合は，系統樹を作成すると同一の汚染源であるか，を識別することができる。
4）病理
肝臓に感染している場合は，剖検時，肝臓に白色斑点の散在が見られ，病理組織で壊死巣及び細胞融合した巨細胞の形成が見られる。腸管に感染している場合は，腸管上皮細胞が融合して巨細胞を形成する。免疫染色により，感染細胞内にウイルス抗原が検出される。
6．汚染状況
国内の検査施設 2 箇所［ICLAS モニタリングセン
ター，株式会社メルシャンクリンテック環境検査センター（MEC）］から，最近の抗体検査結果を掲載する許可をいただいた。MHV 抗体陽性率（全検査匹数に お け る 割 合 ） を 2 社 の 比 較 が で き る 2006 年 と2009 年について示すと，2006 年 ICLAS の結果：製薬・企業 2.8％，大学・研究所 2.7％，MEC の結果：1.5％，2009 年 ICLAS の結果：製薬・企業 0.0％，大学・研究所 1.3％，MEC の結果：0.4％である。2006 年に比べて 2009 年は MHV 陽性率が一段と低下している。
2 社の検査結果から見る限りでは MHV の汚染はほとんどなくなっているように見受けられる。しかし，一部の実験動物関係者からの情報によれば，大学などで管理の不十分な小規模施設で，特に施設間での動物授受や自家繁殖を行なっている場合，MHV の検査を行なうと汚染が摘発されるケースが多いという。
また，筆者の施設でも大学からのマウス導入前検査で MHV 汚染が発覚した経験がある。国内の汚染状
況は，充分な管理を行なっている施設は日常的にモニタリング検査をしていて，そのような施設はほとんど清浄，一方で管理の不十分な施設ではモニタリングを実施していないため潜在的な汚染が多い，という 2 極化の状況と考えられる。
日本のみならず，欧米においても MHV は根絶されていない。10 年ほど前の MHV 陽性率は北米，ヨー実験動物ニュース

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ロッパともに 12％程度であった。2009 年のデータでは北米 1.57％（過去 5 年間の集計），ヨーロッパ 3.25％（過去 3 年間の集計）となっている［7］。

ター），高倉 彰先生（ICLAS モニタリングセンター），久保村 華子先生（株式会社メルシャンクリンテック
環境検査センター）に深謝いたします。

7．実験に及ぼす影響と対策

引用文献

免疫が正常な成熟マウスでは病原性が弱いタイプの自然感染が多いので，汚染があっても構わないという研究者はいるだろう。しかし，MHV に汚染された動物を使用した実験結果の信頼性は確保できるだ
ろうか？多臓器に感染する株の一つである JHM 株を実験的に感染させたマウスでは，免疫反応に影響があることが報告されている［8］。また，感染は容易に広がるため，他の飼育マウス，特に幼仔や免疫不全系統への汚染拡大，あるいは免疫抑制処置による発症の懸念は大きい。管理のしっかりした施設ではMHV 陰性が通常の概念である。
MHV による汚染を防ぐ対策は，まずウイルスを施設に入れないことである。導入動物およびマウス由来材料を接種する実験では抗体検査や PCR などで事前にチェックする。それでも万一汚染が発生してしまった場合，対応は施設の状況によって管理者が判断することになろう。汚染が発覚した場合，汚染動物の安楽死処置をすることが多いが，重要なマウスであれば帝王切開や胚の移植で清浄化が可能である。ケージごとの陰圧個別換気システムなどで感染動物を封じ込めることができる施設であれば，飼育管理などの作業手順を強化した上で，実験終了まで飼育を続けることも選択肢の一つである。
国 立 感 染 症 研 究 所 の 病 原 体 等 安 全 管 理 規 程 で，MHV の病原体としてのバイオセーフティレベルは 2，動物実験を行う場合は他のマウスへの感染を防御するため，アニマルバイオセーフティレベルを 3 としている。
MHV に対して，通常の消毒薬は充分な効果がある。
汚染動物を排除した後の施設のクリーニングはアルコール系，塩素系，過酢酸系など種類の異なった薬液を噴霧することで効果が得られる。

1. Hirai, A., Ohtsuka, N., Ikeda, T., Taniguchi, R.,Nakagaki, K., Miura, H.S., Ami, Y., Yamada, Y.K.,
Itohara, S., Holmes, K.V., and Taguchi, F. 2010. Roleof mouse hepatitis virus (MHV) receptor
mCEACAM1 in the resistance of mice to MHV
infection: Study on mice with chimericmCEACAM1a and 1b. J. Virol. 84: 6654–6666.
2. 渡辺洋二，大沢一貴，宅島めぐみ，坂本雅志，佐藤 浩．2001．ケージダストを使用した新しいマウス肝炎ウイルスモニタリング法の開発̶
遺伝子検出法の応用̶．実験動物技術 36: 35–40.
3. Oyanagi, M., Kato, A., Yamada, Y.K., and Sato, N.L.
2004. Detection of MHV-RNAs in mouse intestinesand in filter dust in mouse room ventilation duct bymodified RT-nested PCR. Exp. Anim. 53: 37–41.
4. Okumura, A., Machii, K., Azuma, S., Toyoda, Y., andKyuwa, S. 1996. Maintenance of pluripotency inmouse embryonic stem cells persistently infectedwith murine coronavirus. J. Virol. 70: 4146–4149.
5. Yamada, Y.K., Yabe, M., Takimoto, K., Nakayama, K.,and Saitoh, M. 1998. Application of nested
polymerase chain reaction to detection of mouse
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outbreak in an immunodeficient mouse colony. Exp.
Anim. 47: 261–264.
6. Yamada, Y.K., Yabe, M., Kyuwa, S., Nakamura, N.,
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7. Pritchett-Corning, K.R., Cosentino, J. and Clifford,C.B. 2009. Contemporary prevalence of infectious
agents in laboratory mice and rats. Lab. Anim. 43:165–173.
8. Kyuwa, S., Yamaguchi, K., Toyoda, Y., and Fujiwara,
K. 1991. Induction of self-reactive T cells aftermurine coronavirus infection. J. Virol. 65: 1789–1795.

謝辞
情報提供にご協力いただいた久和 茂先生（東京大学），國田 智先生（筑波大学），笠井 憲雪先生（東北大学），池 郁生先生（理研バイオリソースセン