No.91.qx 08.7.22 15:07 ページ 3『KOD FX』を用いたマウステールライセートからの直接PCR
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 杉山 明生
はじめ に『KOD FX』は、様々な優れた特性を有するPCR酵素『KOD
M1

DNA Polymerase』をベースに開発された高性能PCR試薬です。

123M2

本酵素は、優れた「増幅成功率」、「 増幅効率」、「 伸長性」を示し、幅広いPCRにおいて確実にPCR産物を得ることができます。特に、その「増幅成功率」は、これまでの他のPCR酵素では不可能だった

サンプル：ヒト全血2 μl / 50 μl反応系
ターゲット：Human β-globin cluster領域

PCRを可能とする点で画期的なものです。例えば、クルードサンプ
ルを鋳型に用いた場合や、GCリッチなターゲットを増幅する場合

M1：1 kb Ladder Marker
1：1.3 kb
2：3.6 kb
3：8.5 kb
M2：λ/Hind Ⅲ digest

でも、KOD FXでは、特別な添加剤やサイクルを用いることなく、通常の条件で確実にPCR産物を得ることができます。図1に、全血をそのままサンプルとして増幅を行った例を示します。このように、KOD FXでは、クルードサンプルを直接PCR反応液に加えるよ図1．血液サンプルからの直接PCRうな場合においても、十分な増幅を得ることができます。

今回は、KOD FXのクルードサンプルに強い特長を生かして、マウステールライセートを直接サンプルとして用いて増幅を行った実施例をご紹介します。

方法（1）マウステールライセートの調製
マウステールライセートは、マウステール（凍結保存）をマウステール約3 mm

図2に示すアルカリ溶解法にて調製しました。本方法では、↓ ←50 mM NaOH 180 μlを加え、Vortexにて良く攪拌Proteinase Kを用いる方法と比較して、簡便に短時間で↓ 95℃, 10 min.インキュベート※ライセートを調製することができます。

↓ ←1M Tris-HCl（pH 8.0）20 μlを加え、Vortexにて良く攪拌

なお、本方法ではマウステールは完全には溶解しません↓12,000 rpm, 10 min.遠心のでご注意ください（完全に溶解させる必要はありませ上清回収ん）。また、溶解液の核酸濃度は測定できません。

（※熱アルカリ溶液の取り扱いに十分ご注意ください。）（2）PCR反応

図2．マウステールライセートの調製方法（アルカリ溶解法）

PCR反応には、（1）で調製したライセートを原液（×1）
として、滅菌水にて10倍、100倍希釈したもの5 μlをサンプル（鋳型）として用い、以下の条件にて実施しました。
●PCR condition
Template:

マウステールライセートの希釈系列（×1, ×10, ×100）5 μl / 50 μl Reaction

Target:Mouse membrane glycoprotein（Thy-1）gene 2.6 kb（Accession No.:M10246）

Primer#1 : 5 -CCACAGAATCCAAGTCGGAACTCTTG-3 （26mer）Primer#2 : 5 -GTAGCAGTGGTGGTATTATACATGGTG-3 （27mer）②PCRサイクル＊①反応液組成＊プライマーのTm値が73℃未満の場合

2×PCR buffer for KOD FX

25 μl

2 mM dNTPs

10 μl

94℃, 2 min.

10 pmol /μl Primer #1

1.5 μl

98℃, 10 sec.

10 pmol /μl Primer #2

1.5 μl

68℃, 2.5 min.＊＊マウステールライセート

5 μl

98℃, 10 sec.

KOD FX（1.0 U/μl）

1 μl（Tm−5）℃, 30 sec.

Autoclaved, distilled water

X μl

68℃, 1 min./kbTotal

は、以下の3ステップサイクルを用いることをお薦めします。
30 cycles

94℃, 2 min.
30 cycles50 μl＊＊ 1 min./kbを目安にしてください。

また、比較のためTaqベースの他社PCR酵素を用いて、取扱説明書推奨の条件にてPCRを実施し比較を行いました。

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結果及び考察A社高効率PCR酵素（Taqベース）

KOD FX
ライセート
希釈倍率

M

×1×10×100

M×1×10×100

B社Long PCR酵素（Taqベース）MM

×1×10×100

M

2.6 kb（n=2）
M：1 kb Ladder Marker
図3. マウステールライセートからの直接PCR

PCR産物は、1％アガロースゲルに5 μlアプライして解析を行いました（図3）。その結果、KOD FXでは、PCRが阻害されることなく、明瞭な2.6 kbの増幅を確認することができました。また、希釈したサンプルを用いた場合においても十分な増幅が確認できました。
マウステールサンプルからPCRを行う場合、精製したDNAを用いるか、Proteinase Kにより夾雑タンパク質を分解した前処理サンプルを用いてPCRを行うのが一般的です。しかし今回、KOD FXを用いることによって、簡便な「アルカリ溶解法」で調製したクルードサンプルを用いても十分に増幅産物が得られることが分かりました。これは、KOD FXが①クルードサンプルに強いこと、および②増幅効率が大変優れていることによるものと考えられます。
また、本アルカリ溶解法では、熱アルカリ処理のため、長鎖ターゲットがM

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増幅できないことも危惧されましたが、別の実験により、5 kbのターゲットも増幅できることを確認しています。
図4は、ここで得られたPCR産物10 μlに対し、種々の制限酵素1 μl

M：1 kb Ladder Marker
1：未消化
2：XhoⅠ
3：EcoR Ⅴ
4：PstⅠ
5：SacⅠ（5〜10units）を加え、37℃で1hr処理後、電気泳動解析した結果を示しています。その結果、ターゲット配列から予想されるサイズの断片が得られることが確認できました。よって、本方法は制限酵素を用いる遺伝子タイピング（PCR-RFLP解析）にも応用可能であることが示唆されました。

図4. PCR産物の制限酵素処理結果

まとめ
以上の検討から、KOD FXを用いることでトランスジェニックマウスの遺伝子解析を簡便化できることが示されました。また本酵素を用いた別の実験において、マウステールに限らず、これまでDNA精製が必要であった培養細胞や血液などからも、直接PCR可能であることが確かめられています。さらに、その他のサンプルにおいても、KOD FXを用いることによって、サンプルをそのまま、あるいは、簡便な前処理を行うのみでPCR実験に用いることができる可能性があると考えられます。多数のサンプルを処理しなければならない場合や、スクリーニング等において大変な思いをされている方は、是非一度、KOD FXをお試しください。その優れた「増幅成功率」に驚かれることと思います。
品名および内容
KOD FX
KOD FX（1U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX
2mM dNTPs

包装保存温度Code No.

200U×1本［200回用＊］-20℃

KFX-101（200U×1本）
×5［1,000回用＊］-20℃

KFX-101X5

価格￥35,000￥140,000＊50 μl反応を行った時の反応回数を表示しています。
※KOD FXで増幅されたDNA断片は平滑化されているため、通常のTAクローニングはできません。TArget Clone™ -Plus-をお使いください。

品名および内容
高効率TAクローニングキット

TArget Clone™ -Plus-

装保存温度

Code No.

価10回用-20℃

TAK-201￥16,000

包4格200891