Gebrauchsanweisung

SSP in EUDAMED verfügbar

380236-D
Deutsch972000

Negativkontrolle MTB (NC MTB) ······················· 3 x 0,5 ml
30 µl Tropfer ··········································· 1 x 18 Tropfera) Die aus Geobacillus stearothermophilus stammende Bst DNAPolymerase ist eine strangversetzende DNA-Polymerase ohne
53-Exonukleaseaktivität.

Loopamp MTBC Detection Kitb) Primer, die in der gyrB- und IS-Region der MTBC-Genom-DNA
entwickelt wurden, die durch HPLC von synthetisierten
Oligonukleotiden gereinigt wurden.
c) PC MTB enthält ein Produkt, das aus der In-vitro-Amplifikation
einer Template-Genom-DNA von Mycobacterium tuberculosis
H37Rv (GenBank Nr. NC_000962) stammt.
Die Abkürzungen der folgenden Reagenzien und die
Chargennummer sowie der Hersteller (EKN) sind wie unten gezeigt auf
den Behältern aufgedruckt:

VERWENDUNGSZWECK
Das Loopamp MTBC Detection Kit ist ein qualitativer In-vitroDiagnosetest zum Nachweis von Mycobakterium tuberculosis-Komplex(MTBC)-DNA aus dem Sputum von Patienten mit Symptomen, die auf
eine MTBC-Infektion hinweisen. Das Kit hilft bei der Diagnose einer
MTBC-Infektion und ist für die Verwendung in professionellen Labors
und Krankenhäusern durch entsprechend geschultes Personal
vorgesehen. Das Ergebnis kann entweder mit einem automatischen
Turbidimeter oder visuell unter UV-Bestrahlung interpretiert werden.

Reagenzien
Positivkontrolle MTBTESTPRINZIP
Dieses Produkt basiert auf dem von der Eiken Chemical Co., Ltd.
entwickelten Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren „Loop-mediatedisothermal amplification“ (LAMP).
Die LAMP-Methode zeichnet sich durch folgende Merkmale aus: (1)Es wird nur ein Enzym benötigt und die Amplifikationsreaktion läuft unter
isothermen Bedingungen ab.1),2) (2) Sie hat eine extrem hohe Spezifität
aufgrund der Verwendung von vier Primern, die sechs verschiedene
Regionen auf der Ziel-DNA erkennen. (3) Sie hat eine hohe
Amplifikationseffizienz und kann in kurzer Zeit eine hohe Konzentration
an Amplifikat erzeugen, was einen optischen oder automatischen
Nachweis ermöglicht.3),4)
Die mit diesem Produkt gelieferten Primer wurden in der GyraseUntereinheit B (gyrB) und der Insertionssequenz IS6110 (IS) Region der
MTBC-Genom-DNA entwickelt, die durch die Alignment-Analyse derausgewählten Basensequenzen von MTBC und nichttuberkulösen
Mykobakterien als gut konservierte Basensequenz in MTBC bestätigt
wurde.
Die DNA aus unbehandeltem Sputum oder NALC-NaOHbehandeltem Sputum wird mit dem Loopamp PURE DNA Extraction
Kit (separat erhältlich) extrahiert. Dann wird die DNA-Lösung in ein
Reaktionsgefäß gegeben. Die strangversetzende DNA-Polymerase,
Desoxyribonukleosidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP),
Calcein, Reaktionspuffer und MTBC-spezifische Primer werden ingetrockneter Form in der Verschlusskappe des Reaktionsgefäßes
aufbewahrt.
Diesesgetrocknete
LAMP-Reagenz(MTBCNachweisreagenz (dMTB)) löst sich auf, wenn die DNA-Lösung
hinzugefügt wird. Das Reaktionsgefäß wird dann bei 67,0 C inkubiert
und die DNA wird durch die Katalyse der strangversetzenden DNAPolymerase in der LAMP-Reaktion amplifiziert.
Der Nachweis der Amplifikaten basiert auf der Trübungsmessungeines Nebenprodukts, Magnesiumpyrophosphat (weißes Präzipitat).3)
Alternativ kann anstelle der Trübungsmessung auch eine optische
Beurteilung unter UV-Bestrahlung durchgeführt werden. Vor der
Reaktion befindet sich das Calcein im Reagenz in einem gehemmten
Zustand, da Manganionen daran gebunden sind. Sobald die LAMPReaktion jedoch beginnt, werden Pyrophosphationen gebildet, die die
Manganionen binden, und das Calcein wird fluoreszierend.4)

Negativkontrolle MTB

Beschriftung am Röhrchen Deckelcode
PC MTBPC
Lot No., EKNMTBNC MTBNC
Lot No., EKN
MTB*Informationen zur Metrologischen Rückverfolgbarkeit
Die Positivkontrolle stammt aus dem Amplifikationsprodukt
genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank
Nr. NC_000962). Die spezifische Region von Mycobacterium
tuberculosis H37Rv, die Region von Interesse, dient als Vorlage für die
Amplifikation des PC-MTBDNA-Fragments. Dieses Fragment wird
durch photospektrometrische Analyse quantifiziert und die DNAKonzentration von PC MTB wird auf 1000 Kopien/μl eingestellt.

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN(1) Nur zum Gebrauch in der In-vitro-Diagnostik.
(2) Dieses Produkt ist für die klinische Diagnose von MTBC anhand
von Sputumproben menschlichen Ursprungs vorgesehen. Nicht
für andere Zwecke verwenden.
(3) Bei Verwendung dieses Produkts immer diese Serviceanleitung
beachten.
(4) Reagenzien nicht einfrieren.
(5) Keine abgelaufenen Reagenzien verwenden.
(6) Verschiedene Chargen nicht mischen.
(7) Reagenzien nicht nachfüllen.
(8) Die Leistung des Loopamp MTBC Detection Kit hängt von derKompetenz des Anwenders und der Einhaltung der
Verfahrensanweisungen ab. Die Tests sollten von entsprechendgeschultem Personal unter strikter Einhaltung der mitgelieferten
Anweisungen durchgeführt werden.
(9) Kurz vor Verwendung die erforderliche Anzahl Reaktionsgefäße
aus der Verpackung entnehmen und den Aluminiumbeutel sofort
wieder verschließen.
(10) Trockenmittel im Aluminiumbeutel belassen. Hohe Feuchtigkeit
kann das getrocknete LAMP-Reagenz in den Reaktionsgefäßen
zersetzen.
(11) Hitze, Feuchtigkeit und Licht können das dMTB beschädigen.
Daher nur die erforderliche Anzahl Reaktionsgefäße (Anzahl
Proben + Anzahl Kontrollen) entnehmen und den Aluminiumbeutel
sofort wieder verschließen.
(12) Benutzerhandbuch lesen und vor Beginn des Verfahrens
vergewissern, dass die erforderliche Ausrüstung (Turbidimeteroder Inkubator) verfügbar ist.
(13) Sputumproben stellen ein potenzielles Infektionsrisiko dar. Alle
notwendigen Vorsichtsmaßnahmen zur Vermeidung von
Biogefährdung treffen.5)(14) PC MTB und NC MTB enthalten geringe Mengen an Natriumazid
als Konservierungsmittel. Da Natriumazid als giftig eingestuft ist,
jeglichen Kontakt mit Augen, Mund oder Haut vermeiden.
(15) Bei versehentlichem Kontakt von Reagenzien mit Augen, Mundoder Haut die betroffene Stelle sofort mit reichlich Wasser
abspülen und, falls notwendig, einen Arzt konsultieren.
(16) PC MTB nicht diluieren oder den Proben beifügen. Stattdessen PC
MTB nur wie in dieser Packungsbeilage beschrieben verwenden,
um eine DNA-Kontamination zu vermeiden.
(17) PC MTB und alle positiven Sputumproben getrennt von den
anderen Kit-Reagenzien aufbewahren.

KITBESTANDTEILE
Die Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Datum
haltbar, vorausgesetzt, der Behälter bleibt ungeöffnet bei einer
Lagertemperatur
von230 C.
Bei
Beachtungdieser
Verfahrensanweisungen sind die Reagenzien auch nach dem Öffnen
des Behälters stabil.
MTBC-Nachweisreagenz ························2 x 48 Röhrchen
Die folgenden Reagenzien in getrockneter Form sindin jedem Reaktionsgefäß enthalten.
Bst DNA-Polymerase a)
Desoxyribonukleosidtriphosphate
Magnesiumsulfat
Calcein
Manganchlorid
Primer b)
Positivkontrolle MTB (PC MTB) c) ······················ 1 x 0,4 ml

16

(18) Die Verschlusskappe jedes Reaktionsgefäßes enthält das dMTB
in getrockneter Form. Verschlussinnenseite nicht berühren.
(19) Reaktionsgefäße vor Verwendung sorgfältig auf Risse oderKratzer prüfen. Beschädigte Gefäße können falsche Ergebnisse
liefern und zu DNA-Kontamination von Inkubator undArbeitsbereich führen.
(20) Reaktionsgefäße vor Ende der LAMP-Reaktion keinem UV-Licht
aussetzen. Längere UV-Lichtbestrahlung kann die Gefäße
beschädigen und zu falschen Ergebnissen führen.
(21) Bei
Verwendung
von
UV-Lichtfürdieoptische
Fluoreszenzbeurteilung nicht direkt in die UV-Lichtquelle schauen.
Schon ein kurzer Blick in das UV-Licht kann die Augen reizen und
konjunktivitisähnliche Symptome hervorrufen. Bei direktem
Blickkontakt mit dem UV-Licht sollte eine Glasscheibe verwendet
oder eine Schutzbrille bzw. Augenmaske getragen werden.
(22) Im Benutzerhandbuch des Inkubators nachschlagen. Bei
Verwendung von HumaLoop T oder Real-Time Turbidimeter
HumaTurb C+A die Reaktionsgefäße vorsichtig aus dem Inkubator
entnehmen, um Verbrennungen zu vermeiden.

Loopamp PURE DNA Extraction Kit enthalten ist. Zur
Verarbeitung der NC MTB die Gebrauchsanweisung beachten (imFolgenden
wird
extrahierte
NC
MTB
als
„Negativkontrolllösung“ bezeichnet).

Hinweis: Eine Negativkontrolle sollte jedes Mal enthalten sein.
（3）Positivkontrolle MTB（PC MTB）
Röhrchen anschnippen (oder abzentrifugieren), um den Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln.

Hinweis: Die PC MTB sollte jedes Mal gemessen werden.

MESSVERFAHREN
DNA-Extraktion
Zur Extraktion der DNA aus 60 µl Sputumprobe die Anweisungenfür das Loopamp PURE DNA Extraction Kit (separat erhältlich)befolgen. 60 µl der Sputumprobe in das Heizgefäß geben und in den
HumaHeat oder den auf 90 C vorgeheizten Thermoblock legen.
Wann immer möglich, das purulenteste Sputum verwenden.
Reagenzien- und Probenmischung(1) HumaLoop T oder Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A
einschalten.
(2) 30 µl der Probenlösung unter Verwendung des Loopamp PUREDNA Extraction Kit in ein Reaktionsgefäß geben und die
Verschlusskappe schließen.

ABFALLENTSORGUNG(1) Röhrchen nicht
nach der DNA-Amplifikation öffnen.
Verschlusskappe geschlossen halten und benutzte Röhrchen als
medizinische Abfälle mittels Verbrennung oder doppelt verpackt inverschließbaren Plastikbeuteln entsorgen.
(2) Reaktionsgefäße niemals autoklavieren oder wiederverwenden,
da anderenfalls Amplifikate dispergieren und zu Kontamination
führen würden.
(3) Das Hauptmaterial der Reaktionsgefäße und Reagenzröhrchen ist
PP, des Reaktionsgefäßhalters PET, des Aluminiumbeutels
Aluminium und des Kit-Koffers Papier.
(4) Gebrauchte Reagenzien, Behälter oder Laborutensilien gemäß
lokalen Vorschriften entsorgen.

Hinweis: Das Volumen zwischen den beiden Linien auf dem
Reaktionsgefäß entspricht ca. 30 µl.
(3) 30 µl der Negativkontrolllösung unter Verwendung des Loopamp
PURE DNA Extraction Kit in ein Reaktionsgefäß geben und die
Verschlusskappe schließen.

Hinweis: Das Volumen zwischen den beiden Linien auf dem
Reaktionsgefäß entspricht ca. 30 µl.
(4) 30 µl der PC MTB mit dem mitgelieferten Tropfer in ein
Reaktionsgefäß geben und Verschlusskappe schließen.
(5) Alle Reaktionsgefäße anschnippen (oder abzentrifugieren), um die
Lösung auf dem Boden der Gefäße aufzufangen.

PROBENAHME

Hinweis: Nur wenn sich der Flüssigkeitsstand mittig der beiden
Linien auf einem Reaktionsgefäß befindet, wurden 30 µl
pipettiert.

(1) Den purulentesten Teil der Sputumprobe verwenden.
(2) Sputumproben sollten sofort nach der Entnahme verwendet
werden.
(3) Sputum in einem vom LAMP-Amplifikationsraum getrennten
Raum entnehmen. Aerosole, die die MTBC-DNA enthalten,
können bei der Sputumentnahme entstehen und eine
Kontamination verursachen.

ERFORDERLICHEENTHALTEN

MATERIALIEN,

NICHT

IM

(6) Die getrockneten Reagenzien durch Umdrehen der
Reaktionsgefäße und Sammeln der DNA-Lösung in der
Verschlusskappe rekonstituieren. Zur Rekonstitution dergetrockneten Reagenzien die Reaktionsgefäße 2 Minuten
verkehrt herum lagern.
(7) Zum Mischen des Inhalts die Reaktionsgefäße fünfmal drehen.
Vollständige Auflösung der getrockneten Reagenzien in der
Verschlusskappe prüfen.
(8) Alle Reaktionsgefäße anschnippen (oder abzentrifugieren), um die
Lösung auf dem Boden der Gefäße aufzufangen.

KIT

・ Loopamp PURE DNA Extraction Kit
・ Pipette-60 Set
Für optischen Fluoreszenznachweis(Für HumaLoop T)
・ HumaLoop T

Amplifikation
Für optischen Fluoreszenznachweis（Für HumaLoop T）(1) Überprüfen, ob die Temperatur des HumaLoop T 67,0 C beträgt.
(2) Reaktionsgefäße in den HumaLoop T legen und die grüne Taste
drücken, um die LAMP-Reaktion zu starten (40 Minuten bei
67,0 C). Einzelheiten zur Bedienung des HumaLoop T sind im
Benutzerhandbuch des HumaLoop T zu finden.
(3) Fertigstellung der Polymerase-Inaktivierung bestätigen (wird vom
HumaLoop T automatisch abgeschlossen). Alle Reaktionsgefäße
aus dem HumaLoop T entnehmen.
（Für anderen Inkubator mit UV-Licht）(1) Die Temperatur des Inkubators auf 67,0 C einstellen (wobei die
Temperatur der heißen Haube auf 10 C über der
Reaktionstemperatur oder so nahe wie möglich an diesem Wert
eingestellt werden sollte – Temperaturgenauigkeit: 0,5 C).
(2) Reaktionsgefäße
einsetzenundanschließend
dieAmplifikationsreaktion (40 Minuten bei 67,0 C) starten.
(3) Nach 40 Minuten die Polymerase mittels HumaHeat oder
Thermoblock (5 Minuten bei 80 C oder 2 Minuten bei 95 C)inaktivieren, um die Reaktion zu beenden.

(Für anderen Inkubator mit UV-Licht)
・ Inkubator (Temperaturgenauigkeit: 0,5 C; mit heißer Haube)
・ HumaHeat oder ein anderer Thermoblock
・ UV-Licht oder blaues LED-Licht (Wellenlänge: 240260 nm und
350370 nm)
・ Schutzbrille oder eine UV-blockierende Augenmaske (optional)
Für Echtzeit-Trübungsmessung・ HumaTurb C+A・ HumaHeat oder ein anderer ThermoblockZum Mischen von Reagenzien und Proben
・ Zentrifuge für Mikroreaktionsgefäße (optional)
・ Zentrifuge für acht verbundene Röhrchen (optional)・ HuMax ITA, Mikrozentrifuge (optional)

REAGENZVORBEREITUNG（1）MTBC-Nachweisreagenz
Die erforderliche Anzahl von Röhrchen aus dem
Aluminiumbeutel entnehmen und auf das Gestell legen. (Summe
der Proben und Kontrollen).

Hinweis: Nach Entnahme der benötigten Röhrchen den
Aluminiumbeutel mit den unbenutzten Röhrchen sofort wieder
verschließen.

Für die Echtzeit-Trübungsmessung mit HumaTurb C+A (siehe
Verfahrensablaufdiagramm)(1) Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A für den Nachweis mit
diesem Produkt konfigurieren.
(2) Prüfen, ob die angezeigte Temperatur 67,0 C erreicht(Turbidimeter sollte vor Gebrauch 20 Minuten vorgeheizt werden).

（2）Negativkontrolle MTB（NC MTB）
Röhrchen anschnippen (oder abzentrifugieren), um den Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln. 60 µl der NC MTB in
der NC MTB in das Heizgefäß pipettieren, das im

17

(3) Reaktionsgefäße einsetzen und Messung starten.
(4) Turbidimeter-Anzeige auf einen Trübungsanstieg der Positiv- und
Negativkontrollen prüfen. Steigt die Trübung in der Positivkontrollean, in der Negativkontrolle jedoch nicht, läuft die
Amplifikationsreaktion korrekt ab (Abb. 1). Bei anderen
Bedingungen verläuft die Amplifikationsreaktion möglicherweise
nicht ordnungsgemäß. In einem solchen Fall sind die betroffenen
Proben erneut zu testen.
(5) Fertigstellung der Polymerase-Inaktivierung bestätigen (wird vom
Turbidimeter automatisch abgeschlossen). Alle Reaktionsgefäße
aus dem Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A entnehmen undungeöffnet entsorgen.

Jegliche Kontamination anderer Proben mit der PC MTB
vermeiden. Die Proben und die Negativkontrolllösung
dispensieren und vor der Dispension der PC MTB alle
Reaktionsgefäße verschließen.
(12) Zum Sammeln der Bestandteile auf dem Boden des Gefäßes das
Gefäß mit PC MTB vor dem Öffnen abzentrifugieren odervorsichtig anschnippen. Gefäß unmittelbar nach Dispension von
PC MTB verschließen.
(13) Bei Verwendung des HumaLoop T oder des Real-Time
Turbidimeter HumaTurb C+A wird die Polymerase-Inaktivierung
automatisch durchgeführt.
(14) Bei anderen Inkubatoren ist bei einem optischen
Fluoreszenznachweis vor der Beurteilung eine PolymeraseInaktivierung (5 Minuten bei 80 C oder 2 Minuten bei 95 C)durchzuführen, um Fehlbeurteilungen zu vermeiden.
(15) Bei einem anderen Inkubator darf bei UV-Bestrahlung nicht direkt
in das UV-Licht geschaut werden. Bei jedem direkten Blick in das
UV-Licht sollte eine Glasscheibe verwendet oder eine Schutzbrillebzw. Augenmaske getragen werden.
(16) Reaktionsgefäße nach Beginn oder Abschluss der LAMPReaktion niemals öffnen. Insbesondere ist darauf zu achten, dassdie Reaktionsgefäße beim Entladen aus dem Inkubator nichtversehentlich aufgehen.
(17) Amplifikate in den Röhrchen nicht zur Elektrophorese oder fürandere Anwendungen wiederverwenden.

Amplifikationsplots
Negative Probe
Positive Probe 1
Positive Probe 2

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Trübung

Trübung

Negativkontrolle
Positivkontrolle

0,4
0,3

0,4
0,3

0,2

0,2

0,1

0,1

0
0

5 10

15 20 25 30 35 40

0
0

5 10

INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

15 20 25 30 35 40

Zeit (min)Zeit (min)Abb. 1: Amplifikationsplots für
Kontrollen

Abb. 2: Amplifikationsplots fürProbenFür optischen Fluoreszenznachweis(Für HumaLoop T)
Jedes Reaktionsgefäß in die Fluoreszenz-Detektionseinheit stellen,
bestrahlen und von der Seite beobachten.
(Für Inkubator mit UV-Licht)
Den Boden jedes Reaktionsgefäßes bestrahlen und von der Seite
durch eine Schutzbrille oder eine UV-blockierende Augenmaske
beobachten.
Für eine gültige Testserie müssen folgende Ergebnisse erzielt
werden: Positivkontrolle: Emission von grünem Fluoreszenzlicht
 Negativkontrolle: keine Emission von Fluoreszenzlicht
Falls eine der Kontrollen ungültig ist, sollten alle Proben derTestserie als ungültig gemeldet und der Test wiederholt werden.
Nach erfolgter Bestätigung der Gültigkeit der Testserie sind die
Proben wie folgt zu beurteilen: Positive Probe: Emission von grünem Fluoreszenzlicht.
 Negative Probe: keine Emission von Fluoreszenzlicht.
Für die Echtzeit-Trübungsmessung mit HumaTurb C+A
Nachdem bestätigt wurde, dass die Trübung in der Positivkontrolle
zunimmt, in der Negativkontrolle jedoch nicht, sind die Proben nachden folgenden Kriterien (Abb. 1 und 2) zu bewerten.
 Positiv: leichter Trübungsanstieg zu beobachten Negativ: kein Trübungsanstieg zu beobachten
Anmerkungen:(1) Die
Nachweisgrenze
fürdieses
Produkt
sind
0,38 Genomäquivalente pro Test. Auch bei einem negativen Test
sollten sich Patienten mit einem anhaltenden, auf eine MTBCInfektion hindeutenden Symptom erneut ärztlich untersuchen
lassen.
(2) Obwohl Primer auf eine bestimmte Genregion mit einer relativ
geringen Anzahl von Variationen ausgerichtet sind, kann MTBC
möglicherweise weitere Variationen in dieser Region annehmen
und die Sensitivität dieses Produkts verringern. Deshalb kann eine
MTBC-Infektion trotz negativen Tests nicht immer ausgeschlossen
werden.
(3) Die Testergebnisse können durch Probenahme und -transport,
Probenvorbereitung, Inhibitoren und andere Verfahrensfehler imLabor beeinträchtigt werden. Ein negativer Test schließt das
Vorhandensein von MTBC in der Probe nicht aus. Für eineklinische Diagnose sind das Krankheitsbild des Patienten und alle
weiteren vorliegenden Laborergebnisse zu berücksichtigen.
(4) Dieses Produkt ist ein Kit für den qualitativen Nachweis. Es ist
nicht für die quantitative Messung konzipiert. Die Intensität desbeobachteten Fluoreszenzlichts oder die Anstiegszeit der vom
Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A gemessenen Trübung
korreliert nicht mit der Menge an Template-DNA.

VERFAHRENSHINWEISE(1) Die LAMP-Reaktion ist sehr empfindlich, und jede Kontamination
mit selbst kleinen Mengen des amplifizierten Produkts könnte zu
falsch-positiven Ergebnissen führen.
(2) Bereiche für Sputumprobenahme und LAMP-Testung trennen.
(3) Arbeitsplätze vor und nach dem Testen mit > 0,5 %Natriumhypochloritlösung reinigen.
(4) Alle notwendigen Maßnahmen zur Kontaminationsvermeidung
treffen,insbesondereHandschuhwechselnachSputumprobenübertragung oder bei Kontakt der Handschuhe mit
der DNA-Lösung.
(5) Beim Umgang mit diesem Produkt mikrobielle Kontamination und
Nuklease-Kontamination vermeiden. Selbst eine kleine Menge
DNase, die aus Schweiß oder Speichel in das Reaktionsgefäß
gelangt, kann die DNA zersetzen und ein falsches Ergebnis
verursachen.
(6) Keine Sputumproben verwenden, die eine große Menge Blutenthalten, da dies die Messungen beeinträchtigen kann. Sollte
eine Vorbehandlung der Probe erforderlich sein, bitte im „Manualof Clinical Microbiology“ (12. Auflage)6) nachschlagen.
(7) Die DNA-Lösung sollte idealerweise sofort nach der Herstellung
verwendet werden. Wenn dies nicht möglich ist, kann die DNALösung bei Raumtemperatur gelagert und innerhalb von
72 Stunden verwendet werden.
(8) Beim Einfüllen der Lösung in das Reaktionsgefäß den Kontakt
zwischen der Injektionskappe des Loopamp PURE DNA
Extraction Kit und der Innenwand der Reaktionsgefäße vermeiden.
Das Röhrchengestell aufrecht halten und das Röhrchen befüllen,
bis der Füllstand der DNA-Lösung zwischen den beiden Linien
liegt (30 µl). Inkorrekte Befüllung (über der oberen Linie oder unter
der unteren Linie) kann die Leistung beeinflussen.
(9)（Für HumaLoop T oder einen anderen Inkubator mit UV-Licht)
Wenn Bläschen vorhanden sind, die Röhrchen anschnippen (oderabzentrifugieren), um die Bläschen zu entfernen.
（Für Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A）
Da Bläschen in der Reaktionslösung die Trübungsmessung
beeinträchtigen und zu einer Fehlbeurteilung führen können, sollte
Bläschenbildung beim Mischen von Reagenz und Probenlösung
vermieden werden. Eventuelle Bläschen durch Abzentrifugierenoder Anschnippen entfernen.
(10) Das dMTB sollte vollständig aufgelöst sein. Nicht diluierte
Bestandteile können die Leistung beeinträchtigen, z. B. in Formeiner verminderten Sensitivität. Die Röhrchen insbesondere
2 Minuten lang auf dem Kopf stehend lagern.
(11) Die PC MTB enthält eine hohe Kopienzahl der Kontroll-DNA.

18

INTERFERENZEN

LAMP für unbehandeltes Sputum vs. TRC: 94,3 % (230/244); LAMP
für vorbehandeltes Sputum vs. TRC: 93,0 % (227/244). Außerdem
stimmten die Auswertungen der Echtzeit-Trübungsmessung und
des optischen Fluoreszenznachweises vollständig überein, mit
Ausnahme einer Probe (diese Probe war blutiges Sputum undwurde beim optischen Fluoreszenznachweis aufgrund der Störung
durch Blut falsch negativ getestet). Daher betrachten wir die beiden
Arten von Bewertungen als identisch miteinander. Die folgenden
Tabellen zeigen die Testergebnisse, die mit der EchtzeitTrübungsmessung erzielt wurden. Bemerkenswert ist, dass die
Ergebnisse des optischen Fluoreszenznachweises mit dem
HumaLoop T dieselben waren wie mit dem Real-Time Turbidimeter
HumaTurb C+A.

Interne Studien zeigten keine Beeinflussung der Messung durch das
Vorhandensein von freiem Bilirubin (91,0 mg/dl), konjugiertem Bilirubin(101,0 mg/dl), Chylus (Formazin-Trübung: 7300) und hämolisiertem
Hämoglobin (2475 mg/dl).
Hinsichtlich Arzneimitteln ergaben interne Studien keine
Beeinflussung der Messung durch das Vorhandensein von Isoniazid(100 µg/ml),
Ethambutol(20 µg/ml),
Rifampicin(100 µg/ml),
Pyrazinamid (500 µg/ml), Kanamycin (20 µg/ml) und Streptomycin(500 µg/ml).

LEISTUNGSDATEN
1. Genauigkeit
Beim Testen der folgenden Proben:
 Negative Probe (Konzentration: 0 Genomäquivalente/Test)
 Positive Probe 1 (1,875 Genomäquivalente/Test)
 Positive Probe 2 (125 Genomäquivalente/Test)
Die negative Probe sollte negativ getestet und die positiven
Proben 1 und 2 positiv getestet werden.
2. Reproduzierbarkeit innerhalb einer Testserie
Beim Testen von fünf negativen und positiven Proben gleichzeitig
sollte die negative Probe durchgehend negativ getestet und die
positive Probe durchgehend positiv getestet werden.
3. Nachweisgrenze
0,38 Genomäquivalente/Test
4. Kreuzreaktivität
In Bezug auf nichttuberkulöse Mykobakterien (Mycobacterium
asiaticum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum,

LAMP
Positiv
Unbehandeltes
SputumNegativ
Gesamtübereinstimmungsrate
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Positiver prädiktiver Wert
Negativer prädiktiver Wert
Wahrscheinlichkeitsverhältnis +(Sensitivität/(1-Spezifität))
Wahrscheinlichkeitsverhältnis ((1-Sensitivität)/Spezifität)

Mycobacterium simiae, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
szulgai,
Mycobacterium
gordonae,
Mycobacterium
xenopi,
Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
gastri, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium malmoense,
Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium
flavescens) (1,0 x 104 Genomäquivalente pro Test) und Bakterien fürAtemwegserkrankungen (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Klebsiellapneumoniae, Escherichia coli, Legionella pneumophila, Pseudomonas
aeruginosa, Mycoplasma pneumoniae（I）, Mycoplasma pneumoniae
（II）)

LAMP
Positiv
Vorbehandeltes
SputumNegativ
Gesamtübereinstimmungsrate
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Positiver prädiktiver Wert
Negativer prädiktiver Wert
Wahrscheinlichkeitsverhältnis +(Sensitivität/(1-Spezifität))(1,0 x 105 Genomaquivalente pro Test) testete das Messsystem
negativ auf alle Bakterienarten. Es trat keine Kreuzreaktion auf.

Wahrscheinlichkeitsverhältnis ((1-Sensitivität)/Spezifität)

5. Reaktivität gegen MTBC
Reaktivität gegen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
bovis und Mycobacterium africanum wurde bestätigt.
6. Information über Kalibrator
Beim Leistungstest für dieses Produkt wurde die Plasmid-DNA
verwendet, die das gyrB und die IS-Region der Genom-DNA von
Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank Nr. NC_000962) als
Kalibrator verwendet.
7. Klinische LeistungBis heute ist die Tuberkulose eine der bedeutendsten
Infektionskrankheiten der Welt. Weltweit wird die Gesamtzahl derneuen Tuberkulosefälle auf etwa 10 Millionen geschätzt, und die
Zahl der Sputumabstrich-positiven Fälle liegt bei etwa 4,3Millionen.7) In Japan wurden im Jahr 2008 24.760 Patienten neu alsan Tuberkulose erkrankt registriert, von denen 2216 starben.8)
Dieses Produkt wurde in zwei medizinischen Einrichtungen, die
für Infektionskrankheiten der Klasse 2 ausgewiesen sind(ausgewiesene medizinische Einrichtungen, die über Betten
ausschließlich für Patienten mit Tuberkulose verfügen), auf seine
Leistungsfähigkeit bei der Diagnose von Patienten mit Verdacht auf
Tuberkulose untersucht. Zusammen mit PCR und TRC, die beide
bereits in Japan zugelassen waren, wurde dieses Kit verwendet, um
zwei Tage lang gesammelte Sputumproben zu testen (320 Proben
von 160 Probanden), und die Ergebnisse wurden zwischen den Kits
verglichen. Die auf diesem Produkt basierenden Tests umfassten
insbesondere Bewertungen für die DNA-Extraktlösung, die aus dem
unbehandelten Sputum gewonnen wurde (im Folgenden LAMP fürunbehandeltes Sputum), und solche für die DNA-Extraktlösung, dieaus dem mit NALC-NaOH und einigen anderen Verfahren
vorbehandelten Sputum gewonnen wurde (im Folgenden LAMP fürvorbehandeltes Sputum).
Wie aus den folgenden Tabellen hervorgeht, war die
Gesamtübereinstimmungsrate wie folgt günstig: LAMP fürunbehandeltes Sputum vs. PCR: 91,5 % (291/318 Probanden);
LAMP für vorbehandeltes Sputum vs. PCR: 92,1 % (293/318);

13,1
0,0999PCR
Positiv
Negativ
194
3
22
99
92,1 % (293/318)
89,8 % (194/216)
97,1 % (99/102)
98,5 % (194/197)
81,8 % (99/121)
31,0
0,105

Positiv
Unbehandeltes
SputumNegativ
Gesamtübereinstimmungsrate
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Positiver prädiktiver Wert
Negativer prädiktiver Wert

TRC
Positiv
Negativ
163
5
9
67
94,3 % (230/244)
94,8 % (163/172)
93,1 % (67/72)
97,0 % (163/168)
88,2 % (67/76)

Wahrscheinlichkeitsverhältnis +(Sensitivität/(1-Spezifität))

13,9

Wahrscheinlichkeitsverhältnis ((1-Sensitivität)/Spezifität)

0,0451LAMP

Positiv
Vorbehandeltes
SputumNegativ
Gesamtübereinstimmungsrate
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Positiver prädiktiver Wert
Negativer prädiktiver Wert

TRC
Positiv
Negativ
157
2
15
70
93,0 % (227/244)
91,3 % (157/172)
97,2 % (70/72)
98,7 % (157/159)
82,4 % (70/85)

Wahrscheinlichkeitsverhältnis +(Sensitivität/(1-Spezifität))

32,6Wahrscheinlichkeitsverhältnis ((1-Sensitivität)/Spezifität)

0,0895

LAMP

19

PCR
Positiv
Negativ
196
7
20
95
91,5 % (291/318)
90,7 % (196/216)
93,1 % (95/102)
96,6 % (196/203)
82,6 % (95/115)

BESTELLINFORMATIONEN

Ablaufdiagramm

ProduktNr.

Produktbezeichnung

Wirksame Bestandteile

Vorgehensweise für Echtzeit-Trübungsmessung

972000Loopamp MTBC
Detection Kit

96 Tests

Zubereitung der Probenlösung und der Negativkontrolllösung

980000

HuMax ITA

Mikrozentrifuge

970000Loopamp PURE DNA
Extraction Kit

90 Tests

964000

HumaHeat Incubator

Thermoblock971000

Pipette-60 Set

1 Pipette; 4 x 96 Spitzen

961000

HumaLoop T

963200

HumaTurb C+A

60 µl der Probe und die NC MTB pipettieren.
Mit dem Loopamp PURE DNA Extraction Kit die
DNA aus dem gesammelten Sputum und der NC
MTB extrahieren. Die erhaltenen Lösungen werden
als Probenlösung bzw. als Negativkontrolllösung
verwendet.

1 Haupteinheit
1 FluoreszenzDetektionseinheit
1 Kontrollgerät
1 Amplifikationsgerät

Reagenzvorbereitung

Erforderliche Anzahl von Reaktionsgefäßen des dMTB nehmen.

Mischen von Reagenz
und Probenlösung

(Für Proben, Negativ- und
Positivkontrollen)

HINWEIS30 µl der Proben- oder Kontrolllösung in jedes
Reaktionsgefäß geben.

Bitte melden Sie jegliche schwerwiegenden Zwischenfälle, die im
Zusammenhang mit dem Gerät auftreten, dem Hersteller oder derzuständigen Behörde des Mitgliedsstaates, in dem sich der Benutzer
und/oder der Patient aufhält.

Die Negativkontrolllösung als Negativkontrolle
verwenden.
PC-MTB als Positivkontrolle verwenden.
(Positivkontrolle zuletzt vorbereiten.)

LITERATUR(1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)(2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)(3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)(4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)(5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology 54, No.
3, 667–715 (1999)
6) Isabella MGaby EP and Nicole P., et al.: Manual of ClinicalMicrobiology, 12th edition, ASM PRESS, 558–575 (2019)
7) WHO global TB database:https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/data
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/336069/9789240
013131-eng.pdf
8) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis Association

Reaktionsgefäße umdrehen, um die Lösung in der
Verschlusskappe zu sammeln. 2 Minuten warten.
Zwei Minuten warten, während die Reaktionsgefäße
auf dem Kopf stehen.

Reaktionsgefäße zum Mischen des Inhalts fünf Mal
drehen und anschließend abzentrifugieren.
Amplifikation(Bläschenbildung vermeiden.)

Reaktionsgefäße in den Reaktionsblock des Turbidimeters einsetzen.
Reaktion gemäß Beschreibung in der Gebrauchsanweisung des Turbidimeters starten und die Trübung
messen und beurteilen (40 Minuten bei 67,0 C.)
Abschluss der Polymerase-Inaktivierung (5 Minuten bei 80 C oder
2 Minuten bei 95 C) bestätigen. Alle Reaktionsgefäße aus dem
Turbidimeter entnehmen und ungeöffnet entsorgen. Dabei darauf
achten, die Gefäße nicht zu beschädigen.

TABELLE DER SYMBOLE
Katalognummer

In Serviceanleitung
nachschlagen

Verfallsdatum

Medizinprodukt für
In-vitro-Diagnostik

Hersteller

Temperaturbegrenzung

Chargennummer

Inhalt ausreichendfür <n> Tests

Bevollmächtigter
Vertreter in derEuropäischen
Gemeinschaft

Importeur

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH
Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

https://www.eiken.co.jp/en20*Datum der Revision: 2023-10-31