新製品：ARTIC Kits for Viral Sequencing and Customizable RNA Depletion

NEBNext RNA ライブラリー調製®

FOR THE ILLUMINA® PLATFORM

NEBNext RNA ライブラリー調製

目次

3 概要
4 ～ 17 RNA ライブラリー調製キット
4 ～ 5 ワークフロー
6 キットの選択

7 ライブラリー調製のヒント
8 ライブラリー調製の前処理

9 ～ 11 rRNA 除去

12 ～ 13 RNA ライブラリー調製
14 キット構成品

技術情報

ウェブサイト：NEBNext.com• 最新の NEBNext 製品リスト• プロトコール動画• 製品選択や調製手順のオンライン・チュートリアル• 製品選択に便利なオンラインソフト（NEBNext Selector Tool）• 参考文献• プロトコール＆ FAQs

日本版ウェブサイトも公開中：
www.nebj.jp/re/NEBNEXT

15 アダプター＆プライマー

16 NEBNext Q5 DNA ポリメラーゼ
17 ライブラリー定量

18 ～ 20 Small RNA ライブラリー調製
18 ～ 19 ワークフロー
20 キット構成品

21 ～ 25 関連製品

ウェブサイト（NEBNext.com）で動画配信中

21 シングルセル／微量 RNA ライブラリー調製

22 ～ 23 新型コロナウイルス全ゲノム解析
24 ～ 25 免疫レパトアシーケンス

26 オーダーインフォメーション
27 NEB オンラインツール>10 years of NEBNext Library Prep Kits.

18,000 報を突破

2

NEBNext が選ばれる理由

RNA シーケンスの普及に伴い、より高感度で特異的なシーケンスが求められている。mRNA シーケンスによるトランスクリプトーム解析だけではなく、シングル
セルレベルの超微量 RNA の解析、分解が進んだ FFPE RNA の解析など、様々な量と質の RNA からライブラリー調製を行う機会も多い。NEBNext はこれらのニーズに応えることができ、さらに低発現産物や Non-coding RNA など、これまでできなかった RNA も新たに検出・解析ができる。

合理的なワークフローで効率的にライブラリー調製

NEBNext は様々な種類の RNA サンプルと解析に対応している。mRNA に加えて、Noncoding RNA や Small RNA の解析が可能なキットを取り揃えている。また調製に必要な RNA インプットは、シングルセルレベルの微量 RNA（pg オーダー）から 1 µg トー
タル RNA までワイドレンジに対応している。さらにインタクトな RNA だけではな
く、FFPE RNA など分解が進んだ RNA からも調製可能なキットも提供している。

概要

NEBNext 新製品• 新型コロナウイルスのシーケンス用 ARTIC キット（22 ～ 23 ページ）
• 様々な生物に対応できるカスタム rRNA 徐キット
（11 ページ）• 480 プレックス対応の unique dual index プライマー（15 ページ）• 免疫レパトアシーケンス用ライブラリー調製キット（24 ～ 25 ページ）

ライブラリー調製の前処理として、rRNA など特定の RNA を除去するためのキットも充実している。現在、ヒト／マウス／ラット、バクテリアの rRNA 除去キットと、血液由来 RNA 解析用のグロビン mRNA & rRNA 除去キット、カスタム RNA 除去キットも販売している。

シーケンサーの性能向上に対応すべく、最大 480 プレックスが可能なインデック

NEBNEXT IMMUNE SEQUENCING KITS

テクニカルサポートが NGS 研究を支援

ス（バーコード）も取り揃えている。加えて qPCR によるライブラリー定量キット

・ シーケンス・ライブラリー調製の相談

10 年間以上の実績

・ トラブルシューティングなども提供している。

2009 年に最初の NEBNext 製品を販売して以来、世界中の研究者に愛用されており、今までに 18,000 以上の査読雑誌に掲載、また各国のシーケンスセンターで使用されている。また熟練したテクニカルサポートが各支社に在中、さらに米国本社のNGS 研究グループも合わせて、実験計画からシーケンス・解析までをサポートすることで、シーケンスを成功に導く。製品はその中の構成品を個別に品質検査するとともに、キット全体としてライブラリー調製およびシーケンスにより機能検証されており、常に最高品質を提供している。

・ 製品の選択www.nebj.jp/e/techsupport

フレキシブルなフォーマット

NEBNext ライブラリー調製試薬は、キットの他に、各ワークフローに対応した試薬をモジュールとして販売している。

キットとモジュールキットには、ライブラリー調製ワークフロー全体の試薬が含まれているため、最も便利な仕様である。また、DNA 精製とサイズセレクション
用の NEBNext ビーズ（SPRIselect と同等品）が付属したキットも提供している。

NEBNext モジュールには、ライブラリー調製の個々のステップ用の試薬が含まれている。これらのモジュールを組み合わせてライブラリー調
製全体をカバーすることが可能であることに加えて、NEBNext モジュールと他の試薬と組み合わせて、ワークフローのカスタマイズも可能である。

アダプターとプライマーは、NEBNext Oligos モジュールとして NEBNext キットとは別に提供されている *。必要なプレックス数に応じて柔軟に選択が可能である。
* Small RNA キットを除く

NEB AR アプリ

バルク & カスタム仕様

通常の販売サイズ以上が必要な場合、または特殊な試薬や組成が必要な場合、顧客のニーズに合わせてカスタマイズされたコンポーネント、キット、モジュールが提供可能である。

問い合わせ先：NEB ジャパン（E-mail：tech.jp@neb.com）

NGS ライブラリー調製の概要
詳細は裏表紙を参照

3

ワークフローRNA ライブラリー調製のワークフロー

インプット量製品

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB #E7760）

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep with Sample Purification Beads（NEB #E7765）

10 ng ～ 1 µg Total RNA（rRNA Depletion Workflow）

NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB #E7770）

NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads（NEB #E7775）

10 ng ～ 1 µg Total RNA（poly（A）mRNA workflow）

NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（NEB #E7490）

NEBNext RNA Depletion Kits（NEB #E7400, #E7405, #E7750, #E7755, E7850, #E7860, #E7865, #E7870）

NEBNext Oligos（including 12-plex, 96-plex and dual index primers）（NEB #E6440, #E6442, #E6444, #E6446, #E6448, #E6609, #E7335, #E7500, #E7600, #E7710, #E7730, #E7780）

RNA
NN Random Primer
AA Poly(A) Tail

1

前処理（ポリ A-mRNA 単離、または rRNA 除去）• 他の方法・キットで処理した RNA サンプルも NEBNext ライブラリー調製が可能

2 RNA

5´ m7GAAAAA 3´の断片化 & ランダムプライミング• Mg2+ 存在下、94℃で化学的断片化• RNase III などの酵素で断片化も可能

NNNNN

5´

• ランダムプライマーのハイブリダイズ

5´ m7G

3´

NNNNN

NNNNN

AAAAA 3´

第 1 鎖 cDNA 合成• RNaseH 活性欠損型の逆転写酵素を使用（RNA：DNA 鎖を分解しない）

5´ NNNNN3´• Directional（Stranded）調製の場合、Actinomycin D 含有バッファーを使用– 逆転写酵素の DNA 依存性ポリメラーゼ活性を抑制

4U• オリゴ dT ビーズでポリ A-mRNA を単離（非ポリ A 型 mRNA は不可）
• rRNA を除去（mRNA の他、Non-coding RNA なども残る）

3

DNA
U Uracil

Barcode (BC)P5 Primer
P7 Primer
USER Enzyme
T NEBNext
Adaptor

第 2 鎖 cDNA 合成• RNase H により、RNA：DNA 上の RNA 鎖を分解

3´
5´

DIRECTIONAL• 部分的に残った RNA が
DNA 合成のプライマーとなる

5´
3´• DNA – DNA 間のニックは E. coli DNA ligase で修復されて、完全な DNA 鎖が合成

U

U

U

NON-DIRECTIONAL
U

5´

3´

3´
3´

5´

5´

• Directional（Stranded）法では、ウラシルが取り込まれる

5

エンドリペア、dA 付加、アダプターライゲーション• 平滑化および 5' リン酸化
• 3' A 付加• Read 1/2 配列を含む
ショートアダプターを使用• ループ状アダプターによりライゲーション効率を向上、ダイマー形成を抑制

4

5´

U
3´

T
A

U

U

U

U

A
T

3´

5´

U
5´

U
3´

T
A

A
T

3´

U
5´

ワークフロー6アダプター開環（ウラシル除去）• USER Enzyme による
ウラシル除去とループ開環
Directional

5´（Stranded）法の場合：• 第 2 鎖 cDNA の分解

USER• 第 1 鎖 cDNA だけから PCR 増幅、
RNA の方向性を維持した
ライブラリーが調製

7 PCR

向上

– インデックス（バーコード）を付加– P5/7 配列を付加

3´

3´

5´

クリーンアップまたは
サイズセレクション

クリーンアップまたは
サイズセレクションBC P7 5´

5´
5´

増幅

– ライブラリー収量を

USER

5´

BC P7

• 高正確性ポリメラーゼによる– アダプターが両末端に付加したテンプレート
を増幅

3´

5´

3´

P5
3´

5´
3´

5´

5´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´

5´

5´

5´

NEBNext オリゴ• NEBNext プライマーを使用してインデックス（バーコード）を付加• シングル／デュアルインデックスを選択可能

5´

3´

3´

5´

P7 BC

3´
5´

3´

5´

3´
5´

3´

5´

P5
3´

5´

P5
3´

5´

3´

3´
5´

3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

※ Directional と Non-Directional の違いは 12 ページを参照

5

キットの選択RNA ライブラリー調製キットの選択

RNA ライブラリー調製においては、主に前処理キットの選択とライブラリー調製キットの選択が重要である。
• ポリ A-mRNA 分離

1）前処理– サンプル：ポリ A-mRNA（非分解、RIN>7）– 推奨キット：NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（#E7490）• rRNA 除去– サンプル非ポリ A-mRNA、ポリ A-mRNA（分解）、Non-coding RNA（Small RNA を除く）

2）ライブラリー調製– 推奨キット：NEBNext rRNA Depletion Kit（#E6310 など）••

ディレクショナル（Stranded : ストランド特異的）– 推奨キット：NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit（#E7760、#E7765）
非ディレクショナル（Non-Stranded）– 推奨キット：NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit（#E7770、#E7775）

rRNA 除去キットは RNA 精製ビーズ付属キットも提供している。RNA ライブラリー調製キットは NEBNext ビーズ（SPRIselect と同等）付属キットも提供している。Small RNA、またはシングルセル RNA 用キットは専用のものを使用する。

最適な製品の選択のため、弊社テクニカルサポートもしくはオンラインツール（nebnextselector.neb.com）も利用可能

Small RNA

SingleCell/Low
Input RNA

NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep (Set 1/Set 2/Index Primers 1-48) – #E7300/#E7580/#E7560
NEBNext Small RNA Library Prep Set (Multiplex Compatible) – #E7330
NEBNext Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit – #E6420

Kits &
Oligos

NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6609

ModuleNEBNext Single Cell/Low Input cDNA Synthesis & Amplification Module – #E6421

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit – #E7760

RNA

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep with Sample Purification Beads – #E7765
Kits &
requiredmodules

NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human, Mouse, Rat) – #E7400 – with RNA Sample Purification Beads – #E7405
NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit – #E7750 – with RNA Sample Purification Beads – #E7755
NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria) – #E7850 – with RNA Sample Purification Beads – #E7860
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module – #E7490

OligosTotal RNAmRNA

Directional(Stranded)*

NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6609
NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human, Mouse, Rat) – #E7400 – with RNA Sample Purification Beads – #E7405
NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit – #E7750 – with RNA Sample Purification Beads – #E7755
NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria) – #E7850 – with RNA Sample Purification Beads – #E7860
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module – #E7490

Modules

NEBNext Ultra II RNA First Strand Synthesis Module – #E7771
NEBNext Ultra II Directional RNA Second Strand Synthesis Module – #E7550
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module – #E7546
NEBNext Ultra II Ligation Module – #E7595
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix – #M0544
Oligos* Non-Directional（Non-Stranded）製品も販売中
オリジナル Ultra 製品（従来品）も販売中
詳細は 26 ページを参照

6

NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6609

ライブラリー調製のヒント

RNA ライブラリー調製のヒント
RNA インプットのガイドライン
RNA の精製度と分解度

可能な限り高い精製度の RNA を使用することが最も重要である。以下などの方法を用いて RNA の精製度と分解度を確認する。

• BioAnalyzer®（アジレント社）：トータル RNA の場合、rRNA のピークから分解度を測定する。前処理に mRNA 精製を行う場合には RIN（RNAIntegrity Number）が 7 以上の分解度が低い RNA を使用するとよい• 電気泳動：rRNA のバンドが 2：1 の強度で 2 本観察されることで分解度を確認できる。またゲノム DNA の残存がないことを確認する。あった
場合、DNase I などで DNA 除去を行う• 吸光度：A260/280 = 1.8 以上であることを確認する。ただし吸光度は DNA や小さい核酸分子の混入の影響を受けるため、波形とピークを確認するとよい

RNA の定量• 正確に定量を行うことでライブラリー調製工程中の PCR サイクル設定を正しく行うことが可能となり、アダプターダイマーがない高効率なライブラリーが調製できる• 1 本鎖 RNA 特異的な定量が可能な Qubit®（Thermo Fisher Scientific® 社）での定量がよい• UV 吸光度測定の場合、DNA や他の因子の影響を受け、実際よりも高く RNA が定量されるため、ライブラリー収量が低くなることがある
複数の方法で定量することにより、正確な RNA 定量と純度推測が可能となるライブラリー調製のヒント
ビーズ精製• 上清を取り出す際、ビーズペレットを乱さないようにする• ビーズを使用する前はボルテックスで十分に懸濁して、均一に攪拌したものを使う• ビーズ風乾時は、乾燥しすぎないようにする。少し湿り気がある程度がよい

インデックス（バーコード）• マルチプレックス数に応じて最適なアダプターオリゴセットを選択する• 特に少ないプレックス数（< 4 プレックス）の場合、組み合わせに注意する（推奨はマニュアルに記載）• デュアル・インデックスを使用する場合、プライマー間のコンタミネーション防止のため、インデックス毎にチップを変える• 96 穴プレートキットを使用する場合、穴をあけてから使用する。使いきりとする

NEBNext 専用マグネットラック
NGS ライブラリー 調製 ではマグネティックビーズを 使用 して DNA 精製 あるいはサイズセレクションを行う。この際、確実にビーズを吸着して、上清をロスする
ことなく回収するため、専用のマグネットラックを提供している（#S1515S）。

特長• 強力な磁石により、短時間でビーズ吸着• 24 チューブ対応（12 x 2）

NEBNext マグネットラックには 強力 な 磁石 が 使 われており、 ビーズは 0.2 ml 用
チューブの側面に吸着する。また傾斜が設けられていること、横からビーズ吸着の様子が観察できるため、上清が回収しやすく、風乾の様子も観察しやすいため、
ロスやビーズ 混入 がない DNA 精製 が 可能 である。12 穴ｘ 2 列、計 24 チューブに対応している。
NEBNEXT MAGNETIC SEPARATION RACK

7

ライブラリー調製の前処理

RNA の種類RNA 除去の方法

リボソーム
イントロン

0.91

100

12.37

90

1.00
17.77

1）mRNA 精製

70

0.72

18.96

17.54

33.02

60

48.22

91.00

61.15

50
40

78.07
48.22

20
10
0

mRNA は、RNA-seq においてメインターゲットとなる機能性 RNA である。真核生物では、3' 末端にポリ A テールが付加されている。これを利用し、オリゴ
dT ビーズに結合させることで mRNA を単離する手法である。NEBNext Poly（A）
mRNA Magnetic Isolation Module（#E7490S/L）は、トータル RNA からマグネティック
ビーズにより mRNA（ポリ A 型）を精製するためのキットである。本キットにより、真核生物のポリ A 型 mRNA を高効率で回収できる（図、左から二番目）。
ただし、分解が進んだ RNA には使用できず、またバクテリアなどポリ A テー
ルがない mRNA には使用できない。また、Non-Coding RNA の回収には不向きで
ある。

31.71
3.77
4.55

20.59
0.67

除去なし
（UHR）

polyA-mRNA 精製（UHR）rRNA 除去rRNA 除去rRNA 除去（UHR） （FFPE、
1 年間保存）（FFPE、
10 年間保存）ヒト・リファレンス RNA（UHR、Agilent®）および乳癌 FFPE（1 年／ 10 年保存）

由来 RNA を mRNA 精製 キットあるいは rRNA 除去 キットで 前処理 を 行 い、

Illumina 社 NGS により解析した。なお、イントロンは Non-coding RNA、エキ
ソンは Coding RNA、インタージェニックは Coding RNA 間の RNA を示す。

mRNA 精製キット

NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（NEB #E7490S/L）

2）rRNA 除去

rRNA に 結合 するプローブを 利用 して rRNA を 分解 して 除去 する 方法 である。
NEBNext の rRNA Depletion では、50 塩基程度の 1 本鎖 DNA プローブを用いるため、
RNA の分解度によらず rRNA を除去できる。すなわち、分解が進行した RNA にも使用可能である（図、一番右）。また、Non-coding RNA の回収も可能である。
ただし、mRNA 精製よりもワークフローが複雑で、生物種ごとに異なる専用のキットが必要である。なお、生物種によってはキットが存在しない場合もあるが、NEBNext の Custom Depletion を使えば、キットが存在しない生物種に対しても、自作した専用プローブによって rRNA を含む、解析に不要な RNA 除去が可能である。
詳細は 9 ページ以降で述べる。

Point
RNA 前処理の選択方法（解析対象 RNA の濃縮）●

生物種、解析対象 RNA、分解度などから前処理方法を選択する。

以下ガイドを参照する。分からない場合はテクニカルサポートへ！

生物種

解析対象 RNAヒト・マウス・ラット

mRNA*

真核生物

バクテリア

RNA ウイルス
全生物 ****RNA の分解度

推奨の前処理キット

分解なし（RIN > 7）mRNA 精製キット（#E7490）

mRNA（グロビン mRNA 以外）

分解度は問わない

rRNA & グロビン mRNA 除去キット（#E7750）

mRNA（ポリ A 型）

分解なし（RIN > 7）

ゲノム RNA

分解度は問わない

mRNA

mRNA + ncRNA（small RNA 以外 **）mRNA（非ポリ A 型）
mRNA + ncRNA

分解あり（RIN < 7）
分解度は問わない

分解度は問わない
分解度は問わない

rRNA 除去キット（HMR）（#E7400）
rRNA 除去キット（HMR）（#E7400）
mRNA 精製キット（#E7490）
rRNA 除去キット（#E7850）
必要なし ***

カスタム RNA 除去キット（#E7865）* mRNA の他、ncRNA も検出される** Small RNA ライブラリー調製には #E7300、#E7580、#E7560 を推奨*** ホスト RNA が混入している場合は rRNA 除去キットなどの前処理が効果的**** ヒト／マウス／ラット以外の哺乳類、特定のバクテリアやアーキア、植物、酵母、昆虫など、除去対象の rRNA 配列が分かっている生物

8

エクソン

1.11

30

RNA 除去には、主に 1）mRNA 精製と 2）rRNA 除去の 2 種類がある。

●

インタージェニック

8.65

80

Percent of Reads (%)

RNA には mRNA や rRNA など数多くの種類があり、低い発現量であっても重要な RNA も存在する。ただし一般的には、トータル RNA 中に含まれるのは rRNA
が 大半 である（図、一番左）。 トータル RNA をそのままシーケンスすると、得られるリードはほとんどが rRNA となってしまう。よって、rRNA を除去す
るか、あるいは解析対象の RNA（基本的には mRNA）を精製してからライブラ
リー調製をする必要がある。

容量24/96 rxns

rRNA 除去

NEBNext RNA Depletion

Get more ofwhat you want.

NEBNext RNA Depletion Kits は対象 RNA はインタクトのまま、トータル RNA から rRNAを高効率で除去するキットである。除去対象の RNA に特異的にハイブリダイズするショートプローブと RNase H 法（1、2）を 用 いることにより、分解 が 進行 した
RNA サンプルの対象 RNA も除去可能である。

• NGS 解析の前処理に最適• 未分解 RNA だけではなく、FFPE 由来 など 劣化 が 進行
した RNA からも高効率で除去

NEBNext RNA Depletion Kit のワークフロー• 10 ng ～ 1 µg のトータル RNA 量に対応
• 対象 RNA だけを特異的に除去

トータル RNA• わずか 2 時間のワークフロー：ハンズオンタイムは
8 分間

一般的にトータル RNA 中には>80% の rRNA が存在（赤）• 除去サンプルは NGS のほか、ランダム cDNA 合成などのアプリケーションにも使用可能

rRNA• RNA 精製ビーズ（Agencourt RNAClean XP Beads と同等）付きキットも提供

ssDNA プローブが rRNA に結合
1 本鎖 DNA
ssDNA
probes

プローブが特異的に rRNA に
ハイブリダイズrRNA 除去キット

NEBNext rRNA Depletion Kit v2（Human/Mouse/Rat）（NEB #E7400S/L/X）

RNase H が rRNA を分解
RNase H

NEBNext rRNA Depletion Kit v2（Human/Mouse/Rat）with
RNA Sample Purification Beads（NEB #E7405S/L/X）

RNase H がハイブリダイスしたRNA（rRNA）だけを分解

NEBNext Globin & RNA Depletion Kit（NEB #E7750S/L/X）

DNase I

NEBNext rRNA Depletion Kit（Bacteria）（NEB #E7850S/L/X）

NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set（NEB #E7865S/L/X）

rRNA 除去サンプル
rRNA 以外の RNA が濃縮（青）6/24/96 rxns

6/24/96 rxns
6/24/96 rxns

NEBNext rRNA Depletion Kit（Bacteria）with RNA Sample
Purification Beads（NEB #E7860S/L/X）

DNase I が
DNA プローブを分解

6/24/96 rxns

6/24/96 rxns

NEBNext Globin & RNA Depletion Kit with RNA Sample
Purification Beads（NEB #E7755S/L/X）

DNase I が ssDNA プローブを分解、および精製

容量

6/24/96 rxns
6/24/96 rxns

NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set with RNA Sample
Purification Beads（NEB #E7870S/L/X）

6/24/96 rxns

NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（NEB #E7490S/L）

24/96 rxns

ポリ A-mRNA 精製キット

容量

参考文献：

1. Adiconis, X. et al. (2013). Nature Methods 10; 623-629.
2. Morlan, J.D. et al. (2012). PLoS One 7, e42882.

rRNA Depletion v2 Kit（Human/Mouse/Rat）
10 ng ～ 1 µg のトータル RNA から rRNA を高効率で除去
A.

rRNA

分解が進んだ FFPE RNA サンプルの rRNA も高効率で除去

B.

100
90

RNA of interest

NEBNext

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Human
11.0

99.4

99.4

99.1

89.0

rRNA Reads (%)

Reads (%)

80

I社

70
60
50
40
30
20
10

0.6

Undepleted
1 µg

0.6

0.9

Depleted
100 ng 10 ng

0

Undepleted

Depleted
100 ngDepleted
10 ng（B）から、NEBNext rRNA Depletion Kit v2（Human/Mouse/Rat）（A、B）、または I 社キッヒトのリファレンストータル RNA（A）、またはヒト成人正常肝組織の FFPE トータル RNA（RIN 2.3）
ト（B）を用いて rRNA を除去した。RNA-seq ライブラリーは、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina を用いて調製し、その後ペアエンドシーケンス（2 x 75 bp）を実施した。rRNA を除去したデータから 1000 万リード（A）または 2000 万リード、rRNA を除去していないデータから 2 億リード（B）のリードをサンプリングし（seqtk）、mirabait を用
いて rRNA の割合を同定した。

9

rRNA 除去rRNA Depletion Kit（Bacteria）

バクテリアの 5S、16S、23S rRNA を高効率で除去する。グラム陰性菌および陽性菌に対応、モノおよびメタトランスクリプトーム解析に最適な除去キットである。10 ng ～ 1 µg のトータル RNA から rRNA を除去、インタクトな RNA に加えて、分解が進んだ RNA からも効率的に除去可能である。

20 種類のバクテリアプールでも高効率で rRNA を除去
100 ng ATCC20

除去なし

除去あり

10 ng ATCC20

除去なし

除去あり

Acinetobacter baumannii
Actinomyces odontolyticus
Bifidobacterium adolescentis
Bacillus cereus
Bacteroides vulgatus
Cutibacterium acnes
Clostridium beijerinckii

20 種 類 の バ ク テ リ ア プ ー ル の 凍 結 乾 燥 サ ン プ ル（ATCC®
#MSA-2002）からトータル RNA を抽出し、NEBNext rRNA Depletion
Kit（Bacteria）を用いて rRNA を除去を行った。

Deinococcus radiodurans
Escherichia coli
Enterococcus faecalis
Helicobacter pylori
Lactobacillus gasserirRNA 除去前と除去後で NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep
Kit for Illumina を用いてライブラリー調製を行い、ペアエンド
でシーケンスした（2 x 75 bp）。

Neisseria meningitidis
Pseudomonas aeruginosa
Porphyromonas gingivalis
Rhodobacter sphaeroides
Streptococcus agalactiae
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus mutans
0

5

10

15

20 0

5

10

15

20 0

5

10

15

20

0

5

10

15

rRNA Reads (%)

緑字はグラム陰性菌、紫字はグラム陽性菌を示す。

20

NCBI genome database で composite reference genome にアライメン
トと duplicate の 除去後、ht-seq count により 転写 レベルを 測定した。

各インプット量で、ほとんどの種において、アノテーション

された RNA は効果的に除去されており、また、rRNA 除去前と除去後で相関がみられる。

Globin & rRNA Depletion Kits（Human/Mouse/Rat）

NEB の RNA 除去キットは rRNA だけが対象ではない。血液サンプルにおいては、トータル RNA 中に rRNA の他にグロビン mRNA も大量に含まれている。NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit は、 ヒト、 マウス、 ラットの 血液由来 のトータル RNA から、 グロビン mRNA（HBA1/2、HBB、HBD、HBM、HBG1/2、HBE1、HBQ1、HBZ）、細胞質 rRNA（5S、5.8S、18S）およびミトコンドリア rRNA（12S、16S rRNA）を除去する。さらに未分解の RNA
だけではなく、分解が進んだ RNA からも効率的に rRNA とグロビン mRNA を除去する。解析対象が mRNA であり、かつ RNA が分解されていない
場合（RIN> 7)、Globin&rRNA Depletion Kit の後に、ポリ A-mRNA 精製キット（#E7490）でさらに濃縮することが可能である。
全血のトータル RNA から rRNA とグロビン mRNA を効率的に除去
rRNA

マウス、全血ヒト、全血GlobinRNAs of interest

ラット、全血ヒト、 マウス、 ラットの 血液 から 抽出 したトータル RNA

Percent of Reads

100（1 µg）をインプットとして、RNA 除去なし、rRNA 除去、rRNA

80
60
40
20
0

除去
なし

rRNA

rRNA &

除去

グロビン除去

除去
なし

rRNA

rRNA &

除去

グロビン除去

除去
なし

rRNA

rRNA &

除去

グロビン除去およびグロビン RNA 除去して調製したライブラリーについて、各 RNA の残存率を調べた。ライブラリー調製は NEBNext
Ultra II RNA Library Prep Kit を使用。ペアエンドシーケンス（2 x75 bp）で得られたリードから rRNA およびグロビン mRNA を特定（mirabait、6 or more、25-mers）、トータルリード中の各 RNAに対応するリード割合を計算した。

研究者の声

NEB Bacterial Depletion は、幅広い RIN 値のサンプルにおいて、従来の rRNA 除去法と同等以上の rRNA を除去できています。
Total RNA のインプット量の柔軟性にも満足しており、100 ng の Total RNA インプットに対し、単一またはメタゲノムサンプルの両方において、rRNA 除去がいつでも効果的に実施できています。また、このプロトコールは、ビーズベースの rRNA 除去法
よりもユーザーフレンドリーです。私たちがテストしたすべての新たな rRNA 除去法において、NEB は断然優れていました。
– Research Assistant,
Biomedical research institution

10

rRNA 除去カスタム RNA 除去

NEBNext
Custom RNA Depletion
Design Tool®

RNA-seq では、rRNA のような生物学的に重要でない高発現の転写産物がリードに多数含まれることがあり、量の少ない転写産物の検出が妨げられることがある。この課題
は、専用の RNA Depletion キットを使用できないサンプルでシーケンスする場合に特に問題になる。NEBNext の NEBNext RNA Depletion Core Reagent セットは、ユーザーフレンド
リーな NEBNext Custom RNA Depletion Design Tool で設計したプローブ配列を用いることで、あらゆる生物から不要な RNA を除去することが可能である。
100

99.9

17.0

99.8

9.0

90
80

99.5

99.7

98.3

9.0

91.0

98.6

RNA of interest

83.0

Reads (%)

70
60
50
40
30
20
10
0

0.1

Undepleted

0.2

0.5

Depleted
100 ng 10 ng

UndepletedAedes
aegypti

A.

100
90
80

1.7

0.3

Depleted
1 µg 10 ng

Undepleted

Thermococcus
kodakarensis

97.8

11.4

Pyrococcus
furiosus

rRNA

mtRNA

https://depletion-design.neb.com/

RNA of interest

0.3

88.3

2

Reads (%)

70

Reads (%)

1.4

Depleted
1 µg 10 ng

99.8

使用可能なプローブが設計可能

NEBNext Custom RNA Depletion は、ターゲットとする RNA を効率的に除去することで、目的の RNA をエンリッチすることが可能である。NEBNext Custom RNA Depletion Design Tool を用いて、蚊の一種である Aedes aegypti の rRNA と、古細菌の一種である Thermococcus
kodakarensis の rRNA に 対 するプローブを 設計 した。Thermococcus
kodakarensis と Pyrococcus furiosus の ト ー タ ル RNA（1 µg、100 ng、
10 ng）をインプットとして、Core RNA Depletion Reagent Set を用いて設計したプローブで rRNA を除去した。NEBNext Ultra II Directional
RNA Library Prep Kit for Illumina を用いて RNA-seq ライブラリーを調製し、ペアエンドシーケンス（2 x 75 bp）を実施した。各ライブ
ラリーから 2000 万リードをサンプリング（seqtk）した。リード
ペアは mirabait によりリボソームかどうか同定した（判定基準：
6 個以上の 25mer を共有すること）。rRNA の残存量は、rRNA と判定 されたリード 数 をクオリティフィルタリングをパスした
リードの総数で割ることで算出した。データは 3 回の実験の平均値である。本データにより、NEBNext Core RNA Depletion Reagent
Set を用いることによって、様々な生物種や RNA インプット量（1 µg ～ 10 ng）において、ターゲットとなる rRNA が除去できる
ことが示された。

Targeted RNA

91.0

NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set で

60
50

2.0

1

40
30

0

20
10
0

2.0

Undepleted

B.

0.2

Depleted(rRNA only)

0.2

0.1
0.1

Depleted(rRNA only)

Depleted(rRNA + mtRNA)

0.1
0.1

Depleted(rRNA + mtRNA)

mt rRNA
Undepleted

mt Protein Coding Genes[0-7000]

Depleted [0-3500](rRNA only)
Depleted [0-3500](rRNA + mtRNA)
RNR1

RNR1

MT-ND1

MT-ND2

MT-CO1

MT-CO2

12S & 16S rRNAMTATP6

MT-ND3

MT-ND4

MT-ND4L

MT-CYB

MT-ND5
MT-ND6

MT-ATP8 MT-CO3

他のプローブプールとの組み合わせによって、ヒト rRNA とミトコンドリア mRNA を効率よく除去可能である。NEBNext Custom RNA Depletion Design Tool を使用し、ヒトミトコンド
リア mRNA に対するプローブを設計した。設計したプローブは NEBNext rRNA Depletion Kit v2（Human/Mouse/Rat）のプローブプールと組み合わせて使用した。1 µg の Universal Human
Reference RNA（Agilent 社）に対し、Core RNA Depletion Reagent Set と混合したプローブプールを用いて、ミトコンドリア mRNA と rRNA を除去した。NEBNext Ultra II Directional RNA Library
Prep Kit for Illumina を使用して RNA-seq ライブラリーを調製し、ペアエンドシーケンス（2 x 75 bp）を実施した。各ライブラリーから 2000 万リードをサンプリング（seqtk）した。

A. リードペアは mirabait によりリボソームまたはミトコンドリアかどうか同定した（判定基準：6 個以上の 25mer を共有すること）。rRNA およびミトコンドリア RNA の残存量は、
rRNA またはミトコンドリア RNA と判定されたリード数をクオリティフィルタリングをパスしたリードの総数で割ることで算出した。この結果から、rRNA とミトコンドリア
RNA の両方が効率的に除去されていることが示された。

B. ヒトミトコンドリア遺伝子のリードカバレッジを Integrative Genome Viewer（IGV）で可視化した。

11

RNA ライブラリー調製

Ultra II Directional RNA（Stranded：ストランド特異的）
Ultra II RNA（Non-stranded）

NEBNext RNA キットは、10 ng ～ 1 µg の RNA からライブラリー 調製 が 可能 であり、2 種類を用意している。1 つは Directional（Stranded）仕様であり、対象の RNA から逆転写された第 1 鎖 cDNA だけからライブラリーが調製されるため、そのシーケン
スリードから転写元となった DNA 鎖（＋鎖か－鎖）を特定できる。もう一方は Nondirectional（Non-Stranded）であり、対象の RNA から逆転写された第 1 鎖 cDNA と第 2 鎖
cDNA の両方からライブラリーが調製されるため、DNA 鎖情報は維持されない。
また 一般的 にトータル RNA 中 には 多 くの rRNA が 存在 しているため、調製前 に 除去するか、必要な mRNA だけを精製する必要がある。これらのキットについては

9 ページを参照する。

様々な量の RNA インプットから高収量でライブラリー調製
2,000

NEBNext Ultra II Directional RNA
K 社 Stranded
K 社 HyperPrep
I 社 Stranded

1,800
1,600

Total Yield (ng)

1,400
1,200

Even morefrom less, for RNA.
• 微量 なトータル RNA（10 ng ～ 1 µg） からも 高収量 でライブラリー調製• シンプルなワークフローで、わずか 5.5 ～時間で調製
完了• 最小限の PCR サイクルにより増幅バイアスは最小限• 分解が進んだ FFPE RNA などからも高収量でライブラリーを調製• 多様なサンプルと解析目的に対応できる
豊富なラインナップ– ライブラリー調製キット（Stranded、Non-stranded）– 前処理試薬（rRNA 除去、ポリ A-mRNA 精製）– 最大 480 プレックスが可能なインデックス（バーコード）TOOLS & RESOURCES

1,000
800

製品の詳細や各種データ：

600

UltraIIRNA.com

400
200
0

PCR Cycles
Total RNA Input

9
1 µg

13
100 ng16
10 ng

各社のライブラリー調製試薬と比較した結果、NEBNext Ultra II Directional RNA の収量が最も高く、10 ngの微量 RNA からも高収量でライブラリーを調製することができることが示された。ヒトリファレン
ス RNA（Agilent #740000）を使用、各量（10 ng、100 ng、1 µg）からポリ A-mRNA を精製、ライブラリー
調製を行った（n = 3）。

Point
Directional vs Non-Directional●●

Directional（Stranded）：RNA から合成された cDNA（2 本鎖）の第 1 鎖だけからライブラリーが調製されるため、シーケンスリードは元の RNA の方向性を保っている。センス鎖、アンチセンス鎖のどちらから転写されたかを区別して解析する場合や、アッセンブルする場
合に効果的である。最近の RNA シーケンスの主流である。
Non-Directional：RNA から合成された cDNA（2 本鎖）のそれぞれからライブラリーが調製されるため、シーケンスリードは順向き／
逆向きの両方が得られる。センス鎖、アンチセンス鎖の区別はできない。

NEBNext Ultra II Directional RNA
ワークフロー12RNA ライブラリー調製

研究者の声

NEBNext Ultra II Direction RNA は様々なインプット量でも一定したライブラリー調製が可能
NEBNext Ultra II
Directional RNA

0.05

1 µg
100 ng
10 ng

0.05

0.03

0.02

0.01

0

0.03

0.02

0.01

20

30

40

50

60

70

80

0

90

20

30

40

GC Content (%)

50

60

70

80

90

GC Content (%)

K 社 Stranded

0.05

1 µg
100 ng10 ng

0.05

K 社 Hyper

1 µg
100 ng
10 ng

0.03

0.02

0.03

0.01

0

0

30

40

50

60

70

80

90

20

GC Content (%)

30

40

50

60

70

80

90

GC Content (%)

10 ng、100 ng、1 µg のユニバーサル・ヒト・リファレンス RNA（Agilent #740000）から、4 種類の各社キットを使用して RNA ライブラリーを調製、シーケンスリードをリファレンスゲノ
ムにマッピング、領域 の GC 含量 に 対 するマッピングリード 数 を 調 べた。NEBNext Ultra II
Directional RNA Kit だけがインプット量によらず一定した結果をもたらすことが示された。イン
プット RNA からポリ A-mRNA を単離（NEB は #E7490 を使用）。イルミナ社 NextSeq® 500、ペア
エンド（2 x 76 bp）でシーケンスした。シーケンスリードを hg19 リファレンスゲノムにマッピングした。

分解が進んだ FFPE RNA からも高効率で rRNA を除去してライブラリー調製が可能
40
35rRNA Remaining (%)

30

様々な種類のサンプルを処理しています。これまで

他の RNA-seq キットで問題があった 3 つの植物種について、NEB の Ultra II Directional RNA Library
Prep キットを試してみました。
このキットの 性能 の 高 さと 安定性 には 感激 しまし
た。NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation
Module も 効果的 で、SortMeRNA によって 全 ての植物種で rRNA のコンタミネーションが 2％未満であることが確認されました。
また、RNA 鎖の特異性も 98％と良好でした。この
結果に非常に満足しており、EI Genomics Lab. での生産に向けてプロトコールを自動化しています。

0.02

0.01

20

Earlham Institiute では、植物、微生物、動物 など– Leah Clissold,
Platforms & Pipelines Team Leader,
The Earlham Institute,
Norwich, UK

0.04

Fraction of Reads

0.04

Fraction of Reads

1 µg
100 ng
10 ng

0.04

Fraction of Reads

Fraction of Reads

0.04

I 社 Stranded

Ultra II RNA キットを使用することで、Directional
RNA-seq ライブラリーのインプット量を 10 倍以上削減することができました。現在ではたった 10 ngの高品質なトータル RNA から、1 µg のインプットと同じ遺伝子発現プロファイルを得ることができます。さらに、非常に高い品質のトータル RNA なら、
1 ng までインプット量を減らすことができるようになりました。新しい Ultra II RNA キットにより、微量 サンプルでも RNA-seq を 可能 になったため、ライブラリー調製よりも QC の方が多くの RNA が必要になっています！従来の Ultra RNA キットに比べ、AMpure ビーズのクリーンアップや PCR サ
イクルの削減など、ライブラリー調製プロトコール
が簡単になっています。その結果、高品質なライブ
ラリーをより少ない時間とリソースで得られます。
– Jen Grenier, Ph.D.,
Director of RNA Sequencing Core (RSC),
Center for Reproductive Genomics,
Department of Biomedical Sciences,
College of Veterinary Medicine,
Cornell University

NEBNext Ultra II Directional RNA
K 社 Stranded
K 社 Hyper
I 社 Stranded

25
20
15

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit

1050100 ng

10 ng
Total RNA Input

10 ng あるいは 100 ng の 分解 RNA をインプットとして、4 種類 の 各社 キットを 使用 して、
rRNA 除去とライブラリー調製を行った（human adult normal liver tissue FFPE Total RNA、Biochain#R 2234149. RIN 2.5）。NEBNext rRNA 除去キット（#E6310）と NEBNext Ultra II Directional RNA Kit で調製 したライブラリーが 最 も rRNA の 残存 が 低 かったことから、NEBNext は 分解 が 進 んだ
RNA からも 高効率 で rRNA 除去 ができることが 示 された（n = 3）。 イルミナ 社 NextSeq 500、ペアエンド（2 x 76 bp）でシーケンス、リード中の rRNA の割合を求めた。18S、28S、5S、5.8S、16S、12S ヒト rRNA 配列に 6 または 32 塩基以上マッチしていた場合、そのリードが rRNA とみなした（mirabait 4.9）。

を用いて、得ることが難しい組織からの微量なイン
プット RNA（7 ～ 8 ng トータル RNA）のライブラ
リー調製を実施しました。私は結果に大変満足しております。
– Brian James, Ph.D.,
Genomics Facility Director,
Sanford Burnham Prebys Medical
Discovery Institute13

キット構成品

Ultra II RNA ワークフローとキット構成品

NEBNext ライブラリー調製キットは、キット全体として機能検証をしているだけではなく、各構成品も個別に品質検査を行っている。また構成品は使いやすいように反応ごとに色分けをされている。各反応に使用する酵素とバッファーは、モジュールとして個別販売もしており、柔軟なカスタマイズも可能である。

NEBNext キットと構成品
Input

10 ng – 1 µg

Ultra II Directional Kits

mRNA Isolation/rRNA Depletion

First Strand
cDNA Synthesis

Second Strand
cDNA Synthesis

End Repair/dA Tailing

AdaptorLigation

Size
Selection• Ultra II Ligation
Master Mix• Ligation
Enhancer• Adaptor
Dilution Buffer• NEBNext Sample • NEBNext
Purification
Ultra II Q5
Beads
Master Mix(SPRIselect) –NEB #E7765 only

• NEBNext Sample
Purification
Beads(SPRIselect) –NEB #E7765 only

• End Prep
Enzyme Mix• End Repair
Reaction Buffer• Ultra II Ligation
Master Mix• Ligation
Enhancer• Adaptor Dilution
Buffer• NEBNext Sample • NEBNext
Purification
Ultra II Q5
Beads
Master Mix(SPRIselect) –NEB #E7775 only

• NEBNext Sample
Purification
Beads(SPRIselect) –NEB #E7775 only

Total
Workflow

Clean Up

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep with Sample Purification Beads (NEB #7765)• First Strand Synthesis
Reaction Buffer• First Strand Synthesis Enzyme Mix• Random Primers• Strand Specificity Reagent• Second Strand
Synthesis Reaction
Buffer with
dUTP Mix• Second Strand
Synthesis
Enzyme Mix• Nuclease-free
Water• End Prep
Enzyme Mix• End Repair
Reaction Buffer

Hands-On
27 minTotal
5.5 – 5.7 hrs *6.6 – 6.8 hrs**

NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB #E7770)
NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads (NEB #E7775)• First Strand Synthesis
Reaction Buffer• First Strand Synthesis Enzyme Mix• Random Primers• Strand Specificity Reagent• Second Strand
Synthesis
Reaction Buffer• Second Strand
Synthesis
Enzyme Mix• Nuclease-free
Water

Poly(A) mRNA
Magnetic Isolation
Module (NEB #E7490)

Magnesium RNA
Fragmentation
Module(NEB #E6150)

Ultra II RNA First Strand Ultra II Directional
Synthesis Module
RNA Second Strand(NEB #E7771)
Synthesis Module(NEB #E7550)

NEBNext Ultra II
End Repair/dA-Tailing Module(NEB #E7546)

NEBNext Ultra II
Ligation Module(NEB #E7595)

NEBNext
Ultra II Q5
Master Mix(NEB #M0544)• Oligo d(T)25 beads• RNA Binding Buffer• Wash Buffer• Nuclease-free Water• RNA
Fragmentation
Buffer• RNA
Fragmentation
Stop Solution• First Strand Synthesis
Reaction Buffer• First Strand Synthesis
Enzyme Mix• Random Primers• Strand Specificity
Reagent• Second Strand
Synthesis
Enzyme Mix• Second Strand
Synthesis Reaction
Buffer with dUTP

• Ultra II End Prep
Enzyme Mix• Ultra II End Prep
Reaction Buffer• Ultra II Ligation
Master Mix• Ligation
Enhancer• NEBNext
Ultra II Q5
Master
Mix

rRNA Depletion kit

Ultra II Nondirectional RNA
Second Strand
Synthesis Module(NEB #E6111)

See below list

• Second Strand
Synthesis
Enzyme Mix• Second Strand
Synthesis Reaction
BufferrRNA Depletion kit

14

PCR
Enrichment

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB #E7760)

Ultra II Non-directional Kits
Ultra II Modules

mRNA
FragmentationrRNA Depletion Kit v2(Human/Mouse/Rat)(NEB #E7400, #E7405)

Globin & rRNA
Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)(NEB #E7750, #E7755)

NEBNext rRNA
Depletion Kit (Bacteria)(NEB #E7850, #E7860)

NEBNext RNA Depletion
Core Reagent Set(NEB #E7865, #E7870)• RNase H/RNase H
Reaction Buffer• rRNA Depletion
Solution• Probe Hybridization
Buffer• DNase I/DNase I
Reaction Buffer• Nuclease-free Water• RNA Sample
Purification Beads(NEB #E7405 only)• RNase H/RNase H
Reaction Buffer• Globin & rRNA Depletion
Solution• Probe Hybridization Buffer• DNase I/DNase I
Reaction Buffer• Nuclease-free Water• RNA Sample Purification
Beads (NEB #E7775 only)• RNase H/RNase H
Reaction Buffer• Bacterial rRNA Depletion
Solution• Probe Hybridization Buffer• DNase I/DNase I
Reaction Buffer• Nuclease-free Water• RNA Sample Purification
Beads (NEB #E7860 only)• Probe Hybridization
Buffer• Thermostable RNase H• RNase H & DNase I
Reaction Buffers• DNase I• Nuclease-free Water• RNA Sample
Purification Beads(NEB #E7870 only)

Hands-On
27 minTotal
5.5 – 5.7 hrs *6.6 – 6.8 hrs*** Including poly(A)mRNA isolation** IncludingrRNA depletion

アダプター & プライマー

NEBNext アダプター & プライマー

NEBNext アダプターはウラシルを介したループ状構造を有している。この構造によりアダプターダイマー形成を抑制するとともに、アダプター
ライゲーション効率を向上する。アダプターライゲーション後、USER Enzyme によりウラシル除去とアダプター開環をする。USER Enzyme は
UDG と Endo VIII のプレミックス酵素であり、アダプターライゲーション反応溶液に追添加するだけで簡単に開環する。

NEB アダプターには Read1/2 配列が含まれており、P5/7 配列およびインデックス配列は PCR 中に付与される。この際、シーケンス内容に応じて、シングルまたはデュアルインデックスタイプのプライマーが選択可能である。またプレックス数に応じて、最大 480 プレックス解析が可能な
NEBNext インデックスプライマーから最適なプライマーキットを選択する。
さらに、イルミナ社整列化フローセルタイプのシーケンサーに見られる Index Hopping を解消するためのユニーク・インデックスプライマー

ペアなども取り揃えている。

インデックスプライマー選択チャート

製品番号
分子バーコード付き

Index Hopping 対応
Index 方法

PCR フリー対応
プレックス数
フォーマット

プレミックスシングル・
インデックスデュアル・
インデックスユニーク・デュアル・
インデックス分子バーコード付き
ユニーク・デュアル・
インデックスーーー〇

インデックス・プライマー *インデックス・アダプター **NEB #E7335
NEB #E7500
NEB #E7710
NEB #E7730
NEB #E6609

NEB #E7600
NEB #E7780

ー

NEB #E6440
NEB #E6442
NEB #E6444
NEB #E6446
NEB #E6448

ー〇インデックス・プライマー * インデックス・プライマー *ー

12 プレックス：4 セット
96 プレックス：1 セット
最大プレックス数：ー

8 x 12 プレックス：2 セット
最大プレックス数：

12 x 4 + 96 = 144
バイアル
ー

ー

96 プレックス：5 セット

NEB #E7146〇〇

96 プレックス：1 セット

16 x 24 = 384

最大プレックス数：96 x 5 = 480

最大プレックス数：96 x 1 = 96

バイアル

96 穴プレート

96 穴プレートー* 不完全アダプターを使用。アダプターライゲーションとインデックス付加は別々の工程で行う〇〇** 完全アダプターを使用。アダプターとインデックスは一回の工程で付加される

製品

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（Unique Dual Index UMI Adaptors RNA
Set 1）（NEB #E7416S/L）

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（96 Unique Dual Index Primer Pairs or
96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 1, 2, 3, 4, 5）（NEB #E6440S/L, #E6442S/L, #E6444S/L, #E6446S/L, #E6448S/L）
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（Dual Index Primers Set 1 or 2）（NEB #E7600S, #E7780S）

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（96 Index Primers）（NEB #E6609S/L）

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（Index Primers Set 1, 2, 3 or 4）（NEB #E7335S/L, #E7500S/L, #E7710S/L, #E7730S/L）
NEBNext Adaptor Dilution Buffer（NEB #B1430）

最大プレックス数

容量96 unique pairs

96/384 rxns

96 unique pairs

96/384 rxns

8 x 1296 rxns

96

96/384 rxns

12

24/96 rxns
1 x 9.6 ml

特長• ループ状アダプターにより、ライゲーション効率を向上• ダイマー形成を低減• ライブラリー調製効率を向上• 豊富なオプション– デュアル・インデックスによる最大 384 プレックス
解析– 使いやすいシングル・インデックス（12 プレックス x 4 種類）– Index Hopping を解消できるユニーク・
デュアルインデックスペア（最大 480 プレックス）• 様々なフォーマット
– 小プレックス用のバイアル– 大プレックス用の 96 穴プレート• インデックス・プールのガイドラインを提供• サンプルシートを提供

15

NEBNext Q5 DNA ポリメラーゼ

NEBNext Ultra II Q5 Master Mix

最高レベルの増幅力と最小限の GC バイアスを両立

NGS において、サンプルの配列をエラーや重複なく正しく反映したライブラリーを調製することが重要である。そのためには、ライブラリー
調製最終工程の PCR において、アダプターライゲーション産物を正確かつ均一に増幅する必要がある。多くの PCR 酵素では、GC リッチ領域やリピート配列などの増幅が困難であるため、サンプルを反映したライブラリー調製ができず、時としてシーケンスリード中にエラーが導入されたり、サンプル中の DNA/RNA 量が反映されないことがある。この場合、カバレッジが不均一となり、マッピング時に空白の配列を生じることがある。また正確なトランスクリプトーム解析や SNP 解析ができないことがある。

NEBNext Ultra II Q5 Master Mix（NEB #M0544）はこれらの問題を解消するために開発されたライブラリー調製専用のマスターミックスである。業界最高レベルの正確性と増幅力を持つ Q5 DNA ポリメラーゼをベースとして、NGS 用に最適化された。GC リッチ領域の増幅力の向上や、領域間の均一的増幅性の拡大により、GC 含量などの配列の違いによらず、ゲノム全体を均一に増幅することが可能である。
低カバー領域を含め、ヒトゲノム全領域を均一に増幅
A

I 社製品

No PCR

K 社製品

特長• NGS 専用 Q5 DNA マスターミックス

Ultra II Q5• 最小限の GC バイアスにより、広範囲の GC 領域を
確実かつ均一に増幅• 業界最高レベルの正確性（2）• アプタマーベースのホットスタート機能により、活性化ステップは不要、室温で PCR セットアップ可能

B

製品

NEBNext Ultra II Q5 Master Mix（NEB #M0544S/L）

容量50/250 rxns

ヒトゲノム DNA（NA19240）から各社キットでライブラリー調製とシーケンスを行い、PCR フリー調製
した時とのカバレッジを比較した。結果、NEBNext Ultra II Q5 は他社キットよりもカバレッジの均一性が高く、低カバー領域も深い Depth でシーケンスされた。各社推奨反応条件で調製、イルミナ社 NextSeq 500
でシーケンスした（2 x 75 bp）。各データセット（10X の平均カバレッジ）からランダムに抽出した 42 億
リードを使用して解析、hg19 リファレンスゲノムにマッピング（Bowtie 2.2.4）、各領域のリードをカウントした（bedtools v2.19.1）。

A：ヒトゲノムのシーケンスにおいて、低カバーとして知られる領域（1）の Depth を示す。

B：PCR フリー、旧バージョン酵素（NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix）、最新バージョン酵素（NEBNext
Ultra II Q5 Master Mix）における、低カバーとして知られる領域の検出率（> 10X カバレッジが得られた
リード割合）を示す。

Haemophilus
inﬂuenzae(38% GC)

Escherichia coli
(51% GC)

Rhodopseudomonas
palustris(65% GC)

Coverage (normalized) Coverage (normalized) Coverage (normalized)

幅広い GC 領域で均一なカバレッジを示す
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

0

10

20

30

40
50
60
GC Percentile

70

80

90

GC 含量の異なる 3 種類のバクテリアゲノム DNA（100 ng）から、NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit でライブラリーを調製、イルミナ社 MiSeq® でシーケンス、ゲノムのカバレッジを調べたところ、すべて均一にカバーされていることが示された。GC カバレッジは Picard�s CollectGCBiasMetrics（v1.117）にて計算した。図中、灰色の横線は理論カバレッジ = 1.0 を示す。

16

参考文献：

1. Aird, D. et al. (2011). Analyzing and minimizing PCR amplification bias inIllumina sequencing libraries. Genome Biology 12(2), R18.
2. Popatov, V. and Ong, J.L. (2017). Examining Sources of Error in PCR by
Single-Molecule Sequencing. PLoS ONE. 12(1):e0169774.

ライブラリー定量

NEBNext Library Quant Kit for Illumina

品質の高いシーケンスデータを得るためには、最適な量のライブラリーをシーケンサーにアプライすることが必要不可欠である。特にイル

ミナ社シーケンサーにおいては、正確なライブラリー定量は最適密度のクラスター形成につながる。現在、リアルタイム PCR が最も正確に定量ができると考えられている。NEBNext Library Quant Kit は、最適化された酵素ミックスと、P5/7 配列にアニーリングするプライマーペアを使用することにより、Bioanalyzer よりも正確に NGS ライブラリー量を定量することが可能である。

NEBNext Library Quant Kit for Illumina のワークフロー
Workflow
Time

Kit

Time
Reagent
Preparation

Library
DilutionSet UpqPCR

Data
Analysis

Hands-On
5 min.

10 min.

25 min.

1 min.

10 min.

10 min.

25 min.

60 min.

10 min.

Hands-On
51 min.

Total

Total

5 min.

1 hr. 50 min.

Jurkat (924 bp)

E. coli• Illumina NGS 用ライブラリー定量キット• すべての NEBNext ライブラリーの定量が可能• qPCR により正確かつ高い再現性で定量• 定量用プライマーミックス、サンプル希釈バッファー

Bioanalyzer より高い正確性と再現性で定量
Jurkat (633 bp)

Count on it.

付属• スタンダード DNA 付属（6 種類の濃度）

P. falciparum
NEB
Bioanalyzer

140• ROX 付属（2 種類の濃度）で様々な qPCR 機器に対応

TOOLS & RESOURCES

120

qPCR 結果を入力して簡単に濃度計算ができるオンラインツール配信中：
NEBioCalculator.neb.com

Library Quant (nM)

100
80
60

アプリケーションノートはウェブサイトより閲覧可能：
www.neb.com/E7630

40
20
0

様々なライブラリーを Bioanalyzer と NEBNext Library Quant Kit で定量した結果、Library Quant Kit の方が高い正確性と再現性でライブラリーを定量することができることが示された。定量性はヒト、大腸菌、マラリア原虫をそれぞれ 2 ～ 4 回測定することにより検証した。

製品

容量

NEBNext Library Dilution Buffer（NEB #B6118S）

7.5 mlNEBNext Library Quant Kit for Illumina（NEB #E7630S/L）
NEBNext Library Quant DNA Standards（NEB #E7642S）

100/500 rxns
500 rxns

他社同等品より正確に定量
H. influenzae
E. coli
IMR-90qPCR Quant (nM) qPCR Quant (nM) qPCR Quant (nM)User 1

User 2User 3User 4
NEB

200

KAPA
社
K

100

200

100

200

100

NEBNext Library Quant kit と他社同等製品の定量性を比較した結果、Library Quant Kit の方が高い正確性と再現性でライブラリーを定量することができることが示された。定量性は 4 名の研究者がヒト、大腸菌のライブラリーをそれぞれ 2 ～ 4 回測定することにより検証した。

17

ワークフロー

Small RNA ライブラリー調製のワークフロー
製品

トータル RNA（NEB #E7580）
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina（Set 2）

100 ng ～ 1 µg

（NEB #E7300）
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina（Set 1）

100 ng ～ 1 µg

（NEB #E7560）
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina（Index Primers 1–48）

100 ng ～ 1 µg

（NEB #E7330）
NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina（Multiplex Compatible）

100 ng ～ 1 µg

RNA
App
DNA
RT Primer

1 3'

アダプターライゲーション

5´• トータル RNA を使用 *• 5' P と 3' OH を有する RNA にアダプターを付加

5´

3´

3´

5´

• 5' アデニル化と 3' ブロックされたアダプターを使用

3´ Adaptor
5´ Adaptor
Barcode (BC)5´ App3´

5´ AppP5 Primer
P7 Primer

3´
3´* 予め抽出・濃縮した Small RNA も使用可能、ただし量と精製度が重要

2

プライマー・ハイブリダイゼーション• 逆転写用プライマーがハイブリダイズ• 未反応のアダプターにもハイブリダイズ

3 5'

5´

アダプターライゲーション• 5' アダプターが 1 本鎖 RNA にライゲーション• 3' アダプターとプライマーのハイブリダイズ産物にはライゲーションされないため、ダイマー形成が最小限

4

18

5´
5´

3´

3´
5´

3´
5´

5´

5´

3´
5´

第 1 鎖 cDNA 合成（逆転写）• 逆転写プライマーから第 1 鎖 cDNA を合成• RNase H 欠損型の逆転写酵素を使用、RNA：DNA 鎖は分解されない

5´

3´
5´

3´
5´
3´
5´

5´

5´
3´
5´
3´

5´ App

5´
3´

3´
5´

5´ App
3´
5´

3´
5´
3´
5´

5´ App

3´
5´

3´
5´

5´ App

3´
5´
3´
5´

ワークフロー

5 PCR（増幅と P5/7 & インデックス付加）• 高正確性ポリメラーゼによる増幅– アダプターが両末端に付加したテンプレートを増幅– インデックス（バーコード）を付加

5´

P5
3´

5´

5´

P5
3´

5´

5´

P5
3´

5´

– P5/7 配列を付加

5´

3´

BC P7

3´

5´

BC P7

5´

5´

3´

BC P7

5´
3´

5´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´
3´
5´

5´
3´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

6

サイズセレクション• 以下方法などで目的の Small RNA ライブラリーを精製– ポリアクリルアミドゲル電気泳動の切り出し

3´
5´
3´
5´

5´
3´

5´

3´

3´

5´
3´

5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

– Pippin Prep

– NEBNext ビーズ（SPRIselect など）

19

キット構成品

Small RNA ライブラリー調製のワークフローとキット構成品

NEBNext Small RNA ライブラリー調製はトータル RNA をインプットとして、抽出や濃縮することなく Small RNA ライブラリーを調製することが可能である。またユニークなワークフローによりアダプターダイマー形成が最小限で、6 時間以内に高品質なライブラリーを調製できる。
キットには専用のアダプターとインデックスプライマーが付属している *。
* 15 ページのアダプター＆プライマーは使用できない

ワークフローと構成品
Input

100 ng – 1 µg

3´ Adaptor Ligation

PrimerHybridization

5´ Adaptor Ligation

First Strand Synthesis

PCR Enrichment

NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina（Set 1 NEB #E7300, Set 2 NEB #E7580）• 3´ Ligation
Enzyme Mix• 3´ Ligation Reaction
Buffer（2X）• 3´ SR Adaptor• SR RT Primer• 5´ Ligation
Enzyme Mix• 5´ Ligation Reaction
Buffer（10X）• 5´ SR Adaptor• Nuclease-Free Water• RNase Inhibitor,
Murine• M-MuLV Reverse
Transcriptase（RNase H–）• First Strand Synthesis
Reaction Buffer• LongAmp Taq
2X Master Mix• SR Primer• Index Primers 1–12
（Set 1）• Index Primers 13–24（Set 2）NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina（Index Primers 1-48）（NEB #E7560）• 3´ Ligation
Enzyme Mix• 3´ Ligation Reaction
Buffer（2X）• 3´ SR Adaptor• SR RT Primer• 5´ Ligation
Enzyme Mix• 5´ Ligation Reaction
Buffer（10X）• 5´ SR Adaptor• Nuclease-Free Water• RNase Inhibitor,
Murine• M-MuLV Reverse
Transcriptase（RNase H–）• First Strand Synthesis
Reaction Buffer

NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina（Multiplex Compatible）（NEB #E7330）• 3´ Ligation
Enzyme Mix• 3´ Ligation Reaction
Buffer（2X）• 3´ SR Adaptor

20• SR RT Primer• 5´ Ligation EnzymeMix• 5´ Ligation Reaction
Buffer（10X）• 5´ SR Adaptor• Nuclease-Free Water• RNase Inhibitor,
Murine• M-MuLV Reverse
Transcriptase（RNase H–）• First Strand Synthesis
Reaction Buffer

Size Selection• Gel Loading Dye,
Blue（6X）• Quick-Load pBR322
DNA-MspI Digest• DNA Gel Elution
Buffer（1X）• Linear Acrylamide• TE Buffer• LongAmp Taq
2X Master Mix• SR Primer• NEBNext Index 1-48
Primers for Illumina• Gel Loading Dye,
Blue（6X）• Quick-Load pBR322
DNA-MspI Digest• DNA Gel Elution
Buffer（1X）• Linear Acrylamide• TE Buffer• LongAmp Taq
2X Master Mix• SR Primer• Index Primer 1• Gel Loading Dye,
Blue（6X）• Quick-Load pBR322
DNA-MspI Digest• DNA Gel Elution
Buffer（1X）• Linear Acrylamide• TE Buffer

Total Workflow

Hands-On Time
30 minTotal Time
6 hrs

Hands-On Time
30 minTotal Time
6 hrs

Hands-On Time
30 minTotal Time
6 hrs

シングルセル／微量 RNA ライブラリー調製

NEBNext Single Cell/
Low Input RNA Library Prep

NEB のシングルセル用 RNA ライブラリー調製キットは、シングルセルや微量 RNAからイルミナ 社次世代 シーケンス 用 ライブラリーを 調製 するためのキットである。テンプレート・スイッチング法によりポリ A を有する RNA から完全長の cDNAを 合成、続 いて 断片化 やアダプター 付加 を 行 うため、 ライブラリーは 完全長 のmRNA 遺伝子情報を保持している。
さらに、転写量が少ない mRNA（low Transcripts Per Kilobase Million transcripts）からも確

実にライブラリー調製が可能であるため、高精度のトランスクリプトーム解析が可能となる。

シングルセルまたは微量 RNA から高収量でライブラリー調製

Total Library Yield (ng)

1200

NEBNext Kit
T 社 cDNA 合成キット／ I 社ライブラリー調製キット

How low
can you go?
• シングルセル、または微量 RNA（2 pg ～ 200 ng）からライブラリー調製• わずか 26 分間のハンズオンタイム、
7 時間以内にライブラリー調製– シングルチューブで細胞溶解から cDNA 合成– 2 チューブで合成 cDNA からライブラリー調製• 転写量が少ない RNA からも効率的にライブラリー調製• ライブラリーは完全長の mRNA 遺伝子情報を保持• 様々な哺乳細胞からライブラリー調製• シングルセル（微量 RNA）から cDNA 合成までのモジュールも別途提供

TOOLS & RESOURCES

1000

テクニカルノート公開中：
www.neb.com/E6420

800
600
400

製品

200
0

10 pg
UHR

HeLa
single cell

Jurkatsingle cell

NEBNext Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit
for Illumina（NEB #E6420S/L）*

M1
single cell

様々なサンプルを用いてライブラリー調製を行ったところ、すべてのサンプルにおいて NEBNext Single

Cell/Low Input RNA キットで高いライブラリー収量が得られた。サンプルは Hela シングルセル、Jurkat シン
グルセル、M1 シングルセル、10 pg のヒト・リファレンス RNA（Agilent #740000）を使用した。各サン
プルには推奨量の ERCC RNA Spike-In Mix I（Thermo Fisher Scientific #4456740）を添加した。ライブラリー調
製には NEBNext Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit（#E6420）または、T 社 cDNA 合成キットと I 社ライ
ブラリー調製キットを併用して使用した。エラーバーは N = 6 – 11 の標準偏差を示す。NEBNext キット
では合成した cDNA の～ 80％をライブラリー調製に使用して 8 サイクルの PCR を行った。T 社 cDNA 合成キット／ I 社ライブラリー調製キットではプロトコールに従って 125 pg の cDNA をライブラリー調製に使用して 8 サイクルの PCR を行った。

NEBNext Single Cell/Low Input cDNA Synthesis &Amplification Module（NEB #E6421S/L）

容量24/96 rxns
24/96 rxns

* 別途アダプター＆プライマー（15 ページ）が必要

研究者の声

私の研究室では、公開されている手法をベースに、単一細胞・低インプットサンプルのための独自の RNA-seq プロ
トコールの開発に多くの時間と労力を費やしてきました。数多くのステップを最適化し、トラブルシューティング
する必要があったため、再現性や頑健性に苦労していました。NEBNext Single Cell/Low Input RNA ライブラリー
調製キットを使用することにより、自作プロトコールと比べてライブラリーの品質と再現性が大幅に改善されまし
た。製品マニュアルとドキュメントは非常に分かりやすく網羅的で、品質管理におけるチェックポイントが明確に示されています。性能と使いやすさには非常に満足しています。

– Jon Preall, Ph.D.,
Research Assistant Professor at Cold Spring
Harbor Laboratory and director of the CSHL
Single Cell Sequencing Core.

21

新型コロナウイルス全ゲノム解析

新型コロナウイルス全ゲノム解析用
NEBNext ARTIC 製品

ウイルス 性病原体、特 に 新型 コロナウイルスの 配列決定 のための 高 い 信頼性 と正確なシーケンスに対するニーズに応えるため、NEBNext ARTIC kit が開発された。

NEBNext ARTIC kit は、ロングリードおよびショートリードのシーケンシングに対応しており、ARTIC Network（1）の研究に基づいている。ARTIC SARS-CoV-2 シーケンスのワークフローは、マルチプレックスのアンプリコンによる全ウイルスゲノム
シーケンスである。

• 効率的なプロトコール• 幅広いレンジのインプットに対し、十分なアンプリコン
収量• 最適化 されたプライマープールにより、新型 コロナウイルスのゲノムカバレッジが改善

NEBNext ARTIC Companion Kit には、新型コロナウイルスゲノム RNA の RT-PCR プライ• Illumina と Oxford Nanopore Technologies のシーケンサーに

マーと試薬、および Illumina 社、Oxford Nanopore® Technologies 社のシーケンサーのた対応

めのライブラリー調製試薬が含まれている。また、変異株に最適化されたプライ• Illumina 用のライブラリー調製において、アンプリコンのノーマライズは不要

マーも同梱されている。

最適化された RT-PCR 用のプライマーと試薬により、幅広いコピー数において、均一• 新型コロナウイルスの変異株に最適化されたパフォー
マンス

で十分なアンプリコンが gRNA から得られる。また、ライブラリー調製とシーケン• ビーズ精製をスキップした Express プロトコールも公開

シングは、1 ステップ RT-PCR の後に実施可能である。

Illumina 用のキットでは、NGS ライブラリーのエンリッチメントのために開発された、ハイフィディリティ DNA ポリメラーゼである Q5 DNA ポリメラーゼ試薬により、ライブラリー調製前のアンプリコン濃度の正規化は不要である。2 種類のライ
ブラリー調製キットが利用可能であり、NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit（Illumina）は、酵素を用いた cDNA 断片化ワークフローが含まれており、150 bp 前後のインサート長のライブラリーを生成する。NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Library Prep Kit（Illumina）は、DNA の断片化キットは含まれておらず、ライブラリーのインサート長は 550 bp となる（最新のプライマーセットを使用した場合）。

製品

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Library Prep Kit（Illumina）（NEB #E7650S/L）*

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit（Illumina）

24/96 rxns

（NEB #E7658S/L）*

24/96 rxns

（Oxford Nanopore Technologies）（NEB #E7660S/L）**

24/96 rxns

（NEB #E7626S/L）

24/96 rxns

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 RT-PCR Module* 別途アダプター＆プライマー（15 ページ）が必要

NEBNext ARTIC ワークフロー

ARTIC ワークフロー

cDNA 合成容量** 追 加 で 必 要 と な る Oxford Nanopore Technologies 社 の 試 薬 に つ い て は、
https://international.neb.com/faqs/2021/03/01/which-kits-from-oxford-nanoporetechnologies-do-i-need-for-the-complete-workflow を参照のこと

RNA
DNA

AAAAA 3´

5´

Hexamers and dT primers

3´

5´

5´

cDNA synthesis

3´
3´

5´

3´

5´

Targeted amplification
cDNA 増幅ILLUMINASEQUENCING

3´

5´

Primer Pool 1

3´
5´

5´
3´

OXFORD NANOPORESEQUENCING

Ultra II DNA

Ultra II FS

ONT Companion Kit~550 bp library
PE: 2 X 300 bp~150 bp library
PE: 2 X 75 bp~550 bp library2 – 24 hr run

+
5´

3´

Input:
Viral gRNA

Primer Pool 2

3´
5´

5´
3´

Hands-on:Total:

cDNA
Synthesis

cDNA Amplification(Pool 1 & 2)

Combine Pools, Cleanup,
Quantification/QC

Library Prep
(Illumina/Nanopore)

4 min.
30 min.

5 min.
3 hr. 35 min.

5 – 10 min.
30 – 60 min.

15 min.
3 hrs.

Sequencing&
Data Analysis

プーリング
5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

cDNA input

参考文献：

1. Josh Quick 2020. nCoV-2019 sequencing protocol v2 (GunIt).
protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bdp7i5rn

22

新型コロナウイルス全ゲノム解析
アップデートしたプライマープールと Illumina シーケンサーを用いた、新型コロナウイルスオミクロン変異株のカバレッジ
アップデートプライマー使用

オミクロン変異株の臨床サンプル

NEBNext VarSkip Short v2
NEBNext VarSkip Short
NEBNext ARTIC v3
ARTIC v4.1
ARTIC v4

新型コロナウイルスゲノムのリードカバレッジを Integrative Genome Viewer で可視化した（対数スケール）。NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 プライマープール、NEBNext VarSkip Short
v2 SARS-CoV-2 プライマープール、NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 プライマープール（ARTIC v3）、M 社 ARTIC v4、M 社 ARTIC v4 プライマープール + I 社 ARTIC v4.1 Spike-in プライマーを使用した。ARTIC v3 以外は新型コロナウイルスオミクロン変異株の同一の臨床サンプルからアンプリコンを作製した。NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit（Illumina）を用いてライブラリーを調製し、MiSeq（2 x 75 bp）でシーケンスした。seqtk で 0.5M の PE リードにダウンサンプリングし、新型コロナウイルスのリファレンスゲノム（NCBI, NC_045512）に Bowtie2 でアライメントし、カバレッジデプスを算出した。

アップデートしたプライマープールとナノポアシーケンサーを用いた、新型コロナウイルスオミクロン変異株のカバレッジ
アップデートプライマー使用

オミクロン変異株の臨床サンプル

5 kb

10 kb

29 kb
15 kb

20 kb

25 kb

NEBNext VarSkip Short v2

NEBNext VarSkip ShortARTIC v4.1

ARTIC v4

新型コロナウイルスゲノムのリードカバレッジを Integrative Genome Viewer で可視化した（対数スケール）。NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 プライマープール、NEBNext VarSkip Short
v2 SARS-CoV-2 プライマープール、M 社 ARTIC v4、M 社 ARTIC v4 プライマープール + I 社 ARTIC v4.1 Spike-in プライマーを使用し、新型コロナウイルスオミクロン変異株の同一の臨床サンプルからアンプリコンを作製した。NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit（ONT）を用いてライブラリーを調製し、GridION でシーケンスした。リードは seqtk で 74000 リー
ドにダウンサンプリングし、新型コロナウイルスのリファレンスゲノム（NCBI, NC_045512）に minimap2 でアライメントした。

23

免疫レパトアシーケンス

NEBNext Immune Sequencing Kits
（Human & Mouse）

免疫レパトアシーケンス用ライブラリー調製キット

本製品は B 細胞および T 細胞の免疫レパトアをシーケンスするためのライブラリー
調製キットである。10 ng ～ 1 µg のトータル RNA から B/T 細胞受容体（BCR/TCR）の

可変領域の完全長 cDNA を合成・濃縮して、イルミナ用ライブラリーを調製する。

関連するすべてのコンテクスト（V, D, J 遺伝子部位および抗体アイソタイプの IgM,

IgD, IgG, IgA, IgE）における体細胞変異が高精度でプロファイリングでき、BCR L 鎖、
BCR H 鎖、TCRα 鎖、TCRβ 鎖の解析も可能である。さらにライブラリーには分子バー
コード（UMIs）が付加されるため、PCR バイアスを補正、より正確なプロファイリ
ングが可能である。また、pRESTO ツールに基づいた解析ワークフローが Galaxy 上
で使用でき（ローカルあるいはクラウド）、チュートリアルも公開されているため、初めての方も不慣れな方も安心して解析ができる。

• B/T 細胞受容体（BCR/TCR）の可変領域の完全長 cDNA を
個別または同時に濃縮してライブラリー調製• 生 体 内 の 免 疫 状 態 や 疾 患・ 感 染 に よ る 免 疫 多 様 性（レパトア）の変化の解析、残存病変の検出などに利用• 末梢血単核球（PBMC）や組織由来などのトータル RNA（10 ng ～ 1 µg）からライブラリーを調製• 分子バーコード（UMI）により PCR バイアスを低減、正確な発現解析が可能• データ解析ガイド（pRESTO, Galaxy）を公開

TOOLS & RESOURCES

BCR および TCR の構造と多様性
Heavy chain/TCRβ chain
VD

製品の詳細や各種データ：

www.nebj.jp/re/Immune-Seq

J

C

Heavy chainV

TCRα chain

TCRβ chain

CDR3
Light chain/TCRα chain
V

J

V

J C

BCR

TCR

BCR と TCR の多様性は V（variable）遺伝子、D（diversity）遺伝子、J（joining）遺伝子の組み換えにより生じる。ゲノム上の複数の遺伝子から、各細胞が 1 遺伝子ずつを選択する。これらの遺伝領域が相補性決定領域（CDR3）であり、各 BCR と TCR に特有の CDR3 配列をクロノタイプと呼ぶ。本製品ではこれら BCR/TCR の mRNA ライブラリーを調製する。

24

容量（NEB #E6320S/L）

24/96 rxns

（NEB #E6330S/L）

24/96 rxns

NEBNext Immune Sequencing Kit（Mouse）

C
Light chain

CDR3

製品

NEBNext Immune Sequencing Kit（Human）

DJ C

免疫レパトアシーケンス
NEBNext immune sequencing のワークフロー
5´

D

J

C

AAAAA 3´
3´ TTTTT
5´
Biotin-labeled
RT primer

V
V
cDNA

D
D

J
J

C
C

AAAAA 3´
TTTTT

5´

鋳型非依存的な配列を付加

AAAAA 3´
TTTTT

5´

（ここに UMI とアダプター配列が含まれる）

Reverse transcription& non-templated addition
5´
3´

Template switching

UMI

V
V

D
D

PCR1 (BCR/TCR-specific)

逆転写酵素の機能により cDNA の 3' 末端に

J
J

C
C

RNA の 5' 末端に TSO オリゴをアニール、その相補的 cDNA が合成

Cleanup (with streptavidin beads)

P7 indexprimerBC1
3´（この時点ではまだ濃縮されていない）

Template switchingoligo (TSO)

5´
5´
3´

トータル RNA 中のポリ A-RNA を逆転写

V
RNA

V

D

J

C

TTTTT

BCR/TCR 特異的プライマーと P7 インデックスプライマーで PCR（BCR/TCR プライマーは個別あるいは併用、このステップで濃縮）

5´

BCR/TCRspecific primer
Cleanup (optional qPCR)
PCR2
5´
3´

V
V

D
D

J
J

P5 インデックスプライマーと P7 プライマーで PCR

3´
5´
BC2

C
C
P5 indexprimerCleanup

5´
3´

V
V

D
D

J
J

C
C

3´
5´

5´
3´

V
V

D
D

J
J

C
C

3´
5´

ライブラリーが完成（～ 600 bp）

Final library

分子バーコード（UMIs）による正確なクロノタイプの定量
A. 10 ng T cell RNA

With UMIs
Without UMIs

.007

0.01

.005

Frequency of Replicate 2

Clonotype Frequency

.006

.004
.003
.002
.001
0

Rank

0.01
0.005

0.005

0.002
0.002

0.001

0.001

0.00050.00020.00050.00010.0002R2=0.620.0002 0.0005 0.001 0.002

0.000050.005

R2=0.120.0001

0.001

0.01

Frequency of Replicate 1

B. 100 ng T cell RNA.0020

Frequency of Replicate 2

Clonotype Frequency

.0025

.0015

.0010

.0005

0

.005

.005

.002

.002
.0005

.0005

.0002

.0002

.0001

.0001

.00005.00005.00002

Rank

.001

.001

R2=0.87

.0001

.001

.00002.000010.00001

Frequency of Replicate 1

R2=0.820.0001

0.001

10 ng お よ び 100 ng の T
細胞 トータル RNA から
ライブラリーを 調製 して シ ー ケ ン ス を 行 い、
UMIs の 有無 によるクロノタイプ 頻度 を 比較 した。10 ng の ト ー タ ル
RNA を用いた時にも UMI
によってクロノタイプの 定量 が 可能 となること が 示 さ れ た（ 図 A、With UMIs）。

25

オーダーインフォメーション
RNA ライブラリー調製キット
DirectionalRNA
Non-directional
RNA

Small RNA

Single Cell
SARS-CoV-2
モジュール

RNA

DNA

容量

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina

E7760S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep with Sample Purification Beads

E7765S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina

E7420L

96 rxns

NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina

E7770S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads

E7775S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina

E7530L

96 rxns

NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (Set 1)

E7300S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (Set 2)

E7580S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48)

E7560S

96 rxns

NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (Multiplex Compatible)

E7330S/L

24/96 rxns

NEBNext Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit for Illumina

E6420S/L

24/96 rxns

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Library Prep Kit (Illumina)

E7650S/L

24/96 rxns

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina)

E7658S/L

24/96 rxns

NEBNext NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies)

E7660S/L

24/96 rxns

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 RT-PCR Module

E7626S/L

24/96 rxns

NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set

E7865S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set with RNA Sample Purification Beads

E7870S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)

E7750S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) with RNA Sample Purification Beads

E7755S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat)

E7400S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat) with RNA Sample Purification Beads

E7405S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria)

E7850S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria) with RNA Sample Purification Beads

E7860S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)

E6310S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) with RNA Sample Purification Beads

E6350S/L/X

6/24/96 rxns

NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module

E7490S/L

24/96 rxns

NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module

E6150S

200 rxns

NEBNext Ultra II RNA First Strand Synthesis Module

E7771S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II Directional RNA Second Strand Synthesis Module

E7550S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II Non-directional RNA Second Strand Synthesis Module

E6111S/L

20/100 rxns

NEBNext RNA First Strand Synthesis Module

E7525S/L

24/96 rxns

NEBNext Single Cell/Low Input cDNA Synthesis and Amplification Module

E6421S/L

24/96 rxns

NEBNext Single Cell Lysis Module

E5530S

96 rxns

NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module
NEBNext Ultra II Ligation Module

E7546S/L
E7595S/L

24/96 rxns
24/96 rxns

NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module

E7442S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra Ligation Module

E7445S/L

24/96 rxns

NEBNext End Repair Module

E6050S/L

20/100 rxns

NEBNext dA-Tailing Module

E6053S/L

20/100 rxns

NEBNext Quick Ligation Module

E6056S/L

20/100 rxns

NEBNext Ultra II Q5 Master Mix

M0544S/L

50/250 rxns

NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix

M0543S/L

50/250 rxns

NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix

M0541S/L

50/250 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Unique Dual Index UMI Adaptors RNA Set 1)

E7416S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs)

E6440S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 2)

E6442S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 3)

E6444S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 4)

E6446S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 5)

E6448S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 1)

E7600S

96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 2)

E7780S

96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)

E7335S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 2)

E7500S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 3)

E7710S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 4)

E7730S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Index Primers)

E6609S/L

96/384 rxns

NEBNext Adaptor Dilution Buffer

B1430S1 x 9.6 ml

NEBNext Library Quant Kit for Illumina

E7630S/L

100/500 rxns

NEBNext Library Dilution Buffer

B6118S

15 ml

NEBNext Magnetic Separation Rack

S1515S

24 tubes

アダプターオリゴ

ライブラリー定量キット
マグネティックラック

26

製品番号

製品番号

製品番号

製品番号

製品番号

容量

容量

容量

容量

DNA 用キットは別紙：
NEBNext DNA ライブラリー調製冊子を参照

NEB オンラインツール

NEBNext Selector

オンラインツールを使用すれば、簡単に最適キットを選択可能

NEBNextSelector.neb.com を参照

27

Featured Tools
NEB AR App
NEB

製品資料中のアイコンをスキャンして動画や実験プロトコール、AR ヒントなどを視聴（iPhone®、iPad®、Android ™ 対応）

NEBNext Selector

V1.0

NEBNext Selector で簡単に NEBNext 製品を選択：
NEBNextSelector.neb.com

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ISO 14001

ISO 13485

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Management

Environmental
Management

Medical Devices

Registered

Registered

Registered

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