人工呼吸

特Jpn J Respir Care 2018；35：15-8

集

呼吸不全をきたしうるウイルス感染症

インフルエンザウイルスと呼吸不全―宿主核内システムを標的としたインフルエンザ治療の新たな可能性―
今井由美子
キーワード：インフルエンザウイルス，細胞核，呼吸不全の核外輸送を抑制することによって作用することを見Ⅰ．は じ め に出した。現状の抗インフルエンザ薬は全てウイルスタ

ウイルスは宿主の細胞内小器官を利用して増殖する。

ンパク質を標的としたものであるが、これらの抗インフウイルスが侵入した宿主細胞ではウイルスとの相互作

ルエンザ薬は、急性呼吸促迫症候群（acute respiratory

用からさまざまなシグナル伝達系が動き出し、感染症distress syndrome：ARDS）を発症したような重症型の病態形成につながると考えられる。インフルエンザのインフルエンザ感染症に関しては効果が期待できなウイルスは RNA ウイルスであるが、他の多くの RNAい。興味深いことに、PD1 はマウス重症インフルエン

ウイルスと異なり、ウイルスゲノムの転写、複製は感ザモデルでは、従来の抗インフルエンザ薬（ノイラミ染した宿主細胞の核内で行われる。一方近年、インフニダーゼ阻害薬）と併用すると、発症から 48 時間以降ルエンザウイルスと宿主の相互作用に関して、トランに投与を開始しても、治療効果を示した。これは、宿スクリプトーム、プロテオーム、あるいは RNA 干渉主核内システムを標的とした重症インフルエンザ治療（RNAi）法を用いたデイスラプトームなどのゲノムワの新たな可能性を示唆するものであると思われる。今イドな解析が行われている。しかしながら、DNA、回、インフルエンザウイルスと呼吸不全に関して、宿RNA、タンパク質、その先で機能する代謝物、特に脂主核内システムを標的とした治療の可能性について以

溶性代謝物に関しては、インフルエンザウイルス感染下に述べる。

1 ～ 3）症の呼吸不全をはじめとする病態との関わりは不明であった。
最近私達は、脂肪酸代謝物のライブラリーを用いたスクリーニングと高速液体クロマトグラフィータンデ

Ⅱ．脂肪酸代謝物のライブラリーを用いたインフルエンザウイルスの増殖に関するスクリーニング

ムマススペクトロメトリー（LC-MS/MS）による脂肪酸脂肪酸代謝物の化合物ライブラリーを用いて、イン代謝物の包括的リピドミクス解析を通して、オメガ 3 脂フルエンザウイルス（H1N1/PR8 株）を感染させたヒ肪酸であるドコサヘキサエン酸（DHA）由来の代謝物

ト肺上皮 A549 細胞にライブラリー上のそれぞれの化プロテクチン D1（PD1）がインフルエンザウイルスの増合物を投与し、ウイルス NP タンパク質の mRNA 発現殖を抑えることを見出した 。PD1 はこれまで抗炎症量を指標に、ウイルスの増殖のスクリーニングを行っ作用を有する脂肪酸代謝物として知られていた 。私た。その結果、アラキドン酸（AA）由来の 12-HETE、達は、PD1 は、宿主細胞の核内においてウイルス RNA

15-HETE、ならびに DHA 由来の 17-HDoHE、PD1 が4）

5）

国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
御ワクチンプロジェクト

感染病態制

インフルエンザウイルスの増殖を抑制することがわかった。これらの代謝物の中で PD1 が H1N1/PR8 株ウイ

May 30, 201815Imai Y

ルスの増殖抑制効果が最も強いことがわかった。さらに、PD1 の投与で、強毒型の H5N1 ウイルス（H5N1）の M タンパク質の mRNA の発現、ウイルス価は顕著に低下し、PD1 は強毒型の H5N1 の増殖を抑制した。

Ⅲ．インフルエンザウイルス感染における  宿主 12/15- リポキシゲナーゼ代謝系の寄与

Ⅳ．PD1 の重症インフルエンザに対するin vivo での効果
次に、培養細胞を用いたスクリーニングでインフルエンザウイルスの増殖の抑制が見られた脂肪酸代謝物
に関して、PR8 株ウイルスによるマウス重症インフルエンザモデルを用いて、in vivo での効果を検討した。
12-HETE、15-HETE、17-HDoHE、あるいは PD1 をそPR8 株ウイルスをマウスに経気道的に感染させると、

れぞれ 1μg/mouse、感染 12 時間前と感染直後に静脈ウイルス価は上昇し、呼吸機能は経時的に悪化する。感内投与した。コントロール群は 8 日で全例が死亡した

染 5 日後には、炎症細胞の浸潤、肺出血、肺小硝子膜のが、PD1 投与群では 8 日以降も 40％のマウスが生存し、形成といったヒトの重症インフルエンザ感染症に典型

重症インフルエンザのマウスの生存率が有意に改善し的な肺病理像を示す 。一方で、上記ケミカルライブラた。一方、抗炎症作用を有することが報告されている

リーを用いたスクリーニングから浮上した脂肪酸代謝が、スクリーニングでウイルス増殖の抑制効果の見ら物の多くは 12/15-リポキシゲナーゼ（12/15-LOX）によれなかった代謝物、RvD1、RvD2、LXA4 に関しては、り内因性に生成するものであることから、次に 12/15-マウスの生存率を改善させることはなかった 4）。また、LOX 欠損マウスを用いた感染実験を行った。その結果、2009 H1N1 の経気道感染モデルにおいても、PD1 は有12/15-LOX 欠損マウスは野生型と比べてインフルエン意に生存率を改善させた。PD1 投与によって、感染肺ザウイルス感染による病態の悪化および回復の遅延が組織の炎症性サイトカイン（IL-6、CXCL10、CXCL2）認められた 4）。さらに、この重症インフルエンザのマウやインターフェロン（IFNβ）などの産生には変化がスモデルの肺組織を用いて、AA、DHA、エイコサペン

なかった一方、ウイルスの増殖は PD1 によって有意にタエン酸（EPA）由来の代謝物のリピドミクス解析を抑制された 4）。したがって、PD1 の重症インフルエン行った。肺組織を経時的にサンプリングし、LC-MS/MS

ザ改善効果は、抗炎症作用によるものではない可能性

による質量分析法で、AA-、DHA-、EPA- 由来の代謝が考えられた。

6）

物を網羅的に解析した。その結果、スクリーニングでウイルス増殖の抑制効果を示した 12/15-LOX 系の代謝物、12-HETE、15-HETE、17-HDoHE、および PD1 は、いずれも感染後全経過を通して、内因性代謝物の産生が低下していることがわかった 。
4）

Ⅴ．PD1 によるウイルス RNA の核外輸送の抑制
インフルエンザウイルスでは、ウイルスゲノム vRNA（－）の複製、転写が感染細胞の核内で行われるという次に、病原性の異なるウイルスを野生型のマウスに特徴がある。すなわち、vRNA（－）に宿主細胞から切経鼻感染させ、同様のリピドミクス解析を行った。用いり取られたキャップ構造と poly-A 構造が結合して核内たウイルスは、弱毒型の 2009 年 H1N1 ウイルス（2009で mRNA の転写が行われ、mRNA は細胞質内へ核外H1N1）、強毒型の H5N1、ならびに H5N1 の PB2 タンパ輸送されウイルスタンパク質に翻訳される。また核内ク質の 627 番目のアミノ酸に変異を入れて弱毒化したで vRNA（－）を鋳型に cRNA（＋）が合成され、それウイルス（H5N1 PB2-627E）である。PR8 株ウイルスを鋳型に多数の vRNA（－）が複製される。複製されの経気道感染モデルの結果と同様に、PD1 の産生は、た vRNA（－）はリボ核酸タンパク質複合体（vRNP）

強毒型の H5N1 感染肺では経過中産生の低下を認めた。

を形成して核外へ輸送される 7）。そこで、ウイルスの一方、弱毒型の 2009 H1N1 ウイルスや H5N1 PB2-627E

vRNA ならびに mRNA の動態を調べるために、蛍光

ウイルス感染肺では産生は亢進しており、ウイルスのin situ ハイブリダイゼーション（FISH）法を用いて、病原性と PD1 の産生量に負の相関を認めることがわかウイルス mRNA と vRNA の細胞内局在の変化を経時った 。

的に観察した。mRNA および vRNA は感染後 3 時間

4）から核内での発現が見られ、感染後 5 時間から 8 時間

16May 30, 2018

人工呼吸にかけて細胞質での強い発現に変わっていくことわかとがわかった（図 1）4）。
宿主分子の mRNA の核外輸送には、NXF1 タンパク質が特異的な輸送受容体として機能していることが知られている 8）。私達は NXF1 がウイルス RNA の核外輸送にも関与しているのではないかと考えた。NXF1をノックダウンすると、感染 8 時間におけるウイルス
mRNA および vRNA の核内から細胞質への移行が抑制されることがわかった 4）。さらに、NXF1 のノックダウンでウイルスの増殖が抑制されることがわかった。
また、in vitro RNA ゲルシフトアッセイによってウイルス RNA と NXF1 タンパク質が直接結合することが確認された 4）。したがって、NXF1 はインフルエンザウイルス RNA と直接結合して、ウイルス RNA の核外移行を促すことによって、ウイルスの増殖を促進させていることが示唆された。

3h

Virus vRNA
5h

8hVehicleウイルス RNA の核外輸送が顕著に抑制されているこ

8h

PD1

もに、感染後 8 時間においても核内に留まっていて、Virus mRNA
5hRvD1った。PD1 を投与すると、ウイルス mRNA、vRNA と3h

Jpn J Respir Care Vol.35 No.1

図1‌PD1および RvD1 のウイルス RNA の核外輸送に及ぼす影響

H1N1/PR8 株ウイルスに感染した A549 細胞に vehicle（コントロール）、PD1 あるいは RvD1 を投与した。vehicle ではウイルス mRNA および vRNA ともに 5 時間では核内に留まっていて、8 時間では核外に移行した。一方 PD1 を投与すると、8 時間でもウイルス RNA が核内に留まっていて、ウイルス RNA の核外移行が阻害されていることがわかった。RvD1 を投与してもそのようなウイルス RNA の核外移行の阻害は認められなかった。

Ⅵ．PD1 とノイラミニダーゼ阻害薬と    併用による重症インフルエンザマ
ウスの救命効果

PD1 は NXF1 を介したインフルエンザウイルス RNA

重症インフルエンザの治療の問題点の 1 つは、現在の核外輸送を抑制することによって、ウイルスの増殖を使われているノイラミニダーゼ阻害薬が、感染から 48抑えているのではないかと考え、ウイルス RNA（mRNA、時間以内に投与すると効果があるものの、それを過ぎvRNA）と NXF1 の結合を、NXF1 抗体を用いた RNA 免て投与した場合には、効果がないという点である 9）。

疫沈降法を用いて検討した。PR8 株ウイルスを感染さ

PD1 はウイルスの増殖抑制に関して、ノイラミニダーせ、PD1 を非投与あるいは投与した A549 細胞を用いゼ阻害薬とメカニズムを異にすることがわかったので、て、NXF1 抗体による RNA 免疫沈降を行った。NXF1 抗作用点の異なる両者を併用することによって、感染か体と結合している RNA を抽出し、ウイルス mRNA な

ら 48 時間が経った重症インフルエンザマウスを救命でらびに vRNA の発現量を定量的 RT-polymerase chainきないかと考えた。重症インフルエンザモデルでは、reaction（PCR）法で測定したところ、PD1 の投与で静注用ノイラミニダーゼ阻害薬ペラミビルを単独で感NXF1 と結合するウイルス RNA 量が抑えられることが染 48 時間後に投与すると 65％のマウスが死亡したが、わかった 。さらに、NXF1 抗体と結合している RNA

PD1 とペラミビルを併用すると感染 48 時間後に投与しを用いて、大規模シークエンス解析を行ったところ、ても生存率を有意に改善することができた 4）。これら

PD1 の投与で、NXF1 抗体と結合するウイルス RNAのことから、PD1 は、予防的に投与しても、また感染の減少を認めた（図 2）4）。ところで、NXF1 は宿主の後に治療的に投与しても、重症インフルエンザに対しmRNA の核外輸送に関与していることが知られている。て有効である可能性が示唆された。

4）

そこで、PD1 は宿主の mRNA の核外輸送を抑制するかを検討した。まず、Poly（A）mRNA の FISH 解析をⅦ．お わ り に行ったところ、PD1 の投与でも Poly（A）mRNA の核LC-MS/MS を用いたリピドミクスと化合物ライブラ外輸送は影響を受けなかった 。したがって、PD1 はリーを用いたケミカルスクリーニングを組み合わせる

NXF1 を介したウイルス RNA の核外輸送を特異的にことで、インフルエンザウイルス感染に対して宿主側抑制することによって、インフルエンザウイルスの増の脂肪酸代謝系が防御的に機能するという予想外の事殖を抑えていることが示唆された。

実が明らかになった。このようなメタボロミクスとケ4）

May 30, 201817

Read Depth/Log10（RPM）

Read Depth/Log10（RPM）

Imai YPB2PANPMVehicle
PD1

4.0

4.0

3.0

3.0

2.0

2.0

1.00

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Genome Position/kb

0PB1

HA

0.5 1.0 1.5 2.0
Genome Position/kb

1.02.5

NANS

4.0

4.0

3.0

3.0

2.0

2.0

1.00

図20.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Genome Position/kb

0

1.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Genome Position/kb

PD1 投与がウイルス RNA と NXF1 タンパク質との結合に及ぼす影響H1N1/PR8 株ウイルスに感染した A549 細胞に vehicle（コントロール）あるいは PD1 を投与し、細胞溶解液を用いて NXF1 抗体による免疫沈降を行った。沈降してきた RNA を用いて大規模シークエンス解析を行い、ウイルス RNA をそれぞれのセグメント毎にマッピングした結果を示す。PD1 の投与で NXF1 タンパク質と結合するウイルス RNA 量が全てのセグメントの RNA に関して抑制されていることがわかった。

ミカルバイオロジーを組み合わせたアプローチは、今後、感染症以外にもさまざまな疾患の病態解明や治療戦略にも適用されるだろう。また、新しい創薬標的とし

参考文献
1） Karlas A, Machuy N, Shin Y, et al：Genome-wide RNAi
screen identifies human host factors crucial for influenza
virus replication. Nature. 2010；463：818-22.ても PD1 の強い抗ウイルス作用は大変興味深い。PD1

2） König R, Stertz S, Zhou Y, et al：Human host factors re-はこれまで抗炎症作用を持つことが知られていたが 5）、quired for influenza virus replication. Nature. 2010；463：

今回私達は、PD1 にウイルス増殖の抑制効果のあることを見出した 4）。そのメカニズムとして PD1 は NXF1を介したウイルス RNA の核外輸送を抑制することによって、ウイルスの増殖を抑えていることがわかった。
PD1 がウイルス RNA の核外輸送を抑制するメカニズ
ムの詳細に関しても今後の解明が待たれる。さらに、
PD1 に特異的な受容体は未だ同定されておらず、PD1の作用点や RNA の核外輸送に関わるシグナル伝達経路に関しても今後の重要な課題であると思われる。今回の検討では、感染から 48 時間が経過した重症インフ
ルエンザマウスを、従来の抗インフルエンザ薬と併用することで、生存率を改善させることができた 4）。このことから、PD1 はこれまで救命の難しかった感染から 48 時間以上経過した重症インフルエンザにも効果のある可能性が考えられ、重症インフルエンザの治療薬として有用ではないかと考えられる。
本稿の著者には規定された COI はない。

18May 30, 2018813-7.
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