No.124

高性能 SEC カラム TSKgel® UP-SW3000-LS について
─目次─

ページ
1. はじめに1

2. TSKgel UP-SW3000-LS の基本特性

12 - 1. 充塡剤、カラムの仕様

12 - 2. カラムの分離特性

22 - 3. たんぱく質のカラムへの吸着特性

32 - 4. 光散乱検出器での分析

42 - 5. 測定流速の影響

52 - 6. カラムの耐久性

62 - 7. 充塡剤のロット間差

8

3. 応用例8

4. 光散乱検出器での使用上の注意点

9

5. おわりに

9

東ソー株式会社

1．はじめに

2．TSKgel UP-SW3000-LS の基本特性
2-1．充塡剤、カラムの仕様

抗体医薬品をはじめとするバイオ医薬品は、たんぱく質、核酸、多糖などの高分子を利用した医薬品で、通常

表 1 に TSKgel UP-SW3000-LS の充塡剤の特性、カラの医薬品と比較して分子サイズが大きいことから高分子ム仕様及び既存の TSKgel UP-SW3000 との比較を示し医薬品とも呼ばれます。高分子を利用しているために変ます。TSKgel UP-SW3000-LS は、細孔径 25 nm のシリ性や分解を受けやすい特性をもち、製造工程や保管・輸カゲル表面にジオール基を導入した粒子径 2 μm の充塡送において凝集体やフラグメントなどのサイズバリアン剤を充塡したカラムです。既存の TSKgel UP-SW3000

トが生じ、これらが免疫原性を示す可能性があることもと同様に高い分離性能を示し、抗体の二量体と単量体の指摘されています。そのため、サイズバリアントの含量分離に適していることに加えて、たんぱく質試料の初期は重要品質特性（CQA；Critical Quality Attribute、医吸着が低減され、かつカラムシェディングが少なく光散薬品の品質を保証するために必要な特性または性質）の乱検出器へ容易に適用できます。
カラムサイズは、4.6 mm I.D. × 30 cm の高分離分析

1 つに挙げられており、サイズ排除クロマトグラフィー用と 4.6 mm I.D. × 15 cm の高速分析用があります。

（SEC）が広く用いられています。さらに近年では紫外可視吸光光度検出器（UV 検出器）に加え、絶対分子量や分子サイズが直接評価可能な光散乱検出器を用いることも推奨されています。
今回たんぱく質などの初期吸着を低減し、かつ光散乱検出器への適用が可能な高性能 SEC カラム TSKgel UPSW3000-LS を商品化いたしました。本稿では、TSKgel
UP-SW3000-LS の基本特性と分離例を紹介いたします。

表1

充塡剤、カラムの仕様

品名
カラムサイズ

本カラム

既存カラム

TSKgel UP-SW3000-LS

TSKgel UP-SW3000

4.6 mm I.D. × 30 cm

4.6 mm I.D. × 15 cm

4.6 mm I.D. × 30 cm

4.6 mm I.D. × 15 cm

基材

シリカゲル

シリカゲル

官能基

ジオール

ジオール

粒子径2 μm

2 μm

細孔径

25 nm

25 nm

排除限界分子量（たんぱく質）

800 kDa

800 kDa

10 ～ 500 kDa

10 ～ 500 kDa

分子量測定範囲（たんぱく質）

0.1 mol/L りん酸塩緩衝液 + 0.1 mol/L 硫酸ナト
保管溶媒20 % エタノール水溶液

リウム + 0.05 % アジ化ナトリウム（pH 6.7）又は 0.05 % アジ化ナトリウムを含む緩衝液抗体（二量体 / 単量体 抗体（二量体 / 単量体）
用途/ フラグメント）の高 の高速分析抗体（二量体 / 単量体 抗体（二量体 / 単量体）/ フラグメント）の高 の高速分析

分離分析

分離分析

光散乱検出器での分析

─1─

2-2．カラムの分離特性同等の較正曲線を有していることがわかります。

TSKgel UP-SW3000-LS 及 び TSKgel UP-SW3000 にまた、図 1 における各ピークの分離度（R）を表 2 に、ついて、標準たんぱく質を測定したクロマトグラムの比カ ラ ム の 理 論 段 数 を 表 3 に 示 し ま す。TSKgel UP-

較を図 1 に、標準たんぱく質による較正曲線の比較をSW3000-LS は、既存の TSKgel UP-SW3000 と比べてた

図 2 に 示 し ま す。TSKgel UP-SW3000-LS は 既 存 のんぱく質の分離度が同等であり、理論段数が同等以上でTSKgel UP-SW3000 と同様の分離選択性を有しており、あることがわかります。

751'13
TSKgel UP-SW3000-LS（4.6 mmI.D. 㽢㻌30 cm）

2'1'234454B）

211'33
TSKgel UP-SW3000（4.6 mmI.D. 㽢30 cm）

2'5791113 min

標準たんぱく質のクロマトグラム

図25A）TSKgel UP-SW3000-LS（4.6 mmI.D.㽢30 cm)
B）TSKgel UP-SW3000（4.6 mmI.D.㽢30 cm)

213

図12'5log M

UV 280 nmA）

2164468
溶出時間（min）

1012

標準たんぱく質の較正曲線〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW3000-LSＢ）TSKgel UP-SW3000
カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 30 cm
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム
流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料：1. チログロブリン（MW 640,000）（1'. チログロブリン二量体）
2. γ - グロブリン（MW 155,000）（2'. γ - グロブリン二量体）
3. オブアルブミン（MW 47,000）
4. リボヌクレアーゼ A（MW 13,700）
5. p - アミノ安息香酸（MW 137）

表2カラム性能の比較（分離度 R）
カラム

分離度 R
ピーク 1/2

ピーク 2/3

ピーク 3/4

ピーク 4/5A）TSKgel UP-SW3000-LS

4.05

3.70

4.4312.60B）TSKgel UP-SW3000

4.01

3.46

4.07

10.29

─2─表3

カラム性能の比較（理論段数）
理論段数

カラム

リボヌクレアーゼ A（ピーク 4）

p- アミノ安息香酸（ピーク 5）A）TSKgel UP-SW3000-LS

51,59558,233

B） TSKgel UP-SW3000

43,34048,455

2-3．たんぱく質のカラムへの吸着特性

ブミン：Mw 47,000）を試料とした場合の初期吸着を検TSKgel UP-SW3000-LS の 保 管 溶 媒 に は、 既 存 の証しました。20 % エタノール水溶液で 4 CV（カラム容TSKgel SW カラムとは異なり、20 % エタノール水溶液量）通液したカラムを溶離液に置換した後に試料を連続を推奨しています（表 1）。20 % エタノール水溶液で保10 回注入し、注入 10 回目（プラトー）と注入 1 回目のピー管するメリットとしては、カラム保管安定性の向上やカク面積値を比較することで、カラムへの吸着率を確認しラム内への移動相由来の塩結晶の蓄積防止（カラムシェ

ま し た。TSKgel UP-SW3000-LS、TSKgel UP-SW3000

ディングの増加防止）、アジ化ナトリウム不使用などが及び市販の UHPLC 用 SEC カラムを用い、検証した結挙げられます。しかし、20 % エタノール水溶液で保管

果 を 図 3 に 示 し ま す。TSKgel UP-SW3000-LS は、する場合、試料の初期吸着が発生する可能性が考えられ

TSKgel UP-SW3000 や市販の UHPLC 用 SEC カラムとたことから、低濃度のたんぱく質（チログロブリン：比べて、たんぱく質の初期吸着が低減されていることがMw 640,000、γ - グロブリン：Mw 155,000、オブアル

わかります。

〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW3000-LS20A）TSKgel UP-SW3000-LS（4.6 mm I.D. × 30 cm）

ὀධ1ᅇ┠ ྾╔⋡（%）15Ｂ）TSKgel UP-SW3000
Ｃ）市販 UHPLC 用 SEC カラム

B）TSKgel UP-SW3000（4.6 mm I.D. × 30 cm）

カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 30 cm
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

C）市販UHPLC用SECカラム（4.6 mm I.D. × 30 cm）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム+ 0.05 % アジ化ナトリウム10流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm温度：25 ℃

注入量：10 μL

5

試料：1. チログロブリン（MW 640,000）、0.05 g/L
2. γ - グロブリン（MW 155,000）、0.1 g/L
3. オブアルブミン（MW 47,000）、0.1 g/L

0

図3A

B

C

たんぱく質のカラムへの吸着率

─3─

2-4．光散乱検出器での分析ることがわかります。

TSKgel UP-SW3000-LS 及び市販の UHPLC 用 SEC カ

また、異なるロットの充塡剤を充塡した TSKgel UP-ラムについて、ウシ血清アルブミンを測定したクロマト

SW3000-LS について、ウシ血清アルブミンを測定したグラムを図 4 に示します。TSKgel UP-SW3000-LS は、クロマトグラムの比較を図 5 に示します。いずれのカ

市販の UHPLC 用 SEC カラムに比べてベースラインノラムもベースラインノイズが少なく、ロット間差も小さ

イズが少なく、また、インジェクションピークが観察さいことがわかります。

れないことから光散乱検出器を用いた測定にも適してい

44MALS 90°

1

市販UHPLC用カラム（4.6 mm I.D. × 30 cm）

324A)

012426インジェクションピーク
B）

MALS 10°

インジェクションピーク
B)

14TSKgel UP-SW3000-LS（4.6 mm I.D. × 30 cm）

38101214 min

A）

012Time（min）

図42

市販UHPLC用SECカラム（4.6 mm I.D. × 30 cm）

3462

TSKgel UP-SW3000-LS（4.6 mm I.D. × 30 cm）

38101214 min

Time（min）

ウシ血清アルブミンのクロマトグラム（光散乱分析，製品比較）〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW3000-LS
Ｂ）市販 UHPLC 用 SEC カラム
カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 30 cm
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム
流速：0.35 mL/min

検出：MALS 10°，90°

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料：ウシ血清アルブミン（MW 66,500）
1. 凝集体，2. 三量体，3. 二量体，4. 単量体

─4─

442 3

1 2 3Lot. A

MALS10°Lot.A

MALS 90°

1Lot B

Lot B

Lot C0

図524681012Lot C14 min

02468101214 min

ウシ血清アルブミンのクロマトグラム（光散乱分析，充塡剤ロット間差）〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000-LS
カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 30 cm
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム
流速：0.35 mL/min

検出：MALS 10°，90°

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料：ウシ血清アルブミン（MW 66,500）
1. 凝集体，2. 三量体，3. 二量体，4. 単量体

2-5．測定流速の影響す。一方、分子量の大きいたんぱく質では、測定流速が分子量の異なる 2 種類のたんぱく質（ウシ血清アルブ

低くなるほどカラム効率が向上し、理論段数が高くなる

ミン：Mw 66,500、リボヌクレアーゼ A：Mw 13,700）

ことがわかります及び低分子化合物（p- アミノ安息香酸：Mw 137）におまた、図 7 に測定流速と圧力損失の関係に示します。

ける、測定流速と理論段数の関係を図 6 に示します。拡

TSKgel UP-SW3000-LS（4.6 mm I.D. × 30 cm）は、標散係数が大きい低分子の p- アミノ安息香酸では、測定準流速（0.35 mL/min）では 35 MPa 以下の低い操作圧流速が高くなるほど理論段数が高くなることがわかりまで使用することが可能です。
〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000-LS

70000

カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 30 cm

60000

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム

理論段数

50000

+ 0.05 % アジ化ナトリウム

40000
30000
20000
ウシ血清アルブミン（66,500Da）
リボヌクレアーゼA（13,700 Da）

10000
0

図60.1

0.2
流速（mL/min）0.3

速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料：1. ウシ血清アルブミン（MW 66,500）
2. リボヌクレアーゼ A（MW 13,700）

p-アミノ安息香酸（137 Da）
0流0.4

測定流速と理論段数の関係
─5─3. p- アミノ安息香酸（MW 137）

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000-LS30カラムサイズ：Ａ）4.6 mm I.D. × 30 cm
圧力損失（MPa）

Ｂ） 4.6 mm I.D. × 15 cm
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

20+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム+ 0.05 % アジ化ナトリウム100図7A）TSKgel UP-SW3000-LS（4.6 mm I.D. × 30 cm）
B）TSKgel UP-SW3000-LS（4.6 mm I.D. × 15 cm）
00.1

0.2

0.3
0.4
流速（mL/min）0.5

流速：0.05 ～ 0.50 mL/min

温度：25 ℃

0.6

測定流速と圧力損失の関係2-6．カラムの耐久性の関係を図 8、9 に示します。また、30 cm カラムにてγ - グロブリンを連続注入した場合の 100 回毎のクロマ× 15 cm について、最大使用流速（30 cm カラム：0.35トグラムを図 10 に示します。500 回測定後のカラム性mL/min、15 cm カラム：0.50 mL/min）にて p- アミノ

能やクロマトグラムにおいても顕著な変化は認められ安息香酸を連続測定した場合の試料測定回数と理論段数ず、良好な耐久性を有することがわかります。

120120100100

理論段数維持率（%）

溶出時間維持率（%）

カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 30 cm 及び 4.6 mm I.D.

8060Lot. A
408060Lot. A
40Lot. B

Lot. B

Lot. C20

図80100200300
測定回数400Lot. C
500200100200300
測定回数400500

測定回数と維持率の関係（4.6 mm I.D. × 30 cm）〈測定条件〉
カラム : TSKgel UP-SW3000-LS
カラムサイズ : 4.6 mm I.D. × 30 cm
溶離液 : 100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム流

速 : 0.35 mL/min

検

出 : UV 280 nm

温度 : 25 ℃

注入量 : 10 μL
試料 : p- アミノ安息香酸（MW 137）

─6─

100100
理論段数維持率（%）

120

溶出時間維持率（%）

1208060
Lot. A
408060Lot. A
40

Lot. B

Lot. B
Lot. C

Lot. C
200100200300

400

20500

0100200

測定回数

図9300

400500

測定回数

測定回数と維持率の関係（4.6 mm I.D. × 15 cm）〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000-LS
カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 15 cm
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム
流速：0.50 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：5 μL
試料：p- アミノ安息香酸（MW 137）

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000-LS2300

カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 30 cm

134

測定1回目

250+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム測定100回目

UV 280 nm

200150100

流速：0.35 mL/min

測定300回目

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

測定500回目
4

図 1056789+ 0.05 % アジ化ナトリウム測定200回目

測定400回目

500

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

10 min連続測定時のクロマトグラム（4.6 mm I.D. × 30 cm）

─7─

注入量：10 μL
試料：γ - グロブリン
1. 二量体，2. 単量体，3. フラグメント

2-7．充塡剤のロット間差に示します。各カラムのピーク形状、溶出位置の差が小異なるロットの充塡剤を充塡したカラムについて、標さいことから、ロット間差が小さく製造再現性が高い充準たんぱく質を測定したクロマトグラムの比較を図 11

塡剤であることがわかります。

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000-LS
1'12'

3254

カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 30 cm
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

Lot. A+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム+ 0.05 % アジ化ナトリウムUV 280 nm

Lot. B

Lot. C

流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注入量：10 μL

Lot. D

試
357911料：1. チログロブリン（MW 640,000）

Lot. E（1'. チログロブリン二量体）

13 min2. γ - グロブリン（MW 155,000）（2'. γ - グロブリン二量体）
3. オブアルブミン（MW 47,000）

図 11 標準たんぱく質のクロマトグラム（充塡剤ロット間差）

4. リボヌクレアーゼ A（MW 13,700）
5. p - アミノ安息香酸（MW 137）3．応用例

ピークが分離されていることに加え、ノイズレベルが低

TSKgel UP-SW3000-LS を用いて、ヒト化モノクロー

いことから光散乱分析への適用が可能であることがわか

ナル抗体を紫外吸光度検出器（UV）、多角度光散乱検出ります。また、より高分子量である凝集体は、光散乱検器（MALS）にて測定したクロマトグラムを図 12 に示出器において高い強度で観測されるため、解析が容易でします。各検出器において凝集体、二量体、単量体の各あることがわかります。

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW3000-LS
カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 30 cm

31

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム2LALS 10°

+ 0.05 % アジ化ナトリウムRALS 90°流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm, MALS 10°，90°

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試

UV 280 nm
3

図 124

料：ヒト化モノクローナル抗体（MW 150,000）
1. 凝集体，2. 二量体，3. 単量体

5678910 min

ヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラム

─8─4．光散乱検出器での使用上の注意点
表 4 に検出器として光散乱検出器を適用する際の注意点を示します。
表 4. 光散乱検出器での使用上の注意点
１．使用前の装置洗浄（カラムを接続する前に実施）
装置洗浄に使用する溶液は、使用前に細孔径 0.2 μm 以下のフィルターでろ過をすることをお勧めします。
１）十分に系内洗浄がなされているシステムの場合純水を 30 分以上送液し系内洗浄を実施。
２）古いシステム、系内洗浄が不十分なシステムの場合
シ ス テ ム① 純水を 30 分以上送液② 10 % メタノール水溶液を一晩以上送液③ 純水を 30 分以上送液
１）、２）ともに上記の洗浄を実施した後、溶離液に置換してください。
その後、カラムを接続し平衡化、測定を開始してください。
２．ラインフィルター
ポンプとインジェクターの間に細孔径 0.2 μm 以下のラインフィルターを装着することをお勧めします。
塩を用いた緩衝液を溶離液に用いる場合、溶離液に微生物が発生しやすいため、使用時に調製する

溶離液ことをお勧めします。また、溶離液は調製後に細孔径 0.2 μm 以下のフィルターでろ過をしてから使用することをお勧めします。

試 料 溶 液
カラムの洗浄試料溶液は細孔径 0.2 μm 以下のフィルターでろ過をしてから使用することをお勧めします。
光散乱検出器に接続する前に、溶離液を 0.17 mL/min 以下の流速でカラムボリュームの 4 倍以上送液してください。
送液停止後 5 日以上使用しない場合は、カラム内を水に置換した後、20 % エタノール水溶液（出荷カラムの保管溶媒）に置換して保管してください。カラム内に移動相由来の塩結晶や細菌物質が蓄積すると、光散乱測定時のノイズの増加などにつながることがあります。

5. おわりに以上、TSKgel UP-SW3000-LS について概説しました。
本カラムを用いることにより、抗体の二量体、単量体、フラグメントの高分離を短時間で達成することが可能であり、光散乱検出器を用いた測定に適しています。

─9─

※ “TSKgel” は東ソー株式会社の登録商標です。

バイオサイエンス事 業部
東京本社 営業部
大 阪 支 店 バイオサイエンスG
名古屋支店 バイオサイエンスG
福岡支店
仙台支店
カスタマーサポートセンター（03）5427-5180（06）6209-1948（052）211-5730（092）781-0481（022）266-2341（0467）76-5384〒105-8623〒541-0043〒460-0008〒810-0001〒980-0014〒252-1123

東京都港区芝3-8-2
大阪市中央区高麗橋4-4-9
名古屋市中区栄1-2-7
福 岡 市 中 央 区 天 神 1 - 13 - 2
仙 台 市 青 葉 区 本 町 1 - 11 - 1
神奈川県綾瀬市早川2743-1

お問合わせe-mail tskgel＠tosoh.co.jp
バイオサイエンス事業部ホ－ムペ－ジ https://www.separations.asia.tosohbioscience.com/
3206SB- 品番0000000
3101SB品番0994151 A