深部組織イメージング／神経科学

高速 ､ 深部組織イメージングの散乱制御
バーバラ ･ ゲフベルト
事前に組織散乱を抑えるために ､ 検出範囲の拡大と再構成計算を組み合わせる新しいアプローチで ､ 組織深部構造の高品質の広視野画像が可能になる ｡
組織散乱は ､ 励起光と放出光の両方動的に組織散乱に対処する包括的方法

ング共焦点顕微鏡は ､ ピンホールを使を曲げることでイメージングを劣化さである ｡｢ われわれは適応光学（アダブって空間的に散乱放出光をフィルタリせる（図 1 ）｡ 生物組織は ､ 不均質媒質

ティブオプティクス）を提案した ｡ 励起

ングすることで深度を強化する ｡ 散乱であり ､ ランダムに光を散乱させる（ 1 ）。

光に悩まされる散乱を克服するためでを減らすより動的で直接的な方法は、

また ､ 強い後方散乱では ､ 励起光は組ある ｡ また ､ 再構成計算が放出光の散長波長の光を使うことである ｡ レイリ

織に浸透する力が制限される ｡ 散乱が乱信号を利用できるようにするためでー散乱が ､ 波長の 4 乗として反比例変少ない状況でさえ、イメージングパフある ｣とコン氏は説明している ｡

化することを考慮する ｡ 多光子顕微鏡

ォーマンス ､ 焦点の歪みやクロストー

コン氏は ､ 精密機器学部の准教授で（ MPM ）では ､ 近赤外光を使い ､ 非線クによって劣化する ｡ このため ､ 散乱あり ､2018 年 に MIT Technology Re

形光学効果に基づいて信号を励起すに対処する目的で多くの方法が提案さ

view で“ Innovator under 35 ”として認る。これが散乱を弱める ｡ 非線形効果れてきた ｡ 神経科学では ､ 究極目標は、められた ｡ これは ､ 同氏のチームのシは ､ 局所的励起を確実にする ｡ 従って、脳深部に高速で ､ 高品質の画像を生成

ステム開発を対象にしただけでなく、非デスキャン検出における発光のクロすることである ｡

同氏とその同僚が ､ そのイノベーショ

ストークをなくする ｡ しかし ､ 多次元中 国 精 華 大 の リ ン ジ エ・ コ ン 氏

ンを複製し ､ 適用しようとしている世

レーザスキャニングの必要性がイメー（ Lingjie Kong ）の研究室は ､ 多くの新界中の神経科学研究室に提供しているジング速度を遅くする ｡

しい神経イメージングツールに関わって支援もたたえられている ｡

おり､最新のものは､適応補償技術と計算を組み合わせた拡張検出である。他のアプローチと違い ､同氏のツールは ､顕微鏡からスタート
パッシブアプローチ ､ レーザスキャニ

aTMFP

yx

2020.1 Laser Focus World Japan（ LTFM ）は有望である ｡ 強い軸閉じ込めを維持しながら高速イメージングができるからである（ 2 ）。LTFM では ､ 励
図１ 均質媒質からのコリメートビー
ムの光線が散乱組織の中に進む、混濁媒質における光散乱 ｡ 光は ､1 TMFP（平均自由行程）進んだ後 ､ 拡散する ｡
蛍光体から出た光の光線が散乱組織に進む様子は（ b ）に示した ｡（提供：リンジエ・コン氏）

bMFP40

ラインスキャニング時間集光顕微鏡

dFxz

b10mdx10ymm

Sys em

1501002m

400

48mfF300

Sys em

200
10000b2e03am

F

200

500

Sys emy010250

F2xc

Sys em

強度 a. .

b

強度 a. .

a12cm

302dy
GTx

WD1.0
強度 a. .

EDfGTWDCSD
ED

0.80.
0.40.2001xe231.0
強度 a. .

eCSD

GTWDCSD
ED0.80.
0.4

図２ 励起光の組織散乱抵抗を示している。
Cx3Cr1-GFP マウスの 25μm 厚画像スタッ
クの Z 軸に沿った最大値投影法を含む ｡ 画像
は、（ HSSCAC; [a] ）を利用して得た ｡ また、
18μm 厚 x-z スタック y 軸に沿った MIPs（[a]に破線枠でマーク）は完全補正で撮った（左 ､サンプルと光学系誘起波面歪の両方を補償）､およびシステム補正（右 ､ 光学系誘起波面歪のみを補償）;（ b ）に示されたラインに沿った強度プロファイルは ､（ c ）に示している ;（ a ）の破線ボックスによってマークした測域の拡大図、（ d ）の完全補正（上）とシステム補正（下）;（ d ）に示したラインに沿った強度プロファイルを（ e ）に示している : また対物レンズの瞳裏の補償波面は（ f ）に示している ｡（ Ref.4 から採用した ､ リンジエ・コン氏提供図）

図３ 数値シミュレーションは、拡張検出と他の時間的集光イメージング技術の比較を可能にし、神経構造（ a ）画像のグラウンドトルース（ GT ）を見せてくれる。広視野検出（ WD ）で得られた画像、共焦点スリット検出（CSD）、提案された拡張検出（ ED ）、それぞれ（ b-d ）である。また、（ b ）で破線に沿った x 軸と y 軸強度プロファイル - シミュレーションは、WD は両軸（e-f）
でぼやけることを示している。CSD
は、x 軸に沿ったぼやけを低減できるが、y 軸沿いでは微細構造細部の維持ができない。一方、ED は、両方向で細部を回復できる。
（提供：リンジエ・コン氏）

0.200102030
xe4050発光

起光は､軸に沿って空間的に集光する、面歪が計測され、次に補償波面が ､ 空

一方パルス分散は他の軸に沿って変調

間光変調器のような能動素子により励

特に広視野検出モードでは ､LTFMされる ｡ これには ｢ 時間集光 ｣ 原理を起光に適用される ｡ これにより回折限は ､ 組織散乱によって引き起こされる使って、深さ解像度を保証する ｡ 点ス界焦点が回復される｡特にLTFMでは、放出光のクロストークに悩まされる ｡

キャニングと比較すると ､ラインスキャ

波面補償は空間的次元とスペクトル的レーザスキャニング共焦点顕微鏡と同ニングは ､イメージング速度を１ケタ以次元の両方で必要とされている ｡

様、LTFM は、共焦点スリット検出を｡とはいえ ､最大深度を精華大の技術は、ハイブリッド空間ス使える。そこでは、共焦点スリットが達成するには ､LTFM における組織散

ペクトルコヒーレント適 応補償（ HSS

ライン形状励起と対になっており、空乱は ､制御されなければならない。

CAC ）と言われ ､LTFMで波面歪を完全間的に散乱光をフィルタで除去し、イ補償するように設計されている 。研究メージング深度が改善される。そのよ者は、シミュレーションと実験の両方をうな技術は、励起ライン間の散乱で引利用して､グローバル最適補償回収で、き起こされる黒ストークに効果的に対点歪 ､ 励起効率低下に ､ また光学分解

HSSCACアルゴリズムの性能を評価し処できるが、励起ラインに沿った黒ス能やイメージング深度低減になる ｡ 適

た｡HSSCACにより､励起光の軸閉じ込トークには耐性がない。

応光学（ AO ）は ､ こうした制約への対めが維持された､これは励起光の散乱を処に役立つ ｡AO では ､ サンプル誘起波克服する力を示唆している（図 2 ）｡

上改善できる

（3）

（4）

励起光
励起光の組織散乱は ､MPM では焦従って、精華大の研究者は、より深い検出のために共焦点スリットを除去
Laser Focus World Japan 2020.141

深部組織イメージング／神経科学

z130

m

10LTFM

ED-LTFMm

1001mm

図４ ED-LTFM で、生体内生物動力学の深部イメージング。30μm 画像スタックに沿った一連の小グリア細胞の時間カラーコード最大値投影法。
スタックは、従来の LTFM
（ a ）と ED-LTFM（ b ）で取得した。（ Ref. 5 から、リンジエ・コン氏提供図）

し、計算による再建を行うことを提案れたイメージング深度のパフォーマン入深さは、利用できるレーザで制限さした。このアプローチは、拡張検出スを評価した。Thy1-YFP マウス脳のれる。研究者の報告では、約 200μm

LTFM（ ED-LTFM ）と言われ、明らかニューロンを撮像し、Cx3Cr1-GFP マでイメージングしているが、理論的にに、初の広視野 2 光子イメージング技

ウス脳のマイクログリア（小膠細胞）のは最大深度は、点スキャニング 2 光子術である。これは、散乱フォトンから動的イメージングを行った（図 4 ）。

顕微鏡の深度に一致する（これまでの低繰り返しレート、高パルスエネル

ところ約 1000μm ）。3 光子励起では、。2D で各ラインの画ギーでフェムト秒レーザを適用すると、もっと深く組織侵入が達成できると研像 を連 続 的 に取 得 することで、ED-低い信号対雑音比（ SNR ）を維持しな究者は考えている。

LTFM は、散乱した信号も散乱しないがら、イメージング深度強化が可能で信号も、すべて完全に記録する。EDある、と研究者は見ている。

信号を抽出し、イメージング深度を効果的に深める（5）

技術のアプリケーションに続いて、研究者たちは再構成計算を利用して、取限界を押し広げる

点スキャニング MPM と同様、基本的イメージング深度限界（ 6 ）は、究極的には表面近傍蛍光に寄与する。これは焦点変調で最小化できる（ 7 ）。

得した画像スタックを忠実に再構成し研究チームの成果は、統合された

上述の統合戦略は、散乱組織のイメた。また、アーチファクト低減にはヘ

HSSCAC と拡張検出ベース計算イメーージング深度の限界をさらに押し広げッセ正則化法（回帰の 1 形式）を取り込ジング技術の能力が、励起光と放出光る。また、脳の深部の信号を高速分解む。数値シミュレーションの示すとこの両方の、組織散乱の影響を最小化すする能力は、神経結合や機能マッピン

ろでは、従来の LTFM と LTFM ベーることを実証している。その方法の侵グの研究を促進する。

ス共焦点スリット検出の双方と比較して、ED-LTFM はパフォーマンス改善を示している（図 3 ）。
研究者は、トランスジェニック（遺伝子組み換え）マウスの脳で、生体内深部イメージング実験を通じて強化さ

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LFWJ

422020.1 Laser Focus World Japan