トランスレーショナルリサーチ／顕微鏡法

リアルタイム生検を目指す
マルチモーダル顕微鏡法
エルベ・ラインオルト、アルベルト・ロンバルディーニ、ダリル・マコイ、マルコ・アリゴーニ
中空コアファイバが伝搬するナノ秒レーザ光ががん診断を加速させる

スの構造を詳細に見分けることができ、がんやそのほかの重篤な疾患に存多種類のがんの診断や治療の初期における重要なステップが組織生検だ。
現在のスタンダードでは、組織サンプルは外科的に採取され、顕微鏡的分析ムな組織病理学的診断や手術ガイドの可能性を切り開くものだ。

在する異常を認識できるようになる。
この手法の大きな欠点は、手術によるサンプル採取から診断まで少なくと生検の情報も数日を要することだ。これは、検査のために病理学のラボに送られるた組織病理は、疾患を示す異常を同定結果が陽性だった場合に治療が遅れるめ、数日間を要する。たとえば、内視するために、顕微鏡下で組織サンプルことを意味する。さらに、もし腫瘍や鏡検査中のようにその場で組織を分析を分析するプロセスである。組織病理

組織を外科的に切除する必要がある場するようになれば、大きな利点となる学的なイメージングプロセスは強固に合、従来の手法では複数回の手術を患のは明らかだ。しかし、ラベル標識な確立されている。採取された組織サン者に要求することになる。これはさらしに遠隔操作を行い、必要なコントラプルは構造を安定化させるためにホルなる遅れにつながり、治療コストが増

ストと解像度をもつ切片イメージを得マリンで化学的に固定され、続いて脱大し、また外科的治療の対象とならなることには数多くの課題がある。

水され、パラフィンろうに埋め込まれい患者では課題になり得る。

だが近年、仏フレネル研究所（Institutる（固定やろう処理では、代わりに凍Fresnel ）の研究者が、即時利用可能結処理もよく行われている）。サンプなフェムト秒レーザと組み合わせ、ダルはその後、慎重に薄くスライスされ、ブルクラッド中空コアファイバを基に細胞核や細胞質、コラーゲン、抗原にこれらの限界は、組織病理学によるしたユニークな内視鏡検査を用いるこ

特異的に結合する複数の色素またはラ情報と同じものを手術中のイメージンとで、高解像度なマルチモーダルイメ

ベルで染色される（膨大な数のカスタグで得ることができれば解決できるかージングを実行できることを示していマイズされた抗体も使われる）。

もしれない。この目標に達成できるイマルチモーダルな非線形イメージングる。この研究は、手術中にラベルフリ

この組み合わせによって、組織病理メージング法にはさまざまな性能が求ーなイメージングを行い、リアルタイ

学者は細胞体や核、細胞外マトリックめられる。この手法は、色素や蛍光ラベルを用いずに、光学的な切片（ラボCARS SHG

TPEF

PMT

PMT

PMT

71 mm
4.2 mmレーザOPO

小型対物レンズ

ポンプ
800nm
中空コアのストークス 1040nm
ダブルクラッドファイバ
金属ハウジング

圧電チューブ40

ガラス微小球2018.9 Laser Focus World JapanFOV
320 µm

図１ フレネル研究所の研究者が開発するマルチモーダル内視鏡のコンセプトには、典型的な渦巻きパターンで小型の対物レンズを走査する圧電チューブアクチュエータがある。この図に基づくシステムは、高解像度なマルチモーダルイメージングを実行する。リアルタイムで手術中のラベルフリーなイメージングに向けたステップとなる。

で行われる物理的なミクロトーム切片に似せたもの）を実現し、形態を強調するためさまざまな種類の組織成分を識別できるものでなければならない。
また、内視鏡のマニュアルポートと互換性があり、リアルタイムイメージング性能を有する必要がある。
リアルタイムに光学切片（すなわち 3次元イメージング）を実施する必要性から、共焦点または非線形顕微鏡法を使用することになる。内視鏡と互換性

のある共焦点デバイスはすでに存在す

a)b)

るが、共焦点のイメージングで組織病理学的なスクリーニングに必要な情報をすべて得るためには、一般に蛍光色素やラベルが必須である。これにより、高解像度でラベルフリーなイメージングが可能な唯一の適切なツールとして、超高速のレーザパルスをもつ非線形顕微鏡法が候補に残る。
多くの非線形顕微鏡法が利用可能で200 µm200 µm

図２ (a) フェムト秒パルスの効率的な伝送と、非線形シグナルの回復を可能にするダブルクラッドの中空コアファイバの断面図。(b) 同じファイバの先端に 30μm のシリカビーズを埋め込んだもの。

あるなかで、二光子自己蛍光（ TPF ）は悪化する。

励起、第二高調波発生（ SHG ）、誘導長を手早くもたらす。研究者の証明でラマンによる一部のものが、ラベルフは、調整可能で多重波長のレーザシス

これらの問題を回避するため、研究リーなイメージングに最も活用できる

テ ム（米 コ ヒ レ ン ト 社 [Coherent] の者は、時間特性とスペクトル特性の大とされている。これらの手法は特異性

Discovery ）を用いる。これは、イッテきなひずみが発生せずに、CARS に必も有する。コヒーレント反ストークス

ルビウム（ Yb ）ファイバレーザ増幅器と、要な 2 つの同調パルス列を伝送できるラマン散乱（ CARS ）と誘導ラマン散乱統合された調整可能な光パラメトリック

中空コアファイバを設計、製作した。

（ SRS ）は、脂質とタンパク質をイメー発振器（ OPO ）がベースになっている。

これは、石英より1000 分の 1 の非線形ジングできる。十分なスペクトル解像

この統合されたワンボックスシステムで計数をもつ空気で満たされたコアの中度を有するため、ラマンイメージングはは、2 種類の同調した超短波の 80MHzを、2 つのパルス幅が伝送するためだ。

脂質（=CH2 の振動）とタンパク質（ -CH3の パ ル ス 列 が 生 じ る。 す な わ ち、加えて、群速度分散（ GVD ）が非常にの振動）を原理的には識別できるだろ

CARS のポンプ波長として機能するよ小さく（全伝送ウィンドウで 5fs/nm/mう。その一方で、SHG はコラーゲン、う800nmに調整された100fs パルスと、以下）、そのため、1m のファイバ長をすなわち細胞外マトリックスを良質にストークス用の 1040nm の 140fs パル伝送するときの 150fs 以下のパルスのイメージングできることが証明されてスだ。これらの波長の違いは、炭化水

時間的広がりはわずか数フェムト秒でいる。

素（ CH2 と CH3 ）結 合（〜 2888cm ）のあり、ほぼ無視できるものとなる。

それゆえ、2 つのコヒーレンスラマ
ン波長と SHG イメージングを組み合わ-1

CARS イメージングに理想的だと考えられている。

ファイバの NA を修正するせることで、細胞体、核、細胞外マト内視鏡との互換性のため、これらフリックスすべてを必要な解像度で明確ェムト秒パルスの伝送には、高解像度ンズで終端する 4 分割された圧電チュに識別できるイメージを取得できるだに必要なパルス形状を保ち、小さいビーブにファイバの先端が結合する。一般

ろう。さらに、2 つのレーザ波長を組ームウエストを可能とするよう、単一的な渦巻きパターンで共鳴的に圧電チュみ合わせることで、3 種類のイメージモードファイバが必須である。従来のーブをドライブする（図 1 ）。空芯は反射すべてを生成できるだろう。

石英ファイバでは、単一のフェムト秒係数がほぼ 1 であるため、単一モード操パルス列で高い忠実性をもちながら伝作に対して比較的大きくなければなら播することは、色分散や自己位相変調、ない（たとえば、単一モードのガラスフ

フレネル研究所の研究者は、3 つのソリトン発生などの問題があるため重ァイバの数μm に対して 20μm ）。組性能をもつ実用的かつ実行可能な内視大な課題となる。波長が 2 種類あるこ織ではサブミクロンに落としてレーザ鏡ツールを示している。

短パルスと中空コア

イメージ走査のため、小型の対物レとで、サンプルシグナルを弱める石英パルスをイメージする必要があり、こ即時利用できるレーザ源は、スペクガラスそのものからの強い誘導ラマン

れには 20 倍の顕微鏡の対物レンズを使

トル幅の広いコヒーレントラマンに必バックグラウンド（ 4 波混合 [FWM] ）をう縮小が必要になる。しかしこれは、要な分割ポンプとストークスパルス波含む、多くの非線形効果によって問題ファイバの先端の走査範囲、つまり視Laser Focus World Japan 2018.941

トランスレーショナルリサーチ／顕微鏡法ーバーラップを意味するが、微小球にズムによって可能になる。その結果生

お け る も の で は な い。 こ れ に よ り、じる広い伝送ウィンドウによって、こFWM バックグラウンドの発生を回避のファイバは、脂質で見られる高周波する。

（〜 2888cm-1 ）の CH2 結合の振動をターゲットとする CARS に理想的なもの高効率のシグナル収集となる。

CARS と SHG シグナルを効率よく収ある程度の分散はカゴメファイバの集し、フィルタと光検出器があるコン伝送中に発生する一方で、リターンシトロールユニットに、ファイバに沿っグナルにはほぼ影響がない。最も重要て逆向きに伝送することにも課題があなことは、空気の穴に囲まれたハイイる。標準的な中空コアでは、伝送がンデックスのクラッディングが、ファ700nm 以 下 に 制 限 さ れ、CARS とイバの有効開口数（ NA ）を 0.6 まで増SHG シグナルの収集が阻害される。そ加させる。これは標的組織からの後方野を意味するが、同じ 20 倍の縮小率のため研究者は、カゴメ格子配列と呼散乱シグナルを高効率に収集するのにに狭くなる。

ばれる六角形の穴で囲んだ空芯の中心十分だ。

5 µm

図３ ガラスカバースリップにランダムに配置された 2μm のポリエステルビーズを描写した高コントラスト CARS イメージ。

ファイバの先端にある直径 30μm のに、カスタマイズしたダブルエアクラ

ガラス微小球は、直径 1μm 以下のスッドファイバを設計した（図 2 ）。このポットに出力モードの焦点を合わせるタイプのマルチセルのファイバ格子は、ほかのシステムの詳細も、簡単に述ものであり、解像度と視野のトレード超短波の光パルスを効率よく伝送し、べるに値する。図 1 に示すように、内オフに対処する。20 倍ではなく 1.5 倍ロスを減少するということが知られて視鏡システムの先端のコンポーネントの対物レンズを使うことで、効果的ないる。カゴメファイバ格子の中心に光である中空コアファイバ、圧電走査チ走査範囲（現在の設定で直径 320μm ）を閉じ込めることは、光バンドギャッ

ューブ、小型対物レンズは、外径がちでわずかな減少に留めている。重要なプによるものではなく、クラッドモー

ょうど 4.2mm の薄い金属保護ハウジことは、超短波のパルスを使用するこドとガイドされるコアモードとの間のングで覆われている。先端のヘッドはとは、サンプル上におけるパルスのオ結合が抑制されることに基づくメカニ

十分に小さく、多くの従来型内視鏡のシグナル検出とサンプル描写ユーザーが使うチャネルに挿入できる。
a)

内視鏡のもう一端は、CARS、SHG、c)

TPF に基づいて同時にイメージデータを記録するよう設計されている。これ
らのシグナルがファイバを通じて逆向きに伝送された後、3 つの光電子増幅管（ PMT ）によって検出される前に、50 µm

スペクトル的に 3 つのチャネルに分割され、一連のダイクロイックミラーとb)

バンドパスフィルタによってフィルタされる。
内視鏡の光学パラメータを評価するため、研究者は CARS を用いてガラスカバースリップにランダムに配置され50 µm

50 µm

図４ ガラスカバースリップにランダムに配置された 2μm のポリエステルビーズを描写した高コントラスト CARS イメージ。

42

2018.9 Laser Focus World Japanた 2μm のポリエステルビーズを記録した（図 3 ）。テストイメージの結果によって、内視鏡はファイバ中の非線形バックグラウンド効果なしに CARS イでイメージを転送した。SHG イメージ

もし =CH2 と -CH3 の CARS シグナル

メージ を 得 ら れ る こ と が 示 さ れ た。

も 800nm パルスのみを用いて取得し、を分解できるほどの画像の実現に成功

CARS イメージの平面の xy の点広がりより高い xy 解像度（ 0.8μm ）だった。

できれば、この設計に基づくマルチモ関数（ PSF ）は、xy 面で 1μm、z 方向で 7.7μm と推定された（ 1μm のポリ臨床の可能性

ーダル顕微鏡は、従来のラボの生検に匹敵する画像を手術中に、リアルタイ

図 4 に、平均数秒かけて同時に取得ムで届けることができるかもしれない。

研究者はその後、CH 振動の周波数した SHG と CARS イメージをマージしこの性能は次に、患者ケアに大きなプで高い CARS コントラストをもたらすた例を示す。この結果により、マルチラスの影響を与えるだろう。のに十分な量の脂質を含む、脂肪が多モーダル内視鏡コンセプトはヒト組織

いヒトの結腸組織のフレッシュな（生の複雑な形態学的構造を明らかにし、検した）サンプルを用いて、さまざま脂質とコラーゲンファイバが豊富なゾなイメージを取得した。この組織は、ーンの間に明確な区切りを強調できる暑さ 1mm のスペーサーを用いて 2 つのことが示される。さらに、系統的テス

ガラスカバースリップの間に水とともトによって、イメージング中に伝送フに入れ、内視鏡プローブの前面に垂直ァイバをハンドリングすること（動かすに設置した。取得時間はわずか 0.8 秒など）は、画質に影響しないことが示で、生検目的に適したシグナルノイズされた。

エステルビーズのイメージによる）。

著者紹介
エルベ・ラインオルト（ Hervé Rigneault ）は
CNRS とフレネル研究所のリサーチディレク
ター、アルベルト・ロンバルディーニ（AlbertoLombardini ）はフレネル研究所の研究者、ダリル・マコイはコヒレント社の製品マーケティ
ングディレクター兼製品ラインシニアマネー
ジャー、マルコ・アリゴーニは同社のマーケティングディレクターである。
e-mai：darryl.mccoy@coherent.com
LFWJ
URL：www.coherent.com.

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