バイオイメージング／照明

固体照明の最適化、光源から試料面へジャスミン・シェーファー、イアン・ジョンソン、クラウディア・ジャフィ
ライトエンジンからの光子が顕微鏡の試料面に向かう途中で失われる場合、ルを生成するために必要な放射束密度光路を追跡して障害点を探索しよう。

は 2 倍、すなわち 750nm（2 × 375nm）となる。その結果、赤色スペクトル領蛍光顕微鏡では、さまざまな固体技ーネントによる寄与を用心深く検討し域（ 635/22nm、表の右端の列を参照）

術を用いた高度なライトエンジンがまなければ、真に問題を解決することはでは、より低い放射束レベルとなり、すます使用されるようになっている。

できない。

蛍光顕微鏡という状況下では想像よりこれらの光源の設計は、水銀やメタル固体ライトエンジンから顕微鏡の試料ハライドアークランプの大きな制限を面への光スループットの段階的な分析を表１に示される放射束レベルは、従克服し、これら初期の照明オプション表に示す。10 倍対物レンズ（位置 5A ）来の広視野蛍光顕微鏡では十分すぎるをはるかに超える優れた性能を実現しを用いた試料面で測定された放射束はほどではあるが、改善する機会は存在ている。固体ライトエンジンは高いシ15 〜 50mW/mm の照射量に対応してする。そうした改善は、2 つの主要なグナルノイズ比（ SNR ）と分解能をもたおり、これは広視野蛍光顕微鏡に必要アプリケーション要件に向けられていらし、検出限界も低く、蛍光顕微鏡アな範囲内（1〜100mW/mm ）である。

る。第一に、SNR を損なうことなく、22も影響は少ない。

プリケーションにおける感度と安定性、蛍光顕微鏡アプリケーションでは、より短い時間でより多くの画像を取得

さらにはデータ品質、寿命、コスト削

一定量の蛍光放射が発生するのに必要するため、カメラの露出時間を短くす減も高まった。

な放射束密度は、すべての波長においることと関連づけて光源からの放射束

しかしながら、その性能の真価を実現て同じとは限らない。蛍光放射密度が、を上げることが求められている。第二するためには、照明器の出力が顕微鏡の蛍光体による吸光に利用できる光子のに、広視野蛍光顕微鏡の空間分解能を（1）、（2）試料面に伝搬される必要がある。

数に依存するためであり、一定レベル上げるための多くの技術には、照明を光源と顕微鏡の試料面を接続する光路の放射束密度に対して波長とともに増空間的にフィルタリングすることが含まを解析することで、装置の性能を最適加する。他の要因が一定である限り、れる。空間的フィルタリングによる損化するだけでなく、照明に関するトラ

375nm 励起光で特定の蛍光強度レベ失を補償するには、光源の出力を増加ブルシューティングを行うためのフレームワークを得ることができる。

真実への光路
試料面において蛍光励起の欠損が発5見された場合、その問題は光源に原因1があると考えるのは適切であるように思3える（そしてよくあることだ）。しかし、そのような帰属は一般的には不適切である。なぜなら、光路に沿って介在す4るすべてのコンポーネントが関与する可能性があるという事実があるためだ。すべての光学コンポーネントは、照明器の出力を顕微鏡に伝搬させ（図１）、システム全体のスループットに影響をもたらす。そのため、すべての光学コンポ

202021.3 Laser Focus World Japan

2ライトエンジン

フィルタキューブ
液体ライトガイド

図１ 倒立蛍光顕微鏡への固体ライトエンジンの組み合わせ。黄色で示された 1 〜 5 の位置は、表に記載されているスループット測定に使用される光路の場所と対応する。緑の線は、コリメータアダプタの入力から試料面への光路の方向を示す。

表１SPECTRA X ライトエンジンからニコン Ti 顕微鏡の試料面への光スループット
放射束（ mW ）位置（図を参照）

紫（ 390/22nm ）シアン（ 475/28nm ）緑（ 555/28nm ）赤（ 635/22nm ）1. ライトエンジン出力

4704451110

345

2. 液体ライトガイド出力終端（コリメータアダプタ入力）

250

230

520

195

3. 顕微鏡入力（コリメータアダプタ入力）

145

170395150

4. 対物レンズバックプレーン（フィルタ後、対物レンズ前）

13012022065

5A. 試料面（ 10 倍対物レンズ、開口数 0.5 ）110105195555B. 試料面（ 40 倍対物レンズ、開口数 0.75 ）25254515

米コヒレント社（ Coherent ）の FieldMaxII-TO パワーメーターを PM3 サーモパイル検出器に接続し、パワーを計測した結果を上に示す（精度は±5mW ）。 光 源 は 米 ル メ ン コ 社（ Lumencor ）の SPECTRA X ラ イ ト エ ン ジ ン で、 内 部 は 390/22nm、475/28nm、555/28nm、635/22nm（中心波長 / 半値全幅帯域幅）励起フィルタを使用した。ライトエンジンからの出力は、直径 3mm の液体ライトガイドとルメンコ社のコリメータアダプタを通過して顕微鏡（ニコン Ti ）に伝搬され、米セムロック社（ Semrock ）の FF409/493/573/652-Di02 クアッドダイクロイックによって試料面に届き、開口数 0.5 の 10 倍対物レンズまたは開口数 0.75 の 40 倍対物レンズを通過する。

させるか、顕微鏡との結合を改善する

大きい液体ライトガイド（例えば 3mm判明したときには、固体ライトエンジか、またはその両方を行う必要がある。の代わりに 5mm ）を使えば放射束がかンは候補となり得る。しかし、前述しなり大きくなるが、増加した放射束をた分析のステップを踏むことで、顕微試料面に伝搬させるため、通常は顕微鏡ユーザーは照明と顕微鏡の関係を詳鏡の光路を再設計する必要がある。

細に理解することができ、このようなよりよいものとなるために実例として、表に示した光路の段階別に改善する方法を簡単に検討してみよう。

コリメータアダプタ：フライアイレン

問題の真の原因を突き止める自信を得

ライトエンジン：本例で使用されたズが内蔵されたコリメータは、アクロられるだろう。こうすることで、最新SPECTRA X ライトエンジンに内蔵さマートレンズをベースにした従来設計の固体ライトエンジンによって得られれている非コヒーレント光源とは対照と比較して、光スループットと空間的る性能を最大限に発揮する際に、研究的に、固体ダイオードレーザ光源を使な均一性に優れている者を支援できるだろう。

用することで出力（特に放射束密度に関して）の向上を実現できる。

。

（3）対物レンズ：落射蛍光顕微鏡では、検出された蛍光強度は対物レンズの開口数

液体ライトガイド：液体ライトガイド（NA）の4 倍に比例する。そのため、適は、ライトエンジンの振動を顕微鏡か切な作動距離を有し、最も高い開口数をら分離させるという点でメリットがあもつ対物レンズを選択するのが好ましい。

る。また、顕微鏡の周囲はしばしば雑

蛍光顕微鏡の照明はパラダイムシフ多となるが、そこから離れた場所に光トの真っ只中にある。従来のアークラ源を設置することも可能となる。しかンプには有毒な水銀蒸気が含まれていし、これらの利点は、ライトエンジンるなど、多くの問題があった。一方、の出力の 35 〜 50％を犠牲にすることにこれまでの LED では光学的な出力要なる。ただ、十分に高出力なライトエ件を満たしていない。固体ライトエンンジンならば、こうしたロスは問題にジンはこれらの課題を解決しており、ならないだろう。また、直径がさらに新たな課題として光が不十分であると

参考文献（ 1 ）D. Grünwald, S. M. Shenoy, S. Burke,and R. H. Singer, Nat. Protoc., 3, 18091814（ 2008 ）.
（ 2 ）D. Dormann, PLoS One, 14, e0214659（ 2019 ）.
（ 3 ）B.Van Giel, Y. Meuret, and H. Thienpont,Opt. Eng., 46, 043001（ 2007 ）.
著者紹介
ジャスミン・シェーファーはルメンコ社のテクニカルサポートスペシャリスト、イアン・ジョン
ソンは同社テクニカルサポートディレクター、クラウディア・ジャフィは同社の共同創業者で営業開発部長。iain.johnson@lumencor.com、
claudia.jaffe@lumencor.com
https://lumencor.comLFWJ

Laser Focus World Japan 2021.3

21