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本コーナーでは、この実験をするためにはどの試薬を用意し、どの様に実験を進めればよいかをご案内いたします。
皆さまの日々の実験にご参考ください。

MultiReporter Assay System -Tripluc®を用いるマルチ遺伝子発現制御解析
多色同時測定可能な新時代のマルチレポーターアッセイシステムです。
はじめ にレポーター遺伝子を用いる遺伝子発現制御解析は、レポーター遺伝子にシス作用性エレメント（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）を連結して細胞に導入し、ある条件下で発現されるレポーター酵素の活性を指標に遺伝子発現制御を評価する手法です。この方法で問題となるのは、遺伝子導入効率、細胞数、生育状態など遺伝子発現の変動に起因しない、サンプル間のバラツキが生じてしまうことです。そのため、被験対象となるレポーターの他に、内部標準となるレポーターが必要です。さらに、生命現象の発現において、様々な遺伝子が関与していることからも、複数のレポーターを用いた解析は有効なツールと考えられます。
弊社では、緑色発光ルシフェラーゼ（SLG、最大発光波長550nm）、橙色発光ルシフェラーゼ(SLO、580nm)、赤色発光ルシフェラーゼ（SLR、630nm）の3色のルシフェラーゼ遺伝子を用いたマルチ遺伝子転写活性測定システムMultiReporter Assay System -Tripluc®-を販売し、ご好評をいただいております。本
TM稿では、あらためて本システムを用いた遺伝子発現制御解析について、実験のフローに沿ってご紹介させていただ
きます。
図1．緑色・橙色・赤色発光ルシフェラーゼの発光スペクトル

被験配列のクローニング

図2．MultiReporter Assay System -Tripluc®-を用いた遺伝子発現制御解析のフロー

イプの他にTAクローニングタイプもあります。
TAクローニング法は制限酵素処理等を必要としないため、PCR(1) ルシフェラーゼの選択
MultiReporter Assay System -Tripluc®-では、3色の発光産物を効率的にクローニングすることが可能です。弊社では、こルシフェラーゼをご用意しております。勿論、同時に調べたい被のTAクローニング技術をプロモーター解析にもご利用いただく験配列（シス作用性エレメント）の数などによって、1色あるいべく、SLO/SLR TA Cloning Kitとしてご提供しております。

は様々な組合せで2色のルシフェラーゼだけでもご使用いただけ

また、SLO/SLR TA Cloning Kit for KODは、高フィデリテます。表1に選択の目安をまとめていますのでご参照ください。

ィー酵素の特性上平滑末端産物を生じやすく、TAクローニング1色でご使用いただく場合は、SLGないしSLOルシフェラーゼを苦手とするKODシリーズのPCR産物においても、簡便にTAクローニングが行えるように工夫されたキットです。

をご使用ください。酵素及び測定機に用いられる光電子増倍管のプロモータースクリーニングなどを目的として、多くの種類の特性上、SLRに比べ強いシグナルを取得することが可能です。
2色でご使用いただく場合は、発光波長域の重なりの少なく、遺伝子プロモーターを同時にクローニングしたい場合、あるいはより精度の高い計測を行うことのできる、SLG、SLRの組合せ

転写活性機能部位の特定のために特定プロモーターデリーションをお薦めします。シグナル強度などによりSLRでは解析が難しいシリーズなどを作製されたい場合など、効率的なクローニングに場合には、SLGと被験配列・内部標準の組合せを入れ替えて使用ご利用いただけます。

するか、SLOを用いることも可能です。
3色でご使用いただく場合には、被験配列をSLO、SLRに、内遺伝子導入部標準をSLGとして用いることをお薦めします。シグナルの強い

通常よく用いられる1色系のアッセイでは、単に被験配列をク

SLGを内部標準として用いることによって、内部標準プラスミドローニングしたベクターを用いて比較を行いますが、本システムの添加量を低く抑えることができます。

ではサンプル間のバラツキを補正するため、内部標準となる一定

また、サーカディアンリズムや刺激応答など、ダイナミックな発現プロモーターに連結されたルシフェラーゼ遺伝子を有する、遺伝子変動を解析する場合には、近日発売予定の不安定化ルシフ

内部標準ベクターを同時トランスフェクションするアッセイをおェラーゼ（-short lifeタイプ-）をご利用ください。

奨めしています（2色系や3色系による同時解析）。MultiReporter
Assay System -Tripluc®-では構成発現プロモーターベクター(2) TAクローニングとして、SV40プロモーターまたはHSVtkプロモーターをレポ

被験配列挿入用ベクターには、各レポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子の上流にマルチクローニングサイトを含むスタンダードターターの上流に組み込んだ、2種類の内部標準用ベクターをご用意しております。

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表1．レポーターの選択の目安(1) SV40プロモーター
発現活性が高いため、トランスフェクション効率の低い細胞株溶液を用いる場合など、シグナルのレベルに問題がある場合に特に有効です。
(2) HSVtkプロモーター
図3．in vivo 計測

発現活性が低い一方、SV40プロモーターに比べ薬剤などの実験処理により変動する可能性が低く、より安定した内部標準として有用です。

計測(1) in vivo計測（非破壊計測）
ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞の培養液中にDluciferinを添加して細胞内へ浸透させ、細胞を破壊することなく、ルシフェラーゼ活性を計測する方法です。In vitro計測と比較してシグナル強度は低くなりますが、同一サンプルで転写活性の経時変化を調べたい場合に有効です。インキュベーター機能付ルミノメーター（ATTO社「クロノス」など）を用いることによって、TMさらにリアルタイムな変動を解析することが可能です。
図4．in vitro 計測（チューブ測定）(2) in vitro 計測（破壊計測）
MultiReporter Assay System -Tripluc ®- Detection
Reagentを用いて検出します。
ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を必要に応じて薬剤刺激処理した後、培地を除去し、溶解剤Lysis Solutionで細胞を溶解し、このライセートに発光基質Assay Reagentを加え、発光を測定します。サンプル数が少ない場合にはライセートの一部をとり、発光基質を加え、カラフルックアナライザーTMのような色分離機能つきチューブタイプのルミノメーターで測定を行うことができます。一方、サンプル数が多い場合には、白色不透明タイプの96ウェルプレートに細胞を培養し、このプレートのまま、Lysis Solutionによる細胞の溶解、Assay Reagentによる検出・測定を行います。この96ウェルプレートの使用例については、次号のUploadにてご紹介する予定です。
図5．in vitro 計測（プレートリーダー測定）

最後に、次項に2色系および3色系において、in vitro 計測によって遺伝子発現制御解析を行った例をご紹介いたします。是非、一度MultiReporter Assay System -Tripluc®- をお試しください。

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使 用 例
1. 2色系での使用例

2. 3色系での使用例

ハウスキーピング遺伝子として知られる10種類の遺伝子について、転写開始（予測）点より上流1.4kbまたは0.5 kbから下流0.1kbをKOD
plusでPCR増幅し、SLR TA Cloning Kit for KODを用いてSLR遺伝子上流にクローニングし、pSLG-SV40 controlとJurkat細胞にコトランスフェクションした。細胞を遠心操作で回収後、DetectionReagentsで検出し、内部標準であるSLGに対する相対活性として各遺伝子プロモーターの転写活性を評価しました（詳細は、Upload80号、P.13、14に掲載されておりますので、合わせてご参照ください）。

pSLO-test、pSLR-testの上流にSV40プロモーター、さらに上流にAP1またはNFκB応答エレメントを挿入した。これら2つを内部標準
HSVtk-SLGとともにHeLa S3細胞にトランスフェクションした。
24時間後、下記の薬剤を添加し、3時間インキュベートした。
Detection Reagentsで検出し、未処理条件のルシフェラーゼの活性を１として、各条件でのルシフェラーゼの活性をプロットしました

参考文献
1. バイオテクノロジージャーナル, 7-8: 453-455 (2005)
2. Biotechniques, 38: 891-894 (2005)

装保存温度

Code No.

価

プロモーター挿入用ベクター

品 名 及 び 内 容
pSLG-test

20μg

包-20℃

MRV-101¥80,000

格

プロモーター挿入用ベクター

pSLO-test

20μg

-20℃

MRV-102¥80,000

プロモーター挿入用ベクター

pSLR-test

20μg

-20℃

MRV-103¥80,000

SV40コントロールベクター

pSLG-SV40 control20μg-20℃

MRV-201¥80,000

SV40コントロールベクター

pSLO-SV40 control

20μg

-20℃

MRV-202¥80,000

SV40コントロールベクター

pSLR-SV40 control

20μg

-20℃

MRV-203¥80,000

HSVtkコントロールベクター

pSLG-HSVtk control

20μg

-20℃

MRV-301¥80,000

SLO TA Cloning Kit

20回用

-20℃

MRT-101¥65,000

SLR TA Cloning Kit

20回用

-20℃

MRT-102¥65,000

SLO TA Cloning Kit for KOD

20回用

-20℃

MRT-201¥69,000

SLR TA Cloning Kit for KOD

20回用

-20℃

MRT-202¥69,000

100回用
500回用
10,000回用-80℃

MRA-101
MRA-102
MRA-103¥30,000¥99,000¥1,350,000

D-luciferin（カリウム塩）

20 mg
100 mg-20℃

MRL-101
MRL-102¥24,000¥92,000

カラフルックアナライザーTM

1式−CLX-101¥1,350,000

MultiReporter Assay System -Tripluc®- in vitro アッセイ用試薬

Detection Reagents・Lysis Solution ・Assay Reagent
MultiReporter Assay System -Tripluc®- in vivo アッセイ用試薬※特許の関係上、ご購入の際には別途申込書を提出していただきます。企業の方のご購入に関しては、別途ライセンスが必要です。詳しくは弊社までお問い合わせください。
※ベクターに関しては別途セット販売をしております。詳しくは、弊社までお問い合わせください。

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