Press Release2024 年 2 ⽉ 26 ⽇
京都⼤学アイセムス（⾼等研究院 物質−細胞統合システム拠点）
科学技術振興機構（JST）

マウス精巣を⽤いた
個体内遺伝⼦スクリーニング系の開発
・個体臓器レベルでの CRISPR Cas9※1 システムを⽤いた遺伝⼦スクリーニングに成功
・マウス精巣を⽤いた遺伝⼦スクリーニング系の確⽴
・マウス精⼦の品質を決定する遺伝⼦の同定にも成功
京都⼤学アイセムス（⾼等研究院 物質―細胞統合システム拠点）の鈴⽊淳教授、野⼝勇貴
特定研究員、圓岡真宏特定助教らの研究グループは、北海道⼤学の⼩野寺康仁准教授、⼭⼝⼤学の宮本達雄教授、徳島⼤学の⼩迫英尊教授らのグループと共同で、個体臓器を⽤いた遺伝⼦スクリーニング系の開発に成功しました。この成果は、3 ⽉ 6 ⽇（⽇本時間）に Cell Genomics
誌（Cell Press）においてオンライン公開されます。
＜概要＞
個体を構成する各臓器は、個々の細胞で起こるさまざまな⽣化学反応が連動することで機能を発揮しています。⽣化学反応の各過程を制御するタンパク質は、遺伝⼦に情報がおさめられており、それぞれの細胞で発現し機能する遺伝⼦を同定することにより、⽣化学反応の理解が進みます。これまで、特にがん細胞などの細胞株を⽤いて、特定の⽣化学現象に注⽬した網羅的な遺伝⼦の解析（スクリーニング）が⾏われてきました。近年では、ノーベル賞を受賞した
CRISPR Cas9 システムを⽤いた遺伝⼦のスクリーニングが⾏われてきましたが、個体の臓器レベルでのスクリーニングを⾏うことは困難でした。今回、野⼝研究員らは、個体臓器、特にマウスの精巣を⽤いた遺伝⼦スクリーニング系を開発し、精⼦の品質を決定する遺伝⼦を同定することに成功しました。
マウス精巣内で精⼦幹細胞から発⽣する精⼦は、受精能獲得刺激により精⼦尾部・頭部において細胞外カルシウムが流⼊することで活性化し、卵⼦との受精が可能となります。ゆえに、カルシウムの流⼊は、精⼦の品質（受精獲得能）を保証する指標の⼀つとして適⽤することができます。そこで野⼝研究員は、受精能を有する精⼦の品質を規定する遺伝⼦を同定することを⽬的として研究を進めました。まず、マウス精巣の⽣殖細胞において遺伝⼦をランダムに⽋損させ、成熟した精⼦のカルシウムの流⼊を指標として、精⼦の品質決定に関与する因⼦を同定することを試みました。この時、⼀度同定した遺伝⼦群を別のマウスの精巣で⽋損させることで、偽陽性の遺伝⼦を排除し、真に関与する遺伝⼦のみを絞り込む⽅法論を確⽴しました。
さらに、同定した因⼦ RD3 の結合因⼦とそれらの発⽣時における発現解析から、発⽣時のどのような状況下において RD3 が機能するか、計算機を⽤いて特定する⽅法論も確⽴しました。
これらの技術を組み合わせることで、円形精⼦が発⽣の特定の時期にミトコンドリアを適切に分布させ活性酸素を減少させる巧妙な仕組みが明らかになり、それが精⼦の品質を保証することも分かりました。
本研究により、精⼦の品質を網羅的に同定する⽅法論が確⽴されました。今後、今回確⽴されたスクリーニング技術を改善することで、より多くの遺伝⼦が同定され、不妊のメカニズム

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の解明、さらに避妊薬の開発が進むことが期待されます。また、同様のスクリーニングの⽅法論は他の臓器においても⽤いることができるため、今後、他の⽣化学現象の解明、並びに創薬標的の発⾒にも繋がることが期待されます。

1. 背景CRISPR/Cas9 sgRNA※2 ライブラリー※3 を⽤いたゲノムワイドスクリーニング※4 法は特定の⽣物学現象のメカニズムを解明する上で強⼒な⽅法として広く使⽤されてきました。特に、細胞の増殖性をスクリーニングの標的にすることで、がん細胞の増殖メカニズムなどが明らかにされ、創薬開発などを促進してきました。⼀⽅で、細胞の増殖とは直接関連のない、⼀過的で不安定である細胞内の⽣物学現象のメカニズムをスクリーニングにより明らかにすることは困難でした。
このような問題点を克服するために、鈴⽊グループでは新しいスクリーニングの⽅法論、「リバイバルスクリーニング法」を樹⽴し、不安定な⽣化学反応においてもスクリーニングを実施する
こ と を 可 能 に し ま し た （ 2021 年 Molecular Cell 誌 に 発 表 、 https://www.icems.kyotou.ac.jp/news/3946/）。
しかしながら、マウス個体の臓器内でこのようなゲノムワイドスクリーニング法(in vivo スクリーニング法)を実施することは未だ困難なままです。近年、脳や⼼臓、そして肝臓などを標的にした in vivo スクリーニング法が提案されてきましたが、これらは細胞の増殖性に依存したスクリーニングに留まり、⽣化学反応を直接標的とする in vivo スクリーニング法は実現できていません。こうした背景から、本研究では、⽣化学反応を直接標的とする in vivo スクリーニング法の樹⽴を⽬指し、リバイバルスクリーニング法をマウスの精巣に応⽤し、成熟した精⼦の⽣化学反応を指標として、精⼦形成における精⼦の品質決定因⼦を網羅的に同定することを試みました。

2. 研究内容と成果上述したリバイバルスクリーニング法をマウスの精巣に応⽤する上で、本研究では、①センダイウイルスのエンベロープタンパク質を有するレンチウイルスベクター※5 を⽤いることで、⾼い効率で sgRNA ライブラリーを精⼦幹細胞へ導⼊可能にする⽅法、②成熟した精⼦の⽣化学反応(精⼦のカルシウム流⼊)を適切に誘導し補⾜する⽅法、③プライマーゼを⽤いた全ゲノム増幅法※6 を⽤いることで数が少ない精⼦からでもゲノム DNA を⽤いた解析を可能にする⽅法、④ゲノム DNAに組み込まれた sgRNA 領域を PCR により増幅することでライブラリーを再構築し、次のスクリーニングに⽤いる⽅法を精巣を用いた個体内遺伝子スクリーニング
⼀つずつ確⽴しました。そのsgRNAライブラリー
2.回収
1.感染
結果、精⼦の品質決定に関与Cas9を発現するフローサイトメトリーする因⼦として RD3 遺伝⼦ マウスの同定に成功しました。加え様々な遺伝子を欠損させた精子て、精巣細胞内において、同再感染スクリーニング
定した RD3 がどのような分を繰り返す⼦シグナル経路で制御されているのかを推定できるソ 再構成したライブラリー
ゲノムDNA
機能的な精子
フトウェア「Hub-Explorer」
sgRNAを開発し、単細胞の遺伝⼦発機能不全の精子
PCR法によりsgRNA 領域を増幅現を扱うシングルセル解析
3.全ゲノム増幅法
4.ライブラリー再構成と網羅的なタンパク質発現

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を扱うプロテオミクス解析と組み合わせることで RD3 が精⼦形成期においてミトコンドリアを円形精⼦内で適切に分布させ、酸化ストレスレベルを制御していることを明らかにしました。
本成果は、精⼦形成を制御する分⼦メカニズムの網羅的な解明を可能にする⽅法と、計算機を⽤いた細胞種特異的な分⼦シグナル経路の機能推定法を提案するものであり、これまでのノックアウトマウスなどを⽤いて遺伝⼦の機能を⼀つずつ明らかにするような⽣殖細胞の研究⽅法に、網羅的アプローチという新たな切り⼝を与え、将来のさらなる重要な発⾒を後押しする意義があると考えられます。

3. 今後の展開
近年、世界的な⼈⼝爆発を解決すべく、⼥性のみならず男性も使⽤可能な避妊薬(男性避妊薬)の開発が希求されており、Bill & Melinda Gates Foundation に代表される財団が⼤規模な助成を提供しています。本研究で樹⽴した、精巣を標的とする in vivo スクリーニング法は、このような男性避妊薬や不妊症治療薬などの創薬ターゲットを網羅的に同定することができる可能性があり、基礎医学的にも社会的にも⼤きな波及効果が期待されると考えます。また、精巣にとどまらず、その他の臓器に対しても同様のスクリーニングを適⽤することで、さまざまな基礎的な分⼦メカニズム、病態理解、そして創薬開発につながることが期待されます。

4. ⽤語解説
※1
※2※3
※4
※5

※6

CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9はDNAを切断する酵素で、バクテリアにおける免疫システムの⼀部として⾃然に存在し、侵⼊してきたファージなどのDNAを識別して切断します。
sgRNA：short guide RNA(sgRNA)は、Cas9を特定のDNA配列に導くための短いRNAです。
sgRNAライブラリー：さまざまなDNA配列を標的とする異なるsgRNAのミックスです。
ゲノムワイドスクリーニング：sgRNAライブラリーを細胞に導⼊し、⼀度にさまざまな遺伝⼦を編集・⽋損させ、網羅的な遺伝⼦解析を⾏うことを⾔います。
レンチウイルスベクター：ヒト免疫不全ウイルス（HIV）などに代表されるレンチウイルスの病原性を取り除き、特定の遺伝⼦を細胞にデリバリーすることができるようにしたシステム。
全ゲノム増幅法：⾮常に微量なDNAサンプルから全体のDNAを増幅する⽅法のことを⾔います。特に本研究では、プライマーゼという酵素を⽤いることにより、偏りのない増幅を可能にしています。

5. 研究プロジェクトについて
1.
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Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Grant No. 21H00230 to J.S.),
Japan Science and Technology Agency (JST) Fusion Oriented Research for disruptive
Science and Technology (FOREST) (Grant No. JPMJFR2162 to J.S.),
Joint Usage and Joint Research Programs of the Institute of Advanced Medical Sciencesof Tokushima University (to J.S.),
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (Grant No. 22K20972 to Y.N.),
Japan Science and Technology Agency (JST) Support for Pioneering Research Initiatedby the Next Generation (SPRING) (Grant No. JPMJSP2110 to Y.N.)
Sasakawa Scientific Research Grant from The Japan Science Society (Grant No. 20224005 to Y.N.).

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6. 論⽂タイトル・著者“In vivo CRISPR screening directly targeting testicular cells”（精細胞を標的とした個体内でのCRISPRスクリーニング）
著者：Yuki Noguchi, Yasuhito Onodera, Tatsuo Miyamoto, Masahiro Maruoka, Hidetaka
Kosako, Jun Suzuki
Cell Genomics｜DOI:

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