NEBNext® Direct Genotyping Solution
超ハイスループットターゲットジェノタイピング

期待に応える NEB のジェノタイピングソリューション
NEBNext Direct Genotyping Solution –イルミナ社シーケンサー対応のハイスループットターゲットジェノタイピング

NEBNext NEBNext Direct Genotying Solution は、次世代シーケンスを使った、高度なマルチプレックス化とキャプチャー法によるエンリッチメントを組 み 合 わせた 費用対効果 の 高 い、超 ハイスループットジェノタイピング

ソリューションで、幅広いアプリケーションに対応しています。100 ～ 5,000

種類の広範なマーカーで適用でき、プレキャプチャーフラグメントにおいて最大 96 サンプルのサンプルインデックスと最大 8 種類のプールインデックスを用いることで、イルミナ社シーケンサーによる 1 回のランで 380 万を超えるハイスループットジェノタイピングが可能です。

特長：• 1 日で完結のワークフロー• 100 ～ 5,000 種類のマーカー領域で自由に設計可能• ベイトデザインとマルチプレックス化により、最大 768 サンプルを１ランで解析• 高い特異性と均一の coverage により、最小リードで最大のジェノタイピングコール

幅広い各アプリケーションで NGS によるターゲットジェノタイピング

植物

マーカー選抜／育種

QTL（量的形質遺伝子座）のスクリーニング

動物

マウスのジェノタイピング
家畜育種

ヒト

バイオバンキングNGS によるサンプルトラッキング

サンプルのインデックス配列付加とマルチプレックス化
プレキャプチャーサンプルに 96 種類のサンプルインデックス（下図、黄緑色）、さらにポストキャプチャーサンプルに 8 種類のプールインデックス（下図、青色）* を使用することができ、イルミナ社シーケンサーにおいて、1 ランで最大 768 サンプルのシーケンスが可能です。加
えて、プレキャプチャーで付加されるアダプターには、サンプルインデックスの他 12 bp のランダム塩基配列である分子バーコード（UMI：Unique Molecular Identifier）が含まれており、これにより coverage とジェノタイピングコールの正確性が向上します。シーケンシングサイ
クル数は、マーカージェノタイピングに必要なターゲット領域、インデックス配列、およびUMI のシーケンスに最適化されています。NEBNext Direct Genotyping Solution は、イルミナ社のシーケンサー全機種に対応しています。
* バルク対応の場合は、8 種類より増やすことも可能です。ご相談ください。

NEBNext Direct Genotyping Solution のリードの構造
Read 1: 20 bases
P5UMISampleindex

12 bp

8 bp

Target marker
Inserti7 index: 8 bases
3´ adaptor

Poolindex
8 bp

Read 2: 75 bases

5´ adaptor

ベイトデザインの最適化

NEBNext Direct Genotyping Solution ではシーケンシング効率を最大化するために、専用のベイトデザイナーを使用しています。これにより、ターゲット遺伝子座を高い精度で特異的にキャプチャーするようにベイトが 最適化 されます。 ターゲット 遺伝子座 に 近接 する 各 ターゲッ
ト DNA 鎖にベイトを個別にデザインすることにより、より短いリードをジェノタイピングコールに利用することができます。さらに、ベイト配列上流のオフターゲット領域を除去することで、個々のベイトをシーケンスリードに確実にリンクさせることができます。ベイトはターゲットレベルごとに最適化され、マーカー全体で均一性が高い coverage を得ることができます。
DNA 鎖におけるマーカーの coverage
60,426,700 bp

60,426,800 bp

37,019,600 bp

1. Robinson, J.T., et al (2011) Nat Biotech., 29, 24-26.
2. Thorvaldsdottir, H., et al (2013) Briefings in Bioinformatics. 14, 178-192.

37,019,700 bp

96 プレックスエンリッチメン
トの 1 サンプル 内におけるマー
カ ー の coverage を Integrative
Genome Browser（IGV）1,2 により2 例を示した。リード数は、UMIによりデュプリケートを除いている。図 の 赤色 と 青色 で 示 されている 通り、ベイトはインプッ
ト DNA 両鎖をターゲットとしていることが確認できる。

P7パフォーマンス

NEBNext Direct Genotyping Solution は、より少ないシーケンスリードで、正確かつ信頼性が高いジェノタイピングコールを可能にします。これは、ターゲット遺伝子座に対する極めて高い特異性と確実なエンリッチメントにより、オフターゲットのシーケンスが低減され、より多くのマーカーを使用することが可能になるためです。

プールされた 96 サンプルにおける coverage の一貫性

プローブキャプチャー 法 によるター
ゲットエンリッチメントの場合、PCR増幅法に比べてターゲット遺伝子座のcoverage において極めて高い均一性が得 られる。 これにより、 ターゲット遺伝子をカバーするのに必要なシーケンスの全データ量が低減され、解析できるマーカー 数 を 最大化 することができる。

高い uniformity

NEBNext Direct Genotyping Solution では、サンプルにかかわらず、一貫性が高く、かつ特異性に優れたエンリッチメントが可能で、ターゲット領域に対するシーケンスリードマッピング 率は >90 ％ である。 この 高 い 特異性 は、ジェノタイピングのために 最適化 したキャプチャー 法 によるエンリッチ
メントと、酵素 を 用 いた 独自 のオフ
ターゲットシーケンス 除去 とを 組 み合わせることで実現した。

10090

Percent Selected

80706050403020100012243648

Samples

60728496

プールされた 96 サンプルにおける Passing Filter リード数
350,000
300,000

Passing Filter Reads

ターゲットキャプチャー 前 のサンプ
ル 96 種類 をプールすることにより、ピペッティング 操作 の 手間 が 削減 され、プラスチックチューブなど消耗品の使用も劇的に減らすことができる。
さらに、プールされた最大 768 種類のサンプルを 1 ランでハイスループッ
トシーケンシング解析でき、高い費用対効果が得られる。

NEBNext Direct Genotyping Solution によるプールされた
96 サンプルにおけるエンリッチメントの特異性

250,000
200,000
150,000
100,000
50,0000012243648

Samples

607284

1 サンプルにおける 2,390 種類のマーカーの mean coverage
Marker Coverage Post-duplicate
Filtering Using UMIs

プールされた 96 サンプルにおける特異性の高いエンリッチメント

3002502001501005000575

1,150

Markers

1,725

2,300

96

NEBNext Direct Genotyping
Solution を 用 い た 場 合、 タ ー
ゲット 領域にマッピングされた
Passing Filter リードの割合は 96
マルチプレックスサンプル 全体を 通 じて 高 く、優 れた 特異性 が示されている。各サンプルにはトマトの 精製 DNA 25ng を 使用している。サンプルにインデックス 配列 をタグ 付 けした 後、 ハイブリダイゼーション 前にプールしてライブラリー調製を行い、ライブラリーサンプルをイ
ルミナ社 MiSeq® により、Read 1を 20 サイクル設定で、12 bp のUMI および 8 bp のサンプルイ
ンデックスをシーケンシング、Read 2 を 75 サ イ ク ル 設 定 で、ターゲット 領域のシーケンシングを行った。

公開されている使用可能なSolCAP マーカー 2,309 種類からなるジェノタイピングパネルを用い、トマトの DNA サンプル 96
種類を NEBNext Direct Genotyping
Solution によりエンリッチメントを行い、Passing filter リードを確認した。各サンプルには 25 ngの精製 DNA を使用し、サンプルにインデックス 配列をタグ 付けした 後、ハイブリダイゼーショ
ン 前にプールしてライブラリー調製 を 行 った。 ライブラリーサ
ンプルをイルミナ社 MiSeq により、Read 1 を 20 サイクル設定で、12 bp の UMI および 8 bp のサンプルインデックスをシーケンシング、Read 2 を 75 サイクル設定で、ターゲット 領域のシーケンシングを行った。

使用した SolCAP マーカー 2,309
種類における coverage をヒストグラムで 示す。ターゲットエンリッチメントの 均一性と coverage は、 ジェノタイピングコー
ルに 充分なレベルであることが示されている。これらのデータは、ハイブリダイゼーション 前にプールされた 95 種類 のトマトサンプルの 内の 1 サンプルである。各 サンプルには 25 ng の精 製 DNA を 使 用 し た。 サ ン プ
ルにインデックス 配列を 付加した 後、ハイブリダイゼーション前にプールしてライブラリーを調製した。ライブラリーサンプ
ルをイルミナ 社 MiSeq により、Read 1 を 20 サイクル設定で、12bp の UMI および 8 bp のサンプルインデックスをシーケンシング、Read 2 を 75 サイクル設定で、ターゲット 領域のシーケンスを行った。

NEBNext Direct
NEBNext Direct Genotyping Solution では、25 ～ 100 ng の精製したゲノム DNA を使用します。DNAを酵素処理により断片化した後、プール前のサンプルに対して 5′ 末端にサンプルインデックス配列と Unique Molecular Identifier（UMI）を含むイルミナ社シークエンサー対応の P5 アダプターを付加します。これにより最大 96 サンプルをプールすることができます。次にビオチン化ベイトをハイブリダイズし、 ストレプトアビジンビーズによるキャプチャーと 酵素処理 によるオフターゲット配列を除去することでエンリッチメントを行います。その後、3′ 末端にアダプターをライゲーションし、最後に PCR により 3′ 末端にプールインデックスが付加され、96 サンプル／ 1 プールのシーケンス用ライブラリーが調製されます。

3´ Genomic
5´ DNA

5´
3´NEBNext Direct Genotyping Solution Target Enrichment Kit

NEBNext Direct Genotyping Solution Sample Prep Kit

Target marker
Fragmentation,
End Repair,
5´ Phosphorylation,dA-tailingA 3´5´
3´ A

5´

5´ adaptor

Adaptor ligation& sample tagging

UMISample indexA5´3´A

3´A

3´
5´

Sample pooling
Sample 1A

5´

3´
5´A

Sample 2AA

Sample 96

ADenaturation & 5´bait hybridization

3´

Bead binding& 3´ blunting

3´

3´Biotin bait

5´

3´
5´

Streptavidinbead
3´ ligation
5´and additional
off-target removal

PCRamplification

サンプルをプールする
前に 5′ アダプター（サンプルインデックス、
UMI : Unique Molecular
Identifier を含む）を付加

3´

酵素処理によりオフターゲット配列を除去

3´ adaptor

5´
3´

Sequencing-ready fragment

DNA フラグメント両鎖にビオチン標識ベイトをハイブリダイズ（図は片鎖での反応を示す）

Pool index

各 DNA フラグメントはサンプルインデックス配列とプールインデックス配列により識別

NEBNext Direct Genotyping
Solution の製品内容
製品名

製品番号

容量Sample Prep Kit

E9500

96 reactions

Target Enrichment Kit

E9530

8 reactions※それぞれの構成品は、個別購入も可能です。

説明

ライブラリー調製用試薬

濃縮用試薬およびベイト• ベイトはサンプル毎に NEB で個別にデザイン• 検証済みのベイトを納品• 既存のベイトも利用可能

製品詳細につきましては、下記をご覧ください。

www.nebj.jp/re/NEBNext_Genotyping
お問い合わせ、ご相談につきましては tech.jp@neb.com
までご連絡ください。

本製品は、研究用限定です。診断には使用できません。
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202006-NEBNext_Genotyping_BRO-V1.1-07/19