No.120

高性能 SEC カラム TSKgel® UP-SW2000 について
─目

次─

ページ
1. はじめに1

2. TSKgel UP-SW2000 の基本特性

1

2 - 1. 充塡剤、カラムの仕様

1

2 - 2. カラムの分離特性

2

2 - 3. 測定流速の影響

6

2 - 4. 試料注入量の影響

8

2 - 5. カラム外体積（配管）の影響

9

2 - 6. カラムの耐久性

11

2 - 7. 充塡剤のロット間差

12

2 - 8. 市販 UHPLC 用 SEC カラムとの比較

12

3. 応用例

14

3 - 1. バイオ医薬品の分離

143 - 2. オリゴヌクレオチドの分離

15

4. おわりに

東ソー株式会社

15

1．はじめに

2．TSKgel UP-SW2000 の基本特性
2-1．充塡剤、カラムの仕様

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は試料の分子サイズによる分離であり、古くからたんぱく質の分離・

表 1 に TSKgel UP-SW2000 の充塡剤、カラム仕様及び同じ用途で用いられる既存カラムとの比較を示しま精製に使われてきました。
（粒子径 5 μ m）
当社の既存カラム TSKgel G2000SWXL

す。

及び TSKgel SuperSW2000（粒子径 4 μm）は分子量がTSKgel UP-SW2000 は、細孔径 12.5 nm のシリカゲ

5,000 ～ 100,000 の範囲のたんぱく質やペプチドの分離

ル表面にジオール基を導入した粒子径 2 μm の充塡剤分析に適していますが、高速の高分離測定が可能なを充塡したカラムです。既存カラムに比べ高い分離性能

SEC カラムが求められています。

を示し、低分子量のたんぱく質やペプチドの分離分析に

今回、UHPLC 及び HPLC で使用可能な粒子径 2 μm

適しています。

の高性能 SEC カラム TSKgel UP-SW2000 を商品化いた

カラムサイズは 4.6 mm I.D. × 30 cm の高分離分析用しました。

と 4.6 mm I.D. × 15 cm の高速分析用があります。

本稿では、TSKgel UP-SW2000 の基本特性と分離例を紹介いたします。

表1

カラム、充塡剤仕様
本カラム
品

名

カラムサイズ基

既存カラム

TSKgel UP-SW2000
4.6 mm I.D. × 30 cm

4.6 mm I.D. × 15 cm

TSKgel SuperSW2000

TSKgel G2000SWXL

4.6 mm I.D. × 30 cm

7.8 mm I.D. × 30 cm

材

シリカゲル

シリカゲル

シリカゲル

官能基

ジオール

ジオール

ジオール

粒子径

2 μm

4 μm

5 μm

排除限界分子量500 kDa

500 kDa

500 kDa

分子量測定範囲

5 ～ 100 kDa

5 ～ 100 kDa

5 ～ 100 kDa

─1─

2-2．カラムの分離特性

図 1 に、標準たんぱく質による較正曲線の比較を図 2

2-2-1．たんぱく質の分離に示します。

TSKgel UP-SW2000、TSKgel SuperSW2000（粒子径TSKgel UP-SW2000 は既存カラムと同様の分離選択

4 μm）及び TSKgel G2000SWXL（粒子径 5 μm）を用性を有していることがわかります。また、較正曲線は既いて標準たんぱく質を測定したクロマトグラムの比較を存カラムと同等の傾きを有していることがわかります。

5
4

1

A）

UV 280 nm

2’

B）

2

2’

2

5

TSKgel SuperSW2000（4 μm, 4.6 mm I.D．
× 30 cm）

3

1

3

5

4

1

C）

図1

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D．
× 30 cm）

3

2

5

TSKgel G2000SWXL（5 μm, 7.8 mm I.D．
× 30 cm）

4

3

7

9

11

13 min標準たんぱく質のクロマトグラム〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel SuperSW2000（4 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｃ）TSKgel G2000SWXL（5 μm, 7.8 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム流速：A）,B）0.35 mL/min, C）1.0 mL/min

検出：UV 280 nm、マイクロセル

試料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）

温度：25 ℃

3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）

注入量：10 μL

2. γ - グロブリン，155,000 Da（1.0 g/L）
（2' γ-グロブリン二量体）
4. リボヌクレアーゼ A，13,700 Da（1.0 g/L）

5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

6

1
2’

log

M

5

3
4

4
3
2
1

図2

2

● A）TSKgel UP-SW2000▲ B）TSKgel SuperSW2000■ C）TSKgel G2000SWXL

4

6

8
10
12
溶出時間 (min)標準たんぱく質の較正曲線

514〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel SuperSW2000（4 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｃ）TSKgel G2000SWXL（5 μm, 7.8 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム+ 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：A），B）0.35 mL/min，C）1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm, マイクロセル
温 度：25 ℃
注入量：10 μL
試 料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）
2. γ - グロブリン，155,000 Da（1.0 g/L）
（2′γ - グロブリン二量体）
3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
4. リボヌクレアーゼ A, 13,700 Da（1.0 g/L）
5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）
─2─

表2

カラム性能の比較（標準たんぱく質の分離能（R））
カラム

粒子径

R（ピーク 1/2）

R（ピーク 2/3）

R（ピーク 3/4）

R（ピーク 4/5）

Ａ）TSKgel UP-SW2000

2 μm

3.3

4.0

4.5

14.5

Ｂ）TSKgel SuperSW2000

4 μm

2.0

2.7

3.7

11.2

Ｃ）TSKgel G2000SWXL

5 μm

1.9

2.4

3.2

10.4

表 2 に図１の各ピークの分離能を示します。粒子径が

表 3 に各カラムの保証理論段数を示します。

小さい TSKgel UP-SW2000 が全てのピーク間について最粒子径の小さい TSKgel UP-SW2000 は既存カラムにも高い分離能を示しました。
表3

比べて保証理論段数が高いことがわかります。

カラム性能の比較（理論段数）
カラム

理論段数

粒子径

リボヌクレアーゼ A（ピーク 4）

p- アミノ安息香酸（ピーク 5）A）TSKgel UP-SW2000

2 μm

28,76753,818B）TSKgel SuperSW2000

4 μm

13,30835,929C）TSKgel G2000SWXL

5 μm

10,11529,371

異なるカラムサイズの TSKgel UP-SW2000 を用いて、

30 cm のカラム（クロマトグラム B））に比べ約半分の標準たんぱく質を測定したクロマトグラムを図 3 に示

時間で同様な分離能のクロマトグラムが得られており、します。長さ 15 cm のカラム（クロマトグラム A)）は、

高速分析が可能であることがわかります。

5

A）

UV 280 nm

1

4TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D．× 15 cm）

2 3
2’

5

B）

4

1

2’

1
図3

3

5

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D．× 30 cm）

3

2

7

9

11

13 min標準たんぱく質のクロマトグラム（カラムサイズの比較）〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm、マイクロセル

試料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）
3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）

温度：25 ℃

注入量：A）5 μL , B）10 μL

2. γ - グロブリン，155,000 Da（1.0 g/L）
（2' γ - グロブリン二量体）
4. リボヌクレアーゼ A，13,700 Da（1.0 g/L）

5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）
表4

カラム性能の比較（理論段数）
理論段数

カラム

カラムサイズA）TSKgel UP-SW2000

4.6 mm I.D. × 30 cm

28,76753,818B）TSKgel UP-SW2000

4.6 mm I.D. × 15 cm

17,53529,545リボヌクレアーゼ A（ピーク 4） p- アミノ安息香酸（ピーク 5）

─3─

TSKgel UP-SW2000、TSKgel UP-SW3000 を 用 い てます。TSKgel UP-SW2000 は TSKgel UP-SW3000 に比標準たんぱく質を測定したクロマトグラムの比較を図

べ、より低い分子量領域（約 5 万以下）で校正曲線の傾4、標準たんぱく質による較正曲線の比較を図 5 に示し

きが緩やかであることがわかります。
5

4

A） 1

5
4

B） 1
1’

3

図4

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

3

2

UV 280 nm

2’TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

3

2
2’

5

7

9

11

13 min標準たんぱく質のクロマトグラム〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：A）,B）0.35 mL/min, C）1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm、マイクロセル
温 度：25 ℃
注入量：10 μL
試 料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）（1' チログロブリン二量体）
2. γ - グロブリン，155,000 Da（1.0 g/L）
（2' γ - グロブリン二量体）
3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
4. リボヌクレアーゼ A，13,700 Da（1.0 g/L） 5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）
7
1’

6

1

2’

2

5

log

M

3
4

4
3

5

2
1

●
◆

A）TSKgel UP-SW2000
B）TSKgel UP-SW3000

4

6

8
10
12
溶出時間 (min)図5

標準たんぱく質の較正曲線

表5

カラム、充塡剤仕様カ ラ ム サ イ ズ
基
材
官
能
基
粒
子
径
排 除 限 界 分 子 量*
分 子 量 分 画 範 囲*
カ ラ ム 用 途

14〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム+ 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：A），B）0.35 mL/min，C）1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm, マイクロセル
温 度：25 ℃
注入量：10 μL
試 料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）
（1′チログロブリン二量体）
2. γ - グロブリン，155,000 Da（1.0 g/L）
（2′γ - グロブリン二量体）
3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
4. リボヌクレアーゼ A，13,700 Da（1.0 g/L）
5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

TSKgel UP-SW2000
4.6 mm I.D. × 30 cm, 15 cm
シリカゲル
ジオール
2 μm
500 kDa
5 ～ 100 kDa
低分子量たんぱく質、ペプチドの分離分析＊ 標準たんぱく質
─4─

TSKgel UP-SW3000
4.6 mm I.D. × 30 cm, 15 cm
シリカゲル
ジオール
2 μm
800 kDa
10 ～ 500 kDa
抗体（二量体／単量体／フラグメント）の分離分析

2-2-2．ペプチドの分離

ラムの比較を図 6、7 に、各溶出ピークの分離能（R）の比較を表 6、7 に示します。

TSKgel UP-SW2000（ 粒 子 径 2 μm） 及 び TSKgel
SuperSW2000（粒子径 4 μm）を用いて、溶離液を 40

TSKgel SuperSW2000 に 比 べ、 粒 子 径 の 小 さ な％アセトニトリル水溶液 + 0.05 ％トリフルオロ酢酸と

TSKgel UP-SW2000 は何れのペプチドもピーク幅が狭してペプチド混合物を変性条件下で測定したクロマトグ

く、分離能が高いことがわかります。

2〈測定条件〉

3

カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000

1

UV 215 nm

A)（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

4Ｂ）TSKgel SuperSW2000（4 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D.× 30 cm）

3

2
1

B)

溶離液：40 % アセトニトリル + 0.05 % トリフルオロ酢酸

TSKgel SuperSW2000（4 μm, 4.6 mm I.D.× 30 cm）

流

速：0.35 mL/min

検出：UV 215 nm, マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：10 μL

4

試料濃度：各 0.05 g/L
試料：1. アプロチニン，6,512 Da
2. ビッグガストリン，3,849 Da

4

6

8

図6

ペプチド混合物のクロマトグラム（1）表6カラム性能の比較（分離能（R））
カラム

3. ボンベシン，1,620 Da

min

10

4. オキシトシン，1,007 Da

粒子径

R（ピーク 1/2）

R（ピーク 2/3）

R（ピーク 3/4）

Ａ）TSKgel UP-SW2000

2 μm

6.6

4.4

7.6

Ｂ）TSKgel SuperSW2000

4 μm

3.1

2.5

3.7

〈測定条件〉

3（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

2

A)Ｂ）TSKgel SuperSW2000（4 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D.× 30 cm）

1

UV 215 nm

カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000

溶離液：40 % アセトニトリル + 0.05 % トリフルオロ酢酸3

流速：0.35 mL/min

検出：UV 215 nm，マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：10 μL
B)

4

2

1

6

TSKgel SuperSW2000（4 μm, 4.6 mm I.D.× 30 cm）
8

10

図7

ペプチド混合物のクロマトグラム（2）表7カラム性能の比較（分離能（R））
カラム

試料濃度：各 0.05 g/L
試料：1. ミオグロブリン，17,800 Da
2. グルカゴン，3,483 Da
3. LH - RH，1,182 Da

min

粒子径

R（ピーク 1/2）

R（ピーク 2/3）

Ａ）TSKgel UP-SW2000

2 μm

7.3

8.8

Ｂ）TSKgel SuperSW2000

4 μm

6.2

4.6

─5─

2-3．測定流速の影響

段数の関係を図 8 に示します。低分子の p- アミノ安息

2-3-1．理論段数との関係

香酸では測定流速が高くなるほど理論段数が高くなって分子量の異なる 2 種類のたんぱく質（オブアルブミン：

います。一方、分子量の大きいたんぱく質では、測定流

Mw 47,000、リボヌクレアーゼ A：Mw 13,700）及び p-

速が低くなるほど理論段数が高くなる傾向を示しており

アミノ安息香酸（Mw 137）における、測定流速と理論

ます。

70000

〈測定条件〉

p-アミノ安息香酸（137 Da）

カラム：TSKgel UP-SW2000

リボヌクレアーゼA（13,700 Da）

60000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

オブアルブミン（47,000 Da）

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

理論段数

50000

+ 0.05 % アジ化ナトリウム

40000

流

速：0.05 ～ 0.40 mL/min

検出：UV 280 nm, マイクロセル

20000

温

度：25 ℃

10000

試

30000

0

図8

+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム

注入量：10 μL
料：オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
リボヌクレアーゼ A，13,700 Da（1.0 g/L）

0

0.1

0.2
0.3
流速 [mL/min]

p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

0.4

測定流速と理論段数の関係

2-3-2．理論段高さ（HETP）との関係

下を抑えることができます。

TSKgel UP-SW2000（ 粒 子 径 2 μm）と TSKgel Super

一方、TSKgel SuperSW2000 では、測定流速により

SW2000（粒子径 4 μm）の測定流速と理論段高さ（HETP）

HETP が大きく変化しています。特にたんぱく質ではの関係を図 9 に示します。

顕著で流速が高くなるに従い HETP が大きくなり、カ充塡剤の粒子径が小さい TSKgel UP-SW2000 では、ラム効率が低下していることがわかります。従って、測定試料の分子量に依らず、測定流速の HETP への影

TSKgel UP-SW2000 は特にたんぱく質の高速分析に適響が小さく、測定流速を高くした場合のカラム効率の低用可能であることが示唆されます。

A）TSKgel UP-SW2000
UP-SW2000
A）TSKgel（2 μm,
μm, 4.6
4.6 mmmm I.D.
I.D.×
×30
30 cm）cm）（2B）TSKgel SuperSW2000
SuperSW2000
B）TSKgel（4 μm,
μm, 4.6
4.6 mmmm I.D.
I.D.×
×30
30 cm）
cm）
（4
70
70

p-アミ
ノ安息香酸
（137Da）
Da）
p-アミ
ノ安息香酸
（137
リ
ボヌ
ク
レアーゼA
（13,700Da）
Da）
リ
ボヌ
ク
レアーゼA
（13,700オ
ブアルブミ
ン（47,000Da）
Da）
オ
ブアルブミ
ン
（47,000

60
60
50
50

HETP
HETP［μm］
［μm］

HETP
HETP［
［ μm］
μm］

70
70

40
40
30
30
20
20
10
10
00

図9

p-アミ
ノ安息香酸
（137Da）
Da）
p-アミ
ノ安息香酸
（137
リ
ボヌ
ク
レアーゼA
（13,700Da）
Da）
リ
ボヌ
ク
レアーゼA
（13,700オ
ブアルブミ
ン（47,000Da）
Da）
オ
ブアルブミ
ン
（47,000

60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10

00

0.1
0.1

0.2
0.3
0.2
0.3
[mL/min]流速 [mL/min]
流速

00

0.4
0.4

測定流速と理論段高さ（HETP）との関係
─6─

00

0.1
0.1

0.2
0.3
0.2
0.3
[mL/min][mL/min]
流速
流速

0.4
0.4

2-3-3．カラム圧力との関係

cm については測定流速 0.05 ～ 0.50 mL/min の範囲で流測定流速とカラム圧力の関係を図 10 に示します。

速と圧力の関係は直線関係を示しており、図 11 に示す

カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 30 cm について、測定流ように測定流速を 0.50 mL/min として標準たんぱく質

速 0.05 ～ 0.35 mL/min の範囲で流速と圧力の関係は直を測定した場合、5 min の分析時間で良好な分離を得る

線関係を示します。又、カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 15

ことが可能となります。

〈測定条件〉

30

カラム：TSKgel UP-SW2000
カラムサイズ：4.6 mm I.D. × 15 cm, 30 cm

圧力損失 [ＭＰａ]溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

20

+ 0.05 % アジ化ナトリウム流

速：0.05 ～ 0.50 mL/min

10

0

図 10

+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム●TSKgel UP-SW2000（2 μm、
4.6 mm I.D.× 30 cm）▲TSKgel UP-SW2000（2 μm、
4.6 mm I.D.× 15 cm）

0

0.1

0.2
0.3
0.4
0.5
流速 ［ mL/min］

0.6

測定流速とカラム圧力の関係

A）0.50 mL/min
5

UV 280 nm

1
2’

4

2

3

B）0.35 mL/min

5
1
2’

1
図 11

2

3

2

4
3

4

5

6

min

標準たんぱく質のクロマトグラム（測定流速の影響）〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：A）0.50 mL/min、B）0.35 mL/min
検 出：UV 280 nm, マイクロセル
温 度：25 ℃
注入量：5 μL
試 料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）
2. γ - グロブリン，155,000 Da（2' γ - グロブリン二量体）（1.0 g/L）
3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
4. リボヌクレアーゼ A, 13,700 Da（1.0 g/L）
5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）
─7─

2-4．試料注入量の影響す。

オブアルブミン、リボヌクレアーゼ A 及び p- アミノ

試料注入量の増加とともに理論段数が低下する傾向を安息香酸を用いて試料負荷量（試料注入量）と理論段数示しました。4.6 mm I.D. × 30 cm については、試料注の関係を検討しました。一定の試料濃度で注入量を 1 ～

入量が 10 μL を超えると理論段数の低下率が大きくなっ

30 μL の範囲で変更して測定した場合の理論段数を図ており、注入量 10 μL 以下での使用をお勧めします。

12、図 13 に示します。図 12 は 4.6 mm I.D. × 30 cm

又、4.6 mm I.D. × 15 cm については、試料注入量 5

カラム、図 13 は 4.6 mm I.D. × 15 cm カラムの結果でμL 以下での使用をお勧めします。

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW2000

理論段数

60000

（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

p-アミノ安息香酸（ 137 Da）

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウムリボヌクレアーゼ A(13,700 Da）

40000+ 0.05 % アジ化ナトリウムオブアルブミン（ 47,000 Da）

20000

流

速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm, マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：1 ～ 30 μL
試

0

0.1

料：オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
リボヌクレアーゼ A, 13,700 Da（1.0 g/L）

1
10
100
[μL]
試料注入量

p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

図 12 試料注入量と理論段数の関係（4.6 mm I.D. × 30 cm）〈測定条件〉

理論段数

30000

20000

10000

カラム：TSKgel UP-SW2000
p-アミノ安息香酸（137 Da）
リボヌクレアーゼ A（13,700 Da）
オブアルブミン（47,000 Da）（2 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム+ 0.05 % アジ化ナトリウム流速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm, マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：1 ～ 15 μL
試

0
0.1

料：オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
リボヌクレアーゼ A, 13,700 Da（1.0 g/L）
p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

1
10
100
試料注入量 [μL]

図 13 試料注入量と理論段数の関係（4.6 mm I.D. × 15 cm）

─8─

2-5．カラム外体積（配管）の影響

2-5-1．インジェクションバルブ－カラム入口
間の配管の影響

TSKgel UP-SW2000 は粒子径が小さい為、配管等のカラム外での試料の拡がりにより、カラム本来の性能が4.6 mm I.D. × 15 cm カラムについて、インジェクショ

得られない場合があります。十分なカラム性能を得るた

ンバルブ－カラム入口間の配管径、配管長さと理論段数

めに検出器のセルはマイクロセルなど容量の小さなセルの関係を図 14 に示します。
配管径を 0.20 mm とした場合（図 14 の〇、△、□）、を用いる必要があります。また、カラム前後の配管は出配管が長くなるにしたがい徐々に理論段数の低下が認め

来るだけ容量を小さくする必要があります。
インジェクションバルブ－カラム入口間及びカラム出られ、配管長さ 20 cm（配管容量：約 6.28 μL）での理

口－検出器（UV セル）間の配管径、配管長さと試料成

論段数の低下率（対配管長さ 5 cm）
は 10 ％を超えました。

分の理論段数との関係を確認する為、配管径を内径 0.10

インジェクションバルブ－カラム入口間の配管径はmm、0.13 mm、0.20 mm とし、配管長さを 5 cm から

0.13 mm 以下、配管長さは 20 cm 以下で使用すること

30 cm まで長さを変えて、たんぱく質、低分子化合物のをお勧めします。

理論段数を測定しました。

〈測定条件〉

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D．
× 15 cm）

カラム：TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）

理論段数

30000

+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム+ 0.05 % アジ化ナトリウム

20000
10000
0

速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm, マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：5 μL
試

0

10
20
配管長さ [cm]30● p-アミノ安息香酸（0.13 mm I.D.） 〇 p-アミノ安息香酸（0.20 mm I.D.）▲ リボヌクレアーゼA（0.13 mm I.D.） △ リボヌクレアーゼA（0.20 mm I.D.）■ オブアルブミン（0.13 mm I.D.）

図 14

流

□ オブアルブミン（0.20 mm I.D.）

カラム入口配管と理論段数の関係

─9─

料：オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
リボヌクレアーゼ A, 13,700 Da（1.0 g/L）
p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

※ カラム出口配管：0.10 mm I.D. × 20 cm

2-5-2．カ ラム出口－検出器（UV セル）間の配管の影響

2-5-1 と同様に、配管径を 0.20 mm とした場合（図 15の〇、△、□）、配管長さが 20 cm では理論段数の低下

4.6 mm I.D. × 15 cm カラムについて、カラム出口－が認められました。

検出器（UV セル）間の配管径、配管長さと理論段数のカラム出口－検出器（UV セル）間の配管径は 0.13関係を図 15 に示します。又、配管容量と理論段数の関mm 以下、配管長さは 30 cm 以下で使用することをお係を図 16 に示します。

勧めします。

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D．
× 15 cm）

30000

30000

20000

20000

理論段数

理論段数

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D．
× 15 cm）

10000
0

0

10

20
30
配管長さ [cm]040● p-アミノ安息香酸（0.13 mm I.D.） 〇 p-アミノ安息香酸（0.20 mm I.D.）（0.20 mm I.D.）▲ リボヌクレアーゼA（0.13 mm I.D.）△ リボヌクレアーゼA■ オブアルブミン（0.13 mm I.D.） □ オブアルブミン（0.20 mm I.D.）

図 15

10000

カラム出口配管と理論段数の関係

0

2

4
6
配管容量 [μL]8● p-アミノ安息香酸（0.13 mm I.D.） 〇 p-アミノ安息香酸（0.20 mm I.D.）▲ リボヌクレアーゼA（0.13 mm I.D.）△ リボヌクレアーゼA（0.20 mm I.D.）■ オブアルブミン（0.13 mm I.D.）

図 16□ オブアルブミン（0.20 mm I.D.）

カラム出口配管容量と理論段数の関係〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 15 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム流 速：0.35 mL/min
検 出：UV 280 nm，マイクロセル
温 度：25 ℃
注入量：5 μL
試 料：オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
リボヌクレアーゼ A, 13,700 Da（1.0 g/L）
p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）
※ カラム入口配管：0.10 mm I.D. × 20 cm

カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 30 cm については、配管

I.D. × 15 cm）についても装置の配管径を 0.13 mm 以下、長さの影響が小さくなりますので、カラムサイズ 4.6

インジェクションバルブ－カラム入口間の配管長さをmm I.D. × 15 cm での推奨条件で使用可能です。

20 cm 以下、カラム出口－検出器（UV セル）間の配管

又、同じ粒子径である当社の既存カラム TSKgel UP-

長さを 30 cm 以下として推奨しております。

SW3000（カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 30 cm、4.6 mm

─ 10 ─

2-6．カラムの耐久性の変化を確認しました。500 回注入後の理論段数の変化は

カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 30 cm 及び 4.6 mm I.D. ×

小さく、図 18 に示す標準たんぱく質のクロマトグラムの15 cm について p- アミノ安息香酸を連続注入した場合の変化も無いことから、十分なカラム耐久性を有することが試料注入回数と理論段数の関係を図 17 に示します。

わかりました。

カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 30 cm については、流速を又、カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 15 cm については、

0.35 mL/min として試料を 100 回連続注入後に溶離液の流速を 0.50 mL/min として同様の操作を行い、十分な送液を 6 時間以上停止する操作を 5 回繰返し、理論段数

カラム耐久性を確認しました。

A）4.6 mm I.D.×30 cm

100

流速：0.35 mL/min

80

図 17

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

90

0100 200 300 400
注入回数（回/total）

B）4.6 mm I.D.×15 cm

110

理論段数の変化 (%)

理論段数の変化 (%)

110

100

90

TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D.× 15 cm）
流速：0.50 mL/min

80

500

0

100 200 300 400 500
注入回数（回/total）

試料注入回数と理論段数の関係〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW2000（2 μm，A）4.6 mm I.D. × 30 cm、B）4.6 mm I.D. × 15 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム + 0.05 % アジ化ナトリウム流速：A）0.35 mL/min、B）0.50 mL/min

検出：UV 280 nm，マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：A）10 μL，B）5 μL
注入間隔：A）15 分間隔（100 回注入後、溶離液の送液を 6 時間以上停止）：B）5 分間隔（100 回注入後、溶離液の送液を 6 時間以上停止）
試料：p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

〈測定条件〉

A）
500回注入後

UV 280 nm2’

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム32+ 0.05 % アジ化ナトリウム

B）
試験前

5
4

1
2’

5

（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

4

1

3

カラム：TSKgel UP-SW20005

速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm, マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：10 μL

3

2

流

試

料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）
2. γ - グロブリン，155,000 Da（1.0 g/L）

7

9

11

13 min

図 18 標準たんぱく質のクロマトグラム（耐久性試験前後）
─ 11 ─

（2' γ - グロブリン二量体）
3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
4. リボヌクレア - ゼ A，13,700 Da（1.0 g/L）
5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

2-7．充塡剤のロット間差

ピーク形状、溶出位置の差が小さいことから、ロット

カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 30 cm について、異なる間差が小さく製造安定性が高い充塡剤であることが分か

ロットの充塡剤を充塡したカラムの標準たんぱく質を測ります。

定したクロマトグラムの比較を図 19 に示します。

400
Lot.F

300

Lot.E

UV 280 nm

350

250
200
150
100

2’

2

4

3

カラム：TSKgel UP-SW2000（2 μm，4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム+ 0.05 % アジ化ナトリウム

Lot.D
Lot.C

流

速：0.35 mL/min

検出：UV 280 nm，マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：10 μL

Lot.B

50
0

1

〈測定条件〉

5

試料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）
2. γ - グロブリン，155,000 Da

Lot.A

3

図 19

5

7

9

11

（2' γーグロブリン二量体）（1.0 g/L）

13 min

3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
4. リボヌクレアーゼ A, 13,700 Da（1.0 g/L）

標準たんぱく質のクロマトグラム（充塡剤ロット間差）

5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

2-8．市販 UHPLC 用 SEC カラムとの比較

用 SEC カラム（粒子径 1.7 μm）において、標準たんぱ

2-8-1．たんぱく質の分離

く質を測定したクロマトグラムの比較を図 20 に示しまTSKgel UP-SW2000（粒子径 2 μm）と市販 UHPLCA）
TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D.× 30 cm）

1

A）

カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）市販 UHPLC 用 SEC カラム

3

2

UV 280 nm〈測定条件〉

54（1.7 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

2’

B）

す。

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 6.7）
+ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム1

B）
市販UHPLC用SECカラム（1.7 μm, 4.6 mm I.D.× 30 cm）
2

4

5

3

+ 0.05 % アジ化ナトリウム流速： 0.35 mL/min

検出：UV 280 nm, マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：10 μL

1
図 20

3

5

7

9

11

13 min

試料：1. チログロブリン，640,000 Da（0.5 g/L）
2. γ - グロブリン，155,000 Da（2' γーグロブリン二量体）（1.0 g/L）

標準たんぱく質のクロマトグラム（製品比較）

3. オブアルブミン，47,000 Da（1.0 g/L）
4. リボヌクレアーゼ A，13,700 Da（1.0 g/L）
5. p- アミノ安息香酸，137 Da（0.01 g/L）

─ 12 ─

2-8-2．ペプチドの分離

ニトリル水溶液 + 0.10 ％トリフルオロ酢酸としてペプ

TSKgel UP-SW2000（粒子径 2 μm）、TSKgel Super

チド試料を測定した較正曲線の比較を図 21 に、ペプチ

SW2000（粒子径 4 μm）及び市販 UHPLC 用 SEC カラド混合物を測定したクロマトグラムの比較を図 22 に示ム（粒子径 1.7 μm）において、溶離液を 40 ％アセト

します。

〈測定条件〉
カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｂ）TSKgel SuperSW2000（4 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｃ）市販 UHPLC 用 SEC カラム（1.7 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：40 % アセトニトリル+ 0.10 % トリフルオロ酢酸
流 速：0.35 mL/min
検 出：UV 215 nm, マイクロセル
温 度：25 ℃
注入量：10 μL
試料濃度：0.05 g/L
試 料：1. ミオグロブリン，17,800 Da
2. リボヌクレアーゼ A，13,700 Da
3. アプロチニン，6,512 Da
4. インスリン，5,808 Da
5. グルカゴン，3,483 Da
6. ビッグガストリン，3,849 Da
7. α - エンドルフィン，1,746 Da
8. ボンベシン，1,620 Da
9. アンジオテンシンⅢ，931 Da
10. Gly-Gly-Tyr-Ag, 451 Da
11. グリシン，75 Da

5

log M

4
3
2
● A）
TSKgel UP-SW2000▲ B）
TSKgel SuperSW2000■ C）
市販UHPLC用SECカラム

1
0

4

6

8

10

12

溶出時間 (min)図 21

ペプチド試料の較正曲線〈測定条件〉
3

UV 215 nm

A）

1

2

2

1
3

C）

図 22

（1.7 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：40 % アセトニトリル+ 0.10 % トリフルオロ酢酸

C）
市販UHPLC用SECカラム（1.7 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

7（4 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
Ｃ）市販 UHPLC 用 SEC カラム

4

2

5

Ｂ）TSKgel SuperSW2000

4B）
TSKgel SuperSW2000（4 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

1

3（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）

A）
TSKgel UP-SW2000（2 μm, 4.6 mm I.D. × 30 cm）
3

B）

カラム：Ａ）TSKgel UP-SW2000

4

911 minペプチド混合物のクロマトグラム

流速：0.35 mL/min

検出：UV 215 nm, マイクロセル

温度：25 ℃

注入量：10 μL
試料濃度：0.05 g/L
試料：1. ミオグロブリン，17,800 Da
2. インスリン，5,808 Da
3. LH-RH，1,182 Da
4. TRH，362 Da─ 13 ─

3．応用例

質を本質とするバイオ医薬品です。TSKgel UP-SW2000

3-1．バイオ医薬品の分離で測定することによりエポエチンアルファと多量体が十図 23 及び 24 にバイオ医薬品を TSKgel UP-SW2000

分に分離されました（図 23）。

で測定したクロマトグラムを示します。何れも第 17 改

ヒトインスリンは分子量約 5,800 のぺプチドで遺伝子組

正日本薬局方に準拠した条件で測定しました。尚、局方換え品が医薬品として使用されます。疎水性の高いペプに記載されたカラムとは内径が異なるため、線速度を合チドのため 20 % アセトニトリルを含む溶離液で測定されわせて流速を変更しています。

ます。TSKgel UP-SW2000 で測定することによりヒトイ
ンスリンと高分子量体が良好に分離されました（図 24）。

エポエチンアルファは分子量約 28,000 の糖たんぱく〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW2000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：0.25 mmol/L りん酸水素二ナトリウムUV 215 nm+ 1.7 mmol/L りん酸二水素ナトリウム+ 0.15 mol/L 塩化ナトリウム流速：0.3 mL/min

検出：UV 215 nm

注入量：10 μL
試

0

図 23

5

10

15

料：エポエチンアルファ製剤

min

エポエチンアルファの分離〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW2000（4.6 mm I.D. × 30 cm）
溶離液：0.1 % L- アルギニン / アセトニトリル / 酢酸 =UV 276 nm

13 / 4 / 3
速：0.2 mL/min

検出：UV 276 nm

注入量：10 μL
試

0

図 24

流

5

10

15

20

min

25

遺伝子組換えヒトインスリンの分離─ 14 ─

料：遺伝子組換えヒトインスリン30

3-2．オリゴヌクレオチドの分離

フィーを用いることにより、より簡便に分離分析をする

近年合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸医薬品が盛ことが可能です。核酸医薬品に用いられるオリゴヌクレ

んに開発されており、承認・市販された製品が増加してオチドは通常修飾型ですが、ここでは未修飾の鎖長の異います。オリゴヌクレオチドを合成する際、鎖長の異ななるオリゴヌクレオチドを TSKgel UP-SW2000 で分離る成分が生成されるため分離分析が必要となり、一般にした例を示します（図 25）。各試料とも主ピークと鎖長

イオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラの異なる成分が分離されています。又、約 100 量体まで

フィーで分析されます。一方、サイズ排除クロマトグラの分離が可能です。

〈測定条件〉
カラム：TSKgel UP-SW2000

50 mer（4.6 mm I.D. × 30 cm）

100 mer

溶離液：50 mmol/L りん酸塩緩衝液（pH 6.7）

UV 260 nm

20 mer

+ 0.3 mol/L 塩化ナトリウム19 mer

+ 0.05 % アジ化ナトリウム流速：0.2 mL/min

検出：UV 260 nm

温度：25 ℃

注入量：2 μL
試

料：粗合成オリゴヌクレオチド（100mer、50mer、20mer と 19mer の混合物）

min

図 25

粗合成オリゴヌクレオチドの分離

4．おわりにSW3000 より分子量分画帯が低いため、低分子量たんぱ

以 上、 粒 子 径 2 μm の 高 性 能 SEC カ ラ ム TSKgel
UP-SW2000 について概説しました。UHPLC 或いはシ

く質、ペプチド、オリゴヌクレオチドの分離に適しています。

ステムのデッドボリュームを低減した HPLC システム

TSKgel UP-SW2000 は既存のバイオ医薬品のみならを用いることにより、汎用の SEC カラムに比べより高ず、今後市場の拡大が期待されている中分子医薬品の研分 離、 高 速 の 分 離 が 可 能 で す。 既 存 品 TSKgel UP-

究開発、品質管理に利用可能と考えられます。

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※ “TSKgel” は東ソー株式会社の登録商標です。

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