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実験動物用マーカー遺伝子検出キット

Marker Gene Detection Kit
遺伝子改変動物に使用頻度の高い9種類のマーカー遺伝子をマルチプレックスPCRで検出再現性の高い動物実験を行うには、実験に使用する動物の遺伝子的な情報を正確に把握しておくことが重要です。本製品は、理化学研究所バイオリソースセンターにて開発された遺伝子組換え系統の交雑による意図しない遺伝的汚染を検出する方法＊１、2を遺伝子組換え動物の利用者が誰でも簡単に実施できるようにしたキットです。
遺伝子改変動物に導入頻度が高い9種類の代表的なマーカー遺伝子をマルチプレックスPCRにて増幅し、電気泳動にて各マーカー遺伝子の有無を判定することができます。

作業フロー

サンプル調製PCR・アルカリ溶解法によるライセート・細胞懸濁液
・精製ゲノムDNA判別

KOD FX Neoを用いたマルチプレックスPCR

アガロースゲル電気泳動による解析

特長1 さまざまなサンプルから高効率に検出
高効率・高成功率PCR酵素「KOD FX Neo」
（p.4掲載）を使用しているため、表1に示すように精製ゲノムDNAに加え、マウス尾（テール）・耳をアルカリ溶解法により簡易調製したライセートや、細胞懸濁液をそのままテンプレートとして用いることが可能です。マウス・ラット・ヒトにおいては内部標準（IC）としてトランスフェリンレセプター遺伝子を検出するよう設計されています。
表1．使用可能な動物、サンプルおよびテンプレート

動物種

マウス・ラットヒト

サンプル

テンプレート尾（テール）
・耳

ライセート

培養細胞

細胞懸濁液、精製DNA

血液・さまざまな組織等

精製DNA

培養細胞

細胞懸濁液、精製DNA

特長2 9種類のマーカー遺伝子を同時に検出
マルチプレックスPCRにより遺伝子改変動物に使用頻度の高い9種類のマーカー遺伝子（表2）をマルチプレックスPCRにて同時に検出することが可能です。
本キットにはPrimer Set 1とPrimer Set 2が含まれており、目的により標準とハイスループットの2種類のプロトコールを選択して検出できます。標準プロトコールではPrimer Set 1、2で別々にPCRを行い、ハイスループットプロトコールではPrimer Set 1、2を同時に使用し、ICを含む10種類すべての検出対象遺伝子を検出します。
表2．検出対象遺伝子

遺伝子名

略称

備

考

対象配列

Primer Set

トランスフェリンレセプター遺伝子

Tfrc（IC）

内部標準（Internal Control） NM̲011638

1、2

βガラクトシダーゼ遺伝子

lacZ

レポーター遺伝子NC̲011750

1

フリッパーゼ遺伝子

flp

組み換え酵素U46493

2

Creリコンビナーゼ遺伝子

cre

組み換え酵素NC̲005856

1

ハイグロマイシン耐性遺伝子

hyg

薬剤耐性遺伝子V014992

ネオマイシン耐性遺伝子

neo

薬剤耐性遺伝子NC̲008460

1

GFP（Green fluorescence protein）

GFP

蛍光タンパク質U557632

Cas9（CRISPR associated protein 9）

cas9

切断酵素

＊3

1

ピューロマイシン耐性遺伝子

puro

薬剤耐性遺伝子M25346

2IRES（Internal Ribosome Entry Site）

IRES

リボソーム進入部位

X74312

1※ マウス、ラット、ヒト以外の動物種では内部標準（IC）に使用しているトランスフェリンレセプター遺伝子は検出されませんが、基本的に表2記載の遺伝子を検出することは可能です。

2017

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特長3 容易に判別が可能
本キットには特長2記載の検出対象のマーカー遺伝子9種類と内部標準（IC）のDNA断片を含むControl templateが付属されています。
ポジティブコントロールとしてサンプルを同時に増幅させることで、電気泳動した際にバンドサイズを確認しやすく、判別が容易になります。

実施例

マウステールライセートを用いたマーカー遺伝子の検出

標準プロトコールとハイスループットプロトコールを使用し、下記の4系統のマウステールライセートを用いてマーカー遺伝子の検出を行いました。マウステールライセートはアルカリ溶解法により調製し、テンプレートとして1μl 使用しました。
その結果、アルカリ溶解法によるライセートから矛盾なく4系統に使用されているマーカー遺伝子を検出することができました。
【解析したマウスの系統】

マウス系統

マーカー遺伝子系統1−系統2cre, GFP

系統3hyg, neo, GFP

系統4

lacZ, neo, IRES

①標準プロトコールを用いた解析結果（検出対象遺伝子を2つに分けて解析しました）

Primer Set 1M

1

Primer Set 2
234NP

M

1.5kb

234N

P

1.5kb
Tfrc（IC）
lacZ

1kb【アルカリ溶解法によるライセート】

尾（テール）（約3mm）耳（約φ1.5mm）

1

Tfrc（IC）

1kb

flp

cre

マイクロチューブに移す

500bp

hyg

500bp
neo

GFP

cas9

12

puro

IRES

②ハイスループットプロトコールを用いた解析結果

50mM NaOH 180μl（検出対象を一度に解析しました）

ボルテックス

3

Primer Set 1 + Primer Set 2
M

95℃, 10min.

1234

N

P

1.5kb

1M Tris-HCl（pH8.0）20μl

1kb

ボルテックス
12,000rpm, 5min.（必要に応じて）Tfrc（IC）
lacZ
flp
M： 分子量マーカーcre
1： 系統 1hyg
2： 系統 2neo
3： 系統 3GFP
4： 系統 4cas9
N： ネガティブコントロール
puro
P： ポジティブコントロール（Control templateを使用）
IRES

4500bp

上清 0.5〜2μl
PCR（50μl）

文献

5＊1 Nakata H et al., Exp. Anim., 58：437-442（2009）＊2 吉木 淳, 動物実験技術：第49巻1号35-40（2014）＊3 Cong L et al., Science, 339（6121）：819-23（2013）

品名および内容
Marker Gene Detection Kit
・ Primer and Control template
Primer Set 1
Primer Set 2Control template
・ KOD FX Neo＊
KOD FX Neo（1.0U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX NeodNTP Mixture（2mM）

包装1セット（200反応用＊＊）

保存温度

Code No.

-20℃

MGK-101

価格￥82,000＊KOD FX Neo（Code：KFX-201）が1セット含まれます。
＊＊50μl反応を行った時の反応回数で表示しています。

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