顕微鏡

破壊的な蛍光顕微鏡
クリストファー・シュメイト
照明、フィルタ、カメラなどの顕微鏡の構成要素の進歩により、システムの設計にパラダイムシフトが起きており、その影響は広範囲にわたる。
顕微鏡は、世界で最もありふれた研べていたが、構造が進歩するにつれ、の応用で使われる可視波長で十分な強究室の機器である。ある研究室では、鏡台や試料ステージ、接眼レンズ、調度をもたらすために、さまざまなアー他のどの機器よりもまず顕微鏡を所有

光式照明を収めるための筐体が登場しク灯が開発されてきた（ 1 ）。興味深いのするようになっている。このように顕た。初期の試行錯誤では、基本的に構は、アーク灯のスペクトルまたはレー微鏡法は、イノベーションが絶え間な成要素は筐体デザインに合わせられザ線として利用できるものの中から最く新たな進展を生み出している分野だ。

た。そのため、カメラがよりよく機能も顕著に励起できるものとして、初期

ここ 10 年における最も劇的な進歩するために筐体を再設計するのではなの蛍光色素が設計されたことだ。我々により、光学顕微鏡法の最もありふれく、スタンダードな構造に合わせてカはこれら初期に好まれた波長と共存をたモードの 1 つが変化している。倒立メラが作られた。カメラ設計がより複続けている。

顕微鏡、落射顕微鏡、広視野顕微鏡は、雑化するにもかかわらず、である。こLED の出現と、LED が消費者や通その構造のほぼすべての構成要素に関の伝統的な顕微鏡筐体のデザインは顕信市場で使われることで、十分な強度する進歩によって破壊的な影響を受け微鏡のベンダー大手 4 社やその同類にかつ適切な波長で利用できるところまている。携帯電話のように、現在の倒よって守られてきた（下の写真）。本記

で技術が進んだ。アーク灯に対する立顕微鏡の設計や性能は 10 年前のも事では、蛍光顕微鏡の主な構成要素と、LED の利点は多くある。のをはるかに凌駕している。その結果、現在お互いに影響を与えている技術的・L
 ED にはウォームアップやクールダ新たな形状となり、機能が設計を導く破壊について述べる。顕微鏡法の設計シナリオが描かれている。の未来におけるインパクトも示す。

最も基本的なこととして、顕微鏡に照明はイメージセンサ（ヒトの眼またはカメラ）、接眼レンズ、サンプルホルダー、透過光は単純な白熱電球から得られ観察対象物がある。初期のデザインでるが、蛍光励起には高い強度を持つ特は、これらの構成要素を鏡筒の中に並定の励起波長を必要とする。ほとんどウンの時間が必要ない・シ ャッターなしでオンとオフを瞬時に切り替えることができる・多 くのアーク灯の寿命が数百時間であるのに対して LED の寿命は 1 万から 5 万時間である・時
 間による強度の減衰がない・ア ーク灯より低コストa)b)・強 度をパルス幅変調で連続的に変えることが可能
・所要電力がより低い・LED は狭帯域放射であるため、弱い紫外線（ UV ）や赤外線（ IR ）を放射しない・LED は数センチではなく数ミリメートル範囲で照射する（図 1 ）
・使用済み LED は危険廃棄物と見なされていない

接眼レンズのない顕微鏡の設計は非常にシンプルなものとなる（ a ）。米エタルマ社（ Etaluma ）の光学モジュール（ b ）。

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現在のところ、各波長に対応する別々の LED を必要とすることは強調a)b)

図 1 LED はアーク灯に比べ多くの利点がある（ a ）。CMOS カメラは、CCD カメラの多くの性能特性を上回る（ b ）。（提供：エタルマ社提供）すべきだろう。すでにベンダーは、フたりして、励起から不要な UV と IR 波斥するために必要だ。散乱光は、蛍光ィルタを通したアーク灯に代わる、直長を除去するためにフィルタを必要と放射強度のほぼ 1000 倍である。

接マウントできる非常に明るい LED エしている。これと比較して単色 LED

近年の無限遠補正光学系は、有限共ンジンを提供している。これらの照射

では、スペクトルをさらに狭めるため役光学系よりも複雑化するものの、フシステムは、従来の光路の非効率性をだけに励起フィルタが用いられる。まィルタなどの光学構成要素を光路に誘代償するほど十分な明るさでなければたダイクロイックフィルタは、サンプ導できる。フィルタはほとんどの場合、ならない。

ルに対して励起を反射させるために用物理的に光路の内部と外側に移動されいられ、より長い発光波長が眼やイメる。しばしば、励起、ダイクロイック、ージングセンサに届くようになる。こ

放射範囲を選択するために 3 つのフィ

従来より、アーク灯の励起波長を選れらのフィルタは発光を描写するためルタホイールが一斉に機能する、光路択したり、不要な幅広い放射を排斥しに、数ケタ大きい非励起散乱波長を排を変更することで必然的に画像レジス

フィルタ

ン ル

トル ン
パク
フ ル

カメラ（ク）

図２ SearchLight ツール（右）が示すように、マルチバンドパスフィルタにより半導体のロバスト性とゼロピクセルシフトが可能になる。（提供：米セムロック社（ Semrock ））Laser Focus World Japan 2019.731

顕微鏡

図３ コンパクトで高解像な 3 色蛍光顕微鏡のモジュールは、ピクセルシフト合成を不要として高感度とするために LED 励起、マルチバンドフィルタ、CMOS カメラを用いる。

b)a)

トレーションが変わり、各蛍光チャネを送り、長時間露光でキャプチャされ能なバージョンを意味する。sCMOSは、

ルに対してピクセルシフトとして知らた。長時間露光するときには、露出中優れた量子効率とダイナミックレンジ、れている、異なるイメージシフトが生の動きと振動を最低限に抑える必要が暗ノイズ仕様をもち、CCD センサと同成される。

ある。この理由により、従来の顕微鏡等のパフォーマンスを有するグローバルのほとんどは巨大で重い空気振動テーシャッター方式である。CMOS は、よブルの上に置かれている。

り高性能の応用においても CCD に置

最初にマルチバンドパスフィルタを用 い た の は ダ ン・ ピ ン ケ ル 氏（ Dan（2）Pinkel ）だ（図 2 ） 。マルチバンドダ

天文学が遠い星のかすかな光を捉えき換わるだろうと推定されている。電イクロイックフィルタは、複数の異なるために CCD カメラを開発したため、子増倍型デバイス（ emCCD ）やペルシる励起をサンプルに反射させ、さらにCCD カメラは蛍光顕微鏡法のわずかなェ冷却なしに、CMOS カメラは CCD各チャネルのそれぞれの励起を透過さ蛍光のための自然なツールとなった。

カメラより 2 〜 10 倍小さい。重量、サせることができる。一致したマルチバ

CCD カメラは一般的に高価で、高度イズ、環境抵抗性が、新たな顕微鏡法

ンドパスの放射フィルタはさらに、セなペルシェ冷却と電子増倍エレクトロの構造において位置づけられる。

ンサにとって不要な光を排斥する。こニクスを必要とする。

（3）

筐体の構造により、フィルタホイールがな

もともと CMOS センサの性能はかなくなり、ピクセルシフトが不要な、コり低かったが、消費者向けのデジタル顕微鏡法の歴史のほとんどにおい

ンパクトな半導体のフィルタソリュー

カメラやスマートフォンの出現により、て、ヒトの眼は画像の感度に適していションが存在するようになる。多位置CCD と CMOS のギャップは埋まりつない。そのため、顕微鏡のデザインはホイールにあるカスタムフィルタを代つある。過去 30 年間 CCD のリーダー

これまで接眼レンズを重視している。

替できない欠点はあるものの、普及しであったソニーが 2017 年に製造を中

デジタルイメージングの時代においてている色素に対するマルチバンドフィ止し、2020 年に出荷終了予定であるも、この特徴は、システムにデジタルルタのセットは商業的に入手可能だ。

ほどだ。現在、CMOS センサは低コスカメラが搭載されていない場合に続いト、高速な読み出し速度のためにビデている。この設計では観察するために、オ、スマートフォン、デジタル一眼レ画像をステージから相対的に人間工学フに応用され、それらの主要なセンサ的な位置に向け直すことが必要となとなっている。

る。問題は、光路でレンズやミラーがカメラ最初の蛍光イメージは、ミラーとレンズのあるポートを通じて筐体にマウントされた一眼レフのフィルムカメラ

科学研究用 CMOS（ sCMOS ）は、現多くなればなるほど信号が弱くなるこを使い、接眼レンズからカメラに画像在の顕微鏡法で用いられる、より高性とだ。概算では、ある屈折率を持つ素32

2019.7 Laser Focus World Japan材から別の素材に光が移動するとき、小型に、安価に、パワフルに4％もの光が喪失する。そのため、光技術が発展するにつれ、製品はよりがレンズを通過するとき、強度の最大小型に、安価に、パワフルになる傾向8％が失われる。従来の設計では、イにある。顕微鏡法もこの傾向の影響をメージセンサに届く前に 60％以上の光受け、これまで述べた構成要素は、光子が失われるとされる。対象物から届路長や光路内の構成要素数、動作が最く画像を維持するために、レンズが多小化された筐体をベースとする顕微鏡

くなるほど多くの調節が必要になるこ設計の新たな時代の到来を告げている。とは強調すべきだろう。

こうした破壊により、数十年に渡る製光子効率が低くなると、バックグラ品ライン設計のレガシーがない市場にウンドも高くなる。シグナルノイズ比新たな企業が参入できる道が開かれる。

は最重要であり、バックグラウンドが照明、フィルタ技術、CMOS カメラ

高ければ素晴らしいシグナルも無意味の発展により、手のひらに収まる顕微だ。解決のため、回転式の遮光ドアの鏡が作られるだろう。小型サイズによある暗室が作られた。

り振動抵抗性ができ、振動台が不要に接眼レンズへの固執は、使いやすいなる。これらの進展により、感受性のという事実で説明できる。それゆえ、劇的な増加（ 2 倍以上）と所要電力の減ユーザーは画像を評価するとき、接眼少（ 5 VDC ）、そして環境抵抗性が実レンズの使用を心地よいと感じる。し現する。高感度により暗室の需要がなかし、カメラとディスプレイの解像度くなり、シンプルな設計により、技術が向上するにつれて新世代の顕微鏡使的専門知識がなくても装置を簡単に扱用者は、接眼レンズのために前屈姿勢えるようになる。サイズと所要電力ので何時間も過ごすのではなく、ヘッド減少は、より多くのカメラを平行に置アップディスプレイを通じて 4K モニタ

くことができ、狭いスペースに複数のーから画像を得ることが快適と感じつ顕微鏡を設置できることを意味するつある。

（図 3 ）。

前述したように、高倍率と高感度は、環境抵抗性により、組織培養インキ筐体デザインでは解決できない、振動ュベータ、グローブボックス、低酸素のない環境を必要とした。そのため、や嫌気性チャンバ、さらに冷蔵庫内で巨大で空気圧サスペンションのある防動作する in situ（その場で）顕微鏡法が振台が必須となった。

可能になる。生きた細胞の成長や振る従来の巨大な筐体デザインの利点

舞いを観察することは、生物医学分野

は、アップグレードのために専用に作における近代の顕微鏡法の中で最も強られたポートと接続する付属品による力な使用法の 1 つである。

拡張性だ。新たな技術が利用可能になるにつれ、フィルタホイール、進化したカメラ、レーザ、回転盤、マイクロミラーアレイを含む付属品のいくつかは、ベースとなるプラットフォームより高価になっている。一方で、装置の通常のユーザーにとって、難解な付属品の追加は重荷となっている。

参考文献（ 1 ）http://bit.ly/BOWref1（ 2 ）http://bit.ly/BOWref2（ 3 ）http://bit.ly/BOWref3
著者紹介
クリストファー・シュメイトは、エタルマ社CEO である。
e-mail：cshumate@etaluma.com
URL：https://etaluma.com
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