Analyse des étudesgénétiquesfamiliales : établir lelien variants rares maladie et intégrer
l’expression desgènes

Alexandre Bureau

Plan de la présentationü Variation génétique et séquençage à haut débit§ Analyse de variants génétiques rares dans les familles
basée sur les probabilités de partage de variants§ Calcul des probabilités de partage§ Étude de puissance de l’approche de partage devariants rares§ Intégrer l’expression des gènes aux analyses
génétiques dans les familles

Variation dans laséquence d’ADN
Génotypes :Individu 1

CTCCGAATACGAATGGCCGT C/G, A/T
CTCCGAATAGGATTGGCCGT

Individu 2

CTCCGAATACGAATGGCCGT C/G, A/A
CTCCGAATAGGAATGGCCGT

Individu 3

CTCCGAATACGATTGGCCGT C/C, T/T
CTCCGAATACGATTGGCCGT

SNV = Single Nucleotide Variant(Variant de nucléotide), identifiés par no. rsXXX

L’évolution duséquençage
Déterminer la séquence d’ADN par la méthode Sangerétait un processus coûteux et fastidieux, réservé auxgrands projets de génomique ou à des régions cibléesdans les études de maladies.
À partir de 2007, diverses compagnies de génomiqueont introduit des méthodes de séquençage de nouvelle
génération atteignant des débits beaucoup plus élevés
que la méthode Sanger.
Cela a permis l’avènement d’études de séquençage àgrande échelle visant la détection des variants rares
impliqués dans des maladies.

La séquence du génome
humain pour 1000$!
Évolution du coût de séquençage d’un génome humain

Source: Illumina

Résultat de l’alignement ds
Integrated Genome Viewer

Transmission génétique

Source: A. Labbe

Plan de la présentation§ Variation génétique et séquençage à haut débitü Analyse de variants génétiques rares dans lesfamilles basée sur les probabilités de partage devariants§ Calcul des probabilités de partage§ Étude de puissance de l’approche de partage devariants rares§ Intégrer l’expression des gènes aux analyses
génétiques dans les familles

Séquençage d’apparentés
distants

9Whole exome sequencing studyof multiplex cleft families
54 multiplex cleft families ascertained through nonsyndromic oral clefts in distant relatives• Sequenced 2 affected subjects in 50 families, 3 in 4 families

Families recruited from Germany, Philippines, India,Syria, Taiwan, China, USA
Exon capture using Agilent SureSelectSequencing of 100 bp paired-end reads on Illumina Hi-Seq
Multi-sample variant calling using GATKDefined rare SNVs as < 1% frequency in Exome sequencing
project (ESP) and 1000 Genomes, and seen in < 20% offamilies (60,038 exonic and splice site SNVs).
10Méthode basée sur lepartage de variants rares
Sachant qu’on observe un variant rare chez un sujet
séquencé, il y a une probabilité qu’on l’observe aussi
chez son ou ses apparentés séquencés• Cette probabilité dépend seulement de leur degréd’apparentement.
• Elle est calculées sous l’hypothèse que le variant n’est ni lié
ni associé à la maladie (hypothèse nulle).

La probabilité que tous les sujets atteints partagent
un variant dans la ou les familles où il est détecté est
une valeur p pour cette hypothèse nulle.
Même principe que l’analyse de liaison basée sur lepartage d’allèles identiques (identity-by-descent ouIBD)

Probabilités de partage
sous l’hypothèse nulle

Formule:Relation
Parent-enfant (D=1)
Oncle-neveu (D=2)
Cousins germains (D=3)
Petits cousins (D=5)

Probabilité de partage
IBD
Variant rare
1/2D-1
1/(2D+1 – 1)*
1
1/2
1/4
1/16

D: degré de parenté*Feng et al., 2011. PLoS One 6, e23221

1/3
1/7
1/15
1/63

Plan de la présentation§ Variation génétique et séquençage à haut débit§ Analyse de variants génétiques rares dans les familles
basée sur les probabilités de partage de variantsü Calcul des probabilités de partage§ Étude de puissance de l’approche de partage devariants rares§ Intégrer l’expression des gènes aux analyses
génétiques dans les familles

Problèmes à résoudre
1. Calcul de la probabilité de partage d’un variant rare
par n=3+ apparentés et 2+ apparentés de familles
complexes.
2. Calcul de la probabilité de partage d’un variant rare
par k parmi n>k apparentés.

1. Rare variant sharing by
n sequenced relatives
Ci  :  Number of copies of the rare variant in subject i
Fj  :  Indicator variable that founder j  introduced one copyof the RV into the pedigree

16Expression in a special case
Sequenced subjects descend from common foundercouple through independent lines of descent

Where Dij is degree of relatedness between sequenced
subject i and founder j, d(j) is subset of sequenced
subjects descending from founder j and Df is the sumof Dij for a common founder17

Calcul exact sur arbres
généalogiques simples
Entrées: objet de classe
S3 "pedigree" (liste devecteurs)
0
Attribuer profondeur dechaque sujet.

1

De profondeur R à 0,
incrémenter nombre de2
générations desbranches de l’arbre,
combinant les branches 3qui se rejoignent.
Sortie: classe S4"RVsharingProb ».Approximation Monte Carlopour arbres complexes
Définition d’une classe
S4 "trio" (parents etenfant)Codage de l’arbre enliste récursive de trios
Introduit un variantchez un fondateur
Simule transmission
avec prob. ½ de parent
à enfantImplantation
Module R RVsharing• Calcul exact sur arbres généalogiques simples• Approximation Monte Carlo pour arbres généalogiques
complexes

Probabilités de partage
observées vs. attendues
Étude des fentes
labio-palatines
Sous-ensemblede 2 355 variants
avec puissancesuffisante.

2. Partage par sousensemble des atteints
Hétérogénéité intra-familiale, erreur de diagnosticØ Variant causal absent de certains atteints

Avec grand nombre d’atteints dans une famille,
partage par un sous-ensemble d’atteint est informatif

Ex: famille québécoise
avec trouble bipolaireporteur atteint BP

Valeur p du partage obs.
= 0.0072

porteur non-atteint
non-porteur atteint BP
non-porteur non-atteint

Partage d’un variant rare
par k parmi n>k sujets
Pour le numérateur P[C1=…=Ck=1,Ck+1=…=Cn=0], on sesert des relations:
P[A,B,C,Dc] = P[A,B,C] – P[A,B,C,D]
P[A,B,Cc,Dc] = P[A,B] - P[A,B,C] - P[A,B,D] + P[A,B,C,D]…
Chacun des termes calculés avec algorithme pourpartage par tous les sujets appliqué à k, …, n sujets.
Dénominateur P[C1+…+Cn>=1] inchangé.
Disponible dans prochaine version du module RVsharing.

Plan de la présentation§ Variation génétique et séquençage à haut débit§ Analyse de variants génétiques rares dans les familles
basée sur les probabilités de partage de variants§ Calcul des probabilités de partageü Étude de puissance de l’approche de partage devariants rares§ Intégrer l’expression des gènes aux analyses
génétiques dans les familles

Power assessment
Simulation setup
Variant frequency =0.0001
Dominant effect
Disease prevalence = 1%
Heterogeneity model
Recurrence risk
1st cousins: 2
2nd cousins: 1.25
α = 2.2 x 10-526

Alternative: comparer avec
un groupe témoin en plus
En plus du partage par apparentés atteints, compare
fréquence du variant chez les atteints p1 à fréquencedans un groupe témoin p0.
Avantage:• utilise information de tous les atteints porteurs (incluantatteints non-apparentés)Désavantages:• Groupe témoin doit être de même origine ethnique que legroupe des cas, car les fréquences de variants fluctuent
d’une population à l’autre. Échantillons de référence (1000génomes, Exome sequencing project) souvent inappropriés.
• Le nombre de variants considéré inclut tous les variants
observés, incluant ceux seulement chez les témoins (pénalité
plus grande pour la mutiplicité des tests)

Simulation
100 familles avec paire de petits cousins atteints +1000 témoins non-atteints non reliés
Variant avec risque relatif = 50, de fréquence = 0,001
Prévalence de la maladie dans la population = 1%
Compare• test de probabilité de partage• test association + liaison et test de liaison seule (modèledominant) implanté dans pVAAST (Hu et al. Nat Biotechnol,2014. 32(7): p. 663-9.)

100 réplicats

Comparaison de puissance
Test statistique
Test exact de partage de variant rare
Test cas-témoin + liaison (pVAAST CLRT)
Test liaison seulement (pVAAST LOD)

Puissance*54%
100%
19%

* Seuil α = 1 x 10-5• Pour CRLT, puissance reste 100% jusqu’à α = 10-15• Score LOD calculé par pVAAST capture liaison
seulement, pas le partage d’un allèle spécifique.

Extension: analyse au
niveau du gène
Analyse d’un variant à la fois est limitée aux variants
retrouvés dans plus d’une famille (ou dans une très
grande famille).
• Dans l’étude des fentes labiales, 57 583 des 60 038 variants
rares n’ont pas pu être analysés faute de puissance.

Analyse simultanée de tous les variants d’un mêmegène permet d’inclure variants vus dans une seulefamille.
Problèmes à surmonter:• Variants de risque noyés parmi variants bénins
• Traitement de plusieurs variants dans une même famillePlan de la présentation§ Variation génétique et séquençage à haut débit§ Analyse de variants génétiques rares dans les familles
basée sur les probabilités de partage de variants§ Calcul des probabilités de partage§ Étude de puissance de l’approche de partage devariants raresü Intégrer l’expression des gènes aux analysesgénétiques dans les familles

L’expression des gènes

Source: A. LabbeEastern Quebec major
psychosis kindreds
48 multigenerational kindreds densely affected byschizophrenia (SZ) and bipolar disorder (BP).
Ascertainment criterion: at least 4 relatives with SZor BP.
Over 1000 subjects with diagnosis, gene expression
and genotype.
Gene expression measured on immortalized
lymphocytes using Illumina chip (19 000 expressedtranscripts).
720 000 SNVs genotyped using Illumina Omni Expresschip.

Représentation graphique
S: Génotype (SNVs)

X1

G: Expression degèneY: Maladie (oui/non)

SGX2Y

X: Covariables

Objectif
Détecter SNVs impliqués indirectement dans lamaladie via l’expression de gènes sans quel’association avec la maladie soit détectabledirectement.

X1
SG

X2

Y

Approche de Zhao et al.
Applicable à des sujets non apparentés
Modèle de la maladieg(E[Yi|Gi,X1i]) = α0 + GiTαG + X1iTαX
Peut inclure expression de plusieurs gènes

Modèle de l’expression de gènes
GiTαG = β0 + SiTβS + X2iTβX + εi
Estime α et β en résolvant équations d’estimation
Estimation empirique de la varianceZhao et al. Biometrics, 2014. 70(4):881-90

Analyses familiales
Appliquer le même modèle que Zhao et al.
• Tenir compte de l’apparentement dans l’estimation de lavariance (estimateur robuste à la dépendance familiale)

Tenir compte de l’apparentement dans le modèle• Modèle linéaire mixte généralisé?
• Difficile de conditionner sur la condition de recrutement desfamilles (ex. au moins 4 sujets atteints)

À la recherche d’étudiants et collaborateurs!

Remerciements
Financement :• Fonds de recherche du Québec, Santé• NIH X01-HG-006177, R01-DE-014581, U01-DE-020073• Intramural Research Program of NHGRI• Deutsche Forschungsgemeinschaft• Center for Inherited Disease Research• The Eastern Quebec Kindred Study is funded by CIHR (grantsMT-12854, MOP-74430 and MOP-1194089) and by a Canada
Research Chair (# 950-200810) in the genetics ofneuropsychiatric disorders of which Michel Maziade is the Chair.

Recrutement:• Deutsche Selbsthilfevereinigung für Lippen-GaumenFehlbildungen

Programmation: Jordie Croteau (CRIUSMQ)
38

Potential –log10 p

Selection of rare SNVs to test-log10 (0.05)

αdetcercorinorr
Bonfe

2355
Rank of variant

39

Impact of variant frequency on actual
identical-by-state sharing probability

40rs149253049 in ADAMTS9
Synonymous triallelic SNV
G allele shared by 3 relative pairs from India is rarest(not seen in ESP and 1000 Genomes)
No evidence of relatedness among founders of these 3families
Performed assessment of sensitivity to population
frequency in an Indian population

41

Sharing remained significant
up to allele frequency of
1.1% for G allele

42

rs117883393 in ORA2T allele shared in 3 families out of 4 where it occurred
Population frequency 0.8% in Caucasians ESP
2 Syrian families shared T allele where cryptic relatedness
among founders was suspected (estimated mean kinship =0.0013)
P-value increased from 6.1 x 10-6 to 1.4 x 10-5 after
correction for cryptic relatedness (not taking allele
frequency into account)43

Poissons solubles
Acrylique sur toile
Jean-Claude Bélanger

Programme d’accompagnement
artistique Vincent et moi