医薬品におけるニトロソアミン類生成のリスク軽減について: 医薬品添加剤の役割-NEW-更新版

乳糖中の微量亜硝酸塩の測定における課題にどう対処するか

Ricarda Leister – Head of R&D
MEGGLE Excipients, Wasserburg, Germany

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1. はじめにMEGGLEのホワイトペーパー"医薬品におけるニトロソアミン類生成の リスク軽減について: 医薬品添加剤の役割"では、近年、製薬業界や保健当局にとって重大な関心事となっている、医薬品および添加剤製造におけるニトロソアミン不純物の問題について詳細に解説している。今回、乳糖中の微量亜硝酸塩を測定できる新しい分析法の開発にMEGGLEが取り組んだことがきっかけで、ホワイトペーパーを更新することとなった。この新しい分析法は、ミュンヘン工科大学（TUM）の協力のもと、検証に成功した。
よく知られているように、添加剤は、添加剤中に存在する前駆物質（亜硝酸塩、アミンなど）を介して、ニトロソアミン類の生成に寄与する可能性がある。従って、この新しい測定法によって、弊社の幅広い乳糖製品群において微量濃度の亜硝酸塩の測定が可能になったことは重要な成果である。

2. MEGGLE の添加剤中の亜硝酸塩 - 新分析法とその結果
弊社は長年にわたり、乳糖の亜硝酸塩含量を定期的にモニタリングしている。硝酸塩含量もまたベビーフードにとって重要であるため、乳製品用に特別に設計され、乳児用乳製品に要求される低亜硝酸塩含量を測定するのに十分な感度を持つ方法を導入した（ISO 14673-3:2007-05）。MEGGLEの医薬品グレードの乳糖では、通常、乳糖粉末から亜硝酸塩は検出されないことが過去に判明している（検出限界0.2ppm以下）。注目すべきは、すべての値が、Boetzelら（2022）が乳糖について報告した平均値よりも低いことである。
有効性が確認された新しい分析法により、乳糖中の微量亜硝酸塩の測定が可能になった。新分析法はイオンクロマトグラフィー（IC）をベースにしており、これはイオン性溶質の分離と定量に使用される液体-固体クロマトグラフィーの手法である。IC分析では、固相として異なるカラム、液相として異なる溶離液系を選択することができる。イオンの交換と分離は、適用される固定相（イオン交換カラム）に対するイオンの電荷と親和性に依存し、分離されたイオンは、導電率測定やUV/VIS分光法を用いて検出・定量される。最もよく使用されるカラムは、水酸化物選択的陰イオン交換カラム、炭酸塩溶離液陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、イオン排除カラム、アミノ酸カラム、逆相カラムである。ラクトースマトリックス中の亜硝酸塩を良好な分離能で定量するために、カラム、溶離液システム、グラジエント、流速、およびサンプル前処理に関してICメソッドのセットアップを最適化した。乳糖を用いたメソッドバリデーションに基づく定量限界（LOQ）は0.03 ppm、検出限界（LOD）は0.01 ppmである。
新測定法の検証に成功した後、異なる製品群（篩過、粉砕、造粒、スプレードライおよび無水乳糖、ならびに粉砕および篩過した吸入グレード乳糖）から少なくとも3検体を分析した。その結果、すべて0.01ppm以下との結果が得られた（表1）。

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表1. MEGGLE添加剤中の亜硝酸塩濃度。定量限界（LOQ） 0.03 ppm、検出限界（LOD） 0.01 ppm。

製品グループ篩過乳糖
粉砕乳糖
造粒乳糖
スプレードライ乳糖
無水乳糖

商品名SpheroLac® 100

GranuLac 200
GranuLac® 200 US
Tablettose® 70
Tablettose® 80
Tablettose® 100
FlowLac® 90
FlowLac® 100®

DuraLac® H

吸入グレード篩過乳糖

InhaLac® 120
InhaLac® 230
InhaLac® 251

吸入グレード
粉砕乳糖

InhaLac® 145
InhaLac® 300
InhaLac® 400

亜硝酸塩含有量試験ロット数< 0.01 ppm

3< 0.01 ppm

5< 0.01 ppm

3< 0.01 ppm

6< 0.01 ppm

3< 0.01 ppm

3< 0.01 ppm

3MEGGLEの医薬品グレードの乳糖製品群では、亜硝酸塩の値が0.01 ppm以下であるため検出されず、基本的に「亜硝酸塩フリー」であることを意味する。MEGGLEの直接打錠（DC）乳糖グレード（造粒乳糖、スプレードライ乳糖、無水乳糖）においても、亜硝酸塩の含有量は最低量であり、これは医薬品製造におけるニトロソアミン類生成のリスクを軽減/低減するための完璧なソリューションとなりえる。

3. 亜硝酸塩定量へのIC応用研究
MEGGLEは、TUMとの新測定法の検証の成功に加え、Thermo Fischer Scientific社と共同でICの応用研究も実施した。
この研究では、微量濃度の亜硝酸塩測定のためのいくつかの可能性のあるICセットアップが評価された。
ここでの主な課題のひとつが、製品マトリックスからの干渉（マトリックス効果）であった。
乳糖にはppmの範囲でミネラル塩や有機酸のイオンが含まれているが、これらはターゲットイオンの分離と定量を妨害し、共溶出による不正確な結果に繋がることがある。
例えば、マトリックス中に乳酸、酢酸などの有機酸が存在すると、亜硝酸塩に通常使用される低波長(210nm)での分離やUV検出に影響を与える可能性がある。同様に、塩化物、リン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩のような無機および有機陰イオンが存在すると、導電率測定を妨害する可能性がある。これらのマトリックス効果を最小限に抑えるために、インライン透析、沈殿、ろ過/プレカラムなどのサンプル前処理技術が使用されることがある。選択的イオン交換樹脂と溶離液は、マトリックス中の妨害物質から標的イオンを分離するのに役立つのである。（Gapper et al., 200; Jireš, J. & Douša, M., 2022, Thermo Scientific
Application Note 279）。

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Thermo Fischer Scientificのアプリケーションラボでは、炭酸塩システムやグラジエント水酸化物システ
ムなど、導電率測定やUV検出と組み合わせたいくつかのICシステムの設定が評価された。テスト設定においては、マトリックス除去システムが使用された。

3.1 材料と方法
本研究では、濃度50 g/Lのラクトース溶液を調製した。本測定法の目標定量下限は、固形分に関する亜硝酸塩20 µg/kg（0.02 ppm）であり、試験溶液中の1 µg/Lに相当する。標準溶液には1 µg/Lの亜硝酸塩が含まれていた。
本研究で使用したさまざまなカラム、溶離液、検出システムを表2に示す。
表2. 使用したICシステムの材料と方法。定量下限（LOQ） 0.02-0.05 ppm。

IC システム (Dionex™ Integrion™ and Dionex™ Aquion™)
カラム

溶離液システム

IonPac™ AS-14A

イソクラティック炭酸塩システム

IonPac™ AS11-HC, AS-15,AS-18, AS-19 and AS-30

グラジエント水酸化物システム

検出
導電率測定とUV検出(210 nm)
導電率測定とUV検出(210 nm)

これらのカラムは通常、水分析などの無機陰イオンの分析に使用される。

標準溶液では、少量の亜硝酸塩の定量が可能であった (クロマトグラム1を参照)。一方、ラクトース溶液に関しては、共溶出の影響で、この低濃度で亜硝酸塩をUV検出でも導電率測定においても、信頼性のある定量をすることはできなかった (クロマトグラム2+3を参照)。
クロマトグラム1：標準溶液（1 µg/L 亜硝酸塩）を導電率で測定

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クロマトグラム2：ラクトース溶液（50 g/L）を導電率で測定

クロマトグラム 3: ラクトース溶液 (50 g/L) と標準溶液の複合

そこで、代替アプローチとして、ICシステムをポストカラムグリース誘導体化および525 nmでのUV検出と組み合わせた。
またこの方法でも、濃度50 g/Lのラクトース溶液を調製した。

この方法の目標定量下限は0.1 µg/Lであった。固形分に関連する亜硝酸塩は、試験溶液中で1 µg/Lに相当する。標準液には1 µg/Lの亜硝酸塩が含まれていた。
この研究では、NaClを溶離液とするIonPac™カラムAS-22を備えたDionex™ Integrion™を、カラム後のグリース誘導体化と525 nmでのUV検出と組み合わせた。
この方法では、ラクトース溶液中の亜硝酸塩1 µg/Lを安全に定量することができ、干渉ピークは存在しなかった (クロマトグラム 3 を参照)。 試験した GranuLac® 200 サンプルの亜硝酸塩の量は 2 ppb (0.002ppm) と推定され、これは弊社の新しい測定方法での検証結果 (検出限界 0.01 ppm 未満の乳糖の結果) と十分一致する。

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クロマトグラム4:標準溶液（亜硝酸塩1 µg/L）とラクトース溶液（50 g/L）の比較（IC Plusポストカラムグリース反応および525 nmでのUV検出を使用）。

標準溶液 1 µg/L

ラクトース溶液 50 g/L
乳糖サンプル 2 ppb 亜硝酸塩（推定値）

この応用研究から、微量濃度の亜硝酸塩含有量の測定は困難な可能性があり、製品のマトリックスを考慮する必要があることが判明した。
グリース反応は、さまざまなサンプル中の亜硝酸塩を検出するために一般的に使用される確立された方法である。この方法は、酸性条件下で亜硝酸塩とスルファニル酸およびN-(1-ナフチル)エチレンジアミン二塩酸塩を選択的に反応させることで、分光光度法を用いて測定できる赤紫色のアゾ色素を生成する。
試料の540 nmにおける吸光度を所定の標準曲線と比較することにより、試料中の亜硝酸濃度を算出することができる。
Gapperら(2004) は、カドミウムまたはバナジウムによるオンライン・ポストカラム還元を組み込んだ高性能イオン交換法を、グリース試薬による誘導体化と540 nmでの検出を組み合わせて、乳製品とベビーフード用に報告した。このクロマトグラフィーによる硝酸塩と亜硝酸塩の分離は、発色性のアゾ誘導体への特異的なポストカラム変換と組み合わされ、従来のアッセイの潜在的なマトリックス干渉の制限や、他に報告されているクロマトグラフィー検出方法の固有の欠点を回避している。

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4. まとめと展望
医薬品中の N-ニトロソアミン生成のリスクを最小限に抑えるには、原薬と添加剤の種類と量を慎重に選択することが重要であり、特に原薬の製造工程と潜在的な不純物や前駆物質を第一に考慮する必要がある。 しかし、医薬品の製造工程自体もニトロソアミン類の生成に影響を与える可能性があり、その点において直接打錠は、水と熱の使用を避けるため好ましいプロセスである。通常、既存処方はそれに応じて、処方変更することができる。
直接打錠用に特別に設計されたMEGGLEの添加剤は、湿式造粒から直接打錠への切り替え、製剤中の添加剤量の削減、必要な打錠圧の低減、または必要な崩壊剤の量の削減に寄与し、N-ニトロソアミン生成のリスクを軽減する。
しかしながら、亜硝酸塩含量の測定のために使用される分析法は、潜在的なマトリックス干渉に関して慎重に検討されなければならないことに注意することが重要である。さらに、固形製剤中のN-ニトロソアミン生成を促進するすべての固相相互作用がまだ完全に解明されているわけではないため、実際の配合での予備試験を行うことが望ましい。局所的なpH勾配、反応性官能基の存在、対イオン効果、形態学的な型、粒子径、構成成分の表面積など、固相反応に影響を及ぼす可能性のある他の要因を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
本研究では、正しい方法を用いれば、ICを用いた亜硝酸塩の定量が非常に微量濃度まで可能であることが示された。 ただし、乳糖では共溶出が見られるため、これは課題となる可能性がある。多くの異なるICの試験設定 (6 種の異なるカラムで評価) においても、この影響により、微量濃度 (20 ppm) の亜硝酸塩においては信頼性の高い定量を行うことはできなかった。 ラクトース溶液中の亜硝酸塩の定量のための最も感度の高い試験設定は、IC とポストカラムグリース誘導体化を組み合わせることによって達成された。この試験設定におけるMEGGLEの GranuLac® 200 サンプルの亜硝酸塩推定量は 0.002 ppm (2 ppb)と極めて低い値であった。報告されている乳糖中の亜硝酸塩の値は、しばしばこの数値より著しく高い。
したがって、MEGGLEは検証された新しい試験法により、弊社の乳糖全製品が「亜硝酸塩フリー」であることを示すことができた。

MEGGLEがニトロソアミン類に関連するリスクを軽減するためにどのようなお手伝いができるか、さらに詳しくお知りになりたい方は、弊社までご連絡ください。
この場をお借りして、これらの研究において熱心で専門的かつ忍耐強い協力をしていただいた、ミュンヘン工科大学とThermo Fischer Scientific社に感謝申し上げます。

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参考資料
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