光学・高度顕微鏡法

高度顕微鏡法の実用上の考慮点
セス・W・ペリー、ジム・パッサルゴ、パラシャント・プラバート
研究対象の生物学を正確に描く高度イメージング法のデータを確かなものとせる（すなわちシステムの感受性を最するためには、伴となる課題の理解が必要である。

大化させる）。そのレンズは通常、最大補正プランアポクロマートレンズで

ほんの 10 年前では、全反射照明蛍

NA が達成しうる最大数は、一般的あり、色の忠実性、イメージの質を向光（ TIRF ）顕微鏡法や超分解能顕微鏡に、対物の倍率、光学収差の補正度合上させ、画素シフト（画像レジストレ法は物理学者、エンジニア、学際的ない、油浸レンズとともに増加する。実ーション）を減少させる。レンズの NA

科学者や研究者の領域がほとんどだっ用的にも理論的にも、NA の限界は 1.4を最大化することで常に x-y-z 分解能た。商業的なターンキーシステムを利〜 1.7 である（対物 NA は液浸媒体の光を最大化できるが、広い被写界深度や用できる機会が増えたことで、これら収集能と屈折率（ RI ）によって決まり、深い組織のイメージングのときなどは、の技術に接することが大きく広がり、RI の高 いオイルが最 大 NA を生 み出

やや小さい NA が好まれるときがある。

世界中で科学の発展を加速させている。

す）。回折限界による顕微鏡法の XY

しかし、まれにしか使わないユーザ

分解能の限度は約 0.25μm だったが、ーでも、装置の技術的基礎の知識、特いくつかの超分解能顕微鏡法技術では一般的な落射蛍光顕微鏡では、ダイに理論と実践をつなぐ考慮点に関する約 10 倍となる約 0.025μm（ 25nm ）まクロイックのビームスプリッタが試料ことから得られるものはある。ここでで向上できる。に届く比較的短い波長の励起光を反射

ダイクロイックの平坦度は、いくつかの伴となる光学的考慮をPSF の形状から推論できることとしさせ、試料から検出器に届く長い波長取り上げる。これらは、イメージの忠て、最大 NA レンズを用いても z 方向の放出蛍光を透過する（図 2 ）。ダイク

実性や質、光透過率、分解能、そしての分解能は半分程度（約 0.5μm ）であ

ロイックは、透過率と反射率が高いこ

データの信頼性を最大化するのに役立り、超分解能顕微鏡法技術では約 10と、レーザ波長に合ったエッジ急峻度つだろう。

倍以上に向上できるだろう（多くの超が高いこと、後面の反射防止膜が優れ分解能顕微鏡法では、xy 軸の分解能ていること、ガラスの自己蛍光が低い

では大きく向上できる反面、z 軸の分こと、レーザ損傷閾値が高いこと、透高い開口数の対物定められた倍率で利用可能で最も高い開口数（ NA ）をもつ対物を用いるこ（1）

解能の向上はわずかだ）。より高い

過波面エラー（ TWE ）が低いことが条NA レンズはまた、光透過率を増加さ件である（ 2 ）。だが、最先端のイメージとで、顕微鏡の分解能は最大化できる。
ここで、空間的にお互いに非常に近い、2 つの極小の蛍光粒子を考えよう。こa)b) 広視野共焦点

図 1 焦点面の光源点では、回折から生じる同心円状のリングパターンに囲まれたエアリーディスクとして、y 顕微鏡対物を描写する（ a ）。これら
xのエアリーパターン（ b 上段）が、3 次元で投影したときに PSF（ b 下段）を構成する（ 12 ）、（ 13 ）。これらの PSF の幅は x、y 分解能、深さは z 分解能を示す。レンズの NA が高いほどエアリーパターンと PSF は小さくなり、よ。（全ての画z り高い分解能となる（ c ）x
像は、クリエイティブコモンズのオープンアクセスライセンス供与条件による許諾に基づいて複製（ 14 ））

二光子

強度

れらの粒子を別のものとして分解する

距離
エアリー
ディスク

ためには、顕微鏡は実際のサイズで描1 µm写しなければならない。しかしながら、レンズを通した光の物理特性によって、それぞれの粒子は点広がり関数αn（ PSF、図１）と呼ばれる 3 次元的な不鮮明画像となってしまう。PSF が、粒c)
強度

1 µm

子の実際のサイズに可能な限り近いと未分解

きに、x、y、z 方向の最大分解能が得回折限界られる。物理特性として、NA 対物が高いほど PSF が小さくなる。

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エアリーパターン分解
λd= ‒2(n sinα)
d

未分解

分解
距離

回折限界

分解yx

CCDカメラング技術で伴となるダイクロイックの特徴は、平坦度だ。励起経路や吸収経路でダイクロイックの平坦度が不十分だと、イメージの質、統一性、分解能、吸収フィルタピクセル配置、信号対雑音比（ SNR ）ダイクロイックのビームスプリッタを損なう可能性があり、結果としてデ励起フィルタ

図 2 一般的な落射蛍光顕微鏡の構成では、望みの波長を分離させるために、励起光は最初にレーザを抽出するフィルタを通され、ダイクロイックで反射して試料に届く。放射された蛍光はダイクロイックに戻って透過する。検出器にシグナルが届く前に、吸収フィルタで望みの放射光をさらに分離し、不要な散乱光をブロックする。

ータの解釈、信頼性、定量可能性に影響を与えうる。TIRF や超分解能顕微

光源

鏡は、その性質上、特にダイクロイックの収差の影響を受けやすい。
試料

TIRF では、ダイクロイックの屈曲がどんなものでもビームプロファイルに非点収差を及ぼすであろう。さまざ
まな予想しない角度で光が試料に入ターン照明、レーザを用いる共焦点顕

あ る と 見 な し て い る（ 7 ）。 さ ら に、り、結果としてバックグラウンドの蛍微鏡法（図 3 ）、さらに LED または広帯

STED で要求されるドーナツ状の抑制。大き域の光源を用いる超分解能技術（図 4 ）ビームは、非点収差の影響を非常に受な屈曲や表面のむらがあると、TIRFのようなイメージング技術にも利点をけやすいため、「非点収差があると焦を得ることや、干渉縞の生成すら困難もたらす。

点視野はすでにゆがんでおり、これら（3）

光が増え、SNR が低下する（4）になりうる。

誘導放出抑制（ STED ）顕微鏡法で2 つのパターンによって、おそらく超似たような考慮点は、他の超分解能は、予想されるサイズ、形状、励起ビ分解能の光学顕微鏡法は使い物にならアプローチにも通じるだろう。構造化照ームの規則性、そして特に“ドーナツ状”（8）ないだろう」。思い通りの、そして明顕微鏡法（ SIM ）では、よりフレキシの抑制ビームの規則性を変える光学収信頼できる STED のためには、ダイクブルでユーザーフレンドリなアプローチ差からの影響を大きく受けやすい。わ

ロイックの平坦度は重要である。これ（5）のひとつである、システムの非点収差

れわれは非点収差を、十分に平坦でな

ら平坦度を考慮することは、パルス波を修正することが、光学的分解能の劇

いビームスプリッタの歪曲光学収差でと連続波（ CW ）両方の STED に当ては（6）。

まる一方で、パルスの STED では超高非点収差を最小化するために、可能な速レーザを使用するので光学最適化が限りで最も平坦なダイクロイックを用いさらに必要になるだろう。

的な向上につながるとわかっているることが大きな改善につながるはずだ。

試料中の PSF の深さで変わる PSF

あらゆる非点収差、そして他の収差も、の形状（楕円率）について、光学的な非実効分解能を減少させるだろう。なぜ

点収差の変化は予測可能だ。言い換えなら、そのような光学収差によって、れば、非点収差によって変化した PSF

完璧に平坦なダイクロイックが作る理の正確な形状特性から、z 軸における想的な回析限界の PSF とは異なるスポ正確な位置情報がわかる。すなわち、ットサイズや形状が生まれうるからだ。

既知で制御された方法で意図的に非点ピーク バ レー（ P-V ）平 坦 度 が λ /10収差を作ることで、PSF の物理特性は（ 0.1waves/ インチ ) の厚 さ 3mm ガラ
スと、P-V がλ /2（ 0.5waves/ インチ )の厚さ1mmガラスという新しいダイクロイックは、それらの要求を満たす。そして、TIRF、SIM、PALM、STORM、STED、GSDIM、SPIM、MUM、 パ

図 3 GFP カドヘリンと RFP アクチンを添加したアフリカツメガエルの胚を、セムロッ
ク 社 の LF405/488/561/635-B で λ/2の平坦度の超分解能顕微鏡キューブを用いる二色 TIRF でイメージングした。（提供 : 米バージニア大（ University of Virginia ）のケックイメージングセンター（ Keck ImagingCenter ））サブ回折精度で軸（ z 軸）分解能を再現するのに利用できる。このアプローチを早期に実現した 3D-STORM は、円柱レンズが作る非点収差を利用する（9）。
より最近に報告された同様のアプロー
チでは、制御された非点収差を作り、Laser Focus World Japan 2017.139光学・高度顕微鏡法a)

細胞がある
ガラス底の培養皿

対物
2x, 0.5 NA
励起
投影されたλ/10の平坦度をもつパターン化照明フィルタ
超分解能ダイクロイック
DMD
吸収フィルタsCMOSb)Di01-R488/543/635-60×85 (厚さ1mm)

Di03-R405/488/561/635-t3-60×85 (厚さ3mm)
1 mmm

図 4 ひとつの神経細胞を光遺伝学的に刺激するためにデジタルマイクロミラーデバイス（ DMD ）を用いるイメージング
構成では、バイナリ画像が DMD 上に投影され、システムのキャリブレーションのために均一な蛍光膜が試料上で撮像される。照射パターンを伴う LED の励起光はカスタムな 60 × 85mm のダイクロイックで反射し、試料からの蛍光放射はダイクロイックを透過する（a）。
（b）では、平坦度が不十分なダイクロイックではビーム内で収差を起こすが（上段）、セムロック社の厚さ 3 mm でλ /10 の平坦度をもつダイクロイックは収差を効率的に消去する（下段）（提供 : Q ステート・バイ
オサイエンス社のワーリー氏とジョン・フェランテ氏）。

励起フィルタと吸収フィルタ透過率が最も高い特性であり、検出器に届くまでに SNR を減少させるであろ う 励 起 迷 光 を よ く ブ ロック す る（ OD6 以上の）励起フィルタと吸収フィルタを選ぶことが大切である。
レーザは通常スペクトル的に 100％純粋でなく、しばしば他の波長のシグナルが含まれているため、レーザを抽出するフィルタ（励振器）を用いることでバックグラウンドを減少し、SNR を上げることができる。一般的にはレーザの先端にそのようなフィルタを取り経細胞に光遺伝学的に刺激するために、付けることが推奨されるが、この場所

LED 励起源を用いて、試料上でマイクはファイバを用いるシステムでは特に超分解能イメージングを実現する理

ロミラーアレイをイメージングするとき非現実的だろう。例えば TIRF システ

想の（つまり制御された）非点収差を作に、収差を効率的に消去する（図 4 ）」。

ムでは、しばしばフィルタキューブ内るために使う光学を選択するとき、あスタンダードな厚さ（ 1mm ）のガラに励起フィルタがないのだが、レーザるいは類似の方法によって正確で信頼スを使うことは、多くの先端顕微鏡シを抽出するフィルタはそこに組み込ま類似した分解能向上効果をもたらす可（ 10 ）変鏡を用いる。

できる局在と分解能情報を得るためにステムにとって、超平坦度のダイクロれることがある。抽出するフィルタは、は、不要な非点収差を最小化するか消イックが業界標準のキューブ内に極め可能なときは常に光学ベンチトップシ去しなければならないと考えることはて簡単に「すっぽりと当てはまる」こステムから 2 〜 3 度傾けるべきだ。こ

重要である。そのため、ダイクロイックとを意味し、費用対効果のあるシステれにより、レーザキャビティへの後方は波面の歪曲を最小限にすべきなのだ。

ムのアップグレードとして使うよう推反射を防ぐことができる。

イメージングの質を維持するために奨される。フィルタのキューブやフォもうひとつの重要な側面は、励起フさらなる平坦度が要求されるシーンルダにダイクロイックを慎重にマウン

ィルタと吸収フィルタが透過性とブロは、処理量の増大、より広い視野のイトすることが決定的であると言及する

ック要件を有していることを確保する

メージング、より大きな径の照射ビーことは大切である。なぜなら、トルクことだ。加えて、全てのフィルタのスム（ LED のように）であるが、これらや他のストレスによって平坦度は大きペクトルエッジを最適化することで、に対する需要が現在、多くの技術を推く変わってしまうかもしれないから最大 SNR を保証できる。これらのデザ進させる。新たなλ /10 の平坦度をもだ。特に、マウントするプラットフォ

イン需要は、励起フィルタ、吸収フィつダイクロイックによって、大きな径ームやキューブが平坦度を維持するた

ルタ、ダイクロイックフィルタを含むのビームを用いても反射ビームへの影めに特別に設計されていないときはそスタンダードなフィルタセット構成の響を最小限にできる。例えば、TIRF

うである。セムロック社の新しい超分中に提供されている（図 5 ）。多くの設

なら反射レーザビームに対して22.5mm、解 能 の 顕 微 鏡 法 キ ュ ー ブ は、 厚 さ

定では、フィルタのセットではなく個々SIM なら 633nm の反射イメージングビ

1mm のダイクロイックのような平坦度のフィルタを用いる。セムロック社の。米Qの仕様の維持を保証している。これら

SearchLight tool（ https://searchlight.

ステート・バイオサイエンス社（Q-Stateを使うことで、透過におけるビームシ

semrock.com ）は、そのようなイメー

Biosciences ）のキット・ワーリー氏（ Kit

フトや光散乱を最小限に抑え、異なるジング設定でシグナルと SNR のトレー

Werley ）の最近の実験によると、セム

厚さのダイクロイックをホールドするキュドオフを評価できる。

ロック社の厚さ 3mm でλ /10 の平坦ーブの間で切り替えたときに要求される（ 11 ）ームに対して 37mm である度をもつダイクロイックは「ひとつの神40

2017.1 Laser Focus World Japan（ 12 ）

かもしれない再調整を不要にする。

最後に、顕微鏡の放射経路における吸収フィルタとダイクロイックの組み

図 5 蛍光の最大忠実性を実現するには、励起フィルタ、吸収フィルタ、ダイクロイックビームスプリッタのデザインによってお互いを補完し合うことが求められる。スペクトルプロットはSearchLight を用いて再現できる（ http://bit.ly/2bZrlkP ）。

合わせは、異なる色の間で画素シフト

フトウエア処置が最もよく扱っている。

（画像レジストレーション）のパフォー

本稿では、顕微鏡法システムやデーマンスに大きな影響を与える。マルチタ収集を最適化するための実用的な助カラーの超分解能技術には、サブピク言を紹介したが、これらのトピックのセルの画像レジストレーションが求め議論としては十分ではない。理論とハられる。光学、機械コンポーネントにンズオンの経験の両面から得られる、sおける技術が発展しているにもかかわさらに詳細に掘り下げた白書は 2016 年

らず、サブピクセルの画像レジストレ

末に www.semrock.com で公開されるーションの需要（例えば 10 分の 1 ）はソ予定だ。

参考文献（ 1 ）L. Schermelleh, R. Heintzmann, and H. Leonhardt, J. Cell Biol., 190, 2, 165-175 (2010).
（ 2 ）See "Optical filters for laser based fluorescence microscopes," http://bit.ly/2ccLZt.
（ 3 ）A. Yildiz and R. D. Vale, Cold Spring Harb. Protoc., 9, 801-810 (2015).
（ 4 ）P. Prabhat and T. Erdogan, BioOptics World (Jan/Feb. 2009); see http://bit.ly/2bZiKyD.
（ 5 ）J. A. Thorley, J. Pike, and J. Z. Rappoport, "Super-resolution microscopy: A comparison ofcommercially available options," Fluorescence microscopy: Super-resolution and other noveltechniques, Elsevier Inc., 199-212 (2014).
（ 6 ）D. Debarre, E. J. Botcherby, M. J. Booth, and T. Wilson, Opt. Express, 16, 13, 9290-9305 (2008).
（ 7 ）See "Flatness of dichroic beamsplitters affects focus and image quality," http://bit.
ly/2ccLZtT.
（ 8 ）S. Deng, L. Liu, Y. Cheng, R. Li, and Z. Xu, Opt. Express, 18, 2, 1657-1666 (2010).
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（ 10 ）I. Izeddin et al., Opt. Express, 20, 5, 4957-4967 (2012).
（ 11 ）See "Practical flatness," Semrock Wavelengths Newsletter, 7, 1 (Apr. 2016); http://bit.
ly/2ccMTX1.
（ 12 ）H. C. Ishikawa-Ankerhold, R. Ankerhold, and G. P. Drummen, Molecules, 17, 4, 4047-4132 (2012).
（ 13 ）A. Diaspro et al., Biomed. Eng. Online, 5, 36 (2006).
（ 14 ）See http://bit.ly/1GZ2EOO.
著者紹介
セス・W・ペリーはリサーチサイエンティスト、ライター、技術コンサルタント、米ベルオプティクス社（ Veroptics LLC、www.veroptics.com ）の創設者、ジム・パッサルゴは米 IDEX ヘルスアンドサイエンス社（ IDEX Health & Science LLC ）のユニットであるセムロック社の事業分野ダイレクター、パラシャント・プラバートは同社の事業分野リーダーである。
e-mail：pprabhat@idexcorp.com URL：www.semrock.com

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