.feature
バイオサイエンス向けレーザ

フローサイトメトリーを拡張する
新しい 320nm 紫外線レーザ源ウィリアム・テルフォード、リン・ストリックランド、マルコ・コショレック
320nm レーザは高次元フローサイトメトリーをより簡便に、より安価にする。
フローサイトメトリーは、生物医学

フローサイトメトリーは、免疫系、せいぜい 1 種類か 2 種類の蛍光プロー

科学における基礎技術である。細胞にがん細胞学、感染症の理解を広めるうブを励起できた。最近のフローサイト結合する蛍光タグ分子がレーザによっえで決定的なツールとなっている。こメータは今や、紫外線（ 355nm 付近）て励起し、光電子倍増管（ PMT ）や他の技術において、細胞を標識するためから赤の長波（ 700nm 付近）まで、全の光センシング技術を用いて検出するに使われる蛍光プローブは、複雑な混可視スペクトルに広がる波長の固体レ（図 1 ）。細胞は、流体力学的に集めら合物の中から個々の細胞の種類、さらーザを使う。

れた液体ストリーム内で、レーザビーに一細胞の物理的・生理学的特徴を同ムによって誘導される。

定できる。

いくつかのフローサイトメータは、細の異なる単一波長レーザを搭載でき、異なる励起と発光特性をもつ大量の蛍フローサイトメトリー向けレーザの背景胞表面もしくは内部に結合する蛍光タグのみ解析する。蛍光活性化細胞選別

高度なサイトメータには、10 種類も光プローブを励起できる。初期の装置
は、1 種類か 2 種類のプローブを励起、（ FACS ）では、液体ストリームは水滴とフローサイトメトリーは、蛍光タグを励検出するしかできなかったが、現在のなり、水滴が静電的に帯電し、収集管起するレーザ技術に完全に依存する（1）。

高度な装置では 30 種類以上の蛍光プに集められる。蛍光タグに基づく細胞の初期のフローサイトメータは単一のレローブを同時に検出できる。この高次分離と回収が細胞選別によって可能とーザ（当時は巨大な水冷式イオンレー元分析によって、免疫系に関する知見なり、回収された細胞は機能研究やタザ）が使われ、フルオレセインやローダがかつてないレベルに広がっている。

ンパク質・ゲノム解析に利用できる。

ミンなどのよくある蛍光色素を含む、近年のフローサイトメータは、多くのレーザ波長と、それらに対応する蛍光プローブを用いて、20 種類以上の細図 1 基本的なフローサイトメトリーのオシレーションの概要を描いた。細胞は、ノズルまたは内にあるクォーツのフローセルによって流体力学的に集められる。
そして、液体ストリーム内でレーザビームによって誘導される。シグナル収集光学は励起した蛍光シグナルを集め、シグナルはダイクロイックミラーと狭帯域フィルタを用いて PMT に進む。近年の装置では、レーザ伝送やシグナル収集にファイバ光学を利用できる。

胞特性を同時に分析する。高度な装置

ノズルは、シアンレーザ（ 488nm ）、赤色レーザダイオード（ 640nm 付近）、緑色、黄 緑、 黄 色 の ダ イ オ ー ド 励 起 固 体（ DPSS ）レ ー ザ（ 532nm、552nm、レーザ集光対物561nm ）の使用が普通になるだろう。

レーザ照射

これらのレーザはすべて、多様な蛍光色素を励起する（図 2 ）。
紫色レーザダイオードは、BD シリゲダイクロイックン 社（ BD Sirigen ）の Brilliant Violet（ BV ）ポリマー色素の発展とともに重要
側方散乱

530/30nm

PMT585/42nm

フィルタな励起源である（ 2 ）。7 種類の BV 色素（ BV4 2 1、BV4 8 0、BV5 1 0、BV5 7 0、BV605、BV650、BV787 ）はスペクト
ル的に混合可能であり、同時に分析で30

2017.11 Laser Focus World Japana)

355 nm
20 mV

320 nm
20 mV

図 3 （ a ）ラソス社の 320nm レーザモ
ジュールは非常に小さい。（ b ）InSpeck
InSpeck Blue ミクロスフィア
Blue のミクロスフィアの混合物（ 7 つの(7 populations) BUV563 mCD8 BUV661 mCD45
集 団 ）を 20mW で、320nm のレーザb)c)d)
源（上）と 355nm のレーザ源（下）を用い2000て 分 析 し た。（ c、d ）BUV5 6 3 と1500
BUV661 で標識したマウスの膵臓細胞
1000を 20mW で、320nm のレーザ源（上）5000と 355nm のレーザ源（下）を用いて分析
101102 103104105 101102103104105 101102103104105
した。色の付いた線が標識された細胞を、グレーの線が標識されていないコントロ
BUV661-A
BUV496-A
BUV563-Aールを示す。InSpeck Blue のミクロス
1500
フィアの BUV563 と BUV661 で標識1000された細胞で使われるバンドパスフィル
タのスペクトルカーブをヒストグラムの500下に示した。（提供：ウィリアム・テルフォ
0ード氏）
12345123451234510 10 10 10 1010 10 10 10 1010 10 10 10 10

450/50 nm

575/25 nm

660/20 nm

きる細胞マーカー数を劇的に増やした。

や他のUV励起色素を励起するために、

紫外（ UV ）レーザは、近年開発された 6

周波数 3 倍のネオジウムドープバナデ

より安価や近 UV レーザダイオード

種類の Brilliant Ultraviolet 色素（ BUVート（ Nd:YVO4 ）の 355nm 固体レーザ（ 375nm ）が、BUV を含 む多 くの UV

3 9 5、BUV4 9 6、BUV5 6 3、BUV6 6 1、に主に依存している。これらのレーザ

励起色素に対する 355nm 源の代わり

BUV737、BUV805 ）を用いるフローサは、かつて UV 励起に必要とされたアになり得る（３）。だが、これらの波長は、イトメトリーにおいて新たな重要性をルゴンイオンやクリプトンイオンレーシリーズの中 で波 長 の最 も短 いもたらしており、同時に蛍光分析するザよりもはるかに性能が向上しておBUV395 の発光範囲に対して非常に近合計数は 30 種類近くになった。UV レ

り、より小さく、より維持しやすくなく、検出を困難にしている。それゆえ、ーザは現在、高度なフローサイトメトリっている。しかしながら、いまだに高高次元フローサイトメトリーのコストー装置で重要なコンポーネントである。

価であり、高価格帯の装置において最を下げる、より安価な固体 UV レーザ

近年のフローサイトメータは、BUVもコストのかかる唯一のコンポーネンオプションが必要とされている。

図 2 フローサイトメトリーで用いられる蛍光プローブは、励起に必要なレーザ波長とペアになる。これらのプローブのほとんどはスペクトル的に混合可能で、レーザ波長を十分に配置した 装 置 で は 同 時 に 使 用 で き る。Brilliant Blue（ BB ）、
Brilliant Yellow Green（ BYG ）、Brilliant Violet（ BV ）、
Brilliant Ultraviolet（ BUV ）色素は BD シリゲン社の商標、Pacific Blue、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 790 はサーモフィッシャー社（ Thermo Fisher ）の商標である。

レーザ nm）
320 nm355 nm375 nmトである。

る
BUV395
BUV661

BUV496
BUV737

BUV563
BUV805405 nm

Paciﬁc Blue
BV570

BV421
BV605

BV480
BV650

BV510
BV787

488 nmFluorescein
PerCP

Alexa Fluor 488
PerCP-Cy5.5

BB dyes

532 nmフィコエリスリン（PE）
PE-Cy5PE-Cy5.5
BYG dyes

552 nm561 nm
640 nm

APCCy5685 nm

Alexa Fluor 660
Alexa Fluor 700
Alexa Fluor 790

PE-Texas redPE-Cy7

APC-Cy5.5
Alexa Fluor 647

APC-Cy7Alexa Fluor 680
Alexa Fluor 750
IR780

Laser Focus World Japan 2017.1131

.feature

バイオサイエンス向けレーザ

コンパクトな320nm レーザモジュール

タグが付いたポリマーミクロスフィアを用いた。明るい UV に励起するミク

この状況は、独ラソス社（ LASOS ）ロスフィアと、暗い UV に励起するもが最近開発した、小さな空冷ユニットのの混合物（サーモフィッシャー社のに収 めた連 続 波 発 光と小 型 の固 体

InSpeck Blue ミクロスフィア）も分析320nm レーザモジュールによって変わされた。最も暗い集団の解像度が、良ってきている。フローサイトメータは、質な励起と検出の指標となる。最も暗歴史的にヘリウム・カドミウム（ HeCd ）い集団を含むこれらのミクロスフィアレーザを搭載しており、UV 色素を励起は、このレーザ源で容易に分解できた

するために 325nm のレーザラインを活（図 3b ）。感度は、同等の出力におい用する。ところが、HeCd レーザは大きて355nmレーザと類似していた。次に、く、あまりパワフルではなく、経年劣マウスの膵臓細胞を、2 種類の BUV 色化でノイズ問題が生じる。320nm源は、素である BUV563、BUV661 に結合す

このレガシーである波長に非常に近く、る抗体を用いて標識し、細胞表面マー合理的に BUV 色素を励起するスペクトカーとした。320nm モジュールによっルに基づいていると予測できる。て、これらの試料は 355nm 源とほぼこのレーザ波長とレーザ源がフローサ同様に励起した（図 3c、3d ）。

イトメトリーに適しているかテストする

こ れ ら の 結 果 か ら、 ラ ソ ス 社 のため、BD LSR II フローサイトメータの320nm レーザ源が、フローサイトメト

従来の 355nmUV レーザ源の代わりに、リーにおいて 355nm 励起の良い代替（4）
このモジュールを組み込んだ（図 3a）。となることが示された。これらのモジレーザは、細胞をレーザ路に注入する

ュールは、ほとんどの 355nm 源に比ために使われる液体ストリームに当たべて小さく安価であるため、高次元フるよう配置された。本来は 355nm レー

ローサイトメトリーに対して費用対効ザ源向けに構成された装置の光学は、果の高い代替である。この範囲と全可320nm に下がっても効率は維持されて視スペクトルの両方において、小型のおり、試料ストリームとビームに集束さ固体レーザ源はフローサイトメトリーせる合成石英レンズにレーザを進ませに革命をもたらし、近年の装置における広帯域の UVミラーを用いた。

るサイズ、コスト、保守ニーズを減らフローサイトメトリーは、装置動作すことができる。これは、技術開発にが適切かどうか決定するため、そしておいて有望なトレンドであり、より良新規レーザ源をテストするため、シミい生物医学の分析装置に貢献し続けるュレーションサンプルとして蛍光色素だろう。

参考文献（ 1 ）W. G. Telford, Methods Cell Biol., 102, 375–410（ 2011 ）; doi:10.1016/b978- 0-12-3749123.00015-8.
（ 2 ）P. K. Chattopadhyay et al., Cytometry A, 81, 456–466（ 2012 ）.
（ 3 ）W. G. Telford, Cytometry A, 87, 1127–1137（ 2015 ）.
（ 4 ）W. G. Telford, L. Strickland, and M. Koschorreck, Cytometry A, 91, 314– 325（ 2017 ）.
著者紹介
ウィリアム・テルフォードは米国立衛生研究所、米国立がん研究所の実験移植、免疫部門職員（ email: telfordw@mail.nih.gov ）、リン・ストリックランドはラソス北米社、マルコ・コショレックはラソス社（ドイツ）
。

LFWJ

32

2017.11 Laser Focus World Japan