22-06®

ReverTra Ace qPCR RT Kit(Code No. FSQ-101)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPANA3736K－ 目 次 －[1] はじめに ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1[2] 製品内容

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 2[3] 製品のほかに用意するもの[4] 使用方法

・・・・・・・・・・・・・・・・ 3

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 4[5] 関連プロトコール・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5[6] トラブルシューティング[7] 関連商品

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6

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ご注意
本キットに含まれる試薬は、すべて研究用試薬です。診断・臨床用試薬として決して使用しないでください。本キットの使用にあたっては、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。
FSQ-101

[1] はじめにReverTra Ace® qPCR RT Kit は、リアルタイム PCR 用鋳型 cDNA 作製のために開発された、高効率かつ簡便な逆転写反応キットです。本製品は、弊社高性能逆転写酵素 ReverTra Ace®と、リアルタイム PCR のターゲットとなる短鎖 cDNA の合成に最適化された反応組成を採用しており、リアルタイム PCR 用に適した cDNA 鋳型を効率的に調製することができます。また本製品は、簡略化されたキット構成と迅速な反応プロトコールによって、短時間で簡便に cDNA 合成を行うことが可能となっています。
本製品にはリアルタイム PCR 試薬は添付されていません。リアルタイム PCR には、弊社高性能リアルタイム PCR 試薬 THUNDERBIRD® qPCR Mix シリーズのご使用をお薦めします([7] 関連製品の項をご参照ください)。

◆本製品の特長◆
1. 幅広いターゲットに対する高効率逆転写
ReverTra Ace® qPCR RT Kit は、リアルタイム PCR 用の cDNA 合成に最適化された反応バッファーと、最適な混合比を持つプライマーミックスを使用しており、様々なターゲットに対して、条件検討を行うことなく効率的に逆転写反応を行うことができます。
2. 短時間・簡便なプロトコール
ReverTra Ace® qPCR RT Kit は、わずか 15 分の逆転写反応で、幅広いターゲットに対して効率的に逆転写反応を行うことができます。また、リアルタイム PCR において反応阻害の要因となる残存 RNA の除去においても、追加的な RNase H 処理を必要としません。
3. リアルタイム PCR 試薬との適合性向上
ReverTra Ace® qPCR RT Kit は、リアルタイム PCR の反応系への影響を最小限に抑える組成を採用しており、最大で 20%液量の逆転写反応液を PCR に添加した場合でも、高い直線性を示します(弊社 Realtime PCR Master Mix にて確認)。発現量が少な
い mRNA の高感度検出にも最適です。

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[2] 製品内容
本製品には、以下の試薬が含まれており、10μL 反応で 200 回用としてご使用になれます。全ての試薬は-20°C で保管してください。
試薬名

保存容量

-20°C

400μL

Enzyme Mix

-20°C

100μL

Primer Mix

-20°C

100μL

-20°C

1,000μL×2

5x RT Buffer(Reaction Buffer + MgCl2 + dNTPs)(ReverTra Ace® + RNase inhibitor)(Random Primer + Oligo(dT) Primer)

Nuclease-free Water5×RT Buffer
反応バッファー、MgCl2、dNTPs などを含んだ 5×濃度の逆転写反応バッファーです。
溶解時に白濁することがありますが、品質には影響ありません。ボルテックスミキサー
等で激しく攪拌し、完全に溶解させてからご使用ください。
Enzyme Mix
弊社高性能逆転写酵素 ReverTra Ace®と RNase inhibitor を混合した酵素液です。
Primer Mix
Random Primer と Oligo(dT) Primer を混合したプライマーミックスです。様々なターゲットに対して効率よく逆転写を行うことができるよう、混合比が最適化されています。
Nuclease-free Water
Nuclease-free グレードの滅菌蒸留水です。ポリメラーゼ活性に影響を及ぼす恐れのあるジエチルピロカーボネート(DEPC)処理を行わずに調製されています。

FSQ-101-2-[3] 製品のほかに用意するもの
本製品の他に、以下の試薬・機器類をご用意ください。
・サーマルサイクラーまたはインキュベーター
本製品の推奨する温度(37°C、98°C、および65°C)を保つことができる機器をご用意ください。
・Nuclease-free Water
本製品には、200 回分の反応に必要な量が添付されていますが、鋳型 RNA の希釈などを行う際に、必要に応じて別途ご用意ください。DEPC(ジエチルピロカーボネート)不使用タイプの Nuclease-free Water の使用をおすすめします。DEPC 処理水を使用することも可能ですが、DEPC の残留により反応が阻害されることがありますので、オートクレーブを十分に行って DEPC を完全に除去してから使用してください。また逆転写反応
や PCR に使用する Nuclease-free Water は、核酸の混入を防ぐため、他の実験とは別に保存し、共用しないことをおすすめします。
・Total RNA
本製品では、Total RNA を直接、鋳型として用いることができます。組織、培養細胞等から得られた Total RNA には、発現解析の対象となる mRNA が通常 1-2%程度含まれています。発現量が極端に低いターゲットの検出を行う場合などを除き、通常は Total
RNA を鋳型とすることで十分に検出が可能です。
カラムタイプの RNA 抽出キットや AGPC(Acid Guanidium - Phenol - Chloroform)法などにより精製された Total RNA には、ゲノム DNA が混入しています。検出するターゲットに偽遺伝子が多く存在する場合や、イントロンをまたぐ位置にプライマーを設定できない場合などには、混入したゲノム DNA に由来する偽陽性シグナルが発生する可能性があります。必要に応じて、DNase I 等を用いてゲノム DNA を除去してください(p.5 参照)。あるいは、ゲノム DNA 除去機能を持つ弊社姉妹品 ReverTra Ace® qPCR RT
Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)をご使用ください。
・poly(A)+ RNA (mRNA)poly(A)+ RNA は、oligo(dT)とのハイブリダイゼーションを利用して poly(A)+末端を有する mRNA のみを選択的に分離したものです。精製段階で mRNA を濃縮できるため、mRNA を高感度で検出したい場合に有用です。しかしながら、Total RNA と比較してリボヌクレアーゼ(RNase)による分解を受けやすい、ribosomal RNA を内部参照とした相対定量ができないなどの短所があります。

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[4] 使用方法(1)RNA の変性
RNA を 65°C で 5 分間インキュベートし、氷上で急冷します。
・この処理を行うことで、高次構造を取りやすい RNA に対する逆転写効率が向上する場合があります。
・この処理を行う際は、5× RT Buffer や酵素液は添加しないでください。

(2)反応液の調製
反応液組成
Nuclease-free Water
5×RT Buffer
RT Enzyme Mix
Primer Mix
RNA

to 10 μL
2 μL
0.5 μL0.5 μL
0.5pg～1μg

Total volume10 μL

・本試薬に添付の Primer Mix のほか、遺伝子特異的プライマー(Gene Specific Primer)を用いることもできます。その際は、最終濃度 0.5pmol/μL (10μL 反応あたり 5pmol) を目安として反応系に添加してください。

(3)逆転写反応
37°C で 15 分間インキュベートし、逆転写反応を行います。
↓98°C で 5 分間インキュベートし、酵素失活反応を行います。
↓反応終了後、4°C または-20°C で保存します。リアルタイム PCR 実施の際は、鋳型として反応液に直接または希釈して添加してください。
・この温度条件は本キットの組成に最適化された条件となっており、温度条件の変更は、酵素活性以外にも、プライマーのアニーリング効率や、RNA 除去効率、逆転写反応後の酵素失活効率などに大きく影響を与えます。条件の検討を行う際も、必ずこの条件を基本として実施してください。
・逆転写反応液のリアルタイム PCR 反応液への添加量は、最大で 20%程度としてください。多量の添加は PCR の反応効率を低下させ、正確な定量が行えないことがあります。
・遺伝子特異的プライマーを用いる場合において、特に同一の配列を持つ逆転写プライマーと PCRプライマーを使用する場合は、逆転写時の非特異的アニーリングが PCR における非特異的増幅産物を生じさせる原因となることがあります。その際は逆転写反応温度を高温(42-50°C 程度)にすることによって、改善されることがあります。
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[5] 関連プロトコール
1. Total RNA の DNase I 処理
AGPC 法などにより精製された Total RNA にはゲノム DNA が混入している場合があります。ゲノム DNA 由来の偽陽性シグナルが発生する可能性がある場合には(p.3 参照)、下記の方法によりゲノム DNA を除去してください。あるいは、ゲノム DNA 除去機能を持つ弊社姉妹品 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (CodeNo. FSQ-301)をご使用ください。
(1)反応液調製と反応(一例)Total RNA (<10μg)
10× DNase I Buffer

X μL
1 μL

(10mM Tris-Cl, pH7.6, 2.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2)

RNase-free DNase I (10U/μL)
Nuclease-free Water

0.5 μLto 10 μL

上記反応組成液を調製し、氷上で 10 分から 30 分間静置して反応させます。
(2)精製 (市販の精製キットを用いることもできます)
反応液に 100μL の Nuclease-free Water、100μL の TE 飽和フェノールを添加し、ボルテックス等で混合した後、氷上で 5 分間静置します。
↓
12,000rpm、5 分間の遠心分離を行い、上清を回収します。
↓
100μL のクロロホルムを添加し、混合します。
↓
12,000rpm、5 分間の遠心分離を行い、上清を回収します。
↓
100μL の 5M 酢酸アンモニウム、200μL のイソプロパノールを添加し、混合した後、-20°C で 30 分間静置します。
↓12,000rpm、5 分間の遠心分離を行い、上清を廃棄します。
↓沈殿に 70%エタノールを加えます。
↓12,000rpm、5 分間の遠心分離を行い、上清を廃棄します。
↓沈殿に適量の Nuclease-free Water を加え、溶解します。
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[6] トラブルシューティング
1. リアルタイム PCR でシグナルが出ない、あるいは遅れて検出される
原因
対策
RNA の純度が低い
RNA 調製時に残留した不純物によって逆転写反応が阻害されている可能性があります。鋳型 RNA を再精製してください。
RNA が分解している
RNase の混入によって RNA が分解している可能性があります。RNA の再調製を行ってください。また RNA を低濃度で保存した場合、RNase による分解をより受けやすくなるほか、反応容器への吸着によって実質的な RNA 量が減少する場合があります。希釈した RNA は、使用後に凍結保存して再使用することは避け、毎使用時に高濃度保存液から調製することをおすすめします。
RNA の量が少なすぎる、 本製品では、0.5pg から 1μg までの RNA を用いた場合であるいは多すぎる安定的な効率で逆転写が可能であることを確認していますが、RNA の種類や品質によっては、反応可能な RNA量は変動する可能性があります。鋳型 RNA の添加量を増減させてください。
反応温度が不適切反応条件の変更は、プライマーのアニーリング効率、酵素活性、逆転写反応後の酵素失活、鋳型 RNA の除去効率など広範囲に影響します。反応温度は必ず本説明書に記載の条件に従って実施してください。
逆転写反応液の添加量が 本製品では、逆転写反応液を PCR 反応液へ最大 20%添多すぎる加しても直線性には問題がないことを確認していますが、使用する PCR 試薬の性質によっては、この値は低下する可能性があります。逆転写反応液の添加量を減らしてください。
2. リアルタイム PCR で非特異的シグナルが検出される
原因
対策
プライマーの非特異的ア 遺伝子特異的プライマーを使用した逆転写では、プライマニーリングが発生している ーの非特異的アニーリングが PCR における非特異的シ(遺伝子特異的プライマー グナルの発生要因となる場合があります。アニーリングの使用時)特異性を向上させるためには、逆転写反応温度を上げることが効果的な場合があります。42°C から 50°C の範囲を目安として反応温度を設定してください。

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[7] 関連商品
リアルタイム PCR 用 cDNA 合成試薬
品名
リアルタイム PCR 用 cDNA 合成マスターミックス

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
ゲノム DNA 除去試薬をプラスしたリアルタイム PCR 用 cDNA合成試薬

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover
リアルタイム PCR 試薬
品名
各種蛍光プローブ・蛍光プライマー検出系用
リアルタイム PCR 試薬

THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix
SYBR® Green I 検出系用リアルタイム PCR 試薬

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

容量Code No.

200 回用

FSQ-201

200 回用FSQ-301

容量1mL×1 本(100 回用/20μL 反応)
1.67mL×3 本(500 回用/20μL 反応)
1mL×1 本(100 回用/20μL 反応)
1.67mL×3 本(500 回用/20μL 反応)

Code No.
QPS-101T
QPS-101
QPS-201T
QPS-201※THUNDERBIRD® qPCR Mix では、50× ROX reference dye が別容器で添付されます。
※2,500 回用/20μL 反応の QPS-101X5、QPS-201X5 (QPS-101 または QPS-201 の 5 セット組) もご用意しています。

RNA 調製関連試薬
品名
磁性ビーズを用いる簡便な Total RNA 精製キット

MagExtractorTM -RNA磁性ビーズによる精製を簡単に行う専用磁性スタンド

Magical Trapper内容

Code No.

100 回用NPK-201F

1個MGS-101

より詳細な情報は、弊社ウェブサイトをご覧ください

https://lifescience.toyobo.co.jp-7-FSQ-101

【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
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開設時間 9:00～12:00 , 13:00～17:00 (土日祝日、休日を除く)
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