成蹊大学理工学研究報告
J. Fac. Sci. Tech., Seikei Univ.
Vol.44 No.２ (2007) pp.65-73（特別研究費に係る論文）

大豆リン脂質クラスの新規分画法
節子*1・宇野原奈奈*2・戸谷洋一郎*3

Novel Fractionation Method for Soy Phospholipid Classes
Setsuko HARA*1, Nana UNO*2, and Yoichiro TOTANI*3
ABSTRACT : A novel method for the fractionation of crude soy phospholipids was developed using
hexane/ethanol solvent system to take the place of conventional acetone fractionation. Phospholipid
purity of 97.6% achieved by the present method using cold hexane/ethanol (4/1) mixed solvent wasfound equivalent to that by conventional acetone fractionation. This method should serve as a safe
alternative to the latter whose use has been attended with harmful acetone oxides remaining inpurified phospholipids.
Keywords: soyphospholipids,

acetonefractionation,

hexane/ethanol

mixed

solvent,phosphatidylcholine(Received September 26, 2007)

１． 緒

論型エマルション製剤は栄養輸液として,さらにドラッグデリバリーシステムや遺伝子デリバリーシステムにも応グリセロリン脂質（PL）は様々な分野で幅広く利用さ用されている 4）。また，PL の sn-1 位と sn-2 位に結合しれている。例えば，食品分野では主に安価である大豆 PLた脂肪酸（FA）を様々な機能性 FA と変換し，その FAがマーガリン，クリーム類，菓子類等の乳化剤として大の生理機能を PL に付与することも試みられている 5）。

量に利用され，酵素的に改質して乳化作用を向上させた

さらに，記憶学習機能向上作用，制ガン作用，コレステリゾリン脂質（LPL）は乳化剤のみならず，デンプンのロール低下作用などを持つイコサペンタエン酸（EPA）

1）。化粧品分野ではやドコサヘキサエン酸（DHA）などの高度不飽和脂肪酸

水素添加大豆 PL が乳化剤としてクリームや乳液に，ま（PUFA）を構成脂肪酸として持つ機能性 PL は PUFA とたその高い親水性を利用して天然保湿・潤滑剤としてロPL の機能を併せ持っており，脳機能改善作用や神経伝達ーションなどに配合されている。その他に生理学的，栄系への作用 6,7）などがあると報告されている。その他に養学的な効用も注目され，医薬品や健康食品，栄養補助も，PL は塗料，インキ，感光剤に添加すると顔料の沈殿食品にも配合されている。すなわち，PL の生理機能とし防止効果が発揮されることも報告され，様々な分野で多て，肺機能改善，血清コレステロール低下，肝臓脂質代量に使われている。

老化防止剤としても利用されている2,3）など

工業的には大豆および卵黄由来の PL が主に利用されがあり，その界面活性作用を利用して大豆油や中鎖脂肪ており，全世界で年間約 11 万トンが生産され，日本では酸トリグリセリド（MCT）を水溶液中に分散させた O/W7,550 トンの市場規模と言われている 8,9）。これらの PL

謝異常改善，神経機能改善，動脈硬化症の改善は PL 純度 65-70％程度のペースト状の粗製品から，95％*1以上に精製された粉末状のものまで様々な形態で製品化：成蹊大学理工学部物質生命理工学科教授

されている。特に，量的に最も多く，安価な粗製大豆 PL(Professor, Dept of Materials and Life Science,e-mail: shara@st.seikei.ac.jp)

は大豆油製造時の副産物として，脱ガム工程で油分と分*2：成蹊大学大学院工学研究科博士前期課程修了生*3：成蹊大学名誉教授

離されて得られる。この粗製 PL は茶褐色ペースト状物－65－

/EtOH＝90/10～60/40 または H2O/プロピレングリコール質であり，臭気も強いことから，そのままでは取り扱い
9）にくく，広範な用途に用いることが困難である 。それ＝90/10～50/50 の水混和性アルコール類と混和し，上層故，PL の分画・精製には従来からアセトンを使用した溶に油層，下層に PL 含有の水性層を生ずるように相分離媒分画法が用いられてきた。このアセトン分画法は主にさせ，油層を除去することを目的とした白川らの特許

ホスファチジルコリン(PC)を中心とした PL がアセトン

H3-22396 の方法では，80～90％純度の精製 PL が得られに対して溶解性が低いことを利用し，アセトン可溶部とている 13）。特許 H1-197492 の酢酸エステルを使用した場

してトリグリセリド(TG)をはじめとした中性脂質を，ア合には，TG 含有 PL の重量(g)に対して 4 倍以上の容量セトン不溶部として PL を回収している。この方法は操（mL）の酢酸エステルに粗製 PL を溶解した後，-5℃以作が簡便であり，効率が良いことから精製 PL を製造す下に冷却して分画することによって，溶媒不溶部に PCるため広く工業的に用いられているが，得られた PL を含有率の高い，純度 99％以上の精製 PL が得られると報食品・香粧品・医薬品などへ利用することを考慮すると，告されている 14）。また，96％程度の精製 PL が得られる安全性の高い溶媒の使用が望まれている。アセトンは超臨界流体抽出法 15）や分子量の違いにより分ける限外

Fig.1 に示すように，有害な有臭物質であるアセトン酸化ろ過膜分離法なども報告されている 16）。しかし，その実物(アセトン二次生成物)の生成が懸念され，製品の臭い際的な分離能，溶媒および設備費用などを含めた全体的や風味を損ねる原因となることが報告されている 10,11）。

なコスト面から実用化されているものはほとんど無く，

このような問題点を解決すべく，アセトン分画法に代大量の精製 PL を得るためにはアセトン溶媒分画法に頼わる様々な分画法がこれまでにも開発されている。例えるほかに道がないのが現状である。また，PL は加熱されば，高畑らは粗製 PL を 2 倍量のヘキサン（Hex）に溶解ると酸化，褐変を引き起こすために，その処理は低温でした後，5～25w/w％の水を含む C1～C4 の低級アルコー短時間であることが好ましい。それ故に，本研究ではアルを Hex に対して 0.05～1.5 倍量加えて混合すると，アセトンを使用しない大量分画法として，安全性に優れたルコール画分に原料と類似した組成をもち，色調や風味新規溶媒分画法を確立することを目的とした。すなわち，の改善された PL が得られることを報告している

11）

。村

脂質に対して非常に優れた溶解性を有するものの，環境山らは Hex／含水エタノール（EtOH）系溶媒を用いた無破壊やオゾン層破壊などを引き起こす塩素系溶媒を避け担体液々分配クロマトグラフィーによって分配液の上層て，EtOH/Hex/H2O 系のような限られた溶媒系を用いてに PE を，下層に PC ををそれぞれ分画・精製できること

精製 PL を単離することについて検討した。

を報告している12）。また，粗製 PL を重量比率が水（H2O）
CH32 CH3-C-CH3OH－

CH3

CH3-C-CH2-C-CH3O

OHAcetone
CH3-C-CH3OH－

CH3-C＝CH-C-CH3O(A)-CH2-C-CH3O

O(B)(A) ＋ (B)

H2O

O

CH3

CH3-C-CH2-C-CH2-C-CH3
CH3O
OO
HO

CH3H 3C

CH3CH3H 3C

CH3Acetone oxide (isophorone)
Fig. 1

Formation of Acetone Oxide (Isophorone) 10).

－66－O２．実験方法

また，分析の際に標準物質として用いた日清オイリオグループ（株)製の PL 製品である精製大豆 PL ベイシス

2. 1LP-20B（PC-30）と PC 濃縮大豆 PL ベイシス LP-60B

試料と試薬新規分画法の検討に用いた PL は池田糖化工業(株)か（PC-70）の性状を Table 2 に示した。なお，本実験で用ら提供された Bunge Limited（ブラジル）製の粗製大豆いた試薬はすべて市販特級品をそのまま使用した。

PL であり，その性状は Table 1 に示したとおりであった。
Table 1

Characterization of Crude Soy PL.

TGPLFA

Lipid Composition（％）
29.6
Fatty AcidComposition（％）

Color by Lovibond Method

0.3

PC

PE*1

PI*2

Others

19.8

14.7

17.0

18.6

C16:0

C18:0

C18:1

C18:2

C18:3

16.42.2

18.4

56.2

6.8

Red

Yellow

Neutral430―

Peroxide Value（PV, meq/kg）

1.0

Acid Value (AV)

15.8

12

* ：ホスファチジルエタノールアミン，* ：ホスファチジルイノシトール，以下同じ

Fatty AcidComposition (%)

Lipid Composition (%)

Table 2

2. 2

Lipid and Fatty Acid Compositions of PC-30 and PC-70.

PC-30

PC-70

TG00.5

FA00Others

2.7

1.9

PC

35.6

67.1

PE

19.8

14.2

PI

28.9

3.1

Others

13.0

13.2

C16:0

19.2

14.4

C18:0

4.0

3.5

C18:1

7.9

12.5

C18:2

60.9

62.5

C18:3

8.0

7.1

PL系とし，溶媒比と溶媒量を種々に変えた。すなわち，

PL 分画法

試料として粗製大豆 PL を用いて Fig.2 に示した

5g の試料をビーカーに採取し，これに所定量の分ように溶媒分画を行い，PL を精製する方法を検討

画溶媒を加えて 5 min 撹拌後，1h 静置した。次に，した。なお，分画溶媒は EtOH/Hex/H2O の混合溶媒

吸引濾過により溶媒不溶部と可溶部に分け，不溶部－67－

は減圧乾燥し，可溶部は脱水・脱溶媒を行った。なを持った精製 PL を分画できる。従って，新規法でお，従来法であるアセトン分画法は PL 試料に対しは 10 倍量以下の分画溶媒を用いて得られた不溶部て 10 倍量以上の冷アセトンを撹拌しながら加えての PL 純度が TLC-FID 分析により 95％以上になる氷冷静置すると，溶媒不溶部に約 95％以上の純度ような分画法の開発を目指した。

Crude Soy PL (5g)
Fractionation solvent (EtOH/Hex/H2O system)
Shaking for 5 minStanding for 1h
Separation by suction filtration
Drying in vacuo

Dehydration with sodium sulfate

Weighing

Desolvent by evaporator
Weighing

Insoluble Fraction（PL）

Fig. 2
2. 3

Soluble Fraction（TG+FA）

Solvent Fractionation Procedure for PL.

分析法

負荷して，一次展開溶媒にクロロホルム/MeOH/28%アン溶媒による分画・濃縮法を検討する際に得られた溶媒モニア水系を，二次展開溶媒にクロロホルム/MeOH/酢酸

可溶部と不溶部の脂質組成はTLC-FID分析により測定/ H2O 系を用いて分離した。個々の脂質の確認には 10％し，良好な結果が得られたものについてはその脂肪酸組硫酸銅-8％リン酸試薬を，PL の確認には Dittmer 試薬成をGLC分析した。また，原料である粗製大豆PL，（Zinzade 試薬）を，アミノ基の確認にはニンヒドリン試

EtOH/Hex分画不溶部および可溶部はそれぞれロビボン薬を，酸性 PL の確認にはローダミン 6G 試薬を，コリンド法による色相，過酸化物価（PV），酸価（AV）も併せの確認には Dragendorff 試薬を発色試薬としてそれぞれて測定した。

用いた。

2. 3. 1

2. 3. 2

脂質組成

脂肪酸組成

TLC-FID 分析はイアトロスキャン MK-5 型（三菱ヤト粗製大豆 PL および分画して得られた溶媒可溶部と不ロン㈱）を用いて行った。すなわち，試料を 1％クロロ

溶部の脂肪酸組成は Jham 法 17）により構成脂肪酸をメチホルム溶液とし，その 1µL をクロマロッド S-Ⅲ（三菱ヤルエステル化した後，結合型キャピラリーカラム

トロン㈱）に負荷して一次展開溶媒であるベンゼン/クロHR-SS-10（0.25mm×25m，信和化学工業㈱）と FID 検出

ロホルム/酢酸（35/15/1）により PL 区分と TG 区分を分器を装備したガスクロマトグラフ GC-18A 型（㈱島津製離し，二次展開溶媒であるクロロホルム/メタノール作所）を用いて GLC 分析を行った。その分析条件はヘリ（MeOH）/H2O（75/25/2）により PC，PE，PI などの各ウム(80kPa)をキャリアーガス，注入口・カラム・検出器

種 PL を分離した後，水素流量 160mL/min，空気流量の温度を 250℃，スプリット比を 50/1 とした。

2,000mL/min，スキャンスピード 20cm/min，記録・定量計算をクロマトパック CR-6A 型（㈱島津製作所）により2. 3. 3

PL の性状分析

脂質組成を分析した。二次元 TLC 分析は 2 波長フライン

分画・濃縮の過程で PL の自動酸化や加水分解が起る

グスポットスキャナ CS-9300（(株)島津製作所）を用いか，否かをチェックするために，自動滴定装置 GT-05 型て定量した。まず，Merck 社製のプレコート TLC プレー（三菱化学㈱）を用いて電位差滴定-PV 法 18）で PV を，ト（Silica Gel 60，10×10cm）の下端から 1.5cm，右端か中和滴定法で AV をそれぞれ測定した。

ら 1.5cm の位置に分析試料（1％のクロロホルム溶液）を－68－

３. 結果と考察して 10％塩化マグネシウム (MgCl2･6H2O)-MeOH 溶液を少量添加していることを参考にして，EtOH と 10％

3. 1

MgCl2･6H2O/EtOH 溶液を組み合わせた溶媒を用いて検PL 分画法

試料として粗製大豆 PL を用いて，2.2 の方法により討した。すなわち，MeOH の毒性を考慮して本研究ではMeOH 溶液を EtOH 溶液に換えて分画溶媒を調製し，粗PL を精製するために種々の溶媒系の組成比を検討した。

製大豆 PL に対して溶媒量を 1.1 倍から 8.8 倍まで変化さ
3. 1. 1せた結果を Fig.3 に溶媒不溶部と溶媒可溶部における PL

塩化マグネシウムの添加効果

まず，基準としたアセトン分画法において，PL が金属塩と複合体を形成する性質を利用しての回収率・純度としてそれぞれ示した。

10），PL 沈殿剤と(%)
100(%)
1009090

Insoluble Fraction

80

Soluble Fraction

80707060605050

404030302020

10

1000
1.1

2.2

4.4

8.8

1.1

2.2

4.4

8.8

Solvent Amount Ratio
Solvent Amount Ratio
PL Recovery
PL Purity
PL Recovery
PL Purity
Fig.3 Fractionation of Crude Soy PL with EtOH/MgCl 2･6H2O（10/1）Solvent System.

(%)
100(%)
100909080

Insoluble Fraction

70806060505040403030202010100Soluble Fraction

7004810Solvent Amount Ratio
PL Recovery
PL Purity

4810Solvent Amount Ratio
PL Recovery
PL Purity

Fig.4 Fractionation of Crude Soy PL with EtOH Solvent System Containing 2mL of 10%MgCl2･6H2O-Ethanol
Solution.

－69－なお，溶媒不溶部と可溶部はいずれも粘性のあるどろし，不溶部は粘性の強いペースト状から固体の蝋状となどろとした液状であった。また，溶媒量が 1.1 倍と 2.2ったが，PL 純度はいずれの場合も 90％以下であり，目倍では不溶部に回収率は低いものの 70～75％純度の PL標とする PL 純度 95％以上にはならなかった。また，無が回収されたが，8.8 倍量のときには不溶部に約 70％，水 MgCl2 を使用した溶媒系についても検討を行ったが，可溶部に約 80％の PL が存在してしまい，明確な分画をMgCl2・6H2O を用いた結果と同様であった。

することができず，回収率も不溶部が約 85％，可溶部は100％を超える結果となった。これは使用した溶媒量が多3. 1. 2かったことと，多量の MgCl2 量が除去できずに残存して溶媒を氷冷（約 0℃）して分画を検討した結果は Fig. 5しまったためと考えられた。なお，全体的に 10％MgCl2･に示したように，いずれの場合でも PL 回収率と PL 純度

6H2O /EtOH 溶媒系の場合は脱溶媒が困難であり，1.1～に大差は見られなかった。しかし，不溶部に得られた PL4.4 倍の系では PL 回収率が 10～55％に過ぎなかったことの状態が室温（約 24℃）においては黄褐色の蝋状であっから，PL を不溶部に確実に分画できる方法とは言い難かたのに対して，氷冷溶媒で分画した場合には黄色の粉末った。それ故，次に 5g の粗製大豆 PL に対して EtOH を状のものを含む状態となったことから，目的とする粉末主とした溶媒系に 10％MgCl2･6H2O-EtOH 溶液を 2mL だ状に近づけるのではないかと考えて，以下の実験はすべけ添加して分画を検討した結果を Fig. 4 に示した。しかて氷冷溶媒で分画を行うことにした。

(%)
1009080706050403020100(%)
1009080706050403020100

Room Temp (24℃)

Fig.５

Ice-cooling (0℃)

48
Solvent Amount Ratio

48Solvent Amount Ratio
PL Recovery

分画温度の影響

PL Recovery

PL Purity

PL Purity

Effect of Temperature on Fractionation of Crude Soy PL with EtOH Solvent System Containing 2mL of0%MgCl2･6H2O-Ethanol Solution.
3. 1. 3

EtOH/Hex 系の検討と考えられた。

次に，粗製大豆 PL がペースト状であるため EtOH 系の

特に，溶媒量を試料 PL に対して 6 倍量用いる方が好分画溶媒に均一に試料が分散しないと考えられたので，結果につながった。それ故，次に溶媒量を試料 PL に対試料が液状になるように Hex を最少量加えた後，EtOHして 6 倍量に固定して，EtOH/Hex の割合を 2/1，4/1，5/1を用いて分画を行った結果を Fig. 6 に示した。に変化させて分画を試みた結果，いずれの溶媒比においFig. 6 から明らかなように，Hex を使用することによても 90％以上の純度の PL を得ることができた。これより溶媒不溶部の PL 純度は 90％以上となり，PL 回収率もり，溶媒混合比については Hex 量に対して EtOH 量を 2多少向上した。従って，EtOH のみよりも Hex を組み合倍以上にすれば良好な結果が得られることが判明した。

わせた溶媒系を用いた方が良好な結果が得られると考え続いて，PL 純度が 93.5％に達した EtOH/Hex(4/1)に溶媒られた。また，粗製大豆 PL を Hex に溶解させてから所比を固定して溶媒量の検討を行った結果，溶媒量が試料定量の EtOH を加えて手早く撹拌を行った方が好ましく，に対して 5 倍以上であれば不溶部の PL 純度はすべて

これは粗製大豆 PL 中の単純脂質を先に Hex に溶解させ90％以上になり，さらに 9～10 倍量では 95％程度に達しることによって，それらを溶媒可溶部へ分画できるためた。

－70－(%)
1009080706050403020100Without Hexane

With Hexane

46Solvent Amount Ratio

46Solvent Amount Ratio]

PL Recovery

PL Recovery

Fig.63. 1. 4(%)
1009080706050403020
100PL Purity

PL Purity

Effect of Micro-amounts of Hexane on Fractionation of Crude Soy PL.
量の 4 倍量の EtOH を手早く注ぎ入れて約 1,000rpm の速撹拌効率の影響

溶媒量は可能な限り少量にすることが望ましいため，度でマグネチックスターラーを用いて撹拌した。その結次にこれまで分画溶媒を加えた後に 5min の手撹拌を行果，Fig. 7 に示したように 6 倍量の溶媒量を用いると不っていた操作をマグネティックスターラーによる撹拌に溶部の PL 純度は 95％になり，溶媒量を 8 倍量使用した代えてその効率を検討した。すなわち，あらかじめ粗製場合には PL 純度は本実験で検討した約 70 種の分画条件

大豆 PL に所定量の Hex を加えて均一に溶解した後，Hexの中で最高の 97.6％にまで達した。

(%)
100(%)
10090908080

Insoluble Fraction

70Soluble Fraction

706060505040403030202010100056785

Solvent Amount Ratio
PL Recovery
PL Purity
Fig.7678

Solvent Amount Ratio
PL Recovery
PL Purity

Purity and Recovery of PL fractionated with EtOH/Hexane (4/1) Solvent under Magnetic Stirring (%).

EtOH/Hex 分画とアセトン分画の比較

クスターラーを用いて，約 1,000rpm の撹拌を 5min 行い，

本実験で得られた最適分画条件の EtOH/Hex（4/1）溶１h 氷冷後の溶媒不溶部として純度 97.6％の PL を得るこ

媒分画法と従来法であるアセトン分画法の結果を比較しとができた。すなわち，この新規法はアセトン分画法とて Table 3 に示した。これより，新規分画法では EtOH/Hex

比べて使用する溶媒量が少ないにも拘らず，精製 PL の（4/1）溶媒を試料に対して 8 倍量使用し，マグネティッ

純度はアセトン分画法に匹敵するものであった。

3. 1. 5－71－

Table ３

Comparison of Fractionated PL by Usual and Novel Methods.

Usual Method

Novel Method

Acetone Fractionation

EtOH/Hex Fractionation

Solvent UsedAcetone

EtOH/Hex（4/1）

Solevent Amounts

10 times larger quantity of sample PL

8 times larger quantity of sample PL(Ratio to Sample PL)

amounts

Fractionation
Procedure

Recovery of PL for 5g

PL composition

Lipid Composition (%)

Sample (%)

Insoluble

SolubleTotal

Insoluble

Soluble

Total

66.5

28.8

95.3

44.9

47.4

92.3

Insoluble

SolubleInsoluble

Soluble

PC

38.6

0

15.5

26.1

PE

12.9

0.7

20.0

7.7

PI

21.9

0.2

36.4

0

Others

24.8

1.4

25.7

0.9

TG

1.8

94.8

2.4

64.4

FA0

2.9

0

0.9

2.1

―2.0―

PV（meq/kg）

４．総amounts
Desolving sample PL with Hex,
Adding cold acetone into sample PL,
stirring by magnetic stirrer for 5 minstirring with glass rod for 5 min in anunder ice-cooling, adding fixed
ice-cooling bath, and then standing as
amounts of cold EtOH quickly, andit is over 1h.
then standing as it is over 1h.

括

参考文献

本研究ではアセトン分画法に代わる大豆 PL クラスの新規分画・濃縮法の開発を目的として，粗製大豆 PL から精製 PL を得る方法を以下のように確立した。すなわ
ち，アセトンより生体に対する安全性の高い冷 EtOH/Hex（4/1）の溶媒系を粗製大豆 PL に対して 8 倍量用いることにより，PL 純度 97.6％の精製 PL を得ることが可能となり，従来法であるアセトン分画法に匹敵する高純度のPL を調製できる新規 EtOH/Hex 分画法を確立した。

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