No.117

高性能アフィニティークロマトグラフィーカラム
TSKgel® Protein A-5PW について
─目

次─ページ
1. はじめに1

2. 基本的性質

12 - 1. 充塡剤の性質

12 - 2. 標準的分離条件

12 - 3. 溶離液中の塩濃度と添加剤の影響

22 - 4. 溶離液 pH の影響

32 - 5. 検量線

42 - 6. 耐久性

52 - 7. アルカリ洗浄

52 - 8. 充塡剤のロット間差

6

3. 分離例

63 - 1. 高速分析

63 - 2. モノクローナル IgG の定量（添加回収試験）

7

4. おわりに

東ソー株式会社

7

1．はじめに

表 1 TSKgel Protein A-5PW カラムの仕様

免疫グロブリン G（IgG）を中心とした抗体医薬に対する需要はますます増加しています。抗体医薬の研究開品

名TSKgel Protein A-5PW品番0023483

発や製造プロセス構築においては、IgG 発現のスクリー基ニングのため細胞培養液中の IgG の迅速かつ高精度な定量が必要になります。さらに商業製造プロセスにおい充塡剤ても IgG の定量は重要な品質管理項目の一つです。この目的のため、Protein A をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー（AFC）が用いられます。
カラム

本レポートでは、IgG の高速・高精度分析を目的として材

平均粒子径20 μm

平均細孔径

100 nmリガンド

遺伝子組換え Protein A

サズ

4.6 mm I.D. × 3.5 cm

質PEEKイ材

出荷溶媒

開発された AFC カラム TSKgel Protein A-5PW につい

多孔性の親水性ポリマー

20 % エタノール水溶液て、基本的性質、特長、分離例などをご紹介します。

2．基本的性質

2-2．標準的分離条件

2-1．充塡剤の性質

多くの IgG は中性付近（pH 7.0 〜 7.5）で Protein A

TSKgel Protein A-5PW は、多孔性の親水性ポリマーに吸着し、酸性条件下（pH 2.5 〜 3.5）で溶出するため、基材 TSKgel G5000PW に、遺伝子組換え Protein A を

TSKgel Protein A-5PW による抗体の分離には、通常、導入した充塡剤を PEEK カラムに充填した AFC カラム

pH の異なる 2 液のステップグラジエント溶出法を用いです。Protein A は IgG の Fc 領域と特異的に結合するます。

ため、IgG と夾雑物を含む細胞培養上清などの試料から溶離液としては、吸着用、溶出用ともりん酸塩緩衝液

IgG を特異的に吸着、分離することができます。また、が一般的ですが、溶出用には低 pH のクエン酸塩緩衝液

濃度既知の IgG を用いて検量線を作成することにより、も使用できます。吸着用溶離液で予めカラムを平衡化後濃度未知の試料中の IgG を定量することができます。

（カラム容積の 5 倍以上を流す）、試料を注入し、IgG の本カラムの基材、リガンド及びリガンド固定化方法は、分取用充塡剤 TOYOPEARL® AF-rProtein A HC-650Fみを吸着させます。その後、溶出用溶離液に切り替え、IgG を溶出させます。と同様です。そのため、TOYOPEARL AF-rProtein A

0.15 mol/L NaCl などの高濃度の塩を溶離液に添加す

HC-650F と類似した分離選択性を持ちます。

ることもできますが、疎水性の高い IgG はカラムへの基材の粒子径が大きく機械的強度が高いため、本カラ非特異的吸着が起こる場合がありますのでご注意くださ

ムは高流速下で使用でき、IgG のハイスループット分析

い。また、疎水性の高い IgG の分離の際にはエタノーにも使用可能です。また、溶媒変化に対する充塡剤の膨ルなどの水溶性有機溶媒やアルギニン（0.2 mol/L）を潤収縮が小さいため、有機溶剤を添加した溶離液を用い吸着用、溶出用の両溶離液へ添加することも非特異的吸ることも可能です。

着の抑制に効果的です。但し、これらの場合には溶離液更に化学的安定性が高く、耐アルカリ性のあるリガンドの切替えによりベースラインが変動する場合がありますを用いているため、NaOH 水溶液による洗浄も可能です。

ので、試料を注入する前に溶離液の切替えのみを実施しNaOH 水溶液によりカラムを洗浄する際には、試料注入バてご確認ください。

ルブから 0.5 〜 2 mL の 0.1 mol/L NaOH 水溶液を注入し表 2 に代表的な溶離液の例を示しますが、IgG によってください。て最適条件が異なる場合がありますので条件検討の実施

表 1 に本カラムの仕様を示します。

をお薦めします。図 1 にポリクローナル IgG の分離例を示します。

─1─表2

溶離液の例
例1
例2
例3

溶離液Ａ：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4
溶離液Ｂ：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5
溶離液Ａ：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4 / エタノール＝ 90/10（v/v）
溶離液Ｂ：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5 / エタノール＝ 90/10（v/v）
溶離液Ａ：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4
溶離液Ｂ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5〈測定条件〉
カラ

ム：TSKgel Protein A-5PW（4.6 mm I.D. × 3.5 cm）

溶 離 液 Ａ：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，
pH 7.4
UV 280 nm

Ｂ：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，
pH 2.5
溶離液切替：0 → 0.5 分 溶離液 A
0.5 → 1.1 分 溶離液 B1.1 → 2.0 分 溶離液 A（再平衡化）（‌ポ ン プ と イ ン ジ ェ ク タ と の 間 に ス タ（Ⅰ）

図1ティックミキサ（容量 10 μL）を装着）（Ⅱ）

流速：2.0 mL/minmin

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

注

ポリクローナル IgG の分離

試

入量：20 μL
料：（Ⅰ）‌0.5 g/L ポリクローナル IgG を含む
CHO 細胞培養液上清（Ⅱ）‌0.5 g/L ポリクローナル IgG（溶離液A に溶解）

2-3．溶離液中の塩濃度と添加剤の影響りましたが、0.15 mol/L NaCl の場合と同様にピーク形種々の溶離液にてモノクローナル IgG を含むチャイ状はテーリングでした。しかし、このモノクローナル

ニーズハムスター卵巣（CHO）細胞培養液上清を分離

IgG の場合には吸着画分の相対ピーク面積に顕著な差はしたときのクロマトグラムを図 2 に示します。いずれの認められず、吸着能や回収率に対する影響が小さいこと

溶離液でも IgG を溶出できますが、溶出時間やピークが示唆されました。

形状が異なることがわかります。ここで用いたモノク

このように、溶離液組成により IgG の溶出挙動が異ローナル IgG の場合、0.15 mol/L NaCl を含む溶離液（クなりますが、IgG の特性によっても溶出挙動が異なるこ

ロマトグラム（3））ではピークの溶出が最も遅く、テーとが予想されます。前項にも記載したように最適条件はリングを示しました。一方、0.2 mol/L アルギニンを含IgG によって異なる場合がありますので条件検討の実施

む溶離液（クロマトグラム（5））では溶出が最も早くなをお薦めします。

─2─

〈測定条件〉
溶離液と試料を除き図 1 と同じ。
溶離液（1）A：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4
相対面積：41 ％）B：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5（2）A：50 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4
B：50 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5（3）A：‌20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液

UV 280 nm＋ 0.15 mol/L NaCl，pH 7.4
B：‌20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液＋ 0.15 mol/L NaCl，pH 2.5（4）A：‌20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4/ エタノール＝ 90/10（v/v）
B：‌20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5/ エタノール＝ 90/10（v/v）（5）A：‌20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液＋ 0.2 mol/L アルギニン，pH 7.4
B：‌20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液＋ 0.2 mol/L アルギニン，pH 2.5
試 料：‌0.5 g/L モノクローナル IgG を含む CHO 細胞培

min

養液上清

図 2 モノクローナル‌IgG の分離に対する溶離液塩濃度
及び添加剤の影響

2-4．溶離液 pH の影響
モノクローナル IgG を含む CHO 細胞培養液上清を
種々の pH の溶離液 B で溶出したときのクロマトグラムを図 3 に示します。pH が高くなるに従い溶出が遅くなりました（クロマトグラム⑴〜⑶）が、このモノクローナル IgG の場合にはピーク形状や吸着画分の相対ピー
ク面積に対する影響はほとんど認められませんでした。
また、クエン酸ナトリウム緩衝液を用いた場合（クロマトグラム⑷）にも同様に溶出できることがわかります。
なお、pH 2.5 のクエン酸ナトリウム緩衝液と pH 2.2 のUV 280 nm

りん酸ナトリウム緩衝液の溶出時間がほぼ同等になっているのは、ここで用いたクエン酸ナトリウム緩衝液の濃度がりん酸ナトリウム緩衝液よりも高いため、pH 変化がより早く起こったものと考えられます。

〈測定条件〉
溶離液を除き図 2 と同じ。
溶離液
Ａ：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4
Ｂ：（1）20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.2min（2）20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5（3）20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 3.0（4）50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5

図 3 モノクローナル IgG の分離に対する溶離液 pH の影響─3─

2-5．検量線

ピーク面積との間に良好な直線関係が得られた（0.1 〜TSKgel Protein A-5PW カラム及び他社 Protein A カ10 g/L（2 〜 200 μg），R2=0.9996）ことから、IgG の定ラムを用い、異なる負荷量で市販ポリクローナル IgG

量範囲が広く、培養初期の低濃度試料から高濃度試料まを分離し、IgG 負荷量に対する吸着成分のピーク面積をで測定可能であることがわかります。また、このときのプロットし、最小二乗法による近似直線（検量線）と決クロマトグラムを図 5 に示します。低負荷量から高負荷定係数を求めた結果を図 4 に示します。他社 Protein A量まで良好なクロマトグラムが得られました。また、図カラムでは高濃度域での直線性が低下したのに対し、6 に示すように、10 % エタノールを含む溶離液を用い

TSKgel Protein A-5PW カラムでは負荷量の広い範囲でた場合でも検量線の直線性は良好でした。

UV 280 nm

TSKgel Protein
A-5PWカラム

A社カラム

min

図4

IgG の検量線

図5

試料負荷量の異なる IgG のクロマトグラム〈測定条件〉〈測定条件〉（1）TSKgel Protein A-5PW（4.6 mm I.D. × 3.5 cm）

図 4（1）と同じ。

試料を除き、図 1 と同じ。
試料：‌0.1 〜 10 g/L ポリクローナル IgG（溶離液A に溶解）

（2）他社カラム（4.0 mm I.D. × 3.5 cm, PEEK）
溶離液と溶離液切替条件を除き（1）と同じ。
溶 離 液 Ａ：50 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液＋ 0.15 mol/L NaCl, pH 7.4
Ｂ：50 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液＋ 0.15 mol/L NaCl, pH 2.5
溶離液切替：0 → 0.2 分

溶離液 A

0.2 → 1.2 分

溶離液 B

1.2 → 2.0 分

溶離液 A（再平衡化）

図6IgG の検量線（10% エタノール含有溶離液）〈測定条件〉
溶離液を除き、図 4（1）と同じ。
溶離液Ａ：‌20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4/ エタノール＝ 90/10（v/v）
Ｂ：‌20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5/ エタノール＝ 90/10（v/v）

─4─

2-6．耐久性

しかしながら、試料中に不溶性物質が含まれる場合、ポリクローナル IgG を含む CHO 細胞培養液上清を試

カラムの入口に蓄積しやすく、性能の低下を引き起こす料として 2,000 回以上の連続注入試験を行いました。図ことがあります。カラムへの注入前に試料をろ過する、7 に約 400 回注入ごとのクロマトグラムを示しますが、あるいは、インジェクタとカラムの間にラインフィルタピーク形状に顕著な変化は認められませんでした。ま（品名 : ラインフィルタキット PEEK、品番：0018014）

た、2,009 回注入後に市販ポリクローナル IgG を用いてを取り付け、適宜交換することにより、カラムの劣化を検量線を作成したところ、図 8 に示すように試験前後で防いで長期間安定した測定を行うことができます。

直線性に差は見られませんでした。

UV 280 nm

注入回数min試料

図7

連続注入試験時のクロマトグラム

図8

連続注入試験前後の IgG の検量線〈測定条件〉〈測定条件〉

図 1 と同じ。

図 1 と同じ。

試料：‌10 g/L ポリクローナル IgG を含む CHO 細胞培

試料：‌0.1 〜 10 g/L ポリクローナル IgG（溶離液 A に溶解）

養液上清2-7．アルカリ洗浄
一 般 的 に、 カ ラ ム に 強 く 吸 着 し た 成 分 の 除 去 に はNaOH 水溶液による洗浄が有効ですが、カラムにダメージを与える可能性があります。そこで、アルカリ洗浄前後のカラム性能を確認しました。洗浄は、試料注入バルブを用いて 0.1 mol/L NaOH 水溶液 500 μL を注入することにより行いました。これを 5 回繰り返した後、ポリクローナル IgG を注入し吸着画分のピーク面積を測定しました。さらに、5 回注入（合計 10 回注入）した後のピーク面積も測定しました。アルカリ洗浄前後のピー

図9ク面積（相対値）を図 9 に示します。5 回後、10 回後の〈測定条件〉
試料を除き、図 1 と同じ。

ピーク面積はアルカリ洗浄前のピーク面積とほぼ同じで、カラムの吸着能に変化は見られませんでした。

アルカリ洗浄前後の相対ピーク面積

試料：10 g/L ポリクローナル IgG（溶離液 A に溶解）
（試料注入バルブを用いて 0.1 mol/L NaOH 水溶液 500μL を注入。5 回注入ごとにポリクローナル IgG を分離。）
─5─

2-8．充塡剤のロット間差

ク形状に顕著な差は見られず、充塡剤ロット間差が小さ

図 10 に 3 ロットの充塡剤を用いてポリクローナル IgGいことがわかります。また、図 11 に示すようにロット間を分離した際のクロマトグラムを示します。IgG のピー

UV 280 nm

で検量線の直線性に顕著な差は見られませんでした。

min

図 10充塡剤 3 ロットでの IgG のクロマトグラム

図 11充塡剤 3 ロットでの IgG の検量線〈測定条件〉〈測定条件〉

試料を除き、図 1 と同じ。

図 1 と同じ。

試料：5 g/L ポリクローナル IgG（溶離液 A に溶解）

試料：0.1 〜 10 g/L ポリクローナル IgG（溶離液 A に溶解）

3．分離例

では吸着画分の相対面積にほとんど差はありませんでし3-1．高速分析

た。また、ポリクローナル IgG を用いて、流速 1.0 mL/

図 12 に 異 な る 流 速 で モ ノ ク ロ ー ナ ル IgG を 含 む

min 及び 4.0 mL/min で作成した検量線を図 13 に示し

CHO 細胞培養液上清を分離したときのクロマトグラム

ます。いずれの流速でも良好な直線性が得られました。

を示します。流速 1.0 mL/min から 4.0 mL/min の範囲〈測定条件〉
流速と溶離液切替条件

UV 280 nm

流速

溶離液 A

溶離液 B

1.0 mL/min0 → 1.00 分

1.00 → 2.20 分 2.20 → 4.00 分

2.0 mL/min

0 → 0.50 分

0.50 → 1.10 分 1.10 → 2.00 分

3.0 mL/min

0 → 0.33 分

0.33 → 0.73 分 0.73 → 1.33 分

4.0 mL/min

0 → 0.25 分

0.25 → 0.55 分 0.55 → 1.00 分

試料：‌モノクローナル IgG（0.5 g/L）を含む CHO 細胞培養液上清（その他の条件は図 1 と同じ。）

min

図 12

溶離液 A

分離に対する流速の影響
─6─

図 13

検量線に対する流速の影響〈測定条件〉
試料を除き、図 12 と同じ。
試料：0.1 〜 10 g/L ポリクローナル IgG（溶離液 A に溶解）

3-2．‌モノクローナル IgG の定量（添加回収試験）

表3添加回収率

濃度既知のモノクローナル IgG を用いて検量線を作成しIgG（g/L）

ました。次に、同じモノクローナル IgG を添加した CHO細胞培養液上清を分離し、モノクローナル IgG の回収率を求めました。クロマトグラムと検量線を図 14 に、添加回収率を表 3 に示します。いずれの濃度でも 100 〜 105 ％の回収率が得られ、広い濃度範囲で IgG を定量できることがわかります。

回収率（%）

添加濃度

定量結果

0.50.50

100

1.0

1.05

105

2.52.60

104

5.05.13103

UV 280 nm（分離条件は図 14 参照）

4．おわりにmin以上、高性能アフィニティークロマトグラフィーカラ
図 14

モノクローナル IgG の分離

ム TSKgel Protein A-5PW について紹介しました。本カ〈測定条件〉
試料を除き、図 1 と同じ。

ラムは耐久性に優れており、アルカリ洗浄も可能なこと

試料：‌0.1 〜 10 g/L モ ノ ク ロ ー ナ ル IgG（20 mmol/Lから、夾雑物を多く含む細胞培養液中の IgG の迅速か

りん酸ナトリウム緩衝液＋ 0.15 mol/L NaCl，pH

つ高精度な定量に適しています。また、IgG の定量範囲7.4 に溶解）が広いため、培養初期の低濃度試料から高濃度試料まで‌0.5 〜 5.0 g/L モノクローナル IgG を含む CHO 細分析可能です。

胞培養液上清─7─

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