トランスレーショナル・リサーチ／フローサイトメトリ

気候変動の実態を明らかにする
大規模フローサイトメトリ
ジャレッド・E・スウォルウェル
海洋学における技術アプリケーションを劇的に広げるために、フローサイトメトリへの新たなアプローチでは光学が利用される。それにより、環境動態における真相解明が期待されている。

するための手がかりである。

スピードに向けた
光学イノベーション

今後 50 年の地球がどうなるか、さ0.5 〜 0.7μm で、水深約 200m に多くフローサイトメトリは、細胞計数とまざまなモデルで異なる気候シナリオ存在しており、地球上で最も多い光合特性評価の技術である。一般的なフロが予測されているという事実がある。

成生物だ。しかしながら、その分布ーサイトメータは、外側にあるシース

その大きな理由として、環境を通してと濃度の情報を入手することは困難で液の流体力学的絞り込みによって、液炭素がどのように移動するのかというある。なぜなら、世界の海の表面積は体のサンプル中の細胞を細いストリーム理解が不十分であることが挙げられ3 億 km を超えるからだ。

として導く。単波長のレーザを解析部（1）

2る。特に、海洋への炭素溶解量のメカそのような広大なエリアに生息する分に照射し、サイトメータは散乱光（通ニズムが大きな疑問である。これが解サブマイクロメートル規模の生物の個常は前方散乱と側方散乱）を収集する。

明できれば、気温や二酸化炭素（ CO2 ）体数を信頼性高く推定するには、どのフローサイトメータは、蛍光を検出の変化に対して生命がどう反応するかような計測方法があるのだろうか。そするためにさまざまなスペクトルチャを明らかにできると期待されている。の答えは、連続的なサンプリングだ。

ネルも搭載できる。ストリームは、サ生態系を理解するには、食物連鎖の米ワシントン大（ University of Wash­

ンプル中の各細胞をユニークに同定す基礎にある生物であり、エネルギーをington ）の研究者は、革新的な光学デるために必要である。光電子倍増管は、バイオマスに変換する独立栄養生物のザインを特徴とする、プランクトンを個々の細胞における散乱光と特定の蛍理解が欠かせない。外洋では、植物プ連続的にモニタリングできる装置

光放射のスペクトル領域を計測する。

ランクトンがこの役目を果たす。優占SeaFlow をデザインした。これは、生そのスピードは、1 秒あたり細胞数千種は、最小の植物プランクトンである物の地球的分布だけでなく、地球規模個だ。光散乱はおおよそ細胞サイズにプロクロロコッカス属である。直径はや地域規模の環境変化への反応も理解比例し、蛍光は色素や染色の発光スペクトルを反映する。

SeaFlow は大規模な連続的計測が可能a)である。ここに示した、2014 年ごろのクルーズ船から収集したシネココッカス属の濃度データが証明している（ a ）。
高密度サンプリングも同様であり、ハワイ諸島近くのプロクロロコッカス属の濃度のプロットを示す（ b ）。

過去 30 年間でフローサイトメトリ
は、海洋学において不可欠なツールとなっている。その理由は、個々のプランクトンの細胞の数、サイズ、蛍光特性を計測する際のスピードと感度だ（ 2 ）。
この技術によって理論的には、全プラb)ンクトン群の密度を推定できるだけでなく、さまざまなプランクトンの種類を区別もできると、われわれは認識した。
自動化フローサイトメータの現世代には CytoBuoy（ 3 ）や FlowCytobot（ 4 ）などがあるが、主に沿岸水域の係留で使われており、航海中の船上で使用され36

2017.9 Laser Focus World Japanる例は少ない（ 5 ）（ 6 ）。しかし、従来の

光検出器
(D2)

フローサイトメトリは、サンプル流におけるシース流の圧力によって定義さストリームれるサンプリング領域に、一度にわずレーザか 1 個の細胞を流すことができる各機細胞器の独自性を保証する。

散乱バー

海洋学のアプリケーション向けにデ光検出器

ザインされた装置には、サンプルの準備にも時間がかかる。海の広大なエリアのサンプリングでは、準備の時間はサンプル間の距離を意味する。そのた対物レンズ 結像
レンズ

対物面

光検出器
(D1)

像平面

図 1 SeaFlow の散乱光検出器は光学的にサンプルボリュームが決定される。この特徴によって連続的なデータ収集が可能になる。

め、スタンダードなアプローチでは、連続的なサンプリングで要求される条に影響される。SeaFlow では、検出ボ別できなかった 2 変数のドットプロッ件に合わなかった。

リュームは光学、特に位置感度検出器トが作成される（図 2 ）。と前方散乱検出器からのシグナルを比SeaFlow の科学的な重要性と、その較することによって決定される（図 1）。

独創的な光学デザインが認識されたの最適配置された粒子（ OPP ）とは、測は、さらにコンパクトで低出力バージ

SeaFlow の決定的な特徴は、われわ定ボリュームが決定されたものだが、ョンの開発を支援するために 1 万ドル

れが開発し、Virtual Core サイトメト

これは各位置感度検出器からのシグナを支払った米エドモンド・オプティク

リとして知られている光学システムでルと同一である。

ス社（ Edmund Optics ）によってであ光学的に特徴付けるサンプルの体積ある（ 7 ）。これにより、他のフローサイトさらに、前方散乱の検出器からのシった。教育助成金申請で最初のデザイ

メータの一般的な特徴であるシース流がグナルは、位置感度検出器からのシグンを提案したあと、エドモンド社の製不要になる。その代わり、事前に海水ナルより低くはできない。レーザ出力品エンジニアは代替部品で可能となるを100μm でフィルタし、直径 200μmの能動的安定化とあいまって、これらパフォーマンス向上とコスト抑制を指のストリームで動作する。こうして、の制約によって連続的に決定されるボ摘した。初代の部品の一部を、在庫に連続的な計測方法が可能となっている。

リュームのサンプル領域が制限されあるレンズ、フィルタ、ミラー、特別Virtual Core サイトメトリでは検出る。OPP のソフトウエアフィルタのアな光学フィルタに置き換えた（図 3 ）。

器を 3 つ利用して、ストリームの中にプリケーションによって、従来のフリわれわれと共同研究を続け、PipeCyteある粒子の位置を特定する。2 つの位ーサイトメータで得られたものでは識と呼ぶ最新のデザインを準備中であa)方散乱光のシグナルと合わせてこれら域は、粒子を測定できるストリームの断面であり、200μm の広いストリー

40,00020,0000ムの一部を分析する。対物の大きさとシステムの視野によって、ボリュームセットを決定する。
従来のフローサイトメータの検出領域は、サンプルボリュームの物理的な大きさによって決まるため、シース流

30,000 60,000
光散乱c)
赤の蛍光

視野絞りの幅によって定義される光学

0d)
60,000赤の蛍光の検出器に基づいて計測する。検出領b)
60,000オレンジの蛍光定し、焦点面に対する縦方向位置は前オレンジの蛍光置検出器が粒子の左右方向の位置を決40,00020,0000030,000 60,000
光散乱

図 2 キャリブレーションビー
ズ（ a, b ）と、亜熱帯の太平洋で採取した海水サンプル（ c, d ）ビーズ640,000の光散乱と蛍光のフローサイトメトリ計測。検出可能な全粒子20,000（ a, c ）と OPP（ b, d ）を示 す。
ビーズ1
赤いほど粒子量が多いことを意
0030,000 60,000 味する。豊富なプロクロロコッ
光散乱
カス属群がベースラインを超えていることに注目。
60,000

ビーズ1060,000

ナノプランクトン
40,000
シネココッカス属
ビーズ120,000
プロクロロコッカス属
0030,000 60,000
光散乱

Laser Focus World Japan 2017.937

トランスレーショナル・リサーチ／フローサイトメトリとなる。培養物と自然界のサンプルのFSC
ミラー

分析によって、SeaFlow が得る細胞濃457nmレーザ

度は、サイトメータのゴールドスタン

FSCダードである BD Influx を使用すると

D1

PE200μm
ストリーム

CHL 1
CHL 2

対物2軸にマウントされたプリズムとレンズ、モーター駆動の位置決めステージ

イメージング
カメラ

PCがリアルタイムにレーザ位置を決定するためにイメージを処理してドリフトを代償する

ダイクロイック
フィルタ
D2
位置感度検出器が焦点内と焦点外の粒子を識別する

図 3 SeaFlow の空間・スペクトルの識別によって、細胞ごとにサイズと色素含量の特徴付けが可能になる。これにより、計測された全細胞を明確に同定できる。

きと一致することが示された（ 8 ）。
Virtual Core の光学は、装置の設定と操作を簡便化するという多くの自動化と合わせて、2010 年にいくつかの研究船にあるSeaFlowに組み込まれている。われわれは 200 日分以上のデータを集めており、これはフリーサイトメトリのサンプル10 万回分に相当する。さらに、米ロングビーチから香港まで太平洋を横断する貨物船上で SeaFlow を操作して、この横断における 5 万 km同等のデータも収集した。

り、2017年後半に開発を予定している。

をリアルタイムに計数する。連続的な海洋における CO2 挙動の生物地球化

PipeCyte は SeaFlow よりさらに小 さフローという特徴によって、数 m から学的な計測を合わせて、SeaFlow のデく、よりエネルギー効率がよい。最新

数千 km の空間スケールで、表面の植ータは、植物プランクトンのホットスのデザインによって、世界中の複数の物プランクトンの動態を探索できるよ

ポットが炭素循環量の不均化の原因でプラットフォームで同時に環境モニタうになる。

あることを示唆している。この機器の異なる集団の細胞濃度を決定するたよりコンパクトで低出力なバージョン

めに、検出領域のボリュームと、全検であれば、無人潜水機や海洋係留、研出粒子に対する OPP 粒子の比を乗算

究ブイを含めた計測プラットフォームして、OPP 領域（ Virtual Core と呼ぶ）を拡大できるだろう。理想は、この技のボリュームを最初に計算する。OPP術によって世界で経済的な不利益を被SeaFlow は 7 つの分析パラメータをボリュームで分割された群内の細胞数っている地域の水質や、近隣の運河の使用する。2 つの位置感度検出器、直は、1ml あたりの細胞数における濃度工業化の影響を調査することだろう。

リングするためにより多くの機器が作られるべきである。

フィールドで証明される
パフォーマンス

交偏光と垂直偏光それぞれの前方散乱、クロロフィル、大きい粒子のためのクロロフィル、フィコエリトリンである。この装置は 0.5 〜 1.5μm にわたる異なる細胞を識別、定量化するために、各細胞の光散乱と自家蛍光特性を利用する。
実際には、船の海水システムが、解析すべき生の海水を装置に流す。まず、水を 100μm のステンレス鋼のメッシュに通し、200μm のノズルに入れて計測ストリームを形成する。SeaFlow
は個々の細胞のサイズと色素含量に関する情報を収集し、1 秒あたり数千個

382017.9 Laser Focus World Japan

参考文献（ 1 ）F. Partensky, W. R. Hess, and D. Vaulot, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63, 1, 106–127 (1999).
（ 2 ）M. Sieracki et al., "Sustained ocean observations and information for society," Proc.
OceanObs '09, 2, ESA Publication WPP­306 (2009); doi:10.5270/oceanobs09.cwp.81.
（ 3 ）G. B. J. Dubellar and P. L. Gerritzen, Sci. Mar., 64, 255–265 (2000).
（ 4 ）R. J. Olson, A. Shalapyonok, and H. M. Sosik, Deep Sea Research Part I: Oceanographic
Research Papers, 50, 2, 301–315 (2003).
（ 5 ）A. Cunningham, D. McKee, S. Craig, G. Tarran, and C. Widdicombe, J. Marine Syst., 43, 1–2, 51–59 (2003).
（ 6 ）M. Thyssen, N. Garcia, and M. Denis, Biogeosciences, 6L, 569–583 (2009).
（ 7 ）J. E. Swalwell, T. W. Petersen, and G. van den Engh, Cytometry Part A, 75, 11, 960–965(2009).
（ 8 ）J. E. Swalwell, F. Ribalet, and E. V. Armbrust, Limnol. Oceanogr., 9, 466–477 (2011).
著者紹介
ジャレッド・E・スウォルウェルはワシントン大アルムブラスト（ Armbrust ）生物海洋学研究室のリサーチエンジニア。
e­mail: jarred@u.washington.edu URL: http://armbrustlab.ocean.washington.edu
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