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Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solutionを用いたウェスタンブロッティングにおけるブロッキング条件の検討
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 川井 淳
はじめ に結果及び考察

ウェスタンブロッティングにおいて良好な結果を得るために

1. Can Get Signal によるシグナル増強効果の比較（図1）®

は、抗体濃度の至適化とともに、ブロッキング条件の検討が非常段階希釈したHis-ERK2タンパク質合成反応液を電気泳動しに重要な要素となっています。解析されるタンパク質や用いる抗たものから、抗Hisタグ抗体を用いてタンパク質を検出する系

体には、それぞれに多様な性質があり、最適なブロッキング条件において、ブロッキング剤としてスキムミルクとBSAをそれも異なります。ブロッキング剤として主に用いられるものとしてぞれ用いたものについて、Can Get Signal ®によるシグナルは、スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン（BSA）、ゼ増強効果を比較しました。

ラチン、正常血清等がありますが、万能といえるものはなく、まスキムミルクによりブロッキングを行った場合、従来法たそれらの添加濃度やインキュベート温度・時間によっても効果（TBS-T）で希釈してアッセイを行ったものでは、微弱なシグナが異なります。用いる抗体の種類によっては使用に適さないブロルしか得られませんでしたが、Can Get Signal ®の使用によッキング剤もあります。従って、最も良好な結果を得るためには、りバックグラウンドを低く抑えたままポジティブなシグナルのそれぞれの解析に最適なブロッキング条件をその都度決定するこみを増強することができました（図1上）。一方、BSAによりブとが好ましいと言えます。

ロッキングを行ったものでは、従来法でもある程度強いシグナ

Can Get Signal ® Immunoreaction Enhancer Solutionは、ルは検出できた一方で非特異的なバンドが多数出現しました

ウェス タ ン ブ ロッティン グ や E L I S A（ e n z y m e - l i n k e dが、Can Get Signal ®の使用により非特異的なバンドを減らし、immunosorbent assay）などの解析でしばしば問題になる、なおかつ特異的なシグナルを増強することができました（図1

感度不足や高いバックグラウンドを改善するために開発された免下）。

疫アッセイ用の反応促進試薬です。Can Get Signal ®の使用法

このように、Can Get Signal ®は、ブロッキング剤としては非常に簡便で、従来ご使用されていた抗体希釈液の代替としてスキムミルク、BSAのどちらを用いた場合でも、より改善さ用いるだけで、現行の実験系をほとんど変えずに高いS/N比の結れた結果を得ることができることがわかりました。

果を得ることができます。ブロッキングにはいずれのブロッキング剤を用いることも可能ですが、ブロッキング条件の至適化を行うことによって、より改善された結果が得られると期待されます。
®

本号では、Can Get Signal ®を用いたウェスタンブロッティ

Can Get Signal

ングにおいて、ブロッキング剤を変えた場合に得られる結果の違1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

従来法（TBS-T）
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いを、最も頻繁に用いられるブロッキング剤であるスキムミルクとBSAを用いて比較検討した例についてご紹介いたします。

方法

サンプル ＊を4×SDSサンプルバッファーに懸濁し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行いました。
電気泳動を行ったゲルからPVDF膜へ、セミドライ法によりタンCan Get Signal

パク質をトランスファーし、ブロッキングバッファー（5%スキ1/1

ムミルク/TBS-Tまたは5% BSA/TBS-T）で室温で1時間ブロ®

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従来法（TBS-T）
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ッキング処理を行いました。一次抗体反応は、抗体＊をCan Get

Signal ® Solution 1で希釈した液を用いて、室温で1時間行いました。また同時に比較対照として、通常抗体の希釈に用いられるTBS-T（TBS、0.1%Tween20）を用いて同様に実験を行いました（図1のみ）。二次抗体反応は、抗体＊をCan Get Signal ®
Solution 2またはTBS-Tを用いて希釈した液（図1のみ）で、室温で1時間行いました。検出は、ECL Plus【AmershamBiosciences社】を用い、弊社微弱発光検出システムFAS-

図1．Can Get Signal ®によるシグナル増強効果の比較
上: 5%スキムミルク/TBS-T使用
下: 5%BSA/TBS-T使用

1000により撮影しました。
＊：次ページ掲載の表をご参照ください。

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サンプル

一次抗体

二次抗体

図1

His-ERK2無細胞タンパク質合成反応液

抗His-probe抗体（rabbit polyclonal）（Santa Cruz社） 1000倍希釈

抗rabbit IgG-HRP（Santa Cruz社） 10000倍希釈

図2A431細胞

抗EGFR抗体（rabbit polyclonal）（Santa Cruz社） 1000倍希釈

抗rabbit IgG-HRP（Santa Cruz社） 10000倍希釈

図3

HeLa細胞

抗Actin抗体（goat polyclonal）（Santa Cruz社） 1000倍希釈

抗goat IgG-HRP（Santa Cruz社） 10000倍希釈

2. スキムミルクとBSAのブロッキング能の直接比較（Can Get

今回は、Can Get Signal ®を用いたウェスタンブロッティ

Signal 使用）（図2、図3）

ングにおいて、スキムミルク、BSAいずれのブロッキング剤サンプルとしてA431細胞またはHeLa細胞抽出液を用い、を用いた場合でもそれぞれより改善された結果が得られるといそれぞれからEGFR、Actinを検出する系において、ブロッキうこと、またそれぞれのタンパク質・抗体に最適なブロッキン

ング剤としてスキムミルクまたはBSAを用いた場合に得られグ条件が異なり、条件検討により更に良い結果が得られることる結果の違いを、直接比較しました。

を示しました。Can Get Signal ®はウェスタンブロッティン®

A431細胞からEGFRを検出する系では、BSAよりスキムミグのシグナルを強化し、高いS/N比の結果を得るための強力なルクを用いた方がわずかに強いシグナルが得られ、またBSAツールですが、ブロッキング条件の最適化により更に明瞭な結を用いた場合には分子量マーカータンパク質に由来する非特異果を得ることができます。抗体濃度の条件検討でもなかなか結的シグナルが強力に検出されました（図2）。一方、HeLa細胞果が改善しない場合などには、ブロッキング条件の至適化検討

からActinを検出する系では、BSAを用いた方がスキムミルクを強くお勧めします。

より全体的に強いシグナルが得られました。多少非特異的なシグナルも強くなってますが、S/N比はほぼ同等であり、BSAの方が検出感度が高いという結果になりました（図3）。

※ご注意

一般的に、BSAよりスキムミルクのほうが強力なブロッキ

ブロッキングバッファー調製時に、ブロッキング剤の希釈液としング効果がありますが、ここに示したように、ブロッキング剤てCan Get Signal ®を用いないでください。ブロッキング能がの効果はタンパク質・抗体により違いがあり、それぞれ最適な低下する場合があります。

ブロッキング条件は異なるということがわかりました。

5% Skim milk/TBS-T

5% BSA/TBS-T

5% Skim milk/TBS-T

5% BSA/TBS-T

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図2．A431細胞におけるEGFRの検出品 名 及 び 内 容

Can Get Signal

図3．HeLa細胞におけるActinの検出

包装

保存温度

Code No.

価

格各250ml
各50ml

4℃

NKB-101
NKB-101T¥30,000¥10,000250ml

4℃

NKB-201¥17,000

250ml4℃

NKB-301¥17,000

保存温度

Code No.

価4℃

NKB-401¥12,000®

Immunoreaction Enhancer Solution

Solution 1 for primary antibody
Solution 2 for secondary antibody®

Can Get Signal
Solution 1 for primary antibody®

Can Get Signal
Solution 2 for secondary antibody

品 名 及 び 内 容

包装

免疫反応促進試薬

Can Get Signal ® immunostain
Immunoreaction Enhancer Solution

各5ml＊

格＊：この印のついた製品には、上記以外に他の容量でも販売しております。詳しくは本誌P.7をご参照ください。

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