実験動物ニュース

Vol. 68

No. 2

実験動物感染症の現状

肺パスツレラの細菌分類再編と微生物モニタリング
佐々木啓
順天堂大学スポーツ健康科学部健康学科環境衛生学教室

要約

肺パスツレラ（旧学名：[Pasteurella] pneumotropica）は，2017 年 6 月から新しい属種名が与えられ，1 属 8 種と 2 種の genomospecies から構成される Rodentibacter 属のうちの 2 種に再編されることが提案された。これまでの属種名が改められ，遺伝子データベース上の名称も新学名に移行しつつある。今回新設された Rodentibacter 属には，これまで暫定的に命名されていた [P.] pneumotropica のほかに，属種名を与えられてなかった Bisgaard Taxon 17，21，22，41 ならびに 48 も同属に入ることになった。今回の再編では，生化学性状よりも遺伝子配列による相同性が重視されている。
本稿では新設された Rodentibacter 属の概要を紹介するとともに，今後考えられる肺パスツレラの微生物モニタリング時の問題点についても述べたい。

osteomyelitidis といった学名がそれぞれ与えられた [4,5, 7]。

1．げっ歯類を宿主とするパスツレラ科再編の流れ
1）パスツレラ科再編
近年，パスツレラ科に属する菌種の分類再編が相次 い で 進 め ら れ て い る。 ヒ ト の 病 原 体 で はActinobacillus 属であった侵襲性歯周炎の原因菌がAggregatibacter actinomycetemcomitans へと属名変更され [10]，Pasteurella 属であったウシ呼吸器病原因菌は Mannheimia haemolytica へと属名変更された [10]。
また，属種名が与えられなかった菌群についても新属種名が与えられつつある [4, 5, 7, 10]。遺伝子解析による属や種の区別を行なうことにより，パスツレラ科の多様な種をカバー可能な枠組みを再編する必要が生じたものと考えられる。
2）げっ歯類を宿主とする菌群の再編（肺パスツレラについては後述）
パスツレラ科のなかでもげっ歯類を宿主とする菌種では，肺パスツレラに近縁な [Actinobacillus] muris
が長らく暫定的な属名（[ ] 内の属名は暫定名称を示す）が与えられてきたが，2015 年に Muribacter muris
への属種名変更が提案された [11]。そのほか，実験動物にも感染する同じパスツレラ科の Bisgaard Taxon
23，24 な ら び に 25 と い う 名 称 の 菌 群 に は，
M a n n h e i m i a c a v i a e，N e c ro p s o b a c t e r ro s o r u m，Mesocricetibacter intestinalis な ら び に Cricetibacter

263）肺パスツレラとは
肺パスツレラは従来 [Pasteurella] pneumotropica とされてきたマウス，ラット，ハムスターを宿主とする グ ラ ム 陰 性 短 桿 菌 で， 生 物 型（biotype ま た はbiovar）Jawetz ならびに Heyl に分けられる。基準株
は [P]. pneumotropica の生物型 Jawetz に設けられたが，生物型 Jawetz と Heyl とで生化学性状や 16S rRNA 遺伝子（rDNA）配列に違いが見られ，肺パスツレラ同定の際の混乱の一因となっていた。
実際，筆者が生物型 Jawetz の基準株と生物型 Heylの代表株のゲノムを解析した結果によると，両生物型は同一菌種とはいえない配列を保有していた [13,14]。
4）肺パスツレラ分類再編の動き
パスツレラ科の再編についてはコペンハーゲン大学を中心とする研究グループが精力的に行っている。
肺パスツレラの再編について筆者が 2016 年末に研究統括の Henrik Christensen 博士に問い合わせたところ，内容については伏せながら解析は終了し公表できる段階だとの回答だった。2017 年，およそ 400 株の詳
細な性状解析から導き出された大規模な分類再編案が発表された [1]。それによると肺パスツレラは属名

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表1Vol. 68

No. 2Rodentibacter 属菌種の旧名称と主要宿主
菌種

旧名称

主要宿主

R. pneumotropicus[P.] pneumotropica biotype Jawetz
Bisgaard Taxon 21[P.] pneumotropica biotype Heyl

Mouse
Rat
Mouse
Rat
Hamstar
Rat
Mouse
Rat
Rat
Rat
Myodes glareolus
Apodemus sp.
Apodemus sp.
Rat
Apodemus sp.
Mouse
Myodes glareolus

R. heylii

R. heidelbergensis
R. trehalosifermentans
R. rarus
R. myodis
R. mrazii
R. genomospecies 1[P.] pneumotropicaBisgaard Taxon 22
Haemophilus ?（一部 V 因子要求性）
Haemophilus ?（V 因子要求性）
Bisgaard Taxon 17
Bisgaard Taxon 41
Bisgaard Taxon 21
Bisgaard Taxon 48

R. genomospecies 2−

R. ratti

も種名も全く新しいものが提案された。肺パスツレ
ラは，パスツレラ科の Rodent cluster と言われたグルー
プの 1 属 1 菌種の構成であったが，パスツレラ科Rodentibacter 属のなかの 2 菌種へと移行した。
2．Rodentibacter 属の概要
表 1 に Adhikary らの論文 [1] と Boot らの解説 [3]を参考に Rodentibacter 属 8 菌種と 2 種の genomospeciesの旧名称と主要宿主を示した。国内で使われる和名の “肺パスツレラ または “[P]. pneumotropica という実験用げっ歯類の微生物モニタリング対象菌種は，
R. pneumotropicus ならびに R. heylii の 2 菌種になった。
この 2 菌種はかつての生物型 Jawetz ならびに Heyl に相当し，当初は炭素源利用性で区別できるとされていた [9] が，その後は方法の違いや多様な野生株が続々と分離されたことにともなって一律した結果が得られなくなっていた。しかしながら両生物型は遺伝子配列に違いが見られ，現在では 16S rDNA 配列の違いや，16S rDNA と 23S rDNA のスペーサー領域の塩基配列に違いが見出されている [2]。したがって，これらは今回の再編に則した 2 菌種を同定できる手段にもなり得ると考えられる。これら R. pneumotropicus
ならびに R. heylii が，マウス，ラット，ハムスターをおもな宿主としており微生物モニタリングの対象となる所謂 “肺パスツレラ になる。

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これら 2 種と比較的近い性状を持つのがおもにラットを宿主とする R. ratti である。この種の中にはBisgaard Taxon 22 と過去に [P.] pneumotropica と同定された菌株が編成されたが，後述する遺伝子配列の相同性を考慮して Boot らはこれを微生物モニタリングの対象種と考えていない [3]。R. ratti の基準株は，
16S rDNA 配列で R. pneumotropicus の基準株との相同性が 96%（R. heylii とは 95% の相同性）であることから R. pneumotropicus や R. heylii とは線引きがなされ，約 98% の相同性を持つ R. heidelbergensis 基準株の方が近縁種であるとされている [1]。
表 1 に示す R. heidelbergensis 以下は，遺伝子配列のほかに基準株の生化学性状や主要宿主が異なる。
後述するが複雑な要素として，R. heidelbergensis の一部の菌株は NAD（V 因子）要求性を示すことが記載されている。さらに，R. trehalosifermentans には V 因子要求性があるが，ポルフィリンを合成するとも記載 さ れ て お り，V 因 子 要 求 性 は 見 ら れ て もHaemophilus 属のように常に生育のために X 因子とV 因子依存性を示さないものと考えられる。
今回の分類で象徴的なのが 2 種の genomospeciesの存在である。Rodentibacter 属に限らず，近年の細菌 分 類 は 遺 伝 子 解 析 が 主 軸 に な っ て い る。
Rodentibacter 属は，宿主の違いと 16S rDNA と RNAポリメラーゼ β サブユニットをコードする rpoB 遺伝子の塩基配列の違い，ならびに DNA-DNA ハイブリ

実験動物ニュース表2

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No. 2

Rodentibacter 属 3 菌種の生化学性状の違い
R. pneumotropicus

R. heylii

R. ratti

−−
D [+]
D [+]
−−
−
D [(+)]
−
−

−
D [+]
−
D [−]
−−
−
D [−]
−
D [(+)]

D [−]
D [−]
D [+]
−
−−
−
D [−]
−
D [(+)]

V 因子要求性
リジンデカーボキシラーゼ
オルニチンデカーボキシラーゼ
インドール
アラビノースリボース
キシロース
イノシトールマンニトールラクトース＋ : 90% 以上陽性，(+): 遅延陽性，−: 10% 以下が陽性，D: 11–89% が陽性，[ ] は基準株のデータを示す．

ダイゼーションの結果を参考に菌種が区別された。
そ の た め， 今 回 提 案 さ れ た 8 菌 種 の 基 準 株 と 16S
rDNA 配列などと相同性が低い菌株は，「遺伝子配列で分類した菌種」という位置付けで genomospecies 1および 2 と名称が与えられた。げっ歯類を宿主とするパスツレラ科は，8 菌種ではまかなえないほど遺伝 的 多 様 性 が 高 い も の と 考 え ら れ る。 こ れ ら
genomospecies 2 種はマウスやラットからも少数分離されているが，ほとんどは野鼠であるアカネズミ属からの分離である。
3．肺パスツレラの生化学性状について
表 2 に R. pneumotropicus，R. heylii および R. rattiのおもな生化学性状の違いを示した。ここで注目すべきは，生化学性状として “ ＋ ” や “−” などの表記のほか，脚注にあるように 11–89% が陽性といった“D” で示される “different strains give different reaction”が使われていることである。さらに “D” と示されていても，基準株の性状（[ ] 内に表記）が “−” であることもあり，同一菌種内の菌株間で生化学性状に差が生じている。R. ratti では，V 因子要求性のように生育に必須なはずの要素も同一菌種内の株間で異なっている。
表 2 に記載されている生化学性状の差を見ると，リジンデカルボキシラーゼ，オルニチンデカルボキシラーゼならびにラクトース利用能を調べれば，3菌種の中から 1 菌種を特定できる可能性があると思われるが，“ ＋ ” の表示が必ずしも 100% 陽性ではないため生化学性状結果の判断が難しいところである。
Rodentibacter 属では，これら 3 菌種に “D” や基準株

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性状の “[ ]” の表記が多用されている。したがって，微生物モニタリング時に菌種を絞り込むための目安に生化学性状は有用であるが，確定的な同定の手段としては信頼性という点で遺伝子解析に劣るのは否めない。その一方で，遺伝子解析で明確にならない場合には生化学性状試験を併せて行うことで高いエビデンスが得られ，重要な補助手段となる。
筆者の個人的経験になるが，過去に同定された肺パスツレラやその近縁種を一度グリセロールやスキムミルクで長期的に超低温保存した後に血液成分を含まない培地で復起させると，同一菌株でも様々な大きさのコロニーが 1 枚のプレート上で形成されることがある。おそらく V 因子要求性に不均一性があるため，衛星現象に類似した様相を示すのだろうと考えている。
4．再編根拠に基づく肺パスツレラ同定の問題点
最初に個人的な見解を述べてしまうが，従来のモニタリング方法を行なう限り，今回再編された R.
pneumotropicus と R. heylii を見逃すことは先ずないと考えられる。ただ，従来のモニタリング方法はこの2 菌種以外を捕捉する可能性はある。ここでは，筆者の経験と現在公開されている論文について紹介し，その上で考慮したい点を述べたい。
1）遺伝子配列の相同性を基にした菌種の同定
これまで DNA-DNA ハイブリダイゼーションが細菌分類では重視されてきたが，今回のパスツレラ科
再編における菌種判別の最大の根拠は，16S rDNA とrpoB 遺伝子配列の相同性である [1]。しかし，98%

実験動物ニュースと高いしきい値を設定しても同一種判定に不十分であるという報告もある [15]。この再編論文 [1] と遺伝子配列データが公開された後に，筆者はワーキング用としてすぐに起こすことができる 12 株だけを簡易的に調べてみた。これらの菌株は，既に複数の PCR法で肺パスツレラであることを確認している菌株であったが，16S rDNA 塩基解析による種レベルの同定方法 [15] に基づき相同性のみで判定したところ，2株が R. pneumotropica や R. heylii と判定できなかった。
では Rodentibacter 属の他菌種かというと，他菌種の基準株とも相同性が低いので，Rodentibacter sp. と同定せざるを得なかった。また，rpoB 遺伝子配列の短い領域（520 bp）[6] を対象に相同性を比較したところ，95% 以上の相同性が確保されるのは 6 株だった。
肺パスツレラ再編データ [1] をもとに菌種同定を行って上記の筆者と同じような状況に陥った海外の事例が，2019 年早々，J Am Assoc Lab Anim Sci のオンライン版アブストラクトとして公開された [8]。遺伝子配列の相同性と，商用モニタリングセンターによる PCR の結果が一致しなかったという事例であり，著者らは PCR に用いるプライマー配列を明記することを提案している。今後，このような報告が多く出てくると予想される。
2）再編された肺パスツレラの同定にあたって肺パスツレラを疑う菌の 16S rDNA 全長解析で基準株と BLAST 解析で 99% 以上の相同性があれば肺パスツレラ（R. pneumotropicus あるいは R. heylii）であると判断できるだろう。菌種によってはマルチコ
ピー rRNA の変異で同一菌株でも 1% を超える差が生じる菌種も存在する [12] が，筆者が調べた限り，肺パスツレラの場合は多くても数塩基変異なので 1%程度の相同性の違いであれば同種と判断できる可能性は高い。その一方で，基準株の 16S rDNA 全長配列との相同性が 95–98% の場合に被験菌が肺パスツレラ（R. pneumotropicus あるいは R. heylii）ではないとは結論できないと考えている。もし相同性が低い場合に “ 肺パスツレラ ” ではないとするのであれば，
16S rDNA 全長の塩基配列解析のほかに rpoB 遺伝子の塩基配列解析，複数のプライマーセットを用いたPCR 結果，生化学性状試験結果，動物の健康状態などを総合して判断する必要があると考えている。同時に，前述の Dafni ら [8] のような事例を公表し，常に同定方法に改良を加えていく必要があるだろう。

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参考文献
1. Adhikary S, Nicklas W, Bisgaard M, Boot R, KuhnertP, Waberschek T, Aalbæk B, Korczak B, Christensen
H. Rodentibacter gen. nov. including Rodentibacter
pneumotropicus comb. nov., Rodentibacter heylii sp.
nov., Rodentibacter myodis sp. nov., Rodentibacter
ratti sp. nov., Rodentibacter heidelbergensis sp. nov.,
Rodentibacter trehalosifermentans sp. nov., Rodentibacter rarus sp. nov., Rodentibacter mrazii and two
genomospecies. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017.
67: 1793–1806.
2. Benga L, Benten WP, Engelhardt E, Bleich A, Gougoula C, Sager M. Development of a multiplex PCR
assay based on the 16S-23S rRNA internal transcribed spacer for the detection and identification ofrodent Pasteurellaceae. J. Microbiol. Methods. 2013.
95: 256–261.
3. Boot R, Nicklas W, Christensen H. Revised taxonomy
and nomenclature of rodent Pasteurellaceae: Implications for monitoring. Lab. Anim. 2018. 52: 300–303.
4. Christensen H, Bojesen AM, Bisgaard M. Mannheimia caviae sp. nov., isolated from epidemic
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Syst. Evol. Microbiol. 2011. 61: 1699–1704.
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Syst. Evol. Microbiol. 2014. 64: 3636–3643.
8. Dafni H, Greenfeld L, Oren R, Harmalin A. The Likelihood of misidentifying rodent Pasteurellaceae byusing results from a single PCR assay. J. Am. Assoc.
Lab. Anim. Sci. 2019. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-18–000049.

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No. 2

13. Sasaki H, Ishikawa H, Asano R, Ueshiba H, Matsumoto T, Boot R, Kawamoto E. Draft genome
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14. Sasaki H, Ishikawa H, Terayama H, Asano R, Kawamoto E, Ishibashi H, Boot R. Identification of avirulence determinant that is conserved in the Jawetz
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2006. 33: 152–155.

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