Abstract

RNA 干渉（RNA interference; RNAi）とは，細胞に導入した 2 本鎖 RNA（double-stranded RNA;dsRNA）が，相同な塩基配列をもつメッセンジャー RNA（mRNA）を特異的に切断することによって遺伝子発現を抑制する現象である．RNAi の分子機構は，生体内においてはウイルスやトラン
スポゾンに対する防御機構の一部と考えられているほか，生体内で多数発現しているマイクロRNA（microRNA; miRNA）による遺伝子発現の制御において重要な役割を担っている．また人為的に dsRNA を細胞内に導入することによって，任意の遺伝子を簡便にノックダウンできることから，RNAi は遺伝子の機能解析に有効な手法として注目されている．
哺乳類細胞で RNAi 実験をおこなうには，標的遺伝子と相同な，化学合成した約 21 塩基対の短い 2 本鎖 RNA（short-interfering RNA; siRNA）または siRNA を発現するベクターを細胞に導入する方法が一般的に用いられる．しかし siRNA の配列はどのようなものでも細胞内で機能する
わけではなく，無作為に設計した siRNA の 7 〜 8 割は RNAi 活性を示さない．さらに，siRNA の長さは約 21 塩基対と短いため，標的遺伝子とはまったく無関係な遺伝子にも相同部分が存在する確率が高く，siRNA がそのような遺伝子を抑制してしまうことがある（オフターゲット効果）．
本研究ではまず，特にこれら 2 つの問題点を考慮した，哺乳類細胞で有効かつオフターゲット
効果の少ない siRNA の設計法を構築した．哺乳類細胞で有効な siRNA の設計法は，著者らを含む 3 つの研究グループから提唱されている方法の比較検討をおこない，もっとも良い著者らの方法（Ui-Tei et al. 2004, Nucleic Acids Res. 32, 936-948）を用いた．またオフターゲット効果が少な
い siRNA を設計するために，標的以外のすべての遺伝子に対して相同性が最小となる siRNA 配列を選択するという情報科学的手法を用いた．21 塩基の相同性検索は，Yamada らのアルゴリズ
ム（Yamada et al. 2005, Bioinformatics 21, 1316-1324）を用いた．本研究で構築した siRNA 設計シス
テムによって，ヒトの全遺伝子をほぼ網羅できるゲノムワイドな siRNA 設計をおこなった．
一方，siRNA の標的は内在性遺伝子に限定されず，細胞に感染したウイルス由来の RNA を標的とすることによってウイルスの増殖を抑制できることが示されている．本研究で構築した
siRNA 設計法は，哺乳類細胞に感染するウイルスを標的とする場合にもそのまま適用できると考えられる．しかし HIV-1 や HCV など多くの RNA ウイルスは，著しくゲノム多様性が高く，
1 種類の siRNA を単独で用いた場合，その siRNA に耐性をもつ変異ウイルスが容易に出現しうることが報告されている．そこで本研究では，多様性の高いウイルスを対象として，その高度保存領域を同定し，それらの領域を標的とする siRNA の設計をおこない有効性を評価した．

Abstract

RNA interference (RNAi) is the process of double-stranded RNA (dsRNA) mediated, post transcriptional
gene silencing. It is now widely used to knockdown gene expression in a sequence-speciﬁc manner, making
it a powerful tool not only for studying gene function, but also for therapeutic applications including
antiviral treatments.
In mammalian cells, RNAi can be induced using 21 nucleotide-length short-interfering RNA(siRNA) or siRNA expression vectors. However, the eﬃcacy of each siRNA varies widely depending on its
sequence; only a limited fraction of randomly designed siRNAs is functional. Moreover, oﬀ-target silencing
eﬀects arise when the introduced siRNA has sequence similarities with unrelated genes. In the present study,
rational designing of highly functional, oﬀ-target minimized siRNAs is proposed. Highly functional siRNAs
are selected using novel guidelines that were established through an extensive study of the relationshipbetween siRNA sequences and their RNAi eﬃcacy (Ui-Tei et al. 2004, Nucleic Acids Res. 32, 936-948). Oﬀtarget eﬀects are minimized by an exhaustive scan of the non-redundant transcriptome database using
accelerated oﬀ-target search algorithm developed by Yamada et al. (Yamada et al. 2005, Bioinformatics 21,1316-1324). The present study also publicizes the entire list of highly eﬀective, oﬀ-target minimized siRNAsequences for human and mouse genes listed in the RefSeq database.
siRNA mediated RNAi is also applicable for antiviral therapy by targeting viral sequences.
However, in case of RNA viruses, designing functional siRNAs that target viral sequences is problematic
because of their extraordinarily high genetic diversity. It is also known that siRNA-resistant viral mutants
emerge rapidly due to their high mutation rate. In this study, I attempted to design the eﬀective antiviralsiRNAs that target HIV-1. Highly conserved regions within HIV-1 genomes were identiﬁed through an
exhaustive computational analysis, and the functionality of siRNAs targeting the highest possible conserved
regions was validated. Several promising candidates of antiviral siRNAs are presented, which eﬀectively
inhibited multiple subtypes of HIV-1 by targeting 5′ UTR, protease, and integrase regions. The present
study also publicizes the web-based online software system named siVirus (http://siVirus.RNAi.jp/), which
provides functional, oﬀ-target minimized siRNAs that target highly conserved regions of divergent viralsequences including HIV, HCV, inﬂuenza virus, and SARS coronavirus, all of which pose enormous threats
to global human health.

目

緒

次

論 ................................................................................................................................ 1

第 一 章 ................................................................................................................................ 9
1. 結果と考察 ...................................................................................................................11
1-1. 哺乳類細胞で活性の高い siRNA 設計法の検討.......................................................11
1-2. ゲノムワイドな siRNA 設計への適用可能性 ..........................................................15
1-3. siRNA の標的切断活性を評価するアッセイ系の構築 .............................................16
1-4. オフターゲット効果が少ない siRNA 設計法の実験的検討（１）.............................21
1-5. オフターゲット効果が少ない siRNA 設計法の実験的検討（２）.............................24
1-6. siRNA 設計システムの構築 ..................................................................................26
1-7. ヒト全遺伝子に対する siRNA 設計 .......................................................................28
1-8. 長い 2 本鎖 RNA から生成される siRNA のオフターゲット効果 ...........................30
2. 方

法 ..........................................................................................................................33

2-1. Ui-Tei らによる siRNA 設計法..............................................................................33
2-2. Reynolds らによる siRNA 設計法........................................................................33
2-3. Amarzguioui らによる siRNA 設計法 ..................................................................33
2-4. siRNA ..................................................................................................................33
2-5. 細胞の培養およびトランスフェクション ................................................................34
2-6. ルシフェラーゼ遺伝子を標的とする RNAi .............................................................34
2-7. 標的 mRNA 発現ベクター pTREC の構築 .............................................................34
2-8. 標的切断アッセイ..................................................................................................34
2-9. ビメンチン遺伝子を標的とする RNAi ....................................................................35
2-10. プライマーエクステンション法 ...........................................................................35
2-11. seed マッチによるオフターゲット効果の検討 ....................................................36
2-12. 共同研究に関する事項 ........................................................................................36

第 二 章 ...............................................................................................................................37
1. 結果と考察 ...................................................................................................................39
1-1. HIV-1 を標的とする siRNA 設計法の検討 .............................................................39
1-2. siRNA の抗 HIV-1 効果の検証 ..............................................................................42
1-3. 抗ウイルス siRNA 設計システムの構築 .................................................................49

2. 方

法 ..........................................................................................................................53

2-1. siRNA ..................................................................................................................53
2-2. 細胞の培養およびトランスフェクション ................................................................53
2-3. 標的切断アッセイ..................................................................................................53
2-4. HIV-1 逆転写酵素活性の測定 ................................................................................53
2-5. siVirus ウェブサーバの構築 .................................................................................53
2-6. 共同研究に関する事項 ...........................................................................................53

文

献 ...............................................................................................................................55

巻 末 表 ...............................................................................................................................63
Table S1 .........................................................................................................................65
Table S2 .........................................................................................................................67
Table S3 .........................................................................................................................77
Table S4 .........................................................................................................................80

謝辞 ...............................................................................................................................85（附録）

配 列 表 ............................................................................................................................. 1

3

■

緒

論

RNA 干 渉（RNA interference; RNAi） と は， 細 胞 に 導 入 さ れ た 2 本 鎖 RNA（double-stranded
RNA; dsRNA）が，相同な塩基配列をもつメッセンジャー RNA（mRNA）を特異的に切断することによって遺伝子発現を抑制する現象である．RNAi の分子機構は，生体内においてはウイルスやトランスポゾンに対する防御機構の一部と考えられているほか，生体内で多数発現している
マイクロ RNA（microRNA; miRNA）による遺伝子発現の制御において重要な役割を担っている．
また人為的に dsRNA を細胞内に導入または発現させることによって，ヒト，マウス，ショウジョ
ウバエ，線虫などを含む多くの真核生物において簡便に任意の遺伝子をノックダウンできることから，RNAi は遺伝子の機能解析に有効な手法として大きな注目を集めている．
RNAi は，1998 年に Fire らによる線虫を用いた実験ではじめて報告された（Fire et al., 1998）．
Fire らは，dsRNA を線虫にインジェクションにより導入することで，dsRNA と相同な配列をもつ遺伝子が効率よく抑制されることを示した．一方，その dsRNA を構成するセンス 1 本鎖 RNA
またはアンチセンス 1 本鎖 RNA を単独で線虫にインジェクションしても，標的遺伝子を抑制する効果は見られなかった．同様の現象は線虫のみならず，ショウジョウバエ（Kennerdell et al.,1998）
，ゼブラフィッシュ（Wargelius et al., 1999），哺乳類細胞（Ui-Tei et al., 2000）などにも見いだされ，RNAi の基本的な機構が多くの生物種に保存されていることが明らかになった．
Dicer によって 21 〜 23 塩基対の短い 2 本鎖 RNA（short-interfering
細胞内に導入された dsRNA は，RNA; siRNA）に分解される（Bernstein et al., 2001; Ketting et al., 2001）．このとき siRNA の 5′ 末端はリン酸基を有し，3′ 末端は 2 塩基の突出末端となっている（Fig. 1）．siRNA は数種類のタンパ
ク質と複合体（RNA-induced silencing complex; RISC）を形成し，この複合体が標的 mRNA を認識し切断する．RISC を構成する主要なタンパクとして，Argonaute（Hammond et al., 2001; Martinez

Target mRNAto 5′ end
to 3′ end
C C A U G G G C C A U U C U A U C C G C U G G A A G A U G A G A A C C

5′3′
p C A U U C U A U C C G C U G G A A G A U G Sense strand
C G G U A A G A U A G G C G A C C U U C U p Antisense strand
3′
5′

siRNA

Figure 1.

siRNA は 21 塩基対前後の短い 2 本鎖 RNA である．siRNA は 5′ 末端にリン酸基を有し，3′ 末端は 2 塩基の突出末端となっている．

4(ii) G/C(iii) AU rich

5′3′ Sense strand

3′5′(iv) No long GC stretch

Antisense strand(i) A/U

Figure 2. Ui-Tei らによる，哺乳類細胞で高い RNAi 活性を示す siRNA 配列の規則性．

et al., 2002; Doi et al., 2003），Dicer，TRBP（Chendrimada et al., 2005），PACT（Lee et al., 2006）などが報告されている．
RNAi が発見された当初，哺乳類細胞に 30 塩基対以上の長い dsRNA を導入すると，遺伝子発現を非特異的に抑制するインターフェロン応答が誘導されるため（Grant et al., 1995; Kaufman
et al., 1999），哺乳類細胞で RNAi をおこなうことは難しいと考えられていた．しかし 2001 年にElbashir らによって，約 21 塩基対の siRNA を用いればインターフェロン応答を引き起こすことなく RNAi を誘導できることが示されたため，ヒトやマウスを含む哺乳類細胞に対しても RNAiの利用が可能となった（Elbashir et al., 2001a）．
しかしながら，哺乳類細胞に対して siRNA を用いる場合，siRNA の配列によって RNAi 活性に大きな差異が見られることがわかった（Holen et al., 2002）．ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とした実験では，無作為に設計した siRNA のうちの 2 〜 3 割程度しか十分な RNAi 活性を示さず，それ以外の多くの siRNA は機能しなかった（Ui-Tei et al., 2004）．そこで Ui-Tei および著者らは，多数の siRNA を用いた系統的な解析をおこない，RNAi を効率よく誘導できる siRNA が示す配列上の規則性を検討した．その結果，(i) siRNA を構成するアンチセンス鎖の 5′ 末端が A またはU であり，(ii) センス鎖の 5′ 末端が G または C であり，(iii) アンチセンス鎖の 5′ 端の 7 塩基のうち 4 塩基以上が A または U であり，(iv) 配列中に G/C が 10 塩基以上連続しないような siRNA（Fig. 2 に i 〜 iv を図示）は，Figure 3 に示すように哺乳類細胞において高い確率で標的遺伝子を抑制できた．一方，(i) 〜 (iii) の条件をすべて満たさない siRNA の活性はどれも非常に低かった．
この配列規則性は，ヒトおよびマウスの内在性遺伝子を標的とした場合でも，またニワトリ胚における個体レベルの実験でも成り立っていた．さらに，siRNA を細胞に導入する場合だけでな
く，DNA ベクターから siRNA を発現させた場合でもこの規則性が同様に成り立っていた．この規則性に基づいて siRNA を設計することにより，ノックダウンの成功率を飛躍的に高めることが可能となった．
一方，siRNA の長さは約 21 塩基対と短いため，標的遺伝子とはまったく無関係な遺伝子にも相同部分が存在する確率が高い．そのような場合，siRNA によって標的とは無関係な遺伝子の発5ホタルルシフェラーゼ遺伝子

A

1
6
12
18
24
30
36
42
48
54
ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCAT
siFL-36siFL-6siFL-42siFL-12siFL-48

siFL-18siFL-54

siFL-24siFL-30

1064
1075
1085
GGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGA
siFL-1064

1430
1439
GCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGC

siFL-1430

siFL-1075

siFL-1439
siFL-1085

siFL-1440
siFL-1441

B

センス鎖
5′
アンチセンス鎖 3′有効siFL-6siFL-1085
siFL-1075
siFL-36siFL-1440
siFL-30

中程度

siFL-1064
siFL-1441
siFL-1439
siFL-54
siFL-42siFL-24

無効

siFL-48
siFL-1430
siFL-12siFL-18

C

siFL-5siFL-184
siFL-272
siFL-309
siFL-428

有効siFL-515
siFL-658
siFL-695
siFL-734
siFL-774
siFL-891
siFL-904
siFL-1186
siFL-1308
siFL-1586

無効

siFL-14siFL-265
siFL-295
siFL-411
siFL-1044

Figure 3.

siRNA

5′
ACGCCAAAAACAUAAAGAAAGUCUGCGGUUUUUGUAUUUCUUGGUAAAGUUGUUCCAUUUUUU
AGCCAUUUCAACAAGGUAAAA
GGGCGCGGUCGGUAAAGUUGU
GGCCCGCGCCAGCCAUUUCAACAUUCUAUCCGCUGGAAGAUGCGGUAAGAUAGGCGACCUUCU
CCGCCGCCGUUGUUGUUUUGG
AGGGCGGCGGCAACAACAAAACGGCGCCAUUCUAUCCGCUGG
GGGCCGCGGUAAGAUAGGCGAGAUGAUAAACCGGGCGCGGUCCCCUACUAUUUGGCCCGCGCC
CGCCGCCGUUGUUGUUUUGGAGGGCGGCGGCAACAACAAAAC
CCCGCCGCCGUUGUUGUUUUG
AAGGGCGGCGGCAACAACAAAAUGGAACCGCUGGAGAGCAAC
UCUACCUUGGCGACCUCUCGUAUCCGCUGGAAGAUGGAACCGGAUAGGCGACCUUCUACCUUG
AAGGCCCGGCGCCAUUCUAUCCUUUCCGGGCCGCGGUAAGAUUGGAAGAUGGAACCGCUGGAGCGACCUUCUACCUUGGCGACC
GGUGAACUUCCCGCCGCCGUU
GGCCACUUGAAGGGCGGCGGC
AAAACAUAAAGAAAGGCCCGG
GUUUUUGUAUUUCUUUCCGGG
UAAAGAAAGGCCCGGCGCCAUGUAUUUCUUUCCGGGCCGCGGGACGCCAAAAACAUAAAGAAAUUCUGCGGUUUUUGUAUUUCUGUUGGCAGAAGCUAUGAAACGGCCAACCGUCUUCGAUACUUUGUGUUGGGCGCGUUAUUUAUCGCCACAACCCGCGCAAUAAAU
CCGCGAACGACAUUUAUAAUG
CGGGCGCUUGCUGUAAAUAUUCCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAGGGUUAGUAGGUUUUUUAAUCCUCCCGGUUUUAAUGAAUAC
AUGGAGGGCCAAAAUUACUUAGCAUGCCAGAGAUCCUAUUUU
AGCGUACGGUCUCUAGGAUAACCGGAUACUGCGAUUUUAAGU
AAGGCCUAUGACGCUAAAAUUGGUUUUGGAAUGUUUACUACAUGCCAAAACCUUACAAAUGAUGAUUUCGAGUCGUCUUAAUGUACCUAAAGCUCAGCAGAAUUAGCACUCUGAUUGACAAAUACGUUCGUGAGACUAACUGUUUAUCAAAUACGAUUUAUCUAAUUUCUGUUUAUGCUAAAUAGAUUAGAUUAUGUCCGGUUAUGUAAAUACUAAUACAGGCCAAUACAUGCCUGAAGUCUCUGAUUAAGU
GGCGGACUUCAGAGACUAAUUCUCGACGCAAGAAAAAUCAGAUUGAGCUGCGUUCUUUUUAGU
AACAUAAAGAAAGGCCCGGCGUUUUGUAUUUCUUUCCGGGCC
UAUGCCGGUGUUGGGCGCGUUAAAUACGGCCACAACCCGCGC
AGUUGCAGUUGCGCCCGCGAA
CCUCAACGUCAACGCGGGCGC
ACGUGCAAAAAAAGCUCCCAACUUGCACGUUUUUUUCGAGGGUUCUGAUUACACCCGAGGGGG
AUAAGACUAAUGUGGGCUCCC

ルシフェラーゼ相対活性（％）
3′

0

20

40

60

80

100

0

20

80

CHO-K1HeLa
E14TG2aS2

CHO-K1HeLa
E14TG2aS2

ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対して設計した siRNA とその RNAi 効果（Ui-Tei etal. 2004 より作成）．哺乳類細胞であるチャイニーズハムスターの CHO-K1，ヒトの HeLa，マウス ES 細胞の E14TG2a における結果および，ショウジョウバエの S2 細胞における結果を示した．(A) ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対して無作為に設計した 16 種類の siRNA．(B) 16
Dual-luciferase reporter assay system（Promega 社）で測定し，種類の siRNA による RNAi 効果を，
RNAi 効果の高い順番に並べた．(C) 有効と予測した siRNA（15 種類）と，無効と予測した
siRNA（5 種類）の RNAi 効果．siRNA の番号は，ホタルルシフェラーゼ遺伝子のコード領域
における位置に対応している．

6

現まで抑制される可能性がある．これは siRNA のオフターゲット効果と呼ばれ，siRNA を用いた遺伝子機能解析や，siRNA を医薬に応用するうえでの深刻な課題のひとつと考えられている（Jackson et al., 2004）．オフターゲット効果を回避するためには，標的以外のすべての遺伝子に対して相同性が最小となる siRNA 配列を選択することが望ましい．一般的には，設計した siRNA
配列を BLAST（Altschul et al., 1990）で検索し，無関係な遺伝子がヒットしないものを選択すればよいとされている．しかし BLAST による検索は，siRNA のような短い配列の検索において見落としが多いという欠点があることが判った．たとえば，Figure 4A に示すアライメントは 19 塩基中 16 塩基が一致しているが，連続した 7 塩基以上の一致が存在しないため BLAST では相同性を検出できない．また Figure 4B のアライメントは 19 塩基中 18 塩基が一致しているが，BLASTの標準パラメータは 1 塩基の一致を +1 点，1 塩基の不一致を -3 点として相同性を評価するた
め，3′ 端の 3 塩基の一致（CTG）を見落とし，15 塩基中 15 塩基の一致という不完全な結果を返す．このように BLAST は短い配列の相同性検索に不向きであるため，BLAST で siRNA の特異性を確認する従来の方法ではオフターゲット効果のリスクが過小に評価される（Naito, Yamada etal., 2004）．この問題に対し Yamada らは，siRNA のような短い配列の相同性検索を見落としなく高速に実行するアルゴリズムを開発した（Yamada et al., 2005）．Yamada らの方法は，与えられた
19 塩基の配列に対し，ヒト全遺伝子のなかから 3 ミスマッチ以内で相同なすべての配列を，数ミリ秒で見落としなく検索可能である．
本研究では，このような siRNA 設計において考慮すべき 2 つの項目，すなわち，(1) 哺乳類細胞に対して有効な siRNA を選択し，かつ，(2) オフターゲット効果が低く特異性の高い siRNAを選択することが可能な siRNA 設計法の構築をおこなった．第 1 章では，この siRNA 設計シス
テムの構築について述べ，さらにこのシステムを用いたヒト全遺伝子に対するゲノムワイドなsiRNA 設計について論じる．

アライメント：BLASTの結果：
正

解：

A

B

(NM_000014)
GAAGGCAGTCCAGTGAAAT|||| |||| ||| |||||GAAGCCAGTACAGAGAAAT(NM_002827)(NM_000014)
ACCGCAGTATATGGTTCTG|||||||||||||||
ACCGCAGTATATGGTGCTG(NM_002864)(No hit)

15/15 match

16/19 match

18/19 match

Figure 4. BLAST は短い配列の相同性を見落とす（Naito, Yamada et al. 2004 より作成）．
(A) 7 塩基以上の連続一致が存在しない場合は BLAST で相同性を検出できない．(B) 配列の末端付近にミスマッチがある場合，BLAST は最良のアライメントを見落とす．

7

A

B

HIV-1 replication (%)
0100

shRNA 標的部位

Day 14HIV-1: TAAAA CTGCTTGTACCAATTGCTATT GTAAA
Day 14: TAAAA CTGCTTGTACCAATTGCTATT GTAAA
Day 21: TAAAA CTGCTTGTACCAATTGCTATT GTAAA
Day 25: TAAAA C TGCTTGTTCCAATTGCTATT GTAAA
Day 35: TAAAA C TGCTTGTTCCAATTGCTATT GTAAA
Day 49: TAAAA C TGCTTGTTCCAATTGCTATT GTAAA

Day 21
Day 25
Day 35
Day 49Figure 5.

Boden et al., 2003a より作成．(A) tat 遺伝子を標的とする shRNA を恒常的に発現する H9 細胞における，HIV-1 の増殖抑制効果．HIV-1 の増殖は p24 抗原を ELISA で定量することによって評価した．(B) 培地上清中の HIV-1 をシークエンスした結果．25 日後より
shRNA の標的部位に 1 塩基の置換を含む耐性ウイルスがあらわれた．

また，siRNA の標的は内在性遺伝子に限定されず，細胞に感染したウイルス由来の RNA を標的とすることによってウイルスの増殖を抑制できることも示されている（Leonard et al., 2006）．
第 1 章に述べる siRNA 設計法は，哺乳類細胞に感染するウイルスを標的とする場合にもそのまま適用できると考えられる．しかしながら，HIV-1 や HCV など多くの RNA ウイルスでは，著しく高いゲノム多様性のために siRNA の設計が難しいばかりでなく，1 種類の siRNA を単独で用いた場合，その siRNA に耐性をもつウイルスが容易に出現しうることが報告されている（Bodenet al., 2003a; Das et al., 2004）．Boden らの報告によれば，HIV-1 の tat 遺伝子を標的とする siRNAと同様の効果をもつヘアピン型 RNA（short hairpin RNA; shRNA）を恒常的に発現する細胞に
HIV-1 を感染させたところ，感染の初期においては HIV-1 の増殖を効率よく抑制できた．しかし感染の 25 日後には，shRNA の標的部位に 1 塩基の置換を含む shRNA 耐性ウイルスがあらわれた（Fig. 5）．このような課題を克服するひとつの方法は，ウイルスの配列のなかで高度に保存された領域を標的とすることであると考えられる．
第 2 章では，ウイルスの配列のなかで高度に保存された領域を標的に，有効な siRNA を設計する方法について論じる．本研究ではまず，データベースより入手可能な約 500 種の HIV-1 ゲ
ノム配列を詳細に解析し，siRNA の標的として好適な，21 塩基の長さで保存度が高い領域を同定した．ついで，これらの領域を標的とする siRNA を，第 1 章で述べる siRNA 設計法に基づき設計した．さらに，設計した siRNA の HIV-1 増殖抑制効果を，複数のサブタイプに属する 4 種の HIV-1 感染性分子クローンで検証した．その結果，多くの siRNA が 4 種すべての HIV-1 の増殖を効果的に抑制でき，本研究で構築した抗ウイルス siRNA 設計法の有効性を確認できた．
第 2 章の最後では，本結果に基づく抗ウイルス siRNA 設計システム siVirus の構築およびウェブ
サーバの公開についても述べる．

8

なお，本研究の一部は既に下記に報告した．

Ui-Tei, K., Naito, Y. & Saigo, K. Guidelines for the selection of eﬀective short-interfering RNA sequences
for functional genomics. Methods Mol. Biol. 361, 201-216 (2006).
Ui-Tei, K., Naito, Y. & Saigo, K. Essential notes regarding the design of functional siRNAs for eﬃcientmammalian RNAi. J. Biomed. Biotechnol. 2006, 65052 (2006).
Naito, Y., Ui-Tei, K., Nishikawa, T., Takebe, Y. & Saigo, K. siVirus: web-based antiviral siRNA design
software for highly divergent viral sequences. Nucleic Acids Res. 34, W448-W450 (2006).
Naito, Y., Yamada, T., Matsumiya, T., Ui-Tei, K., Saigo, K. & Morishita, S. dsCheck: highly sensitive oﬀtarget search software for double-stranded RNA-mediated RNA interference. Nucleic Acids Res. 33,
W589-W591 (2005).
Naito, Y., Yamada, T., Ui-Tei, K., Morishita, S. & Saigo, K. siDirect: highly eﬀective, target-speciﬁc siRNAdesign software for mammalian RNA interference. Nucleic Acids Res. 32, W124-W129 (2004).
Ui-Tei, K., Ueda, R., Zenno, S., Takahashi, F., Doi, N., Naito, Y., Yamamoto, M., Hashimoto, N.,
Takahashi, K., Hamada, T., Tokunaga, T. & Saigo, K. RNA interference induced by transient or stable
expression of hairpin structures of double-stranded RNA in Drosophila and mammalian cells. Mol. Biol.
38, 276-287 (2004).
Ui-Tei, K., Naito, Y., Takahashi, F., Haraguchi, T., Ohki-Hamazaki, H., Juni, A., Ueda, R. & Saigo, K.
Guidelines for the selection of highly eﬀective siRNA sequences for mammalian and chick RNAinterference. Nucleic Acids Res. 32, 936-948 (2004).

11

■

第一章
哺乳類細胞で有効かつ標的遺伝子に特異的な siRNA 設計法の構築

1. 結果と考察
1-1. 哺乳類細胞で活性の高い siRNA 設計法の検討
哺乳類細胞では，無作為に設計した siRNA のうち 2 〜 3 割程度しか十分な RNAi 活性を示さず，それ以外の多くの siRNA は機能しないことが知られている（Holen et al., 2002）．この問題に対して Ui-Tei および著者らは，哺乳類細胞で高い RNAi 活性を示す siRNA の配列規則性を見いだした（Ui-Tei et al., 2004）．また，他の研究グループからも，哺乳類細胞で有効な siRNA の設計法について，実験結果に基づく具体的な方法が提唱されている（Reynolds et al., 2004; Amarzguioui etal., 2004）．本研究ではまず，Ui-Tei ら，Reynolds ら，Amarzguioui らの 3 つの siRNA 設計法の比較評価をおこなった．
Ui-Tei ら，Reynolds ら，Amarzguioui らの各 siRNA 設計法は，いずれも siRNA の配列自体から
その RNAi 活性を予測し，有効な siRNA を選択しようとするものである（Fig. 1-1）．まず，siRNAを無作為に設計した場合に，それぞれの設計法を満たす siRNA がどのような割合で設計できる

A

Ui-Tei et al.
(ii) G/C(iii) AU rich

5′′

3′

3′

5′
(iv) No long GC stretch

B

Antisense strand(i) A/UC

Reynolds et al.
(V) A

Sense strand(VIII) not G(VI) U(II) AU rich (IV) A

5′

Amarzguioui et al.
(3) not U3′5′(I) 7 ≤ GC ≤ 10(VII) not GC(4) A(5) not G

5′′

3′

3′

3′

5′
(2) G/C(1) A/U differential(6) A/U(III) Tm < 20ºC

Figure 1-1.

哺乳類細胞で有効な siRNA の設計法．(A) Ui-Tei らの提唱する siRNA 設計ガイ

ドライン
（Ui-Tei et al., 2004）．(i) 〜 (iv) の条件をすべて満たす siRNA を有効と予測している．(B)Reynolds らの siRNA 設計法（Reynolds et al., 2004）．(I) 〜 (VIII) の条件をできるだけ満たす
siRNA を有効と予測している．(C) Amarzguioui らの siRNA 設計法（Amarzguioui et al., 2004）．
(1) 〜 (6) の条件をできるだけ満たす siRNA を有効と予測している．

12100% = 69,015,727 targets in RefSeq 16, mRNA

Ui-Tei et al. 14.6%
0.7%

6.7%

1.9%

4.4%

7.6%

7.3%

0.8%

Reynolds 12.6%

Figure 1-2.

Amarzguioui 20.1%

ヒトの全遺伝子に対して設計可能な siRNA の全体を 100% として，Ui-Tei ら，Reynolds ら，Amarzguioui らの設計法を満たす siRNA の割合をそれぞれ示した．

かを検討した．RefSeq（Pruitt et al., 2007）release 16 に登録されたヒトの全遺伝子に対して設計可能な 69,015,727 種の siRNA のうち，Ui-Tei ら，Reynolds ら，Amarzguioui らの設計法を満たす
siRNA は，それぞれ 14.6%，12.6%，20.1% であった（Fig. 1-2）．各 siRNA 設計法は，いくつかの相違点があるものの，siRNA を構成するアンチセンス鎖の 5′ 末端が A または U であることが好ましく，アンチセンス鎖の 5′ 末端からある程度の長さ（3 〜 7 塩基）に A または U が多いほうが有効である点で一致している．このため各設計法を満たす siRNA の集合は互いに重なり合い，3 種の設計法をすべて満たす siRNA も全体の 4.4% 存在した．また特に，Ui-Tei らの設計法および Amarzguioui らの設計法は，センス鎖の 5′ 末端が G または C であることが好ましいという点も共通であるため，互いによく重なり合った．
各 siRNA 設計法の有効性を検証するため，ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とする 114 種の siRNA（Table S1, 巻末）の RNAi 活性を，ルシフェラーゼアッセイにより評価した．114 種のsiRNA の内訳は下記のとおりである．なお，詳細は Table S1（巻末）に示した．
・3 種の設計法をすべて満たさない siRNA .................... 43 種
・3 種の設計法のうち 1 種のみを満たす siRNA ........... 30 種
・3 種の設計法のうち 2 種を満たす siRNA .................... 26 種
・3 種の設計法をすべて満たす siRNA ............................. 15 種

13※ siRNA終濃度：50 nM
ルシフェラーゼ相対活性

2

2

4

5

0 - 10%10

Ui-Tei et al.

20 10 - 20%
30 20 - 30%

9 11

40 30 - 40%
50 40 - 50%
60 50 - 100%
1

1

1

3

2

2

3

3

3

3

2

4

4

5

3

5

5

7

3

5

7

7

5

5

6

5

5

6

12 13 143

12 13 148

6 12 13

8 11 24

31 39 42

14 15 15 16 17 17 18

21 63 1039

13 17 25

26 33 54

54 56 62

8

9
3

6

6

6

9 13

18 19 21 22 23 25 26
31 35 37 38 41 44 46
47 50 53 64 68 72 75
75 81 81 82 83 87 93

2

6

6

93

10 13 17

Reynolds et al.

Figure 1-3.

Amarzguioui et al.

3種の設計法をすべて満たさないsiRNA

ホ タ ル ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 を 標 的 と す る 114 種 の siRNA を，Ui-Tei ら，Reynolds ら，Amarzguioui らの各設計法への適合性に基づき分類し，RNAi 活性とともに示した．ルシフェラーゼ相対活性の値が低いほど，siRNA の RNAi 活性が高いことを示している．

これらの siRNA の RNAi 活性を，ルシフェラーゼアッセイで評価した結果を Table S1（巻末）および Figure 1-3 に示した．Ui-Tei ら，Reynolds ら，Amarzguioui らの各設計法を満たす siRNAのうち，ルシフェラーゼ相対活性を 50% 以下に抑制した siRNA は，それぞれ
40 / 41 (97.6%)
・Ui-Tei らの設計法
36 / 38 (94.7%)
・Reynolds らの設計法
44/ 48 (91.7%)
・Amarzguioui らの設計法であった．また，ルシフェラーゼ相対活性を 10% 以下に抑制した，高い RNAi 活性を有する
siRNA は，
30 / 41 (73.2%)
・Ui-Tei らの設計法
25 / 38 (65.8%)
・Reynolds らの設計法
・Amarzguioui らの設計法 27 / 48 (56.3%)であった．3 種の設計法とも哺乳類細胞で有効な siRNA を効率よく選択できたが，特に Ui-Tei
らの設計法が良好な成績であった．また，Reynolds らの設計法のみを満たす 12 種の siRNA と，
Amarzguioui らの設計法のみを満たす 12 種の siRNA とに注目すると，RNAi 活性が低い siRNAが相対的に多いことが判った（Fig. 1-3）．一方，Ui-Tei らの設計法のみを満たす 6 種の siRNAは，いずれも有効であった（Fig. 1-3）．Ui-Tei らの設計法は，他の設計法よりも判定項目が少14なく単純であるが，すべての判定項目を満たす siRNA のみを有効としている点で Reynolds らや
Amarzguioui らの設計法と異なっており，このため有効な siRNA を効率よく選択できたのかも知れない．本研究では以上の結果を考慮し，Ui-Tei らの設計法のみを採用して siRNA 設計をおこなうこととした．
なお，Ui-Tei らの設計法によって有効な siRNA を選択できる理由は以下のように考えられる．
RNAi の実行過程において，siRNA は複数のタンパク質と複合体（RISC）を形成するが，このとき RISC には siRNA を構成する 2 本の RNA 鎖のうち 1 本のみが取り込まれる（Martinez et al.,2002）
．siRNA のアンチセンス鎖側が RISC に取り込まれた場合，RISC は標的 mRNA を認識して切断できるが，センス鎖側が RISC に取り込まれた場合は標的 mRNA を認識できず，mRNA は
切断されない（Fig. 1-4）．Schwarz らは，ショウジョウバエの in vitro の実験系を用いて，siRNAのどちらの RNA 鎖が RISC に取り込まれるかを，siRNA の両末端部分の塩基対形成の強さに注目して解析した．その結果，siRNA のアンチセンス鎖の 5′ 末端側が，センス鎖の 5′ 末端側よりも塩基対形成が弱い場合に，siRNA のアンチセンス鎖がおもに RISC に取り込まれていることが判明した（Schwarz et al., 2003）．また Khvorova らは，ヒト培養細胞において RNAi 活性が高い siRNA は，アンチセンス鎖の 5′ 末端側の塩基対が熱力学的に安定性が低くなっており，このことが RISC にどちらの RNA 鎖が取り込まれるかを規定すると報告している（Khvorova et al.,siRNA5′-end phosphorylation

PO4
PO4

AGO2

PO4

PO4

Target-mRNArecognition

Sense strand
loading into RISC
(Nonfunctional RISC)

AGO2
m7G
AAA

Figure 1-4.

PO4

AAA

mRNA cleavage

AGO2

m7 G

AGO2

Antisense strand
loading into RISC

PO4
AAA

RISC に は siRNA を 構 成 す る 2 本 の RNA 鎖 の う ち 1 本 の み が 取 り 込 ま れ る．

siRNA のアンチセンス鎖が RISC に取り込まれた場合は標的 mRNA を認識して切断できるが，センス鎖が取り込まれた場合は標的 mRNA を認識できない．

152003）．これらの報告は，Ui-Tei らの設計法の，アンチセンス鎖の 5′ 末端およびその周辺に A ま
たは U が多く，センス鎖の 5′ 末端が G または C であるような siRNA が有効であるという条件と対応している．ただし，siFL-1063（Table S1; 巻末）のように，siRNA のアンチセンス鎖の 5′末端から 9 塩基が連続して G または C であっても活性の高い siRNA が存在することから，末端部分の塩基対の安定性以外にも，RISC 形成における RNA 鎖の選択に関わる要因が存在すると考えられる．
1-2. ゲノムワイドな siRNA 設計への適用可能性
Ui-Tei らの設計法では，ヒトの全遺伝子に対して設計可能なすべての siRNA のうち 14.6% が有効と判定された（Fig. 1-2）
．ただし，この割合は遺伝子の種類によって変動し，Figure 1-5 の赤色のヒストグラムに示すような広い分布を示した．たとえば，src 遺伝子（SRC; NM_005417）では 9.3%，EGF 遺伝子（EGF; NM_001963）では 17.9% の siRNA が有効と判定された（Fig. 1-5）．
また，RefSeq release 16 に登録されたヒトの全遺伝子に対して siRNA の設計を試みたところ，すべての遺伝子に対して，すくなくとも 1 個の有効な siRNA が設計可能であった．
さらに，Pol III プロモーターをもつベクターから shRNA を発現させる場合，・センス鎖の 5′ 末端が G であること．（この G から転写が開始されるため．）
・配列中に UUUU もしくはその相補的配列である AAAA を含まないこと．
（途中で転写が終結することを防ぐため．）
が必要である（Ui-Tei et al., 2006）．この条件を加えると，Ui-Tei らの設計法で有効と判定される

Number of transcripts

siRNA は，ヒトの全遺伝子に対して設計可能なすべての siRNA のうちの 5.7% となった．このとき，

3000
src
2000

EGF

1000

0

5

10

15

20

25

Fraction of functional siRNAs
on a single target (%)

Figure 1-5.

ヒトの全遺伝子について，Ui-Tei らの設計法を満たす siRNA の割合を求め，その分布を示した（赤色のヒストグラム）．また，Ui-Tei らの設計法を満たす siRNA のうち，
Pol III プロモーターから発現させる shRNA としても使用可能な配列の割合を求め，その分布を示した（青色のヒストグラム）．ヒストグラムの階級の幅は 0.3% である．src 遺伝子およびEGF 遺伝子における割合を例示した．

16

個々の遺伝子における割合は Figure 1-5 の青色のヒストグラムのような分布となった．RefSeq
release 16 に登録されたヒトの全遺伝子に対して siRNA の設計を試みたところ，99.9% 以上の遺伝子に対して，すくなくとも 1 個の有効な siRNA が設計可能であった．
以上の結果は，Ui-Tei らの siRNA 設計法が，ヒトの全遺伝子をほぼ網羅できるゲノムワイド
な siRNA 設計に適用可能であることを示唆した．
1-3. siRNA の標的切断活性を評価するアッセイ系の構築
siRNA が本来の標的とは別の遺伝子の相同部分を認識し，その遺伝子を抑制してしまう現象
は，siRNA のオフターゲット効果と呼ばれる（Jackson et al., 2004）．本研究では，siRNA 配列とmRNA 配列との間にどの程度の相同性があるとオフターゲット効果が生じるかを検討するため，任意の標的配列に対して siRNA の標的切断活性を評価できるアッセイ系（以下，標的切断アッセイ）を構築した．
siRNA の標的となる 21 〜 40 塩基の配列を組み込んだ発現ベクター
標的切断アッセイの概略は，と siRNA とを同時に培養細胞に導入して，ベクターから発現する標的 mRNA が siRNA によって切断される効率を，リアルタイム RT-PCR で定量するというものである．本アッセイのために構築した標的発現ベクター pTREC（Target RNA Expression Construct の略）の概要を Figure 1-6 に

5’-GUACGUCAGCAAUAUGAAAGU-3’:::::::::::::::::::
3’-UGCAUGCAGUCGUUAUACUUU-5’

siRNA

変異を導入

vs.
Target sequence

合成 DNA オリゴを挿入

AATTCACGTACGTCAGCAATATGAACGTC:::::::::::::::::::::::::
GTGCATGCAGTCGTTATACTTGCAGAGCTEcoRI site

XhoI site

PCR primer-F

PCR primer-R

MCS
IntronpTREC
Target mRNA
Expression Vector

5.5 kbAmpr
neo(Internal control)

Figure 1-6.

本研究で構築した標的 mRNA 発現ベクター pTREC の構造．RT-PCR に用いる

PCR プライマーの一方（PCR primer-F）の配列は，イントロンによって分断されるように設計した．この工夫により，PCR の際にプラスミドが鋳型となって DNA が増幅することを防ぐことができた．

17

5′ cap

10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
TCAGATCACT AGAAGCTTTA TTGCGGTAGT TTATCACAGT TAAATTGCTA ACGCAGTCAG TGCTTCTGAC ACAACAGTCT CGAACTTAAG CTGCAGTGAC
chimeric intron 133bp
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
TCTCTTAAGG TAGCCTTGCA GAAGTTGGTC GTGAGGCACT GGGCAGGTGT CCACTCCCAG TTCAATTACA GCTCTTAAGG CTAGAGTACT TAATACGACT>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
PCR primer-F
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
CACTATAGGC TAGCCACCAT GGAATTCACG CGTCTCGAGT CTAGAGTCGA CCCGGGCGGC CGCTTCCCTT TAGTGAGGGT TAATGCTTCG AGCAGACATG
/
/
/
/
/
/
/
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
Kozak /
NheI
EcoRI MluI
XhoI
XbaI SalI SmaI NotI
PCR primer-R
310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
ATAAGATACA TTGATGAGTT TGGACAAACC ACAACTAGAA TGCAGTGAAA AAAATGCTTT ATTTGTGAAA TTTGTGATGC TATTGCTTTA TTTGTAACCA

410
TTATAAGCTG CAATAAA
poly A signal

Figure 1-7.

pTREC から標的 mRNA として転写される領域の塩基配列．本研究では，EcoRI

部位と XhoI 部位との間に合成 DNA オリゴで作製した標的配列を挿入した．

示す．本アッセイでは，合成 DNA オリゴを pTREC ベクターの MCS に挿入することによって標的配列を自由に設定できるため，ある特定の siRNA に対して標的 mRNA の配列を 1 塩基ずつ変えていくような系統的な解析が可能となる．たとえば Figure 1-6 の例では，siRNA の標的部分に 1 塩基の置換を導入した場合の切断活性を評価できる．また，pTREC ベクターから発現する
mRNA の配列（Fig. 1-7）は標的部分を除き共通であるため，まったく同一の実験条件下で siRNAの標的切断活性を定量的に評価できる．また RT-PCR をおこなう際も共通の PCR プライマーを使用するため，PCR の条件検討が不要でハイスループットなアッセイが可能である．
まず本アッセイの有効性を検証するために，本アッセイの結果と，実際の標的遺伝子に対して siRNA を用いた場合の RNAi 活性とを比較した．
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とする 9 種の siRNA について本アッセイにより標的切断
活性を評価し，一方でホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する RNAi 効果をルシフェラーゼアッセ
イで測定した．本アッセイで得られた結果は，実際にルシフェラーゼ遺伝子に対して各 siRNAが示した RNAi 活性と高い相関を示した（Fig. 1-8）．両者の関係が完全に線形になっていない理
由は，本アッセイが mRNA の量を評価しているのに対し，ルシフェラーゼアッセイは発現したタンパクの活性を評価しているという違いのためであろう．
また，ヒト内在性遺伝子のビメンチン（VIM; NM_003380）を標的とする 2 種の siRNA について本アッセイにより標的切断活性を評価し，一方で内在性ビメンチンをノックダウンした効果をリアルタイム RT-PCR および抗体染色で評価した．本アッセイで得られた結果は，内在性ビメ
ンチンに対して各 siRNA が示した RNAi 活性とよく一致した（Fig. 1-9）．
以上の結果より，本アッセイが RNAi 活性を評価する方法として有効であることが確認できた．

185’-ACGCCAAAAACAUAAAGAAAG-3’:::::::::::::::::::
3’-UCUGCGGUUUUUGUAUUUCUU-5’(B)

5’-CGUACGCGGAAUACUUCGAAA-3’:::::::::::::::::::
3’-GUGCAUGCGCCUUAUGAAGCU-5’(C)

5’-CCUGGAACAAUUGCUUUUACA-3’:::::::::::::::::::
3’-AAGGACCUUGUUAACGAAAAU-5’(D)

5’-CAUUCUAUCCGCUGGAAGAUG-3’:::::::::::::::::::
3’-CGGUAAGAUAGGCGACCUUCU-5’(E)

5’-UCCUGGAACAAUUGCUUUUAC-3’:::::::::::::::::::
3’-CAAGGACCUUGUUAACGAAAA-5’(F)

5’-AAGGCCCGGCGCCAUUCUAUC-3’:::::::::::::::::::
3’-CUUUCCGGGCCGCGGUAAGAU-5’(G)

5’-GUGGACAUCACUUACGCUGAG-3’:::::::::::::::::::
3’-UCCACCUGUAGUGAAUGCGAC-5’(H)

5’-AAAACAUAAAGAAAGGCCCGG-3’:::::::::::::::::::
3’-GUUUUUGUAUUUCUUUCCGGG-5’(I)

5’-UAAAGAAAGGCCCGGCGCCAU-3’:::::::::::::::::::
3’-GUAUUUCUUUCCGGGCCGCGG-5’

Figure 1-8.

※ siRNA終濃度：50 nM
100［標的切断アッセイの結果］
Relative target mRNA quantity (%)

(A)

80

(I)
(G)

Ineffective
siRNAs

60

40

(H)

(F)

Effective
siRNAs

20

(E)

(C)
(D)

(B)
(A)

0
0

20

40

60

80

100

Relative luciferase activity (%)

ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とする 9 種の siRNA を標的切断アッセイで評価した．標的切断アッセイの結果（縦軸）と，ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対するRNAi 効果（横軸）との間には高い相関が認められた．ルシフェラーゼ相対活性の値が低い
ほど，siRNA の RNAi 活性が高いことを示している．

100%

siControl
siVIM-812● 標的切断アッセイによる
siRNA 活性値
Relative target mRNA quantity● 内在性ビメンチン mRNA の
RT-PCR による検出
Relative VIM mRNA quantity

Relative target mRNA quantity● 標的切断アッセイによる
siRNA 活性値

5’-AGGAUGUUCGGCGGCCCGGGC-3’
siVIM-35:::::::::::::::::::(50 nM) 3’-CGUCCUACAAGCCGCCGGGCC-5’

100%

10.2%

● 内在性ビメンチン mRNA の
RT-PCR による検出97.6%

siControl
siVIM-35

Relative VIM mRNA quantity

5’-GUACGUCAGCAAUAUGAAAGU-3’
siVIM-812:::::::::::::::::::(50nM) 3’-UGCAUGCAGUCGUUAUACUUU-5’

95.2%

3.5%

● 内在性ビメンチンの抗体染色による検出

Vimentin

Figure 1-9.

● 内在性ビメンチンの抗体染色による検出

Yes (Internal control)

Vimentin

Yes (Internal control)

ヒト内在性遺伝子のビメンチンを標的とする 2 種の siRNA を標的切断アッセ

イで評価した．標的切断アッセイの結果は，内在性ビメンチンをノックダウンしたときのmRNA 定量値および抗体染色の結果と一致した．

19

pTREC ベクターから発現させた標的 RNA の siRNA による切断を直接検出するために，
さらに，プライマーエクステンション法による解析をおこなった．
ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する siRNA（siFL2-153）と相同な 23 塩基を挿入した標的
mRNA を，pTREC から発現させた．それと同時に，siFL2-153 もしくは無関係な配列の siRNA（siControl）を導入した場合について，poly A+ RNA を抽出してプライマーエクステンションをおこなった．その結果，いずれの場合も標的 mRNA の 5′ 末端に対応するバンドが予想された位
置にあらわれた（Fig. 1-10A）．また，RNA 抽出の過程で核を分離していないため，イントロン
を含む pre-mRNA の 5′ 末端に対応するバンドも見られた．
標的 mRNA に siFL2-153 を作用させた場合，核内の pre-mRNA のバンドに大きな変化はなかっ
たが，mRNA の 5′ 末端に対応するバンドが薄くなった（Fig. 1-10A）．さらに，siRNA の標的配列部分に新たなバンドが生じた（Fig. 1-10B）．このバンドは，siRNA によって切断された mRNAのうち 3′ 側の RNA 断片の 5′ 末端に対応するものと考えられる．すなわち，Figure 1-10B のバンドの位置が，siRNA による標的 RNA の切断点であると考えられる．シークエンスラダーを参照すると，この切断点は siRNA のアンチセンス鎖の 5′ 末端から 10 番目の塩基と 11 番目の塩基の間の位置に対応することが判明した（Fig. 1-10C）．この結果は，ショウジョウバエの in vitro

pre-mRNA from nuclei(not spliced)での実験における切断点と一致した（Elbashir et al., 2001b,c）．なお，この切断点から 3′ 側に 5mRNA 5′ end

Intact mRNA*

siRNA target sitemRNA 5′ end

Cleaved mRNA

*
32

A

B

siRNA (siFL2-153)

P labeled primer

C

siControl
No siRNA

Target mRNANo transfection

to 5′ end
to 3′ end
G C A C G U A C G C G G A A U A C U U C G A U U A

Cleavage site

C ladder5′
3′
C G U A C G C G G A A U A C U U C G A U U

T ladderA ladderG ladder311 bpFigure 1-10.

G U G C A U G C G C C U U A U G A A G C U
3′5′siRNA (siFL2-153)

TGCGCCTTATGA : read
ACGCGGAAUACU : mRNA sequence

プライマーエクステンション法による標的 mRNA の切断の検出．(A) mRNA お

よび pre-mRNA の 5′ 末端に対応するバンド．(B) siRNA による切断点に対応するバンド．(C)
本実験のバンドの位置から求めた切断点を図示した．

20

N sub-domain

Sub-domain A
G1-binding
pocketTargetG1

RNase H-like
sub-domain

T10

Guide

T11

Location of
putative slicer
catalytic site

G10

Scissile
phosphate
T19

G19

Figure 1-11.

硫酸還元古細菌 Archaeoglobus fulgidus の PIWI ドメインと，19 塩基対の 2 本鎖

RNA の複合体の立体構造（Parker et al., 2005 より作成）．緑色の RNA 鎖が siRNA のアンチセ
ンス鎖，黄色の RNA 鎖が標的 mRNA に相当する．

塩基離れた位置にも薄いバンドが存在し（Fig. 1-10B），この位置でも標的 mRNA の切断が起こっている可能性が示唆された．この第 2 のバンドがアーティファクトである可能性を排除するため，異なる配列の siRNA でも実験をおこなったところ，同様の位置に第 2 のバンドが確認された．
また，siRNA のアンチセンス鎖の 5′ 末端から 7 塩基を DNA に置換したキメラ型 siRNA で同様の実験をおこなったところ，主バンドはそのままに，第 2 のバンドのみ消失した（データ示さず）．
標的 mRNA の切断点については，RISC を構成するタンパク質である Argonaute がもつ PIWI
ドメインの立体構造からも検討できる．Argonaute の PIWI ドメインは RNAi の実行過程において標的 mRNA の切断活性を担っており（Yuan et al., 2005），RNaseH と類似した立体構造を有する（Song et al., 2004）．Figure 1-11 に示すように，Argonaute と結合した siRNA のアンチセンス鎖（緑色）の 5′ 末端（G1）は PIWI のポケットに収まり，siRNA のアンチセンス鎖と対合した標的
mRNA（黄色）の切断点に相当する部分（赤色）が，RNaseH の活性中心とされているアミノ酸の近傍に位置している（Ma et al., 2005; Parker et al., 2005）．しかしながら，この切断点から 3′ 側に 5 塩基離れたヌクレオチドは PIWI ドメインの反対側に位置しており，どのようなメカニズム
でこの部分の切断が起こっているのか説明できず疑問が残った．

21

1-4. オフターゲット効果が少ない siRNA 設計法の実験的検討（１）siRNA 配列と mRNA 配列との間にどの程度の相同性があるとオフターゲット効果が生じるかを明らかにするため，これまでの報告では，標的 mRNA とは少しずつ配列が異なる siRNA を合成しそれらの RNAi 効果を評価する方法がとられてきた．しかしながら，化学合成の siRNA は
高価なこともあり，特定の遺伝子の限られた配列しか検討されていなかった．さらに，緒論でも述べたように siRNA の活性はその配列自体によって大きく変化するため，siRNA の配列を変えるという手段ではオフターゲット効果を独立に評価することはできない．オフターゲット効果を正確に評価するためには，siRNA の配列は変えずに，標的 mRNA の配列を変化させる方法が必要である．そこで本研究では，ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とする siRNA（siFL-36）の配列に対して，様々なミスマッチを含む標的 mRNA を発現する pTREC コンストラクトを系統的に構築した．
まず，siFL-36 の標的配列に 1 塩基の置換を導入したすべての場合を検討した（Fig. 1-12）．
siRNA を 50 nM で導入した場合，特に標的配列の中央付近の置換により RNAi 効果が失われた▲場合があったが（ で 表示），57 例中 49 例について標的 mRNA が 50% 以下まで分解された．
siFL-36 以外の配列でも検討をおこなったところ，やはり標的配列の中央付近の置換で RNAi 効果が失われた場合があった（データ示さず）．ただし，RNAi 効果が失われるような置換の位置や，塩基の種類について規則性は見いだせなかった．標的配列の中央付近と末端付近とでミスマッ
チの効果が異なる事実は，他の報告（Du et al., 2005; Birmingham et al., 2006）でも指摘されている．
つぎに，siFL-36 の標的配列に 2 塩基の置換を導入した 23 例を同様に検討した（Fig. 1-13）．標的配列の中央付近に 2 塩基の連続する置換を導入した場合，RNAi 効果がほぼ失われた．ただし，標的配列の末端付近の置換においては，標的 mRNA が 50% 以下まで分解された場合があった▲（ で表示）．また，連続しない 2 塩基の置換を導入した場合，それらの位置や種類によってミスマッチの効果は異なっていた（Fig. 1-13）．
さらに，siFL-36 の標的配列に 3 塩基の置換を導入した 12 例を同様に検討した（Fig. 1-14）．そ▲の結果，1 例（ で表示）を除くすべての例で，RNAi 効果がほぼ失われた．
以上の結果を考慮すると，siRNA 設計においては，標的と無関係なすべての配列に対してかな
らず 3 塩基以上がミスマッチする配列を選択することが望ましい．後述する情報科学的な解析
からは，そのような siRNA は全体の約 10% 存在するが，4 ミスマッチ以上を保証できる siRNAはほとんど存在しない（Naito, Yamada et al., 2004）．したがって，現実的なアプローチとして 3 ミ
スマッチ以上の siRNA を選択することが妥当と考えられる．
なお，ミスマッチの位置によってその影響が異なる理由は，次のように考えられる．siRNAのアンチセンス鎖と標的 mRNA は，A-form の 2 本鎖 RNA を形成して PIWI ドメインと結合している（Fig. 1-11）．ところが，siRNA のアンチセンス鎖の中央部分が標的 mRNA とミスマッチす22siRNA:
5’-CAUUCUAUCCGCUGGAAGAUG-3’:::::::::::::::::::
3’-CGGUAAGAUAGGCGACCUUCU-5’

Inserted sequence:
GCCATTCTATCCGCTGGAAGATG

Relative target mRNA quantity (%)

0

50

100

complete match

GCaATTCTATCCGCTGGAAGATG
GCgATTCTATCCGCTGGAAGATG
GCtATTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCcTTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCgTTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCtTTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCAaTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCAcTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCAgTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCATaCTATCCGCTGGAAGATG
GCCATcCTATCCGCTGGAAGATG
GCCATgCTATCCGCTGGAAGATG
GCCATTaTATCCGCTGGAAGATG
GCCATTgTATCCGCTGGAAGATG
GCCATTtTATCCGCTGGAAGATG
GCCATTCaATCCGCTGGAAGATG
GCCATTCcATCCGCTGGAAGATG
GCCATTCgATCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTcTCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTgTCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTtTCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTAaCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTAcCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTAgCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTATaCGCTGGAAGATG
GCCATTCTATgCGCTGGAAGATG
GCCATTCTATtCGCTGGAAGATG
GCCATTCTATCaGCTGGAAGATG
GCCATTCTATCgGCTGGAAGATG
GCCATTCTATCtGCTGGAAGATG
GCCATTCTATCCaCTGGAAGATG
GCCATTCTATCCcCTGGAAGATG
GCCATTCTATCCtCTGGAAGATG
GCCATTCTATCCGaTGGAAGATG
GCCATTCTATCCGgTGGAAGATG
GCCATTCTATCCGtTGGAAGATG
GCCATTCTATCCGCaGGAAGATG
GCCATTCTATCCGCcGGAAGATG
GCCATTCTATCCGCgGGAAGATG
GCCATTCTATCCGCTaGAAGATG
GCCATTCTATCCGCTcGAAGATG
GCCATTCTATCCGCTtGAAGATG
GCCATTCTATCCGCTGaAAGATG
GCCATTCTATCCGCTGcAAGATG
GCCATTCTATCCGCTGtAAGATG
GCCATTCTATCCGCTGGcAGATG
GCCATTCTATCCGCTGGgAGATG
GCCATTCTATCCGCTGGtAGATG
GCCATTCTATCCGCTGGAcGATG
GCCATTCTATCCGCTGGAgGATG
GCCATTCTATCCGCTGGAtGATG
GCCATTCTATCCGCTGGAAaATG
GCCATTCTATCCGCTGGAAcATG
GCCATTCTATCCGCTGGAAtATGGCCATTCTATCCGCTGGAAGcTG
GCCATTCTATCCGCTGGAAGgTG
GCCATTCTATCCGCTGGAAGtTG※ siRNA終濃度：50 nM

Figure 1-12.

siFL-36 の標的配列に 1 塩基の置換を導入した場合の，siFL-36 による RNAi 効果．

最上段は，siFL-36 と相同な標的配列に対する RNAi 効果（コントロール）．siFL-36 の配列および，pTREC に挿入した配列を図中に示した．

23siRNA:
5’-CAUUCUAUCCGCUGGAAGAUG-3’:::::::::::::::::::
3’-CGGUAAGAUAGGCGACCUUCU-5’

Relative target mRNA quantity (%)

0

50

100

Inserted sequence:complete match

GCCATTCTATCCGCTGGAAGATG
GCatTTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCtaTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCAggCTATCCGCTGGAAGATG
GCCATcaTATCCGCTGGAAGATG
GCCATTacATCCGCTGGAAGATG
GCCATTCacTCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTtcCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTAcaCGCTGGAAGATG
GCCATTCTATggGCTGGAAGATG
GCCATTCTATCaaCTGGAAGATG
GCCATTCTATCCcaTGGAAGATG
GCCATTCTATCCGggGGAAGATG
GCCATTCTATCCGCccGAAGATG
GCCATTCTATCCGCTacAAGATG
GCCATTCTATCCGCTGtcAGATG
GCCATTCTATCCGCTGGtcGATG
GCCATTCTATCCGCTGGAtcATG
GCCATTCTATCCGCTGGAAtcTG
GCCAaTCTATCCGCTGGAAcATG
GCCAcTCaATCCGCTGGAAGATG
GCCATaCTAaCCGCTGGAAGATG
GCCAgTCTATCCGCTGtAAGATG
GCCATTgTATCCGCTGGAgGATG※ siRNA終濃度：50 nM

Figure 1-13.

siFL-36 の標的配列に 2 塩基の置換を導入した場合の RNAi 効果．

siRNA:
5’-CAUUCUAUCCGCUGGAAGAUG-3’:::::::::::::::::::
3’-CGGUAAGAUAGGCGACCUUCU-5’

Relative target mRNA quantity (%)

0

50

100

Inserted sequence:
GCCATTCTATCCGCTGGAAGATG

complete match

GCgcaTCTATCCGCTGGAAGATG
GCCAgcgTATCCGCTGGAAGATG
GCCATTggtTCCGCTGGAAGATG
GCCATTCTcaaCGCTGGAAGATG
GCCATTCTATggcCTGGAAGATG
GCCATTCTATCCaaaGGAAGATG
GCCATTCTATCCGCaacAAGATG
GCCATTCTATCCGCTGtccGATG
GCCATTCTATCCGCTGGActtTG
GCCATTgTcTCCtCTGGAAGATG
GCCATTaTATCtGCTGcAAGATG
GCCATTCTgTCCGCTaGAAtATG※ siRNA終濃度：50 nM

Figure 1-14.

siFL-36 の標的配列に 3 塩基の置換を導入した場合の RNAi 効果．

24

る場合，2 本鎖の立体構造がみだれ，標的 mRNA の切断点と PIWI ドメイン活性中心との位置関係が変化すると予想される．その結果，標的 mRNA は切断を受けなくなる可能性が高い．一方，
ミスマッチの位置が siRNA の末端部分の場合は，中央付近のミスマッチと比較して立体構造への影響は少なく，このため標的 mRNA の切断活性も保持されるのであろう．
1-5. オフターゲット効果が少ない siRNA 設計法の実験的検討（２）
近年，siRNA を構成するアンチセンス鎖の 5′ 末端から 2 〜 8 番目の塩基（以下，seed と呼ぶ）
が mRNA と完全一致する場合に，翻訳の抑制および mRNA の分解が起こりうることが示された（Lim et al., 2005; Lin et al., 2005; Birmingham et al., 2006）．しかしながら，長さが 7 塩基の seed は計
算上は mRNA の約 16 kb に 1 箇所の割合で存在するため，seed の完全一致のみで遺伝子が抑制されるならば，膨大な数の遺伝子が影響を受けることになる．そこで本研究では，seed マッチ
によるオフターゲット効果を以下の方法で検討した．
ヒト GRK4 遺伝子に対する siRNA（Fig. 1-15A; siGRK4）の配列と完全一致しないにも関わらず，siGRK4 によって抑制される遺伝子として，Hif-1 が報告されている（Lin et al., 2005）．そこで，Hif-1 遺伝子の 3′ UTR から，siGRK4 と seed マッチする Box1 および Box2（Fig. 1-15B）だけを取り出して，ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の 3′ UTR に挿入したコンストラクトを作製した．
また同様に，Box1 または Box2 をタンデムに 2 個もしくは 3 個挿入したコンストラクトを作製した．これらのコンストラクトと同時に，siGRK4 を 0.05 〜 50 nM の濃度で HeLa 細胞に導入した
ときの，ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の相対活性を測定した．
その結果，標的配列として Box1 を 1 個挿入した場合，siGRK4 が 5 nM または 50 nM のときにルシフェラーゼ相対活性が 50% 近くまで抑制されたが，Box2 を 1 個挿入した場合ではルシフェ

A

siGRK45’-GACGUCUCUUCAGGCAGUUCU-3’:::::::::::::::::::
3’-UUCUGCAGAGAAGUCCGUCAA-5’

Box1

B

Box2

5′ auauAAUUUUUGUAAGAAGGCAGUAACcuuUCAUCAUGAUCAUAGGCAGUUGAaaaauuu|| : | ||||||||UUCUGCAGAGAAGUCCGUCAA| | : :||||||||UUCUGCAGAGAAGUCCGUCAA

5′siGRK4 antisense 21bp

Figure 1-15.

5′

siGRK4 antisense 21bp

(A) siGRK4 の配列．(B) ヒト Hif-1 遺伝子の 3′ UTR に存在する，siGRK4 と seed

マッチする 2 つの配列．siGRK4 のアンチセンス鎖とのアライメント中，seed マッチしている部分を影付きで示した．

25

AComplete match

Relative luciferase activity (%)

150

100

50

0
0.05nMB

siGRK450 nM0.05 nM

siGRK450 nM0.05 nM

siGRK4

50 nM

50 nM

0.05 nM

siGRK450 nM0.05 nM

siGRK4

50 nM

50 nM

0.05 nM

siGRK4

50 nM

Seed match (Box1)

Relative luciferase activity (%)

150

100

50

0
0.05nMC

siGRK4

Relative luciferase activity (%)

Seed match (Box2)
150

100

50

0
0.05nM

Figure 1-16.

siGRK4(A) siGRK4 と相補的な標的配列（黄色）に対して siGRK4 を作用させた場合の抑制効果．(B) Box1（緑色）を 1 つ，2 つ，または 3 つ挿入した標的に対して siGRK4 を作用させた場合の抑制効果．(C) Box2（青色）を 1 つまたは 2 つ挿入した標的に対して siGRK4 を作用させた場合の抑制効果．いずれも siGRK4 は 0.05, 0.5, 5, 50 nM の終濃度で導入した．

26

ラーゼ相対活性の減少は見られなかった．一方，Box1 を 2 個または 3 個挿入した場合，もしくは Box2 を 2 個挿入した場合に，ルシフェラーゼ相対活性が強く抑制された（Fig. 1-16）．
以上の結果は，わずか 7 塩基の seed マッチであっても，同一の mRNA 分子内に複数の seed
マッチが存在する場合に大きなオフターゲット効果が起こりうることを示唆した．したがってsiRNA の設計においては，標的とは無関係な転写産物のなかに複数の seed マッチが存在するような siRNA 配列を避けることが望ましいと考えられた．ただし，RefSeq release 20 に登録されたヒトの全遺伝子の配列を解析したところ，いかなる遺伝子においても同一の転写産物内に 2 回
47 種類の seed のうちわずか 5 種類しか存在しなかった．したがっ以上出現しないような seed は，て，現実的にはより緩やかな基準を検討する必要がある．そのような方法のひとつとして，ヒトの転写産物において出現頻度の高い seed をなるべく避けるというアプローチが考えられる．
1-6. siRNA 設計システムの構築
これまでに述べた実験的な結果に基づき，哺乳類細胞に有効かつオフターゲット効果の少ない siRNA の設計システムを構築した．哺乳類細胞に有効な siRNA の設計法は，Ui-Tei ら，Reynolds ら，Amarzguioui らの 3 つの設計法を比較検討した結果に基づき，Ui-Tei らの方法を用いた．また，オフターゲット効果の少ない siRNA を選択するために全遺伝子に対する相同性検
索をおこない，標的と無関係なすべての配列に対して 3 塩基以上がミスマッチする配列を可能なかぎり選択することとした．相同性検索には，当初 BLAST（Altschul et al., 1990）を用いたが，Alternative splice variants on the same locus
Block of length 18

Non-redundant sequence set of genes
Duplicate-free exons

Non-redundant sequences over exon-exon junctions

Figure 1-17.

NRDB の構築（Naito, Yamada et al., 2004 より作成）．冗長な配列をゲノムにマッピングすることによって，非冗長なエクソン配列およびエクソンジャンクション配列を得た．

27

10,000,000

19-mer の数

8,000,000

6,000,000

4,000,000

2,000,000

0
0

1

2

3

4

最小ハミング距離（bp）

Figure 1-18.

ヒトの NRDB を構成する 19-mer の最小ハミング距離の分布（Naito, Yamada etal., 2004 より作成）．最小ハミング距離が 5 であるような 19-mer は存在しない．

BLAST は siRNA のような短い配列の検索において見落としが多いという欠点があることが判った（Fig. 4）．このため短い配列の検索を見落としなく高速に実行できる Yamada らのアルゴリズ
ム（Yamada et al., 2005）を用いることとした．
全遺伝子に対する相同性検索においては，RefSeq や GenBank など既存のデータベースを用い
ると，同一の遺伝子に由来する配列が複数登録されているため siRNA の特異性の評価が難しいという問題があった．たとえば，ヒトの src 遺伝子は RefSeq release 20 において NM_005417 および NM_198291 という 2 件の配列として登録されているため，src を標的とする siRNA の配列を
RefSeq release 20 に対して検索すると，この 2 件の配列がヒットしうる．このとき，2 件のヒットが同一の遺伝子に由来するのか，それとも無関係な遺伝子を含むのかを機械的に判断することは困難である．そこで，非冗長な遺伝子配列データベース（NRDB; Non Redundant DataBase）に対してオフターゲット検索をおこなうこととした（Naito, Yamada et al., 2004）．NRDB は，RefSeq
および Unique UniGene の配列をゲノムにマッピングして得られた非冗長なエクソン配列と，エクソンジャンクション配列とを統合した配列データベースである（Fig. 1-17）．
Yamada および著者らは，ヒトの NRDB を構成する 19-mer の部分配列をすべて生成し，各配列の NRDB における最小ハミング距離を求めた（Naito, Yamada et al., 2004）．最小ハミング距離とは，NRDB 内でその配列を除きもっとも相同性の高い配列とのミスマッチ数である．たとえばある 19-mer の配列が複数の遺伝子に存在する場合，その 19-mer の最小ハミング距離は 0 である．また，ある 19-mer が他のすべての配列に対して必ず 3 塩基以上のミスマッチを有する場合，
すなわち，その 19-mer と 2 ミスマッチ以内で相同な配列が他の遺伝子に存在しない場合，その19-mer の最小ハミング距離は 3 である．なお，相補的（complementary）な配列も相同と見なす．

28

その結果，ヒトの NRDB を構成する 19-mer のうち最小ハミング距離が 3 以上である配列は10.7% であったが，4 以上の配列はほとんど存在しなかった（Fig. 1-18）．この結果は，siRNA を設計する際，標的と無関係なすべての配列に対して 3 塩基以上がミスマッチする配列は十分に選択可能であるが，4 ミスマッチ以上を保証できる配列はほとんど選択できないことを示唆した．
本研究で構築した siRNA 設計システムの一部は，siDirect ウェブサーバ（Naito, Yamada et al.,
2004; http://design.RNAi.jp/）として公開されており，その概略は下記のとおりである．

▲

トップページ（Fig. 1-19A）
基本的にはこの画面上に標的遺伝子の塩基配列またはアクセッション番号を入力するだけで，有効な siRNA の配列が得られる．オフターゲット検索をおこなう生物種（ヒト，マウス等）を選択できるほか，各種のオプションが用意されている．

▲

siRNA 設計結果の表示（Fig. 1-19B）
画面上の Eﬀective, both-strand speciﬁc siRNA は，Ui-Tei らの設計法を満たし哺乳類細胞で有効と予測される配列で，かつ siRNA のセンス鎖，アンチセンス鎖とも，標的以外のすべての遺伝子に対して 3 塩基以上がミスマッチするような siRNA 配列である．通常はこのリストから siRNA配列を選択すればよい．これらの siRNA は，画面上の Graphical view of eﬀective siRNA candidates
では濃い青色で表示される．
このような siRNA がひとつも設計できない場合は Eﬀective, plus-strand speciﬁc siRNA を参照する．これらの siRNA は，少なくとも siRNA のアンチセンス鎖については，標的以外のすべての遺伝子に対して 3 塩基以上がミスマッチするような配列である．この場合，siRNA のセンス鎖側の特異性は保証できないが，もしセンス鎖とハイブリダイズしうるオフターゲット遺伝子が存在しても，Ui-Tei らの設計法を満たす siRNA のセンス鎖側は，RISC に効率よく取り込まれないと考えられるため（Ui-Tei et al., 2004），その遺伝子に対するオフターゲット効果はおそらく問題にならない．これらの siRNA は，Graphical view of eﬀective siRNA candidates で薄い青色で表示される．

▲

オフターゲット遺伝子の表示（Fig. 1-19C）
Figure 1-19B のリストで個々の siRNA 配列をクリックすると，その siRNA と 3 ミスマッチ以

内で相同なすべての遺伝子が表示され，設計した siRNA の特異性を確認できる（Fig. 1-19C）．
siRNA のアンチセンス鎖（緑）またはセンス鎖（青）と相同な部分がアライメントとして表示される．
1-7. ヒト全遺伝子に対する siRNA 設計
本研究で構築した siRNA 設計システムにより，RefSeq release 20 に登録されたヒトの全遺伝子に対して siRNA の設計を試みた．各遺伝子について 1 個ずつ，下記の条件を可能なかぎり満たA

siDirect ウェブサーバ（http://design.RNAi.jp/）．(A) トップページ．(B) ヒトの claudin 17 遺伝子（NM_012131）を標的とする

19/19 マッチで表示されている．またその下には，17/19 マッチで本来の標的遺伝子とは無関係な claudin 8 が表示されている．

siRNA を設計した結果．(C) siRNA 配列と 3 ミスマッチ以内で相同なヒト遺伝子の一覧．最上段には本来の標的遺伝子である claudin 17 がFigure 1-19.

B

C

29

30

target (21) + overhang (2) :siRNA :

Figure 1-20.

aagacgtctcttcaggcagttct
5’-GACGUCUCUUCAGGCAGUUCU-3’:::::::::::::::::::
3’-UUCUGCAGAGAAGUCCGUCAA-5’

配列表（附録）に記載の塩基配列と，実際の siRNA 配列との対応．

す siRNA の配列を，配列表（附録）に示した．ただし，必須と表示されている条件は，かなら
ず満たすこととした．
・Ui-Tei らの siRNA 設計法を満たす，哺乳類で有効と予測される配列（必須）．
・Pol III プロモーターから shRNA を発現させる場合にも使用可能な配列（必須）．
・ヒトの当該遺伝子と対応する，マウスの遺伝子にも共通な配列．なお，共通な配列とは，siRNA のアンチセンス鎖部分の 21 塩基が完全一致していることを意味する．
・選択的スプライシングによるバリアントが知られている場合，できるだけ多くのバ
リアントに共通な配列．
・標的と無関係なすべての配列に対して 3 塩基以上がミスマッチする配列．
・全遺伝子における出現頻度が低い 7 塩基を seed とする配列．
なお，配列表（附録）に記載した項目は下記のとおりである．
・spe :Hs（ヒト）または Mm（マウス）．

・Gene ID :Entrez GeneID．

・symbol :遺伝子名．

・accession :アクセッション番号．

・position :siRNA 配列の最初の塩基の位置．

・target (21) + overhang (2) : siRNA のオーバーハングを含む 23 塩基の配列を，a, t, g, cの 4 文字で記載した．G と C の区別を容易にするため，すべて小文字で記載した．
詳細は Figure 1-20 を参照．
1-8. 長い 2 本鎖 RNA から生成される siRNA のオフターゲット効果
化学合成した siRNA を用いて RNAi を誘導する方法以外にも，長い dsRNA を Dicer で処理して得た，さまざまな配列の siRNA の混合物によって RNAi を誘導する方法がある（Kittler et al.,2005）
．また，チャイニーズハムスターの CHO-K1 細胞では，長い dsRNA を直接用いて RNAiを誘導できるほか（Ui-Tei et al., 2000），ショウジョウバエや線虫など哺乳類以外の種では長いdsRNA が一般的に用いられている．長い dsRNA は細胞内で Dicer によって約 21 塩基対の siRNAに分解され，さまざまな配列の siRNA 混合物として標的 mRNA に作用することとなる．このような場合，各 siRNA と相同性の高い配列をもつ遺伝子は，すべてオフターゲット効果を受ける可能性がある．しかしながら，長い dsRNA によるオフターゲット効果を予測する方法としては，BLAST で単純に dsRNA の全長を検索する方法が一般的であった．

31

本研究では，長い dsRNA によるオフターゲット効果をより正確に予測するため，細胞内における RNAi の実行過程を反映したアルゴリズムを構築した．まず，細胞内で dsRNA が Dicer によって siRNA に分解されることを考慮して，dsRNA 配列を構成する 19 塩基の部分配列（以下，単に
19-mer と呼ぶ）をすべて生成した（Fig. 1-21A）．たとえば，500 塩基の長さの dsRNA 配列からは，482 種の 19-mer が生成できる．このようにして仮想的に生成した各 siRNA について個別にオフターゲット検索をおこない，完全マッチ（19/19 マッチ），1 ミスマッチ（18/19 マッチ），2 ミスマッ
チ（17/19 マッチ）で相同なすべての遺伝子を列挙して集計した（Fig. 1-21B）．実際には dsRNA
配列を構成するすべての部分配列が siRNA として生成されるわけではないが，オフターゲット
効果の対象となりうる遺伝子を見落としなく列挙するため，本研究ではすべての部分配列が生成されると仮定して解析をおこなった．なお，部分配列の長さを 21 塩基ではなく 19 塩基とした理由は，siRNA の末端の塩基が標的 mRNA とミスマッチしていても，中央の 19 塩基が完全一致していれば標的の切断が起こりうるためである．

A

B
Target mRNA

dsRNA

dsCheck Results

Cleavage by Dicer
0 mis : Total hits with a complete match (19/19 matches).

siRNAs

1 mis : Total hits with one mismatch (18/19 matches).
2 mis : Total hits with two mismatches (17/19 matches).

off-target effects

1479

4

4

NM_078834.2| Drosophila melanogaster CG12287-PA (pdm2) mRNA, complete cds

1337

11

23

NM_165017.1| Drosophila melanogaster CG12287-PB (pdm2) mRNA, complete cds

128

45

53

NM_057311.4| Drosophila melanogaster CG6246-PA (nub) mRNA, complete cds

20

28

72

NM_079224.3| Drosophila melanogaster CG10037-PA (vvl) mRNA, complete cds

3

15

128

NM_168571.1| Drosophila melanogaster CG32133-PA (CG32133) mRNA, complete cds

2

7

36

NM_142597.2| Drosophila melanogaster CG12254-PA (Arc92) mRNA, complete cds

nub (NM_057311)

0 mis 1 mis 2 mis Description:

2

4

48

NM_176557.1| Drosophila melanogaster CG33106-PB (mask) mRNA, complete cds

2

4

48

NM_176556.1| Drosophila melanogaster CG33106-PA (mask) mRNA, complete cds

2

4

15

NM_132116.1| Drosophila melanogaster CG14441-PA (CG14441) mRNA, complete cds

2

4

13

NM_135957.2| Drosophila melanogaster CG31738-PB (CG31738) mRNA, complete cds

2

4

7

NM_131968.2| Drosophila melanogaster CG32772-PA (CG32772) mRNA, complete cds

2

4

5

NM_165168.1| Drosophila melanogaster CG31738-PA (CG31738) mRNA, complete cds

2

3

16

NM_133124.1| Drosophila melanogaster CG7502-PA (CG7502) mRNA, complete cds

2

3

10

NM_079524.3| Drosophila melanogaster CG1030-PA (Scr) mRNA, complete cds

1500
2000

2

3

10

NM_206443.1| Drosophila melanogaster CG1030-PB (Scr) mRNA, complete cds

2

3

10

NM_206442.1| Drosophila melanogaster CG1030-PC (Scr) mRNA, complete cds

2

3

7

NM_057525.2| Drosophila melanogaster CG7937-PA (C15) mRNA, complete cds

2

3

4

NM_134555.1| Drosophila melanogaster CG15454-PA (CG15454) mRNA, complete cds

2

3

2

NM_057268.3| Drosophila melanogaster CG6944-PA (Lam) mRNA, complete cds

1

18

33

NM_132246.2| Drosophila melanogaster CG10555-PA (CG10555) mRNA, complete cds

1

17

109

NM_167335.1| Drosophila melanogaster CG4013-PC (Smr) mRNA, complete cds

1

17

109

NM_167334.1| Drosophila melanogaster CG4013-PB (Smr) mRNA, complete cds

1

17

109

NM_080536.2| Drosophila melanogaster CG4013-PA (Smr) mRNA, complete cds

1

10

65

NM_078592.2| Drosophila melanogaster CG11172-PA (NFAT) mRNA, complete cds

1

7

4

NM_132281.1| Drosophila melanogaster CG12660-PA (CG12660) mRNA, complete cds

1

6

48

NM_143409.1| Drosophila melanogaster CG11873-PA (CG11873) mRNA, complete cds

1

6

45

NM_206357.1| Drosophila melanogaster CG33261-PD (Trl) mRNA, complete cds

Unrelated mRNAs

vvl (NM_079224)

C

2500

1000
1

Query (pdm2 ; NM_078834)

Figure 1-21.

1497

Naito, Yamada et al., 2005 より作成．(A) 長い dsRNA は細胞内で Dicer によって

約 21 塩基対の siRNA に分解される．(B) ショウジョウバエ pdm2 遺伝子の全長を標的とする
dsRNA のオフターゲット効果を予測した例．最上段には本来の標的遺伝子である pdm2 遺伝
子の 2 つのバリアントが表示されている．その下にはオフターゲット遺伝子の候補として，
nub 遺伝子，vvl 遺伝子などが表示されている．(C) pdm2 遺伝子，nub 遺伝子，vvl 遺伝子は，保存された POU ドメインを共有している．17/19 以上のマッチをプロットした．

32

Amatches
19/19>18/19>17/19100

50

0matches
19/19>18/19>17/19B 10000
10
00
1
10
1
1

Figure 1-22.

1497

pdm2 遺 伝 子 に 対 し て 特 異 性 の 高 い dsRNA を 設 計 す る 方 法 の 検 討（Naito,

Yamada et al., 2005 より作成）．(A) 100 bp の dsRNA から生成した 82 種の 19-mer による，協調的ヒットの最大値．矢印で示した位置が最も協調的ヒットが少なくなる．(B) 各 19-mer と相同性をもつ遺伝子の数．影付で示した位置の 19-mer は，多数の遺伝子と相同性を有する．

Figure 1-21B は，ショウジョウバエの POU ドメインタンパクである pdm2 遺伝子（NM_078834）のコード領域の全長（1497 bp）を標的とする dsRNA について，この方法でオフターゲット効果を予測した結果である．最上段から順に，pdm2 遺伝子の 2 つのバリアント（NM_078834,
NM_165017）および，無関係な遺伝子である，nub 遺伝子（NM_057311），vvl 遺伝子（NM_079224）がヒットしている．Figure 1-21C に示すように，pdm2, nub, vvl の各遺伝子は，高度に保存された
POU ドメインを有しており，この領域を標的とする dsRNA は，nub 遺伝子や vvl 遺伝子に対するオフターゲット効果のリスクが高いと予想される．
このような遺伝子に対して特異性が高い dsRNA を設計するためには，特定のオフターゲッ
ト遺伝子に対して多数の 19-mer がヒットする協調的ヒット（collaborative oﬀ-target hit）を避けることが望ましい（Naito, Yamada et al., 2005）．Figure 1-22A は，pdm2 遺伝子に対して 100 bp のdsRNA をさまざまな位置に設計した場合に，dsRNA から生成された 82 種の 19-mer による協調的ヒットの最大値を計算したものである．POU ドメインが存在する 1000 bp 付近にピークがあり，この付近では dsRNA から生成した 19-mer の多くが特定のオフターゲット遺伝子（この場合は nub 遺伝子）と相同性を有することを示している．一方，500 bp 付近の矢印（▼）で示した位
置は協調的ヒットが少なく，100 bp の dsRNA を設計するうえで好適と考えられる．また Figure
1-22B の影付で示すように，特定の 19-mer が多数の遺伝子と相同性を有する場合があり，そのような 19-mer を含まないように dsRNA を設計することが望ましいと考えられる．
本研究で構築した，長い dsRNA によるオフターゲット効果の予測法と，特異性が高い dsRNA
dsCheck ウェブサーバ（http://dsCheck.RNAi.jp/）として公開されている（Naito,の設計法の一部は，
Yamada et al., 2005）．

33

2. 方

法

2-1. Ui-Tei らによる siRNA 設計法
Ui-Tei et al., 2004 にしたがい，下記 (i) 〜 (iv) の条件をすべて満たす siRNA を有効と判定した．
Figure 1-1A に (i) 〜 (iv) を図示した．以下，siRNA を構成するセンス鎖，アンチセンス鎖を，それぞれ単にセンス鎖，アンチセンス鎖と呼ぶ．
(i) アンチセンス鎖の 5′ 末端が A または U である．
(ii) センス鎖の 5′ 末端が G または C である．
(iii) アンチセンス鎖の 5′ 端の 7 塩基のうち 4 塩基以上が A または U である．
(iv) 配列中に G/C が 10 塩基以上連続しない．
2-2. Reynolds らによる siRNA 設計法
Reynolds et al., 2004 にしたがい，
下記 (I) 〜 (VIII) の合計得点が 6 以上の siRNA を有効と判定した．
Figure 1-1B に (I) 〜 (VIII) を図示した．
(I)
(II)

siRNA の 2 本鎖部分における G/C の数が，19 塩基中 7 〜 10 塩基の範囲であれば +1 点．
アンチセンス鎖の 5′ 端の 5 塩基における A または U の数（0 〜 5）を得点とする．

(III) 2 本鎖部分の Tm が 20℃未満．判定不能のため本項目は無視する．
(IV) センス鎖の 5′ 端から 19 番目の塩基が A であれば +1 点．すなわち，アンチセンス鎖の 5′末端が U であれば +1 点．
(V) センス鎖の 5′ 端から 3 番目の塩基が A であれば +1 点．
(VI) センス鎖の 5′ 端から 10 番目の塩基が U であれば +1 点．
(VII) アンチセンス鎖の 5′ 末端が G または C であれば -1 点．
(VIII) センス鎖の 5′ 端から 13 番目の塩基が G であれば -1 点．
2-3. Amarzguioui らによる siRNA 設計法
Amarzguioui et al., 2004 にしたがい，下記 (1) 〜 (6) の合計得点が 3 以上の siRNA を有効と判定した．Figure 1-1C に (1) 〜 (6) を図示した．

(2)
(3)
(4)
(5)

∆T3：アンチセンス鎖の 5′ 端の 3 塩基における A または U の数（0 〜 3）から，センス鎖の 5′
端の 3 塩基における A または U の数（0 〜 3）を引いた値を得点とする．-3 から +3 までの値を取りうる．
センス鎖の 5′ 末端が G または C であれば +1 点．
センス鎖の 5′ 末端が U であれば -1 点．
センス鎖の 5′ 端から 6 番目の塩基が A であれば +1 点．
センス鎖の 5′ 端から 19 番目の塩基が G であれば -1 点．すなわち，アンチセンス鎖の 5′(6)末端が C であれば -1 点．
アンチセンス鎖の 5′ 末端が A または U であれば +1 点．

(1)

2-4. siRNA
Proligo 社より購入したセンス 1 本鎖 RNA とアンチセンス 1 本鎖 RNA をアニーリングして使用した．アニーリングは，終濃度 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，20 mM NaCl の緩衝液中で 95℃

34

で 3 分インキュベートし，徐々に室温まで冷却した．もしくは，2 本鎖にアニーリングされた siRNA を RNAi 社（東京）より購入した．siRNA の配列は Table S1（巻末），Figure 1-8, 1-9,
1-10C, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15A にそれぞれ示した．
2-5. 細胞の培養およびトランスフェクション
HeLa 細 胞 は 10% 非 働 化 ウ シ 胎 児 血 清（ 三 菱 化 学 ） を 含 有 す る Dulbecco’s modiﬁed Eagle
medium（DMEM; Gibco 社）に抗生物質（10 U/ml ペニシリン，50 µg/ml ストレプトマイシン）を添加して 37℃で培養した．HeLa 細胞へのトランスフェクションは，24 ウェルプレートにおいて，Lipofectamine 2000（Invitrogen 社）を用いて同製品のマニュアルに記載の方法でおこなった．
細胞に導入するプラスミドは，Qiagen Plasmid Midi または QIAwell 96 Ultra（Qiagen 社）を用いて抽出した．
2-6. ルシフェラーゼ遺伝子を標的とする RNAi
ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードする pGL3-Control（Promega 社）を 1 µg/well，内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードする pRL-TK（Promega 社）を 0.1 µg/well，siRNA を 終 濃 度 50 nM で HeLa 細 胞 に 導 入 し た．24 時 間 後 に 細 胞 を 回 収 し，Dual-luciferase
reporter assay system（Promega 社）でルシフェラーゼ相対活性を測定した．
2-7. 標的 mRNA 発現ベクター pTREC の構築
pCI-neo（Promega 社）の NheI 部位と XbaI 部位との間に，Kozak 配列およびいくつかの制限
酵素部位を挿入して pTREC を構築した．挿入した配列は下記のとおりである．
[NheI site]-CACCATGGAATTCACGCGTCTCGAG-[XbaI site]
構築したベクターの構造は Figure 1-6 に，標的 mRNA として転写される領域の塩基配列は
Figure 1-7 に示した．
2-8. 標的切断アッセイ
pTREC ベクターの EcoRI 部位と XhoI 部位との間に，評価対象の siRNA と相同な 23 塩基の標的配列を Figure 1-6 の例にしたがって挿入した．ただし，siRNA の配列に対してミスマッチを含む標的配列は，Figure 1-12, 1-13, 1-14 に示した配列をそれぞれ挿入した．ベクターに挿入した標的配列部分はすべてシークエンスの確認をおこなった．
構築した pTREC コンストラクト（0.5 µg/well）を siRNA（終濃度 50 nM）とともに HeLa 細胞に導入し，24 時間後に細胞を回収後，RNeasy96（Qiagen 社）で全 RNA を抽出した．得られた
RNA を，オリゴ dT をプライマーに SuperScript（Invitrogen 社）で逆転写して cDNA を得た．リ
アルタイム PCR は，ABI PRISM 7000（Applied Biosystems 社）を使用して SYBR Green PCR Master
Mix（Applied Biosystems 社）でおこなった．プライマーの配列は，

35Target-F : 5′-AGGCACTGGGCAGGTGTC
Target-R : 5′-TGCTCGAAGCATTAACCCTCACTA
neo-F :
neo-R :

5′-ATCAGGATGATCTGGACGAAG
5′-CTCTTCAGCAATATCACGGGTである．ベクターに組み込まれているネオマイシン耐性遺伝子を内部標準として使用し，[ 標的 mRNA 量 ] / [ neo mRNA 量 ] により算出される値を，標的 mRNA 相対量とした．
2-9. ビメンチン遺伝子を標的とする RNAi
抗体染色によるビメンチンタンパク質の検出においては，HeLa 細胞を 24 ウェルプレートにまき，1 日後，2 日後，3 日後にそれぞれ siRNA を終濃度 50 nM で導入した．3 回目の導入操作から 24 時間後に，細胞を 3.7% ホルムアルデヒドで固定し，PBS で洗浄した．ビメンチンの検出は，抗ブタビメンチン抗体（Oncogene Research Products 社）および Cy3 標識 2 次抗体（Jackson
Immuno Research 社）を用いた．またコントロールとして Yes タンパク質（YES1; NM_005433）の検出を，抗ヒト Yes 抗体（Upstate Biotechnology 社）および Cy5 標識 2 次抗体（Jackson Immuno
Research 社）でおこなった．
リアルタイム RT-PCR によるビメンチン mRNA の定量においては，HeLa 細胞に pCAGIPuroEGFP（ピューロマイシン耐性遺伝子および EGFP をコードするベクター）を 0.5 µg，siRNA を終濃度 50 nM で導入した．24 時間後より培地をピューロマイシン含有培地に変更して細胞を培養した．導入 3 日後に標的切断アッセイと同様の方法で HeLa 細胞から RNA を抽出し，ビメンチ
ンの mRNA 量および，内部標準としてβ−アクチン（ACTB; NM_001101）の mRNA 量を定量した．ビメンチンおよびβ−アクチンの検出に用いたプライマーの配列はそれぞれ，
VIM-F : 5′-GAGCTACGTGACTACGTCCA
VIM-R : 5′-GTTCTTGAACTCGGTGTTGATACTB-F : 5′-CACACTGTGCCCATCTACGAACTB-R : 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCである．[ VIM mRNA 量 ] / [ ACTB mRNA 量 ] の値をビメンチン mRNA 相対量とした．
2-10. プライマーエクステンション法
pTREC コンストラクトを 0.5 µg/well，siRNA を終濃度 5 nM で HeLa 細胞に導入した．24 時間後，
1 サンプルあたり 48 ウェルから細胞を回収し，QuickPrep Micro mRNA Puriﬁcation Kit（Amersham
32
P で末端標識したプライマー社）
で poly A+ RNA を抽出した．抽出した RNA をテンプレートに，

5′-CTCGAAGCATTAACCCTCACTA を用いて，Primer Extension System（Promega 社）でプライマー
エクステンション反応をおこなった．反応産物はシークエンスゲル（尿素− 6% ポリアクリルア
ミドゲル）で泳動した．マーカーとして，同じプライマーを用いて pTREC コンストラクトをダ
イデオキシ法によりシークエンスして得たラダーを泳動した．

36

Construct

Inserted sequence

GRK4.x1[XhoI site]-AAGACGTCTCTTCAGGCAGTTCT-[EcoRI site]

GRK4.x2[XhoI site]-AAGACGTCTCTTCAGGCAGTTCT AAGACGTCTCTTCAGGCAGTTCT-[EcoRI site]

GRK4.x3[XhoI site]-AAGACGTCTCTTCAGGCAGTTCT AAGACGTCTCTTCAGGCAGTTCT AAGACGTCTCTTCAGGCAGTTCT-[EcoRI site]

Box1.x1[XhoI site]-AATTTTTGTAAGAAGGCAGTAAC-[EcoRI site]

Box1.x2[XhoI site]-AATTTTTGTAAGAAGGCAGTAAC AATTTTTGTAAGAAGGCAGTAAC-[EcoRI site]

Box1.x3[XhoI site]-AATTTTTGTAAGAAGGCAGTAAC AATTTTTGTAAGAAGGCAGTAAC AATTTTTGTAAGAAGGCAGTAAC-[EcoRI site]

Box2.x1[XhoI site]-TCATCATGATCATAGGCAGTTGA-[EcoRI site]

Box2.x2[XhoI site]-TCATCATGATCATAGGCAGTTGA TCATCATGATCATAGGCAGTTGA-[EcoRI site]

Box2.x3[XhoI site]-TCATCATGATCATAGGCAGTTGA TCATCATGATCATAGGCAGTTGA TCATCATGATCATAGGCAGTTGA-[EcoRI site]

Table 1-1.

seed マッチによるオフターゲット効果の検討のため，psiCheck-1 ベクターに挿入した配列の一覧．

2-11. seed マッチによるオフターゲット効果の検討
psiCheck-1 ベクター（Promega 社）の XhoI 部位と EcoRI 部位との間に，Table 1-1 の配列を挿入したコンストラクトを構築した．構築したコンストラクトを 0.1 µg/well，pGL3-Control（Promega社）
を 1 µg/well，siRNA を終濃度 0.05 〜 50 nM で HeLa 細胞に導入した．24 時間後に細胞を回収し，Dual-luciferase reporter assay system（Promega 社）でルシフェラーゼ相対活性を測定した．
2-12. 共同研究に関する事項
Table S1（巻末）のうち siRNA の名称に＊を表示した箇所は Ui-Tei et al., 2004 によった．また，それ以外の約半数のデータを東京大学の程 久美子博士より供与いただいた．それ以外の箇所は著者が実験をおこない，全体にわたって著者が主体となって分析および検証をおこなった．
Figure 1-8 のルシフェラーゼ相対活性のデータは，東京大学の程 久美子博士，江田 理愛氏よ
り供与いただいた．それに対応する標的切断アッセイは著者がおこない，全体にわたり著者が主体となって分析および検証をおこなった．
Figure 1-9 の内在性ビメンチンタンパク質の抗体染色のデータは，東京大学の高橋 史峰博士より供与いただいた．それに対応する標的切断アッセイおよび内在性ビメンチン mRNA の定量は著者がおこない，全体にわたり著者が主体となって分析および検証をおこなった．
NRDB の構築および siDirect ウェブサーバのプログラム作成は東京大学の山田 智之氏，森下真一博士がおこなった．NRDB の概念および siDirect ウェブサーバの仕様は著者が主体となって発案，構成したほか，siDirect ウェブサーバのプロトタイプを著者が作成した．また，構築時における評価およびデバッグを著者が主体となっておこなった．
dsCheck ウェブサーバのプログラム作成は東京大学の山田 智之氏，松宮 孝大氏，森下 真一
博士がおこなった．dsCheck ウェブサーバの仕様は著者が主体となって発案，構成したほか，
dsCheck ウェブサーバのプロトタイプを著者が作成した．また，構築時における評価およびデバッ
グを著者が主体となっておこなった．

39

■

第二章
抗ウイルス siRNA 設計システムの構築および HIV-1 を標的とする RNA 干渉法への応用

1. 結果と考察
1-1. HIV-1 を標的とする siRNA 設計法の検討
HIV-1 や HCV など多くの RNA ウイルスでは，著しく高いゲノム多様性のために siRNA の設計が難しいばかりでなく，1 種類の siRNA を単独で用いた場合，その siRNA に耐性をもつウイ
ルスが容易に出現しうることが報告されている（Boden et al., 2003a; Das et al., 2004）．これらの課題を克服するひとつの方法は，ウイルスの配列のなかで高度に保存された領域を標的とすることである．そこで Los Alamos HIV Sequence Database（http://www.hiv.lanl.gov/）より入手可能な
HIV-1 グループ M のゲノム配列 495 種（Table S2, 巻末）をもとに，siRNA の標的として有力な候補となりうる高度保存領域を同定した．まず，495 種の HIV-1 配列を構成する 21 塩基の部分配列（以下，単に 21-mer と呼ぶ）をすべて生成し，そのひとつひとつの 21-mer が 495 種のうち何種に共通であるかを調べた．たとえば AATAGCAACAGACATACAAAC という 21-mer が 495 種のうち 300 種に共通であった場合，その 21-mer の 保存度（conservation）を 300/495 × 100 ＝ 60.6 (%)と計算した．ただし，本解析に用いた HIV-1 配列の多くは 5′ UTR 部分の配列を欠いているため，5′
UTR 領域の保存度を計算する際に分母を 495 とすると，保存度が過小に評価されるという問題があった．そこで，5′ UTR 領域のうち LTR 部分については，各々の配列の 3′ LTR の配列を用いて補完した．さらに，保存度の計算では分母を一律に 495 とするのではなく，保存度を求めよ
うとしている 21-mer に対応する領域を欠いていない配列の個数をその都度求め，それを分母とした．以上の操作により，5′ UTR 領域の 21-mer についても正確に保存度を評価できた．
495 種の HIV-1 配列を構成する 21-mer は合計で 4,417,157 種であり，配列の重複を除くと1,208,150 種となった．495 種の HIV-1 配列から生成された全 21-mer が，重複を除いた際に 4 分の 1 程度にしかならない事実は，HIV-1 ゲノムの多様性が著しく高いことを示唆した．ついで各 21-mer の保存度を siVirus プログラム（Naito et al., 2006）を用いて計算し，青色（保存度0%）から赤色（保存度 100%）の点で示したところ（Fig. 2-1A），それらのほとんどが青色に近く，HIV-1 ゲノムの大部分の領域は 21-mer の単位では保存されていないことが明らかになった．
具体的には，保存度が 70% 以上の 21-mer は全体のわずか 1.6% であり，保存度が 50% 以上の
21-mer でも全体の 5.2% に過ぎなかった（Fig. 2-2）．また，すべての HIV-1 配列に共通な，保存度が 100% であるような 21-mer は存在しなかった．これらの結果は，HIV-1 を標的とする siRNA

40

A
1

Position :
1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

9699

100%

0%
Subtype A

Conservation among
HIV-1 group M

Subtype B

Subtype C

Subtype D
Subtype F,G,H,J,K
CRF01_AE
CRF02_AG
CRF03 -16

URFs

R U5
U3
5′ LTR

p2 p1
p17

p24
gag

tat

vif

p7 p6

vpu
prot

p51 RT

p15

vpr

p31 int

nef

rev
gp120

pol

gp41

R U5
100%

U3
3′ LTR

env
50%

B

0%

300

400

500

600

700

800

900

4600

4700

4800

4900

5000

5100

9000

9100

100%

0%
Subtype A

Conservation anomg
HIV-1 group M

Subtype B

Subtype C

Subtype D
Subtype F,G,H,J,K
CRF01_AE
CRF02_AG
CRF03 -16

URFs

5′ LTR U3

R

U5

gag

p31 int

3′ LTR U33′ PPTPAS PBS DIS SD
TCF-1α
Sp1
TAR
NFκB
TATA
poly A

Figure 2-1.

cPPT

CTS
vif

nef

HIV-1 ゲノムを構成する 21-mer の保存度．(A) 495 種の HIV-1 配列から生成した

4,417,157 種の 21-mer について保存度を求め，青色（保存度 0%）から赤色（保存度 100%）の点で示した．折れ線グラフは各位置における保存度の最大値（最頻値と一致）を示す．(B) 5′
UTR，インテグラーゼ遺伝子内の cPPT/CTS 領域，および 3′ PPT 領域の拡大図．

410.5% 0.8%
0.3%
1.5%
2.1%
Conservation among
HIV-1 group M
90 - 100%
80 - 90%
70 - 80%
94.8%

60 - 70%
50 - 60%
0 - 50%Figure 2-2.

495 種の HIV-1 配列から生成した全 21-mer の保存度の分布．

を無作為に設計しても，高い多様性をもつ HIV-1 を効率よく標的とすることが難しいことを示唆した．なお，HIV-1 を標的とする RNAi 法の試みは既に複数の研究グループより報告されているが，それらの研究で使用されている siRNA の多くは保存度が低かった（Table S3, 巻末）．
しかしながら，21-mer のうち特定の領域に位置するものは高度に保存されていることが判った（Fig. 2-1B）．これらの領域の多くはウイルスの遺伝子発現や増殖に必須な配列を含んでいた．
すなわち，ウイルスの遺伝子発現に必要な TATA 配列やポリ A シグナル（AAUAAA），逆転写に必要な primer activation signal（PAS）および primer binding site（PBS），ウイルスのパッケージン
グに必要な packaging signal（Ψ），ゲノムの＋鎖 DNA 合成に必要な central polypurine tract（cPPT），
central termination sequence（CTS）ならびに 3′ polypurine tract（3′ PPT）などが高度に保存されていた．これらはすべて，アミノ酸配列ではなく RNA の配列自体もしくは RNA の 2 次構造を通して機能を発揮するような領域であることは興味ある知見であった．実際，アミノ酸配列のレベルで保存されているような領域の多くは，コドンの 3 番目の塩基の変異を許容するため，塩基配列レベルでは必ずしも保存されていない例が多かった．
以上の解析により同定した，保存度が 70% 以上であるような 21-mer を Table S4（巻末）に示した．
この 216 種の siRNA 配列のうち 36 種が Ui-Tei らの siRNA 設計ガイドラインを満たし，哺乳類細胞で有効と予測された．また，Reynolds らの siRNA 設計法では 30 種，Amarzguioui らの設計法
では 44 種がそれぞれ有効と予測された（Table S4, 巻末）．siRNA の抗 HIV-1 効果を検証するため，
Table S4 に記載された Ui-Tei らのガイドラインを満たす 36 種の siRNA から，感染性分子クローン pNL4-3（GenBank: M19921）と配列が完全一致するものを 23 種選択し，また，保存度が中程度で Ui-Tei らのガイドラインを満たし，かつ pNL4-3 と完全一致するものを 18 種選択した．選
択した合計 41 種の siRNA の配列を Figure 2-3 に示した．

42

Target site (21 bp)

Sense strand

Antisense strand

Conservation

si505
si509
si510
si512
si515
si521
si554
si575
si689
si690
si764
si770
si1490si1817si2075si2329si2330si2333si2485si2486si3000si3005si3006si3011
si4175si4373si4378si4652
si4746
si4750si4751
si4753si4794si4806si4809si4840si4888si4960si4961
si7653si7658

5′
3′
GGGAACCCACTGCTTAAGCCTACCCACTGCTTAAGCCTCAAT
CCCACTGCTTAAGCCTCAATA
CACTGCTTAAGCCTCAATAAATGCTTAAGCCTCAATAAAGCT
AGCCTCAATAAAGCTTGCCTT
TAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATACGCAGGACTCGGCTTGCTGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGACTAGCGGAGGCTAGAAGGACGGAGGCTAGAAGGAGAGAGAGTGACATAGCAGGAACTACTATAGAAGAAATGATGACAGCATGACAGGCTAATTTTTTAGGGACAGGAGCAGATGATACAGTATAGGAGCAGATGATACAGTATT
AGCAGATGATACAGTATTAGAGACCTACACCTGTCAACATAAACCTACACCTGTCAACATAATCAGGGATGGAAAGGATCACCAATGGAAAGGATCACCAGCAATTGGAAAGGATCACCAGCAATAAGGATCACCAGCAATATTCCATGGAGGAAATGAACAAGTAGAAGCCATGCATGGACAAGTAGATGCATGGACAAGTAGACTGTA
TCCCTACAATCCCCAAAGTCAAAGACAGCAGTACAAATGGCA
CAGCAGTACAAATGGCAGTATAGCAGTACAAATGGCAGTATTCAGTACAAATGGCAGTATTCAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGGGTACAGTGCAGGGGAAAGATACAGTGCAGGGGAAAGAATATAGCAACAGACATACAAACTATTCAAAATTTTCGGGTTTATT
AAGGTGAAGGGGCAGTAGTAA
AGGTGAAGGGGCAGTAGTAATGACAATTGGAGAAGTGAATTATTGGAGAAGTGAATTATATAA

5′3′GAACCCACUGCUUAAGCCUCA
CCACUGCUUAAGCCUCAAUAACACUGCUUAAGCCUCAAUAAA
CUGCUUAAGCCUCAAUAAAGCCUUAAGCCUCAAUAAAGCUUG
CCUCAAUAAAGCUUGCCUUGAGUGUGUGCCCGUCUGUUGUGUGACUCUGGUAACUAGAGAUCCGCAGGACUCGGCUUGCUGAAGCAGGACUCGGCUUGCUGAAGC
CUAGCGGAGGCUAGAAGGAGAGAGGCUAGAAGGAGAGAGAUGGACAUAGCAGGAACUACUAGUGAAGAAAUGAUGACAGCAUGUCAGGCUAAUUUUUUAGGGAAGGGAGCAGAUGAUACAGUAUUAGAGCAGAUGAUACAGUAUUAGCAGAUGAUACAGUAUUAGAAGCCUACACCUGUCAACAUAAUUCUACACCUGUCAACAUAAUUGGGGAUGGAAAGGAUCACCAGCGGAAAGGAUCACCAGCAAUAUGAAAGGAUCACCAGCAAUAUUGAUCACCAGCAAUAUUCCAAAGAGGAAAUGAACAAGUAGAUA
CCAUGCAUGGACAAGUAGACUCAUGGACAAGUAGACUGUAGU
CCUACAAUCCCCAAAGUCAAGGACAGCAGUACAAAUGGCAGU
GCAGUACAAAUGGCAGUAUUCCAGUACAAAUGGCAGUAUUCAGUACAAAUGGCAGUAUUCAUCGGGGAUUGGGGGGUACAGUGCGUACAGUGCAGGGGAAAGAAUCAGUGCAGGGGAAAGAAUAGUGCAACAGACAUACAAACUAAA
CAAAAUUUUCGGGUUUAUUAC
GGUGAAGGGGCAGUAGUAAUAGUGAAGGGGCAGUAGUAAUAC
CAAUUGGAGAAGUGAAUUAUAGGAGAAGUGAAUUAUAUAAAU

5′3′
AGGCUUAAGCAGUGGGUUCCCAUUGAGGCUUAAGCAGUGGGUUAUUGAGGCUUAAGCAGUGGGUUUAUUGAGGCUUAAGCAGUG
AGCUUUAUUGAGGCUUAAGCA
AAGGCAAGCUUUAUUGAGGCUACAACAGACGGGCACACACUAAUCUCUAGUUACCAGAGUCACUCAGCAAGCCGAGUCCUGCGUUUCAGCAAGCCGAGUCCUGCGUCCUUCUAGCCUCCGCUAGUCUCUCUCUCCUUCUAGCCUCCGUAGUAGUUCCUGCUAUGUCACAUGCUGUCAUCAUUUCUUCUAUCCCUAAAAAAUUAGCCUGUCAUACUGUAUCAUCUGCUCCUG
AAUACUGUAUCAUCUGCUCCUUCUAAUACUGUAUCAUCUGCUUUAUGUUGACAGGUGUAGGUCAUUAUGUUGACAGGUGUAGGUUGGUGAUCCUUUCCAUCCCUG
AUUGCUGGUGAUCCUUUCCAUUAUUGCUGGUGAUCCUUUCCAUGGAAUAUUGCUGGUGAUCCUUCUACUUGUUCAUUUCCUCCAUCUACUUGUCCAUGCAUGGCUUACAGUCUACUUGUCCAUGCAUGACUUUGGGGAUUGUAGGGAUGCCAUUUGUACUGCUGUCUUAUACUGCCAUUUGUACUGCUGAAUACUGCCAUUUGUACUGCUUGAAUACUGCCAUUUGUACUG
ACUGUACCCCCCAAUCCCCCC
UCUUUCCCCUGCACUGUACCC
UAUUCUUUCCCCUGCACUGUAUAGUUUGUAUGUCUGUUGCUAAAUAAACCCGAAAAUUUUGAAUUACUACUGCCCCUUCACCUUAUUACUACUGCCCCUUCACCUUAAUUCACUUCUCCAAUUGUCUUAUAUAAUUCACUUCUCCAA

77 %
84 %
84 %
85 %
85 %
94 %
68 %
68 %
88 %
69 %
88 %
88 %
56 %
82 %
70 %
77 %
77 %
77 %
66 %
66 %
57 %
60 %
61 %
47 %
76 %
49 %
49 %
64 %
66 %
74 %
74 %
71 %
80 %
72 %
84 %
60 %
80 %
69 %
70 %
67 %
65 %

siControl

ACGTACCGCACGTCATTCGTAGUACCGCACGUCAUUCGUAUCUACGAAUGACGUGCGGUACGU

U3
R
U5

TCF-1αSp1 TAR PAS
DIS
NFκB TATA poly A PBS SD

siRNA

HIV-1 Genome

Figure 2-3.

抗 HIV-1 効果の検証のために選択した 41 種の siRNA 配列

およびそれらの標的部位．siRNA の名称は，HIV-1 ゲノムにおける標的

90 - 100%
80 - 90%
70 - 80%
60 - 70%
50 - 60%
0 - 50%部位の座標に対応している．

1-2. siRNA の抗 HIV-1 効果の検証
まず，siRNA 自体が備える標的切断活性を，第 1 章で述べた siRNA の標的切断活性を評価するアッセイ系（以下，標的切断アッセイ）で評価した．すなわち，各 siRNA の標的配列をmRNA の一部として発現するコンストラクトを構築し，siRNA とともに HeLa 細胞に導入した．
ついで，そのコンストラクトから発現させた標的 mRNA の分解を，リアルタイム RT-PCR 法により定量した．その結果，各 siRNA を 5 nM で用いた場合，41 種の siRNA のうち 39 種が標的
mRNA を 40% 以下に抑制した（Fig. 2-4B）．si4794 と si4888 は有効と予測されたにもかかわらず，5 nM の濃度において十分な抑制を示さなかった．この理由は明らかでないが，si4794 は配列中に連続するグアニン残基（GGGGGG）および連続するシトシン残基（CCCCCC）を含むた
め RNA オリゴの化学合成が難しく，また si4888 は配列中に AAAAUUUU という回文配列が存在
し 2 次構造を取りやすいため，いずれも正しく塩基対を形成した 2 本鎖 siRNA の実効濃度が低下していた可能性がある（Ui-Tei et al., 2004; Reynolds et al., 2004）．

TCF-1αU3RU5

Sp1 TAR PAS
DIS
NFκB TATA poly A PBS SD

HIV-1 genome

Inhibited all 4 strains by >90%
Inhibited all 4 strains by >80%

Overall efficacy

090 - 100%
80 - 90%
70 - 80%
60 - 70%
50 - 60%
0 - 50%0Subtype B′
95MM-yIDU106

100

Relative RT activity (%)

perfect matches
imperfect matchessiRNA vs. target sequence

Subtype B
pNL4-3(M19921)100

Relative RT activity (%)

AConservation among
HIV-1 group M

si505 77 %si509 84 %si510 84 %si512 85 %si515 85 %si521 94 %si554 68 %si575 68 %si689 88 %si690 69 %si764 88 %si770 88 %si1490 56 %si1817 82 %si2075 70 %si2329 77 %si2330 77 %si2333 77 %si2485 66 %si2486 66 %si3000 57 %si3005 60 %si3006 61 %si3011 47 %si4175 76 %si4373 49 %si4378 49 %si4652 64 %si4746 66 %si4750 74 %si4751 74 %si4753 71 %si4794 80 %si4806 72 %si4809 84 %si4840 60 %si4888 80 %si4960 69 %si4961 70 %si7653 67 %si7658 65 %siControl
vector only
no transfection

siRNA

Conservation
0

CRF01_AE
93JP-NH1(AB052995)

100

Relative RT activity (%)
0Target mRNA
cleavage assay

100

Relative target mRNA quantity (%)

本研究で設計した 41 種の siRNA の評価．いずれも siRNA0

第 1 章で述べた標的切断アッセイで評価した．

染性分子クローンで評価した．(B) siRNA 自体が備える標的切断活性を，の終濃度は 5 nM．(A) HIV-1 に対する増殖抑制効果を，4 種の HIV-1 感

Figure 2-4.

Subtype C
93IN101(AB023804)

100

Relative RT activity (%)

B

43

44

ついで，各 siRNA の HIV-1 に対する増殖抑制効果を，サブタイプ B, C, CRF01_AE 属する 4 種の HIV-1 感染性分子クローン（Table 2-2）で評価した．これら 3 種のサブタイプはアジア地域における HIV-1 流行の主要な原因となっており，また塩基配列のうえでは相互に隔たりのあるク
ラスタを形成している（Fig. 2-5, Takebe et al., 2003）．
本アッセイでは，それぞれの感染性分子クロー
ンを siRNA とともに HeLa 細胞に導入し，48 時間後に培地上清を回収して HIV-1 由来の逆転写酵素活性を測定することにより，ウイルスの増殖を評価した．その結果，各 siRNA を 5 nM で導入した場合，41 種の siRNA のうち 26 種がすべての HIV-1 株の増殖を 20% 以下に抑制した（Fig.
2-4A, 赤およびオレンジの丸印で表示）．残りの 15 種の siRNA のうち si4794/4888 を除く 13 種は，
標的切断アッセイにおいて活性が認められ（Fig. 2-4B），また si690/4794/4888 以外の 12 種は少な
くとも 1 種の HIV-1 株の増殖を 20% 以下に抑制していることから，それらの siRNA 自体は有効▲であると考えられた．しかし Fig. 2-4A において矢印（ ）で表示した HIV-1 株では，siRNA 配
列と標的配列との間に 1 塩基〜数塩基のミスマッチが存在するため（Fig. 2-6），それらの HIV-1株の増殖を抑制できなかった．一方，塩基の置換が siRNA の末端に近い場合には siRNA の効果が保持される場合があった（Fig. 2-4A, ＊で表示）．このように末端に近い位置においてミスマッチの影響が少ないという結果は，第 1 章で述べたオフターゲット効果の解析結果（Fig. 1-10,
1-11, 1-12）とおおむね一致した．また si689/690 については，siRNA 配列と標的配列とが完全に一致しているにもかかわらず HIV-1 の増殖を抑制できなかった（各感染性分子クローンの標的領域をシークエンスして配列が一致することを確認済み）．この領域は，HIV-1 の 5′ UTR がとりうる 2 種類の 2 次構造（Huthoﬀ et al., 2001），すなわち BMH（branched multiple hairpin; Fig. 2-7）とLDI（long distance interaction; Fig. 2-8）の両方において固く閉じており，siRNA が標的配列に接近することを妨げている可能性が示唆された．さらに，si575 の効果が pNL4-3 と 93IN101 とで異なる点が注目された．この理由は明らかでないが，ひとつの可能性として，各感染性分子クロー

F1

C
CIN

F2
K
H

08
07

J

G
A
B′
01AF

B
D

Figure 2-5.

01TH

01

HIV-1 グループ M の分子系統樹（Takebe et al., 2003 より作成）．

45

GGGAACCCACTGCTTAAGCCT
si505.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.................AG.C
93JP-NH1GACAGGCTAATTTTTTAGGGA
si2075.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.G...................
93IN101.....................
93JP-NH1AAGACAGCAGTACAAATGGCA
si4746.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

ACCCACTGCTTAA-GCCTCAAT
si509.............-........
pNL4-395MM-yIDU106 .............-........
.............-........
93IN101.............A........
93JP-NH1

CAGGAGCAGATGATACAGTAT
si2329.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

CAGCAGTACAAATGGCAGTAT
si4750.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

CCCACTGCTTAA-GCCTCAATA
si510............-.........
pNL4-395MM-yIDU106 ............-.........
............-.........
93IN101............A.........
93JP-NH1

AGGAGCAGATGATACAGTATT
si2330.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

AGCAGTACAAATGGCAGTATT
si4751.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

CACTGCTTAA-GCCTCAATAAA
si512..........-...........
pNL4-395MM-yIDU106 ..........-...........
..........-...........
93IN101..........A...........
93JP-NH1

AGCAGATGATACAGTATTAGA
si2333.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

CAGTACAAATGGCAGTATTCA
si4753.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101...................T.
93JP-NH1TGCTTAA-GCCTCAATAAAGCT
si515.......-..............
pNL4-395MM-yIDU106 .......-..............
.......-..............
93IN101.......A..............
93JP-NH1GACCTACACCTGTCAACATAA
si2485.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
....C......A.........
93IN101.....................
93JP-NH1GGGGGGATTGGGGGGTACAGT
si4794.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .............AC...T..
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

AGCCTCAATAAAGCTTGCCTT
si521.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

ACCTACACCTGTCAACATAAT
si2486.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
...C......A..........
93IN101.....................
93JP-NH1

GGGTACAGTGCAGGGGAAAGA
si4806.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .AC...T..............
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

TAGTGTGTGCCCGTCTGTTGT
si554.....................
pNL4-395MM-yIDU106 ....A................
C...............A....
93IN101.G................GT.
93JP-NH1CAGGGATGGAAAGGATCACCA
si3000.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

TACAGTGCAGGGGAAAGAATA
si4809.....................
pNL4-395MM-yIDU106 ...T.................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1GTGACTCTGGTAACTAGAGAT
si575.....................
pNL4-395MM-yIDU106 ............G........
.....................
93IN101
AG...................
93JP-NH1ATGGAAAGGATCACCAGCAAT
si3005.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

TAGCAACAGACATACAAACTA
si4840.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

ACGCAGGACTCGGCTTGCTGA
si689.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1TGGAAAGGATCACCAGCAATA
si3006.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

TTCAAAATTTTCGGGTTTATT
si4888.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1CGCAGGACTCGGCTTGCTGAA
si690.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101....................G
93JP-NH1

AGGATCACCAGCAATATTCCA
si3011.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

AAGGTGAAGGGGCAGTAGTAA
si4960.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1GACTAGCGGAGGCTAGAAGGA
si764.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1TGGAGGAAATGAACAAGTAGA
si4175.....................
pNL4-395MM-yIDU106 ......G.........A....
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

AGGTGAAGGGGCAGTAGTAAT
si4961.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1CGGAGGCTAGAAGGAGAGAGA
si770.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1

AGCCATGCATGGACAAGTAGA
si4373.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1GACAATTGGAGAAGTGAATTA
si7653.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1GTGACATAGCAGGAACTACTA
si1490.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1TGCATGGACAAGTAGACTGTA
si4378.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1TTGGAGAAGTGAATTATATAA
si7658.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101.....................
93JP-NH1TAGAAGAAATGATGACAGCAT
si1817.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.......G.............
93IN101.....................
93JP-NH1TCCCTACAATCCCCAAAGTCA
si4652.....................
pNL4-395MM-yIDU106 .....................
.....................
93IN101
C....................
93JP-NH1

Figure 2-6.

本研究で評価した 41 種の siRNA 配列と，各感染性分子クローンの標的配列とのアライメント．siRNA 配列はアンチセンス鎖の 21 塩基に対応するセンス側の配列を示した．
いずれも RNA 分子であるが，塩基配列は GenBank に収録された各データにあわせ A, T, G, Cの 4 文字を用いて記載した．

46

U U U
U
A
C
C –G
C –U A
A GG
A –C
G
A C
G
G
A
U
G
A
A – –G U
C
C
C
C
G
–
A
C
U –G A
C
G
C
G G
U
A
C
U
G
C
G
G
–A
C
A
A
si515 C UA –UC
GA
C – G si512
U
G – –U
A
G– C
A –C
G C U
G
G
U
G
A–U
si521
A
U
C
A – –A A–
GUG C
U –G C
A
G
A
C
C
A
A
A
C
A
U A–U
G G
A A G
A
C
U
G– C
U–A
si510
A–U
A–U
G– C
C G C
C –G
A–U
G– C
C – G si509
C –G
G
G
A
U–A
U–A
C
A
G– C
C –G
C–G
A
A
U
A–U
–A
U
–
–
–
U A
C G
G C
A G
C–G
U–A
G– C
U –G
C
G
A
GAG U
G– C
C –G
A–U
A
G
U
G– U
C –G
G– C
A–U
CUC C
si770
G
G
C
U
U – A si505
G– C
U–A
G G
C –G
U –G
U–A
U–A
U–A
G A
si575 U – A si689
U –G
G– U
C –G
C –G A
U–A
G
G
C –G
G– C A
G– C
C –G
A–U
G
si554
G
U–A
A
C –G
G– U
U–G
G
–
–
–
C
G
C
G– U G
G
C
G
C
U–A
si690
G– C
si764 A – U
U–A
C –G
U–A
C –G
C –G
U–A
G–C
U–A
A–U
G– C
U–A
A–U
G– C
C –G
G– U
C –G
G– C
U–G
C–G
5′ endAAAAA UUUUGAAAGGAGAGAAAGCGGUGUGC C CGU C UGA
G G G C

BMH

PBS

TAR

poly A

DIS

SD

AUG

–
–
–

PAS

Figure 2-7.

BMI（branched multiple hairpin）型の 2 次構造．本研究で評価した siRNA の標的部位を示した．

ンで標的部分の 2 次構造に差異があり siRNA の接近のしやすさが異なるのかも知れない．このような 2 次構造の影響を検討するひとつの方法として，5′ UTR 配列の全体を pTREC に挿入した
コンストラクトを構築し，標的切断アッセイをおこなう方法が有効と考えられる．
本研究で構築した抗ウイルス siRNA 設計法により，HIV-1 の高度な多様性に対応しうる siRNAを高い確率で設計できた．本研究で実際に評価をおこなった siRNA のうち，保存度が 70% 以上であり，かつウイルス増殖を 10% 以下に抑制できた siRNA は，・si521（ポリ A シグナルを標的とする ; 保存度 94%）
・si764/770（Ψ; 88%）
・si510（TAR- ポリ A シグナル ; 84%）
・si2075（ribosomal slip site; 70%）・si2329/2330/2333（プロテアーゼ ; 77%）
・si4750/4751/4753（インテグラーゼ ; 71-74%）であった．しかしながら，1 種の siRNA 単独でデータベースに登録された全 HIV-1 を標的とすることは不可能であった（Fig. 2-9A）．これを克服するひとつの方法は，標的が異なる複数のsiRNA を同時に用いることであろう．本研究で設計し検証をおこなった siRNA は，2 種を組み合わせて同時に用いることにより 99% 以上の HIV-1 に対応可能である（Fig. 2-9B）．また本研究で構築した抗ウイルス siRNA 設計法は，HIV-1 のみならず，高い多様性をもつ HCV，インフルエ
ンザウイルス，SARS コロナウイルス等にも応用できると考えられる．

47

U U U
U
A
C
C –G
C –U A
A GG
A –C
G
A C
G
G
A
U
–
G
A
A –G UCCCCGC
U – –G A A
C
G
C
U
A
C
C
G
G
C U –AUAG
A – –C
A
U
G –U
A
A –C
G
G
G –U
C
A –A AG
U –G C
A
C
A
G A
A
G
G
A A
A
U–A
G– C
G– C
U–A
C–G
U–A
C–G

PBS

LDI

PAS

si575

A

G

G

A

U –G
G– C U
U

C
U
UC

G– C
U –G
U–A
G– C GCU –G A
C –G
U–A
G– C UCC –G C
C –G
–
UG C
U
G
U G– U
U –G
–
si554
AG C
U
G
G G
A A–U
U
G
C – G si689
C
A
U–A
C –G
U–A
G– C
C – G si690
A–U
G– C
–C
G
U –G
U
G– C
C
A
G
U A–U
G– C
si521
G– C
U–A
A–U
U
C
C –G
C –G
C –G
C –G
si515
A
G– C
G – C si512
U–A
A–U
U–A
U–A
A G C
A G
U–A
A
G
A
G– C
G U
A
–G
G– U
C
si770
G
G
U A A C –G
U–A
G– C
U –G
U–A
C – G si510
U–A
G A
U –G
G– U
C –G
C –G
G
G
C – G si505
G– C A
A–U
C –G
U–A
A
C –G
G– C
A
si509
–C
–C
C
G– U G
G
G
G
A U–A
si764 A – U
U–A
U–A
C –G
G– C
A–U
U–A
U –G
G–C
G– C
C –G
G– U
G–C
C–G
5′ endAAAAAUUUUGAAAGGAGAGAAAGCGC A C U G
G G C

TAR

DIS

poly ASD

Figure 2-8.

AUG

LDI（long distance interaction）型の 2 次構造．本研究で評価した siRNA の標的部位を示した．

48

A
Single siRNA
si521
si770
si689
si764
si512
si515
si509
si510
si4809si1817
si4888si4794si2330si505
si2329si2333si4175
si4750si4751si4806
si4753si2075
si4961
si4960
si690
si554
si575
si7653si2485si2486
si4746
si7658si4652si3006si3005
si4840si3000si1490si4378si4373si30110

1020

Coverage in HIV-1 group M (%)
30
40
50
60
70

80

90

100

0

10

20

Coverage in HIV-1 group M (%)
30
40
50
60
70

80

90

100

94.2%
88.6%
88.2%
88.0%
85.4%
85.3%
84.9%
84.9%
84.4%
82.3%
80.6%
80.4%
77.9%
77.8%
77.7%
77.3%
76.5%
74.1%
74.1%
72.3%
71.5%
70.6%
70.1%
69.8%
69.2%
68.1%
68.1%
67.0%
66.8%
66.8%
66.4%
65.4%
64.6%
61.3%
60.3%
60.0%
57.2%
56.4%
49.8%
49.0%
47.9%

B
Combining two siRNAs
si509 + si4888
si510 + si4888
si512 + si4888
si515 + si4888
si509 + si1817
si510 + si1817
si512 + si1817
si509 + si689
si510 + si689
si512 + si689
si515 + si689
si521 + si689
si521 + si4888
si689 + si764
si689 + si770
si515 + si1817
si521 + si770
si521 + si1817
si521 + si4652
si521 + si764
si689 + si1817
si764 + si1817
si521 + si1490
si521 + si2485
si521 + si2486
si521 + si4175
si521 + si4794
si521 + si554
si689 + si4809
si689 + si7653
si689 + si7658
si764 + si4888
si770 + si1817
si509 + si2075
si510 + si2075
si512 + si2075
si512 + si770
si515 + si770
si521 + si2075
si521 + si2329
si521 + si2330
si521 + si2333
si521 + si3000
si521 + si3006
si521 + si4746
si521 + si4750
si521 + si4751
si521 + si4753
si521 + si4806
si521 + si4809

Figure 2-9.

99.6%
99.6%
99.6%
99.6%
99.2%
99.2%
99.2%
99.1%
99.1%
99.1%
99.1%
99.1%
99.1%
98.9%
98.9%
98.8%
98.7%
98.7%
98.7%
98.6%
98.5%
98.5%
98.3%
98.3%
98.3%
98.3%
98.3%
98.2%
98.2%
98.2%
98.2%
98.2%
98.2%
98.0%
98.0%
98.0%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%
97.9%

(A) 本研究で評価した 41 種の siRNA を単独で使用した場合に標的とすることが可能な HIV-1 の割合．各 siRNA 配列の保存度に等しい．(B) 本研究で評価した 41 種の siRNAから 2 つを選択して同時に使用した場合に標的とすることが可能な HIV-1 の割合．

49

1-3. 抗ウイルス siRNA 設計システムの構築
以上に述べた結果に基づき，(1) ウイルス配列の中で保存度が高く，(2) 哺乳類細胞に有効で，(3) オフターゲット効果の少ない siRNA を設計するシステムを構築した．特に，HIV-1，HCV，
A 型インフルエンザウイルス，SARS コロナウイルスを標的とする抗ウイルス siRNA 設計システ
siVirus ウェブサーバ（http://siVirus.RNAi.jp/）として公開した（Naito et al., 2006）．siVirus ウェ
ムを，
ブサーバの概略は下記のとおりである．

▲

トップページ（Fig. 2-10）
HIV-1，HCV，A 型インフルエンザウイルス，SARS コロナウイルスから，siRNA を設計する

ウイルスを選択する．各ウイルスの配列はそれぞれ下記のデータベースより入手した．
・Los Alamos HIV Sequence Database（http://www.hiv.lanl.gov/）
・Los Alamos HCV Sequence Database（Kuiken et al., 2005; http://hcv.lanl.gov/）
・NCBI Inﬂuenza Virus Sequence Database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html）
・GenBank（Benson et al., 2007）より SARS コロナウイルスのゲノム 126 種を入手．

Figure 2-10.

siVirus ウェブサーバ（http://siVirus.RNAi.jp/）のトップページ．

50▲

ウイルス配列の選択画面（Fig. 2-11）
保存度の計算に用いるウイルス配列の母集団を選択する．特定のサブタイプやサンプリング

国に絞って保存度を求めることにより，そのサブタイプや地域でもっとも保存度の高い siRNAを設計できる（Fig. 2-11A）．サブタイプや地域を限定する必要のないときは，単にすべての配列を選択して siRNA 設計をおこなってもよい．ウイルス配列の選択は，チェックボックスによる
ほか，アクセッション番号のリストをテキスト形式で与えることもできる（Fig. 2-12）．最下部のオプションでは，siRNA の標的遺伝子または標的とする領域の範囲を指定できるほか，ユー
ザ独自のウイルス配列を FASTA フォーマットで入力できる（Fig. 2-11B）．

A

B

Figure 2-11.

siVirus による，HIV-1 を標的とする siRNA の設計画面の例．(A) ウイルス配列の選択画面および (B) オプション指定画面．

51

Figure 2-12.

siVirus による，HIV-1 を標的とする siRNA の設計画面の例．ウイルス配列の選

択は，チェックボックスによるほか，アクセッション番号のリストをテキスト形式で与える
こともできる．

▲siRNA 設計結果の表示（Fig. 2-13）
ウイルス配列を選択したのち submit ボタンを押下すれば，直ちに結果が表示される（Fig.

2-13）．通常，Ui-Tei，Reynolds，または Amarzguioui の siRNA 設計法にしたがう，哺乳類細胞で有効と予測された siRNA のみが保存度の高い順番に表示される．結果の表示画面には下記の項
目が表示される．
・siRNA target site（siRNA の標的配列およびウイルスゲノムにおける位置）
・siRNA eﬃcacy prediction（哺乳類細胞における有効性の予測）- Ui-Tei（Ui-Tei et al., 2004 の siRNA 設計法を満たす場合に yes と表示）
- Reynolds（Reynolds et al., 2004 の siRNA 設計法を満たす場合に yes と表示）
- Amarzguioui（Amarzguioui et al., 2004 の siRNA 設計法を満たす場合に yes と表示）・≤ 2 mismatch oﬀ-target hits（2 ミスマッチ以内で相同なヒト遺伝子の数）・Conservation in the selected sequences（選択した配列における保存度）
なお，≤ 2 mismatch oﬀ-target hits の [detail] を押下すると，各 siRNA 配列と 3 ミスマッチ以内で相同なヒト遺伝子の一覧が表示される（Fig. 2-14）．この機能は第 1 章で述べた siDirect ウェブサー
バにより実現している．

52

Figure 2-13.

siVirus による siRNA の設計結果．HIV-1 のサブタイプ B, C, CRF01_AE の合計

182 種を選択して siRNA 設計をおこなった例．

Figure 2-14.

各 siRNA 配列と 3 ミスマッチ以内で相同なヒト遺伝子の一覧．

53

2. 方

法

2-1. siRNA
化 学 合 成 の siRNA は，2 本 鎖 に ア ニ ー リ ン グ さ れ た も の を RNAi 社（ 東 京 ） よ り 購 入 した．siRNA の配列は Figure 2-3 に示した．各 siRNA の名称は，HIV-1 ゲノム（HXB2; GenBank:
K03455）における標的部位の座標に対応している．siControl は，Ui-Tei らのガイドライン（Ui-Tei
et al., 2004）を満たし，かつ，ヒトの全転写産物に 3 ミスマッチ以内で相同な配列が存在しない
ネガティブコントロールである．
2-2. 細胞の培養およびトランスフェクション
細胞の培養およびトランスフェクションは，第 1 章の方法にしたがった．
2-3. 標的切断アッセイ
第 1 章で構築した pTREC ベクターの EcoRI 部位と XhoI 部位との間に，各 siRNA の標的配列を挿入した．ベクターに挿入した標的配列部分はすべてシークエンスの確認をおこなった．各
コンストラクトの構築に使用した DNA オリゴヌクレオチドの配列を Table 2-1 に示した．各コ
ンストラクト（0.5 µg/well）を siRNA（終濃度 5 nM）とともに HeLa 細胞に導入し，24 時間後に
RNeasy 96（Qiagen 社）で細胞を回収した．その他は第 1 章の方法にしたがった．
2-4. HIV-1 逆転写酵素活性の測定
Table 2-2 に示した各 HIV-1 感染性分子クローンを siRNA（終濃度 5 nM）とともに HeLa 細胞に導入し，48 時間後に培地上清を回収した．ついで，HIV-1 に由来する逆転写酵素活性を Willey
らの方法（Willey et al., 1988）にしたがって測定した．
2-5. siVirus ウェブサーバの構築
siVirus ウェブサーバは，Mac OS X が稼働する PowerMac G5 Dual 2GHz 主記憶 6GB（Apple 社）
1 台の上に構築した．ユーザの要求に対して高速に応答できるよう，あらかじめ全ウイルス配列を構成する 21-mer をすべて生成し，そのひとつひとつの 21-mer がどのウイルス配列と完全一致するかを求め，データベース化した．このデータベースを参照し，ユーザが選択したウイ
ルス配列の組み合わせにおいて保存度が高い 21-mer を短時間で求めるプログラム（siVirus core）
を作成した．また，2 ミスマッチ以内で相同なヒト遺伝子の数を，あらかじめ siDirect（Naito,
Yamada et al., 2004）で算出してデータベース化した．
2-6. 共同研究に関する事項
Figure 2-4B の初期のデータについて，HeLa 細胞へのトランスフェクションは東京大学の程 久美子博士がおこなった．

54

HIV-1 の増殖実験および逆転写酵素活性の測定（Fig. 2-4A）は，国立感染症研究所の武部 豊博士，
納冨 香子氏，小野木 利成氏がおこない，著者が主体となって分析および検証をおこなった．
siVirus core の仕様は著者が決定し，実装は東京大学の西川 徹氏がおこなった．なお，ウェブサー
バ全体の実装は著者がおこなった．

pTREC constructpTREC-0505
pTREC-0521
pTREC-0554
pTREC-0575
pTREC-0689
pTREC-0764
pTREC-1490
pTREC-1817
pTREC-2075
pTREC-2323
pTREC-2482
pTREC-2999
pTREC-4175
pTREC-4373
pTREC-4652
pTREC-4746
pTREC-4746
pTREC-4794
pTREC-4840
pTREC-4888
pTREC-4959
pTREC-7653
pTREC-7658

Table 2-1.

Inserted DNA oligonucleotide duplex

siRNAs assayed5’-AATTCGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAC-3’
3’-GCCCTTGGGTGACGAATTCGGAGTTATTTCGAACGGAACTGAGCT-5’5’-AATTCAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAC-3’3’-GTCGGAGTTATTTCGAACGGAACTGAGCT-5’5’-AATTCTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACC-3’3’-GATCACACACGGGCAGACAACACACTGAGACCATTGGAGCT-5’5’-AATTCGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCC-3’
3’-GCACTGAGACCATTGATCTCTAGGGAGCT-5’5’-AATTCACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCC-3’
3’-GTGCGTCCTGAGCCGAACGACTTCGGAGCT-5’5’-AATTCGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGC-3’
3’-GCTGATCGCCTCCGATCTTCCTCTCTCTACGAGCT-5’5’-AATTCGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACC-3’
3’-GCACTGTATCGTCCTTGATGATCATGGAGCT-5’5’-AATTCTAGAAGAAATGATGACAGCATGTC-3’
3’-GATCTTCTTTACTACTGTCGTACAGAGCT-5’5’-AATTCGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAGC-3’
3’-GCTGTCCGATTAAAAAATCCCTTCGAGCT-5’5’-AATTCTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGC-3’3’-GATCTATGTCCTCGTCTACTATGTCATAATCTTCGAGCT-5’5’-AATTCTAGGACCTACACCTGTCAACATAATTGGAAGAAATCTC-3’
3’-GATCCTGGATGTGGACAGTTGTATTAACCTTCTTTAGAGAGCT-5’5’-AATTCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAAAC-3’3’-GTGTCCCTACCTTTCCTAGTGGTCGTTATAAGGTTTGAGCT-5’5’-AATTCTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATC-3’
3’-GACCTCCTTTACTTGTTCATCTATTTAGAGCT-5’5’-AATTCAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTC-3’
3’-GTCGGTACGTACCTGTTCATCTGACATCAGAGCT-5’5’-AATTCTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGC-3’3’-GAGGGATGTTAGGGGTTTCAGTTCGAGCT-5’5’-AATTCAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCAC-3’3’-GTTCTGTCGTCATGTTTACCGTCATAAGTGAGCT-5’5’-AATTCAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCC-3’
3’-GTTCTGTCGTCATGTTTACCGTCATAAGTAGGAGCT-5’5’-AATTCGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTC-3’
3’-GCCCCCCTAACCCCCCATGTCACGTCCCCTTTCTTATCAGAGCT-5’5’-AATTCTAGCAACAGACATACAAACTAAAC-3’3’-GATCGTTGTCTGTATGTTTGATTTGAGCT-5’5’-AATTCTTCAAAATTTTCGGGTTTATTACC-3’3’-GAAGTTTTAAAAGCCCAAATAATGGAGCT-5’5’-AATTCAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTC-3’
3’-GTTTCCACTTCCCCGTCATCATTATGTTCTATTATCAGAGCT-5’5’-AATTCGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGC-3’
3’-GCTGTTAACCTCTTCACTTAATATATTTATATTTCGAGCT-5’5’-AATTCTTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGC-3’3’-GAACCTCTTCACTTAATATATTTATATTTCGAGCT-5’

si505/509/510/512/515
si521
si554
si575
si689/690
si764/770
si1490si1817si2075si2329/2330/2333
si2485/2486
si3000/3005/3006/3011
si4175si4373/4378
si4652
si4746/4750/4751
si4753si4794/4806/4809
si4840si4888si4960/4961
si7653si7658

抗 HIV-1 siRNA の標的切断アッセイのために構築した pTREC コンストラクトの一覧．挿入した DNA オリゴヌクレオチドの配列中，siRNA の標的部分を影付で示した．

Molecular clone

Subtype/CRF

導入した量

M19921subtype B

0.2 µg/well

Takebe, Y. et al.
(unpublished)subtype B′

1.0 µg/well

93IN101

AB023804

subtype C

1.0 µg/well

93JP-NH1

AB052995

CRF01_AE

1.0 µg/well

pNL4-395MM-yIDU106

Table 2-2.

AccessionsiRNA の評価に使用した HIV-1 感染性分子クローンの概要．

57

■

文

献

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65

Table S1
siRNA namesiFL-5*siFL-6*siFL-12*siFL-14*siFL-18*siFL-24*siFL-29siFL-30*siFL-31siFL-33
siFL-34
siFL-35
siFL-36*siFL-37
siFL-40siFL-42*siFL-47siFL-48*
siFL-49siFL-53siFL-54*
siFL-55
siFL-179
siFL-184*
siFL-257
siFL-265*
siFL-272*
siFL-295*
siFL-296
siFL-309*
siFL-329
siFL-370
siFL-387
siFL-411*
siFL-412
siFL-421
siFL-423
siFL-428*
siFL-431
siFL-507
siFL-515*
siFL-575
siFL-583
siFL-630
siFL-655
siFL-658*
siFL-694
siFL-695*
siFL-721
siFL-734*
siFL-749
siFL-750
siFL-758
siFL-765
siFL-766
siFL-767
siFL-768
siFL-769
siFL-770
siFL-771

1/2
Sense strand
GACGCCAAAAACAUAAAGAAA
ACGCCAAAAACAUAAAGAAAGAAAACAUAAAGAAAGGCCCGG
AACAUAAAGAAAGGCCCGGCGUAAAGAAAGGCCCGGCGCCAUAAGGCCCGGCGCCAUUCUAUC
CCGGCGCCAUUCUAUCCGCUG
CGGCGCCAUUCUAUCCGCUGG
GGCGCCAUUCUAUCCGCUGGACGCCAUUCUAUCCGCUGGAAGGCCAUUCUAUCCGCUGGAAGACCAUUCUAUCCGCUGGAAGAUCAUUCUAUCCGCUGGAAGAUGAUUCUAUCCGCUGGAAGAUGGCUAUCCGCUGGAAGAUGGAACAUCCGCUGGAAGAUGGAACCG
CUGGAAGAUGGAACCGCUGGAUGGAAGAUGGAACCGCUGGAGGGAAGAUGGAACCGCUGGAGAGAUGGAACCGCUGGAGAGCAAAUGGAACCGCUGGAGAGCAACUGGAACCGCUGGAGAGCAACUGUUCGGUUGGCAGAAGCUAUGGUUGGCAGAAGCUAUGAAACGCAAUUCUUUAUGCCGGUGUUGUAUGCCGGUGUUGGGCGCGUU
GUGUUGGGCGCGUUAUUUAUCAGUUGCAGUUGCGCCCGCGAAGUUGCAGUUGCGCCCGCGAAC
CCGCGAACGACAUUUAUAAUGGAACGUGAAUUGCUCAACAGUCGUGGUGUUCGUUUCCAAAAAAAAAGGGGUUGCAAAAAAUUUACGUGCAAAAAAAGCUCCCAACGUGCAAAAAAAGCUCCCAAUAAAGCUCCCAAUCAUCCAAAAAGCUCCCAAUCAUCCAAAAAACCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAUCAUCCAAAAAAUUAUUAUCCUCAUCUACCUCCCGGUUUUACCUCCCGGUUUUAAUGAAUAC
GCACUGAUCAUGAACUCCUCUCAUGAACUCCUCUGGAUCUAC
CUCAUAGAACUGCCUGCGUGACUCGCAUGCCAGAGAUCCUAUGCAUGCCAGAGAUCCUAUUUUUCCGGAUACUGCGAUUUUAAGCCGGAUACUGCGAUUUUAAGU
UCCAUUCCAUCACGGUUUUGGGGUUUUGGAAUGUUUACUACAACUACACUCGGAUAUUUGAUACUACACUCGGAUAUUUGAUAUGGAUAUUUGAUAUGUGGAUUUUGAUAUGUGGAUUUCGAGUCGGAUAUGUGGAUUUCGAGUCGUAUAUGUGGAUUUCGAGUCGUCUAUGUGGAUUUCGAGUCGUCUAUGUGGAUUUCGAGUCGUCUUUGUGGAUUUCGAGUCGUCUUAGUGGAUUUCGAGUCGUCUUAA

Antisense strand
UCUUUAUGUUUUUGGCGUCUUUUCUUUAUGUUUUUGGCGUCUGGGCCUUUCUUUAUGUUUUUG
CCGGGCCUUUCUUUAUGUUUUGGCGCCGGGCCUUUCUUUAUGUAGAAUGGCGCCGGGCCUUUCGCGGAUAGAAUGGCGCCGGGC
AGCGGAUAGAAUGGCGCCGGG
CAGCGGAUAGAAUGGCGCCGGUCCAGCGGAUAGAAUGGCGCCUUCCAGCGGAUAGAAUGGCGC
CUUCCAGCGGAUAGAAUGGCGUCUUCCAGCGGAUAGAAUGGC
AUCUUCCAGCGGAUAGAAUGGUCCAUCUUCCAGCGGAUAGAAGUUCCAUCUUCCAGCGGAUAGCAGCGGUUCCAUCUUCCAGCG
CCAGCGGUUCCAUCUUCCAGC
UCCAGCGGUUCCAUCUUCCAGGCUCUCCAGCGGUUCCAUCUUUGCUCUCCAGCGGUUCCAUCUUUGCUCUCCAGCGGUUCCAUCUAGCUUCUGCCAACCGAACGGUUUCAUAGCUUCUGCCAACCG
ACACCGGCAUAAAGAAUUGAACGCGCCCAACACCGGCAUAAA
UAAAUAACGCGCCCAACACCG
CGCGGGCGCAACUGCAACUCCUCGCGGGCGCAACUGCAACUCUUAUAAAUGUCGUUCGCGGGCUGUUGAGCAAUUCACGUUCAUUUUGGAAACGAACACCACGGUAUUUUUUGCAACCCCUUUUUGGGGAGCUUUUUUUGCACGUUCUGGGAGCUUUUUUUGCACGUUUUGGAUGAUUGGGAGCUUUUUUUUUGGAUGAUUGGGAGCUUUUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGAUAAUAAUUUUUUGGAUGAUUGAAACCGGGAGGUAGAUGAGAUAUUCAUUAAAACCGGGAGGUA
AGGAGUUCAUGAUCAGUGCAAAGAUCCAGAGGAGUUCAUGAUACGCAGGCAGUUCUAUGAGGC
AGGAUCUCUGGCAUGCGAGAAAAUAGGAUCUCUGGCAUGCGAUAAAAUCGCAGUAUCCGGAAUUUAAAAUCGCAGUAUCCGGAAAAAACCGUGAUGGAAUGGAACUAGUAAACAUUCCAAAACCGUUCAAAUAUCCGAGUGUAGUAA
AUCAAAUAUCCGAGUGUAGUAAUCCACAUAUCAAAUAUCCGAACUCGAAAUCCACAUAUCAAAGACUCGAAAUCCACAUAUCAACGACUCGAAAUCCACAUAUCAACGACUCGAAAUCCACAUAUCGACGACUCGAAAUCCACAUAUAGACGACUCGAAAUCCACAUAAAGACGACUCGAAAUCCACAU

siRNA efficacy prediction
Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui
yes
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yes

Relative luc
activity (%)
17
7
93
81
93
83
47
54
22
14
31
18
11
44
9
87
17
81
8
17
64
9
5
6
53
75
13
68
23
6
7
3
5
72
9
21
17
4
63
13
25
9
26
39
5
5
2
5
12
6
3
8
2
19
50
38
25
14
13
2

66

Table S1
siRNA namesiFL-772
siFL-773
siFL-774*
siFL-775
siFL-776
siFL-777siFL-778
siFL-779
siFL-780
siFL-781
siFL-782
siFL-783
siFL-857
siFL-891*
siFL-903
siFL-904*
siFL-998
siFL-1044*
siFL-1048
siFL-1054
siFL-1063
siFL-1064*
siFL-1065
siFL-1074
siFL-1075*
siFL-1076
siFL-1081
siFL-1085*
siFL-1110
siFL-1111
siFL-1120
siFL-1137
siFL-1186*
siFL-1190
siFL-1228
siFL-1234
siFL-1308*
siFL-1346
siFL-1352
siFL-1429
siFL-1430*
siFL-1431
siFL-1431
siFL-1439*
siFL-1440*
siFL-1441*
siFL-1482
siFL-1509
siFL-1512
siFL-1522
siFL-1539
siFL-1565
siFL-1586
siFL-1601

2/2
Sense strand
UGGAUUUCGAGUCGUCUUAAUGGAUUUCGAGUCGUCUUAAUGGAUUUCGAGUCGUCUUAAUGUAUUUCGAGUCGUCUUAAUGUAUUUCGAGUCGUCUUAAUGUAUUUCGAGUCGUCUUAAUGUAUAUCGAGUCGUCUUAAUGUAUAGCGAGUCGUCUUAAUGUAUAGAGAGUCGUCUUAAUGUAUAGAUAGUCGUCUUAAUGUAUAGAUUGUCGUCUUAAUGUAUAGAUUUUCGUCUUAAUGUAUAGAUUUGCUGGUGCCAACCCUAUUCUCCGCACUCUGAUUGACAAAUACG
ACAAAUACGAUUUAUCUAAUUCAAAUACGAUUUAUCUAAUUU
CCAGGUAUCAGGCAAGGAUAUUUCUGAUUACACCCGAGGGGGGAUUACACCCGAGGGGGAUGAACCCGAGGGGGAUGAUAAACCGGAUGAUAAACCGGGCGCGGUGAUGAUAAACCGGGCGCGGUCAUGAUAAACCGGGCGCGGUCGCGGGCGCGGUCGGUAAAGUUG
GGGCGCGGUCGGUAAAGUUGU
GGCGCGGUCGGUAAAGUUGUUGGUCGGUAAAGUUGUUCCAUUGGUAAAGUUGUUCCAUUUUUUCGAAGGUUGUGGAUCUGGAUAGAAGGUUGUGGAUCUGGAUAC
GGAUCUGGAUACCGGGAAAAC
AAACGCUGGGCGUUAAUCAAAGAUUAUGUCCGGUUAUGUAAAAUGUCCGGUUAUGUAAACAAUCUUGAUUGACAAGGAUGGAUGUGACAAGGAUGGAUGGCUACAGCCUGAAGUCUCUGAUUAAGU
GCUCCCGCUGAAUUGGAAUCCGCUGAAUUGGAAUCCAUCUUGCGGUGAACUUCCCGCCGCCGUGGUGAACUUCCCGCCGCCGUUGUGAACUUCCCGCCGCCGUUGGUGAACUUCCCGCCGCCGUUG
CCCGCCGCCGUUGUUGUUUUG
CCGCCGCCGUUGUUGUUUUGG
CGCCGCCGUUGUUGUUUUGGAAAAAAGAGAUCGUGGAUUACGGUCAAGUAACAACCGCGAAAAAAGUAACAACCGCGAAAAAGUCGCGAAAAAGUUGCGCGGAGGGAGGAGUUGUGUUUGUGGACGCCGAAAGGUCUUACCGGAAAACUCGACGCAAGAAAAAUCAGAAUCAGAGAGAUCCUCAUAAAG

Antisense strand
UAAGACGACUCGAAAUCCACAUUAAGACGACUCGAAAUCCACAUUAAGACGACUCGAAAUCCACAUUAAGACGACUCGAAAUCCACAUUAAGACGACUCGAAAUC
UACAUUAAGACGACUCGAAAUAUACAUUAAGACGACUCGAAAUAUACAUUAAGACGACUCGAACUAUACAUUAAGACGACUCGAUCUAUACAUUAAGACGACUCGAUCUAUACAUUAAGACGACUCAAUCUAUACAUUAAGACGACU
AGAAUAGGGUUGGCACCAGCAUAUUUGUCAAUCAGAGUGCUUUUAGAUAAAUCGUAUUUGUCAAUUAGAUAAAUCGUAUUUGUC
AUCCUUGCCUGAUACCUGGCA
CCCUCGGGUGUAAUCAGAAUAAUCCCCCUCGGGUGUAAUCAGUUUAUCAUCCCCCUCGGGUGUCGCGCCCGGUUUAUCAUCCCC
CCGCGCCCGGUUUAUCAUCCC
ACCGCGCCCGGUUUAUCAUCCACUUUACCGACCGCGCCCGGU
AACUUUACCGACCGCGCCCGG
CAACUUUACCGACCGCGCCCGUGGAACAACUUUACCGACCGCAAAAUGGAACAACUUUACCGAUCCAGAUCCACAACCUUCGCUAUCCAGAUCCACAACCUUCGCUUUCCCGGUAUCCAGAUCCACUGAUUAACGCCCAGCGUUUUCUACAUAACCGGACAUAAUCAUUGUUUACAUAACCGGACAUAAUCCAUCCUUGUCAAUCAAGGC
UAGCCAUCCAUCCUUGUCAAUUUAAUCAGAGACUUCAGGCGG
AUUCCAAUUCAGCGGGAGCCA
AGAUGGAUUCCAAUUCAGCGG
GGCGGCGGGAAGUUCACCGGC
CGGCGGCGGGAAGUUCACCGG
ACGGCGGCGGGAAGUUCACCG
ACGGCGGCGGGAAGUUCACCG
AAACAACAACGGCGGCGGGAAAAAACAACAACGGCGGCGGGACAAAACAACAACGGCGGCGGG
UAAUCCACGAUCUCUUUUUCCUUCGCGGUUGUUACUUGACUGUUUUUCGCGGUUGUUACUUGAUCCGCGCAACUUUUUCGCGGUUCCACAAACACAACUCCUCCGUUCCGGUAAGACCUUUCGGUAUGAUUUUUCUUGCGUCGAGUUUUAUGAGGAUCUCUCUGAUUUsiRNA efficacy prediction
Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui
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Relative luc
activity (%)
3
3
1
37
31
7
15
1
3
35
54
6
24
5
14
13
5
75
6
10
6
46
15
5
8
3
2
5
1
4
6
13
2
103
26
3
4
3
11
21
82
16
18
62
33
41
3
42
12
56
2
12
12
6

67

Table S2

1/10
Accession
Name
AF193275
97BL006
AF457052
KER2008
AF457053
KER2009
AF457055
KER2012
AF457068
KNH1207
AF457069
KNH1209
AF457070
KNH1211
AF457077
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1999
-

68

Table S2

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1984
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69

Table S2

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1996
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1998
1998
1998
1998
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1999

70

Table S2

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ZA

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1993
1993
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1998
1998
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1999
1999
1999
1999
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2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000

71

Table S2

5/10
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F1
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ZM
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2000
2000
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1998
1998
1998
1998
1998
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1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1998
1999
1999
1993
1989
1989

72

Table S2

6/10
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CM
CM
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CM
CM
CM
CM
CM
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1993
1996
2002
1995
1995
1997
1996
2001
2000
1999
1993
1992
1993
1993
1993
1990
1993
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1996
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1990
1990
1997
1997
1993
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1990
1990
1993
1993
1993
1993
1995
1995
1997
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2001
2002
2002

73

Table S2

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GR
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BE
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ML
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CN
CN
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SN
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2002
2002
2002
2002
2002
2002
2002
2002
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1997
1997
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1991
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1998
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1997
1998
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1995
1995
1997
1997
1997
1998
1997
1997
1997
1998
1996
1995
1995
1999
1996
1996
1996
2001

74

Table S2

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CM
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CM
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FR
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UY
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ES
ES
ES
ES
ES
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TH
TH
TH
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IN
KE
KE
KE
KE
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TZ
TZ
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UG
UG
KE
KE
KE
KE
KE
SE
SE
TZ
TZ

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2001
2002
2002
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1999
1999
1997
1997
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1999
1999
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1996
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2000
2000
2000
1999
1999
2002
2002
1999
1999
1997
1995
2000
2000
1995
1999
1992
1996
1997
1997
1997
1997
1999
1999
2000
2000
2000
1999
1999
1993
1994
1996
1997

75

Table S2

9/10
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BF
BF
BF
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BF
BF
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BF
BF
BF
BF
BF
BF
BF
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01B
01B
01B
01B
01B
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A1G
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UG
UG
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UG
UG
UG
UG
UG
UG
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AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
BO
UY
MM
MM
TH
TH
TH
TH
TH
TH
KE
KE
CM
ZA
SE
NO
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CM
CM
BE
CM
KE
NG
GA

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year
1997
1998
1998
1998
1998
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
2000
1997
1997
1998
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
1999
2000
1999
2000
2000
2001
1999
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-

76

Table S2

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B76
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Subtype
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A2C
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A2D
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AD
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AGU
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AHJU
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BC
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01A
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01A1
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U
U
U

Country code
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CD
CM
CM
CM
CM
CM
CM
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CN
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MM
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ES
BW
KE
TZ
UG
BE
CM
CM
CM
MM
CM
CM
MM
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CD
CM
GH
GH
CM
BE
CM
BJ
CD
CD
GR

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year
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76
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1998
1990
1999
1999
1997
2001
2002
2001
2002
2001
2001
2000
2000
1999
1999
1993
1999
2000
2000
1997
1999
1994
2001
2002
1997
1999
2001
2001
2000
1999
1997
2001
1997
2002
1993
2002
1983
1990
1999

77

Table S3
HXB2
coordinate
Target gene
64
U3, nef
67
U3, nef72
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130
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U3
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R, TAR
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R, poly A
551
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PBS
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gag (p24)
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gag (p24)
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gag (p24)
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rebosomal slip site2167
gag (p6), pol2315
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pol (prot)2328
pol (prot)2375
pol (prot)2559
pol (RT)
2586
pol (RT)
2748
pol (RT)
2960
pol (RT)
2961
pol (RT)
3092
pol (RT)
4168
pol (p15)

1/3
Target site
AAGGCTACTTCCCTGATTGGC
GCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTATTCCCTGATTGGCAGAACTACACACGATGGTGCTTCAAGCTAGTACAAGGAGAGAACACCAGCTTGT
AAGGCCCGAGAGCTGCATCCGG
AAGACTGCTGACATCGAGCTT
AAGGGACTTTCCGCTGGGGAC
AACTGGGGAGTGGCGAGCCCTGTCTCTCTGGTTAGACCAGATTTAGACCAGATCTGAGCCTGG
AGACCAGATCTGAGCCTGG
CTGGGAGCTCTCTGGCTAACTTCTGGCTAACTAGGGAACCCATGCTTAAGCCTCAATAAAGCTAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGT
TCTCTAGCAGTGGCGCCCG
GGTGGCGCCCGAACAGGGACCTT
GTGGCGCCCGAACAGGGACTGGCGCCCGAACAGGGACTGCGGAGGCTAGAAGGAGAGGGCTAGAAGGAGAGAGATG
AAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGATGGGTGCGAGAGCGTCGGGCAAGCAGGGAGCTAGAAC
GGGCAAGCAGGGAGCTAGAACTTGAGAACCAAGGGGAAGTGACAAATAAAATAGTAAGAATGTAAATAGTAAGAATGTATAGCCC
AAGCATTGGGACCAGGAGCGATAGAAGAAATGATGACAGCATGAAGAAATGATGACAGCATGTCAAGATTGTACTGAGAGACAGGAAGATTGTACTGAGAGACAGGCTGATTGTACTGAGAGACAGG
GATTGTACTGAGAGACAGG
GTACTGAGAGACAGGCTAA

Conservation(%)
Reference
34.5 Dave (2004)
18.6 Yamamoto (2006)
17.9 Yamamoto (2006)
28.3 Capodici (2002)
0.4 Chang (2005)
0.9 Suzuki (2005)
1.1 Suzuki (2005)
23.5 Suzuki (2005)
0.2 Suzuki (2005)
16.2 Yoshinari (2004)
16.1 Yoshinari (2004)
16.1 Jacque (2002)
9.5 Yoshinari (2004)
11.3 Yoshinari (2004)
85.3 Yoshinari (2004)
65.1 Chang (2005)
92.0 Nishitsuji (2006)
17.0 Han (2004)
90.1 Das (2004)
54.2 Das (2004)
88.1 Das (2004)
91.0 Das (2004)
93.2 ter Brake (2006)
92.9 Westerhout (2006a)
21.5 Capodici (2002)
21.5 Han (2004)
44.3 Capodici (2002)
77.3 ter Brake (2006)
75.9 Chang (2005)
0.0 Hu (2002)
82.3 ter Brake (2006)
62.1 Chang (2005)
9.3 Novina (2002)
9.5 Suzuki (2005)
9.3 Song (2003)
9.3 Lee (2005)
9.1 Pusch (2003)

CAGGCTAATTTTTTAGGGAA

70.6 ter Brake (2006)GAGGAGAGCTTCAGGTTTGGG
AGCTCTATTAGATACAGGAGCTCTATTAGATACAGGAGCAACAGGAGCAGATGATACAGTATGGAAACCAAAAATGATAGG
CCTATTGAGACTGTACCAGAAGCCAGGAATGGATGGCCCA
GACAGTACTAAATGGAGAATTTGAGACACCAGGGATTAGAGAGACACCAGGGATTAGATTCAATACATGGATGATTTGTAAAGGAATTGGAGGAAATGAAC

4.2 Lin (2004)
44.5 Paul (2003)
47.1 Scherer (2004)
59.5 ter Brake (2006)
81.9 ter Brake (2006)
8.0 Paul (2003)
63.5 Chang (2005)
0.0 Sabariegos (2006)
22.8 Surabhi (2002)
22.8 Surabhi (2002)
26.5 Huelsmann (2006)
47.2 Chang (2005)

78

Table S3

2/3

HXB2
coordinate
Target gene4173
pol (p15)4285
pol (int)4537
pol (int)4539
pol (int)
4650
pol (int)
4776

pol (int), cPPT

4809
4811
4884
4888
4893
4953
4960
4966
5040
5138
5138
5195
5323
5323
5323
5481
5852
5864
5887
5889
5889
5889
5915
5954
5966
5967
5969
5980
5983
5983
5983
5983
5983
5994
6205
6213
7152
7368
7384
7460
7464
7497
7635
7798

pol (int)
pol (int)
pol (int), CTS
pol (int), CTS
pol (int), CTS
pol (int)
pol (int)
pol (int)
pol (int), vif
vif
vif
vif
vif
vif
vif
vif
tat
tat
tat
tat
tat
tat
tat
tat, revtat, revtat, revtat, revtat, revtat, revtat, revtat, revtat, revtat, revtat, rev
vpu
vpu, env
env
env
env
env
env
env
env
env

Conservation
Target site(%)
Reference
ATTGGAGGAAATGAACAAGT
47.6 ter Brake (2006)
GGAGAGCAATGGCTAGTGA
58.7 Nishitsuji (2006)
AATTAGCAGGAAGATGGCCAG
67.0 Chang (2005)
TTAGCAGGAAGATGGCCAGT
67.4 ter Brake (2006)
ATTCCCTACAATCCCCAAAG
50.7 ter Brake (2006)
CACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGG 90.7 ter Brake (2006)
GGGG
TACAGTGCAGGGGAAAGAATA
84.4 ter Brake (2006)
CAGTGCAGGGGAAAGAATA
84.4 Westerhout (2006a)
AAAATTCAAAATTTTCGGGT
77.3 ter Brake (2006)
TTCAAAATTTTCGGGTTTATT
80.6 ter Brake (2006)
AATTTTCGGGTTTATTACAG
78.5 ter Brake (2006)
CTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAAT 84.0 ter Brake (2006)
AAGGTGAAGGGGCAGTAGTAA
69.8 Chang (2005)
AAGGGGCAGTAGTAATAGAAG
0.0 Hu (2002)
TATGGAAAACAGATGGCAGGTG
90.7 ter Brake (2006)
GGAAAGCTAAGGACTGGTT
0.2 Jacque (2002)
GGAAAGCTAAGGACTGGTT
0.2 Joshi (2005)
GTTCAGAAGTACACATCCC
60.8 Lee (2005)
AGCACACAAGTAGACCCTGA
24.4 Jacque (2002)
AGCACACAAGTAGACCCTG
24.4 Jacque (2002)
AGCACACAAGTAGACCCTG
24.4 Nishitsuji (2004)
CTTGGCACTAGCAGCATTA
5.6 Jacque (2002)
CTAGAGCCCTGGAAGCATC
7.8 Surabhi (2002)
AAGCATCCAGGAAGTCAGCCT
10.3 Dave (2004)
AACTGCTTGTACCAATTGCTA
1.8 Coburn (2002)
CTGCTTGTACCAATTGCTATT
5.0 Boden (2003a,b)
CTGCTTGTACCAATTGCTA
3.2 Boden (2004a)
CTGCTTGTACCAATTGCTATT
5.0 Huelsmann (2006)
AAGTGTTGCTTTCATTGCCAAG
5.4 Lee (2003)
GCCTTAGGCATCTCCTATG
1.2 Das (2004)
TCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAG
81.5 ter Brake (2006)
CCTATGGCAGGAAGAAGCG
56.8 Das (2004)
TATGGCAGGAAGAAGCGGA
79.9 Surabhi (2002)
GAAGCGGAGACAGCGACGA
45.5 Surabhi (2002)
GCGGAGACAGCGACGAAGAGC
7.4 Lee (2002)
GCGGAGACAGCGACGAAGAGC
7.4 Li (2003)
GCGGAGACAGCGACGAAGAGC
7.4 Scherer (2004)
GCGGAGACAGCGACGAAGAGC
7.4 Joshi (2005)
GCGGAGACAGCGACGAAGAGC
7.4 Li (2005)
GACGAAGAGCTCATCAGAACA
0.2 Boden (2004b)
AAGAGCAGAAGACAGTGGCAA
53.6 Chang (2005)
AAGACAGTGGCAATGAGAGTG
52.2 Chang (2005)
AAGAGGGGACCAGGGAGAGCAC
0.0 Park (2003)
AAGTTCTACTGTAATTCAACAC
0.0 Park (2003)
CAACACAACTGTTTAATAGTA
4.0 Scherer (2004)
CACAATCACACTCCCATGCAG
1.0 Scherer (2004)
AAGACACTCCCATGCAGAATAC
0.0 Park (2003)
AAGATGTGGCAGGAAGTAGGAC
0.2 Park (2003)
GGAGGAGGCGATATGAGGGAC
0.4 Scherer (2004)
CAGCAGGAAGCACTATGGGCGC
75.8 ter Brake (2006)

79

Table S3
HXB2
coordinate
Target gene
7858
env
7916
env
7924
env
8425
tat, rev, env
8472
rev, env
8483
rev, env
8509
rev, env
8509
rev, env
8509
rev, env
8509
rev, env
8509
rev, env
8509
rev, env
8509
rev, env
8558
rev, env
8759
env
8762
env
8817
nef
8844
nef
8914
nef
8960
nef
8960
nef
8960
nef
8960
nef
8999
nef
9063
nef, U3
9069
nef, U3
9078
nef, U3
9081
nef, U3
9083
nef, U3

3/3
Target site
TGTCTGATATAGTGCAGCAGC
TCTGTTGCAACTCACAGTCTG
AACTCACAGTCTGGGGCATCAAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGAACGGATCCTTGGCACTTATCGGCACTTATCTGGGACGATGCCTGTGCCTCTTCAGCTACC
GCCTGTGCCTCTTCAGCTACC
GCCTGTGCCTCTTCAGCTACC
GCCTGTGCCTCTTCAGCTACC
GCCTGTGCCTCTTCAGCTACC
GCCTGTGCCTCTTCAGCTACC
GCCTGTGCCTCTTCAGCTACC
AACGAGGATTGTGGAACTTCTAAGAATAAGACAGGGCTTGGAAATAAGACAGGGCTTGGAAAGAAGTAGTGTGATTGGATGGCC
AAGGGAAAGAATGAGACGAGCCAUGGAGCAAUCACAAGUATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAGTGCCTGGCTAGAAGCACAGTGCCTGGCTAGAAGCACAGTGCCTGGCTAGAAGCACA
TTCCAGTCACACCTCAGGTAC
CTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAGGGGGGACTGGAAGGGCTA
GGGACTGGAAGGGCTAATTGACTGGAAGGGCTAATTCA

Conservation(%)
Reference
0.0 Scherer (2004)
24.1 Scherer (2004)
11.9 Dave (2004)
7.1 Dave (2004)
0.4 Coburn (2002)
0.4 Lee (2005)
40.6 Lee (2002)
40.6 Banerjea (2003)
40.6 Li (2003)
40.6 Scherer (2004)
40.6 Unwalla (2004)
40.6 Joshi (2005)
40.6 Unwalla (2006)
8.7 Dave (2004)
9.5 Dave (2004)
10.9 Dave (2004)
0.4 Chang (2005)
6.3 Dave (2004)
0.0 Sabariegos (2006)
11.6 Jacque (2002)
11.6 Das (2004)
11.6 Westerhout (2005)
11.6 Westerhout (2006a,b)
1.6 Scherer (2004)
90.7 ter Brake (2006)
90.7 Dave (2004)
14.1 Das (2004)
10.6 Westerhout (2006a)
2.6 Nishitsuji (2006)* For the target sequence longer than 21 nt, conservation was calculated for each possible 21 nt
subsequence, and the highest value is shown. Target sequence shorter than 21 nt was extended to 21 nt
for calculating their conservations.

80

Table S4
HXB2
coordinate
Target gene
412
U3, TATA
413
U3, TATA
414
U3, TATA
415
U3, TATA
416
U3, TATA
505
R, TAR
506
R, TAR
507
R, TAR, poly A
508
R, TAR, poly A
509
R, TAR, poly A
510
R, TAR, poly A
511
R, TAR, poly A
512
R, poly A
513
R, poly A
514
R, poly A
515
R, poly A
516
R, poly A
517
R, poly A
518
R, poly A
519
R, poly A
520
R, poly A
521
R, poly A
522
R, poly A
523
R, poly A
524
R, poly A
525
R, poly A
526
R, poly A
527
R, poly A
528
R, poly A
552
U5
576
U5, PAS
577
U5, PAS
578
U5, PAS
579
U5, PAS
580
U5, PAS
581
U5, PAS
582
U5, PAS
583
U5, PAS584
U5, PAS585
U5622
U5, PBS623
U5, PBS624
U5, PBS625
U5, PBS626
U5, PBS627
U5, PBS628
U5, PBS629
U5, PBS630
U5, PBS631
U5, PBS

1/5
Conservation
siRNA efficacy prediction
Target site (21 bp)(%) Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui
CCCTCAGATGCTGCATATAAG
74.6
CCTCAGATGCTGCATATAAGC
75.1
CTCAGATGCTGCATATAAGCA
74.6
yes
TCAGATGCTGCATATAAGCAG
74.6
CAGATGCTGCATATAAGCAGC
75.8
GGGAACCCACTGCTTAAGCCT
77.8
yes
GGAACCCACTGCTTAAGCCTC
81.3
GAACCCACTGCTTAAGCCTCA
84.9
AACCCACTGCTTAAGCCTCAA
85.3
yes
ACCCACTGCTTAAGCCTCAAT
84.9
yes
yes
yes
CCCACTGCTTAAGCCTCAATA
84.9
yes
yes
yes
CCACTGCTTAAGCCTCAATAA
85.2
yes
CACTGCTTAAGCCTCAATAAA
85.4
yes
yes
yes
ACTGCTTAAGCCTCAATAAAG
84.7
CTGCTTAAGCCTCAATAAAGC
85.3
TGCTTAAGCCTCAATAAAGCT
85.3
yes
GCTTAAGCCTCAATAAAGCTT
85.7
CTTAAGCCTCAATAAAGCTTG
85.7
TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC
86.7
TAAGCCTCAATAAAGCTTGCC
86.6
AAGCCTCAATAAAGCTTGCCT
93.9
yes
AGCCTCAATAAAGCTTGCCTT
94.2
yes
yes
GCCTCAATAAAGCTTGCCTTG
95.0
CCTCAATAAAGCTTGCCTTGA
94.2
CTCAATAAAGCTTGCCTTGAG
94.6
TCAATAAAGCTTGCCTTGAGT
87.5
CAATAAAGCTTGCCTTGAGTG
87.5
AATAAAGCTTGCCTTGAGTGC
85.5
ATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT
79.5
AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTT
70.3
TGACTCTGGTAACTAGAGATC
71.5
GACTCTGGTAACTAGAGATCC
81.3
ACTCTGGTAACTAGAGATCCC
81.9
87.1
yes
CTCTGGTAACTAGAGATCCCT
TCTGGTAACTAGAGATCCCTC87.1
CTGGTAACTAGAGATCCCTCA
87.7
yes
TGGTAACTAGAGATCCCTCAG
88.2
GGTAACTAGAGATCCCTCAGA
88.2
yes
GTAACTAGAGATCCCTCAGAC
87.7
TAACTAGAGATCCCTCAGACC
83.7
AAAATCTCTAGCAGTGGCGCC
90.2
AAATCTCTAGCAGTGGCGCCC
93.1
AATCTCTAGCAGTGGCGCCCG
92.0
ATCTCTAGCAGTGGCGCCCGA
92.1
TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAA
93.3
CTCTAGCAGTGGCGCCCGAAC
92.8
TCTAGCAGTGGCGCCCGAACA
92.4
CTAGCAGTGGCGCCCGAACAG
92.4
TAGCAGTGGCGCCCGAACAGG
93.8
AGCAGTGGCGCCCGAACAGGG
93.3

81

Table S4
HXB2
coordinate
Target gene632
U5, PBS633
U5, PBS
682
U5
683
U5
684
U5
685
U5
686
U5
687
U5
688
U5
689
U5
761
U5, Ψ
762
U5, Ψ
763
U5, Ψ
764
U5, Ψ
765
U5, Ψ
766
U5, Ψ
767
U5, Ψ
768
U5, Ψ
769
U5, Ψ
770
U5, Ψ, gag (AUG)
771
U5, Ψ, gag (AUG)
772
U5, Ψ, gag (AUG)
773
U5, Ψ, gag (AUG)774
U5, Ψ, gag (AUG)
775
U5, Ψ, gag (AUG)
776
U5, Ψ, gag (AUG)
777
U5, Ψ, gag (AUG)
778
U5, Ψ, gag (AUG)
779
U5, Ψ, gag (AUG)
780
U5, gag (AUG)
781
U5, gag (AUG)
782
U5, gag (AUG)783
U5, gag (AUG)784
U5, gag (AUG)785
U5, gag (AUG)
786
U5, gag (AUG)
787
U5, gag (AUG)
1597
gag (p24)
1598
gag (p24)
1599
gag (p24)
1600
gag (p24)
1601
gag (p24)1602
gag (p24)
1603
gag (p24)
1604
gag (p24)
1605
gag (p24)
1606
gag (p24)
1817
gag (p24)
1818
gag (p24)
gag (p7, p1), pol,2075
ribosomal slip site

2/5
Conservation
siRNA efficacy prediction
Target site (21 bp)(%) Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui
GCAGTGGCGCCCGAACAGGGA
90.0
CAGTGGCGCCCGAACAGGGAC
90.1
TCTCTCGACGCAGGACTCGGC
85.2
CTCTCGACGCAGGACTCGGCT88.1
TCTCGACGCAGGACTCGGCTT88.5
CTCGACGCAGGACTCGGCTTG
88.5
TCGACGCAGGACTCGGCTTGC
88.2
CGACGCAGGACTCGGCTTGCT88.5
GACGCAGGACTCGGCTTGCTG
90.0
ACGCAGGACTCGGCTTGCTGA
88.2
yes
yes
TTTGACTAGCGGAGGCTAGAA
85.2
yes
TTGACTAGCGGAGGCTAGAAG
86.9
TGACTAGCGGAGGCTAGAAGG
87.6
GACTAGCGGAGGCTAGAAGGA
88.0
yes
ACTAGCGGAGGCTAGAAGGAG
88.0
CTAGCGGAGGCTAGAAGGAGA
88.4
yes
TAGCGGAGGCTAGAAGGAGAG
88.1
AGCGGAGGCTAGAAGGAGAGA
87.8
yes
GCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG
88.3
CGGAGGCTAGAAGGAGAGAGA
88.6
yes
yes
GGAGGCTAGAAGGAGAGAGAT
88.3
yes
GAGGCTAGAAGGAGAGAGATG
91.0
AGGCTAGAAGGAGAGAGATGG
91.4
GGCTAGAAGGAGAGAGATGGG
91.4
GCTAGAAGGAGAGAGATGGGT
91.1
CTAGAAGGAGAGAGATGGGTG
90.4
TAGAAGGAGAGAGATGGGTGC
90.4
AGAAGGAGAGAGATGGGTGCG
90.1
GAAGGAGAGAGATGGGTGCGA
90.4
AAGGAGAGAGATGGGTGCGAG
92.1
AGGAGAGAGATGGGTGCGAGA
92.1
yes
GGAGAGAGATGGGTGCGAGAG
92.1
GAGAGAGATGGGTGCGAGAGC
93.2
AGAGAGATGGGTGCGAGAGCG
92.5
GAGAGATGGGTGCGAGAGCGT
93.2
AGAGATGGGTGCGAGAGCGTC
92.9
GAGATGGGTGCGAGAGCGTCA
89.8
TTAAATAAAATAGTAAGAATG
72.4
TAAATAAAATAGTAAGAATGT
77.3
AAATAAAATAGTAAGAATGTA
76.9
yes
AATAAAATAGTAAGAATGTAT77.7
ATAAAATAGTAAGAATGTATA
77.7
yes
TAAAATAGTAAGAATGTATAG
77.5
AAAATAGTAAGAATGTATAGC
75.9
AAATAGTAAGAATGTATAGCC
75.9
AATAGTAAGAATGTATAGCCC
75.9
ATAGTAAGAATGTATAGCCCT75.9
TAGAAGAAATGATGACAGCAT
82.3
yes
yes
AGAAGAAATGATGACAGCATG
82.3
GACAGGCTAATTTTTTAGGGA

70.6

yes

82

Table S4
HXB2
coordinate
2077
2251
2252
2328
2329
2330
2331
2332
2333
2334
2335
2336
2375
2487
2488
2489
2490
2611
2613
2614
2615
2696
3302
4173
4174
4175
4176
4177
4178
4179
4182
4183
4184
4749
4750
4751
4752
4753
4754
4776
4777
4778
4779
4780
4781
4782
4783
4784
4785
4786

3/5
Target genegag (p7, p1), pol,ribosomal slip sitegag (p6), pol (prot)gag (p6), pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (prot)pol (RT)pol (RT)pol (RT)pol (RT)pol (RT)pol (RT)pol (p15)
pol (p15)
pol (p15)
pol (p15)
pol (p15)
pol (p15)
pol (p15)
pol (p15)
pol (p15)
pol (p15)
pol (int)
pol (int)
pol (int)
pol (int)
pol (int)
pol (int)
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT
pol (int), cPPT

Conservation
siRNA efficacy prediction
Target site (21 bp)(%) Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui
CAGGCTAATTTTTTAGGGAAA

70.0

TCCCTCAAATCACTCTTTGGC
CCCTCAAATCACTCTTTGGCAACAGGAGCAGATGATACAGTACAGGAGCAGATGATACAGTATAGGAGCAGATGATACAGTATTGGAGCAGATGATACAGTATTAGAGCAGATGATACAGTATTAG
AGCAGATGATACAGTATTAGAGCAGATGATACAGTATTAGAACAGATGATACAGTATTAGAAG
AGATGATACAGTATTAGAAGAATGGAAACCAAAAATGATAGG
CCTACACCTGTCAACATAATTCTACACCTGTCAACATAATTG
TACACCTGTCAACATAATTGG
ACACCTGTCAACATAATTGGATTAAACAATGGCCATTGACAG
AAACAATGGCCATTGACAGAAAACAATGGCCATTGACAGAAGACAATGGCCATTGACAGAAGA
AATTGGGCCTGAAAATCCATACTGGACTGTCAATGATATACAATTGGAGGAAATGAACAAGTATTGGAGGAAATGAACAAGTAGTGGAGGAAATGAACAAGTAGAGGAGGAAATGAACAAGTAGATGAGGAAATGAACAAGTAGATAAGGAAATGAACAAGTAGATAAGGAAATGAACAAGTAGATAAAAATGAACAAGTAGATAAATTAATGAACAAGTAGATAAATTAGTGAACAAGTAGATAAATTAGTACAGCAGTACAAATGGCAGTACAGCAGTACAAATGGCAGTATAGCAGTACAAATGGCAGTATTGCAGTACAAATGGCAGTATTCCAGTACAAATGGCAGTATTCAAGTACAAATGGCAGTATTCATCACAATTTTAAAAGAAAAGGGACAATTTTAAAAGAAAAGGGG
CAATTTTAAAAGAAAAGGGGG
AATTTTAAAAGAAAAGGGGGG
ATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGTAAAAGAAAAGGGGGGATTGG
AAAAGAAAAGGGGGGATTGGGAAAGAAAAGGGGGGATTGGGG

79.9
81.9
81.3
77.7
77.9
79.1
78.5
77.3
79.7
78.3
77.7
81.9
72.0
72.2
72.2
73.0
70.0
73.0
73.0
73.6
74.8
70.2
76.7
76.5
76.5
71.1
71.1
70.5
70.7
71.7
71.9
71.9
74.9
74.1
74.1
71.5
71.5
71.5
89.8
89.8
89.8
90.5
90.5
90.5
90.7
90.7
90.7
90.3
89.4

yes

yes

yes
yes
yes

yes
yes
yes
yes

yes

yes
yes
yes
yes

yes

yes
yes

yes
yes

yes
yes
yes

yes
yes
yes

yes

yes
yes
yes
yes

yes
yes

yes

yes
yes

yes

yes

yes

83

Table S4
HXB2
coordinate
Target gene4787
pol (int), cPPT
4788
pol (int), cPPT
4789
pol (int), cPPT
4790
pol (int), cPPT
4791
pol (int), cPPT
4792
pol (int), cPPT
4793
pol (int), cPPT
4794
pol (int), cPPT
4795
pol (int), cPPT
4796
pol (int), cPPT
4797
pol (int), cPPT
4798
pol (int), cPPT
4799
pol (int), cPPT
4800
pol (int), cPPT
4801
pol (int)
4802
pol (int)4803
pol (int)
4804
pol (int)
4805
pol (int)
4806
pol (int)
4807
pol (int)
4808
pol (int)4809
pol (int)4810
pol (int)4811
pol (int)4812
pol (int)4813
pol (int)4814
pol (int)4883
pol (int), CTS
4884
pol (int), CTS
4885
pol (int), CTS
4886
pol (int), CTS
4887
pol (int), CTS
4888
pol (int), CTS
4889
pol (int), CTS
4890
pol (int), CTS
4891
pol (int), CTS
4892
pol (int), CTS
4953
pol (int)4954
pol (int)
4955
pol (int)
4956
pol (int)4957
pol (int)4958
pol (int)4959
pol (int)4961
pol (int)
5040
pol (int), vif5041
pol (int), vif5966
pol (int), vif5967
pol (int), vif

4/5
Conservation
siRNA efficacy prediction
Target site (21 bp)(%) Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui
AAGAAAAGGGGGGATTGGGGG
86.6
AGAAAAGGGGGGATTGGGGGG
78.1
GAAAAGGGGGGATTGGGGGGT
78.1
AAAAGGGGGGATTGGGGGGTA
78.1
AAAGGGGGGATTGGGGGGTAC
76.9
AAGGGGGGATTGGGGGGTACA
76.7
yes
AGGGGGGATTGGGGGGTACAG
80.2
GGGGGGATTGGGGGGTACAGT
80.4
yes
yes
GGGGGATTGGGGGGTACAGTG
80.4
GGGGATTGGGGGGTACAGTGC
80.0
GGGATTGGGGGGTACAGTGCA
79.3
GGATTGGGGGGTACAGTGCAG
78.9
GATTGGGGGGTACAGTGCAGG
79.1
ATTGGGGGGTACAGTGCAGGG
76.1
TTGGGGGGTACAGTGCAGGGG
75.9
TGGGGGGTACAGTGCAGGGGA
75.5
yes
GGGGGGTACAGTGCAGGGGAA
73.5
yes
GGGGGTACAGTGCAGGGGAAA
72.9
yes
GGGGTACAGTGCAGGGGAAAG73.1
GGGTACAGTGCAGGGGAAAGA
72.3
yes
yes
GGTACAGTGCAGGGGAAAGAA
72.9
GTACAGTGCAGGGGAAAGAAT
74.5
yes
TACAGTGCAGGGGAAAGAATA
84.4
yes
yes
yes
ACAGTGCAGGGGAAAGAATAA
71.5
yes
yes
CAGTGCAGGGGAAAGAATAAT
71.5
yes
yes
AGTGCAGGGGAAAGAATAATA
73.7
yes
GTGCAGGGGAAAGAATAATAG
73.9
TGCAGGGGAAAGAATAATAGA
74.1
yes
yes
yes
AAAAATTCAAAATTTTCGGGT
77.3
AAAATTCAAAATTTTCGGGTT
76.7
AAATTCAAAATTTTCGGGTTT
78.5
AATTCAAAATTTTCGGGTTTA
78.7
ATTCAAAATTTTCGGGTTTAT
79.3
yes
TTCAAAATTTTCGGGTTTATT
80.6
yes
yes
TCAAAATTTTCGGGTTTATTA
76.9
yes
CAAAATTTTCGGGTTTATTAC
77.5
AAAATTTTCGGGTTTATTACA
77.7
AAATTTTCGGGTTTATTACAG
78.5
CTCTGGAAAGGTGAAGGGGCA
82.2
yes
TCTGGAAAGGTGAAGGGGCAG
82.0
CTGGAAAGGTGAAGGGGCAGT
82.2
yes
TGGAAAGGTGAAGGGGCAGTA
84.0
GGAAAGGTGAAGGGGCAGTAG
83.6
GAAAGGTGAAGGGGCAGTAGT
83.4
AAAGGTGAAGGGGCAGTAGTA
72.1
yes
yes
AGGTGAAGGGGCAGTAGTAAT
70.1
yes
yes
TATGGAAAACAGATGGCAGGT
90.7
ATGGAAAACAGATGGCAGGTG
90.1
TCCTATGGCAGGAAGAAGCGG
81.5
CCTATGGCAGGAAGAAGCGGA
79.9

84

Table S4
HXB2
coordinate
Target gene5970
pol (int), vif7654
env (gp120)7655
env (gp120)7796
env (gp41)7797
env (gp41)7798
env (gp41)7799
env (gp41)
7830
env (gp41)7831
env (gp41)
9063
nef, 3'PPT
9064
nef, 3'PPT
9065
nef, 3'PPT
9066
nef, 3'PPT, U3
9067
nef, 3'PPT, U3
9068
nef, 3'PPT, U3
9069
nef, 3'PPT, U3

5/5
Conservation
siRNA efficacy prediction
Target site (21 bp)(%) Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui
ATGGCAGGAAGAAGCGGAGAC
70.2
ACAATTGGAGAAGTGAATTAT
70.7
CAATTGGAGAAGTGAATTATA
70.5
yes
AGCAGCAGGAAGCACTATGGG
71.1
GCAGCAGGAAGCACTATGGGC
71.7
CAGCAGGAAGCACTATGGGCG
75.4
AGCAGGAAGCACTATGGGCGC
75.8
ACGCTGACGGTACAGGCCAGA
72.1
yes
CGCTGACGGTACAGGCCAGAC
72.9
CTTTTTAAAAGAAAAGGGGGG
86.1
TTTTTAAAAGAAAAGGGGGGA
89.5
TTTTAAAAGAAAAGGGGGGAC
90.2
TTTAAAAGAAAAGGGGGGACT90.1
TTAAAAGAAAAGGGGGGACTG
90.3
TAAAAGAAAAGGGGGGACTGG
90.5
AAAAGAAAAGGGGGGACTGGA
90.7

謝

辞

本研究の機会を恵与され，終始多大なる御指導，御鞭撻を賜りました東京大学教授 西郷 薫
博士に謹んで感謝の意を表しますとともに，厚く御礼申し上げます．

本研究全般にわたり直接御指導を賜り，また，本論文の校閲を戴きました東京大学助教授
程 久美子博士ならびに国立感染症研究所室長 武部 豊博士に謹んで謝意を表しますとともに，共同研究を通じて終始御懇篤なる御指導，御討論を賜りました東京大学教授 森下 真一博士ならびに東京大学特任助手 山田 智之氏に深謝いたします．

また，数々の御助言，御討論を戴きました国立遺伝学研究所教授 上田 龍博士，前橋工科大学
助教授 善野 修平博士，東京大学助手 高橋 史峰博士に厚く御礼申し上げます．

さらに，実験に御協力，御援助を戴きました江田 理愛氏，田中 愛氏ならびに西郷研究室，
程研究室の皆様に感謝いたします．