特集

タンパク質の凝集剤としての塩・有機溶媒・高分子
吉澤

俊祐 *・白木賢太郎

ど塩析させる力が強い．この塩析の強さはどのように説はじめに明できるのだろうか．一つは溶解度で説明できる．タン

タンパク質の凝集剤として，塩や有機溶媒，高分子がパク質の溶解度は，一般に，イオンの濃度を増加させる広く用いられている．タンパク質の分画や結晶化など，と増加し，極大値があって，さらに濃度を高めると低下それぞれの目的に応じて経験的に使い分けられているする（図 2）．これは，デバイ−ヒュッケルの理論によるが，原理はかなり複雑で，それぞれに違った顔を持ってと次のように考えられる．タンパク質溶液に塩を加えるいる．塩はタンパク質分子の間の静電相互作用を弱めると，低濃度では静電遮蔽によってタンパク質の分子間のことでタンパク質を沈殿させるが，数百 P0 まで加え反発力が弱まって，タンパク質が占める実質的な体積がると塩の種類によって異なる性質が現れる．有機溶媒は減り，その結果，溶解度が増加する．さらに塩を加えて溶液の誘電率を低下させるとともに，アミノ酸残基とも

いくと，タンパク質間のファンデアワールス力や疎水性相互作用することでタンパク質の凝集と変性を引き起こ相互作用などの引力が強まり凝集しやすくなる．

す．高分子は排除体積効果による凝集と，アミノ酸残基

このように静電相互作用だけで塩析が説明できるならとの相互作用による溶解の両方の効果を考える必要があ

加える塩の種類にはよらないだろう．しかし，すでにる．本稿では，このような 3 タイプの典型的な凝集剤の1932 年に Green らが報告しているように，この曲線は図 2 のように塩の種類によって異なったのである 3)．し特徴を俯瞰してみたい．

たがって，タンパク質とイオンとの間には，静電相互作

塩用だけでなく，別の相互作用があるか，もしくは水の構

タンパク質溶液に硫酸ナトリウムなどの塩を加えると，タンパク質は析出する．塩析と呼ばれるこの現象の1)造への影響があると予想できる．
それ以降，この効果についてはイオンが水の構造に影

研究は，1888 年の研究にまでさかのぼることができる ．

響するという説が有力だった 4)．塩析させやすい塩をコ+RIPHLVWHU らは，卵白やウシ血清や膠などにさまざまスモトロープ，塩溶させやすい塩をカオトロープというな塩を添加して，タンパク質が沈殿する様子を観察した．

が，その語源どおりコスモトロープは水の水素結合ネッ

その結果，塩の種類によって沈澱が生じる濃度が変わる

トワークを秩序化し（＝コスモス），逆にカオトロープことを，一連の論文として報告した．この塩析の強さはは無秩序化する（＝カオス）という考えである．しかし，後にホフマイスター系列と呼ばれるようになった．この

水の水素結合を直接観察したところ，イオンは水の水素原典にあたる論文はドイツ語で書かれていたが，今では結合ネットワークには影響を与えないという重要な論文

2)

英訳も出版されている ．繙いてみると，タンパク質を塩析させる塩は利尿作用があり，溶解させる塩は下剤作用があるといった塩と生理作用の関係を議論しているのが興味深い．当時はまだタンパク質がどういう物質なのかもわかっていなかったころだ．
図 1 にホフマイスター系列を示す．たとえば 1 M 程度のイオンをタンパク質溶液に加えたとき，左のイオンほ

図 1．ホフマイスター系列

図 2．塩濃度によるタンパク質の溶解度のイメージ図．S はタンパク質の溶解度， は溶液のイオン強度を表す．

* 著者紹介 筑波大学大学院数理物質科学研究科（博士後期課程 1 年） (PDLO\VKX#JPDLOFRP260

生物工学

第93巻

タンパク質溶液の理解と制御が報告されている 5)．つまり，溶液中のイオンは，バルに 12)，今もなお面白い研究分野である．

ク水の構造を変えるというよりも，むしろタンパク質の有機溶媒表面にある水和水に影響して，タンパク質の安定性や凝有機溶媒は古くから '1$ や 51$ を沈殿させる手法集などの性質を変えるのだろう．
表面張力は水和を理解するための一つの指標である 6)．

として用いられてきた．タンパク質への応用は，アルコー

コスモトロープは気液界面の表面張力を増加させるのルによる血清タンパク質の沈殿の報告があって以降 13)，で，広い界面ほど不安定になり，溶液は表面を減らそう

簡便な分画法として組換えタンパク質の精製などに用いとして，タンパク質は凝集する．一方，カオトロープはられている．
基本的な仕組みは単純に考えることができ，逆の議論が成り立ち，凝集しにくくなる．このような平有機溶媒によって水溶液の誘電率が低下して，タンパク衡論的な考えは，加熱にともなうリゾチームの凝集速度質間の静電反発力が強まる結果，溶解度が減少して沈殿と，溶液の表面張力とが正の相関があるという速度論的するというものである．しかし，誘電率だけではタンパな結果とも矛盾しない 7)．

ク質の溶解度は説明できないことも分かってきている．

数百 P0 という高濃度のイオンがタンパク質と相互作
8).OLEDQRY らは 34 種類の有機溶媒中におけるリゾチーム用する場合，選択的相互作用という概念が必要になる ．の溶解度を測定し，有機溶媒の性質を示すパラメーター

このパラメーターは，タンパク質表面に結合した溶質のと溶解度の相関を調べたが 14)，意外なことに相関は一部量から，水和によってタンパク質表面から排除された溶だけしか見られなかった．つまり，タンパク質の有機溶質の量を差し引いた値として定義される．選択的相互作

媒への溶解度は誘電率というバルクの性質だけではな

用の値が正であればタンパク質表面にはバルク中の水よ

く，有機分子とタンパク質との相互作用も考える必要がりも多くの溶質が存在することを意味し，逆に負であれある．

ば溶質の量は少なくなるという見方である．これまでに

ア ミ ノ 酸 と 有 機 分 子 と の 相 互 作 用 は，1R]DNL とさまざまな塩や溶質やタンパク質の選択的相互作用が調7DQIRUG の一連の研究に端を発する 15)．エタノールとジべられており，たとえば，コスモトロープイオンであるオキサンに対するアミノ酸やペプチドの溶解度を調べた

硫化物イオンのタンパク質への選択的相互作用の値は，ところ，有機溶媒はアミノ酸の疎水性側鎖を安定化し，塩化物イオンよりも低く，硫化物イオンがタンパク質表親水性のアミノ酸側鎖やペプチド結合の領域を不安定化面から選択的に排除されることが実測されるなど，表することがわかった．$UDNDZD らは実際に，ジメチルス面張力に関する議論と整合性が取れた結果が得られてルホキシドと 4 種類のタンパク質の相互作用を調べた 16)．

いる 9)．

その結果，高濃度では，ジメチルスルホキシドは疎水性

ホフマイスター系列は周期表と興味深い規則性が見ら相互作用によってタンパク質に選択的に結合して変性される．たとえばハロゲン族では，フッ素イオン＞塩化物せるが，低濃度では，それよりも親水性部位の不安定化

イオン＞臭素イオン＞ヨウ素イオンという順番に塩析作

効果が強まるので，タンパク質表面から選択的に排除さ用は強まるが，これは元素表ではちょうど上から下へのれることを報告している．

順番に一致している．この傾向は，アルカリ金属のカチ有機溶媒がタンパク質の疎水性側鎖を安定化するのでオンでは逆になる．したがってホフマイスター系列は，あれば，有機溶媒を加えていくとタンパク質は変性し，イオンの半径や電子密度，質量で説明できることを示唆同時に溶解度が増加するはずである．しかし実際には異しているが，硫酸イオンやグアニジウムイオンなどの複なる結果が得られている．<RVKLNDZD らは還元変性させ雑な構造を持つイオンとは違った説明が必要になるだ

たウシアルブミンのエタノール水溶液に対する溶解度とろう．

二次構造の変化を調べた 17)．その結果，エタノール濃度ホフマイスター系列とタンパク質凝集のこれまでの研が増加するにつれて，ネイティブ構造からランダムへと究は，実験科学の性質が強いものだったが，量子化学な変性し，さらに D ヘリックスに富む構造へと複雑な構造

10)どを用いた原理からの理解も深まりつつある ．一方，変化をした．一方で，エタノール濃度が増加すると，タ測定装置も著しく進歩し，最近ではテラヘルツ分光にンパク質の溶解度は単調に減少したのである．エタノー

よってピコ秒単位の水分子のダイナミクスが実測できる

ルはタンパク質の疎水性部分と相互作用して変性させ，ようになっている（本特集の青木らの解説を参照）．なお，同時に疎水性部分の溶解度を上げる効果はあるが，荷電タンパク質の凝集を調べることで発見されたホフマイス残基との好ましくない反発の影響が強くあらわれ，結果ター系列だが，酵素活性にも影響を与えるなど依然としとしてタンパク質の溶解度を低下させると考えられるて謎が多い 11)．最近でも「ホフマイスターを超えて」と（図 3）．

いう解説がハイインパクトな雑誌に記載されているよう2015年 第5号

有機溶媒のなかでも，ハロゲン系アルコールは興味深

261

特集

図 4．PEG によるタンパク質の凝集の模式図

図 3．エタノールによるタンパク質の変性と沈殿作用の模式図

分子を加えるとタンパク質の会合が促進される．このような効果を排除体積効果という．高分子の中でも特にポリエチレングリコール（PEG）は無毒であり，さまざい挙動を示す．トリフルオロエタノール 18) や，ヘキサまな分子量のものが安価に合成できるので，タンパク質フルオロイソプロパノール 19) は，タンパク質を D ヘリッの沈殿剤や結晶化剤としてよく用いられている．

クス構造に富んだ構造へと変性させる．たとえば，酸性高分子は排除体積の効果以外にもタンパク質に影響を条件の 50％トリフルオロエタノール溶液中にタンパクおよぼす．PEG のような荷電のない高分子でも影響が質があると，主鎖の間にできる水素結合が強められて Dあり，大きな PEG ほどタンパク質の選択的水和をうなヘリックス構造に富んだ構造へと変性するが，それと同がし，タンパク質を沈殿させる傾向が強まる 22)．PEG

時に，タンパク質が高濃度までよく溶けて，最終的にはとアミノ酸の相互作用を調べた報告によると，芳香族ア透明なゲルになる．ハロゲン系アルコールは，タンパクミノ酸の溶解度は，PEG 溶液中で増加する 23)．トリプ

質の溶解を考える良い題材になると思う．

トファンはわずかに溶けやすく，グリシンはわずかに溶

有機溶媒は殺菌作用を持つという応用上の利点があけにくい（およそ 20％ PEG4000 の溶液に対して N-る．この作用は，ウィルスや細菌の脂質膜を溶解させる質からなるウィルスも pH 依存的に不活化させる 20)．実PRO 程度）．さらに，主鎖の効果を差し引くと，結果的に PEG 溶液には脂肪族アミノ酸をわずかに溶かす性質がある 24)．つまり，高濃度の PEG は，タンパク質の疎際にエタノール溶液中のタンパク質は，荷電状態によっ水性部分に結合する性質があり，弱い変性作用があるこことに起因する．しかし，エタノールは外殻がタンパクて凝集のしやすさが異なる 21)．つまり，pH を少し変化とを意味する．図 4 のように整理すると，PEG には，1）させるだけで，エタノール中のタンパク質凝集を制御で排除体積効果によるタンパク質の安定化と凝集，および，きることを意味する．たとえば，アルコール溶液中でタ2）弱い変性作用によるタンパク質の不安定化と溶解をンパク質を保存するとき，凝集を防ぐためには，タンパ促進する両方の性質がある．

ク質の等電点から離すことが有効である．

タンパク質一分子に注目したとき，高分子はタンパク

このように有機溶媒によるタンパク質の凝集には，1）質のフォールディングにも影響する．高濃度の PEG やタンパク質の構造変化とそれにともなう疎水性の変化，多糖類を加えると，変性状態を不安定化するので，ネイ2）マクロに見た溶液の誘電率の低下，3）有機溶媒とティブ構造が安定化し，フォールディング速度も増加すタンパク質の非極性領域との相互作用，4）有機溶媒とる． こ の よ う な 構 造 へ の 効 果 は 活 性 に も 影 響 す る．

タンパク質の荷電残基との反発，という複雑な影響があ'HUKDP らは，3 種類の多量体酵素にクラウダーを加えるので，pH やイオン強度やアルコール濃度を少し変えて活性の変化を調べた．その結果，PEG やデキストラるだけで溶解と凝集の正反対の効果を生むこともある．

ンを加えると活性が減少したが，ヘモグロビンやリゾ

このような性質は，応用面からみると，溶液を適切にデチームをクラウダーとして加えると活性が 5–10 倍程度ザインすればタンパク質凝集を制御できる可能性を秘めに増加するという興味深い現象を報告している 25)．おそている．

らく，クラウダーによって多量体形成が促進されて高活高分子高分子によるタンパク質の沈殿も，古くから知られて性化するが，PEG のように粘度を増加させるクラウダー
では，基質や生成物の拡散速度が遅くなり，かえって活性が減少してしまうのだろう．

いる現象である．作用機構は塩や有機溶媒と異なり，基このような高分子による混み合いがタンパク質に与え本的には高分子の振る舞いによって説明ができる．高分る影響は，細胞内でのタンパク質の物性を理解する鍵に子は溶液中で，ある広がりをもって存在するので，タンなる 26)．

パク質が占めることのできる空間が減る．その結果，高262

電荷を持つ高分子電解質とタンパク質との相互作用の生物工学

第93巻

タンパク質溶液の理解と制御研究も進められている．ポリアミノ酸のような高分子電のような結果は実験科学らしい成果だが，では，なぜそ

解質とタンパク質は，静電相互作用によって複合体を形うなっているのかという問いに答えることは難しい．ア

成して，複合体の間の静電的な反発力が弱まって沈殿す

ルギニンは化学反応を抑制するし 31)，芳香族化合物の溶る 27)．このタンパク質・高分子電解質複合体の沈殿は，解度を上げ 32)，低濃度タンパク質でより加熱にともなう静電相互作用が主な駆動力になっているので，pH や塩タンパク質凝集の抑制効果が高まるが 33)，こうした実験

濃度の変化で凝集の制御ができる 28)．本特集で栗之丸が事実がいったいどのような理由で生じるのかは説明でき解説するように，低塩濃度で抗体・ポリアミノ酸の複合ない．今はこのように，タンパク質の凝集を合理的に制体を形成させた懸濁液は生理食塩水によって簡単に解離御するまでに必要な，ある種の博物学的知見が蓄積してさせることもできる．高分子電解質をタンパク質にまといる時期にあたるのだろうと思っている．

わせることで，凝集の制御性を付与するという視点は面白い．
凝集の制御へタンパク質の凝集剤としての塩と有機溶媒，高分子はそれぞれに特徴がある．簡単にまとめると，1）塩の凝集剤としての性質は，塩に共通の静電相互作用とホフマイスター系列による特異的な塩析の効果，2）有機溶媒の凝集剤としての性質は，溶媒の誘電率とタンパク質を変性させるほど強い相互作用，3）高分子の凝集剤としての性質は，排除体積効果とタンパク質への弱い相互作用が主な因子である．かつてタンパク質の凝集は，水の構造や誘電体など，溶媒全体のバルクの性質から考える研究が盛んに進められてきたが，10 年ほど前からようやく，分子間の個々の相互作用を含めた研究が本格化してきている．
このようなタンパク質の凝集の仕組みをふまえると，逆に，タンパク質の凝集抑制剤の理想的な形を思い描くことができる．すなわち，タンパク質の溶解度を増加させる働きを持つが，タンパク質を変性させるほどアミノ酸残基と強く結合せず，水和を強めたり溶液の表面張力を上げたりするような効果も弱い分子がふさわしいだろう．こうして考えると，アルギニン塩酸塩はタンパク質の凝集抑制剤として理想的であることも納得がいくように思う 29)．なお，アルギニンについては，本特集の荒川らがタンパク質とカラムとの相互作用の制御法について，平野が難容性の化合物の溶解度の向上について解説している．
タンパク質が凝集する現象は馴染み深いものだが，かなり複雑な現象がおこっている．Matsuoka らは，変性タンパク質の凝集をふせぐ理想的な分子を探す目的で，アミノ酸やその誘導体など 40 種類を準備し，網羅的に調べた 30)．その結果，加熱によるタンパク質凝集と還元変性からのリフォールディングにともなうタンパク質凝集を抑制できる分子は違うことがわかった．加熱凝集の抑制にはアミノ酸主鎖の骨格，つまり双性イオンの性質が必要だったが，リフォールディングにともなう凝集の抑制にはアルギニンのグアニジウム基が必要だった．こ

2015年 第5号

文献  +RIPHLVWHU ) Arch. Exp. Pathol. Phamakol. 24    .XQ]:et al.Curr. Opin. Colloid Interface Sci.9   *UHHQ$J. Biol. Chem.95  
  0DUFXV<Chem. Rev.109    2PWD$et al.Science301    3HJUDP/DQG5HFRUG0J. Phys. Chem. B111
   +LUDQR$et al.Protein J.26  8) 荒川 力，喜多淑子：生物物理，45    $UDNDZD7DQG7LPDVKHII6 Biochemistry21
   6DOLV $ DQG 1LQKDP % Chem. Soc. Rev. 43    3LQQD0et al.J. Phys. Chem. B109    -XQJZLUWK3Nat. Chem.6    &RKQ(et al.J. Am. Chem. Soc.72    &KLQ-et al.Biotechnol. Bioeng.44    1R]DNL< DQG 7DQIRUG & J. Biol. Chem. 248    $UDNDZD7et al.Biophys. Chem.131    <RVKLNDZD+ et al. Int. J. Biol. Macromol.50
   6KLUDNL.et al.J. Mol. Biol.245    +LURWD1et al.J. Mol. Biol.275    3DUN*et al.J. Food Protec.73    <RVKL]DZD 6 et al. Int. J. Biol. Macromol. 68    $UDNDZD7DQG7LPDVKHII6 Biochemistry24
   6DVDKDUD.DQG8HGDLUD+ Colloid Polym. Sci.271
    +LUDQR$ et al.Biopolymer97    'HUKDP % DQG +DUGLQJ - Biochim. Biophys. Acta.
1764    0LQWRQ$Biophys. J.88    .D\LWPD]HU$et al.Soft Matter9    .XULQRPDUX7et al.J. Pharm. Sci.103    $UDNDZD 7 DQG .LWD< Curr. Protein Pept. Sci. 15    0DWVXRND7et al.Biotechnol. Prog.25    7RPLWD 6 DQG 6KLUDNL . Biotechnol. Prog. 27    +LUDQR$et al.J. Biochem.27    7RPLWD6 et al.Biotechnol. Bioeng.109  263