ラマン分光法／顕微鏡法

SRS における進展がシングルセルの代謝イメージングのブレークスルーを誘導する

バーバラ・ゲフェルト

非侵襲的でラベルフリーな技術である誘導ラマン散乱（ SRS ）によって、重要な発見やツールが可能となっている。
ラマンイメージングは、生物試料を米ハーバード大（ Harvard Univer­

ロンビア大（ Columbia University ）の傷つけることなく、研究者が試料を染sity ）のサニー・シェ氏（ Sunney Xie ）研究者は最近、DO­SRS という、個々色する必要がない、非侵襲的な技術でのグループの開発によって、誘導ラマの細 胞 内 の変 化 を追 跡 するために、ある。このアプローチでは、組織をラン散乱（ SRS ）が、微弱で自然発生すSRS ベースの新たな拡 大手法であるスター走査するために励起レーザを用るラマンシグナルを 1 万倍以上に増幅DO­SRS を報告した。SRS に、化学トい、その成分の分子結合の分光学的特させることで、標準的なラマン技術をレーサーである D2 O（重水）を組み合わ性に基づいて化学組成を決定する。こ

改良する。これにより、ビデオレートせることで、代謝活動の可視化を可能の情報を用いて、ラマンイメージング（ 30 フレーム / 秒）な化学的なイメージとした（ 1 ）。

は試料のポイントごとに 3D 描写する。

ングが可能となる。

従来のラマン分光法は素晴らしく特異的な化学分析をもたらす一方で、極端に弱いシグナルには限界がある。そDO-SRS が代謝産物の進行を明らかにする

D2 O は、通常の水にある水素原子を重水素に置き換えたもので、通常の水のように振る舞い、少量なら摂取しても安全である。D2 O は in vivo（生体内）の場合には、高濃度な試料、そして数SRS はさまざまな段階で開発されてで細胞によって代謝され、新たに産生分から数時間という多くの時間を必要おり、生きた細胞内の活動を描くなど、されるタンパク質や脂質、DNA に取とする。

興味深い科学を可能としている。米コ

り込まれる。炭素とともに、重水素は化学結合を形成し、研究者が発見した

新たな脂質

新たなDNA

新たなタンパク質合成

図 1 生きた細胞が重水を取り込むと、新たに産生されるタンパク質や脂質、DNA に重 水 素 が 取 り 込 ま れ る。
SRS 顕 微 鏡 の照 射 下 では、シングルセル内でさまざまな高分子を同定できる。米カリフォルニア大アーバイン校（ University of California/Irvine ）のエリック・ポトマ化学教授（ Eric Potma ）は、本研究に参加していないが、この技術を美しくシンプルだと言い、「顕微鏡がより小型にな れ ば、 重 水 素 ラ ベ ル のSRS イメージングは、 より早期の腫瘍発見に貢献するかもしれない」と述べる。
（提供：コロンビア大ウェイ・ミン研究室）

ように、照射したときにさまざまな周波数で振動する。こうして、タンパク質、脂質、DNA といった高分子を同定でき、周波数特性を用いて、脳、皮膚、その他の臓器における in vivo での増加も追跡できる。
D2 O は、以前は代謝性変化を追跡するためにタンパク質や脂質をラベルするのに使われていたが、これらの手法
では多くの分光計と、体から細胞を大量に抽出する必要がある。新たな手法
では、細胞内の変化をリアルタイムに、in vivo で可視化できる。以前は細胞内のダイナミクスのスナップショットしか得られなかったが、今では「生きた40

2019.1 Laser Focus World Japanミラー3
ダイクロイックミラー

ガウスビームミラー
6ミラー
5

ディレイステージ

ポンプビームストークスビーム レンズ2レンズ1ミラー2

音響光学変調器
光ビームスプリッタ

光ダイオード

フィルタ

ベッセル
ビーム

アクシコン1

パルス
レーザ

コンデンサ
180°
試料レンズ
3レンズ
4波長

レンズ7

アクシコン2ミラー
7ミラー1

ステージとD移動ステージと接続対物レンズ

Mirror 8

2D走査ミラー
レンズ5 レンズ6ミラー4

図２ SRP 顕微鏡とトモグラフィイ
メージングシステムでは、調整可能なパルスレーザが、ポンプビームとストークスビームとして 1 組の同調したフェムト秒の列を発生する。ダイクロイックミラーで 2 つのビームを時空間的に組み合わせる前に、音響光学変調器がストークスビームを変調し、並進ステージがポンプビームを遅延させる。同一線上に重なったビームは 1 組のアキシコンに移り、そこではリング状のビームが発生する。ビームは、レーザ操作のために 2D のガルバノシス
テムに入り、対物レンズに移ってベッセルビームが生じる。試料を通過後、ベッセルビームはコンデンサで集束し、光ダイオードに向かう。光ダイオードの前に 2 つのショートパスフィル
タでストークスビームの成分が除去される。シグナル検出のためのロックイン増幅器の前に、研究室で作った共振増幅器が、光ダイオードで発生する光電流を増幅させる。

動物細胞の内部で何が起きているのれた。ある実験では、マウスの脳と大である。他の研究者は、別の SRS ベーか、連続的な画像を得ることができる」

腸におけるがん性細胞の分裂を観察

スの技術を開発している。米パデューと、共著者であるポスドク研究員のリし、タンパク質と脂質が重水素を取り大（ Purdue University ）のジーシン・チンヤン・シー氏（ Lingyan Shi ）は言う。

込み、腫瘍の周囲に明るいラインが現

ェン氏（ Ji­Xin Cheng ）のチームは、卵「新たなタンパク質、脂質、DNA 分子れることを観察した。これにより、「腫巣がん幹細胞（ CSC ）には非常に高レベが、いつ、どこで作られるのかを追跡

瘍をより容易に切除できる」とシー氏

ルの不飽和脂質が含まれていることをすることで、動物がどう成長し、加齢は言う。

明らかにするために、ハイパースペクし、そして怪我や病気のときにどう悪実験により、細胞発生と老化に関す

トル SRS を用いた研究を率いた。そし化するのか、より多くのことを知るこる多くの知見も得られた。例えば、高て、この特徴はそれらの細胞のマーカとができる」と、この研究の上席著者

齢の線虫ではタンパク質の凝集が観察ーのみならず、CSC 特異的療法の標的で あ る ウェイ・ ミ ン 化 学 教 授（ Wei

されたことから、DO­SRS イメージンとなる得ることを示した（ 2 ）。現在、米Min ）は述べる。

グはタンパク質沈着に関わる、加齢にボストン大（ Boston University ）フォ

この技術の将来的な応用には、腫瘍伴う疾患の追跡に利用でき得る。また、

トニクス・光電子工学のムスターカスの切除、そして頭部損傷、成長・代謝

仔マウスの脳発生では、各細胞の周囲主席教授であるチェン氏（ Cheng ）は、異常の発見を迅速かつ正確に行うことにミエリン鞘と呼ばれる絶縁性の脂質化学種を分析する体積イメージング技が挙げられる。

層の形成が観察された。この新たな技術である誘導ラマンプロジェクション

試験では、通常の水と D2 O の混合術により、子どもの適切な脳形成を追（ SRP ）の開発を続けている（ 3 ）。

物を線虫、マウス、ゼブラフィッシュ

跡できるだけなく、脳のミエリンが攻

体積イメージングは、複雑な 3D 試の胚に投与し、さまざまな組織で新た撃されて情報フローが阻害される疾患

料の全体積における定量的な分子デーに重水素ラベルされたタンパク質、脂である多発性硬化症

タを収集できるため、細胞代謝、脳機質、DNA が産生されるのを、SRS レ貢献できるかもしれない。

ーザを照射して数時間から数日にわたって観察した。実験により、健常組織患者の発見にも体積イメージングの SRP

能、発生学の研究では極めて重要である。最もシンプルな方法は、軸方向で光学的に切片化することだ（強く集束とがん性組織の差の詳細な描写など、コロンビア大の研究は、先端研究にしたレーザビームを必要とする）。もう興味深いかつ有用な応用が明らかにさ向けて SRS を活用する唯一の最新研究

１つのアプローチは、複数の角度から
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ラマン分光法／顕微鏡法

グに確かに応用できる。
チェン氏は、in situ（その場）で細胞内の小さな生体分子のモニタリングや代謝作用の理解を目的に、技術の有用信号用フォトダイオード性を見ている。知的メリットと広いインパクトに対するレビュー基準に基づ

顕微鏡
コントローラ

いて、彼のチームはさらなる技術開発のために 2018 年 7 月に全米科学財団

レーザ走査顕微鏡

可飽和吸収体976
アイソレータ nm

ErEr

Yb

コリメータ

ディレイ

周期的に分極するニオブ酸リチウム

通を目指した商業化を計画している。

手術中の組織病理に向けた SRH

976 アイソレータ
チューナブル
フィルタ
nm
976nm
コリメータ
Er

アイソレータ
976nm

高非線形ファイバ（ NSF ）の助成金を獲得し、広範な流チェン氏 の想 像 するシステムは、SRS の商業用機器の第 2 の種となるか参照用フォトダイオードもしれない。その後、2012 年に設立された米インベニオ・イメージング社（ Invenio Imaging ）は、ハーバード大化学・生化学科のシェ教授が率いる研

図３ 臨床装置は手術室にある他の機器との互換性が容易でなければならないため、統合の容易さは、インベニオ・イメージング社の完全に統合されたポータブルイメージング SRH 顕微鏡システ
ムにおいて重要な点であった。この設計を可能とさせる重要な要素は、ファイバ結合した顕微鏡とモーター駆動ステージ、二波長ファイバレーザモジュール、レーザ制御モジュール、顕微鏡制御モジュール、そして画像の取得、表示、処理を行うコンピュータである。レーザの略図では、上の軸がストークスビーム（赤）の発生を示し、下の軸がポンプビーム（オレンジ）の配置を示す。2 つのビームは、標本を通過する前に組み合わさる（紫）。

究がベースとなっており、米ミシガン大（ University of Michigan、UMich ）のダニエル・オリンジャー氏（ DanielOrringer ）の研究室に、最初に統合された SRS の研究用顕微鏡を 2015 年に納品した。これは、NSF の中小企業集めたイメージから 3D モデルを再構から 3D 体積の全化学組成を定量化で技術革新研究（ SBIR ）プログラム、国築するトモグラフィである。光シート

きる。しかし、SRP 顕微鏡は軸方向の立衛生研究所（ NIH ）の生体工学研究

蛍光顕微鏡（ LSFM ）と光プロジェクシ解像度が失われるため、チームは随伴パートナーシッププログラム、UMichョントモグラフィが高解像度かつ高速するトモグラフィ 手 法 を開 発 した。のトランスレーショナルリサーチ・商業で 3D イメージを行うが、これらは化学SRP と試料回転を組み合わせること化（ MTRAC ）プログラムによる。神経標的として蛍光ラベルを必要とし、生で、ガウスビームベースの SRS 切片よ外科の准教授であるオリンジャー氏と物学的機能を障害するかもしれない。

りも高速に、光学的な空間解像度で化

彼のチームは、400 人以上の患者からラベルフリーな SRP によって、3D学組成の 3D 分布の再構築が可能とな集めたサンプルを用いてシステムを評のサブミクロン解像度で、高速な体積る（さらに、より大きい体積のものを価 し た。 そ し て、NIH の 2016 年 の化学イメージングが可能となる。SRPより高速にイメージングできる）。

SBIR プログラムの資金を用いて、イでは、長距離にわたって軸方向に焦点シングルセルの実験によって、SRS

ンベニオ社のチームはファイバレーザを合わせ、インプットに使われるベッ切片イメージよりも SRP トモグラフィ技術を組み込んだ後続機器を開発しセルビームのレイリー 長 に従 っ て、イメージでは空間解像度がわずかに低た。これは、初の臨床の誘導ラマン組SRS 強度と検出されたシグナルが統合いことが確認されたが（ SRP 計測にお織学（ SRH ）イメージングシステムであする。

ける有効 NA が低いことが原因だ、ガる。2017年、脳神経外科会議（CNS）
は、標準的なガウスビームベースの SRS

ウス SRS は 1.07 に対してベッセル SRP

SRH の開発におけるオリンジャー氏の顕微鏡と比較して、ベッセルビームベは 0.88 ）、SRP トモグラフィは 3D 体積役目に対して、イノベーター・オブ・ザ・ースの SRP 顕微鏡は 2 次元の側方走査における生体分子の in vivo イメージンイヤーに彼の名を挙げた。

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2019.1 Laser Focus World JapanSRS 顕微鏡は、脳腫瘍の浸潤をフレ

トキシリン・エオジン染色組織の仮想的シングルセルの代謝イメージングにおッシュに、すなわちヒトの組織を処理なスライドを作るためのベースとして、いて非常にパワフルなツールとなってせずに発見できることがすでに示されSRSイメージを使う処理法だ。グループいる」。光学技術がシステムを発展さていた。2017 年、米ニューヨーク大は、92％以上の正確性と、予測診断にせ、研究者が応用を押し出すにつれて、（New York University）、米ブリガム・

おいて SRHと従来の組織学の一致を示

SRS がパワーと性能を上げ続けることアンド・ウィメンズ病院（ Brigham andす特異度（コーエンのカッパ係数、κは疑いようがなく、in vivo で高い空間・Women ’ s Hospital ）、 ハーバード大、>0.89 ）の両方を証明した。また、脳腫

時間解像度で代謝ダイナミクスのダイ

米ダナ・ファーバーがん研究所（ Dana­

瘍のサブタイプを 90％の正確性で予測レクトな可視化も可能にするだろう。

Farber Cancer Institute ）、UMich、できる機械学習処理を構築、評価した。

この種のイメージングは生体プロセス（4）

インベニオ・イメージング社と共同で書かれた論文で、オリンジャー氏は101 名の患者から採取した未処理の神経学的標本に、手術中にポータブルシステムで SRS 顕微鏡による最初の応用を記述した（ 5 ）。さらに、そのグループの SRHイメージを紹介した。すなわち、診断に必須の特徴を明らかにできるヘマパワーを上げる
チェン氏は明確に述べる。
「 SRS はを理解するのに必要不可欠であるため、生物科学がさらに進展することが期待できる。

参考文献（ 1 ）L. Shi et al., Nat. Commun., 6, 9, 1, 2995（ 2018 ）.
（ 2 ）J. Li et al. Cell Stem Cell, 20, 3, 303–314（ 2017 ）.
（ 3 ）X. Cheng et al. Nat. Commun., 8, 15117（ 2017 ）; doi:10.1038/ncomms15117.
（ 4 ）M. Ji et al., Sci. Transl. Med., 4, 5, 201, 201ra119（ 2013 ）.
（ 5 ）D. A. Orringer et al., Nat. Biomed. Eng., 1, 27（ 2017 ）.

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