No.123

分取用 AFC カラム TSKgel® FcR-IIIA-5PW について
─目

次─

ページ
1. はじめに1

2. 基本的性質

12 - 1. 充塡剤の性質

12 - 2. 標準的分離条件

22 - 3. 分離条件の影響

32 - 4. 試料負荷量の影響

42 - 5. 耐久性

42 - 6. 洗浄法

52 - 7. 保存安定性

13. 応用例

6（1）抗体の分離例

6（2）フラクションの分析と精製結果

7

4. おわりに

東ソー株式会社

8

1．はじめにに増加した分取用カラム TSKgel FcR-IIIA-5PW を商品

抗体医薬品は、ガンや自己免疫疾患などの治療薬とし化いたしました。本稿では、TSKgel FcR-IIIA-5PW のて需要がますます増大しており、世界各地で生産設備が基本的性質と応用例を紹介いたします。

新設、増強されています。抗体医薬品の均一性を担保するためには、さまざまな品質管理および品質分析が要求

2．基本的性質されます。特に、抗体の Fc 領域に存在する糖鎖構造の2-1．充塡剤の性質違いは、近年の研究で抗体医薬品の薬効、物理的安定性、TSKgel FcR-IIIA-5PW は、多孔性の親水性ポリマー

免疫原性、血中半減期など、重要な物性に影響すること

基材に、遺伝子組換え FcγRIIIa をリガンドとして導入が報告されており 1）－ 3）、研究段階のみならず生産バッした充塡剤を PEEK 製カラムに充塡した抗体分取用

チ毎に詳細な分析が必要とされています。

AFC カラムです。FcγRIIIa リガンドは、天然型のアミ抗体の糖鎖の違いを迅速に分析可能な製品として、当ノ酸配列の一部を改変して物理化学的安定性を向上させ

社では抗体医薬品の作用機序に密接に関わる「ヒト Fcており、FcR-IIIA-NPR と同一の構造を有しています。

受容体（FcγRIIIa）」を固定化した高性能アフィニティー多孔性の基材を用いることで、FcR-IIIA-NPR に対しクロマトグラフィー（AFC）カラム TSKgel FcR-IIIA-て 100 倍以上の吸着容量向上を達成しており、1 回の測NPR を販売しております。同カラムを用いることで、定で 5 mg 以上の抗体の分取が可能です。また、安定化糖鎖構造や活性に基づいた分離パターンが 30 分以内でした FcRγIIIa を使用することで優れた耐久性と長期保得られ、抗体医薬品の品質分析に有用と考えられます。

存安定性が得られています。
表 1 に分析用カラム FcR-IIIA-NPR と分取用カラム

一方で、FcR-IIIA-NPR で分離されるピーク成分をそれぞれ詳細に解析するためには mg オーダーの量を得る必FcR-IIIA-5PW の仕様の比較を示します。

要があります。このような背景により、結合容量を大幅

表 1 TSKgel FcR-IIIA-NPR および TSKgel FcR-IIIA-5PW の仕様
品番0023513

0023532

品

名TSKgel FcR-IIIA-NPR

TSKgel FcR-IIIA-5PW

特徴／使用目的

高分離能／高速分析用

高吸着容量／ラボスケール分取用

基材

親水性ポリマー（非多孔性）

親水性ポリマー（多孔性）

5 μm

10 μm

充填剤

平均粒子径
リガンド
サイズ

カラム

4.6 mm I.D. × 7.5 cm

材質
出荷溶媒
抗体負荷量
標準的な測定時間

使用条件

改変型ヒト FcγRIIIa（大腸菌生産）

適正流速
最大圧力損失pH 範囲

7.8 mm I.D. × 7.5 cm
PEEK®

0.025 % ProClin 300 + 0.65 mmol/L クエン酸 + 9.35 mmol/L クエン酸三ナトリウム（pH 6.5）
5 ～ 50 μg

最大≧ 5 mg

30 分

180 分

1.0 mL/min

0.3 mL/min

9.0 MPa

1.0 MPa

pH 4.0 ～ 8.0（短期）、pH 5.0 ～ 7.0（長期）温度

15 ～ 25 ℃

保管条件

出荷溶媒に置換し、冷蔵（2 ～ 8 ℃）
“ProClin” は Rohm and Haas Company の登録商標です。

─1─

2-2．標準的分離条件

りますので、ご注意ください。

多くの抗体は中性付近（pH 6.0 ～ 7.5）で FcγRIIIa にまた、抗体や夾雑物質の種類によっては、非特異的な吸着し、酸性条件下（pH 4.0 ～ 5.0）で溶出するため、吸着によりカラムに蓄積することで、徐々に抗体の保持時

TSKgel FcR-IIIA-5PW による抗体の分離には、通常、pH間が早くなることがあります。多くの場合、これらは静電の異なる2 液によるpHグラジエント溶出法が用いられます。

的な相互作用により吸着しているものと考えられ、NaCl溶離液としては、種々の緩衝液が使用できますが、幅広などの塩を 150 ～ 500 mmol/L 添加した緩衝液を適宜通い pH 範囲で緩衝能を有するクエン酸塩緩衝液が多用され液し て 洗 浄 す るか、 溶 離 液 A 及 び B に そ れ ぞ れ 150ます。一般的な CHO 細胞で作製したヒト IgG1 抗体を分離mmol/L 程度の NaCl を添加した緩衝液を使用することでする場合、吸着用溶離液（溶離液 A）として 50 mmol/L抑制可能です。

クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）
、溶出用溶離液（溶離表 2 に標準的な分離条件を示しますが、抗体によっ液 B）
として 50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）て最適条件が異なる場合がありますので、抗体ごとに条が用いられます。溶離液 A で予めカラムを平衡化した後（カ件検討の実施をお勧めします。

ラム容量の 3 倍量程度流す）、試料を注入して抗体を結合

FcγRIIIa リガンドの抗体親和性は、温度の影響を大きくさせます。その後、リニアグラジエントにて溶離液 B に切受けることが知られています。測定再現性を得るために、り替えて抗体を溶出させます。ピークが溶出した後、できカラムオーブンの使用を強く推奨します。図 1 にカラムオーるだけ速やかに溶離液 A にて再平衡化することで、酸性緩ブン温度を 15 ℃及び 25 ℃に設定して抗体を分離した際の衝液によるカラムの劣化を抑制できます。本カラムに使用クロマトグラムを示します。温度が高い状態では抗体へのされる FcγRIIIa リガンドは一定の耐酸性を有しますが、酸親和性が低下し、抗体保持時間が短くなることがわかりま性緩衝液への長時間暴露はカラムの劣化を早める原因となす。一方、ピークの分離はカラム温度が高い方が良好です。

表 2 標準的な分離条件

溶離液

条件 1

条件 2

Ａ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）
Ｂ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）

A ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液 +150 mmol/L NaCl（pH 6.0）
B ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液 +150 mmol/L NaCl（pH 4.0）

0 － 10 分 B 0 %10 － 130 分 B 0 % → B 100 %, リニアグラジエント
130 － 150 分 B 100 %※測定前後に 10 分間の平衡化ステップを実行

グラジエント条件
流速0.3 mL/min（平衡化ステップは 1.0 mL/min）

検出UV 280 nm

備考

標準的な分離条件

静電的相互作用による非特異的吸着を抑制する条件〈測定条件〉
カラム：TSKgel FcR-IIIA-5PW（7.8 mm I.D. × 7.5 cm)
溶離液Ａ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）
溶離液Ｂ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）
UV 280 nm

グラジエント：0－10 分 B 0 %15Υ010－130 分 B 0 %→100 %，リニアグラジエント

25Υ20406080100120140130－150 分 B 100 %流速：0.3 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：図中に記載

試料：ヒト化モノクローナル抗体，5 mgmin

図 1 カラム温度が分離に与える影響
─2─

2-3．分離条件の影響

グラジエント勾配については緩やかな方が、より良好な2 種のグラジエント勾配にて種々の流速でモノクロー分離が得られることがわかります。本抗体における最適ナル抗体の分離を行い、測定条件の違いが分離に与えるな測定条件は流速 0.3 mL/ 分、グラジエント時間 120 分

影響を確認しました（図 2）。流速に関しては低い方が、（B 0 - 100 %）と考えられました。

䜾䝷䝆䜶䞁䝖䠖 B 0 - 100 %, 60ศ
(1) ὶ㏿0.3 mL/ศ(2) ὶ㏿0.5 mL/ศ(3) ὶ㏿1.0 mL/ศ6030100502580402060301540201020105000UV 280 nm

120-2055657585min-1045556575min-530405060min䜾䝷䝆䜶䞁䝖䠖B 0 - 100 %, 120ศ(4) ὶ㏿0.3 mL/ศ40602530202015961010350-101230

4000min80 90 100 110 120 130-5(6) ὶ㏿1.0 mL/ศ153550

UV 280 nm(5) ὶ㏿0.5 mL/ศ60 70 80 90 100 110min-345556575

図 2 各測定条件における分離ピークの比較〈測定条件〉
カラム：TSKgel FcR-IIIA-5PW（7.8 mm I.D. × 7.5 cm)
溶離液 A：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）
溶離液 B：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）
グラジエント：図中に記載
流速：図中に記載

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃試

料：ヒト化モノクローナル抗体，1 mg
─3─

85 min95

2-4．試料負荷量の影響のクロマトグラムを示します。負荷量が小さい程ピーク

TSKgel FcR-IIIA-5PW は表面積の大きな多孔性の基分離が良い傾向がありますが、10 mg 負荷時にも本抗体材を使用しているため、高い抗体吸着容量を有していまに特徴的な 3 本のピークが確認できました。

す。図 3 に抗体負荷量を 1 ～ 10 mg まで変化させた際〈測定条件〉
カラム：TSKgel FcR-IIIA-5PW（7.8 mm I.D. × 7.5 cm）
溶離液 A：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）350

溶離液 B：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）

10 mg

300

グラジエント：0 － 10 分 B 0 %UV 280 nm

250

10 － 130 分 B 0% → 100 %，2005 mg

リニアグラジエント

150130 － 150 分 B 100 %100

流速：0.3 mL/min

50

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

試料：‌ヒト化モノクローナル抗体（試料負荷量は図中1 mg

0-50020406080100120140に記載）

min160

図 3 抗体負荷量が分離に与える影響

2-5．耐久性を示しますが、抗体の保持時間や分離度に顕著な変化はモノクローナル抗体を試料として、100 回の連続測定認められませんでした。

を行いました。図 4 に 10 回注入ごとのクロマトグラム〈測定条件〉
カラム：TSKgel FcR-IIIA-5PW（7.8 mm I.D. × 7.5 cm）
100回目

溶離液 A：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）

90回目

溶離液 B：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）
グラジエント：0 － 10 分 B 0 %

80回目

10 － 130 分 B 0 % → 100 %,UV 280 nm

70回目

リニアグラジエント

60回目

130 － 150 分 B 100 %

50回目

40回目
30回目
20回目
10回目
1回目

02040

60

80

100120140

流速：0.3 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃試

料：ヒト化モノクローナル抗体，1 mg※ク エン酸塩緩衝液はカビ等の微生物が発生し易いため、溶離液を 0.2 μm のフィルターでろ過する、定期

min
160

的に新しい溶離液に交換するなどの対策を適宜実施し

図 4 耐久性試験時のクロマトグラムてください。また、カラムとインジェクションバルブの間にラインフィルターの設置を推奨します。

─4─

2-6．洗浄法

ンドを劣化させる原因となりますので、洗浄剤としては精製対象の試料に依っては充塡剤の表面が汚染され、不適です。

抗体保持力や分離度の低下、圧力損失の上昇などが生じ2-7．保存安定性る可能性があります。このような現象が発生した際には、500 mmol/L の NaCl を含む緩衝液や 20 vol% のエ

図 5 に本カラムを指定の保存緩衝液封入下、10 ℃でタノールを含む緩衝液をインジェクター経由で 0.5 ～ 2.0

保管した際の抗体結合容量維持率、理論段数及びシンメmL 注入する方法により充塡剤の表面を洗浄することトリー係数の変化を示します。12 ヵ月以上の期間にで、性能を回復できることがあります。

亘って充塡剤上に固定化した FcγRIIIa リガンドが安定

本カラムに使用されている FcγRIIIa リガンドはアルして機能することがわかりました。ただし、本カラムのカリ耐久性が十分ではないため、洗浄液として水酸化ナリガンドは、各種プロテアーゼや微生物の影響により性トリウム水溶液等のアルカリ溶液は使用できません。ま能が低下する可能性がありますので、保管時には適切なた、たんぱく質の変性剤や高濃度の有機溶媒などもリガ管理が必要です。

350021.8

3000

1001.68060
Lot A0246810
保管期間（月）121500

Lot A
Lot B

500

Lot C
202000

1000

Lot B

4014

シンメトリー係数

2500
理論段数

抗体結合容量維持率（％）

1200

Lot C0246810
保管期間（月）12141.41.2

10.80.6

Lot A0.4

Lot B0.2

Lot C00246810
保管期間（月）1214

図 5 カラムの保存安定性〈抗体結合容量の測定条件〉〈理論段数およびシンメトリー係数の測定条件〉

カラム：TSKgel FcR-IIIA-5PW（7.8 mm I.D. × 7.5 cm）

カラム：TSKgel FcR-IIIA-5PW（7.8 mm I.D. × 7.5 cm）

溶離液 A：20 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）

溶離液：100 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液

溶離液 B：20 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）
グラジエント：0 － 30 分 B 0 %30 － 42 分 B 100 %＋ 100 mmol/L 硫酸ナトリウム（pH 6.7）
流速：1.0 mL/min

検出：UV 280 nm

流速：1.0 mL/min

温度：25 ℃

検

出：UV 280 nm

試料：1 % アセトン水溶液，10 μL

温度：25 ℃

試料：ヒトγ‐グロブリン，100 mg※ ‌カラム吸着分を回収し、吸着容量を測定しました─5─

3．応用例り 48 %、33 %、19 % でした。同様に同抗体 5 mg を分（1）抗体の分離例

取用カラム FcR-IIIA-5PW で精製して得たクロマトグラ

FcR-IIIA-5PW による抗体の分離例を以下に示しまムを図 7 に示します。溶出液が pH 5.0 に到達した時点す。抗体サンプルとして CHO 細胞で生産したヒト化モより抗体が溶出し、FcR-IIIA-NPR での分析結果と同様ノクローナル抗体をプロテイン A カラムで精製した試に 3 成分が確認できました。フラクションは抗体溶出時料を用いました。本抗体を分析用カラム FcR-IIIA-NPR

点より 2 分間隔で分取し、1 mol/L Tris-HCl 緩衝液（pHで測定した結果を図 6 に示します。成分がピーク 3 本9.0）を各 100 μL ずつ添加して中和しました。に分離され、それぞれのピーク面積の割合はピーク 1 よ〈測定条件〉
カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR（4.6 mm I.D. × 7.5 cm）
溶離液 A：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）
溶離液 B：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）

UV 280 nm

グラジエント：0 － 2 分 B 0 %2 － 20 分 B 0 % → 100 %，リニアグラジエント
20 － 25 分 B 100 %25 － 30 分 B 0 %051015min20

流速：1.0 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

試料：ヒト化モノクローナル抗体、20 μｇ

図 6 FcR-IIIA-NPR によるモノクローナル抗体の分離〈測定条件〉
カラム：TSKgel FcR-IIIA-5PW（7.8 mm I.D. × 7.5 cm）
2802409溶離液 A：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）8グラジエント：0 － 10 分 B 0 %溶離液 B：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）71606120805pH（破線）

UV 280 nm

20040
40-40020406080

100120140160min

3

図 7 FcR-IIIA-5PW によるモノクローナル抗体の分離

─6─

10 － 130 分 B 0 % → 100 %,リニアグラジエント
130 － 150 分 B 100 %流速：0.3 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

試料：ヒト化モノクローナル抗体，5 mg

（2）フラクションの分析と精製結果た。結果を図 8 に示します。各ピークについて純度 80% 以上のフラクションを混合すると、表 3 の精製結果分取した各フラクションを 280 nm の吸光度法により濃度を算出した後、FcR-IIIA-NPR を用いて分析しましが得られました。

〈測定条件〉
カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR（4.6 mm I.D. × 7.5 cm）

Fr 15

溶離液 A：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）

Fr 14

溶離液 B：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）

Fr 13

グラジエント：0 － 2 分 B 0 %Fr 12

2 － 20 分 B 0 % → 100 %，Fr 11

リニアグラジエント

Fr 1020 － 25 分 B 100 %UV 280 nm

Fr 925 － 30 分 B 0 %Fr 8
Fr 7Fr 6Fr 5Fr 4

流速：1.0 mL/min

検出：UV 280 nm

温度：25 ℃

試料：分取フラクション，各 20 μL

Fr 3Fr 2Fr 1051015min

51015min

UV 280 nm※0※参考に図６のクロマトグラムを再掲
図 8 フラクションの TSKgel FcR-IIIA-NPR による測定

表 3 精製結果
成分回収フラクション

純度［%］

収量［mg］

Peak 1Fr1 ～ Fr698.6

2.1

Peak 2

Fr9 ～ Fr1189.7

1.0

Peak 3

Fr13 ～ Fr1587.90.5

─7─

4．おわりに〈参考文献〉
1）‌Martin Schiestl, et al., Nature Biotechnology , 29, 310-

以 上、 抗 体 医 薬 品 向 け 分 取 用 AFC カ ラ ム で あ る
TSKgel FcR-IIIA-5PW について概説しました。FcR ア312（2011）

フィニティークロマトグラフィーは抗体医薬品の糖鎖構2）‌Jing Fang, et al., Biochemistry , 55, 860-868（2016）

造や活性に基づいた知見が得られるため、品質管理に有3）‌Dietmar Reusch, et al., Glycobiology , 25, 12, 13251334（2015）

用と考えられます。高速分析を行う場合は分析用カラム
FcR-IIIA-NPR を、各ピークを分取し、その構造、機能、安定性を評価する場合は、分取用カラム FcR-IIIA-5PWをご使用ください。

─8─

※ “TSKgel” は東ソー株式会社の登録商標です。

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