ライブセルイメージング／蛍光顕微鏡

オンザフライの光学超解像をシンプルなワンステップでトーマス・ヒューザー、マルセル・ミュラー、アンドレアス・マークヴィルト
電気光学変調器とコンシューマーレベルのグラフィックスカードを用いる新たなアプローチにより、超解像のイメージが瞬時に作成される。
超解像の光学顕微鏡は十分に性能がTechnologies ）、独フリードリヒ・シラ

即時 GPU 加速のオープンソース再構向上しており、今や商業的に実装されー 大（ Friedrich Schiller University ）築）と呼んでいる。て多く利用されている。しかしながらだ。このチームは、オンザフライで即ほとんどの場合、これらのシステムを時に超解像イメージを作成する新イメ

利用する人は、優れた光学解像度を得ージングシステムを開発している

パターン照射。

9ソースのイメージそれぞれに対して、るために代償を払う。すなわち、イメ

これを実現するため、研究チームは光学顕微鏡が解像できる限界においージング処理では通常、従来の顕微鏡超解像構造化照明顕微鏡法（ SR-SIM ）て、周期性をもつ干渉パターンを用いイメージングよりも膨大な時間を要すを用いた。SR-SIM は、2D 実装においる。このパターンは試料に照射され、る。この欠点に対して近年取り組んでて（ 3D 実装もある）、約 130nm の空間事前に塗布した薬剤中の蛍光物質が励いるのが、独ビーレフェルト大（ Uni-分解能を有する 1 つの最終イメージを起する。空間を照明で満たすために、3versity of Bielefeld ）の研究者らと独作成するために 9 ソースの取得を必要

つのイメージを異なる位相で、そしてライプニッツ・フォトニクス技術研究所とする（図 1 ）。研究者らは自分たちの60 度ずつずらした 3 つの異なる角度で（ Leibniz Institute for Photonic

SR-SIM 法を VIGOR（ビデオレートの照射する。パターンを発生させるため（1）に、変調可能で 2 値の光回折格子とし
図 １ ワンステップの手法は、空間分解能が130nm であるこのよう な 画 像 を 作 成 す る。
核（青）、ミトコンドリ
ア（緑）、細胞骨格（マゼンタ）を強調させるために異なる蛍光色素で染色した骨肉腫の生きた細胞を示す。て空間光変調器（ SLM ）を用いる。パターンはアルゴン・クリプトン（ ArKr ）レーザからの直径 12mm の平行レーザビームによって照射される（図 2 ）。
異なる蛍光色チャンネルに対応する
3 つの sCMOS カメラとつなげた開口数
1.45 の 60 倍 油 浸 対 物レンズにより、試料のイメージングが可能になる。このセットアップにより（図 3 ）、チームは最大で毎秒 63 フレーム（ fps ）の超解像蛍光イメージを取得して描写できた。このスピードに到達するため、研究者はイメージ再構築アルゴリズムをカスタマイズし、コンシューマーレベルのグラフィックスカードでランできるようにした。データ転送も含めて再5 µm構築処理にかかる時間は、9 の原画像から 1 つの SIM シーケンスに対して約20ms だ。

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2020.3 Laser Focus World JapanSLM200 mm
FM L200 mmL1P1ファイバ結合

F1P2250 mm
L3DIC13 mm
L4 (対物レンズ)

ミラー
DIC2ミラーP1: 4分の1波長板 (QWP)
P2: “ピザ”偏光板
FM: フーリエマスク

F2垂直向き（顕微鏡とは逆）L5250 mm

カメラ 1

BP1

DIC3LP1

図２ 新しい高速な構造化照明顕微鏡法の光学レイアウトには空間光変調器（ SLM、英フォ ース・ ディメンジョン・ ディスプレイ社（ Forth Dimension Displays ） の SXGA3DM ）が含まれている。SLM は変調可能で2 値の光回折格子として機能し、3 つの干渉パターンを発生させる。3つの干渉パターン（4分の 1 波長板、“ピザ”偏光板、フーリエマスク）は異なる位相で 3 つの異なる角度で試料に照射される。これらのパターンは、アルゴン・ク
リ プ ト ン（ ArKr ）レ ー ザ（米 コ ヒ レ ン ト 社（ Coherent ）の Innova 70C ）か ら の 直 径12mm の平行ビームによって照射される。

DIC4SP1 カメラ 2
LP2カメラ 3

図３

迅速なイメージ再構築の実現には、油のカメラ
再構築PC 浸対物レンズ（日オリンパス社（ Olympus ）2x G
カメラリンクGGPlanApo60x/1.45）とsCMOS
カメラ（こNvidia
60 65
512
2 5 fps
ットット
GPUの場合は独 PCO AG 社）から開始する。これ
lin sat.
145 M /s
ークーク
CUDA
OS
TCP
らが取得するデータは、再構築パイプライン
GG
メラリン
ドライバ
スタック
を通って堅牢性のために環状バッファにキャットット
NI-2-CUDA
フレー器ークーク
パラメータ
再構築
ッシュされる（後のオフライン分析のためにオドライGbE GbE
イメージNetwork
Network
S TCPスタック
スレッド（メー ー）プションでデータは保存できる）。研究者は、
環状バッファ 環状バッファ 環状バッファ
マイクロマ
ジャOS TCP stack
Network
Network
コンシューマー市場のグラフィクスカード（米RA
イメージ
SIMシーンス
airSIMプラグインの GTX 1060 ）をImgDisp ImgDisp エヌビディア社（ Nvidia ）ディスク シー ンス
OS TCPッフ
stackイメージ
器
fairSIM-Plugin
SIMき
用いてイメージ再構築アルゴリズムをランさ
fairSIM-VIGOR
Micro-Manager
ImageSender ッフ
せ、 最 大 63fps のスピードを実 現 できた。
イメージ
fairSIM-Plugin
VM XServer VIGOR（ビデオレートの即時 GPU 加速のオ
ファイルシス ム
ImageSenderープンソース再構築）プロジェクトの詳細はカメラPC
SSD
fairSIM プロジェクト（ fairsim.org ）を通じてストレージ自由に入手できる。

すべての SR-SIM セットアップは、生物学への応用

ライブセルイメージングを実施する

シンプルで直感的なオペレーションをオンザフライのイメージ再構築を生システム性能を検証するために研究者可能とするグラフィカル・ユーザー・イ

物学的な試料の描写で実証するためは、生きた U2OS 細胞内のミトコンド

ンタフェース 1 つを通じて制御できる。に、チームはヒト骨肉腫の上皮細胞リアを染色する MitoTracker グリーン

プラットフォームは、標準的な広視野（ U2OS 株）を使用した。蛍光ラベルをを使用した。多くの科学者は、オルガ

蛍光セットアップと似たユーザーエク用いて、広視野顕微鏡では分解能がな

ネラの超微細構造（改めて述べるが従スペリエンスをもたらす。これは、自いミトコンドリア膜や小胞体などの微来の広視野顕微鏡では分解能がない）動的でリアルタイムなイメージ再構築細構造を特異的に染色した。試料が移を、ミトコンドリアの機能と構造変化と描写を統合した設計によるものだ。

動してフォーカスが合ったときに広角の関係を解明できる可能性があるもの

ユーザーは対象エリアを選択し、それでどう即座に応答するか、そしてイメとみなしている。チームは、長い時間にフォーカスを合わせ、超解像の多色ージ描写を 250ms 以下の遅れでどう生枠によるモーションブラーを回避するイメージをビデオレート以上のスピー成させるか、ということを示した。まため、ちょうど 1 フレームあたり 5ms

ドで取得でき、処理が起きている間にた、超解像のイメージを利用して細胞の露出時間を用いて、サブ秒のフレー他の関係者と経験をシェアできる。

内の特定の領域を確認した。

ムレートでオルガネラのダイナミクス
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ライブセルイメージング／蛍光顕微鏡

ジキャプチャのフレーム間遅延を選択a)

Raw imagedataできる。こうしたオプションは、生きた細胞実験における光障害を制限するのに特に有効だ。例えば、ユーザーはInstantly
reconstructedimage

試料へのダメージが弱いモード（モーションブラーを和らげるために高速露出で毎秒 1 イメージをキャプチャする）で閲覧できる。そして特定のエリアで対象のダイナミクスを発見し、高速な最大フレームレートに切り替えできる。
これらのプロセスは自動化でき、研究者がすぐにイメージ処理するのを補助b)c)d)することで、インテリジェントなタイプの顕微鏡を実現するようになるかもしれない。
研究者は自身の成果の詳細をfairSIM プロジェクト（ fairsim.org ）でコミュニティ向けに自由に利用できる10 µmようにしている。このプロジェクトはフリーでオープンソースのツールやリ

図４ 迅速な超解像イメージ再構築により、高速なライブセルイメージングが可能になる（ a ）。
MitoTracker グ リーン で 染 色 し た ミ ト コ ン ド リ ア を 示 す 488nm 蛍 光 チャン ネ ル（ b ）と、
ER-Tracker レッドでラベルした小胞体を描写した 647nm チャンネル（ c ）の 2 つの SIM 再構築により、重なっている部分があることがわかる（ d ）。

ソースを提供しており、これらはオープンソースライセンス下に置かれている。彼らは SR-SIM 向けの光学機械設計だけでなく、多色拡張、電子・ソフを描写できた。図 4 に、タイムラプスデータ（取得した位相の間で限定されたトウェア制御コンポーネント、再構築で取得したものからの抜粋を示し、ダフィードバック）の取得、それに続く専ソフトウェア向けの設計図も共有してイナミクスをハイライトする。クリス

用ワークステーションでのイメージ再構いる。この手段を通じて、他者に推奨テとよばれる内膜の折りたたみ構造を築がある。1 ステップの統合された手法し、自分たちの手法をコピーして適応含むミトコンドリア膜は、広視野イメ

では、完全な超解像データが実験操作する、すなわちオンザフライの再構成

ージでは識別できないが、SIM イメー中に即時に取得できる。

を持つ現在の SR-SIM 顕微鏡システム

ジでは明確に描写できた。
研究者は SIM 再構築を観察でき、そフレキシブルで自由に利用可をアップグレードして、別の SR-SIM実装を開発するよう希望している。例の中には実験中にリアルタイムでのミ新しく統合されたシステムは素晴ら

えば、ノンリニア SIM、最大 NA 対物

トコンドリアのダイナミクスの描写も含しい柔軟性を有しており、科学者はイレンズが利用できる全反射照明蛍光まれた。これにより、実験とダイレクメージング条件を素早く調節でき、例（ TIRF ）SIM、さらには複数平面のストに作用できる。例えば、対象領域間えば照明時間やタイムラプスのイメーキームの検出もあり得るかもしれない。の移動、特定のイベントの記録、効果の破棄もできる。これらはすべて処理後の待機時間がない。こうした性能はSR-SIM のイメージングフローを完全に変え、分かれた 2 つのステップを 1 つにまとめる。本来の 2 ステップ処理には生

参考文献（ 1 ）A. Markwirth et al., Nat. Commun., 10, 4315（ 2019 ）; doi:10.1038/s41467-019-12165-x.
著者紹介
トーマス・ヒューザーはビーレフェルト大物理学教授で生物分子フォトニクスリサーチグループのリーダー、マルセル・ミュラーは同大博士研究員、アンドレアス・マークヴィルトは同大博士号取得候補者である。e-mail: thomas.huser@physik.uni-bielefeld.de
www2.physik.uni-bielefeld.de/542.html?&L=1LFWJ

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