The Journal of The Kyushu Dental Society

Vol.78 No.1・2 June 2024
第78巻

第1・2号

令和６年６月ONLINE ISSN：1880-8719

九州歯科学会Kyushu Dental Society

PRINT ISSN：0368-6833

九州歯会誌

J Kyushu Dent Soc

九州歯会誌

66（１）：01 〜 06，2012．

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九州歯科学会雑誌
第78巻

第１・２号

（令和６年６月）
目次

原著
歯学部におけるクリティカルシンキングおよびロジカルライティングの実践力の差が及ぼす学修効果の違いと主観的評価に影響を与える因子……………………………………………………………………… 渡辺 崇文・笠井 信吾・福泉 隆喜

1

短期間低酸素刺激によるヒト歯髄幹細胞K4DTの分化誘導に及ぼす影響…………………………………………………………… 中垣（梶原）優那・折本

愛・郡司掛（米谷）香織

徐

嘉鍵・中富

有吉

渉・豊野

川元

龍夫

千尋・臼井

通彦

孝・小野堅太郎
12

The…Journalofthe…Kyushu…Dental…Society
Vol.……78 No.…1・2
Original Work
Influence of differential practical skills and factors affecting subjective evaluations ofeducational programs on critical thinking and logical writing in the school of dentistry
Takafumi Watanabe, Shingo Kasai, Takaki Fukuizumi… ……………………………………………… … …1

The Effects of Short-term Hypoxic on the Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells K4DT
Yuna Kajiwara-Nakagaki, Ai Orimoto,  Kaori Kometani-Gunjigake,
Chia-Chien Hsu, Chihiro Nakatomi, Michihiko Usui,
Wataru Ariyoshi, Takashi Toyono, Kentaro Ono,

Tatsuo Kawamoto…………………………………………………………………………………………… … 12

九州歯会誌

78（１・２）：1歯学部における批判的思考等の学修効果と主観的評価〜 11，2024．
（渡辺）

―1―

歯学部におけるクリティカルシンキングおよびロジカルライティングの実践力の差が及ぼす学修効果の違いと主観的評価に影響を与える因子
渡

辺

崇

文１・笠

井

信

吾２・福

泉

隆

喜３

１

九州歯科大学顎口腔欠損再構築学分野

２

九州歯科大学歯周病学分野

３

九州歯科大学共通基盤教育部門

令和６年１月10日受付
令和６年４月22日受理

Inﬂuence of differential practical skills and factors affecting subjective evaluations ofeducational programs on critical thinking and logical writing in the school of dentistry
Takafumi Watanabe １, Shingo Kasai ２, Takaki Fukuizumi ３

１

Division of Occlusion & Maxillofacial Reconstruction,
Department of Oral Functions, Kyushu Dental University

２

Division of Periodontology, Department of Oral Functions, Kyushu Dental University

３

Section of primary dental education, Kyushu Dental University

Abstract
Our university’s first-year education program teaches students critical thinking and logical writing, aspects
necessary for university study and personal growth. Previously, we conducted a survey on the learning effects of afirst-year education program. The results suggested that learning effects depend on the “critical thinking test” results
before attending the program, such as measures to increase student satisfaction, are needed. It also analyzed thedifferences in learning effectiveness and subjective evaluation between the top and low-performing groups and thedifferences in subjective evaluation with teachers. This study conducts a structural covariance analysis of therelationship between factors affecting subjective evaluation of the training content, learning environment, andinstructional content, as well as student satisfaction. It identified and clarified the points in instruction and issues
regarding instructional policy that should be focused on. Although learning effects were observed between the top-

責任者への連絡先：渡辺崇文〒803-8580

福岡県北九州市小倉北区真鶴2-6-1

九州歯科大学顎口腔欠損再構築学分野

TEL：093-582-1131
FAX：093-582-1286
Takafumi Watanabe
address：Division of Occlusion & Maxillofacial Reconstruction, Department of Oral
Functions, Kyushu Dental University (2-6-1 Manazuru, Kokurakita-ku Kitakyushu, Fukuoka, 803-8580, JAPAN)
E-mail: r15watanabe@fa.kyu-dent.ac.jp

―2―

九州歯会誌

第78巻第１・２号

2024

and bottom-performing groups, some items were rated differently with respect to the subjective evaluation ofsatisfaction with the training. In addition, students and teachers tended to have low self-evaluations of each other.
The instruction should prioritize the improvement of abilities in the “hidden premise.” Improvements in instructional
methods include efforts to obtain feedback, eliciting several opinions and devising instructions that allow students toexperience the effects of learning. This suggests that strengthening “broad instructional skills with compassion” iscrucial.

Key words：First-year experience, critical thinking, logical writing, exploratory factor analysis (EFA), structural equation
modeling (SEM)抄

録

本学の初年次教育では１年次生を対象に，大学での学びおよび人格的な成長に必要な「考える力」と「主張する力」
であるクリティカルシンキングおよびロジカルライティングに関する教育を行っている．過去にわれわれは，その学
修効果について調査を行った結果，受講前の「批判的思考テスト」の成績の違いによって学修効果に差がある可能性
や，学生満足度を向上させる取り組みの必要性が示唆された．そこで本研究は，成績上位群と成績下位群の学修効果
や主観的評価の違い，教員との授業評価の違いについての分析に加え，実習内容，学修環境，指導内容に対する主観的評価に影響を及ぼす因子と学生満足度との関連性について調査し，指導で注力すべき点や指導方針についての課題点を明らかにすることを目的とした．その結果，成績上位群と成績下位群ともに受講による一定の学修効果は認められた一方で，実習の満足度に関する主観的評価では評価に差が認められた．また，学生群と教員群の比較では互いに自己評価が低い傾向があることがわかった．指導で優先して注力すべき項目は「隠れた前提」における能力の向上であることがわかった．指導方法の改善点は，互いにフィードバックが得られるような取り組みや平等に多くの意見を引き出すこと，学修効果を実感させるような指導の工夫が挙げられ，「思いやりのある幅広い指導能力」を強化することが特に重要な課題であることが示唆された．
キーワード：初年次教育，クリティカルシンキング，ロジカルライティング，探索的因子分析，共分散構造分析

Ⅰ．緒言育の一環として，１年次生前期にクリティカルシンキン
グおよびロジカルライティングを学修する正規必修科目

学生が自ら学び考える習慣を身に付け，新しい学びの「基礎教育セミナー」（以下，セミナーという）を開講して段階への円滑な移行を学士課程教育の入口において支援いる．クリティカルシンキングとは，自分の推論過程をすることが重要であるといわれている１）．文部科学省の論理的，客観的に吟味する反省的思考で，学問を学ぶた

調査報告（令和４年11月）によると，令和２年度においめ，さらには社会人として必要なスキルや態度として位て全国の96.8％の大学が初年次教育を導入しているが，置づけられる３）．また，ロジカルライティングとは自分「論理的思考や問題発見・解決能力の向上のためのプロの意見や主張を，相手にわかりやすく伝えるための文章

グラム」を実施している大学は69.8％に留まっている２）．

作成法である４）．歯学部新入生に対するこれらのスキル

なかでも，歯学部新入生に対する初年次教育は，全般的の学修効果や満足度との関連について検証した報告はほなスタディ・スキルを学修するものが多い．本学では，

とんど見当たらない．

初年次教育におけるスタディ・スキルのなかでも，大学われわれは過去に，歯学部における初年次教育としてでの学びおよび人格的な成長に必要な論理的な思考「考実施したセミナーによるクリティカルシンキングおよびえる力」や「主張する力」の向上を図るため，初年次教ロジカルライティングの学修効果について調査した５）．

歯学部における批判的思考等の学修効果と主観的評価（渡辺）―3―

その結果，セミナーの受講によってクリティカルシンキ

る．ただし，教員は授業アンケートのみ実施した．

ングおよびロジカルライティングのスキルを有意に向上

１）セミナー受講後のクリティカルシンキングおよびロ

できることが示されたが，受講前の「批判的思考テスト」

ジカルライティングの実践力の成績の違いによって学修効果に差がある可能性や，学セミナーの終講時に定期試験に代って実施される確認

生満足度を向上させる取り組みの必要性が示唆された．

テストの結果から実践力を評価した．
この確認テストは，

しかしながら，成績上位者と成績下位者ではクリティカ

与えられたテーマといくつかの図表から問題点を抽出

ルシンキングおよびロジカルライティングの学修効果にし，それに対する根拠に基づいた解決策を考え，論理的どのような差があるのかや，学生満足度を向上させるたに記述させることでクリティカルシンキングおよびロジ

めにはどのような取り組みが必要であるかについては不カルライティングの実践力を60点満点で評価するもの

明である．

である．
点数化に際しては，
各項目を４段階（評価０～３）

そこで本研究では，本学における初年次教育の課題点で評価するルーブリック（表１）を利用した．本ルーブを明らかにするため，①クリティカルシンキングおよびリックは，セミナーで使用したテキスト「クリティカル

ロジカルライティングの実践力がついた学生とついてな

シンキング・ロジカルライティング」（（株）ベネッセi-

い学生の，セミナーの受講による学修効果や主観的評価

キャリア）４）における「トライアングルチェック」を改の違い，②教員と学生の指導における認識の違い，③実

変し作成した．この「トライアングルチェック」はロジ

習内容，学修環境，指導内容に対する主観的評価に影響

カルライティングのスキルを評価する「主張・意見」にを及ぼす因子と学生満足度との関連性の３つについて着関する２項目，「根拠」に関する５項目，「念押し」に関目した．なお，項目③の分析には共分散構造分析を用いする１項目の合計８項目からなるチェックリストであた．共分散構造分析は質問項目に対する回答のような観る．このチェックリストに根拠の確かさや矛盾の有無，

測可能なデータ（観測変数）をもとに，直接観測できない

文章の完成度や量などに関する項目を追加した．さらに抽象的な概念（構成概念）を仮定し，その構成概念や観測応用力が試される項目１，
２，
３，
５，
７，
９，11，12はルー

変数がどのような関連性を持つかを検討するための統計

ブリックの評価を２倍して６点満点とし，その他の項目手法である．その結果は円や四角，矢印を利用したパス

４，６，８，10は３点満点として重み付けを行うことで図によって表現され，複雑な変数間の関係を示すことが合計60点満点とした．評価に際しては，このルーブリッ

できる ．これらの分析から，学生の実践力やスキル，クを利用して採点担当教員１名で行った．

主観的評価の傾向を把握し，指導で注力すべき点や指導２）
セミナー受講前後のクリティカルシンキングおよび

６）

方針について検討することを本研究の目的とした．
Ⅱ．方法

１．調査対象ロジカルライティングのスキル
テキストの冒頭と末尾に付属するセルフチェック用の「クリシン度診断」および「トライアングルチェック」
を使用してセミナー受講前後のスキルの評価を行った．

本研究の調査対象は令和4年度の歯学科1年次生全員「クリシン度診断」はクリティカルシンキングにおける（97名）および，指導にあたった教員（12名）とした．除

３つの項目（「議論を正確に把握する」，「表れていない考外基準は，学生では過去にセミナーを受講した経験のあえに着目する」「根拠自体が妥当か確認する」
，
）
について，

る者，対面で受講できなかった者，アンケートに欠測値

その姿勢と能力を評価するものである．クリティカルシ

を含む対象者（リストワイズ除去法）とし，教員ではアンンキングの姿勢においては，１つの項目に対して３つのケートの分析を行う者，アンケートに欠測値を含む対象設問があり，
各４段階評価（「１：あてはまらない」～「４：者（リストワイズ除去法）とした．最終的に１年次生（87

あてはまる」）であるため，12点満点とした．クリティ名），指導にあたった教員（９名）を対象として分析を行っカルシンキングの能力においては，「議論を正確に把握

た．

する」
，
「表れていない考えに着目する」の項目が３段階

２．調査内容評価，「根拠自体が妥当か確認する」の項目が４段階評

調査内容はセミナー受講後のクリティカルシンキング

価のため，前者を３点満点，後者を４点満点とした．「トおよびロジカルライティングの実践力，セミナー受講前

ライアングルチェック」では，ロジカルライティングの後のクリティカルシンキングおよびロジカルライティン

スキルを評価する全８項目について各１点，８点満点でグのスキル，授業アンケートによる授業評価の３つであ

評価した．

―4―

九州歯会誌

第78巻第１・２号

2024の実践力がついた学生とついていない学生の学修効果や

３）授業アンケート
授業アンケートは２部構成となっており，前半が実習

主観的評価の違いを把握するために層別化を行った．わの満足度に関する主観的評価で，後半が実習の振り返り

れわれが過去に行った研究５）では，「批判的思考テスト」

に関する調査内容となっている．

の得点順位によって，４階級に層別化して分析した結果，前半の実習の満足度に関する主観的評価では，「実習指導への満足度」に関する先行研究

７-10）

上位２階級と下位２階級の学生で，セミナー受講後の得のアンケート項

点の増加に異なる傾向が認められた．このことを踏まえ目を参考に一部改変して用いた．「実習内容」，「実習班」，て，層別化は確認テスト（60点満点）の結果の中央値を「指導内容」，「満足度」に関わる合計25の質問項目につ用いて，成績上位群と成績下位群の２階級とした．また，いて，各尺度とも５件法（「１：全く当てはまらない」～

成績上位群と成績下位群のルーブリックの各評価項目に「５：よく当てはまる」）により評価した．ただし，「総合おける得点の違いを評価するためにMann-WhitneyのU的な満足度」については10段階（「１：不満」～「10：検定を行い２群間の比較を行った．

満足」）で評価した．

２）セミナー受講前後のクリティカルシンキングおよび後半の実習の振り返りに関する調査では，多肢選択式

ロジカルライティングのスキル（単一回答法）で実施した．テキストの中で「一番難しかっ

成績上位群と成績下位群の学修効果を評価するため

た，もしくは分かりにくかった部分はどこか」についてに，セミナー受講前後のクリティカルシンキングの姿勢，

は，10個の選択肢のうちから１つを選択，実習中「発クリティカルシンキングの能力，ロジカルライティング

言しやすいと感じるときはどんなときか」については５の能力の各項目について，それぞれの群でWilcoxonの個の選択肢のうちから１つを選択させた．

符号付き順位検定を行い前後比較した．また，各項目に

３．分析方法

おける成績上位群と成績下位群のスキルの違いを評価す１）
確認テストの結果を用いた層別化とルーブリックのるためにMann-WhitneyのU検定を行い２群間の比較を

各評価項目の得点

行った．

クリティカルシンキングおよびロジカルライティング３）
成績上位群と成績下位群の授業アンケート結果の比較

表１

確認テストの評価に使用したルーブリック

歯学部における批判的思考等の学修効果と主観的評価（渡辺）

成績上位群と成績下位群の実習の満足度に関する主観Ⅲ．結的 評 価 の 各 項 目 に お け る 回 答 結 果 に つ い て，Mann-

WhitneyのU検定を行い比較検討した．

４）学生群と教員群の授業アンケート結果の比較
学生群と教員群の実習の満足度に関する主観的評価の―5―

果１．確認テストの結果とルーブリックの各評価項目における得点の２群間の比較
学生全体の確認テストの結果は，平均点40.9，標準偏各項目における回答結果について，Mann-WhitneyのU差8.32，中央値42，最高点60，最低点15であった（図１）．

検定を行い比較検討した．また，実習の振り返りに関す

層別化では，分析対象の87名の得点の中央値は42点でる調査の集計では，回答結果が成績上位群，成績下位群，あったため，42点以上を成績上位群（n=45），42点未満

教員群の各群で異なるかどうかについてフィッシャーのを成績下位群（n=42）として分類した．学年全体のルー

正確確率検定により独立性の検定を行った．

ブリックの各評価項目における平均得点の結果では，重５）
主観的評価に影響を及ぼす因子と学生満足度との関み付けを行った項目のうち，項目12（ 文章量）が最も評

連性の検討

価が高く（平均値5.22，標準偏差1.74），項目７（示して学生の授業アンケートによる主観的評価から直接問題いる根拠は確からしい），項目９（それぞれの根拠に矛盾点を把握することは，授業改善において有効な手段の一がないように書いている）
が評価が低かった（それぞれ平つであるが，個々の学生の意見について網羅的に改善す

均値2.62，標準偏差2.32，平均値2.69，標準偏差2.21）．

ることは難しい．また，満足度のような尺度は複合的な重み付けを行っていないその他の項目では，項目４（根ものであるため，注力すべき課題点が把握しにくい．そ拠は３つ挙げている）が最も高く（平均値2.78，標準偏差こで本研究では，経済学や教育心理学などの分野で用い

0.55）
，項目６
（根拠には事実を書いている），項目10（最られる探索的因子分析および共分散構造分析を行った

後に主張・意見と一致する念押しをしている）が評価が11）低かった（それぞれ平均値2.26，標準偏差0.87，平均値．探索的因子分析を行うことで，主観的評価の背景にある因子を抽象概念化し，指導改善の方向性を見出す．

2.26，標準偏差1.11）（図２）．

さらに共分散構造分析により，学生満足度に各因子がどルーブリックの各評価項目における得点の２群間の比の程度の影響関係があるかを明らかにすることで，指導較の結果では，項目１（主張・意見や立場をはっきり書における注力すべき課題点について検討した．具体的にいている），項目２（主張・意見はテーマに答えている）

は，実習の満足度に関する主観的評価の25項目のうち，以外の項目において，成績上位群は成績下位群と比較し直接満足度を評価する４項目（アンケート項目１，８，て有意に平均得点が高かった（図３）．

18，25）を除く21項目の回答に対し，探索的因子分析（最２．セミナー受講前後のクリティカルシンキングおよび

尤法，プロマックス回転）を行い，因子負荷量が0.4以下の項目を除外し，再度因子分析を行って因子を抽出した．
得られた因子を構成概念として共分散構造分析を行い，その関連性について検討した．
統計処理はすべての検定においてR（version 4.2.1），RStudio（version 2022.12.0+353）13）を使用し，有12）

意水準は５％とした．
４．倫理的配慮
本研究の調査開始前に，対象者に本研究の主旨を十分に説明し，同意を得た者を対象に実施した．本調査の結果は，匿名化して集計した．匿名化符号と個人識別情報との対応表は研究代表者のみが厳重に管理し，必要な場合の対応表の閲覧は，研究代表者の臨席の場でのみ可能とすることで，個人情報保護に配慮した．
なお，本研究は，九州歯科大学研究倫理委員会の承認（承認番号：22-11）を得て実施した．
図１

学生全体の確認テストの得点の分布

―6―

九州歯会誌

第78巻第１・２号

2024

ロジカルライティングのスキルの変化と成績上位群

妥当か確認する」項目においては，成績上位群，成績下と成績下位群の２群間のスキルの違い

位群ともにセミナー受講後に中央値が有意に向上した．

１）クリティカルシンキングの姿勢
セミナー受講前後のスキルの比較では，成績上位群，
成績下位群ともに「議論を正確に把握する」，「表れていまた，成績上位群と成績下位群の２群間の比較では，いずれの項目においても有意差は認めなかった
（表２）
．
３）
ロジカルライティングの能力ない考えに着目する」，「根拠自体が妥当か確認する」のセミナー受講前後のスキルの比較では，ロジカルライ

いずれの項目においても，セミナー受講後に中央値が有ティングの能力において，成績上位群，成績下位群とも意に向上した．また，成績上位群と成績下位群の２群間にセミナー受講後に中央値が有意に向上した．また，成の比較では，セミナー受講後の「表れていない考えに着績上位群と成績下位群の２群間の比較では，いずれの項

目する」項目において成績上位群の中央値が有意に高目においても有意差は認めなかった（表２）．

かった（表２）．

３．成績上位群と成績下位群の実習の満足度に関する主

２）クリティカルシンキングの能力

観的評価

セミナー受講前後のスキルの比較では，成績上位群は成績上位群と成績下位群の主観的評価の比較では，ア「議論を正確に把握する」項目において，セミナー受講後

ンケート項目６，14，19において，成績下位群の方がに中央値が有意に向上した一方で，成績下位群では有意有意に評価が低かった（表３）．

差が認められなかった．
「表れていない考えに着目する」

４．学生群と教員群の実習の満足度に関する主観的評価，

項目においては，
成績上位群，
成績下位群ともに，セミナー受講前後で有意な変化が認められなかった．
「根拠自体が

図２

学生全体のルーブリックの各評価項目の平均得点

および実習の振り返りに関する調査結果
学生群と教員群の主観的評価の比較では，アンケート

図３

成績上位群と成績下位群のルーブリックの各評価項目の平均得点の比較表２

セミナー受講前後のスキルの変化，および成績上位群と成績下位群の２群間のスキルの違い

歯学部における批判的思考等の学修効果と主観的評価（渡辺）―7―

項目３，４，８，９，18，19，20，21，22，24において，７，13であることから「グループワークでの手応え」

教員群の方が有意に評価が低く，アンケート項目12はと定義して構成概念とした．「思いやりのある幅広い指

学生群の方が有意に評価が低かった（表３）．

導能力」のクロンバックのα係数は0.90，「グループワー

実習の振り返りに関する調査の集計では，「一番難し

クでの手応え」の因子のα係数は0.69であり，内的整合

かった，もしくは分かりにくかった部分はどこか」の質性はほぼ満たしていた．「思いやりのある幅広い指導能

問では，成績上位群，成績下位群，教員群いずれにおい力」の因子を高く評価すれば，「グループワークでの手ても「隠れた前提」の回答が最も多く，次いで「根拠を応え」も向上するという傾向があると考えられるため，たくさん出す」の回答が多かった．フィッシャーの正確これら２つの構成概念間に影響関係があることを仮定

確率検定の結果，３群間に有意差は認められなかった（p

し，総合満足度との関連性を評価した．共分散構造分析= 0.837）．「発言しやすいと感じるときはどんなときか」を行った結果では，円で囲ったものは構成概念，四角での質問では，成績上位群，成績下位群ともに「順番に回囲ったものは観測変数として表現され，矢印を受け取る

答を求められたとき」，「多数の意見が出たとき」の回答

変数は，矢印が出発している変数から影響を受けているが多かった．教員の回答では「順番に回答を求められたことを表し，矢印に付随する係数（絶対値）
は影響の強さとき」が最も多く，次点で「少数の意見が出たとき」「多，を示している（図５）．全ての係数（標準化推定値）に関し数の意見が出たとき」，「指名されたとき」の回答が多かって，５ %水準で有意な結果が得られた．適合度指標はた．フィッシャーの正確確率検定の結果，３群間に有意差は認められなかった（p = 0.463）．（図４）．
５．主観的評価に影響を及ぼす因子と学生満足度との関CFI=1.00，RMSEA=0.00，SRMR＝0.059であり，良好な適合を示した．構成概念である「思いやりのある幅広い指導能力」から「グループワークでの手応え」への係
数は0.52であった．また，２つの構成概念から「総合的連性の検討
学生の実習の満足度に関する主観的評価の21項目のな満足度」への係数はそれぞれ0.33，0.40であった．構回答に対し探索的因子分析を行った結果，解釈可能な２

成概念の「思いやりのある幅広い指導能力」からは観測

因子７項目が得られた（表４）．そこで，構成概念を以下変数である「納得のいく指導」，「能力に合わせた指導」のように定義した．第1因子の変数はアンケート項目への係数が大きく（0.97，0.89），構成概念の「グループ19，21，23であることから「思いやりのある幅広い指ワークでの手応え」からは観測変数である「自身の能力

導能力」とし，第２因子の変数はアンケート項目２，
３，

や価値への確信」への係数が比較的大きかった（0.73）．

表３

実習満足度に関する主観的評価の内容と成績上位群と成績下位群の比較，および学生群と教員群の比較

―8―

九州歯会誌

Ⅳ．考

第78巻第１・２号

2024

２．成績上位群および成績下位群のセミナーの学修効果

察

について
１）
クリティカルシンキングの姿勢

１．学生の実践力の傾向について
学年全体のルーブリックの各評価項目における平均得

クリティカルシンキングの姿勢はいずれの項目におい点の結果では，根拠の数や文章の量に関する評価は高ても，成績上位群，成績下位群ともに有意に学修効果がかったことから，学生全体の実践力の傾向として与えら認められたことから，セミナーはクリティカルシンキン

れた課題の量をこなすことはできると考えられる．
一方，グの姿勢向上に有効であった．しかし一方で，成績上位

根拠の質を問うような項目においては評価が低かったこ

群と成績下位群の２群間の比較では，セミナー受講後のとから，提示する根拠が矛盾なく論証を行うことができ「表れていない考えに着目する」姿勢において学修効果

るような質の高い根拠であるかを判断する実践力が不足に差が認められた．クリティカルシンキングの姿勢とはしている可能性があることがわかった．成績上位群と成さまざまな情報や知識に対する探究心のことであり，自績下位群の比較では，多くの項目で有意差が認められたらの信念と異なる情報を受け入れるための重要な態度でことから全般的な実践力に大きな差が生じていることがあるといわれている14）．セミナーでは，与えられたテー

明らかになった．

マに沿って疑問点や着眼点について考え，自らの主張を

図４
表４

実習の振り返りに関するアンケート調査結果

探索的因子分析の結果

図５

共分散構造分析の結果

歯学部における批判的思考等の学修効果と主観的評価（渡辺）―9―

発表し，互いに意見交換するようなグループワークをテ

実習時間では，隠れた前提が存在することに対する気づキストの例題ごとに行う．そのため，意見の異なる相手

きや見抜こうとする姿勢は得られても，「表れていないの主張に対して質問をする機会がすべての学生に多く与考えに着目する」能力を習得することはやや難しかった

えられる．相手がその主張に至った背景について探る質ものと考える．したがって，本項目においてはより丁寧問を考えるとき，この「表れてない考えに着目する」姿な指導が必要であると考える．

勢が必要となる．教育学部を対象とした初年次教育に関「根拠自体が妥当か確認する」能力では，成績上位群，する先行研究では，さまざまな質問にふれる経験を増や

成績下位群ともに有意に学修効果が認められ，成績上位

すことにより質問する態度や質問を出す力が向上すると群と成績下位群のスキルに有意差は認められなかった．

15,16）．この結果は他学部のものセミナーで使用したテキストでは，根拠の妥当性を確認

ではあるが，初年次教育として実施されているため本学するために比較対照群，調査対象数，その他の要因の３と履修状況は大きく変わらないものと考えられる．したつについて問うことを挙げている．これは根拠として提がって，本セミナーにおいても，互いに質問させるだけ示されている図表から数値や意味を読み解く必要がある

でなく，どのような質問をしたか多数の学生同士で共有が，歯学部受験生の多くが理系科目選択者であることかさせるような取り組みを行うことで，グループワークにら，習得しやすいスキルであったものと推察される．

いう結果が示されているおける「表れていない考えに着目する」姿勢の学修効果

これまでに本セミナーと同一のテキストを用いたクリの差を改善していくことができると考えられる．

ティカルシンキングの能力に関する先行研究がいくつか

２）クリティカルシンキングの能力報告されている．心理学専攻の大学生を対象とした先行「議論を正確に把握する」能力では，成績上位群は有研究19）では，「議論を正確に把握する」，「根拠自体が妥

意に学修効果が認められたが，成績下位群では有意差が当か確認する」能力が有意に向上するという結果におい認められずそれぞれ異なる傾向を示したことから，一部て本研究との類似点が認められた．一方，我々の先行研の学生に対してセミナーの学修効果が不十分だった可能究５）では，「根拠自体が妥当か確認する」能力が有意に性がある．ただし，成績上位群と成績下位群のスキルに向上することは同様であったが，「議論を正確に把握す

有意差は認められなかった．議論は単純な形をしたものる」能力には有意差が認められず，「表れていない考えばかりではなく，複数の根拠をもとに１つの主張がなさに着目する」能力が有意に向上するという結果が本研究れたり，主張が根拠となって別の主張が導き出されたりとの相違点であった．この相違点の考察として，本セミする複雑なものも存在する．それゆえ，議論となる問題

ナーと心理学専攻の大学生を対象とした先行研究の受講点を正確に把握することは，それに続く主張や根拠のず期間が前期のみの半期であるのに対して，我々の先行研れを防ぎ，矛盾のない論証を行うための重要なステップ

究でのセミナーの受講期間が前後期の通年であったたである．問題・仮説・主題の明確化は，批判的思考の認め，「表れていない考えに着目する」能力の学修効果に

知的過程の出発点であるとされている ．このことから受講期間の差が影響した可能性が考えられる．「表れてクリティカルシンキングの指導においては，はじめに議いない考えに着目する」能力を向上させるためには受講論となっている問題点は何かということを学生が把握で期間についても見直す必要があると考えられる．

きているかについて確認しながら指導する必要があると３）
ロジカルライティングの能力

17）

考えられる．

ロジカルライティングの能力では，成績上位群，成績「表れていない考えに着目する」能力においては，成下位群ともに有意に学修効果が認められ，成績上位群と績上位群，成績下位群ともに有意な学修効果が認められ

成績下位群のスキルに有意差は認められなかった．テキ

ず，成績上位群と成績下位群のスキルに有意差は認めら

ストでは，論理的な文章を組み立てるための思考ツールれなかった．また，学年全体の実践力の傾向としてルー「ロジライチャート」を用い３），「主張や意見を考える」，

ブリックの評価項目のうち隠れた前提や論理の飛躍がな「根拠をたくさん出す」，「整理する」，「文章にする」のいことを評価する項目３の得点は比較的低かった．これ

４つのステップを段階的に行うことで，文章の骨組みをらのことから，多くの学生に対して，本項目に対するセ

作成する指導を行う．大学で必要とされる「書く力」を

ミナーの学修効果が不十分である可能性が示された．隠養うためには，論旨の一貫性や文章の構成を意識させる

れた前提を見抜くためには，背景となる知識や社会，文ような指導が必要とされる20）．頭の中の考えを文章にす

化，個人の多様性への理解が必要である４,18）．限られたるプロセスを視覚化できる「ロジライチャート」は多く

― 10 ―

九州歯会誌

第78巻第１・２号

2024の学生に対してロジカルライティングのスキル向上に有る「根拠自体が妥当か確認する」実践力についても改善

効なツールであったと考えられる．

すべき点があることがわかった．これらの論理の力を鍛

３．成績上位群と成績下位群の実習の満足度に関する主えるためには実技による地道なトレーニングが必要であ

観的評価の違いについてるといわれている21,22）．そのため，指導内容の改善策と成績上位群と比較して，成績下位群の学生はクリティ

しては，個々の学生の学修状況に配慮しながら，より実

カルシンキングおよびロジカルライティングのスキルの践的な内容を加えることが有効であると考える．また，

学修効果やディスカッションを通じた自分の意見の深ま

指導方法の改善策としては，平等に多くの意見を引き出りを感じにくいことから，より丁寧に指導を進めていく

せるように指導者が順番に発言を促し，学生が自ら発言必要がある．また，成績上位群と比較して，成績下位群

しやすい環境を作り出すことや，個々のスキルに合わせの学生は指導者が自分の意思を尊重していると感じにくて学修効果を実感させるような工夫をすることが重要でいため，学生全員に均等に寄り添うように指導する必要ある．

があると考えられる．
４．学生群と教員群の実習の満足度に関する主観的評価，および実習の振り返りに関する違いについて

本研究の成績上位群と成績下位群の分析では，セミ
ナー終講時に行われる確認テストによって層別化を行った．そのためセミナーによる学修効果のほかに，もとも実習の満足度に関する主観的評価の調査では，学生群と有しているスキルも確認テストの結果に影響していると比較して教員群は，自身の指導内容や指導に使用する可能性がある．各群のセミナーの学修効果について正確

テキストの理解しやすさ，適切な実習の進度に関して評に分析するためには，セミナー前の実践力を把握するこ価が低かったことから，学生が考えているよりも教員のとが今後の検討課題である．

自己評価が低いことがわかった．また，班におけるリー５．実習内容，学修環境，指導内容に対する主観的評価に

ダーシップは学生群の方が評価が低かったことから，教影響を及ぼす因子と学生満足度との関連性について員が考えているよりも学生の自己評価が低いことがわ

探索的因子分析および共分散構造分析の結果，「思いかった．これらのことから，実習の満足度の向上を図る

やりのある幅広い指導能力」は，学生の実習満足度に関ために，学生と教員の双方に両者のアンケート結果をする主観的評価の21項目の回答のうち，学生にとってフィードバックすることが重要である．

「納得のいく指導」であるかや学生の「能力に合わせた

実習の振り返りに関する調査では，「一番難しかった，指導」であるかの項目に強く影響が表れることがわかっ

もしくは分かりにくかった部分」は成績上位群，成績下た．また，「グループワークでの手応え」は，学生の実位群，教員群ともに「表れていない考えに着目する」ス

習満足度に関する主観的評価の21項目の回答のうち，キルを学ぶ「隠れた前提」の部分だという回答が多く，「自身の能力や価値への確信」や「積極的な実習態度」

３群間に有意差は認められなかったことから，セミナーの項目に強く影響が表れることがわかった．学生の「総を受講する学生だけでなく，指導する教員も同様に学修

合的な満足度」との関連性では，「思いやりのある幅広

しにくい部分だという認識があると考えられる．確認テ

い指導能力」，「グループワークでの手応え」はそれぞれストにおける同項目の評価平均値が低いことやセミナー「総合的な満足度」に影響を与え，さらに「思いやりの前後の学修効果に有意差が認められなかったことも併せある幅広い指導能力」は「グループワークでの手応え」て考察すると，セミナーにおける「隠れた前提」の指導にも影響を及ぼすという関連性があることがわかった．

は，最も注力すべき項目であることが明らかとなった．

つまり，「思いやりのある幅広い指導能力」は「総合的「発言しやすいと感じるとき」では成績上位群，成績下な満足度」に対して直接的に影響する上に，「思いやり位群，教員群ともに「順番に回答を求められたとき」とのある幅広い指導能力」から「グループワークでの手応いう回答が多く，３群間に有意差は認められなかったこえ」を経由して「総合的な満足度」に影響を及ぼすといとから，教員が学生に発言させるタイミングに問題はな

う間接的な影響も期待できることから，教員の「思いやかったものと考えられる．

りのある幅広い指導能力」の向上を図ることは学生の満

上記の１～４の考察を小括すると，優先して改善すべ

足度向上に最も有効であることが明らかとなった．
大学・

き項目は，セミナー受講後における「表れていない考え

短大生の講義や演習の授業評価に関する他の研究ではに着目する」能力の向上であり，セミナー受講後におけ23）

る「議論を正確に把握する」能力や，確認テストにおけ生のスキルの習熟度の向上も学生の授業満足度の評価に，教員の指導における努力が必要になるとともに，学

歯学部における批判的思考等の学修効果と主観的評価（渡辺）影響を及ぼしているという結果が報告されている．以上のことから具体的な方策としては，学生が納得のいくわ
かりやすい指導を心がけることや，あらかじめ学生の能力を可視化するアセスメントを利用し，能力に合わせた指導を行うことが挙げられる．さらに，学生の課題として実習の振り返りなどのレポートのみではなく，単元ごとに習熟度を図るような小テストを実施して学生の学修状況を把握しつつ，学生にフィードバックをすることで，学生がスキル向上の手応えを感じるような工夫が必要である．教員はこのような指導能力を高める努力や工夫をすることが今後の課題であることが示唆された．
Ⅴ．結論

セミナー受講による学修効果は，成績上位群と成績下位群で共通する点が多く認められた一方で，主観的評価
においては評価が異なる項目が認められた．指導方法の改善点は，平等に多くの意見を引き出すことや学修効果を実感させるような指導の工夫が挙げられ，「思いやりのある幅広い指導能力」を強化することが特に重要な課題であることが示唆された．
なお，本論文の一部は，第71回 九州地区大学教育研究協議会（令和５年９月９日，大分）
において発表した．

― 11 ―

検討，九州歯科学会雑誌 72：7-17, 2018.

６）豊田秀樹：共分散構造分析[Ｒ編]東京図書，東京，2014，24-43.

構造方程式モデリング，７）関裕也, 松本直人, 隆島研吾, 関貴子：学生が満足する実習
指導因子の検討，理学療法学 33：334-337, 2006.

８）中村修也, 赤倉貴子：授業形態ごとの満足度の要因分析，日本教育工学会論文誌 42：165-168, 2018.

９）西田昌彦：基礎物理の授業を受講した学生の達成感とその授業評価・成績との相関・因果関係の分析，工学教育 59：
3-10, 2011.

10）阿部武彦, 田嶋拓也, 木村春彦：多変量解析による授業アン

ケート分析と授業改善に関する考察，工学教育 54：136140, 2006.

11）豊田秀樹：測定・評価と共分散構造モデル，教育心理学年報
36：119-127, 1997.

12）R Core Team (2022). R: A language and environment

for statistical computing. R Foundation for StatisticalComputing, Vienna, Austria. URL https://www.
R-project.org/.
13）Posit team (2022). RStudio: Integrated Development
Environment for R. Posit Software, PBC, Boston,
MA. URL http://www.posit.co/.
14）平山るみ, 楠見孝：批判的思考態度が結論導出プロセスに及ぼす影響--証拠評価と結論生成課題を用いての検討，教育心理学研究 52：186-198, 2004.
15）道田泰司：問いのある教育，琉球大学教育学部紀要 71：
105-117, 2007.

16）道田泰司：授業においてさまざまな質問経験をすることがⅥ．引用文献１）中央教育審議会：新たな未来を築くための大学教員の質的転換に向けて-生涯学び続け，主体的に考える力を育成する大学へ-，（2012年8月28日）

２）文部科学省高等教育局大学教育・入試課：令和2年度の大学

https://www.
mext.go.jp/a_menu/koutou/daigaku/04052801/1417336_00009.
（最終アクセス日：2023年11月22日）
htm.
３）楠見孝, 田中優子, 平山るみ：批判的思考力を育成する大学
初年次教育の実践と評価，認知科学 19：69-82, 2012.
４）林創, 平山るみ, 山本直子：クリティカルシンキング・ロジ
における教育内容等の改革状況について

カルライティング「型」で身につける学びの土台，第8版

ed，ベネッセi-キャリア，岡山，2023, 30-37.
５）福泉隆喜, 鯨吉夫, 中原孝洋, 深井康成, 海寳康臣, 吉野賢
一：歯学部における初年次教育プログラムによるクリティ

カルシンキングおよびロジカルライティングの学修効果の質問態度と質問力に及ぼす効果，教育心理学研究 59：193205, 2011.

17）楠見孝：批判的思考の能力と態度の測定. 教育測定 カリキュ
ラム開発講座研究会, 第6回研究会，1-18, 2005.

18）楠見孝, 服部弘, 一色伸夫：第84回公開シンポジウム 批判的思考力を身につける・育む，子ども学，75-102, 2013.

19）菊島正浩, 寺本妙子, 柴原宜幸：大学生における批判的思考
力と態度の育成を目的とした教育プログラムの実践と評価，
日本教育工学会論文誌 41：427-437, 2018.

20）安藤葉子：大学で必要とされる「書く力」とは，文化学園大学・文化学園大学短期大学部紀要 49：133-143, 2018.

21）野矢茂樹：論理トレーニング101題，産業図書，2001，1-6.
22）野矢茂樹：論理トレーニング，産業図書，1997，1-3.

23）谷口るり子：授業評価アンケートを用いた授業の総合評価に影響する要因の分析，日本教育工学会論文誌 37：145152, 2013.

―
九州歯会誌
12 ―

78（１・２）：12 〜 20，2024．

九州歯会誌

第78巻第１・２号

2024

短期間低酸素刺激によるヒト歯髄幹細胞K4DTの分化誘導に及ぼす影響
中垣（梶原）優那１，２・折 本
徐嘉 鍵２・中 富 千
有 吉
渉５・豊 野川 元 龍 夫１愛３・郡司掛（米谷）香織１
尋２・臼 井 通 彦４
孝６・小 野 堅太郎２１九州歯科大学顎口腔機能矯正学分野

２

九州歯科大学生理学分野

３

九州歯科大学口腔保存治療学分野

４九州歯科大学歯周病学分野

５

九州歯科大学感染分子生物学分野

６

九州歯科大学ラーニングデザイン教育推進学分野

令和６年３月28日受付
令和６年４月22日受理

The Effects of Short-term Hypoxic on the Differentiation of
Human Dental Pulp Stem Cells K4DT
Yuna Kajiwara-Nakagaki １, ２, Ai Orimoto ３, Kaori Kometani-Gunjigake １,
Chia-Chien Hsu ２, Chihiro Nakatomi ２, Michihiko Usui ４,
Wataru Ariyoshi ５, Takashi Toyono ６, Kentaro Ono ２,
Tatsuo Kawamoto １

１

Division of Orofacial Functions and Orthodontics, Kyushu Dental University

２

Division of Physiology, Kyushu Dental University

３

Division of Endodontics and Restorative Dentistry, Kyushu Dental University

４

Division of Periodontology, Kyushu Dental University

５

Division of Infections and Molecular Biology, Kyushu Dental University

６

Division of Promoting learning design for innovative education, Kyushu Dental University

責任者への連絡先：郡司掛（米谷）香織〒803-8580

北九州市小倉北区真鶴2-6-1

九州歯科大学顎口腔機能矯正学分野

TEL：093-582-1131
Kaori Kometani-Gunjigake
Division of Orofacial Functions and Orthodontics, Kyushu Dental University,
Kokurakita-ku, Kitakyushu, Fukuoka, 803-8580, Japan
E-mail：k-kaori@kyu-dent.ac.jp

短期間低酸素刺激によるK4DTの分化誘導に及ぼす影響（中垣 他）― 13 ―

Abstract
Hypoxic stimulation of dental pulp cells can enhance cell proliferation and increase stemness. However, dental pulp
cells obtained from extracted teeth contain both differentiated cells, such as odontoblasts and fibroblasts, andundifferentiated dental pulp stem cells. In this study, we investigated the effects of short-term hypoxic stimulation on
immortalized human dental pulp stem cells (K4DT). Hypoxic stimulation was carried out by culturing cells in 3%
oxygen for 2, 4, or 6 hours. mRNA expression of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) significantly increased after
2 and 4 hours of hypoxic stimulation, and protein levels were confirmed to be increased by Western blotting. Cell
viability of K4DT increased significantly after 4 hours under hypoxic conditions. mRNA expression of vascularendothelial growth factor A, a known target gene of HIF-1α, significantly increased after 6 hours of hypoxic
stimulation; in contrast, mRNA expression of osteogenic markers alkaline phosphatase and collagen I, as well as the
adipogenic marker lipoprotein lipase, were decreased. Fluorescence intensities of mesenchymal stem cell markers did
not change in flow cytometric analysis. To examine the effects of hypoxic stimulation on differentiated K4DT cells,
they were treated with osteogenic differentiation medium for 14 days. Compared with undifferentiated cells,
osteogenic-differentiated K4DT cells displayed significantly increased HIF-1α mRNA expression that was unchanged
following induction by hypoxic stimulation. These results suggest that dental pulp stem cells promote angiogenesis
under hypoxic stimulation.

Key words：K4DT, short-term hypoxic , HIF-1α, vascular endothelial growth factor A, angiogenesis
抄録

歯髄細胞への低酸素刺激は細胞増殖能を高め，幹細胞性が上昇すると報告されている．しかし，抜去歯から採取された歯髄細胞には，象牙芽細胞や線維芽細胞などの分化細胞だけでなく，未分化な歯髄幹細胞も含まれている．本研
究では，無限分裂ヒト歯髄幹細胞（K4DT）に対する短期間低酸素刺激による分化・脱分化への影響を検討した．低酸
素刺激として，3%酸素，5%二酸化炭素，92%窒素の混合ガス下で2，4，6時間培養した．2，4時間の低酸素刺激に
より低酸素誘導因子hypoxia-inducible factor 1α（HIF-1α）のmRNA発現は有意に上昇し，ウェスタンブロッティン
グ法にてタンパク質量の増加を確認した．低酸素環境下において，K4DT の細胞生存率は4時間後に有意に上昇していた．HIF-1αの標的遺伝子として知られる血管内皮細胞増殖因子 vascular endothelial growth factor AのmRNA発現は6時間の低酸素刺激で有意に上昇していたが，骨分化マーカー alkaline phosphataseとcollagen Iおよび脂肪分化マー
カー lipoprotein lipaseのmRNA発現は低下していた．フローサイトメトリー解析において，間葉系幹細胞のマーカーの蛍光強度は変化しなかった．低酸素刺激による分化K4DTへの影響を検討するため，K4DTを骨分化培地にて14日間処理した．未分化細胞と比べて，骨分化K4DTは著しくHIF-1αのmRNA発現が増加し，低酸素刺激によるHIF-1
αのmRNA発現に変化はなかった．これらの結果より，歯髄幹細胞は低酸素刺激により血管新生を促進する可能性が示唆された．
キーワード： K4DT，短期間低酸素，HIF-1α，vascular endothelial growth factor A，血管新生

緒言

歯髄への血流が減少し，長期間低酸素状態になっている
ことが予想されている１，２）．局所麻酔薬であるキシロカ

歯科医療において，歯の外傷，う蝕や歯周病による炎

インは血管収縮薬アドレナリンが含まれており，血流低症，あるいは矯正治療による根尖部への圧迫などにより下により麻酔効果の増強がなされている．よって，局所

― 14 ―

九州歯会誌

麻酔により歯髄内は短期間低酸素状態になっていると報３）

告されている ．低酸素状態に陥ると，細胞内では低酸素誘導因子Hypoxia-Inducible Factor 1 α（HIF-1α）が産生され，環境に適応するような生体反応が起こることがよく知られている４，５，６） ．HIF-1αは，細胞の低酸素状態への適応を調節する重要な転写因子であり，様々な遺伝子発現を調節して，細胞の代謝調節，生存能力の維 持， 特 に 血 管 上 皮 成 長 因 子vascular endothelial

growth factor（VEGF）の発現を増加させて血管新生を促進する．血管新生は，歯髄組織への酸素と栄養素の供

2024

（10%）
，抗菌薬
（１%: ペニシリ
Bovine Serum（FBS）
ン-ストレプトマイシン溶液； Wako，Osaka，Japan）
を添加した高グルコースDMEM培地（Wako）を使用
し，37℃，５% CO2の加湿下で培養した．培地は３日ごとに交換した．細胞は，コンフルエントになったことを確認して低酸素刺激を与えた．低酸素は，３% O2，

５% CO2，
92% N2の混合ガスで２，４，６時間維持した．
２．骨分化誘導
骨分化誘導は，FBS
（10%）
，抗菌薬
（１%: ペニシリン-ストレプトマイシン溶液: Wako）を添加したMEMα培地（Wako）に骨芽細胞分化試薬キット（0.01µMデキサ

給を改善する７，８）．
歯髄細胞は再生医療におけるドナー細胞としても注目を浴びている第78巻第１・２号

９，10，11）．歯髄内には治癒再生の起点とな

メタゾン，６mM β-グリセロールリン酸，50µg/mlア

スコルビン酸: Takara Bio Inc，Shiga，Japan）を添加る歯髄幹細胞を含んでおり，間葉系幹細胞の一つであるした培地を用いて，キットのプロトコルに従って７-14とされている12）．歯髄幹細胞は，ラット歯髄において歯日間行った．誘導培地は３日ごとに交換した．

髄中央の血管周囲部に豊富に存在すると報告されている

３．細胞生存率測定

Cell-Counting Kit-8 （CCK-8; Dojindo，
得られた歯髄細胞は，硬組織から摘出されるまで一時的
Kumamoto，Japan）を用いて，細胞生存率の評価を行っに数時間の低酸素状態となる．
た．測定には，波長450 nmで相対的な細胞生存率を評
これまでの研究では，ヒト歯髄細胞への48時間低酸
価 し た（Bio-Tek Synergy H1; Winooski， VT，
素刺激後に HIF-1αの発現が上昇し，骨芽・象牙芽細
USA）．
14）
胞への分化促進が報告されている ．さらには，数日
４．定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）
間に及ぶ長い低酸素環境下での歯髄細胞の培養により，細胞は，RNAqueous Total RNA Isolation Kit （Ambion
細胞増殖能の上昇や幹細胞マーカーの発現促進が引き起
Inc，Austin，TX，USA）を用いて，Total RNAを抽出し，15，16）
こされる．しかしながら，歯髄細胞は象牙芽細胞
DNase処理（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，や線維芽細胞など多くの分化細胞種の集まりであり，そUSA）し，0.5µgのRNAをSuperScript VILO Master Mix
れぞれの細胞において個別の反応は調べられていない．
（Thermo Fisher Scientific）
を用いてcDNAに逆転写した．
無限分裂ヒト歯髄幹細胞K4DT（以下K4DT）は，変異Power UpTM SYBR Green Master Mix（Applied型サイクリン依存性キナーゼ４（CDK4R24C）, サイク
Biosystems，Foster City，CA，USA）を使用し，cDNAを
リ ンD（Cyclin D １）， テ ロ メ ラ ー ゼ 逆 転 写 酵 素
QuantStudio3 Real-time PCR system（Thermo Fisher（TERT）の３種類の遺伝子発現によって細胞の無限分
Scientific）で増幅した．定量はGAPDHを内在性コント裂を誘導する手法（導入する遺伝子の末尾の文字からロールとして，ΔCt法およびΔΔCt法で行った．以下のプライマーを使用した（表１）．
K4DT法と呼ぶ）を用いて樹立されたヒト歯髄幹細胞由
17）５．ウェスタンブロッティング
来の無限分裂細胞である . K4DTは, 元々のヒト歯髄サンプルバッファー（Wako）を用いてタンパク質を幹細胞のゲノム安定性と分化能を維持したまま無限に増13）．さらに智歯の抜去や矯正治療での便宜抜歯によって殖できるため，歯髄研究において非常に有用な性質を有抽出した．細胞から抽出したタンパク質濃度は，タンパしている．そこで, 本研究ではK4DTを用いて短期間低ク 質 ア ッ セ イ 試 薬（Apro Science Group，Osaka ，酸素刺激（２－６時間）がヒト歯髄幹細胞の分化能に及ぼす影響を遺伝子発現や間葉系幹細胞マーカーの発現変動の解析により検討した．
材料および方法
１．細胞培養
無 限 分 裂 ヒ ト 歯 髄 幹 細 胞K4DTの 培 養 は17），Fetal

Japan）を用いて測定した．20µgのタンパク質を7.5%ポ

リアクリルアミドゲル電気泳動（Bio-Rad，Hercules，

CA ，USA）により分離した．ゲル上のタンパク質は，Trans-Blot Turbo Transfer System（Bio-Rad）を用い てPVDF膜（Bio-Rad）に 転 写 し た．PVDF膜 を ブ
ロ ッ キ ン グ 溶 液（Bullet Blocking One , Nacalai
Tesque ，Kyoto ，Japan）で7分間ブロッキングした後，

短期間低酸素刺激によるK4DTの分化誘導に及ぼす影響（中垣 他）

HIF-1α に 対 す る 一 次 抗 体（1:2000，Cat. No:
GTX127309; GeneTex, Irvine, CA，USA）で室温12― 15 ―

で30分 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た． コ ン ト ロ ー ル に は

FITC標識されたマウス IgG1，κアイソタイプコント
ロール抗体を用いた．抗体は全て Becton Dickinson
Tween-20（TBST，20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）， （San Jose，CA，USA）か ら 購 入 し た． 検 出 に は150 mmol/L NaCl，0.1 % Tween-20を含む）で５分間
CytoFlex フローサイトメトリーシステム（Beckman
３ 回 洗 浄 し た 後， ２ 次 抗 体 と し てhorseradish
Coulter，Brea，CA，USA）を用いて解析した．
標
識
（1
25
000
７．統計解析
peroxidase
anti-rabbit IgG : ,; Jackson
データは全て平均値±標準誤差で示した．独立した実Immuno Research，West Grove，PA，USA）を使用
験数をnで示した．統計解析はGraphPad Prism ９ソフ
し，１時間インキュベートした．TBSTで５分間３回洗浄 し た 後，Immobilon Western HRP Substrate
ト ウ ェ ア（ version 9 . 3 . 1 for Windows, 2021 ,（Millipore，Bedford，MA，USA）を用いて化学発光
GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA）を使で検出し，画像はChemiDoc Touch MPイメージング
用し，正規性を確認した上で２群間比較にStudentʼs t
シ ス テ ム（Bio-Rad）で 取 得 し た． 取 得 し た 画 像 は，
testおよび３群以上の比較にOne-way ANOVA test後のDunnett's post hoc testを行った．p<0.05を統計学的ImageJソ フ ト ウ ェ ア（ バ ー ジ ョ ン1.53e，Nationalに有意であるとした．
，
，
，
）
で定量
Institutes of Health Bethesda MD USA
し た． ま た コ ン ト ロ ー ル と し て 抗 β-ア ク チ ン 抗 体
結 果（1:5,000，Santa Cruz Biotechnology，CA，USA）を用いてタンパク質バンドの密度を標準化した．
１．K4DTの低酸素刺激によるHIF-1αの発現量変化
６．フローサイトメトリー
細胞を２，４，６時間低酸素刺激したときのHIF-1αのおおよそ 1.0×106個の細胞を，0.5％ FBSおよび２
遺伝子およびタンパク質発現量を測定した．HIF-1αの
mMEDTAを含むPBS溶液45µlで懸濁し，その細胞懸mRNA発現量は，コントロールと比較して2，4時間で濁溶液にFITC標識された CD44
有意に高く，６時間においても高い傾向を認めた（図１（Cat. No: 560977），
73（
561254），90（555595），）．また
1αのタンパク質発現量も，低酸素２時
CD Cat. No:
CD Cat. No:
A
HIFCD105（Cat. No: 561443），CD34（Cat. No: 560942）， 間時点でコントロールと比較して高い傾向を認め，４，６時間で有意に高かった（図１B）．
CD45（Cat. No: 560976）抗体５µl を加え，遮光し４℃
時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た． ト リ ス 緩 衝 生 理 食 塩 水

表１

PCR primer

― 16 ―

２．K4DTの低酸素刺激による細胞生存率および分化マーカー発現量変化

九州歯会誌第78巻第１・２号

2024

トリーを用いて検討した．通常酸素培養（Normoxia）および低酸素刺激（２，４，６時間Hypoxia）を行ったK4DT

K4DTにおける低酸素刺激による細胞増殖への影響をの間葉系幹細胞マーカー発現はコントロールのアイソタ調べるために細胞生存率を計測した．コントロール

イプと比べて高く，造血幹細胞マーカーの発現はアイソ（Normoxia）と比較して４時間低酸素刺激（Hypoxia）にタイプの蛍光強度と一致した（図３A-D）．また，通常

おいて有意に上昇し，６時間においても高い傾向にあっ

酸素時と比べて低酸素刺激した細胞における間葉系幹細た（図２A）．血管新生への影響を調べるために血管内胞マーカーの発現量に変化はなかった（図３E-J）．

皮細胞増殖因子 vascular endothelial growth factor

A（VEGFA）のmRNA発現量を検討したところ，６時間
低酸素刺激において有意に増加した（図２B）．
分化への影響を調べるために骨分化マーカー alkaline
phosphatase（ALP）とcollagen I（COL1）および脂肪分 化 マ ー カ ー CCAAT-enhancer-binding proteins（C/EBP）とlipoprotein lipase（LPL）の発現量の変化を検討した．
mRNA
ALP，COL1およびLPLの mRNA発現は，コントロールと比較して６時間に お い て 有 意 に 低 下 し た（ 図 ２ C, D, F）．C/EBPのmRNA発現は各時点で差は認められなかった（図２E）．
３．K4DTの低酸素刺激による間葉系幹細胞と造血幹細胞マーカーの発現量変化
低酸素刺激によるK4DTにおける幹細胞性の変化を調

４．骨分化誘導後のK4DTの低酸素刺激による分化影響

骨分化誘導されたK4DTにおける低酸素刺激による影響を調べるため，14日間骨分化誘導したところ骨分化マーカー（ALP，COL1）のmRNA発現量が７日目と14日目に著しく増加した（図４A，B）．これはK4DTの骨分化誘導に成功したことを示している．分化前と比較して分化後（分化誘導14日目）は HIF-1αのmRNA発現量が10倍ほど増加していた（図４C）．次に，分化K4DTに低酸素刺激後（２－６時間）のHIF-1αと間葉系幹細胞マーカー のmRNA発現量の変化を検討した．コント

ロールと比較して，HIF-1αのmRNA発現量の増加はなく（図４D，６時間低酸素により発現低下），間葉系幹細胞マーカー（CD44，CD73，CD90，CD105）のmRNA

べ る た め， 低 酸 素 刺 激 後 の 間 葉 系 幹 細 胞 マ ー カ ー（CD44，CD73，CD90，CD105）および造血幹細胞マーカー（CD34，CD45）の発現量の変化をフローサイトメ

低酸素刺激によるHIF-1α発現量変化
A：定量性RT-PCR法における通常酸素環境下 (Normoxia)と２－６時間低酸素刺激 (Hypoxia) によるHIF-1αmRNA発現量(n=5)，* : p＜0.05, vs. Normoxia．
B：ウェスタンブロッティング法におけるNormoxiaと２－６時
間Hypoxiaに よ るHIF-1α タ ン パ ク 質 発 現 量 (n=4)，N:
Normoxia，* : p＜0.05, vs. Normoxia
図１

図２

低酸素刺激による細胞生存率および分化マーカー発現量変化

A：２－５時間低酸素刺激による細胞生存率 (n=6)． *： p＜0.05 vs. Normoxia．
B~F： 定 量 性RT-PCR法 に お け るNormoxiaと ２ － ６ 時 間
Hypoxiaに よ るVEGFA，ALP，COL1，C/EBP，LPLのmRNA発現量 (n=5)，*： p＜0.05，**： p＜0.01 vs. Normoxia．

短期間低酸素刺激によるK4DTの分化誘導に及ぼす影響（中垣 他）

図３

低酸素刺激による間葉系幹細胞および造血幹細胞マーカーの発現量変化― 17 ―

A~D：通常酸素（Normoxia）と低酸素刺激（Hypoxia）２－６時間における間葉系幹細胞と造血幹細胞マーカーの発現量．いずれの条件においても，アイソタイプと比べて 間葉系幹細胞マーカー (CD44，CD73，CD90，CD105)の発現は高く，造血幹細胞マーカー(CD34，CD45)の蛍光強度はアイソタイプと一致した．
E~J：Hypoxia2－6時間における間葉系幹細胞マーカーと造血幹細胞マーカー発現量のNormoxiaとの比較．

― 18 ―

九州歯会誌

発現量にも変化はなかった（図４E-H）．
考第78巻第１・２号

2024

これらの作用は，長期間酸素刺激での歯髄細胞での報告とは異なる傾向を示している14）．

察

K4DTは無限分裂するように遺伝子組換えされた細胞本研究では，短時間低酸素刺激による歯髄幹細胞の分であり，異種細胞の混入のある採取歯髄細胞をサンプル化誘導への影響を明らかにした．２時間の低酸素刺激でとした研究よりも，歯髄幹細胞に特異的な研究を可能ともHIF-1αの発現は有意に増加していることから，低酸している．フローサイトメトリーによる解析では，コン素応答は長時間必要ではなく急速に引き起こされること

トロールアイソタイプと比べて４つの間葉系幹細胞マーが明らかとなった．

カーの蛍光強度は明らかに高く，これはK4DTが間葉系

低酸素環境４時間において細胞生存率は上昇してお幹細胞としての性質を保持していることを示している．

り，細胞増殖能の促進が示唆された．血管上皮成長因子

短時間低酸素刺激によってもこの傾向は維持されたた

VEGFは転写因子HIF-1αの最も重要な標的遺伝子でめ，低酸素刺激により細胞増殖能やVEGF発現が上昇あり，低酸素刺激６時間後にはVEGFAのmRNA発７，８）現の有意な上昇が観察された．歯髄幹細胞は歯髄中央部
13）したとしても，間葉系幹細胞としての機能は維持されているといえる．よって，抜歯後の歯髄サンプルの摘出か，歯髄幹ら得られた歯髄幹細胞は再生医療における間葉系幹細胞細胞からのVEGF分泌による血管新生により迅速な歯（ドナー細胞）として十分に機能すると考えられる．
一方，の血管周囲に存在しているということから

髄内酸素供給に対応すると考えられる．一方，骨分化マー

骨分化培地で骨様分化させたK4DTは短時間低酸素刺激

カー ALPとCOL1と脂肪分化マーカー LPLのmRNA

によって間葉系幹細胞マーカーのmRNA発現に変化がは６時間低酸素刺激後に低下しており，骨・脂肪分化誘なかったため，象牙芽細胞や線維芽細胞などが脱分化す

導には抑制的に反応した．また，間葉系幹細胞マーカー

る，もしくは幹細胞性を獲得する可能性は低い．しかしであるCD44，CD73，CD90，CD105に変化はなかった．

ながら，数日間と長期間，低酸素環境下で培養された歯髄細胞では幹細胞マーカーの発現促進が起きることが報告されていることから15，16），低酸素環境への安定した歯髄細胞はより再生医療に用いる細胞として適正かもしれない18）．
摘出ヒト歯髄細胞へ48時間低酸素刺激を行った研究
で は，HIF-1α 活 性 化 に よ りWnt/β-cateninとB-cell

CLL/lymphoma9（BCL9）を介して骨芽・象牙芽細胞への分化促進が引き起こされることが報告されている
14）．さらに数日間から21日間低酸素環境下で培養した歯髄細胞で石灰化が促進することが報告されている19）．その 他 に も， ラ ッ ト 骨 髄 間 葉 系 幹 細 胞 で は HIF-1α

図４ 骨分化K4DTにおける低酸素刺激によるHIF1-αと間葉系幹細胞マーカー mRNA発現量の変化
A, B：骨分化誘導時における骨分化マーカー（ALPとCOL1）
mRNA発 現 量 の 変 化． (n=5)，* : p＜0.05，** : p＜0.01, vs. 0
day．
C： 未 分 化K4DTと 分 化14日 後 のK4DTに お け るHIF1-α
mRNA発現量の比較．undiff : 未分化，diff : 分化．(n=5)，** : p＜0.01, vs. undiff．
D~H：通常酸素（Normoxia）と低酸素刺激（Hypoxia）におけるHIF1-αと間葉系幹細胞マーカーの発現量．(n=5)，* : p＜0.05,
vs. Normoxia．

-TWIST経 路 を 介 し て， マ ウ ス 胎 生 線 維 芽 細 胞 で は
HIF- 1α - runt-related transcription factor
2(RUNX2)- Bone morphogenetic protein 9(BMP9)経路 を 介 し て， ヒ ト 脂 肪 由 来 幹 細 胞 で は HIF-1α-VEGF-AKT- mammalian Target ofRapamycin(mTOR) 経路を介して骨分化誘導が引き起こされることが報告されている20-22）．しかしながら本研
究では，低酸素刺激６時間後において，K4DTの骨分化マーカー発現は低下した．この結果の違いには，低酸素
刺激時間の違いや対象細胞の違いが影響していると考えられる．本研究では低酸素刺激２時間で HIF-1αの発現上昇がみられたことから，歯髄幹細胞の低酸素環境への第一段階での適応は数時間で完了している可能性が高短期間低酸素刺激によるK4DTの分化誘導に及ぼす影響（中垣 他）

い．その後の長時間に渡る低酸素環境の継続は２次的な環境適応のメカニズムが機能したと考えられる．実際，
歯の外傷，歯髄炎，歯科矯正動的治療による長期間の低酸素環境が予想される場合においては，生体防御機構として硬組織の再生・リモデリングが期待されるため，骨芽・象牙芽細胞への分化促進が長期間低酸素刺激後に引き起こされることに矛盾はない．逆に，局所麻酔時に予想される歯髄での短時間低酸素環境により硬組織形成が促進されることは理にかなっておらず，歯科臨床的な観点からも短時間低酸素刺激では骨分化・脂肪分化がむしろ抑制される方が合理的である．

K4DTを骨分化培地で培養することにより，骨分化マーカー ALPとCOL1は経日的に発現上昇した．しかし，同時に HIF-1αの発現上昇がみられ（14日目で10倍程度），未分化K4DTで観察された低酸素刺激による
HIF-1αのさらなる発現上昇はなかった．造血幹細胞での研究において，HIF-1αの過剰発現により骨髄移植能が抑制されることが報告されているため23），骨様分化

K4DTでの低酸素刺激による応答が抑制されたと考えられる．
本研究では２－６時間の低酸素刺激を行ったサンプルでの解析を行った．VEGFAのmRNA発現上昇は６時間

刺激において観察されたが，２時間刺激で既にHIF-1αは発現上昇していることから，VEGFA 発現に必要な低酸素刺激は２時間で十分であった可能性がある．また，
歯髄内で硬組織産生細胞は象牙芽細胞であるが，本研究での骨様分化K4DTを象牙芽細胞とみなすためにはより詳細な検討が必要である．K4DTの線維芽細胞への分化プロトコルはまだ確立していない．これらの問題は今後の課題として将来的に検討する必要がある．
結論

無限分裂歯髄幹細胞K4DTにおいて，短期間低酸素刺激はHIF-1α-VEGF経路を活性化させて血管新生を促進し，骨・脂肪への分化誘導は抑制する可能性が示唆された．一方，これまでの長期間低酸素刺激を行った採取
歯髄細胞で報告される作用とは異なり，骨様分化後は短期間低酸素刺激により反応しない可能性がある．
謝

辞本研究のフローサイトメトリー解析に関する御指導を賜りました北九州市立大学環境生命工学科 望月慎一准教授にも厚く御礼申し上げます．本研究は，JSPS科学

研究費22K10253（研究代表者：郡司掛香織）の助成を受― 19 ―

けた．
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九州歯会誌

第78巻第１・２号

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九州歯科学会雑誌編 集 委 員第78巻第１・２号

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