新製品：NEBNext Ultra II DNA & FS DNA PCR-free Library Prep

NEBNext DNA ライブラリー調製®

FOR THE ILLUMINA® PLATFORM

NEBNext DNA ライブラリー調製

目次

3 概要
4 ～ 13 DNA ライブラリー調製キット
4 ～ 5 ライブラリー調製のワークフロー
6 キット選択チャート

7 ～ 13 PCR-free ワークフローでも使用可能な、NEBNext Ultra II FS DNA・Ultra II DNA キット
メチル化解析用 NEBNext EM-seq キット

NEBNext Magnetic Separation Rack

7 ライブラリー調製のヒント
14 ～ 21 関連製品

技術情報

ウェブサイト：NEBNext.com• 最新の NEBNext 製品リスト• プロトコール動画• 製品選択や調製手順のオンライン・チュートリアル• 製品選択に便利なオンラインソフト（NEBNext Selector Tool）• 参考文献• プロトコール＆ FAQs

日本版ウェブサイトも公開中：

www.nebj.jp/re/NEBNEXT

14 アダプター、インデックスプライマー

15 ライブラリー調製専用 Q5 DNA ポリメラーゼ
16 FFPE DNA 修復ミックス v2

17 マイクロバイオーム DNA 単離・濃縮キット

18 ～ 19 ライブラリー定量キット

20 ～ 21 NEBNext Direct ジェノタイピング

22 ～ 23 オーダーインフォメーション>10 years of NEBNext Library Prep Kits.

18,000 報を突破

2

NEBNext が選ばれる理由

現在、次世代シークエンスは様々な研究分野に広く普及している。各アプリケー

ションに対応した技術や製品が豊富にあるが、NEBNext が選ばれるには理由がある。

高性能でユーザーフレンドリー

NEBNext はイルミナ社各種シーケンサーに対応したライブラリー調製試薬である。
シンプルかつ合理的なワークフロー、そして微量サンプルからの調製が可能でありながら、高収量かつ高品質なライブラリー調製を実現する。
NEBNext DNA ライブラリー調製キットは Ultra II テクノロジーに基づいており、イン
タクトなインプット DNA だけではなく、分解や損傷している DNA インプットからもライブラリー調製が可能である。また 100 pg ～ 1 µg の幅広いインプット量に対応している。さらに、ハイスループット解析に対応すべく、最大 480 プレックスが可能 なインデックス（ バーコード ）も 取 り 揃 えている。加 えて、 メチル 化解析、ターゲットエンリッチメント、FFPE DNA の 修復、 マイクロバイオーム DNA の分離・濃縮、qPCR によるライブラリー定量など、各アプリケーションに対応した
試薬・キットを取り揃えている。

長年の信頼と実績

2009 年に最初の NEBNext 製品を販売して以来、世界中の研究者に愛用されており、今までに 18,000 以上の査読雑誌に掲載、また各国のシーケンスセンターで使用されている。また熟練したテクニカルサポートが各支社に在中、さらに米国本社の NGS

研究 グループも 合 わせて、実験計画 からシーケンス・解析 までをサポートすることで、シーケンスを成功に導く。製品はその中の構成品を個別に品質検査するとともに、キット全体としてライブラリー調製およびシーケンスにより機能検証されているため、常に最高品質を提供している。

概要

NEBNext 最新情報

• UltraII DNA・UltraII FS DNA キット– 増幅バイアス低減のためのPCR フリーワークフローにも対応• Unique Dual インデックスプライマー– 最大 480 プレックスが可能– ユニークなインデックスペアによりインデックス・ホッピングを低減• Unique Dual UMI アダプター– 分子バーコード付きの完全アダプター– PCR の増幅エラーを低減– PCR フリーライブラリー調製も可能• NEBNext Direct ジェノタイピング– コストパフォーマンスが高く、ハイスループットなシーケンスベースのジェノタイピング

テクニカルサポートが NGS 研究を支援

・ シーケンス・ライブラリー調製の相談
・ 製品の選択・ トラブルシューティング

www.nebj.jp/e/techsupport

フレキシブルなフォーマット

NEBNext ライブラリー調製試薬は、キットの他に、各ワークフローに対応した試薬をモジュールとして販売している。

キットとモジュールキットには、ライブラリー調製ワークフロー全体の試薬が含まれているため、最も便利な仕様である。また、DNA 精製とサイズセレクション用の NEBNext ビーズ（SPRIselect と同等品）が付属したキットも提供している。

NEBNext モジュールには、ライブラリー調製の個々のステップ用の試薬が含まれている。これらのモジュールを組み合わせてライブラリー調製全体をカバーすることが可能であることに加えて、NEBNext モジュールと他の試薬と組み合わせて、
ワークフローのカスタマイズも可能である。
アダプターとプライマーは、NEBNext Oligos モジュールとして NEBNext キットとは別に提供されている *。必要なプレックス数に応じて柔軟に選択が可能である。
* EM-Seq キットを除く

バルク & カスタム仕様

通常の販売サイズ以上が必要な場合、または特殊な試薬や組成が必要な場合、顧客のニーズに合わせてカスタマイズされたコンポーネント、キット、モジュールが提供可能である。

問い合わせ先：NEB ジャパン（E-mail：tech.jp@neb.com）

NEB AR アプリ
NGS ライブラリー調製の概要
詳細は裏表紙を参照

3

ワークフロー

NEBNext Ultra II DNA/FS DNA ライブラリー調製
標準ワークフロー（PCR あり、不完全アダプターを使用）
Ultra II FS DNA ワークフロー

Ultra II DNA ワークフロー

DNA 断片化、末端処理 & dA 付加••••

DNA 断片化• DNA 断片化（物理的：Covaris® や Nebulizer など、酵素的：Fragmentase）

酵素による DNA 断片化
平滑化（5' 突出末端の埋め込みと 3' 突出末端の除去）
5' リン酸化3' A 付加
5´

5´
3´ A

A 3´
5´

3´
5´

3´
5´
3´

5´

A 3´

5´
3´ A
5´
3´ A

5´

5´

3´

3´
5´

3´

末端修復と dA 付加

A 3´
5´

• 平滑化（5' 突出末端の埋め込みと 3' 突出末端の除去）• 5' リン酸化• 3' A 付加
5´
3´ A

5´

3´ A

A 3´

5´
3´ A

T

U

5´

5´

U
3´

T
A

A
T
アダプター開環

NEBNext Adaptor
Compatible with:• DNA• ChIP DNA• RNA(non-Small RNA)

3´

U
5´

5´

3´

3´

5´

DNA
U Uracil

USER

Barcode 1
Barcode 2

5´

USER
EnzymeDNA
U Uracil

BC1 P7 5´
3´

Barcode 1
Barcode 2
USER
Enzyme

3´
5´

5´

5´

P7 BC1

3´
5´

3´

3´
5´

3´

P5 BC2
3´

5´
3´

4

PCR 増幅5´

5´

BC1 P7

5´

TU

アダプターライゲーション

NEBNext アダプター
以下に使用可能• DNA• ChIP DNA• RNA(non-Small RNA)

A 3´

5´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

A 3´
5´

5´
3´ A

A 3´
5´

ワークフロー

NEBNext Ultra II DNA/FS DNA ライブラリー調製

特殊ワークフロー（PCR あり／なし、分子バーコード付き完全アダプターを使用）
UMI = 12 nt

+

A
A

DNA

5´
3´

BC1
T

BC2

T

A

A

T

Illuminasequences

3´
5´

PCR（ユニバーサルプライマー使用）

PCR-FREE（直接シーケンス可能）

最初の PCR サイクル

5´
5´
3´

T

A

A

T

3´
5´

T

A

A

T

3´

5´

3´

3´
5´

5´
3´

3´
5´

5´
3´

以降の PCR サイクル

製品

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB #E7805）

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep with Sample Puriﬁcation Beads（NEB #E6177）

NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep w/wo Sample Puriﬁcation
Beads（NEB #E7410, #E7415）

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB #E7645）

100 pg ～ 0.5 µg DNA

5´
3´

3´
5´

250 ng ～ 1,000 ng DNA
500 pg ～ 1 µg DNA

NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep w/wo Sample
Puriﬁcation Beads（NEB #E7430, #E7435）

50 ng ～ 500 ng DNA

NEBNext Oligos（including unique dual index, dual and single index
primers, as well as unique dual index UMI adaptors）（NEB #E6440, #E6442, #E6444, #E6446, #E6448, #E6609, #E7140,#E7335, #E7395, #E7500, #E7535, #E7600, #E7710, #E7730, #E7780）

5´
3´

インプット量

NEBNext Ultra II DNA Library Prep with Sample Purification Beads（NEB #E7103）

3´
5´

N/A

5

キットの選択DNA ライブラリー調製キットの選択

DNA ライブラリー調製においては、主に DNA インプットの断片化の必要性に応じてキットを選択する（メチル化解析を除く *）。
• 断片化が必要な場合– サンプル例：ゲノム DNA、分解が進んでいない FFPE DNA、大きなサイズのアンプリコンなど– 推奨キット：NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit（#E7805 or #E6177）または NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit（#E7430 or #E7435）• 断片化が必要でない場合– サンプル例：予め断片化したゲノム DNA、ChIP-DNA、分解が進んだ FFPE DNA、200 ～ 500 bp 程度のアンプリコンなど– 推奨キット：NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit（#E7645 or #E7103）または NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep Kit（#E7410 or #E7415）* メチル化解析には専用の NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit（#E7120S）を使用すること

このほか、DNA 断片化酵素や FFPE DNA 修復キットなどの前処理キット、各キットの反応に必要な試薬のモジュールなど、様々なニーズに対応した製品を提供している。

最適な製品の選択のため、弊社テクニカルサポートもしくはオンラインツール（nebnextselector.neb.com）も利用可能
Kit

Integrated
fragmentation

Oligos

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit +/– Sample Purification Beads – #E7805/#E6177
NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit +/– Sample Purification Beads – #E7430/#E7435
NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E6609/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6444/#E6446/#6448/#E7395
NEBNext Ultra II FS DNA Module – #E7810

Modules

NEBNext Ultra II Ligation Module – #E7595
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix – #M0544
Oligos

NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E6609/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6444/#E6446/#6448/#E7395

Genomic
Fragmentase
Kit

Separate
fragmentation

Oligos

NEBNext dsDNA Fragmentase – #M0348
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit +/– Sample Purification Beads – #E7645/#E7103
NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep Kit +/– Sample Purification Beads – #E7410/#E7415
NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E6609/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6444/#E6446/#6448/#E7395
NEBNext dsDNA Fragmentase – #M0348
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module – #E7546

ModulesDNA

NEBNext Ultra II Ligation Module – #E7595
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix – #M0544
Oligos

Methylation
analysis

Kit

NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit – #E7120

Kit

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit +/– Sample Purification Beads – #E7645/#E7103

Oligos

NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E6609/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6444/#E6446/#6448/#E7395

ChIP

NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module – #E7546
Modules

NEBNext Ultra II Ligation Module – #E7595
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix – #M0544
OligosGenotyping

オリジナル Ultra 製品（従来品）も販売中
詳細は 22 ページを参照

6

NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E6609/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6444/#E6446/#6448/#E7395

Kit

NEBNext Multiplex Oligos – #E7335/#E7500/#E7710/#E7730/#E6609/#E7600/#E7780/#E6440/#E6442/#E6444/#E6446/#6448/#E7395

NEBNext Direct Genotyping Solution – #E9500B-S
NEBNext Direct Genotyping Solution – #E9530B-S

ライブラリー調製のヒント

DNA ライブラリー調製のヒント
DNA インプットのガイドライン
DNA の精製度

調製時に RNA 除去を行い（RNase 処理、#T3010 を推奨）、可能な限り精製度の高い DNA を使うことが最大のポイントである。DNA 溶液は pH 7.0 ～ 8.5 の TE バッファーや水を使用すること。精製度は、以下の方法などを用いて確認可能である。

• 電気泳動：ゲル上でシャープなバンドが観察されるレベルが良い。スメアな場合には界面活性剤や小分子 DNA/RNA の混入の可能性、また DNA が損傷を受けている可能性がある。また低分子側にバンドが観察された場合、RNA 残存の可能性があるため、RNase による RNA 除去を行う• 吸光度：A260/280 = 1.8 ～ 2.0 であることを確認する。ただし吸光度は RNA や小さい核酸分子の混入の影響を受ける
ため、スペクトルや他の方法と合わせて確認するとよい

DNA の定量

正確に定量を行うことでライブラリー調製の PCR のサイクル数を適切に設定でき、アダプターダイマーがない

ライブラリーが調製できる。2 本鎖 DNA 特異的な定量が可能な Qubit®（ThermoFisher Scientific® 社）
での定量を推奨する。

UV 吸光度測定の場合、RNA や他の因子の影響を受けることに注意が必要である。この場合、実際よりも高く DNA が定量されるため、ライブラリー収量が低くなることがある。複数の方法で定量することにより、正確な 2 本鎖 DNA
定量と純度推測が可能となり、ライブラリー調製の成功につながる。

インデックス（バーコード）• マルチプレックス数に応じて最適なアダプターオリゴセットを選択する• 特に少ないプレックス数（< 4 プレックス）の場合、組み合わせに注意する（マニュアルに記載）• デュアル・インデックスを使用する場合、プライマー間のコンタミネーション防止のため、インデックス毎にチップを変える• 96 穴プレートキットを使用する場合、穴をあけてから使用する。使いきりとする

NEBNext 専用マグネットラック
NGS ライブラリー 調製 ではマグネティックビーズを 使用 して DNA 精製 あるいはサイズセレクションを行う。この際、確実にビーズを吸着して、上清をロスする
ことなく回収するため、専用のマグネットラックを提供している（#S1515S）。

NEBNext マグネットラックには 強力 な 磁石 が 使 われており、 ビーズは 0.2 ml 用
チューブの側面に吸着する。また傾斜が設けられていること、横からビーズ吸着の様子が観察できるため、上清が回収しやすく、風乾の様子も観察しやすいため、
ロスやビーズ 混入 がない DNA 精製 が 可能 である。12 穴ｘ 2 列、計 24 チューブに対応している。

特長• 強力な磁石により、短時間でビーズ吸着• 24 チューブ対応（12 x 2）

NEBNEXT MAGNETIC SEPARATION RACK7

Ultra II FS キット

NEBNext Ultra II FS Library Prep Kit

ユーザーフレンドリーなライブラリー調製プロトコール

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit は DNA 断片化からアダプターライゲーション
までを 1 チューブで実施できるため、シンプルなワークフローでライブラリー
調製可能である。また、100 pg から 500 µg までの幅広いインプット量に対応する。
PCR フリーのライブラリー調製キットも利用可能である。

100 pg ～ 500 ng DNA から高収量でライブラリーを調製

Library Yield (nM)

140

K 社製品

100

I 社製品

• PCR フリーのライブラリー調製キットでは、
50 ～ 500 ng のインプット DNA から調製可能• 酵素による DNA 断片化からライブラリー調製終了まで< 2.5 時間（ハンズオンタイムは < 15 分間）

Covaris + NEBNext Ultra II• 2 チューブ反応で簡単にライブラリー調製、面倒なビーズ精製は 2 回のみ

80• GC 含量、サンプルの塩濃度に依存せず、
低バイアスで DNA を断片化

60

• 酵素で DNA を断片化するので、高価な機器や専用チューブは不要

40
20
0

PCR cycles
DNA input• 100 pg DNA よりライブラリー調製（100 pg ～ 500 ng インプット DNA に対応）
• 断片化時間の調整により、自由にインサートサイズを変更可能

NEBNext Ultra II FS

120

You’ll be thrilled
to pieces.

13
100 pg10500 pg

9
1 ng

5
50 ng

4
100 ng3
500 ng

各社のライブラリー調製試薬および断片化方法を比較した結果、NEBNext Ultra II DNA FS キットの感度と収量が最も高く、100 pg の微量 DNA からでも高収量でライブラリーを調製できることが示された。
ライブラリーはヒト NA19240 ゲノム DNA より調製、DNA 量と PCR サイクル数は図に記載、実験作業
は 2 名の研究者（n = 3 ～ 6）により個別に行われた。

NEBNext Ultra II FS は様々なインプット量から一定した• 物理的断片化と比較して酸化ダメージや塩基置換のリスクが低減• DNA 精製ビーズ（SPRIselect と同等）付属キットも提供

TOOLS & RESOURCES
製品の詳細や各種データ：

NEBNextUltraII.com

製品

ライブラリー調製が可能

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB #E7805S/L）

NEBNext Ultra II FS

100 pg500 pg

[FU]

1 ng
50 ng
100 ng200 ng

300
250
200

容量

24/96 rxns

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep with Sample Purification
24/96 rxns
Beads（NEB #E6177S/L）※ビーズ付き
NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit
for Illumina（NEB #E7410S/L）

24/96 rxns

NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep with
24/96 rxns
Sample Purification Beads（NEB #E7415S/L）※ビーズ付き

150
100
50
0

35

100

200

300

400 500 600 1,000 2,000

10,380

[bp]

K 社製品
[FU]

150

100

50

0

35

8

100

200

300

400 500

700

2,000

10,380[bp]

100 pg ～ 200 ng のインプット DNA（ヒトゲノム DNA、NA19240）からライブラリー 調製 を 行 ったところ、 どの 量 からも 一定 したライブ
ラリー調製ができることが示された。各社推奨条件に従って調製、NEBNext は 20 分間で断片化とエンドプレップ、K 社製品は 20 分間の断片化後にビーズ精製してからエンドプレップした。ライブラリー
は Agilent® Bioanalyzer® にて測定した（無希釈または 5 倍希釈）。

Ultra II FS DNA

研究者の声

低バイアスの GC カバレッジを実現
2.0

ウェルカム・ サンガー 研究所 は、現在毎月数千 のDNA サンプルを処理し、そのコア DNA シーケンス
ライブラリ 構築 パイプラインにより、毎月数千 のDNA サンプルを処理しています。しかし、最近では 高品質の 全ゲノムおよびターゲットシーケンス
データを 生成 することが 求 められています。高品
質な 全ゲノムおよびターゲットシーケンスデータ
を 生 検 材 料 か ら 生 成 す る 必 要 が あ る こ と か ら、
NEBNext Ultra II FS を使用した新しいワークフ
ローを開発・導入しました。この新しい自動化されたワークフローは、NEBNext Ultra II FS の高い効率性と相まって、100 ～ 1000 個のヒト細胞から日常的にディープシーケンスデータを 生成することができるようになりました。

Coverage (Normalized)

NEBNext Ultra II FS
1.8

K 社製品

1.6

I 社製品

Covaris + NEBNext Ultra II

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

GC Percentile

各社ライブラリー調製キットおよび断片化方法を比較した結果、NEBNext Ultra II FS キッ

トが最も低バイアスの GC カバレッジをもたらすことが示された。50 ng のヒトゲノ
ム DNA（NA19240）を使用して、各社推奨条件下にてライブラリーを調製した（PCR は
5 サイクル）。NEBNext は 20 分間で断片化とエンドプレップ、K 社製品は 20 分間の断片化後にビーズ精製してからエンドプレップした。Covaris は 200 bp のインサートサ
イズになるように断片化後、NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit（NEB #E7645）でライブ
ラリー 調製 をした。 イルミナ 社 MiSeq® にてペアエンド 解析（2 x 76 bp）、 リードを
hg19 リ フ ァ レ ン ス ゲ ノ ム に マ ッ ピ ン グ（Bowtie 2.2.4）、Picard�s CollectGCBiasMetrics（v1.117）により GC カバレッジを算出した。図中、理論カバレッジ（1.0）を灰色線で、各 GC 含量における 100 bp 領域の数を縦棒で示す。

– Dr. Peter Ellis,
Senior Staff Scientist,
R&D Sequencing,Wellcome Sanger Institute
他の NGS ライブラリー調製キットで小さなゲノム／ DNA 断片でこれほどうまく機能するものを他に知りません。

例： バクテリア、 ファージゲノム、 プラスミド、

PCR アンプリコン– Anton Bryksin, Ph.D., Director,
Molecular Evolution Core,
Parker H. Petit Institute for
Bioengineering and Bioscience

Covaris + NEBNext Ultra II

Coverage profile (autosomes)

K 社製品

1.0

I 社製品

1.0

0.9

0.5

0.8

Haemophilus influenzae(38% GC)

2.0
1.5
1.0
0.5

Escherichia coli
(51% GC)

2.0

NEBNext Ultra II
I 社製品

0.7
0.6

Coverage profile(mitochondrial genome)

0.5
0.4
0.3

1.5

0.2
1.0

Rhodopseudomonas
palustris(65% GC)

0.5
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

GC Percentile

各社のライブラリー調製試薬および断片化方法を比較した結果、NEBNext Ultra II FS キッ

トが最も低バイアスの GC カバレッジをもたらすことが示された。ライブラリーは
1 ng のゲノム DNA（3 種類の微生物）より各社推奨条件下にてライブラリーを調製した（PCR は 9 サイクル）。NEBNext は 20 分間で断片化とエンドプレップ、K 社製品は 25 分
間の断片化後にビーズ精製してからエンドプレップした。Covaris は 200 bp のインサー
トサイズになるように断片化後、NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit（NEB #E7645）でライ
ブラリー調製をした。イルミナ社 MiSeq にてペアエンド解析（2 x 76 bp）、リードを
hg19 リファレンスゲノムにマッピング（Bowtie 2.2.4）、Picard�s CollectGCBiasMetrics（v1.117）
により GC カバレッジを算出した。図中、理論カバレッジ（1.0）を灰色線で、各 GC 含量
における 100 bp 領域の数を縦棒で示す。

0.1
0

1.0

Expeced coverage

NEBNext Ultra II FS

1.5

Fraction of chrM

2.0

PCR フリーライブラリー調製キットにおいて、
ヒト DNA の均一なゲノムカバレッジを実現

Fraction of Genome

Coverage (Normalized)

様々な GC 含量のゲノムでも均一な GC カバレッジを実現

0.5

0

0

20K

40K

60K

80K

60

70

Depth
0

10

20

30

40

50

80

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

Depth

他社の PCR フリーのライブラリー調製キットと比較して、より均一なカバレッジをもたらすことが示された。bam ファイルから 28 億リードがランダムにサンプリングされた（sambamba view -s 0.6.8）。mosdepth（v0.3.1, -F 772）によって一次、パスフィ
ルタアライメントのカバレッジが計算され、常染色体とミトコンドリア DNA（挿入図）についてプロットした。予想されたカバレッジは、（リード数 * リード長／
ゲノムサイズ）から算出された。

9

ULTRA II DNA

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit

Even morefrom less.

断片化済ゲノム DNA や ChIP/FFPE DNA など幅広く対応
500 pg ～ 1 µg の DNA 断片から高収量でライブラリー調製が可能
K 社製品

120
Library Yield (nM)

• 500 pg ～ 1 µg DNA よりライブラリー調製

Ultra II

140

I 社製品

100
80

• GC/AT リッチサンプルも均一なカバレッジで調製• 少ない PCR サイクルで、低バイアスかつ信頼性の高いライブラリーを調製• 約 2.5 時間のワークフロー（ハンドリング時間は 13 分）
で自動化にも対応

60
40• DNA 精製ビーズ（SPRIselect と同等）付属キットも提供

20
0• 断片化済みゲノム DNA のほか、ChIP/FFPE DNA にも対応

100 ng
5

10 ng
8

1 ng
11

500 pg
14

DNA Input
PCR Cycles

TOOLS & RESOURCES
製品の詳細や各種データ：

各社のライブラリー調製試薬と比較すると、NEBNext Ultra II の収量が最も高く、500 pg の微量 DNAからでも 高収量 でライブラリーを 調製 することができる。 ライブラリーはヒト NA19240 ゲノム
DNA より調製、インプット DNA 量と PCR サイクル数は図に記載。

NEBNextUltraII.com

プロトコールおよびライブラリー調製のヒントの動画を配信中

様々な量のインプット DNA に高効率でアダプターを付加
Ultra II

Relative Conversion Rate

1.2

K 社製品

1

I 社製品

0.8

NEBNext Ultra II DNA Library Prep with Sample Purification
Beads（NEB #E7103S/L）※ビーズ付き

0.4
0.2

NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep Kit for Illumina

100 ng

10 ng

1 ng

（NEB #E7410S/L）

500 pgDNA Input

各社キットと比較したところ、NEBNext Ultra II のアダプターライゲーション付加効率が最も高いことが示された。ヒト NA19240 ゲノム DNA を用いてライゲーション、産物を qPCR で定量して、付加効率を求めた。

少ないインプット DNA からも高品質なシーケンスリードを取得可能
DNA Input
100 ngLibrary Kit

Total Reads% Mapped% Duplication% Chimeras

Ultra II

419,093,838

96

1.87

0.48

419,097,926

96

2.00

0.60

419,086,546

97

1.91

0.53

226,860,968

96

3.96

0.44

226,857,578

96

11.40

0.53

226,857,754

97

34.80

0.41

K 社製品
I 社製品
Ultra II

1 ng

K 社製品
I 社製品

各社 キットでヒトゲノム DNA（NA19240）からライブラリー 調製、 シーケンスを 行 ったところ、

NEBNext は 1 ng のインプット DNA でも高い Mapping rate と低い％ Duplication を示した。各社推奨条
件でライブラリー調製、NextSeq® 500 でシーケンスした。リードは GRCh37 リファレンスにマッピ
ング（Bowtie 2.2.4）した。
％ Mapped：ヒト GRCh37 リファレンスへのマッピング率％ Duplication：Duplicate としてマークされたリード割合％ Chimeras：最大インサートサイズから外れている、あるいは異なる染色体に 2 つのエンドマッ

ピングを持つリード割合

10

製品

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB #E7645S/L）

0.6

0

引用論文はウェブサイト製品ページ（www.nebj.jp）に掲載
容量24/96 rxns
24/96 rxns
24/96 rxns

NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep with
24/96 rxns
Sample Purification Beads（NEB #E7415S/L）※ビーズ付き

ULTRA II DNA
様々な GC 含量のゲノムでも均一な GC カバレッジを実現

GC 含量が異なる 3 種類の微生物ゲノム DNA を用いて、各量（500 pg、1 ng、100 ng）から NEBNext Ultra II DNA キットでライブラリーを調製、MiSeq でシーケンスをした。リードを各リファレンスゲノムにマッピング（Bowtie 2.2.4）して、GC カバレッジを計算した（Picard�s CollectGCBiasMetrics v1.117）。低 GC から高 GC ゲノムまで、すべて均一
なカバレッジが得られることが示された。図中、理論カバレッジ（1.0）を灰色線で、各 GC 含量における 100 bp 領域の数を縦棒で示す。

500 pg ～ 100 ng の幅広いインプット DNA で均一な高カバレッジを実現

500 pg1 ng
1,000,000

100 ng# reads/10 kb interval

100,000

10,000

各 インプット 量（100 ng、1 ng、500 pg）のヒトゲノム DNA（NA19240）を 用 いてライ

1,000

100

10
1
1

100
10,000 1,000,000 1# reads/10 kb interval

100
10,000 1,000,000# reads/10 kb interval

ブラリー 調製、 イルミナ NextSeq 500 でシーケンスを 行 い、423 M リードを GRCh37
リファレンスゲノムにマッピングした（Bowtie 2.2.4）。bedtools coverage にて GRCh37の 各 10 kb 領域 のカバレッジを 計算 して、各 インプット 量 データを 比較 した 結果、
ほぼすべての領域で～ 1,000 リードのカバレッジが得られ、インプット量間で高い相関がみられた。このことから、NEBNext Ultra II はインプット量によらず、均一な高いカバレッジを実現できることが示された。

PCR フリーライブラリー調製キットにおいて、
ヒト DNA の均一なゲノムカバレッジを実現
Coverage profile (autosomes)
1.0

NEBNext Ultra II
I 社製品

0.9

0.7
0.6

Coverage profile(mitochondrial genome)

0.4
0.3
0.2
0.1
0

1.0

Expeced coverage

0.5

Fraction of chrM

Fraction of Genome

0.8

0.5

0

0

20K

40K

60K

80K

60

70

Depth
0

10

20

30

40

50

80

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

Depth

他社の PCR フリーのライブラリー調製キットと比較して、より均一なカバレッジをもたらすことが示された。bam ファイルから 28 億リードがランダムにサンプリング
された（sambamba view -s 0.6.8）。mosdepth（v0.3.1, -F 772）によって一次、パスフィル
タアライメントのカバレッジが計算され、常染色体とミトコンドリア DNA（挿入図）（リード数 * リード長／ゲノムについてプロットした。予想されたカバレッジは、
サイズ）から算出された。

11

メチル化解析

NEBNext Enzymatic Methyl-seq（EM-seq）

バイサルファイト法に代わる新規メチル化 DNA シーケンス
全ゲノムバイサルファイトシーケンス（WGBS）はメチル化 DNA 解析における一般的方法であるが、バイサルファイト変換の際に DNA 損傷が起こりやすく、断片化

や DNA のロス、不均一 な GC カバレッジなどを 生 じることが 問題 となっている。

NEB の EM-seq では、酵素 を 使用 したマイルドな 条件下 で 非 メチル 化 シトシンをウラシルに 変換 するため、DNA ダメージを 低減 することが 可能 である。 さらにNEBNext Ultra II DNA キットとの組み合わせにより、高収量かつ低バイアスなメチル化
DNA シーケンス用ライブラリー調製ができ、5-mC と 5-hmC の高感度検出が可能である。

• 10 ng DNA から高収量でライブラリー調製• WGBS と同じ解析プログラムが使用可能• WGBS より高感度、均一な GC カバレッジ

NEBNext.com

hm

原理とワークフローの動画を配信中

m

C C G T C G G AC C G C

ca/g

ca/g

C C G T C G G AC C G CAPOBECm

U U G T C G G AU U G C• 酵素でマイルドに変換、DNA ダメージを低減

製品の詳細や各種データ：

TET2/
Oxidation
Enhancerhm• メチル化シーケンスのためのライブラリー調製キット

EM-seqmethodmhm

C C G T C G G AC C G C

There’s a new alternative tobisulfite sequencing

TOOLS & RESOURCES

酵素で非メチル化シトシンをウラシルに変換
Sodium bisulfite
methodHeads up!

ca/g

ca/g

U U G T C G G AU U G C

製品

容量NEBNext Enzymatic Methyl-seq Conversion Module（NEB #E7125S/L）

24/96 rxns

NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit（NEB #E7120S/L）

NEBNext Multiplex Oligos for Enzymatic Methyl-seq

24/96 rxns

（Unique Dual Index Primer Pairs）（#E7140S/L）

24/96 rxns

（Methylated Adaptor, Index Primers Set 1）（NEB #E7535S/L）

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina

Converted
T T G T C G G AT T G C

T T G T C G G AT T G C

Sequenced

EM-seq は WGBS よりも高収量でライブラリー調製
80

Library Yield (nM)70

EM-seq
WGBS

60
50
40
30
20

0

10 ng
8
10

50 ng
6
8

200 ng
4
6

EM-seq 法と従来の WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析
用ライブラリー調製を行ったところ、EM-seq は少ない PCR サイクル数で高収量のライブラリー調製ができることが示された。またこの結果から WGBS では調製中に DNA ロスが多いことが考えられる。サンプルはヒト NA 12878 ゲノ
ム DNA（10、50、200 ng）、Covaris S2 で 300 bp に 断 片 化 し た も の を 用 い た。
WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。

12

バイサルファイト 法と 同じ 変換で DNA を 壊さな
いようマイルドにするものだということで、注目しました。確かに DNA をバイサルファイト法ほ
どには 壊さず、変換効率は 遜色ない 結果が 確認できました。DNA を壊さないということは、必要なサンプル量が少なくて済みますから、貴重な試料を使いやすくなります。私たちは患者さんにサンプルを提供していただくわけですが、状態によっては取れるサンプルが非常に少ない場合もありま
すから、それらを無駄にせず、十分に使えるようになるだろうと期待しています。
– 国立がん研究センター

10

DNA input
PCR cycles

研究者の声

分子診断・個別化医療開発グループ

エピゲノム解析分野ユニット長山下聡 氏

メチル化解析
EM-seq は低い coverage depth で WGBS よりも多くの CpG を検出、かつ均一な GC カバレッジを示す
60

EM-seq 10 ng

WGBS 10 ng

EM-seq 50 ng

WGBS 50 ng

EM-seq 200 ng

WGBS 200 ng

50
40
30
20
10
0

B. 3.5

EM-seq 10 ng

WGBS 10 ng

EM-seq 50 ng

WGBS 50 ng

3EM-seq 200 ng

WGBS 200 ng

Normalized Coverage

CpGs Covered (Millions)

A.

2.5
2
1.5
1
0.5

1

6

11

16

Observed Coverage Depth

21

26

0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

GC Content (%)

EM-seq 法と WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析用ライブラリー調製を行った。サンプルはヒト NA12878 ゲノム DNA（10、50、200 ng）、Covaris S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナ NovaSeq® 6000（2 x100 bp）でシーケンス、hg38 でアライメントした（bwa-meth 0.2.2）。
A：各 coverage depth における CpG 検出数。EM-Seq と WGBS で調製したライブラリーのシーケンスリード（3.24 億ペアエンドリード）について、検出された CpG
をカウントした。トップ鎖とボトム鎖の CpG は個別にカウントした結果、coverage depth = 1 のときに EM-seq で 5,600 万、WGBS で 4,300 万の CpG サイトが検出された。coverage depth 毎の CpG サイトのプロットから、EM-Seq は低い coverage depth において、WGBS よりも多くの CpG を検出できることが示された。
B：EM-seq 法と WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析用ライブラリー調製を行い、ゲノムの各領域の GC 含量に対する coverage を解析した（Picard 2.17.2）。EM-Seq は 広 い GC 含量域 で 均一 な coverage を 示 した。一方、WGBS は 低 GC 含量領域 の coverage が 高 く、高 GC 領域 が 低 く 示 された。 これは
WGBS ライブラリーに一般的に見られる傾向である。

EM-seq は低い coverage depth で WGBS よりも多くの CpG を検出

C.

1X minimum
coverage

17.9M

35.8M

0.2M 9.8M

44.4M

0.2M

9.5M

44.6M

0.2M

8X minimum
coverage
10.3M

10 ng

0.7M 0.9M

12.5M

4.1M 2.5M

50 ng
Unique EM-seq

11 M

4.3 M 2.8 M

200 ngUnique WGBS

CommonC：3.24 億ペアエンドリードについて、EM-seq と WGBS の minimum coverage 毎の CpG サイト数を解析した。1x minimum coverage において、異なる 3 つのインプット
量すべてで、EM-seq は WGBS よりも 20％以上多い CpG が検出された。2 つの方法で検出された CpG 検出数の差は、8x を閾値として、minimum coverage を上げ
ると大きくなった。

13

アダプター & プライマー

NEBNext アダプター & プライマー

NEBNext アダプターはウラシルを介したループ状構造を有している。この構造によりアダプターダイマー形成を抑制するとともに、アダプター
ライゲーション効率を向上する。アダプターライゲーション後、USER Enzyme によりウラシル除去とアダプター開環をする。USER Enzyme は
UDG と Endo VIII のプレミックス酵素であり、アダプターライゲーション反応溶液に追添加するだけで簡単に開環する。

NEB アダプターには Read1/2 配列が含まれており、P5/7 配列およびインデックス配列は PCR 中に付与される。この際、シーケンス内容に応じて、シングルまたはデュアルインデックスタイプのプライマーが選択可能である。またプレックス数に応じて、最大 480 プレックス解析が可能な
NEBNext インデックスプライマーから最適なプライマーキットを選択する。
さらに、イルミナ社整列化フローセルタイプのシーケンサーに見られる Index Hopping を解消するためのユニーク・インデックスプライマー
ペアなども取り揃えている。

インデックスプライマー選択チャート

製品番号
分子バーコード付き

Index Hopping 対応
Index 方法

PCR フリー対応
プレックス数
フォーマット
プレミックスシングル・
インデックスデュアル・
インデックスユニーク・デュアル・
インデックス分子バーコード付き
ユニーク・デュアル・
インデックスーーー〇

インデックス・プライマー *インデックス・アダプター **NEB #E7335
NEB #E7500
NEB #E7710
NEB #E7730
NEB #E6609

NEB #E7600
NEB #E7780

ー

NEB #E6440
NEB #E6442
NEB #E6444
NEB #E6446
NEB #E6448

ー〇インデックス・プライマー * インデックス・プライマー *ー

12 プレックス：4 セット
96 プレックス：1 セット
最大プレックス数：ー

8 x 12 プレックス：2 セット
最大プレックス数：

12 x 4 + 96 = 144
バイアル
ー

ー

96 プレックス：5 セット

NEB #E7395〇〇

96 プレックス：1 セット

16 x 24 = 384

最大プレックス数：96 x 5 = 480

最大プレックス数：96 x 1 = 96

バイアル

96 穴プレート

96 穴プレートー* 不完全アダプターを使用。アダプターライゲーションとインデックス付加は別々の工程で行う〇〇** 完全アダプターを使用。アダプターとインデックスは一回の工程で付加する

製品

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（Unique Dual Index UMI Adaptors DNA
Set 1）（NEB #E7395S/L)

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（96 Unique Dual Index Primer Pairs or
96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 1, 2, 3, 4, 5）（NEB #E6440S/L, #E6442S/L, #E6444S/L, #E6446S/L, #E6448S/L）

最大プレックス数

容量96 unique pairs

96/384 rxns

96 unique pairs

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（Dual Index Primers Set 1 or 2)（NEB #E7600S, #E7780S）

8 x 1296 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（Index Primers Set 1, 2, 3 or 4）(NEB #E7335S/L, #E7500S/L, #E7710S/L, #E7730S/L）

96

96/384 rxns

12

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（96 Index Primers）（NEB #E6609S/L）

NEBNext Adaptor Dilution Buffer（NEB #B1430）

1 x 9.6 ml

特長• 様々なアプリケーションに適したインデックスを提供• インデックスは増幅工程により付加• PCR フリーワークフロー用のインデックスアダプター– 分子バーコードによりエラー補正や重複リードの削除が可能• 品質管理工程により純度を確認済• ライブラリー調製効率を向上• 使用しやすいフォーマット
– 小プレックス用のバイアル– 大プレックス用の 96 穴プレート• インデックス・プールのガイドライン• サンプルシートを提供

14

NEBNext Q5 DNA ポリメラーゼ

NEBNext Ultra II Q5 Master Mix

最高レベルの増幅力と最小限の GC バイアスを両立

NGS において、サンプルの配列をエラーや重複なく正しく反映したライブラリーを調製することが重要である。そのためには、ライブラリー
調製最終工程の PCR において、アダプターライゲーション産物を正確かつ均一に増幅する必要がある。多くの PCR 酵素では、GC リッチ領域やリピート配列などの増幅が困難であるため、サンプルを反映したライブラリー調製ができず、時としてシーケンスリード中にエラーが導入されたり、サンプル中の DNA/RNA 量が反映されないことがある。この場合、カバレッジが不均一となり、マッピング時に空白の配列を生じることがある。また正確なトランスクリプトーム解析や SNP 解析ができないことがある。
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix（NEB #M0544）はこれらの問題を解消するために開発されたライブラリー調製専用のマスターミックスである。業界最高レベルの正確性と増幅力を持つ Q5 DNA ポリメラーゼをベースとして、NGS 用に最適化された。GC リッチ領域の増幅力の向上や、領域間の均一的増幅性の拡大により、GC 含量などの配列の違いによらず、ゲノム全体を均一に増幅することが可能である。
低カバー領域を含め、ヒトゲノム全領域を均一に増幅• NGS 専用 Q5 DNA マスターミックス

A
I 社製品

No PCR

K 社製品

特長

Ultra II Q5• 最小限の GC バイアスにより、広範囲の GC 領域を
確実かつ均一に増幅• 業界最高レベルの正確性（2）• アプタマーベースのホットスタート機能により、活性化ステップは不要、室温で PCR セットアップ可能

B

製品

NEBNext Ultra II Q5 Master Mix（NEB #M0544S/L）

容量50/250 rxns

ヒトゲノム DNA（NA19240）から各社キットでライブラリー調製とシーケンスを行い、PCR フリー調製
した時とのカバレッジを比較した。結果、NEBNext Ultra II Q5 は他社キットよりもカバレッジの均一性が高く、低カバー領域も深い Depth でシーケンスされた。各社推奨反応条件で調製、イルミナ社 NextSeq 500
でシーケンスした（2 x 75 bp）。各データセット（10X の平均カバレッジ）からランダムに抽出した 42 億
リードを使用して解析、hg19 リファレンスゲノムにマッピング（Bowtie 2.2.4）、各領域のリードをカウントした（bedtools v2.19.1）。

A：ヒトゲノムのシーケンスにおいて、低カバーとして知られる領域（1）の Depth を示す。

B：PCR フリー、旧バージョン酵素（NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix）、最新バージョン酵素（NEBNext
Ultra II Q5 Master Mix) における、低カバーとして知られる領域の検出率（> 10X カバレッジが得られた
リード割合）を示す。

Haemophilus
inﬂuenzae(38% GC)

Escherichia coli
(51% GC)

Rhodopseudomonas
palustris(65% GC)

Coverage (normalized) Coverage (normalized) Coverage (normalized)

幅広い GC 領域で均一なカバレッジを示す
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

0

10

20

30

40
50
60
GC Percentile

70

80

90

GC 含量の異なる 3 種類のバクテリアゲノム DNA（100 ng）から、NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit でライブラリーを調製、イルミナ社 MiSeq でシーケンス、ゲノムのカバレッジを調べたところ、すべて均一にカバーされていることが示された。GC カバレッジは Picard�s CollectGCBiasMetrics（v1.117）にて計算した。図中、灰色の横線は理論カバレッジ = 1.0 を示す。

参考文献：

1. Aird, D. et al. (2011). Analyzing and minimizing PCR amplification bias inIllumina sequencing libraries. Genome Biology 12(2), R18.
2. Popatov, V. and Ong, J.L. (2017). Examining Sources of Error in PCR by
Single-Molecule Sequencing. PLoS ONE. 12(1):e0169774.

15

DNA 修復

NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module

FFPE サンプルは広く利用されている保存方法であり、そこから DNA を抽出することが可能である。しかしながら、固定および保存中、DNA はニック、ギャップ、シトシンの脱アミノ化（ウラシル化）、酸化、3' 末端ブロックなどの様々な損傷を受けている。これらの損傷は、ライブラ
リー調製の収量低下や、エラー導入による擬陽性・偽陰性判定を招く恐れがある。

NEBNext FFPE DNA Repair Mix は DNA 修復に必要な酵素から構成された酵素ミックスであり、DNA と混合して 15 分インキュベートするだけで、ニック、ギャップ、シトシンの脱アミノ化（ウラシル化）、酸化、3' 末端ブロックなどのダメージを修復することができる。FFPE DNA の修復によりインプット DNA としての品質向上が可能であるため、NGS 解析の前処理に最適である（1）。NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module は NEBNext
FFPE DNA Repair Mix（NEB #M6630）の改良版であり、より効率的に損傷 DNA を修復することができる。
様々な品質の FFPE DNA を修復してライブラリー調製効率を向上
140

特長• DNA のダメージを修復する酵素ミックス

Unrepaired
NEBNext FFPE DNA Repair v2120• 15 分のインキュベーションで DNA を修復• ミスなしに損傷箇所を修復

Library Yield (nM)100

• FFPE DNA の NGS 解析に最適

80• NGS 以外のアプリケーションにも使用可能

60
40
20
0

DIN

NormalLiver

NormalLiver

NormalLiver

NormalLiver

Normal
Lung

Liver
Tumor

Normal
Liver

Colon
Tumor

Normal
Liver

Lung
Tumor

Normal
Lung

1.7

1.7

1.9

2.1

2.7

3.4

4.3

4.7

5.9

6.4

6.7

様々な組織や品質の FFPE DNA サンプルに対し、修復・未修復でライブラリー調製した（n = 2）。組織やDNA の品質にかかわらず、修復によりライブラリーの収量が向上したことから、品質や組織が異なる
FFPE DNA に対して修復効果があることが示された。

修復により脱アミノ化シトシンに由来する偽陽性のバリアントコールが減少

NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module により修復可能な DNA 損傷
損傷の種類

修復の可否

シトシンの脱アミノ化によるウラシルへの置換

可ニックとギャップ

可

塩基の酸化

可

3' 末端のブロック
断片化

DNA- タンパク質の架橋

可不可（キメラ DNA を生じない）
不可

製品

NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module（NEB #E7360S/L）

容量24/96 rxns

品質 と 組織 が 異 なる 4 種類 の FFPE DNA に 対 し、NEBNext FFPE DNA Repair Mix（前 バージョン、v1）で修復、NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module で修復、または未修復でライブラリーを調製した（n = 2）。調製したライブラリーを custom cancer hotspot panel（Twist Bioscience）でキャプチャーし、Illumina NextSeq 2000
でシーケンスした。ダウンサンプリング、トリミング、マッピングした後、UMI からコンセンサス
リードを生成し、体細胞変異コールした。未修復や前バージョンで修復したライブラリーと比較して、
NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module は C → T / G → A 変異（シトシン脱アミノ化）や G → T / C → A 変異（酸化ダメージ）を効率的に修復した。よって、バージョンアップによって DNA 修復効率が改善されたことが示された。

参考文献：

1. Chen. L. et al. (2017) Science 355, 752-756.

16マイクロバイオーム DNA 濃縮

NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit

Microbiome DNA Enrichment Kit はホスト DNA（真核生物由来）とマイクロバイオーム DNA（原核生物由来）の混合物から Methyl-CpG binding Domain（MBD）
を 利用 してマイクロバイオーム DNA を 単離・濃縮 するキットである。 ホスト DNA の 多 くは CpG メチル 化 されているため、MBD2-Fc ビーズ
により捕捉される。一方 CpG メチル化されていないマイクロバイオーム DNA はビーズに捕捉されないので、ホスト DNA と分離される（1）。
さらに、CpG メチル化ホスト DNA はビーズから回収することが可能であるため、マイクロバイオーム DNA とは別に解析することが可能である。

Microbiome DNA Enrichment Kit のワークフロー
NEBNext MBD2-Fc

特長• ホスト DNA よりマイクロバイオーム DNA を濃縮

NEBNext Protein A ビーズ

MBD2-Fc とProtein A ビーズを混合

室温で 10 分間インキュベート、
その後バッファーで 2 回洗浄

DNA サンプルを添加しビーズと混合室温で 15 分間インキュベート• わずか 1 時間の簡単プロトコール• NGS、qPCR、マイクロアレイなどの前処理に最適• 様々なサンプルからマイクロバイオーム DNA を濃縮• 生細胞以外からもマイクロバイオーム DNA を濃縮• ホスト真核生物 DNA も回収可能• 真核生物の核 DNA とミトコンドリア DNA を分離可能（2）マグネティックラックにより、ビーズに結合したメチル化
ホスト DNA を捕捉、上清の
マイクロバイオーム DNA を回収
メチル化ホスト DNA

マグネット

製品

容量

（NEB #2612S/L）

6/24 rxns

NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit

上清のマイクロバイオーム DNA

CpG メチル化 DNA 結合タンパク質を利用して、ホスト真核生物 DNA だけをビーズに 補足 する。微生物 DNA は CpG メチル 化 されていないため、ビーズに補足されず、上清を回収することで分離・濃縮ができる。

ヒト唾液よりマイクロバイオーム DNA を濃縮

10

濃縮後

100

Oral microbes(HOMD)
Human (hg19)

90

70
60
50
40
30

7
6
5

*

4
3

0.15
0.10
0.05
0

2

20

0

SalivaSalivaSalivaSalivaReplicate 1 Replicate 2 Replicate 1 Replicate 2ヒト唾液 DNA（非濃縮 DNA サンプル）および Microbiome DNA Enrichment Kit
によりマイクロバイオームを 濃縮 した DNA サンプルを NGS で 解析 した。得 られたリードをヒト・ リファレンス DNA（hg19）と HOMD（3）にマッピングし、DNA 比率を解析した。非濃縮 DNA のマイクロバイオーム
DNA はわずか 5 ％ であったのに 対 し、濃縮 DNA では 約 95 ％ ものリードがマイクロバイオーム DNA であった。これらの結果は、Microbiome DNA
Enrichment Kit がマイクロバイオーム DNA を 約 20 倍 に 濃縮 したことを 示
している。

0

0.05

0.10

0.15

0.2

Enriched Oral Microbes (%)

1

10
0

0.20

8
Input of Oral Microbes (%)

Mapped Reads (%)

80

9Input of Oral Microbes (%)

濃縮前

濃縮によるバイアス無しでマイクロバイオーム DNA を解析

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Enriched Oral Microbes (%)

ヒト 唾液 DNA（非濃縮 DNA サンプル ）および Microbiome DNA Enrichment Kit によりマイクロ
バイオームを 濃縮 した DNA サンプルを NGS で 解析 した。得 られたマイクロバイオーム
DNA のリード 比率 を HOMD（3）に 登録 されている 微生物種属毎 にプロッティングしたと
ころ非濃縮 DNA・濃縮 DNA サンプル間で高い相関性があった。これらの結果は Microbiome
DNA Enrichment Kit の濃縮によるバイアスがほとんどないことを示している。
* Niesseria flavescens は特殊なメチル化パターンであるため、低頻度でビーズに補足される。その他の Niesseria 属（N. mucosa , N. sicca and N. elognata ）はビーズに補足されることはない。

参考文献：

1. Feehery, G. R. et al. (2013). PLoS One 8, e76096.
2. Yigit, E. et al. (2014). Applications in Plant Sciences 2014 2 (11): 1400064
3. Chen, T., et al. (2010) Database, Vol. 2010, Article ID baq013, doi: 10.1093/database/baq013

17

ライブラリー定量

NEBNext Library Quant Kit for Illumina

品質の高いシーケンスデータを得るためには、最適な量のライブラリーをシーケンサーにアプライすることが必要不可欠である。特にイル

ミナ社シーケンサーにおいては、正確なライブラリー定量は最適密度のクラスター形成につながる。現在、リアルタイム PCR が最も正確に定量ができると考えられている。NEBNext Library Quant Kit は、最適化された酵素ミックスと、P5/7 配列にアニーリングするプライマーペアを使用することにより、Bioanalyzer よりも正確に NGS ライブラリー量を定量することが可能である。

NEBNext Library Quant Kit for Illumina のワークフロー
Workflow
Time

Kit

Time
Reagent
Preparation

Library
DilutionSet UpqPCR

Data
Analysis

Hands-On
5 min.

10 min.

25 min.

1 min.

10 min.

10 min.

25 min.

60 min.

10 min.

Hands-On
51 min.

Total

Total

5 min.

1 hr. 50 min.

Jurkat (924 bp)

E. coli• Illumina NGS 用ライブラリー定量キット• すべての NEBNext ライブラリーの定量が可能• qPCR により正確かつ高い再現性で定量• 定量用プライマーミックス、サンプル希釈バッファー

Bioanalyzer より高い正確性と再現性で定量
Jurkat (633 bp)

Count on it.

付属• スタンダード DNA 付属（6 種類の濃度）

P. falciparum
NEB
Bioanalyzer

140• ROX 付属（2 種類の濃度）で様々な qPCR 機器に対応

TOOLS & RESOURCES

120

qPCR 結果を入力して簡単に濃度計算ができるオンラインツール配信中：
NEBioCalculator.neb.com

Library Quant (nM)

100
80
60

アプリケーションノートはウェブサイトより閲覧可能：
www.neb.com/E7630

40
20
0

様々なライブラリーを Bioanalyzer と NEBNext Library Quant Kit で定量した結果、Library Quant Kit の製品

容量

ヒト、大腸菌、マラリア原虫をそれぞれ 2 ～ 4 回測定することにより検証した。

NEBNext Library Dilution Buffer（NEB #B6118S）

7.5 ml方が高い正確性と再現性でライブラリーを定量することができることが示された。定量性は他社同等品より正確に定量
H. influenzae
E. coli
IMR-90qPCR Quant (nM) qPCR Quant (nM) qPCR Quant (nM)User 1

User 2User 3User 4
NEB

200

KAPA
社
K

100

200

100

200

100

NEBNext Library Quant kit と他社同等製品の定量性を比較した結果、Library Quant Kit の方が高い正確性と再現性でライブラリーを定量することができることが示された。定量性は 4 名の研究者
がヒト、大腸菌のライブラリーをそれぞれ 2 ～ 4 回測定することにより検証した。

18

NEBNext Library Quant Kit for Illumina（NEB #E7630S/L）

100/500 rxns

ライブラリー定量
ロット間誤差が最小限のスタンダードが付属
NEB

28

K社

26
24
22

Cq

20
18
16
14

NEBNext Library Quant Kit と他社キットに含まれるスタンダード DNA について、4 ロット 分、計 70 回以上 の qPCR を 行 ったところ、NEBNext
Library Quant Kit のスタンダードはロット間誤差が非常に少ないことが示された。このことは、より正確なライブラリー定量ができることを意味する。各スタンダードの Cq values をプロット、灰色のボックスと線とは平均値（mean）と四分位値を示す。なお、現在は 6 種類のスタンダードが付属している。

12
10
0

0.01

0.1

1

10 0.0002 0.002 0.02

0.2

2

20

Standard Concentration (pM)

最適なクラスター密度を達成可能
NEB
K社

Target Density
200

qPCR Quant (nM)

150

100

50

様々なライブラリーを NEBNext Library Quant Kit と他社同等製品で定量した後にクラスター密度を比較した結果、当社製品で定量した方が、最適な密度のクラスター（900 ～ 1300 k/mm2, ave. = 1160）を形成することが示された。定量したライブラリー（2 ～ 200 nM の濃度）は 8 pM に希釈して MiSeq（v2 chemistry; MCS v2.4.1.3）にアプライして検証した。

0
500

600

700

800

900

1,000

1,100

1,200

1,300

Raw Cluster Density (k/mm2)

様々な GC 含有量とサイズのライブラリーも正確に定量、最適密度のクラスターを形成
E. coli

JurkatJurkatE. coli

H. influenzae

GC Content:

Input: R. palustris H. influenzae
65%

38%

51%

41%

R. palustris H. influenzae R. palustris
65%

38%

65%

41%

51%

38%

Library Size (bp):

310

311

341

633

638

656

900

946

958

963

qPCR Quant (nM)

100

50

0

Cluster Density (k/mm2)

800

400

0

Target Density

1,200

様々な GC 含有量とサイズのライブラリーを Library Quant Kit で定量した 後、 それぞれを 8 pM に 希釈 して MiSeq（v2 chemistry; MCS v2.4.1.3）にアプライした。その結果、すべてのライブラリーは最適な密度のクラスター（965 ～ 1300 k/mm2, ave. = 1199）を形成することが示された。
ライブラリー濃度（7 ～ 120 nM）は上段のドット、クラスター密度は下段のカラムで示している。

19

NEBNext Direct ジェノタイピングソリューション

NEBNext Direct Genotyping Solution

NEBNext Direct Genotying Solution は、次世代シーケンスを使った、高度なマルチプレッ
クス化とキャプチャー法によるエンリッチメントを 組み合わせたジェノタイピ
ングソリューションである。費用対効果が高く、超ハイスループットで、幅広い
アプリケーションに対応している。100 ～ 5,000 種類の広範なマーカーが適用可能である。プレキャプチャーフラグメントにおいて、最大 96 サンプルのサンプル
インデックスと最大 8 種類のプールインデックスを用いることで、イルミナ社シー
ケンサーによる 1 回のランで 380 万を超えるハイスループットジェノタイピングが可能である。
NEBNext Direct Genotyping Solution では、25 ～ 100 ng の精製したゲノム DNA が使用可能である。DNA を酵素処理により断片化した後、プール前のサンプルに対して 5' 末
端にサンプルインデックス配列と Unique Molecular Identifier（UMI）を含むイルミナ社
シークエンサー対応の P5 アダプターを付加する。これにより最大 96 サンプルをプールすることができる。次にビオチン化ベイトをハイブリダイズし、ストレプ
トアビジンビーズによるキャプチャーと酵素処理によるオフターゲット配列を除去することでエンリッチメントを行う。その後、3' 末端にアダプターをライゲー
ションし、最後に PCR により 3' 末端にプールインデックスが付加され、96 サンプ
ル／ 1 プールのシーケンス用ライブラリーが調製される。

Your
Genotyping
Solution特長：• 1 日で完結のワークフロー• 100 ～ 5,000 種類のマーカー領域で自由に設計可能• ベイトデザインとマルチプレックス化により、
最大 768 サンプルを 1 ランで解析• 高い特異性と均一の coverage により、最小リードで最大のジェノタイピングコール

製品

容量NEBNext Direct Genotyping Solution（NEB #E9530B-S）

8 rxns

NEBNext Direct Genotyping Solution（NEB #E9500B-S）

96 rxns

本製品は研究用であり、体外診断用としては使用できません。

NEBNext Direct は、キャプチャーとライブラリー調製を組み合わせた
ハイブリダイゼーションベースの高速なワークフローを採用

植物

3´ Genomic
5´ DNA

5´
3´

マーカー選抜／育種

NEBNext Direct Genotyping Solution Target Enrichment Kit

NEBNext Direct Genotyping Solution Sample Prep Kit

Target marker
Fragmentation,
End Repair,
5´ Phosphorylation,dA-tailing5´

5´ adaptor

Adaptor ligation& sample tagging

UMI

Sample index
A

5´
3´

A

3´

A

3´
5´

Sample pooling
Sample 1A

5´

Sample 2

3´
5´

A
A

Sample 96

A

Denaturation & 5´
bait hybridization

3´

Bead binding& 3´ blunting

3´

3´

Biotin bait

5´

3´
5´

Streptavidinbead
3´ ligation
5´and additional
off-target removal

PCR
amplification

サンプルをプールする
前に 5′ アダプター（サンプルインデックス、
UMI : Unique Molecular
Identifier を含む）を
付加

A

3´

NEBNext Direct
ワークフローDNA フラグメント両鎖にビオチン標識ベイトをハイブリダイズ（図は片鎖での反応を示す）
酵素処理によりオフターゲット配列を除去

3´ adaptor

5´
3´

Sequencing-ready fragment

20

QTL（量的形質遺伝子座）のスクリーニング

A 3´

5´
3´ A

Pool index

各 DNA フラグメントは
サンプルインデックス配列とプールインデックス配列
により識別

動物

マウスの
ジェノタイピング
家畜育種

ヒト

バイオバンキングNGS による
サンプルトラッキング

NEBNext Direct ジェノタイピングソリューション

パフォーマンス

NEBNext Direct Genotyping Solution は、より少ないシーケンスリードで、正確かつ信頼性が高いジェノタイピング
コールを可能にする。これは、ターゲット遺伝子座に対する極めて高い特異性と確実なエンリッチメントにより、
オフターゲットのシーケンスが低減され、より多くのマーカーを使用することが可能になるためである。

ターゲットキャプチャー 前 のサン

プル 96 種類 をプールすることにより、ピペッティング操作の手間が削減され、プラスチックチューブなど
消耗品 の 使用 も 劇的 に 減 らすことができる。さらに、プールされた最大NEBNext Direct Genotyping Solution によるプールされた
96 サンプルにおけるエンリッチメントの特異性
100
90
80

Percent Selected

プールされた 96 サンプルにおける特異性の高い
エンリッチメント

768 種類 のサンプルを 1 ランでハイ
スループットシーケンシング解析でき、高い費用対効果が得られる。

ゲ ッ ト エ ン リ ッ チ メ ン ト の 場 合、PCR 増幅法 に 比 べてターゲット 遺伝
子座 の coverage において 極 めて 高 い
均一性が得られる。これにより、
ター
ゲット遺伝子をカバーするのに必要なシーケンスの全データ量が低減され、解析 できるマーカー 数 を 最大化することができる。

高い uniformity

NEBNext Direct Genotyping Solution では、サンプルにかかわらず、一貫性が高く、かつ特異性に優れたエンリッチ
メントが可能で、ターゲット領域に対 するシーケンスリードマッピン
グ 率 は > 90 ％ である。 この 高 い 特異性は、ジェノタイピングのために最適化したキャプチャー法によるエンリッチメントと、酵素を用いた独自のオフターゲットシーケンス除去とを組み合わせることで実現した。

50
40
30
20
10
0

0

12

24

36

48

Samples

60

72

84

96

公 開 されている 使 用 可 能 な SolCAP
マーカー 2,309 種類 からなるジェノ
タ イ ピ ン グ パ ネ ル を 用 い、 ト マ トの DNA サンプル 96 種類 を NEBNext

プールされた 96 サンプルにおける Passing Filter リード数
350,000
300,000

Passing Filter Reads

プローブキャプチャー法によるター60

250,000
200,000
150,000
100,000
50,000
0

0

12

24

36

48

Samples

60

72

84

1 サンプルにおける 2,390 種類のマーカーの mean coverage
Marker Coverage Post-duplicate
Filtering Using UMIs

プールされた 96 サンプルにおける coverage の一貫性

70

250
200
150
100
50

0

575

1,150

Markers

1,725

96

Direct Genotyping Solution によりエンリッチメントを 行 い、Passing filter
リードを 確認 した。各 サンプルには
25 ng の精製 DNA を使用し、サンプルにインデックス 配列をタグ付けした
後、ハイブリダイゼーション前にプールしてライブラリー 調製 を 行 った。
ライブラリーサンプルをイルミナ社
MiSeq により、Read 1 を 20 サイクル
設定で、12 bp の UMI および 8 bp のサンプルインデックスをシーケンシ
ング、Read 2 を 75 サイクル設定で、ターゲット領域のシーケンシングを行った。

使用した SolCAP マーカー 2,309 種類

300

0NEBNext Direct Genotyping Solution を用 いた 場合、 ターゲット 領域 にマッピングされた Passing Filter リードの割合は 96 マルチプレックスサンプル
全体 を 通 じて 高 く、優 れた 特異性 が示 されている。各 サンプルにはトマ
トの精製 DNA 25 ng を使用している。
サンプルにインデックス配列をタグ付 けした 後、 ハイブリダイゼーショ
ン前にプールしてライブラリー 調製を 行 い、 ラ イ ブ ラ リ ー サ ン プ ル をイルミナ社 MiSeq により、Read 1 を
20 サイクル設定で、12 bp の UMI お
よび 8 bp のサンプルインデックスを
シーケンシング、Read 2 を 75 サイ
クル 設定 で、 ターゲット 領域 のシー
ケンシングを行った。

2,300における coverage をヒストグラムで示す。ターゲットエンリッチメントの均一性と coverage は、ジェノタイ
ピングコールに充分なレベルである
ことが示されている。これらのデー
タは、ハイブリダイゼーション前にプールされた 95 種類のトマトサンプ
ルの 内 の 1 サンプルである。各 サン
プルには 25 ng の精製 DNA を使用した。 サンプルにインデックス 配列 を付加 した 後、 ハイブリダイゼーショ
ン 前 にプールしてライブラリーを調製 した。 ライブラリーサンプルをイルミナ社 MiSeq により、Read 1 を
20 サイクル設定で、12 bp の UMI お
よび 8 bp のサンプルインデックスを
シーケンシング、Read 2 を 75 サイ
クル 設定 で、 ターゲット 領域 のシーケンスを行った。

21

オーダーインフォメーション
DNA ライブラリー調製キット

DNA & ChIP

モジュール

DNA & ChIP

容量

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina

E7645S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II DNA Library Prep with Sample Purification Beads

E7103S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina

E7805S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep with Sample Purification Beads

E6177S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep Kit for Illumina

E7410S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II DNA PCR-free Library Prep with Sample Purification Beads

E7415S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep Kit for Illumina

E7430S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II FS DNA PCR-free Library Prep with Sample Purification Beads

E7435S/L

24/96 rxns

NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit

E7120S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina

E7370S/L

24/96 rxns

NEBNext Enzymatic Methyl-seq Conversion Module

E7125S/L

24/96 rxns

NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module

E7360S/L

24/96 rxns

NEBNext FFPE DNA Repair Mix

M6630S/L

24/96 rxns

NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit

E2612S/L

6/24 rxns

NEBNext Ultra II FS DNA Module

E7810S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module

E7546S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II Ligation Module

E7595S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra II Q5 Master Mix

M0544S/L/X

50/250/500 rxns

NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module

E7442S/L

24/96 rxns

NEBNext Ultra Ligation Module

E7445S/L

24/96 rxns

NEBNext dsDNA Fragmentase

M0348S/L

50/250 rxns

NEBNext End Repair Module

E6050S/L

20/100 rxns

NEBNext dA-Tailing Module

E6053S/L

20/100 rxns

NEBNext Quick Ligation Module

E6056S/L

20/100 rxns

NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix

M0543S/L

50/250 rxns

NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix

M0541S/L

50/250 rxns

NEBNext Q5U Master Mix

M0597S/L

50/250 rxns

NEBNext dsDNA Fragmentase Reaction Buffer v2

B0349S

6 ml

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Unique Dual Index UMI Adaptors DNA Set 1)

E7395S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs)

E6440S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 2)

E6442S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 3)

E6444S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 4)

E6446S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Enzymatic Methyl-seq (Unique Dual Index Primer Pairs)

E7140S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 1)

E7600S

96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 2)

E7780S

96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)

E7335S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 2)

E7500S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 3)

E7710S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 4)

E7730S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 5)

E6448S/L

24/96 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Index Primers)

E6609S/L

96/384 rxns

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Methylated Adaptor, Index Primers Set 1)

E7535S/L

24/96 rxns

NEBNext Adaptor Dilution Buffer

B1430S1 x 9.6 ml

NEBNext Direct Genotyping Solution

E9500B-S

96 rxns

NEBNext Direct Genotyping Solution

E9530B-S

8 rxns

NEBNext Library Quant Kit for Illumina

E7630S/L

100/500 rxns

NEBNext Library Dilution Buffer

B6118S

7.5 mlNEBNext Magnetic Separation Rack

S1515S

24 tubes

アダプターオリゴ

ジェノタイピングソリューション
ライブラリー定量キット
マグネティックラック

22

製品番号

製品番号

製品番号

製品番号

製品番号

製品番号

容量

容量

容量

容量

容量

RNA 用キットは別紙：
NEBNext RNA ライブラリー調製冊子を参照

オーダーインフォメーション

NEBNext Selector

オンラインツールを使用すれば、簡単に最適キットを選択可能

NEBNextSelector.neb.com を参照

23

Featured Tools
NEB AR App
NEB

製品資料中のアイコンをスキャンして動画や実験プロトコール、AR ヒントなどを視聴（iPhone®、iPad®、Android ™ 対応）

NEBNext Selector

V1.0

NEBNext Selector で簡単に NEBNext 製品を選択：
NEBNextSelector.neb.com

www.nebj.jp
ISO 9001

ISO 14001

ISO 13485

Quality
Management

Environmental
Management

Medical Devices

Registered

Registered

Registered

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202208-NEBNext_DNA_ILL_v7.1-6/22