定量位相顕微鏡／創薬

深部組織で細胞以下のサイズの定量位相イメージングを付加する
カタリン・チリテスキュー、ガブリエル・ポペスク
蛍光顕微鏡法の限界を克服するのが位相イメージングだ。このリアルタイム顕微鏡法（SLIM）
として知られており、技術の最新の発展は、厚みがあり強く散乱する組織において、ラベルフリー一細胞のように薄くて透明なサンプルかつ定量的な 3D トモグラフィを拡張し、ナノメートル解像度と驚くべきコを観察することに優れている（図 1 ）。

ントラストをもたらしている。

現在、勾配光干渉顕微鏡（ GLIM ）とよばれる新しい QPI 技術は、光学的に厚生きた細胞や組織への光学顕微鏡法法を作ることであろう。だが薬剤スクみがあり、強く散乱する組織において、は、生命科学の研究者にとって知見のリーニングの方 法 論 は、1990 年に inラベルフリーかつ定量的な 3D トモグ主な情報源である。その一方で、薬剤vitro（生体外）のヒト細胞株のスクリーラフィイメージングを拡張しており、や疾患の影響を測定することが強く求ニングが導入されてから本質的には変ナノメートル解像度と驚くべきコントめられている。なぜなら、観察に数時わらずにいる。既存の方法は細胞生存ラストをもたらす。このいずれも、生間から数日を要するからだ。事実、薬の全体的効果の情報をもたらす一方で、命科学研究と創薬にとって、重要な意剤研究には、生きたサンプルで定量的巨大なサンプルサイズのバルク計測に味をもつ。

かつナノスケールな 3D トモグラフィの制限される。そのため、個々の細胞レ機能的測定を可能にするハイスループベルにおける増殖動態は測定できない。

ットで非侵襲的、ラベルフリーな技術

定量位相イメージング（ QPI ）は、こ多くの創薬パイプラインでは、初期が必要である。理想としては、細胞ベれらの領域すべてに到達する顕微鏡法の臨床試験で失敗する（ 1 ）。これが示唆ースのアッセイの光学イメージングは、である。ラベルフリーで低照度というするものは、より予測可能なバイオマ巨大集団の細胞間で不均質な特性を素性能のため、QPI 法は非破壊的であり、ーカーと前臨床の細胞毒性モデルが必早く評価するのに十分なほどの感度をそのため安定して長時間の観察に適し要であるということだ。補助療法の個有するべきである。そして、サンプルている。加えて、広視野をイメージし別化を開発するために細胞増殖を真にの 3D イメージングは、 理 想 的 には、ながら同時に 3D でサブミクロン解像理解するときには、細胞ベースの増殖多重散乱のバックグラウンドを抑制度を提供する。

アッセイにおける薬剤効果、そして一し、焦点外の光を抑制する強固な切片確立された QPI 技術は、空間光干渉創薬を加速する細胞レベルの形態、表現型の変化に関する定量的な情報が求められる（ 2 ）~（ 4 ）。
前臨床研究（ 5 ）〜（ 7 ）は、3D 組織モデ
ルが臨床における腫瘍の複雑性や不均質性（ 8 ）を再現するのに役立つことを示唆する。これには細胞間相互作用、低酸素、薬剤の透過性・応答性・抵抗性、細胞外マトリックスの産生と沈着が含まれる。オルガノイドとよばれる組織様の構造（ 9 ）~（ 11 ）が、in vivo（生体内）におけるがん細胞の表現型、機能、シグナル経路の制御を簡略化するのに使われている（ 12 ）。そのように光学的に厚図 1 SLIM の定量位相画像による U-2 OS 細胞の 3D 表面画像を示す。

402018.7 Laser Focus World Japanみがある in vitro の 3D 構造には、生きたまま長時間の可視化と定量化、それa)も細胞以下のサイズで多細胞スケール

光レンなハイスループットが要求される。

ンランプ
フィラメントり

対物レン

色素がないため、顕微鏡下での観察がせ、定量的なパラメータを測定できる

21714676

LC M

ームスプリッ結像面
フーリ レン L1または色素）を直接または遺伝的な改をもつ光学顕微鏡は蛍光分子を励起さフーリレン L2

288

鏡は、造影剤（ナノ粒子を含む蛍光分子変によって補う（ 13 ）~（ 15 ）。特殊な光源c)

面結像レン困難なことで有名である。現在の手法

3 /2

CCD

サンプル

生きた細胞は、含水量が多く天然の位相リング/2SLIMモジュール
コン ンサ

コン ンサレン

現在の手法b)010

図 2 (a)SLIM では、生きた非染色細胞で高い軸解像度の光学切片を取得し、3D トモグラフィマップを描画する。位相リング、それらと対応するカメラの記録画像 (b)、海馬の神経細胞のSLIM 定量位相画像 (c) を示す（ http://dx.doi.org/10.1364/oe.19.001016 より許可を得て掲載）。

よう生きた構造や現象を強調させる。
イメージングは短時間のインターバルり、従来の広視野蛍光顕微鏡法よりも自然な構造で維持するための一般的なに制限しなければならない。なぜなら、厚いサンプルの光学的切片を可能にすホルダーのイメージングができない。

内部の光エネルギーは光褪色る。しかし、イメージングの深度が増（ 15 ）、（ 16 ）と光毒性すほど、照度ビームの焦点がずれ、ピをもたらす。

（ 17 ）~（ 21 ）定量位相イメージング（ 22 ）

位相コントラスト（ PC ）顕微鏡法ンホールを通過する光は弱くなる。こQPI（ 33 ）は蛍光顕微鏡法の限界を克（23）や微分干渉コントラスト顕微鏡法（DIC）のため、CM の透過限界となるサンプ服する。新たな手法の急速な広がりにのような古典的な技術は、外因性の化

ルの厚さは 100μm である（ 27 ）。

は、回析位相（ 34 ）、デジタルホログラ

学物質を用いずに生きた細胞を描画でレーザ走 査 型 共 焦 点 顕 微 鏡 法

フィック顕微鏡法（ 36 ）、四分波横方向きる。光がサンプルを通過するときに（ LSCM ）は、回転盤共焦点よりも精細シェアリング干渉計（ 37 ）、タイコグラフ生じるわずかな差からコントラストをな軸光学切片をもたらす。サンプルへ

ィ（38）、強度輸送方程式ベースの技術（39）、

作 る た め だ。 し か し な が ら、PC とのスポット照明と、ピンホールで反射光 回 析 ト モ グ ラ フィ（ 40 ）、 配 向 独 立DIC は定性的な測定しかできない。強ビームの空間的フィルタリングを実行DIC（ 41 ）がある。これらの手法は、光度差は、サンプルにおける光学密度差することで、外因性の光を排斥する。

がサンプルを通過するときの波面（位と一意に関連しないからである。

LSCM は大量の光を排斥するために非相シフト）における定量的な変化によ

どのような光学手法を用いても、厚常に小さい絞り値を用いるため、高強ってコントラストをもたらし、生成さみのある 3D 生体構造をイメージング

度の光源、明るい蛍光タグ、サンプルれた画像でピクセル値として記録すする際には、多重散乱のためにコント固定が必要だ。

る。ピクセル強度は光路長（ OPL ）のラストが失われる（28）、二光子顕微鏡法や三光子顕微鏡法変化、すなわちサンプルの物理的な厚つれ、多重散乱によってバックグラウ（29）は、光褪色を減らして深部（200 ～さと反射率に比例する。これは、QPIンドの非干渉性が生じ、シグナルノイ300μm以下）を描画する。一方で光シー（44）がサンプルの形態（42）と乾燥質量（43）、ズ比（ SNR ）が指数関数的に減少する。

ト顕微鏡法や格子光シート（ 30 ）、（ 31）顕微を直接計測できることを意味する。複生きた 3D 生体構造をイメージングす

鏡法は、光源を分離して光学経路を検数の角度からの照明または軸のサンプる現在の手法

出することで、低い光毒性で高解像度ル位置にまたがる位相シフトを計測す

蛍光タグからのシグナルの空間的分布の軸イメージングを可能にする。こるために QPI を用 いること（ 45 ）~（ 48 ）、の検出に基づいている。

れらの技術はそれぞれ、特殊なシステ逆散乱問題を解決すること（ 49 ）、（ 50 ）で、（ 26 ）
共焦点顕微鏡法（ CM ）は、焦点ムと特定のサンプルマウンティングを不均質なサンプルの 3D 構造を明らか外のバックグラウンド蛍光を排斥する必要とする。しかしながら、スライドにできる。

ためのピンホールを用いる。これによガラス、ペトリ皿、その他サンプルを。厚みが増すに（ 24 ）

は、対象に結合した（ 25 ）（ 32 ）SLIM（ 35 ）と GLIM（ 60 ）は、 位 相イメ
Laser Focus World Japan 2018.741定量的顕微鏡／創薬

コン ンサージング（ PC と DIC ）に低コヒーレンフィラメント
ラライ
コン ンサプリ ムa)面ス干渉法と共通光路形状のホログラフ
ィを組み合わせる、2 つの QPI 技術である。ナノメートルレベルの空間位相

コン ンサ

サンプル面感度と同時に、高い時間安定性をもたらす。SLIM と GLIM はそれぞれ、商サンプル業用の PC と DIC 顕微鏡フレームのアドオンとして開発された。これらは、対物レン

被写体と結像面との間で回析限界に近い、忠実性の高い光学視野の再構成を対物レン

ウ ラストンプリ ム

面もたらす。いずれも標準的な白色光をカラーフィル使用することで、レーザ照射ベースの結像レン

QPI 技術で問題となるスペックルを避け、光学切片を向上させる。これは、結像面光源のコヒーレンス長が短いためだ。

GLIMモジュール

空間・勾配光干渉

L2L1

リアルタイムで非破壊的なSLIM（図2）
では、4D（ 3D 時系列）で生きた細胞培養における構造や動態とナノメートル感度で明らかにするために、光干渉法

ームスプリッSLMb)c)

度画像

0カメラ

ア ライ

2.
1.2
0.0-1.2-2.

101.
(redx)-110d)

34.0
2.20.
-1.2(red)

2018.7 Laser Focus World Japanする（ 53 ）。 この散 乱 したビーム光 は、フーリエ面で参照ビームから幾何学的に分離し、結像面で干渉によって組み合わさる。
照ビームの位相が 0.5 πずれ、その大e)432
10-1-2-1結合
グラウンドトゥルース

きさが弱まる。相殺的干渉によって、グレーのバックグラウンドと合わせて細胞の稠密部分に対する暗画像を作る。SLIM モジュールには、フーリエ面の空間光変調器（ SLM ）で 1 対 1 に対-10 -x010 1

図 3 (a)GLIM は SLIM を補完するもので、光学的に厚みのある生きた生物サンプルに対して、高コントラストで 3D トモグラフィイメージングを提供する。(b)GLIM モジュールでは、SLM が処理する位相シフトである 4 つのフレームを取得する。(c)4 つのフレームから、GLIM は定量位相勾配マップを構築する。(d) この GLIM 定量位相画像は、位相シフト方向に沿って結合することで得られた。(e) 再構築された位相と、計算上のグラウンドトゥルースの横断面も示す（ http://dx.doi.org/10.1038/s41467-017-00190-7 より許可を得て掲載）。

42

レンズの後焦点面（フーリエ面）に収束

フーリエ面にある位相板によって参t)

位相 rad6.

I (co10 3

円環コンデンサから放出された光ビームがサンプルを通過し、顕微鏡の対物GLIM画像 (r )0.

1.0を用いる（ 35 ）、（ 51 ）、（ 52 ）。PC 照明では、応する 4f のリレーシステムがある。そして、1 対 1 の比で最低限の収差（回析限界）で顕微鏡の結像面を、出口に設置されたカメラに中継する。位相マス
クリングは、SLM スクリーンに同サイズで表示され、顕微鏡の被写体の後焦SLIM

図 4 ファイ・オプティクス社は、あらゆるメジャーブランドの光学顕微鏡の C マウントと接続するアップグレードモジュールの形でSLIM・GLIM 技術を提供している。SLIM・
GLIM チャンネルは既存の顕微鏡の蛍光性能にシームレスにアドオンでき、3D スキャンと時系列を無限に組み合わせることができる。

GLIM

02010i3080

点 面 と対 になる。 こうして SLM は、

GLIM モ ジュ ール に は フーリ エ 面 にに干渉するようなサンプル内の多重散さまざまな厚さで位相板のように参照

SLM があり、1 対 1 に対応する 4f リレ

乱があるからだ。新しい手法であるもビームを変調させる。

ーシステムが組み込まれている。SLIMのの、GLIM はすでにさまざまな研究

定 量 位 相 画 像 を生 成 するために、のアクティブ軸は 1 つのビームの偏光グループに使われており、ゼブラフィ

SLM では参照ビームの位相を固定した方向に配置されており、π /2 の倍数（4ッシュ、線虫、胚を含む、光学的に厚数値だけ（0、0.5 π、π、1.5 π）ずらし、分の 1OPL ）で位相を遅延させ、一方みのあるサンプルを 3D タイムラプス

カメラが強度画像を得る。4 つのフレーでほかの視野は改変しない。2 つのビで可視化している。

ムを組み合わせ、各ピクセルで視野の干ームで位相シフトを正確に制御するこ

SLIMもGLIMも、C マウントと接続

渉方程式を解くことで、定量位相画像とで、カメラ面で 4 つの強度画像を取するモジュールの形で米ファイ・オプティが一意に決定される。SLIMは、細胞周得できる。これらのインコヒーレントクス社（ Phi Optics ）から入手でき、あら期に依存する増殖や動態を測定したりバックグランドは同一だが、異なるコ

ゆる商業 用の倒立光 学顕 微 鏡（10 ～（56）、赤血球の構造を研究したり、ヒーレンス分布をもつ。お互いから 2100 倍）をアップグレードできる。

ラベルしていない生きた細胞の 3D 構組の画像（サインとコサイン）を減算

モジュラーユニットは簡単に重ねる造を明らかにしたりし、さらに多重散乱を差し引くことでことができ、顕微鏡の蛍光チャンネルコヒーレント成分を保持する。と組み込むことで、蛍光タグをベース（54）、（55）、ラベル（ 48 ）、（ 57 ）フリーのがんマーカーの開発を促進しすることに成功している。

GLIM の最も重要な側面は、2 つのとする制御実験や共局在実験が可能とGLIM（図 3 ）は SLIM を補 完 するもイメージングビームの出力は常に同じなる。それゆえ、SLIM・GLIM チャンのである。多重散乱を排除して、厚みであり、同一の減衰（すなわち同一のネルは既存の顕微鏡の蛍光性能にシーのあるサンプルをラベルフリーで定量バックグラウンドノイズ）に悩まされる

ムレスにアドオンでき、3D スキャンとイメージングするための強固な光学切ことだ。これは、サンプルの厚みに関時系列を無限に組み合わせることがで片を可能にする係なく、高いコントラストがあるとききる（図 4 ）。

たり（ 58 ）、（ 59 ）

。DIC 照射シェー（ 60 ）

ムには、回析点以下の距離にあるコンデンサ（ウォラストンプリズム）によって横方向にシフトした、同一出力のクロス偏光ビームが 2 つある（ 53 ）。サンプ
ルと、それに続くウォラストンプリズ
ムを通過したあとに生じる干渉ビームは、アナライザを通過せずに GLIM モジュールに送られる。SLIM のように、参考文献リストは以下を参照。
www.bioopticsworld.com/may2018references.html
著者紹介
カタリン・チリテスキューはファイ・オプティクス社最高執行責任者である。e-mail：chirites@phioptics.com URL：http://phioptics.com
ガブリエル・ポペスクは米ベックマン高等科学技術研究所（ Beckman Institute for AdvancedScience and Technology ）電気・コンピュータ工学・生体工学准教授である。
e-mail：gpopescu@phioptics.com URL：http://beckman.illinois.edu
LFWJ

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