Apr. 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―2

123（ 51 ）愛知県で分離された腸球菌の疫学解析
坂梨大輔 1）・山岸由佳 1,2）・鈴木隆佳 1）・大野智子 1）・山田敦子 1）・末松寛之 1）・三鴨廣繁 1,2）
1）

愛知医科大学病院感染制御部2）愛知医科大学病院感染症科（2014 年 1 月 6 日受付）

2008 年 4 月から 2013 年 1 月の期間に愛知医科大学病院で臨床分離され，バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）選択培地に発育を認めるかバンコマイシン（VCM）の MIC
値が 4 ȝg/mL 以上を示した腸球菌 353 株および同期間に愛知県下 8 施設より検査依頼のあった腸球菌 120 株について VCM 耐性遺伝子（van 遺伝子）の保有状況を調査した。vanA 保有腸球菌が愛知医科大学病院および他 2 施設から計 8 株，vanB 保有腸球菌
が 6 施設から計 105 株それぞれ検出された。vanC1 単独保有腸球菌については愛知医科大学病院および他 2 施設から計 21 株，vanC2/C3 単独保有腸球菌については愛知医科大学病院から 4 株検出された。van 遺伝子保有腸球菌のうち，全自動細菌検査装置
にて VCM の MIC 値が 4 ȝg/mL で感受性と判定された株が vanB 保有腸球菌で 4 株，

vanC1 保有腸球菌で 3 株，vanC2/C3 保有腸球菌で 2 株認められた。vanA または vanB保有腸球菌の同一菌種間で repetitive-sequence-based PCR（rep-PCR）による分子疫学解析を実施したところ vanA 保有 Enterococcus faecium および vanB 保有 Enterococcus

faecalis は施設間で菌株の相同性が低く関連性に乏しいと考えられたが，vanB 保有 E.
faecium については 3 施設間で高い相同性を示し，菌株の施設間伝播の可能性が示唆された。愛知県下複数の施設から van 遺伝子保有腸球菌が検出され一部の株については施設間伝播の可能性が示唆されたこと，また，VCM の MIC 値が現在の感受性判定基準では感受性と判断される株も存在していたことなどから，分子生物学的手法を用いた VRE の診断を地域連携の中で実施することは感染対策上きわめて重要であると考えられた。

バンコマイシン耐性腸球菌（vancomycin-resistant症新法が施行された 1999 年に五類感染症の全数Enterococci: VRE）は 1986 年にイギリスで初めて把握疾患となって以降，届出数は年々増加傾向に分離されて以降，治療困難な微生物であるうえにあり施設内伝播やアウトブレイクの報告も散見さ

プラスミドによる耐性遺伝子の伝播をきたす可能れるようになってきた 2〜5）。また，施設内伝播の性もあるなど，院内感染対策上注意すべき菌としみならず，病院間または病院と介護施設間の患者

1）の移動により地域で VRE の検出施設が増加したて注目され続けている 。本邦においては，感染124（ 52 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―2

Apr. 2014

事例も報告されており 6,7），医療機関の地域連携培地（日本ベクトン・ディッキンソン）に塗布しが盛んになってきている昨今，VRE の正確な疫学た後，37°C で 48 時間培養を実施した。発育が認を知ることは地域医療においても重要な課題であめられた株については菌種同定および MIC 値測る。VRE 感染対策として重要なのは，保菌者をも定を実施した。

れなく速やかに発見し接触感染予防策を講じることであるが，自動分析器や選択培地など，表現型

2. 菌種同定および VCM の MIC 値測定

による検査のみで正確に van 遺伝子保有菌の検出

分離菌株の菌種同定，MIC 値の測定は，全自動やその遺伝型を判定することはきわめて困難であ

細菌検査システム RAISUS（日水製薬）を用い実8,9）。このような背景から，当院では 2008 年 4 月施した。MIC 値は日本化学療法学会が規定する微から従来の細菌同定・薬剤感受性試験に加え，バ量液体希釈法に準拠し，VCM の MIC 値が 8 ȝg/ンコマイシン（VCM）の最小発育阻止濃度（MIC;mL 以上を示した株については，Etest®（SYSMEX

minimal inhibitory concentration）値が 4 ȝg/mL 以上bioMérieux）による判定を追加した。

るを示した腸球菌について分子生物学的手法を用いた van 遺 伝 子（vanA, vanB, vanC1, vanC2/C3）の3. van 遺伝子の検出検索をルーチン業務として開始するとともに，近DUTKA-MALEN ら 10）のプライマーに内部コント隣施設からの検査依頼も受託してきた。今回，現ロールとして 16S リボソーム RNA を標的とした在までに得られた結果について解析を行ったのでプライマー 11）を加え，Multiplex PCR 法にて実施報告する。

した（Table 1）。ミュラー・ヒントン寒天培地に発育した腸球菌 1 コロニーを TES buffer（pH 8.0）対象と方法

150 ȝL に 懸 濁 し 100°C に て 15 分 間 加 熱 し た 後，13000 rpm で 2 分間遠心した上清を templete DNA

2008 年 4 月から 2013 年 1 月の期間に愛知医科と し た。 Multiplex PCR 反 応 は AmpliTaq Gold®

大学病院（以下，当院）で臨床分離された菌株のPCR Master Mix （Applied Biosystems）を 用 い，うち，糞便検体において VRE 選択培地に発育をVeriti®96-Well サ ー マ ル サ イ ク ラ ー（Applied認めるか，その他検体において VCM の MIC 値がBiosystems）に て 95°C 10 分 の 後，「95°C 20 秒，4 ȝg/mL 以上を示した腸球菌 353 株および同期間55°C 2 分」を 35 サイクル施行し，最後に 74°C 5 分内に愛知県下の尾張地域，西三河地区，東三河地の伸長反応を行う条件で実施した。PCR 産物の確区の 3 地区 8 施設（a, b, c, d, e, f, g, h）から検査依

認は 2% アガロースゲルを用いた電気泳動法とエ頼のあった腸球菌 120 株の計 473 株を対象としチジウムブロマイド染色にて実施した。

た。8 施設の所属は尾張地区が a，b，c，h，西三河地区 f，東三河地区 d，e，g の分布であった。8施設はすべて急性期総合病院であり，病床数 500

4. 分子疫学解析
vanA および vanB 保有腸球菌の同一菌種につい床未満が 4 施設，500 床以上 1000 床未満が 3 施設， て，rep-PCR 法を原理とした自動細菌タイピング

1000 床以上が 1 施設の内訳であった。

装 置 DiversiLab® system （SYSMEX bioMérieux）
用 い て 分 子 疫 学 解 析 を 実 施 し た。 DNA 抽 出 は

1. 糞便検体の VRE スクリーニング
便または肛門周囲擦過スワブ検体を VRE 選択

UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit（MO BIOLaboratories）を 用 い て 行 っ た。rep-PCR 反 応 は

Apr. 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―2125（ 53 ）Table 1. PCR primers used for analysis

DiversiLab® Enterococcus kit （SYSMEX®

来 3 株，入院 97 株，不明 20 株であった。由来検体bioMérieux）を用い，Veriti 96-Well サーマルサイの内訳は，当院分離株では尿 171 株，呼吸器由来

クラーにて 94°C 2 分の後，「94°C 30 秒，50°C 30

材料 73 株，糞便 2 株，膿 32 株，血液・カテーテル秒，70°C 90 秒」を 35 サイクル施行し，最後に 70°C

先端 21 株，生殖器分泌物 22 株，ドレーン 8 株，胆3 分の伸長反応を行う条件で実施した。PCR 産物

汁 9 株，腹水 6 株，その他 9 株であった。他施設依は 0LFURÀXLGLF&KLS を用い Agilent 2100 Bioanalyzer

頼株の内訳は糞便 93 株，尿 12 株，膿 2 株，血液 2にて検出，専用ソフトウェア（version 3.4）を使用株，その他 6 株，不明 5 株であった（Table 2）。

し POUNDER らの方法

12）にならい Pearson correlation（PC）法にて解析した。関連性の判定は DiversiLab2. 同定菌種・VCM の MIC 値測定および van 遺Analysis Guide version 3.4 に基づき，＜95% similarity，伝子の検出3 本もしくはそれ以上のフィンガープリントの違い

対象菌 473 株の同定菌種内訳は，Enterococcus，＞95% similarity，1 ないを Different（関連性なし）

faecalis 334 株， E. faecium 121 株， E. gallinarum

し 2 本のフィンガープリントの違いを Similar（関連12 株，(FDVVHOLÀDYXV 4 株，E. avium 1 株，Enterococcus性あり），＞97% similarity，フィンガープリントの違sp. 1 株であった。VCM の MIC 内訳は 4 ȝg/mL がい無しを Indistinguishable（識別不能）とした。

72.3%（342 株），8 または 16 ȝg/mL が 21.6%（102株），＞16 ȝg/mL が 5.9% （28 株），不 明 0.2% （1結果株）であった。保有遺伝子の内訳は，vanA 1.7%（8 株），vanB 22.2%（105 株），vanB および vanC1

1. 対象菌の検出状況

0.2%（1 株），vanC1 4.4%（21 株），vanC2/C3 0.8%

当院で検出された対象菌 353 株の内訳は，外来 （4 株），検出せず 70.6%（334 株）であった。vanA89 株，入院 264 株，他施設由来 120 株の内訳は外保有腸球菌は E. faecalis 1 株（f 1 株），E. faecium

Table 2. Number of isolates in Aichi Medical University Hospital and 8 facilities in Aichi prefecture126（ 54 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS
67―2
Apr. 2014

Table 2. (Continued)

Apr. 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―2127（ 55 ）

128（ 56 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―2

Apr. 2014

Table 3. Vancomycin resistant genes and distribution for vancomycin MIC values

Fig. 1. Regional spread of vanA or vanB positive Enterococci

AMU: Aichi Medical University Hospitala–h: 8 facilities in Aichi prefecture
Values in parentheses indicate the detected number of VRE.

Apr. 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―2

129（ 57 ）7 株（当院 2 株，f 4 株，h 1 株）の計 8 株で 3 施設連性あり）であった。また，施設 h 以外の 3 施設から分離された。vanB 保有腸球菌は E. faecalis 6で検出された V38 株，V328 株，V404 株もそれぞ株（e 1 株，g 5 株），E. faecium 99 株（a 90 株，c1れ Indistinguishable（識別不能）の結果が得られ，株，h 7 株，d 1 株），E. gallinarum 1 株（a 1 株）の施設間伝播が示唆された。

計 106 株が 6 施設から分離された。vanC1 およびvanC2/C3 は種固有の染色体性遺伝子であるが，考察

今 回 の 同 定 に お い て， vanC1 保 有 腸 球 菌 は E.

faecalis 2 株（当 院 1 株， b 1 株）， E. faecium 7 株

VRE 感染症は 1999 年に施行された感染症新法（当院 6 株，b 1 株），E. gallinarum 11 株（当院 9 株， により五類感染症として全例報告が義務付けられb 1 株，d 1 株），Enterococcus sp. 1 株（当院 1 株） ている。その報告数は増加傾向にあり，1999 年にの計 21 株が 3 施設から分離された。vanC2/C3 保は 23 例だった報告数も 2010 年には 120 例に上っ

有腸球菌は (FDVVHOLÀDYXV 4 株が当院から分離さている 2）。加えて，報告義務は感染症発症例に限れた（Table 2, Table 3）。地域分布については Fig.

られており無症状 VRE 保菌者に関しては実態が1 に示す。

掴めていない現状がある。VRE 感染症が発生する
背景には施設内無症状保菌者の存在があることが3. 分子疫学解析（Fig. 2）知られており，実際には報告をはるかに上回る数

1）vanA 保有 E. faeciumの保菌者が存在している可能性がある。今回の施設 f から検出された V654 株と V657 株，V669

VCM 耐性遺伝子検索では，vanA 保有腸球菌が 3株と V670 株がそれぞれ Indistinguishable（識別不施設から，vanB 保有腸球菌が 6 施設からそれぞれ能）と判定された。それ以外の菌株は Different（関検出された。そのうち 5 施設は複数の患者から連性なし）であった。

VRE が検出されており，特に施設 a は環境培養か

2）vanB 保有 E. faecalis

らも菌が検出されるなど蔓延を認め（Data not

施 設 g で 検 出 さ れ た V676 株，V679 株，V680shown），最終的に 95 株に上る VRE（vanB 保有 E.

株， V681 株， V682 株 の 5 株 が Indistinguishable

faecium 88 株）が検出された。これらの株はパル（識別不能）と判定された。一方，施設 e で検出さスフィールドによる疫学解析が実施され単一株にれた V507 株は Different（関連性なし）であった。 よる伝播が証明されている 13）。VRE の感染対策

3）vanB 保有 E. faeciumとして重要なのは，保菌者をもれなく速やかに発施設 a で検出された vanB 保有 E. faecium に関し見し接触感染予防策を講じることであるが，今回ては，先行して実施されたパルスフィールドによ我々が対象から検出した van 遺伝子保有腸球菌のる疫学解析から，単一株と結論付けられたため初なかには，全自動細菌検査装置にて VCM の MIC回検出株のみ解析図に示した（Data not shown）。 値が 4 ȝg/mL を示し CLSI の判定基準で感受性と施設 h で検出された 7 株は V714 株，V715 株，V716

判定された株が vanB 保有腸球菌で 4 株，vanC1 保株，V718 株の計 4 株が形成するパターンと V717

有腸球菌で 3 株，vanC2/C3 保有腸球菌で 2 株認め株と V719 株，V720 株の計 3 株が形成するパターられた。

ンに分類され，各パターン内の菌株はそれぞれま た， vanC1 お よ び vanC2/C3 は そ れ ぞ れ E.

Indistinguishable（識別不可）と判定された。また， gallinarum，(FDVVHOLÀDYXV，(ÀDYHVFHQV が 染 色
両パターン間の相同性は 95% 以上で Similar（関体上に有する種固有の遺伝子であり，プラスミド

130（ 58 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―2Apr. 2014

Fig. 2. '1$¿QJHUSULQWLQJVRIvanA- and vanB- positive Enterococci by DiversiLab® system

AMU indicates Aichi Medical University Hospital.

伝達をきたす vanA や vanB と鑑別することは適切

では染色体性の vanC1 に加え新たに vanB を獲得な感染対策を講じるために重要であるが，自動分した E. gallinarum も検出されており，表現型だけ析器にて E. faecium など他菌種に判定された菌株

で VRE を詳細に鑑別することは困難であると考から vanC1 が検出される例も認められた。本研究えられた。池田ら 8）や山岡ら 9）も同様に自動分析

Apr. 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―2131（ 59 ）器による MIC 測定や選択培地など表現型による文献

VRE の検出について問題を指摘している。感染症

1）LECLERCQ, R.; E. DERLOT, J. DUVAL, et al.:Plasmid-mediated resistance to vancomycin andteicoplanin in Enterococcus faecium. N. Engl. J.
Med. 319: 157〜161, 1988
2）国立感染症研究所ホームページ：http://www.
nih.go.jp/niid/ja/idwr/2085-ydata/1615-report-ja.
html3）前原依子，他：当院におけるバンコマイシン耐性腸球菌の院内伝播事例。日本環境感染学会誌 23: 327〜331, 2008
4）浅沼秀臣，吉崎清美，岩井中里香，他：当院におけるバンコマイシン耐性腸球菌のアウトブレイクへの対応。日本環境感染学会誌 27:226〜233, 20125）森山和郎，他：山梨県 A 病院における VanB 型
バンコマイシン耐性腸球菌集団分離事例。日本環境感染学会誌 21: 168〜174, 2006
6）SHIRANO, M., et al.: Regional spread of vanA- orvanB-positive Enterococcus gallinarum in
hospitals and long-term care facilities in Kyoto
prefecture, Japan. Epidemiol. Infect. 139: 430〜436, 20117）MATSUSHIMA, A., et al.: Regional spread andcontrol of vancomycin-resistant Enterococcus
faecium and Enterococcus faecalis in Kyoto,
Japan. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31:
1095〜1100, 20128）池田 恵，他：VanB 型 - バンコマイシン耐性腸球菌による局地的流行伝播の早期発見と拡散防止対策の有効性について。日本環境感染学会誌 22: 203〜210, 20079）山岡一清，他：岐阜県下におけるバンコマイシン耐性腸球菌の検出状況とその判定に関する問題点について。日本臨床微生物学雑誌 15:77〜85, 2005
10）DUTKA-MALEN, S.; S. EVERS & P. COURVALIN:
Detection of glycopeptide resistance genotypes
DQG LGHQWL¿FDWLRQ WR WKH VSHFLHV OHYHO RI
clinically relevant enterococci by PCR. J. Clin.
Microbiol. 33: 24〜27, 1995
11） VAN DE KLUNDERT, J. A. M. & J. S. VLIEGENTHART:
PCR detection of genes coding foraminoglycoside-modifying enzymes. Diagnostic
molecular microbiology: principles and法においては，2013 年 4 月の一部改定を受け，バ
ンコマイシン耐性腸球菌感染症の届出基準が「分離・同定による腸球菌の検出かつ分離菌に対するVCM の MIC 値が 16 ȝg/mL 以上」の感染症例に変更となり遺伝子型の検索は不要となった。しかし，本研究において検出された vanB 保有腸球菌の う ち 6.7%（7/105 株）は 16 ȝg/mL に 満 た な い

VCM の MIC 値であったことなどから，MIC 値の測定のみでは VRE の見逃しが起こる危険性が示唆された。以上より VRE 感染症の正確な診断のために耐性遺伝子の検索を実施することはきわめて重要であると考えられた。
国内における VRE の地域的流行については各地で大規模なサーベイランスが実施されてきているが，2000 年代前半に行われた調査では濃厚な地域伝播は確認されなかった 14）。しかし，2005 年京都地区で複数の病院にわたるアウトブレイクが確認されて以降，医療施設間の連携における地域での VRE 感染対策が課題となっている 6,7）。今回検出された vanA または vanB 保有腸球菌の rep-PCR 法
による分子疫学解析では，vanA 保有 E. faecium お
よび vanB 保有 E. faecalis に関しては同一施設内での伝播が強く示唆される一方，施設間での菌株の相同性は低く関連性に乏しいと考えられた。しかし，vanB 保有 E. faecium に関しては 3 施設間で菌株の伝播があった可能性が示唆された。診療報
酬改定により感染対策における医療連携の重要性が高まってきた現在，薬剤耐性菌の正確な診断を地域連携の中で実施することは，感染対策上重要である。VRE に関する遺伝子検査は保険点数が認められていないだけに基幹病院で遺伝子検査を実施する意義はきわめて大きいと考えられる。

132（ 60 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

applications. American Society for
Microbiology, Washington, DC, 547〜552,
199312）POUNDER, J. I.; C. K. SHUTT, B. J. SCHAECHER, etal.: Clinical evaluation of repetitive sequencebased polymerase chain reaction using theDiversi-Lab System for strain typing ofvancomycin-resistant enterococci. Diagn.

67―2Apr. 2014

Microbiol. Infect. Dis. 54: 183〜187, 2006
13）川瀬義久：VRE アウトブレイク時に発生したVRE による SSI の 2 症例。日本外科感染症学
会誌 7: 667〜671, 201014）MATSUMOTO, T., et al.: No regional spread ofvancomycin-resistant enterococci with vanA orvanB in Kitakyushu, Japan. J. Infect.
Chemother. 10: 331〜334, 2004

Epidemiological analysis for enterococci isolated in
Aichi prefecture
DAISUKE SAKANASHI1）, YUKA YAMAGISHI1,2）, TAKAYOSHI SUZUKI1）, TOMOKO OHNO1）,
ATSUKO YAMADA1）, HIROYUKI SUEMATSU1）and HIROSHIGE MIKAMO1,2）
1）

Department of Infection Control and Prevention,
Aichi Medical University Hospital2）
Department of Clinical Infectious Diseases,
Aichi Medical University HospitalWe investigated vancomycin-resistant genes for clinical isolates of 353 vancomycin-resistantenterococci in the Aichi Medical University hospital and 120 vancomycin-resistant enterococci
from the 8 facilities in Aichi prefecture between April 2008 and January 2013. We detected 8,105, 21 and 4 strains of enterococci with vanA, vanB, vanC1 and vanC2/C3, respectively. Amongenterococci with vancomycin-resistant genes, we detected 4, 3 and 2 enterococci of vancomycin
MIC level 4 ȝg/mL with vanB, vanC1 and vanC2/C3, respectively. According to molecularanalysis using repetitive-sequence-based PCR（rep-PCR）for enterococci with vanA or vanBgenes, although there have been no similarity for Enterococcus faecium with vanA andEnterococcus faecalis with vanB, high similarity was shown among E. faecium with vanB, whichmight be nosocomial spread in each hospital. These results showed that molecular analysis forvancomycin-resistant genes would be useful for the management of healthcare-associatedinfections.