博士（医学）藤本和歌子
学 位 論 文 題 名cA
MP
誘導性グルコース応答インスリン分泌のメカニズム
学位論文内容の要旨
膵ロ細胞からのインスリン分泌は，栄養素，ホルモン，神経系入カなど様カな因子による調節を受けている．その中で，グルコースによるイシスリン分泌(glucose‑stimulatedinsulinse
cretion，GSIS)とその増強機構は最も基本的かっ重要な制御機構である，GSI
Sについては，現在以下のようなモデルが広く受け入れられている．すなわち，血中のグルコース濃度が上昇 すると，グルコースはロ細胞膜表面にあるグルコーストランスポーターを介してロ細胞内 に取り込まれ，代謝された後ATPが産生される．細胞内ATP濃度（［ATP］i）ワ増加
は，ATP感受性カリウムチャネル(KATPチャネル）の閉鎖を引き起こし，ロ細胞の膜を脱分極 させる ．膜の脱分極は電位依存性カルシウムチャネル(VDCC)を 開口させ．細胞内にカルシウムイオン(Ca2゛）を流入させる．この[Ca2゛］iの上昇が引き金となルインスリン分泌が 惹起さ れる．一方，消化管ホルモンであるgastric inhibitory polypeptide (GIP)とgluc
agon‑like peptidel(GLP‑1）は，それぞれ腸内分泌細胞であるK細胞とL細胞から分泌さ れ，膵 ロ細胞膜上に存在する7回膜 貫通G蛋白共役型のレセプタ ーに作用し，ロ細胞にお ける cA
MPの シグ ナル 伝達 系を 活性 化さ せる こと によ ってGSISを増強する，このイン
クレチ ン作用の特徴として，細胞外グルコースが一定の濃度以上のときにのみインスリン分泌を 惹起させることが挙げられる．近年，この点に着目して，GLP‑1のアナログやGL
P‑1の分解 阻害剤が低血糖の危険性の低い2型糖尿病の治療薬として着目されつっある，興味深いこ とに，グルコース刺激によるインスリン分泌能が失われ てしまった2型糖尿病患者におい ても，GLP‑1によルグルコー ス応答性のインスリン分泌増強と血糖降下作用が認められる ．GLP‑1のインスリン分泌増 強メカニズムとして，AT
Pに対するKA
T
Pチャネル閉鎖の感受性を上げることが示されているが，その詳細なメカニズムはいまだ解明されていない，
正常 な膵 ロ 細胞 では ，グ ルコース 濃度依存性にGSISが起こり．6mM以上のグルコース濃 度がGSISの誘導には必要と言われている．KA
TP
チャネル欠損マ ウスでは．GSI
Sがほとんど認 められないことから，GSI
SにはKATPチャネルが極めて重要な役割を果たすことが明らかにされた，ところが最近，KAT
P
チャネル欠損マウス（Kir6.
2‑'‑)では，GSISおよびスルホニル 尿素剤によるインスリン分泌がともに消失しているにも かかわらず，GLP‑1またはGIP処置 によ りGSISが 誘導 され ることが報告された．この事実は ，cAM
Pシグナルを介した，し かしKAT
Pチャネルの閉鎖によらないグルコース応答性インスリン分泌機構が存在する こと を示 唆 して いる ．本 研究 はcAM
Pに よる GS
ISのメ カニズム を解明することを目的として行われた．
ま ず GLP‑1や GIPの イ ン ク レ チン 効果 がcAMPの シグ ナル を介 して い るか どう かを 検討する ため，cAM
Pのアナログである8‑Br‑cA
MPを用いてK
ir6.
2‑'‑マウスにおける膵灌流実験を行った，K
ir6.
2"‑
マウスでは，8‑Br‑cA
MPによってインクレチンと同様にグルコースによる イン スリ ン 分泌 が惹 起さ れた こと から ，イ ンク レチ ンによる GSlSの誘導はcAM
Pシグナ ルを介 していることが示された．次にアジ化ナトリウムを用い た膵灌流実験により，Kir6．2゛マウスでみられた8｜BトcAMPによるGSI
Sの誘導にはATPが重要であることも明‑ 282―

ら か にな っ た ，さ ら に ，こ の cA
MP誘 導性 グルコ ース応答 がL型V
DC
Cの阻害 薬であ るニフェ ジピンあ るいは C
I'チャネルの阻害剤であるニフルム酸とN‑phenylanthranili
cacid(DPC)により阻 害され ることを 示した ．これらの実験から，cAMPとATPのシグナルがロ細胞に存在するcr
チャネルを活性化させ，細胞外へのCI'流出を引き起こし，それにより生じた膜の脱分極がVDCCを活性化するのではなぃかと考えた，C「チャンネル阻害剤であるニフルム酸とDPCはtransientreceptorpotential(TRP)
チャネル も阻害す ること が知られ ており， TRP
チ ャネルか らのNa
゛ 流入がcA
MPとグルコースによる膜の発火とそれにっづくインスリン分泌に関わる可能性が否定できない．そこで，Na
゛を N‑methyl‑
D‑
gluc
amin
eに置 き換えた 条件下での膵灌流実験を行った，その結果，
cA
MPとグ ルコース によるインスリン分泌の惹起（第1相）にはNa
゛は必須ではないが．その 維 持 （ 第 2相 ） に は 細 胞 外 の Na゛ が 必 要 で あ る こ と が 判 明 し た ，最後 に，この ニフル ム酸感受 性チャ ネルを介したcAMP誘導性のグルコース応答インスリン分泌が．K
A
TPチャネルが機能する正常な膵ロ細胞でどのような役割を担っているかを検討した，その結果，cAM
Pは僅かなグルコース濃度の上昇を感知し，それに応じてインスリン 分泌を引 き起こ す役割を 担ってい ること が明らかになった，ところが，2.
8m
Mから17.6 m
Mというグ ルコース濃度変化に対する早期のインスリン分泌応答はニフルム酸で阻害されなかったことから，急激なグルコース濃度の変化の際には，KAT
Pチャネルの閉鎖がインスリン分泌を引き起こしていると考えられた．一方，ニフルム酸処理により，インスリン分泌 の第2相が阻害 されたのは，ニフルム酸がNa
゛透過性の陽イオンチャネル（あるいはTRPチャネル）を阻害することに由来すると考えられた，cAMP
ある いはグ ルコースによってインスリン分泌細胞のCI'
電流が増強することは，ロ細胞株や単離ロ細胞を用いた研究によって，これまでにも報告されでいる，しかし，本研究は， 「cAMP存在下 での僅 かなグル コース 濃度変化に対する応答性」にはニフルム酸感受性のイオンチャネルが非常に重要であることを初めて明らかにした．健常人の食前の血糖が 4〜 5 mM． 食 後 の 血 糖 が 8mM前 後 で あ る 事実 と 食 後に は GL
P‑1や G
IPな どの イ ン ク
レチンが分泌される事実を考慮すると，生理的条件下では僅かなグルコース濃度の変化によるインスリン分泌応答に対してはニフルム酸感受性チャネルが重要な役割を担っていると考えられる．今後，ニフルム酸の標的となるイオンチャネルの分子実体や，糖尿病状態での 本メ カ ニズ ム の役 割 を明 ら か にす る こと が 重要である と考えられ る，― 283―

学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 岩 永 敏 彦
副 査 教 授 神 谷 温 之副 査 教 授 渡 邉 雅 彦

学 位 論 文 題 名cAMP誘導 性グル コース応答インスリン分泌のメカニズム
膵ロ 細胞に おいて、 グルコ ースによ るインス リン分泌（glucose‑stimulatedinsulinsecretion，GSIS)は基本 的な制御 機構であ る。一方、消化管ホルモンであるGI
PとGLP‑
1は 、 膵 ロ 細 胞 に お け る cAMPシ グ ナ ル 伝 達系 を 活 性 化さ せ る こと に よ って GSI
Sを 増強 す る。 興 味深 いこと に、グル コース 刺激によ るインス リン分 泌能が失 われて しまっ
た 2型 糖 尿 病 患 者 にお い て も、 GLP‑1に より GSIS
増 強 が 認め ら れ る。 GLP‑1の イン スリ ン 分泌 増 強 機構 と し て、 ATP感受 性 カ リウ ム チ ャネ ル (KATPチャ ネル ）閉鎖 の感受性を 上げる ことが示 されてい るが、 その詳細 なメカニズムは解明されていない。最近、
KATPチャネル欠損マウス(Kir6.
2．′・）では、GSISおよびスルホニル尿素剤によるインス
リ ン 分泌 が と もに 消 失 して し ヽ る にも か かわらず 、GLP−1
ま たはGI
P処置に よりGS
ISが誘 導され ることが 報告され た。こ の事実は 、c」い佃シ グナルを 介した、しかしKAT
Pチャネルの閉鎖によらないGSISが存在することを示唆している。本研究はぬr6．21／・マ
ウ ス およ び 野生 型マウ スの膵灌 流標本 を用いて 、c心 m 誘導性GS
ISの メカニ ズムを解明することを目的として行われた。
瓩r6．21′l
マウスにcAMPのアナログである8‐B卜c」心佃を投与することにより、インクレ チ ン に よ る GSISの 誘 導 は cAMPシ グ ナ ル を 介 し て い る こ と 、 こ の 誘 導 に はATPが必 要 で あ る こ と を 示し た 。 また 、 こ のc触 岨 P
誘 導 性 GS
ISは L型 電 位 依存 性 カ ルシ ウム チ ャネ ル （ VDCC）の 阻 害 薬 であ る ニ フェ ジ ピ ンあ る い はCrチ ャネ ルの阻 害剤であるニ フルム 酸とMp
henylanmranilicacid（DPC）により阻害された。これらの実験から、
c問 HPと A11Pの シ グ ナ ル が B細 胞 の Crチ ャ ネ ルを 刺 激 して 細 胞 外へ の Cr流 出 を 引き起 こ し 、 そ れ に よ り 生 じ た 膜 の 脱 分 極 が VDCCを 活 性 化 す る と 考 え た 。
Crチャンネル阻害剤はtransientr
eceptorpotential（TRP）チャネルも阻害することが知ら れ てお り 、 TRPチ ャネ ル か ら のNa十 流入 がインス リン分 泌に関わ る可能 性が否定 できな い。こ のことを 検証した 実験に おいて、 c」 心佃とグ ルコース によるインスリン分
泌 の 惹起 （ 第1相） にはNa
十は 必須で はないが 、その維 持（第 2相） には細 胞外Na十が必 要 であ る こ とが 判 明 した 。 最 後 に、 こ の ニフ ル ム 酸感 受 性 チャ ネル を介し たc
AMP
誘 導 性GSISがK A
TPチ ャネルが 機能す る正常な 膵ロ細 胞でどの ような役 割を担 っている か を検 討 し た。 そ の 結果 、 cAM
Pシ グ ナル 伝 達 系は 僅 か なグ ル コ ース濃 度の上昇 を感 知 し、 そ れに 応じて インスリ ン分泌 を引き起 こすこと がわか った。急 激なグ ルコー
ス 濃 度変 化 に対 する早 期のイン スリン 分泌応答 はニフル ム酸で 阻害され ず、こ の場合には、K．A
T
P
チャネルの閉鎖がインスリン分泌を引き起こしていると考えられた。一方、
ニ フ ルム 酸 処 理に よ ル イン ス リ ン 分泌 の 第2相 が阻害さ れたの は、ニフ ルム酸 がNa十一 284 ‑透過 性 の陽 イオ ンチ ャネ ル（ ある いは TRPチ ャネ ル） を阻 害す るこ とに よる と予 想された。
健 常 人 の 食 前 の 血 糖 が 4‑‑5 mM、 食 後 の 血 糖 が 8mM前 後 で あ り 、 食 後 に は イ ン ク
レチ ン が分 泌さ れる 事実 を考 慮す ると 、生 理的 条件 下で は僅かなグルコース濃度の変化に よ るイ ンス リン 分泌 応答 に対 して はニ フル ム酸 感受 性チャネルが重要であると考えられた。
公開発表会では、渡辺教授よ り、（1）K▲T
Pチャネルを介する経路とインクレチンを介す る 経 路 に お い て VDCCは 共 通し てい るか 、（ 2）ロ 細胞 が2タ イプ の血 糖感 知機 構を
もっ こ との 生理 学的 意義 はな にか、神谷教授より、（3）c心 沺が直接C
lIチャネルに作用し て いる のか 、そ れと もPKA
リ ン 酸化 酵素 を介 して いるか 、（4）消化管内分泌細胞のインクレチン分泌にも血糖値 に反応する機構があるか、岩永教授より、（5）Crチャネ
ルの 分 子同 定は でき たか 、な どに つい て質 問が あっ た。 申請者は、これらの質問に的確に答え、意義のある質疑応答 がなされた。
こ の 論文 は、 ロ細 胞の 分泌 調節 に関 して 新し いメ カニ ズムを提唱した点で高く評価
さ れ 、 糖 尿 病 の 発 症 機 序 解 明 や 治 療 法 開 発 に 寄 与 す る こ と が 期 待 さ れ る。
審 査 員一 同は 、こ れら の成 果を 高く 評価 し、 大学 院課 程における研鑽や単位取得なども 併せ申請者が博士（医学）の 学位を受けるに充分な資格を有するものと判定した。

― 285―