博 士 （ 医 学 ） 大 山 尚 貢
学 位 論 文 題 名

血管平滑筋増殖抑制に対するラパマイシンの作用機序の検討―細胞周期抑制とcyclin‑dependentkinaseinhibitor(CKI)の関係一

学位論文内容の要旨
背 景 ：静 止 期 に ある 正 常 血 管中 膜 平 滑 筋細 胞 が 増 殖型 の Phenotypeに 変 化 す る際 に は 、 細胞 外からの 増殖 刺 激が 平 滑 筋 細胞 の 核 内 に伝 達 さ れ 、（刃 からの 逸脱、 G1‑S期への 進行が 促され る，G1‑S移 行には cdk
inhibitorで あ る p27Kip1の 分 解 促 進 か 重 要 な ス テ ッ ブ で あ る が 、 我 々 の 研 究 か ら は p27Kip1分 解 はp57Kip2の 発現 量 に よ り規 定 さ れ てい る こ と が示 さ れ て いる ． す な わち 、 増 殖 刺激 が 核 内に 伝達さ れる
こ と によ り p571くip2の 蛋白分 解が促進 され、 その結 果p27Hp1を りン酸 化する 酵素活性 が上昇 し、p27虹p1の 核 外へ の 汲 み 出し と 蛋 白 分解 が 進 行 する こ と が 示唆 さ れ て いる ．薬剤 溶出ス テント に用いら れてい る
ラ パ マイ シ ン の 平滑 筋 細 胞 増殖 抑 制 の 詳細 な 機 序 は未 だ 明 ら かで は な い が、 FK506結合 蛋 白（FKBP12）
お よ び m1DR（ 脚mmaliantargetofr叩 anリ cin） と 複合 体 を 形 成し 、 n11DRに よ る 未 知の 蛋 白 リ ン酸 化 酵
素 の 活性 化 を 抑 制し 、 p27耐 P1の 分 解 を抑 制 す る とさ れ て い る． その 一方でp271くip1の丿 ックア ウトマ
ウス におい ても、ラ バマイ シンは 新生内 膜の増 生を抑 制する ことか ら、ラノ くマイ シンの 作用点 がp27耐plで ある こ と を疑 問 視する 報告もあ る．本 研究では 培養血 管平滑筋 にラパマ イシン を添加し た際のp57Kip2、 p27Kip1の 変 化、 p27Kip1の 分 解 に作 用 す る 蛋白 の 変 化 、p27Kip1の 細 胞 内 局在 の 変 化 を検 討し、 ラパマ イシンの 平滑筋 細胞増 殖抑制 機構の 分子機 構につ いて考 察した．
方 法 ： 胎 児 ラ ッ ト 大 動 脈 由 来 血 管 平 滑 筋 細 胞 A10（ pロ C） を 使 用し た ． 培 地を DMEM／ 0t5ゲ DFBSに 交換 し て 60時 間 培 養 し （ 珀 /G1期 に 同 調 さ せ た 後 、 DMEM／ 10％ FBSに 交換 し 血 清 刺激 を 加 え た， 刺 激 前
お よ ぴ刺 激 開 始 8， 12， 16，20， 24時 間 後 にDMEM／10％ FBS／3Hチミ ジン1□ くニi/nに 交換し 37℃5％C02の 条 件 下 で 90分 培 養 し 3Hの 取 り 込 み を 行 い 、 DNAの 合 成 の 指 標 と し た ， 次 に ラ バ マ イ シ ン を1，3， 10，30，100，300nmolnの各濃度で添加し、同様の方法で3Hチミジン取り込みを測定した．次にWbsternblot法 に よる p57瓩 p2、 p27騒 p1、 Jab1、 C薑 W1の 蛋白 検 出 を 行な い 、 そ れそ れ に 対 する ラ バマイ シンの効 果 を 検 討 し た ． 次 に p27Kiplの 細 胞 内 局 在 の 変 化 を 観 察 す る 目 的 で 、 緑 色 螢 光 蛋 白 （ EGFP） 標識
p27Kipl（ p271くip1―EGFPとEG・FP‐ p27Kip1）を 培養平 滑筋細 胞に一 過性発現 させ， 血清刺 激およぴラバ
マ イ シ ン の 効 果 を 検 討 し た ， 精 製 プ ラ ス ミ ド を A10細 胞 に 導 入し 、 螢 光 顕微 鏡 に よ る観 察 を 行 った ．
結 果 ： A10細 胞 に お け る 細 胞 周 期 同 調 後の 3Hチ ミジ ン 取 り 込み を 経 時 的に 解 析 し た結 果 、 血 清添 加 によ る 増殖 刺 激 を 加え て 、 12時 間 後 より 3Hチ ミジ ン 取 り 込み の 増 加が見 られ、 16時間後 に最大 となっ た，
20時 間 後 、 24時 間 後 と取 り 込 み は減 少 し て しヽ っ た ． ラパ マ イ シン各 濃度に おける 3Hチミジ ン取り 込み

検討したでは、Inmo
Mのラバマイシンを添加した群より高濃度 の群で、コントロール群と比し有意に3Hチミジン取り込みを抑制した． Western blot法による蛋白に対するラパマイシンの影響を検討では
p27
Kip1蛋白は血清除去によるGO/G
1静止期では増加し、血清刺激によルコントロール群で は8時間後から血清刺激開始時に比して有意な減少を認め、20時間後まで低い発現量が維持された，一方ラバマイシン添加群ではp27K
ip1蛋白の減少は抑制されていた．p57l
くip2蛋白は血清除去によるG
O/G
1
静止期では増加し、血清刺激によルコントロール群では4時間後から血清刺激開始時に比して有意な減少を認め、16時間後まで低い発現量が維持さ れた後、再度増加することが確認された．ラバマイシン添加群では
p57Kip2蛋 白の 減少 はp27Ki
p1蛋白同様に抑制されていた．Jabl蛋白およぴCRM1蛋白は 血清刺激20時間までコントロール群、ラバマイシン添加群ともに有意差を認めなかった． p27Kip1の細胞内局在に対するラバマイシンの影響を検討では 、p27lくiplーE
GFPとEGFP‑
p27Kiplのそれそれを発現するプラスミドを細胞内ヘ取り込ませ観察したところ、コントロール群では細胞質への移行が認められたが、ラバマイシン添加群では細胞質の螢光発光は認められず、核内にプラスミドが留まっていることが確認された．
考察：ラパマイシンは一定濃度で Al0細胞の細胞周期を止め、細胞増殖を抑制することが示された．諸家の報告によると、ラバマイシン はp27Kiplの分解を抑制し細胞増殖を抑制するとされている．しかし
p27Kip1ノックアウトマウスにおいても同様の効果があるとの報告もある．我々の結果ではラバマイシンはp27K
ip1ぱかりでなく、p57lくip2の蛋白分解も抑制することが示されており、mTORが連関する蛋
白リン酸化酵素はp571
くip2も標的としている可能性が考えられる，我々はすでにp57Kip2の強制発現モデルにおいて、p27Kip1の血清刺激による蛋白減少が抑制されることを確認しており、血清刺激によりp27Kipl蛋白の減少に先立ちp57Kip2蛋白の減少が認められたことを考え合わせると、ラバマイシンはp57Kip2を介してp27l
くiplに働いている可能性がある，p57l
くip2のノックアウトマウスは胎生致死あるいは生後まもなく死亡する．一方、p27l
くiplのノックアウトマウスは正常に発生し、成長するが、最終的に正常マウスよりも体重が増加し、6〜 12ケ月まで生存する．p27Kip1は様々な処理により誘導され、細胞周期の停止を起こすが、p27lくipl
ノックアウトマウスにおいてもこれらの処理による細胞周期の停止すると報告されている．これらの 遺伝子改変動物モデルも、p57Kip2がp27Kip1の作用を補完的に行なっているという我々の仮説を支持 するものであると考えられる，p27Ki
p1がCKIとして機能をもっためには、核内に局在することが必要である． p27l
くiplの核外移行にJab1とCRMlか深く関わっていると考えられている．今回の我々の検討 ではJ
ab1、CIはnともにラバマイシンの添加によって変化をきたすことはなく、コントロール群と有意 差を認めなかった．このことからp27K
ip1蛋白の減少には、G1
早期のS10リン酸化を制御しているりン酸化酵素価naseinteractingstathInin）の活性調節が重要であると考えられる，
結語：ラパマイシンは胎児ラット大動脈由来の血管平滑筋細胞の細胞周期を止めることによって増殖を抑制した。ラバマイシンはp27K
ip1蛋白とp57K
ip2蛋白の両方の減少を抑制していること、 p27函p1の核外移行を抑制していることか明らかとなった．ラパマイシンとp57
1くip2の関係についての報告は他になく、今までの我々の知見と合わ せて、p57
Kip21がp27Kip1に対し補完的な役割を果たしている可能性も示唆された．

− 526―

学位論文審査の要旨
主副副査
査
査

教
教
教

授
授
授

北長
川畠
嶋
口和
秀顕郎
明

学 位 論 文 題 名

血管平滑筋増殖抑制に対するラパマイシンの作用機序の検討―細胞周期抑制とcy
clin
‑de
pen
den
tk
in
asein
hibitor(CKI)の関係一静 止 期 にあ る 血 管 平滑 筋 細 胞 が増 殖 型 の Phenotypeに 変化 する際 には、 増殖刺 激が核 内に
伝 達 さ れ 、 GOか ら の 逸 脱 、 G1‑S期 への 進 行 が 促さ れ る 。 G1‑S移行 に は p27lく iplの分 解 促進が 重 要 な ステ ッ プ で ある 。 ラ バ マイ シ ン は 平滑 筋 細 胞 増殖 抑 制 薬 とし て 最 近 され ているが、そ の機序は未だ明らかではない。過去の報告ではcyclin‑dep
endentkinaseinhibi
torである
p27Kip1の分 解 を 抑 制す る と さ れて い る 。 その 一 方 で p27Kip1のノ ッ ク ア ウト マ ウ スにおいても 、 ラバ マイシ ンは新生 内膜の 増生を抑 制するこ とから 、ラバマ イシン の作用点 がp27Kip1であ る こ と を疑 問 視 す る報 告 も あ る。 本 研 究 では 培養 血管平 滑筋に ラバマイ シンを添加 し た 際 のp57Kip2、 p27Kip1の 変 化 、p27Kip1の 分 解 に 作用 す る 蛋 白の 変 化 、 p27lくiplの細 胞 内 局 在の 変 化 を 検討 し 、 ラ バマ イ シ ン の平 滑 筋 細 胞増 殖 抑 制 機構 の 分 子 機構 について考察 した。
胎 児 ラ ッ ト 大 動 脈 由 来 血 管平 滑 筋 細 胞A10（ pば CC)を 使 用し た 。 培 地を 低 血 清 培地 に 交換 し て 60時 間 培 養 し GO/G1期に 同 調 さ せた 後 、 血 清刺 激 を 加 えた 。 刺 激 前お よ び 刺 激開 始
後 4時 間 毎 に 3Hチ ミ ジ ン の 取 り 込 み を 行 な い 、 DNAの 合 成 の 指標 と し た 。次 に ラ バ マイ シ
ンを1， 3，10，30， 100，300nmol/lの各濃 度で添 加し、珊 チミジ ン取り 込みを測定した。次にWestern blot法 に よる p57Kip2、 p27Kip1、 Jabl、 CRM1の 蛋白 検 出 を 行な い 、 そ れそれ に対する ラ バ マ イシ ン の 効 果を 検 討 し た。 次 に p27Kip1の 細胞 内局 在の変 化を観 察する目 的で、
緑 色 螢 光 蛋 白 (EGFP)標 識 p27Kip1を 培 養 平 滑 筋 細 胞 に 一 過 陸 発 現 さ せ 、 血清 刺 激 お よぴ
ラバマ イシン の効果 を検討し た。
A10細 胞 に お け る細 胞 周 期 同調 後 の 3Hチ ミ ジ ン 取り 込 み を 経時 的 に 解 析し た 結 果 、血 清
刺激 を 加 え て、 12時 間後 よ り 取 り込 み の 増 加が 見 ら れ 、16時 間 後に 最 大 と なっ た 。ラバ マ‑527一

イシン各濃度における3Hチミジン取り込み検討したでは、1nmol/lのラバマイシンを添加した群より高濃度の群で、DNA合成は抑制された。W
ester
nblot法による蛋白に対するラバマ
イ シンの影 響を検討ではp27l
くipl蛋白は血清除去によるGO/G1
静止期では増加し、血清刺激によルコントロール群では8時間後から血清刺激開始時に比して有意な減少を認めたが、ラバマイシン添加群ではp27l
くipl蛋白の減少は抑制されていた。p57l
くip2蛋白は血清除去に
よ るG
O/G1
静 止期で は増加し 、血清 刺激によ ルコン トロール 群では4時間後から血清刺激開 始時に比 して有 意な減少 を認め たが、ラバマイシン添加群ではp57l
くip2蛋白の減少は
p27l
くipl
蛋 白同様に 抑制され ていた 。J
abl蛋白およぴC
RM1蛋白は血清刺激20時間までコントロール群、ラバマイシン添加群ともに有意差を認めなかった。p27K
ip1の細胞内局在に対 するラパ マイシンの影響を検討では、コントロール群では細胞質への移行が認められたが 、 ラ バマ イ シ ン添 加 群 では 核 内 にプ ラ ス ミ ドが 留 ま って い る こと が 確 認さ れ た 。
ラ パマイシ ンは一 定濃度で A10細 胞の細胞周期を止め、細胞増殖を抑制することが示された。今回の結果ではラパマイシンはp27Kip1
ぱかりでなく、p57l
くip2の蛋白分解も抑制する ことが示 されて おり： mTORが連 関する蛋 白リン 酸化酵素 はp57K
ip2も標的としている
可 能 性が考え られる 。p27Ki
p1の 核外移 行にJablとC
RM1が深く関 わって いると考 えられて いるが、 今回の 検討では J
abl、CRM1とも にラバ マイシン の添加によって変化をきたす
こ とはなく 、コン トロール 群と有 意差を認めなかった。このことからp27K
ip1蛋白の減少に は、Gl早期 のSl0リン酸化 を制御 しているりン酸化酵素の活性調節が重要であると考えられる。
ラ バマイシ ンは胎児ラット大動脈由来の血管平滑筋細胞の細胞周期を止めることによって 増殖を抑 制した 。ラバマ イシン はp27Kip1
蛋 白とp57Kip2蛋白の両方の減少を抑制してい ること、 p27]くiplの核外移 行を抑 制していることが明らかとなった。ラバマイシンとp57Kip2の関 係につい ての報告 は他に なく、今 まで知 見と合わ せて、p57K
ip21がp27K
ip1に対し補完的な役割を果たしている可能性も示唆された。
口頭発表に際し、川口教授からp27Kip1
分解のメカニズムと、内皮細胞の細胞周期にっいて の質問が なされ た。次い で長嶋 教授からp27K
ip1が核内に留まる理由とその核内での分解 およぴp57Kip2との 関係につ いて質 問がなされた。最後に北畠教授から薬物溶出ステント の臨床的 意義とラバマイシンと心肥大についての関係ついて質問がなされた。いずれの質 問に対し ても、申請者は研究結果に基づいて、あるいは文献的知識により、概ね妥当な回答を行った。
この論文は、B
MIPPの心筋集積に及ぼす虚血後経過時間の影響を明らかにしたものとして意 義のある ものと評価され、審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程におけ る研鑽や 取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。
‑ 528一