2014 JULY
No. 587

2014 年（平成 26 年）7 月号

第 60 巻 第 4 号（通巻 587 号）

挨拶・巻頭言理事長就任のご挨拶........................................長 井 伸 也（ 2 ）獣医病理学研修会
第 52 回 No. 1067 イヌの上顎神経........................................ 岩 手 大 学（ 3 )第 53 回 No. 1080 ケツギョの肝臓・腎臓.................................... 大阪府立大学（ 4 )レビュー
生ワクチン中に混入する感染性のレトロウイルスについて .............宮 沢 孝 幸（ 5 ）文献紹介
細菌、核酸及び抗体検出に口腔液を用いた Erysipelothrix rhusiopathiae
感染の生検法の改善 ......... 大 嶋
篤（10）

お知らせ
お知らせ .............................................. （16）
研修者・見学者受け入れ状況................ （16）

2（46）

日生研たより理事長就任のご挨拶
長井伸也
2014 年 5 月 30 日に開催されました当研究所の定時評議員会におきまして、上田進前理事長の後任としてこのたび理事長を拝命いたしました。大役を仰せつかり身の引き締まる思いでございますが、職責を全うすべく全力を尽くす所存でございます。
なお、当日の評議員会では、前理事長の他に、これまで長年当研究所の発展に貢献してこられました布
谷鉄夫前理事、吉村巌雄前理事、佐々木伸雄前理事が退任することになりました。前理事に対する皆様方の長年に亘るご支援、ご鞭撻に深くお礼申し上げます。
前理事長および前理事の方々には、時代の潮流に則した研究およびワクチンの開発に尽力されたことはもちろんのことながら、研究所の経営の安定化に大きく貢献されました。ご就任当時はバブル崩壊後の研究所の経営状態が不安定な時期で、事業の遂行もおぼつかない状況にありました。そのような中、知恵と工夫を凝らされ、そしてあくなき努力を積み重ねられ、研究所の経営を見事に立て直されました。また、公益法人法の改正に伴い、一般財団法人日本生物科学研究所と関連組織である日生研株式会社の事業を再編成し、両組織の経営を軌道に乗せられたのも前理事の方々のご功績であります。今般、我々が安心して事業を引き継ぐことができますのも、前理事の方々のご尽力の賜物と考えております。
さて、当研究所は昭和 22 年（1947 年）3 月、戦後の混乱の中、立川の地に創立されました。その後、
昭和 34 年（1959 年）には研究開発を担う財団法人日本生物科学研究所と、ワクチンの製造と販売を担う
日生研株式会社の 2 組織体制となり、そして平成 24 年（2012 年）には研究開発と製造を担う一般財団法人日本生物科学研究所と、販売（薬事上は製造販売）を担う日生研株式会社とに再編され、現在に至っております。事業の中心は、一貫して動物用生物学的製剤の研究開発・製造・販売であります。関連した事
業として、昭和 41 年（1966 年）に山梨県小淵沢町（現在北杜市）に実験動物研究所が設立され、SPF 鶏
卵やミニブタ等の実験動物を本所の製造部門に供給するほか、他所社への販売も行っております。そのような研究所の創立の歴史から、民間の学術研究機関として、これまでニューカッスル病、豚コレラ、PED、
狂犬病、鳥インフルエンザ（備蓄用）、馬インフルエンザ、その他の様々な家畜疾病に対するワクチンの研究開発と供給を通じまして、微力ながら日本の動物衛生および公衆衛生に寄与することができました。
これも、先輩研究員や役職員の方々のご努力の賜物であります。
さて、私共が今後行わなくてはならないことは、先輩方から引き継いだ歴史と伝統のある病原微生物の取り扱い技術を絶やすことなく、また、日進月歩のバイオテクノロジーやバイオインフォマティクスを導入した先端的な動物用ワクチンの開発・改良・製造に邁進することであります。そして、昨今は国際的な物流の活発化により、これら病原微生物がたやすく国境を越えて侵入して来るようになりました。そこで、
これから動物の感染症をコントロールするためには、日本国内のみならず、地球規模での病原体の動きを制御する技術や手段の研究開発が必要となっております。この国境を越えた疾病制御技術につきましては、
我々のような民間学術研究機関の方がむしろ容易に研究活動を展開できるのではないかと考えております。
私どもは地球規模で動物疾病を制御することを最終目標とし、国内のみならず、世界の動物衛生・公衆衛生にも寄与できることが将来の夢でございます。
以上、当研究所の創立者である中村䝌治博士に始まり、先輩諸氏により高く挙げられた明りが絶えることなく、その時代々々に則してさらに一層輝きを増すことができますよう、役職員一丸となって努力してまいる決意でございます。皆様には引き続き当研究所に対しまして温かいご指導とご支援を賜りますよう、
何卒よろしくお願い申し上げます。
（理事長）

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、2014

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イヌの上顎神経
第 52 回獣医病理学研修会 No. 1067

岩手大学

動物：犬、ミニチュアダックスフンド、避妊雌、9 歳。

は、Ki – 67 にはほとんど陰性であった。同様の病変は、臨床事項：2010 年 4 月頃より両側眼瞼の下垂がみられ胸腰髄の背根や腹根をはじめ、三叉神経、三叉神経節、

はじめ、精密検査のために本学動物病院を受診した。神馬尾などの広範な部位で認められた。

経学的検査では、両眼対光反射・角膜反射の消失、眼診 断：犬 の 上 顎 神 経 に お け る リ ン パ 球 性 神 経 炎

瞼反射・威嚇瞬き反応・上下顎の知覚などの低下、右眼Lymphocytic neuritis of maxillary nerve in a dog

縮瞳、顔面神経麻痺、側頭筋・咬筋の萎縮などが認めら

考察：犬の根神経症は、アライグマ猟犬麻痺として知られ、X 線検査では巨大食道症と診断された。脳脊髄液のれる多発性根神経炎や、主に感覚神経が障害される神細菌検査、抗アセチルコリン受容体抗体、咀嚼筋筋炎抗経節根炎などが知られている。本症例では、胸腰髄の背体、抗 GFAP 自己抗体検査にはすべて陰性であった。

根および腹根の両方に病変がみられ、さらに三叉神経や意識状態は傾眠を示して、呼びかけには反応するものの馬尾などの広範な領域にも同様の病変が認められた点症状の改善がみられず同月末死亡し、死後約 24 時間後が特徴的であり、従来の疾患とは一致しないものの、に病理解剖を実施した。

Panciera らの報告したエアデールテリアの 1 例と類似し組織所見：上顎神経のほとんどの領域において、リンパていた。本症の原因としては免疫介在性の機序が疑われ球浸潤が重度に認められた（図 1、2）
。軸索は断裂、膨たが、確定には至らなかった。リンパ球クローナリティ

化していた。免疫組織化学的染色では CD20 陽性細胞が検査では、T または B リンパ球のモノクローナルな腫

優性にみられ、CD3 や lysozyme 陽性細胞はほとんど認瘍性病変は否定された。

められなかった（図 3 – 5）。λ – light chains に陽性を示

参考文献：Panciera, R. J. et al. 2002. Vet. Pathol. 39 : 146

す円形細胞は散在性にみられた（図 6）。浸潤リンパ球– 149.

（佐々木淳）

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日生研たよりケツギョの肝臓・腎臓
第 53 回獣医病理学研修会 No. 1080

大阪府立大学動物：魚、ケツギョ（Siniperca chuatsi）、雄、年齢不明、

伝染性脾臓腎臓壊死症ウイルス（ISKNV）の遺伝子が検

体重 550 g。

出された。

臨床事項：水族館において 20 年ほど群で繁殖を繰り返

診断：ケツギョのイリドウイルス（伝染性脾臓腎臓壊死

しながら飼育されていたが、2011 年の春には繁殖せず、症ウイルス）感染による肝血管周囲における好塩基性肥

春から夏にかけて削痩する個体が現れ始めた。その後大細胞の出現および好塩基性肥大細胞の出現を伴う腎造

30 匹以上いた群の約半数が次々に死亡し始め、最終的

血組織の壊死に全個体が死亡した。水族館の獣医師によって剖検さ

考察：本疾病の特徴である好塩基性肥大細胞は尿細管やれ、主要臓器が当研究室に送付された。

類洞に隣接して存在していたり、グリソン鞘内に存在し剖検所見：肝臓、腎臓、鰓など多くの臓器で褪色が見らていた。ISKNV の遺伝子に対する in situ hybridization

れた。

の結果から、好塩基性肥大細胞は腎間質の線維芽細胞

組織所見：肝臓において、核および細胞質の肥大した好や、肝臓の線維芽細胞、肝星細胞などの間葉系の紡錘形

塩基性の細胞が認められた（図 1、矢印）。また、肝細細胞由来の可能性が示唆された（図 4）。
（田中夏樹・井澤武史）

胞の空胞変性も認められた。腎臓でも同様の好塩基性肥

献：Tanaka, N., Izawa, T., Kuwamura, M.,

大細胞が認められ（図 2、矢印）、腎間質の造血組織の参壊死も認められた。電子顕微鏡による観察で，好塩基性

Higashiguchi, N., Kezuka, C., Kurata, O., Wada, S. and肥大細胞の細胞質に多数のウイルス粒子が認められた

Yamate, J. 2013. The first case of infectious spleen and（図 3）。これらのウイルス粒子は正二十面体で、中心部

kidney necrosis virus（ISKNV）infection in aquarium-にコアを有し直径はおよそ 150 nm であった。PCR と

maintained mandarin ﬁsh, Siniperca chuatsi（Basilewsky）,

シークエンス解析の結果、イリドウイルスの一種である

in Japan. J. Fish. Dis.（in press）.

考文

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、2014

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レビュー

生ワクチン中に混入する感染性のレトロウイルスについて
宮 沢 孝 幸（京都大学ウイルス研究所 進化ウイルス研究領域）
2010 年 1 月に私の研究グループとグラスゴー大学の研究グループが共同で、一部の動物用生ワクチ
ンに、感染性のレトロウイルスが混入していることを発表した [4]。この論文は、生ワクチン中に感染
性の内在性レトロウイルスが混入していることを世界ではじめて示した論文であった。混入していたウ
イルスは RD – 114 ウイルスというネコの「内在性レトロウイルス」であり、獣医の領域でもあまりなじみのないウイルスである。本稿では、内在性レト
ロウイルスと RD – 114 ウイルスに関する基礎的な知識と生ワクチンへの混入事例をまとめた。

細胞が生きている限り安定して維持される。すなわ
ち、細胞に感染したレトロウイルスのゲノムは、プロウイルスとして細胞のゲノムと同化していることになる。
通常、レトロウイルスは体細胞にのみ感染するが、ごく稀に生殖細胞や初期胚にも感染することが過去にはあったと考えられる。レトロウイルスが生殖細胞に感染し、その細胞由来の受精卵が個体として発生すると、ウイルスのゲノム DNA はプロウイルス
として、その個体のすべての細胞に存在することになる。このような状態になったレトロウイルスのことを内在性レトロウイルスと呼んでいる（図 2）。
内在性レトロウイルスはメンデルの遺伝の法則に
1. 内在性レトロウイルスとは何か？
のっとり、子孫に伝達される。
レトロウイルスは細胞に感染すると、ウイルスが生体の生存に不利な内在性レトロウイルスは、長もっているゲノム RNA は DNA に逆転写される。
い年月の間に変異や欠失により不活化されると考え逆転写された DNA は細胞のゲノムに組み込まれ、られる。逆に、生存に有利なものは不活化されずにそこからウイルスゲノム RNA は転写され、ウイル保持される場合もある。すなわちオープンリーディ
ス構成蛋白質は合成される（図 1）。レトロウイル
ングフレーム（ORF）を維持し、ゲノム内に長期間スの DNA ゲノム（これをプロウイルスと呼ぶ）は、 （数百万年以上）存在しているものもある。また、

図 1 レトロウイルスの生活環
レトロウイルスのエンベロープ蛋白と細胞表面上の受容体が結合すると、ウイルスの膜と細胞膜が融合して、ウイルスの殻（コア）は細胞質に侵入する。ウイルスのゲノム RNA は、ウイルスがもつ逆転写酵素により DNA へと逆転写される。ウイルス DNA は細胞の核内に侵入し、細胞のゲノムにウイルスがもつインテグラーゼにより組み込まれる。この状態のウイルス DNA をプロウイルスと呼ぶ。プロウイルスからウイルスのゲノム RNA が転写され、そこからウイルス蛋白が翻訳、ウイルスゲノム RNA を取り込んだウイルス粒子を形成し、細胞外へ出芽する。ここではウイルス粒子の細胞への吸着からウイルスゲノム RNA が転写されるまでの過程（前期過程）を示す。

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宿主のゲノムに入り込んだ後に、感染性を維持した
まま種に固定されているものも存在するとされている。
内在性レトロウイルスに対して、感染によって個体から個体へと伝達されるレトロウイルスのことを外来性レトロウイルスと呼び、内在性レトロウイル
スと区別している（図 2）。獣医臨床上問題になっているレトロウイルスは外来性レトロウイルスであり、それには、ネコ白血病ウイルス（feline leukemia virus : FeLV）、ネコ免疫不全ウイルス（feline
immunodeﬁciency virus :FIV）、ウマ伝染性貧血症ウ
イルスやウシ白血病ウイルスなどが含まれる。
内在性レトロウイルスが単独で疾病を引き起こす
ものは、家畜では知られていないが、マウスにおいては内在性レトロウイルスがリンパ腫を引き起こしている例がある。また、コアラにおいては内在性レ
トロウイルスが白血病や免疫不全を惹起している可能性を示唆する報告もある [11]。さらに、ネコの外来性レトロウイルスである FeLV の病態には、FeLVに極めて近縁の内在性レトロウイルスが深く関与していることが明らかになっている [3]。
2. 内在性レトロウイルスと哺乳類の進化の密接な関係
内在性レトロウイルスの配列はヒトゲノム中に約8%、マウスゲノム中に約 10% も含まれる。ヒトでは機能をもっている遺伝子の配列は、ゲノムの約2% ほどしか占めていないので、内在性レトロウイ

日生研たよりルスは遺伝子の約 4 倍をもゲノム中に占めていることになる。
内在性レトロウイルスの配列は哺乳類のゲノムで大きな割合を占めているが、その役割はまだほとん
ど分かっていない。マウス、ネコ、ヒツジにおいては、病原性レトロウイルスの防御に役立っている例が知られている。また真獣類の胎盤においては、内在性レトロウイルスの発現が昂進しているが、最近になって、胎盤形成において様々な内在性レトロウ
イルスの発現が必要であることが明らかになってきた [8]。特にヒト内在性レトロウイルスの一つである HERV – W のエンベロープ（Env）蛋白はシンシ
チンとも呼ばれ、トロフォブラスト（栄養膜細胞）の融合に関与している。また、最近我々は、ウシの胎盤で発現し、ウシ胎盤特異的な三核細胞の形成に関与している内在性レトロウイルス（ウシ内在性レ
トロウイルス K1）を発見し、その Env 蛋白を Fematrin – 1 と名付けた [5]。
3. ワクチン中の内在性レトロウイルスを検査した
きっかけ
2006 年の 3 月に PLoS Pathogens 誌に興味深い論文が発表された。ヒトの前立腺ガンの患者の組織にヒトの内在性レトロウイルスとは異なるガンマレト
ロウイルスの配列が見つかったというのである[13]。異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（xenotropic murine leukemia virus-related virus :図 2 外来性レトロウイルスと内在性レトロウイルスの概念図
外来性レトロウイルスは体細胞に感染し個体から個体へと感染により伝搬する。通常同じ動物種に感染するが、ごくまれに異種動物に感染する。これを種間伝搬という。レトロウイルスはごくまれに生殖細胞へも感染すると考えられる。感染した細胞が受精卵となり、それが個体へと発生すると、すべての体細胞と生殖細胞にウイルスゲノ
ム DNA が組み込まれることになる。この状態のウイルスを内在性レトロウイルス（endogenous retrovirus [ERV]）と呼ぶ。種に固定化された内在性レトロウイルスは、メンデルの遺伝の法則に従って親から子供へ伝達される。

60（4）、2014

XMRV）と名付けられたウイルスは、その後の研究により前立腺ガンの組織に組み込まれていることが示され、実際にヒトの前立腺に感染していることがわかった。さらに 2009 年の 10 月には、Science 誌にヒトの慢性疲労症候群の患者から高率に XMRVが分離されることが報告された [1]。これらの結果
から、XMRV がアメリカの一部のヒトの間で広まっていることが示唆された。XMRV は名前が示すよ
うに異種指向性のマウス白血病ウイルス（xenotropic murine leukemia virus : MLV – X）に非常に近縁なウイルスである。重要なことは、MLV – X がマウスの内在性レトロウイルスであることである。gag 遺伝子配列の上流に 24 塩基対の欠損が見られること
が XMRV の特徴であるが、その他の領域について
は、XMRV は MLV – X とほぼ同一である。このことから、XMRV は何らかの経路により、MLV – X か
それに似たマウスの内在性レトロウイルスがヒトに感 染 し た 結 果 生 じ た と 考 え ら れ た。す な わ ち
XMRV の発見は、「動物由来の内在性レトロウイル
スが異種の動物（この場合はヒト）に感染し、病気を引き起こす可能性がある」ということを意味した。
ヒトや動物のワクチンでは、様々な動物由来の細胞を用いて製造されている。これまでも動物由来の内在性レトロウイルスが生ワクチンなどの生物学的製剤中に混入することは予想されていた。しかしながら、生ワクチン中に感染性の内在性レトロウイル
スが混入しているという報告はこれまでなく、生ワクチンに混入する内在性レトロウイルスの危険性について、科学的に議論されたこともほとんどなかった。そこで我々は、市販の動物用の生ワクチン中に感染性の内在性レトロウイルスが混入しているかど
うかを調べることにした。少なくとも、ブタ、ニワ
トリ、ネコ、マウスの細胞は感染性の内在性レトロ
ウイルスを産生しうることが知られている。この中で我々は、ネコがもっている感染性の内在性レトロウイルス（RD – 114 ウイルス）に着目して研究を進めた。
なお、ヒトに感染しているとされた XMRV ではあるが、その後の調べで、実験室内コンタミ、もしくは、試薬内に混入していたウイルスゲノムを検出していたに過ぎないことが明らかとなった [7]。実際 我 々 も、市 販 の RT – PCR の キ ット の 酵 素 に、MLV のゲノム RNA が混入していることを明らかにした [10]。

4. RD‒114 ウイルスとは何か？
RD – 114 ウイルスは 1972 年にヒトの横紋筋肉腫
由来の細胞（RD 細胞）から分離されたレトロウイ
ルスである [2]。当時はヒトのレトロウイルスはまだ見つかっておらず、初めてのヒトレトロウイルス7（51）であると誤認された経緯がある。その後の調べにより、RD – 114 ウイルスはヒトの外来性レトロウイル
スではなく、ネコの内在性レトロウイルスであることがわかった。RD – 114 ウイルスは gag-pol 領域がガンマレトロウイルス、env 領域がベータレトロウ
イルスのキメラウイルスである（図 3）[14]。興味深いことに RD – 114 ウイルスの env 領域はヒヒ内在性レトロウイルスの env 領域と極めて相同性が高い。数百万年前にヒヒのレトロウイルスがネコの祖
先動物に感染し、その動物が元々持っていた内在性
レトロウイルスと組換えを起こして、内在化したものと推察されている。ネコ属（Genus Felis）に分類される動物はすべてこの RD – 114 ウイルス由来の配列をもっているとされている。
RD – 114 ウイルスはネコを含む様々な動物種の細胞に感染する。ヒトの細胞に感染する際は、ASCTと呼ばれるナトリウム依存性の中性アミノ酸トラン
スポーターを受容体として使用する。ASCT を利用するレトロウイルスの中には、病原性をもつものも存在する。例えば、免疫抑制を引き起こす Mason –Pﬁzer サルウイルス、ニワトリ細網内皮症ウイルス、
アヒル脾臓壊死ウイルスなどである。
RD – 114 ウイルスがネコ属で長い間維持されてきたということは、このウイルスがネコ属において生体側に有利に働いていることを示唆している。興味深いことに、ヒトの胎盤形成に必要な内在性レトロウイルス（HERV – W）の受容体も ASCT であるので、ネコの胎盤形成に RD – 114 ウイルスの Env 蛋白が関与している可能性も考えられる。しかしたとえ
RD – 114 ウイルスが宿主動物と共存していたとしても、RD – 114 ウイルスがネコで非病原性であると結論することはできない。感染性の内在性レトロウイ
ルスの活性化がガンを誘発している例も、免疫不全のマウスで見られているからである [17]。
RD – 114 ウイルスはネコ細胞でも効率よく増殖す
る。In vitro の結果から考えれば、RD – 114 ウイル
スがネコの体内で活性化した場合、感受性細胞に感染し、体内で増殖する可能性は否定できない。過去の文献では、FeLV 陰性のリンパ腫で RD – 114 ウイ
ルスの発現が上昇していることが報告されており[6]、RD – 114 ウイルスの（再）感染、あるいは転座などによりリンパ腫が誘導されていることも考えられる。しかし、これまでネコのリンパ腫の発生にRD – 114 ウイルスが関与しているかを調べることは困難であった。それは、ネコゲノム中には RD – 114
ウイルスに類似の内在性レトロウイルスの配列が多数存在し、再感染によるものと区別が付かないからである。最近、ネコのゲノム情報が明らかになり、さらに感染性をもつ RD – 114 ウイルスの塩基配列が明らかになったので、今後 FeLV 陰性のリンパ腫に RD – 114 ウイルスが関与しているかどうかを調8（52）

べることは可能になると思われる。

5. ワクチンへの RD‑114 ウイルスの混入とそのルート
我々は、RD – 114 ウイルスの検出のために、ヒトの横紋筋肉腫由来の TE671 細胞を用いた LacZ マー
カ ーレ ス キ ューア ッセ イ 法 を 開 発 し た [9]。RD –114 ウイルスに特異的なプライマーを用いた PCR法でも、RD – 114 ウイルスの検出は可能である。
PCR 法は、手技そのものは比較的単純であるが、テンプレート DNA への PCR 増幅産物のコンタミ
ネーションの危険性が常にあるため、擬陽性となる可能性がある。我々は LacZ マーカーレスキュー法の方が信頼できると考えている。
LacZ マーカーレスキュー法を用いて、国内で市販されているネコの混合生ワクチンを調べたところ、
1 社の製品に感染性の RD – 114 ウイルスの混入が認められた。さらに同様の方法でイヌの混合生ワクチンを調べたところ、2 社の製品に混入が認められた[4]。イ ギ リ ス の グ ラ ス ゴ ー大 学 に お い て も ヨ ー
ロッパで市販されている混合生ワクチンで RD – 114
ウイルスの混入が確認された [4]。
一部のネコ細胞は感染性の RD – 114 ウイルスを産生している。RD – 114 ウイルスを産生しているネコ細胞を生ワクチン製造に使用すると、生ワクチン
製品中に RD – 114 ウイルスが混入する。また RD –114 ウイルスはネコ細胞のみならず、イヌ細胞やヒ

日生研たよりト細胞などにも感染し、効率よく増殖する。従って、
シードロットのウイルス（種ウイルス）に RD – 114
ウイルスが混入している場合、たとえ製造用細胞がRD – 114 ウイルスを産生していなくても、RD – 114
ウイルスがワクチン製造用細胞で増殖して生ワクチ
ン中に混入することが考えられる。特にイヌパルボ
ウイルスはネコ細胞を用いてウイルス分離することが多く、シードロットに RD – 114 ウイルスが混入することが危惧される [16]。実際我々は、ネコ以外の細胞を用いて製造されている生ワクチンにも、高力価の感染性の RD – 114 ウイルスを検出している [15]。

6. ワクチン中の RD‒114 ウイルスは問題なのか？
イヌは RD – 114 ウイルスを内在性レトロウイルスとしてもっておらず、イヌにとって RD – 114 ウ
イルスは、外来性レトロウイルスである。言い換えれば、イヌに RD – 114 ウイルスを接種することは、
イヌに FeLV や FIV を接種するのと同じ意味をもっている。イヌの株化細胞（MDCK 細胞や Cf2Th 細胞など）や初代イヌ腎細胞は、RD – 114 ウイルスに高感受性であり、ウイルスは良く増殖する。さらに、
RD – 114 ウイルスの Env 蛋白を被った遺伝子治療用のベクターを静脈内に接種すると、効率よく骨髄細胞に外来遺伝子を導入することができる [12]。
このことは、高力価の RD – 114 ウイルスをイヌに接種した場合、ウイルスは骨髄細胞に感染し得るこ

図 3 RD‑114 ウイルスのゲノム構造
ここでは細胞のゲノム DNA に組み込まれたプロウイルスの状態の構造を示す。RD‑114 ウイルスは gag 遺伝子、pol 遺伝子、env 遺伝子の 3 つの遺伝子をもっている。プロウイルスの両端には長い反復配列（LTR）が存在し、ウ
イルス RNA の転写を制御している。RD‑114 ウイルスは、gag-pol 領域がガンマレトロウイルス由来、env 領域がベータレトロウイルス由来のキメラウイルスである。

60（4）、2014とを示唆している。
我々は RD – 114 ウイルスをイヌに接種すること
により、リンパ節や脾臓、精巣にウイルス感染を確認している。また、RD – 114 ウイルス感染イヌの一部では、RD – 114 ウイルスに対する抗体が誘導され、中和活性も有していた ( 吉川ら、投稿準備中 )。しかしながら、RD – 114 ウイルスが感染したイヌにおいて、RD – 114 ウイルスが増殖したということに関しては、確認出来ていない。
イヌにおいて RD – 114 ウイルスが病原性を発揮し得るかどうかは、今のところまったく不明である。
ひとたびイヌで RD – 114 ウイルスの感染が成立す
れば、レトロウイルスの性質上、免疫系で体内から完全に除去することは困難であると考えられる。イヌ の 体 内 に お い て RD – 114 ウ イ ル ス が 増 殖 し なかったとしても、ウイルスゲノムの組み込み部位（ガン遺伝子の近傍に組み込まれた場合など）によっては、腫瘍化する可能性は否定できない。
RD – 114 ウイルスがイヌに感染することは明らかになったものの、RD – 114 ウイルスのイヌにおける病原性は依然として不明である。レトロウイルスの性質を考慮すると、RD – 114 ウイルスの病原性は、短期間の感染実験では明らかにすることはできない。
腫瘍性疾患を想定した場合、病原性を明らかにするためには、感染が成立した多数のイヌを一生涯追跡することが必要となろう。一部の研究機関において、数頭規模で長期の感染実験を行うことができたとしても、多数のイヌ（数十頭以上）を用いた長期の感染実験は不可能である。感染実験で病原性を明確に出来ないのだとすれば、レトロウイルス感染で引き起こされ得る疾病に、RD – 114 ウイルスが関与しているかを疫学的に調べるしか方法はない。RD – 114
ウイルスの感染により引き起こされる可能性がもっとも高い疾患は、他のレトロウイルス感染の事例を考えると、腫瘍および免疫抑制であろう。

7. 今後取るべき対策
現在市販されている生ワクチンと過去に市販されてきた生ワクチン中に、どれほどの量の感染性 RD– 114 ウイルスが混入していたかについてであるが、詳細は明らかになっていない。我々の試験においては 最 大 10,000 TCID50/shot の RD – 114 ウ イ ル ス が混 入 し て い る ロ ット を 見 い だ し て い る（な お、TCID50 と は 培 養 細 胞 で の ウ イ ル ス の 感 染 価 を 示す。
）[15]。我々はごく一部のロットでしかウイル
ス混入量を調べていないので、これよりも多くの感
染性 RD – 114 ウイルスを含むワクチンロットが存在する（あるいは存在していた）可能性はある。
生ワクチン中の RD – 114 ウイルスの混入量が最
大 10,000 TCID50/shot にとどまれば、イヌに感染す9（53）る可能性はほぼゼロなのかも知れない。また、RD– 114 ウイルスがイヌに感染したとしても、病気を引き起こす可能性は極めて低いのかもしれない。しかしながら、RD – 114 ウイルスは感染性のウイルスである。生ワクチンは世界中のイヌに年間数百万頭接種されている。感染個体において、RD – 114 ウイ
ルスがより感染力と病原性が強いウイルスに変異する可能性は完全には否定できない。たとえ個体レベ
ルでのリスクが極めて低くても、ウイルスが変異してイヌに広まった場合を想定すると、リスクは計り知れないものがある。従って、少なくとも、今後はRD – 114 ウイルスフリーのワクチン製造に努めるべきと考えている。

引用文献
1. Lombardi, V. C., Ruscetti, F. W., Das Gupta, J.,
Pfost, M. A., Hagen, K. S., Peterson, D. L., Ruscetti, S. K., Bagni, R. K., Petrow-Sadowski, C., Gold,B., Dean, M., Silverman, R. H. and Mikovits, J. A.
2009. Detection of an infectious retrovirus, XMRV,in blood cells of patients with chronic fatigue syndrome. Science 326 : 585 – 589.
2. McAllister, R. M., Nicolson, M., Gardner, M. B.,
Rongey, R. W., Rasheed, S., Sarma, P. S., Huebner,
R. J., Hatanaka, M., Oroszlan, S., Gilden, R. V., Kabigting, A. and Vernon, L. 1972. C-type virus released from cutured human rhabdomyosarcoma
cells. Nat. New Biol. 235 : 3 – 6.
3. Miyazawa, T. 2002. Infections of feline leukemia
virus and feline immunodeficiency virus. Front.
Biosci. 7 : d504 – 518.
4. Miyazawa, T., Yoshikawa, R., Golder, M., Okada,M., Stewart, H. and Palmarini, M. 2010. Isolationof an infectious endogenous retrovirus in a proportion of live attenuated vaccines for pets, J. Virol. 84 : 3690 – 3694.
5. Nakaya, Y., Koshi, K., Nakagawa, S., Hashizume,
K. and Miyazawa, T. 2013. Fematrin-1 is involvedin fetomaternal cell-to-cell fusion in Bovinae placenta and has contributed to diversity of ruminant
placentation. J. Virol. 87 : 10563 – 10572.
6. Niman, H. L., Stephenson, J. R., Gardner, M. B.
and Roy – Burman, P. 1977. RD – 114 and feline
leukaemia virus genome expression in naturallymphomas of domestic cats. Nature 266 : 357 –360.
7. Paprotka, T., Delviks-Frankenberry, K. A., Cingöz,O., Martinez, A., Kung, H. J., Tepper, C. G., Hu, W.
S., Fivash, M. J. Jr,, Cofﬁn, J. M. and Pathak, V. K.
2011. Recombinant origin of the retrovirus XMRV.

10（54）

Science 333 : 97 – 101.
8. Rawn, S. M. and Cross, J. C. 2008. The evolution,
regulation, and function of placenta-specificgenes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24 : 159 – 181.
9. Sakaguchi, S., Okada, M., Shojima, T., Baba, K.
and Miyazawa, T. 2008. Establishment of a LacZ
marker rescue assay to detect infectious RD114
virus. J. Vet. Med. Sci. 70 : 785 – 790.
10. Sato, E., Furuta, R. A. and Miyazawa, T. 2010. An
endogenous murine leukemia viral genome contaminant in a commercial RT – PCR kit is amplified using standard primers for XMRV. Retrovirology 7 : 110.
11. Tarlinton, R., Meers, J. and Young, P. 2008. Biology and evolution of the endogenous koala retrovirus, Cell. Mol. Life Sci. 65 : 3413 – 3421.
12. Ting – De Ravin, S. S., Kennedy, D. R., Naumann,N., Kennedy, J. S., Choi, U., Hartnett, B. J., Linton, G. F., Whiting-Theobald, N. L., Moore, P. F.,
Vernau, W., Malech, H. L. and Felsburg, P. J. 2006.
Correction of canine X-linked severe combined
immunodeﬁciency by in vivo retroviral gene therapy. Blood 107 : 3091 – 3097.
13. Urisman, A., Molinaro, R. J., Fischer, N., Plum-

日生研たよりmer, S. J., Casey, G., Klein, E. A., Malathi, K.,
Magi – Galluzzi, C., Tubbs, R. R., Ganem, D., Silverman, R. H. and DeRisi, J. L. 2006. Identiﬁcationof a novel gammaretrovirus in prostate tumors ofpatients of homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2 : e25.
14. van der Kuyl, A. C., Dekker, J. T. and Goudsmit, J.
1999. Discovery of a new endogenous type C retrovirus（FcEV）in cats: evidence for RD-114 beingan FcEVGag-Pol/baboon endogenous virus BaEVEnv recombinant. J. Virol. 73 : 7994 – 8002.
15. Yoshikawa, R., Sato, E. and Miyazawa, T. 2011.
Contamination of infectious RD – 114 virus in vaccines produced using non – feline cell lines. Biologicals 39 : 33 – 37.
16. Yoshikawa, R., Sato, E. and Miyazawa T. 2012.
Presence of infectious RD-114 virus in a proportion of canine parvovirus isolates. J. Vet. Med. Sci.
74 : 347 – 350.
17. Young GR, Eksmond U, Salcedo R, Alexopoulou L,
Stoye JP, Kassiotis G. 2012. Resurrection of endogenous retrovir uses in antibody – deficientmice. Nature. 491 : 774 – 8.

文献紹介

細菌、核酸及び抗体検出に口腔液を用いた
Erysipelothrix rhusiopathiae 感染の生検法の改善
大嶋篤

Improving ante mortem diagnosis of Erysipelothrix rhusiopathiae infection by use of oral ﬂuids for bacterial,
nucleic acid, and antibody detection.
Luis G. Giménez-Lirola, Chao-Ting Xiao, Marissa Zavala, Patrick G. Halbur, T. Opriessnig
J. Microbiol. Methods. 2013 Feb 15 ; 92（2）: 113 – 21.
紙面の都合上、本文の一部を割愛して掲載致します。

要約
豚丹毒は Erysipelothrix rhusiopathiae によって引き起こされる経済的に重要な疾病である。豚房単位での口腔液の収集は近年、養豚運営における感染動態の監視に利用されている。実施した検査である細菌分離、リアルタイム PCR、enzyme – linked
immunosorbent assay（ELISA） 及 び ﬂuorescent
microbead – based immunoassay（FMIA）を 用 い た
抗体検出は、陰性対照（n＝32）と E. rhusiopathiaeに実験感染させた豚（n＝112）の豚房単位の口腔液を用いて評価した。リアルタイム PCR は接種後1 日で 100％（7/7 豚房）の検出力を示す鋭敏な手法である一方、E. rhusiopathiae の菌分離が成功したのは 28.6％（2/7 豚房）のみであった。豚房単位の口腔液からの抗 Erysipelothrix IgM 及び IgG 抗体
は FMIA で は 接 種 後 4 か ら 8 日、ELISA で は 接 種
後 5 から 8 日より検出された。豚房内の感染動物数、
特に抗菌剤投与のタイミングは菌分離及び ELISAの結果に影響を及ぼした。口腔液検体において、E.
rhusiopathiae DNA は 23.3％に 認 め ら れ た が、抗Erysipelothrix IgM 及び IgG 抗体は各試料の 59.6％
及び 5.5％に認められた。この結果から、口腔液の採取法及びリアルタイム PCR と FMIA を用いた検60（4）、2014

出法は、豚丹毒の出現を早期に発見するのに効果的であり、よりよい治療結果を導く可能性を示している。

11（55）はかなり安価なので、大規模な調査研究を促進し、豚群の各種病原体をモニタリングする機会を増加させた。
E. rhusiopathiae は汚染された飼料あるいは水の摂取または皮膚の擦過傷を介して豚に感染する。一序論
度感染すると、動物は糞、尿、唾液及び鼻汁に菌をErysipelothrix rhusiopathiae に よ っ て 引 き 起 こ さ
排出し、口腔液検体から E. rhusiopathiae を分離、れる豚丹毒は、死亡率及び増体重の低下に関連性が
あ る い は DNA を 検 出 で き る。表 面 防 御 抗 原 A
ある豚の重要な疾病であり続けている。世界中の （SpaA）の 一 部（SpaA415 と し て 設 計 さ れ た
30 から 50％の家畜豚がこの細菌を扁桃あるいはリ （rSpaA415））を用いた 2 つの新しい血清学的検査
ンパ節に保持しており、そのことがこの病気の流布
方 法 で あ る ELISA と FMIA は、豚 血 清 中 の 抗
Ersipelothrix spp. IgG 抗体を同定するために開発さに寄与している。急性型の豚丹毒は熱、元気消失、跛行を伴った症状が突然発生することが特徴である。 れた。
この研究の目的は、E. rhusiopathiae を実験感染
急性的に感染した豚は時々死亡が認められるが、多させた豚から集めた豚房単位での口腔液検体についくが皮膚に特徴的な菱形疹を発症している。亜急性型の豚丹毒ではしばしば特徴的な症状は認められず、 て、直接的（菌分離とリアルタイム PCR）及び間接的（ELISA と FMIA）な検出方法の両方を評価す
慢性型では感染した豚群における慢性的な関節炎にること、ならびに検査検体として口腔液を用いたより跛行が発生する。
E. rhusiopathiae のコントロールの妨げになって
Ersipelothrix spp. のモニタリングについて効率的ないるのは、豚群における細菌の動態をリアルタイム
検査手順を確立する事である。
に検出するのに、豚を生かしたまま検査可能な方法がないためである。急性型の E. rhusiopathiae 感染
材料と方法
は基本的に死後の検査であり、現在主に行われてい2.1. 感染状況が既知である検体るのは病変部と思われる部位からの菌分離である。
2.1.1. 実験計画
しかしながら、豚丹毒のコロニーは小さく、成長は
E. rhusiopathiae 陽性及び陰性が既知である口腔液
遅く、しばしば検体が汚染されているせいで、大抵を得るために、血清型 1a 及び 19 の E. rhusiopathiae
分離が困難である。
で豚を攻撃した。飼育と攻撃を含む実験手順の詳細
28 の血清型が知られており、豚においては血清は既報に記載した。要約すると、3 週齢の雌雄 33型 1a、1b 及び 2 が頻繁に認められる。加えて、E.
rhusiopathiae、E. tonsillarum、E. inopinata sp. nov.、 頭の豚は E. rhusiopathiae 陰性が確かな群から入手
E. species strain 1 及び E. species strain 2 を含むいし、豚房当たりそれぞれ 3 から 6 頭の異なる群に分けられた（図 1）。ひとつの豚房は陰性対照として
くつかの既知の遺伝子型がある。さらに近年では、
E. rhusiopathiae, E. tonsillarum 及び E. species strainの非攻撃群、6 つの豚房は E. rhusiopathiae 参照株
E1 – 6P（血 清 型 1a）で 攻 撃 し、1 つ の 豚 房 は E.
2 を区別可能な新しいマルチプレックスリアルタイ
rhusiopathiae 参照株 2019（血清型 19）で攻撃した。
ム PCR 検査法が開発されている。
血清型 1a の参照株 E1 – 6P は SpaA タンパクを発現
豚の口腔液の収集法及び検査法は、検査及び監視する spaA 遺伝子を持っており、血清型 19 の参照
ツールとして近年確立され、養豚獣医師によって広株 2019 は SpaB タンパクを発現する spaB 遺伝子をく受け入れられている。口腔液検体は基本的に豚持っている。血清型 1a の E. rhusiopathiae で攻撃さ
房内に垂らされた縄によって集められ、それによっれた豚（2A 及び 2B）とともに飼育されていた 4 頭てその豚房内に飼育されている大部分の豚から収の豚は、希釈の影響（感染と悲感染動物が同居した集できる。過去の研究では、生前に収集された口場合、双方が豚房の唾液検体に影響するため）を調
腔 液 を 用 い て porcine reproductive and respiratory
べるための接触対照とした。検査における抗生物質
syndrome virus（PRRSV）, bovine virus diarrhea
投与の影響を調べるために、2A、2B、3A、3B の豚
vir us, foot – and – mouth disease vir us, porcine
房の豚は臨床症状が強くなる接種後 2 から 4 日の間
circovir us type 2, pseudorabies vir us, vesicularstomatitis virus を検出できることが確認されている。 に筋肉内にセフチオフル（Excede®、5 mg/kg、ファイ ザ ー）を 単 回 投 与 し た。同 様 に、4A 及 び 4B
唾液検体に関する研究（特に最近の 20 年）は様々の豚房の豚には、臨床症状が起きる前に同じ抗生物なヒトの病原体についての PCR 及び抗体検出法を
質を同じ用量で投与した。口腔液は接種前 7 日、接生 み 出 し て き た（HIV, hepatitis viruses, Epstein –種日、接種後 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、Barr, measles, etc.）。
12、13、14、21 及び 28 日に採取され、Ersipelothrix
養豚産業におけるこの研究の影響力は大きい。血spp. 陽性検体（n＝112）と陰性検体（n＝32）に分
清検体に比較して、豚群における口腔液の収集は簡。口 腔 液 は Ersipelothrix spp. に つ
便で、検体収集は基本的に一人の人間で十分であり、 け ら れ た（図 1）
いて直接的（菌分離とリアルタイム PCR）及び間
豚房に入らず、豚にストレスを与えない。この方法

12（56）日生研たより図 1 実験計画と収集した検体数
豚房内の円は豚の頭数を表す。白い円は感染させなかった非攻撃豚、ピンクの円は血清型 1a の E. rhusiopathiaeを接種した豚、緑の円は血清型 19 の E. rhusiopathiae を接種した豚、赤字の A は臨床症状発生後に抗生物質を投与したことを示し、黒字の A は臨床症状が認められる前（攻撃 2 日後あるいは攻撃日）に抗生物質を投与したことを示す。豚房 2B と 3B の赤線の円は、豚が接種後 2 日に豚丹毒で死亡した事を示す。豚房 1：非攻撃陰性対照群。
豚房 2A 及び 2B：口腔液中の細菌量の影響を調べるために半分の豚は非攻撃のまま。
32 の陰性対照検体：豚房 1 から 18 検体、豚房 2 から 14 検体（共に感染前）。112 の陽性検体：豚房 2 から 5の接種後 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21 及び 28 日に得られた口腔液。

接的（ELISA と FMIA）検出法を用いて検査された。
接種前 7 日、接種日、接種後 7、14、21 及び 28 日に採血し、血清はリアルタイム PCR で検査され、さ ら に ELISA 及 び FMIA に よ っ て 抗 E.
rhusiopathiae IgM 抗体の有無を検査された。以前に ELISA と FMIA によって検出されたすべての陰性対照豚 は、実験期間中は陰性のままであったが、攻撃後の豚は血清中の抗 E. rhusiopathiae IgG 抗体が上昇した。
2.1.2 検体採取
口腔液収集に必要な条件として、実験開始より前に、すべての動物は綿製の縄を噛む訓練をさせた。
豚房単位の口腔液は既報と同様に収集した。要約す
ると、縄の一部はそれぞれの豚房に垂らされ、豚が縄を吸える様に 20 – 30 分間各豚房の前面に「縄保定器」を用いて固定した。曝露後、湿った縄の一部
は 1 ガロンのプラスチック袋に入れ、縄の下部を切って縄が中に入った状態で袋に封をした。実験室
では、口腔液は湿った縄を絞り器に通すことで機械的に抽出され、袋の下部に貯められた。その後、袋の 下 部 の 端 を 切 り、収 集 さ れ た 口 腔 液（3.5 – 10mL）を 50 mL 遠沈管に注いだ。検体は 4℃、10 分
1000 × g で遠心分離してゴミ取りし、上清を 5 mL
ポリスチレンチューブに入れ、検査まで – 80℃で保管した。
2.2. 感染状況が不明な野外検体の口腔液
実験検体に加えて、PRRSV の監視のために集められた検体及びアイオア州立大学に提出された検体から無作為に選択された 146 の口腔液検体も供試した。野外から収集した口腔液検体は 10 州の 28 の異なる農場の育成及び肥育豚のいずれかから得られ、それらはリアルタイム PCR、IgG 及び IgM FMIA
により検査された。

結果
3.1. 感染状況が既知な検体
3.1.1. 口腔液収集と E. rhusiopathiae 感染の相関
口腔液検体の収集における E. rhusiopathiae 感染の影響は群単位で十分な検体量が収集できたかに関して評価した。すべての豚は接種前の 7 日間で縄を咀むことに興味を示し、結果としてこの期間の口腔60（4）、2014

液検体の収集に成功した。E. rhusiopathiae 血清型
1a 感染前（接種前 7 日及び接種日）と後（接種後 6日まで）における試験群 2、3 及び 4 から収集した検体量の比較から、豚の行動による影響が示唆され、結果として縄を用いて収集した口腔液量が減少した。
加えて、豚房 2B 及び 3B（表 1）において接種後 2日に 1 頭の豚の死亡が認められたため、これらの群から集められた液量が減少した。しかしながら、抗生物質投与後の接種後 6 日から、豚が縄を噛む事に再び興味を示し始め、得られる検体量が徐々に通常の状態に回復した。すべての検査日において、陰性対照群（豚房 1）と E. rhusiopathiae 19 に感染させた群（豚房 5）の間に得られた口腔液量に有意な差は認められなかった。
3.1.2. E. rhusiopathiae 陰性状態の確認
32 の陰性の口腔液は直接的（菌分離及びリアル
タイム PCR）及び間接的（ELISA 及び FMIA）検出法によって検査した。陰性対照の豚房 1（n＝18）から収集された口腔液はすべての検査結果において陰性であった。加えて、攻撃群の接種前（n＝14）に収集された口腔液はすべての検査法において陰性であり、結果として 4 つの検査法の特異性は 100％であった。
3.1.3. 豚房の口腔液検体からの E. rhusiopathiae 分離攻撃されたすべての豚の豚房単位の口腔液（n＝112）における液体培地増菌法を用いた菌分離結果
は表 1 に示した。血清型 1a の E. rhusiopathiae は豚房 4B では接種後 1 及び 2 日に分離され、豚房 3B
では接種後 1、2 及び 3 日に分離された。豚房 2A、2B、3A、4A 及び 5 から収集された口腔液からの菌分離は成功しなかった。
3.1.4. 豚房単位の口腔液及び個体別の血清検体における E. rhusiopathiae DNA の検出
表 1 に示したように、E. rhusiopathiae DNA の最も早い検出日はすべての攻撃群で接種後 1 日に認められ、検出期間は接種後 1 から 8 日であった。実験
感染後、最初の血清採取は接種後 7 日（おそらく急性期の後）に行い、DNA はどの血清検体からも検出されなかった。
3.1.5. 血清中の抗 E. rhusiopathiae IgM 及び IgG 抗体の検出
実験感染させた豚から接種後 0、7、14、21 及び28 日 に 採 取 し た 血 清 に つ い て の 抗 Erysipelothrix
spp. IgM の 動 態 は ELISA で 接 種 後 7 日、FMIA で接種後 7 から 14 日に、感染した全ての群で検出された。しかしながら、FMIA を用いた IgM 力価は接種後 21 日の時点では 2B（1/3）
、 3B（1/4）、4A（1/4）
、4B（1/4）及び 5（3/3）で検出され、接種後 28 日では 3B（1/4）にのみ検出された。IgM が13（57）

検出限界以下であった 3B 群の 1 頭を除いて、感染したすべての豚はアイソタイプが IgG に変化していることがわかった。4A 群の 2 頭と 4B 群の 1 頭は接種後 28 日まで IgM 及び IgG 陰性のままであった。
3.1.6. 豚房単位の口腔液における抗 E. rhusiopathiae IgM 及び IgG 抗体の検出
実験期間中の ELISA あるいは FMIA で得られた口腔液の IgM 及び IgG の分布を表 1 に示した。攻
撃した全ての豚房において、抗 Erysipelothrix spp.の IgM 及び IgG 抗体が両検査法により検出された。
最も早い IgM 抗体応答は、FMIA によって豚房 5の接種後 4 日に、ELISA によって豚房 2B、3A、3B
及び 5 の接種後 5 日に検出された。予想された様に、FMIA 及び ELISA の両方において、曝露後日数の経 過 と と も に 豚 房 単 位 の 口 腔 液 中 抗 E.
rhusiopathiae IgG 抗体に対するシグナル強度は上昇し た。し か し な が ら、全 体 的 な シ グ ナ ル 強 度 はFMIA で 強 か っ た。最 も 早 い IgG 抗 体 応 答 は、
FMIA に つ い て は 豚 房 4B と 5 の 接 種 後 5 日 に、
ELISA については豚房 3B で接種後 7 日に検出された。抗 E. rhusiopathiae IgG 抗 体 は 特 定 の 豚 房 でFMIA によって最初に検出され、一度 FMIA によって特定の豚房に抗 E. rhusiopathiae IgG 抗体が検出さ れ 始 め る と、そ の 後 は 口 腔 液 中 の 抗 E.
rhusiopathiae IgG 抗体陽性が継続した。その結果は、
E. rhusiopathiae に対する抗体応答が接種後 12 から
14 日（表 1）で検出されなかった豚房 2B（1/3 の豚が感染）を除いて、ELISA の結果と同様であった。
攻撃した豚房から採取したすべての口腔液検体は接種後 8（FMIA）あるいは 14 日（ELISA）まで抗 E.
rhusiopathiae IgM 抗体陽性であった（表 1）。
3.2. 感染状態が不明な野外検体
3.2.1. 野 外 口 腔 液 検 体 中 の Erysipelothrix spp.
DNA の分布146 件の口腔液において、E. rhusiopathiae DNA
は 検 体 の 23.3％（34/146）に 認 め ら れ、一 方、E.
tonsillarum DNA あるいは E. sp. strain 2 DNA はい
ずれの検体からも検出されなかった。
3.2.2. 野外検体の口腔液における抗 E. rhusiopathiae IgG/IgM 抗体の分布
野外検体において、E. rhusiopathiae IgG 抗体は59.6％（87/146）の 検 体 に 認 め ら れ、一 方 IgM 抗体は検体の 5.5％（8/146）に認められた。PCV2 のDNA あ る い は IgM/IgG 抗 体 は 口 腔 液 の 33.6％（49/146）には認められなかった。

考察
以前より豚群中のウイルスの動きを証明するための優れた検査用検体として用いられていた口腔液は、

14（58）E. rhusiopathiae の様な細菌の動態を証明するためにも有用である事がわかった。
おそらく臨床症状を呈する前の E. rhusiopathiae
感染のタイムリーな検出は、より効果的な治療を行うのに重要である。さらに、この研究の目的は口腔液検体に基づいた実験的検査方法の構築と確認、感染の初期段階からの E. rhusiopathiae 感染動態についてのリアルタイムな監視、および豚丹毒の発症を予想するためにこの情報を利用することであった。
増菌培養による E. rhusiopathiae 分離、リアルタイ
ム PCR に よ る E. rhusiopathiae DNA 検 出 及 び
rSpaA415 を 用 い た ELISA と FMIA に よ る 抗 E.
rhusiopathiae IgM/IgG 抗 体 の 検 出 は、E.
rhusiopathiae に実験的あるいは自然に感染した豚から集められた個々の口腔液検体に用いられた。
我々の知る限りでは、既知の陽性及び陰性検体について E. rhusiopathiae 感染をモニタリングするために口腔液が有用かどうかの網羅的な研究は行われていなかった。本研究より得られたデータ（表 1）は、
E. rhusiopathiae の直接的検出法（特にリアルタイ

日生研たよりム PCR）は間接的あるいは抗体検出法（FMIA 及び
ELISA）より接種後 4 日までは感度が高いことを示している。核酸増幅法が培養法より感度が高いことが証明され、血清学的検査と違って、感染症の急性期に有用であるということと、この結果は一致してい た。口 腔 液 に お い て 最 初 に 検 出 さ れ た 抗 E.
rhusiopathiae IgM 抗体は豚房 5 の接種後 4 日であり、FMIA による最初の IgG 抗体検出は豚房 4B 及
び 5 で接種後 5 日であった。口腔液における抗 E.
rhusiopathiae IgG 抗体の早期検出は、PRRSV を実験感染させた豚から得られたデータと類似しており、
抗 PRRSV IgG は接種後 7 日で検出された。さらに、接種後 5 日までの IgM 及び IgG を合わせた、全豚房単位の検出率はリアルタイム PCR（2/7）よりFMIA（5/7）で高かった。接種後 5 日以降の結果から、間接検出法（特に FMIA）は高い検出力を示し、一方直接検出法では感染から回復する接種後 9日以降、どの陽性サンプルからも検出できなかった。
感染が進むにつれて、IgM の急激な上昇が口腔液サンプルで観察され、それは血清でも裏付けられ

表 1 接種後 1 から 28 日の異なる処置条件（図 1 より）の各豚房から得られた口腔液中の Erysipelothrix spp. の同定

検査方法は増菌培養法による菌分離、リアルタイム PCR（RT-PCR）、rSpaA415 を用いた間接的 IgG あるいはIgM ELISA および rSpaA415 を用いた IgM あるいは IgG FMIA を使用した。
白色は陰性を、黄色は IgM での検出を除き、すべての検査法における陽性を示す。オレンジは ELISA 及び FMIA
において、IgM の検出が可能であったことを示す。赤色は ELISA 及び FMIA において、IgM と IgG 両方で陽性の検体を示す。黄色及びオレンジの枠は偽陰性の可能性がある結果を示す。豚房 1（非攻撃対照群）はすべての検査法で陰性であった。

60（4）、2014た。その後 IgG 量の増加につれて、IgM の減少が続いた。従って、口腔液中の IgM と IgG の割合を測定することによって、Erysipelothrix spp. 感染の推移と継続を同定する事が可能である。IgM は初感
染時の早期に現れることから、IgM の高比率は早期の感染段階を示しており、一方 IgG の高比率は感染後期を示している。
本研究において 1）群における感染動物数（希釈効果）、2）抗生物質投与のタイミング（臨床症状の認められる前か後か）、3）使用した E. rhusiopathiaeの病原性、4）収集した口腔液量の 4 つの問題が考えられた。様々な検査法の成績は、同じ処置をした
豚房間で少し異なっていた。本研究の条件下では、非攻撃動物に対する攻撃した動物数は検査の感受性に影響を与えた。直接法で比較した場合、いくつかの陽性検体は特定の日においてリアルタイム PCRが偽陰性であり（この「ギャップ」は表 1 に示した）、菌分離は実験感染を行ったすべての豚において、3B 及び 4B の豚房の豚からのみ成功した。間接検出法において、ELISA はおそらく希釈効果（豚房2）によって抗体量の変化に影響が認められ、一方
FMIA は抗体量が非常に少ない希釈されたサンプル（感染と非感染豚が同居する豚房から得られたサンプル）を検出できるほど十分に高感度であった。
予想された様に、抗生物質投与のタイミングはす
べての検査の感受性と検出にある程度影響を及ぼした。本実験条件下では、リアルタイム PCR は菌分離に比べて多くの陽性検体を検出し、予想通り、明らかに抗生物質投与後に集められた検体は感度がよくなかった。これらの結果は、抗生物質を投与されて間もない野外検体からの病原体分離が困難なことを明らかにした。豚房 4A 及び 4B（臨床症状を呈する前に抗生物質を投与された）の抗生物質投与後
2 か ら 5 日 に 得 ら れ た 口 腔 液 で は、Erysipelothrix
spp. DNA の検出率が減少した。しかしながら、臨床兆候の出現後に抗生物質を投与された豚がいる豚房 3A 及び 3B で DNA は容易に検出された。加えて、早期の抗生物質投与によって、口腔液中の抗E.rhusiopathiae IgG/IgM 抗体検出に干渉する可能性が主に ELISA で認められた。この現象は血清検体における IgM 抗体の結果と、以前に報告された
IgG 抗 体 の 血 清 デ ータ か ら 支 持 さ れ、豚 房 4A の
2/4 と 4B の 1/4 の豚は接種後 28 日まで検出可能な
液性免疫反応が認められなかった。
いくつかの研究では、多くの感染症における急性
初期感染の重要なマーカーである IgA 抗体の検出が支持されている。本研究では、抗 E. rhusiopathiae
IgM 及び IgG 抗体のみを測定した。我々の研究室で実施した抗 rSpa415 IgA 検出についての予備試験
的 ELISA（not shown）では、IgA 測定は血清中及び粘膜面の抗体動態についての追加情報をもたらす
が、E. rhusiopathiae 感染のいずれの段階においても実験室内検出法の感度を改善するものではなかった。この結果に加えて、高品質の抗ブタ IgA の二15（59）

次抗体を定期的に入手することが困難であることから、本研究に IgA 検出の結果は含めなかった。
株の病原性から見ると、直接検出法は豚房 5 の口腔液検体中の E. rhusiopathiae 血清型 19 を検出するのに効果的ではなかった。初めの接種後 3 日以内に臨床的に影響が認められた E. rhusiopathiae 血清型
1a 感染豚と異なり、E. rhusiopathiae 血清型 19 感染
豚の群は臨床症状が認められなかった。豚房 5 では、
抗 E. rhusiopathiae IgM 抗体は FMIA で接種後 4 日、
ELISA で接種後 5 日に早くも検出された。また、豚房 5（E. rhusiopathiae 血清型 19）のいずれの豚も抗生物質投与を受けなかった。
訓練していない動物から集められた口腔液では検査が難しいことが以前より報告されていた。本報告の実験条件下では、感染の急性期の動物の口腔液収集は、動物が発症し、不活発となり、縄を噛む事に興味を失ったため検体採取が困難であった。口腔ス
ワブの収集は、直接検出法（PCR、菌分離）の選択肢として機能したが、多くの液量を必要とする抗体検出にとって選択肢とはならなかった。縄を均一に噛んでくれなかったことは、野外条件と似た状態になる様に豚房に多くの豚を入れることによって改善されるだろう。縄にりんごやいちごの香りの様な誘引剤を利用することは、検体の回収量を改善するだろう。しかしながら、今回の結果から、検査の成功には、集まった検体量よりも細菌に対する抗体量が重要であると我々は考えている。

結論
実験的に感染させた豚から得られた唾液検体の分析により、リアルタイム PCR と FMIA IgM/IgG の組み合わせが Erysipelothrix spp. 感染の診断あるいはモニタリングに最もよい手段であった。リアルタ
イム PCR と FMIA IgM の両方あるいは一方が陽性で IgG が陰性の検体は、感染の急性期を示していると考えられた。IgG のみが陽性の検体は感染の慢性期を示していると考えられた。実験感染豚から得られる口腔液が少量に限られていても、利用価値の高い標本であるこの検体には大きな可能性があることが我々の研究により立証された。この新しい手段
は、おそらく豚丹毒の発生を予測することができ、潜在的な生産損失を最小限にするための積極的な処置と予防を行うのに利用可能なデータを生み出す事がわかった。加えて、本稿で提案された検査手法は、
豚丹毒の発生に関連したワクチン接種の有効性についても新たな知見を提供するかもしれない。この手法に関する研究は、他の細菌に対しても応用することができるだろう。

16（60）日生研たよりお知ら

せ

当研究所の平成 26 年度定時評議員会が、去る平成 26 年 5 月 30 日に開催され、平成 25 年度の事業報告及び決算報告が承認・可決されると共に、組織、理事、監事及び評議員が新たになりましたので、お知らせいたします。
組織
評議員会

管理部

企画学術部

理事会

監事

理事長

常任理事会

研究開発部

製造部

品質管理室

小川

小野憲一郎

検査部

実験動物部

評議員
井土

俊郎

博之

杉浦

勝明

担

当

理事・監事
氏

名

役

職

長井

伸也

理事長

経営

笹川

千尋

所長

研究開発及び検査担当

岩田

晃

常務理事

製造、品質管理及び実験動物担当

草薙

公一

常務理事

企画学術担当

朱通

市次郎

常務理事

管理担当

真板

敬三

監事

小坂

善三

監事

平成 25 年度研修者・見学者受け入れ状況（平成 25 年 4 月から平成 26 年 3 月）
来所日・期間平成 25 年度

所属機関・人数

研修・見学内容

8 月 19 日〜 8 月 21 日

大分県食肉衛生検査所

1名

技術習得

8 月 26 日〜 8 月 30 日

日本獣医生命科学大学

1名

学外実習

3 月 3 日〜 3 月 5 日

三重県中央家畜保健衛生所

1名

技術習得

日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（隔月 1 回発行）

（通巻 587 号） 平成 26 年 6 月 25 日印刷
発行所〒 198 0024

生命の「共生・調和」を理念とし、生命体の豊かな明日と、研究の永続性を願う
気持ちを快いリズムに整え、視覚化したものです。カラーは生命の源、水を表す「青」としています。

編集室

表紙題字は故中村⛲治博士の揮毫

印刷所

平成 26 年 7 月 1 日発行（第 60 巻第 4 号）

一般財団法人 日本生物科学研究所
東京都青梅市新町 9 丁目 2221 番地の 1

TEL：0428（33）1056（企画学術部） FAX：0428（33）1036
http://nibs.lin.gr.jp/
発行人

草薙公一

委

員／大嶋 篤（委員長）、川原史也、今井孝彦

事務／企画学術部

株式会社 精ഛ社（無断転載を禁ず）