植物タンパク質由来δオピオイドペプチドの中枢作用

園田壮司 1、楊樹長 1、土山直美 1、高橋正克 2、吉川正明 1
1 京都大学大学院農学研究科
2 長崎大学教育機能開発センター

Central effect of a δ-opioid peptide derived from plant protein
Soushi Sonoda1, Shuzhang Yang1, Naomi Doyama1, Masakatu Takahashi2, Masaaki Yoshikawa1
1Division of Food Science and Biotechnology, Graduate School of Agriculture

Kyoto University
2 Division of Higher Education Research, Research and Development Centerfor Higher Education, Nagasaki University

Summary: Rubiscolin-6 (Tyr-Pro-Leu-Asp-Leu-Phe) a delta-selective opioid peptide derived fromribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) showed analgestic and memory-enhancing
activitiy after oral administration at dose of 100 mg/kg. It also showed an anxiolytic effect in miceat a dose of 30 nmol/mouse (i.c.v.) or 100 mg/kg (p.o.) in elevated plus maze experiment. The
anxiolytic effect was blocked by naltrindole.

緒言

実験方法

Rubiscolin-6 (Tyr-Pro-Leu-Asp-Leu-Phe) は抗不安実験は ddY 系雄性マウス（体重 23-26

すべての緑葉の主要タンパクである ribulose‑g）と高架式十字迷路装置を用いて行った。ペプ

bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco)

チドは観察開始の 10 分前（脳室内投与）、30 分

から派生するδ オピオイドペプチドである 1)。以前（経口投与）にそれぞれ投与した。アンタゴニ

前、我々は小麦グルテンより得られた δ オピオ

ストはペプチド投与の 10 分前に投与した。実験

イドペプチド Gluten exorphin A5 (Gly-Tyr-Tyr

開始後、目視にて、オープンアームの滞在時間お-Pro-Thr) が学習促進作用および弱い抗不安作

よびそれぞれのアームへの侵入回数を 5 分間に用を有することを見出した

2,3) 。 ま た 、Rubiscolin-6 が Gluten exorphin A5 よりも強い学習促進作用を有することをも見出した 4)。今
回は、 Rubiscolin-6 の抗不安作用について検討した。

わたり観察した。

結果
Rubiscolin‑6 の脳室内投与（30 nmol）および経口投与 (100 mg/kg) により、オープンアーム

Fig. 1. Anxiolytic effect of rubiscolin‑6 after oral administration. Rubiscolin‑6 was given
orally 30 min before applying the mice onto elevated plus maze. Each value represents mean±sem. * p<0.05 vs control group, students t‑test.

への滞在時間および侵入回数の有意な増加が認

抗不安作用および学習促進作用を示し、められた (Fig. 1A および B)。なお、両アームへ

Rubiscolin‑6 の方が作用が強いことがわかった。

の総侵入回数に変化は見られず行動抑制は生じ

引用文献なかった(Fig. 1C)。また、δオピオイドアンタ
ゴニストである naltridole の投与によりこの抗1)

Lipkowski AW, Kawamura Y, Yoshikawa M.

不安作用の有意な抑制が認められた。

Rubiscolin,

考察

δ

a

selective

opioidpeptide derived from plant Rubisco.
FEBS Lett 2001;509;213‑7.

Rubiscolin‑6 の脳室内投与 (30 nmol)、経口投与 (100 mg/kg) いずれの場合にもオープンア

Yang S, Yunden J, Sonoda S, Doyama N,

2)

Fukudome

S,

Yoshikawa

M.

Opioidームへの滞在時間の延長および侵入回数の増加

peptides derived from wheat gluten:が認められたことにより、Rubiscolin‑6 は、抗their isolation and characterization.

不安作用を有することがわかった。また、δオピ

FEBs Lett 1992;296:107‑111.

オイドアンタゴニスト投与によりこの現象は抑3)Takahashi M, Fukunaga H, Kaneto H,

制されたことにより、抗不安作用はδオピオイド

Fukudome S, Yoshikawa M. Behavioral

レセプターを介していることがわかった。

Pharmacologicalstudies

exorphinsa

なお、以前の結果では Gulten exorphin A5 は

A5,

on

newly

gultenisolated

経口投与の際に有意ではないが、 用量依存的な

bioactive food protein fragment, in

抗不安作用を示した。また、経口投与による学習

mice. JPN J Pharmacol 2000;84:259‑265.

促進作用に必要な最小用量については Gulten
exorphin A5 が 300 mg/kgであったのに対し、

Rubiscolin‑6 は 100 mg/kg であった。
このように rubiscolin‑6 と Gluten exorphin
A5 はいずれもδオピオイドレセプターを介して

4)

Yang S, Kawamura Y, Yoshikawa M. Effectofrubiscolin,derivedaδ opioid

peptidefrom

Rubisco,onconsolidation.

Peptides2003:24;325‑328

memoryモルヒネ禁断時の不快な精神症状におけるextended amygdalaの役割

冨士尾まゆみ、山本梨絵、中川貴之、南 雅文、佐藤公道
京都大学薬学研究科生体機能解析学分野

A role of the extended amygdala in the negative affective component ofmorphine withdrawal in rats

Mayumi Fujio, Rie Yamamoto, Takayuki Nakagawa, Masabumi Minami, Masamichi Satoh
Department of Molecular Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University
Summary: We examined the role of the central nucleus of the amygdala (CeA) and the bed nucleus of the stria
terminalis (BNST) in the negative affective component of morphine withdrawal in rats. CeA- or BNST-lesion
significantly reduced the naloxone-precipitated morphine withdrawal-induced conditioned place aversion.
CeA-lesion reduced morphine withdrawal-induced c-Fos expression in the BNST, while BNST-lesion had no effecton that in the CeA. More than a half of retrogradely labeled neurons in the CeA by intra-BNST injection of
WGA-apoHRP-gold, a retrograde-tract tracer, were immunoreactive to morphine withdrawal-induced c-Fos. Further,many CRF-immunoreactive neurons in CeA were retrogradely labeled from the BNST and labeled to morphinewithdrawal-induced c-Fos. Intra-BNST injection of α-helical CRF (9-41), a CRF antagonist, significantly reduced
the morphine withdrawal-induced CPA. These results suggest that activation of the CRF-containing neurons from theCeA to BNST contributes to the negative affective component of morphine withdrawal.

緒言

様々な依存性薬物による薬物耽溺に関与していることを示唆されている［2］。Extended amygdalaに含まれる神経核間には互いに密な線維連絡があり、モルヒネは強い鎮痛作用を有することから、疼

特にCeAからBNSTへは非常に密な投射があること

痛治療において欠くことのできない薬物であるが、［3］、さらに、これらの神経核はどちらもモルヒ

医師や患者がその「麻薬」性を恐れて使用をため

ネ禁断発現時に強く活性化されることが知られて

らい、適正な疼痛治療が行われない場合がある。

いる［4,5］。そこで本研究ではこれらの神経核にモルヒネ依存には精神依存と身体依存が存在し、焦点を絞り、モルヒネ禁断時の不快な精神症状に

その退薬時には不快な精神症状を伴った禁断症状

関与するCeA–BNST間の神経ネットワークを明らかが発現する［1］。最近では、扁桃体中心核（CeA）にするため、モルヒネ禁断により惹起される条件

や分界条床核（BNST）、側坐核shellなどからなる付け場所嫌悪反応を不快な精神症状の指標とした

extended amygdalaと呼ばれる前脳基底部の領域が、行動薬理学的検討のほか、解剖学的、免疫組織化

学的手法を用いた検討を行った。さらに、そこでナロキソンによりモルヒネ禁断を誘発した１時

働く神経伝達物質を同定するため、各種依存性薬

間後に、4% paraformaldehydeで経心灌流固定して物による依存形成に寄与することが報告されてい脳を摘出した。後固定、sucrose置換後脳を凍結さるcorticotropin‑releasing factor (CRF)［6］のせ、クリオスタットで厚さ25 µmの切片を作成した。

関与を検討した。

免疫染色には抗c‑Fos抗体、抗CRF抗体を一次抗体として用い、ABC法–DAB発色もしくは蛍光標識した

実験方法

二次抗体を用いて可視化した。また、一部のラットにおいては、モルヒネペレットを埋め込んだ翌
日 に 、 逆 行 性 標 識 物 質 で あ る wheat germ

両側CeAあるいはBNSTの興奮性神経毒による限

agglutinin（WGA）‑apoHRP gold（0.5 µl）を5分

局的損傷

間かけてBNSTに注入した。逆行性標識物質は銀染

動物は雄性SD系ラット（体重180‑250g）を使用し色を施すことで可視化した。

た。CeAの限局的損傷はbregmaよりAP ‑1.8 mm、L

両側BNST内への薬物微量投与±4.0 mm、DV

8.0 mmの位置へ、BNSTの限局的損傷

麻酔下、BNSTの背側へガイドカニューレを埋めはbregmaよりAP ‑0.3 mm、L ±1.6 mm、DV 7.0 mm

込み、手術後6日目以降に実験に用いた。薬物は、の位置へ0.3 M NMDA 0.3 µl/sideを、3分間かけて

33G イ ンジ ェ ク シ ョ ン カニ ュ ー レ を用 い て 両 側投与することにより行った。実験終了後、組織学

BNST内へ1.0 µl/sideを2分間かけて微量投与した。

的検討を行い、CeAおよびBNSTが両側ともに限局的実験終了後、組織学的検討を行い、両側ともにBNSTに損傷されている個体のみをデータ解析に用いた。

への投与が確認された個体のみをデータ解析に用

条件付け場所嫌悪性試験いた。

壁の色と床の質感が異なる2つのボックスからなる装置を用いた。ラット頸背部皮下にモルヒネ

結果

75 mgを含有するペレット1個を3日間埋め込むことにより依存を形成させた。条件付け場所嫌悪性試
験開始1日目と2日目に、15分間両ボックス間を自CeA あるいは BNST 限局的損傷によるモルヒネ禁由に探索させ、2日目により長く滞在したボックス

断場所嫌悪反応および c‑Fos 発現誘導への影響を嗜好側ボックスとした。3日目午前にsaline（1モルヒネ依存ラットにナロキソンを腹腔内投ml/kg）を腹腔内投与して非嗜好側ボックスに1時与することによって惹起される条件付け場所嫌

間閉じこめ、同日午後にナロキソン（0.3 mg/kg）

悪反応は、両側 CeA あるいは両側 BNST を限局的を腹腔内投与して嗜好側ボックスに1時間閉じこに損傷しておくことにより、どちらも有意に減弱めることで条件付けを行った。4日目に再び15分間された（Fig.1）。

両ボックス間を自由に探索させ、この時の嗜好側
ボックスでの滞在時間から2日目の滞在時間を引き、その値が負の場合、場所嫌悪反応が惹起されたものと評価した。
免疫染色および逆行性標識

50
0

CeA
(7) (11)

BNST(11) (8)Table 1 Effect of CeA- or BNST-lesion on the numbersofc-Fos
immunoreactive
cells
inducedbynaloxone-precipitated morphine withdrawal.
Numbers of c-Fos immunoreactive cells

-50
-100

*

**

-150
-200
-250
-300

controllesionFig.1 Effect of CeA- or BNST-lesion on naloxone
precipitated morphine withdrawal-induced conditioned
place aversion. *P<0.05, **P<0.01 vs. control. n=7-11.

CeA–BNST 間の神経連絡の相互関係を、モルヒ
ネ禁断による c‑Fos の発現誘導を神経活性化のcontrollesionCeA-lesion
BSTLJ
BSTLD
BSTLP
BSTMA
BSTLV/MV

49.6 ± 5.7
154 ±1929.3 ± 7.3
156 ±2481.1 ± 2.4

31.5 ± 7.7 **118 ±1617.1 ± 5.1 *68.9 ±14 **80.7 ± 4.0

BNST-lesion
CeC
CeL
CeM

221 ± 6.1
9.9 ± 3.8
7.5 ± 3.1

216 ± 4.9
7.3 ± 5.3
7.3 ± 2.3

*P<0.05, **P<0.01 vs. control. BSTLJ; bed nucleus of thestria terminalis, lateral division, juxtacapsular part, BSTLD;
lateral division, dorsal part, BSTLP; lateral division,
posterior part, BSTMA; medial division, anterior part,
BSTLV; lateral division, ventral part, BSTMV; medial
division, ventral part, CeC; central nucleus of the amygdala,capsular part, CeL; lateral division, CeM; medial division.

指標として検討した。その結果、モルヒネ禁断により誘導される BNST での c‑Fos の発現細胞数は、
CeA の限局的損傷により、特に lateral division,

モルヒネ禁断時の CeA から BNST へ投射する CRF

juxtacapsular part（BSTLJ）、lateral division,

含有神経の活性化

posterior part （ BSTLP ）、 medial division,

ナロキソン誘発モルヒネ禁断後の CeA におい

anterior part（BSTMA）において、非損傷群と比て、CRF に対する免疫染色と BNST からの逆行性較して有意に減弱された。一方、CeA での c‑Fos

標識との二重染色を行った。その結果、BNST か

発現細胞数は、BNST の限局的損傷によっても、

ら逆行性に標識された CeA の神経の多くが抗 CRF

いずれの subdivision においても有意な変化は抗体を用いた免疫染色により二重標識された。さ見られなかった（Table 1）。

らに、ナロキソン誘発モルヒネ禁断発現 1 時間後の CeA において、抗 c‑Fos 抗体と抗 CRF 抗体を用

モルヒネ禁断時の CeA から BNST へ投射する神経

いた蛍光二重免疫染色を行った。その結果、CeAの活性化

における CRF 陽性細胞の多くが抗 c‑Fos 抗体陽性

BNST に逆行性標識物質を注入することにより、
CeA において逆行性標識された神経（すなわち、CeA から BNST に投射する神経）の約半数以上が、モルヒネ禁断後に、抗 c‑Fos 抗体によって二重標識された（Fig.2）であった。

活性化され、不快な精神症状の惹起につながっていくことが示唆される。一方、CeA から BNST に投射するニューロンの多くは CRF を含有していることが報告されている[7]。本研究においても、
BNST から逆行性に標識された CeA のニューロンの多くが抗 CRF 抗体を用いた免疫染色により二重標識されることを確認し、また、抗 c‑Fos 抗体と抗 CRF 抗体を用いた蛍光二重免疫染色により、モルヒネ禁断時の CeA における CRF 陽性細胞の多くが、抗 c‑Fos 抗体陽性であることを見いだした。
本研究結果より、CeA から BNST へ投射する神経
Fig.2 Double staining with retrograde tract-tracer(intra-BNST) and anti-c-Fos antibody in the CeA.
(
Double labeled neurons,
retrogradely labeledneurons,
c-Fos positive neurons)

CRF受容体アンタゴニストのBNST内微量投与によの活性化がモルヒネ禁断による条件付け場所嫌悪反応（不快な精神症状）を惹起させること、またその神経の少なくとも一部のニューロンはCRF を伝達物質としていることが示唆される。

るナロキソン誘発モルヒネ禁断場所嫌悪反応の変

引用文献

化
CRF受容体アンタゴニストであるα‑helical CRF(9‑41)（0.1 µg/side）を条件付けの10分前に、両側BNST内へ微量投与したところ、ナロキソン誘発
モルヒネ禁断場所嫌悪反応は有意に減弱された。

考察
本研究において、興奮性神経毒をもちいた脳部
位限局的損傷実験により、モルヒネ禁断時の場所
嫌悪反応に、extended amygdala に含まれる CeA
および BNST がともに寄与していることが示された。この extended amygdala に含まれる神経核間には互いに密な線維連絡があることが知られて
おり[3]、特にこの CeA–BNST 間の線維連絡が関与している可能性が考えられた。c‑Fos の発現誘導
を神経活性化の指標とした本研究結果から、モル
ヒネ禁断時には、CeA から BNST へ投射する神経が興奮し、そのシグナルを受けた BNST の神経が[1] Schulteis, G., Markou, A., Gold, L. H., Stinus, L., Koob,
G. F.: Relative sensitivity to naloxone of multiple indicesof opiate withdrawal: a quantitative dose-response
analysis. J. Pharmacol. Exp. Ther., 271, 1391-1398(1994)[2] Koob, G.F.: The role of the striatopallidal and extended
amygdala systems in drug addiction. Ann. N. Y. Acad.
Sci., 877, 445-460 (1999)[3] Bourgeais, L., Gauriau, C., Bernard, J. F.: Projections
from the nociceptive area of the central nucleus of theamygdala to the forebrain: a PHA-L study in the rat. Eur.
J. Neurosci., 14, 229-255 (2001)[4] Guen, S.L., Gestreau, C., Besson, J.M.: Sensitivity tonaloxone of the behavioral signs of morphine withdrawal
and c-Fos expression in the rat CNS: A quantitative
dose-response analysis. J. Comp. Neurol., 433, 272-297(2001)[5] Frenois, F., Cador, M., Caillé, S., Stinus, L.,Moine, C.L.:
Neural correlates of the motivational and somaticcomponentsofnaloxone-precipitatedmorphine
withdrawal. Eur. J. Neurosci., 16, 1377-1389 (2002)[6] Sarnyai, Z., Shaham, Y., Heinrichs, S.C.: The role ofcorticotropin-releasing factor in drug addiction.
Pharmacol. Rev., 53, 209-243 (2001)[7] Sakanaka, M., Shibasaki, T., Lederis, K.: Distribution
and efferent projections of corticotropin-releasing
factor-like immunoreactivity in the rat amygdaloid
complex. Brain Res., 382, 213-238 (1986)

内因性μ‑オピオイド受容体作動薬 endomorphin‑1 のマウス認知機能モジュレーターとしての作用
間宮隆吉、加藤寿規、奥田亜美、鵜飼 良
名城大学薬学部

薬品作用学教室

Effects of endomorphin-1, a µ-opioid receptor agonist on the learning and memory
function in mice
Takayoshi Mamiya, Toshinori Katoh, Ami Okuda and Makoto Ukai
Department of Chemical Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Meijo University

Sammary:

Endomorphin-1, an endogenous µ-opioid peptide, has been reported to distribute in the brain

and plays various roles in not only regulation of pain threshold but also emotion and memory in rodents.
Here we investigated the effects of this neuropeptide on cognitive functions in mice using Y-maze andpassive avoidance tests. At higher doses, endomorphin-1 impaired the spontaneous alternation behaviorof the Y-maze and the performances of step-down type passive avoidance in mice.

In the Y-maze test,

higher doses of endomorphin-1 induced the deficits of short-term memory, although lower doses did notaffect alternation behavior.
memory deficits.

Lower doses of endomorphin-1 attenuated the scopolamine-induced

In the step-down type passive avoidance test, lower doses of this peptide decreased thestep-down latency, but at higher doses it was ineffective. These results suggest that endomorphin-1 has
biphasic neuroregulatory effects on cognitive functions in mice.

緒言
脳内の神経ペプチドのうちオピオイドペプチ
ドはオピオイド受容体に作用するペプチドであり、オピオイド受容体は、生体内では µ‑、δ‑、κ‑の 3 種に分類され、それらが学習記憶に影響を与えていることは古くから知られている。内在性の δ‑オピオイドペプチドおよび κ‑オピオイド
ペプチドに続き、近年 µ‑オピオイドペプチドとして 4 個のアミノ酸からなる endomorphin‑1 および endomorphin‑2 が単離精製され、第４のオピオ
イド様ペプチドの nociceptin を含めオピオイド受容体に関連した内在性のペプチドはすべて発見された。さらにそれらの受容体欠損マウスもすべて作製され、ペプチドおよび受容体を含めたオ
ピオイド神経系の学習記憶機能における役割が詳細に検討されてきている。
内 在 性 µ‑ オ ピ オ イ ド ペ プ チ ド のendomorphin‑1 の含量はウシ全脳においてκ‑オ
ピオイドペプチドの dynorphin と同程度であり、特に endomorphin‑1 の脳内含量は endomorphin‑2の約 3 倍であることも認められている。
Endomorphin‑1 は視床、視床下部、線条体、前脳皮質などに分布し、µ‑オピオイド受容体の分布と類似している。そこで、endomorphin‑1 を用いて

µ‑オピオイド受容体を介した学習記憶に対する作用について検討した。

実験方法
7‑8 週齢の ddY 系雄性マウスを用いた。また、実験前の少なくとも 3 日間は室温 24±1℃、湿度
55±5%、8:00‑20:00 明期の明暗サイクルの恒温室で飼育し、水および飼料は自由に摂取させた。
Endomorphin‑1 および scopolamineHBr は 0.9 % 生
理食塩液に溶解した。側脳室内投与では、マウスをエーテル麻酔下で頭部を固定し、マイクロシリ
ンジに長さ 2 mm のステンレス製注射針 (30 ゲージ) をつけた。その注射針の先端をマウスの耳の付け根と正中線との交点より左右いずれかの外側 2 mm の頭蓋骨に垂直に刺入し、約 30 秒かけて
4 µl/mouse を側脳室内に注入した。
１．自発的交替行動試験
実験装置として、1 本の arm の長さが 40 cm、壁の高さが 12 cm、床の幅が 3 cm、上部の幅が10 cm で、内側が黒色に塗装された 3 本の arm が120 度の角度で接続された木製 Y 字型迷路を使用した。自発的交替行動の測定は、マウスを Y 字型
迷路のいずれかの arm の先端より入れ、8 分間にわたってマウスが入った arm の総数を total arm
entries とし、自発運動の指標とした。次に、マウスが連続して異なる 3 本の arm を選択した数をno. of alternation とし、 常法に従って自発的交替行動率を算出した。なお、endomorphin‑1 は自発的交替行動の測定開始 15 分前に側脳室内投与 (i.c.v.) した。
２．受動的回避試験
実験装置として、電球 (15 W) のついた木製半
防音箱 (35×35×90 cm) の中に、30×30×40 cmの透明アクリル製ケージを設置し、床にはグリッド（直径 3 mm のステンレス棒を 1 cm 間隔で 30本設置)と、その中央には 4×4×4 cm の木製プラ
ットホームを固定した step‑down 型装置を用いた。また、電気ショック負荷用として電気刺激装
置およびアイソレーターを接続した。
訓練試行では、マウスをプラットホーム上に静かに置き、床グリッドにステップダウン(四肢がプラットホームより離れ、床グリッドヘ完全に下りること)した直後より、間欠的な電気ショック(80V, D.C., 1 Hz, 0.5 秒) を 15 秒間負荷した。
なお、3 秒から 15 秒以内にステップダウンした
マウスのみ使用した。保持試行では、訓練試行の24 時間後に訓練試行と同様にマウスをプラット
ホーム上にのせ、床グリッドヘ完全に下りるまでの時間 (step‑down latency) を測定した。この試行では、グリッドからの電気ショックは負荷されなかった。Cut‑off 時間は、300 秒とした。なお、endomorphin‑1 は保持試行の 15 分前に側脳室内投与 (i.c.v.) した。
３. 統計処理
Kruskal‑Wallis 検定による一元配置分散分析を行い、その後 Bonferroni 検定を用いて群間の比較を行った。なお、P<0.05 を統計学的に有意差有りとみなした。

結果および考察１． 自発的交替行動試験
自発的交替行動は、マウスが実験室の壁や物の位置などを手がかりとした空間記憶により、 Y
字型迷路の各 arm を区別しているものと考えられており、 この行動は作業記憶または短期記憶に基づくとされている。今回の研究では µ‑オピ
オイド受容体作動薬の役割を詳しく調べるために幅広く用量を検討した。Endomorphin‑1 (10 お
よび 17.5 µg) は、自発的交替行動率を有意に減少させた。このことは µ‑オピオイド受容体を刺激すると学習記憶機能が障害されることを意味している。実際、ヒトにおいてもモルヒネを高用量摂取すると意識障害などの認知機能障害が観察されることもあり、このような薬理学的作用を反映した用量なのではないかと考えられる。そしてこの endomorphin‑1 (10 µg) による自発的交
替行動率の有意な減少は、µ1‑オピオイド受容体拮抗薬で抑制されたことから、µ1‑オピオイド受容体を介した反応と考えられる。
一方、スコポラミン誘発自発的交替行動障害に対し endomorphin‑1 は高用量では何ら作用しなかったが、非常に低い用量で緩解作用を示した。
この緩解作用もµ1‑オピオイド受容体拮抗薬で抑制されたことから、µ1‑オピオイド受容体を介した反応と考えられる。Endomorphin‑1 の低用量は一般行動に対しては特に無作用であったことを含めると、上述したように自発的交替行動を障害した用量は薬理学的に過剰投与であったのかも知れない。以上のことから、endomorphin‑1 は学
習記憶機能と密接に関連しており、コリン作動性
神経機能の低下を伴った学習記憶障害に対して優れた治療薬となる可能性があると考えられる。
２． 受動的回避試験
この試験では、マウスに電気（嫌悪）刺激を与えることによって、床が危険であることを学習させ、 再び同じ条件下に置いた時の反応状態から
その学習記憶能を測定することができる。マウスが同じ条件下で再び情報を思い出すためには、長期間その情報を記憶する必要があり、受動的回避
学習は長期記憶に相当すると考えられる。受動的回避試験において、endomorphin‑1 (10 および17.5 µg) は step‑down latency を有意に短縮した。この短縮は、ß‑FNA (5 µg) により有意に抑制されたが、δ‑オピオイド受容体拮抗薬 NTI (4ng) あるいはκ‑オピオイド受容体拮抗薬 n‑BNI(4 µg) を併用しても影響されなかった。これらの結果は、µ‑オピオイド受容体作動薬 TAPA を受
動的回避試験の訓練試行前に投与すると学習記憶が障害される事実と一致した。したがって、
endomorphin‑1 は µ‑オピオイド受容体を介して長期記憶を障害させるものと考えられる。また、今回用いた学習記憶障害を誘発させる
endomorphin‑1 の用量は、抗侵害作用を誘発させる用量と異なっており、それらの作用メカニズムも異なっている可能性が示唆される。

結論
Endomorphin‑1 は単独では学習記憶障害を誘発するが、低用量では学習記憶障害モデル動物に対して改善作用を示し、２相性の作用を有していることが見出された。どちらもµ1‑オピオイド受容体を介した反応と考えられるが、どのような調節機構によるものかについては詳細な検討が必
要である。

参考文献
Ukai M, Okuda A.
Endomorphin‑1, an
endogenous µ‑opioid receptor agonist,
improves apomorphine‑induced impairment of
prepulse inhibition in mice. Peptides, inpress.
Ukai M, Lin HP. Endomorphins 1 and 2 induce
amnesia via selective modulation of
dopamine receptors in mice.
Eur J
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Ukai M, Lin HP. Involvement of µ1‑opioid
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intheendomorphins‑induced impairment of passive
avoidance learning in mice. Behav Brain
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Ukai M, Katoh T, Mamiya T. Endomorphin‑1
improves scopolamine‑induced impairment ofshort‑term memory via µ1‑opioid receptor inmice. Neuroreport. 2001 12:3723‑3727.
Ukai M, Watanabe Y, Kameyama T. Endomorphins
1 and 2, endogenous µ‑opioid receptor
agonists, impair passive avoidance learningin mice.
Eur J Pharmacol. 2001
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Ukai M, Watanabe Y, Kameyama T. Effects ofendomorphins‑1 and ‑2, endogenous µ‑opioid
receptoragonists,onspontaneousalternation performance in mice. Eur J
Pharmacol. 2000 395:211‑215.

Morphine 誘発報酬効果発現に対する
脊髄内 protein kinase C の役割
大江公晴 1,2)、成田 年 2)、芝崎真裕 2)、
久保田千晴 2)、矢島義識 2)、山崎光章 1)、鈴木 勉 2)
1) 富山医科薬科大学麻酔科学講座
2) 星薬科大学薬品毒性学教室

The role of protein kinase C within the spinal cord in the expression of the morphine-induced
rewarding effect in mice
Kousei Oe1,2), Minoru Narita2), Masahiro Shibasaki2), Chiharu Kubota2),
Yoshinori Yajima2), Mitsuaki Yamazaki1) and Tsutomu Suzuki2)
1) Department of Anesthesiology, Toyama Medical and Pharmaceutical University
Faculty of Medicine
2) Department of Toxicology, Hoshi University
School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences
Summary: We previously demonstrated that the morphine-induced rewarding effect was attenuated under a neuropathic
pain-like state following partial sciatic nerve ligation in rodents. Furthermore, it is well recognized that the facilitation ofprotein kinase C (PKC) activity in the spinal cord is the key factor for the induction of thermal hyperalgesia following
nerve ligation. However, little is known about the possible involvement of spinal PKC in the reduction of rewarding effectinduced by morphine. The present study was designed to investigate whether activation of spinal PKC by nerve ligation
could be implicated in the suppression of the morphine-induced rewarding effect under the neuropathic pain-like state inmice. The rewarding effect induced by morphine was markedly attenuated in nerve-ligated mice accompanied with theactivation of spinal PKC by nerve ligation. It should be noted that the suppression of the morphine-induced rewarding
effect by nerve ligation was significantly reversed by repeated i.t. pretreatment with PKC inhibitor RO-32-0432 just before
and once a day for first 3 days after the nerve ligation. These findings suggest that the preliminary facilitation of spinal
PKC activity caused by nerve ligation could affect the morphine-induced rewarding effect in mice. Then, the next study
was designed to examine whether direct activation of PKC in the spinal cord by a specific activator, phorbol
12,13-dibutyrate (PDBu), could suppress the rewarding effect induced by morphine in mice. A single i.t. injection of PDBu
produced a marked pain-like behaviors and a long-lasting thermal hyperalgesia in a dose-dependent manner. Under these
conditions, the rewarding effect induced by morphine was abolished by a single i.t. pretreatment with PDBu in mice.
Furthermore, it is worthwhile to note that a single i.t. injection of PDBu caused a marked increase in the number ofc-Fos-like immunoreactivity expressing cells in the parafascicular nucleus, amygdala and cingulate cortex , but not
hippocampus in the mouse. Collectively, these findings raise the possibility that activated PKC in the spinal cord withchronic pain-like hyperalgesia causes synaptic changes in the emotionality-related brain regions, resulting in the
suppression of the morphine-induced rewarding effect in mice.

緒言

1,2)

、我々も脊髄の PKC の持続的な活性化が神経因性疼痛の発現に重要な役割を果たしているこ

近年、神経因性疼痛の発現に protein kinase Cとを確認している 3,4)。一方、幅広い臨床経験から、(PKC) が関与している可能性が示唆されており

疼痛下においてはモルヒネに対する精神依存はほとんど問題とならないことが知られている。

終了後１日目にモルヒネ (5 mg/kg) あるいは溶

我々は、起炎物質であるカラゲニンあるいはホル媒をマウスに皮下投与し、白あるいは黒の区画に

マリンの足蹠皮下投与により作製した炎症性疼

60 分間閉じ込めた。2 日目にはそれぞれ 1 日目と痛モデルおよび坐骨神経結紮により作製した神は逆の操作を行い、これを 1 セッションとし、計経因性疼痛モデルを用いて、慢性疼痛下ではモル

3 セッション (6 日間) 行った。また、条件づけ開

ヒネに対する精神依存 (報酬効果) が形成され始前日および条件づけ終了翌日にプレおよびポ

ないことを明らかにしている

5-8)

。

ストテストを行い、モルヒネあるいは溶媒のいず

こうした背景から、脊髄における PKC の活性れも処置せずに 15 分間、白と黒の区画を自由に化は、モルヒネの精神依存形成の抑制に深く関与行き来させ、それぞれの区画に滞在する時間を測している可能性が想定される。そこで本研究では、

定し、下記の式にしたがって CPP スコアを算出し坐骨神経を結紮したマウスの髄腔内に選択的た。

PKC 阻害薬である Ro-32-0432 を前処置し、坐骨CPP スコア (sec) ＝ポストスコア – プレスコア

神経結紮によるモルヒネの報酬効果の抑制作用に及ぼす影響を検討した。また、PKC の活性化薬

PKC 活性化薬の髄腔内投与による疼痛関連行動である phorbol-12,13-dibutyrate (PDBu) を正常マの測定

ウスの髄腔内に投与し、モルヒネの報酬効果に対する影響についても検討した。

PKC 活性化薬である PDBu (1, 3 および 10
nmol/mouse) をマウスの髄腔内に投与し、引き起
こされる引掻き (Scratching)、舐め (Licking)、噛

実験方法
実験動物
実験には ICR 系雄性マウス (20-25g) を使用し

み (Biting) 行動の発現回数あるいは累積発現持
続時間、および尾を激しく振る行動 (Severe
tail-shaking) ならびに啼鳴反応 (Vocalization) の発現の有無を投与後 20 分間観察した。

た。
神経因性疼痛モデルは、Seltzer ら 9) の方法に準

熱刺激対する疼痛閾値の測定

じ、sodium pentobarbital (70 mg/kg，i.p.) 麻酔下に坐骨神経結紮による熱刺激に対する痛覚過敏て、絹糸で右側後肢の坐骨神経を半周結紮するこ

反応の測定には、正常動物において後肢を跳ねのとにより作製した。これに対し、坐骨神経を露出けるまでの反応潜時が、約 8-10 秒になるように熱しただけで、結紮しなかった群を非結紮群とした。

刺激を調整した足底熱刺激装置を用いた。マウスの両側後肢の足底にそれぞれ熱刺激を加え、後肢使用薬物を跳ねのけるまでの反応潜時を疼痛閾値の指標

本 研 究では 、 選 択的 PKC 阻 害 薬と し てとし、3 回測定した平均値を結果として示した。

Ro-32-0432 (0.1 および 1 nmol/mouse) を、PKC のなお、体重移動などによる後肢の動きは評価しな活性化薬として PDBu (1, 3 および 10 nmol/mouse)

かった。また、測定はマウスをアクリル製シリンを用いた。なお、マウスの髄腔内への薬液の投与

ダー (高さ 15 cm、直径 8 cm) 内で無拘束下にて

容量は 4 L/mouse とした。

行った。

モルヒネ誘発報酬効果の測定
モルヒネの報酬効果は、条件づけ場所嗜好性試

結果および考察験 (conditioned place preference; CPP) を用いて評

坐骨神経を結紮すると、結紮後 4 日目をピーク価した。条件づけはプレ方式に従い、プレテストとする熱刺激に対する痛覚過敏反応が観察された。そこで、熱痛覚過敏反応がピークとなる結紮

ヒネの報酬効果は著明に抑制されることが明らか

後 4 日目からモルヒネの条件づけを行ったところ、となった。

非結紮群で認められるモルヒネの報酬効果は著明に抑制された。

このように、脊髄における PKC の活性化を介した上位中枢への痛覚伝達が、モルヒネの報酬効

一方、選択的 PKC 阻害薬である Ro-32-0432 (1

果を抑制する主因となっている可能性が推察さnmol) を坐骨神経結紮前ならびに結紮後 1 日 1 回れる。そこで、PDBu の単回髄腔内投与後の上位

3 日間マウスの髄腔内に処置すると、坐骨神経結中枢における c-Fos タンパク (神経の活動マーカ

紮による熱痛覚過敏反応は有意に抑制された。こー) の変化を免疫組織染色法により検討した。そのような条件下で、坐骨神経結紮によるモルヒネの結果、PDBu を単回髄腔内投与した 1 時間後にの報酬効果の抑制に対する Ro-32-0432 の髄腔内は、痛みや情動機能を司る脳部位である側傍核、前処置の影響を検討した。その結果、坐骨神経結

帯状回、扁桃体において c-Fos 様免疫陽性細胞数

紮群の溶媒処置マウスで認められるモルヒネ誘の著明な増加が認められたが、記憶・学習に重要

発報酬効果の減弱は、Ro-32-0432 (0.1 および 1な役割を担う海馬においては、このような変化はnmol/mouse) の髄腔内前処置により用量依存的に認められなかった。

回復し、非結紮群と同程度のモルヒネの報酬効果

以上、本研究の結果から、脊髄における PKC のが発現した。これらのことから、坐骨神経結紮に活性化を介した上位中枢への痛覚情報伝達は、痛み

よる熱痛覚過敏反応の発現には、脊髄におけるや情動機能を司る脳部位の可塑的変化を引き起こ

PKC の活性化が重要な役割を果たしていること

し、モルヒネの報酬効果を抑制する可能性が示唆さが改めて確認された。また、この活性化を阻害すれた。

ることにより、坐骨神経結紮によるモルヒネの報
酬効果の減弱は、コントロールレベルにまで回復

引用文献

することが明らかとなった。
このように、脊髄における PKC の活性化が、モ

1) Mao J, Price DD, Mayer DJ, Hayes RL (1992)

ルヒネの報酬効果の抑制に関与している可能性がPain-related increases in spinal cord membrane-bound

強く示唆されたため、次に PKC の活性化薬である

protein kinase C following peripheral nerve injury.

PDBuをマウスの髄腔内に直接投与し、モルヒネのBrain Res 588: 144-149

報酬効果に及ぼす影響を検討した。PDBu (1, 3およ2) Yashpal K, Pitcher GM, Parent A, Quirion R,

び10 nmol/mouse) をマウスの髄腔内に単回投与す

Coderre TJ (1995) Noxious thermal and chemical

ると、scratching、biting、licking、tail-shaking およびstimulation

vocalization が用量依存的に誘発された。さらにこ12,13-dibutyrate binding in spinal cord dorsal horn as

れらのマウスでは、PDBu を単回投与した 24 時間

well as persistent pain and hyperalgesia, which is

後および 5 日後においても、熱刺激に対して有意

reduced by inhibition of protein kinase C. J Neurosci

な痛覚過敏反応を示した。そこで、PDBu (10

15: 3263-3272

nmol/mouse) を単回髄腔内投与した 24 時間後から

3) Narita M, Yajima Y, Aoki T, Ozaki S, Narita M,

モルヒネの条件づけを開始し、モルヒネの報酬効果

Mizoguchi

発現に対する影響を検討した。その結果、溶媒処置

Up-regulation of the TrkB receptor in mice injured by

群で認められるモルヒネの報酬効果は、PDBu を単

the partial ligation of the sciatic nerve. Eur J Pharmacol

回髄腔内前処置することにより著しく抑制された。

401: 187-190

これらのことから、PDBu を髄腔内投与し、痛みを

4) Ohsawa M, Narita M, Mizoguchi H, Suzuki T,惹起させた状態では、坐骨神経結紮時と同様にモルTseng LF (2000) Involvement of spinal protein kinaseinduceH,

Tseng

increases

LF,

inSuzuki3H-phorbol

T(2000)

C in thermal hyperalgesia evoked by partial sciatic
nerve ligation, but not by inflammation in the mouse.
Eur J Pharmacol 403: 81-85
5) Suzuki T, Kishimoto Y, Misawa M (1996)
Formalin- and carrageenan-induced inflammation
attenuates place preferences produced by morphine,
methamphetamine and cocain. Life Sci 59: 1667-1674
6) Suzuki T, Kishimoto Y, Misawa M, Nagase H,
Takeda F (1999) Role of the κ-opioid system in theattenuation of the morphine-induced place preference
under chronic pain. Life Sci 64: PL1-7
7) Ozaki S, Narita M, Narita M, Iino M, Miyoshi K,
Suzuki T (2003) Suppression of the morphine-induced
rewarding effect and G-protein activation in the lower
midbrain following nerve injury in the mouse:
involvement of G-protein-coupled receptor kinase 2.
Neuroscience 116: 89-97
8) Ozaki S, Narita M, Narita M, Iino M, Sugita J,
Matsumura Y, Suzuki T (2002) Suppression of themorphine-induced rewarding effect in the rat withneuropathic pain: implication of the reduction inµ-opioid receptor functions in the ventral tegmental
area. J Neurochem 82: 1192-1198
9) Seltzer Z, Dubner R, Shir Y (1990) A novel
behavioral model of neuropathic pain disorders
produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 43:
205-218

モルヒネ暴露による P 糖タンパク質機能変化
黄倉崇、小澤匡宏、井部路子、山田静雄、木村良平
静岡県立大学薬学部薬剤学教室

Regulation of P-glycoprotein function by morphine treatment
Takashi Okura, Tadahiro Ozawa, Michiko Ibe, Shizuo Yamada, Ryohei Kimura
Department of Biopharmacy, School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka

Summary: Morphine is a substrate for P-glycoprotein (Pgp), a broad-specificity efflux pump. The uptake byhuman colon carcinoma Caco-2 cells of the Pgp substrates, [3H]vincristine and Rhodamine123, was significantly
reduced by pretreatment with morphine. The reduction of [3H]vincristine uptake was seen at 12 h after morphine
treatment and almost same reduction level was maintained during morphine treatment for 14 days. Further,morphine transport through the Caco-2 cell monolayer in the efflux direction was increased by pretreatment withmorphine. These results suggest that treatment with morphine increases Pgp activity and efflux transport ofmorphine in Caco-2 cells.

緒言

ついて検討した。

実験方法

P糖タンパク質（Pgp）は、癌細胞の多剤耐性因子として見出された排出トランスポータ

細胞培養

ーであり、血液脳関門や消化管などの正常組

24ウェルプレートまたはトランスウェルに織にも分布し、薬物の排出輸送に関わる。モ

Caco-2 細 胞 を 1 〜 5 × 105 cells/cm2 で 播 き

ルヒネはPgpの基質であり、その鎮痛作用は

HEPES（20 mM）、非必須アミノ酸（1%）、ペ

Pgp阻害剤の投与やPgpのノックアウトによりニシリン（50 unit/ml）、ストレプトマイシン

増強される

1,2)

。また、モルヒネの連続投与に（0.05 mg/ml）、fetal bovine serum（10%）を含よりラット脳組織におけるPgp発現量が増加

む Dulbecco’s Modified Eagle Medium を培地と3)すること 、Pgpに対するアンチセンスオリゴ

して37℃で培養した。実験には24ウェルプレ

ヌクレオチド投与によりモルヒネの鎮痛耐性

ート上で14日間、またはトランスウェル上で4)形成が抑制されること から、モルヒネの慢性

21日間単層培養したものを用いた。

投与に伴うPgp発現量の増加が、モルヒネの鎮

Pgp 基質の取り込み実験及び排出実験

痛耐性形成に関与する可能性が考えられる。

Pgp の排出機能は、Pgp 基質である[3H]ビン

しかし、モルヒネ暴露によりPgpの排出機能がクリスチンまたはローダミン123の Caco-2細亢進し、モルヒネの膜透過性が変化するのか胞への取り込み実験または排出実験により評は明らかでない。そこで本研究では、薬物の価した。薬物未処理（対照群）またはモルヒ

膜透過性評価に汎用されるヒト大腸腺癌由来

ネ暴露（0.1〜500 µM, 12時間〜14日間）した

Caco-2細胞を用い、Pgp排出機能並びにモルヒ

Caco-2細胞を洗浄後、[3H]ビンクリスチン（31ネの膜透過性に対するモルヒネ暴露の影響にnM）またはローダミン123（3 µM）を含むメ

ディウム中で、細胞を37℃、10〜120分間イン透過量（pmol/min）を、C0は初濃度（pmol/mL）

キュベーションした。その後細胞を PBS で洗を、Acellは培養細胞面積（cm2）を示す。また

浄、可溶化し[3H]ビンクリスチンの放射活性Caco-2細胞の膜抵抗値は Millicell-ERS によりまたはローダミン123の蛍光強度を測定した。

測定し、膜抵抗値が200Ω/cm2以上の単層膜をタンパク質量は BCA protein assay kit を用いて実験に用いた。

測定した。またジゴキシン（0.1 µM, 24時間）、
リファンピシン（10 µM, 24時間）またはコル
ヒチン（7.5 µM, 48時間）暴露し、同様にロー結果
Caco-2細胞における Pgp 排出機能

ダミン123の細胞内取り込み量を測定した。

Caco-2細胞への[3H]ビンクリスチンの取り

ローダミン123の排出実験では、ローダミン

込み量は、[3H]ビンクリスチンを添加後経時

123（3 µM）を37℃、90分間インキュベーショ

的 に 増 加 し 、 60 分 で 定 常 状 態 （ 15 µL/mg

ンし、ローダミン123を細胞内に取り込ませた

protein）に達した。[3H]ビンクリスチンの定常

後、37℃に加温したローダミン123を含まない

状態取り込み量は、Pgp 阻害剤のベラパミル

メディウムを添加し、37℃、90分間インキュ（500 µM）及びシクロスポリン A（17 µM）

ベーションした。インキュベーション終了後、存在下で有意に増加した。同様にローダミン

細胞内に残存するローダミン123の蛍光強度

123の Caco-2細胞への取り込み量は、シクロスを同様に測定した。

ポリン存在下で増加した。これらの結果から、モルヒネ透過実験

本実験で用いた Caco-2細胞における Pgp の排

モルヒネの透過実験には、トランスウェル

出輸送機能が確認された。

上で単層培養した Caco-2細胞を用いた。薬物

次に、Caco-2細胞をモルヒネ存在下で14日

未処理またはモルヒネ暴露（10 µM, 21日間）

間培養後、[3H]ビンクリスチンの定常状態取した Caco-2細胞を洗浄後、apical 膜側またはり込み量を指標にしてPgp排出機能を測定しbasolateral 膜側にモルヒネ（10 µM）を添加した。[3H]ビンクリスチンの取り込み量は、モた。37℃で60、120、180分インキュベーショ

ルヒネ暴露により対照群に比べ有意に減少し、ン後、apical 膜側から basolateral 膜側（A to B）、

その減少率はモルヒネ濃度（0.1〜500 µM）にまたは basolateral 膜側から apical 膜側（B to A）

依存して増加した（Fig. 1）。この[3H]ビンクリ

へのモルヒネの透過量を HPLC 法により定量

スチンの取り込み量の減少は、シクロスポリ

した。次式に従い、見かけの透過係数（Pe）

ンAの存在下で、モルヒネ未処理群の場合とを算出した。

同程度まで回復した。また、[3H]ビンクリス
チンの取り込み量の減少は、モルヒネ暴露12

dx/dt
C0・AcellPe =時間ですでに観察され、1、2、3、7、14日の暴露期間中、その減少率はほぼ一定の値を示した。同様にローダミン123の取り込み量は、

30

10 µMのモルヒネ暴露（24時間）により減少
し、その減少率は8.5 %であった（Fig. 2）。リ

20

10

3

[ H]Vincristine uptake(% decrease)

ここで、dx/dt は単位時間当たりのモルヒネ

0
0.1

1

10

100

500

Morphine concentration (µM)

Fig. 1 [3H]Vincristine uptake by Caco-2 cells pretreatedwith morphine (0.1 – 500 µM, 14 days)
The cells pretreated with or without morphine wereincubated with 31 nM [3H]vincristine at 37℃ for 60
min. [3H]vincristine uptake was demonstrated as %decrease from the control value. Each column representsmean ± S.E. of three to nine experiments.

Rhodamine123 Efflux(% effluxed)

Rhodamine123 uptake(% decrease)

40
30
20
10
0

Morphine Rifampin Digoxin Colchicine

Fig. 2 Rhodamine123 uptake by Caco-2 cells pretreatedwith morphine, rifampin, digoxin or colchicine
The cells were pretreated with morphine (10 µM, 24 hr),rifampicin (10 µM, 24 hr), digoxin (0.1 µM, 24 hr) orcolchicine (7.5 µM, 48 hr). The cells were incubatedwith 3 µM rhodamine123 at 37 ℃ for 90 min.
Rhodamine123 uptake was demonstrated as % decrease
from the control value. Each column represents mean ±S.E. of three to eleven experiments.

ファンピシン、ジゴキシン及びコルヒチン暴露によりCaco-2細胞へのローダミン123の取り込み量は減少し、その減少率は、リファン
ピシンで13%、ジゴキシンで17%、コルヒチン

40

***

30

*

20
10
0

ControlMorphine

DigoxinFig. 3 Rhodamine123 efflux from Caco-2 cells pretreatedwith morphine or digoxin
The cells were pretreated with morphine (10 µM, 24 hr)or digoxin (0.1 µM, 24 hr). The cells were incubatedwith 3 µM rhodamine123 at 37℃ for 90 min. Then cells
were washed, and incubated with rhodamine123-free
medium at 37℃ for 90 min. Each column representsmean ± S.E. of three experiments. Asterisks show asignificant difference from control values, *P < 0.05, **P< 0.01.

ヒネの膜透過係数は、A to B 方向で減少、B to
A 方向で増加し、A to B 方向に比べ、B to A
方向の膜透過係数は2倍有意に高値を示した。

考察

で26%であった。
Caco-2細胞にローダミン123を取り込ませた後測定したローダミン123の細胞からの排出量は、モルヒネ（10 µM, 24時間）暴露によ
り対照群に比べ1.4倍有意に増加し、ジゴキシン（0.1 µM, 24時間）暴露により2.5倍有意に増加した。（Fig. 3）
モルヒネの Caco-2細胞単層膜透過性
Caco-2細胞単層膜を介したモルヒネの累積
透過量は、180分まで直線的に増加し、これより算出したモルヒネの膜透過係数は、A to B
方向で0.206±0.019×10-3 cm/min、B to A 方向
で0.203±0.011×10-3 cm/min であった（Fig. 4）。
モルヒネ暴露（10 µM, 21日間）により、モルPgpの薬物排出機能及びモルヒネの細胞膜透過性に対するモルヒネ暴露の影響について、
Caco-2細胞を用いて検討した。Caco-2細胞のapical膜に局在するPgp機能の評価のため、Pgpの代表的な基質である[3H]ビンクリスチン及びローダミン123の細胞内取り込み量を測定した。Caco-2細胞への[3H]ビンクリスチン取り込み量は、モルヒネ暴露により濃度依存的に減少した。この[3H]ビンクリスチンの取り込み量の減少は、シクロスポリンAの存在下で、モルヒネ未処理群の場合と同程度まで回復した。これらの結果から、モルヒネ暴露によりPermeability coefficient-3(x 10 cm/min)

Pgpの排出機能が亢進することが示唆された。
0.4

P<0.05

0.3

0.2

0.1

0.0
A to B

B to A

Non treated

A to B

B to A

Morphine treated

このPgp機能の亢進は、モルヒネ暴露開始後12
Fig. 4 Effect of pretreatment with morphine (10 µM,
21 days) on transepithelial transport of morphine in theapical to basolateral direction (A to B) and basolateral toapical direction (B to A) across Caco-2 cell monolayers.
The cells were pretreated with 10 µM morphine for21 days. The cells were washed, and then 10 µM
morphine was added to the apical side (A to B) or to
the basolateral side (B to A) of monolayers. Afterincubation at 37℃ for 120 min, the medium on theother side was collected and assayed. Each column
represents mean ± S.E. of three experiments.

時間ですでにみられ、14日の暴露期間中維持
3以上の結果から、Caco-2細胞においてモルされた。また、[ H]ビンクリスチンと同様に、ヒネ暴露により Pgp 機能並びにモルヒネの排

ローダミン123のCaco-2細胞への取り込みが出輸送が亢進することが示された。

モルヒネ暴露により減少したことから、モル

引用文献

ヒネ暴露はローダミン123の排出輸送も亢進することが示された。モルヒネ（10 µM）暴露

1) Letrent SP, Pollack GM, Brouwer KR,

によるCaco-2細胞へのローダミン123の取りBrouwer KLR: Effects of a potent and specific込みの減少率は8.5％であり、Pgp誘導作用のP-glycoprotein inhibitor on the blood-brain

5)6)あるリファンピシン 、ジゴキシン 、コルヒ
7)barrier distribution and antinociceptive effect

チン 暴露では、モルヒネ暴露以上の減少率

of morphine in the rat. Drug Metab Dispos, 27,（13〜26%）がみられた。また、Caco-2細胞

827-34 (1999)からのローダミン123の排出は、モルヒネ暴露

2) Zong J, Pollack GM: Morphine antinocicep-

により1.4倍増加し、ジゴキシン暴露では2.5

tion is enhanced in mdr1a gene-deficient mice.

倍に増加した。モルヒネのPgp機能亢進作用は、

Pharm Res, 17, 749-753 (2000)

10 µMで最大であったことから、モルヒネは、

3) Aquilante CL, Letrent SP, Pollack GM,

リファンピシン、ジゴキシン、コルヒチンほBrouwer KLR: Increased brain P-glycoprotein

どのPgp機能亢進作用は示さないと考えられ

in morphine tolerant rats. Life Sci, 66, 47-51

る。

(2000)

次に、モルヒネの細胞膜透過性に対するモ

4) King M, Su W, Chang A, Zuckerman A,

ルヒネ暴露の影響について検討した。Caco-2

Pasternak GW: Transport of opioids from the

細胞単層膜を介したモルヒネの累積透過量かbrain to the periphery by P-glycoprotein:ら算出したモルヒネの透過係数は、A to BとB

peripheral actions of central drugs. Nat

to A方向で差はみられなかったが、モルヒネ暴

Neurosci, 4, 268-274 (2001)

露によりモルヒネの膜透過係数は、B to A方向

5) Geick A, Eichelbaum M, Burk O: Nuclear

で減少、A to B方向で増加した。この結果から、

receptor response elements mediate induction

モルヒネの長期投与によりモルヒネの排出輸

of intestinal MDR1 by rifampin. J Biol Chem,

送が亢進し、モルヒネの吸収方向への膜透過276 14581-14587 (2001)

性が低下する可能性が示唆された。

6) Takara K, Tsujimoto M, Ohnishi N, Yokoyama

モルヒネの連続投与によりラット脳ホモジ

T: Digoxin up-regulates MDR1 in human

ネートにおけるPgpの発現量が2倍に増加する

colon carcinoma Caco-2 cells. Biochem

3)

ことが報告 されているが、このPgpの増加が、Biophys Res Commun, 292, 190-194 (2002)

脳毛細血管か脳実質で起きているのかは明ら

7) Declèves X, Chappey O, Boval B, Niel E,

かではない。Caco-2細胞においてモルヒネ暴

Scherrmann JM: P-glycoprotein is more

露によるPgp機能亢進とモルヒネ膜透過性のefficient at limiting uptake than inducing

変化がみられたことから、モルヒネ暴露が脳

efflux of colchicine and vinblastine in HL-60

毛 細血管内皮細胞管腔側膜に存在するPgpのcells. Pharm Res, 15, 712-718 (1998)

機能亢進とモルヒネの脳移行性の低下を起こす可能性が考えられる。しかしモルヒネの鎮痛耐性形成にお けるPgpの寄与に関してはさらに検討が必要であろう。

µ‑Opioid 受容体作動薬の慢性処置による脊髄内 µ‑opioid 受
容体のトラフィッキング機構およびアストロサイトの形態変化の解析
鈴木雅美, 成田年, 鈴木勉

星薬科大学薬品毒性学教室µ-Opioid receptor trafficking and changes in astroglial cells in the mouse spinal cord
induced by repeated opioid administration
Masami Suzuki, Minoru Narita, Tsutomu Suzuki
Department of Toxicology,
Hoshi University School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Tokyo Japan
Summary:

Chronic treatment with µ-opioid receptor agonist has been reported to cause the receptor

desensitization and internalization which were deeply concerned with the modulation by kinds of protein kinases.
Either repeated s.c. administration of morphine or etorphine once a day for 7 days produced a marked reductionin each spinal µ-opioid receptor-mediated antinociceptive effect in the mouse.

The present molecular approachstrongly supports the idea that the etorphine-induced µ-opioid receptor desensitization may result from µ-opioid
receptor internalization associated with translocation of several kinds of trafficking proteins and conventional
protein kinase C (cPKC) to the plasma membrane. Unlike etorphine, morphine had no effect on the levels of
trafficking proteins in membranes and failed to induce the internalization of µ-opioid receptors. Repeatedtreatment with morphine also had no effect on levels of membrane-bound cPKC, whereas it produced asignificant increase in the level of phosphorylated-cPKC (p-cPKC) in the spinal dorsal horn detected byimmunohistochemistry.

Repeated treatment with morphine promoted astroglial hypertrophy as well as its

proliferation in the dorsal horn of the mouse spinal cord. A deletion of cPKC caused a dramatic inhibition ofastroglial changes by chronic administration of morphine.

These findings provide further evidence that the

etorphine-induced µ-opioid receptor internalization may be associated with the translocation of trafficking
proteins to the plasma membrane in the mouse spinal cord. Furthermore, the present data raise the fascinating
possibility that the increased astroglial response is involved in the development of morphine tolerance associatedwith the sustained activation of cPKC.

緒言

dynamin II および β-arrestin 2 の蛋白量の変化
を、Western blot 法に従い定量した。さらに、

一般に、µ-opioid 受容体作動薬の慢性適用

各薬物を 7 日間投与し、最終投与の 24 時間は、受容体の脱感作および細胞内陥入を引き後に灌流固定を行い、脊髄凍結切片を作製し起こし、これらの反応は protein kinase など多た。この脊髄切片を用いて、それぞれ µ-opioid

種の細胞内リン酸化酵素によって調節されて受 容 体 、 phosphorylated-conventinal proteinいると考えられている 1,2,3)。しかしながら、

kinase C (p-cPKC)、樹状突起のマーカーである

臨床で汎用されている morphine は、動物実

microtubule associated protein 2 (MAP2) および

験において慢性処置によりほとんど受容体のア ス ト ロ サ イ ト の マ ー カ ー で あ る glia

細胞内移行を示さずに鎮痛耐性を形成するこfibrillary acidic protein (GFAP) の特異的抗体をとが報告されている。一方、現在、臨床にお使用し、その局在および形態変化を免疫染色ける疼痛治療はがん疼痛のような激しい痛み法に準じて検討した。

の存在下では morphine を長期使用しても鎮痛耐性は形成されないという臨床上の経験を基に進められているが、これらの科学的根拠

結果および考察は未だに十分とは言えない。そこで本研究でまず、etorphine を 7 日間投与し、鎮痛耐

は、morphine 鎮痛耐性の分子機構を解明する性が形成されたことを確認した後、脊髄後角

目的で、opioid 受容体作動薬慢性処置によるにおける µ-opioid 受容体陽性細胞の形態をµ-opioid 受容体のトラフィッキング (代謝回観察した。その結果、etorphine 群において明転) 機構およびアストロサイトの変化を機能瞭な µ-opioid 受容体の細胞内移行が認めら

形態学的に解析した。

れた。次に、etorphine 慢性処置による脊髄後角の p-cPKC の変化を検討したところ、脊髄実験方法

後角表層部において膜結合型 p-cPKC の著明な増加が認められた。さらに、脊髄細胞膜実験には、ICR 系雄性マウスを使用した。

分 画 に お け る GRK2 、 dynamin II お よ び

ま ず 、 morphine (10 mg/kg, s.c.) お よ び

β-arrestin 2 の蛋白量の変化を検討したところ、

etorphine (10 mg/kg, s.c.) を 1 日 1 回、7 日

etorphine 群では saline 群と比較し、GRK2、間投与することで鎮痛耐性が形成されることdynamin II および β-arrestin 2 の著明な増加がを tail-flick 法により確認した。次に、各薬物認められた。これらのことから、etorphine 反を 7 日間投与し、最終投与の 24 時間後に脊復投与は、p-cPKC、GRK2、dynamin II および髄細胞膜分画標本を作製し、受容体の細胞内

β-arrestin 2 に依存した µ-opioid 受容体の持陥入を制御することが報告されている

続的な細胞内陥入を引き起こし、これら一連

G-protein coupled receptor kinase 2 (GRK2)、の反応により鎮痛耐性が形成されるものと想定される。一方、morphine を慢性処置し、同引用文献様の検討を行ったところ、従来の報告通り、µ-opioid 受容体の細胞内移行がほとんど観察

1) Zhang J, Ferguson SS, Barak LS, Bodduluri SR,

されないにもかかわらず、脊髄後角表層部にLaporte SA, Law PY, Caron MG (1998) Role forおける p-cPKC 活性の増大や、鎮痛耐性が認Gめられた。また、この時の脊髄細胞膜分画に

agonist-specific regulation of µ-opioid receptor

おける GRK2、dynamin II および β-arrestin 2

responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S Aの蛋白量は、saline 群と比べ、有意な変化は

95:7157-7162.

認められなかった。そこで morphine 慢性処

2) Narita M, Mizoguchi H, Narita M., Suzuki T,

置により、脊髄後角において p-cPKC が著明Narita M, Dun N J, Imai S, Yajima Y, Nagase H,に増加することの生理的意義を詳細に検討すSuzuki T, Tseng LF (2001) Enhanced µ-opioid

るために、MAP2 抗体および GFAP 抗体を用

responses in the spinal cord of mice lacking

いて p-cPKC と二重染色を行った。その結果、

protein kinase Cγ isoform. J Biol Chem

p-cPKC の増加はアストロサイトではなく、27:15409-15414.

主として脊髄後角表層の神経終末周辺部およ3) Narita M, Mizoguchi H, Narita M, Nagase H,

び樹状突起で強く認められた。また、これら

Suzuki T, Tseng LF (2001) Involvement of spinalの条件下、アストロサイトの著しい星状化がprotein kinase Cγ in the attenuation of opioid認められた。しかしながら、この反応は選択µ-receptor mediated G-protein activation after

的 PKC 阻害薬の併用により抑制された。一chronic intrathecal administration of [D-Ala2,

方、PKC 基質の一つであり、神経細胞の軸索

N-MePhe4, Gly-ol5] enkephaln (DAMGO). J

伸展ならびにシナプス形成に関与することがNeurosci 11:3715-3721.

報告されているGAP-43 免 疫 活 性 のmorphine 慢性処置による変化を検討したと
ころ、saline 群と morphine 慢性処置群間に大きな差は認められなかった。
以上、本研究の結果より、morphine 慢性処
置 に よ る µ-opioid 受 容 体 の 脱 感 作 は 、µ-opioid 受容体のトラフィッキングに対する直接的な影響よりもむしろ、神経細胞内のPKC の活性化に依存したアストロサイトの形態変化を伴うシナプス伝達効率の変化が関与している可能性が考えられる。

protein-coupled

receptorkinasein