Dec. 2016

〈総THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―6357（ 9 ）説〉
抗インフルエンザ薬耐性ウイルスの高感度検出分離法の開発
紅林佑希
静岡県立大学大学院薬学研究院生化学講座（2016 年 11 月 24 日受付）
インフルエンザ A・B 型ウイルスや一部のパラミクソウイルスは，ウイルス受容体であるシアル酸を糖鎖末端から切断する酵素「シアリダーゼ」を持つ。ウイルスの感染細胞上には，ウイルス由来のシアリダーゼが豊富に発現する。筆者らが開発したシアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」は，シアリダーゼ活性を組織化学的に蛍光イメージングする。BTP3-Neu5Ac は，特異的抗体や細胞の固定化操作を必要とせずに，ウイルスや感染細胞を簡便迅速に蛍光イメージングできる。インフルエンザ治療薬である Neuraminidase（NA）阻害薬を BTP3-Neu5Ac と併用することで，薬剤耐性インフルエンザウイルスの感染細胞を選択的に蛍光イメージングして，薬剤耐性ウイルス株を高効率に単離することができる。本稿では，BTP3-Neu5Ac を利用した，ウイルスの蛍光イメージングと薬剤耐性ウイルスの検出分離法への応用について概説する。

細胞からの遊離を促進する働きを示す。IAV の感はじめに染後期では，新生ウイルス粒子の部品として HA

インフルエンザウイルスは感染に糖鎖が関与すや NA が感染細胞表面に大量に発現する。ウイル

る代表的なウイルスであり，ウイルス粒子の表面

スの NA は，細胞が本来持つシアリダーゼより著には糖鎖利用に関わるスパイクタンパク質が存在しく高い活性を示し，ウイルスの粒子表面や感染する。インフルエンザ A 型ウイルス（Inﬂuenza A

後期の宿主細胞表面ではこの NA が大量に発現しvirus, IAV）およびインフルエンザ B 型ウイルスているため，これを利用すればウイルスや感染細（Inﬂuenza B virus, IBV）はスパイクタンパク質と胞を容易に検出できるようになるのではないかとし て 糖 鎖 結 合 タ ン パ ク 質「ヘ マ グ ル チ ニ ン

考えた。

（Hemagglutinin, HA）」と糖代謝酵素タンパク質

我々の研究室では最近シアリダーゼを高感度に「ノイラミニダーゼ（Neuraminidase, NA）」の 2 種検出する蛍光検出試薬（2-ベンゾチアゾール-2-イのタンパク質を持つ。NA は糖鎖末端のシアル酸（2-Benzothiazol-2-yl）-4ル）-4-ブロモフェノール（を切断する「シアリダーゼ」酵素活性を有し，宿bromophenol, BTP3）のシアル酸；N-アセチルノ

主への感染増殖機構における最終段階である感染イラミン酸（N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac）付

358（ 10 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―6Dec. 2016

加体である「BTP3-Neu5Ac」を開発した。BTP3-Neu5Ac はシアリダーゼにより，酵素活性部位がNeu5Ac はシアリダーゼと反応してシアル酸が外認識するシアル酸の分子種 Neu5Ac と，水溶性のれ蛍光物質である BTP3 が遊離・沈着すること蛍光物質 4-メチルウンベリフェロン（4-Methyl-で，シアリダーゼを高感度に蛍光イメージングすumbelliferone, 4 MU）に 加 水 分 解 す る。 4 MU-ることが可能になる。我々はこの BTP3-Neu5Ac

Neu5Ac はシアリダーゼ活性を高感度に蛍光検出により IAV や IBV，およびその感染細胞を蛍光イできる。4 MU の蛍光性は酸性条件では減弱すメージングする方法を開発した。この蛍光イメーる 2）。 NA-Star は 4 MU-Neu5Ac と 同 様 に シ ア リ

ジング法は IAV，IBV の「型」や「亜型」の違い

ダーゼにより Neu5Ac が遊離することで化学発光に依らず検出が可能であり，BTP3-Neu5Ac と反物質が生成し，化学発光を検出することでシアリ応させる簡単な操作により約 10 分程度で感染細ダーゼの酵素活性を検出することができる 3）。

胞を蛍光イメージングできる。さらに，我々はこ4 MU-Neu5Ac や NA-Star は定量性に優れ，IAV をの BTP3-Neu5Ac を利用することで IAV のオセル含むシアリダーゼ活性の測定や薬剤耐性化度の測

タミビル耐性を検出し，検出した耐性ウイルスを定に使用される。しかし 4 MU-Neu5Ac や NA-Star

直接的かつ選択的に感染細胞から単離する方法をの反応生成物は，水溶性でありシアリダーゼ活性開発した。本稿では，BTP3-Neu5Ac によるウイルの存在部位を組織化学的に蛍光イメージングする

スや感染細胞の蛍光イメージング法の原理と薬剤

こ と は で き な い。 5-ブ ロモ-4-ク ロ ロ イ ン ド ー

耐性 IAV の検出法および分離法への応用について

ル-3-イル-Neu5Ac （5-Bromo-4-chloroindol-3-yl-

概説する。

Neu5Ac, X-Neu5Ac）は増感剤 Fast Red Violet LBを併用することで，IAV のシアリダーゼ活性の存シアリダーゼの検出試薬

在部位を蛍光イメージングすることができる 4,5）。

シアリダーゼ活性を検出する試薬は，これまで

しかしこの方法は，酵素活性の検出感度が十分でにいくつか開発されている（表 1）。4-メチルウンはなく，非特異的な蛍光も増感されやすいため

ベ リ フ ェ リル-N-ア セ チ ル ノ イ ラ ミ ン 酸（2′-IAV を特異的に蛍光イメージングすることは出来（4-Methylumbelliferyl）-N-acetylneuraminic acid,ない。

4 MU-Neu5Ac）は，シアリダーゼ活性を蛍光検出

我々は，ベンゾチアゾリルフェノール誘導体する試薬としてよく利用されている 。4 MU- （BTP）を利用して糖鎖やリン酸基に対する加水1）

表 1. シアリダーゼ活性の主な検出試薬

Dec. 2016

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―6359（ 11 ）

図 1. BTP3-Neu5Ac による蛍光イメージング

分解酵素の蛍光検出剤を開発してきた。BTP は，水に不溶性を示す結晶性の蛍光物質であり，そのインフルエンザウイルスの蛍光イメージング

蛍光は pH の影響を受けにくく安定な蛍光を示

我々は最初に BTP3-Neu5Ac が IAV と反応するす 。150 nm 以上の大きなストークスシフトを示かの確認を行った。ヒト IAV と BTP3-Neu5Ac をすため，蛍光検出時に励起光や細胞組織の自家蛍水溶液中で反応させたところ，紫外線照射により6）光の影響を受けにくい。BTP の最大の特徴は， 緑色蛍光化が認められた。IAV および IBV の NA
フェノール性水酸基に水溶性の高い官能基を結合特異的シアリダーゼ阻害薬であるザナミビル 10）させることで BTP の蛍光性をオフに水溶性をオの存在下では，BTP3-Neu5Ac による蛍光発色はンに制御できる点である。BTP にガラクトース阻害された。このことから BTP3-Neu5Ac によるウ（Galactose, Gal）を結合させた BTP-Gal やリン酸

イルスの蛍光化は IAV のシアリダーゼ活性に依存。IAV を感染さ基（Phosphate, Phos）を結合させた BTP3-Phos は， していることが確認された（図 2A）

β-ガラクトシダーゼやフォスファターゼと反応しせたイヌ腎由来 MDCK 細胞を BTP3-Neu5Ac と反。そこで同じく加水分解酵素の応させたところ，IAV 感染細胞は組織化学的に蛍て蛍光を示す

7,8）

シ ア リ ダ ー ゼ を 蛍 光 イ メ ー ジ ン グ す る た め， 光イメージングされた（図 2B）。この感染細胞のBTP3 のフェノール性水酸基にシアリダーゼが認

蛍光イメージングは，特異的抗体等は不要であ識するシアル酸の分子種 Neu5Ac を結合させた

り，必要な操作は BTP3-Neu5Ac の添加のみであBTP3-Neu5Ac を開発した。
「水溶性」の「非蛍光」 る。この蛍光イメージングは抗 NA モノクローナ物質 BTP3-Neu5Ac はシアリダーゼの反応によりル抗体で蛍光免疫染色した部位とほぼ同様であ「不溶性」の「蛍光」物質 BTP3 を生成し，酵素活り，BTP3-Neu5Ac により蛍光イメージングされ性の存在部位を組織化学的に蛍光イメージングすた細胞は IAV 感染細胞であることが確認された。

る（図 1）。この方法では，ウイルスや感染細胞をIAV には幅広い宿主域（ヒト，トリ，ブタなど）

BTP3-Neu5Ac と反応させる簡単な操作で高感度と 多 く の 表 面 抗 原 性（亜 型）が あ る。 BTP3-に感染細胞を蛍光イメージングできる 9）。

Neu5Ac は，IAV の宿主，亜型，分離年代の違いに

360（ 12 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―6

Dec. 2016

図 2. BTP3-Neu5Ac による IAV の検出

図 3. BTP3-Neu5Ac による IAV の分離

関係なく，ウイルスを検出できる。IAV，IBV のあった（表 2）。

他にパラミクソウイルスの一部がシアリダーゼをBTP3-Neu5Ac による感染細胞の検出の利点は持つことが知られており，BTP3-Neu5Ac はヒトライブイメージングという点であり，これはウイパラインフルエンザ 1 型および 3 型ウイルスやルス株を単離する際に特に効果を発揮する。一般，ニューカッスル病ウイル

的なウイルス株単離法は，寒天培地を用いて感染，おたふく風邪の原因となるムンプスウイル細胞を培養することで，一つのウイルスクローン

ス 14）などのパラミクソウイルスを検出可能でに由来する感染細胞集団（フォーカス）やアポセンダイウイルス
ス11）

12）

13）

Dec. 2016

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―6361（ 13 ）表 2. BTP3-Neu5Ac により検出したウイルス

図 4. NA 阻害薬の構造

トーシス誘導により生じる細胞集団の脱落（ププラーク形成が起こるよりも早い時間でフォーカラーク）を形成させる。このプラークからウイルスを蛍光化できるため，従来のプラーク法よりもスを単離して，新しい細胞で培養することで単一効率的にウイルス単離が可能になる。さらに，従の ウ イ ル ス 株 を 得 る こ と が で き る。 BTP3-来法ではウイルス単離が困難であったプラーク形

Neu5Ac はフォーカスをライブイメージングする

成能の無い，あるいはプラーク形成能の低いウイため，蛍光化フォーカスからウイルス株を単離・ルス株においても，BTP3-Neu5Ac を利用するこ培養することができる（図 3）。フォーカスの蛍光とで容易にウイルス株の単離が可能になった。

検出によりプラークよりも高い視認性が得られ，

362（ 14 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―6

Dec. 2016

スの流行により，いわゆる「薬剤耐性インフルエ

薬剤耐性インフルエンザウイルス

ンザウイルス」の流行拡大の危険性が認知される

現在，インフルエンザ治療薬として最も一般的ようになった。2008 年の薬剤耐性インフルエンザに使用されるのは NA 阻害薬であり，ザナミビ

ウイルス流行の背景には NA タンパク質上のいくル，オセルタミビル，ラニナミビル，ペラミビル

つかのアミノ酸変異が重なり，NA 阻害薬に対すの 4 種類が存在する。これらの薬は IAV およびる耐性を獲得しつつシアリダーゼ活性やウイルスIBV のシアリダーゼ活性を特異的に阻害することの増殖性が低下しない新しい耐性機構が寄与してでウイルス増殖を抑制する。NA 阻害薬はいずれいたことが報告された 20）。以後，薬剤耐性インフも本来の基質であるシアル酸 Neu5Ac の構造類似

ルエンザウイルスの流行拡大が起こり得るものと体であり（図 4），酵素活性を競合的に抑制する。 認識され始め，薬剤耐性ウイルスの検出と流行監

IAV は非常に変異が起こりやすいため，過去に使視が行われている。

用されていた M2 チャネル阻害薬に対しては現在

薬剤耐性インフルエンザウイルスの検査法にはの流行型である H1N1 型と H3N2 型ではほぼ全て主に遺伝子検査法と酵素活性測定法がある 21,22）

が M2 のアミノ酸変異により耐性化している 15）。 （表 3）。現状では薬剤耐性ウイルスの発生状況は
一 方， NA 阻 害 薬 は Neu5Ac と 同 じ 酵 素 活 性 ポ

H1N1 型のオセルタミビル耐性ウイルスの出現率

ケットに結合するため，NA 阻害薬への耐性を獲が毎年数パーセント程度で最も高く，その他の薬得した NA は本来の基質であるシアル酸への親和剤耐性出現率はごくわずかである 23）。そのため，性も低下し，一般的に NA 阻害薬耐性 IAV はシア

薬剤耐性の検査法は H1N1 型 IAV の H275Y の遺リダーゼ活性やウイルスの増殖性が低下す

伝子変異を検査することが主流であり，実際に酵。このため，NA 阻害薬に対しては薬剤耐素活性を測定して薬剤耐性を判定する方法は少数性化したウイルスは散発的に発生してもその拡大の抜き取りサンプルについて行われているのみでは起こりにくいと考えられていた。しかし，2008ある。H1N1 型と同様に毎年流行を起こす H3N2る16,17）

年に世界的に流行した H1N1（A ソ連）型 IAV は， 型 IAV や IBV の検査体制や未知の薬剤耐性変異

NA の 275 番目のアミノ酸が変異したことでオセウイルスの発生監視体制は十分ではない。酵素活ルタミビルに対する感受性が低下したオセルタミ性測定法には定量性の高い検出試薬が用いられ，。この耐性ウイル検出が直接的で未知の耐性変異でも検出可能であビル耐性ウイルスであった

18,19）

表 3. 薬剤耐性ウイルスの検査手法

Dec. 2016

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―6363（ 15 ）るが，操作が煩雑で多検体の検査には不向きであ可能になることが期待される。BTP3-Neu5Ac はる。酵素活性検出法を簡易化しスクリーニング手

酵素活性を検出可能な基質であり，ウイルスシア法として確立することが出来れば，現在の手法とリダーゼの活性を蛍光イメージングするため，定併せてスクリーニング陽性の検体のみを定量的に性反応として簡易スクリーニングに利用できるも検査することで多数の検体であっても全数検査がのと考えれられた。そこで，BTP3-Neu5Ac による

図 5. BTP3-Neu5Ac による薬剤耐性 IAV の検出

図 6. 薬剤耐性 IAV の選択的な分離364（ 16 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―6

Dec. 2016

蛍光イメージングを薬剤耐性インフルエンザウイスを単離したところ，すべてオセルタミビル耐性ルスの検出技術として利用できるかについて検討

化 IAV が検出された（図 6）。薬剤存在下で BTP3-を行った。

Neu5Ac によるフォーカスのライブイメージングを行うことにより，薬剤耐性ウイルス株の選択的薬剤耐性ウイルスの検出分離法の開発なイメージングと分離が可能となった 24）。BTP3-

インフルエンザ治療薬である NA 阻害薬の存在

Neu5Ac による薬剤耐性ウイルス感染細胞の選択下では，通常の IAV や IBV はシアリダーゼ活性が的イメージングは，未知の薬剤耐性化変異にも対完全に阻害される。しかし，薬剤に耐性化したウ

応し，薬剤を段階希釈で使用することで耐性化度

イルスはシアリダーゼ活性を維持できる。これにも同時に測定できる。本手法を用いることで薬剤より NA 阻害薬の存在下では，BTP3-Neu5Ac は薬耐性ウイルス感染細胞を迅速かつ選択的に蛍光イ剤耐性ウイルスやその感染細胞を選択的に蛍光イメージングすることが可能となり，さらに検出しメ ー ジ ン グ で き る こ と が 予 想 さ れ た。我 々 はた薬剤耐性ウイルスは培養や分離を容易に行うこ2008〜2009 年のシーズンに分離されたオセルタとができる。

ミ ビ ル 感 受 性 IAV 株 の A/Shizuoka/838/2009（H1N1pdm）とオセルタミビル耐性化 IAV 株の A/

おわりにShizuoka/738/2008（H1N1）を使用して，BTP3-シアリダーゼの蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac による薬剤耐性の判別を試みた。BTP3-Neu5Ac」の開発により，IAV，IBV やその感染細Neu5Ac をオセルタミビル存在下でウイルスや感胞を簡便な操作で迅速に蛍光イメージングでき染細胞と反応させたところ，オセルタミビル耐性る。また，フォーカスをライブイメージングするウイルスやその感染細胞のみがオセルタミビル存ことにより，ウイルス株の単離を容易にした。

在下で選択的に蛍光イメージングされた（図 5）。 BTP3-Neu5Ac を用いた検出技術は，インフルエ
薬剤耐性 IAV 感染細胞を BTP3-Neu5Ac により選ンザ治療薬の NA 阻害薬を併用することで，薬剤択的にライブイメージングできたため，この蛍光耐性インフルエンザウイルスを選択的に検出・分化細胞からはウイルス株を単離することで，薬剤離することを可能にする。本技術は薬剤耐性ウイ耐性 IAV 株が高効率に単離できるものと予想されルスの流行拡大監視や薬剤耐性機構の解析の効率た。薬剤耐性ウイルスと感受性ウイルスを同量ず化に大きく貢献するものと期待される。今後，つ混合させウイルスサンプルを用いてオセルタミ

BTP3-Neu5Ac の高性能化や応用利用法を確立す

ビルと BTP3-Neu5Ac によりフォーカスを蛍光イることで，医療や衛生，研究といった各方面へ貢メージングしたところ，オセルタミビル存在下で献していきたい。

蛍光化されたフォーカスの数は，阻害剤が無い条件のおよそ半分であった。オセルタミビル存在下謝辞で蛍光化されたフォーカスが，オセルタミビル耐2016 年度の日本感染症医薬品協会奨励賞受賞

性化 IAV 株に由来することを確認するため，各にあたり，これまで御指導頂いた静岡県立大学大フォーカスからウイルス株を単離培養し，その学院薬学研究院生化学講座の鈴木NA 遺伝子（オセルタミビル耐性化 275Y，オセル忠伸准教授，南タミビル感受性 275H）を RT-PCR 法により検出しいた広島国際大学薬学部薬品合成化学研究室の池た。8 個の蛍光化フォーカスからそれぞれウイル

田隆教授，高橋彰講師，BTP3-Neu5Ac を合成頂潔教授，大坪忠宗准教授，ウイルス株を御提Dec. 2016

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

供頂いた静岡県環境衛生科学研究所微生物部の佐69―6365（ 17 ）specificity phosphatase MKP-6. Chem.
Commun. 39: 5895〜5897, 2009
原啓二部長および諸先生方，本賞の選考委員の先
7）OTSUBO, T.; A. MINAMI, H. FUJII, et al.: 2生方に心より感謝申し上げます。
（Benzothiazol-2-yl）-p h e n y l - β- D galactopyranoside derivatives as ﬂuorescentpigment dyeing substrates and their application
利益相反自己申告
for the assay of β-D-galactosidase activities.
著者 紅林佑希は公益財団法人 日本感染症医Bioorg. Med. Chem. Lett. 23: 2245〜2249,
薬品協会，公益財団法人 服部報公会，花王健康2013
科学研究会から研究助成金を受けている。
8）TAKAHASHI, T.; T. OTSUBO, K. IKEDA, et al.:Histochemical imaging of alkaline phosphataseusing a novel ﬂuorescent substrate. Biol. Pharm.
［この総説は 2016 年度日本感染症医薬品協会奨励
Bull. 37: 1668〜1673, 2014
賞受賞者 紅林佑希氏より投稿したものです。
9）KUREBAYASHI, Y.; T. TAKAHASHI, T. OTSUBO, et2016 年度奨励賞の対象研究について，2016 年 10al.: Imaging of inﬂuenza virus sialidase activity
in living cells. Sci. Rep. 4: 4877, 2014月 18 日（火）に学士会館にて受賞記念講演会が開催され（座長；藤村 茂先生），その内容をまとめ 10）ITZSTEIN, M. von; W. Y. WU, G. B. KOK, et al.:Rational design of potent sialidase-basedたものです。］
inhibitors of inﬂuenza virus replication. Nature363: 418〜423, 1993
11） TAKAHASHI, T.; M. TAKANO, Y. KUREBAYASHI, et引用文献
al.: Rapid ﬂuorescent detection assay for human
1）NAYAK, D. P.; U. REICHL: Neuraminidase
parainﬂuenza viruses. Biol. Pharm. Bull. 38:
activity assays for monitoring MDCK cell1214〜1219, 2015
culture derived influenza virus. J. Virol.
12）TAKANO, M.; T. TAKAHASHI, T. AGARIKUCHI, et al.:
Methods 122: 9〜15, 2004
Histochemical ﬂuorescent staining of Sendai
2）GRABER, M. L.; D. C. DILILLO, B. L. FRIEDMAN,virus-infected cells with a novel sialidase
et al.: Characteristics of ﬂuoroprobes for
substrate. Virology 464〜465, 424〜431, 2014
measuring intracellular pH. Anal. Biochem.
13）TAKAHASHI, T.; M. TAKANO, T. AGARIKUCHI, et al.:156: 202〜212, 1986
A novel method for detection of Newcastle
3）BUXTON, R. C.; B. EDWARDS, R. R. JUO, et al.:disease virus with a ﬂuorescent sialidase
Development of a sensitive chemiluminescent
substrate. J. Virol. Methods 209: 136〜142,
neuraminidase assay for the determination of2014
inﬂuenza virus susceptibility to zanamivir. Anal.
14）TAKAHASHI, T.; T. AGARIKUCHI, Y. KUREBAYASHI,
Biochem. 280: 291〜300, 2000
et al.: Easy and rapid detection of mumps virus4）FUJII, I.; Y. IWABUCHI, T. TESHIMA, et al.:by live ﬂuorescent visualization of virusX-Neu5Ac: a novel substrate for chromogenic
infected cells. PLoS One 10: e0144038, 2015
assay of neuraminidase activity in bacterial15）ISON, M. G.: Antivirals and resistance: inﬂuenza
expression systems. Bioorg. Med. Chem. 1:virus. Curr. Opin. Virol. 1: 563〜573, 2011147〜149, 199316）IVES J. A.; J. A. CARR, D. B. MENDEL, et al.: The5）SUZUKI, T.; T. TAKAHASHI, C. T. GUO, et al.:
H274Y mutation in the inﬂuenza A/H1N1
Sialidase activity of inﬂuenza A virus in anneuraminidase active site following oseltamivir
endocytic pathway enhances viral replication. J.
phosphate treatment leave virus severely
Virol. 79: 11705〜11715, 2005
compromised both in vitro and in vivo. Antiviral
6）KIM, T. I.; H. J. KANG, G. HAN, et al.: A highly
Res. 55: 307〜317, 2002
selective ﬂuorescent ESIPT probe for the dual
17）ABED, Y.; N. GOYETTE, G. BOIVIN: A reverse

366（ 18 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

genetics study of resistance to neuraminidase
inhibitors in an inﬂuenza A/H1N1 virus. Antivir.
Ther. 9: 577〜581, 2004
18）HAYDEN, F. G. & M. D. D. JONG: Emerging
inﬂuenza antiviral resistance threats. J. Infect.
Dis. 203: 6〜10, 201119）BARANOVICH, T.; R. G. WEBSTER, E. A.
GOVORKOVA: Fitness of neuraminidase inhibitorresistant inﬂuenza A viruses. Curr. Opin. Virol.
1: 574〜581, 201120）BLOOM, J. D.; L. I. GONG, D. BALTIMORE:Permissive secondary mutations enable theevolution of inﬂuenza oseltamivir resistance.
Science 328: 1272〜1275, 201021）BOIVIN, G.: Detection and management ofantiviral resistance for influenza viruses.

69―6Dec. 2016

Inﬂuenza Other Respir. Viruses 7 Suppl. 3: 18〜23, 201322）OKOMO-ADHIAMBO, M.; T. G. SHEU, L. V.
GUBAREVA: Assays for monitoring susceptibilityof inﬂuenza viruses to neuraminidase inhibitors.
Inﬂuenza Other Respir. Viruses 7 Suppl. 1: 44〜49, 2013
23）HATA, A.; R. AKASHI-UEDA, K. TAKAMATSU, etal.: Safety and efﬁcacy of peramivir for
inﬂuenza treatment. Drug Des. Devel. Ther. 8:
2017〜2038, 201424）KUREBAYASHI, Y.; T. TAKAHASHI, C. TAMOTO, etal.: High-efﬁciency capture of drug resistantinﬂuenza virus by live imaging of sialidase
activity. PLoS One 11: e0156400, 2016

High efﬁciency method of detection and isolation ofneuraminidase inhibitor resistant inﬂuenza viruses byﬂuorescence sialidase imaging
YUUKI KUREBAYASHI
Department of Biochemistry, School of Pharmaceutical Sciences,
University of Shizuoka
Inﬂuenza A and B viruses possess an enzyme “sialidase” that cleavages terminal sialic acidfrom glycochains. These viral sialidase proteins are highly expressed on the virus infected cells.
We developed sialidase imaging probe “BTP3-Neu5Ac” that enables histochemical ﬂuorescencestaining of sialidase activity. BTP3-Neu5Ac was able to perform speedy and easy ﬂuorescenceimaging of these virus infected cells, with no needs of speciﬁc antibody and cell ﬁxation. Inaddition, combination use of anti-influenza drugs（sialidase inhibitors）and BTP3-Neu5Ac
resulted in selective ﬂuorescence imaging for detection and high-efﬁciency isolation of drugresistant virus. Fluorescence imaging of drug-resistant virus will be a powerful method for studyof the drug-resistance mechanism, for monitoring of drug-resistant viruses. A novel tool for
ﬂuorescence imaging of viral sialidase activity is described in this review.