2018 JULY
No. 608

第 64 巻 第 3 号（通巻 608 号）
2018 年（平成 30 年）7 月

挨拶・巻頭言石崎良太郎先生の思い出.................................... 土屋耕太郎（ 2 ）発表論文紹介豚胸膜肺炎血清型 15 抗体検出系としての
ELISA の確立 ................ 手 島 香 保（ 3 ）論文紹介
鶏のカンピロバクターワクチンの可能性.................................. 古 澤 貴 章（ 6 ）レビュー
牛ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）の遺伝子多様性と遺伝子全長解析..................................長 井
誠（13）

お知らせ
研修者･見学者受け入れ状況 ........... （18）平成 30 年度定時評議会開催 .......... （19）

2（38）

日生研たより石崎良太郎先生の思い出
土屋耕太郎
30 年余りも前になりますが学生の頃、年に 1 度石崎良太郎先生が集中講義にいらしていました。失礼ながら講義の内容はよく覚えていないのですが、「ピペット 1 本持って世界中どこへでも行ける、ウイルスの培養ならどこへ行っても任せてもらえる。
」と豪語したり、
逆転写酵素発見の功績でノーベル医学賞を受賞したテミン博士の名刺を財布から取り出して学生に披露したりしていたことは今でも覚えています。講義ではいつも首を右左に振りながら「石崎ちぇんちぇいは云々」という口調でこの様なことを話していました。
その当時、私は微生物学研究室におりましたので講義終了後、研究室で先生のお話を伺った り、一 緒 に 会 食 し た り す る こ と が で き ま し た。そ の 折 に「こ れ か ら は Humanism とGeneralism が大事だ」と仰っていたことは今でも覚えております。この 2 つについて先生
は細かなことは仰らなかった（私が先生の話をきちんと聞いていなかった ?）ので今でも気になって思い出すのかもしれません。
「自分は○○主義者」と名乗ったところで本質が直ぐについてくるわけではないので、先生は「これからの人は Humanist たれ、Generalist たれ」と仰っていたのだと思います。
それでは、はて「Humanist たる」にはどうすればよいかなどと考えてみてもわからないのです。それでもなお愚考を弄してみると、例えば、批評家の小林秀雄が「パスカルが人間は考える葦であると言っているが、あれは、人間は弱いものだということを認めるように考えるのが正しい考え方で、人間は考える力があるから強くなれるというような考えは間違いである。パスカルはそう言っているのだ。
」とか「個性というものは一人で居ても現れない。
人と交わることで自ずと現れてくるものだ。」と言っており、このようなことも Humanist
たるための一つのヒントになるかなと思ったりします。一方、石崎先生が Humanist であったのは、一人ひとりをそれぞれ個人と認めて尊重し、グループの構成員というような十把一
絡げにはしないことだったのではなかったかと、この頃は感じています。
もう一方の「Generalist たる」ためにはどうしたらよいか。石崎先生のことを想ってみると、自分の携わっている仕事に真摯であること、その本質を常に追求していることでGeneralist に近づけるのではないかと思ったりします。先生は、何かに名前を付けるときはカッコいい名前がいいと仰って、その当時の御自身の研究室を「分子腫瘍学研究室」と命名されていました。常に時代の流れを掴むことを大事にしていらっしゃいました。研究室には新たな時代の仕事をする優秀な研究者を招聘して最先端の研究を進めながら、ご自身はウイルス培養を大事にされていました。自分の仕事をずっとやっていれば一生に一度は時代に遇う時期が来るものだとも仰っていました。いつも個々の感染症の本質は何かということを考
えていらした先生でした。日生研の主任研究員として毎月弊所の研究会にいらっしゃると、我々が報告する研究課題一つひとつに「今、報告した仕事のポイントとそれを取り巻く状況は○○である。以上 !」ということをいつもの調子で助言してくださいました。
上の研究会のような議論ではいつもニコニコと話される先生でしたが、いざ研究の突っ込
んだ部分の相談をすると、急に目をキラキラして厳しくなり、相談に付き合ってくれる先生でした。改めて石崎良太郎先生の御冥福をお祈りいたします。
（常務理事）

64（3）
，2018

3（39）

発表論文紹介豚胸膜肺炎血清型 15 抗体検出系としての ELISA の確立
手島香保
Application of an enzyme – linked immunosorbent assay for detection of antibodies to Actinobacillus
pleuropneumoniae serovar 15 in pig sera.
Teshima K et al.
J Vet Med Sci. 2017. 79（12）: 1968 – 1972.
法として重要な検査であると言える。血清型別特異要約

的な抗体検査法として、補体結合反応、スライド凝豚胸膜肺炎菌（A.pp）血清型 15 に対する抗体を集反応、ラテックス凝集反応および ELISA が広く検出する為に LPS 抽出抗原を用いた間接 ELISA を

用 い ら れ て い る。こ れ ら の 抗 体 検 査 法 の 中 で も作出しその有用性を評価した。作出した A.pp 血清

ELISA は、簡便でかつ感度や特異度が高く、近年粗型 15 特異的 ELISA（血清型 15 ELISA）の感度およ

加熱抽出物（CBE）、CPS および LPS を抗原としたび特異度を実験感染豚血清と非感染血清を用いて算ELISA が開発されている。

出し、ラテックス凝集法（LA）と比較した結果、日本において、血清型 2 の分離が最も多く、次い

LA より血清型 15 ELISA の方が感度及び特異度とで 血 清 型 1、5、15 が 多 い。こ の う ち A.pp 血 清 型

もに高値であった。野外豚血清を用いて、血清型

15 の感染例は愛知県、千葉県、愛媛県、福岡県、

15 ELISA の野外への応用を検証した結果、A.pp 血

北海道、香川県で報告されている。そのため、血清

清型 15 が豚から分離された発生農場由来の豚血清型 15 に対するワクチンや血清学的診断方法の開発は高い陽性率を示したのに対して、A.pp 非発生農が望まれている。近年、Biovet 社から血清型 3 – 6 –場由来の豚血清はいずれも陰性であった。これらの

8 – 15 型特異的な ELISA として、Swinecheck mix –結果から、作出した血清型 15 ELISA は野外におけ

APP ELISA が海外では市販されている。しかし日る A.pp 血清型 15 の浸潤調査に有用であることが示本では市販されていない。本研究では、A.pp 抗体

唆された。

価を測定する為に、血清型 15 の LPS を抗原とした
ELISA を作製した。この APP15 ELISA の感度及び特異度を調べる為に、実験感染した豚血清を用い、本文
豚胸膜肺炎菌（A.pp）は、豚に伝染性の肺炎を起こ

ラテックス凝集反応と比較した。更に野外血清への応用も調べた。

し、養豚産業に経済的損失を与える重要な細菌疾病

LPS は A.pp 血清型 15 の参照株である HS143 株として知られている。これまでに、15 の血清型が存からホットフェノール法で抽出した。簡単に説明す

在することが知られており、これらは、莢膜（CPS）

ると、菌体を 5mM EDTA 0.05％ sodium azide を含とリポ多糖（LPS）の O 抗原の抗原性、化学構造おむ 50 mM sodium phosphate buffer で懸濁し、リゾ

よび遺伝子構造の違いに基づき型別される。更に、チームを添加して 4℃ 1 晩反応させた。懸濁液に新たに抗原性や遺伝子構造が異なる血清型として血RNAse、DNAse、ProK を順々に添加した後、68℃

清型 16 が提唱された。これらの血清型によって病のフェノールを 50％（v/v）で混合して 30 分間反原性も異なると言われており、同血清型でも発生国応させ、ホットフェノール抽出を行った。抽出後、によって病原性が異なることも知られている。

30 分間氷上で冷却し、遠心分離した。上の水層を感染予防のためにワクチンが市販されているが、回収し、このフェノール抽出を 2 回繰り返した。2異なる血清型に対して十分な効果を示さない為、血回抽出し、遠心分離した水層の回収液は、フェノー

清型別にモニタリングができる抗体検査は生前診断

ルを除去する為に、4℃ 72 時間透析を行った。得ら4（40）

日生研たよりれた LPS は ELISA および LA の抗原として使用した。LPS の純度や抗原性は SDS – PAGE とイムノブ
ロット法で確認した。
0.9 μm polystyrene beads（ア イ カ 工 業）に LPSを付加させ LA 法を既出の方法を用いて実施した。
ELISA のプロトコールを簡単に述べる。Polysorp
イムノプレートに LPS 抗原（50 μl/well）をコート
し 4℃ 1 晩 反 応 さ せ た。プ レ ート は、0.05％
Tween20 PBS （PBST）で 1 回 洗 浄 後、1％ BSA
PBST（200 μl/well）で 25℃ 1 時間ブロッキングした。
1 回洗浄後、1％ BSA PBST で 100 倍希釈した豚血清（50 μl/well）を 37℃ 30 分反応させた。2 回洗浄後、10000 倍 に 希 釈 し た HRP 標 識 抗 豚 IgG 抗 体

図 1 血 清 型 1、2、3、5、6、7、8、11、15 の 実 験
感染血清および非感染血清を用いた ELISA の特異性の比較
各棒の高さは、豚血清の ELISA titer の平均値およびSD を示す。最も右側の 2 本の棒は、実験感染前の豚血
清（CT1）と、血清型 3、6、8、15 に感染していない野
外の豚血清（CT2）を示している。破線は、カットオフ
値を表している。カッコ内の数字は、陽性検体数 / 測
定した検体数を表している。

（50 μl/well） を 37℃ 30 分反応させた。2 回洗浄後、OPD 溶液（50 μl/well）を 30℃ 30 分発色させ、4.0
N H2SO4（50 μl/well）で発色停止した。プレート

為に、カットオフ値は 0.2 と設定した。
このカットオフ値に基づいて、血清型 3、6、8、

リーダーで吸光度（波長 490 – 650 nm）を測定した。 15 の感染血清 32 検体と非感染血清 111 検体を用い
ELISA 値（E 値）は、次式に基づいて算出した。
E 値＝（S – N）／（P – N）
P ：陽性血清の奇数列の OD 値 – 偶数列の OD 値て、ELISA と LA の特異度および感度を比較した結果、ELISA では、感染血清 32 検体中 29 検体が陽性であった。一方ラテックス凝集反応において、カッ（それぞれ 2 列の平均）

トオフ値である凝集抗体価 8 倍以上となった検体は、

N ：陰性血清について P と同様

32 検体中 24 検体であった。非感染血清 111 検体は、

S ：被検血清について P と同様

血清型 1、2、5、7、11 の実験感染血清、ワクチン

陰性血清には、A.pp 非感染農場から導入した豚

免疫野外血清（使用ワクチン；グレーサー、豚丹毒、から採取した血清を、陽性血清には、A.pp 非感染

プラズマ肺炎）であり、いずれも陰性であった。こ農場から導入し、A.pp 血清型 15 HS143 株を実験感のことから、感度は ELISA の方が LA より高く、特染させた豚から採取した血清を用いた。陰性血清の異度はいずれも 100％と同等であることが示された。

OD 値は、0.00 から 0.07 の間を示し、陽性血清の（表 1）また、血清型 3、6、8、15 の実験感染血清

OD 値はおよそ 1.0 を示した。

32 検体、血清型 1、2、5、7、11 の実験感染血清 31

カットオフを決定する為に、血清型 15 と共通の検体、感染前の SPF 豚血清 40 検体、血清型 3、6、8、LPS の O 抗原をもつ血清型 3、6、8 をそれぞれ気15 の発生がない野外農場の豚血清 40 検体を用いて、管内投与し実験感染させた豚血清 32 検体、血清型 1、 LA と ELISA の相関を調べた結果、R2＝0.94 と高い
2、5、7、11 をそれぞれ気管内投与し実験感染させ相関を示した。
（図 2）

た豚血清 31 検体、感染前の SPF 豚血清 40 検体、野外への応用を検証する為に、A.pp 血清型 15 が血清型 3、6、8、15 感染のない野外農場の豚血清分 離 さ れ た A.pp 発 生 2 農 場 の 豚 血 清 454 検 体 と40 検体を測定し、カットオフを設定した。
（図 1）

A.pp 非発生農場の豚血清 215 検体を用いて、陽性また、野外への応用を調べる為に、血清型 15 発生率を調べたところ、発生農場は 50.9％（A）、88.7％

農 場 A と B と、A.pp の 発 生 が な い 農 場 の 豚 血 清（B）に対して、非発生農場は 0％であった。また陽454 検体を用いた。

性検体のうち、発生年前の検体が、47.2％（A）おその結果、血清型 3、6、8、15 の発生がない農場

よび 82.9％（B）と高い割合で検出された。
（表 2）の豚血清 111 検体の平均値＋ 3SD を算出したとこ型別 ELISA として、これまで CBE、CPS およびろ、0.14 であった。しかし、2 検体において 0.15、LC – LPS 抗原を用いた ELISA が報告されている。

0.17 を示したことから、より高い特異性を担保する

CPS 抗原は高い特異性を示すが、CPS の作製には、

64（3），2018

5（41）

多くの時間とコストがかかり、工程も煩雑である。

作 製 し た ELISA を、そ の 他 の 血 清 学 的 診 断 法

LC – LPS 抗原は、CBE 抗原よりもより感度および（チューブ凝集反応法、寒天ゲル内沈降反応、補体特異度が高いことが知られている。血清型 15 の結合反応）よりも特異度および感度が高いとされて

LC – LPS と short O – chain は、血清型 3、6、8 およいる、LA 法と比較し評価した。その結果、血清型

び 15 を実験感染させた豚血清に反応するが、血清

15 の LPS を抗原とした ELISA と LA は、血清型 15型 1、2、5、7、11 を実験感染させた豚血清には反の抗体だけでなく、血清型 3、6、8 の抗体も検出し応せず、今回の結果は Perry らの既報とも一致してた。一方血清型 1、2、5、7、11 の抗体とは交差反いた。

応しなかった。また、今回感染 7 日後に陽転し、陽また、血清型 3、8、15 の O 側鎖多糖の化学的構性率は、LA 法では 75％、ELISA 法では 91％であっ造は同じだが、血清型 6 は、その他と比べて少々異た。二つの測定法には高い相関が認められたが、こなることが報告されている。過去には、血清型 2、6、 のうち 5 検体は結果が一致しなかった。すなわち、12 の LC – LPS を 抗 原 と し た 間 接 MIX – ELISA に

血清型 3（n＝1）、血清型 6（n＝1）
、血清型 8（n＝よって、血清型 8 の抗体価が検出されることが報告

1）、血清型 15（n＝2）を感染させた 5 検体は、LAされている。しかし、血清型 3、8、15 と 6 の O 側では陰性であったが、ELISA では陽性であった。こ鎖多糖の化学的構造には違いがあることから、報告されている、血清型 6 を用いた ELISA よりも、血清型 15 の LC – LPS と O 側鎖多糖を含む抗原を用いた、今回の APP15ELISA は、血清型 15 の抗体価の検出系として適していると考えられる。更にこれ
らの抗原は、既出の方法より少ない工程で大量に抽出することが可能であった。我々の試験において、
表 1 ELISA と LA の感度、特異度、的中率の比
ELISA result

LA result

Positive

Negative

Positive

Negative

Sera from pigs experimentally
infecte with A . pleuropneumoniae
serovars 3, 6, 8 and 15

29

3

24

8

Sera from pigs not infected with A.
pleuropneumoniae serovars 3, 6,
8 and 15

0

111

0

111

Sensitivity
（％）

91

75

Speciﬁcity
（％）

100

100

Positive predictive value
（％）

100

100

Negative predictive value（％）

97

93

表2

図 2 ELISA と LA の相関
App に 非 感 染 血 清 80 検 体、App 血 清 型 1、2、5、7および 11 の感染血清 31 検体、および App 血清型 3、6、8 および 15 の感染血清 32 検体を用いて、ELISAと LA の相関を調べた。回帰直線（R‑squared value＝0.94）は、「y（ELISA titer）＝0.2081×log2（LA titer）＋
0.1812」を示し、ELISA と LA は高い相関を示した。
両法には、lysozyme‑phenol–water 法によって抽出された血清型 15 の LPS が使用された。

ELISA によるA.pp 血清型15 感染農場における感染抗体の検出

Number of pigs tested
Farms
Number of positive pigs
The time of sample collection（Sows＋Growing pigsa）） （Sows＋Growing pigs）（Number of farms）

Positive（％）

Mean ELISA titerin pigs tested

SDb）

Aﬀected（2）A

B

During the occurrence of thedisease（2013）34（16＋18）

20（8＋12）

58.8

0.39

0.13

During the occurrence of thedisease（2004‑2012）

72（48＋24）

34（24＋10）

47.2

0.26

0.19

Total

106（64＋42）

54（32＋22）

50.9

0.36

0.28

During the occurrence of thedisease（6/2015‑9/2015）

63（23＋40）

60（22＋38）

95.2

0.64

0.41

During the occurrence of thedisease（2010‑5/2015）

70（9＋61）58（9＋49）

82.9

0.66

0.35

133（32＋101）

118（31＋87）

88.7

0.66

0.36

215

0

0

0.03

0.03

Total
Free（12）a）Growing pigs in Farm A and Farm B were 4‑5 and 6 months of age, respectively.
b）SD, standerd deviation.

6（42）

日生研たよりの結果は、LA 法では感染 7 日後は早い段階である

陽性率を示した。これら知見によって、Morioka A

為に検出できなかったと説明しうるかもしれない。

らの報告（2008）や Shimazaki Y らの報告（2016）

更に、血清型 15 を低濃度感染させた豚の血清 3 検と同様に、血清型 15 が同定される前から、血清型

体は、ELISA と LA において共に陰性であった。こ15 による感染は存在していたことが示唆された。

れらの 3 頭は、臨床症状や典型的な肺病変を呈さな

また、今回の ELISA を用いて A. suis の感染血清とかった。これらの豚は症状を誘発するよりも低い濃の交差反応について明らかにしなかった。LPS の度で投与したため、感染しないまま抗体価も検出でlipd – A の抗原エピトープや構造の類似性を除いて、きなかったかもしれない。この他にも、菌の病原性、 CPS や LPS の抗原エピトープや構造は、A. suis と攻撃菌濃度、宿主側の細胞性免疫や液性免疫の反応

A. pleuropneumoniae では異なることが知られていの違いが要因となって、発症や抗体の陽転といったる。これらの報告により、A. suis に対する感染抗体

結果が異なってくる。

は、A. pleurneumoniae の LPS の lipid – A に は 反 応

今回の結果から、作出した AP15LPS ELISA は、

するが、lipid A 以外の CPS や LPS には反応しない

血清型 3、6、8 および 15 の感染血清中抗体の検出ことが示唆された。我々の過去の報告では、リゾに有効であり、もしかすると A.pp 血清型 15 の成分

チーム処理後、フェノール抽出した LPS 中に、LPSを含むワクチンの免疫血清中抗体の検出にも有効かの core – lipidA に関連する低分子物質は認められなもしれないことが示唆された。これまで、血清型 3、 かった。我々の方法では主に血清型 15 の LPS O –6、8 および 15 の感染血清中の抗体を型別できる検chain が抽出され、この LPS 抗原を用いた ELISA は、

査法は開発されていない。従って、ELISA で陽性で血清型 15 に対する抗体検出の為に高い特異性およあった場合、どの血清型に感染しているか確定診断

び感度を保持しうるであろう。

する為には、菌分離を行い、型別検査を実施しなけ

結論として、血清型 15 の LPS を抗原とした間接

ればならない。幸いなことに、A.pp 血清型 3、6、8

ELISA は、最適な感度と高い特異性を示し、野外には日本ではほとんど分離されず、一方血清型 15 はおける A.pp 血清型 15 のサーベイランスにとって有2003 年から日本各地で分離報告がある。

用な手法となりうることが示唆された。

今回の ELISA を A.pp 血清型 15 感染農場および非感染農場の野外血清に応用した結果、感染農場で参考文献は割愛させていただきます。

は高い陽性率を示した一方、非感染農場では示さなかった。更に加えて、A.pp 血清型 15 感染農場にお本 稿 は J Vet Med Sci. 2017. 79（12）: 1968 – 1972.

いて発生前に遡って調査した所、2004 年から高いに掲載された論文を編集・日本語訳したものである。

論文紹介

鶏のカンピロバクターワクチンの可能性
古澤貴章
Reducing Campylobacter jejuni Colonization of Poultry via Vaccination.
Jason M. Neal – McKinney, Derrick R. Samuelson, et al.
PLoS ONE 9（12）: e114254. doi : 10.1371/journal.pone. 0114254（Dec. 4. 2014）
も例にもれず問題になっており、毎年 300 〜 400 件
論文紹介の意図ほど発生しノロウイルスに続き 2 番目に多い食中毒

現在、カンピロバクターによる胃腸炎は先進国、の原因微生物です。また、農場や食鳥処理場で分離

後進国問わず世界中で問題になっています。我が国されたカンピロバクターは近年薬剤耐性化が進んで

64（3）
，2018

7（43）

います。カンピロバクターは鶏に症状が現われずに一般的に検出され、下痢症状で毎年 4 億〜 5 億件に定着していることから対策が難しく、未だ世界でそ上 る。ア メ リ カ で の Campylobacter jejuni（C.

のワクチンは販売されていません。子供や高齢者、

jejuni）の感染は一年で 240 万〜 400 万件発生して免疫不全患者などでは重症化することもあるため一いると見積もられている。2013 年のアメリカでは刻も早いワクチンの開発が望まれている感染症の一カンピロバクター症の発生は国民 10 万人当たり

つです。このような現状でカンピロバクターに対す

13.82 件発生していたが、実際の感染者の数はよりるワクチンの可能性を示した下記の論文を紹介しま

多い可能性がある。

す。原文は PLoS ONE からダウンロードすることが（ h t t p : / / w w w. c d c . g o v / f o o d n e t / d a t a / t r e n d s /できるので興味を持たれた方は、原文も参考にしてtables/2013/table2a-b.html#table-2b）ください。

C. jejuni 感染症は欧州連合（EU）でも最も一般的な人獣共通感染症であり、2008 年から 2012 年の5 年間で顕著な増加傾向がみられている。2012 年の要約

EU の報告によると 10 万人あたり 55.49 件に上るとCampylobacter jejuni は世界中で人の胃腸疾患のいう。急性の胃腸炎に加えて、特定の C. jejuni 株

主要な原因の一つである。C. jejuni は鶏の常在菌でに感染するとギラン・バレー症候群（GBS）の発症ある一方、症例研究によって、C. jejuni の感染と未の可能性が高まる。末梢神経系に影響する自己免疫

調理品や生焼けの鶏肉と交差汚染した食品の摂食の疾患である GBS はポストポリオ時代における弛緩

関係が明らかになっている。筆者らは鶏に C. jejuni

性麻痺の主要な原因になっている。現在、急性の C.

の表面暴露定着蛋白（surface – exposed colonization

jejuni 感染症と GBS の治療に関連するコストはア

proteins ; SECP）を免疫することで C. jejuni の鶏へ

メリカでは一年で 12 億ドル、EU では 24 億ユーロの定着能力を低下させ、小売店レベルでの鶏肉製品と見積もられている。

の汚染を減らし、消費者に安全な食品を提供できる

C. jejuni は鶏に盲腸内容物 1 g に対して 108 コロ

可能性があると仮定した。この仮説を確かめるためニー形成単位（CFU）かそれ以上の密度で病気を起に C. jejuni のたんぱく質である CadF、FlaA、FlpA、 こすことなく定着している。C. jejuni は鶏舎の数羽
CmeC、お よ び CadF – FlaA – FlpA の 融 合 蛋 白 を 発に定着したのち、鶏舎全体に急速に蔓延するうえ、

現し鶏に投与した。攻撃から 7 日後に鶏を安楽殺し、鶏の生涯を通して存在し続ける。部位や季節にもよ

盲腸内容物を段階希釈し平板上で培養して材料 1 g

るが、驚くことにアメリカ国内の鶏肉の 90％以上が当たりの C. jejuni の菌数を決定した。免疫血清は販売の時点で C. jejuni に汚染されている。その対策

C. jejuni の SECP に対する抗体の濃度と特異性を決として C. jejuni の量を減らす方法が、鶏の C. jejuni

定して解析した。鶏への CadF、FlaA、および FlpA

暴露阻止や、定着した C. jejuni を減らす処置、食鳥

蛋白の免疫によって盲腸内の C. jejuni の数がコント

処理場での汚染減少、肉製品の表面からの C. jejuni

ロール群と比較して少なくなった。最も C. jejuni の除去などすべての生産段階で開発されつつある。量

定着の減少が大きかったものは FlaA、FlpA または的リスクアセスメントによると鶏の腸管内の C.

CadF – FlaA – FlpA の融合蛋白を投与した鶏で見られ

jejuni を 1000 分の 1 まで減らすか、と体表面の菌数た。様々な SECP を鶏に投与することで C. jejuni 特を 100 分の 1 まで減らすことができれば公衆衛生リ

異的 IgY 抗体が産生された。まとめると、筆者らはスクを 90％減らすことができると見積もられている。

C. jejuni が 保 有 す る 個 々 の SECP や 組 み 合 わ せ た

C. jejuni の保菌鶏を減らすための戦略としては以SECP を鶏に免疫することで鶏への C. jejuni 定着を阻

下の 4 つが考えられている：1）抗 C. jejuni 活性を止することができる、ということを示した。

持つ化合物の投与；2）C. jejuni と競合関係にある菌や抑制物質を産生する菌を使用したプロバイオ
ティクス；3）C. jejuni 特異的なバクテリオファー

背景
Campylobacter 属は世界中の細菌性胃腸炎で最もジ の 応 用；4）鶏 へ の C. jejuni 抗 原 の ワ ク チ ネ ーション。本研究で、筆者らは C. jejuni が保有する

8（44）

日生研たよりた ん ぱ く 質 の ワ ク チ ネ ーシ ョン を 介 し て 鶏 の C.

）、
CadF（Campylobacter adhesion to ﬁbronectin（Fn）

jejuni 定着を減少させるという戦略を描いている。

FlpA（Fibronectin – like protein A）お よ び CapA

鶏の C. jejuni に対抗するために様々なワクチネー（Campylobacter adhesion protein A）を 含 む。ア ドション戦略が現在開発されている。不活化全菌体経

ヘジンに加えて、細菌の運動性も動物への定着の面

口ワクチンでは定着を中程度の減少という結果にで重要な役割を果たす。C. jejuni の運動性を最大にす至った一方で、組み換え CmeC の経口投与では血るには FlaA（メジャー）と FlaB（マイナー）の線維

清の抗体反応を引き起こしたが C. jejuni 定着阻止性たんぱく質を必要とする。最後に、CmeC や主要外には至らなかった。一部の研究では CjaA、CjaD ま

膜蛋白（PorA）などの膜関連蛋白が存在し、鶏の腸管

たは Dps を弱毒したサルモネラに組み込んだ生ワ

内での生存性に関する機能に関与するかもしれない。

クチンとしての使用の有効性が示されている。弱毒

本研究で使用されたこれらのたんぱく質（CadF、化したアイメリア属寄生虫は CjaA 抗原を運ぶもう

FlpA、FlaA および CmeC）は以下の基準に 1 つ以

一つの手段である。Annamalai らは C. jejuni の外膜

上当てはまるものが選抜された：1）C. jejuni の鶏蛋白を封入したナノ粒子の投与によって鶏への定着への定着にかかわる（細菌の運動性、細胞への付着、が減少することを十分に証明した。鶏卵から得た栄養の獲得に必要など）；2）外界にエピトープが曝

C. jejuni 特異的 IgY 抗体を受動免疫として投与するされていると予測され、抗体が細菌表面のたんぱく方法も現在調査されている。C. jejuni の定着を効果質に結合し、定着に不可欠な段階を阻止する可能性的に抑制する抗原や投与形態の決定に関してはまだがある（腸管の細胞への結合や運動性など）；3）移研究の余地がある。

行抗体が産生されることによって示されるように、ここ数年で鶏に対する C. jejuni 定着に関する理

自然な定着の流れで免疫反応が刺激される。以前の解がかなり深まっている。孵化後 3 〜 4 日は移行抗研究によると、CadF と FlpA は C. jejuni の定着を

体のレベルが高く保たれ、2 〜 3 週間かけて徐々に大きく減少させる可能性が報告された。これら 2 種

検出限界以下まで減少していくことが知られている。 類のフィブロネクチン結合たんぱく質は上記の基準
従って、鶏への C. jejuni の定着は特異的な抗体のを 3 つとも満たし、C. jejuni による腸管の培養細胞減少（消失）と同時に起こる。鶏が C. jejuni に暴への結合を促進することが知られている。FlaA も 3

露される前までに抗 C. jejuni 抗体を産生すること

つの基準を満たすため、同様に優先度の高いターが C. jejuni の定着能力を減少させるに至るというゲ ット だ と 考 え ら れ て い る。C. jejuni の 鞭 毛 はことが分かっている。筆者らは防御効果のある移行

FlaA と FlaB と呼ばれる 2 種類のたんぱく質で構成抗体を作らせる C. jejuni のたんぱく質を同定してされている。FlaA は鞭毛線維の主要な構成成分で、いる。具体的には、C. jejuni のアドヘジン（CadF、細菌の運動性に必要とされている。CmeC は多剤排FlpA な ど）や 鞭 毛 蛋 白（FlaA、FlaB な ど）
、膜 関

出 シ ス テ ム（CmeABC）の 構 成 成 分 で あ る。

連蛋白に対する抗体を筆者らは新たに孵化した幼鶏

CmeABC 排出システムはデオキシコール酸耐性にの血清から検出した。カンピロバクター特異抗体を関与し、鶏への定着を可能にしている。

産生させることで鶏の C. jejuni 定着を減少、さらには阻止できる可能性がある。

本研究の目標は鶏の消化管内の C. jejuni 量の減少における C. jejuni の SECP ワクチネーションの

C. jejuni の鶏への定着が促進されるたんぱく質の有効性を評価することだった。筆者らはターゲット同定によって大きな進歩がなされた。C. jejuni の表として鶏への十分な定着に必要で、C. jejuni 株間で

面 暴 露 定 着 蛋 白（surface – exposed colonization

よく保存されており、細菌表面に存在する CadF、proteins ; SECP）として鶏への定着に寄与する表面

FlpA、FlaA および CmeC を選出した。筆者らの中に曝されたたんぱく質に言及する。これらのたんぱ

心となる仮説は鶏の腸管内の C. jejuni の総数を減

く質は宿主細胞への付着（アドヘジン）、運動性、少させることによって人への感染リスクを減少させ

宿主腸管での生存性などの役割を果たすたんぱく質

るだろう、ということである。

のグループに細分化することができる。C. jejuni のアドヘジンは細菌体内で恒常的に合成されているが、材料・方法については割愛させていただきます。

64（3）
，2018

9（45）

全長のペプチドを使用した。その結果、（GST を含
成績まない）90 アミノ酸残基の断片に対して特異的な

C. jejuni 組み換え抗原の選抜と確認

反応になった。今回使用した 90 アミノ酸残基の部

この試験系のデザインの根拠は C. jejuni の SECP

分は表面に存在している（親水性付与など）と推定に内包される目的の部分を 30 アミノ酸残基以内にされ、C. jejuni 間で保存されており、たんぱく質の狭めることと様々なたんぱく質の断片を組み合わせ機能にその配列が必要であるということに基づいてることで個々の SECP を投与するのと比べて防御効

選抜された。

果（C. jejuni 定着減少など）が強まるかどうかを試注目すべきことは CadF と FlpA を構成する 30 ア

験することだった。筆者らは CadF、FlaA、FlpA のミノ酸残基が C. jejuni NCTC 11168 株がコードする

外界に面していて免疫原性があり、防御効果（たんCadF および FlpA と一致していることである。対ぱく質の機能に必要であるなど）が最も期待できる

照的に FlaA を構成する 30 アミノ酸残基は多数の｢ 目的の部分 ｣ を明確にした。筆者らの戦略は GST

C. jejuni から得られた配列と一致していた。図 1 で

タ グ 結 合 90 残 基 と CadF、FlaA、FlpA、CmeC のは 24 株の C. jejuni および 2 株の C. coli から得られ

His タグ結合全長蛋白（シグナルペプチドを削った

た FlaA 蛋白の一致した配列が示されている。重要もの）の両方を作成することを含む（図 1）。3 つのなことに、FlaA の一致した配列には調べたすべて

30 アミノ酸残基で構成された trifecta（CadF – FlaAの C. jejuni の FlaA の 配 列 に 存 在 す る 一 連 の エ ピ– FlpA）は GST タグ結合蛋白としてのみ発現させた。 トープが含まれる。
異なる 2 種類のペプチドを使用した根拠は最初の精製した CadF、FlaA、FlpA、CmeC の GST タグ

GST タグ結合 90 アミノ酸残基の投与で使用するた

結合 90 アミノ酸残基と His タグ結合全長蛋白（シんぱく質の特異的な部分に対して免疫反応が引き起

グナルペプチドなし）の SDS – PAGE 解析が図 2 にこされるということである。ブースト投与では免疫示 さ れ て い る。図 2 に は 精 製 し た GST タ グ 結 合反応の強化に 26 kDa の GST タグを含まないように

CadF – FlaA – FlpA の trifecta 蛋白も示されている。
CadF の 90 アミノ酸残基のペプチドには FRLS ドメ

1 19 55144319

全長＋6X HIS
GST＋90残基
Trifecta用30残基

CadF

156

127
1 31

FRLS

203

572

292

278

307

とされている。FlaA の 90 アミノ酸残基のペプチドは表面に存在すると推定され、フラジェリンの D2
ドメインと D3 ドメインの間に位置することから選

FlaA
D2/D3

インが含まれ、 フィブロネクチンへの結合に必要D2/D3抜された。FlpA の 90 アミノ酸残基のペプチドには

INAVKDTTGVRASIDANGQLVLTSADGRGI

1 27

231

142

フ ィブ ロ ネ ク チ ン で 認 め ら れ る Type III repeat

411

FlpA

（WRPHPDFRV 残基）があり、これはフィブロネク
170

チンとの結合に必要とされる。CmeC の 90 アミノ

WRPHPDFRV

50
37

CadF+HIS

FlpA+HIS

kDa
75

FlaA+HISkDa

CmeC+HIS

ワクチンのターゲットとする C. jejuni のたんぱ
く質のドメインHis タグ結合ペプチドで使われた部分を明るいグレー
で、GST タグ結合 90 残基で使われた部分を濃いグレー
で、trifecta ペプチドを構成する 30 残基を黒で示した。
シグナルペプチド（CadF、FlpA、CmeC）または 3 型
分泌系（FlaA）の部分は His タグ結合ペプチドからは削られており、白で示されている。CadF と FlpA の図の下の矢頭はフィブロネクチンへの結合に必要なアミノ酸残基を示している。FlaA の図の箱は下に示された配列に基づいて FlaA30 残基ペプチドを設計するのに選ばれた部分を示す。この領域は FlaA の D2 およびD3 ドメインの間にあり、元のたんぱく質では外界に面すると予測されている。CmeC の 90 残基の部分は親水性領域にあり、外界に面すると予測されている。
図1

Trifecta+GST

492

CadF90残基+GST

289

FlpA90残基+GST

200

FlaA90残基+GST

1 24
CmeC

CmeC90残基+GST

141

50
37

25
25
図 2 精製された GST タグおよび His タグ結合蛋白
精製された蛋白抽出物は 12.5％のポリアクリルアミド
ゲルで分離されクーマシーブリリアントブルーで染色された。

10（46）日生研たより酸残基のペプチドは細胞外環境に曝露されているとし く は 80 μg ず つ の CadF – His、FlaA – His、FlpA –推定され親水性の付与に関連している。

His、CmeC – His を混合した 240 μg のブースト投与

C. jejuni の組み換え蛋白の防御効果が行われた。2 グループの非ワクチン群の鶏はコン

鶏へのワクチン投与実験のデザインは図 3 に示さトロール群（1 グループが非攻撃コントロール群、れている。1 日齢のひなを 7 つのグループに分け、もう一方が攻撃コントロール群）として扱った。20

アイソレータに導入した。6 日齢のときに 240 μg の

日齢で 2 × 108 CFU の C. jejuni F38011 株（野生株）

GST タグ結合 90 残基ペプチド（GST – CadF、GSTの経口投与を実施した。1 週間後（27 日齢）にひな– FlaA、GST – FlpA、GST – CmeC）お よ び GST –を剖検し、盲腸と血液を採取して解析した。

trifecta を 投 与 し た。16 日 齢 で 240 μg の 全 長 のC. jejuni 攻撃 / 非ワクチン群の C. jejuni 定着の中CadF – His、FlaA – His、FlpA – His、CmeC – His も。trifecta ワ
央 値 5.35 × 107 CFU/g だ っ た（図 4A）
クチン群では C. jejuni 定着は有意に減少し、7/9 羽

1

2

3

4

5

6

7

のみに定着し、その中央値は 4 × 104CFU/g だった。

非投与

非投与

CadF

FlaA

FlpA

Trifecta

CmeC

FlaA ワ ク チ ン 群 と FlpA ワ ク チ ン 群 も 同 様 に C.
jejuni が定着した鶏が減少した（それぞれ 11/12 羽

6日齢：免疫（90残基）

240µg

および 9/10 羽）。FlaA ワクチン群および FlpA ワク
チン群の菌数の中央値はそれぞれ 2.55 × 104 CFU/

240µg

g および 4.5 × 104 CFU/g だった。興味深いことに、

16日齢：ブースト（全長）CadF ワクチン群では全羽で C. jejuni の定着が確認されたが菌数は 1.1 × 106 CFU/g に減少していた。

820日齢：C. jejuni 攻撃（2×10 CFU）

CmeC ワクチン群では菌数に大きな幅がみられ、中27日齢：剖検（盲腸・血液）

央値はほんのわずかな減少を示した。

有意な抗体反応が示された（図 4B）。2 つの 95％信頼区間は 2 グループのコントロール群に基づいて確立された。攻撃コントロール群と比較してすべての

1.0
0.5
0.0
CmeC

CmeC

C.Jejuni 攻撃

1.5

Trifecta

Trifecta

FlaA

12/12

CadF

7/9

非投与

コロニー形成数 0/11 12/12 11/11 11/12 9/10

非投与

FlpA

103
非検出

2.0

FlpA

104

2.5

FlaA

107
106
105

B

CadF

109
108
CFU/g

ントール群と比較して攻撃コントロール群において

非投与

1010

図4

C. jejuni WCL に対する ELISA によって非攻撃コ

WCS反応性（450nm吸光値）

A

C. jejuni 菌体蛋白に対する抗体反応

非投与

図 3 鶏のワクチン投与試験のスケジュール
最初のペプチドの投与（GST‑CadF、GST‑FlaA、GST‑
FlpA、GST‑CmeC お よ び CadF‑FlaA‑FlpA の GST‑
trifecta）は 240 µg で行った。ブースト投与は 240 µgの CadF‑His、FlpA‑His、GST‑FlaA、GST‑CmeC、
CadF‑FlaA‑FlpA の GST‑trifecta で行った。グループ
1 および 2 は C. jejuni の SECP は投与しなかった。グ
ル ー プ 2 か ら 7 の 鶏 に は 20 日 に 2 × 108CFU の C.
jejuni を投与した。27 日齢で剖検を行った。

C.Jejuni 攻撃

CadF、FlaA、FlpA および trifecta ペプチドのワクチンによって C. jejuni の定着が減少した。A：C. jejuni の
CFU は盲腸内容物の希釈系列を作成し、Campy‑Cefex 培地を用いてカウントした。それぞれのグループで中央値と四分位範囲が示されている。B：剖検時に採取した血液から血清を分離し、C. jejuni の全菌体可溶化液でコートしたマイクロタイタープレートを用いて ELISA を実施した。各ウェルに吸着した IgY を HRP 標
識ウサギ抗ニワトリ IgY 抗体で検出した。非ワクチン・非感染コントロール群（実線）および非ワクチン・
攻撃コントロール群（破線）の血清の反応のレベルから 95％信頼区間を算出した。

64（3），201811（47）

ワクチン群で有意に血清の反応が増加した。FlaA

クチン群の鶏は抗 C. jejuni 抗体を産生したが、こワクチン群は SECP ワクチン群の血清の反応の中でれらの抗体は C. jejuni 定着を阻止または減少させ一番低かった。血清の反応は鶏の定着のレベルと正ることはなかった。対照的に事前に C. jejuni の抗確には一致しなかった。

体を産生させた鶏では定着を減少または阻止するこ観察された抗体反応がワクチンに使用した抗原特と が で き た。筆者 ら は FlaA 鞭 毛 蛋 白 だ け で な く

異的なのかを確かめるために、CadF、FlaA、FlpA

CadF や FlpA ア ド ヘ ジ ン の 割 合 が 鶏 に お け る C.

および trifecta を投与した鶏の血清を用いてイムノ

jejuni 定着に対して防御効果のある免疫反応を引きブロットを行った。CmeC は試験には含まれていな

起こすのに影響を与えるということに気が付いた。

い。これは CmeC 投与が C. jejuni 定着減少を起こ

FlpA お よ び FlpA を 含 む trifecta の ペ プ チ ド は C.

さなかったからである。C. jejuni の野生株および変jejuni の攻撃に対して強い防御効果を示した。これ

異株の WCL に対して鶏の血清を調べたところ、は ﬂpA 変異株の C. jejuni が鶏に定着できないこと

CadF 投与群の 7/11 羽の血清は C. jejuni 野生株のから驚くことではない。FlpA がフィブロネクチン

WCL に 対 し て 反 応 し た が、cadF/ﬂpA 変 異 体 のに結合するのに必要な残基は外表面に位置していて、WCL に対して反応しなかった。対照的に FlpA 投抗 FlpA 抗体によって C. jejuni がフィブロネクチン

与群の中で 1 羽のみが FlpA に対して特異的には反に結合するのを減少させることができる。重要なこ応しなかった。面白いことに、筆者らは FlaA 投与とに、FlpA のたんぱく質は調査された C. jejuni す

群の血清からは C. jejuni 野生株の WCL における

べてにおいて 100％保存されていた。これは広い範FlaA に対して特異的な反応を検出できなかった。

囲の C. jejuni の分離株に対してこのたんぱく質が特異性を増加させる試みにおいて、FlaA 投与群の防御効果のある免疫を引き起こすのに利用できると血清を外膜抽出物及び FlaA – GST ペプチドに対しいうことを示している。trifecta 投与群の鶏の血清て試験を行った。trifecta 投与群のすべての血清では FlpA に最も強く反応した。それどころか、イム

FlpA に対して非常に強い反応を示したが、CadF お

ノブロット法では CadF や FlaA に対する反応を検よび FlaA の分子量のたんぱく質には反応を示さな出することができなかった。CmeC を投与した鶏でかった。まとめると、これらのデータは FlpA によは C. jejuni 攻撃後の定着を防ぐことはほとんどでるワクチネーションが最も特異的な抗体反応を引ききなかった。CmeC に対する抗体はたんぱく質の機起こすということを示している。

能を阻害しない可能性がある。FlaA、FlpA およびtrifecta 投与群で同程度の防御効果が観察されたことを踏まえ、エピトープの組み合わせがワクチン戦考察

略の効果を強めるかどうかを確かめるためにさらな

C. jejuni 研究者の目標は人での感染症発生減少とる研究が必要とされる。エピトープの組み合わせは、

安全な食物の提供を保証することである。鶏肉製品

遺伝に多様な SECP を産生する広範囲の C. jejuniの処理中の交差汚染やキッチンでの鶏肉と生ものの分離株に対して防御効果をもたらすかもしれない。

交差汚染のレベルは鶏の盲腸内の C. jejuni の量と鶏での C. jejuni 定着が減少することは SECP ワク

関連している。C. jejuni 感染の可能性は曝露量に相チン投与の予備実験で観察されていた。

関し、わずか 500 個の菌で病気を発生させる。それ筆者らは C. jejuni の WCL の FlaA に対して特異ゆえ、鶏から食品へ移行する C. jejuni の数を減ら的な抗体を検出することができなかった。対照的にすことによって人での感染症の発生を減らすことがELISA では FlaA ワクチン投与によって C. jejuni のできるはずである。本論文中に説明したワクチン戦

WCL に対する抗体の産生を引き起こしたことが示略は結果として C. jejuni 定着のレベルにおいて 2された。より具体的に言うと、精製された FlaA –log10 を超える減少に至った。リスク分析研究によ

GST に対して反応性が観察された。これは、ワク

ると、この定着の減少は公衆衛生的なリスクを減らチン投与で使用されたペプチドに特異的な免疫反応

すのに十分である。

が引き起こされたことを示す。この明確な矛盾を説

本研究では高レベルの C. jejuni を投与した非ワ明できる可能性としては 2 つの試験における FlaA

12（48）日生研たよりたんぱく質のコンフォーメーションが異なるというレスレベル、温度、湿度、初めて C. jejuni に曝露ことである。にもかかわらず FlaA ワクチン投与にされた日齢などが異なるということがある。さらに、

よって C. jejuni の定着は減少するに至った。

本研究の成績は工業的な鶏の処理の間に発生する交本研究の限界としては鶏に投与された C. jejuni

差汚染の影響を反映していない。今後の研究では生が単一の株でしか攻撃試験をしていないことである。 産環境でのこのワクチン投与方法の効果を調べる必したがって、今回のワクチンは別のペプチド配列を持つ C. jejuni に対して有効でない可能性がある。

要がある。
筆者らは 4 種類の SECP 、すなわち CadF、FlaA、

CadF および FlpA のアミノ酸配列は筆者らが試験

FlpA、CmeC お よ び 組 み 換 え CadF – FlaA – FlpA ペ

した全ての C. jejuni 株間で一致していたが、FlaA

プチドが C. jejuni に対する獲得免疫の反応を引きおよび CmeC には様々な配列が含まれていた。こ起こすか、および鶏への定着を減少させるかどうかのワクチン戦略の有効性は C. jejuni 分離株の多様を評価した。CadF、FlaA および FlpA を個々に投性を利用して広範囲な防御効果を示すペプチドを同

与 す る と C. jejuni の 定 着 を 減 少 さ せ た 一 方 で、定する必要があるだろう。

CadF – FlaA – FlpA の trifecta のペプチドは最も強く本研究で利用したワクチン戦略における重要な懸防御効果を示した。イムノブロット解析によると、

念は筋肉内投与によって抗原を輸送したため、強い個々のペプチドとして、および CadF – FlaA – FlpA

IgY 反応が引き起こされたことである。しかしながの trifecta ペプチドとしての両面で FlpA ペプチド

ら、C. jejuni は鶏の消化管内にのみ局在するため、が最も強力で特異的な抗体反応を引き起こした。加

粘膜の抗体だけが C. jejuni に到達して中和するこ

えて、FlpA ペプチドの 30 アミノ酸残基はエピトーとができるはずである。筆者らのワクチンの輸送方

プを中和するのに十分な抗体反応を引き起こした。

法によって C. jejuni の定着減少に至った一方で、FlpA は C. jejuni 株間で非常によく保存されている

IgA 産生を強化する輸送方法（粘膜輸送など）ではため、今後の免疫を介した戦略には FlpA を含める

C. jejuni の定着をさらに減少させるかもしれない。

ことを筆者らは提案する。本研究では調べていない

たとえば、インフルエンザワクチンの粘膜輸送は筋が、FlpA ワクチンによってもたらされる防御効果

肉内投与と比較して粘膜の抗体産生の強化を引き起が C. jejuni の全株に及ぶ可能性が考えられる。要

こした。数千羽の鶏に筋肉内投与を行うことは非常するに、鶏に対する FlpA の免疫によって盲腸内にに多大な労力とコストを要するため、もう一つのペ存在する C. jejuni が減少すれば、より安全な食糧

プチド輸送の方法は多数の鶏のワクチン投与がより供給が作り出せるだろう。

便利になるかもしれない。先述のように抗原の輸送に弱毒化サルモネラを用いる方法が現在調査されている。非病原性の抗原輸送法の一つは Lactobacillus

文献紹介者の所感のプロバイオティクスであり、これは C. jejuni のカンピロバクターは鶏に対して病原性を持たず、たんぱく質を生産するようデザインされている。組

また腸管内に定着して細菌叢を構成することから、

み換え Lactobacillus の腸管への定着は抗原の粘膜表

これまで注射をはじめとする通常のワクチン投与の面への輸送に至る。この方法はコストのかかるたん方法では難しいと考えられてきました。しかし本論

ぱく質の精製や投与が必要ない。にもかかわらず、

文ではカンピロバクターの表面に存在し、腸管上皮

筆者らは抗原の筋肉内投与によって防御効果のあるとの接着に関わるたんぱく質で免疫することでその粘膜反応を引き起こし、C. jejuni の定着の減少に定着を阻止することを示しています。カンピロバク

よってそれが証明された。

ターが問題となるのはブロイラーであることから、本研究で行われた試験はコントロールされた環境注射によるワクチンは敬遠されるため現場で使用すで、小グループを用いて行われた。ウインドレス鶏

るにはまだ障壁があります。2011 年の欧州食品安舎や開放鶏舎のような異なる環境で飼育されている

全機関の報告によると、通常は鶏の盲腸内容物 1 g

鶏へのワクチン投与は防御のレベルが異なる結果に

当たり 108 個のカンピロバクターが存在するが、至る可能性がある。その理由としては鶏の数やスト1000 分の 1 まで減らすことができれば公衆衛生リ

64（3），2018

13（49）

スクが 10 分の 1 になると言われていることから、

私もワクチンメーカーの一員としてとして新たなワさらなる研究によってワクチン使用に対する壁を克クチン開発を推し進めていきたいと感じました。

服し、食の安全が確保されることを望んでいます。

（研究員）

レビュー

牛ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）の遺伝子多様性と遺伝子全長解析長井誠（石川県立大学生物資源環境学部生産科学科、現所属：麻布大学獣医学部獣医学科）
5ʼ UTR の遺伝子配列の違いにより分類されたが、はじめにBVDV – 1 と BVDV – 2 の間には血清学的な差がある

牛ウイルス性下痢ウイルス感染症（BVD）は養こ と が 明 ら か に さ れ て い る。BVDV – 1 お よ び

牛経営に与える経済損失が大きいことから、北欧諸

BVDV – 2 それぞれの中にはさらにサブグループが国では国家を挙げた清浄化対策が行われ、清浄化に存在し、現在、BVDV – 1 は 21（1a 〜 1u）サブグルー

成功しており、オーストリアやスイスがそれに続い

プ、BVDV – 2 は 4（2a 〜 2d）サブグループに分かて国家的な清浄化策を進めている。我が国においてれている [2]。遺伝子全長が登録されているサブグ

は BVD の経済被害に対する認識が高まりつつある

ループの代表株の塩基配列による分子系統樹（近隣ものの、原因ウイルスである牛ウイルス性下痢ウイ接合法で作成）を図 1 に示した。色を付けてあるグルス（BVDV）は全国的に浸潤しているのが現状で

ル ープ（1a、1b、1c、1j、1n、1o お よ び 2c）は 我ある。BVDV は抗原性状が多様であり、ワクチン株

が国で株が確認されているグループである。KZ –との抗原性状の差はワクチンの効果に影響を与える。 91 株に代表される我が国の BVDV – 2 株はこれまで
また、BVDV の動物に対する病原性にウイルス遺伝

BVDV – 2a と分類されていたが、近年このグループ

子の変異が関連することが報告されており、遺伝子を 2c と分類する報告が多くなってきたことから、

全長にわたる解析が求められる場合がある。本稿でここでは 2c とした。我が国で分離された株と免疫は、BVDV の遺伝子多様性および BVDV の病原性血清を用いて行った交差中和試験成績を R 値で表 1

解明への遺伝子全長解析の有用性についてまとめた。 に示した。R 値は血清学的性状の差を客観的に判断

1．BVDV の遺伝子多様性（1）BVDV のサブグループ
BVDV は豚コレラウイルスやボーダー病ウイルスとともにフラビウイルス科ペスチウイルス属に分類される。BVDV は、1990 年代に北米で致死率の高い BVDV 感染症が発生し、分離ウイルスの 5ʼ 非翻訳領域（UTR）の遺伝子配列が従来の株のものと約 25％の違いを認めたため、新しい型を BVDV – 2
として従来の株（BVDV – 1）と区別された [1]。その後、国際ウイルス分類委員会により、BVDV – 1と BVDV – 2 はそれぞれ独立した種として認定された。BVDV – 1 と BVDV – 2 は蛋白質をコードしない

0.05

図1

BVDV 遺伝子全長による分子系統樹

14（50）

表1

日生研たよりBVDV サブグループ代表株の交差中和抗体価（2）BVDV の遺伝子変異
RNA ウイルスは全く均一な遺伝子集団を形成す
るのではなく、準種（quasispecies）と呼ばれる塩基配列がごくわずかに違った個体の集合体を形成する。RNA ウイルスが持つ遺伝子 RNA の合成を触媒
す る 酵 素 で あ る RNA 依 存 性 RNA ポ リ メ ラ ーゼ
（BVDV の 場 合、NSP5B が コ ード し て い る）の エ
ラー率が高いため、高い突然変異率で複製し多様な＊遺伝子集団である準種が生ずる。この高い突然変異

R 値で表す率は RNA ウイルスに正の選択圧による遺伝子の点する数値で、25 未満で有意な抗原性状の差がある

変異を起こし、進化することによりサブグループがと判断することができる。表 1 の R 値から、我が形成される。BVDV – 1n および BVDV – 1o に分類さ国の BVDV – 1 のいずれのサブグループ間にも有意れる BVDV は我が国や韓国および中国といったアな抗原性状の差があると考えられる。BVDV – 1 のジアの国に限局して分布している。BVDV – 1n およワクチンは世界的にも BVDV – 1a で作られたものがび BVDV – 1o の 代 表 株 と し て Shitara/02/06 株

多いが、この表からも 1a と 1b には血清学的性状に（1n）および IS26NCP/01 株（1o）の全遺伝子配列有意な差があることがわかり、BVDV – 1b ワクチンを 決 定 し [3]、全 塩 基 配 列 が DDBJ/EMBL/の必要性が示されている。

GenBank に登録されている他の遺伝子型およびサブグループとの相同性を SimPlot 解析により比較し

SimPlot query: BVDV 1n Shitara/02/06

相 同 性

1.0

0.75

0.5 0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

SimPlot query: BVDV 1o IS26NCP/01

相 同 性

1.0

0.75

図2

BVDV‑1n Shitara/02/06 株および BVDV‑1o IS26NCP/01 株と他の遺伝子型およびサブグループとの遺伝子の相同性

64（3），2018

15（51）た（図 2）。Shitara/02/06 株 お よ び IS26NCP/01 株

同時に感染した時に発生するので、BVDV の持続感は、全遺伝子領域にわたり他の遺伝子型およびサブ

染（PI）牛に BVDV 生ワクチンを接種した時にもグループとは相同性は高くなく、東アジアで独自に遺伝子組換えウイルスが発生する可能性があると考進化したサブグループであることが示唆された。

えられる。

RNA ウイルスは遺伝子の点変異による変異だけではなく、ウイルス遺伝子の相同性組換えによって（3）BVDV 細胞病原性（CP）株と BVDV 遺伝子のも進化する。著者らは以前、BVDV 遺伝子の 5ʼ UTR

変異

pro

から 3ʼ UTR までの間の 5 領域（5ʼ UTR、N 、E2、野外で流行しているほとんどの BVDV は培養細NS3 および NSB4 〜 3ʼ UTR）の部分配列を決定し、胞に細胞変性効果を起こさない非細胞病原性

系統樹解析での比較を行った [4]。ほとんどの株が、 （NCP）株であり、PI 牛が主な感染源となり水平感
どの領域も同じサブグループに分類されたが、米国
proの分離株である ILLNC は 5ʼ UTR、N 、E2 および染および垂直感染で流行を繰り返している。PI 牛は、BVDV に対する抗体を保有しない妊娠初期の牛NSB4 〜 3ʼ UTR は BVDV – 1b に分類されたのに対し、 に BVDV が感染した時に、免疫機能が十分でないNS3 では BVDV – 1a 株のグループとクラスターを胎子が垂直感染し、感染 BVDV に対して免疫寛容

形 成 し た。こ の 株 は 遺 伝 子 全 長 が DDBJ/EMBL/となることで発生し、生涯にわたり持続感染してい

GenBank に登録されているので、遺伝子組換え解るウイルスを排泄し続ける。粘膜病は PI 牛のみが

析 ソ フ ト RDP4 を 用 い て BVDV – 1a の 代 表 株

発症する致死的な病型で、粘膜病発症前には持続感

NADL と BVDV – 1b の 代 表 株 CP – 7 と の 遺 伝 子 組

染している NCP 株しか分離されないのに対し、粘換えを調べたところ、NS3 および NS4B に遺伝子膜病を発症すると培養細胞に細胞変性効果を起こす

組換えのブレークポイントが見つかった（図 3）。

CP 株が分離される。CP 株は NCP 株のウイルス遺これらの遺伝子組換えがウイルス株の増殖や宿主に伝子が変異を起こし、NS2 – 3 蛋白が開裂して NS3

対 す る 病 原 性 な ど に 関 わ る か は 不 明 で あ る が、蛋白が発現することで発生する。実際のところ他の

BVDV においても他の RNA ウイルス同様、相同性遺伝子がコファクターとして働くことが必要で、遺伝子組換えが起こることがわかった。相同性組換

NS3 蛋白のみを細内に発現させても細胞変性効果

えは、1 つの細胞に同時に 2 種類以上のウイルスがは起こらないが、全ての CP 株で NS3 蛋白の発現

Bootstrap support（％）

100

50

BVD‑V1a NADL
BVD‑V1b CP‑7

0

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

遺伝子位置

ILLNC
5ʼUTR Npro C Erns E1

NADL（1a）

E2

P7

NS2

NS3
5460

NS4A NS4B
6750

NS5A

NS5B

7370 7710

CP‑7（1b）
図3

BVDV‑ILLNC 株に認められた BVDV‑1a と BVDV‑1b の遺伝子相同性組換え

3ʼUTR

16（52）

日生研たよりがあり、6 は著者らが発見したメカニズムである

2. NS2遺伝子における点変異
NS3

NS2

3. 宿主遺伝子の挿入およびウイルス遺伝子の重複

1. 開裂部への宿主
遺伝子の挿入
NS3

NS2

NS2−3

NS3

宿主細胞遺伝子

宿主細胞遺伝子NS3の発現4. 開裂部上流のNS2遺伝子
内への宿主遺伝子挿入

5. 構造遺伝子欠損

NS2

NS3
Npro.

NS3

宿主細胞遺伝子欠損

6. 構造蛋白コード領域への宿主遺伝子（cINS）の挿入
Jiv

Npro

C cINS

図4[5]（図 4）
。

Npro

C

NS2

NS3

BVDV CP 株の NS2‑3 開裂のメカニズム

2．BVDV の遺伝子全長解析（1）BVDV CP 株の遺伝子全長解析
近年、次世代型シーケンシングまたは「第 2 世代」シーケンシングと言われるゲノムを短い配列（ショートリード）で大規模に取得する配列解析技術が普及し、ウイルス遺伝子の全長解析に用いられが認められることは事実である。これまでに NS2 –て い る。図 5A は Illumina 社 の MiSeq で、50 bp の3 蛋白が開裂するメカニズムとして、1．NS2 – 3 蛋

シングルエンドリードを用いてあるウイルスの遺伝

白コード遺伝子領域開裂部位への宿主遺伝子（ユビ子を解析した結果である。ウイルス遺伝子のランダ

キチン、GABA（A） – RAP、GATE – 16）の挿入、2． ムな領域を 50 bp ずつシーケンスし、その配列の相NS2 遺伝子内での点変異による NS2 – 3 蛋白の構造同性をもとにアセンブリして全長配列を決定する。

変化、3．宿主遺伝子の挿入およびウイルス遺伝子

この方法で我が国の BVDV – 2 代表株である KZ91 –の重複、4．ヘルパーウイルス存在下におけるウイ

CP 株 や、前 述 の Shitara/02/06 株（1n）お よ び

ルス構造遺伝子の欠損、5．開裂部上流の NS2 遺伝

IS26NCP/01 株（1o）の全遺伝子配列を決定した [3、子 内 へ の 宿 主 遺 伝 子（cINS）挿 入、6．構 造 蛋 白6]（この時は 300 bp のペアエンドリードを用いた）。

（Core）コード領域への宿主遺伝子（cINS）の挿入

BVDV CP 株の全遺伝子配列の決定にショートリー（Ａ）

アセンブルされたcontig

リードデプスリード（Ｂ）
BVDV‑ILLC

NS4B
NS4A

p7
Npro C Erns E1

E2

NS2‑3

Ubi

NS 2

2049, 192, 156 bp
1356 bp

NS4A
NS3

NS4B

NS5A

NS5B

2049, 192, 1041 bp
615 bp（Ｃ）

図 5 BVDV の遺伝子全長解析法と問題点。
（Ａ）Illumina 社 MiSeq による解析結果。（Ｂ）BVDV‑ILLC 株の遺伝子構造。（Ｃ）Oxford 社の小型のシーケンサー
MinION。

64（3），201817（53）

ドによるシーケンシングを応用する場合、注意が必伝子挿入や欠損は認められなかったが、E2 糖蛋白要である。CP 株である BVDV ILLC 株は、宿主遺のアミノ酸配列において BVDV – 1 に共通する保存

伝子の挿入およびウイルス遺伝子の重複のパターン

性の高い 4 つのグリコシル化サイト以外に、他の株の遺伝子配列を有し、NS2 および NS3 〜 NS4B ににないもう一つのグリコシル化サイトが存在するこ

そ れ ぞ れ 615 bp お よ び 2397 bp（2049 bp＋192 bpとが確認され、さらに Erns 糖蛋白にユニークなア＋156 bp）の重複領域が存在する（図 5B）。これをミノ酸配列およびエピトープの変異が認められた。

Illumina 社の MiSeq で 300 bp のペアエンドリード

グリコシル化や RNase 活性はペスチウイルスの毒でシーケンスした場合、どちらの重複領域を読んだ性に関わることから、これらの変化がウイルスの生

リードであるかを識別することができず、正確なア

存性、伝播性および病原性に関連した可能性がある

センブリを行うことができない。ごく最近、長い分と報告している [7]。北米で 1990 年代に流行した子の配列を解析可能な技術、「第 3 世代」シーケン

高病原性の BVDV – 2（BVDV – 2a）について、弱毒シングが登場したが解析価格が高額であり、利用はの BVDV – 2a 株との比較で 5ʼ UTR に存在する IRES

限られている。このような中、他のゲノム解析技術の二次構造の微妙な差が見いだされ、この構造の差と異なり専用機器を必要とせず、USB ケーブルでがウイルスの転写効率に影響し、ウイルス毒性に関パーソナルコンピュータに専用アダプターを接続すわることが示唆された [8]。その後、2013 年にドイ

る だ け で ゲ ノ ム 配 列 を 解 析 で き る、Oxford 社 のツのノルトライン＝ヴェストファーレン州およびNanopore 技術による小型のシーケンサー MinION

ニーダーザクセン州で子牛、育成牛および搾乳牛に（ミナイオン）が発売された（図 5C）。MinION は発生した死亡率の高い集団発生例から分離された

フローセル中にあるナノポアの近くを、生体分子がBVDV – 2（BVDV – 2c）は、ディープシーケンシン

通過するときに発生する電流の変化を計測すること

グによる遺伝子全長解析で 3 タイプのウイルスが共で塩基を識別し、物理的にロングリードを取得する。 存していることが確認された [9]。その中で 95％を
実際に CP 株 BVDV の遺伝子解析はまだ実施して占める最も大きな集団は p7 〜 NS2 の 222 塩基の遺いないが、重複領域のある CP 株の解析に MinION

伝子重複を保有し、重複のない小さな集団の p7 〜の活用を期待している。しかし、CP 株は粘膜病を

NS2 は 3 パターンの配列を示した。リバースジェ

発症した動物からしか分離されず、CP 株は垂直感

ネティック技術を用いた実験で、重複のないウイル

染するが PI することはなく、健康な動物の間に水スは重複のあるウイルスの複製の課程で発生するこ平感染により拡散することはない。したがって、とが判明した。p7 はウイルスの組み立てや放出に

CP 株は粘膜病を発症した動物から新たに発生する関わると考えられており、重複している p7 によりが、その株は存続することなく滅亡する運命にあるウイルスの組み立てと放出の効率が増加し、これがと言える。このことから CP 株の全長解析で遺伝子

高病原性に関連するのではないかと考察している。

構造を決定することは限られた価値しかないと思わこの報告では、北米の高病原性 BVDV – 2a の代表株れる。

である 890 株の解析も併せて行っており、890 株にも同様な p7 〜 NS2 の重複があり、リバースジェネ（2）BVDV の病原性と遺伝子全長解析
BVDV 感染症は粘膜病を除き致死率は高くない
が、BVDV NCP 株の感染による高死亡率を示す集

ティクス解析では同様な動向を示すことから、この重複遺伝子も高病原性に関わる可能性があることを示唆している。

団発生が報告されており、このような症例からの分離株について遺伝子全長解析が行われている。SD– 15 株は、中国山東省の 320 頭飼養規模の養牛農場おわりにで発生した激しい下痢症例から分離された。本症で本原稿では BVDV の遺伝子および抗原性状の多は、症状を示した 214 頭の約 60％にあたる 128 頭様性と病原性に関わる遺伝子変異について述べた。

が 10 〜 15 日の経過で死亡した。BVDV – 1m に分抗原性状については最も外側のウイルス構造蛋白を類されたこの株のウイルス遺伝子全長解析では、遺コードする E2 遺伝子で推定することが可能である18（54）日生研たよりが、ウイルスの病原性については遺伝子全長を解析

Kida, H., and Akashi, H. 2003. Insertion of cellular

する必要があることが示唆されている。近年シーケ

sequence and RNA recombination in the

ンス技術の発展は目覚ましく、様々な方法が応用で

str uctural protein coding region of

きるようになった。BVDV の多様性や病原性を解

cytopathogenic bovine viral diarrhoea virus. J Gen

明するために、利用可能な方法を駆使し、できるだ

Virol. 84 : 447 – 452.

け詳細に解析することが重要と考えられる。

6. Sato, A., Kameyama, K., Nagai, M., Tateishi, K.,
Ohmori, K., Todaka, R., Katayama, K., Mizutani,T., Yamakawa, M. and Shirai, J. 2015. Complete

引用文献

genome sequence of bovine viral diarrhea virus 2

1. Ridpath, J.F., Bolin, S.R. and Dubovi, E.J. 1994.

Japanese reference and vaccine strain KZ – 91CP.

Segregation of bovine viral diarrhea virus into

Genome Announc. 12 ; 3（1）. pii : e01573 – 14. doi.

genotypes. Virology 205 : 66 –74.

7. Zhu, L., Lu, H., Cao, Y., Gai, X., Guo, C., Liu, Y.,

2. Ye㶆ilba侃, K., Alpay, G. and Becher, P. 2017.

L i u , J , a n d Wa n g , X . 2 0 1 6 . M o l e c u l a r

Va r i a b i l i t y a n d G l o b a l D i s t r i b u t i o n o f

Characterization of a Novel Bovine Viral Diarrhea

Subgenotypes of Bovine Viral Diarrhea Virus.

Virus Isolate SD – 15. PLoS One. 20 ; 11（ 10）:

Viruses 26 ; 9（6）. pii : E128.

e0165044.

3. Sato, A., Tateishi, K., Shinohara, M., Naoi, Y.,

8. Topliff, C.L., Chon, S.K., Donis, R.O., Eskridge,

Shiokawa, M., Aoki, H., Ohmori, K., Mizutani, T.,

K.M. and Kelling, C.L. 2005. In vitro and in vivo

Shirai, J. and Nagai, M. 2016. Complete Genometranslational efficiencies of the 5ʼ untranslated

Sequencing of Bovine Viral Diarrhea Virus 1,

region from eight genotype 2 bovine viral

Subgenotypes 1n and 1o. Genome Announc. 18 ; 4

diarrhea virus ﬁeld isolates. Virology. 331 : 349 –（1）. pii : e01744 – 15.

356.

4. Nagai, M., Hayashi, M., Sugita, S., Sakoda, Y.,

9. Jenckel, M., Höper, D., Schirrmeier, H., Reimann,Mori, M., Murakami, T., Ozawa, T., Yamada, N.

I., Goller, K.V., Hoffmann, B. and Beer, M. 2014.

and Akashi, H. 2004. Phylogenetic analysis of

Mixed triple: allied vir uses in unique recent

bovine viral diarrhea viruses using ﬁve different

isolates of highly virulent type 2 bovine viral

genetic regions. Virus Res. 99 : 103 – 113.

diarrhea virus detected by deep sequencing. J

5. Nagai, M., Sakoda, Y., Mori, M., Hayashi, M.,

Virol. 88 : 6983 – 6992.

研修者･見学者受け入れ状況 （平成 29 年 4 月から平成 30 年 3 月まで）

平成 29 年

平成 30 年

来所日・期間

所属機関・人数

研修・見学内容

4 月 24 日〜 4 月 28 日
5 月 15 日〜 5 月 19 日

株式会社ジャパンファーム

1名

技術習得

5 月 10 日

東京都立青峰学園

2名

現場実習

6 月 16 日、6 月 19 日、6 月 20 日

東京都立青峰学園

1名

現場実習

9 月 11 日

岩手大学農学部

1名

施設見学

10 月 5 日〜 10 月 13 日

鹿児島大学農学部

1名

技術習得

10 月 10 日〜 10 月 12 日

イセファーム株式会社

1名

技術習得

10 月 18 日

宮崎大学農学部

1名

施設見学

12 月 4 日〜 12 月 8 日

東京都立青峰学園

1名

現場実習

1 月 17 日

麻布大学獣医学部

2名

施設見学

1 月 29 日、1 月 30 日、2 月 1 日、2 月 2 日

東京都立青峰学園

1名

現場実習

2 月 23 日

農林水産省動物医薬品検査所

3名

施設見学

64（3），2018

19（55）

平成 30 年度定時評議会開催
当研究所の平成 30 年度定時評議員会が、去る平成 30 年 6 月 20 日に開催され、平成 29 年度の事業報告及び決算報告が承認されると共に、次期の理事及び監事が選任されました。現在の組織、評議員、理事及び監事は下記のとおりです。
1. 組織

評議員会

理 事 会

監

事

理 事 長

常任理事会
監 査 室

管 理 部

経営企画部

研 究 部

検 査 部

2. 評議員
杉浦

勝明

真板

敬三

佐々木

伸雄

山手

丈至

担

当

古我

知史

3. 理事・監事
氏

名

笹川 千尋

役

職

理事長

研究及び検査

長井 伸也

所長

経営統括

土屋

耕太郎

常務理事

経営企画

朱通

市次郎

常務理事

管理

小坂 善三

監事

加藤 哲雄

監事

日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（年 4 回発行）（通巻 608 号） 平成 30 年 6 月 25 日印刷
発行所
生命の「共生・調和」を理念とし、生命体の豊かな明日と、研究の永続性を願う
気持ちを快いリズムに整え、視覚化したものです。カラーは生命の源、水を表す「青」としています。
表紙題字は故中村⛲治博士による揮毫です。

平成 30 年 7 月 1 日発行（第 64 巻第 3 号）

一般財団法人日本生物科学研究所〒 198 0024

東京都青梅市新町 9 丁目 2221 番地の 1

TEL：0428（33）1520（経営企画部） FAX：0428（31）6166
URL：http://nibs.lin.gr.jp/
発行人
編集室
印刷所

土屋耕太郎

委

員／小野浩輝（委員長）、近内将記、安田早織

事務／経営企画部

株式会社 精ഛ社（無断転載を禁ず）