【オーラルセッション 2】】17:00-18:30
16:50
O6

17:10
O7

17:30
O8

17:50
O9

座長

岡

哲雄（東海大学）、鵜飼良（名城大）

神経因性疼痛下におけるモルヒネ誘発報酬効果の抑制に対する ERK (extracelullar
signal regulated kinase) の役割
尾崎 覚、成田 年、成田道子、尾崎雅彦、白藤明日香、鈴木 勉
星薬科大学薬品毒性学教室
The role of ERK (extracelluar signal regulated kinase) in the inhibition of the morphineinduced rewarding effect under neuropathic pain, Satoru Ozaki, et al, Department of
Toxicology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Science, Hoshi University

18-21

モルヒネ禁断場所嫌悪反応における扁桃体中心核の役割
中川貴之、渡辺中川貴之、渡辺 豪、山本梨絵、南 雅文、佐藤公道
京都大学薬学研究科生体機能解析学分野
京都大学薬学研究科生体機能解析学分野
Role of the central nucleus of amygdala in morphine withdrawal-induced conditioned place
aversion in rats, Takayuki Nakagawa, et al, Department of Molecular Pharmacology,
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University

22-27

扁桃体外側基底核へのモルヒネ微量注入による疼痛関連嫌悪反応の抑制
南 雅文、山本潤希、町田泰一、谷本
雅文、山本潤希、町田泰一、谷本 幸、中川貴之、佐藤公道
京都大学薬学研究科生体機能解析学分野
Suppression of Pain-induced Aversive Response by Microinjection of Morphine into theBasolateral Amygdaloid Nucleus, Masabumi Minami, et al, Department of Molecular
Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University

28-32

2,6-dimethyl-L-tyrosine(Dmt)のオピオイドミメティクス開発への応用のオピオイドミメティクス開発への応用
岡田芳男１，２、津田裕子１，２、宮崎杏奈１、横井利夫１，２、藤田快男１、藤沢豊１、塩谷公隆１、
佐々木有亮３、安保明博３、Sharon D. Bryant4, Lawrence H. Lazarus4
神戸学院大学薬学部１・ハイテクリサーチセンター２、東北薬科大学３、米国立環境保健研究所４
Application of 2,6-Dimethyl-L-tyrosine (Dmt) to the Development of Opioid Mimetics
Yoshio Okada, et al, Faculty of Pharmaceutical Sciences1 and High Technology
Research Center2, Kobe Gakuin University,33-37

神経因性疼痛下におけるモルヒネ誘発報酬効果の抑制に対するERK (extracellular signal regulated kinase) の役割
尾崎 覚 , 成田 年 , 成田道子,
成田道子 , 尾崎雅彦,
尾崎雅彦 , 白藤明日香,
白藤明日香 , 鈴木 勉
星薬科大学薬品毒性学教室

The role of ERK (extracelluar signal regulated kinase) in the inhibition of themorphine-induced rewarding effect under neuropathic pain
Satoru Ozaki, Minoru Narita, Michiko Narita, Masahiko Ozaki, Asuka Shirafuji,
Tsutomu Suzuki
Department of Toxicology, School of Pharmacy and Pharmaceutical Science,
Hoshi University
Summary: We previously reported that the morphine-induced place preference was abolished in
sciatic nerve-ligated mice. The present study was designed to investigate whether a state ofneuropathic pain induced by sciatic nerve ligation could be implicated in the ERK and p38
activation in the lower midbrain area including the ventral tegmental area (VTA), which
contributes to the development of its rewarding effect, in the mouse. A dose-dependent place
preference induced by s.c. morphine was observed in sham-operated mice but not in sciatic
nerve-ligated mice. Here we found a persistent and significant reduction in protein levels ofphosphorylated-ERK and p38, indicative of these active states, in cytosolic preparations of thelower midbrain following nerve injury. The inhibition of ERK cascade by either PD98059 or
U0126 impaired the morphine-induced place preference in naive mice. In contrast, i.c.v. treatment
with SB203580, a specific inhibitor of p38, did not interfere with its rewarding effect. These
results suggest that the persistent reduction in the ERK-dependent signaling pathway in the lower
midbrain may, at least in part, contribute to the suppression of the rewarding effect of morphine
under neuropathic pain.

緒言

明らかにしており、これらは臨床報告を支持

モルヒネは慢性投与により精神依存を形成

にくい難治性の慢性疼痛として神経因性疼痛

するが、臨床においてがん患者にモルヒネをが問題視されており、この疼痛メカニズムを適切に使用した場合、精神依存が問題になる解明するためにさまざまな研究が行われていことはほとんどない。我々はカラゲニンやホる。最近我々は、坐骨神経結紮による神経因

ルマリンによる炎症性疼痛モデルにおいてモ

性疼痛モデルを作製し、モルヒネの報酬効果

ルヒネの報酬効果が形成されないことを既にについて検討したところ、炎症性疼痛時と同する結果である 1,2)。近年、オピオイドが効き

18

様に神経因性疼痛下においてはモルヒネの報を行った動物を非結紮群とした。これらの動酬効果が認められないことを明らかにした 3)。

物は手術後 4 日目より以下の実験にて使用した。

Mitogen‑activated protein kinase (MAPK)は様々な外界刺激を伝達するセリン/スレオ

1. Conditioned Place Preference (CPP) 法

ニンキナーゼであり、現在までに 4 つの MAPK

報酬効果は conditioned place preferenceの存在が知られ ている。 その 1 つである

(CPP) 法を用いて評価した。条件づけはプレ

extracellularkinase

方式に従い 1 日 1 回行い、1 日目にモルヒ(ERK) は細胞分化・増殖に重要な役割を担っ

ネ (2.5, 5, 10 mg/kg) あるいは溶媒を皮下ているが、近年、この ERK がオピオイド受容投与したマウスを白あるいは黒の区画に 60

体刺激により活性化されることが報告されて分間閉じ込め、2 日目にはそれぞれ 1 日目といる。また、我々はモルヒネを慢性暴露したは逆の操作を行い、これを 6 日間繰り返した。

動物において長期的に ERK 活性が増加してまた、条件づけ期間中、モルヒネの代わりに、いる事実を見いだしている。一方、p38 は UV

その溶媒のみの投与を続け、条件づけを行っ照射や高浸透圧などの物理的ストレスで活性た群を溶媒対照群とした。条件づけ開始の前化されることから、アポトーシスのシグナル

日および 6 日間の条件づけが終了した翌日伝達に関与している因子として以前より注目にそれぞれ pre‑ および post‑test を行い、を集めている。しかしながら、オピオイド受モルヒネあるいは溶媒のいずれも処置せずに容体を介したシグナル伝達における p38 の

15 分間、白・黒の区画を自由に行き来させる活性化経路の存在やオピオイドの依存形成にことにより、それぞれの区画に滞在する時間

おける関与については依然として未知のままを測定し、これらの値から CPP スコアを算出

である。

した。

signalregulated

2. Western blot 法

そこで本研究では、坐骨神経結紮による神
経因性疼痛下におけるモルヒネ誘発報酬効果

ドデシル硫酸ナトリウム‑ポリアクリルアの抑制機構を解明する目的で、MAPK の中でもミドゲル電気泳動法 (SDS‑PAGE 法) に従っ

特に ERK ならびに p38 に着目し、坐骨神経結て、4‑20% の濃度勾配のゲル中の各レーンに紮によるこれらの脳内活性変化について詳細2%に検討し、モルヒネ誘発報酬効果に対するそ

dithiothreitol (DDT) を含む loading dye

れらの役割を明らかにした。

と 8‑15

SDS 、 10%glycerol

と

0.2

M

g の細胞質分画の混合液を注入し、抗原タンパクを分子量の差によって分離した。

方法

分離完了後、速やかにゲルを取り出し、電気本研究において、実験動物として ICR 系雄mM glycine を含む Tris‑glycine buffer に性マウスを使用した。慢性疼痛モデルは、浸したニトロセルロースメンブランにトラン

Seltzer らの方法をマウスに応用し、右後足スブロットセル (Bio‑Rad) を用い電気的に坐骨神経を半周結紮することにより作製した移行させた。ニトロセルロースメンブランに

4)移行後、メンブランを 5% nonfat dried milk

永動した抗原タンパクを 25 mM Tris と 192。また、坐骨神経を結紮しないで同様の手術

19

を含む Tris‑buffered saline (TBS) 中でブ

において抑制性伝達物質である GABA の遊離

ロッキングし、さらに、メンブラン上で抗原を抑制し（脱抑制）、ドパミン神経系の過興奮タンパクと 5% nonfat dried milk 中で 250を惹起する。実際、我々は倍希 釈し たphosphorylated‑ERK 抗 体

容体作動薬を動物の腹側被蓋野へ微量注入す(Santa Cruz Biotechnology) および 2000 倍ることによりこれらの説を支持する結果を多希釈した phosphorylated‑p38 抗体 (Santa

数見いだしている 5)。このような背景から、Cruz Biotechnology) を反応させるため、一オピオイドの精神依存形成と密接に関連

オピオイド受晩インキュベーションを行った。その後、0.5%する腹側被蓋野周辺部領域

Tween 20 を含む TBS (TTBS) で洗浄し、膜上midbrain) に的を絞り、坐骨神経結紮 1, 4

で抗原と結合した抗体を 5% nonfat driedおよび 28 日後のにおける ERK および p38

milk

倍 希 釈 さ れ た

活性変化を検討したところ、結紮 4 日後をピ

horseradish peroxidase (HRP) 標識の二次抗ークとして持続的かつ有意な活性の減弱がそ体と、室温にて 2 時間インキュベーションをれぞれに認められた。そこで、ERK および p38

行い反応させた。インキュベーション後、TTBSの選択的阻害薬を用いて、正常動物におけるで洗浄し、ケミルミノエッセンス法に従い蛍

モルヒネ誘発報酬効果の発現に対する ERK

光発色性の基質を用いて目的とするタンパクならびに p38 の直接的な関与について検討を検出した。

した。その結果、モルヒネ誘発報酬効果は ERK

中 で

10,000(lowerの 選 択 的 阻 害 薬 で あ る PD98059 お よ び
U0126 の脳室内前処置によりそれぞれ有意に結果および考察抑制されたが、p38 の選択的阻害薬である

坐骨神経を結紮していない対照群において、SB203580 の脳室内前処置では有意な変化がモルヒネにより用量依存的かつ有意な報酬効認められなかった。これらの結果から、モル果の発現が認められが、坐骨神経結紮群におヒネの報酬効果発現には少なくとも一部 ERK

いてはモルヒネによる報酬効果の発現は認めの活性化が関与していることが明らかとなっられなかった。この結果は、臨床での疼痛緩た。

和を目的としたモルヒネ使用は精神依存をほ以上の本研究結果から、坐骨神経結紮にとんど形成しないという報告を支持するもの

よる神経因性疼痛下におけるモルヒネ誘発報であり、本疼痛モデルのような神経因性疼痛

酬効果の抑制は、lower midbrain での ERKの動物モデルでも確認できたことは意義深い。

活性の減弱に一部起因している可能性が示唆

モルヒネなどの µ オピオイド受容体作動された。モルヒネを含む依存性薬物の長期使

薬は、腹側被蓋野から側坐核に投射している

用による依存形成には様々なタンパク質リン

中脳辺縁ドパミン神経系に対して強力な活性酸化や遺伝子発現の変化を伴う神経機能の再化作用を示すために精神依存を形成する。こ構築、すなわち可塑性変化が寄与している考の活性化機構には中脳辺縁ドパミン神経系のえられている。ERK は遺伝子発現の調節やリ起始核が存在する腹側被蓋野が非常に重要でン酸化酵素などの活性化に深く関与しているあり、µ オピオイド受容体作動薬はこの領域ことから、結紮下における ERK 活性の低下は20モルヒネ反復投与によって生じる神経系の可3) Ozaki S., Narita M., Narita M., Iino M., Sugita

塑性変化に直接影響を及ぼし、その結果とし

J., Matsumura Y. and Suzuki T. Suppression ofて報酬効果の抑制が認められたと推察される。

the morphine-induced rewarding effect in the
rat with neuropathic pain: Implication of the
reduction in µ-opioid receptor functions in the

引用文献

ventral segmental area. J. Neurochem. (inpress).

1) Suzuki T., Kishimoto Y. and Misawa M.
Formalin-andcarrageenan-induced

inflammation

attenuates

place4) Seltzer Z., Dubner R. and Shir Y. A novel

preferences

behavioral model of neuropathic pain disorders

produced by morphine, methamphetamine andproduced in rats by partial sciatic nerve injury.

cocaine. Life Sci.: 59, 1667-1674, 1996.

Pain: 43, 205-218, 1990.

2) Suzuki T., Kishimoto Y., Misawa M., Nagase H.

5) Narita M., Funada M. and Suzuki T.

and Takeda F. Role of the κ-opioid system inRegulations of opioid dependence by opioid

the attenuation of the morphine-induced place

receptor types. Pharmacol. Ther.: 89, 1-15.

preference under chronic pain. Life Sci.: 64,(2001)

PL1-7, 1999.

21

モルヒネ禁断場所嫌悪反応における扁桃体中心核の役割
中川貴之、渡辺 豪、山本梨絵、南 雅文、佐藤公道
京都大学薬学研究科生体機能解析学分野

Role of the central nucleus of amygdala in morphine withdrawal-induced conditioned place
aversion in rats
Takayuki Nakagawa, Takeshi Watanabe, Rie Yamamoto, Masabumi Minami and Masamichi Satoh
Department of Molecular Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
Kyoto University
Summary : We investigated the role of the amygdala in the naloxone-precipitated morphine withdrawal-induced
conditioned place aversion (CPA). Excitotoxic lesion of the central (CeA), but not basolateral, nucleus of the amygdalaattenuated the CPA. Both extracellular glutamate and noradrenaline levels in CeA were elevated during morphinewithdrawal. Microinjection of glutamate receptor or β-adrenoceptor antagonists into bilateral CeA attenuated the CPA.
These results suggest that both glutamatergic and noradrenergic systems in CeA contribute to the morphinewithdrawal-induced CPA.
受容体拮抗薬を局所微量投与することにより幾緒言

つかの禁断症候が誘発されること 3)などが報告さモルヒネなどの麻薬性鎮痛薬の連続的使用にれており、扁桃体が麻薬依存形成あるいは禁断より生じる麻薬依存には精神的依存と身体的依症候発現に関与していることが示唆されている。

存が存在し、薬物の適用中止あるいはナロキソ

そこで本研究では、モルヒネ禁断症候発現時のン等の拮抗薬の適用により、不快な精神症状を不快な精神症状惹起における扁桃体の役割を伴った禁断症候が発現する。しかしながら、この明らかにするため、条件付け場所嗜好性試験にような退薬時の不快な精神症状発現のメカニズ

よって得られる場所嫌悪反応を指標とし、まず、

ムに関しては未だ不明な点が多く残されている。

興奮性神経毒による CeA あるいは BLA の限局

一方、扁桃体は大脳辺縁系に属し、中心核的損傷による影響を検討し、さらに、麻薬依存に（CeA）、基底外側核（BLA）などの機能の異なる

重要な役割を果たしていることが指摘されている幾つかの亜核から構成されており、外部からのグルタミン酸神経系 4)及びノルアドレナリン神経

各種感覚情報を受容し、それらを不安、恐怖な系 5)の関与を検討した。

どの情動反応として発現する機能や、自律神経応答に重要な役割を果たしていることが知られて実験方法

いる 1)。また、モルヒネ禁断症候発現後に扁桃体において c-fos mRNA 発現が顕著に誘導される

使用動物

こと 2)、モルヒネ依存ラットの扁桃体にオピオイド

SD 系雄性ラット（体重 200-280 g）

22

CeA あるいは BLA の限局的損傷

降ろし、午前中に生理食塩水（1 ml/kg）を腹腔内

ペントバルビタール麻酔下、興奮性神経毒であに投与し、プレファレンス・コンパートメントとは逆る NMDA（0.3 M）を、CeA の場合には AP -1.8のコンパートメントに 60 分間閉じこめた。さらに同

mm、L ±4.0 mm、DV 8.0 mm の位置へ 0.3 µl を

日の午後、ナロキソン（0.3 mg/kg）を腹腔内に投3 分間かけて、BLA の場合には AP -1.8 mm、L

与し、プレファレンス・コンパートメントに 60 分間±4.8 mm、DV 8.5 mm の位置へ 0.4 µl を 3 分間

閉じ込め、ナロキソンによる場所条件付けを行っ

かけて、両側性に微量投与した。NMDA の投与た。5 日目に、両コンパートメントを自由に探索で後、7 日目以降に実験を行った。

きる状態で、再び 900 秒間の各コンパートメントで実験終了後、組織学的検討を行い、NMDA によの滞在時間を測定した。5 日目のプレファレンス・

る各亜核での限局した損傷が両側共に確認できコンパートメントでの滞在時間から 3 日目の滞在た個体から得られたデータのみを解析に用い時間を差し引き、その値が負になった場合、場所た。

嫌悪反応が惹起されたものと評価した。

CeA への薬物微量投与

In vivo マイクロダイアリシス法

ペントバルビタール麻酔下、ガイドカニューレ

ペントバルビタール麻酔下、マイクロダイアリシ（外径 0.5 mm）を AP -1.8 mm、L ±4.0 mm、DV

ス用ガイドカニューレ（長さ 8.0 mm、外径 0.5

3.0 mm の位置に固定し、少なくとも 5 日間の回mm）を片方の CeA（AP -1.8 mm、L ±4.0 mm）に復期間の後に実験に用いた。薬物の投与は、こ埋込んだ。翌日、マイクロダイアリシス用透析プロのガイドカニューレにインジェクションカニューレーブ（長さ 8.0 mm、膜長 1.0 mm、外径 0.22 mm）（外径 0.2 mm）を挿入し、DV 8.0 mm の位置へを装着し、ラットが無拘束で自由に行動できる状薬液 1 µl/side を、0.5 µl/min の流速で 2 分間、態でリンゲル液を流速 1 µl/min で灌流した。10両側性に同時に微量投与した。実験終了後、組分あるいは 20 分間隔で灌流液を回収し、グルタ

織学的検討を行い、CeA 内への限局した投与がミン酸あるいはノルアドレナリン量を HPLC により両側共に確認できた個体から得られたデータの測定した。

みを解析に用いた。
条件付け場所嗜好性試験

結果

床面が滑らかな黒い部屋と床面が凹凸の白い部屋の 2 つのコンパートメントからなる CPP 装置

1. CeA あるいは BLA の限局的損傷によるモル（夏目製作所）を用いた。1 日目に、モルヒネ 75

ヒネ禁断場所嫌悪反応への影響

mg を含有するモルヒネペレットあるいはプラセボ

興奮性神経毒 NMDA を用いて、CeA あるいはペレットを頸背部皮下に 1 個埋込み、2 日目にラBLA をそれぞれ限局的に損傷することによる、

ットが両コンパートメントを自由に探索できる状態

ナロキソン誘発モルヒネ禁断場所嫌悪反応へので 900 秒間放置し、装置に対する馴化を行った。

影響を検討した（Fig.1）。CeA に対して sham 処

3 日目に同様の操作を行い、各ラットについて置を施したモルヒネ依存ラットにおけるナロキソン

900 秒間の各コンパートメントでの滞在時間を測

条件付け前後でのプレファレンス・コンパートメン

定し、より長く滞在したプレファレンス・コンパート

トにおける滞在時間の差は、プラセボペレットをメントを決定した。4 日目に、中央のスライドドアを埋め込んだ naive ラットの値と比較して有意に負23に増大しており、ナロキソン誘発モルヒネ禁断場

2. モルヒネ禁断症候発現時の CeA でのグルタミ所嫌悪反応が惹起されたことが確認できた。このン酸およびノルアドレナリンの遊離

ナロキソン誘発モルヒネ禁断場所嫌悪反応は、ナロキソ ン誘 発 モルヒネ 禁 断症候 発現時 のCeA 両側の限局的損傷により有意に減弱し、まFig.2 Effects of naloxone-precipitated morphinewithdrawal on the extracellular glutamate (a) andnoradrenaline (b) level in CeA. Animals were i.p.
injected with naloxone (0.3 mg/kg) at the time zero
indicated. Data are expressed as the means±SEM of %of the basal values calculated as an average of threeconsecutive stable dialysates before naloxone
injection. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs naive
rats (Bonferroni post hoc test). n=4-7.

た CeA を損傷した naive ラットで得られた値との間に有意な差は見られなかった。
Fig.1 Effects of CeA (a) or BLA (b) lesions on thenaloxone-precipitated morphine withdrawal-induced
CPA. Each column represents the time (sec) in thenaloxone-paired compartment in the test session minusthat in the preconditioning session. *P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001 vs respective naive rats;#
P<0.05 vs CeA-sham-operated morphine-dependent
rats (Bonferroni post hoc test). n=6-11.

CeA での細胞外グルタミン酸量及びノルアドレナ
リン量の経時変化を in vivo マイクロダイアリシス
一方、BLA に対して sham 処置を施したラットに法により検討した（Fig.2）。その結果、naive ラット

おいても、同様に有意なナロキソン誘発モルヒネ

においては、ナロキソンの腹腔内投与によっても禁断場所嫌悪反応が惹起されたが、BLA 両側細胞外グルタミン酸量及びノルアドレナリン量にの限局的損傷によって減少する傾向が見られた

変化は見られなかったが、モルヒネ依存ラットにものの、これは有意な差ではなく、また、BLA を

おいては、ナロキソンの投与により、グルタミン酸

損傷した naive ラットの値との間には有意な差がに関してはナロキソン投与後 10 分から 20 分、ノ認められた。

ルアドレナリンに関しては投与後 20 分から 40 分
をピークとする一過性の有意な増加が認められた。

24

Fig.3 Effects of microinjection of glutamate receptor antagonists into CeA on the naloxone-precipitatedmorphine withdrawal-induced CPA. Morphine-dependent or naive rats were microinjected with vehicle,
CNQX, MK-801 or D-CPPene into bilateral CeA 10 min before i.p. injection of naloxone (0.3 mg/kg).
***P<0.001 vs vehicle-microinjected naive rats. #P<0.05, ##P<0.01 vs. vehicle-microinjectedmorphine-dependent rats (Bonferroni post hoc test). Numerals in parentheses indicate the numbers of rats used.

3. 各種グルタミン酸受容体拮抗薬の CeA 内微

nmol/side）を微量投与すると僅かに場所嗜好性量投与によるモルヒネ禁断場所嫌悪反応への効を示し、D-CPPene（0.1 nmol/side）を微量投与す

果ると僅かに場所嫌悪反応を示したが、これらの効

ナロキソン誘発モルヒネ禁断場所嫌悪反応に果は有意なものではなかった。

おけるCeAのグルタミン酸受容体の関与を検討するために、各種グルタミン酸受容体拮抗薬を

4. β-アドレナリン受容体拮抗薬の CeA 内微量

ナロキソンによる条件付けの10分前に両側CeA

投与によるモルヒネ禁断場所嫌悪反応への効果

内に微量投与し、その効果を検討した（Fig.3）。

各種β-アドレナリン受容体拮抗薬をナロキソン

モルヒネ依存ラットの両側CeA内にvehicleを微量による条件付けの10分前に両側CeA内に微量投投与した群においては、naiveラットにvehicleを微与し、その効果を検討した（Fig.4）。その結果、ナ量投与した群と比較して有意な場所嫌悪反応がロキソン誘発モルヒネ禁断場所嫌悪反応は、β-ア惹起された。このナロキソン誘発モルヒネ禁断場

ド レ ナ リ ン 受 容 体 拮 抗 薬 propranolol （ 30

所嫌悪反応は、AMPA/kainate型グルタミン酸受

nmol/side）のCeA内微量投与により、vehicle投与

容体拮抗薬 CNQX（30 nmol/side）のCeA内微群と比較して有意に減弱された。さらに、膜安定量投与により有意に減弱された。なお、naiveラッ化 作 用 の な い β- ア ド レ ナ リ ン 受 容 体 拮 抗 薬

トにCNQX（30 nmol/side）を微量投与しても、条timolol（10 nmol/side）によっても有意に減弱され件付け前後での滞在時間に何ら変化は見られな

た 。 な お 、 naive ラ ッ ト に propranolol （ 30かった。同様に、非競合的NMDA受容体拮抗薬

nmol/side）あるいはtimolol（10 nmol/side）を両側

MK-801（30 nmol/side）あるいは競合的NMDA

CeA内に微量投与しても、条件付け前後での滞受 容 体 拮 抗 薬 D-CPPene （ 0.01 お よ び 0.1

在時間に有意な変化は見られなかった。次に、

nmol/side）によっても有意な減弱効果が認められ た 。 一 方 、 naive ラ ッ ト に MK-801 （ 3025

Fig.4 Effects of microinjection of β-adrenoceptor antagonists into CeA on the naloxone-precipitatedmorphine withdrawal-induced CPA. Animals were microinjected with vehicle, propranolol, timolol, atenolol
or butoxamine into bilateral CeA 10 min before i.p. injection of naloxone (0.3 mg/kg). ***P<0.001 vs
vehicle-microinjected naive rats. #P<0.05, ##P<0.01 vs. vehicle-microinjected morphine-dependent rats
(Bonferroni post hoc test). Numerals in parentheses indicate the numbers of rats used.

β1-受容体拮抗薬 atenololあるいはβ2-受容体拮

らの結果から、扁桃体亜核の中でも、BLAよりも

抗薬 butoxamineの効果を検討した。その結果、

むしろCeAがモルヒネ禁断場所嫌悪反応に重要

atenolol（30 nmol/side）あるいはbutoxamine（30な役割を果たしていることが示唆される。一方、

nmol/side）のCeA内微量投与により、場所嫌悪

グルタミン酸は広くシナプス機能の可塑的変化

反応は有意に減弱された。なお、naiveラットにに関与し、さらにモルヒネ依存形成・禁断症候発

atenolol （30 nmol/side）を両側CeA内に微量投

現にも重要な役割を果たしていることが知られて与しても滞在時間の差に何ら変化は見られず、

いる 4) 。今回の、in vivoマイクロダイアリシスおよbutoxamine（30 nmol/side）を微量投与することにび両側CeA内への薬物微量投与による検討から、より僅かに場所嫌悪反応を示したが、この効果はモルヒネ禁断時にCeAにおいてグルタミン酸が遊有意なものではなかった。

離され、このグルタミン酸がCeAのAMPA/kainate
受容体およびNMDA受容体を介してモルヒネ禁断場所嫌悪反応の発現に関与していることが示考察唆される。同様に古くからモルヒネ依存との関連

扁桃体は解剖学的に異なる幾つかの亜核からが指摘されてきたノルアドレナリン 5) に関しても、構成されており、近年ではそれらの亜核が、それモルヒネ禁断時にCeAで遊離が促進されること、

ぞれ異なる生理学的役割を担っていることが明ら

CeA内のβ1-およびβ2-アドレナリン受容体の活性1)かにされている 。本研究においても、ナロキソン化が重要な役割を果たしていることを示した。

誘発モルヒネ禁断場所嫌悪反応は、興奮性神経

CeA内のグルタミン酸神経系及びノルアドレナリ

毒により予めCeAを限局的に損傷しておくことにン神経系は、これまでにも条件付け恐怖刺激やより有意に減弱されるが、BLAの限局的損傷に

ストレスによる応答などに関与していることが報告

よっては変化が見られないことが示された。これされており6, 7)、様々なケースでの不快な精神症

26

4. Zhu H, Rockhold RW and Ho IK. The role ofglutamate in physical dependence on opioids.
Jpn J Pharmacol. 76:1-14, 1998
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27

扁桃体基底外側核へのモルヒネ微量注入による
疼痛関連嫌悪反応の抑制
南 雅文，山本潤希，町田泰一，谷本 幸，中川貴之，佐藤公道
京都大学薬学研究科生体機能解析学分野

Suppression of Pain-induced Aversive Response by Microinjection of Morphine
into the Basolateral Amygdaloid Nucleus
Masabumi Minami, Junki Yamamoto, Taiichi Machida, Sachi Tanimoto, Takayuki Nakagawa,
Masamichi Satoh
Department of Molecular Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
Kyoto University
Summary: Effect of morphine on the formalin-induced place aversion was examined when it was bilaterally injected into
the basolateral amygdaloid nucleus (BLA). Intra-BLA injection of morphine at a dose of 10 µg/side almost completely
suppressed the formalin-induced place aversion. Although the intra-BLA injection of the same dose of morphinesignificantly suppressed the formalin-induced nociceptive resposes such as lifting, licking and biting, the degree of the
suppression was low, suggesting that the suppressive effect of morphine on the conditioned place aversion was not
exclusively due to the analgesic effect of morphine. Microdialysis revealed that formalin-induced sustained pain evoked
the glutamate release in the BLA, and this evoked release was suppressed by the local application of morphine via themicrodialysis probe. Intra-BLA injection of MK801, but not CNQX or AP3, suppressed the formalin-induced place
aversion, while neither of these glutamate receptor antagonists affected the formalin-induced nociceptive responses.
These results suggest that intra-BLA injection of morphine produced suppressive effect on pain-induced aversive response
through the inhibition of the glutamate release in the BLA.
種々の機能差があることが明らかにされつつある。

序論

本研究室でもこれまでにμオピイオイド受容体が扁痛みに伴う情動反応（不快、不安、抑鬱）は患者の桃体亜核の中でも特に BLAにおいて強く発現していQOL を低下させるが、それに関わる神経機構およびること、さらに、ホルマリンの後肢足底皮下投与による物質的基盤はほとんど不明のままである。また、モル

侵害刺激によって、主として BLA において c-fos

ヒネの鎮痛作用、特にヒトにおける鎮痛作用には、こmRNA 発現が上昇することを明らかにしている。

のような負の情動反応の抑制が関与している可能性

そこで本研究では、ホルマリン後肢足底皮下投与が考えられる。

により惹起される侵害受容反応および疼痛関連嫌悪

一方、種々の情動反応との関連が報告されている反応に対する BLA へのモルヒネ微量注入の効果を

扁桃体は、中心核、基底外側核（BLA）、皮質内側核検討した。さらに、モルヒネの作用機序解明の手始めなどの複数の亜核から構成されており、各亜核間にとしてグルタミン酸神経系の関与を検討した。

28

マリン 100 µl をラット後肢足底皮下に投与し、侵害受方法

容反応の指標として lifting、licking および biting 行動を行った時間を 5 分間隔で 50 分間計測した。

使用動物

In vivo マイクロダイアリシス法

実験には Sprague-Dawley 系雄性ラット 6 週齢（体重 180-220g）を用いた。

透析用ガイドカニューレ（長さ 8.0 mm）を一側のBLA に埋め込み、ダミーカニューレを装着した。24

基底外側核への薬物投与

時間後にダミーカニューレを取り去り、透析プローブ

ペントバルビタール麻酔下（50 mg/kg, i.p.）、ラット（長さ 9.0 mm、うち透析膜長 1.0 mm）を装着した。灌を脳定位固定装置に固定し、bregma から尾側へ流開始から約 60 分後に、2%ホルマリン 100 µl を後肢1.8mm、外側へ 4.8mm、腹側へ 3.0mm の位置に両側

足底皮下投与し 10 分間隔で 60 分後まで灌流液を回性にガイドカニューレの埋め込み、５日間の回復期収した。なお、灌流路にはコイル状チューブおよび間の後、実験に用いた。薬物投与時には、インジェク

可動式連結具を用い、実験中ラットが無拘束でケーションカニューレはガイドカニューレに装着した際、ジ内を行動できるようにした。回収したサンプル中のその先端が頭蓋表面から腹側へ 8.5mm の位置に達グルタミン酸量は、高速液体クロマトグラフィー法によするように作製した。各薬物は、saline に溶解し、マイり定量した。

クロインジェクションポンプにより 0.5µl/min の流速で両側の BLA に各 1 µl を投与した。

組織学的検討実験終了後、BLA にクレシルバイオレットあるいは

条件付け場所嗜好性試験

チオニン 1 µl を両側性に投与した後、冠状切片を作

壁の色と床の材質が異なった 2 つのボックスからな製した。Nissle 染色の後、顕微鏡下で投与部位の確り、ラットが各々のボックスに滞在した時間を自動計認を行い、両側の BLA への投与が確認された個体測できる装置（夏目製作所製）を用いた。０日目に装からのデータのみを統計学的処理に用いた。

置への馴化を行い、１日目に中央のスライドドアを開け両ボックス間の移動が可能な状態でラットを入れ、結果それぞれのボックスに滞在した時間を 15 分間計測し、プリファレンスサイドを決定した。２日目の条件付け時

侵害刺激誘発場所嫌悪反応に対するモルヒネ BLAには、中央のスライドドアを下ろしボックス間の移動内投与の効果naloxone

ができない状態で、ラットに saline 100 µl を後肢足底30 µ g/side

30 µg/side

morphine

皮下投与し、ノンプリファレンスサイドに 60 分間閉じ
Change of time spent in preference side (sec)

込め、その後さらに 2%ホルマリン 100 µl を後肢足底皮下投与し、プリファレンスサイドに 60 分間閉じ込めた。３日目に、再び中央のスライドドアを開けた状態でテストを行い、ラットがプリファレンスサイドに滞在する時間を測定し、１日目と３日目でのプリファレンス
サイドでの滞在時間の変化を求めた。各薬物は、ホルマリン後肢足底皮下投与 5 分前に BLA へ両側性に投与した。

0

saline(n=8)

1 µg/side(n=7)

10 µg/side(n=9)

10 µ g/side(n=12)

(n=9)

-50

-100

-150

-200

-250

##

#

-300

Fig. 1 Effect of intra-BLA injection of morphine on the

ホルマリンテスト

formalin-induced place aversion. #, ##, P < 0.05 and 0.01.

両側 BLA への薬物の微量投与 5 分後に 2 %ホル

29

（A）
ホルマリン後肢足底皮下投与により、条件付け前

#

300

##

##

H
E

HE
JB

HE

Nociceptive behaviors (sec)間が有意に短縮し、場所嫌悪反応が惹起された（Fig. 1）。この場所嫌悪反応は、ホルマリンによる条件付けの 5 分前にモルヒネ 1 および 10 µg/side を両

E
B

J

# H

200

HE

*

B

と比較して条件付け後のプリファレンスサイド滞在時

#

HE
B
J

E
HJB

H
E

B
B

**
J

B

J

**J

# H

E
B

J

E
B
J
H

*

##

100

saline (n=5)
morphine 1 µ g/side (n=4)
morphine 10 µ g/side (n=4)
morphine 10 µ g/side+ naloxone 30 µg/side (n=5)

H
E
J

側 BLA 内に微量投与することにより濃度依存的に

B

** J

0

抑制され、モルヒネ 10 µg/side では、ほぼ完全に有

0

10

20

30

40

50

Time after injection of formalin (min)意に抑制された。また、この抑制作用はナロキソン（B）

30 µg/side を同時投与することにより有意に拮抗さ

##

**

3000
Nociceptive behavior (sec)

れたが、ナロキソン 30 µg/side 単独投与ではホルマ
リン誘発場所嫌悪反応に対して影響は認められなかった。
なお、図には示さないが、ホルマリンの代わりに

saline (n=5)
morphine 1 µg/side (n=4)
morphine 10 µg/side (n=4)
morphine 10 µg/side+ naloxone 3 0 µg/side (n=5)

*

#

2000

##

**

1000

*

0
phase 2( 10-50 min)phase 1(0-10 min)saline を後肢足底皮下投与したラットにおいては、場所嫌悪反応は惹起されず、saline の後肢足底皮下投Fig. 2 Effect of intra-BLA injection of glutamate receptor antagonists

与５分前にモルヒネ 10 µg/side の BLA 内投与を行っ

on the formalin-induced aversive responses. Time course (A) and

た群では有意な場所嫌悪反応および場所嗜好反応

AUC (B) of the aversive responses. *, **, P < 0.05 and 0.01のどちらも惹起されなかった（10.0 ± 26.8 sec）。

compared with the saline-injected group. #, ##, P < 0.05 and 0.01
compared with the morphine (10 µg/side)-injected group.
###

侵害受容反応に対するモルヒネ BLA 内投与の効果

#

12000
Extracellular glutamate level

両側 BLA 内にモルヒネ 1 および 10 µg/side を微量投与することにより、ホルマリン後肢足底皮下投与により誘発される二相性の侵害受容反応は、saline
投与群と比較して有意に抑制されたが、その抑制率はわずかであった（Fig. 2）。

saline i.pl.
10000

formalin i.pl.
# P < 0.05 ,## P < 0.01
(Mann-Whitney's U-test)

8000
6000
4000
2000
0

また、この抑制作用は、ナロキソン30 µg/sideを同時

30 µM
Ringer perfusion

投与することにより拮抗された。

100 µ Mmorphine perfusion

Fig. 3 Effect of morphine on glutamate release in the BLA induced
by intraplanter injection of formalin.

In vivo マイクロダイアリシス
ホルマリン後肢足底皮下投与群では、saline 注射群

侵害刺激誘発場所嫌悪反応に対するグルタミン酸と比較して BLA での細胞外グルタミン酸量の増加が受容体拮抗薬 BLA 内投与の効果認められた（Fig. 3）。この細胞外グルタミン酸量の増

ホルマリンの条件付けによる場所嫌悪反応は、1 お

加は、還流液中にモルヒネ30および100µMを加える

よび 10 nmol/side の MK801 の両側 BLA 内投与にことにより濃度依存的に減少した。

より用量依存的に抑制され、10 nmol/side の MK801
によりほぼ完全に抑制された（Fig.4）。

30

MK-801
saline(n=18)

Change of time spent in preference side (sec)0

10 nmol/side(n=10)

1 nmol/side
(n=7)

CNQX

AP-3

30 nmol/side(n=11)

30 nmol/side(n=11)

侵害受容反応に対するグルタミン酸受容体拮抗薬
BLA 内投与の効果
NMDA 受容体拮抗薬 MK801 （10 nmol/side ）、
nonNMDA 受容体拮抗薬 CNQX（30 nmol/side）
、および

-50

代謝型グルタミン酸受容体拮抗薬 AP3（30 nmol/side）いず
れの BLA 内投与も、ホルマリンによる侵害受容反応に影響-100を及ぼさなかった（Fig. 5）
。
-150
#

考察

-200

Fig. 4 Effect of intra-BLA injection of morphine on the

ホルマリン後肢足底皮下投与により惹起される場
所嫌悪反応は、モルヒネのBLA内投与により用量依

formalin-induced place aversion. #, P < 0.05.

存的に抑制された。このモルヒネの抑制作用はナロ

一方、30 nmol/side CNQX 、および AP3 30

キソンの同時投与によって有意に拮抗された。モル

nmol/side の投与では場所嫌悪反応に対して有意な

ヒネ側脳室内投与により、条件付け場所嗜好性試験

影響は見られなかった。また図には示さないが、ホにおいて嗜好性が惹起されるという報告があるが１、ルマリンの代わりに saline を後肢足底皮下投与した

saline 後肢足底皮下投与群へのモルヒネ BLA 内投群においては、10 nmol/side のMK801のBLA内投

与では場所嗜好性が惹起されなかったことから、本与では有意な場所嫌悪反応および場所嗜好反応の実験で見られたモルヒネの場所嫌悪反応抑制作用

どちらも惹起されなかった（0.0±36.4）。

は、ホルマリンにより惹起される場所嫌悪反応がモ(A）

ルヒネの報酬効果によって相殺された結果ではな



Nociceptive behaviors (sec)

300
J
H
E

E
JH

B
E
HJ

E
HBJ

いと考えられる。また、ホルマリン後肢足底皮下投与により惹起される侵害受容反応も、モルヒネ BLA 内

B

B

200

HE
B
J

HJ
E

E
HBJ

E
HB
J

B

投与により有意に抑制されたが、その抑制の程度はE

10 µg/side の用量でも小さいものであった。一方、

B
H

100

B
E

J

E
B
J
H

場所嫌悪反応はモルヒネ 10 µg/side の BLA 内投与

saline (5)MK-801 10 nmol/side (5)CNQX 30 nmol/side (5)AP-330 nmol/side (7)によりほぼ完全に抑制されたことから、この抑制効

HJ

果をモルヒネの鎮痛効果に専ら帰することはできな

0
0

10

20

30

40

50

いと考えられる。以上より、モルヒネは BLA 内に存Time after injection of formalin (min)（B）

在するオピオイド受容体に作用し侵害刺激により惹

Nociceptive behavior (sec)3000

saline (n=5)
MK-801 10 nmol/side (n=5)
CNQX 30 nmol/side (n=5)
AP-330 nmol/side (n=7)

起される嫌悪反応を抑制することが示唆される。
グルタミン酸は、中枢神経系の種々の領域にお2000

いて神経機能の可塑的変化に関与していると考えられている。また、脊髄では痛覚情報の重要な伝達物

1000

質であることが知られている。本研究において、ホルマリン後肢足底皮下投与による持続性疼痛により0phase 1(0-10 min)BLA において細胞外グルタミン酸量が増加した。さphase 2(10-50 min)

らに、このグルタミン酸遊離量増加は、マイクロダイ

Fig. 5 Effect of intra-BLA injection of glutamate receptor

アリシス灌流液中にモルヒネを添加することにより有antagonists on the formalin-induced aversive responses. Time

意に抑制された。BLA に終末を有するグルタミン酸

course (A) and AUC (B) of the aversive responses.

31

作動性神経が疼痛刺激により活性化されること、さら以上の結果より、モルヒネは、ホルマリン誘発持に、BLA 内に局在するオピオイド受容体がグルタミ

続性疼痛により惹起される BLA でのグルタミン酸遊

ン酸遊離を抑制的に調節していることが示唆され

離を抑制することにより、BLA内ＮＭＤＡ受容体を介る。

して起こる場所嫌忌反応を抑制することが示唆されホルマリンにより惹起される場所嫌悪反応に対する。

る各種グルタミン酸受容体アンタゴニストの効果を検参考文献討したところ、10 nmol/side の MK801 により場所嫌悪反応がほぼ完全に抑制されたが、30 nmol/side の

1) Minami M. Satoh M. Molecular bioogy of the opioid

CNQX および AP3 では有意な影響は見られなかっreceptors: structures, functions and distributions. Neurosci.

たことから、ホルマリン後肢足底皮下投与により惹起Res. 23: 121-145, 2002

される持続性疼痛が BLA 内においてグルタミン酸

2) Katsuya A. Yamamoto J. Machida T. Tanimoto s. Nakagawa

遊離を増大させ、NMDA 受容体を介して場所嫌悪

T. Minami M. Satoh M. Effects of somatic and visceral

反応を引き起こしている可能性が示唆される。

noxious stimuli on the expression of c-fos mRNA and

MK801 の BLA 内投与がホルマリンによる侵害受容extracellular glutamate level in amygdala. Jpn. J. Pharmacol.

反応に影響を及ぼさなかったことから、MK801 の場

85 (Suppl. 1): 221P, 2001

所嫌悪反応抑制効果は鎮痛作用によるものではな

3) Suzuki T. Conditioned place preference in mice. Methods

いと考えられる。

Find Exp. Clin. Pharmacol., 18: 75-83, 199632

2,6-Dimethyl-L-tyrosine (Dmt) のオピオイドミメテイックス
開発への応用
岡田芳男１，２、津田裕子１，２、宮崎杏奈１、横井利夫１，２、藤田快男１、藤沢豊１、塩谷公隆１、
佐々木有亮３、安保明博３、Sharon D. Bryant4, Lawrence H. Lazarus4
神戸学院大学薬学部１・ハイテクリサーチセンター２、東北薬科大学３、米国立環境保健研究所４

Application of 2,6-Dimethyl-L-tyrosine (Dmt) to the Development of Opioid
Mimetics
Yoshio Okada1,2, Yuko Tsuda1,2, Anna Miyazaki1, Toshio Yokoi1,2, Yoshio Fujita1, Yutaka Fujisawa1,
Kimitaka Shiotani1, Yusuke Sasaki3, Akihiro Ambo3, Sharon D. Bryant4, Lawrence H. Lazarus4
Faculty of Pharmaceutical Sciences1 and High Technology Research Center2, Kobe Gakuin
University, Japan; Tohoku Pharmaceutical University, Japan3;
National Institute of Environmental Health Science, USA4
Summary: Endomorphins (Tyr-Pro-Trp/Phe-Phe-NH2) are potent and µ-selective mammalian endogenous
opioid ligand. Dmt-Pro-Phe-Phe-NH2 exhibited more potent binding activity for μ- and δ-opioid
receptors than Endomorphin-2 with Ki values of 0.15 (4.6 times) and 28.2 (330 times) nM, respectively.
In this presentation, we discuss the effect of Dmt on interaction between ligands and opioid receptors.

緒言

実験方法

我々の生活習慣が変遷し、また高齢化社会を迎えた今日、がん、心疾患、脳血管疾患が死亡原因の上位を占めている。中でもがんは増加の一途をたどっており末期がん患者の疼痛緩和は解決されなければならない大きな課
題である。脳内に存在するオピオイド受容体を介して痛みが制御されており、鎮痛薬として主にモルヒネが使用されている。しかしながらモルヒネ使用時に伴う種々の副作用を考えるとき、それに替わりうる新しいタイプの体にやさしい鎮痛薬を開発しなければならない。我々は内因性オピオイドリガンドの構造をモデルにしてペプチド誘導体を合成し、構造―活性相関についての検討を続けている。
今 回 オ ピ オ イ ド ペ プ チ ド で あ る
Endomorphin‑2(1)( 以 下 EM‑2) 中 の Tyr を
2,6-dimethyl-L-tyrosine(2)(以下 Dmt) (Figure‑1)に置換し、それらの活性を測定し、Dmt の invivo, in vitro 活性に及ぼす影響を検討したので報告する。

ペプチド及びペプチドミメテイックスの合成
この報告で使用するペプチド及びペプチド
ミメテイックスは液相法により合成された。その一例を Scheme‑1 に示す。
Phe

Phe
Boc

Boc

OH

Boc

OH

NH2
NH2
NH2
NH2

(a)

(c)

Boc
H

H

OH

(a)

(b)

Boc
Boc

H

H

NH2
(a)

(b)

Boc

(a)

NH2
NH2
NH2

Reagents:(a) HCl/dioxane, (b) IBCF, NMM, (c) PyBop, DIPEA

Scheme-1. Synthetic scheme for [Dmt1]EM-2.
分析機器類
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）には
Waters 600E を 使 用 し た 。 カ ラ ム に は
COSMOSIL-5C18-AR を 用 い 、 移 動 相 に は
A:0.05% TFA 水溶液、B:0.05%TFA アセトニト
リル溶液を用いた。
NMR 測定には Bruker DPX400 を用い、内部標準物質としてテトラメチルシラン（δ: 0ppm）を用いた。

HO

H 2N

Pro

Dmt

COOH

Figure-1. Structure of 2,6-dimethyl-L-tyrosine(Dmt).

33

質量分析にはマトリックス支援レーザーイ
オン化飛行時間型計測質量分析装置（MALDI
TOF-MS）を使用した。数値は[M+H]+で表した。マトリックスにはシナピン酸を用いた。
ＣＤ測定には JASCO J-725 を用い、0.01,
0.02, 0.1cm のセルを用い、サンプルを溶媒 neat
TFE (2,2,2-trifluoroethanol)に溶かし、室温で測定した。
オピオイド受容体との結合実験
化合物をラットの脳シナプス分画膜に[3H]
ラベル化したµ-受容体に特異的なリガンドである DAMGO (Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-Gly-ol)、δ-受容体に特異的なリガンドである DPDPE(cyclic[Tyr-Pen-Gly-Phe-Pen])をそれぞれ用い、それらとサンプルを競合拮抗させることにより Ki 値を求めオピオイド受容体との親和性の指標とした。
µ-及びδ−、
及びδ−オピオイド受容体に対する
δ−オピオイド受容体に対する agonist、
antagonist の評価
モルモット回腸 (Guinea Pig Ileum, GPI) ＝µ agonist assay、マウス輸精管 (Mouse Vas
Deference, MVD) ＝ δ agonist assay
GPI、MVD を用いてµ-及びδ−オピオイド受容体に対する agonist の評価を行った。試験方法はモルモット回腸、マウス輸精管にそれぞれ電気刺激を与えた時の筋肉の収縮を 50%阻害するのに要したサンプル量 IC50 値を測定し、µ-及びδ-受容体に対する agonist 活性の指標とした。

構成アミノ酸の活性に及ぼす影響を検討しその結果を Table‑1 にまとめた。予想どおり 1
位 Tyr を Ala に置換した化合物の結合活性が最も弱く、1 位 Tyr の重要性が理解される。1
位 Tyr を Dmt に置換するとμ―受容体結合活性は 4.6 倍、δ―受容体結合活性は 330 倍上昇した。また Endomorphin‑2 のＣ末端からアミノ酸を除去して得られる Tyr‑Pro‑Phe‑NH2と Tyr‑Pro‑NH2 はそれぞれ Ki μ=46.3, Ki δ
=15,900 及び Ki μ=26,107, Ki δ=40,126 nMを示した。これら両者の Tyr を Dmt に置換した化合物 Dmt‑Pro‑Phe‑NH2 と Dmt‑Pro‑NH2 はそれぞれ Kiμ=0.12, Kiδ=532 及び Kiμ=41.7,
Kiδ=734.9 nM を示した。この結果は Tyr 誘導体と受容体との相互作用が弱い場合にも Dmt
置換する事により相互作用を強化することができる。Tyr 誘導体と受容体との相互作用がもともと強い場合には Dmt に置換しても増強の度合いは小さい。これらのことから Dmt の役割を類推することができる。Dmt 置換による結合活性増加の度合いを Figure‑1 に示す。
Figure‑2 に [Ala1]EM‑2, EM‑2, [Dmt1] EM‑2の CD スペクトルを示す。また NMR を用いたコンフォーメーション解析の結果、DMSO 中、
Tyr-Pro-X は trans 体が多く存在しているのに
対し、Dmt-Pro-X は cis 体が多く存在していることが分かった。Table-3 に Tyr 誘導体とそれぞれに相当する Dmt 誘導体の GPI, MVD 活性を示す。[Dmt1]EM-2 の GPI 活性は EM-2 のそれに較べ 81.5 倍の活性を示している。これは化合物の酵素抵抗性の増強と関連しているものと考えられる(4)。

結果及び考察Ｉ Endomorphin-2 置換体について
先ず、Endomorphin-2 (EM-2)を基本骨格としTable-1. The binding activities of EM-2, [Dmt1]EM-2, and their analogues.
[3H]DAMGO[3H]DPDPE
Binding selectivity
Kiδ (nM)
Kiδ/KiµKiµ (nM)
R.P.
R.P.
Compounds
EM-2
0.69 ± 0.16
19230 ± 200
1
13400[des-Phe4]EM-2(3)46.3 ± 3.8
0.015
15900 ± 2300
0.58
343
H-Tyr-Pro-NH2
26107 ± 1397
(3) 2.6x10-6
40126 ± 1115
(3) 0.23
1.5
APFF-NH216750 ± 6242
(3) 4.1x10-64722 ± 650
(4)
2
0.3
3466 ± 710(4) 2.7
1
YAFF-NH23272 ± 283(3) 2.1x10-5
YPAF-NH2
257.4 ± 9.7(3)0.00272658 ± 738(4) 3.5
10
YPFA-NH2
65.7 ± 2.3
(3)
0.011
3740 ± 662(4) 2.5
57[Dmt1]EM-2
0.15 ± 0.035(3)
4.6
28.2 ± 8.1(3) 330
188
H-Dmt-Pro-Phe-NH2
0.12 ± 0.09
(3)
5.8
53.2 ± 6.1(3) 170443
41.7 ± 1.2(3)
1.7734.9 ± 97(3) 12.6
24
H-Dmt-Pro-NH2
Displacement of [3H]DAMGO (µ-selective) and [3H]DPDPE (δ-selective) from rat brain membrance synaptosome.
The Ki values are the mean ± SEM. The potency is relative to that of EM-2.

34

Table-2. The cis/trans ratio of [Dmt1]EM-2 andits Analogues in DMSO.
Increasing ratio forµ- and δ-opioid receptor

700µ

cis : trans a
EM-1
1 : 3 (5)EM-2
1 : 2 (6)4[des-Phe ]EM-2
1:2[Dmt1]EM-2
7:3
H-Dmt-Pro-Phe-NH2
13 : 7
H-Dmt-Pro-NH2
5:3
aDetermined by integration of the 1H NMR.

δ

600
500
400
300
200
100
0

-PFF-NH2-PF-NH2-P-NH2

Table-3.

X=

The GPI and MVD assay[Dmt1]EM-2 and its Analogues
GPI assay*1

Figure 2. Increasing ratio in binding activities of
EM-2 analogues for µ- and δ-opioid
receptors by substitution Tyr with Dmt.

MVD assay*2

Compounds

IC50 (nM)

R.P.

IC50 (nM)

EM-2

5.79 ± 0.41344 ± 931

0.071 ± 0.016 81.5 1.87 ± 0.6

1842.33 ± 0.49

3.0

[Dmt1]EM-2
H-Dmt-Pro-Phe-NH2

50

of

2.5

113 ± 35

R.P.

*1 Values are the mean of seven experiments ± SEM.
*2 Values are the mean of six experiments ± SEM.

The potency is related to that of EM-2.

40

Ⅱ Endomorphin Ｃ末端部の置換
我々は EM-2 の構造活性相関に関する研究を行い、YPF-NH2 でもオピオイド受容体に弱いながら結合することを報告した(3)。EM-2 の
4 位の Phe-NH2 を様々なアミンに置換した
EM-2 誘導体、更にそれらの 1 位の Tyr を Dmtに置換した[Dmt1]EM-2 誘導体を合成し、オピ
オイド受容体との結合活性を検討した。
YPF-NH-X のシリーズの中に EM-2 よりµ−受容体結合活性の強い誘導体は得られなかった。
YPF-NH-C2H4-Ph は EM-2 の C 末端の-CONH2基を除去した構造で、受容体との結合活性に-CONH2 基が重要である事が示された。これら誘導体の 1 位の Tyr を Dmt に置換すると、µ及びδ-受容体に対する結合活性が共に上昇し、EM-2 と同等若しくはそれ以上の結合活性を示した(Figure-4)。特にµ-受容体に対して 1 nM
以下の結合活性を示した。しかしながら、δ受容体に対する結合活性が上昇した為、EM-2の特徴であるµ-受容体選択性は著しく低下した。

-1[θ]m x 10 (deg cm dmol )

30

2

20

3

10

0

-10

-20

-30

190

200

220

240

260

Wavelength (nm)Figure-3. CD spectra of EM-2, [Dmt1]EM-2 andtheir analogues in neat TFE. 0.993mM
EM-2 (―), 1.25mM APFF-NH2 (●),
1.00mM [Dmt1]EM-2 (×).

35

1Table-4. The binding activities of EM-2, [Dmt ]EM-2, and their analogues.
3[ H]DAMGO[3H]DPDPE
Binding selectivity
CompoundsKiδ (nM)
Kiδ/KiµKiµ (nM)
EM-2
0.69 ± 0.169230 ± 200
13400[des-Phe4]EM-2
46.3 ± 3.8
15900 ± 2300
343
H-Tyr-Pro-Phe-NH-C2H4-Ph
13.3 ± 2.6(3)4310 ± 635(3)324
H-Tyr-Pro-Phe-NH-1-Nph
2.41 ± 0.5(4)3640 ± 1260
(4)
1510
H-Tyr-Pro-Phe-NH-3-Qln
55.75 ± 5.03
(4)18600 ± 1740
(3)333
H-Tyr-Pro-Phe-NH-5-Qln
4.07 ± 0.45
(4)12700 ± 2470
(3)
3110
H-Tyr-Pro-Phe-NH-6-Qln
72.9 ± 6.6(4)9880 ± 2640
(3)
136
H-Tyr-Pro-Phe-NH-8-Qln
249.2 ± 20.6
(4)17100 ± 3590
(3)
68
H-Tyr-Pro-Phe-NH-5-Isq
61.11 ± 14.2
(5)3480 ± 640(3)570.15 ± 0.035(3)
28.2 ± 8.1(3)[Dmt1]EM-2
188
H-Dmt-Pro-Phe-NH2
0.12 ± 0.09
(3)
53.2 ± 6.1(3)
443
H-Dmt-Pro-Phe-NH-C2H4-Ph
0.51 ± 0.15
(3)18.0 ± 2.5(3)35
H-Dmt-Pro-Phe-NH-1-Nph0.29 ± 0.037(4)
19.9 ± 3.0(4)68
H-Dmt-Pro-Phe-NH-3-Qln
0.33 ± 0.017(4)
190.4 ± 22.3
(3)580
H-Dmt-Pro-Phe-NH-5-Qln
0.11 ± 0.014(3)30 ± 3.8(3)283
H-Dmt-Pro-Phe-NH-6-Qln
0.22 ± 0.038(4)
46.6 ± 2.4(3)
212
H-Dmt-Pro-Phe-NH-8-Qln
0.49 ± 0.057(5)33.1 ± 1.71
(4)
68
H-Dmt-Pro-Phe-NH-5-Isq
0.19 ± 0.018(5)
98.3 ± 8.83
(4)517
Displacement of [3H]DAMGO (µ-selective) and [3H]DPDPE (δ-selective) from rat brain membrance synaptosome.
The Ki values are the mean ± SEM.

nM、Kiδ = 435 nM と最も結合活性が強かった。
一方 Dmt を導入した化合物群では n = 3 が Kiµ= 0.042 nM、n = 2 が Kiδ = 7.26 nM と最も結合活性が強かった。

Increasing ratio forµ- and δ-opioid receptor

600
500
µ

δ

HO

R

n = 1-4
R = H or Me

400

N

300

H
N

R
H2N

200

O

( )n

N
H

O

( )n
N
H
O

NH2
R

R

100

Compounds

Ki δ (nM)n = 4 R = H 2185 +/- 133= 4 = Me 23.2 +/- 2.5= 3 = H 434.7 +/- 84= 3 = Me 13.2 +/- 1.7= 2 = H 2902 +/- 587= 2 = Me 7.26 +/- 1.2= 1 = H 1833 +/- 520= 1 = Me 15.7 +/- 2.1

0

l
l
l
l
l
l
oly oly oly oly
thy thy
ne aph quin quin quin quineph 1-n58- -iso35
C-terminal

Ki µ (nM)
70.2
0.114
25.7
0.042
308.5
0.115
460
1.16

OH

δ/µ

+/- 4.831+/- 0.0078 204+/- 3.0
17+/- 0.003 314+/- 11.2
9.4+/- 0.009 63+/- 144.0+/- 0.18
13.5

Displacemnt of [3H]-DAMGO (µ-selective) and [3H]-DPDPE(δ-selective) from rat membrane synaptosome. Values are means +/-S.E.

Figure 4. Increasing ratio in binding activities of
EM-2 analogues for µ- and δ-opioid
receptors by substitution Tyr with Dmt.

Figure-5. Structure and receptor binding profilesof
opioidmimetics
containing
pyrazinone ring.

Ⅲ ピラジノン環を含む Dmt 誘導体
Figure-5 に示すようなピラジノン環の側鎖アミノ基に Tyr 又は Dmt を導入し、更にメチ
レン鎖の長さを変えたオピオイドミメティク
ス(7)を合成し、オピオイド受容体との結合活性を検討した。ピラジノン環側鎖に Tyr を導入した一連の化合物群では、
n = 3 が Kiµ = 25.7

Tyr から Dmt への置換による結合活性の上昇
は Figure-6 に示すようにµ-及びδ-受容体共に n= 2 が最も上昇した。

36

for µfor δ

Increasing Ratio

3000

for µ
for δ

2500
2000
1500
1000
500
0

1

2

3

for delta
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0

450
400
350
300
250
200
150
100
50
0

R

R
H2N

H
N

H
N
[CH2]n

OH

R
NH2

O
O
n = 2,4,6 or 8.
R = H or Meδ/µKi δ (nM)

Ki µ (nM)

Dmt-NH-(CH2)2-NH-Dmt

116 +/- 10.6

1.43+/- 0.01

81

Dmt-NH-(CH2)4-NH-Tyr
Dmt-NH-(CH2)4-NH-Dmt
Dmt-NH-(CH2)6-NH-Dmt
Dmt-NH-(CH2)8-NH-Dmt

133 +/- 18
53.4 +/- 14.8
46.1 +/- 8.8
14.8 +/- 3.0

0.38+/- 0.02
0.041+/- 0.003
0.053+/- 0.01
0.19+/- 0.024

349
1300
870
78

Compounds

for delta

7000
5000
3000
1000
0
n=

6

n=

8

Figure-8. Increasing ratio in binding activities of
opioid mimetics containing diaminoalkane,
H-Dmt-NH-(CH2)n-NH-Dmt-H..

Ⅳ メチレン鎖を含む Dmt 誘導体
次にピラジノン環をより簡単な構造にするためにジアミノアルカンを用い、Figure-7 に示すオピオイドミメティクス合成した。
R

for mu9000

for mu

2
t)
t)
Dm
Dm
n=
no
(di
o
4
m
=
4(
n
n=

4

(n)
Figure-6. Increasing ratio in binding activity by
substitution of Tyr with Dmt for µ- andδ-receptor.

HO

Increasing ratio

Displacemnt of [3H]-DAMGO (µ-selective) and [3H]-DPDPE(δ-selective) from rat membrane synaptosome. Values are means +/-S.E.

Figure-7. Structure and receptor binding profilesof opioid mimetics containing diaminoalkane,
H-Dmt-NH-(CH2)n-NH-Dmt-H.
ここでも Dmt 置換は Figure-8 に示すように、結合活性を上昇させた。これらの結果は、Dmtの治療薬への応用の可能性を示唆している。

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