2010 JULY
No. 563

2010 年（平成 22 年）7 月号

第 56 巻 第 4 号（通巻 563 号）

挨拶・巻頭言鳥，ブタ，そしてパンデミックインフル
エンザ騒動を振り返る ......喜 田宏（ 2 ）

獣医病理学研修会
第 49 回 No. 984 マウスの精巣腫瘤................................. 残留農薬研究所（ 3 ）第 49 回 No. 973 スナメリの心嚢部腫瘤..................... 鳥取大学獣医病理学教室（ 4 ）レビュー
抗体医薬品の研究開発........................................鈴 木 雅 実（ 5 ）発表論文紹介Detection of Five Avian Eimeria
Species by Species-Speciﬁc Real-TimePolymerase Chain Reaction Assay....................................... 川 原 史 也（12）お知らせ
研修者・見学者受け入れ状況................ （16）
柏崎評議員 瑞宝中綬章 受賞 ............ （16）http://nibs.lin.gr.jp/2（42）

日生研たより鳥，ブタ，そしてパンデミックインフルエンザ騒動を振り返る
喜田宏

H5N1 高病原性鳥インフルエンザウイルスによる家禽と野生水禽の被害が，ユーラシアとアフリカの 62
カ国に拡がった。内 15 カ国では，6 年間に，計 495 名のヒトがこのウイルスに感染し，6 割が死亡した（2010
年 4 月 21 日現在）。中国，ベトナム，インドネシアと，2006 年からはエジプトが，家禽に不活化ワクチンを接種して，摘発淘汰を怠ったために，H5N1 ウイルスが 10 年以上も感染を拡大し，抗原変異まで起こしたのである。さらに，これら 4 カ国が，ヒトの H5N1 ウイルス感染例数の 87 % を占める。
斯かる背景の下で，H5N1 鳥インフルエンザウイルスがヒトにおける伝播能と病原性を獲得してパンデミックを起こすのは，秒読み段階との妄想の基に対策が執られた。日本では，プレパンデミックワクチンと称して，不活化 H5N1 ウイルス完全粒子に水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして加えたワクチンを成人のみならず，3 歳以下の幼児を含む 6,000 人余に接種する臨床試験が実施された。これに驚いた外国の識者から「日本は何故このように無駄な暴挙に走るのか」との抗議や質問が寄せられ，返答し辛くて困ったものである。
鳥インフルエンザとパンデミック対策の基本は，まず，「感染家禽の摘発，淘汰により，被害を最小限にくい止めるとともにヒトの健康と食の安全を守る。鳥インフルエンザウイルスを鳥に止める」ことである。
次に，「過去のパンデミックウイルスの出現にブタが関与したことには疑いがないので，ブタインフルエン
ザの疫学調査を，特に鳥インフルエンザの多発地である中国，東南アジア，北・中米で継続実施する」ことである。2004 年以来，これらを OIE（国際獣疫事務局，世界動物衛生機関と自称），WHO と各国に提案してきた結果，本年になってようやく一部が OIE の鳥インフルエンザ対策の指針に記述されることとなった。
残念ながら，WHO，わが国の厚生労働省と多くの所謂専門家は，未だに，「H5N1 鳥インフルエンザウイル
スはヒトに対しても 高毒性 で，これがパンデミックウイルスの本命」と 警告 している。
昨年 4 月，メキシコで，ブタ由来 H1N1 インフルエンザウイルスがヒトに伝播して，米国にその感染が拡大していることがわかった。WHO は 6 月に，パンデミックの段階に至ったと宣言した。日本では，これを「新型インフルエンザ」と呼び，流行防止を図ろうとしたが，対策に一貫性は見られなかった。
「毒性の高いH5N1 ではなく，季節性インフルエンザ並みの毒性の低い H1N1 なので，これまでの新型インフルエンザ対策を緩める」とした。インフルエンザウイルスは毒素ではないので， 毒性 は誤用であり， 新型インフル
エンザ も「インフルエンザとは異なる，怖い病気」との誤解を招いている。そもそもブタのウイルスがヒトに伝播してすぐには，ヒトに高い病原性を示すことはない。鳥インフルエンザウイルスも同じである。インフルエンザウイルスの病原性は，感染した宿主体内における増殖の速さと量によって決まるからである。
これがヒトからヒトに感染伝播を繰り返すうちに，ヒトでよく増殖する子孫ウイルスが選択される結果，ヒトに対して高い病原性を示すのである。第二波の病原性が高いのは 謎 ではない。当たり前である。現に，このブタ由来 H1N1 パンデミックウイルスは，出現してから 1 年間に，214 カ国に感染が拡がったが，確認された死亡者は 17,919 名（4 月 25 日現在）に止まり，季節性インフルエンザによるそれよりはるかに少ない。
おそらく，日本だけでも数千万人がこのウイルスに既に感染した，すなわち，不顕性感染が圧倒的に多かったものと推察する。
日本だけで毎年数千名以上を死亡させ，数百名以上に脳症，多臓器不全を起こしている，季節性インフル
エンザウイルスこそ，恐るべき相手なのである。しかるに，季節性インフルエンザ対策を放置して，新型，
新型と大騒ぎするのは見当違いである。日本政府は，一千億円超を投じてこのブタ由来 H1N1 ウイルスワク
チンを一億ドースも国外企業から輸入するという途方もない契約を交わしてしまった。これまで日本の季節性ワクチンの年度毎の総接種量でさえ，三千万ドースを超えたことはない。輸入品のほとんどが使われずに廃棄されるであろう。
インフルエンザのような人獣共通感染症については，自然界から人間社会に至る病因微生物の生態，伝播経路，感染と宿主生体の応答としての発症，免疫と宿主集団の疫学をトータルで捉えて，対策に活かす視点
が欠かせない。昨今のインフルエンザ騒動は，斯かる姿勢が定まらない，所謂専門家，行政（WHO などの国際機関を含む），メディアの人々の大合唱によって引き起こされたものである。感染症の本質を踏まえた，
筋の通った情報発信を望むものである。特に行政には，「危機管理とは一般市民に安全・安心を齎すための方策であって，徒に危機感を煽ることではない」ことを強調したい。
（北海道大学大学院獣医学研究科教授・同大学人獣共通感染症リサーチセンター長）

56（4）
，2010

3（43）

マウスの精巣腫瘤
残留農薬研究所

第 49 回獣医病理学研修会 No. 984

動物：マウス，Crlj : CD1（ICR），雄，84 週齢。
臨床事項：発がん性試験に用いた投与群の動物で，79週間投与終了後に計画殺。剖検の 1 週間前より外陰部の腫脹。
剖検所見：右側精巣に直径約 20 mm の淡褐色腫瘤。
組織所見：腫瘍細胞は卵円形から紡錘形の核を持ち，腫瘤の辺縁部（図 A）では微細〜中程度の空胞を有する細胞が充実性に増殖し，中央部（図 B）では好酸性の細胞質を持つ細胞が時に花筵様に増殖していた。核の異型性や分裂像とともに，出血，壊死，被膜への浸潤像が観察され，一部の壊死周囲では pseudopalisading が認められた。腫瘍細胞は oil red O に陽性（図 C），免疫染色では
inhibin（図 D），S‒100（図 E），α‒smooth muscle actin（αSMA，図 F），vimentin に陽性，androgen receptor に陰性であった。腫瘍内部には，萎縮精細管や eosinophilic globule cell が散見された。Bar ＝ 20μm。
診断：Malignant Leydig cell tumor，spindle cell type
考察：紡錘形細胞の増殖より当初，間葉系由来の腫瘍を疑った。しかし，脂肪の蓄積や卵円形細胞の集蔟巣，免疫染色の結果から，Leydig cell 由来が示唆された。一般に Leydig cell tumor はαSMA 陰性であり，ヒトでαSMA陽性を示す腫瘍として Incompletely differentiated（unclassiﬁed）sex cord/gonadal stromal tumor が 知 ら れ ている。しかし，この未分化腫瘍ではほとんどの腫瘍細胞がαSMA 陽性を示すため，本症例の染色パターンとは異なっていた。Leydig cell の progenitor cell はαSMA 陽性を示すことから，腫瘍細胞の 脱分化 を反映している可能性も考えられた。
（吉田敏則，大沼 彩）
参考文献：
Magro, G., Gurrera, A., Gangemi, P., Saita, A. and Greco,
P. 2007. Incompletely differentiated（unclassified）sex
cord/gonadal stromal tumor of the testis with a purespindle cell component : report of a case with diagnostic
and histogenetic considerations. Pathol. Res. Pract. 203 :759‒762.

4（44）

日生研たよりスナメリの心嚢部腫瘤
鳥取大学獣医病理学教室

第 49 回獣医病理学研修会 No. 973

動物：イルカ，スナメリ（Neophocaena phocaenoides），
対する抗体には陰性を示した。肺，縦隔リンパ節および雄，成体（年齢不詳）。
膵十二指腸リンパ節に認められた病変においても同様の
臨床事項：約 2 年前に国内にて捕獲され水族館で飼育。
所見を示した。
数ヶ月前より食欲低下，削痩。1 ヶ月前の血液生化学検
診断：接合菌（ムコール目真菌）による肉芽腫性心嚢炎
査では，γ‒GTP，ALT，カリウムおよび総蛋白質の上昇
考察：病原性，菌糸の形態学的特徴および免疫染色の結が認められた。総白血球数は正常範囲内だった。その後， 果より上記の診断とした。一般に接合菌は菌糸の幅が比
強肝剤，ビタミン剤投与などによる治療を行ったが著効較的太く，直角に分岐し，隔壁は無いもしくは乏しいとなし。一般状態が徐々に悪化し死亡。
理解されている。本例では，多数の隔壁を持つ菌糸が見
剖検所見：心室下部の位置の心嚢部に 22 × 12 × 13 cmられたが，ムコール目真菌の中にもそのように多数の隔大の白色結節の形成が認められた（図 1）。また，その壁を有するものが報告されている。また，接合菌による
他の心嚢部位にも 2 cm 大に至る同様の白色結節（図 2動物における代表的な病変形成部位は肺，鼻腔，脳，消挿入図）が多数散在していた。同様の病変が肺，縦隔リ化管，皮膚などである。本例のように心嚢炎を引き起こ
ンパ節および膵十二指腸リンパ節に認められた。
すことはまれであり，さらに海生哺乳類での本症の報告
組織所見：心嚢部結節は真菌性肉芽腫性炎で構成されてはこれまでになかったことから出題した。
おり（図 2, Bar ＝ 50μm），真菌が血管に集積している（直田みさき・島田章則）像が見られた（図 3, Bar ＝ 50μm）。結節周囲では線維参考文献：化が顕著だった。菌糸は幅が広くさまざまな角度に分岐
Frater, J. L., Hall, G. S. and Procop, G. W. 2001. Histologic
し，隔壁を持つ菌糸（図 4, Bar ＝ 30μm）が時折見らfeatures of zygomycosis : emphasis of perineural invasion
れた。病巣内のほぼ全ての菌糸が抗 Rhizomucor 抗体にand fungal morphology. Arch. Pathol. Lab. Med. 125 : 375–
陽性を示した（図 5, Bar ＝ 100μm）。その他の真菌に378.

56（4），2010

5（45）

レビュー

抗体医薬品の研究開発
鈴木雅実（中外製薬・富士御殿場研究所）
抗体医薬品は，1）標的分子（抗原）に対する高抗体医薬品の研究開発ブームは 1980 年代に到来

い特異性と親和性に基づく高い効果と少ない副作用

し，最初の抗体医薬品は 1986 年に臓器移植の際のが期待できる，2）標的分子の多様性ならびに抗体

免疫抑制剤としてマウス抗体が上市された（Tableの有する作用メカニズムの多様性からさまざまな薬2）。しかし，マウス抗体がヒトにおいて抗原性を発剤標的に作用できる，3）遺伝子工学的手法の改変・現するなどの問題点より，その後約 10 年間抗体医改良，組み換え体製造技術の確立により工業生産が薬品の上市はなかった。その間，抗体工学の技術開可能であるなどの特徴から，ゲノム研究で見出され発が活発に行われ，マウス抗体からキメラ抗体，ヒた標的分子に対していち早く治療法の提供を検討でト化抗体を作出する技術が確立された。また，ヒト

きる医薬品として注目されている（Table 1）。

抗体ファージライブラリーやヒト抗体産生マウスの活用などによるヒト抗体取得技術も確立された。こTable 1抗体医薬品の特徴のような技術革新を背景に，キメラ抗体，ヒト化抗高い効果，少ない副作用
標的分子（抗原）に対する高い特異性と親和性
抗原以外には作用しない体，ヒト抗体の研究開発が活発化し，1990 年代半ばより抗体医薬品の上市が相次ぎ，現在までに 30弱の抗体医薬品が臨床の場で活用されている。抗体

多様な薬剤標的に作用できる
標的分子（抗原）の多様性
作用メカニズムの多様性

医薬品の対象疾患領域は，研究開発初期には移植，循環器，癌領域で展開され，その後，感染症，炎症

工業生産が可能遺伝子工学的な手法により改変，改良が可能
組み換え体製造技術の確立などの領域に拡大された（Table 3）。現在，癌，炎症，移植，循環器，感染症，呼吸器，眼科などの領域で医薬品として活用されている。

Fig. 1抗体医薬品の主な作用機序（模式図）

6（46）

日生研たより抗体医薬品＊の抗体型と上市時期

Table 2
1980
6

7

1990

8

9

0

1

2

3

4

5

2000
6

7

8

9

0

1

1

マウス抗体

1

キメラ抗体

1

2

3

1

1

4

2

6

7

8

9

1

1

1

1

1

1

3

ヒト化抗体

5

1

1

2

2

1

ヒト抗体

1

3

＊：いずれかの国・地域（日本，US，EU など）で医薬品として上市された抗体医薬品数。

Table 3領域

抗体医薬品＊の適応疾患と上市時期

製品数

1980
5–9

1990
0–4
5–9

2000
0–4
5–9

癌

10

2

6

2

炎症

6

1

1

4

移植

3

循環器

Table 4領域

抗体医薬品の作用機序と適応疾患
作用機序

Blocking＊

ADCC/CDC

Targeting

Signaling

癌

（+3 ）
1

6

3

―

炎症

6

―

―

―

2

移植

3

―

―

―

1

1

循環器

1

―

―

―

感染症

1

1

感染症

1

―

―

―

呼吸器

1

眼科

1

その他

1

1

4

2

呼吸器

1

―

―

―

1

眼科

1

―

―

―

2

その他

4

―

―

―

＊：いずれかの国・地域（日本，US，EU など）で医薬品として上市された抗体医薬品数。

＊：ADCC/CDC を主な作用機序とする抗体のうち，3抗体は blocking 作用も合わせもつものと考えられている。

抗体医薬品は，抗体に種々の機能を付加することで癌領域では，抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用

医薬品としての薬理作用を発現する（Fig. 1）。現在（ADCC），補体依存性細胞傷害作用（CDC），ある

上市されている抗体医薬品の多くは，標的分子の生

いは，ドラッグデリバリー担体（いわゆるミサイル

理機能を阻害する中和作用により薬理作用を発揮し療法）として，標的分子発現細胞を傷害することでている（Table 4）。

薬理作用を発揮する抗体医薬品も上市されている。

Fig. 2

IL–6 の生理作用（西本憲弘 , 吉崎和幸 . 医学の歩み . 1999 [1] を一部改変）

56（4）
，2010

7（47）

Table 5抗体医薬品の抗体型，標的分子，作用機序，ならびに主な適応疾患

Antibody

Approval

Type

RituxanHerceptin
Mylotarg
CampathZevalinBexxarErbitux
Avastin
Vectibix
Removab

1997
1998
2000
2001
2002
2003
2004
2004
2006
2009

Chimera（IgG）
Humanized（IgG）
Humanized（IgG）, conjugated
Humanized（IgG）
Mouse（IgG）, radiolabelled Ab
Mouse（IgG）, radiolabelled Ab
Chimera（IgG）
Humanized（IgG）
Human（IgG）
Humanized（bi–speciﬁc）

ADCC/CDC 血液癌
CD20
ADCC/CDC 固形癌
Her2
血液癌
Targeting
CD33
ADCC/CDC 血液癌
CD52
血液癌
Targeting
CD20
血液癌
Targeting
CD20
ADCC/CDC 固形癌
EGFR
固形癌
Blocking
VEGF
ADCC/CDC 固形癌
EGFR
Ep–CAM, CD3 ADCC/CDC 固形癌

Remicade
HumiraActemra炎症
CimziaIlarisSimponi

1998
2003
2005
2008
2009
2009

Chimera（IgG）
Human（IgG）
Humanized（IgG）
Humanized（Fab）
Human（IgG）
Human（IgG）

TNF
TNF
IL–6R
TNF
IL–1β
TNF

Blocking
Blocking
Blocking
Blocking
Blocking
Blocking

関節リウマチ，乾癬，クーロン病など
関節リウマチ，乾癬，クーロン病など
関節リウマチ，キャッスルマン病など
クローン病など
関節リウマチ，乾癬
関節リウマチなど

Orthoclone
移植 Simulect
Zenapax

1986
1998
1998

Mouse（IgG）
Chimera（IgG）
Humanized（IgG）

CD3
CD25
CD25

Blocking
Blocking
Blocking

急性拒絶反応
急性拒絶反応
急性拒絶反応循環器 ReoPro

1995

Chimera（Fab）

GPIIb/IIIa

Blocking

急性心虚血性合併症の抑制

感染症 Synagis

1998

Humanized（IgG）

RSV

Blocking

RS ウイルスによる下気道疾患

呼吸器 Xolair

2003

Humanized（IgG）

IgE

Blocking

喘息

Lucentis

2006

Humanized（Fab）

VEGF

Blocking

加齢黄斑変性症

Raptiva
Tysabri
その他
SolirisStelara

2003
2004
2007
2008

Humanized（IgG）
Humanized（IgG）
Humanized（IgG）
Human（IgG）

CD11a
VLA–4
C5
p40

Blocking
Blocking
Blocking
Blocking

尋常性乾癬
多発性硬化症
発作性夜間ヘモグロビン尿症
尋常性乾癬

癌

眼科

Antigen

MoA

Indication
非ホジキンリンパ腫
乳癌など
AML（急性骨髄性白血病）
CLL（B 細胞性慢性リンパ腫）
B 細胞性非ホジキンリンパ腫
CD20 陽性非ホジキンリンパ腫
結腸直腸癌，頭頚部扁平上皮癌
結腸直腸癌，非小細胞肺癌 , 乳癌
結腸直腸癌
がん性腹水（卵巣癌など）

また，癌領域の抗体医薬品には，その薬理作用に複IL–6 は T 細 胞，B 細 胞，単 球，線 維 芽 細 胞，内数の機序（ADCC/CDC と中和機能）が関与するも皮細胞などさまざまな細胞から産生される炎症性サのと想定されている製品もある。なお，シグナル誘

イトカインであり，肝細胞を介しての急性期タンパ

導（アゴニスト）として作用する抗体は，現時点でクである CRP やフィブリノーゲンの産生，B 細胞

上市されていない。2009 年 11 月までに上市されたを介しての抗体産生，破骨細胞の活性化など多様な抗体医薬品について，疾患領域別に，抗体型，標的

生理作用を有することが知られている [1]（Fig. 2）。

分子，作用機序，ならびに，主な適応疾患を Table

また，関節リウマチ，全身型若年性特発性関節炎，5 に示す。

キャッスルマン病の病態形成に深く関与していることも知られている。IL–6 には，膜結合性と可溶性

現在上市されている抗体医薬品の中で，日本オリのレセプターが存在し，これらのレセプターとの複ジンの抗体医薬品の第 1 号として，大阪大学と中外合体が IL–6 ファミリーサイトカインの共通のシグ

製薬との産学連携により 抗 IL–6 レセプター抗体

ナル伝達分子である gp130（糖タンパク分子）と結トシリズマブ（商品名：アクテムラ）が研究開発さ合することにより，細胞核内へシグナルが伝達されれた。抗体医薬品を理解していだくための 1 例としる（Fig. 3）。トシリズマブは，膜結合性 IL–6 レセて，トシリズマブの特徴を概説する。

プターと可溶性 IL–6 レセプターの両方に結合する

トシリズマブは，マウスで作成された抗ヒト IL–

ことにより，IL–6 と IL–6 レセプターの結合を阻害

6 レセプター抗体をもとに，ヒトに対する抗原性をし，gp130 を介する IL–6 の核内へのシグナル伝達減らす目的で，マウス抗体の抗原認識部位である相を抑制する（Fig. 4）。

補性決定領域（CDR）のみをヒト IgG1 に移入し，このような特徴を有する抗体を医薬品としていく

全アミノ酸配列の 90％以上をヒト由来としたヒトために種々の臨床試験が行われた。関節リウマチを化抗体である。

対象とした臨床試験成績の一部を紹介する。臨床試

8（48）

日生研たよりFig. 3

IL–6 のシグナル伝達機構（模式図）

Fig. 4

トシリズマブの作用機序（模式図）

験（SATORI 試験）は，メトトレキサート使用中で血，骨粗鬆症など関節リウマチに伴う種々の全身症

一定の活動性を有する関節リウマチを対象に，トシ状を緩和し，関節リウマチ治療薬としての有用性がリズマブ群は 8 mg/kg を 4 週間隔で計 6 回点滴静示された。現在，日本をはじめ，ヨーロッパ，米国

注投与し，メトトレキサート群は 8 mg/ 週ごとになど世界各国で治療に用いられており，多くの方々

計 24 週間経口投与した。その結果，トシリズマブの健康回復に貢献している。

投与により関節リウマチ治療薬の評価である ACR

新たな抗体医薬品の上市に向けた研究開発状況に

スコア（米国リウマチ学会が策定した関節リウマチ

目を移すと，世界規模で抗体医薬品プロジェクトが診断の基準）は改善し，トシリズマブ群における最

活発に推進されており，情報公開されている臨床開終観察時の ACR20，ACR50，ACR70 の改善率は，発段階（実験動物での有効性・安全性が確認され，それぞれ 80.3％，49.2％，29.5％であり，いずれもヒトでの臨床試験が行われている段階）にあるプロ

メトトレキサート群に比べて有意に高い改善率を示

ジェクトだけでも 300 程度挙げられ，非臨床研究段

した [2]（Fig. 5）。また，さまざまな視点から臨床階にあるものを加えると相当数になるものと推察さ試験を実施した結果，関節の炎症を改善するとともれる。特にここ 1–2 年，臨床開発段階に移行したプに，関節変形・破壊から生じる機能障害，疲労，貧ロジェクトが急増しており，2 年間で約 2 倍近い数

56（4），2010

Fig. 59（49）ト シ リ ズ マ ブ 投 与 に よ る ACR 改 善 率：第 III 相 試 験 SATORI 試 験（Nishimoto, N., et. al. 2009：Mod.
Rheumatol. [2]）に増加している。研究開発段階にある抗体医薬品の遺伝子発現解析より肝がんにおいて高発現する分標的分子は生理機能や病態での役割が良く研究され子としてグリピカン 3（GPC3）が見出され，肝がているものに加え，新規標的分子も含まれている。

んを適応疾患とする抗 GPC3 抗体プロジェクトに

新規標的分子は魅力的である反面，こうした分子の取り組んだ。GPC3 は，ヘパラン硫酸プロテオグリ

多くは病態での役割が良く判っていないことが多く，カンであるグリピカンファミリーの一員であり，細臨床応用のためには標的分子の生理学的ならびに病

胞膜上に繋留されている。GPC3 を含むヘパラン硫

理学的な機能解析が必要不可欠となり，結果として

酸プロテオグリカンは，そのコアタンパクやヘパラ

開発が不成功に終わるリスクも高い。このような背ン硫酸糖鎖への結合を介して，ケモカインや細胞増景から，最近の標的分子は，臨床でバリデーション

殖因子など様々なサイトカインの調節に関わっていされたものや生理機能や病態での役割が良く分かっることが知られているが，GPC3 の機能は明らかにているものに集中する傾向がみられる。CD20，TNF，されていなかった。そこで，肝がんで高発現していCD3，CD22，amyloidβ，VEGR，Erb B，HER2，

る GPC3 の機能を解析した。

CD4，CD40 などを標的分子とするプロジェクトに抗ヒト GPC3 抗体を GPC3 発現肝がん移植モデ

は，5 プロジェクト以上が集中し，開発が進められ

ルに投与し，同モデル腫瘍組織を病理組織学的に解ている。また，現在の抗体工学ではさまざまな機能析した。その結果，腫瘍細胞の変化に加え，マクロ（中和，細胞傷害など）を有する抗体の創生が可能

ファージ（Mφ）の浸潤状態に変化がみられ，GPC3となり，標的分子の選択に加え，どのような機能をと Mφとの間の生物学的な関係が示唆された [3]。

抗体に付加していくかも研究開発成功に向けた重要

そこで，肝細胞がん患者由来の肝臓を用いて，な要因となっている。

GPC3 の機能と Mφ浸潤との関係を検討した。各肝中外製薬でもトシリズマブに続く抗体医薬品の医細胞がんサンプルを GPC3 発現パターンに基づき 3

療現場への提供に向け，複数の抗体医薬品プロジェ

群（GPC3 陰性：GPC3–，GPC3 陽性だが細胞膜発クトに取り組んでいる。その標的分子には，生理学

現は不明瞭：GPC3+/UC，GPC3 陽性で細胞膜発現的ならびに病理学的な機能が明らかでない新規標的

明 瞭：GPC3+/C）に 分 類 し た（Fig. 6）。次 い で，分子も含まれている。このような分子を標的とする

汎 Mφ（pMφ）マーカーを用いた免疫染色を行い，抗体の臨床応用に向け，標的分子の生理学的・病理

上記の GPC3 発現パターンによる群間で陽性細胞学的な機能を解析した経験を以下に概説する。

数を比較した。その結果，pMφマーカー陽性細胞

10（50）Fig. 6日生研たよりヒト肝がん組織における GPC3 発現と CD68 陽性細胞
（Takai, H., et. al. 2009: Liver Int. [4]）数は，GPC3+/C の肝細胞がん組織で GPC3– 及びGPC3+）肝細胞がん移植モデル腫瘍組織を用いて，

GPC3+/UC と 比 較 し て 有 意 に 増 加 し て い た [4]遺伝子発現プロファイルを比較したところ，SK03（Fig. 7）
。また，ヒト肝細胞がんマウス皮下移植モ

移植組織で M2 Mφ関連遺伝子の発現上昇がみられデルを用いた検討でも同様の現象が再現され，肝がた [5]（Fig. 8）。さらに，SK–Hep–1 移植組織と比ん細胞における GPC3 の細胞膜発現と同組織へのべて SK03 移植組織で浸潤が増加していた Mφの大Mφ動員との関連が示された。

部分は M2 Mφ特異的マーカーに対して陽性であっ上 記 Mφの phenotype（M1 or M2）を マ イ ク ロ

た。これらの結果から，SK03 移植組織に動員されアレイ及び病理組織学的手法を用いて解析した。

た Mφは M2 Mφであることが強く示唆された。腫GPC3 非発現（SK–Hep–1 : GPC3–）及び発現（SK03 :瘍 組 織 中 の M2 Mφは，一 般 に tumor – associatedFig. 7ヒト肝がん組織における GPC3 発現とマクロファージ数（Takai, H., et. al. 2009: Liver Int. [4] を一部改変）

56（4），2010

Fig. 811（51）

GPC3 非発現（SK–Hep–1 : GPC3–）及び発現（SK03 : GPC3+）肝細胞がん移植モデル腫瘍組織を用いた
M1, M2 関連遺伝子クラスター解析（Takai, H., et. al. 2009 :Cancer Biol. Ther. [5] を一部改変）

macrophage（TAM）に分類され，腫瘍の進展や転188 : 942–948.

移を促すとされている。実際に，SK03 移植組織で

2. Nishimoto, N., Miyasaka, N., Yamamoto, K., Ka-

は，TAM の機能としての血管・リンパ管新生や基wai, S., Takeuchi, T., Azuma, J. and Kishimoto, T.

質リモデリングの亢進が観察された。

2009. Study of active controlled tocilizumab mono-

こ れ ら の 研 究 成 績 か ら，肝 が ん 細 胞 に お け る

therapy for rheumatoid arthritis patients with an

GPC3 の細胞膜発現により，肝がん組織への M2 タ

inadequate response to methotrexate（SATORI） :イプの TAM の動員が促されることが明らかになっsigniﬁcant reduction in disease activity and serum

た。 また，GPC3 は，これら TAM の機能を介して，vascular endothelial growth factor by IL–6 receptor

血管・リンパ管や細胞外マトリックスなどの腫瘍微inhibition therapy. Mod. Rheumatol. 19 : 12–19.

小環境を調節し，肝がんの進展や転移を促している

3. Takai, H., Kato, A., Kinoshita, Y., Ishiguro, T.,

可能性が示唆された。現在，抗 GPC3 抗体は肝がん

Takai, Y., Ohtani, Y., Sugimoto, M. and Suzuki, M.

を対象に臨床試験による有効性・安全性の評価を進2009. Histopathological analyses of the antitumor

めている。

activity of anti–glypican–3 antibody（GC33）in hu-

今回，抗体医薬品の研究開発状況，上市抗体医薬

man liver cancer xenograft models : The contribu-

品の標的分子と適応疾患に加え，抗体医薬開発過程

tion of macrophages. Cancer Biol. Ther. 8 : 930–938.

から明らかとなる新規標的分子の機能などをごく簡

4. Takai, H., Kato, A., Kato, C., Watanabe, T., Matsub-

単に紹介した。抗体医薬品は分子標的治療薬のひと

ara, K., Suzuki, M. and Kataoka, H. 2009. The ex-

つとして脚光を浴び，研究開発が盛んで，近年，レpression profile of glypican–3 and its relation to

ビューを含めおびただしい報告がなされている。詳

macrophage population in human hepatocellular細について興味のある読者の方はこれらの書籍，レcarcinoma. Liver Int. 29 : 1056–1064.

ビューならびに最新の報告を参照いただきたい。

5. Takai, H., Ashihara, M., Ishiguro, T., Terashima, H.,
Watanabe, T., Kato, A. and Suzuki, M. 2009. Involvement of glypican–3 in the recruitment of M2–

参考文献

polarized tumor–associated macrophages in hepa-

1. 西本憲弘 , 吉崎和幸 . 1999. Castleman 病と MCD

tocellular carcinoma. Cancer Biol. Ther. 8 : 2329––IL–6 シグナル阻害による治療 . 医学のあゆみ

2338.

12（52）

日生研たより発表論文紹介Detection of Five Avian Eimeria Species by Species‒
Speciﬁc Real‒Time Polymerase Chain Reaction Assay
川原史也 1，平健介 2，長井伸也 1，大永博資 1，小沼操 1，布谷鉄夫 11 財団法人日本生物科学研究所，2 麻布大学
Avian Diseases 52 : 652‒656, 2008
川原史也
19]。今 回，我 々 は E. acervulina，E. brunetti，E.
背景

maxima，E. necatrix および E. tenella の 5 種を対象

鶏コクシジウム症は Eimeria 属の原虫によって引とし，プローブベースと比較してより省コストかつき起こされる疾病であり，養鶏産業において甚大な

省力的な SYBR Green ベースの qPCR 法を開発した。

経済的被害をもたらしている。原虫の寄生により腸管が傷害されることから，臨床症状は水様から血様に至る下痢を主体とし，増体の抑制や死亡なども認
められる。

材料と方法
実験には，野外から分離されて当研究所で維持さ鶏に寄生する Eimeria 原虫は 8 種が報告されていれている E. acervulina Na 株，E. brunetti Nb 株，E.

る が，そ の う ち 病 原 性 が 問 題 と な る の は 主 に E.

maxima Nm 株，E. necatrix Nn 株 お よ び E. tenella

acervulina，E. brunetti，E. maxima，E. necatrix お

Nt 株を使用した。各種のオーシスト浮遊液は 107

よび E. tenella の 5 種である。疾病の発生があった

個 /mL に調製した後，10 倍に段階希釈して標準試場合，腸管に病変が形成される部位や糞便中に排泄料 を 準 備 し た。そ れ ぞ れ の 濃 度 の 標 準 試 料 をされるオーシストの形態などにより原因種が同定さ0.5 mL 分 取 し て 遠 心 し た 後，上 清 を 捨 て て High

れるが，これらの方法は熟練を要する上に常に客観

Pure PCR Template Preparation Kit（ロ シ ュ）の的な成績が得られるとは限らない [7, 9]。また，多tissue lysis buffer 0.5 mL に浮遊した。浮遊液は直径

くの野外感染事例では，同時に複数種が感染してい0.5 mm のガラスビーズとともに振盪してオーシス

るため，その病態は複雑で正確な診断は極めて困難

ト 壁 を 破 砕 し，そ の 後 は キ ット の 手 順 に 従 っ てである。

DNA 抽出を実施した。野外の糞便検体は，糞便を臨床の現場や疫学的調査に利用するために，鶏コ

PBS で 10 倍に希釈した後，0.5 mL を分取して上述

クシジウム原虫種を鑑別できる客観的かつ簡便な方した方法で同様に DNA を抽出した。また，野外の法の確立が望まれてきた。これまでに，5S rRNA 遺

糞便検体は定法により，オーシスト含有量測定およ伝子，スモールサブユニット rRNA 遺伝子，ITS–1

び 形 態 に よ る 簡 易 的 な 種 鑑 別 を 実 施 し た。E.

領域および ITS–2 領域を対象にした PCR 法をベー

acervulina，E. brunetti，E. necatrix および E. tenella

スにした鑑別法が報告されている [3–6, 8, 10–12, 16については今回，ITS–1 領域を対象にして独自に種–18, 20, 21]。近年，様々な応用が試みられているリ

特異的プライマーを設計したが，E. maxima につい

ア ル タ イ ム PCR 法（以 下，qPCR 法）は，反 応 時て は 既 報 の プ ラ イ マ ー に 基 づ き 改 変 し た [8]。

間が短い上にゲル電気泳動などの作業が不要であり，

qPCR 反応には Light Cycler（ロシュ）を使用し，これまでの PCR 法と比べて大幅に省力化すること

反応液の組成は SYBR Premix Ex Taq（タカラバイが 可 能 で あ る。こ れ ま で に E. acervulina，E.

オ）10μL，10 mM の種特異的プライマーセット各

maxima，E. necatrix および E. tenella を対象とした

1μL（最 終 濃 度 各 0.5 mM），DNA サ ン プ ル 5μL

プローブベースの qPCR 法が報告されていた [1, 2,とした。増幅条件は，初期変性が 95℃，60 秒，そ56（4），2010

13（53）

acervulina は 8 農場でそれぞれ検出された（Table 2）。

の後 95℃，10 秒，62℃，10 秒，72℃，10 秒の増幅
反応を 45 サイクル繰り返した。増幅完了後，60℃から 95℃に温度を上昇させて融解曲線分析を実施

総括
qPCR 法は反応中であってもリアルタイムに成績した。

を確認可能な上に，反応後のゲル電気泳動などの作業が不要であるため，これまでの PCR 法と比較し成績て迅速に結果を得ることができる。これまでに，鶏今回，構築した qPCR 法は交差反応を認めず，対コクシジウム原虫を対象とした SYBR Green ベース

象とした 5 種の鶏コクシジウム原虫を種特異的に検の qPCR 法 は ま だ 報 告 さ れ て い な か っ た。SYBR出できた。各種の検出限界は，E. brunetti，E. maxima

Green ベースの反応ではプローブの設計および合成

1

および E. tenella では 10 /mL，E. acervulina およびが不要であり，種特異的なプライマーセットを変更

2

E. necatrix で は 10 /mL で あ っ た（Table 1）。増 幅

するだけで系の構築が可能である。その一方で，非産物の融解曲線は各種で単一かつ固有のピークを示し，特異的な DNA 断片の増幅産物も検出してしまうた

Tm 値は E. acervulina 88.8℃，E. brunetti 83.5℃，E.

め，特異的なプライマーセットの設計が極めて重要

maxima 81.6℃，E. necatrix 80.2℃お よ び E. tenellaである。今回，我々が設計した種特異的なプライ

88.3℃であった（Fig. 1）。野外の 32 ヶ所の養鶏場

マーセットは他種の DNA とは反応せずに高い特異のうち，E. brunetti は 21 農場，E. maxima および E.

性を示し，プライマーダイマーなどの非特異的な反necatrix は 16 農場，E. tenella は 12 農場ならびに E.

応産物が生じることもなかった。
一般的な糞便検査によるオーシストの検出限界は100 個 /g であるが，本 qPCR 法は同等以上の検出限界を示した。本 qPCR 法の検出感度が優れているのは，PCR 増幅の対象とした ITS–1 領域がマルチ
コピーである上に，一つのオーシストには 8 隻のス
ポロゾイト（虫体）が含まれているためと考えられる。
鶏コクシジウム原虫は，E. acervulina，E. brunetti，
E. maxima，E. necatrix および E. tenella の 5 種が主に 疾 病 を 引 き 起 こ す と 言 わ れ る。そ の う ち，E.
brunetti は過去の野外調査において確認されていなかったため，日本には本種は浸潤していないと考えFig. 1 増幅産物の融解曲線分析
EA, E.acervulina ; EB, E.brunetti ; EM, E.maxima ;EN, E.necatrix ; ET, E.tenella.

Table 1.

内で E. brunetti の分離が報告されて以来，浸潤の拡

本 qPCR 法の標準試料を用いた定量および検出範囲の成績
標準試料のオーシスト数（個 /mL）

種A
検討範囲

定量範囲（相関係数）710 ‒ 10（0.9992）

102

EB

1
107 ‒ 10（0.9947）

1012
107 ‒ 10（0.9971）

101

EN

3
107 ‒ 10（0.9971）

102

ET

1
107 ‒ 10（0.9997）

101

107 - 10-1

2

検出限界

EA

EM

A

られてきた [14, 15]。ところが 1990 年に始めて国EA, E. acervulina ; EB, E. brunetti ; EM, E. maxima ; EN, E. necatrix ; ET, E. tenella.

14（54）日生研たよりTable 2.

野外糞便検体の検査成績

形態による鑑別C

qPCR 法による検出D

農場A

日齢

OPG
B
（Log）

AMi

NPT

BMa

EA

EB

EM

EN

ET

BB

25

2.9

-

+

+

-

-

+

+

+

BB

39

NT

NT

-

+

+

+

-

BB

39

NT

NT

+

-

-

+

-

BB

48

3.0

-

+

-

-

+

+

+

-

BB

49

3.0

-

+

-

-

+

-

+

-

BB

51

NT

-

-

+

+

-

BB

60

4.0

-

+

+

+

+

+

-

+

BB

60

4.7

-

+

-

-

-

-

+

-

BB

70

4.0

-

+

-

-

-

-

+

+

BB

91

NT

NT

-

+

-

+

-

BB

111

NT

NT

-

+

+

-

+

BB

112

5.0

-

-

+

-

+

-

-

-

BB

175

2.0

-

+

+

-

+

+

+

-

BB

200

4.0

-

-

+

-

+

-

-

-

BB

203

5.0

-

+

+

-

+

-

-

-

BL

40

6.6

-

-

+

-

+

-

-

-

BL

71

NT

+

+

-

+

-

BL

80

5.6

-

+

-

-

+

-

-

-

BL

149

6.4

-

+

+

-

+

-

-

-

L

71

6.1

-

+

+

-

+

+

-

+

L

86

5.0

-

+

+

-

+

-

+

+

L

110

5.0

-

-

+

-

+

+

-

-

L

140

4.0

+

+

+

+

+

+

-

-

L

140

NT

NT

-

-

-

+

-

L

157

NT

NT

+

+

+

+

+

NT

NT

-

+

-

+

-

+

+

+

-

+

-

+

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

+

+

-

+

+

+

-

+

-

+

-

+

+

+

+

-

+

-

-

+

-

-

L

210

5.5

B

29

NT

B

37

5.4

-

+

B

42

3.0

-

B

45

3.7

+

B

46

3.8

+

B

50

NT

+

NT

NT

A

BB, Breeders for broilers ; BL, Breeders for layers ; L, Layers ; B, Broilers. B, C NT, Not tested. CAMi, small oocysts（<19.0μm ; tentatively E. acervulina and/or E. mitis）; NPT, medium-sized oocysts（19.0 to 24.0μm ; tentatively E.
necatrix, E. praecox and/or E. tenella）; BMa, large oocysts（>24.0μm ; tentatively E. brunetti and/or E. maxima）.
D
EA, E. acervulina ; EB, E. brunetti ; EM, E. maxima ; EN, E. necatrix ; ET, E. tenella. C, D+, Detected ; -, Not detected.

大と被害の発生が危惧されてきた [13]。その後，野reproduction as revealed by quantitative real-time

外調査の報告は見当たらず，国内での広がりは不明

PCR. Int. J. Parasitol. 36 : 97–105.

のままであったが，今回，検査の対象とした 21 ヶ2. Blake, D. P., Qin, Z., Cai, J. and Smith, A. L. 2008.

所の種鶏場のうち，20 農場で E. brunetti が検出さDevelopment and validation of real-time

れたことから，その浸潤が大幅に進行したものと示

polymerase chain reaction assays specific to four

唆された。

species of Eimeria. Avian Pathol. 37:89–94.
（研究員）

3. Cantacessi, C., Riddell, S., Morris, G. M., Doran, T.,
Woods, W. G., Otranto, D. and Gasser, R. B. 2008.
Genetic characterization of three unique

引用文献

operational taxonomic units of Eimeria from

1. Blake, D. P., Hesketh, P., Archer, A., Shirley, M. W.

chickens in Australia based on nuclear spacer

and Smith, A. L. 2006. Eimeria maxima : theinfluence of host genotype on parasite

ribosomal DNA. Vet. Parasitol. 152 : 226–234.
4. Gasser, R. B., Woods, W. G., Wood, J. M., Ashdown,56（4），2010

L., Richar ds, G. and Whithear, K. G. 2001.

15（55）

Nippon Juigaku Zasshi 52 : 859–860.

Automated, fluorescence-based approach for the

14. Oikawa, H., Kawaguchi, H., Katagiri, K. andspecific diagnosis of chicken coccidiosis.

Nakamoto, K. 1979. Incidence of chicken coccidia

Electrophoresis 22 : 3546–3550.

from broiler houses in Japan, 1973 – 1977. Zbl.

5. Jenkins, M. C., Miska, K. and Klopp, S. 2006.

Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A. 244 : 339–344.

Application of polymerase chain reaction based on

15. Oikawa, H., Kawaguchi, H., Nakamoto, K. and

ITS1 rDNA to speciate Eimeria. Avian Dis. 50 : 110

Tsunoda, K. 1977. Field sur veys on coccidial–114.

infection in broilers in Japan in 1974 and 1975.

6. Jenkins, M. C., Miska, K. and Klopp, S. 2006.

Nippon Juigaku Zasshi 39 : 127–134.

Improved polymerase chain reaction technique for

16. Schnitzler, B. E., Thebo, P. L., Mattsson, J. G.,

determining the species composition of Eimeria in

To m l e y, F. M . a n d S h i r l e y, M . W. 1 9 9 8 .

poultry litter. Avian Dis. 50 : 632–635.

Development of a diagnostic PCR assay for the

7. Joyner, L. P. and Long, P. L. 1974. The specificdetection and discrimination of four pathogenic

characters of Eimeria, with special reference to the

Eimeria species of the chicken. Avian Pathol.

coccidia of the fowl. Avian Pathol. 3 : 145–157.

27 : 490–497.

8. Lew, A. E., Anderson, G. R., Minchin, C. M., Jeston,

17. Schnitzler, B. E., Thebo, P. L., Tomley, F. M.,

P. J. and Jorgensen, W. K. 2003. Inter- and intra-

U g g l a , A . a n d S h i r l e y, M . W. 1 9 9 9 . P C R

strain variation and PCR detection of the internal

identification of chicken Eimeria : a simplified

transcribed spacer 1（ITS-1）sequences ofread-out. Avian Pathol. 28 : 89–93.

Australian isolates of Eimeria species fromchickens. Vet. Parasitol. 112 : 33–50.
9. Long, P. L. and Joyner, L. P. 1984. Problems in theidentification of species of Eimeria. J. Protozool.
31 : 535–541.

18. Stucki, U., Braun, R. and Roditi, I. 1993. Eimeria
tenella : characterization of a 5S ribosomal RNA
repeat unit and its use as a species-speciﬁc probe.
Exp. Parasitol. 76 : 68–75.
19. Swinkels, W. J., Post, J., Cornelissen, J. B., Engel,

10. M o r r i s , G . M . a n d G a s s e r, R . B . 2 0 0 6 .

B., Boersma, W. J. and Rebel, J. M. 2006. Immune

Biotechnological advances in the diagnosis of

responses in Eimeria acervulina infected one-day-avian coccidiosis and the analysis of genetic

old broilers compared to amount of Eimeria invariation in Eimeria. Biotechnol. Adv. 24 : 590–603.

the duodenum, measured by real-time PCR. Vet.

11. Morris, G. M., Woods, W. G., Richards, D. G. andParasitol. 138 : 223–233.

Gasser, R. B. 2007. Investigating a persistent

20. Tsuji, N., Kawazu, S., Ohta, M., Kamio, T., Isobe,

coccidiosis problem on a commercial broiler-

T. , S h i m u r a , K . a n d F u j i s a k i , K . 1 9 9 7 .

breeder farm utilising PCR-coupled capillar y

Discrimination of eight chicken Eimeria species

electrophoresis. Parasitol. Res. 101 : 583–589.

using the two-step polymerase chain reaction. J.

12. Morris, G. M. Woods, W. G., Richards, D. G. andParasitol. 83 : 966–970.

G a s s e r, R . B . 2 0 0 7 . T h e a p p l i c a t i o n o f a

21. Woods, W. G., Whithear, K. G., Richards, D. G.,–basedpolymerase chain reaction（PCR）

Anderson, G. R., Jorgensen, W. K. and Gasser, R.

capillar y electrophoretic technique provides

B. 2000. Single-strand restriction fragment length

detailed insights into Eimeria populations inpolymorphism analysis of the second internal

intensive poultry establishments. Mol. Cell. Probes

transcribed spacer（ribosomal DNA）for six

21 : 288–294.

species of Eimeria from chickens in Australia. Int.

13. Nakamura, T., Kawaguchi, H. and Imose, J. 1990.
Identification of Eimeria brunetti using glucose
phosphate isomerase and lactate dehydrogenase.

J. Parasitol. 30 : 1019–1023.

16（56）日生研たより研修者・見学者受け入れ状況（平成 21 年 4 月から平成 22 年 3 月）
来所日・期間

所属機関・人数

研修・見学内容

4月27日〜 4月28日

株式会社

ナルク

2名

実験動物取扱手技習得等

6月11日〜 6月12日

長崎県中央家畜保健衛生所

1名

豚病診断技術習得

7月13日〜 7月15日

静岡県畜産技術研究所

1名

組織培養等技術習得

8月 3日〜 8月 7日

北里大学獣医学部

1名

学外実習

8月17日〜 8月28日

麻布大学獣医学部

1名

専門学外実習8月25日〜 8月27日

日本大学生物資源科学部

1名

学外実習

11月16日〜11月20日

株式会社

1名

豚病診断技術習得

2月15日〜 2月19日

北海道大学獣医学部

1名

インターンシップ

3月19日

日本獣医生命科学大学獣医学部

4名

施設見学

3月23日〜 3月24日

グローバルピッグファーム

2名

豚病診断技術習得

中小家畜研究センター

食環境衛生研究所― 柏崎評議員

瑞宝中綬章

受賞 ―

当所の柏崎守評議員は，平成 22 年春の叙勲で瑞宝中綬章の栄に浴されました。お慶び申し上げます。

日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（隔月 1 回発行）

（通巻 563 号） 平成 22 年 6 月 25 日印刷
発行所
生命の「共生・調和」を理念とし，生命体の豊かな明日と，研究の永続性を願う
気持ちを快いリズムに整え，視覚化したものです。カラーは生命の源，水を表す「青」としています。

〒 198 0024

東京都青梅市新町 9 丁目 2221 番地の 1

TEL：0428（33）1056（企画学術部） FAX：0428（33）1036
発行人
編集室
印刷所

表紙題字は故中村⒥治博士の揮毫

平成 22 年 7 月 1 日発行（第 56 巻第 4 号）

財団法人 日本生物科学研究所

林

志鋒

委

員／黒田丹（委員長），竹山夏実，鈴木敬之

事務／企画学術部

株式会社 精ഛ社（無断転載を禁ず）