博 士 （ 医 学 ） 重 松 明 男
学位論文題名Effects oflowーdoselrradiationonenhanCementof
immunitybydendritiCCe11S（低線量の放射線照射が、樹状細胞の免疫効果に与える影響に関する研究）

学位論文内容の要旨【 背景 と 目 的 】
従 来 、 放 射 線 は 線 量 に 比 例 し て 有 害 作 用 が 増 加 す る と 考 え ら れ て い た (Linearnothresholdmodelっ LNTmodel） 。 近 年 、 0． 1（ 尠 以 下 の ご く 低 線 量 の 放 射 線 照 射 は 生 体 に 有 益 に 働 く こ とが 、 疫 学 的 な 調 査 や 加 伽 D、 mWf′ Dの 実 験 系 で 多 数 報 告 さ れ て お り 、 ILamationHomesis効
果 と 呼 ば れ る 。 こ れ は 、 ご く 低 線 量 の 放 射 線 照 射 に よ り 、 DNAや 蛋 白 合 成 、 DNA修 復 な どが 促進 さ れ る こと に よ る と考 え ら れ てい る 。 抗 腫瘍 効 果 や 免疫 系 に 対 する 効 果 も 報告 さ れて いる 。
樹 状 細 胞 （ Dendrmccell， DC） は 骨 髄 の 造 血 幹 細 胞 よ り 分 化 し 、 皮 膚 な ど の 末 梢 臓 器 に 広く 分 布 し て い る 。 抗 原 を 貪 食 し た 後 に 活 性 化 さ れ 、 リ ン パ 臓 器 へ 移 動 し T細 胞 へ の 抗 原 提示 を 行 う 細 胞 で あ り 、 抗 原 提 示 の 主 要 な 役 割 を 果 た す と 言 わ れ て い る 。 こ れ ま で DCに 対 する 低 線 量 の 放 射 線 効 果 の 報 告 は 認 め ら れ な い 。 今 回 我 々 は 、 マ ウ ス の 脾 臓 由 来 の DCを 用 いて 、 低 線 量 放 射 線 が 樹 状 細 胞 の 抗 原 提 示 能 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た 。
【対象 と方法 】
C57BL/6マ ウ ス (B6マ ウ ス ， MHC: H̲2 ） よ り 脾 臓 細 胞 を 取 り 出 し 、 様 々 な 低 線 量 の 放 射線 (0.02， 0.05， O.l， 0.5 1.0 Gy線 量 率 lGy/min)を 照 射 し 、 RPMIで 48時 間 培 養 し た 。 ま た 、BALB/cマ ウ ス (MHC: H̲2d)の 脾 臓 細 胞 よ り 抗 Thyl.2抗 体 を コ ー ト し た magnetic beadsを用 い て T細 胞 を e而 chし た 。 B6マ ウ ス の 脾 臓 細 胞 を 25（ り の 放 射 線 照 射 に て 非 働 化 し 、 これ を stimmatorと し 、 BALB/cマ ウ ス か ら endchし た T細 胞 を respondcrと し た allogencicmixedleukoヴ tereaぬ on（ al10gcneicMLR） を 行 い 、 T細 胞 増 殖 刺 激 の 評 価 を 行 っ た （Expedmentla） 。
次 い で 、 B6マ ウ ス の 脾 臓 細 胞 に 抗 CDllc， CD3， CD19抗 体 を コ ー ト し た magneticbeadsを 反
応 さ せ 、 CD11c十 ， CD3‐ ， CD19‐ 細 胞 を e血 chし た 。 こ の DCに 同 様 の 低 線 量 放 射 線 照 射 を 施
行 し 、 MLRの s血 1ulatorと し て 用 い 、 DCの T細 胞 増 殖 刺 激 能 の 検 討 を お こ な っ た（D（p師mentlb）。
ま た 、 こ の DCを 48時 間 培 養 し 、 DCの 活陸化マ ーカーで ある副 刺激分子 や接着分 子（ CD80、 CD86、 I‐ ぐ 、 CDld、 IC」 W‐ 1、 LI・A‐ 1） の 発 現 を 検 討 し た （ Exp師 ment2） 。

次 い で 、 低 線 量 放 射 線 照 射 後 、 48時 間 DCを 培 養 し た 上清 中 の サ イ トカ イ ン （ IL‐ 12， IL− 10）を ELISA法 に て 定 量 を 行 っ た （ E） 【 periment3a） 。 ま た 、 同 じ 培 養 DCか ら RNAを 抽 出 後 、
R．eve
rsetra恥cnpt
ase・polymer譌ech蔽nrea
出on（RT．PCR）法にてIL‐12，IL．2，IFN．ッ，IL｜10などの サ イ ト カ イ ン 産 生 お よ び chcmokinercceptor（ CCRCCR6， CCR7） の 検 討 を 行 っ た（Exp鹸ment3b）。
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【結果】Experimentl：AllogeneicM
LRla:B6
マウスの全脾臓細胞をstimulatorとして用いたMLR
では0.
02Gy―0.
1Gy
照射群においてT細胞の増殖が促進される傾向を認めた。
lb:DCをenrichし、これをstimulatorとして用いたM
LRにおいて、0.
05Gyをピークに、低線量放 射線照射群では非照射群、0.
5Gy以上の照射群と比べて、有意にT細胞の増殖亢進が認められた￠くO.
Ol)。一方、DCに対する低線量放射線の増殖効果は認められなかった。
この結果 から、 低線量の 放射線 照射はDCのT細胞 に対す る抗原提示能を亢進させると考えられた。
Experiment2：Surfacemarkeranalysis
低線 量放射 線照射群 と非照射 群、0.
5 Gy
以 上の照 射群の間 にD
C活性 化マーカ ー分子(CD80，CD86など）の発現の差は認められなかった。
Experiment3：Cytokineassay3a:ELIS
Aにおける検討では、低線量放射線照射群においては、非照射群や1.
0Gy以上の照射群と比較して有意にIL‑12の産生亢進が認められた（Pく0.
01)。一方、IL‑10の有意な産生亢進は認められず、1111指向性が示唆された。
3b: RT‑
PC
Rでは、 I
L‑12に 加えIFN‑ッ、IL‑2も同群でmRNAの発現亢進を認めた。ELISAと同様に 、IL‑10の産生に差は認められなかった。CCR
6，CCR7においても発現の差は認められなかった。
【考察と結論】
これまで、免疫系に対する様々なR
adiationHormesis効果が示されてきたが、DCに対する報告は認められなかった。我々の実験において、0.
05Gyの低線量放射線を照射したマウス脾 臓由来の DCによる 、T
細 胞の増 殖促進効 果が示さ れた。 これはD
Cおよび免疫系に対するR
adiationHormesis効果と考えられる。次いで、我々は放射線照射によるDC
抗原提示能の亢進の機序を検討した。フローサイトメトリーによる、DCの活性化マーカーは低線量照射 群と非照 射群およびlGy以上の照射群との間に差を認めなかったが、ELISA法およびRT‑PCRにおいてIL‑12，IFN‑ッ，IL‑2などのサイ卜カイン産生は低線量照射群で有意な増加が認 められた 。T
hlサイトカインであるIL‑10の増加は認められず、Th2指向性が示唆された。 DCに対する 低線量 放射線照 射によ るT
細 胞活性化 には、 DCの細胞数や表面抗原の変化 で は な く 、こ れ ら のTh2サイ ト カ イン の 産 生増 加 が 関 与し て い ると 考 え られ た 。
結 語 ：DCに対す る低線 量放射線 照射は 、Th2
サ イ卜カイ ンの増 加を介し てT細胞増殖 刺激を促進すると考えられた。

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学位論文審査の要旨
主 査

教 授

小 野 江 和 則

副 査

教 授

自 土 博 樹副 査

教 授

今 村 雅 寛学位論文題名EffeCtSOf
10W−dO
Selrradiationonen
hanCementofimmun
itybyden
drit
iC
Ce
11S
（低線量の放射線照射が、樹状細胞の免疫効果に与える影響に関する研究）

従来、放射線は線量に比例して発がん作用などの有害作用を増加させ、低線量においても同様であると考えられていたが(linearnot
hresholdmodel)、極低線量の放射線照射は生体に有益に働くと考えられており、radiationhormesis効果と呼ばれる。その機序としては、極低線量 の放 射線 照射 に対 する 適 応反 応と して のD
NA損 傷予防や、DNA修復促進など によると考えられている。抗腫瘍効果や免疫系に対する効果に関する報告も多く認められ、低線量放射線による宿主免疫能増強で悪性腫瘍の増殖や転移が減少するといわれている。従来の報告の多くはT細胞への影響を検討したものであり、これまで樹状細胞(dendriticcell，DC)に対する低線量放射線効果の報告は認められない。申請者は、本研究において低線量放射線が 樹 状 細 胞 の 抗原 提示 能に 与え る影 響、 お よび その 機序 につ いて の検 討を 行っ た。
C57BL/6マ ウ スの 脾臓 細胞 より M
ACSにて CDllc陽性 細胞 (DC)を選 別し 、低 線量 放射線(0.
02，0.
05，0.1，0.
5，1.
0Gy
線量率1Gy/min)
を照射した細胞をstimulatorとし、BALB/c
マウスの脾臓由来のT細胞をresponderとしたallogen
ei
cmixedleukocytere
action(MLR)
を行い、T細胞増 殖刺激の評価を行ったところ、0.
05 Gyをピークに低線量照射群においてT細胞増殖刺激の亢進を認めた。マクロファ ージやB細胞などの抗原提示細胞に対して低線量照射を施行したものでは同様の効果は認められなかった。また、低線量照射によるDCの直 接 増 殖 刺 激 は 認 め ら れ ず 、 DCの 機 能 亢 進 に 伴 う も の と 考 え ら れ た 。
DCの活 性化 マー カーである副刺激分子や接着分子 (CD80、CD86、I̲パ、CDld、CD40、10｀Mー1、u強‐1）の発現を検討したところ、低線量照射群と非照射群およびo．5Gy以上の照 射 群 に 差 は 認め られ ず、 表面 マー カー へ の低 線量 照射 の影 響は 否定 的で あっ た。
次いで、EuSA法にてDC培養上清中のサイ トカイン測定を行ったところ、低線量照射群においてIL一12産生の増加が認められた。 また、RT‐PCR法にてサイトカインのmRNA測定を行ったところ、低線量照射群においてIL112，IFN・アなどのn1指向性サイトカイン産生の有意な増加が認められた。IL110などT
h2サイトカイン産生は差が認められなかった。また、RT−P
CR
法 においてCCR6，CCR7など遊走に関わるケモカインレセプターの発現の検討も行ったが、低線量照射群と非照射群、0．5Gy以上の照射群との間に差は認められなかった。
DCに対 する 低線 量照射はDCのT細胞増殖刺激を亢進させるが、その機序として は、DC
表面マーカー分子の変化ではなく、IL112やIFN‐アなど恥1サイトカイン産生によるものと考えられた。
本研究で、申請者はradiationhornlesisにおけるDCの関わりを初めて明らかにし、低線量
放 射 線 照 射 DCの 抗 腫 瘍 効 果 誘 導 に お け る 可 能 性 に つ い て 示 唆 し た 。
‑ 445−

公開発表にあたって、副査自土博樹教授からinv
ivo
応用のための実験法、実験テーマの選択理由、celltherapyに応用する際の問題点についての質問があった。申請者は担がんマウスに対してinvivoで放射線照射を施行し、マウスのDCを評価する方法、またはcelltherapyとして低線量照射 を施行したDCを用いる方法を示した。免疫学的に抗腫瘍効果を高めるた
め のDCの基 礎デ ータ が必 要で あっ た こと 、低 線量 の放 射線 照射 によ りDNA
傷害自体は高まる可能性はあることや、celltherapyに用いるにはデータが不足しており、動物種やストレインの差異を考慮する必要があるとの回答を示した。
次いで、主査小 野江和則教授からD
CのI
L‑12産生を促進する工夫の有無、実験に使用したD
Cの 成熟 段階 、MLRにお ける D
Cの 細胞 数の 影響 につ いて の質 問 があ った。申請者はIL‑12産生を促進させるために特別な工夫はせず、低線量照射の影響だけを検討したこと、
MHC class II
分 子の 発現 、CD80
な ど の表 面マ ーカーの検討からある程度成熟したDC
であ ると 考え られ るこ と、 非働 化前 の D
C細 胞数 に変化がなく、その後のDCに25（おの放射線照射で非働化 した後にT細胞との共培養を 行っているため、DCの細胞数の影響は考えられないとの回答をした。
最後に、副査今 村雅寛教授より、他の抗原提示細胞では同様の効果は認められず、DCに
特 異的 な現 象で ある 理由、DCのsubtype、cell ther
apyに用いる際の培養DCの回収率、測 定し たIL‑1
2の subunitにつ いて の 質問 があ った。申請者はD
C特異的である理由は不明 であ るが 、高 用量 の放射線照射もI
L‑12産生に影響するとの報告があり、放射線はDCのサイトカイン産生に影響する可能性が高いと考えられるが、他の抗原提示細胞との違いについては不明であ ること、表面マーカー、機能からDC subtypeは骨髄球系 DCとして矛盾し ない こと 、GM‑C
SFがcell therapyの際 のDCの培養には必要と考えられるが、今回はサイトカインを入 れずに培養したものを用いているため回収率は不明であること、E
LISAに おい ては IL‑12 p75を、 RTPCR法 で はp40 subunitに 対す るprimerを 用いて測定しているとの回答をした。
この論文はDCの 免疫能に対する低線量放射線照射の影響を明らかにした 初めての報告
で あ り 、 DCに よ る 免 疫 療 法 な ど の 抗 腫 瘍 効 果 増 強 へ の 応 用 が 期 待 さ れ る 。
審査員一同はこれらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判定 し た。

ー 446一