博 士 （ 医 学 ）大 村 悦敬
学 位 論 文 題 名ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー T(NKT)細 胞 は 高 脂 血 症 発 症
アポE欠損マウスにおける動脈硬化の粥腫破綻に寄与する
学位 論文内容の要旨【背景と目的】近年高齢化と食 生活の欧米化に伴い，わが国においても心筋梗塞などの動脈硬化性疾患が増加している． 動脈硬化の発症・進展においては，血管壁局所における脂質代謝異常を基盤とした慢性炎 症が重要で，先行研究によって自然免疫を担うマクロファージ （ M￠ ）や ，獲得免疫の柱となるT細胞の関与が明らかにされて いる．ナチュラルキ
ラ ー T (NKT)細 胞 は ， ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー(NK)細胞 とT細胞 双方 の表 面抗 原 を発 現し ，自然免疫と獲得免疫を調節する T細胞亜群である．糖脂質を 特異的に認識して炎症性サイトカインを産生することより， 動脈硬化病巣の発症・進展に諮いて重要な役割を果たしていると考えられ，動脈硬化モデ ルマウスを用いた検討において，NKT細胞は動脈硬化病巣に存 在 し， NKT細胞の活性化によりTH1サイトカインを誘導し，動脈 硬化病巣の発症・進展に関与していることが報告さ れている．急性心筋梗塞は冠動脈内の動脈硬化病巣での粥腫が破綻し血栓性閉塞をきたす ことで発症するが，機序としては粥腫を覆う線維性被膜が分解されて破綻をきたすと考えられて韜り，病変局所での慢性炎症が重要な役割を果たす．
我々の高齢アポE欠損マウスを用いた検討では，大動脈弁輪 部における複雑病変の面積はNK
T細 胞を 刺激 活性 化さ せて も不 変 であ ったが，病巣内で線維性成 分が減少しており，NKT細胞活性化によって動脈硬化病巣に質的な変化がもたらされることが示唆されている．
さらに我々は，粥腫破綻が関与 する不安定狭心症患者において，末梢血中のNKT細胞が活性化された結果，総数が減少し ていることを報告している．これらのことより，NK
T細胞は動脈硬化粥腫破綻に関与して いる可能性が考えられるが，これまでNKT細胞と粥腫破綻の関係を直接検討した研究はな い，本研究では，ヒト粥腫破綻に類似した病理所見が観察され る 高脂 肪食 投与アポE欠損マウスを 用いてN
KT細胞を刺激活性化 し，腕頭動脈レベルにおける動脈硬化病巣を病理組織学的に評価し，遺伝子発現の変化を生化学的に解析して，NKT細 胞 が 動 脈 硬 化 粥 腫 破 綻 に お い て 果 た し て い る 役 割 を 検 討 し た ．
【材 料 と方 法】 高脂 血症 発症 雄性 アポ E欠損マウスを用い，8週齢より高脂肪食で8週間飼育した．高脂肪食開始と同時 にN
KT細胞特異的刺激物質であるa‐ガラクトシルセラミド(aGC)ま た は コ ン ト ロ ー ル と し て り ン 酸 緩 衝 食 塩 水 (PBS)を 週 2回 ，計 16回腹 腔内 投与した． 1
6週齢の時点で糖負荷試験を行い，採血後屠殺し，腕頭動脈，大動脈組織を採取した．腕頭動脈はホルマリン固 定後に切片を作製し，エラスチカ・ワンギーソン染色を行い，最も病変形成が強い切片に おける粥腫の面積，埋没した線維被膜の数，弾性板の断裂数，線維被膜の厚さを測定した ．左総頚動脈，左鎖骨下動脈分岐部を含む遠位大動脈弓組織からRNAを抽出し，定量的RTPCRを行った．
【結 果 】両 群と もに 体重 ，血 清総 コレ ステ ロール値，HDL，中性脂 肪，遊離脂肪酸に有意差は認めなかった．糖負荷試 験では空腹時血糖値に有意差は認めなかったが，グルコー― 345−

ス投 与後 30分，60分 血糖 値が aGC投与 群で PBS
投 与群 より 有意 に高 値で あった，内臓脂肪を 用い た遺 伝 子発現解析の結果，aGC
投与 群でのV
a14/
Ja18 (NKT細胞マーカー），MHCclass II (M￠ マーカー），RANTES（T細胞 ケモカイン）の発現はP
BS投 与群にくらべて有意に亢進しており，NKT細胞の活性化によって内臓脂肪で炎症 が惹起されることが示された．腕頭動脈を用いた病理組織学的検討では，両群とも同程度の粥腫形成が見られたが，
a,GC投与群で粥腫内に埋没した線維 性被膜や断裂した弾性板の数が増加し，線維性被膜の厚さ が減 少し て おり ，NKT
細 胞の 活性 化に よって粥腫が脆弱化すること が示唆された．
大動 脈組 織を 用 いた遺伝子発現解析では，Va14/J
a18，MHC class II，RANTES，IFN‑yMMP‑2の 発 現 は aGC投 与 群 で PBS投 与 群 にく らべ て有 意 に増 加し てお り， N
KT細胞 特 異的刺 激物 質aGCの投 与に よっ て血 管組 織へ の N
KT細胞 ，T細 胞の 集簇 ，M￠の活性化ならびに ，TH1サイ トカ イン であ るIFN‑yや 細胞 外マトリックス分解酵素MMP‑2が病理組織で確認された粥腫の脆弱化に寄与して いることが示唆された．
【考察】 アポE欠損マウスを高脂肪食で飼育した動脈硬化粥腫 破綻マウスモデルにおいて， aGCを 腹腔 内反復投与してNKT細胞を活性化すると，腕頭動脈におけ る動脈硬化粥腫の脆弱性が増すことが明らかになっ た．血管組織の遺伝子発現解析では，aG
C投与によって NKT細 胞 や T細 胞 の 集 簇 お よ ぴ Mめ の 活性 化が 確認 さ れ， N
KT細胞 も粥 腫破 綻に お いて重要な役割を果たしていることが 示された．N
KT細胞は炎症早 期に活性化し，自然免疫と獲 得免 疫の 双 方を 調節 する 働き を有 する ことから，NKT細胞の活性化 によってM￠やT細胞が刺激され，血管局所での慢性 炎症が惹起されたと考えられた，NKT細胞の活性化によっ て血 管局 所 でIFN‑yやMMP‑2の 発現 亢進 が認 めら れた が， IF
N‑yはTH1タイプの免疫応答を誘導し，粥腫での脂質の蓄積 や血管壁細胞のアポトーシスを誘導し，MMPも粥腫の脆弱性に重要なことが知られており ，NKT細胞活性化による動脈 硬化粥腫破綻の有カな分子機序と考えられた．また，NKT細胞刺激活性化によって，耐糖 能障害の悪化も認めており，耐糖能障害が粥腫破綻に関与し た可能性も考えられる．実際，耐糖能障害が遷延すると生体内では糖化最終産物(AGE: Advanced GlycationEndproducts)が増加するが，AGEは酸化LDLの増加を介して血管内皮細胞や平滑筋細胞に酸化ストレ スや炎症を惹起することが報告されている．今回の研究結果よりN
KT細胞は動脈硬化の発症・進展に寄与しており，
NK
T細 胞活 性化 を抑制する介入が有効である 可能性がある．一方，NKT
細 胞は自己免疫性疾患や腫瘍などの病態では生体防御 的な役割を果たしていることが示されており，本研究の成果を臨床に応用するためにはNKT細胞の病態における関与に ついてさらに詳細な解析を行ぬぃ，有効かつ安全な介入方法 を開発する必要がある，【結 論】 アポ E欠損 マウ スを 高脂 肪食 で飼 育した動脈硬化粥腫破綻マウ スモデルにおいて ， aGCを 腹腔 内反 復投 与 して N
KT細胞 を活 性化 する こ とに より ，血 管組 織へ のNKT細胞， T細胞 の集 簇およぴM￠の活性化，TH1
サ イトカインI
FN‑1や細胞外マ トリックス分解酵素MMP‑2の亢進が認められ，さらに腕頭動脈に韜ける動脈硬化粥腫の脆弱性が増加した．
これまでの研究結果と合わせると， NKT細胞は動脈硬化病巣の発 症・進展のみならず，動脈硬化粥腫の破綻にも寄与している ことが確認され，免疫調節細胞であるNKT細胞が動脈硬化 性疾 患の 新た な予 防・ 治療 の標 的と して有 望で ある 可能 性が 示唆された．

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学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 筒 井 裕 之
副 査 教 授 松 居 喜 郎
副 査 教 授 小 池 隆 夫

学 位 論 文 題 名ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー T(NKT)細 胞 は 高 脂 血 症 発 症
アポE欠損マウスにおける動脈硬化の粥腫破綻に寄与する
近年高 齢化と食 生活の欧米化に伴い、わが国においても心筋梗塞などの動脈硬化性疾患が増加 している 。動脈硬化の発症・進展においては、血管壁局所における脂質代謝異常を基盤とした慢性炎症が重要で、先行研究によって自然免疫を担うマクロファージ（M￠）や、獲得 免 疫 の 柱と な る T
細 胞 の 関与 が 明らか にされ ている。 ナチュ ラルキラ ーT (NKT)細胞は 、 ナ チュラ ルキラー (NK)細胞と T細胞 双方の 表面抗原 を発現 し、自然 免疫と獲 得免疫を調 節するT細胞亜 群であ る。糖脂 質を特 異的に認識して炎症性サイトカインを産生すること より、動 脈硬化病巣の発症・進展において重要な役割を果たしていると考えられ、
動脈 硬 化 モ デル マ ウ スを 用 い た検 討 において 、NKT細胞は動 脈硬化 病巣に存 在し、 NKT細胞の 活性化に よりTH
Iサイト カインを 誘導し、動脈硬化病巣の発症・進展に関与していること が報告さ れている。急性心筋梗塞は冠動脈内の動脈硬化病巣での粥腫が破綻し血栓性閉塞 をきたす ことで発症するが、機序としては粥腫を覆う線維性被膜が分解されて破綻をきた すと考え られており、病変局所での慢性炎症が重要な役割を果たす。我々の高齢アポE欠損マウ スを用い た検討 では、大 動脈弁 輪部にお ける複 雑病変の 面積はN
KT細胞を刺激活性 化させて も不変 であった が、病巣 内で線維性成分が減少して韜り、NKT細胞活性化によって動脈硬化病巣に質的な変化がもたらされることが示唆されている。さらに我カは、粥腫破綻が関与する不安定狭心症患者において、末梢血中のNKT細胞が活性化された結果、総数が 減少して いるこ とを報告 している 。これらのことより、NKT細胞は動脈硬化粥腫破綻に関 与してい る可能 性が考え られるが 、これまでNKT細胞と粥腫破綻の関係を直接検討した研 究はない 。本研究では、ヒト粥腫破綻に類似した病理所見が観察される高脂肪食投与アポ E欠損 マウスを 用いて NKT細胞 を刺激 活性化し 、腕頭 動脈レベ ルにおける動脈硬化病巣を 病理組織 学的に 評価し、 遺伝子発 現の変化を生化学的に解析して、NKT細胞が動脈硬化粥腫破綻において果たしている役割を検討した。
アポE欠損マ ウスを 高脂肪食 で飼育し た動脈 硬化粥腫 破綻マ ウスモデルにおいて、NKT細胞の 特異的リ ガンドであるa‐ガラクトシルセラミドを腹腔内反復投与してNKT細胞を活‑ 347−

性 化 する こ と によ り 、血管 組織へ のN
KT
細 胞、T細胞の 集簇およ びM￠の活性 化、TH1サ
イト カインIFN‑yや細 胞外マト リック ス分解酵 素MM
P‑2の亢進が認められ、さらに腕頭動脈に おける動 脈硬化 粥腫の脆 弱性が増加した。これまでの研究結果と合わせると、NKT細胞は動脈硬化病巣の発症・進展のみならず、動脈硬化粥腫の破綻にも寄与していることが確認 され、免 疫調節 細胞であ るNKT細胞が動脈硬化性疾患の新たな予防・治療の標的として有望である可能性が示唆された。
公開発表に際し、まず松居教授より動脈硬化の初期病変、大動脈瘤、移植心での動脈硬化 病 変で の NK
T細 胞 の役割 につい て質問が あった 。ついで 小池教 授よりNKT細胞の 刺激方法による免疫反応の変化について、本研究におけるTH17の検討の有無、ヒトの動脈硬化とNKT細胞の 関連に 関する報 告の有無について、また、動脈硬化研究におけるマウスの組織像とヒト動脈硬化病変の類似性についての質問があった。最後に主査より動脈硬化でのNKT
細 胞 の 活性 化 に 際し、 どのよ うなりガ ンドが 候補とし て考え られるか 、また、 N
KT細胞とマクロファージの直接的な関係についての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は研究結果および文献的知識により適切な回答を行った。
この 論文は 、高脂血 症発症ア ポE欠損マウ スを用 いてNKT細胞が動脈硬化粥種の炎症を増強 し、マク ロファ ージやT細胞を活性化させて動脈硬化粥種の破綻に関与するとの初めて明らかにした点で高く評価され、今後の動脈硬化粥種の破綻の機序解明やその予防治療に期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ 申請 者 が 博士 （ 医学） の学位 を受ける のに充 分な資格 を有す るものと 判定した 。

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