研究論文

光学 36, 1 (2007) 35‑40
Received April 4, 2006;Accepted November 2, 2006

SHG（第二高調波発生光）顕微鏡を用いた真皮コラーゲン
線維分布の観察伊藤誠啓 ・安井高橋元次

武史

・福島修一郎 ・荒 木勉 ・山下豊信

・國澤直美 ・大阪大学大学院基礎工学研究科 〒560‑8531 豊中市待兼山町 1‑3(株)資生堂 ライフサイエンス研究センター 〒224‑8558 横浜市都筑区早渕 2‑2‑1

Observation of Dermal Collagen Fiber Distribution by Second-HarmonicGeneration Microscopy
Masahiro ITO , Takeshi YASUI , Syuichirou FUKUSHIM A , Tsutomu ARAKI ,Toyonobu YAMASHITA , Naomi KUNIZAWA and M otoji TAKAHASHI
Graduate School of Engineering Science, Osaka University, 1‑3 M achikaneyama-cho, Toyonaka 560‑8531
Life Science Research Center,SHISEIDO Co.,Ltd.,2‑2‑1 Hayabuchi,Tsuzuki-ku,Yokohama
224‑8558
Second-harmonic-generation (SHG)microscopy has been applied to observe collagen ﬁber structure in porcine dermis. Diﬀerence of collagen ﬁber structure among diﬀerent sliced samples isclearly visualized as high contrast SHG images using a sample-scanning SHG microscope basedon a transmission conﬁguration. From comparison of the SHG images between the transmission
detection mode and reﬂection one, we have conﬁrmed that the reﬂection-mode SHG imaging isalso applicable to observation of the collagen ﬁber structure in the porcine dermis.Furthermore,
we have employed a beam-scanning SHG microscope based on the reﬂection conﬁguration for
optical-sectioning of dermal collagen ﬁber in thick porcine skin every 10-μm depth and conﬁrmedthat the collagen ﬁber structure in the dermis is spatially evolved along the depth direction.
Key words: second-harmonic-generation, collagen, femtosecond laser, dermis, skin, microscope

1. は じ め に組織切片のコラーゲンを特異的に染色し（ワンギーソン染

ヒト身体における最大の臓器といわれる皮膚は，表皮色等），光学顕微鏡で組織診断をするが，さらにコラーゲ（epidermis)・真皮（dermis)・皮下組織（subcutis）の三ン構造や配向を評価する手段として，電顕観測 ，X 線回層構造からなる．これらの中で，真皮は皮膚の張り・弾折 ，マイクロ波法 ，機械的特性法 なども報告されてい性・水分保有の機能に深く関与しており，皮膚における中る．しかし，いずれも侵襲的あるいは破壊的測定手法であ心的役割を担っている．真皮には構造タンパク質であるコり，解剖学的皮膚生検が必要である．このような生検に基ラーゲンが豊富に含まれており，真皮の形態的および機能づいた手法はコラーゲン構造の異常を実際に識別するうえ的特性を決定するうえで重要な役割を果たしている．このでは信頼性が高いが，医療現場での臨床応用を考えた場

ような真皮コラーゲン（dermal collagen）の構造異常や合，患者に対して非常に大きな負担を強要することにな構造的変化を観察することは，皮膚性状を探るだけでなくる．そこで臨床応用を考慮し，迅速簡便に毛穴の観察から皮膚疾患に関する情報を得るうえでも重要と考えられるこ

コラーゲンの配向を知る方法が提案されている ．さらにとから，真皮コラーゲンの変化をモニターするための診断

高度の診断をめざすためには，コラーゲン濃度と配向の局技術が皮膚科学の分野で強く望まれている．通常は，皮膚所断層情報を非接触で得る方法の開発が強く望まれる．

E-mail:t-yasui＠me.es.osaka-u.ac.jp

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35 (35 )そのような要求を満たす可能性を有するひとつの手段が光プローブ法である．生体における最外殻組織である皮膚は光学的アプローチが比較的容易であり，これまでにもさまざまな光学的皮膚計測法が報告されている．光コヒーレ
ンストモグラフィー (OCT)では，多重散乱光の中からコヒーレンスを保持する後方散乱光のみをコヒーレンスゲー
ト検出することにより得られた散乱係数空間分布から組織の断層構造を可視化する ．例えば，コラーゲン計測に関しては，コラーゲンの有する複屈折性を偏光感受型 OCTで抽出することにより，火傷深度診断への応用が試みられている ．反射共焦点顕微計測では，生体組織中で後方散乱されたレーザー反射光に対して，共焦点配置を導入することにより，三次元の空間分解能を達成する．同時に，このような空間フィルタリング法は，大多数の多重散乱光を除去し比較的散乱程度の小さい後方反射光のみ抽出可能とFig.1 In situ observation of dermal collagen ﬁber withSHG imaging.

するため，多重散乱による画像ぼけの少ない三次元画像取得を可能にする．また近年，二光子蛍光顕微鏡を用いた生からなるトロポコラーゲン（コラーゲン分子）であり，こ体組織観察に関する研究も活発に行われており，特に，組れが規則的に順次集合して階層的に太くなっていく．この織や細胞の自家蛍光を利用することにより無染色で組織観ようなコラーゲンは，その光波長オーダーでの非中心対称察する試みも行われている ．これら従来法は，生体組織性構造ゆえに，高い二次の非線形光学特性を有している．

全体の構造を可視化するという点ではすぐれているが，そそのため，非常に高い瞬時ピークパワーを有するフェムトの中からコラーゲン情報のみを抽出し詳細に測定すること秒パルスレーザー光をコラーゲン含有生体組織に照射するは困難であった．と，非位相整合型 SHG 発生過程を介して ，生体 SHG

フェムト秒（10秒）オーダーの超短パルスレーザー光が特異的に発生する．例えば，皮膚にフェムト秒パルス光を生体組織に照射すると，光電場とコラーゲン分子の非レーザー光を照射した場合，コラーゲンは真皮のみに局在線形相互作用によって，入射レーザー光の半波長（あるいしているので，生体 SHG 光を用いることにより真皮コラは 2 倍の周波数）の光が第二高調波発生 光（生 体 SHGーゲン構造の選択的計測が可能になる（Fig.1）．コラー光）として発生する ．筆者らは，この生体 SHG 光がコゲン以外に筋肉フィラメントや微小管といった生体構成物ラーゲン情報を非接触リモートで測定する手段として有効

質も SHG 光を発生させるがであることに注目し，生体 SHG 光を用いてさまざまなヒSHG 発生効率を有しているうえに，皮膚におけるこれらト組織のコラーゲン配向測定法に関する研究を行っていの物質の含有率を考慮すると，皮膚からの生体 SHG 光はる．皮膚組織の場合，コラーゲンは真皮のみに豊富真皮コラーゲン由来のものであるといえる．また，近赤外に含まれ (含有量 70%)，表皮および皮下組織にはほとん

超短パルス光の良好な生体透過性を利用すると表皮越しにど含まれないことに注目すると，真皮コラーゲンの分布情生体 SHG 光を誘起し，その後方散乱光を検出できる．そ報のみを特異的に抽出する手段として，生体 SHG 光が有れ以外にも，バックグラウンド光（拡散反射光，蛍光）と効であると考えられる．これまでにも，生体 SHG 光を用の分離が容易，低侵襲，深浸透性，熱的ダメージが小さいた真皮コラーゲンの構造計測が提案さい，三次元イメージングが可能といった特徴を有していれているが，真皮コラーゲンの詳細な構造分布測定はほとる．また，真皮コラーゲン固有の非線形光学特性を利用すんど報告されていない．そこで本研究では，動物試料に対るため組織染色が不要であり，in situ 測定が可能なため，して真皮コラーゲンの詳細な構造分布測定を行ったので報

火傷診断

告する．

なツールになることが期待される．

2. 生体 SHG 光を用いた真皮診断

3. 実験装置およびサンプルや配向計測

コラーゲンの基本構造はポリペプチド鎖三重らせん構造
36 (36 )や光老化診断，特にコラーゲンが高いといった臨床応用分野で有用

Fig.2 に実験装置を示す．光源にはモード同期チタン・光学

Fig.3 M icrophotograph of HE-stained porcine dermis(image size:400μm×400μm). (a) upper porcine dermis,(b) lower porcine dermis. R:reticular dermis, P:papillarydermis, E:epidermis, B:blood vessel.

サンプルには，さまざまな動物の中で比較的ヒト皮膚に類似した構造を有する市販ブタ皮膚（Yucatan M icropig，米国チャールズ・リバー社）の背中部分を用いた．採取さFig.2 Experimental setup. AOM: acousto-optic modulator, P: polarizer, λ/4: quarter-wave plate, HS: harmonicseparator, GM:galvano mirror, L1, L2, L3, and L4:lenses,
OL: objective lens, CL: condenser lens, BPF1 and BPF2:
blue-pass ﬁlters, PMT1 and PM2:photomultiplier tubes.

れた皮膚組織は OCT コンパウンド（サクラファインテッ
クジャパン社）で包埋した後，液体窒素で凍結される．凍結皮膚組織ブロックをミクロトームによって皮膚表面と平行方向に連続スライスすることにより，各皮膚深さでのブタ真皮切片サンプル（porcine dermis，厚さ 16μm）を作サファイアレーザー（中心波長 800 nm，パルス幅 100 fs，成した．また，規則的な単一配向のコラーゲン構造を有す

繰 り 返 し 周 波 数 80 MHz）を 用 い る．音 響 光 学 変 調 器るマウス腱（mouse tendon，厚さ 10μm）をコントロー（AOM ）で強度変調されたレーザービームは，ガルバノミ

ルとして用意した．Fig.3 (a)および (b)は，真皮上層部ラー（GM ）とリレーレンズ光学系（L1，L2）を経た後，および下層部の切片サンプルの光学顕微鏡像［400μm×対物レンズ（OL）でサンプル照射することにより生体400μm，ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色］を示しSHG 光（中心波長 400 nm）を発生させる．なお，入射レている．HE 染色では，細胞核が青紫色，線維・細胞質・ーザー光は SHG 光発生効率の偏光依存性をキャンセルす赤血球等はそれぞれの性質に応じ濃淡各種の赤色に染まるため，偏光子（P）と 1/4 波長板（λ/4）を用いて円偏る．真皮上層部では，表皮が真皮に落ち込んだ表皮突起光にしている．透過配置計測では，生体 SHG 光の前方直（E: epidermis），血管（B: blood vessel），乳頭真皮（P:進成分をコンデンサーレンズ（CL）で集め，青色透過フpapillary dermis）および網状真皮（R:reticular dermis）

ィルター（BPF1，透過波長 300〜500 nm）でレーザー光が混在している様子が確認できるが，乳頭真皮と網状真皮成分を除去した後，光電子増倍管（PM T1）でロックインの違いは明確ではない．一方，真皮下層部では，規則的構検出を行う．一方，反射配置計測では，生体 SHG 光の後造をもたない網状真皮が分布している様子が確認できる．

方散乱成分を同じ対物レンズで集光し，ハーモニックセパ

反射配置計測では，表皮を剥離した凍結ブタ真皮組織ブロレーター（HS，反射波長 400 nm）と青色透過フィルターック（厚さ 3 mm）をサンプルとして用いた．

（BPF2，透過波長 300〜500 nm）で抽出した後，別の光電子増倍管（PM T2）でロックイン検出を行う．また反射4. 測 定 結 果

配置では，空間分解能向上と多重散乱光除去の目的で，マ4.1 組織切片の SHG イメージング

ルチモードファイバー（コア径 50μm）とレンズ（L4）を

ここでは組織の詳細を知るため，空間的，時間的に焦点用い共焦点配置を導入している．最終的に，ステッピングの変化しないステージスキャンにより切片サンプルのモーター駆動ステージによるサンプル走査あるいはガルバSHG イメージングを行った．測定には，長作動距離対物ノミラーによるビーム走査を用いて，SHG イメージング

レンズ（NA＝0.42，倍率 20 倍，作動距離 20 mm，ドライ）計測を行った．本システムの面内分解能と深さ分解能はそを用い，入射レーザーパワーは 5 mW に設定した．得られぞれ 1.5μm と 14μm である ．

れた SHG イメージ（400μm×400μm）を Fig.4 に示す．

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37 (37 )Fig.5 (a) Transmitted SHG image, (b) reﬂected SHG
image of porcine reticular dermis (image size: 200μm×200μm).

部と同様に，太いコラーゲン線維が分布しているが，網状のコラーゲン線維分布は確認できない（Fig.4 (d)）．また，真皮各層で SHG イメージを比較すると，乳頭層と網状層ではコラーゲン線維分布の相違が確認できたが，網状Fig.4 SHG images of sliced samples (image size: 400μm×400μm). (a) mouse tendon, (b) papillary layer, (c)upper reticular layer, (d) lower reticular layer in porcine
dermis.

層上部と下部では明確な相違は確認できなかった．一般に真皮に含まれるコラーゲンはタイプⅠコラーゲンが主であり，タイプⅢコラーゲン等のタイプの異なるコラーゲンが若干混在している程度である．しかしながら，真皮表皮境界に近づくにつれタイプⅢコラーゲンの比率が上昇する．

いずれのサンプルにおいても，コラーゲン線維分布が高コ

タイプⅢコラーゲンは肌のきめの細かさを決定する重要なントラストな SHG イメージとして可視化できていることファクターであり，別名ベビーコラーゲンともいわれ新生がわかる．これは，コラーゲン自身の高い非線形光学特性児では 50% 程度の構成比となっている．乳頭層と網状層以外に，SHG 光強度が屈折率分布の 2 乗に反比例するたにおける SHG イメージの相違は，コラーゲンタイプの含め ，従来の屈折率分布に対して線形な光イメージング法有率の違いによるコラーゲン線維構造の違いを反映してい（例えば，OCT）と比較すると，メリハリのきいた高コンると考えられる．このように，SHG イメージングを用いトラスト像を取得することが可能となる．マウス腱では，ることにより，組織コラーゲン線維の詳細な分布情報のみ太く発達したコラーゲン線維が非常に規則性高く配向分布を特異的に抽出することが可能になる．

している様子が確認できる（Fig.4 (a)）．一般に腱組織の一般に，コヒーレントな非線形光学過程として発生するコラーゲン線維は単一軸配向を示すとされており，このよ

生体 SHG 光の大部分は前方直進成分であるため，薄い切うなコラーゲン構造が腱組織の配向方向に沿った高い機械片サンプルの SHG イメージを高 S/N 比で取得するため的強度を支えている．ブタ皮サンプルに関しては，真皮上には上述のような透過配置が適している．一方，本手法の層（乳頭層付近；papillary layer），真皮中層（網状層上in situ 計測への拡張を考慮した場合，反射配置が現実的部；upper reticular layer）および真皮下層（網状層下部；であるが，その場合には微弱な後方散乱 SHG 光を用いる

lower reticular layer）をそれぞれ測定した．真皮上層部必要がある．そこで，透過配置と反射配置における SHG

では，非常にきめの細かいコラーゲン線維が密に分布してイメージの違いを確認するため，ブタ皮切片サンプル（真いる様子がわかる（Fig.4 (b)）．Fig.4 (b)は，Fig.3 (a)皮中層部）を用いて，透過配置と反射配置の同時 SHG イの HE 染色光顕像と 1 対 1 で対応はしていないが両者をメージング計測を行った．前述の実験と同様の実験条件で

比 較 す る と，表 皮 が 真 皮 に 落 ち 込 ん だ 表 皮 突 起 部 分取得した透過および反射 SHG イメージを Fig.5 (a)およ（epidermal prolongation）は，表皮がコラーゲンを含有び (b)に示す（200μm×200μm）．透過 SHG イメージでしていないため，SHG 光の全く検出されない丸い領域とは，左上部から切り込んだ皮溝部分以外の領域から発生しして現れている．次に真皮中層部では，比較的太いコラーた SHG 光より，コラーゲン線維の分布状態が明確に確認

ゲン線維が直交方向にゆるやかに交叉した網状分布が部分できる．一方，反射 SHG イメージでは，検出 SHG 光の的に確認できる（Fig.4 (c)）
．真皮下層部では，真皮中層微弱化による測定 S/N 比低下のためコントラストが低下

38 (38 )光学しているが，透過配置と同様なイメージが取得できている．これらの結果から，測定 S/N 比の低下はあるものの，反射配置でも十分に測定が可能であることがわかった．
4.2 ブタ真皮組織ブロックの深さ分解 SHG イメージング
次に，ブタ真皮組織ブロック（厚さ 3 mm）の深さ分解SHG イメージングを反射共焦点配置で行った．また，皮膚の非接触リモート計測という観点からドライの対物レンズ（NA＝0.50，倍率 20 倍，作動距離 2 mm）を用い，入射レーザーパワーを 30 mW （1 ms/spot）に固定して実験を行ったが，このようなレーザービーム入射時に屈折率ミスマッチング（対物レンズ‑空気境界および空気‑サンプル境界）が発生する場合，イメージング深さに依存した球面

Fig.6 Depth-resolved SHG images of porcine reticulardermis at 10μm-depth step (image size:100μm×100μm).

収差が生じ，結果的に点像分布関数が低下するとされている ．また，生体組織のような厚みのある強散乱体中にお深度向上だけでなく空間分解能改善という観点からも，こいては，多重散乱によるレーザー集光ぼけも三次元の空間のような屈折率ミスマッチングを解消する必要があり，油分解能を低下させるひとつの要因である．このような空間浸対物レンズ利用による屈折率マッチングが望まれる．こ

分解能の低下を防ぐため，マルチモードファイバー（コアのような点を踏まえて測定可能深度を向上させるため，フ径 50μm）をピンホールとして用いた共焦点配置を導入

ェムト秒モード同期クロム・フォルステライトレーザーした（Fig.2）．また，測定時間を短縮するため，ガルバ（中心波長 1250 nm）と油浸対物レンズを用いたシステム

ノ走査機構（ガルバノミラー）の利用により連続的かつ高を現在開発中である．

速にビーム照射位置を走査することが可能なビームスキャ
ンモードを用いた．そして，生体 SHG 光を用いることに

5. まとめと今後の展望

より，機械的スライスを行うことなく，非接触リモートで

本論文では，生体 SHG イメージングが真皮コラーゲン生体内部のコラーゲン構造の計測（オプティカルセクショ分布を抽出する手段として有効であることを示した．高コニング）を行った．Fig.6 は各測定深度（10μm ごと）でントラスト・高空間分解な透過型 SHG イメージをもと得られた SHG イメージ（100μm×100μm）を示していに，真皮各層の切片サンプルにおけるコラーゲン線維の詳る．反射配置における測定 S/N 比の低下によりイメージ細な二次元分布が調査できた．さらに，反射型深さ分解が若干ぼけているが，オプティカルセクショニングされた

SHG イメージングによってコラーゲン線維分布のオプテ

SHG イメージが連続的に変化している様子が確認できィカルセクショニング像が得られ，本法が三次元的コラーる．例えば，真皮上層部ではコラーゲン線維がきめ細かくゲン構造の in situ 計測に有効な手法であることを確認し分布している一方で，真皮下層部では発達した太いコラーた．

ゲン線維が確認できる．これらの特徴は，真皮切片サンプ

実際にヒトへの臨床応用を実施する場合，照射レーザー

ルの SHG イメージング結果（Fig.4）と一致しており，光パワーに対する安全性の配慮が必須である．CW レーザ

真皮コラーゲン線維の三次元的な特徴が本手法によってとーの人体に対する JIS 安全基準値は，照射時間 1 ms におらえられている．しかしながら，実際の応用計測を考慮しいて 3 MW /m であり，1 ms 以下であれば照射時間に反た場合，現在の測定可能深度はまだ十分とはいえない．今比例した光パワー増加が許される．現時点ではフェムト秒回の検出 SHG 光は，中心波長 400 nm と非常に生体内多パルスレーザーの安全基準はまだ定まってはいないが，照重散乱を受けやすい波長帯に位置し，それによる信号減衰

射スポット径を 10μm とし，各点における測定時間を 1が測定可能深度を制限している．一般に多重散乱効果は波ms とした場合，上記に準処すれば 0.25 mW 程度に制限長の 4 乗に反比例するため，レーザー波長の長波長化が測される．今回報告した計測システムのままで安全基準値を定可能深度の向上に有効である．測定深度を制限する別の満たすには，照射光強度と照射時間の積を 120 分の 1 に減要因として，レーザービーム照射時の空気‑サンプル境界衰する必要がある．この場合問題となる S/N 比低下は光での屈折率ミスマッチングによるサンプル表面反射があ子計数法を採用することで解決できる．

り，これがレーザー光の生体内侵入を制限している．測定36巻 1号（2 07）

また，臨床における in situ 計測では，光学配置は反射39 (39 )型が基本となる．しかし，生体 SHG 光の後方散乱成分は前方直進成分と比較するとかなり微弱となる．さらに，今回のような顕微鏡計測は光学系の可動性が制限されるため，ただちに臨床に適用できるとはいえない．今後はより臨床応用に適応した光学設計が望まれる．例えば，真皮コラーゲンの断層構造を取得したい場合には，SHG 計測にOCT 技術を導入した SHG-OCTが有効である．SHG

光発生はコヒーレントな過程によって発生するため，低コヒーレンス干渉やヘテロダイン検出を利用することにより，微弱 SHG 光の増強，多重散乱光除去，高速測定，良好な深さ分解能といった特徴を有した OCT ライクな計測が可能になる．この場合にも光子計数方式の併用は効果的である．このような計測手法を利用することにより臨床応用にも耐えうる真皮コラーゲン診断法が可能となり，さまざまな皮膚科学分野への応用が期待できる．
本研究は科研費・基盤研究(A)17200032 および基盤研
究(B)16300155 より援助を受けた．
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