上原記念生命科学財団研究報告集, 30 (2016)133. 膵癌モデルマウスを用いた新規代謝制御分子の機能解析
坂本毅治

東京大学 医科学研究所 人癌病因遺伝子分野
Key words：膵癌，マウスモデル，ERK，RNF126

緒

言

膵癌は外科手術以外で有効な治療法が無く、5 年生存率が 5 %を切り、膵腺癌と診断された患者の生存期間の中央値は 6 カ月と極めて予後不良ながんである。膵癌では KRAS、CDKN2A、TP53、SMAD4/DPC4 などの変異が高頻度に観察されており、これらの変異を導入した遺伝子改変マウスではヒトの膵癌と良く似た病態を呈することから、遺伝子改変マウスを用いた膵癌の研究が盛んに行われている。しかしながら、膵癌悪性化の分子機構の理解は未だ不完全である。
我々は、これまでにゲノムワイド shRNA ライブラリーを用いた網羅的スクリーニングを行い、酸素依存性の細胞増殖に関わる遺伝子を 13 種類同定した１）。その中のひとつである RNF126 について解析を進めたところ、RNF126 は乳癌細胞株などで、足場非依存的な細胞増殖やヌードマウス皮下での腫瘍増殖を促進することが明らかとなった。メタボ
ローム解析の結果、RNF126 ノックダウン細胞では解糖系代謝産物には影響は無かったが、ミトコンドリアの TCA サイクルの代謝産物の低下が観察され、この傾向はがん細胞を非接着状態にした時により顕著に表れた。さらなる解析の結果、RNF126 は解糖系－TCA サイクルへの代謝フラックスを制御し、がん細胞の浮遊状態での生存、増殖に関わる
pyrubate dehydrogenase kinase（PDK）の E3 ユビキチンリガーゼであることが明らかとなった。以上の結果は乳癌、肺癌細胞株を用いた実験であり、膵癌において RNF126 ががんの悪性化を制御するかについては不明である。そこで本研究では、RNF126 が膵癌においてどのような役割を果たしているかについて、細胞株および膵癌モデルマウスを用いて検討を行った。

方法、結果および考察
RNF126 欠損膵癌モデルマウスの作製が予定よりも時間がかかったため、その間、先行研究の延長で、ヒト乳腺上皮MCF-10A、ヒト乳癌 MDA-MB-231、肺腺癌 A549 細胞における RNF126 の発現制御機構について解析を行った。細胞を浮遊状態で培養した際に、MCF-10A 細胞において RNF126 の発現低下が観察された（図 1A）。一方、MDAMB-231、A549 細胞では浮遊状態でも RNF126 の発現は保持されていた。がん細胞の足場非依存性の増殖には ERK シグナルが関わることから、ERK のリン酸化状態を調べたところ、浮遊状態での MCF-10A 細胞の ERK リン酸化が著しく低下しているのに対して、MDA-MB-231、A549 細胞では ERK のリン酸化が保持されていた。また、MEK 阻害剤
U0126 で細胞を処理したところ、MDA-MB-231、A549 細胞においても RNF126 の発現が低下した。以上の結果から、RNF126 の発現が ERK シグナルにより発現制御を受けることが明らかとなった。U0126 処理により MDA-MB-231、A549 において RNF126 の mRNA レベルが低下したことから（図 1B）、ERK シグナルにより RNF126 が転写レベルで制御されていることが示唆された。そこで、RNF126 のプロモーター領域を用いたレポーターアッセイを行った結果、開始コドン上流 1880-1860 塩基に存在する２つの ELK1 結合サイトが U0126 処理に応答することが分かった（図 1C）。
続いて、ELK1 抗体を用いてクロマチン免疫沈降実験を行った結果、ELK1 が U0126 処理応答性に上述の ELK1 結合サイトに結合していることが明らかとなった（図 1D）。以上の結果から、ERK シグナルは ELK1 を介して RNF126 の転写を促進することが明らかとなった２）。

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図 1． ERK シグナルによる RNF126 の発現制御（A）MCF-10A、MDA-MB-231、A549 細胞の ERK1/2、リン酸化 ERK1/2、RNF126、アクチンのウエスタンブロット解析。溶媒（DMSO）または U0126（10μM）を加え、接着または浮遊状態で 24 時間細胞培養した。
（B）RNF126 mRNA レベルの定量 PCR 解析。RNF126 mRNA レベルは Actb mRNA レベルで標準化した。エラーバーは標準偏差（n = 3）。データは t 検定で解析した。*p < 0.05、**p < 0.01。
（C）MDA-MB-231 細胞における RNF126 プロモーター活性の解析。エラーバーは標準偏差（n = 3）。データは t 検定で解析した。*p < 0.05、**p < 0.01。
（D）ELK-1 抗体またはコントロール IgG を用いた RNF126 プロモーターの ChIP–定量 PCR 解析。エラーバーは標準偏差（n = 3）。データは t 検定で解析した。*p < 0.05、**p < 0.01。
続いて、膵癌において RNF126 をノックダウンした際に、乳癌、肺癌で見られたように造腫瘍能が低下するかについて、ヒト膵癌 AsPC1 を用いてヌードマウス皮下での腫瘍増殖を解析した。その結果、RNF126 ノックダウンにより、AsPC1 の造腫瘍能が低下することが明らかとなった（図 2）。この結果から、膵癌においても RNF126 を抑制することで造腫瘍能が抑制されることが示唆された。

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図 2． RNF126 ノックダウンはヒト膵癌 AsPC1 細胞の造腫瘍能を抑制するコントロール（shLuc）および RNNF126 ノックダウン（shRNF126）AsPC1 細胞をヌードマウス皮下に移植し、腫瘍サイズを測定した。各群 n = 6、エラーバーは標準誤差。移植後 25 日の腫瘍サイズを Mann-Whitney
U 検定で解析した。*p < 0.05、**p < 0.01。
これらの細胞株を用いた実験の間、cre リコンビナーゼ発現下でのみ特異的に変異型 Kras を発現する LSLKrasG12D マウス、膵臓特異的に cre リコンビナーゼを発現する Pdx1-cre マウス、Cre リコンビナーゼにより各遺伝子の欠損が起こる Tp53flox/flox マウスを交配させた膵癌モデルマウス（KPC マウス）と Rnf126flox/flox マウスを交配させることで、RNF126 欠損膵癌モデルマウスを作製した。まず、膵癌モデルマウスにおいて、コントロールマウスと RNF126 欠損マウスでの生存期間の比較を行った。その結果、細胞株での結果に反し、RNF126 欠損膵癌モデルマウ
スはコントロールマウスに比べて有意に生存期間が短縮していることが明らかとなった（図 3A）。RNF126 欠損膵癌モ
デルマウスの膵臓の組織病理的解析を行ったところ、RNF126 ノックアウトマウスは４週齢の時点で膵臓の構造が確認できないほどに膵癌が進行していることが明らかとなった（図 3B）。以上の結果から、膵癌モデルマウスでは RNF126は膵癌の進行に対し抑制的に働くことが明らかとなった。

図 3． RNF126 欠損膵癌モデルマウスの解析（A）コントロール（n = 12）および RNF126 欠損（n = 11）膵癌モデルマウスの生存期間を Log-rank テストで解析した。P = 0.0023。
（B）生後 28 日の RNF126 欠損膵癌モデルマウスの膵臓のヘマトキシリン＆エオジン染色。
膵癌細胞株 AsPC1 では RNF126 は腫瘍促進的に働くのに対し、膵癌モデルマウスでは抑制的に働いたことから、RNF126 はがんのステージにより異なる役割を果たしている可能性が考えられる。今後は膵癌モデルマウスにおいて、3

RNF126 がどのようなメカニズムでがん抑制的に働くかについて、経時的に回収した膵臓組織の病理組織学的、生化学的解析を進める予定である。

共同研究者
本研究の共同研究者は、東京大学医科学研究所人癌病因遺伝子分野の中岡寛樹、芳野聖子、金森茜、村上善則、金沢大学医薬保健研究域医学系の清木元治である。

文

献1） Genetic screening of new genes responsible for cellular adaptation to hypoxia using a genome-wide shRNA
library. Yoshino S, Hara T, Weng JS, Takahashi Y, Seiki M, Sakamoto T. PLoS One. 2012;7(4):e35590. doi:
10.1371/journal.pone.0035590.
2） The ERK-signaling target RNF126 regulates anoikis resistance in cancer cells by changing themitochondrial metabolic flux. Yoshino S, Hara T, Nakaoka HJ, Kanamori A, Murakami Y, Seiki M,Sakamoto T. Cell Discovery. 2016;2:16019. doi:10.1038/celldisc.2016.19.

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