2020 OCTOBER
No. 617

第 66 巻 第 4 号（通巻 617 号）2020 年（令和 2 年）10 月

挨拶・巻頭言健康長寿 ........................ 朱通市次郎（ 2 ）レビュー
野兎病菌の自然宿主内における増殖と共生機構 ..................... 度 会 雅 久（ 3 ）解説
微生物の動物接種・動物継代の際に必要な動物数の統計学的推定について‒ 二項分布の応用 ‒.................................. 玄 間剛（ 7 ）日生研たより

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健康長寿
朱通市次郎

2020 年も残り二か月余となりました。
「新しい生活様式」、「with コロナの時代」となった本年を振り返ってみますと私自身、健康長寿への意識が非常に強くなったと感じております。
さて、7 月 30 日に厚生労働省から 2019 年の日本人の「平均寿命」が発表されました。その資料によりますと、女性 87.45 歳、男性 84.41 歳でいずれも過去最高とのことです。また、10 年ほど前からは「健康寿命」も発表されるようになりました。こちらは厚生労働省国民生活基礎調査（自己申告）をもとにしたものであり、「健康上の問題で日常生活が制限されることなく生活できる期間」と定義されております。最新データ（2016 年発表）による健康寿命は女性 74.79 歳、男性 72.14 歳となっております。
人生 100 年時代を見据えて、健康寿命を伸ばすことが日本社会の大きな課題の一つとされております。
実際、誰もが望んでいる「ピンピンコロリ」はまれであり、「ピンピン」の後の「ヨロヨロ・ヨタヨタ」期間、さらには「寝たきり」の時期もあります。10 年超となる「ピンピン」後の人生、どうよく過ごすか考えざるを得ません。
厚生労働省は、2011 年から健康寿命を延ばすための生活習慣病予防の啓発活動「スマート・ライフ・プロジェクト」を立ち上げ、以下の取り組みを推進しています。
①毎日プラス 10 分の身体活動（毎日なら、10 分のはや歩き。3 曲分歩きましょう等）② 1 日あと 70 グラムの野菜をプラス（野菜不足は、あとトマト半分等）③禁煙でタバコの煙をマイナス④健診・検診で定期的な健康チェック
先の見えない自粛期間中、私はあまりの閉塞感に圧し潰されてしまう恐怖に喘ぎました。偶然、書棚にあった「人は感情から老化する」（和田秀樹著 祥伝社新書）が目に留まり、「感情が老化（意欲や自発性や好奇心が低下）すると体を動かさなくなったり、頭を働かせなくなる」、そして「他の機能の老化が進む」とありました。さらに「感情の老化は 40 代から始まる」との言葉に、もう手遅れかと感じつつ、とにかく何か新しいこと、面白そうなことを始めることにしました。
手始めに前から興味があったクリーピングタイム、アロマティカスとバジルを植えました。しかし、その後のバジルとタイムの成長・広がりの速さに手を焼き、その利活用もよく分からず悩んでおります。
次に一度も読んだことのない作家の小説等 7 冊を購入、読みづらさを感じながら現在も挑戦しております。そして八月からは週 1 回の食事作り（キーマカレー専門ですが）を開始し、九月には数年ぶりにウォーキングを再開しました。また、この間にスマホのみならずズームデビューも果たしました。いろいろ試していますが、家人から好評なのはキーマカレーと風呂掃除ぐらいです。
「Go To トラベル」に東京が追加され、少し気分的に楽になりました。久し振りに親戚、友人を訪ねてみようかと思っております。
（常務理事）

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レビュー

野兎病菌の自然宿主内における増殖と共生機構
度 会 雅 久（山口大学共同獣医学部）状などが認められる。
1．はじめに病原体は人や動物に感染後、標的臓器・細胞内で増殖し、破壊することによって最終的には体外へ脱3．マダニにおける野兎病の動態出し、新たな宿主に感染する。この過程で宿主が死

野兎病の制御には、環境中の病原体の実態を把握に至る場合もある。一方で、病原体が環境中で自らすることが必須である。しかしながら、日本では媒の居場所としている自然宿主に侵入した場合、宿主介するマダニの種類も不明確な状況であった。そこ内での爆発的な増殖は認められず、体内で維持されで、我 々 は 国 内 に お い て 採 取 さ れ た マ ダ ニ 由 来共生関係が成立すると考えられる。この自然宿主はDNA を用いた疫学調査を行い、野兎病菌を保有し病原巣となり感受性宿主にとって排除しなければなているマダニ種の特定を試みた。その結果、ヤマトらない脅威となっている。感染症を予防するために

マ ダ ニ（Ixodes ovatus）と シ ュル ツ ェマ ダ ニ（I.

は病原巣からの感染ルートを断つことが重要である。 persulcatus）に維持されていることが示された。こしかしながら、病原体の環境中での動態、特に自然の調査により、症例未報告地域や西日本にも野兎病宿主との共生メカニズムは不明な点が多い。そこで菌を保有したマダニが分布し、野兎病菌は全国的に我々は病原体の感染環を断ち切るために、環境中の存在していることが認められた［6］。

自然宿主内における病原体の共生機構を解明し、新マダニ体内における野兎病菌の動態を解析するた

たな感染制御法の構築を目指している。本稿では、

めに、研究室内で繁殖させたシュルツェマダニを用細 胞 内 寄 生 菌 の 一 つ で あ る 野 兎 病 菌 Francisella

いた感染モデルの構築を行った。若ダニに野兎病菌

tularensis と自然宿主との関係について最近の知見

LVS 株を肛門より注入後、一定期間、25℃で飼育し、を紹介する。

体内の野兎病菌 DNA 量をリアルタイム PCR により定量した。加熱処理した死菌を対照として用い、DNA 量の推移を比較検討した。当初はマダニ体内2．野兎病の菌数をコロニー計測により定量することを試みた

野兎病菌は人獣共通感染症の一つである野兎病のが、雑菌が多く困難であったため、DNA 量の変化原因菌であり、主にマダニや蚊などによって媒介さを解析することにした。その結果、加熱処理した死れると考えられている。感染動物から人へ感染する菌は注入 1 週間後から減少し、2 から 3 週後では生ことも知られており、公衆衛生上重要な感染症であ菌と比べ有意に減少することが認められた。一方、る。北米大陸で確認されている強毒型の菌では健常

生菌を注入した群では、一定量維持されていることな皮膚から数個の菌で感染が成立するといわれておが明らかとなった（図 1）。注入された野兎病菌はり、感染力が非常に強いことから生物兵器としてのシュルツェマダニの体内で生存し、その菌数が長期使用が懸念されている。日本には弱毒型の菌が分布間維持されることが示唆された［6］。

しており、東北地方を中心に散発的に症例が報告さ

野兎病菌のマダニ体内における共生に関与する菌れ、現在は四類感染症に指定されている。症状とし側因子を検索するために、37℃と比較して 26℃でては、皮膚潰瘍やリンパ節の腫脹、感冒様の全身症発現が上昇する因子に着目して解析を行った。複数日生研たより4（44）

図 1 シュルツェマダニ体内における野兎病菌 DNA 量の推移
生菌（黒丸）および熱処理死菌（白丸）注入後、定期的に体内の菌 DNA量を定量した。点は個々のマダニ、バーは各群の平均、＊ : P<0.05 を示している。の因子を検討したところ、I 型分泌装置を構成する行った。黄色ブドウ球菌を感染させたカイコは感染HlyD が関与することが認められた。LVS 株の生菌24 時間後から、身体が黒色化して死亡し始め、1 週あるいは hlyD 遺伝子を欠損させた変異株の生菌を間以内に全て死亡した。一方、野兎病菌および大腸マダニに注入した場合、hlyD 変異株は親株に比べ菌を感染させたカイコは死亡しなかった（図 2A）。

注入 2 週間後に、DNA 量が有意に減少することが同時にカイコ体内の菌数を測定したところ、黄色ブ認められた［6］。HlyD は大腸菌などの病原細菌にドウ球菌は感染 1 日後に急激な増殖を示した。大腸

おいて I 型分泌機構を構成する因子の一つであり、菌は感染後、時間の経過とともに体内菌数が減少し、病原因子を菌体外へ分泌する機能を有している［5］。

排除されていくことが認められた。一方、野兎病菌

HlyD が野兎病菌のマダニ共生因子として機能しては感染後ほぼ一定の菌数が維持され、マダニ感染モいる可能性も考えられる。

デルと同様の結果が示された（図 2B）。野兎病菌の感染の有無により、カイコの外見上の変化は認められない。これらのことから、野兎病菌はカイコと共

4．カイコにおける野兎病の動態
カイコは飼育や取り扱いが容易であり、逃亡のリ生関係にあると考えられ、自然宿主モデルとして有用であることが示された［7］。

スクもなく管理しやすい点において、モデル動物としてはマダニより優れていると言える。マウスなどの実験動物で課題となっている倫理的な問題がない

5．カイコにおける免疫応答ことから、大量のサンプルを用いた解析に応用でき節足動物の免疫応答は血球細胞による細胞性免疫るため、今後のその有用性が増加するものと考えらと血漿成分による液性免疫に分けられる［2］。野兎れる。マダニにおける実験時間の短縮を図るために、 病菌は細胞内寄生菌であるため、最初にカイコの血カイコを用いた解析を試みた。カイコの 5 齢幼虫に、 リンパ球内における増殖の解析を行った。GFP を野兎病菌 LVS 株、大腸菌および黄色ブドウ球菌を発現した野兎病菌および大腸菌をカイコに感染させ、接種し、カイコの生存率とカイコ体内の菌数測定を体内から血リンパ球を分離して細胞内の菌を共焦点

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図 2 野兎病菌感染後のカイコ生存率（A）と体内菌数（B）
野兎病菌（丸）、大腸菌（四角）および黄色ブドウ球菌（三角）をカイコに感染させた（5x105
CFU/カイコ）。

レーザー顕微鏡で観察した。感染直後は細胞内には菌はメラニン化を抑制する機能があることが示されほとんど菌は認められないが、野兎病菌を感染させた。野兎病菌が黄色ブドウ球菌感染によって引き起た場合、感染 5 日後には細胞内で増殖する菌が認めこされるメラニン化に影響を与えるかどうか検討をられた。一方、大腸菌は細胞内における菌の増殖は行なった。野兎病菌の生菌を感染させ、72 時間後

認 め ら れ な か っ た。カ イ コ 由 来 の 細 胞 株 で あ るに黄色ブドウ球菌を接種し、メラニン化の有無を解BmN4 細胞を用いた実験でも、野兎病菌は細胞内で析した。その結果、野兎病菌は黄色ブドウ球菌によ消化されず一定の菌数が維持されることが確認されるメラニン化も抑制することが認められた。さらに、た。これらのことから、野兎病菌はカイコ細胞内で野兎病菌共生後の黄色ブドウ球菌感染カイコにおけ共生していることが考えられた。

る生存率の推移と黄色ブドウ球菌の体内菌数を解析

液性免疫として、フェノール酸化酵素前駆体カスした。野兎病菌が共生したカイコでは黄色ブドウ球ケードの活性化によるメラニン形成と抗菌ペプチド

菌感染によるカイコの死亡率と体内菌数の低下が認の産生が代表的なものとして知られている［2］。メめられた（図 3）。

ラニン化は活性型フェノール酸化酵素がドーパ等の野兎病菌の共生による黄色ブドウ球菌感染に対すフェノール性物質を酸化して、異物周囲にメラニンる防御機構を解析するために、抗菌ペプチドの産生が形成されるものである。これにより異物を物理的量について検討を行った。節足動物は抗体を持たず、に包囲するとともに、活性酸素等の殺菌物質の作用脂肪体と呼ばれる組織から抗菌ペプチドを血リンパにより異物を排除する。この反応が体液において過液中に放出する。この抗菌ペプチドは静菌的または度に引き起こされると、自身の組織にも障害を与え殺菌的な作用を示す。カイコにおいてこれまでに報有害となる。黄色ブドウ球菌をカイコに感染させた告されている抗菌ペプチドのうち、cecropin B につ場合、全身がメラニン化し死亡することが知られていて、野兎病菌を感染させたカイコの血リンパ液中いる［3］。野兎病菌の感染でメラニン化が引き起こへの分泌量をウエスタンブロッティング法により継されるかどうか検討を行なった。菌接種後 1 時間後時的に測定した。その結果、cecropin B は感染 24と 18 時間後に確認したところ、野兎病菌の熱処理時間後から血リンパ液中に検出されることが認めらした死菌ではメラニン化が引き起こされるが、生菌れた。生菌処置群においては感染 48 時間および 72の感染ではメラニン化は認められず、野兎病菌の生時間後においても分泌が確認された。一方、熱処理

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図 3 野兎病菌共生後の黄色ブドウ球菌感染カイコの生存率
PBS（×）、野兎病菌の生菌（白丸）および熱処理死菌（黒丸）接種 72 時間後に黄色ブドウ球菌の感染を行った。

死菌投与群では分泌量が徐々に低下し、72 時間後ダ菌では野兎病菌で認められるようなカイコへの共では検出されなかった。さらに、cecropin B 以外の生は認められない。ノビシダ菌が感染したカイコは抗菌ペプチドである、lebocin、attacin、moricin の感染後 3〜7 日で死亡し、菌はカイコ細胞内で著し発現量の検討を行った。脂肪体から mRNA を採取

く増殖する［4］。この差異は何に起因するのか詳細し、各々の遺伝子発現量を RT – PCR で定量した。

は不明であるが、野兎病菌との自然宿主の違いによ

その結果、測定した全ての抗菌ペプチドにおいて、るものかもしれない。ノビシダ菌は野兎病菌と違い、cecropin B と同様に生菌処置群に特異的な発現上昇

海水、汽水、土壌といった環境中から分離されるこが認められた。これらの抗菌ペプチドはいずれも広とが多い［1］。節足動物が自然宿主とは考えられない抗菌スペクトルを持つことから、野兎病菌感染にいため、共生しないと推測される。

よって分泌された抗菌ペプチドが黄色ブドウ球菌の増殖を阻害したと考えられる。抗菌ペプチドは細胞外に存在するため細胞内寄生菌である野兎病菌は影響を受けにくく、細胞外に存在する細菌にのみ作用したと推察される［7］。

7．おわりに野兎病菌はカイコ感染初期において、メラニン化やノジュール形成を阻害することによって、体内からの排除機構を回避していると考えられる。その後、血リンパ球などの細胞内に侵入し、カイコ体内に適6．ノビシダ菌応することによって共生が可能になると推察される。

野兎病菌の類縁菌に Francisella novicida（ノビシ

その後、感染後期では抗菌ペプチドが産生・分泌さダ菌）がある。現在では遺伝子配列の相同性から野れ、新たに感染してきた外来の細菌に対する抵抗性兎病菌の亜種 Francisella tularensis subsp. novicidaの向上につながっている。野兎病菌は細胞内に存在とされている。人への感染は非常に稀であるが、野するため抗菌ペプチドの影響は少なく、これにより兎病菌と同様に細胞内増殖能を有している。ノビシ共生関係が維持されているとも考えられる。また、

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過剰なメラニン化は正常な組織にも傷害を与えるこ

3. Kaito, C. 2016. Understanding of bacterial virulenceとから、その抑制により宿主の保護に寄与している

using the silkworm infection model. Drug Discov.

可能性もある。病原細菌は人や動物にとっては有害

Ther. 10 : 30 – 33.

なものであるが、自然界の中では何らかの役割を

4. Saha, S.S., Suzuki, J., Uda, A., Watanabe, K., Shimizu, T.

持って存在しているのではないだろうか。野兎病菌

and Watarai, M. 2017. Silkworm model for Francisellaと自然宿主との共生関係の解析が、病原細菌の自然

novicida infection. Microb. Pathog. 113 : 94 – 101.

界における役割を理解するヒントを与えてくれると

5. Spitz, O., Erenburg, I.N., Beer, T., Kanonenberg, K.,

考えている。さらに研究を進めることによって、新Holland, I.B. and Schmitt, L. 2019. Type I secretion

たな感染制御法の開発につながることが期待される。

systems – one mechanism for all ? Microbiol. Spectr.
7（2）: doi : 10.1128/microbiolspec. PSIB – 0003 –2018.

8．引用文献6. Suzuki, J., Hashino, M., Matsumoto, S., Takano, A.,

1. Brett, M.E., Respicio – Kingry, L.B., Yendell, S., Ratard,

Kawabata, H., Takada, N., Andoh, M., Oikawa, Y.,

R., Hand, J., Balsamo, G., Scott – Waldron, C., OʼNeal,Kajita, H., Uda, A., Watanabe, K., Shimizu, T. andC., Kidwell, D., Yockey, B., Singh, P., Carpenter, J.,

Watarai, M. 2016. Detection of Francisella tularensis

Hill, V., Petersen, J.M. and Mead, P. 2014. Outbreak

and analysis of bacterial growth in ticks in Japan. Lett.

of Francisella novicida bacteremia among inmates atAppl. Microbiol. 63 : 240 – 246.

a louisiana correctional facility. Clin. Infect. Dis.
59 : 826 – 33.
2. Chen, K. and Lu, Z. 2017. Immune responses tobacterial and fungal infections in the silkworm,

7. Suzuki, J., Uda, A., Watanabe, K., Shimizu, T. andWatarai, M. 2016. Symbiosis with Francisellatularensis provides resistance to pathogens in thesilkworm. Sci. Rep. 6 : 31476.

Bombyx mori. Dev. Comp. Immunol. 83 : 3 – 11.

解説

微生物の動物接種・動物継代の際に必要な動物数の統計学的推定について– 二項分布の応用 –玄間

剛

筆者は日生研株式会社の製品開発部で動物用医薬歩や獣医学領域における微生物学、伝染病学の進展品の製造販売承認申請のための資料整備や、当局かに伴い、動物用医薬品の承認基準が人体薬や VICHらの指摘対応を行っているが、近年、製造販売承認（動物用医薬品の承認審査資料の調和に関する国際申請に係る添付資料において、試験結果の統計処理協力）ガイドラインとの整合性が求められてきていや統計学的な根拠に基づく考察や、規格値、判定基ることによるものと思われる。この流れは客観的な準の設定根拠の明示が求められることが多くなって指標に基づく審査がなされるという点では妥当であきているのを実感する。これは製造・測定技術の進ると思いつつも、最近の「供試動物数・有意差検定

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原理主義」とでも呼びたいほどの統計処理偏重の雰の場合の確率―すなわち確率分布―のことを二項分

囲気に疑問を感じないわけではない。しかし、この布という、といった説明がされている。コインやサ流れは今後進みこそすれ、元に戻ることはないであイコロの比喩は正しくはあるが、いかにも説明のたろう。従って、動物用医薬品の開発に携わる者は、めの説明のような感じでピンとこないという人も多統計処理についての知識を増していく必要がある。

い（多かった）と思う（筆者もそうだった）。だが、さて、冒頭で試験結果の統計処理、と書いたが、ここを「微生物の分離を n 回試みて、分離に『成統計処理は結果の解釈だけに適用されるものではな功した』回数の確率分布」と読みかえたらどうだろい。試験設計にも適用でき、例えば動物試験であれう。俄然、現実味を帯び、普段の研究との接点が見ば、事前に必要最低限の動物数を推定することがでえてこないだろうか。微生物の分離も結果は「成きる。これにより、必要以上の動物を供試すること功」と「失敗」の 2 種類しかないので、何もおかしなく、あるいは本来必要な数の動物を供試しなかっいことはない。

たがために、意味の乏しい試験を繰り返すような事二項分布では、結果が 2 種類しかないことを n 回態を避けることができる。統計処理というと専用の行って、「出た（成功した）」回数が k 回となる確

ソフトウェアや高等数学を駆使するような印象が率は、次の式で与えられるとされている。

あって身構えてしまうが、そのようなものばかりではない。統計学の教科書のかなり最初の方に出てくn−k
Ck pk（1−p）…

n式①るような内容であっても普段の実験に応用が利くもここで、p は「成功する」確率とする。nCk は「組のがある。今回はそうした初歩的ではあるが知ってみ合わせ」（コンビネーション）で、総数 n 個の異いると役立つ一例を紹介したい。

なるものから k 個を選ぶ組み合わせの数を表すも前置きが長くなったので本論に入ろう。最近ではので、この種の計算では汎用されるものである。計動物試験の結果や考察だけでなく、試験において適算自体は階乗の計算が要るので手計算や通常の電卓切な動物数が用いられているかについても審査されだと面倒だが、Excel なら組み込み関数の CONBINる。実際に試験設計をしたことがある方は痛感する関数を使って簡単に計算できる。多機能の関数電卓ところだと思うが、必要な動物数を決定するのは一によっては、nCk が求められるものもある。今回の苦労である。具体例として、ここでは「目的とする例でいえば、p は微生物を分離できる確率、言い換微生物の検出に必要な動物数を推定する」ことを考えれば検出率ということになる。言うまでもなく、えよう。これは、例えば「菌やウイルスの排泄の予n は微生物の分離を試みた（サンプルの）数であり、防」を指標とした感染防御試験や、生ワクチンに用つまりはそのサンプルが由来する動物の数というこいる菌株やウイルス株の病原性復帰否定試験（動物とになる。そして、k は分離に成功した（サンプル継代しても病原性が復帰、もしくは増強しないことの）数となる。

を確認する試験で、その方法として何代で継代でき具体例を挙げてみる。方法は何でも（直接分離でなくなるかを調べることが多い）といったものに利も、PCR 法による特異的遺伝子検出でも）よいが、用できる。ここで登場するのが、「二項分布」である。

その検出率が例えば 70％ だとしよう。ここで動物「二項分布」について、統計学の教科書やインター

2 頭からのサンプルを用いて（すなわち 2 回分離をネットの検索エンジンで検索すると、大抵はコイン行って）1 回分離に成功する確率は、式①に n＝2,を投げた時に表が出るか裏が出るか、あるいはサイ

k＝1, p＝0.7 を代入してコロを振ったときに特定の目が出るか出ないか、といった「出た」か「出ない」のような、結果が 2 種類しかないことを n 回行って、「出た」回数と、そ21
2−1C10.7（1−0.7）＝0.420となる。微生物分離の可否ということであれば、266（4），20209（49）

回分離を試みて 2 回とも分離されるということもあ何頭必要かを試験計画立案の時点で見積もることがりえる。この場合の確率は、同様に式①に n＝2, kできる。
ここで紹介した方法は、筆者が勝手に思いついた＝2, p＝0.7 を代入して22−2C20.7（1−0.7）＝0.4902

方法ではなく、現実の試験ガイドラインにも用いられている。VICH の動物用生ワクチンにおける対象を得る。つまり、分離を 2 回試みて最低 1 回（つま動物の病原性復帰否定試験ガイドライン（VICHり 1 回以上）分離できる確率は、この 2 値の和、GL41）では、被験微生物の動物継代中に動物から0.420＋0.490＝0.910 となる。90％ 以上の確率で目被験微生物が回収されなくなった場合、その確認方的とする微生物が分離できるのであれば、これは十法として、最後に分離できた微生物を用い、改めて分高い確率といってよいし、このような実験系で仮10 頭の動物に接種して微生物の分離（回収）を試に 1 回も分離されなければ、その結果は信頼できるみることを定めている。この 10 頭というのは、微と見なしてよいだろう（つまり、供試動物数が少な生物の検出率が 20％ である検出方法が用いられたかったから、たまたま分離できなかったということと仮定し、最低 1 頭から微生物が回収される確率がは考えなくてもいいということ）。ちなみに、同様

約 90％ となるような動物数であって、その根拠とにして検出率 70％ の方法を用いて 3 回分離を試みして、被験微生物を動物に接種し、被験微生物の検て最低 1 回以上分離できる確率を計算すると、これ出率（上述の数式でいう p）と接種した動物（上述は 1 回分離できる確率、2 回分離できる確率、そしの数式でいう n）の数ごとに、最低 1 頭から微生物て 3 回分離できる確率の総和である 0.189＋0.441＋が分離（回収）できる確率を求める数表とグラフが0.343＝0.973 となる。これを一般化して、n 回分離

EMEA（European Medicines Evaluation Agency、を試みて最低 1 回以上分離できる確率は、欧州医薬品審査庁）のウェブサイトで掲載している

ni
n−i{nCip（1−p）}
Σi＝1…

式②（ただし n は 1 以上の整数）となる。

VICH GL41 には付属書（Appendix）として添付されている（https://www.ema.europa.eu/en/documents/
scientific – guideline/vich – gl41 – target – animal –safety – examination – live – veterinar y – vaccines –話を戻す。ここで分かることは、検出率 70％ のtarget – animals – absence – reversion – en.pdf）（この数

微生物の分離方法があるならば、ある試験、例えば表とグラフは、VICH のウェブサイトに掲載されて試作ワクチン投与後にその微生物の攻撃株で攻撃し、いる VICH GL41 には含まれていない）。この数表

排泄の有無を調べるであるとか、ワクチン候補株をを読むと、検出率 20％ で供試動物数が 10 頭の場合、動物継代して、継代ごとに当該株の排泄の有無を調

最低 1 頭から微生物が分離（回収）できる確率が約べるというような場合、供試動物は 2 頭、できれば90％（0.893）となっている。先に例で挙げた検出3 頭用いればよいということである。ところが、例率 40％ の場合について表をみてみると、供試動物えば検出率が 40％（p＝0.4）とすると、2, 3, 5, 7 回数が 5 頭の場合は分離（回収）できる確率は 92.2％

分離を試みて（n＝2, 3, 5, 7）最低 1 回以上分離で（0.922）となっており、先の計算結果と符合していき る 確 率 を 式 ② で 計 算 す る と、そ れ ぞ れ 0.640,る。供試動物数を 10 頭に増やせば分離（回収）で0.784, 0.922 そして 0.972 となる。先ほどと同じくきる確率は 99.4％（0.994）まで上げることができ90％ の確率で分離できることを目標にすると、供る（言い換えれば、誤って検出不能と判定する「偽試動物は最低でも 5 頭は必要になる計算になる。検陰性」の確率は 0.6％ にまで下げられる）。逆に、出率が低ければ、それだけ余計に動物が必要なこと検出率が 10％ だと、10 頭の動物を供試しても分離は定性的には容易に想像できるが、こうした方法で、 （回収）できる確率は 65.1％（0.651）に過ぎない。

日生研たより10（50）

付属書には数表の数値の算出方法については一切説な動物数を推定する例を紹介した。これにより、必明がないが、数表の数値は上述の計算式で求めた値

要な動物数を事前に予測して試験計画を立案できると一致するので、上述の計算式と考え方で求めたもだけでなく、結果的に試験費用、結果を出すまでののと考えて差し支えないであろう。

期間の短縮、供試動物数の削減も可能になる。統計

実際に上述の数式あるいは（VICH GL41 の）数学の初歩的な部分であっても、思った以上に活用で表を用いて、今回の目的である、ある動物試験におきそうなことが感じられたのではないだろうか。

ける、微生物の検出に必要な動物数を推定する手順

Excel や多機能な関数電卓を用いれば気軽に計算では次のようになる。まず、試験で採用する微生物検きるので、自分の PC など使って、実際に試してみ出法の検出率 p を調べる。これは文献や、自分の過ていただきたい。本稿が、日常の研究活動の一助と去の実験で明らかにされていればそれを用いるのがなれば幸いである。

一番であるが、そうでなければ類縁の微生物なり研究、あるいは教科書、総論などで一般的とされてい参考文献る値を用いる。ついで、大雑把に供試動物数 n を

1. 統 計 WEB 13 – 1. 二 項 分 布（https://bellcurve.jp/

決めて、その前後数頭分について、式②あるいはVICH GL41 の数表を用いて、推定される微生物のstatistics/course/6979.html）
2. V I C H G L 4 1 （ TA R G E T A N I M A L S A F E T Y ）–

分離（回収）確率を求める。その確率がおおよそ 9

REVERSION TO VIRULENCE割（0.9）を超えていれば、そのときの n を供試動

TARGET ANIMAL SAFETY : EXAMINATION OF物数とする。そうでなければ n を増やして再計算

LI V E VE T ER I N AR Y VA CC I N ES I N TARGE Tする。n がどこまで許容できるかは供試動物種にもANIMALS FOR ABSENCE OF REVERSION TO

よるが、あまり多くなるときは検出法を再検討する

VIRULENCEか、微生物の分離の可否を指標とすることの是非を（日生研株式会社）再検討しなくてはならないかもしれない。
以上、統計的手法で、事前に微生物の検出に必要

日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（年 4 回発行）

（通巻 617 号） 令和 2 年 9 月 25 日印刷
発行所
生命の「共生・調和」を理念とし、生命体の豊かな明日と、研究の永続性を願う気持ちを快いリズムに整え、視覚化したものです。カラーは生命の源、水を表す「青」としています。
表紙題字は故中村稕治博士による揮毫です。

令和 2 年 10 月 1 日発行（第 66 巻第 4 号）

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