【ポスターセッション】10:30-11:30(自由討論
自由討論)、
ポスター掲示)【ポスターセッション】
自由討論 、23 日 15:00-24 日 17:00 (ポスター掲示
ポスター掲示セッション１：非オピオイド鎮痛物質
P1
新規ノシセプチン前駆体由来ペプチドの発痛分子メカニズム近藤沙織 1、川島敏子 1、井上誠 1、Richard G.Allen2、植田弘師 1
1
長崎大学医歯薬学総合研究科分子薬理学研究
2Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology (CROET),The Oregon Health Sciences University
In vivo signal transduction of novel prepronociceptin-derived peptides
Saori Kondo, et al, Division of Molecular Pharmacology and Neuroscience
Nagasaki University Graduate School of Biomedical Sciences
P2

P3

P4

P5

38-40

新奇環境における情動行動に対するノシセプチンの効果
新奇環境における情動行動に対するノシセプチンの効果
松縄保宏、亀井淳三
松縄保宏、亀井淳三
星薬科大学薬物治療学教室
Effect of nociceptin on the exploratory behaviors of mice on a hole-board
Yasuhiro Matsunawa, et al, Department of Pathophysiology & Therapeutics, Hoshi
University School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Tokyo Japan

41-43

N 型カルシウムチャンネル阻害薬としてのジヒドロピリジンの鎮痛効果
村上 学 1、中川西修 2、萩原邦恵 3、森 豊樹 4、柳澤輝行 3、北村憲司 5、飯島俊彦 1、只野 武 2
1
秋田大学医学部薬理、2 東北薬科大学薬理、3 東北大学医学部分子薬理、
4
大塚製薬薬効開拓、5 福岡歯科大学歯科薬理
Analgesic action of dihydropyridines blocking N-type calcium channels
Manabu Murakami, et al,
Department of Pharmacology, Akita University School of Medicine

44-48

カプサイシン受容体 VR1 の PKC リン酸化部位の同定
沼崎満子、富永、富永 真琴沼崎満子
三重大学医学部第一生理学講座、筑波大学臨床医学系麻酔科
Direct phosphrylation of capsaicin receptor VR1 by protein kinase Cεand identification of two target serine residues, Mitsuko Numazaki,, et al
Department Physiology, Mie University School of Medicine

49-53

催眠・鎮痛作用を有するウリジン N 3 位誘導体及びその関連化合物の作用メカニズム
(その３
その３)
その３ オピオイド受容体との相互作用
清水寛美 1、木村敏行 1、舟橋達也 1、渡辺和人 1、近藤繁美 2、橘圀臣 2、Inb Kang Ho3、山本郁男 41
北陸大学薬学部、、3 ミシシッピ大医学部、
北陸大学薬学部、2 日水製薬（株）
4
九州保健福祉大学保健科学部
Mechanism of uridine and arabinofuranosyluracil derivatives having analgesic and hypnotic
effects. Their interactions with opioid receptors, Tomomi Shimizu, et al,
Department of Hygienic Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokuriku University

P6

牛乳β-ラクトグロブリン由来のニューロテンシンアゴニストβ
の鎮痛作用
牛乳β ラクトグロブリン由来のニューロテンシンアゴニストβ-lactotensin
ラクトグロブリン由来のニューロテンシンアゴニストβ
Jinsmaa, 吉川正明
山内玲奈、
園田荘司、
山内玲奈、園田荘司、Yunden
京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻
Antinociceptic activity of β-lactotensin, a neurotensin agonist derived from β-lactoglobulin
in bovine milk, Rena Yamauchi, et al, Division of Food Bioscience and Biotechnology,
Graduate School of Agriculture, Kyoto University
57-59

P7

ハロセン麻酔と血中タキキニン濃度の変動
関山裕詩、角田俊信、澤村成史、冨岡俊也、有田英子、花岡一雄
関山裕詩、角田俊信、澤村成史、冨岡俊也、有田英子、花岡一雄
東京大学医学部附属病院麻酔科・痛みセンター
Serum tachykinins levels are not elevated during emergence from halothane-anesthesia
in normal rats. Hiroshi Sekiyama, et al, Department of Anesthesiology and Pain Relief

54-56

Center, The University of Tokyo Hospital60-63

新規ノシセプチン由来ペプチドの発痛分子メカニズム近藤沙織 1、川島敏子 1、井上誠 1、Richard G.Allen2、植田弘師 1
1

長崎大学医歯薬学総合研究科分子薬理学研究室

2Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology (CROET),The Oregon Health Sciences University

In vivo signal transduction of novel prepronociceptin-derived peptides
Saori Kondo,1 Toshiko Kawashima,1 Makoto Inoue,1 Richard G.Allen ,2 Hiroshi Ueda1
1

Division of Molecular Pharmacology and Neuroscience

Nagasaki University Graduate School of Biomedical Sciences, Japan
2

Division of CROET, The Oregon Health Sciences University, USA

Summary : Prepro-nociceptin/orphanin FQ 160-187, a C-terminal peptide of its prohormone was recently
found to exist in the brain and spinal cord. However, little is known of its pharmacological actions andphysiological roles in pain regulation. In a novel algogenic-induced nociceptive flexion (ANF) test in mice,
we found the pharmacological mechanisms of C-terminal peptide-induced nociception were mediated via
Gs-mediated mechanism through capsaicin insensitive fibers. On the other hand, nociceptin/orphanin FQ(N/OFQ), heptadecapeptide is reported that this peptide metabolized by the activation of aminopeptidase N
and endopeptidase 24.15. I.pl. administration of the C-terminal fragments of N/OFQ elicited nociceptive
actions, and of the C-terminal fragments, N/OFQ (13-17), was found to be most potent. The nociceptive
effects of N/OFQ (13-17) were insensitive to N/OFQ receptor (NOR) gene knock-out mice, indicating that
N/OFQ (13-17)-induced nociception is mediated by a novel mechanism independent of activation of NOR.
Like N/OFQ, N/OFQ (13-17)-induced nociception was completely abolished by PTX, indicating the
involvement of Gi in this signaling mechanism. Morever, NK1 receptor antagonist CP-99994 effectively
blocked the nociception induced by N/OFQ (13-17) indicating that N/OFQ (13-17) may elicit the
nociceptive responses through an SP release from nociceptor endings via activation of Gi. These results
suggest that two novel neuropeptides derived from prepro N/OFQ have different mechanisms underlying
algogenic actions in the ANF test, and the C-terminal peptide mediates Gs activation unlike both N/OFQ
and its fragment N/OFQ (13-17).

要な役割を果たしていると考えられている。近緒言
ノシセプチン

1)

年、この前駆体のカルボキシル末端側から生成やノシスタチンは、ノシセプ

される新たな生理活性ペプチドとして、プレプチン前駆体由来の生理活性ペプチドとして広ロノシセプチン 160‑187 2),3) が発見さく知られており、疼痛制御機構において重れ、疼痛制御における薬理学的作用、及び生理38

的役割が注目されている。又、ノシセプチンは毒素(PTX) 10 ng、ホスホリパーゼ C（PLC）阻ある条件下でアミノペプチダーゼ N により害薬、及び NK1 拮抗薬（CP‑99994）1 pmol の前

1

2

Phe ‑Gly 結合が、エンドペプチダーゼ 24.15

処置によって完全に抑制され、これはノシセプ

により Ala7‑Arg8、Ala11‑Arg12 および Ala12‑

チン誘発性の反応と同様の結果であった

Lys 結合が切断され、それに伴い分解フラグメ（ Fig.1-A ）。 一 方 、 プ レ プ ロ ノ シ セ プ チ ン

ントが生じることが報告されている。今回、発160‑187（1 pmol）による侵害反応は、これら

痛物質誘発性屈曲反射試験法を用い、二種の新の阻害薬による影響を受けず、cAMP 依存性プロ規ノシセプチン前駆体由来ペプチドであるノテインキナーゼ (PKA)阻害薬（3 nmol）の投与

134)

シセプチン（13‑17） 、及びプレプロノシセプ

により抑制された（Fig.1-B）。又、新生仔カプ

チン 160‑187 の疼痛制御機構における役割を解

サイシン処理マウスおいては、ノシセプチン

析した。

（13‑17）反応は完全に消失した。一方、プレプロノシセプチン 160‑187 反応は、このマウスにおいても対照マウスと同様の反応が観察された（Fig.2）。

実験方法
発痛物質誘発性屈曲反射試験法
マウスを柔らかい布製の袋に入れ、布にあけた穴から四肢を出しそれぞれの肢に糸を取り付けた。右後肢に取り付けた糸はアイソトニッ
クトランスデューサーに連結し、それに接続されたレコーダーを利用して屈曲反射の軌跡を記録した。他の三肢に取り付けた糸は床に固定
しマウスを空中に浮かせた状態で保持した。マウスの右後肢足蹠皮下にカニューレを挿入しこれより薬物を投与し数秒以内に生じる屈曲反応を侵害反応として評価した。

結果
発痛物質誘発性屈曲反射試験法において、ノシセプチン（13‑17）およびプレプロノシセプ
チン 160‑187 は用量依存的な侵害性反応を誘発した。この侵害反応について疼痛制御機構を解析した結果、両薬物によって誘発される侵害反応は、ノシセプチン受容体遺伝子欠損あるいは

Fig.1

Schematic

model

of

in

vivo

signal受容体拮抗薬による影響を受けなかった。又、 transduction of N/OFQ, N/OFQ (13-17) (A), andノシセプチン（13‑17）10 amol の繰り返し投与によって得られた安定した侵害反応は、百日咳

39

ppN/OFQ 160-187 (B) at the nociceptor endings引用文献
1) Inoue M, Kobayashi M, Kozaki S, Zimmer A,
Ueda H. Nociceptin/orphanin FQ-induced
nociceptive responses through substance P
release from peripheral nerve endings in mice.
Proc

Natl

Acad

Sci

USA.

95

(18):10949-10953, 1998
Fig.2 Schematic model of in vivo signaling induced2) Connor M, Vaughan CW, Jennings EA, Allenby novel prepronociceptin-derived peptides in

RG,

Christie

MJ.

primary afferent neuron

psi-nociceptin(1-13),
prepro-nociceptin

Nociceptin,Phenocictatin(154-181)

effects

(1)
and
on

calcium channel currents and a potassium
current in rat locus coeruleus in考察

vitro. Br J

Pharmacol, 128 (8):1779-1787, 1999

本研究では、ノシセプチン受容体遺伝子欠損

3) Mathis JP, Rossi GC, Pellegrino MJ, Jimenez

あるいは受容体拮抗薬を用いることにより、ノ

C, Pasternak GW, Allen RG. Carboxyl

シセプチン（13‑17）及びプレプロノシセプチ

terminal

ン 160‑187 によって誘発される侵害反応は、ノ

prepro-orphanin FQ/nociceptin (ppOFQ/N)

シセプチンとは異なる受容体に作用すること

are produced in the hypothalamus and possessが明らかになった。更にノシセプチン（13‑17）

analgesic

は、ノシセプチンと同様にポリモーダル C 線維

23;895(1-2):89-94, 2001

peptidesderivedbioactives.

Brain

from

Res.

に作用し、Gi 蛋白の活性化と SP の遊離を介し

4) Inoue M, Matsunaga S, Rashid MH, Yoshidaて侵害作用を引き起こすのに対して、プレプロ

A, Mizuno K, Sakurada T, Takeshima H,

ノシセプチン 160‑187 はカプサイシン非感受性

Uedaの侵害線維 (Aδ線維など)に作用し、PKA を介し

nociceptin/Orphanin FQ (13-17) at peripheralて侵害反応を誘発することが明らかになった。

and spinal level in mice. J Parmacol Exp Ther.

H.

Pronociceptive

299 (1):213-219, 200140

Effectsof新奇環境における情動行動に対するノシセプチンの効果
松縄保宏、亀井淳三
星薬科大学薬物治療学教室

Effect of nociceptin on the exploratory behaviors of mice on a hole-board
Yasuhiro Matsunawa, Junzo Kamei
Department of Pathophysiology & Therapeutics, Hoshi University
School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Tokyo Japan.
Summary: Nociceptin (1-5 nmol, i.c.v.) produced dose-dependent anxiogenic effect in mice. Anxiogenic effect of
nociceptin was antagonized by either nocistatin, an ORL-1 receptor antagonist, or 8-OH-DPAT, a 5-HT1A agonist.
These results suggest that anxiogenic effect of nociceptin may be mediated by the inhibition of serotonergic functions
followed by the activation of ORL-1 receptors.
セプチンの情動行動に対する作用が 5-HT 神

緒言

経系、特に 5-HT1A 受容体を介したものである

ノシセプチンは中枢神経系に内在する 17 ア

かについても併せて検討した。

ミノ酸ペプチドであり、構造的にはオピオイド
ペプチドに非常に類似しているが、従来のオピ実験方法

オイド受容体 （μ、δ、κ受容体） にはほとん ど 親 和 性 を 示 さ ず 、 opioid receptor like-1

実験動物(ORL-1) 受容体に対し選択的に結合する。不安実験には 6 週齢の ICR 系雄性マウスを用いた。

やうつといった情動性との密接な関係が多数報告されている脳内セロトニン (5-HT) の遊離をHole-board 試験

1)

ノシセプチンが抑制するといった報告があり 、情動行動は自動 hole-board 試験装置を用いてさらに、このノシセプチンをマウスやラットに5 分間測定した。測定項目としては、総行動距

脳室内投与すると、高架十字迷路やコンフリク

離、立ち上がりの回数および時間、head-dip 行

ト試験において抗不安作用を示すことが報告さ動の回数、時間および潜時とし、特に head-dip

2)

れている 。以上のことから、内因性のノシセ

行動の変化を不安の指標として用いた。

プチンが情動性の調節に重要な役割を果たして
5-HT および 5-HIAA の測定いることが示唆されている。また、ノシセプチ
ンは侵害刺激反応や自発運動量に対して、用量

Hole-board 試験終了後、直ちに摘出、分画しにより相反する作用を示すことが報告されていたマウスの前脳、海馬、扁桃体、中脳をそれぞ

る

3) 4)

れホモジナイズし、HPLC により 5-HT および。したがって、ノシセプチンは用量により情動行動に対しても、異なった修飾作用を示す

5-HT の代謝物である 5-HIAA の濃度を測定した。

可能性が考えられる。そこで本研究では、

5-HT 代謝回転は 5-HIAA/5-HT を算出すること

hole-board 試験を用いて情動行動に対するノシで評価した。

セプチンの影響について検討した。また、ノシ

41

使用薬物
ノシセプチンは測定 30 分前に脳室内に投与
シセプチン投与の直前に脳室内投与した。また、
WAY100635 (5-HT1A 受容体拮抗薬) および
8-OH-DPAT (5-HT1A 受容体作動薬) はノシセ
プチン投与 15 分前に腹腔内投与した。

Head-dip counts

し、ノシスタチン (ORL-1 受容体拮抗薬) はノ

結果

40
35
30
25
20
15
10
5
0

*

*

Saline 0.01 0.03 0.1 1 2.5 5(i.c.v.)
Nociceptin(nmol,i.c.v.)

Figure 1. Effect of nociceptin on head-dip counts ofmice tested in the hole-board test. Nociceptin (0.01 –5 nmol, i.c.v.) or vehicle was injected 30 min prior tothe measurement of exploratory behavior. Eachcolumn represents the mean with S.E.M. of 9 to 17
mice. *P<0.05 vs saline-treated group (opencolumn).

低用量のノシセプチン (0.01nmol) 投与により head-dip 回数および時間は saline 処置群と比較して有意に増加した。それに対し、高用量の ノ シ セ プ チ ン (1 – 5nmol) 投 与 に よ りhead-dip 回数および時間は saline 処置群と比較して、用量依存的な減少を示し、5nmol のノシ

プチンを投与しても 5-HT 代謝回転に有意な

セプチン投与群においては、head-dip 回数の有変化は認められなかった。

意な減少が認められた (Fig. 1)。
低用量のノシセプチン (0.01nmol） 投与によって認められた head-dip 回数と時間の増加お考察

よび高用量のノシセプチン (5nmol) 投与によ低用量のノシセプチン (0.01nmol) 投与によって認められた head-dip 回数と時間の減少はとって head-dip 行動の有意な増加が認められた

もに、ノシスタチン（5nmol） により有意に拮ことから、低用量のノシセプチンは抗不安作用抗された (Fig. 2)。

を示すことが明らかとなり、この結果は過去の低用量のノシセプチン (0.01nmol) 投与によ報告と一致するものであった。一方、高用量のって認められた head-dip 回数の増加およびノシセプチン (5nmol) 投与によって head-dip

head-dip 時間の増加は WAY100635(0.03 –

行動の有意な減少が認められ、高用量のノシセ

0.3mg/kg) の併用により用量依存的かつ有意にプチンは不安惹起作用を有することが明らかと拮抗された。一方、高用量のノシセプチンなった。以上のことから、侵害刺激反応や自発(5nmol) 投与によって認められた head-dip 回

運動量と同様に、ノシセプチンは不安などの情数の減少は 8-OH-DPAT (0.1 – 1µg/kg) の併用動に対しても、用量によって相反する作用を示

により用量依存的かつ有意に拮抗された。

すことが明らかとなり、内因性のノシセプチン

海馬において、低用量のノシセプチン(0.01nmol)が情動の変化に一部関与している可能性が示唆を投与することにより 5-HT 代謝回転の有意された。また、低用量のノシセプチンによる抗な亢進が認められた。一方、扁桃体においては、不安作用および高用量のノシセプチンによる不高用量のノシセプチン (5nmol) を投与するこ安惹起作用が、ともにノシスタチンの併用によとにより 5-HT 代謝回転の有意な抑制が認めらり有意に拮抗されたことから、ノシセプチンはれた。しかし、前脳と中脳においては、ノシセ

ORL-1 受容体を介して情動に対する調節を行

42

系の亢進が認められ、逆に、高用量のノシセプチン投与によって扁桃体での 5-HT 代謝回転

(A)

50

の抑制、つまり 5-HT 神経系の抑制が認められ

Head-dip counts

40

た。過去に、ストレス負荷によって 5-HT の遊

*
#

30

離促進や 5-HT 神経系の過活動が多数報告されているが 5)、これらの結果はストレス等の不20

安を惹起するような状態に対する、生体内の順

100応もしくは防御機構と考えることができる。しSaline Nocistatin Saline Nocistatin(i.c.v.) (5nmol, i.c.v.) (i.c.v.) (5nmol, i.c.v.)
Saline(i.c.v.)

たがって、 ORL-1 受容体を介したノシセプチ
ンによる情動行動の変化は、その詳細な機序はNociceptin(0.01nmol, i.c.v.)

依然として不明であるが、5-HT 神経活性を調(B)

節することにより二次的にシナプス後膜の5-HT1A 受容体を介し発現すると推察できる。

Head-dip counts

40

#

30
20

引用文献

*

1.

10
0

Siniscalchi A. Rodi D. Beani L. Bianchi C.
Inhibitory effect of nociceptin on [3H]-5-HT
release from rat cerebral cortex slices. Br J

Saline Nocistatin Saline Nocistatin(i.c.v.) (5nmol, i.c.v.) (i.c.v.) (5nmol, i.c.v.)
Saline(i.c.v.)

Pharmacology. 128(1):119- 123,1999

Nociceptin(5nmol, i.c.v.)

2.

Jenck F. Moreau JL. Martin JR. Kilpatrick GJ.
Reinscheid RK. Monsma FJ Jr. Nothacker HP.

Figure 2. Effect of nocistatin on the nociceptin (0.01
nmol (A) and 5nmol (B), i.c.v.)-induced behavior
responses of mice in the hole-board test. Nociceptin(0.01 nmol or 5nmol, i.c.v.) was administrated 30
min before testing. Nocistatin (5nmol, i.c.v.) was
given just before nociceptin injection. Each column
represents the mean with S.E.M. of 9 to 12 mice.
*P<0.05 vs saline-saline-treated group (opencolumn). #P<0.05 vs saline-nociceptin-treated group(closed column).

Civelli O. Orphanin FQ acts as an anxiolytic toattenuate behavioral response to stress. Proc
Natl

Acad

Sci

U

S

A.

94(26):14854-14858,1997
3.

Inoue M. Shimohira I. Yoshida A. Zimmer A.
Takeshima
Dose-related

H.

Sakurada
opposite

nociceptin/orphanin

FQ

T.

Ueda

H.

modulation

by

of

P

substanceっていることが明らかとなった。低用量のノシ

nociception in the nociceptors and spinal cord.

セプチンによる抗不安作用が 5-HT1A 受容体

J Pharmacol Exp Ther. 291(1):308-313,1999
4.

拮抗薬である WAY100635 によって、また、高Civelli O. Northacker H.P.. Reinscheid R.

用量のノシセプチンによる不安惹起作用がReverse physiology: discovery of the novel

5-HT1A 受容体作動薬である 8-OH-DPAT によneuropeptide orphanin FQ nociceptin. Crit Revってそれぞれ有意に拮抗された。以上のことか

Neurobiol. 12:163-176,1998

5.

ら、ノシセプチンは 5-HT1A 受容体を介して情Hashimoto S. Inoue T. Koyama T. Effects of

動性に影響を与えていることが明らかとなった。

conditioned

さらに、低用量のノシセプチン投与により海馬

neurotransmission and freezing behavior in rats.

での 5-HT 代謝回転の亢進、つまり 5-HT 神経

Eur J Pharmacol. 378:23-30,1999

43

fear

stressonserotonin

N 型カルシウムチャネル阻害薬としてのジヒドロピリジンの鎮痛効果
学 1、中川西修 2、萩原邦恵 3、森 豊樹 4、丹野孝一 2、只野 武 2

村上1

秋田大・医・薬理、2 東北薬大・薬理、3 東北大学・医・分子薬理、4 大塚製薬・薬効開拓

Analgesic action of dihydropyridines blocking N-type calcium channels
Manabu Murakami1, Osamu Nakagawasai2, Kunie Hagiwara3, Toyoki Mori4,
Koichi Tan-No2, Takeshi Tadano2
1

Department of Pharmacology, Akita University School of Medicine,2

Department of Pharmacology, Tohoku Pharmaceutical University,

3

Department of Molecular Pharmacology, Tohoku University School of Medicine,

4 nd

2 Tokushima Institute of New Drug Research, Otsuka, Pharmaceutical Co., Ltd., 4

Summary : We investigated the antinociceptive action of dihydropyridine （DHP）derivatives, which act
on voltage-dependent calcium channels in mice. Further, we compared their pharmacological effects withtoxins, which specifically inhibit N-(ω-conotoxin GVIA) or P/Q-( ω-agatoxin IVA) type calcium channels.
Intrathecal injection of cilnidipine, pranidipine or amlodipine, which are thought to act on L- and N-typechannels, significantly shortened the licking time in the late phase of a formalin test. On the contrary,nicardipine, which is another DHP derivative and acts exclusively on L-type channels, showed no effect.
Toxins, which act either N-type (ω-conotoxin GVIA) or P/Q-type (ω-agatoxin IVA) channels, also
showed analgesic effects.
DHP analogues, which have analgesic effects, significantly suppressed the KCl-induced intracellular
calcium changes ([Ca2+]i) increase in a dose-dependent fashion in DRG neurons, which are known tohave L-, N-, P/Q- and R-type channels. ω-conotoxin GVIA and ω-agatoxin IVA also showed inhibitory
effects on the calcium-influx due to high KCl, suggesting that [Ca2+]i measurement might be a tool forsurveying antinociceptive effect of calcium channel antagonist.
Our results suggest that calcium channel antagonists exert their antinociceptive actions by blocking
N-type calcium channels in the primary nociceptive afferent fibers, resulting in attenuation of synaptictransmission of nociceptive neurons.

44シルニジピン、アムロジピン、プラニジピ

緒言ン（各々300 nmol/kg）は脊髄腔内投与により、L 型カルシウムチャネルを阻害するジヒ

有意な鎮痛効果を示した（図 1）。これら薬物
による鎮痛効果は後期反応でのみ認められた。

ドロピリジン（DHP）系カルシウム拮抗薬は降圧治療の目的で広く臨床応用されている

1。

一方、L 型チャネルのみを選択的に阻害する

近年になり、DHP アナログでありながら、L

ニカルジピンは鎮痛効果を示さなかった。こ型だけでなく、N 型（neuronal）カルシウム

れに対し、特異的に N 型あるいは P/Q 型チャ

チャネルにも作用するシルニジピン、アムロ

ネルを抑制するω-conotoxin GVIA、ω-agatoxin

ジピンが注目され 2,3、我々はこれらの鎮痛効

IVA は そ れ ぞ れ よ り 低 濃 度 （ ω-conotoxin

果について報告してきた 4,5。このほかシルニ

GVIA; 0.5 nmol/kg 、 ω-agatoxin IVA; 0.02

ジピンとの構造の類似性からプラニジピン

nmol/kg）で前期、後期反応とも有意な鎮痛も N 型チャネル抑制作用があるのではない

効果を示した。

かと考えられている。われわれは N 型カルシ
図1

ウムチャネルが神経終末に豊富に存在することから、痛覚一次繊維の神経終末における200

反応時間︵秒︶

神経伝達物質のシナプス間隙への放出に関与すると考え、本研究では特にプラニジピン
による鎮痛効果、およびそのチャネル抑制効
果を中心に検討した。

実験方法

Early Phase

160
120
*

80

*

40
0

1

鎮痛作用

2

3

4

5

6

*

*

7

マウス（体重 23-25g）に各種薬剤を脊髄腔内投与し、10 分後に右下肢底に 2.0%フォルマ

Late Phase

細胞内カルシウム濃度の測定
脊髄後根神経細胞に蛍光カルシウム指示薬
である fura-2AM を負荷し（1 µM, 60 分室温）、
浜松フォトニクス製アルガス装置にて細胞内反応時間︵秒︶

リンを皮下注射し、疼痛反応を測定した。

160
120

*

80

カルシウム濃度を測定した。

40

マウス脳膜分画を用いたω-conotoxin GVIA 結

0

*

*

合阻害作用
マウス脳膜分画を用いてω-conotoxin GVIA

1

2

3

4

5

6

Figure 1結合に対する阻害作用を検討した。

Analgesic effect of dihidropyridines
lane 1: control; 2: cilnidipine; 3: amlodipine; 4:

結果

nicardipine;5:

pranidipine;6:

ω-conotoxin

GVIA; 7: ω-agatoxin IVA. * p< 0.05 vs. control

鎮痛作用

45

7

ピークに達した（75.6 %抑制）。さらに高濃度のプラニジピンも試みたが、細胞内カルシウ

細胞内カルシウム濃度の測定
脊髄後根神経節には痛覚一次繊維の細胞体

ム流入を完全に阻害することはできなかった。

が存在するので、その神経細胞を単離培養し、このほか、L/N 型抑制作用を示すシルニジピ

下記の実験を行った。本実験の目的として、ンも同様の効果を示した。ω-conotoxin GVIA

複雑な制御機構が存在する生体ではなく、よ（1 µM）により 37.5 %、ω-agatoxin IVA（0.1

り単純かつ平易な方法で上記薬物の鎮痛効果µM）により 46.9 %の細胞内カルシウム流入ののスクリーニング解析を試みた。後根神経節抑制が認められたことから、N 型、および P/Q

培養細胞において高濃度 KCl（90 mM）によ型チャネルを介するカルシウム流入はそれぞる脱分極刺激により、電位依存性カルシウム

れ約 38 %と 47 %であると推定された。

チャネルを介するカルシウム流入が発生する。
このカルシウム流入による細胞内カルシウム

マウス脳膜分画を用いたω-conotoxin GVIA 結

濃度の変化は蛍光指示薬である fura-2 により、

合阻害作用

6

比較的平易に測定可能である 。そこで本研究

上記鎮痛効果を示すジヒドロピリジン系薬

では上記薬物、特にプラニジピンによるこの物が N 型チャネル阻害作用を介して鎮痛作用カルシウム流入に対する阻害程度と鎮痛効果を示すと考えられることから、N 型チャネルとの相関を調べた（図 2）。

に 対 す る 特 異 的 阻 害 剤 で あ る ω-conotoxin
GVIA に対する結合阻害作用を検討した（図

図2

3）
。
90 mMKCla

蛍まずω-conotoxin GVIA 自身による結合阻害90 mMKCl

蛍

光

光

比

比

効果であるが、ラット脳膜分画における研究cと基本的には同様の知見が得られた 7。Ki 値
は 6.06x10-10 M であった。一方、すべての鎮痛実験に用いたジヒドロピリジン化合物は結Time (min)Time (min)合阻害効果を示さなかった（図 3）。したがっ

90 mMKCl

90 mMKClて、L/N 型ジヒドロピリジンは少なくともマ

蛍

蛍
b

光
比

光

ウス脳においてはω-conotoxin GVIA とは N 型

dチャネルの全く別の部位に結合すると考えら

比Time (min)れた。
シルニジピンは以前ラット脳膜分画を用いTime (min)た研究で結合阻害効果が報告されているが 7、Figure 2

その効果は弱く、我々のマウス脳膜分画を用Intracellular calcium changes measured by fura-2

いた実験では認められなかった。したがって、

method少なくともマウスにおいては N 型チャネルに

Calcium-influx was evoked by high (90 mM) KCl

作 用 す る ジ ヒ ド ロ ピ リ ジ ン は ω-conotoxin

and inhibited by pranidipine. a: control; b:

GVIA の N 型チャネル結合部位に影響を及ぼ

0.1 µM; c: 0.3 µM; d: 1.0 µM.

さない結合部位を有すると考えられる。このことは、鎮痛を目的にこれら薬剤を用いる上

プラニジピンは濃度依存性に細胞内へのカで重要と思われる。なぜなら、現在米国等でルシウム流入を阻害した。その作用は 1 µM で臨床応用、あるいは臨床治験段階にあるジコ46

ノタイドはω-conotoxin 類似のペプチドであルシウムチャネルにも作用することから、おり、有効濃度と副作用を起こす濃度との差がそらく N 型チャネル抑制作用を有するジヒド

比較的近い、つまり振戦などの副作用を起こ

ロピリジン系化合物に限定した効果であるとしやすいと考えられる。したがって、L/N 型

考えられる。

ジヒドロピリジンをジコノタイドと同時投与、次に Fura-2 を用いたスクリーニングの可追加投与することにより、ジコノタイドの N

能性について検討する。イオンチャネルの電型チャネルに対する結合に影響せずにその投気生理学的解析は 1970 年代後半に始まった与量を低下させることが可能と考えられ、相パッチクランプ法の開発に伴い、革命的に進当程度ジコノタイドによる副作用の発生を抑歩した。しかし、パッチクランプ法は技術のえることが期待できる。

習得が比較的困難であること、短期間での多数サンプルの検討に適さないことなどが問題である。これに対し、1980 年代に Tsien のグ

図3

ループにより開始されたカルシウム蛍光指示

100

害

60

効

40

果

20

(%)

0

薬 fura-2 を用いた細胞内カルシウム濃度測定

ω-conotoxin GVIA

80

阻法 6 は比較的平易な方法であり、初心者でもamloidipine
pranidipine

nicardipine

一旦条件が安定すれば可能であり、短時間に

cilnidipine

多数の薬物を試すことが可能である。
本研究においても同方法でプラニジピンによる濃度依存性の効果が認められたことから、

1x105 2x105 3x105

3.0x106

ある程度のスクリーニング効果は期待できる

9.0x106と考えられた。しかし、N 型を特異的に抑制

Dose (M)するω-conotoxin GVIA により 37.5 %、P/Q 型
を特異的に抑制する ω-agatoxin IVA により
46.9 %しか細胞内カルシウム濃度を抑制できないのに対し、プラニジピンでは 75.6 %も抑Figure 3

制するのに、鎮痛効果はほぼ同等であるなど、

Displacement analysis with ω-conotoxin GVIA

一部鎮痛効果と解離する結果も得られた。こand DHPs

れは神経情報伝達において神経終末に多く存在する N、P/Q 型チャネルがより重要でありながら、細胞体に多く存在するのは L 型チャ考察ネルであるためと考えられる。つまり、情報

今回、われわれはジヒドロピリジン、とく伝達にあまり関係のないチャネルに対する効にプラニジピンを中心にその鎮痛効果、カル果まで測定してしまうためである。今後、Lシウム流入抑制効果、ω-conotoxin GVIA の N

型チャネルを特異的に抑制するニカルジピン型チャネル結合に対する阻害作用について検などを前処置することなどにより、薬理学的討した。

に N、P/Q 型チャネルのみを検討することにより、この問題は解決可能であると思われる。

ジヒドロピリジン系化合物による鎮痛効果は一部の薬物でのみ認められ、さらにその効
果は後期反応でのみ認められた。シルニジピ
ン、アムロジピンが L 型だけでなく、N 型カ47

今後の課題現在まで研究対象とされているジヒドロピ
リジン系化合物が L 型チャネルに対する作用

M. Hozumi S. Esashi A. Tanigichi R. Okamura

中心にスクリーニングされているため、L 型

T. Suzuki T. Sasano H. Yanagisawa T. Tan-No

チャネルに作用を有さないジヒドロピリジン

K. Tadano T. Kitamura K. and Kisara K.

系化合物は入手困難である。今後、N 型特異Antinociceptive effect of cilnidipine, a novel

的に作用するジヒドロピリジン系化合物など、

N-type calcium channel antagonist, Brain Res.,

特徴をもったジヒドロピリジン系化合物の開868: 123-127, 2000.
5) Murakami M. Nakagawasai O. Fujii S.

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Kameyama K. Murakami S. Hozumi S. Esashi
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4) Murakami M. Nakagawasai O. Fujii S. Hosono

48

カプサイシン受容体 VR1 の
PKC によるリン酸化部位の同定
沼崎満子、富永真琴
三重大学医学部生理学第 1 講座、筑波大学臨床医学系麻酔科

Direct Phosphrylation of Capsaicin Receptor VR1 by Protein Kinase Ce and
Identification of Two Target Serine Residues
Mitsuko Numazaki, Makoto Tominaga
Department Physiology, Mie University School of Medicine
Department Anesthesiology, University of Tsukuba School of Medicine
Summary : The capsaicin receptor, VR1 is a six trans-membrane ion channel that serves as a polymodal
detector of pain-producing chemical and physical stimuli.

It has been reported that ATP, one of theinflammatory mediators potentiates the VR1 currents evoked by capsaicin or protons and reduces thetemperature threshold for activation of VR1 in a PKC-dependent pathway, suggesting the phosphorylationof VR1 by PKC.

In this study, direct phosphorylation of VR1 upon application of PMA was provenbiochemically in cells expressing VR1.

An in vitro kinase assay using GST fusion proteins withcytoplasmic segments of VR1 showed that both the first intracellular loop and carboxyl terminus of VR1
were phosphorylated by PKCe. Patch-clamp analysis of the point mutants where Ser or Thr residues
were replaced with Ala in the total 16 putative phosphorylation sites showed that two Ser residues, S502
and S800 were involved in the potentiation of the capsaicin-evoked currents by either PMA or ATP.

In

the cells expressing S502A/S800A double mutant, the temperature threshold for activation was not
reduced upon PMA treatment.

The two sites would be promising targets for the development of

substance modulating VR1 function, thereby reducing pain.

は計 16 ヶ所の PKC によるリン酸化候補部位が

緒言

N 末端、第１細胞内ループおよび C 末端に存在

カプサイシン受容体 VR1 はカプサイシン、熱、酸という痛み刺激を受容する 6 回膜貫通型イオする。そこで、PKC による VR1 のリン酸化の証明およびリン酸化部位の同定を試みた。

ンチャンネルである。痛みは炎症によって増強されるが、炎症関連メディエーターである ATP

実験方法

やブラジキニンはプロテインキナーゼ C（PKC）依存的に VR1 活性を増大させること

In vivo phosphorylation assay: HEK293細胞を 10%が報告されている 1,2。この効果には PKC によfetal bovine serum、ペニシリン、ストレプトマイる VR1 のリン酸化の関与が予想され、VR1 にシン、L-グルタメート添加 Dulbecco’s Modified

49

Eagle’s Medium (SIGMA)で培養し、Lipofectamine

で pH7.4 に調整した。

plus reagent (Invitrogen)で rat VR1 plasmid DNAを導入した。非血清培地にて 36 時間培養し、結果[32P]orthophosphate (300mCi/ml)で標識した。
(37℃,
3 時間) PMA (50ng/ml)で 10 分間刺激した後、VR1

を 発 現 し た

HEK293

細 胞 を

32

TNE buffer （10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM[ P]orthophosphate で標識し、PKC を直接活性化

EDTA, complete EDTA-free protease inhibitor

させる PMA で刺激したところ、膜分画から抗

mixture (Roche), phosphatase inhibitor mixture

VR1 抗体で免疫沈降した蛋白質での 32P の取り(Sigma)に懸濁し、100,000×g,15 分間遠心した。

込みが上昇し、細胞レベルでの PKC による VR1

ペレットを 1%Nonidet P-40 TNE buffer に懸濁し、のリン酸化が確認された。(Fig.1A)

100,000×g, 30 分間遠心後、上清に Protein A を

VR1 には細胞内ドメインのうち N 末端、第 1

加え preclear を行った。rabbit anti-rat VR1 抗体１

細胞内ループ、C 末端に計 16 ヶ所の PKC によmg を加え 4℃で 3 時間反応後、anti-rabbit IgG をるリン酸化の候補部位が存在する。(Fig.1B) こ

追加し、1 時間反応させた。上記の免疫沈降にれらの GST 融合蛋白質を用いて In vitro kinase

よって得られた蛋白を SDS-PAGE に展開し、オ

assay を行ったところ、第 1 細胞内ループと Cートラジオグラフィーで検出した。

末端において 32P の取り込みを認めた。(Fig.1C)

In vitro kinase assay: VR1 の細胞内ドメイン(N 末端、第 1 細胞内ループ、C 末端)を PCR にて作成し、pGEX vector (Amersham Biosciences)にサ
ブクローニングした。VR1 の各細胞内ドメインの GST 融合蛋白質を Amersham Biosciences 社の方法に準じて精製した。これらの蛋白質を以下
の反応液
100mM

(20mM Tris-HCl, 0.01%Triton-X,

MgCl2,

200mg/ml

phosphatidylserine,

10mM ATP, 0.5mM CaCl2, 0.25% bovine serum
albumine, 0.5mM dithiothreitol, 1mCi [g-32P]ATP)に
0.04unit PKCeを加え 30℃で 15 分間反応させた。
SDS-PAGE に展開し、オートラジオグラフィーで検出した。
電気生理学的解析： PCR 法を用いて VR1 の点
Fig. 1. In vivo and in vitro phosphorylation of
VR1 by PMA or PKCe. (A) PMA induced

変異体を作成し、pcDNA3 vector にサブクロー
ニングした。これらの VR1 点変異体プラスミド
および Green Fluorescent Protein (GFP) cDNA を
Lipofectamine plus reagent (Invitrogen)で HEK293
細胞に導入し、1－2 日後にパッチクランプ法を用いて全細胞膜電流記録を行った。
細胞外液の組成は、140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2
mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose で
NaOH で pH7.4 に調整した。細胞内液の組成は、140 mM KCl, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA で NaOH

50

phosphorylation of VR1 in vivo. An arrow head
indicates the expected size of VR1. (B) Positions of Ser
and Thr residues sensitive to PKC-dependent
phosphorylation in the VR1 channel are shown in thecontext of a putative transmembrane topology model. (C) a
CBB staining of the GST-VR1 fusion proteins showsnearly equal amount of proteins were loaded in the gel.
Arrow heads indicate the expected size for GST fusion
proteins with N-terminus, the first intracellular loop andC-terminus of VR1. b In vitro kinase assays with
GST-VR1 fusion proteins (wild type and the indicatedpoint mutants) as substrates. Arrow heads indicate theexpected size for GST-VR1 fusion proteins.

significant change in the wild type and the mutants.
Positions S502 and S800 were shown in Fig.1 B.
Cells were perfused for 1 min with solution
containing PMA before exposure to capsaicin.
Holding potential was –60 mV. (E) Effects of PMA
on the capsaicin-activated currents in HEK293 cells
expressing wild type and point mutants of VR1.
Currents were normalized to the currents evoked
initially by capsaicin (20 nM) before application of
PMA and the normalized values represent the mean
± SEM. Normalized currents were 7.95 ± 2.72 (n= 8), 6.36 ± 2.92 (n = 5), 12.8 ± 4.94 (n = 8), 5.58 ±0.74 (n = 5), 7.24 ± 2.47 (n = 5), 14.6 ± 8.27 (n = 5),
12.6 ± 2.91 (n = 8), 2.13 ± 0.41 (n = 9), 2.76 ± 0.52
(n = 11) and 0.95 ± 0.04 (n = 7) for wild type,
T708A, S722A, S776A, S778A, S783A, S820A,
S502A, S800A and S502/S800A, respectively. *, p
< 0.05 vs. wild type; one-way ANOVA andtwo-tailed unpaired t test.

第 1 細胞内ループと C 末端には 16 ヶ所のう
ち 8 ヶ所の候補部位が存在し、これらのセリン
およびスレオニンをアラニンに置換した点変異体を用いて電気生理学的解析を行った。野生型
では 20ｎM のカプサイシンにより小さな内向き電流が観察され、細胞外カルシウム非存在下ではカプサイシンの繰り返し投与によって活性化電流の大きさは変化しない。一方、100nM
PMA の１分間の前投与により同量のカプサイ
シンによる活性化電流は大きく増大する。野生型や他の点変異体に比べて 502 番目のセリンと800 番目のセリンの点変異体では PMA による

また、ATP でも同様に野生型で見られるカプカプサイシン活性化電流の増大が有意に小さく

サイシン活性化電流の増大がこれらの点変異体なった。(Fig.2)では見られなかった。(Fig.3)

Fig. 3. Two Ser residues are involved inphosphorylation of VR1 by PKCe. (A and B)
Representative traces of increase of capsaicin(CAP)-activated currents in transfected HEK293
cells expressing wild type (A) and S502A/S800A
mutant (B) of VR1. ATP (100 mM) did notincrease the currents in S502A/S800A mutant (B)whereas ATP increased the current in wild type VR1(A). Cells were perfused for 1 min with solution
containing ATP before exposure to capsaicin.
Holding potential was –60 mV. (C) Effects of ATP
on the capsaicin-activated currents in HEK293 cells
expressing wild type and point mutants of VR1.
Currents were normalized to the currents evoked
initially by capsaicin (20 nM) before application of
ATP and the normalized values represent the mean ±SEM. Normalized currents were 2.61 ± 0.19 (n =7), 1.05 ± 0.24 (n = 7), 0.63 ± 0.10 (n = 6) and 0.79
± 0.12 (n = 7) for wild type, S502A, S800A andS502/S800A, respectively. *, p < 0.05 vs. wild type;two-tailed unpaired t test.

Fig. 2. Two Ser residues are involved inphosphorylation of VR1 by PMA. (A - D)
Representative traces of increase of capsaicin(CAP)-activated currents in transfected HEK293
cells expressing wild type (A) and mutants (B - D)of VR1. PMA (100 nM) increased the currents alittle in S502A and S800A mutants (B and C)
whereas PMA greatly increased the current in wild
type VR1 (A). PMA did not increase the current in a
S502A/S800A double mutant (D).
Currents
initially activated by capsaicin (20 nM) were 330 ±52 pA (mean ± SEM) (30 – 1600 pA) without any

51

In vitro kinase assay においても 502 番目のセ考察

リンと 800 番目のセリンをアラニンに置換したGST 融合蛋白質では野生型に比べて 32P の取り

炎症性疼痛の発生メカニズムの１つとしてと込みが減少し、リン酸化の減少が確認された。

して感覚神経終末に発現したイオンチャネルのVR1 の活性化温度閾値についても、野生型で感作が挙げられる。VR1 は感覚神経特異的に発は PMA 存在下で約 42℃から約 32 度まで低下し現するイオンチャネル型受容体でカプサイシン、

たが、
S502A/S800A では活性化温度閾値は PMA

熱、プロトンという複数の痛み刺激を受容する

投与によって変化しなかった。(Fig.4)

3,4。VR1 は炎症関連メディエーターである細胞

外ATPやブラジキニンにより活性化温度閾値が体温以下に低下することが報告されており 1,2、
新たな疼痛発生メカニズムとして注目されている。いずれも代謝型受容体に作用しphospholipase C 活性化・PKC 活性化を介することが知られており、PKC は VR1 を活性化することが報告されている 5,6。今回の結果はこれらの報告に一致し、このシステムにおいて PKC が重要な役割を果たすことが示された。PKC のアイ
ソフォームのうち特に PKC は疼痛感作に関与することが報告されており 7,8、今回の結果においても PKC による VR1 のリン酸化が確認された。PMA によるカプサイシン活性化電流の増大
が 502 番目のセリンおよび 800 番目のセリンの点変異体では有意に小さくなることから PKC の
基質がこれらのセリンであることが示唆される。
一方、PMA にはフォスファチジルイノシトール
Fig. 4. Thermal sensitivity is increased by PMA
in wild type VR1, but not in S502A/S800A
mutant. (A) Representative temperature-response
profiles of heat-activated currents obtained by atemperature ramp in wild type VR1 without (left)
andwith(right)PMA
treatment.
Temperature-response profiles were made with only
current responses during the heat stimulation.
Dashed lines show the threshold temperature forheat activation of VR1. Holding potential was –60
mV. (B) Representative temperature-response
profiles of heat-activated currents in a
S502A/S800A mutant without (left) and with (right)
PMA treatment. (C) Temperature threshold for
activation of wild type VR1 in the presence of PMA(31.8 ± 1.6oC, n = 4) was significantly
lower thanthat in the absence of PMA (41.9 ± 0.9oC, n= 3). *,p < 0.005 vs. wild type without PMA; #, p < 0.05 vs.
S502A/S800A without or with PMA; two-tailed
unpaired t test. There was no significant differencein temperature threshold foro activation of
S502A/S800A
mutant (38.0 ± 1.4 C, n= 7, and 37.4
± 0.7oC, n= 9, with and without PMA treatment,
respectively, p = 0.7; two-tailed unpaired t test).
Threshold was defined as a temperature at whichclear current increase was observed in thetemperature-response profile.

２リン酸による VR1 の抑制を阻害するという報告があり 9、PMA の効果について PKC を介さない系の関与を否定できない。そこで生理的刺激である ATP での反応についても検討したところ、
ATP によるカプサイシン活性化電流の増大もこの点変異体(S502A/S800A)では観察されなかった。より生理的な条件下においても PKC のリ
ン酸化にこれらのセリン残基が関与することが強く示唆された。また、VR1 の活性化温度閾値
の低下もこの点変異体では見られないことから、
これらのセリン残基のリン酸化が炎症性疼痛の発生メカニズムに大きく関与すると思われ、新たな鎮痛薬のターゲットなることが期待される。

52

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for

催眠・鎮痛作用を有するウリジン N3 位誘導体及びその関連化合物の作用メカニズム (その３
(その３)
その３)
‑ オピオイド受容体との相互作用
オピオイド受容体との相互作用 ‑◯清水寛美 1、木村敏行 1、舟橋達也 1、渡辺和人 1、近藤繁美 2、橘圀臣 2、
Ing Kang Ho3、山本郁男 4、1

北陸大学薬学部衛生化学教室、2 日水製薬㈱、3 ミシシッピ大学医学部薬毒理学教室、
4

九州保健福祉大･保健科学部

Mechanism of uridine and arabinofuranosyluracil derivatives having
analgesic
analgesic and hypnotic effects‑ Their interactions with opioid receptors ‑Tomomi Shimizu1, Toshiyuki Kimura1, Tatsuya Funahashi1, Kazuhito Watanabe1, Shigemi Kondo2,
Kuniomi Tachibana2, Ing Kang Ho3 and Ikuo Yamamoto4
Department of Hygienic Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokuriku University1,
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd2., Department of Pharmacology and Toxicology, Universityof Mississippi Medical Center3, Faculty of Health Sciences, Kyushu University of Healthand Welfare4
Summary: Uridine is one of sleep-promoting substances. We revealed that hypnotic activities of uridine
derivatives were mediated through uridine receptor. In addition, we have found for the first time that thesederivatives also exerted analgesic effect on mice by intracerebroventicular (i.c.v.) administration.
N3-(2',4'- and 2',5'-Dimethoxyphenacyl)arabinofuranosyluracil exhibited the strong analgesic effects
among uridine and arabinofuranosyluracil derivatives synthesized, but the affinities of these derivatives touridine receptor were quite low. Moreover, the analgesic effects of these derivatives were antagonized bynaloxone. In the present study, the interaction of uridine and arabinofuranosyluracil derivatives with
opioidreceptor

assay

was

also

studied.

Scatchard

analysesN3-(2',4'-

utilizingand

2',5'-dimethoxyphenacyl)arabinofuranosyluracil had not revealed the apparent interaction of thesederivatives to opioid receptors (μ, δ and κ-receptor). These results suggest that uridine and opioid
receptors

have

not

been

involvedsignificantly

in

the

analgesic

effectofuridineandarabinofuranosyluracil derivatives.

緒言
我々は核酸であり内因性睡眠物質とD2 (PG D2)及び Oxidized glutathione (GSSG)には

3

し て 知 ら れ る ウ リ ジ ン (Ud)の N 位置換体

鎮痛作用が報告されている。また、核 酸 で あ るが催眠の他、マウス脳室内投与によるアデノシンやアデノシン関連物質である鎮痛作用を有することを既に報告した 1,2）。

Adenosine triphosphate (ATP) にもその作用がこ れ ま で に 内 因 性 睡 眠 物 質 で あ る Delta

確認されており、これら鎮痛作用メカニズムの詳

sleep inducing peptides (DSIP) 、Prostaglandin

細は各々異なるものの、一部の物質には共通した

54

オピオイド受容体への直接的あるいは間接的なプ ス 膜 を 用 い リ ガ ン ド を [ 3 H] N 3 ‑PhAcUd

関与が知られている 3‑5)。 そ こ で 先 に ウ リ ジと し て 、各 試 験 化 合 物 100ン誘導体の鎮痛作用メカニズム追究の結合阻害能を比較検討した。

M 添加による

一貫として催眠作用との比較を行った[3H]DAMGO( μ ) 、 [3H]DPDPE( δ ) 及 び

ところ、両作用間には相関性は認めら[3H]U‑69,593(κ)結合阻害実験:ラット大脳から得れ な か っ た 。 更 に 、 ウ リ ジ ン N3 位置換体

たシナプス膜画分を用い、オピオイドμ、δ及びの催眠作用に関わる特異的な受容体、κ受容体に対し各々[3H] DAMGO、[3H]DPDPE 及び

ウリジン受容体

6)[3H]U‑69,593をリガンドとし、試験化合物100の関与についても検M討したが相関は認められなかった。そ

添加時における各リガンドの結合量をこでオピオイド受容体との関連を明確測定、更にスキャッチャード解析を行っ

3に す る た め 、 ウ リ ジ ン N 位置換体の 中 でた。

3

強 い 鎮 痛 作 用 を 有 す る N ‑(2',4'‑ 及び2',5'‑ジメトキシフェナシル)アラビノフラノシ

結果及び考察( N3‑(2',4'‑ 及 び

ル ウ ラ シ ル

2',5'‑DiMeOPhAc)AraU)を用い鎮 痛 作用におけN3‑(2',4'‑及び 2',5'‑DiMeOPhAc)AraU は睡眠るナロキソン拮抗作用を評価した。その結果、有作用を最大にもつ N3‑PhAcUd と比較し、より強い

意な拮抗作用が認められ 7)、ウリジン N3 位置換体

鎮痛作用を示した (Fig. 1)。
これら誘導体のウリジン受容体に対する作用の鎮痛作用に一部オピオイド受容体(μ及びδ受について受容体結合実験を行った結果、N3‑PhAcUd容体)の関与が示唆された。
びと比較し N3‑(2',4'‑及び2',5'‑DiMeOPhAc)AraUは2',5'‑DiMeOPhAc)AraU を選びウリジン受容体及ウリジン受容体に対しその関与が少ないことが明びκ受容体を含むオピオイド受容体についてスらかとなった (Table 1)。

今

回

、

特

に

N3‑(2',4'‑

及

キャッチャード解析を行い、オピオイド受容体の関与があるか否かをより詳細に検討した。

方法
鎮痛作用
ddY 系雄性マウス(体重 23‑28g)を用い、各試験
化合物は 1% Tween‑80 生理食塩液に溶解した。
試験化合物は 500 nmol/mouse の用量で脳室内(i.c.v.)投与し 15 分後、Hot plate 法により鎮痛活性を測定した。Cut off time は 60 秒とし、Analgesic effects of N3‑substituted

Analgesic effect ( ％) = ［（ test latency ‑Fig. 1

control latency ） / ( 60 sec ‑ control

uridine and arabinofuranosyluracil on the hotlatency ) ］x 100 の式により算出した。

plate test by i.c.v. injection to mice.

受容体結合実験[3H]N3‑フェナシルウリジン(N 3 ‑PhAcUd)結合阻
害実験: 常 法 に 従 い ウ シ 視 床 か ら 得 た シ ナ

55

Table 1 Specific [3H]N3‑PhAcUd binding tosynaptic membranes.
Specific
Compounds[3H] N3‑PhAcUdbinding tosynaptic membranesa)(% of control)
N3‑PhAcUd23
N3‑(2',4'‑DiMeOPhAc)AraU
52
N3‑(2',5'‑DiMeOPhAc)AraU
51ていることが明らかとなった。また、これらの鎮痛作用へのオピオイド受容体の直接的な関与が少ないことも示唆され、今後、更なるウリジン誘導体の特異的な鎮痛メカニズム追究が必要である。

a) Specific [3H]N3‑PhAcUd binding is expressed % of
the control specific binding in the presence ofcompound(100 M).

Table 2 Inhibitory effects of uridine and arabinofuranosyluracil derivatives on specific binding of [3H]DAMGO(µ),[3H]DPDPE(δ) or [3H]U-69,593(κ) to opioid receptors.
Compounds a)µKd

Control35.7±3.2

3

N -PhAcUd

δ

b)

Bmax

**

N -(2',4'-DiMeOPhAc)AraU
3

N -(2',5'-DiMeOPhAc)AraU

750±145**35.7±4.1

505±13534.5±4.5*840±80

b)

κ
c)

Kd

11.1±1.6

208±164.5

3014.3±0.6

198±184.8

28

9.5±2.0

**

4.4

25

**

4.5

29

Kd

1230±5531.3±5.0

3c)

8.5±0.5

Bmax

131±4

89±6

b)

Bmaxc)a) The concentration of the derivatives added was 100µM. b) nM c) fmol/mg protein * and ** indicate significant difference
from control at the level of p< 0.05 and p< 0.01, respectively.

オピオイド受容体の関与についてはμ、δ及びκ受容体に対する受容体結合実験を行った。その参考文献

結果、μあるいはδ受容体に対しウリジン誘導体

1) 木村敏行, 清水寛美, 山本郁男 他, 第21 回 鎮痛薬・オピオイドペプチドシンポ
ジウム(長崎)講演要旨, pp 93‑96 (2000).
2) 清水寛美, 木村敏行, 山本郁男 他, 日本
薬学会 第 121 回年会講演要旨 3 (札幌), p
56 (2001).
3) 井上昌次郎, 山本郁男編
睡眠のメカニズム
塩見浩人, 睡眠誘発機構と痛覚制
御機構
睡眠誘発へのオピオイドペプチ
ドの関与‑, 朝倉書店, pp 74‑102 (1997).
4) Fukui, M., Nakagawa, T., Minami, M.,
Satoh, M., Antinociceptive effects of
intracerebroventicularly administered P2
purinoceptor agonists in the rat. Eur. J.
Pharmacol., 419, 25-31 (2001).
5) Fukui, M., Nakagawa, T., Minami, M.,
Satoh, M., Involvement of β 2-adrenergicand µ-opioid receptors in antinociception
producedbyintracerebroventicularadministration of α, β‑methylene‑ATP.
Jpn. J. Pharmacol., 86,
423‑42886(2001).

である 2',4'‑及び 2',5'‑DiMeOPhAc 体、また同置換基を有するアラビノフラノシルウラシル誘導体において阻害傾向が認められた。そこで更に

N3‑PhAcUd

及びN3‑(2',4'‑及

び

2',5'‑DiMeOPhAc)AraU においてスキャッチャー
ド解析を行ったところ、μ、δ及びκ受容体においてコントロールと比較し Kd 値には何ら影響が認められなかったものの、Bmax を比較したところ
μ及びδ受容体に対して各誘導体に有意な低下が認められた (Table 2)。しかし、基質濃度が100 M と高濃度であったことからそれらの相互作用は弱く、オピオイド受容体はウリジン誘導体の鎮痛作用発現に主要となる役割を演じていな
いと推察された。
以上の結果から、鎮痛作用を有するウリジン関連誘導体はウリジン受容体を介さない、つまり催眠とは異なるメカニズムにおいて作用を発現し

56

6)

Kimura T., Ho I. K., Yamamoto I., Uridine
receptor; discovery and its involvement insleep mechanism. Sleep, 24, 251-260(2001).
7) 清水寛美, 木村敏行, 山本郁男 他, 第 22
回 鎮痛薬・オピオイドペプチドシンポジ
ウム(京都)講演要旨, pp 138‑141 (2001).

57

牛乳β
牛乳β‑lactoglobulin 由来のニューロテンシンアゴニスト
β‑lactotensin の鎮痛作用
山内玲奈、園田壮司、Yunden
山内玲奈、園田壮司、Yunden Jinsmaa、吉川正明
Jinsmaa、吉川正明
京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻

Antinociceptic activity of β‑lactotensin, a neurotensin agonist
derived from β‑lactoglobulin in bovine milk
Rena Yamauchi, Soushi Sonoda, Yunden Jinsmaa,
Jinsmaa, Masaaki Yoshikawa
Division of Food Bioscience and Biotechnology, Graduate School of Agriculture,
Kyoto University

Summary: β-Lactotensin (His-Ile-Arg-Leu), which has been isolated from the chymotrypsin digest of
β-lactoglobulin as an ileum-contracting peptide, showed weak affinities for neurotensin receptors; IC50
for NT1 and NT2 were 18.6µM and 10µM, respectively. We examined antinociceptive activity ofβ-lactotensin since neurotensin is known to show antinociceptive activity, which is mediated by NT2
receptor. β-Lactotensin showed antinociceptive activity by i.c.v. (200 nmol/mouse) and s.c. (300 mg/kg)
administration by tail-pinch test in ddY mice. The antinociceptive activity was not blocked by naloxone(2 mg/kg, i.p.).

緒言
β−lactotensin(H‑I‑R‑L)

は

実験方法

、

β−lactoglobulin のキモトリプシン消化物から回

ddY マウス（体重 16‑18ｇ、♂）を用い、腸収縮活性を指標にして単離されたペプチドで

β−lactotensin を脳室内投与または皮下投与し、ある。以前我々は、β−lactotensin が neurotensin

投与後 5 分間隔で tail‑pinch 法により response

NT2 レセプターを介してコレステロール低下作用

time (sec) を 計 測 し た 。 naloxone 及 び

1)を有することを見出した 。neurotensin は NT2
レセプターを介した鎮痛作用を示すことから

haloperidol はβ−lactotensin 投与の 30 分前に 2

2,3)

、

本研究では、β−lactotensin のマウスに対する鎮痛作用について検討した。

57

mg/kg の用量で腹腔内投与した。

2. 鎮痛作用

結果および考察β−lactotensin はマウスへの脳室内投与の際に1. レセプター親和性

200 nmol/mouse の用量で tail‑pinch test により

neurotensin 及びβ−lactotensin の NT1 及び NT2

鎮痛活性を示した (Fig.1) 。 皮下投与ではレセプターに対する affinity を Table1 に示した。 300 mg/kg という高用量で鎮痛活性が見られた
NT2 レセプターに対する親和性を比較すると(data not shown)。

neurotensin とβ−lactotensin では 2,000 倍の差

また、β−lactotensin による鎮痛活性は、オピがみられる。しかし、neurotensin が NT1 に対しオイドレセプターの アンタゴニストであ るて選択性を示すのに対して、β−lactotensin はむ

naloxone の 投与に よって阻害さ れなかった

しろ NT2 に対する選択性を示す。β−lactotensin(Fig.2)。このことより、β−lactotensin の鎮痛活は、NT2‑selective な最初の天然リガンドである。

性は非オピオイド性のメカニズムによるものであると考えられる。一方、haloperidol を投与す

Table 1. Receptor affinity of neurotensin agonists.
IC50 (µM)

peptidesNT 1
0.00025
18.6

neurotensin
β-lactotensin

NT1

るとβ−lactotensin による鎮痛活性が block された (data not shown)。neurotensin が dopamine

NT2

NT2

0.005
10

20
0.54

ニューロンを制御するという報告もあることから

4,5)、 neurotensin ア ゴ ニ ス ト で あ る

β−lactotensin の鎮痛活性は dopamine レセプ

90Antinociceptive effect (AUC)

5

Response time (sec)

300nm ol
200nm ol4

100nm ol

3

▲

2
▲
▲

1
▲

▲

▲

80

**

**

200

300

70
60
50
40
30
20

▲

10

0
pre

5

10

15

20

25

30

0
100

β‑lactotensin (nmol)

Time after administration (min)Fig. 1. Antinociceptive effect of β-lactotensin. β‑lactotensin was given by i.c.v. administration. The values shown are the means ± SEM. ** P < 0.01 against control.

58

Antinociceptive effect (AUC)70602) Dubuc I., Sarret P., Labbe-Julle C., Botto J. M.,

50

Honore E., Bourdel E., Martinez J., Costentin J.,

40

Vincent J. P., Kitabgi P., Mazella J. Identification

30of the receptor subtype involved in the analgesic
effect of neurotensin. J. Neurosci. 19: 503-510,

20

1999

10

3) Tyler B. M., Groshan K., Cusack B., Richelson0

β ‑lactotensinE.

β‑lactotensin+Naloxone

In vivo studies with low doses oflevocabastine and diphenhydramine, but notpyrilamine,antagonize

neurotensin-mediatedantinociception. Brain Res. 787: 78-84, 1998

Fig. 2. Effect of naloxone on antinociceptive effectof -lactotensin. Naloxone (2 mg/kg, i.p. ) was
given 30 min. before i.c.v. injection of-lactotensin (200 nmol/mouse).

4) Haubrich D. R., Martin G. E., Pflueger A. B.,
Williams M.

Neurotensin effects on brain

dopaminergic systems. Brain Res. 231: 216-221,
1982

ターが関与している可能性がある。

5) Brun P., Steinberg R., Le Fur G., Soubrieβ−lactotensin の鎮痛作用の耐性形成の有無につP. Blockade of neurotensin receptor by SR48692

いては現在検討中である。

potentiates the facilitatory effect of haloperidol on
the evoked in vivo dopamine release in the rat
nucleus accumbens. J. Neurochem. 64: 2073-2079,

文献

1995

1) Yamauchi R., Jinsmaa Y., Takenaka Y., Yoshikawa
M.

Hypocholesterolemic

activityofβ−lactotensin as a neurotensin receptor agonist.
Peptide Science 2000. 225-228, 2001.

59

ハロセン麻酔と血中タキキニン濃度の変動
関山裕詩、角田俊信、澤村成史、冨岡俊也、有田英子、花岡一雄
東京大学医学部附属病院麻酔科・痛みセンター

Serum tachykinins levels are not elevated during emergencefrom halothane-anesthesia in normal rats.
Hiroshi Sekiyama, Toshinobu Sumida, Shigehito Sawamura, Toshiya Tomioka , Hideko Arita andKazuo Hanaoka
Department of Anesthesiology, The University of Tokyo Hospital

Summary : Intraoperative bronchospasm can have many etiologies, including the patient's intrinsic
disease and mechanical, chemical, or neurogenic causes. Insufficient anesthesia, such as emergence isalso one of risk factors of intraoperative bronchospasm . However, the mechanism of bronchospasm byinsufficient anesthesia is not well defined.

Recently tachykinins (substance P, neurokinin A ) are

reported to have potent effects on bronchomotor tone, airway secretions, and bronchial circulation.
We hypothesized that the possible mechanism of bronchospasm by insufficient anesthesia would
involve tachykinins released from sensory airway nerves and, therefore serum tachykinins levels
would be elevated during insufficient anesthesia like emergence. The aim of this study was to compare
serum substance P (SP) or neurokinin A (NA) levels under halothane-anesthesia and during the
emergence.This protocol was approved by our institutional Animal Care and Use Committee.
Experiments were conducted on 14 adult male Sprague-Dawley rats weighing 300-350g. They weredivided into two groups: 1) SP group ( n = 7);2) NA group, (n = 7). Following tracheotomy andtracheal intubation under general anesthesia, catheters were inserted into the left external jugular vein
for fluid administration, and the left carotid artery for blood sampling.
ventilated with 100% O2 to maintain normal end tidal CO2 levels.

Each rat was mechanically

We used colorectal

distention(70-80 mmHg) as noxious stimulation, because colorectal distention is repeatable andvisceral pain involve tachykinins.

We maintained each halothane level (0.3MAC, 1.0MAC, 2.0MAC,

and 0MAC i.e. emergence ) for 20 minutes and performed colorectal distention during last 5 minutesof each 20 minutes period.

After each colorectal distention, blood samplings of SP or NA werecollected. The serum SP or NA levels were estimated by radioimmunoassay.

60

Although the serumSP and NA levels during the emergence were a little higher, analysis of the blood samples
demonstrated no significant change in the SP (p = 0.628) or NA (p = 0.216) level at all anesthetic
levels. Serum tachykinins levels are not elevated during emergence from halothane-anesthesia in therat. However, we are not sure that the mechanism of bronchospasm by insufficient anesthesia do not
involve tachykinins system. One reason is that tachykinins are scarce in a human body and serum
tachykinins levels may not do reflect local release of tachykinins.

Another reason is that we

employed normal animals, not asthmatic rats, which might demonstrate higher serum tachykinins
levels during emergence from halothane-anesthesia.

緒言

実験方法

術中気管支痙攣は臨床麻酔の現場では重大な

ハロセン麻酔下に体重 300 350g の健常 SD ラ

麻酔合併症であり、その原因としては気管支へのット(n=14)に気管切開、総頚動静脈カニュレーシ

1

機械的刺激、副交感神経亢進 、気管支喘息の増ョンを施行し、経直腸的にバルーンを挿入した。

悪、そして浅麻酔もその誘発因子として挙げられ

その後純酸素にて人工呼吸下でハロセンを約 202ている 。しかし、浅麻酔が気管支痙攣を起こし分やすい機序については不明である。

毎に0.3MAC(minimumalveolar

近年喘息発症機序はアレルギー性疾患としてconcentration)、1.0MAC、2MAC、0MAC と変化させの側面だけではなく、神経原性疾患としての機序た。各ハロセン濃度を一定化してから 15 分後経に注目が集まっている3,4。この中心がサブスタン

直腸的バルーンを緩除に拡張させ 70 80 mmHg でスP（SP）、ニューロキニンA (NKA)そしてカルシ維持し、その 5 分後動脈ラインより採血した。まトニン遺伝子関連ペプタイド(CGRP)等の知覚神

た採血後バルーンは脱気した。Ｃolorectal

経C線維に存在するニューロペプタイドによる軸

distention (CRD)を術中侵害刺激として代用した。

5

索反射である 。これらのニューロペプタイドは各サンプルは遠心分離後、放射性免疫測定法によ

脊髄後根神経節疼痛伝達物質としてのみではな

り SP, NKA (各 n=7)を定量化した。

く、気管支平滑筋収縮作用、気道分泌促進作用、統計処理は repeated ANOVA にて有意差が認め

血管拡張透過性亢進作用があることが判明してられた場合 Posthoc test を施行した。P<0.05 に

3て有意差ありとした。

いる 。
今回我々は不十分な麻酔が気管支痙攣を起こしやすい原因として「気道上皮下の知覚神経C線維
神経終末に浅麻酔ではニューロペプタイドが軸索反射で多く産生され輸送集積し、麻酔が深い状

結果

態ではその量も少ない。このため浅麻酔ではこれ

SP, NKAともにハロセン麻酔覚醒時にやや上昇しらのニューロペプタイドが放出され易く気管支たものの、有意な変化ではなかった。(各p = 0.628、痙攣を発症し易い状態にある。」という仮説を立

p = 0.216)て、麻酔中及び覚醒時の血中SP、NKA濃度を測定し検討した。

61

映されにくかった。局所での SP、NKA の変化をとらえられれば、より的確であったであろう。ただし、有意でなかったものの、ハロセンの麻酔深度が増すと SP、NKA 濃度がやや低下し覚醒時に上昇したということは局所での変化の反映とも考えられる。
今回の仮説には端緒となった症例がある。
喘息及びアレルギー疾患の既往歴、家族歴の全くない健常男性の予定手術において初めの侵害刺激が加わったと同時に術中気管支痙攣が発症した 6。一般的には副交感神経優位の際に喘息発作は発症しやすい。しかし一方で浅麻酔でも気管支痙攣を誘発し易いとされる 2。浅麻酔であれば交感神経優位であろう。これを説明するために、疼痛のニューロトランスミッターであり、近年喘息発症機序にも関連があるとされているタキキニンに着目した。
本モデルでは浅麻酔の状態とするため、術中手術侵襲にCRD を用いハロセンを0 MAC としている。
CRD は反復刺激でき、内蔵痛にはタキキニン系が関与しているとされているため用いた。仮説では「SP、NKA 濃度が高ければ術中気管支痙攣のリス

考察

クが増す。
」ということを前提としている。本モ

術中気管支痙攣の治療としてはβ2 作動薬、テ

デルで真に気管支の被刺激性に影響を与えていオフィリン、ステロイド等が主として用いられる。

るかは検討していない。しかし実際には局所でのまた最近ではロイコトリエン拮抗薬も注目を集

SP、NKA の上昇は起きており、気道内圧上昇等のめている。タキキニン拮抗薬もまた抗喘息薬としメカニクスの変化は起きていたという可能性はて期待されており、術中気管支痙攣の治療薬とし否定できない。

ての可能性を秘めている。
今回我々はハロセン麻酔中及び覚醒時の血中
SP、NKA 濃度を測定し検討した。しかし、有意な結語

血中 SP、NKA 濃度の上昇は認められなかった。原

正常ラットにおいてハロセン麻酔覚醒時に血中因として 2 つ考えられる。(1) 本対象が健常ラッ

SP, NKA 濃度は有意に上昇しなかった。

トであったため、浅麻酔に対しても反応性が弱かった。気管支の被刺激性が亢進している喘息モデ
ルを用いればより大きな変化が得られた可能性

今後の課題はある。 (2)SP、NKA が浅麻酔で確かに一次求心

今後は喘息モデルにおいて局所でのタキキニ性線維から放出されていたとしても、局所的な放ンの変化を捉えて、気道のメカニクスとも関連付

出でしかなく生体内で微量のため血中濃度に反けて検討していきたい。

６２

Acta Anaesth Scand, 31:244-52,1987
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vagus

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