原著

脂肪細胞分化に伴う脂肪蓄積に対するアミノ酸の効果
Effects of amino acids on lipid accumulation in differentiated adipocytes
田中千尋

鎌田由香

矢内信昭

Chihiro TANAKA

Yuka KAMADA

Nobuaki YANAI

Adipose tissue plays important roles in lipid homeostasis, though less is known about the regulation of amino acid metabolism in adipocytes. We administered 11 kinds of amino acids to differentiating adipocytes to quantify the contributions of amino acids to lipid accumulation in differentiatedadipocytes from mouse bone marrow mesenchymal progenitor cell line. Among those amino acids, 8amino acids including branched-chain amino acids (BCAAs) enhanced lipid accumulation in adipocytes, and arginine, asparagine, and cysteine administration did not affect lipid accumulation. All theamino acids tested did not suppress the lipid accumulation in adipocytes. The highest lipid accumulation was observed in leucine (one of BCAAs) administration, suggesting leucine has an effectdifferent from isoleucine and valine (other BCAAs) addition. When asparagine is easily synthesis
from aspartic acid in cells, only aspartic acid enhanced the lipid accumulation. Arginine is a popularsupplement as it is touted to increase nitric oxide activity in the body, and arginine administration
did not affect the lipid accumulation in adipocytes. When taking a large amount arginine as a supplement, there is no worry of the lipid accumulation in adipocytes.
Keywords: adipocyte, mesenchymal progenitor, amino acid
脂肪細胞，中胚葉性前駆細胞，アミノ酸1.

よって、分岐鎖アミノ酸が濃度依存的に TCA 回路を活性

緒言

脂肪組織は、グルコースからの脂質合成を担い、グル化させたり、3T3L1 脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を促進

コースと脂質の恒常性を維持し、余分なエネルギーを中性させたり、脂肪酸代謝酵素の転写を促進させることが知ら

脂肪の形で保存する組織である。脂肪細胞は、脂肪組織のれている6,7) 。脂肪細胞に分化した 3T3 L1 細胞では、ミ主な構成成分で、ホルモンやサイトカインを介して、脂質トコンドリアのアセチル CoA の 1/3 が分岐鎖アミノ酸由の合成と放出が調整されている。また、脂肪細胞が分泌す来であると考えられている8)。このように、脂肪細胞ではるアディポカインは、肝での脂質代謝、食欲、炎症やイン分岐鎖アミノ酸代謝が脂肪細胞機能に大きく関わっている。

スリン抵抗性に影響を与えている1)。脂肪細胞での脂質代

今回、脂肪細胞のモデルとして、マウス骨髄由来前駆細謝において、タンパク質の積極的摂取やアミノ酸の摂取胞が脂肪細胞へと分化して細胞内に脂肪滴を蓄積する系をが、肥満の発症を抑制、すなわち脂肪細胞への脂肪蓄積を用いて、培養細胞に対するアミノ酸添加が脂肪滴形成にど抑制すると考えられているが、脂肪細胞に直接作用して機のような作用があるかを検討することとした。効果を観る能していることが明らかとなっているわけではない。

アミノ酸として、分岐鎖アミノ酸（バリン、ロイシン、イ従来、分岐鎖アミノ酸であるバリン、ロイシン、イソロソロイシン）、分岐鎖アミノ酸に次いでエネルギー源としイシンは、骨格筋の増殖と維持に効果的であるといわれてて用いられているアスパラギン酸と容易にアスパラギン酸いるが、近年、分岐鎖アミノ酸と肥満の関係が注目され、へ変換が可能なアスパラギン、脂肪組織の量を減少させる

分岐鎖アミノ酸代謝と脂肪細胞の分化過程での遺伝子発現事が報告されているシトルリン9)、アルギニン10)、シトル制御の研究も進んでいる2,3) 。分岐鎖アミノ酸は、多くのリンとともにオルニチン回路を構成するアミノ酸であるオ

組織で重要なケト原性アミノ酸で4)、血中のこれらのアミルニチン、脂肪細胞分化を促進するシステイン11) 、脂肪ノ酸は、代謝の過程で、血中濃度依存的にインスリン抵抗組織での代謝抑制効果のあるメチオニン12) 、脂肪細胞に性を増大させるという結果も示されている5)。ただ、これ作用するという報告がほとんどないトリプトファン（インらのアミノ酸の脂肪細胞に対しての効果をもたらす機序のスリン依存的なグルコースの取り込みを促進しない13) ）詳細については明らかとなっていない。いくつかの報告にの 11 種類とし、それらのアミノ酸が、脂肪細胞への脂肪宮城学院女子大学大学院健康栄養学研究科

17生活環境科学研究所研究報告

蓄積に対する影響を調べることとした。

3)

第50巻（2018)

アミノ酸添加通常臨床的に用いられているアミノ酸の投与量は、1 日

脂肪細胞分化に際して添加したアミノ酸（和光純薬）は、あたり 1 g 程度なので、体重が 60 kg の場合、アミノ酸のアスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシ

分子量にもよるが、そのままの量が血流に入ったと仮定す

ン、オルニチン、シトルリン、システイン、トリプトファ

れば数 mM になることが予想されることから、今回の実ン、メチオニン、バリン、ロイシンで、 1 M 水酸化ナト

験では、培地に含まれるアミノ酸とは別に添加するアミノリウム溶液を用い、それぞれ 1 M 溶液を作成した。アミ酸濃度を 2 mM と設定した。

ノ酸添加に際しては、コントロール培養には 1/500容の 1M 水酸化ナトリウム溶液、アミノ酸液は 1 / 500 容を添加

2. 材料と方法し、最終濃度を 2 mM とした。

1)4)

培養細胞

脂肪染色

脂肪細胞分化を観察する系として、骨髄由来マウス前脂1 週間の脂肪細胞分化誘導培養後、細胞内に形成された肪細胞株 TBR311を用いた。TBR311細胞は、温度感受性脂肪滴を 0.18 ％オイルレッド（ OilRed O ）溶液で染色しSV40の T 抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウた。イソプロパノールで可溶化した0.3％オイルレッド溶

スの骨髄から樹立された細胞株で、 33 °C では T 抗原が活液 6 に対して 4 容の純水を加えて染色液とした。細胞を性化して細胞を増殖させ、 37 °C の培養によって T 抗原が20 ％中性ホルマリン溶液（和光純薬）で 10 分間固定した

不活化され、増殖が遅くなり、細胞の分化が促進される中後、 PBS でリンスし、 60 ％イソプロバノールで置換した胚葉性前駆細胞である14,15)。継代培養は、10％牛胎児血清後、染色液で 10 分間染色した。定量に際しては、 60 ％イ（FBS：fetal bovine serum）を添加した F12/DMEM（In-ソプロバノールで脱色した後、 PBS で 2 回リンスして風vitrogen）を用い、10 cm プラスチック培養皿（住友ベー乾した。乾燥後、イソプロパノールで色素を抽出し、島津クライト）で、33°Cの 5％炭酸ガスインキュベータ内で行製作所 UVmini1240を用い、520 nm の波長で吸光度を測った。培地は、1 週間に 2 回交換した。細胞の継代は、細定した。

胞が培養面に飽和した状態で、トリプシン溶液（ 20 mg /mL 牛膵臓由来トリプシン（シグマ）、 0.02 ％ EDTA 、リ

3. 結果と考察

ン酸緩衝塩類溶液（PBS: Dulbecco's phosphate buffered

マウス骨髄由来の中胚葉性前駆細胞株である TBR311saline ））処理により細胞を培養皿から剥がした後、培地細胞は、1 mM デキサメタゾンを添加し、リポタンパク質に細胞を分散し、5 倍の培養面積へと経代した。の多い馬血清を20％加えた培地で、37°
C、6 日ほどの培養2)で、細胞内に脂肪的を蓄積して脂肪細胞へと分化した（図脂肪細胞分化

TBR311の脂肪細胞への分化は、6 穴プラスチック培養1 ）。細胞内に蓄積した脂肪滴は、オイルレッドでよく染皿（ベクトンディッキンソン）を用い、飽和状態（ 1.3 ×まるため、オイルレッド染色後に色素を抽出して吸光度を105細胞/ウェル程度）となった培養に対して、リポタンパ測定することで、細胞内に蓄積した脂肪の概量を求めるこク質が多い馬血清（HS: horse serum）を20％、脂肪細胞とができる。

分化を誘導する 0.1 mM デキサメタゾン（合成グルココル

TBR311細胞の脂肪細胞への分化過程における脂肪蓄積チコイド）、グルコースの取り込みと脂肪酸合成を促進すに対する各種アミノ酸の効果を調べるために、アスパラギるための10 mg/mL インスリン（シグマ）を添加した F12/ン、アスパラギン酸、アルギニン、イソロイシン、オルニDMEM 培地で、 37 °C の 5 ％炭酸ガスインキュベータ内でチン、システイン、シトルリン、トリプトファン、バリ脂肪細胞へと分化させた。培地交換は 3 日毎に行った。

ン、メチオニン、ロイシンの 11 種類のアミノ酸の効果を

図 1：TBR311細胞の脂肪細胞分化
A ：維持培養で飽和状態となった TBR311細胞。B ：分化誘導 6 日目には細胞内に脂肪滴が観察できる。C：分化誘導 6日目に脂肪滴をオイルレッド染色した。

18

脂肪細胞分化に伴う脂肪蓄積に対するアミノ酸の効果（田中，鎌田，矢内)検討した。添加するアミノ酸の濃度は、経口摂取可能な量実験の 3 ウェルあたりの平均値を結果とした。脂肪滴蓄（体重 60 Kg の個体に対して 1 g 程度）を想定し、すべて積を阻害するアミノ酸は見当たらず、すべてのアミノ酸でが吸収され血中濃度に反映することを仮定して、2 mM と陽性コントロールを上回っていた。最も脂肪蓄積量が増加した。アミノ酸の添加は、脂肪細胞分化誘導培養期間を通したのはロイシン添加で、およそ 1.5倍量の脂肪蓄積であして行い、分化誘導培養 3 日目に行った培地交換時にもった。分岐鎖アミノ酸では、バリン、イソロイシン添加とアミノ酸を添加した。アミノ酸の効果が脂肪細胞分化誘導

もに 1.2 倍量の脂肪蓄積があった。従来の報告に見られるにあるのか、分化後の脂肪蓄積にあるのかを判別すること

分岐鎖アミノ酸の脂肪細胞への効果16） とほぼ同様の結果はできないが、すべてのアミノ酸添加において脂肪滴の蓄が得られた。アミノ酸添加によって脂肪蓄積が増加したア積が見られたことから、今回添加したアミノ酸が分化誘導

ミノ酸は、 11 種類の内 8 種類で、脂肪蓄積に対して効果の過程に作用したとは考えにくい。のなかったアミノ酸はアスパラギン、アルギニン、システ

脂肪細胞分化誘導培養 6 日目に細胞を固定し、オイルインの 3 種であった。以下にアミノ酸毎の脂肪蓄積効果

レッドで染色された脂肪をイソプロパノールで可溶化してについて考察する。

吸光度を測定し、蓄積した脂肪量とした（表 1 ）。脂肪細分岐鎖アミノ酸）
分岐鎖アミノ酸 3 種類は、摂取したタンパク質のアミ胞分化の実験系は、分化して脂肪滴を蓄積した細胞の培養基質に対する接着性が弱くなること、固定・染色の過程でノ酸組成のおよそ 20 ％を占め、主に肝臓で代謝される残細胞が培養基質から剥がれやすくなること、さらにオイルりの（タンパク合成に使われる） 17 種のアミノ酸と異なレッドのプラスチックに対する親和性による染色ムラなど

り、筋肉組織や脂肪組織で代謝される。分岐鎖アミノ酸から誤差の多い実験系となっているため、6 回の独立したは、主に筋組織で代謝されると思われていたが17) 、分岐実験を行い、その平均的な値に最も近い値を持つ 1 回の鎖アミノ酸の組織重量あたりの代謝は、筋組織よりも脂肪組織の方が高く、脂肪組織では分岐鎖アミノ酸濃度に依存して代謝量が変動することが明らかとなった18) 。また、分岐鎖アミノ酸の代謝酵素である分岐鎖アミノ酸トランス

表 1：TBR311細胞の脂肪蓄積量

アミナーゼ（branched-chain amino acid transaminase 2：BCAT2）や分岐鎖 a ケト酸デヒドロゲナーゼ（branchedchain alpha keto acid dehydrogenase：BCKD）などの分

岐鎖アミノ酸代謝酵素が脂肪細胞にロイシンを添加することで転写が増加することが示されている19) 。また、筋組織ではこれらの代謝酵素の変動が見られないことから、分岐鎖アミノ酸の血中濃度は、脂肪組織の代謝に依存して、脂肪組織が調節していると考えられるに至っている18)。
分岐鎖アミノ酸は、動物に摂取させる際には、ほとんどの場合 BCAA （ branched-chain amino acid ）として一括して扱われて研究されてきたが、今回の結果から、脂肪細胞内への脂肪蓄積に関しては、バリン、イソロイシンに比較して、ロイシン添加の場合に蓄積量が高くなることが分かった。ロイシンは、細胞に取り込まれた後、小胞体にあるロイシンセンサーである Sestrin220)に結合して活性化す
ると、栄養環境感知システムとしての mTOR を活性化させ、代謝や細胞分裂を促進させている21) 。今回の分岐鎖
アミノ酸添加による脂肪蓄積の結果を見ると、バリンとイソロイシンはほぼ同じような脂肪蓄積量を示したが、ロイシンはその 25 ％程度多い脂肪蓄積量を示した。さらに、ロイシンを添加した場合の脂肪蓄積量は、容量依存的に増加したことから（表 2 ）、分岐鎖アミノ酸の中でもロイシンは、単に代謝の基質として使われているだけではなく、シグナルとして機能しているものと考えられる。分岐鎖アミノ酸の脂肪蓄積に対する効果は、バリン、ロイシン、イソロイシンすべての場合で期待できるが、ロイシンが最も効果が高い。

19

生活環境科学研究所研究報告

表 2：添加アミノ酸容量依存的 TBR311細胞の脂肪蓄積量

第50巻（2018)

ンとシトルリンの添加が脂肪蓄積に対する効果を検討したが、前述の通り、アルギニンによる脂肪蓄積促進効果は見られなかったが、オルニチンとシトルリンの添加は、同程度に脂肪蓄積促進効果を観ることができた。オルニチン回路を構成するアミノ酸の中で、なぜオルニチンとシトルリンが脂肪蓄積に効果があってアルギニンにはないのかについては、興味深い結果であり、さらなる詳細な解析が必要である。今回用いた TBR311 細胞の脂肪細胞分化は、白色脂肪細胞の表現系を持ったものであるが、褐色脂肪細胞の場合には、アルギニンが分化と増殖を促進することが最近報告されている24)。
アスパラギン、アスパラギン酸）
分岐鎖アミノ酸に次いでエネルギー源として用いられているアスパラギン、アスパラギン酸を添加した場合には、脂肪蓄積量が、アスパラギン酸の場合には 1.2 倍であったが、アスパラギンではほとんど促進作用が無かった。アス
パラギンは、アスパラギン合成酵素により容易にアスパラギン酸から合成されることが古くから知られており、アスパラギン酸の添加はアスパラギン添加と同様であろうと予想していたが、予想に反し、両アミノ酸間で差のある理由については、今後の検討が必要である。
トリプトファン、メチオニン、システイン）
ロイシンに次いで脂肪蓄積量が多かったのが、トリプトファン添加（約 1.4 倍）、メチオニン添加（約 1.3 倍）の場アルギニン、オルニチン、シトルリン）

合であった。メチオニンに関しては、抑制効果を期待してmTOR を活性化させ、代謝や細胞分裂を活性化させて検討したが、脂肪蓄積を促進するという結果を得たので、いる事が知られているもうひとつのアミノ酸がアルギニ

この効果の理由についてはさらなる検討が必要である。トンである21) 。アルギニンは、細胞内のセンサーである

リプトファンは、ヒトが摂取する場合には、比較的低濃度CASTOR122）に結合して活性化すると、栄養環境感知シ

で、セロトニンやナイアシンの前駆物質として用いられてステムとしての mTOR を活性化させ、代謝や細胞分裂をおり、今回のような高濃度での検討は、従来、実施されて活性化させている21) 。今回、脂肪細胞へのアルギニン添こなかった。もしも、今回用いた高濃度の摂取が生理的な加による脂肪蓄積量は、アミノ酸添加のない陽性コント副作用を生じないのであれば、脂肪蓄積促進効果を期待しロールの場合とほぼ同じ量で、アルギニンの濃度を変化さての使用が可能かもしれない。

せた場合でも濃度依存的な効果は見られなかった（表 2）。

脂肪細胞分化の標準的実験系として使われている 3T3mTOR を活性化させる点では、ロイシンでもアルギニン

L1 細胞では、システインの添加により脂肪細胞分化が促でも可能であるが、両アミノ酸受容体以降の mTOR に至進されることが報告されているが11) 、今回の結果、シスる過程が異なるので、脂肪細胞ではアルギニン受容体がテインの添加は、脂肪蓄積には効果が無かった。

発現していないことや mTOR までの経路に関わるタン

今回の 11 種類のアミノ酸による脂肪蓄積促進効果の結パク質の発現のないことが予想され、脂肪細胞での果から、脂肪蓄積促進を期待して経口摂取するとした場合

CASTOR1 の発現量を調べるなどのさらなる検証が必要

は、分岐鎖アミノ酸、特にロイシンが効果的であろうと考である。アルギニンが脂肪組織を減少させるという報えられる。アスパラギン、アスパラギン酸を利用する際に告23) があるが、個体の脂肪組織を用いた観察で、直接脂は、アスパラギンを用いた方が脂肪蓄積に影響が無いとい肪細胞での作用を見ているわけでは無い。今回、脂肪細胞える。一酸化窒素（NO ）の産生を期待して使われるアル分化において、アルギニンによる脂肪蓄積の増加が見られギニンは、脂肪蓄積の増加は考慮せずに使用することがでなかったことから、動物実験系でのアルギニン摂取の効果きると思われる。

が脂肪細胞のアルギニン受容体を直接介した作用ではな
4. 要約

く、二次的な作用ではないかと思われる。
アルギニンは、細胞内の尿素回路の構成アミノ酸であ

脂肪組織は、脂質代謝を担う重要な組織であるが、脂肪り、アルギニン添加と尿素回路の構成要素であるオルニチ

細胞の脂質代謝に対するアミノ酸の役割は、部分的にしか20脂肪細胞分化に伴う脂肪蓄積に対するアミノ酸の効果（田中，鎌田，矢内)理解されていない。今回、マウス骨髄由来中胚葉性前駆細9) Joffin N, et al. Citrulline induces fatty acid release

胞から脂肪細胞へ分化誘導する過程で、アミノ酸の添加がselectively in visceral adipose tissue from old rats.

細胞内の脂肪蓄積に与える影響を検討した。添加した 11

Molecular Nutrition, 58, 17651775 (2014)

種 類のアミ ノ酸の 内、脂 肪蓄積を 促進し たもの が 8 種

10) Jobge W, et al. Dietary Larginine supplementation

類、促進効果の無かったものが 3 種類で、脂肪蓄積を抑reduces white fat gain and enhances skeletal muscle

制したアミノ酸は無かった。分岐鎖アミノ酸の中で、ロイand brown fat masses in diet-induced obese rats. J.

シンが最も脂肪蓄積作用が高く、イソロイシンやバリンとNutr. 139, 230237 (2009)は異なる経路で作用していると考えられた。アスパラギン

11) Ueki I, Stipanuk MH. 3T3L1 adipocytes and rat adi-は、細胞内で容易にアスパラギン酸から転換されるにもか

pose tissue have a high capacity for taurine synthesis

かわらず、アスパラギン酸添加の場合のみが脂肪蓄積を促by the cysteine dioxygenase/cysteinesulfinate decar-

進した。一酸化窒素の供給を期待して用いられているアルboxylase and cysteamine dioxygenase pathways. J.

ギニンは、脂肪蓄積に対しては効果の無いことが分かった。

Nutr. 139, 207214 (2009)12) Castellano R,et al. A methionine deficient diet en-

5. 謝辞

hances adipose tissue lipid metabolism and alters an-

本研究は、 2016 、 2017 年度宮城学院女子大学研究助成

ti-oxidant pathways in young growing pigs. PLoS
One, 10(7): e0130514. (2015)

金により進められた。

13) Inubushi T, et al. Ltryptophan suppresses rise in

6. 引用文献

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22