技術紹介
点状の蛍光シグナルとして検出されたプローブでもサファイバーFISH と複製フォークの検出イズに応じたライン状蛍光シグナルとして検出される。
これで数壱百 kb から 1Mb ぐらいまでのゲノム領域が三重大学大学院生物資源学研究科解析できる。一見容易であるが、実際は変性等の操作

分子細胞生物学研究室

時に DNA ファイバーが細かく寸断され、ライン状と奥村克純、齋藤辰朗、杉村和人

いってもドットの連なりで、時にはその間隔も広く解析の妨げになる(図 1a)。これは以下に述べるファイバ

はじめにー上のシグナル検出で常に問題となるポイントである。

いわゆる遺伝子の染色体マッピング法として 1980

熱、酸よりもアルカリ変性がライン状の質の高い蛍光年代終わり頃に登場した FISH は、標本作製法を含めシグナルを得るのによいとされるがケースバイケース様々な改良がなされてきた。SKY などヒトやマウスので、目的に応じた条件検討を行う必要がある。

全染色体を染め分け、転座などをマルチカラーで一挙一方、複製フォークを DNA ファイバー上に可視化に判定できる手法から、質の高い個別染色体ペインテする試みは 1960 年代のファイバーオートラジオグラィングプローブを用いたゲノムの核内配置のダイナミフィー(RI 標識チミジンを hot ラベル、warm チェイス

クスを解析する手法、ゲノムを核から引き出して DNAの二段階で複製標識)に始まる。その後、1980 年代後ファイバー上で高解像度に解析できる手法、また転写半に BrdU を取り込ませ、複製フォークの進行方向は物やそのプロセシングを検出する手法、さらにはこれわからないもののファイバー上に複製部位を蛍光検出らをタンパク質の免疫染色と組み合わせる手法に至るする方法が報告された。さらに CldU、IdU を染め分けまで多様に技術開発・改良が進んできた。Live cell

る抗 BrdU 抗体の開発で複製フォークの進行方向も判imaging 技術が進展する中、FISH は一見時代遅れと考定できるようになり、RI では検出に数ヶ月も要したのえてしまう研究者もいるかもしれないが、工夫次第でが数時間に短縮された。しかしハロゲン化ヌクレオシ

核ダイナミクス解析の極めて有効なツールとして利用

ドによる方法の問題点は、修飾塩基の検出に DNA のできる。今や基本的な FISH は誰もが知るところとな変性が必要で、検出されるシグナルはやはりファイバり、他の分子生物学の手法と同様に生命科学研究の基ーFISH と同様にドットの連なりとなってしまう(図本ツールのように見えるが、職人芸的なところもあっ1b)。また、培地に加えるヌクレオシドの濃度に依存して現実にはプロトコール通りにやっても必ずしもうまて S 期の進行が遅くなることにも留意すべきである。

くいかないことも事実である。本稿では、筆者のグループで行っている FISH を用いる核ダイナミクス解析のうち、特に DNA ファイバーを用いる方法を中心に、総説等では述べられない技術的なポイントや留意点を解析例とともに紹介する。その他、増幅系を用いる高感度 FISH についても言及する。

DNA ファイバーFISH と複製フォークの可視化
細胞を市販の特殊被覆していないスライドガラスにabc
図１DNA ファイバーFISH と複製フォークの検出(a) ヒトゲノム上のコスミドクローンの検出。
イメージ中のバーは各クローンの配置と検出される色の模式図。

滴下し、風乾後 SDS 入りの溶解液に浸して細胞を溶か(b,c) ハロゲン化ヌクレオシドによる複製ラベルのチャンしスライドガラスを傾ける。核内 DNA は溶解液の流ピオンデータ。細胞を BrdU、IdU で 10 分間隔で連続的にれに乗って展開され、はだかの二重らせんとしてスライドガラスに張りつく。あとは変性させて二重らせんを開き通常の FISH をやれば、染色体上ではクリアな複製ラベル後 DNA ファイバーを調製し緑と赤で検出した。
(b)は最初の 10 分標識のみ、(c)は両方検出。２色ラベルすることで矢印の方向に複製フォークが進と推定される。通常は(a)のような寸断シグナルとなることが多い。

留意点はあるものの DNA ファイバー上で複製部位とa

特定のゲノムクローンの FISH をマルチカラーで併用して検出すれば、ファイバーオートラジオグラフィー
ではできなかった特定部位の複製フォークや複製起点の解析が理論的には可能である。しかし、ここでさらに留意しておくべきことは、解析したいゲノム領域のOri 1

Ori 2

Ori 1

Ori 2

細胞当たりのコピー数である。ファイバーFISH でゲノムの構造解析をする場合はスライドガラスに塗布する細胞数を多くすればさほど困難ではなく、むしろ容易

b
複製フォーク速度 (kb/min)に見つけることができるが、一本のファイバーで 1Mbのゲノム領域を解析できるとしても１コピーの領域ならヒトゲノムでは 1/3000Mb の確率で、しかもその部位が複製中となるとさらに確率は下がり、顕微鏡下に見つけ出すのは至難の業であることが想像できよう。
それでも同調系でうまくすればいくつか見つけること2HeLa 細胞10ができるが、増幅遺伝子系や、例えば図 2c に示すよう0にマウスメジャーサテライト領域など反復配列をター

123456
G1/S 期同調解除後の時間 (hr)7ゲットにすれば十分解析に耐える。
細胞の複製標識法としては BrdU などのハロゲン化ヌクレオシドやビオチン等修飾ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチドが用いられるが、後者は検出に DNAの変性を必要とせず、ファイバー上に寸断のない高質の蛍光シグナルが得られる。しかし、ヌクレオチドは培地に加えただけでは一般的に細胞内に取り込まれず、c
MMS/forksforks

図２ 修飾ヌクレオチドによって複製標識された
DNA ファイバー上の複製フォークの検出(a) マウス線維芽細胞 m5S を Biotin-dUTP (２色の場合その利用はマイクロインジェクションや膜透過性をよ

Digoxigenin-dUTP を併用)で複製標識後 DNA ファイバー

くした細胞、ツメガエル等の in vitro の系に限られる。

を調製し、蛍光検出した顕微鏡像。矢印は複製フォーク

ではビオチン等修飾ヌクレオシドを用いればとなるが、大きな修飾基がついているヌクレオシドが細胞膜を透過するのか、透過しても細胞内ヌクレオチドに変換さの進行方向を示す。下のイメージは２色標識で図は複製起点 ori の存在と複製ラベルの進行過程の推定。
(b) S 期の進行に伴う複製速度。m5S 細胞を G1/S に同調し、リリース後各時間に２色で複製ラベルして検出した。下のイメージに示すように２色目ラベルまでに要しれるのかなど考慮すべき点があり、現状ではうまくいた時間当たりの複製進行距離(矢印間)で算出。っていない。筆者らは、微細なガラスビーズで細胞を(c) FISH と複製フォークの併用。マウスメジャーサテラ

スクラッチして隙間から修飾ヌクレオチドを細胞内に入れるビーズローディングや、細胞を一時的に低張状イト(MMS)を DNA ファイバー上に FISH 検出(赤)し、そのファイバー上の複製フォークを上述の方法で検出(緑)した。下は複製ラベルのみのイメージ。

態にしてヌクレオチドを移入するハイポトニックシフ
トを用いている。特に後者では、ほぼすべての細胞に移入でき、ヌクレオチド濃度も均一に近く、さらに浮った修飾ヌクレオチドが複製の進行に伴って消費され遊系の細胞にも用いることができ使いやすい。この方

るか、拡散あるいは代謝され複製鎖に取り込まれる確法を用いて複製標識後 DNA ファイバー標本を作製し、率が下がるためと考えられるが、深く追求していない。

複製フォークを検出した結果、驚くべきことに図 2aいずれにしろ DNA ファイバー上に高質の蛍光シグナに示すような流れ星様の蛍光を観察し、二段階の複製ルが検出でき、二種のヌクレオチドを使い、またそれ標識を使わずとも単色蛍光ラベルで複製フォークの進らの濃度を変えて使うことで複製起点の高解像度の解行方向を判定出来ることがわかった。これは核内に入析やフォークのスピードを見ることができる(図 2b)。

少なくとも S 期チェックポイントは作動しないことは(a)Pull out

確認しているが、修飾基の大きいヌクレオチドを用いCover slipている点で本来の複製過程を反映しているのか、移入時に内在性のヌクレオチドプール等、核内環境が大きmeniscus

く変わらないかなど常に認識しておくべき留意点があDNA solution

るが、この方法には核内複製 foci の検出が非変性で行え、タンパク質の免疫染色と併用する場合なども含め、数多くのメリットがある。
上述の修飾ヌクレオチドによる複製標識と FISH を併用して特定のゲノム領域のフォークの進行をみる場
合、FISH 検出にはやはり DNA 変性が必要となり、結果として寸断された蛍光シグナルとなってしまう。しDNA molecule

かし条件を選べば、FISH との併用は十分可能で、これ

(b)

(c)

図３

分子コーミングの原理とコーミング装置によって特定ゲノム領域上の複製フォークの進行の様子を捉えることができた(図 2c)。
細胞から DNA を引き出すファイバーで問題となる
さらなるポイントは、DNA 鎖伸展の均一性とファイバーの重なりである。顕微鏡の一視野内では伸展率はある程度均一であるが視野を変えて比較してもシグナルの長短関係は必ずしも一致しない。また、またスライドガラスに塗布する細胞数が多い場合や、少なくても(a) コーティングしたカバーガラスを DNA 溶液に浸核から DNA が束になって引き出されるので、特に複し。一定の速度で引き上げる。DNA 分子はメニスカス

製フォークと FISH を組み合わせる際には同一 DNA フ
ァイバー上のシグナルを見ているかどうか注意を要する。これらをある程度解決する手法として登場したのが分子コーミングである。の移動にしたがい直鎖状に張りつく。下図右は張りついた DNA 分子の YOYO 染色蛍光顕微鏡像。
(b,c) コーミング装置。(b)はパスツール研製(写真はBensimon 提供)。(c)はと都度コントロール下にペリスタポンブとガラスシリンジで引き上げ速度を調節する
当研究室の装置。

分子コーミング
分子コーミング[Dynamic Molecular Combing (DMC)

知されてからは、我々の質問等に対しても実に親切で後に命名]の最初の報告は、Aaron Bensimon による 1994ある。しかも親日派であるので DMC をやりたい人は年の Science に遡るが、定量的 DNA ファイバーマッピぜひ連絡を取っていただきたい。

ング(QDFM)と称した FISH によるヒトゲノムの高解像

さて DMC とは、溶液中に DNA 分子を浮遊させ、溶度解析への応用で有名になった。FISH についてもいく

液にカバーガラスを浸して一定の速度で引き上げ、つかポイントがあるが、この方法の特に重要なポインDNA 分子を櫛状に均一な伸びで張りつけるというもトは、DNA を張りつける顕微鏡用カバーガラスのコーのである(図 3a)。溶液中の DNA 分子の一部が、溶液ティング方法と DNA 溶液の調製法、さらに DNA 分子から出てくる疎水的にコーティングしたガラス面にまの引き延ばし方にある。DMC 開発者 Bensimon はずくっつき、引き上げる際に溶液とガラス面にできるQDFM の発表での扱われ方などが原因したと思われ移動するメニスカスにかかる力を利用してガラス上にるが、当時は方法論についての情報提供や共同研究にDNA 分子が張りつくらしいが、コーティング剤、DNA極めて慎重かつ懐疑的であったことを記憶している。

溶液の pH 等、引き上げ速度は詳細に検討されている。

FISH を用いた応用例が彼らの手によって 1997 年のDNA を張りつけるコーミング装置は Bensimon が開発

Science に掲載され、その後に DMC の開発者として認し Pasteur 研究所から販売された(図 3b)。これについてずいぶん以前に問い合わせもしたが品切れで、いつ製ンでコートしたカバーガラスを用いている(当研究室造されるかわからない状況が続いているようである。

出身の香田(現在環境科学技術研究所)が藤山研で確立)。

一方で我々は藤山ら(現在国立情報学研究所)の方法を

分子コーミングを用いた研究報告は徐々に出てきて参考に図 3c のような装置を組み立てて湿度コントロいるが、複製と FISH を別々に検出する場合には大きール下に使用している。

な問題はないであろう(図 4)。しかし、両者を併用しコーティング法については Bensimon は酸素やアル3-4 色蛍光で検出するのはこれまで述べてきたいくつゴンガスの出入りを電磁弁でコントロールでき、UVかの問題点もかぶってくるので困難である。特定ゲノ照射やシラン注入も可能なガラス容器を自作し、そのム領域上での複製解析例は、ゲノム量の小さい酵母や中でシランをカバーガラスに蒸着させるコーティング遺伝子増幅系がほとんどである。我々は Bensimon かガラス作製装置を組み立てている。張りつけに比べコらコートしたガラスを送ってもらい DNA の張りつきーティングの成否は極めて微妙で、Bensimon 自身、装具合や蛍光検出について比較検討したが、はずかしな置の設置場所を移動するだけでも適切なコーティングがらそれを使っても納得できる結果を得ていないのがを施す調整に一ヶ月ぐらいはかかると言っている。こ現状である。Bensimon といえども低倍率の対物レンズのような理由で世界の研究者の多くはコーミング装置を使用して解像度を下げ、さらにイメージプロセスしを購入し Bensimon からコーミング用カバーガラスのてライン状シグナルとしたり、FISH 検出で幾重にも増供給を受け、DNA 溶液のみ調製して張りつけている幅するなどして何とかすすめているのか実情と思われ(これではコートしたガラスの供給が限られるため、思る。

うような実験が組めないと”ぼやく”ことになる)。こうなるとコーティングは誰もできないということになっ高感度 FISH などてしまうが、当然いくつかの研究室では独自の方法を

本稿では DNA ファイバーFISH を中心に紹介してきもっている。要はガラス面をいかにほどよく疎水的にたが、核ダイナミクスの解析に利用できそうなさらにするかであり、筆者らも種々検討した。おもしろいこ

いくつかの技術について簡単に紹介する。とに文献から自動車のフロントガラス用のシラン系撥

核マトリックスは、細胞を界面活性剤処理し、さら水剤で代用できることがわかり、中でも Rain-X が DNAに DNase、高塩処理してタンパクや DNA を抽出し残の張りつきが最もよかった。ただ FISH や BrdU 検出なされた画分と定義され、核の内部構造と強く相互作用

ど目的によって使い勝手があり、現在特に FISH 用にしない核内成分は除かれる。DNA についてみれば 8-9は手間などを考え、某社に特注のアミノプロピルシラ割程度除かれ、DAPI ではほとんど染まらず核マトリ(a)
IdU
CldU
merge

(b)
MMS
BrdU
merge
BrdU+MMS

図４

分子コーミングで張りつけたゲノム上での複製フォークと FISH 検出(a)ヒト白血病細胞 HL60 ゲノムを IdU で 20、さらに CldU で 20 分連続ラベルし、マゼンタ、緑で検出。Merge イメージ
では見やすいように CldU イメージを下方にずらせてある。(b)マウスゲノム DNA を分子コーミング法で伸展、固定し、major satellite sequence(MMS)の FISH と MMS 上における複製領域(BrdU)をそれぞれ緑と赤で蛍光検出した。bar:50kb

ックスの可視化にはラミンなどの構成成分を免疫蛍光介しなかったが他にも、転写中あるいは直後の RNA染色で検出している。この核マトリックス標本に対しやそのプロセシングを観察できる RNA/DNA FISH、テてコスミドや BAC クローンをプローブとして通常のロメアの鎖特異的に検出する CO-FISH や ReDFISH、FISH をしてもまず検出できない。一方、クロマチン

RNA、DNA、タンパクを同時検出する系などは核ダイ

DNA には 5-200kb 程度の頻度で核マトリックス結合領ナミクスの解析に今後も有効な手段であることは変わ

域 MAR (Matrix Attachment Region)が存在し、また転写りないであろう。また、DNA ファイバーではなくクロや複製は核マトリックスを介して行われることが示さ

マチンファイバー上でタンパク間相互作用やヒストンれているので、特に転写している遺伝子領域の少なく修飾、さらには DNA FISH との併用を試みてみるのもとも一部は核マトリックスに含まれるはずである。こおもしろい。一方、浸透性のよいプローブとして使えのわずかな DNA を検出するのに TSA (Tyramide Signal

るペプチド核酸(PNA)の合成も注文できるようになり、

Amplification Biotin system, ヒストン脱アセチル化阻

さらに次世代の核酸として LNA(locked NA)が注目を害剤トリコスタチン A と混同しないで)を用いること浴びている。これについては次の機会に検討結果を示ができる。TSA の原理は、ビオチン化チラミドをしたい。原理的に退色しない微粒子による蛍光

Peroxidase (HRP)、過酸化水素でラジカル化して検出しQuantum dot など、プローブ側、蛍光試薬側の開発改良

たいプローブ付近に結合させビオチン量を増やしてシも進んで、今後さらに一般化して選択肢が増えることグナルを増幅するというもので、FISH でビオチン化になろう。

DNA プローブのハイブリダイゼーション後、ストレプ

さて、当研究室には時々技術習得目的の訪問者があトアビジン-HRP を結合させ、続いてビオチン化チラる。持ち帰られて、やってみたがうまく行かないと聞ミド、過酸化水素を加えて HRP 近傍にあるチラミドのくことがある。実はうまく行っているのであるが顕微みラジカル化して付近のタンパク等に結合させる、こ鏡が整備されていないために見えていないのである。

れを蛍光標識ストレプトアビジンで検出する。この方

ランプ交換やフィルター類のチェックなど顕微鏡の整法によれば、数百ベース程度の長さの DNA でも検出備が最も重要であることを最後に強調しておきたい。

でき、複数カラーにも対応できキットとなっている。
留意点は、洗浄等でバックグラウンドを低くする努力

参考文献をすることで、古くなったキットの使用でうまく行か(1)

目で見る複製・転写のダイナミクス

化学と生物, 41(9), 511-517 (2003)

ないという原因が最も多い。TSA は開発当初から核内転写部位の検出にも利用され、我々はそれほど検討し

奥村克純

(2)

杉村和人、齋藤辰朗、奥村克純

DNA ファイバたわけではないが、種々の高感度蛍光検出法として有ーFISH、核内 RNA/DNA の三次元 FISH効であろう。

チン・染色体実験プロトコール (押村光雄、平岡泰、編)

最後に
今回は DNA ファイバー上の複製フォークや FISH 検
出を中心にポイントと留意点を紹介した。ここでは紹(3)

実験医学別冊

奥村克純
イナミクス

クロマ

羊土社 (2004)

核内クロマチン構造と複製・転写のダ
生化学, 77(3), 191-199 (2005)