博 士 （ 医学 ） 中 島 款 冬
学 位 論 文 題 名サ イトメガロウイルスに対する完全 ヒト型モ ノクロー ナル抗 体の作製 と性状解析
学 位論文内容の要旨【 背景と目的】 サイトヌガ口ウイルス(CMV)はヒトに広く侵淫しているウイルスであり、胎 児の先天性感染による死産や中枢神経系障害および免疫不全宿主での感染症（問質性肺炎 、肝炎、胃炎）が問題となっている。CM
V高力価免疫グ口ブリンは先天性感染の予防や移 植患者におけるCMV感染症の 予防に効果があることが報告されており、抗体はCM
V感染症 の治療に有効と考えられる。しかし、CMV高力価免疫グ口ブリンは安定的な確保の点で問 題 があ り、 C
MV感染症の治療薬としてモノク口ーナ ル抗体の開発が期待されている。
抗体医薬開発は1990年代から盛んになり、この20年間で 大きく発展した。当初はマウス 抗体やキヌラ抗体の開発が主流であり、アナフィラキシーショックなどの問題があったが 、現在ではヒト化抗体、完全ヒト型抗体の開発が主流となっている。完全ヒト型抗体作製 法 のー つに E
pstein―Ba
rr
ウイルス(EBV)法がある。この方法はEB
VがヒトのB1」ンバ球 をトランスフオームし無限増殖させる活性を利用し、増殖したBリンパ球から目的の抗体 を産生する細胞を分離するものである。EBVによる抗体作製法は30年以上前からある技術 であるが、目的の抗体を産生する細胞クローンを分離するのは技術的に難しく、成功例は 少ない。
本研究では、CMV感染症の新たな治療薬となりうる抗体の開発を目的として、EBV法によるCMV
抗体の作製を行った。
【 材料と方法】CMV
抗体の作製 ：CMV
エンベロープタンバク 質の中和抗体結合領域を組換え タンパク質として調製し、CMV抗原とした。CMV
抗体のスクルーニングはCM
V
抗原を使用し たE
LISAで行った。CMV抗体産生細胞獲得のため、CMV
抗体価の高いポランテイアの血液
か らBリンバ球を分離し、EBVを感染した。EBVによルトランスフオームしたBリンバ球（リン バ芽球様細胞：LCL)は培養とスクリーニングを繰り返し、最終的に限界希釈培養によりCMV抗体 産生 LC
Lを 分離 した 。CMV抗体 は抗 体産生L
CLの培養上清からprotein
Aカラムを使 用して精製した。
CMV
抗体の性状解析：CMV抗原に対する結合性、アイソタイプ、ウイルス粒子への結合性はELISAで確認した。ウイルス 抗原との反応性はC
MV
感染細 胞を使用したウェスタンブ口ッ トにより確認した。中和活性評価はプラークアッセイもしくは免疫染色により行った。
工 ピトープマッピングはCMV
抗 原の一部を欠失させた抗原を用いウェスタンブ口ットにより 行った。アフイニテイー解析はSPR法により行った。
抗体遺伝子ク口ーニングと発現：抗体産生LC
Lから抗体重鎖および軽鎖遺伝子をクローニ ン グ し 、 CHO― Kl細 胞 に 導 入 し て 抗 体 安 定 発 現 株 を 作 製 し た 。
抗体の糖鎖解析と修飾：抗体定常領域に結合するN型糖鎖の構造解析は株式会社グライエ ンスに外注した。抗体産生LC
Lからク口ーニングしたロ1．4ーgalactosyltransferase（B―208−

1，4GT)遺伝子はCHO―Kl細胞の抗体安定発現株に導入した。
【結果】本研究におしゝて、CMV抗体のスクリーニングにはCM
Vエンベ口ープタンバク質
glyco
proteinB(gB：gp58お よび gp116)と glycop
roteinH(gH:gp86)の中 和抗 体結 合領域を 抗原 として使用した。20回の試行からCM
V抗体産生L
CLを3つ獲得し、その中で安定した 抗体 産生が認められた1つ のLCLが産生する抗体(G3D)について性状解析を行った。
G3DはCMVのgB (gp58)に 対す る補 体依存性の中和抗体であ り、IC50は1．2u
g/ml、アフイニテイーは1． 7x10‑10（M）と高い値を示し、医薬候補として十分な活性を示した。G3Dの結合領域はCMV gB (gp58)のAnt
ig
en
ic Domainl(AD1）に含まれる50のアミノ酸からなる領域であった。
ついで、大量生産を目的として、G3D抗体産生L
CLか ら抗体遺伝子をクローニングし、
CHO―Kl細胞に導入した。しかし、CHOーKl細胞由来抗体(
G3D―CHO)はLCL由来抗体(G3DーLCL)と比較して、中和活性が1/40に低下した。この中和活 性の違いの原因は抗体定常領域に結合するN型糖鎖の構造に あると考え、G
3D―LCLおよびG
3DーCHOの糖鎖解析を行った。その結果、G
3D−CHOではN型 糖鎖が短く、末端にガラクトースが付加されているものが少なかった。G3DーCHOのN型糖鎖末端構造をG
3D一LCL型にするため、CHO―Kl細胞の抗体安定発現株に糖鎖修飾酵素であるロ1，4GT遺伝子を導入した。その結果、CHO−Kl細胞由来糖鎖修飾抗体(
G3D―CHO+Gal）のN型糖鎖末端にはG
3D―LC
Lと同等のレベルにまでガラクトースが付加され、中和活性もG
3D
一LCLと同等のレベルにまで回復した。
【考 察】 本研究で獲得したCMVのgB (gp58)に対する中和モ ノクローナル抗体はCMV
高力
価 免 疫 グ ロ プ リ ン よ り も 優 れ た CMV感 染 症 治 療 薬 と し て 期 待 で き る 。
本研究で、CHOーKl細胞 で産生されたC
MV抗体の補体依存性の中和活性はL
C
L由来抗体の1/40にま で低 下し た。 抗体 定常 領域 に結 合す るN型 糖鎖 末端 からガラクトースを除去
す る と補 体活 性化 カス ケー ドの 第1成 分で ある Clqと抗 体 の親 和性 が低 下し 、補 体依存 性 細 胞 障 害 活 性 (CDC活 性 ） が 低下 する との 報告 があ る。 本研 究で もCMV抗体 の補体依 存性 の中 和活 性に 対す る糖 鎖の 影響を検討し、この糖鎖のガラクトース末端構造が重 要な 要素であることが明らかとなった。CH
O細胞は抗体の生産に広く使用されているが、本研究の結果から、CHO細胞では産生される抗体の定常領域に結合するN型糖鎖は短く、末端にガラクトースが付加されないため、補体依存性の中和活性の高い抗体は作製できないことが明らかとなった。しかし、C
H
O細胞に糖鎖修飾酵素（ロ1，4GT)を発現させることにより、この糖鎖末端にガラクトースを付加することが可能であり、CHO細胞による 補 体 依 存 性 の 中 和 活 性 の 高 い 抗 体 の 生 産 法 と な り う る こ とが 明ら かと なっ た。
ヒトの血液リンパ球から作製する抗体はナチュラルな免疫応答と親和性成熟の過程を経ているため高いアフイニテイーを有するものが得られる。E
B
V法はヒトの血液リンバ球をソースとして、活性の高い完全ヒト型モノクローナル抗体を作製することのできる優れた技 術 で あ り 今 後 の抗 体 医 薬 開 発 に お い て 中 心 的 な 技 術 の ー つ に な る だ ろ う【結 論】 本研 究に おい て、 EB
V法 によ りCMVの gB (gp58)に対 する補体依存性の中和活性を有する完全ヒト型モノク口ーナル抗体を作製した。作製した抗体の中和活性は高く、医薬候補として有望な抗体であった。しかし、C
H
O細胞で産生した抗体の補体依存性の中和活性は著しく低下していた。また、CHO細胞が産生した抗体には定常領域に結合するN型糖鎖末端にガラクトースが付加されていないことが明らかとなった。そこで、抗体を産生するCHO細胞に糖鎖修飾 酵素（ロ1，4GT)を発現させたところ、抗体定常領域のN型糖鎖末端にガラクトースが付加され、補体依存性の中和活性が回復することが明らかとなった。
EBV法は活性の高い完全ヒ ト型モノク口ーナル抗体を作製することのできる優れた技術であることが明らかとなった。
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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 高 田 賢 藏
副 査 教 授 今 村 雅 寛
副 査 教 授 有 賀
正学 位 論 文 題 名サイトメガロウイルスに対する完全ヒト型モノクローナル抗体の作製と性状解析
ヒトに広く侵淫しているサイトメガロウイルス(
CM¥
Oの臨床における問題には胎児の先天性感染や免疫不全宿主での感染症がある。CM
V
感染症の治療には抗ウイルス薬ガンシク口ピルが使用されているが、骨髄抑制の副作用などから使用できない場合も多い。また、C
M
V
高力価免疫グ口プリンもCM
V
感染症の予防や治療に使用されるが、供給やカ価の点で問題がある。近年、抗体医薬が次々と医薬品として認可されている。C
M
V感染症の治療薬としても、副作用が少なく、高いカ価をもったモノクローナル抗体医薬の開発が期待されることから、
本 論 文 は CMV感 染 症 の 新 た な 治 療 薬 と な り う る CMV抗 体 の 開 発 を 目 的 と し た 。
抗 体開発は 完全ヒ ト型モノ ク口ー ナル抗体 作製法 の1つ であるE
psteinーBarr
ウイルス(EBV)法で行 った。 この方法 はEB
Vがヒトの Bリン パ球を 無限増殖 させる 活性を利 用し、増 殖したBリン パ球(Lymphoblastoid cell line．LCL)
か ら目的抗体産生細胞を分離するものである。申請者はさらに抗体作製効率化のため、抗体遺伝子をクローニングし、他のホスト細胞で抗体産生させる系の開発も目指した。
申 請者はCMV
抗体 を3つ 作製し 、その中 の1つ の抗体 (G3D)について性状解析を行った。
G3DはCMVのグ リ コ プ口 テ インBのgp58に結 合し、 補体依存 性の中 和抗体で あった。 G3Dの中和活性はIC50=1.
2
ルg/ml、アフイニテイーは1．7X
10―loMといずれも高い値を示した。
ま たエピトープマッピングを行い、G3Dのgp58における結合領域を特定した。さらに、G3Dの 抗体遺伝子をクローニングし、抗体産生に適しているとされるCHO細胞やNSO細胞における抗体産生系を開発した。
し かし、CHO細胞 で産生さ れたG3Dは中和活性が非常に低いことが判明した。G3Dが補体依存性の中和抗体であることから、活性低下の原因として抗体定常領域に結合する糖鎖に着目した。抗体定常領域の糖鎖は抗体のエフェクター機能に影響を及ぼすもので、補体活性化にも関与しており、複合体糖鎖の非還元末端のガラクトース(Gal）が重要である。次いで、糖 鎖解析を 行い、 LCL
産生 G
3Dで は2つ の非還元 末端に Galが付加されたG2構造糖鎖が80％以 上を占め ている 一方、CHO産生 G
3Dの糖鎖にはGalがほとんど付加されていないことを明ら かにした。この結果から、抗体糖鎖のGal末端がG3Dの中和活性に影響を及ぽしている可能 性が示唆 された 。その検 証のため、CHO産生G3Dの糖鎖へのGal付加による中和活性の回復を試みた。複合体糖鎖へのGal
付加に関わる酵素ロ1，4―ガラクトシルトランスフェラーゼ（ ロ1，4GT)遺伝子をG3D産生CHOに導入、発現させた結果、G3Dの糖鎖のG2構造は70％以上と なった。 このGalを付加 したCH
O産生G3Dの中和 活性は 2．5ルg/mlと なり、LCL産生 G3Dと同等のレベルにまで中和活性の回復が認められた。
申請者は、EBV法により、Kdl0−10（M）レベルのアフイニテイーの高い抗体を作製した。
― 210ーこの結果を踏まえ、ヒトBリンパ球の抗体ソースとしての利点からEBV法について考察した。
抗体作製の手法には大きく分けてハイブリドーマ法とEBV法がある。ハイブリドーマ法ではマウスの脾臓リンパ球を抗体ソースとして使用している。これは、過剰な抗原でマウスを免疫することで、短期間に誘導、活性化された抗体産生細胞であり、産生する抗体のアフイニ
テ イーは低 く、高く ともKdl0―9(M)レベル である。一方、EBV法が使用するヒトBリンバ球は自然免疫すなわち少ない抗原による活性化を長期間、繰り返し受け、アフイニテイー成熟過程を経ており、産生する抗体のアフイニテイーはKdlO‑lo〜lO‑lt(M)レベルに達する。
このことから、ヒトBリンバ球を抗体ソースとして使用するEB
V法はアフイニテイーの高い抗体を作製する手法として優れていると結諭した。
さらに、補体依存性活性を有するG3DをCH
O細胞で産生すると、著しく活性が低下すること を発見し 、原因は C
HO産生G
3Dの糖鎖にGalが付加されていないためであることを明らかにした。この結果から、CHO細胞は抗体生産に汎用されているが、補体依存性活性を有する抗体の生産には不向きであると結論した。また、解決策の1っとして、ロ1，4GTをCHO細胞に発現させる方法を提案した。
主査から紹介があった後、申請者はスライドを用いながら約20分に渡って学位論文ないようの発表を行った。その後、副査の有賀教授から中和活性と補体依存性の関連、抗体のClq結合性 が糖鎖構 造によ り異なる ことを 確認したか、LC
L抗体からガラクトースを除くと補体依存性の中和活性が低下することを確認したかの質問があった。次いで、副査の今村
教 授からCHO細胞で 産生さ せた抗体 の中和 活性が低 下した 原因とし て糖鎖に着目した理由、ガラクトース以外の糖鎖が補体依存性中和活性に影響を与える可能性があるのか、生体内でも糖鎖構造の違いが中和活性に重要と考えられるかの質問があった。最後に、主査の高田教授から、今回の観察はウイルスの中和活性に関するものであったが、糖鎖のガラクトース構造は抗体の癌細胞に対する補体依存性細胞障害活性におしゝても重要と考えられるかの質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は自身の実験結果やこれまでの文献を参考に適切な回答を行った。
こ の論文は 、医薬 品として有望なCMV抗体を開発し、さらにその性状解析から抗体定常領域の糖鎖へのガラクトース付加が補体依存性抗体活性に重要であることを明らかにしたことで高く評価され、今後の補体依存性抗体開発にも大きく貢献することが期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者が 博 士 （医 学 ） の学 位 を 受け る の に充 分 な 資格 を 有 す るも のと判 定した。

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