博士（医学）内山也寸志
学位論文題名AntiーIL―6receptorantibodyincreasesbloodI
L一6levelv
iatheblockadeofI
L―6clearance・
but not via the induction of IL− 6production（ 抗 IL− 6レ セ プ タ ー 抗 体 投 与 後 の 血 中 IL− 6濃 度 の 上 昇 はIL− 6産 生 誘 導 で は な く IL− 6の ク リ ア ラ ン ス 阻 害 を 介 す る ）学 位論文内容の要旨【背景と目的】IL‑6は免疫バランスの制御に関わるキーとなるサイトカインであり、様々な免疫細胞の分化、活性化過程において重要な役割を果たしてぃ、る。IL‑6レセプターには、膜結合型と可溶型の2種類が存在するが、ともにIL‑6と結合後、細 胞膜に存在するgp130分子と複 合体を形成し、IL‑6のシグナルを伝達する。トシリズマ ブは、可溶型およぴ膜結合型の両方のIL‑6レセプターに結 合してI
L‑6のシグナルを特異的に阻害するヒ
ト化抗I
Lー6レ セプター抗体であり、関節リウマチ、クローン病などのIL‑6産生が亢進している疾患に対する有効性が確認されている。一般に、生体の可溶性蛋白抗原を標的とした抗体製剤では、投与後に抗原と抗体の複合体が形成されるために、対応抗原のクリアランスが遅延し、抗原の血中濃度が増加することが報告されている。しかし、トシリズマブ
投与後においては、可溶型IL‑6レセプター のみならず、IL‑6の血中濃度の上昇が観察される。このI
L‑6濃度の上昇機序の詳細は不 明であるが、IL‑6のシグナル伝達が阻害されるために代償性にIL‑6産生が誘導される可能性、血中に大量に存在するIL‑6/可溶型I
L‑6レセプターの複合体からIL‑6が遊離する可能性あるいは血中からのILー6のクリアランスが阻害される可能性が考えられる。本研究では、抗IL‑6レセプター抗体投与後の血中IL‑6濃度の上昇機序を明らかにするために、これらの3つの可能性について、サルコラーゲン関節炎モデルおよびヒトIL‑6を持続注入し たI
L‑6遺伝子欠損マウスを用いて検討した。
【材料と方法】1）サルコラーゲン関節炎モデルを用いた解析：サルコラーゲン関節炎はカ ニク イザ ルに ウシ n型 コ ラー ゲン を3週間 間隔 で2回免疫し誘導した。関節炎発症後に トシ リズ マブ 30 mg
俶 gある いは PB
Sを 静脈 内投 与し 、投 与後 1、3およ び7日目に血中 のIL‐6濃度 、可 溶型 IL‐6レセ プタ ー濃 度お よびCRP濃度を測定した。投与後1、3
お よぴ 7日 目に 肝臓 、脾 臓 、リ ンパ 節、 血液 細胞お よび滑膜を採取しtotalRNAを抽出し た 後 、 リ ア ル タ イ ムPCR
法 で各 組織 中の IL・6およ ぴILー6レ セプ ター のmRNAの発現 量を 測定 した 。ま た、関節炎サル血漿にトシリズ マブ200
pg／mLを添加し、室 温で1時間放置後のIL‐6濃度を測定し、処置前後の値を比較することによって、IL一6／可溶型IL―6レセプターの複合体に及ぼす影響を検討した。2）ヒトI
L．6持続注入I
L．6
遺伝子欠 損マ ウス を用 いた 解析 ：IL．6遺 伝子 欠損 C57B
L／6マウスの背部皮下にmZetミニ浸透圧ポンプを移植し、ヒトIL．6を持続注入（31g／日）したマウスモデルを作製した。本モデルは、ヒトIL‐6の血中濃度が一定量に保たれ、かつ内因性IL16産生が認められない特徴を有する。ヒトILー6はマウスIL．6レセプターに結合しIL‐6シグナルを伝達できることが確認されていること から、本マウスに抗マウスIL．6レセプター抗体を投与し、血中のヒトIL‑6濃度の推移を経時的に測定することにより血中からのIL‑6のクリアランスに 及 ば す 影 響 の 評 価 が 可 能 と な る 。 な お 、 対 照 群 に は PBSを 投 与 し た 。
【結果】1）血中のIL‑6濃度と可溶型I
L‑6レセプター濃度に及ばす影響゛（サル関節炎）：
ト シリズマブ 投与群では、投与後1、3船よび7日目のいずれの時期においても血中IL‑6濃 度およぴ可 溶型I
L‑
6レセプターの上昇が認められた。一方、炎症マ ーカーの血中CRP濃度はトシ リズマブ投与群の全例で低下した。また、トシリズマブ投与群では関節腫脹の減 少が 観察 され た。 2） IL‑6 mR
NAおよ ぴ可 溶型 IL‑
6レ セプターm
RNAの発現量に及ばす影響（サ ル関節炎）：肝臓、脾臓、リンパ節、全血液細胞および滑膜のいずれの組織においてもト シリズマプ投与によるIL‑6mm弧の発現量の増加は認められなかった。I
L・6レ セプ ター mR
NAにお い ても 発現 の増 加は 観察 され なか った 。3） 血中 のIむ6/可 溶型
IL・6レセプター複合体に及ばす影響（サル関節炎）：関節炎サル血漿にトシリズマブ200pg／mLを添 加し、室温で1時間処理した が、処置前後でIL・6濃度の変化は認められなかった。4）血中からIL一6のクリアランスに及ばす影響（ヒトIL‐6持続注入マウスモデル）：
ヒトIL 6を持続注入したILー6遺伝子欠損マウスでは、抗マウスIL．6レセプター抗体投与後にIL‐6の血中濃度の上昇が認めら れた。一方、PBS投与群では変化は認められなかった。
【考察】一般に、血中半減期が短い生体の可溶性蛋白抗原を標的とした抗体の場合、投与後に抗原と抗体の複合体が形成され、対応抗原のクリアランるが遅延するために、抗原の血中濃度が増加することが報告されている。今回の サル関節炎モデルでは、IL‑6レセプ
ターのmDRNAの増加は認められていない ことから、トシリズマブにおいても、他の抗体と同様の機序を介して、可溶型IL‑6レセプターの血 中濃度の増加が観察されると考えられた。一方、トシリズマブにおいては、可溶型IL‑6レセプターのみならず、IL‑6の血中濃度の増加が観察される。その機序として、まず、 IL‑6のシグナル伝達が阻害されるために代償性にI
L‑6産生が誘導される可能性が考えら れた。しかし、関節炎サルを用いた検討 では 、い ずれ のIL‑6産 生組 織に おい ても ト シリ ズマブ投与に よるI
L‑6 mR
NAの発現誘導は認められていないことから、この可能性は否定的である。また、関節炎サル血漿を用いた検討より、血中に大量に存在するIL‑6/可溶型I
L‑6レセプターの複合体からI
L‑6を遊 離さ せる 可能 性も 否定 された。一 方、ヒトI
L‑6持続注入I
L‑6遺伝子欠損マウスにおい て、 抗IL‑6レ セプ ター 抗体の投与 後にI
L‑6の血中濃度の上昇が認められたことから、I
L‑6上昇の主因は、血中のIL‑6のクリアランスの遅延であることが強く示唆された。
クリアランスの遅延の機序は、IL‑6レセプターに抗 I
L‑6レセプター抗体が結合することにより、IL‑6の利用率が低下し、血中にIL‑6が蓄積 されるためと考えられる。また、今回の サル コラ ーゲ ン関 節炎 モデルでの 結果から、このように血中のIL‑6と可溶型IL‑6レセプターが増加している状態においても、トシリ ズマブは強カにI
L‑6活性を阻害し、CRPを低下させ、関節腫脹を減少させて いることが確認された。臨床においても同様と考えられる。
【結論】抗IL‑6レセプ ター抗体投与後の血中I
L‑6濃度の上昇は、IL‑6産生誘導あるいはIL‑6/可溶型I
L‑6レセプター複合体からのIし‑6の遊離によるものではなく、I
L‑6のクリアランス阻害を介する と考えられた。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 岩 永 敏 彦
副 査 教 授 秋 田 弘 俊
副 査 教 授 西 村 孝 司

学位 論文題 名Anti一 工 L― 6receptor antibody increases blood工 L― 6level via
the blockade of IL― 6clearance・
but not via the induction of IL― 6production（抗IL―6レセプター抗体投与後の血中IL―6濃度の上昇はIL一6産生誘導ではなくIL−6のクリアランス阻害を介する）

本研究では、抗IL―6レセプター抗体投与後の血中ILー6濃度の上昇機序を明らかにするために、サルコラーゲン関節炎モデルおよぴヒトエL−6を持続注入したI
L―6遺伝子欠損マウスを用いて検討した。その結果、サル関節炎モデルにおいて、抗ILー6レセプター抗体投与群
では、血中エL―6濃度およぴ可溶型I
L―6レセプターの上昇が認められた。一方、炎症マーカーの血中CRP濃度は抗I
L―6レセプ ター抗体投与群の全例で低下するとともに、関節腫脹の減少が観察された。ここで肝臓、 脾臓、リンパ節、全血液細胞および滑膜組織における抗I
L―6レセプター抗体投与後のIL―6mRNAレベルを解析した結果、IL―6およびI
Lー6レセプターm
RNAの発現量の増加は認められなかった。さらに関節炎サル血漿に抗I
Lー6レセプター抗体200ng/mLを添加し、室温で1時間処理したが、処置前後で血漿中のIL−6濃度の変化は認められなかった。最後に、ヒトIL―6持続注入マウスモデルを構築して、血中からIL―6のクリアランスに及ぼす影響について検討したところ、ヒトエL―6を持続注入したI
L‑6遺伝子欠損マウスでは、抗マウスI
Lー6レセプター抗体投与後にIL―6の血中濃度の上昇が認められた。
以上の結果により抗I
L―6レセプター抗体投与後の血中I
L―6濃度の上昇は、IL―6産生誘導あるいはIL―6/可溶型IL―6レセプター複合体からのIL―6の遊離によるものではなく、IL―6のクリアランス阻害を介することが示唆された。
学位論文発表後、主査の岩永敏彦教授から、抗ILー6レセプター抗体の生体内投与による血中IL―6レベルの上昇機構解明の作業仮説について質問があった。この点に関して、実際に抗IL‑6レセプター抗体の生体内投与により炎症が軽減される事から、まずはじめにI
L―6のmRNAレベルによる新たな発現増強の可能性は低い事を予測し、次いで抗IL―6レセプター抗体とIL―6免疫複合体からの乖離、さらにIL‑6の生体内におけるクリアランスの遅延によってIL―6レベルの上昇がおこる事を想定し、本研究においてこれらの仮説についてサルあるいはマウスモデルを用いて証明するに至ったことを回答した。また、実際の生体内での抗IL一6レセプター抗体の結合様式に関する質問があった。これに対して、IL−6と可溶性あるいは膜結合型IL―6レセプターとの結合様式、さらに可溶性gp130分子を含む結合様式が存在する事を回答した。
次に副査の秋田弘俊教授から、本研究で示された各種臓器以外の組織における抗I
L一6レセプター抗体投与後のIL−6のmRNA発現レベルの増減についての質問があった。この点に対ー 13ーして、今回示された組織以外ではILー6のmRNAレベルの確認してはいないが、本研究ではILー6の産生が知られている代表的な組織において検討した旨を述べた。また、IL−6の生体内からの排除機構に関する質問があった。この点に関して、蛋白分解酵素による分解と尿からの排出機構がある旨を回答した。さらに抗I
L―6レセプター抗体投与後に生ずるI
L―6レベルの上昇により、何らかの副作用が生体内において発生する可能性にっいて質問があった。
この点に関して、これまで抗エL−6レセプター投与による重篤な副作用は報告されていなぃ
事、また抗IL−6レセプター抗体により増加したI
L―6の生物学的活性もまた、抗I
L−6レセプター抗体により中和されており、副作用は極めて少ないものと考察できると回答した。
また、副査である西村孝司教授から、抗IL−6レセプター抗体を用いた臨床応用について、今後の展望についての質問があった。これに対して、実際にヒト自己免疫疾患に対しての抗I
Lー6レセプター抗体が臨床応用され、それらの疾患の軽減効果が示されていることを例に挙げ、特に関節リューマチ患者では一過性にI
L―6レベルの上昇は認められるものの、病態の軽減によりIL一6レベルが減少する事から、今後、自己免疫疾患の改善効果のみならず、
抗 IL― 6レ セ プ タ ー 抗 体 を 用 い た 治 療 後 の 離 脱 も 期 待 で き る と の 見 解 を 述 べ た 。
この論文は、生体モデルによる抗I
Lー6レセプター抗体投与後の血中IL―6濃度の上昇メカニズムが、IL−6産生誘導あるいはIL
一6／可溶型I
L−6レセプター複合体からのIL−6の遊離によるものではなく、ILー6のクリアランス阻害を介することを証明した点で高く評価され、今後、抗ILー6レセプター抗体投与によるヒト自己免疫疾患の改善を目指した新規治療法の開発に貢献することが期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、これまでの研究活動における研鑽なども併せ
申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た。

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