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THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―4253（ 39 ）住木・梅澤記念賞受賞講演会記録
2013 年 10 月 3 日，学士会館 320 号室【2013 年度受賞講演，座長：中田雅也】

微生物二次代謝産物生合成の精密解析
江口正（東京工業大学大学院理工学研究科物質科学専攻）

天然由来の低分子有機化合物，いわゆる天然有ら，現在でもなおゲノム DNA 配列からだけでは機化合物は，医薬・農薬・香料等として人類の繁遺伝子機能の予測が困難であることは多く，生合栄に大きく貢献してきた。その中でも，微生物や成遺伝子が解読されても，そのコードするタンパ

植物の二次代謝による産物は，構造の多様性に富ク質が触媒する反応場は未解明な部分が多々あんでいるがゆえに様々な生理活性を示すものも多り，天然有機化合物の生合成反応から学ぶべき化

く，抗生物質，抗がん剤，酵素阻害物質などとし学はまだまだ多い 1）。すなわち，ゲノム万能ともて利用されている。

見える今の生命科学の流れの中で，セントラルド

現在では，多くの生物種のゲノム DNA 配列のグマの下流に位置する酵素タンパク質とその酵素解読が達成され，ポストゲノム研究が盛んに行わが担う触媒反応との対応づけに明確な指針がないれるようになり，プロテオーム等の網羅的解析が状況である。

行われる一方で，遺伝子やタンパク質の本質的な我々は，この様な状況の下，微生物二次代謝産機能解明は困難なことも多い。このことは裏を返物生合成を化学的な精密さを持って解析すること

すと，自然界にはまだ多くの未知の反応場が隠さを目指し，先端的解析法を駆使して種々の二次代れていることを意味し，化学と生物にまたがる研謝系を有機化学的に追究し，特徴ある抗生物質の究領域は，学術的にも産業的にも重要性を益々増

生合成酵素及び生合成遺伝子を世界に先駆けて解している。二次代謝産物生産に関わる自然界にお明するなど分子生物学的視点からの研究を展開しける反応場，すなわち生合成は，一般に複雑で多た。本稿では，紙面の都合上その中でもアミノグ段階に渡る酵素反応により行われている。現在でリコシド系抗生物質，特にブチロシンおよびネオは，遺伝子組換え技術の発展に伴い，二次代謝産マイシンの生合成に於ける興味ある酵素反応に着物の生合成研究に於いても遺伝子レベルの研究が目した反応解析について紹介する。

盛んに行われ，代表的な抗生物質に関しては解析しつくされたといえる状況になった。しかしなが［Proceedings］ TADASHI EGUCHI: Mechanistic enzymology of biosynthetic enzymes for microbial
secondary metabolites.

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トレプタミン（DOS）をアグリコンとするもので，

1. アミノグリコシド系抗生物質

ネオマイシン，カナマイシン，ゲンタマイシン，リボスタマイシン，ブチロシン等々多くの抗生物

アミノグリコシド系抗生物質とはアミノサイク質が知られている（図 1）。

リトールをアグリコンとするオリゴ配糖体であ

我々は，DOS の炭素環形成反応を触媒する 2-る。その多くが細菌のリボソームへの結合によるデオキシ-scyllo-イノソース合成酵素の単離と遺タンパク質合成阻害を作用機序としており，真核伝子クローニングを機に Bacillus circulans 由来ブ

生物のタンパク質合成系には作用しないことからチロシン生合成遺伝子クラスターと Streptomyces有意な選択毒性を示す。

fradiae 由 来 ネ オ マ イ シ ン 生 合 成 遺 伝 子 ク ラ ス

アミノグリコシド系抗生物質は，そのアグリコターを特定した 3〜5）。その後，諸外国の研究グンの構造から大きく 2 種に分類される 2）。1 つはループも類似 DOS 含有型アミノグリコシド系抗myo-イノシトールを前駆体として生合成される生物質遺伝子クラスターを特定し，現在では 10

炭素 6 員環アグリコンを有し，ストレプトマイシ以上の遺伝子クラスターが公共データベースに登ンを代表とする環炭素すべてにヘテロ原子が結合録されている 6）。

している一群である。もう一群は，ヘテロ原子が我々は，共通に見出される化学構造と生合成遺結合しない炭素を含む 6 員環化合物 2-デオキシス

伝子との比較から翻訳産物の酵素機能を推定し，図 1. アミノグリコシド系抗生物質の構造Aug. 2014

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255（ 41 ）組換えタンパク質を用いた酵素反応解析を進めてと変換する。本酵素は，酸化，リン酸基の脱離，還きたおり，これまでに，我々と英国のグループに元，開環，アルドール型反応といった多段階反応よる研究から，グルコース-6-リン酸からブチロシを単一酵素で触媒している。このような反応を行ン及びネオマイシンへと至る全ての生合成酵素機

う酵素としては，芳香族アミノ酸生合成経路中の7）。以能が酵素反応レベルで解明されている（図 2）デヒドロキナ酸合成酵素（DHQ 合成酵素）が知ら下に興味ある酵素反応に着目した反応解析についれており，DOI 合成酵素は，デヒドロキナ酸合成て述べる。

酵素と相同性を持つことが知られているが，厳密な反応機構は異なることが明らかにされている 8,9）。

1.1 2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素 BtrC

我々は B. circulans 由来の本酵素（BtrC）の阻害

2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素（DOI 合剤との共結晶化に成功し，原子レベルでの基質認成酵素）は，DOS 含有型アミノグリコシド系抗生

識機構，触媒機構を解明することに成功した 10）。

物質生合成の初発反応を触媒する酵素であり，グ

BtrC は，ダイマー構造を有し，活性に必須なコバルコース-6-リン酸を基質とし，直接炭素六員環へルトイオンを中心とした N 末端ドメインと C 末端

図 2. ブチロシンとネオマイシンの生合成経路と関与する生合成酵素

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ドメインから構成されていた。前者は NAD＋結合る。その後の開環反応では，アノマー位を認識す

ド メ イ ン 特 有 の Rossmann-fold を 示 し，後 者 はる Glu 235 がプロトンを受容し，反応を促進してDHQ 合成酵素特有のĮ-へリックスから成るドメいると考えられ，舟型遷移状態を経て環化反応がインに似た構造であることが明らかになった。

進行し，2-デオキシ-scyllo-イノソースが生成す

BtrC と阻害剤であるȕ-D-カルバグルコース 6-る。最後に，水分子を介して，Lys 141 と Glu 243

リン酸および NAD＋ 補酵素との複合体の構造での間でプロトン移動が生じ，最初の状態に戻るとは，活性部位における基質周辺のアミノ酸残基が思われる。

明らかとなり，基質認識および触媒に関与するアDHQ 合成酵素（Aspergillus nidulans 由来）と構造を比較したところ，活性部位に存在するアミノミノ酸残基が明らかとなった。
これら得られた知見より，反応機構の詳細は以酸残基は非常に類似しており，違いは二つの残基下の様に考えられる（図 3）。まず，4 位水酸基ののみであった（図 4）。一つは BtrC における Glu

プロトンは，水分子を介してヒスチジン残基（His235 がアルギニン残基（Arg 264）に相当しており，250）によって引き抜かれ，基質は NAD＋によりこの残基は両者の基質が異なる部分の認識に関与酸化される。次に，Glu 243 によって，5 位プロトしていた。

ンの引き抜きが生じ，リン酸基の syn 脱離が起きもう一つは，Glu 243 であり，DHQ 合成酵素で

図 3. DOI 合成酵素の反応機構

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67―4257（ 43 ）は，アスパラギン残基（Asn 268）に相当していえられる。このリシン残基は炭素六員環形成のた。アスパラギン残基は中性残基であるため，プ際，負電荷を持つエノラート中間体と静電的相互ロトンの引き抜きは起こらず，結果として BtrC作用していると考えられており，リシン残基が酵の Lys 141 に相当するリシン残基（Lys 152）は， 素反応中にアミン型（NH2）へと変換される BtrCアンモニウム型（NH＋3 ）のまま存在していると考図 4. DOI 合成酵素と DHQ 合成酵素の活性部位の比較の場合は，このような静電的相互作用が生じないために，エノラートの最小回転で生成することができ，DHQ 合成酵素ではアルドール型環化反応が椅子型遷移状態を取るのに対し，DOI 合成酵素
では舟型遷移状態を経由しているのではないかと考えられる。このように，両酵素間で一つの残基の違いにより酵素反応中の立体化学が大きく異なるということは大変興味深い。
さらに両者の全体構造は，基本的には DHQ 合成酵素フォールドといわれる類似した構造を取っているが，基質 1 位を認識する残基を含むループ構造が異なっていた（図 5）。一般に二次代謝酵素は，一次代謝酵素から進化して生じるものと考えられており，一次代謝系にある DHQ 合成酵素と典型的な二次代謝酵素である DOI 合成酵素とのこの様なループ構造の違いがどの様に形成されてきたか，進化論的な興味も持たれる。

1.2 ラジカル SAM 脱水素酵素 BtrN
ブチロシン生合成遺伝子クラスター中にコードされる BtrN は，そのアミノ酸一次配列の相同性
図 5. DOI 合成酵素と DHQ 合成酵素の基質 1 位の認識に関わるループ構造の比較

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検索からラジカル SAM（S-アデノシル-L-メチオ67―4

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れた破壊株はブチロシン生産能を失っており，本ニン）酵素と予想された。ラジカル SAM 酵素は， 遺伝子がブチロシン生合成に関わっていることが4Fe-4S クラスターを補因子として，SAM の還元分かった。さらにǻbtrN に対して生合成中間体の的開裂によって生じる 5ƍ-デオキシアデノシルラ投与実験を行ったところ，DOS を投与した場合にジカルを用いて種々のラジカル反応を触媒する酵は 抗 生 物 質 の 生 産 が 回 復 し た が， 2-デ オ キ素の一群である。酵素間での相同性は高くないもシ-scyllo-イノサミン（DOIA）投与では抗生物質のの，一般的に N 末端側に共通の 4Fe-4S クラスの生産を確認することができなかった。このこと

ター結合モチーフである CXXXCXXC を有してはブチロシン生合成において DOIA 酸化反応にいる。これまでの研究によってこれら 3 つのシス

BtrN が関与することを示す結果である。

テイン残基が 3 つの鉄原子に直接配位し，残る鉄そこで次に BtrN が酵素として実際に酸化反応原子には SAM のカルボキシル基とアミノ基が配を触媒しているかを明らかにするために，大腸菌位していることが明らかとなっている。このこと

にて異種発現させ，その酵素活性の検出を試みから SAM の開裂の反応機構に関して以下のようた。ラジカル SAM 酵素は一般に酸素に対して極に提唱されている。すなわち，活性型クラスターめて不安定であることが知られていたので，BtrN＋は 1 価の［4Fe-4S］ で，SAM に 1 電子与えるこを発現させた大腸菌の無細胞抽出液を嫌気的に調とによって，SAM を還元的に開裂させて 5ƍ-デオ製 し，活 性 測 定 を 行 っ た。そ の 結 果， BtrN とキ シ ア デ ノ シ ル ラ ジ カ ル と L-メ チ オ ニ ン を 生

SAM，DOIA を嫌気条件下で反応させたところ，じる。この 5ƍ-デオキシアデノシルラジカルが様々DOIA からの酸化反応が進行した。以上の結果よなラジカル反応を引き起こすと考えられている

り，ブチロシン生産菌 B. circulans においてはネ

11,12）（図 6）。

オマイシン生産菌 S. fradiae とは異なり，SAM をしかし，このようなラジカル反応を触媒するとその活性に必要とする新規ラジカル SAM 脱水素

予想される酵素がどのようにブチロシン生合成に酵素 BtrN が DOIA 酸化反応を触媒していること関わるかは不明であり，非常に興味深い問題でが明らかになった。

あった。そこで我々は B. circulans の btrN 遺伝子

ラジカル SAM 酵素によるこのような水酸基の欠損型破壊株（ǻbtrN）を構築したところ，得ら酸化反応は知られていなかったので，本酵素の反図 6. ラジカル SAM 酵素のラジカル発生機構

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応機構解明に向けてさらに詳細な解析を進めた。 抜くラジカル機構で進行することが明らかになっまず，酵素反応生成物の解析を行ったところ，本た。

反応では DOIA の酸化に伴い，メチオニンと 5ƍ-デ

さ ら に EPR 測 定 や 反 応 速 度 論 の 実 験 か ら，オキシアデノシンが生成していた。そこで，反応

BtrN の反応機構は次のように考えられる（図 7）。の当量関係を明らかにするために，酵素反応生成すなわち，SAM の還元的解裂によって生じた 5ƍ-物と 5ƍ-デオキシアデノシンの生成量および SAMデオキシアデノシルラジカルが基質 3 位の水素原の消費量の時間変化を追跡した。その結果，本反子を直接引き抜くことでラジカル中間体を与え応では基質を酸化するために 1 当量の SAM が消る。この後，ラジカル中間体がケトンへと酸化さ費され，酵素反応生成物，5ƍ-デオキシアデノシンれるが，反応系中に電子受容体が存在しないことおよびメチオニンが等量生成することが明らかにから，BtrN 自身の酸化型［4Fe-4S］2＋クラスターなった。

を還元することによって反応が進行するものと思さらに基質の重水素置換体による実験の結果， われる。今回の結果は酵素反応において 5ƍ-デオキ
本反応は酵素活性部位内で生じた 5ƍ-デオキシアシアデノシルラジカルのような有機ラジカル種がデノシルラジカルがタンパク質アミノ酸側鎖など水酸基の酸化反応を引き起こすことを示すことがを介さず直接基質 3 位の水素原子を可逆的に引きできた初めての例である。また，このような反応

図 7. ラジカル SAM 脱水素酵素 BtrN の反応機構

260（ 46 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICSの存在から，嫌気的な条件下では，SAM が従来知67―4

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析を行った。

られていたようなメチル化の他に，酸素に代わるNeoN の反応は，BtrN の反応と同様に SAM を 1酸化剤としての役割を果たしていると考えられ当量必要とする化学量論反応であることが明らか

る13,14）。となった。さらに，重水で調製した緩衝液中での酵素反応解析を行い，ネオマイシン B の C-5ƍƍƍ 位1.3 ラジカル SAM 異性化酵素 NeoNに重水素が導入されることが分かった。すなわ

ネオマイシン生合成における最終段階は，ネオち，本反応で生じたラジカル中間体がシステイン

マイシン C からネオマイシン B へと至る 5ƍƍƍ 位の残基等のプロトン交換可能な水素を引き抜き反応

エピメリ化反応である。この反応は，遺伝子クラが完結することが明らかとなった。さらに酵素のスターの情報からラジカル SAM 酵素 NeoN が担変 異 実 験， ESR 解 析 等 の 実 験 か ら，次 の 様 な6）うものと考えられた 。

NeoN によるラジカル異性化反応機構を提唱でき先にも述べたように，一般にラジカル SAM 酵た。すなわち，5ƍ-デオキシアデノシルラジカルが素は酸素に非常に不安定で，酸素存在下では不活

基質 5ƍƍƍ 位の水素原子を直接引き抜くことでラジ性型であるアポ型へと変換されてしまうことが知カル中間体を与える。その後，ラジカル中間体がられている。そこで我々は，高い活性を有する精酵素内のシステイン残基によって，水素原子が供製酵素 NeoN を得るべく検討し，酵素反応機構解与され，エピメリ化反応が完結する（図 8）。生じ

図 8. ラジカル SAM エピメリ化酵素 NeoN の反応機構

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67―4261（ 47 ）たチイルラジカル種およびクラスターは，何らかことが分かった。それに加えて予想外に，アミノの還元剤により還元され最初の状態に戻るものとグリコシド系抗生物質生合成においては，共通の思われる。本例はラジカル SAM 酵素が触媒する糖部分の修飾反応は同一の酵素が二度ずつ繰り返エピメリ化反応の機構を初めて明らかにしたもの

し同じ反応を触媒していることを見出した 16,17）。

である。

本生合成経路の特徴は基質認識が寛容な酵素の反我々は，この様にラジカル SAM 酸化酵素 BtrN復利用である。一般に酵素は基質認識が厳しく，とネオマイシン C エピメリ化酵素 NeoN の 2 つのたとえ同一代謝経路中の同様の反応であっても異DOS 含有型アミノグリコシド系抗生物質生合成なる酵素が触媒することがほとんどである。それ中のラジカル SAM 酵素の機能を明らかにしてきゆえ類縁体調製への応用も困難である。様々な基た。また LIU らによりゲンタマイシン生合成にお質類縁体との反応から，その特異な基質認識機構

けるラジカル SAM 依存 C-メチル化酵素 GenK のの解析を行い，酵素がいかに反応性や特異性を失15），アミノグリコシド生合成わずに，基質一般性を広げることに成功している中のラジカル SAM 酵素の機能が明らかとなりつかということについての知見を得ることができつある。この他にも，アミノグリコシド生合成遺た。このような酵素の基質認識機構は分子認識の伝子中には，様々な C-メチル化やデオキシ化などモデルと考えられ，化学の広い分野にとって有用化学的にも興味深い反応を触媒すると考えられるな知見である。今後は基質認識の寛容なこれらのラジカル SAM 酵素が多数コードされており，な酵素を用いた類縁体調製が可能と考えられ，多様ぜ多くラジカル SAM 酵素がアミノグリコシド生な抗生物質生合成酵素を用いた抗生物質ライブラ

合成遺伝子中に含まれているのかは不明である

リーの調製への道を開いたことになり，さらなるが，今後のさらなる酵素機能解明により，その答発展と多方面への波及効果が期待される。

解析がなされておりえを導き出したいと考えている。
謝辞

2. 終わりに

本研究は東京工業大学大学院理工学研究科で行われた成果であり，工藤史貴准教授を始めとする以上のようにアミノグリコシド系抗生物質に関研究室のスタッフおよび学生諸君の努力の賜物でする研究では，我々は世界で初めてブチロシン， あり，ここに深く謝意を示したいと思います。まネオマイシンの生合成経路を遺伝子・酵素レベルた，本研究は文部科学省科学研究費，上原記念生で明らかにした。これらの生合成遺伝子クラス命科学財団の支援を受けたものであり，ここに感ター内に存在する遺伝子のアミノ酸配列相同性検謝いたします。最後に本研究のきっかけを与えて索などの生物情報学的手法に加え，類似化合物のいただいた故 柿沼勝己教授に感謝したいと思い

生合成遺伝子の比較から，各反応を触媒する酵素ます。

を予想し，発現酵素を用いて酵素活性を調べた。
その結果，ブチロシンおよびネオマイシン生合成に必要なほとんどの酵素の機能を in vitro で明らかにした。各アミノグリコシド系抗生物質の生合成について，それぞれの糖部分の修飾された構造に特化した特異な酵素遺伝子がコードされている

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