新規高感度エクソソーム検出方法の開発○青木洋一, 彼谷高敏
（コニカミノルタ株式会社）目的
近年、様々な疾患診断マーカーとして、血液等に分泌されたエクソソームまたはその構成物質を検出する方法が盛んに研究されている。これまでに報告されているエクソソーム検出方法は、生体試料を対象とした評価における分析感度性能や測定範囲性能が不十分であるため、分析感度性能を確保するために複雑なエクソソーム抽出前処理工程を必要とし、再現性など多くの分析基本課題を抱えている。今後、多様なエクソソームの機能解析や臨床応用検討を進めるためには、上記課題を解決した高感度検出方法の確立が急務であると考える。
そこで本研究では、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光（SPFS: Surface Plasmon field-enhanced Fluorescence Spectroscopy）技術を検出原理とする小型血液検査システムを用いて、高感度かつ幅広い測定範囲性能を高い再現性の下で両立した新規高感度エクソソーム検出方法を開発した。
本発表では、開発したSPFS自動免疫測定システムを用いて、システムの分析感度性能と測定範囲性能について評価した結果について報告する。

方法

＜原理＞
金属表面で増強された電場を励起エネルギーとして蛍光を検出

SPFS原理説明
受光系

受光系＜特徴＞近接場光による局所励起➡非特異反応の影響低減

蛍光標識分子2次抗体

蛍光標識分子

増強電場分布

増強電場

Exosome特異抗原

増強電場Exosome

数100nm程度

測定対象
（BM）

Exo

Exo

Exosome特異抗原
or
疾患特異抗原

数10nm以内

金属膜

1次抗体

E2(エネルギー増強度）

金属膜

サンプル量:90～135μl（血清/血漿）（系内持ち込み量:15～50μl）

Prism

結果

・血漿/血清サンプルの希釈直線性(必要希釈率の見積もり）■SPFSとELISAのエクソソーム検量線比較

希釈直線性_シグナル比 vs 希釈系列
120%
基質

Signal ( kdigit)

Exo

1次抗体

金属膜

ELISA
HRP

1000

Streptavidin
Biotin10010

ELISA_LoD

SPFS_LoD

1

Exo

抗CD63抗体
CD630.1
1.0
10.01.0×10
1.0E+00
1.0E+01
1.0E+022 1.0×10
1.0E+033 1.0×10
1.0E+044 1.0×10
1.0E+055 1.0×10
1.0E+066
Conc. (particles/μl)*《SPFS》

Signal ( kdigit)

8.3

LNCaP_PSMA陽性CD9陽性Exo

1.9×102

SKBR3_CD9陽性CD63陽性Exo

1.4×101

SKBR3_HER2陽性CD9陽性Exo

7.5×101

HCT116_CD9陽性CD63陽性Exo

4.3×101

100101Blank

濃度
CVparticles/μl （N=10)＊ナノ粒子マルチアナライザーqNano(メイワフォーシス株式会社)にて値付け

100%

CD63

CD9

Exo

CD9/CD63系_健常人プール血漿②0120%

510152025303540Dilution Ratio

2.9×10553.3×104.7×10554.5×10

96.5%

SKBR3_HER2陽性CD9陽性エクソソーム

2.6×105

2.9×105111.4%

HCT116_CD9陽性CD63陽性エクソソーム

3.6×105

3.4×105■機能解析への応用例

6.7%
2.4%

1.4×103

10.3%

4.0×103

6.8%

90.0%

1.2×103

4.7%

80.0%

1.6×104

2.5%

7.0×102

7.5%

1.3×104

4.2%

2.3×102

6.4%

1.4×104

4.6%

LoB=Averageblank+1.645SDblank
LoD=LoB+1.645SD低濃度サンプル

ダイナミックレンジ：5桁以上‼

CD980%

実測値
particles/μl
3.5×105

1.3×104※Exosomeスタンダード （各細胞培養上清由来）購入品_コスモ・バイオ株式会社

PSMAorHER260%

Dilution Factor

理論値particles/μl
3.6×105

6.7×101

10.0
1.0×10
1.0×104 1.0E+05
1.0×105 1.0×10
1.0×107 *LoDは下記の式にて算出（Blankサンプル、低濃度サンプル共にN=10測定）
1.0E+01
1.0E+022 1.0×10
1.0E+033 1.0E+04
1.0E+066 1.0E+07

Conc. (particles/μl)*

PSMA/CD9系_PSMA陽性エクソソーム in 女性プール血清
HER2/CD9系_HER2陽性エクソソーム in 健常人プール血漿①
CD9/CD63系_健常人プール血漿①20%

他は、健常人プール血漿を使用。

LNCaP_CD9陽性CD63陽性Exo

PSMA/CD9系: 9倍希釈以上
CD9/CD63系: 4.5倍希釈以上

40%

PSMA陽性エクソソーム時は、女性プール血清を使用。
LoD*
particles/μl

LNCaP由来_CD9/CD63陽性LNCaP由来_PSMA/CD9陽性
SKBR3由来_CD9/CD63陽性
SKBR3由来_HER2/CD9陽性
HCT116由来_CD9/CD63陽性

疾患特異抗原40%

SKBR3_CD9陽性CD63陽性エクソソーム

検量線

Exo

20%

LNCaP_PSMA陽性CD9陽性エクソソーム

ELISAと比較して約3000倍高感度‼

100000HER2/CD9系: 10倍希釈以上

60%

0%
0%

LNCaP_CD9陽性CD63陽性エクソソーム

・検量線、検出感度、再現性、ダイナミックレンジ

0.1
1.0
1.0E+0080%・血漿/血清サンプルへのエクソソーム添加回収試験※Exosomeスタンダード （細胞培養上清由来）購入品_コスモ・バイオ株式会社

1000

20%

《ELISA》＊ナノ粒子マルチアナライザーqNano(メイワフォーシス株式会社)にて値付け■各種細胞由来エクソソームの測定※

40%

抗CD9抗体

Blank

Prism

60%

0%

CD9Blank

Signal Ratio

SPFS

10000

Exosome特異抗原(CD63)

100%

80%

増強電場

高感度且つ高い再現性‼

回収率
97.7%
112.4%

94.4%（N=3平均)血漿/血清でも前処理なしで測定可能!!

膜タンパク由来シグナル分布

Membrane Protein-derived Signal Distribution

2次抗体

10000

100%

100000希釈直線性_シグナル×希釈率
120%

PSMA/CD9系_PSMA陽性Exo in 女性プール血清
HER2/CD9_HER2陽性Exo in 健常人プール血清
CD9/CD63系_健常人血漿①
CD9/CD63系_健常人血漿②Dilution Adjusted Signal Ratio

LNCaP細胞由来CD9陽性CD63陽性エクソソーム※

蛍光標識分子Exosome特異抗原
(CD9)

Prism

CD9

CD63

CD81

70.0%
60.0%
50.0%

ExoCD9orCD63or
CD81

40.0%
30.0%

CD920.0%
10.0%
0.0%

Particles/ul
Cell LineLNCaP_4.61E+05
LNCaP_4.61E+04
4.6×105
4.6×104
particles/μl
particles/μl
LNCaP

SKBR3_4.97E+05
SKBR3_4.97E+04
HCT116_4.71E+05
HCT116_4.71E+04
5.0×105
5.0×104
4.7×105
4.7×104
particles/μl
particles/μl
particles/μl
particles/μl
SKBR3
HCT116

各エクソソームの濃度が変わっても、膜タンパク由来のシグナル比の関係性はほぼ変わらないが、細胞腫が変わると、膜タンパク由来のシグナル比の関係性は変わる。

エクソソームの質の変化を幅広い濃度域で解析することが可能。

考察と今後の展開
ELISAの系と比較して約3000倍程度高感度であり、さらに幅広い測定範囲を持つことも確認した。また、前処理なしの自動測定であるため簡便かつ高い再現性も実現でき、解析ツールとして有用であると思われる。本システムは、エクソソームをマーカーとした診断以外にも、創薬研究などにおけるエクソソームの分泌抑制効果確認や、各膜タンパク量の増減解析、抗体医薬における薬物投与前の目的エクソソーム量の確認＆投与量の決定、注入したエクソソームの広範囲なモニタリングなどに適用可能と考えており、エクソソームの解析ツールの一つとしてエクソソーム研究開発の一助となることを期待する。
課題としては、現行の小型タイプではスループット性が低いため、大量のサンプルを測定するためのハイスループット機についても現在開発中である。