2007 NOVEMBER
No. 547

2007 年（平成 19 年）11 月号

第 53 巻 第 6 号（通巻 547 号）

挨拶・巻頭言豚繁殖・呼吸障害症候群（Porcine reproductive and respiratory
syndrome ; PRRS）ウイルスの流行は、現在では潜在化し、養豚産業において大きな問題となっている………………………………石崎良太郎（ 2 ）獣医病理学研修会
第 46 回 No.926 イヌの胃壁腫瘤……………北里大学獣医病理学研究室（ 3 ）第 46 回 No.927 イヌの精巣………………宮崎大学獣医病理学教室（ 4 ）レビュー
ドリーからスナッピーへ………………………………李柄 千（ 5 ）ミニブタ及びイヌにおける生殖工学技術の開発とモデル動物の作出………………………………島 津 美 樹（10）お知らせ
新人紹介……………………………………（12）http://nibs.lin.go.jp/

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日生研たより豚繁殖・呼吸障害症候群（Porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS）
ウイルスの流行は、現在では潜在化し、養豚産業において大きな問題となっている
石崎良太郎
我が国で PRRS が最初に確認されたのは 1993 年であった。世界では，1987 年に米国において成豚での繁殖障害，幼若豚での呼吸器症状を主徴とする疾病として初めて報告された。その後カナダ，ドイツでも発生がみられ，次いで西ヨーロッパに広がり，やがて世界各国の豚の間に大流行し，養豚産業で大きな被害が報告された。
歴史的には，同属のウイルスとして，馬動脈炎ウイルス（Equine arteritis virus ; EAV）が 1957 年に報告された。このウイルスは，馬流産起因病原体として馬ヘルペスウイルスについて最初に研究が実施された米国の競走馬生産州であるケンタッキー州の研究所において，馬に流産を惹起する別の新しいウイルスとして報告された。
分類学的には，プラス 1 本鎖 RNA 球形エンベロープを持った脊椎動物に感染するウイルスで，Nido ウイ
ルス目，Arteri ウイルス科，Arteri ウイルス属の中に分類され，先の EAV が代表ウイルスとなっている。
ビリオンは，ほぼ球形で，直径 45 〜 60nm である。粒子内に直径 25 〜 35nm の等軸対称のヌクレオカプ
シドを持ち，エンベロープを有する。粒子表面には，特徴的なスパイク様構造は観察されない。このウイルスのゲノムは 12.7 〜 15.7kb のプラス 1 本鎖 RNA である。
PRRS ウイルスは，マクロファージを標的細胞とし，細胞への接着・侵入の際，低 pH 依存細胞内侵入経路を利用し，接着に際しては，唾液腺癒着因子がマクロファージへのウイルスレセプターとして作動することが最近明らかにされた。ウイルスの主要糖蛋白質がこのレセプターに結合し，エンドサイトージスによって細胞内に取り込まれると考えられている。
細胞質内に放出されたウイルスゲノム RNA は，mRNA として働き，ここから蛋白質分解酵素や RNA ポ
リメラーゼが作られ，ゲノムが転写される。各 mRNA は，他の Nido ウイルスと同様，5' 末端に共通のリーダー配列を持ち，3' 側に共通のゲノム配列を持つ。翻訳される蛋白質は，各 mRNA の 5' 側の最初の ORFのみである。ウイルス合成に重要なウイルス非構造蛋白質がコードされ，EAV では 12 個の蛋白質が知られている。ウイルス mRNA は，非常に複雑な一組の入れ子となるセットを形成しているので，目名の Nido とは，nest= 網，巣あるいは入れ子と言う意味だが，この一組のセットの mRNA の構造を nest と解釈し，ウ
イルス分類における学術名になったと考えられる。
我が国では，1989 年頃から，千葉県下で肥育豚に慢性肺炎が多発した。その症状は，呼吸数の著しい増加と強い腹式呼吸が特徴で，呼吸の度に腹がヘコヘコと波打つことから，ヘコヘコ病と名付けていた。この様な症例は我が国の他の地域でも多数観察されていた。日生研では，1992 年に，呼吸器障害を示した子豚からの新鮮材料から，PRRS ウイルスを分離することができた。このウイルス学的性状はヨーロッパ型 ( タイプ 1) とは異なる，北米型（タイプ 2）である事が確認された。これらのウイルスは，その後，当研究所
内でミニチュア豚に実験室内感染・継代され，現在は培養細胞を用いて継代・維持されている。
PRRS の流行状況をみると，繁殖障害は数カ月間流行病的に発生し，その後，不顕性感染が多くなる。そして，その養豚場内にウイルスが常在化し，繁殖障害の発生は散発的となる。育成養豚場においては，離乳
豚に呼吸器障害が集中して起こり，慢性に経過した豚には間質性肺炎が認められ，重度の発育不良豚が散見される。
馬の EAV の流行においても，流産よりも呼吸器感染が主体となり，広い地域で流行して問題となったが，EAV と同様，PRRS ウイルス感染症においても，肺炎を起こした感染豚の鼻汁や下痢便中にウイルスが排泄され，その流行が拡大する。症状としては，母豚は食欲不振と発熱を呈した後，流産，妊娠後期の早産，死産などの繁殖障害が起きる。感染母豚が死亡する場合もある。子豚においては，虚弱，開脚姿勢，眼瞼の浮腫，下痢や肺炎など種々な症状を示す。母豚の泌乳停止により子豚の死亡率が高まる。流行ウイルス株によって病原性の強弱がある。現況では，慢性化・潜在化して，汚染養豚場も増えているので，間接蛍光抗体法
や ELISA による血清抗体の調査，豚マクロファージ培養細胞その他の適切な培養細胞を用いたウイルス分離，
免疫組織化学染色による病理材料における抗原検出，および RT – PCR による血液材料でのウイルス血症の証明などにより，流行状況を早期に把握することが重要である。現在では，ワクチンも利用可能であり，定期的な抗体調査で，母豚，哺乳豚，および育成豚の免疫状態を把握しながら対策を立ててゆくことが望ましい。最近，中国本土で本ウイルスが広く流行し，大問題となっているようで，本病に対する関心は一層高まっているようである。
（主任研究員）53（6）
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イヌの胃壁腫瘤
北里大学獣医病理学研究室

第 46 回獣医病理学研修会標本 No. 926

動物：イヌ，シェルティ，雌，7 歳 5 ヶ月齢。
臨床事項：2005 年 2 月 7 日に嘔吐の主症で某動物病院に来院。その後，粘液状〜血液成分を混じる嘔吐を繰り返す。2005 年 5 月 6 日に本学付属動物病院に来院し，幽門部に形成された腫瘤を切除。術後経過良好であったが，7 月 21 日から再び嘔吐を始めた。8 月 26 日に内視鏡とバリウム検査で再発が確認され，対症療法を施すも好転せず，9 月 13 日未明に死亡した。死亡約 12 時間後に病理解剖を行った。
剖検所見：腫瘤は幽門部〜十二指腸移行部の平滑筋層に形成されていた。境界不規則な類円形腫瘤（6 × 6 ×
5 cm）で肝臓の外側左葉と一部で癒着していた。割面では，腫瘤中心部に出血壊死が強く，辺縁では乳白色を呈していた。膵臓および腸間膜リンパ節にも転移が認められた。
組織所見：胃粘膜から筋層，漿膜にかけて紡錘形細胞が束状配列で錯綜し，一部では上皮細胞様類円形細胞も混在 性 に 増 殖 し て い た（図 1）。核 分 裂 像 は high power
field（HPF，× 40）50 視 野 中 102 個，平 均 1 視 野 中
2.02 個であった。神経節細胞様細胞（図 2）や大小の空胞を有する細胞（図 3）および偽管様構造への分化も散見された。ワンギーソン染色では，個々の腫瘍細胞を取り包むように膠原線維の増生が観察された。免疫染色では，極一部の腫瘍細胞が抗 SMA 抗体に陽性（図 4）を示した，抗 c – kit 抗体は陰性であった。電顕では，核の両端を中心に細胞小器官が比較的豊富に分布し，大型の粗面小胞体が多数観察された。稀ながら myofilament（図 5）と pinocytotic vesicle が観察された。Dense bodyや時折 GIST にみられるシナプス様分泌顆粒は確認されなかった。
診断：犬の胃壁に形成された多形型平滑筋肉腫
考察：本症例の組織学的特徴は，紡錘形細胞の錯綜配列，
神経節細胞様細胞や上皮細胞様円形細胞の混在性増殖であった。免疫染色では，抗 SMA 抗体が一部陽性であり，
抗 c – kit 抗体は陰性を示した。このことから本腫瘍の起源が筋原性である可能性が示唆されたが，GIST および悪性神経鞘腫の場合でも筋原性マーカーに陽性を示すことがあり，確定診断には至らなかった。電顕では，核の両端を中心に発達した細胞小器官，myofilament およびpinocytotic vesicle が散見され，平滑筋細胞としての構造を保持していた。神経節様細胞や粘液産生細胞では，腫大したミトコンドリアと分泌液を貯留する大型粗面小胞体が観察されたが，神経系細胞への分化を示す所見は観察されず，これらの細胞形態は腫瘍細胞の壊死像に相当するものと推測された。以上の HE，免疫染色，電子顕微鏡学的所見に基づいて，本腫瘍を多形型平滑筋肉腫と最終診断した。（朴 天鎬）日生研たより

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イヌの精巣
宮崎大学獣医病理学教室

第 46 回獣医病理学研修会標本 No. 927

動物：イヌ，ゴールデンリトリバー，雄，1996 年 4 月 1

両細胞が衝突するように混在しているが，分隔する線維日生（9 歳 9 ヶ月）。

性結合織がない増殖部位では細胞接着が弱いのが明瞭で臨床事項：2005 年 7 月 17 日に飼い主が左下顎腫瘤（2ある。線維性結合織が富む部位に異型を示す巨細胞が観× 3 cm）を，さらに 7 日後某動物病院にて診察時に著察される。小葉毎に壊死部がみられ，白血球の浸潤が若明に腫大した精巣（10 × 10 cm）を発見。下顎腫瘤の干みられた。また，下顎の組織（頚部）では細胞質の乏穿刺細胞診では円形細胞が主としてみられたため他の検しい小型の細胞が多く，分隔する線維性結合織が頻繁に査機関で炎症が疑われた。血液検査に著変なし。翌日，みられた。部位によっては精巣と同様，異型巨細胞がみ

左下顎腫瘤摘出及び精巣全切除後当教室に検査依頼。13られた。大型の細胞はほとんど見られなかった。腫瘍細日後に再診。前日より食欲低下。さらに下顎術部腫脹。

胞はビメンチン，HHF35（Actin）（図 2），ミオグロビ

右目が違和感あり。やや眼圧上昇，瞳孔軽度散大，対光ン（図 3）には陽性を示し，デスミン，CD3，サイトケ

反射，痛みなし。眼下に膿瘍または腫瘤（不明確）ある

ラチン，HLA – DR，Lysozyme，BLAα– 1 – anti – trypsin

いは緑内障合併と診断。18 日後食欲不振，起立不能のには陰性を示した。

ため排尿なし。翌日身体を触れると痛みあり。8 月 7 日

診断：横紋筋肉腫

痛みが続き呼吸不全により死亡。剖検はされなかった。

考察：精巣原発で，下顎部腫瘤に転移したものと考えら

組織所見：精巣腫瘤はクロマチンに富む類円形核とごくれるが，剖検されなかったので詳細は不明である。精巣

わずかな細胞質を有する小円形から類円形細胞で，これに横紋筋肉腫が見られることは少なく，原発もわずかでらの細胞群（小型の横紋筋芽腫瘍細胞塊）と好酸性細胞

特に動物での報告はない。（山口良二）

質を有する大型の腫瘍細胞塊からなり分隔する線維性結参考文献：

合 織 が み ら れ た（図 １ a と b，HE × 40 と × 400）
。結

1. Kumar, P.V. et al., Br. J. Urol. 59 : 282（1987）.

合織に近い細胞群は吊し柿状配列を呈する。他の部位で

53（6）
，2007

5（65）

レビュー

ドリーからスナッピーへ
李1. 体細胞クローン動物の作出

柄 千（ソウル国立大学獣医学部教授）

子にインジェクションしなければならない。さらに，
電気刺激により細胞を融合させた後発生を促し，胚受精，胚発生及び胚移植は，その個体の次世代を移植，着床及び胎子の発育後クローンとなる次世代得るために欠くことができないプロセスである。体が誕生する。SCNT は，100% 複製となる個体の作

細 胞 を 用 い た 核 移 植（Somatic Cell Nuclear

出が可能で，クローニング技術は基礎研究分野ではTransfer ; SCNT）技術は，「受精」とは異なり，体

もちろん，生物医学研究分野においても利用されて細胞を由来とする分化全能性を有した胚を構築する。 いる。
すなわち，除核卵子にその卵子とは異なる遺伝子を

McGrath, J. と Solter, D. が超微細手術と細胞融合起源とする細胞をインジェクションすることで全く技術によりマウスにおける核移植実験に成功して以異質の細胞，組織及び次世代を作出するものである。 降，核移植技術による個体作出がいくつかの動物種
さらに，SCNT 技術は，近年，家畜動物の遺伝的・において報告されるようになった。1997 年 2 月の定量的改善，絶滅危惧種の救済及び遺伝的に同一な体細胞クローンヒツジ「ドリー」に関する Wilmut,

動物の生産に利用可能である。

I. らの報告は世界的なニュースとなり，大論争を巻クローニング技術には 2 種類あり，1 つは受精卵き起こした。中国，フランス，イタリア，イギリス，の割球を除核卵子にインジェクションする手法で，アメリカ，日本及び韓国等の国々で様々な動物種にもう一つが SCNT となる。しかし，受精卵クロー

おける SCNT 研究がなされている。その結果，ネン技術は，「受精」のプロセスを経ているため，母コ（アメリカ），ウサギ（フランス），ウマ（イタリア），

方と父方の両方の遺伝背景を受け継ぐ。しかも，そシカ（アメリカ）及びフェレット（中国）等のクロの極めて低い作出効率と 1 つの個体（受精卵）からーン動物が誕生した。2003 年 6 月の異種臓器移植

わずか 8 – 16 個の細胞（割球）しか利用できないこを目的とした遺伝子組換えブタ作出の成功は世界中とから適当な技術とは言い難い。

を驚かせたが，実際の臨床応用までには問題が山積

一方，SCNT では，ドナー細胞として卵子及び精している。このような SCNT 技術はまだまだ未解子といった生殖細胞ではなく体細胞を利用する。そ明な部分が多いが，生物医学分野及び産業分野の研れは，遺伝的に同一な個体の無制限の複製が理論上究において潜在的な可能性を秘めている。一方，ヒ可能となる。血清飢餓処理と細胞処理により，培養

トを除く霊長類では，胚性幹細胞は樹立されている体細胞の周期を G0 または G1 期に制御する。

が体細胞クローン個体の作出には至っていない。

体細胞へのゲノムのインジェクションにより再構築された卵子を制御する研究は盛んに行われている2. 体細胞を用いた核移植の手法

が，実用段階には至っていない。従って，卵子を卵図 1 に体細胞を用いた核移植の手法を示す。具体

巣から直接回収し，成熟培養を行う必要がある。ド的には，レシピエント卵子，ドナー細胞，細胞のイ

ナー個体から体細胞を得，除核したレシピエント卵

ンジェクション，卵子活性化処理，リモデリング，

日生研たより

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図1

体細胞を用いた核移植の手法

リプログラミング，体外培養及び移植の各プロセス

amino acid solution を補足した DMEM+10% ウシ胎がある。

子血清（FBS）を用いた。浮遊した細胞もしくは組

2. 1.

イ ヌ

2. 1. 1.

織片の凝集を除去した後，接着した細胞のみをさら

体細胞を用いた核移植のためのドナー細に培養した。細胞の継代培養は 3 – 5 日間隔で行っ胞の準備た。1 分 間 の ト リ プ シ ン（0.1% ト リ プ シ ン 及 び 11 頭（雄）のアフガンファンド種よりバイオプシ

mM EDTA）処理により解離した細胞は，さらなるーによってサンプリングした耳真皮から，線維芽細

継代培養もしくは凍結保存を行った。凍結細胞は，胞を単離した。具体的には，耳組織断片の小片をダ

80% DMEM，10% DMSO 及び 10% FBS を含む培地

ルベッコリン酸バッファー（DPBS）内で 3 回洗浄

内に保存された。融解後の細胞は，カルチャーディ

した後，手術用メスで細切した。その後，37℃に加ッシュ内いっぱいの増殖が認められるまで 3 – 4 日

温された 0.25% トリプシン及び 1 mM EDTA で補足

間の培養を行い，1 分間のトリプシン処理により単されたダルベッコ修正イーグル培地（DMEM）内層から解離させた。SCNT には 2 – 8 継代培養したで 1 時間培養した。トリプシン処理した組織は，細胞を用いた。

300 g，2 分間の遠心処理により DPBS でさらに 1

2. 1. 2.

排卵卵子の回収

回洗浄し，直径 100 mm のカルチャーディッシュ内

卵子は，開腹手術を施した麻酔下の個体から回収で培養した。培養条件は，39℃，5% CO2 及び 95%した。卵管の膨大部またはより上方部に反転フラン

Air であり，8 – 10 日間培養を継続した。培地は，1ジバルブ針を挿入した。フランジバルブ針は 3 cm

mM グルタミン，25 mM 炭酸水素ナトリウム，1%のプラスチックチューブと止血鉗子を結わえ付けた

Minimal essential medium 及び 1% Non – essential

縫合糸で保定した。子宮卵管接合部に当たる卵管峡

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部を指で露出させて 24 G の注射針を挿入し，シリ7（67）2. 1. 4.

移 植

ンジに充填した培地を注入した後に，排卵卵子を培

再構築胚は，排卵後 2 – 4 日目のレシピエント個

地と共にプラスチックチューブへ回収した。培地は体の子宮角に移植した。具体的には，レシピエント

2 mM 炭酸水素ナトリウム及び 5 mg/ml ウシ血清に塩酸ケタミンとキシラジンを静脈内投与すること

ア ル ブ ミ ン（BSA）を 補 足 し た Medium 199

で前麻酔処理を施した後，2% イソフルランで麻酔

Hepes+10% FBS を 8 ml 用いた。

を維持した。開腹手術下で子宮を手繰り寄せ，3.5

2. 1. 3.

除核，マイクロインジェクション，融合，Fr の Tom cat catheter を用いて片側の子宮角に胚活性化及び胚培養を移植した。移植後 23 日目には，超音波画像診断

第Ⅱ成熟分裂中期に当たる回収卵子の卵丘細胞は， 装置により妊娠診断を行った。
ウシとブタ

ヒアルロニダーゼを 0.1% 含む CR2 Hepes バッファ2. 2.

ー（1% Non – essential amino acids 補 足）内 で ピ ペ

2. 2. 1.

ッティング処理を施すことにより除去した。その後，

レシピエント卵子

ウシ及びブタの卵巣は，屠殺場でサンプリングし，

5 μg/ml bis Benzimide H 33342 で 5 分間染色を行

30 – 35℃の生理食塩水に浸した状態で加温しながらい，落射蛍光顕微鏡を用いて 200 倍の倍率で観察を実験室に運搬した。卵巣の直径 2 – 8（ウシ）及び 3行った。マイクロマニピュレーターを用いて卵子の– 6（ブタ）mm の卵胞から，18 G の針を装着した

除 核 を 行 っ た。培 地 は，1% Non – essential amino

10 ml のシリンジを用いて卵子を含む卵胞液を吸引

acids 補足した CR2 Hepes バッファー +10% FBS に回収した。顆粒膜細胞あるいは 3 層以上の卵丘細胞

5 μg/ml cytochalasin B を添加したものを用いた。

が付着した卵子を選抜し，数種の因子を補足した修

bis Benzimide H 33342 で染色した第Ⅰ極体とその正 199 medium を 用 い て 500 μl 当 た り 30 – 40（ウ近くにある染色体をアスピレーションピペットによシ）及び 50（ブタ）個の割合となるよう分割し，り取り除いた。除核卵子は Medium 199 Hepes+10%

39℃，5% CO2 及び 95% Air の条件下で成熟培養を開FBS 内 で 保 持 し た。核 移 植 は，1% Non – essential

始した。

amino acids 及 び 100 μg/ml phytohemagglutinin を数層の卵丘細胞が付着した良質な卵子を選抜する補足した CR2 Hepes バッファー中に移動させた除ことが重要であり，卵子の成熟割合を左右する。ク

核卵子のアスピレーションピペット挿入部位に，既ローン研究における大半の問題点はレシピエント卵

述のアフガンファンド種由来耳真皮から単離した線

子の数に制約があることである。卵子の体外成熟培

維芽細胞 1 個をインジェクションすることで行った。 養には，より vivo に近い環境を再現することが重なお，phytohemagglutinin はドナー細胞とレシピエ要である。

ント側の細胞質の融合を促すために用いられた。そ2. 2. 2.

ドナー細胞と核移植の後，260 mM mannitol，0.1 mM 硫酸マグネシウム，

ドナー細胞は，妊娠 40 日齢の胎子から線維芽細

0.5 mM Hepes 及び 0.05% BSA を含む培地に卵子を胞を単離し用いた。胎子の頭部をハサミを用いて切移し，Cell fusion chamber 上で活性化処理を施した。 除し，肝臓，腸管等の比較的柔らかな組織は鉗子で
1 時間後に，実体顕微鏡下でドナー細胞とレシピエ掻き出した。残りの組織を細切し，0.1% トリプシ

ント側の細胞質の融合の状態を観察した。移植を行ン及び 1 mM EDTA を含むハンクスメディウム内でうまでの間，卵子は 25 μl mSOF 培地当たり 5 – 6 個

1 – 2 時間培養し細胞を解離させた。トリプシン処理の割合となるよう分割し，39℃，5%O2，5% CO2 及

終了後，300 × g，10 分間の遠心処理により DPBS

び 90% N2 の気相下で保持した。

で 1 回洗浄し，直径 100 mm のカルチャーディッシ

日生研たより

8（68）ュ内 で 培 養 し た。培 養 条 件 は，37 – 39℃，5% CO2

5%O2，5% CO2 及び 90% N2 の気相下で保持した。

及び 95% Air であり，6 – 8 日間培養を継続した。培2. 2. 3.

地は，数種の因子を補足した DMEM+10% FBS を用いた。

リプログラミング

体細胞の核は，未受精卵に移植されると遺伝子発
現プロファイルが復帰させられ，全能性を獲得する。

浮遊した細胞もしくは組織片の凝集を除去した後， このプロセスが「リプログラミング」であり，除核接着した細胞のみをさらに培養した。細胞の継代培卵子に移植された核はリプログラミングが起こるこ

養 は 5 – 7 日 間 隔 で 行 っ た。5 分 間 の ト リ プ シ ンとが証明されている。結果として，再構築直後の胚（0.1% トリプシン及び 1 mM EDTA）処理により解が生物学的な時間をリセットする。

離した細胞は，2 回の継代培養後に凍結保存を行っ

2. 2. 4.

再構築胚の発生培養と移植た。凍結保存用培地は，イヌの場合と同様な組成の再構築胚の培養は発生に悪影響を及ぼす。しばしものを用いた。融解後の細胞は，カルチャーディッ

ば，Cell block を被る。当初，このような理由から

シュ内のおよそ 80% の増殖が認められるまで 3 – 4発生の初期段階のみの同種または異種となる動物の日間の培養を行い，FBS を 0.5% にまで減少させた子宮への移植が試みられたが，近年，種々の優れたDMEM 内で 3 日間培養を継続させた。その後，30培地が開発された。しかし，胚の発生培養技術は完秒間のトリプシン処理により単層から解離させ，

全とは言い難く，例えば，妊娠率が低いこと，流産

SCNT に用いた。

子となる割合が高いこと及び産子が過大子症候群で

SCNT では，成熟培養後の卵子はピペッティング

ある割合が高いことなどが知られている。また，により裸化処理を施し，マイクロマニピュレーター

SCNT 技術では，レシピエント卵子の細胞質ミトコを用いて除核を行った。ウシ卵子では cytochalasin

ンドリア DNA の胚への影響を除外することはでき

B を添加した CR2 Hepes バッファーを，ブタ卵子ないため，本当に体細胞クローン動物といえるか否では cytochalasin B を添加した NCSU – 23 Hepes をかという疑問が常について回る。多くの科学者は，それぞれ基礎培地として用いた。

ヒト X 染色体連鎖性遺伝病及び絶滅した動・植物

除 核 操 作 後，卵 子 は 5 μg/ml bis Benzimide Hに影響を与えないためのミトコンドリア DNA 除外

33342 で 5 分間染色を行い，落射蛍光顕微鏡を用いのための手法発見に努力している。核移植に用いるて観察を行った。除核が完全ではない卵子は SCNT

組換え体によりミトコンドリア DNA の影響を消失から除外した。既述の線維芽細胞の中から表面が滑することが期待される。胚はある発生ステージでレ

らかなもの 1 個をインジェクションした。

シピエントの子宮に移植される。

そ の 後，260 mM mannitol，0.1 mM 塩 化 マ グ ネ
シウム，0.1 mM 塩化カルシウム及び 0.5 mM Hepesを含む培地に卵子を移し 4 分間平衡させた後，Cell
fusion chamber 上で活性化処理を施した。

3. クローン技術の展開と可能性
遺伝子組換え動物，特に，ヒトの病気モデルは
SCNT 技術により作出可能である。マウス以外の動融合の方法は，化学刺激，不活化ウイルスの刺激物に関しては限定的に研究されてきた経緯がある。

及び電気刺激によるものがあるが，電気刺激によるクローン技術は新しい製剤及び新規化合物探索の研手法が一般的である。

究を加速させ，遺伝子組換え動物を用いた研究は人移植を行うまでの間，ウシ卵子は 25 μl mSOF 培
地当たり 5 – 6 個，ブタ卵子は 25 μl NCSU – 23 当た
り 5 – 7 個の割合となるよう分割し，それぞれ 39℃，の生活を向上させ，寿命を伸ばすことに貢献するであろう。

53（6）
，2007

9（69）

4. 初めて作出に成功したクローン犬「スナッピー」

3 胎子の着床に成功した。スナッピーを除く，1 頭は流産子となり，残り 1 頭は 560 g で帝王切開によ

4. 1.

結

果

り誕生したが 3 週齢時に誤嚥性肺炎で死亡した。

ここに，クローン犬誕生に関して報告する。

スナッピーと 3 週齢時に死亡したクローン犬の 2

世界初のクローン犬の作出は，2005 年 8 月 4 日

頭とタイのゲノム DNA をマイクロサテライト・アにソウル大学が発表した。8 月 24 日にソウル大学

ナライシスにより検査したところ，同一であること

獣医病院で 530 g の世界初のクローン犬「スナッピが認められ，また，血液型も一致した。

ー」が誕生した。スナッピー（Snuppy）は，ソウ

これらの研究は，2002 年 8 月より開始したもの

ル大学（SNU）と子犬（puppy）とを合わせて名付であった。

けられたもので，3 歳齢のアフガンファンド種「タ

4. 3.

今後の展開

イ」（雄）のクローンであった。借腹犬は 4 歳齢のクローン犬は遺伝病のための新規治療に有用であ雑種であった。今回の研究成果は，Nature 誌（436る。また，ヒトの病気モデルとして用いることによ

巻，7051 号，2005 年）に掲載されている（写真 1）。

り，創薬と細胞治療が可能となるため，クローン動物とこれを用いた細胞療法の確立は究極の目標である。さらに，多くの未知の遺伝病の研究及び治療法の開発のために有用である。さらなるステップとして，韓国灰色オオカミを含む絶滅危惧種のクローンの作出が可能となった。

5. まとめ
我々は，クローン犬以外にイヌレシピエント卵子を用いた 2 頭のクローン灰色オオカミの作出に成功した（写真 2）。これらの研究は，SCNT 技術は絶滅危惧に瀕したイヌ科動物の保存のための実用的アプローチであることを意味する。

写真 1

4. 2.

左：体細胞供与犬「タイ」，右：クローン犬「スナッピー」

研究成果の意義

犬に関して，卵子の培養は不明確な部分が多く，
SCNT 手技は不可能であると考えられていた。また，排卵卵子は未成熟な状態にあること及び発情回帰が
年 2 回しか認められないこと等ユニークな繁殖生理を有することからクローン犬の誕生は難しいと思われた。
我々は，1,095 個の胚を 123 頭の借腹犬に移植し，

写真 2

クローンオオカミ

日生研たより10（70）

レビュー

ミニブタ及びイヌにおける生殖工学技術の開発とモデル動物の作出
島 津 美 樹（研究員）
私は，1994 から 2000 年の間，現独立行政法人農1. はじめに業･食品産業技術総合研究機構の出資事業に参加し，私は昨年 9 月に財団法人日本生物科学研究所に入

ゲッチンゲン系ミニブタ（写真 1）の実験動物化の所し，現在，核移植技術を用いた実験動物の作出にための背景データ，飼育・実験手技マニュアル等の関する研究を主たる課題として掲げ業務を遂行して整備，さらには遺伝子導入個体作出を最終目的に据いる。本日は，これまでに関わってきた特にミニブ

えた生殖工学技術確立に関するプロジェクトに従事

タ及びイヌに関する生殖工学技術の開発とモデル動した。当時，農林水産省は実験動物を第三の家畜と物の作出について紹介する。

位置付け 8），研究助成に注力しており，特にミニブタにおいては，イヌ及びサルに代わる中型実験動物

2. ゲッチンゲン系ミニブタを用いた研究としての需要拡大が期待されていた。そのため，実験動物として必須な体系的・普遍的ベースラインデ

ブタは，解剖学的及び生理学的特性がヒトに類似ータの充実，飼育管理方法の確立，実験手技の検討しており，古くから生物医学的研究に用いられてき等が急務な状況にあった。私が参加したプロジェクた。しかし，体重は 6 ヶ月齢で 90 kg 前後あり，繁トの成果としては，実験マニュアルの作成 9），精液

殖用個体では 300 kg にまで及ぶため，外科的手術の液状保存技術 10）及び凍結保存技術の確立，過剰の処置等を施すのは容易ではない。これらのことか

排卵誘起技術の確立 11），発情同期化技術の確立 12），

ら，より小型なブタ（ミニブタ）の育種改良がなさ

受精卵移植技術の確立，マイクロインジェクション

れるようになった法による遺伝子導入個体の作出 13）等がある。

。我が国においては，1967 年

1 – 6）に当研究所及び現独立行政法人農業･生物系特定産業技術研究機構畜産草地研究所にピットマンムーア
系ミニブタ，1975 年に財団法人実験動物中央研究所及び現株式会社中外医科学研究所にゲッチンゲン
系ミニブタが導入され，系統維持がなされた 7）。また，オーミニ系ミニブタ，クラウン系ミニブタ等の新規系統の作出も行われた 7）。
近年，欧米ではミニブタの実験動物化の検討が急速に進み，医薬品開発等の評価に関わるガイドラインに使用動物種として加えられた。1998 年度の欧写真 1

8 ヶ月齢のゲッチンゲン系ミニブタ（雌）州におけるブタの実験使用頭数は 14,000 余りとなり，そのおよそ 3 割はミニブタであったことが報告

3. イヌを用いた研究されている。一方，日本国内で実施された動物実験に関するアンケート調査では，2001 年度のブタ及筋ジストロフィーは，筋線維の変性・壊死を主病

びミニブタ使用頭数は 3,371 に及んでいる。しかし，

変とし，進行性の筋力低下を示す経過をとる遺伝性

この数値は任意回答の集計結果であるため，実際のの疾患である。近年，同病態のモデル動物としてマ

使用頭数はより多いものと考えられる。

ウス，ハムスター，ネコ，イヌ等で自然発症個体が

53（6），2007

11（71）

見出され，維持・繁殖がなされるようになった。さた。現在，本技術による研究の本格稼働に向け，基らに，トランスジェニック，ジーンターゲティング

礎データを集積しているところである。

等の手法による数多くのモデルマウスの作出が行われている。これらモデル動物の中で，筋ジストロフ

参考文献

ィー犬は進行性で重篤な症状を示すことから，モデ

1）Bustad LK, et al. : Swine in Biomedical Research,ルとしては最適であり，最も注目されている。
Cooper ら14）

及 び Kornegay ら

Bustad LK and McClellan RO（eds）（1966）pp.

は，ゴ ール デ ン

15）

769 – 774.

レトリバー種に X 染色体連鎖性劣性遺伝をとり，2）England DC, et al.: Growth（1954）17 : 207 – 214.

進行性の筋力低下を示す個体のあることを見出し，

3）Glodek P : Swine in Biomedical Research,

筋 ジ ス ト ロ フ ィー犬（Golden retriever muscular
dystrophy ; GRMD）のコロニーを確立した。我々は，Tumbleson ME（eds）（1986）pp. 23 – 28.
4）Haring F, et al. : Swine in Biomedical Research,

同コロニーの病態犬の凍結精液を用いることでビー

Bustad LK and McClellan RO（eds）（1966）pp.

グル種との交雑による新たな病態犬コロニーの立ち

789 – 796.

上げに成功し，この筋ジストロフィー犬を Canine5）R e m p e l W E a n d D e t t m e r s A E : S w i n e i n

X – linked muscular dystrophy in Japan ; CXMDJ と名Biomedical Research, Bustad LK and McClellan

付けた 。CXMDJ（写真 2 ; 参考文献 17 より引用）

RO（eds）（1966）pp. 781 – 787.

16）

の 病 態

の

6）Tumbleson ME, et al. : Swine in Biomedical

GRMD における病態解析と比較した場合，より軽Research, Tumbleson ME（eds）（1986）pp. 597 –度であることが推察された。その原因は，ビーグル

609.

16）
, 17）

を Kornegay ら

Valentine ら

15）

18）
, 19）

との交雑による特異性，体格の小型化に伴う総筋肉7）中西喜彦 : アニテックス（1999）11 : 4 – 11.

量の減少等が考えられた。

8）農林水産省畜産局家畜生産課 : 第三の家畜―実

また，凍結精液を用いた授精タイミング，精子数
及び授精回数の検討

験動物―（1986）.

，授精タイミングと繁殖

9）谷川学ほか : ミニブタ実験マニュアル（2000）.

成績の検討 ，さらにはドパミン作動薬を用いた発10）Shimatsu Y, et al. : Exp Anim（2002）51 :143 – 147.

情統御の検討等イヌにおける生殖工学技術確立を目

11）S himatsu Y, et al. : Theriogenology（2000）

20）, 21）

22）

指した研究を行った。

53 : 1013 – 1022.
12）Shimatsu Y, et al. : Vet Rec（2004）155 : 633 – 635.
13）Uchida M, et al. : Transgenic Res（2001）10 : 577– 582.
14）Cooper BJ, et al. : Nature（1988）334 : 154 – 156.
15）K or negay JN, et al. : Muscle Ner ve（1988）
11 : 1056 – 1064.
16）Shimatsu Y, et al. : Exp Anim（2003）52 : 93 – 97.
17）Shimatsu Y, et al. : Acta Myol（2005）24 : 145 –154.
18）Valentine BA, et al. : Acta Neuropathol（Berl）

写真 2

12 ヶ月齢の CXMDJ（参考文献 17 より引用）
側頭筋の萎縮，関節の拘縮等が認められる（1986）71 : 301 – 310.
19）Valentine BA, et al. : J Neurol Sci（1988）88 : 69 –81.

4. おわりに20）Shimatsu Y, et al. : J Reprod Dev（2000）46 : 315 –318.

私は，入所以来，外部機関にて遺伝子改変動物を作出するための核移植技術について研修を受けてき21）Shimatsu Y, et al. : Vet Rec（2003）153 : 369.
22）Shimatsu Y, et al. : Reprod Dom Anim in press.

日生研たより12（72）

新 人 紹 介個人情報保護のため、新人紹介欄は削除させていただきました（2010年9月）。

日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（隔月 1 回発行）

（通巻 547 号） 平成 19 年 10 月 25 日印刷
発行所
生命の「共生・調和」を理念とし，生命体の豊かな明日と，研究の永続性を願う
気持ちを心よいリズムに整え，視覚化したものです。カラーは生命の源，水を表す「青」としています。
表紙題字は故中村稕治博士の揮毫

平成 19 年 11 月 1 日発行（第 53 巻第 6 号）

財団法人 日本生物科学研究所〒 198-0024

東京都青梅市新町 9 丁目 2221 番地の 1

TEL：0428（33）1056（企画学術部） FAX：0428（31）6166
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