2010 MARCH
No. 561

2010 年（平成 22 年）
3 月号

第 56 巻 第 2 号（通巻 561 号）

挨拶・巻頭言情報収集........................................布 谷 鉄 夫（ 2 ）獣医病理学研修会
第 49 回 No. 980 ブタの回腸.................... (財)日本生物科学研究所（ 3 ）第 49 回 No. 993 イヌの皮下腫瘤.................. 北海道大学比較病理学教室（ 4 ）レビュー
体細胞クローン技術を用いた遺伝子組換えブタの開発と利用........................................大 西彰（ 5 ）
ニワトリ乳酸脱水素酵素 A サブユニット
遺伝子（LDH‒A）プロモーター領域の解析........................................勝 俣
淳（ 8 ）

お知らせ
ホームページのドメイン変更について ........................................... （12）
編集後記 ................................................. （12）http://nibs.lin.gr.jp/

2（18）

日生研たより情報収集
布谷鉄夫
春暖の候，皆様におかれましてはいよいよご清適の御事と拝察申し上げます。今冬は当初予測に反し降雪の多い寒い日々が続きましたが，梅花も盛りを迎え桜花もほころび始めました今日この頃です。此処青梅は市民マラソン発祥の地でもあり，今年も 1 万 5 千人近くのランナーが全国から集い，先行き不透明な社会不安を払拭しながら一つゴールを目指して健脚が競われました。
年々，時の流れを短く感じるような昨今でありますが，同様に感じておられる読者もおられるかと思います。一説によれば，これは主観的に記憶される年月の長さが経験の少ない年少者にはより長く，経験豊かな年長者にはより短く評価されるという心理学的な現象（ジャネーの法則）と解釈されているようです。しかし，筆者自身はその他にも近年のインターネットの普及と氾濫する情報の影響を少なからず受けているような気がします。毎日出勤するとまず机上のパソコンの電源を入れ，電子メールをチェックするのが日課となっておりますが，日々配信されてくるその多さに開封するのが億劫になることも屡々あります。コン
ピュータシステムやインターネットなどの情報インフラが進み，あらゆる情報のやり取りが瞬時にして可能になっていますが，これら情報社会基盤の普及は電話や手紙のような個人対個人との人を介した情報交換から電子メールやブログなどに見られる個人対（不特定）多数とのコミュニケーションを可能にしました。それにより我々の日常業務は大幅に迅速・効率化するとともに，生活基盤そのものが急激かつ大きく変容しています。その便利さとは裏腹に，他方では個人情報の流出や最近ではグーグルへのハッキングに見られるような情報社会基盤の脆弱性を脅かす様々なサイバー犯罪も増加しているようです。情報インフラの恩恵をもっとも身近に感じる一例が文献検索です。以前は図書室に足を運んで目的の書物を捜し出しコピーをとって持ち帰るといった，ややもすれば時間単位の作業であったものが，現在では机上で指を動かすのみの分単位の作業でこと足り，労せず目的を達することが可能になりました。このような学術情報の収集は我々にとっては専門領域のフロントラインを把握し，また研究の方法論や経験則を補う手段としても欠かせない作業の一つであり，そのために割く労力の減少は研究遂行の効率化に大いに役立っています。一方，ネット情報は過去の出来事であり，それらは情報として発信された時点で固定され過去のものとなる；例えば今我々がネット上で調べている情報は全て過去の遺産であって，それらを毎日情報収集と称して追い求め一喜一憂していると仮定すれば，過去に向って全力で生きていることになる；つまり後ばかり見ていれば前が見えな
くなり，従って，未来が見えなくなって不安でしょうがなくなる（養老猛著「ネットの中にあるものは全て過去の遺物”」）。この考え方を筆者なりに解釈させていただければ，情報を集めて目を通せば自らが経験したかのような錯覚に陥り安心してしまうことがあってはならない，新しい情報（過去の遺産）ばかりを追って一喜一憂せず足元もしっかりと見据える，未来の情報はネットに在らず現場に在る，と云うことでありましょうか。
最近，米国で起きた日本車のリコール問題に関連した経営者による会見での，「会議室で報告書やデータで物事を判断するのではなく，実際に現場を見ることで初めて顧客の視点から判断できると確信している」との言葉は印象的でありました。有為転変する社会状況の下で発生する諸問題，とりわけ現場で今何が起こっているか，何が求められているか，についての生の情報を得るためには視線を絶えず現場に向けながら行動する必要があると自らを戒めております。溢れる情報の中から必要不可欠且つ正確な内容を効率よく選択する作業は無論のこと， 過去の遺物であるネット情報と現場に在る生の情報をバランスよく収集し活用していくことが大変重要であると思っております。
（所長）

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，2010

3（19）

ブタの回腸
（財）日本生物科学研究所

第 49 回獣医病理学研修会 No. 980

動物：ブタ，約 50 日齢，品種及び性別は不明。

おいても観察され，さらに結腸でも同様な部位の浸潤細臨床事項：鹿児島県の A 農場で，2007 年 10 月頃より胞に陽性シグナルが少数認められた（図 9）。

45 日齢以降の豚で下痢が見られ，60 日齢頃から死亡が診断：肉芽腫性回腸炎および壊死性出血性結腸炎

目立つようになった。豚の死亡は 2007 年 12 月頃がピー

考察：結腸で観察されたらせん菌は細菌検査が未実施のクで，30％以上に達したが，その後は回復傾向を示した。 ため鑑別不能であったが，それらの形態と細胞外に存在
検体は病性鑑定目的で 2008 年 1 月 31 日に A 農場で採することなどからブラキスピラ属の細菌を疑った。

材され，十二指腸から直腸までの腸管のみが 2 月 1 日にPCV2 に関連した腸炎では，ローソニアやブラキスピラ

当所へ冷蔵された状態で到着した。

属の菌種との重感染についての症例や調査報告が多数発

肉眼所見：腸管は十二指腸から直腸まで黒褐色を呈し，表されている [1, 2]。病理組織学的診断は上述の通りで腸壁は菲薄化していた。腸管内には黒茶色の液状便が中あるが，疾患名としては，腸管以外の臓器の検索を行

等量認められた（図 1）。

なっていないものの腸間膜リンパ節にも PCV2 のウイル

組織所見：結腸では，粘膜面の壊死および出血，粘膜固ス封入体が観察されることから，豚サーコウイルス関連

有層でのリンパ球およびマクロファージの浸潤が観察さ疾患（PCVAD）に相当すると考えられる。

れ（図 2），陰窩の内外には細長いらせん菌が散在し，（上塚浩司）

それらはワーチンスターリー染色で黒く染め出された

参考文献：（図 3）。回腸では，粘膜の絨毛は消失し，パイエル板リ

1. Jensen, T. K., Vigre, H., Svensmark, B. and Bille–Han-

ンパ球の減少とマクロファージの浸潤が観察された（図sen, V. 2006. Distinction between porcine circovirus type4，5）
。マクロファージの細胞質内には好塩基性の封入体が観察され（図 6），2 型豚サーコウイルス（PCV2）2 enteritis and porcine proliferative enteropathy caused by
Lawsonia intracellularis. J. Comp. Pathol. 135 : 176–182.

に対する免疫染色で陽性を示した（図 7）。PCV2 に対す

2. Komarek, V., Maderner, A., Spergser, J. and Weissen-

る in situ ハイブリダイゼーションでは，免疫染色の結bock, H. 2009. Infections with weakly haemolytic
Brachyspira species in pigs with miscellaneous chronic
diseases. Vet. Microbiol. 134 : 311–317.

果よりもさらに多数の陽性シグナルが回腸粘膜下織の細胞集簇巣（図 8）のみならず，粘膜固有層の浸潤細胞に

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日生研たよりイヌの皮下腫瘤
北海道大学比較病理学教室

第 49 回獣医病理学研修会 No. 993

動物：イヌ，バーニーズ・マウンテン・ドッグ，雄，9 歳。 パ球・形質細胞の血管周囲への浸潤も観察された（図 3,4）。
臨床事項：本症例は約半年前より左前肢に軽度の跛行が診断：柵状肉芽腫 Palisading granuloma
あり，1 週間前より左前肢を挙上するようになった。触
考察：提出標本中に認められた組織所見は，成書に記述
診により左肘関節の腫脹，X 線検査により左肘関節に骨されている柵状肉芽腫の特徴に一致した。柵状肉芽腫は吸収像と関節炎を疑う所見が認められた。血液検査では単発性の皮膚結節性病変として，大型犬に多く発生する
白血球数の増加，関節液中には好中球を主体とする炎症傾向がある。しかし，その報告数は少なく，原因および性細胞が認められたが，関節液の細菌培養検査の結果は病理発生の詳細は不明である。本症例では単核球浸潤を陰性であった。関節洗浄および増生した滑膜の切除生検伴う関節炎が認められたことから，犬のリウマチ様関節が行われ，その際，左肘関節付近の皮下に存在した腫瘤炎およびリウマチに関連した皮下結節である可能性を考も同時に摘出された。提出標本はこの皮下腫瘤より作製慮したが，リウマチ因子が陰性であったこと，関節炎がされた。
単発性であったことから臨床的にはリウマチは否定的で
肉眼所見：皮下腫瘤は左肘関節に隣接して存在していたあった。浸潤細胞の大部分は豊富な細胞質を有する類上が，関節腔との連続性は明らかではなかった。皮下腫瘤
皮細胞であり，細胞の異型性や有糸分裂像が観察されなはやや硬度を有しており，その割面は白色から桃白色でいこと，細胞の増殖形態などから腫瘍の可能性を除外しあった。
た。
組織所見：腫瘤は多数の炎症性細胞の浸潤によって構成（寸田祐嗣）
されており，膠原線維の変性，断裂を伴っていた（図 1）。
参考文献：
マクロファージを中心とする炎症性細胞の多結節性増殖
1. Gross T. L. et al. 2005. pp 337–341 In : Skin Diseases ofが認められ，結節の中心部にはしばしば変性した膠原線
the Dog and Cat, 2nd ed. Blackwell.
維が存在し，その周囲を上皮細胞様のマクロファージが
2. Lee M. W. et al. 1999. Clin. Exp. Dermatol. 24 : 193–195.
柵状に取り囲む像が認められた（図 2）。また腫瘤の辺縁部では軽度の水腫および粘液の沈着が認められ，リン

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5（21）

レビュー 1体細胞クローン技術を用いた遺伝子組換えブタの開発と利用
大西彰（独立行政法人農業生物資源研究所遺伝子組換え家畜研究センター）
るようになってきた。小動物であるマウスが外科的1. はじめに治療法の開発に不向きであるのは言うまでも無い。

ブタは，これまで長い歳月をかけて育種改良され， 例えば，狭窄している冠動脈内へステントを設置し，その高い生産性から食肉用の家畜として欠かせない

血管を広げる手法の開発や訓練をマウスで行うこと存在になっている。一方，ブタは解剖学的および生は不可能で，より大型動物であるブタが最適とされ理学的にヒトとの類似点が多く，実験動物としてのている。循環器系におけるヒトとブタの類似性の高利用も進められてきた。実験用ブタに対しては，食さが，この分野でブタが選択される理由となる。ま

肉生産のための高い発育能力と大型化とは異なり，

た，最近では，内視鏡手術の訓練にブタが多用され扱いやすさに重点を置いた小型化が求められる。そるようになってきた。これらの利用は，大型動物とのため，実験用ミニブタの開発が，食肉用とは別途して，ブタが生理学的，解剖学的にヒトと多くの類に進められてきた。近年，動物愛護運動の高まりか似点を持つために他ならない。

ら，実験用イヌの利用が大きく制限されるなか，イ

マウスの限界は，単に身体の大きさだけではない。

ヌに代わる実験動物としてブタが注目されている。

現在，遺伝子組換え技術により多くの疾患モデルが

しかし実際には，実験用ブタの利用は必ずしも進ん開発されているが，遺伝子組換えマウスが必ずしもではいない。その理由として，ブタが取り扱える施

ヒトの症例を反映しないことが問題となっている。

設や技術者の絶対的な不足など，多くの問題点が挙生活習慣病の一つに高脂血症があげられる。ヒトにげられるが，一つには，遺伝子組換え技術がブタでおいては，高脂血症は動脈硬化を引き起こし，重症は未発達で，例えば疾患モデルの開発が困難な点にの場合には死に至る。遺伝子組換え技術により高脂あったのではないかと考える。遺伝子組換えマウス

血症モデルマウスの作出は可能だが，マウスは動脈の需要が年々増加することからも明らかなように，硬化に対する抵抗性が強く，動脈硬化症の誘引は非実験動物としての汎用性を増すためには，任意の遺常に困難である。一方，ブタは冠動脈の構造がヒト

伝子組換え技術が必要不可欠である。ブタにおけるに近く，血中のリポタンパク質のパターンが最もヒ任意の遺伝子組換えは，これまでは技術的にほぼ不トに近い動物である。実際，血中コレステロールで可能であった。しかし，その状況は，体細胞クロー

ある，VLDL（ver y low density lipoprotein）, LDL

ン技術の発展により一変しつつある。本稿では，遺（low density lipoprotein）および HDL（high density

伝子組換えブタの現状を紹介すると共に，実験動物

lipoprotein）の各分画パターンを見ると，ヒトとブとしてのブタの可能性を探りたい。

タの類似性が極めて高いことがわかる。マウスの場
合，ヒトやブタの分画パターンとは異なり，LDL
よりも HDL の値が高くなる。これは，マウスでは

2．なぜ実験用ブタなのか

コレステロールエステル転送タンパク質が欠損して食と同様に医は，人間の福祉と健康に欠かせない。 い る た め，HDL の コ レ ス テ ロ ール エ ス テ ル が，
そして医学の発展には，実験動物が計り知れないほVLDL や LDL に転送されないためである。さらにど大きな貢献をしている。感染試験による病因の解

ブタでは動脈硬化が生じることから，リポタンパク

明および治療法の開発，薬物の毒性や薬効の評価な

質およびコレステロールの代謝に係わるヒトのモデ

ど，病気を克服するのに不可欠な多くの知見が実験ル動物として，ブタはマウスよりも相応しいと考え動物により得られている。特に小動物であるマウスられる。血管狭窄の治療法であるステントの開発にでは，遺伝子組換え技術により人間の病態を再現すブタが有用であることは前述したが，もしもブタでる疾患モデルが数多く開発され，その利用は増加の高脂血症による粥状動脈硬化症が再現できれば，新一途をたどっている。

薬やステントを含むヒトの治療戦略をそのままブタ

一方，実験動物としてのマウスの限界も指摘されに外挿することができ，新たな治療法の開発が可能

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日生研たよりとなるに違いない。その他にも，例えば，癌研究に可能となり，特定の遺伝子座を破壊した，ノックア

おいて，発癌に関連する遺伝子の種類がヒトとマウウトマウスが次々と開発されるようになった。近年，

ス間で異なり，ブタがよりヒトに近いことが明らか

疾患モデルとして，これらのノックマウスの有用性になりつつある。実際，マウスの発癌モデルがヒトは高まるばかりである。ブタの場合，ES 細胞の作の症例を必ずしも反映しない問題があり，その解決出に向けた数多くの研究がなされたが，実用性のあにブタの利用が考えられている。また最近の動向とる ES 細胞は世界的にも得られなかった。ブタにおして，トランスレーショナルリサーチへのブタの利

い て，任 意 の 遺 伝 子 組 換 え 体 を 得 る 手 段 は，用があげられる。具体的には，再生医療などの先端2000 年の体細胞クローンブタの出現を待つより他的医療の開発において，得られた基礎研究の成果をになかった。

臨床試験に応用するためには，小動物の他，中〜大（2）体細胞クローン技術による遺伝子組換えブタ動物を用いた試験が必須となってきている。その候

体細胞クローンブタの成功は，我々を含め，2000

補となる動物の一つに，ヒトとの類似性が多く見ら

年に相次いで報告された 2）3）。ブタはウシと異なりれるブタが取り上げられるようになってきた。

多産なため，体細胞クローン技術による優良家畜の増産はほとんど意味を持たない。しかし，系統保存への活用は有効と思われる。ブタの生殖細胞，特に3．遺伝子組換えブタ

受精卵の凍結保存技術は不安定で必ずしも実用レベ

ブタを実験動物，特にヒトの疾患モデルとして利ルに達していない。一方，線維芽細胞を代表とする用するためには，遺伝子組換え技術が欠かせない。

体細胞の凍結保存は極めて容易で安定している。そブタの遺伝子組換えは，体細胞クローン技術の開発のため，ブタの系統維持において最も懸念される近により飛躍的に進展しているが，これまでの経過を

交退化や感染病汚染に対して，近交係数の低い，あ述べる。

るいは清浄なブタより体細胞を採取し凍結保存する
ことは，体細胞クローン技術による個体再生が可能（1）前核内注入法による遺伝子組換えブタとなった現在，不測時への備えとして有効な手段に従来，遺伝子組換えブタの作出には，受精卵の前なるに違いない。しかし，ブタにおける体細胞ク

核内に直接に DNA を注入する，前核内注入法が用ローン技術の最大の長所は，やはり遺伝子組換え体

いられてきた。1983 年，Palmiter らは，メタルチの作出に他ならない。

オネインをプロモーターとする成長ホルモン遺伝子

体細胞クローンの場合，細胞の段階で遺伝子の導をマウス卵子の前核内に注入した結果，誕生したマ入や発現が確認できることから，これらの細胞を用

ウスの成長が明らかに促進されたことを報告した。

いて核移植をした場合，組換え体の成功率が飛躍的

このいわゆる スーパーマウス の誕生は，畜産分に向上される。培養体細胞への遺伝子導入に用いら野でも注目され，ブタを用いた同様の研究がアメリれる，発現ベクターあるいはノックアウトベクター

カ農務省を中心に盛んに行われた。しかし，満足でには，通常，ネオマイシンやピューロマイシン等のきる結果は得られず，成長促進が見られなかったば抗生物質に対する耐性遺伝子が組み込まれる。したかりか，痩身，胃潰瘍，無性欲などの異常が多発しがって，これらの薬剤を培養液に添加することによ

１）た 。成功率に関してみると，前核内注入法によるり，遺伝子が組み込まれた細胞のみが生存し選択さ産子の誕生率は約 8%，遺伝子が導入された個体のれることになる。しかし，遺伝子が導入されても，誕生率で約 0.7%，実際に遺伝子が発現した個体の必ずしも発現するとは限らない。実際には，多くの誕生率は約 0.4% と低いものであった。また，遺伝

細胞で遺伝子の発現は見られない。この解決策の一子の発現がみられた個体であっても，発現細胞と非つには，FACS（ﬂuorescence activated cell sorting）

発現細胞が入り交じるモザイクの状態となり，導入解析による発現細胞の選択があげられる。導入したした遺伝子が生殖細胞を介して必ずしも後代に伝わ遺伝子の発現が細胞表面上に影響を及ぼす場合には，らない欠点を有することが明らかになった。実験動抗体等を用いて直接に細胞が選択できる他，細胞質物としてブタを利用するためには，任意の組換え体

内 で の 発 現 の 場 合 に は，導 入 す る 遺 伝 子 に GFPを得て，安定的に獲得した形質を後代に伝えること（green ﬂuorescence protein）等の蛍光タンパク質が必須条件となる。ブタの前核内注入法は，これらを連結することにより，間接的ながら発現細胞の選の点で全く実用性に欠ける技術であった。その後マ択が可能となる。我々は，FACS 解析により導入遺

ウスでは，ES（embryonic stem）細胞が作出され，伝子が発現した細胞のみを選択し，体細胞クローン

相同遺伝子組換えによる遺伝子ターゲッティングがに用いた結果，誕生した全てのクローンブタにおい56（2），20107（23）て導入遺伝子の発現が認められ，その有効性が極め

チャー会社が，2002 年に相次いで体細胞クローンて高いことを明らかにした。体細胞クローン技術の技術を用いたヘテロのα1,3GT ノックアウトブタの問題点の一つに，成功率が動物種にかかわらず約作出に成功し 4）5），その後，ホモのノックアウトを1% と低いことがあげられる。そのため，誕生した経てヒヒへの臓器移植が実行された。その結果，超個体が確実に遺伝子組換え体であることの意義は極

急性拒絶反応の抑制効果は確認されたが，引き続く

めて大きい。さらに，前核内注入法と異なり，体細急性拒絶反応の問題が残った。我が国においても，

胞クローンの場合にはモザイクが生じることがなく，我々を含む 2 グループでα1,3GT 遺伝子ノックアウ獲得した形質を確実に後代に伝えることができる大トブタの誕生に成功している。

きな利点を持つ。
（3）体細胞クローン技術による遺伝子ノックアウトブタ

4．我々の試み

マウスでは，ES 細胞による特定の遺伝子座の改前述のように，ブタは実験動物としての可能性を変が可能である。しかし，ブタでは ES 細胞の作出

大きく秘めている。そこで，我々（農業生物資源研，ができず，同様の手法を用いることができなかった。

理化学研，名古屋大学，（株）プライムテック）は

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相同遺伝子組換えの頻度は 1/10 〜 1/10 と低い。

2007 年より，農林水産省委託プロジェクトにおいこれだけ多数の受精卵を用意することは不可能なたて医療用モデルブタの開発に取り組んでいる（図 2）。

め，前核内注入法による遺伝子ターゲッティングも， 同プロジェクトでは，臓器移植用，再生医療用，お全く非現実的であった。一方，培養細胞の場合には， よび疾患モデル用の 3 分野において，体細胞クロー
例えば，10 cm 大のシャーレで，106 個の細胞を容ン技術と遺伝子組換え技術の併用による新たなブタ易に用意することができる。体細胞の場合，ES 細の開発を行っている。疾患モデルとしては，生活習

胞よりも相同遺伝子組換えの頻度がさらに低くなる

慣病および癌をターゲットにしている。プロジェクとされているが，実際には比較的に増殖速度の速い

ト以前に 3 種類の遺伝子組換えブタの作出に既に成胎児由来の線維芽細胞を用いることにより，遺伝子

功していたが，その後，3 種類の遺伝子ノックアウ

ターゲッティングは可能である（図 1）。

トブタを含む，7 種類の遺伝子組換えブタ（計 10種類）を誕生させている。それら全ての詳細を述べる段階ではないが，異種移植研究に関連した遺伝子組換えブタに関して紹介したい。我々は GFP 発現ブタ 6）の成功に引き続き，異種移植を目的とする 2種類の遺伝子組換えブタの作出に成功した。その一つ は，補 体 反 応 を 抑 制 す る hDAF（human decay
accelerating factor）を高発現するブタで，もう一種は異種抗原であるαGal 抗原を特異的に切断する酵
素，EndoGalC（endo–β–galactosidase）を 発 現 す
るブタである。両者とも，前述の FACS 解析により発現細胞を選択し，体細胞核移植により誕生させている。特に hDAF 発現ブタに関しては，FACS の利

図1

ノックアウトクローンブタの作出法

体細胞クローン技術を用いた遺伝子ターゲッティ
ングに最も注目したのが，異種移植の分野である。
ブタ臓器は，生理学的および解剖学的にヒトに類似することから，慢性的に不足しているヒト臓器の代換え利用が考えられている。しかし，ブタ細胞表面には，主要異種抗原であるαGal 抗原が存在するため，ヒトへ移植した場合には超急性拒絶反応が生じてしまう。そこで，αGal 抗原を発現させる酵素であ る，α1,3GT（α1,3galactosyltransferase）の 遺 伝子ノックアウトが考案された。欧米の 2 社のベン

図2

開発中の遺伝子組換えブタ

8（24）

日生研たより用により，ヒトの 30 倍以上の発現量を持つ，他に例のないブタが得られている。次に，両者の交配に

参考文献

より両遺伝子を保持するブタも誕生し，これらのブ

1. Pursel, V. G., Bolt, D. J., Miller, K. F., Pinkert, C. A.,

タから腎臓を摘出し，ヒヒへの移植を実施した。海Hammer, R. E., Palmiter, R. D. and Brinster, R. L.

外での報告では，強力だが臨床への利用が認可されていない免疫抑制剤や，予め胸腺の移植による免疫1990. Expression and performance in transgenic
pigs. J. Reprod. Fert. Suppl. 40 : 235–245.

寛容を誘導した状態での異種移植試験が実施されて

2. Onishi, A., Iwamoto, M., Akita, T., Mikawa, S.,いる。我々は，臨床で用いられる通常の免疫抑制剤

Takeda, K., Awata, T., Hanada, H. and Perry, A. C.

の使用下での移植試験とした。その結果，超急性拒絶反応は抑制され，ブタ腎臓はヒヒ体内で約 1 週間

F. 2000. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 289 : 1188–1190.

生着したが，その後の拒絶は免れなかった 7）。En-

3. Polejaeva, I. A., Chen, S. H., Vaught, T. D., Page, R.

doGalC 発現ブタは，95% 以上のαGal 抗原を切断除

L., Mullins, J., Ball, S., Dai, Y., Boone, J., Walker, S.,

去するが，100% の除去は不可能である。そのため，

Ayares, D. L., Colman, A. and Campbell, K. H. S.

次の段階として，100% のαGal 抗原の除去を可能と

2000. Cloning pigs produced by nuclear transferfrom adult somatic cells. Nature 407 : 505–509.

する，α1,3GT 遺伝子ノックアウトブタの利用が必要となる。また，凝固系の抑制も不可欠なことから， 4. Lai, L., Kolber–Simonds, D., Park, K. W., Cheong,
抗凝固を目的とする遺伝子組換えブタも必要となる。

H. T., Greenstein, J. L., Im, G. S., Samuel, M.,

我々は，既にその両者の遺伝子組換えブタを誕生さ

Bonk, A., Rieke, A., Day, B. N., Murphy, C. N.,

せており，その有効性の評価が今後の課題となってCarter, D. B., Hawley, R. J. and Prather, R. S. 2002.
Production ofα–1,3–galactosyltransferase knockいる。

out pigs by nuclear transfer cloning. Science
295 : 1089–1092.
おわりに我々の作出したブタは，いずれも食肉用の家畜ブタを用いている。遺伝子組換えブタの作出においては，体細胞クローン技術の成功率の低さを考慮すると，価格および繁殖性の点で有利な家畜ブタを用い

5. Dai, Y., Vaught, T. D., Boone, J., Chen. S. H.,
Phelps, C. J., Ball, S., Monahan, J. A., Jobst, P. M.,
McCreath, K. J., Lamborn, A. E., Cowell–Lucero, J.
L., Wells, K. D., Colman, A., Polejaeva, I. A. andAyares, D. L. 2002. Targeted disruption of the α–

ミニブタ化の必要性が生じる。また，実験用動物の

1,3–galactosyltransferase gene in cloned pigs. Nat.
Biotechnol. 20 : 251–255.

基準に適した微生物制御の問題もある。これらの問

6. Watanabe, S., Iwamoto, M., Suzuki, S., Fuchimoto,

題は，家畜ブタとミニブタとの交配により解決する

D., Honma, D., Nagai, T., Hashimoto, M., Yazaki,

ことができる。

S., Sato M. and Onishi, A. 2005. A novel method for

ざるを得ない。しかし，実験用としての普及には，

実験動物としてのブタは，大きな期待が持たれる
一方，決して普及は進んでいない。実験用ブタへのthe production of transgenic cloned pigs : electroporation–mediated gene transfer to non–cultured

関係者あるいは医学関係者が単独で行動しても解決

cells and subsequent selection with puromycin.
Biol. Reprod. 72 : 309–315.

できない。アメリカにおいては，医薬医療分野での7. Yazaki, S., Iwamoto, M., Onishi. A., Miwa, Y., Suzu-

新たなブタの需要拡大を見越し，農学分野と医学分

ki, S., Fuchimoto, D., Sembon, S., Furusawa, T.,

野の橋渡しとなる，国立のブタ資源研究センター

Hashimoto, M., Oishi, T., Liu, D., Nagasaka, T., Ku-（National swine resource and research center） がzuya, T., Maruyama, S., Ogawa, H., Kadomatsu, K.,

2003 年に設立された 8）。同センターは，農学分野

Uchida, K., Nakao, A. and Kobayashi, T. 2009. Successful cross–breeding of cloned pigs expressing

理解を深めるための普及活動が欠かせないが，農学と医学分野の情報交換の場とし，実験用ブタの維持および配布を実施する他，遺伝子組換えブタの開発，
ブタ胚の凍結保存技術の開発，微生物制御法の開発，
遺伝子モニタリング技術の開発などを行っている。
アメリカでの動向は，新産業創出に向けた新たな戦略と考えられ，日本においても同様の組織の設立が強く望まれる。

endo– β–galactosidase C and human decay accelerating factor. Xenotransplantation. 16 : 511–512.
8. Web site: http://www.nsrrc.missouri.edu/

56（2），2010

9（25）レビュー 2

ニワトリ乳酸脱水素酵素 A サブユニット遺伝子（LDH‒A）プロモーター領域の解析
勝俣
乳酸脱水素酵素（LDH）は解糖系においてピルビン酸→乳酸を触媒する酵素として古くからよく研究されている。この酵素は，生殖細胞を除く体細胞
では 2 種類のサブユニット（A 及び B サブユニット）からなるヘテロ 4 量体を形成し，各ヘテロ 4 量体（A4, A3B1, A2B2, A1B2, B4）の比率は組織によって異なっている。LDH は各組織に多量に発現しているタンパク質であり，その発現量は転写レベルで調節されていることが知られている。したがって，
タンパク質をトランスジェニック動物で大量に発現させる場合のよいプロモーターになることが期待される。一方，近年，解糖系の酵素について，いわゆ
る化学反応を司る酵素としての機能だけでなく，別の機能を持つという報告が多数なされている 1）。
LDH についても，LDH–A サブユニットが一本鎖
DNA 結合タンパクであること 2），LDH–B がアヒル
で目のレンズの構成タンパクである e–crystallineと同じ遺伝子にコードされていること 3）など，興
味深い知見が報告されている。そこで今回，我々は淳

ニワトリ LDH–A サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター解析を行った。
ニワトリゲノムから得られた LDH–A プロモー
ターを含むフラグメントの塩基配列を決定し た（GeneBank Accession No. AB3818）。すでに報告されているヒト，マウス等のプロモーターと同じように，SP–1，AP–2，CREB などの転写因子の結合配列があり，また TATA–BOX がない，G–C に富むといった典型的なハウスキーピング遺伝子のプロモー
ターの特徴があった。 次に，ニワトリ繊維芽細胞から得た mRNA を鋳型に 5 RACE を行い，転写開始点を決定した。クローニングした cDNA の塩基配列を調べたところ，4 種類に分類されたので，clone 1–4 とした（図 1）。これらクローンのシーク
エンス解析から，スプライシング部位の異なるク
ローンの存在も明らかとなり，転写開始点およびス
プライシングの異なる 4 種類の RNA が存在することがわかった。図中の clone 3, 4 については，G ク(A)
LDH genome CTCACCCACCCCGCTACGACCGCAGCCGCGCTAGAAGGGGAAGACGCCGG(gtag---intron---tttcag)CAGTACACC
CE5‘clone1 GGGGGGGGGCCCGCTACGACCGCAGCCGCGCTAGAAGGGGAAGACGCCGG
CAGTACACCATGTCTCTCAAGGA
CE5‘clone2 GGGGGGGGGCCCGCTACGACCGCAGCCGCGCTAGAAGGGGAAGACGCCGG-----TACACCATGTCTCTCAAGGA
CE5'clone3 GGGGGGGGGGGGGCTACGACCGCAGCCGCGCTAGAAGGGGAAGACGCCGG-----TACACCATGTCTCTCAAGGA
CE5'clone4 GGGGGGGGGGGGGCTACGACCGCAGCCGCGCTAGAAGGGGAAGACGCCGG
CAGTACACCATGTCTCTCAAGGA

(B)

(C)

図 1 5 RACE クローンの塩基配列および LDH‒A プロモーター領域の解析（A）ニワトリ繊維芽細胞から得た RNA を鋳型に 5 RACE を行った。4 タイプの 5ʼ RACE クローンの塩基配列を示した。図中赤字の C および G は転写開始点，小文字はイントロンを示す。2 つの異なるイントロンの 3ʼ 末端はゲノムシークエンス（最上段）にアンダーラインで示した。
（B）プロモーター領域，deletion plasmid の図およびスロットプロットの結果。最上段にゲノムの構造，その下に各deletion plasmid に含まれるフラグメント，各 plasmid 右にスロットプロットの結果を示した。図中 ND は実験を行っていない事を示す。
（C）（B）に示した plasmid の抗 EGFP 抗体ウエスタンブロティングの結果
MW; マーカー，C1; pEGFP–C1, NC; トランスフェクションしていない細胞のサンプル

10（26）

ラスターの最後の G が一連の反応中に付加されたG なのか，鋳型 cDNA 由来のものであるかを確かめるため，5 RACE のヌクレオチド付加反応の基質
を A に換え，前述と同様に 5 RACE を行った。ただ，これらのスプライシング部位の違いは，オープ
ンリーディングフレーム（ORF）の上流に位置し，LDH の ORF の上流に翻訳開始コドンは見られない事から，コードされているタンパク質には影響はな
いと考えられた。

日生研たよりEGFP タンパク質の発現量は相関していて，–282〜 –232 bp の抑制エレメントの存在が確認された。
驚いたことに，plasmid S では EGFP タンパク質が検出されず，タンパク質に翻訳されない転写が起こっている事が示唆された。plasmid S は RNA の発現量も多い，すなわち，転写活性が強いのでこの領域の解析を行うことにした。

前述と同様に，plasmid S を導入した HeLa 細胞から RNA を調製し，5 RACE クローンを得た（図次に，転写開始点を含む，LDH ORF の翻訳開始
2A）。クローンは 3 種類に分類され，それぞれ，通コドン ATG の上流約 1,200 bp の領域について，図常のスタートサイト（S1）, イントロン内 –42（S2）1B に示すような deletion シリーズを作製し，EGFP
および –52（S3）から転写が起こっていた。
の上流に繋いでプロモーター活性を調べた（図 1,
S フラグメントからの転写が in vivo でも起こっB）。それぞれのプラスミドを HeLa 細胞に導入し，ているかを調べるために，鶏の心筋，骨格筋，およ24，48 時 間 後 に RNA を 回 収 し，EGFP 断 片 を プ
びふ卵 48 時間目の embryo から採取した RNA を鋳ローブとしてスロットブロットを行った。
型に oligodT アダプタープライマーで逆転写し，3そ の 結 果，図 1B の plasmid BBs と plasmid EBs
RACE を行った。5 RACE で決定した上流プロモー
での RNA の発現量から，–282 〜 –232 bp（図中のターの転写開始点（▼）の下流に作ったプライマー，
ヌクレオチドの番号は翻訳開始コドン ATG の A を
LFH–START および第 1 イントロン内からの転写産+1 とした）には発現を抑制するシスエレメントが物の 5 末端（▽）の下流に作ったプライマー , LDH–42 を用いてそれぞれの転写産物の区別をした。そある事が示唆された。
一方，plasmid S においては 48 時間後にスロットの結果，図 2B に見られるように，第 1 イントロン
ブロットで特異的なシグナルが検出され，予想され内からの転写産物（レーン ST）が各組織に存在すたプロモーター領域を欠失した，すなわち，典型的ることが判明した。3 側のプライマーは oligodT でなプロモーター配列を持たない S フラグメントにあることから，それらの RNA は polyA 付加を受けもプロモーター活性があることが判明した。
ることが明らかとなった。すなわち，第 1 イントロ
一方，それぞれのプラスミドから EGFP タンパクン内にプロモーター（以降，近位プロモーター）が質が生産されているのか，48 時間後に細胞を回収し， 存在することが明らかとなった。
ウ エ ス タ ン ブ ロ ッテ ィン グ で 調 べ た（図 1C）。
と こ ろ が，近 位 プ ロ モ ータ ー に は，RNA
plasmid BBs と plasmid EBs で の RNA の 発 現 量 とpolymerase II のプロモーターの一般的な特徴が見

図 2 近位プロモーターの転写開始点および転写産物の解析（A）LDH–A genome と 5 RACE クローンの比較 HeLa 細胞に plasmid S をトランスフェクトしたサンプルから得られた RNA を鋳型にした 5 RACE の結果および，図 1 で 5 RACE で付加させるヌクレオチドを A に換えて行った 5 RACE の結果を示した。星印は genome およびクローン S2,3 間で，また，小さい点は genome とクローン S3 で配列が一致していることを示す。▼は上流プロモーターの転写開始点，▽は plasmid S をトランスフェ
クトした HeLa 細胞での plasmid S の転写開始点。
LDH–START および LDH–42 は（B）で PCR に用いた 5 側のプライマーを示す。
（B）心筋，骨格筋および 48 時間ふ卵後の embryo における下流プロモーターからの転写産物各サンプルから得られた RNA を 鋳 型 に，oligo dT adapter プ ラ イ マ ー で 逆 転 写 反 応 を 行 い，(A) に 示 し た プ ラ イ マ ー と oligo dT
adapter プライマー内の配列に相補的な M4 プライマーを用いて PCR を行った。ST および –42 は PCR に使った 5 側プライマーで，それぞれ (A) に示すプライマー，LDH–START と LDH–42 を示す。

56（2），2010

in vitro 転写系を用いた近位プロモーターのα‒amanitin 耐性転写活性の解析
In vitro HeLa 細胞転写系に plasmid S を加え，α–amanitin の存在・非存在下で転写反応を行い，その転写産物を鋳型に PCR を行った。
レ ーン 1, 2 は プ ラ ス ミ ド 中 に 含 ま れ る SV40 major
late プロモーターで読まれる Neo 遺伝子について PCRを行ったもの（加えたα –amanitin で pol II による転写が抑えられることを示している）。レーン 7, 8 は逆転写
反応前に RNase を加えたもの。
図311（27）

図 4. 心筋，骨格筋および embryo での上流プロモーターおよび近位プロモーターからの転写産物各組織から得た RNA を鋳型に LDH–A ORF 内の上流（+890）に設定したプライマー LDH3–7 で逆転写反応を
行 い，LDH3–14（+861）と LDH–START ま た は LDH–
42 の間で PCR を行った。

プロモーターからの転写が盛んに行われ，近位プロ
モーターからの転写は弱い事が示唆された。
図 2 に見られるように polyA 付加される RNA の量は，embryo においても上流プロモーターからのられない。そこで，plasmid S を HeLa Cell in vitro
転写産物に比べて多い様子はないことから，図 4 に転写系に加え，転写活性のα– アマニチンに対する見られた近位プロモーターからの転写産物由来の感受性を in vitro で調べた（図 3）。
PCR 産物は polyA 付加されていない RNA 由来であ転 写 反 応 後 に RNA を 抽 出 し，oligo dT ア ダ プ
ると思われる。今回，ここには示さなかったが，近ターで逆転写後，アダプタープライマーに特異的な
位プロモーターからの転写産物をダイレクト・シー
プ ラ イ マ ー M4 と LDH–42 で PCR を 行 い，polyA付加される RNA を検出した（レーン 3, 4）。さらに， クエンスし，得られた塩基配列をデーターベースに
照 合 し た と こ ろ，機 能 不 明 の ニ ワ ト リ RNA
EGFP の ORF 内の 5 側に作ったプライマーを用い（GeneBank Accession No. AJ720887 ）と高い相同性て RT–PCR を行い，polyA 付加されない RNA も検があった。しかしながら，今回塩基配列を決定した
出した（レーン 5, 6）。
LDH–A ゲノム領域 1,200 bp にはこれと相同性のあそ の 結 果，こ の プ ロ モ ータ ー か ら 転 写 さ れ る
る領域がなかった。
RNA は 2 種類存在することが示唆された。 一つは polyA 付 加 を 受 け る RNA で，こ れ は 20 μg/mlのα– アマニチンに感受性を示すことから，一般にこのことは，この配列が LDH–A 遺伝子の下流のタンパク質をコードする mRNA を 転 写 す る RNA
イントロン中にコードされている可能性を想像させpolymerase II で転写されていることが示唆された。
るが，まだ，その箇所を特定していない。
–
もう一つは，α アマニチン耐性であることから
以 上 の 解 析 結 果 を 図 5 に ま と め た。ニ ワ ト リ
RNA polymerase I または III によって転写され，おLDH–A 遺伝子には 2 つのプロモーターがあり，上そらく polyA が付加されていない転写産物であるこ流プロモーターには複数の転写開始点が存在し，報とが示唆された。
次に，生体内での近位プロモーターからの転写活性をみるために，polyA 付加されない RNA をも検出できるように LDH の ORF 内の 100 base の位置にプライマーを作製し（図 4 中のプライマー LDH3–14），先程と同じように心筋，骨格筋，ふ卵 48 時
間後の embryo から得た RNA を鋳型に RT–PCR を行った。
その結果，LDH–A がほとんど発現していない心筋で近位プロモーターからの転写活性が強く，逆に
図5
LDH–A が盛んに転写されている embryo では上流

12（28）日生研たより告されている通常のプロモータと考えられた。また，転写産物は ORF の上流で異なるスプライシングを受け，2 種類の mRNA になる。通常のプロモータ
配列をもたない近位プロモーターから転写されるRNA は 2 種 類 あ り，一 つ は polyA 付 加 を 受 け，
RNA polymerase II に よ っ て 転 写 さ れ る が 他 方 はpoly A 付加を受けず，RNA polymerase I または III
によって転写される。また，近位プロモーターの転写活性は，LDH–A が転写されない心筋で強い。今回の解析では著者が思っていた程に LDH–A のプロ
モーターの活性は強くなかったが，近位プロモー
ターを欠損させる，あるいは転写に抑制的に働いているように思われる –282 〜 –232 bp の領域を欠損させる，他の遺伝子のエンハンサーを組み合わせる等の加工をすることで，強い転写活性のあるプロ
モーターを作れる可能性も残っている。サイトメガ
ロウイルス IE プロモーターに見られるように，ウイルス由来プロモーターがゲノムに組み込まれるとお知

メチル化等の修飾を受け不活性化される現象があることを考えると，トランスジェニック動物作製の上で，強い転写活性を示すゲノム由来プロモーターを作ることは有意義であると考える。また，今回の解析で明らかとなった近位プロモーターの存在，その転写産物の生体内での役割など，興味深い点が残されている。かなり飛躍するが，今回解析した LDH–
A のような解糖系酵素遺伝子のように，一見，解析し尽くされたようにみられる遺伝子でも，コードされている RNA，タンパク質が一種類か？ タンパ
ク質の機能は複数ないか？ （1 遺伝子 1 酵素⇒ 1
遺伝子複数タンパク質？ 1 遺伝子複数機能タンパ
ク質？）など，疑ってみる必要があるのかもしれない。
（研究員）
1. J–W, Kim. 2005. Trends Biochem. Sci. 30 : 142–150.
2. Cattaneo, A. 2000. Exp. Cell. Res. 161 : 130–140.
3. Wiljan H., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
85 : 7114–7118.

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（編集委員長）日生研たより昭和 30 年 9 月 1 日創刊（隔月 1 回発行）

（通巻 561 号） 平成 22 年 2 月 25 日印刷
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表紙題字は故中村⒥治博士の揮毫

平成 22 年 3 月 1 日発行（第 56 巻第 2 号）

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林

志鋒

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員／竹山夏実（委員長），入江拓也，佐藤寛子

事務／企画学術部

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