ABML2011

OS2-4

2011年11月3日-5日 東京（芝浦工業大学）

脳回路の３次元再構成技術と機能計測
3D reconstruction of neuronal network and functional measurement○ 鈴木郁郎（東京工科大学）、小田原あおい（東京工科大学）、福田真生（東京工科大学）、天野翔太（東京工科大学）、萩原詩穂（東京工科大学）、後藤正男（東京工科大学）
Ikuro SUZUKI, Aoi ODAWARA, Mao FUKUDA, Shota AMANO, Shiho HAGIWARA,
Masao GOTOH, Tokyo University of Technology
Abstract: We have developed the 2D and 3D reconstruction techniques of neuronal network, the carbon nano tube
multi-electrode arrays for real-time measurements of neurotransmitter and the simulation techniques of neuronal networkby spot heating. Reconstruction techniques are (1) neuron patterning methods using chemical inkjet printer, (2) thecollagen gel photo-thermal etching method, (3) controlling the orientation of collagen fibers, (4) micro fabrication of
biocompatible materials using excimer laser. The advantages of these methods are that it allows control of the cell numbers
and the position of synaptic connections during cultivation and that control of cell position and direction of neurite in 3D.
Using these methods, we have constructed the 3D neuronal network model with multiple layers, and confirmed thefunction of it by Ca 2+ imaging. These techniques can potentially be used for regenerative medicine and development ofdrug screening model, as well as research in basic neural biology.
Key Words: Neuronal network, 3D reconstruction, Collagen gel, 1064nm laser, Carbon nano tube, Multi-electrode arrays
1. はじめに細胞の空間配置を制御する細胞アレイチップは、生体分子との相互作用解析や細胞間相互作用解析などの基礎研究への応用および幹細胞の効率的培養法や創薬スクリーニング技術などの医学創薬分野への応用が期待されている。また、細胞から組織モデルを人工的に再構成する技術は、将来の再生医療技術や医薬品開発の評価モデルとしての応用が期待されている。本研究では、生体組織の中でも最も再構成することが難しいとされている脳組織に着目し、神経ネットワークの細胞数制御技術および脳神経回路機能で重要となる情報の伝達方向（神経突起の伸長方向）を３次元で制御した培養技術の開発を行った。また、神経回路機能で重要となる神経伝達物質のリアルタイム計測を目指した
カーボンナノチューブ微小多電極アレイチップの開発、および任意の神経細胞を自在に刺激できるレーザ局所熱刺激法を開発した。

ガロースゲル上にプリンティングした。また、３次元立体組織を構築するために、コラーゲンゲルに Rat 海馬初代培
養細胞の懸濁液を混ぜ、細胞内包型カプセルを作製した。
2-2 コラーゲンゲルレーザ加工技術による２Ｄ・３Ｄ神経回路の制御技術
細胞数や異種細胞の細胞間相互作用を 2D および 3D で制御した神経回路の再構成技術として、コラーゲンゲルレーザ加工技術による培養法を開発した。ITO ガラス上にコラーゲンゲル（Rat tail collagen typeⅠ）をコートし、細胞周りのコラーゲンゲルを 1064nm レーザ照射により融解することで細胞数を制御した。細胞播種後に任意の細胞を選んで細胞数を制御できる点と神経突起の伸長方向を培養中に誘導できる点が本技術の特徴である。
1064nmレーザ

コラーゲンゲル３細胞ネットワーク

2. 方法
2-1 ケミカルインクジェットプリンターを用いた 2D・3D
神経回路の再構成技術
神経回路の再構成技術としてピコリットルで制御できるケミカルインクジェットプリンター（CHIP-1000, shimazu）を用いた。2 次元でのパターニングは、神経細胞の接着基質である poly-D-lysine 100pL を細胞非接着基質であるア

グリア細胞

孤立１神経細胞レーザ照射領域

ITOガラス

Fig. 2 コラーゲンゲルレーザ加工による細胞数制御技術

蛍光画像 （8×8アレイ Pitch:500mm）

2-3 コラーゲンゲル繊維の配向技術を用いた神経組織の３Ｄ再構成技術
細胞体の空間配置と神経突起の伸長方向を３次元で制御する培養技術として、コラーゲン繊維配向技術を開発した。
コラーゲンゲル繊維の方向に沿って神経突起の伸長方向を誘導させる技術である。細胞体の空間配置は、PDMS マイクロチャンバにより制御し、３次元細胞体層を作製した。細
胞接着後、PDMS シートを剥がし、コラーゲン繊維の配向技術と組み合わせることで、多層構造を持った３次元脳回路モデルを構築した。

Piezo 制御

1Drop
100ｐＬ

カバーガラス
2%アガロースゲル薄膜（細胞非接着材料）
100mm

Fig. 1 Alexa488 のケミカルインクジェットプリンティング
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2-6 レーザ局所熱刺激による神経細胞刺激技術
神経細胞を刺激する技術としてケイジド化合物などを用いた光刺激や微小電極を用いた電気刺激があるが、ここでは新しい刺激法として熱によって神経細胞を刺激する技術を開発した。局所的に熱を発生させるために、レーザ吸収素材である ITO ガラス上に神経ネットワークを培養し、1064nm レーザを照射した。レーザ照射による神経細胞の誘発応答を評価するために Ca2+インジケータである
Oregon green 488 BAPTA を用いた Ca2+イメージング法と神経ネットワークの応答を多点で計測できる多電極アレイ細胞電位計測法を用いた。

Collagen gel fiberorientation
コラーゲン繊維の配向Fig. 3 コラーゲンゲルレーザ加工による細胞数制御技術

1064nmレーザ

2-4 エキシマレーザ加工技術を用いた神経回路の３Ｄ再構成技術
生体適合性材料の中に意図した形状に細胞を埋め込む技
術としてエキシマレーザを用いた細胞の３次元空間配置技術を開発した。エキシマレーザは、ガラスなどの硬い材料を３次元加工できる特徴を持つ。ここでは、材料としてコラーゲンファイバーを用いて、細胞体の位置と神経突起の伸長方向を Z 軸に制御した培養法を試みた。エキシマレー
ザによるコラーゲンファイバーの最小加工幅は約 5mm であった。

Excimer LASER

培養した神経ネットワーク
ITOガラス

熱刺激によって活性化された神経細胞

Fig. 6 レーザ局所加熱による神経細胞刺激技術

Neuron layer

2-7 細胞培養
ラット胎児（E18）から海馬神経細胞および大脳皮質細胞を採取し、neurobasal Medium（Invitrogen）、B27 Supplement（Invitrogen）培地、CO25%37℃下で培養を行った。

3D Collagen fiberMicro channel

Fig. 4 エキシマレーザを用いた 3 次元加工技術
2-5 カーボンナノチューブ微小多電極アレイを用いた神経伝達物質計測
神経細胞から放出される神経伝達物質を非侵襲に長期間計測する技術として、高導電性および吸着物質特異的な反応を示すカーボンナノチューブ（CNT）を電極材料として微小多電極アレイチップを開発した。カーボンナノチュー
ブは強い凝集特性を持ち、分散化がボトルネックとなっていたが、分散化法と電気メッキ条件を検討したことにより直径 20mm～50mm の微小電極が作製できた。作製した CNT
多電極アレイ基板の電極表面の構造評価を電子顕微鏡で行い、神経伝達物質の感度特性を電気化学測定（サイクリックボルタメトリー法）にて評価した。

3. 結果
3-1 インクジェットプリンティングを用いた神経ネットワーク培養
アガロースゲル上に poly-D-lysine 100pL をドッドプリンティングした結果、直径 100mm でリジンコートされていることがわかった。海馬神経細胞を播種した結果、リジンコート領域のみに１細胞単位でマイクロネットワークが構築されている様子が観察され、シナプス形成も確認された（Fig. 7）。また、１細胞培養では、リジンコート領域の淵に沿って神経突起が伸長し、自己ループ（Autapse）を形成している様子が高い頻度で観察された。

1細胞

2細胞

カーボンナノチューブ多電極アレイ

多電極チップ

3細胞

カーボンナノチューブ電極

50μmFig. 7 １細胞レベルマイクロネットワークアレイ
100mm20mm

３次元再構成技術として、コラーゲンゲルに細胞を内包させたカプセルのプリンティングに成功した。

Fig. 5 カーボンナノチューブ多電極アレイチップ
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3-2 コラーゲンゲルレーザ加工による細胞数制御
細胞播種後に任意の細胞を選択し、レーザ加工を施した
結果、細胞数を制御した培養に成功した。抗体免疫染色法を行った結果、レーザ加工した部分のみ Collagen gel が排除されていることが観察され、周りのネットワークと結合することなく隔離培養されていた。また、３次元ゲル内に立体的に培養されていることが確認された。更に、培養中に神経突起の伸長エリアを制御することで特定の箇所でシナプス結合させるができた。Ca2+イメージングを行った結果、１細胞レベルのネットワーク（１細胞～5 細胞ネットワーク）においても機能を有していることが確認できた。

た、細胞が接着できるマクロチャンネル内に 50mm 間隔でZ 軸加工することによって神経突起の誘導を行った（Fig.10A）。電子顕微鏡で観察した結果、作製した Z 軸ホールに神経突起が落ち込んでいる様子（Fig.10C）および加工領域のみに細胞が落ち込んでいる様子（Fig.10B）が観察された。
A

マイクロチャンネル

コラーゲンファイバー
マイクロチャンネル

BA

ニューロン

ニューロン

レーザ加工領域
10mm

A
Z軸加工

B

B

C
Micro chamber
Micro chamber

Collagen fiber

B
20mm

50mm

Fig. 8 １細胞レベルマイクロネットワークアレイ
A：隔離した１細胞培養の位相差像、B：免疫化学染色(Red:anti-collagen typeⅠ,Green:MAP2, Blue:Hoechst33258）

Neurite1mm

Neuron1mm

3-3 PDMS マイクロ加工技術とコラーゲンゲル繊維配向技術を用いた３Ｄ脳回路モデルの構築
PDMS マイクロ加工技術とコラーゲン繊維の配向技術を用いた結果、細胞体の位置と突起の伸長方向を 1 方向に制御した３次元脳回路モデルの構築に成功した(Fig.9)。また、細胞体層を多層にすることで、多層脳回路モデルの構築および大脳皮質の６層構造を再現したモデルの構築に成功した。多層構造の機能評価として Ca2+イメージングを行った
結果、層間を活動電位が伝播している様子が確認できた。
また、多電極アレイ基板上に３次元層構造を構築した結果、各層から活動電位が取得され、層間の遅延時間が 20ms 程度であったことからシナプス伝達による伝播であることが確認できた。

Fig. 10 エキシマレーザ加工による神経細胞の埋め込み
A：模式図とマイクロチャンネル内の神経回路パターニ
ンング、B：加工領域のみに培養されている神経細胞のSEM 画像、C：Z 軸加工領域に落ち込んでいる神経突起胞の SEM 画像、
3-5 カーボンナノチューブ多電極アレイ基板の開発
単層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ
共に電着法により ITO 電極上にメッキすることに成功した。
Fig. 11 は作製した単層カーボンナノチューブ電極の位相差像と電子顕微鏡画像である。約 100nm の粒状の凝集体が形成されている様子が観察され、このような表面構造は、電気メッキ条件によって異なることがわかった。
カーボンナノチューブ電極

電子顕微鏡画像

細胞体層
20mm

100nm

Fig. 11 カーボンナノチューブ微小電極
伸長突起エリア

Fig. 9 細胞体位置と神経突起伸長方向を制御した
3D 脳回路モデル
3-4 エキシマレーザ加工技術を用いた神経細胞の埋め込みコラーゲンファイバー表面に細胞非接着基質でポリエチレングリコール（PEG）をコートすることで、エキシマレーザ加工領域のみに神経細胞を培養することに成功した。ま次に、作製した微小 CNT 電極の神経伝達物質に対する感度を評価するために、電気化学測定を行った。図 12A はアセチルコリン 10nM によるサイクリックボルタンメトリー（CV）の結果を示している。0.4V 付近にピーク電流が観察された。図 12B は従来の白金黒電極の結果を示している。
濃度によらずピーク電流は検出されないことがわかった。
このことから、作製した微小カーボンナノチューブ電極は神経伝達物質に対して優れた電気化学特性を持つことがわかった。また、ドーパミン、グルタミン酸、ノルアドレナ
リンにおいても 10nM の低濃度でピーク電流が観察されたことから、細胞から放出される神経伝達物質をリアルタイ
ムで計測できる可能性が示唆された。

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の基礎研究や薬剤評価モデルや移植技術などの医学薬学分野への応用が期待できる。

Pt/pt-black 50mm電極

CNT 50mm電極

AB
50mm

50mm

70300
250

Current/nA

Current/nA

5030
10200
150100500-10-5000.20.40.60.8

Potential/V vs. Ag/AgCl00.20.40.60.8Potential/Vvs. Ag/AgClPotential/V

Fig. 12 アセチルコリン 10nM の CV 測定
A：CNT 電極、B：白金黒電極
3-6 レーザ局所加熱による神経ネットワークの誘発応答
1064nm レーザ照射による神経細胞の誘発応答を Ca2+イメージング法により観察した。ITO ガラスに照射するレーザパワーを計測したところ、8.27mW で神経細胞が刺激できることがわかった。Fig.13 はレーザ照射によって神経ネットワークが Ca2+オシレーションしている様子である。レ
ーザ照射位置周辺の神経細胞が照射直後に応答し、その後ネットワーク全体に活動が伝播している様子を示している。
更に、多電極アレイ基板に培養した神経ネットワークにレーザ照射した結果、照射後に活動電位が発生している様子が観察された。これらの結果から、局所的な熱によって任意の神経細胞を刺激できることがわかった。
Ca2+の輝度変化

aj3

1 7456c326 84 5dfg71h8ΔF/F0=0.1

レーザ照射時間

1S5. 謝辞
本研究の一部は、カシオ科学振興財団の研究助成により行われた。

abcdei

4-3 局所熱刺激による神経細胞刺激技術の開発
従来の光、電気刺激ではなく、熱によって任意の神経細胞を刺激する技術を開発した。任意の細胞および任意のシナプスを簡便に刺激する新しい方法および３次元脳回路を非侵襲に刺激する方法として発展が期待される。

Ca2+の輝度変化

レーザ照射位置124-2 神経伝達物質のリアルタイム計測を目指した CNT 多電極アレイ基板の開発
カーボンナノチューブを用いた微小多電極アレイ基板の開発に成功し、10nM の濃度において CNT 電極特異的にピーク電流が検出されることがわかった。これらの結果は、神経機能で重要となる神経伝達物質をリアルタイムで計測できる可能性を示唆しており、これまでにない新しい計測技術として多いに発展が期待できる。今後、ピーク電流が検出される酸化電位に固定して、細胞から放出される神経伝達物質を計測する予定である。

befghij

ΔF/F0=0.1

レーザ照射時間
1S

Fig. 13 レーザ局所熱刺激による神経ネットワークの誘発応答（Ca2+イメージング）
4. まとめ4-1 脳回路の３次元再構成技術の開発
神経回路を２次元および３次元で再構成する技術として、①ケミカルインクジェットプリンターを用いた細胞プリンティング技術、②コラーゲンゲルレーザ加工による細胞数制御および神経突起の伸長方向制御技術、③コラーゲンゲ
ル繊維の配向技術を用いた神経突起の 3 次元伸長方向制御技術および多層脳回路モデルの構築技術、④エキシマレー
ザ加工技術による生体適合性材料内への細胞埋め込み技術を開発した。コラーゲンレーザ加工技術は、細胞播種後に任意の細胞を選んでパターニングできる点と培養中にネットワークパターンを変化させることができる点が特徴である。また、コラーゲンゲル繊維の配向技術は、脳回路で重要となる情報の伝播方向を３次元で制御した培養技術および生体脳構造を模倣する技術として発展が期待できる。エキシマレーザ加工技術は、硬い生体材料を微細加工できる利点があるため、細胞と生体適合性材料を組み合わせた組織モデルの新しい展開が期待できると考えている。これら開発した技術を更に発展すれば、細胞間相互作用解析など
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