博 士 （ 地球 環境 科学） 川原裕 之
学位 論文 題名Study on the BiogenlCAmineReCeptorSin
Barnacleづ々励 刀郷 ロ卿 カZケ￠ た（夕 テジ マフ ジッボ にお ける生体アミンレセプターに関する研究）

学 位 論 文内 容 の 要 旨

夕テ ジマフ ジッ ボは幼生期から生体に変態する際に岸壁等への付着（接着）を行う動物 であ る。従 来、 こうした付着生物は汚損生物とされ様々な産業活動に障害をもたらすた め、 付着の 防除 に関する研究・開発が行われている。こうした研究の中でセ口トニン（ 5ーヒ ド口 キシ トリ プタ ミン ；5― HT)や ドー パミンといった生体アミンがフジッボ幼生 の付 着を誘 引す る効果のあることが報告された。これらの生体アミンは神経伝達物質と して 知られ 動物 の様々な行動などを制御している物質である。この生体アミンがフジッ ボに おいて どの ような生理的役割を担っているかを知ることは、付着行動のヌカニズ
ム を分 子レベ ルで 知るためには必要不可欠なことである。しかしながらフジッポにおいて は分 子生物 学レ ベルでの研究がほとんどなされていないため、より多くの分子生物学的 情報 が必要 とな る。そこで、本研究ではフジッポの生体アミン受容体（レセプター）に関する研究を行った。
ほ乳 類では 様々 なアミンレセプターに対するアゴニスト・アンタゴニストが知られ、そ れら に対す る親 和性の違いからアミンレセプターは幾っかのファミリー・サブファミル ーに 分類さ れて いる。しかし、フジッポの付着に対してはこれらのアゴニスト・アン
タ ゴニ ストが どの ように作用するかはあまり検討されていない。そこで、これらの試薬を 用い てフジ ッポ の付着に対する影響を系統的に解析した。予想とは異なり、付着誘因活 性を 示すセ 口ト ニン・ドーパミンのアゴニストはいずれも同様の付着誘因活性を示さ
な か っ た 。 し か し 、 ドー パミ ン関 連試 薬の 中で 1種の アゴ ニス ト（ 7一 ○H― DPAT)と1種 の ア ン タ ゴ ニ ス ト (SCH― 23390)が 非 常 に 強 い 付 着 阻害 活性 を示 した 。こ れら の付着阻害活性は既に報告されている強カな阻害剤2，5，6―トリブロモ−1‑ヌチルグラミンと同 程度 のもの であ った。さらに内在性のアゴニストのヒスタミンはフジッボの付着に対し て 影 響 を 及 ぽ さ な い に も 関 ら ず1種 の ア ゴ ニ ス ト (Dimaprit)と 1種の アン タゴ ニスト (Chlorpheniramine)が セ ロ ト ニン ・ ド ー バ ミ ン と 同様 の付 着誘 因活 性を 示す ことを 見い だした 。こ れらの結果からフジッポの体内で付着行動に関係している生体アミン
レ セプ ターは ほ乳 類のレセプターとは機能が相当異なっていることが推測され、レセプタータンパク質の詳細な解析が必要となってきた。

一 般 に、こ れまで知 られてい る種々の 生体アミ ンレセプ ターの構造 には幾っ かの共通の 特徴 があ り、これ らの情報 を頼りに フジッポ の生体ア ミンレセプ ター遺伝 子の解析 を行 った 。 生体 ア ミ ンレ セ プタ ー の 多く は 7回 の細 胞 膜 貫通 領 域 を有 し、G夕ン バクと結合 して いる 膜夕ンパ ク質であ る。この 機能的に 重要な膜 貫通領域に は非常に 保存性の 高
い 配列 が幾 っかあり 、無脊椎 動物でも ほ乳類の レセプタ ー遺伝子と も非常に 保存され た配列が あること が知られて いる。こ れらの領域に合わせて幾っかのプライマーを合成し、フ ジッ ボ 遺伝 子 を テン プ レー ト と して PCR反 応を 行 った 。 そ の結 果、 膜貫通領 域の6番目と7番 目の間の 遺伝子配列 の増幅に 成功した 。
完 全 長の 遺 伝 子を 得 る ため に フジ ッ ボのゲノ ム遺伝子 ライブラリ ーを作成 し、PCRで得 られ た 部分 配 列 を用 い てレ セ プ ター 遺伝子 のスクリ ーニングを 行った。 総数2xl05個の プラ ーク をスクリ ーニング し、最終 的に12個の 陽性ク口 ーンを単離 した。こ れらの陽性 ク口 ー ンは 制 限 酵素 の 切断 パ タ ーン やサザ ンハイプ リダイゼー ション、 PCR等の手法
で 解 析 し 、 幾 っ か の 重 複 し た ク 口 ー ン と 誤 っ た 選択 を した ク ロ ーン を 除 き、 No.9、No.15、 No.18、 No.20の 4つ の ク 口 ー ン を レセ プ ター 遺 伝 子の 候 補と し て シー ク ェンス解析 へ進めた 。
シ ー クエ ン ス 解析 の 結 果、 ク 口ー ン No.15は強いハ イブリダ イゼーショ ンシグナ ルを
示 すも の のレ セ プ タ一 遺 伝子 で は ない ことが 判明した 。ク口ーン No.9はG夕ンパ ク結合型 レセ プ ター の 持 つ幾 っ かの 特 徴 であ る 7回 の膜 貫 通 領域 、 N端 付近 の糖鎖修 飾部位、細 胞内 ル ープ 領 域 のり ン 酸化 部 位 、G夕ン パ ク結 合 モ チー フ を 有し ており目 的のG夕ン
バ ク結 合型 レセプタ ー遺伝子 のーつで あること が解った 。データベ ースをホ モ口ジー から 検索 し たと こ ろ Qア ドレ ナ リン レ セ プターに 最も近く 、セロトニ ンレセプ ターとも 高い 相同 性 を有 す る こと が 示さ れ た 。ク ロ ー ンNo.18も ま た クロ ー ンNo.9とは 異なるG夕ン パク 結 合型 レ セ プタ ー 遺伝 子 で ある ことが 解った。 クローンNo.18の ホモロジ ー検索
で はセ 口ト ニンレセ プター、 アドレナ リンレセ プターが 同様に高い 相同性を 示し、特 にセ 口 ト ニ ン レ セ プ タ ー の 5HT1フ ァ ミ リ ー と の相 同 性 が最 も 高く 示 さ れた 。 ク口 ー ンNo.20も 別の G夕 ン パ ク結 合 型レ セ プ ター 遺 伝 子で あ るこ と が 解っ たが、 翻訳領域 に遺．伝子 ライブラ リー作成時 に使用し た制限酵 素BamHIの切断 部位を含んでいたため完全長の 遺伝 子を このクロ ーン内に は含んで いなかっ た。約半 分長の部分 遺伝子で はあるが ホモ口ジ ー検索か らはやはル セ口トニ ン、アドレナリンレセプターとの相同性が示された。
こ れ らの遺 伝子が生 体アミン レセプタ ー遺伝子 であるこ とはここま での解析 め結果、
間 違い ない と推定さ れるが、 それぞれ のレセプ ターの本 来のりガン ドが何で あるかは レセ プタ ータ ンパク質 とりガン ドとのア フイニテ ィーを解 析する必要 があり、 今後の研 究に おい て、 これらの 遺伝子を 発現させ た系を用 いた解析 を通して決 定される ことが望 まれる。

― 264ー学位論文審査の要旨
主査

教授

戸倉清一

副査教授

高木信夫

副査

教授

西副査

教授 西村紳一郎（理学研究科）

則雄

学位論 文題名Study on the BiogenlCAmineReCeptorSln
Barnacle，上を 励刀銘sロ 勿ゆカZケ Z彪
（夕テ ジマフジ ッボにお ける生体 アミンレ セプターに 関する研究）

夕 テジマフ ジツボは幼 生期から 生体に変 態する際 に岸壁等への付着（接着）を行う動物 である。 従来、こう した付着 生物は汚 損生物と され様々な産業活動に障害をもたらすた め、付着 の防除に関 する研究 ・開発が 行われて いる。こうした研究の中でセロトニン(5‑ヒ ド口キシ トリプタミ ン；5―HT)やドーノヾミンといった生体アミンがフジッポ幼生の 付着を誘 引する効果 のあるこ とが報告 された。

この生体アミンがフジツポにおいてど のような 生理的役割 を担って いるかを 知ること は、付着行動のメカニズムを分子レベル で知るた めには必要 不可欠な ことであ る。しか しながらフジッボにおいては分子生物学 レベルで の研究がほ とんどな されてい ないため 、より多くの分子生物学的情報が必要となる。
申 請者はフ ジツポで生 体アミン 生理作用 に及ぼす 影響を調べるため、生体アミン受容体 （レセプ ター）に関 する研究 を行った 。ほ乳類 では様々なアミンレセプターに対するア ゴニスト ・アンタゴ ニストが 知られ、 それらに 対する親和性の違いからアミンレセプ
タ ーは幾っ かのファミ リー・サ ブフんミ リーに分 類されている。しかし、フジツポの付着 に対して はこれらの アゴニス ト・アン タゴニス トがどのように作用するかはあまり検討 されてい ない。そこ で、これ らの試薬 を用いて フジツポの付着に対する影響を系統的に 解析した 。予想とは 異なり、 付着誘因 活性を示 すセロトニン・ドーバミンのアゴニス
ト はいずれ も同様の付 着誘因活 性を示さ なかった 。しかし、ドーバミン関連試薬の中で1種 の ア ゴ ニ ス ト （ 7‑OH‑DPAT）と 1種 の ア ンタ ゴ ニス ト （ SCH‑23390)が 非常 に 強 い
付 着 阻害 活 性 を示 し た 。こ れ らの 付 着 阻害 活 性は 既 に 報告 さ れて い る 強カ な 阻 害剤
2，5，6−トリブロモ‑1‑メチルグラミンと同程度のものであった。さらに内在性のアゴニスト のヒスタ ミンはフジ ツボの付 着に対し て影響を 及ぼさな いにも関 らず1種のア ゴニスト （Dimaprit)と1種の アンタゴニ スト（Chlorpheniramine)が セロトニ ン・ドー バミン

と 同様の 付着誘因活性を示すことを見いだした。これらの結果から、フジツポの体内で付 着行動 に関係している生体アミンレセプターは、ほ乳類のレセプターとは機能が相当異 な っ て い る こと を 見 出 し 、 レ セ プ タ ー タ ンバ ク 質 の 詳 細 な 解 析 を行 った 。
一般に 、これまで知られている種々の生体アミンレセプターの構造には幾っかの共通の特徴があり、これらの情報を頼りにフジツボの生体アミンレセプ夕．ー遺伝子の解析を行 った。 生体 アミ ンレ セプ ター の多 くは 7回の 細胞 膜貫 通領 域を 有し、G夕ンバクと結合 してい る膜夕ンバク質である。この機能的に重要な膜貫通領域には非常に保存性の高い 配列が 幾っかあり、無脊椎動物でもほ乳類のレセプター遺伝子とも非常に保存された
酉己歹IJがあることが知られている。これらの領域に合わせて幾っかのプライマーを合成し、フ ジツボ 遺伝 子を テン プレ ート とし てPCR反応 を行 った 。そ の結 果、膜貫通領域の6番目 と7番 目の 間の 遺伝 子配 列の 増幅に 成功した。完全長の遺伝子を得るためにフジツボの ゲノム 遺伝 子ラ イブ ラリ ーを 作成 し、PCRで得られた部分配列を用いてレセプター遺伝 子のス クリ ーニ ング を行 った 。総 数2x105個のプラークをスクリーニングし、最終的に12個の陽性ク口ーンを単離した。これらの陽性ク口ーンは制限酵素の切断/ヾ夕ーンやサ ザンハ イブ リダ イゼ ーシ ョン 、PCR等の手法で解析し、幾っかの重複したクローンと誤 った選 択を した ク口 ーン を除 き、 No.9、No.15、 No.18、 No.20の4つのク口ーンをレセ プター 遺伝子の候補としてシークエンス解析ヘ進めた。シークエンス解析の結果、ク口 一ンNo.15は強 いハ イブ リダ イゼー ションシグナルを示すもののレセプター遺伝子では ないこ とを 明ら かに した 。ク ロー ンNo.9はG夕ンバク結合型レセプターの持つ幾っかの 特徴で ある 7回 の膜 貫通 領域 、N端 付近 の糖 鎖修 飾部 位、 細胞内 ループ領域のりン酸化 部位、 G夕 ンバ ク結 合モ チー フを有 して おり 目的 のG夕ン バク結 合型レセプター遺伝
子 のーつ であることが解った。データベースをホモロジーから検索したところばアドレナ リンレ セプターに最も近く、セ口トニンレセプターとも高い相同性を有することが示さ れた。 ク口 ーン No.18も また クロー ンNo.9と は異 なる G夕 ンバク 結合型レセプター遺伝子であることが解った。ク口ーンNo.18のホモ口ジー検索ではセロトニンレセプターヽ
ア ド レ ナ リ ン レ セ プ タ ー が 同 様に 高 い 相 同 性 を示し 、特 にセ 口ト ニン レセ プタ ーのSHT1フん ミリ ーと の相 同性 が最 も高 く示 され た。 ク口 ーン No.20も別のG夕ンバク結合型 レセプ ター遺伝子であることが解ったが、翻訳領域に遺伝子ライブラリー作成時に使用 した制 限酵 素BamHIの切 断部 位を含 んでいたため完全長の遺伝子をこのク口ーン内には 含んで いなかった。約半分長の部分遺伝子ではあるがホモロジー検索から、やはルセ
口 ト ニ ン 、 ア ド レ ナ リ ン レ セ プ タ ー と の 相 同 性 の あ る こ とを 示 し た 。
これら の遺伝子が生体アミンレセプター遺伝子であることはここまでの解析の結果、間 違いな いと推定されるが、それそれのレセプターの本来のりガンドが何であるかはレセ プター タンパク質とりガンドとのアフイニテイーを解析する必要があり、今後の研究に おいて 、これらの遺伝子を発現させた系を用いた解析を通して決定することが望まれる。
この様 に、申請者が提出した論文の内容及ぴ研究の将来性・展望が広いことから、審査 員一同 は、申請者は博士（地球環境科学）の学位を受けるにふさわしい資格を有するものと判定した。
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