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SHG(第２高調波発生光)イメージングを用いた火傷診断に関する基礎研究
Fundamental study on burn diagnosis using
second-harmonic-generation imaging○佐々木邦彦 1)，安井武史 1)，東野義之 2)，荒木勉 1)○Kunihiko Sasaki1), Takeshi Yasui1), Yoshiyuki Tohno2), and Tsutomu Araki1)

大阪大学大学院基礎工学研究科 1)，奈良県立医科大学医学部第１解剖学教室 2)
Graduate School of Engineering Science, Osaka University1)
Department of 1st Anatomy, Nara medical University 2)
E-mail:t-yasui@sml.me.es.osaka-u.ac.jp
http://sml.me.es.osaka-u.ac.jp
We propose an optical probe method for burn diagnosis using second-harmonic-generation (SHG) light
induced by collagen. The specific sensitivity of collagen SHG light to thermal change of collagenstructure is effectively used for monitoring of burn in dermis.
The proposed method clearlyvisualizes burned area and depth in fresh chicken dermis as depth-resolved SHG image with highcontrast.
１．はじめに皮膚は表皮・真皮・皮下組織の 3 層構造を有しており、真皮は皮膚の張り・弾性・水分保有といった皮膚の重要な機能に深く関与している。したがって、真皮の構造異常や構造的変化を観察することは、皮膚性状を探るだけでなく皮膚疾患に関する情報を得る上でも重要と考えられる。例えば、代表的皮膚疾患である火傷は診断手法が未だに確立されていないが、表皮下の真皮における受傷面積や深度を非接触リモー
トで客観的に評価できれば、その治療方法に関して重要な指針を得ることができる。
このような真皮には生体構造タンパク質であるコラーゲン分子が豊富に含まれており、様々なサイズの構造集合体を形成している。コラーゲン分子はポリペプチド鎖 3 重らせん構造を有しており、その光波長オーダーでの非中心対称構造ゆえに、超短パルス光照射時に第 2 高調波発生光(SHG 光)を特異的に発生することが知られている 1）。この生体 SHG 光を用いると、生体組織中のコラーゲン分布情報のみを非接触リモートで可視化できることから、新しいプローブ法として注目されている 2-4）。一方、火傷という観点で考えた場合、コラーゲン分子を構成するポリペプチド鎖の 3 重らせんは加熱と共にほどけ始め、熱変性温度である約 60℃で各々のポリペプチド鎖が糸まり状となったゼラチンに変性する。このようなコラーゲン分子の熱的構造変化は生体 SHG 光に敏感に反映され、生体 SHG 光強度の減少及び消失として観測される 5）。
したがって、このような生体 SHG 光の特性を用いると火傷診断用プローブとして有用であると考えられる。
本講演では、生体 SHG 光を用いた光学的火傷診断法に関する基礎研究を報告する。
２．実験装置
図１に実験装置を示す。レーザー光源にはモード同期チタン・サファイアレーザー（パルス幅=100fs、平均パワー800ｍW、繰り返し周波数 80MHz、中心波長 800nm）を用いる。レーザーから出射された超短パルス光は、電気光学変調器（AOM）で強度変調された後、対物レンズ（OL、×50、NA=0.42）によりサンプルに照射される。後方散乱した生体 SHG 光（波長 400nm）は、ハーモニックセパレーター（HS）、青色透過フィルター（BPF）、分光器（Monochromator）によって基本波光から分離され、光電子増倍管（PMT）でロックイン検出される。サンプルを、３次元機械ステージで走査することにより、イメージング測定を行う。さらに深さ分解能向上のため、ピンホール（PH、直径 50μm）を用いた共焦点配置を導入している。
本システムの面内分解能は約 1.5μm、深さ分解能は約 15μm である。
３．実験結果測定に用いたサンプルは、生の若鶏手羽先の皮を用いた。カッターによってスライスされたサンプル（2mm 厚）の半分の領域に対して、80 度に加熱されたアルミ板を約 1秒間押し当てて火傷部位を作成した。
火傷部位は、熱により軽く赤みを帯び、変色していることが肉眼で確認された。このようにして作成されたサンプルは、表面をフラットにするために 2 枚のスライドガラスに挟み込まれた。0µm（サンプル表面）、
40µm、80µm、100µm、120µm の各深さにおいて、SHG 光の深さ分解 2 次元イメージング測定を行った。
図 2 は、得られた SHG イメージを示しており、測定領域は 6mm×6mm である。測定イメージの左側が正常部位、右側が火傷部位を示している。サンプル表面では、正常部位からは強い SHG 光が観測されている-34-

のに対し、火傷部位からは SHG 光は観測されていない。また、火傷の有無が、高いコントラストではっきりと示されている。さらに測定深度を 40µm、80µm と深くしていっても、高いコントラストが保たれていることから、これらの深さまで火傷が到達していることが推測される。一方、測定深度 100μm、120μm では左右両部位のイメージコントラストの差異が若干小さいことから、この深さでは若干緩和されていると考えられる。

Fig.1 Experimental setup.

AOM: acousto-optic modulator, OL: objective lens, PH: pinhole (φ50μm),

HS: harmonic separator, PMT: photomultiplier tube, BPF: blue pass filter.

Fig.2 Confocal SHG images of fresh chicken at five different depths.
４．おわりにコラーゲンの熱変性に伴う生体 SHG 光の強度減少を利用した非接触リモート火傷診断に関する基礎研究を行った．火傷深度の評価に関しては，深さ分解 SHG イメージングが有効であることを確認した．今後は，共焦点反射イメージと SHG イメージの同時取得により，組織構造と火傷部位の同時測定を行う予定である．
本研究は文部科学省科学技術研究費補助金 16300155 及び 17200032 より援助を受けた．
文献1) S. Roth and I. Freund, “Second harmonic generation in collagen”, J. Chem. Phys., 70, pp. 1637-1643 (1979).
2) T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki, "Determination of collagen fiber orientation in human tissue by polarization
measurement of molecular second-harmonic-generation light", Appl. Opt., 43, pp. 2861-2867 (2004).
3) T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki, "Characterization of collagen orientation in human dermis by two-dimensional
second-harmonic-generation polarimetry", J. Biomed. Opt., 9, pp. 259-264 (2004).
4) T. Yasui, K. Sasaki, Y. Tohno, and T. Araki, Tomographic imaging of collagen fiber orientation in human tissue
using depth-resolved polarimetry of second-harmonic-generation light”, Opt. Quantum Electron., (in revision).
5) T. Theodossiou, G.. S. Rapti, V. Hovhannisyan, E.Georgiou, K. Politopoulos, and D.Yova, “Thermally inducedirreversible conformational changes in collagen protein probed by optical second harmonic generation andlaser-induced fluorescence” Lasers Med. Sci., 17, pp. 34-41 (2002)-35-