博 士（ 医学 ）丁倖

学位論文題名ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と癌抑制遺伝子p53
遺伝子導入は相乗的に癌細胞のアポトーシスを誘導する
学位論文内容の要旨
癌抑制遺伝子p53の変異はヒト癌において最も多く認められる遺伝子異常である。p53変異や欠失によってp53の機能を喪失している癌細胞に正常p53遺伝子を導入するとアポトーシスが誘導され，造腫瘍性が失われることが報告されてきた。p53遺伝子導入の臨床治験の結果は60%以下の患者でのみ効果が認められたとの成績が得られた。さらに，ある種の癌細胞はp53遺伝子の導入によるアポト丶一一シスに抵抗性であることが知られている。
したがってp53遺伝子導入療法をより効果的にするためには，併用薬剤の探索が重要と考えられる。現在は放射線療法や化学療法がそのような併用療法の候補として臨床的に検討されている。
Trichostatin
A(TSA)は当初抗真菌剤として見出された抗生物質であるが，最近ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することが報告された。さらに哺乳動物細胞の細胞周期を特異的に阻害し，自血病細胞や癌細胞のアポトーシスを誘導することも数多く報告された。従ってヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は，直接アポトーシスを誘導する機序を介する以外に，p53遺伝子発現の亢進やp53の下流遺伝子発現亢進等の機序を介して，p53遺伝子導入と相乗 的 に ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 する 可 能 性 を 仮 説 と し て 考 える こと もで きる 。
まず 第一 にTSAや FR901228が p53遺伝 子導 入と 相乗 的に 癌 細胞 のアポトーシスを誘導するのか否かを検討した。ついでp53
遺伝子導入とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の同 時処 理後 のp53
遺 伝子 発現 量 ，p53の 下流 で働 くア ポト ー シス 関連蛋白質のmRNA
発現量，ミトコンドリアの膜電位，カスベース3活性を検討した。
その 結果 、1）MDA‑MB‑231細 胞を p53遺伝 子導 入と ヒス ト ン脱 アセチル化酵素阻害剤による相乗的に癌細胞死誘 導した。PCI‑10とSW‑
480細胞では，同様に相乗効果を認めた 。 2） MDA‑MB‑231細 胞 を TSA単 独 お よ び併 用処 理し た後 のp53 mRNAも蛋 白質 も発現 増加 が示 さな かっ た。 3） MDA‑MB‑231細胞をp53，TSA単独および併用処理した後のp21 mRNAが 25 MOI濃 度 の Ad‑p53導 入 に よ っ て 誘 導 さ れ た 。 TSAの 併 用は p21 m
RNA発現に対してp53単独に比較して若干の相加的効果しか認められなかった。p53導入がp21
プロモータ一活性を誘導して いることを示しており，TSAは若干の増加効果を示した。
Bax mRNA発 現 も 同 様 に 25 MOI濃 度 の Ad‑p53導入 によ って 誘導 され た 。し かし ながらT
SAはBax mRNA
発 現の 増強 効 果を 示さ なかった。ルシフェラーゼアッセイも同様にTSAが Ba
xの プ口 モー ター 活性 を増 強し なかった。その他にp53の下流にてアポトーシ
ス に関 連す るとされている蛋白群の 発現についても検討したが，PIG3とPERP
はAd‑p53
導 入 に よ っ て 誘 導 さ れ た が ， TSAの 併 用 は 何 ら の 増 強 効 果 も 示 さ な か っ た 4）
MDA‑MB‑231細胞 をp53， TSA単 独お よび 併用 処理 した 後の ミ トコ ンドリア膜電位の変化 を示 して いる。p53単独やTSA単独 処理後にはミトコンドリア膜電位の軽度の低下を認めるが，併用すると少なく ともTSA 250nM
ではミトコン ドリア膜電位相乗的に低下させることが明らかになった。 TSA以外のヒストン脱アセチル化酵素F
R901228も同様にp53―724−と併 用すると 相乗的 にミトコ ンドリア 膜電位 を低下さ せた。5）P53単独では100M01
まで濃 度をあげ てもカ スベース 3活性 の軽度 の上昇し か認められなかった。同様にTSA単独(250and500nM)
でもカスペース3活性の軽度の上昇しか認められなかった。ー方両者を併 用 す る と 相 乗 的 な カ ス ベ ー ス 3活 性 の 上 昇 を 濃 度 依 存 的 に 認 め た 。
以上の結果は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤単独，またp53
導入単独では低レベルのアポトーシスを誘導するのみであったが，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とp53遺伝子導入を併用することで相乗的に癌細胞株のアポトーシスを誘導できた。その機序については，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とp53遺伝子導入によって引き起こされた細胞死シグナルがミトコンドリア膜電位を相乗的に低下させる可能性が示唆された。正常p53導入によって癌細胞がアポトーシスに陥るその機序はいまだ明確ではない。本研究で，p53遺伝 子導入に よって 誘導され ると報告されてきたp21とBaxの転写が，p53遺伝子導入単独に よって誘導されることを示したが，p2JとBaxの転写レベルとアポトーシスには何らの関係も見出されなかった。この事実は，ある種の細胞においてはBaxの転写がアポトーシス 誘導には十分ではないことを示唆する。さらに，p53遺伝子導入とTSAの併用によってbcl‑2を合めてp53の下流にてアポトーシスに関与すると報告されてきたさまざまの遺伝子発現に変化がなかったこと，ミトコンドリア膜電位の相乗的低下，カスペース3活性の相 乗的増強という結果が得られたことは，p53
遺伝子導入とTSAの併用が何らかの機構で相乗的にミトコンドルア膜電位を低下させ，続いてカスペースカスケードを動かしてアポトーシス誘導の増強をもたらしていると考えられる。TSA単独でもミトコンドリア膜電位をp53非 依存 的 に 低下 させ ており ，TSAやFR901228がミト コンドリ ア膜電 位の低下と言う段階にてp53
遺伝子導入と相乗効果をもたらしたと考えられる。著者の成績は，p53
アデノウイルスの注射部位から離れた部位に存在して導入p53コピー数が少ない細胞に対してもヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を併用することでアポトーシスを誘導できる可能性を示唆するとともに，p53導入単独に抵抗性の癌細胞株にもヒストン脱アセチル化酵素阻害 剤を併用することでアポトーシスを誘導できる可能性も示唆する。すでにFR901228は生体にも使用可能であることが報告されており，著者らは現在FR901228とp53導入の併用効果のinvivo効果を検討している。

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学位論 文審査の要旨

主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 守 内 哲 也
雅
副 査 教 授 今 村 和 寛
副 査 教 授 長 嶋郎
学位論文題名ヒ ス ト ン 脱 ア セ チ ル 化 酵 素 阻 害 剤 と 癌 抑 制 遺 伝 子 p53
遺 伝 子 導 入 は 相 乗 的 に 癌 細 胞 の アポ ト ー シ スを 誘 導 す る

申 請 者 は ま ず TrichostatinA(TSA)や FR901228が p53遺 伝 子 導 入 と 相乗 的 に 癌 細胞 のア ポ トー シ ス を 誘導 す る の か否 か を 検 討し た ． ついで p53遺伝子 導入と ヒスト ン脱ア セチ
ル 化 酵素 阻 害 剤 の同 時 処理後 のp53遺 伝子発 現量，p53の下流 で働く アポトー シス関 連蛋白質の mRNA発現 量，ミト コンド リアの 膜電位 ，カス ペース 3活性を 検討し た．MDA− MB−231細胞をp53遺伝子導入とヒストン脱アセチノレイ啌＃素pij.8t：用処理によって相乗的に細脆既が誘導された．p53遺伝子導入単独と併二用処ゴ里を比彰けるとp53 m
RNA量も蛋白質量も増加して
い な かっ た ． TSA処 理は Bax mRNA発 現 の 増 強効 果 を 示 さず ， BaXの プロ モ ーター活 性の増強も 示さな かった ．p53の下 流にて アポト ーシス に関連 すると されてい る他の 蛋白群 の発現に つ いて も 検 討 した が ，p53遺 伝子導 入単独 と比較し てTsAの 併用は 何らの増 強効果 も示さ
な か った ． p53単 独 やTsA単 独処理 後には ミトコ ンドリ ア膜電 位の軽 度の低下 を認め るのみ
で あ るが ， 併 用 する と 相乗的 に低下 させる ことが 明らか になっ たITSA以外 のヒス トン脱 ア
セ チ ル化 酵 素 阻 害剤 FR901228も同 様 に p53と併 用す ると相 乗的に ミトコ ンドリ ア膜電 位を低下 させた ，また 両者を 併用す ると相 乗的なカスペース3活性の上昇を濃度依存的に認めた．
以上 の結果 は，ヒ ストン 脱アセ チル化 酵素阻害 剤とp53遺伝子 導入の併 用療法 は，相 乗的にミト コンド リア膜 電位の 低二下 とカス ベース3の活性化を介してアポトーシスを誘導することを示唆する．また両者の併用遺伝子治療は有用と考えられた．
口頭 発 表 後 ，副 査 守 内 教授 か ら ヒ スト ン 脱 アセ チルイ 撚阻害 剤とp53遺 伝子導 入併用 の報告 の有無 につい て，FR901228の生体 内投与 の可能性 につい て，ヒストン脱アセチル化酵素阻害 剤とp53遺 伝子導 入の臨 床応用 の可能 陸につ いての 質問が あった． 申請者 はこれ らに対し「 今まで の両者 併：用 報告が 少ない こと，H西01228の生体内での使用可能，Hで901228単独で｜よすでに臨昧治験モ）行われており，p53遺伝子導入との併用は期待できると考えられる・」と 回 答し た ． 次 いで ， 副査今 村教授 から， p53遺伝子 の作用 機序に っいて ，TSAとFR901228に よ るカ ス ペ ー ス3活 性の増 加の差に ついて の質問 があっ た．申 請者は ，「導 入した p53の発 現 がmRNA，蛋 白 質 レ ベル で は TsA併用 に よ る 増強 が 認 め られ な か っ たこ とやp53の 下流
遺 伝 子 の 発 現 増 強 も み と め ら れ な か っ た こ と か ら p53非 依 存 的 の pathwayを 介 し てapoptosisを誘 導 す る 可能性 が考え られるこ と，TsAとFR901228の ヒストン 脱アセ チル化 酵
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素阻 害作用 機序は また明 らかに なって いないの で明確 には答 えられない．」と回答した．副査 長 嶋教 授 か ら ，ヒ ス ト ン脱ア セチル 化酵素 阻害剤の 機能と してミ トコン ドリア の膜電 位を 調 べる に 至 っ た経 緯 に ついて ，ヒス トン脱 アセチル 化酵素 阻害剤 は他の 遺伝子 の転写 活性 化 にっ い て ， ヒス ト ン 脱 アセ チ ル 化 酵素 阻 害 剤 とp53遺 伝 子 導 入に よ るカ スペー ス3活性の 増加率 とFACS解析 でのア ポトー シスの 増加度についての質問があった．申請者は，「p53の下 流遺伝 子の発 現増強 もみと められ なかった こと， 培養細 胞で見る限り，形態的に変化は見ら れなか ったこ と，カ スベー ス3活性 の増加 率はアポ トーシ スの増 加を説 明可能 と考え られる ．」と 回答し た．さ らに， 主査の 浅香教授から，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とp53
遺伝 子導入 の期待 する効 果にっ いて， 低酸素下 におけ るアポ トーシス誘導効果にっいての質問が あった ．申請 者は， 最初の 質問に 対して「 今回の 結果に より， p53アデノ ウイル スの注射部 位から 離れた 部位に 存在し て導入 p53コピー 数が少 ない細 胞に対し てもヒ ストン 脱アセチル 化酵素 阻害剤 を併用 するこ とでア ポトーシ スを誘 導でき る可能陸を示唆するとともに，p53導 入 単独 に 抵 抗 性の 癌 細 胞 株に も ヒ ス トン 脱 アセ チル化 酵素阻害 剤を併 用する ことでアポ トーシ スを誘 導でき る可能 性もあ る，」と回答し，2番目の質問には「低酸素のアポトーシス を誘導 にっい て今後検討する必要がある，」と回答した，最後に浅香教授が，上記審査員の 質 問 へ の 補 足 質 問 と そ の 回 答 の 確 認 を 行 っ て， 発 表 を終 了 した ．
本研 究 は ヒ スト ン 脱 ア セチ ル 化 酵 素阻 害 剤 は p53遺伝 子導入 と相乗 的に癌 細胞のア ポトー シ スを 誘 導 し たこ と を はじめ て明ら かにし たこと， また両 者の併 用遺伝 子治療 は有用 と考 え られ た こ と で高 く 評 価され た．今 後のさ らなる研 究と将 来の癌 治療へ の応用 が期待 される ．
審査 員 一 同 は， こ れ らの 成果を 高く評 価し， 大学院 課程に おける研 鑽や取 得単位 なども併 せ ，申請者 が博士 （医学） の学位 を受ける のに十分 な資格 を有する と判定 した．

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