Vol. 15, No. 17 (2015)

日本蛋白質科学会ニュースレター

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」
第 16～18 回原稿配信のお知らせ
平成 27 年 10 月 20 日
本年、7 月に始まった本シリーズですが、今回は第 16 回から第 18 回の原稿を配信いたします。
今回は下記の 3 先生方の原稿を配信いたします。
第 16 回

油谷克英先生

第 17 回

月原冨武先生

第 18 回

阿久津秀雄先生

なお、これまでに下記の 15 名の先生方による原稿を配信済みです。
第1回

石井信一先生

第2回

大村恒雄先生

第3回

福井俊郎先生

第4回

香川靖雄先生

第5回

岩永貞昭先生

第6回

高木俊夫先生

第7回

八木達彦先生

第8回

崎山文夫先生
崎山文夫先生「赤堀四郎先生 生誕 100 年に想う」（蛋白質核酸酵素より転載）

第9回

高橋健治先生

第 10 回

田隅三生先生

第 11 回

北川禎三先生

第 12 回

森川耿右先生

第 13 回

伊藤維昭先生

第 14 回

福山恵一先生

第 15 回

桑島邦博先生さらに、現時点で下記の先生方に執筆をお願いしています。ご期待下さい。
坪井正道先生
大島泰郎先生井本泰治先生日本蛋白質科学会 広報担当

内山 進、池口満徳

本文は PDF をご覧ください。
電子メール版ニュースレター発行〒562-8686 大阪府箕面市稲 4-1-2 千里インターナショナル内
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Tel:072-729-4125, Fax: 072-729-4165

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編集：内山 進（大阪大学大学院工学研究科）

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

蛋白質のかたち、立体構造の安定性研究------- 50 余年の私の研究の歩み --------油 谷 克 英 （ゆたに かつひで）

１.「銅鉄的研究」の教えに学ぶ

素をウサギ肝臓から抽出した。その酵素が、SS 結

日米安全保障条約改定に反対するいわゆる 60 年

合を含まないバクテリアのアミラーゼの尿素変性

安保反対闘争の真っ只中 1960 年に、大阪大学理学の再生も促進させることを見出した。促進効果に

部生物学科の 4 年生の卒業研究で生物物理化学講

は BSA なども大変有効であることが分かった(2)。

座の伊勢村寿三教授の研究室に配属された。テー

更に、還元タカアミラーゼの再生も蛋白質のある

マは「蛋白質の変性とその可逆性」。私の名前が出濃度範囲では蛋白質濃度に比例して再生速度が上た最初の論文は、先輩の大学院生、前田安昭さんの昇することを認めた(3)。これらの研究から、当時仕事を手伝ったもので、「8 モル尿素中で全ての SS

は、一分子だけなら蛋白質の変性は可逆的でない結合を切断した完全変性タカアミラーゼの再生研と真剣に考えていた。蛋白質の社会学をどのよう究」であった。しかし、この研究の評判はすこぶるに進めるべきか、未熟な知識で無駄な実験に多く悪かった。Anfinsen らの変性リボヌクレアーゼのの時間を費やした。SS 交換酵素よりもっと有効な再生研究の 2 番煎じであると。当時は、安保闘争、再生促進蛋白質の探索にも多くの時間を費やした

大学紛争で大学は荒れていたが、良い意味では「研ことを覚えている。何十年も経た今日では、分子究とは何か」をいやが上でも真剣に考えさせられシャペロンとか蛋白質の crowding 効果による安た時代であった。どのような経緯か忘れてしまっ

定化などとして学問的に確立されているが、当時たが、江上不二夫教授が「銅鉄的研究(牛馬的研究)」の私としては発展の方向を見いだせなかった。

を薦められていることを知った(1)。銅でやった研究を鉄でやる研究も悪くない。つまり、リボヌクレ
アーゼの再生研究を他の蛋白質でも行うことを推奨しているのである。これには非常に勇気を与えられた。研究のやり方を初心者に充分に納得させるものであった。
そこで、SS 結合を有するタカアミラーゼと SS結合を有しないバクテリアのアミラーゼを材料に変性とその可逆性の研究に取り組んだ。その中で、Goldberger(1963)らがラット肝ミクロソームの中に、SS 交換酵素が含まれていて、その酵素が還元
リボヌクレアーゼの再生を促進するという報文を図 1. 伊勢村研究室のハイキング。
1963 年ごろ 上段左から二人目浜口浩三さん、三人目高木俊夫さん、下段右から二人目が著者。

見つけた。しかし、よく論文を読むと酵素としては考えられないほどの大量を必要としていることが分かった。それを確認するために、自身で、その酵109

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

２．好熱菌由来の蛋白質はなぜ高い安定性を示すかかにした(4)。
「変性と再生」の研究から何を引き出すべきな1961 年に、好熱菌 Bacillus stearothermophilusのかを考える中で、どのような機構で立体構造が由来の -アミラーゼの天然状態の旋光性の値が、維持、安定化されているかを明らかにすることが8Ｍ尿素または 5M 塩酸グアニジンなどの変性剤中重要な課題の一つであると捕えるようになっていでの値と変わらないので、好熱菌蛋白質の天然構た。そこで、私自身も好熱菌由来の蛋白質の研究に

造は変性状態のようなセミランダムかランダム状も着手した。具体的には、好熱菌由来と常温菌由来態の構造である。そのため、高い温度でも構造が壊の-アミラーゼの安定性の比較実験であった。

れた状態で機能を有するとする論文が発表されて1975 年 8 月にスイスのチューリッヒで ETH のいた。当時、研究室の大学院生の小笠原京子さんがZuber の 主 催 す る 国 際 会 議 ”Enzymes andこの結果を検証すべく追試実験を行っていた。実Proteins from Thermophilic Microorganism:

験結果は好熱菌-アミラーゼも常温菌由来のもの

Structure and Function”があった。初めての海外と似た特徴ある立体構造を有していることを明ら旅行であったが、「好熱菌由来と常温菌由来の-ア

図 2. “Biochemistry of Thermophilly”の日米ジョイントセミナー（1977 年、ハワイ）
写真のうち日本人参加者、1.T.Saiki, 3. Y.Kagawa, 5. M.Yaguchi, 7. Y.Nosoh, 8. K. Yutani,
10. K.Imahori, 13. M. Oshima, 15. T.Oshima, 16. Y.Kaziro, 17. M.Tsuboi,

110

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

ミラーゼの Ca イオンの結合の強さを定量的に比参加してくれ、論文作成にもいろいろと重要な役

較して、好熱菌蛋白質の熱安定化の原因は Ca 結合

割を果たしてくれた。
この成果を1977 年にNature

定数の差異による」という論文(5)を持って参加しに発表(6)することができたが、彼が参加していな

た。すべての発表は oral で、5 日間に及ぶものでければ J. Biochem.に投稿していたであろう。表 1あった。
その論文集は Experientia Supplementum,

は、大腸菌トリプトファン合成酵素サブユニット

26 として出版されている(5)。ページ数は 450 ペーの 49 位の Glu を Gln に置換すると野生型よりもジ近くあり、”Round table and general discussion”

安定性が低下し、Met に置換すると安定性が向上の記録も含まれている。英語も充分に聞き取れなすることを示している。同じ 49 位での置換が置換かったが、会議に参加して、自分の研究発表との関残基の種類によって、安定性を高くも低くもさせ係で、アミラーゼの熱安定化の差異である Ca 結合

ることが分かった。このように、同じ部位での置換定数の差は、両者のわずかなアミノ酸の差異に依が安定性を著しく変化させるので、49 位で一揃い存するであろうと確信できた。会議では”Round

19 種の変異型の安定性研究が完成すれば安定性のtable….”の議論は全く理解できなかったと記憶し理解は飛躍的に進むであろうと思い、ぜひ定年まているが、今あらためてその記録を読み返してみでの 25 年間に完成させたいと強く決心したことをると、その重要な部分を聞き取っていたことにな覚えている。
当時可能な分子生物学の手法を駆使して得られる。

た、49 位での一残基変異型を徐々に増やしていっ３．アミノ酸一残基置換の研究た が 、 残 っ て い た 13 種 の 変 異 型 は 合 成
oligonucleotide

好熱菌蛋白質が僅か数残基のアミノ酸置換が重を 用 い たsite-directed

要なポイントとなって熱安定化していることを追mutagenesis によるものであった。Ulmer が究しようとする時、好熱菌と常温生物蛋白質間にScience に“Protein engineering”の展望を記載しは熱安定化に関係のない多くの残基の差異が存在たのは 1983 年である。時代の流れに乗れたので、するので、どの残基が重要かを特定するのは大変

一揃いの変異型が完成して、論文として発表でき困難である。いろいろと検討をしていたが、確か職たのは 10 年後の 1987 年であった(7)。
その結論は、員組合のハイキングの時、松代愛三教授（阪大微研、49 位は分子内部にあり、分子内部での置換は、置

80 ファージの発見者）に相談したところ、トリプ
トファン合成酵素サブユニットなら多くの一残基変異型の株が分離されているし、彼自身もいく
らかの株は所有している。また、他の株が必要なら簡単に航空便（Yanofsky などから）で入手できるとのことであった。トリプトファン合成酵素サブユニットは、“蛋白質安定化機構をアミノ酸置換から解明する”ために必要と考えていた次の 3 条件に適っていた。①多くの変異型が分離されている。
②SS 結合を含まない単量体蛋白質である。③立体構造が近く期待できる。当時、大腸菌トリプトファ
ン合成酵素αサブユニットのＸ線解析のための結晶の論文が既に(1969, EJB)発表されていたが、私達が 2001 年に結晶構造を発表するまでαサブユ
ニット単独の構造は解かれなかった。この研究には、同期の杉野義信さん（阪大理、分子遺伝学）も111

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

換残基の疎水性に比例して安定性が高くなるとい性のギブスエネルギー変化(G)を求めた。平衡定

うことであった。これらの一連の研究によって、数を得るための非線形解析のプログラムは岩崎裕

49Glu がαサブユニットの活性必須アミノ酸であさん（阪大産研）の援助を得て自身で作成した(8)。

ることも判明した。当初、精製αサブユニットを得その時のプログラム作成の経験はその後の研究にるために、大腸菌を 200L のタンクで培養していて、いろいろと役立っている。しかし、いくつかの仮定

小さな工場での作業のようであった。だが、遺伝子を含む 3 状態の変性剤変性から求めたG の値の操作技術の進展に伴って、5L のフラスコのレベル

信頼性を得るために、他の方法による検証が必要まで低下できたことはありがたかった。

であった。最も信頼性の高い熱力学的パラメータの求め方は、精度の高い熱量計で直接変性の熱量

４．安定性の定量的評価----カロリメータの導入を求めることである。当時、それが可能な装置はソ連の Privalov らが開発した断熱型示差走査熱量計

サブユニット変異型の安定性の定量的評価は、(Differential Scanning Calorimeter; DSC) 、

塩酸グアニジンによる変性を次構造の指標とな

DACM1 のみであった(9)。そこで、試料を持参しる 220nm 付近の CD スぺクトルの変化から追跡して彼の研究室で測定することを決意した。日本学

た。サブユニットの変性曲線は安定な中間状態を術振興会とソ連科学アカデミー間の交流プログラ

もつ状態変性のカーブであった。このカーブをムがあったのでそのグラントを利用して、モスク

curve fitting によって平衡定数を求め、それから変ワオリンピックが開催された翌年の 1981 年 3 月

図 3. ソ連科学アカデミー蛋白質研究所滞在時の写真(1981 年 3 月～6 月)(1)研究所全景、残雪が見られるが、到着した３月中旬には一面に数十センチほどの雪が積もっていた。(2) カロリ
メータ、DACM1、左側が本体、右側は XY レコーダー、(3) ４月中旬、研究所の近くに流れる Oka 川の氷が解け始めた様子、(4)６月上旬の研究所創立記念日に上図の川に船でハイキング。参加者は川での水浴を楽しんでいた。写真は川岸で Privalov 研の女性たちと。

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

中旬から 6 月末まで、モスクワから南方 120-

５．ヒトリゾチームを用いた系統的で網羅的

130km 離れた研究都市、Poustchino にあるソ連科

変異型の研究学アカデミー蛋白質研究所を訪問した。当時のソ

1990-91 年頃、
阪大吹田キャンパスに隣接する蛋連は、食糧難などネガティブな情報ばかりであっ白質工学研究所（蛋工研）の Thierry Herning、黒たが、予想外に、食糧、住居などの環境も申し分な

木良太、谷山良雄さんらがヒトリゾチーム変異型

く、研究室の最も調子のよいカロリメータを使っの熱測定に私どもの DSC（示差走査熱量計）またて測定も手伝ってくれた（実質は測定してもらっは ITC（等温滴定熱量計）を利用していた。トリた）。得られたデータは変性剤変性から得られたデプトファン合成酵素サブユニットは、大腸菌由来

ータを確証してくれるものであった。カロリメーの蛋白質の中で最も早くその立体構造が解かれる

タに魅せられ、その後の安定性の定量評価は熱測と期待されていたが 10 年たっても解析の見込みが定が中心となった。しかし、ソ連のカロリメータを立っていなかった。アミノ酸置換による安定性研

すぐ購入したわけではない。アメリカの知人によ

究は、野生型は勿論のこと置換による変異型の構ると、DACM1 を輸入すると 3 か月で故障して、造変化の情報も必須である。蛋工研で用いていた修理に 1 年かかるとのことであった。
そのことを、

ヒトリゾチームは、変異型の作成方法とその発現

真空理工の岸 証さんに話すと、回路部分の修理は系も確立され、変異型も X 線構造解析に適した結真空理工で対応するとのことなので DACM1 を購晶が容易にでき、その上、熱測定に適した蛋白質で入した。真空理工の技師によると DACM1 の回路あると確信できたので、ヒトリゾチームを用いた部分は 30 年遅れているが DSC 本体のセル部分は系統的で網羅的変異型の研究を始めた。表 2 には

日本では作れない精巧なものであるとのことだっ取り組んだ変異型の例を示す。1992 年 4 月、4 年

た。ある特化した部分に優れているのは、流石に、生で研究室配属になった高野和文さんを蛋工研の最初に人工衛星を飛ばせる国である。

菊池正和さんの研究室に派遣して、ヒトリゾチー

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

ムの変異型の作成法と発現、精製法を習得してもっている。しかし、変性状態を通じて形成されたア

らった。Ｘ線結晶構造解析も習得するために、彼をミロイドのコア構造は一次配列によらずに一様に

阪大薬学部の山縣ゆり子さんの所に派遣した。蛋クロスβ構造をとる。このβ構造は非常に安定で

白研では物理化学的測定と研究室の雑誌会に参加

実質的に不可逆である。これら一連の実験結果かした。彼は大学院生と学術振興会特別研究員としら、アミロイド形成は蛋白質共通の普遍的な性質て 2001 年まで在籍し、表 2 に掲げた多くの変異型であると認識していた。アミロイド形成の物理化の研究に後輩の学生、院生と取り組んだ。代表的な学は大変興味ある課題であるが、これ以上追及す論文を 2-3 挙げておく(10-12)。それらの研究を総る余裕がなかった。

合的に解析して、アミノ酸置換による蛋白質の安７．超好熱菌由来の蛋白質を用いた研究

定性変化に及ぼす各安定化因子の定量的パラメー
タを推定できた(12)。例えば、それらのパラメータ1970-80 年代に、生育至適温度が 100℃近くの微を用いると、「置換により 3Å の水素結合が１本増生物、超好熱菌(hyperthermophile)が次々に発見

えれば 8.6kJ/mol の安定化を獲得できる。また、空されていたので、いつかチャンスがあれば超好熱洞に水分子が入り 2 本の水素結合ができれば、水菌由来の蛋白質の安定化機構の研究をしたいと考素結合形成による安定化と水の挿入で得るエント

えていた。1996-7 年頃、宝酒造の加藤郁之進、綱ロピーの減少で相殺され、安定性への影響はほと沢 進 さ ん な ど の 協 力 で 超 好 熱 菌 Pyrococcus

んどない。
」ということが分かる。

furiosus 由来のPyrrolidone carboxyl peptidase(以後 PCP と略す)と Methionine Aminopeptidase と

６．アミロイド形成を取り扱うことができた。これらの物性研究は小表 2 のアラカルト型の 2 つの変異型(Ile56Thr、

笠原京子さんが中心的に進めた(16-17）。また、月

Asp67His)は、それぞれ 2 組の家系の遺伝性非神経原冨武研究室（阪大蛋白研）の田中秀明さんと性全身性アミロイドーシスの原因となっていると

Tahir Tahirov さんらによって、それぞれの立体構

報告されているものである。大学院生の船橋順さ造が X 線結晶解析によって解かれた。これらの研んらはこの 2 種の変異型ヒトリゾチームを作製し、究の中で、最も重要な発見は、超好熱菌由来の蛋白その立体構造と物性を調べた(13)。その結果は、ア質の変性速度は一般に常温蛋白質に比べ遅いが、

ミロイド形成は、天然状態の構造に起因している

refolding 速度も大変に遅いということである。結のではなく、変性状態をより安定化させることに果的には超好熱菌由来蛋白質もその生育至適温度

より、変性状態での構造変化を通じて、導かれるこ

においてはわずかなエネルギーバランス（37℃近とを示した。更に、院生の郷田秀一郎さんらは、ア

傍では常温生物由来の蛋白質に比べればG は随ミロイド形成のメカニズムを研究する中で、条件分と高いが）で安定化されている。特に、PCP のを選択することによって、野生型のヒトリゾチー

場合、Jai Kaushik さん（学術振興会研究員）らは

ム、野生型の卵白リゾチームもアミロイドを形成

pH と温度を変化させるだけで、PCP の refolding

することを見つけた(14)。また、驚いたことに、超速度を大きく制御できることを見つけた(18)。

好熱菌由来の蛋白質からもアミロイド形成を確認

pH2.3 で、30℃では 24 時間でほぼ intact な構造した。院生の高山剛さんが、好熱菌蛋白質の酸性中に refolding するが、4℃では 1 週間後でもほとんでの塩酸グアニジン変性を追跡していたところ、

ど refolding の進行がみられない。この結果は別の二次構造の破壊を期待したが、逆にβ構造の増加観点から大変興味を引いた。生理的条件下で天然が確認された。このβ構造はアミロイドを形成し(N)構造と平衡にある変性(D)構造の存在率は、
安定ていた(15)。蛋白質の天然構造はアミノ酸配列に規化のG が 50kJ/mol の場合 1/108 程度（一億分の定された固有の構造をとり、ほどけた変性状態と一）である。そのため、N 状態と平衡にある D 状

平衡にあるが生理的条件では著しく天然構造に偏態の構造研究は大変困難である。PCP の refolding114

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

速度を自由に制御できることは、D 状態の構造研

platform; MicroCal)を 2003 年度に購入して頂いた。

究及び D 状態から N 状態への refolding 過程を追DSC の測定、維持管理は竹平美千代さんが担当し跡できる貴重なサンプルであると思えた。

た。
「蛋白質 3000」においては、構造解析のために質の良い結晶を得ることが求められる。精製され私の阪大での定年(2002 年 3 月)も近づいていた

た多くの蛋白質を、純度検定と共に完全な folding

ので、定年後は PCP の refolding 過程を NMR で状態であるかどうかを確認するために DSC 測定を追跡する研究を行おうと決めて、関西学院大学理行った。

学部の瀬川新一教授の門を叩いた。研究生としての受け入れを断られたが、客員教授として働かせ

超 好 熱 菌 Pyrococcus horikoshii 由 来 のてもらうことになった。そして、大学院生の飯村哲

CutA1(PhCutA1) を通常の方法で DSC 測定する

史さんと一緒に研究を始めた。順調に研究は進展と、熱変性を示すピークが現れない。単調な曲線のしたが、非常に refolding 速度が遅いにもかかわらみが現れる。一方、高度好熱菌由来の CutA1 はず、二状態転移であることが分かった(19)。定年後

110℃付近に変性ピークが現れた。このことは、

10 年ほどかけて NMR で refolding 過程を研究しPhCutA1 の変性温度は、DSC の測定限界の 130℃

ようと意気込んでいたが、半年余りで refolding 過より高温にある可能性を示唆していた。PhCutA1程の追跡は困難であることが分かりがっかりした。

の変性温度を実測するため、130℃以上の温度で測しかし、飯村さんは博士課程に進学し、N 状態と平定可能な DSC が世界の何処にあるか、あらゆるコ衡にある D 状態（D1 状態と呼んでいる）の構造をネを使って探した。製造元では既に廃盤になってHD 交換の手法で明らかにした(20)。更に、富山大いたが、幸いなことに、日本のつくばに 150℃まで

学薬学部の水口峰之教授らも D1 状態の構造研究

測定可能な装置があることを業者が知らせてくれに寄与した(21)。

た。その業者（日本シーベルへグナー）と加藤悦子
主任研究員（農業生物資源研究所）の協力をえて、

８．史上最高の熱安定性を有する蛋白質の発見

超 好 熱 菌 PhCutA1 の 変 性 温 度 が 中 性 付 近 で予測に反して PCP の refolding 過程が二状態でがこれまで報告されていた蛋白質の実測熱変性温度

っくりしていた時、理研播磨で年齢不問で人を探より約 30℃高い (22)。
150℃付近の高温での DSC 測していると友人からの情報を得た。それも、文科省

定は 5-6 気圧の一定気圧内の密閉セル中で行われの大型プロジェクト「蛋白質 3000」関連であった。

る。

148.5℃であることを突き止めた。この変性温度は

京都大学の郷信広教授を代表者とする重点領域研
究「蛋白質の構築原理」（1995-1999 年度）は、「蛋

150℃近くに変性温度を持つ蛋白質の発見をき

白質 3000」プロジェクトのプロトタイプ的な性格

っかけに、熱安定性研究を CutA1 蛋白質に集中さであったが、郷重点関係者は「蛋白質 3000」にはせた。CutA1 はバクテリアからヒトの脳に至るまほとんど参加していなかった。私自身は郷重点にで広範囲の生物に存在することが知られているが、深くかかわっていたので、ぜひ、参加したかった。

その機能は、大腸菌では金属イオンとの関わりが、幸い採用(2003 年 2 月)されたので、関学での実験議論されているが、まだよくわかっていない。大腸は飯村さんに任し、週に 1 度程度 Discussion のた菌、ヒト脳、イネ、高度好熱菌、超好熱菌由来の 5めに関学に出向いた。
「蛋白質 3000」では、情報解種類の CutA1 の X 線結晶構造が解析された。大腸析チームを任されたが、情報解析は素人で、その分菌、ヒト脳、イネ由来の CutA1 の中性での変性温野では充分に活躍できなかったが、自分の守備範

度は、それぞれ 89.0、 96.2、 98.9℃で、常温生物

囲での実質的な成果を上げるべく心がけた。有難の他の球状蛋白質の変性温度に比べて、異常に高いことに自動測定の熱測定装置(VP-capillary DSC

い。全ての CutA1 の高い安定性は、CutA1 の立体

115

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

因する。図 4 には、高度好熱菌 T. thermophilus 由来

９．100℃以上の高温領域での蛋白質変性の熱力学の CutA1 の立体構造を示す。その構造は、同一サ

蛋白質の立体構造は熱力学的法則に従って安定

ブユニットの 3 量体構造で、一つのサブユニット

化されているので、蛋白質の各安定化因子の役割

が他の二つのサブユニットと絡み合うように、シ

を熱力学的に分析することが重要である。疎水性ートを互いに共有していた。また、3 量体の中心部

相互作用と静電的相互作用は蛋白質の主要な安定にβシートが集まり、そのまわりをαへリックス化因子である。低温における両安定化因子の熱力のらせん構造が覆っている。それぞれの起源の学的役割は、共にエントロピー効果によると説明

CutA1 は特徴ある安定化因子が見られるが、150℃されてきた。つまり、変性状態において疎水性残基近くの高い熱安定性を示す超好熱菌由来の CutA1に水和していた水分子は、天然構造（疎水性相互作

は他の起源の CutA1 に比べ極めて多くのイオン対用）が形成されると解放（脱水和）される。これにの形成が見られる。この多数のイオンーイオン相

伴うエントロピー効果によって安定化される。ま互作用（塩結合）は、CutA1 分子表面一面にに広がた、静電的相互作用（塩結合）も変性状態においてった塩結合のネットワークを形成し、あたかも塩

荷電性残基に配向する水分子が、塩結合形成によ結合の層が断熱材の役割を果たし、異常に高い温って解放されることによるエントロピー効果であ度までこのタンパク質のかたちを保護しているかると信じられている。しかし、高温領域でも、これのようである。これらの研究は、理研の澤野雅英、ら両相互作用が熱安定化に寄与しているのか。

Bagautdin Bagautdinov、田中智之、山本等、松浦祥

80℃以下の蛋白質変性の熱力学的解析から、高温

悟、竹平美千代さんらによって行われた(22-26)。特では疎水性相互作用は安定化因子として機能しなに、松浦祥悟さんは大腸菌 CutA1 の変異型の安定いと推定する報告もある。高温領域における蛋白性を 50℃近く高めることに成功して、次に述べる

質安定化の熱力学的機構を実験的に解析した例は100℃以上の温度領域での蛋白質変性の熱力学にない。それは、2 つの技術的困難があったからであ貢献した。

る。一つは 100℃近く又はそれ以上の温度では、熱構造が特徴のある共通のパターンをもつことに起変性に伴う凝集によって熱変性が不可逆となり、信頼のできる熱力学的パラメータの測定が困難であった。第二は、熱力学的解析において、要になるパラメータである変性に伴う比熱変化(Cp)は、多くの蛋白質の実測値から判断して 80℃以下では温度依存性を無視できるとされている。それ以上の温度では、Cp の温度依存性をどうのように考慮すべきか、実質的に実測が困難であった。
超好熱菌蛋白質の 100℃以上における安定化の熱力学的機構を追究するために、私たちは大腸菌の CutA1 (EcCutA1) の Cys を Ala に 置 換(EcCutA1_0SH) することによって、非常に良好な可逆的熱変性を示すDSC 曲線を得ることができた。
さらに、2 残基を Val に置換した疎水性変異型

EcCutA1_0SH_S11V/E61V も良好な可逆性を示

図 4. 高度好熱菌 Thermus thermophilus 由来の CutA1の立体構造(三量体) 赤、緑、茶色は それぞれ 3 本の単量体の構造である。

し、変性温度は 85.6 から 112.3℃に向上した。この 2 重変異型(Ec0VV と略す)を鋳型として、種々

116

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回の荷電性残基を導入して、変性温度の改善を試み

幸いなことに同じキャンパス SPring8 の高輝度光た。その結果、6 個の荷電性残基を導入した変異型

科学研究センターのチームリーダ、その道のエキ

Ec0VV_A39D/S48K/H72K/S82K/Q87K/T88R(Ec0VV_6 と略す）の変性温度は 136.8 ℃に上昇した。この変性温度は、PhCutA1 の値に接近するもスパートの城地保昌さんから協力を受けることがのであった（まさに 大腸菌から超好熱菌 CutA1 へ

まず、低温菌、常温菌、高度好熱菌、超好熱菌由の変換である）。Ec0VV と Ec0VV_6 の DSC 測定

来の馴染みのトリプトファン合成酵素サブユニ

からそれぞれのCp の温度依存性を求め、これらッ ト に つ い て 、 360K と 450K に お け る MDの熱変性の熱力学的パラメータの温度関数を算出

simulation を行った。結晶構造では決定できないル

した(26)。その結果、100℃付近での疎水性相互作

ープ構造の動態、安定性の違いによってどのよう用による熱安定化は低温とは異なりエンタルピーに MD simulation が変化するか、また 揺らぎによの寄与に由来していること、さらにエントロピーって起こる構造変化と活性発現の関係などを明ら的にはむしろ不利に働いていること、が判明した。

かにして、2013 年の蛋白質科学会で口頭発表した

また、113℃以上では、荷電性残基(塩結合形成)にが、続く実験が多忙で論文の作成には至っていな

よる熱安定化は、天然状態でのイオンーイオン相

い。

できた。

互作用によるエンタルピー効果と塩結合形成に伴うイオン（荷電）残基からの脱水和によるエントロ

続いて、N 状態と平衡にある天然条件下での変ピー効果の両方に依存していることがわかった

性 (D) 構 造 の 特 性 を 明 らか に す る た め に MD

（26）。

simulation を行っている。述べてきたように、PCPの D1 状態の構造が NMR によって詳細に研究され１０．MD simulation の研究ているので、MD simulation 研究に有利であると考系統的で網羅的なアミノ酸変異型蛋白質を用いえた。具体的には、PCP の D1 状態の構造を MDた研究で、蛋白質の安定化機構を構成アミノ酸残simulation を用いて、再現することを試みた。

基の役割から詳細に説明できるようになった。しGROMACS を用いて AMBER99sb 力場によるかし、熱安定性の向上を意図した蛋白質の設計は、MD を行っている。
MD 計算には、理研播磨の mini-

色々な方針が提案されているものの、設計指針通K、和光の RICC、神戸の SCLS のスーパーコンピ

りには成功していないのが現状である。その主な

ュータと研究室の数台のワークステーションを用

理由は、蛋白質は N 状態と D 状態との平衡にあり、いている。NMR 実験で見られた D1 状態に存在す

両状態の僅かなエネルギーバランスで立体構造がる-4、-6 へリックスが MD simulation において安定化されている(marginal stability)が、N 状態の構も確認されるなどいくつかの興味ある知見が得ら造は X 線結晶構造解析などにより詳細に解析されれたので 2015 年の蛋白質科学会でポスター発表ているが、D 状態の研究はほとんど皆無である。先した。しかし、現状では、N 状態と平衡にある Dに述べた PCP の D1 状態の NMR 研究はそれに相状態を提示できるレベルには程遠い。ただ、その糸当する僅かな例である。また、X 線構造解析から得口でも見つかればと、スパコンから出てくる大量られる構造は個体の結晶構造である。N 状態も Dのデータと悪戦苦闘しているのが今日の現状であ状態も水中では揺らいでいる。とりわけ 水中におる。

ける D 状態の構造の揺らぎは大きいと推定される。

１１. おわりに

この揺らぎを考慮した両状態の構造特性を知ることは重要であると考えた。これらの問題を解決す

50 余年間の研究生活を振り返ってみて、実による手法は、MD (Molecular dynamics) simulation であい環境で研究を続けてこられたと思う。よい研究

ろうと思った。私はその分野の経験がなかったが、施設で、比較的潤沢な研究費に加えて、先輩、国内

117

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

外の研究者、同僚、後輩にその時々に適した多くのThermophilic -Amylase from Bacillus

ことを教えてもらいながら研究を進めることがでstearothermophile. I. Some General and Physico-

きた。そのよい環境の中でも、とりわけ、「銅鉄的

chemical Properties of Thermophilic -amylase. J.

研究の薦め」(1)に最初に出会ったのは幸運であっ

Biochem. 67, 65-75 (1970).

た。

5. Yutani, K. Role of Calcium Ion in the Thermostability of
-Amylase Produced from Bacillus Stearothrmophilus.

「銅鉄的研究」は、最初は真似た研究でも、自分の行っている研究をよく観察し、その評価を冷静

Experientia Suppl. 26, 91-103 (1976 ).

に受け止め、自分でよく考え、その中から新しい価

6. Yutani, K., Ogasahara, K., Sugino, Y. and Matsusiro, A.

値を見出し、自分自身で独創的（オリジナル）な研

Effect of a Single Amino Acid Substitution on Stability

究に発展させることである。そのような態度で研of Conformation of a Protein. Nature 267, 274-275

究を進めていくと、よく考えると必ず解決の糸口(1977).

が見つかるという自信めいたものができる。これ

7. Yutani, K., Ogasahara, K., Tsujita, T. and Sugino, Y.

は長い研究者生活から獲得できる研究者ならでは

The Dependence of Conformational Stability on theの役得だと思っている。阪大定年の際、PRC 編集

Hydrophobicity of the Amino Acid Residue in a Series

部依頼の、雑文「研究者の役得」(PRC News letterof Variant Proteins Substituted at a Unique Position of

No.2002.50、2002 年 8 月 29 日号)にも記載した

the Tryptophan Synthase -Subunit. Proc. Natl. Acad.

が、この考え方は、日常生活の種々の問題に接した

Sci. USA 84, 4441-4444 (1987).

時にも活用できるのが有難い。

8. Yutani, K., Ogasahara, K., Suzuki, M. and Sugino, Y.
Comparison of Denaturation by Guanidine

最後に言っておきたいことは、このように、50 余Hydrochloride of the Wild Type Tryptophan Synthase

年間、楽しい研究生活を続けてこられたのは、やは-Subunit of E. coli. and Two Mutant Proteins (Glu49 -り、日本が平和であったからだと思う。憲法 9 条> Met or Gln). J. Biochem. 85, 915-921 (1979).

のお蔭で、日本は戦後 70 年間戦争に参加しないで

9. Privalov, P.L. and Khechinashvili, N.N. A

済んだ。最近、それが怪しくなっている。何とか止thermodynamic approach to the problem of stabilization

められないかと思う昨今である。

of globular protein structure: a calorimetric study. J.

（2015 年 9 月 9 日記）

Mol. Biol. 86, 665-684 (1974).
10. Takano, K., Ogasahara, K., Kaneda, H., Yamagata, Y.,
Fujii, S., Kanaya, E., Kikuchi, M., Oobatake, M. and文 献

Yutani, K. Contribution of Hydrophobic Residues to the

1. 笠井献一「科学者の卵たちに贈る言葉-----江上不二

Stability of Human Lysozyme: Calorimetric Studies and夫が伝えたかったこと」岩波科学ライブラリー210、X-ray Structural Analysis of the Five Isoleucine to

岩波書店 (2013).

Valine Mutants. J. Mol. Biol. 254, 62-76 (1995).
11. Takano, K., Funahashi, J., Yamagata, Y., Fujii, S. and2. Yutani, K., Yutani, A. and Isemura, T. Accelerating
Effect of Proteins on Renaturation of Denatured Bacterial

Yutani, K. Contribution of Water Molecules in the-Amylase. J. Biochm. 62, 578-583 (1967).

Interior of a Protein to the Conformational Stability. J.
Mol. Biol. 274, 132-142 (1997).

3. Yutani, K., Yutani, A. and Isemura, T. The Study of

12. Funahashi, J., Takano, K. and Yutani, K. Are theRenaturation Process of Reduced Taka-Amylase A:
Dependence of Rate of Renaturation on Protein

parameters of various stabilization factors estimatedConcentration. J. Biochem. 66, 823-829 (1969).

from mutant human lysozymes compatible with otherproteins? Protein Eng. 14, 127-134 (2001).

4. Ogasahara, K., Imanishi, A. and Isemura, T. Studies on

13. Funahashi, J.,Takano, K., Ogasahara, K., Yamagata, Y.

118

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

and Yutani, K. The Structure, Stability, and Folding

structure of pyrrolidone carboxyl peptidase from a

Process of Amyloidogenetic Mutant Human Lysozyme.

hyperthermophile under nondenaturing conditions: role

J. Biochem. 120, 1216-1223 (1996).

of the C-terminal alpha-helix of the protein in folding

14. Goda, S., Takano, K., Yamagata, Y., Nagata, R., Akutsu,

and stability. Biochemistry 46, 3664-3672 (2007).

H., Maki, S., Namba, K. and Yutani, K. Amyloid

21. Mizuguchi, M., Takeuchi, M., Ohki, S., Nabeshima, Y.,

protofilament formation of hen egg lysozyme in highly

Kouno, T., Aizawa, T., Demura, M., Kawano, K. andconcentrated ethanol solution. Protein Sci. 9, 369-375

Yutani, K. Structural Characterization of a Trapped(2000).

Folding Intermediate of Pyrrolidone Carboxyl Peptidase

15. Yutani, K., Takayama, G., Goda, S., Yamagata, Y.,from a Hyperthermophile. Biochemistry 51, 6089–6096

Maki, S., Namba, K., Tsunasawa, S. and Ogasahara, K.

(2012).

The Process of Amyloid-like Fibril Formation by

22. Tanaka, T., Sawano, M., Ogasahara, K., Sakaguchi, Y.,

Methionine Aminopeptidase from a Hyperthermophile,

Bagautdinov, B., Katoh, E., Kuroishi, C., Shinkai, A.,

Pyrococcus furiosus. Biochemistry 39, 2769-2777

Yokoyama, S. and Yutani. K. Hyper-thermostability of(2000).

CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly
150 oC. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).

16. Ogasahara, K., Lapshina, E.A., Sakai, M., Izu, Y.,
Tsunasawa, S., Kato, I. and Yutani, K. Electrostatic

23. Sawano, M., Yamamoto, H., Ogasahara, K., Kidokoro,

Stabilization in Methionine Aminopeptidase from

S.-i., Katoh, S., Ohnuma, T., Katoh, E., Yokoyama, S.

Hyperthermophile, Pyrococcus furiosus. Biochemistry

and Yutani, K. Thermodynamic basis for the stabilities

37, 5939-5946 (1998).

of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii, Thermus

17. Ogasahara, K., Nakamura, M., Nakura, S., Tsunasawa,

thermophilus, and Oryza sativa, with unusually highS., Kato, I., Yoshimoto, T. and Yutani K. Unusuallydenaturation temperatures. Biochemistry 47, 721-730

Slow Unfolding Rate Causes the High Stability of(2008).

24. Matsuura, Y., Ota, M., Tanaka, T., Takehira, M.,

Pyrrolidone Carboxyl Peptidase from a
Hyperthermophile, Pyrococcus furiosus: Equilibrium

Ogasahara, K., Bagautdinov, B., Kunishima, N. andand Kinetic Studies of Guanidine Hydrochloride-

Yutani, K. Remarkable improvement in the heat stability

Induced Unfolding and Refolding. Biochemistry 37,

of CutA1 from Escherichia coli by rational protein

17535-17544 (1998).

design. J. Biochem. 148, 449-458 (2010).

18. Kaushik, J.K., Ogasahara, K. and Yutani, K. The

25. Matsuura, Y., Takehira, M., Sawano, M., Ogasahara, K.,

unusually slow relaxation kinetics of the folding-

Tanaka, T., Yamamoto, H., Kunishima, N., Katoh, E.

unfolding of pyrrolidone carboxyl peptidase from aand Yutani, K. Role of charged residues in stabilization

hyperthermophile, Pyrococcus furiosus. J. Mol. Biol.

of Pyrococcus horikoshii CutA1, which has a

316, 991-1003 (2002).

denaturation temperature of nearly 150oC. FEBS J. 279,

19. Iimura, S., Yagi, H., Ogasahara, K., Akutsu, H., Noda,

78-90 (2012).

Y., Segawa, S. and Yutani, K. Unusually Slow

26. Matsuura, Y., Takehira, M., Joti, Y., Ogasahara, K.,

Denaturation and Refolding Processes of Pyrrolidone

Tanaka, T., Ono, N., Kunishima, N. and Yutani, K.

Carboxyl Peptidase from a Hyperthermophile are Highly

Thermodynamics of protein denaturation at temperatures

Cooperative: Real-Time NMR Studies. Biochemistry 43,

over 100°C: CutA1 mutant proteins substituted with

11906-11915 (2004).

hydrophobic and charged residues. Scientific Reports

20. Iimura. S., Umezaki, T., Takeuchi, M., Mizuguchi, M.,(in press)

Yagi, H., Ogasahara, K., Akutsu, H., Noda, Y., Segawa,S. and Yutani, K. Characterization of the denatured

119

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第16回

油谷克英先生ご略歴
1938年7月 大阪市で誕生
1961年3月 大阪大学理学部生物学科卒業
1962年5月 大阪大学蛋白質研究所教務員
1969年9月 大阪大学理学博士
1981年3月 ソ連科学アカデミー蛋白質研究所、
日本学術振興会特定国派遣研究員（約4ヶ月）
1982年5月 アメリカ合衆国、国立衛生研究所(NIH)のVisiting Scientist(6ヶ月）
1983年7月 大阪大学蛋白質研究所助手
1987年3月 アメリカ合衆国、国立衛生研究所(NIH)のVisiting Scientist(3ヶ月)1990年6月 大阪大学蛋白質研究所助教授、2015年8月26日理研にて1993年3月 文部省在外研究員（短期2ヶ月）パリ、
パスツール研究所など
2002年3月 大阪大学定年退官
2002年4月 関西学院大学大学院理学研究科客員教授（2ヶ年）
2003年2月 理化学研究所播磨研究所上級研究員、現在に至る（2003年度、情報解析チーム、チームリーダ）

120

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回

蛋白質結晶学取り組んだ最初の頃
月 原 冨 武 （つきはら とみたけ）
私は大阪大学薬学部でＸ線結晶構造解析の手ほどきを受けた後、1968 年に理学研究科に進学して蛋白質研
究所で蛋白質結晶学の研究を始めた。その頃、ヘモグロビン、ミオグロビンに続いてリゾチームが酵素蛋白質として初めて構造決定され、蛋白質結晶学が英国から世界に拡がって行った。我が国では 1960 年代前半に、笹田義夫先生（阪大蛋白研、後に東工大）が英国 MRC の M.F.Perutz の所で仕事をされた。帰国後、実験化学講座続８巻（1965 年）に結晶化から回折実験、位相決定まで蛋白質結晶学の全容を書かれた(1)。この総説
は、黎明期の蛋白質結晶学について詳しく述べられており、蛋白質結晶構造解析の理解が一層深まる内容が随所にあり、今でも推奨したい論文である。1960 年代後半には、蛋白質研究所がチトクローム c、名古屋大学の坂部知平先生のグループがインスリンのＸ線結晶構造解析を軌道に乗せようとしていた。当時は、あらゆることを自分たちで構築しなければならない時代であった。そうした時代から 1980 年初頭まで、私自身が経験した今では考えられない蛋白質結晶学について、役に立つことがあることを願って述べてみよう。

チトクロム c の結晶化
回折強度データ収集

1960 年代後半、蛋白質研究所では高野常広先生
を中心に18 リットル缶一杯のカツオの心臓からチ1960 初頭までは、蛋白質結晶の回折データ収集

トクロムｃを 10 グラム以上精製し、15ml の試験

はプレセッション写真法が一般的であった（第１管を使って硫安塩析法で結晶化していた。細かく図）。この方法では逆格子の形がそのまま現れるの砕いた硫安粉末を少しずつ加えながら蛋白質の沈で、直ちに指数付けを行うことができる利点があ殿の出方と氷上で冷やした時の沈殿の消え方を見るが、撮影に時間を要して強度の読み取り精度もて飽和度を推し量り、適当なところで室温に静置高くなかった。徐々に線形回折計など正確に強度する。数日経つとゲル化して不透明になり、試験管を測定できるカウンターによる回折データ収集もを逆さにしてもこぼれない状態になる。ゲルの中行われるようになった。蛋白質研究所でもゼネラから小さな核が出来てゆっくり大きくなる。大きルエレクトリック（GE）社の３軸型手動回折計がくなるにつれて結晶の周囲が徐々に透明性を増す。

あって、１斑点ごとに結晶の方位とカウンターの結晶が十分大きく成長した時点で試験管の壁を軽位置を変えて強度を測定した。しかし、それではチく叩くと、液中に浮いていた結晶が試験管の底に

トクロム c の高分解能のデータ収集を行うのは困

落下し結晶成長が止まる。
（この結晶化の過程は録難であり、植木龍夫先生を中心に４軸型自動回折

画されており、高野先生にお願いしてどこかで見計(AFC)を理学電気と共同で開発した。その後、こることができるようにしていただこうと思う。
）この AFC は長く分子量数万以下の小さい蛋白質結晶

うして大量の結晶を準備することができて、重原の回折データ収集を実験室で行うために使用され子誘導体の調製や回折強度測定を存分に行う準備た。

ができた。いずれも試行錯誤によって方法を確立しなければならなかったので、今では考えられな
いくらいの多くの結晶が必要であった。

121

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回

め、最も短い c 軸をφ軸に合わせて反射の重なりを回避した。現在はφ軸を振動させる振動法で、結晶の一部分に X 線を照射して回折データ収集が行われている。吸収の大きさはφの値に最も強く依存する。また、振動幅も小さいので同じイメージ内の反射はほぼ同じφであると見做せて、イメージ
間のスケーリングの際に実質的に吸収補正も行われているので、こうした幾何学を考慮する必要はない。ただ、格子が 1000Å近い場合には斑点の重なりを避けるために、こうした幾何学を考慮することは有用である。
反射強度を計数する方法にはピーク値を強度とする方法、特定の角度範囲を走査して積分値を採用する方法がある。GE 社の３軸型回折計を用いて手動で測定していた時はピーク値を採用していた

第１図 プレセッション写真 後述するスピルリナのフェレドキシンのプレセッション写真。斑点の並びに沿って指数をつけることができる。この写真を撮るた
めには結晶の軸を X 線に対して特定の方向に向けなけ
ればならない。そのために何度も回折像を撮影して軸の方向を調整する。さらに撮影にあたっては目的の反射以外を除くために、フィルムの前面の特定の位置にスクリーンを入れる。

結晶全体に X 線を照射するか、結晶の一部に当てるかということも問題になった。どの方位でも結晶全体からの回折が得られる前者の完浴法を採用した。回折強度の相対値が方位によって影響を受けることを少なくするためである。今でも中性
子回折はこの方法を採用している。X 線は最も強い強度が得られる波長 1.54Åの CuK線を使用した。しかし、この波長では、回折強度が結晶や結晶を封入しているガラスキャピラリーによる吸収の影響を強く受けるので、測定後吸収補正をしなければならない。そのために任意の方位での回折ではなく特定の結晶軸を回折計のφ軸（結晶の回転軸）に一致させなければならなかった（第２図）。
チトクロム c はアミノ酸残基数が 103 の小さい蛋第２図 ４軸回折計にキャピラリーに封入した結晶をセットしている。
大きな白い円形の部分をχサークルと呼ぶ。
キャピラリーの左側に少しだけ見えているのがコ
リメーターの先端で、ここから X 線が出てくる。キャピ
ラリーを乗せているのがオメーターヘッドという部分
で、２つのアークがあってキャピラリーの傾きを変えることができる。そうすることによって結晶の軸を X 線に対して特定の方向に合わせることができる。

白質であり、最大の格子定数も 100Åに満たないものであったが、a, b, c どの軸でもφ軸に合わせて良いわけではなかった。長い軸をφ軸に合わせると特定の方位で２つの反射が同時にカウンターに入る重なりの問題が生じた。完浴法を採用するためにビームサイズを大きくしたためである。そのた122

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回

が、AFC ではより正確な強度を見積もることがで送ると、１〜２日後に計算結果が返ってきた。大型

きる積分法を採用した。走査方法ではω軸と 2θ軸といえども、今日の感覚では主メモリーも恐ろしを連動して走査するω/2θ走査法と、2θを固定しく小さく、計算速度も遅いものであった。そのためてω軸を走査するω走査法が検討された。重原子に電子密度計算も任意の間隔でなく特定の間隔に誘導体ではモザイク幅が大きくなり、ω/2θ走査法

限定して行った。三角関数は計算機に組み込まれでは反射の重なりの問題が深刻になる。
（回折計のている関数を使うと時間がかかるので、前もって幾何学等及びモザイクの詳細は注釈を参照してくテーブルを作っておいてそのテーブルから引き出ださい。
）そこで、モザイク幅が変化しても正しいした。より一般性のあるプログラムシステムの構強度が得られるω走査法を採用した。現在の振動築も視野にあったと思うが、何よりもチトクロム c

法でのイメージ間で強度を足し合わせる方法は３の構造解析を早く成功させることが優先された。

次元の積分が行われており、理想的な積分法であ等高線を作図するプロッターなどはなく、電子密る。ただ、ピーク値だけでも結構まともな強度測定

度値を印字したものをもとに手で描いた。こうしになっていたことは、現在取り組んでいる X 線自て作成した等高線に基づいて阪口健一技官に協力

由電子レーザー(XFEL)による静止法による回折強してもらって作った２つの木のモデル蛋白質研究

度データ収集法の開発の際にも念頭に入れている。

所の玄関にある（第３図）。一つは 6Å分解能でもプロトタイプの AFC は紙テープ制御であった。

う一つは 4Å分解能のモデルである。6Å分解能の結晶を回折計に乗せて方位を調整して格子定数等モデルでは、計算間隔を適切な値に選択できなかを決める。それらをコンピュータに入力して任意ったために水平面内と垂直方向での縮尺にずれがの反射の４軸の設定角を計算し、その値を紙テーあり、少し縦長になっている。4Å分解能の時にはプに出力した。紙テープを回折計側で読み込ませほぼ一致させる計算が可能になり、正確なモデルて４軸角を設定し強度を測定した。後にコンピュになっている。

ータから直接回折計を制御するようになり随分楽

重原子誘導体に測定できるようになった。その後、この AFC は急速に普及して低分子用に利用者を拡大した。し蛋白質研究所での大学院時代に、揺籃期の蛋白

かし、原理的に０次元の計数装置であり、蛋白質の質結晶学をじっくり学ぶことができた。チトクロ

分子量が大きくなるにつれて測定効率が低下する

ム c の構造解析で私が最も貢献できたと自負して弱点が深刻になる。そのため、大きな蛋白質では振いるのは、K3UO2F5 修飾が良好な重原子誘導体と動写真法が主流になった。

なることを見つけたことである。当時、重原子誘導体としては K2PtCl4 が見つかっていたが、Pt その構造解析プログラム

ものの電子密度に異方性が高くて良質の重原子誘重原子同型置換法の原理は確立されていたが、導体結晶ではなかった。これはよくあることで、Pt位相の確率分布を求める際の誤差の取り扱い、重が Met の S の２つの孤立電子対に 50%ずつの確率

原子パラメータの精密化の際の反射データごとので入るためである。私はフローセルという装置を重みなど未確立であり、個々の蛋白質で検討しな作って重原子誘導体を検索した。その装置のキャければならないことが多くあった。こうしたこと

ピラリーに結晶をいれて外から重原子試薬溶液をを検討しながら位相決定のためのプログラム開発

流し込みながら、回折像の変化を調べた。重原子をが、芦田玉一先生を中心にして行われた。毎週の雑流すことによって変化の可能性があると判断する誌会は殆どが位相決定法に関する原論文の紹介でと、5Å分解能のデータを収集し、ネイティブ結晶あった。当時、大阪大学では豊中に大型計算機センとの差のパターソン関数を計算した。チトクロム c

ターがあり、研究所のあった中之島からは学内便の結晶は溶媒含量が 40%に満たない隙間の少ないでプログラムとデータがセットになったカードを結晶である。それでも３分以内に外の溶媒が内部123

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回に浸み込む。この結晶では 10Åより低い分解能の手動回折計で回折データを収集するための設定角

斑点の強度は溶媒領域の電子密度の変化と共に変を計算しようとしたが、休み中で建物が冷え切っ化するので、10Åより低角側の反射強度の変化でて部屋の温度が低くて計算機が起動しなかった。

溶媒が置換される様子を観測できた。
修士課程 2 年

計算機室にガスストーブを持ち込んで数時間かけの時、重原子検索実験を毎日繰り返していたが、回て２０℃以上にして、やっとの思いで計算機を起折強度変化があっても低分解能側だけとか、同型動した。設定角を計算して、100 反射弱の２次元性が崩れるなどで、良好な重原子誘導体を見つけ(0kl)の 5Å分解能の反射強度を測定し、ネイティブ

ることができないまま 12 月末になった。小さい蛋

結晶との差のパターソン関数を計算した。等高線

白質は隙間が小さいために良好な重原子誘導体をを引いて確かに特定の位置に重原子が入っている作るのが難しいことが多いのである。初期の蛋白ことを確認できた時には、とっくに元日の朝にな

質構造解析では、できるだけ小さい分子量の蛋白っていた。この上ない喜びに浸った元日であった

質が研究対象にされたこともあって、いずこも重ことは、今でも鮮明に覚えている。修士論文は、原子誘導体調製に苦労することが多かった。

K3UO2F5 誘導体を見つけたという内容だけで書い修士論文のためのデータを得るために、冬休みた。その後 K3UO2F5 は私にとってはマジック試薬を返上して重原子誘導体検索を行っていた。大晦で、フェレドキシン、ウイルス（SBMV）等使った

日に K3UO2F5 誘導体がこれまでにない良さそう

結晶で 100％成功している。しかし、その後ウラン

な回折プロファイルを示した。急遽、GE 社の３軸が核燃料物質であることから使用しなくなった。

第３図 チトクロム c の木製モデル カツオの心臓の還元型チトクロム c のモデルであり、左側は４Å分解能、右側は６Å分解能の電子密度に基づいて作成した。４Å分解能のモデルで赤く塗っている部分はヘムである。赤色と黄色の球はそれぞれ導入した重原子 Pt, U の位置を示している。両者で見る方向が少し違っている。そのために４Å分解能のモデルでは Ptが隠れている。

124

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回

現在は SeMet 置換が普及して重原子試薬を浸漬さ

遠心機は農学部の設備を借りた。生物学的に重要せる重原子同型置換法は余り使われていない。扱な結晶を作れば何とかなるだろうと楽天的に取りう蛋白質が大きくなるほど重原子誘導体を調製す組んだ。Fd-FNR 複合体の調製は新先生に鳥取まるのは容易であることが忘れられている。SeMet

で指導に来て頂いてホーレンソウを用いて行った。

蛋白質の大量発現に苦労している話を聞くたびに、数年間学生と一緒に試行錯誤したが、結晶を選る

なぜ重原子誘導体を調製しないかと思うことが多に到らなかった。

い。

そうしているときに松原先生からスピルリナの２鉄フェレドキシンの結晶が出来たので見に来い

鳥取大学という連絡があり、早速阪大に行って当時大学院

1970 年代初頭、鳥取大学には勝部幸輝先生がお生の長谷俊治先生が作った結晶を頂いて帰った。

られて天然物のＸ線解析を行っておられた。そこ

タイミング良く勝部先生がプレセッションカメラ

の助手にならないかと角戸正夫先生から話があっを科研費で購入されたので、空間群決定など予備た。よく考えて蛋白質のＸ線結晶構造解析をやっ実験は十分行うことが出来た。回折強度データ収て良いというお話を頂いたので決心し、博士課程

集は蛋白研の安岡則武先生に便宜をはかって頂いを２年で中退して 1971 年 1 月に鳥取大学工学部て、AFC で収集した。当初、回折強度は紙テープに助手として就職した。任期のないポジションでにも出されたが、そのまま鳥取大学では読むことあり、これでじっくり蛋白質結晶学の研究をしてができなかったので、紙に印字されたものを鳥取

一生食べていけると思い大変嬉しかった。しかし、に持って帰り、紙テープに打ち込んだ。位相決定用

1971 年当時研究条件は殆ど整っておらず、周囲ののコンピュータは TOSBAC-3400 という 主メモ

先輩もどなたも私が蛋白質の研究を鳥取で行うこリーが 8K words（1 word = 64 bits）のテープコンとが出来るとは考えておられなかった。

トロールのものが１台、鳥取大学共通の設備とし鳥取大学に就職する時に、当時阪大理学部にいてあった。今では誰も想像できないでしょうが、そた吉川信也さんに、チトクロム c の相手であるチ

ろばんで計算していたことを考えれば不可能なわ

トクロム酸化酵素の構造解析をやりたいと相談し

けではなく、上手にプログラムを書いて K3UO2F5た。それがどんなに難しいことか十分に理解して誘導体によって異常散乱を利用した単一重原子同いたわけではない。ただ、大学院時代に蛋白研の生型置換法で位相決定を行った。研究の殆どの時間

理機能部門の談話室で友達とお茶（お酒だったか

は計算プログラム書きに費やしていた。このコンも）を飲んでいた時に、佐藤了先生が「これからはピュータは共通設備で、運用はオペレータの勤務

膜蛋白質、蛋白質間相互作用だ」と２つのキーワー

時間中に限られていて仕事がはかどらなかった。

ドをあげられたことがいつも頭にあった。1962 年

しかし、大口ユーザーであったことで、特別に夜間に米国ジョンソン研の米谷隆先生が結晶の写真を使用を許可してもらって、[２鉄２硫黄]フェレドキ報告されているが、回折像は撮っておられず、吉川

シンの活性中心の構造を決定することができた。

さんの所でもまだ精製法が確立されていなかった。

、構造解析に見通しを付けた。
これを論文にし（2）結晶化に取り組むにはまだ早いので待っておれ、

当時鳥取大学では勝部教授、月原講師、福山恵一助

しばらくは別のことをやるようにということで、手の体制であった。天然物化合物の研究が中心で

阪大理学部の松原央先生と神戸山手女子短大の新あった勝部先生と福山先生もフェレドキシンの仕勝光先生を紹介して貰った。そこで、フェレドキシ

事をしてくれるというので、思い切って２年間米ン(Fd)−フェレドキシン還元酵素(FNR)複合体のＸ

国パデュー大学に留学した。その間、福山先生を中線結晶構造解析をすることにした。最初は冷室も心にした緻密な構造解析によって 2.8Å分解能の遠心機も無い状態であったが、クロマト用の低温構造を得て、Nature 誌(1980 年)に掲載された（3）。

チャンバーは機械工場の指導のもと自分達で作り、125

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回を取り替え、前の結晶に対して正確に次の角度領域になるように結晶の配向を合わせなくてはなら

パデユー大学ない。この結晶の方位調整に１日、１枚の写真撮影

フェレドキシンの構造解析である程度自信がつに１日かけて、２日で１枚取るのが優秀なポスド

いた頃、チトクロム c 酸化酵素はフェレドキシン

クの仕事であった。これでは留学期間中に仕事がよりも１桁以上大きいので、より大きな蛋白質複終わらない。そこで３枚の静止写真で、現像時間も合体の構造解析を行う能力を養う必要性を痛感し入れて４時間で精密に結晶の方位を調整し、２０ていた。田中信夫先生の紹介でパデユー大学の M.
G. Rossmann 教授のところでウイルスの構造解析を行うことにした (1978-1980 年)。そこで最初に意外であったのは回折データ収集が古典的な写真法であったことである。しかし、分子量がフェレド
キシンの百倍を超える巨大なウイルスでは、反射数は分子量に比例するので１斑点ずつ正確に測定するカウンター法では対応できないことは一目瞭然であった（第４図）。パデユーでもっとも嬉しかったのは、義務から完全に解放されて 24 時間研究のことだけであったこと、お金の心配をしなくて良いことであった。
Rossmann 教授の所ではＴ＝３ウイルスである
SBMV の 3.5Å 分解能構造決定が不成功で、もう一つ重原子誘導体を探し、2.8Å 分解能の構造解析を行う方針を立てたところであった。当時、重原子

第４図 Southern Bean Mozaic Virus の 2.8Å分解

誘導体検索には撮影に時間が掛かるプレセッショ能性があることを実際に示した頃から信用してく能の振動写真。回転対陰極発生装置に２枚の全反射ミラーを装着して焦点を絞ったX 線を用いて２０時
間照射、0.6°振動で撮影している。チトクロム c や
フェレドキシンの回折像を見慣れていたので最初にこの写真を撮ったときは、それなりのカルチャーシ
ョックを覚えた。しかし、チトクロム c やフェレドキシンで回折像撮影に際に苦労した軸たては、ウイ
ルスでは斑点が密にあるために容易であることにすぐ気がつき、写真法によるデータ収集は以外と難し
くないと思った。

れ始めて、仕事が随分やりやすくなった。とは言っ

時間で１枚の振動写真を撮る計画を立てて、実行てもこの誘導体が実際に使えるかどうかはフルセした。この辺は日本で結晶学の経験を積んでいたットのデータを収集しなければならない。それにので自信があった。１週間に６枚、3.0 度分撮った。

は、通常１年以上かかる。常温で回折実験を行うた

全く無駄がなければ３０週で実験が完了すること

めに１個の結晶で１照射すれば結晶は劣化する。

になる。実際には撮り直しや 0.5 度振動の他に低（凍結結晶で回折実験が最初に行われたのは分解能用の 1.0 度振動のデータも収集したので、1990 年代半ばにリボソームに適用されたのが最１年近くかかった。私が撮影した回折像は、ポスド初である。
）振動幅 0.5 度、全部で最低 90 度分、ク仲間で今は回折像の処理プログラムの作成者と180 枚測定しなければならない。１照射毎に結晶しても著名な Andrew G. W. Leslie が毎日１枚ずン写真法が適用されていて、１イメージの撮影に数日要していた。それを正確に配向させた振動写
真法で１日以内に行うことを提案したが、「きけな
い、しゃべれない奴が何を言っているのだ」と言う雰囲気で誰にも相手にされなかった。しかし、その方法で K3UO2F5 誘導体を作り、良い誘導体の可つ処理して、回折像の状況を知らせてくれた。

126

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回

2.8Å分解能のデータ収集が完了し、重原子同型

わることができ、優れた研究者仲間と一緒に研究

置換法による位相決定はボスが担当した。次はウが出来たことは何よりの幸運であった。いかなるイルスの対称性を利用した平均法による電子密度

巨大な蛋白質の結晶構造解析を行う自信もついた。

の精密化である。それを私が担当したが、2.8Å分

チトクロム c 酸化酵素

解能になりコンピュータ容量の限界を超えて、それまで使っていた 3.5Å分解能用のプログラムで

パデユー大学に留学することになった頃チトク

は実行不可能であった。3.5Å分解能用のプログラ

ロム c 酸化酵素は、吉川さんが甲南大学理学部でムを作成し、 Assistant Professor になって独立し反応機構の研究を続けると共に精製法の改善に取ていた Jack Jhonson と議論した結果、プログラム

り組んでいた。鳥取大学で FNR やフェレドキシン

を修正して直径約 30cm の大きさの磁気テープをを一緒にやっていた小川恵三さん（阪大薬学部の10 数本使えば可能であることが判った。プログラ

博士課程）にも協力して貰って、吉川さんの所で結ムを根本的に作り替えて臨むか、プログラム修正晶化も始めた。小川さんが何回か結晶らしいもの

で 10 数本のテープの交換という労力によって対の回折像を撮ろうとしたが成功しなかった。1980

処するかの選択であったが、躊躇せず労力によっ

年 2 月に帰国して、その春甲南大学の冷室でキラて解決する道を選択した。約２００メートル離れ

キラした輝きを見たときの感動は今でも鮮明であた計算機センターに磁気テープ１０数本を１日１る。顕微鏡下で結晶であることを確認できたが、濃サイクルの計算を行う度に運ぶのである。私にと縮法による塩溶領域（塩析とは異なり塩濃度の低って最も大きな問題は、計算の時に計算センター

いところ）での結晶化であるために、微妙な条件ののアルバイトの担当者が磁気テープの順番を間違

変動によっても結晶が溶けてしまった。回折像をえずに掛けるという厄介な仕事をやってくれるか撮るのにも随分苦労した。吉川さんや甲南大学のどうかということであった。この件については、セ学生さんがバスで鳥取まで結晶を運んできて、実ンターの最大の利用者である Rossmann が直接セ

験室のプレセッションカメラで回折像の撮影を試ンターに掛け合ってくれて、センターが特段の配みた。最初は結晶をキャピラリーの中に入れるこ慮をして実施してくれることになった。こういうともなかなか出来なかった。鳥取まで運んでいる

不細工な戦術をとる私の考え方は Rossmann の考

途中で結晶が消えることも何度かあった。徐々にえ方とは必ずしも一致しなかったが、理解してく結晶の取り扱い方に習熟して、何とか空間群を決れた。しかし、今振り返ってみると、なんとかモデ
ル作成はできる程度に電子密度は改善されていたが、平均法による精密化が十分収束するだけのサ
イクル数は行えていなかった。その後の高速化されたコンピュータによる計算では、完全に収束させるには数 100 サイクルは必要であることが判った。しかし、当時のコンピュータの性能では無理であった。今日ではコンピュータの進歩があって、膨
大な繰り返し計算を行うことが可能になり、ウイ
ルスでは重原子誘導体を用意しなくても平均法のみによって構造決定が可能になっている。2.8Å の構造解析を Nature 誌(５)に掲載されるめどが立って２年間の留学期間を終えた。２年間で日本にいる時の１０年分の仕事をした感じであった。また、
１０年を超える研究の集大成の時期にチームに加127

第５図 ウシ心筋のチトクロム c 酸化酵素結晶のプレセッション写真。最高 10 Å の斑点が見える。塩溶領域での結晶化されており壊れやすい結晶であったが、良質の蛋白質を精製できている証拠となった。

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回

めることが出来る回折像を撮影できたのは 1983

はこのオイラー角を採用し()に対応する角を年であった（第５図）。その後、1993 年の末に 2.8(ω,χ,φ)としている。４軸角の残りの 2θはカウÅ分解の回折像を得て約１年かけて構造決定を行

ンターの位置を決める角である。回折が生じる中った。1995 年に活性中心構造(5)、1996 年に全構心の位置ではω＝θとなるので、３軸回折計では造(6)、1998 年に H−パスプロトンポンプ機構(7)に

ω軸と 2θ軸は常時１：２になって連動して動くよ

ついて報告した。その後、反応中間体や高分解能のうになっている。

構造解析、部位特異的変異体の機能解析等によっω/2θ走査ではω軸と 2θ軸を連動して走査すて H−パス説の正当性を示してきた。現在は、新しる。逆格子原点と逆格子点を結ぶ線に沿ったプロ

い X 線自由電子レーザー（XFEL）によって高速ファイルが得られる。例えば(h00), (0k0), (00l),

時分割 X 線結晶構造解析によって、酸素還元・プ(nh nk nl)などのプロファイルがチャートに現れる

ロトンポンプ機構の全容の解明を行っている(8)。

ので重原子誘導体検索に便利であった。

後になれば、随分無駄なことをして時間がかかっω走査ではカウンターの位置 2θを固定してωてしまったことが多くあり、反省することが多い。

軸を走査する。これは逆格子原点と逆格子点を結しかし、新しいことに挑む際には無駄も覚悟で取ぶ線分を半径とする円弧に沿ったプロファイルがり組むことも必要ではないでしょうか。

得られる。構造解析の対象にしている結晶は完全な一つの結晶ではなくて、ほんの少し向きが違う

あとがき

小さな結晶の集まりであり、モザイク結晶と呼び、1980 年代前半まで、私に限らず我が国で蛋白質向きの違いの大きさをモザイク幅と呼ぶ。ω走査の X 線結晶構造解析を行っていた研究者は誰も計法ではこのモザイク幅の大きさが直接プロファイ

算プログラム作りに没頭していた。しかし、構造解

ルに現れる。蛋白質の結晶ではその大きさは 100

析ソフト開発のエキスパートを生み出すことはな

分の数度から１度を超えるものもある。モザイク

かった。この原因の一つは、構造解析結果は高く評幅が小さいほど良い結晶である。

価されるが、方法の開発者が評価される機会が少なく、方法の開発に没頭していると昇進の機会が文 献

少ないことであった。もう一つは積極的な異分野(1)（特に計算科学）との連携が弱く広くユーザーに

笹田義夫、角戸正夫、実験化学講座（続）８巻、450-506 (1996).

使われる普遍性のあるプログラムを作りきれなか(2)ったことにある。
（低分子結晶構造解析では優れた

T. Tsukihara et al., J. Biochem., 84, 1645-1647(1978).

プログラム体系が作られた。
）これらは今日でも克服されていない弱点である。XFEL や中性子、電子(3)K. Fukuyam et al., Nature, 286, 522-524 (1980).

顕微鏡などによる構造研究の新しい展開が期待さ

(4)

C.

れる今日、我が国においても回折データ処理及びAbad-Zapatero et al., Nature, 286, 33-39(1980)..

構造解析のソフトウェア開発を一層推進させる必(5)

T. Tsukihara et al., Science, 269, 1069-1074 (1995).

要性を痛感している。

(6)

T. Tsukihara et al., Science, 272, 1136-1144 (1996).

(7)

S. Yoshikawa et al., Science, 280, 1723-1729 (1998).

(8)

K. Hirata et al., Nature Methods, 11, 734-736 (2014).

注釈 ４軸回折計とモザイク幅
４軸回折計はこのシリーズの福山恵一先生の文章の第１図にある。結晶による回折班点が生じる
ためには結晶を X 線に対して特定の方向に向けなくてはならない。向きを変える操作としてよく使われるのがオイラー角 ()である。４軸回折計

128

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第17回

月原冨武先生ご略歴
1967 年 3 月 大阪大学薬学部製薬化学科卒業
1969 年 3 月 大阪大学大学院理学研究科高分子学専攻
終了
1969 年 4 月～1970 年 12 月 同上博士課程に在学
1971 年 1 月 ～1973 年 1 月 鳥取大学工学部工業化学科助手
1973 年 2 月 ～1978 年 3 月 鳥取大学工学部工業化学科講師
1978 年 4 月 ～1991 年 3 月 鳥取大学工学部工業化学科助教授（1978 年 2 月～1980 年 2 月 パデュー大学ロスマン
教授の元で在外研究）
1991 年 4 月 ～1995 年 3 月 徳島大学工学部生物工学科教授
1995 年 4 月 ～2008 年 3 月 大阪大学蛋白質研究所
教授
2008 年 4 月～現在 兵庫県立大学大学院生命理学研究科 特任教授
大阪大学蛋白質研究所 客員教授

129

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第18回

構造を基礎とした生命機能理解の試み
阿 久 津 秀 雄 （あくつ ひでお）

１．研究を志した頃味を持つようになった。生体膜は生命の必須の構

私が大学院に進学したのは 1967 年で、Watson-

成成分であるが、よく分かっていないというとこ

Click の DNA 二重らせん構造モデルの提案から始ろが魅力的であった。また細胞膜は生命を外界かまった生物学の革命が全く新しい生命科学を切りら峻別しながら、さまざまな形で外界との相互作

開きつつあった。当時在籍していた東大薬学の坪用を仲介する役割を果たしているところが面白い。

井正道研究室にはその一端を担っているとの空気

生体膜の主要な構成成分は脂質と蛋白質であるこが流れていた。三井幸雄さんや森川耿右さんなどとは分かっていたが、膜蛋白質はとても物理化学に、時には坪井先生も加わって活発な学問談義が的な研究の対象になる状況ではなかった。脂質に行われていた。私は分子構造を基礎に生命を理解

ついては単分子膜等の研究があったので、埼玉大したいと思って坪井研に加わり、最初は研究室の学の福田清成教授（当時）・中原弘雄先生のご指導主流である核酸から入ったが、やがて生体膜に興を得て、単分子膜を累積することにより脂質二重写真１．坪井研遠足 (1967 年)
右から、坪井、松崎、（1 人）、川島、森川、玉懸、京極、飯高、(２人)、市川、濱田
前列右から、平川、武田、樋口、秋元。著者撮影、敬称略

130

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第18回

膜モデルを作り、その構造解析を行うことを博士

フォスファチジルコリン二重膜極性基が金属イオ

課程のテーマとした。幸いなことに、フォスファチ

ンとの相互作用により構造変化することを見いだ

ジルエタノールアミンを使うと水相上に広げた単し、少し後になるが、その様子を原子の分解能で明分子膜から交互配向の累積膜を作れることを見いらかにすることができた。また、佐竹博士・R. M.

だした。交互配向中の（極性―炭化水素鎖 炭化水

Franklin との共同研究で PM2 という脂質含有ウィ

素鎖―極性）の部分を生体膜中の二重膜構造モデ

ルスをインタクトな状態で固体 NMR を用いて解析

ルと考え、赤外線二色性を用いて構造解析を行っでき、固体 NMR の威力を実感した。この時期は ETHた。

の Wüthrich, Ernst 教授による２次元 NMR を用いたタンパク質構造決定法の開発が始まった頃であ２．固体 NMR との出会い

り、NMR 方法論の劇的発展を目の当たりにすること指導を受けていた京極好正先生が大阪大学蛋白ができた。Wüthrich 研で活躍していた永山国昭さ質研究所の教授となって移ったあと、助手に採用

ん（現生理研名誉教授）を訪ねて伺った話は実に興していただいて私も蛋白研に移った。同時に主要味深かった。

な手法も振動スペクトルから核磁気共鳴（NMR）に1980 年に蛋白研に戻ると 360 MHz の超伝導 NMR変わった。後者の方が生理的条件に近い環境で解の導入が決まり、国際レベルの実験ができるよう

析することができる。しかし、当時使っていた 100になっていた。それまでに超伝導 NMR は大学関係

MHz の NMR による蛋白質や膜の研究は容易ではな

では京大と東大（本シリーズ第 10 回田隅先生の項かった。膜系の研究には固体 NMR を使う必要があ参照）に入って活躍していた。蛋白研は共同利用研

るのではでないかと考え、選択的重水素化脂質膜究所であるため導入した超伝導 NMR 装置は全国のの研究で活躍していたバーゼル大学バイオセンタ

研究者に開放されるので、全国的なレベルアップ

ーの J. Seelig 教授の下に 1978 年に留学して固体につながった。こうしてわが国における蛋白質のNMR を学んだ。

NMR 研究が本格的に始まった。この時期、私は研究

この留学はいろいろな意味で実り多かった。仕室の北川禎三さん（現分子研名誉教授）の影響でこ事の面では、固体 NMR を用いて液晶状態におけるの装置を用いて電子伝達蛋白質の研究に手を染めた。
一方、お役御免になった 100 MHz の装置を固体NMR 用に改造して、クロマチン、ウィルス、脂質小胞のような巨大システム系の測定も行った。これ
らは手作りの面白さがあったが、超伝導溶液 NMR に比べて情報量が限られることを痛感させられた。

３．電気化学との出会い
1985 年には横浜国大工学部の仁木克己教授の研究室の助教授に採用していただいた。仁木先生の専門は蛋白質の電気化学で、特に硫酸還元菌（Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F）の四ヘムタンパ
写真２．阪大蛋白研の 100 MHz FT-NMR 装置（JMN PFT-100）

ク質であるシトクロム c3（cyt c3）に興味を持って掃引式の本体にフーリエ変換測定のためのアタッチメント

おられた。そこで電気化学と NMR が協力して（右側の電磁石の奥）がついた当時の最新装置。著者（中央）と学生の河野（左）、岩橋。

cyt c3 の酸化還元機構を調べようということになった。膜を介してのエネルギー変換との関係にも興味があった。しかし、当時の横浜国大工学部には生131シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第18回

物系の研究室がなく、嫌気性バクテリアの培養シ

膜存在下で上昇することが分かっていたので、脂ステム、蛋白質精製用の諸装置等全て零から立ち

質膜結合マストパラン X について解析した。アミ上げた。この時は蛋白研で手作りの研究をしていノ酸の種類の同定、アミノ酸同士のつながりの同たのが大変役に立った。蛋白質を測定・解析できる定を行う２次元、３次元のパルス系列を開発し、ア

NMR 装置もなかったので、全国共同利用研である

ミノ酸の配列帰属が可能になった。この 13C ,15N シ

蛋白研には大変お世話になった。cyt c3 についてのグナルの帰属から骨格の二面角情報を得た。次に電気化学との共同研究は大変実りあるものになっ

選択的安定同位体標識のマストパランＸを化学合た。NMR は電子の動きを直接見ることができる強成し、５つの距離情報を得た。この距離情報と化学みがあり、電気化学の情報と樋口・安岡の結晶構造

シフトから得た二面角を拘束条件として構造を得を合わせることにより精緻な議論をすることがでた。さらに、リン脂質膜のリン、あるいは脂肪酸重きた。この研究は 2000 年に阪大蛋白研に移ってか

水素の核スピンとペプチドのプロトンの間の距離らも続いた。小澤潔博士による c 型シトクロム発情報を得る測定法を開発してマストパランＸが膜現系の開発が研究の発展に重要な役割を果たした。

とどのように結合しているかを明らかにした。

最終的にはAccounts of Chemical Research から invite

５．H+-ATP 合成酵素 F1 の NMR による研究されて結果のまとめを報告した（１）。また、アメリカの研究者からの申し入れで日本の硫酸還元菌
宮崎株 DNA を提供し、その全塩基配列が決定・公開された。こうしてわが国の宮崎株は硫酸還元菌の国際的リストの仲間入りをした。これは八木達
彦先生（静岡大名誉教授）、樋口芳樹兵庫県立大教授等による日本での宮崎株関連蛋白質研究が評価されたためと思われる。

４．固体 NMR への本格的取り組み
1980 年代の終わりには固体 NMR でマジック角
試料回転によるシグナルの先鋭化と、磁気的相互作用の再結合による構造情報の獲得を結びつけた研究が Griffin, Schaeffer らによって始まり、蛋白質を意識した高分解能構造解析が具体的課題になっていた。1991 年に私が横浜国大で自分の研究室を持つようになった時、このような状況を考慮して生体膜の重要なシステムに本格的に取り組もうと考えた。固体 NMR はまだ方法論開発の段階であったので京極研出身の藤原敏道博士に助教授としてチームに加わってもらった。幸い 400 MHz の固体 NMR 装置を導入できたので、若松馨先生（当時群大助教授）との共同研究で G タンパク質共役受容体のモデルであるＧタンパク質活性化ペプチド、
マストパラン X の構造解析に取り組んだ。これは14 残基のペプチドで、測定法の開発に適していた。
マストパランＸのＧタンパク質活性化効率は脂質

132

本格的な膜蛋白質としてはそれまでやっていた電子伝達系とも関わりがある H+-ATP 合成酵
素に的を絞った。この酵素に関する歴史は本シ
リーズ第 4 回の香川靖雄先生（現女子栄養大副学長）のお話に詳しい。当時、結晶構造は知られていなかったし、回転説論争の渦中にあった。この酵素は分子量が 50 万を超える巨大な膜タンパク質で NMR にとっては巨大すぎる分子複合体であったが、電気化学ポテンシャルとATP の間のユニークなエネルギー変換機構に興味を持った。本酵素は膜外の水相に突きだしたF1 、膜に埋まった Fo 部分からなり、バクテリ
アではそれぞれ33, ab2cn のサブユニット組
成を持っていた。われわれが研究を始めて間もなく発表された Walker らのミトコンドリア F1の結晶構造によれば触媒サブユニットである
は細長いサブユニットでヌクレオチド結合型では Closed 構造をとり非結合型では Open 構造（N 末端・C 末端ドメインの相対的配向角がClosed 型より開いている）をとっていた。また
ATP の加水分解に伴って33 リングを貫くサブユニットが回転することを野地・吉田・木下らが示した。NMR の分子量の壁を考慮して、まずはこれをサブユニットに分解して研究を始めることにした。F1 部分は溶液 NMR 解析を基本とし、Fo 部分や FoF1 は固体 NMR でやるとシリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第18回

いう方針で研究に取りかかった。東工大の吉田賢右教授（当時）の協力を得ることができたので、材料としては好熱菌の H+-ATP 合成酵素を使った。この酵素は丈夫であるという点でも利点があった。F1 関係の仕事は八木宏昌博士が中心となって取り組んだ。
分子モーターである F1 におけるサブユニッ
トの回転にはβサブユニットの Open 型とClosed 型の間の構造変化が関係すると推定された。この構造変化がβサブユニット固有の性質
であれば、これは F1 回転の重要な駆動力となりうる。そこで、βサブユニットモノマー（52kDa）におけるリガンド結合の影響を安定同位体区分標識法で帰属された骨格アミドの 1H,
15N シグナル全体を用いて解析した。次にこの帰属を用いてヌクレオチド非結合状態と結合状
態でのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインの相対的配向角を NMR により決定したところ、モノ
マーでも結晶構造での Open 型と Closed 型に対応する構造をとっていることが明らかになった（２）。このことは F1 を回転させる駆動力の一つが ATP の結合によるβサブユニットの構造変化であることを示めす。同時に、これは F1の回転における ATP 分解のエネルギーがβサ
ブユニットの構造変化に使われているのではな
く、回転方向の決定に使われていることを示唆するものである。われわれはさらに、ヌクレオチド結合による構造変化がリン酸基結合によって誘発される活性部位水素結合ネットワークの再構成によって誘起されることを明らかにした（３）。しかし、モノマーと F1 は違うのではな
いかと誰しも思う。そこで、結晶化条件と同じ
溶液中の33’複合体（再構成 F1）でβの C末端領域を解析した。NMR 的に見てモノマーと同じ Open 型が F1 中にも観測されたのでモノマーの Open 型は複合体中の Open 型と同じであることが確認された。一方、非 Open 型のシグナルも存在し、Closed 型と思われる。こちらはサブユニット間相互作用を反映してモノマーとは異なる部分があった。この研究は 360
kDa の大きさのタンパク質でも溶液 NMR による解析が可能となったことを示した。結晶構造解析との連携ではεサブユニットでも面白い仕事ができた。εサブユニットはγサブ’ユニット
が ATP 分解方向に回転するのを抑制するブレー
キではないかと言われている。好熱菌εサブユ
ニットは ATP の結合下で結晶ができ、ヘリック
ス部分が折りたたまれた構造をとっていた。溶液中 ATP 存在下では NMR でも同様の構造が観測されたが、ATP がないと折りたたまれていた
ヘリックスは伸びてふらふらした構造をとっていた。これは好熱菌細胞内の ATP 濃度が下がると ATP 分解を抑制するためにヘリックス部分が伸びて ATP 分解のブレーキとして働くという生
化学的な解析結果を支持するものであった（４）。
上記の研究が本格化する頃、私は縁あって再び阪大蛋白研に戻った。その翌年 2001 年に日本蛋白質科学会が創立された。思い出すと、先輩である長岡技術科学大の三井幸雄教授はわが国で蛋白質研究を飛躍的に発展させるためにはタンパク質構造討論会と蛋白工学会を基礎として新しい学会を作る必要があると機会あるごとに説いておられた。この考えに沿って、1998
年には三井さんが長岡でタンパク質構造討論会と日本蛋白工学会の合同年会（98’蛋白合同年会）を開催した。当時熱狂的な参加者を集めていた鄕信広京大教授（当時）の重点領域研究「タンパク質の立体構造構築原理」のグループ
も新しい学術団体を模索していた。そこで、翌
年に第 50 回タンパク質構造討論会を記念した
蛋白合同年会横浜 99’を私がお世話した際に、日程を重ねて同じ場所でタンパク質の立体構造
構築原理研究会第 6 回ワークショップを開いていただいて交流を行った。その翌年には三浦謹一郎先生（当時学習院大教授、遺伝研・東大名誉教授）が蛋白合同年会東京 2000 という形で3 団体をまとめてくださった。その後、構造生
物学シンポジウム等他の団体も加わって学会が創立されるに至った。この流れを作り出す上で重要な役割を果たしたのは三井さんの新しい学会への情熱だったように思う。しかし、悲しい133

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第18回

ことに三井さんは病に倒れ、日本蛋白質科学会の創立を見ることなく他界された。三井さん自身の研究も発展段階にあり、心中さぞかし無念であったろうと拝察する。改めてその努力に感謝したい。

ノ酸（最小限のプロトン以外を重水素に置き換えた 13C,15N-標識アミノ酸）を用いて解析した。脂質
リポソーム存在下、無細胞系で発現したサブユニ
ットｃは一定条件下で脂質膜に取り込まれて自動的に正常なリング（この場合は c10）をつくるようで Fo F1 に再構成すると活性を持つリングを精製す+ることができた。これを脂質膜に再構成して活性膜内に存在する Fo は戦略的には固体 NMR の部位の構造を調べた。脂質膜中での活性部位での対象であると考えていたが、好熱菌サブユニット

プロトン保存の方法が大腸菌と好熱菌で異なる可ｃについては既に発表されている大腸菌にならっ能性があるという興味深い結果が得られた (6)。大て有機溶媒の疎水環境中での溶液構造を決定した。

腸菌に発現した Fo F1 からインタクトな状態のリン

大腸菌のサブユニットｃ構造を基に、プロトン移

グを精製することにも成功し、全体の構造決定に

動・回転モデルが提案されていた。われわれの基本

利用している。

６．H -ATP 合成酵素 Fo の NMR による研究

構造は大腸菌のものと似ていたが、プロトン移動

７．まとめと深い関係のある pH 変化に対する挙動は全く異なっていた。サブユニットｃリングについては本

生命科学全体で見ると生命活動への理解は私

来、脂質膜中の構造決定をすべきである。そこで、が研究を始めた頃に比べると非常に進んだ。それ

固体 NMR を用いてこれに取り組んだ。まず、蛋白はまたさまざまな研究方法論の発展に支えられて研の相本三郎教授の協力を得て大腸菌のサブユニいる。私は構造生物学と呼ばれる分野で研究をしットｃの選択的標識を行い、これをリングとしててきたが、問題意識と方法論と実験設備が揃うの

脂質膜に再構成し、その活性部位構造と大腸菌モはなかなか難しいと感じた。また、生命機能の個人

ノマー構造を基に提案されたリング構造を比較し的理解についてはなお道は遠いと感じている。

たが、提案構造とはやはり一致しなかった。視点を変えて大腸菌 c－リングと液晶状態における脂質二重膜の相互作用を脂質の側から固体 NMR で見ると、その相互作用が非常に滑らかでリングの回転によるエネルギーロスが少ないことが明らかに文 献なった（5）。

1)c-リング構造の本格的解析は好熱菌サブユニッ

H. Akutsu and Y. Takayama, Accounts Chem. Res.,40, 171-178 (2007).

トｃを用いて行った。固体 NMR の弱点は多くの

2) H. Yagi, T. Tsujimoto, T. Yamazaki, M. Yoshida, and試料が必要なことで、しかもインタクトなリング

H. Akutsu, J. Am. Chem. Soc., 126, 16632-16638

構造を脂質膜に再構成するのが最も重要なポイン(2004).

トである。そこで、大腸菌で採用されているようなモノマーからの再構成ではなく、吉田研の協力を

3) H. Yagi, N. Kajiwara, T. Iwabuchi, K. Izumi, M.

得て酵素本体（Fo F1）からインタクトなリングを精Yoshida, and H. Akutsu, J. Biol. Chem., 284,

製して再構成する方法を確立した。もう一つの方

2374-2382 (2009).

法は無細胞系を使うもので、選択的標識に向いて

4) H. Yagi, N. Kajiwara, H. Tanaka, T. Tsukihara, Y.

いる。X 線結晶構造解析で他の生物種について界

Kato-Yamada, M. Yoshida and H. Akutsu, Proc.

面活性剤中でのリング構造が報告されたので、そNatl. Acad. Sci. USA, 104, 11233-11238 (2007).

れとの対比で脂質膜中の活性部位の構造を甲斐荘

5) M. Kobayashi, A. V. Struts, T. Fujiwara, M. F. Brown,

正恒先生（首都大名誉教授）が開発した SAIL アミ

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第18回

and H. Akutsu,. Biophys. J., 94, 4339-4347 (2008).
6) S.-J. Kang, Y. Todokoro, I. Yumen, B. Shen, I. Iwasaki, T.
Suzuki, A. Miyagi, M. Yoshida, T. Fujiwara, and H. Akutsu,
Biophys. J., 106, 390-398 (2014).

阿久津秀雄先生ご略歴：

1944 年 東京に生まれる
1967 年 東京大学理学部生物化学科卒業
1972 年 同上理学系研究科博士課程単位修得退学（73 年理学博士）
1972 年 大阪大学蛋白質研究所助手
1985 年 横浜国立大学工学部助教授
1991 年 横浜国立大学工学部教授
2000 年 大阪大学蛋白質研究所教授
2006 年- 横浜市立大学客員教授
2006-2008 年 日本蛋白質科学会会長
2007 年 大阪大学名誉教授
2007-2014 年 大阪大学蛋白質研究所客員教授
2009-2013 年 ソウル国立大学 WCU 教授
2014 年 日本学術振興会ストックホルム研究連絡センター長135