博士（医学）林
学位論文題名宏恵

JCウイルス初期転写領域の腫瘍原性の解析及びヒト髄芽腫との関連に関する検討
学位論文内容の要旨［目的と背景］
JC virusく JCV)は ヒ ト 脳の脱 髄性疾 患であ る進行 性多巣 性白質 脳症progressive multifocal
leukoencephalopathy (PML)の 原 因virusで ある ． JCVは 同属 の polyomavirusで あ る simianvirus 40 (SV40)，BK virus (BKV)と同様に 実験的 に新生 仔hamster脳に腫瘍原性がある事が示
さ れ てお り ， 脳 腫瘍 と の 関連性 が示唆 されてい るが， 未だそ の詳細 な機構 にっい ては解 明され て い な い ． Polyomavirusの transform能 の 解 析 では ， 現 在 まで に SV40で の 研 究が 詳 細 に
行 わ れ て き て い る ． JCVは SV40と DNA全 体 で 69％ の homologyを 有 し ， かつ 腫 瘍 化 に関 連
す る LargeT(LT)遺 伝 子 で は 72％ の homologyを 持 つ ． 現 在 ま で の 報 告 で は ， JCVの LT抗原 （ 蛋白 ） の transform誘 導 能 は SV40のLT抗 原 のtransform誘 導 能よ り 著 しく低 いとレ ゝう結 果 が発 表 さ れ てい る ． しかし 通常LTと smallt (st)とは 同じframeから翻訳 される ため， LT
単 独 の機 能 は 不 明で あ っ た ．そ こ で 著 者ら は ， JCVのLTの み を発 現 す る plasmidを構 築し，NIH3T3細 胞を 用 い て stable transformantを 作製 し ，腫瘍 原性の有 無を解 析し， その強 度をSV40， BKVと 比較 検 討 し た． ま た 最 近、 JCVが ヒ トmedulloblastomaの発 生 に 関 連し て い ると い う報 告 が あ り， 再 び JCVとヒ ト 脳 腫 瘍と の 関 連性 が注目を 集めて きてい る，そ こで． ヒト medulloblastomaの 手 術 材 料 を 用 い て JCVの LT遺 伝 子 と そ の 蛋 白 の 有 無 を 検 討 し た ．
［対象と方法］
1． Mouse線 維 芽 細 胞 で あ る NIH3T3細 胞 に JCV， SV40， BKVの LT遺 伝 子 の み を 単 独 で 発現さ せるplasmids，すな わちJCLT, SV40LT, BIく工Tを構築し，それらをPCXN2―Flag vectorに組 み 込 み LTの transform能 を colony formation assay， 細 胞 増 殖 能 の 検 討 に 用 い た ．
2． LTとstを判 別する 為に，JC virus smallt (JCst)に対する抗体の作製を試みた．JCstは172
個 の amino acid残 基 か ら な り ， 688個 の JCLTと N末 端 の 81残 基 が 同 じ frameか ら 翻 訳 され ， そ の 後 splicingに よ り 異な っ た 蛋 白と し て 作 られ る ． そ こで JCLTと 交 差 し ない C末 端の16残基を抗原として抗体を作製した，
3． ヒ ト 脳 腫瘍 と JCLTの 関 連性 を 調 ぺ る為 に ヒ ト 小脳 に 発 生 した medulloblastomaの手術材料を用いてJCV遺伝子の有無をP
CR，genom
icSouthernblotting，insituhybridization(ISH)法，および免疫染色法にて検討を行った．

一 417―

［結果］1） Transform
能の解析：NI
H3T3を 用いてJCLT, S
V40L
TおよびBKLTをstableに発現する
cloneをそれぞれ3cloneずつ樹立した．Colonyformat
iona
ssayの結果，JCLTを組み込んだN
IH3T
3細 胞は S
V40L
T， B
KLTを組 み込 んだ N
JJ
‑13T
3細胞よりはやや低いものの，これらとほぼ同等のtransform
能を誘導する事が判明した．さらに細胞増殖能とtransform能が比例していた．
2） J
Cst抗体 の検討：JCLTと交差しないJC
stのC末端の16残基を抗原として抗体を作製し，抗体の感度と特異性をJC
V
持続感染細胞(JCI)
およびJCVtransfor
medhamstercellline(Med‑l)を用いて調べたところ，感染細胞及び腫瘍化細胞のいずれにおいても予想される分子量の位置にstが発現していることが判明した．非感染 細胞のIMR‑32は陰性であり，抗体が特異的であると思われた．またヒトPML脳においてはJC
V
感染oligodendrogliaの核内に陽性となった。
3） ヒ ト medulloblastomaと JCV genomeと の 関 連 ：ヒ ト 小 脳 に 発 生 し た 8例 のmedullo
blastoma（6例の凍結手術材料と3例のparaffin‑embeddedtissue)
を用レュてJCV
感染の有無をP
CR，genomicSouthernblotting，ISH，免疫染色にて検討を行った．その結果8例のヒト のmedullo
blastoma
ではいずれ の方法においてもJCV genomeは検出されなかった．
［考察］
現在までのR
at2細胞を用いた実験ではJCLTのtransform能がないと報告されているが，今回JCstを欠いたJ
CLTでNIH
3T3細胞に高い腫瘍原性を示し た．このことは，我々の実験で使用したPCX
N2‑Flag vect
orのpromoterがJ
CVの野生型promoterより非常に強カな機能を持つ 事と ，mouseの培 養細 胞 に対 して 高い 活性 を持 つ特 徴を 有す る為と考えられた．
JCstの抗体が作られ，これを用いた解析で，JCVによってtr
ansform
レた細胞とJCVに感染した細胞の両方にJCstが発現していることが明らかとなった，
ヒトのmedulloblastomaの検索で，いずれの方法でも陰性であった。我々は凍結保存材料からDNAを抽出して検討して おり，報告された論文に比してより正確な結果が得られたものと考えられた，1
症例のVP領域にて増幅されるbandが出現したが，PCRによる非特異的増幅産物であった．
［結語］
1． JCVSV40，BKVのLTのみを発現するNI
H
3T3細胞株を樹立し，colonyformationassayを行った結果，SV40やBKVと同 様にJ
CL
Tもrodent cellをtransformさせることが判明レた．
ま た い ず れ の transformantで も 細 胞 増 殖 能 の 増 加 が 見 ら れ た ． そ の 活 性 はSV40L
T>
B1
:
く工T>
JCLTの順であった．
2． JCstに対する抗体を作製し，JCstがJCV
感染細胞および腫瘍化細胞で発現していることを明らかにした．
3．ヒトmedulloblastoma8例についてPCR法，genomicSouthernblotting，ISH法，および免疫染色法で検討したが，いずれの方法においてもJCV genomeの存在は認められなかった．

418−

学 位論文審査の要旨
主 査 教 授 長 嶋 和 郎
副 査 教 授 吉 木敬哲也
副 査 教 授 守 内

学 位 論 文 題 名JCウイ ル ス初 期転写 領域の腫 瘍原性の 解析
及び ヒト髄芽 腫との関連に関する検討

JCv
irus(JCV)はヒト脳の脱髄性疾患である進行性多巣性白質脳症progressiv
emultifocalleukoence
phalopathy (PML)の原因virusである。JCVは同属のpolyomav
irusであるSV
40，
BKVと同様、 実験的に新生仔ハムスター脳に腫瘍原性がある事が示されており、脳腫瘍との関連性が示唆されているが、未だその詳細な機構については解明されていない。最近、JCVがヒト髄 芽腫の発生に関連しているという報告があり、再びJCVとヒト脳腫瘍との関連性が注目を集めてきている。一方、トランスフオーム能の解析では、現在までにSV
40での研究が詳細に行われてきている。JC
VはSV40とDNA組成で69 010の相同性を有し、かつ腫瘍化に関連するする大型T抗原遺伝子では720/0の相同性があり、JCVの腫瘍化機構の解析が興味の対象となってきている。現在 までの報告では，JCVの大型 T
抗原蛋白のトラン
スフオーム誘導能はSV40の大型T抗原蛋白のトランスフオーム誘導能より著しく低いという結果が発表されている。しかし通常大 型T抗原と小型t抗原とは同じフレームから翻訳され るた め、 大型 T抗原単独の機能は不明であった 。そこで著者らは、JCVの大 型T抗原のみを発現するプラスミドを構築し、NIH
3T3細胞を用いてク口一ン化細胞を作製し、腫瘍原性の有無を解析し、その強度をSV40，BKVと比較検討した。又、注目されているヒト髄芽腫との関連に関しては、ヒト手術材料 を用いてJ
CVの大型T抗原遺伝子とその蛋白の有無を解析した。その結果、以下の4点が明らかとなった：
11 Transfo
rm能の 解析 ： N
IH3T
3を 用い てJCLT, SV40L
TおよびBKLTをsta
bleに発現するcloneをそれぞれ3clone
ずっ樹立した，Colonyformationassayの結果，JCLTを組み込んだ
NIH3T3細 胞 は SV40LT，BKLTを 組み 込ん だ N
IH3T3細 胞よ りは やや 低い もの の， これ らとほぼ同等のtransform能を誘導する事が判明した．さらに細胞増殖能とtransform能が比例していた．
2、 JCst抗体 の検 討： JCL
Tと交差しないJ
CstのC
末 端の16残基を抗原として抗体を作製し．抗体の感度と特異性をJ
CV
持続感染細胞(JCDおよびJC
Vtra
nsformedhamstercellline― 419ー(Med‑l)を用いて調べたところ，感染細胞及び腫瘍化細胞のいずれにおいても予想される分子量の位置にstが発現している ことが判明した，非感染細胞のIMR−32は陰性であり，抗体が特異的であると思われた． またヒトPML脳においてはJCV感染oligodendrogliaの核内に陽性となった。
3） ヒ 卜 medulloblastomaと JCV genomeと の 関 連 ：ヒ ト 小 脳 に 発 生 し た 8例 のmedulloblastoma（6例の凍結手術材料と3例のparaffin‑embeddedtissue)
を用いてJ
C
V感染の有無をP
CR，genomicSouthernblotting，ISH，免疫染色にて検討を行った．その結果8例のヒト の medulloblastomaではいずれの方法においてもJCV genomeは検出されなか った。
口 頭 発表 にあたり、副査の古木教授から、1） NIH
3T3細胞以外でJCVによるト ランス
フ オ ー ム 能の 報告 につ いて 、2） 大型 T
抗 原 と小 型t抗原 の局 在に つい て 、31小型 t抗原遺伝子の機能につしゝて、4） 1999
年発表のProcN
atlAcadSciU
S
Aの報告との差異に関しての質問があった。続いて副査の守内教授から、1） PCRassayの結果について、2）この論文のまとめ方について。更に主査の長嶋から、1） JCLTがNLH
3T3細胞強卜ランスフオー
ム能を示した点、2） smallt抗体でmedulloblastomaを検討したかについての質問を行った。
これらの質問に対して発表者は 豊富な知識と文献例を引用し、ほぼ妥当な解答をした。
こ の 論文 は、 JCVの大 型T抗 原が 単独 でNIH3T3細胞のトランスフオーム誘導能 を有することを明らかにした。さらに、JCVはヒト髄芽腫には直接関係していないことを示した。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

― 420ー