アクト･ビヨンド･トラスト研究助成 成果報告会 @2023年 6 月11日

神経回路形成期の時期特異的ネオニコチノイド曝露影響と発達神経毒性の継世代評価
星 信彦
神戸大学 大学院農学研究科
応用動物講座 動物分子形態学分野(nobhoshi@kobe-u.ac.jp)
Animal Molecular Morphology, Kobe University

2背景と目的
ネオニコチノイド系農薬（NN）
ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）
競合的モジュレーター
（NNとnAChRの親和性：哺乳類≪昆虫）［Tomizawa & Casida, 2003］

無毒性量以下のNNによる高等脊椎動物への毒性
鳥類・哺乳類への生殖毒性［Tokumoto et al., 2013；Hoshi et al., 2014;
Yanai et al., 2017; Kitauchi et al., 2021］

ラットの胸腺・腸内細菌叢への影響［Onaru et al., 2020］

マウスへの神経行動学的影響［Hoshi et al., 2014; Hirano et al., 2015, 2018,2021; Takadaet al., 2018, 2020; Yoneda et al., 2018, Hoshi 2021; Maedaet al., 2021; Hirai et al., 2022; Nishi et al., 2022 ］

NNの母子間移行➤ 成人・子供・新生児の尿からNNを検出［Ichikawa et al., 2019; Ikenaka et al., 2019;
Oya et al., 2021; Ueyama et al., 2015］➤ NN・代謝産物の胎盤を介した胎子への迅速な移行［Ohno et al., 2020］➤ NNが母体内で代謝・濃縮され迅速に母乳中へ移行［Shoda et al., 2023a］
Animal Molecular Morphology, Kobe University

3

背景と目的
NNの次世代影響
胎子・新生子期のCLO曝露E1.5

出生 PND21（離乳）

10wk

CLO

神経発達の阻害
幼年・成年期で異なる行動異常
幼年期

成年期

PND21

10wk

不安様行動多動［Maeda et al., 2021］

脳の神経回路形成期

神経新生，神経細胞移動，神経突起・軸索の伸長，シナプスの形成・刈込みなどが行われる 脳機能形成において最も重要な時期
各発達段階のCLO曝露による神経行動学的な影響は明らかではない
Animal Molecular Morphology, Kobe University

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背景と目的
環境因子の継世代影響※
エピゲノム: ゲノムに加えられた修飾で，後天的に変化を受ける※

細胞エピゲノムの変化により，複数の世代に有害な表現型が伝達される可能性［Xin et al., 2015］

無毒性量のCLO
F1，F2，F3世代の雌産子の雌性生殖器に影響を及ぼす

F0 妊娠雌マウス
化学物質♀

［Kitauchi et al., 2021］ ［北内, 2021］

除草剤グリホサート
F2，F3世代の疾患に関与，精子DNAメチル化領域の変化［Kubsad et al., 2019］

妊娠中のニコチン曝露
F1，F2世代の行動異常，DNAの低メチル化 ［Buck et al., 2019］

♀

♂ F1♀

♂

♀

♂

♀ F2♂

♀

♂

♂

♀

F3♂

♀

各発達段階のCLO曝露による神経行動学的な影響は明らかではない
Animal Molecular Morphology, Kobe University5

背景と目的
NNの次世代影響

実験①の目的

神経発達の阻害
幼年・成年期で異なる行動異常 ［Maeda et al., 2021］
神経回路形成期（胎子・新生子期）を4つの期間に分け，胎子・新生子期のCLO曝露

CLO曝露が脳の発達へ最も影響する発達段階を検証
幼年期
成年期

E1.5

出生 PND21（離乳）

CLO

10wk

不安様行動

多動

脳の神経回路形成期 実験②の目的

妊娠・授乳期のF0世代に無毒性量のCLOを曝露し，F1，F2，F3世代の神経行動学的な継世代影響を検証

実験③の目的
神経新生，神経細胞移動，神経突起・軸索の伸長，シナプスの形成・刈込みなど
妊娠・授乳期のF0世代に無毒性量のCLOを曝露し，が行われる 脳機能形成において最も重要な時期

F1，F2，F3世代の胸腺・腸管免疫系への継世代影響を検証
各発達段階における神経行動学的な影響は明らかではない

Animal Molecular Morphology, Kobe University

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実験① 結果と考察
評価装置

項目

幼年期

成年期

CLO-1 CLO-2 CLO-3 CLO-4 CLO-1 CLO-2 CLO-3 CLO-4

自発運動量

不安様行動

4
つの発
達
期

OF

総移動距離

OF

移動速度

EPM

総移動距離

EPM

アーム総進入回数

OF

中心区画滞在時間

EPM

オープンアーム滞在時間

EPM

オープンアーム進入割合

CLO-1（胎齢 9～12 日）:

成年期 不安様行動の増加・抑制傾向

有意に増加

CLO-2（胎齢 15～18 日）:

成年期 不安様行動の増加・抑制傾向

増加傾向

CLO-3（生後 1～4 日） :成年期 自発運動量の増加

CLO-4（生後 11～14 日）:

幼年期 不安様行動の増加傾向

抑制傾向
変化なし
※対照群との比較

脳の神経回路形成期の発達段階別の行動影響が明らかとなった
Animal Molecular Morphology, Kobe University

7

実験① 結果と考察
生後1～4日（CLO-3）のCLO曝露

先行研究［Maeda et al., 2021］

本研究

曝露期間

幼年期

成年期

DCX陽性細胞数（成年期）

E1.5～PND21

不安様行動

多動減少

E9～12 (CLO-1)―

不安への影響―E15～18 (CLO-2)―

不安への影響―PND1～4 (CLO-3)―多動減少

PND11～14 (CLO-4)

不安様行動――
E=胎齢 PND=生後日齢❏免疫組織化学的解析(/mm²)

成年期: DCX陽性細胞数（未熟神経細胞）の減少
生後1～4日のCLO曝露による神経発達への影響が成年期の海馬においても継続

胎子・新生子期（全期間）のCLO曝露と同様の結果が，生後1～4日のCLO曝露（CLO-3）でも明らかとなった
Animal Molecular Morphology, Kobe University

8

実験① 結果と考察
生後1～4日（CLO-3）のCLO曝露(/mm²)❏網羅的遺伝子発現解析
幼年期: 海馬の神経突起・軸索の伸長・分枝が促進
成年期・ “Neuritogenesis（神経突起形成）”や,“Outgrowth of neurites（神経突起の伸長）”など
・ Fgfr1（線維芽細胞増殖因子受容体1）

適正な時期の神経発達を阻害

生後1～4日シナプス形成マウスの脳における神経回路形成過程 ［Reemst et al., 2016より］
Animal Molecular Morphology, Kobe University

9

実験① 結果と考察
生後1～4日（CLO-3）のCLO曝露(/mm²)❏網羅的遺伝子発現解析
幼年期: 海馬の神経突起・軸索の伸長・分枝が促進
成年期・ “Neuritogenesis（神経突起形成）”や,“Outgrowth of neurites（神経突起の伸長）”など・ Fgfr1（線維芽細胞増殖因子受容体1）

適正な時期の神経発達を阻害

海馬
神経新生・発達は生後も継続
CLOは母体内で代謝・濃縮され迅速に母乳中へ移行［Shoda et al., 2023a］

海馬の神経発達に悪影響
発達中のマウス脳における神経細胞の発生時期 ［Rodier et al., 1977より］
Animal Molecular Morphology, Kobe University

10

実験① 結果と考察
生後1～4日（CLO-3）のCLO曝露海馬情動行動を制御する重要な役割を担う

ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）由来脳オルガノイド

母性ニコチン曝露を受けた
マウス産子

出生前ニコチン曝露による早期の神経細胞分化，神経突起の伸長

認知・行動異常および分子層と海馬CA1の神経突起長の増加［Wang et al., 2018］

本研究［Zhou et al., 2021］

生後1～4日のCLO曝露(CLO-3)

脳の神経突起や軸索の伸長・分枝に影響し，成年期の行動異常に繋がる可能性
Animal Molecular Morphology, Kobe University

11結論（実験①）
脳の神経回路形成期（胎子・新生子期）を4つの期間に分け，無毒性量のCLO曝露による影響を発達段階別に評価
曝露期間

幼年期

成年期

DCX陽性
細胞数（成年期）

先行研究［Maeda et al., 2021］

本研究

不安様行動

多動減少

E9～12―

不安への影響―E15～18―

不安への影響―PND1～4―

多動減少

PND11～14

不安様行動

―

―

E1.5～PND21

胎齢 9～12，15～18日
成年期の不安レベルに影響
生後 1～4日
成年期の自発運動量増加
幼若神経細胞の減少
神経突起や軸索の伸長・分枝促進

脳の神経回路形成期（胎子・新生子期）における，発達段階特異的な神経行動学的影響を初めて明らかにした

生後1～4日：CLO曝露による脳の発達への影響が最も大きい［Shoda et al., 2023b (doi: 10.1292/jvms.22-0570)］
Animal Molecular Morphology, Kobe University

12

実験② 結果と考察
妊娠・授乳期のF0世代に無毒性量のCLOを曝露し，F1，F2，F3世代の神経行動学的な継世代影響を検証
装置

成年期

項目
F1

自発運動量

不安様行動

OF

総移動距離

OF

移動速度

EPM

総移動距離

EPM

アーム総進入回数

OF

中心区画滞在時間

F2

F3

F1

自発運動量の減少
不安様行動の増加

F2

自発運動量の減少傾向
不安様行動の増加傾向

F3 自発運動量の増加傾向

EPM オープンアーム滞在時間有意に増加

有意に減少

変化なし

EPM オープンアーム進入割合増加傾向

減少傾向※対照群との比較

F0 妊娠雌マウス

CLO

無毒性量のCLOによる影響は
F1・F2・F3へ世代を経ると減弱する［Shoda et al., 2023c (in press)］

♀
♀

♂F1♀

♂

♀

♂

♀ F2♂

♀

♂

♂

♀

F3♂

♀

Animal Molecular Morphology, Kobe University

評価

13

実験①＆②の総括
神経回路形成期の時期特異的クロチアニジン（CLO）曝露影響と発達神経毒性の継世代評価
F0 妊娠雌マウス

CLOF1世代

♀

♂ F1♀

♂

♀

♂

♀

F2♂

♀

♂

♂

♀

♂

♀

F3

脳神経回路形成の発達段階別の影響が明らかとなった

F2・F3世代 影響は波及するが，世代を経ると減弱していく［Shoda et al., 2023b, c］

Animal Molecular Morphology, Kobe University♀

実験③ まとめn=6, Mean+SD, ＊:P<0.05

細菌の相対存在量変動（属レベル）［Murata et al., 2023］

n=6-8, Mean+SD

Animal Molecular Morphology, Kobe University

14

実験③ 結果と考察（腸内細菌叢解析）

15☑
 無毒性量のCLOが腸内細菌叢を攪乱した☑
 複数の短鎖脂肪酸産生菌の相対存在量が変動した

 門レベルでの変動はみられなかった☑
 α多様性に対する影響も顕著ではなかった☑
先行研究においても，無毒性量の投与群では細菌叢組成に大きな変化はみられなかった［Onaru et al., 2020］

Animal Molecular Morphology, Kobe University

先行研究と一致［Onaru et al., 2020］

実験③ 結果と考察（腸内細菌叢解析）

16☑
 無毒性量のCLOが腸内細菌叢を攪乱した☑
 複数の短鎖脂肪酸産生菌の相対存在量が変動した

 門レベルでの変動はみられなかった☑
 α多様性に対する影響も顕著ではなかった☑
先行研究においても，無毒性量の投与群では細菌叢組成に大きな変化はみられなかった［Onaru et al., 2020］

Animal Molecular Morphology, Kobe University

先行研究と一致［Onaru et al., 2020］

実験③ 結果と考察（腸内細菌叢解析）

17☑
 無毒性量のCLOが腸内細菌叢を攪乱した☑
 複数の短鎖脂肪酸産生菌の相対存在量が変動した

無毒性量のCLOが腸内細菌叢に先行研究と一致及ぼす影響は甚大ではないものの，細菌叢組成を継世代的に変動させる
 門レベルでの変動はみられなかった☑
［Murata et al., 2023 (doi: 10.1292/jvms.23-0038)］

 α多様性に対する影響も顕著ではなかった☑
先行研究においても，無毒性量の投与群では細菌叢組成に大きな変化はみられなかった［Onaru et al., 2020］

Animal Molecular Morphology, Kobe University［Onaru et al., 2020］

結 語18

化学合成農薬が一般に使用されるようになっておよそ70年が過ぎました．人類は漸く農薬の本当の姿を理解できるようになってきたのではないでしょうか．

さらに近年，細胞世代を超えて継承され得る，塩基配列の変化を伴わない遺伝子発現制御について研究する新たなパラダイムとして，エピゲノム毒性の領域が提唱され，環境中微量化学物質が生物に及ぼす環境エピゲノムの展開が期待されています．
「環境汚染と健康」の問題は未来（次世代）に先送りしてはならないし，「疑わしきは罰せず」ではすまされません．農薬との付き合い方を真剣に考えるときが来たと思っています．

Animal Molecular Morphology, Kobe University

一般に胎子および新生子は成体と比べて化学物質等への感受性が極めて高く，非可逆的に脳・生殖機能，さらには胸腺･腸管免疫系を障害する可能性が示唆されています．環境中微量化学物質の作用メカニズムの解明は，分子生物学的知見をもとに新しい時代に入ったといえますが，器官形成・発達時期である胎子・新生子期での曝露が，長期にわたって非可逆的にフィードバック機構の破綻を招来する作用機序については未だ不明な点が多くあります．