上原記念生命科学財団研究報告集, 29 (2015)

185. ベーチェット病新規感受性遺伝子 KLRC4 の機能解析

桐野
Key words：ベーチェット病，KLRC4，NK 細胞，自然免疫，HLA-B*51

洋平

横浜市立大学 大学院医学研究科
病態免疫制御内科学
緒言

ベーチェット病は原因不明の炎症性疾患であり，発作性の口内炎，ブドウ膜炎，皮膚粘膜病変などを来す．病態にはNK 細胞を含む自然免疫の活性化が重要視されてきたが，直接的証拠は少なかった．ゲノムワイド関連解析によりベーチェット病の感受性遺伝子が複数同定されたが，この中に KLRC4 が含まれている．KLRC4 は "NK complex" とよばれる NK 受容体が複数存在する 12 番染色体に存在している．KLRC4 の隣に位置する KLRK1 は NKG2D をコードしており，研究が進んでいる．KLRK1 のリガンドは MICA であり，MICA はベーチェット病の最強の感受性遺伝子 HLAB*51 と同じハプロタイプブロックに存在していることから NK 受容体と MICA の相互作用が疾患に重要な可能性がある.

方法

本研究は横浜市立大学附属病院倫理委員会の承認を得て推進した（承認番号 B131107009）．またベーチェット病患者に対してインフォームドコンセントと同意書を得て，ヘルシンキ宣言に則り実験を行った．ヘパリン加血をフィコール法により遠心分離し，末梢血単核細胞 (PBMC) を得た．これを MACS 法を用いて NK 細胞と単球に分離した(negative selection) ． こ れ ら の 細 胞 か ら Qiagen RNeasy を 用 い て mRNA を カ ラ ム 精 製 し ， Super ScriptIII(Invitrogen) を用いて cDNA を作製した．ヒト KLRK1 および KLRC4 の real-time PCR 用プライマーを AppliedBiosystems より購入し，同 StepOnePlus system を用いて解析した．PCR は quadruplicate にて行った．統計解析は
GraphPad prism を用いて行った．

結果KLRK1 と KLRC4 の mRNA の発現量を PBMC，単球分画，NK 細胞分画で比較した．その結果 KLRK1（ABI プライマー assay ID Hs00183683_m1）と KLRC4 (Hs04188025_g1) の mRNA が NK 細胞で高いという結果が得られた（n=3, 図 1 および 2）．次にプライマーの特異性を調べるために， KLRK1 ， KLRC4 ，その他 NK complex に属するKLRC1, 2, 3 との相同性を検討した．その結果, KLRK1 のプライマーは Exon1-2 の特異性が高い領域に設計されていたが，KLRC4 のプライマーがアニーリングする領域は Exon2 に位置しており，KLRC2 の Exon1-2 とわずか 1 塩基の差であったことから KLRC4 の特異的増幅は Hs04188025_g1 プライマーでは困難と考えられた．

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図 1． 末梢血における KLRC4 の発現．
赤い線は中央値を示す．

図 2． 末梢血における KLRK1 の発現．
赤い線は中央値を示す．

考察

KLRK1 と KLRC4（もしくは KLRC2）がヒト末梢血 NK 細胞に高発現していることが確認できた．予想通り NKcomplex の遺伝群は相同性が極めて高く，発現評価には困難が予想されることから．今後は強制発現ベクターを用いた機能解析が重要と考えられる．RNA expression array のデータ (GNF Expression Atlas 2 Data from U133A andGNF1H Chips) を参照すると， KLRC4 と KLRK1 はともに NK 細胞だけでなく CD4/8T 細胞にも高発現している．
CD8T 細胞は HLA-Class I を直接認識することから，CD8T 細胞による HLA-B*51 と MICA の両方の認識機構がベー2

チェット病に重要な可能性がある．また NK 細胞は HLA が低発現，MICA 高発現の細胞を認識して攻撃することからこの機構も重要視される．今後これら CD8T 細胞や NK 細胞に KLRC4 を強制発現させて HEK293 や抗原提示細胞と共培養して，NK 活性などへの影響を検討していきたい．また，MICA と KLRC4 が直接結合できるかも検討したい．
さらに患者血球における KLRC4 の発現や，治療による影響も調べる必要がある．

共同研究者
本研究の共同研究者は横浜市立大学大学院医学研究科病態免疫制御内科の石ヶ坪良明と，上田敦久である．

文献

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