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放射光第巻第号

(

)

トピックス

大腸菌多剤排出トランスポーター AcrB の X 線結晶構造解析
村上聡1,2,4，中島良介1，山下栄樹3，山口明人1,4
1大阪大学産業科学研究所，2 科技団さきがけ，
3大阪大学蛋白質研究所，4科技団CREST

Crystal Structure of Bacterial Multi-drug EŒux Transporter AcrB
Satoshi MURAKAMI1,2,4, Ryosuke NAKASHIMA1, Eiki YAMASHITA3 and Akihito YAMAGUCHI1,4
1Institute of Scientiˆc and Industrial Research, Osaka University,
2PRESTO, Japan Science and Technology Corporation,
3Institute for Protein Research, Osaka University,
4CREST, Japan Science and Technology Corporation
Abstract
Multi-drug resistance of pathogenic bacteria often results from the over-expression of the multi-drug eŒux system.
AcrB is a major multi-drug eŒux transporter protein in E. coli that exports wide variety of drugs, antibiotics and toxic
compounds. It cooperates with a membrane fusion protein, AcrA, and an outer membrane channel, TolC. We have
solved the crystal structure of AcrB at 3.5 Å resolution. This is the ˆrst crystal structure of drug transporter and also theˆrst atomic-level structure of a secondary transporter which driven by proton motive force across the plasma membrane.
Three AcrB monomers are organized as a trimer. Each monomer is composed of 12 trans-membrane a-helices and a 70 Å
protruding hydrophilic region in periplasmic space. There is a funnel like opening at the top of trimer, where TolC might
be dock directly into AcrB. A pore, which comprised by three a-helices from each protomer, exists at the end of the bottom of the funnel. It is connected to the central cavity at the very center of the AcrB molecule. The cavity has three vestibules between each protomers, which lead into periplasm. The structure implies that substrates translocated from the cellinterior through the transmembrane region and from the periplasm through the vestibules are collected in the central cavity and then actively transported through the pore into the TolC tunnel.

.

はじめにポンプチャンネルトランスポーターも呼ぶ）が出現し，今までは薬が効果を発揮してきた臨床

細胞膜を介した物質輸送をつかさどる膜タンパク質の御例でさえ，時として危険な状態に陥れることがある。この三家として，ポンプ，チャンネル，そしてトランスポー

多剤耐性菌は院内感染や市中感染などで広がりを見せ，今ターを挙げることができる。ポンプとチャンネルがイオンや感染症の数割から半数以上が耐性菌によるものであるとを輸送するのに対して，トランスポーターは糖，アミノも言われている。この耐性化の重要な要因は，薬剤排出タ酸，ビタミン，脂質，薬剤など，イオンに比べて大きな

ンパク質の過剰発現によるものであることが知られてい“分子”を輸送する。またチャンネルが，受動的な輸送

る1,2)。排出タンパク質群の働きにより，薬剤が細胞内の（促進拡散）であることに対して，ポンプとトランスポー

作用点に達する前に菌体内から排出されてしまい効力が失

ターは ATP の加水分解エネルギーや，プロトン濃度勾配

われる。また末期癌や再発癌に見られる抗癌剤耐性も，こなどのエネルギーを用いた能動輸送を行う。トランスポーの多剤排出タンパク質による化学療法剤排出によることがターのうち，呼吸鎖などのタンパク質により形成されたプ判っている。近年細菌類を始め，多くの生物のゲノム配列＋ ＋

ATPase により形成されたが解析されているが，驚くべきことに多剤排出タンパク質Na＋ イオン濃度勾配などを利用して能動輸送を行うトラ遺伝子は原核生物からヒトに至るまで広く分布しているこンスポーターを二次性トランスポーター（共役輸送系）ととが判ってきた3)。大腸菌では，37種もの薬剤排出タンパ呼ぶ。そのうち，イオンの流入と輸送する基質の方向が同ク質遺伝子が存在することが予想されている。これらは全じものをシンポーター，逆のものをアンチポーターと呼てが発現しているわけではなく，様々な因子により誘導さぶ。また， ATP 加水分解のエネルギーを利用する ABC

れ，薬剤耐性化することが判ってきた。しかし，大腸菌の型（ ATP-Binding Cassette ATP 結合部位を有する）ト

持 つ主 要な多 剤排 出系と して 知ら れる AcrAB TolC 系

ランスポーターは，二次性トランスポーターとは異なり単は，大腸菌体内で常に発現しており，その自然抵抗性の主一の基質のみを輸送するので，ユニポーターとよぶ。

因であることはゲノム解析以前から知られていた4)。このロトン濃度勾配や， Na

K

系 は R esistance- N odulation-Cell D ivision ( RND ) 型 と 呼.

ばれるファミリーに属し5)，ポリトピック型膜タンパク質序論薬が効かない
近年臨床の場に於いて，薬が効かない病原性細菌によるでトランスポーター本体である AcrB と，膜融合タンパク感染症が大きな問題となっている。通常の感染症では，セ質（Membrane Fusion Protein )6)である AcrA ，外膜貫通

フェム系薬剤とペニシリン系薬剤の二剤が奏効してきた。

チャンネル TolC7)と三者複合体を形成し機能している8,9)。

しかし耐性肺炎桿菌や耐性緑膿菌といった複数種の薬剤

AcrB は，膜を介したプロトン濃度勾配をエネルギー源（多剤）に対して抵抗性を示す多剤耐性菌（単に耐性菌ととして，化学構造や静電的特徴が異なる色素系毒素，界面――(C) 2003 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

放射光第巻第号()

活性剤や多くの脂溶性抗生物質など多種多様な薬剤を能動要な役割を果たす RND 型膜輸送タンパク質が存在する。

的に排出する，二次性のアンチポーター型トランスポー

それは，リソソーム内にコレステロール蓄積をひきおこすターである10,11) 。これは 1049 アミノ酸残基からなり， 12

遺伝性疾患 Niemann-Pick 病の原因タンパク質 Niemann-

回の膜貫通 a ヘリックスと，2 つのペリプラズム側へ突出

Pick C1 である。これはエンドソーム，リソソームからのした親水性領域から構成されている12)。AcrA は光散乱に

脂肪酸透過を行うタンパク質と同定された17)。

よる知見から細長い分子であると推定されており，細胞内

近年，膜を介して物質輸送を行う膜タンパク質のうち，膜と外膜とを繋ぐか，あるいは融合させると推定されていK＋ チャンネル18) や， Ca＋＋ ポンプ19) の構造が相次いで高る13,14) 。基質が結合することによって AcrAB 複合体は分解能で構造解析された。いわゆるトランスポーターとしTolC を誘引し一時的に三者複合体をつくり，両方の膜をては，脂質をフリップフロップにより輸送する ABC 型

貫通するような大きな排出機構を形成すると考えられていタンパク質である MsbA20) や，ビタミン B12 を細胞内にる 。 TolC の 結 晶 構 造 は 2000 年 ケ ン ブ リ ッ ジ 大 学 の取り込む ABC 型トランスポーターである BtuCD21)の構造

Koronakis らによって解明されたが15) ，それによると，も報告された。しかし，膜輸送タンパク質の中でもっともTolC は，40 Å の厚みを持つ b バレルからなる外膜貫通チ

大きなグループである，プロトン共役型二次性トランス

ャンネル部分と100 Å もペリプラズムにつきだした a へリ

ポーターの高分解能構造はまだ得られていなかった。まックスの束からなるトンネル構造がつながった大きな筒状

た，薬剤排出トランスポーター遺伝子発現に関わる多剤結の構造をしていた。

合タンパク質である， BmrR （トランスポーター Bmr のAcrB の類似タンパク質はグラム陰性細菌だけではなく制御タンパク質)22) や QacR （トランスポーター QacA のグラム陽性細菌にも存在し，広く微生物の薬剤耐性を付与

制御タンパク質)23)の立体構造などは解析されているもの

している5,16)。そればかりか真核細胞でも，生理学的に重の，膜タンパク質である排出トランスポーター本体の構造

Table 1.

Data collection and crystallographic analysis
Derivatives

NativeK2HgI4

K2PtCl6

OsCl3

Se-MetR32
0.9000R32
0.9000R32
0.9000R32
0.9000R32
0.9795

3.5（3.633.5）

4.3（4.45
4.3）

4.3（4.45
4.3）

4.4（4.564.4）

5.0（5.15.0）

Observed re‰ections

198,425（13,165）

102,662（9,465）87,755（7,482）

96,176（9,107）131,081（3,590）Independent re‰ections

26,406（2,584）

14,401（1,406）

13,908（1,393）

13,510（1,338）

8,109
（720）

（I）
I/s

11.5
（2.6）

6.6
（5.4）

10
（6.5）

8.2
（5.0）

12.7
（6.9）

Averaged redundancy

7.5
（5.1）

7.1
（6.7）

6.3
（5.3）

7.1
（6.8）

16.2
（5.0）

Completeness

98.8（98.6）

99.7
（100）

94.9
（95.8）

99.3
（100）

87.9
（78.7）

Rmerge9.0（36.5）

12
（30）

10.8
（24.6）

11.1（39.2）

14.2（33.2）

Riso
Rcullis

14.5
0.81

17.2
0.86

28.9
0.83

16.9
0.96

Phasing Power

0.53

0.43

0.54

0.28

Space group
Wavelength（Å）
Resolution（Å）

Overall ˆgure of merit

0.32

Reˆnement
Resolution range（Å）
R factor（）8.03.5

Rfree（）Bond length（Å））
Bond angles（°

0.0032Average B-factor for
main-chain atoms（Å2）
Average B-factor forside-chain atoms（Å2）

29.0
35.5
0.867
95
117

全てのデータは大型放射光施設 SPring-8，大阪大学たんぱく質研究所超分子複合体解析ビームライン BL44XU で100 K で収集した。

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

放射光

解析はおろか，結晶化の報告さえも無かった。

第巻第号()ことができた。またモノマー内の二回対称性もまた原子モ

我々は2002年，大腸菌多剤排出トランスポーター AcrB

デルを組む際の助けとなった。AcrB は1049個のアミノ酸の結晶構造を明らかにしたが24,25)，これは多剤排出トラン残基からなるが， N 末端や C 末端の他に，大きく揺らいスポーターとしてだけでなく，二次性トランスポーターとでいるループ部分を除き， 1006 個の側鎖のモデル構築にしても世界で初めての結晶構造解析例である。

成功した。構造精密化後の R 値は 29 ， Rfree 値は 35 であった（Table 1）。

.

構造決定

. 全体構造

構造決定は水銀，白金，オスミウムによる置換体結晶を

AcrB は1049アミノ酸残基から成る単量体が三個絡み合用いた多重同型置換法（ MIR 法）により行った。初期位った三量体タンパク質であった（ Fig. 1 ）。三量体は，膜相は4.5 Å 分解能で計算し，その後溶媒平滑化等26)によると垂直な三回対称軸を持ち，全体としてはクラゲのような位相拡張で3.5 Å 分解能の電子密度図を得た。最初はセレ形をしていた。ペリプラズムにある親水性部分であるクラ

ノメチオニンによる多波長異常散乱法（MAD 法）による

ゲの頭と，膜貫通部分を形成しているクラゲの足の部分か

位相決定を試みたが，分解能が低かったためか，この方法

ら成り，各々70 Å と50 Å の厚さを持つ。親水性部分およでは残念ながら位相を決めることが出来ず， MIR を行っ

び膜貫通部分の最大径は，各々100 Å，80 Å である。親水た。3.5 Å 分解能での原子モデリングは困難であったが，性頭部は横から見ると台形をしており，さらに上下二層に

MIR による位相決定後，セレノメチオニン誘導体中のセ分かれている。 TolC は結晶構造よりペリプラズムに 100

レン原子 42 個（非対称単位中）のうち 38 個が差フーリエÅ 突き出ていることがわかっており15) ，ペリプラズム側で確認でき，メチオニン残基の位置やトリプトファンなどに突き出ている AcrB と合わせると170 Å であり，ペリプの嵩高い側鎖の位置を基に確信を持って原子モデルを組む

ラズム空間を横切るのに十分な長さを持つ（ Fig. 6A ）。

Figure 1.

Whole structure of AcrB trimer. A, Side view B, Upper view.

――

放射光

第巻第号()

Figure 2.

Cut view of AcrBtrimer. A, Transmembrane domain B, Pore domains C, TolC docking domain.

またロート状に開口している AcrB 分子頂上部の直径とメインの各プロトマーは 12 本の膜貫通 a ヘリックスからTolC 底部の直径とはほぼ等しい15)。これらのことより，なる（ Fig. 2A ）。膜貫通ドメインでのプロトマー間相互

AcrB と TolC は直 接 結 合 す る こ と が 示 唆 さ れ， そ の た

作用は，TM1 と TM8 の間にのみ局在していた。TM4 とめ，ペリプラズム上層ドメインを TolC 結合ドメインと名TM10は比較的長く，細胞質側に突出していた。これらは付けた。

12 本のヘリックスの束の中心に位置し，他はそれらを取親水性頭部の下層には，3 つの a ヘリックスからなるポり囲むような形に存在した。いくつかの例外を除くと N

アが存在した。このポアは，三量体各々から一本ずつ a末端側と C 末端側は偽対称の関係にあることがよくわか

ヘリックスを出しあって形成されている。ポアは TolC 結る。TM2 もまた長いヘリックスで，膜の境界を横切りペ合ドメインにあるロート状開口部の底と連結しており，まリプラズム側に伸びていた（Fig. 3B ）。一方，TM2 と対たポアの下端は細胞膜の界面近くに存在する中央腔の天井称の関係にある TM8 のペリプラズム側も，どうやら伸びまで続いている。今回得られた結晶構造では結合基質が存ているようではあるものの，非常に温度因子が高く，電子在しないためか，このポアは閉じていた。ポアの存在する

密度が不明瞭な箇所が多かった。ここは，膜貫通部分で捉

このペリプラズム下層ドメインをポアドメインと名付けた。

えられたプロトン濃度勾配エネルギーによる構造変化を水TolC 結合ドメインとポアドメインの界面付近には非常溶性頭部に伝達するなど，動きに富んだ機能上重要な部分に長い（～ 35 Å ）特徴あるヘアピン構造が存在する。こではないかと考えている。AcrB を含む12回膜貫通型トラの構造は各々のプロトマーからつきだしていて，隣のプロンスポーターは元来 6 回貫通型のトランスポーターが遺トマーに差し込まれていた。この相互の絡み合い構造によ伝子重複により倍の 12 回貫通型になったと考えられていり ， AcrB 分 子 の 三 量 体 形 成 を 強 固 な も の に し て い るる。遺伝子配列や一次構造だけでなく立体構造も N 末端

（Fig. 1B）。

側半分と C 末端側半分が対称的であることが今回初めて

水溶性部分とは対照的に，膜貫通部分の各々のプロト

明らかになった。 N 末端半分と C 末端半分との重ね合わマーは緩くパッキングしていた。3 つの膜貫通ドメインプ

せの RMS は 2.4 Å 程度であり極めて良く重なる。これら

ロトマーは中心に直径約 30 Å の穴を持つリング状の構造

が，対称性の例外となる細胞膜の細胞質側に平行に存在すをしていた（ Fig. 2A ）。この穴は膜を横切り，さらにペるヘリックス Ia で繋がっている。

リプラズム部分の下側まで達している。もしここが水で満緑膿菌のもつ相同体タンパク質である MexB27)や AcrB

たされているチャンネルであるとすれば，AcrB は膜に30の部位特異的変異導入実験の結果，膜貫通部分には機能上Å もの穴を空けてしまい，イオン濃度勾配などを破壊す

極めて重要な 3 つの電荷性機能残基が存在することが知

る脱共役剤として働くことになり，細胞死を招くことにな

ら れ て い る14) 。 Asp407 ， Asp408 ， そ し て Lys940 で ある。分解能による限界で結晶構造中にリン脂質を観察するる。これらが他のアミノ酸に置き換わった変異体は薬物耐ことはできなかったが，膜貫通部分に存在するこの穴には性化能をほぼ完全に失う。これらの残基は TM4 と TM10

おそらくリン脂質が満たされているに違いないと考えていの中程に存在することが構造から明らかになり，塩基対をる。

形成しているようである。これらはプロトン透過経路の重要な部分であることが示唆される（Fig. 4 ）。膜貫通部分に存在する荷電性アミノ酸のうち，近縁種のタンパク質間. 膜貫通部分の構造
多くのトランスポーターがそうであるように，膜貫通ドで保存性が高いものを全て，部位特異的変異導入により，

――




放射光

第巻第号()Figure 3. Structure of single monomer. A, Topology diagram of AcrB monomer. B, Ribbon representation of AcrB
monomer.

荷電を持たないアラニン残基に置換したところ，上記の 3

ブドメインから構成されている（Fig. 2B ）。 PN1 と PN2

アミノ酸以外に， Arg971 も AcrB の薬剤排出活性に極めは TM1 と TM2 の 間 に， PC1 と PC2 は TM7 と TM8 のて重要であることが判った。 Arg971 は，上記のトリプレ間に存在する。これら全てのサブドメインは特徴ある構造

ットの真下にあたり，プロトン輸送経路の一部をなすと考モチーフを持っている。それは 2 つの， b ストランドa

えられた（ Fig. 4B ）。分解能の制限から，水素結合ネッ

ヘリックスb ストランドというモチーフが直接繰り返さ

トワークをペリプラズム側から，細胞質側までたどること

れ，a ヘリックスを外側に，b シートを内側にして，お互は出来なかったが，分解能を向上させることにより，プロいをサンドイッチし存在している。この構造モチーフは，トンの輸送経路が明らかになると期待できる。

Dali データベース28) によるモチーフ検索で，カルボキシ

. ポアドメインの構造

ペプチダーゼ G229)と相同であることが判ったが，この酵

ポアドメインは PN1, PN2, PC1, PC2 という 4 つのサ素との関係は不明である。 PN2 と PC2 の前半 b a b モ

――

放射光

第巻第号()

Figure 5.

Figure 4.
TM10.

Surface representation of AcrB.

Functionally essential charged residue in TM4 andチーフと後半のそれの間に，TolC 結合ドメインのポリペ
プチドが挿入されている（ Fig. 3A ）。ポアを形成しているヘリックスは PN1 の中の Na2 である（Fig. 3A）。

PC1 と PC2 の 間 に は 膜 に 垂 直 な 深 い 溝 が 存 在 す る（ Fig. 2B お よ び Fig. 3B 右 ）。 長 さ が 約 40 Å で ， 幅 20

Å ， 深さ 15 Å であ る。 この溝 は分子 の外側 を向 いており，ここに，細長い形と予想されている AcrA13)が結合すると推定している。この溝の底には， PC1 の短いヘアピ
Cb3 ′があり，フックのような形をしている
ン構造 Cb2 ′（Fig. 3B の◯部）。この部分は，溝の底面を形成するような役割を担っているようである。この部分は上記モチーフ
からはずれる例外的な特徴有る部分である。
. TolC 結合ドメインの構造

TolC 結合ドメインは， 2 つの DN と DC というサブド
メインを含んでいる（ Fig. 3A ）。それぞれのサブドメイ
ンには， 4 本平行逆平行混成 b シートが存在する。 2 つの逆平行 b シートは，単量体の隣の半分，もしくは隣のFigure 6.

Proposed model of AcrAB-TolC complex.

プロトマー（Fig. 3A の破線矢印部分）と平行になるヘアピン構造を作る。約 35 Å の長いヘアピン構造は，サブド
メイン DN から隣の DC へ向けくちばしのように突き出挿入されている。これとは別に，分子の頂上部分には膜面

し，隣のプロトマーに挿入されている。また，同様のヘアに対して垂直なヘアピン構造が単量体あたり 2 本存在す

ピン構造は単量体内部にも存在し，DC から DN へ向けてる（ Fig. 2C の破線楕円部および Fig. 3B の破線◯部）。

――




放射光

第巻第号()

TolC 下端にも同様に 2 本のヘアピン構造が存在し，AcrB

TM7 と TM8 （ Fig. 5 の緑色部分）の間には比較的深い

分子先端にある縦向きヘアピン構造と対応し，密着した結溝が存在する。この溝は膜貫通部分全体を横切るようにし合部を形作ると考えられる（Fig. 6B）。また TolC 結合ドて上から下へと伸びている。溝の底の部分は TM9 により

メイン先端の直径と，TolC 下端の直径とはほぼ等しく，形成されている。TM9 は傾いているので，細胞質側ではこれらを並 べてみると 歯車のよう に相補的に かみ合う

この溝は浅く，ペリプラズム側では深くなっている。この（Fig. 6B）。基質排出過程でこの両者が一時的に結合し，溝の上端は構造が揺らいでいる部分を経由して空洞につな

基質分子の受け渡しのための閉じたジョイントを形作るのがっている。この接合部は，上述の玄関近くにあたる。こだろう。

の溝はリン脂質二重膜中にある脂溶性基質が膜中を輸送されるための通路で，おそらくはフリップフロップによる.

基質輸送メカニズム

輸送で脂質二重膜内葉から外葉へと運ばれ，玄関へと導かFig. 5 に AcrB の溶媒接触表面を示す。内部の構造を示れると考えている。細胞質側では浅く，ペリプラズム側ですために三量体のうち紙面手前側にある単量体を取り除きは深いという溝の形状も，細胞質側からペリプラズム側へ描いた。頭頂部のロート状開口部の底は狭くなり，そしてとフリップフロップされるのに好都合であると考えられ

ポアへと接続する様子がわかる（図中の黄色の部分）。ポる。このように AcrB には明らかに 2 つの異なる基質の透ア下端は分子中央部に存在する空洞へと続く。空洞は膜貫過経路が存在することが，我々の結晶構造から明らかにな

通部分三量体の中央にあるリン脂質で満たされている穴のった（Fig. 5 の点線の経路）。

上にあたる。すなわち，膜面と，ポアの下端との間に現れる空洞で，約 15 Å の高さを持つ。この空洞へペリプラズ

.

まとめ

ム空間から通ずる開口部があり，そこを“玄関”と名付け

我々は，AcrB 結晶構造に基づく多剤輸送の分子メカニ

た。 Fig. 5 においては手前のプロトマーが取り除いて描ズムを世界で初めて提案した24) 。構造から AcrB と TolC

かれているため図中の二量体中央に 1 つの玄関しか見るが直接相互作用する可能性を示唆した。基質が輸送されることができないが，各々のプロトマー間に合計 3 個存在

とき， AcrB は TolC を誘導して結合し，細胞質から細胞する。ペリプラズム，あるいは脂質二重膜外葉に存在する外環境までを直接繋ぐようなダクトを形成するのだろう

基質はこれらの玄関より分子内に入り，通路を通って分子（ Fig. 6 ）。 AcrB に基質が入ってくるときは 2 つの入り口

中央の空洞へと到達するのだろう。これをペリプラズムかが推定される。細胞質あるいは脂質二重膜の内葉に存在すらの基質の 取り込み経 路であろう と考えてい る。また

る基質は，膜貫通部分の分子表面に存在する溝を通って膜

AcrB はペリプラズムで働く基質を排出するだけでなく，を横切る。それから玄関を通りペリプラズム側に開いた通明らかに細胞質側からも基質を排出する。では膜中あるい路を通って，三量体中央の空洞に集められると考えている

は，細胞質からの基質の輸送についてはどうだろうか（Fig. 5）。脂質二重膜の外葉に存在する基質は，玄関より各プロトマーの膜貫通部分の膜に露出した表面に位置する入り空洞に集められる。空洞に集められた基質は，ポアをFigure 7.

Schematic hypothesis of transport mechanism mediated by AcrAB-TolC system.

――

放射光

第巻第号()抜け，漏斗状開口部を経て，それから TolC へと輸送されムの解明を目指すほか，薬剤との複合体の構造解析を行て い る の だ ろ う （ Fig. 5 ， お よ び Fig. 7 ）。 Asp407 ，い，化学構造が異なる多種多様な基質を認識する，多剤認

Asp408，そして Lys940の間のイオン対は，膜貫通プロト

識機構を解明したいと考えている。また，他の構成成分

ン輸送経路の候補だろう。これらのアスパラギン酸がプロ（ AcrA や TolC ）との複合体の構造解析を行うことによトン化したら，イオンペアーが壊れ，それがきっかけとな

り，多剤の認識とそれに続く排出メカニズムの本質的理解

り， TM4 ，および TM10 の構造変化が起こり，遠隔構造に迫りたいと考えている。これらの知見は，多剤耐性の特変化伝搬によりポア部分が最終的に開くのだろう。

効薬となる阻害剤や回避剤開発などの応用に繋げることも

AcrAB TolC 系は化学構造が異なる多種多様な薬剤を可能であり興味が持たれる。

基質とし，また b ラクタム系抗生物質に対しても耐性化を付与する特徴を持つ30,31)。bラクタム系抗生物質の標的

おわりには，細胞壁の生合成に関わるペリプラズム酵素である。

筆者は放射光を用いた膜タンパク質複合体の結晶構造解

AcrB のような二次性トランスポーターは内膜を介する水析に大学院生の頃から携わってきた。当時は良い結晶も出

素イオン濃度勾配をエネルギー源にしているから，内膜のせなかったので，回折データをそろえるのにたいへん苦労

外側であるペリプラズムに存在する基質に対して能動輸送した。最終的には国際的な構造解析競争で苦杯をなめた。

を行う事は出来ないとこれまで考えられていた。しかし，

そのため，薬剤排出トランスポーターの結晶構造解析は筆AcrB や緑膿菌 MexB など RND 型トランスポーターはこ

者にとって最後のチャンスといっても過言では無かった。

れらペリプラズムで働く抗生剤に対してもはっきりと耐性

トランスポーターに携わって約 5 年間を要したが，やっを与える。ではどのようにして RND 型トランスポーター

たこともなかったモデル構築や構造精密化まで自らの手ではペリプラズムから薬物を能動輸送できるのだろう

カ

行い構造解析を完了させたことは感無量であった。興味有

リフォルニア大学バークレイ校の二階堂らは， 1994 年にるテーマに巡り会えたことを上司や，恩師に感謝するととAcrB に は 2 種 類 の 口 が あ る に 違 い な い と い う Dual-

もに，共に斗う仲間を持てたことに感謝したい。この成果

Entrance Model を提唱した。このモデルでは，脂質二重は皆の頑張りの成果である。

膜の内葉と外葉の両方から基質を取り込むのではないか
とされていた32)。前述のように，AcrB のペリプラズム側

謝辞

方に開く通路が発見され，ペリプラズムと脂質二重膜の外本研究は，阪大蛋白研の月原冨武教授，中川敦史教授の葉に存在する基質を直接分子内に取り込む可能性が明らか

支援と協力によるものです。また多くの方々の協力によるになった。また，AcrB には細胞質あるいは脂質二重膜のものです。著者らは深く感謝の意を捧げます。

内葉からペリプラズムへ基質を輸送する経路も存在した。
こ れ ら の 構 造 は AcrB の 多 剤 輸 送 に つ い て 二 階 堂 ら の

参考文献

Dual-Entrance Model を支持するものであった（Fig. 5）。

1)

驚くべき事に，能動的膜輸送は，膜貫通部分でなく水溶性ドメインのポアで起こっていた。しかし，細胞質に存在する基質だけでなく，ペリプラズムに存在する基質もまた等2)

しく排出する事実を鑑みるとこれはむしろ自然であると考えることもできる。

3)

ペリプラズム空間にはペプチドグリカン層という多糖類で出来た細胞壁が存在する（Fig. 7）。ペリプラズムに100

Å も突き出た TolC の水溶性のトンネル部分は，おそらく

4)

このペプチドグリカン層によってトラップされることにより側方拡散を抑制され， AcrAB 複合体の方のみが側方拡散が可能であるように思われる。 AcrAB TolC 系の詳細な反応機序は不明であるが， AcrAB 複合体が基質を結合5)するかプロトン濃度勾配のエネルギーを受けるかして構造変化を起こし，ペプチドグリカン層から足を覗かせている

TolC 分子を捜して一時的に結合し，細胞内膜から外膜を一気に貫く 巨大な超分 子複合体を 形成するの であろう

6)

（Fig. 7）。基質の受け渡しが終わるとこれらは解離して，新たな基質を求めて，細胞膜中を拡散するのだろう。
今後，分解能を上げることにより，より詳細なメカニズ

7)

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村上聡

大阪大学産業科学研究所
〒567
0047
大阪府茨木市美穂ヶ丘 81

TEL0668798547
FAX0668798549
E-mailmura＠sanken.osaka-u.ac.jp
専門構造生物学，蛋白質結晶学
略歴

1968年

兵庫県神戸市生まれ

1997 年

大阪大学大学院理学研究科高分子化学専攻修了
理学博士

1998 年

大阪大学産業科学研究所
門

2002 年――

生体応答科学研究部

生体情報制御学研究分野

助手

科学技術振興事業団戦略的創造研究推進事業（さきがけ研究）併任