博士（医学）横田良一
学位論文題名ANovelH
ydroxyl RadicalScav
enger，Nicaraven，Protects The Liver From Warm Ischemia
AndR
ep
erfus
ionInjury（/ヽイドロキシルラデイカルスカベンジャー：ニ カラベ ンによる肝温虚血再灌流障害の軽減）
学位論文内容の要旨
背景
現 在、 肝移植は生体 肝移植及び脳死肝移植が行われているが、心停止後ドナ ーの肝臓は温虚 血 時間 が長く使用で きない。心停止後ドナーからの肝移植実現には、虚血再 灌流障害の強カ な 軽減 が必要である 。肝虚血再灌流障害においては、活性酸素種が深く関与 し、なかでも
ハ イ ドロ キシルラディ カルは生体内に消去系がなく、強い障害性を持っため、 その制御が虚血 再 灌流 障害を軽減す るためには重要と考えられる。新しいハイドロキシルラ ディカルスカ
ベ ンジャー、ニカラベンは水溶性と脂溶性の2つの媒性を持ち、細胞内外に速やかに到達し、ハ イ ドロ キシルラディ カルを効果的に消去することができる。二カラベンの虚 血再灌流障害に お け る 効 果 は 、 脳 、 心 臓 、 腎 臓 ては 報告 され てい るが 、肝 臓で は報 告さ れて いな い。
方法
雌性ピーグル犬を用い、肝門部及び肝静脈を 2時間遮断し、門脈血は内頚静脈にバイノくスする完全肝温虚血モデルを作成した。コント口ール群（n＝12）と治療群(n二ニ6）の2群とした。二カ ラ ベ ン は 、 虚 血 前 60分問 と再 灌 流30分前 より 3時 間、 2m g/kg/minに て静 脈内 持続 投与した。検討項目は、循環動態、レーザードッブラー法による肝組織血流量、肝逸脱酵素(ALT)、肝 組 織 過 酸 化 脂 質 (Phosp
hatidylcholinehydroperoxide (PCOOH)／ phosp
hati
dylcholine(PC)，phosphat
idyl‑ethanolamine (PE)、組織学的肝障害、肝組織好中球浸潤 、肝エネルギー代謝産物、2週生存率である。
結果
2週生存率はコントロール群て25％(3/12)、治 療群では100％(6/6)てあった。（Pく0.
01)
治療群では、肝組織て の過酸化脂質生成が抑制され、肝組織血流量と循環動態 が改善し、AI」TとET‑1の上昇、組織 学的肝障害と肝組織好中球浸潤が抑制された。
考察
心 停止 後ドナーのモデル として、ブリングル法では肝静脈血の流入が問題となり 適切ではなく 、肝 門部及び肝静脈を クランプする完全肝温虚血モデルを作成した。クランブ の完全性はICG残存 率が 虚血 中90％以 上で ある こと で 確認 した 。ハ イボ キサ ンチ ンー キサ ンチ ン系によ る再 灌流後のスーバー オキサイドによる生体膜の損傷は肝虚血再灌流障害の重 要な因子
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と 考えられている。スーノくーオキサイドはハイド口ゲンベルオキサイドとなり、フェントン
反 応によル ハイド ロキシル ラディカ ルが生 成する。 ハイド ロキシルラディカルは非常に反応性 が高く、 生鉢膜 蛋白や脂 質を過酸 化する 。また、 スーバ ーオキサイドには消去系のスーバー オキサイ ドジス ムターゼ が存在す るのに 対して、 ハイド ロキシルラディカルには特異的な消 去系が存 在しな い。これ らのこと から、 ハイドロ キシル ラディカルを消去することが障害を 軽減する ために 重要てあ ると考え られ、消去剤を用いた多くの実験カi報告されている。しか し こ れら は 、 in vi
troては 効果が認 められて も、invivo
で は効果 が一定し ていな い。この 矛盾は生 体内て の薬剤の 分布と関 係があ ると考え られ、 この点てニカラベンは両媒性てある ことから 、生体 内で細胞 内外に分 布し有 効に作用 すると 考えられる。ニカラベンの有効性
は 、ラット の心臓 虚血再灌 流、脳外 科領域 てはネコ の脳虚 血、人のくも膜下出血での報告があ るが、同 様にハ イド口キ シルラデ ィカル が重要な 働きを していると考えられる肝虚血再灌流 障害にお ける報 告はなく 、これが はじめ ての報告 である 。ニカラベン投与量については、脳 、 心 臓 の 報 告 か ら 10‑5〜 10 ‑3Mの 血 中 濃 度 が 必 要 と 考 え ら れ 、 こ れ を 得 る た め に
1〜5mg/kg/min
で 予備実験 を行っ た。その 結果、Img/kg/minでは十 分な効果 が得ら れず、2mg/kg/minで は 副 作 用 な し に 効 果 が 得 ら れ 、5mg/kg/minで は 徐脈 が 出 現し た こ とか ら2mg/kg/min
を 至適投 与量と決 定した 。
我 々は、再 灌流直 後にスー バーオ キサイド 、ハイド ロキシルラディカルが大量に発生し、生 体膜の脂 質過酸 化を起こ すとの仮 説て研 究を行っ ている 。実際にラディカルスカベンジャー であるラ ザロイ ドの実験 では、肝 臓ヘ虚 血前に薬 剤を到 達させ虚血中に保っための前投与と 再灌流直 後から 発生する スーバー オキサ イドを消 去する ための後投与の両方を行った群が最 も 効 果的 で あ った 。 こ のた め 、 ニカ ラ ベ ンは 虚 血前60分 間と再灌 流30分前 から3時間の前 後投与と した。
二 カラ ベ ン 1分 子 は だ゜dimerizationに より2分子の ハイドロ キシル ラディカ ルを消 去する 。ニカラ ベンが ハイド口 キシルラ ディカ ルを消去 するこ とによって脂質過酸化を抑制する
こ と は 、CL‑H
PLC法に よ り 過酸 化 脂 質の 定 量 を 行い 確認した 。過酸 化脂質測 定は、マ ロン
ジ アルデヒ ドの測 定を行っ た報告が 多いが 、感度と 特異性 の点で問題性が指摘されている。
我 々 は 、最 近 確 立さ れ 、生体膜 脂質の 主要構成 成分で あるPC、PEと その一 次過酸化 物である PCOOH、 PEOOHを 測 定 す る 方 法 を 行 い 、 そ の 比 で あ る PCOOH/PC、 PEOOH/PEを 脂質 過 酸 化 の 指 標 と し た 。 PCOOH/PC、 PEOOH/PEは 再 灌 流 15分 後 に ピ ー ク と な り 、 コ ン
ト ロ ー ル 詳 で は 前 値の 15及 び6倍 と なっ た が 、治 療 群 ては 4及 び1.5倍と そ の 増 加は 有 意に 抑制され た。
肝 組織 血 流 量は 再 灌流 後15分で 、コント ロール 群では虚 血前値の 27％に対 して、治 療群で は105％ と有意 に高値で あった。 これは 、肝実質 細胞と 異なり活 性酸素 種からの 防御系が発 達してい ない類 洞内皮細 胞が、そ の攻撃 から守ら れた結 果、微小循環が保たれたためと考え られる。 類洞内 皮細胞が 障害され ると1）エン ドセリ ン、工イ コサノイ ド、NOな どの血管
作 動性物質 が活性 化、2）接着分 子の発 現と好中 球活性 化、3） PAF、サイトカイン活性化、が 起きる。 その結 果、微小 循環は低 下する と考えら れる。 エンドセリンは強カな内因性血管 収縮物質 てあり 、活性酸 素種によ り上昇 するとの 報告が あるが、コントロール群に比べて治 療群では 再灌流 後有意に 上昇が抑 制され た。様々 な接着 分子を発現した類洞内皮細胞ヘ浸潤 した好中 球も、 さらに活 性酸素種 を産生 し微小循 環障害 を起こす。治療群では再灌流後の肝 組織への 好中球 浸潤が抑 制された 。
虚 血前投与 により 虚血中の 高工ネ ルギ一代 謝産物の 減少及びハイボキサンチン、キサンチン の蓄積が 抑制さ れた。脂 質過酸化 は虚血 中にも起 きると の報告がある。虚血中に細胞膜が障 害 を 受け る と 、細 胞 内 C
aを 汲 み出 す AT
Pを 消 費 すること になる。 ニカラ ベンは虚 血中、生 体膜の脂 質過酸 化を防ぐ ために、 ATP低 下とハイ ボキサ ンチン、 キサン チン蓄積 を抑制、
ひ い て は 再 灌 流 後 の ハ イ ド ロ キ シ ル ラ デ ィ カ ルの 産 生 を抑 制 し てい る 可 能性 も あ る 。
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結諭
ニカラベンは肝組織脂質過酸化を抑制し、肝温虚血再灌流障害を軽減した。ニカラベンは、
心 停 止 後 ド ナ ー か ら の 肝 移 植 を 可 能 に す る 有 カ な 候 補薬 剤に なり うる と考 えら れる 。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 藤 堂省
副 査 教 授 加 藤 紘 之

学位論文題名A Novel HydroxylRadicalScaven
ger，Nicaraven，Protects The Liver From Warm Ischemia
And Reperfusion Irijury（/ヽイドロキシルラデイカルスカベンジャー：ニカラベンによる肝温虚血再灌流障害の軽減）

本邦にお いてもH齬翻干移植カsiM{ff
テされているが、ドナー数は不足し、その解決策のーっとして心停止後ドナ ー から の肝 臓 移植 があ げられる。その実 現には、肝温虚血 再灌流障害（以下同 障害）の強カな軽 減が必要で あ る。 再灌 流 後の スー バーオキサイド゛ 、さらにフェント ン反応から生成する ハイドロキシルラ ディカ
ルは、生体内 に消去系がなく生 体日莫を過酸化し 同障害の重要な因子 とされる。ハイド ロキシルラディカルの消去 が 同障 害を 軽 減す るた めに重要であると 考えられ、実際こ れを消去する薬剤を 用いた多くの実験 が報告されているカ s、未だ 臨昧応用可能な薬剤 はない。両帝 離也：）新しいハイド□キシルラディカルスカベンジャー、ニカラベ ンは細胞内タuこ速やかに至 ｜ほし、ハイドロ キシルラディカルを効果的に消去すると考えられ、同障 害 に対 する 軽 成効 果を 検 討し た。 雌 陸ピ ーグ ル 犬を 用い た 2時 儲夢 嚮温虚血モデ)t/で、ニカラ ベンを
虚 血 前 60分 間 と 再 灌 流 30分 前 よ り 3時 恩 頚 静 脈 よ り 投 与 し た 。 治 摩 群 で は 、 有 意 に 生 繍 肝 組 叢 血 流量、循環動態 カ識ぞ善丶肝過酸 f
凹旨質生 成．肝逸悦酵薬勧 眼肝静脈血中エン ドセリン−1上昇、肝組織津書と好中球浸潤カ 寸q
瑞IJされた。肝実質細胞 と異なり活f錨磐瓢いらの防御系カェ発達していない類洞内皮細抱が、その攻撃から 守られ、肝‑I
旨質 過酸fヒカ s
瞞止肝 静脈血中エンドセリ ン‑1上昇を扣瑞｜ L微小循f
勅瀕能れ、その後 の 肝実 質細 胞 障害 を軽 減したためと考え られた。二カラベ ンは肝温虚血再灌流 障害を軽減した。 また、肝温虚血時間 の長い心停止後の ドナーからの肝移 植のための有カな薬 剤となる可能性カ ェあると考えられた。
審査にあた って、加藤教授か ら全身の血圧への 景彡響について、ニ カラベンは肝臓に 特異的に有効なのか、
薬剤 使 用量 の設 定 につ いて 、前段与の意義丶 ハイボキサンチン 蓄積抑制の織事、過 酸化脂質の経時的 変化、虚血再灌お都 章害におけるニカ ラベンの意義につ いて質問があった。 申請者tま、ハイドロキシルラディカルおよびニカラベ ンに関する文献、 申請者自身の実験 データを用いて、全 身の血圧に対する 直接作用はないこと、
血圧′m亀まハイド口 キシルラディカルを 消去し虚血再灌荘 瀦鑵諱呈減の結果と考えられること、投与量は文献と予 備実験から決 定したこと、前段 与由童血中の障害を 4W IJす るためであること、 ハイボキサンチン 蓄積抑制に っ いて は、 棚 亨は 明ら カ′ではなく今後 の研究が必要であ ること、脂質過酸化 は再濯流15分後に ビークを認めその後 イ氏下すること、 100％の生 存を得たことカゝらもニカラベンの重要f生は高いと考えられることを匝塔した。次 いで、浅香孝姑受 からノヽイド口キ シルラディカルの損｜lとミ皿暇S
OD
よりも有効なのカ丶虚血再― 38 ‑

灌滴障害におけ る好中球の重要は 虚血中のAT
P低下の抑乕｜‖ こついて、四塩化炭 素、エンドトキシ ンなどによる活性埴壹素 の障害で用いたか 、肝冷保存に有用か について質問があった。申請者f
ま、フリーラディカルとハイドロキシル ラディカル、SOD、奸中球に関する文南ふ申ヨ青者自身の実嘉貪うぇータを用いて、ハイドロキシルラディカルの 而V
I VOでの直接の損I健は困難であり、従来より鋭敏な脂質i醪珂ヒ（畊餅票を用いてこれを証明したこと、SODについてほ 翁価が一定してい ないこと、スーリ ヾーオキサイドより もハイドロキシル ラディカ
ルの 方 力羈 曜牲 が 高いことから二カラ ベンの方が有効と 考えられること、 好中球は再灌流後期 で肝組繊に浸潤し 重 要で ある と 考えられること、ATP低下の 抑制については今後 の研竇めs必要と考えられる こと、四塩化炭素、エンドト キシン投与モテシ レにニカラベンは用 いていないこと、 冷保存にも応用可能でその実験も期待され る こと を回 答 した 。最 後 に、 藤堂 教 嫐ら 活陛 酸 素に よる 障害とェン ドセリン産生の関係 について、心停止後ドナーか らの肝移植に向け て、今後どのような 実験系を検討すべ きかにっいて質問 カsあった 。申請者
は、 ハ イド ロキ シ ルラ ディ カ ルお よび ニ カラ ベン 、 工ン ドセ リ ン、 内皮 細 脆障 害に 関する文i申請者自身の実験データを 用いて、ハイドロ キシルラディカルに よる血管内皮障害 によってエンドセリンカ漣！生される
こと、灌1潮女でcD使用、 H
蔵器保 存液で￠蜘カ淇B待されると 回答した。
こ の 論文 はニ カ ラベンカ嗣褞虚血再 灌流障害を軽減し 丶今後の心停止後 ドナーからの肝移植 の可能陸を示唆したことで高 く評価され、その 臨床応用ヘ向けて更 なる研究が期待さ れる。
審 査 員一 同は 、 二カラベンによる肝 温虚血再灌流障害 の軽減という新し い知見を明らかにし た本研究の成果を高く評価し 、大学院譟隈にお ける研鑚や取得単位 なども併せ申i青者カ縛士（ 医学）学位を受け るのに充分な資格を有す るものと半嵯した 。

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