博士（理学）江藤真澄
学 位 論 文 題 名大 動脈平滑筋ミオシン 軽鎖ホスファダーゼの活性調 節機 構に 関す る研 究

学 位 論 文 内 容 の 要旨

血 管 中 膜 を 構 成 する 平 滑 筋 は、 そ の 収 縮・ 弛 緩 に よっ て 、 血 流量 や 血 圧 を調 節 し て いる 。 平 滑 筋 収 縮 の 引 き 金 と な る の は 、 ミ オ シ ン 分 子 の 調節 サ プ ユ ニッ ト で あ る20kDa軽 鎖(LC20） に お ける り ん 酸 化反 応 で あ る。 こ の 反 応を 触 媒 す るミ オ シ ン LC20キナ ー ゼ の 活性はカ ルシ ウ ム イ オン 濃 度 に よっ て 調 節 され て い る こと が 知 ら れてい るが、 LC20のり ん酸エス テ
ル 結合 の 加 水 分解 反 応 を 触媒 す る ミ オシン LC20ホスフ ァター ゼ(XtyosinLC20Phosphatase；MLCP)活 性 の 調節 機 構 は 解明 さ れ て いな か っ た 。そ こ で 、 本研 究 で は MLCP活性 の 調 節 機構を
生 化学 的 に 解明す ること で、豚 大動脈 平滑筋 におけ る収縮制 御の分 子機構 を明ら かにす ることを目的 とした 。
第 1章 で は 、 豚 大 動 脈 平 滑 筋 ミ オ シ ン LC20ホ ス フ ん タ ー ゼ (Porcine Aorta smoothmuscleMLCP； PA‑htLCP)の 精 製 、 お よ び 精 製 標 品 の 性 質 につ い て 述 べた 。 豚 大 動脈 平 滑 筋lkg (60‑70頭 分 ） か ら 、 210メ gの 均 一 な PA‑MLCPが 得 られ た 。 こ の酵 素 は 、 69kDaと 37kDaの サ プ ユ ニ ッ ト が 1対1のモ ル 比 で 結合 し た ホ ロ酵 素 で あ り、 そ の 37kDaの 成 分 は1型セ リ ン／ スレ オ ニ ン ホス フ ァ タ ーゼ の 触 媒 サブ ユ ニ ッ ト(PPlc)で ある と推定 された 。しか し、こ の酵素の 活性は 、既に 知られ ている PPlcの特異 的阻害 蛋白質 である インヒ ビター1、インヒビター
2に 対 し て 抵 抗 性 を 示 し た た め 、 新 た な 活 性 調 節 因 子 の 存 在 が 示 唆 さ れ た 。
第 2章 で は、 PA‑NtLCPの 活 性 調 節因 子 の 発 見と そ の 精 製、 お よ び 性質 に つ い て述 べ た。
豚大動 脈平滑筋抽出液にATPのアナログであるadenosi
ne5．‑0‑(3‑thiotriphosphate)を加えると、
内 在す る M LCP活 性 が 経 時的 に 低 下 した 。 こ の 阻害 に は チ オル ん酸化 に依存 してPA‑MLCP活性を 阻 害 す る 蛋 白 質 (Inhibitory Protein； IP） と 、 こ れ を り ん 酸 化 す る キ ナ ー ゼ (IP．
potentiatingKinase； IP‑K)の 2成 分 が必要 であっ た。IP‑Kを 部分精 製した 後に、 IPの精製 を行 な っ た 。 lkgの 豚 大 動 脈 平 滑 筋 か ら 2つ の 阻 害 蛋 白 質 、 IP(710pg） と IP (93Pg）を 均一 に ま で精製 した。 SDS‑PAGE、及 び未変 性条件 でのゲ ルろ過の 結果か ら、と ゛ちら の阻害蛋 白質 の 分 子 量も そ れ ぞ れ20kDa、 21kDaと 見 積も ら れ 、 単量 体蛋 白質で あること が明ら かとな っ た 。 IPと IP の ア ミノ 酸 組 成 はほ ぽ 一 致 し、 配 列 は 同一 で あ る こと が 推 定 され た oIP― 76 ‑についてアミノ酸配列分析を行ない、全体の75％に相当する137残基分の配列を決定した。これらの配列は、既知の阻害蛋白質を含めてデータベースに登録されているどの蛋白質にも存在しておらず、IPが新規の蛋白質であることが示された。
IPの阻 害活性は Imol/molのりん 酸化で 最大とな った。精 製PA‑MLC
P活性を 50％阻害す るのに 必要なり ん酸化IPの濃度は 1.
4nMであった。また、豚大動脈の抽出液のMLCP活性もlOOaYo阻害できることが明らかとなった。IPは兎骨格筋から精製したPP
lcのML
C
P活性も阻害したが、2A型ホスファターゼの触媒サプユニット(PP2Ac)の活性には全く影響を与えなかった。以上の結果から、IPは1型ホスフんターゼ特異的阻害蛋白質であること、また、これまで に報告 のある阻害蛋白質と異なり、IPの阻害活性にPA‑MLCPの69k
Da
サプユニットは何ら影 響を与 えないことが示され、IPが性質の面でも新しい阻害蛋白質であると示唆された。
こ の阻害 活性に必 須なIPの りん酸化 部位の アミノ酸 配列は、RHARVT．VK、であった（＊印はりん酸化残基を示す）。この配列はミオシンLC20のりん酸化部位の配列と塩基性アミノ酸の位置において類似性が認められた。また、IPのりん酸基を最も良く脱りん酸化する
ホスファターゼはP
P2Acであったが、活性を阻害されるPA‑NL
C
P、PPlcも弱いながらりん酸化IPを脱り ん酸化した。以上の結果から、I
Pのりん酸基がPPlcの活性部位に、基質と競争的に結合する可能性が示された。
第 3章 では IPを りん 酸 化 する キ ナ ーゼ に つ いて 述 ぺ た。IPの 阻害に必 須なり ん酸化部位の配列は、カルシウム・りん脂質依存性プロテインキナーゼ(ProteinKinaseC；PKC)の認識配列であった。そこで豚脳から調製したPKCによるIPのりん酸化を調べたところ、IPはCa2
゛／ホスフフチジルセルン／ジオレイン(Ca/PS/DO)に依存してりん酸化され、その阻害活性はIP・Kでりん酸化したI
Pと一致した。さらに、大動脈平滑筋の抽出液にもCa/PS/DOに依 存して IPをりん酸 化する PKC
活性 が確認され、この酵素が生理的に働くIP
キナーゼであることが示唆された。一方、部分精製したIP‑
KはCa/PS/DOやトリプシン処理によって活性化されなかった。PKCとIP‑Kの他に、大動脈平滑筋にトリブシンで活性化されるI
P
キナーゼ活性も見い出され、IPの活性化には調節機構の異なる複数のキナーゼが関与することが示された。このように、PA‑¥ILCP活性を複数の経路で調節することによって、血管平滑筋に要求される複雑な収縮制街を行なっていると思われる。

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学位論文審査の要旨
主副副査
査
査

教
教
教

授
授
授

盛菊矢田池澤フ』
え、ミ三
生

学位論 文題名

大動脈平滑筋ミオシン軽鎖ホスファ夕一ゼの活性調節機構に関する研究
ミオ シン は大 動脈 平滑 筋にお いて 、そ の張力維持に寄与するモータータンパク質である 。ミ オシ ンは ATPの 化学 エネ ルギ ーを 得る ため に、 分子内 にATPase活性部位を持ち、必 要な 時に ATPを加水分解して張力発生に寄与する。ATPase活性はミオシン分子のサブュニットのーっであるミオシン制御軽鎖LC20の燐酸化によって制御され、その燐酸化には、細胞内のカルシウムイオン濃度で制御されるミオシン軽鎖キナーゼ（l[LCK）が作用する。
一 方、 平滑 筋ミ オシ ン内 の燐酸 化LC20は ミオシン軽鎖ホスファターゼ(ILCP)で脱燐酸化さ れる が、 IILCPの制御因子の存在はこれまで報告されていなかった。従って、ミオシン
ATPase活性 制御 に関 し、 一般に 認め られ ていた機構では、細胞内のカルシウムイオン濃度 が高 い間 、ILCKと ILCPの両者 が作 用し 続け 、ATPが 費やさ れる とい う難点を含んでいた。
申請 者は 、ブ タ大 動脈 平滑筋 に、 燐酸 化に 依存 して IILCP活性 を阻 害するタンパク質（ IP)が 存在 することを見いだした。申請論文では、IPの発見、単離、キャラクタリゼー
シ ョン 、IPを燐 酸化 する 内在性 キナ ーゼ の精製と性質、大動脈平滑筋ミオシンの脱燐酸化系路における制御機構、にっいて述べられている。
先ず、大動脈平滑筋抽出液のHLCP活性が、ATPアSの共存で阻害されることを見いだし、組 織内 に燐 酸化に依存したIILCP活性阻害タンパク質の存在が示唆された。そこで、大動脈 抽出 液を DEAEカラ ムに 供し、 吸着 しな い素 通り 画分 を、 更に 3種類 のカラムクロマト
グ ラフ アで 精製 し、 均一 な阻害 タン パク 質IPを得た。lPは未変性およぴ、変性、何れの条 件下 にお いても2万の分子畳を示し、モノマーの球状タンパク質であると推定された。
IPをり シル エン ドペ プチ ダーゼ 、あ るい は、BrCNで分解し、ペプチド断片を精製した。
IPの7596のアミノ酸配列を決定し、データーペースを用いて解析すると、既存の何れのタンパク質とも有意な相同性を示さず、IPは新しいタンパク質であると判断された。IPは、
ほ ぼl mol/molの 割合 で燐 酸化 され 、阻 害活性は燐酸化量に比例した。IPは、タイプ1のー 78ープ ロテ イン ホス ファ ター ゼ活 性の みを阻 害し 、タ イプ 2Aの ホスファターゼ活性を全く阻害しなかった。〔7―3 ZP] ATPを用いて燐酸化したI
Pから燐酸化ペプチドを単離し、その配列 を決 定し た。 RHARVTVKの配 列中 、6残 基日 のThrが燐 酸化 されていた。この配列は、プロ テインキナーゼCが認識する燐酸化部位の共通配列のーつである、K/RXS＊/T,kXK/Rを共有 している。ここで、S,k/T*は燐酸化部位である。そこで、ブタ脳から精製したプロテイン キナ ーゼ CでIPを燐 酸化 する と、 同一 のThrが燐 酸化 され 、ILCP活性の阻害も同様に観測 された。IPを燐酸化する内在性のキナーゼ（IPキナーゼ）に関しては、部分精製標品を得 たが 、抗 プロ テイ ンキ ナー ゼC抗 体と 反応 しな かっ た。 また、プロテインキナ―ゼCの活 性化 剤で ある カル シウ ムイ オン や、ホ スフ ァチ ヂル セリ ンで活性化されなかった。従っ て、 内在 性IPキナ ーゼ は、 プロテインキナーゼCのホモログと考えられるが、その同定は 今後 に残 され てい る。 内在 性IPキナー ゼの 制御 因子 が未 だ不明であるが、これらの結果から、in vivoにおけるIILCP活性は、IPの燐酸化で制御されている可能性が高い。また、大 動脈 には プ口 テイ ンキ ナー ゼCも 存在 して いる ので 、プ ロテインキナーゼCでIPが活性化 され 、IILCP活 性が 阻害 され ることも考えられる。最近、透過性にした大動脈平滑筋の張 カが プロ テイ ンキ ナー ゼCの 活性化剤で増強され、それは、ILCP活性阻害に由来すること が報 告さ れた 。IPは、 IILCP活性阻害に直接作用するタンパク質として制御に関わっている可能性が高い。
以上 の結 果は 、大 動脈 平滑 筋ミ オシン LC20の脱 燐酸 化経 路において、燐酸化を介した制 御機 構が 存在 する 可能 性を 初め て示し てい る。 これ は、 大動脈平滑筋の生理機能の解
明 に大 きく 貢献 する と共 に、 プロ テイン ホス ファ ター ゼ一 般の制御機構の解明にも寄与
で き、 高く 評価 され る。 審査 員一 同は、 申請 者が 博士 （理 学）の学位を受けるに充分な資格を有するものと認めた。

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