2010 ＮＯＶＥＭＢＥＲ
No. 565

2010 年（平成 22 年）11 月号

第 56 巻 第 6 号（通巻 565 号）

挨拶・巻頭言老いについて........................................土 井 邦 雄（ 2 ）獣医病理学研修会
第 49 回 No. 986 イヌの小脳日本獣医生命科学大学獣医病理学教室（ 3 ）第 50 回 No. 1007 ネコの腎臓.....................（財）日本生物科学研究所（ 4 ）第 50 回 No. 1020 イヌの乳腺部腫瘤................ 北里大学獣医病理学研究室（ 5 ）第 50 回 No. 997 イヌの鼻粘膜..................... 山口大学獣医病理学教室（ 6 ）レビュー
難治性慢性疾病における免疫疲弊化機序の解明と新規治療法への応用−獣医医療への応用にむけて−.......... 池渕良洋，今内 覚，寸田祐嗣，
小沼 操，村田史郎，大橋和彦（ 7 ）発表論文紹介豚丹毒菌とその他のエリシペロトリックス
属菌種の検出および鑑別のための定量的リアルタイム PCR 法の開発............... ToHo，小山智洋，長井伸也，
土屋耕太郎，布谷鉄夫（11）お知らせ
学会発表演題 ....................................... （12）http://nibs.lin.gr.jp/

2（72）

日生研たより老いについて
土井邦雄
この夏，転居を機に，長年押入れの奥で眠っていた懐かしい書物の数々に再会することが出来た。そのなかに，高峰秀子・松山善三夫妻の共著もあり，再読していて，「野郎というものは，女性への興味が薄らぐと共に，過去への強い郷愁と，学問という不可思議なる道楽に走る。
」という一文に遭遇した。昔読んだ時には何の感慨も覚えなかったのに，この度は違った。改めて我が身を振り返ると，このところ女性への興味は確実に薄れ，また，折に触れて遠い過去の日常が鮮やかに脳裏に蘇るようになった。加えて，仏教史に登場する仏法者への人間的興味から，仏教書を読み漁っている。仏教書を耽読することを学問とは言うまいが，不可思議なる道楽であることには違いあるまい。これはつまり，私が老年期に一歩足を踏み入れたということの証であろうか。一説によると，ヒトは 65 歳を区切りに老年期に移行するという。
近年，日本人の寿命は大幅に延びたと言われている。しかし，延びたのは老年期であって，決して幼少年期や青壮年期が延びた訳ではない。つまり，体力の衰えを実感しつつ，意識的にであれ無意識的にであれ，寿命の尽きる瞬間に向かって歩み続ける期間が延びた訳で，こうなると寿命が延びたことを素直に喜ぶことも難しく，老年期を生きる新たな覚悟が必要になってくる。老いは昔から人間の大いなる関心事で，古代ローマ時代のキケローをはじめ多くの人々によって様々に語られて来た。また，老いを扱った文学作品も数多い。何程かの参考になろうかと，それらの書物を読み漁った結果，老いの輪郭はおぼろげながら見えて来たような気はするものの，私には未だ，「老いを正面から我が身に引き受けることこそが，生の道程の最後に現れる課題である。」（黒井千次）といった心構えも覚悟も出来てはいない。
科学の世界では，20 世紀になって色んな動物種を用いて老化の生物学的な指標が追及され（東大獣医病
理学教室におけるイヌの脳の老人斑に関する研究もその一つ），1990 年代以降には個体および特に細胞レベルで老化のメカニズムに関する研究が急速に進展し，所謂老化関連遺伝子に関する知見の蓄積も加速している。それと並行して，最近では anti‒aging drugs の開発をはじめ，老化を防止し，寿命を延ばそうという試みも盛んになりつつある。こうした流れの中にあって，「老化とは，実は生命活動を正常に保つために不可
欠なしくみである。
」（近藤祥司）という指摘は重要であると思われる。また，健康・老化・寿命を一括して，時間軸，生態学，文学などの多角的な視点から解析し，人といのちの文化誌として纏めた黒木登志夫氏の著
書は，医学の世界に身を置く著者がヒトの老化の二側面（肉体的および精神的側面）を総合的に捉えようとした試みとして興味深い。
ところで，古代ローマからルネサンスに至るイタリアを舞台に，多くの著書を上梓している塩野七生氏によれば，ヒトに年齢があり，老いるのに似て，組織にも年齢があり，老いるという。ヒトは肉体的にも精神的にも老い，ついには寿命が尽きる。一方，組織の老いとは，組織としての理念の揺らぎ，施策の継続性の欠如，即応力の鈍化などの総決算としての自信の喪失であるらしく，こうした現象は如何なる形態の組織にも生じ得る。逆に言えば，組織としての自信を堅持することで，組織の老いを阻止出来るということになろう。それには先ず，組織のトップがその組織の「基本理念」とそれを実現する「意志」を明確に示し，組織の全構成員がその精神を共有することが肝要であろう。次いで，理念を実現するための施策を決定し，それを実行する中枢機能を，柔軟な思考力と異質なものをも取り込む包容力を持ち，かつ，「不幸でさえも滋養にしてしまう」若さ（塩野七生）を兼ね備えた少人数の集団に託すべきであると考える。組織も所詮ヒトの集合体で，構成員はいずれヒトとして老いて行く。しかし，明確な理念，それを実現するという強固な意志，
および一貫した施策が組織内で継承される限り，組織は老いることなく存続し，あまつさえ，若い構成員の斬新な発想によって，若返ることも可能であろう。すなわち，個人のそれとは違って，組織の老化は幸いにも可逆的であり得る。
私にとって老いは未だ半ば観念の域を出ず，また，悟道の境地にも程遠い。従って，今しばらくは「未熟な」一老年として，「諸行無常，諸法無我，涅槃寂静，一切皆苦」の世の中を気儘に彷徨っていたいと願っている。
（東京大学名誉教授・財団法人日本生物科学研究所常務理事）

56（5）
，2010

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イヌの小脳
日本獣医生命科学大学獣医病理学教室

第 49 回獣医病理学研修会 No. 986

図1

図2

動物：イヌ，ミニチュアダックスフンド，避妊雌，12 歳。 診断：小脳髄質髄鞘融解（Myelinolysis）
臨床事項：1 年以上にわたり，副腎皮質機能低下症によ考察：本病変は一種の脱髄であるが，慢性アルコール中

る低 Na 血症を持続していた。治療中に重度低 Na 血症

毒や重度栄養失調の患者で報告され，多発性硬化症など（110 mEq/L）がみられたため，食塩 3 ｇの給餌，生理の脱髄と区別され，Myelinolysis と命名された 1）。後に食塩水の点滴による Na 補正を試みた。補正により血中

この病因は急激な Na 補正であることが明らかになったのナトリウム値は 25 時間で 16 mEq/L 上昇した。補正2）

3 日後，起立困難，震え，痙攣がみられた。症状はさらリウム血症に対する急激なナトリウム補正後に神経症状に悪化し，意識消失，遊泳運動がみられた。9 日目にはを呈し，解剖学的に限局した領域に脱髄巣がみられる特予後不良と判断され，安楽死された。

徴的な組織所見が得られた。イヌでは病変は視床でみら

肉眼所見：両側副腎皮質の高度萎縮。大脳の表面血管樹れることが多いが 3），本症例は視床よりも小脳の方が顕枝状充盈の他には著変認めず。

著であった。本疾患では急激なナトリウム補正が原因で組織所見：左右対称に小脳小葉白質板を中心に空胞病巣あることは明らかであるが，浸透圧の変化がどのようながみられた（図 1）。病巣部ではボディアン・LFB 二重機序で髄鞘融解をひき起こすのかは未だ不明である。

染色において髄鞘崩壊と比較的保存された軸索が認めら（佐々木菜保子，高橋公正）。本症例も慢性副腎皮質機能低下症に随伴した低ナト

れ，残存する軸索間には LFB 陽性顆粒を含む髄鞘貪食

参考文献：

細胞が多数みられた（図 2）。重度病巣では病変は小脳1. Adams, R. and Victor, M. 1959. Arch. Neurol. Psychiat.

灰白質にまで及んでおり，顆粒層の多くの細胞にアポ

81 : 154‒172.

トーシス（TUNEL 法により）が認められた。同様の病2. Sterns, R. H., et al. 1986 New Engl. J. Med. 12 : 1535‒42.

変は間脳視床，大脳白質にもみられた。副腎は特発性副3. Oʼ Brien, D.P., et al. 1994. J. Vet. Int. Med. 8 : 40‒48.

腎皮質萎縮症と診断された。

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日生研たよりネコの腎臓（財）
日本生物科学研究所

第 50 回獣医病理学研修会 No. 1007

厚あるいはメサンギウムの増生は顕著ではなかった。腎動物：ネコ，雑種，雌，3 ヶ月齢。
臓表面の血管において石灰沈着を伴う器質化血栓が認め
臨床事項：症例は某所において，研究用に飼育されていられた。病変部の電顕検索では尿細管上皮内において放たネコで，出生時より成長不良が認められた。2009 年 6
射 状 構 造 を 示 す CaOx 結 晶 が 認 め ら れ（図 8），CaOx
月 18 日から数回にわたり実施した血液化学検査より，
ghost が尿細管上皮及び尿細管間質において散見された
BUN 及び creatinine の上昇が認められたため，同年 6
月 26 日に安楽殺後病理解剖され，左右腎臓が病性鑑定 （図 9）。多くの近位尿細管上皮でミトコンドリアの膨化
及び崩壊を伴う細胞質の空胞化が認められた（図 10）。
の目的で弊所に送られてきた。
診断：シュウ酸カルシウム（CaOx）結晶の沈着を伴う
剖検所見：左右の腎臓はどちらも硬結及び一部瘢痕化を呈し（図 1），割面では皮質の菲薄化が認められた。そ尿細管上皮の変性・壊死及び間質性腎炎（シュウ酸塩腎の他の臓器には肉眼的に異常は認められなかった。
症）
組織所見：皮質の表層部の瘢痕巣（図 2），尿細管の拡考察：シュウ酸症は主に腎臓に CaOx 結晶が沈着する疾
張及び結晶状物の沈着，尿細管上皮細胞の変性・壊死及病であり，重度になると腎不全や全身性の CaOx 結晶のび扁平化（図 3），尿細管間質の一部において軽度から沈着に発展する。その発生機序により原発性と続発性に中等度の結合織の増生及びリンパ球浸潤が認められた分類されるが，本症例は室内で食餌管理下のもとで飼育（図 4）。尿細管に認められた結晶状物は無色透明〜好塩されていたことや，同腹のネコで同様の肉眼病変が観察
基性，滑車様ないし角柱様の構造を示し（図 3），コッされていたことから，原発性のシュウ酸塩腎症が疑われ
サ染色では褐色〜黒褐色に染色され（図 5），偏光下でた。
（鈴木敬之）
は複屈折性を示した（図 6）。また，アリザリンレッド
参考文献：
S 染色では pH7.0 及び pH7.0 に 2M 酢酸処理を加えた条
1. Danpure, C. J. and Rumsby, G. 2004. Molecular aetiolo件下で淡赤色に染色され（図 7），pH4.2 及び pH7.0 に
gy of primary hyperoxaluria and its implications for clini0.1N 塩酸処理を加えた条件下でその染色性は消失した。 cal management. Expert Rev. Mol. Med. 6 : 1–16.
これらの結果から本結晶状物はシュウ酸カルシウム
2. De, Lorenzi, D., Bernardini, M. and Pumarola, M. 2005.
（CaOx）結晶と同定された。糸球体ではボーマン嚢に好Primary hyperoxaluria（L–glyceric aciduria）in a cat. J.
Feline Med. Surg. 7 : 357–361.
酸性漿液物の貯留が散見されたが，毛細血管基底膜の肥56（5）
，2010

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イヌの乳腺部腫瘤
北里大学獣医病理学研究室

第 50 回獣医病理学研修会 No. 1020

動物：イヌ，シーズー，避妊雌，10 歳。

化肉腫（癌肉腫）

臨床事項：右第三乳腺から第四乳腺にかけて硬結腫瘤が考察：本例は多数の多核巨細胞を伴う非上皮性腫瘍が特触知されたため，本学附属動物病院にて摘出した。3 ヶ徴的であった。巨細胞が出現する非上皮性腫瘍として骨月後来院時には右第三乳腺および第五乳腺に腫瘤が認め

肉腫，組織球肉腫，悪性線維性組織球腫が知られている

られ，X 線検査で肺に結節が 1 個確認された。

が，本例では vimentin を除く間葉系および白血球系抗

肉眼所見：初診時の腫瘤の大きさは約 2 × 3 × 3 cm で原は全て陰性であり，超微形態学的にも特定の細胞，組あった。割面は白色から黄白色，充実性で，小型の空隙織への分化を示す所見は得られなかった。提出標本ではが 1 ヵ所認められた。

上皮性，非上皮性腫瘍は離れて存在していたが，一部で組織所見：上皮性腫瘍（図 1，*）と非上皮性腫瘍（図 1， 互いに浸潤（混合）し，再発病巣でも双方の成分が混在†）が接し，互いに浸潤していた。上皮性腫瘍は基底様していたことから，癌肉腫と診断された。

細胞に縁取られ，扁平上皮への分化を示し（図 2），cy-

（畑井

仁）

tokeratin AE1/AE3 に陽性であった（図 3）。基底様細胞

参考文献：

から連続して腺構造を形成する領域も見られ（図 4），

1. Misdorp, W., Else, R. W., Hellmen, E. and Lipscomb, T.

AE1/AE3 および cytokeratin 19 に陽性を示した（図 5，

P. 1999. WHO International Histological Classiﬁcation of6）。非上皮性腫瘍細胞は多角形から紡錘形で充実性に増Tumors of Domestic Animals, 2nd series Vol. 7. Mamma-

殖し（図 7），多核巨細胞も多数認められた（図 7，矢頭）。 ry Tumors of the Dog and the Cat., AFIP, Washington, D.
免疫染色では vimentin のみ陽性で（図 8），筋上皮，筋C.

線維，骨，組織球，白血球に関連する抗原は全て陰性で

2. Misdorp, W. 2002. Tumors of the Mammar y Gland.

あった。

pp.575 – 606. In : Tumors in Domestic animals, 4th ed.

診断：腺扁平上皮癌および多核巨細胞を特徴とする未分（Meuten, D. J. ed.）, Blackwell, Iowa.

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日生研たよりイヌの鼻粘膜山口大学獣医病理学教室

第 50 回獣医病理学研修会 No. 997

動物： イヌ，ミニチュアダックスフント，雄，3 歳。
球が接着し，内腔に多数の好酸球を認めた。鼻腺の粘液
臨床事項・肉眼所見：2009 年 8 月 20 日，一週間前から産生は亢進し，表皮と同様に好酸球が浸潤し，粘液細胞の突然のくしゃみ，逆くしゃみ，右側鼻孔からの黄色では破壊され，軽度の線維化も認めた。細菌・真菌・寄生粘稠性の高い膿状の鼻汁を主訴に開業医を受診。血液検
虫は認められなかった。免疫組織化学染色では，粘膜固査で好中球増加と CRP 上昇が認められ，マルボフロキ
有層および血管内のリンパ球は CD4，IL–4，IL–5，IL–
シンとメロキシカムを投与。2009 年 8 月 23 日，依然と13，CD79αを発現し，IFN–γ発現リンパ球は少数であっして鼻汁が認められ，鼻汁の塗抹検査で多数の好中球・た。好酸球も IL–4，IL–5，IL–13 陽性で，リンパ球・好酸球は VLA–4 陽性，血管内皮細胞は VCAM–1 陽性，上好酸球と球菌が認められた。鼻汁の培養検査で Staphylococcus aureus が検出されたため，セファレキシンを処
皮・好酸球は Eotaxin–2 陽性を示した。
診断：イヌの慢性好酸球性鼻炎方。2009 年 9 月 8 日，鼻腔内視鏡で，鼻粘膜の充血・考察：本症例の特徴的な組織学的所見は上皮層の杯細胞
腫脹，鼻腔内に多量の粘稠な鼻汁の貯留を認め，洗浄・の過形成と好酸球にリンパ球を混じた浸潤であり，ヒト吸引は困難であった。洗浄時，鼻甲介のヒダの間に粘膜の非アレルギー性の好酸球性鼻茸の組織像に類似していの色と異なる赤桃色の線状の鼻粘膜組織が採取され，生た 1）。リンパ球は免疫組織化学的には Th2 細胞が主体
検検査を依頼された。洗浄後，右側鼻腔からの鼻汁は減で，Ⅰ型アレルギーが関与しないアレルギーによる鼻炎
少したが，左側からも鼻汁が認められるようになった。
が強く示唆された。プラズマ細胞の存在は何らかの抗原
プレドニゾロン投薬後，症状は改善し，その後無処置でに対する特異的免疫反応が成立している可能性が示唆さ2 日に 1 度，軽度のくしゃみがみられる程度で現在も経れるが，アレルゲンは特定されず，非アレルギー性の可過観察中である。プレドニゾロン処置前血清の多くのア能性もあり，診断名は犬の慢性好酸球性鼻炎とした。なレルゲン（室内吸入群，花粉群，食物群）特異的 IgE 測
お，好酸球性鼻炎はアレルギーによるとの記載もある 2）。
定は陰性であった。
また，これまで本例と類似の組織所見を示す報告は見ら
組織所見：鼻粘膜は全体に肥厚していた。粘膜上皮層でれない。
（中嶋朋美，林 俊春）
は杯細胞は著しく肥大，過形成／化生（図 1：HE）に
参考文献：
よる粘液産生が著明であった（図 2：PAS）。一部に粘1. Ferguson, B. J. 2000. Eosinophilic mucin rhinosinusitis
膜のびらん・潰瘍を認め，上皮内に好酸球が浸潤し，それらを破壊し，上皮は解離し海綿状を示していた。また， : a distinct clinicopathological entity. Lar yngoscope
110 : 799–813.
基底膜の不規則な硝子様肥厚と断裂を認めた。粘膜固有2. Caswell, J. L. and Williams, K. J. 2007. Rhinitis in respi層は水腫性で，多数の好酸球を主体とし，次いでリンパratory system. pp. 534. In : Jubb，Kennedy and Palmer s.
球・プラズマ細胞，一部好中球を混じた浸潤が見られ，
Pathology of Domestic Animals. 5th ed. Vol. 2.（Maxie, M.
肥満細胞は殆ど認められなかった。さらに充血・出血・
G. ed.）, Elsevier Saunders, Philadelphia.
鬱血がみられ，血管は拡張して内皮細胞は肥大し，好酸56（6）
，2010

7（77）

レビュー

難治性慢性疾病における免疫疲弊化機序の解明と新規治療法への応用−獣医医療への応用にむけて−
池渕良洋，今内 覚，寸田祐嗣，小沼 操，村田史郎，大橋和彦（北海道大学大学院獣医学研究科）

１．背景
感染症や腫瘍ワクチン開発において，その研究過程では試験管レベル（in vitro）で，抗ウイルス効
果や抗腫瘍効果が認められたにもかかわらず，実際の免疫動物では期待された効果が認められなかった
り，効力が弱いという事例は多い。なかでも慢性感染症に対するワクチン開発は困難を極める。ヒトのウイルス感染症において，ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）感染症やヒト T 細胞白血病ウイルス（HTLV–1）感染症などは代表的なワクチン不在の疾患である。これらの感染症の共通点は慢性感染症である。
長年，多くの研究者がワクチン開発に取り組んできたにもかかわらず実用化に至っていない背景には，生体内でのワクチン効果の低さという点である。近年，このような難治性慢性感染症疾患が，なぜワク
チン実用化に至らないかの理由の一端が明らかになりつつある。すなわち，ワクチンの問題ではなくウ
イルス感染細胞や腫瘍細胞が兼ね備える免疫回避シ
ステムが原因であることが明らかとなってきた。事実，ワクチン接種によって誘導されるエフェクター
細胞は，免疫動物内に多く認められるにもかかわらず，抗ウイルス効果や抗腫瘍効果を発揮していないのである。ヒト，サルおよびマウスなどのウイルス
感染細胞や腫瘍細胞とエフェクター細胞を解析した
結果，細胞上に発現する免疫制御因子の関与が明らかとなってきた。いわゆる，免疫抑制受容体 Programmed death 1（PD–1）と そ の リ ガ ン ド Programmed death ligand 1（PD–L1）である。感染細胞や腫瘍細胞では PD–L1 の発現が亢進する一方，エフェクター細胞上の PD–1 の発現も亢進し，お互いが結合する。その結果，本来，感染細胞や腫瘍細胞の排除のために作用するエフェクター細胞を休眠状態（これをリンパ球の疲弊化（exhaustion）という）へと陥れることによって免疫回避を行っている
ことが明らかとなってきた [2, 7, 39]。幸いこのエフェクター細胞の疲弊化は可逆的であることも明らかとされている。すなわちエフェクター細胞上のPD–1 とウイルス感染細胞や腫瘍細胞上の PD–L1の結合を妨げてやることで本来の感染細胞や腫瘍細胞に対する傷害活性を回復することが証明されている。これまで，生体内でワクチン効果が認められない理由はワクチン選定の不備として考えられてきたが，少なくとも in vitro で傷害効果等が明らかであるものについては，ワクチンには問題がなく，宿主側の要因であった可能性を示唆するものである。すなわち，この免疫抑制機序を解除することさえ可能
ならばエフェクター細胞が従来持つ抗病原体や抗腫瘍効果を回復，増強することが期待される。現在，ヒトの慢性感染症や腫瘍疾患では，この PD–1/PD–
L1 機構に注目が集まり基礎研究から応用研究まで多くの研究が進められている。しかし，ウシ等の産業動物では，PD–1/PD–L1 機構の免疫抑制機能は明らかにされておらず研究も進んでいない。

2．PD–1 およびそのリガンドとは免疫反応において重要な点は，生体外から侵入す
る有害な病原体の抗原を特異的に排除することおよび自己組織の抗原は特異的に免疫寛容することである。PD–1，PD–L1 および PD–L2 は近年同定された
細胞膜上の免疫抑制受容体とそのリガンドであり，
B7–CD28 ファミリーに属している。この 2 つの分子からなる PD–1/PD–L1 機構は T 細胞による過剰な免疫反応を抑制し，免疫寛容に強く関与していることが解明されている。PD–L1 が PD–1 に結合することで抑制性シグナルが細胞内に伝達され，近傍の CD3/CD28 からの活性化シグナルを阻害して免疫抑制作用が起こっていると考えられている [30,35]。PD–1 からの抑制性シグナルを受けた T 細胞
は抗原提示などの活性化刺激を受けても反応しない
アネルギーという状態に陥る。通常の生体内では，例えば，胎盤などの免疫学的寛容が起きやすい組織
では PD–L1 が恒常的に発現しており，自己抗原反応性 T 細胞の PD–1 と結合することで，正常組織を免疫系システムによる破壊から保護していることが示唆されている [12]。また，PD–1 との結合による逆シグナルは送られないとされてきた PD–L1 が，共刺激因子である B7–1（CD80）と結合することで抑制性シグナルを細胞内に送る可能性が示唆されている [3]。また，PD–1 は樹状細胞やマクロファー
ジにも発現しており，自然免疫の制御にも関与している可能性が報告されている [13, 44]。このように
PD–1 / PD–L 機構は生体内の免疫寛容システムの一つとして機能しており，研究が盛んに行われているが，全貌は未だ解明されていない。

8（78）

PD–1，PD–L1 および PD–L2 は多くの種類の細胞に発現しており，免疫活性化刺激により発現が誘導されることが知られている。ヒトにおいて，PD–1は主に活性化 T 細胞や B 細胞，また，機能は解明されていないが樹状細胞や活性化単球，ナチュラル
キラー T 細胞の細胞膜にも発現している [20]。休止期のＴ細胞では発現が確認されないが，やはり活性化により誘導されることが報告されている [1]。
一方，PD–L1 は活性化 T 細胞，樹状細胞，単球，
血管内皮細胞，肝臓の間質細胞，角質細胞など，造血系に限らず，非造血系の細胞にも広く発現している [20, 29]。また I 型あるいは II 型 Interferon（IFN）により PD–L1 の発現が誘導または増強される [8, 32]。一方，PD–L2 は PD–L1 と対照的に，樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞などに限局して発現している [20]。

日生研たより異的 CD8+ T 細胞の増殖能やサイトカイン産生能の上昇 [2] などが報告されている。以上のように，
PD–1 または PD–L1 特異的抗体投与により，免疫疲弊に陥った免疫細胞の再活性化を誘導し，ウイルスの排除や腫瘍退縮効果が証明され，慢性感染症などの治療や新規ワクチン開発への応用の可能性が示
唆されている。特筆すべき点としては，治療として
生体へ抗体投与した場合の懸念される副作用が，現在のところないとされている点である [42]。最新の知見では，メラノーマや大腸癌などの癌患者に対して PD–1 抗体による新規治験（第 I 相臨床試験）が米国で行なわれ，副作用を認めない抗腫瘍効果が報告されている。
このように，ヒトの慢性感染症や腫瘍疾患では，
この PD–1/PD–L1 機構に注目が集まり基礎研究か
ら応用研究まで多くの研究が進められ治療やワクチンが頓挫している疾患の新規制御法の一つとして期待されている。現在，我々はウシ，水牛およびニワトリの PD–1 および PD–L1 遺伝子を同定し，これらの因子の機能解析を行なっている。また，種々の感染症における免疫抑制状態と PD–1/PD–L1 機構との関係について解析を進めている。ここでは，牛白血病ウイルス（BLV）感染症をモデルとした PD–
1/PD–L1 機構の解析結果を紹介し，獣医医療への3．PD‒1/PD‒L1 機構による免疫疲弊化
PD–1/PD–L1 機構は正常時のみではなく疾患時にも関与することが明らかになりつつある。特に慢性感染症での報告が多い。前述の HIV 特異的 CD8+
T 細 胞 [7, 39]，HTLV–1 感 染 者 の CD8+ T 細 胞，
HTLV 特異的 CD8+ T 細胞 [23] や C 型肝炎ウイルス
応用の可能性を紹介したい。
（HCV）特異的 T 細胞 [40] などでは PD–1 の発現上–昇が報告されている。また，PD L1 発現の上昇もB 型 肝 炎 ウ イ ル ス（HBV）[5]，HIV[43] や
HTLV[23] に関する研究などで報告されている。こ4. BLV 感染症の現状
れらの病原体は免疫抑制機構である PD–1/PD–L1
BLV はレトロウイルス科に属し，その遺伝子構機構を免疫回避に利用して生体内で生存していると造は HTLV と最も近縁である [31]。感染血液を介考えられてる。また，慢性感染症だけではなく，膵
して B 細胞に感染したのち長期間持続感染する
臓癌 [27] や成人 T 細胞白血病 [23, 36] などの腫瘍[24, 34]。感染牛の大部分は無症候感染（AL）牛で––性疾患においても PD 1/PD L1 機構の関連が示唆あるが，感染牛の 20 〜 30％ではポリクローナルなされている。これらの報告以外にも，他のウイルス
B 細胞の異常増殖を呈する持続性リンパ球増多症
感染症，自己免疫疾患，細菌感染や寄生虫感染でも （PL）を引き起こす。さらに感染牛の 2 〜 3％は B関連があることが報告されており，PD–1/PD–L1
細胞性の白血病である地方病型牛白血病（EBL）を
機構はエフェクター細胞の機能不全，すなわち免疫引き起こし，リンパ節に悪性リンパ肉腫が形成され，疲弊を引き起こしている様々な疾患において，非常予後不良で死に至る [33]。近年，北海道を含む全国に重要な役割を果たしている。
で，感染牛の増加傾向が見られ，将来的な BLV 汚––
これらの PD 1 および PD L1 の発現解析と同時
染の拡大と EBL 発症数の増加が懸念されている。
に，抗 PD–1 ま た は 抗 PD–L1 抗 体 を 用 い て PD–1
しかし現在のところ，実用的なワクチンや治療法がと PD–L1 との結合を阻害する研究も数多く行われなく，迅速な対策や治療法の開発が求められている。
ている。抗体投与により結合を阻害すると，in vi本症は長年の研究にもかかわらず，未だワクチンがtro で，HIV 特異的 T 細胞の増殖能やサイトカイン
樹立されていない感染症である。しかし，抗ウイル
産 生 能，エ フ ェク タ ー分 子 発 現 の 上 昇 [7, 39]，
ス 作 用 を 導 く よ う な CTL エ ピ ト ープ や Th エ ピ
HTLV 特異的 CD8+ T 細胞のサイトカイン産生能のトープの同定はすでに報告されている [4, 9, 11]。
これらのエピトープマッピングを基盤としたワクチ
上 昇 [23]，サ ル 免 疫 不 全 ウ イ ル ス（SIV）特 異 的CD4+ T 細胞の増殖能の上昇 [41] などの報告がある。 ン開発が試みられ，これまで，ペプチドワクチン，DNA ワクチン，ワクチニアウイルスワクチンなど
さらに in vivo でも，SIV 特異的抗体価の上昇やウ
種々のワクチンによる治験が行なわれ，生体内でのイ ル ス 量 の 減 少 や SIV 感 染 サ ル の 生 存 率 の 上 昇
エフェクター細胞の誘導が確認されるものの期待さ[42]，リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）特56（6），2010

れた感染防御効果は得られておらず実用化に至っていない [17]。

5. ウシ PD 1/PD L1 遺伝子の同定
3 および 5 RACE 法によりウシ PD–1 および PD–L1 遺伝子を同定した [14]。その結果，ウシ PD–1の予想アミノ酸配列は，機能が明らかであるヒト
PD–1 と 72.9％，マウス PD–1 と 65.6％の相同性を示した。今回同定したウシ PD–1 を他の動物種のPD–1 と比較した結果，細胞内領域にある二箇所のImmunoreceptor tyrosine – based inhibitor y motif（ITIM ; I/L/V/S/TxYxxL/V/I）[6] が完全に保存されていた。PD–1 の ITIM には二つのチロシン脱リン酸化酵素 SHP–1 および SHP–2 が誘導され，抑制性シグナルが細胞内に伝達される [28, 35]。このことから，ウシ PD–1 もヒトおよびマウス PD–1 と同様に，本因子への刺激により抑制性シグナルが細胞内に伝達される可能性が高いと考えられた。一方，
ウ シ PD–L1 予 想 ア ミ ノ 酸 配 列 は，ヒ ト PD–L1 と85.2％，マウス PD–L1 と 80.7％の相同性を示した（投稿中）。興味深いことに近年，フグあるいは牛と同じ偶蹄目である豚においても PD–L1 遺伝子の発現ならびに PD–L1 による T 細胞性免疫の抑制機能が 報 告 さ れ て い る [15, 38]。今 回，決 定 し た ウ シ
PD–L1 予想アミノ酸配列は，他の動物種と比較してブタ PD–L1 とより高い相同性を示していることから，同様の免疫抑制機能に関与していることが予想された。以上の予想アミノ酸配列の比較や発現解析から，ウシ PD–1 および PD–L1 は PBMC において T 細胞性免疫の活性化により発現が上昇し，免疫抑制を誘導している可能性が示唆された。

6. BLV 感染牛における PD L1 発現解析
ヒト肝細胞ではアデノウイルスや HBV 感染により PD–L1 mRNA 発 現 が 上 昇 し [25]，ま た HBV 患
者の樹状細胞あるいは HCV 患者の T 細胞，単球系
細胞や B 細胞でも PD–L1 の発現上昇が報告されている [5, 16]。さらには，抗 PD–L1 抗体処理によりT 細胞の機能が回復することも同時に報告されている。このように PD–1/PD–L1 機構の免疫抑制機能と慢性感染症との関連が示唆されていることから，
フローサイトメトリーを用いて BLV 感染の様々な病態ステージにおける PD–L1 発現解析を行った。
その結果，病態が進行した BLV 感染牛（PL およびEBL 牛）の PBMC で PD–L1 発現上昇が認められた（投稿中）。すなわち，PD–L1 発現は BLV 感染の病態進行を示す白血球数，ウイルス量およびウイルス
力価と正の相関を示した。本症は CD5+ B 細胞に感
染 す る こ と に 起 因 す る 腫 瘍 疾 患 で あ る。そ こ で9（79）EBL 牛および PL 牛における PD–L1+ 細胞の同定を試みた結果，IgM+ 細胞あるいは CD5+ 細胞でやはり PD–L1 発現の上昇が認められ，BLV–gp51+ 感染細胞でも PD–L1 の発現が確認された（投稿中）。
今回の結果から BLV 感染症においても，異常に増殖した B 細胞を中心とした PD–L1 発現亢進が本症の免疫抑制やウイルスの持続感染に関与するものと 推 察 さ れ た。HIV 感 染 症 の 場 合，PD–1 お よ び
PD–L1 発現上昇の機序は 3 つの仮説が唱えられて
おり [19]，1）同一抗原の慢性的抗原提示による
PD–1 発現上昇 [37]，2）HIV ウイルスタンパク質
Nef による PD–1 発現上昇 [26]，3）IL–2 や IL–7 な
どのサイトカインによる PD–1 または PD–L1 発現上昇である [21]。BLV 感染においても慢性感染による長期間の抗原提示や，Th2 型へのサイトカイン
環境の変化が報告されている [18, 22]。現在，本症における PD–L1 発現機序について解析を行なっている。
7．PD‒1/PD L1 制御による
牛白血病ウイルス増殖抑制効果
病態が進行した本症では，ウイルスを排除するためのサイトカイン産生能やリンパ球増殖能の低下など免疫抑制が顕著である [18, 22]。そこで，PD–1/
PD–L1 システムの遮断により免疫抑制状態が回復するか否かについて検討した。すなわち，PL 牛や白血病・肉腫発症牛からリンパ球を分離し，PD–L1
抗体を使い PD–1/PD–L1 ブロック試験を行った。
その結果，コントロール抗体添加では変化が認められなかったが，PD–L1 抗体を添加することで，IFN– γおよび IL–2 の分泌能回復効果が得られた。このときのウイルス動態を検討した結果，PD–L1 抗体の添加によりウイルス増殖を顕著に抑制することが明らかとなった。
以上より，ウシ PD–1/PD–L1 機構が免疫抑制に関与することが示唆され，BLV 感染症の発症機構の一部と考えられた。現在，PD–1 やその他の免疫制御因子の発現解析，病態が進行した牛におけるPD–L1 発現上昇機序の解析や PD–1 と PD–L1 との結合阻害による生体内での免疫活性効果および抗ウ
イルス効果の検討を行なっている。

8．獣医医療への応用にむけて2009 年，HIV ワクチン開発のモデルとして行なわれている SIV 感染サルにおいて，PD–1 抗体の賦与による in vivo 内でのウイルス排除効果が報告された [10, 42]。また，前述のとおりメラノーマや大腸癌などの癌患者に対する第 I 相臨床試験もすでに開始されている。今回の我々の結果でも in vitro 下ながらウシ PD–1/PD–L1 システムの制御により免10（80）

疫抑制状態下にある BLV 感染ウシ由来のリンパ球の機能を回復し，ウイルス増殖を抑制する効果が得られた（投稿中）。割愛したが，正常牛においても同法により免疫増強効果が得られている。今後，生体内においてワクチン効果が増強されるか，ウイル
ス排除が可能か否かについて臨床試験を行なう予定である。

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発表論文紹介豚丹毒菌とその他のエリシペロトリックス属菌種の検出および鑑別のための定量的リアルタイム PCR 法の開発
Development of quantitative real‒time polymerase chain reaction for detection of and discrimination
between Erysipelothrix rhusiopathiae and other Erysipelothrix species.
J. Vet. Diagn. Invest. 21, 701‒706（2009）
ToHo，小山智洋，長井伸也，土屋耕太郎，布谷鉄夫
豚丹毒菌とその他のエリシペロトリックス属菌種
を組織材料から検出および鑑別するための増菌培養を組み合わせた定量的リアルタイム PCR（qPCR）
法 を 開 発 し，検 証 し た。SYBR Green を 用 い た12（82）

日生研たよりqPCR 法の標的は，エリシペロトリックス属菌種の16S リボソーム RNA 遺伝子および豚丹毒菌の莢膜形成に関与する遺伝子とした。qPCR 法の特異性は，
エリシペロトリックス属菌種の各株および他の関連菌種を用いて評価した。qPCR 法の検出限界は，1反応あたり 5 CFU であった。豚丹毒菌を添加した
関節および脾臓材料から抽出した DNA を用いた
qPCR 法の感度は，培養菌液そのものから抽出した
DNA を用いた qPCR 法の感度と同等であった。豚丹毒菌により実験感染した豚 3 頭およびマウス 50匹から得た組織材料 88 検体ならびに，自然感染豚

3 頭および未感染豚 11 頭から得た組織材料 36 検体を用い，本 qPCR 法を評価した。本 qPCR 法と，直接 qPCR 法および従来の細菌培養法について，検出感度を比較した。増菌培養を組み合わせた qPCR 法
は，細菌培養法および組織材料からの直接 qPCR 法
より検出感度が高く，豚丹毒菌およびその他のエリ
シペロトリックス属菌種の検出に要する作業時間を大幅に短縮できた。したがって，本 qPCR 法はエリシペロトリックス属菌種の検出および鑑別に臨床応用が可能な方法であると考えられた。

学会発表演題（2010 年 4 月〜 9 月）
9th International Veterinary Immunology Symposium
日：2010 年 8 月 16 日〜 8 月 20 日

期
開催

地：東京（タワーホール船堀）

発 表 演 題：Oral delivery of enteric–coated TGE vaccine protects piglets from TGE by passive transfer
of maternal antibodies.
○ N. Takeyama 1, T. Sato 1, T. Hosokawa 1, I. Sato 1, M. Sugiyama 2, H. Yamada 1 and K.
Kusanagi1（1 Nippon Institute for Biological Science, 2 Freund Corporation）.
発 表 演 題：Acquired immunity against bovine Eimeria is species–speciﬁc but not cross–protective.
○ F. Kawahara1, G. Zhang1, Y. Tamura2, M. Koiwa3, M. Onuma2 and T. Nunoya1（1 Nippon.
Institute for Biological Science, 2 Hokkaido University, 3 Rakuno Gakuen University）

第 150 回日本獣医学会学術学会
日：2010 年 9 月 16 日〜 9 月 18 日

期
開催

地：帯広畜産大学

発 表 演 題：牛コクシジウム原虫の遺伝子学的解析と種鑑別 PCR 法の確立
○川原史也 1，張2

国宏 1，田村

悠 2，小岩政照 3，小沼

操 2，布谷鉄夫 1（1 日生研，

北海道大学大学院，3 酪農学園大学）

発 表 演 題：Eimeria tenella メロゾイト表面タンパク質 Mzp5–7 cDNA のクローニング及び組換えタン
パク質の ELISA 法への応用○張国宏，藤野美由紀，川原史也，岩田

日生研たより晃，布谷鉄夫（日生研）

昭和 30 年 9 月 1 日創刊（隔月 1 回発行）

（通巻 565 号） 平成 22 年 10 月 25 日印刷
発行所
生命の「共生・調和」を理念とし，生命体の豊かな明日と，研究の永続性を願う
気持ちを快いリズムに整え，視覚化したものです。カラーは生命の源，水を表す「青」としています。

〒 198 0024

東京都青梅市新町 9 丁目 2221 番地の 1

TEL：0428（33）1056（企画学術部） FAX：0428（33）1036
発行人
編集室
印刷所

表紙題字は故中村⒥治博士の揮毫

平成 22 年 11 月 1 日発行（第 56 巻第 6 号）

財団法人 日本生物科学研究所

林

志鋒

委

員／黒田丹（委員長），竹山夏実，鈴木敬之

事務／企画学術部

株式会社 精ഛ社（無断転載を禁ず）