Aug. 2016

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

291（ 71 ）69―4〈研究報告〉
自動遺伝子解析装置「GENECUBE」を用いた
クラミジア・トラコマティスおよび淋菌の迅速検査の性能評価
宮崎成美 1）・山岸由佳 1,2）・和泉孝治 3）・
川嶋洋介 4）・末松寛之 1）・三鴨廣繁 1,2）
愛知医科大学病院感染制御部感染検査室

1）

愛知医科大学病院感染症科

2）

いずみレディスクリニック

3）

東洋紡株式会社

4）（2016 年 5 月 6 日受付）
性器クラミジア感染症および淋菌感染症の検出法としては，核酸増幅法（遺伝子検査法）が感度の高い方法として推奨されている。我々は，約 1 時間で遺伝子検査を実施可能な全自動遺伝子解析装置 GENECUBE（東洋紡株式会社）を用いた遺伝子検査法（以下 GC 法）の感度，特異度について，検査に 2 〜 4 時間程度を要する既存検査法である TMA 法および免疫クロマトグラフィー法（クリアビュー
リアビュー

ゴノレア，共にアリーア

クラミジア，クメディカル株式会社）と比較検討した。クラミジア・トラコマティス検出における GC 法と TMA 法との全体一致率は 95.8%，陽性一致率は 90.5%，陰性一致率は 98.6% で良好な相関を示した。淋菌検出におけるGC 法と TMA 法との全体一致率，陰性一致率はいずれも 100.0% で非常に良好な相関を示した。GENECUBE を用いたクラミジア感染症および淋菌感染症検査は，従来の核酸増幅法による検査と同等の結果が得られた。GENECUBE は約 1 時間で核酸抽出，核酸増幅，増幅産物の検出が可能であるため，従来よりも短時間での検査が可能になり，クラミジアおよび淋菌感染症の迅速な診断や治療に貢献することが期待される。

多く，女性でも淋菌感染症は頻度が高い性感染症

I. 序文である 1,2）。クラミジア，淋菌とも女性が感染した
場合は子宮頸管炎などを発症し得るが，無症状の日本国内で最も感染者数が多い性感染症はクラまま感染が進行し，卵管障害や腹腔内癒着を形成

ミジア・トラコマティス（以下，クラミジアと略して異所性妊娠や不妊症の原因となることもあす）感染症であり，男性では次いで淋菌感染症がる。そのため，高感度かつ正確にクラミジアや淋292（ 72 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―4Aug. 2016

検体採取

菌を検出できる検査法の意義は大きい。
性器クラミジア感染症および淋菌感染症の検出

対 象 の 患 者 か ら は フ ロ ッ ク ス ワ ブ・TR100法としては，核酸増幅法（遺伝子検査法）が感度 （COPAN ITALIA S.p.A.）を用いて子宮頸管擦過の高い方法として推奨されており，複数の方法が物を採取した。擦過物は 2 本のスワブを用いて採臨床検査用に提供されている 2）。2015 年時点では取し，採取後のスワブは後述する方法により GC

リアルタイム PCR 法（コバス®4800 システム CT/法あるいは TMA 法での検査を行った。また，こNG，ロシュ・ダイアグノスティックス株式会れとは別に免疫クロマトグラフィー法を原理とす社），TMA 法（アプティマ Combo2 クラミジア /る検査キットであるクリアビュー

ゴノレア，ホロジックジャパン株式会社），SDA

よびクリアビュー法（BD プローブテック ET クラミジア・トラコマ

た。クリアビューでの検査は添付文書の記載にチス，ナイセリア・ゴノレア，日本ベクトン・従って行った。

™

クラミジアおゴノレアを用いた検査も行っディッキンソン株式会社），リアルタイム PCR 法（アキュジーン m-CT/NG，アボットジャパン）なGC 法用の検体前処理法

どが主に用いられている。また，免疫クロマトグ

検体前処理方法の概要を Fig. 1 に示す。具体的

ラフィー法を原理とする検査キットも臨床現場でな手順は以下のとおりである。検体を採取したスは用いられている 。

ワブをジーンキューブ専用スワブ検体懸濁液（東2）今回，約 1 時間で遺伝子検査を実施可能な全自洋紡株式会社）を 1 mL 充填した前処理用チューブ

動遺伝子解析装置 GENECUBE（東洋紡株式会社） に浸して撹拌した。十分に懸濁後，スワブを容器を用いた遺伝子検査法（以下 GC 法）が，臨床検から引き上げた。スワブ懸濁後の液（以後，試料体を測定した場合に臨床的に有用と認められる感液と記載する）から 800 μL をマイクロピペットで度，特異度を有すること，および既存検査法（以採取し，ジーンキューブ専用イージー・ビーズ

下既存法）と十分な相関性を有することを検討す （東洋紡株式会社）のビーズ入りチューブに分注る目的で行った。既存法には TMA 法および免疫し た。試 料 液 と ビ ー ズ が 入 っ た チ ュ ー ブ をクロマトグラフィー法（クリアビュー

10,000 g で 3 分間遠心分離を行い，遠心分離後のア，クリアビュー

クラミジ

ゴノレア，共にアリーア

メディカル株式会社）を選択した。

試料液のうち上清 400 μL をマイクロピペットで除去し，400 μL をチューブ内に残した。
試料液 400 μL が残ったビーズ入りチューブにII. 方法対しては，試料液に含まれるヒト細胞等の夾雑物や細菌を破砕する目的で，ビーズ処理法と呼称す対象患者る処理を行った。ビーズ処理法の具体的な方法は

本検討は 2015 年 10 月から 2015 年 12 月までに以下の通りである。まず，チューブを 1〜2 秒間ボ

いずみレディスクリニック（岐阜県岐阜市）を受ルテックスミキサーにより撹拌し，卓上遠心機を診した女性患者のうち，クラミジアまたは淋菌感用いてスピンダウンを行った。スピンダウンした染症の疑いがある患者を対象として行った。なチューブを 80°C で 10 分間加熱した。加熱後のお，本研究は，愛知医科大学病院倫理委員会の承チューブはボルテックスミキサーを用いてパルス認を得て実施した（承認番号 13-151）。

ボルテックスを 20 秒間行った。パルスボルテッ
クス後のチューブに対して再度卓上遠心機により

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69―4293（ 73 ）Fig. 1. Overview of pretreatment method of specimens for GENECUBE

Fig. 2. The flow of nucleic acid extraction, amplification and detection performed byGENECUBE

スピンダウンを行い，チューブの側壁に付着した用消耗品，GENECUBE 専用クラミジア検出試薬

試 料 液 や ビ ー ズ 粒 子 を 底 面 に 落 と し た。こ のであるジーンキューブクラミジア・トラコマチス

チューブに対してジーンキューブ専用溶解吸着液 （東 洋 紡），同 じ く 淋 菌 検 出 試 薬 で あ る ジ ー ン（東洋紡株式会社）を 600 μL 添加し，軽く撹拌しキ ュ ー ブ ナ イ セ リ ア・ゴ ノ レ ア（東 洋 紡）をた後，約 1,500 g で 3 分間遠心分離を行った。遠心GENECUBE の所定の位置にセットし，GC 法に分離後，上清 800 μL をマイクロピペットで回収よる検査を行った。GENECUBE では専用の試薬，し，ジーンキューブ専用カートリッジの検体分注消耗品，検体入りカートリッジをセットし，検体スポットに分注した。

情報を GENECUBE 本体に入力し，測定項目としてクラミジア，ナイセリアを選択してスタートすGC 法
ビーズ処理法によって得られた上清 800 μL を分注した専用のカートリッジ，およびその他の専ることで，自動的に核酸抽出，PCR による核酸増
幅，QProbe による増幅産物の検出，結果表示が行われる（Fig. 2）3,4）。

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TMA 法

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び淋菌の検出を行った。クラミジア検出の結果を検体を採取したスワブを APTIMA STD スワブ

Table 1 に示した。GC 法と TMA 法との全体一致採取セット（ホロジックジャパン株式会社）のス率は 95.8%，陽性一致率は 90.5%，陰性一致率はワブ搬送液入り保存チューブに浸して懸濁した。 98.6% で良好な相関を示した。GC 法と TMA 法とこの搬送液を検体として，TMA 法での検査をで結果が乖離した検体は合計 4 検体であった。内行 っ た。TMA 法 で の 検 査 は 株 式 会 社 ビ ー・エ

訳は，GC 法で陽性で TMA 法で陰性であったもの

ム・エルに依頼した。

が 1 検体，GC 法で陽性で TMA 法で判定保留であったものが 1 検体，GC 法で陰性で TMA 法で陽III. 結果性であったものが 2 検体であった。
のべ 96 名中 94 名でクリアビュー

性器クラミジア感染症検査の検討結果クラミジア（以下 IC-C 法）によるクラミジア検出を行った。

のべ 96 名から採取した子宮頸管スワブ 96 検体

GC 法と IC-C 法との比較を Table 2 に示した。GCを用いて，GC 法と TMA 法によるクラミジアおよ法と IC-C 法との全体一致率は 85.1%，陽性一致率

Table 1. Comparison of GENECUBE（GC）and TMA on the C. trachomatis tests

Table 2. Comparison of GENECUBE and lateral ﬂow on the C. trachomatis tests

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69―4295（ 75 ）は 100.0%，陰性一致率は 83.9% となった。全体一IC-C 法で陰性であった 14 検体のうち，2 検体は致率および陰性一致率が低率であるのは，94 検体

GC 法で陰性であり，残り 12 検体は GC 法で陽性

中 14 検体が GC 法陽性で IC-C 法陰性であったたであった。

めであると考えている。また，TMA 法と IC-C 法との全体一致率は 84.0%，陽性一致率は 100.0%， 淋菌感染症検査の検討結果
陰性一致率は 82.8% となった。こちらも全体一致クラミジア検出と同じ子宮頸管スワブ 96 検体率および陰性一致率が低率であるのは，94 検体中を用いて行った淋菌検出の結果を Table 3 に示し

14 検体が TMA 法陽性で IC-C 法陰性であり，かつた。GC 法と TMA 法との全体一致率，陰性一致率

1 検体が TMA 法判定保留で IC-C 法陰性であったはいずれも 100.0% で非常に良好な相関を示した。

ためである。GC 法で陽性で IC-C 法で陰性であっ淋菌陽性例は本検討の期間中 1 例しか得られなた 14 検体のうち，1 検体は TMA 法で陰性，1 検体かった。その 1 例は GC 法と TMA 法の両方で陽性は TMA 法 で 判 定 保 留 で あ り，残 り 12 検 体 はを示し，結果が一致した。

TMA 法で陽性であった。また，TMA 法で陽性でのべ 96 名中 92 名でクリアビューゴノレア

Table 3. Comparison of GENECUBE and TMA on the N. gonorrhoeae tests

Table 4. Comparison of GENECUBE and lateral ﬂow on the N. gonorrhoeae tests

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Aug. 2016（以下 IC-G 法）による淋菌検出を行った。GC 法と数であったと考えられる。また，共に唯一陽性

IC-G 法 と の 比 較 を Table 4 に 示 し た。 GC 法 とだった患者は IC-G 法で陰性だったことから，クIC-G 法との全体一致率および陰性一致率は共にラミジア検出と同じく淋菌検出でも免疫クロマト98.9% となった。GC 法と IC-G 法とで共に陽性とグラフィー法は核酸増幅法と比べて感度が低いこなった検体はなかったため，陽性一致率は算出でとが改めて示唆された。

きなかった。また，TMA 法と IC-G 法との全体一GENECUBE は，核酸抽出工程と核酸増幅・検致率および陰性一致率も共に 98.9% であり，陽性出工程の双方が自動的に行われ，かつ核酸抽出と一致率は算出できなかった。GC 法で陽性，IC-G核酸増幅・検出の両方が合わせて約 1 時間で完了

法で陰性となった 1 検体は TMA 法で陽性であっする 3,4）。現在提供されている他のクラミジアおた。

よび淋菌の遺伝子検査法はいずれも検査に数時間を要するため，GENECUBE を利用することで，IV. 考察既存の検査法と同様の感度，特異度で，かつ既存の検査法よりも高速にクラミジア感染症および淋クラミジア検出では核酸増幅法と IC-C 法との菌感染症の検査を行うことが可能である。

比較で，核酸増幅法は陽性で IC-C 法は陰性だっ感染症の迅速診断法として遺伝子検査を活用すた検体数が，両者で陽性だった検体数の 2 倍とな（b）る利点には，（a）早期診断が可能となること，り，IC-C 法では検出できないクラミジア感染症が抗菌薬投与後であっても診断できる可能性が高ま少なくないことが示唆された。免疫クロマトグラること，（c）培養不可能か困難な病原体が検出でフィー法は核酸増幅法と比較して感度が低いこと

きること，（d）発育が遅い病原体の検出が早期に，本検討の結果はその報告可能となること，（e）きわめて病原性の高い微生を裏付けるものであると考えられる。性器クラミ物が迅速に診断できること，（f ）薬剤耐性遺伝子ジア感染症の検査法の一つである TMA 法の添付の検出ができること，（g）病原性に関与する遺伝文書には，発光強度が陰性判定のカットオフより子や毒素遺伝子の検出ができること，（h）至適培高く，陽性判定のカットオフより低い場合に判定養法などが明らかでない新興病原微生物の迅速診は知られていたが2,5）

保 留 と 判 定 さ れ る 旨 の 記 載 が あ る こ と か ら， 断ができることなどがあげられる。今回検討した

TMA 法の判定保留とは，検査対象菌の遺伝子を自動遺伝子解析装置「GENECUBE」を用いたク増幅し検出したが，検出した遺伝子増幅産物の量ラミジア・トラコマティスおよび淋菌の迅速検査が十分ではなかった状態であると考えられた。今は，マルチプレックス PCR 法を用いたものである

回の子宮頸管スワブを用いた検討の結果，GC 法が，前述した条件の（a）から（e）を満たしていはクラミジア検出と淋菌検出の双方で TMA 法とる。マルチプレックス PCR 法を用いた迅速診断に高い一致率を示した。クラミジア検出においてはおいての欠点には，プライマーのアニーリング温全体一致率が 95.8% となった。

度や反応液組成の濃度調整など至適反応条件の淋菌検出では GC 法と TMA 法は全検体での検設定が複雑となることやシングル反応と比較し査結果が一致した。本検討では陽性例数が少ないて検出感度が低下する傾向にあることなどがあため，感度についてはさらなる検証を行うことがげられるが，今回検討した自動遺伝子解析装置

望 ま し い と 考 え ら れ る が，特 異 度 に つ い て は 「GENECUBE」を用いたクラミジア・トラコマ

TMA 法と同等であることを示すには十分な検討

ティスおよび淋菌の迅速検査キットではそれらのAug. 2016

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

69―4297（ 77 ）問題も解決されていると判断され，装置が全自動薬品（株），富山化学工業（株），第一三共（株），であるだけではなく，臨床的に現在使用されていファイザー（株），MSD（株），アステラス製薬

る遺伝子診断と同等の有用な診断ツールであると （株），Meiji Seika ファルマ（株），ミヤリサン製薬（株）から講演料を得ている。三鴨廣繁は，大日本考えられる。

住友製薬（株），大正富山医薬品（株），第一三共

V. 結語（株），ファイザー（株），MSD（株），富山化学工業（株），武田薬品工業（株），富士フィルムファーGENECUBE を用いたクラミジア感染症および淋菌感染症検査は，従来の核酸増幅法による検査マ（株），Meiji Seika ファルマ（株）から研究費を得ている。と同等の結果が得られた。GENECUBE は約 1 時間で核酸抽出，核酸増幅，増幅産物の検出が可能であるため，従来よりも短時間での検査が可能になり，クラミジアおよび淋菌感染症の迅速な診断や治療に貢献することが期待される。
利益相反
本研究は，東洋紡株式会社と愛知医科大学との間で締結した共同研究契約に基づいて実施した。
宮崎成美，山岸由佳，和泉孝治，末松寛之には申告すべき利益相反はない。
川嶋洋介は東洋紡株式会社の社員である。
三鴨廣繁は，大日本住友製薬（株），大正富山医文献1）小野寺昭一：近年のわが国における性感染症の動向。モダンメディア 58: 210〜218, 2012
2）性感染症 診断・治療ガイドライン 2011。日
本性感染症学会誌 22（1）Suppl.: 52〜64, 20113）曽 家 義 博：全 自 動 遺 伝 子 解 析 装 置「GENECUBE®」を用いた遺伝子検出法の開発。生物試料分析 36: 310〜315, 2013
4）HIDA, Y., et al.: Rapid detection of theMycobacterium tuberculosis complex by use ofquenching probe PCR （geneCube）. J. Clin.
Microbiol. 50: 3604〜3608, 20125）福地邦彦：クラミジアトラコマチス抗原・抗体。Medicina 47: 408〜410, 2010

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Aug. 2016〈RESEARCH REPORT〉

Evaluation of rapid measurement ofChlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae byusing automatic gene analyzer “GENECUBE”
NARIMI MIYAZAKI1），YUKA YAMAGISHI1,2），KOJI IZUMI3），YOSUKE KAWASHIMA4），HIROYUKI SUEMATSU1）and HIROSHIGE MIKAMO1,2）
1）

Department of Infection Control and Prevention,
Aichi Medical University
2）
Department of Clinical Infectious Diseases,
Aichi Medical University
3）
Izumi Ladiesʼ Clinic
4）
TOYOBO CO., LTD.

Nucleic acid amplification tests（NAATs）are considered as one of critical diagnostic
methods on Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections due to their highsensitivity and accuracy. However, conventional NAATs required 2–6 hours to complete themeasurements including extraction, ampliﬁcation, and detection of the target nucleic acids. To
reduce the time, we evaluated the clinical signiﬁcance of the rapid NAAT using GENECUBE（TOYOBO CO., LTD.）which can complete the measurement within 1 hour. We compared theperformance of GENECUBE with those of TMA method（APTIMA™ Combo2 chlamydia/gonorrhoeae, Hologic Japan, Inc.）and lateral ﬂow immunochromatographic assay（Clearview
Chlamydia, Clearview gonorrhoeae, Alere Medical Co., Ltd.）by detecting specimens from 96
cervical swabs. The overall agreement results between GENECUBE and TMA were 95.8% and100% for C. trachomatis and N. gonorrhoeae, respectively. The results suggested thatGENECUBE showed equivalent sensitivity and speciﬁcity of TMA. Indeed, more than half of thepositive samples in NAATs were measured as negative in the lateral ﬂow. The lateral ﬂow is
known as a rapid assay, however the results revealed its poor sensitivity. We think rapid NAATs
using GENECUBE on C. trachomatis and N. gonorrhoeae can be one of the methods, which
realize rapid tests with high sensitivity and accuracy.