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通性嫌気性細菌を利用した廃棄物処理と水素生産の検討
伊藤 武志＊・中島田 豊＊＊・仙波 光太郎＊＊・松井 知彰＊＊・西尾 尚道＊＊

The production of hydrogen from waste
by facultative anaerobes
Takeshi Ito＊, Yutaka Nakashimada＊＊, Koichiro Senba＊＊, Tomoaki Matsui＊＊ and Naomichi Nishio＊＊
Abstract
H2 and ethanol production from glycerol-containing wastes discharged after a manufacturing process
for biodiesel fuel (biodiesel wastes) using Enterobacter aerogenes HU-101 was evaluated. The biodiesel
wastes should be diluted with a synthetic medium to increase the rate of glycerol utilization and theaddition of yeast extract and tryptone to the synthetic medium accelerated the production of H 2 andethanol. The yields of H2 and ethanol decreased with an increase in the concentrations of biodiesel wastes
and commercially available glycerol (pure glycerol). Furthermore, the rates of H2 and ethanol production
from biodiesel wastes were much lower than those at the same concentration of pure glycerol, partially due
to a high salt content in the wastes. In continuous culture with a packed-bed reactor using selfimmobilized cells, the maximum rate of H 2 production from pure glycerol was 80 mmol/l/h yielding
ethanol at 0.8 mol/mol-glycerol, while that from biodiesel wastes was only 30 mmol/l/h. However, using
porous ceramics as a support material to fix cells in the reactor, the maximum H2 production rate frombiodiesel wastes reached 63 mmol/l/h.

１．はじめに
現在のディーゼル車の排気ガス中にはSOx、NOx、浮遊粒子状物質（Suspended particulate matter, SPM）等が含まれ、大気汚染の問題が深刻化している。SOxやNOxは酸性雨や光化学スモッグの原因となり、SPMは呼吸器疾患や肺がんの原因になると懸念されている。一方、わが国で発生する廃食用油の総量は年間50万トンと言われており、その有効な処理法の開発が必要である。
これら二つの問題を同時に解決する方法として、クリーンエネルギーであるバイオディーゼル燃料生産の開発がある。バイオディーゼル燃料は軽油代替エネルギーとして車、船、自家発電用燃料など様々な用途が期待されている １）。バイオディーゼル燃料（BDF）はパーム油、ナタネ油、廃油などの混合物とメタノールを反応させてできるメチルエステルで、排気ガス中にSOxはほとんど排出されず、SPMの排出量も従来のディーゼル燃料と比べて1/3に抑えられる。バイオディーゼル燃料生産には
現在、化学触媒法が利用されているが、この方法ではグリセロールを含む廃液が副産物として生成され、その処理が問題となっている。

＊総合教育科＊＊広島大学大学院

近年、グリセロールを基質とした微生物による様々な化合物の発酵が報告されているが、特にポリエステルの成分である１，３-プロパンジオール発酵が注目されている２）。グリセロールからの１，３-プロパンジオール生成はKlebsiella pneumoniae３）, Citrobacter freundii４）,
Clostridium butyricum５）, Enterobacter agglomerans６）
等の微生物によって行われている。しかし、H2はクリーンエネルギーとして期待され、エタノールはガソリンの添加剤として用いられていることから、グリセロールからのH2およびエタノール生産は魅力的な方法である。
H2生産菌であるE. aerogenesは表１にみられるように、グリセロールを基質としたとき他の基質と比べて、H 2生成が非常に高いということが確認されている ７）。
本菌はグリセロールを基質とした場合、主にH2、エタノール、1，3-プロパンジオール生成し、酢酸、乳酸、コハク酸生成は僅かである。そこで本研究では、E.
aerogenes を用いてグリセロールを主成分としたバイオディーゼル廃液を基質とし、H2およびエタノール生成のための培地検討を行った。また、充填床式リアクターを用いた連続培養でのH2生産も検討した。

平成18年９月30日受理
先端物質科学研究科

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弓削商船高等専門学校 紀要 第29号（平成19年）

表１ Enterobacter aerogenesによる様々な炭素源からの水素、エタノール収率

２．実験方法２．１ 培養方法
使用菌株は、広島大学大学院先端物質科学研究科代謝変換制御学研究室でメタン発酵汚泥より単離されたEnterobacter aerogenes HU 101を使用した。
前培養は15%グリセロールで冷凍保存（−80℃）した保存株を５mlの複合培地または最小培地に４%（v/v）接種し、37℃、120rpmで好気的に一晩振盪培養した。嫌気培養の際、各培地を100℃、20minボイルした後、氷中にて急冷しながらN2ガスを吹き込み、脱気を行った８）。
なお、滅菌する際、培地中にグリセロール、リン酸塩、マグネシウム塩が同時に存在すると、培地が褐変するため、それぞれ別々に調整し、滅菌後（18min、121℃）、シリンジで、嫌気的に混合した。前培養液を125ml容バ
イアル瓶中の50mlの培地に４％接種し、37℃で振盪培養した９）。

図１

充填床式リアクターによる連続培養

２．４ 分析方法
H2およびCO2はガスタイトシリンジを用いてサンプルを引き取り、ガスクロマトグラフィーで分析した。
エタノール、酢酸、乳酸、コハク酸、1，3-プロパンジオール、2，3-ブタンジオールはサンプルを遠心分離後、上清を適度に希釈した後、液体クロマトグラフィーで分析した。
グリセロール濃度はF-キット グリセロール（RocheDiagnostics K. K., Tokyo, Japan）を用いて測定した。
３．実験結果および考察

２．２ 使用培地
本研究で用いたバイオディーゼル廃液は広島県大朝町で回収されたものを使用し、グリセロール413g/lを含む。
また、25％のメタノールおよび８％の灰分を含んでおり、全TOCは540g/lであった。
本研究で用いた合成培地にはリン酸二水素カリウム
7.0g/l、リン酸水素二カリウム5.5g/l、硫酸アンモニウム
1.0g/l、硫酸マグネシウム七水和物0.25g/l、塩化カルシ
ウム二水和物0.021g/l、モリブテン酸ナトリウム二水和物0.12g/l、ニコチン酸2.0mg/l、セレン酸ナトリウム0.172mg/l、塩化ニッケル0.02mg/lおよび微量元素が含まれる。複合培地は0.5〜５g/lの酵母エキスとトリプトンを実験に応じて各濃度で合成培地に加えた。
２．３ 連続培養
連続培養は図１示す充填床式リアクター（培地容量60ml、φ2.7×17cm height）を使用した。培養は嫌気条件下で37℃でpHコントロールおよび攪拌なしで行われた。

３．１ バイオディーゼル廃液における最適培地の検討
E. aerogenes HU101によるバイオディーゼル廃液を基質としたH2およびエタノール発酵はコスト面または発酵後の処理を考えた場合、できるだけ添加物を加えない方が望ましい。そこで、最初にバイオディーゼル廃液の培
養は脱イオン水希釈液を培地として希釈しただけで検討を行った。バイオディーゼル廃液を10g/l（80mM）グリセロール濃度になるように希釈した時、48時間の培養でも完全にグリセロールを消費せず、菌の生育もほとんど見られなかった。この結果より、バイオディーゼル廃液の成分だけでは栄養が不足している、もしくはバイオディーゼル廃液に阻害物質が含まれていることが示唆された。
そこで、栄養不足の検討を行うため、合成培地を用いて、バイオディーゼル廃液を希釈し培養を行った。硫酸アンモニウムおよび硫酸マグネシウム濃度を変えて、12時間培養した結果を表２、３に示す。水のみの培養ではほとんどグリセロールが消費されなかったのに対して、合成培地では12時間の培養において最大で約70ｍMのグ通性嫌気性細菌を利用した廃棄物処理と水素生産の検討（伊藤・中島田・仙波・松井・西尾）

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リセロールを消費することができた。また、硫酸アンモニウム濃度1.0g/l、硫酸マグネシウム濃度で0.25g/lにおいてグリセロール消費量および水素生産量が最大であった。今後、この濃度を用いて実験を行った。

表２ 完全合成培地における硫酸アンモニウムの最適濃度検討

表３ 完全合成培地における硫酸マグネシウムの最適濃度検討

次に酵母エキスとトリプトンを加えた複合培地を使用することで、H2およびエタノール生成速度が促進した。
（図２）12時間後のグリセロール消費速度は0.5g/lの酵母エキスとトリプトンの添加でさえ、合成培地と比べ大きく促進し、酵母エキスとトリプトンを５g/l添加することでグルコースを12時間で完全に消費することができた。これら結果からE. aerogenes HU101の生育にはアミノ酸やビタミンなど複合培地に含まれる栄養が必要であることが示唆された。
３．２ バイオディーゼル廃液濃度の効果
なるべくランニングコストを安く、リアクターサイズを小さくするには、可能な限りバイオディーゼル廃液の濃度が高いほうが望ましい。そこで、グリセロール濃度を1.7, 3.3, 10, 25g/lにそれぞれ調製し、５g/lの酵母エキスとトリプトンを添加した複合培地で、回分培養を行った（表４）。グリセロールを基質とした場合、理論上1.0mol/molのH2生成が最大である。しかし、グリセロール
濃度1.7g/lの培養において、1.12mol/molのH2を生成した。
これはバイオディーゼル廃液に含まれる未知の炭素源がH2生成に使われたためだと考えられる。また、グリセロール濃度が高くなるにつれて、H2、エタノール､酢酸生成が減少し､乳酸生成が増加した。さらに、グリセロー
ル濃度25g/lの時､48ｈの培養ですら､グリセロールを完全に消費できなかった。
グリセロール濃度のみの効果を検討するため、市販されているグリセロール（純グリセロール）を用いて、同様にグリセロール濃度を調製し、回分培養を行った（表図２

複合培地での回分培養。
○：トリプトン、酵母エキスなし■：トリプトン、酵母エキス共に0.5ｇ/ｌ△：トリプトン、酵母エキス共に1.0ｇ/ｌ●：トリプトン、酵母エキス共に2.5ｇ/ｌ■：トリプトン、酵母エキス共に5.0ｇ/ｌ５）。その結果、純グリセロール濃度５g/l, 10g/lでは６時間でグリセロールは消費され、25g/lでも12時間で消費した。グリセロール濃度５g/lの培養において､H2およびエタノールは１mol/mol-glycerol生成したが、グリセロール濃度が増加するにしたがい、H2、エタノールの生成は減少した。このことより､高濃度のグリセロールはH2､エタノールの収率を減少させることが示唆された。
3．3 E. aerogenes によるH2生産における不純物濃度の効果
表４と表５を比較すると、グリセロール濃度10g/l、25g/lにおいて、バイオディーゼル廃液のグリセロール消費速度が純グリセロールのグリセロール消費に比べ著しく低いことがわかる。また、バイオディーゼルはアルカリ触媒法によって作られる。アルカリ触媒法は主に水酸化ナトリウム、メトキシドナトリウム、水酸化カリウ
ムが使われており、エステル化後、中和が行われるため、バイオディーゼル廃液はNaClなどの塩を大量に含んでいる。これら中和を伴う塩の存在が生育に阻害を与えている可能性があるため、H2およびエタノール生産における

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表４

弓削商船高等専門学校 紀要 第29号（平成19年）

バイオディーゼル廃液のグリセロール濃度の検討※複合培地を使用。

表５

市販のグリセロールを用いた濃度検討

NaCl濃度の効果を検討した（図３）。基質に純グリセロールを用いた場合、１%のNaCl添加はNaClを含まない培地と比べてH2､エタノール生成に変化は見られなかった。
一方、バイオディーゼルを基質として用いた場合、１%のNaClでH2､エタノール生成が減少した。バイオディー
ゼルをグリセロール濃度10g/lに希釈したときの灰分濃度は約0.2%である。図３で灰分をすべてNaClと考えた場
合、バイオディーゼル廃液に１%のNaClを加えた時の実質のNaCl濃度は1.2%である。純グリセロールのH2､エタノール生成は塩濃度を増やすと減少しているため、バイオディーゼル廃液に含まれる高い塩濃度は生産物形成を阻害している因子の１つかもしれない。しかし、バイオディーゼル廃液のグリセロール濃度10g/l、25g/lに含まれる灰分濃度はそれぞれ、0.2%、0.5%であるので、純グリセロールはNaCl濃度１%まで水素を生産していることを考慮すると、バイオディーゼルに灰分以外の阻害物質が含まれている可能性が考えられる。
また、今回使用したバイオディーゼル廃液には25%のメタノールが含まれている。そこで、本培養において、メタノールの効果を検討した。その結果、純グリセロー
ル濃度10ｇ/lに３%メタノールを添加した培養において、全く阻害がなかった。今回、著しくグリセロール消費が減少したバイオディーゼル廃液をグリセロール濃度25g/lに希釈したときのメタノール濃度は約1.5%である。
このことは、今回の培養において、メタノールは阻害の一因ではないことが確認された。

図３ H2およびエタノール生産におけるNaCl濃度の効果○：純グリセロールにおける水素生産量●：廃液における水素生産量□：純グリセロールにおけるエタノール生産量■：廃液におけるエタノール生産量

3．4 充填床式リアクター（packed-bed reactor）を用いた連続培養
バイオディーゼル廃液からのエタノール生産速度､H2生産速度を測定するため､固定化菌体を用いて連続培養を行った。自己固定化菌体や様々な担体を用いた固定化菌体システムは水素発酵の連続培養に適合していることが近年報告されている10-12）。
図４に自己固定化菌体を用いた連続培養の結果を示す。110ｍMのグリセロール（純グリセロール、バイオディーゼル廃液）、複合培地（5.0g/l酵母エキス、5.0g/lトリプトン）の培養条件で行った。純グリセロールを基質とした場合、最大H2生産速度は80mmol/l/hでグリセロールは1.3ｈ-1まで完全に消費した（図４−A）。また、希釈率が高くなると1,3-プロパンジオール生成が増加したが､エタノール収率は0.9mol/mol-glycerolを維持した。
一方､バイオディーゼル廃液を用いた場合、純グリセロールと比較して菌体の凝集性が悪かった。希釈率0.8ｈ-1
において最大H2生産速度は30mmol/l/hであった。そこ
で担体に発泡練石（サイズ4-14ｍm、空隙率81％、孔長径128μm）13）を､菌体をより多く付着するために用いた。
その結果、希釈率1.2ｈ-1、最大H2生産速度63mmol/l/hまでH2生産が改善された（図５）。純グリセロールと比較してH2生産速度は低いが、発泡練石を用いることでバイオディーゼル廃液の連続培養が可能であった。
4．まとめ
近年､地球温暖化防止のために二酸化炭素放出の国別総量規制の交際的合意がなされたことにより､石油などの化石燃料に代わる循環型エネルギーの利用が急務となっている。特にH2は燃料電池の開発に伴い、次世代通性嫌気性細菌を利用した廃棄物処理と水素生産の検討（伊藤・中島田・仙波・松井・西尾）

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図４ 自己固定化菌体を用いた連続培養●：水素生産速度、○：グリセロール、□：エタノール△：1,3-プロパンジオール、▲：ギ酸

図５

発泡練石を用いた連続培養●：水素生産速度、○：グリセロール、□：エタノール、△：1,3-プロパンジオール、▲：ギ酸

クリーンエネルギーとして注目されている。H2はこれまで､各種のH2生産法が検討されているが､その中で微生物を利用したH 2生産の研究が盛んに行われている。
また、近年ナタネ油等からバイオディーゼルを精製する際、廃油も同時に生成され近年その処理が問題になっている。そこで本研究では、廃油の主成分であるグリセロールを基質としたE. aerogenes HU101の培養条件及びH2生産の最適化を検討し、本菌を使った環境廃棄物からの発酵H2生産の実用化を目指した。回分培養でグリセロール濃度の検討をおこなった結果、グリセロール濃度が高くなると副生成物である乳酸、酢酸、1,3−プロパンジオールの生成量が増加しH2収率が低くなった。合成培地で（NH4）2SO4、MgSO4、の最適濃度を検討したところ、廃液中のグリセロール濃度10g/lに対しそれぞれ、1.0g/l、0.25g/lだった。同様にNaCl濃度の検討も行ったが、0.5%の添加でさえH2生産が減少することから、廃液中の塩濃度が高いことが考察される。
また、この合成培地は複合培地に比べ、H2生産、グリセロール消費が低く、さらなる条件検討が必要である。
次に複合培地を用いグリセロール濃度10g/lで自己固定化菌体を用いた固定相リアクターによる連続培養を行った。その結果、基質が純グリセロールの時、希釈率1.3ｈ-1、最大H2生産速度80mmol/l/hまでH2生産が可能だったのに対し、基質がグリセロール廃液の時、希釈136

弓削商船高等専門学校 紀要 第29号（平成19年）

率0.9ｈ-1、最大H2生産速度30mmol/l/hと低いH2生産であった。そこで担体に発砲練石を用いたところ、希釈率1.2ｈ-1、最大H2生産速度63mmol/l/hまでH2生産が改善された。今後、さらなる最適条件の検討、高H2生産株の構築および解析を行なうことで、将来的実用可能な高H2生産系の構築が期待される。
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