GGGenome & CRISPRdirect update:
ゲノム編集の実験を支援するためのウェブツール
内藤雄樹

ライフサイエンス統合データベースセンター (DBCLS)

227 times cited
2018 年 9 月末時点
Google Scholar

CRISPR-Cas9 法の実験を支援するためのウェブツールとして、我々が公開している高速塩基配列検索 GGGenome

Naito Y, Hino K, Bono H, Ui-Tei K (2015) CRISPRdirect:
software for designing CRISPR/Cas guide RNA with
reduced off-target sites. Bioinformatics 31, 1120-1123.

https://crispr.dbcls.jp/(https://GGGenome.dbcls.jp/) およびガイド RNA 設計ソフトウェア CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp/) のアップデートを紹介する。GGGenome は、20 塩基程度の短い配列をゲノム全体から高速に検索することができるツールであり、ミスマッチや挿入・欠失を含む配列であっても検索漏れがなく、ガイド RNA の特異性を確認するために役立つ。
CRISPRdirect は、GGGenome による検索機能を利用することにより、特異性の高いガイド RNA を簡便に設計できるツCRISPR direct — Rational design of CRISPR/Cas target.

ールである。昨年以降のアップデートでは、各種の実験動植物や作物などのゲノムを追加したほか、GGGenome API か

Helpら取得できる情報を拡充するなど、利用者の要望をもとに改良を行なった。GGGenome および CRISPRdirect は商用利用
Enter an accession number (e.g. NM_001187) or genome location (e.g. hg19:chr7:900000-901000): ?

を含め誰でも無償で自由に利用でき、他のデータベースやソフトウェアとも容易に連携できる。

retrieve sequenceor Paste a nucleotide sequence: ?
>sample sequenceggctgccaag aacctgcagg aggcagaaga atggtacaaa tccaagtttg ctgacctctc
tgaggctgcc aaccggaaca atgacgccct gcgccaggca aagcaggagt ccactgagta
ccggagacag gtgcagtccc tcacctgtga agtggatgcc cttaaaggaa ccaatgagtc
cctggaacgc cagatgcgtg aaatggaaga gaactttgcc gttgaagctg ctaactacca
agacactatt ggccgcctgc aggatgagat tcagaatatg aaggaggaaa tggctcgtca
ccttcgtgaa taccaagacc tgctcaatgt taagatggcc cttgacattg agattgccac
ctacaggaag ctgctggaag gcgaggagag caggatttct ctgcctcttc caaacttttc
ctccctgaac ctgagggaaa ctaatctgga ttcactccct ctggttgata cccactcaaa
aaggacactt ctgattaaga cggttgaaac tagagatgga caggttatca acgaaacttc
tcagcatcac gatgaccttg aataaaaatt gcacacactc agtgcagcaa tatattacca● 表計算ソフトで GGGenome 検索

https://GGGenome.dbcls.jp/
ゲノムをミスマッチおよび挿入・欠失を許容して検索

or upload sequence file: ?

または塩基配列を入力

no file selected

Choose File(e.g. NGG, NRG) ?

PAM sequence requirement: NGG

Human genome, GRCh37/hg19 (Feb, 2009)

Specificity check:

生物種を選択する
350 種以上に対応

Accession 番号やゲノムの座標を入力?

design生物種を選択する
350 種以上に対応

Results: ?

ヒット件数

Sequence name: sample sequence
PAM sequence: NGG
Specificity check: Human genome, GRCh37/hg19 (Feb, 2009)
Time: 201X-XX-XX XX:XX:XX

Highlighted target positions (e.g., 45 - 67) indicate sequences that are highly specific and have fewer
off-target hits.
Target sequences with '0' in '20mer+PAM' (in number of target sites column) are shown in gray.
Such sequences may possibly span over exon-exon junctions, so avoid using these.
Target sequences with TTTTs are also shown in gray. Avoid TTTTs in gRNA vectors with pol III promoter.
show highly specific target only

ミスマッチおよび挿入・欠失を赤く表示

Show

1. URL 作成sbjct
AC-TGCTG-GACAGAGTACAC
CCTTGCTGTGCCAGAGTACAC
ACTTG-TGTGACAGAG-ACAC
ACTTGCTGTG-CA-AGTACAC
ACTTGCTGTGACAGAGAACAA
ACTTGCTGTGACAGAGTTCATACTTGCTGTGA-ACAGTACAC
CCTTGCTCTGACAGAGTACACGTGTGCACTGTCACAGCAAGTGTGTACT-TGTCAAAGCAAGTGTGTAGTCTGTCACAGAAAGTGTGTAACTCTCTCACAGCAAGTGTGTACTCTGTCACA-CAA-T
GTGTACTCTGTCACA-CAA-T

align|| ||||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| |||||||||| |||||||||||||| || ||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| ||||||||||||| | ||||||||||||| ||||||||||||||||| | ||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||| |||||||||| |||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||| ||| |||||||||||||||| ||| |e ditmatch mis del ins==I=====I============
19002X=========X==========
19200=====I==========I====
19002==========I==I=======
19002================X===X
19200=================X==X
19200===========I=X=======
19
101
X======X=============
19
200====X=X==============
19
200=======I=====X=======
19101=====X==========X====
19200====D=====X===========20
1
10===============I===I=
1900
2===============I===I=
19002+

1 - 23

http://GGGenome.dbcls.jp/hg19/TCYTTGACAR.bed

テキスト出力も充実

number of target sites ?

sequence information

20mer+ PAM (total 23mer)

GC% of
20mer

Tm of
20mer

TTTT in
20mer

restriction
sites

+

ggctgccaagaacctgcagg agg

65.00 %

80.27 °C

-PstI

1 [detail]19 [detail]4120 [detail]6 - 28-cca agaacctgcaggaggcagaa

55.00 %

76.78 °C

-PstI

1 [detail]24 [detail]3084 [detail]12 - 34+

acctgcaggaggcagaagaa tgg

55.00 %

76.78 °C-

PstI

1 [detail] 3159 [detail]7292 [detail]13 - 35-

cct gcaggaggcagaagaatggt

55.00 %

75.77 °C-

PstI

1 [detail]55 [detail]4120 [detail]42 - 64-

cca agtttgctgacctctctgag

50.00 %

71.86 °C-

0 [detail]9 [detail]1578 [detail]43 - 65+

caagtttgctgacctctctg agg

50.00 %

70.46 °C-

0 [detail]33 [detail]4279 [detail]54 - 76+

acctctctgaggctgccaac cgg

60.00 %

78.13 °C-

1 [detail]1 [detail]214 [detail]55 - 77-

cct ctctgaggctgccaaccgga

65.00 %

80.02 °C-

1 [detail]28 [detail]4279 [detail]69 - 91-

cca accggaacaatgacgccctg

60.00 %

77.46 °C-

BsaHI

1 [detail]1 [detail]129 [detail]73 - 95-

ccg gaacaatgacgccctgcgcc

65.00 %

79.11 °C-

BsaHI

1 [detail]1 [detail]169 [detail]76 - 98+

gaacaatgacgccctgcgcc agg

65.00 %

79.11 °C-

BsaHI

1 [detail]3 [detail]665 [detail]85 - 107+

cgccctgcgccaggcaaagc agg

75.00 %

85.51 °C-

1 [detail]25 [detail]2946 [detail]87 - 109-

ccc tgcgccaggcaaagcaggag

65.00 %

81.00 °C-[detail][detail][detail]

88 - 110-cct gcgccaggcaaagcaggagt

制限酵素サイト65.00% 81.54 °C-[detail][detail][detail]

94 - 116-

cca ggcaaagcaggagtccactg

60.00 %

76.89 °C-[detail][detail][detail]

102 - 124+

agcaggagtccactgagtac cgg

55.00 %

75.25 °C-

1 [detail]2 [detail]150 [detail]109 - 131+

gtccactgagtaccggagac agg

60.00 %

75.72 °C-

1 [detail]4 [detail]409 [detail]111 - 133-cca ctgagtaccggagacaggtg

60.00 %

75.67 °C-

1 [detail]2 [detail]1173 [detail]121 - 143-

ccg gagacaggtgcagtccctca

60.00 %

76.98 °C-

1 [detail]2 [detail]409 [detail]133 - 155+

gcagtccctcacctgtgaag tgg

60.00 %

76.19 °C-

1 [detail]52 [detail]3242 [detail]● ゲノムブラウザによる可視化
緑：おすすめのガイド RNA

Search:target sequence

start
- end

3. コピペstr startend
query+204895405 204895423 ACTTGCTGTGACAGAGTACAC+64817429
64817449 ACTTGCTGTGACAGAGTACAC+147681558 147681576 ACTTGCTGTGACAGAGTACAC+159168436 159168454 ACTTGCTGTGACAGAGTACAC+165637589 165637609 ACTTGCTGTGACAGAGTACAC+75742257
75742277 ACTTGCTGTGACAGAGTACAC+9429995694299975 ACTTGCTGTGACAGAGTACAC+118247368 118247388 ACTTGCTGTGACAGAGTACAC
201564762 201564782 GTGTACTCTGTCACAGCAAGT
216298157 216298176 GTGTACTCTGTCACAGCAAGT
21684333
21684353 GTGTACTCTGTCACAGCAAGT
134132434 134132455 GTGT-ACTCTGTCACAGCAAGT
91376591
91376609 GTGTACTCTGTCACAGCAAGT
52141405214158 GTGTACTCTGTCACAGCAAGT

entries

position

2. ImportData() 関数

namechr2chr3
chr3
chr3
chr6
chr7
chr11
chr11
chr1
chr2chr7
chr8
chrX
chrY

20Showing 1 to 20 of 73 entriesFirst● GGGenome の特徴

20mer
+PAM

12mer
+PAM

8mer
+PAM

13550
オフターゲット検索
11665
by1332173

Previous

1234Next

Last

Graphical View:● ゲノムを高速に検索可能

102030405060708090
100
ggctgccaagaacctgcaggaggcagaagaatggtacaaatccaagtttgctgacctctctgaggctgccaaccggaacaatgacgccctgcgccaggca

350 種の生物種（うち植物は 80 種）に対応

>

>

>
<

1. add custom tracks● 短い塩基配列の検索に強い><><<<110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
aagcaggagtccactgagtaccggagacaggtgcagtccctcacctgtgaagtggatgcccttaaaggaaccaatgagtccctggaacgccagatgcgtg>

2. URL をコピペ

ミスマッチや挿入欠失が多くても見落としのない検索>

<>

>

<<<>

<>

<>

<<<<<<210
220
230
240
250
260
270280290
300
aaatggaagagaactttgccgttgaagctgctaactaccaagacactattggccgcctgcaggatgagattcagaatatgaaggaggaaatggctcgtca● 他のツールから呼び出すことができる（REST API）><<Google スプレッドシートの ImportData() 関数

>

<>

<>

>

<<<310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
ccttcgtgaataccaagacctgctcaatgttaagatggcccttgacattgagattgccacctacaggaagctgctggaaggcgaggagagcaggatttct>

Excel 2013 以降の WEBSERVICE() 関数

>
<<>

<>

>

>

<<<<410
420
430
440
450
460
470
480490500ctgcctcttccaaacttttcctccctgaacctgagggaaactaatctggattcactccctctggttgatacccactcaaaaaggacacttctgattaaga

R、Ruby、Galaxy、ゲノムブラウザ・・・>>><● 無償で自由に利用可能>
<<>
<<>

<>

<<<<510
520
530
540
550
560
570
580
590
600
cggttgaaactagagatggacaggttatcaacgaaacttctcagcatcacgatgaccttgaataaaaattgcacacactcagtgcagcaatatattacca

商用利用であっても無償><

利用記録は当センターにおいて機密扱い

Data Export:● 応用例：核酸医薬品のオフターゲット検索

Tab-delimited text: Open in new window | Download
JSON format: Open in new window | Download● GGGenome REST API

ある核酸医薬品のFDA承認審査資料（2013）http[s]://GGGenome.dbcls.jp/db/k/[str]/seq[.format][.download]db : データベース ; hg19, mm10, TAIR10, refseq 等
k : 許容するミスマッチおよび挿入・欠失の数（未指定の場合 0 ）str : 特定の方向のみ検索 ; +, –（オプション）
seq : 塩基配列
format : データベース ; html, txt, csv, bed, gff, json（オプション）
download : ファイルとしてダウンロード（オプション）

Clinical Pharmacology Biopharmaceutics Review(s)Kynamro (mipomersen sodium) Injection, FDA

3.1.3 Reviewer’s analysis
An updated search (report was dated 2003) was conducted on mipomersen’s sequence(GCCTCAGTCTGCTTCGCACC) using the NIH BLAST tool (BLASTN 2.2.27;
RefSeq RNA). The BLAST search identified the APOB mRNA as the only location
100% complementary to mipomersen, consistent with the applicant’s findings.
Additional sequences identified in the BLAST search are listed in the table below; thenext highest alignment had 6 mismatches.

Examples:

http://GGGenome.dbcls.jp/TTCATTGACAACATT

Tab-delimited text can be copy-pasted into spreadsheet softwares (e.g. Excel) or text editors.
# [ CRISPRdirect | 201X-XX-XX XX:XX:XX ]# sequence_name:sample sequence# pam_sequence: NGG# specificity_check:
Human genome, GRCh37/hg19 (Feb, 2009)# start end
strand sequence
GCTmTTTT#123+
ggctgccaagaacctgcaggagg 65.00
80.27
628
ccaagaacctgcaggaggcagaa 55.00
76.78
1234+
acctgcaggaggcagaagaatgg 55.00
76.78
1335
cctgcaggaggcagaagaatggt 55.00
75.77
4264
ccaagtttgctgacctctctgag 50.00
71.86
4365+
caagtttgctgacctctctgagg 50.00
70.46
5476+
acctctctgaggctgccaaccgg 60.00
78.13
55
77
cctctctgaggctgccaaccgga 65.00
80.02
6991
ccaaccggaacaatgacgccctg 60.00
77.467395
ccggaacaatgacgccctgcgcc 65.00
79.11
7698+
gaacaatgacgccctgcgccagg 65.00
79.11

Excel にコピペ可能
hit_20mer

hit_12mer

0000000000019243159
55
9331281131111001111141203084
7292
4120
15784279
2144279129169665「最も類似性の高いオフターゲットサイト」

ヒトゲノム hg19 から TTCATTGACAACATT を検索

http://GGGenome.dbcls.jp/mm/2/TTCATTGACAACATTGCGT.txt
マウスゲノム mm10 からミスマッチ、挿入、欠失を 2 塩基まで許容
して TTCATTGACAACATTGCGT を検索しタブ区切りテキストで出力

GCCTCAGTCTGCTTCGCACC||||||||||||||DCK GCCTCAGTCTGCTTTCTCTA

核酸医薬品

14/20 マッチFDAが実施したBLAST検索では、最も類似性の高いオフターゲットサイトは6ミスマッチ（実際には14/14マッチ）● PAM に隣接し、特異性の高い 20 塩基を選択

見落としの例
核酸医薬品● TogoGenome からの配列検索

http://togogenome.org/

GCCTCAGTCTGCTTCGCACC|||||||||||||||
MCM3AP-AS1 CGAGCAGTCTGCTTCGCACT
15/20 マッチ

ノンコーディングRNAの一種

ゲノムのほかの領域とは塩基配列が一致せず、標的とする

2014にRefSeqに登録部位とだけ完全一致する配列を選択。特に PAM 近傍の seed

データベースに載っていない配列（12 塩基または 8 塩基）の特異性を重視

は当然ヒットしない
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC|||| ||||| |||||| ||OCRL GCCTTAGTCTTCTTCGCTCC● 大量設計にも対応

核酸医薬品

17/20 マッチGCCTCAGTCTGCTTCGCACC|| ||||||||||| ||||
MYT1L TCCGCAGTCTGCTTCTCACC

核酸医薬品

17/20 マッチ
核酸医薬品

GCCTCAGTCTGCTTCGCACC||||||| ||||| |||||
KCNE2 GCCTCAGCCTGCTGGGCACC● CRISPRdirect の特徴

ヘルプページにてスクリプトを公開
見落としの例● 既存のガイド RNA のオフターゲット検索

BLASTで見落とす検索パターン
途中にミスマッチが複数ある
短い配列は、BLASTでヒットしないことがある

Powered by● 多くの生物種に対応
350 種（うち植物は 80 種）● 無償で自由に利用可能

検索もれのないソフトウェアを使用する必要がある

商用利用であっても無償利用記録は当センターにおいて機密扱い

17/20 マッチ● 核酸医薬品のオフターゲット検索には BLAST 検索は適さないsiRNA（19〜21 塩基を検索）、CRISPR（〜20+3 塩基を検索）● GGGenome など検索もれのないソフトウェアを使う必要がある

Licensed under CC-BY 4.0 ©2018 Yuki Naito (Database Center for Life Science)