総説

FBXL21によるCRYの安定化とマウス行動リズム制御
平野有沙✉
東京大学大学院理学系研究科生物化学専攻

はじめに最初に、私が学部生のときからお世話になっている日本時間生物学会の学会誌に研究の紹介記事を載せていただけることに深く感謝申し上げます。
「今年Cell誌に掲載された論文の要約を」という話ではありましたが、それだけでは味気ないので、できるだけ時系列に沿いながらこの研究成果がCellに受理されるまでの裏話も交えてざっくばらんに書かせていただきます。詳しい日本語の紹介レビューはイン
ターネット上で公開されている新着論文レビュー（http://ﬁrst.lifesciencedb.jp/）に載せているので、あわせてご覧いただければ幸いです。
FBXL3とFBXL21は概日時計の発振に必須である
私は東大深田研に配属されてからずっと時計タン

図１．Fbxl3/Fbxl21 ノックアウトマウスの輪回し行動
リズム
Fbxl3 ノックアウトマウスは27.7時間のフリーラン周期を示した。Fbxl3/Fbxl21 ダブルノックアウトマウス
では、Fbxl3 ノックアウトマウスの長周期性が大きく緩和されていたが、一部の個体では行動リズムが消失した。

パク質の翻訳後修飾について研究を行ってきた。研究を開始した頃、F-box型E3リガーゼFBXL3による周期を示し、点変異マウスより著しくシビアな表現

CRYの分解制御が概日時計の周期調節に重要な役型を呈した（図１）。一方、Fbxl21ノックアウトマ割を果たしていることが報告された［１−３］。こウスにおいては、活動量のプロファイルに異常が観れらの研究成果は、３つのグループからサイエンス察されたものの、フリーラン周期とLDサイクルへとセルに同時掲載されたことも世界的に注目を浴びの同調性には大きな影響が見られなかった。当初た。 そ こ で、 注 目 し て い たCRYの リ ン 酸 化 とは、Fbxl21は何もやっていないのかとがっかりした

FBXL3によるユビキチン化との連関を探るべく、が、意外なことにFbxl3/Fbxl21ダブルノックアウ

Fbxl3ノックアウトマウスを中山敬一教授（九大・トマウスではFbxl3ノックアウトによる長周期性が生医研）より分与していただいたのがプロジェクト

大きく緩和されていた。自分のジェノタイピングのの始まりである。

ミスを疑って何回もジェノタイピングをやり直した

まずは、FBXL3点変異マウスの表現型がFBXL3が、どうもちゃんとしたダブルノックアウトマウスの機能欠損によるものなのかを確かめる必要があっらしい。解析数を増やすにつれ、ダブルノックアウた。さらに、ほ乳類にはFBXL3と極めて似た相同

トマウスは周期が25.6時間に戻るだけではなく、

タ ン パ ク 質FBXL21が あ り（［ ４］FBXL3bと 呼 ばDDにしてから数週間経つと行動リズムが消失するれることもある)、FBXL21による相補がある可能性

個 体 が 現 れ る こ と が 明 ら か に な っ た。 つ ま り、も考えられたためFbxl21ノックアウトマウスも分FBXL3とFBXL21は概日時計の発振を安定に保つ与していただき、マウスの輪回し行動を解析した。

働きがあることを見出した。

Fbxl3ノックアウトマウスは27.7時間のフリーラン✉sahirano@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
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Vo l . 19 , No . 1（ 2 0 1 3 ）図２．FBXL21によるCRY1安定化と細胞内局在
A．培養細胞にCRY1-LucとともにFBXL3またはFBXL21を発現させた。タンパク質合成阻害剤（シクロヘキシミド）を投与して生物発光を計測し、CRY1-Lucの減衰曲線から半減期を算出した。FBXL3によってCRY1の分解が促進される一方、FBXL21によってCRY1は安定化する。
B．細胞免疫染色法によりFlag-FBXL3とFlag-FBXL21の局在を解析した。FBXL3は核に局在するが、FBXL21は細胞質に多く存在する。

FBXL21はCRYをユビキチン化して安定化するな海を満喫してバカンス気分に浸っていたが、状況FBXL21はCRY1と 相 互 作 用 す る と い う 報 告 がは一変した。急遽、教授とのディスカッションが始あったため［５］、FBXL21がCRYを基質として時まり、論文を同時投稿できるように交渉することに計の調節を行っている可能性を検証した。まず、ユ決まった。かくして、相手が論文の投稿を少し待つビキチン化アッセイを行い、FBXL21の過剰発現にことを承諾してくれたため、全身全霊を傾けて論文よりCRY1のユビキチン化レベルが上昇することを作製に打ち込むこととなった。このとき、マウスの示した。FBXL3はCRYの分解を促進するため、培行動データと核となる分子データしか手元になかっ養細胞にFBXL3とCRYを共発現させるとCRYの発た上に、一文字も論文が書けていなかった。帰国後現量は劇的に減少する［１］。しかし、FBXL21とすぐに予定されていたラボ旅行の集合場所でも深田CRY1を共発現させるとCRY1のタンパク質量が増教授と論文についてディスカッションしていたほど加し、FBXL3とFBXL21の両方を発現させると両者である。のCRY1への効果が相殺された。この発現量の変化が、CRY1の安定性の変化によるものかどうかを調FBXL21による細胞リズムと分子リズムへの影響べるために分解アッセイを行ったところ、やはりFBXL21が概日リズムにおいてどのような役割をFBXL21によってCRY1は安定化していた（図２）。

果たすかをさらに詳細に調べるため、FBXL21によ一般的にユビキチン化されたタンパク質はプロテアる細胞リズムと分子リズムへの影響を解析した。

ソームの分解ターゲットとなる例が圧倒的に多い

Fbxl21のノックダウンによって細胞の概日周期はが、FBXL21はCRYをユビキチン化して安定化する短くなり、細胞リズム周期に対してFbxl21はFbxl3という予想外の事実が判明した。とは逆向きの働きをすることが明らかとなった。さらに、Fbxl21ノックアウトマウスから樹立した繊維SRBRでの出会い芽細胞において、Cry1とCry2のmRNA量が増加す

2012年 ５ 月 に フ ロ リ ダ で 開 催 さ れ たSRBRる一方、CRY1とCRY2のタンパク質量は著しく減

meetingに お い て、FBXL21の 点 変 異 マ ウ ス

少していた。培養細胞を用いた過剰発現系で得られPasttime（FBXL3点変異マウスはOvertimeである）た結果と一致して、FBXL21の欠損によってCRYタの 発 表 を 聴 い た。 発 表 し て い た の は、Joseph S.

ンパク質が不安定化していた。FBXL21の阻害によTakahashiラボ（米国テキサス大学）のDr. Yooさる細胞時計への影響は、Fbxl3の点変異や機能阻害んで、世界中で使用されているPER2::Lucマウスのに よ る 表 現 型 と は 大 き く 異 な っ て お り、 ２ つ の生みの親である。それまでサンデスティンのきれいF-boxタンパク質が極めてよく似た配列を持ちなが時間生物学

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ら、CRYと概日時計に対してまったく異なる働きをしているという興味深い結果を得た。
CRYのユビキチン化部位の同定
運良く別プロジェクトで行っていたCRYの質量分析（東大・医科研 尾山大明准教授との共同研究）により、CRY1には３カ所の、またCRY2では５カ所のユビキチン化部位を同定していた。そこ
で、CRY1とCRY2の間で保存されているリジン残基をアルギニン残基に置換し、FBXL3とFBXL21による分解制御または安定化制御を受けるかを調べた。その結果、K107R変異型CRY1ではFBXL21による安定化制御を受けなくなることを見出した。この こ と か ら、CRY1のK107（CRY2で はK125） がFBXL21による安定化に重要であること、FBXL21とFBXL3は互いに（少なくとも一つは）異なるリジン残基をユビキチン化してCRYの安定性を制御

図３．FBXL21とFBXL3によるCRYタンパク質ダイナ
ミクスの形成細胞質においてFBXL21は分解機構と拮抗することによりCRYを安定化して蓄積を助ける。一方、夜の時間帯には核内で転写抑制の働きを終えたCRYはFBXL3による分解制御を受けて消失し、次の一日のサイクルが始まる。このような２つのF-boxタンパク質による逆向きの拮抗作用によって、CRYタンパク質のダイナミクスが生み出される。

すると考えられた。Cellに投稿できるほどのデータをとるには到底一人ではできない実験量であったた

な る 結 合 様 式 の ユ ビ キ チ ン 鎖 をCRYに 付 加 し、め、当時、私の下について卒業研究を行っていた中CRYを安定化することが判明した。

川智貴氏も動員して論文投稿ぎりぎりまで実験データを取り続けた。研究を初めてたった２ヶ月だった

FBXL21は細胞質、FBXL3は核に局在するが、CRYのユビキチン化部位の変異体の作製と、FBXL21とFBXL3のN末端領域は互いにアミノ酸FBXL3のNLS変異体の解析（後述）は彼が行って配列の保存性が低く、FBXL3のN末端近くには核移くれたものである。

行シグナル様の配列があることを見出した。そこ
で、細胞免疫染色法によりFBXL21とFBXL3の細FBXL3はK48結 合 型 ユ ビ キ チ ン 鎖 を 伸 長 し、胞内局在を解析したところ、予想通りFBXL3は核FBXL21は異なるユビキチン鎖を伸長するに限定的に局在し［２］、NLS配列に変異を入れた

CRYがどのようなメカニズムでFBXL21による安変異型FBXL3では主に細胞質に存在した。一方、定化制御を受けるのか明らかにするため、CRYにFBXL21は細胞質に多く存在することがわかった

付加されたユビキチン鎖の結合様式の同定を試み（図２）。これらの結果から、FBXL21とFBXL3によた。実際、CRY精製物の質量分析では、K48結合型るCRYタンパク質量のダイナミクス形成モデルをユビキチンの他にK63, K11結合型ユビキチンが同提唱した（図３）。つまり昼の時間帯においてCRY定されており、CRYに付加されたユビキチン鎖のタ ン パ ク 質 が 増 加 し て い く タ イ ミ ン グ で は、結合様式には様々な種類があると考えられた。ユビFBXL21は分解機構と拮抗することによりCRYを安キチン分子内の７つのリジン残基のうち、K48結合定化して蓄積を助ける。一方、夜の時間帯には核内型ユビキチン鎖はプロテアソーム系分解の標的になで転写抑制の働きを終えたCRYはFBXL3による分ることが知られている。そこで、K48以外のリジン解制御を受けて消失し、次の一日のサイクルが始ま残基を全てアルギニンに置換した変異ユビキチンる。 こ の よ う なCRYタ ン パ ク 質 の ダ イ ナ ミ ク ス（K48-Ub）を用いたアッセイを行った。野生型のユは、概日時計の安定な振動の維持に必要不可欠であビ キ チ ン（WT-Ub） を 用 い た 場 合 は、FBXL3とると結論づけた。

FBXL21が同程度にCRY1のユビキチン化を促進したのに対して、K48-Ubを用いるとFBXL3に比べておわりにFBXL21によるCRY1のユビキチン化促進が大きく本研究成果と、順遺伝学を用いてFBXL21を同定抑制された。つまり、FBXL3がK48結合型ユビキチしたJoseph S. Takahashi（米国テキサス大学）ら

ン鎖を伸長するのに対して、FBXL21はそれとは異のグループの成果は、Cellに同時掲載された［６］。

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Vo l . 19 , No . 1（ 2 0 1 3 ）ラストを描いてもらうのも良いかもしれない。今回の表紙については、インターネット上でいろいろ話題を呼んだようで、どこに行っても「あの表紙の人ですよね？」と言われる。これをきっかけに論文の方も多くの方に読んでいただければ嬉しい限りである。
文献
１）Siepka, S.M., Yoo, S.H., Park, J., Song, W.,Kumar, V., Hu, Y., Lee, C., and Takahashi, J.S.
図４．
左：Cellの表紙に採用されたデザイン。右：原案（広瀬健太郎氏デザイン）。FBXL3とFBXL21による概日時計の制御を、２人の女性が時計の針を互いに逆方向から押し合っている様子になぞらえてデザインした。右の絵の女性の着物の柄は、それぞれCRYの分解（散る桜）と安定化（満開の桜）を表している。

Circadian mutant Overtime reveals F-box
protein FBXL3 regulation of cryptochrome
and period gene expression. Cell 129: 10111023.（2007）２）Godinho, S.I., Maywood, E.S., Shaw, L., Tucci,V., Barnard, A.R., Busino, L., Pagano, M.,

彼らは、細胞質でFBXL21はCRYの分解を促進し、Kendall, R., Quwailid, M.M., Romero, M.R.,

核ではFBXL3と競合して安定化するモデルを立て

O'Neill, J., Chesham, J.E., Brooker, D., Lalanne,ている。ただ、細胞全体を見ればFBXL21はCRYをZ., Hastings, M.H., and Nolan, P.M. The after-

安定化していて、私共の実験結果と食い違いはな

hours mutant reveals a role for Fbxl3 inい。実験系が異なるためそこから得られる結論やモ

determining mammalian circadian period.

デルが異なることもあるだろうし、これから明らか

Science 316: 897-900.（2007）にしていくべき課題も多い。FBXL21によってCRY

３）Busino, L., Bassermann, F., Maiolica, A., Lee, C.,に付加されたユビキチン鎖の同定と、修飾された

Nolan, P.M., Godinho, S.I., Draetta, G.F., andCRYが 実 際 に 細 胞 内 の ど こ に、 い つ 存 在 す る のPagano, M. SCFFbxl3 controls the oscillation

か。 そ し てFBXL21とFBXL3に よ るCRYの 安 定 化

of the circadian clock by directing theと分解のスウィッチングがどう行われるのか。想像degradation of cryptochrome proteins. Science以上に複雑な時計タンパク質修飾のネットワークの理解が今後の課題になる。

316: 900-904.（2007）
４）Jin, J., Cardozo, T., Lovering, R.C., Elledge, S.J.,

さて、Cellへの掲載が決まり、雑誌の表紙を狙う

Pagano, M., and Harper, J.W. Systematicことになった。その頃、自身の学位審査も重なって

analysis and nomenclature of mammalian

いたのもあり、適当なラフスケッチを原案にしてプF-box proteins. Genes Dev. 18: 2573-2580.

ロのイラストレーターに頼めば良いかと考えていた（2004）

ところ、ラボの後輩（広瀬健太郎氏）が「是非、表５）Dardente, H., Mendoza, J., Fustin, J.M., Challet,紙に使ってほしい」とイラストを持ってきた（なんE., and Hazlerigg, D.G. Implication of theてタイミングの悪い…もうイラストレーターに依頼

F-Box Protein FBXL21 in circadian

してしまったのに…）。結局、広瀬氏がデザインしpacemaker function in mammals. PLoS One 3:

たものをもとにイラストレーターに描いてもらい、e3530.（2008）

広瀬氏がデザインしたものも一緒にCellの編集部に

６）Yoo, S.-H., Mohawk, J.A., Siepka, S.M., Shan, Y.,

送った。結果は、派手な見た目が編集者の目を引い

Huh S.K., Hong, H.-K., Kornblum, I., Lumar, V.,

たのかイラストレーターが描いたものが採用された

Koike, N., Xu, M., et al. Competing E3 ubiquitinが、日本人にはより和風でシックな原案も人気があligase govern circadian periodicity byるようである（図４）。余談だが、広瀬氏は日本時

degradation of CRY in nucleus and cytoplasm.

間生物学会のロゴマークの考案者でもある。皆さん

Cell 152: 1091-1105（2013）の研究成果が良いジャーナルに受理された際にはイ

時間生物学

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