Vol. 15, No. 15 (2015)

日本蛋白質科学会ニュースレター

第 15 回日本蛋白質科学会年会 若手奨励賞優秀賞受賞者による解説
平成 27 年 9 月 3 日
本年度第 15 回年会の若手奨励賞優秀賞受賞者の 3 名にごる、天然状態での構造を見たい”と思う研究者のモチベーシ

自身の研究などについて自由に書いていただきました。

ョンは 10 年前とちっとも変わってはいないと思う。蛋白質

日本蛋白質科学会 理事会

科学会の若手奨励賞での発表内容である「フェムト秒 X 線レーザーを用いた光化学系 II 複合体の 1.95 Å 分解能での無フェムト秒 X 線レーザーを用いた光化学系 II 複合体の損傷結晶構造解析」は X 線自由電子レーザー施設 SACLA を1.95 Å 分解能での無損傷結晶構造解析用いて、放射線損傷の全く無い、巨大な膜タンパク質複合体

菅 倫寛（岡山大学）の結晶構造を高い分解能で決定したものである。その内容について簡単に紹介したい。

私のタンパク質研究の始
まりは大阪大学蛋白質研究はじめに所の月原冨武教授の研究室に配属希望者への説明を受

光化学系 II 複合体は 20 個のタンパク質サブユニットと多けに行った日までさかのぼ数の補欠因子から構成される 700 kDa の巨大な膜タンパク質る。以来、分子量の限界に複合体であり、その“心臓”部分である酸素発生中心においてとらわれることなくタンパは文字どおり水分子が水素原子、酸素原子、電子へと分解さ研究室にて共同研究者のみなさんとともに。光化学系 II 複合体の立体構造モデルを持っていただきました。左から中島芳樹氏、本人、沈建仁博士、秋田総理博士。

れ最終的に酸素分子が発生する。2011 年、光化学系 II 複合

月原研究室に配属された当時、研究室のメインテーマであっ分子を含む詳細な構造情報を提供し水分解反応の理解を大きたチトクロム酸化酵素の結晶構造解析においては X 線還元く進展させたが、これまで報告されていた X 線吸収微細構による活性中心への影響が問題視されており、この問題を解造を用いて決定された Mn-Mn の距離と比べると 0.1～0.2 Å

決するためにひとつの結晶から一枚の回折写真だけを測定し長くなっており、シンクロトロンの X 線を用いて決定したて、気の遠くなるような数の結晶を使用して構造解析が可能

結晶構造は放射線による損傷の影響をうけている可能性を否なデータを得ようとしていた。私の卒業研究のテーマはこれ定できなかった。とくに、Mn4CaO5 クラスターの 5 つの酸素らの回折写真の処理条件の検討で、研究室の先輩が作成した原子のうち、O5 とよばれる酸素原子はそのまわりの Mn とソフトウェアを用いて、リファレンスデータとの比較するこの結合距離がきわめて長く、このような長い結合距離が放射とで部分反射のパーシャリティーを決定し、パーシャリティ線による損傷に由来するのか、あるいは、本来の特徴を示しーから逆算して完全反射の強度を求めるというものであっているのか不明であった。この放射線損傷の問題を排除するた。

ため、我々は X 線自由電子レーザーを使用して光化学系 IIク質の世界を原子のレベルで理解することのできる結晶学に魅力を感じ、これまで研究を続けてきた。私が体の 1.9 Å 分解能での X 線結晶構造解析が成功し、酸素発生中心の正体が“ゆがんだイス型構造”の Mn4CaO5 クラスターであることがつきとめられた。この酸素発生中心の構造は水あの頃から約 10 年が経った。放射光よりも 100 兆倍の輝度を持つ光を発する X 線自由電子レーザー施設の登場は“試料が壊れる前に回折現象が起こる（Diffraction beforedestruction）”と称されるこれまでとは全く異なる原理に基づく結晶構造解析を可能とした。さらに検出器の高速化により、数十ヘルツで記録したイメージのうちから回折現象が起こったものだけを選出して、それらにモンテカルロ法的なア

図 1：X 線自由電子レーザーにより決定された天然状態の酸素発生中心の構造。Nature 517, 99 (2015) および放射光 28, 4, 177 (2015)のものを改変。
（a）電子密度マップおよび酸素発生中心の全体構造。
（b）Mn-Mn の距離。
（c）Mn-O、Mn-H2O、Ca-O、Ca-H2O の距離。
Mn を灰色、Ca を緑色、O1～O4 を水色、O5 を赤色、水分子を青色で描いた。Mn の球の上の数字は価数。

プローチを行うことで（あるいはポストリファインメントなどを行って）構造解析が可能な回折データを得るという、シリアルフェムト秒結晶構造解析法が確立しつつある。このように X 線結晶解析についてはパラダイムシフトが起きたわ
けだが、放射線損傷の無い構造を見たい、すなわち、“機能す1Vol. 15, No. 15 (2015)

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複合体の結晶の無損傷構造解析を行った。の結合がとくに弱く不安定な状態で存在していた。X 線自由電子レーザーにより得られた酸素発生中心の構造では、酸素発生中心の構造

Mn3-O5 が 2.2 Å、Mn4-O5 が 2.3 Å、Mn1-O5 が 2.7 Å、Ca-X 線自由電子レーザーにより得られた酸素発生中心の全体O5 が 2.5 Å となっており、Mn3、Mn4、Ca との結合は 0.2 Å

構造はこれまでに報告されていたシンクロトロンの X 線を短くなり、Mn1 との結合は逆に 0.1 Å 長くなっていた（図用いて得られた構造と非常によく似ていたが（図 1a）、Mn-1c）。これまでのシンクロトロンの X 線による構造解析でMn の距離および Mn-O の距離に顕著な違いがみられた。

は、長い結合距離をもつ O5 の性質は放射線損傷によるアー

Mn-Mn の距離は Mn1-Mn2 が 2.7 Å、Mn1-Mn3 が 3.2 Å、ティファクトである可能性が否定できなかったが、X 線自由Mn1-Mn4 が 5.0 Å、Mn2-Mn3 が 2.7 Å、Mn2-Mn4 が 5.2 Å、

電子レーザーによる構造解析によりこの性質が酸素発生中心

Mn3-Mn4 が 2.9 Å となっており、すべての Mn-Mn の距離がに固有のものであり、したがって、O5 が水分解反応の基質シンクロトロンの X 線による構造と比べ 0.1～0.2 Å 短くな分子として反応機構に深くかかわっていることがあらためてっていた（図 1b）。これらの距離は X 線吸収微細構造により示された。

報告されていたものともよく一致しており、X 線自由電子レ
水分解の反応機構ーザーにより放射線損傷のない構造が得られたことが支持された。

X 線自由電子レーザーを用いて決定された水分解反応の開シンクロトロンの X 線により得られた酸素発生中心の構始状態の構造にもとづき、O5 を基質分子のひとつとする水造においてもっとも特徴的な点は、O5 がほかの酸素原子と分解反応の機構を提唱した（図 2）。まず、S1 状態において比べ異常に長い結合距離をもつ点であった。シンクロトロン

は Mn1 および Mn4 が同じ+3 の価数をもち、さらに、Jahn-の X 線による構造では、O5 と Mn1、Mn3、Mn4、Ca との結Teller 効果により Mn1-O5 と Mn4-O5 は長い結合距離をも合距離は 2.4 Å から 2.7 Å であり、換言すると、O5 は周囲とつ。電子がひき抜かれ S2 状態になると Mn1 あるいは Mn4 のいずれかが+4 の価数をもつことになり、O5 は一方の Mn の正の電荷が高くなったこと、および、Jahn-Teller 軸の消失により、+4 の価数をもつ Mn の側にひき寄せられる。このとき、Mn4 の価数が+4 になれば O5 は Mn4 の側にひき寄せら
れ Mn3CaO4 のキュバンの部分は開いた構造をとり、その結果、Mn1 の側にスペースができる（O5 の右にスペースができるので右型構造とよばれる）。逆に、Mn1 の価数が+4 になれば O5 は Mn1 の側にひき寄せられキュバンの部分の閉じた左型構造になる。つづく S3 状態および S4 状態では、この開いたスペースに新しい水分子が入り O5 と O=O 結合を形成する。生成された酸素分子は排出され酸素発生中心は S0 状態にもどり、新たな水分子が O5 の位置へと取り込まれる。
S0 状態から S1 状態への遷移にともない、水分子からプロトンが抜き取られることにより O5 は OH–になり、S1 状態へもどる。これらの一連の反応機構は理論計算の結果、および、最近の電子スピン共鳴による結果とも大方で一致していた。
おわりにこの研究により、水分解反応を触媒する酸素発生中心の天然状態における構造が明らかになり、その構造にもとづき、

図 2：X 線自由電子レーザーにより解析された酸素発生中心の構造にもとづき推定された水分解反応の機構 Nature 517, 99 (2015) および放射光 28, 4, 177 (2015) のものを改変。
S3 状態および S4 状態において新たに挿入される水分子については、Mn4 および Ca のリガンドとして存在する O5 の近傍の水分子なのか、まったく別の水分子なのか、現時点では不明であるため、両方の可能性を示した。

O5 が OH–であることだけでなく、O5 を基質分子のひとつとする水分解反応の機構を提唱した。これらの知見は、水分解反応の基本原理を提供し、人工光合成を行う触媒のデザインのためのモデルテンプレートとなることが期待される。しかしながら、今回、決定されたのは水分解反応の開始状態の構2

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造であり、基質分子となるもう 1 つの水分子がどこから供給の研究の過程で、細菌が生きていくために積極的に細胞毒されるのか、O5 を中心とする反応機構が本当に機能していNO を合成している点に興味をもちました。いわば、命がけるのか、H+の放出場所はどこかなど、解明すべき点は多く残で生きるためのエネルギーを作っているわけです。そこで、っている。反応機構の全貌を解明するためには、光化学系 II

なぜこのような細菌は、自身が合成した NO によって細胞損複合体の中間状態での高分解能の構造情報が必須である。X

傷を受けることなく生育できるのだろうと考えるようにな

線自由電子レーザーの真髄は放射線損傷の無い原子構造をフり、今回の講演につながる研究がスタートしました。本稿で

ェムト秒領域という超高速で捉えることが可能となるところは、発表ではふれなかった話も交えながら、研究内容についにある。今後は X 線自由電子レーザーを用いた動的な構造て紹介します。

解析により、中間状態の構造を明らかにしていきたい。

脱窒において、NO を合成するのは、亜硝酸還元酵素 NiR

この研究は岡山大学の秋田総理博士、中島芳樹氏、清水哲で、NO を分解するのが NOR になります（図 1）。NiR によ哉博士、沈建仁博士、理化学研究所の吾郷日出夫博士、平田って合成された NO が NOR によって直ちに分解されなけれ邦生博士、上野剛博士、村上博則博士、山下恵太郎博士、山ば、NO が細胞内を拡散してしまいます。このことから、直本雅貴博士との共同研究である。この場を借りてお礼申し上

感的に NiR と NOR が相互作用して、NO の受け渡しをしてげる。

いるのでは？と考えました。NiR と NOR が相互作用するのか調べようともしたのですが、もう始めてしまえ！と思い、脱窒にみられる効率的な一酸化窒素

NiR と NOR を混合し、結晶化のスクリーニングを開始しま

分解システムの構造基した。発表ではきれいな茶色の単結晶を示しましたが、最初當舎 武彦（理研・SPring-8）のスクリーニングで得られたのは、厚みがなく、エッジも明「當舎さんって若手なの？」年

確でない結晶（のようなもの）でした。厚みがないせいで色会のホームページをみた知り合いが薄く、楽観的にみると NiR の緑色と NOR の赤色を混ぜたや、学会会場で会った何人かの知茶色っぽい色をしているけど…、と思いながら SPring-8 での人からこのような質問がありましビームタイムにのぞみました。X 線をあててみると回折点がた。蛋白質科学会における若手奨

みられ、結晶であることがわかり、分解能は 6.5 Å 程度でし励賞への応募資格は、「発表当日たが、データセットをとりました。得られた回折データを処に 40 歳未満のもの」とありま理し、NOR と NiR を用いて分子置換を行ったところ、解がす。私の誕生日は 11 月。あと、半年もしないうちに 40 歳に得られました。興奮しながら結果をみてみると、低分解能でなります。
「若手なの？」と質問された方々の目は正しく、すが、それらしい構造にみえました。すると解析を手伝ってまさに、ぎりぎりでの受賞でありました。写真は、懇親会後下さった杉本宏研究員が「NOR と NiR の鉄原子の部分に強に研究室のメンバーで飲みに行ったときのものです。若手にはみえないか…。
私は、2009 年 2 月に、理研・SPring-8 の城研究室に参加し、今回の講演の主役である膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）の研究に加わりました。NOR は、ヘム鉄と非ヘム鉄からなる活性中心において、NO の還元反応を触媒する膜タンパク質です。私は、それまでも NOR と同様に、鉄などの遷移金属を活性部位に持つタンパク質の構造・機能に関する研究に携わってきましたが、膜タンパク質を扱うのは初めてのことでした。研究室内外の方々に教えをこいながら、膜図 1：脱窒に関わるタンパク質の構造と本研究で明らかにした亜硝酸還元酵素（NiR）-一酸化窒素還元酵素複合体（NOR）の構造。脱窒では、硝酸が段階的に還元され、最終的に窒素分子に変換される。その過程で、細胞毒性の高い一酸化窒素 NO が中間生成物として生成する。本研究では、NO を生成する NiR と NO を分解するNOR が複合体を形成すること発見し、その構造を決定した。NiR とNOR が複合体を作ることで、NiR が NOR のごく近傍で NO を生成することになり、NO が細胞内を拡散する前に NOR により分解されるようにしているものと考えられる。

タンパク質の取り扱い方を学び、NOR の構造解析に関する研究を進めることができました。
NOR は、細菌が嫌気下で生きるためのエネルギーを得るために行う脱窒という過程に関わる酵素です。脱窒では、硝酸が段階的に窒素分子にまで還元され、その中間生成物として細胞毒性の高い NO が合成されます（図 1）。私は、NOR3

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いポジティブの電子密度がみえてるでしょ。これ、多分あっ

Asymmetric and cooperative recognition ofてるよ。
」と言ってくれました。よし、これはいける！と思histone post-translational modification by two

い、結晶化条件を展開することで、茶色のきれいな単結晶がantigen-binding sites of an antibody得られるようになり、分光学的にも NiR と NOR を含んだ結服部 峰充（The Univ. of Chicago）晶が得られていることが示されました。デハイドレーション

本学会は、私にとって修士課程や氷晶防止法を検討することで、最終的に分解能 3.2 Å で1 年のころから参加している特別

NiR-NOR 複合体の構造を決めることができました（図 1）。

な学会である。若手奨励賞・ポス

結晶構造解析に加えて、NOR と NiR が本当に相互作用すター賞制度が始まった 2008 年にるのか？その複合体形成の意義は？という問いに答えるため

はポスター賞を受賞し、当時の喜の実験にも着手しました。そこで、まず表面プラズモン共鳴

びはいまでも忘れない。その 7 年法を利用して、NOR と NiR の相互作用の検出を試みまし

後に若手奨励賞優秀賞を受賞できた。しかし、NiR がセンサーチップそのものと相互作用しやるとは思ってもおらず、今回の受賞は大変光栄であり、今後すく、NiR と NOR の相互作用を正確に調べることはできまの研究活動の大きな励みになる。

せんでした。等温滴定熱測定にも挑戦しましたが、試料の調私はこれまで、進化分子工学を駆使した抗体の機能改変、製が難しく、満足な結果を得ることができませんでした。困及び新規抗体の開発を行ってきた。学生時代、東北大学・熊ったなぁ、と思っていたときに、緑膿菌の研究をされている谷 泉教授の下で抗体工学を学び、博士号を取得した。その東京大学農学部の新井博之先生と知り合う機会を得ました。

後、私はシカゴ大学の小出研究室に留学し、抗体の標的抗原

城研究室の研修生が NOR の大腸菌での発現に関する発表をの中でも最も難易度が高い「タンパク質の翻訳後修飾」に特していたのを聞いた新井先生が声をかけてくれたのです。新異的に結合する抗体の作製に取り組んできた。奨励賞シンポ

井先生が構築された緑膿菌での NOR の発現系を用い、緑膿ジウムで発表した内容は現在論文投稿中であるため詳細を記

菌内で、NOR の NiR 結合部位の変異体を発現させ、緑膿菌載することはできないが、ここでは私がこれまでシカゴ大学の生育度合をみる、という実験系を考えました。もし、NiRで行ってきたヒストン翻訳後修飾に特異的な組換え抗体の作と NOR の相互作用が NO の細胞内での拡散を防ぐために重製について紹介したい。

要ならば、NOR の変異体を発現させた緑膿菌では、NO が細胞内に蓄積してしまい、生育が悪くなるはずです。実験の結エピジェネティクス分野における抗体の低特異性、低再現性

果、期待通り NOR の変異体を発現させた緑膿菌の生育が悪問題くなるという傾向がみられました。つまり、NiR-NOR の複クロマチンの基本構造となるヌクレオソームを構成するヒ合体形成は、細胞内でも起こっており、この複合体形成がストンタンパク質は、N 末端もしくは C 末端領域内の様々なNO の迅速な消去に寄与していることを示せたわけです（図箇所においてメチル化やアセチル化、リン酸化などの翻訳後1）。今後は、細胞内において、NiR と NOR の複合体形成が修飾を受ける。それら一つ一つの翻訳後修飾が DNA 配列に常に起こっているのか？離合集散しているものなのか？調べ

依存しない転写・翻訳の制御、すなわちエピジェネティクスたいと思っています。に関与し、近年では、エピジェネティクス機構の異常によ最後になりましたが、本研究に協力してくださった皆様にり、癌や疾患が引き起こされる例も報告されている。エピジは、本当に感謝しています。一緒に実験をしてくれた城研究ェネティクス分野において抗体は必須の研究試薬であり、室の皆様の協力なくしては、本研究を進めることはできませImmunostaining や Western blot、そしてクロマチン免疫沈降んでした。NiR-NOR 複合体の結晶構造が解けたのは、城研（ChIP）と次世代シーケンサーによる DNA 配列解析を組み究室研修生の寺坂瑛里奈さんの頑張りのおかげです。また、合わせた ChIP-Seq などの解析手法に用いられている。一方

東京大学農学部の新井博之先生には、緑膿菌での NOR の発で近年、抗ヒストン翻訳後修飾抗体の多くにおいて、オフタ現系を提供していただき、それまで不可能であった種々の実ーゲット、すなわち標的以外の配列や修飾基に結合するとい験ができるようになりました。この場をおかりして深く感謝った特異性の問題があることが報告された。さらに市販抗体申し上げます。のほとんどがポリクローナル抗体であり、ロット間で抗体の結合特性が異なることが、再現性の高い結果を得る上で足枷となっていた。我々は、抗ヒストン翻訳後修飾抗体の特異性を定量的に評価するため、ChIP を模倣した Peptide IP assay

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ヒストン翻訳後修飾特異的な組換え抗体の作製を開発した(1)（図 1A、1B）。これまで抗ヒストン翻訳後修飾抗体の特異性は、Western blot や Dot blot など定性的な方法で我々はこれら抗体の低特異性・低再現性の問題を根本的にのみ評価されてきたが、我々が開発した手法では、結合曲線解決するため、進化分子工学を用いた組換え抗体の作製を試から解離定数 KD を算出することで定量的に抗体の特異性及みた。組換え抗体は、遺伝子配列が同定されているベクターび親和性を評価できる利点を持つ。Peptide IP assay により市を用いて組換えタンパク質として生産されるため、それらの販抗体の結合評価を行った結果、そのほとんどが低特異性も特性は高い再現性を持ち、普遍的に利用可能な研究試薬となしくは低親和性を示し、さらにロット間での結合特性が異なる。我々はまず、ヒトの未免疫抗体ライブラリーからトリメっていた(1)（図 1C）。この抗体の特異性問題は、ヒストン翻チル化 Lys 残基に特異的な抗体を単離した(2)。さらにタンパ

訳後修飾が、抗体にとって特異的に認識することが難しい抗ク質の機能に関わるアミノ酸残基を網羅的に同定することが原の一つであるためと考えられる。すなわち、Lys 残基のモ可能であるショットガンスキャニング法により、単離した抗ノメチル化、ジメチル化、トリメチル化に見られるような修体のトリメチル化 Lys 結合に重要なアミノ酸残基を同定し飾基間の高い類似性や、修飾箇所付近の高い配列相同性（図た。我々は、その情報を元にライブラリーを設計し、ファー1A）、さらに翻訳後修飾を受ける領域の柔軟性に起因する結ジ提示法を用いてスクリーニングを行った結果、ヒストン

合エントロピーロスにより、高い特異性と親和性を持つ抗体

H3 のトリメチル化した Lys9（H3K9me3）及び Lys4を取得することが難しいためであると考えられる。
(1) Nishikori, S. Hattori, T. et al., J. Mol .Biol., 424, 391-399, 2012

（H3K4me3）それぞれについて、高特異性、高親和性を示す抗体の取得に成功した(2)（図 1D）。これらの抗体は、ChIPや Western blot などの解析手法において、ロットに関わらず高い再現性で機能し、エピジェネティクス分野に貢献しうる研究試薬の開発に成功した。我々は、これらの抗体について特許を出願し、企業との連携により商品化にも至っている。
これらヒストン翻訳後修飾特異的な組換え抗体は、その普遍的な結合特性を生かすことで、基礎研究に限らず、エピジェネティクスを標的とした医薬や診断薬開発にも応用可能であると考えられる。
(2) Hattori, T. et al., Nat. Methods, 10, 992-995, 2013

図 1：Peptide IP assay による抗ヒストン翻訳後修飾抗体の結合評価(A) Peptide IP assay に使用したヒストンペプチドのアミノ酸配列。翻訳後修飾を受ける Lys 残基を赤枠で示す。その Lys 残基を中心として H3K9 配列と共通するアミノ酸残基を青文字で示す。
(B) Peptide IP assay の概念図。抗体をビーズに固定化後、ビオチン化ヒストンペプチドと混合し、ビーズを洗浄する。その後、蛍光標識したストレプトアビジンを加え、再度洗浄し、フローサイトメトリーにて蛍光強度を測定する。ペプチド濃度に対して蛍光強度をプロットし、解離定数 KD 値を算出する。
(C, D) Peptide IP assay による抗 H3K9me3 抗体の結合評価。同一のカタログナンバーであるが、異なるロットの市販抗体 (C) と我々が作製した組換え抗体 (D)。
(A-C) は Nishikori, S. Hattori, T. et al., J. Mol .Biol., 424, 391-399, 2012より改変。
(D) は Hattori, T. et al., Nat. Methods, 10, 992-995, 2013 より改変。

おわりに我々は、進化分子工学を駆使することで、高い分子認識を必要とする標的に対して特異的かつ高親和性を示す抗体の作製に成功した。この経験を生かし、私は今後、医薬としてはもちろん、基礎研究や生命現象の解明に役立つツールとして、また検出・診断薬としての抗体の開発を行い、基礎科学及び医療分野の発展に貢献していきたい。最後に本プロジェ
クトのグループリーダーを私に任せてくださり、叱咤激励とともに研究のアドバイスをくださったシカゴ大学・小出 昌平教授に深く感謝する。

電子メール版ニュースレター発行〒562-8686 大阪府箕面市稲 4-1-2 千里インターナショナル内 日本蛋白質科学会事務局
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編集：内山 進（大阪大学大学院工学研究科）

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