ブレファリズマの巨大化メカニズムの解明に向けて
6年C組
4年B組
4年B組
指導教諭

東野
中澤永井
櫻井友哉
春香
伸明
昭

１．要約
繊毛虫ブレファリズマは、飢餓状態になると共食いすることが知られている。この現象が起きる際の形態変化の基礎研究を行なった結果、共食いをすると、細胞サイズと大核が巨大化することが示唆された。しかし、細胞が巨大化するしくみはまだ明らかにされていない。そこで、本研究では、餌のサイズとブレファリズマの細胞サイズの変化との関連性を調べるために、ブレファリズマに大きさの異なる４種類の餌を与えて培養し、細胞サイズの変化を、日を追って観察した。その結果、ブレファリズマは大きい餌を食べると細胞サイズが大きくなるという傾向が見られた。
キーワード

ブレファリズマ、共食い、大核、DAPI 染色、銀染色

２．緒言
ブレファリズマは特定の環境下（饑餓状態）に置かれると、共食いをし、巨大化するという性質を持っている。本研究では巨大化したブレファリズマを「ジャイアントブレファリズマ」とよぶことにする。
右の図は通常サイズのブレファリズマ（左）とジャイアントブレファリズマ(右)である。バーは 200μm。
（写真右下）
これだけ大きな変化を示すジャイアントブレファリズマだが、1980 年のレナルツらの報告以降詳しい研究はなされていない。そこで、本研究では、ジャイアントブレファリズマが形成される過程を詳しく観察することにした。また、ジャイアントブレファリズマのでき方も共食いに注目して観察することにした。

３．研究目的・ジャイアントブレファリズマは、どのような細胞なのか調べる。
・細胞の巨大化がどのように起こるのかも調べる。
４・研究内容研究Ⅰ

Ⅰ－(1) 仮説
ジャイアントブレファリズマの形態は、細胞サイズに対して口径サイズが肥大化する。
Ⅰ－(2) 研究方法
①培養方法
実験材料：Blepharisma japonicum
R1072 株、R48 株
培養液：滅菌したレタスの絞り汁に、バクテリア(Enterobacter aerogenes)を増殖させたレタス培養液をエサとして用い、インキュベーターで培養する（25℃、２日間）。
②観察方法
カウント法とサイズ測定
毎日 1000μℓ ずつ３回サンプリングし、実体顕微鏡下で個体数のカウントを行う。また、光学顕微鏡を用い、デジタルカメラで細胞を撮影する。その後、パソコン画面上で長径と短径、そして口径のサイズを測定する。
大核の面積測定
ブレファリズマをカルノア液で固定し、DAPI染色を行い、蛍光顕微鏡を用いデジタルカメラで細胞を撮影する。その後、画像処理ソフト（Scion Image）で大核の面積を測定する。
繊毛列と膜板帯の測定
ブレファリズマを銀染色し、光学顕微鏡を用
いデジタルカメラで細胞を撮影し、Scion Imageで繊毛列の幅と膜板帯の幅を測定する。
（膜板帯とは、ブレファリズマの口の周りにある特殊化された繊毛であり、繊毛列とは、ブレファリズ
マの細胞表面に列を成すように並んだ繊毛である。
）
観察時には、他の菌が混ざらないよう、熱殺菌、消毒など、無菌操作を心掛けた。

Ⅰ－(3) 結果
大核の面積35012000

30010000

大核の面積(μ㎡）

短径(μm）

400

250200150100＊ ＊ ＊8000
6000
4000
2000

50R1072

R4800

ジャイアントブレファリズマ

通常型ブレファリズマ

0200400
長径(μm）

600800

図３ 大核面積の比較

図１ 長径と短径の関係
400350口径(μm）

300
250
200
150100R1072

50

R48（バーは 100μm）

0200

400
長径(μm）

600800

図４

図２ 長径と口径の関係

繊毛列

膜板帯

図５

銀染色によって染色されたブレファリズマ(左)と口部の拡大(右)繊毛列の幅の比較

膜板帯の幅の比較

14.0

繊毛列の幅(μm）

図１と図２は、サンプリングしたブレファリズマの長径、短径、口径の結果である。長径が約 300μm付近のブレファリズマが通常型ブレファリズマであり、長径が約 600μm 付近のブレファリズマがジャイ
アントブレファリズマである。図１のグラフより、ジャイアントブレファリズマの長径に対する短径の比は、通常型ブレファリズマの長径と短径の比に等しいことが分かった。また、ジャイアントブレファリズマの長径と口径の比と、通常型ブレファリズマの長径と口径の比に等しいことが分かった。
図３は、大核面積の測定結果である。通常型ブレファリズマの大核に比べ、ジャイアントブレファリズマの大核は 2.8 倍もの大きさになっていることが分かった。また、図４のように 1 本の長い大核が途中で枝分かれして大核面積を大きくしているようであった。
銀染色を行った結果、図５のようにブレファリズ
マの繊毛の基部が染色された。そして、繊毛列の幅では、通常型ブレファリズマに比べ、ジャイアントブレファリズマのほうが大きくなっていた。しかし、
膜板帯の幅は、通常型ブレファリズマとジャイアントブレファリズマでは違いがなかった（図６参照）。

ジャイアントブレファリズマ（左）と通常型ブレファリズマ（右）の蛍光顕微鏡写真

3.0

＊12.0

膜板帯の幅(μm）

010.0
8.0
6.0
4.0
2.0

2.52.01.5
1.00.50.00.0
通常型
通常型のジャイアント
ジャイアント

通常型
通常型のジャイアント
ジャイアント

図６ 繊毛列の幅の比較(左)と膜板の幅の比較(右)ていた。しかし４日目以降では、細胞サイズは小さくなったが、コントロールよりは大きい状態を保っていた。ただし、ゾウリムシ（B）では細胞サイズに大きな変化は見られなかった（図８）。

A研究Ⅱ
Ⅱ－(1) 仮説
餌のサイズが大きくなるとブレファリズマの細胞サイズも大きくなる。
Ⅱ－(2) 研究方法
① 培養方法
実験材料：Blepharisma japonicum R48 株
餌の種類：

DE

11234567

培養日数（日目）

図７ 個体数の変化

AB

CDE450.0

長径（μm）

400.0350.0300.0
250.0200.0

培養方法：４種類の餌を定常期になるまで培養し、１ml まで入る穴が３つ開いた厚いスライドガラス（ディプレッションスライドガラス）に 600μl ずつ分注する。その中に 10 匹のブレファリズマを入れて、ブレファリズマの個体数変化と細胞サイズ変化を測定する。このとき、コントロールとして SMB（ブレファリズマの生理食塩水、以下 E）を 600μl 加えたものを用意する。

01234567

培養日数（日目）

図８ 細胞サイズの変化

AB

C

34

D

3500
3000

大核の面積（μｍ2）

観察方法（カウント法とサイズ測定法）
一日ごとにディプレッションスライド一枚（３サンプル）の細胞数を実体顕微鏡でカウントする。また、サイズ測定は実験Ⅰと同様に行った。

C100

餌の名前（学名）
細胞サイズ
小型のブレファリズマ
200 ㎛（Blepharisuma sp：A）
ゾウリムシ
100 ㎛（Paramecium sp：B）
小型の繊毛虫40 ㎛（Sathrophilus sp：C）
バクテリア1㎛（Enterobacter aerogenes：D）②B100
ﾌﾞﾚﾌｧﾘｽﾞﾏの個体数（cells/ml）

ここで図１と図２を、ブレファリズマの株の違いに注目して検証してみた。すると、R1072 株よりもR48 株のほうがもともとの細胞サイズにばらつきがあり、ジャイアントブレファリズマの発生個体数も多くなっている。これは、「共食い」をしやすい株のほうがジャイアントブレファリズマになりやすいのではないかと考えられる。そこで、餌のサイズによって細胞サイズが左右されるのか調べることにした。

2500
2000
15001000500

Ⅱ－(3) 実験結果
４種類の餌を与えたそれぞれのブレファリズマは、
図７と図８のような培養日数に対する個体数変化と細胞サイズ変化を示した。個体数変化においては、ゾウリムシ以外は培養日数に対して、個体数は順調に増えていった（図７）。また、培養３日目までは、大きい餌を食べたものほど細胞サイズが大きくなっ

00

12567

観察日数（日目）

図９ 大核の面積の変化
次に、与えた餌の違いによりブレファリズマの大核の面積は図９のような変化を示した。小型のブレファリズマ（A）はバクテリアに比べて、２日目から大核の面積が大きくなっていた。また、小型の繊毛虫（C）はバクテリア（D）に比べて、１日目からほぼ大核の面積が大きくなっていた。しかし、小型ブレファリズマは５日目に、小型繊毛虫は４日目に、ほぼもとの大核の面積に戻ってしまった。一方で、ゾウリムシ（B）を餌にしたブレファリズマの大核の面積は、バクテリア（D）に比べて大きくなっておらず、返って小さくなっていた。

５．考察
通常型ブレファリズマとジャイアントブレファリズマの大核の面積の比較から、ジャイアントブレフ
ァリズマの大核は通常型のそれに比べて巨大化させていると考えられる。また、長径と短径、長径と口径の比が、通常型ブレファリズマとジャイアントブレファリズマでほぼ等しかったことから、ジャイア
ントブレファリズマは、体の一部が局所的に大きくなっているのではなく、全体的に大きくなっていると考えられる。そして、繊毛列の幅は大きくなっているのに、膜板帯の幅はほぼ変わらなかったことから、ジャイアントブレファリズマの繊毛列の数は、通常型のそれに比べて増えていない。しかし、口径が大きくなっているにも関わらず、膜板帯の幅が大きくなっていないことから、膜板帯の数が増えていると考えられる。
最も細胞サイズの小さいバクテリアを餌としていたブレファリズマと、小型繊毛虫、小型ブレファリズマを餌として食べたブレファリズマの細胞サイズの比較から、大きい餌を食べると細胞サイズもおおきくなると考えられる。そして、それらのブレファリズマは、細胞サイズが大きくなってからも個体数を増やしていることから、細胞サイズを大きく保ったまま分裂・増殖をしていると考えられる。さらに、
それらのブレファリズマの細胞サイズが大きくなったとき、大核の面積も大きくなっていることから、細胞の巨大化には大核の巨大化が関係していると考えられる。そして、細胞の増殖が弱まり、細胞サイズが小さくなってくる（元のサイズに戻る）ころに、大核の面積がもとの大きさに戻ってきたことから、大きな餌が得られなくなると大核の面積が減少し、細胞サイズも減少すると考えられる。しかし、どちらが先に生じるのか、どのようにもとの細胞サイズに戻るのか今回の実験だけでは分からない。最後に、ゾウリムシで培養したブレファリズマの細胞数はほとんど増えず、細胞サイズと大核の面積ともに、巨大化するような変化が見られなかった。また、捕食されるはずのゾウリムシの個体数は、培養日数が多くなっても、減少しているようには感じられなかった（正確なカウントは行っていない）。これらのことから、ゾウリムシはブレファリズマの餌にならなかったために、細胞サイズが大きくならず、それに伴い大核の面積も大きくならなかったと考えられる。
つまりブレファリズマの細胞サイズには餌が大きく影響していると考えられる。

６．まとめと今後の課題
今回の実験より、ジャイアントブレファリズマのできる過程は次のように予想できる。
まず、最初に、餌を捕食したブレファリズマは分裂するための準備に入る。そして、大核を倍化させ、新しい口の原基を、既存の口の下部に形成する。分裂準備の整ったブレファリズマはこの後分裂をしてもとのサイズに戻るはずである。しかし、何らかの理由で分裂できずに、口の原基が、もともとあった口と合体してしまう。その結果、大核が倍加させた、細胞サイズの大きい細胞となり、口を形成する膜板帯の数も増えてしまうのではないか。
この仮説を検証するため、大核の巨大化がどの時点で生じるものなのか、その巨大化が分裂する細胞の大核の倍化と同じ過程を経ているのかを調べる必要がある。また、今回の実験では、細胞サイズがもとのサイズに戻ると、大核の面積ももとに戻るという結果を得たが、先にどちらが減少するのかも明らかにできなかった。よって、今後はこの大核の面積と細胞サイズの関係について、より観察間隔を細かくするなどの工夫を加え、調べていきたい。
７．参考文献・サイト[1]「ブレファリズマの接合」、春本晃江・杉浦真由美、
原生動物学会誌、第 36 巻(2003)[2] http://protist.i.hosei.ac.jp/Protist_menu.html「原生生物情報サーバー」[3] http://mail2.nara-edu.ac.jp/~masaki/ 「 CallBiology Lab.」
８．謝辞
ブレファリズマの株を分けていただき、培養方法をはじめ色々と助言を戴きました、奈良女子大学理学部生物科学科細胞情報学分野 春本晃江教授、ありがとうございます。また、ご指導いただきました、
櫻井昭先生、矢野幸洋先生ありがとうございました。