★ 喫煙の生理・薬理

喫煙による酸化ストレスと動脈硬化
国友勝＊ージに取り込まれ、コレステロールを大量に蓄はじめに積した泡沫細胞を形成させる。
また酸化 LDL は、喫煙は、動脈硬化の重大な危険因子である。

内皮細胞や平滑筋細胞の機能を障害し、障害をしかし、喫煙と動脈硬化とを関係づける数多く

受けた内皮細胞や平滑筋細胞からは活性酸素がの基礎・臨床研究がなされてきたにもかかわら産生され、それによって LDL の酸化が亢進する

ず、喫煙による動脈硬化の発症機序は、未だ十という悪循環が起こる。さらに酸化 LDL は、内分に解明されていない。

皮細胞における一酸化窒素の産生を抑制するこ

最近、酸化ストレスが動脈硬化病変の形成にとによって血小板凝集を亢進し、また内皮細胞重要な役割を果たしていることが明らかにされに接着分子や走化因子を発現させ、血中の単球ている。たばこ煙にはフリーラジカルなど多種(血管壁でマクロファージ化する) を呼び寄せのオキシダントが含まれていることから、喫煙る3)。これらの変化はすべて動脈硬化形成におと動脈硬化の接点に酸化ストレスが関わっていける初期病変の事象である。一方、酸化 LDL をるのではないかと考えられる。私たちはこれま取り込んだマクロファージは、活性酸素種及びで、「喫煙－酸化ストレス－動脈硬化形成」とい炎症性メディエーターを産生・放出する。最近、う一連の過程を総合的に解明することを目的と動脈硬化の発症・進展や不安定プラーク形成にして研究を行ってきた。現在、図-1 に示す仮説

酸化ストレスによる炎症が主要な役割を持つこを提唱し、それを裏付ける研究を進めている。とが明らかにされている4)。

下記にその研究成果について最近の知見を交え喫煙による酸化ストレスの増大てまとめてみた。

たばこ煙には、活性酸素、一酸化窒素、パー酸化ストレスと動脈硬化

オキシナイトライト (ONOO-）、その他のフリー

生体内における活性酸素産生と抗酸化シスラジカルや酸化物など数多くのオキシダントがテムとのバランスが崩れ酸化に傾くことを酸化含まれていることから、それらオキシダントのストレスという。酸化ストレスは、生体成分の複合効果による酸化ストレスの増大が、動脈硬脂質、蛋白質、DNA を酸化変性させ、細胞及び化形成に促進的に働いていると考えられる。事組織を徐々に障害する。とくに血管壁 (血管内実、喫煙によって、LDL 中の過酸化脂質の上昇、皮細胞) の障害は、動脈硬化形成や循環器疾患

血管内皮細胞機能障害、血管平滑筋 Rho-kinase1)の活性化、各種酸化ストレスマーカーの上昇、の病態形成を促進する 。
低比重リポ蛋白 (LDL) の酸化によって生成

血小板凝集能の亢進など、酸化ストレスと同様する酸化 LDL は、動脈硬化の発症・進展に重要の変化が起こることが報告されている5)-7)。これな役割を演じていることを示す数多くの証拠がらのことから、喫煙によって酸化ストレスが増2)ある 。酸化 LDL は、血管内皮下のマクロファ大することは明白である。
われわれは、喫煙者と非喫煙者の血漿中酸化＊武庫川女子大学薬学部

動脈硬化発症・進展
O2-, NOONOO-など〔肺胞腔〕

LDLの酸化内皮細胞障害〔肺胞上皮粘液〕〔肺胞壁〕

たばこ煙ガス相成分

CSEの生成（ONOO-類似反応物質）

ONOOその他のたばこ煙成分

？

MPO
〈一過性〉

血 液酸 化 ストレス

肺胞上皮細胞
結合組織〔肺毛細血管〕

肺胞マクロファージ

図-1 喫煙－酸化ストレス－動脈硬化形成の関係を示す概念図
ストレスマーカーを測定し比較した。
その結果、刺激して活性酸素を放出させる必要がある。し非喫煙者に比べ喫煙者では、LDL の酸化変性がかし、活性酸素やフリーラジカルは、一般に反亢進し、過酸化脂質 (TBARS)、DNA の酸化損傷応性に富み、また特定の酵素により分解されや産物の8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)

すく、非常に不安定である。それゆえ、たばこ-及び 3-ニトロチロシン (ONOO のバイオマー

煙が直接接触する口腔や肺組織に障害が起こカー) が増加し (図-2）、逆に抗酸化物質であるったとしても、容易に血液に到達し、LDL や血ビタミン E が顕著に減少していることを報告し

管内皮細胞に影響を及ぼすまでには至らないた。ONOO- は強力な酸化作用とニトロ化作用をものと推察される。そこで、たばこ煙中の何が有することが知られていることから、上記の結酸化ストレスを増大させているかが次の課題

果は、喫煙による酸化ストレス上昇に ONOO- あとなる。

-るいは ONOO 類似反応物質が強く関わっていることを示唆している。しかも、注目すべきこと

たばこ煙水抽出液中のオキシダントは、喫煙者が 10 時間以上禁煙した後に紙巻た

横出ら9)は、たばこ煙水抽出液と反応させてばこ 1 本喫煙した場合でも、30 分後における作製したたばこ変性 LDL が、マクロファージに8-OHdG、3-ニトロチロシン及び酸化 LDL の血漿容易に取り込まれ泡沫細胞化を促進すること

中濃度が喫煙前に比べさらに顕著に増加したこを報告している。われわれは、たばこ煙からニ8)とである (図-2) 。このことは、喫煙による酸コチン及びタールを除去したガス相の水抽出化ストレスの上昇が相当速やかであることを示液 (CSE) が、LDL の酸化変性作用ばかりでなく唆している。

LDL アポ蛋白チロシン残基のニトロ化作用を持もし、たばこ煙中のオキシダントが全身の酸つことを見出し、CSE 中には ONOO- 類似反応物化ストレスを増加させるとするならば、そのオ質が存在すると推測した10)11)。なぜならば ONOO-

キシダントは、直接肺胞壁を通過して血液中には不安定で、pH 7.4 において数分以内で分解到達するか、またはマクロファージや好中球をされるのに対し、CSE 中の ONOO- 類似反応物質

酸化変性 LDLTBARS(%totalcholesterol)(% ofof totalcholesterol)(nmol/ml)(nmol/mL)

8-OHdG

3-ニトロチロシン(pmol/ml)(pmol/mg protein)(pmol/mg protein)(pmol/mL)

70****

6*

800

*

*

40060

5503406003004400200220200100301Before After
Before After
SmokerNon-smoker
Non-smoker
Smoker00Before After
After
BeforeNon-smoker
SmokerSmokerNon-smoker

BeforeAfter
Before After
Non-smoker
SmokerNonsmoker
Smoker

0Before After
After
BeforeSmokerNon-smoker
SmokerNon-smoker

図-2 喫煙者の血漿中酸化ストレスマーカー
喫煙者の喫煙前 (約 10 時間禁煙、Before) と紙巻たばこ 1 本再喫煙 30 分後 (After) の比較
は室温で長時間安定であったからである。
また、ているとすれば、CSE 中の ONOO- 類似反応物質

in vitro 実験において、チロシンと ONOO- の反が肺胞壁を通過する必要がある。すでに ONOO-応による 3-ニトロチロシン生成速度はきわめ

は、赤血球膜や血小板膜を容易に透過して細胞-て速いのに対し、CSE 中の ONOO 類似反応物質内に拡散し、水に匹敵する透過性を示すことがとの反応は徐々に進行する (反応終了まで 5報告されている14)。そこで、CSE 中の ONOO- 類似時間以上) ことから、CSE 中の ONOO- 類似反応

反応物質も膜透過性を示すのではないかと考え、物質は ONOO- とは異なる構造を有すると考えら

2 種の透過実験を ONOO- と比較して行った。透れる。次に、CSE を自然発症高脂血症 (WHHL) ウ過性は、膜または肺胞壁を透過した後チロシンサギに 1 日 1 回、長期間静脈内投与したとこ溶液と反応して生じる 3-ニトロチロシン濃度

ろ、in vitro の実験と同様に LDL の酸化変性とを測定することにより判定した。まず、ケモタニトロ化が亢進し、粥状動脈硬化巣の形成が促キセルを用いた厚さ約 50 μm の基底膜 (マトリ12)進された 。また、これらの変化は、抗酸化作ゲル) の透過実験において、ONOO- は瞬時に基用を有するビタミン E やフルバスタチンの投与

底膜を透過したのに対し、CSE 中の ONOO- 類似により抑制されることが判明した13)。これらの反応物質はゆっくりと時間をかけて (6 時間以-

ことは、CSE 中の ONOO 類似反応物質が酸化ス上) 透過することが明らかとなった。次いで、トレスを増大し、動脈硬化を進展させる可能性ラット摘出肺標本の肺内空気を除いた後、両試が高いことを示唆している。

液を肺内に注入し、肺外液への透過実験を行っ-

CSE 中の ONOO 類似反応物質の化学構造は今たところ、基底膜を用いた時とほぼ同様の結果のところ不明である。目下、高速液体クロマトが得られた15)。一方、CSE 中の ONOO- 類似反応物グラフィーを用いて分離し、HPLC/MS により構質は、in vitro の実験において、肺胞マクロフ造解析を行っている。

ァージを活性化しなかった。これらのことは、
CSE 中の ONOO- 類似反応物質はゆっくりと透過

たばこ煙水抽出液中オキシダントの膜透過性
喫煙による酸化ストレスの増大に CSE が関与しし、透過後もチロシン溶液と徐々に反応するのに対し、ONOO- の透過性及び反応性はともに急速で一過性であることを示している。

8-OHdG

3-ニトロチロシン% Change% Change% Change

800

§

§

300600

§§

*

§400

*
§200

§

§

*
§300
§

§§§
§

200

§

100

* *

§

200
§

§

§

100

*

*

*60120§000

3-クロロチロシン

60120

18000120

Time (min)Time (min)Smoking

60

Aprotinin + Smoking

1800180

Time (min)*p < 0.05 vs. Smoking, §p < 0.05 vs. value at 0 min

図-3 たばこ煙ガス相を吸入させたラットの血漿酸化ストレスマーカーの経時的変化と MPO 阻害薬
アプロチニン前処置による影響
8 本のたばこ煙 (ニコチンとタールを除去) を 30 分間隔で 2 回 (計 16 本) 曝露なり以後減衰したが、再曝露による増加は全く喫煙による酸化ストレス増大機序

みられなかった (図-3)16)。

喫煙者でも一定時間禁煙した後に再喫煙する

生体内で生じる 3-クロロチロシンは、ミエと酸化ストレスが著明に増大することを先に述

ロペルオキシダーゼ (MPO) の唯一のバイオマべたが、その増大機序を解明するため、ラットーカーである。MPO は好中球やマクロファージを用いて詳細に検討した。紙巻たばこ (フロンに存在し H2O2 と Cl- から次亜塩素酸 (HOCl) のティアライト) 8 本の煙をアスピレーターにて生成を触媒する酵素で、殺菌作用や炎症反応に吸引し、その途中にケンブリッジフィルターに密接に関与している。HOCl は蛋白チロシン残基よりニコチンとタールを除去する装置とそのガをクロル化するが、さらに NO2- と反応して NO2Clス相をラットに曝露させる装置を設けた。曝露を生成することで蛋白チロシン残基のニトロ化装置は 15 cm 立方のアクリル板製のボックスで、 とクロル化を引き起こすことができる17)。それ
その一部にガスの通路口とラットの頭部のみがゆえ、MPO の活性化は、8-OHdG、3-ニトロチロ挿入できる半円形の孔が空いている。麻酔した

シン、3-クロロチロシンの全ての生成を増加さラットの頭部のみを密着して入れ、ラット大腿せる可能性がある。本実験において、たばこ煙静脈にカニューレを挿入して経時的に採血し、ガス相の曝露によって MPO が活性化されること各種血中の酸化ストレスマーカーを測定した。

が示唆されたので、血清中の MPO 活性 (一部血その結果、8 本の紙巻たばこ煙ガス相の曝露中にも漏出する) を測定した。その結果、10 分(30 分後に再曝露、計 16 本) によって、血清後にピークとなる一過性の MPO 活性上昇が認め中の 8-OHdG、3-ニトロチロシン及び 3-クロロられた。この活性上昇は MPO 阻害薬アプロチニチロシン濃度が曝露後 5 分後から有意に増加

ン (500 U/kg、i.p.) の前処置 (たばこ煙吸入しはじめ、8-OHdG と 3-ニトロチロシンは 2 時20 分前) によって完全に抑制された。また、ア間後にピークとなり 3 時間以降まで持続した。

プロチニン前処置によって、血清中の 3-ニトロ一方、3-クロロチロシンは 30 分後にピークとチロシンの上昇は初期変化のみ抑制され、3-クロロチロシンの上昇は完全に抑制された。

去物質を発見することにより、毒性の少ないた8-OHdG の上昇は初期には抑制されず 60 分以ばこ製品の開発が期待される。

16)

降に抑制された (図-3) 。これらの結果、たばこ煙ガス相曝露の初期 (30 分まで) において

文

献1) Madamanchi NR, Vendrov A, Runge MS. Oxidative
stress and vascular disease. Arterioscler
Thromb Vasc Biol 2005; 25: 29-38.
性化され、MPO 活性が上昇することによって
2) Witztum JL, Steinberg D. The oxidative
HOCl 及び NO2Cl が生成し、血清蛋白質チロシン
modification hypothesis of atherosclerosis:残基がニトロ化及びクロル化されたと考えられ
does it hold for humans? Trends Cardiovasc
Med 2001; 11: 93-102.
る。また MPO の活性化が一過性である理由とし
3) Stocker R, Keaney JF Jr. Role of oxidativeては、酵素蛋白の酸化、ニトロ化またはクロル
modifications in atherosclerosis. Physiol
Rev 2004; 84: 1381-478.
化により自ら失活したのであろうと推察してい
4) Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation
る。さらに、ごく初期の変化の一部にはガス相
and atherosclerosis. Circulation 2002; 105:
中の ONOO- が直接肺胞壁を透過した可能性も否
1135-43.
5) Harats D, Ben-Naim M, Dabach Y, Hollander G,
定できない。たばこ煙ガス相曝露 30 分以降にStein O, Stein Y. Cigarette smoking renders
おける持続的な 3-ニトロチロシンの上昇には、LDL susceptible to peroxidative modification
おそらく持続的ニトロ化能を有する CSE 中のand enhanced metabolism by macrophages.
Atherosclerosis 1989; 79: 245-52.
ONOO 類似反応物質が関与していると考えられ
6)
Anazawa T, Dimayuga PC, Li H, Tani S,る。8-OHdG の上昇に関しては、ONOO- 及び ONOOBradfield J, Chyu KY, Kaul S, Shah PK, Cercek
B. Effect of exposure to cigarette smoke on
類似反応物質に加え MPO 以外のアプロチニンでcarotid artery intimal thickening: the role
抑制されるペルオキシダーゼが関わっているとof inducible NO synthase. Arterioscler
思われるが、詳細についてさらに追究する必要
Thromb Vasc Biol 2004; 24: 1652-8.
7)
Noma K, Goto C, Nishioka K, Hara K, Kimura M,がある。
Umemura T, Jitsuiki D, Nakagawa K, Oshima T,
In vitro の実験において、われわれは CSE（おChayama K, Yoshizumi M, Higashi Y. Smoking,
そらく ONOO- 類似反応物質）が ONOO- と同様に、endothelial function, and Rho-kinase in
humans. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;
培養内皮細胞のアポトーシスを誘導すること、
25: 2630-5.
内皮細胞とマクロファージとの接着を促進する
8) Yamaguchi Y, Haginaka J, Morimoto S, Fujioka
Y, Kunitomo M. Facilitated nitration andことを明らかにしている。したがって、CSE 中
oxidation of LDL in cigarette smokers. Eur Jの ONOO- 類似反応物質は、肺胞壁を透過した後、Clin Invest 2005; 35: 186-93.
動脈硬化発症に促進的に作用していると考えら
9) Yokode M, Kita T, Arai H, Kawai C, Narumiya
S, Fujiwara M. Cholesteryl ester accumuれる。
lation in macrophages incubated with lowdensity
lipoprotein
pretreatedwithまとめcigarette smoke extract. Proc Natl Acad Sci
USA 1988; 85: 2344-8.
喫煙した場合、たばこ煙が気道や肺胞の水分
10) Yamaguchi Y, Kagota S, Haginaka J, Kunitomoに溶解して CSE を生成する。CSE 中に存在する
M. Peroxynitrite-generating species: goodcandidate oxidants in aqueous extracts of
安定な ONOO- 類似反応物質が肺胞壁を徐々に透cigarette smoke. Jpn J Pharmacol 2000; 82:
過し血液中に到達して、LDL を徐々に酸化及び78-81.
ニトロ化して変性し、また、血管内皮細胞の機11) Yamaguchi Y, Kagota S, Haginaka J, Kunitomo
M. Participation of peroxynitrite in
能を障害し、DNA を酸化損傷することで動脈硬oxidative modification of LDL by aqueous化の発症・進展を促進すると考えられる (図-1)。
extracts of cigarette smoke. FEBS Lett 2002;
今後は、たばこ煙中の ONOO- 類似反応物質の化
512: 218-22.
12)
Yamaguchi
Y, Matsuno S, Kagota S, Haginaka J,
学構造を決定し、このオキシダントの抗酸化消は、一時的にマクロファージまたは好中球が活Kunitomo M. Oxidants in cigarette smoke
extract modify low-density lipoprotein in
the plasma and facilitate atherogenesis intheaortaofWatanabe
heritable
hyperlipidemic rabbits. Atherosclerosis2001; 156: 109-17.
13) Yamaguchi Y, Matsuno S, Kagota S, Haginaka J,
KunitomoM.
Peroxynitrite-mediatedoxidative modification of low-density
lipoprotein by aqueous extract of cigarettesmoke and the preventive effect offluvastatin. Atherosclerosis 2004; 172:259-65.
14) Lufrano M, Balazy M. Interactions ofperoxynitrite and other nitrating substanceswith human platelets: the role of glutathione
and peroxynitrite permeability. Biochem
Pharmacol 2003; 65: 515-23.
15) Yamaguchi Y, Nasu F, Harada A, Kunitomo M.
Oxidants in gas-phase of cigarette smokeraise systemic oxidative stress through thelung alveolar wall. J Pharmacol Sci, inpress.
16) 国友勝、山口優 他. リポ蛋白及び血管壁を酸化変性させるたばこ煙成分の同定ならびにその機構の解明．平成 17 年度喫煙科学研究財団研究年報 2006; 958-63.
17) Gaut JP, Byun J, Tran HD, Lauber WM, Carroll
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Myeloperoxidase produces nitrating oxidants
in vivo. J Clin Invest 2002; 109: 1311-9.