原子衝突学会誌「しょうとつ」
2019 年 9 月 17 日発行
第 16 巻第 5 号

しょうとつ
原

子

衝

突

学

会

誌

Journal of Atomic Collision Research

Vol.16 Issue5
2019

解説

ホタル生物発光関連分子の電子状態に関する理論研究
樋山みやび

原子衝突学会｜www.atomiccollision.jp

原子衝突学会賛助会員（五十音順）

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第 16 巻 第 5 号

目

次

解説
ホタル生物発光関連分子の電子状態に関する理論研究

樋山みやび

… 75

第 40 回秋の学校
開催事務局

… 87

2019 年度国際会議発表奨励賞について

顕彰委員会委員長… 87「しょうとつ」原稿募集

編集委員会事務局… 87

原子衝突若手の会第 40 回秋の学校開催のお知らせ

ユーザー名とパスワード

… 88

74

解

説

ホタル生物発光関連分子の電子状態に関する理論的研究
樋山みやび
群馬大学大学院環境創生部門 〒376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1
miyabi@gunma-u.ac.jp
令和元年 8 月 29 日原稿受付

初夏になると日本のあちこちでホタルを見ることができる．ホタルの発光は，タンパク質酵素内での化学反応により起こる現象であることが知られているが，発光機構については未だ謎の部分も多い．この発光反応の解明のためには，基質や発光体など，発光反応に重要な役割を果たす分子そのものの情報を得ることが必須である．私たちはこれまで，ホタル生物発光の基質であるルシフェリンと発光体である
オキシルシフェリンの分光的な性質を理論的に調べてきた．本解説では，これまで行ってきた理論研究
により実験スペクトルがどこまで解釈できるようになったかについて紹介する．

1．序論

ゼタンパク質中で酸化反応を起こし発光が起き

生物発光は生物内で起こる化学反応により発る．この反応は「ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応」と呼ばれている [2]．

光する現象であり，バクテリア，藻，キノコ，魚，イ
カ，エビ，昆虫等で観測されている．その多くは

図 2 に，ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応の詳基質であるルシフェリンがタンパク質酵素中で化細を示す．この反応は二段階で進むことが知ら

学反応を起こすことにより発光する．図１に示す

れている．まず，ルシフェリンはアデノシン三リン

ように，生物によって異なるルシフェリンが生物発酸（ATP）と結合し，Luciferyl-AMP 中間体を生成

光に使われている．このため，反応過程も生物のする．次に，この中間体が酸素と結合し，二つ目種類に依存する [1]．

の中間体（Dioxsetanone 中間体）を経由して CO2，

中でもホタル生物発光は，pH やタンパク質のアデノシン一リン酸（AMP）および励起状態のオ変異体など環境条件の違いで異なる発光色にな

キシルシフェリンになる．ルシフェラーゼそのもの

ることや，反応に関与する物質は生体にとって害は反応の前後で変化せず，反応の触媒として働が少ないことから，環境，医療，バイオテクノロジ

く．ホタル生物発光ではルシフェラーゼが化学エー分野で広く利用されている．ホタル生物発光

ネルギーを光エネルギーに変換している，とも言の反応過程では，基質であるホタルルシフェリン

える．
この反応はルシフェラーゼや ATP を使うことか（以下，単にルシフェリンと呼ぶ）がルシフェラー

ら，生体内のルシフェラーゼを検出することにより，ルシフェラーゼをつけた薬剤やルシフェラーゼを含む細胞の動態を画像で調べることのできる
in vivo 分子イメージングに用いられる．また，ル
シフェリン１分子と ATP １分子から中間体を経由してオキシルシフェリンが生成するため，ATP も検出することができる．このため，ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応は RNA の生物発光解析による遺伝子解析に用いられている．他にも，培養を行う検査法に比べて，迅速に測定できる利点を
図 1: 代表的な発光生物のルシフェリン．
Copyright© 2019 The Atomic Collision Society of Japan, All rights reserved.

75図 2: ホタル生物発光におけるルシフェリン‐ルシフェラーゼ反応．

生かし，食品工場での微生物検査や食品製造ラ

吸収・蛍光スペクトルを解析することで，ルシフェ

インなどの汚染微生物の検出など食品分野に用リンとオキシルシフェリンそれぞれの電子状態をいられている．現在では手軽に汚染状況を検査明らかにすることを目指した.

できるキットも実用化されている [1].

ルシフェリンの分子構造はオキシルシフェリン

ホタル生物発光は，発光現象の不思議，というの分子構造と良く似ている．図 2 に示すように，ど観点だけでなく，上記のような遺伝子解析や微ちらも 7 個の C, N, S 原子からなるベンゾチアゾ

生物検査などの応用研究の重要性から，発光機

ール環と 3 個の C, N, S 原子からなるチアゾリン

構解明の基礎研究が多く行われている．1917 年

環をもつ．さらに，両者のベンゾチアゾール環にに，Harvey により北米産ホタルの発光がルシフェ

は水酸基（OH 基）がついている．オキシルシフェ

リン-ルシフェラーゼ反応であることが初めて確認

リンとは異なり，ルシフェリンのチアゾリン環にはされた [3]．その後，Conti ら [4] や Nakatsu ら [5]カルボキシ基（COOH 基）がついている．オキシの X 線構造解析から，北米産ホタルルシフェラ

ルシフェリンはベンゾチアゾール環とチアゾリンーゼやゲンジボタルルシフェラーゼの構造やアミ環が平面にある構造が安定であるが，カルボキノ酸残基の違いの発光色に対する効果が明らか

シ基の影響でルシフェリンの安定構造は平面かになった．2008 年には Ando らの絶対発光量測らずれた構造になる．

定により，北米産ホタルの発光量子収率が 41%

私たちの理論研究の開始当初は，ルシフェリであると決定され [6]，それまで 80% [7] と言わンとオキシルシフェリンともに，pH に依存して変れていた値が約 50 年ぶりに修正された．また，化する水溶液中の吸収・蛍光スペクトルは報告さ溶媒や金属イオンに対する発光色変化も調べられていた [27–30] が，水溶液中に存在する異なれている [7–20]．これらの実験研究によりタンパる個々の化学種を識別したスペクトルの報告例

ク質，基質，発光体の構造が明らかになったため，は無かった．そこで，私たちは，水溶液中に存在

それに歩調を合わせて理論研究が進展してきたする可能性があるルシフェリンとオキシルシフェリ[21–26].

ンおよびそれぞれの共役酸・塩基に着目した．こ反応機構を理論的に明らかにするためには，

れらの化学種を考慮し，ルシフェリンとオキシル

反応物と生成物それぞれの励起状態を含む電シフェリンそれぞれの分光的性質の解明を目的

子状態についての詳細な情報が必要になる．ホ

とした理論研究を行った．本解説では量子化学

タル生物発光のように，タンパク質が関与する反計算と分子動力学計算を使った理論化学的な応の場合は，実験スペクトルにタンパク質の影響

視点から行ったこれらの研究成果 [31–39] につが含まれているため，スペクトルの解析に考慮す

いて紹介する．

べき要素が多い．そこで，私たちは水溶液中のCopyright© 2019 The Atomic Collision Society of Japan, All rights reserved.

76

2．ルシフェリン研究
ホタル生物発光における発光エネルギーはオ
キシルシフェリンの励起状態から基底状態への遷移エネルギーであるため，オキシルシフェリンの励起状態を明らかにすることが重要である．しかし，オキシルシフェリンは水溶液中で不安定な化合物であることから，私たちが研究を開始した
当初は気相中や水溶液中の実験データが非常に少なかった [40–42]．
これに対してルシフェリンは扱いやすい上に，その分子構造がオキシルシフェリンの分子構造に似ているため，ルシフェリンの励起状態についての研究は，ホタル生物発光の発光経路解明の手がかりになると期待されていた．実際に，ルシ

図 3: 気相中ルシフェリンの実験吸収スペクトル（ Expt. ） ， GW + Bethe-Salpeter 法 （ BSE ） お よ び
TDDFT 法（TDDFT）による理論吸収スペクトル．
Reproduced from Ref. 36, with the permission of
AIP Publishing.

フェリンの蛍光エネルギーは 550 nm ほどであり[28]，北米産ホタル生物発光の発光エネルギー（560 nm）[6] とほぼ同じである．
ルシフェリンはホタル生物発光の基質としてだ
けでなく，タンパク質がなくても起こる化学発光の反応物としても興味がもたれ，1950 年代からそのすることにより，ルシフェリンアニオンの基底状態

分光的性質を明らかにする研究が行われてきたからの吸収スペクトルの測定に成功した．

[7–11, 14, 21, 28]．さらに，蛍光過程に重要なプ

私たちは，気相中のルシフェリン吸収スペクト

ロトン付加・脱離の情報について，基底状態だけルについて，独自に開発した第一原理計算に基

でなく励起状態についても詳しく研究がなされる

づく GW + Bethe-Salpeter 法 [44] を用いて，気相ようになった [29, 30]．

中のルシフェリン吸収スペクトルについてより高近年では，放射光を用いた測定技術が発展し，精度な解析を行った [36]．その結果，図 3 に示

気相中のルシフェリン吸収スペクトルの測定にもすように，時間依存密度汎関数（TDDFT）計算を成功している [43]．一方で，ルシフェリンについ用いた理論吸収スペクトルは最も低いピークとての理論研究は，1973 年に X 線構造解析により

4.7 eV 付近のピークのみ再現されることがわかっ

ルシフェリンの分子構造 [12] が解明されてからた．これに比べて，GW + Bethe-Salpeter 法の理発展した [21]．1980 年代は，ルシフェリン分子の論吸収スペクトルには，4 eV 付近の小さなピーク

チアゾール環を省略したモデル系に対する振動や 5 eV 付近のピークも記述できている．4 eV 付子強度の計算から，ルシフェリン吸収スペクトル

近の小さなピークは Rydberg 状態に起因することの解析がなされた [22, 23]．これらの状況をふまが明らかになった．

えて，私たちはまずルシフェリンの気相および水溶液における電子励起状態を解明することにし水溶液中ルシフェリン吸収・蛍光スペクトル
pH に依存して変化するルシフェリンの吸収・た．

蛍光スペクトルの詳細は，2010 年に報告された[28]．図 4 に Ando らにより報告されたルシフェリ

ルシフェリン単分子の光吸収
静電型イオン蓄積リング ELISA を使って測定

ンの吸収・蛍光スペクトルを示す．ルシフェリンのされた気相中のルシフェリン吸収スペクトルは吸収スペクトルは，塩基性条件では 390 nm にピ

Stochkel らにより報告されている [43]．彼らは真ークをもち，pH 8 よりも酸性条件では 310 nm に

空中に噴射したルシフェリンを一度クールダウン

ピークをもつ．一方で，ルシフェリンを 350 nm で

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77表 1: ルシフェリンとその共役酸および共役塩基 [35]．

図 4: ルシフェリン吸収・蛍光スペクトルの pH 依存性 [28]．Copyright (2010) The Japan Society ofApplied Physics.

オン (6’OH, 4COO-) 由来のピークがスペクトルに励起すると，pH に依らず 550 nm 付近に蛍光が現れると考えられていた．私たちはルシフェリン

現れることが示された．

の吸収・蛍光スペクトルの過程を明らかにするたpH 7 付近では，ルシフェリンのカルボキシ基

め，水溶液中に存在すると考えられる表 1 の-はプロトンが外れて COO になり，全電荷が -1 の(6’OH, 4COOH), (6’OH, 4COO-), (6’O-, 4COOH),

アニオンになっている．ルシフェリンのベンゾチア(6’O-, 4COO-), (6’OH, 3H+, 4COOH), (3’H+, 6’OH,

ゾール環についている OH 基の pKa は 8.7 であ

4COOH) について，量子化学計算によりスペクト

る [10] ため，pH 9 よりも塩基性の水溶液ではル

ル解析を行った [31]．

シフェリンアニオンの OH 基からプロトンが外れ，これらの化学種に対して，DFT および TDDFT

ジアニオンになる．図 3 の吸収スペクトルでは計算（B3LYP/aug-cc-pVTZ）により基底状態（S0）390 nm のピークがジアニオン由来，330 nm のピ

および第一励起状態（S1 ）の構造最適化をそれークがアニオン由来と考えられた．さらに蛍光ス

ぞれ行い，励起エネルギーおよび振動子強度をペクトルについては，励起状態では pKa ＜ 0 で求めた．溶媒は，連続誘電体モデル（PCM）で近あるため，励起状態ではアニオンからジアニオン

似した．
図 5 に計算から得られた Kohn-Sham 軌道の最になり 550 nm の発光が起こると考えられた．
しかし，この考え方では説明がつかない部分

高被占軌道（HOMO）と最低空軌道（LUMO）をがある．まず，図 4 の 330 nm 付近の吸収スペクト示す．HOMO および LUMO 共に非局在型のルのピーク値が pH に応じてわずかにずれており，π 軌道になっている．吸収・蛍光スペクトルに現誤差と考えるのは正しいのか疑問がある．またれる S1 は，HOMO → LUMO への π → π* 励起

pH の小さいところではジアニオンのピークはほとが主成分となっている．

ん ど な く な る は ず で あ る が ， pH 1 と 2 で は ，また，pH の小さいところでの 390 nm 付近の吸390 nm 付近にピークが存在するように見える．さ収は (6’OH,3H+, 4COOH)，蛍光スペクトルにおら に 蛍 光 ス ペ ク ト ル は pH の 小 さ い と こ ろ でける 610 nm の発光は (6’OH, 4COO-) の S1 に起

610 nm 付近に発光があるように見える．

因する可能性があることが明らかになった．しかし，ここで用いている従来の計算方法では，個々の化学種に対する振動子強度を得ることはでき

水溶液中ルシフェリン吸収・蛍光過程の解明

たが，水溶液中に共存する化学種の相対的な強ルシフェリンとその共役酸・塩基および本解説で用いる名称を表 1 に示す．Ando らの解析では，-度比はわからない．

-

ジアニオン (6’O , 4COO ) とフェノール型のアニ
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78図 7: 350 nm 光励起の場合のルシフェリン蛍光経路．
図 5: ルシフェリンの Kohn-Sham 軌道 [31]．
(a) (6’O-, 4COO-) の HOMO ， (b) (6’O-, 4COO-) のLUMO ， (c) (6’OH, 4COO-) の HOMO ， (d) (6’OH,
4COO-) の LUMO．

pH が 9 より大きい場合は，(6’O-, 4COO-) が主化合物であるため，この化合物の励起 → 発光が蛍光スペクトルに現れる．それよりも酸性の場
合 (3 < pH < 9) は ， (6’OH, 4COO-) の 励 起 →(6’O-, 4COO-) からの発光がこれに加わる．一方，
pH < 3 では中性のルシフェリン (6’OH, 4COOH)
が励起され，その後プロトン脱離を起こしてアニオン (6’O-, 4COOH) になった後，発光していることがわかった [34, 35]．
Gibbs の自由エネルギー計算
ルシフェリン吸収・蛍光スペクトルの解析が合(a) pH 8

理的に解釈できた理由は，表 1 の化学種の pKa(b) pH 10

図 6: (a) pH 8 と (b) pH 10 の理論吸収スペクトル [32]．

を得ることができたことにある．物理化学の教科
書 に あ る よ う に ， pKa は 自 由 エ ネ ル ギ ー ΔG
(Jmol-1) とpKa = ΔG / 2.303RT

そこで，水溶液中に存在する可能性のあるル(1)シフェリンおよびその共役酸・塩基 12 種類（表 1の関係にある．ここで R と T はそれぞれ気体定数参照）に対し，それぞれの基底状態における pKa(JK-1mol-1) と温度 (K) である．そこで，ルシフェリ

を求め，水溶液中における相対濃度を pH ごとにンの pKa を求めるために，化学種 AH のプロトン得た [32]．この相対濃度から，pH ごとに異なる脱離過程を
AH + H2O ⇄ A- + H3O+

吸収スペクトル形状を得ることができた．

(2)

図 6 に pH 8 と 10 の場合の吸収スペクトルを示により近似し，右辺と左辺の自由エネルギー差をす ． 図 6 (a) に 示 す よ う に ， pH 8 で は (6’OH,

AH のプロトン脱離の ΔG とした．量子化学計算

4COO-) 由来の吸収ピークが最も大きく，長波長から得られる ΔG を使って pKa を見積もった．

側に (6’O-, 4COO-) の低い吸収ピークがある．こどの原子に結合しているプロトンが外れるかにれに対して，pH 10 では (6’O-, 4COO-) の吸収ピ

より pKa は異なる．表 2 に，水溶液中に多く存在ークが最も大きい．

するルシフェリン化学種に対するプロトン解離前

これらの結果から，pH と励起波長ごとにどの後の化学種とその pKa について，ΔG から得られ化学種が最も励起されるか明らかになったため，る値（計算値）と補正した値を示す．ΔG から得ら

pH と励起波長ごとに励起される化学種を知るこれる pKa は 30 を超える値となった．
(6’OH, 4COO-) の OH 基からプロトンが外れるとができる．図 7 に，350 nm の励起光を用いた場合の蛍光経路を示す．

場合の pKa は 8.7 であることが知られている [10]．
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79表 2: ルシフェリンの pKa の計算値と補正値（データは文献 [32] の値）．

(6’O-, 4COOH)

計算
pKa
38.7

補正
pKa
7.7

(6’OH, 4COOH)(6’OH, 4COO-)

33.6

2.8

(6’O-, 4COOH)(6’O-, 4COO-)

34.5

3.8

プロトン解離前

プロトン解離後(6’OH, 4COOH)

-

-

-

(6’OH, 4COO )(6’O , 4COO )

39.7

8.7†

CH3COOH

CH3COO--4.8‡

図 8: ケト-エノール互変異性．

†

実験値[10]
実験値[45]のスペクトル解析に有効な方法が，オキシルシフ‡

ェリンの吸収スペクトル解析にも使えると期待できる．

そこで，計算値の相対的な値は実験値を再現しオキシルシフェリンはとても不安定な物質であていると仮定し，pKa 値 8.7 で他の化学種の pKa

り，1969 年になって初めて Suzuki らにより合成さ値を補正することにより，他の化学種の pKa 値をれた [46]．溶媒の違いによる蛍光の特徴が明ら補正した（表 2 の補正値）．その結果，(6’OH,

かになり，オキシルシフェリンの吸収スペクトルは，

4COOH) の OH 基からプロトンが外れる場合の補生物発光後のルシフェラーゼ存在下でのオキシ

正 pKa は 7.7 となり，(6’OH, 4COO ) の OH 基のルシフェリンの吸収スペクトルとよく似ていること-

pKa と 似 た よ う な 値 が 得 ら れ た ． ま た ， (6’O ,が明らかになった．1990 年代に入ると，ルシフェ

4COOH) のカルボキシ基の補正 pKa は 2.8 となり，リンとともにオキシルシフェリンについても吸収・参考のために載せた酢酸のカルボキシ基の pKa

蛍光スペクトルの pH 依存性の詳細が明らかに実験値と似たような値になった．同じ置換基のなった [40–42]．

-

pKa は似たような値になる傾向がある [45] ことか
ケト-エノール互変異性

ら，表 2 の補正した pKa 値は妥当な値であると考

ルシフェリンの場合と異なり，オキシルシフェリ

えられる．

ンにはケト型とエノール型が存在する．ケト型とエ

pH ごとの相対濃度は

ノール型は水溶液中で平衡状態にあり，有機化(3)

学の分野で「ケト-エノール互変異性」として知られている．図 8 に一般的なケト-エノール互変異から得ることができる．

性を示す．ケト型とエノール型のどちらの構造がルシフェリンについては，気相中，水溶液中と水溶液中で安定か，については一概に言うこともに吸収あるいは蛍光スペクトルを解析することはできない．分子の構造によっては，分子内でにより，その電子状態が明らかになった，といえプロトン移動が起こることにより，エノール型からる．水溶液中には複数の共役酸・塩基が存在す

ケト型，あるいはその逆に構造が変わる．また，るため，吸収・蛍光スペクトルを解析するために周囲の水分子を介在して，エノール型からケト型，は，共役酸・塩基を考慮し，水和の影響を高精あるいはその逆に構造が変わることもある．安定度に見積もる必要があることも示された．

な構造は，その分子の構造と水和の状況から決まる．

3. オキシルシフェリン研究

表 3 にオキシルシフェリンとその共役酸・塩基

実験値を参考にして pKa を得る方法は，ルシの構造および本解説で用いる名称を示す．オキ

フェリンの吸収・蛍光スペクトルの解析においてシルシフェリンの構造のうち，4C （4 番の炭素原有効であることがわかった．ホタル生物発光にお子）- 5C （5 番の炭素原子）間の結合が単結合にける発光体であるオキシルシフェリンの分子構造なっている構造がケト型，二重結合になっているはルシフェリンと似ているため，このルシフェリン

構造がエノール型である．

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80表 3: オキシルシフェリンとその共役酸・塩基 [33]．

表 4: オキシルシフェリンの pKa の計算値と補正値．
プロトン解離前
-

-

計算

補正

pKa

pKa

(6’OH, 4O )(6’O , 4O )

41.5

8.7†

(6’OH, 4O)-(6’O , 4O)

37.1

4.4†

(6’OH, 4OH)

(6’O-, 4OH)

39.9

7.2†

(6’OH, 4OH)-

(6’OH, 4O )

38.8

6.1†

(6’O-, 4OH)

(6’O-, 4O-)

40.4†

7.6†

-

-

†

8.1†

(6’O , 4O)†

プロトン解離後-†-(6’O , 4O )

45.8

[33]

ペクトルと同様に，pH が塩基性から酸性へ変化
ホタル生物発光における発光色は，黄緑色ですると 414 nm と 371 nm の二つのピーク強度がある．この発光はケト型由来か，エノール型由来

入れ替わる．ただしオキシルシフェリンのこの変か，について未だに決着していない．気相にお化は，ルシフェリンの場合よりもずっと酸性条件

けるオキシルシフェリンの電子状態計算を行うと，である pH 5–6 で起こっている．ルシフェリン吸収

ケト型がもっとも安定になる [33]．その理由は，ケスペクトルの解析から考えると，この変化にはオト型が共鳴構造を持つからである．溶媒を PCM

キシルシフェリンとその共役酸・塩基の pKa が関で近似した場合も，同様の結果になる．また，互係していると予想できる．

変異性が生じないようにルシフェリンの 5C に結

私たちは，水溶液中に存在する可能性のある合している二つの水素原子をメチル基 （CH3 基）

オキシルシフェリンとその共役酸・塩基 18 種類で置換した類似体を用いた生物発光でも黄緑色（表 3 参照）に対し，ルシフェリンの場合と同じ計の発光が検出されたため，ケト型説が有力である

算方法により，それぞれの基底状態における pKa[16]．そのため，ホタル生物発光の反応機構を値を得た． 表 4 に水溶液中に多く存在するオキ示した図のほとんどには，図 2 のようにケト型のオ

シルシフェリン化学種の pKa を示す．ΔG から得ら

キシルシフェリンが描かれている [例えば 1, 2]．

れる pKa は，37–46 くらいの値になった．オキシル

一方で，水溶液中の実験が報告されるようになり，

シフェリンアニオン (6’OH, 4O-) の OH 基とルシ

黄緑色の発光はエノール型由来である可能性もフェリンアニオン (6’OH, 4COO-) の OH 基は同じ出てきた [42]．

ベンゾチアゾール環に結合している．前章で述オキシルシフェリンの場合は，ケト型からエノー

べ た ル シ フ ェ リ ン の 結 果 か ら ， (6’OH, 4O-) のル型へ変わる場合，5C に結合しているプロトン

OH 基からプロトン脱離する pKa 値は，ルシフェリ

が外れ，4C に結合している O がプロトンを受け

ンアニオン (6’OH, 4COO-) の pKa 値に近い値に取って，OH になる必要がある．構造から直接こなると考え，(6’OH, 4O-) の補正 pKa 値を 8.7 としのプロトン移動が起こるとは考えにくいため，周た．また，この値を用いて他の補正 pKa 値を見積

囲の水分子が関与する可能性が高い．すなわち，もった．
表 3 の補正 pKa 値を用いて pH ごとの吸収ス

理論的な解析を行う上で，水和の問題を高精度ペクトルの相対的な強度比を見積もることで，化に扱う必要がある．

学種ごとの理論吸収スペクトルを得た．図 9 (a) と(b) に，pH 5 と 6 の場合の理論吸収スペクトルをオキシルシフェリン吸収・蛍光スペクトル
オキシルシフェリンの吸収スペクトルは Esteved示す．pH 5 では (6’OH, 4OH) に起因する吸収da Silva らにより報告されている [27]．オキシルシが最も大きく，他の化学種に起因する吸収はほとフェリンの吸収スペクトルもルシフェリンの吸収ス

んど無い．pH 6 では，(6’OH, 4OH) に起因する

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81図 9: オキシルシフェリン理論吸収スペクトル; (a) pH 5, (b) pH 6 [33]．

吸収が最も大きいが，(6’OH, 4O-) や (6’O-, 4O)に起因する吸収も (6’OH, 4OH) に起因する吸収強度の 1/3 程度の強度になることがわかった．
分子振動解析
私たちの上記の研究が投稿論文として受理されたのと同時期に，水溶液中のオキシルシフェリ
ンとその共役酸・塩基に対する詳細な実験吸収
スペクトルが Reberz らと Ghose らの同じグループ
により報告された [47, 48]．これらの実験スペクト
ルと理論スペクトルを比べることで，オキシルシフ
ェリン電子状態に対する水和の影響が明らかになると考えられる．
そこで，私たちは水溶液におけるオキシルシフ
ェリンの振電相互作用を調べた．スペクトルの強図 10: enol: (6’OH, 4OH), keto: (6’OH, 4O),
phenolate-keto: (6’O-, 4O), phenolate-enol: (6’O-,
4OH), enolate: (6’OH, 4O-), OxyL2-: (6’O-, 4O-) の蛍光スペクトル (a) 実験 [48]，(b) 理論 [37]．

度を与える遷移双極子モーメントは，近似的に始状態と終状態の間のフランク・コンドン因子（FCF）に比例する．pH 7 の場合に水溶液中に主に存在する化学種は，オキシルシフェリン吸収

振動準位 v’ = 0 と S0 の振動準位 v の FCF を求および蛍光スペクトルの解析 [33] から，ケト型の-(6’OH, 4O)，(6’O , 4O) およびエノール型 (6’OH,--

スペクトルを得た [37]．

4OH)，(6’O , 4OH), エノレート型 (6’OH, 4O )，-め，振動によるスペクトル幅を考慮した理論蛍光-(6’O , 4O ) の 6 種類であることがわかっている．

図 10 に 6 種類のオキシルシフェリンとその共

そこで，これら 6 種類のオキシルシフェリンとその役塩基について，Ghose らによる実験蛍光スペク

共役塩基の S0 と S1 状態それぞれの安定構造を

トル [48] と本研究の理論蛍光スペクトルを示す．

TDDFT 計算（cam-B3LYP/aug-cc-pVTZ）により実験の蛍光スペクトルではケト型アニオン (6’O-,求めた．溶媒効果は PCM により取り入れた．S0

4O) のみスペクトル幅が小さくなるという特徴が現の安定構造における振動準位 v = 0 と S1 の振動れている．この特徴は，理論蛍光スペクトルにも準位 v’ の FCF を求め，振動によるスペクトル幅を見られる．(6’O-, 4O) は基底状態の v = 0 と励起考慮した理論吸収スペクトルを得た．また，S1 の状態の v’ = 0 の間の遷移（0-0’バンド）が強いた

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め，鋭いスペクトル形状になることがわかった．
(6’O-, 4O) 以外の化学種の場合は，0-0’バンド以
外の遷移も強度をもつため，ブロードなスペクト
ル形状となる．
この研究から，水溶液中におけるケト型とエノ
ール型のオキシルシフェリンとその共役塩基の(a) 系全体

吸収および蛍光スペクトルにおけるスペクトルの形状とスペクトル幅，さらにそれらの起源を解明することができた．ただし，ここで用いた計算方法
ではケト型については実験結果をあまりよく再現できていない．蛍光エネルギーに着目してみると，(6’O-, 4O) と (6’OH, 4O) のケト型はどちらも実験値よりも 0.3–0.6 eV 程度高くなる．すなわち，ケト型の蛍光エネルギーは他の化学種のエネルギーに比べて過大評価されたことになる．

(b) (6’O-, 4OH) とその水分子鎖

Full QM/MD 計算
PCM を用いた場合にはケト型のみ計算結果
が実験結果と異なったことから，私たちは PCM では水和の記述に限界があると考えた．

図 11: FPMD 計算に用いた系のスナップショット．
Reprinted (adapted) with permission from
Reference 38 Copyright (2019) American
Chemical Society.

この水和の問題に対応するため，さらに高精度な計算方法を検討した．上記の原因は，ケト型アの結果は「理論計算では水溶液中ではケト型がニオンの場合は他の化学種に比べて特異な溶

最も安定」というケト型説の根拠の一つを覆し，エ媒効果があり，溶媒環境の記述が従来の連続誘

ノール型からの発光の可能性もあることを理論的

電体モデルでは不十分であるためと考えられる．

に示した結果として，ホタル生物発光研究におそこで，水素結合相互作用をより高精度に理論いて重要な意味をもつ．

計算に取り入れる方法として，水分子をあらわに

水和構造は FPMD 計算により得られるスナッ

扱う分子動力学（MD）計算である第一原理分子

プショットに現れるため，スナップショットごとのオ

動 力 学 （ First principle molecular dynamics:

キシルシフェリンアニオンの励起状態を計算する

FPMD） 計算に着目した．FPMD 計算では，オキ

ことで，水和構造をより正確に取り入れた吸収ス

シルシフェリンアニオンと 64 個の水分子を取り入ペクトルを得ることができると考えられる．そこで，れ，水溶液中オキシルシフェリンのモデル系とし

FPMD 計算の結果から 1000 個のスナップショット

た．この系に対して 1 ns （計算時間は 200 日） をを取り出し，スナップショットごとの水分子に対し超える FPMD 計算を実行した [38]．

て，量子化学計算（QM 計算）と分子力学計算（MM 計算）を組み合わせた QM/MM 計算を行

図 11 に，FPMD 計算に用いた系のスナップシ-った [39]．

ョットと，この計算から得られる (6’O , 4OH) とその周囲に生成した水分子鎖のスナップショットを

ここでは，QM 領域はオキシルシフェリンのみと示す．オキシルシフェリンアニオンのエノール型

し，溶媒である水分子は MM 領域とした．QM 領やエノレート型は，周囲の水分子によりベンゾチ

域 には ， 時間 依 存（ TD） DFT 法 （ cam-B3LYP/

アゾール環とチアゾリン環からなる面の左右に水

aug-cc-pVTZ）を用いた．MM 領域である水分子分子鎖が生成する．この水分子鎖の影響により，は点電荷で近似されるため，分子を構成する酸

エノール型やエノレート型は水溶液中で特にエ素原子と水素原子の座標以外に，それぞれの原

ネルギー的に安定化されうることが示された．こ子に対する電荷の情報が必要になる．そこで，よCopyright© 2019 The Atomic Collision Society of Japan, All rights reserved.

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FPMD 計算により PCM を用いた場合よりも，特にケト型オキシルシフェリンの水和構造が改良されたと言える．
相対的な吸収エネルギーは QM 部分の計算レベルに依存することから，cam-B3LYP/aug-ccpVTZ よりも高精度な EOM-CCSD/6-31G* を用
いて QM/MM のスペクトルを補正した（図 12 (d) ）．
補正 QM/MM のスペクトルは，相対的な吸収エネルギーも実験値に近い値となった．

4. まとめと今後の展望
本解説ではホタル生物発光の基質であるルシ
フェリンと発光体であるオキシルシフェリンの水溶-図 12: オ キ シ ル シ フ ェ リ ン ア ニ オ ン (6’O , 4O)(phenolate-keto), (6’O-, 4OH) (phenolate-enol),(6’OH, 4O-) (enolate) の吸収スペクトル．
Reproduced from Ref. 39 with permission from the
PCCP Owner Societies. (a) 実験値 [47]，(b) フラン
ク ・ コ ン ド ン 近 似 [37] ， (c) QM/MM ， (d) 補 正
QM/MM．

液における電子状態について，量子化学計算と分子動力学計算を使った理論化学的な視点から行った研究成果について紹介した．ホタル生物発光の基質と発光体としてのルシフェリンとオ
キシルシフェリンの水溶液における吸収・蛍光ス
ペクトルの解析を通じて，① pH を変えた吸収・り高精度な電荷を得るために，各スナップショット

蛍光スペクトルには，共役酸・塩基の影響が入る，の 構 造 に 対 し て Natural Population Analysis 計②これらの化学種の pKa は量子化学計算と実験算を行った．この計算から得られた水分子の電値を利用した補正により得ることができる，③分

荷を MM 領域の電荷とし，オキシルシフェリンア

子動力学計算＋量子化学計算により高精度にニオンの励起エネルギーおよび振動子強度を，水和を扱うことができる，ということがわかった．オ

QM/MM 計算により求めた．振動幅に影響を与キシルシフェリンやルシフェリンは，カルボキシ基えない程度に，振動子強度のラインに適当な不やフェノール基といった有機化合物の特徴を備

均一幅をつけて，積算することにより，理論吸収えているので，他の有機化合物に対しても②のスペクトルを得た．

補正や③の計算方法による解析が有効であろ
-

-

う．

図 12 に，水溶液における (6’O , 4O)，(6’O ,-4OH)，(6’OH, 4O ) の 3 種類のオキシルシフェリ

FPMD 計算は計算コストがかかるため，タンパ

ンアニオンの理論吸収スペクトルを Reverz らのク質も扱う場合には現状では古典 MD 計算の方

実験スペクトル [47] と比較して示す．図 12 では，が実用的である．古典 MD 計算と量子化学計算--

を組み合わせる方法は他のグループでも試みら(6’O , 4O) は phenolate-keto, (6’O , 4OH) は-

phenolate-enol, (6’OH, 4O ) は enolate としている．

れており，FPMD 計算の代わりに古典 MD 計算

また，比較のためフランク・コンドン近似を用いたを使った結果について報告されている [49]．ここ分子振動解析から得られた理論吸収スペクトルで紹介した FPMD 計算を用いた研究により，オも図 12 (b) に載せた．この分子振動解析から得キシルシフェリンの水和の様子が明らかになった-

られたスペクトルでは，(6’O , 4O) のケト型のスペだけでなく，古典 MD 計算を使った結果の評価

クトル幅は他のスペクトル幅に比べて狭くなってが可能になったと言える．今後，励起状態のい る ． 一 方 ， 図 12 (c) に 示 す よ う に ， QM/MMFPMD 計算が可能になれば，オキシルシフェリン（cam-B3LYP/aug-cc-pVTZ）計算から得られたケ

励起状態の詳細なデータが得られるであろう．

ト型のスペクトル幅は他のスペクトル幅と同程度

ホタル生物発光の発光機構解明という視点かになり，実験結果とも一致する．すなわち，

らみれば，ホタル生物発光における反応物と生

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成物の励起状態を含む電子状態については，[4] E. Conti et al., Structure 4, 287 (1996).

ほぼ明らかになったと言える．反応途中の中間[5] T. Nakatsu et al., Nature 440, 372 (2006).

体を経由する発光機構について，理論計算によ[6] Y. Ando et al., Nature Photonics 2, 44

る予測やルシフェラーゼ変異体とルシフェリンあ(2008).

るいは中間体の類似体を用いた実験により検証[7] H. H. Seliger et al., Biochem. Biophys. Res.

されている [50, 51]．しかし，発光色が pH や温Commun. 1, 21 (1959).

度により変化する理由を明確に説明できるほど[8] H. H. Seliger et al., Arch. Biochem. Biophys.

の成果はまだ出ていない．タンパク質変異体を

88, 136 (1960).

作製することのできる生物学，生体内での観測[9] H. H. Seliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

ができる医学・薬学，中間体など類似体を合成

USA 52, 75 (1964).

できる有機化学，反応経路予測のできる量子化[10] R. A. Morton et al., Biochem. 8, 1598

学等を駆使した，タンパク質中の反応過程を追(1969).

跡する手法のブレークスルーが待たれる．

[11] E. H. White et al., Bioorg. Chem. 1, 92(1971).

謝辞[12] D. Dennis et al., Acta Cryst. B 29, 1053

ホタル生物発光関連分子の理論研究は，(1973).

2010 年ごろから名古屋大学の古賀伸明教授と[13] N. Kajiyama et al., Protein Eng. 4, 691

東京大学物性研究所の秋山英文教授との共同(1991).

研究として始まりました．現在は群馬大学板橋研究室にて板橋英之教授のご協力のもと，学生た[14] O. A. Gandelman et al., J. Photochem.

ちとホタル生物発光の研究を続けています．

Photobio. B: Biol. 19, 187 (1993).

この理論研究に協力してくださった，古賀教授，
秋山教授，静岡大学野口良史准教授，東京大[15] V. A. Viviani et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 280, 1286 (2001).

学物性研究所杉野修教授，原田慈久教授，原[16] B. R. Branchini et al., Biochemistry 43, 7255

研の志賀基之博士，中外製薬山田健太博士，(2004).

産総研望月敏光博士および秋山研のみなさん，[17] T. Hirano et al., J. Am. Chem. Soc. 131,

そして板橋教授と板橋・樋山研のみなさんに感

2385 (2009).

謝します．

[18] Y. Wang et al., Photochem. Photobiol. 87,

ここで紹介した計算は，名古屋大学情報基盤

846 (2011).

センター，物性研究所，九州大学のスパコンを使[19] Y. Wang et al., Scientific Reports 3, 2490って行われました．また，特定非営利活動法人(2013).

量子化学探索研究所平成 26 年度助成金と科[20] T. Mochizuki et al., Appl. Phys. Lett. 104,

研費 26610081, 15K05379, 17KT0094 の支援に

213704 (2014).

より研究が行われました．

[21] J. Jung et al., J. Am. Chem. Soc. 98, 3949
(1976).

参考文献[22] N. Wada et al., J. Phys. Soc. Jap. 49, 1519

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Principles and Methods (World Scientific,[24] L. W. Chung et al., J. Am. Chem. Soc. 130,2012).

12880 (2008).

[3] E. N. Harvey, Science, 46, 241 (1917).

[25] N. Nakatani et al., Chem. Phys. Lett. 469,

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571 (2013).
[33] M. Hiyama et al., Chem. Phys. Lett. 577,
121 (2013).
[34] M. Hiyama et al., Photochem. Photobio. 90,
35 (2014).
[35] M. Hiyama et al., Photochem. Photobio. 90,
820 (2014).
[36] Y. Noguchi et al., J. Chem. Phys. 141,044309 (2014).
[37] M. Hiyama et al., Photochem. Photobiol. 91,
74 (2015).
[38] Y. Noguchi et al., J. Phys. Chem. B 120,
8776 (2016).
[39] M. Hiyama et al., Phys. Chem. Chem. Phys.,
19, 10028 (2017).
[40] O. A. Gandelman et al., J. Photochem.
Photobiol B: 19, 187 (1993).
[41] J. C. G. Esteves da Silva et al., Tetrahedron
Letters 42, 8173 (2001).
[42] P. Naumov et al., J. Am. Chem. Soc. 131,
11590 (2009).
[43] K. Stochkel et al., J. Phys. Chem. A 115,
2155 (2011).
[44] Y. Noguchi et al., Phys. Rev. A 81, 045201(2016).
[45] A. Streitwieser et al., Introduction to Organic
Chemistry (Macmillan Publishing Company,

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862019 年度 役員・委員会
会長
城丸春夫（首都大学東京）幹事
平山孝人（立教大学）〔副会長〕

土田秀次（京都大学）

彦坂泰正（富山大学）

松本淳（首都大学東京）

吉井裕（量子科学技術研究開発機構）
運営委員
東俊行（理化学研究所）

鵜飼正敏（東京農工大学）

加藤大治（核融合科学研究所）

田沼肇（首都大学東京）

土田秀次（京都大学）

彦坂泰正（富山大学）

平山孝人（立教大学）

間嶋拓也（京都大学）

松本淳（首都大学東京）

吉井裕（量子科学技術研究開発機構）

石井邦和（奈良女子大学）

大橋隼人（富山大学）

金安達夫（九州シンクロトロン光研）

歸家令果（東京大学）

木野康志（東北大学）

中井陽一（理化学研究所）

常置委員会
編集委員会

委員長：彦坂泰正（富山大学）

行事委員会

委員長：土田秀次（京都大学）

広報渉外委員会

委員長：吉井裕（量子科学技術研究開発機構）

顕彰委員会

委員長：平山孝人（立教大学）

庶務委員会

委員長：松本淳（首都大学東京）

編集委員

大橋隼人，岡田邦宏，金安達夫，北島昌史，
中井陽一，彦坂泰正，松田晃孝，森下亨

しょうとつ

第 16 巻 第 5 号（通巻 90 号）

Journal of Atomic Collision Researchⓒ原子衝突学会 2019http://www.atomiccollision.jp/
発行: 2019 年 9 月 17 日
配信: 原子衝突学会事務局 <acr-post@bunken.co.jp>