R特集“木も森も見る”生体の深部観察技術
オリンパス㈱の透明化液と対物レンズが「エジソン・アワード」金賞を受賞にはかなり透明化が進み、“まさか”と思いながら顕微鏡で観察してみると、深さ1mmを超えた辺りで、蛍光で光っている神経幹細胞が見えたのです。衝撃的だったので日付も覚えています。2009年1月14日です。

脳科学の進展は目覚ましいが、ある領域の神経細胞がどの領域の神経細胞とつながり情報を伝えているのか、神経回路がくまなく調べられているわけではない。
それは、限られた領域を高分解能で精細に見る“木を見て森を見ず”と、分解能は高くないが脳全体を見る“森を見て木を見ず”との間をつなぐ“木も森も見る”
生体の深部観察技術がなかったからだ。
理研和光研究所 脳科学総合研究センター（BSI）細胞機能探索技術開発チームのはまひろし

宮脇敦史チームリーダー（TL）、濱 裕研究員らは昨年8月、生体を透明化する水溶ス ケ ー ル

■木も森も見る──報告を受けた宮脇TLの感想は。
宮脇：尿素という点に特に興味を持ちました。一般的に尿素はタンパク質を変性させる能力を持ちます。しかし、性試薬「Scale 」を発表（図1）。11月にはオリンパス㈱が、Scale に光学的調整をほぼすべての蛍光タンパク質は高濃度施した透明化液「SCALEVIEW-A2」と、深さ4mmまでを高精細に観察できる対の尿素の中でも壊れません。私は米国

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物レンズ「XLPLN25XSVMP」を発売した（図2）。そして今年4月、それらの製品は「エジソン・アワード」金賞に輝いた。
宮脇TLと濱研究員、理研BSI-オリンパス連携センターの木村博之テクニカルス
タッフ（オリンパス主任研究員）に、開発の経緯と展望を聞いた。

おさむのロジャー・チェン博士（下村 脩博士らとともに2008年ノーベル化学賞受賞）の研究室に留学していたときに、そのことを確認していました。
現在、透明化試薬として、BABB（ベンジルアルコール）が一般的に使われ■きっかけは、駄目もとの実験

パク質で光るようにしたマウスの脳かています。しかし、サンプルを脱水す──開発の経緯から教えてください。

ら海馬を取り出し、ホルマリンで処理る過程、さらにBABBによる直接の作

濱： 発生の過程で脳がつくられるとしたサンプルを観察する実験を進めて用で蛍光タンパク質の蛍光が消えてしき、神経幹細胞から新しい神経細胞がいました。海馬全体をくまなく見たいまう問題がありました。濱さんの話を次々とつくられます。ただし、ヒトをのですが、脳組織は不透明なため表面聞いて、その問題を解消できそうだと含む哺乳類の大人の脳では新しく神経から深さ0.1mmくらいまでしか見る直感し、組織を透明化して深部を観察細胞がつくられることはない、と長年ことができません。サンプルも残りわする「Scale プロジェクト」をチーム信じられてきました。ところが最近、ずかになったとき、ある実験手法を思内に立ち上げました。脳科学にハード脳の深部にある海馬などに神経幹細胞い出しました。その手法では、合成膜ウエア・ソフトウエアの要素技術開発が存在し、神経細胞が新しくつくられを尿素に浸す工程があります。そのとを加えた学際的プロジェクトです。ていることが分かってきました。

き合成膜が一瞬、透明になるのです。

──深部観察は、それほど切望されていでは、海馬のどこに神経幹細胞があ駄目でもともとと、海馬のサンプルをる技術なのですね。

るのか。私は、神経幹細胞が蛍光タン尿素に浸してみました。すると3日目

宮脇：進展の目覚ましいMRI（核磁気かい ば共鳴画像法）やPET（陽電子放出断層撮影：STUDIO CAC

5mm画像法）などは、脳全体の観察を可能にする画期的技術ですが、分解能はあまり高くなく、“森を見て木を見ず”といえます。一方、光学顕微鏡や電子顕微鏡は、高い分解能で観察することができますが、その観察範囲は最大でも1mm立方に限られおり、“木を見てたい じ

図1 Scale A2で透明化したマウス胎仔（右）ヒトを含む哺乳類の組織は、光を散乱・吸収するため不透明になっている。特に散乱効果が大きい。
Scale は散乱だけを抑え、光の吸収は抑えない。そのため、網膜や肝臓の色は残っている。

10

RIKEN NEWS September 2012

森を見ず” といえます。その間をつな

Scale A2

生理食塩水溶液

図2 多光子専用対物レンズ「XLPLN25XSVMP」
深さ4mmまでを高精細に観察できる。オリンパス
では、サンプル作製から撮影、3次元画像構築まで、Scale を使った深部観察技術に関するセミナーを開催したり、ユーザーからの質問に対応するなど、技術支援を行っている。

ぎ、“木も森も見る” 観察技術がこれまでなかったのです。光学顕微鏡を軸に、生体組織を透明化して深部を観察する技術が生まれれば、“木も森も見図3 マウス脳の深部観察画像

── “木も森も見る” と、どんな研究に木村：研究者の方々が生体の深部観察役立ちますか。

を切望していることは、自社の調査で宮脇：そもそも神経細胞同士がどのよ分かっていたので、Scale への評価は非うにつながり神経回路をつくっている常に高いものでした。早速、社内の第のか、くまなく調べられていません。

一 線 の 技 術 者 を 理 研 に 連 れ てきて、そこで今、神経細胞同士の連結を網羅

Scale を使った深部観察を体験させ、対的に調べる取り組みが世界中で進めら物レンズや画像処理ソフトの制約を取れています。米国のハーバード大学医り払うための技術開発を始めました。

学部では、隣り合う神経細胞を異なる対物レンズの先端面から焦点を結ぶ色で光らせたブレインボー（Brainbow

ポイントまでの距離を作動距離と呼び＝Brain＋Rainbow）マウスが開発さます。普通、作動距離を長くすると、れました。また、IBM社が出資するブ分 解 能 が 低 く な っ て し ま い ま す。

ルーブレイン・プロジェクトでは、ヒScale 試薬の光の屈折率は、脳組織のトの脳全体にわたる神経構築のコン光の屈折率に近いことが明らかになっピュータ・シミュレーションが目標にていました。その情報をもとに、作動なっています。こうしたプロジェクト距離と分解能の問題を克服するようにではたいてい、多くの組織切片を調製対物レンズを設計し、1μmの分解能して撮影した画像をつなぎ合わせる方を保ちつつ、4mmの作動距離を達成

法が採用されています。しかし、切片することができました（図2・図3）。

が丸まったり壊れたりすることが多く、

──画像処理ソフトの制約とは。

画像のつなぎ合わせが難しいのです。

木村：ある場所の深部観察によって得組織をスライスすることなく、透明られる3次元の再構築データは角柱状に化して深部まで高精細に観察できれなります。顕微鏡の視野は限られていば、たくさんの画像をもとに3次元構るので、場所をずらしながら角柱状の造を再構築することが極めて容易になデータをたくさんつくり、それらをつり、脳の離れた領域間で起きる神経細なぎ合わせて広い領域のデータを作製

胞連絡も確実に調べることができます。

する必要があります。実際には視野周Scale による透明化と4mmの作動距離を持つ対物レンズにより、脳表面から大脳皮質の6層構造、海馬の歯状回という部位までを高精細に捉えることができた。

脳表面

第Ⅳ層第Ⅴ層第Ⅵ層
4mm 白質CA1

海馬評価したのですか。

大脳皮質る” ことが可能になります。

歯状回

図4 マウス海馬の神経幹細胞神経幹細胞の核（緑色）が、血管（赤色）の近くに存在していることを証明した。

辺部にゆがみや陰りが出る場合がある

らえませんでした。従来技術との差を■顕微鏡技術の制約を取り払う

ため、データをきれいにつなぎ合わせどのように論じていくか、毎日悩みま──どのように開発を進めたのですか。

るソフトウエアの開発に注力しました。

した。実際の画像についても、本当に濱：まず生体組織をさらに透明化する

宮脇：“木も森も見る” 観察では、撮影納得がいくものはほんのわずかしか得ことを目指して、尿素にさまざまな化合した画像のデータ量が膨大になりまられませんでした。

物を配合する試行錯誤を繰り返しましす。従来の顕微鏡システムのメモリー──どのような観点で画像をチェックすた。そして尿素に界面活性剤とグリセ容量では足りません。画像データの管るのですか。

ロールを加えた透明化試薬「Scale A2」

理と処理に関しては、あらゆるところ

宮脇：神経細胞は軸索と呼ばれる長いが完成しました（図1）。に予想を超えた制約がありました。私

突起を伸ばして情報を送り、樹状突起ハードウエアで、いくつかの問題にたちはそうした制約を取り払いながと呼ばれる突起で情報を受け取りま直面しました。例えば顕微鏡の対物レら、Scale 技術を使った深部観察技術す。それら軸索や樹状突起をどこまでンズです。各社から発売されていた対の有用性を示す論文を作成していきま正確に追跡できるか、これが第一のポ物レンズは、表面から深さ2mm程度した。私は、「proof-of-concept（ 概イントでしょう。それぞれの神経細胞までしか高精細に見ることができませ念の実証）」に関して人一倍厳しくながどこへ軸索を伸ばして情報を伝えてん。そこで、以前から蛍光イメージンります。どういう実験と考察を組み立いるのか。それを脳全体で包括的に解グに関する共同研究を行っていたオリてていくべきか、知恵を絞りました。

析するにはコンピュータで自動追跡すンパスにお願いすることにしました。

当初、Scale 技術の革新性は、投稿先る必要があります。画期的なソフトウ──オリンパスでは、Scale をどのようにの雑誌の編集者になかなか理解してもエアの開発を期待したいと思います。
September 2012 RIKEN NEWS11

撮影：STUDIO CACて、真の距離測定を行いました。そしチャンスも大きく広がりますね。て、増殖する神経幹細胞の核が、ほか

木村：そうですね。ヒトの病理標本なの神経細胞の核に比べて血管のより近ど、より大きなサンプルを観察するたくに存在することを証明しました。

めに、私たちは8mmの作動距離を持このような研究を発展させ、脳内の販売する準備を進めています。

ることを予定しています。そして近い

濱：BSIでは小型霊長類のマーモセッ

将来、ダメージを受けた神経組織を修トを使った研究が始まっています。サ

復させる技術を開発することを目指し

ル や ヒ ト の 大 き な 脳 を 見 る に は、ています。現在は、外部から神経細胞8mmの作動距離はとても有効です。

を移植する試みが行われていますが、

木村：大きなサンプルをいかに効率よ

私は、患者本人の脳内にある神経幹細く撮影していくのかが今後の課題です。

胞を利用して組織を修復したいのです。

宮脇：私たちの究極の目標は、動物の■「エジソン・アワード」金賞に輝く──昨年11月には、Scale 技術の普及を促

脳を生きたまま、その一部を透明化し──昨年8月末、Scale の研究成果を発表

す、透明化液「SCALEVIEW-A2」と、深て観察することです。完璧な透明化をしました。反響はいかがでしたか。

部4mmまでを高精細で観察できる対物レ狙っているわけではありませんが、い宮脇：世界各国の新聞など、メディア

ンズ「XLPLN25XSVMP」が、オリンパ

ずれにしても、透明化しても神経細胞からの問い合わせが多かったですね。

スから発売されました。

がほぼ正常に活動することを証明しな『ニューヨーク・タイムズ』の記者か

木村：脳神経科学の研究者や医療関係ければなりません。それが難題です。

らは、2回にわたり計6時間の電話イン者はもちろん、製薬メーカーの開発者や──生きたまま透明化することで、どのタビューを受けました。その記者はブ研究者にも利用していただいています。

ような実験が可能になりますか。

レインボーマウスの開発者にもインタ──今年4月、それらは、新製品やサービ

宮脇：表層の脳組織を取り除いたり内ビューを行い、科学的に信頼性の高いスにおける画期的な技術革新に贈られる、視顕微鏡を差し込んだりすることな記事に仕上げました。米国からの問い

米国の「エジソン・アワード」科学・医く、海馬や扁桃体のような脳深部にあ合わせは、その記事を読んだ人からの療部門の金賞に輝きました。

る領域で起こる神経細胞の発火を観察ものが多かったようです。

木村：3位の銅賞に入賞することすらできるはずです。

深部観察では従来、2光子励起蛍光難しい賞と聞いています。オリンパス

濱：脳深部で発火した神経細胞がほか顕微鏡が用いられてきました。Scaleでは初の入賞、それも金賞でした。の領域へ情報を伝えている様子をリア

左から、濱 裕 研究員、宮脇敦史チームリーダー、
木 村 博 之 テ ク ニ カ ル ス タ ッ フ。 そ れ ぞ れ「SCALEVIEW-A2」、「エジソン・アワード」金賞トロフィー、「XLPLN25XSVMP」を手にしている。

ろ、1光子励起でも深さ4mmまで十分

へん とう

ルタイムに観察できれば画期的です。

で透明化した脳サンプルを試したとこ

12つ対物レンズを開発し、特注品として神経幹細胞の増殖制御機構を詳しく探■病理検査への応用やこれまで知られていない領域間での神に高精細で観察できることが分かりま

生きたままの透明化を目指すした。1光子励起蛍光顕微鏡（共焦点──Scale を使った深部観察技術をどのよできるはずです。

レーザー走査顕微鏡）は世界中にたくうな形で発展させていきますか。

宮脇：蛍光技術の進展のおかげで、特経細胞の連結や新しい神経回路を発見

さん設置されているので、それとの組

宮脇：現時点で、目指すレベルの10％定の細胞やタンパク質を自在に光らせみ合わせで、Scale 技術が急速に普及にも達していないと思いますが、さまて観察することができるようになり、する可能性があります。

ざまな目標を設定しています。例えば、脳科学や医学、生命科学に大きな革命──Scale を用いた神経幹細胞の画像も発

この技術は、脳以外の組織を透明化すがもたらされました。しかし、蛍光技表しました（図4）。

ることも可能です。ヒトから採取した術で主に使われている可視光は哺乳動

濱：神経幹細胞は血管から成長因子を病理標本を透明化して、がん細胞など物の組織によって散乱・吸収され、組受け取って増殖する、という仮説があの病変を標識する技術と組み合わせる織は不透明です。そのため、深部の蛍ります。では神経幹細胞は血管の近くことで、病理検査に応用することを目

光シグナルを捉えることはなかなかでに存在しているのか？ 脳組織をスライ指しています。透明化することで、病きません。私たちは今後も開発研究をスして観察する従来の2次元的なアプ変を見落とすことなく、くまなく調べ推し進め、この技術の新たな有効性をローチでは、よく分かりませんでした。

ることができるはずです。

実証し、世界に向けて提案していきた

私はScale 技術をマウス海馬に適用し──そのような検査技術が開発できれば、いと考えています。て作成した3次元再構築データにおい医 療に貢 献 できるとともに、ビ ジ ネ ス

RIKEN NEWS September 2012

（取材・構成：立山 晃／フォトンクリエイト）