[研究報告]

大根塩漬けからの乳酸菌単離とスターターとしての検討＊
玉川 英幸**
大根の一本漬は自然に起こる発酵を通して製造される日本の伝統漬物である。本
研究では、塩漬け大根より乳酸菌の単離を試みた。乳酸菌菌叢の変化を解析した結果、漬込みの初期の発酵は Leuconostoc mesenteroides によって開始され、その後Lactobacillus curvatus と Lactobacillus sakei が次いだ。各単離株をスターターとして大根塩漬の試作試験を行ったところ、Leu. mesenteroides 分離株と Lb. curvatus 分離株を用いた場合では良好な発酵が行われた。特に Leu. mesenteroides 分離株を用いた場合
では酢酸に起因する強い酸味が感じられた。
キーワード ： 乳酸菌、大根塩漬け、Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus curvatus、
Lactobacillus sakei

Isolations of lactic acid bacteria from pickled daikon (Japanese whiteradish) and effect as inoculation of starter cultures on the fermentation.
Hideyuki Tamakawa
Daikon ippon-zuke is a traditional pickled white radish from Japan. Such radish wasproduced via spontaneous fermentation. In this study, we attempted to isolate, characterize,
and identify lactic acid bacteria (LAB) in such pickled daikon. The analysis of changes inLAB flora indicated that the fermentation process was initiated by Leuconostoc
mesenteroides, and followed by Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei. Using theseisolates as the initiation of fermentation process, the trial production of pickled daikon wasdemonstrated. As the result, improved fermentation was efficiently made using the isolatesof Leu. mesenteroides and Lb. curvatus. A strong acid taste due to acetate, however, was felt
by inoculation of isolated Leu. mesenteroides.
keywords : Lactic acid bacteria, pickled white radish from Japan,
Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei
1 緒 言
漬物とは、様々な野菜を漬け込み材料とともに漬け込むことで、保存性を高めるとともに熟成させ、風味を良くした食品の総称である。漬物には醤油漬けや酢漬けのように微生物の発酵を伴わないタイプの漬物と塩漬けや粕漬けのように発酵を伴うタイプの漬物が存在する。後者においては、主に野菜に付着している乳酸菌が野菜自体の糖分を代謝して風味の変化が起こっていることが知られており、Pederson が報告したザワークラウトの漬込み試験においては、漬込み初期に Leuconostoc 属、Enterococcus 属、Pediococcus 属などの乳酸球菌が増殖し、後期には Lactobacillus plantarum などを中心としたLactobacillus 属の乳酸桿菌が増殖すると報告されている
1)。こうした前半に乳酸球菌、後半には乳酸桿菌が増殖するという菌叢変化は漬物の製造において、極めて一般的なものと考えられているものの、実際には様々な外的要因によって容易に変化する。すなわち、漬込み前の野* 平成 28 年度** 食品技術部

技術シーズ創生研究事業

プロジェクトステージ

菜の洗浄状況、漬込み時の気温、またそもそもの野菜原料に付着している微生物種によっては、発酵が不十分だったり、逆に過発酵に至ったりすることは珍しくない。
こうした状況を改善する目的として有望な乳酸菌菌株をスターターとして接種することが効果的と考えられている。
本研究においては、岩手県内メーカーが製造する大根塩漬け製造工程の主要な菌叢変化を確認するとともに、分離された乳酸菌のスターターとしての機能を検討したので報告する。
2 実験方法2-1 使用菌株実験に使用した乳酸菌株を Table 1 に示す。

岩手県工業技術センター研究報告第 20 号（2017）

Table 1 Strain used in this study.
StrainRelevant genotype

Lactobacillus sakei
NBRC15893T
Wild type (Type strain)
NW34625
Wild type
Lactobacillus curvatus
NW33915
Wild type
Leuconostoc mesenteroides
NBRC100496T
Wild type (Type strain)
NW24612Wild type
NW33920
Wild type
NW35418
Wild type

2-2 漬液の生菌数、代謝物の測定および乳酸菌の分離
県内漬物メーカーの大根漬込み槽から経時的に漬液をサンプリングした。一般生菌数はサンプリングした漬液を適宜希釈し、標準寒天培地(Nissui Pharmaceutical、Tokyo, Japan）に塗布し、35°C で 3 日間培養後、塗布漬
液 1 ml あたりのコロニー数を計測することで算出した（colony formation unit; cfu）
。また、乳酸菌数は同じサンプルを 10 g/L 炭酸カルシウム、10 mg/L アジ化ナトリウ
ム、10 mg/L シクロヘキシミドを含む MRS 液体培地（Merck, Darmstadt, Germany）に塗布し、30°C、2-7 日間培養後にハローを形成したコロニー数を計測することで算出した。ハローを形成したコロニーは同じ培地に塗布し、再度ハロー形成を確認した後、各種増殖試験、菌種の同定試験、漬込み試験に供した。
2-3 機器分析
グルコース、フルクトース、マンニトール、酢酸、乳酸、エタノールの定量は Shi らの高速液体クロマトグラ
フィーによる方法を一部改変して行った 2)。60°C で保持した ICSep-ION-300 カラム (Tokyo Chemical Industry,Tokyo)を用い、溶媒として 0.01 N 硫酸(流速 0.4 mL/min)を使用した。検出には示差屈折率検出器(RID-10A,Shimadzu, Kyoto, Japan)を用いた。
2-4 乳酸菌種の同定
乳酸菌種の識別、同定には PCR-RFLP 法を用いた 3)。
MRS 培地で培養した乳酸菌菌体から PrepMan Ultra
Sample Preparation Reagent (Thermo Fisher Scientific, SanJose, CA, USA)を用いてゲノム DNA の抽出を行った。
PCR に は SimpliAmp Thermal Cycler (Thermo FisherScientific)を用いた。各乳酸菌の 16S rDNA 配列は、それ
ぞ れ の 乳 酸 菌 の ゲ ノ ム DNA を 鋳 型 と し て27FC(5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3')と1490RC(5'-GTTACCTTGTTACGACTTC-3')のプライマ―セット用いて EX Taq HS (Takarabio)で増幅した。反応は94°C 30 秒、50°C30 秒、72°C、90 秒の 3 ステップ 35 サイクルとし、サイクル終了後は 4°C に保持した。PCR

Reference
NBRC
This work （from Tank 46 in day 20）
This work （from Tank 39 in day 22）
NBRC
This work （from Tank 46 in day 20）
This work （from Tank 39 in day 22）
This work （from Tank 54 in day 18）

産物はフェノール/クロロホルム抽出を行った後、エタノール沈殿で精製した後、MboI と XspI (Takarabio)で 37°C、24 時間処理した。制限酵素処理溶液は 2.5%アガロース S(Nippon Gene, Tokyo, Japan)を用いてゲル電気泳動し、文献 3 に示された DNA の断片化パターンを照合することで乳酸菌種の同定を行った。
2-5 増殖試験
増殖試験には大根破砕液もしくは MRS 液体培地を用いた。大根破砕液は市販の大根をジューサーで破砕することで調製した。破砕液は 121°C、15 分間オートクレー
ブ処理を行った後、ガラス繊維ろ紙で吸引ろ過した。ろ液は-30°C で凍結、20°C で融解した後、1.0 m フィルター、0.22 m フィルターを用いた吸引ろ過を段階的に行うことにより、無菌化を行った。
各乳酸菌を MRS 液体培地、もしくは大根破砕液に接種後、30°C、静置条件で培養を行い、72 時間後の OD660と代謝物を測定した。
2-6 漬込試験
乳酸菌の前培養には大根破砕液を用いた。大根は 100ppm の次亜塩素水に 15 分間浸漬した後、アルコール消毒したまな板と包丁を用いてカットした。
真空包装用の袋で 500 g 大根、12.5 g 食塩、0.4 g 醸源
（87.9% 炭酸カルシウム、5.5% サッカリン Na、6.6% 食品素材；大和食品工業）、0.5 g 新砂糖（93％ グルコース、5% サッカリン Na、2% クエン酸；株式会社三幸） 、57.1 ml 滅菌水 を混合した。乳酸菌培養液を初発
OD660=0.001 となるように添加し、減圧条件下でヒートシールを行い、10°C で 40 日間漬込みを行った。
3 結果と考察3-1 大根漬液中の代謝物と菌叢解析
3 つの塩漬け大根漬樽から経時的に 3 回のサンプリングを行い、各種生菌数および代謝物測定を行ったところ、乳酸菌数の増加と発酵に起因すると思われる乳酸と酢酸の生成が認められた(Table 2)。特に樽番号 46 と 54 に関大根塩漬けからの乳酸菌単離とスターターとしての検討
Table 2 Biochemistry of salted radish.
Tank No.

Storageperiod(day)pH

BrixSalt(%)

398

5.77

4.50

3.20

46MRS

GlucoseFructose

LactateAcetateEthanol

2.8

0.5

0.1

0.1

1.2

0.00
6

5.52

4.80

2.63

6.70 x 10

6.30 x 10

4.3

1.7

1.0

0.3

2.2

43

4.50

2.50

1.55

ND1)

ND1)

0.9

0.1

1.5

0.2

0.8

6

5.88
4.18

4.40
4.30

3.10

4

5.25 x 10

41.32 x 10

3.4

0.6

0.1

0.1

1.2

2.71

88

1.2

0.4

2.1

0.4

2.5

3.46 x 101)

3.24x101)

413.933.201.69NDND

1.7

0.3

1.1

0.5

1.845.80

4.70

3.50

2.22 x 104

4.00 x 102

2.00.40.1

0.0

0.5184.33

4.50

2.69

2.31 x 108

1.69 x 108

2.9

0.6

1.8

0.4

1.9

2.6

1.0

1.80.3

1.2391)

6

Substrates and products (g/L)

222054cfu
Plate
Count Agar
4.80 x 104

4.182.501)

1.38

ND1)

ND

No data

しては、漬込み 20 日前後のサンプリングにおいて、乳酸乳酸菌数(MRS 培地によって検出される)が 106～108 cfuまで増加していた。これらの結果は、今回サンプリングを行った 3 つの樽に関しては健全な発酵が行われていることを示している。一方、グルコースやフルクトースについては樽間で増減に差が認められた。また、樽番号 46の乳酸濃度は漬込み41日目より20日目の方が高かった。
野菜は塩漬けにすることにより、脱水に伴う原形質分離によって細胞が死滅し、細胞内の成分が漬液中へ浸出する 4)。通常の野菜の漬込みにおいては、こうした野菜の細胞内成分浸出と漬液中での微生物の発酵が同時に起こっている。
したがって、発酵が速ければ糖類は減少し、発酵が遅ければ糖類は増加するとともに乳酸菌が生成した乳酸は希釈され減少する。樽番号 39 に関しては、漬込
み 8 日目では乳酸菌は検出されず、漬込み 22 日目でグルコースとフルクトース濃度が増加したことから漬込み初期の発酵は遅かったものと想定される。しかし、43 日目の漬込みでは各糖濃度は大きく減少し、乳酸濃度も増加し続けたことから漬込みの後半は発酵が活発になっていることが示唆される。樽番号 46 については、漬込み 20日の乳酸濃度が高いものの、43 日目では減少していること、グルコース濃度も増加していることから漬込み初期は活発な発酵が行われたものの、後半は乳酸菌の活性が低下していたことが想定される。樽番号 54 については、
樽番号 39 と 46 の間程度の速度で発酵が進んだものと思

樽番号 39 と 46 の間程度の速度で発酵が進んだものと思われる。
3 つの漬樽から 3 回行ったサンプリングのうち、それぞれ最初の 2 回について乳酸菌の分離と PCR-RFLP 法を用いた乳酸菌種の識別と同定を行った。今回、PCR-RFLP法で乳酸菌の識別を行ったところ、乳酸菌種が検出された す べ て の サ ン プ リ ン グ に お い て Leuconostoc
mesenteroides が検出された(Table 3)。また、それぞれの樽の 2 回目のサンプリングにおいては、Lactobacillus
curvatus もしくは Lactobacillus sakei が検出された。漬込
み初期に乳酸球菌が増加し、中期から後期に乳酸桿菌が増殖するという現象は、漬物の乳酸菌菌叢を解析した過去の報告と矛盾ないものである 1)。なお、引用文献 3 によれば、評価に用いた 99 種のうち 52 種の乳酸菌については、制限酵素断片化パターンが特的であり、同定し得る可能性があると示されているが、今回検出した 3 つの菌種については特異的な制限酵素断片化パターンを示すものであり、同定し得る菌種である。Lb. curvatus と Lb.
sakei は 16S rDNA 配列の相同性が 98.2%であり、系統分類学的には極めて近しい菌種である 3, 5)。
乳酸菌の系統分類学的な報告を行ったFelisとDellaglioの報告では、どちらも Lactobacillus sakei グループに属する菌種として分類されている。3 つの樽において同様の微生物種が似たような増殖パターンを示したことから、少なくとも今回分離を行った加工場においては、こうした菌叢変化がどこでも起こっているのかもしれない。

Table 3 Identification of isolates.
Tank No.
394654Storage period (day)Leuconostoc mesenteroides

Lactobacillus curvatus

225261920644184

Lactobacillus sakei

8Total analyzed
071917437

岩手県工業技術センター研究報告第 20 号（2017）

Table 4 Fermentation of LAB in MRS and radish juice.
Inoculated LAB

Medium

without strain

Substrates and products (g/L)

OD600

GlucoseFructose

LactateAcetateEthanol

MRS

0.000

18.9

0.0

0.1

4.00.2

Lb. sakei

NW34625

MRS

4.800

4.3

0.0

12.9

5.1

0.2

Lb. curvatus

NW33915

MRS

4.440

3.7

0.5

13.34.30.2

Leu. mesenteroides

NW24612

MRS

2.040

0.7

0.0

9.3

4.4

4.1

Leu. mesenteroides

NW33920

MRS

3.820

0.2

0.2

10.2

4.4

2.4

Leu. mesenteroides

NW35418

without strain

MRS

2.780

0.6

0.3

8.5

4.6

2.9

Radish juice

0.000

21.8

18.2

0.1

0.1

0.2

Lb. sakei

NW34625

Radish juice

0.042

19.0

18.0

1.9

0.1

0.2

Lb. curvatus

NW33915

Radish juice

0.039

19.3

17.8

1.8

0.1

0.2

Leu. mesenteroides

NW24612

Radish juice

0.158

14.3

6.2

3.6

2.20.2

Leu. mesenteroides

NW33920

Radish juice

0.211

14.3

6.4

3.6

2.1

0.2

Leu. mesenteroides

NW35418

Radish juice

0.159

13.8

6.7

2.7

2.0

0.2

Table 5 Fermentation of salted white radish by inoculated LAB.
OD600

pH

Brix

Salt
(%)

Gas

0.41

5.62

6.4

2.23

NBRC15893T

0.78

4.13

6.5

Inoculated LAB
without strain
Lb. sakei

Substrates and products (g/L)
GlucoseFructose

MannitolLactateAcetateEthanol

+/-

12.9

9.6

0.5

0.1

0.1

1.2

2.21+

11.7

9.8

0.5

3.2

0.1

1.3

Lb. sakei

NW34625

0.41

5.67

6.5

2.15+/-

13.9

10.3

0.6

0.1

0.1

1.3

Lb. curvatus

NW33915

1.79

3.95

6.4

2.19+

10.5

9.1

0.4

4.1

0.2

1.2

Leu. mesenteroides

NBRC100496T

0.94

3.94

6.1

2.20

+++

6.8

0.0

9.9

3.4

1.7

1.4

Leu. mesenteroides

NW24612

1.78

3.70

6.1

2.20

+++

5.4

0.0

10.11)

1)

4.2

1.71)

2.0

Leu. mesenteroides

NW33920

1.38

3.76

6.0

2.18

+++

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.1)

Leu. mesenteroides

NW35418

1.613.836.02.17+++

5.80.89.2

3.51.61.91)

1)

1)

Not Detected

3-2 分離乳酸菌の増殖特性
Leu. mesenteroides は乳酸の他に酢酸やエタノールを生成するヘテロ型発酵を示す菌種である。Lb. curvatus と
Lb. sakei は糖濃度が高い環境では乳酸を主要に生成する条件付きヘテロ型発酵を示す菌種である（糖濃度が低くなると乳酸以外の代謝物も生成する）。今回、単離・同定された乳酸菌の特性を確認するために MRS 培地と大根破砕液中での増殖、発酵能を解析した。なお、解析は各漬樽から分離された乳酸菌種のうち代表的な 1 株を用いて行った(Table 2)。
分離されたいずれの菌株においても MRS 培地に接種した場合は良好な増殖を示した (Table 4)。特に Leu.
mesenteroides に分類された菌種についてはグルコースをほぼ完全に消費し切っており、約 10 g/L の乳酸と 2-4 g/Lのエタノールが生成された。Lb. curvatus、Lb. sakei に分類された菌種については主要な生産物として主に乳酸を生成し、その濃度はおおよそ 12 g/L であった。これらの結果は、菌種の特徴を反映していることから、同定結果と矛盾ないものである。

しかし、一方でいずれの菌株も大根破砕液での増殖性は乏しかった (Table 4)。Leu. mesenteroides に分類された菌種については OD600 が 0.2 程度まで増加したものの、Lb. curvatus、Lb. sakei では 0.05 程度までしか増加しなかった。大根漬液中で優勢だった菌種が破砕液で増殖性が乏しかった理由は不明ではあるが、調製時の加熱処理で必要な栄養素が失活した可能性、物理的破砕によって抽出される成分と原形質分離によって抽出される成分に差異がある可能性、培養初期に生育した微生物の代謝物を生育に要求する可能性が考えられ、これらについては今後詳細な調査が必要である。
3-3 乳酸菌スターターを用いた塩漬け大根の発酵単離した乳酸菌の大根塩漬けにおける性質を確認するため、大根の漬込みを行った際の発酵パラメーターの解析を行った。
漬込み 40 日目の主要な発酵パラメーターについて
Table 4 に示した。乳酸菌を接種しなかった群においては、乳酸生成は認められず、発酵によるガス産生も認められ大根塩漬けからの乳酸菌単離とスターターとしての検討なかったものの、Lb. curvatus もしくは Leu. mesenteroidesをスターターとして接種した群においては有意な乳酸生成と pH の低下が認められた。それぞれの試作品について官能評価を行ったところ、Leu. mesenteroides をスターターとして接種した群においては強い酸味が感じられた
一方で、Lb. curvatus 摂取群の酸味は穏やかであった。
これら菌株の摂取群で乳酸濃度こそ 3-4 g/L と同程度であったが、Leu. mesenteroides では 1.6 g/L の酢酸を含んでいた。これは一般的なストレートタイプの果実酢飲料と同レベルの酢酸含有量である。各有機酸と酸味の関係
は、これまでに種々の検討がなされており、同じ pH であれば乳酸より酢酸の方が酸味に与える影響は大きいとされている 6, 7)。これらの結果は大根塩漬けにおける酸味が、Leu. mesenteroides のような酢酸を生成するヘテロ発酵型乳酸菌に起因している可能性が考えられる。なお分離株の 1 種である Leu. mesenteroides NW33920 については粘性物質を生成するため、代謝物の分析が不能であった。
このように塩漬け大根に接種された Lb. curvatus と Leu.
mesenteroides については良好な発酵が認められた。また、
Lb. sakei 標準株である NBRC15893 接種群では乳酸生成は認められたものの、分離株である NW34625 の増殖は認められなかった。先の大根破砕液での増殖性も同様ではあるが、分離後の増殖試験で増殖が乏しい菌種がなぜ製造現場で優勢となっているのかは今後調査が必要と思われる。
4 結 言
本研究では、大根塩漬けより乳酸菌種の単離を行い、Lb. sakei、Lb. curvatus、 Leu. mesenteroides の単離に成功した。単離株のうち、Lb. curvatus と Leu. mesenteroides
は大根の漬込み環境下で良好な増殖を示したのに対して、分離した Lb. sakei 株の増殖性は乏しかった。また、

Leu. mesenteroides の生成する酢酸は最終商品に強い酸味をもたらす可能性が考えられる。
謝 辞
本試験を実施するにあたり製造現場からの乳酸菌分離を快く提供していただいた西和賀産業公社株式会社様に深く感謝いたします。また、分離に関わる実験補助にご協力いただいた阿部敏之氏、小笠原唯氏に深く感謝申し上げます。
文 献1) Pederson CS: Floral changes in the fermentation ofsauerkraut, New York State Agricultural Experiment
Station, 1930.
2) Shi NQ, Cruz J, Sherman F, Jeffries TW:
SHAM-sensitive alternative respiration in thexylose-metabolizing yeast Pichia stipitis, Yeast, 19, 1203–1220 (2002).
3) Tamakawa H, Ito Y: 16S rDNA genotyping using
PCR-RFLP analysis among lactic acid bacteria, J Jpn Soc
Food Sci (Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi), 64,355-364, 2017 (Japanese).
4) 小川敏男: 最新漬物製造技術, 食品研究社, 1986.
5) Felis GE, Dellaglio F: Taxonomy of lactobacilli andbifidobacteria, Curr issues intestinal microbial, 8, 44-61,2007.
6) Harvey RB: The relation between the total acidity, theconcentration of the hydrogen ion, and the taste of acidsolutions, J Am Chem Soc, 42, 712–714, 1920.
7) Johanningsmeier SD, McFeeters RE, Drake MA: A
hypothesis for the chemical basis for perception of sourtaste, J Food Sci, 70, 44-48, 2005.