Application NoteTotal protein（トータルタンパク質）によるノーマライズの方法

2023 年 05 月 10 日

1. 概要
ウェスタンブロッティングはターゲットタンパク質の検出をするために、最もよく使用されている方法です。ターゲットタンパク質の発現量の変化や、サンプル間における発現量の比較を検出するためには、ターゲットタンパク質の量を何らかの方法で定量する必要があります。一般的にウェスタン
ブロッティングのデータはサンプル間やレーン間でのバラつきがあります。そこで、それらの影響を最小限にするために、ある指標（リファレンス）を利用して補正します（ノーマライズ）。これまでノーマライズといえば、ハウスキーピングタンパク質（HKP) の発現量がリファレンスとして利用されてきました。しかし最近になって、ハウスキーピングタンパク質の発現量が組織や細胞種によって、また細胞周期や発生段階によって必ずしも一定ではないこと、その発現量もターゲットタンパク質のものとはかけ離れていることが指摘されるようになり、ノーマライズに使用する場合は十分注意する必要があるといわれるようになりました。そんな中、ハウスキーピングタンパク質に変わってノーマライズに使用できるリファレンスとして、Total protein（TP、トータルタンパク質、総タンパク質 ) が注目されてきています。
今回は、アトー製品などを使用したトータルタンパク質 によるデータノーマライズの方法をご紹介します。

ターゲットタンパク質の検出

ターゲット

ターゲット

輝度値 1,000 500 900 1,200 800

①

電気泳動

②

ウェスタンブロッティング③

データの解析

サンプル中に含まれるタンパク質は︖

ターゲットタンパク質は発現してるの︖

ターゲットタンパク質のバンドはどれ︖

電気泳動をするとサンプル中に含まれるタン
パク質がバンドに分かれます。しかし、ター
ゲットタンパク質が、どのバンドなのかは判別できません。

ウェスタンブロッティングをするとターゲッ
トタンパク質のバンドと量（輝度値）が分かります。分子量マーカーの移動度から、ター
ゲットタンパク質の分子量も推定できます。
しかし、どのサンプルで最も多く発現しているのかは判断できません。

電気泳動パターンとウェスタンブロッティン
グの検出バンドを重ねると、どのバンドがター
ゲットタンパク質なのかが判別できます。各
レーンのトータルタンパク質の情報をリファレンスとして、サンプル中にどのくらい含まれるのか、どのサンプルで最も多く発現しているのかなども解析可能になります。

なぜノーマライズは必要︖①

サンプル自体の不均一さ
生物種や組織・発生ステージによる違い、抽出方法などにより影響を受けます。

②③

アプライ量の不均一さ

タンパク質定量の方法や抽出溶媒の影響、アプライするときの手技などにより影響を受けます。

転写効率・検出効率・抗体反応の不均一さ

これらの影響を最小限にするため
ノーマライズは必要です

転写バッファーや転写方法、手技、抗体のタイターや希釈率や反応時間などにより影響を受けます。

④

複数のブロット間での比較

多検体を比較するときなど複数のブロットの発現量を比較するときに基準が必要になります。

ノーマライズのリファレンスには︖①

トータルタンパク質◆ EzLabel FluoroNeo, Cy5 などの蛍光色素により標識◆ステインフリーゲルの利用◆ブロッティング膜の染色（CBB、ポンソーなど）②

データノーマライズは
ターゲットタンパク質の発現量をリファレンスにより補正します

ハウスキーピングタンパク質◆ GAPDH、アクチン、チューブリンなどの発現量※ただし、ハウスキーピングタンパク質をリファレンスに使用するときは下記の注意が必要といわれています。
・実験条件によりリファレンスの発現量が影響されないこと
・リファレンスの発現量とターゲットタンパク質の発現量はかけ離れていないこと
・リファレンスの検出がターゲットタンパク質の検出を妨げないこと1ウェスタンブロッティングのノーマライズ
２. ノーマライズとは前述したようにタンパク質のサンプルは不均一な上に、同じサンプルを同じ量だけアプライして電気泳動をしたとしても、レーン間の差は生じます。
どんなに注意をしても、転写ムラや抗体反応のバラつきなども避けられません。そこで精度良く、再現性良く、定量的にウェスタンブロッティングを行う上で、ノーマライズというプロセスは必要不可欠になります。ウェスタンブロッティングのノーマライズでは、ターゲットタンパク質の輝度値を、リファレンスの輝度値から算出された各レーンの相対値（リファレンス比）で割って補正します。

ノーマライズによる定量
リファレンスの輝度値のレーン間での比（『リファレンス比』）を算出し、これをばらつきの補正係数とします。

[ リファレンス比（ref. 比）] ＝ [ 各リファレンスの輝度値 ] ÷ [ 最初の番号のレーンのリファレンスの輝度値 ]トータルタンパク質

ハウスキーピングタンパク質（A と B）
A

輝度値 10,000 4,000 9,500 15,000 9,000
ref. 比 1.0 0.4 0.95 1.5 0.9

輝度値 1,000 800
ref. 比 1.0 0.8

このレーンを 1 とした
ときの輝度値の比B

700 1,200 1100

輝度値 1,000 420

0.7ref. 比

1.2

1.1

1.0

850 1,700 1000

0.42 0.85 1.7

1.0

このレーンを 1 としたときの輝度値の比

各レーンのターゲットタンパク質のバンドの輝度値を『リファレンス比（ref. 比）』で割ってノーマライズします。

[ ノーマライズ値 ] ＝ [ レーン N のバンドの輝度値 ] ÷ [ レーン N のリファレンスバンド比（ref. 比）]ターゲットタンパク質

ターゲットタンパク質同じもの

輝度値 1,000 500 900 1,200 800
500 ÷ 0.4 ＝ 1250

ノーマライズ

ノーマライズ

ノーマライズ値 1,000 1,250 947
定量値

輝度値 1,000 500 900 1,200 800

800

888

1.0 1.25 0.95 0.8 0.89

ノーマライズ値
定量値

高値① トータルタンパク質によるノーマライズ
PVDF 膜に転写されたタンパク質量（トータルタンパク質）を

1,000 1,190 1060 700 800
1.0 1.19 0.95 0.7 0.8

高値
と低
値
が逆
転︖
︕

高値

トータ

ルタン
パ
と同 ク質
じ傾
向

ハウスキーピングタンパク質によるノーマライズ
GAPDH やアクチンなどのハウスキーピングタンパク質をリファレンスとしてノーマライズ

リファレンスとしてノーマライズした例です。トータルタンパ

した例です。ハウスキーピングタンパク質は比較的安定に発現していますが、組織により

ク質は、ある特定のタンパク質の発現量ではないため、普遍的発現量が異なる場合や、発現量がターゲットタンパク質よりも著しく高い場合、抗体の反応性がな指標といえます。抗体反応や転写ムラによる影響や、組織の良く過剰に検出される場合は、正確に補正できないことがあります。上記はハウスキーピングタ

違いなどによる影響も最小限に抑えられます。上記は最もター

ンパク質が過剰に検出される例（A）と理想的に検出される例（B）のイメージです。極端な例

ゲットタンパク質のシグナルが弱かったサンプルが、ノーマラですが、発現量が高いサンプルと低いサンプルが逆転する可能性を示しています。

イズした結果、最も多く発現している例を示しています。

2②

ノーマライズ

1,000 625 1290 1000 727
1.0 0.63 1.29 1.0 0.73
低値

1,000 500 900 1,200 800

3. 実験の流れ
下図はトータルタンパク質でノーマライズするための実験フローを示しています。トータルタンパク質 でノーマライズする場合、転写された PVDF
膜上のタンパク質バンドを視覚化する必要があります。PVDF 膜上のタンパク質を検出する方法は大きく分けて①サンプル標識、②ステインフリーゲ
ル、③転写後の膜染色があります。

①サンプル標識(EzLabel FluoroNeo など）

サンプル調製②ステインフリーゲル(Bio-rad Stain-Free ゲルなど）③転写後の膜染色( ポンソー、 CBB 染色など）

サンプル調製

サンプル調製

EzLabel FluoroNeo によりサンプル調製

EzApply によりサンプル調製

EzApply によりサンプル調製

調製済み泳動サンプルの標識は不可能
還元剤を含む場合は前処理が必要

調製済みの泳動サンプルも使用可能
有色マーカーや標識サンプルは検出不可

調製済み泳動サンプルも使用可能
有色マーカーや標識サンプルも使用可能

WSE-7010 EzLabel FluoroNeo

AE-1430 EzApply

イージーラベルフルオロネオ

2,000 サンプル用

サンプル調製＆標識
タンパク質の蛍光標識
Ex:330,470nm Em:530nm
SDS 処理と蛍光標識が同時にできます

イージーアプライ5mL × 5 本

電気泳動
ステインフリーゲルは自作可能

参考文献 C.L. Ladner et al. / Analytical
Biochemistry 326 (2004) 13–20

ゲルは自作でも既製ゲルでも OK ︕

ゲルは自作でも既製ゲルでも OK（特殊なゲルも使用可能）

Activation（標識）トランスファー

タンパク質の蛍光標識

PVDF 膜推奨

Ex:300nm Em:420nm
UV 励起 1-5 分（特殊なゲルも使用可能）

5mL × 5 本

電気泳動

ステインフリーゲルを使用

電気泳動

バンド検出 ( 蛍光）バンド検出 ( 蛍光）泳動像の確認

泳動像の確認UV 励起
UV カットフィルターまたは 535BP フィルター

Blue/Cyan 励起
オレンジ (YA-3) フィルターまたは 595BP フィルター

トランスファー

AE-1430 EzApply

イージーアプライ

WSE-4050/1/2/3/4
クリアブロット ‣P+ 膜
20 枚入り膜の染色
ポンソー、 CBB 染色など

WSE-7160
EzStain AQua MEM

トランスファー

タンパク質検出用 CBB 染色脱色キット

低蛍光の PVDF 又はニトロセルロース膜推奨

低蛍光の PVDF 又はニトロセルロース膜推奨

WSE-4060/1/3/4
クリアブロット P 膜（低蛍光）WSE-4060/1/3/4
クリアブロット P 膜（低蛍光）10 枚入り10 枚入りバンド視覚化（染色）膜の脱色

転写効率の確認トータルタンパク質検出

転写効率の確認トータルタンパク質検出

バンド検出 ( 蛍光）バンド検出 ( 明視野）

Blue/Cyan 励起
オレンジ (YA-3) フィルターまたは 595BP フィルター

UV 励起
UV カットフィルターまたは 535BP フィルター

庫内照明（白色落射光源）ND フィルター

バンド検出 ( 蛍光）転写効率の確認トータルタンパク質検出

ブロッキングブロッキングブロッキング

抗体反応

抗体反応

抗体反応

検出

検出

検出

ウェスタンブロッティングのデータノーマライズ解析
今回は上記のうち、①サンプル標識と②ステインフリーゲルの実験方法に関して説明します。またウェスタンブロッティングの結果のノーマライズ解析
に関して、アトーの画像解析ソフト CS Analyzer 4 を使用した方法を簡単にご紹介します。

3

EzLabel FluoroNeo を使用したトータルタンパク質 の検出
4. サンプル標識によるゲル染色フリー
4-1.

サンプル調製 （EzLabel FluoroNeo）

EzLabel FluoroNeo は SDS サンプルバッファーの代わりに使うだけで、タンパク質の蛍光標識と電気泳動用サンプル調製ができます。電気泳動後のゲルは、染脱色不要で、すぐにバンドが蛍光検出できます。

実験材料︓

組織・細胞・細菌等
EzLabel FluoroNeo （WSE-7010）
マイクロ遠心チューブ、チップ等
遠心機、マイクロピペット等

実験方法︓① EzLabel FluoroNeo を使用して電気泳動サンプルを調製します。40 µL のタ
ンパク質サンプルにキット添付の 10 μ L の Sample buﬀer (5x conc.)と Labeling reagent を 0.5 μ L 添加して混合します。

蛍光標識終了
標識反応

還元処理

95℃ 3 分間95℃ 3 分間

ラベル化剤

4-2.

完成︕

② 95℃で 3 分間加熱します（煮沸でも OK）。
③ ②の混合液に Reducing agent (DTT) を 2 μ L 添加して混合します。
④ 95℃で 3 分間加熱します（煮沸でも OK）。
※作製したサンプルは -20℃で遮光保存可能です。
※サンプル中に還元剤が含まれると蛍光標識反応を著しく妨げる原因となります。そのため標識後に還元処理（ステップ③～④）をします。

DTT

電気泳動

EzLabel FluoroNeo で標識した電気泳動サンプルは、一般的なゲル、泳

実験材料︓

動バッファー、泳動条件で分離できます。ここでは既製ゲル（ePAGELHR) を使用した、高速電気泳動に関してご紹介します。
高速泳動対応既製ゲル
ePAGEL-HR

EzLabel FluoroNeo で調製した泳動サンプル
既製ゲル（ePAGEL-HR など）
泳動バッファー（AE-1410 EzRun など）
電気泳動装置、電源、チップ等

実験方法︓① ePAGEL-HR を PageRun Ace（電源付電気泳動装置）にセットします。
② １レーンあたり 5 ～ 10 μ L のサンプルをアプライします。
※サンプル濃度は精製タンパク質では 100ng ～ 1 μ g/lane、抽出液では 1 ～ 50 μ g/lane が適当です。
③ スタートボタンを押して電気泳動を開始します。
※ High mode (24W) で約 35 分間、もしくは Standard mode (20mA/gel) で約 80 分間泳動します。

+
タッチパネル電源
WSE-3100
PowerStation Ghibli I

4-3.

※ 外部電源を使用する場合は、300V で約 35 分間、もしくは 150V で
約 75 分間泳動します。
ラピダスミニスラブ
WSE-1165
電気泳動装置

電源付電気泳動装置
WSE-1150
PageRun Ace④ 泳動先端 ( 色素ライン ) がゲルの下端から 5-10 mm 上まで泳動された
ら、出力を止めて終了します。
※サンプルの溶媒に Tris などのアミノ基が含まれると、非特異的なシグナルが出る原因になります（ゲルの蒸留水洗浄により消えます）。

電気泳動パターンの確認 ( 蛍光検出 )EzLabel FluoroNeo を使用した電気泳動後のゲルは、すぐに、Blue LED

実験材料︓

あるいは Cyan で励起することにより、バンドパターンを確認できます。

泳動後のゲル（EzLabel FluoroNeo 使用 )LuminoGraph III もしくはLuminograph I/II などの撮影装置
Cyan (CyanoView) もしくはBlueLED (VariRays) 光源 とフィルター

[

[

実験方法︓

染脱色操作不要︕① 泳動終了後のゲルを泳動槽から外し、ゲルプレートを外さずに、水道水でガラス表面を軽く洗浄し、水気をペーパータオルで拭きとります。

すぐに検出︕② 撮影装置と光源、フィルターを準備します。
撮影装置
撮影装置
LuminoGraph III

LuminoGraph I/II など
ゲル :

EHR-T520L

サンプル : HeLa および HepG2 細胞抽出液の 1/2 希釈系列
撮影装 :Cyan 光源
CyanoView

4

LuminoGraph III

フィルター
YA-3（560LPF)

もしくはCyanoView
Blue LED

もしくはCyan 光源もしくはオレンジフィルター

BPF595もしくはBPF535[Ex: 330 (UV), 470 nm, Em: 530 nm]

LuminoGraph III

撮影条件︓Blue LED 光源BPF595 フィルター
1 秒 露光

光源
VariRays (Blue)③

ゲルをプレートごと光源照射面に置いて撮影します。

4-4.

転写

通常の転写条件で転写できます。PVDF 膜は、自家蛍光の低い蛍光検出用の PVDF 膜の使用が望ましいですが、一般的な PVDF 膜でも検出可能です。特に Blue LED 光源で検出する場合は、自家蛍光の影響が低減できます。ここでは高速転写バッファー（EzFastBlot）を使用した、
高速転写に関してご紹介します。

Powered BLOT 2M－

ろ紙 2~3 枚ゲル
PVDF 膜ろ紙 2~3 枚

電極板陽極側 ＋

実験方法︓② 蛍光検出後のゲルを EzFastBlot で洗浄し、陽極側（下）からろ紙 (0.9mm厚）2 ～ 3 枚、PVDF 膜、ゲル、ろ紙 2 ～ 3 枚の順に重ねます。ろ紙は重ねる直前に EzFastBlot に充分浸漬します。
※空気を専用ローラーを使って押し出し、ろ紙、膜、ゲルを密着させます。
③スタートボタンを押してトランスファーを開始します。
※ Rapid mode で 10 ～ 15 分通電します。

転写バッファーと転写条件

EzBlotCat#

AE-1460

転写条件

4-5.

2 mA/cm2
60 min(~40V)

EzFastBlot
HMW

EzFastBlot

泳動後のゲル（WSE-7010 EzLabel FluoroNeo 使用 )転写バッファー（AE-1465 EzFastBlot など）
PVDF 膜 ( クリアブロット P 膜 ( 低蛍光 ) など）
ブロッティング装置（PoweredBLOT 2M など）
遠心機、マイクロピペット等① あらかじめ PVDF 膜をメタノールで親水化処理し（5 秒）、EzFastBlot に浸漬します（15 分以上振とうします）。

セッティング方法
電極板陰極側

実験材料︓※ 外部電源を使用する場合は、24V で約 10 ～ 15 分間、もしくは 12V
で 約 30 分間転写します。

EzRun TG
(Towbin 法）

AE-1465

WSE-7210

WSE-7055

20~25V c.v.
5~15 min(500mA/gel)

25V c.v.
15~30 min
(500mA/gel)

2 mA/cm2
60 min(~40V)

転写効率の確認 ( 蛍光検出 )EzLabel FluoroNeo で調製したサンプルは、転写後の PVDF 膜上のバンドもゲルと同様に蛍光検出できます。EzLabel FluoroNeo の蛍光強度は、
タンパク質濃度と相関しているため、PVDF 膜上のタンパク質バンドのシグナル強度をトータルタンパク質としてノーマライズに利用することが可能です。ノーマライズに関しては 8 ページ『6. トータルタン
パク質によるノーマライズ』を参照してください。
各レーンの全バンドのシグナル⇒トータルタンパク質

実験材料︓

転写後の PVDF 膜（EzLabel FluoroNeo 使用 )LuminoGraph III もしくはLuminograph I/II などの撮影装置
Cyan (CyanoView) もしくはBlueLED (VariRays) 光源 とフィルター

[

実験方法︓
① 転写終了後の PVDF 膜を蒸留水等で軽く洗浄します。
② 撮影装置と光源、フィルターを準備します。
撮影装置
LuminoGraph I/II など③

PVDF 膜 : クリアブロット P+ 膜

サンプル中の夾雑物やアミノ酸由来の非特異的なシグナル
TCA 沈殿で除去可能
水洗でも軽減可能

撮影装 :

と紹介
ちょこっ
品
関連製

EzLabel FluoroNeo

もしくはCyanoView

もしくはCyan 光源もしくはオレンジフィルター

BPF595もしくはBPF535

PVDF 膜を光源照射面に置いて撮影します。
※ PVDF 膜は汚れないように十分注意して取り扱ってください。ピタットクリア（2322438）に挟むと、蛍光検出に影響を与えずに、汚れから保護できます。
※ PVDF 膜は乾燥した方が、蛍光シグナルを強く明瞭に検出できます。
乾燥した PVDF 膜はメタノールで親水化処理をした後に、ブロッキング、
抗体反応に進んでください。

15
7.5
4
2
1
0.5
0.3

イージーラベルフルオロネオ✔
✔
✔

EzStainSilver

EzStainAQua

フィルター
YA-3（560LPF)

EzLabel FluoroNeo の検出感度
50
0
25
0
12
5
63
31

Transferrinng/LaneLuminoGraph III

撮影条件︓ BlueLED 光源BPF595 フィルター
0.1 秒 露光光源
VariRays (Blue)

Blue LED

LuminoGraph III

撮影装置
LuminoGraph III

[

✔
✔
✔

サンプル調製 & 蛍光ラベル
ゲル染色フリー ‼
電気泳動後すぐに蛍光検出︕
Cyan, Blue LED, UV 光源対応
Ex: 330 (UV), 470 nm, Em: 530 nm
銀染色レベルの検出感度
ラベル後のバンド移動度の変化なし
ウエスタンブロッティング可能名称

EzLabel FluoroNeo

型式・コード WSE-7010・2332333

キット内容

Sample buﬀer (5x): 12 mL
Labeling reagent: 10 mg
Reducing agent (DTT): 300 mg
MW marker : 600 μ L
RIPA Lysis buﬀer: 10 mL

保 存

冷凍 -20℃

１年 （未開封時）

CBB

5

ステインフリーゲルを使用したトータルタンパク質 の検出
5. ステインフリーゲル
5-1.

サンプル調製（EzApply)

実験材料︓ステインフリーゲルを使用する場合も、電気泳動サンプルは通常の方法で調製します。有色マーカーは検出できないので、無色マーカーを併用します。

組織・細胞・細菌等
SDS サンプルバッファー（AE-1430 EzApply）
マイクロ遠心チューブ、チップ等
遠心機、マイクロピペット等

実験方法︓① 50 μ L のサンプルに 50 μ L の EzApply（2 ×濃度、DTT 添加済み）
を加えて混合します。

完成︕② 小型ブロックインキュベータ WSC-2610 MyMiniBlock で 95℃
5 分間加熱します（煮沸でも OK）。

SDS 付加＆還元処理③ 15,000rpm で 5 分間遠心し（しなくても OK）上清を回収します。

95℃ 5 分間※作製したサンプルは -20℃で保存可能です。

SDS サンプルバッファーと混合（EzApply など）

5-2.

電気泳動

ステインフリーゲルを使用して泳動します。プレキャストゲルを使用する場合は、取扱説明書に従ってください。ここでは、自作ステインフリー
ゲルを作製し、泳動する方法を紹介します。
ステインフリーゲル作製方法の詳細は下記 Ladner らの文献を参照して
ください。
参考文献
C.L. Ladner et al., Analytical Biochemistry 326 (2004) 13–20
Visible fluorescent detection of proteins in polyacrylamide gelswithout staining

ゲル組成表

分離ゲル

実験材料︓

泳動サンプルステインフリーゲル
泳動バッファー（AE-1410 EzRun など）
電気泳動装置、電源、チップ等（自作する場合）30(w/v)% アクリルアミド / ビス (29:1) 溶液
ゲル緩衝液（WSE-7310 EzGelAce)
過硫酸アンモニウム (APS)
TEMED

実験方法︓

① ゲル作製器を組み立てます。組み立て方法はご使用になる作製器の取扱説明書に従ってください。
② 左記のゲル組成表を参照して、分離ゲルと濃縮ゲルのゲル溶液を APSと TEMED 以外の試薬を混合して調製します。重合開始直前に APS とTEMED を添加して、ゲルを作製します。

濃縮ゲル

ゲル濃度

7.5％

10 ％

12.5％

15%

4.5％

蒸留水

5 mL

4.2 mL

3.3 mL

2.5 mL

3 mL

30% A.A/BIS*

2.5 mL

3.3 mL

4.2 mL

5 mL

0.75 mL

EzGelAce

2.5 mL

2.5 mL

2.5 mL

2.5 mL1.25 mL

TCE**

0.05 mL

0.05 mL

0.05 mL

0.05 mL

0.05 mL

10% APS

0.075 mL

0.05 mL

0.05 mL

0.05 mL

0.05 mL

TEMED

0.005 mL

0.005 mL

0.005 mL

0.005 mL

0.005 mL

③ ゲルを PageRun Ace（電源付電気泳動装置）にセットします。
④ １レーンあたり 5 ～ 10 μ L のサンプルをアプライします。
※サンプル濃度は精製タンパク質では 100ng ～ 1 μ g/lane、抽出液では 1 ～ 50 μ g/lane が適当です。
⑤ スタートボタンを押して電気泳動を開始します。
※ High mode (24W) で約 35 分間、もしくは Standard mode (20mA/gel) で約 80 分間泳動します。
※ 外部電源を使用する場合は、300V で約 35 分間、もしくは 150V で
約 75 分間泳動します。
⑥ 泳動先端 ( 色素ライン ) がゲルの下端から 5-10 mm 上まで泳動された
ら、出力を止めて終了します。

*30% A.A/BIS: 30(w/v)% アクリルアミド / ビス (29:1) 溶液**TCE: 2,2,2- トリクロロエタノール (CAS 番号 : 115-20-8)
上記組成表はミニゲル 1 枚あたりに必要な容量です。

と紹介
ちょこっ
品
関連製

HorizeBLOT 2M/4M

ホライズブロット 2M/4M✔ 4 点バネ方式で強力かつ均等な押圧でゲル＆膜を密着固定✔ 転写流れ・ムラなどのリスクを最小限に低減✔ 最短５分の高速転写対応（2 枚のミニゲル、1 枚のワイドゲル）✔ 装置の操作性・データの再現性向上
WSE-4025
HorizeBLOT2M

電源付でもっと簡単！

４点バネ方式
WSE-4125
パワードブロット２M

6

名称

ホライズブロット 2M

ホライズブロット 4M

型番・コードWSE-4025

WSE-4045

転写方式

ミニゲル 2 枚、ワイドゲル 1 枚

ミニゲル４枚、ワイドゲル２枚

転写サイズ

205(W) × 100mm(H)

205(W) × 200mm(H)電極板

陽極 耐腐食性白金めっきチタン板

寸法・質量

246 × 145 × 92mm・1.8kg

2322466

2322476

陰極 ステンレス
246 x 235 × 92mm・3kg

5-3.

検出

電気泳動後のゲルは、すぐには蛍光検出できません。タンパク質を可視化するために、ゲルを直接 UV 照射装置の上に置き、約 1 分間照射します。
UV 波長は 312nm を使用します。いったん UV 照射で可視化したゲルの蛍
光は比較的安定なので、蒸留水等でリンスしてゲルの状態を整えてから撮影すると、きれいな画像が得られ、電気泳動パターンが確認できます。

実験材料︓

泳動後のゲル（ステインフリーゲル使用 )LuminoGraph III もしくはLuminograph I/II などの撮影装置[UV 光源 (312nm) とフィルター］

実験方法︓ゲルの可視化
① 泳動終了後のゲルを、ゲルプレートを外さずに水でガラス表面を軽く洗浄し、ペーパータオルで水気を拭きとります。
② UV 照射装置の上に蒸留水を 1~5mL 滴下します。

UV 照射で標識︕③ ゲルをプレートから外し、UV 照射装置に滴下した水滴の上に載せます。

ステインフリーゲル※ゲルをリンス・洗浄しないでください。シグナルが弱くなります。
※ UV の波長が異なると可視化されない原因になります。
※ UV 照射光源を直視・接触しないようにご注意ください。

撮影装置 LuminoGraph IIIの UV 照射面

ゲル :

《参考》

サンプル : HeLa および HepG2 細胞抽出液の 1/2 希釈系列

プレキャストゲルの泳動パターン
サンプルと撮影条件
は右記と同等

︕

危険

5-4.

10% 自作ステインフリー
ゲル

撮影装 :

LuminoGraph III

撮影条件︓ UV 光源BPF535 フィルター
2 秒 露光UV を直視した場合、失明や皮膚の炎症などの危険性があります。保護眼鏡・手袋・防護服をご使用ください。

※ゲルを可視化するための工程なので、照射面にゲルを整えて置く必要はありません。またゲルが破れやすいので注意していください。
④ UV 照射装置を点灯し、ゲルを約 1 分間、照射します。
⑤ UV 照射後、蒸留水等でリンスしてゲルの状態を整える。
ゲルの撮影⑤ 撮影装置の UV 光源とフィルターをセットします。
撮影装置

光源

フィルター

LuminoGraph I/II など

UV (312nm)

SWP フィルター (UV/ 近赤外カット )LuminoGraph III

UV (312nm)

BPF535⑥ ゲルを UV 照射面もしくは専用のトレイに置いて撮影します。
※ UV 照射面をきれいにしてから撮影してください。
※ UV 照射面の水垢汚れはくえん酸水溶液を使用すると落とせます。

転写

PVDF 膜は、自家蛍光の低い蛍光検出用の PVDF 膜を使用します。転写方法は 5 ページ『4-4. 転写』を参照してください。

5-5.

転写効率の確認 ( 蛍光検出 )

可視化処理をしたステインフリーゲルは、転写後の PVDF 膜上のバンドもゲルと同様に蛍光検出できます。PVDF 膜上のタンパク質バンドのシグナル強度をトータルタンパク質としてノーマライズに利用することが可能です。ノーマライズに関しては 8 ページ『6. トータルタン
パク質によるノーマライズ』を参照してください。

実験材料︓

実験方法︓

転写後の PVDF 膜（ステインフリーゲル使用 )LuminoGraph III もしくはLuminograph I/II などの撮影装置[UV 光源 (312nm) とフィルター］① 転写終了後の PVDF 膜を蒸留水等で軽く洗浄します。
② 撮影装置の UV 光源、フィルターを準備します。

各レーンの全バンドのシグナル⇒トータルタンパク質

撮影装置

光源

フィルター

LuminoGraph I/II など

UV (312nm)

SWP パスフィルター (UV/ 近
赤外カット )

LuminoGraph III

UV (312nm)

BPF535③

PVDF 膜を UV 照射面もしくは専用のトレイに置いて撮影します。
※ PVDF 膜は汚れないように十分注意して取り扱ってください。
※ UV 照射により励起する場合、PVDF 膜は濡れている方が、バックグ
ラウンドが低くなり、バンドを明瞭に検出できます。撮影中に乾燥しな
いようにご注意ください。

PVDF 膜 : 低蛍光用 PVDF 膜
撮影装 :LuminoGraph III※ピタットクリアやラップに挟むと、バックグラウンドが高くなる場合がありますので、ご注意ください。

撮影条件︓ UV 光源BPF535 フィルター
1 秒 露光
撮影装置
LuminoGraph III

7

トータルタンパク質 によるノーマライズ方法
6. トータルタンパク質によるノーマライズの方法
6-1.

トータルタンパク質によるノーマライズ

EzLabel FluoroNeo やステインフリーゲルなどを使用して検出したトータルタンパク質をリファレンスとしてノーマライズします。リファレンスにはPVDF 膜上の各レーンの転写されたタンパク質の総量（輝度値）を使用します。

6-2.

ノーマライズの手順

スポット計測によりノーマライズ

EzLabel FluoroNeo を使用する場合も、ステインフリーゲルを使用する場合も、同様の方法で画像を解析します。ノーマライズに必要な画像は PVDF 膜上に転写されたトータルタンパク質のバンド ( 蛍光像または色素染色した場合は明視野像 ) と抗体反応後のターゲットタンパク質のバンド ( 発光像ある
いは蛍光像など ) です。まず PVDF 膜上のトータルタンパク質の各レーンのバンド全体のシグナル強度を、続いてターゲットバンドのシグナル強度を定量します。ここでは画像解析ソフト CS Analyzer
4 を使用して解析する方法を紹介します。解析手順としては① ~ ③の手順で行います。
① PVDF 膜上のトータルタンパク質検出画像のスポット解析② ターゲットタンパク質の検出画像のスポット解析③ ノーマライズ計算

6-3.

①トータルタンパク質の解析②ターゲットタンパク質の解析③ノーマライズ計算

トータルタンパク質の解析

まずノーマライズ換算するためのリファレンスとなるトータルタンパク質を検出した蛍光撮影画像をスポット解析します。

CS Analyzer 4.0 を
起動します

①

ウェスタンブロッティングのノーマライズでは主にスポット解析を使用します。

各レーンの輪郭を囲む
各レーンの輪郭を『領域設定』⇒『四角』あるいは『ポリゴン』などを選択して囲みます。レーンが曲がっているときは、『ポリゴン』の方がより正確に囲むことができます。
またレーンの輪郭を囲む際は、泳動先端が含まれないようにします。泳動先端にはBPB などの色素由来の非特異的なシグナルなどが含まれており、トータルタンパ
ク質量を必ずしも反映しません。特に EzLabel FluoroNeo でラベルした場合は、ゲル濃度が高いとサンプル中の夾雑物やアミノ酸由来の非特異的シグナルが泳動先端に検出されますので、その部分を除いて囲みます。
CS Analyzer 4 でノーマライズ解析する際は、リファレンスタンパク質の解析デー
タとターゲットタンパク質のレーン番号が一致している必要があります。

ステインフリーゲル

EzLabel FluoroNeo『ポリゴン』を使用するとレーンがゆがんでいても囲めます。

サンプル中の夾雑物
やアミノ酸由来の非特異的なシグナル※ TCA 沈殿などにより、あらかじめ除去することも可能です。

非特異的シグナル

8

『ポイント』により設定②

バックグラウンドの設定①で囲んだ領域以外の PVDF 膜の余白部分にバックグラウンドを設定します。『四角』や『領域選択』でスポットと同様の領域を設定する、または『ポイント』によりレーン以外の余白に複数のポイントを設定する、などの方法があります。

③

解析およびデータ保存
解析ボタンをクリックしてバンドのシグナル強度を数値化し、さらに『解析情報保存』ボタンをクリッ
クして解析結果を保存します。解析後のデータは CSV 形式でも出力できます。

計測結果が表示される。コピー＆ペースト、もしくは CSV 形式での出力、解析データの保存が可能

6-4.

ノーマライズにデータを使用する場合は、必ず、解析情報を保存する。

ターゲットタンパク質の解析

次に抗体反応によりターゲットタンパク質を検出した発光（蛍光など）撮影画像をスポット解析します。解析方法はトータルタンパク質の解析方法と同様です。
①

バンドの輪郭を囲むスポット解析により、ターゲットタンパク質のバンドの輪郭を『四角』あるいは『ポリゴン』を選択して囲みます。特に発光撮影像はコントラスト
によりバンドの強さと大きさが影響されますので、ある程度コントラストを上げた状態でバンドを囲むようにします。また、このとき、トータルタ
ンパク質解析で設定したレーンの番号と解析する対象のバンドの番号は同
じにしてください。ターゲットのバンド番号とノーマライズするレーン番
号がずれると、バンド番号と同じ番号の別レーンのデータで誤った補正がされることになります。

②

ターゲットタンパク質のバンドを囲む。
（トータルタンパク質で設定した全レーン）
バンドは、やや縦長に囲みますシグナルがなくても、リファレンスで選択したレーンの相当部位を囲みます

バックグラウンドの設定①で囲んだ領域以外の PVDF 膜の余白部分にバックグラウンドを設定します。『四角』や『ポリゴン』でスポットと同様の領域を囲むか、『ポイント』
を利用してレーン以外の余白に複数のポイントを設定します。

『領域選択』によりバックグラウンド設定

と紹介
ちょこっ
品
関連製

LuminoGraph Ⅲ ルミノグラフⅢ
最高の画質でデータを残せるハイエンドケミルミ撮影装置✔ 10 インチタッチパネル制御による簡単操作✔ 超高感度・高解像度 6 メガピク
セル冷却 CCD カメラ搭載✔ 蛍光・発光・可視光など多種多様なサンプルの撮影に対応✔ オートフォーカス・自動露光・積算撮影など多彩な撮影モード✔ フラットフィールド・ディスト
レーション補正・ダークイメー
ジ処理対応

名称

WSE-6300H-CP LuminoGraph Ⅲ

カメラ

絶対感度校正 高感度・高解像度冷却 CCD カメラ
画素数 2750 × 2200

レンズ

F0.8

制御

10 インチタッチパネルからの制御

蛍光励起光源
可視光

オートフォーカス（電動制御）

落射 LED︓Blue(472nm)/Green(528nm)/Red(615nm)
落射 LED︓Cyan(505nm)
透過 UV︓312nm
白色透過光源 (LED)フィルター

電動ホイール方式 5 ポジション
535nmBPF / 595nmBPF / 680nmBPF / ND フィルター

撮影サイズ

10 × 7.5cm / 14 × 10cm / 18 × 13cm / 26 × 20cm
4 ポジション・オートフォーカス

保存画像形式

原画像︓16bit TIFF（8bit 別名保存可能）USB/ 本体内蔵メモリ

寸法
電源・消費電力

472mm(W) × 480mm(D) × 802mm(H）, 76 kg
AC100-240V

50/60Hz200W

9

トータルタンパク質 によるノーマライズ方法③

ノーマライズ解析
ターゲットタンパク質のバンドを囲み、バックグラウンドを設定したら、『解析』ボタンをクリックしてシグナル強度を数値化します。

計測結果が表示される。コピー＆ペース
ト、もしくは CSV
形式での出力、解析
データの保存が可能

解析ボタンをクリック『ノーマライズ』ボタンをクリックして、リファレンスタ
ンパク質（トータルタンパク質）の解析データを呼び出します。

ノーマライズをクリック

リファレンス解析
データを選択する

リファレンスタンパク質の解析データが表示されますので、ノーマライズするバンドと同じ番号のトータルタンパク質のレーンをクリックして選択し『OK』します。ノーマライズの計測結果は、コピ－ & ペースト、CSV 形式での出力、もしくは解析データとして保存できます。
ターゲットタンパク質の解析中デ－タノーマライズ後の計測結果

バックグラウンドに指定した領域②解析ボタンをクリックする。

①ターゲットタンパク質のバンドを囲む。
（トータルタンパク質で設定した全レーン）③ノーマライズボタン

をクリックし、トータ
ルタンパク質（もしくは HKP）の解析データを呼び出す。

ノーマライズに使用するトータルタンパク質の解析済デ－タ⑤ノーマライズ後の計測
結果（ノーマライズ値）
が表示される。計測結果
は直接コピー＆ペースト、CSV 形式による出力、もしくは解析データとして保存できる。

同じ番号のレーンを選択する④解析するターゲットタンパク質のバンドの番号と同じレーンを選択する。

④

ノーマライズ値の定量解析
ノーマライズ結果を相対値として換算する場合は『定量』ボタンをクリックします。基準となるバンドをクリックして選択し『OK』します。『ノーマライズ値』を選択し、『１（もしくは任意の数）』と入力します。ノーマライズ値が相対値として換算されますので、コピ－＆ペースト、CSV 形式による出力、もしくは解析データとして保存します。
ノーマライズ後の相対値換算

定量ボタンをクリックし、基準となるバンドを選択する（相対値として『１』になる）。

ノーマライズ後の計測結果

平均輝度︓指定した領域の輝度の平均値（ノーマライズ前）
積算値︓指定した領域の輝度の総和（ノーマライズ後）
定量値（ノーマライズ値）
︓ノーマライズ後の積算値の相対値
ノーマライズ値︓ノーマライズ後の積算値『ノーマライズ値』を選択し、相対値として『１』を入力する。

10

Ref. スポット比︓リファレンスとなるトータルタンパク質の相対比ノーマライズ解析結果
7. ノーマライズ解析結果
7-1.

トータルタンパク質とハウスキーピングタンパク質によるノーマライズ定量結果の比較

下図は EzLabel FluoroNeo でラベルした HeLa 細胞抽出液からウェスタンブロッティングにより SMAD2 タンパク質を検出したデータです。1/2 希釈系
列したサンプル中の SMAD2 タンパク質の発現量を、トータルタンパク質およびハウスキーピングタンパク質でノーマライズした結果を示しています。

直線性ダイナミックレンジ
ハウスキーピングタンパク質も①相関性・直線性のある領域

ターゲットの撮影画像

ノーマライズ後の定量結果

ターゲットタンパク質
SMAD2①相関性・直線性のある領域

ハウスキーピングタンパク質も理 論 値 「1」 に近い値を示す[ ノーマライズ値 ]＝[ バンドの輝度値 ][ リファレンスバンド比 ]ハウスキーピングタンパク質はハウスキーピングタンパク質はリファレンスの撮影画像②相関性・直線性のない場合

ハウスキーピングタンパク質
GAPDH②相関性・直線性のない場合

トータルタンパク質
HeLa 細胞抽出液

理論値から外れた値を示す

上図①のようにターゲットタンパク質とリファレンスタンパク質の検量線が直線で相関性が高い場合は、トータルタンパク質でもハウスキーピングタンパク質でも、ノーマライズした結果は理論値の 1 に近い値を示します。しかし一般的に②のようにハウスキーピングタンパク質は発現量が豊富なため、ターゲットタンパク質とは検量線の直線性ダイナミックレンジが異なります。そのためハウスキーピングタンパク質によりノーマライズした結果は理論値から外れる場合があります。

7-2. EzLabel FluoroNeo とステインフリーゲルによるサンプル標識の比較
EzLabel FluoroNeo とステインフリーゲルにより検出したバンドを、ゲル、転写後の PVDF 膜の蛍光検出像（膜 _ 蛍光）、と CBB 染色像（膜 _CBB) で比較した結果を示しています。バンドを比較しやすいように、各イメージをグレースケールで表示しています。

膜

_

ル

膜

ゲ

_
蛍
光
_C
BB
膜

ル
ゲ

膜

BB

光
蛍
_

_C

膜

ル
ゲ

膜

蛍
光
_C
BB

_

膜

ル
ゲ

膜

蛍
光
_C
BB

ステインフリーゲル

EzLabel FluoroNeo『膜 _ 蛍光』のレーンは、EzLabel FluoroNeo もしくはステインフリー
ゲルの蛍光色素で標識されたバンドを検出した結果を示しています。EzLabel FluoroNeo で検出すると（左図）、泳動先端にサンプル中のアミノ酸などに由来する非特異的なシグナルが見えますが（赤丸で表示）、検出されるバンドの数やシグナルの強さは、ほぼ同

*
白黒表示

白黒表示

*
*
*
サンプル中の夾雑物やアミノ酸由来の非特異的なシグナル

*
*
*
*

*

等です。EzLabel FluoroNeo は第１、第２アミンが標識されるため、ほぼ全てのタンパク質が同等に標識されるためです。一方、ステインフリーゲルはアミノ酸のうちトリプトファンが標識されるため、トリプトファンの有無や数によりシグナルの強さが変わりま**す（右図）。そのため、蛍光検出と CBB 検出でバンドパターンがやや異なります。 ＊ で示したバンドは、蛍光検出と CBB 検出で検出感度が顕著に異なるバンドを示しています。

蛍光検出されるバンドパターン
は CBB 染色とは異なる（＊）

11

関連製品
主な既製ゲル
コードNo.

製品名

ゲル濃度

分画範囲

検体数

アプライ量

2331970

EHR-T520L

5-20%

5～400kDa

14検体

最大24μL

入数

価格

ミニサイズゲル、Tris/Glycine系
他 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 10-20%

2332070

EHR-R520L

5-20%

5～400kDa

18検体

最大18μL

10枚

17,400円

2332260

P-T16.5S

16.5%

1～75kDa

14検体

最大24μL

2332265

P-R16.5S

16.5%

1～75kDa

18検体

最大18μL

ミニサイズゲル、Tris/Tricine系
低分子ペプチド分離用

10枚

20,400円

2331605

CHR-520L

5-20%

5～400kDa

15検体

最大7.5μL

コンパクトサイズゲル、Tris/Glycine系
他 7.5%, 10%, 12.5%, 15%

10枚

20,400円

2331695

CP16.5S

16.5%

1～75kDa

15検体

最大7.5μL

コンパクトサイズゲル、Tris/Tricine系低分子ペプチド分離用

10枚

20,400円

2332240

M-520L

5-20%

5～400kDa

30検体

最大20μL

ワイドゲルサイズ、Tris/Glycine 系

6枚

17,400円

電気泳動用ランニングバッファー
コードNo.

型式名称

数量

2332310

AE-1410 EzRun

1袋

10 L分の粉末 Tris-Glycine-SDS 高速泳動対応5,720円

価格

2332325

AE-1415 EzRun T

1袋

5L分の粉末 低分子用 Tris-Tricine-SDS 高速泳動対応8,250円

2332326

WSE-7065 EzRun MOPS

1本

20×濃縮溶液

8,250円

250mL/容器 Tris-MOPS-SDS さらに高速・広範囲分子量域分離が可能

分子量マーカー

5

3.5
1

kDa

10

kDa

15

6.5
25
20

14
35

1組

17

WSE-7020 EzProtein Ladder
250μL×2本 SDS-PAGE用有色マーカー

452332346

60

1本

75

WSE-7025 EzStandard LMW
100μL(20×) SDS-PAGE用低分子マーカー

292332348

価格

100

数量

180
140

型式名称

245

コードNo.

16,500円

23,100円

サンプル調製用試薬
コードNo.

型式名称

数量

価格

2332336

WSE-7420 EzRIPA Lysis kit

1組

動物細胞用抽出液:100ｍL プロテアーゼインヒビター＆フォスファターゼインヒビター付

10,780円

2332339

WSE-7423 EzBactYeast Crusher

1組

大腸菌・酵母用抽出液:100ｍL プロテアーゼインヒビター＆ DNase付

16,280円

2332330

AE-1430 EzApply

1組

SDS-PAGE用サンプル調製バッファー 5 mL × 5回分

2332333

WSE-7010 EzLabel FluoroNeo

1組タンパク質用蛍光ラベル化＆泳動サンプル調製:2000サンプル分

8,580円
分子量マーカー付

33,000円

ブロッティング用試薬・消耗品
コードNo.

型式名称

数量

価格

2322443

WSE-4057 QBlot kit M

1組

ろ紙、PVDF膜、転写バッファー不要 10回分のミニサイズゲルのトランスファーパック

18,480円

2322451

WSE-4051 クリアブロット・P+膜

1箱

ミニサイズゲル用カット済 PVDF膜 85×90mm 0.2µm 20枚 （その他サイズ有）18,700円

2322506

WSE-4061 クリアブロットP膜（低蛍光）1箱

ミニサイズゲル用カット済 蛍光検出用PVDF膜 85×90mm 0.2µm 10枚 （その他サイズ有）19,800円

2332375

WSE-7160 EzStainAQua MEM

1箱

洗浄液 (500ｍL)、染色液 (500ｍL)、脱色液 (500ｍL)、完全脱色液 (500ｍL)

22,000円

2332595

WSE-7210 EzFastBlot HMW

1本

5倍濃縮液 500ｍL 高分子量タンパク質の高速セミドライブロッティング試薬

9,680円

2332590AE-1465 EzFastBlot

1本

10倍濃縮液 500ｍL

高速セミドライブロッティング試薬

11,000円

2332600

AE-1460 EzBlot

1組

3液法セミドライブロッティング試薬 溶液A: 475mL, B: 475mLx2, C:475mL

14,080円

その他の関連装置
コードNo.
2311130

型式・名称

WSE-3100 PowerStation GhibliⅠ

数量
1台

価格
タッチパネル式電源装置

217,800円

2322197

WSE-1165 ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽

1台

アクリル製ミニサイズゲル対応電気泳動槽

85,800円

2321905

AE-6530P ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽

1台

パジェル・ミニゲル対応電気泳動槽

52,800円

2322210

WSE-1170 マルチレーンゲル電気泳動槽

1台

ワイドゲル用泳動層

91,300円

23216702322240

WSE-1150P パジェラン Ace
WSE-1010 コンパクトPAGE Ace

1台
1台

電源付 パジェル・ミニゲル対応泳動槽
電源付 コンパクトサイズゲル対応泳動槽

123,200円
112,200円

2322466

WSE-4025 ホライズブロット2M

1台

ミニゲル2枚対応ブロッター

123,200円

2322476

WSE-4045 ホライズブロット4M

1台

ミニゲル4枚対応ブロッター

154,000円

2322496

WSE-4125 パワードブロット2M

1台

電源付ミニゲル2枚対応ブロッター

206,800円

本誌記載の価格 ( 税抜き ) および製品仕様は予告なく変更する場合がありますので、ご了承ください。最新の情報などに関しましては当社ホームページでご確認ください。

Bulletein 190210 2019 年 10 月