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遺伝子発現プロファイルの生物学的解釈
By
Stuart M. Tugendreich, Ph.D. and Jean-Noel Billaud Ph.D.

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RNA-seq データの解釈を行うには、発現変動を示す遺伝子や転写でも、4,000 回以上引用されています 2）。IPA の基盤となるナレッ

プロファイル中の遺伝子発現レベルの差異は、対象の細胞または組アルで抽出、精査された 670 万を超える文献由来の知見（ 20192）この生物学的意義は、他の実験系から得られたデータの解釈

遺伝子や転写産物群の発現変動データの解釈に使われます。例

産物に関する以下の主要な疑問に答える必要があります。1）発現織において、どのような生物学的意義として理解できるでしょうか？とどのような関連があるのでしょうか？ また他の研究分野のデータの解釈との間に有益な類似性があるのでしょうか？

Ingenuity® Pathway Analysis（IPA ™）は、これらの疑問に答えるための理想的なソフトウェアで、2003 年後半のリリース以降、25,000 以上の出版物で引用され 1）、RNA-seq に限定した場合ジベース（ QIAGEN Knowledge Base）は、専門家によりマニュ

年 5 月現在）をカバーし、発現が有意に亢進または減少した

えば、1）どのシグナル伝達経路または代謝経路が活性化または不活性化されているのか？ 2）どの上流制御分子が活性化または阻害され、観察された発現プロファイルに至るのか？ 3）
遺伝子やタンパク質の発現変動は、どのような下流の生物学的プロセス、表現型、または疾患に影響を与えるのか？ 3） などの解釈に使用されています。

図1. Ingenuity Pathway Analysis に「オミックス」
データを入力すると、上流の制御因子、活性化または不活性化パスウェイ、生物学的機能、疾患に関する生物学的解釈が得られる。

今回は、Analysis Match（IPA の新機能、以下 AM）について

IPA は、まず PPARα によって活性化される上流調節ネットワー詳しく説明します。AM を用いれば、IPA の生物学的解釈を他ク（図２）を予測しました。PPARα は、Gemfibrozil によって活の生物学的プロセスなどの予測からシグネチャ（特性）を作成

PPARα が最も有意な上流調節因子として活性化されていることの解釈の結果と比較できます。AM は、上流の制御分子や下流し、同様に作成した他の解釈のシグネチャと比較します。この比較は、公共レポジトリや世界的コンソーシアム由来の膨大な遺伝子発現データから解析された解釈結果（以下、事前解釈性化が予想される核内受容体です（図２: オレンジ）。IPA は、を予測しましたが（ z-score=4.6）、偶然にこの結果が予測される確率は 0.001％未満です。さらに、QIAGEN Knowledge

Base の 20,000 以上の生物学的プロセスから、PPARα に制御結果）を含みます。この IPA の事前解釈結果は、大規模で継続されている遺伝子群によって活性化される生物学的プロセスを果によって構成されています。これらの事前解釈結果は、Geneました（図２: オレンジ色）。

（ TCGA）、ArrayExpress、および Sequence Read Archive（SRA）

この予測は、専門家がマニュアルで作成する網羅的で高品質な的に増加しており、2019 年 5 月現在、52,000 以上の解釈結
Expression Omnibus（GEO）、The Cancer Genome Atlasなどのソースから入手した 310,000 を超える個々の生物学的サンプルから抽出され、同じ解析手法で再処理されたものが IPA

検索し、IPA は脂肪酸のベータオキシデーションの亢進を予測し

QIAGEN Knowledge Base によって可能になるもので、解析をIPA に統合された公共のデータソースのみに限定すると、興味深の事前解釈結果としてデータベース化されています。

いことに PPARα はまったく予測されません（データ非表示）。同

IPA による発現プロファイルの解釈例と事前解釈結果との比較

または他の分子が観察された発現変化を上流で制御するのか否ゴニスト）で処理したラットの肝臓に由来する RNA-seq データ

IPA 解釈の結果が、過去の自身の解釈または事前解釈結果と様に、上流予測能力を持たない DAVID5） の場合では、PPARαかを予測することができません。

本稿では一例として、高脂血症治療薬 Gemfibrozil（PPARα アIPA による解釈で重要なステップは、AM による解析で自身のに焦点を当てて説明します（ GSE 55347） 4）。この解析では、類似あるいは異なる生物学的意義を持つかを調べられることでラットに Gemfibrozil（ 700 mg/kg）を 7 日間経口投与した試す。AM は、自身の解釈（上流の制御因子や変動が予測されRNA-seq 解析は、DESeq2 アルゴリズムのデフォルト設定を用るかを確認するために役立ち、他の類似の解釈が得られる状

験群とコーン油のみを投与したコントロール群を比較しました。

いて OmicSoft ArrayStudio で行い、964 遺伝子を IPA CoreAnalysis で解析しました。

2る生物学的プロセスや疾患など）がどれほど一般化されてい況を見出すことを可能にします。IPA の AM は、以前に IPA で実行した解釈と上述の 52,000 を超える解釈との類似性の検

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QIAGEN図 2. PPARα は、Gemfibrozil 投与ラットの肝臓において活性化された上流調節因子であると予測された（z-score=4.6、p 値 =1.96E-47）。PPARα はリガンド依存性の転写因子であり、その主要な作用部位は、IPA で表示された細胞内のレイアウト図に見られているように核内である。ネットワーク内の他の分子（赤と緑）は、PPARα に転写を制御される分子であり、赤色の分子は Gemfibrozil 処理でその発現が亢進し、緑色の分子は抑制されることを示している。この遺伝子セットの重要な機能は脂肪酸のベータオキシデーションの亢進である。ベータオキシデーションは、この遺伝子セットと有意に重複し（p = 7.00E-25）、その活性は亢進すること（オレンジ色）が予測された。

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索を可能にします。表 1 は、Gemfibrozil 投与ラット肝臓に由来する解釈結果を、AM で解析した結果を示しています。類似する結果の多くは、Fenofibrate、Tesaglitazar、Rosiglitazone、脂肪組織への分化に重要な要因（ PRDM16）のノックダウン、3-nitroproprionic acid（毒素）をマウスに投与した結果など、多岐にわたります。3-nitroproprionic acid の作用は、PPARα のPioglitazone、および Amorfrutin のような Gemfibrozil に類似アゴニスト、Fenofibrate で相殺されることがわかっています 8）。

ものです。類似性の見られた解釈の中には、高脂肪食、肥満（マに、28 のマッチングおよびアンチマッチング分析のすべてを表 1の作用機序の化合物に曝露されたヒト細胞またはマウス由来の各解釈のどの構成要素が解釈間で一致したかを検討するためウス）などが含まれ、高脂肪食はマウスで PPARα を活性化するから抜粋し、ヒートマップを作成しました。Gemfibrozil（クエリー）性肝炎（ NASH）から生体を防御する可能性があります 。負（ Upstream Regulators）、CN（Causal Networks）、および DE

ことが知られており 6）、これらの状態は、非アルコール性脂肪7）の相関がある結果は、皮膚炎の疾患モデルや、白色から褐色の検索には、表 1 のように、CP（Canonical Pathways）、UR（ Downstream Effects）の 4 つの指標が使われました。

表 1. Gemfibrozil RNA-seq の解釈結果との類似性について、52,000 以上の事前解析結果と比較し、強く一致する（ピンク色）または一致しない（シアン色）ものを、類似性スコアが、+45％または –45％のカットオフを使用して表示した。一番上の行は、同じ解析者の研究によって得られたデータだが、RNA-seq ではなく、マイクロアレイによる解析の結果である。それ以下の行にある残りのデータは、事前解釈結果に由来する結果である。

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QIAGEN図 3 は、Gemfibrozil の解釈結果の Upstream Regulator（ UR）

特定の遺伝子群の上流の制御因子であると、IPA は予測します

シグネチャの一部を示しています。PPARα 自体がシグネチャの（図 3 の列）。SREBF1、SREBF2、SIRT2 のように、中段のクラプは両方の軸でクラスター化され、4 つの分析クラスター（図同じ調節因子のいくつかを活性化しますが、PPARα 自体は活性中にあることに着目してください（図 3 の赤矢印）。ヒートマッ3 の行）と Upstream Regulator の 2 つの主要なクラスター（図スター（青い四角）の分析は、赤い四角の PPARα アゴニストと化されないため、類似の解析結果の中でも個々の因子をどのよ3 の列、一部のみ表示）があることがわかります。

うに識別するかに着目すべきです。緑色のボックス内の分析は、一番下の「スーパークラスター」（大きな赤い枠内）の解釈でどおり Gemfibrozil（クエリー）に反する結果、つまり解釈が似個々の因子が、Gemfibrozil 解析の結果と全く一致せず、予想は、すべての解析結果が PPARα を強く活性化し、Fenofibrateていない状態を教示してくれます。

似ていることが予測されました。Ciprofibrate や Bezafibrae な

興味深いことに、アンチマッチング結果のうちのニつは、PPARαて因果関係を裏付ける文献が示される限り、それらの化合物を織における PRDM16 遺伝子のノックダウン（図 3 の上段）です。

や pirinixic acid などの PPARα アゴニストの活性化パターンにどの化合物は、IPA が使用する QIAGEN Knowledge Base によっ自体を有意に阻害すると予測され、一つは、マウス白色脂肪組

図 3. クエリーと比較して 28 のマッチングまたはアンチマッチング解釈結果に由来する Upstream Regulator（上流調節因子シグネチャ）（ Gemfibrozil をピンク色で強調）を示している。この図では一部の結果のみが表示され、Gemfibrozil 分析用の Upstream Regulator の実際のシグネチャには 100 の ”entity” が存在している。z-score に基づき、ヒートマップのオレンジ色は活性化、青色は不活性化という予測が示されている（左上のカラースケールを参照）。特定のヒートマップセル中のドットは、統計的に有意でない（ –2 ≦ z-score ≦ 2）という結果を示している。

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5このノックダウンによって、PPARA、PPARG、および PPARGC1A遺伝子の発現レベルが下がり、脂肪細胞分化は阻害されます（図 4）。PPARα が阻 害されている（Gemfibrozil の結 果と逆相関がある）もう一つの解釈は、正常な皮膚とアトピー性皮膚炎患者からの皮膚の比較解析由来の結果で、アトピー性皮膚炎が PPARα シグナル伝達を抑制することを示唆しています（ E-MTAB-729） 9）。このことは、PPARα アゴニストがこの疾患の治療薬として役立つ可能性を示唆しています。興味深いこと

PPARα と同様に、pirinixic acid 自体がアトピー性皮膚炎分解析における「抑制された」上流調節因子として強く予測され（図3）、この分子も、治療法として適用できることを示唆しています。

これらの機能は、AM の重要な強みであり、潜在的な治療薬や新たなターゲットの予測を可能にします。

AM のもう 1 つの重要な機能は、ヒートマップに複数のタイプのシグネチャエンティティをまとめられることです。図 5 に示すよに、2012 年にはマウスモデルで、PPARα アゴニスト（pirinixic

うに、カノニカルパスウェイと上流調節因子は、シグネチャエンしたプにまとめられています。このクラスターは、コレステロール生acid）が実際にアトピー性皮膚炎を好転させることが示されま。

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ティティ間の既知および未知の類似性を明らかにするヒートマッ

図 4. IPA は、PRDM16（青色）のノックダウンが PPAR 関連遺伝子（緑色）の発現抑制にどのようにつながるかを示しており、この経路から、脂肪細胞の分化の抑制（青色）が予測される。図に示されている各関係は、参考文献によって裏付けられている。

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合成経路とコレステロール生物学に必須の上流調節因子との間に存在する密接な関連性を示唆しています 。

図 5 に示すクラスターの上流の調節因子には、コレステロールHMGCR14） が含まれます。図 6 では、これらの分子がコレステロール生合成代謝標準経路（薄色表示）における重要な段階をどのように調節するかを示しています。

および脂肪酸の合成および取り込みに関与する遺伝子の重要IPA の AM は、IPA で解析中の解釈と、自身で行った過去の解小胞体から SREBP の核への輸送に関与するタンパク質 SCAP12）る機能を持ちます。これによって、有意な公的情報に迅速かつされる）、SREBF1 の発現の調節因子である PPARα能になります。

な転写因子（SREBP）をコードする SREBF1 および SREBF2、11）（SREBP は、ゴルジ体でのタンパク質分解切断後に核に放出、そして13）

釈結果や 52,000 件以上もの事前解釈結果を短時間で比較す簡易にアクセスすることや、解析中の結果のより深い解釈が可図 5. IPA では、Upstream Regulator とカノニカルパスウェイのシグネチャを組み合わせて表示することもできる。ヒートマップの左側に表示されているエンティティの密接な相関は、エンティティ間で関連する機能を示唆している。

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IPA ならびに Analysis Match の利点のまとめ

今回の例では、ヒト、マウスおよびラットのように異なる生物種します。さらに、AM は、対象となる生理現象の分子メカニズ

らには、マイクロアレイや RNA-seq のような解析手法の差異にができ、潜在的に疾病の治療における利点がある薬物、化合物、や、脂肪組織、胚、皮膚、肝臓のように多種多様な組織、さ関わらず、類似の IPA 解釈を有する情報に瞬時にアクセスできムの理解を支援する可能性がある「非類似性」を特定することまたは標的分子を明らかにできる可能性も持っています。このよることを示しました。AM は、各解釈間の類似性を明らかにし、うに IPA と AM が協調し、膨大な量の文献情報と遺伝子発現ターンを示しているなど、生理現象のメカニズム理解に貢献し、な仮説など、より多くの新しい生物学的洞察が得られることに上流の調節因子が特定のカノニカルパスウェイに似た活性化パ上流の調節因子の探索やそのレベルでの類似性の発見を可能に情報が統合されて解析に利用することで、研究により実証可能貢献します。

図 6. IPA のコレステロール生合成経路のスーパーパスウェイの初期段階（色の薄い部分）に図 5 のクラスターからの上流調節因子を加え、文献情報を介して連結した。
パスウェイは HumanCyc からキュレーションされたもの。

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QIAGEN参考文献
1	Ingenuity Pathway Analysis first release. www.bionity.com/en/news/30709/stanford-university-licenses-ingenuity-pathways-analysiscollaborates-on-systems-biology-solutions.html
2

PMC search. www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/?term=%22ingenuity+pathway%22+AND+rna-seq

3	Krämer, A., Green, J., Pollard, J. Jr., and Tugendreich, S. (2014) Causal Analysis Approaches in Ingenuity Pathway Analysis.
Bioinformatics 30 (4): 523–30. doi:10.1093/bioinformatics/btt703
4	Wang, C., et al. (2014) The concordance between RNA-seq and microarray data depends on chemical treatment and transcriptabundance. Nat Biotechnol. Sep; 32(9): 926–932, doi: 10.1038/nbt.3001
5DAVID. https://david.ncifcrf.gov

6	Patsouris, D., Reddy, JK, Müller, M., Kersten, S. (2006) Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the effects of highfat diet on hepatic gene expression. Endocrinology. Mar;147(3):1508-16
7	Abdelmegeed, MA., Yoo, SH., Henderson, LE., Gonzalez, FJ., Woodcroft, KJ., Song, BJ. (2011) PPARα Expression Protects Male
Mice from High Fat–Induced Nonalcoholic Fatty Liver. Journal of Nutrition, Apr 1;141(4):603-610. doi: 10.3945/jn.110.135210.
8	
Bhateja, DK., Dhull, DK., et al. (2012) Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation attenuates 3-nitropropionic acidinduced behavioral and biochemical alterations in rats: possible neuroprotective mechanisms. Eur J Pharmacol. Jan 5;674(1):33-43.
DOI: 10.1016/j.ejphar.2011.10.029.
9	Rebane, A., Zimmermann, M., et al. (2012) Mechanisms of IFN-γ-induced apoptosis of human skin keratinocytes in patients withatopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. May;129(5):1297-306. doi: 10.1016/j.jaci.2012.02.020.
10	Chiba, T., Takeuchi, S., et al. (2012) Topical application of PPARα (but not β/δ or γ) suppresses atopic dermatitis in NC/Nga mice.
Allergy. Jul;67(7):936-42. doi: 10.1111/j.1398-9995.2012.02844.x
11	Horton, JD., Goldstein, JL., Brown, MS. (2002) SREBPs: Activators of the Complete Program of Cholesterol and Fatty Acid Synthesisin the Liver. J Clin Invest. May 109 (9): 1125–31. doi:10.1172/JCI0215593.
12	
Shao, W., Espenshade, PJ. (2012) Expanding Roles for SREBP in Metabolism.Cell Metab. Oct 3;16(4):414-9. doi:10.1016/
j.cmet.2012.09.002.
13	Morán-Salvador, E., López-Parra, M., et al. (2011) Role for PPAR γ in obesity-induced hepatic steatosis as determined by hepatocyteand macrophage-specific conditional knockouts. FASEB J. Aug;25(8):2538-50. doi: 10.1096/fj.10-173716.
14	Sugawara, A., Takeuchi, K., et al. (2001) Transcriptional suppression of type 1 angiotensin II receptor gene expression by
peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in vascular smooth muscle cells. Endocrinology. Jul;142(7):3125-34.

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トランスクリプトミクス、プロテオミクスについての関連資料（英語）もご覧ください

go.qiagen.com/IPA-transcriptomics-whitepaper-JP

記載の製品は研究用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。最新のライセンス情報および製品ごとの免責事項については、
各 QIAGEN キットの Handbook または User Manual をご覧ください。

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