MiSeqを用いた超多検体分析‒サンプリングからシーケンスまで‒

東樹 宏和（京大・人環）
2016年3月24日
第63回生態学会大会 仙台

生物群ごとに方法論が細分化された現状：
共通の手法で比較研究を促進

ゲノム科学における情報革命により、膨大な生物群集データが生態学に流入• これまで解明できなかった小さな生物間の相互作用を大規模なデータとともに解明• DNAさえあればどんなシステムにも適用できるため、一人の研究者が生態系全体を俯瞰しやすくなるこの方たちだったら、きっと膨大な生物多様性情報に熱狂したに違いないCharles Darwin

Alfred R. Wallaceフィールド生態学者の視点で進化学・生態学の根本的な問いに答える

DNAバーコーディング1サンプルから複数生物をバーコーディング

複数サンプルのそれぞれから、複数生物をバーコーディング

ライブラリの構造

1st フュージョン・プライマー（フォワード）DNA バーコーディング・プライマー

シーケン（解析する領域に特異的）

シング・プラ5ʼ -TNのイマCGTCGG
連続ー付CAG着CGT部
CAG分ATG
TGTA

TAA
GAG

鋳型 DNA

ACA

GN

NNNNN

GCATCGATGAAGAACGCAGC

鋳型 DNA

GCATACAATAAGCGGAGGA NNNNN
NG

AC

Nの連続

DNA バーコーディング・プライマー（解析する領域に特異的）

AGAG

AA

TA
T

GT

GT

AGAGGCTCG
シーGGTG
CTC
ケンTG- 5ʼシング・プラ
イマー付着部

1st フュージョン・プライマー（リバース）

1st PCR の産物
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN XXXXXXXXXXXXX NNNNNN CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACAGCAGCCGTCGCAGTCTACACATATTCTCTGTC NNNNNN XXXXXXXXXXXXX NNNNNN GACAGAGAATATGTGTAGAGGCTCGGGTGCTCTG

N の連続N の連続バーコーディング領域
シーケンシング・プライマー付着部分
シーケンシング・プライマー付着部分（DNA バーコーディング・プライマー(Rd2)(Rd1)の部分を含む）
シーケンス・データとして出てくる部分分2nd フュージョン・プライマー（フォワード）シーケンシング・プライマー付着部分の一部
P5 ア5ʼ -A

ATG
ATAIn（サダプ
ンプ dex 2ター
ルご

CGG
CGAとにCCA

異なCCG

AGA
T

CTA
CACる）

GGC

C TCGTCGGCAGCGTCAGCAGCCGTCGCAGTCTACACATATTCTCTGTC NNNNNN XXXXXXXXXXXXX NNNNNN GACAGAGAATATGTGTAGAGGCTCGGGTGCTCTG

1st PCR の産物

1st PCR の産物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN XXXXXXXXXXXXX NNNNNN CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGGCTCGGGTGCTCTG AGAGT（サンプAGAGCATACGIndeルご x 1とに異なる）

GCAGP7AAGACアダGA
AC-5ʼプター

シーケンシング・プライマー付着部分の一部

2nd フュージョン・プライマー（リバース）

2nd PCR の産物
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC GGCC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG NNNNNN XXXXXXXXXXXXX NNNNNN CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC TCTC ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTG CCGG AGCAGCCGTCGCAGTCTACACATATTCTCTGTC NNNNNN XXXXXXXXXXXXX NNNNNN GACAGAGAATATGTGTAGAGGCTCGGGTGCTCTG AGAG TAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC

P5 アダプター

Index 2（サンプルごとに異なる）

N の連続

N の連続

Index 1

（サンプルごとに異なる）

シーケンシング・プライマー付着部分
シーケンシング・プライマー付着部分(Rd2)
バーコーディング領域(Rd1)（DNA バーコーディング・プライマーの部分を含む）
シーケンス・データとして出てくる部分

P7 アダプター

調査地の配置：
だめな例

調査地の配置：「とりあえずサンプル採ってみる」はだめ空間的自己相関にも気をつけよう多サンプルのDNA抽出・PCR

マーカー領域と特異的プライマー
."&@I;I>16S rRNA (V3-V4)
16S rRNA (V4)%

 18S rRNA (V4) 18S rRNA (V4) 18S rRNA (V9)C=;H>F9 COIC=;H>F9 COI
C=;H>F9 COI
 ITS2' rbcL' rbcL' trnH-psbA

 ITS2
& ITS1
 ITS2

,JK 
400 bpFR
300~350 bp
FR
380 bpFR
380 bpF
R
200 bpF
R
700 bpF
R
700 bpFR
400 bpF
R
300 bpFR
500 bpFR
450 bpFR
400 bpFR
250 bpFR
250 bpF
R
300 bpF
R

AE:BI
S-D-Bact-0341-b-S-17
S-D-Bact-0785-a-A-21
515f
806r
3NDf
V4_euk_R1
3NDf
V4_euk_R2
Euk_1391f
Eukbr
LCO1490
HCO2198jgLCO1490
jgHCO2198
ARTHR_1708F
ARTHR_2173R
ITS3
ITS4
rbcLa_F
rbcLa_R
rbcL_F3
rbcL_R4
psbA3_f
trnHf_05
ITS2F
ITS3R
ITS1F_KYO1
ITS2_KYO2
ITS3_KYO2
ITS4+CCTACGGGNGGCWGCAGGACTACHVGGGTATCTAATCCGTGYCAGCMGCCGCGGTAAGGACTACNVGGGTWTCTAATGGCAAGTCTGGTGCCAGGACTACGACGGTATCTRATCRTCTTCG
GGCAAGTCTGGTGCCAG
ACGGTATCTRATCRTCTTCGGTACACACCGCCCGTCTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACGGTCAACAAATCATAAAGATATTGGTAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCATITCIACIAAYCAYAARGAYATTGGTAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
TAATIGGAGGATTYGGWAAYTACTTCTGGITGACCRAARAAYCA
GCATCGATGAAGAACGCAGC
TCCTCCGCTTATTGATATGCATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCGTAAAATCAAGTCCACCRCG
AAYTCCCAACCATTYATGCGCATATGCCAAACRTGAATACCGTTATGCATGAACGTAATGCTCCGCGCATGGTGGATTCACAATCCATGCGATACTTGGTGTGAATGACGCTTCTCCAGACTACAATCTHGGTCATTTAGAGGAASTAATTYRCTRCGTTCTTCATCGATGAAGAACGYAGYRAA
TCCTCCGCTTATTGATATGC

#Klindworth et al. (2012)
Klindworth et al. (2012)
Caporaso et al. (2012)
The Earth Microbiome Project
Caporaso et al. (2012)
The Earth Microbiome Project
Brate et al. (2010)
Brate et al. (2010)
Brate et al. (2010)
Brate et al. (2010)
Amaral-Zettler et al. (2009) The Earth Microbiome Project
Amaral-Zettler et al. (2009) The Earth Microbiome Project
Folmer et al. (1994)
Folmer et al. (1994)
Geller et al. (2013)
Geller et al. (2013)($J!31K)D?@I<G($J!31K)D?@I<GWhite et al. (1990)
White et al. (1990)
rbcL5 *Kress et al. (2009)
Kress et al. (2009)rbcL5 *Toju et al. (2013)Toju et al. (2013)
Sang et al. (1997)
Tate & Simpson (2003)
Chen et al. (2010)
Chen et al. (2010)8 140/
Toju et al. (2012)
Toju et al. (2012)6 27
Toju et al. (2012)
White et al. (1990)

シーケンシングはとても簡単どうやって膨大な生物群集データを共通の土台で解析するか？

捕食・寄生・競争・共生における「物理的接触」を利用したDNAバーコーディング
宿主・環境サンプル
餌 / 寄生者 / 共生者

胃内容物・糞、 寄生／相利共生部位、共存環境サンプル....

さまざまな種間相互作用において、物理的接触（もしくは近接）が伴う宿主や環境サンプルの中に

餌 / 寄生者 / 共生者のDNAが含まれている

捕食・寄生・競争・共生における「物理的接触」を利用したDNAバーコーディング
宿主・環境サンプル
餌 / 寄生者 / 共生者
宿主サンプル 1

宿主サンプル 2

宿主サンプル 3個々のサンプルについて、「宿主 」および 「餌 / 寄生者 / 共生者 」
をDNAバーコーディング

群集行列としてデータを統合

陸上生態系を支える
複雑共生系
植物群集 x 真菌群集

Whi$ield (2007) Nature地球上の物質循環を制御する共生系
糖（光合成産物）

植物真菌（きのこ・かび類）

土壌中の窒素やリンの供給・外敵からの保護

多様な菌根菌

国立科学博物館 編 「菌類のふしぎ」

真菌（Fungi）は、記載種だけで10万種、推定種数は、 150~510 万種→

真菌をとりまく生物間の相互作用は「ブラックボックス」

大規模DNAバーコーディング
次世代シーケンスデータ→ 生態学のデータファイルに変換

1回の解析で 300〜1000 bpほどの配列が10万~2500万個得られる“Claident”
次世代シーケンシングの生データ解析
から生物同定、集計表作成まで種間相互作用を表現する行列
真菌種
植物種

Tanabe & Toju (2013) PLoS ONE 8:e76910

QuercusIlex
serrataPrunuspedunculo
Symplocos
jamasakur
Pleioblas
prunifoli
Lyoniachino
Quercusovalifoli
Evodiopan
glaucaIlexinnovans
Cleyeramacropoda
Eurya
japonica
Rhododendjaponica
macrosepa

真菌

植物と真菌の共生行列

植物
Quercus glauca
Quercus serrata
Pinus densiflora
Lyonia ovalifolia
Ilex pedunculosa
Prunus grayana
Prunus jamasakura
Cinnamomum camphora
Ilex macropoda
Pleioblastus chino

248 (Cenococcum) [EcM]
652 (n.a.) [n.a.]1580 (Capronia) [n.a.]176 (Herpotrichiellaceae) [n.a.]1334 (Herpotrichiellaceae) [n.a.]226 (Elaphomyces) [EcM]
678 (Scleropezicula) [n.a.]1692 (Dermateaceae) [n.a.]674 (Phialocephala) [n.a.]158 (n.a.) [n.a.]636 (n.a.) [n.a.]1046 (n.a.) [n.a.]1624 (n.a.) [n.a.]666 (n.a.) [n.a.]396 (Hypocrea) [n.a.]15 (n.a.) [n.a.]
92 (n.a.) [n.a.]180 (n.a.) [n.a.]336 (n.a.) [n.a.]378 (n.a.) [n.a.]558 (n.a.) [n.a.]630 (n.a.) [n.a.]1068 (n.a.) [n.a.]1114 (n.a.) [n.a.]1556 (n.a.) [n.a.]1646 (n.a.) [n.a.]1682 (n.a.) [n.a.]406 (n.a.) [n.a.]1 (Clavulina) [EcM]
672 (Lactarius) [EcM]
388 (Lactarius) [EcM]1312 (Lactarius) [EcM]
566 (Russula) [EcM]
5 (Russula) [EcM]
7 (Russula) [EcM]
48 (Russula) [EcM]
544 (Russula) [EcM]
556 (Russula) [EcM]
584 (Russula) [EcM]
600 (Russula) [EcM]
314 (Russulaceae) [EcM]
548 (Tomentella) [EcM]
650 (Tomentella) [EcM]
542 (Thelephoraceae) [EcM]
632 (Thelephoraceae) [EcM]
9 (n.a.) [n.a.]1268 (n.a.) [n.a.]136 (Glomeraceae) [AM](Dothideomycetes)
1090 (Glomeraceae) [AM]

どの植物種にどの真菌が共生しているか？

DNA配列情報

サンプル = 菌根宿主 = 植物共生者 = 真菌Q
Q
P
L
I
P
P
CI
P

植物種
248 (Cenococcum) [EcM]
Glomerales
652 (n.a.) [n.a.]1580 (Capronia) [n.a.]Trechisporales
176 (Herpotrichiellaceae) [n.a.]1334 (Herpotrichiellaceae) [n.a.]226 (Elaphomyces) [EcM]
678 (Scleropezicula) [n.a.] Thelephorales
1692 (Dermateaceae) [n.a.]674 (Phialocephala) [n.a.]158 (n.a.) [n.a.]636 (n.a.) [n.a.]1046 (n.a.) [n.a.]1624 (n.a.) [n.a.]666 (n.a.) [n.a.]
Russulales
396 (Hypocrea) [n.a.]15 (n.a.) [n.a.]
92 (n.a.) [n.a.]180 (n.a.) [n.a.]336 (n.a.) [n.a.]378 (n.a.) [n.a.]558 (n.a.) [n.a.] Cantharellales
630 (n.a.) [n.a.]Agaricales
1068 (n.a.) [n.a.]1114 (n.a.) [n.a.]1556 (n.a.) [n.a.]1646 (n.a.) [n.a.]1682 (n.a.) [n.a.]406 (n.a.) [n.a.]1 (Clavulina) [EcM](Unknown)672 (Lactarius) [EcM]
388 (Lactarius) [EcM]1312 (Lactarius) [EcM]
566 (Russula) [EcM]
5 (Russula) [EcM]
Hypocreales
7 (Russula) [EcM]
48 (Russula) [EcM] (Letiomycetes)
544 (Russula) [EcM]
556 (Russula) [EcM]
584 (Russula) [EcM]
600 (Russula) [EcM]
Helotiales
314 (Russulaceae) [EcM]
548 (Tomentella) [EcM]
650 (Tomentella) [EcM]Eurotiales
542 (Thelephoraceae) [EcM]
632 (Thelephoraceae) [EcM]
9 (n.a.) [n.a.] Chaetothyriales
1268 (n.a.) [n.a.]136 (Glomeraceae) [AM](Dothideomycetes)1090 (Glomeraceae) [AM]

共生関係の行列データ（抜粋）
真菌種（OTU）

Glomeromycota
Basidiomycota
Ascomycota

Quercus glauca
Quercus serrata
Pinus densiflora
Lyonia ovalifolia
Ilex pedunculosa
Prunus grayana
Prunus jamasakura
Cinnamomum camphora
Ilex macropoda
Pleioblastus chino

どの真菌種がどの植物種から見つかるか（広義の共生）？

「ネットワーク」として可視化いままで無視されてきた真菌（内生菌）たちが重要な役割を果たしている？

●
●
●
●

植物種（33種）
外生菌根菌
アーバスキュラー菌根菌
機能不明菌（内生菌）

先見的に「重要そうな」生物群に視野を絞ってきたこれまでの研究アプローチに疑義

Toju et al., (2014) Nature Comm.

捕食・寄生・競争・共生における「物理的接触」を利用したDNAバーコーディング
宿主・環境サンプル
餌 / 寄生者 / 共生者
宿主サンプル 1

宿主サンプル 2

宿主サンプル 3

個々のサンプルについて、「宿主 」および 「餌 / 寄生者 / 共生者 」
をDNAバーコーディング

群集行列としてデータを統合

さまざまな相互作用系でデータを収集：
タンガニーカ湖のシクリッドと藻類の被食-捕食関係
シクリッド種ごとの藻類群集の組成

藻園サンプル

藻園サンプル
藻類

胃内容サンプル

胃内容サンプル
藻類

Hata et al. (2014) BMC Biol

さまざまな相互作用系でデータを収集：
タンガニーカ湖のシクリッドと藻類の被食-捕食関係

藻園サンプルに基づくネットワーク
上段： シクリッド
下段： 藻類

胃内容サンプルに基づくネットワーク
上段： 藻類
下段： シクリッド

Hata et al. (2014) BMC Biol

ネットワーク構造にみられる普遍性と地域性を統合的に理解
植物種
外生菌根菌
アーバスキュラー菌根菌
機能不明菌

Toju et al., (2015)
Science Advances

冷温帯林

暖温帯林

亜熱帯林

TM（苫小牧）YSD（京都・吉田山）YK（屋久島）さまざまな生態系に研究を拡大
マレーシア
ランビル
熱帯雨林

カンボジア
Bokor
雲霧林

立山
高山・亜高山帯

北海道大学演習林
冷温帯林

日本各地の水田ニュージーランド
南極ブナ林

共生微生物たちの相互作用‒複雑なネットワーク‒

Toju et al., (2016)
J. Royal Soc. Interface

一見複雑なネットワーク内に、「仲良し菌グループ」が存在

Toju et al., (2016)
J. Royal Soc. Interface

共生真菌相について、植物個体がタイプ分けできる

Toju et al., (2016)
J. Royal Soc. Interface

ヒト腸内細菌で得られた知見と整合性

地球上のヒト個体は、腸内細菌群集に関して、少数のタイプ（エンテロタイプ）に分かれる

ヒトの健康状態と腸内細菌群集の構造（エンテロタイプ）に関連性がある
Armugam et al. (2012) Nature微生物社会全体の動きを研究しやすくする
共生微生物

植物

1種1種を個別に研究していたのではきりがない「仲良し菌グループ」をみつけることで、微生物社会（群集）全体を見渡す研究が格段にやりやすくなる「仲良し菌グループ」の中に「まとめ役」がいる？

Toju et al., (2016)
J. Royal Soc. Interface

「仲良し菌グループ」の中心を重点的に研究できる
共生微生物

植物

複雑な微生物群集を最小の労力で研究・管理する

植物の生涯を「中核」
微生物で一括管理
植物体に「中心核」
微生物を摂取「善玉」微生物☓「悪玉」微生物

菌根菌に比べて、内生菌には培養可能な種が多い

あらゆる生態系のあらゆる生物を一研究者が眺める

自然生態系に関する知識を活かすシステムとしての安定性・自律性を最小の労力・資源投入で実現する

生態系サービス・システムとしての安定性

自然生態系
単純な構造の農地から複雑な構造へ複雑性をそのまま活かす
農業生態系の設計

代替農法
慣行農法

生物多様性・空間構造の多様性

謝辞(発表/投稿中論文で直接お世話になった共同研究者・敬称略)

植物-真菌系
田辺晶史（中央水研）
佐藤博俊（京都大学）山本哲史（神戸大学）
門脇浩明（京都大学）
日高周（北海道大学）
阿形清和 （京都大学）
Gregory S. Gilbert (UCSC)
西村理（理化学研究所）
矢澤重信（名古屋大学）
石井博（富山大学）
早川卓志（京都大学）
片山昇（北海道大学）
岸田治（北海道大学）

シクリッド-藻類系
畑 啓生（愛媛大学）

理論生態学
John N. Thompson (UCSC)
Jens M. Olesen (University of Aarhus)
Paulo R. Guimaraes Jr (Universidade de Sao Paulo)

そのほか、進行中のプロジェクトで、多くの共同研究者のみなさんにお世話になっておりますDNA情報で生態系を読み解く‒環境DNA・大規模群集調査・生態ネットワーク‒