カツオブシ菌とその働き
４年Ｃ組

中西夏輝

４年Ｃ組

谷口亜紳

指導教諭

矢野幸洋

１．要約
サイエンス研究会生物班４年生は主に微生物を研究対象に据えて活動をしている。私たちはその中でも発酵食品に携わる菌・バクテリアなどに注目しており、身近な食品に潜む微生物の働きについて研究している。このレポートは、その中でも我々に昔からなじみのある発酵食品「カツオブシ」に関わる菌類についてまとめたものである。
キーワード

カツオブシ菌、ペプトン培地、抗生物質

２．研究の背景と目的

この菌の特徴は、低水分･高塩分でも増殖菌類は私たちの生活に大きくかかわってできる点にある。これはこの菌の吸水力がいる。身近な生活品や食材から、社会の最極めて強いことに由来する。また、脂質分先端科学技術まで、もはや人間は菌類の助解酵素とタンパク質分解酵素により余分なけなくしては現在のような生活を送ること脂肪・タンパク質をアミノ酸、イノシン酸はできない。さらにいうならば、そもそもという旨味成分へと分解している。鰹節か

この社会が成り立っているのは菌類たちのら取ったダシに旨味があるのはこのためでおかげである。私たちはそのような目立たある。加えて、酸化防止酵素を生成していずとも世界を縁の下で支えている菌類に興るため、一般の食品に比べて保存が効くよ味を持ち、その中でも日本の伝統的な発酵うになっている。｢カツオブシ菌｣はまさに食品である「鰹節」に携わる「カツオブシ鰹節を作る上で極めて適した菌だといえる。

菌」を研究対象とした。

この菌を研究するために培地を作りたい鰹節とはその製作過程に「カツオブシ菌が、カツオブシ菌に関する資料が著しく少(Aspergillus repens / Aspergillus glaucus )」とないため単離培養の方法を確立するところいうカビの一種が使われた世界でもっと堅から始めた。

い発酵食品である。その食品を作る際に使菌を育てるための培地には寒天培地や液われる菌がどの様な性質を持っているのか、体培地など多様にあるが、今回は「麹菌鰹節以外にその性質を応用できないのかに(Aspergillus oryzae)」と同じアスペルギルついて興味を持ち、調べることにした。

ス属ということで寒天培地を用いて単離培今回扱う「カツオブシ菌」は菌界、子嚢菌門、ユーロチウム目、マユハキタケ科、アスペルギルス属に分類される真菌である。

養することにした。

図１

使用した鰹節図２

黄色のコロニー

図３

灰色のコロニー３．研究内容培地は、カビの育成に適したペプトン培地を使用した。培地の作成方法を次に示す。
①200mlの蒸留水に、3.2gの寒天と10ｇのブドウ糖ペプトンを加えて攪拌し完全に溶かす。
②この溶液を300mlビーカーに入れ、オートクレーブを用いて20分120℃で滅菌する。
③６つのシャーレに均等に分け、寒天が固まったら冷蔵保存する。
作成したペプトン培地に、削り取った鰹節の表面の粉末をかけて、30℃で数日間培養した。結果、数種類の菌のコロニーが確認できた。それらの菌の一部を採取し、それぞれを800μlの滅菌水に溶かし、ループで培地にまんべんなく塗りつけた。前回と同じ環境で数日間培養した後、灰色と黄色の２種類のコロニーが成長した。

図４

単離培養

資 料 な ど を 調 べ た 結 果 、 Aspergillus
repensは黄色、Aspergillus glaucusは灰色のコロニーを作ることが分かった。その他、成長するときに大量の水分を必要とするなどの特徴が、今回できたコロニーと一致した。よってこの２つのコロニーはカツオブ

シ菌であると断定した。
つまり、図２はAspergillus repens、図３はAspergillus glaucusであると思われる。
図２，３の段階では一種類ではあるが複数のコロニーが混在している状況で、一つオートクレーブにかけた固まる前の培地に濃度が20μg/mlとなるようにカナマイシンを加え、シャーレに移して冷蔵した。このカナマイシン入の培地は合計11個作成した。の細胞からできた一つのコロニーがほかのコロニーとは接していない状態でないと単離培養とは言えない。この実験を繰り返していくうち、単離培養に成功した培地もあったが、多くの培地でコンタミネーションが起こり、実験を次の段階まで進めるまでには至らなかった。
そこで、単離培養の成功確率を上げるために、抗生物質を用いた培地を使用することにした。前述のペプトン培地にカナマイ

図５完成した培地シンを混ぜるという方法をとった。カナマイシンは、カビなどの菌を培養するときにコンタミネーションを防ぐために使われる抗生物質である。

４．考察
今回の実験は、コンタミネーションを防ぐために行ったのもので、作成段階で菌の今回は保存濃度が20mg/mlであるカナマ混入を防ぐ必要がある。使う機材や手を消イシンを、溶媒として滅菌SP水を用い、毒し、クリーンベンチやオートクレーブを使用濃度を10～50μg/mlに設定した。

使用するなどの細心の注意を払った。作成

まず、カナマイシンは、常温では活性がした培地を使用してデータを取っていない失われるので、冷凍するために濃度が、培地に菌を移した場合、以下のような20mg/mlの保存ストックを作成した。作業結果が予想できる。

はすべてクリーンベンチ内で行った。

①カツオブシ菌のみが成長し、他のバクテ①マイクロピペットで10mlの滅菌水を量る。
②電子天秤を用いてカナマイシンを200mg量りとる。
③先ほど量った滅菌水にカナマイシンを加えボルテックスで溶かしこむ。
④この水溶液を1mlずつ分けて冷凍保存する。

リアなどは全く成長しない、つまり、単離培養に成功する。
②カツオブシ菌と他のバクテリア等が混在し、抗生物質を使う前とあまり変化が無い。
③カツオブシ菌が成長せずに、バクテリアのみが成長する。
④全くなにも成長しない。

このストックを10本作成した。
①の場合なら問題無いが、②～④の場合

にはそれぞれ以下のような改善点が挙げら

サイエンス生物班の活動において、顧問れる。の矢野先生、櫻井先生に、多大なご指導を②バクテリアがカナマイシンに対して耐性賜りました。そのほか、本校や仙台でのポを持っていることが考えられるので抗生スター発表において、的確なアドバイスを物質の種類を変える、もしくはカツオブ下さった他校の先生方、大学の先生方に感シ菌のみが成長できるぎりぎりの濃度を謝申し上げます。

調べる。
③カナマイシンが、カツオブシ菌の成長を妨げており、さらにバクテリアに対しては効果を上げていないので、この場合、カナマイシン以外の、カツオブシ菌には効かない抗生物質を利用する。
④カナマイシンが、シャーレ内の全ての菌の成長を抑制しているので、濃度を下げて実験をやり直す。

５．今後の課題
現段階ではカツオブシ菌の培養というごく初歩的な実験だが、将来的にはカツオブシ菌が持っているとされるリパーゼやプロテアーゼと言った酵素の検出や、それらの酵素が分解した結果できたアミノ酸などの検出を行っていくつもりである。そのためには、カツオブシ菌の単離培養する方法を確立する必要がある。今回はカナマイシンを使用するが、カナマイシンがアスペルギルス属に適さなければ、ほかの抗生物質の使用も検討する。他にも、カツオブシ菌は高塩分の状態にも耐性があるので、培地に塩を混ぜることも考えている。

６．参考文献[1] 「バイオ実験イラストレイテッド」
４巻～７巻，真壁和裕，秀潤社(1996, 1997, 2003)
７．謝辞