RIKEN BRC Experimental Plant Division

核酸染色試薬の検討
二つの留意点をご紹介

エチジウムブロマイド(EtBr)

ミドリグリーン

理化学研究所
バイオリソース研究センター
実験植物開発室https://epd.brc.riken.jp/ja/(1)

 EtBr 変異原性があり発がん性も疑われる。
(2)(3)(4)
 ミドリグリーン 非発癌性で、EtBrよりも低い変異原性を示す。

リソースの品質検査では、リソースの特性に応じたPCRでDNAを増幅し、アガロース電気泳動を実施しています。
今回、強い変異原性があるEtBrから非発癌性ミドリグリーンへの核酸染色試薬変更時に実施した検討実験で、判明した二つの留意点をご紹介します。

目次
1. アガロースゲル保存容器の選択について（Tip1）
DNA染色試薬に適したアガロースゲル保存溶液の選択

2ミドリグリーンエクストラ含有のアガロースゲル保存容器テスト

3

2. アガロースゲル保存方法（Tip2）

3.

保存は4℃プラス遮光、保存の基本に忠実に4

1st~4 th week 保存ミドリグリーンエクストラ含有アガロースゲル電気泳動テスト

5まとめ61

Tip1

DNA染色試薬に適したアガロースゲル保存容器の選択

ミドリグリーンには3種類の染色液シリーズがあります。実験植物開発室ではアガロースゲルをまとめて作り、保存容器からアガロースゲルを取り出して泳動を行う実験スタイルです。そのスタイルに適した先染め法ができるミドリグリーンエクストラの使用を試みました。

① ミドリグリーンエクストラを含むアガロースゲルを、ミドリグリー
ンエクストラの吸着性が高い特性をもつ保存容器でゲルを保存すると、保存液(TAE)とアガロースゲルに含まれるミドリグリーンエクストラが溶出し、ゲルのDNA染色能力が低下することがわかりました。(Fig.1 Fig.2 Fig.3)② 実験植物開発室ではプラステック容器3種類試しましたが、保存に適した容器はBOX1でした(Fig.1) 。
③ EtBr含有アガロースゲルにおいてはプラステック容器3種類で試しましたが、保存容器によるDNA染色の違いはなく３種類すべてが保存容器として使用可能でした。

(5)④ DNA染色試薬であるSYBR Green II はガラス表面あるいはpolyethylene 製容器に吸着することがメーカー説明書に記載されていました。
保存容器
気を付けてナズナちゃん

2 ミドリグリーンエクストラ含有のアガロース
ゲル保存容器のテスト
保存容器




３種類の保存容器でテスト
BOX1 DAISO ポリプロピレン 商品名 フタ付きお道具箱
BOX2 岩崎工業株式会社 ポリプロピレン
BOX3 蝶プラ工業株式会社 ポリプロピレン 商品名 タイトボックスロング

テスト方法

 ミドリグリーンエクストラを含む2％アガロースゲルを等濃度ミドリグリーンエクストラを含むTAEバッファー
BOX1だけOK!
で室温あるいは4℃で、遮光状態で1か月間保存 容器とTAEバッファーの着色を観察(Fig.1 Fig.2 Fig.3)
 保存したアガロースゲルで電気泳動を実施(Fig.4 Fig.5)
カモジくん

4℃ バッファーの着色あり

容器の角に着色なし

室温 バッファー

容器の角に着色なしの着色あり

Fig.1 BOX1 保存容器として使用可能

バッファーには着色が残り容器への吸着が確認できなかった。

4℃

バッファーの着色なし

容器の角に着色あり⇒染色液からの移行あり

ゲル板への着色あり

室温
容器への着色あり

Fig.2 BOX2

Fig.3 BOX3

バッファー中のミドリグリーンエクストラを確認できず、容器への吸着を確認した。

容器へのミドリグリーンエクストラの吸着を確認し、一緒に保存していたアガロースゲル板への着色も確認した。

保存容器として使用不適

保存容器として使用不適

3

Tip2

やっぱり保存は4℃プラス遮光、保存の基本に忠実に① Tip1で使用したBOX1とBOX2を使用して、ミドリグリーンエクストラを含むアガロースゲルを1～４週間保存し、電気泳動を行いました。Tip1で染色液の付着が観察できなかった容器のBOX1に、４℃暗所保存したアガロースゲルでの電気泳動の蛍光強度が一番高い結果となりました。(Fig.4 Fig.5)② 電気泳動のDNAフラグメントの蛍光強度より、保存条件によるミドリグリーンエクストラの保存性の高さはⅠ＞Ⅱ＞Ⅲでした。

Ⅰ 保存容器 BOX1 保存条件 ４℃暗所(Fig.4)
Ⅱ 保存容器 BOX1 保存条件 室温暗所(Fig.4)
Ⅲ 保存容器 BOX2 保存条件 ４℃暗所(Fig.5)

やっぱり4℃ね‼

ナズナちゃん

参考文献(1) 田村隆明 羊土社 バイオ試薬調製ポケットマニュアル(2) https://www.n-genetics.com/products/1072/1024/16850.pdf(3) https://www.n-genetics.com/products/1072/1024/13208.pdf(4) https://www.n-genetics.com/products/1072/1024/13326.pdf(5) https://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/5760a_5761a_5770a_5771a_j.pdf

4 1st~4 th week 保存ミドリグリーンエクス
トラ含有アガロースゲル電気泳動テスト
0 weekテスト方法
 BOX1(Fig.1)とBOX2(Fig.2)を使用した。
 遮光条件で、室温保存と4℃保存を比較(Fig.4 Fig.5)
 ミドリグリーンエクストラを含む2％アガロースゲルを等濃度ミドリグリーンエクス
トラを含むTAEバッファーで保存後、電気泳動を行いDNA染色の経時的な劣化を観察

ここからスタート

カモジくん

BOX1

1st week

2 nd week

3 rd week

4 th week

4℃
暗所

室温
暗所

4℃
暗所

室温
暗所

4℃
暗所

室温
暗所

4℃
暗所

②

①

②

①

②

①

室温
暗所

Fig.4
Fig.1 のBOX1で保存したアガロースゲルを使用した
電気泳動結果保存容器として使用可能なBOX

BOX2

①4℃
暗所

4℃
暗所

4℃
暗所

③③

②Fig.5Fig.2 のBOX2で保存したアガロースゲルを使用した電気泳動結果
保存容器として使用不適なBOX③5 まとめ 今回の検証結果から実験植物開発室では、PCR反応液に直接添加してDNA染色できるミドリグリーンダイレクトを使用することにしました。今まで通りゲルを作り置くスタイルはそのままにすることで、DNA染色液変更に対するメンバーへの負担を軽減できました。また保存容器選定の必要もなくなりました。
 先染めで染色してミドリグリーンアドバンスを使用している
BRC内の他研究室では、アガロースゲルは作り置きせず必要時に作成しています。その場合も保存容器の選定は必要はありません。
 BRC内の各研究室では、ミドリグリーンダイレクトやSYBRGreen、Gel Green、Gel Red等を使用してDNA染色を行っています。各室での実験装置、実験スタイルにあった染色試薬の選択をしています。
 これまで便利に使用していたEtBrから、より安全性の高い染色液の使用へと模索が進行しています。

私たちは高い品質のバイオリソースを維持、提供するた
めに 、常に品質管理の方法の検討と改良を行っています。

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