Chromatography, Vol.22 No.1(2001)

Original

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水100%移動相を用いたHPLC逆相固定相の保持挙動（２）
榎並敏行、長江徳和

Retention Behavior of Reversed-Phase for HPLC Using 100% Aqueous
Mobile Phase(2)Toshiyuki Enami and Norikazu Nagae
Nomura Chemical Co., Ltd., 851 Anada-cho, Seto, Aichi 489-0003, Japan
Received for review August 30, 2000.

Accepted October 20 , 2000.

Abstract
The retention behavior of the reversed-phase was evaluated under 100% aqueous conditions. It is commonly said that reversed-phases, such as
ODS (C18) and C8, show a decrease in the retention time under 100% aqueous conditions. It was found that 100% aqueous mobile phase waspulled out of the pore of the packing materials, so that the stationary phase in contact with the mobile phase decreased and the retention timedecreased. Some parameters, such as the pore size, length of the alkyl group of the stationary phase, the amount of residual silanol groups of thestationary phase and back pressure of the column, were shown to influence of the decrease in retention.
Keywords: HPLC, reversed-phase, 100% aqueous mobile phase, retention behavior

基結合後シリカ担体に残る残存シラノール基を減少させるた

１ 緒言
現在HPLCにおいて化学結合型逆相クロマトグラフィー充

めに行うエンドキャッピング処理に極性基を結合した固定相

填剤としては炭素数1から18程度のアルキル基結合型が広くなど固定相内に極性基を含んだもの、もしくはアルキル基の用いられ、その中でも炭素数18であるODS充填剤が広範囲の結合密度を下げることにより固定相の疎水性を低くしたもの

化合物に適応でき、また他のアルキル基結合型より耐久性に［８］が充填剤として用いられている。しかしながら、極性優れている等の理由から最も一般的に使用されている。しか基を含む固定相はこれら極性基の影響により分離に対する選しながらODS充填剤は親水性化合物の分析を対象とした際、択性が変化したり、固定相の疎水性がこれらの極性基により水100%移動相、塩・酸などを含む緩衝液移動相（以下水減少するため、保持が減少したり、耐久性が低下するなど、100%移動相の表現には緩衝液も含む）もしくはこれら100%

今までの逆相固定相とは異なる分離性能を示す。従って、分水系溶媒に有機溶媒を数パーセント混合した移動相を使用し離が改善される場合もあるが、逆に保持が小さくなることなた場合、試料の保持時間が一定せず、時間の経過とともに保どにより、分離できなくなる等の問題点も有している。また持が減少し、実質的には使用不可能であると考えられている。

別の解決方法として、従来用いられていた炭素数1から22ま

これらの現象はステアリル基（C18）の寝込み現象により引きでのアルキル基以外の長鎖アルキル基［９］〜［11］を用いる

起こされ、この寝込みにより固定相の選択性までも変化する

ことにより、水100%移動相を使用可能にするこれまでとはと報告［１］されている。この問題点を解決するために、極異なるアプローチから開発された固定相も提唱されている。

性の高いアミド基［２］〜［６］やカルバメート基［７］を含本研究［12］では立体的に寝込みが生じるとは考えられなむアルキル基をシリカ担体に結合した固定相や、ステアリル

い炭素数１のTMS充填剤についても条件次第では同様な保〒489-0003

愛知県瀬戸市穴田町851

野村化学株式会社*Corresponding author: Tel, +81-561-48-1853, fax, +81-56-48-1434;
e-mail, nagae@sa2.so-net.ne.jp−33−

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持の減少が生じることを確認し、このことから水100%移動

は約16%減少している。また72時間以降の通液停止後は更に相を用いた場合、現在まで考えられてきたアルキル基の寝込58%もチミンの保持時間は減少した。一方カラムを素通りしみだけでは説明することができない通常のアルキル基結合型

固定相に全く保持していないと考えられる亜硝酸ナトリウム

逆相固定相に起こる保持の減少について、その過程を明らかについても同様に溶出時間の変化を示した。固定相に保持しにし、水100%移動相が使用不可能であると考えられていたない試料は充填剤粒子間の間隙および充填剤内の細孔容積の逆相固定相でも、ある一定の条件を満たした固定相を用いる

和に相当する溶出時間を示す。数十パーセントの有機溶媒をまたは使用条件を変更することにより、水100%移動相を用含む移動相ではウラシルが、また水90%以上の移動相では亜いても十分な保持の再現性が得られることを見い出したので

硝酸ナトリウムが固定相と全く相互作用しない保持値0の試報告する。

料として用いられることが多い。Fig. 1の亜硝酸ナトリウムの初期の溶出時間は1.61分であり、ポンプ停止後は溶出時間が1.10分まで減少している。また、アセトニトリル/水

２ 実験（70：30）移動相でODS（10）カラムを平衡にした後、Fig. 1と同じ条件で1時間通液後、送液ポンプを停止し、圧力表示が0２・１ 装置HPLCシステムは日本分光製PU-980送液ポンプ、UV-970検

MPaになると同時にカラムを外し密栓をし、カラム重量を測出器及び830-RI検出器、レオダイン製7125インジェクター、定した。カラムを外し密栓をするまでには約７秒の時間がか

システムインスツルメンツ製480データ処理装置を用いた。

かった。重量を測定したカラムから密栓を外し大気圧にて開カラム恒温槽にはウォーターバスを用い、ヒーターによりオ放した。カラムの乾燥による重量の減少を防ぐため、カラム

ムロン製E5C3温度コントローラーで温度制御した。物性値の両端には移動相を満たしたステンレスチューブを接続し、については比表面積、細孔容積、平均細孔径はベックマンコ

40℃の恒温槽内にて10時間放置した後、再度カラムの重量をールター製SA3100を、また炭素含有率はヤナコ製CNコーダ測定した。カラム重量はそれぞれ62.3ｇと61.8ｇとなり0.5ｇーを用いて測定した。

の重量差であり、この重量差は再現性のあるものであった。
この時、カラム両端のステンレスチューブから溶媒約0.5 mlの溶出が確認された。つまり、1.61分から1.10分までの亜硝

２・２ 試薬水は水道水を２回蒸留し、ODSカラムに一度通液したもの

酸ナトリウムの溶出時間の減少分は、カラム内の移動相が抜を用いた。リン酸ナトリウム、チミン、亜硝酸ナトリウム、け出たため生じたと推測され、またチミンの溶出時間の減少

n-プロパノールは和光純薬製を用いた。充填剤は担体としてはカラム内の移動相の減少に伴う分離場の喪失であると考え

野村化学製Develosil 250-5、220-5、170-5、140-5、100-5、られる。

80-5、60-5、30-5の粒子径５µmのシリカゲルを用い、アルキ

移動相と試料をそれぞれ水とn-プロパノールを用いた単純

ル基の結合は常法により12時間トルエン還流にて合成を行っな系においても、10 mMリン酸緩衝液およびチミンを用いた。試薬はトリアコンチルジメチルクロロシラン（C30）、オ

たFigure 1の実験と同様な結果が得られた。チミンはイオン

クタデシルジメチルクロロシラン（ODS）、オクチルジメチ

性試料ではあるが、シリカ系逆相充填剤の残存シラノール基

ルクロロシラン（C8）およびトリメチルクロロシラン（TMS）の影響や移動相中の10 mM程度の塩濃度に対してのピークを用いた。それぞれの試薬は実際に結合する量に比べ大過剰

形状への影響がほとんどない事を確認している。また、移動量を加え反応させているため、モノメリック状態では最大に相の塩濃度の影響については前報［13］で報告しているよう近い結合密度となっている。さらに、全ての充填剤についてに、保持の変化に対し大きく影響をしており、水のみを移動

常法によりトリメチルシリル化によるエンドキャプ処理を行相として用いる場合よりも、10 mMリン酸緩衝液を移動相った。各充填剤の物性値をTable 1に示す。以下充填剤の表として用いた場合の方が、送液開始直後の保持の安定性が高示はTable 1の固定相名で示す。また、市販のカラムとしていため、本研究では移動相に10 mMリン酸緩衝液および試

野村化学製Develosil ODS-HG-5, ODS-T-5, ODS-A-5を水素料にチミンを用いて実験を行った。

結合性の評価に用い、Develosil ODS-UG-15/30を使用し、カラム圧の保持時間への影響を調べた。
３・２ 細孔径の影響
３ 結果と考察３・２・１ ODSとTMS固定相について
Figure 2とFigure 3には細孔径の異なるODSとTMSの保持

３・１ 水100%移動相を用いた場合の保持の減少
Fig. 1には平均細孔径10.4 nmのODS（10）固定相の40℃での変化を比較した。実験条件は、アセトニトリル（70：30）のチミンと亜硝酸ナトリウムの保持の変化を示す。70時間連

移動相でカラムを平衡化した後、Figure 1と同じ条件で移動

続通液の場合１時間後から19時間後までにチミンの保持時間

相の送液を行った。送液時間と送液停止時間はそれぞれのグ−34−

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ラフに示すとおりである。Figure 2より10.4 nmの細孔径のODS（10）は保持時間が減少しているが、21.9 nmの細孔径のODS（22）は一定の保持時間を示した。ODS（10）では大きく保持時間が減少している通液停止後もODS（22）はほとんど
保持時間は変化していない。この時、ポンプ停止直後とポンプ停止放置後のカラムの重量もほとんど変化していない事を確認した。水100%移動相を用いた場合は、このODS（22）は細孔径が大きいことにより移動相が時間の経過とともにカラムから抜け出ることがなく、亜硝酸ナトリウムもチミンも溶
出時間および保持時間が一定であると考えられる。Figure 3
はTMSの比較例であり、連続通液停止後の保持時間の変化をプロットしている。各点は、1時間通液後15分間通液停止
し、その後再度通液開始し30分通液後の保持時間を測定した。
次に1.75時間通液停止し合計2時間通液停止後の保持時間を同様に測定し、最後に合計20時間後を測定した。TMS（13）は保持時間が一定であるが、TMS（６）は大きく減少していFigure 1. Retention behavior of ODS (10) under 100% aqueousconditions
Conditions: stationary phase, ODS (10); column size, 150 x 4.6mm i.d.; mobile phase, 10 mM sodium phoshate (pH 7.0); flow
rate, 1.0ml/min; column temperature, 40˚C; wave length of UVる。またTMS（３）については、チミンの保持時間が水100%
移動相に切り換え直後から、1.25分であり、Figure 3には示していないが亜硝酸ナトリウムの溶出時間が初期から1.20分
であることを考慮すると、3nmの小さな細孔径では水100%
移動相切り換え直後から、試料と固定相の相互作用は十分に

detection, 254nm; sample, thymine (□) and sodium nitrite (■)

起こっていないと結論づけられる。この3nmの細孔径のTMS（３）でもアセトニトリル/水（70：30）のような十分に−35−Chromatography, Vol.22 No.1(2001)

Figure 2. Retention behavior of ODS (10) and ODS (22) under
100% aqueous conditions
Conditions: stationary phase, ODS (10) and ODS (22); otherFigure 3. Retention behavior of TMS (13), TMS (6) and TMS (3)under 100% aqueous conditions
Conditions: stationary phase, TMS (13), TMS (6) and TMS (3) ;conditions as in Fig. 1. □: ODS (10) and thymine; ■:ODS (10)sample, thymine; other conditions as in Figure 1. □:TMS (13);and sodium;△: ODS (22) and thymine;▲: ODS (22) and sodium
nitrite△:TMS (6); ○:TMS (3)アルキル鎖長と細孔径が及ぼす水100%移動相を用いた際

有機溶媒濃度の高い移動相では、TMS（６）よりも高い保持の保持の減少への影響は、異なる細孔径を有する基材に異なを示した。
これらの結果から、水100%移動相を用いた場合の保持時

る鎖長のアルキル基を結合した充填剤を用いて実験を行っ間の再現性は、細孔径により大きな差が生じており、固定相た。それぞれの充填剤はTable 1に示しており、カラムサイが異なっていても、細孔径が大きい場合には保持が減少しな

ズ4.6×150 mmに充填し使用した。Figure 4には細孔径と保い事が明らかになった。ODS（10）とODS（22）およびTMS

持時間が変化する前後の相対保持時間との関係を示す。アセ（13）とTMS（６）は粒子径は同じであり、細孔径が異なるの

トニトリル/水（70：30）移動相にてカラムを平衡にした後みである。細孔径のより大きなODS（22）やTMS（13）では保Figure1に示す移動相を40℃にて１時間通液した後試料とし持の変化がなく、移動相がカラム外へ抜け出さないのに対し、てチミンを用いて得た保持時間を基準の保持時間とし、その細孔径の小さいODS（10）やTMS（６）では、移動相のカラム

後ポンプを停止し、10時間放置した後再度測定したチミンの外への抜け出しによる保持の減少が起こる。このことから、保持時間から相対保持時間を求めた。またFigure 5には90%

移動相は充填剤細孔径の50倍以上大きな充填剤粒子間隙から以上の相対保持時間を有する充填剤の細孔径を示す。アルキ

抜け出ているのではなく、充填剤細孔内から抜け出している

ル鎖長により違いはあるが、どの充填剤についてもある細孔と考えられる。つまり、細孔内の移動相が抜け出してしまう

径以上であれば90%以上の相対保持時間を維持している。

ことで分離場が減少してしまい、亜硝酸ナトリウムの溶出時90%以上の相対保持時間を示す細孔径は、炭素数8のアルキ間の減少とチミンの保持の減少が生じると考えられる。これ

ル基が極大値を示し、炭素数8から18および30に増加するにらのことから、細孔径の大きな充填剤を用いれば、水100%

従い小さくなった。細孔径15 nm程度のC8とODSを比較する

移動相でも保持時間が一定の分析が可能となることが明らかと保持の減少度合いは大きく異なりC8が80%に対しODSはとなった。また、細孔径のさほど大きくないTMS（13）で40%に留まり、大きな差が存在する。C30はC8からODSへのも水100%移動相で保持の変化がなく高い再現性が得られて変化の延長線上にあり、より小さな細孔径で90%以上の相対いることから、固定相の種類、例えばアルキル鎖長により、保持時間を示しており、C30だけが特異的ではなく炭素数8

水100%移動相が抜け出る細孔径の大きさは異なることが示

以上のアルキル鎖長と90%以上の相対保持時間を示す細孔径された。

には相関関係が存在すると考えられる。TMSは8 nm以上の細孔径で90%以上の相対保持時間を示し、C30と同様な結果が得られた。TMSは炭素数１でシリカ表面上のシロキサン

３・２・２ アルキル鎖長と細孔径の影響−36−

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Figure 4. Effect of the pore diameter of packing materials on therelative retention time
Conditions: stationary phase, (A) C30, (B) ODS, (C) C8 and (D)TMS; sample, thymine; other conditions as in Figure 1.

Figure 5. Area with high reproducibility for the retention
Conditions are the same in Figure 4. The value by each plot was
the relative retention time.

結合等の相互作用がより強く発現するため、より小さい細孔径でも高い相対保持時間を示したと推測される。
ODSの結合密度の低い固定相は結合密度の高い固定相に比べ、水100%移動相条件で保持の減少が少なく、保持の再現性が高くなることが報告［８］されているが、これはODSの結合密度を下げた分エンドキャッピングとしてのTMSの結合密度が上がっており、ODSの結合密度の低い固定相は、
Figure 4のODSとTMSの曲線の間に位置すると考えられる。
つまり、ODSの結合密度を下げTMSの結合密度が上がるほFigure 6. Effect of back pressure of the column on the retention time
conditions are the same as in Figure 1.

ど相対保持時間と細孔径の関係は、Figure 4のODSからより抜け出る現象は固定相表面の極性すなわち残存シラノー

TMSの曲線に移動すると考えられる。

ル基の影響も強く受けており、残存シラノール基が少ないほ
ど細孔内より水100%移動相が抜け出しやすいといえる。つ３・３ 残存シラノール基の影響
固定相表面の極性基の影響として残存シラノール基量が異まり、水100%移動相を使用する際には、残存シラノール基なる市販カラム３種類について水100%移動相を使用した際の多い充填剤を選択すれば、保持時間の変化の少ない分析がの保持の変化を比較した。一般に水素結合性の値は残存シラ可能である。しかし、残存シラノール量が多い充填剤は中性

ノール基の量を反映していると考えられている。Table 2にからアルカリ性における耐久性が著しく低くなる欠点を有しそれぞれの充填剤に対する水素結合性と水100%移動相を用ている。緒言で述べたようにアルキルアミド基のように、固いた保持時間の減少後の相対保持時間を示す。水素結合性は定相内に極性基を含む場合も水100%移動相で高い再現性がメタノール／水（75：25）移動相を用い、40℃のカラム温度得られるが、シリカ表面のシラノール基による極性部によっでのフェノールに対するカフェインの分離係数を用いた。相ても同様に高い再現性が得られることが示された。

対保持時間はFigure 4中の値と同じ方法で求めた。水素結合
３・４ カラム圧の影響性の値よりDevelosil ODS-HG-5が最も残存シラノール基が少なく、Develosil ODS-A-5は残存シラノール基が最も多く残今まで実験に用いたカラムは粒子径5µmの充填剤を4.6×っている。水素結合性が高く、残存シラノール基が多く残っ

150 mmカ ラ ム に 充 填 し た も の を 用 い て お り 、 40℃ で 1ているDevelosil ODS-A-5は高い相対保持時間を示した。逆ml/minの流速で通液した場合6 MPa前後の圧力を示していに水素結合性の最も低いDevelosil ODS-HG-5は低い相対保持る。Figure 1に示されているように通液停止後に大きな保持時間を示した。これらの結果より、水100%移動相が細孔内の減少が観察されており、充填剤にかかる圧力により、細孔−37−

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内から抜け出る移動相量が異なると考えられる。Figure 6に

疎水性の高い結合相を有していることを特徴としている。こはバックプレッシャーと保持時間の関係を示す。今回は粒子

れら固定相の疎水性表面上には、水のような極性の高い溶媒

径20µmのDevelosil ODS-UG-15/30を4.6 x 150 mmカラムには表面張力などの物性が関与し、反発しあい接触面積が小さ

充填して用いた。条件はFigure 1と同じであり、通液開始1くなるように作用する。したがって、固定相内に極性基を含時間後のチミンの保持時間を測定した。このカラムは粒子径

み固定相そのものの疎水性が低くなったもの、またはアルキが大きいため、1 ml/minで通液してもカラム圧は0.4 MPaでル基の結合密度を下げ固定相の疎水性を下げたものはこの反あった。バックプレッシャーはカラムのOUT側に内径0.13発作用が低下し、水になじみやすくなったと考えられる。まmmのチューブを接続し、チューブの長さを26 cmから5 cm

た、充填剤の細孔径も逆相固定相表面上と水とのなじみやす程度まで変えることにより調圧した。Figure 6に示されていさ、または逆の反発作用に関与し、細孔径が大きいほど水とるようにバックプレッシャー0 MPaの時は4分の保持しか示のなじみやすさが増大する。さらに固定相の種類により水とさないが、3.6 MPaのバックプレッシャーを加えた時には7.8のなじみやすさは変化し、10nm前後の細孔径の場合、C8が分の保持時間を示した。また、0.7MPa前後で保持時間の増

最も水となじみにくく、ODS、C30とアルキル鎖長が長くな

加傾向が大きく変化した。これらの結果から、3.6 MPaのバるほど水となじみやすくなる。また、TMSは炭素数1のメチ

ックプレッシャーを加えている場合は、カラムIN側に4.0ル基で鎖長が短くシリカ表面の影響が強くなるため水となじ

MPa、カラムOUT側に3.6 MPaの圧力がかかっている状態でみやすくなると考えられる。

あり、このように圧力の存在している状態では細孔内から移従来水100%移動相では再現性の問題から使用できないと動相は抜け出ていないと考えられ、長い保持時間を示すが、考えられていたC8、ODS固定相でも細孔径の大きな充填剤

バックプレッシャーを加えていない場合はカラムIN側の圧力を用いれば再現性の高い分離が可能である。しかしこの場合が0.4 MPaであり、カラム全体では0.4 MPa以下の圧力しかっ

比表面積も下がるため、大きな保持は期待できない。しかしかっておらず、このように低い圧力においては、水100%移ながら、C30固定相を用いれば、C8、ODS固定相に比べより動相に切り換え直後から細孔内から移動相が抜け出ているこ小さな細孔径すなわち大きな比表面積にて水100%移動相がとになる。0.7 MPa前後に保持の減少度合が変化することか使用可能なため十分な保持が期待される。また、細孔径以外

ら、0.7 MPaの圧力以下で細孔より水100%移動相が抜け出しのパラメーターとしては残存シラノール基とカラムへのバッやすくなっていると推測される。また、Figure 4の細孔径にクプレッシャーが水100%移動相の細孔内からの抜け出しにより保持の減少度合が異なることを考慮すると、小さい細孔

影響していることが明らかとなり、これらのパラメーターをほど細孔内に水100%移動相を留めておくために高い圧力が考慮すれば水100%移動相を使用した分析の再現性が向上で必要であると推察される。この実験において、亜硝酸ナトリ

きると考えられる。

ウムの溶出時間もチミンの保持時間と相関していた。また、送液停止し、大気圧に1時間以上放置した後更に保持時間は

４．文献

減少した。
バックプレッシャーを加えない粒子径5 µmの充填剤を用[1]

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るが、カラムのOUT側から長さ10%の位置では0.6 MPa以下

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の圧力しかかかっておらず、細孔内から移動相が抜け出し始[3]

めていると推察される。

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３・５ 逆相固定相の水100%移動相使用に関する検討[5]

逆相固定相はメチル基からオクチル基、オクタデシル基とAscah, L. T.; Kallury, R. M.; Szafranski, A. C.; Corman, D.;
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