Global Viewer of Local Alignments

完全長cDNAプロジェクト
Last Update 2003.07.02

SpVaPJでは解析配列と対象配列の比較が必須。

従 来＜ローカルアライメント＞＜グローバルアライメント＞○ 正確なアライメント情報が得られる。

○ 全体像が把握し易い。

× 部分的なアライメントの為に、GAP領域の位置など、全体像が把握しにくい。

× 配列全体にアライメントさせるため、本来アライメント可能にも関わらず、バラバラに貼り付く事がある。
ロングGAPに弱い。

Long GAPを考慮して、配列全体のアライメントを簡単に把握できるアライメントツールの開発が必要。

1

アライメントツールのアルゴリズム
BLASTのアルゴリズムを利用して、ローカルアライメントをとり、その結果を非アライメント領域の配列で繋ぎ一本にしてグローバル化する。
BLAST結果よりのアライメント情報

非アライメント配列

GAPを考慮した高精度のアライメントが可能となるインストール方法-1
STEP1：アライメントツール実行環境の確認●動作確認済みOS ： Windows 2000 / XP
●ALVISIONの実行には、Perlのインストールが必要になります。
Active Perl 5.6.1 Build 631 以上のバージョンで動作確認済みです。
使用するパソコンにPerlがインストールされていない場合は、CD-Rに格納されているインストーラ（ActivePerl-5.8.0.804-MSWin32-x86.msi ）でインストールを行って下さい。
●PerlTkのインストール
通常、Perlインストール時にインストールされているものです。
ALVISIONが起動しない場合のみ、インストールの必要があります。
・ コマンドプロンプトを起動 スタート→ プログラム→ アクセサリ→ コマンドプロンプト
・ ppmと入力
・ search tk と入力
・ install tk と入力
これでインストール完了です。

2

インストール方法-2
STEP1のつづき●PDFファイルを閲覧するために、Adobe Acrobat Readerが必要です。
Acrobat Reader 5.0以上のバージョンで動作確認済みです。
（Acrobat Reader 4.X以前のバージョンでは閲覧できません）
使用するパソコンにAcrobat Readerがインストールされていない場合は、CD-Rに格納されているインストーラ（AcroReader51_JPN.exe ）でインストールを行って下さい。
※）以前のバージョンが既にインストール済みの場合は、古いAcrobat Readerをアンインストールしてから、インストールして下さい。

STEP2-1 ： 実行プログラムのコピー（iTextFront版）● CD-Rに格納されている「iTextFront版」フォルダに移動し、「Align」フォルダを“Cドライブ直下”にコピーする。
CD-Rからドラッグアンドドロップで、“Cドライブ直下”にコピーして下さい。

インストール方法-3
STEP2-2 ： 実行プログラムのコピー（PDFJ版）（※）このプログラムはiTextFront版で実行した結果、白紙のPDFファイルが出力される場合にご利用ください。既に「iTextFront版」がインストール済みの場合、コピー済みの「Align」フォルダのフォルダ名称は別名に変更しておいて下さい。尚、PDFJ版のALVISIONは、iTextFront版に比べ、処理速度が大幅に低下します。
● CD-Rに格納されている「PDFJ版」フォルダに移動して下さい。
● 「Align」フォルダ、「PDFJ」フォルダ、「PDFJ.pm」ファイルが格納されている事を確認して下さい。
● 「Align」フォルダを“Cドライブ直下”にコピーして下さい。
● 「PDFJ」フォルダ、「PDFJ.pm」ファイルを、ActivePerlをインストールしたフォルダにコピーします。
（注） ActivePerlを“Cドライブ直下”にインストールした場合、 「PDFJ」フォルダ、「PDFJ.pm」ファイルのコピー先は、“C:¥Perl¥Site¥lib” の下になります。

作業完了

3

フォルダ構成イメージ
Alignフォルダ

実行プログラムファイル（ALVISION.pl）alignment_tool.ini
TOOL格納ディレクトリー：実行に必要な各種ツール

作業毎個別フォルダ
Input.txt
query

sbjct

blast

outputpdf

アライメント結果（PDF）を格納
アライメント結果（PDF）を格納

アライメント結果ファイル（テキスト）を格納
アライメント結果ファイル（テキスト）を格納
ローカルアライメント結果ファイル（テキスト）を格納
ローカルアライメント結果ファイル（テキスト）を格納

比較配列格納フォルダ：比較配列を格納
比較配列格納フォルダ：比較配列を格納
解析配列格納フォルダ：解析配列を格納
解析配列格納フォルダ：解析配列を格納
Inputファイル＊ピンク色のフォルダは処理実行時に自動的に作成されます
Inputファイル

ALVISION実行手順
Input.txt

inputファイルの作成・格納

query

解析配列をqueryフォルダに格納

sbjct

比較配列をsbjctフォルダに格納

ALVISON.plを実行

blast

pdf

output

処理結果が各フォルダに格納される

4

Inputファイル形式-1
比較配列情報

解析配列情報

解析配列名
解析配列 ORF開始位置 ORF終止位置 比較配列名
比較配列 ORF開始位置 ORF終止位置
Z-ASTRO2007289-01
C-ERLTF2002178
Z-BRACE2006690-01
NM_021160.1
Z-BRACE3002532-01
NM_032773.1
Z-BRAMY2014483-01
AL117482.1
Z-BRAMY2034995-01
AB028968.1
Z-BRAMY3013305-01
NM_017712.1
Z-BRAWH2018633-01
AB020702.1
Z-BRAWH3004005-01
NM_144579.1
Z-BRAWH3013633-01
AB037784.1
Z-BRAWH3023732-01
BC028035.1
Z-BRAWH3028717-01
C-FEBRA2000805
Z-BRAWH3039770-01
NM_152904.1
Z-BRHIP2000006-01
NM_052926.1
Z-BRHIP2006833-01
NM_001606.2

A列

B列

C列

D列

E列

F列

G列

H列

解析配列名（A列）・比較配列名（E列）を元に、指定フォルダを検索し、解析配列名（A列）・比較配列名（E列）を元に、指定フォルダを検索し、一致するファイルから配列情報を抜き出し、B列・F列に記載する。
一致するファイルから配列情報を抜き出し、B列・F列に記載する。

B列とF列の配列をアライメントさせる
B列とF列の配列をアライメントさせる
注）実際のInputファイルはエクセル形式ではなく、タブ区切りのテキスト形式になります。

Inputファイル形式-2● Inputファイルは以下の形式で作成

ファイル形式 ： タブ区切りのテキスト
ファイル名： input.txt●A列に解析配列名、E列に比較配列名を記載する。
B・C・D・F・G・H列は現在のツールでは使用しないので、空白にする。
●前ページでは説明用に1行目に「解析配列名」「解析配列」・・・があるが実際のファイルではこの行は削除する
実際のInputファイルは以下のようになります。

5

配列ファイル形式
ファスタ形式

配列のみのテキスト形式

queryフォルダ・sbjctフォルダには、上記のどちらかの形式のファイルを格納可能。両方の形式が混在していても構いません。
尚、マルチファスタには対応していません。
Inputファイルに記載されたファイルは必ず格納して下さい。

ALVISION実行方法-1
Alignフォルダ内のALVISION.plをダブルクリックしALVISIONを起動（Alignフォルダ内にはaligin.plもありますので、ご注意下さい）
ALVISION.plのショートカットをデスクトップ等に作成する事をお勧めします。

ALVISION起動画面
処理対象フォルダを指定

オプションE設定（使用する時のみ）
出力方法選択
オプションS選択
終了
処理タイプの選択
重複度の設定処理結果一覧の表示

処理実行＊各機能の説明は次ページ以降を参照

6

ALVISION実行方法-2
処理タイプの選択について
ALVISIONでは2タイプのアライメント処理を行う事が可能です。
1）核酸 vs 核酸 （BLASTN）
queryフォルダ・sbjctフォルダには核酸配列のファイルを格納
2） アミノ酸 vs アミノ酸 （BLASTP）
queryフォルダ・sbjctフォルダにはアミノ酸配列のファイルを格納

処理実行時にどちらのタイプか選択（処理タイプを誤って選択すると全てNGで終わります）

BLASTN実行時には”blastn”フォルダに、BLASTP実行時には”blastp”フォルダにBLAST処理結果が保存されます。これらのフォルダは実行時に自動的に作成されます。

ALVISION実行方法-3①②“参照”ボタンを押してフォルダ選択画面を開く

処理するフォルダを選択④③

実行タイプを選択し、“実行“ボタンをクリック

処理開始

7

アライメントツール実行方法-4
処理終了後、自動的に結果一覧が表示されます。

表示している
フォルダ名

アライメント結果を表示（テキスト）

Inputファイルを表示

アライメント結果を表示（PDF）

BLASTN結果を表示

NGファイルを表示

BLASTP結果を表示

各項目をダブルクリックすると、各処理結果を見る事ができます。

その他の使用方法①
処理済みの結果を結果一覧から見る事もできます③“処理結果”ボタンを押してフォルダ選択画面を開く②

処理するフォルダを選択結果一覧が表示される

8

オプションEについてオプションEを用いると、設定値以上のE-valueのローカルアライメントはグローバル化の際に排除されます。
このオプションを用いる事により、偶発的に貼り付く短いアライメントを排除することが可能となります。

任意の数値を入力する＊オプションEについては、次ページの使用上の注意も必ずお読み下さい

オプションEの使用上の注意
ALVISONでは、BLASTによるローカルアライメントの結果からスコアの高いアライメントを基準として、整合性が取れるようにアライメント結果の真偽を判定し、真のアライメントと判断されたものを整列化しています。
しかし、あくまでBLASTのアルゴリズムを利用しているため、偶然に短い配列が整合性の取れる位置にアライメントされる事があります。
この様なアライメントについての真偽の判定はゲノム配列等と比較しないとできません。現行のバージョンではそのような機能は付加されていません。
短いアライメントはローカルアライメントのE-valueが大きな値になります。
明らかに偽と判定されるアライメントである場合には、ツール実行時にオプションEを利用して下さい。
これにより、指定したE値以上のローカルアライメントは偽と判定されます。
ただし、短くても真と判定されるべきアライメントも多く存在します。
よって、通常の実行時にはオプションEは使用せず、明らかに問題があると判定される配列に対してのみ、オプションEを使用するようにして下さい。

9オプションSについてオプションSとは、比較配列（Sbjct）のアライメント
領域配列の配列ファイルをアライメント領域毎に出力する機能です。 例えば、下記の様な場合は・・・・
Query Z-ACBDE1000001
Sbjct NM_000016
QuerySbjct
Z-ACBDE1000001_SS_01.txt

Z-ACBDE1000001_SS_02.txt

Z-ACBDE1000001_SS_03.txt

ファイル名称はクエリー名+「 _SS_XX 」（XXは上流から01・02・・・と付与します）
本来、比較配列（Sbjct）の名称を基準に名前を付与すべきなのですが、同じ比較配列（Sbjct）を有するクローンが存在する為、重複がない解析配列（Query）の名称をもとに、名前を付与しています。
作業毎個別フォルダ
SSFASTA

Input.txt

query sbjct blast output pdf

作成されたファイルは作業毎フォルダ内に自動的に作成される「SSFASTA」フォルダ内に格納されます。
Sオプションを指定しない場合、このフォルダは作成されません。

＊オプションSはBLASTN実行時のみ有効で、BLASTP実行時には使用できません。

パラメーター＜重複度＞計算方法
重複度とは、クエリー配列・サブジェクト配列において同一領域のアライメントが重複して複数箇所に存在する時、その重複領域がローカルアライメントにおいて占める割合を計算したものです。
Query: 181 ggaaactggcactgaagtggcatccagataaaaatcctgagaataaagaag 231|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||A Sbjct: 226 ggaaactggcactgaagtggcatccagataaaaatcctgagaataaagaag
276

B

Query: 225 aaagaaggattaaatggtggaggaggaggtggaagtcattttgacagtccatttgaattt 284||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 363 aaagaaggattaaatggtggaggaggaggtggaagtcattttgacagtccatttgaattt 422

重複度は重複領域を持つアライメントの中で最もアライメントスコアが高いアライメントを基準配列とし、その基準配列に対する重複度を計算します。
例えば、上図の様なアライメント結果で、AがBよりアライメントスコアが高いとした時、AとBの配列におけるクエリー配列の重複領域がBのアライメントにおいて占める割合を計算します。
上図の場合、重複領域は225-231の7塩基、Bのアライメント長は225-284の60塩基。
よって重複度は7÷60×100＝11.7％となります。

10

パラメーター＜重複度＞について-1
ALVISIONでは、ローカルアライメントの結果からアライメントスコアの高いものを基準とし、位置情報の整合性が取れるかどうかローカルアライメントの真偽を判定し、真のアライメントと判断されたものを整列化しています。
しかし、ローカルアライメントの結果からは、アライメント領域の末端が他のアライメント領域の末端配列と同じ配列を有しているために、整合性が取れない場合があります。

例1

Query: 181 ggaaactggcactgaagtggcatccagataaaaatcctgagaataaagaag 231|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||A Sbjct: 226 ggaaactggcactgaagtggcatccagataaaaatcctgagaataaagaag
276

Query: 225 aaagaaggattaaatggtggaggaggaggtggaagtcattttgacagtccatttgaattt 284||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 363 aaagaaggattaaatggtggaggaggaggtggaagtcattttgacagtccatttgaattt 422

B

上図のAとBではQueryの225～231がA・B両方のアライメントに存在し、位置的な矛盾が起こっています。
しかし、225～231は偶然一致したものであり、実際にはA・B両アライメントが真であり、下図の様なアライメントを取るのが理想的です。この様な場合、ほとんどのアライメントにおいて重複度は10％以下になります。
Query :
Sbjct :

Query :
Sbjct :

重複配列削除Query :
Sbjct :

ctcgtaaaacatggtggattactatgaagttctaggcgtgcagagacatgcctcacccgaggatattaaaaaggcatatcggaaactggcactgaagtgg||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ctcgtaaaacatggtggattactatgaagttctaggcgtgcagagacatgcctcacccgaggatattaaaaaggcatatcggaaactggcactgaagtgg
155
165
175
185
195
205
215
225
235
245
210
220
230
catccagataaaaatcctgagaataaagaag|||||||||||||||||||||||||||||||
catccagataaaaatcctgagaataaagaagAAGCAGAGAGAAAATTCAAGCAAGTAGCGGAGGCATATGAAGTGCTGTCGGATGCTAAGAAACGGGACA
255
265
275
285
295
305
315
325
335
345
240
250
260
270
280
290
300
gattaaatggtggaggaggaggtggaagtcattttgacagtccatttgaatttggcttcacattccgtaacccaga||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TCTATGACAAATATGGCAAAGAAGgattaaatggtggaggaggaggtggaagtcattttgacagtccatttgaatttggcttcacattccgtaacccaga
355
365
375
385
395
405
415
425
435
445

パラメーター＜重複度＞について-2
例2 :同塩基の連続した配列の場合
Query: 977

Aaaaaaaaaaaa 987|||||||||||
Sbjct: 2114 aaaaaaaaaaa 2124

例3:同一配列が複数箇所にある場合
Query: 1551 atgcatgcatgat 1563|||||||||||||
Sbjct: 2264 atgcatgcatgat 2276

B

Query: 1551 atgcatgcatgat 1563|||||||||||||
Sbjct: 2534 atgcatgcatgat 2546

Query: 977

Baaaaaaaaaaa 987|||||||||||
Sbjct: 2116 aaaaaaaaaaa 2126

A

重複度 11÷11×100＝100％

重複度 13÷13×100＝100％

例2は連続する同塩基の配列が、少しずつずれた状態でアライメントされています。
実際にアライメントに使用するべき配列はAのみで、Bのアライメントは排除すべきものです。
理想的なアライメントは下図の様になります。

例3は同一は配列が複数箇所に存在するために、複数箇所でローカルアライメントがとれます。
しかし、実際に使用するのはAのみでBのアライメントは排除すべきものです。

Query: 977

aaaaaaaaaaa 987|||||||||||
Sbjct: 2114 aaaaaaaaaaaaa 2126

例2・3のように重複領域が存在し、一方のアライメントを排除するような場合、ほとんどのアライメントにおいて、非常に高い重複度を示します。

11パラメーター＜重複度＞について-3
重複度を用いる事により、ローカルアライメント同士で位置的な矛盾があった
場合、例1のようにローカルアライメントを採用すべきケースと、例2・3のように排除すべきケースの分類を行う事ができます。
現在は50％に設定されています。
アライメントツールでは、設定値以上の重複度のアライメントを排除されます。
例1のようなパターンは多くのケースにおいて、アライメント長が長く重複度は低くなります。それに対して、例2・3のようなパターンはアライメント長が短く重複度は高くなります。
パラメーター設定方法
重複度の設定はオプションの“重複度の設定”で行います。
ALVISON起動時にはデフォルト値が設定されています。
ここで設定した値は起動中のみ有効であり、ALVISON終了後は再度設定する必要があります。
起動時のデフォルト値はalignment_tool.iniファイルにて変更可能です。

BLASTN実行時の重複度
BLASTP実行時の重複度

NG_FILEについて実行時にエラーがあった場合、各エラー内容がNG_FILE.txtに出力されます。
このファイルは作業毎フォルダ内に自動的に作成されます。
ただし、エラーがない場合は作成されません。
・アライメントに用いている配列と、形成されたアライメントの配列が一致しない時。
・アライメントの取れる領域がない場合

作業毎個別フォルダ
NG_File.txt

Input.txt
query sbjct

blast

outputpdf

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実行結果表示例
Query :
Sbjct :

Query :
Sbjct :

Query :
Sbjct :

10203040506070
8090100
CTTAAGACCCGCTGTCTGGCCCTGAGTAGGGTGTGACCTCCGCAGCCgcagaggaggagcgcaGCccggcctcgaagaacttctgcttgggtggctgaac||||||||||||||||**|||||||||||||||||||||||||||||||||||gcagaggaggagcgcaCGccggcctcgaagaacttctgcttgggtggctgaac
1020304050110120130140150160170180190
200
tctgatcttgacctagagtcatggccatgCACAAACAACGAGGAAACAGAAGATTCACCAAACATTTATGAACAGCCAGCTGTTATAAAGACAAGGGACC|||||||||||||||||||||||||||||
tctgatcttgacctagagtcatggccatgGCAACCAAAGGAGGTACTGTCAAAGCTGCTTCAGGATTCAATGCCATGGAAGATGCCCAGACCCTGAGGAA60708090100110120130140150210220230240250260270280290
300
AATCTGAAAAATCAGAATAAAGTCTCCTTGTTAAAGCTGCTGCAAGAAACAggcaccgatgaagacgccattattagcgtccttgcctaccgcaacaccg|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GGCCATGAAAGGGCTC
ggcaccgatgaagacgccattattagcgtccttgcctaccgcaacaccg
160
170
180
190
200
210

アライメントが取れるところは小文字の塩基と「｜」で表示。
ミスマッチのところは大文字の塩基と、「＊」で表示。

Global Viewer of Local Alignments

に関するお問い合わせは下記まで

完全長cDNAプロジェクト
磯貝 隆夫 flj-cdna@nifty.com

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