Alt-R ™ CRISPR-Cas9 System
sgRNA（シングルガイド RNA）はこれまで、その長さのために一度に合成することが出来ませんでした。Alt-R ™ CRISPR-Cas9 System は、sgRNA を元来の crRNA（シーアール RNA）と tracrRNA（トレイサー RNA）の 2 種に分けることで、gRNA を 2 本の化学合成 RNA で納品するサービスです。
sgRNA complex の作製も 5 分 95℃インキュベートを行うだけ、と非常に簡単に効率の良いゲノム編集を行えます。

原理と特徴
図1

Alt-R™ crRNA:tracrRNA complex 模式図

表

元来の gRNA と Alt-R ™ gRNA の塩基長の比較
S. pyogenes (bases)

Alt-R ™ CRISPR-Cas9
System (bases)
36crRNA42

tracrRNA

8967

Total

131103

Cas9 タンパク質を誘導する sgRNA は、約 100 塩基の RNA から成ります。長鎖 RNA 合成について、お客様より多数ご質問を頂きましたが、弊社でも最大 90 塩基の RNA しか合成できません。また合成が出来たとしても非常に高価で、純度の低い物しか提供出来ません。そのため、sgRNA はこれまで、プラスミドへの導入や二本鎖 DNA をテンプレートにした転写産物 RNA が使用されてきました。
この Alt ™ -R CRISPR-Cas9 System は、sgRNA を crRNA と tracrRNA の 2 種の機能的コンポーネントに分け、さらに、それぞれをできるだけ短くしたものです。元来の crRNA (native crRNA) は 42 塩基、tracrRNA (native tracrRNA) は 89 塩基でしたが、Alt ™ -R CRISPR-Cas9 System では、Alt-R ™
crRNA が 36 塩基、Alt-R ™ tracrRNA が 67 塩基と大幅に短くする事が出来ました。少し短くなっただけと思われるかもしれませんが、多くの点が改善されました。

1) 合成が容易にRNA は DNA と比較し合成が難しく、native tracrRNA の様に、89 塩基ともなると、取得できる収量や純度も非常に小さくなります。しかし、Alt-R ™
tracrRNA の 67 塩基であれば、短いため比較的容易に合成できます。

2) 安価に提供が可能に
RNA は DNA と比べ非常に高価です。native crRNA:tracrRNA complex は計 131 塩基で、Alt-R ™ crRNA:tracrRNA complex は 103 塩基と、合計で 28 塩基短くなりました。また Alt-R ™ tracrRNA は、合成の難易度も軽減したため一度に大量に合成する事ができ、大変安価に提供できるようになりました。

3) 修飾の付加が可能に
Alt-R ™ tracrRNA は 67 塩基と短くなった事によって、ヌクレース耐性の修飾ができるようになりました。これにより、細胞内でより長く Alt-R ™
crRNA:tracrRNA complex が機能するようになります。

4) ゲノム編集がより高効率に
Alt-R ™ crRNA:tracrRNA complex、S.pyogenes の計 131 塩基の元来の RNA complex (native crRNA:tracrRNA complex)、シングルガイド RNA である
In Vitro Transcribed sgRNA (IVT)、2 本鎖 DNA である gBlocks®、そして gRNA として 2.7 Kb の gRNA 発現プラスミドを用いて、Cas9 安定発現株にリバーストランスフェクションにより gRNA を導入しました。合計 12 ヶ所でゲノム編集の効率を測定したところ、9 ヶ所で Alt-R ™ crRNA:tracrRNA complexの切断効率が最も高く、Alt-R ™は全体的に高い効率でゲノム編集を行う事ができる事が分かりました。
なお、効率の測定には、T7E1 を用いています。T7E1 は 1 塩基以上のミスマッチを切断する酵素で、ゲノム編集の効率測定に優れています。1 塩基置換は認識できませんが、約半数の非相同末端結合が 1 塩基置換であることから、T7E1 の切断効率からゲノム編集で起こった非相同末端結合の割合を推定できます。
図2 gRNA の種類による効率の比較（gRNAs Targeting HPRT)
100

Alt-R™ RNA (36/67)
90

Native RNA (42/89)
In vitro transcribed sgRNA

80

sgRNA Expression Plasmid (2.7 kb)
gBlocks Gene Fragments sgRNA

ゲノム編集

T7EI cleavage (%)

70
60
50
40
30
20
100

HPRT
HPRT
38094 S 38231 S+34

Cas9安定発現株

HPRT
38371 S

HPRT
HPRT
HPRT
HPRT
HPRT
HPRT
HPRT
HPRT
HPRT
38509 S 38574 S 38087 AS 38133 AS 38285 AS 38287 AS 38358 AS 38636 AS 38673 AS

or
Alt-R™ or Native
crRNA/trancRNA complex

orIn vitro transcribedsgRNAorsgRNA発現プラスミド

Integrated DNA Technologies MBL 株式会社 (IDT-MBL KK)

gBlocks® Gene Fragments sgRNAE-mail：oligo@mbl.co.jp

Alt-R ™ CRISPR-Cas9 System 製品リスト

お見積もり・ご注文方法 ▶▶▶ p.74

CRISPR crRNA価格
Alt-R ™ CRISPR crRNA, 2 nmol, Plate¥8,300

Alt-R ™ CRISPR crRNA, 2 nmol

¥9,800

Alt-R ™ CRISPR crRNA, 10 nmol

¥13,000※ 24 本以上をご注文の場合、プレートをご利用頂けます。

CRISPR  tracrRNA
価格
5 nmol Alt-R ™ CRISPR tracrRNA¥12,000

20 nmol Alt-R ™ CRISPR tracrRNA¥25,000

100 nmol Alt-R ™ CRISPR tracrRNA¥64,000※ Nuclease-Free Duplex Buffer が同梱されます。

CRISPR-Cas9 control kits
価格
2 nmol Alt-R ™ CRISPR Control Kit Human¥19,500

2 nmol Alt-R ™ CRISPR Control Kit Rat¥19,500

2 nmol Alt-R ™ CRISPR Control Kit Mouse¥19,500＜ Kit 内容品＞
・5 nmol Alt-R ™ CRISPR tracrRNA・Alt-R ™ CRISPR HPRT Positive Control crRNA・Alt-R ™ CRISPR Negative Control crRNA #1・Alt-R ™ HPRT PCR Primer Mix
・Nuclease-Free Duplexing buffer

CRISPR Controls (kit 内容の各 crRNA の単品販売です )価格
2 nmol Alt-R ™ CRISPR Human HPRT Pos Ctrl crRNA¥12,300

2 nmol Alt-R ™ CRISPR Rat HPRT Pos Ctrl crRNA¥12,300

2 nmol Alt-R ™ CRISPR Mouse HPRT Pos Ctrl crRNA¥12,300

2 nmol Alt-R ™ CRISPR Negative Control crRNA #3¥12,300

2 nmol Alt-R ™ CRISPR Negative Control crRNA #2¥12,300

2 nmol Alt-R ™ CRISPR Negative Control crRNA #1¥12,300

Control PCR primer mixes (kit 内容の各 crRNA の単品販売です )価格
2 nmol (ea.) Alt-R ™ HPRT PCR Primer Mix Human¥5,8002 nmol (ea.) Alt-R ™ HPRT PCR Primer Mix Rat¥5,8002 nmol (ea.) Alt-R ™ HPRT PCR Primer Mix Mouse¥5,800

Cas9 expression plasmid
価格
Alt-R ™ S.p. Cas9 Expression Plasmid¥12,800

Nuclease-Free Duplex Buffer
価格
10 x 2 mL Nuclease Free Duplex Buffer¥3,000300 mL Nuclease Free Duplex Buffer¥3,000ゲノム編集

納期
約 5 ～ 10 営業日

Alt-R ™ crRNA:tracrRNA complex の調製法
Alt-R ™ tracrRNA に同梱される Duplex Buffer に Alt-R ™ crRNA と Alt-R ™ tracrRNA を溶解し、95℃ 5 分インキュベートを行うことで、Alt-R ™
crRNA:tracrRNA complex を作成できます。complex 作成後は、-20℃保存で最大 4 週間程度は gRNA として使用できます。
詳細は Alt-R ™ CRISPR-Cas9 System user guide をご参照ください。

https://www.idtdna.com/pages/docs/default-source/
CRISPR/alt-r-crispr-cas9-system-user-guide.pdf

Alt-R IDT

検索35
詳細、ご注文は MBL ライフサイエンスサイト http://ruo.mbl.co.jp/bio/idt/index.html をご利用下さい。

ゲノム編集コラム 1

導入プラスミドのサイズと導入効率

S.pyogenes Cas9 は 1,368 aa (4,104 bp) と、とても 大きなタンパク質です。そのため、この Cas9 発現系を含むプラスミドは、通常7-10 kb 程度と大きなサイズのプラスミドになります。しかし、図 1 のように 9.2 kb と大きなプラスミドを細胞に導入した場合、その導入効率が低く、4.7 kbのプラスミドと比べるとその差は歴然です。IDTで販売しているAlt-R™ S.p. Cas9 Expression Plasmid は7.3 kbのため、9.2 kb のプラスミドと比較すると容易に細胞に導入されます。
Alt ™ -R CRISPR-Cas9 System では、Alt-R ™ crRNA:tracrRNA complex を導入する 24 時間前に Cas9 プラスミドを導入するプロトコールを勧めております。これはプラスミドと complex を同時に導入した場合、Cas9 が発現される前に Endogenous Nucleases により Alt-R ™
crRNA:tracrRNA complex の分解が始まり、質が落ちてしまうためです。
図1

プラスミドのサイズとその導入効率

9.2 kb sgRNA + Cas9 Plasmid

図2

Alt-R™ crRNA:tracrRNA complex 導入のタイミング

4.7 kb eGFP Plasmid

24h 後500 ng plasmid, 1 μL Mirus TransIT-X2

ゲノム編集コラム 2crRNA と tracrRNA の最適な長さの追求

ゲノム編集

元来の tracrRNA は 89 塩基と長いため、合成するのが難しく非常に高価でした。そこで IDT は、この tracrRNA を短く出来ないかと考え、crRNA を含めて、様々な長さの tracrRNA でその効率を測定しました。その結果、36 塩基と 67 塩基を組み合わせた場合に最も良い効率であることを発見しました。また、67塩基であれば89塩基と比較して容易に大量合成できる事から安価で提供ができるようになりました。さらに、化学修飾によってヌクレース耐性も付加させています。

図 3 crRNA、tracrRNA 鎖長とゲノム編集の効率
様々な長さの crRNA:tracrRNA complex を HPRT-38285-AS サイトで試し、その導入効率を測定しました。crRNA:tracrRNA complex
は、Lipofectamin® RNAiMAX Transfection Reagant (Thermo Fisher) を用いてリバーストランスフェクションによって HEK293-Cas9 安定発現株に導入しました。ゲノム編集の効率は、1) ターゲット部位を PCR で増幅させ、2) T7E1 mismatch endnuclease (New EnglandBiolabs) を用いて増幅断片を切断し、3) Fragment Analyzer ™ (Advanced Analytical) を用いて測定しました。

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E-mail：oligo@mbl.co.jp

ゲノム編集コラム 3

自然免疫による細胞死と Alt-R ™ CRISPR-Cas9 System

社内で行った実験では、In Vitro Transcribed sgRNA (IVT) を細胞に導入した際、自然免疫機構により多くの細胞が細胞毒性により死んでしまいました。そこで、HEK293-Cas9 安定発現株を用いて、IVT と Alt-R ™ crRNA:tracrRNA complex の免疫活性の比較実験を行いました。
実験の結果、IVT ではストレス反応遺伝子である IFIT1(P56) と OAS2 が顕著に活性化されているのが観察されました。しかし Alt-R ™
crRNA:tracrRNA complex では、これらの活性は見られませんでした。他のストレス反応遺伝子 IFITM1 、RIGI 、OAS1 でも、同様の結果が見られました。
図 4 Alt-R ™ CRISPR-Cas9 System
は自然免疫機構を刺激しない
Alt-R ™ crRNA:tracrRNA complex
お よ び IVT を、HPRT1 の 12 遺 伝 子に 対 し て 設 計 し ま し た。IVT お よ び
Alt-R ™ crRNA:tracrRNA complex は、Lipofectamin® RNAiMAX Transfection
Reagant (Thermo Fisher) を用いてリバーストランスフェクションによりHEK293-Cas9 安定発現株に導入しました。一般的なストレス反応遺伝子である IFIT1 (A) と OAS2 (B) の発現レベルをそれぞれの導入 24 時間後に測定しました。
(A)IVT による顕著な IFIT1 の増幅が見られました。
(B)IVT による顕著な OAS2 の増幅が見られました。
(A)(B) ともに Alt-R ™ crRNA:tracrRNAcomplex では、活性は見られませんでした。IFITM1 、RIGI 、OAS1 でも、同様の結果が得られました。

ゲノム編集コラム 4

ゲノム編集とノックイン

ノックインの効率は、一本鎖オリゴ (single-strand DNA, ssDNA) が最も良いとされています 1,2)。しかし、ホモロジーアームとして切断箇所の上流下流それぞれに 40 塩基ずつが必要とされ、最短でも 80 塩基 の ssDNA が必要です。IDT が提供する Ultramer® DNA 合成というサービスは、ssDNA を脱塩グレードでも 200 塩基まで合成できます。
培養細胞への導入は脱塩グレード、受精卵への導入は PAGE 精製品をお勧めしておりますが、脱塩か PAGE 精製どちらの精製グレードが良いのか実験してみたいという場合は、お得なご案内がございますので、お気軽にお問い合わせ下さい。また、GFP や BAC 等の大きな遺伝子を導入する方法をウェブサイトのテクニカルレポート vol.2 にてご案内しております。遺伝子導入にお悩みの方は、是非そちらも併せてご覧ください。
＜参考文献＞
1) Chen F et al . Nat Methods. 8, 753-5 (2011)
2) Ran FA et al . Nat Protoc. 8, 2281-308 (2013)

図5

ゲノム編集と HDR5ʼ
5ʼ
ZFN、TALEN、CRISPRによる二本鎖切断

ゲノム編集

5ʼ
5ʼ
ssDNAを用いたHDR（相同組換え修復）
任意配列を追加した ssDNA

HDR37
詳細、ご注文は MBL ライフサイエンスサイト http://ruo.mbl.co.jp/bio/idt/index.html をご利用下さい。

遺伝子 / DNA の変異 / 多型検出キット：Surveyor® Mutation Detection KitsSurveyor® Mutation Detection Kits は、遺伝子や DNA の変異や多型を検出するキットです。変異箇所を特異的に切断するセロリ由来のヌクレアーゼ（CELファミリータンパク質）、Surveyor Nuclease の特徴的な活性を利用するキットで、主要な変異解析法として、多くの研究者に広く使用されています。

主な用途● がん遺伝子の変異解析● SNP の検出
● ゲノム編集実験（TALE Nuclease、CRISPR/Cas9 等）での変異導入有無の確認

Surveyor Nuclease の作用
2 本鎖 DNA 内のミスマッチ箇所特異的なエンドヌクレアーゼです。ミスマッチ箇所の 3' 側を切断します。
Surveyor Nuclease

Location of mismatch
5’5’

3’

3’

Resulting fragments

5’5’

5’

3’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’3’

テストサンプル

コントロール
サンプル

キットの原理と実験の流れ

テストサンプルに含まれる変異型の細胞

赤色：変異型の相補塩基対

コントロールサンプルに含まれる野生型の細胞緑色：野生型の相補塩基対1）ゲノム DNA 抽出

2）PCR 増幅

3）熱処理による1 本鎖化

ミスマッチが入った状態で再会合した 2 本鎖↓↑：ミスマッチ箇所のみ認識する
Surveyor Nulclease による切断箇所

4）再会合による2 本鎖化5）Surveyor Nuclease
処理

コントロールサンプル：

2）PCR 増幅 後

テストサンプル：変異型、5）Surveyor Nuclease 処理 後

6）電気泳動による検出

1）ゲノム DNA 抽出：
解析対象のテストサンプル（上の図では変異型と想定）、及び野生型のコントロールサンプルから、ゲノム DNA を抽出する。

2）PCR 増幅：変異が入っていると想定される箇所を増幅するプライマーセットによる PCR を行う。

3）熱処理による 1 本鎖化：
2 つのサンプル由来の PCR 増幅断片を 1 本のチューブの中に入れ、熱処理により 2 本鎖を乖離させ、1 本鎖にする。

ゲノム編集

4）再会合による 2 本鎖化：
クールダウンを行い再会合させる。コントロールサンプル由来（野生型）の 1 本鎖と、テストサンプル由来（変異型）の 1 本鎖が会合した際に、ミスマッチが起こる。

5）Surveyor Nuclease 処理：
Surveyor Nuclease が、2 本鎖の中のミスマッチ箇所を切断する。

6）電気泳動による検出：
サンプル内の DNA を電気泳動で分画し、Surveyor Nuclease 処理による 2 本鎖の切断が起こったかどうかを確認する。複数のバンドが観察されれば、変異型の細胞がテストサンプルに含まれていることが分かる（電気泳動像の右側レーン）。さらに、切断されたバンドの長さを確認することによりその変異の具体的な場所を、及びバンドの濃さからテストサンプル中に含まれる変異型の割合を、おおよそ同定することができる。

38
Integrated DNA Technologies MBL 株式会社 (IDT-MBL KK)

E-mail：oligo@mbl.co.jp

検出方法と製品設定
電気泳動で検出：Surveyor® Mutation Detection Kits（S シリーズ）
Surveyor Nuclease により切断された DNA 断片を、電気泳動により検出します。

WAVE システムで検出：Surveyor® PLUS Mutation Detection Kits（W シリーズ）
Surveyor Nuclease により切断された DNA 断片を、Transgenomic 社の WAVE あるいは WAVE HS システム（ion-pairing reverse-phase HPLC）により検出します。

価格・納期予定
価格

納期予定

Surveyor® Mutation Detection Kit – S2525 反応

IDT-706025¥16,800

Surveyor® Mutation Detection Kit – S100

100 反応IDT-706020¥56,000

1～2営業日Surveyor® Mutation Detection Kit – S1000

用法

製品名

電気泳動で検出（S シリーズ）

WAVE システムで検出（W シリーズ）

容量Code No.

1000 反応

IDT-706021¥480,000

1 ～ 2 週間

Surveyor® PLUS Mutation Detection Kit – W2525 反応IDT-706035¥16,800

1 ～ 2 週間

Surveyor® PLUS Mutation Detection Kit – W100

100 反応IDT-706030¥56,000

1 ～ 2 週間

Surveyor® PLUS Mutation Detection Kit – W1000

1000 反応

IDT-706031¥480,000

1 ～ 2 週間

発注方法・納品方法
MBL に在庫がございます。Code No.、製品名、数量をご指定のうえ、代理店様へ発注してください。冷凍品のため、代理店様に納品いたします。

保存方法-20℃にて保管してください。

ユーザーガイド、使用文献リストなどのダウンロード
本キットの詳細なプロトコール、トラブルシューティングは、MBL の Web サイトにあるプロトコール（Users Guides）でご確認いただけます。そのほか、製品概要（Product Sheets）、使用文献リスト、MSDS（Material Safety Data Sheets）もダウンロードできます。

http://ruo.mbl.co.jp/bio/idt/surveyor.html

SurveyorIDT

検索

本キットの日本における販売について
IDT の Surveyor® Mutation Detection Kits（本キット）は、米国 Transgenomic社の同名キットと同一の製品です。米国 Transgenomic 社が 2014 年 7 月に本キットの事業を IDT へ売却した為、本キットは IDT 製品サービスのラインナップに加わり、日本総代理店の MBL から販売されることになりました。

ゲノム編集
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詳細、ご注文は MBL ライフサイエンスサイト http://ruo.mbl.co.jp/bio/idt/index.html をご利用下さい。