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日本家禽学会誌,39:J"‑J24,2002

ニワトリの卵殼腺部におけるCaBP‑D28Kの遺伝子発現に及ぼす性ステロイドホルモンの影響
後藤尚也l).田上雅之l).伊那佐江子2).荒川仲代2）
山村奈美子2)・武石勝!)・上吉道治2）'）日本配合飼料株式会社中央研究所，栃木県芳賀郡茂木町字天子451,321‑362]
2)岐阜大学農学部生物資源生雌学科，岐阜県ll皮阜市脚￨1戸1‑1,501‑1193
ニワト￨ﾉにおいて，腸管におけるカルシウム(Ca)吸収と卵管の卵投腺部におけるCa沈着にCa結合

蛋白質(CaBP‑D28K)が関与していることは良く知られている。ペプチドであるCaBP‑D28Kの遺伝子発現が腸管においては主に1,25(OH)2D:}に支配されていることはIⅢらかにされているが，卵殼ll鼎部においては未だ十分には明らかにされていない。そこで本実験では卵管機能に影響を与えることが知られている性ステロイドホルモンが卵殼腺部におけるCaBP‑D2HKmRNAレベルに与える影響を検討した。
最初の実験では，産卵鶏に1001Uの妊馬I(1l情性腺刺激ホルモン(PMSG)を5日間毎日投与して，性ステロイドホルモン分泌を増加させた場合の卵殼腺部におけるCaBP‑D28KmRNA濃度に与える影響を検討した。PMSG投与により101中エストラジオール‑17B(E2)とテストステロン(T)濃度は投与2日後から，プロジェステロン(P4)濃度は投与3日後から，生理的食塩水を投与した対照鶏に比べ有意に増jl1した。Ⅲl中Caイオン膿度は産卵が停止した投与3日後から対照鴎に比べて有意に高くなった。一方，血中非透過性Ca濃度は投与2日後において対照鶏に比べ有意に高い値を示したが，その他の時期では有意な差は認められなかった。51''''二￨のPMSG投与2411寺間後に測定したCaBP‑D28KmRNA膿度

はPMSG投与により有意に減少した。これらのことは，産卵鶏では性ステロイドホルモンが卵殼腺部におけるCaBP‑D28K遺伝子発現を刺激する可能性は少ないことを示している。

次に，排卵周期中においてまだ卵殼形成が認められない排卵2時間後と卵殼形成の盛んな排卵10時

間後にそれぞれE2,T,P4を投与し，それらの投与411寺間後に卵重量，卵殼重塁卵殻中のCaとMg含量および卵殼腺部のCaBP‑D28KmRNA濃度を測定した。その結果，卵重量はいずれの投与時期においても性ステロイドホルモン投与による有意な影響は認められなかった。これに対して，卵殼重量，卵殻
中CaとMg含量およびCaBP‑D28KInRNA機度は，いずれも排卵lOll寺間後にP4を投与した場合においてのみ対照鶏に比べ有意に低い値を示した。

以上の結果より，性ステロイドホルモンが産卵鶏の卵殼腺部におけるCaBP‑D28K辿伝子発現を刺激する可能性は少ないと推察された。

キーワード：カルシウム結合蛋白質，遺伝子発現，性ステロイドホルモン，卵殼腺部，ニワトリ

一巨緒

カルシウム(Ca)結合タンパク質であるCaBP‑D28K
2001年8)J6FI受付2001年9ﾉ‑l25H受理

連絡者：後藤尚也〒321‑3621口本配合飼料株式会社1‑￨]央"￨究所，栃木
県芳賀郡茂木町字天子451

は，賜管からのCaの吸収と卵殼腺部における卵殼へのCaの沈着に関与していることが知られている(Barej(ZZ.,1990)｡CaBP‑D28Kの迫伝子発現は，暘管においては

TelO285−63−ll21

lq,25dihydroxy‑vitaminD;｝により誘導される

FaxO285−63−ll20(Normanaa/.,1982;CorradinoandFullmer,1991;

Email:hisaya.goto@nippai.cojp

Nys"".,1992)が，卵殼腺部においては腸管におけるCopyright ©2002, Japan Poultry Science Association

J 1 2 1 1 本 家 禽 会 誌

39巻J1号(2002)

場合とは異なった制御によって淵節されていると報告さ

代謝エネルギー2,830kCal/k9,Ca3.1%,リン0.6%)とれている(Bargml.,1978b;Navickisgra1.,1979;Bar

水は，自由摂取させて単飼ケージで飼育した。これらのαα/.,1984;NysanddeLaage,1984;Nys"".,1989;

飼育条件下で，産卵記録を一ケ月以上記録し,1クラッ

BareJ".,1990;StriemandBar,1991;Corradinogj

チの長さが7以上で，かつ，クラッチを比較的正{i惟に繰(zI.,1993)｡Corradinoら(1993)は，腸管におけるり返しているニワトリを使用して，次の2通りの実験を

CaBP‑D28KmRNAの発現はビタミンDにより誘発されｨ]･った。

るが，卵殼腺部におけるCaBP‑D28KmRNAの発現はビ
タミンDよりむしろ性ステロイドホルモンによって洲

実験I卵殼腺部におけるCaBP‑D28KmRNAレベルに及ぼすPMSG投与の影響

節されている可能性を示唆し，また,Corradinoと実験に際し，連産中のニワトリ40羽を選び出し，生理Alaimo(1994)は，卵殼腺部におけるCaBP‑D28K

的食塩水に溶解したIOOIUの妊馬血清性l1鼎刺激ホルモ

mRNA発現にはビタミンDとエストラジオール‑176ン(pregnantmareserumgonadotropin:PMSG;帝(E2)の両方が関与していると報告している。一方,Bal‑匡￨臓器製薬株式会社一試験区20羽）または生理的食塩

ら(1996)は，卵殼腺部におけるCaBP‑D28KmRNAの発水（対照区20羽）を1m/の容量で筋肉内に，午前10時

現はE2によってはほとんど影響されず，卵殼の形成とに5日間にわたって毎日投与した。これらのニワトリか関連した促進因子と排卵周期中に変動することが知られら，血液をPMSG投与開始1日後から,PMSG投与のているプロジェステロン(P4)による抑制因子によって直前に翼下静脈から5日間採取した。血液は予めヘパリ制御されているとの仮説を提唱している。さらに,Ieda

ンで湿らせておいた注射筒を用いて採取し，血漿!￨‑'Caら(1995)は，ステロイドホルモンの合成をII1害するとイオン測定用の血液は，ヘパリンと酸化防止のため流動報告されているAminoglutethimideを産卵鶏に投与す

パラフィンを0．1ml入れておいた小型試験管にできるることにより，卵殼腺部のCaBP‑D28KmRNAレベルと限り空気に触れないように入れた。その後,30分以内に卵重量に対する卵殼重量の割合が有意に減少したことか

遠心分離(3,000×9,10分間,4℃）し,lⅢ漿を得た。Ca

ら，性ステロイドホルモンが卵殼腺部におけるイオン濃度は，血漿を得た後,60分以内に測定した。他

CaBP‑D28K遺伝子発現を促すような作用で関係しているのCa濃度とステロイドホルモン測定用のⅢ!液は，流動と推察している。このように，ニワトリの卵殼腺部におパラフィンを用いないで同様にⅢl漿を得，測定までのけるCaBP‑D28Kの遺伝子発現に対する性ステロイドホ

間，‑20℃で凍結保存した。ニワト'ﾉは,PMSGまたはルモンによる影響は，必ずしも明確にされていない。

生理的食塩水投与開始後5H目の午前10Ⅱ#に屠殺し，

そこで本実験では，最初に，産卵鶏に妊馬血清性腺刺対照区と試験区それぞれ卵殼腺部の粘膜組織を採取し激ホルモン(PMSG)を投与することによって，卵胞発た。屠殺には，試験区ではPMSG投与後3日目から放卵育を促し，それに伴う性ステロイドホルモン分泌の増加が停止し，屠殺時に卵管に卵が認められなかった10羽，が血1I｣Ca濃度と卵殼腺部におけるCaBP‑D28KmRNA

また対照区は産卵が正常に行われ，屠殺時に卵殼￨￨鼎部にレベルに与える影響を検討し，次に，排卵周期中におい卵が認められなかった8羽のニワトリを供した。粘膜て卵殼形成のまだ認められない排卵211寺間後と卵殼形成

は，採取後速やかに液体窒素で凍結し，その後,illll定まの膿んな排卵1O時間後にそれぞれ性ステロイドホルモ

で，ディーフ．フリーザー（‑20℃）内で凍結保存し，ンを投与して，それらの投与が卵殼質と卵殼腺部のCaBP‑D28KmRNAの測定に供した。

CaBP‑D28KmRNAレベルに与える影響を検討することにより，産卵鴉の卵殼腺部のCaBP‑D28Kの遺伝子発現に性ステロイドホルモンが関与する可能性があるか否かを明らかにしようとした。

材料及び方法実験2卵殼腺部におけるCaBP‑D28KmRNAレベルに及ぼす性ステロイドホルモン投与の影響

まだ卵殻形成が認められない排卵2時Ⅲ後または卵殼形成が礁んな排卵10時間後に，試験鶏には1mg/0.5mIの濃度でオリーブ油に溶解したE2,テストステロン(T)またはP4をlmg/kg体重の投与量で，また対照鶏

供試鶏には0.5mj/kg体重のオリーブ汕をそれぞれ筋肉内投本試験に使用したニワトリは白色レグホーン種の雌鶏

与し，それらの投与4時間後に卵殼腺部に存在していた(40週齢のデカルブTX‑35)である。ニワトリは，日本

卵の重量，卵殼重量，卵殼中Caとマグネシウム(Mg)

配合飼料株式会社中央研究所の無窓鶏舎において，点灯含量を測定した。また，卵殼腺部の粘膜組織における管理を午前5時とする14時間照明:10時間暗黒の照明

CaBP‑D28KmRNA儂度を測定した。

周期下で，飼料（産卵鶏用市販飼料；粗蛋白質17.3％，

血漿Ca濃度の測定

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後藤ら:CaBP‑D28K遺遺伝二伝子発現と性ステロイドホルモンJl3l)Caイオン濃度の測定法に準拠して，山村ら(2001)と同様な方法で,Solution

血漿Caイオン濃度は，血漿を得た後,60分以内にCa

hybridization法で行なった。組織からのTotalRNA

イオン測定器(Caイオンアナライザー,CA++150;の抽''1はグアニジンチオシアネー￨、．フェノールクロロ（株)常光）でⅢl漿状態のままで測定した。なお，測定のホルム法(AGPC法）によって行った。SenseRNAと際，流動パラフィンによる測定妨害を避けるため，パス

AntisenseRNAの作成は,Komm博士が作成し，島田

ツールピペットで血漿のみを保存チューブに移し換え測博士と家[LI博士から提供された560bpのCaBP‑D28Kプ

定を行った。

ローブを用いて行った。

2）非透過性Ca濃度の測定

卵重量，卵殼重量及び卵殼割合の測定

非透過性Ca機度は，総Ca儂度と透過性Ca機度を測

卵殻腺部から採取した卵の重量を卵亜量として，ま定し，総Ca濃度から透過性Ca濃度を差し引くことにた，採取した卵の卵殼を蒸留水で洗浄し，乾燥させた後より求めた。すなわち，総Ca濃度は,li11漿100"を小型の重量を卵殼重量として求めた。卵殻割合は卵殻重量を試験管に採取して原子吸光分析用希釈液で50倍希釈し卵重量で除することによって算出した。

た後，原子吸光分光光度計(PolarizedZeemanAtomic

卵殼中CaとMg含量の測定

AbsorptionSpectrophotometer;ll立Z6100型）で測l)Caの測定定した。透過性Ca儂度は，血漿を限外濾過用チューブ

乳鉢で磨砕した卵殼1gをるつぼに入れ,600｡Cで2（セントリカットW‑10;分凹分子量1万；倉敷紡績株式

時間炭化したものに6N塩酸を10m/加え，約10分間放会社）に400 入れ，遠心分離(5,000×9,1時llll,4℃）

置後，蒸留水を"Ⅱえ，6倍に希釈した。得られた溶液は，して得られた濾液25

1N塩酸で500倍に希釈し，原子吸光分光光度計で測定を原子吸光分析用希釈液で40倍希釈した後，原子吸光分光光度計で測定した。

した。

血漿性ステロイドホルモン濃度の測定

2)Mgの測定

血漿中の性ステロイドホルモンの測定は，Ⅲ漿巾より

Mgi1ll定の場合はCa測定の場合と同様にして炭化さエチルエーテルによりステロイドをⅢlllll後，群馬大学医

せた卵殻にlN堀雌を20mj加え，約10分間放置した。

学部生朋活性分析センターより提供された抗Ⅲ清を用い得られた溶液は，蒸留水で50倍に希釈し，原子吸光分光て，ラジオイムノアッセイにより行った。すなわち，血光度計で測定した。なお，測定値はCaの場合もMgの漿中からのステロイドの抽出はエチルエーテルにより2場合も1個当たりに換算して表した。

回行い，その乾￨占￨物を1%牛血清アルブミン(BSA)‑

統計処理

0.01Mリン酸緩衝液(PBS)で測定可能な濃度に希釈しF検定により有意差が認められたとき，多重間の差のた。この希釈溶液100"jと0.05Mエチレンジアミン￨兀｜

検定はDuncan'snewmultiplerangetestで行い,2つ酢駿(EDTA)‑001MPBSで10,000または20,000倍にの平均値間の差の検定はStudent'st‑tcstで行った。

希釈した抗血清100"と1%BSA‑0.01MPBSで約25,000cpm/100"/となるように希釈した3H標識ステロ

イドホルモン(104Ci/mmol,AmershamPharmacia
BiotecUKLtd)100"jを入れ，攪拝した後，常温で20時間以上培養した。培養後,0.5%チャコール･().05%デ
キストラン懸濁液を200"/"llZ,攪枠後，正確に30分

間，4℃下で静置した。その後，遠心分離(3,000×9,15
分，4℃）して,̲l澄み700"/を放射能測定用バイアルに採取し，これに液体シンチレーター(ACS‑II,
AmershamPharmaciaBiotecUKLtd.)を4m/加え，約10秒間攪枠し，一日放置した後，彼休シンチレーショ
ンカウンター(Packard)で放射能を測定した。なお，測定は同一検体について3本ずつ行いその平均値を検体の測定値とし，｜司様にして作成した標準'''1線から，性ステ
ロイドホルモン攪度を算出した。

図1

卵胞発育におよぼす妊馬血満性腺刺激ホルモン(PMSG)投与の影響

戸

■

1

r19．1

Effectofpregnantmareserumgonado‑

CaBP‑D28KmRNAの測定

tropin(PMSG)injectiononfollicular

CaBP‑D28KmRNA量の測定は,Leungら(1988)の方

growth.

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０
０２
００
０４
０
０
６

日本家禽会誌39巻J1号(2002)

114

合︻目一ｍｇ︶ロＣｐｍ息口①ＱｐＣＣｍ頃﹇︲ぢ壱呵揖切目

□■

〆

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一
一
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■二一一一一.‑口−‑‑‑‑‑‑‑.‑口･‑‑‑‑‑‑‑‑口一一一‑‑‑‑‑口−対照区Contorol★

﹄■Ⅱ

口○画呵角砦白のロロ○○①目◎閂①やめ①︑Ｏ紺四︵一口憎く︑ｑ︶︵冒蔵ｅ遡謹入口卜ＫＨ翁口稲

０
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８
１１

ロ○国呵垣口①ロロ◎︒①口ｏ圏四○筋①自︵一︹員︑︑色︶今日玩ｇ留謹入口卜×一Ｋト

０
００
００
０２
０
６
４

︵一日罰ｅ囲辿逗自︲ミー棯筑卜壬Ｋｕ

対照区Contorol
試験区PMSGtreatment*

1

2

3

4

5

晶初のPMSG投与後の￨‑I数
DayafterthefirstimectionofPMSG
図2.11Ⅱ漿中のエストラジオール‑178(E2),テストステロン(T)及びプロジェステロン(P4)濃腱に及ぼすhf馬￨Ⅲ情刺激ホルモン(PMSG)投与の影響
Fig2.Effectofpregnantmareserumgonadotropin(PMSG)injectiononplasma
concentrationsofestradiol‑176(E2),testosterone(T)andprogesterone(P4)

PMSGは毎l11羽当たり1001Uの投与量で筋肉内に5日間投与した．
PMSGwasinjectedintramuscularlyfor5dayswithadoseoIIOOIUdaily
各点は8〜10羽の平均値±標準誤差．
Eachpointismean=tSEof8〜10henS.
＊対照区に対して5％水準で有意差あり(t‑検定).
*P<0.05versuseachcontrol(t‑test).

結杲

産Il1しているニワトリに1001Uの役ﾉj量でPMSGを筋肉内に毎口511間連続して投与することによって，投卵殼腺部におけるCaBP‑D28KmRNAレベルに及ぼす与した20羽の'‑￨‑!で，最初の投与2日後から4羽,3日後

PMSG投与の影響から13羽,41̲1後から3>1>lにおいて，それぞれ産卵が停Copyright ©2002, Japan Poultry Science Association

後藤ら:CaBP‑D28K遺伝子発現と性ステロイドホルモンJ15止した。本実験では,PMSGまたは生理的食塩水を投与れは平均3.97cmと，岐大卵胞の直径はPMSG投与鶏のの1日後から5日間にわたってⅢl漿中のCa濃度と性ス〃が対照鶏に比べて有意に大きかった(P<0.05)｡

テロイドホルモン濃度を測定すると共に，投与5日後にPMSG投Ij‑により,liⅡ漿T膿腱とE2膿度は投与21」
おいて卵殼腺部の粘膜組織におけるCaBP‑D28KmRNA後から，血漿P4濃度は投与311後から，それぞれ対照
濃度を肌￨￨定した。その結果PMSGを投与したニワトリ鶏に比べて有意に高くなり(P<0.05),その後も増IIIしは,IXllに示したように，対照として生理的食塩水を投た(IM2)。

与したニワトリに比べて，卵巣中に発育した大きな卵胞Ixl3に示されるように,PMSG投与鶏の非透過性Caが数多く認められた。対照鶏における最大卵￨￨包の直経が濃度は，投与2日月において対1I({鶏のそれに比べてｲ｣意

平均3.62cmであるのに対し,PMSG投与鶏におけるそに高い値が認められた(P<005)",その他の時期では−e−−対照区Contorol
７★

6︵︼宮口智︶︵冒日︶腿辿司や斜ミ侭剴↑項咽器

口自首揖口８口８日日当ｇ当碧目出石︲ｐＯｚ‑●一試験区PMSGtreatment

5

4

3

2

︵︼酉員ら

８１
６１
４１
２１
０
１

目︵︶冨甸ら目①︒ｐＣＱ口自尽ロロぢ急︒︵冒日︶囲辿入楡や４心八ミ債

2．0

★

1

2

3

4

5

最初のPMSG投与後の日数

DayafterthefIrstmjectionofPMSG
図3

Fig.3

血漿中の非透過性カルシウム濃度とカルシウムイオン濃度に及に血漿中の非透過性カルシウム濃度とカルシウムイオン濃度に及ぼす妊馬lill情性腺
刺激ホルモン(PMSG)投与の影響

Effectofpregnantmareserumgonadotropin(PMSG)injectiononplasma
concentrationsolnon‑diffusiblecalciumandcalciumion

PMSGは毎日1羽当たりlOOIUの投与菫で筋肉内に5日間投与した．
PMSGwasinjectedintramLIsclllarlyfor5dayswithadoscoflOOIUdaily
各点は8〜10羽の平均値±標準誤差．
Eachpointismean±SEof8〜10hens.

＊対照区に対して5％水準で有意差あり(t‑検定）*P<0.05versLIseachcontrol(t‑test).

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f1本家禽会誌

Jl6

39巻J1号(2002)ａｚ

卵殼重量と卵殼重量をﾘ'唾量で除して算出した卵殼割

︵くｚ画冨Ｃ乱ミヨ壱眉︶

Fig.4

４３
０
０２
０１
００
０

目白苗揖口のＱｐ８くｚ酉日望爲口山画呵ｏ禦呼己昌︒Ｅ︶囲延くｚ西日苦含山鴇︒￨叉 4合は，いずれも排卵2時間後の投与の場合に比べ，排卵lOll寺間後の投与の場合の方が有意に高い値であった。それらに対する｣腓ステロイドホルモン投与の影響は排卵2I

ll＃,川後の投与の場合においては認められなかったが，排卵lO時間後の投与の場合においてはP4投与のみにおいて対照に比べ，有意に低い値を示した(P<005)(図
5
)
｡
★

由

対照区Contorol試験区PMSGtreatment

卵殼腺部におけるカルシウム結合蛋''1質(CaBP‑D28K)mRNA濃度に及ぼすjf,(511[[
清'帷腺刺激ホルモン(PMSG)投与の影響
EIfectofpregnantmareserumgonado‑

tropin(PMSG)injectiononmRNAcon‑
centrationofcalciun‑bindingprotein

卵殼中Ca含量とMg含量は共に，排卵2時間後の場合に比べ，排卵lO時間後の場合の方が有意に高い値であった。性ステロイドホルモンの投与によって，排ﾘ￨110
時,川後のP4においてのみ対照に比べ，有意に低い値が認められた(P<0.05)(￨叉￨6)｡

卵殼腺部から採取した粘膜組織のCaBP‑D2HKmRNA

濃度をsolutionhybridizationRNaseprotection法で測定した結果，排卵2時間後の投与の場合に比べ，排卵1O時間後の投与の場合の方が有意に高い値であった。ま(CaBP‑D28K)intheshellgland.

た,CaBP‑D28KmRNA濃度は，性ステロイドホルモンのPMSGは毎日1羽当たり100の投与量で筋肉内に5日''1投与した．最後の投与の24111f間後に卵般腺部中のカルシウム結合
蛋白質(CaBP‑D28K)mRNAを測定した．

投与によって，排卵2時間後の投与においては影響は認

PMSGwasinjectedintramuscularlyfor

考 察

められなかったが，排卵IO時間後の投与においてはP4投与によって有意な減少が認められた（図7)。

5dayswithadosGo[1001Udaily.24hr

afterthelastinjectionCaBP‑D2HK
mRNAinthshellglandwasmeasrued.
各棒は8〜10羽の平均値±標準誤差．
Eachbarismean=tSEo｢8〜l0hens．

＊対!!((区に対して5％水準で有意差あり(t‑検定).
*P<0.05versLIseachcontrol(t‑test).

Ca結合タンパク質であるCaBP‑D28Kの腸管における辿伝子発現は，主に活性型ビタミンDIにより誘導されることは知られているが，卵殼腺部におけるその辿伝子
発現制御機椛はまだ十分にはIⅢらかにされていない。そこで本実験では，最初に，卵胞発育を刺激して性ステロ
イドホルモンの分泌を促すことが知られている妊馬血清'WIJI泉刺激ホルモン(PMSG)を投与することにより，卵般腺部におけるCaBP‑D28Kの遺伝子発現が影響を受け有意な差は見られなかった(p>005)｡これに対して，るかどうかを検討することによって，性ステロイドホル

Ⅲl漿Caイオン膿度は,PMSG投与により産卵が伸ll1しモンがCaBP‑D28Kの遺伝子発現に関与する可能性があた投与3ull後からPMSG投与鶏において対照鶏に比るかどうかをIﾘlらかにしようとした。

べて有意に高くなり，その後も少しずつ増加した(P<005)｡

PMSGを投与したニワトリは，対照として生理的食塩水を投与したニワトリに比べて，卵巣中に発育した大き卵殼腺部の粘￨漠組織におけるCaBP‑D28KmRNA濃度

な卵胞が数多く認められ，最大卵ll包のl自径は，対照鶏には,PMSGの投与により有意な減少が認められた(P<比べて試験鶏の方が有意に大きく，本実験の投与方法で0.05)(図4)。

PMSGによって卵胞の発育が刺激されることが確認さ

卵殼腺部におけるCaBP‑D28KmRNAレベルに及ぼすれた。さらに,I111漿中TとE2濃度は投与2日後から,P

性ステロイドホルモン投与の影響

4濃度は投与31｣後から，それぞれ対照鶏に比べて有意

卵殼腺部内に存在していた卵の重量は，排卵2時間後に高くなり，その後も増ﾉjⅡすることが見出された。これの投与の場合に比べ，排卵10時間後の投与の場合の方らの￨Ⅲ中濃度の結果は，卵胞発育の発育初期にはTとEが有意に高い値を示した(P<0.05)。しかし，いずれの2の分泌が，卵胞が発育して成熟するとP4の分泌が多時期に投与した場合においても性ステロイドホルモン投

くなるとの報告(Haunggr".,1979;Scanesand

与による卵亜II{:への影響は認められなかった(I叉￨5)。

Fagioli,1980;Hammond"".,1981;Robinson"".,Copyright ©2002, Japan Poultry Science Association

後藤ら:CaBP‑D28K遺伝子発現と性ステロイドホルモン

T1ワ

tJ1I

〃排卵2時間後2hrafterovulation■排卵10時間後10hrafterovulationb b b baaaa

■ ■ − ■ − ＝ − ロ F 一 一 −−篝篝c b c c■n=声一旦ﾛIa a a a

鯵鯵鯵鯵

I
Ｃ

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︵ま︶①穏当句揚如即自︵ま︶︵佃巨ご佃龍島︶犯一一部語呂｜ｃｌ︵︑︶二二評の陰︑即自︵︑︶碧昌評の筐﹃﹇曵茄︑切目含里凶の夢︑︑国事昌評①芦︻も二の︑即自︶︵砂咽佃呂面︶川佃龍邑

００２
０．０５４３２１０６５４３２１０
６４

80

詞

a a a a

鯵鯵鯵鯵

…

C

̲ b
■■■■■■■■■3

裳

C E 2 T P 4 C E 2 T P 4

性ステロイドホルモン
Sexsteroidhormones

図5．
Fig.5

卵重量，卵殻壺量及び卵殼割合に及ぼす

kステロイドホルモン投与の影響

EI
e
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o
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n
e
i
n
j
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c
t
i
o
sh
he
el
ll
lweight
andeggshellrate

オリーブ油（対照）と性ステロイドホルモン(1mg/kg体重）を排卵2時間後または排卵10時間後に筋肉内投与し，投与4時間後に卵重量，卵殼重晟と卵殼割合（卵殼雨量/卵重量）を測定した．

Oliveoil(control)andsexsteroidhormones(1mg/kgBW)wereinjectedin‑
tramuscularly2orlOhraftertheovulation,and4hraftertheinjectionegg
weight,eggshellweightandeggshellrate(eggshellweight/eggweight)
weremeasured．

C:ｵﾘｰブ汕.C:Oliveoil.
E2:エストラジオールー176.E2:Estradiol‑178.
T：テストステロン.T:Testosterone.

P4:フロジエステロン.P4:Progesterone.

各樺は8〜10羽の平均値±標準誤差
Eachbarismean±SEof8〜lOhens・

異符号間で5％水準で有意差あり．
DifferentalphabeticalsuperscriptsindicatesignillcantdifIerence(P<0.05).

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日本家禽会誌39巻J1号(2002)

J18

０
０
５
１０
１５

■排卵10時間後10hrafterovulation

合﹇の畠︑ヘ︑員料︶

砦目①碧目○口目員昌呂呵Ｑ弓の二ｍ︵語呂瓦日︶咽伽４いぶミ侭仔龍号

００００〃排卵2時間後2hrafterovulation

a

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C

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a

a

a

…
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■÷‐単一÷
10

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５０

︵弓の昌切へ︑員肖︶

ごロ①碧口○○︹眉目易①ロ即呵︹目弓①畠ｍ︵語呂瓦日︶咽伽ぐゃ斜情︑け１号龍呂

15

a

E2

a a

｜
T P 4 C E 2 T P 4

性ステロイドホルモン
Sexsteroidhormones￨叉'6．卵殼'￨'のカルシウム含量とマグネシウム含量に及ぼす'肱ステロイドホルモン投与の影響

Fig.6．EffectofsGxsterOidhormoneiniectiononconcentrationsofcalciumandmagnesiumintheeggshell

オリーブ油（対雌）とﾔ￨ミステロイドホルモン(Img/kg体重）を排卵2時￨ﾊ￨後または排卵10時間後に筋肉内投与し，投与4時間後に卵殼中のカルシウム含量とマグネシウム含量を測定した．
Oliveoil(control)andsexsteroidhormones(lmg/kgBW)wereinjected
intramuscularlv2orlOhraftertheovulation,and4hraftertheiniections

andthecontentsoIcalciumandmagnesiumintheeggshellwere
measured．

C:ｵﾘｰプ汕
C：Oliveoil･E2:エストラジオールー17B
E2:Estradiol‑176.
T：テストステロン
T：Testostel‑one・P4:プロジェステロン

P4:Progesterone.

各体は8〜10羽の平均値±楪唯誤差
Eachbal･ismean±SEof8〜lOhens.

異符号間で5％水準で有意差あり．
DifferentalphabeticalsLIperscriptsindicatesignincantdifference(P<0.05).

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後藤ら:CaBP‑D28K遺伝子発現と性ステロイドホルモン

119

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７６５４３２１０ａｚ

Z排卵2時間後2hrafterovulation■排卵10時間後10hrafterovulation

J C E 2 T P 4 C E 2 T P 4

性ステロイドホルモン
Sexsteroidhormones￨又 7

卵殼IIIN部におけるカルシウム結合蛋白質mRNA(CaBP‑D28kmRNA)膿度に及
ぼす

Fig.7

腓ステロイドホルモン投与の影響

Effectofsexsteroidhormoneinjectionontheconcentrationol
calciumbindingprotein(CaBP‑D28K)mRNAintheshellgland

オリーブ油（対照）及びﾔ￨ミステロイドホルモン(1mg/kg体重）を排卵2時間後
または排卵10時間後に筋肉内投与し，投与4時間後に卵殻腺部中におけるカル
シウム結合蛋白質mRNA(CaBP‑D2sKmRNA)濃度を測定した．
Oliveoil(control)andsexsteroidhormoneswereinjectedintramuscularly
2orlOhraftertheovulation,and4hraftertheinjectionsandthe
concetrationsofcalcium‑bindingprotein(CaBP‑D28K)mRNAintheshell
giandweremeasured.

C:オリーブ油
C：Oliveoil、E2:エストラジオールー17B
E2:Estradiol‑17B.
T：テストステロン
T：Testosterone・P4：う。ロジェステロン

P4:Progesterone.

各棒は8〜10羽の平均値士標準誤差．
Eachbarlsmean±SEof8〜10hens.

異符号間で5％水準で有意差あり．
Differentalphabeticalsuperscriptsindicatesignificantdifference(P<0.05).

1988)から推察すると,PMSGの投与によって卵胞発育により排卵が停止したため，卵殼腺部での卵殼形成が行が刺激され，その結果としてTとE2の分泌が埆加し，

われなくなり，卵殼形成に要するCa需典がなくなった

その後さらに卵胞が発育することにより発育した卵胞に結果として，血液中のCaイオン機度が増加したと推察

おいてP4の分泌が墹加したことを反映しているものとされる。これに対し，血漿中の非透過性Caイオン濃鹿

思われる。

は,PMSG投与により対照鶏に比べて投与2日後に有意血漿中のCaイオン濃度は,PMSG投与により産卵のに高い{111が認められたが，その他の時期では有意な差は停lkした投与3日後から対照鶏に比べて有意に高くな

認ぬられなかった。このことは,PMSGの投与により投り，その後も少しずつ増加したことから,PMSGの投与

与2日後から分泌が促進されたE2により肝臓での卵黄Copyright ©2002, Japan Poultry Science Association

J 2 0 日 本 家 禽 会 誌

39巻J1号(2002)

前駆物質の生産が刺激された結果，卵黄前駆物質に結合時間という短時''1では卵重量には影響を与えないと思わしたCaすなわち非透過性Caの血中濃度が増加したもれる。卵殼重量と卵殼割合，卵殼中Ca含量とMg含量のと考えられる。また，非透過性Ca濃度の岫加は，は，いずれも排卵2時間後の投与の場合に比べ，排卵10PMSG投与による卵胞発育の刺激の程度が少ない投与2時間後の投与の場合の方が有意に高い値を示した。これ

日後にはllll'1'濃度に反映しているが，その後卵ll包発育がは，排卵2時間後から試料採取をした排卵6時間後まで

さらに刺激され卵I包に取り込まれる卵黄前駆物質の量がの期間は，卵殼形成が開始されたばかりで卵殼形成が盛多くなると￨｢il時に非透過性Caの卵胞への取り込み量もんではないのに対し，排卵1011:＃間後から試料採取をし多くなったものと考えられる。その結果として,PMSG

た排卵14時間後までの期間は，卵殼形成が盛んに行わ

投与3日以降においてPMSG投与により血中非透過k

れているため，卵殻重量,卵殼禅￨￨合，卵殻中CaとMg含Ca濃度が増加しているにも関わらず，見かけ上は対照

量が排卵2時間後の投与の場合に比べて排卵10時間後

鶏と差のない結果として現れているのでないかと考えらの投与の場合の方が高い値を示したと考えられる。まれる。

た，卵殼重量と卵殼割合，卵殼中Ca含量とMg含量は，未成熟なニワトリでは，卵殼￨￨鼎部において性ステロイ

いずれも投与した3種類の性ステロイドホルモンのうドホルモン，特にエストロジエンがCaBP‑D28Kの遺伝子

ち，排卵10時間後のP4投与の場合においてのみ，対照

発JJJを誘起することが報告されている(Corradino.1993に比べ，有意に低い値を示した(p<0.05)oこのことは，;Nys"".,1992;Nys"".,1989;Corradinoand

卵殼形成が盛んな時期においては,P4が卵殼へのCa沈

Alaimo,1994;Navickisgj",1979)。これに対して，着を抑制する可能性を示唆している。さらに，卵殼腺邪Barら(1996)は産卵鶏へのE2投与によって卵殼腺部

から採取した粘膜組織のCaBP‑D28KmRNA臘度においにおけるCaBP‑D28Kの過伝子発現に影響は認められなても，排卵2時間後の投与の場合では，性ステロイドホ

かったが,P4投与により卵管における卵の滞留時間がルモンによる影響は認められず，排卵1O時間後の投与延長されたにもかかわらず卵殼へのCa沈着との場合ではP4を投与した場合においてのみ有意な減少

CaBP‑D28KmRNA濃度が減少したことから，卵殼腺部が認められ(P<0.05),しかもその減少した値は卵殼形におけるCaBP‑D28Kの遺伝子発現はE2によっては影響

成初期でまだ卵殻へのCa沈着が余り鴨んでない排卵6

されず，卵殻形成と関連した刺激因子とP4による抑制

時間後における値（後藤ら1998)と同じ位であった。こl天￨子によって帝llillされていると報告している。この産卵れらの結果は，少なくとも卵殼形成が盛んな排卵loIIJT

鶏における報告と本実験において産卵鶏にPMSGを投間後から14時間後の時期においてはP4が卵殼腺部に与することによって性ステロイドホルモンのlill!￨'濃度がおけるCaBP‑D28KmRNA濃度を抑制する可能性を示し増加したにも関わらず，卵殼腺部におけるCaBP‑D28Kている。これらのことと，後藤ら(1998)によって，ニmRNA濃腱が減少したことを考･え合わせると，卵管がワ｜、リの排ﾘ￨jl,!1期中において，卵般腺部における機能化している産卵鶏の卵殼腺部におけるCaBP‑D28K

CaBP‑D28KmRNA濃度は，排卵された卵が卵殼腺部に遺伝子発現は，性ステロイドホルモンによって,*ll激さ入り卵殼形成が始まると急激に増加し，その後は高い{iliれるよりはむしろ抑制されている可能性が高いと推察さが維持された後，放卵4〜5時間前から放卵時にかけてれる。

急激に減少することが見''1されていること，及び

そこで，次に，後藤ら（1998）により￨雁認されている

CaBP‑D28KmRNA濃度が減少するこの時期には血中に排卵周期I‑￨'における卵殻腺部のCaBP‑D28KmRNA濃度

おけるP4濃度が著しく増加する(Johnson,1990)ことの変動の様相に基づいて，卵殼腺部におけるCaBP‑D28K

から，卵管が機能化している産卵鶏においては,P4が卵

mRNA濃度が未だ卵殼形成が行われず低い排卵2時￨川

殻腺部におけるCaBP‑D28K遺伝子発現を抑制し，このP後と卵殼形成が盛んで高い排卵10時間後に性ステロイ4の作用によって卵殼形成の末期にCaBP‑D28K儂度が減

、
＄
1
8
‐

ドホルモンを投与し，卵殻腺部におけるCaBP‑D28Kの哩

少し，リ'1殻へのCa沈着が減少して，卵殼形成が終了し伝子発現と卵殼質に及ぼす影響を検討した。

てして放卵に至るのであろうと推察される。

その結果，投与4時間後に，卵殼腺部￨ﾉ1に存在していすでに述べたように,P4を排卵211ｷ間後に投与したた卵の重量は，排卵2時間後の投与の場合に比べ，卵殼

場合にはCaBP‑D28KmRNA濃度に影響は認められず，形成が進んでいる排卵10時間後の投与の場合の方が有排卵lOllキ間後に投与した場合にはCaBP‑D28KmRNA

意に高い値を示した(P<0.05)が，いずれの投j了時期に濃度の減少が認められたことは，投与の時期の相違によ

おいても'￨1iステロイドホルモンによる影響は認められなりP4がCaBP‑D28KmRNA濃陛に与える影響が異なる

かったことから，性ステロイドホルモンは少なくとも4ことを示している。この投与時期の相違により影響が異Copyright ©2002, Japan Poultry Science Association

後藤ら:CaBP‑D28K遺伝子発現と性ステロイ
遺伝三なる理由は，本実験の結果からでは明らかではないが，

ホルモン

1
2
］

MetabolicResearch,27:39‑40.1994．

は少なく，むしろP4により抑制され，結果として卵殼

後藤尚也・高橋大三･m上雅之・地岡絵郁子・lll村奈美
子・武石勝・上吉道治．十二指腸と卵管子宮部におけるカルシウム結合蛋白質(CaBP‑D28K)mRNA発現及びIⅢ中カルシウム濃度のニワトリ排卵周期巾の変動東海畜産学会報,9:1‑5.1998.

へのCa沈着が抑制されると推察される。

HammondRW,BurkeWHandHertelendyF.Inn‑

以上のように，本実験の結果から，卵管が機能化した
産卵鶏においては，卵殼腺部におけるCaBP‑D28K遺伝子
発現は，性ステロイドホルモンにより刺激される可能性

謝 辞
実験遂行にあたり懇意なる御指導を賜り,CaBP‑D28K
cDNAをご提供頂いた名古屋大学農学部教授島田渭司
博士及び家田照子博士に深く感謝の意を表します。まuenceoffollicularmaturationonprogesteronere‑leaseinchcikengranulosacellsinresponseto
turkeyovinegonadotropins.BiologyofReproduc‑tion,24:1045‑1055.1981.

HuangESR,KaoKjandNalbandovAV.Synthesisof
sexsteroidsbycellularcomponentsoIchciken

た，性ステロイドホルモンの坑血清を提供して頂いた群

follicles.BiologyofReproduction,20:451‑461.1979.

馬大学医学部生理活性分析センター及び終始実験に協力

IedaT,SaitoNandShimadaK.Effectso｢戴いた日本配合飼料株式会社中央研究所．飼料畜産開発

AminoglutethimideonLevelsofMessengerRibo‑

センター所員一同に感謝いたします。

nucleicAcidofCaBP‑D28KandofVitaminDIReccp‑
torintheShellGlandofLayingHen.Japanese

引 用 文 献BarA,Dubrov,EisnerUandl‑IurwitzS.Calcium‑

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1
9
8
6
．

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D28Kbiosynthesisbyestradiolinprecociouslv

LawsonDEMIncreasesincalbindinD28KmRNAinmatllred,vitaminD‑depletedchicks.Endocrinolo‑

theuterusofthedomesticfowlinducedbysexLIal

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calbindinD28KmRNAby1,25‑dihydroxyvitaminD:,

mRNAintheintestineoIthedomestichen.Gener‑

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1
9
9
2
．

andestradiolinprecociously‑maturcdeggshell

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後藤ら:CaBP‑D28K適伝子発現と性ステロイドホルモン

J23

EffectofSexSteroidHormoneonGeneExpressionofCalcium‑
BindingProtein(CaBP‑D28K)intheShellGlandHisayaGoto'),MasayukiTagami'),Saekolna2),
NakayoArakawa2),NamikoYamamura2),
MasaruTakeishi')andMichiharuKamivoshi2)')LaboratoryofNipponForlnulaFeedMfg.Co.,Ltd・Tochigi321‑3621
2)TheUnitedGraduateSchoolofAgriculturalScience,GifuUniversity,Gifu501‑1193

Itisknownwellthatcalcium‑bindingprotein(CaBP‑D28K)participatesintocalcium(Ca)absorptionfromtheintestineandCadepositionintheshellgrandoftheoviduct.

Itisevidentthatthegeneexpressionofpeptide,CaBP‑D28Kiscontrolledbyl,25(OH)2D3
intheintestine.Ontheotherhand,thegeneexpressionintheshellgrandremainsto
beclear.Thepurposeofthestudywastoexaminee廿ectsofsexsteroidhormones,
knowntomodifythefunctionoftheoviduct,ontheCaBP‑D28KmRNAlevelsintheshelllgranq.

Inthe6rstexperiment,changesintheCaBP‑D28KmRNAlevelsintheshellgrandwasexaminedwhilesexsteroidhormonewasincreasedfollowing5‑dayadministra‑tionofpregnantmareserumgonadotropin(PMSG)tolayinghens.Thebloodproges‑
terone(P4)concentrationson3daysafterthelstinjection,andestradiol‑17B(E2)and
testosterone(T)concentrationson2daysafterthelstinjectionsignincantlyincreased
inthePMSG‑treatedhenscomparedwiththoseincontrolhens・ThebloodCaion

concentrationson3daysafterthelstinjectionwhenovipositionstoppedsigni6cantly
increasedinthePMSG‑treatedhenscomparedwiththatinthecontrolhens.Thebloodnon‑diffusibleCaconcentrationson2daysafterthelstinjectionsignincantlyin‑creasedinthePMSG‑treatedhenscomparedwiththatinthecontrol,butdidnot
signi6cantlychangeontheotherdays.TheCaBP‑D28KmRNAconcentrationsinthe
shellgrandsigni6cantlydecreasedat24hoursafterthenfthadministrationofPMSG.

Theseresultsdemonstratedtherewaslesspossibilityofsexsteroidhormone‑stimulatedgeneexpressionofCaBP‑D28Kintheshellgrand.
Inthesecondexperiment,changesintheCaBP‑D28KmRNAconcentrationsinthe
shellgrandwasexaminedafteradministrationofE2,T,andP4at2andlOhoursafter

ovulationwhentheCaBP‑D28KmRNAIevelsarelowandhigh,respectively・Thesex
steroidhormonesproducednosignincantchangeintheeggweightatbothtimesof

administration.Theadministrationo｢P4atlOhoursafterovulationsignificantly
decreasedintheshellweight,theratioofshell,andtheshellCaandMagnesium
colltentscomparedwiththecontrolhens・TheCaBP‑D28KmRNAconcentrationswere

signi6cantlydecreasedfollowingtheadministrationofP4atlOhoursafterovlllation.
TheseresultsdemonstratedthatE2andTdidnotaffectonshellformationatanearlv

phaseoftheovulatorycycle,andP4probablyinhibitedshellformationatmatureCopyright ©2002, Japan Poultry Science Association

日本家禽会誌39巻J1号(2002)

J24

phase.

Inconclusion,thesexsteriodhormonesweresuggestednotinducinggeneexpres‑sionofCaBP‑D28Kintheshellgrand.

【んpα"csGPozJ"ryScjg7zce,39.JIZ‑J24,2002j

Keyword:calciunm‑bindingprotein,geneexpression,sexsteroidhormone,shellgland,chicken