「万能乳酸菌」誕生への過程と課題の発見
３年 B 組 市瀬拓人
指導教諭 矢野幸洋
1．要約
細菌のより有効な培養法や、細菌の性能向上を乳酸菌を用いて１から実験や研究をした。
その結果、乳酸菌の長所や短所、および最も良い生育環境のための条件などが分かった。
今後は、短所のない万能乳酸菌の製作を目指していきたい。
キーワード

乳酸菌、発酵、無酸素呼吸、乳酸、謙気性細菌、乳酸桿菌、カタラーゼ反応、グラム染色法、ペプチドグリカン

乳酸菌桿菌モデル CG

２．緒言

中の乳酸菌について研究をすることにした。乳カルシウムを摂取する方法として代表的な酸菌は原核生物に分類され Lb.casei（カゼイ

例が、牛乳を飲むという方法が挙げられる。し菌）などが有名である。乳酸菌も種類によりかし、牛乳が嫌いな私にとっては、かなり苦痛様々な特徴があるが、全ての乳酸菌についていである。そこで、乳製品を食べれば、カルシウえることは、ペプチドグリカンと呼ばれる細菌ムを摂取できると考えたため、このヨーグルト特有の細胞壁が一般的な細菌よりも厚いといの研究を思いついた。

う特徴である。これはグラム陰性とよばれる特また、乳酸菌について調べると、乳酸菌は健徴である。

康状態を良くしたり、重病を予防、改善することが分かった。主にヨーグルトに用いられてい３．目的る菌には、乳酸菌とビフィズス菌があり、乳酸２つの目的のうちの１つは、細菌のより有効菌は縦に長い形（桿菌という）をしており、ビな培養条件や培地を見つけ出すことである。もフィズス菌は Y 字型をしている。今回は、このう１つは、乳酸菌の短所を排除した「万能乳酸菌の開発」である。これらのことが成功すると、

25℃）、35℃、45℃の条件で行い、ｂ、ｃ、細菌類を利用して病気を直したり、健康を維持ｄについては常温（約 25℃）で行う。

していくことのできる方法の糸口が分かると④４日目にはｐH についても測定する。

考えている。

⑤ａ～ｃについては、始めはサランラップ

その目的達成のため、まず乳酸菌を確実に殖やす方法や条件を調べた。あわせて、乳酸菌のでふたをしていたが、水分がついたため、途中からガーゼに変えて実験した。

分類の位置づけや、そのグループの特徴についても調べる実験をした。

(3) 実験結果
実験の結果は次のとおりである。
表１ ヨーグルトに混ぜるものの違い（常温）乳酸菌ＬＧ21（光学顕微鏡にて）

４．研究内容＜実験Ⅰ＞ ヨーグルトを作る乳酸菌の特徴や最も良い生育環境の条件などを調べるために、以下の実験を行った。
（1）仮説
ヨーグルトに含まれる乳酸菌は人間の腸にもともと生息しているため、人間の体温

月日

ａｂｃ

5月6日

実験開始

実験開始

実験開始

5月7日

お お む ね やや柔ら やや固か5月8日固まった。 かかったった

変化なし

やや固ま変化なしっていた
5月9日

変化なし

変化なし

かなり固まった

5 月 10 日 固まったや や 固 ま 固まったった

5 月 11 日 変化なし

大 体 固 ま 変化なし
った

5 月 12 日 変化なし

固まった変化なしと同じくらいの約 37℃で活発に発酵を進めると思われる。
（2）実験方法① 滅菌した紙コップに市販のヨーグルトと牛乳を混ぜ、サランラップまたはガーゼで口の周りをおさえ、輪ゴムでとめた。
② ａ～ｄのようにヨーグルトと牛乳、または低脂肪乳を 1：5 の割合に混ぜる。
ａ．市販のヨーグルトと牛乳
ｂ．市販のヨーグルトと低脂肪牛乳
ｃ．市販のヨーグルトから作った自家製のヨーグルトに牛乳を混ぜたもの
ｄ．牛乳だけのもの③

温度については、ａは４℃、常温（約表２ 温度による違い（ａを用いる）
月日

4℃

35℃

45℃

5月6日

実験開始

実験開始

実験開始

5月7日

変化なし

チーズのよ

やや固まうだったった

5月8日

変化なし

刺激臭が－

した
5月9日

変化なし

水分がな－

くなった
5 月 10 日 変化なし

処分－

5 月 11 日 変化なし－－5 月 12 日 変化なし－－

・pH について

低脂肪牛乳を混ぜたものは、発酵が遅かった。

4 日目の時点でのｐＨを以下のとおりである。
ａ．牛乳＋ヨーグルト（常温）：pH=4.5
ｄ．牛乳だけ：pH=4.8。
牛乳とヨーグルトの混合物の方が、酸度が高かった。

牛乳は、置いていると悪臭がしたのに対し、ヨーグルトを混ぜると、まろやかな香りになった。
一方、サランラップでおおったものは、カビは発生しなかったのに対し、ガーゼでおおったものは発生したため、カビは、ヨーグルト自体から発生したのではなく、外から進入したもの◎参考資料だと思われる。

○使用したヨーグルト

市販されたヨーグルトを牛乳に混ぜてでき

種類別

発酵乳

たヨーグルトは、固まる速度が速かったため、無脂乳固形分

11.5%

乳酸菌の力が強くなっているかもしれないと乳脂肪分3.0%考えられる。

原料名 乳製品、生乳、乳たんぱく質濃縮物
・栄養成分（100ｇ）＜実験Ⅱ＞ 乳酸菌の DNA を抽出する。

エネルギー

70kcal

今回は、ヨーグルトが本当に乳酸菌で発酵したんぱく質5.0ｇているのか確かめるために、乳酸菌の DNA を脂質3.0ｇ抽出しようとした。対照実験として、ヨーグル炭水化物

5.8ｇ

ト、牛乳、低脂肪牛乳でも同じ実験を行った。

ナトリウム48mg（1）実験方法

カルシウム160mg

クロロホルム法を用いて DNA 抽出を行った。
◎抽出方法①TE20 バッファーは、0.5M Tris-HC1 10ml○使用した牛乳
無脂乳固形分8.3%以上と 0.5M EDTA 4ml に蒸留水 86ml を入れ、乳脂肪分3.5%以上

オートクレーブにかけた後、冷暗所に保存す

原料名

生乳 100%る。TE20 バッファーを 20 倍に薄めたものを TE1 とする。

・栄養成分（100ml）
エネルギー

64kcal

たんぱく質

3.1ｇ

脂質3.6ｇ

炭水化物

4.7ｇ

ナトリウム4.6mgカルシウム103mg②試料を 1.5ml チューブに入れ、TE20 バッフ
ァーを 30μl 加えてすりつぶす。
③TE20 を 170μl 入れて混ぜた後、フリーザーにわずかの間入れる。
④クロロホルムを 100μl 加え、５分間振って混ぜる。
⑤５分間４℃で 15000rpm で５分間遠心分離（4）考察する。

温度が 45℃のときや、４℃のときよりも、⑥新しいエッペンチューブにガラスウールを35℃のときの方が、発酵は早く進んだ。これに少量（10-30mg）下方にまとめて入れ、⑤のついては、10℃以下になると乳酸菌の働きが止上澄みを移す。

まるということが文献から分かった。つまり、⑦３酢酸 Na を 20~30μl と冷エタノールを人間の体温と同じくらいの温度で発酵が最も500μl 入れゆっくり上下に回転させ、その後、効率よく進んだといえる。

フリーザーに３～５分静置させる。

⑧遠心分離した後上澄みを捨てる。
⑨冷やした 70%エタノールで内壁を洗い、遠心分離後、上澄みのエタノールは捨てる。

タンパク質しか無いことが分かる（4）考察
クロロホルムを用いて DNA 抽出を行ったが、⑩自然乾燥後、TE1 を 25μl 入れ、更に蒸留水DNA が確認できなかった。これはヨーグルトを 125μ入れ、65℃のまま５分間保つ。に含まれている DNA の量がかなり少ないから⑪新しいチューブに入れフリーザーに入れ保であろうと予測できる。

存する。ガラスウールは捨てる。ガラスウー

後日、乳酸菌のみについて簡易抽出法で抽出

ルにより DNA がより効率的に吸収できる。

を何度も行った結果、わずかではあるが、DNA⑫DNA の含まれた溶液を分光光度計にかける。

を目で確認することができた。おそらく、ヨー（2）仮説

グルトで DNA 抽出を行った場合、乳酸菌のヨーグルトには乳酸菌が含まれているためDNA 量に対して、ヨーグルト中に他のタンパDNA があるが、牛乳と低脂肪牛乳には DNAク質などが多く含まれていたため、DNA の抽が無いと思われる。

出が困難になったと思われる。

（3）実験結果
分光光度計にかけ、分析した結果、牛乳と低脂肪牛乳の場合は 280 ㎚にピークが確認でき＜実験Ⅲ＞ 乳酸菌を培養する(1)

目的たことよりタンパク質の存在が確認できた。

前回の実験でヨーグルトを増やすことにつDNA は無いと分かったが、ヨーグルトは何もいては成功したものの、それが何の働きで行わ確認できなかった。

れているのかが不明なので無菌状態で乳酸菌のみを培養することにした。そこで、乳酸菌をプレート LB 培地で培養し、乳酸菌の集まったコロニーをこれからの実験に利用することにした。
(2) 実験方法
まず、Luria-Bertani （LB 培地用試薬：
Tryptone,Bacto
5g・NaCl

分光光度計の結果（通常の牛乳）ピークが 280nm にしか確認できないた
めタンパク質しか無いことが分かる

10g ・ Yeast extract,bacto10g）と Agar,Powole（寒天粉末1.5g）を計り取り、蒸留水を 100ml 入れ、よくかき混ぜたあとペトリ皿に入れ、オートブレークにかける。よく冷めたら、クリーンベンチ
内で白金耳でヨーグルト水を薄くぬる。１~２日程おいておくとコロニーが出来る。
（3）実験結果
大体のものは下の写真のように薄橙がかったコロニーができ、うまく培養できたといえる。

分光光度計の結果（低脂肪牛乳）
ピークが 280nm にしか確認できないため、

カタラーゼ陽性だったお菓子に入っている乳酸菌は、普通の乳酸菌とは違い、分裂ではなく胞子で増える「バチルス・コアグラス」という乳酸菌が含まれていることが分かったため、さらに詳しく研究する。
＜実験Ⅴ＞乳酸菌ということを確かめる[Ⅱ]グラム染色法
細菌類は主にグラム染色法という染色で２寒天培地（LB 培地で培養した乳酸菌）つの種類に分けることができ、その例としてグラム陽性が枯草菌類、グラム陰性が大腸菌類が＜実験Ⅳ＞ 乳酸菌ということを確かめる[Ⅰ]あげられる。これらの細菌の違いは、細菌の細カタラーゼ反応

胞の表面を覆っているペプチドグリカンとい乳酸菌には他の細菌と違い、カタラーゼといわれる物質の厚みで区別されている。つまり、う物質が含まれていないのでカタラーゼ反応

このペプチドグリカンが厚ければグラム染色によりカタラーゼ陰性になるので、区別できる。

法で染めた後、アルコールで洗浄しても染色液（1）実験方法が抜けないが、ペプチドグリカンが薄ければグ培地で培養した乳酸菌のコロニーと思われラム染色法で染めた後、アルコールで洗浄したるものを白金耳でかき集め、過酸化水素水にひ際に染色液が抜けてしまうという仕組みであたす。ここで酸素が発生すればカタラーゼ陽性

る。

（枯草菌類）となる。酸素が発生しなければ、（1） 実験方法

カタラーゼ陰性（枯草菌類以外）となり、乳酸・使用薬品菌のグループであると分かる。
（2）実験結果

ルゴール(Lugol)液：ヨウ素１g,ヨウ素カリウム２g,蒸留水 300ml（先ずヨウ素カリウ

あるお菓子に含まれている乳酸菌はカタラムを少量の蒸留水に溶かし、次にヨウ素液ーゼ陽性だったが、それ以外の一般的なヨーグを加え、溶かしてから残りの蒸留水を加えルト（プレーンヨーグルト）では、カタラーゼる。
）陰性だった。

Ａ液：クリスタルバイオレット 0.3g，95%エタノール 20ml
Ｂ液：シュウ酸アンモニウム 0.8g，蒸留水
80ml
混合液：前日にＡ液とＢ液を混合し、使用当日に濾過する。
・染色方法
(1)

スライドガラスに白金耳で蒸留水を１滴と菌をいれ、よく伸ばす。

(2) 乾かす枯草菌類と過酸化水素水での反応（カタラーゼ反応・陽性）
（3）考察

(3)

ガスバーナーの上を３回ほど通す。

（固定）(4) 染色用混合液を 1 滴、滴下する。
（１～３分）(5) 染色トレーで洗う。
（２回）

（3）考察
グラム染色法で乳酸菌が染まったので、枯(6) 乾かす。

草菌類と同じグループに分類され、乳酸菌の(7) ルゴール液を 1 滴、滴下する。
（１分）

ペプチドグリカンは厚いということが分か(8) 染色トレーで洗う。
（２回）

る。

(9) 乾かす。
(10) エタノールを 1 滴、滴下する。
（30 秒）(11) 染色トレーで洗う。
（２回）(12) 乾かす。
(13)

サフラニン液を１滴、滴下する。（１分）(14) 染色トレーで洗う。
（2 回）(15) 完全に乾かす。

＜実験Ⅵ＞
ヨーグルトの養分を利用した培養法
前回の実験Ⅰでカビが発生した事を利用して、ヨーグルト水で植物を育てた場合と、通常の水で育てた場合の比較実験を行った。
（1）仮説
普通の水で植物を育てた場合より、カビ(16) 顕微鏡で観察する。

が育ちやすかったヨーグルトの養分が入※ これについて染色時間を１分、２分、３っているものの方が植物は効率よく育つ分とかえて実施し、合計 15 種類を実施した。
（2）実験結果と考えられる。
（2）実験方法
同じ種類の植物を、同じ条件で、通常のプレパラート 15 枚中 13 枚の乳酸菌の細胞壁水で育てる場合：Ａと、ヨーグルトを溶か（ペプチドグリカン）が紅色やうすい黒色に染した水で育てる場合：B を製作して育てる。

まった。

グラム染色法により染まった乳酸菌（3）実験結果
通常の水で育てた場合：Ａより、ヨーグルトを溶かした水で育てた場合：Ｂの方が３日間ほど長く生育できた。
（4）考察
ヨーグルトには、ヨーグルトの乳酸菌か牛乳のどちらかは分からないが、養分が蓄えられていることが分かったが。しかし、楕円形に見える一つずつがペプチドグリカ

これが乳酸菌の働きによるものであるかンの染まった乳酸菌は分からない。

＜実験Ⅶ＞ 無酸素状態で乳酸菌を培養する
乳酸菌は、嫌気呼吸を利用する謙気性通気から応用までの様々なことを学ぶことができた。今回、分かったことをまとめると、以菌のため、酸素が無い状態の方が育ちやすい下のとおりである。という仮説をたて、次のような実験をした。

(1)乳酸菌の生育に最も関わる条件は、温度で、（1）実験方法

最もよく（早く）生育する温度は 37℃（人密閉容器（すりきりの付いた容器）に乳間の体温と同じくらい）であり、10℃以下

酸菌をまいた LB 培地を入れ、その中にでは生育が止まるということ。

水の電気分解で発生させた水素を満たして培養した。
（2）実験結果
通常の空気中で培養したもののように薄橙色のコロニーが複数個でき、見た目の変化は無かった。
（3）考察
嫌気性呼吸とはただ酸素が必要ないというものであって、酸素が無いからといって元気になったり成長が速くなったりするものではないといえる。

(2)乳酸菌には何らかの養分があるということ。
(3)乳酸菌は培養した際、コロニー（集団）を作るということ。
(4)乳酸菌は何らかの特定の物質を持っているものにしか働かず、その物質を持っていなければその個体を発酵させないということ。
(5)乳酸菌の DNA はとても少なく、抽出が困難であるということ。
(6)乳酸菌には、分裂して増えるものと胞子で増えるものがあり、それは、カタラーゼ反＜実験Ⅷ＞ 乳酸菌でダイズを発酵させる応で区別できるということ。

この実験は、納豆が嫌いな人のために納豆(7)嫌気性呼吸を利用している嫌気性通気菌

菌を使わずに、乳酸菌で発酵させるという実は、酸素を嫌うのではなく、酸素を利用し験である。

ない菌であるということ。

（1）実験方法(8)細菌は主にグラム染色法で二種類に分け実験Ⅲで製作したコロニーの上にダイズられ、それは、ペプチドグリカンの厚みでを載せる方法をＡとし、ヨーグルトの中に区別できるということ。

ダイズを入れたものをＢとした。
（2）仮説

次に、今後の課題としたいのは、胞子で増ダイズには乳酸菌が発酵をするために必える乳酸菌があるので、コケのように胞子で要なガラクトースという糖が含まれてい増える植物と組み合わせることができるよないため発酵しないと思われる。

うにして、より強い乳酸菌を作ることである。

（3）結果
Ａ，Ｂともに発酵しなかった。
（4）考察
仮説の通り、乳酸菌は、大豆を発酵させな

また、乳酸菌が働く特定の物質の解明や、より正確な DNA 抽出方法の開発なども今後の課題としたい。より適切な方法で、実験・研究を進めていこうと思う。

かった。理由がわからないため、これから調べていきたい。

６．参考文献・参考資料
・ダイナミックワイド「図解生物」 東京書籍

５．まとめと今後の課題
今回の様々な実験を通して乳酸菌の基礎・ヨーグルトの科学・遺伝工学実験ノート DNA を得る

・2007 年 公開講座 実験試料
・明治乳業 HP
・グリコ乳業 HP・建部ヨーグルト HP
・社団法人 全国日本発酵乳乳酸菌飲科協会発酵乳、乳酸菌飲料公正取引協議会 HP
・信州大学農学部 細野明義教授 HP・京都大学大学院農学研究科 応用生命科学専
攻岸野、小川、清水さん論文

・生物学辞典 岩波文庫
７ 謝辞
今回の研究では株式会社グリコ乳業 発酵乳
Ｇの瀧澤さんに様々な実験方法について、適切なアドバイス等をいただき、研究の大きな手助けをしていただいたことに、大変感謝しております。
また、今回の研究において、特に貴重なご助言をして下さり、グラム染色法で指導してくださった本校教諭の櫻井先生にも、深く感謝しております。ありがとうございました。