［技術報告］

堆肥の高窒素化のための微生物分離方法の開発
山本忠*

堆肥の有効利用を進めるためには、肥料に窒素成分を保持する技術を検討した。堆肥を分解する際に菌体内あるいは体外に窒素を保持する微生物を検索することとして、分別方法を検討した。
たんぱく質染色方法とソフトアガー重層法を組み合わせることで、簡単な高窒素生産菌の分別方法開発の可能性が見出せた。
キーワード：微生物、堆肥、たんぱく質

Development of the Microorganism Separation Method
for a Raise in the Nitrogen of Compost
YAMAMOTO Tadashi
In order to advance effective use of a compost , the technology of holding a nitrogen
ingredient was examined. When disassembling a compost, the judgment method wasexamined as searching the microbe which holds nitrogen to the microorganism inside of thebody or the outside of the body. By combining the protein dyeing method and a soft agar
multistory method, the possibility of the judgment method development of an easy highnitrogen production microorganisms was able to be found out.
key words : microorganism, compost,
１

緒protein言

で保管費用の点で有利となる。また、農地への散布作業の岩手の農業の方向は、土づくりによる有機農産物・減農負荷が軽減されるため、農家での利用の促進につながる。

1）

薬で差別化を図ろうとしている 。そのために、牛糞の堆堆肥を高窒素化するために、たんぱく質を菌体内に多く肥の高窒素化が出来れば有益である。有機農産物の有機表保持するか培地に多量に分泌する菌の分離方法開発の視示には化学肥料ではなく、有機肥料の使用が前提である。

点で検討したのでその結果を報告する。

また、減農薬農産物と表示するためには、慣行法の 1/2 の使用量という基準をクリアーしなければならない。その減２

農薬には、耐病性を上げるための土づくりが重要である。

２−１

現在の牛糞堆肥は、窒素が少ないためそのままでは特殊肥実験方法
堆肥化微生物分離試験に用いた土壌

市販の堆肥と土壌改良材および発酵過程の堆肥を微生料の表示ができない。家畜排泄物を土づくりの役割から本物の分離源として使用した。

格的な肥料への利用に転換を図ることが出来れば表示の２−２

微生物試験法問題を解決できる。岩手県では、土づくりのみでは、堆肥衛生試験法・注解 2）に基づいて試験を行った。微生物の充足率が 197％となり、大幅な過剰となる。しかし、肥分離の基本は、ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬料 としての活用まで利用範囲を広げると充足率 90％と製）あるいはトリプトソーヤ寒天菌培地を用いて 25℃、3されている。

日間培養で測定した。

本研究では、農業サイドの要望に対応して堆肥の肥料化をまた、放線菌分離用には、Actimomyces Isolation Agar目指した高窒素化となる微生物検索技術である。特に、牛（Difco 製）にシクロヘキシミドとグリセロールを添加し糞堆肥の窒素濃度を上げて、鶏糞のような特殊肥料の認定て作成し、35℃、3 日間培養して測定した。

を狙うこととした。それにより、特殊肥料の認定を受ける

２−３

たんぱく質検出用培地ことが出来れば、他の認定肥料との混合が可能となる。そ

一次分離用としては、微生物を生育させた培地上に微生の結果、肥料製造現場で成分が補完できるので肥料として物がコロニーを形成したプレートへ、たんぱく質検出色素利用しやすいこととなる。

を含む寒天を重層した。重層用寒天としては、培地用寒天

また、堆肥を減容化すると、その保管容積が削減できるのを 0.3％でオートクレーブしたもの、あるいは電気泳動用＊

食品技術部 （現在企画情報部）

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岩手県工業技術センター研究報告 第１１号（２００４）

低融点寒天（TAKARA LO3）を 0.3％として電子レンジ３−３溶解したものを使用した。

重層染色コロニーの生存率

重層法により染色したコロニー50 個をトリプトソーヤ

重層培地に用いるたんぱく質検出色素は、BCA 法の市販寒天培地の平板培地に竹串で突いて生存率を比較し、表 1

試薬であるプロテインアッセイ試薬 BCA（PIERCE 製）に結果を示した。この結果は、1 回の試験によるものであを 10 倍希釈して使用した。

り、さらに検討を要するが、培地用の寒天を用いた重層法の移植先培地での生存率 32％に比べ、低融点の電気泳動用の寒天を用いた重層法では、移植先の培地での生存率が表1 BCA試薬染色で重層に用いた寒天培地の相違による微生物生存率の比較
寒天の種類

植付け菌数

生育菌数

生育率（％）

50163250448888％と大幅に改善することができた。
４考察

本研究の目的は、堆肥製造時に高窒素化となる微生物検培地用の寒天重層法
低融点の寒天重層法

索技術の開発であり、たんぱく質を菌体内に保持するか培地に分泌する微生物分離操作の効率化とした。
微生物分離操作効率化の鍵となるたんぱく質の定量にBCA 法を用いた理由は以下のとおりである。BCA 法はアルカリ側では、Bicinchoninate が Cu とコンプレックス

３３−１結を形成して紫色を形成することを利用しており、実際の操果作では、試薬の pH が強いアルカリ性のため堆肥製造時の培地用寒天による重層の検討

アンモニア発生などの条件に耐える微生物選択に有効とプロテインアッセイ試薬 BCA を用いて試験とした。

考えている。

BCA 溶液に nakarai の寒天を 0.3％加え、121℃、15 分

BCA 法はいくつかのあるたんぱく質の定量法の中でも、オートクレーブ後に寒天培地に重層を試みた。BCA 溶液の pH が高いため、重層を試みた寒天はうまく固まらなか溶液の場合は Lowry 法と比較して妨害物質の影響を受けった。

にくく、感度は 0.1〜１mg/ml といわれており、感度が高次に BCA 溶液の濃度や寒天濃度を変えて、混合しないい点が評価されている。しかし、高濃度のたんぱく質だけでオートクレーブ後混ぜ合わせて重層するなどの方法をを染色していると言いがたい点もある 3）ので合わせて検試みた。寒天濃度を 2％程度にすれば固まるが、この濃度討を進めたい｡

では培地の温度を低くすると培地に流す前に固まり、高い今回の方法では、BCA 試薬を 10 倍希釈していること及温度のままで流すと微生物の発現数に問題が生じ、有効なび寒天を加えたことでたんぱく質の定量性の範囲が変動重層は出来なかった。

していると考えられるので、定量性の確認が必要である。

３−２

また、染色の範囲が、細胞外分泌物と表層だけに留まって電気泳動用寒天による重層の検討いるのかなどを含め微生物選択の手段として用いるには高濃度の寒天では、使用できる温度に下がるまでに凝固さらに検討が必要である。

するので、その問題を解決するため低融点の寒天を用いて本研究は、平成 15 年度の基盤的先導的研究事業でおこ重層法を試みることにした。低融点の寒天として、電気泳動用低融点寒天（TAKARAなった。

LO3）を用いた。寒天濃度を 0.3％として電子レンジ溶解して、重層平板培地にして文使用した。LO3 は融点が 37℃と低いため、温度が十分に献

1）岩手県農業・農村基本計画：(1999)下がってからコロニーにかぶせることが出来た。

2）日本薬学会編：衛生試験法・注解，金原出版(1990)

また、コロニーの周辺が強く染まるものとコロニー自体

3）タンパク質実験法、p.27、祥土社(1996)

が強く染まるもの両方染まるものなどの現象が見られた。

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