No.93

2014年 7 月

http://peptide-soc.jp
新会長ご挨拶

あかじ けんいち
京都薬科大学薬品科学教室
akaji@mb.kyoto-phu.ac.jp

券献献献鹸

兼献献献験

ペプチド科学は生命科学の基礎をなすものとして，理学，工学，医学，薬学，農学などの領域の発展に大きく貢献してきました。1990年，ペプチド科学に携わる者の学会として，アメリ
カペプチド学会，ヨーロッパペ
プチド学会などが海外で結成さ赤路 健一
れたのと期を同じくして日本ペプチド学会が結成され，我が国におけるペプチド科学の発展を図るとともに，欧米の学会とも緊密な連携を保ちつつ国際的な活動を分担することとなりました。
1997年に第 1 回の国際ペプチドシンポジウム（IPS）
が京都において開催されましたのも，日本ペプチド学会の呼びかけによるものであります。この度，第12期会長・下東先生の後を受け，第13期の日本ペプチド学会・会長を拝命することとなりました。歴代の会長・理事・監事・評議員の先生方をはじめとする諸先輩方が築かれてきた学会活動に微力ながらも貢献できるよう，鋭意努める所存です。何とぞご支援賜りますよう
お願い申し上げます。
日本ペプチド学会の最も重要な事業は，毎年秋に開催される年会「ペプチド討論会」です。第 1 回のペプ
チド化学討論会は1962年に大阪で開催され，以後回を重ね昨年50回の節目を迎えました。この間日本ペプチド学会は，2004年の1st Asian-Pacific International
Peptide Symposium（APIPS），2006 年 の 4th Peptide
Engineering Meeting，2010年度国際ペプチドシンポ
ジウム・IPS，などの国際学会の開催にも携わってきました。昨年2013年の第50回ペプチド討論会は第 4
回 APIPSとの併催として開催され，最近日本で開催されたペプチド討論会のうち 2 ～ 4 年に 1 回は国際会議として開催されるようになっております。このよ
うに，ペプチド討論会は広く海外を含めたペプチド研究者を対象とする総合的な学術集会へと進化しつつあり，研究発表の多くが英語でおこわなれるようになっております。このような対応により，毎年の討論会はもちろん各種国際会議も回を追って急速に盛況となり，我が国におけるペプチド科学研究の活況を内外に強く示す機会となっております。ペプチドがかかわる
多様な領域の研究者の方々に積極的に討論会に参加いただき，ますます内容が充実されることを強く願っております。
2001年からは，特に若手研究者の課題探求の意識からペプチドフォーラムが企画されるようになり，これまでに19回を数えています。次代を担う若い研究者の方々の挑戦的な企画を大いに期待しております。日本
ペプチド学会はこのような継続的事業を通じて国際化が急速に進む研究環境に対応し，グローバルなペプチ
ド科学の学術進展，特にその基盤となる次代を担う若い研究者の育成に努めております。今後もこのような活動を継続・発展させるため，会員の皆さまの積極的なシンポジウム等への参加を心からお願い申し上げる次第です。
日本ペプチド学会ではこれら学術集会とあわせ，学会賞，奨励賞および討論会でのポスター賞の選考・授与を行っております。また，アメリカ・ヨーロッパ・
アジアとほぼ全世界をカバーするペプチド関連学会への若い会員の参加・発表を支援し，新しいテーマ探求の一助としていただくために国際学会（APS，EPS，
IPS，APIPS，そして中国および韓国の討論会）参加
に対するJPS Travel Award の授与を行っております。
これらAward 事業を大いに利用していただき，新たな研究展開を図っていただくきっかけとしていただく
ことも学会の大きな使命の一つと考えております。多くの研究者の方々の積極的な応募をお待ちしております。
日本ペプチド学会では，このような日々の活動の広報を通じた新たな会員の参加と学会活性化をめざし，
ホームページやニュースレターによる情報発信を行ってきました。ニュースレターでは，学術雑誌では得られない貴重な情報が盛り込まれた紙面づくりが行われております。会員の皆様にもユニークな情報発信の場として積極的にこのニュースレターご利用いただきた
いと考えております。また，ホームページを通じた情報発信は最近とみに重要度が増しており，ペプチド学会でも多様な情報を盛り込むべく今年度からホーム
ページを一新いたしました。ぜひこのホームページにつきましても会員の皆様からのご意見を頂き，魅力的な情報発信の場にしたいと考えております。
今後とも，様々な活動を通じて会員の皆様の研究のますますの発展に少しでも寄与できる学会をめざして努力したいと考えております。学会に対する要望などございましたら，会長あるいはお近くの理事，評議員，または学会事務局までお寄せください。皆様のご支援をあらためてお願い申し上げ，ご挨拶に代えさせていただきます。

1

オートファジー誘導物質としての8-ニトロcGMP
1 ． はじめにオートファジーは，恒常性維
持や疾患の観点から爆発的な勢いで発展している研究分野である。 本 稿 では，内 因 性の オ ートフ ァジ ー 誘導 因 子8-ニト ロ
cGMPについて紹介する1）。
有本 博一
2 ． 生 体 分 子 の ニ ト ロ 化，8ニトロcGMPの発見
一酸化窒素（NO）は，ガス状のシグナル分子である。血管弛緩因子として同定され，1998年にはノーベ
ル生理医学賞の対象となっている。細胞間を超えて拡散する性質があり，代表的な機能として可溶性グアニ
ル酸シクラーゼの活性化（cGMPの合成促進）が知られている。
NOは化学的反応性が高いラジカルなので，酸化，ニトロソ化，ニトロ化など生体分子と修飾反応をおこなう。これらの修飾は，生体分子の傷害と捉えれることもできる。実際，本稿に関連するニトロ化修飾，とくに，グアニン環 8 位のニトロ化については1990年
代半ばに大島寛史教授，J. P. E. Spencer 教授らによってDNA/RNA 損傷の観点から活発に研究されていた。
一方，熊本大学（当時）の赤池孝章教授らは，グアニン環ニトロ化がDNA 鎖以外にも存在し，炎症や細菌感染症に対して保護的に働くという逆向きの着想をもとに研究を進め，8-ニトロcGMPの細胞内存在を突き止めた（筆者も化学者として，この共同研究に参画した）2）。
8-ニトロcGMPは，穏和な条件下でシステイン残基と徐々に反応してS-グアニル化反応を起こす（図 1 ，パネルA）。この予想外の反応性は，タンパク質機能に影響を与えると考えられた。実際，8-ニトロcGMP
は，レドックスセンサーであるKeap1のシステイン残基と反応してNrf2を活性化し，細胞保護的な応答を起こすことが分かった2）。
3 ． 8-ニトロcGMPの生理機能解明を目指して: 蛍光
プローブの利用3, 4）8-ニトロcGMP 報告の翌年，新学術領域研究「活性酸素シグナル」が組織され，筆者は計画研究として本格的に生理機能解明の検討を始めた。化学出身の特徴を生かすべく，生細胞イメージング用8-ニトログアノ
シン蛍光プローブの開発に着手した。プローブを培養細胞に投与すると粒子状の蛍光局在が観察され，これはリソソームマーカーとよく共局在した（図 2 ）。また， 8 位にニトロ基を持たないグアノシン蛍光プロー
ブをコントロールとして投与すると，細胞質に広く分散し，ニトロ体の局在と明確な違いが見られた。
以上の知見は，8-ニトログアニン誘導体とリソソー
ムを介する細胞内分解系の関係を示唆している。細胞内分解系の主たるものとして，ユビキチン―プロテア
ソーム系とオートファジーがある。
2

4 ． 一酸化窒素シグナルとオートファジー
オートファジーは，酵母からほ乳類まで幅広く存在
する細胞内分解経路であり，恒常性維持には欠かせない。オートファゴソームとよばれる二重膜からなる小胞が生じ，内部に取り込まれた基質が分解，再利用される。私達が毎日合成しているタンパク質の大部分
は，オートファジーにより供給されるアミノ酸に基づくと言われている。
化学合成した8-ニトロcGMPを培養細胞（RAW264.7
やA549）に投与すると，オートファゴソーム数が増加し，オートファジーが誘導されることがわかった（図 1 ，パネルB）1）。一口にオートファジーと言っても複数の経路が知られているが，この場合はAtg5に依存する古典的な経路でオートファジーを誘導することが明らかとなった。
オートファジー誘導におけるNOの役割は，十分に明らかになっていないが，LPS 刺激条件下においてはNOと活性酸素の両方に依存してオートファジーが誘導されることが知られている。すなわちYuanらは，
NO 合成酵素（NOS）の阻害剤を用いるとLPS 処理した心筋細胞においてもオートファジーが抑制されることを示した5）。既に述べたようにほ乳類細胞のLPS 刺激によって8-ニトロcGMPが生じる。これらの事実を考え合わせると，NOに依存するオートファジー誘導において内因性8-ニトロcGMPが重要な役割を果たすと予想された。
5 ． 細 菌 排 除 に 関 わ る オ ー ト フ ァ ジ ー と8-ニ ト ロ
cGMPの関係（図 3 ）1）
オートファジーは，細胞内に侵入した病原体（細菌やウィルス）の排除にも関与する。そこでA 群連鎖球菌感染系（GAS 感染系）を用いて，8-ニトロcGMPの働きを調べた。この細菌は取り込みののちエンドソー
ムから細胞質へ抜け出し，そこで認識されてオート
ファゴソームに捕捉されることが分かっている。
8-ニトロcGMPを培地に添加すると，GASに感染したマウスマクロファージ様 RAW264.7では細菌排除が有意に促進された。同時にオートファゴソーム数も増加し，オートファジー活性化が示唆された。リソソー
ムの機能（オートファジーに必須）を阻害すると，
GAS 排除促進効果はキャンセルされるので，8-ニト
ロcGMPによる細菌排除促進は，化合物の直接的な抗菌活性によらないことが分かる。
細菌感染によりマクロファージ細胞内ではNOや活性酸素が生じる。結果として内因性の8-ニトロcGMPが生じるはずである。これは免疫細胞化学によって直接証明できた。各種の阻害剤を使って，内因性8-ニトロcGMP 生成を抑制するとオートファジーが抑制され，GASの排除も遅延した。これらの観察は，抗菌
オートファジーにおける8-ニトロcGMPの重要性を示唆している。同様の効果は，初代マクロファージ細胞でも見られ，in vivoにおける自然免疫応答の一端を表していると考えられた。
さて，飢餓による誘導と異なり，細菌感染による
オートファジー誘導は選択的とされる。つまり，狙った標的を選んで分解する機構があると考えられている。この関係で，上記の免疫細胞化学実験は，思いが図18-ニトロcGMPによるタンパク質 S-グアニル化反応（パネルA，スケールバー 10 μm），およびオート
ファジー誘導（パネルB: RAW264.7細胞，青 DAPI，緑はオートファゴソーム，8-ブロモ-および8-ニトロ
cGMP 100 μM，ラパマイシン 200 nM）1）

図2

ニトログアノシン蛍光プローブはリソソーム局在を示す（RAW264.7）4）

けない発見をもたらすことになった。細菌（GAS）の
周囲にS-グアニル化修飾が観測されたのである。
このS-グアニル化は，細胞質において概ね半数のGASで確認された。一方，オートファゴソームに捕捉されたGASに注目すると，この割合は跳ね上がり，
90％以上のGASにS-グアニル化修飾が見られた。Sグアニル化修飾が，選択的排除の目印である可能性が大きく浮上した。

オートファジーによる細菌の選択的捕捉過程で，ユビキチン鎖による標識化が一部の細菌（サルモネラなど）で知られている。また，ユビキチン鎖がp62などのアダプタータンパク質を介してLC3タンパク質と結合し，オートファゴソーム形成を促進することも知られている。私達の結果から，S-グアニル化とユビキチン化の関係が疑われた。検討したところGAS 表
面のS-グアニル化はユビキチン修飾に先立って起こ3

図3

内因性8-ニトロcGMPによる抗菌オートファジー誘導のモデル（青はA 群連鎖球菌，赤はS-グアニル化，オレンジはユビキチン鎖，二重膜はオートファオゴソームを表す）1）

り，S-グアニル化されたGAS 細胞が優先してユビキチン化を受けることが示唆された。実際，薬剤でSグアニル化を抑制すると細菌周囲のユビキチン化は明確に抑制された（逆に，ユビキチン化の阻害は細菌のS-グアニル化レベルに影響を与えなかった）。つまり，8-ニトロcGMPは，単にオートファジーレベルを上げるだけでなく，分解対象の周囲に集積して，選択性を支配しているのである。
オートファジーに対する個々の病原体の応答は個々に違いがあり，今回 GASで観察された8-ニトロcGMPの効果を全ての病原体に一般化するには，さらなる検討が必要である。一方，非感染条件下，S-グアニル
化されたタンパク質が，同様にユビキチン化を受け，
オートファジーによる分解を受ける初期的結果が得られている1）。この事実は，S-グアニル化がユビキチン化を促進するメカニズムの一般性を想像させる。
6 ． オートファジー誘導のmTOR 依存性
近年の研究でオートファジーと癌，神経変性疾患，
クローン病など様々な疾患との関係が証明されている。治療薬開発を目指して，オートファジーの促進と阻害の両方が検討されている。
化合物によるオートファジー活性化には，ラパマイシンがよく用いられる。ほ乳類細胞におけるラパマイ
シンの標的（mammalian target of rapamycin: mTOR）
は，オートファジーのネガティブレギュレーターである。すなわち，mTORの機能を阻害すると，オートファジーが活性化される。しかしながら，mTORは，
広汎なタンパク質の生合成を制御しているため，その特定の疾患の治療薬としては副作用が懸念される。そのため，mTOR 非依存的経路によるオートファジー
誘導に注目が集まっている。リチウムカチオンやトレ
4

ハロースなどがmTOR 非依存的にオートファジーを誘導する6）。8-ニトロcGMPも，mTOR 非依存的経路
でオートファジーを誘導するので1），今後は活発な創薬展開が期待される。
7 ．おわりに
私達は，もともと（今も）天然物有機化学をバック
グラウンドにしている。しかし，過去 6 年ほどで研究
内容は大きくオートファジー研究にシフトすることになった。「牛に引かれて善光寺参り」という言葉がある。「これは」という分子に何処までも付いて行くことで，本来のバックグラウンドとかけ離れた，思いがけないところへ導かれる。今回は内因性低分子を研究対象としたことで細胞生物学への道が拓けた。研究開始当初はそこまで強く意図していた訳ではないが，「牛」の選択は運命の分かれ目である。
謝辞
今回紹介した研究は，伊藤千秋博士（現 金沢大がん進展研），斎藤洋平博士（現 金沢大薬）を中心に進められた。抗菌オートファジーの評価は，中川一路
教授，野澤孝志博士（京大院医）にご指導いただいた。8-ニトロcGMP 全般の共同研究者である赤池孝章
教授，澤智裕准教授，藤井重元博士（東北大院医）にも深く感謝する。
引用文献
1 ） Ito, C.; Saito, Y.; Nozawa, T.; Fujii, S.; Sawa, T.; Inoue, H.;
Matsunaga, T.; Khan S.; Akashi, S.; Hashimoto, R.; Aikawa, C.; Takahashi, E.; Sagara, H.; Komatsu, M.; Tanaka,
K.; Akaike, T.; Nakagawa, I.; Arimoto, H. Endogenous
Nitrated Nucleotide Is a Key Mediator of Autophagy andInnate Defense against Bacteria. Molecular Cell, 2013,
52, 794-804.
2 ） Sawa, T.; Zaki, M. H.; Okamoto, T.; Akuta, T.; Tokutomi, Y.;
Kim-Mitsuyama, S.; Ihara, H.; Kobayashi, A.; Yamamoto,M.; Fujii, S.; Arimoto, H.; Akaike T. Protein S-guanylationby the biological signal 8-nitroguanosine 3＇,5＇-cyclic
monophosphate. Nature Chem. Biol. 2007, 3, 727-735.
3 ） Saito, Y.; Taguchi, H.; Fujii, S.; Sawa, T.; Kida, E.; Kabuto,C.; Akaike, T.; Arimoto, H. 8-Nitroguanosines as chemicalprobes of the protein S-guanylation. Chem. Commun.
2008, 5984-5986.
4 ） Saito, Y.; Ito, C.; Fujii, S.; Sawa, T.; Akaike, T.; Arimoto, H.
Fluorescent probes for live cell imaging of endogenous
guanine nitration. ChemBioChem 2013, 14, 1068-1071.
5 ） Yuan, H., Perr y, C.N., Huang C. et al.: LPS-induced
autophagy is mediated by oxidative signaling in cardiomyocytes and is associated with cytoprotection. Am. J.
Physiol. Heart Circ. Physiol. 2009, 296, H470-H479.
6 ） Fleming, A., Noda, T., Yoshimori, T.; Rubinsztein, D. C.
Chemical modulators of autophagy as biological probes
and potential therapeutics. Nature Chem. Biol. 2011, 7,
9-17.

券献献献鹸

兼献献献験

ありもと ひろかず
東北大学大学院生命科学研究科
arimoto@biochem.tohoku.ac.jp

ポリフェノールの高度利用を目指した
エステラーゼ研究1 ． はじめにフィトケミカルはさまざまな分野での応用が進められている。そ の 中 には，多 様な フ ェ
ノール酸エステル化合物，フラボノイド配糖体などがあり，食品においては，その味や加工特性に関わり，また，これらは抗酸化性，抗菌性，メタボリック
小関 卓也
シンドロームパラメーター改善効果など有用機能を有するものが多い。このうち，タンニンやカテキンには没食子酸がデプシド結合（エステル結合）で存在し，茶飲料においてはそれが不溶化して白濁（クリームダウ
ン）する原因となっている。クリームダウンの防止
やビールの清澄化等のために，没食子酸を加水分解するタンナーゼが利用されている。また，没食子酸
自体にも抗酸化性等の有用機能があり，カテキン分
解物は機能性を向上させることができる。タンナー
ゼに関する研究は古く，1960年代にAspergillus oryzaeの酵素の性質が報告され1），茶飲料の加工など温故知
新的な特徴がある一方で，有用健康機能が見つかってきたカテキンおよびタンニンのタンナーゼを介した脱没食子酸による可溶化，また，没食子酸自体にも抗酸化性等の機能があり没食子酸の酵素抽出，さらに，エラグタンニンの構造は複雑であることから

エラグタンニンの構造決定へのタンナーゼの利用な
ど，酵素利用技術の開発が期待できる。また，植物
糖質素材はバイオ燃料，パルプ，食品そして飼料など，工業分野や食品分野に応用可能である。植物糖質のうち，イネ科植物の細胞壁の構成成分はヘミセル
ロースの割合が20-40％と比較的高く，植物バイオマ
スを酵素糖化する際にはセルロースに加えてヘミセル
ロースを効率よく分解することが必要である。ヘミセ
ルロースの一つであるキシランは1,4-β-キシロースのポリマーを主鎖として側鎖にアラビノフラノース，Oメチルグルクロン酸，フェルラ酸およびp-クマール酸を含み，また，一部のキシロースはアセチル化されている。ヘミセルロースを効率よく分解するには主鎖を加水分解する酵素に加えて側鎖の基質を分解す
るアクセサリー酵素と呼ばれるα-L-アラビノフラノシ
ダーゼ，α-グルクロニダーゼ，フェルラ酸エステラー
ゼ，アセチルキシランエステラーゼの存在が不可欠である。一方，食品機能の面からフェルラ酸エステラー
ゼの有効性が報告されてきている。例えば，乳酸菌などの腸内細菌がフェルラ酸エステラーゼを分泌することで食物繊維が分解されてフェルラ酸が遊離する2）。フェルラ酸は血圧降下，コレステロール低下，血糖値低下などの作用を有し，ヒトの腸管から吸収されたフェルラ酸は生活習慣病の予防・改善が期待される3）。このようにフェルラ酸エステラーゼはバイオ燃料生産に重要であるばかりでなく，生理活性物質として有用なフェルラ酸の抽出など，産業上有用な酵素の一つと考えられる。本稿では麹菌由来のタンナーゼおよびフェルラ酸エステラーゼの触媒作用を紹介する。
2 ． A. oryzae タンナーゼ
天然には様々な形態のタンニンおよびカテキンが存在する。没食子酸（3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸）がデプシド結合したカテキンは，（＋）および（－）
カテキンガレート（（＋）-Cgおよび（－）-Cg）），（＋）
および（－）エピカテキンガレート（（＋）-ECgおよび（－）-ECg），（＋）および（－）エピガロカテキ
ンガレート（（＋）-EGCgおよび（－）-EGCg）などのように化学構造の異なるカテキンが存在する。タンナーゼは没食子酸を加水分解するが，A. oryzaeでは 2つのタンナーゼ遺伝子が報告されている4, 5）。しかしながら，詳細な基質特異性などの機能解析に関する報告はなかった。また，A. oryzaeタンナーゼの成熟タン
パク質は翻訳後の修飾過程で 2 つのヘテロサブユニッ
トからなると報告されている4）。このような背景を踏
まえ，筆者らはA. oryzae 由来の市販タンナーゼ製剤
から精製したネイティブタンナーゼとA. oryzaeRIB40
由来のタンナーゼ遺伝子（AotanA）をPichia pastoris
を用いて発現させたリコンビナント酵素を用いて基質特異性などの解析を行った6）。SDS-PAGEからネイティ
ブ酵素およびリコンビナント酵素とも45 kDa-70 kDaの幅広いバンドを示し，高度にN 糖鎖修飾されていることが分かった（図 1 ）。エンドグリコシダーゼH
処理後ではそれぞれのタンパク質で30kDaと32kDa，30kDaと34kDaの 2 つのバンドが確認できた（図 1 ）。
リコンビナント酵素で脱糖鎖処理後の 2 つのバンドのN 末端配列を調べたところ，34kDaタンパク質は5

AoTanAのN 末端ドメインに発現ベクター由来で酵母
α-ファクターシグナル配列に由来する 5 アミノ酸が付加した産物，30kDaタンパク質はAoTanAのArg316以
降のC 末端ドメイン産物であることが分かり，リコン
ビナントタンパク質においても翻訳後修飾が示唆された。熱安定性は両酵素とも40℃まで安定で，50℃ではネイティブ酵素は70％以上の活性を保持していたのに対し，リコンビナント酵素は約40％と違いがみられた。両酵素の脱 N- 糖鎖処理を行い熱安定性を測定し

図1

精製した野生型およびリコンビナントタンナーゼとエンドグリコシダーゼH（エンドH）処理後のポリアク
リルアミドゲル電気泳動
レーン 1 ，スタンダードタンパク質；レーン 2 ，野生型タンナーゼ；レーン 3 ，エンドH 処理後の野生型
タンナーゼ；レーン 4 ，リコンビナントタンナーゼ；
レーン 5；エンドH 処理後のリコンビナントタンナー
ゼ．

表1

6

たところ，40℃で残存活性が低下しはじめ，50℃ではほとんど活性が消失した。この結果からN 糖鎖が耐熱性に寄与することが示唆された。タンナーゼ基質に対する比活性はリコンビナント酵素よりもネイティブ酵
素の方がわずかに高い傾向を示し，合成基質より天然
基質に対して触媒効率が高く，（－）-ECgに対して最も高かった（表 1 ）。基質特異性は基質構造の違いに
より触媒効率が異なることから，ポリフェノールの化学構造も関係していることが推定できる。
3 ． A. oryzae フェルラ酸エステラーゼ
フェルラ酸エステラーゼは，2004年の時点で，表 2に示すようにアミノ酸配列の相同性と 4 つの合成基質に対する特異性でタイプA － Dの 4 タイプに分類された。また，エステル加水分解酵素を分類している
ESTHERデ ー タ ベ ー ス（http://bioweb.ensam.inra.fr/
ESTHER）7）においてはリパーゼやタンナーゼファミ
リーなどに分類される。その中で，タイプCのフェル
ラ酸エステラーゼはESTHERデータベースにおいてはタンナーゼファミリーに属している。A. oryzae 由来のタンナーゼファミリーに属する遺伝子は11個同定され，他のカビ由来に比べて数が多い。その中でいくつかの遺伝子を特徴付けた。AO090001000066（aspor_
q2up89）はタンナーゼファミリーに分類されたフェルラ酸エステラーゼの一つであったが，基質特異性はタイプCではなく，タイプBであったためAoFaeBと名付けた8）。AoFaeBのアミノ酸配列はAoTanAと類似しているが，タンナーゼ活性はなく，しかしながら，既知のクロロゲン酸エステラーゼとの類似性はなかった
ものの，クロロゲン酸（カフェオイルキナ酸）に対する分解性を示した。従って，フェルラ酸エステラーゼの基質特異性による分類は，必ずしもアミノ酸配列の相同性による分類とは対応しないことが分かる。
4 ． 新規エステラーゼ
筆者らはフェルラ酸エステラーゼやタンナーゼの活性中心セリン残基近傍のアミノ酸配列が保存されネイティブ及びリコンビナントタンナーゼの触媒パラメーター

て いる もの の， それ ら とは 異 なる クラ ス ター に分類される酵素遺伝子が存在することを見いだし，A.
oryzae 由来の遺伝子をゲノム情報を利用して探索し，
AO090023000615（aspor_q2uh24）の機能を解析した。
AO090023000615リコンビナント酵素の最適 pHは7.0，
pH5.0-9.0において安定で，最適温度は45℃，50℃まで安定であった。基質特異性はフェルラ酸エステラー
ゼ基質のMFA，MpCA，MCA，MSA，タンナーゼ基
質の没食子酸メチル（3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸
メチル；MGA）および(-)-ECg 並びに(-)-EGCg，さらには3,4-ジヒロドキシ安息香酸メチルには活性を示さず，興味深いことに，4-ヒドロキシ安息香酸エチル（E4HBA），4-ヒドロキシ安息香酸プロピル（P4HBA），
4-ヒドロキシ安息香酸ブチル（B4HBA）に対して活性を示した（図 2 ）。これら4-ヒドロキシ安息香酸エ
ステル類はパラベンと称され，抗菌剤として食品，
日用品，化粧品等に配合されている。糸状菌由来のパラベンエステラーゼは初めて見出され，本酵素をAoPrbAと名付けた9）。本酵素はパラベンを加水分解す
るが，フェルラ酸エステラーゼ活性やタンナーゼ活性は示さず，基質特異性の狭いエステラーゼであり，パラベンの一つであるブチル4-ヒドロキシ安息香酸エス
テルのカビに対する抗菌性は本酵素の作用により消失した（図 3 ）。
5 ． タンナーゼファミリーのユニークなモチーフ
フェルラ酸エステラーゼの触媒残基はSer，Asp，Hisのcatalytic triadで 構 成 さ れ， リ パ ー ゼ お よ び セ
リンプロテアーゼと同様の触媒機構で，その構造は
α/βヒドロラーゼフォールドを有している。最近，A.
oryzae 由来フェルラ酸エステラーゼ（AoFaeB）の結晶構造を明らかにした10）。本酵素の構造は触媒ドメイ
ンとlidドメインの 2 つのドメインから構成され，これまで報告のない大きなlidドメインと，触媒残基のSer，His 残基の隣のそれぞれのCys 残基がジスルフィ
ド結合を形成するユニークなモチーフを有することがわかり，CS-D-HCモチーフと名付けた。また，CysをAlaに置換した変異酵素は活性が1/1000程度に低下した。このモチーフはタンナーゼファミリーに共通して見いだされ，このファミリーのタンパク質に重要な構造の一つと推察される。
6 ． おわりに
本稿ではポリフェノールの利用に関わるタンナーゼ
やフェルラ酸エステラーゼの構造と機能について紹介してきたが，本酵素はバイオマスの効率的分解に寄与するとともに，食品素材の開発の面からも重要である
ことがわかってきた。麹菌ゲノム情報を基にした酵素の構造解析が一段と進み，機能との関連性が明らかに

図3

図2

α-ナ フ チ ル エ ス テ ル 類（C2-C10） お よ び パ ラ ベ ン（E4HBA, P4HBA，B4HBA）に対する比活性表2A. oryzaeに 対 す る ブ チ ル-4-ヒ ド ロ キ シ 安 息 香 酸(B4HBA)の 抗 微 生 物 活 性 に 及 ぼ すAoPrbAの 影 響 A;
B4HBA (1.0 μM), B; B4HBA (1.0 μM)+AoPrbA (5.0μg), C; B4HBA (1.0 μM)+AoPrbA (10.0 μg)をペーパーディスクに添加し，PD 寒天培地でA. oryzaeを30℃，
4 日間培養アミノ酸配列の類似性と 4 種類の桂皮酸メチルエステルに対する特異性に基づいたフェルラ酸エステラーゼの分類

7

されることにより，今後の応用展開が期待される。
最後に，本研究は東京大学大学院農学生命科学研究
科応用生命工学専攻・伏信進矢先生との共同研究によるものです。また，寄稿の機会を与えていただいた山形大学大学院理工学研究科・今野博行先生に感謝いたします。
1 ） Iibuchi, S., Minoda, Y. and Yamada, K., Studies on tannin
acyl hydrolase of microorganisms part Ⅲ . Purification of
the enzyme and some propertyes of it. Agric. Biol. Chem.,
32, 803-809 (1968).
2 ） Guglielmetii, S., Noni, I. D., Caracciolo, F., Molinari, F.,
Parini, C. and Mora, D., Bacterial cinnamoyl esterase
activity screening for the production of a novel functional
food product. Appl. Environ. Microbiol., 74, 1284-1288(2008).
3 ）Poquet, L., Clifford, M. N. and Williamson, G., Transportand metabolism of fer ulic acid through the colonicepithelium. Drug Metabol. Disposit., 36, 190-197 (2008).
4 ）Hatamoto, O., Watarai, T., Kikuchi, M., Mizusawa, K. andSekine, H., Cloning and sequencing of the gene encoding
tannase and a structural study of the tannase subunit from
Aspergillus oryzae. Gene, 175, 215-221 (1996).
5 ） 町田ら，タンナーゼ，その遺伝子及びタンナーゼの製造法，特許4370395（2009）．
6 ） Mizuno, T., Shiono, Y. and Koseki, T., Biochemical
characterization of Aspergillus or yzae native tannase
and the recombinant enzyme expressed in Pichia
pastoris. J. Biosci. Bioeng., http://dx.doi.org/10.1016/
j.jbiosc.2014.04.003
7 ） Lenfant, N., Hotelier, T., Velluet, E., Bourne, Y., Marchot,
P. and Chatonnet, A., ESTHER, the database of the alpha/beta-hydrolase fold super family of proteins: tools to
explore diversity of functions. Nucleic Acids Res., 41,
D423-429 (2013).
8 ） Koseki, T., Hori, A., Seki, S., Murayama, T. and Shiono,Y., Characterization of two distinct feruloyl esterases,
AoFaeB and AoFaeC, from Aspergillus or yzae. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 83, 689-696 (2009).

タンパク質間相互作用を阻害する
ペプチド医薬の開発
1 ． はじめに我々の体を構成する 1 つ 1 つの細胞の中には，酵素を含む無数のタンパク質が存在し，我々の想像の域を遥かに超える非常に複雑なネットワークにより細胞の機能を制御している。一方
で，酵素が活性化すべきでない尾㟢
拓時に異常に活性化したり，または活性化すべき時に不活性化したりなど，その制御が正常に保たれなくなると，神経変性疾患など多くの病変が引き起こされる。そこで以前より，特定の酵素を特異的に阻害する化合物の探索が盛んに行われてきた。その阻害剤の標的となる部位の多くは酵素の活性中心であるが，カルパインやカテプシン，カスパーゼ
といった多くの類似の分子種から成るスーパーファミ
リーを形成する酵素群に対しては，阻害剤の特異性が低いという傾向があった。また，細胞質とミトコンド
リア，細胞質と核，細胞質と小胞体などといった 2 つ
以上のオルガネラに，類似のまたは同種の酵素が存在する場合，活性中心を標的とした従来の阻害剤では両方の機能が阻害されてしまい，細胞が正常に機能していく上でむしろ不利益となる場合も多かった。例えば，Ca2＋依存性中性システインプロテアーゼであるカルパインの阻害剤では，ミトコンドリアに存在するカルパインだけでなく細胞質にあるカルパインも阻害されてしまうため，細胞の機能が破綻してしまうという懸念があった。そこで我々は，ある 1 つの酵素が分子シャペロンや足場タンパク質など別のタンパク質と結合して活性が制御されている場合，その相互作用を合成ペプチドによって競合的に阻害することによって活性を特異的に抑えることは出来ないものかと考えた。
本稿では，我々がこれまで明らかにしてきたミトコン
ドリアカルパインの機能とその特異的阻害法の原理，阻害ペプチドの探索法，細胞内への送達方法，網膜の視細胞変性に対するペプチドの効果について概説する。

9 ） Koseki, T., Mihara, H., Murayama, T. and Shiono, Y.,
A novel Aspergillus or yzae esterase that hydrolyzes
4-hydroxybenzoic acid esters. FEBS Lett., 584, 40324036 (2010).
10）Suzuki, K., Hori, A., Kawamoto, K., Thangudu, R. R.,
Ishida, T., Igarashi, K., Samejima, M., Yamada, C.,
Arakawa, T., Wakagi, T., Koseki, T. and Fushinobu, S.,
Crystal structure of a feruloyl esterase belonging to thetannase family: a disulfide bond near a catalytic triad.
Proteins, accepted.

8

券献献献鹸

兼献献献験

こせき たくや山形大学農学部食料生命環境学科
tkoseki@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp

2 ． ミトコンドリアカルパインとその生理機能
カルパインは活性化にCa2＋ を必要とする細胞内システインプロテアーゼで，基質分子を限定分解することで様々な細胞機能を調節する1）。哺乳類では14種類の分子種が存在し，μ-カルパインやm-カルパインなど
組織普遍的に存在するものと，カルパイン 3 など組織
特異的に存在するものがある。これら全てのカルパイ
ン分子種は細胞質にのみ存在すると考えられていたが，ミトコンドリアにもカルパイン様活性をもつプロ
テアーゼが存在するという知見がいくつか報告されていた。そこで我々は，ラット肝臓のミトコンドリアからカルパイン様のプロテアーゼを精製したところ，ミトコンドリアにも少なくとも 2 種のカルパイン分子が存在していることを明らかにした2-4）。その 1 つであるミトコンドリアµ-カルパインの生理機能を図 1 に示した。ミトコンドリアµ-カルパインは，ミトコンドリ
ア内のCa2＋ の上昇に伴って活性化し，基質となるアポトーシス誘導因子（AIF: Apoptosis-Inducing Factor）のN 末端を限定的に分解することによって，AIFをミトコンドリア内膜から切り離す。限定分解されたAIF（tAIF: truncated AIF）は，ミトコンドリアから細胞質，さらには核へ移行し，DNAaseを活性化させることによりDNAの断片化を誘導する。DNAの断片化が起こると細胞は死に至る。このAIFを介した細胞死は，網膜色素変性や虚血性脳疾患，アルツハイマー，心筋梗塞，シスプラチン誘導性腎障害などで起こると言われている。我々は，網膜色素変性モデルラットにおける視細胞変性の初期にミトコンドリアカルパインが活性化して，AIF 依存性の視細胞死が誘導されることを明らかにした5）。そこで我々は，ミトコンドリアカル
パインを特異的に阻害することによって視細胞変性を抑制しようと考え，ミトコンドリアカルパインの特異的阻害ペプチドの開発に着手した。
3 ． 合成ペプチドによる特異的阻害法の原理
ミトコンドリアµ-カルパインはERp57と呼ばれる分子シャペロンと結合している（図 2 ）。そこで我々は，カルパイン由来の合成ペプチドによりこの結合を競合的に阻害することを試みた。抗体と抗原の結合が抗体
認識部位のペプチドを作用させることによって解除さ

図1

ミトコンドリアµ-カルパイン依存的細胞死の機構

図3

れるという原理を基にしたものである。すなわち，ミトコンドリアµ-カルパインとERp57が結合している部
位に相同的な配列の合成ペプチドを作用させることによって，その結合を解除させ，ミトコンドリアµ-カル
パインを不安定化または不活性化させようとする試みであった。分子シャペロンと結合して存在する多くのタンパク質は，分子シャペロンと解離すると，正常に機能しなくなる場合が多いことからも，ミトコンドリ
アµ-カルパインを特異的に阻害するにはこの方法が最適だと考えた。
4 ． ミトコンドリアµ-カルパインを特異的に阻害するペプチドの開発
ミトコンドリアµ-カルパイン特異的阻害ペプチドの開発を始めようとした当初，ミトコンドリアµ-カルパ
インとERp57の結合部位はまだ解明されていなかった。しかしながら，細胞質 µ-カルパインとミトコン
ドリアµ-カルパインは構造維持ドメインのアミノ酸配列が一部異なっていることを示唆する実験データを得ていたため，おそらくこのドメインのどこかにERp57が結合しているのではないかと考えた。そこで，この構造維持ドメインのアミノ酸をN 末端側から20残基毎に分割し，赤色で示すように 3 残基ずつ重複させて，全部で14本のペプチドを合成した（図 3 ）。

図2

合成ペプチドによるミトコンドリアµ-カルパインの特異的競合阻害µ-カルパイン構造維持ドメインの部分ペプチド9

次に，どのペプチドがミトコンドリアµ-カルパインの活性を阻害するか試験管内で調べた結果，N 末端
から 2 番目と 9 番目のペプチドが活性を特異的に阻害することが分かった6）。さらに，この 2 種のペプチドをミトコンドリアµ-カルパインに作用させたところ，
ERp57との解離が誘導され，他のプロテアーゼにより分解されることも示された6）。続いて，活性阻害効果のあった 2 種のペプチドの位置を調べた（図 4 ）。N
末端から 2 番目のペプチドを青色， 9 番目のペプチドを黄色で示した。驚くべきことに，この 2 種のペプチドが由来する部位は，活性ドメインと構造維持ドメイ
ンに存在するアミノ酸の側鎖が塩架橋（Salt Bridge）を形成している立体構造上とても重要な部位であった。この塩架橋部位にERp57が結合して，ミトコン
ドリアµ-カルパインを安定化していることが示唆された。 2 種の合成ペプチドによりミトコンドリアµ-カル
パインとERp57の結合を解離させることに成功した。
5 ． 膜透過ペプチドの付加による細胞内への送達
ミトコンドリアµ-カルパインに対して阻害効果のあった 2 種のペプチドを，細胞内さらにはミトコンド
リアへ効率よく送達させるため，阻害効果のある領域
を20残基から10残基まで限定した。その過程で，N 末端側から 9 番目のペプチドは阻害効果を失ったため，
N 末端側から 2 番目のペプチドのみを選んで以後の

図4

カルパインの立体構造における活性阻害ペプチドの位置と活性阻害機構実験に使用した。まず，膜透過ペプチドをカルパイン
ペプチドのN 末端またはC 末端に付加して，ペプチドを効率よく細胞内に取り込ませようと試みた（図 5 ）。
HIV1-tatやオリゴアルギニンなどの膜透過性のあるペプチドを用いて，動物細胞へ特定のペプチドやタン
パク質などを導入する方法は確立されつつある7）。既に報告されている数種類の膜透過ペプチドを試した
結果，HIV1-tatをカルパインペプチドのN 末端に付加したものが，最も高い活性阻害効果を示した6）。培養細胞を用いて，実際にHIV1-tatを付加したカルパイン
ペプチド（Tat-µCL）が細胞内，さらにはミトコンド
リアまで送達されているのか確かめたところ，核およ
び細胞質，ミトコンドリアへ送達されていることが分かった。さらにラットを用いて硝子体投与または点眼投与を施したところ，視細胞を含む網膜の各細胞へ
Tat-µCLが送達されていることが確認された6）。
6 ． 網膜の視細胞変性に対するミトコンドリアµ-カル
パイン阻害ペプチドの効果
我々の以前の研究により，網膜の視細胞変性の初期に，ミトコンドリアカルパインが活性化し，AIF 依存性の細胞死を引き起こすことが示された5）。そこで，
網膜視細胞変性モデルラットでみられる網膜変性に対してTat-µCLが保護効果を示すか否かを調べた。視細胞変性モデルラットへTat-µCLを硝子体内注射または点眼投与したところ，視細胞変性が有意に抑制され，視機能の低下を抑えることができた6, 8）。従って，TatµCLは網膜視細胞変性に対する治療薬として期待されている。また，虚血・再灌流誘導性の網膜神経節細胞死に対してもペプチドの保護効果が示されたことか
ら，神経節細胞死が観察される緑内障に対しても治療効果を有する可能性が見い出された。さらに，ミトコ
ンドリアμ-カルパインやAIFが関与する虚血性脳疾患など網膜視細胞変性以外の多くの疾患に対しても治療効果を有する可能性が高いと考えられる。
7 ． おわりに
本稿では，合成ペプチドによりタンパク質 -タンパ
ク質間の結合を解除することによって，ある特定のタ
ンパク質の機能を特異的に阻害するという新たなペプ
チド医薬の概念を紹介した。この手法は，ミトコンド
リアカルパインに限らず，様々な疾患に関わる多くのタンパク質を標的としたペプチド医薬の開発に広く利用できると信じている。
本稿で紹介させて頂いた研究は，弘前大学農学生命科学部石黒誠一教授，岩手大学農学部山下哲郎准教授，弘前大学大学院医学研究科中澤満教授ならびに上野伸哉教授を始めとする多くの方々の御指導を賜りながら実施してきたものです。その方々に，この場をお借りして深く感謝申し上げます。また，このような寄稿の機会を与えて頂きました山形大学大学院理工学研究科の今野博行准教授に，心より御礼申し上げます。
参考文献1 ） Ono Y, Sorimachi H., Calpains: an elaborate proteolytic
system., Biochim. Biophys. Acta, 2012, 1824(1): 224-236.

図510

膜透過ペプチドHIV1-tatによる細胞内へのペプチド送達

2 ） Ozaki T, Tomita H, Tamai M, Ishiguro S., Characteristics

of mitochondrial calpains., J. Biochem., 2007, 42(3): 365376.
3 ） Ozaki T, Yamashita T, Ishiguro S., ERp57-associatedmitochondrial µ-calpain truncates apoptosis-inducing
factor., Biochim. Biophys. Acta, 2008, 1783(10): 1955-1963.
4 ） Ozaki T, Yamashita T, Ishiguro S., Mitochondrial mcalpain plays role in release of tr uncated apoptosisinducing factor from mitochondria., Biochim. Biophys.
Acta, 2009, 1793(12): 1848-1859.
5 ） Mizukoshi S, Nakazawa M, Sato K, Ozaki T, Metoki
T, Ishiguro S., Activation of mitochondrial calpain andrelease of apoptosis-inducing factor from mitochondria in
RCS rat retinal degeneration., Exp. Eye Res., 2010, 91(3):353-361.

MeAAをビルディングブロックとして通常のペプチド合成と同様に伸長反応を行うことである。保護 MeAAの合成は，古くから行われており2），一部は市販品として入手可能である。また，N-メチル化ペプチドの合成に適した縮合剤（PyBrop, CIP-HOAt, BEP/BEMTなど）3） が開発され，N-メチル化天然ペプチドの全合成研究を通じてその有用性が示されてきた。さらには，福山アミン合成を応用したoNBS-SPPS（oNBS＝2-nitrobenzenesulfonyl）も開発され，保護 MeAAを用意せずとも配列中の任意の位置にMeAAを導入したペプチドの合成が可能である4）。このようにN-メチル化ペプチドの化学は，合成手法の開発と共に日々進化してきた。本稿ではN-メチル化ペプチドの化学合成について筆者らの研究を交えながら紹介したい。

6 ） Ozaki T, Nakazawa M, Yamashita T, Sorimachi H, Hata
S, Tomita H, Isago H, Baba A, Ishiguro S., Intravitreal
injection or topical eye-drop application of a µ-calpain C2L
domain peptide protects against photoreceptor cell deathin Royal College of Surgeons＇ rats, a model of retinitis
pigmentosa., Biochim. Biophys. Acta, 2012, 1822(11):1783-1795.
7 ） Futaki S, Hirose H, Nakase I., Arginine-rich peptides:
methods of translocation through biological membranes.,
Curr. Pharm. Des., 2013, 19(16): 2863-2868.
8 ） Ozaki T, Ishiguro S, Hirano S, Baba A, Yamashita T, Tomita H, Nakazawa M., Inhibitory peptide of mitochondrialµ-calpain protects against photoreceptor degeneration inrhodopsin transgenic S334ter and P23H rats., PLoS One,2013, 8(8): e71650.

券献献献鹸

兼献献献験

おざき たく弘前大学大学院医学研究科
t-ozaki@cc.hirosaki-u.ac.jp

高度にN -メチル化された生物活性ペプチドの簡便合成法の開発
1 ．はじめにN-メチル化されたペプチド
は天然有機化合物中に多く見受けられ，多様な生物活性を示す。例えばシクロスポリン
A（CsA） は，N-メ チ ル ア ミノ 酸（MeAA） を 7 残 基 含 む
天然環状ペプチドであり，臓器移植時の拒絶反応の抑制を山田 圭一
はじめとして様々な自己免疫疾患の治療に用いられている。CsAのアナログ体であ るAlisporivir（DEBIO-025） は， 免 疫 抑 制 剤 と しての効果はないが抗 C 型肝炎ウイルス薬候補として 有 望 で あ り， 現 在 臨 床 試 験 が 行 わ れ て い る。 一方，生物活性ペプチドのN-メチル化アナログは，凝集阻 害や代 謝安定 性・ 脂 溶 性の 向 上 な どに 有 効であり， ペプチ ド創 薬 の 観 点 か らも 注 目を 集 めている1）。
N-メチル化ペプチドを合成する最も単純な方法は，

2 ． 位置選択的 N -メチル化を利用したペプチドの配座解析
種々のアミド化合物をDMF 中で過剰のCH3IとAg2Oを作用させると収率よくN-メチルアミドが得られる。
この方法は保護アミノ酸のN-メチル化にも適用でき，簡便に保護 MeAAが得られる5）。筆者の恩師である川井正雄先生らは，高分解能 NMRが十分普及していな
い時代にこの反応を生理活性ペプチドに適用し，得られたN-メチル化生成物のアミノ酸分析をもとに微量で配座解析を行うことができることを示した6）。この方法によりN-メチル化に抵抗するアミノ酸残基，すなわち分子内水素結合に関与するアミノ酸残基とNメチル化を受けるアミノ酸残基，すなわち溶媒に露出したアミノ酸残基を区別することができる。余談だが，本法は後にα, α- 二置換グリシン含有鎖状ペプチ
ドの配座解析にも利用されている7）。
このN-メチル化反応はプレパラティブスケールでも適用可能であり，β-シート型環状ペプチド抗生物質グラミシジンS（GS, cyclo(Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro)2）のbis-Boc 誘導体では分子内水素結合に関与しない
Orn 及 びD-Pheの 4 つ の ア ミ ド 水 素 が メ チ ル 化 さ れたtetra-N-methyl 体を収率良く与えた（図 1 ）。一方，
2 つ の 保 護 Orn 側 鎖 NHはN-メ チ ル 化 に 抵 抗 し た。
NMR 解析の結果，Orn 側鎖 NHとβ-ターンを構成す
るD-Pheのカルボニル基との間でi → i+2 型の分子内水素結合を形成しており，これがN-メチル化に抵抗する要因であると考えた8a）。また，筆者らはtetra-Nmethyl 体の単結晶の作成に成功し，X 線結晶構造（図2a）を得ることができた。その結果，Orn 側鎖の立体化学が変わり，i → i+2 型の水素結合がi → i-3 型になることも分かった（図 2 b）8b）。この研究が契機とな
り，筆者らはN-メチル化生物活性ペプチドの合成研究へと傾注していくこととなった。
3 ． 鎖状ペプチドへのMultiple N -methylation: シクロ
スポリンOの液相全合成
段階伸長法でN-メチル化ペプチドを合成する場合，
N-メチル基の立体障害に起因する縮合効率の低下が懸念されるため，縮合方法の選択が鍵となる。しかし，保護 MeAAが連続する配列を含むペプチドの合成において，縮合剤の工夫だけでは縮合効率の低下を克服できず，欠損ペプチドの副生が避けられなかっ11

た。筆者らは，これらの問題点を克服する手段としてペプチド鎖を構築してから分子内の全てのアミドを一挙にN-メチル化して完全 N-メチル化ペプチドを得る
方法（Multiple N-methylation 法）を提案した（図 3 ）。
この反応の基質となる非メチル化前駆体の合成には一
般的なペプチド合成法が適用できるので保護アミノ酸活性化時のラセミ化の危険性が低い。また，N-メ
チル基に起因する縮合効率の低下もないので，保護
MeAA 誘導体を 1 残基ずつ段階伸長する方法よりも効率的にMeAA 残基が連続する鎖状ペプチドを合成することができる。実際にシクロスポリンO(CsO) 中

図1

12のN-メチル化ペプチドセグメントBoc-MeLeu-MeLeuMeVal-MeLeu-OMeをH-Leu-OMeから全収率75％で合成した。Multiple N-methylationの反応条件を種々検討した結果，室温24時間で完全にN-メチル化するには1 残基あたりCH3Iが30当量，Ag2Oが 5 当量必要であった。 2 つめのN-メチル化ペプチドセグメントBoc-SarMeLeu-OHも同様の手法で合成した。 3 つめのN-メ
チル化ペプチドセグメントの合成はH-Ala-OBzlを出発物質として段階伸長法により行った。Boc-Val-OHと
H-MeLeu-Ala-OBzlの縮合はEDC-HOAt (0.1 eq.)で十分反応が進行し，収率84％でトリペプチドを与えた。こGS 誘導体の位置選択的 N-メチル化

図2a）tetra-N-methyl GS 誘導体のX 線結晶構造（アミドNH 以外の水素原子は省略している。点線は分子内水素結合を示している。Val 及びLeu の側鎖は簡略化のため省略している。），b）N-メチル化に伴うOrn 側鎖立体化学の変化

図3a）Na- 保護 MeAAの段階伸長によるN-メチル化ペプチドの合成，b）Multiple N-methylation 法によるN-メチル化
ペプチドの合成れらのペプチドセグメントをHATUで縮合し，接触水素化による末端保護基の除去と環化反応を経てCsOの液相全合成を達成した（図 4 ）9）。NMR 測定の結果，N-メチル基に由来する 7 つのシグナルと 4 つのアミド水素由来のシグナルを確認した。また，アミド水素の温度依存性を調べたところ，シクロスポリンAと同様の分子内水素結合の形成が示唆され，目的物が得ら

図4

図5れたことを確認した（図 5 ）。
4 ． 環状デプシペプチドへのMultiple N -methylation:
PF1022Aの液相全合成
PF1022Aは，強力な抗線虫活性を有するN-メチル
化環状デプシペプチドであり， 4 つのMeLeuと 2 つのD- 乳 酸（D-Lac） とD-フ ェ ニ ル 乳 酸（D-PhLac） かMultiple-N-methylation 法を利用したシクロスポリンOの液相全合成

シクロスポリンOの1H NMRスペクトル（抜粋）a）N-メチル基由来のシグナル, b）アミド水素由来のシグ
ナル

13

図6

a）PF1022Aの構造，b）非メチル化 PF1022Aに対するMultiple N-methylation，c）N-メチル化生成物の同定，HPLC 条件：カラムYMC-Pack Pro C4 (150×4.6 mmI.D.)，溶離液：70-100％ CH3CN(0.1%TFA)，流速 : 1 ml/min.，検出 : UV220 nm

ら 成 る（ 図 6 a）。 現 在，PF1022Aの 誘 導 体 で あ る
Emodepsideが安全性の高い動物用駆虫薬（商品名：
Profender）として市販されている。以前，著者らが文献既知の合成法（液相法）に基づき全合成を行った
ところ，N-メチル化ジデプシペプチドのセグメント
縮合の収率が著しく低く，PF1022Aの全収率はわずか2 ％であった。そこで，メチル化されていない環状ペプチド前駆体に対してMultiple N-methylationを行い，PF1022Aが合成できるかどうか検討した。
まず，メチル化されていない前駆体環状ペプチド（cyclo(Leu-D-Lac-Leu-D-PhLac)2） を 液 相 法 に て 合 成し，N-メチル化反応に付したところ，先のGS 誘導体の場合と同様に分子内水素結合に関与する 2 つのア
ミドはN-メチル化に抵抗し， 2 種類のジメチル体を与えた（図 6 b）。その後，鋭意反応条件を検討した
結果，鎖状前駆体を環化後精製せずにN-メチル化す
ると収率よく目的とするPF1022Aを与えることが分かった。この方法での全収率は52％であり，Multiple
N-methylation 法 の 有 用 性 の 一 端 を 示 す こ と が で き
た10）。
5 ． MeAA 残 基 が 連 続 す る 鎖 状 ペ プ チ ド の 合 成：Multiple N -methylationとマイクロ波固相合成の比較
近年，マイクロ波固相合成（MW-SPPS）を用いてN-メチル化ペプチドを合成する試みがなされてい る。Albericioら はFmoc-MeAA (3 eq.)をDIPCDI(3eq.), HOBt(3 eq.)で活性化させ，MW 照射下で35℃，
20分間反応させると縮合は完結し，純度よく完全メ
チル化された短鎖ペプチドを与えることを示した11）。
しかし，N 末端にMeVal 残基を持つペプチド樹脂に対するアシル化では，MW 照射による反応促進効果
は見られない。例えば，筆者らは以前 αvβ3-インテク
リンアンタゴニストであるCilengitide の鎖状前駆体（H-Asp(OtBu)-D-Tyr(tBu)-MeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH） を
14

MW-SPPSに て 合 成 し た。D-Tyr(tBu)-MeVal 間 の 縮合ではHATUを用いてもトリプルカップリングが必
要で，Aib 含有ペプチドのMW-SPPSで効果があった
COMU12） を用いた場合でもダブルカップリングが必要であった13）。また，MeValが連続するペプチドの合成はさらに困難を極める。筆者らはHATUを用いてMW 照 射 下（50 ℃，10分 間 ） でFmoc-MeVal-OHと
H-MeVal-Gly-(2-Cl-Trt)-resinを縮合させたが，トリプ
ルカップリングでも反応は完結しなかった。このようなMeVal 残基が連続するN-メチル化ペプチドの合成にはMultiple N-methylation 法が適している。一例として抗マラリア活性を示す海洋天然物由来リポペプチ
ドDragonamide A（図 7 a）14）の部分合成について述べる。Dragonamide Aは，MeVal 残基が 3 つ連続する配列を有している。本研究ではペプチド部分の合成にMultiple N-methylation 法を適用した。まず，非メチル化前駆体 Boc-Val-Val-Val-Phe-OMeを液相法で合成
後，DMF 中 室 温 でCH3I (120 eq.), Ag2O (20 eq.)と 反応させたところ，対応するN-メチル化ペプチドBocMeVal-MeVal-MeVal-MePhe-OMeを 定 量 的 に 与 え た。
C 末端メチルエステルをアルカリけん化後，混合酸無水物法よりアミド化し，目的ペプチドを全収率27％で得ることができた（図 7 b）15）。
6 ． 今後の展望
N-メチル化ペプチドの合成に関する最近の研究
例 に つ い て 紹 介 す る。Whiteら はAg2Oを 使 わ な いMultiple N-methylationによりN-メチル化環状ペプチ
ドライブラリーを構築し，ペプチドの膜透過性評価に応用した16）。この方法では樹脂上で直接 N-メチル化を行うことで効率良くライブラリーを構築することが可能であり，今後の展開が注目される。また，Danishefskyらはisonitrile 誘導体を用いてC 末端側へとペプチド鎖を伸長してN-メチル化ペプチドを合成する方法を開発し，冒頭で述べたCsAの液相全合成を

8 ） a) Kawai, M.; Yamamoto, T.; Yamada, K.; Yamaguchi, M.;
Kurobe, S.; Yamamura, H.; Araki, S.; Butsugan, Y.; Kobayashi, K.; Katakai, R.; Saito, K.; Nakajima, T. Lett. Pept.
Sci. 1998, 5, 5-12. b) Yamada, K.; Unno, M.; Kobayashi,K.; Oku, H.; Yamamura, H.; Araki, S.; Matsumoto, H.;
Katakai, R.; Kawai, M. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124,
12684-12688.
9 ） a)Yamada, K.; Endo, T.; Oku, H.; Katakai, R. Peptide Science 2004, Y. Shimohigashi (Ed.), The Japanese Peptide
Society, Osaka, pp591-594. (2005)
10）a）Nakatsu, S.; Yamada, K.; Oku, H.; Katakai, R. Peptide
Science 2006, H. Ishida & H. Mihara (Eds.), The JapanesePeptide Society, Osaka, pp 66-67. (2006), b） 山 田 圭 一，
中津信吾，奥浩之，片貝良一，「PF1022類の製造法」，

特許第4734656号（2011）
11）Rodríguez, H.; Margarita Suarez, M.; Albericio, F. J. Pept.
図7a）Dragonamide Aの構造，b）Multiple N-methylation法を利用したDragonamide A 部分ペプチドの合成達成した17）。化学合成以外では，フレキシザイムを利用した翻訳合成18） が注目されており，今後生物活性ペプチドのスクリーニングにおける強力なツールになるものと思われる。
本稿ではN-メチル化ペプチドの化学合成について
筆者らの研究成果を中心に紹介した。ここで取り上げた合成法を含め，N-メチル化ペプチドに対する関心が深まり，ペプチド創薬の発展に貢献することを願って止まない。

Sci. 2010, 16, 136-140.
12）Subiros-Funosas, R.; Acosta, G. A.; El-Faham, A.;
Albericio, F. Tetrahedron Lett. 2009, 50, 6200-6202.
13）Yamada, K.; Nagashima, I.; Hachisu, M.; Matsuo, I.;
Shimizu, H. Tetrahedron Lett. 2012, 53, 1066-1070.
14）a)Jiménez, J. I.; Scheuer, P. J. J. Nat. Prod., 2001, 64,
200-203.; b) McPhail, K. L.; Correa, J.; Linington, R. G.;
González, J.; Ortega-Barría, E.; Capson, T. L.; Gerwick, W.
H. J. Nat. Prod., 2007, 70, 984-988.
15）Yoshinari, T.; Yamada, K.; Oku, H.; Katakai, R. Peptide
Science 2006, H. Ishida & H. Mihara (Eds.), The JapanesePeptide Society, Osaka, pp 50-51. (2006)16）White, T. R. et al. Nat. Chem. Biol. 2011, 7, 810-817.

Chem. Int. Ed. 2013, 52, 254-269.

Chem. Soc. 2010, 132, 4098-4100.
18）Kawakami, T.; Murakami, H.; Suga, H. Chem. Biol. 2008,
15, 32-42.

やまだ けいいち
群馬大学大学院理工学府 分子科学部門
kyamada@gunma-u.ac.jp

券献献献鹸

参考文献
1 ） Chatterjee, J.; Rechenmacher, F.; Kessler, H. Angew.

17）Wu, X.; Stockdill, J. L.; Wang, P.; Danishefsky, S. J. J. Am.

兼献献献験

本稿で紹介した研究は，川井正雄 名誉教授，山村初雄 教授（名古屋工業大学大学院工学研究科），齋藤一樹 博士（東京大学大学院新領域創成科学研究科），
片貝良一 名誉教授（群馬大学工学部材料工学科），松尾一郎 教授，奥浩之 准教授（群馬大学大学院理工学
府分子科学部門），清水弘樹 博士，長島生 氏（産業技術総合研究所生物プロセス研究部門）を始めとする多くの方々のご指導とご協力を得て実施したものです。
お世話になった皆様並びに日夜研究に励んでくれた遠藤晃哉 氏，中津信吾 氏，吉成隆昌 氏にこの場を借りて厚く御礼申し上げます。また，本稿執筆の機会を与えていただきました山形大学大学院理工学研究科の今野博行 准教授に，心よりお礼申し上げます。

第51回ペプチド討論会
日時：2014年10月22日（水）～ 2014年10月24日（金）会場：徳島大学蔵本キャンパス 大塚講堂
主催：日本ペプチド学会
ホームページ：http://www.societyinfo.jp/jps51/
本文：詳細についてはHPをご参照ください。

2 ） Aurelio, L.; Brownlee, R. T. C.; Hughes, A. B. Chem. Rev.
2004, 104, 5823-5846.
3 ） El-Faham, A.; Albericio, F. Chem. Rev. 2011, 111, 65576602.
4 ） Miller, S. C.; Scanlan, T. S. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120,
2690-2691.
5 ） Olsen, R. K. J. Org. Chem. 1970, 35, 1912-1915.
6 ） Kawai, M; Nagai, U. Chem. Lett. 1977, 1397-1398.

問合先
住所：〒770-8505 徳島県徳島市庄町1-78-1
徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部
担当者名：大高 章
Tel: 088-633-7283
Fax: 088-633-9505
E-mail: aotaka@tokushima-u.ac.jp

7 ） Moretto, A.; Crisma, M.; Kaptein, B.; Broxterman, Q. B.;
Toniolo, C. Biopolymers (Peptide Science) 2006, 84, 553565.

15

第46回若手ペプチド夏の勉強会開催のお知らせ

編集後記（ごあいさつ）

2014年 8 月 3 日から 2 泊 3 日で，第46回若手ペプチ
ド夏の勉強会を京都府宮津市にて開催いたします。
今回の会場は，日本三景の一つ，天橋立にほど近い「京都府立青少年海洋センター マリーンピア」です。
若手ペプチド研究者からの発信を中心に，ペプチド研究の基礎からケミカルバイオロジー，創薬などの領域への広がりについて，活発な討論を通じて，今後のペプチド研究を牽引する若手研究者育成につながる勉
強会の準備を鋭意進めております。
現在までのところ（ 6 月10日現在），全国の40を超える研究室から150名にせまる参加予定のご連絡をいただいております。また，特別，依頼，一般講演などの口頭発表は30件前後，さらに40件を超えるポスター
発表申し込みをいただきまして，過去最大規模となる
勉強会になることが予想され，世話人一同，心より感謝致しております。
当日，皆様と天橋立にてお会いできることを楽しみにしております。

本年 4 月より広報担当理事として，ニュースレターの編集に携わることになりました。どうぞよろしくお願い申し上げます。引き続き日本ペプチド学会の学会誌として，会員の皆様にタイムリーで有益な情報をお届けしていきたいと思っております。本誌の制作では，各号毎に編集委員の先生が企画・編集を担当されています。そして，多くの先生のご寄稿によって成り立っております。本93号は山形大学大学院今野博行先生の多大なるご尽力により， 4 名の先生のご研究を掲載することができました。厚くお礼申し上げます。これからも会員の皆様の情報交換の場として，さらに日本ペプチド学会の活動の軌跡を残す場として，本誌の内容の充実を図っていきたいと思います。会員の皆様におかれましては，今後ともご理解・ご協力の程よろ
しくお願い申し上げます。
林 良雄

日時：2014（平成26）年 8 月 3 日（日）～ 5 日（火）場所：京都府立青少年海洋センター マリーンピア〒626-0068 京都府宮津市田井TEL: 0772-22-0501，FAX: 0772-22-0503
URL: http://www5.ocn.ne.jp/~marinpia/（北近畿タンゴ鉄道宮津駅下車，車で15分）
世話人：富崎欣也（龍谷大学理工学部）
臼井健二（甲南大学フロンティアサイエンス学部）（第46回若手ペプチド夏の勉強会ホームページ
http://www.usui-lab.com/peptide_summer46.html）
お問い合わせは，pepwakate46@gmail.comまでお願
いいたします。

PEPTIDE NEWSLETTER JAPAN
編集・発行 : 日本ペプチド学会〒 562-8686 箕面市稲 4-1-2㈱千里インターナショナル内
編集委員
林良雄（担当理事）（東京薬科大学薬品化学教室）
TEL・FAX 042-676-3275
e-mail: yhayashi@toyaku.ac.jp
日高 雄二（近畿大学理工学部）
TEL 06-6721-2332，FAX 06-6723-2721
e-mail: yuji@life.kindai.ac.jp
今野 博行（山形大学大学院理工学研究科）
TEL 0238-26-3131，FAX 0238-26-3131
e-mail: konno@yz.yamagata-u.ac.jp
松島 綾美（九州大学大学院理学研究院）
TEL 092-642-4353，FAX 092-642-2607
e-mail: ayami@chem.kyushu-univ.jp
小野 慎（金沢工業大学バイオ・化学部応用化学科）
TEL 076-274-9259（直通）e-mail: shinono@neptune.kanazawa-it.ac.jp（本号編集担当：今野博行）

16