ブレファリズマのシスト形態
６年Ｃ組

西本舞

指導教諭

櫻井昭

１．要約
ブレファリズマは、水田に多く生息している単細胞の繊毛虫である。この生物は、環境が悪化するとシストと呼ばれる休眠状態に変化する。しかし、ブレファリズマのシストについては詳しい研究が成されていなかったため、シストの形態を追及しようと試みた。そして光学顕微鏡・電子顕微鏡などを用いた観察から、シスト形態の一部を明らかにした。
また、観察結果をもとに、“シスト化”の過程について、一つの仮説を立てた。
キーワード

シスト、乾燥、水田、endcyst、ectocyst、コムシスト

２．研究の背景と目的「原生動物やごく下等な動物がからだの

通常型ブレファリズマとシストでは外形表面に厚い膜をつくり、一時的な休止状態が大きく異なる上に、「シストは乾燥に強に入ったもの」の総称をシストという。まい」ことで知られている。実際にシストをわりの環境変化に影響されて、シスト化・乾燥させてみると、シストの表面に細胞壁脱シスト化が誘導されると言われている。

が形成されているように観察された。乾燥繊毛虫の一種である「コルポーダ」のシに耐えるために、シストには特殊な膜が形ストについては研究が進んでいるが、ブレ成されているのではないかと考えた。そこ

ファリズマのシストについては研究報告がで、まずはシストの外形から観察を始め、少ない。

シストの乾燥に対する耐性と、膜構造の関係を探ることにした。
２－１． 基本事項（1）ブレファリズマ
赤色色素をもつ単細胞生物で、繊毛虫の一種である。野生では水田や沼地に生息し、環境の悪化によってシストを形成する。そ図１

通常型ブレファリズマの証拠に乾燥した田んぼの稲株には、シストが付着していることが多い。
本校では、500～1000ml フラスコ内で、バクテリアを餌に培養している。
（2）シスト

３．研究内容＜研究Ⅰ

細胞外形の変化＞

シスト化における外形の変化を明らかにすべく、光学顕微鏡で観察を行った。

点で止まった。結果、はっきりと２重の膜(１) 観察方法
ディプレッションスライド 6well に、①に分かれて見えた。

それぞれ 1ml の SMB を入れる。
②①の 6well それぞれに、通常型ブレフ
ァリズマを 1cell ずついれ、乾燥しないよう小箱に入れたのち、インキュベー
ター（15℃）内で保存する。

③

１日おきに、光学顕微鏡で細胞外形を観察する.

(２) 観察結果・考察
シスト化の過程は、外形の違いから大きく３つに分類できた。
.・１段階目（図２）

図３

シスト化

２段階目

図４

シスト化

３段階目

外形から「しずく形」と命名した。細胞質が凝縮を始め、口部は消失していた。繊毛は存在し、回転・前後運動が観察された。

＜観察Ⅱ
図２

シスト化

１段階目

・２段階目（図３）
細胞質がさらに凝縮して外形が球状に近シストの大核・小核の形＞

観察Ⅰにおいて、外形に大きな変化が生じたことから、遺伝子レベルで変化が起きているのではないかと考え、以下の観察を行った.

づいた。繊毛は存在するが、回転運動のみ(１)仮説観察された。

シストの大核には凝縮が生じ、シスト固・３段階目（図４）繊毛が消失して運動は停止した。そして有の遺伝子が活性化されている。
(２)観察方法

新たな膜が観察された。外側の膜を通常型ブレファリズマとシストの固定・

ectocyst、内側の膜を endcyst と呼ぶ。膜の染色は、以下の手順で、それぞれ容器を分間の空間は時間とともに広がるが、ある地けて行った。

●細胞の固定①

細胞を遠心機で集める②

細胞を固定させるプレパラートをアル
大核

コール消毒する
マイクロピペット（200μl）を 35μl③に設定し、①の細胞を顕微鏡で見なが小核ら確実に吸い取る④②のプレパラートの中央にのせる⑤

カルノア液を１、２滴落とす

⑥

乾燥させる

図５

通常型ブレファリズマの大核と小核※カルノア液で固定後、１ヶ月以内に DAPI染色を行う。
●脱色（ブレファリズマの赤色色素があると、DAPI 染色時に観察しにくいため）①

70％エタノールを容器にいれる②

固定した細胞がついたプレパラートを③

大核100μｍ

容器内に並べる

図６

プレパラート全体が浸るまで①を注ぎ(４)考察

通常型ブレは 1overnight、シストは 3overnight おく。

シスト化したブレファリズマの大核

シスト化の過程で著しい細胞質の凝縮がおこるため、大核もそれに従って折りたた●DAPI 染色まれたと考えられる。しかし、平面図では①

エタノールから取り出したプレレパラ

核サイズを詳しく検証できないため、核のートを約 10 分間乾燥させる凝縮が生じているかどうかの確認はできな顕微鏡で細胞のある場所を確認した後、かった。

②

プ レ パ ラ ー ト １ 枚 に つ き 約 10μl のDAPI をかける③④②の上からカバーグラスをかけ、その＜観察Ⅲ

細胞小器官＞

膜構造を調べるため電子顕微鏡でさらに縁にマニキュアを塗って密封する

詳しい観察を行った。

アルミホイルをかける(１)観察方法※完成したプレパラートを、蛍光顕微鏡で観察する。
(３)結果

●細胞固定
①

集めた試料をガラスチューブにいれ、水位を 500μl に合わせる

シストの大核は折りたたまれた状態で観② サンプルをドラフトに持っていき、グル察された（図５，６）。小核に変化は見られタルアルデヒド固定液を 500μl 加える

なかった。

③ ときどき混ぜながら、30 分放置する

④

ら１時間放置する

先を細くしたプラスチックピペットで上清を吸い取る⑫⑧～⑪の作業をもう一度繰り返す⑤

リンス液を 500μl 加え、混ぜる⑬

遠心機にかける⑥

細胞が沈殿した後、上清を吸い取る⑭

ドラフト内で上清を全量吸い取る⑦

オスミウム固定液を 500μl 加える⑮

新しい Spurr 樹脂を２、３滴加える⑧

時々混ぜながら、30 分放置する⑯

ビームカプセルに細胞懸濁液を移す⑨

細胞が沈殿した後、上清を吸い取る⑰

遠心機にかけて、カプセルの底に平均⑩蒸留水を 500μl 加えて混ぜる⑪

細胞が沈澱した後、上清を吸い取る

的に液を沈ませる⑱

Spurr 樹脂を加える（ここまでドラフト内で行う）●脱水・包埋⑲

チューブに 50%エタノールを 1000μl①

ドラフト内で、カプセルの９分目まで重合オーブンに入れ、70℃で８時間重合する

程度加える

●観察②

時々混ぜながら、20 分間放置する

・SEM 試料③

先を細くしたプラスチックピペットで①99%, 100%（２回）エタノールでの置換を、前述の通りに行う

回収する
70%, 90%, 95%, 99%, 100%エタノー②

amyl acetate を 1ml 加える

ルについても、①～③と同様に置換を③軽く攪拌し、５分間放置する繰り返す。

④

上清を半量捨てる※SEM（走査型）試料は 90%エタノール⑤

新しい amyl acetate を２倍量加えるの段階でストップし、冷蔵庫に保存する⑥

軽く攪拌し、20 分間放置する⑦

上清を全量捨てる

ルの置換を２回繰り返す⑧

新しい amyl acetate を 1ml 加える（以下 TEM 試料について）⑨

軽く攪拌し、20 分間放置する

試料をエッペンチューブに移し、100%⑩

上清を全量捨てる

エタノールを 500μl える⑪⑧～⑩を２回繰り返す

サンプルをドラフトに持っていき⑫

試料を臨界点乾燥器にかける

Sppur 樹脂を加え全量を 1000μl にす⑬

試料をイオンスタッパーコーティング④※TEM（透過型）試料は 100%エタノー

⑤⑥

処理する

る
⑦ 軽く混ぜた後、冷蔵庫で 1overnight お⑭

走査型電子顕微鏡に試料をセットし観察する

く⑧ 遠心機にかける・SEM 試料⑨ ドラフト内で、上清を半量吸い取る①

重合後の試料をカプセルから取り出す⑩ 新しい Spurr 樹脂を加えて全量 1000μl②

特殊カッターでスライスし、超薄切片をつくるとする⑪ 15 分置きにボルテックスで攪拌しなが③②を 3%ウラン水溶液とクエン酸鉛染

④

色液で染色する[シスト]

試料を透過型電子顕微鏡にセットし観・SEM

察する膜の表面が網目状の構造をしているよう(２)観察結果に観察された。繊毛はなく、バクテリアが試料には、通常型ブレファリズマとシストの混合液を用いたが、結果は別に記す。
[通常型ブレファリズマ]・SEM
表面はなだらかで、無数の小さな穴があ多く付着していた(図９)。
・TEM２層の膜(ectcyst, endcyst)に分かれて見えた(図 10)。細胞の内部から分泌物が放出されている(図 11)。

るように見えた(図７)。
・TEM
細胞の表面から、フィラメント状の物質（＝コムシスト）が分泌されていた(図８)。

図９

図７通常型ブレファリズマの細胞表面（SEM）

シストの細胞表面（SEM）

ectcystendcyst

図 10 シストの細胞表面（TEM）

図 11
シストの細胞 表面に
図８

通常型ブレファリズマの細胞表面（TEM）

見られる分泌胞

（３）考察観察した細胞の中には、実際にシスト化した細胞も多数見られたことから、観察しる。シストが特殊な膜構造を持つことで、長期間の乾燥を乗り切り、子孫繁栄に繋がったのではないか。

た通常型ブレファリズマはシスト化の準備

また、今回観察した japonicum 以外の種段階にあった可能性が比較的高いと言える。

や生息地域の異なるブレファリズマのシス

こう考えると、コムシストはシスト形成にト形態を比較すると、違いがみられる可能深く関係する物質であると考えられる。

性もある。

シスト表面にはバクテリアが付着していたことから、シストの膜には粘性があると

５．参考文献考えられる。

[1]「ENCYSTMENT AND EXCYSTMENT」

また、外形観察で観察されたシストの新[2]「 ENCYSTMENT-SPESIFIC mRNA IS

しい膜は、細胞内部からの分泌物によってACCUMULATE徐々に形成されたものと推測される。

CILIATE」

４．まとめ

CYSTSOFTHE

６．謝辞

ブレファリズマはシスト化に時間がかか貴重な時間を割いて協力して下さった奈

るため、リアルタイムでの観察はできなか良女子大学大学院 春本晃江教授、神戸大学った。よって立証はできないが、観察結果

理学部 州崎敏伸教授には深く感謝申し上よりシスト化の過程につい以下の①～⑤のげます。また、今回の観察を進めるにあた仮説をたてた。って、櫻井先生に多大なご指導を賜りまし①環境の悪化を感知するた。誠にありがとうございました。

②通常型ブレファリズマの細胞質が凝縮を始め、細胞表面から粘性のあるコムシストが放出される② 外形が球状に変化し、コムシストが繊毛や細胞膜に絡まる③ 繊毛の動きが妨げられ、次第に運動は停止に向かう④ 繊毛が消失する（基部はそのまま残る）⑤細胞内部からシストの膜の構成物質が分泌され、endcyst と ectocyst の２層にはっきりと分かれた状態になる
はっきりと分かったことは、「ブレファリズマのシストは２重膜構造をもつ」ことである。ブレファリズマが主に生息する田んぼは、季節によって水の有無が決まってい