日本家禽学会誌，53 : J 7-J 14，2016

Copyright ©2016, Japan Poultry Science Association

遠距離輸送した凍結始原生殖細胞の移植による比内鶏の機能的な配偶子の生産─高病原性鳥インフルエンザ発生時のリスク分散を想定して─
中村隼明1, 2*・力丸宗弘3*・高橋大希3・小松
1

恵4・高橋利清3・田上貴寛5

大学共同利用機関法人 自然科学研究機構 基礎生物学研究所，愛知県岡崎市明大寺町字東山 5-1 444-8787
2
独立行政法人 日本学術振興会 特別研究員（PD）
3
秋田県畜産試験場，秋田県大仙市字神宮寺字海草沼谷地 13-3 019-17014
秋田県南部家畜保健衛生所，秋田県大仙市富士見町 6-55 014-0011
5
国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 畜産研究部門，茨城県つくば市池の台 2 305-0901

本研究では，高病原性鳥インフルエンザ発生時のリスク分散を想定し，茨城県つくば市のサブバンクで保管した比内鶏の凍結始原生殖細胞（PGCs）を秋田県大仙市まで輸送した後，融解・移植による個体復元を試みた。東日本大震災の影響により凍結融解した比内鶏 PGCs の大部分を失ったものの，残りを 33 個の白色レグホーン胚へ移植することができ，このうち 19 個（雄 12 個，雌 7 個）がふ化し，8 羽（雄 7 羽，雌 1 羽）が生殖系列キメラニワトリであることを確認した。検定
交雑の結果から，凍結 PGCs 由来の後代産出率が高かった雄の生殖系列キメラニワトリ 2 羽と，雌の生殖系列キメラニワ
トリ 1 羽を交配したが，これらの組み合わせからは比内鶏を復元できなかった。代わりに，これら雄の生殖系列キメラニ
ワトリ 2 羽と，Rikimaru et al.（2014）において比内鶏の非凍結 PGCs の移植により作出した雌の生殖系列キメラニワトリ
2 羽と交配した結果，14 羽の比内鶏を復元することができた。性成熟に達した比内鶏 11 羽（雄 6 羽，雌 5 羽）のうち，ふ化日が比較的近い 7 羽（雄 3 羽，雌 4 羽）についてそれぞれ精液性状および産卵率を検査した結果，通常の比内鶏と同等の成績であった。以上より，本研究は遠距離輸送したニワトリ凍結 PGCs が機能的な配偶子へ分化することを初めて証明した。このことから，ニワトリ凍結 PGCs の保管とその遠距離輸送は，産業有用品種や希少品種の高病原性鳥インフルエ
ンザ発生時のリスク分散になることはもちろん，近年増えつつある遺伝子改変ニワトリの維持コスト削減や系統断絶事故のバックアップに加えて配布にも資するものと期待される。
キーワード : 遠距離輸送，生殖系列キメラニワトリ，凍結 PGCs，比内鶏，復元──────────────────────────

緒

これには広大な施設と多額の費用を必要とするうえ，感染症の流言行や自然災害の脅威に常に曝されている。特に高病原性鳥インフ

ニワトリは，肉および卵を継続的に生産するための家禽としてルエンザについては，アジア各国で頻繁に発生しており，国内に極めて重要であるのみならず，実験動物としての利用価値も非常

おいても多くの肉用および卵用鶏が殺処分されている。地鶏や銘に高い。特に我が国の畜産業では，全国各地の地鶏や銘柄鶏の作

柄鶏の原原種鶏が絶滅した場合，復活ができない，あるいは復活

出に様々な在来鶏（明治時代までに国内で成立，又は導入され定に長い年月を要することになる。また，原原種鶏の損失により地着したニワトリ 38 品種）が利用されており（社団法人日本食鳥協

域の肉および卵の生産が停滞するため，一次産業から六次産業を会，2007），それらを利用した肉用鶏の生産羽数は年間 841 万羽に含めると生産地域に及ぼす経済的損失は計り知れない。このたのぼる（農林水産省，2014）。また，食卵の差別化を図るため，卵め，原原種鶏や在来鶏を有する種鶏場では，生体のみならず細胞用としても在来鶏が多く利用されている。このことから在来鶏やレベルでのリスク分散が必要とされている。

それらを利用した商業用の系統は，地域の養鶏産業には欠かせな

ニワトリでは，精液の凍結保存は可能になっているものの，卵い貴重な遺伝資源となっている。

の凍結保存は技術的に不可能である。これに対して，胚発生過程

現在，家禽の遺伝資源は生体による系統維持が主流であるが，に出現する配偶子の前駆細胞である始原生殖細胞（PGCs）は凍結
保存することが可能であり，他のニワトリ胚へ移植することによ2015 年 8 月 10 日受付，2015 年 10 月 14 日受理
連絡者 : 田上貴寛
〒305-0901 茨城県つくば市池の台 2 農研機構畜産研究部門
Tel : 029-838-8624
Fax : 029-838-8624
E-mail : tagami@affrc.go.jp* 中村隼明と力丸宗弘は筆頭著者として同等の貢献をした。

り受精能を持つ配偶子へ分化することから（Naito et al., 1994a ;Nakamura et al., 2010a），雌雄両方に由来する遺伝資源を安全に長期間保存することができる。秋田県畜産試験場（以下，秋田畜
試）では，日本三大地鶏の一つである比内地鶏を生産するための比内鶏の原原種鶏を有しているため，将来的には秋田県のメイン
バンクおよび県外のサブバンクにて凍結 PGCs を保管することに

J7

日 本 家 禽 学 会 誌

53 巻

J 1 号（2016）

クライオワン，大阪）に移して専用ハードケース内に梱包後，鉄より，高病原性鳥インフルエンザ発生時のリスク分散を目指している。しかし，これまでにニワトリ凍結 PGCs を遠距離輸送し，道ならびに乗用車を利用して搬送した。具体的には，JR 常磐線

融解・移植によって個体が復元された事例はない。そこで本研究

ひたち野うしく駅から上野経由で秋田新幹線大曲（秋田）駅まで

では，高病原性鳥インフルエンザ発生時のリスク分散を想定し鉄道を利用し，研究機関と駅の間の移動には乗用車を利用した。

て，県外のサブバンクとして茨城県に所在する国立研究開発法人

搬送に要した時間は約 6 時間であった。秋田畜試では白色レグ

農業・食品産業技術総合研究機構・畜産草地研究所を設定し，同ホーンの種卵をふ卵器（P-008（B）型 ; 昭和フランキ）を用いて前所で採取・保管した比内鶏の凍結 PGCs を秋田県まで輸送した後述と同様の条件で 52 時間∼ふ卵した。卵殻の鈍端に極小の穴を融解・移植によって比内鶏を復元することができるか検討するこ

開 け た 後，鋭 端 に 直 径 1. 0-1. 5 cm の 窓 を 開 け た。実 体 顕 微 鏡とを目的とした。

（SZK12 ; オリンパス）下にて，マイクロガラスピペット（内径0.69 mm ; 外径 1.19 mm ; 先端角 20°; Drummond Scientific Co.）材 料 と 方 法を用いて白色レグホーン胚の背側大動脈から血液（3.5∼6 μL）を1． 種卵および供試動物除去した。この操作により，宿主胚の内在性 PGCs 数の減少が期

秋田畜試において維持している比内鶏および家畜改良センター

待される（Naito et al., 1994b）。比内鶏凍結 PGCs の融解は，液体

岡崎牧場より導入した白色レグホーンの種卵を供試した。なお，

窒素中から取り出した凍結チューブを 39.0℃の恒温槽へ浸漬して比内鶏の種卵は，秋田畜試（大仙市）から農業・食品産業技術総急速におこなった。凍結保護液を除去するため，10% ウシ胎児血合研究機構 畜産草地研究所（茨城県つくば市 ; 以下，「畜草研」）

清（Gibco/Invitrogen，Grand Island，NY，USA）を含む PBS（−）

まで輸送した。本研究における動物の取り扱いおよび飼養は，にて凍結融解した PGCs を洗浄し，5 分間遠沈した後（200 g，室「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン」（日本学術会議，

温），上 清 を 除 去 し た。細 胞 懸 濁 液 約 20 μL を プ ラ ス チ ッ ク

2006）および秋田県畜産試験場動物実験規定に則りおこなった。

ディッシュ上に滴下し，位相差顕微鏡（IX71 ; オリンパス）下に

2． 比内鶏の PGCs の分離および凍結保存て，凍結融解した比内鶏 PGCs をマイクロガラスピペット内に回本作業は，畜草研においておこなった。比内鶏の種卵のふ卵収した。回収した比内鶏 PGCs を約 100∼200 個ずつ，実体顕微は，ふ卵器（P-008B Biotype ; 昭和フランキ，埼玉）を用いて 39.0

鏡（SZK12 ; オリンパス）下にて，白色レグホーン胚の背側大動℃，相対湿度 50∼60%，転卵 1 時間あたり 1 回（転卵角度 90°）の脈より血液中へ移植した。卵白を 2∼3 mL 除去した後，卵殻鋭端条件でおこなった。発生段階 14∼15（Hamburger and Hamilton，部の窓をラップで覆い，38.5℃，相対湿度 50∼60%，転卵 1 時間あ1951）の胚を用いるために，輸送された種卵 118 個を 50∼54 時間

たり 2 回（転卵角度 30°）の条件にてふ化までふ卵した。

ふ卵した。実体顕微鏡（MZ75 ; Leica Microsystems，東京）下に

4． 検定交雑てマイクロガラスピペット（内径 0.69 mm ; 外径 1.19 mm ; 先端

性成熟した操作個体は，人工授精により通常の比内鶏と交配

角 20°; Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA）を用いて比し，それぞれ約 100 羽の後代の羽色を鑑別した。ドナーに用いた

内鶏胚の背側大動脈より採血し，Ca2 ＋および Mg2 ＋を含まな

比内鶏は，優性白色遺伝子座を劣性ホモ（i/i）で保有するために

い PBS（PBS（−））中に回収した。なお，回収した血液の性判別

羽色が茶色である。これに対して，宿主に用いた白色レグホーン

はおこなわず，PGCs の分離・凍結保存・移植については雌雄混在

は，優性白色遺伝子座を優性ホモ（I/I）で保有するために羽色がの状態でおこなった。血液からの PGCs の分離は，Nycodenz 密

白色である。したがって，検定交雑によって得られる羽色が茶色

度勾配遠心分離（Zhao and Kuwana, 2003）を一部改変した方法のヒヨコ（i/i）は比内鶏の PGCs に由来する後代であり，羽色が（Nakamura et al., 2010b）によりおこなった。ニワトリ PGCs は白色で小さな黒色の斑点があるヒヨコ（I/i）は宿主の内在性

位相差顕微鏡下で観察することにより，細胞の大きさや細胞質に

PGCs に由来する後代である（Rikimaru et al., 2014）。本研究で非常に多くの顆粒を含有するといった形態学的特徴の違いから赤

は，羽色が茶色の後代を産出した操作個体を生殖系列キメラニワ

血球と識別することができる（Fujimoto et al., 1976）。位相差顕微トリと判定した。

鏡（IX71 ; OLYMPUS，東京）下にて濃縮した細胞中から，マイ5． 比内鶏の復元

クロガラスピペット（内径 0.69 mm ; 外径 1.19 mm ; 先端角 20°;検定交雑の結果から比内鶏の凍結 PGCs 由来の後代産出率が高Drummond Scientific Co.）を用いて形態的に異常のみられなかっかった雄の生殖系列キメラニワトリ 2 羽（Z703 と Z718）と，雌た PGCs のみを回収した。回収した比内鶏 PGCs は，1.2 mL の凍の生殖系列キメラニワトリ 1 羽（Z707）を人工授精により交配

結チューブ（Nalgene, Rochster, NY, USA）内に準備した細胞凍結

し，後代を可能な限り得てその羽色を鑑別した。

保存液（セルバンカー 1 ; 十慈フィールド株式会社，東京）200 μL

続いて，前述の雄の生殖系列キメラニワトリ 2 羽（Z703 と中に懸濁した。凍結チューブはクライオ 1℃凍結容器（NalgeneTM

Z718）と，Rikimaru et al.（2014）において報告した凍結保存してCryo 1℃ Freezing Container ; Nalgene, Rochster, NY, USA）を用いない新鮮な PGCs を移植した雌の生殖系列キメラニワトリ 2 羽いて−80℃まで 1 分あたり 1℃ずつ冷却した後，畜草研の液体窒（B892 と B899 ; 比内鶏 PGCs 由来の後代産出率はそれぞれ 37.7%

素タンク中にて 1∼2ヶ月間凍結保存した（−196℃）。

と 71.7%）を人工授精により交配し，後代を可能な限り得てその

3． 凍結 PGCs の輸送および生殖系列キメラニワトリの作出

羽色を鑑別した。

秋田畜試にて凍結 PGCs から比内鶏を復元するために，畜草研

なお，羽色が茶色の後代については，比内鶏 DNA 識別マー

にて凍結チューブを凍結試料搬送容器ドライシッパー（DR-2DS ;カー（Rikimaru et al., 2014）を用いて DNA レベルでの鑑別もおJ8中村ら : 凍結・輸送 PGCs からの配偶子生産
いては，精液を希釈液で 100 倍に薄めた後，37℃に加温した測定

こなった。
6． 復元した比内鶏の飼養管理

専用のスライドグラスチャンバーに移し，精子運動解析装置

生殖系列キメラニワトリ同士の交配により復元した比内鶏の幼（SMAS ; 株式会社ディテクト，東京）を用いて評価した。

雛は，4 段式バタリーケージ（78.5 cm×73.0 cm×48.3 cm）で 4 週

結齢まで飼育した。その後，育雛用ケージ（90.6 cm×60.5 cm×60.5

果

1． 生殖系列キメラニワトリにおける比内鶏 PGCs 由来の後cm）に移して 17 週齢まで飼育した。18 週齢以降，雄は平飼い

代産出率

舎，雌は採卵用ケージ（22.7 cm×39.5 cm×45.5 cm）へ移して 60

畜草研にて採取した合計 9,446 個の比内鶏 PGCs（合計 10 バイ

週齢まで飼育した。
飼料は，0∼4 週齢まで幼雛用（ME，3,000 kcal/kg ; CP，24%），アル）を 1∼2ヶ月凍結保存した後，試験を実施するために秋田畜

5∼10 週齢まで中雛用（ME，2,850 kcal/kg ; CP，18%），11∼17 週

試へ搬送した。凍結融解後における比内鶏 PGCs の回収率は，齢まで大雛用（ME，2,800 kcal/kg ; CP，15%），18 週齢以降成鶏

65.5±4.1%（4 バイアル）であった。なお，移植当日東日本大震災

用（ME，2,850 kcal/kg ; CP，18%）を給与した。なお，18∼60 週の激しい揺れによって凍結融解した比内鶏 PGCs の大部分を失っ齢の期間では，明期を 16 時間に設定した。飼料と飲水は，試験期たため，残る 6 バイアルの回収率は計測できなかった。不特定数

間を通して自由摂取とした。

（約 100∼200 個）の PGCs を 33 個の白色レグホーン胚へ移植し7． 復元した比内鶏の精液性状および産卵率た結果，19 羽（雄 12 羽，雌 7 羽）がふ化し，性成熟に達した。検生殖系列キメラニワトリ同士の交配により復元した比内鶏のう

定交雑の結果，比内鶏の凍結 PGCs を移植した操作個体 8 羽（雄ちふ化日が比較的近い個体について，雄では腹部マッサージ法に7 羽，雌 1 羽）より茶色の後代が得られたことから，生殖系列キメより採取した精液中の精子濃度（百万個/mL）および精子運動率

ラニワトリであると判定した（表 1 および 2）。これら生殖系列キを調査し，雌では 21∼60 週齢におけるヘンディ産卵率および 4

メラニワトリにおける比内鶏の凍結 PGCs 由来の後代産出率は週間ごとの産卵率を算出した。なお，精子濃度と精子運動率につ

8.7±4.4%（最高 38.7%，最低 1.7%）であった。

表 1． 比内鶏の凍結 PGCs を移植した雄の操作個体と通常の雌の比内鶏の交配による検定交雑
キメラ ID

後代数

ドナー由来の後代数（茶色のヒヨコ）宿主由来の後代数（黒班のある白色のヒヨコ）

ドナー由来後代の割合
（%）

Z703
Z708

111

43
0

68
89

38.7

89

Z709
Z710
Z711

109
106
136

0
4
0

109
102
136

0.0
3.8
0.0

Z712
Z713
Z714

103
114
107
110
102
112
83

98
114
105
110

4.9
0.0
1.9

Z715
Z717
Z718
Z719*

5
0
2
0
4
6
8

98
106
75

0.0

0.0
3.9
5.4
9.6

*, Z719 は途中へい死

表 2． 比内鶏の凍結 PGCs を移植した雌の操作個体と通常の雄の比内鶏の交配による検定交雑ドナー由来の後代数（茶色のヒヨコ）宿主由来の後代数（黒班のある白色のヒヨコ）

108

0

116
118
121
106
121
105

0
0
0

108
116
118
121

0
2
0

106
119
105

キメラ ID

後代数

Z701
Z702
Z704
Z705
Z706
Z707
Z716

J9

ドナー由来後代の割合
（%）
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
1.7
0.0

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J 1 号（2016）

表 3． PGCs を移植した生殖系列キメラニワトリ同士の交配結果
キメラ ID雄

雌Z703（凍結）

Z707（凍結）

Z718（凍結）後代数

ドナー由来の後代数雑種と白色レグホーンのドナー由来の割合（茶色のヒヨコ）

後代数

（%）

17
3
41

0
1
12

17

B892（非凍結）*
B899（非凍結）*

2
29

0.0
33.3
29.3

Z707（凍結）

54

0

54

0.0

B892（非凍結）*
B899（非凍結）*

3

0

3

0.0

43

1

42

2.3

*, B892, B899 は Rikimaru et al.,（2014）において作出した雌の生殖系列キメラニワトリ

表 4． PGCs から復元した雄の比内鶏の精液性状
精子濃度（百万/mL）

精子運動率（%）

生殖系列キメラニワトリから得られた比内鶏（n＝3）

2,213±2,16469±26

比内鶏*（n＝4）2,262±1,004

77±16*, 2013 年生まれの比内鶏種鶏

表 5． PGCs から復元した雌の比内鶏の産卵成績
比内鶏 ID

週

齢

21∼24

25∼28

29∼32

33∼36

37∼40

41∼44

45∼48

49∼52

53∼56

57∼60

平均

C960
C990

0.0
0.0

25.0

28.6
64.3

53.6
57.1

28.6
64.3

0.0
50.0

0.0
0.0

0.0

25.0

0.0

17.9
32.1

C998
C919
平均
比内鶏*

0.0
14.3
3.6
4.4

10.7
71.4
33.0
20.5

53.6
64.3
52.7
34.1

57.1
60.7
57.1
40.0

7.1
35.7
33.9
37.5

0.0
39.3
22.3
25.9

0.0
53.6
13.4
38.1

0.0
14.3
3.6
32.1

7.1
39.3
57.1

16.1
33.2
25.0

57.1
40.2
27.6

64.3
3.6
29.5
25.4

41.4
28.9
28.5

*, 群飼ケージにおける比内鶏種鶏の平均産卵成績（2011 年∼2013 年）

2． 生殖系列キメラニワトリ同士の交配による比内鶏の復元

3． 復元した比内鶏の精液性状と産卵率

前述の検定交雑の結果から，比内鶏の凍結 PGCs 由来の後代産生殖系列キメラニワトリ同士の交配により復元された比内鶏出率が高かった雄の生殖系列キメラニワトリ 2 羽（Z703 と Z718 ;14 羽のうち，3 羽は育成過程でへい死し，11 羽（雄 6 羽，雌 5 羽）

比内鶏 PGCs 由来の後代産出率はそれぞれ 38.7% と 5.4%）と，本が性成熟に達した。復元した比内鶏のうちふ化日が比較的近かっ

研究において 1 羽のみ得られた雌の生殖系列キメラニワトリ

た 7 羽（雄 3 羽，雌 4 羽）について，それぞれ精液性状および産（Z707 ; 比内鶏 PGCs 由来の後代産出率は 1.7%）を交配したが，卵率を検査した。本研究において復元した雄の比内鶏の精液性状

これらの掛け合わせでは比内鶏を復元できなかった（表 3）。代わを表 4 に示した。復元した雄の比内鶏の精子濃度および精子運動

りに，前述の雄の生殖系列キメラニワトリ 2 羽（Z703 と Z718）

率はそれぞれ 2,213±2,164（百万個/mL）および 69±26% であり，と，Rikimaru et al.（2014）において報告した比内鶏の非凍結 PGCs

通常の雄の比内鶏（精子濃度 2,262±1,004（百万個/mL），精子運を移植した雌の生殖系列キメラニワトリ 2 羽（B892 と B899 ; 比

動率 : 77±16%）と同等の成績であった。また，復元した雌の比

内鶏 PGCs 由来の後代産出率はそれぞれ 37.7% と 71.7%）を交配

内鶏における 21∼60 週齡のヘンディ産卵率は 28.9±5.4% であした結果，3 通りの掛け合わせ（Z703 と B892，Z703 と B899，

り，通常の雌の比内鶏（28.5%）と同等の成績であった（表 5）。

Z718 と B899）から比内鶏を復元できた。比内鶏の復元率は，そ考れぞれ 33.3%（1/3），29.3%（12/41），2.3%（1/43）であった。比察

内鶏 DNA 識別マーカーによる解析の結果，これら復元個体の遺本研究は，比内鶏を地鶏の原原種鶏のモデルとして用いて，遠伝子型はすべて比内鶏のものと一致したことから，DNA レベル

距離輸送したニワトリ凍結 PGCs が融解・移植によって受精能をにおいても比内鶏であることが確認された（データ非表示）。

持つ配偶子へ分化することを初めて証明した。本研究では，茨城

J10中村ら : 凍結・輸送 PGCs からの配偶子生産
県つくば市（サブバンク）で保管した凍結 PGCs を秋田県大仙市

ES 細胞では，ガラス化法を用いることにより有意に生存率が向（メインバンク）まで搬送した後，雌雄両方の生殖系列キメラニワ

上する（Fujioka et al., 2004）。最近の研究において，ガラス化法

トリを作出することに成功した。この結果から，サブバンクにおはゼブラフィッシュやコイの PGCs の超低温保存に有効であるこける凍結 PGCs の保管は，高病原性鳥インフルエンザ等の感染症とが示された（Higaki et al., 2013 ; Kawakami et al., 2015）。また,発生時のリスク分散対策として現在最も有効な手段であると考えガラス化法はニワトリ 7 日胚生殖巣由来の生殖細胞の超低温保存にも利用可能であり（Kohara et al., 2008）, 凍結溶液や凍結容器等られる。

の条件を最適化することにより生存率の向上が期待される。

本研究では，遠距離輸送した凍結 PGCs を移植して作出した生殖系列キメラニワトリ同士の交配によって比内鶏を復元すること

生殖系列キメラニワトリ同士の交配により復元した比内鶏の精ができなかった。これは，作出された生殖系列キメラニワトリ 8

液性状および産卵率は，通常の比内鶏と同等の成績であった。復羽のうち雌は 1 羽のみであり，そのドナー PGCs 由来の後代産出元した雌の比内鶏の一部には卵を産まない休産期間が確認された率が 1.7% と低かったためと考えられる。主な原因として，凍結・が，これは比内鶏が他の品種や商業鶏と比較してクラッチ間の休融解した PGCs を計数している最中に東日本大震災が発生したた産期間が長い（Robinson et al., 1990 ; Chen et al., 2007）ことや，他

め，PGCs の大部分を損失したことに加えて，作業を中断したこの日本鶏と同様に季節繁殖性が強い（河野ら，1982）ため，ふ化とにより適切な発生段階で PGCs を移植できなかったことが挙げ

時期の違いによる影響を受けた可能性が考えられる。復元した雄られる。また，作業再開後も停電等による非常に困難な状況下での比内鶏の精子濃度および精子運動率は，正常な比内鶏と同等の移植したことも一因として挙げられる。一方で，Rikimaru et al.

成績であった。復元した雄の比内鶏の精子濃度（約 20 億/mL）は（2014）において作出したドナー PGCs 由来の後代産出率が比較一般的なニワトリ（30∼50 億/mL ; 家畜改良センター岡崎牧場，

的高い（37.7% と 71.7%）雌の生殖系列キメラニワトリとの交配で2006）と比較して低かったが，品種によって前述の濃度よりも低は，比内鶏を復元することができた。これらの結果から，凍結いことが報告されている（Lin et al., 2005）ことから，品種間差に

PGCs から効率的に個体復元するためには，ドナー PGCs 由来のよるものと考えられる。

後代産出率の高い生殖系列キメラニワトリを作出することが重要

ニワトリ遺伝資源を安全に長期間保存するためには，精液の凍となる。ドナー PGCs 由来の後代産出率の高い生殖系列キメラニ

結保存も重要である。精液と PGCs の両方を凍結保存することにワトリを作出するには，ドナー PGCs と宿主胚の性を一致する方より，雌の生殖系列キメラニワトリに凍結精液を人工授精するこ法，および宿主胚の内在性 PGCs を除去する方法が効果的であるとが可能になる。これにより，生殖系列キメラニワトリ同士の交（Nakamura et al., 2013a）。前者に関しては，異性の宿主胚へ移植

配よりも効率的な個体復元が可能になる。生体と凍結細胞を同じしたドナー PGCs は機能的な配偶子へ分化しない（Naito et al.,

施設に保管した場合，有事の際にこれらを利用できない可能性が1999 ; Tagami et al., 1997, 2007）ことから，雌雄の PGCs をそれぞある。リスク分散のためには，凍結 PGCs と凍結精液をメインバ

れ凍結保存することが望ましい。後者に関しては，PGCs が一過

ンクと，遠隔地のサブバンクの両方で保管する必要がある。この的に血中を循環する鳥類特有の特徴（Nakamura et al., 2007）を利ため，サブバンクとなる機関と連携を取り，凍結細胞を保管する用して宿主胚の血液を除去することにより PGCs を除去する方法

ための体制を整備することも重要である。現在，農業生物資源（Naito et al., 1994b ; Nakamura et al., 2010a）や，γ 線や X 線を宿

ジーンバンク（NIAS ジーンバンク，つくば）や大学連携バイオ

主胚に照射することにより PGCs を除去する方法（Carsience et

バックアッププロジェクトセンター（IBBP センター，岡崎）等のal.,1993 ; Nakamura et al., 2012）により，ドナー PGCs 由来の後代

機関にて所定の手続きを行うことにより凍結細胞や凍結精液の保産出率が向上した。また，アルキル化剤であるブスルファン（1，管が可能である。

4-butanediol dimethanesulfonate）を宿主胚に投与することによ

ニワトリにおいて雄の PGCs の in vitro 培養法が樹立されたり PGCs を除去する方法では，ドナー PGCs 由来の後代のみを産（van de Lavoir et al., 2006 ; Macdonald et al., 2010 ; Miyahara et

出する生殖系列キメラニワトリがコンスタントに作出された

al., 2014, 2016）ことにより，ニワトリにおいてもマウス同様の遺（Nakamura et al., 2010b）。これらの方法を利用して生殖系列キメ

伝子改変が可能になり，これまでに様々な遺伝子改変ニワトリがラニワトリを作出することにより，凍結 PGCs からの効率的な個作製されてきた（van de Lavoir et al., 2006 ; Macdonald et al., 2012 ;体復元が期待される。

Park and Han 2012 ; Glover et al., 2013）。このため，実験動物とし今後，凍結 PGCs の保管によるニワトリ遺伝資源のリスク分散てのニワトリの価値は一層高くなり，遺伝子改変ニワトリを用いを実施していくうえで，PGCs の凍結保存法の改善は重要な課題

た基礎および応用研究が世界規模で展開されることが予想されである。現在使用している凍結プロトコルは，手順が非常にシンる。これに伴って，遺伝子改変ニワトリの維持コスト削減や系統プルであり，様々なニワトリ品種やウズラにおいても融解後の回断絶事故のバックアップ，他研究機関への配布が重要になると考収 率 お よ び 生 存 率 が 安 定 し て い る（Nakamura et al., 2011,

えられる。ニワトリ凍結 PGCs の保管とその遠距離輸送は，産業2013b）。一方で，本法では PGCs の凍結・融解操作に伴うダメー

有用種や希少品種の高病原性鳥インフルエンザ等の感染症発症時ジにより，生殖巣への移住能や分裂能が低下する（Nakamura etのリスク分散になることはもちろん，遺伝子改変ニワトリの維持

al., 2011）。冷却速度や凍結保護剤等の条件を最適化することにコスト削減やバックアップに加えて配布にも資するものと期待さより，細胞内外の氷晶形成と高濃度の凍結保護剤によるダメージれる。

の低減が期待される。また，耐凍性が低いヒトを含む霊長類のJ11

日 本 家 禽 学 会 誌

謝

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文

J 1 号（2016）

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53 巻

J 1 号（2016）

Production of Functional Gametes Following Transfer of Frozen-thawed
Primordial Germ Cells of Hinai-dori Fowl after Long Distance Transportation―For Diversification of the Risk to Outbreaks ofHighly Pathogenic Avian Influenza―
Yoshiaki Nakamura1, 2*, Kazuhiro Rikimaru3*, Daiki Takahashi3, Megumi Komatsu4,
Toshikiyo Takahashi3 and Takahiro Tagami5
1

National Institute of Natural Sciences, National Institute for Basic Biology,
5-1 Higashiyama, Myodaiji, Okazaki, Aichi 444-8787, Japan
2

3

Research Fellow of Japan Society for the Promotion of Science (PD)Akita Prefectural Livestock Experiment Station, 13-3 Kaisonumayachi, Jinguji, Daisen, Akita 019-1701, Japan
4

Akita Prefectural Nanbu Livestock Hygiene Service Center, 6-55 Fujimi, Daisen, Akita 019-0011, Japan
5

Naro Institute of Livestock and Grassland Science, 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305-0901, Japan* Y.N. and K.R. contributed equally to this work.

This is the first successful report to produce functional gametes from cryopreserved chicken primordial germ cells(PGCs) after long distance transportation. PGCs of Hinai-dori fowl, a chicken breed that native to Hinai area in Akita,Japan, were transported from Tsukuba (Ibaraki, Japan : subbank) to Daisen (Akita, Japan : main bank), then demonstrated whether frozen PGCs could give rise to functional gametes after long distance transportation. Though a majorpart of frozen-thawed Hinai-dori PGCs had been lost due to the Great East Japan earthquake (March 11, 2011), theremaining could be transplanted intravascularly into recipient White Leghorn chicken embryos. Among 33 manipulated
embryos, 19 (twelve males and seven females) hatched, and eight (seven males and one female) were confirmed as
germline chimeras by test-cross analysis. Two male chickens with highest germline chimerism (Z703 and Z718) weremated with one female germline chimeric chickens but no Hinai-dori offspring were obtained from this combination.
Alternatively, 14 Hinai-dori offspring were regenerated by crossing these two male germline chimeras with two female
germline chimeras that had been received unfrozen Hinai-dori PGCs (B892 and B899 ; Rikimaru et al., 2014). Amongthem, 11 Hinai-dori offspring reached sexual maturity, tested seven birds (three males and four females) had normal
semen property or hen-day egg production, respectively. In conclusion, storage of frozen PGCs in subbank and subsequent transportation will be a powerful tool not only for diversification of the risk to outbreaks of highly pathogenic
avian influenza in poultry industry but also for cost reduction, backup and distribution of genetically modified chickens.
(Japanese Journal of Poultry Science, 53 : J7-J14, 2016)
Key words : frozen PGCs, germline chimeras, Hinai-dori fowl, long distance transportation, regeneration

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