大渡・牧野・松林・田畑：メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第１報)資料

メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第１報)−メタボローム解析による日本酒の品質評価技術について−
大渡康夫†・牧野１. 目正知§・松林
2.2

的和彦＊・田畑

光正＊

GC/MSによるメタボローム解析

2.2.1 試料の前処理 (誘導体化)｢メタボローム (＝ Metabolome)｣ とは, 代謝産物を前処理はMimuraらの方法に準じて行った14). 試料20μL意味する ｢Metabolite (メタボライト)｣ に, 全体を意味に内部標準物質のRibitol (0.2mg/mL水溶液) を60μL加するラテン語の接尾語 ｢ome (オーム)｣ が組み合わされえて混合し, 遠心式濃縮機 (VR-C36R, タイテック) をた造語である. ガスクロマトグラフ質量分析装置

用いて減圧しながら25℃, 2,000rpm, 10分間遠心した.

(GC/MS) を用いたメタボローム解析では, アミノ酸や糖,その後−80℃ディープフリーザーで30分間凍結し, 凍結乾有機酸, 脂肪酸などの代謝産物を網羅的に分析することが燥機 (FD-10BME, 日本テクノサービス) で一晩乾固した.

できる. これらは食品の味や栄養, 品質などに大きく関わ用事調製したメトキシアミン塩酸塩 (20mg/mLピリジンるため, 食品分野において, 近年メタボローム解析を活用

溶液, 富士フィルム和光純薬) を100μL加え, 超音波洗1)-6). また, 地方の特産品浄機を用いて残滓が分散するまで処理した. インキュベーの特徴づけや品質管理に活用する事例も報告されておター内に撹拌機 (TM-282, アズワン) をセットし, 30℃,した研究が飛躍的に増えている
7) -10)り, 島根県でもメタボローム解析技術を企業の技術支援に活かせるような取り組みが求められる.

1,200rpm, 90分間撹拌しながらオキシム化を行った. 続
いてN-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトア

一方, 日本酒は, 精米歩合や麹米の使用割合, 醸造アル

ミド (MSTFA) (富士フィルム和光純薬) を50μL添加し,コール添加の有無など ｢清酒の製法品質表示基準｣ に基づ

37℃, 1,200rpm, 30分間再度撹拌しながらトリメチルシ11)

き, 吟醸酒や純米酒などの区分に分類され , さらには原リル化を行った. 反応終了後, 遠心機 (CF16RX, 日立工

料米や製法の違いで多様なタイプのお酒が上市されている.

機) で15,000rpm, ３分間遠心して上澄みをGC/MS用のバ

日本酒に含まれる成分の数は, これまでに約300種類の化イアルに回収した. 誘導体化処理後の試料は分解されやす

合物が報告されているが12), この中から製品の特徴となるいため, 反応後ただちに分析に供した. なお, 各試料の前ものを見出すために, 一つずつ成分を調べることは, 理論処理はN＝３で実施した. また, 全５種類の試料を等量比的には可能でも現実的に不可能に近い. この課題に対して,で混合したものをQC (Quality control) 試料として用意

複数成分を網羅的に測定できるメタボローム解析技術が,し, 同様に前処理を行った.

酒質と成分の客観的評価法として適用され始めている13)-15).
そこで本研究では, 分類別に異なる日本酒を実試料として選択し, それぞれに特徴ある成分を捉えることを目的に,
GC/MSを用いたメタボローム解析による品質評価技術の確立の検討を行った.

２. 方
2.1

法

試料

県内の同一メーカーの市販酒で, 分類別に５点 (普通酒,本醸造酒原酒, 純米酒生, 特別純米酒, 純米吟醸酒) を選択し, 分析試料に用いた.

†食品技術科 (現：生物応用科),生物応用科 (現：食品技術科), ＊食品技術科

§―7―

表１

GC/MS測定条件

島根県産業技術センター研究報告
2.2.2 GC/MS分析

第56号(2020)

PCA) および階層的クラスター分析 (hierarchical cluster

GC/MS分析はMimuraらの方法に準じて行った14). 装置analysis; HCA) を実施した.

はISQ 7000シングル四重極 GC-MSシステム (Thermo

３. 結果および考察Fisher Scientific) を用い, 測定条件は表1に示す. データにバイアスがかからないように, 実試料の測定の順番はラ3.1

GC/MSよる日本酒の代謝物分析

ンダム化した. さらにMSの感度ドリフトを補正するため,GC/MSにより分析した各試料のトータルイオンクロマ

分析の前後および試料５回測定ごとにQC試料を挟みながトグラム (TIC) を図１に示す. この分析によりアミノ酸,ら測定を行った. また, 保持指標 (RetentionIndex) を糖, 有機酸などの成分が同時に多数検出され, デコンボリュー求めるためアルカン混合標準溶液 (C8-20, C21-40 Alkane

ション, アライメントなどのデータ処理により, 439個のstandard solution, Sigma Aldrich) を同じ条件で測定し成分由来のピークが確認された. 各ピークの保持指標とマた.

ススペクトルをライブラリー情報と照合することで76個の2.2.3 データ解析

代謝物を同定し, 未同定のピークについてはUnknownと分析データをnetCDFフォーマットに変換し, 津川らが開発したメタボローム解析用ソフトウェアMS-DIAL (ver.

して, その後の多変量解析に供した.
3.2

多変量 (高次元) のデータを２〜３次元に縮約し, 試料

3.96) により, ベースライン補正, ピーク検出, デコンボ
16)

主成分分析によるメタボローム解析

リューション, アライメント, 化合物同定を行った . ス

間の差異を可視化する解析の一つとして, 主成分分析

ペクトルライブラリーには, MSPフォーマットの ｢Osaka(PCA) がメタボローム解析においては有効な手法である.

Univ. DB

GC/MS分析で取得したデータ行列をPCAにより解析した(CPSil-8CB, Kovats RI, 430 records)｣ をPRI
17)

Meからダウンロードし, 化合物同定に用いた . 未同定結果, スコアプロット上で日本酒の種類ごとに分類するこのピークはNIST 11 MS スペクトルライブラリーのマスとができた (図２A). さらに, 分散分析 (ANOVA, pスペクトルとの照合により化合物を推定した. その後, 内<0.05) によるフィルタリングを行い, 群間で統計的有意部標準物質およびLOWESS法18) によりピーク強度を標準差がない成分は除去し, ピーク数を439個から158個に絞り化し, 得られたデータ行列を, Web解析ツールMetaboAn

込むことで試料間の差異をより明確に表すことができた19), 20). AutoScalingで正(図２B). 続いて, 試料中のどのような成分が影響してい規化した後に主成分分析 (principal component analysis;るのか, ローディングプロットにより確認した (図２C).

alyst 4.0に供し多変量解析を行った

図１

各試料のトータルイオンクロマトグラム―8―大渡・牧野・松林・田畑：メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第１報)

図２ 主成分分析(A) フィルタリング前スコアプロット, (B) フィルタリング後スコアプロット, (C) ローディングプロット
スコアプロットの楕円範囲は95％信頼区間を表す―9―島根県産業技術センター研究報告
純米酒生

第56号

(2020)

および純米吟醸酒は第１主成分 (PC１；横可視化するため, 試料に含まれる全成分を俯瞰して見るこ軸) の正負のスコアで分類され, それぞれに多くの成分がとができる. 図に示すとおり, 普通酒は5種類の中では成特徴的にプロットされていた. それに対し, 普通酒, 本醸分の存在量が最も少なく, 本醸造原酒と特別純米酒は成分造原酒, 特別純米酒は第２主成分 (PC２；縦軸) の正側の変動パターン (＝メタボロームプロファイル) が類似しに位置し, そのローディングプロットの結果から特徴づけていた. 一方で, 純米酒生る成分数が比較的少ないことが推測できた. このように,的多いものの, そのメタボロームプロファイルは他の試料主成分分析によるメタボローム解析で日本酒の分類が可能とは類似しておらず, 両者が試料間で異なる特性を示すこであることが示された.とが容易に推定できた.

3.3

階層的クラスター分析によるメタボローム解析と純米吟醸酒は成分量が比較

次に試料間で有意差がある成分のうち, 特徴的だったも階層的クラスター分析 (HCA) は, ピーク強度変動ののを抜粋して図４に示した. 純米酒生に特徴的多い成分

類似度をもとに試料間の距離を定義し, 距離が近いもの同としてCadaverine, Putrescineなどのアミン類が確認され士をクラスターで分類する手法である. 図３にHCAによた (図４A左, 中央). これらアミン類は微生物によるアる解析結果をヒートマップで示した. ヒートマップは, 色ミノ酸の脱炭酸反応によって産生される代謝物であり, 通の違い (赤色：多い, 青色：少ない) で各成分の存在量を常, 食品の腐敗生産物中に多く見出されるが, 発酵食品

図３ 階層的クラスター分析
縦軸は成分, 横軸は試料を示す. 赤色に近いほど平均値よりも高く, 青色に近いほど平均値よりも低いことを示す.

― 10 ―

大渡・牧野・松林・田畑：メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第１報)

図４ 各試料に特徴的な成分のピーク強度
１：普通酒, ２：本醸造原酒, ３：純米酒生 , ４：特別純米酒, ５：純米吟醸酒(A) 左：Cadaverine, 中央：Putrescine, 右：α-EG(B) 左：Glucose, 中央：Maltose, 右：Isomaltose(C) Pyruvic acid, 中央：Citric acid, 右：2-Isopropylmalic acid

(チーズ, 味噌, 醤油, ワイン, ビール) にも含まれてお21)

り , 日本酒では生(図４B). 一般に吟醸酒は糖の生産力を高めた吟醸用麹をのお酒に多いことが報告されてい原料に, 甘味を基調とした味わいの酒質に仕上げるため,る22). 今回の試料にアミン類が多く検出されたことは過去糖類などの成分が比較的に多くなる. 対照的に, 純米酒生の知見と一致する. さらに, 日本酒特有の機能性成分としはこれら糖類の存在量が試料間で最も低く, 酒質としてて注目されるEthyl-α-D-Glucoside (α-EG) が純米酒生は辛口タイプのお酒と推測された. 食品の品質を評価するで多く認められた (図４A右). α-EGは日本酒中に0.2〜

うえで単一の成分だけでなく複数の成分で評価することは0.7％含まれており, 即効性の甘味と遅効性で穏和な苦味極めて重要であり, メタボローム解析のような多成分一斉23)を持つ呈味成分であると報告されている . その機能性と分析法が有効である. 特別純米酒と本醸造原酒では,しては, ｢皮膚｣, ｢肝保護｣, ｢利尿・体重抑制｣, ｢腸内環Pyruvic acid, Citric acid, 2-Isopropylmalic acidを含む

24)境｣ などの分野で効果が評価されている . このように網有機酸類が類似の変動を示した (図４C). 日本酒中の有羅的な探索から思いもよらない成分が発見できることはメ機酸の多くは酵母によって作られることから25), この２種

タボローム解析の利点の一つと言える. 純米吟醸酒では,のお酒の醸造には同系統の酵母の使用の可能性が考えられGlucose, Maltose, Isomaltoseなどの糖類が多く存在した

た. さらに普通酒の場合, 標準より多めの醸造用アルコー― 11 ―

島根県産業技術センター研究報告
ルを添加し, 最終的に加水してアルコール度数を調整する

第56号(2020)

https://www.nta.go.jp/taxes/sake/hyoji/seishu/

ため, 成分全体の濃度が薄まる. つまり, メタボローム分

kokuji891122/03.htm. (参照：2019年９月１日)

析の結果は, 試料間の製造条件の違いを反映しており, 製12) 日本醸造協会. 醸造物の成分 (清酒編) . 1999, p.1-83.

造プロセスの検証などにも応用が可能と考えられる.

13) Sugimoto, M.; Koseki, T.; Hirayama, A.; Abe, S.; Sano, T.;
Tomita, M.; Soga, T. Correlation between sensory evalua-

以上のことから, GC/MSを用いたメタボローム解析は,

tion scores of Japanese sake and metabolome profiles.

通常の分析では長期間を要するような多成分の評価を, 短Journal of agricultural and food

期間で成し遂げることが可能であり, 尚且つ試料間の成分的特性の差異を把握するのに非常に有用な手法であること

chemistry. 2010, vol.58,no.1, p.374-383.
14) Mimura, N.; Isogai, A.; Iwashita, K.;, Bamba, T.; Fukusaki,が示された. 今後は日本酒だけに限らず, 島根県の特産品E. Gas chromatography/mass spectrometry based compo-も含めた様々な食品の分析にも応用していく.

nent profiling and quality prediction for Japanese sake.

文

Journal of bioscience and bioengineering. 2014, vol.118,

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― 12 ―造協会誌. 2000, vol.95, no.4, p.227-234.