［技術報告］

針葉樹バーク分解微生物の検索
山本忠*、小野寺和江**

針葉樹バークを堆肥化するため、リグニン分解微生物を検索した。リグニン分解微生物検索試
験は、市販の針葉樹バーク堆肥や漆チップの堆積されている土壌を分離源として行った。ダイオキシン分解菌の選択に利用されている色素を用いた方法で、色素を変色させる微生物がいくつか見出された。これらはリグニン分解微生物である可能性が高い。また、針葉樹バークの高速堆肥化について現場規模への準備試験として、10m3 程度の針葉樹バークで添加栄養条件の相違による比較試験を進めている。
キーワード：リグニン、分解、微生物、堆肥、針葉樹、バーク

Screening of Conifer Bark - Degrading Microorganism
YAMAMOTO Tadashi, ONODERA Kazue
The degrading microorganism was examined in order to decompose lignin. The lignindegrading microorganism retrieval test did the soil that conifer bark compost and Japaneselacquer chip of the marketing were piled up with the separation source. Somemicroorganisms were found in the selection which made the decomposition of the pigment
to be an index. And, the comparative test by the difference of addition nutritional factor of
the conifer bark of about 10m3 is advanced on the high-speed composting of the conifer barkas preparation test to the field scale.
key words : lignin, degrading, microorganism, compost, conifer, bark
１ 緒

言ない。

リグニンは木材に多く含まれ、その構造・強度を支え

岩手県は、多くの杉を生産しており、その際に皮の部る天然高分子成分として知られている。その分解されに分であるバークと呼ばれる部位の利用価値が低いため、くいという性質から、難分解性物質の代表とみなされて多くの製材所で処理に困っている。この杉バークを堆肥いる。生物的リグニン分解については、製紙工程への利に利用するための工夫が有限会社グリーン総業によりな用などの観点から広く研究されている。特に、ダイオキされてきた。しかし、杉バークの堆肥製造への利用は、シン分解と共通する反応があることから環境の視点での有機性の窒素を多量に添加しないと堆肥化するまでに広検討が進んでいる。1980 年代に白色腐朽菌がダイオキシ

葉樹バークの数倍の時間がかかることから、肥料化としンを分解することが報告 1）されてから急激に研究が進みて扱おうとする場合でも課題が多い。また、針葉樹は燃多くの分解微生物が報告されている。

料用にペレット化した場合でも灰分が多く出るため、灰今まで担子菌でリグニン分解について知られていることを割石は以下のようにまとめているの処理が課題であることから有効な利用方法の開発が期2）。リグニン分解待されている。今回、針葉樹バークの堆肥化で、有機性の初期段階に働く主要な酵素は、リグニンパーオキシダ廃棄物添加の効果をリグニン分解菌の分離源の視点で検ーゼ、マンガンオキシダーゼ、ラッカーゼであることが討したので報告する。

知られている。また、リグニン分解にはセルロース、グルコースのようなエネルギー源が必要で、酸化的に進行２し、二次代謝として発現、過酸化水素により促進され、２−１

実験方法
堆肥化試験に用いたバークおよび微生物細胞外活性であることが知られている。さらに、複雑な岩手県産の杉由来のバークを原料として使用した。対構造を有する芳香族高分子であるリグニンを分解する担照としてブナを中心とする広葉樹由来のバークを使用し子菌は、優れた芳香族化合物分解酵素群を有すると考えた。また、これらに添加する種菌と呼んでいる微生物は、られている。それに比べて、細菌によるダイオキシン分

有限会社グリーン総業（岩手県藤沢町）で従来菌の市販解はKlecka ら 3）によって報告されているもののまだ少菌を自社でトウモロコシとふすまベースの培地で拡大培＊＊＊

食品技術部、現在 企画情報部
有限会社グリーン総業

61岩手県工業技術センター研究報告 第１１号（２００４）

養して堆肥製造に使用しているものである。種菌試験区

は、変法 GAM 培地（日水製薬株式会社製）で脱酸素剤をの菌株は、メタン発酵残さ微生物群である。

用い、37℃、48 時間で測定した。

２−２２−６ リグニン分解菌検出用培地

バーク分解速度に与える栄養条件比較試験

現場での実施につながる規模で、バーク分解速度に与一次分離用の培地としては、橘らの方法 5）に準じてポテえる栄養条件比較試験を行った。窒素源として用いた鶏トデキストロース寒天培地に 0.03％の RBBR を添加して、糞は、養鶏場から分けていただいたものを使用した。窒オートクレーブ後平板培地にして使用した。培地の色素の素を総窒素で 0.5％として、投入鶏糞量を計算した。

変化は、植菌後 25℃で培養したプレートで、 2 日後、7 日後、14 日後に観察した。また、トリプトソーヤ寒天菌培地

表1 バーク分解速度に与える栄養条件比較試験の配合
バーク(kg)
試験区
名称記号

針葉樹 広葉樹

対照区

C1 1,000

従来区

C2 1,000

種菌
試験区

C3 1,000

窒素
添加区

C4 1,000

種菌(kg)なし

従来の種菌

でも 0.03％の RBBR を添加して、同様に行った。
２−７ セルロース分解菌検出用培地

窒素
メタン発酵
残渣

鶏糞(kg)

0

合計(kg)

一次分離用の培地としては、ポテトデキストロース寒天培地に 1％のセルロースパウダーを添加して、オートクレーブ後平板培地にして使用した。分解菌の存在は、培地の1,000

クリアーゾーンの形成を、植菌後 25℃で培養したプレート
10

1,010
100

窒素添加
C5 1,000
従来菌区

10

窒素添加
C6 1,000
新菌区

10広葉樹
対照区

B11,000

広葉樹
従来区

B21,0000

で、2 日後、7 日後、14 日後に観察した。針葉樹バークの堆肥化現場での管理を考えて、栄養源の少ない状況で生育1,010できる微生物を選択するため、ポテトデキストロース寒天

101,01010

1,0201.5％になるように調整したセルロース培地も作成した。ま101,020

た、トリプトソーヤ寒天菌培地でも、同様に行った。

培地の量を通常の 1/10、また 1/100 量とし、寒天濃度を２−８ キシラン分解菌検出用培地

1,00010セルロース分解菌と同様に行った。 一次分離用の培地としては、ポテトデキストロース寒天培地に 1％のキシラ1,010ンパウダーを添加して、オートクレーブ後平板培地にして

平成 14 年 9 月に、有限会社グリーン総業の敷地内の屋外使用した。分解菌の存在は、培地のクリアーゾーンの形成に積み上げ自然条件下で堆肥化を行った。温度は、おんどを、植菌後 25℃で培養したプレートで、2 日後、7 日後、とり Jr.TR52（株式会社ティアンドディ製）のセンサーを14 日後に観察した。針葉樹バークの堆肥化現場での管理を堆肥の山に 50cm 突き刺し検知・記録した。

考えて、栄養源の少ない状況で生育できる微生物を選択す

２−３ ダイオキシン分解標準微生物

るため、
ポテトデキストロース寒天培地の量を通常の 1/10、標準微生物は、ダイオキシン分解菌として知られている

また 1/100 量とし、寒天濃度を 1.5％になるように調整した

3 株を使用した。白色腐朽菌として NBRC 9791 Coriolus

キシラン培地も作成した。また、トリプトソーヤ寒天菌培versicolor、NBRC 30340 Coriolus versicolor、細菌として地でも、同様に行った。

は ATCC 13368 Bcillus megaterium de Bary を用いた。

２−９ 成分分析

２−４ 微生物培養液の吸光度測定

分析は次のとおり行った。窒素分析は、TECATOR 社

吸光度の測定は、吸光度計 UV200（島津製作所株式会社製ケルテックオートサンプラーシステム 1035 を用いて製）を用い、色素レマゾール ブリリアント ブルー−R測定した。試料約 1g を耐熱ビーカーに精秤して、105℃（RBBR）の吸収が大きい波長 595nm で測定した。10mlの送風乾燥機で 2 時間乾燥した。減少した重量を水分と容の L 字試験管に培地を 10ml 分注して、高通気性のシリして計算した。直接還元糖はソモギー変法で、pH は遠心コン栓をしてオートクレーブで 121℃、15 分の滅菌後、別チューブに取った試料 10g に精製水 10ml 加え振とう後途培養した微生物を植菌した。培養条件は、25℃で静置培ろ過し、pH メーターの電極を直接差し込み読みとった。

養とした。

有機態炭素及び硫黄は LECO SC144DR を用い燃焼法、

２−５ 微生物試験法

脂質はクロホルム・メタノール抽出法によって測定した。

衛生試験法・注解 4）に基づいて試験を行った。一般細菌

木材の高分子成分であるリグニン、セルロースは、木は、標準寒天培地（日水製薬株式会社製）を用いて 37℃、質科学実験マニュアル 6）に準じて測定した。リグニンの48 時間で測定した。生酸菌は、BCP 加プレートカウント

うち酸不溶リグニン成分については、硫酸分解、ガラスアガール（日水製薬製）を用いて、37℃、48 時間で測定しフィルターろ過により重量分析した。酸可溶性リグニン

た。大腸菌群は、デソキシコレート培地を用い（日水製薬

成分は、吸光度法（205nm）により測定した。

株式会社製）を用い、37℃、48 時間で測定した。嫌気性菌

62

針葉樹バーク分解微生物の検索

セルロースは、α-セルロースについては、硫酸分解、ガラスフィルターろ過により重量分析した。β-セルロー
微生物数 （ｌｏｇ１０ 個／ｇ土壌）

8

スは、α-セルロースのろ液に酢酸を加え加熱して結晶を形成させ、ろ紙で集めて重量測定した。
２−１０ 微生物分離源
リグニン分解菌などの分離源は、漆廃木材など特殊な土壌を含めて岩手県内で収集したものを用いた。
果

３−１ 微生物源の違いによるリグニン分解菌出現度合い6543210

別の微生物源の違いによる分析結果を図 1 に示した。
白色腐朽菌標準株のような強い色素変化を示すものは

高窒
素
高区
窒
素
従来菌区
高窒素
新菌区
広葉
樹
対照区
広葉
樹
従来区

(対照区

試験に用いた針葉樹･広葉樹別、接種微生物群、養分添加

従来区
種菌
試
験区

３ 結

7

試験区

指標とする変色は赤色化するものと、緑色化するものがあ変色(色素変化）無変色(色素変化なし）った。ダイオキシン分解で知られた白色腐朽菌の 2 株は、ポテトデキストロース培地の色素 RBBR を赤色化させた。
一方、細菌 ATCC 13368 Bcillus megaterium de Bary は、透明化(色素分解）

図1 針葉樹バーク堆肥製造における分解酵素生産菌の動向

周辺を緑色化した。多くは得られなかったが、色素を変化させる微生物が色を変化させない普通の微生物の数％程とした堆肥のリグニン及びセルロース成分を試験 5 ヶ月後度出現し、かなりの割合で見いだされた。ただし、鶏糞の試料で分析したものを表 2 に示した。

で窒素添加し、メタン発酵残渣を微生物源とした区では、３−３ 微生物による色素分解の変化

色素を変化させるような微生物を見いだすことはできなカビの培養でよく利用される培地で、窒素があまり高くかった。

ないポテトデキストロース培地で培養した微生物のこの試験のほかに、漆廃木材置き場土壌など県内の幾RBBR 3-3 色素分解の変化を図 2 に示した。ここでは対つかの土壌から色素変化を指標として微生物の分離を行照とした NBRC 30340 の変化が大きかった。細菌が生育った。そこで得られた色の変化の強い株を経時的なしやすい窒素の多い培地であるトリプトソーヤブイヨン培

RBBR 色素分解試験に用いた。

地での RBBR 色素の吸光度の経時変化を図 3 に示した。こ３−２ 堆肥成分の比較

こでは、選択した Kenkyou b1、Kenkyou b2、Japan a、

試験 5 ヶ月後の堆肥の基本成分及び今回検討の主な対象

表2

Coniffer c の変化が大きかった。

発酵6ヶ月後の肥成分表（乾物あたりの％、イタリックは各成分の内訳）

酸可溶性 ホロセル
リグニン ロースa- セルロース

ß- セル
ロース

? - セル
ロース

CN比

脂質

Ｓ

a-1 対照区

2.41 36.65 15.20

1.11

0.18

41.32

0.81

45.92

28.43

4.93

12.55

a-2 従来区

3.53 38.69 10.96

2.47

0.21

43.68

0.79

44.88

27.49

5.00

12.39

a-3 種菌試験区

8.74 34.96

4.00

1.18

0.30

37.18

1.05

47.34

27.95

5.07

14.32

a-4 窒素添加区

2.36 37.56 15.95

0.98

0.1641.27

0.60

47.66

28.77

5.32

13.56

記号内容

ＮＣ

リグニン

a-5 窒素添加従来菌区 10.56 39.36

3.73

1.00

0.25

38.44

1.46

45.40

27.39

5.35

12.66

a-6 窒素添加新菌区

7.61 36.81

4.84

1.27

0.23

39.71

0.90

45.63

30.05

6.00

9.57

b-1 広葉樹対照区

3.08 37.89 12.30

1.62

0.15

39.29

1.54

53.15

28.56

9.26

15.32

b-2 広葉樹従来区

4.93 39.03

7.92

2.51

0.15

40.84

1.64

53.58

26.39

6.28

20.90

t-1 屋外新菌区

7.91 37.13

4.69

0.81

0.20

41.23

1.14

40.68

28.37

5.08

7.23

a-0 針葉樹原料

2.09 41.03 19.620.73

0.21

37.08

0.58

47.39

30.35

4.22

12.82

b-0 広葉樹原料

2.65 42.73 16.15

2.76

0.13

32.04

1.33

49.19

30.12

5.1713.963

岩手県工業技術センター研究報告 第１１号（２００４）

0.51024681000-1

吸光度の変化

吸光度の変化

0-0.5-1.5-2-2.5-34

68

10-2-3-4

日数(日）

-5

bl(PD+RBBR)NBRC 9791

NBRC 30340

Kennkyou b 1

Kennkyou b 2

Ｊａｐａｎ aConiffer c

ATCC 13368

Coniffer C-1

bl(PD+RBBR)

日数(日）
bl(SCD+RBBR)NBRC 30340
Kennkyou b 2
Coniffer c
Coniffer C-1

図2 ポテトデキストロース培地でのRBBR色素の変化
３−４2-1NBRC 9791
Kennkyou b 1
Ｊａｐａｎ aATCC 13368

図3 トリプトソーヤブイヨン培地でのRBBR
色素の変化

セルロース分解菌の選択

ポテトデキストースをベースとした栄養成分の濃度の用いた微生物源の中では、新鮮な抜根材を砕いたものか違いによるセルロース分解菌の検索の結果を表 3 に示しら多く検出できた。なお、栄養成分濃度の影響は、標準た。用いた微生物源の中では、新鮮な抜根材を砕いたもで用いられる濃度で分解菌の発現が多く見られた。のから多く検出できた。なお、栄養成分は、標準で用い４られる濃度での発現が多く見られた。
３−５考

察

今までに見出されているダイオキシン分解菌は、白色

キシラン分解菌の選択

ポテトデキストースをベースとした栄養成分の濃度の腐朽菌がほとんどであり、生育速度に問題があり、類似違いによるキシラン分解菌の検索の結果は表 4 に示したの分解機構をもっているリグニン分解への微生物によるように、セルロース分解菌の場合と同様な結果となった。

実用化研究の幅を狭めていた。今回、リグニン分解の可能性のある細菌と考えられる微生物が簡単に見出された

表3

意義は大きい。ただし、それらの微生物は指標色素の分微生物分離源のポテトデキストロースをベースとしたセルロース分解菌の出現頻度の比較

解力が弱く、実用化のためには、さらに選択方法の検討を進める必要がある。

（土壌1gあたりの106培地でのコロニー数）

培地条件
微生物源

微生物分離源のポテトデキストロースをベースとしたキシラン分解菌の出現頻度の比較

1％

培地中のセルロース濃度
PDA
標準量（1/1）

表4（土壌1gあたりの106培地でのコロニー数）

培地中のキシラン濃度 1％

PDA
PDA
極薄薄め（1/100（1/10））

微生物源

培地条件 PDA
標準量（1/1）

PDA
薄め（1/10）PDA
極薄（1/100）

針葉樹バーク堆肥（開始時）

200

針葉樹バーク堆肥（開始時）810

針葉樹バーク堆肥
（1年後）

100

針葉樹バーク堆肥
（1年後）

200

針葉樹バーク堆肥（完熟製品）

100

針葉樹バーク堆肥（完熟製品）

300抜根材チップ
（開始時）

152

1抜根材チップ（開始時）

25

52抜根材チップ（1年後）200抜根材チップ
（1年後）

720

PDA:ポテトデキストロースアガー

PDA:ポテトデキストロースアガー

64

針葉樹バーク分解微生物の検索

白色腐朽菌は、培地に窒素が多いとダイオキシン分解

本研究は、平成 14 年度の基盤的先導的研究事業でおこ酵素を生産しなくなるとされており、今回の RBBR 色素ない、一部をテクノブリッジ推進事業の研究として、平を指標とする L チューブによる培養試験でも、白色腐朽成 14〜15 年度に実施した。最後になりましたが、本研究

菌はテトデキストロース培地では、色素分をよく分解すを進めるにあたり、多くの御配慮をいただいた有限会社

るが、窒素の高いトリプトソーヤブイヨンではほとんどグリーン総業代表取締役熊谷勝氏の御支援に感謝いたし分解しなかった。このことは、針葉樹バークを畜舎の敷ます。

き藁とした場合、堆肥化過程でリグニンの分解が期待出来ないことになるため、実用化を目指してリグニン分解

文献1）J. A. Bumpus, M. Tien, D. Wright and S. D. Aust：

酵素生産の条件をさらに検討したい。ただし、堆肥の高Science,228,1434-1436（1985）

速製造視点では、リグニン分解にこだわる必要はなく、

2）片山義弘、桑原正章、林隆久編：木材科学講座 11 バ

高窒素で針葉樹バーク堆肥を製造できることを考慮しなければならない。針葉樹バークの堆肥化の際、熟成不十イオテクノロジー：p105、海青社（2002）
3 ） Klecka, G. M. and Gibson, D. T. ： Biochem.

分な針葉樹バークが水をはじくことやテルペン成分が微J.,180,639-645（1979）

生物の生育の阻害因子となる 7）などの問題点が解決されれば土壌改良材としては十分利用できる可能性が高いの

4）日本薬学会編：衛生試験法・注解,金原出版（1990）

で、その面での検討も進めたい。

5）橘燦朗、大川浩樹、伊藤和貴、沖妙、平林達也：

なお、リグニンに比べてはるかに分解速度が速く、ま紙パルプ技術協会誌：50、1806-1815（1996）

たセルロースに比べても微生物に利用されやすく、成分

6）日本木材学会編：木質科学実験マニュアル：p97、文としても含有率の高いヘミセルロースの代表であるキシ永堂出版（2000）
7）今村博之、岡本

ランの分解菌の選択を試みた。窒素成分の少ない培地で一、後藤輝男、安江保民、横田徳郎、生育するキシランの高速分解菌を選択することで、針葉善本智知孝編：木材利用の科学：p97、文永堂出版

樹バークの高速堆肥化が可能となると考えている。

（2000）

65