S6-23 生物学的評価に関する地盤環境のISOについて○古川靖英1・中森泰三2・ISO/TC190部会1
1土壌環境センター・2横浜国立大学大学院環境情報研究院
1.はじめに国際標準化機構ISO (International Organization for Standardization)の技術委員会への日本からの参加は、自動車や鉄鋼などの産業界を中心として多岐にわたっており、活発な提案やJIS規格との整合性調整がなされている。第 190 技術委員会（Technical Committee190, ISO/TC 190）は、地盤環境に関わる国際標準の策定・改定を行っており、日本からは約40名のエキスパートが登録されている。この中の第4小委員会（Sub Committee 4“Biological methods”, SC4）へは、23ヶ国から計約90名のメンバー（うち、日本からは7名）が登録され、「土壌環境分野の生物学的手法の標準化」を目的とし、議論を行っている。表-1に国際標準の段階ごとに、現在のSC4で主に審議されているドラフトを示す。
表 1 ISO/TC190 SC4で主に審議されているドラフト
審議段階

ドラフト名（原文）概要（和訳）

ISO規格化済Soil quality–Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia
土壌汚染物質によるトビムシ（Folsomia candida）の繁殖阻害
ISO 11267candida) by soil pollutants
ISO規格化済Soil quality–Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus 汚染物質がヒメミミズ類に与える影響 繁殖影響評価
ISO 16387sp.) – Determination of effects on reproduction
ISO規格化済Soil quality－Assessment of genotoxic effects on higher plants - 高等植物に対する遺伝毒性の評価 Vicia faba小核試験
Vicia faba micronucleus test
ISO 29200
FDIS ス テ ー ジ ISO/FDIS Soil quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia汚染物質がミミズ（Eisenia fetida）に与える影響 野外における影響評
11268-3fetida) – Part 3: Guidance on the determination of effects in価
field situations
FDIS ス テ ー ジ ISO/FDIS Soil quality – Method to quantify the abundance of microbial
土壌から直接抽出されたDNAのリアルタイムPCRによる微生物群集の
17601
communities from soil DNA extracts
定量
DIS ス テ ー ジ ISO/DIS Soil quality – Method for testing effects of soil contaminants on 土壌汚染物質が土壌生物の摂食活動に与える影響の評価 ベイト・ラミ
18311
the feeding activity of soil dwelling organisms – Bait-lamina test ナ試験
DIS ス テ ー ジ ISO/DIS Soil quality – Quality of solid samples – Solid contact test using Anthrobacter globiformis を用いたデヒドロゲナーゼ活性を用いた個体
接触試験
18187
the dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis
DIS ス テ ー ジ ISO/DIS Soil quality – Determination of the effects of pollutants on
汚染物質が高等植物の発芽と初期生長に与える影響の評価
18763
germination and early growth of higher plants
NWIP ス テ ー ジ ISO/NP Soil quality – Measurement of enzyme activity patterns in soil
マイクロプレートでの比色基質法を用いた土壌試料の酵素活性パター
20130
samples using colorimetric substrates in micro-well plates
ンの計測
NWIPステージ
ISO/NP 20131-1

Soil quality – Easy laboratory assessments of soil denitrification, 簡易の実験室での土壌の脱窒能評価手法 土壌脱窒酵素活性a process source of N2O emissions – Part 1: Soil denitrifying
enzymes activities
NWIP ス テ ー ジ ISO/NP Soil quality – Easy laboratory assessments of soil denitrification, 簡易の実験室での土壌の脱窒能評価手法 亜酸化窒素削減の土壌
20131-2
a process source of N2O emissions – Part 2: Assessment of the キャパシティ
capacity of soils to reduce N2O

2.ISO/TC190 SC4の概況
本小委員会に関わる土壌の質は、その土壌に生息している生物の特徴、あるいは、土壌に実験的に投入された生物の反応から評価されている。本小委員会では従来から、生物相調査のためのサンプリング方法や生物の生存、生長、繁殖といった数量（個体数・バイオマス）に関わる項目への影響評価試験方法の規格化が審議されてきが、近年では以下の点が議論されるようになってきている。
○機能の種類や機能する程度を指標とした評価手法の提案
例として、SC4 WG4の「ISO/DIS 18311」があげられる。本規格は土壌小型節足動物（主に植物遺体や微生物を摂食する）の摂食活動の程度を評価する手法に関するものである。有機物の消費速度や微生物により消費される速さに関係している。
○既存の規格における適用対象地域の拡大
既存の規格は主に温帯地域において開発された手法に基づいており、亜寒帯や熱帯地域における評価は考慮されていない。適用対象とする地域が異なれば、扱う生物種やその生物の飼育条件も異なり、それらの違いを考慮する必要がある。国際規格としては全世界を対象にしたものが望ましく、亜寒帯および熱帯地域における評価にも利用可能な手法の文献調査（あるいは開発）を行うことで合意した。
○試験生物種の遺伝的特徴の記述
試験方法が国際化され、各国の研究室で同じ生物種が使われるようになると、その生物種の同定の確かさや遺伝的変異が問題視されるようになってきた。そこで、各国の研究室で利用されているミミズの遺伝子型に基づく種同定がおこなわれた。この結果、いくつかの研究室では誤同定されていたこと、同じ種でも大きく3つの系統に分けられることがわかっている。この国際比較試験の結果をふまえて、既存の規格に試験生物種の遺伝的特徴の記述が加えられる予定である。
○遺伝子評価方法の記述
具体的にはＩＳＯ/FDIS17601定量的ＰＣＲ分析による微生物遺伝子の存在量推測が挙げられる。国内でも使用する機会が増えていることから、図1にドラフトの概要を、図2にリングテスト（妥当性を評価するための試験）の概要を示す。
Task1 定量的ＰＣＲの標準物質の準備と分析のキャリブレーション
Ｓｔｅｐ1 最適な単位複製配列（Primer）のデザイン
Ｓｔｅｐ2 定量的ＰＣＲの標準物質の準備
Ｓｔｅｐ3 定量的ＰＣＲのキャリブレーション

定量的ＰＣＲのキャリブレーション

Task2 土壌ＤＮＡのテンプレートの準備と阻害テスト
Ｓｔｅｐ4 土壌ＤＮＡの準備
Ｓｔｅｐ5 阻害テスト

定量的ＰＣＲのためのＤＮＡ抽出物質の質の検証

Task3 定量的ＰＣＲ評価
Ｓｔｅｐ6 定量的ＰＣＲ評価

Task4 定量的ＰＣＲの検証と分析
Ｓｔｅｐ7 定量的ＰＣＲの効率と融解曲線の分析

定量的ＰＣＲの検証

Ｓｔｅｐ8 土壌ＤＮＡ抽出物中の対象となる遺伝子のコピー数算出

図1 定量的ＰＣＲ分析による微生物遺伝子の存在量推測のためのタスクとポイント
ISO/FDIS 17601（ISO/TC190 SC4/WG4 N426）より【概要】
・国際リングテストの実施機関 6機関
・対象試料
表層0-20cmで採取後、 -20℃凍結(2.0±0.2ng/μＬか4.9±0.4ng/μＬの土壌DNAを含有)
・対象試料土質
砂質ローム×3、ローム×1、黒土（チェルノーゼム質土壌）×1、砂（Sandy neoluvisoil）×1【リングテストの流れ】
1）各機関はそれぞれが保有する計測装置とキットを使用
2）一斉に送られてくる対象試料から、16S rRNAとnirK遺伝子を定量
3）定量時の変動性を推測するために、同じプレートでの繰り返し試験
4）定量時の再現性テストのための異なったプレ－トでの繰り返し試験5）結果はシートに記入後、送付【結果】
・両遺伝子の平均的な効率は85％～115％の間に収まっている。
・16S rRNAの再現性は、nirKよりも高い。
・変動性については、実施機関での差があり、実施機関の再現性の順位が示されている（機関名は非公開）。
・2～3の異常値を除けば、16S rRNAとnirKについての結果は“受入れ可能 (Acceptable)”のレベルであった。
図2 リングテストの概要
ISO/FDIS 17601（Annex B）より

3．考察
2014年のベルリン総会での議論は主にリアルタイムPCRや今後規格化の可能性のある統一指標についてであった。定量的PCRに関わる
リングテストについて、今回、日本は参加しなかったが、リアルタイムPCRを用いた計測が可能な研究機関は国内に多数存在することから、今後は積極的に参加していくことが望ましいであろう。
国内のJIS規格は、1995年に発効された「貿易の技術的障害に関する協定（WTO/TBT協定）」に基づき、基本的にISO国際規格に整合させる、あるいはその努力をする必要があるが、徹底されるまでには至っていない。そこで、国内で使用されているJIS規格や日本として必要な規格を、逆にISO規格に採用させる、あるいは部分的に整合させる努力が重要となってくる。
現在、土壌環境センター ISO/TC 190 部会では、国内の審議団体である地盤工学会と共同で、ISO/TC 190 で行われている土壌汚染に関わる規格の情報を収集すると共に、一部の方法の国際標準化（ISO 化）を目指しており、今後、国内の関係各所のエキスパート登録や研究機関の連携をはじめとした諸々の活動を推進していく予定である。