Virus Bank SOP-HCV-001

RT-PCR 法による C 型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムの定量に関する標準操作手順書
1. 目的
1.1 本標準操作手順書は RT-PCR 法による HCV 感染細胞中の HCV ゲノムの定量について述べたものである。

1.2 本試験で用いる HCV 感染細胞の調製はの記載に従う。

1.3 本試験で用いる competitor DNA の調製はの記載に従う。

1.4 本試験で用いるサーマルサイクラー（MJ Research, PTC-200）の詳細な取扱いは
トー, AE-6920M-03 型）の詳細な取扱いはに、デンシトグラフ（アに従う。

2. 原理
2.1 HCV 感染細胞より抽出した total RNA を鋳型として、competitor DNA を内部標準とした RT-PCR 法により、HCVゲノム中で比較的塩基配列が保存されている 5’非翻訳領域の cDNA を増幅し、さらに nested PCR を行った後、アガロースゲル電気泳動にて内部標準の competitor DNA との比率から感染細胞中の HCV ゲノムの定量を行うものである。

3. 試薬類
3.1 ISOGEN（Cat. No. 311-02501）はニッポンジーン社、dNTP mixture（#27-2035-02）は Pharmacia Biotech 社、ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水（#364-15）はナカライテスク社、AMV 逆転写酵素（#120248）は生化学工業、AmpliTaq DNA Polymerases with buffer（#N-808-0160）は Perkin-Elmer 社、アガロース（#A6013）は Sigma社、50×TAE バッファー（#24710-030）、5×First Strand Buffer、0.1 M DTT（#18057-018）は GIBCO BRL 社製を使用する。

4. PCR プライマーの調製
4.1 HCV ゲノム増幅用の 1st sense primer #5: 5’-AGTATGAGTGTCGTGCAGCCT-3’、1st antisense primer #8:5’-GCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’、2nd sense primer #6: 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3’、2ndantisense primer #7: 5’-TACCACAAGGCCTTTCGCGAC-3’を合成し、それぞれ DEPC 処理水に終濃度 10 µMとなるように溶解する。

5. 操作手順
5.1 HCV 感染ヒト肝細胞を 1 ml の PBS で 3 回洗浄した後、ISOGEN 500 µl を添加し、十分ピペッティングする。
ISOGEN 可溶化サンプルを 1.5 ml 容のエッペンドルフチューブに移し、total RNA の調製に持ち込む。直ちにRNA 抽出を行わないサンプルは- 80℃のフリーザーにストックする（少なくとも 1 ヶ月は保存可能）。

1

5.2 ISOGEN 可溶化サンプルにクロロホルム 200 µl/チューブを添加し、vortex mixer で 15 秒間遠心後、室温で 3 分間静置する。次に 20,000×g（半径 9 cm, 14000 rpm）、4℃で 15 分間遠心した後、上清（水相）300 µl をグリコーゲン添加エッペンドルフチューブ（2 µl/チューブ、遠心中に準備）に加え、更にイソプロピルアルコール 300 µl を添加後に 10 秒間撹拌する。撹拌したサンプルは- 80℃に 30 分間放置する（overnight も可能）。20,000×g、4℃
で 15 分間遠心後、上清を除去（多少上清が残っても良い）し、70 %エタノールを 700 µl 添加する。撹拌せずに
20,000×g、4℃で 5 分間遠心した後、上清を除去し、そのまま 1 分間遠心して壁に付着したエタノールを完全に落とす。最後にマイクロピペットで完全に上清を除去する（この時完全に乾燥させないように注意する）。

5.3 RT（Reverse Transcription）反応は以下の方法で実施する。即ち、下記の RT-1 溶液を抽出した total RNA に添加し（30 µl/チューブ）、vortex mixer で撹拌溶解後、氷上に静置する。沸騰したお湯で 5 分間インキュベートし、氷水にて急冷した後（5 分以上）、20,000×g、4℃で flash 遠心して壁に付着した水滴を落とす。2〜3 回ピペッティングした後、12 µl を RT-PCR 用チューブに分注し、下記の RT-2 溶液 8 µl を添加後、ピペッティングする。43℃に設定したサーマルサイクラー（MJ Research, PTC-200）で 30 分間インキュベートし、更に 99℃で 5 分間インキュベートした後、4℃で保存する（RT-1、RT-2 は RNA 抽出のクロロホルム添加後の遠心時に調製する。但しRT-2 への AMV-RTase 添加は本項の「沸騰したお湯で 5 分間インキュベートし、氷水にて急冷」中に実施）。

●RT-1 溶液の組成（RNA サンプル 1 本当たり）
1st antisense primer #8（10 µM）

10 µl

DEPC 処理水

20 µl
30 µl

●RT-2 溶液の組成（RNA サンプル 1 本当たり）
5×First Strand Buffer

4 µl

0.1 M DTT

2 µl

dNTP mixture（10 mM each）

1 µl

AMV-RTase（30 U/µl）

1 µl
8 µl

5.4 RT 反応により得られた cDNA を以下の方法により増幅する（1st PCR）。即ち cDNA を 5 µl ずつ 3 本の RT-PCR用チューブに分注し、各濃度の内部標準 competitor DNA（103、104、105 copies/チューブ）を含む 1st PCR 溶液を 45 µl 添加する。ピペッティング後、以下に示すプログラムを設定したサーマルサイクラーにより PCR を実施する。

● PCR におけるサーマルサイクラーのプログラム
94℃、2 分間 Æ 94℃、30 秒間 Æ 55℃、30 秒間 Æ 72℃、60 秒間 Æ 72℃、7 分間 Æ 4℃、forever2|_______________<________________|
合計 35 サイクル

●1st PCR 溶液（cDNA 1 サンプル当たり）
10×PCR buffer

5 µl

1st sense primer #5（10 µM）

0.5 µl

1st antisense primer #8（10 µM）

0.5 µldNTP mix（10 mM each）

1 µl

DEPC 処理水

27.75 µl

AmpliTaq DNA polymerase（5 U/µl）

0.25 µl

内部標準 cDNA（competitor）

10 µl
45 µl

5.5 1st PCR 後のサンプル 5 µl を新しい PCR 用チューブに添加し、さらに以下に示す 2nd PCR 溶液 45 µl を添加し、ピペッティング後、1st PCR と同様のプログラムで 2nd PCR を実施する。

● 2nd PCR 溶液（cDNA 1 サンプル当たり）
10×PCR buffer

5 µl

1st sense primer #6（10 µM）

2.5 µl

1st antisense primer #7（10 µM）

2.5 µldNTP mix（10 mM each）

1 µl

DEPC 処理水

33.75 µl

AmpliTaq DNA polymerase（5 U/µl）

0.25 µl45 µl

5.6 PCR 終了サンプルの cDNA の検出はアガロースゲル電気泳動により実施する。泳動ゲルは以下の通り調製する。
即ち、ミリ Q 水で希釈した 1×TAE バッファーに懸濁したアガロース（3%、w/v）を電子レンジ等により加熱し、完全にアガロースが溶解したのを確認し、室温で固まらない程度まで冷却する。Mupid-2 ゲルメーカーセット（アドバンス, #EM-2）の大プレートに 40 ml のアガロースを流してゲルを作製する。2nd PCR 産物 10 µl に 6×
Gel-loading buffer（0.25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol/30% glycerol）を 2 µl 添加し、そのうちの 10 µlをゲルにアプライして 1×TAE バッファー中、100 V で 30 分間泳動する。

5.7 終濃度 2 µg/ml のエチジウムブロマイドを添加したミリ Q 水に電気泳動後のゲルを浸し、室温で 10 分間放置する。
その後、水道水で 5 分間洗浄する。UV（312 nm）照射により、デンシトグラフ（アトー, AE-6920M-03 型）にライブ画像を取り込んだ後、解析ソフトウエア「ゾーンデンシトメトリー」により HCV cDNA と competitor DNA のバンドの強度を定量する。データは Excel のテキストファイルとして保存する。

6. 計算

3

6.1 ゾーンデンシトメトリーによる解析データをコンピューターソフトウエア“Microsoft Excel 5.0”を用いて HCV ゲノムのコピー数を算出する。例えば、105 copies の competitor のバンドと HCV 由来の cDNA のバンドの比（HCV ゲノム/competitor）が 1±0.1 の範囲内であれば、最初に含まれる HCV RNA は competitor のコピー数と同じであると判断し、105 と 104 copies の間であれば両者の中間値 104.7 copies であると判断する。得られた値を 10 倍した値がウエル当たりの HCV ゲノムのコピー数となる。

6.2 プリントアウトし、必要事項を記入し報告用紙とする。

6.3 測定例を以下に示す。

day 0-1
Competitor

103 104

day 0-2105

103 104

day 0-3105 103 104

day 2-1105 103 104

day 2-2105

103 104

105

Competitor
HCV cDNA

Quantity

104.7

104.7

Lane No.

104

Failed quantitation

HCV genome

Competitor

HCV/Competitor

Comp.103

18780

4070

2.2

Comp.1042969084501.1

Comp.10

53

103.7

6680

15810

0.42

410730790

13510800

5940

1.8

4

Day 0-1
10

5.7

copies/well

Day 0-2

105.7 copies/well

68300

14820

0.56

7

11030

3330

3.3810380

11330

0.92

Day 0-3

97890

16270

0.48

105 copies/well

10840

15360

0.054

11820

16950

0.048

Day 2-1

123990

17670

0.23

Failed1311480

4730

2.4

14

10150

12240

0.83

Day 2-2

157280

14360

0.51

104.7 copies/well5