再構成型無細胞タンパク質合成系 (PUREfrex®) を用いた標的タンパク質のN末端ミリストイル化の効率向上
Improving efficiency of N-Terminal myristoylation of target proteins using a reconstituted cell-free protein synthesis system○松本 令奈1, 丹羽 達也2, 嶋根 康弘3,久野 香3, 車 兪澈3, 田口 英樹2, 金森 崇1(1ジーンフロンティア株式会社、2東工大・研究院・細胞センター 、3海洋研究開発機構・超先鋭研究開発プログラム)○ Rena Matsumoto1, Tatsuya Niwa2, Yasuhiro Shimane3, Kaori Kuno3, Yutetsu Kuruma3, Hideki Taguchi2 and Takashi Kanamori1(1GeneFrontier Corp., 2Cell Biology Center, IIR, Tokyo Tech, 3X-star, JAMSTEC)<Introduction><Abstract>

Previous Study

Membrane localization of the synthesized proteins was low (approximately 20%).

PUREfrexは、PURE systemを基にした、大腸菌でのタンパク質合成に関与する因子のみから再構成した無細胞タンパク質合成系である。反応条件や追加因子の調節が容易なため、様々な翻訳後修飾の条件検討も容易である。昨年度は、翻訳後修飾されたタンパク質の合成例として、N末端にミリストイル基を付加したタンパク質の合成例を示した。N末端ミリストイル化は開始メチオニン切断によりN末端がグリシンとなることが必須である
が、メチオニンアミノペプチダーゼ (MAP)による開始メチオニン切断効率の低さなどから、合成されたタンパク質のリポソーム(GUV)膜への局在は、２割程度にとどまった。
そこで本研究では、PUREfrexで合成された標的タンパク質のミリストイル化効率を向上させるため、TEVプロテアーゼを利用してN末端がグリシンとなる標的タンパク質を作製した。標的タンパク質のN末端側にTEVプロテアーゼ切断サイトを付加したコンストラクトを作製し、TEVプロテアーゼを添加した反応液による標的タンパク質の合成および翻訳後ミリストイル化反応を行った。この反応産物のN末端ペプチドについて質量分析を行ったところ、N末端へのミリストイル基修飾が確認された。また、GUV内で翻訳後ミリストイル化反応を行った
ところ、GUV膜に局在する標的タンパク質の割合は6割程度にまで向上した。さらに膜局在向上を図るため、タ

Why the membrane localization efficiency was low?
・ Low efficiency of N-terminal methionine cleavage
by methionine aminopeptidase (MAP).
・ Low affinity of myristoyl groups to lipid bylayer.

ーゲットタンパク質にプラスチャージ配列を付加したコンストラクトの使用および修飾する脂質についても検討したので紹介する。この結果を基に、現在、PUREfrexで合成されたミリストイル化タンパク質をリポソームのMatsumoto et al., ACS Synth. Biol. (2023)
DOI: 10.1021/acssynbio.3c00191

外側から膜に局在化させる方法についても検討している。

1. N-myristoylation of the target protein cleaved by TEV protease1-2. N-myristoylation of the target protein cleaved by TEV protease1-1. Cleavage of the synthesized protein using TEV protease
Previous study：G(o)α (C3S)-sfGFP-His

1.E+09

sfGFP

Hisx6

Methionyl aminopeptidase (MAP)

GSTLSAE

sfGFP

Hisx6

MS1 Intensity

MGSTLSAE

G[Myr]STLSAESKMAP can cleave non-formylated α-aminogroup of initiator methionine.
→ Protein synthesis reaction should be
performed without 10-CHO-THF.

5.E+080.E+00
TEVMyr-This study：His-TEV-G(o)α (C3S)-sfGFP-FLAG
MKI

Hisx6 SSG

TEVGoα(C3S)

ENLYFQ

GSTLSAE

TEV+Myr-

TEV+Myr+

Detection of myristoylated N-terminal peptide derived from TEV

sfGFP

protease-digested His-TEV-Goα(C3S)-sfGFP by MS analysis

FLAG

The target protein cleaved by TEVprotease was myristoylated.

TEV protease
Target protein: His-TEV-Goα (C3S)-sfGFP-FLAG
NMT: human N-myristoyltransferase 1 (hNMT1)_Δ80

Goα(C3S)

GSTLSAE

sfGFP

FLAG

The conventional PUREfrex reagent with 10-CHO-THF can be used forsynthesizing the target proteins with TEV protease cleavage site.

1-3. Membrane localization of the myristoylated protein after cleavage by TEV protease
TEV(+)_NMT(+)

TEV(-)_NMT(+)

PUREfrex ver. 2.1+ 50 µg/mL TEV protease
1 ng/μL His-TEV-Goα(C3S)-sfGFP DNA
reaction at 37 oC for 4 h

TEV(+)_NMT(-)

6h

GSTLSAESKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHK

IHHHHHHSSGENLYFQGSTLSAESK
1.E+08MS1 Intensity

MS1 Intensity

2.E+101.E+10
5.E+090.E+00
TEVMyr-

TEV+
Myr-

24 h

5.E+070.E+00TEV+Myr+

TEVMyr-TEV+
Myr-

TEV+Myr+

Detection of TEV protease-digested N-terminal peptide derived from His-TEV-Goα(C3S)-sfGFP by MS analysis

The synthesized protein was efficiently cleaved by TEV protease.

2. Insertion of N-acylated protein to Nanodisc

The membrane localization efficiency of the N-myristoylated protein wasincreased to 60% by using TEV protease.

2-2. Insertion of N-acylated target proteins to Nanodisc membrane

Only N-myristoylation is insufficient for the efficient localization to membrane, andother signal is usually required, such as S-palmitoylation and positive charged aminoacids cluster. (Maurer-Stroh et al, Genome Biol. 2004, 5, R21)

Fluorescence intensity (485/520 nm)

sfGFP inserted into ND• Addition of positive charged amino acids (RRR or RRRRRR) between myristoylation motif(Goα(C3S)) and sfGFP.
• Use of palmitoyl-CoA (16:0) instead of myristoyl-CoA (14:0) as a substrate for NMT

2-1. Construct with positive charged amino acidsMKI+ 3x Arg+ 6x Arg

MKI

MKI

Hisx6 SSG

Hisx6 SSG

Hisx6 SSG

TEVGoα(C3S)

ENLYFQ

GSTLSAETEVGoα(C3S)

R3ENLYFQGSTLSAE

RRR

TEVGoα(C3S)

R6ENLYFQGSTLSAERRRRRR

sfGFP

180
160
140
120
100
80
60
40200Rx(-)

FLAG

R3(-)

sfGFP

sfGFP

Myr-CoA

R6Pal-CoAFLAG

Both the addition of positive charged aminoacids and the use of palmitoyl-CoA increased
the insertion of N-acylated protein to ND.

FLAG<Conclusion>• Cleavage by TEV protease instead of MAP increased N-myristoylation and following the membrane
localization efficiency to 60%.
• Addition of positive charged amino acids improved the efficiency of insertion of the protein to ND.
• Use of palmitoyl-CoA as a substrate for NMT increased the efficiency of insertion to ND.

<On-going>• Insertion of N-acylated proteins to the liposome from outside• Engineering of NMT for palmitoyl-CoA