島根県産業技術センター研究報告報第45号（2009）

文

天然ゼオライトによる臭化エチジウムの吸着処理
Adsorption Treatment of Ethidium Bromide with Natural Zeolite

永田

＊

善明

核酸染色色素である臭化エチジウムは変異原性が指摘されており，その廃液は厳格に処理されなければならない．臭化エチジウム廃液の処理は，活性炭または樹脂による吸着処理が推奨されているが，市販の吸着処理キットはいずれも高価である．そこで，安価な臭化エチジウム吸着材を探索する目的で，天然ゼオライト，合成ゼオライト，層状鉱物，無機吸着材について，吸着等温線により臭化エチジウム吸着性を評価した．その結果，天然ゼオライトが臭化エチジウム吸着処理材として有望であることを見いだした．特に島根県産モルデナイト，および島根県産クリノプチロライ
トが優れた吸着性を示した．合成ゼオライトは，純水中における吸着性が天然ゼオライトと同程度であっても緩衝液中では吸着性能が大幅に低下するなど，臭化エチジウム吸着材としては不適当であった．また天然ゼオライトを充填した臭化エチジウム吸着カラムによる模擬廃液の吸着処理試験を行い，カラムの吸着寿命を視覚的に判断できることがわかった．さらに，カラム通過後の廃液をAmes 試験に供し，変異原性がないことを確認した．
とを見いだし，既に報告した 3）．本報告では，天然ゼオラ

1．はじめにイト，合成ゼオライト，層状鉱物，アルミナ等無機吸着材

臭化エチジウム（Ethidium Bromide，以下 EtBr と称す）の EtBr 吸着性能を比較した．さらにゼオライト充填カラ

は，遺伝子実験において DNA，RNA 等の核酸染色に使用ムによる EtBr 吸着処理試験を行うとともに，処理後の廃される色素である．EtBr は DNA 二重鎖間にインターカ

液の安全性を変異原性試験により確認したので報告する．

レートするが，これにより核酸の塩基間距離が引き延ばさ

2．方れるため，フレームシフト型突然変異を引き起こすことが知られている．従って，使用の際にはビニール手袋を着用

2.1

法

試料

評価に供した試料は，天然ゼオライト 7 種，合成ゼオラ

し，廃液は厳格に処理するなど，人体への接触や環境中へ

イト 12 種，層状鉱物 2 種，無機吸着材 4 種である．天然ゼの漏出を避けるために注意を払う必要がある．
日本における EtBr 廃液の処理は，58％が次亜塩素酸ナ

オライトの名称，産地，結晶型，陽イオン交換容量（Cation

トリウムによる酸化分解処理のみで排水処理施設に廃棄しExchange Capacity，以下 CEC と称す）を表 1 に，合成ゼ1）ているとの報告がある ．しかし，この方法では変異原性

オライトの名称，結晶型，CEC を表 2 に，層状鉱物およびが完全には消失しないとの指摘があり，活性炭，または樹

無機吸着材の名称を表 3 に示す．なお，各ゼオライト試料

脂による吸着処理が推奨されている 2）．活性炭，吸着用樹の CEC は，野田による改良ショーレンベルジャー氏法 4）

脂をフィルターやカラムに加工した EtBr 廃液処理キット

により測定した．

が市販されているが，いずれも高価である．活性炭を用い

2.1.1

EtBr 吸着試験用試料の調製た処理キットの場合，黒色であるため吸着寿命が分からな

天然ゼオライトは，粒径 2−5mm の粗砕試料を遊星ボーいという欠点があり，廃液処理量を記録して規定の処理量

ルミルを用いて湿式粉砕し，目開き 32µm のふるい通過分に達したら廃棄するという方法をとっている．またフィルを水簸して平均粒径が 10−30µm となるよう分級した．分

ター型ろ過吸着材の場合，規定の通水速度を越えた場合に級したゼオライトは蒸留水で十分洗浄した後 110℃で乾燥

EtBr の吸着漏れが生じる可能性があるため，通水速度のさせ，試料とした．

厳守が必要となる．このように，現在市販されている

合成ゼオライトは，交換性陽イオンが Na+ のものは入手

EtBr 廃液処理キットは，価格および使用の簡便さにおい時の状態で試料とした．交換性陽イオンが Na+ 以外のものて改良の余地があると言える．

は，重量比 100 倍量の 1N NaCl 水溶液に 80℃−16 時間浸漬

我々は島根県産天然ゼオライトが EtBr 吸着性を持つこすることにより，イオン交換して Na+ 型とした．その後，蒸留水で十分洗浄した後 110℃で乾燥させ，試料とした．
なお，合成ゼオライトは形状が粉末と粒状のものがあるが，−1−

永田：天然ゼオライトによる臭化エチジウムの吸着処理

表1

表2

天然ゼオライト試料の性状

合成ゼオライト試料の性状

表3

層状鉱物および無機吸着材の性状

酢酸セルロース製メンブレンフィルターでろ過後，分光光度計（日本 分 光 製 V−550）により285nm の 吸 光 度を 測 定し，
EtBr 濃度を求めた．上清の EtBr 濃度から，試料に吸着された EtBr 量と平衡濃度を算出し，吸着等温線を作成した．得られた吸着等温線はいずれも Langmuir 型に近い形となった
ため，次の方法で吸着平衡定数および飽和吸着量を算出した．Langmuir 式⑴を変形すると式⑵となり，C/W に対して今回の試験では粉砕や粒度調整は行わず，そのまま供試体

C をプロットすると，切片−1/a，傾き Ws の一次式となる．

とした．
W=a Ws C/（1+aC）…… ⑴

層状鉱物および無機吸着材は，入手時の状態で試料とした．
2.1.2

Ｃ=Ws
（C/W）
−1/a …… ⑵EtBr 吸着カラム用天然ゼオライトの調製

天然ゼオライトは，粒径 2−5mm の粗砕試料を遊星ボー

W：吸着量，Ws：飽和吸着量，a：吸着平衡定数，C：平衡濃度

ルミルを用いて湿式粉砕し，ふるいによる湿式分級で粒径45µm−250µm のものを回収した．また，粒度による通水

そこで，得られた実験結果による C/W と C の一次回帰速度試験用には，目開き 45µm，75µm，150µm，250µm，

式を最小二乗法を用いて求め，切片と傾きより吸着平衡定500µm の各ふるいによる湿式分級を行った．分級したゼ数および飽和吸着量を算出した．

オライトは蒸留水で十分洗浄した後 110℃で乾燥させ，試2.2.2 緩衝液中における EtBr 吸着試験
緩衝液には，核酸電気泳動で使用される TAE，TBE を

料とした．
2.2

用いた．TAE の組成は，40mM Tris−酢酸（pH8.3），1mM

EtBr 吸着試験
超純水中における EtBr 吸着試験

EDTA，TBE の 組 成は，89mM Tris−ほう酸（pH8.3），2 mM

試験操作は，以下に示す方法で行った．

EDTA である 5）．緩衝液は，和光純薬製特級試薬を用いて粉末試料の場合は，試験管に試料を 0.05−0.3g 秤量し，調製した．これらの緩衝液を用いて EtBr 溶液を作成し，

2.2.1

一定濃度の EtBr 溶液を 3mL 添加後，5−10 秒の超音波処

2.2.1 項と同様の方法で試験を行った．

理により試料を分散させた．次にボルテックスミキサーに

2.2.3

統計処理

より撹拌し，3000rpm−10 分の遠心操作により固液分離を

飽和吸着量の差の検定は，2.2.1 項式⑵より「直線の傾き行い，上清を回収した．粒状試料の場合は，ふた付き試験の差の検定」として行うことができる．従って，3.2 項の管に粉末試料の場合と同様に試料を秤量し，一定濃度の超純水と緩衝液中における飽和吸着量の差は，文献 6）に従EtBr 溶液を 3mL 添加して密栓し，80℃−72 時間放置後，い有意水準 5％の両側 t 検定を行った．

上清を回収した．

2.3

粉末試料，粒状試料とも，回収した上清は孔径 0.2µm の−2−

ゼオライト充填カラムの試作と通水試験

ゼオライト充填カラムは，2.5mL ディスポーザブル注射島根県産業技術センター研究報告第45号（2009）

器を用いて作製した．カラムの模式図を図 1−A に示す．

同様であるが，試料は 0.1−0.3g の間で約 0.05g 間隔で秤量

ディスポーザブル注射器はピストンを抜き，アルカリ性洗し，濃度 5µg/mL の EtBr 溶液を添加して，試料重量依存剤でシリコングリスを洗浄した後，底の部分にポリプロピ

的な EtBr 濃度の減少が見られるか確認した．図 2 に合成

レン製焼結フィルターを装着し，その上に目開き 40µm のゼオライト A−4，合成ゼオライト F−9，珪藻土，アルミナ，

ナイロンメッシュを設置してゼオライト試料を充填した．

酸化チタンの各試験結果を示す．これら 5 試料は，試料重さらに上部をポリプロピレン製フィルターで閉じた．この量の増加に依存した EtBr 濃度の低下が見られなかったこ

カラムを図 1−B に示すように設置し，通水試験を行った．

とから EtBr を吸着しないと判断し，以降の試験から除外

吸 引 用 エ ア ー ポ ン プ に は イ ワ キ 製 BA−330SN
（吸引力

した．

550mmHg，最大流量 34L/min）
を用い，吸引力の調整は行3.1.2 天然ゼオライトの EtBr 吸着性の評価わなかった．模擬廃液は 5µg/mL EtBr 含有 TAE とし，1

図 3 に天然モルデナイトの EtBr 吸着等温線を，図 4 に天試験につき 1L を通水した．また，1L を通水するのに要し

然クリノプチロライトの EtBr 吸着等温線を，図 5 に天然た時間から通水速度を算出した．

フェリエライトの EtBr 吸着等温線をそれぞれ示す．表 42.4に図 3−5 から求めた飽和吸着量および吸着平衡定数を示

Ames 試験

2.3 項の通水試験後，カラム通過廃液の安全性を確認す

す． 天 然 モ ル デ ナ イ ト で は， 島 根 県 産 I が 飽 和 吸 着 量る目的で，Ames 試験による変異原性の確認を行った．

21.2mg/g，吸着平衡定数 6.33L/mg と最も吸着性に優れ，Ames 試験の方法は，衛生試験法・注解 7）に従った．試験

次に宮城県産 N，島根県産 W の順であった．天然クリノ

用の Salmonella typhimurium 菌株はフレームシフト型変プチロライトでは，島根県産 O が飽和吸着量 21.1mg/g，

異検出用の TA98
（NBRC 14193）とし，独立行政法人製品

吸 着 平 衡 定 数 3.06L/mg， 北 海 道 産 NK が 飽 和 吸 着 量

評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部より分譲を受け19.7mg/g，吸着平衡定数 3.34L/mg でほぼ同等，ついで秋た．代謝活性化に要する S9 mix は，オリエンタル酵母製

田県産 S であった．天然フェリエライト島根県産 A は，飽エームステスト用 S9/ コファクター A セットを用いた．

和吸着量，吸着平衡定数ともに低い値であった．

3．結
3.1

3.1.3 合成ゼオライトの EtBr 吸着性の評価

果

図 6 に Y 型合成ゼオライトの EtBr 吸着等温線を，図 7にモルデナイト型合成ゼオライトの EtBr 吸着等温線を，超純水中における EtBr 吸着性の評価

3.1.1

図 8 にフェリエライト型および MFI 型合成ゼオライトの予備試験

各試料の EtBr 吸着性を評価するに当たり，EtBr の吸着量が非常に少なく吸着材に適さないものを，予備試験によ

EtBr 吸着等温線をそれぞれ示す．表 5 に図 6−8 から求めた飽和吸着量および吸着平衡定数を示す．

り除外した．予備試験の方法は，2.2.1 項に示す方法とほぼ

Y 型合成ゼオライトでは，HSZ360HUD1C が飽和吸着量19.1mg/g と天然ゼオライトの上位性能試料とほぼ同じ値であり，また吸着平衡定数は 2.24L/mg で，合成ゼオライ
トの中では最も吸着性に優れていた．また，Y 型合成ゼオ
ライトの場合，型番が大きいほど飽和吸着量，吸着平衡定数が大きくなる傾向が見られた．粉末，粒状という異なる形状の試料を比較することは適切ではないが，Y 型合成ゼ
オライトは型番が大きくなるほど SiO2/Al2O3 比が大きくなることから，Y 型ゼオライトによる EtBr の吸着は疎水

図2
図１

ゼオライト充填カラムによる通水試験の概略−3−

EtBr を吸着しない試料の予備試験結果

永田：天然ゼオライトによる臭化エチジウムの吸着処理

図3

天然モルデナイトの超純水中における EtBr 吸着等温線

図6○：島根県産 I，△：宮城県産 N，□：島根県産 W

Y 型合成ゼオライトの超純水中における EtBr 吸着
等温線○：HSZ360HUD1C，△：HSZ350HUA，□：HSZ330HUD1C，◇：HSZ320HOA.

図4

天然クリノプチロライトの超純水中における EtBr
吸着等温線

図7

EtBr 吸着等温線○：島根県産 O，△：北海道産 NK，□：秋田県産 S.

図5

モルデナイト型合成ゼオライトの超純水中における○：HSZ640HOA，△：HSZ690HOD1A，□：HSZ640HOD1S.

天然フェリエライト島根県産 A の超純水中における

図8

EtBr 吸着等温線

フェリエライト型，MFI 型合成ゼオライトの超純水中における EtBr 吸着等温線○：HSZ720KOA，△：HSZ830NHA，□：HSZ890HOD1C.

表４

天然ゼオライトの EtBr 飽和吸着量および吸着平衡定数

図9

セピオライト，セリサイト，シリカゲルの超純水中における EtBr 吸着等温線○：セピオライト，△：セリサイト，□：シリカゲル−4−島根県産業技術センター研究報告表5

合成ゼオライトの EtBr 飽和吸着量および3.1.4

吸着平衡定数第45号（2009）

ゼオライト以外の試料の EtBr 吸着性の評価

図 9 にセピオライト，セリサイト，シリカゲルの EtBr
吸着等温線を，表 6 に図 9 から求めた飽和吸着量および吸着平衡定数を示す．セピオライトが全試料中最も飽和吸着
量 が 大 き く，51.5mg/g に 達 し た． ま た 吸 着 平 衡 定 数 は2.93L/mg であり，島根県産 O に匹敵する選択性を示した．
セリサイトは飽和吸着量 14.7mg/g で天然ゼオライトに匹敵する吸着量を示したが，吸着平衡定数は 1.18L/mg と，
天然ゼオライトよりも選択性が低かった．シリカゲルは飽和吸着量，吸着平衡定数ともに小さく，EtBr 吸着材としての性能は低かった．
3.2

緩衝液中におけるゼオライトの EtBr 吸着性

EtBr 廃液として最も多いと考えられるのが，核酸電気泳動に用いられる EtBr 含有 TAE 緩衝液，または TBE 緩
衝液である．そこで，これら緩衝液における天然ゼオライ
表6トの EtBr 吸着性を評価した．図 10−16 に各天然ゼオライ

層状鉱物 , 無機吸着材の EtBr 飽和吸着量およびト試料の TAE，TBE における EtBr 吸着等温線を，表 7 に吸着平衡定数

図 10−16 より求めた飽和吸着量および吸着平衡定数を示す．なお，飽和吸着量については超純水と TAE，またはTBE の差の検定を行い，p 値を併記した．
天然モルデナイトでは，島根県産 I および宮城県産 N は，
超純水と TAE における飽和吸着量の差に統計的な有意差はなく，TAE による飽和吸着量への影響は小さいと判断された．超純水と TBE の間では飽和吸着量の統計的な有的相互作用による可能性がある．
合成モルデナイトの吸着等温線は，いずれの試料も図 7

意差が観測されたが，島根県産 I の場合は 5.2% の上昇，宮に示されるように傾きの小さいほぼ直線であり，表 5 の吸

城県産 N の場合は 3.1% の減少と，その差はわずかであっ

着 平 衡 定 数 の 値 か ら も EtBr 選 択 性 が 低 い と 言 え る．

た． 島 根 県 産 W の 飽 和 吸 着 量 は，TAE，TBE と も に

Langmuir 式⑴より，吸着等温線は希薄溶液（平衡濃度 C

11.7% の減少となった．飽和吸着量の減少は，EtBr 吸着サが小さい値をとる時）において aWs を傾きとする直線に近

イトに緩衝液の成分が吸着したため EtBr が吸着できなくくなる．従って，Ws がほぼ同じである試料を比較する場なったということを表しているが，TAE 中における飽和合，吸着平衡定数 a の値が大きい吸着材ほど希薄溶液にお吸着量は W のみが減少しているため，W には I，N とは異ける EtBr 吸着能力が高いことがわかる．逆に，吸着平衡

なる EtBr 吸着成分があるものと考えられる．緩衝液中に定数が小さい場合，飽和吸着量が十分に大きくなければ低おける吸着平衡定数は，全ての天然モルデナイト試料にお濃度 EtBr 溶液の処理において EtBr が吸着されずに残存いて小さくなり，EtBr 選択性が低下したことが示された．

する可能性を示唆している．

吸着平衡定数が小さくなる理由は，EtBr 吸着サイトに対

合成モルデナイトの形状によるEtBr 吸着性について検討すして緩衝液の成分が競合するためと考えられる．

ると，粉末の HSZ640HOA に比較して粒状の HSZ640HOD1S

天然クリノプチロライトでは，緩衝液中における飽和吸では吸着平衡定数が大幅に小さくなった．今回の試験では，着量は，超純水中と比較して全ての試料において有意に小合成ゼオライトは市販品をそのまま使用することを想定し，さくなった．飽和吸着量の減少率は，島根県産 O の場合

敢えて粉砕・分級をせずに試験に供したが，同じ型番であTAE 11.8%，TBE 11.4%，北海道産 NK の場合 TAE 4.1%，

るにもかかわらず形状の違いによって吸着性に差が出たこTBE 4.6%， 秋 田 県 産 S の 場 合 TAE 35.7%，TBE 38.4%，とは，粒状の場合，80℃−72 時間では EtBr 吸着平衡に達であり，秋田県産 S の減少率が大きいことが分かった．

していない可能性を示している．またこのことは，Y 型の緩衝液中における吸着平衡定数は，秋田県産 S の TBE 中

HSZ360HUD1C を粉末にした場合には本試験の結果以上における値を除いて小さくなり，モルデナイト同様 EtBr 選択性が低下したことが示された．秋田県産 S において TBE 中の吸着性を示す可能性を示唆している．
合成フェリエライト，MFI 型合成ゼオライトは，飽和の吸着平衡定数が上昇している理由は不明であるが，図15に吸着量の大きなものでも 10mg/g 程度であり，また吸着平示されるように TAE，TBE 中における EtBr 吸着等温線はほ

衡定数はいずれも天然ゼオライトに及ばなかった．

ぼ重なっていることから，その影響はわずかと考えられる．
−5−

永田：天然ゼオライトによる臭化エチジウムの吸着処理

図 10

島根県産 I の超純水，TAE，TBE 中における吸着
等温線

図 11

図 12

着等温線

図 15

図 16

○：超純水，△：TAE，□：TBE.

○：超純水，△：TAE，□：TBE.

HSZ360HUD1C の超純水，TAE，TBE 中における
吸着等温線

−6−

○：超純水，△：TAE，□：TBE.

島根県産 A の超純水，TAE，TBE 中における吸
着等温線

図 17

○：超純水，△：TAE，□：TBE.

秋田県産 S の超純水，TAE，TBE 中における吸着等温線○：超純水，△：TAE，□：TBE.

島根県産 O の超純水，TAE，TBE 中における吸北海道産 NK の超純水，TAE，TBE 中における吸着等温線○：超純水，△：TAE，□：TBE.

宮城県産 N の超純水，TAE，TBE 中における吸
着等温線

図 13

○：超純水，△：TAE，□：TBE.

島根県産 W の超純水，TAE，TBE 中における吸
着等温線

図 14

○：超純水，△：TAE，□：TBE.

島根県産業技術センター研究報告第45号（2009）

表7

TAE，TBE 中における天然ゼオライトの EtBr 飽和吸着量および吸着平衡定数

表8TAE，TBE 中における HSZ360HUD1C の EtBr 飽和吸着量および吸着平衡定数

フェリエライト島根県産 A は，緩衝液中の飽和吸着量

ラムにおいて着色が下端に達しているものがあり，EtBr

は TAE，TBE ともに 2.9% の減少であり，吸着平衡定数がカラム外へ流出している可能性が示唆された．

も小さくなった．

3.3.2

ゼオライト粒子径と通水速度の関係

合成ゼオライトでは，最も吸着性に優れる HSZ360HUD1C

表 9 より，粒径 45µm−250µm のゼオライトでは 1L の通について評価した．図 17 に HSZ360HUD1C の TAE およ

水に 1 時間程度かかることがわかる．これは微細な粒子にび TBE における EtBr 吸着等温線を，表 8 に図 17 より求めよる目詰まりのためと考えられる．そこで，廃液処理に要た飽和吸着量および吸着平衡定数を示す．超純水と比較しする時間とゼオライト粒径の関係を知る目的で，島根県産

た場合の飽和吸着量の減少率は TAE 55.0%，TBE 57.6%

I を粒径ごとに分級してカラムに充填し，1L の廃液処理にと大幅に小さくなり，また吸着平衡定数も小さくなった．

要する時間を測定した．図 19 に廃液通水後のカラムを，このことから HSZ360HUD1C は実用には適さないと判断

表 10 に通水速度とゼオライト粒径の関係を示す．1L の廃した．

液処理時間を 10 分未満に設定した場合，100mL/min 以上

以上より，実廃水に対して最も吸着性に優れるのは，島の通水速度が必要となるので，表 10 の結果から粒径 75−

根県産Ｉであることが示された．

150µm 以上のゼオライト充填カラムとすればよいことが3.3

天然ゼオライトによる EtBr 吸着処理用カラムの試作

分かる．しかし，図 19 より 150−250µm の粒径では EtBr

3.3.1

ゼオライト充填カラムの試作による着色がカラム下端に達しており，図には示さなかっ

EtBr 廃液の処理法として，ゼオライト充填カラムに廃たが，250−500µm，500−1000µm も同様であった．以上

液を通水して EtBr を吸着除去する方法を想定し，島根県のことから，カラム式 EtBr 廃液処理において EtBr の十産 O および島根県産 A を除く天然ゼオライト 5 種につい分な除去と処理時間を両立する最も適した粒径は，75−て，粒径 45µm−250µm のゼオライトを充填した EtBr 除

150µm であることが示された．

去カラムを試作した．このカラムに廃液として 5µg/mL

3.4

EtBr を含有する TAE 緩衝液 1L を通液し，EtBr のゼオラ

Ames 試験によるゼオライト充填カラムによる EtBr
吸着処理の安全性評価

3.3 項による吸着処理後の廃液について，Ames 試験に

イトへの吸着状態を確認するとともに，処理にかかる時間を測定した．なお，島根県産 O は，今回用いた試料が粉よる変異原性の有無を確認した．

末精製品であることからカラムに充填した際の通水抵抗が

3.4.1

予備試験

大きかったため，また島根県産 A は天然ゼオライト中最予備試験により，Ames 試験におけるEtBr の変異原性出現濃も吸着性が低かったため，評価を行わなかった．図 18 に度を確認した．図 20 に EtBr 濃度と Salmonella typhimurium

廃液通水後のカラムを，表 9 に 1L の廃液を処理するのに菌コロニー数の関係を示す．グラフでコロニー数が一端上要した平均時間を示す．試験には１試料につき 3 本のカラ昇した後に減少するのは，EtBr の変異原性よりも毒性がムを用いた．着色がカラム中間に留まったものは島根県産

勝 る 濃 度 領 域 で あ る こ と を 示 し て い る． 試 験 の 結 果，

Ｉと宮城県産 N であった．他の 3 試料については一部のカ

EtBr 濃度 25ng/mL においてコロニー数 35 となり，ポジテ−7−永田：天然ゼオライトによる臭化エチジウムの吸着処理

A

B

図 18

C

D

E

EtBr-TAE 廃液通液後の天然ゼオライト充填カラムの着色状況

A：島根県産 I，B：島根県産 W，C：宮城県産 N，D：北海道産 NK，Ｅ：秋田県産 S.
表9

ゼオライト充填カラムによる廃液１L の処理に要した時間

A

図 19

B

C

粒径を選別した島根県産 I 充填カラムによる EtBr の吸着状況
Ａ：45−75μm，B：75−150μm，C：150−250μm
表 10

ゼオライトの粒径と通水速度の関係ィブコントロールである AF-2
（2（2-furyl）-3（5-nitro-2-furyl）
acrylamide）
よりも低濃度で EtBr による変異原性が確認され た． こ の こ と か ら，Ames 試 験 に よ る EtBr の 検 出 は
25ng/mL 以上であれば可能であることが示された．
3.4.2

ゼオライトカラム通過廃液の Ames 試験

3.4.1 項の結果を基に，3.3 項のゼオライトカラム通過廃液の Ames 試験を行った．検液量は，試験に用いることのできる最大量の 100µL とした．表 11 に 3.3.1 項のカラム通
過後の廃液によるコロニー数を示す．コロニー数はカラム
3 本の検液の平均値で示した．なお，市販の EtBr 吸着処
理キットである「Extractor（Whatman 社製）」についても，

図 20

プロトコールに従って廃液を 10L ろ過し，処理液について□：EtBr + S9mix，△：AF−2（positive control）.

同様に試験を行った．その結果，いずれの試料からも変異原性は確認されなかった．

Ames 試験による EtBr 変異原性の確認とが示された．

表 12 に，3.3.2 項のカラム通過後の廃液によるコロニー

4．考数を示す．ゼオライトの着色がカラム内部に留まっている
45−75µm および 75−150µm のカラムにおいては，変異原

4.1

察

ゼオライトの EtBr 吸着性性は確認されなかった．一方，着色がカラム下端に達した

今回，吸着等温線を用いて天然ゼオライト 7 種，合成ゼ150−250µm 粒子径のゼオライト充填カラムは，通過廃液

オライト 12 種，層状鉱物 2 種，無機吸着材 4 種についてに変異原性が確認され，EtBr が十分除去されていないこ

EtBr 吸着性を評価した．その結果，天然ゼオライトが高とが示された．以上のことから，カラムの着色によりカラい吸着性を持つことが示された．天然ゼオライトの結晶型

ム通過廃液の安全性や，カラムの吸着寿命を確認できるこ

別では，モルデナイトは島根県産 I が最も吸着性に優れ，−8−島根県産業技術センター研究報告第45号（2009）

表 11

Ames 試験によるコロニー数 ( ゼオライト試料ごと )表 12

Ames 試験によるコロニー数 ( 島根県産 I・粒度ごと )ついで宮城県産 N，島根県産 W，クリノプチロライトは有量で島根県産 I の EtBr 飽和吸着量と一致する．

島根県産 O と北海道産 NK がほぼ同等，ついで秋田県産 S

クリノプチロライトの場合，EtBr 飽和吸着量および吸であった．島根県産フェリエライト A は，モルデナイト，

着平衡定数は，CEC の順位とほぼ一致している．特に島クリノプチロライトに比較して飽和吸着量，吸着平衡定数

根県産 O は，CEC から見積もられる純度が 96.7% と高純ともに小さかった．

度であることから，クリノプチロライトそのものが EtBr

合成ゼオライトは，超純水中における EtBr 吸着試験のを吸着していると考えられる．しかし，EtBr 分子の大き結果，HSZ360HUD1C を除いて EtBr 吸着性に乏しく，特さが 0.9nm 程度であることからクリノプチロライトの細孔に吸着平衡定数が小さいことが明らかとなった．また，

内には入らない，あるいは入ったとしても分子の一部のみ

HSZ360HUD1C についても緩衝液中での性能低下が顕著と考えられ，大部分は表面吸着によるものと考えられる．

であることから，合成ゼオライトは EtBr 吸着材には適さ4.2ないことが示された．

セピオライトの EtBr 吸着性

今回の試験では，セピオライトが最も飽和吸着量の値がゼオライトの EtBr 吸着機構について考察すると，EtBr

大きかった．粘土鉱物が層間に色素や有機化合物をインタ

は分子内に正電荷を持っており，この正電荷がゼオライト

ーカレートすることはよく知られており 9），セピオライト，の陽イオン交換サイトと相互作用する可能性がある．しか

モンモリロナイトともに EtBr を吸着することから，EtBr

し，表 1 に示した天然ゼオライトの CEC と表 4 に示した飽もこれらの鉱物の層間にインターカレートされるものと考

和吸着量および吸着平衡定数に相関が見られないこと，えられる．セピオライトは粉末の他に造粒品，繊維状のも

CEC の大きい A−4，F−9 が EtBr を吸着しないことから，のが市販されており，それらを加工することで EtBr 吸着

EtBr 吸着への CEC の寄与は小さいと考えられる．

材として十分使用可能と考えられる．

次に，結晶型の関与を考える．天然モルデナイトと合成

4.3

ゼオライト充填カラムによる EtBr 吸着処理

モルデナイトを比較すると，合成モルデナイトの吸着平衡

市販の活性炭による EtBr 吸着キットは，「ティーバッグ

定数はいずれの試料においても非常に小さい．このことは，型」「カラム型」「フィルター型」がある．そこで本試験でモルデナイトは本来 EtBr 選択性が低いということを示し

は，吸着処理に要する時間が短く，かつ試作が容易な天然ており，天然モルデナイトの EtBr 選択性が高い理由は，

ゼオライト充填カラムによる EtBr 廃液処理試験を行った．

モルデナイトが EtBr の主たる吸着材ではなく，むしろ天カラム式の場合，ゼオライトが白色系であるため図 18，

然モルデナイトの随伴鉱物が EtBr 吸着に寄与している可19 に示されるように EtBr の吸着状況が容易に確認でき，能性を示唆している．このことは，最も EtBr 吸着性に優処理量の記録が必要な活性炭よりも利点がある．また，処れる島根県産 I の純度が CEC 換算で 62.8% であるのに対し，

理済み廃液の Ames 試験により，EtBr による着色がカラ

それよりも EtBr 吸着性に劣る宮城県産 N の純度が 83.0%

ム内部にとどまっている場合は通過廃液に変異原性はなく，であることからも言える．EtBr を吸着している物質の候

カラム下端まで着色した場合は変異原性が現れることから補としては，3.1.4 項に示したように，セピオライトやセリ

も，ゼオライトの着色がインジケーターとして有効である

サイトが EtBr を良く吸着し，またデータは示さないが，ことが示された．なお，北海道産 NK 充填カラムでは，

モンモリロナイトも EtBr 飽和吸着量約 340mg/g と吸着性

3.3.1 項において EtBr の着色が全てのカラムで下端に達しに優れていることから，ゼオライトに随伴する層状鉱物がていたが，変異原性は確認されなかった．しかし，これは考えられる．天然モルデナイトの場合，粘土鉱物や石英，

EtBr の流出直前の状態と考えられ，着色がカラム下端に8）長石を含むことが指摘されており ，島根県産 I に含まれ達する前にカラムを交換することが望まれる．

る粘土鉱物がモンモリロナイトだとすれば，6% 程度の含−9−EtBr 廃液は，ほとんどが核酸電気泳動に使用される

永田：天然ゼオライトによる臭化エチジウムの吸着処理

0.5µg/mL EtBr 含有 TAE 緩衝液である．そこで，この廃⑵天然ゼオライトを充填した EtBr 吸着処理用カラムを試

液を 10L 処理した場合の市販キットによるコストを比較す

作し，EtBr 廃液を通液してゼオライトの着色によりカると，Q-BIOgene 社製「EtBr Green Bag kit」
（活性炭テ

ラム寿命が判定できることを示した．

ィーバッグ型）が 200 円，Whatman 社製「Extractor」（活⑶カラムを通過した EtBr 廃液を Ames 試験に供し，変異性 炭 フ ィ ル タ ー 型）が 3500 円，Elechrom Scientiﬁc 社 製

原性がないことを確認した．

「Bind-ET」（樹脂カラム・タンク一体型）
が 475 円と，いず以上により，島根県産天然モルデナイト，または島根県産

れも高価である．天然ゼオライトは原料が安価であること

天然クリノプチロライトを EtBr 廃液の吸着処理に用いるに加え，前述のように EtBr 吸着を目視確認できる利点がことを提案する．

あることから，市販キットに対しても十分競争力のある製品になると考えられる．

本研究は，平成 19 年度シーズ発掘試験「イオン交換性鉱物を用いた 1step プラスミド精製法の開発」による研究

4.4 島根県産天然ゼオライト充填カラムの注意点
島根県産Ⅰは，今回評価したゼオライト中最も EtBr 吸着性に優れていた．しかし，これをカラムに充填して使用

成果の一部である．本研究を支援していただいた，独立行
政法人科学技術振興機構に深く感謝いたします．

する際には留意すべき点がある．島根県産 I はやや軟質で文あり，撹拌によって崩壊し微細な粒子を生成する．従って，目開きの小さいフィルターをカラムに使用すると，微粒子による目詰まりのため通水速度の低下が起こる．今回の試
験では，これを避けるために目開き 40µm のナイロンメッ
シュを使用し，微粒子が通過するようにした．島根県産
W は硬質であるため，吸着性は島根県産 I に劣るが目詰まりの心配は少ない．ただし，図 18 に示されるように，1Lの廃液処理後のカラムは一部下端まで EtBr による着色が見られた．このため，Ames 試験結果では処理水に変異原性は認められないものの，安全性を見込んでゼオライト充填量を増やす必要がある．

5．ま と め⑴天然ゼオライト 7 種，合成ゼオライト 12 種，層状鉱物 2種，無機吸着材 4 種について，吸着等温線により EtBr
吸着性を評価した．その結果，島根県産モルデナイト，
島根県産クリノプチロライトを筆頭に，天然ゼオライトが優れた EtBr 吸着性を持つことを明らかにした．

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