RNase H–Dependent PCR Primers and Enzyme
RNase H–Dependent PCR とは
RNase H–Dependent PCR（以下、rhPCR）とは、IDT が独自に開発した高感度 PCR システムで、RNase H2 という酵素を利用することから RNaseH 依
存型 PCR と呼ばれています。
RNase H2 は、「RNA/DNA ヘテロ 2 本鎖を認識し、RNA の 5' 末端側 DNA とのホスホジエステル結合を切断する」酵素です。
この高感度 PCR システムでは、プライマーの 1 塩基を RNA に変更することでテンプレート DNA と RNA/DNA ヘテロ 2 本鎖を形成させ、さらに RNA の 3’側にヌクレアーゼが結合できない領域（ブロッキング部位）を設けることにより、RNase H2 が RNA/DNA ヘテロ 2 本鎖を認識 / 切断した場合のみ PCR が進行します。
この酵素が RNA と DNA のホスホジエチル結合を切断するには、以下の 2 つの条件を満たす必要があります。
（1) プライマー内の RNA がテンプレート DNA の相補塩基であり、ミスマッチではないこと（2) プライマーの RNA の上流 10 塩基と下流 4 塩基がテンプレートの DNA と相補であること
上記の (1)(2) の条件を満たさない場合は PCR が進行しないため、極めて配列特異的な PCR を行う事が出来ます。

rhPCR の作用スキーム
rhPrimer
テンプレート DNA

R

5’

5’

5’5’

R
ブロッキング部位

1. 通常の PCR の準備を行います。
ただし、プライマーを rhPCR 用の rhPrimer に置き換え 、マスターミックスに RNase H2 を加えます。
2. 左図は rhPrimer が、テンプレート DNA にアニーリングし、ヘテロ 2 本鎖を形成している様子です。

RNase H2 による切断
Rp
OH5’

3. RNase H2 が rhPrimer の RNA の 5' 末端側のホスホジエステル結合を切断する事で、ブロッキング部位が乖離し、プライマーの 3' 末端の OH が露呈します。

5’OHp5’5’

RDNA ポリメラーゼによる伸長反応-p-O-5’5’-O-p-5’

4. プライマーの 3' 末端が露呈したことで、溶液中の遊離 DNA とのホスホジエステル結合が出来るようになり、DNA の伸長反応が進みます。

5’※ RNase H2 による切断が起こらなければ、ブロッキング部位がポリメラーゼの結合を阻害するため、PCR産物は産生されません。

rhPCR で出来ること
1）SNPs 検出
RNA/DNA が相補配列でなければ、プライマーのブロッキング部位が RNase H2 によって切断されないため、PCR 産物は産生されません。
そのため、ターゲットとなる SNP と rhPrimer 中の RNA がマッチする様に設計すれば、ターゲットとなる SNP を持つ DNA に対してのみ PCR 産物が産生され、SNP の有無を識別できます。

2）高感度 PCRrhPrimer の RNA の上流 10 塩基と下流 4 塩基もテンプレートの DNA と相補である必要が有るため、この部位に DNA のミスマッチがあれば PCR 反応は進みません。そのため、非特異 PCR 産物の産生を抑える事ができます。サンプルが少ない場合等に特に有用です。

3）マルチプレックス PCRPCR を進めるためには、RNase H2 の認識部位である「DNA14 塩基及び RNA1 塩基」がテンプレート DNA に対して相補鎖である必要があります。
配列の相補性がポリメラーゼだけでなく、RNase H2 によってもチェックされますので、非特異産物が厳密に制限され、一度に多数の PCR 反応を行うことが出来ます。社内検討では 14 種の PCR 産物を一度に検出できております。

rhPrimer について
ゲノム編集

rhPrimer には、GEN1 及び GEN2 という 2 種類があります。
右図は GEN1 タイプの プライマーです。
GEN1 は、RNA がテンプレートの DNA と相補の場合、低濃度の Rhase H2でも機能します。このため、反応系の構築が比較的安易かつ安価です。
GEN2 は 3' 末端側の配列が、「RDxxDM」という形になります。GEN1 に比べて RNA/DNA サイトの特異性が高く、qPCR を用いたレアアレル検出実験
では、GEN1 が 1:1,000 程度なのに比べ、GEN2 は 1:10,000 という検出結果が得られています。
この様に GEN2 は高い特異性が求められる実験に有用ですが、反応系の最適化のための条件検討と高濃度の RNase H2 が必要となります。
（GEN1：2-10 mU/10 μL、GEN2：5-200 mU/10 μL）
そのためrhPCRを行う際は、まずGEN1をお試し頂くことをお勧め致します。

GEN1 rhPrimer
Single RNA（切断サイト）
5’ DDDDDDDDDD DDDDDDDDDD DD R DDDDM-x
ブロッキング部位
RNase H2切断
5’ DDDDDDDDDD DDDDDDDDDD DD -OH

p-RD

D = テンプレートに相補的な DNA
R = RNA
M = テンプレートに ミスマッチ している DNA 塩基（ブロッキング部位の一部）
x = ブロッキングのための C3 スペーサー修飾

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Integrated DNA Technologies MBL 株式会社 (IDT-MBL KK)

E-mail：oligo@mbl.co.jp

DDDM-xプライマーデザインについて効果的な rhPCR を行うためには、rhPrimer の RNA の 5' 側に 10 塩基、3' 側に 4 塩基の相補配列が必要です。特に RNA の近接にミスマッチした DNA 配列がある場合には、RNase H2 の切断効率は顕著に減少します。
PCR の一端のみを rhPrimer に置き換えた場合でも rhPCR は機能しますが、両端に rhPrimer を用いる事をお勧め致します。
また、RNase H2 による切断後の配列（RNA の 5' 側）がプライマーとして機能するため、この プライマーの Tm 値は通常お客様が用いているプライマーと同じになるように設計して下さい。
※ GEN2 rhPrimer の場合には、RNA にウラシルの使用を避けることを推奨します。ウラシルを用いると、より多くの RNase H2 Enzyme が必要となるためです。

価格／納期
カテゴリ

製品名プライマー

内容物

価格

rhPrimers GEN1 脱塩グレード…… RDDDDMxのプライマー￥5,000rhPrimers GEN1 HPLC 精製…… RDDDDMxのプライマー￥15,400

rhPrimers GEN2 脱塩グレード…… RDxxDMのプライマー￥7,000…… RDxxDM

rhPrimers GEN2 HPLC 精製のプライマー￥17,400

RNase H2 Enzyme Small (50 U at 2 U/μL)
2 mL Dilution Buffer￥40,000

RNase H2 Enzyme Small

50 U at 2 U/μL￥40,000

RNase H2 Enzyme Large

500 U at 20 U/μL

￥400,000

酵素＆溶解バッファー
RNase H2 Enzyme Kit（初回発注時にオススメ）
酵素のみ

2 mL RNase H2 Enzyme Dilution Buffer

バッファーのみ

10 x 2 mL RNase H2 Enzyme Dilution Buffer￥800￥7,000

納期

5 〜 10営業日

10 〜 15営業日

5 営業日

・ プライマーの合成スケールは、100 nmole 合成スケールです。
・ 保証収量は、配列と精製グレードに応じて変わります。事前確認希望の場合、IDT に確認が必要です。
・ DNA、RNA 合わせて全体で 60 bases まで合成可能です。
・ 他の修飾の付加など、プライマーの形態が異なる場合は、rhPrimer（上記の価格表）ではなく、カスタム DNA 合成サービスでの対応となります。
・GEN1 では 2-10 mU/10 μL、GEN2 では 5-200 mU/10 μL の酵素が必要となります。

使用方法
一般的な PCR の手順とほぼ変わりません。RNase H2 を加え rhPrimer を用いるだけです。
IDT ウェブサイトにプロトコールが掲載されています。
「IDT DNA」で検索 または IDT ウェブサイト（http://sg.idtdna.com/）より
products & services ＞ Genotyping ＞ Rnase H-Dependant PCR（http://sg.idtdna.com/pages/products/genotyping/rnase-h2-dependent-pcr）の support タブ

上記ウェブサイトには、各社マスターミックスとの条件も記載しております。
※本製品に含まれる RNase H2 は 好熱性古細菌である P. abyssi 由来のため、高温下でなければ活性を示しません。そのため、ホットスタートミックスを使う必要はありません。

ご注文方法
oligo@mbl.co.jp までメールにて下記の情報をお送りください。
・お客様情報（名前（ふりがな）、メールアドレス、所属先、所属先住所（ふりがな）、電話番号）
・代理店様情報（代理店名、担当者名）
・納品方法（直送もしくは代理店納品）
・rhPrimer（配列、配列名）、Enzyme & Dilution Buffer（製品名、容量）※ GEN １と GEN2 で、x (C3 スペーサー ) の記載方法が異なりますので、ご注意ください。アルファベットの前に "r" を付けることで、RNA を表します。
GEN1 例：GCGTCTCGTCTTACTGAAATCTrGAGTCG/3SpC3/
GEN2 例：GCGTCTCGTCTTACTGAAATCTrGA/iSpC3//iSpC3/CG

rhPrimer の 3’末端の M ( ミスマッチ ) の推奨塩基についてM（ミスマッチ）には、下記の塩基を推奨しています。設計の参考にしてください。

ゲノム編集

テンプレートMismatch

G→

GA→

C

T→

C

C→C

■ 参考文献1）Dobosy JR, et al . RNase H-dependent PCR (rhPCR): improved specificity and single nucleotide polymorphism detection using blockedcleavable primers. BMC Biotechnol. 11, 80 (2011) [Open Access]2) Boucard AA, et al . Latrophilins function as heterophilic cell-adhesion molecules by binding to teneurins: regulation by alternative splicing. J
Biol Chem. 289, 387-402 (2014)41
詳細、ご注文は MBL ライフサイエンスサイト http://ruo.mbl.co.jp/bio/idt/index.html をご利用下さい。

DsiRNA 合成サービス
RNA 干渉（RNA Interference）とはRNA 干渉とは、短い RNA がターゲットとなる mRNA に作用し分解を促進することにより、その mRNA の調節を行う機構です。
細胞中では、RNA 干渉を引き起こす短い 2 本鎖 RNA（総称して small interfering RNAs = siRNAs) は、RNase III class エンドヌクレースである Dicer によって長い 2 本鎖 RNA が断片化されることで作られます。この機構を利用して、化学合成した短い 2 本鎖 RNA を用いて細胞内で特定の mRNA に対して RNA干渉を引き起こし、その発現を人為的にノックダウンする方法が、広く一般的な分子生物学実験として行われています。
この Dicer による断片化プロセスで、siRNA は RISC（RNA Induced Silincing Complex）と結合します。RISC の中で、2 本鎖のうちの 1 つであるpassenger strand と呼ばれるセンス鎖が、乖離して RISC から離れます。もう一方の guide strand と呼ばれるアンチセンス鎖は、RISC の中に留まりAgo2 タンパク質に取り込まれます。guide strand がその相補配列を含むターゲット mRNA に RISC を誘導し、相補鎖を形成すると、RISC 内の Ago2 タン
パク質のヌクレアーゼ活性が mRNA を分解し、その結果、細胞中の mRNA の量が減り、ノックダウンが起こります。

27mer DsiRNA（Dicer-Substrate RNAi）
IDT は、City of Hope 研究所の Dr. John Rossi と一緒に、27mer と 25mer からなる 27mer DsiRNA を開発し、その合成品を提供しています。
この 27mer DsiRNA には、21mer siRNA と比較して 2 つの長所があります。それは RNA 干渉のプロセスにより高頻度に取り込まれること、及び 2 本鎖の RNA のうちターゲット mRNA に対してアンチセンスとして働く側の鎖を特定できること、の 2 つです。
27mer DsiRNA の場合、Dicer により 21mer の siRNA の形に切断され、その後に RISC にローディングされます。この Dicer の基質になり切断されるステップを経ることで、RISC に認識されやすくなります。一方で、通常使われる 21mer siRNA は直接 RISC に入るのですが、Dicer の基質となるステップを経ないために RISC に認識される頻度が減る、すなわち RISC に入る頻度が減ることが予想されます。
また、左右非対称な 27mer は、Dicer にその基質として認識される際に、3' 末端にオーバーハングがある鎖がアンチセンス鎖（下側の鎖）であると認識し、3' 末端の 2 塩基が DNA になっている鎖がセンス鎖（上側の鎖）と認識します。この形態の左右非対称性により、Dicer が基質として DsiRNA を取り込む際に、一律の方向で認識されます。誤ってセンス鎖がアンチセンス鎖として働いてしまうオフターゲットを防ぐことができます。
RISC に入った後は、27mer DsiRNA も通常の 21mer siRNA も同様の経路をたどりますが、その前のプロセスでの上記 2 つの利点から、27mer DsiRNA は、21mer siRNA と比較して、より高いノックダウン能をもつことが予想され、その報告もされています 1-3）。

27mer DsiRNA の性能
上記の説明から 27mer DsiRNA は、高い効率と特異性でノックダウンが可能と考えられています。
特異性のチェックのためには siRNA の配列のチェックが必要です。IDT の 27mer DsiRNA は、推奨セットを購入した場合、納品時に配列情報を開示しますので特異性について検証することができます。
安定性という観点では、IDT の 27mer DsiRNA は通常の RNA および DNA ですので、特別に高い安定性は期待できません。しかし IDT は、培養細胞での使用を想定している通常の 27mer DsiRNA では、特別な化学修飾は必要ないと考えています。ただし、培養細胞で検証実験を行った後、それを In vivo の系に移行させて使用したいという要望がある場合には、移行の前に2-O-Met塩基や5'リン酸化などの修飾を施したDsiRNAを使用することを推奨しています。
細胞毒性という観点では、通常の RNA と DNA ですので分子自体の毒性はありません。また 25mer と 27mer からなる短い 2 本鎖ですので、インターフェロン反応も起こさないと考えられています。

RNAi target sequence

Dicer
DNA

ACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACcg
ACUGGGACUUCAAGUAGACGUGGUGGC
Dicer processing

ゲノム編集siRNA(21 mer)pACCCUGAAGUUCAUCUGCACC
ACUGGGACUUCAAGUAGACGUp% EGFP Expression

ACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAADsiRNA(27 mer)Comparison of Relative Potency

120

21 mer
25 mer
27 mer100806040200050pM

200pM

1nM

5nM

Duplex Concentration

20nM

50nM

■ 参考文献27mer DsiRNA についての基礎論文
Dicer-Substrate siRNA (27mer DsiRNA) は、IDT と Beckman Research Institute of the City of Hope National Medical Center, Dr. John Rossi らとの共同研究成果です。27mer DsiRNA は、Dicerの基質として認識され切断されることで21mer siRNAとなり、21mer siRNAそのものを導入した場合と比べ、ノックダウン効率が高くなることが報告されています。
1) Amarzguioui M, et al . Rational design and in vitro and in vivo delivery of Dicer substrate siRNA. Nat Protoc. 1, 508-517 (2006)
2) Rose SD, et al . Functional polarity is introduced by Dicer processing of short substrate RNAs. Nucleic Acids Res. 33, 4140-4156 (2005)
3) Kim DH, et al . Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nat Biotechnol. 23, 222-226 (2005)

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Integrated DNA Technologies MBL 株式会社 (IDT-MBL KK)

E-mail：oligo@mbl.co.jp

TriFECTa™ DsiRNA Kit
プレデザインの 27 mer DsiRNA 3 種類セット＋コントロール 3 本、ノックダウン保証付き価格

内容

発注に必要な情報

納期¥63,500

3 種類の Screening DsiRNA duplexes (27 mer DsiRNA、2 nmole × 3 種類 )導入効率確認用コントロール (TYE™ 563標識、1 nmole × 1本）
ノックダウン確認用陽性コントロール (HPRT-S1 DS Positive Control、1 nmole × 1 本）
陰性コントロール (NC1 Negative Control、1 nmole × 1 本）
溶解用 RNase Free duplex buffer（100 mM KAc/30 mM HEPES pH7.5）

RefSeq データベース番号(Accession No.)

5 ～ 10
営業日2種類以上の27 mer DsiRNAでノックダウンが確認されなければ、無償で3種類の追加提供いたします。ノックダウンの確認方法はお問い合わせください。
対象となる種は、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、チンパンジー、ウシ、イヌです。
27 mer DsiRNA 3 種類の具体的な配列は、納品時にお知らせします。

Screening DsiRNA duplex (27mer DsiRNA)
価格
納品量

形態

修飾

・2 本鎖 RNA (24 〜 30 mer)・アニーリング処理後に精製・空気乾燥品

センス鎖
5' リン酸化修飾無し

プレート納品

チューブ納品

精製(24本以上発注)

2 nmole¥15,200¥12,000

10 nmole¥23,300¥18,500

40 nmole¥36,200

設定なし※ In vitro 実験用

Affinity 精製※ 40 nmole 品は脱塩グレード

発注に必要な情報

納期Accession No.
または具体的な2 本鎖配列

5 ～ 10 営業日

Screening DsiRNA duplex は、センス鎖の 5' 末端がリン酸化修飾されておりません。IDT にて、in vitro 実験の際にはセンス鎖 5' 末端のリン酸化修飾の有無はノックダウン効率に影響を与えないことを確認しております。

RNAi duplex oligos (21mer siRNA)
納品量価格

形態2 nmole¥28,100

精製10 nmole¥41,800

40 nmole¥63,500

・2 本鎖 RNA (18 〜 23 mer)・アニーリング処理後に精製・空気乾燥品

Affinity 精製※ 40 nmole 品は脱塩グレード

発注に必要な情報

納期具体的な 2 本鎖配列

5 ～ 10 営業日

検証済みコントロール、溶解用バッファー
導入効率確認用コントロール

陰性コントロール

RNAi 実験に成功するためには、トランフェクション効率がとても重要です。
効率を確認する際に用いる蛍光色素で修飾された陽性コントロールです。

Human/mouse/rat の各ゲノムに存在しない検証済み陰性コントロールです。NC1 が現在の IDT 推奨の陰性コントロールです。

製品名Cy®3 DS Transfection Control
TYE™ 563 DS Transfection Control
TEX™ 615 DS Transfection Control

納品量

価格

1 nmole¥15,100

5 nmole¥37,600

1 nmole¥12,500

5 nmole¥31,300

1 nmole¥12,500

5 nmole¥31,300

ノックダウン確認用陽性コントロール

製品名
NC1
DS Scrambled Neg

納品量

価格

1 nmole¥9,6005 nmole¥24,100

1 nmole¥9,6005 nmole¥24,100

溶解用バッファー

HPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase 1) の mRNA
を 90％以上ノックダウンすることが既に証明されている陽性コントロー
ルです。
納品量

価格

1 nmole¥9,6005 nmole¥24,100

溶解用 RNase Free duplex buffer(100 mM KAc/30 mM HEPES pH7.5)

容量価格

2 mL x 10 本もしくは 300 mL¥3,0001L¥4,800

ゲノム編集

製品名
HPRT-S1 DS Positive Duplex Control(Human/Mouse/Rat/Chinese hamster)

製品名

注文方法
oligo@mbl.co.jp までメールにて下記の情報をお送りください。
・お客様情報（名前（ふりがな）、メールアドレス、所属先、所属先住所（ふりがな）、電話番号）
・代理店様情報（代理店名、担当者名）
・納品方法（直送もしくは代理店納品）
・発注に必要な情報（製品名など）

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詳細、ご注文は MBL ライフサイエンスサイト http://ruo.mbl.co.jp/bio/idt/index.html をご利用下さい。

miRNA に対するオリゴヌクレオチド阻害剤
miRNA の機能解析
miRNA が細胞内でどのような機能を果たしているのかを確かめることは、miRNA 研究の中で非常に重要です。miRNA の機能を確かめるための実験の一つとして、miRNA の機能を阻害し、その影響を確認するという実験が行われています。

miRNA Inhibitor による miRNA の機能阻害
一般的な miRNA の阻害方法は、mature miRNA に対して相補的な配列のオリゴヌクレオチドを阻害剤として利用する方法です。このオリゴヌクレオチド阻害剤は、miRNA と相補結合することによって、ターゲット mRNA へ結合することを阻害します。
IDT® miRNA Inhibitors は、IDT が開発した新たなオリゴヌクレオチド阻害剤です。修飾塩基 2'-O-Methyl RNA（2-O-Met) と IDT オリジナルの修飾 ZENを用いており、従来法に比べてお求めやすい価格でご提供します。

IDT® miRNA Inhibitors◎ In vitro （培養細胞の実験系）で、miRNA に相補結合し機能阻害を行うオリゴヌクレオチドです。
◎ オリゴヌクレオチド阻害剤として必要な条件を満たしています。
・強い結合力・高い特異性（2-O-Met と ZEN が、miRNA との相補結合の Tm 値をアップ）
・ヌクレアーゼ耐性（2-O-Met で endonuclease 耐性、ZEN で exonuclease 耐性）・毒性が無い（Phosphorothioate bond（PS-bond、S 化）や LNA を使わない）◎ siRNA と同様のプロトコールで細胞導入可能です（Lipofection 法やエレクトロポレーション法で導入可能）。
◎ シンプルなデザイン、簡単にオーダーできます（miRBase に記載の miRNA の mature sequence の配列情報で発注可能）
。

価格／納期
納品量

精製グレード価格

納期

5 nmole脱塩¥ 29,800

1 ～ 2 週間

20 nmole

脱塩¥ 89,800

1 ～ 2 週間

250 nmole

脱塩¥ 249,800

約 2 週間250 nmole

IE-HPLC（純度 80% 以上保証）¥ 289,800

約 3 週間コントロール
価格と納期は、上記のターゲット miRNA 用と同じです。
Controls

SpeciesSequence (Inhibitor の配列は、以下の配列の antisense の 21 mer)

Positive Control

Mature miR-21-5p Sequence (Human, Mouse, Rat)

uagcuuaucagacugauguuga

NC1 Negative Control (Human)

ucguuaaucggcuauaauacgc

NC5 Negative Control (Mouse)accauauugcgcguauagucgc

Negative Control

デザイン
M: 修飾塩基 2-O-Met、z:ZEN 修飾を示します。

Seed region
5’ ‒ P R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R ‒ 3’ miRNA：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：
3’ ‒z M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M zM ‒ 5’ IDT® miRNA Inhibitor

具体的なデザイン（Positive control: Mature miR-21-5p を例に）Mature miR-21-5p

5’ ‒ uagcuuaucagacugauguuga ‒ 3’

IDT miRNA Inhibitor

5’ ‒ mU/ZEN/mCmAmAmCmAmUmCmAmGmUmCmUmGmAmUmAmAmGmCmU/3ZEN/ ‒ 3’

ゲノム編集

修飾の表記方法：

2-O-Methyl RNA ⇒ m_ 、internal ZEN 修飾 ⇒ /ZEN/ 、3'ZEN 修飾 ⇒ /3ZEN/

注文方法
oligo@mbl.co.jp までメールにて下記の情報をお送りください。
・お客様情報（名前（ふりがな）、メールアドレス、所属先、所属先住所（ふりがな）、電話番号）
・miRBase で得られた mature sequence
・代理店様情報（代理店名、担当者名）
・納品量、精製グレード
・納品方法（直送もしくは代理店納品）■ 参考文献44

IDT の研究グループがテクニカルレポートを論文化しています。IDT® miRNA Inhibitors とほぼ同様のオリゴヌクレオチド（配列長は 22 mer、論文中での記載は "2'OMe, 5'inZEN, 3'ZEN"）を使った実験結果を解説しています。オープンアクセス論文です。ぜひご覧ください。
Lennox KA, et al . Improved performance of anti-miRNA oligonucleotides using a novel non-nucleotide modifier. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e117 (2013)

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