研究課題名In silico 及び in vitro 解析によるヒトチトクローム P450 を介したポリ塩化ビフェニルの代謝能評価

共同研究者名平川 周作（代表、福岡県保健環境研究所）

梶原 淳睦（分担、福岡県保健環境研究所）

堀 就英（分担、福岡県保健環境研究所）

宮脇 崇（分担、福岡県保健環境研究所）

芳之内 結加（分担、愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

岩田 久人（拠点構成員、愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

野見山 桂（拠点構成員、愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

研究目的
本共同研究プロジェクトでは、ヒトのチトクローム P450 (CYP) 分子種を 介 し た ポ リ 塩 化 ビ フ ェ ニ ル (PCB) の 代 謝 の 特 徴 を in silico 及 び invitro 解析を用いて調査した。
1968 年、福岡県を含む西日本地域において、米ぬか油への PCB やダイオキシン類の混入による油症事件が発生した。事件後約 50 年が経過した現在でも、油症患者の体内には、高濃度の PCB 及びダイオキシン類が残留していることが明らかになっている 。一方、2000 年代に検診で採取した血液中の PCB 蓄積パターンを解析した結果、油症患者では一般人と比べて低塩素化 PCB が優先的に代謝されていることが推察された。また、
これまでの LaMer 共同研究プロジェクトにおいて、in silico 解析を用いてPCB 異性体 (69 種) とヒト CYP 分子種 (7 種) のドッキング様式をシミ
ュ レ ー シ ョ ン し た 結 果 、 ダ イ オ キ シ ン 類 に 誘 導 さ れ る CYP 分 子 種 がPCB 異性体を代謝しやすいドッキング様式をとることが示唆されている 。
平成 30 年度の共同研究では、in silico 解析を用いて PCB 異性体とのド ッ キ ン グ 様 式 のシミ ュ レ ー シ ョ ン 結果を 詳 細 に 解 析 す ること で 代 謝 産物として生成される水酸化 PCB の形態を予測し、最短距離のデータと統合して代謝能の評価を行った。さらに、シミュレーションで予測した PCBの代謝反応が実際に起こり得るかを確認する予備検討として、ヒトCYP2A6 組換え酵素を用いて、代謝物の生成が予測される HxCB153 及び代謝が困難と考えられる HxCB156 の in vitro 試験を実施し、生成された水酸化 PCB の測定を試みた。

研究内容【PCB-CYP ドッキングシミュレーションによる水酸化 PCB の形態予測】
これまでの共同研究プロジェクトにより、愛媛大学沿岸環境科学研究センター化学汚染・毒性解析部門の岩田研究室が所有している分子シミュレーションソフトウェア Molecular Operating Environment (MOE) プログラ
ムを利用し、69 種類の PCB 異性体とヒト CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4 のドッキング様式に関するシミュレーションを 実施してきた。CYP の活性中心にあるヘム鉄と基質の標的部位の距離が 5Å (または 6Å) 以内にある場合、効率的に代謝されるとの報告がある 。そのため、PCB 異性体の 塩素が結合していない炭素原子 を標的部位として、CYP の ヘム鉄 と標的部位 の最短距離を測定し、距離に重点を置いて代謝能の有無の評価基準とした。なお、一対の CYP と化合物の 組 み 合わ せ で ド ッキ ン グ 様式 を シ ミ ュレ ー シ ョン す る と 5 ～ 9 パターンの結果が得られるため、全てのパターンで標的部位との最短距離を測定し、その中で最も短い距離になるものを「最短距離」として採用している。一方、PCB 異性体の標的部位を詳細に解析することにより、PCB の代 謝 に よ っ て 生 成 さ れ る 水 酸 化 PCB の 種 類 や 関 与 す る CYP 分 子 種 の予測が可能と考えられることから、平成 29 年度から標的部位の情報を獲得するため、詳細解析を実施してきた。
本年度の共同研究により、CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4 の 7 分子種とヒトの血液中から検出された 69 種類のPCB 異性体について、最短距離と標的部位の情報を揃えることができた 。
そ こ で 、各 PCB 異 性体に対する CYP 分子種の代謝能を評価する ため 、
①標的部位とヘム鉄の最短距離 (< 5Å)、②標的部位とヘム鉄の全パターンの最短距離の平均値 (< 5Å)、③標的部位から推測される水酸化 PCB の検出事例の有無を調査し、取りまとめた。
【CYP2A6 による PCB 異性体の in vitro 試験と水酸化 PCB の測定】
市 販 さ れ て い る ヒ ト CYP2A6 組 換 え 酵 素(Human CYP2A6 + P450

Reductase + Cytochrome b 5 , CORNING) を使用し、シミュレーションで予測し た PCB の 代 謝 反 応 が 実 際 に 起 こ り 得 る か を 確 認 す る 予 備 検 討 を 実 施した。検討には、代謝物の生成が予測される HxCB153 及び代謝が困難と考えられる HxCB156 を用いた。In vitro 試験と水酸化 PCB の測定は、化学汚染・毒性解析部門の野見山准教授のもとで実施 した。
10 mL 試験管に Mix PCB バッファー (100 mM リン酸バッファー pH
7.4、5 mM MgCl 2 )、0.55 µM PCB 異性体、80 nM CYP2A6 を加え、37 ℃ で10 分間プレインキュベートした。続いて、NADPH regenerating system (フナコシ) を加えて 代謝反応を開始させ、 37 ℃ で 180 分間インキュベートした。氷冷メタノールを 1 mL 添加することにより、反応を停止させた。
In vitro 試験後の反応液について、PCB 及び生成した水酸化 PCB を測定するため、下記の通り前処理を実施した。試験管内の代謝試験反応液にクリーンナップスパイクを添加した後、1＋1 HCl を 2 mL、2-propanol を
1 mL、50% methyl tert-butyl ether (MTBE)/hexane を 2 mL 加え、ボルテックスにて 1 分間撹拌した後、遠心分離し、有機層を分取した (繰り返し 3回)。抽出液に 10% NaCl を 2 mL 加え、1 回の天地逆転で混合後、30 分間静置し、下層の夾雑層を除き、2 mL まで窒素気流下で濃縮した。1 M
KOH (50% ethanol/Hexane 洗浄水) を 2 mL 濃縮した抽出液に加え、1 分間 撹 拌 し、PCB を 含む有機層と 水 酸 化 PCBs を含む KOH 層に分配した (繰り返し 2 回)。KOH 層に濃硫酸を数滴加えて pH 2 以下にし、50%
MTBE/hexane を 2 mL 加え、撹拌して水酸化 PCBs をヘキサンに転溶し、上層の有機層を分取した (繰り返し 3 回)。分取した溶液を窒素気流下で1 mL まで濃縮した後、メタノールを 250 µL、ジクロロメタンを 250 µL、trimethylsilyldiazomethane を 150 µL 加え、一晩静置して水酸化 PCBs をCH 3 O-PCBs に誘導体化した。その後、 3 g の活性化シリカゲルカラムク
ロ マ ト グラフィー (Wako-gel S-1) に よ り クリーンアップ し 、140 mL の

10% DCM/hexane を用いて CH 3 O-PCBs を溶出し、ロータリーエバポレー
ターで減圧濃縮後、濃縮管に分取した。シリンジスパイクを添加、窒素気流下で 50 µL まで濃縮したものを最終溶液とし、HRGC-HRMS を用いて測定した。
ま た 、KOH 分配後 の有機層には PCB が含まれ ている。 親 PCB の減量 を 確 認 す る た め、 4 g の 活 性 化 シ リ カゲ ル カ ラ ム ク ロ マトグ ラ フ ィ ー(Wako-gel DX) に供してクリーンアップした。110 mL の 5% DCM/hexane
を 用 い て PCBs を溶出し、ロータリーエバポレーターで 減圧 濃縮後、濃縮管に分取した。シリンジスパイクを添加、窒素気流下で 50 µL まで濃縮したものを最終溶液とし、GC-MS を用いて測定した。

研究成果
平 成 30 年 度 の 共 同研 究 で は、 69 種 の PCB 異性 体 に 対 する 7 種のCYP 分子種の代謝能を評価するため、PCB-CYP のドッキング様式を詳細に解析することにより、①標的部位とヘム鉄の最短距離、②標的部位とヘム鉄の全パターンの最短距離の平均値、③標的部位から推測される水酸化PCB の検出事例の有無を調査し、Table 1 に取りまとめた。①～③の評価項目のあてはまりが多いほど、代謝能を有する可能性が高いと考えられる。
特に、CYP2A6 や CYP2B6 は評価項目のあてはまりが多い異性体が多く、次いで CYP1A1 が PCB の代謝への寄与が高いと推察された。また、シミ ュ レ ー シ ョ ン に よ る ド ッ キ ン グ 様 式 の 解 析 に よ り 、 水 酸 化 PCB と 親PCB を結ぶ代謝経路に 関わる CYP 分子種を推定することができた。 一方、水酸化 PCB の検出事例については、血液中で検出されたものをまとめた Grimm et al. (Crit. Rev. Toxicol. 2015) のレビューを参考にした 。しかし、血液中に移行しやすい水酸化 PCB はレビューに記載されているものの、生体内には肝臓で代謝されるが血中に移行しにくい異性体も存在すると考えられる。特に、低塩素 PCB が親化合物と考えられる水酸化 PCB は報告例が少ないものの、代謝されやすいドッキング様式を示すことや油症患 者 と 一 般 人 の 濃 度 比 較 か ら 誘 導 さ れ た CYP 分 子 種 に よ っ て 代 謝 されやすいことが推察されるため、代謝の可能性を注視していきたい。

次に、in vitro 試験により、CYP2A6 を介した HxCB153 及び HxCB156の代謝を調査した。その結果、ドッキング様式から代謝が困難と推察されていた HxCB156 では、代謝物の生成が確認されなかった。一方、代謝の可能性が示唆されていた HxCB153 において、4’-OH-CB101 の生成が認められた。ドッキング様式のシミュレーション結果から予測される標的部位を考慮すると、3’ 位を標的部位とした 3’, 4’-epoxide 体の生成に引き続き、4’ 位の塩素が脱離して 4’-OH-CB101 に代謝された可能性が高い。Mise etal. (Toxicol. Sci. 2016) の報告でも、PeCB118 の代謝物として 5-OH-CB66が検出されており、脱塩素化した水酸化 PCB の生成反応は起こり得ると考 えら れる 。しか し 、HxCB153 から 4’-OH-CB101 が生 成 さ れる 経 路については知見が乏しく、また、in vitro 試験の再現性は確認できていない。

今後の課題
こ れ ま でに実施し た 共同研究により 、CYP 分子種と PCB のドッキン
グ 様 式の シミュレーション か ら、 各 PCB 異性体の代謝能を 有する CYP分子種を推定することができた。また、単一の CYP 分子種と PCB 異性体を用いた in vitro 試験により、代謝の反応経路の確認のために利用できることが示唆された。
今後、研究を進展させるために取り組む課題は、下記の通りである。
1．PCB 異性体の代謝標的部位及び最短距離に関するシミュレーションの解析結果と基質の化学的特性等の要因を統合 し、ヒトの体内で代謝されやすい異性体の特徴と CYP 分子種の関係を明らかにし、油症患者におけるこれら物質の蓄積特性を解明する。
2．CYP 分子種と PCB 異性体を in vitro 系で反応させ、生成される水酸化 PCB を測定し、シミュレーションの結果と統合することで代謝経路の予測を試みる。 特に、油症患者で特異的に濃度が高いとされる 水酸化 PCB の生成に関与する CYP 分子種を明らかにする。
これらの研究を通して、油症患者における PCB やダイオキシン類の代謝・排泄に関連した治療に寄与していきたい。