2006/6 Version 1.0

麹菌オリゴアレイ 12k Ver1.0 取扱書

Fermlab Array Aspergillus oryzae 12k

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製品の内容
本製品は、麹菌の全ゲノム（約 3,800 万塩基対）に含まれるほぼ全遺伝子 12,168 個を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ（鎖長：60mer）を固相化したマイクロアレイです。
本製品は、上記マイクロアレイとサンプル処理・ハイブリダイゼーション法を記載した「麹菌オリゴアレイ 12k 取扱い説明書」からなります。マイクロアレイはアクチベーション処理後の保存期間は 1 ヶ月です。また、開封された場合は早めに使用して頂くことをお勧めします。なお、プローブは切り込みがある方とは反対側にスポットされています2
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発現解析の流れ本製品を用いた、遺伝子発現頻度解析は基本的には市販キットを使うことを前提しています。
次の①～⑤で全体の流れを解説します。
① Total RNA・ｍＲＮＡの抽出
生体試料から、ターゲットとなるＲＮＡを抽出します。いくつかの方法がありますが抽出効率が後の発現解析の良否を左右する重要な部分です。
② Total RNA・mRNA への蛍光ラベル
Total RNA、ｍRNA への蛍光ラベルはｃDNA への逆転写反応時に Cy-dUTP を取り込ませる方式とリニア増幅によるｃRNA 合成後 Cy ラベルする方式のどちらかを選択します。
③ ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、試料をマイクロアレイに必要量滴下した後、カバーガラス等で蓋をし恒温下で行います。ハイブリチャンバーと呼ばれる専用のインキュベーターを使用しますが、タッパウェアーを湿潤箱状態にすることでも代用できます。
④ 洗浄
ハイブリダイゼーション反応後の洗浄工程は、非特異的に結合したターゲットを取り除いたり、バックグランドを低くする上でも重要です。
⑤ データ読みとり
市販されている、マイクロアレイリーダー・スキャナーであればどの機種でもシグナルをとることができます。スポッティングエリアは 17.5x53.5mm です。尚、マイクロアレイのサイズは 25x76mm です。

試料調整前の準備■ 器具類の取り扱い
市販のディスポーサブルプラスチック器具類（滅菌済みのもの）は通常 RNase フリーで、そのまま実験に用います。遠心チューブやマイクロピペット用チップなどはオートクレーブ処理を行った後用います。ガラス器具などを用いる場合には、180℃で少なくとも 2 時間以上乾熱滅菌を行います。乾熱滅菌できないものは、0.1％ ジエチルピロカーボネート（DEPC）溶液で 37℃、10 時間程度処理し、オートクレーブ処理を行った後，用います。
■ 試薬類
試薬類は可能な限り 0.1％ DEPC 処理水で調製し、オートクレーブ処理を行ってから使用します。オートクレーブ処理ができない試薬が含まれている場合には、あらかじめ滅菌操作を行った器具類、水などを用いて溶液を調製し、ろ過滅菌後使用します。

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試料調整手順ISOGEN を用いた total RNA の抽出(RNA 抽出条件は日本ジーンの ISOGEN のプロトコールに従って行ってください)
ＲＮＡ専用のクロロフォルム、イソプロパノール、エタノールを用意する。
作業を開始する前に作業台上をクロロフォルムで拭いておく。また作業は、RNase のコンタミを防ぐため、手袋を着用し清潔な環境で行う。
1.

ISOGEN を 15 ml のファルコンチューブに 5 ml ずつ分注し、氷上に置く。

2.

凍結した麹菌を液体窒素の入った乳鉢の中で十分に破砕する。

3.

１．のファルコンチューブに破砕した菌体をいれ、チューブを強く振り、良く混和する。

4.

ボルテックスミキサーを用いさらに混和する。この時チューブのフタをしっかり締め、上下反転させてさらに良く混和する。

5.

混和後、氷上に置く（-80℃で保存可能）。

6.

この作業の終了後、クロロフォルムで机を拭き、手袋を替える。

7.

ISOGEN 5 mL につき 1 mL のクロロフォルムを加え、ボルテックスミキサーで良く混和する。

8.

室温で３分間静置する。

9.

10000 rpm ×10 min （４℃）で遠心する。

10. 別の 15 mL ファルコンチューブにイソプロパノールを 2.5 mL ずつ分注しておく。
11. 遠心終了後、水相を注意深く取り、10 の中に入れる。ＲＮＡの回収率を上げるため有機相および中間相が混入しないように、注意して水相を吸い取る。少し水相を残す程度にすると良い。
12. チューブを上下して混合する。
13. 室温で１０分間静置する。
14. 10000 rpm ×10 min （４℃）で遠心する。
15. 沈殿がＲＮＡとなるので、上清をデカンテーション等で取り除く。
16. 残った上清はピペット等を使い吸い取る。
17. ７０％エタノールを 2 ～ 3 mL 加え、ＲＮＡの沈殿が剥がれないように注意して、軽くまぜＲＮＡの沈殿をリンスする。
18. 10000 rpm x 3 min 遠心する。
19. エタノールを吸い取る。
20. ５分間 風乾する。
RNA は完全に乾燥させると溶解性が著しく減少するため、乾かしすぎないように注意する。
21. エタノールが残っていたら、ピペットチップで吸い取る。
22. 沈澱を RNase free の滅菌蒸留水に溶解する。
Pellet が小さい時は 150 µl、大きい時は 300 µl の滅菌蒸留水で溶解する。

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23. 穏やかにピペッティングしてＲＮＡを溶解する。
24. 溶解したＲＮＡはエッペンドルフ型サンプリングチューブに移す。この時溶解していないＲＮＡも合わせて移す。
25. Total RNA の吸光度を測定する。ＯＤ260/OD280 が 1.6 以上であることを確認する。

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OligotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit を用いた mRNA の精製(mRNA 精製は TAKARA の OligotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit の説明書に従って行ってください)
作業を開始する前に以下の準備を行う。
・

Total RNA を凍結保存している時は、氷上で溶解する。

・

1 サンプルにつき、150 μL の RNase Free Water を 70℃に加熱しておく。

・

OligotexTM-dT30<Super>を 37℃に保温し、沈降した Latex 粒子をピペッティングもしくはタッピングにより十分懸濁しておく。

・2 x Binding Buffer が析出している場合は、37℃に保温し溶解しておく。

・

キットに付属している Wash Buffer は氷上に置く。

1.

反応液の調製
サンプリングチューブ中に以下の用量で反応液を調製する。
RNA 量が 150-250 µg で行う場合
2 x Binding Buffer

150 µL

OligotexTM-dT30<Super>15 µL

RNA 水溶液＊60 µL

RNase free H2O

90 µL：Total RNA の濃度により調整する

反応液最終 Total 量 315 µL＊Total RNA 濃度が 4 mg/mL の場合。
2.

サンプリングチューブのふたをしっかり閉め、反応液を穏やかによく混合する

3.

70℃で３分間加熱する（RNA の変性）。

4.

室温で１０分間静置する（OligotexTM-dT30<Super>と mRNA のハイブリダイゼーション）。

5.

15,000 rpm ×5min. 遠心する。

6.

OligotexTM-dT30 を吸い込まないよう注意して上清を除去する。

7.

Wash Buffer 350 µL で OligotexTM-dT30 を懸濁した後、スピンカラムセット（キットに付属）のカップに移す。

8.

15,000 rpm ×30 sec. 遠心しカップより洗浄液を除去する。

9.

Wash buffer 350 L で OligotexTM-dT30 を懸濁し、カップを新しいスピンカラム用遠心チューブ（キット付属）に移す。

10. 15,000 rpm ×30 sec.遠心しカップより洗浄液を除去し、カップを新しいスピンカラム用遠心チューブ（キット付属）に移す。
11. あらかじめ 70℃に加熱しておいた RNase free H2O 60 µl でよく懸濁する。
12. 15,000 rpm ×30 sec. 遠心して、mRNA を溶出する。
13. 再度、カップ内の OligotexTM-dT30<Super>を 70℃に加熱しておいた RNase free H2O 60 µlでよく懸濁する（スピンカラム用遠心チューブは、変えずにそのまま使う）。
14. 15,000 rpm ×30 sec. 遠心して mRNA を溶出する。

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Ethachinmate による mRNA の濃縮（mRNA の濃縮は日本ジーンの Ethachinmate の説明書に従って行ってください。ただし、Dry up後の操作は下記の手順に従って行ってください）＊mRNA 精製を２本に分けて行っていた場合、この段階で１本にまとめる。
1.

Ethachinmate に添付されている 3 M Sodium Acetate を 3.3 µl/100 µl 加える

2.

Ethachinmate を 1 µl 加え、Vortex する（十分行う）

3.

RNA 用 Ethanol を２ ～ ２．５倍量加え、Vortex する。

4.

10 Kg×10 min 遠心する。

5.

上清を除去する。

6.

Dry up 5 min RNA は完全に乾燥させると溶解性が著しく減少するため、乾かしすぎないように注意する

7.

沈澱を RNase free H2O 30 µl でよく懸濁する
2 本を 1 本にまとめる時は 50 µl でよく懸濁

8.

OD260/OD280 を測定する。
濃度：50 µg/µl Ratio>1.65 であることを確認する。理想の Ratio は 2.0 前後である。

9.

問題がない場合は、mRNA 溶液を-80℃で保存する

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ポストラベリング法（Cy3,5 使用）(ポストラベリング反応は GE ヘルスケアの CyScribe cDNA Post Labelling Kit の説明書に従って行ってください)
作業を開始する前に以下の準備を行う。
・ ピペットマン、机の上を RNase 除去剤で拭いておく。
・ ヒートブロックを７０℃と４２℃にセットする。代替として、200 L の PCR チューブを用い、サーマルサイクラーを使用してもよい。
・ 凍結乾燥された AA-dUTP のチューブをスピンダウン（１５秒）し、AA-dUTP をチューブの底に集める（粉体は見えない）。30 L の Nuclease free water で完全に溶解する。調製した日付を記録し、-15℃～ -30℃で保存し、１ヶ月以内に使用する。

プライマーのアニーリングと伸長反応
1.

キットから酵素以外の各種試薬を取り出し氷上で解凍し、均一に懸濁する。酵素は使用直前に氷上に取り出す。

2.

新しい 1.5 mL のチューブ を出して、氷上で以下の試薬を添加する。
精製済み mRNAX L（1g）*

Random nonamers primers（黒）1LAnchored oligo(dT)（白）1L(9-X) L

Nuclease Free Water（透明）Total volume

11L＊精製済み mRNA の量が 1g となるよう添加量を調整する。
3.

穏やかにピペッティング撹拌する。

4.

70℃、5 min 反応させる。

5.

室温で１０分間静置する（プライマーのアニーリング）。

6.

スピンダウンする。

7.

4 のチューブを氷上に置き、標識反応試薬を以下の順で加える（酵素は使用直前に取り出し最後に加え、使用後直ちに-15℃～ -30℃に戻す）。
アニーリング反応済み混合液

11L5 x CyScript Buffer（黄）4 L —黄色いふたは２種類あるので注意

0.1 M DTT（オレンジ）

2 L

Nucleotide Mix（緑）1 L

AA-dUTP（ピンク）

1 L

CyScript reverse transcriptase（赤）1 LTotal volume20 L

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8.

穏やかにピペッティングして反応液を混合する（激しく撹拌すると酵素が失活する）。

9.

42 ℃、90 min 反応させる

10. 30 - 40 min 後、一度スピンダウンする。
＊すぐに使用するときは、氷上で保管する。保存する場合は-15℃～ -30℃で保存する。

アミノアリル標識 cDNA の精製
mRNA の分解
1.

ヒートブロックを 37℃に設定する。

2.

2.5 M NaOH をアミノアリル修飾 cDNA が入ったチューブ（10）に 2L 加える。

3.

37 ℃で 15 分 反応させる

4.

2 M HEPES を 10L 加える

5.

ボルテックスで混和後、スピンダウンする（１５秒間）。

＊この段階で -15℃～ -30℃で保存可能。

CyScribe GFX Purification kit による cDNA の精製
・0.1M Sodium bicarbonate (pH 9.0)を準備する。pH が 8.5 以下の時は、新たに作成する。
・Wash Buffer として 80% エタノール（V/V %）を作成する。
1.

コレクションチューブを GFX スピンカラムにセットし、500L の Capture Buffer を添加する

2.

1. に未精製のアミノアリル標識 cDNA を加え、5 回程度穏やかにピペッティングして十分に混和する。

3.

すぐに、13,800 g x 30 sec で遠心し、コレクションチューブにたまったろ液を捨てる。
（30 sec 以上遠心すると効率が悪くなる）

4.

カラムに 600L の Wash Buffer（80% エタノール） を加える。

5.

13,000 rpm x 30 sec 遠心する。

6.

コレクションチューブにたまったろ液を捨てる

7.

4. ～ 6.を２回繰り返す。

8.

Wash Buffer を完全に取り除くため、13,800 g x 10 sec 遠心する。

9.

新しい 1.5ml チューブにカラムをセットする。

10. カラムに 0.1M Sodium bicarbonate を 60 L 加え、５分間静置する（バッファーがメンブレン全体をカバーする様に加える）。

0.1M Sodium bicarbonate は 1 回使い切り
11. 13,800 g x 1 min 遠心し、cDNA 溶液を集める。
＊ 10. ～ 11.を繰り返すことで約１０％収率が上がる。
＊この段階で -15℃～ -30℃で保存可能。

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CyDye によるアミノアリル修飾した cDNA の標識
・CyDye を室温に戻す（結露を防ぐため、CyDye NHS Ester のチューブは使用直前まで未開封のまま室温に放置しておく）。
12. 11. の精製したアミノアリル修飾 cDNA 溶液を CyeDye NHS Ester のはいった 1.5mL のチ
ューブに直接加え、数回ピペッティングを行い、完全に溶解する。
13. 13,800 g x 1 min 遠心し反応液をチューブの底に集める。
14. 遮光して室温で９０分間静置する。
15. 4 M Hydroxylamine を 15L 加える。数回ピペッティングを行い混和後、スピンダウンする。
16. 遮光して室温で１５分間静置する。
17. すぐに次の精製プロトコールを行う。
GFX による精製
・40mL の無水エタノールを Wash buffer のボトルに添加しよく混ぜておく。
・ボトルのフタはエタノールが蒸発しないように、強く締め、１５℃～２２℃で保存する。
18. コレクションチューブを GFX スピンカラムにセットし、500L の Capture Buffer を添加する。
19. GFX スピンカラムに標識した cDNA サンプルを加え、5 回程度穏和にピペッティングして、Capture buffer と十分に混合する（Capture Buffer 中に cDNA を１０分以上放置すると、収率が下がるので注意する）。
20. 13,800 G x 30 sec 遠心し、コレクションチューブにたまったろ液を捨てる。
21. カラムに 600L の Wash Buffer を加える。
22. 13,000 rpm x 30 sec 遠心し、コレクションチューブにたまったろ液を捨てる。
23. 21. ～ 22. の反応を２回繰り返す（反応しなかった CyDye を完全に取り除くため、必ず３回洗浄する）。
24. Wash Buffer を完全に取り除くため、13,000 rpm x 10 sec 遠心する。
25. 新しい 1.5ml チューブにカラムをセットする。
26. カラムに Elution Buffer を 60L 加える。Elution buffer がメンブレンを完全に覆うよう注意する。
・Elution buffer を６５℃に暖めておくと、収量が５％程度あがる。
27. 室温で 5 分間静置する。
28. 13,800 G ×1min. 遠心し、溶液を集める。
29. 遠心エバポレーターで水分を完全に除去する。

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ハイブリダイゼーション
・事前にハイブリダイゼーションオーブンを 42℃に設定し、ハイビリダイゼーションチャンバーを入れて暖めておく。
・ヒートブロックを 95℃に設定しておく
1.

ハイブリダイゼーション溶液を作製する（１サンプルあたりの量）
26.4 μL
10.2 μL
21 μL
0.6 μL
1.8 μL
60 μL

MiliQ 水
20×SSC
Formamide
Salmon Testes
10％SDSTotal
2.

乾固した標識 cDNA に 1 の溶液を加えて溶解する。

3.

95℃ 5 分間熱変性する。

4.

室温で 30 分間放置（遮光）5.

マイクロアレイをキムタオルの上に置き、ギャップカバーグラスをかぶせて 5 の溶液を脇から流し込む。(プローブは切り込みがある方とは反対側にスポットされています)6.

42℃、over night でハイブリダイゼーションを行う。

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ポストハイブリダイゼーション
・次の濃度の Wash buffer を事前に用意する。
Wash buffer 1 : 2 ×SSC、0.03% SDS
Wash Buffer 2 : 0.2× SSC
Wash Buffer 3 : 0.05 × SSC
アレイ洗浄用容器（染色バッド）に上記 Wash Buffer を満たしておく。また別の染色バッドにMiliQ 水を満たしておく。
1.

インキュベータからハイブリチャンバーを取り出す。

2.

Wash Buffer 1 の中で１枚ずつカバーガラスをはずす。

3.

カバーガラスのはずれたスライドガラスを、Wash Buffer 1 を満たした洗浄用容器内のスライドガラスホルダーにセットする。

4.

Wash Buffer 1 の中で１５分間室温で、振とう洗浄する。

5.

洗浄が終わったら、キムタオル上で数回振って、水分を切る。
（乾燥させないよう、手早く行う）

6.

Wash Buffer ２の中で５分間室温で、振とう洗浄する。

7.

キムタオル上で数回振って、水分を切る。

8.

Wash Buffer ３の中で５分間室温で、振とう洗浄する。

9.

キムタオル上で数回振って、水分を切る

10. MiliQ 水中で ３－４回上下する。
11. 800 rpm x 2 min 遠心し、乾かす。
12. すぐに画像化しないときは、遮光バックスにいれ、なるべく早く画像化する。

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製品についてのお問い合わせ先
株式会社ファームラボ Fermlab Inc.
Tel 03-5500-6248 Fax:03-5500-6272 E-mail:query@fermlab.com

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