中国の発酵ハム｢金華火腿｣から分離した糸状菌の同定及び酵素活性(中国の金華火腿に関する研究、第 2 報)
和久 豊* ･ 角田潔和** ･ 進藤 斉** ･ 小泉武夫***株式会社ビオック(〒441 愛知県豊橋市牟呂町内田 111 ｰ 1)**東京農業大学醸造学科(〒156 東京都世田谷区桜丘 1 ｰ 1 ｰ 1)
Identification

andEnzymeActivity

of

Molds

Isolatedfrom

ChineseFermented Food “Jinhua Huotui “( A study on a Chinese fermented food “Jinhua Huotui” partⅡ)

YutakaWAGU*,

Toshitaka KAKUTA**,

Hitoshi

SHINDO**,and Takeo KOIZUMI***Bio'c Co.,Ltd., 111 ｰ 1, Uchida Muro-cho, Toyohashi-shi, Aichi**Department

ofAgriculture,

1-1-1,“Jinhua

Huotui”

BrewingisandFermentation,Tokyosakuragaoka,

setagaya-ku,

Tokyo

a traditional

fermented

food

441

University

of

156,

produced in China.

Thisstudy aims at the identification ofmolds from “ Jinhua Huotui ” and theinvestigation of their enzyme activities .

They were identified 30 strains of genes

Penicillium and 25 strains of genes
aurantiogriseum,othersfour

versicolor,P. solitum,

kinds

of

A. sydowii,

other three kinds ofAspergillus. From genus Penicillium, P.

P. implicatum,molds

P.viridicatum ,P. fellutanum andwere identified.

From genes Aspergillus,

A. candidus, Eurotium rubrum,molds were identified.

E.amstelodami

A.
andAs to enzyme activities, genus

Penicillium showed strong acidic protease activity, and, genus Aspergillus showedstrong neutral and alkaline protease activities. Especially, A.ochaceus

has strong

protease activity as compared to standardstrain of A. oryzae. Genus Penicillium

showed stronger lipaseactivities than genus Aspergillus. Especially, P. fellutanum ,P.canescens

had very strong lipase activities. As to

α-amylase and phoshataseactivities, all isolated molds from “ Jinhua Huotui “ showed low activities.
There results showed that genus Asperillus played the main rolefor decomposition of protein, and genus Penicillium played the main role fordecomposition of lipid in “ Jinhua

Huotui金華火腿は中国で製造されている伝統的発酵食品である．火腿製造における微生物の役割を解明することを目的に，本報では分離糸状菌の同定及び酵素活性について検討した．
火腿の糸状菌は Penicillium 属，Asper-gillus 属のみで構成されていた．30 株の Penicillium
属より，P.aurantiogriseum，P.solitum，P.implicatum，P.viridicatum，P.fellutanum，
他 4 種類の菌が，25 株の Aspergillus 属では A.ochra-ceus，Eurotium repens，A.sydowii，E.amste-lodami 他 4 種類が同定された．また，分離糸状菌 249 株について酵素活性を検討した．その結果，プロテアーゼは Penicillium 属が酸性側で，Aspergillus 属が中性・アルカリ側で強力であった．特に A.ochraceus は，標準株(A.oryzae）のプロテアーゼに比べても強力な活性を有していた.リパーゼは Penicillium 属が全般に強く，特に，P.fellutanum，

P.canescens が強力な活性を有していた．しかし，α-アミラーゼ・ホスファターゼは全体にその活性は低くかった．以上より，金華火腿における蛋白質の分解には Aspergillus 属が，脂質の分解には Penicillium 属が主として作用していると推察した.
金華火腿（以下火腿）とは 800 年前より中国浙江省金華地方で豚生肉に微生物を増殖させて製造され，高級な中華料理のだしなどに使用されている発酵ハムの一種である．火腿の最も大きな特長として，製造に通常の肉加工品で行われる加熱・くん煙の行程が無く，微生物による発酵工程があることが大きな特徴である．筆者らは火腿製造における微生物の作用について解明することを目的として研究を進めている．前報１）では火腿の一般成
分と微生物相について検討し，火腿の一般成分の特長として水分含量が 23.9％と低く，遊離アミノ酸（特にグルタミン酸）および 5'−イノシン酸が豚もも肉に比べ多いこと,微生物
相は糸状菌が最も多く，次いで細菌・酵母の順であることを明らかにした．この様に分離
微生物の中で糸状菌が優勢なことや，中国では火腿製造中にカビが発生しないと火腿の味・風味が向上しないと言われていることから，糸状菌の品質への関与が示唆される．本報では火腿より分離した糸状菌の同定を行うと共に，火腿の各種成分の生成に関与していると思われる分離糸状菌のプロテアーゼ，リパーゼなどの酵素活性について検討したので
報告する．

実

験 方 法

１．供試菌株前報１）で糸状菌数を測定したコロニーを MEA 培地２）に釣菌し，同培地で平板培養を繰り返し純粋分離を行い，得られた糸状菌計 249 株を実験に使用した．なお,供試菌の一部に MEA 培地で生育の悪い菌株 39 株が存在したので，純化および保存の培地として MY20
寒天培地３）を使用した．
２．糸状菌の同定
糸状菌の同定は，成書４）５）６）従って行った．特に Penicillium 属は Pitt７）８）に従い,Aspergillus 属は Raper ら９），Klich ら１０）の方法に従った.Euro- tium 属の分類については Kozakiewics１１）に従った.
３．分離糸状菌の各種酵素活性の測定
300ml 容三角フラスコにフスマ 10ｇを入れ，7.5ml の水を混合，３−１糸状菌の培養

3 時間放置後 121℃ で 30 分間加圧殺菌した．これに 25℃･7 日間培養した供試菌株を斜面培地から培地ごと菌体（約 5mm 角）を切り取り,それぞれに接種した．撹拌後，25℃･7 日
間培養を行った.途中で生育状態を均一化するため,培養 24 時間目と 40 時間目にフスマを良く撹拌した.
３−２ 酵素液の調製

分離糸状菌を培養したフスマ（原料フスマ 10ｇ，フラスコ 1

本分）に 0.5％NaCl 水溶液 50ml を加え,室温で 3 時間酵素を抽出した.次いで，東洋ろ紙
No.2 にて濾過を行い，得られた上澄液を粗酵素液とし,適宜希釈して酵素活性を測定した．
その際，標準株としてプロテア−ゼ，およびホスファタ−ゼ活性が強力な株式会社ビオッ
ク保存菌株 Aspergillus oryzae KBN1031,α-アミラ−ゼ活性が強力な A.ory- zae KBN525
およびリパ−ゼ活性強力な Eurotium repens KBN2062 を供試し，各々の酵素活性を測定した.
３−３ 各種酵素活性の測定（１）プロテア−ゼ

国税庁所定分析法注解１２）に準じて，Hammarsten のミルク

カゼイン（Merck 社） 2％溶液を基質として，反応温度 38℃，反応 pH3.0， 6.0，9.0 における活性を測定した．活性の表示は粗酵素液 1ml が 38℃１分間にＬ-チロシン１μg を生ずるプロテア−ゼ活性を１単位とした.
（２）リパ−ゼ町田ら１３）の方法に従い，オリーブ油エマルジョン（オリーブ油

25％（V/V)含有）を基質として反応温度 37℃，反応 pH7.0 における活性を測定した.活性の表示は，粗酵素液 1ml が 37℃1 分間に 1μM の脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした．
（３）α-アミラ−ゼ

国税庁所定分析法注解１４）に準じて，可溶性デンプン 1％溶

液を基質として反応温度 40℃，pH5.0 の条件で測定を行った．活性の表示は粗酵素液１mlの Wohlgemuth 値として表示した．
（４）ホスファタ−ゼ

難波らの方法１５）により準じて，10mM p-Nitrophenyl

phosphate disodium 溶液を基質として反応温度 30℃，反応 pH5.0 及び 9.0 における活性を測定した.活性は粗酵素液 1ml が 30℃ 1 時間に 1μM の p-Nitrophenol を遊離する酵素
量を１単位とした.
実
１.分離糸状菌の同定

験 結 果

供試菌株 249 株は顕微鏡観察の結果,

1）菌糸に隔壁を有する
2）分生子形成はフィアロ型
3）分生子柄先端に複数のフィアライドを群生する
4）分生子は球状〜楕円形で１細胞により形成する5）分生子は塊状とならず連鎖するという共通の特長を有していた．その中で 145 株は，コロニー表面の色が緑色系であり，また，分生子柄が直接分岐してフィアライドを形成する，あるいは分生子の先端が膨らむが柄足細胞が認められないことから Peni- cillium 属と同定した．残り 104 株は分生子柄の先端が膨大して頂のうとなり,多数のフィアライドを形成して分生子を生じること，および
柄足細胞が観察されることから Aspergillus 属と同定した．このように Peni- cillium
属,Aspergillus 属のみが火腿から検出されたのは，火腿の水分１）が 23.9％，水分活性 0.80
（コンウェイユニット法１６）による）と低い事から,比較的低い水分活性でも生育する
Penicillium 属,Asp- ergillus 属１７）が選択的に生育したためであると思われる.
(1) Penicillium 属の同定
Penicillium 属 145 株は，CYA 培地上での生育速度，コロニーの状態を観察し，9 種のグ
ループに分類した．各グループの特徴を Table1 に示した．各グループより最低一株が選択される割合で任意に菌株を選択し，計 30 株を同定に供した．
選択した 9 グループ 30 株について同定のため，CYA・ MEA・G25N２）培地上における生育速度，コロニーの状態，および顕微鏡による形態観察を行った．そのうち，培養温
度 25℃（Tab.1)を除く CYA での状態を Table 2 に示した．
P-1 は単輪生で分生子壁が滑面,生育が遅いことから P. implicatum と同定した．
P2〜5 は複輪生で，P2〜4 は Furcatum 亜属に属し， P-2 が分生子柄壁・分生子壁が滑面であることから P. fellutanum，P-3 は分生子柄壁が粗面，分生子壁が滑面であることから P.canescens と同定した．また， P-4 は分生子が球形で分生子壁が滑面であることから,P.
raistrickii と同定した．P-5 は Biverticillium 亜属に属し,ビロード状の灰緑色のコロニー
で，栄養菌糸が黄色であることから，P.variabile と同定した.
P-6〜9 は三輪生で，P-6 は青緑色のコロニーで分生子柄壁は粗面，分生子壁は滑面であることから，P.au- rantiogriseum と同定した.P-7 はビロード状の鈍緑色のコロニーで，ペニシリは密着型などから，P.soli- tum と同定した.P-8 はビロード状〜粒状のコロニーで，分生子壁が粗面などの性質から，P.viridicatum，P- 9 は鈍緑色のコロニーで分生子柄，分生子とも粗面であることから，P.echinulatum と同定した.
(2)Aspergillus 属の同定
Aspergillus 属 104 株についても，Penicillium 属の場合と同様に CYA 培地上での生育速度，コロニーの特徴から，8 グループ（A-1〜5，U ｰ 1〜3）に分別した．なお，前述のMEA 培地上で生育が悪く，MY20 寒天培地で単離および保存を行った 39 株はすべてAspergillus 属で，U-1〜3 のグループに属していた．
各グループの特長を Table3 に示した．次に 8 グループから Penicillium 属の場合と同様に供試菌 25 株を選択し，CY20S１８）・MEA 培地上における生育速度，コロニーの状態の観察，および顕微鏡観察を行った．その結果を Table4，5 に示した．
A-1〜5 の 5 グループはすべてメトレを有していた． A-1 は黄褐色の胞子を形成し，鈍い
ピンク色の菌核を形成することから A.ochraceus と同定した.A-2 は分生子の色が青緑色で生育が遅くヒューレ細胞が観察されることから A.sydowii，A-3 は菌糸の色が白色,黄色.オ
レンジ色と変化することから A.versicolor と同定した.A-4 は白い胞子を形成し，頂のうのほぼ全面をメトレが覆っているなどから，A.candidus，A-5 は生育が早く分生子柄が 1.5〜
2.0mm と長く,胞子が滑面で直径が大きいなどから，A.oryzae と同定した.
U-1〜3 の 3 グループは CY20S 培地で生育の良い好乾性な菌株で，黄色の子のう胞子を形成することから，As- pergillus 属のテレオモルフ種であり，分生子頭が放射状からやや円筒状，厚膜細胞を形成せず，柔らかい子のう果壁を持つ黄色の子のう果を多数形成する，などの特長から Eurotium 属に属すると判断された．
U-1〜3 の形成する子のう胞子はいずれも 6μm 以下であり，U-1，2 は子のう胞子赤道面での溝は明確でなく，U-3 は，子のう胞子赤道面に溝が明確に観察された． U-1 は子のう
胞子表面が滑面で，コロニーの裏面の色が暗褐色であることから Eurotium rubrum，U-2はコロニーの裏面の色が黄橙色，分生子頭が 150-180μm と大きく，子のう果の上方に形成されていることから, E.repens と同定した.U-3 は子のう胞子の表面が粗で，子のう果の形成が分生子に比べ優勢である事から,E. amstelodami と同定した.
以上の同定結果より求めた,火腿分離糸状菌 249 株の菌種の構成比を，Table6 に示した．
P.aurantio- griseum が全体の 17.3％を示し，次いで P.solitum が 11.6％，A.ochraceus が11.2％，A.sydowii が 8.8％となっていた．畜肉製品から分離された糸状菌として,ハム･ソーセージから E.rubrum，P.vari- abile１９），発酵型サラミソーセージから P.viridi- catum，A.versicolor,A.candidus２０）などが報告されている．また Ciegler ら２１）は今回分離された P.viridicatum を発酵型サラミソーセージの主な加工菌の１つとして報告している．
火腿と同様に糸状菌を生育させ製造するかつお節から分離された糸状菌として,宇田川ら
２２）は，A.repens， A.oryzae，A.ochraceus，E.amstelodami，P. aurantiogriseum，P.echinulatum，P.steckii， Monilia sp，谷川ら２３）は A.candidus，A.sydo- wii などを報告している．この様に，火腿より分離された菌株とハム・ソーセージ・かつお節などから分離報告されている菌種は近似しており肉基質に生育する共通の菌と推察した.
火腿は 800 年前より食用とされており，また，前報１）の通り，火腿からアフラトキシン（G１，G２，B１，B２），オクラトキシンＡ，パツリン，ゼアラレノンのいずれも検出されず，また，シトリニンもその後の検討の結果不検出であった．一方，今回分離・同定された同種の糸状菌におけるマイコトキシン生産性については，食肉由来の P.viridicatumのシトリニン生産性２４）・オクラトキシンＡ生産性２５）２６），A.ochraceus のオクラト
キシンＡ生産性２７），A.versicolor のステリグマトシスチン生産性２８）などが報告されており，今回分離同定された糸状菌についても検討が必要と思われる．２．分離糸状菌の酵素活性 Table 7 (1)プロテアーゼ活性
分離糸状菌 249 株のプロテアーゼ活性を測定した結果を Table 7 に示した. 通常生肉の極限 pH は pH5.4〜5.5２９）であり，また火腿の pH が pH5.85１）であることから，火腿のタンパク質分解は，pH6.0 でのプロテア−ゼ活性が主体を成すと思われる．pH6.0 でのプロテア−ゼ活性は Penicillium 属は低いものの，Aspergillus 属は全般に強く，中でもA.ochraceus の平均値は 363unit と特に高い値を示していた．また，標準株と比較して 2倍を越える活性を持つ菌株も 3 株存在した．このため，pH6.0 でのプロテアーゼ活性の強力な A.ochraceus の生肉蛋白質の分解への寄与が示唆された．一方，Penicillum 属のプロ
テア−ゼが酸性側で，より高い傾向を示したことについては松嶋らの報告３０）と一致した.
α-アミラ−ゼ活性を測定した結果を Table 8 に示した.分離糸状菌のα-アミラ−ゼ平均
活性は標準株に比べ約 1/20 と低く，その分布は活性の低い区分に集中していた．筋肉中のグリコーゲンは屠殺後，速やかに乳酸へと分解されること，分離糸状菌のα-アミラ−ゼが極めて低いことから，α-アミラ−ゼが火腿の品質に与える影響は少ないと推察した．
Aspergillus 属のα-アミラーゼ活性が Penicillium 属に比べ，全体として高い値となっているが，これは,A.oryzae 6 株のα-アミラ−ゼ活性が 1,000unit を越えているためであり,6 株を除いた Aspergillus 属の平均活性値は 37 となり, Penicillium 属の平均値 95 に比べ低い値となっていた.
分離糸状菌のリパ−ゼ活性を測定した結果を Table 9 に示した.供試菌 249 株のリパーゼ活性は平均 3unit となっていた.現在日本の醸造用に使用されている麹菌 (A.oryzae，A.sojae)のリパーゼ活性が 2unit 以下(データ未公開)であることから,分離された糸状菌のリパーゼ活性は比較的高い値と思われる.分離した As- pergillus 属は 2unit 以下の菌株が約70％を占め，特に活性が強力な菌株は認められなかった．しかし，Pe- nicillium 属にはリパーゼ活性の高い菌株が存在しており，脂肪の分解には Penicillium 属が主体となっているものと推察した．その中で，P.fellutanum，P. canescens と同定された 3 株は標準株
KBN2062 より高い活性を有していた．
高尾ら３１）によると食肉に生育した微生物の生産するリパ−ゼは脂肪をグリセリンと脂肪酸に分解し，生成された不飽和脂肪酸は空気中の酸素などにより過酸化物を生じるとされる．一方，かつお節製造では，製造中に繁殖する糸状菌の中で A.glaucus が有用菌とされるが，それは，この菌株がリパ−ゼ活性が強く，その作用が原料中の脂質を減少させるのに必要なためであるとされている３２）．火腿は長年食品として使用されており，製品に脂肪の酸化臭は認められないことから，過酸化物が多く含まれているとは考えにくく，
リパ−ゼの存在はかつお節製造時と同様に有用に働いているものと思われる．
分離糸状菌のホスファタ−ゼを測定した結果を Table 10 に示した．ホスファターゼは核酸系呈味成分を呈味性のないヌクレオシドに分解することが知られている３３）．供試菌
249 株のホスファターゼ活性は標準株 KBN1031 に比べ，pH5.0 の活性において 1/10 以下，
pH9.0 の活性は 1/50 と極めて低い値であった．このため火腿中の微生物の中で最も数の多い糸状菌のホスファタ−ゼ活性が低いことは火腿中のイノシン酸含量の保持に有効と推察した．
以上より火腿製造への糸状菌の関与はタンパク質の分解に Aspergillus 属由来のプロテアーゼが，脂肪の分解に Penicillium 属由来のリパーゼが主体に作用していることが推察さ
れた．
要

約

中国の金華火腿より分離した糸状菌の同定,酵素活性の測定を行った. (1) 火腿から分離された糸状菌は比較的低い水分活性でも生育する Penicillium，Aspergillus 属で構成されていた. (2) Penicillium 属では P.aurantiogriseum, P.solitum, P.implicatum, P.viridicatum,
P.fellutanum,他 4 種類の菌が，Aspergillus 属では A.ochraceus,E.repens,A.sydowii,E.amstelodami 他 4 種類が同定された．以上より火腿には Penicillium 属 9 種，Aspergillus 属
8 種，計 17 種の糸状菌が分布していた． (3)プロテアーゼ活性は酸性側で Penicillium 属，
中性〜アルカリ側で Aspergillus 属が強力であった． pH6.0 でのプロテアーゼ活性の強い菌種 は A.ochraceus で あ り，原 料の 分解 に関 与す る と考え られ た． (4)リ パー ゼは
Penicillium 属での活性が高く，火腿製造時における脂質の分解は Penicillium 属が主体と推察した．Penicillium 属の中では特に P.fellu- tanum，P.canescens が強い活性を有していた． (5)分離糸状菌のα-アミラーゼは全体に活性は低く，火腿の品質へ与える影響は少ないものと推察した． (6)分離糸状菌のホスファタ−ゼ活性の強い菌株は存在しておらず，そのため 5'-イノシン酸が高く維持されているものと推察した．
以上より火腿に生育する糸状菌は，その低水分活性のため， Penicillium 属，Aspergillus
属が選択的に生育し，蛋白質分解は Aspergillus 属が，脂質の分解は Penicillium 属が主体となっているものと思われた．

｢欄外見出し｣和久･他:金華火腿の糸状菌
中国の発酵ハム「金華火腿」から分離した糸状菌の同定及び酵素活性†
和久 豊*・角田潔和**・進藤 斉**・小泉武夫**｢脚注｣†中国の金華火腿に関する研究(第２報)*株 式 会 社 ビ オ ッ ク**東 京 農 業 大 学 醸 造 学 科( 〒 4 4 1 愛 知 県 豊 橋 市 牟 呂 町 内 田 111 ｰ 1 )( 〒 156 東 京 都 世 田 谷 区 桜 丘 1 ｰ 1 ｰ 1 )文献1) 和久 豊・角田潔和・進藤 進・小泉武夫：日食工誌，41,921(1994).
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G r o u p in g of P e n ic i l lu m s p . is o la t ed f r om J i nh u a Ho u t u i

Tab le 1
No. of Group

P-1

P-2

P-3

P-4

P-5

P-6

P-7

P-8

P-9

Diameter (mm)15 -20

16 -2131- 3338 -42

13 -1529 -3324 -2829 -3531- 33

Color

Greyish-greenGray

Dark-greenDull-greenGreenish
-gray

Dull
-greenDark-greenYellow-greenDark-greenTextureVel

Vel

Flo -Gra

Vel

Vel

Vel

Vel

Vel-Gra

Vel-GraSulcateRadially

Radially

Radially

Plane

Plane

Radially

Radially

Radially

Radially

Conidiogenesis

Moderate

Light

Light

Light

Heavy

Heavy

Heavy

Moderate

Heavy

−

−

−

−

−

−

−

−

−

Mycelium color

White

White

White

White

Yellow

White

White

White

White

Reverse color

Brown

Pale
-gray

Orange-brownYellow-brownOrangeOrangeBrown

Orange-brownOrange-brownExudate( color )−＋Clear＋Clear＋Clear−＋Clear−＋Brown＋ClearSolublePigment

−

−

−

−

−

−

−

−

−

Sclerotium

All plates are observed after 7days incubation on CYA at 25℃.
Vel , velutinous ;Gra , granular ; Flo ,floccose ; − , Absent, ;+ , Present

Table 2
No.

ofPenicillus

Morphologicalcharacterist ics

ofPenicillin

genus

isolatedf rom

J inhu a Huotui

Group

P-1

P-2

P-3

P-4

P-5

P-6

P-7

P-8

P-9

type

Mon

Bi

Bi

Bi

Bi

Ter

Ter

Ter

Ter

ａ）

ｂ）

ｂ）

ｃ）

ｄ）

ｅ）

ｅ）

−

−

＋

＋

−

−

＋ (1-3mm)＋ (1-3mm)＋ (5-7mm)＋ (4-5mm)

−

−

−

−

−

−

−

−

ｅ）

ｅ）

featureColonyCYA

onGermination at
5℃
Growthat

37℃

Amp 11-13
×
2.02.6

Phialides
Shape

Amp

4-8
×
2.22.4

Amp

8-10

×

Metulae

Conidia

7-11

×

12-25
×
2.2-2.6

11-22
×
2.8-3.8

Sus
2.5-3.0Ell
2.0-3.0Sph
2.0-3.0

9-12

Amp
×

11-13
×
2.5-2.8

Sph -Ell
3.0-4.5

Amp

8-11

×

-2.9

Amp 8-10
×

2.5

2.9

5-13
×
3.1-3.6

9-12

2.6-

2.2
-2.7

2.5
-3.1

12-13
×
2.9-3.3

12-14
×
2.7-3.0

10-16
×
3.5-4.7

11-22
×
3.2-3.5

Sph -Sph - Sus
3.0-5.0

Sus - Ell
3.0-4.0Sph
3.2-4.0Sus
3.0-4.0

2.0-3.0
Surface texture f )8-11

2.52.8Sus

Amp×2.52.9

−

Ace
×

2.
2-2.6

and size (μm)f)

AmpStipes

S

S

R

R

S

S-Fr

S-Fr

R

R

Conidia

S

Fr

S

S

S-Fr

S

S

S

R

P.implicatum

P.fellutanum

P.canescens

P.raistrickii

P.variabile

P.aurantio-griseumP.solitumP.viridicatum

P.echinulatum

Proposed species

Mon, monoverticillate ; Bi , biverticillate ; Ter, terverticillte ; Vel , velutinous ; Gra , granular ; Flo ,floccose ; − , No-growth,Amp, Ampulliform ; Ace, acerose ;Sus , subspherica ; Sph , spherical ; Ell , ellipsoidal ; S , smooth ;ａ） Stipes vesiculate,ｂ） Penicilliｄ）With subterminal rami,ｅ）One to two rami

terminal verticils ofNo-germination ; + , Growth,Germination

R , rough ; Fr, finely rough ; Vr , very roughmetulae, subterminal and intercalary metulae, ｃ）Penicilli

produced, borne terminally, f）Incubation on CYA 7days at 25℃

terminal

verticils of metulae,

Tabl e 3

M or ph o l og ic a l
A-1

Color

Yellow- buffc h ar ac t er is t ic sofAs p e r g i l lus

sp.

is o l a t e d

f r om

J in h u a Huot u i

A-2

A-3

A-4

A-5

U-1

U-2

U-3

Dark
-turquoise

Grey green

White

Olive brown

Grey green

Grey green

Greyish-green5 - 1210 - 13

Diameter （mm）

42 - 60

18 - 20

18 - 24

16 - 2065 - 701-

TextureVel - flo

Vel -flo

Vel - flo

Vel

Flo

Vel

Vel

Vel

SulcatePlane

Radially

Radially

Plane

Plane

Plane

Plane

Plane

Conidiogenesis

Heavy

Heavy

Heavy

Heavy

Moderate

Light

Light

Light

＋(Dull pink)

−

−

−

−

−

−

−

Mycelium color

White

White

White- buff

White

White

Yellow

Yellow-orange

White

Reverse color

Dull - yellow

MaroonBrown

Yellow

UncolorYellow

Yellow-orange

Brown

Exude

−

−

−

−

−

−

−

−

Soluble pigment

−

−

−

−

−

−

−

−

Sclerotia

A l l p l a t e s a r e o b s e r v e d a f t e r 7 d a y s i n c u b a t i o n o n C YA a t 2 5 ℃ .

7Table 4
No.

ofColonyMor phologicalGroup

on CY20Sa )on MEAa )Surface texture b )f rom

J inhua Huotui
A-5

26 - 34

3-5

4-6

20 - 2355 - 60

Diameter (mm)54 - 60

24 - 31

19 - 33

17 - 32

58 - 70

Color

Wheat,
Ochraceus

Dull green

White

Olive brown

TextureVel - floVel

Flo - gra

Flo

Flo

color

White

White

White

White

White

Reverse color

Brown

Orange brown

UncolorRed brown

UncolorYellow

at

37℃ (mm)

Diameter (mm)45 - 57

Color

Pale
Light yellow

Dark green,
Dark turquoise

16 - 32

14 - 24

Dark green
Dark turquoise

10 - 23

Greyish green

White
Pale yellow

62 - 70
Olive brown

Flo

Flo (Gra)

Vel

Gra

Flo

color

White

White

White

White

White

Reverse color

Yellow

Dull green,
Red brown

Orange brown

Pale yellow

Uncolor

VesiclesGlo ( 29 -36 )Glo ( 6 -15 )Glo ( 8 -17 )Glo ( 8-18 )Glo ( 20-40 )Phialides

10- 4 × 2-3

5-8 × 2-3

4-7×2-3

6-10×2-3

9-12×3-5

Conidia

Sph - Elll
( 2.5 - 3.2 )Sph( 2.5 - 4.0 )Sph( 2.5 - 3.5 )Sph( 2.5 - 4.0 )Sph - Sus
( 4.0 - 7.0 )StipesRSSSS - FrConidia

S

R

R

S

S

Hülle cellHülle cell

A.sydowii

A.versicolor

A.candidus

A.oryzae

Othersb )Proposed species

isolated
A-4

Mycelium

(μm)

genus

A-3

TextureShape and sizeb )Aspergillus

A-2

Mycelium

Colonyof

A-1

diameter on CYA

Colonycharacter istics

A.ochraceusａ） Incubation in 7days at 25 ℃，ｂ）Incubation

on CYA

in

7days

at

25℃

Tabl e 5No.

of

M or p ho l og ic a l

c h ar ac t er is t ic s

group

on CY20Sa)on MEA a )

40-55

38-44

35-47

Color

Yellow orange
Dull green

Red orange
Dull green

Dull green
Yellow

TextureVel

Vel - gra

Vel

Yellow

OrangeWhite,yellow

Reverse color

Pale orange

Deep maroon

Dull-green

Diameter (mm)2-8

0.9-1.2

15-24

Color

Yellow

Yellow red

Dark green

Texture

Vel

Vel

Vel

color

Yellow

Yellow red

White,yellow

Reverse color

YellowRed

Yellow green

Glo – Sug ( 20-32 )Glo - Sug ( 25-40 )Glo - Sug (15-35 )RadiateRadiateRadiate tocolumnarPhialides

7-10×4-7

7-9×3-4

6-9×3-5

ConidiaSph ( 4.5 - 9.0 )Sph ( 5.0 - 8.0 )Sph ( 3.0 - 5.0 )StipesS - FrS - FrS - FrConidia

Vr

Vr

Vr

color

Vesiclesandsize (μm)

Surface texture b )Cleistothecia c )Conidialheadf r omColor

Yellow

S – FrS - FrShapeSph-Sus

Sph-Sus

Glo

Size (μm)

70-10580-120120-145

Len(4.5-5.5×4.5-5.0)

Len(5.5-7.0×5.0-6.5)

Len(4.5-5.0×3.5-4.0)

Trace

Trace

V-shaped

S

S

R

E.rubrumE.repens

E.amstelodami

Shape andm)
Ascospore c )is o l at e d
U-3

MyceliumShapeb)g e nus

U-2

Mycelium

ColonyEu r o ti u m

U-1
Diameter (mm)ColonyofSize(μFurrow
Surface texture

Proposed species

Glo,globose ;Sug,subglobose ;Len,lenticular

J inh u a Huot u iａ） Incubation in 7days at 25 ℃，ｂ）Incubation on CY20Sｃ）Incubation on CY20S in 14days at 25℃

Ta b l e 6
Identified moldin

7days at

25℃，

Identification of mold isolated from Jinhua Huotui
Rate of total
isolated mold

Identified moldRate of total
isolated mold

(％ )

(％ )

P. a u r a n t i o g r i s e u m

17.3

A.ochraceus

11 . 2

P. s o l i t u m

11 . 6

A.sydowii

8.8

P. i m p l i c a t u m

7.6

E.repens

6.8

P. v i r i d i c a t u m

7.6

E.amstelodami

5.6

P. f e l l u t a n u m

6.0

E.rubrum

3.6

P. c a n e s c e n s

2.0

A.candidus

1.6

P. e c h i n u l a t u m

2.0

A.oryzae

3.2

P. r a i s t r i c k i i

2.0

A.versicolor

0.8

P. v a r i a b i l e

2.0
Number of total isolated mold： 249strains

Table 7

Prot easeactivit y

of

the

mold

Count
pH 3.0isolated

of

f rom

Jinhua Huotuimold

pH 6.0pH 9.0Protease
activit y

Pen.

Asp.

Total

Pen.

Asp.

Total

Pen.

Asp.

Total

0 − 100

126

100

226

137

43

180

140

44

184

101 − 200

10

4

14

8

13

21

5

5

10

201 − 300

6

0

6

0

17

17

0

19

19

301 − 400

1

0

1

0

17

17

0

14

14

401 − 500

1

0

1

0

6

6

0

9

9

501 − 600

1

0

1

0

5

5

0

9

9

701 over

0

0

0

0

3

3

0

4

4

Average of activity

42

20

33

37

175

94

22

224

105

Standard strains(Aspergillus ory zae KBN1031) act ivit y： pH3. 0,112 ； pH6.0,321 ； pH9.0,401
Protease activit y was measured under

the conditions descr ibed in Mater ials and Methods.

Table 8 α−Amylase activity of the mold isolated from Jinhua Huotui
Count

of

mold

α-Amylase
activit y

Pen.

Asp.

Total

0 − 100

87

91

178

101 − 200

51

7

58

201 − 300606301 − 400

10

1

601 Over0

6

6

Average of activity

147

71

111

Standard strains(Aspergillus oryzae KBN525) activity：2247
α-Amylase activity was measured under the conditions described in Materials and Methods.

Table 9

Lipase activity of the mold isolated from Jinhua Huotui

Lipase

Count

of

mold

Activit y

Pen.

Asp．

Total

0 −

2. 5

45

73

118

2.6 −

5.0

52

21

73

5.1 −

7.5

21

7

28

7.6 − 10.0

10

2

12

10.1 − 12.5

7

1

8

12.6 − 15.0

4

0

4

15.1 − 17.5

3

0

3

17.6 − 20.0

1

0

1

20.1

2

0

2

3.8

1.6

3.0

over

Averageof activit yStandard strain( Eurot ium repens KBN2062) activit y： 15.3
Lipase act ivit y was measured under

the conditions described in Materials and Methods.

Table 10

Phosphat ase act ivit y of mold isolated f rom Jinhua Huotui
Count

Phosphataseactivit y

Pen.

pH5.0
Asp.

Total

0 −

200

109

72

201 −

400

22

401 −

600

601 −

of

mold
Pen.

pH9.0
Asp.

Total

181

144

103

247

6

28

1

1

2

6

10

16

0

0

0

800

3

7

10

0

0

0

801 −

1000

2

6

8

0

0

0

1001

over

3

3

6

0

0

0

160

277

208

31

58

42

Average of activity

Standard strain( Asper gillus ory zae KBN1031) activit y： pH5.0； 2436， pH9. 0； 2055
Phosphatase activity was measured under the conditions described in Materials and Methods.