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医学医療分野への応用を目指した
医学医療分野への応用を目指した細胞・生細胞・生体材料のフェムト秒レーザプロセシング
体材料のフェムト秒レーザプロセシング
細川*細川 陽一郎陽一郎

Y. Hosokawa
１．まえがきることにより，細胞間の接着強度の評価が可能となっている１６，１７）．

顕微鏡下で，近赤外のフェムト秒レーザパルスを高開口数の対物レンズを通して水媒体に集光照射すると，衝撃波

このようにフェムト秒レーザ誘起衝撃力を細胞の外でが水中を伝搬し，キャビテーションバブルと呼ばれる気泡発生させ，細胞を操作する手法として適用してきており，が発生する．これは，集光点における多光子吸収に起因し，現在その医療技術への展開を模索している．本稿では，こフェムト秒レーザを用いると非熱的なプロセスによってのフェムト秒レーザと AFM を用いた細胞・生体材料の操これが引き起こされる．また，キャビテーションバブルの作・計測技術を診断技術と治療技術へ展開しようとする試

膨張，収縮にともなう応力波が水中に発生し，伝搬する．

みについて紹介する．

この応力波は，マイクロメートル程度の微小物体に撃力として作用し，物体を変位させる（図１）．
我々は，数～数十マイクロメートルの空間に局在するこの撃力に注目し，高い空間選択性を利用して，その大きさに相当する物体である動物・植物細胞の操作手法を開発してきた１）．この撃力をフェムト秒レーザ誘起衝撃力と称し，細胞パターンの形成２－４），光穿孔による細胞への分子導入５－８），マイクロチップ内での細胞選別９，１０）といった応用研究を展開してきた．
さらに，互いに接着している細胞の近傍にフェムト秒レーザを集光照射することで，細胞を破壊することなく分離することに成功している１１）．このときにレーザ誘起衝撃

図 1 フェムト秒レーザ誘起衝撃力の概略図

力によって付加された力を定量化できれば，細胞間の接着強度を定量評価できると考えた．しかし，従来の手法では，微小領域に局在するレーザ誘起衝撃力を定量化すること

２．診断技術への展開は非常に困難であった．たとえば，撃力を定量評価する代表的な手法にハイドロフォンを用いた計測があるが

１２，１

我々は，診断技術へのフェムト秒レーザ誘起撃力の適用

３），そのヘッドの大きさは最小でも数百マイクロメートル技術として，超高速セルソータの開発を進めている９，１０）．

程度であるため，レーザ誘起衝撃力の定量化には不適であ細胞群から特定の細胞を高速に分取し，個別に細胞を解析る．また，高速カメラを用いて衝撃波のフロントを観測すすることを可能にしたセルソータは，近年の細胞生物学のることによって衝撃波を定量評価する手法もあるが

１４），研究において不可欠な装置であり，より高速かつ高純度な衝撃波だけでなくキャビテーションバブルの発生と消失細胞分取技術の確立が望まれている．現在，マイクロキャによる力学的作用を含むレーザ誘起衝撃力に対しては，こピラリ中を流れる細胞を液滴に閉じ込め，その液滴を振りの手法も不適である．

分ける方法が分取に用いられているが，この方法では高速

そこで原子間力顕微鏡（AFM）の探針（カンチレバ）に化と高純度化に限界がある．マイクロチップ中を流れる細注目し，独自の局所応力計測システムを開発した１５－１８）．

胞を極めて短時間の外力で直接操作して分取することがこのシステムでは，AFM カンチレバを微小な板バネとみできれば，この限界を超えられると考え，我々はその外力なし，水媒質中に浸漬した状態で，レーザ誘起衝撃力をカとしてフェムト秒レーザ誘起衝撃力を用いることに挑ん

ンチレバの振動として直接検出する．その振動に基づき，でいる．

カンチレバに作用したレーザ誘起衝撃力およびレーザ集図２にそのシステム構成を示す．蛍光活性型セルソータ

光点において発生した衝撃力を定量化する．本手法を用い(Fluorescence activated cell sorter)では，回収したい細胞を蛍* 奈良先端科学技術大学院大学
物質創成科学領域

教授

先端科学技術研究科- 69 -光標識し，蛍光検出された細胞に外力を加え，その細胞を号遅延時間（Δt）の依存性とレーザ強度依存性を調べ，流分取する．本システムでは，顕微鏡ステージ上に配置され路中にある微小球の空間選択性を評価した（図５）．このたマイクロ流体チップに，蛍光励起用レーザを集光し，マ示す条件では，フェムト秒レーザが蛍光励起用レーザの下イクロチップ中を流れる細胞の蛍光が，光検出器で検出さ流 13 µm に集光されており，1 m/s の微小球の速度から予れると，その検出信号をトリガとしてフェムト秒レーザを測される理想条件の Δt = 13 µs で分取成功率が最大となり，Δt = 10 – 20 µs の間で，微小球は回収用流路に導かれ出射するようになっている．

ることが示された．10 µs の時間で，微小球はその直径に相当する 10 µm の距離を流れるため，この結果は前後に光電子増倍管ある微小球にほとんど影響を及ぼさずに，標的となる微小信号処理
蛍光検出オシロスコープ（しきい値処理）

パルスジェネレータ（信号遅延）

球のみに衝撃力を作用させて分取できることを示している．

トリガー信 号

微小球の流速は 1 m/s であり，本実験結果よりフェムト高速度カメラ

対物レンズ（NA: 0.46）

水銀ランプ

フェムト秒レーザ（分取用）(<400 fs, 1040 nm,1 MHz, 1 μJ/pulse)
コリメータ

秒レーザ誘起衝撃力によりマイクロチップ中で，１秒間に最大１０万個の微小球から標的微小球を分取できることが実証された．本手法でより小さな物体を高速に流すこと

半導体レーザ（蛍光励起用）（488 nm, 40 mW）

により，さらなる高速分取性能が期待でき，その潜在性能はマイクロキャピラリを用いた従来法を遥かに上回ってシリンジポンプいる．

図２ フェムト秒レーザ誘起衝撃力を用いた高速細胞分取システム

図３に示すように，マイクロ流体チップは３分岐になっており，蛍光を発しない細胞は中央の流路（Waste）に流れるが，蛍光を発する細胞は，フェムト秒レーザ誘起衝撃力により，右下側の流路（Collection）に導かれる．フェムト秒レーザ光源として，1 MHz の繰り返し周波数を持つイッテルビウムフェムト秒レーザ増幅器を用い，このパルス

図４ 蛍光微小球分取の高速撮影像列から単発のフェムト秒パルスを抽出し，細胞近傍に照射することで分取をおこなった．

分取成功率 [%]

100

図３ マイクロチップ内の流路での細胞分取の概要

500

図４に疑似細胞試料として 10 µm の蛍光ポリマー微小球を試料として用いた実験例を示す．蛍光励起用レーザにより検出された微小球の近傍にフェムト秒レーザが照射され，集光点で発生した衝撃力により微小球は押され，下側の回収用（Collection）流路に導かれた．このような分取の成功率を蛍光検出からフェムト秒レーザ照射までの信- 70 -1.0 μJ/pulse

各点
n=500102030Δt [μs]図５ 蛍光検出からレーザ照射までの信号遅延時間(Δt)と分取成功率の関係

３．治療技術への展開

本実験で測定された衝撃力の伝搬速度は，筋組織中の応レーザの治療技術への最たる応用はレーザメスである

力波の速度約 1.5 – 1.7×103 m/s と概ね一致した．骨中の振が，レーザメスの欠点として，術者である医師に，メスで動伝搬速度は 3.0 – 4.0×103 m/s 程度であると報告されてお生体を切断している感覚が返らないことが指摘されていり，このような振動伝搬速度の解析により，レーザが肉組る．術者が油断するとレーザは目的としない部位まで切断織に照射されているか，骨組織に照射されているかを見分してしまう危険性がある．それを避けるために近畿大学のけることができる．

橋新らは，レーザが生体に照射された際に発する音響波を検出し，その情報が術者に帰還されることを提案している．
一方で我々は，これまでにレーザが生体材料を切断した際に生じる音響波を AFM により高感度に検出する手法を開発しており１９－２０），この技術をレーザメスの機能向上に結びつける検討を始めている．
図６に AFM によるフェムト秒レーザ誘起衝撃力計測の概要図を示す．顕微鏡上に据え付けた AFM ヘッドによってカンチレバ（バネ定数: 0.2 N/m）を肉組織表面に接触させた．チタンサファイアフェムト秒レーザ増幅器（800 nm,150 fs）から出射されるパルス光を，メカニカルシャッタにより切り出し，20 倍対物レンズを通して AFM 探針近傍に照射した．レーザ照射により誘導される肉組織の振動をAFM 探針により検出する．探針の先端には検出用レーザが照射されており，探針の変位によるレーザ光線の進行方
図７向の変位を４分割フォトダイオードで検出し，その振動をオシロスコープにより検出する．

フェムト秒レーザ誘起衝撃力による生体組織の振動挙動．x は、レーザ集光点と AFM 探針の距離

図６ フェムト秒レーザ誘起衝撃力により肉組織を伝搬すると考えられる振動と AFM によるその振動計測
集光点とカンチレバ間の距離を変化させてパルス光を集光照射し，振動挙動を AFM カンチレバによって検出した結果を図７に示す．集光点とカンチレバの距離が遠くな
図８ 振動波の到達時間のレーザ集光点と AFM 探針の距離依存性

るにつれて振幅が小さくなり，衝撃力の強さが減衰していることが分かる．振動波形の概形から，振動波形は複数の周波数成分を含んでおり，各測定点においてレーザ集光点を起点とする同一の振動伝搬を計測できていることが分かる．衝撃力が伝搬する速度を測定するために，初めて測今後さらに，周波数成分の分析に取り組み，部位などに定場所に到達する振動に着目し（図中の矢印），図８に示

よって硬さや弾力が異なる種類の試料に対して同様の実す振動波の到達時間のレーザ集光点と AFM 探針の距離依験を行うことで，より高速かつ高精度に生体組織の機械特存性について調べた．伝搬波が到達するまでの時間は，距性から見分ける手法の開発に取り組んでいこうと考えて離が遠くなるにつれて伝搬するまでの速度が遅れており，いる．

傾きから，試料中の振動伝搬速度は約 2.0×103 m/s であることが分かる．

- 71 -謝in a microfluidic chip by directional femtosecond laser

辞impulse, Sens. Actuators A, 297, (2019), 111566.

本研究の一部は，公益財団法人天田財団の一般研究開発
助成 AF 2016225 によっておこなわれたものであり，ここ10) T. Iino et al.: High-speed microparticle isolation unlimited
by Poisson statistics, Lab on a Chip, 19, (2019), 2669–2677.に感謝の意を表します．本研究本研究の遂行にあたり，本実験を実際に遂行いただきました飯野敬矩博士，山川健氏，

11) Y. Hosokawa, J. Takabayashi, T. Omoto, T. Adachi, K.

萩原宏規氏，荒木崇志氏，前田祐希氏，井上一輝氏，釣優Fujiyama, T. Seki, and H. Masuhara: Nondestructive

香博士，および関係諸氏に感謝します．

Manipulation of Single Live Plant Cell by Laser Induced
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