東京慈恵会医科大学

東京慈恵会医科大学 教育・研究年報 2018年版

管機能検査 update】機能性ディスペプシアの診断．
消化器・肝臓内科 2019；5(2)：147 55．

バイオフィルム研究センター

Ⅲ．学会発表1）江崎裕敬，綾部誠人，政木隆博，越智小枝，目崎喜弘，中山律子，池脇克則，松浦知和．循環器病専門ク
リニックの受診者を対象とした空腹時 13C グルコース教

授：金城（細菌学講座）

2）政木隆博，松浦知和，江崎裕敬，目崎喜弘，越智小枝，中村まり子，中山律子．非アルコール性脂肪性肝謝研究会．米子，７月．
3）中村まり子，政木隆博，目崎喜弘，横山教

授：矢永勝彦消化器外科

教

授：丸毛啓史膝関節外科，骨・靭帯の生化学

教

授：上園教

授：穎川

教

授：岩本（感染制御科）

腹時 13C glucose 呼気試験による肝臓インスリン抵抗性の検討．第 10 回日本安定同位体・生体ガス医学応用学会大会．横浜，９月．

感染症，感染化学療法，薬物の安全性（外科学講座（消化器外科））（整形外科学講座）

寛，松浦知和．肥満・Ⅱ型糖尿病発症モデルラットを用いた空学

授：堀炎症例における空腹時 13C glucose 呼気試験による肝臓インスリン抵抗性の評価．第５回肝臓と糖尿病・代誠治

感染免疫学，細菌学，真菌教

呼気試験を用いた肝臓インスリン抵抗性の検討．第５回肝臓と糖尿病・代謝研究会．米子，７月．

雄樹

晶一（麻酔科学講座）晋（泌尿器科学講座）

武夫

小児麻酔，心臓血管外科麻
酔，肺高血圧の診断と治療
前立腺癌，
泌尿器悪性腫瘍，腹腔鏡手術
生化学・分子生物物理（基盤研究施設（分子細胞生物学）
）

教

授：髙田

耕司

分子細胞生物学，病態生化学

教

授：海渡健

准教授：岩瀬忠行

細菌学，分子生物学

准教授：杉本真也

細菌学，分子生物学

准教授：堀野哲也

細菌感染症，HIV 感染症，抗菌化学療法（国領校（生物学研究室）
）

臨床血液学

（臨床検査医学講座／中央検査部）（細菌学講座）（細菌学講座）（感染制御科）准教授：荒屋潤准教授：長堀隆一

呼吸器病学（内科学講座（呼吸器内科））（心臓外科学講座）

後天性心疾患の外科，心疾患の基礎的研究講

師：田嶌亜紀子

細菌学，分子生物学

講

師：奥田賢一

細菌学，分子生物学

講

師：村井

法之

生化学，分子生物学

講

師：河野

緑

（細菌学講座）（細菌学講座）（分子生物学講座）（臨床検査医学講座）

臨床微生物学

教育・研究概要
本センターは基礎と臨床が共同し，臨床検体から分離したバイオフィルムの細菌叢を網羅的に解析し，バイオフィルム形成における各細菌の役割と疾患との関連性を解明することにより，バイオフィルム感染症に対する診断法・予防法の開発を目指している。
また，バイオフィルム形成メカニズムの解明とバイ― 322 ―電子署名者 : 東京慈恵会医科大学
DN : cn=東京慈恵会医科大学, o, ou,
email=libedit@jikei.ac.jp, c=JP
日付 : 2020.02.01 13:17:40 +09'00'

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オフィルム形成を阻害する物質の探索を行い，バイルムが観察されたのに対し，Δオフィルム感染症治療薬の開発を目指した研究を推なバイオフィルムが観察され，Δ進している。

薄く平坦なバイオフィルムが観察された。この結果

株では厚く平坦Δ

株ではは，Eap が複雑なバイオフィルムの構造形成に寄与
Ⅰ．次世代シーケンサーを用いた中心静脈カテーテ
ルに付着した細菌 DNA の網羅的解析
細菌の 16S rDNA を標的とした次世代シーケンシング（NGS）によりカテーテル関連感染症（CRI）の原因菌の同定を行い，従来の培養法との比較を行った。対象とした 156 例中 125 例は症状のないルーチン除去であり，31 例は CRI の疑いで CVC が除去された。CVC から抽出した DNA から細菌 16SrDNA の PCR による増幅を行い，NGS による解析を行った結果，156 例中 14 例（9.0％）が NGS 陽性であった。14 例中９例は CRI が疑われたグループであり，５例はルーチン除去グループであった。
CRI が疑われたグループにおいて NGS と培養法の結果はよく一致し，感度と特異度はそれぞれ 80.0％と 76.9％であった。培養法と NGS がともに陽性であった４例において，培養法によって検出された細菌はすべて NGS でも検出された。
そのうち１例では，培養法ではのみが同定された が，NGS で は Klebsiella に 加 え Staphylococcusと Enterobacteriaceae が検出された。一方，ルー
チ ン 除 去 グ ル ー プ に お け る NGS の 偽 陽 性 率 は，4.0％と低かった。結論として，細菌の 16S rDNAを標的とした NGS による CVC 検体の細菌組成解析により CRI の原因となる病原体を検出することができ，CRI の診断に応用できる可能性が示唆された。
Ⅱ．バイオフィルムの立体構造における分泌タンパ
ク質 Eap の重要性
附属病院で患者から分離された MRSA 臨床分離
株 MR23 は，分泌タンパク質 Eap を多量に含むタンパク質性のバイオフィルムを形成する。これまでの研究で，１．Eap と細胞壁アンカータンパク質
SasG がバイオフィルム形成量を規定する上で Redundant に機能すること，２．SasG は細胞壁に共有結合した状態でバイオフィルム形成に寄与すること，３．SasG は DNA に結合し，その分解を抑制すること，４．との二重遺伝子欠損株はカイコに対する病原性が低下することを見出した。
次に，RNA に結合する蛍光プローブであるチオフ
ラビン T を用いてバイオフィルムを染色し，共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果，野生株やΔ株では分厚く凹凸の大きいバイオフィすることを示唆している。以上より，Eap と SasG
はバイオフィルムの形成量の点では相補的に機能するが，バイオフィルムの立体構造構築の点では異なる機能を有することがわかった。従来の研究では，バイオフィルム形成に関わる単一の分子に着目したものが主であったが，今後，単一の分子だけでなく複数の分子を同時に解析することで，バイオフィルム形成の分子機構の理解が一層深まると考えられる。
Ⅲ．バイオフィルム内での RNA の安定化のメカニズム
黄色ブドウ球菌は，健常者の３割に常在する細菌である。しかし，高いバイオフィルム形成能を有するため，血管内留置カテーテルや人工関節などの生体内に挿入された人工物にバイオフィルムを形成し，難治性感染症を引き起こす。このような感染症に対する新しい予防・治療法の開発には，バイオフィル
ム形成の分子基盤の理解が重要である。黄色ブドウ球菌が形成するバイオフィルムの構成成分として，多糖，タンパク質，DNA については，これまでに多くの解析がなされている。我々は，附属病院の臨床検体から分離された MRSA の MR10 株を用いて，RNA がバイオフィルムの構成成分であることを見出した。しかし，環境中では容易に分解されやすいRNA がバイオフィルム内で安定的に存在できる機序は明らかでなかった。本研究では，MR10 株の多糖産生量が多いことに着目し，多糖と RNA の関係について，共焦点レーザー顕微鏡による局在観察と表面プラズモン共鳴法による相互作用解析を行った。
その結果，RNA は細胞外多糖と結合することでバイオフィルム内に局在していることが分かった。また，MR10 株のゲノム DNA を次世代シーケンサーで解析し，既知の黄色ブドウ球菌のゲノム DNA と比較したところ，黄色ブドウ球菌の DNase/RNase活性を規定する遺伝子が完全に欠損していることが分かった。そこで，黄色ブドウ球菌 Newman 株 の intact なを プ ラ ス ミ ド に 連 結 し，MR10 株で発現させたところ，バイオフィルム形成が顕著に阻害された。以上より，バイオフィルム内での RNA の安定的な保持には，多糖の産生だけでなく― 323 ―の欠損も重要であることがわかった。

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Ⅳ．バイオフィルム形成に重要なアミロイド線維
Curli の形成を制御するメカニズムの解明「点検・評価」
本センターは，微生物によって形成される高次機細菌は多様なタンパク質分泌装置を保有し，これまでに９つの分泌装置が報告されている。それらの能的構造体

バイオフィルムとそれに関連した感染症を研究の対象とした本邦初の研究機関である。

文部科学省私立大学戦略的研究基盤形成支援事業
機能は菌体外酵素の分泌，毒素の産生と宿主細胞へ（2012〜の注入，DNA の取り込み，薬剤耐性プラスミドの 「バイオフィルム感染症制圧研究拠点の形成」
2016 年度）の支援を受けた研究を推進するため，伝播など多岐に渡る。なかでも，８型分泌装置はタンパク質の分泌と Curli（菌体外アミロイド線維） 本学の先端医学推進拠点群の１拠点として 2015 年の形成が共役したユニークな分泌装置である。我々４月に設立された。本センターはバイオフィルム基は，８型分泌装置の発現に必須な転写因子 RpoS お礎研究コア（リーダー：金城雄樹）とバイオフィル
よび CsgD のフォールディングと，Curli の構成タム感染症研究コア（リーダー：堀 誠治・矢永勝彦）
ンパク質 CsgA および CsgB の細胞内での品質管理の２つのコアから構成され，臨床と基礎が連携してにおいて，細菌から哺乳類まで高度に保存されたバイオフィルム感染症の制圧に向けた学内横断的なHsp70 ホモログである分子シャペロン DnaK が極研究を展開している。また，学外の研究機関（東京
めて重要な役割を果たすことを明らかにした。また， 大学，九州大学，熊本大学，筑波大学，産業技術総茶カテキン EGCG を用いた Curli 形成の阻害法を考合研究所，国立感染症研究所等）とも積極的に共同案し，その作用機序の一端を明らかにした。さらに， 研究を実施し，密に情報交換や技術移転を行っていCsgA のペリプラズムにおける品質管理において重る。さらに，留学生の受け入れや各国の研究機関（フ要な分子シャペロンとプロテアーゼを同定し，現在ランス・パスツール研究所，ポルトガル・ミンホ大学，スウェーデン・ウメオ大学，フィンランド・ヘ
それらの詳細な機能を解析中である。これらの知見は，８型分泌装置の発動メカニズムの解明に加え， ルシンキ地域開発機構）との研究交流を行い，ジョイント・カンファレンスをパスツール研究所とウメ様々なアミロイドーシス発症の理解や予防に資するオ大学で実施してきた。
ものであると考えられる。
2018 年度の特筆すべき研究成果としては，従来から取り組んでいる黄色ブドウ球菌や大腸菌のバイⅤ．大気圧走査電子顕微鏡（Atmospheric ScanningElectron Microscopy : ASEM）を用いたバイオフィルムの液中高分解能観察
ASEM は，解放環境の水溶液中で細胞を直接観察できる電子顕微鏡である。本研究では，ASEMを用いて種々の細菌の形態やバイオフィルムを観察した。重金属染色，正荷電ナノゴールドラベルなどにより，ブドウ球菌や大腸菌のバイオフィルムとそれらのマトリクス成分（アミロイド線維 Curli，鞭毛，菌体外 DNA，分泌タンパク質 Eap，分泌小胞など）を高い分解能かつ自然に近い状態で観察することができた。また，附属病院で分離されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌臨床分離株 MR23 のバイオフィ
ルム形成に関わる分泌タンパク質 Eap および細胞壁アンカータンパク質 SasG の遺伝子欠損株を作製し，そのバイオフィルムの構造を ASEM を用いて比較した。その結果，Eap のみが菌の凝集体形成において重要な役割を担うことを明らかにした。さらに，JST ERATO プロジェクトの一環として，属細菌や属細菌の Dish 表面への付着過程を ASEM を用いて観察することが出来た。
今後，様々な研究分野に本手法が応用されることが期待される。

オフィルム形成機構および患者から抜去された中心静脈カテーテルに付着した細菌叢の網羅的解析が上げられる。
これらの成果は，本センターが主体となって４報の英文原著論文として報告した。そのなかには，編集者が選ぶ Editor s Picks に選出されたものや雑誌の表紙を飾ったものも含まれる。また，臨床講座との共同研究も着実に成果を上げ，英文原著論文２報が掲載された。現在，投稿中もしくは投稿準備中の成果もあり，今後も継続的な研究成果の発信が期待できる。さらに，競争的資金の獲得に向けた取り組みを積極的に行い，文部科学省科学研究費補助金，AMED，JST ERATO，および各種財団助成金の獲得にも繋がっている。以上のように，本センターの活動は国内外から評価され，本邦におけるバイオフィルム研究の重要拠点として認知度も高まってきている。今後も，学内外の研究機関との共同研究をさらに活性化させ，最新の研究成果を継続的に発表していくとともに，若手研究者の育成にも尽力していくことが望まれる。

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研究業

績

フィルム研究の魅力．実験医 2018；36(16)：2823．

Ⅰ．原著論文1）Sugimoto S, Arita Morioka K１）２）(１ Fukuoka Dent

Ⅲ．学会発表Coll), Terao A, Yamanaka K２）, Ogura T２）(２ Kuma-

1）杉本真也，山中邦俊１），小椋

光１）（１ 熊本大），水moto Univ), Mizunoe Y. Multitasking of Hsp70 chap-之江義充．８型分泌装置に依存する Curli 形成の制御

erone in the biogenesis of bacterial functional amy-機構の解明．第 15 回 21 世紀大腸菌研究会．南陽，５月．

loids. Commun Biol 2018 ; 1 : 52.

2）米本圭吾，千葉明生，杉本真也，斎藤2）Arita Morioka K１）２）, Yamanaka K２）, Mizunoe Y,樹，丸毛啓史，水之江義充．Redundant and distinct

Tanaka Y１）(１ Fukuoka Dent Coll), Ogura T２）(２ Ku-roles of secreted Eap and cell wall anchored SasG inmamoto Unvi), Sugimoto S. Inhibitory effects ofbioﬁlm formation and pathogenesis of. 第 32 回日本バイオフィルム学会学術集会．宇Myricetin derivatives on curli dependent bioﬁlm formation in. Sci Rep 2018 ; 8(1) : 8452.

充，金城雄

都宮，７月．

3）Abe M１）２）３）, Kinjo Y, Ueno K１）, Takatsuka S１）,

3）奥田賢一，長堀隆一，山田聡美，杉本真也，佐藤主Nakamura S１）, Ogura S３）, Kimura M３）, Araoka H３）４）,

税１），佐藤真理１）（１ 産業技術総合研究所），岩瀬忠行，

Sadamoto S , Shinozaki M , Shibuya K (橋本和弘，金城雄樹，水之江義充．ペースメーカーよ５）

５）

５） ５

TohoUniv), Yoneyama A３）４）(３ Toranomon Hosp, ４ Oki-

り分離されたnaka Memorial Inst Med Res), Kaku M (イオフィルムの生化学的性質と構造．第 32 回日本バ２） ２

Tohokuが形成するバ

Univ), Miyazaki Y１）(１ NIID). Diﬀerences in ocular

イオフィルム学会学術集会．宇都宮，７月．

complications betweenand non al-4）Sugimoto S, Arita Morioka K (Fukuoka Dent

infection analyzed by epidemiologyColl), Terao A, Yamanaka K１）, Ogura T１）(１ Kuma-bicans

and a mouse ocular candidiasis model. Front Microbi-moto Univ), Mizunoe Y, Kinjo Y. Regulation of bacte-ol 2018 ; 9 : 2477.

rial amyloid biogenesis by molecular chaperones and4)Okuda K, Yoshii Y, Yamada S, Chiba A, Hironaka I,proteases. International Symposium on Pro-Hori S, Yanaga K, Mizunoe Y. Detection of bacterial

teins ; from the Cradle to the Grave . Otsu, Aug.

DNA from central venous catheter removed from5）金城雄樹．（大会企画シンポジウム：アゲラスフィ

patients by next generation sequencing : a prelimi-ン か ら 始 ま っ た NKT 細 胞 研 究 と， そ の 最 前 線 ）nary clinical study. Ann Clin Microbiol Antimicrob

NKT 細胞を介する生体防御．第 62 回日本薬学会関2018 ; 17(1) : 44.

東支部大会．東京，９月．

5）Takatsuka S １）, Inukai T １）, Kawakubo S １）２）

6）金城雄樹，上野圭吾１），定本聡太２），篠崎( Waseda Univ), Umeyama T , Abe M , Ueno K ,大谷淑子

Hoshino Y１）, Kinjo Y, Miyazaki Y１）, Yamagoe S１）大），澁谷和俊２）（２ 東邦大），宮﨑義継１）（１ 国立感染

２１）

１）

１）

，柳原

１）
３）

尚，清水公徳 （１）３）３） ３稔２），東京理科(１ NIID). Identification of a novel variant form of症研究所）．（シンポジウム３：真菌と宿主攻防の最前CalC and generation of anti線）クリプトコックス・ガッティの莢膜多糖による免CalC monoclonal antibodies. Med Mycol J 2019 ;疫回避機構及び樹状細胞ワクチンを用いた感染防御機構の解析．第 62 回日本医真菌学会総会・学術集会．

60(1) : 11 6.
6）Ueno K , Urai M
１）( Tokyo Univ Agriculture),

１）
２） ２

Sadamoto S３）, Shinozaki M３）, Takatsuka S１）, Abe M１）,

東京，９月．
7）杉本真也．大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）を用い

Otani Y１）４）, Yanagihara N１）４）, Shimizu K４）, Iwakura

た複合微生物集団の構造と機能の統合的理解．JST 野Y４）(４ Tokyo Univ Sci), Shibuya K３）(３ Toho Univ),

村 ERATO 集団微生物制御プロジェクト会議．つくば，

Miyazaki Y１）(１ NIID), Kinjo Y. A dendritic cell

９月．

based systemic vaccine induces long lived lung resi-8）Chiba A, Mizunoe Y, Kinjo Y, Sugimoto S. Extra-dent memory Th17 cells and ameliorates pulmonary

cellular RNA contributes to robust bioﬁlm organiza-mycosis. Mucosal Immunol 2019 ; 12(1) : 265 76.

tion. 8th ASM (American Society for Microbiology)
Conference on Bioﬁlms. Washington, D.C., Oct.

Ⅱ．総9）Sugimoto S, Arita Morioka K１）, Terao A, Yamana-説1）杉本真也．News & Hot Paper Digest 細菌から発ka K２）, Ogura T２）(２ Kumamoto Univ), Tanaka Y１）

見されたセルロースの新規な修飾．実験医 2018；(１ Fukuoka Dent Coll), Kinjo Y, Mizunoe Y. Regula-36(11)：1880 1．

tion of bacterial amyloid biogenesis by multitasking2）杉本真也．Opinion こんなところにも！？バイオmolecular chaperon DnaK. 8th ASM (American Soci-― 325 ―東京慈恵会医科大学 教育・研究年報 2018年版

ety for Microbiology) Conference on Bioﬁlms. Washington, D.C., Oct.
10）岩瀬忠行，金城雄樹．バクテリオファージ由来遺伝
子 pmoAB による宿主細菌の遺伝子発現と病原性のコントロール．第 135 回成医会総会．東京，10 月．
11）米本圭吾，千葉明生，杉本真也，斎藤充，金城雄樹，丸毛啓史，水之江義充．黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成と病原性における Eap と細胞壁にアンカーした SasG の多様な機能の解明．第 33 回日本整形外科学会基礎学術集会．奈良，10 月．
12）林﨑浩史，金城雄樹，大石和徳（国立感染症研究所）．
抗 PspA 抗体による肺炎球菌排除機構の解析．AMEDACT M 班会議．大阪，10 月．
13）金城雄樹．（教育講演８）肺炎球菌感染症：ワクチンの研究．第 67 回日本感染症学会東日本地方学術集会・第 65 回日本化学療法学会東日本支部総会合同学会．東京，10 月．
14）杉本真也，山中邦俊１），小椋光１）（１ 熊本大），水之江義充，金城雄樹．バイオフィルム形成に重要なバ
クテリア細胞外アミロイド形成の制御機構．第 41 回
日本分子生物学会年会．横浜，11 月．
15）米本圭吾，千葉明生，杉本真也，斎藤充，金城雄樹，丸毛啓史，水之江義充．黄色ブドウ球菌のバイオ
フィルム・病原性における分泌タンパク質 Eap と細胞壁アンカータンパク質 SasG の多様な機能の解明．
第 41 回日本分子生物学会年会．横浜，11 月．
16）金城雄樹．NKT 細胞のαガラクトシルセラミド類似
細菌糖脂質の認識および感染免疫における役割．第24 回日本エンドトキシン・自然免疫研究会．横浜，
12 月．
17）Takatsuka S１）, Hayashizaki K, Ueno K１）(１ NIID),
Kubo M (Tokyo Univ Sci), Kinjo Y. The critical roleof IL 21＋ NKT cells in the formation of germinal
center B cells by a protein based pneumococcal vaccine. 第 47 回日本免疫学会学術集会．福岡，12 月．
18）吉井悠，奥田賢一，山田聡美，永倉茉莉，杉本真也，長野哲雄１），岡部隆義１），小島宏建１）（１ 東京大），岩本武夫，水之江義充．プロゲスチンによる黄色ブド
ウ球菌バイオフィルム形成メカニズム．第８回家畜感染症学会学術集会．福岡，12 月．
19）金城雄樹．（特別講演１）高病原クリプトコックスに対する感染防御機構．第２回東北医真菌研究会．仙台，12 月．
20）金城雄樹，高塚翔吾１），川久保俊１），林﨑浩史，宮﨑義継１）（１ 国立感染症研究所）．糖脂質に着目した肺炎球菌感染防御．第５回糖鎖免疫研究会．東京，２月．

― 326 ―