ノロウイルス検便検査（リアルタイムRT-PCR法）において試験成立を担保する新規内在性コントロールの開発○齋藤 憲介１）、左近 直美２）
１）タカラバイオ株式会社、２）大阪健康安全基盤研究所

第44回日本食品微生物学会学術総会

本研究の背景および目的
背景1. ＜PCR法を用いた検査での留意事項＞①試料は正しく調製されたか②PCR反応液への試料の添加量は十分であったか③作業者の手技に問題はなかったか（試料の添加ミス等）⇒ 「偽陰性」のリスクに直結、試験全体の信頼性に関わる。
背景2. ＜内在性コントロール (Endogenous Control: EC)の活用＞
 COVID-19検査では、試料中のターゲット以外の特定遺伝子を検出する
EC を利用し、試験精度の管理が求められた。
⇒遺伝子検査におけるECの必要性・重要性は今後益々高まるだろう。

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本研究の背景および目的
目的
 ノロウイルス検便検査用ECとして、ヒト腸内で優勢な菌種をターゲットとするEC反応系を構築する。
 検体によらず安定した結果が得られること
 環境細菌由来の非特異的増幅を極力抑えること 上記を満たすEC反応系の構築により、以下のことが可能になる。
 PCR反応系への試料添加有無の正確な判別 偽陰性判定リスクの低減

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材料および方法

NoV: ノロウイルス材料＜NoV遺伝子型既知の検体（10%便懸濁液）より得られた核酸＞
 抽出法①：NucleoSpin® Virus（製品コード U0983B）●GI陽性 6検体 ●GII陽性 8検体 ●陰性 14検体
 抽出法②：MagLEAD 12gC (PSS社)および専用試薬●GI陽性 4検体 ●GII陽性 29検体 ●陰性 4検体
 陰性対照として、検体の代わりにH2Oを核酸抽出操作に供したもの。
＜検量線作成のための標準物質＞
 NoV定量用鋳型：Norovirus (GI/GII) Positive Control DNA（製品コード RR251A）⇒1反応当り10~1×10^7コピーとなるよう希釈・添加した。
 EC鋳型：標的配列を有するゲノムDNA ⇒一定量（1×10^4コピー）を添加した。

4材料および方法

NoV: ノロウイルス

方法＜cDNA作製＞ 10%便懸濁液より得られた核酸について、TaKaRa qPCR Norovirus (GI/GII) Typing Kit Ver.2（製品コード RR265A）のコンポーネントを用いて、取説に従い反応を行った。

＜リアルタイムPCR＞

抽出法①由来cDNA

試験①：EC単独の反応系の実検体評価

試験③：NoV＋EC マルチプレックス反応系の実検体評価

試験②：NoV反応系とEC反応系の反応干渉の確認⇒前述の標準物質を用いた検量線作成による評価

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抽出法②由来cDNA

試験①：EC単独の反応系の実検体評価 - 方法 PCR反応液調製＜EC単独反応系＞
qPCR Mix

12.5 µl

EC検出用Primer/Probe Mix

2.5 µlRNase Free H2O

8.0 µlcDNA

2.0 µlTotal

25.0 µl NoV反応系には、TaKaRa qPCR Norovirus(GI/GII) Typing Kit Ver.2（製品コードRR265A）のコンポーネントを使用した。

リアルタイムPCR
 PCR条件は、TaKaRa qPCR Norovirus (GI/GII) Typing Kit Ver.2（製品コードRR265A）の反応条件を設定した。

95℃ 10秒
95℃

5秒

56℃ 30秒

645サイクル Thermal Cycler Dice® Real Time System III（製品コードTP950）を使用した。

試験①：EC単独の反応系の実検体評価 - 結果  GII陽性検体（便懸濁液）
NoV (FAM)

 陰性検体（便懸濁液）

EC (FAM)

GI陽性

GII陽性陰性 NoV・GI陽性8検体、GII陽性8検体、NoV陰性14検体のすべてにおいて、安定してECが検出された。
 なお、核酸抽出操作の陰性対象やNo Template Controlでは、非特異的増幅は確認されなかった。

7（大阪健康安全基盤研究所にて実施）

試験②：NoV反応系とEC反応系の反応干渉の確認 - 方法 PCR反応液調製＜GI or GII単独反応系＞＜NoV+ECマルチプレックス反応系＞

qPCR Mix

12.5 µlqPCR Mix

12.5 µl

GI*2 or GII*3検出用Primer/Probe Mix

2.5 µlGI*2 or GII*3検出用Primer/Probe Mix

2.5 µlRNase Free H2O

8.0 µl

EC検出用Primer/Probe Mix

2.5 µl

鋳型DNA (NoV)

2.0 µlRNase Free H2O

3.5 µlTotal

25.0 µl

鋳型DNA (NoV)

2.0 µl

鋳型DNA (EC)

2.0 µlTotal

25.0 µl*2 GI primer: COG1F, COG1R
GI probe: RING1-TP(a), RING1-TP(b)*3 GII primer: COG2F, ALPF, COG2R
GII probe: RING2AL-TPリアルタイムPCR
 PCR条件は、TaKaRa qPCR Norovirus (GI/GII) Typing Kit Ver.2（製品コードRR265A）の反応条件を設定した。

95℃ 10秒
95℃

5秒

56℃ 30秒

845サイクル Thermal Cycler Dice® Real Time System III（製品コードTP950）を使用した。

試験②：NoV反応系とEC反応系の反応干渉の確認 - 結果 ＜GI単独反応系＞＜GI+ECマルチプレックス反応系＞＜GII単独反応系＞＜GII+ECマルチプレックス反応系＞

 NoV反応系とEC反応系を組み合わせ、NoV定量用鋳型を用いて検量線を作成した。
 EC反応系およびEC鋳型存在下でも、直線性の高いNoV検量線を作成可能であった。
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試験③：NoV＋EC マルチプレックス反応系の実検体評価 - 結果 NoV・GI (FAM)

EC (Cy5)

NoV・GII (FAM)

EC (Cy5)

GI陽性
4検体

陰性

4検体GII陽性
29検体

陰性4検体

 実検体においても、NoV陽性/陰性検体によらず、概ね安定してECが検出された。
 なお、核酸抽出操作の陰性対象やNo Template Controlでは、非特異的増幅は確認されなかった。
10（大阪健康安全基盤研究所にて実施）

考察・まとめ考察
 前項にて顕著にCt値が遅れた1検体は、0歳児の検便であった。
⇒乳児の腸内細菌叢は成人と異なっており、本系で標的とした菌種の存在比が低かったと推測される。

まとめ ノロウイルス検便検査用ECとして、ヒト腸内で優勢な菌種をターゲットとするEC反応系を構築した。
 本系は、NoV陽性/陰性検体によらず安定して検出されながら、環境細菌由来の非特異的増幅が生じにくい。
 本系の活用により、試料添加の有無が正確に判別可能となり、偽陰性判定リスクの低減が期待される。

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ご清聴ありがとうございました。タカラバイオブースにもぜひお立ち寄りください。