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生殖生理に関する研究手法と水産重要魚種の再生産研究高度化への応用
清水昭男＊Application of Physiological and Biochemical Methods to the
Advanced Study of Reproductive Biology in Resource Fishes
Akio SHIMIZU＊

Abstract Physiological and biochemical application to biology of resource fishes is an
important matter for improving estimation and management of the resources. The female reproductive system is based on the integration of three systems; germ cell generating system (the ovary), the reproductive endocrine system, and the vitellogenic system.
Specific chemical staining such as periodic acid-Schiff (PAS) reaction and immunochemical procedure such as immunostaining are convenient methods for detecting molecular markers of these systems. In the ayu, PAS staining evidently improved identificationand detection of time-course changes of post-ovulatory follicles. In acanthopterygian
fishes, universal antisera for immunocytochemical identification of FSH cells and LH cells
have recently been obtained, and being successfully used for evaluating the activities of
two different gonadotrophs in resource fishes such as mackerel, saury, and flounder. In
the saury, antisera against vitellogenin can also be used for immunocytochemical evaluation of vitellogenenic activity. Further integrative studies on the three systems will be
important for improving evaluation of biological properties of resource fishes.
Key words: reproductive physiology, endocrinology, ovary, post-ovulatory follicle,
gonadotropin, vitellogenin, immunocytochemistry, reproductive parameter

1. はじめにる抗体）の開発等によってこの問題も解決が見えつつある。本総説では，生理生化学的指標を用いた水産重

魚類の生殖活性評価に関する生理学的，分子生物学
的パラメータは原理的には様々なものが考えられ，実

要魚種の再生産研究高度化の具体例を，将来的な可能性を含めて述べる。

験魚類等では実際に多くの分子指標が使われているが，水産重要魚種に現時点で利用可能なものは多くない。

2. 真骨魚類雌における生殖現象とその内分泌支配

近年のバイオテクノロジー等の著しい発達によって潜在的な可能性は極めて大きなものがあるが，水産重要

生理生化学的手法を水産重要魚種の再生産研究高度

魚種への適用に関しては，生体分子の種間差の問題等化に効率よく応用するためには，生殖現象の内分泌支から応用面が著しく遅れていた。しかしながら，ユニ配を十分理解することが必要である。雌魚の成熟過程

バーサル抗体（ある物質に対する抗原抗体反応を，広とその内分泌的調節機構に関しては詳しい総説があり

い範囲の生物群由来のものに対して起こすことのでき（会田，1989；会田ら，1991；長濱，1991；高野，1989），2006年 1 月 6 日受理（Accepted on January 6, 2006）* 中央水産研究所 236-8648 横浜市金沢区福浦2-12-4 （National Research Institute of Fisheries Science, Fukuura, Kanazawa, Yokohama 2368648, Japan）．

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清水

昭男

本特集号（松山，2006）の記述にもあるのでここではヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン，17α，20β，21トリ

簡単に述べる（図 1 ）。魚類の成熟関連の最上位中枢はヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン等）が産生され，雌に間脳の視床下部（特に視索前野）にある。成熟開始時

おいては卵母細胞の最終成熟を促進する。最終成熟が期になると，そこの特定のニューロンから生殖腺刺激

完了した卵は成熟卵または完熟卵と呼ばれる。

ホルモン放出ホルモン（GnRH，10アミノ酸よりなる卵母細胞の最終成熟時に起こる現象は魚種によってペプチドホルモン）の分泌が促進されると考えられてかなりの差異があり，統一的な説明は困難である。最いる（奥澤，1991；天野，2006）。このニューロンの軸

終成熟の根元的な定義は「媒精した場合に正常に受精

索は脳下垂体中に伸びており，脳下垂体の生殖腺刺激して発生が可能になること」であるが（長浜，1991），

ホルモン分泌細胞を刺激して 2 種類の生殖腺刺激ホル

これは実際には確認が難しい。共通するのは，第 1 減

モン（GtH）を分泌させる。GtHには濾胞刺激ホルモ数分裂の前期にあった核（大型なので特に胚胞とよぶ）

ン（FSH）及び黄体形成ホルモン（LH）の 2 種類がが中期に移行することによって核膜が消失する現象であり，どちらも分子量約 3 万の糖タンパク性ホルモン

あり，胚胞崩壊（GVBD，Germinal Vesicle Break-である。逆にGtHの分泌を抑制する視床下部因子も知down）と呼ばれる。しかし，GVBDが完了してもさられている（ドーパミン，GnIH等）。

らに形態的変化が続く場合も多い。従って，「GVBD

生殖腺刺激ホルモンは血液中に放出されて卵巣に達が完了して一連の外観上の変化が一時的に停止したもし，卵巣の濾胞細胞中に存在するステロイド産生細胞の」が実際的な定義となろう。ただし，完熟した卵もを刺激する。この刺激によって，卵巣ではエストロジェ

排卵あるいは産卵されずに時間が経過すると，油球分ン（エストラジオール17β）が分泌される。エストロ

布の異常等特有の形態変化を伴う過熟と呼ばれる現象

ジェンは肝臓を刺激してビテロジェニン（分子量数十が起こり，正常発生能が低下または消失する（足立，万のホスホリポ糖タンパク）を活発に合成させる。血2000）。卵成熟の段階で多くの魚では主として卵黄タン中に出されたビテロジェニンは卵巣の濾胞細胞と卵膜

パクの部分分解によって，卵黄球の融合，透明化，吸を通して卵母細胞中に取り込まれ，リポビテリンとフォ

水による卵径の著しい増大が起こる。このため，成熟スビチン，β'コンポーネントの 3 種類のタンパク質に卵のことを透明卵，吸水卵と呼ぶことも多い。しかし開裂し，卵黄物質となる。

ながら，魚種によってはこの過程がほとんど起こらな

最終成熟期の近辺においてはエストロジェンの産生

い場合もあり，成熟卵すなわち透明卵及び吸水卵とすは弱まり，黄体ホルモン系ステロイド（17α，20βジるのは正確ではない。また，以上の定義からも，透明図 1 ：真骨魚類の雌成魚における生殖現象の内分泌的制御機構．

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生殖生理に関する研究手法と再生産研究への応用
卵や吸水卵は肉眼観察の結果に用い，成熟卵あるいはの発現量が優れたマーカーとなっているが，mRNAは

完熟卵は，顕微鏡観察等により胚胞崩壊等の細胞学的非常に壊れやすく，屋外サンプリングには困難を伴う。

変化を確認した場合について用いるべきであろう。もこのため水産重要魚種に対しては，mRNAに対応する

ちろん，同一魚種で肉眼観察と組織学的観察を併用，

cDNA塩基配列情報を基にして作成した抗体によって，比較することによって，透明化あるいは吸水した卵が対応するタンパク質の免疫化学的検出を行うことが有成熟卵であることが明らかになっている場合はこれら効な戦略の一つである（表 1 ）。
実験魚類においてはステロイドホルモンも重要な成の用語を広く用いて良いと考えられる。
卵母細胞の最終成熟後，排卵（濾胞壁が破れて卵母熟関連の指標であるが，低分子のため，組織学的に局細胞が卵巣腔または体腔内に排出されること）が起こ在を調べることが困難である。従って，この物質の作る。排卵には生殖腺刺激ホルモン及びプロスタグラン

用に関する適切な評価には血中濃度を測定する必要がジンが働いている。 残された濾胞組織は排卵後濾胞あり，採血を伴うため，現在のところ水産重要魚種に（Post-Ovulatory Follicle；POF） となり， 徐々にま用いるにはあまり適しているとは言えない。しかしなたは急速に（魚種や水温条件によって異なる）退縮す

がら，真骨魚類の主要な雌性ホルモンは実質上エストる（栗田，2006；松山，2006）。

ラジオール17βのみ，最終成熟を誘起する黄体ホルモ
ン系ステロイドも17α，20βジヒドロキシ-4-プレグネ

3. 生殖現象の生理・生化学的評価に有用な分子指標

ン-3-オン，17α，20β，21トリヒドロキシ-4-プレグネ
ン-3-オンのほぼ 2 種類のみであり，同一系統のホルモ

上記のように，成熟は生殖腺と関連器官との密接なンでも魚種によってアミノ酸配列が微妙に異なるタン連携のもとに進行する現象であるため，生殖活性評価

パク系ホルモンと違って，魚種の違いによる分子の差のための分子指標についてもこのことを考慮すべきでをあまり考慮しなくて良いという長所がある。今後，技術の発達により，飼育魚を用いた再生産パラメーターある。

の評価が普遍的に行えるようになれば，これらのステ

雌魚における生殖現象の生理学的評価に有用な分子

ロイドホルモンも指標として非常に有用であろう。

指標の起源としては， 卵巣そのもの， 卵黄タンパク（ビテロジェニン）合成−蓄積系，生殖内分泌中枢（脳1）排卵後濾胞及び脳下垂体）の 3 つが挙げられる。これらの 3 系統
はそれぞれ密接に関連して働いており総合的に考える

排卵後濾胞の存在は古くから知られており，その出ことが重要であるが，最初の段階としてはそれぞれの現が産卵の確たる証明となることから生殖生物学上極系に特有な分子指標の探求が必要である。卵巣においめて重要である。特に近年は，新鮮な排卵後濾胞を検ては，排卵後濾胞の高感度高精度検出，ブロモデオキ

出することによってDEPM （Daily Egg Production

シウリジン標識（DNAラベリング）による生殖細胞分Method）法で資源量の直接推定が可能なことが示さ裂活性の評価，生殖細胞や濾胞細胞のアポトーシス検れ， 資源生物学上も重要な指標物となっている

出等が候補として挙げられる。その他の系においても，（Lasker, 1985；栗田，2006；松山，2006；渡邊，2006）。

生殖腺刺激ホルモン等の各種ペプチドホルモンやビテ

排卵後濾胞の検出には通常はパラフィン切片の光学

ロジェニン等，組織特異的に発現する分子，DNAラベ

顕微鏡観察法を用いる。しかしながら，通常のヘマト

リングによる細胞分裂活性の測定，アポトーシス特異

キシリン-エオシン染色では，新しい排卵後濾胞は検出

的DNA断片等が有用な分子マーカーとして期待できる。

可能であるが，退縮するにつれて他の結合組織との区

また，マーカー分子が発現−作用するどの段階で検出・別が困難になり，判別不可能になることに限界があっ評価するかも問題である。実験生物においてはmRNAた。一方，近年になってPAS（Periodic Acid Schiff；

表 1 . mRNAとタンパク質の分子マーカーとしての特徴
安定性

機

能

配列決定

定

量

局

在

mRNA

極めて不安定翻訳後容易（cDNA）

ノーザン解析
定量的PCR

in situ
バイブリダイゼーション

タンパク質

比較的安定

自身

容易でない

RIA, EIA, FIA

免疫組織化学

cDNA シークエンスデータの情報を用いて抗体を作成し，免疫化学的に同定，定量するのが有効．

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清水

昭男

多糖類及びその関連物質に特異的な染色法）染色を行可能になると考えられる。現在，サンマにおいて肝臓えば判別の感度が著しく上昇することが明らかとなっの抗ビテロジェニン抗体による免疫染色が可能となった。完成した濾胞細胞は 1 層ではなく，結合組織性のて お り 図 2 - b）， ま た ， ELISA （Enzyme Linked

夾膜細胞層と立方上皮性の顆粒膜細胞層とよりなって

Immunosolvent Assay） による血漿中ビテロジェニ

おり，その間に非細胞性の基底膜が存在する。これはンの測定系の開発が進行中で（原と巣山，私信），近い

多糖類を多く含むためPAS反応に強陽性である。非常

将来にはこの両者の解析及び比較が行えるようになるに薄いために未排卵濾胞では強拡大しないと観察しづ見込みである。

らいが，排卵後は濾胞層全体が著しく収縮するために卵巣組織そのものでは，現在の成熟状態がわかって基底膜も凝縮し，観察が非常に容易になる（図 2 - a）。

も，それがどの方面に向かっているか，すなわち成熟

また，非細胞性のため再吸収も一般に遅れるので，アに向かうか退縮に向かうかは必ずしも判断がつけがた

ユではPAS染色を行うことによって古い排卵後濾胞もい。卵黄合成活性の評価が出来るようになれば，それ検出可能となり，退行段階の異なる新旧 2 種類のあるがかなりの程度まで可能になると思われる。実際，カいは 3 種類の排卵後濾胞を区別できるようになって，ダヤシにおいては，産卵期前の魚を成熟促進条件（高多回産卵が直接的に証明でき，バッチ産卵数の変化が温長日）に移した場合，GSI上昇等の生殖腺の発達が明らかになる等，産卵回数に関する知見が著しく向上した（Shimizu et al., 2005；清水ら，未発表）。古い
排卵後濾胞の検出に関しては，退行卵との鑑別が重要であるが，退行卵には卵膜の残滓が必ず含まれており，アユの場合はこの残滓は長期間残り，しかも基底膜とは染色性や形態が異なるため，判別可能である。他の魚種に関しては，両者の形態的な変化を十分に把握して判別の可能性を確かめることが必要である。
より高度な手法としては排卵後濾胞に特異的に出現する分子を検出する方法が考えられる。メダカでは，特異的なプロテアーゼ（ゼラチナーゼB）が排卵後濾胞にのみ存在することが知られており（Matsui et al.,2000）
，近縁なサンマにおいても抗メダカゼラチナーゼ
B抗体による免疫染色によって排卵後濾胞が染色されることがわかっている（清水ら，未発表）。しかしながらその反応は弱く，実用性に関しては今後の改良を待つ必要があるようである。
2）ビテロジェニン
ビテロジェニンは卵の栄養蓄積に直結する物質であり，この動態は生殖活性の評価に重要である。実験魚等においては，一般的な卵黄合成活性の評価には，血漿中のビテロジェニンを免疫化学的に測定することが多い。しかしながら，このためには採血が必要であり，水産重要魚種への適用としてはサンプリング実施上困
難な場合がある。このような場合には，肝臓の組織標
本を抗ビテロジェニン抗体で免疫染色してその動態を調べる手法が考えられる。
肝臓の組織像と血中ビテロジェニン量との関連に関しては今のところ十分な知見が得られているとは言えないが，同一種において血中ビテロジェニン量と肝臓組織像との対応を確かめておけば，将来的には免疫組
織化学のみによって卵黄合成活性の評価を行うことも

図 2. ：生殖活性評価のための各種特異的染色．a：アユの古い排卵後濾胞（中央部の 2 個）のPAS染色像．凝集した基底膜が強く赤染している．b：抗サンマビテロジェニンで免疫染色を行ったサンマ肝臓．茶色部分がビテロジェニンの免疫反
応．c：二重免疫組織化学により染色を行ったマミチョグ下垂体のFSH細胞（青色）とLH細胞（茶色）．

生殖生理に関する研究手法と再生産研究への応用

67認められる前に血中ビテロジェニン濃度の上昇が起こらかとなっている。また，ELISA系などの開発によるることが明らかにされている（Koya et al., 2003）

定量法の確立やin vivoまたはin vitro 投与実験等による生理作用の解析がGtHの機能を明らかにするには必

3）生殖腺刺激ホルモン（GtH）

須であり，今後の研究展開に待つところが多い。

前述のとおり，生殖腺刺激ホルモン（FSHとLH）（2）生殖腺刺激ホルモンの産生細胞の検出とその動態

は生殖現象の大部分に関与している非常に重要な下垂組織切片中のFSH及びLHを特異的に染める一般染体ホルモンである。真骨魚類におけるこのホルモンは，

色法は知られていない。従って，それぞれの生殖腺刺従来はLHに相当するもの一つのみが知られていたが，激ホルモン分泌細胞の検出には免疫組織化学等の手法

1988年にFSHに相当する分子（当初はGtH-Iと呼ばれ，が必要である。以前は，それぞれのGtHに対する特異

従来からのLHに相当する分子はGtH-IIと呼ばれた）的抗体が一部の魚種でしか得られておらず，染色可能が発見され，四足動物と同様，魚類においても 2 種類

な魚種が少ないことが問題であったが，cDNA塩基配の分子があることが明らかとなった（Suzuki et al.,

列情報（Lin et al., 1994）を利用し，アミノ酸配列の1988a）。現在のところ，大部分の魚類において 2 種類

保存性の高い領域に対応した合成ペプチドを抗原に用の生殖腺刺激ホルモンが存在するものと考えられていいたユニバーサル抗体の利用により， 棘鰭上目魚類

る。哺乳類においては，FSHとLHは同一の細胞で産（スズキ目，カレイ目，フグ目，カダヤシ目，ダツ目等

生されると考えられているが，多くの魚類では別々のを含む巨大な分類群） ではほぼ染色が可能となった細胞で産生されている（Nozaki et al., 1990；小林と（図 2 - c; Shimizu et al., 2003a,b）。また，これらの孫，2000；Shimizu et al., 2003b）。しかし，近年に抗体を用いることによって，棘鰭上目魚類に属する水なって，FSHとLH両方を産生する細胞を持つ魚種の産重要魚種（マサバ，ゴマサバ，サンマ，ヒラメ等）

存 在 も 報 告 さ れ て い る （García-Hernádez et al.,の 2 種類の生殖腺刺激ホルモン分泌細胞の同定と分布

2002; Shimizu et al., 2003）。

密度等の測定が可能となった（清水ら，未発表）。

（1）生殖腺刺激ホルモンの生理作用

マミチョグ（北米原産のカダヤシ目広塩魚）の脳下

魚類の脳下垂体を摘出するといかなる成熟状態の魚

垂体の観察により，生殖年周期に伴って，FSH細胞とでも生殖腺の急速な退縮が起こり，短期間のうちに極LH細胞のそれぞれが特徴的な変化を示すことが知られめて未熟な状態となってしまうという古くからの実験ている（Shimizu et al., 2003c）。特に，初秋（産卵結果からも，ほとんど全ての成熟現象にGtHが直接あ期終了後）の最も未熟な時期においては，FSH細胞はるいは間接的に関わっていることは明らかで，卵母細当歳魚，1 歳魚ともわずかである一方，LH細胞は 1 歳胞の成長，卵黄蓄積，ステロイド合成，卵成熟，排卵

魚ではかなり存在するが，当歳魚ではわずかしかない等の調節に関与していると考えられている（小林と孫，ことが判明しており（清水，未発表），経産魚と未産魚

2000；田中，1991）。

の区別に使える可能性がある。また，長期にわたり多2 種類のGtHの動態を調べることによって，卵黄合回産卵を行うハゼの一種チチブにおいて，産卵期の前成活性と同様に，成熟がどの方面に向かっているかを期と後期では主要なGtH細胞（恐らくLH細胞；この報知る手がかりになりうる。現在のところ，最大の問題

告の時点では，魚類のFSHはまだ知られていなかった

は，FSH，LHそれぞれの生物活性が良く分かっていためGtHと表現されている）の微細構造が異なること

ないこと，すなわち，GtH全体の役割としては比較的が明らかにされており（Kaneko et al., 1986），個体

理解がなされているが，サケ科魚類を除いてFSHとLH

毎の産卵履歴の指標になりうる可能性が示唆される。

の役割分担がほとんどわかっていないことである。大さらに，カダヤシにおいては，産卵期前の自然条件か部分の魚類において，最終的な卵成熟にはLHが重要な

ら成熟促進条件（高温長日）に移行後，生殖腺に変化働きをしていることは予想されているが（松山，2006），の現れていない時期（ 3 日後）において既にFSH細胞

他の生殖現象に関しては，わずかな報告間の比較でもの増加が観察されており（Koya et al., 2003），成熟状

魚種による相当の違いがあり （Suzki et al., 1988b;

態変化のより鋭敏な指標となることが期待できる。

Kagawa et al., 1998, 2003; Van Der Kraak et al.,

また，本特集号の記述（奥沢，2006）にあるように，

1992），魚類全体におけるFSHとLHの役割分担はかな

初回成熟においては視床下部―脳下垂体系の発達がキー

り多様である可能性がある。

ポイントとなっており，将来的には初回産卵年齢の変

後述のユニバーサル抗体を用いた免疫組織化学的方法によると，同様の成熟状態の魚でも，魚種によって2 種類のGtH細胞の分布密度が著しく異なることが明動を解析する手段としても活用可能と考えられる。
（3）生殖腺刺激ホルモンの精製と定量
生殖腺刺激ホルモンの生理作用の研究や，生殖腺ホ

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清水

昭男

ルモン血中濃度の測定には，原則としてホルモンの精

糸口をつかみ，時期特異的なマーカー分子の検出法の製が必要である。従来は，大量の脳下垂体の入手に大開発等，実際的な応用研究を行うとともに，3系統間をきな労力や費用を有すること，糖鎖部分の不均一性に仲介する分子に関する基礎的研究を進めることが重要基づく分離の困難性，精製途中におこるサブユニットである。これをもとに仲介分子の機能と動態の解明と解離，FSH及びLH特異的な生物活性評価の困難性のいう次の研究段階に進むことが可能となり，将来的に問題等のため，精製（特にFSHとLHの分離）が難しは本格的な統合的研究が行えるようになってくるもの

かったが，cDNA情報を利用した抗ペプチド抗体の利と思われる。

用や高速液体クロマトグラフィーの活用（特に疎水ク
4. おわりに

ロマトグラフィーの利用）によってこれらの問題も解決可能となってきた（Shimizu and Yamashita, 2002）。
また，バイオテクノロジーの発達によってリコンビナ

水産重要魚種の生物特性に関する知見は，生態学的ントホルモン（遺伝子導入によって人為的に生産した特性に関しては研究の蓄積がかなりあるが，生理学的ホルモン）の利用も将来的には期待できる（吉崎ら，

特性については研究が極めて少ない。生理学的パラメー

2000）。現在，血中LH濃度の測定系は様々な魚種で開ターは，遺伝子工学，バイオテクノロジー，ポストゲ

発されているが，血中FSH濃度の測定系はサケ科魚類

ノム研究などの成果を活用することが出来るため，通（Govoroun et al., 1998; Prat et al., 1996; Suzuki

常の生態学的手法では検出不可能な差異や変化を精度

et al., 1988c）を除いて得られていない。これは，血良く検出することが可能である。従って，将来の研究

中濃度測定系作製に必要なFSHの純品が得られた魚種に期待するものが非常に大きい。

が少ないことが主な原因である。しかしながら，精製

水産重要魚種（特に多獲性浮魚類）の生殖内分泌学

法の発達やリコンビナントホルモンの利用などによっ的研究は，従来ほとんど手が付けられて来なかった分て，今後は 2 種類のGtHの動態が多くの魚種で明らか

野で，現在始まったばかりの段階である。言うまでもにされるようになるであろう。

なく，これらの魚種を用いることに対する手法上の困難性によるものであるが，資源評価対象魚種において

4）将来の統合的研究に向けてABC算出値の妥当性が求められており，その精度向上

以上において代表的なものを例示した生殖生物学上が今後必須の課題であること，このために生物学的知

重要な 3 系統であるが，将来的には，生殖システムと見のさらなる向上が求められていることを考えると，して統合的に解析−評価してゆくことが望ましい。現

この方向の研究の重要性は今後ますます増大して行く在のところ，水産重要魚種，特に大部分の多獲的浮魚ものと考えられる。
文類の生殖生理学的研究は著しく遅れており，統合的研

献究以前の個々の研究，すなわち，生理生化学的手法を用いた生殖腺の構造と機能に関する研究，生殖内分泌会田勝美，1989：成熟・産卵の内分泌支配，「水族繁殖

系及び卵黄合成系に関する生理学的研究等がまだ始め学」（隆島史夫，羽生られたばかりの段階である。従って，具体的な統合的

65-102.

研究のイメージをここに示すことは困難であるが，最も近いステップとしては，これら 3 系統の活性（見かけ上を含む）の乖離を見出し，その差を解析することが挙げられる。生殖現象がこれら 3 系統が密接に協同して働いている現象であれば，単純に，これらの活性功編），緑書房，東京，pp.

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