水研センター研報，第14号，7−20，平成17年
Bull. Fish. Res. Agen. No. 14, 7‑20, 2005

報 文

有害赤潮原因藻に感染する２本鎖 DNA ウイルス（HaV, HcV）ならびに
本鎖 RNA ウイルス（HcRNAV）の各種生物に対する安全性評価試験＊1

外丸裕司 ・片野坂徳章＊2, ＊3＊4＊5・小谷祐一 ・吉田吾郎 ・山中 聡＊5＊5
山口峰生 ・長崎慶三

＊2

・田辺博司

＊2

・

Effects of viruses infecting harmful algae, HaV, HcV and HcRNAV onbivalves, zooplankton, seaweeds, fishes, and a mouse＊1＊2, ＊3＊4＊5

Yuji TOMARU , Noriaki KATANOZAKA, Yuichi KOTANI , Goro YOSHIDA , Satoshi
＊2
＊2
＊5
＊5
YAMANAKA , Hiroshi TANABE , Mineo YAMAGUCHI , and Keizo NAGASAKI

Abstract Harmful bloom-forming algae,（Hada）Hada（Raphidophyceae）andHoriguchi（Dinophyceae）cause a mass mortality ofcultured fish and bivalves, respectively. In recent years, a double-stranded DNA（dsDNA）
virus HaV infectious to, and a dsDNA virus HcV and a single-stranded RNA（ssRNA）virus HcRNAV, both infectious towere isolated from natural
seawaters in Japan. These viruses have some important characteristics suitable as microbiological algicidal agents. However, from the viewpoint of risk management, evaluation of
their effects on various organisms is essential to assess the possibility of their use for eliminating the harmful algal blooms. In the present study, we have evaluated effects of the viruses on marine organisms（bivalves, zooplankton, seaweeds and fishes）and mammals（amouse）, and revealed that there was no significant acute toxicity against the tested organisms through the experiments. These results suggest that the algal viruses are safe for other organisms.
Key Words：Red tide, Algal virus, Acute toxicity, Safety緒言いる。また，カナダ，ニュージーランド，チリ等でも，ラフィド藻の一種である（Hada）Hada は，亜熱帯，温帯から亜寒帯にかけての沿岸域に分布する。日本では春から秋にかけて沿岸で濃密な赤潮を形成し，カンパチ（）等の養殖魚類の死亡を引き起こすことが知られて赤潮によるマスノスケ（）等の養殖魚類の死亡が報告されている（Honjo, 1993）。
二枚貝を特異的に殺す渦鞭毛藻
Horiguchi は，1988年に高知県浦ノ内湾で初めて確認された新種赤潮プランクトンである（Hori-

2004年10月25日受理（Received on October 25, 2004）＊1
NEDO 特 別 研 究 員， 瀬 戸 内 海 区 水 産 研 究 所 〒739-0452 広 島 県 佐 伯 郡 大 野 町 丸 石2-17-5 （National Research Institute of Fisheries andEnvironment of Inland Sea, 2-17-5 Maruishi, Ohno, Saeki, Hiroshima 739-0452, Japan）＊2
株式会社エス・ディー・エスバイオテック つくば研究所 〒300-2646 茨城県つくば市緑ヶ原2-1 （SDS Biotech K.K, Midorigahara 2-1, Tsukuba,
Ibaraki 300-2646, Japan）＊3
現所属：Hitech ㈱ 〒530-6025大阪府北区天満橋1-8-30 （Hitec Co. Ltd., 1-8-30 Tenmabashi, Kita, Osaka 530-6025, Japan）＊4
中央水産研究所 〒236-8648 神奈川県横浜市金沢区福浦2-12-4 （National Research Institute of Fisheries Science, Hukuura 2-14-4, Kanazawa,
Yokohama, Kanagawa 236-8648, Japan）＊5
瀬戸内海区水産研究所 〒739-0452 広島県佐伯郡大野町丸石2-17-5 （National Research Institute of Fisheries and Environment of Inland Sea,
2-17-5 Maruishi, Ohno, Saeki, Hiroshima 739-0452, Japan）

外丸裕司・片野坂徳章・小谷祐一・吉田吾郎・山中 聡・田辺博司・山口峰生・長崎慶三
guchi, 1995）。 そ れ 以 来 年 々 分 布 範 囲 を 広 げ，1990
年代後半までには中部ならびに西日本各地で赤潮防除を目的としたウイルスの微生物農薬的利用を実現するには，ウイルスが実際の赤潮動態にどのよ

赤潮が確認されるようになった。大規うに影響しているかを十分に解明するとともに，自然

赤潮によって，アコヤガイ

環境中に存在する標的外生物に対するウイルスの影響

模な（），ムラサキイガイ（
）
，アサリ（
）
，カキ（

を把握し十分な安全性評価を行う必要がある。前者については，現場環境中における赤潮の終息時にウイル）などの二枚貝養殖産業は甚大な被害を受け，1992年から1998年の間の赤潮による漁業被害金額は約100億

ス密度の特異的増加がみられる複数の事例が観察されており（Tarutani

2000; Nagasaki

Tomaru and Nagasaki, 2004; Tomaru

2004;
2004b），

円に達していることが明らかとなっている（松山，ウイルスと宿主赤潮原因生物との相互関係が徐々に解

2003）
。

明されつつある。しかし，後者については，海洋環境

赤潮の被害から養殖魚介類を守るため，これまでに中に散布する微生物農薬に関する安全性基準は整備さ

赤潮の海面回収，鉄粉吸収，超音波，海水循環，高分

れていない。例えば陸上生物農薬に係るガイドライン

子凝集剤，オゾン，アクリノール，過酸化水素，硫酸（農林水産省農産園芸局植物防疫課，1995）の場合，アルミニウムなどを用いた，物理的，化学的赤潮防除

哺乳類，淡水魚，淡水無脊椎動物，鳥類，昆虫，土壌法が試みられたが，いずれも海洋面積に対する経済性

微生物，食用作物等の生物種に対する急性毒性試験等の問題（コスト，施用規模）や，生態系への水質面かが必須試験項目として掲げられているが，現状では海らの悪影響（安全性）などの問題から殆ど実用化には域での使用を目的とした生物資材に関するガイドライ

至っていない（代田，1992; 今井，1998）。唯一，韓国

ンに相当するものは存在しない。そのことが，海洋環や九州南部で利用されているのが多孔質粘土を用いた境で微生物農薬を使用する際の大きな支障となってい赤潮駆除法である。多孔質粘土散布法は現場海域で赤る。今後，赤潮防除，汚染除去等を目的とした海域で潮駆除に効果をもたらしているものの，長期間に渡っの有用微生物利用の提案が増えてくることが予測されて粘土を投入した場合の底質生態系への影響が懸念さることから，ガイドライン策定に向けた使用生物の安れている（和田ら，2002）。以上のような背景から，全性評価に関する基礎的データの蓄積は急務である。

有効かつ安全な赤潮防除対策の確立が求められていこのような背景から本研究では，各ウイルスの他生物る。

に対する安全性を評価するため，まず水産業上重要種

こうした背景の下，生態系に対する負荷が少なく安である二枚貝類，大型海藻，魚類ならびに動物プラン

全性の高い赤潮対策として，海洋環境中に存在していクトンに対する短期的なウイルス HaV，HcV ならびる生物を利用する生物学的赤潮防除法が注目されていに HcRNAV の影響を検討した。また，微生物農薬安る（石田，1994; 今井，1998）。これまでに，赤潮を全性ガイドラインを参考にしたマウスに対する急性毒形成する鞭毛藻類の栄養塩競合者である珪藻類を用い性試験（経口投与）を実施し，哺乳類に対する藻類ウた防除法，殺藻バクテリアを用いた赤潮防除法が提案

イルスの安全性を評価した。

され，それらは現在開発途上にある（今井，1998; 今井，1999）。そして近年，
イルス HaV（に感染するウvirus）（Nagasaki

and Yamaguchi, 1997; Nagasaki

1999）
，

に感染するウイルス HcV（
virus）（Tarutani
saki

試料と方法

ウイルスの宿主培養液には，
SWM- 改変培地（Chen
2001; Naga-

1969; 伊藤 , 今井 , 1987）に添加した培地を用いた（Imai2003）， な ら び に HcRNAV（RNA Virus）（Tomaru

ウイルス宿主株の培養
nM の Na2SeO3を
1996）。

, 2004a）が西日本沿岸域より分離された。これらのウイルスは，HaV の調整高い複製能を持つ点，低価格で生産可能である点，ま（H93616株）を宿主とし，本株に特異た防除作用の種特異性が高い点など，微生物学的赤潮

的に感染するウイルス HaV（HaV01株）を実験に用防除剤として有利な性質を持つことから（長崎，1998;

いた。対数増殖期にある

Nagasaki

2001; Tomaruていた HaV01培養液を接種し，光強度140μmol pho-2004a），生物学的赤潮防除ツールとしての有用

tons m-2 s-1で12 h: 12 h 明暗周期下，培養温度20℃で1999; Tarutani性が期待されている。

48時間培養し，ウイルス感染によってに予備培養しを藻類ウイルスの安全性評価試験
溶藻させた。培養終了後，遠心処理（2 000 rpm，10

HcV03を用いた。各試験区

分間，ルスならびに℃）を行った溶藻液の上清を連で実験を行った。ウイの最終添加密度は，

採取し，これを HaV 培養液として以下の実験に用い

Table 1ならびに Table 2に示した。各培養液330mLた。また HaV の感染単位は，終点希釈法（MPN）をを用いて測定した（Suttle, 1993; Nagasaki and Yamagu-

エアレーションを行い，各ビーカー内に供試貝を一つ

chi, 1997）。

ずつ静かに入れた。供試貝が開口してから実験を開始

つの500mL トールビーカーに分注して緩やかなし，実験開始時，10，20，30分後に培養液をmL ず

つ採取してクロロフィル自家蛍光強度を蛍光光度計

HcV，HcRNAV の調整
HU9433-P 株を宿主とし，本株に（Turner Designs model 110）により測定した。実験

特異的に感染するウイルス HcV（HcV01, HcV03, HcV08

終了後，貝肉を採取し−20℃で保管し，後日凍結乾燥または HcV10株）ならびに HcRNAV（HcRNAV34），

および60℃，12時間の乾燥処理を行い，貝肉乾燥重量およびを測定した。また実験に用いた

HCLG-

株を宿主と

の密度と蛍

し， 本 株 に 特 異 的 に 感 染 す る ウ イ ル ス HcRNAV

光強度の関係を用い，各測定時間に測定した蛍光強度（HcRNAV109）を実験に用いた。対数増殖期にあるから培養液中のに予備培養していた HcV または
HcRNAV 培養液を接種し，光強度140μmol photons
m

−2

s

−1

で12h : 12h 明暗周期下，培養温度20℃で72時密度を推定した。そしてその値を用いて，各試験区における供試貝のに対する乾燥肉重量当たりの濾過速度（L/gdw/h）を次式により算出した。

間培養し，ウイルス感染によってC =（（lnN0− lnN 1）× V）/gdw/（t １− t ０）を溶藻させた。培養終了後，遠心処理（2 000rpm，

C：濾過速度（L/gdw/h）

10分間，t：時間（h）℃）を行った

溶藻液の上清を採取し，さらに0 8μm ヌクレポアフィルタ

gdw：貝肉乾燥重量（g）

ーまたは GF/F フィルターで濾過した濾液を HcV ま

N0，N １： 時 間 t ０，t １ に お け る

たは HcRNAV 培養液として以下の実験に用いた。

（cells/L）

HcV ならびに HcRNAV の感染単位は，終点希釈法

V：培養液量（L）（MPN） を 用 い て 測 定 し た（Suttle, 1993; Nagasaki

ムラサキイガイ，アサリおよびカキの濾過速度についてはand Yamaguchi, 1997）。

密度

密度が5 000cells/mL 以上，アコヤ

ガイに関しては1 000cells/mL 以上における10分間の
各種生物に対するウイルスの安全性評価

最大値を求めた。実験期間中に開口しなかった個体に二枚貝関しては，データから取り除いた。統計解析は t-test

実験にはアコヤガイ，ムラサキイガイ，アサリ，カで行った（Stat View 2 0 2）。

キを用い，それらの摂食活動に対するウイルスの影響を評価するため，各二枚貝のウイルス存在下における濾過速度を検討した。実験は2000年 月から11月の間

動物プランクトン
小型甲殻類として，アルテミア（）

日前から0 2μm 濾過海水を満を用い，その孵化効率ならびに幼生の生残に及ぼすウ

たした30L ポリカーボネートタンクで実験供試貝を水

イルスの影響を検討した。実験は2001年 月に行った。

（1 0×10 8 cells/ind/day）の100μm メッシュ上で洗浄した乾燥卵0 1g（約2 000粒）に行った。実験開始
温20℃，

給餌条件下で飼育した。換水は毎日一回行い，実験24を15mL 遠沈管に移し，滅菌濾過海水に約時間前からは実験供試貝を絶食条件下に置いた。

後，1 800rpm，Provasoli の改変強化培地（西澤 , 千原 , 1979）で培養していた対数増殖期にある
4を0 2μm 濾
4

過海水で希釈し，2 0×10 −5 0×10 cells/mL になる

操作を

時間浸漬

分間遠心して上清を捨てた。この回反復後，沈降卵だけを選別し，以下の試験に用いた。ウイルスは，HaV01ならびに HcV01を用いた。HaV，，HcV ならびにの最終添加密度は，各試験区でそれぞれように調整した。そこにウイルス培養液を添加したを添加した試水をそれぞれ実験区培養

6 9×105 感染単位 /mL，1 2×105 cells/mL，ならび

液，対照区培養液とした。また，HcV 添加試験時にに2 6×106 感染単位 /mL，2 9×104 cells/mL とした。

試水，SWM-は比較実験区として，
HcV の宿主であるを含む培養液に対しを単独で添加した試験区も用意した。ウイルスは，HaV01ならびにSWM-

改変培地2 5mL にウイルス培養液2 5mL を接種した実験区，SWM-

培養液2 5mL に宿主培養液

2 5mL を接種した実験区，宿主培養液2 5mL にウイ外丸裕司・片野坂徳章・小谷祐一・吉田吾郎・山中 聡・田辺博司・山口峰生・長崎慶三
ルス培養液2 5mL を接種した実験区，そして SWM-

リはそれぞれ10個体ならびに改変培地

については雌雄の配偶体のコロニーを

mL を入れた対照区を穴マイクロプレー個体を供試し，ワカメ
つずつ供試しトに作製した。各試験区のウェルに30粒程度の沈降卵た。また，マルバアマノリ，アナアオサについては培を接種した。各ウェルの卵数を計数した後，20℃，

養液中に単胞子または遊走子を散布し，発芽・成長し12h：12h 明暗周期の条件下で培養を行った。培養期

た個体の中からランダムに選んだ10個体を測定した。

間中，孵化後の卵殻と死亡した幼生は培養液から除去した。培養日目以降は餌料として海産魚類

sp を給餌した。孵化率は各ウェルの総卵数に対して孵化した卵の割合とし，生残率は測定日までに孵化し1．マミチョグ
孵化後48時間以内のマミチョグ（

た総アルテミア数に対して，死亡した積算個体数を総）孵化稚魚を被検体として用い，生残率に対する孵化個体数から差し引いた個体数の割合とした。統計

ウイルスの影響を検討した。ウイルスには HcV08を

解析は ANOVA で行った（Origin 7J）。

用いた。実験は2001年

月から月の間に行った。

培 養 液 の 遠 沈 処 理（2 000rpm，
大型海藻

10分間，

大型海藻類として，褐藻類
紅藻類

種（アカモク℃）後上清を0 8μm ヌクレポアフィルタ

ーで濾過した濾液（ヘテロカプサ培養濾液），ウイル

，ワカメ

の配偶体）
，

ス培養液，ならびにウイルス培養液を100℃で種（カバノリ，マルバア

熱処理したもの（熱処理ウイルス培養液）を作製し，

マノリ

）
，緑藻類

アオサ

）を用い，ウイルスの影響を検討

種（アナ

下記に示す

分間

回の実験に供した。

回目した。ウイルスは，HaV01ならびに HcV01を用いた。

活性炭濾過海水450mL に各実験供試液50mL を添加

実験は2000年11月から2001年 月の間に行った。各藻して十分混合した培養液中に，マミチョグ孵化稚魚10類試験区でのウイルス感染単位は，アカモク，ワカメ，

個体を入れた。対照区では実験供試液として SWM-

カバノリでは HaV ならびに HcV でそれぞれ1 6×10

6感染単位 /mL，5 1×105 感染単位 /mL で，マルバア
4マノリ，アナアオサではそれぞれ7 2×10 感染単位
6/mL ，1 4×10 感染単位 /mL とした。

培地を添加し，同様にマミチョグ孵化稚魚10個体を入れた。水温を22−24℃に保ち，実験開始後

日目まで pH，溶存酸素濃度，生残率を測定した。また，死亡個体が確認された場合は，その個体を培養液中からアカモクは，2000年 月採苗の冷蔵幼胚（吉田ら，取り除いた。実験開始時のウイルス添加区におけるウ

2000）（Fig. 3A）を使用し，培養期間中の形態形成過程，

イルス感染単位は1 9×102 感染単位 /mL とした。実形成された葉の枚数および最大長，仮根長を測定した。

験は各試験区とも

ワカメは，培養中の配偶体の細胞の形状（Fig. 3C, E）

PLSD Method で行った（Stat View 2.0.2）。

を観察し，コロニーの長径を測定した。カバノリは，2000年月に採苗した培養藻体の盤状付着器を均等の大きさに細断し，再生直立体の数，最大長を測定した。

連で行った。統計解析は Fisher s

回目
活 性 炭 濾 過 海 水400mL に 対 し， ウ イ ル ス 培 養 液
mL と SWM-

培養液99mL を添加した培養液（実マルバアマノリは，天然藻体から得られた単胞子体

験区 A），ウイルス培養液ならびに SWM-

（Fig. 3G）を用い，培養期間中の藻体全高，ならびにれぞれ50mL ずつ添加した培養液（実験区 B），ウイ

全幅を測定した。アナアオサは，母藻細断法（Hiraoka

ルス培養液を100mL 添加した培養液（実験区 C），おand Enomoto, 1998）により得られた遊走子（Fig. 3J）

よび SWM-を用い，培養期間中の発芽体全長を測定した。各藻類をそれぞれ用意した。各実験区における実験開始時のはそれぞれ， mL のウイルス培養液（ウイルス培養

ウイルス感染単位は実験区 A，B，C でそれぞれ8 9×液区），100℃で 分間熱処理を行ったウイルス培養液

102，4 5×102，8 9×104 感染単位 /mL とした。マミ（熱処理ウイルス培養液区），SWM-

チョグ孵化稚魚10個体を入れ，水温を23−25℃に保ち，培地（対照区）において，20℃，50μE/m2/s，12h：12h 明暗周期の培地をそ培地を100mL 添加した培養液（対照区）

上記と同様の操作を行った。

条件下で培養を行った。培養期間はマルバアマノリ，

回目

アナアオサで 週間，カバノリ，ワカメ，アカモクでウイルス培養液500mL にマミチョグ孵化稚魚10個週間とした。各培養液には，PESI 原液（Tatewaki,1966）をあらかじめ体を入れ，水温を24−26℃に保ち，実験開始後

日目％濃度で添加し，栄養塩，微量まで毎日ウイルス感染単位，pH，溶存酸素濃度，生元素を補充した。各試験区においてアカモク，カバノ

残率を測定した。対照区には培養液として SWM- を藻類ウイルスの安全性評価試験
用い，同様の操作を行った。実験開始時における培養

同様の方法で濃縮処理したものを用いた。蒸留水は，液のウイルス感染単位は7 0×10 5 感染単位 /mLとした。

滅菌蒸留水を用い，これを無処理区とした。各供試液投与24時間前からマウスを絶食・絶水状態とし，投与．トラフグ，ヒラメ，マダイ

直前に体重を計測した。投与量は，各試験区のマウス実験には平均体長2 8cm のトラフグ（

個体に対し投与試料0 3mL をマウス一頭にゾンデ）稚魚，平均体長7 4cm のヒラメ（針を使用して経口投与した。投与約）稚魚，ならびに平均体長1 3cm のマダイ（

）稚魚を用い，それらの生残に及ぼすウイルスの影響を検討した。ウイルスには HcV10な
らびに HcRNAV109を用いた。実験は2002年

給水を再開し。その後，，時間後に給餌，，14，21日後に各個体の体重を計測した。また，21日後に解剖を実施し，内臓組織の状態を観察した。

月に行った。曝露したウイルスの感染単位はトラフグ，

結果と考察

6

ヒラメ，マダイ試験区で，HcV がそれぞれ2 2×10 ，
3 0×105ならびに3 0×105 感染単位 /mL，ならびに
6

5

HcRNAV が そ れ ぞ れ3 7×10 ，5 1×10 な ら び に5 1
5二枚貝
二枚貝類の摂食に対する HaV の影響評価試験の結×10 感染単位 /mL とした。0 2μm 濾過海水800mL

果を Table 1に示した。アコヤガイ，
ムラサキイガイ，にウイルス培養液200mL を加えた培養液中に稚魚をアサリおよびカキの各試験区において蛍光強度は，入れた。稚魚に対する HcV ならびに HcRNAV 培養

実験開始直後から徐々に減少していった（データ非表

液曝露時間は，トラフグとマダイでは10分間，ヒラ示）。貝肉乾燥重量当たりの濾過速度は，イガイおよ

メではびアコヤガイにおいて対照区と HaV 添加区との間に分間とした。ウイルス曝露後の稚魚を0 2μm 濾過海水を満たした30L 水槽に移し，毎日定時に半有意差は見られなかった（

量ずつサイフォンで下層の海水を除去して，あらかじ

アサリおよびカキの対照区および HaV 添加区におけ

め室温に放置しておいた濾過海水を添加した。ウイル

るそれぞれの濾過速度もほぼ等しかった（Table 1）。

スに曝露しなかった稚魚を用いた実験系を対照区とし

このことから，HaV の存在は短時間に二枚貝の濾過た。１実験区には10個体以上を供し，96時間後の死亡

摂食活動に影響を与えることはないと推察された。

率ならびに魚体の状態を対照区と比較した。

，>0 05）（Table 1）。

二枚貝類の摂食に対する HcV の影響評価試験の結果を，Fig. 1および Table 2に示した。アコヤガイ，

マウス

ムラサキイガイおよびカキの添

マウスの成長ならびに内臓組織に及ぼすウイルスの加区において，それぞれの貝は開口しても直ぐに閉じ影響を，微生物農薬の安全性評価に関する基準（農林る，殻の開閉を激しく繰り返す，擬糞を放出するなど

水産省農産園芸局植物防疫課，1995）を参考にして検して，実験期間中に正常な摂食活動は見られず，蛍光討を行った。実験は2000年12月に行った。マウスは，強度もほとんど減少しなかった（Fig. 1）。一方，対SPF 動物マウス（クローズドコロニー Slc. ddy

照区および HcV 添加区において各貝は齢（雄），日本 SLC 社）を，実験環境に

週

週間馴化飼

添加区で見られたような行動は示さず開口後育した後に実験に用いた。試験区は，ウイルス培養液は安定して殻を開けており，蛍光強度も徐々に減少

投与区，不活化ウイルス培養液投与区，海水培養液投していった（Fig. 1）。また貝肉乾燥重量当たりの濾

与区（対照区）および蒸留水投与区（無処理区）の過速度は，イガイおよびアコヤガイにおいて対照区と区を設定し，それぞれ供試マウス 頭ずつを処理した。

HcV 添加区との間に有意差は見られなかった（，

ウイルス投与には HcV10を用いた。HcV 濃縮溶液な>0.05）（Table 2）。カキの対照区および HcV 添加区

らびに不活化処理した HcV の感染単位はそれぞれ，におけるそれぞれの濾過速度にも著しい差は見られな

1 1×1010 感染単位 /mL ならびに5.5 感染単位 /mL

かった（Table 2）。

とした。

イガイやアコヤガイなどの二枚貝はウイルス培養液投与区は，中空糸膜を用いて濃縮し存在下では，擬糞を排出するなどして通常の濾た HcV を投与試料として用いた。不活化ウイルス培

過摂食活動では見られない忌避活動を行うことが知ら

養液投与区は，濃縮した HcV 20mL をガラスシャー

れている（Matsuyama

レに入れ，光強度20 000lux の条件に24時間曝露した

Nagai

ものを使用した。海水培養液投与区（対照区）の投与
試料には，SWM-

改変培地10L をウイルスの濃縮と1997; Nagai

1996;

2000）
。また長時間にわたって二枚貝にを曝露し続けることによって，それらの二枚貝は死に至ることが確認されている（Mat-外丸裕司・片野坂徳章・小谷祐一・吉田吾郎・山中 聡・田辺博司・山口峰生・長崎慶三
Table 1. Filtration rate of bivalves onsuspension when HaV was added in cultures

Fig. 1. Temporal changes of relative fluorescence intensity during a feeding experiment of bivalves,andin cultures ofsuspension diluted
in a filtered seawater passed through a 0 2μm pore-size filter. ■（control）: with addition of SWM-3 medium;○ : with addition of HcV culture; ● : with addition ofculture. Final concentrationsof HcV andin each experiment were shown in Table 2. Filtration rates of bivalves were
calculated from the changes of fluorescence intensity representing an algal concentration.

藻類ウイルスの安全性評価試験
Table 2. Filtration rate of bivalves on
were added in cultures.

suspension when HcV or

Fig. 2. Temporal changes of
egg hatching rate and its larvae survival rate in a culture including
HaV and/or（A（hatching rate）, C（survival rate））, and HcV and/or（B（hatching rate）, D（survival rate））. ■ : cultures including virus culture and SWMmedium; □ : cultures including host algal culture and SWM-3 medium; ● : cultures including virus culture andhost algal culture; ○ : control（SWM-3 medium）. Error bars indicate standard deviation（n=3）.

外丸裕司・片野坂徳章・小谷祐一・吉田吾郎・山中 聡・田辺博司・山口峰生・長崎慶三
suyama1997; Nagai

大型海藻1996; Nagai

2000）。本研究においてもを添加した試験海水中において実験中に二枚貝は死には至実験に供試したアカモク，ワカメ，カバノリ，アナ
アオサの写真を Fig. 3に示した。

らなかったものの，殻の激しい開閉運動や擬糞の放アカモクについては，いずれの実験区でも正常な形出などがあり蛍光強度もほとんど減少しなかったこ態形成が見られ，HaV，HcV ともウイルス培養液区，とから，アコヤガイ，ムラサキイガイそしてカキの熱処理ウイルス培養液区間で葉上部ならびに仮根部

摂食行動に対しは阻害的な影響（Fig. 3B）の成長に差は見られなかった（Fig. 4A）。

を及ぼすことが確認された。一方，HcV 添加区におHcV ならびに HaV によるアカモクの形態形成異常のいて二枚貝は誘発，ならびに成長の阻害といった現象は観察されなを与えたときのような忌避反応を示さず，対照区と同様な濾過活動を行っていた（Table 2）。このことは HcV の存在およびかった。
ワカメ配偶体の各試験区における相対成長量を Fig.

の溶藻

4B に示した。配偶体コロニーの成長は，雄性配偶体

液は，二枚貝の濾過摂食活動に対し阻害的な影響を与の成長が対照区よりもウイルス培養液区で若干低かっ

えていないことを示唆している。

たものの，ウイルス培養液区と熱処理ウイルス培養液

HcV によって溶藻された区との間ではほぼ等しかった。雌性配偶体ではヶ月以内に全ての実験区で成熟が起こり（データ非表

動物プランクトン
アルテミア卵の孵化率の経時変化を Fig. 2A，2B に示），卵の形成（Fig. 3D）が見られた。形成された卵

添加区，ならびにからは，受精あるいは単為発生による胞子体の発芽が＋ HaV 添加区のアルテミア卵孵化率は見られた。一方，雄性配偶体ではウイルス培養液区な示した。HaV 添加区，

， <0 05）。

らびに熱処理ウイルス培養液区のみで成熟（Fig. 3F）

このことは HaV がアルテミア卵の孵化に短期的にはが見られたが，対照区では見られなかった（データ非影響を与えない事を示唆している。

表示）。これらの観察結果から HaV ならびに HcV に

対照区と有意な差は無かった（

添加区ならびに HcV 添加区における孵化率は対照区よりも低かったが（Aよるワカメ配偶体への成長および成熟の抑制的影響はないものと推察された。

， <0 05），＋ HcV 添加区では対照区とほぼ同等でカバノリでは，全ての実験区において付着器切片か培らの再生（Fig. 3H, I）が確認された。Fig. 4C に示す

養液に HcV を感染多重度64で添加した場合，約10%

とおり，HaV，HcV ともウイルス培養液区では対照のウイルスは溶液中に懸濁している（Nagasaki

区に比べ直立体の成長が悪かったものの，ウイルス培

2003）。HcV ＋

添加区において，

養液区と熱処理ウイルス培養液区間ではほぼ同等の成HcV の初期添加量は2 6×106 感染単位 /mL で，感染長が見られた。このことから，直立体の成長阻害要因

あ っ た（， <0 05）。

5

多重度は約90であったため，培養液中には約10 感染はウイルスの活性とは無関係であり，むしろ培養液中

単位 /mL 程度の HcV 粒子は懸濁していたと推察されに含まれる宿主細胞由来の成分等他の要因によるもの

る。

または HcV をそれぞれ単独と推察された。また，HcV 区では，他の区に比べてでアルテミア卵に曝露した場合の孵化率については

直立体の成長は低調であったが，１つの付着器切片かさらなる検討が必要であるが，少なくともら再生した直立体の数は多かった（データ非表示）。

ならびに HcV が混在している場合には，マルバアマノリの葉状体全高ならびに全幅を Fig.

HcV はアルテミア卵に影響を与えないことが推察さ

4D に示した。葉状体の全高と全幅は HaV，
HcV とも，れた。

対照区よりもウイルス培養液区ならびに熱処理ウイル

アルテミア幼生の生残率の経時変化を Fig. 2C，

ス培養液区で低くなった。しかしながらウイルス培養

日目までには，HaV ならびに液区ならびに熱処理ウイルス培養液区間では，葉状体

HcV 実験系のいずれの試験区においても生残率は90%の全高と全幅はほぼ等しかった。このことから，対照以上を維持していたが，日目以降には各区で生残率

区と比較してウイルス培養液区で葉状体の全高と全幅の低下が見られた。HaV 添加区ならびに HcV 添加区が低くなったのは，ウイルスその物の影響ではなく，の生残率は，実験10日目においてそれぞれ対照区よりカバノリにおける結果と同様，培養液中に含まれるウも高かったことから，HcV ならびに HaV の存在はア

イルス以外の要因が影響しているためと推察された。

2D に示した。孵化後ルテミア幼生の生残に対して悪影響を与えないものと推察された。

アナアオサでは，Fig. 4E に示すとおり HaV，HcV
とも，発芽体（Fig. 3K）の成長は対照区および熱処

藻類ウイルスの安全性評価試験

Fig. 3. Light microscopic photographs of seaweeds used in this study（except）.（A-B）
A, An embryo at the start of the experiment（arrow 1= rhizoid）; B, an plant at the finishof the experiment（arrow 1= rhizoid, arrow 2= an leaf）.（C-F）Gametephytes ofC, femalegametephyta; D, higher magnification of oogonium at the finish of the experiment; E, male gametephyte; F,higher magnification of antheridium.（G-I）A pieced discoid tissue and regenerated thalli ofG,a pieced discoid; H, regenerated thalli from discoid cultured in SWM-3 medium; I, regenerated thalli from discoid
cultured under + heated HcV medium.（J-K）
J, germling; K, spore.

外丸裕司・片野坂徳章・小谷祐一・吉田吾郎・山中 聡・田辺博司・山口峰生・長崎慶三

Fig. 4. Growth of 5 seaweeds after 2（and）and 4（,and）weeks of culture with or without vital HaV or HcV in medium.
Seaweeds were incubated under following experimental treatments, control: SWM- medium; +Heated HaV:
heat treated HaV culture（100 ℃ for 5 minute）; +HaV: HaV culture; +Heated HcV: heat treated HcV culture（100 ℃ for 5 minute）; +HcV: HcV culture. Concentration of HaV and HcV were 1 6×106 and 5 1x105 infectious
units/mL, respectively, in experiments forandand 7 2 × 104 and 1 4x106
infectious units/mL, respectively, in experiments forandEach of the cultures wereadded PESI solution at final concentration of % v/v.（A）Thllus length, rhizoid length and number of leavesof（B）relative increase of gametephyte colony diameter of（C）number and length ofregenerated thalli of（D）height and width of（E）length of germilings of藻類ウイルスの安全性評価試験
理ウイルス培養液区よりもウイルス培養液区で良好であった。このことからアナアオサ発芽体の成長に対し，HaV ならびに HcV は阻害的に作用することはないと推察された。
大型海藻に対するウイルスの影響評価試験では，急性毒性の特徴と思われる組織・細胞の崩壊はどの種類においてもまったく見られず，正常な形態形成・成長が確認された。以上のことから，本実験に用いたウイ
ルスは大型藻類に対して短期間の内に影響を及ぼす事はないと推察された。
海産魚類．マミチョグ
回目の試験で得られた結果を Fig. 5に示した。
各試験区の pH は7 4−7 9，溶存酸素濃度は4 5−6 5
mg/L の間でそれぞれ変動し，実験期間中，各試験区間でそれらに顕著な差が現れることはなかった（データ非表示）。対照区では，実験開始後日目までに生残個体が ± 個体まで減少したが，その後は実験終了時まで減少しなかった。ヘテロカプサ培養液添加区

Fig. 5. Temporal changes of survived fry of（1 st experiment） in ■ :cultures of seawater passed through an active
carbon filter （control）; □ : with addition of aculture filtrate passed
through a 0 8μm pore-size filter; ● : with additionof heat treated HcV culture（100 ℃ for 5 minute）;○ : with addition of HcV culture.

および熱処理ウイルス添加区の実験終了時の生残個体
数は，それぞれ ± 個体および ± 個体であった。
一方，ウイルス添加区の生残個体数は実験終了時で± 個体であった。ウイルス培養液添加区で生残個体数が低くなったのは， 連の試験区のうちの 試験区
で実験開始後 日目に死亡個体数が 個体に増加したためであり，分散分析の結果，対照区との有意差は確認されなかった（， >0.05）。

回目の実験期間中，各試験区の pH は7 8−8 1，
溶存酸素濃度は3 5−6 6 mg/L の間でそれぞれ変動
し，各試験区間でそれらに顕著な差が現れることはな
かった（データ非表示）。実験区 B において実験開始
後 日目に 個体，さらに 日目に 個体の死亡が確認されたが，対照区を含む他の試験区では実験終了時
まで死亡個体は確認されなかった（データ非表示）。
実験終了時における各試験区のウイルス感染単位は，いずれの試験区でも実験開始時と比較して% 程度まで減少した。これらの結果からは，マミチョグの生残が今回の実験ウイルス密度範囲内で，ウイルスによって影響を受けることはないと推察された。
回目の試験で得られた結果を Fig. 6に示した。
各試験区の pH は7 8−8 1，溶存酸素濃度は5 9−6 3
mg/L の間でそれぞれ変動し，試験区間で顕著な差が現れることはなかった（データ非表示）。実験開始時のウイルス感染単位は7 0×105 感染単位 /mL であったが，実験終了時には1 4×104 感染単位 /mL まで減少していた。対照区，実験区とも，実験開始後 日目

Fig. 6. Temporal changes of survived fry of, in ■ :（3 rd experiment）
cultures of seawater passed through an active
carbon filter（control）; ○ : with addition of HcV
culture, and HcV infectious units in the virus added
culture.

外丸裕司・片野坂徳章・小谷祐一・吉田吾郎・山中 聡・田辺博司・山口峰生・長崎慶三まで死亡個体は確認されなかったが， 日目にそれぞに対し108 感染粒子以上の投与を行うという基準（農林れ 個体， 個体の死亡が認められた。

水産省農産園芸局植物防疫課，1995）を満たす十分量

以上の結果から，ウイルス HcV がマミチョグの生が投与できているものと判断された。各投与区のマウ

残に対し，今回の実験のような短期間のうちに重篤なス体重の推移を Fig. 7に示した。いずれの投与区にお影響を及ぼすことはないものと推察された。

いても同様な体重推移が観察され，HcV 投与による影響は認められなかった。また実験期間中，マウスに行．トラフグ，ヒラメ，マダイ

動異常等の外観上の変化も観察されなかった。さらに

有用海産魚へのウイルス接種試験の結果を Table 3

実験終了後の解剖による内臓組織の状態観察からも，に示した。実験期間中の各試験区の水温，塩分はそ

各組織に異常は認められなかった。以上の結果から，れぞれ18−19℃，30 4−31 4 ‰の範囲内で変動した。

HcV は微生物農薬安全性ガイドラインを参考にした

ト ラ フ グ 試 験 区 で は，HcRNAV 曝 露 区 に お い て

マウスに対する急性毒性試験において，影響はないも個体死亡が確認され，HcV では死亡は確認されなかのと推察された。

った。またヒラメ試験区においても，HcV ならびにHcRNAV 曝露区とも稚魚の死亡はなかった。マダイ

まとめ

個体

赤潮防除を目的として藻類ウイルスの現場への適用

ずつ死亡個体が確認されたが，HcV 曝露区では稚魚を考える上で，主要な環境生物に対する影響を測定すの死亡はなかった。いずれの試験区でも対照区に比べることは，その安全性を保証する上で不可欠な工程でてウイルス曝露区で著しい稚魚の死亡は発生しなかっある。本実験では，少なくとも今回実験に用いた生物たことから，HcV ならびに HcRNAV が有用魚類の生群に対して，藻類ウイルスは急性毒性を持たないと推残に対して短期間的に悪影響を及ぼす可能性は低いと察された。これまでの研究においても，今回用いた藻推察された。

類ウイルスが，宿主以外の微細藻類に対して影響を及試験区では HcRNAV 曝露区ならびに対照区でぼさなかったということが報告されている（Nagasaki and Yamaguchi, 1997; Tarutaniマウス
ウ イ ル ス 投 与 区 に お い て， マ ウ ス

頭に対する

ru

2001; Toma-

2004a）。このことは HaV，HcV，HcRNAVHcV 投与量は3 3×109 感染単位 /mL であったため，がきわめて高い宿主特異性を持つことを示すものであ

微生物農薬安全性ガイドラインにある，マウス

る。同じ微細藻類ウイルスであるハプト藻の頭Table 3. Number of survived firies after 96 hour incubation following virus exposure tests.

藻類ウイルスの安全性評価試験
謝辞

二枚貝類，餌料，実験器具を提供していただいた薄浩則博士（瀬戸内海区水産研究所），ならびに供試生物を提供いただいた角埜 彰氏（瀬戸内海区水産研究所），永井清仁博士（ミキモト真珠），門永圭史氏（山口県内海栽培漁業センター），大内晟博士（広島県

栽培漁業センター），今井一郎博士（京都大学）に深謝いたします。
文

献Chen L. C. M., Edelstein T., and McLachlan J., 1969:
Hariot in nature and inculture.

5, 211-220.

Hiraoka M. and Enomoto S., 1998: The induction ofFig. 7. Temporal changes of mice weights（n=3）■ :administered concentrated SWM-3 medium（control）; □ : inactivated HcV culture; ● : HcV culture（1 1× 10 10 infectious units/mL）; ○ : concentrated
autoclaved distilled water （no treatment）.
Concentrations of HcV culture and autoclaved
distilled water were carried out with using hollow
fiber membrane filter. The titer of the concentrated
HcV culture exposed under 20 000 lux light
condition for 24h was decreased to 5 5 infectious
units/mL and its culture was treated as inactivatedHcV culture in this experiment.

reproductive cell formation ofKjellman（Ulvales, Ulvophyceae）.
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属の複数の種に対して感染性を持つこと

石田祐三郎，1994: 赤潮藻の微生物学的防除に関する（Suttle and Chan, 1995），また，褐藻類を宿主とする

現状と将来，「赤潮と微生物」（石田祐三郎，菅原ウイルスは本来の宿主以外の近縁藻に対して感染し増庸編），恒星社厚生閣，東京，pp. 9-21.

殖抑制や形態異常をしばしば引き起こすこと（Kapp,

今井一郎 , 1998: 赤潮の生物学的防除の可能性 . 日本

1998）と比較した場合，HaV，HcV，HcRNAV はより限定された厳密な感染範囲を持つものと推察される。よって，本研究に用いたウイルス HaV，HcV，

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今井一郎 , 1999: 微生物を用いた赤潮の防除 . 化学工業，50, 668-676.

HcRNAV の他生物に対する安全性は高く，海洋環境

Imai I., Itakura S., Matsuyama Y., and Yamaguchiに散布した場合でも標的宿主以外の生物に影響を及ぼM., 1996: Selenium requirement for growth of a

す可能性はきわめて低いと推察される。

novel red tide flagellate

今後，藻類ウイルスの微生物農薬としての実用化の可能性を吟味する上で，本実験で得られたデータを基（Raphidophyceae）in culture.
62，834-835.

本とし，必要に応じ長期間にわたるウイルスの各種生

伊藤克彦，今井一郎 , 1987: ラフィド藻，「赤潮生物研物に対する曝露試験等の安全性評価に関わるデータを究指針」（日本水産資源保護協会編）
，
秀和，
東京，

蓄積することにより，海洋環境中に散布するための藻類ウイルスの安全性基準を早急に策定することが必要である。

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