再構成型無細胞タンパク質合成系 (PUREfrex®) によるN末端翻訳後修飾されたタンパク質の合成
Synthesis of N-terminal post-translationally modified proteins using PUREfrex®
○松本 令奈1, 丹羽 達也2, 田口 英樹2, 金森 崇1 (1ジーンフロンティア株式会社、2東工大・研究院・細胞センター)○ Rena Matsumoto, Tatsuya Niwa, Hideki Taguchi and Takashi Kanamori (1GeneFrontier Corp., 2Cell Biology Center, IIR, Tokyo Tech)<Abstract>

Synthesis of N-terminal post-translationally modified proteins using PUREfrex®

PUREfrex®は、PURE systemを基にした大腸菌でのタンパク質合成に関与する因子のみから再構成した無細胞タンパク質合成系である。反応条件や追加因子の調節が容易なため、様々な翻訳後修飾の検討が可能である。
PUREfrex®を用いた翻訳後修飾の例として、これまでにジスルフィド結合含有タンパク質や糖鎖修飾タンパク質の合成などが可能であることを示してきた。本研究では、異なる翻訳後修飾タンパク質の合成例として、N末端にミリストイル基もしくはアセチル基を付加したタンパク質の合成について検討した。
N末端修飾タンパク質作製のためにはホルミル基のない開始メチオニンから始まるポリペプチドを合成する必要があるため、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸(10-CHO-THF)を含まないPUREfrex®の反応液(Δ10-CHO-THF)を用いた。また、ミリストイル化タンパク質の合成には、付加反応前に開始メチオニンをメチオニルアミノペプチ
ダーゼ (MAP)で切断してGly残基を露出させた。実際に、大腸菌由来のMAPを添加して開始メチオニンが切断されたポリペプチドが合成できることを確認した上で、その後のミリストイル化反応の条件検討を行った。
また、N末端アセチル化反応として、N末端アセチル化酵素NatAによるN末端アセチル化、およびNatBによる
N末端アセチル化について検証した。NatAによるN末端アセチル化にはMAPによる開始メチオニン切断が必要であるが、NatBによるN末端アセチル化は開始メチオニンの切断を必要とせず、それぞれについてPUREfrex®を用いたN末端アセチル化タンパク質の作製に向けて条件検討を行った。
これらについて、質量分析による修飾の有無を調べたところ、 PUREfrex®で合成したポリペプチドのN末端へのミリストイル化およびアセチル化が確認された。

1. N-terminal modification requires
the synthesis of polypeptides with
unformylated methionine.

Reconstituted cell-free protein
synthesis system based on theiMet cleavage
Methionyl aminopeptidase(MAP)

Advantage・Low level of contamination

X

X

Myristoylation

Acetylation (NatA)

Acetylation (NatB)・Easy adjustment of the reagent composition

Enzymes

NMT1/2NatA groupNatB group

・PCR products usable as a template DNA

Consensus
sequences(M)G-(M)XX=A/S/T/V/C/G

MXX=D/E/N/Q

Examples oftarget proteinsgag (HIV), Src, Fyn,
G(o)αCPR1, AHP1

α-synuclein, β-actin(Ref: Shimizu et al. (2001) Nat. Biotechnol., vol. 19, p. 751.)

2. in vitro N-terminal myristoylation of model protein
Myristoylation
Target Protein
DNA

human
NMT1_Δ1-80

MAP

initiator methionine(iMet)

PURE system technology

hNMT1_Δ1-80
Myr-CoA

none

G(o)α (C3S)-sfGFP

post-translation

MGSTLSAE
fMet

N-terminal Post-translational modification

-Myr
sfGFP

GSTLSAESK

Hisx6

XMyristoyl motif

MAP

Δ10-CHO-THF

Δ10-CHO-THF
DnaK Mix

human NMT1

(iMet cleavage is not occurred.)

+Myr

CFPS

G(Myr)STLSAESKhNMT1_Δ1-80

Met

X

Δ10-CHO-THF

XX(Met)G

MAP

X

X

Myr-CoA

iMet cleaved
polypeptide

NMT1

X

iMet cleavaged potypeptide

full-lengthG(o)α (C3S)-sfGFP-Myr

Myristoyl-CoA

MyristoylCoA

in vitro
Myristoylation

Δ10-CHO-THF↓
SDS-PAGE↓
In gel digestion↓
Mass spectrometry (Q-Exactive & Proteome Discoverer 2.4/ Skyline).

MAP

iMet was cleaved by MAP only when synthesized
without 10-CHO-THF.

MS/MS spectrum of N-terminal peptide

N-terminal myristoylation was clearly detected when the target protein was reacted withhNMT1_Δ1-80 synthesized by PUREfrex® and myristoyl-CoA.

4. in vitro N-terminal acetylation of model protein
by NatB

3. in vitro N-terminal acetylation of model protein by NatA
3-1. co-translational acetylation reaction

NatA complex

Acetylation (NatA)

Template DNA

co-translation

Reaction mixture

Target Protein
DNA

Donor

target protein: 5 nM
yNAA10 (ARD1): 0.2 nM
yNAA15 (NAT1): 1 nM

(iMet cleaved)

Ac-X

NatB complex (human)co-translation

NAA25

Δ10-CHO-THF

NatB
DNA

Acetyl-CoA: 1 mM

(4 mM GSH)
+ DnaK Mix+ 1 µM MAP

Ac-MX
X=D/E/N/Q
Δ10-CHO-THF

yNAA10 (NAT1)

X=A/S/T/V/C/G

Δ10-CHO-THF

Acetylation (NatB)

Acetyl-CoA

PUREfrex® 2.1

MAP
NatA
DNA

Acetyl-CoA

yNAA15 (ARD1)

Co-translational acetylation condition
Acetyl-CoA

+Myr

Myr-G

iMet cleaved

Target Protein
DNA

MS1 intensity of N-terminal peptide(AlphaFold)(PDBe 4HNW)

NAA20(PDBe 6VP9)

Co-translational acetylation condition

AHP1 (NKK/SAA)

CPR1 (Q3E)-sfGFP

Template DNA

MSEVYFDVEA

sfGFP

Hisx6

N-terminal 10 AA of CPR1 (Q3E)

yNAA10Ac-CoA

none

Hisx6

MSDLVSAAFP・・・

yNAA10yNAA10yNAA15yNAA15

Ace-CoA

Ace-CoAyNAA10/ yNAA15
Ac-CoAyNAA10Ac-CoAnone

Reaction mixture

PUREfrex® 2.1

target protein: 3 nM
cMBP-yNAA20 (NAT3): 1 nM
yNAA25 (MDM20): 2 nM

yNAA10/ yNAA15
Ac-CoA

Acetyl-CoA

Donor

Δ10-CHO-THF(4 mM GSH)
+ DnaK Mix

Acetyl-CoA (1 mM)

α-synuclein (K6A)
cMBP-yNAA20

MDVFMAGLSK・・・

yNAA25-Ac-Ac

SEVYFDVEASKSDLVSAAFPAGDYK

Ace-CoA

none

+Ac

+Ac
S(Ac)EVYFDVEASKcMBP-yNAA20
Ac-CoAcMBP-yNAA20/ yNAA25
Ac-CoA-Ac
MDVFMAGLSKS(Ac)DLVSAAFPAGDYK

MS1 intensity of N-terminal peptide

-Ac

Hisx6

MS1 intensity of N-terminal peptide

+Ac

-Ac

+Ac

+Ac
M(Ac)DVFMAGLSKMS1 intensity of N-terminal peptide

MS/MS spectrum of N-terminal peptide-Ac

MS/MS spectrum of N-terminal peptide+Ac

Co-translational acetylation of target proteins by NatA and acetyl-CoA using PUREfrex® was successful only when yNAA10 and
yNAA15 were present simultaneously.

3-2. post-translational acetylation reaction
Acetylation (NatA)
post-translation

MAP
Target Protein
DNA

CPR1 (Q3E)-sfGFP
MSEVYFDVEANatA DNA

Acetylation of target proteinsrequires both yNAA10 and
yNAA15.

sfGFP

Hisx6

yNAA10yNAA15
Ac-CoA

N-terminal 10 AA of CPR1 (Q3E)

yNAA10/ yNAA15(simultaneous synthesis)
Δ10-CHO-THF

Δ10-CHO-THF
DnaK Mix

CFPS

none

yNAA10Ac-CoAyNAA10 + yNAA15(separate synthesis)

yNAA15
Ac-CoA-Ac(Met)X
NatA

AcetylCoA

in vitro
AcetylationyNAA10+yNAA15
Ac-CoA

Co-translational acetylation of target proteins by NatB and acetylCoA using PUREfrex® was successful only when yNAA20 and
yNAA25 were present simultaneously.

<Conclution>
N-terminal myristoylation and acetylation of target
proteins were succeeded using PUREfrex®.
<In progress>

SEVYFDVEASK

iMet cleaved
polypeptide

yNAA10/yNAA15
Ac-CoA

MS/MS spectrum of N-terminal peptide

Membrane insertion experiments of myristoylated proteinsusing PUREfrex®.
+Ac
S(Ac)EVYFDVEASK

Ac-X
MS1 intensity of N-terminal peptide

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