目次

分析機器解説シリーズ（３９） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1
ポストカラム蛍光誘導体化高速液体クロマトグラフィー
トピックス・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6
導電性フタロシアニンとその解釈における重要な注意点
お知らせ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10

CENTER OF ADVANCED INSTRUMENTAL ANALYSISKYUSHU UNIVERSITY

★ 分析機器解説シリーズ（39）★
ポストカラム蛍光誘導体化高速液体クロマトグラフィー：
カテコールアミンおよぴその代謝物の一斉分析
薬学部 能 田均

１．はじめに『分析機器解説』とはいいながら、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)に用いられる機器は解説するまでもなく、広く一般的なものとなっている。ここでは筆者らが開発したカテコールアミンおよびその代謝物(図 1)のポストカラム蛍光誘導体化ＨＰＬＣを例に、ハードよりもそのソフトに焦点を当てて解説させていただきたい。

図 1 カテコールアミンとその代謝物
蛍光検出は、数あるＨＰＬＣの検出法のなかでも最も高感度かつ高選択的な方法のひとつである。
しかし、高選択的ということは逆に計測対象物質そのものは検出できない場合が多く、蛍光誘導体化という操作がＨＰＬＣカラムによる分離の前か後で必要になる(それぞれプレカラムおよびポストカラム蛍光誘導体化)。筆者の所属する薬品分析化学教室(大倉洋甫教授)では計測対象物質を 2点で認識し、分子認識能を有する蛍光反応の開発を行っている 1)。その一環として、カテコールアミンの蛍光試薬として 1、2−ジフェニルエチレンジアミン(ＤＰＥ、図 2A)を見出し、これをプレカラム誘導体化反応に利用した。ついでこの反応を利用してカテコールアミンとその代謝物の一斉分析システムヘ発展させた。

−2−２．カテコールアミンの蛍光検出ＨＰＬＣ
カテコールアミン(ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン)は生体の恒常性維持に関与しており、その生体試料(血液、髄液、尿)中の濃度は各種の病態とも深く関与していると考えられる。しかし、その測定には極めて高い選択性と高感度性が要求される。
3 種カテコールアミンにはカテコール核の 2 つの水酸基とアミノ基が共通の官能基として存在するが、筆者らはカテコール核の 2 つの水酸基を 2 点で認識することが高い選択性を得ることができると考え、各種試薬を設計して反応性を検討した 2)。その結果、ＤＰＥがヘキサシアノ鉄（Ⅲ）酸カリウムの存在下、弱酸性〜中性、室温で反応して蛍光誘導体を与えることがわかった(図 2)。この反応はカテコール核の認識と言えるが、実際はカテコールアミンに対して特に強い蛍光を与えたので、極めて簡便な前処理でヒト血漿中カテコールアミンのプレカラム蛍光誘導体化ＨＰＬＣに適用できた 3)。またＤＰＥはそれ自身は無蛍光性で、反応も比較的緩和な条件で進行するのでポストカラム蛍光誘導体化にも容易に適用できる。

図 2 カテコール及び 4−ヒドロキシー3−メトキシフエニル化合物の蛍光誘導体化

３．カテコールアミンおよびその代謝物の一斉分析
カテコールアミンは極めて強い生理活性を持つが故に、生体には迅速な代謝機構が備わっていて、その代謝も数多い(図 1)。カテコールアミンとその代謝物と同時分析することによって飛躍的に情報量が増大することがある。これらの化合物はいずれもカテコール化合物または 4−ヒドロキシ−3−メトキシフェニル化合物であるので(それぞれについてさらに硫酸抱合体が存在する)、その一斉分析のために両者に共通の誘導体化反応を考えた。
ＤＰＥ反応では図 2A のように、カテコールアミンはまずヘキサシアノ鉄（Ⅲ）酸カリウムで o−−3−キノン体へ酸化され、ＤＰＥと発蛍光する。ここで 4‑ヒドロキシ‑3‑メトキシフェニル化合物も図2B に示すように電解酸化または過ヨウ素酸酸化で o‑キノン体へ変換できることに着目した。ただし、この反応ではカテコール化合物と対応する 4‑ヒドロキシ‑3‑メトキシフェニル化合物は同一の蛍光誘導体を与えるためプレカラム蛍光誘導体化には適用できない。そこで酸化およびＤＰＥ反応をポストカラム蛍光誘導体化反応として組込んだＨＰＬＣシステムを作成した(図 3)4,5)。いずれのシステムでもカテコールアミンおよびその代謝物をイオン対逆相分配モードで分離したのち、電解酸化または過ヨウ素酸酸化して o‑キノンヘ変換し、次いでＤＰＥで蛍光誘導体化して蛍光検出する。

Ｍ＝移動相；Ｐ＝ポンプ；ＥＣＤ＝電気化学検出器；ＦＤ＝蛍光検出器
図 3 ポストカラム蛍光誘導体化ＨＰＬＣシステム
電解酸化には市販のクーロメトリック方式の電気化学検出器を利用しているが、o‑キノンヘの変換率は 90−100％であった。電気化学検出器からの流出液にＤＰＥとヘキサシアノ鉄(Ⅲ)酸カリウムの混合液を導入し、80℃の反応コイル（内径 0.5mm、20m）中を通過する間に蛍光誘導体化する。
過ヨウ素酸酸化ではカラムから溶出液に過ヨウ素酸ナトリウム溶液を導入して反応コイル(内径 0.
0.5mm、1m)を通過する間に o‑キノンヘの変換が完了する（変換効率 90−95％）。次いで電解酸化と同様にＤＰＥと反応させる。過ヨウ素酸酸化−ＤＰＥ反応のような 2 段階の反応でもポストカラム反応としてシステムに組み込むことができる。
両システムとも尿および血漿試料に適用可能であり、その前処理も極めて簡便なものであった。
尿および除タンパクした血漿を陽イオン交換カートリッジを用いて得たアミン画分(抽出)と酸・アルコール画分(素通り)をＨＰＬＣ試料とした 5,6)。両システムを比較すると、電解酸化では硫酸抱合休も酸化され o‑キノンヘ変換されて蛍光ピークを与えるので、それを酸化しない過ヨウ素酸酸化の場合より複雑なクロマトグラムになった。図 4 に過ヨウ素酸酸化−ＤＰＥ反応を用いたシステムによる尿の分析結果を示す。

−4−

図 4 ヒト尿中カテコールアミン及びその代謝物
４．おわりに生理活性物質について、活性が共通するグループや代謝物を含めたグループの一斉分析を計画する場合、クロマトグラフィーは必須方法論となる。生体試料のように極めて複雑なマトリックスから目的グループのみを検出するためには様々な工夫が必要となる。グループに共通の蛍光反応があれば、ポストカラム蛍光誘導体化ＨＰＬＣは有用と考えられる。
文 載
1. Y.Ohkura，Ana1．Sci．
，5, 371（1989)
2．能田 均、ぶんせき、307（1992)
3. A.Mjtsuj，H.Nohta and Y.Ohkura，J. Chromatogr．
，344，61（1985)
4. H.Nohta，E.Yamaguchi，Y.Ohkura and H.Watanabe，J. Chromatogr., 493，15（1989)
5. H.K.Jeon，H.Nohta and Y.Ohkura，Anal. Biochem., 200，332（1992)
6. H.Nohta，E.Yamaguchi，Y.Ohkura and H.Watanabe，J．Chromatogr., 493，15（1989)−5−

トピックス
導電性フタロシアニンとその解釈における重要な注意点
工学部 石 川 雄 一
金属様の導電特性を持つフタロシアニンは、米国ノースウェスタン大学のマークスやホフマング「積層構ループによって 70 年代の後半に開発され現在も興味深い研究が続けて行われてます 1)。
造にあるフタロシアニン環のπ電子雲の重なり」と「中心金属の連結鎖」のイメージがもたらす研究衝動だけでなく、これら機能性化合物の持つ合成の容易さと優れた単結晶性も多くの世界的な研究をモーティベィトしているのも事実でしょう。多くの物性データ、特に電気伝導性が理論的観点から活発に議論されてます。そのような中で、最近、私の協同研究先であるホフマングループは、先の特性故に研究者が見落としていた致命的な過ちを明らかにしました 2)。極端な表現をしますと、従来の詳細な研究は何を議論しているのか判らないといえます。ここでは、この事についてフタロシアニンの伝導特性の簡単な説明を踏まえて触れてみたいと思います。ここで述べる仕事の大半は、「㈱日本触媒筑波研究所」の村田和彦博士と J．A．Thompson 博士らがホフマングループでなさったもので J．Am．Chem．Soc．に掲載予定です 2)。
ヨウ素によって部分酸化されたフタロシアニン(ｐｃ)の単結晶は、金属様の導電性を示します。
図 1(a)にこの pc−ヨウ素錯体の結晶構造(断面図)を示してます。ヨウ素酸化体は互いのベンゼン環の接触を避けるように平行に積み重なり、その一次元カラム間に還元されたヨウ素が I3‑として充填されてます。I3‑ 一分子と三つの p c 環が対応しているのが特徴です。即ち、I3‑ 一分子は三つのｐｃ環（HOMO の 2×3＝6 電子から）から一電子を受取り一つの正孔をｐｃ側に作り出します。これが一次元鎖バンド構造内の伝導キャリアーとして作用することにより金属的な特性をもたらすと説明されてます（図 1(b)）
。
図 2 は、ｐｃヨウ素錯体単結晶の規格化された伝導特性に与える調製方法の影響を現してます。
具体的な pc 自身の調製方法には触れませんが、いくつかの方法があります。四つの試料で伝導特性が大きく異なり、A から D の順番で伝導特性が低下します。もちろんこれらの試料は、何れも化学的な分析を充分に満足しているものです。異なるのは、「ｐｐｍ」レベルのラジカル濃度です。
図 2(b)は、有機ラジカル領域に表れたＥＳＲシグナルで、試料 D のシグナル強度は A の 47 倍の強度を与えます。ラジカル性不純物の伝導度に対する影響が明瞭です。同様な効果は、有機ラジカ
ルだけでなく銅や鉄を初めとした常磁性金属イオンからも認められます。特に使用している伝導鎖が配位性化合物なので強く影響します。伝導のキャリアーが、局所的な非常に微量な常磁性モーメントにより摂動を受け、巨視的な電気特性に反映する（「Kondo」）効果として定量的に説明がなされてます 2)。注意が必要なのは、このような常磁性不純物は、加熱などの物理的要因のみに基づ−6−くのでなく、合成過程でのパイレックス製ガラス容器などからも混入してくることです。従って、−7−

理論的精度が必要な議論には純度の高い石英製容器等での合成、調製が不可欠になります。
注意して伝導特性の温度依存性をみますと一つの矛盾に気付きます。純粋に金属的なものでした
ら伝導度は温度の低下とともに増加し絶対零度で発散するはずですがそうなってません。図 3 では
それが明かで極低温で温度の低下とともに増加していた伝導度が減少してます。即ち、伝導度が極大値を持ってます。このことを説明するために少し回り道ですが物理的なことに触れなければなりません。
「パイエルス転移」です。一般に、ＴＴＦ−ＴＣＮＱなどの一次元性伝導物質は、その一次元性故に低温で結晶格子が歪み、バンド構造が変化し(切断され)て金属状態を取れなくなってしまうパイエルス(金属→半導体)転移を引き起こします 3)。この転移に伴い温度の減少とともに増加していた伝導度はその転移点以降、急激に減少するようになります。即ち、伝導度の最大値を示す様になるわけです。詳細な説明は文献 1)に譲りますが、先のヨウ素による p c 部分酸化錯体は強い一次元性にもかかわらずそのような電子格子転移を起こしません。にもかかわらず、その伝導度は低温で最大値を示します。従って、ｐｃヨウ素錯体の伝導度／温度曲線で認められる最大値の存在は、通常の一次元体に特徴的なパイエルス転移ではありません。
図 3 は、非常に注意深く調製された、ニッケル(Ni(pc)I)およびフリーベース型(H2(pc)I)の伝導特性に与える両者の混合効果を示してます。図中の数字は、H2(pc)ヨウ素錯体の含有率です。

図 3．極めて純粋なニッケルおよびフリーベースのヨウ素酸化フタロシアニンの伝導特性に与える混合効果。図中の数字は、ニッケル体に対するフリーベース体のモル％を示す。
−8−

ニッケルとフリーベースのヨウ素錯体は同様に高い伝導特性を示す曲綽を与えるにもかかわらず、それら混合体のヨウ素酸化体の伝導特性は低下し、当量混合体でその低下がはぼ飽和してます。両試料は、共に反磁性化合物なので、前述した「Kondo 効果」もこの特性低下の原因ではありません。

この低下は結晶格子欠陥（有機性の反磁性不純物に基づく）伝導キャリアーの局在化（「Anderson 局在」）として定量的な解釈が可能です。ここで強調したいのは、ニッケルとそのフリーベースといった酷似した異種化合物の混入の場合であってさえもその電気伝導特性は大きく低下する事です。従って、例えば中心金属の錯化が不充分な試料では錯体本来の伝導特性を評価できない事になります。もちろん、図 2 は「Kondo」効果で説明可能です。
ヨウ素錯体を初めとした種々の pc 酸化体の単績晶は、どなたにでも比較的容易に作成できます
し、その元素分析やⅩ線解析も良い結果を与えます。従って、研究者は自分の作成試料に対して満足感を抱き、その物性測定結果が真実の姿を反映しているものとして議論を闘わせることになります。その結果、種々の収拾の付かない局面へ展開して行きます。ここで述べたいのは、化学的な分析手法では検知できない不純物の影響です。特に電気、磁気的な物性測定に対しその効果は、正にも負にも作用します。このような系で重要なことは、先に述べたことを意識して実験を組立て、結果を解釈するか否かでしょう。

文 献1）(a)B. M. Hoffman，J．A．Ibers，Acc．Chem．Res., 1983，16，15．
（b）最近では B．M．Hoffman ら，Inorg．Chem., 1992，31，352．
2）B. M. Hoffman, K. Murata，J. A. Thompson，J．Am．Chem．Soc., 1993，掲載予定。
3）D. 0. Cowan，F. M. Wlygul，Chem. Eng. News，1986，July 21，28．

−9−★★★★ お知らせ ★★★★

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4 1984 1 4 トピックス
5 1984 2 1 分析機器
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7 1984 2 3 トピックス
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8 1985 2 4 トピックス
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10 1985 3 2 分析機器
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15 1986 4 3 トピックス
16 1987 4 4 分析機器
16 1987 4 4 トピックス
17 1987 5 1 分析機器
18 1987 5 2 分析機器
19 1987 5 3 分析機器
19 1987 5 3 トピックス
20 1988 5 4 分析機器

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22 1988 6 2 分析機器
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23 1988 6 3 トピックス
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24 1989 6 4 トピックス
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27 1990 7 3 トピックス
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28 1990 7 4 トピックス
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32 1991 8 4 トピックス
33 1991 9 1 分析機器
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量分析35 1992 9 3 分析機器
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中央分析センター 渡辺美豊里
35 1992 9 3 トピックス 固体高分解能ＮＭＲを用いたｾﾞｵﾗｲﾄのｷｬﾗｸﾀﾘｾﾞｰｼｮﾝ
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36 1992 9 4 分析機器
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38 1992 10 2 分析機器
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