再構成型無細胞タンパク質合成系 (PUREfrex®) による標的タンパク質のN末端翻訳後修飾
N-terminal post-translational modification of target proteins using a reconstituted cell-free protein synthesis system (PUREfrex®)○松本 令奈1, 丹羽 達也2, 嶋根 康弘3, 車 兪澈3, 田口 英樹2, 金森 崇1(1ジーンフロンティア株式会社、2東工大・研究院・細胞センター 、3海洋研究開発機構・超先鋭研究開発プログラム)○ Rena Matsumoto1, Tatsuya Niwa2, Yasuhiro Shimane3, Yutetsu Kuruma3, Hideki Taguchi2 and Takashi Kanamori1(1GeneFrontier Corp., 2Cell Biology Center, IIR, Tokyo Tech, 3X-star, JAMSTEC)

Summary of the N-terminal modification in this study<Abstract>
PUREfrex®は、PURE systemを基にした、大腸菌でのタンパク質合成に関与Acetylation (by NatB)する因子のみから再構成した無細胞タンパク質合成系である。反応条件や追加

initial Met cleavageを付加したタンパク質の合成を行った。

unnecessaryα-synuclein (K6A)

Target protein

N末端翻訳後修飾タンパク質合成には非ホルミル化開始メチオニンから始ま

Myristoylation

PUREfrex®/ (-)10-CHO-THF

PURE system

因子の調節が容易なため、様々な翻訳後修飾の条件検討も容易である。本研究では、翻訳後修飾されたタンパク質の合成例として、N末端にミリストイル基

Acetylation (by NatA)
necessary
CPR1(10aa)(Q3E)-sfGFP

necessaryGoα(C3S)-sfGFP

yNAA10 (ARD1)
yNAA25 (NAT1)
Acetyl-CoA
Co-translational reaction

hNMT1Δ80<Abstract>

るポリペプチド合成が必要であるため、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸(10CHO-THF) 不含PUREfrex®反応液を用いた。

yNAA20 (NAT3)
yNAA25 (MDM20)
Acetyl-CoA
Co-translational reaction

Enzymes

本研究におけるN末端ミリストイル化タンパク質合成については、開始メチ

Substrate
Method

オニンをメチオニンアミノペプチダーゼ (MAP) で切断した標的タンパク質とN-ミリストイルトランスフェラーゼ (NMT) を個別に合成した後、これらとミMyristoyl-CoA
Post-translational reaction

リストイル-CoAを混合して翻訳後ミリストイル化反応を行った。この反応産物のN末端ペプチドについて質量分析を行ったところ、N末端へのミリストイル基修飾が確認された。また、リポソーム(GUV)内で翻訳後ミリストイル化反応

1. N-terminal modification requires the synthesis of polypeptides with unformylated methionine

を 行 っ た と こ ろ 、 GUV 膜 に 局 在 し て い る 標 的 タ ン パ ク 質 が 観 察 さ れ 、PUREfrex® により合成されたミリストイル化タンパク質が膜局在能を持つことが確認された。

1-1. Cell-free protein synthesis with or without
10-CHO-THF

1-2. Cleavage of initial methionine (iMet) withmethionine aminopeptidase (MAP)

PUREfrex®を用いた翻訳後修飾タンパク質合成の他の成功例として、N末端アセCPR1(10aa)(Q3E)-sfGFPチル化タンパク質の合成（翻訳共役型）についても紹介する。

fMet

X X X
MAP

N-terminal post-translational modification(iMet cleavage is not occurred.)Met(-) 10-CHOTHF

X X X
MAPGoα(8aa)(C3S)-sfGFP

X X XiMet cleavaged potypeptide

10-CHO-THF is not essential for protein synthesis within thePURE system but affects the efficiency of protein synthesis,depending on the properties of each protein, especially its
N-terminal sequence.

ACS Synth. Biol. (2023)
DOI: 10.1021/acssynbio.3c00191

Signal intensities of the N-terminal peptide after trypsin digestion

iMet was cleaved by MAP when synthesized without 10-CHO-THF.

2. in vitro N-terminal acetylation of model protein

3. in vitro N-terminal myristoylation of model protein

2-1. N-terminal acetylation by NatB

3-1. N-terminal myristoylation

Synthesis of sfGFP by PUREfrex in the presenceof myristoyl-CoA

SDS-PAGE analysis of α-synuclein (K6A)
after co-translational acetylation

Extracted ion chromatograms of the N-terminal peptide derived from αsynuclein(K6A) after trypsin digestion

Myristoyl-CoA was inhibited protein
synthesis.
N-terminal myristoylation of target
proteins by PUREfrex must be performed
in a post-translational reaction.

SDS-PAGE analysis of Goα(8aa)(C3S)-sfGFP
after post-translational myristoylation

2-2. N-terminal acetylation by NatA

Extracted ion chromatograms of the N-terminal peptide derived from Goα(8aa)(C3S)-sfGFP after trypsin digestion

SDS-PAGE analysis of CPR1(10aa)(Q3E)sfGFP after co-translational acetylation

Extracted ion chromatograms of the N-terminal peptide derived fromCPR1(10aa)(Q3E)-sfGFP after trypsin digestion

N-terminal acetylation of target proteins using PUREfrex was successful only when bothtransferase and auxiliary protein were present.

N-terminal myristoylation was detected when the target protein was reacted with hNMT1Δ80synthesized by PUREfrex and myristoyl-CoA.

3-2. Membrane localization of N-terminal myristoylated protein<Conclusion>• In vitro acetylation or myristoylation at the N-terminus of a protein was
successfully accomplished using the PUREfrex.
• N-terminal modified proteins can be prepared easily and simply, in acompletely controlled manner.
• The modifying enzymes were also synthesized using the PUREfrex and wereused without purification. This may be useful for evaluating the activity ofmodifying enzymes without the use of live cells.

The ratio of membrane localization ofGoα(8aa)(C3S)-sfGFP

PUREfrex is a useful tool for the preparation of N-terminal
modified proteins.
For more information, please contact us.
URL: www.genefrontier.com
E-mail: purefrex@genefrontier.com

Myristoylated proteins produced by post-translational myristoylation
using PUREfrex was partially localized to GUV membrane.