目次

分析機器解説シリーズ（29) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1
細胞生物学における顕微蛍光分析の利用
平成２・３年度センター委員・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5
中央分析センター（筑紫地区）装置利用状況・・・・・・・・・・・・・・・9
中央分析センター工学分室装置利用状況・・・・・・・・・・・・・・・・ 10
中央分析センター工学分室装置利用経費表・・・・・・・・・・・・・・・ 11
お 知 ら せ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13
１．新設装置の紹介
２．登録装置についての変更
３．走査型電子顕微鏡(ABT‑32,WET‑SEM)の利用料金について

CENTER OF ADVANCED INSTRUMENTAL ANALYSISKYUSHU UNIVERSITY

★ 分析機器解説シリーズ（29） ★
細胞生物学における顕微螢光分析の利用
中央分析センター 西 山 宣 昭
１．はじめに
近年、生化学、分子生物学における微視的知見の集積により、細胞レベルでのマクロな現象の解釈が可能となりつつある。このような状況において、細胞生物学における蛍光分析利用の重要牲は、モノクローナル抗体等の特異牲の高い蛍光標識の開発に伴なって、広く認識されるようになった。
本センターには、Ⅹ線回折装置と顕微蛍光分析装置とから成る超高圧物性測定装置が平成元年度に設置され、材料、物性物理の研究者の利用に供されているが、このうち顕微蛍光分析装置の部分はシステムを変更することなく、細胞研究に応用することができる。本稿では、顕微蛍光分析装置について概説するとともに、本システムにおいても測定可能な若干の研究例を紹介する。固体研究に用いる場合の超高圧物性測定装置については、すでに詳しい解説があるので参照されたい。
（センターニュース、Vo1．7、No.2（1989））
２．レーザー顕微螢光分析
細胞生物学の領域で用いる蛍光分析の装置としては、蛍光分光光度計が最も一般的であり、したがって観測される蛍光強度は細胞集成での総和となる。本稿で紹介する顕微蛍光分析装置は、光源としてレーザー光を用いており、顕微鏡の光学系を通過させることによって極めて微小な領域を照射できること、及び照射領域を接眼レンズを通して特定できることが大きな特徴である。したがって、単一細胞内の特定領域あるいは細胞集団における不均一牲など部位特異的な情報を引きだすことが可能であり、蛍光分光光度計では得られない知見を得ることができる。
本システムは、He−Cd レーザーを光源としている。レーザー光は顕微鏡に導入された後に、対物レンズを通して試料に照射される。試料より生じた蛍光は、分光器を経て、ホトマル、フォトンカウンターによって光子計数される。
（装置の構成については、上述のセンターニュースを参照） レーザ
ー光は 40mW、441nm の波長を持つが、生じた蛍光のうち 530nm より短波長の蛍光は、検出系に導入される前にダイクロイックミラーでカットされる。用いるホトマルの感度も考慮すると、測定波長範囲は現システムにおいては 550〜700nm 程度である。したがって、用いる蛍光剤に制約がある。
本システムにおいて、腔腸動物ヒドラを材料として、いくつかの蛍光色素を検討した。核酸結合性蛍光剤として知られるアクリジンオレンジ（0.1μg／ml）でヒドラ組織、解離細胞を処理した。ヒドラの解離細胞は、70mOsm 程度の高イオン強度塩溶液で処理することにより得て、軟寒天中に固定して測定に供した。アクリジンオレンジは、2 本鎖 DNA に対しては塩基対間にインターカレートする−1−ことにより 530nm の蛍光を、また RNA 等 1 本鎖核酸に対しては、リン酸基との静電相互作用によりスタッキングを起こして 640nm の蛍光を発する。ヒドラ解離単一細胞に対して十分な蛍光が検出できた。膜カルシウム結合性蛍光剤クロルテトラサイクリンについても検討した結果、本システムで検出可能であった。現在用意されている対物レンズは×10、×20 であり、照射領域は×20 レンズで直径 20μm 程度のスポットとなる。さらに高倍率のレンズを用いれば、単一細胞内の微小鎖域を照射できる。但し、位相差でなく金属顕微鏡を用いているため、細胞内構造物の判別は難しい。
細胞内の特定の微小領域の蛍光分析を行なった例としては、Nd−YAG レーザーの 4 倍波による微小管の切断と蛍光標識したα−チューブリン抗体を用いた微小管の回復過程の研究(1)、Ca2+ 指示蛍光剤を使って、細胞分裂の際の細胞内コンパートメント間における Ca2+移動を調べた例(2)などがある。
細胞の増殖、分化に関連して、最近注目されているのは細胞間情報伝達の問題である。発生系においてはよく知られているように、分化因子に対する応答は、単一細胞ではなく細胞集成として生じる。(3)
培養系においても、３Ｔ３細胞を用いたギャップジャンクションと細胞増殖との相関を示す実験(4)などは、細胞集団に注目することの重要牲を示すよい例である。
レーザー光を光源とする本システムは、このような細胞集団を研究対象とする上で、極めて有効な手段となる。本来、固体研究用として設置された装置であるため、細胞研究には不備な点があるが、光源がレーザー光である利点を生かした実験が望まれる。
３．螢光退色回復法
先に述べたように、本装置により試料の特定の領域について蛍光強度及び蛍光スペクトルの測定が可能であるが、レーザーと顕微鏡との間の光軸に若干の改良（本来の超高圧物性測定装置としての機能は損なわずに）を加えることによって、原理的には以下に述べる蛍光退色回復法を使うことができる。
この方法では、ある微小領域をレーザー光など強い光で照射して蛍光分子を光退色させた後、励起光強度を 10‑3 〜 10‑4 程度に減少させ、その後の蛍光強度の変化を測定する。光退色後、照射領域外の退色されていない分子の流れ込みによって、蛍光強度は退色前の値へと近づく。この蛍光強度の回復過程を解析することによって、蛍光分子の拡散に関する情報を得ることができる。図 1 は、光退色に伴なう蛍光強度の時間変化を示している。図 2 は、蛍光退色回復法に用いられる装置の概略図を示している。レーザー光はビームスプリッタにより 2 本に分割きれ、1 本は測定用（図中 1）として、もう 1 本は光退色用として（図中 2）用いる。光退色光は、通常はシャッターによりカットされている。測定光は、ニュートラルデンシティーフィルターによって強度を落として用いる。
蛍光退色回復法は、本来細胞膜中の分子のダイナミックスの解析のために開発されたものであり、赤血球膜中の蛍光プローブの並進拡散係数が求められている。(5)その他の測定例としては、神経細胞

−2−

図1

図2

光退色後の蛍光強度の回復曲線

蛍光退色回復法に用いられる装置の概略図。レーザー
光１は測定用、２は光退色用である。ＢＳ１、ＢＳ２：
ビームスプリッタ、ＮＤ：ニュートラルデンシティフィ
ルター、ＳＨ：シャッター。

−3−

の分化に伴なう細胞膜流動性の変化を測定した研究(6)などがある。実験的に得られた蛍光回復曲線を拡散方程式により解析するが、いくつかのモデルに対しては、すでに解析解が得られている。(7)以上述べた蛍光退色回復法は、膜流動性の測定以外にも顕微分光装置と組み合わせて用いる利点を生かして、様々な用途が考えられる。筆者は、この方法をギャップジャンクションのダイナミックスの研究に使えないか、現在検討中である。拡散係数の決定に必要なモデル化が困難な系に対しても、半定量的な物質移動の情報を引き出すことができると考えられる。本システムを使って蛍光退色回復法を用いる場合、大きな問題はレーザー強度が弱いことである。本システムに装着された He−Cd レーザーは、40mW であるが、通常は 2〜4W の Ar イオンレーザーが用いられている。どの程度の光退色が可能か現在検討中である。
４．ま と め本センターに設置されている超高圧物性測定装置は、本来固体研究用のものであるが、この装置に含まれるレーザー顕徴蛍光分析システムは、何ら変更することなく細胞生物学の分野の研究にも応用することが可能である。細胞生物学の領域におけるレーザー顕微蛍光分析は、ここ数年急速に普及しつつある。すでに、共焦点レーザー蛍光顕微鏡が市販されており、上述した部位特異的な蛍光分析及
びいわゆる蛍光顕微鏡としては、きわめて高い解像度が実現されているが高価である。本稿で紹介した顕微蛍光分析システムを構成するユニットは、細胞研究用としては必要最小限のものであるが、通常の蛍光分光光度計による測定からの知見をさらに進めた情報を得ることが期待できる。
（謝辞）
本システムの性能を見るために用いたヒドラは教養部生物・小早川義尚助教授よりいただいた。ここに感謝致します。
（参考文献）（1）J．Cell Biol．107、1025（1988）（2）J．Ce11 Biol．96、598（1983）（3）Development（Suppl）149（1989）（4）Exp. Ce11 Res．185、535（1989）（5）Biochim. Biophys．Acta 367、282（1974）（6）FEBS Lett．140、117（1982）（7）Biophys. J．16、1055（1976）−4−平成２・３年度センター委員
九州大学中央分析センター委員会委員（平成２・３年度）
委員

セ ン タ ー 長
機能物質科学研究所
工

大学院総合理工学研究科長〃斎 藤 省 吾

理学部

〃

岡 崎

篤

理学部

〃香 月

勗

工学部

〃

加 藤 昭 夫

工学部

〃

林

農学部

〃

筬 島農学部〃江 藤 守 総医学部〃

関 口 睦 夫

歯学部

〃太 田 道 雄

薬学部〃古 森 徹 哉

教養部

〃井 手

大学院総合理工学研究科〃

吉 永 日出男

応 用 力 学 研 究 所〃

吉 田 直 亮機能物質科学研究所〃

金 政 修 司〃梶 山 千 里分長宏

原 田 耕 介

学部

小 林

〃工学

教 授室

長

−5−

安 徳
豊

悌

九州大学中央分析センター運営委員会委員（平成２・３年度）
委 員 長

セン

ター

長

教 授

委

工学

分室

長

〃

梶 山 千 里

員

小 林

宏理学部

〃香 月

薬学部

〃

古 森 徹 哉

工学部

〃

高 木誠

農学部

〃

筬 島豊

大学院総合理工学研究科〃沖歯〃

松 家 茂 樹〃金 政 修 司助教授

坂 下 寛 文学部

機能物質科学研究所
中 央 分 析 セ ン ター

勗憲 典

九州大学中央分析センター幹事
幹 事 長

セ幹工理

幹事事ンター長

教 授

小 林

宏学部

〃高 木誠学部〃岡 崎篤

大学院総合理工学研究科〃

荒 井 弘 通機能物質科学研究所

助教授

中 央 分 析 セ ン ター

〃

−6−森章

坂 下 寛 文九州大学中央分析センタ工学分室委員会委員（平成２・３年度）
委員

長分室

長

教 授

梶 山 千 里工 学 部 委 員

（土木系）

助教授

神 野 健 二（建）教 授

松 藤 泰 典（電気系）

助教授

円 福 敬 二（機械系）

教 授

山 本 雄 二機）

助教授

川 上 幸 衛（化工 学 部 委 員（応）教 授

梶 山 千 里（合）

助教授

中 村源）

助教授

井 澤 英 二）教 授

福 島 久 哲冶）

教 授林航）助教授宇 田 暢 秀（応原）教 授

杉 崎 昌 和（応理）教 授

高見沢 橄一郎（資（冶（鉄（造理 学 部 委 員
農 学 部 委 員・博

安 徳

地質学

教 授

青 木 義 和生

物

学

助教授

太和田 勝 久農 芸 化 学教 授

江 藤 守 総食料化学工学

教 授

筬 島豊

教 授

高 木

誠

中央分析センター運営委員会工学部委員−7−九州大学中央分析センター工学分室幹事（平成２・３年度）
幹 事 長分室長

教 授

梶 山 千 里（応化）教 授

加 藤 昭 夫（工分）

助教授

今 坂 籐太郎（合化）

教 授

松 尾（合化）教 授

新 海 征 治（材工）

教 授

林

教 授

高 木拓安 徳中央分析センター幹事（合化）−8−誠中央分析センター（筑紫地区）装置利用状況（平成元年１月〜１２月）

No.

セ ン タ ー 機 器 名

1

エスカ・オージェ表面分析装置

2

蛍光Ⅹ線分析装置

3件数時

間

７１１２９１３０１９４

ワイセンベルグカメラ

８０８９日間44 軸型自動Ｘ線回折計

８５０日間

5

島津Ｘ線回折計

１６４７6

集中法粉末Ｘ線回折計

４１

７２

7

示差走査熱量計

７１４

8

セイコー熱分析装置

２２２

３３２

9

雰囲気中液体急冷装置

８７２

10

高周波 2 極スパッタ装置

９６

２,１８５

11

ラバープレス５５５４12

真空蒸着装置２５８６13超高圧物性測定装置

３５８１

14

超伝導核磁気共鳴装置

８２

６１７No.

登 録 機 器 名

1

多核種用ＦＴ型ＮＭＲ2

GSX‑270H‑FTNMR−9−件数時間

２７４６８１０

中央分析センター工学分室利用状況（平装置ＮＭＲ(GSX‑400)

名

所 属

成

元年

件 数1268

時 間2161

Ｘ線回折計(ADG‑302)

127

フーリエ変換赤外分光光度計度）
名

所 属
応・１

件 数
1010

時 間
1000

469

イオンコーティング装置

応・１436

179

343

382

示差走査熱量計

応・２248527

原子吸光分光装置

20

1

プラズマデポジション装置

応・２112549

熱天秤(TG‑30)3972

透過型電子顕微鏡

応・２2611140

示差熱分析装置(DTA‑30)

1748

イオンシンニング装置

応・２00

双子型恒温壁熱量計

00

光透過式粒度分布測定装置

応・３129136

微量水分測定装置

102

表面積測定装置

応・３2938

シンクログラフ

00ＮＭＲ(R‑600)

応・４4278356282188

精密分留装置応・４42038精密天秤

応・４3063535286

ｶﾞｽｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾌ質量分析計

応・４339184

Ｘ線発生装置00

二波長分光光度計

工 分

00ゼーマン水銀分析計

00

分光けい光光度計

工 分

390820金属中水素分析装置

188

レーザーラマン分光光度計

合・１87147

インピーダンス測定装置

39

160

ＥＳＲ

合・２233534

電炉

59

65

シンクログラフ合・４1717

343

金属顕微鏡

46

ＮＭＲ(R‑24B)

合・５2484787

高速液体クロマトグラフ

161

268

赤外分光光度計

合・５00

走査型電子顕微鏡(ABT‑32)

2071

直読式自動旋光計

合・５00

イオンコーティング装置6020円二色分散計電子・５157266

発光分析装置冶金・２925ミクロフォトメーター
ガラスキャピラリー作成装置
表面張力測定装置

気センター

装
置走査型電子顕微鏡‑
01‑中央分析センター工学分室（箱崎地区）装置利用経費表
装置名＊超伝導核磁気共鳴吸収装置(JNM‑GSX400)
高速液体クロマトグラフ
Ｘ線回折計
Ｘ線発生装置
走査型電子顕微鏡(ABT‑32)(WET‑SEM)
イオンコーティング装置
フーリエ変換赤外分光光度計

利 用 経 費 (円)ＡＢ
1 件当り 1時間当り 1 件当り 1時間当り熱天秤(TG‑30)
示差熱分析装置(DTA‑30)
双子型恒温壁熱量計
金属中水素分析装置

1,500
1,500

400
500
500

1,500
1,500

2,000

1,000 フィルム代は別料金
200

1,500

Nujol 法注)1 件についての測定時間が１KBr 法
時間を超える場合は１時間につき溶液法、１件とみなして件数を加算する
1,000
ATR 法
基本経費 500 円を加算
検量線作成 500 円/件5005002,000
校正 A:1,000 円/回
B: 600 円/回
100
チャート 1m 当り 100 円
シンクロットは利用者負担
ﾁｬｰﾄ 100 円/m を加算
300
100
500

200

100

1,000
1,000
3,000
600

300

微量水測定装置150

シンクログラフミクロフォトメーター
表面張力測定装置
インピーダンス測定装置

考

2,000

2,500
原子吸光分析装置

備

600

50‑
11‑ガラスキャピラリー作成装置
金属顕微鏡
電 気 炉
核磁気共鳴吸収装置(R‑24B)＊核磁気共鳴吸収装置(R‑600)
核磁気共鳴吸収装置(R‑90H)
ガスクロマトグラフ質量分析計
走査型電子顕微鏡(MSM‑6)＊イオンコーティング装置＊透過型電子顕微鏡＊イオンシンニング装置
二波長分光光度計
分光けい光光度計
レーザーラマン分光光度計
円二色分散計＊発光分析装置
示差走査熱量計
シンクログラフ
直読式自動旋光計
光透過式粒度分布測定器
表面積測定装置
精密天秤
プラズマデポジション装置

1,000 単位時間は 4 時間とする
100 フィルムは各自持参
150
700

1,000
2,000
1,000700

3,000

1,000

2,000

1,000

チャート 2m 以上の場合は1,000 円／ｍ（Ａ）、500 円／ｍ（Ｂ）を加算
200 円／写真 1 枚200
4,000
2,000
500
700
1,500
1,000
1,000

1,000
1,000300

250
300
1,000
500
500
100300500
500
100
1,000‑
21‑

★ お知らせ ★

１．新設装置の紹介
顕微画像解析システム
平成元年度教育研究学内特別経費により顕微画像解析システムを中央分析センター工学分室(箱崎地区)に設置しました。顕微鏡面像のデジタル画像解析等に使用することができます。仕様は以下の通りです。
装置の構成（１）面像処理装置

日本アビオニクス㈱ Excel Ⅱ（２）ビデオモニター

Sony（３）ハードコピー装置

日本アビオニクス㈱ FR−1000

PVM1442Q（４）パーソナルコンピューター NEC

PC9801RX4（５）スキャナー

EPSON

GT−6000（６）TV カメラ

東京電子㈱CS 3430（７）顕 微 鏡

NIXON

XF 一 VM

項目

画像入力

内

容

(1)TV カメラ(2)外部ビデオ入力(3)スキャナー

面像メモリ

512 画素 x512 画素 x8bit
x3 プレーン

機(1)画像入力及び濃淡処理

能(2)二値面像化処理(3)計測処理(4)2 次元フーリエ変換
出力

利用料金

備考

(1)①顕微鏡写真をコピースタンドで撮影入力②TV カメラを顛徴鏡にとりつけ直接入力(2)ビデオに記録した面像を入力(VTR はユーザーが用意）(3)面像をスキャナーでデジタル化し、フロッピーにデータファイルを作製する。

(1)積分入力、差分入力、濃度変換、シェイデイング
補 正、エッジ強調(2)膨張、収縮、粒子除去(3)粒度分布、漁度計測、統計処理(4)フーリエ変換、フーリエ逆変換(3)プリンター(1)処理面像(35mm フィルム、ポラロイドフィルム)(2)処理画像データ(MS‑DOS)
計算結果(3)処理面像データ、計算結果

1 時間 1,000 円

フィルム、フロッピイはユーザーが用意する(1)ハードコピー(2)フロッピー・ディスク

尚、この装置の講習会を 7 月に予定しておりますので、ご希望の方は工学分室事務室(内線 5973)までお問合せ下さい。

−13−

２．登録装置についての変更
・登録取消装置
常磁性共鳴吸収装置
型

式：日本電子製 JESME−3Ⅹ

管理講座：工学部合成化学科第 2 講座
・新規登録装置
核磁気共鳴吸収装置
型

式：日立 R−90H

管理講座：工学部工業分析化学講座
装置管理者：石橋信彦
装置責任者：川畑祐司
担当オペレーター：川畑祐司
利用料金：A：1000 円／件
B： 700 円／件（A：担当オペレーターが測定、B：依頼者が測定）
３．走査型電子顕微鏡（ABT−32、WET−SEM）の利用料金について下記のように改定しました。
・改定料金
A：2000 円／件
B：1000 円／時間

（但し、フィルム代は別料金）

・尚、本装置の付属装置としてのイオンコ一夕の利用料金は 1 回の使用につき 200 円とします。

−14−