目次

分析機器解説シリーズ（20) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1
超伝導ＮＭＲ
トピックス・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・7
吸着クロマトグラフィーによる細胞分離お知らせ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・9
・集中法粉末Ｘ線回折計の修理について
・熱分析装置の修理について
・超伝導核磁気共鳴装置について

CENTER OF ADVANCED INSTRUMENTAL ANALYSISKYUSHU UNIVERSITY

★ 分析機器解説シリーズ（20）★
超 伝 導 Ｎ Ｍ Ｒ
工学部 中 村１．概博

要

有機化合物の同定や構造解析においてＮＭＲ(核磁気共鳴)スペクトルは、赤外吸収スペクトル、質量分析、元素分析と並んで、有機化合物を扱う化学者にとって、なくてはならない存在となっている。さらに近年は 1Ｈ、13Ｃ以外に 15Ｎやほとんどの核スピンを持つ元素のＮＭＲの測定が可能となってきており、無機化学者にとっても利用価値の高いものとなってきている。
さて、ＮＭＲの基本的な原理については色々な文献に記載があるので、それを参考にしていただ
きたい。1),2) また、本センターニュース(1、2 号)にも紹介があるので、ここでは工学分室に設置されるフーリエ変換ＮＭＲ(ＦＴ−ＮＭＲ)セカンドシステム（観測周波数 400MHz：日本電子製）について、従来の 60MHz、90MHz のＦＴ−ＮＭＲ装置と異なる点について主に述べることにする。
従来の 100MHz 以下のＮＭＲは磁石として電磁石や永久磁石を使用していたため、せいぜい 2.5T(1T=10000 Gauss, 1Ｈの共鳴周波数にして約 100MHz)の磁場強度しかだせなかったが、超伝導磁石の発達にともない 14T 程度(1Ｈの共鳴周波数にして 600MHz)の磁場強度がだせるようになり、400−600MHz のＮＭＲの測定が可能となった。この超伝導磁石の特長は次の通りである。
(1)鉄心を使わないので強磁場が出せる(飽和がない)。(2)永久電流なので一度励磁すると電力が不要である。(3)永久磁石のように室温や経年による磁場強度、均一性が変化することがほとんどない。
欠点として超伝導にするため 4℃に保たねばならず液体 He を必要とする、ことなどである。
一般的にＮＭＲはより高磁場(すなわち、より高周波数で測定)を使う方向にある。高磁場でＮＭＲを測定するメリットとして次のようなことがあげられる。
（1）測定感度（S／N 比）が向上する。これは、核スピンのエネルギー準位の差が大きくなり、熱平衡時の分布（ボルツマン分布）の差が大きくなることに起因する。
（2）ピークの分離がよくなる。これはピーク幅が核の緩和時間に依るが、これは磁場強度にはあまり影響されないので Hz 単位で変化しない。一方ケミカルシフト差(⊿δ)は Hz 単位で観測周波数に比例するからである。
（3）カップリングによる分裂パターンが明瞭になる。これは上記で述べたように⊿δに対してカップリング定(J)が不変であることによる。従って多くの場合、一次解析（隣に 1Ｈが一個存在するとピークが 2 本に分裂するといった単純な解析法)の条件である⊿δ／J＞10 を満足する。これによって 3 スピン系以上の場合（ABC スピン系など）にも容易にピークの解析ができるようになる。
２．装置

測定装置は図 1 に示すように液体 He（2 重ジュワーに入れてある）中に水平に置かれた超伝導コイルとその中心にゐるプローブと、照射パルス発生器と検出器、及びデータ処理コンピュータ等によ−1−

り構成されている。磁界の方向（Z 軸）は垂直方向でスピニングの軸と同方向で、100MHz 以下の装置とは異なる。
プローブは直径 5mm サンプル管を使用する 1Ｈ、13Ｃ共通プローブと、10mm 管用の多核種プローブが使用できる。後者は 31Ｐから 103Ｒｈまでの全核種(19Ｆを除く)の測定が可能である。観測範囲はＡ／Ｄコンバーターの変換速度（100KHz）で決っており測定核種にかかわらず Hz 単位で最大100KHz、すなわち 1Ｈでは最大 250ppm の範囲に、13Ｃでは最大 1000ppm となる。通常の試料ではこの範囲に十分おさまる。他の核種においてはケミカルシフトが広範囲に及ぶものもあるので、この範囲を越える場合は十分注意する必要がある(折返しピークなど)。また、測定温度は−100〜180℃まで変えることができる。
照射パルスは付属のマルチパルサーによって種々のパルス系列を発生させることができるが、パルスの位相は±x、±y だけである。観測側(検出器)の位相(参照波の位相)は 30°と 45°きざみで設定できる。これにより後述する各種 2 次元スペクトルの測定が可能となる。
検出器はデジタル Quadrature detection 法(注)を採用しており、観測範囲と感度において高効率のデータ取り込みを行っている。
このようにして取り込まれた信号を A／D 変換器を経てコンピュータに取り込みデータ処理を行い、結果をプロッタに描き出すようになっている。コンピュータには高速でフーリエ変換を行うアレイプロッセッサを併用して、以前はかなりの時間を要していたフーリエ変換の高速化を図ってい−2−る。さらに、分解能調整やパルス幅の設定などはコンピュータ化されていて、容易に調整、設定ができる。
３．試料

試料管は 1Ｈ及び 13Ｃの測定には直径 5mm の NMR 用サンプル管を、それ以外の核種の測定には直径 10mm のサンプル管をそれぞれ用いる。
試料は、重水素の共鳴信号を磁場ロックのために使用する関係上、重水素を含んだ溶媒（CDC13 、D 20、C 6D 6 等）を用いて均一な溶液とする必要がある。四塩化炭素のように重水素を含まない溶媒のときには特別の工夫が必要である。また、ごみ、綿くずや固体の混入は、分解能の低下をまねくので避けなければならない。これらの注意は従来のＮＭＲの測定の場合と全く同様である。
液量は高さにして 40mm(5mm 管のとき 640μl)であることが望ましいが、それ以下(30mm)でも可能であるが、分解能の点から好ましくない。
４．2 次元 NMR スペクトル 3,4)
ＮＭＲの高磁場化、高周波数化に伴い、前述したように⊿δ／J＞10 をほとんどの場合満足するようになってきたことと、高感度になり積算回数が少なくなってきたことから、従来のＣＷ法では考えられなかった色々な測定法が発達してきた。2 次元ＮＭＲスペクトル法もそのひとつである。
これは、積算回数の減少（S／N 比の向上）とともに、コンピュータの高速、大容量化と、フーリェ変換の高速化が寄与するところも大きい。このＦＴ−ＮＭＲで初めて可能となった 2 次元ＮＭＲがどんなものであるか、簡単に紹介してみよう。
通常のＦＴ−ＮＭＲ測定では 90°x パルスのすぐ後からＦＩＤ信号（t2 時間軸）をコンピュータに取り込み、これをフーリエ変換するのであるが、2 次元スペクトルを測定する場合には本装置に付属しているマルチパルサーによって種々のパルス系列(パルス角度、種顆、間隔を色々組み合わせたもの）を、ＦＩＤシグナル取り込み以前に加える(図 2)。このＦＩＤ取り込み前のパルス系列によってＦＩＤ信号は、強度や位相に変調を受ける。この変調のモードは、変調の原因（例えばカップリング(J)、NOE 等）によって決まるが、またパルス系列中の時間(tl)によっても変わる。
tl を少しずつ変化させながらＦＩＤ信号を取り込むと tl 軸、t2 軸に展開きれた FID データが得られる。時間 tl と t2 は全く独立であるので、それぞれ独立にフーリエ変換でき、これによって 2 次元化したＮＭＲスペクトル(横軸に F2(t2)が縦軸に Fl(tl))が得られる。t2 軸から得られる F2 軸は通常のＮＭＲスペクトルを表わすが、tl 軸にどういう情報(前述の変調の原因)を入れるかで Fl 軸に引き−3−出される情報が決定される。
一例を示すと 13Ｃの測定において、1Ｈ−13Ｃのカップリング定数 J の周波数でＦＩＤ信号が変調を受けるようにパルス系列を組むと Fl 軸には J によって分裂したピークが、F2 軸にはデカップルされ。
た 13Ｃのピークが投影される（図 3）

このようにスペクトルの 2 次元化は、スペクトルの持つ 2 つ以上の情報（例えばケミカルシフトとカップリング定数など）を 2 つの座標に分離することになり、解析を非常に容易にすることができる。一方、2 次元化のもうひとつの重要な効果としてピークとピークの相関関係（2 つの核が「カップリングしている」、「近い距離にある」など）がスペクトル上に表現できることである。
2 次元ＮＭＲについては現在 100 以上の方法が考えられている。そのうち代表的な測定法をその目的とともに表 1 に示しておいた。特に COSY スペクトルは、スペクトルを帰属するうえで非常に有用であり、以前の選択的デカップリングによって相関関係を見つけていた時に較べ一目瞭然で簡単になった。またＣ−Ｈ J 分解は従来法で言うと OFF− RESONANCE 法による炭素の級数の決定法に相当するが、スペクトルの重なりがなく解析が容易である。さらに 2 次元 INADEQUATE
法は炭素骨格のつながりを決定するうえで現在最良の方法といえるが、測定にかなりの時間を要するのが欠点である。
以上のように 2 次元ＮＭＲを利用すれば非常に容易にスペクトルの帰属ができることは、有機化合物の構造決定のうえで強力な武器になると考えられる。
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表 1．2 次元ＮＭＲスペクトルの代表例
名称

Ｃ−Ｈ Ｊ分解

情報

F2 軸に 13Ｃのケミカルシフト、Fl 軸にＣ−Ｈ間のカップリング定数 J（図 3）

Ｈ−Ｈ Ｊ分解

F2 軸に 1Ｈのケミカルシフト、Fl 軸にＨ−Ｈ間のカップリング定数 J

Ｈ−Ｃ ＣＯＳＹ

F2 軸に 13Ｃのケミカルシフト、Fl 軸に 1Ｈのケミカルシフト。
交点はカップリングがあるＣ−Ｈの関係を示す。
（図 4）

Ｈ−Ｈ ＣＯＳＹ

Fl、F2 軸とも 1Ｈのケミカルシフト、対解線外の交点はカップリングがあるＨ−Ｈの関係を示す。

ＣＯＳＹ−４５

Ｈ−Ｈ ＣＯＳＹと同様であるが、Ｊの符号もわかる。

ＮＯＥＳＹ

Fl、F2 軸とも 1Ｈのケミカルシフト、対角線外の交点は近距離にあるＨ−Ｈの関係を示す。

INADEQUATE

隣同士が 13Ｃ−13Ｃである組合せのみ選び出すので炭素骨格がわかる。

−5−注）QUADRATURE DETECTION 法
初期のＦＴ−ＮＭＲの検出器は図 1 に示す x 軸方向のみからの観測（y 軸方向の振動磁場）のみしか行っていなかった。これによって得られるＦＩＤ信号をフーリエＣＯＳＩＮ変換すると、実数部に吸収型スペクトルが得られる。しかし、データのサンプリング間隔を⊿t(dwe11 time)とすると、スペクトルの観測範囲は 0〜 f／ 2Hz(但 し f＝ 1／ ⊿ t)に限られ、この範囲外（負またはf／2 より大きい場合）にピークがあると、それは折返しピークとして現れ（fold back）誤った解析結果を与えることがある。これに対して Q U A D R A T U R E D E T E C T I O N 法では y 軸方向からの観測も同時に行い(図 5)、これを虚数部とし、x 軸方向からのデータを実数部として複素フーリエ変換を行ないスペクトルを得る。この方法では同じ⊿t でも観測範囲が 2 倍の 0〜f または−f／2〜f／2(通常は後者を使用する)となり、折返しピークが混入する可能性が少なくなる。ただし、この範囲を越えるとやはり折返しが起こるので、あらかじめオペレータに予想ピークの範囲を知らせておく必要があることは従来と変わらない。
参 考 文 献1）藤原鎮男、中川直哉、清水 博 「高分解能核磁気共鳴−化学への応用−」 丸善（1962）。
2）森島 績 「新実験化学講座−3」 基礎技術 2 、p353〔核磁気共鳴〕丸善（1976）。
3）斉藤 肇、森島 績

現代化学 増刊 11、「高分解能 NMR−基礎と新しい展開−」東京化学同人（1987）。
4）日本化学会編

化学総説 No.49 「新しい磁気共鳴と化学への応用」学会出版センター（1986）。
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トピックス
吸着クロマトグラフィーによる細胞分離
工学部 前 田 瑞 夫
クロマトグラフィーは分離・分析の代表的手段として、あらゆる分野で利用されている。最近、クロマト的手法を用いてリンパ球亜集団を簡便かつ効率的に分離しうるシステムが開発された 1)。
ここに紹介したい。
弱塩基性のアミノ基を有する新しい高分子材料 1 がこのシステムの鍵である。1 は親水性の幹部、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、と枝部ポリアミンから成るくし形(グラフト)コポリマーである。1 の特徴は、これを膜にした場合、幹部と枝部が別々に集合し、いわゆるミクロドメイン構造を形成する点である 2)。
対象とされた細胞は、免疫学やバイオテクノロジーの分野で分離法の確立が望まれているりンパ球である。この亜集団である B 細胞と T 細胞を分離するのが目的である。
1 を 48〜60 メッシュのガラスビーズ表面にコーティングする。これを吸着体とし、ポリ塩化ビニル製チューブ(内径 3mm)に充填してカラムとする。システムの概要を図に示した。
ラットの腸間膜リンパ節より採取したリンパ球を用いた場合、カラム中には B 細胞が優先的に吸着し、カラムからの流出分として、95％以上の純度を有する T 細胞が 60％以上の収率で得られたという。分離は 4〜37℃の範囲のいずれの温度でも可能であり、しかも分離に要する時間はわずか 5分である。
報告 1)では分離のメカニズムについても詳しく

図 細胞分離用吸着クロマトグラフィー議論されている。細胞を懸濁させるメディウムのｐＨ、イオン強度を系統的に変化させた実験の結果から、1 上へのリンパ球の吸着は主としてイオン性相互作用に基づくことが示されたという。すなわち、細胞膜表面はシアル酸等の酸性解離基を有するため、全体として弱酸性を有する。一方、1 表面には弱塩基性のアミノ基があり、これが一種のイオン交換カラムの吸着体として勧く。B 細胞と T 細胞の酸性度が異なる（B 細胞の万が強酸−7−性）ため、選択的吸着が達成されたものと考察されている。
カラム内に吸着した B 細胞は、軽いピペッティングでほば 80％の収率で回収できたという。その生存率は 95％以上であり、本方法は細胞に対する損傷の極めて少ない方法であると主張されている。
その理由は、吸着体 1 の表面がつくるミクロドメイン構造にあると考察されている。
種々の細胞混合系から、特定の細胞種だけを分離することは、基礎・応用の両面から重要な課題である。古くから様々な手法が考案されてきたが、細胞の体積や密度に基づく方法（例えば遠心分離）が最も一般的に用いられている。一方、細胞の免疫学的性質や磁場・電場中での挙動の違いを利用した装置(電気泳動法、蛍光活性化細胞分離法など)も開発され、より精致な細胞分離に威力を発揮している。また、アフィニティークロマトの手法も細胞に対して応用されている 3)。しかし、これらの手法は高価な装置を必要としたり、操作が煩雑であること、細胞に対する標識などの前処理が必要であることなどの欠点も有している。
これに対し、ここで紹介した吸着クロマトグラフィーは、個々の細胞集団が有する細胞表面の物理化学的な性質に基づいて細胞を分離する方法であり、装置ならびに操作が実に簡便である。この方法のポイントは、言うまでもなく吸着体である高分子材料をいかに設計していくかであろう。
実はこうしたカラムクロマト的手法は古くから細胞分離に応用され、事実リンパ球の B 細胞、T細胞の分離にナイロンファイバーカラムが実験室、検査室で用いられている。しかし、この方法では午胎児血清によるカラムの前処理が必要であり、また有効な分離を達成するための温度（37℃）
や分離時間(30〜60 分)などに制約がある。さらに、もともと経験的に材料や条件が決められていることから、原理についてはほとんど議論されておらず、他の細胞系への応用がきかない。分離の効率や生存率も必らずしも満足のいくものではなかった 3)。
本報告 1)の著者らは、細胞を生き物としてでなく物理化学的にとらえることにより分離の原理を一般化し、しかも生き物としての特性を保ったままの分離に成功した。彼らの成功の前半は、弱塩基性アミノ基を有する材料を選んでアミノ基量、アミノ基のプロトン化度などを系統的に変化させ「化学的」考察した点にある。一方、後半の生存率については 1 の形成するミクロドメイン構造が大きく寄与していると考えられる。ミクロドメイン構造を有する高分子材料は、血小板活性化抑制材料として人工血管への応用が試みられているのを始め、広く細胞の活性化を抑えることが本論文の著者らを中心に実験的に証明されている 4)。
「分離・分析」というととかく既存原理の組み合わせや借り物の材料を基にした実学であるとの誤解をうけやすいが、新しい分離・分析法の開発にはやはり新原理と新材料が大切であることを改めて感じた次第である。
文 献1）a）片岡一則、化学と教育、35、119（1987）。
b）A．Maruyama，et al., Makromol. Chem., Rapid．Commun., 8，27（1987）。
2）A．Maruyama，et al., Makromol. Chem., 187，1895（1986）。
−8−3）竜田禎二、「バイオマテリアルサイエンス第 2 集」
、鶴田禎二、桜井靖久編、化学の領域増刊
135 号、南江堂東京、1982、p.155。
4）岡野光夫、他、同上、p.57。

★★★★★★ お 知 ら せ ★★★★★★
☆ 集中法粉末Ｘ線回折計（STOE）の一次元カウンターと高圧電源回路の修理を行いました。
長期間御迷惑をおかけしました。
☆ 熱分析装置（セイコー電子）の修理を行いました。
☆ 超伝導核磁気共鳴装置（日本電子製 JNM−GX500）が 3 月 7 日に搬入されます。そのため現在磁気シールドの工事その他を行っておりますが、工事は 3 月 3 日に完了の予定です。NMRは立ち上げに約 2 ケ月かかる見通しです。
☆ 超伝導核磁気共鳴装置（日本電子製 JNM−GSX400）が 3 月 7 日工学分室 118 号室に搬入されます。励磁、分解能調整等の後、4 月中旬より利用可能となる予定です。許細は次号センター
ニュースでお知らせ致します。

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