東京慈恵会医科大学

東京慈恵会医科大学 教育・研究年報 2018年版

関わるタンパク質との相互作用の意義，AZIN の細胞内機能解析やポリアミン依存的フレームシフト機

分 子 生 物 学 講 座構について研究を行った。

講座担当教授：松藤千弥

生化学，分子生物学

１．神経芽細胞腫における MYCN と AZ2 の相講
講

法之
明広

生化学，分子生物学
分子生物学

互作用の意義我々はこれまでに，AZ2 が神経芽細胞腫細胞株で高発現している MYCN と相互作用しその分解をユビキチン非依存的に促進すること見いだした。昨年度は，MYCN と AZ2 の相互作用と神経芽細胞腫細胞株の増殖と関連を軟寒天コロニーアッセイにより解析し，AZ2 をノックダウンした神経芽細胞腫株化細胞におけるコロニー量を形成の増大を確認した。今年度は，この AZ2 ノックダウン細胞とコントロール細胞をヌードマウスに移植するゼノグラフ
トマウスモデル実験を行い，個体における腫瘍形成を比較解析した。マウス左右腹部皮下に対比させる
ように AZ2 ノックダウン細胞とコントロール細胞を接種した。接種後 24 日目には，AZ2 ノックダウン細胞を接種した方の腫瘍体積がコントロールの７倍を超えていた。またその時点で摘出した腫瘍の重量もコントロールに比べ４倍増加していた。このことは個体においても AZ2 の発現が抑制された神経芽腫細胞では，腫瘍増殖能が高くなることを意味し「AZ2 の mRNA の発現が高いほど患者の予後が良好」という正の相関の一端を説明できると考えている。
今後さらに詳細なメカニズムの解析を行うと同時に創薬に向けた構造レベルの解析も行っていきたい。
２．AZ と ATP クエン酸リアーゼ（ACLY）の相互作用の解析
AZ 結合タンパク質の探索から新たに ACLY を同定し解析を進めてきた。ACLY は細胞質のクエン酸からアセチル CoA の生成を触媒する酵素で，脂質代謝と細胞内成分のアセチル化に関与している。
これまでに，がん細胞内で AZ1 と AZ2 は ACLYと結合し，ACLY の活性を増加させることがわかった。AZ は細胞内ポリアミンを負に制御するタンパク質であるが，AZ が ACLY を活性化するという

師：村井
師：小黒

教育・研究概要
Ⅰ．教育概要今年度は以下の講義・演習・実習を担当した。
・コース基礎医科学医Ⅰのユニット「分子から生命へ」講義（アミノ酸代謝，核酸代謝，遺伝子発現制御）
・コース基礎医科学医Ⅰのユニット「分子から生命へ演習」（タンパク質の一生，バイオインフォマティクス，バイオハザードとケミカルハザー
ド，生体分子の探査法）
・コース基礎医科学医Ⅰのユニット「分子から生命へ実習」（食欲・体重調節機構：レプチンとレプチン受容体）
・コース外国語Ⅲのユニット「医学英語専門文献抄読Ⅰ」・コース臨床基礎医学のユニット「症候学演習」
・コース臨床基礎医学のユニット「感染・免疫テュートリアル」
・コース臨床基礎医学のユニット「行動科学」
Ⅱ．研究概要
当講座ではアンチザイム（AZ）というポリアミン調節タンパク質の分子機能に焦点を当て，ポリア
ミン調節系の生物学的意義の解明と医学的応用を目的として研究を推進している。ポリアミンは細胞増殖に必須の生理活性物質であり，個体発生や発がんと深く関わっているばかりでなく，最近ではオートファジーを介した長寿（老化抑制）や血管の炎症抑制による動脈硬化予防にも関与していることが報告されている。AZ は細胞内のポリアミン濃度が高値となると翻訳フレームシフト機構によって発現誘導され，ポリアミン合成の律速酵素であるオルニチン脱炭酸酵素（ODC）に結合し，その活性を抑制するとともにプロテアソームによる分解を促進する。
また AZ はポリアミンの細胞内への取り込みも抑制する。このように AZ は細胞内ポリアミンの濃度のフィードバック調節を行っている。また，AZ にはその機能を抑制するタンパク質，アンチザイムインヒビター（AZIN）が存在する。本年度は，ポリアミン調節タンパク質 AZ とがんの増殖や脂質代謝に機能を持つことは興味深い。
この意義として我々は，ポリアミンが細胞外に排出されるときに受けるアセチル化が，クエン酸から ACLY によって作られるアセチル CoA を基質として行われているという可能性を考えた。その仮説を検証するために，ポリア
ミ ン 過 剰 発 現 株 で あ る EXOD 1 細 胞 を 用 い て
ACLY の強制発現または siRNA によるノックダウンが細胞内外のアセチル化ポリアミン量に影響を与えるか解析を試みた。EXOD 1 細胞に ACLY を過剰発現させると，細胞内外のアセチルポリアミン量― 61 ―電子署名者 : 東京慈恵会医科大学
DN : cn=東京慈恵会医科大学, o, ou,email=libedit@jikei.ac.jp, c=JP
日付 : 2020.02.01 09:09:53+09'00'

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が有意に上昇した。引き続き ACLY のノックダウ子（CAT）由来配列（AACGTGGCCAATATGGA-ンによる効果など検討中である。

CAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACGATG） を

３．AZIN1 の生理機能同様に同義コドンで変異導入し CAI を 0.62 へと減

AZIN1 は，AZ（Oaz）に結合する ODC ホモロ少させると（AAtGTtGCgAATATGGACAAtTTCTTCGCgCCgGTTTTCACGATG，小文字が変異させた塩基），＋１フレームシフト効率は増加した。
以上の結果よりポリアミンで誘導される配列非依存的＋１フレームシフトの効率は mRNA の翻訳効率と逆相関関係にあることが示唆された。

グで，Oaz の機能を阻害することで，ポリアミン濃度を正に調節するタンパク質である。我々はこれまでに，AZIN1 変異型マウスより確立した胎児由来線維芽細胞（M MEFs）は野生型胎児由来繊維芽細胞（W MEF）と比較して，細胞増殖の遅延，多核，巨核，や微小核を有する細胞が増加していることを見出してきた。今年度はその原因を探るため，微小核や多核を生じていない M MEFs（intact MMEFs ; iM MEFs）に着目して解析を進めた。中心体の数を計測するため，中心体マーカーとして知られるγチューブリンを染色したところ，W MEFに対し iM MEFs で中心体数の有意な減少を見出した。細胞分裂のある時期に AZIN1 が中心体局在しているという我々を含めたこれまでの知見から推測
すると，これらの結果は，AZIN1 の欠損が中心体の不安定性を引き起すことにより染色体不分配をもたらし，多核や巨核細胞の形成を増加させた可能性を示唆する。このことは，AZIN1 はポリアミン濃度調節以外に，適切な細胞分裂の進行に関わる重要なファクターであることを意味するのかもしれない。
４．ポリアミンで誘導される配列非依存的＋１フレームシフトと翻訳効率の関係性
昨年度までに，ヒト無細胞翻訳系において，ポリアミン依存的に様々な配列で翻訳フレームが＋１方向にずれること（配列非依存的＋１フレームシフト）を報告した。今年度はこの配列非依存的＋１フレームシフトと翻訳効率との関連性について解析を行なった。翻訳効率は Codon Adaptation Index（CAI）を用いて塩基配列から予測した。CAI はコドンの出現頻度を基に算出される指標で，０から１の間の数値で表され，0.8 から１の範囲で高い翻訳効率とされる。CAI が 0.50 である AZ 遺伝子のリードスルー領域の部分配列 TF＋36nt（TCCTTCTGCTCTTTCAGCCAACTTATTCTACTCCGACGATCGGCT）と，この配列に，コードするアミノ酸配列は同じであるが塩基配列が異なるような変異（同義コドン）を導入した CAI 0.86 の配列（TCCTTCTGCTCTTTCAGCCAgCTcATTCTgCTgCGgCGg
TCcGCT，小文字が変異させた塩基）をレポーターとしてポリアミン依存的＋１フレームシフトの誘導
効 率 を 比 較 す る と， 変 異 配 列 で 低 下 し た。 逆 に
CAI は 0.86 であるクロラムフェニコール耐性遺伝「点検・評価」
１．教育講座としての主な教育は，コース基礎医科学Ⅰのユニット「分子から生命へ」講義，演習，実習である。講義では生化学分野のアミノ酸とヌクレオチド代謝を担当したが，糖代謝や脂質代謝などとも関連づけながら講義した。そしてこれらの代謝を司る酵素が欠損した場合にどのような疾患につながるのかを解説し臨床との関連性を学生に意識させた。また講義の中で演習問題を行うなどし，学生の理解を深めるように工夫した。分子生物学分野では遺伝子発現の制御について講義した。演習では，自己学習および発表課題を提示し，学生の論理的思考とプレゼンテーション能力向上を目指した。具体的には，タンパク質の一生というテーマで，生体内でのタンパク質がどのように合成・輸送され機能しそして分解されていくのか，またそれらの破綻がどのような生命現象や疾患と関係しているのかを PBL 形式で学習させた。本年度の実習は昨年同様，「食欲・体重調節機構：レプチンとレプチン受容体」を行った。
実習内容の理解を深める目的で，演習と連携させ「ゲノム医科学とバイオインフォマティクス」
および「生体分子の探査法」と題して，実習時に必要な遺伝子情報の収集や解析をデータベース上で行う方法や生命科学の実験法を，コンピュータールームを利用して学習させた。演習や実習ではレポートを課し，その書き方などに問題がある学生に対しては個別に指導した。さらに実習では，最終日に口頭試験を行い実習の理解度を評価した。実習終了時に学生に対して行われるアンケートや実習独自のカリキュラム評
価では，高評価を得ており学生の満足度は高かった。
引き続きこのレベルを持続できるよう努力していきたい。
コース外国語Ⅲのユニット「医学英語専門文献抄読Ⅰ」
では医学・生命科学の英語文献を論文の構成，専門用語，実験手法などを学習しながら精読し，英語論文を読むための導入となるよう指導した。その― 62 ―

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他教育概要に挙げた演習等を担当したが，これらにおいては，学生がディスカッションにおいて自分の考えや意見を積極的に発言するように指導した。

5th International Conference on Polyamines. Taipei,Sept.
3）Ohta R １）, Oguro A, Nishimura K (Chiba Univ),Murai K １）, Fujioka H １）, Arisawa M １） ( １ Osaka

２．研究
今年度は講座主体の学術雑誌論文を発表できなかったが，共同研究など論文を複数発表できた。学会発表も国際学会で口頭発表するなど国内外含め積極的に活動できた。さらに多くの論文を発表できるように努力したい。講座主体の投稿準備中の論文があるので来年度は論文数も増加していくと考えている。また研究するための競争的資金の獲得もまだ少ないため科研費に限らず財団などにも積極的に応募していきたい。

研究業

Univ). (Poster) Design and synthesis of polyamine
analogues to obtain their aptamers. 22nd International Conference on Organic Synthesis (22 ICOS). Florence, Sept.
4）太田礼伊也１），小黒明広，西村和洋（千葉大），村井健一１），藤岡弘道１），有澤光弘１）（１ 大阪大）．
（口頭）
アプタマー取得に向けたポリアミン誘導体の設計と合成．第 44 回反応と合成の進歩シンポジウム．熊本，11 月．
5）小黒明広，町田幸大１），今高寛晃１）（１ 兵庫県立大），松藤千弥．（口頭）ヒト無細胞翻訳系における翻訳フ績

レームシフト維持に対するポリアミンの影響．日本ポⅠ．原著論文
1）Ohta R１）, Oguro A, Nishimura K (Chiba Univ),
Murai K １）, Fujioka H １）, Arisawa M １） ( １ OsakaUniv). Design and synthesis of1,

8

リアミン学会第 10 回年会．加賀，12 月．
6）大城戸真喜子，豊島裕子（千葉保医療大）．
（口頭）ロー
ビジョンという視点からの管理栄養士養成教育その２．

diacetylspermi-

第 65 回日本栄養改善学会学術総会．新潟，９月．［栄dine analogues having a linker with desired functional groups. Org Biomol Chem 2019 ; 17(4) : 867 75.
2）Tamari K １）, Konno M １）, Asai A １）, Koseki J １）,

養誌 2018；76（5 Suppl.）：223］
7）秋山政晴，大城戸真喜子，松藤千弥．（口頭）網膜

Hayashi K１）２）, Kawamoto K１）, Murai N, Matsufuji S,
Isohashi F１）, Satoh T１）, Goto N (Kanazawa Univ),
Tanaka S (Tokyo Med Dent Univ), Doki Y２）, Mori
M２）(２ Natl Inst Radiological Sci), Ogawa K１）, Ishii H１）(１ Osaka Univ). Polyamine ﬂux suppresses histonelysine demethylases and enhances

expression incancer stem cells. Cell Death Discov 2018 ; 4 : 104.
3）Katagiri S, Hayashi T, Yoshitake K１）, Murai N,Matsui Z２）, Kubo H, Satoh H２）(２ Tokyo Metropolitan Children s Med Ctr), Matsufuji S, Takamura T,
Yokoo T, Omori Y３）, Furukawa T３）(３ Osaka Univ),
Iwata T１） (１ Natl Inst Sensory Organs), Nakano T.
Compound heterozygous splice site variants in the
SCLT1 gene highlight an additional candidate locus forSenior Løken syndrome. Sci Rep 2018 ; 8(1) : 16733.

Ⅲ．学会発表1）Tajima A. (Oral) Antizyme and ATP citrate lyase
suppresses the cell death of ornithine decarboxylase
overproducing cell line 5th International Conference
on Polyamines : Biochemical, Physiological and Clinical Perspectives. Taipei, Sept.
2）Oguro A, Shigeta T１）, Machida K１）, Imataka H１）( １ Univ Hyogo), Matsufuji S. (Oral, Poster)
Polyamines promiscuously induce ＋1 ribosomal
frameshifting in a human cell free translation system.
― 63 ―芽細胞腫の長期フォローにおける尿中ポリアミンの有用性の検討．第 10 回日本ポリアミン学会．加賀，12 月．