Note
DsbC Set、PUREfrex®は研究用試薬です。ヒトを含む動物などへの投与、臨床、診断など他の用途への使用を禁じます。
また、食品、家庭用には使用しないでください。

#PF005-0.5

PUREfrex®を使用する際には、RNaseフリーの水、試薬、器具類を使用してください。また、手袋、マスクの着用をお勧

500 µL 反応用めします。

PUREfrex は、ジーンフロンティア株式会社の登録商標（第（タンパク質合成試薬は添付されていません）

5443077 号）です。商用利用をご希望の場合は、事前に弊社までお問い合わせください。

e-mail:purefrex@genefrontier.com

Introduction

Introduction

PUREfrex® について

DsbC Set / PDI Set について

PUREfrex® は、PURE system を基に開発された再構成型無は、正しい高次構造を形成する必要があります。細胞外に分泌ベートするだけで、目的タンパク質を合成できます。に、ジスルフィド結合が必要なタンパク質があります。

パク質をコードする DNA（または mRNA）を添加してインキュPURE system は、東京大学大学院の上田卓也教授のグループに精製した後、アミノ酸、NTP などと混合した合成系です (Ref.

正しいシステイン間でのジスルフィド結合形成には、ジスル

翻訳・エネルギー再生に必要なタンパク質、リボソームを個別

1, 2)。精製因子を混合した反応液を使用するため、組成を自由

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ド結合イソメラーゼ（PDI）、PDI の酸化酵素である Ero1α、及EU 程度にまで低減されています。また、RNase、βガラクトシ

タグ配列を付加したタンパク質を合成し、タグ配列により精製、Kit components
GSSG *1

内容：酸化型グルタチオン（60 mM）
開封後保存温度：-20ºC

DsbC *2

内容：30% グリセロール溶液
開封後保存温度：-20ºC

References) 1. Shimizu et al. (2001) Nat. Biotechnol., vol. 19, p. 751

25 µL

500 µL

れています。一方、PDI Set（#PF006）には、ヒト由来のジスルフィび GSSG が 含 ま れ て い ま す。DsbC Set、ま た は PDI Set を

PUREfrex® に添加して合成反応を行うことで、正しいジスルフィド結合を形成して活性を有するタンパク質を合成することができます。

反応液に含まれる還元剤によってジスルフィド結合の形成効率が異なるため、ジスルフィド結合含有タンパク質を合成する
場合は、還元剤を選択できる PUREfrex® 2.1（#PF213）を使用してください。

2. Shimizu et al. (2005) Methods, vol. 36, p. 299

Protocol開封前の保存温度は、すべて -80ºC です。
*1)
使用する還元剤の種類や濃度、合成するタンパク質により、

内容：320 µM DsbC（30% グリセロール溶液）
開封後保存温度：-20ºC または -80ºC *3

Dilution Buffer

検出することが可能です。

Kit components
25 µL

DsbC Set（#PF005）には、ジスルフィド結合形成が可能な環境にするための酸化剤として酸化型グルタチオン (GSSG)、及混入していた大腸菌由来のリポ多糖は、反応液 1 µL あたり 0.1には、精製、検出用のタグ配列が付加されていません。そのため、〒277-0005
千葉県柏市柏 273-1
シャープ柏ビル 4 階

フィド結合異性化活性を有する酵素が必要な場合もあります。

びジスルフィド結合イソメラーゼとして大腸菌の DsbC が含ま

PUREfrex® に含まれる翻訳因子などのすべてのタンパク質

ジーンフロンティア株式会社

ド結合形成には SH 基が酸化されうる環境が必要です。また、PUREfrex® は、反応液を構成するタンパク質、リボソーム、tRNA の調製方法を改良し、純度を高めた合成反応液です。特に、ダーゼなどの混入タンパク質も減少しています。

May 2023

ジスルフィド結合は、近接する 2 つのシステインのスルフヒドリル（SH）基が酸化されて形成される結合のため、ジスルフィど含まないなどの特長があります。

開封前保存温度︓-80℃されるタンパク質などの中には、正しい高次構造の形成や維持により開発された再構成型無細胞タンパク質合成系で、転写・に調節できる、タンパク質合成に無関係なタンパク質をほとん

Distributor

リボソームで合成されたタンパク質が機能を発現するために細胞タンパク質合成キットです。PUREfrex® に、目的のタン最適濃度が異なります。PUREfrex® 2.1 (#PF213) を使用し、DsbC Set を添加したタンパク質合成は、任意の反応液量で行うことができます。例えば、PUREfrex® 2.1 (#PF213) を使用し、0.5 mM Cysteine、4 mM GSH、1 mM GSSG、4 µM

DsbC を添加して、液量 20 µL で合成する場合、以下のように還元剤として 4 mM GSH を添加する場合、GSSG の標準的な使反応液を調製してください。

mM で検討してください。

1. Solution I、Cysteine、GSH、GSSG を、室温〜37ºC で 1*2)

2. Solution II、Solution III、DsbC を氷上で融解します。

用濃度は 1 mM です。GSSG の添加濃度を検討する場合、1-3

DsbC の濃度表記をモル濃度に変更しました。DsbC Set の320 µM は、旧 DS Supplement での 7.5 mg/mL と同濃度です。

DsbC の必要濃度は、合成するタンパク質によって異なります。必要濃度が不明な場合は、1〜16 µM で検討してください。
希釈が必要な場合は、添付の Dilution Buffer を使用してください。

*3)
使用後の残りの反応液を -80ºC で凍結保存する場合、液体窒素やドライアイス／エタノールなどで急速凍結してから保存してください。また、必要に応じて分注し、凍結融解の繰り返しをできるだけ避けてください。

分間ほど温めて完全に融解し、氷上に置きます。

3. 融解した Solution I、II、III、Cysteine、GSH、GSSG、

DsbC を軽くボルテックスした後、遠心して内容物をチューブ下部に集めます。

4. DsbC を Dilution Buffer で 4 倍に希釈します。また、

GSSG を水で 3 倍に希釈します。

Protocol5. 以下のように反応液を調製します。
（DNA は 1 kbp あたり 0.5-3 ng/µL になるように添加してください。）

Water
Solution I
Cysteine
GSH
GSSG (3 倍希釈 )Solution II
Solution III
DsbC (4 倍希釈 )Template DNA
Total

5-X µL
8 µL *4)
1 µL
1 µL
1 µL
1 µL
2 µL
1 µL
X µL
20 µL

6. 37ºC で 2〜6 時間反応させて、タンパク質を合成します。

7. 合成されたタンパク質を、それぞれの目的に使用します。

*4)
PUREfrex® 1.0（#PF001）、PUREfrex® 2.0（#PF201）とは使用量が異なりますので、注意してください。