立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第26号) 2017

pH 応答性トランジスタへの浮遊細胞捕捉による補体活性のラベルフリー測定
Capturing of floating cells on pH sensor for evaluation of complement activity
2161005

研究代表者(助成金受領者)

東京医科歯科大学
生体材料工学研究所

助 教合田

達郎

を ISFET 表面に捕捉する機能性有機界面を構[研 究 の 目 的]築した。次に，浮遊細胞を捕捉した ISFET を
ナノ材料の生体適合性評価においては個体レベルでの評価が必要である (1)。一方，近年にお用いて，外部刺激に対する浮遊細胞膜近傍のイオン微小環境変化を測定した。

ける動物愛護の観点から，Organ-on-a-chip な[研究の内容，成果］

どの動物実験代替モデルの構築が求められている 。生体適合性の評価における重要な項目と(2)して，補体活性測定がある。補体系は約 20 種

1．浮遊細胞捕捉界面の構築

類の血中タンパク質からなる自然免疫の防御機

機能性有機界面の構築のために，ホスホン酸構であり，活性化した補体分子が連鎖反応を繰誘導体にオレイル基を導入した分子 (Oleyl-り返し，異物や病原菌の細胞膜上に膜障害性複acetamide合体を形成することで破壊する (溶膜作用)。補acid : OEP) (図 1) を合成した。片末端のホス体活性はアレルギー反応などその他の免疫反応

ホン酸は金属酸化物に対して強固に結合するこを誘導することから，補体活性の測定はナノ材料とで安定な単分子膜を構築し (3)，もう片末端のの生体適合性評価において不可欠である。通常オレイル基は，細胞膜のリン脂質内に埋入するの補体活性測定法として溶血試験が挙げられることにより，浮遊細胞を非侵襲に捕捉する (4)。

が，膜障害性複合体によって形成される微小孔

また，スペーサー分子として，トリエチレングは大きさが一定でなく，ナノ材料による補体活性リコール基を導入した。ISFET 表面は酸化タンは低い場合も想定されるため，検出法の高感度タルで構築されているため，OEP による金属酸化が求められる。これまでの研究で，申請者らは，化物表面の化学修飾が可能である。そこで，ま半導体型 pH センサである Ion-Sensitive Field-

ず，n-ヘキサン/2-プロパノール混合溶液に溶

Effect Transistor (ISFET) と細胞を融合した解した OEP の前駆体 Carboxyl triethylenglycol

細胞微小環境 pH 測定系を確立した。この測定

hexylphosphonic acid (CEP) を室温で 48 時間

系は，細胞膜のバリア性をリアルタイムかつ高反応させた。次に，ISFET 表面を 2-プロパノー感度に評価できる新しい方法である。本研究ルで洗浄 したの ち，120℃で一 晩脱水縮 合さでは，この系を非接着性の浮遊細胞に拡張するせることにより，ISFET 表面に CEP 単分子膜ことで，新規補体活性評価法の開発を目指したを導入した。そして，4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-(図 1)。まず，補体活性評価に用いる浮遊細胞

triazin-2-yl)-4-methylmorp holinium Chloride― 1 ―triethylenglycol

hexylphosphonic立石科学技術振興財団

図1

図 2 (a) Jurkat T 細胞捕捉時の顕微鏡像。(b) 電位計測法
による溶液 pH 変化時の細胞膜近傍 pH 微小環境変化。

浮遊細胞捕捉用界面を有する ISFET 測定系(DMT-MM)を触媒として用い，メタノールに溶解したオレイルアミン (Oleylamine : OA) とCEP のカルボキシル末端を 50℃で 4 時間縮合反応させ，ISFET 表面に OEP 単分子膜を作製した (図 1)。
2．細胞微小環境 pH 測定系
我々のグループで開発した ISFET/細胞測定系 (図 1) を用いて，浮遊細胞膜近傍の pH 計測を行った。ドレイン-ソース間の電流を 0.5 mA，
電 圧 を 0.5-1.0 V に 調 節 し，参 照 電 極 と し てAg/AgCl ペレット電極を用いた。ISFET/細胞測定系の時間分解能は 0.2 秒，電位分解能は0.01 mV であり，ΔpH では 2.7×10 −4 の変化が測定できる。ISFET のゲート部分 (10 μm×340 μm) の周辺に，内径 5 mm の円筒ガラスを熱硬化性エポキシ樹脂で固定することで，ゲート電極に浮遊細胞を培養した。

図 3 (a) NH 4Cl buffer 添加時の NH 3選択的細胞膜透過による pH 変動。(b) 溶液交換による細胞膜近傍 pH 変化。

ISFET 表面に OEP を導入することで，浮遊細胞周辺の pH 変化の測定を可能とした。浮遊140 mM 塩化ナトリウム，4 mM 塩化カリウム，細胞には，血球系培養細胞である Jurkat T 細

1 mM 塩化マグネシウム，20 mM スクロース；胞を用いた。細胞懸濁液を ISFET 表面に曝し， pH 7.4) を用いた。BTP buffer は緩衝領域が室温で 30 分間培養することで，ISFET 表面へ

pH 6.0-9.5 と広く，生理学の研究において広くの 浮 遊 細 胞 の 捕 捉 を 行 っ た (図 2)。こ の用いられている。本研究では ISFET/細胞測定

ISFET/細胞測定系は 37℃，Jurkat T 細胞存在系を用いて，細胞膜のイオンバリア性に起因す下において，pH 6.0-8.5 の範囲で −37.2±2.7る細胞周辺微小環境 pH の変化を観察した。

mV/pH の電位応答を示した。ISFET は細胞非BTP buffer と NH 4Cl buffer の二つの溶液を細存在下においては，理想的なネルンスト応答を胞周辺において溶液交換を行うことで，細胞周示すことから，電位応答の傾きの低下は，細胞辺での一時的な pH の変動を誘導できる (図膜近傍のイオン微小環境測定に起因すると考え3)。細胞周辺の溶液を NH 4 Cl buffer に交換すられる。細胞の洗浄および電位の安定化には，ると，電位は瞬時に +19 mV 変化し，その後BTP buffer (1 mM Bis-tris propane (BTP)，

1 分以内に緩衝液 (pH 7.2) の電位に収束した。

― 2 ―Tateisi Science and Technology Foundation

次に，NH 4 Cl buffer から BTP buffer に溶液を与しない。つまり，pH 変動は細胞膜のイオン交換すると，電位は −23 mV 変化し，その後バリア性の評価がおこなえる。

BTP buffer (pH 7.4) の電位に収束した。溶液交換時の特徴的なピークは 10 回の溶液交換を3．ISFET/細胞測定系による細胞膜障害性評価行っても形や大きさに変化はなく，相対標準偏細胞膜障害性を引き起こすモデル実験には差は NH 4Cl buffer 添加時のピークで 6.9% (1.3

Triton X-100 (TX-100) を 用 い た。TX-100

mV/19 mV)，BTP buffer 添 加 時 の ピ ー ク では細胞膜溶解を引き起こす非イオン性の界面活8.2% (1.9 mV/23 mV) であり，再現性の高いこ性剤であり，膜タンパク質の抽出や免疫染色なとが分かった (n=10)。これらの結果から NH 4Cl

どに広く用いられている。BTP buffer と NH 4の曝露，及び BTP buffer と NH 4Cl buffer の溶

Cl buffer の溶液交換を行ったのち，BTP buffer

液交換によっては細胞膜のイオンバリア性を損に TX-100 を 加 え た Sample buffer (pH 7.4)なわないことが明らかとなった。さらに，このに交換することで，TX-100 を細胞に作用させ特徴的な電位変動は ISFET 表面に浮遊細胞がた。その結果，TX-100 を細胞に曝露すると，存在する場合にのみ観察された。また，NH 4Cl

溶液交換時の電位変化量が減少し，TX-100 のの代わりに CH 3COONa を細胞に作用させた場

曝露回数を増やすにつれて電位変化量がさらに合は，溶液交換に際する電位応答の方向が反転

減 少 し た (図 4)。こ れ は TX-100 の 作 用 にすることがわかった。

よって細胞膜イオンバリア性が損なわれたこと

この特徴的な pH 変化は，NH 3の細胞膜透過に起因する。つまり，膜障害によって NH 3 とによるものである 。NH 4Cl buffer 中において，NH 4 + の双方が細胞膜を透過するため，細胞外NH 3+H +↔NH 4 +という平衡状態が成り立ってにおいて，アンモニア平衡の乱れが小さくなり，いる (K a =[NH 3][H ]/[NH 4 ]=13.05×10

細胞膜近傍の pH 変化が小さくなったと解釈で(5)++−7mM (37℃))。まず NH 4Cl を加えた瞬間，NH 3きる。

のみ溶液中から細胞膜を透過し細胞質へ受動拡

そ こ で，電 位 変 化 の ピ ー ク 強 度 の 変 化 率散する。その結果，細胞外では NH 3 の平衡状[(ΔV 0−ΔV 1)/ΔV 0]を指標とし，膜障害性を測態が崩れるため，H 濃度が上昇する。細胞内定した。値が大きくなるほど膜障害性が強いこ

へ NH 3 が充てんされると，細胞内外で NH 3 がとを示している。比較として，従来法の細胞膜平衡状態になるため，細胞外では溶液の pH に障害性試験である赤血球溶血試験を TX-100 に収束する。次に，BTP buffer に溶液交換をす対しておこなった。赤血球溶血試験と ISFET/ると，細胞内に充てんされた NH 3 が細胞外へ細胞測定系の結果とを比較したところ，相関係拡散し，再度 NH 3 の平衡状態が崩れるため，数 r=0.69 と相関性が示された。注目すべきこH 濃度が一時的に減少する。細胞外への NH 3とに，赤血球溶血試験ではほとんど違いの識別の拡散が終了すると，再び溶液の pH に安定すできない領域においても ISFET/細胞測定系で++る。以上，BTP buffer と NH 4 Cl buffer の溶液交換によって，過渡的な pH 変化を誘導できる。
CH 3 COONa buffer と溶液交換した場合，細胞膜を透過できる分子は CH 3COOH であるため，
NH 4Cl とは逆に溶液交換に伴い H + は消費される (CH 3COOH↔CH 3COO −+H +)。したがって，溶液交換に伴う電位応答の変化は平衡反応と細胞膜の半透膜性から説明でき，膜電位変化は関図 4 (a) TX-100 暴 露 に よ る pH 変 動 の 減 少。(b)TX-100 暴露に対する Jurkat T 細胞／ ISFET アッセイと赤血球溶血アッセイとの相関プロット。

― 3 ―立石科学技術振興財団

は識別可能であることが分かった。これは，それぞれの測定法の指標であるヘモグロビンの流359, (2003)(7) Nightingale ER, J. Phys. Chem., 63, 1381-1387,(1959)

体力学半径 (≥3.1 nm) と，アンモニウムイオンの水和半径 (≤0.33 nm) に起因する感度の違いであると考えられる (6), (7)。また，溶血試
験は 2 時間かかるのに対し，ISFET/細胞測定系は 20 分間でおこなえることから，アッセイ［成果の発表，論文等］〈学会発表〉
Imaizumi Y, Goda T, Matsumoto A, Miyahara Y,[1]

Non-destructive analysis of cell membrane injury
using proton-sensitive field-effect transistor, Asia-の大幅な時間短縮が可能である。

Pacific Conference of Transducers and Micro-Nano
Technology 2016 (APCOT 2016), Kanazawa, Japan,[今後の研究の方向，課題］

June 26-29, 2016[2] Imaizumi Y, Goda T, Matsumoto A, Miyahara Y,
Non-destructive analysis of ion barrier property of

浮遊細胞固定を可能にする機能性分子の開発によって，アンモニア溶液交換にともなう浮遊細胞近傍の pH 微小環境を計測することに成功

cell membrane using pH-sensitive transistor, International Symposium on Biomedical Engineering,Tokyo, Japan, November 10-11, 2016

した。ISFET による浮遊細胞膜イオン漏出測[3] 合田達郎，今泉祐輝，松元亮，宮原裕二，pH 応

定法は，従来法である赤血球溶血試験に比べて答トランジスタを用いた細胞膜透過性高分子による高感度であることから，今後，ナノマテリアルの補体活性評価に応用できると考えられる。

膜障害性測定，日本バイオマテリアル学会シンポジウム 2016，福岡国際会議場，2016 年 11 月 21-22 日[4]Goda T, Imaizumi Y, Hatano H, Matsumoto A,Miyahara Y, Sensing cell barrier functions by proton
dynamics, 3rd International Conference on Bio-［参考文献］(1)

materials Science in Tokyo, Tokyo, Japan, Novem-Clinton F. Jones, David W. Grainger, Adv. Drug(2)

ber 28-30, 2016
〈論文〉

Deliv. Rev., 61, 438-456, (2009)Neužil P, Giselbrecht S, Länge K, Huang T, Manz

[1] Yuki Imaizumi, Tatsuro Goda, Yutaro Toya,Akira Matsumoto, Yuji Miyahara : Oleyl Group-A, Nat. Rev. Drug Discov., 11, 620-632, (2012)
Textor M, Ruiz L, Hofer R, Rossi A, Feldman K,

functionalized Insulating Gate Transistors for

Hähner G, Spencer N, Langmuir., 16, 3257-3271,

Measuring Extracellular pH of Floating Cells, Sci.

(3)

Technol. Adv. Mater., 17, 337-345, (2016)(2000)(4)

Kato K, Umezawa K, Funeriu D, Miyake M,[2] YukiImaizumi,

TatsuroGoda,

DanielF.

Miyake J, Nagamune T, Biotechniques., 35, 1014-

Schaffhauser, Jun-ichi Okada, Akira Matsumoto,1021, (2003)

Yuji Miyahara : Proton-Sensing Transistor Systems(5)

Schaffhauser D, Fine M, Tabata M, Goda T,(6)

for Detecting Ion Leakage from Plasma Membranes
under Chemical Stimuli, Acta Biomater., 50, 502-

Miyahara Y, Biosensors., 6, 11, (2016)
Winzor DJ, Wills PR, Biophys Chem., 104, 345-

― 4 ―509, (2017)