15

飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

2

飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法
牧野 大作 *1，山田 美帆 *2，佐野 好弘 *2
Determination of Spinosad in Feeds by LC-MS
Daisaku MAKINO *1, Miho YAMADA *2 and Yoshihiro SANO *2( *1 Food and Agricultural Materials Inspection Center, Kobe Regional Center(Now Fertilizer and Feed Inspection Department),*2

Food and Agricultural Materials Inspection Center, Kobe Regional Center)

An analytical method for determination of spinosad in feeds using liquid chromatographyelectrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) was developed.
mL of water, the sample was left standing for 30 minutes.
of acetonitrile.

After addition of 50

Spinosad was extracted with 50 mL

The extract was filtered and topped up to 200 mL with acetonitrile-water (1:1).

10 mL of sample solution (10 mL of 10 times diluted sample solution for grass hay except ricestraw) was purified by Mega bond Elut CH with 10 mL of acetonitrile-triethylamine (49:1).
After the elute was evaporated to dryness, the residue was dissolved in 1 mL of acetonitrile-water(9:1) and subjected to LC-ESI-MS for determination of spinosyn A and D.
determined as sum total quantity of spinosyn A and D.

Spinosad were

The LC separation was carried out on an

ODS column (Inertsil ODS-3, 2.1 mm i.d.×150 mm, 5 µm (GL Sciences)) using acetonitrile-5
mmol/L ammonium acetate solution (9:1) as a mobile phase.
in a selected ion monitoring (SIM) mode.

The determination was performed

A spike test was conducted with formula feed forlayer, for growing cattle, corn, alfalfa hay and rice straw spiked with 0.10 and 0.010 mg/kg (1.0
and 0.10 mg/kg for alfalfa hay, 0.25 and 0.025 mg/kg for rice straw) of spinosyn A and D.

The

spike test resulted in recoveries ranging from 86.8 % to 106 % for spinosyn A and from 86.5 % to
100 % for spinosyn D, and in relative standard deviations (RSD) within 5.4 % and 6.5 %respectively.

A collaborative study was conducted in eight laboratories using formula feed forlayer, rice straw and corn spiked with spinosyn A and D at 0.10 mg/kg (0.25 mg/kg for rice straw ).
The mean recovery of spinosyn A in the formula feed for layer was 96.3 %, and the repeatability
and reproducibility in terms of the relative standard deviation (RSDr and RSDR) and HorRat were
2.7 %, 11 % and 0.49 respectively.

These values were 90.1 %, 1.8 %, 8.5 % and 0.43 for ricestraw, 93.2 %, 4.5 %, 9.2 % and 0.42 for corn respectively.

The mean recovery of spinosyn D

in the formula feed for layer was 95.2 %, and the repeatability and reproducibility in terms of therelative standard deviation (RSDr and RSDR) and HorRat were 3.6 %, 12 % and 0.52 respectively.
These values were 92.8 %, 2.8 %, 10 % and 0.52 for rice straw, 93.2 %, 3.7 %, 14 % and 0.62 forcorn respectively.
Key words: 残留農薬 pesticide residue ; 殺虫剤 insecticide ; スピノサド spinosad ; スピノ
シン A spinosyn A ; スピノシン D spinosyn D ; 飼料 feed ; 乾牧草 grass hay ; 稲わら*1

独立行政法人農林水産消費安全技術センター神戸センター,*2（独）農林水産消費安全技術センター神戸センター

現同肥飼料安全検査部

16

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

rice straw ; 液体クロマトグラフ質量分析計 liquid chromatograph-mass spectrometer(LC-MS) ; エレクトロスプレーイオン化法 electrospray ionization (ESI) ; 共同試験
collaborative study

1

緒

言

スピノサドは 1985 年にダウ・エランコ社（現ダウ・アグロサイエンス社）が発見したスピノシ
ン A 及び D からなる混合物を有効成分とするマクロライド系殺虫剤で，1999 年に国内で農薬登録されている．その作用機構は，ニコチン性アセチルコリン受容体を活性化することにより筋肉にけいれんを引き起こし，最終的に死に至らしめ 1)，抗菌活性はない．
わが国における飼料中のスピノサドの基準値 2) は，稲わらで 0.5 ppm に設定されている．また，
食品，添加物等の規格基準における残留農薬基準値は，とうもろこし，大麦等穀類で 0.02~1 ppm，
綿実で 0.02 ppm 等となっており，諸外国の乾牧草の基準値は 5~30 ppm に設定されている．
定量法としては，国内では厚生労働省通知試験法 3)があり，スピノシン A 及び D について個別に定量を行い，その和をスピノサドの定量値としている．この定量法を参考にして（財）日本食品
分析センターが，「平成 18 年度飼料中の有害物質等残留基準を設定するための分析法開発及び家畜等への移行調査委託事業」において開発した方法 4)（以下「分析センター法」という．）がある．
筆者らは，この分析センター法を基に，飼料分析基準 5)への適用の可否について検討したので報告する．
なお，スピノシン A 及び D の構造式を Fig. 1 に示した．

N

N

O

O
O

O

H

H H

O

O

H

O

H

H

O

H

Spinosyn D
C42H67NO10
MW: 746.0

CAS No.: 131929-60-7

CAS No.: 131929-63-0

Chemical structures of spinosyn A and D

2
試

H H

O

O

O

Spinosyn A
C41H65NO10
MW: 732.0
Fig. 1

2.1

O

O

O

H

O
O

O

O

O

O

実験方法

料

市販の配合飼料（成鶏飼育用及び若令牛育成用配合飼料），とうもろこし，アルファルファ乾
草及び稲わらをそれぞれ 1 mm の網ふるいを通過するまで粉砕して用いた．
なお，検討に用いた配合飼料の配合割合は，Table 1 のとおりである．

飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

Table 1
Formula feedtypes
For layer

Compositions of the formula feeds
Proportion
Ingredients
(%)
59
Corn
25
Soybean meal, Rapeseed meal, Corn gluten meal
1
Fish meal
1
Rice bran
14
Calcium carbonate, Calcium phosphate,
Paprika extract, Feed additives
56
Corn,Wheat flour
21
Wheat bran
11
Soybean meal
12
Calcium carbonate, Calcium phosphate, Alfalfa hay,
Molasses, Salt, Feed additives

Ingredient types
Grains
Oil seed meal
Animal by-products
Brans
OthersFor growing Grains
Brans
cattleOil seed meal
Others

2.2
1)

17

試薬等
スピノシン A 標準原液
スピノシン A 標準品（林純薬工業製，純度 94.9 %）10 mg を正確に量って 50 mL の全量フラスコに入れ，アセトニトリルを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてスピノシン A
標準原液を調製した（この液 1 mL は，スピノシン A として 0.2 mg（f = 0.949）を含有す
る．）．

2)

スピノシン D 標準原液
スピノシン D 標準品（林純薬工業製，純度 99.2 %）10 mg を正確に量って 50 mL の全量フラスコに入れ，アセトニトリルを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてスピノシン D
標準原液を調製した（この液 1 mL は，スピノシン D として 0.2 mg（f = 0.992）を含有す
る．）．

3)

混合標準液
使用に際して，スピノシン A 及び D 標準原液の一定量を混合した後，アセトニトリル－水（9+1）で正確に希釈し，1 mL 中にスピノシン A 及び D として 0.001，0.002，0.005，0.01，
0.02，0.05，0.1，0.5 及び 1 µg を含有する各標準液を調製した．

4)

アセトニトリルは，残留農薬試験用及び液体クロマトグラフ用を用いた．その他，特記している以外の試薬は特級を用いた．

2.3
1)

装置及び器具液体クロマトグラフ質量分析計：
LC 部：島津製作所製

Prominence

MS 部：島津製作所製

LCMS-2010EV

2)

振とう機：宮本理研工業製

3)

ロータリーエバポレーター：東京理化器械製

4)

高速遠心分離器：日立製作所製

5)シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラム：Varian 製
量 1 g）

理研式小型シェーカーMW-DR 型
N-1N 型

SCT15B
Mega Bond Elut CH（充てん剤18

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

2.4
1)

定量方法
抽

出

分析試料 10.0 g（稲わらは 5 g を正確に）を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ，水50 mL を加えて 30 分間静置後，更にアセトニトリル 50 mL を加え，30 分間振り混ぜて抽出した．200 mL の全量フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さを順次アセトニトリル－水（1+1）50 mL で洗浄し，同様に吸引ろ過した．更に全量フラスコの標線までアセトニトリル－水（1+1）を加え，カラム処理に供する試料溶液とした．
2)

カラム処理
シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラムをアセトニトリル 5 mL 及び水 5 mL で洗浄した．
試料溶液 10 mL（稲わらを除く乾牧草では，更にアセトニトリル－水（1+1）で正確に 10 倍
希釈した後，その液 10 mL）をミニカラムに入れ，液面が充てん剤の上端に達するまで流下させた．
更にアセトニトリル 10 mL を加えてミニカラムを洗浄した後，50 mL のなす形フラスコを
ミニカラムの下に置き，アセトニトリル－トリエチルアミン（49+1）10 mL をミニカラムに加えてスピノシン A 及び D を溶出させた．溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．
アセトニトリル－水（9+1）1 mL を正確に加えて残留物を溶かし，5,000×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液を液体クロマトグラフ質量分析計による測定に供する試料溶液とした．

3)

液体クロマトグラフ質量分析計による測定
試料溶液及び各標準液各 5 µL を液体クロマトグラフ質量分析計に注入し，Table 2 の測定条
件に従って選択イオン検出クロマトグラムを得た．

4)

計

算

得られた選択イオン検出クロマトグラムからピーク面積又は高さを求めて検量線を作成し，試料中のスピノシン A 及び D 量を算出し，その合量をスピノサド量とした．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．
Table 2

Operating conditions of LC-MS for analyzing spinosad

ColumnGL Sciences Inertsil ODS-3 (2.1 mm i.d.×150 mm, 5 µm)
Mobile phase
Acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate solution (9:1)
Flow rate
0.2 mL/min
Column temperature
40 °C
Ionization
Electrospray ionization (ESI)
Mode
Positive
N2 (1.5 L/min)
Nebulizer gas
Heat block temperature 200 °C
CDL temperature
250 °C
Monitor ion
m/z 732 (spinosyn A) , m/z 746 (spinosyn D)飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

19

Sample 10.0 g (rice straw:5 g)
add 50 mL of water
allow to stand for 30 min
add 50 mL of acetonitrile
shake for 30 min
filtrate under suction filter (No.5B)
wash with 50 mL of acetonitrile-water (1:1)
top up to 200 mL with acetonitrile-water (1:1)
Mega Bond Elut CH
prewash with 5 mL of acetonitrile and water
apply 10 mL of sample solution (grass hay except rice straw:
10 mL of 10 times diluted sample solution with acetonitrile-water (1:1))
wash with 10 mL of acetonitrile
elute with 10 mL of acetonitrile-triethylamine (49:1)
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 1 mL of acetonitrile-water (9:1)
centrifuge for 5 min at 5,000×g
LC-MS
Scheme 1

Analytical procedure for spinosad in feeds

3
3.1

結果及び考察

質量分析計条件の検討
分析センター法 4)ではスピノシン A 及び D のイオン化法としてエレクトロスプレーイオン化（ESI）法（以下「ESI 法」という．）の正イオンモードが用いられていることから，本法においても ESI 法を用いて検討を行った．
スピノシン A 及び D 各標準液について，本法の測定条件によりスキャンモードで測定したところ，Fig. 2 に示したように，各マススペクトルが得られた．
このマススペクトルにおいて基準ピークは，スピノシン A 及び D で m/z 732 及び 746（プロトン付加分子 [M+H]+）であった．
よって，これらをモニターイオンとして採用することにした．
また，確認イオンとして使用できるようなフラグメントイオンは測定されなかった．

20

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

(A)

(B)

Fig. 2Mass spectrum of standard solution

(A)
3.2

Spinosyn A(B)

Spinosyn D

液体クロマトグラフ条件の検討
スピノシン A 及び D 各標準液を液体クロマトグラフ質量分析計に注入することにより，液体クロマトグラフ条件の検討を行った．
分 析 セ ンタ ー 法 4) で は ， 溶 離 液と し て ア セ ト ニ ト リ ル－ 2 mmol/L 酢 酸 ア ン モニ ウ ム 溶 液（9+1）を使用している．ここで，酢酸アンモニウム溶液の濃度について 2，5 及び 10 mmol/Lを検討したところ，酢酸アンモニウム溶液濃度が 2 mmol/L よりも 5 mmol/L 又は 10 mmol/L を用いた方が感度は良好であり，5 mmol/L と 10 mmol/L とでは特に感度に差異は無かった．このことから，酢酸アンモニウム濃度は 5 mmol/L で十分と考えられた．
これらのことから，溶離液としてアセトニトリル－5 mmol/L 酢酸アンモニウム溶液（9+1）を
採用した．
3.3

検量線の作成2.2 の 3)に従って調製した標準液各 5 µL を液体クロマトグラフ質量分析計に注入し，得られた選択イオン検出クロマトグラムからピーク高さ又は面積を求めて検量線を作成した．その結果，Fig. 3 及び 4 のとおり，検量線はスピノシン A 及び D として 1~1,000 ng/mL（注入量として0.005~5 ng）の範囲で直線性を示した．

21

飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

R² = 0.9974

Peak height/ arb.units

Peak area/ arb.units

R² = 0.9985

0

200

400

600

800

1,000

0

Concentration of spinosyn A/ ng/mL

Fig. 3

600

800

1,000

R² = 0.9981

Peak height/ arb.units

Peak area/ arb.units
0

200

400

600

800

1,000

0

Concentration of spinosyn D/ ng/mL

3.4

400

Calibration curves of spinosyn A by peak area(left) and peak height(right)

R² = 0.9992

Fig. 4200

Concentration of spinosyn A/ ng/mL

200

400

600

800

1,000

Concentration of spinosyn D/ ng/mL

Calibration curves of spinosyn D by peak area(left) and peak height(right)

シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラムの溶出画分の検討
スピノシン A 及び D について，シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラムからの溶出画分の検討を行った．
2.4 の 1)に従って成鶏飼育用配合飼料から抽出した抽出液 10 mL に対して，スピノシン A 及び
D として 80 ng 相当量添加し，2.4 の 2)に従ってミニカラム処理を行った．
ミニカラムからの各溶出画分をそれぞれなす形フラスコに分取し，これらを減圧濃縮，乾固後，残留物をアセトニトリル－水（9+1）に溶かしたものを液体クロマトグラフ質量分析計による測定に供試した．
その結果，Table 3 のとおり，スピノシン A 及び D は，アセトニトリル－トリエチルアミン（49+1）0~10 mL に溶出し，それ以外の画分には溶出されなかった．以上の結果から，本法では分析センター法 4)と同様にアセトニトリル－トリエチルアミン（49+1）10 mL で溶出することとした．
Table 3Elution pattern from mini column
Acetonitrile-triethylamine
Acetonitrile-water
Acetonitrile（49+1）（1+1）
Recovery of spinosyn A (%)
Recovery of spinosyn D (%)

0~10 mL000~10 mL000~10 mL
98
98~15 mL
0
0

Total
98
98

22

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

3.5

妨害物質の検討
市販の配合飼料（成鶏飼育用，ブロイラー肥育後期用，肉豚肥育用，若令牛育成用及び肉用牛

肥育用），とうもろこし，大麦，大豆油かす及び乾牧草（スーダングラス乾草，アルファルファ
乾草及び稲わら）を用い，本法により調製した試料溶液を液体クロマトグラフ質量分析計に注入し，定量を妨げるピークの有無を確認したところ，妨害ピークは認められなかった．
なお，妨害物質の検討で得られた選択イオン検出クロマトグラムの一例を Fig. 5 に示した．

Fig. 5SIM chromatograms of blank solutions

LC-MS conditions are shown in Table 2.
(A) Sample solution of corn (not spiked)(B) Sample solution of alfalfa hay (not spiked)(Arrows indicate the retention time of spinosyn A and D）
3.6

添加回収試験
2.1 で調製した成鶏飼育用配合飼料，若令牛育成用配合飼料及びとうもろこしにスピノシン A

及び D として 0.10 及び 0.010 mg/kg 相当量，アルファルファ乾草に 1.0 及び 0.10 mg/kg 相当量，稲わらに 0.25 及び 0.025 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて，本法により 3 点併行で定量し，回収率及び繰返し精度を検討した．
その結果は，Table 4 及び 5 のとおり，スピノシン A については平均回収率 86.8~106 %，その繰返し精度は，相対標準偏差（RSD）として 5.4 %以下，スピノシン D については平均回収率
86.5~100 %，その繰返し精度は，RSD として 6.5 %以下の成績が得られた．
なお，添加回収試験で得られた選択イオン検出クロマトグラムの一例を Fig. 6 に示した．

23

飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

Table 4

Recoveries of spinosyn A from five kinds of feed
Feed types

Spikedlevel(mg/kg)
1.0
0.25
0.10
0.025
0.010

Formula feed
for layer

Formula feed
for growing cattle

Corn

Alfalfa hay

Rice straw

Recoverya) RSDb)(%)(%)

Recoverya) RSDb)(%)(%)

Recoverya) RSDb)(%)(%)

Recoverya) RSDb)(%)(%)

Recoverya) RSDb)
(%)
(%)

91.6
106

1.6

91.7

93.4

5.4

2.4

92.9

95.8

0.3

1.2

101

1.0

96.8

98.2

2.6

86.8

0.9

4.2

2.2

a) Mean (n=3)b) Relative standard deviation of repeatability
Table 5

Recoveries of spinosyn D from five kinds of feed
Feed types

Spikedlevel(mg/kg)Formula feed
for layera)Formula feed
for growing cattle
b)

a)

b)

Corn

Alfalfa hay

a)

b)

a)

Rice strawb)

Recovery RSD(%)(%)

Recovery RSD(%)(%)

Recovery RSD(%)(%)

Recovery RSD
(%)
(%)
89.2
1.6

99.6

4.3

94.7

2.9

98.0

1.7

91.9

90.1

2.4

95.2

4.8

98.9

1.4

1.0
0.25
0.10
0.025
0.010

a) Mean (n=3)b) Relative standard deviation of repeatabilitya)b)

Recovery RSD
(%)
(%)
100

2.0

86.5

4.0

6.5

24

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

Fig. 6SIM chromatograms of spinosyn A and D

LC-MS conditions are shown in Table 2.
(A) Standard solution of spinosyn A and D (The amount was each 0.25 ng.)(B) Sample solution of formula feed for layer spiked at each 0.10 mg/kg(Arrows indicate the peak of spinosyn A and D）
3.7

定量下限及び検出下限
本法の定量下限及び検出下限を確認するために，成鶏飼育用配合飼料，乾牧草（アルファルフ

ァ乾草）及び稲わらに，スピノシン A 及び D をそれぞれ添加し，添加回収試験により得られるピークの SN 比が 10 及び 3 となる濃度をそれぞれ求めた．
その結果，スピノシン A においては，得られたピークの SN 比が 10 以上となる濃度は 0.0025
mg/kg（乾牧草では 0.025 mg/kg，稲わらでは 0.0050 mg/kg）であった．また，スピノシン D においては，得られたピークの SN 比が 10 以上となる濃度は 0.0050 mg/kg（乾牧草では 0.050 mg/kg，
稲わらでは 0.010 mg/kg）であった．
確認のため，スピノシン A として，成鶏飼育用配合飼料，乾牧草（アルファルファ乾草）及び稲わらに，それぞれ 0.0025，0.025 及び 0.0050 mg/kg 相当量を添加した試料について，本法により 3 点併行で定量を行った結果は Table 6 のとおりであり，成鶏飼育用配合飼料，乾牧草（アルファルファ乾草）及び稲わらにおいて，平均回収率は 95.2，102 及び 89.9 %，その繰返し精度
は相対標準偏差（RSD）として 2.6，4.8 及び 1.4 %であった．
また，スピノシン D として，成鶏飼育用配合飼料，乾牧草（アルファルファ乾草）及び稲わらに，それぞれ 0.0050，0.050 及び 0.010 mg/kg 相当量を添加した試料について，本法により 3
点併行で定量を行った結果は Table 7 のとおりであり，成鶏飼育用配合飼料，乾牧草（アルファルファ乾草）及び稲わらにおいて，平均回収率は 88.7，90.8 及び 84.1 %，その繰返し精度はRSD として 4.4，6.1 及び 0.2 %であった．
以上の結果から，スピノシン A では，本法の定量下限は 0.0025 mg/kg（乾牧草では 0.025
mg/kg，稲わらでは 0.0050 mg/kg）であった．また，検出下限は SN 比が 3 となる濃度から 0.001

飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

25mg/kg（乾牧草では 0.008 mg/kg，稲わらでは 0.002 mg/kg）であった．
また，スピノシン D では，本法の定量下限は 0.0050 mg/kg（乾牧草では 0.050 mg/kg，稲わら
では 0.010 mg/kg）であった．また，検出下限は SN 比が 3 となる濃度から 0.002 mg/kg（乾牧草では 0.02 mg/kg，稲わらでは 0.003 mg/kg）であった．
Table 6

Recoveries and limit of quantification of spinosyn A in feeds
Feed types
Formula feed
SpikedAlfalfa hay
Rice straw
for layer
level(mg/kg) Recoverya) RSDb) Recoverya) RSDb) Recoverya) RSDb)
(%)
0.025
0.00500.0025

(%)

(%)
102

95.2

(%)
4.8

(%)

(%)

89.9

1.4

2.6

a) Mean (n=3)b) Relative standard deviation of repeatability
Table 7

Recoveries and limit of quantification of spinosyn D in feeds
Feed types
Formula feed
SpikedAlfalfa hay
Rice straw
for layer
level(mg/kg) Recoverya) RSDb) Recoverya) RSDb) Recoverya) RSDb)
(%)
0.050
0.010
0.0050

(%)

(%)
90.8

88.7

(%)
6.1

(%)

(%)

84.1

0.2

4.4

a) Mean (n=3)b) Relative standard deviation of repeatability
3.8

共同試験
本法の再現精度を調査するため，成鶏飼育用配合飼料及びとうもろこしにスピノシン A 及びスピノシン D としてそれぞれ 0.10 mg/kg 相当量，稲わらにスピノシン A 及びスピノシン D としてそれぞれ 0.25 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて，JA 東日本くみあい飼料株式会社品質安全部，財団法人日本食品分析センター多摩研究所，株式会社島津総合分析試験センター，独立行
政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部，同仙台センター，同名古屋センター，
同神戸センター及び同福岡センター（8 試験室）において，本法に従って共同試験を実施した．
その結果，Table 8 のとおり，スピノシン A について，成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率
は 96.3 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）
として 2.7 %及び 11 %であり，HorRat は 0.49 であった．稲わらでは，平均回収率は 90.1 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 1.8 %及び 8.5 %であり，HorRat は 0.43 であった．とうもろこしでは，平均回収率は 93.2 %，その室内繰返し精度及び室26

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 4.5 %及び 9.2 %であり，HorRat は 0.42 であった．
また，Table 9 のとおり，スピノシン D について，成鶏飼育用配合飼料では平均回収率は 95.2%，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ相対標準偏差（RSDr 及び RSDR ）として3.6 %及び 12 %であり，HorRat は 0.52 であった．稲わらでは，平均回収率は 92.8 %，その室内
繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 2.8 %及び 10 %であり，HorRat
は 0.52 であった．とうもろこしでは，平均回収率は 93.2 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 3.7 %及び 14 %であり，HorRat は 0.62 であった．
なお，参考のため，各試験室で使用した液体クロマトグラフ質量分析計の機種等を Table 10に示した．

Lab.No.
1
2
3
4
5
6
7
8
Spiked level (mg/kg)

Table 8Collaborative study for spinosyn A
Formula feed
Rice straw
for layer(mg/kg)(mg/kg)
0.107
0.107
0.250
0.249
0.0971
0.0990
0.233
0.235
0.109
0.110
0.247
0.241
0.09230.09220.222
0.229
0.0905
0.09390.200
0.190
0.07540.0813
0.237
0.229
0.106
0.100
0.206
0.202
0.08750.0918
0.215
0.217

Corn
(mg/kg)0.0956
0.0971
0.09710.09090.100
0.103
0.09180.09560.08170.07130.102
0.09840.09110.101
0.08800.0871

0.10

0.25

0.10

0.09630.225

0.0932

Recovery (%)

96.3

90.1

93.2

b)

Mean valuea)(mg/kg)

a)

2.7

1.8

4.5

c)

11

8.5

9.2

d)

22

20

22

0.49

0.43

0.42

RSDr (%)
RSDR (%)
PRSDR (%)
HorRat
a)

n=16

b)

Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd)Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories calculated from themodified Horwitz equation

27

飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

Table 9Collaborative study for spinosyn D
Formula feed
Rice straw
for layer(mg/kg)(mg/kg)Lab.No.
1
2
3
4
5
6
7
8
Spiked level (mg/kg)

0.103
0.104
0.109
0.09920.08970.08140.0797
0.0918

0.101
0.108
0.110
0.09580.09340.09220.07450.0909

0.256
0.244
0.246
0.230
0.194
0.251
0.220
0.217

0.252
0.237
0.247
0.229
0.190
0.274
0.216
0.210

Corn
(mg/kg)
0.100
0.102
0.101
0.09510.07840.115
0.07210.0904

0.10

0.25

0.10

0.09520.232

0.0932

Recovery (%)

95.2

92.8

93.2

b)

RSDr (%)

3.6

2.8

3.7

RSDR c) (%)

12

10

14

22

20

22

0.52

0.52

0.62

Mean valuea)(mg/kg)a)d)

PRSDR (%)
HorRat

0.09790.09700.103
0.09560.07510.103
0.07450.0912

a)

n=16

b)

Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd)Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories calculated from themodified Horwitz equation
Table 10Instruments used in the collaborative study
LC column
Lab.No.
Instrument(i.d. × length,particle size)
SHIMADZUGL Sciences Inertsil ODS-3
1
LCMS-2010EV(2.1×150 mm, 5 µm)
WatersAgilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18
2
micromass Quattro Micro(2.1×150 mm, 3.5 µm)
SHIMADZUGL Sciences Inertsil ODS-3
3
LCMS-2010EV(2.1×150 mm, 5 µm)
WatersAgilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18
4
ACQUITY TQ Detector(2.1×150 mm, 5 µm)
SHIMADZUGL Sciences Inertsil ODS-3
5
LCMS-2010EV(2.1×150 mm, 5 µm)
SHIMADZUGL Sciences Inertsil ODS-3
6
LCMS-2010EV(2.1×150 mm, 5 µm)
SHIMADZUSHIMADZU Shim-pack VP-ODS
7
LCMS-2010EV(2.0×150 mm, 5 µm)
Agilent Technologies
GL Sciences Inertsil ODS-3
8
G1946C(2.1×150 mm, 5 µm)

28

飼料研究報告 Vol. 35 (2010)

4まとめ

飼料中のスピノサドについて，分析センター法を基に，液体クロマトグラフ質量分析計を用いた定量法の飼料分析基準への適用の可否について検討したところ，次の結果を得た．
1)

イオン化法として，エレクトロスプレーイオン化（ESI）法（正イオンモード），モニターイ
オンとして，スピノシン A 及び D についてそれぞれ m/z 732 及び 746（すべてプロトン付加分子[M+H]+）を適用したところ良好な測定が可能であった．

2)

液体クロマトグラフ質量分析計の溶離液にアセトニトリル－5 mmol/L 酢酸アンモニウム溶液（9+1），カラムに Inertsil ODS-3（内径 2.1 mm，長さ 150 mm，粒径 5 µm）を適用したところ良
好な測定が可能であった．

3)

検量線はスピノシン A 及び D として 0.005~5 ng の範囲で直線性を示した．

4)シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラムからの溶出画分の検討を行ったところ，溶出溶媒の必要量は 10 mL であった．

5)

5 種類の配合飼料及び 6 種類の飼料原料について，本法に従ってクロマトグラムを作成したところ，スピノシン A 及び D の定量を妨げるピークは認められなかった．

6)

成鶏飼育用配合飼料，若令牛育成用配合飼料，とうもろこし，アルファルファ乾草及び稲わらにスピノシン A 及び D として 0.10 及び 0.010 mg/kg 相当量（アルファルファ乾草については 1.0
及び 0.10 mg/kg 相当量，稲わらについては 0.25 及び 0.025 mg/kg 相当量）を添加し，本法に従って添加回収試験を実施したところ，スピノシン A については平均回収率 86.8~106 %，その繰返し 精 度 は ，相 対 標 準 偏 差 （RSD） と し て 5.4 %以 下 ， ス ピ ノ シ ン D に つ い て は平 均 回 収 率86.5~100 %，その繰返し精度は，RSD として 6.5 %以下の成績が得られた．

7)

本法によるスピノシン A の定量下限は試料中で 0.0025 mg/kg（乾牧草では 0.025 mg/kg，稲わらでは 0.0050 mg/kg），検出下限は 0.001 mg/kg（乾牧草では 0.008 mg/kg，稲わらでは 0.002
mg/kg）であった．
また，スピノシン D の定量下限は試料中で 0.0050 mg/kg（乾牧草では 0.050 mg/kg，稲わらでは 0.010 mg/kg），検出下限は 0.002 mg/kg（乾牧草では 0.02 mg/kg，稲わらでは 0.003 mg/kg）で
あった．

8)

成鶏飼育用配合飼料及びとうもろこしにスピノシン A 及びスピノシン D としてそれぞれ 0.10
mg/kg 相当量，稲わらにスピノシン A 及びスピノシン D としてそれぞれ 0.25 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて，8 試験室において，本法による共同試験を実施した．その結果，スピノシ
ン A について，成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率は 96.3 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 2.7 %及び 11 %であり，HorRat は0.49 であった．稲わらでは，平均回収率は 90.1 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそ
れぞれ RSDr 及び RSDR として 1.8 %及び 8.5 %であり，HorRat は 0.43 であった．とうもろこし
では，平均回収率は 93.2 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDRとして 4.5 %及び 9.2 %であり，HorRat は 0.42 であった．スピノシン D について，成鶏飼育用配合飼料では平均回収率は 95.2 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 3.6 %及び 12 %であり，HorRat は 0.52 であった．稲わらでは，平
均回収率は 92.8 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 2.8%及び 10 %であり，HorRat は 0.52 であった．とうもろこしでは，平均回収率は 93.2 %，その室飼料中のスピノサドの液体クロマトグラフ質量分析計による定量法

29

内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 3.7 %及び 14 %であり，HorRat は 0.62 であった．

謝

辞共同試験に参加して頂いた JA 東日本くみあい飼料株式会社品質安全部，財団法人日本食品分析センター多摩研究所，株式会社島津総合分析試験センターの試験室の各位に感謝の意を表します．

文
1)

食品安全委員会

献第 54 回農薬専門調査会幹事会：スピノサド農薬評価書（案），平成 21 年 8

月 21 日 (2009).
2)

農林水産省畜産局長通知：“飼料の有害物質の指導基準の制定について”，昭和 63 年 10 月
14 日，63 畜 B 第 2050 号 (1988).

3)

厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：“食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について”，平成 17 年 1 月 24 日，食安発第 0124001 号 (2005).

4)

財団法人日本食品分析センター：平成 18 年度飼料中の有害物質等残留基準を設定するための分析法開発及び家畜等への移行調査委託事業

5)

飼料中の有害物質等の分析法の開発，97 (2007).

農林水産省消費・安全局長通知：“飼料分析基準の制定について”，平成 20 年 4 月 1 日，19
消安第 14729 号 (2008).