アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲をとうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認

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技術レポート

7 アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲を
とうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認
高橋 雄一 *1，嶋村 知紗 *2Validation Study on Application of the Simultaneous Determination Method of Aflatoxins
by LC to Corn Silage
Yuichi TAKAHASHI*1 and Chisa SHIMAMURA *2( *1 Nagoya Regional Center, Food and Agricultural Materials Inspection Center (FAMIC)(Now Fertilizer and Feed Inspection Department, FAMIC),*2

Nagoya Regional Center, FAMIC (Now Audit Office, FAMIC))

We have made a validation study on the applicability of a simultaneous determination method offour aflatoxins (B1, B2, G1 and G2) in formula feed and corn using a liquid chromatograph withfluorescence (LC-FD) to corn silage. The method has been listed in the Feed Analysis Standardof Japan.
In the existing method, since the extraction solvent has been absorbed by the sample, we changed
the volume of the sample and extraction solvent to 25 g and 150 mL respectively.
Aflatoxin B1, B2, G1 and G2 (AFs) were extracted with acetonitrile-water (9:1), and the extracted
solution was centrifuged. The supernatant was purified with a SPE column (MycoSep 226
AflaZon+, Romer Labs Inc.; Union, MO, USA.), and the eluted solution was concentrated todryness. For derivatization, trifluoroacetic acid was added to the residue, and the sample
solution was injected into the LC-FD to determine the concentration of AFs. The LC-FD
separation was then carried out on an ODS column (Mightysil PR-18 GP, 4.6 mm i.d. × 250 mm, 5µm, Kanto Chemical Inc.; Tokyo, Japan) with an isocratic of water-methanol (3:2) as a mobile
phase.
Recovery tests were conducted on corn silages. Corn silage was added with 0.0013~0.044 mg/kg
of aflatoxin (AF) B1, B2 and G1, and 0.00022~0.044 mg/kg of AFG2 respectively. The resulting
mean recoveries ranged from 85.0 % to 116 % for AFB1, 84.0 % to 119 % for AFB2, 88.1 % to106 % for AFG1 and 82.6 % to 101 % for AFG2. The repeatability in the form of relative
standard deviations (RSDr) was less than 4.4 % for AFB1, less than 4.2 % for AFB2, less than
3.3 % for AFG1, and less than 10 % for AFG2.
This method was thus validated as useful for inspections of AFs in corn silage.
The limit of detection of AFs by the existing method for formula feed and corn was 0.0001 mg/kg
each in the samples.
Key words: aflatoxin (AF) B1, B2, G1 and G2; liquid chromatograph with fluorescence (LC-FD);
corn silage
キーワード：アフラトキシン；液体クロマトグラフ；とうもろこしサイレージ*1

独立行政法人農林水産消費安全技術センター名古屋センター，現

肥飼料安全検査部*2

独立行政法人農林水産消費安全技術センター名古屋センター，現

業務監査室

飼料研究報告 Vol. 44 (2019)

122

1

緒

言

飼料自給率の向上は，食料自給率向上の重要な施策として位置づけられ，とうもろこしサイレー
ジを含む粗飼料の増産対策が積極的に行われている．その一方で，平成 24 年度から農林水産省は調査事業として国産粗飼料中の重金属及びかび毒の含有実態調査を実施している．国産粗飼料について，将来的に飼料の有害物質の指導基準及び管理基準 1)に管理基準値が定められた場合に備えて，管理基準の遵守状況を確認するための分析法を整備することが必要となっているが，飼料分析基準2)に収載されているアフラトキシンの液体クロマトグラフ（以下「LC」という．）による同時分析法（以下「収載法」という．）の適用範囲は配合飼料及びとうもろこしであり，とうもろこしサイ
レージを対象としていない．
そこで，今回，とうもろこしサイレージへの収載法の適用の可否を検討したので，その概要を報告する．また，未設定であった収載法による配合飼料及びとうもろこし中のアフラトキシン B1 ，
B2，G1 及び G2 の検出下限を求めたので併せて報告する．
参考にアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 の構造式等を Fig. 1 に示した．

O

O

O

O

O

O

O

O
O

O

O

O

Aflatoxin B1

Aflatoxin B2(6aR,9aS)-2,3,6a,9a-tetrahydro-4-(6aR,9aS)-2,3,6a,8,9,9a-hexahydro-4-methoxy-

methoxycyclopenta[c]furo[3',2':4,5]furo[2,3-h]cyclopenta[c]furo[3',2':4,5]furo[2,3-h] [1]benzopyran-[1]benzopyran-1,11-dione

1,11-dione

C17H12O6

MW: 312.06

CAS No.: 1162-65-8

O

C17H14O6

MW: 314.08

OO

CAS No.: 7220-81-7

O
O

O

O

O

O

O
O

O

O

O

Aflatoxin G1

Aflatoxin G2(7aR,10aS)-3,4,7a,10a-tetrahydro-5-methoxy-(7aR,10aS)-3,4,7a,9,10,10a-hexahydro-5-methoxy-

1H,12H-furo[3',2':4,5]furo[2,3-h]pyrano[3,4-c]

1H,12H-furo[3',2':4,5]furo[2,3-h] pyrano[3,4-[1]benzopyran-1,12-dionec][1]benzopyran-1,12-dione

C17H12O7

MW: 328.06

Fig. 1CAS No.: 1165-39-5

C17H14O7

MW: 330.07

CAS No.: 7241-98-7

Chemical structures of aflatoxins B1, B2, G1 and G2

アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲をとうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認

2
2.1

試

123

実験方法

料

配合飼料（鶏用及びほ乳期子牛育成用代用乳用）及びとうもろこしはそれぞれ目開き 1 mm のスクリーンを装着した粉砕機で粉砕した．とうもろこしサイレージは 60 °C で 6 時間乾燥後，更に室内に静置して風乾した後，同様に粉砕した．
なお，検討に用いた配合飼料を Table 1 に示した．
Table 1

Formula feedtypes
For poultry

For calf milk
replacer

2.2
1)

試

Compositions of the formula feed
Proportion
Ingredient types
Ingredients(%)
58
GrainsCorn, brown rice28
Oil seed meals
Soybean meal, rapeseed meal, corn gluten meal
8
Bran
Rice bran
2
Animal by-productFish meal
4
OthersCalcium carbonate, animal fat, calcium phosphate, salt,
fermented milk powder, feed additives
Animal by-products
72
Dried skim milk, concentrated whey protein
Others28
Vegetable oil, trehalose, glucose, calcium carbonate,lactose, vegetable gum-like substance,
fructooligosaccharide syrup, dry yeast cell wall, fodder
yeast, desugared sugarcane extract, albumin powder,
fatty acid calcium, cellulose, salt, fermented milk powder,lactec acid bacteria, bifidobacteria, melon extract,
feed additives薬

アセトニトリル及びメタノールは高速液体クロマトグラフ用（関東化学製）を用いた．トリ
フルオロ酢酸は Reagent Plus（Sigma-Aldrich 製）を用いた．水は Milli-Q Advantage（Merck
Millipore 製）により精製した超純水（JIS K0211 の 5218 に定義された超純水）を用いた．

2)

アフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 混合標準液
アフラトキシン（B1 ，B2 ，G1 及び G2 ）混合標準液（各 25 µg/mL，富士フイルム和光純薬製）をアフラトキシン混合標準原液とした．混合標準原液 1 mL を 50 mL の全量フラスコに入れ，標線までアセトニトリルを加えてアフラトキシン混合標準液を調製した（この液 1 mL は，
アフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 として各 0.5 µg を含有する．）．
使用に際して，アフラトキシン混合標準液の一定量をアセトニトリルで正確に希釈し，1mL 中にアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 として各 20 ng を含有する混合標準液を調製した．

2.3

装置及び器具1)

粉砕機： ZM 200

Retsch 製（1 mm スクリーン，使用時回転数 14000 rpm）

2)

振とう機：レシプロシェーカーSR-2W タイテック製（使用時振動数 300 rpm）

3)

多機能カラム：MycoSep 226 AflaZon+

Romer Labs 製

飼料研究報告 Vol. 44 (2019)

124

4)

LC：
LC 部：1515 Series Waters 製
蛍光検出器部：2475 Multi λFluorecence Detector Waters 製

5)
2.4
1)

試験管濃縮装置： MGS- 2200G

東京理化器械製

定量方法
抽

出

分析試料 25.0 g を量って 300 mL の褐色共栓三角フラスコに入れ，アセトニトリル－水（9+1）150 mL を加え，30 分間振り混ぜて抽出した．抽出液を褐色共栓遠心沈殿管に入れ，650×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液をカラム処理に供する試料溶液とした．
2)

カラム処理
試料溶液 4.5 mL を試験管に入れ，多機能カラムをゆっくり押し込み，充てん剤を通過した流出液を誘導体化反応に供する試料溶液とした．

3)

誘導体化反応試料溶液 1 mL を 50 mL のなす形フラスコに正確に入れ，40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．残留物にトリフルオロ酢酸 0.1 mL を
正確に加え，なす形フラスコを密栓した後 15 分間静置し，更に水－アセトン（9+1）0.9 mLを先のなす形フラスコに正確に加えて振り混ぜた．この液をプラスチック製遠心沈殿管（容量1.5 mL）に入れ，5000×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液を液体クロマトグラフィーに供する試料溶液とした．
同時にアフラトキシン混合標準液（0.5 µg/mL）2，10，20，30，40，50 及び 60 µL 並びに混合標準液（20 ng/mL）2.5，5，10 及び 25 µL をそれぞれ 50 mL のなす形フラスコに正確に入れ，トリフルオロ酢酸 0.1 mL を正確に加えた．以下試料溶液と同様に操作し，1 mL 中にア
フラトキシン B1，B2，G1 及び G2 としてそれぞれ 0.05，0.1，0.2，0.5，1，5，10，15，20，25
及び 30 ng 相当量を含有する各標準液を調製した．

4)

液体クロマトグラフィー
試料溶液及び各アフラトキシン混合標準液各 20 µL を LC に注入し，Table 2 の測定条件に従って，クロマトグラムを得た．

ColumnMobile phase
Flow rate
Column temperature
Detector

5)

計

Table 2 Operating conditions of LC
Mightysil PR-18 GP (4.6 mm i.d. × 250 mm, 5 μm), Kanto Chemical
Water-methanol (3:2)
0.8 mL/min
40 °C
Fluorescence detector (Ex: 365 nm, Em: 450 nm)

算得られたクロマトグラムからピーク面積及び高さを求めて検量線を作成し，試料中のアフラ
トキシン B1，B2，G1 及び G2 量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．

アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲をとうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認

125

Under the light-shielding conditions

Sample 25.0 g (300 mL amber Erlenmeyer flask)
add 150 mL of acetonitrile-water (9:1)
shake for 30 min
centrifuge for 5 min at 650×g
MycoSep 226 AflaZon+transfer 4.5 mL of supernatant into test tube
push MycoSep 226 AflaZon+ column into test tube
50 mL eggplant flask
transfer 1 mL of effluent solution through MycoSep 226 AflaZon+ column
evaporate under 40 °C and dry with N2 gas
Derivatization
add 0.1 mL of trifluoroacetic acidallow to stand for 15 min
add 0.9 mL of water-acetone (9:1)
centrifuge for 5 min at 5000×g
LC-fluorescence detector

Scheme 1
2.5

Analytical procedure for aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in corn silage

妨害物質の検討で用いた定量方法
LC による測定時に 2.4 の 4)の溶離液を水－メタノール（7+3）に変更して測定した．

2.6

添加回収試験
2.2 の 2)のアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 混合標準原液をアセトニトリルで正確に希釈し添加に用いた．
とうもろこしサイレージについて，アフラトキシン B1 ，B2 及び G1 として，原物換算して0.0013，0.011，0.022 及び 0.044 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 0.5~17 ng/mL），アフラトキ
シン G2 として，原物換算して 0.00022，0.011，0.022 及び 0.044 mg/kg 相当量（最終試料溶液中
で 0.083~17 ng/mL）になるようにそれぞれ添加後よく混合し，一夜静置した後に本法に従って添加回収試験を実施し，平均回収率及び繰返し精度を求めた．
なお，添加は風乾物試料に対してアフラトキシン B1，B2 及び G1 として 0.003，0.025，0.05 及び 0.1 mg/kg 相当量，アフラトキシン G2 として 0.0005，0.025，0.05 及び 0.1 mg/kg 相当量になるよう行い，原物中濃度への換算は，原物中及び風乾物中の水分含有量を 60 %及び 10 %と想定して，原物（水分含有量 60 %）中濃度＝風乾物（水分含有量 10 %）中濃度／2.25 の式により行った．
2.7

収載法の検出下限の検討で用いた定量方法
飼料分析基準第 5 章第 3 節 2 の方法により定量した．振り混ぜることが困難な試料については，

試料採取量を 25.0 g とした．
2.8

10 mL 容褐色共栓試験管を用いた誘導体化法の検討で用いた定量方法
2.4 の 2)で得られた試料溶液 1 mL を 10 mL の褐色共栓試験管に正確に入れ，40 °C 以下に設定

した試験管濃縮装置で窒素ガスを送って濃縮乾固した．残留物にトリフルオロ酢酸 0.1 mL を正確に加え，褐色共栓試験管を密栓し，タッチミキサーで 10 秒程度振り混ぜた後 15 分間静置し，更に水－アセトン（9+1）0.9 mL を先の褐色共栓試験管に正確に加え，タッチミキサーで 10 秒

飼料研究報告 Vol. 44 (2019)

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程度振り混ぜた．この液をプラスチック製遠心沈殿管（容量 1.5 mL）に入れ，5000×g で 5 分間
遠心分離し，上澄み液を液体クロマトグラフィーに供する試料溶液とした．
同時にアフラトキシン混合標準液（0.5 µg/mL）2，4，10，20 及び 30 µL をそれぞれ 10 mL の褐色共栓試験管に正確に入れ，トリフルオロ酢酸 0.1 mL を正確に加えた．以下試料溶液と同様に操作し，1 mL 中にアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 としてそれぞれ 1，2，5，10 及び 15 ng
相当量を含有する各標準液を調製した．測定及び計算は，2.4 の 4)及び 5)により行った．

3
3.1

結果及び考察検量線
2.2 の 2)及び 2.4 の 3)により調製した各混合標準液各 20 µL を LC に注入し，得られたクロマ

トグラムからピーク面積及び高さを用いて検量線を作成した．
得られた検量線の一例は Fig. 2 のとおりであり，各 0.05~30 ng/mL（注入量として 0.001~0.6 ng相当量）の範囲で直線性を示した．
なお，当該検量線の濃度範囲は，アフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 を 0.0003~0.18 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の各アフラトキシン濃度範囲に相当する．

5000000

y = 180336x + 10017
R² = 0.9997

4000000

Fluorescence Intensity／µV

Fluorescence Intensity／µV･s

アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲をとうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認

3000000
2000000
1000000
0

0

10

20

25000020000015000010000050000

y = 207104x + 9896
R² = 0.9998

5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0

0

10

20

0

10

20

30

Concentration of aflatoxin B1 /[ng/mL]

Fluorescence Intensity／µV

Fluorescence Intensity／µV･s

Concentration of aflatoxin B1 /[ng/mL]

6000000

y = 10370x + 685
R² = 0.9996

300000030

12725000020000015000010000050000
030

y = 10619x + 650
R² = 0.9997

300000Concentration of aflatoxin B2 /[ng/mL]

0

10

20

30

Concentration of aflatoxin B2 /[ng/mL]

200000y = 96594x + 4430
R² = 0.9998

2500000

Fluorescence Intensity／µV

Fluorescence Intensity／µV･s

3000000

2000000
1500000
1000000
500000
0

0

10

20

150000100000

50000

0

30

Concentration of aflatoxin G1 /[ng/mL]

y = 132403x + 6367
R² = 0.9998

3000000

Fluorescence Intensity／µV

Fluorescence Intensity／µV･s

10

20

30

3000002000000

1000000

0

10

20Concentration of aflatoxin G2 /[ng/mL]

Fig. 20Concentration of aflatoxin G1 /[ng/mL]

4000000

0y = 6926x + 474
R² = 0.9996

30

y = 9603x + 603
R² = 0.9997

250000200000150000100000
50000
0

0

10

20

30

Concentration of aflatoxin G2 /[ng/mL]

Calibration curves of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 by peak area (left) and peak height (right)

飼料研究報告 Vol. 44 (2019)

128

抽出溶媒量の検討

3.2

最初に，飼料分析基準第 5 章第 3 節 2 に従い，抽出操作を行った．抽出操作は，分析試料
50.0 g を量りとり，抽出溶媒を 100 mL 加えて行うと規定されているが，とうもろこしサイレー
ジに抽出溶媒が吸収され振り混ぜることが困難であった．そこで，飼料分析基準第 5 章第 3 節 2の注 1 のとおり試料採取量を 25.0 g としたが，同様に振り混ぜることが困難であったため抽出
溶媒量を 150 mL とした．
妨害物質の検討

3.3

とうもろこしサイレージ 3 検体を用い，本法により調製した試料溶液を LC に注入し，得られたクロマトグラムを確認したところ，Fig. 3 のように，全ての検体でアフラトキシン B1 及び B2について，各ピークの直前に妨害ピーク（風乾物試料に対して最大 0.0006 mg/kg）が，アフラト
キシン G1 について，定量ピークの直後に妨害ピーク（風乾物試料に対して最大 0.0006 mg/kg）が認められた．アフラトキシン G2 について，定量を妨げるピークは認められなかった．
そこで，確認された各ピークがアフラトキシン B1 ，B2 又は G1 のピークか否か確認するため
LC による測定条件を 2.5 に変更して測定したところ，Fig. 4 のとおり，アフラトキシン B1，B2
及び G1 の保持時間にピークは認められなかった．このことから，妨害ピークであると判断した．
しかし，その面積は 3.5 で確認された定量下限に相当するピークの面積の 1/3 未満であり，飼料分析基準別表 3 の妥当性確認法ガイドライン（以下「妥当性確認法ガイドライン」という．）に定める選択性の許容範囲であることから，試験に支障のないものと判断した．

B
5.5

1

3.5

4

2 3

1.5
-0.5
6

8

10

12

14

16

18

Retention time/min

Fig. 320

Fluorescence Intensity/mV

Fluorescence Intensity/mV

A

1

5.5

2
3

3.5

4

1.5
-0.5
6

8

10

12

14

16

Retention time/min

Chromatograms of standard solution and blank sample solution(LC conditions are shown in Table 2.

Arrows indicate the retention times of 1:

aflatoxin G1, 2: aflatoxin B1, 3: aflatoxin G2 and 4: aflatoxin B2)
A: Standard solution (The concentrations of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 are 0.1 ng/mL,
respectively)
B: Sample solution of corn silage

18

20

A

Fluorescence Intensity/mV

アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲をとうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認

1.9

2

1

129

4

3

0.9

-0.1
12

22

32

42

52

B

Fluorescence Intensity/mVRetention time/min

1

1.9

2

3

4

0.9

-0.1
12

22

32

42

52

Retention time/min
Fig. 4Chromatograms of standard solution and blank sample solution(LC conditions except mobile phase are shown in Table 2.
methanol (7:3).

Mobile phase is water-

Arrows indicate the retention times of 1: aflatoxin G1, 2: aflatoxin

B1, 3: aflatoxin G2 and 4: aflatoxin B2)
A: Standard solution (The concentrations of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 are 0.1 ng/mL,
respectively)
B: Sample solution of corn silage
3.4

添加回収試験
アフラトキシン B1，B2 及び G1 には，3.3 で妨害ピークが確認された．妥当性確認法ガイドラ

インに定める選択性を満たすには妨害ピークの面積は定量下限に相当するピークの面積の 1/3 未
満であることが必要となる．よって，アフラトキシン B1，B2 及び G1 の最低添加濃度は，3.3 で確認された妨害ピークの最大濃度（原物換算して最大 0.00027 mg/kg，風乾物試料に対して最大
0.0006 mg/kg）の 5 倍となる 0.0013 mg/kg（原物換算値．風乾物中で 0.003 mg/kg）とした．アフラトキシン G2 については，妨害ピークは確認されなかったことから，収載法の定量下限（試料
中 0.0005 mg/kg）を参考に，最低添加濃度を原物換算して 0.00022 mg/kg（風乾物中で 0.0005
mg/kg）と設定した．
2.6 に従って添加回収試験を実施した．その結果は Table 3 のとおり，アフラトキシン B1 については，平均回収率は 85.0~116 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSDr）として 4.4 %以下，
アフラトキシン B2 については，平均回収率は 84.0~119 %，RSDr は 4.2 %以下，アフラトキシン
G1 については，平均回収率は 88.1~106 %，RSDr は 3.3 %以下，アフラトキシン G2 については，

飼料研究報告 Vol. 44 (2019)130

平均回収率は 82.6~101 %，RSDr は 10 %以下の成績が得られた．この結果は，妥当性確認法ガイ
ドラインに定められた真度及び併行精度の目標値を満たす良好な結果であった．
なお，得られたクロマトグラムの一例を Fig. 5 に示した．
Table 3Aflatoxin

B1

B2

G1

G2

Spiked level(mg/kg original
matter)Recoveries for aflatoxins in corn silages
Corn silage 1
Corn silage 2
a)Recovery
(%)

b)
RSDr

a)

(%)

Recovery
(%)

b)
RSDr

Corn silage 3
a)

b)

(%)

Recovery
(%)

RSDr
(%)

0.0013

116

2.1

93.0

1.4

97.8

4.4

0.011

－
89.2

－
1.4

92.5

1.6

0.022

－

－

－
85.0

－
3.5

0.044

92.7

1.7

0.0013

104

2.1

－
119

－
2.2

－
113

－
4.2

0.011

－
1.1

89.9

1.5

0.022

－
88.7

－

－

－
84.0

－
3.2

0.044

89.7

1.6

0.0013

103

3.3

－
106

－
3.3

－
96.0

－
3.3

0.011

－
1.4

96.1

2.3

0.022

－
91.6

－

－

－
88.1

－
3.1

0.044

95.3

2.2

0.00022

93.8

6.3

－
94.8

－
10

－
82.6

－
2.6

0.011

－
0.8

93.9

3.5

0.022

－
91.7

－

－

－
87.5

－
2.6

0.044

94.0

1.7

－

－

－

－

－：Not testeda) The aflatoxins were spiked to air-dried corn silage samples one night prior to extraction.

The

spiked levels were 0.003, 0.025, 0.05 and 0.1 mg/kg air-dry matter for aflatoxin B1, B2 and G1,
and 0.0005, 0.025, 0.05 and 0.1 mg/kg air-dry matter for aflatoxin G2, respectively.

The levelsof aflatoxins in original matter were calculated with following equation on the assumption thatthe moisture content of corn silage samples was 60 % for original matter and 10 % for air-dry
matter.
The levels of aflatoxins in original matter (moisture 60 %)= the levels of aflatoxins in air-dry matter (moisture 10 %) / 2.25b) Mean (n = 5)c) Relative standard deviation of repeatability

アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲をとうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認

2 3

B 240

4

Fluorescence Intensity/mV

Fluorescence Intensity/mV

A 240
1

190
140
90
40
-10

131

4

2 3
1

190
140
90
40
-10

5

10

15

20

5

Retention time/min

Fig. 510

15

20

Retention time/min

Chromatograms of standard solution and spiked sample(LC conditions are shown in Table 2.

Arrows indicate the retention times of 1:

aflatoxin G1, 2: aflatoxin B1, 3: aflatoxin G2 and 4: aflatoxin B2)
A: Standard solution (The concentrations of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 are 15 ng/mL,
respectively)
B: Sample solution of corn silage (spiked at 0.044 mg/kg original matter of aflatoxins B1,
B2, G1 and G2 (corresponding to 16.7 ng/mL))3.5

定量下限及び検出下限の検討
アフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 の検量線が直線性を示した範囲，各 0.05~30 ng/mL の下端付近となる濃度（アフラトキシン B1，B2 及び G1 については，とうもろこしサイレージ風乾物中
で 0.003 mg/kg 相当量（最終試料液中濃度 0.5 ng/mL 相当量），アフラトキシン G2 については，
とうもろこしサイレージ風乾物中で 0.0005 mg/kg 相当量（最終試料液中濃度 0.083 ng/mL 相当量））の添加回収試験の結果から本法の定量下限及び検出下限を求めた．Fig. 3 のとおり，各ア
フラトキシンのピークの前後において妨害物質のピークが多数存在していることから，定量値の標準偏差の 10 倍及び 4.26 倍（自由度 4 の t 分布の 0.95 分位点の 2 倍）から定量下限及び検出下限を求めたところ，アフラトキシン B1，B2 及び G1 の定量下限は風乾物中で 0.003 mg/kg，検出
下限は風乾物中で 0.001 mg/kg であり，アフラトキシン G2 の定量下限は風乾物中で 0.0005
mg/kg，検出下限は風乾物中で 0.0002 mg/kg であった．
また，配合飼料及びとうもろこしを対象とした収載法の検出下限が未設定であったため，併せて検討を行った．収載法では試料採取量は 50.0 g としているが，抽出時に振り混ぜることが困
難な試料については試料採取量を 25.0 g にするとしている．
2.2 の 2)のアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 混合標準液（0.5 µg/mL）をアセトニトリルで正確に希釈し添加に用いた．
配合飼料（鶏用及びほ乳期子牛育成用代用乳用）及びとうもろこしについて，アフラトキシン
B1，B2，G1 及び G2 として 0.0005 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 0.25 ng/mL．振り混ぜることが困難で 25.0 g 採取としたほ乳期子牛育成用代用乳用配合飼料については 0.125 ng/mL）になる
ようにそれぞれ添加後よく混合し，一夜静置した後に 2.7 に従って添加回収試験を実施した．そ飼料研究報告 Vol. 44 (2019)132の結果から得られるピークの SN 比が 3 以上となる濃度を求めたところ，配合飼料及びとうもろ
こし中のアフラトキシン B1，B2， G1 及び G2 の検出下限は，試料中で 0.0001 mg/kg であった．この濃度は，配合飼料における最も低いアフラトキシン B1 の管理基準値 0.01 mg/kg に対して
1/100，とうもろこしのアフラトキシン B1 の管理基準値である 0.02 mg/kg に対して 1/200 であり，妥当性確認法ガイドラインに定められた基準値に対する検出下限の目標値を満たしていた．
なお，Table 4 のとおり，添加回収試験結果は良好であった．得られたクロマトグラムの一例
を Fig. 6 に示した．
Table 4Aflatoxin

Recoveries for aflatoxins in corn and formula feeds
Feed types
Formulafeed for calf
Formula feed for
SpikedCornc)poultrylevel
milk replacer
b)
b)
b)
a)
a)
a)
(mg/kg)
RSDr
RSDr
RSDr
RecoveryRecoveryRecovery
(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

B1

0.0005

91.8

4.5

96.6

4.7

94.2

2.7

B2

0.0005

88.9

2.5

90.2

2.5

87.5

1.7

G1

0.0005

94.9

3.7

83.5

8.5

91.9

1.6

G2

0.0005

93.5

2.4

89.9

5.3

91.4

0.8

a) Mean (n = 5)b) Relative standard deviation of repeatabilityc) Weighed volume set to 25.0 g

アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲をとうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認

2

1

3

B 5.5

4

3.5
1.5
-0.5
6

8

10

12

14

16

18

20

Fluorescence Intensity/mV

Fluorescence Intensity/mV

A 5.5

1

2

3

10

12

Fluorescence Intensity/mV

1

2

3

10

12

4

3.5
1.5
-0.5
6

8

Retention time/min

C 5.5

133

14

16

18

20

Retention time/min

4

3.5
1.5
-0.5
6

8

14

16

18

20

Retention time/min

Fig. 6Chromatograms of spiked samples(LC conditions are shown in Table 2.

Arrows indicate the retention times of 1:

aflatoxin G1, 2: aflatoxin B1, 3: aflatoxin G2 and 4: aflatoxin B2)
A: Sample solution of formula feed for poultry (spiked at 0.0005 mg/kg of aflatoxins B1,
B2, G1 and G2 (corresponding to 0.25 ng/mL))
B: Sample solution of formula feed for calf milk replacer (spiked at 0.0005 mg/kg ofaflatoxins B1, B2, G1 and G2 (corresponding to 0.125 ng/mL))
C: Sample solution of corn (spiked at 0.0005 mg/kg of aflatoxins B1, B2, G1 and G2(corresponding to 0.25 ng/mL))3.6

誘導体化反応容器の比較
本法では，50 mL のなす形フラスコを使用して誘導体化反応を行っている．ここで，より小型の容器が誘導体化反応に適していると考えられたことから，誘導体化反応に使用する容器の容量の違いによる定量値への影響を検討した．
2.2 の 2)のアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 混合標準液をアセトニトリルで正確に希釈し添加に用いた．
とうもろこしサイレージについて，各アフラトキシンとして，0.025 及び 0.05 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 4.2 及び 8.3 ng/mL）になるようにそれぞれ添加後よく混合し，一夜静置した後に本法及び 2.8 に従って添加回収試験を実施し，平均定量値及び繰返し精度を求めた．
その結果は Table 5 のとおりであり，10 mL の褐色共栓試験管を使用した場合のアフラトキシ
ンの平均回収率は 84.9~96.4 %，その繰返し精度は，相対標準偏差（RSDr ）として 3.0 %以下，
50 mL のなす形フラスコを使用した場合のアフラトキシンの平均回収率は 84.0~96.1 %，その繰返し精度は，RSDr として 3.5 %以下であり，いずれも妥当性確認法ガイドラインに定められた目
標値を満たした．

飼料研究報告 Vol. 44 (2019)134

また，誘導体化反応時に使用する容器の容量の違いによる定量値に有意な差があるか確認するため，有意水準 5 %で両側検定の t-検定を行った．その結果，アフラトキシン B1 については t(2) = -0.692，p = 0.560，アフラトキシン B2 については t (2) = 7.432，p = 0.0176，アフラトキシン
G1 については t (2) = 0.659，p = 0.577，アフラトキシン G2 については t (2) = 3.548，p = 0.071 であり，アフラトキシン B2 については 10 mL の褐色共栓試験管を使用した方が平均定量値が高く有意な差が認められ，それ以外では有意な差は認められなかった．
これらのことから，誘導体化反応の際は，50 mL のなす形フラスコを 10 mL の褐色共栓試験管に変更しても同等又はそれ以上の結果が得られることから，より小型の容器に変更しても差し支えないと考えられた．
Table 5Aflatoxin

B1

B2

G1

G2

Comparison of reaction containers used for derivatization reaction
Reaction container
Spiked
10 mL brown stoppered test tube
50 mL eggplant flask
level
Quantitative
Quantitative
Feed types
b)
b)
a)
a)
(mg/kg air
a)
a)
RSDr
RSDr
RecoveryRecovery
value
value
dry matter)
(%)
(%)
(%)
(%)
(mg/kg)(mg/kg)Corn silage 1
0.05
0.045090.0
1.8
0.044689.2
1.4
Corn silage 2
0.025
0.022389.3
2.0
0.023192.5
1.6
Corn silage 3
0.05
0.042484.9
2.4
0.042585.0
3.5Corn silage 1
0.05
0.046392.7
1.6
0.044388.7
1.1
Corn silage 2
0.025
0.023192.5
1.8
0.022589.9
1.5
Corn silage 3
0.05
0.043486.7
3.0
0.042084.0
3.2
Corn silage 1
0.05
0.047194.2
2.9
0.045891.6
1.4
Corn silage 2
0.025
0.023694.4
2.7
0.024096.1
2.3
Corn silage 3
0.05
0.044889.7
2.4
0.044088.1
3.1
Corn silage 1
0.05
0.048096.0
2.0
0.045991.7
0.8
Corn silage 2
0.025
0.024196.4
1.6
0.023593.9
3.5
Corn silage 3
0.05
0.044589.0
2.2
0.043887.5
2.6a) Mean (n = 5)b) Relative standard deviation of repeatability

4まとめ

とうもろこしサイレージ中のアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 の定量法として，収載法の適用の可否について検討したところ，試料採取量を 50.0 g から 25.0 g，抽出溶媒量を 100 mL から 150
mL に変更することで，以下の結果が得られ，適用が可能であると考えられた．
また，未設定であった配合飼料及びとうもろこし中の収載法によるアフラトキシン B1 ，B2 ，G1
及び G2 の検出下限について検討したところ，以下の結果が得られた．
1)

検量線はそれぞれ 0.05~30 ng/mL 相当量（注入量として 0.001~0.6 ng 相当量）の範囲で直線性を示した．
なお，当該検量線の濃度範囲は，アフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 を 0.0003~0.18 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の各アフラトキシン濃度範囲に相当する．

アフラトキシンの液体クロマトグラフによる同時分析法の適用範囲をとうもろこしサイレージに拡大するための妥当性確認

2)

135

アフラトキシン B1，B2 及び G1 について，本法に従って得られたクロマトグラムに定量を妨げるピークが認められたが，妥当性確認法ガイドラインに定める選択性を満たしていた．アフラトキシン G2 について，本法に従って得られたクロマトグラムに定量を妨げるピークは認められな
かった．

3)

原物中に換算してアフラトキシン B1，B2 及び G1 として 0.0013，0.011，0.022 及び 0.044 mg/kg
相当量，アフラトキシン G2 として 0.00022，0.011，0.022 及び 0.044 mg/kg 相当量を添加し，本法に従って 5 点併行分析を実施し，回収率及び繰返し精度を求めたところ，妥当性確認法ガイド
ラインに定められた真度及び併行精度の目標値を満たす良好な結果が得られた．

4)

本法のとうもろこしサイレージ中のアフラトキシン B1 ，B2 及び G1 の定量下限は風乾物中で0.003 mg/kg，検 出 下限 は 0.001 mg/kg， アフ ラト キシン G2 の 定量 下限 は風 乾物 中で 0.0005
mg/kg，検出下限は 0.0002 mg/kg であった．

5)

収載法における配合飼料及びとうもろこし中のアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 の検出下限
は，試料中で 0.0001 mg/kg であった．この濃度は妥当性確認法ガイドラインに定められた目標を満たしていた．

6)誘導体化反応の際，10 mL の褐色共栓試験管を用いて添加回収試験を実施し，回収率及び繰返し精度を求めたところ，妥当性確認法ガイドラインに定められた真度及び併行精度の目標値を満たす良好な結果が得られた．

文
1)

献

農林水産省畜産局長通知：飼料の有害物質の指導基準及び管理基準について，昭和 63 年 10 月
14 日，63 畜 B 第 2050 号 (1988).

2)農林水産省消費・安全局長通知：飼料分析基準の制定について，平成 20 年 4 月 1 日，19 消安
第 14729 号 (2008).