Vol.３3 No.2，２０１4

124
センターニュース

分析機器解説シリーズ（124）◆3次元X線マイクロCT …………………………………………………………………… P1
株式会社東陽テクニカ

分析システム営業部

小森研治

トピックス

◆Light Ablation Nano Tome (LANTome) の開発- 3D-SEM画像取得への応用 - ……… P5
九州大学病院

中央形態分析室

九州大学システム情報科学研究院

金丸
興

孝昭
雄司

分析機器解説シリーズ（124）

3 次元 X 線マイクロ CT
株式会社東陽テクニカ

1マイクロ CT の現状

CT装置はComputed Tomograph（トモグラフは断層写真の意）として広く知られている。CT撮影はX線を照射して観察を行う手法であり、レントゲン撮影と同様に、被ばく量という注意すべき事項はあるが、非破壊で内部構造の観察を行える手法として多く使用されている。
臨床用CTは対象が人体であるため500μm程度の解像度を有することで、十分に疾病に関する情報を収集することが可能である。マイクロCTは、このCT装置の解像度を上げたもので、マイクロメートル〜サブマイクロメートル程度の分解能を有し、広く材料科学分野に用いられたり、実験小動物の軟組織／骨組織観察などバイオメディカル分野にも活用されている。

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分析システム営業部

小森研治

設置される。線源から照射されたX線は物体を透過し、検出器に入射する。物体の部位により透過度合いには差が発生し、検出器に入射するX線の量にも分布ができる。この透過度合いの分布を反映して検出器を介して表示される透過像がX線イメージである。X線イメージ
ング（レントゲン）は、1測定は1ショットで終了し、透過像であるため結果は2次元表示され、厚み情報は含ま

図1A）レントゲンの構成

CT 装置の原理

CT装置の原理は、一般的によく知られたX線イメージング（レントゲン撮影、あるいはX線透過イメージング）装置と比較すると理解しやすい。図1はそれぞれ
A）X線イメージング装置、B）CT装置の構成を簡易的に描いたものである。X線イメージングではX線源、撮影対象物、CCD検出器が図A）のように順番に並んで

図1

B）CT 装置の構成（1）

分析機器解説シリーズ（124）れていない。
一方、CT装置の構成はX線イメージングとほぼ同じであるが、動作上は「CTスキャンニング」と「再構成」という2つの大きなプロセスが追加される。CTス
キャニングは対象物にX線を照射しながらスキャンする
動作で、B）図のようにマニピュレータで対象物を回転させる。180度あるいは360度の回転をさせながら、連続してX線撮影が続けられるため、スキャニング完了後には、異なる角度から撮影した大量のX線イメージ群が取り込まれる。スキャンすること、大量にイメージを取り込むことが、前述の1ショットで完了するX線イメージング（レントゲン撮影）と大きく異なる。この大量に取り込まれたX線イメージ群を、対象物の容積内の全体にわたる内部構造情報を含んだボリュームデータに変換する作業が「再構成」プロセスである。
実際に市販されているマイクロCTでは、通常は対象物を約0.7度刻みで半回転させる。その各刻み角度のもとでX線撮影が行われるので、180度回転する間だけでも、約250枚のX線写真を取り込むことができる。
従って、CTスキャンニング完了後には、物体を約250の角度から撮影した、約250枚の2次元X線イメージ群がコンピュータに蓄積される。
この2次元イメージ群に再構成プロセスを適用すると、ソフトウェアにより、全て数字上で接続され、コーンビームの補正、逆投影の際のフィルター補正などが自動で行われ、内部を網羅したXYZ座標値を伴う一大内部データセットが出来上がる。
図2は、食感を数値化するために、内部構造をCT撮影／再構成した後のデータである。このように再構成後のデータは、ソフトウェア上で任意の箇所の断面を任意の角度でカットし、内部構造を観察でき、寸法も完全に校正されているので、サイズの高精度計測も可能である。
またCTは再構成後に得られる全容積内における3次

図3

図4

さまざまな数値解析ディスプレイ

Ni フォームのボリュームレンダリングイメージ（1.9 μ m 分解能）

前述の原理のもとでCTイメージを作るためには、対象物体の内部にX線を透過する箇所と吸収する箇所が必要であり、対象物体の内部構造をより詳細に観察するためには、X線が透過するか吸収されるのかといった2者択一の挙動を見るのではなく、どのくらい吸収されるのか、あるいはどのくらい透過するのかというその細かい度合いを識別し、それを撮影イメージに反映させることが必須となる。その際にCT装置が利用するのがX線で物体を照射した際に生じる光電吸収という現象である。光電吸収量（τ）は、対象物体内の原子の内殻電子との相互作用でX線光子が吸収される量で、以下のように原子番号（Z）と比例関係を持つ（Eは電子のエネルギー）。

τ vZ4／E3.5

図2

食品（ポテトチップス）の内部を表示。
テクスチャー解析などに応用。

元解析が行えるので、体積計算・容積計算・表面積計算などを始めとした多くの立体解析が行える（図3）。
また、ソフトウェアを用いた表示法も豊富に備えており、ボリュームレンダリング（図4）、MIP（MaximumIntensity Projection）あるいは3次元鳥瞰図等さまざまな方法で対象物体内部を表示できる。
（2）

対象物体内の原子の種類に応じて吸収量が異なり、X線透過イメージはこの光電吸収の度合いを利用している。CTイメージもこの光電吸収の量が元になって構築されることになる。実際のCT装置を操作する観点から表現すると、いかにこの吸収量をコントロールして解像度及びコントラストの高いX線イメージそしてCT撮影イメージを作り上げるかが、良質なCTデータの構築の中で重要である

分析機器解説シリーズ（124）3マイクロ CT の分類

マイクロCTは用途に応じて以下のように分類することができる。
A）大エネルギー／大試料タイプ
B）アカデミック高分解能タイプ
C）ライフサイエンス対応（In-Vivo）マイクロCTD）ナノスケールCTA）は200ｋV近い大電圧のX線で、主に金属試料のように吸収量の多い試料を調べるのに使われる（図5）。X線の透過量の少ない材料（主に金属材料）やサイズの大きな試料に対して、高パワーのX線で対応し、内部のボイド、欠陥や表面加工結果の解析に用いられ、工場における製品検査にも多く使用される。車の中のクーラーをスキャンしたデータを図6に示す。

最近のマイクロCTは、X線が透過した、吸収されたといういわゆるイチ／ゼロ検出／観察ではなく、透過の度合いによりコントラストをイメージングすることが主流である。すなわち、撮影時に連続X線の全てのエネルギー帯を使うのではなく、CuやAlのフィルター板を検出器の直前に装着し、一定エネルギー以下のX線をシャットアウトし、その状態でX線電圧を調整し、低エネルギー側のX線に起因する影を適正に調整し、わずかな元素の差による部位の識別ができるようにパラメー
タ設定が行われる。図8は炭素繊維補強プラスチックのデータである。1）では内部と外部で繊維の配向が異なることが視覚化されており、2）では部分拡大により、単一の繊維の詳細が可視化されている。

図8 CFRP のCT内部観察イメージ

図5

Bruker micro CT 社製 SkyScan1173
高エネルギー型マイクロ CT

また、電子顕微鏡（SEM）の中に装着できるマイク
ロCTは、SEMのステージ部分を、X線照射源を搭載した特殊ステージに入れ替えることで、SEMチャンバの中でCT撮影ができる（図9）。必然的に試料サイズは小さくなるが、高分解能観察が可能である。

図9 電子顕微鏡チャンバとBruker micro CT 社製In-SEM CT

図6 自動車のクーラーの内部構造

B）は必ずしも学術目的のみに使われるわけではな
いが、Aと比較して分解能が年々向上していることもあり、検査用途より研究・開発に使用される。分解能も1μmを上回る値を保証されるものが出てきており、最近では図7のように350nm程度まで上げられるものも市販されている。この製品は本体上部に試料を16個入れる試料スロット兼コンベアが搭載されており、試料の自動交換も無人で行なうことが可能である。

図7 Bruker micro CT 社製SkyScan1272高分解能X 線マイクロCT

図10 Bruker micro CT社製SkyScan1176高分解能In-vivoマイクロCTC）のライフサイエンス用は生物を生きたまま撮影するIn-vivoタイプと（図10）、軟組織や骨組織を摘出して撮影するex-vivoタイプがある。
In-VivoタイプマイクロCTは臨床用CTと非常に似たコンセプトで作られた実験動物専用のCT装置であり、図11のような小動物の軟組織を造影剤を使って次々と撮影できるだけではなく、肺、脂肪そして骨に関しては造影剤を使わなくとも、腫瘍まで観察できる。Ex-vivoタ（3）分析機器解説シリーズ（124）
イプは前出の高分解能アカデミック型で兼用する。小動物、中動物の骨の細かい構造を観察できる（図12の大腿骨の内部構造イメージ）だけではなく、臨床用CTで足りない分解能を補えることから、動物のみならずヒトの摘出組織の高分解能観察にも使用されている。

２）リチウム電池の内部構造の観察

３）耐水コーティング膜と下地層の分離

４）アイスクリーム内の脂肪の分布

図 11

マウスの各軟組織の CT イメージ

５）肺の腫瘍の観察（造影剤未使用）

図 12

マウスの大腿骨の内部イメージ

D）のナノスケールCTはその名のとおり既にマイクロCTの解像オーダーを超えたCT装置であり、100nm程度の分解能を保証する高分解能CTが市販されているが、非常に高価である（図13）。

図13 Bruker micro CT社製SkyScan2211マルチスケールX線マイクロCT

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観察例と応用範囲

実際にマイクロCTを使って撮影した結果を紹介する。
１）金属製のパーツの欠陥の可視化（4）６）ゼブラフィッシュの全身骨格の可視化

マイクロCTの応用範囲としては、主に以下で示すような分野が挙げられる。
１）材料科学
原材料物質−金属、石、岩、地質学関連、宝石用原石/ダイ
ヤモンド、木材、有機原材料など
合成材料−高分子、生体材料、建築材料、紙/編物/織物、粉体/パーティクル、セラミック/ガラス、薬錠
剤、芸術品/歴史的遺物、食品関連など
産業製造品−エレクトロニクス部品、工業生産物、金属/非金属、燃料電池/二次電池など
植物、有機材料−花、種子など
２）ライフサイエンス
Ex-vivo−石灰化した組織
骨、動物学における骨格系、古生物学、歯科系他−軟組織

分析機器解説シリーズ（124）／トピックス
肺、心臓、動物学、非石灰化他−植物や有機材料−食品関連
In-Vivo−石灰化した組織
骨、動物学における骨格系、歯科系他−軟組織
肺、造影剤、脂肪他−マルチモダリティ5終わりにマイクロCT装置には、前項のようにタイプは用途によって様々であるが、高分解能化が開発のキーワードになる。
3D-SEMと呼ばれる手法が微細内部構造の観察に使われ始めている。試料をSEMチャンバに装着すると、観察／表面のカッティング（つまり新しい面出し）を繰り返し行い、1ブロックの1000枚以上の断面データを自動で連続で取り込むことができる。SEMの分解能を有したマイクロCT撮影結果のようなデータが取得でき、非常に着目されている技術であるが、その手法は破壊法になる。マイクロCT装置そのものの分解能が上がってくれれば、非破壊でSEMの分解能で内部構造を観察することが実現できるであろう。
また分解能が上がればより細かい箇所のデジタルデータを取得することになり、データポイント数（ピクセル数）は増え、データ容量は増大する。
分解能が上がるということは、同時に大容量データの処理という課題も付帯して発生するため分解能を追及するメーカは、撮影のソフトウェアのみならず、再構成のソフトウェアも工夫し、高速スキャン／再構成を追及する必要がある。
今後は高分解能を追及する以外にも、試料サイズの自由度を高めたり、無人化も含めた操作性を追及したり、さらにはスループットを考慮した高速スキャンを実現するなど、様々な観点から開発されたマイクロCT装置の出現が期待される。
（Bruker製 3次元高分解能X線CTシステム（SkyScan1172）はH26年3月に中央分析センター伊都分室に設置されました。）

Light Ablation Nano Tome (LANTome) の開発- 3D-SEM 画像取得への応用 九州大学病院

中央形態分析室

九州大学システム情報科学研究院

金丸興

孝昭
雄司

1．はじめに
最近、Focused Ion Beam Scanning ElectronMicroscopy（FIB-SEM）やSerial Block-Face
Scanning Electron Microscopy（BFI-SEM）など超微構造の3D立体構築手法が発展してきたが、試料作製法への更なる要望として、非接触で広い面積の画像取得、試料作製時間の短縮、試料が受ける熱ダメージの軽減などが求められるようになってきた。我々は、Light Ablation Nano Tome（LANTome）と名付けたexcimer laser ablationを用いた切削技術で電顕試料を作製し、3D画像作製を試行している（Fig.1）。

Fig.1 UV 光による試料切削の提案

Fig.2 C=C 結合解離エネルギー

2．LANTome の特徴
有機材料に特化している手法であるが、切削に用いるAr*F エキシマーレーザー（波長193nm）は、有機体を構成する結合でもっとも強固なC=C結合（6.1eV）よりも大きい光子エネルギー6.42eVを有しており、有機体のほぼ全ての化学結合を光で直接切断する光解離が起こり、光のエネルギーは対象を加熱するのにほとんど利用されない（Fig.2）。そのため、プラスチックで包埋されている生体試料自体に及ぼす熱変性が少ないことも期待される。
（5）

トピックス

対象サンプルは灌流固定法（固定液：0.01%グルタルアルデヒド+4%パラフォルムアルデヒド）で固定したハムスター腎臓でブロック電子染色しエポキシ樹脂包埋後、SEM観察した（Fig.3）。また、アブレーションへの耐性が異なる包埋材料と生体試料で凸凹が成長しやすい垂直入射を避け、斜め入射・多方向を用いて均一な切削率が得られるような回転速度と入射角を最適化した （Fig.4）。
EPON樹脂包埋、LANTomeで切削後に、SEM（TM-3000, Hitachi Hightec）の低真空モードで試料表面の反射電子線像（Backscattered ElectronImage）を連続撮影し観察した。

Fig.3 初期の試料作製の流れと SEM 観察

Fig.4 斜め入射による傷の軽減原理

3．実験方法

Fig.5 斜め照射による適正照射角≒ 70 度

（6）

トピックス

4．結果
試料表面に凸凹の成長を抑制するため試料表面に対し60〜80度の入射角で方位を変えつつablateすると、事前にブロック面へ残存していた傷も消失した現象が見られた。入射角70°付近で最も表面の掘削状態が良好で有った（Fig.5）。包埋プラスチックと生体、及び染色金属はほぼ同様の掘削速度で進んでおり、約19nm/shotの掘削速度が見積もられた（Fig.6）。
また、1.5×1mm 2 の広い範囲の切削も確認された（Fig.7）。

5．考察

Fig.6 各 50 ショットで ablate した連続画像
8 × 50=400shots 細胞核直径≒ 7.500nm
1shot 当たり約 1.9nm の切削であった。

画像取得時に帯電の少ないSEM画像で３D画像化（Fig.8）が可能なシステムを作製した（Fig.9）。本法は、有機材料に限定している破壊検査法のひとつであり、電子顕微鏡による３D観察が可能なdeviceである。

Fig.7 本法では広範囲の切削が可能である。

Fig.8 ハムスター腎臓 1000 倍「LANTome」によるSEM連続画像（7）

トピックス

Fig.10 Ablation Rate
Fig.9 「LANTome」を組み込んだ SEM システム

AS242Z00018K「腎生検確定診断用自動観察電子顕微鏡の開発」としてJSTより交付を受けて行った成果である。九州大学大学院 包括的腎不全治療学 鶴屋和彦准教授、九大システム 情報科学研究院興研究室 学生･院生、九州大学機械工学部門の藏田耕作准教授などから協力を得た。試料は、九州大学医学部細菌学教室、齋藤光正准教授より頂いた。実験初期には、株式会社
日立ハイテクノロジーズから装置､実験後期には株式会社マックスネットから協力を得た。ここに本研究に関わった多くの方々へ感謝の意を表す。

「LANTome」は1）大面積・高速な切削が可能
2）熱変性が少ない切削法 3）帯電の中和が期待される。現時点のAblation Rateを示す（Fig.10）。３D電子顕微鏡、他切削方法との比較は表1の通りである。

6．謝辞
本 研 究は 、平 成 2 4 年 度 第 2回 A - S t epフィージ ビ リ テ ィ・ス テ ー ジ 探 索 タ イ プ 課 題 番 号

Table.1 既存技術 ･ 競合技術との比較表

価従来手法
ナイフ内蔵タイプ＊ 4FIB-SEM ＊ 5 ＊ 6本手法

格中程度（技術者必要）
＊1

深さ分解能

スループット

対象領域サイズ

切削スピード

試料の熟変性70nm 角×1.5mm 角△○

高価20nm△＊ 30.3mm 角？△○高価5nm△＊ 30.1mm 角

×＊ 3

×

中程度＊ 220nm◎2mm 角◎○＊ 1：切片作成の専門スキルが必要につき、人件費を考えると高価。
＊ 2：エキシマーレーザーを利用した場合高価。
＊ 3：FIB の切削は一回当たり 15-20 分かかるが、EM との高い結合によりスルートップは改善する。
＊ 4：ウルトラミクロトーム内蔵 SEM 例）3-View Gatan 社＊ 5：FIB-SEM 例）㈱日立ハイテクノロジーズ社製 日本 FEI 社製 日本電子社製

九州大学中央分析センターニュース 第124号 平成26年６月５日発行
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