ノロウイルス遺伝子型判別（dual typing 法）の省力化
タカラバイオ株式会社○齋藤憲介、吉崎美和、松本裕之、上森隆司
第40回日本食品微生物学会学術総会 (2019/11/28)

ノロウイルス（NoV）の遺伝子型について
NoVGIGIIHuman

Human

GI.1

GII.1・・・
GI.9・・・ GIV Human ・・・ GVIII Human

GIX Human

GX Bat・・・（国立感染症研究所HP）

GII.27
2*1 Chhabra, Preeti, et al. "Updated classification ofnorovirus genogroups and genotypes." Journal of
General Virology 100.10 (2019): 1393-1406.

 厚生労働省は食中毒の判断根拠の明確化のため、「患者と調理従事者等から検出されたウイルスの遺伝子型が同一であること」*2を確認すべきと提言している。

*2 薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会食中毒部会「ノロウイルス食中毒対策について (提言) 」 (平成19年10月12日)

遺伝子型判別（dual typing法）についてdual typing法（「病原体検出マニュアル ノロウイルス (第1版)*」収載）
 RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）領域の一部とcapsid領域の一部（VP1）の両方の遺伝子型をタイピング可能な手法。
◆ RdRp領域とVP1領域の間（ジャンクション領域）ではゲノムの組換えが頻発する。

◆ この組み換えがウイルスの流行に影響することが示唆されている（GII.2[P16]等）。
⇒VP1領域だけでなく、キメラウイルスも確認出来るRdRp領域を含めたタイピングが必要！
NoVゲノム

ORF1

5’

3

HEL

VPg

GI

MON432GIIMON431

Pro

Forward primer*国立感染症研究所（令和元年6月）

RdRp
POL

VP1

ORF3
ORF2(A)3’

CapsidReverse primer

G1SKR

579 bpG2SKR570 bp

RT-PCR法の操作手順の比較 （dual typing法の場合）
Two step RT-PCR法（「病原体検出マニュアル ノロウイルス (第1版)」収載）
検便懸濁液の調製

RNA抽出

Conventional PCR

cDNA合成 cDNA合成とPCR増幅は異なるチューブで行われる。

One step RT-PCR法

検便懸濁液の調製

cDNA合成RNA抽出

RT-PCR

 cDNA合成（RT反応）とPCR増幅が同一チューブ内で完了する。
✓ピペッティング等の操作が少ないため、同時に多検体を処理するのが容易である。
✓チューブフタの開閉が少ないため、サンプル間のコンタミネーションを抑制できる。

4

One step RT-PCR法によるNoV標的領域の増幅結果
GIGII(bp)

M: 100 bp ladder marker PCR産物は5 µlアプライした。

M: 100 bp ladder marker PCR産物は5 µlアプライした。

＜PCR条件＞

2018/2019シーズンの遺伝子型既知の検体より、高～低コピー (Ct=13.0~29.8)

42C, 20 minのものを任意に選出し、NucleoSpin® Virusを用いてRNAを抽出後、One step

94C, 1 min

RT-PCR法による標的領域の増幅を試みた。

98C, 10 sec
48C, 15 sec

x45

68C, 30 sec
Total：1時間45分

5GIはGI.2[P2], GI.7[P9]、GIIはGII.2[P16], GII.6[P7], GII.17[P17]を供試した。
GIは16検体中13検体（81%）、GIIは16検体中14検体（88%）で、期待する増幅サイズのバンドがアガロースゲル電気泳動により確認された（上図矢尻）。
（大阪健康安全基盤研究所において実施）

PCR産物のシーケンス解析結果＜Exo-SAP処理＞
Exonuclease I (5 U/µl)
Alkaline Phosphatase(SAP, 1 U/µl)
PCR産物Total↓
37C, 1時間
80C, 15分
4C, ∞↓＜シーケンス用組成＞

1 µl
1 µl
20 µl
22 µl

上記処理済みPCR産物
3 µl
F or R primer (7.5 µM)
1 µl
H2O
11 µl
Total
15 µl
↓
プレミックスシーケンス解析へ

GI

Ct値

1234567891011121314151626.3
20.0
24.5
23.5
22.9
28.9
24.8
20.0
22.2
22.8
25.0
17.5
23.5
23.7
28.3
22.5

判別可否*RdRp領域 Capsid領域
×○
×
○
○
×
○
○
○
×○
○
○
○
○
○

×○
×○
○
×○
○
○
×○
○
○
○
○
○

GII

Ct値

1718192021222324252627282930313218.225.022.0
18.919.2
13.0
14.5
20.2
25.7
16.5
25.7
29.8
25.1
19.2
17.2
20.3

判別可否*RdRp領域 Capsid領域○○×××○
○
○
○
○
○
×○
○
○
○

○
○
×××
○
○
○
○
○
○
×
○
○
○
○

全ての検体のPCR産物をシーケンス解析に供試したところ、GI・GII共に16検体中12検体（75%）の遺伝子型を判別することが出来た。
6* 遺伝子型はNorovirus Typing Toolによりタイピングした。

（大阪健康安全基盤研究所において実施）

RNA簡易抽出法によるdual typing法のさらなる省力化
検便懸濁液の調製

RT-PCRRNA抽出従来のRNA抽出法（「病原体検出マニュアル ノロウイルス（第１版）」収載）
Lysis処理

メンブレンへの吸着

メンブレンの洗浄（遠心分離） 溶出液の回収

 市販のRNA抽出キットおよび遠心分離操作が必要であり、操作が煩雑である。

Lysis Bufferを用いたRNA簡易抽出法
Lysis処理（室温2分）

そのままRT-PCRへ！

★96検体を処理する場合・・・
従来法：～数時間
簡易抽出法：30分！

 市販のキットや遠心分離操作が不要であり、操作が非常に簡便かつ短時間で済む。
 得られたLysis溶液にRT-PCR反応液を直接添加して、すぐに反応を開始できる。

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RNA簡易抽出法と組み合わせた場合のOne step RT-PCR法によるNoV標的領域の増幅結果
検便上清を生理食塩水でGI適宜希釈すると・・・(bp)

GII(bp)M: 100 bp ladder marker
A: 検便上清（原液）B: 検便上清（5倍希釈）
M: 100 bp ladder marker

C: 検便上清（10倍希釈） GIは16検体中9検体（56%）、GIIは16検体中5検体（31%）で標的増幅産物と思われるバンドが検出された。
 増幅不良や非特異的増幅が見られた検体でも、生理食塩水で希釈したのち供試することで反応性が改善された。
8（大阪健康安全基盤研究所において実施）今回のまとめ
One step RT-PCR法によるNoV遺伝子型判別
 病原体検出マニュアル収載の遺伝子型判別（dual typing法）を基に、
One step RT-PCR反応系を最適化した。

 同一チューブ内での連続した反応工程により、Two step RT-PCR法と比べ、操作性向上とコンタミネーション抑制を達成した。
 増幅産物の配列を解析すると、GI/GII共に各種遺伝子型を判別可能であった。
RNA簡易抽出法によるNoV遺伝子型判別

 Lysis Bufferにより、市販のRNA精製キットや遠心分離操作が不要で、簡便かつ短時間でRNAの取得が可能な簡易抽出法が適用出来ることを確認した。
 適度な検体濃度であれば、RNA簡易抽出法で増幅出来る可能性が高い。
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ご清聴ありがとうございました

検便懸濁液の調製RNA抽出NucleoSpin® Virus（＃U0983B）

RT-PCROne step RT-PCR Kit
for Dual typing(仮)シーケンス解析

プレミックスシーケンス解析
・8連チューブ・96ウェルプレート◆ Exo-SAP処理したPCR産物

or Lysis Buffer

10Coming soon!

◆ Seq用Primer (F or R)

この2つを混ぜて送るだけ！