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飼料研究報告 Vol. 46 (2021)

7 カルタップの液体クロマトグラフ質量分析計による分析法の適用範囲をイアコーンサイレージに拡大するための妥当性確認
関口 好浩 *1，板橋 葵 *2Validation Study on Application of Cartap Determination Method by LC-MS to Ear-Corn Silage
SEKIGUCHI Yoshihiro*1 and ITABASHI Aoi*2(*1 Kobe Regional Center, Food and Agricultural Materials Inspection Center (FAMIC)(Now Nagoya Regional Center, FAMIC), *2 Kobe Regional Center, FAMIC(Now Fertilizer and Feed Inspection Department))
We have made a validation study on application of a cartap determination method which had beenvalidated for corn and grass hay, to ear-corn silage (ECS). The method, which uses a liquid
chromatograph-electrospray ionization-mass spectrometer (LC-ESI-MS), has been listed in the FeedAnalysis Standard of Japan.
Cartap in ECS was extracted with hydrochloric acid (1:100) containing 1 w/v% L-cysteinehydrochloride monohydrate, and cartap was hydrolyzed to nereistoxin with nickel (II) chloride andammonia. The sample solution was purified with Chem Elut (Volume: 50 mL) (Agilent Technologies
Inc.; Santa Clara, CA, USA) and injected into a LC-MS to determine the concentration of cartap.
The LC separation was then carried out on an ODS column (ZORBAX Eclipse XDB-C18, 2.1 mm
i.d. × 150 mm, 3.5 µm, Agilent Technologies Inc.) with 1 v/v% heptafluorobutyric acid solutionmethanol (4:1) as a mobile phase. In the MS analysis, the positive mode electrospray ionization(ESI+) was used.
Whereas a recovery test was conducted on ECS where cartap was added with 175 µg/kg, theresulting mean recovery was low (28.3 %). Since low recovery results were similarly obtained forcorn as well, the cause unfolding test for this was performed using corn. The test result indicatedthat the main causes of the low recovery rate might have been evaporation/dryness of hexane
solution and ionization inhibition at mass spectrometry. Therefore, a further recovery test for corn
was conducted with the application of different evaporation pressures, but no improvement wasobserved in the recoveries.
Key words: cartap; nereistoxin; liquid-chromatograph mass spectrometer (LC-MS); electrosprayionization (ESI); ear-corn silage; corn
キーワード：カルタップ；ネライストキシン；液体クロマトグラフ質量分析計；エレクトロスプレーイオン化法；イアコーンサイレージ；とうもろこし1緒言

カルタップは，武田薬品工業が開発したネライストキシンをリード化合物とする殺虫剤であり，国内では 1967 年に初回農薬登録されている 1)．国内における飼料中の残留基準値（カルタップ，ベンスルタップをカルタップ含量に換算したもの及びチオシクラムをカルタップ含量に換算したものの総和）は，えん麦，大麦，小麦，とうもろこし，マイロ及びライ麦で 0.2 mg/kg 並びに牧草で*1

独立行政法人農林水産消費安全技術センター神戸センター，現名古屋センター*2

独立行政法人農林水産消費安全技術センター神戸センター，現

肥飼料安全検査部< 86 >

カルタップの液体クロマトグラフ質量分析計による分析法の適用範囲をイアコーンサイレージに拡大するための妥当性確認

81

0.7 mg/kg と定められている 2)．
カルタップの分析法は，アンモニア塩基性条件下で加水分解することでカルタップをネライストキシンに変換した後，多孔性ケイソウ土カラムで精製し，液体クロマトグラフ質量分析計（以下「LC-MS」という．）により定量する方法（以下「カルタップ分析法」という．）が飼料分析基準 3)に収載されている．
近年，食料自給率向上の重点的な施策の取組の一つとしてイアコーンサイレージ（とうもろこしの子実，芯及び外皮から調製したサイレージ．以下「ECS」という．）の生産及び利用が推進されているところである．しかしながら，カルタップ分析法は，ECS における妥当性が確認されておらず，カルタップの残留実態が把握できない状況にある．そこで，カルタップ分析法の ECS への適用の可否を検討したので概要を報告する．
参考にカルタップ及びネライストキシンの構造式等を Fig. 1 に示した．

NH2N

S

SNH2O

HClO
Cartap hydrochloride

S,S’ -2-dimethylaminotrimethylene bis (thiocarbamate) hydrochloride
C7H16ClN3O2S2

MW: 273.8

CAS No.: 15263-52-2

NOS HOOHSO
Nereistoxin oxalate

N,N-dimethyldithiolan-4-amine;oxalic acid
C5H11NS2･C2H2O4Fig. 1MW: 239.3

Chemical structures of cartap hydrochloride and nereistoxin oxalate

22.1

試

CAS No.: 1631-52-3

実験方法

料ECS の分析用試料は，次のとおり調製した．とうもろこしの雌穂（完熟期）を 1 本毎にスクリーンを装着していないカッティングミル 1 で細断し，大きめに残った芯及び穂皮を更におおむね2 cm 未満となるようにはさみで細断した．細断した雌穂 5 本分を 1 つの袋に収めて均質化した
後，2 つの密封用袋に分けた．バキュームシーラーを用いて脱気し密封後，28 °C で 36 日間貯蔵し，ECS とした．ECS を 60 °C で 6 時間乾燥後，更に室内に静置して風乾した後，それぞれ目開き 1 mm のスクリーンを装着したカッティングミル 2 で粉砕し，分析用試料とした．
低回収率の原因究明に用いたとうもろこし（子実のみ）は，ECS に用いたとうもろこしとは別< 87 >

82

飼料研究報告 Vol. 46 (2021)のものを用い，目開き 1 mm のスクリーンを装着した粉砕機で粉砕し，分析用試料とした．
2.21)

試薬

アセトン及びヘキサンは残留農薬・PCB 試験用を用いた．メタノールは LC-MS 用（富士フイルム和光純薬製）を用いた． L-システイン塩酸塩一水和物，塩化ニッケル（II）（無水），塩酸，アンモニア水（質量分率 28~30 %）及びジエチレングリコールは試薬特級 を 用 い た ． 水 は ， LC-MS 用 （ 富 士 フ イ ル ム 和 光 純 薬 製 ） 又 は Milli-Q Element A-10（Merck Millipore 製）により精製した超純水（JIS K0211 の 5218 に定義された超純水）を用いた．

2)

ヘプタフルオロ酪酸溶液
ヘプタフルオロ酪酸液（東京化成製，Ion-Pair Reagent for LC-MS（約 0.5 mol/L 溶液））10mL を水に溶かして 1 L とした．

3)

ネライストキシン標準液
ネライストキシンしゅう酸塩（富士フイルム和光純薬製，残留農薬試験用，純度 98 %）64.1
mg を正確に量って 100 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてネライストキシン標準原液を調製した（この液 1 mL は，ネライストキシンとして 0.4 mg を含有）．
使用に際して，ネライストキシン標準原液 5 mL を 100 mL の全量フラスコに正確に入れ，更に標線までメタノールを加え，1 mL 中にネライストキシンとして 20 µg を含有する液を調製した．この液の一定量をヘプタフルオロ酪酸溶液－メタノール（4+1）で正確に希釈し，1 mL 中にネライストキシンとしてそれぞれ 2，25，50，100，150 及び 200 ng を含有する各標準液を調製した．
試料への添加に当たっては，ネライストキシン標準原液をメタノールで正確に希釈し，試料へ添加後，よく混合した．

4)

カルタップ標準原液
カルタップ塩酸塩標準品（富士フイルム和光純薬製，残留農薬試験用，純度 98 %）25 mg を正確に量って 50 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてカルタップ標準原液を調製した（この液 1 mL は，カルタップとして 0.5 mg を含有）．
試料への添加には，カルタップ標準原液をメタノールで正確に希釈したものを用いた．

5)

抽出溶媒使用時に， L-システイン塩酸塩一水和物 10 g を塩酸（1+100）に溶かして 1 L とした．

6)

塩化ニッケル溶液
塩化ニッケル（II）（無水）2 g を水に溶かして 100 mL とした．

2.31)

装置及び器具カッティングミル：
カッティングミル 1：SM-100

Retsch 製（回転数（仕様）1430 rpm）

カッティングミル 2：SM-2000

Retsch 製（目開き 1 mm スクリーン，回転数（仕様）835 rpm）

2)

粉砕機：ZM-200

Retsch 製（目開き 1 mm スクリーン，使用時回転数 14000 rpm）

3)

振とう機：MW-DRV 宮本理研工業製（使用時振動数 300 rpm）

4)

多孔性ケイソウ土カラム：Chem Elut（50 mL 保持用） Agilent Technologies 製< 88 >

カルタップの液体クロマトグラフ質量分析計による分析法の適用範囲をイアコーンサイレージに拡大するための妥当性確認

5)

LC-MS：
LC 部：Prominence

島津製作所製MS 部：LCMS-2010EV
2.4

83

島津製作所製

定量方法

1)

抽

出

分析試料 10.0 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ，抽出溶媒 100 mL を加え，30分間振り混ぜて抽出した．抽出液を 50 mL の共栓遠心沈殿管に入れ，650×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液 20 mL を 200 mL の共栓三角フラスコに正確に入れ，アルカリ加水分解に供する試料溶液とした．
2)

アルカリ加水分解
試料溶液に塩化ニッケル溶液 2 mL 及びアンモニア水 5 mL を加えた後 15 分間振り混ぜ，カルタップをネライストキシンに加水分解し，カラム処理に供する試料溶液とした．

3)

カラム処理
試料溶液を多孔性ケイソウ土カラムに入れ 10 分間静置した．300 mL のなす形フラスコをカラムの下に置き，試料溶液の入っていた三角フラスコをヘキサン 10 mL ずつで 3 回洗浄し，洗液を順次カラムに加えた．液面が充てん剤の上端に達するまで自然流下させてネライストキシンを溶出させ，更にヘキサン 120 mL をカラムに加えて同様に溶出させた後，溶出液にアセトン－ジエチレングリコール（49+1）0.5 mL を加えた．溶出液を 37 °C 以下の水浴で約 2 mL まで減圧濃縮した後，乾固するまで静置した．ヘプタフルオロ酪酸溶液－メタノール（4+1）4mL を正確に加えて残留物を溶かし，5000×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液を LC-MS による測定に供する試料溶液とした．

4)

LC-MS による測定
試料溶液及び各ネライストキシン標準液各 2 µL を LC-MS に注入し，選択イオン検出（以下「SIM」という．）クロマトグラムを得た．測定条件を Table 1 に示した．
Table 1

Operation conditions of LC-MS

ColumnZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm i.d. × 150 mm, 3.5 μm), Agilent Technologies

Mobile phase

1 v/v% heptafluorobutyric acid solution-methanol (4:1)

Flow rate

0.2 mL/min

Column temperature

40 °C

Ionization

Electrospray ionization (ESI)

ModePositive

Nebulizer gas

N2 (1.5 L/min)Drying gas

N2 (10 L/min)

Heat block temperature

200 °C

CDL temperature

250 °C

Monitor ionm/z 1505)

計算得られた SIM クロマトグラムからピーク高さ又は面積を求めて検量線を作成し，試料中のネライストキシン量を算出し，これに 1.83 を乗じて試料中のカルタップ量を算出した．

< 89 >

84

飼料研究報告 Vol. 46 (2021)

なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．
Sample 10.0 g (200 mL Erlenmeyer flask)
added 100 mL of hydrochloric acid (1:100) containing 1 w/v% L-cysteine hydrochloride monohydrate
shook for 30 min
centrifuged for 5 min at 650×g
transfered 20 mL of supernatant to 200 mL Erlenmeyer flask
Alkali hydrolysis
added 2 mL of 2 w/v% nickel chloride (II)added 5 mL of 28 v/v% ammonia water
shook for 15 min
Chem Elut (Volume: 50 mL)
applied sample solution and allowed to stand for 10 min
placed receiver (300 mL of eggplant-shaped flask)
washed 200 mL of Erlenmeyer flask with 10 mL of hexane (3 times)
eluted with 120 mL of hexane
added 0.5 mL of acetone-diethylene glycol (49:1)
Evaporateed to 2 mL under 37 °C and allowed to stand for dryness
added 4 mL of 1 v/v% heptafluorobutyric acid solution-methanol (4:1)
LC-MS(Cartap is quantified as nereistoxin. Concentration of cartap = Concentration of nereistoxin × 1.83.)

Scheme 1
2.5

Analytical procedure for cartap

予備検討
ECS について，カルタップを原物換算して 175 µg/kg 相当量（最終試料溶液中でネライストキシンとして 55 ng/mL）になるように添加後よく混合し，一夜静置した後に 2.4 に従って定量し，平均回収率及び繰返し精度を求めた．
なお，添加は風乾物試料に対してカルタップとして 200 µg/kg 相当量になるよう行い，原物中濃度への換算は，原物中及び風乾物中の水分含有量を 30 %及び 20 %と想定して，原物（水分含有量 30 %）中濃度＝風乾物（水分含有量 20 %）中濃度／1.14 の式により行った．
とうもろこしについても，カルタップを 200 µg/kg 相当量（最終試料溶液中でネライストキシンとして 55 ng/mL）になるように添加後よく混合し，一夜静置した後に 2.4 に従って定量し，平均回収率及び繰返し精度を求めた．
2.6

低回収率の原因究明
低回収率の原因究明を行うため，下記の試験を神戸センターと本部で実施した．

1)

標準液の劣化の確認
とうもろこしにネライストキシン標準原液を 400 µg/kg 相当量（カルタップとして 732 µg/kg相当量．最終試料溶液中でネライストキシンとして 200 ng/mL）になるように添加後よく混合し，2.4 に従って定量した．

2)

各操作の確認次の試料溶液をそれぞれ調製し，2.4 に従って定量した．なお，カルタップ及びネライストキシンの添加は，それぞれ 2.2 の 3)及び 4)の標準液を用いた．

< 90 >

カルタップの液体クロマトグラフ質量分析計による分析法の適用範囲をイアコーンサイレージに拡大するための妥当性確認i)85

とうもろこしにカルタップを 200 µg/kg 相当量（最終試料溶液中でネライストキシンとして 55 ng/mL）になるように添加後よく混合し，2.4 に従って調製したもの．

ii)

とうもろこし 20 g に抽出溶媒 200 mL を添加し，2.4 に従って調製したもの．

iii)ii)の遠心分離後の上澄み液 20 mL に，カルタップを 200 µg/kg 相当量（同 55 ng/mL）になるように添加後よく混合し，2.4 に従って調製したもの．
iv)ii)のアルカリ加水分解液に，ネライストキシンをカルタップとして 200 µg/kg 相当量（同55 ng/mL）になるように添加後よく混合し，2.4 に従って調製したもの．
v)ii)のケイソウ土カラムからの溶出液に，ネライストキシンをカルタップとして 200 µg/kg相当量（同 55 ng/mL）になるように添加後よく混合し，2.4 に従って調製したもの．

vi)ii)で調製した試料溶液に，ネライストキシンをカルタップとして 200 µg/kg 相当量（同 55ng/mL）になるように添加後よく混合したもの．
本部においては，とうもろこしは神戸センターとは別のものを用い，LC-MS は神戸センターと同機種，カルタップ標準原液，ネライストキシン標準原液及び LC-MS のカラムは同一のものを用いた．
2.7

減圧濃縮操作の確認
とうもろこし 20 g に抽出溶媒 200 mL を添加して 2.4 に従ってカラム処理まで行った後，ネライストキシンをカルタップとして 200 µg/kg 相当量（最終試料溶液中でネライストキシンとして55 ng/mL）添加し，よく混合した後，圧力条件を 250 hPa，280 hPa 及び 290 hPa の 3 通りで減圧濃縮を行い，2.4 に従って定量した．

33.1

結果及び考察予備検討
2.5 により予備検討を行った．その結果は Table 2 のとおり，平均回収率が 28.3 %と低い回収率であった．手技等に問題がないかを確認するために，既に妥当性確認されているとうもろこしについても試験を行ったところ，34.4 %と同様に低い回収率であった．
Table 2Sample

Results of preliminary test
Spiked level (as cartap)(µg/kg)

ECSMaizeb)

200200a)

Recovery(%)
28.3
34.4a) Mean (n = 2)b) Spiked level as air-dried basis
3.2

低回収率の原因究明
既に妥当性が確認されているとうもろこしでも低回収率であったことから，試料である ECSが原因ではなく，手技等に原因があると考えられたため，とうもろこしを用いて 2.6 に従い原因究明を行った．試験室特有の要因によるものかを確認するため，本部でも同様の試験を行った．
その結果は Table 3 のとおりであった．
減圧濃縮前及び最終試料溶液に添加した場合に回収率が大きく低下していることから，減圧濃< 91 >

86飼料研究報告 Vol. 46 (2021)

縮・乾固時の損失及びイオン化阻害が低回収率の主な原因と考えられた．また，抽出溶媒添加前にカルタップを添加した場合でも回収率が低くなる傾向が認められたことから，抽出時の試料への吸着の影響も考えられた．
ネライストキシン標準原液を抽出溶媒添加前に添加した場合と，アルカリ加水分解前にカルタップ標準液を添加した場合やカラム処理前にネライストキシン標準液を添加した場合とを比較して回収率が近かったことから，3.1 の添加に用いたカルタップ標準液に分析操作中の劣化はないものと考えられた．
本部でも同様の結果が得られたことから，低回収率の原因は，試験室特有の要因ではないことが裏付けられた．
Table 3

Cause unfolding results of low recovery
Recovery (%)
Kobe regionalb)
Headquartersa)
centerStage of spike

Standard solution

Spiked levelas cartap(µg/kg equivalent)

Before adding extraction solution

Nereistoxin

732

57.857.6

Before adding extraction solution

Cartap20044.150.1

Before alkali hydrolysis

Cartap200

50.155.4

Before Chem Elut treatment

Nereistoxin

200

57.2

48.8

Before evaporation

Nereistoxin

200

59.4

55.0

Final sample solution

Nereistoxin

200

77.964.3－c)

ND

Not spiked－NDc)a) Mean (n = 2)b) n = 1c) Not detected
3.3

減圧濃縮操作の確認
3.2 において，減圧濃縮・乾固の段階の損失が低回収率の原因の一つとして考えられたことか

ら，2.7 に従い，減圧濃縮前にネライストキシンを添加し減圧条件の確認を行った．前項までの検討は減圧濃縮を 37 °C 以下 280 hPa4)で実施したことから，温度は 35 °C で圧力を 280 hPa の他に 250 hPa 並びに 290 hPa の 3 通りを確認した．その結果は Table 4 のとおり，減圧濃縮時の圧力を変えても回収率は 50 %程度と低回収率のままであった．
Table 4

Recoveries at various pressure conditions of evaporationa)
Pressure condition
Recovery(hPa)(%)

25055.828056.829052.8n=1a) 55 µg/kg equivalent of nereistoxin was
spiked after Chem Elut treatment.

< 92 >

カルタップの液体クロマトグラフ質量分析計による分析法の適用範囲をイアコーンサイレージに拡大するための妥当性確認

487

まとめ

ECS に残留するカルタップについて，飼料分析基準による方法の適用の可否について検討したところ，以下の結果が得られ，低回収率の改善の検討が必要であることが分かった．
1)

ECS について，予備検討として添加回収試験を行ったところ，28.3 %と低回収率の結果が得られた．とうもろこしについても同様に低回収率の結果が得られた．

2)

とうもろこしを用いた原因究明を行った結果，減圧濃縮・乾固時の損失及び LC-MS 測定時のイオン化阻害が主な原因として考えられた．

3)

とうもろこしを用いてカラム処理後にネライストキシンを添加し，減圧条件を確認した結果，圧力を 280 hPa から 250 hPa 又は 290 hPa に変更しても，回収率の改善は認められなかった．

文献

1)

食品安全委員会農薬専門調査会：カルタップ農薬評価書，令和元年 6 月(2016).

2)

農林省令：飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令，昭和 51 年 7 月 24 日，農林省令第35 号 (1976).

3)農林水産省消費・安全局長通知：飼料分析基準の制定について，平成 20 年 4 月 1 日，19 消安
第 14729 号 (2008).

4)

財団法人日本食品分析センター：平成 17 年度飼料の有害物質等残留基準設定等委託事業（分析法の開発）

飼料中の有害物質等の分析法の開発，3-134 (2006).

< 93 >