EMA-PCR法による殺菌効果の確認○赤鹿玉季、吉崎美和、嶌田雅光、向井博之 （タカラバイオ株式会社）
研究の背景

Viable Cell
Live

VNC

GhostsMembranecompromised

culturable+---Metabolically
Active++--Intact+++-culture+---PCR++++

生死と病原性の有無が同義である細菌の検出は、衛生上、特に水や食品の安全性を検査する分野では非常に重要である。伝統的生菌検出方法としては培養法によるコロニーカウントやPCR法による特定遺伝子の増幅などがある。しかしながら、細菌は環境によっては生存していても培養が不可能なケースがあり、培養に必要な時間と培地の選択、代謝活性のリカバーなどのバイアスが原因で、信頼性のある結果を得られないことがあった。一方、PCR法では、細胞死後のＤＮＡの安定性によって、病原性リスクの過剰評価、所謂偽陽性という検出結果を招くことが多く、生菌のリスクを評価することは困難であった。
したがって、分子レベルの迅速なリアルタイム検出方法が求められた。 (参考文献1)生菌(viable cell)、死菌(Dead cell)はしばしば培養、代謝、膜完全性の有無によって4種類に分類される。すなわち、Live、viable but not culturable(VNC)、Ghosts、Membrane compromised である。分類方法は右図に示した。前述の通り、培養法では検査対象に生菌であるVNCが混在しても陰性と判断されるケースがあり、一方、PCR法では殺菌処理後も生菌死菌ともに検出してしまう為、VNCを生菌として判別することは困難であった。 (参考文献2)

本報告は、大腸菌(JM109 K12由来株)をモデルとし、VNCを含めた生菌検出を行う方法の開発を目的に、塩素、UV、アルコール、加温という代表的な殺菌法によってEMA-PCR法ではどのような結果が得られるか、培養法、PCR法の結果を併せて比較する。

(1) 塩素による殺菌 (次亜塩素酸 5分)

sample conc. (cfu/ml)

(1)-A

培養結果

培養結果

(2)-A

2.0.E+08

2.0E+08

2.0.E+07

2.0E+072.0.E+06：検出限界
生存率1%未満

2.0.E+05

2.0.E+04
2.0.E+03
2.0.E+02
2.0.E+01
048163163

4831(2)-C-2
SYTO964 (×100 μJ/cm2 )UV照射
PI(2)-C-3
SYTO9

死菌 (95℃、5分の熱処理で調製)

PI

2.0E+04
2.0E+03
2.0E+02
N.D. →

125012481632643264

UV intensity ( × 100 μJ/cm2)

(2)-B

16

UV未照射

2.0E+0502.0E+00

EMA-PCRとPCRの差
0(2)-C-1
SYTO92.0E+06

hypochlorite conc. (in ppm)(1)-B(2)-C UV殺菌検体におけるBacLight染色2.0E+01

N.D. →

02.0.E+00

生菌死菌分類例。 参考文献2より改変。

(2) UV 照射による殺菌(UV crosslinker 254 nm 直射)

sample conc. (cfu/ml)

結果

Dead cell

63

EMA-PCRとPCRの差

125

01248

1600-4-6-8-12(4)-A

培養結果

2.0E+082.0E+072.0E+072.0E+06
2.0E+05

2.0E+04
2.0E+03
2.0E+022.0.E+07

2.0E+06
2.0E+05

2.0E+04
2.0E+03
2.0E+022.0.E+05
2.0.E+04
2.0.E+03
2.0.E+02

N.D. →

N.D. →

2.0.E+00
010% 15% 20% 25% 30% 40% 50%

no heat35456575-2dCt (w/o-with EMA)

-2-4-6-8-10-4-6chlorine (ppm)

5-8

＜9-16

＜none

UV (×100 μJ/cm 2 )less than 1＜＜none≒

none

alcohol (%)

16-20＜26-30＜none

Heat （℃）

46-55＜86-95＜none

EM A- PC R

PCR

VNC

GhostsMembranecompromised

○

×○

○

○

○

×

×

chlorine

○

○-

○

UV

○

○

×-

alcohol

○

○-○

heat

○

○

×○

culturealmost allPCR

EMA-PCR

24.0

6.0

5.55.0-8

temperature (℃ )(1)-(4)Live-6Time (hours) at 65 ℃

Detection limit
cultureDead cell-4-12-12

Viable Cell-2-10-8考察

4.50-102-propanol conc. (%)

95

4.085

3.575

3.065

2.555

2.045

1.535

EMA-PCRとPCRの差
1.0

no heat0(4)’-B

EMA-PCRとPCRの差

0.5

10% 15% 20% 25% 30% 40% 50%

disinfection

Time (hours) at 65 ℃

0.3(4)-B

disinfection

95

temperature (℃ )0-1285dCt (w/o-with EMA)

5%55

0.05%EMA-PCRとPCRの差
0%dCt (w/o-with EMA)

2.0.E+06

2.0.E+01

2-propanol conc. (%)

培養法、EMA-PCR法、PCR法において、検出限界にいたる各種殺菌手段の処理条件を左テーブルに示した。テーブル中の不等号は、殺菌手段の大小関係を検出方法別に比較したものである。
検出限界は上グラフに示した点線の通り、培養法では生存率1%(2.0E+06)未満、PCR法とEMA-PCR法ではCt値の差dCt値(w/o - with EMA)を95℃5分処理で得られる死菌コントロー
ルの平均値より約10と定めた。検出限界の設定が困難なものは“none”とした。

塩素殺菌 ：
塩素による殺菌効果のメカニズムは完全には解明されていないが、細菌細胞を塩素に曝露することで膜を穿孔すると考えられている。EMA-PCR法では、検出限界に至る塩素濃度が培養法と比較して大きかったことから、EMA-PCR法では膜の損傷を受けていないVNCをPCR増幅していることが示唆された。
UV殺菌 ：
UVによる殺菌効果のメカニズムは完全には解明されていないが、膜穿孔型の殺菌方法とは異なり、短時間の照射では膜への影響は少ないと考えられている。培養法ではUV照射によって検出限界に至ったが、EMA-PCR法とPCR法とではUV強度に関係なく一定の値が得られた。加えて、膜非透過性生死判別用染色試
薬BacLight染色においても判別が不可であった。このことからUV照射による死菌の多くはMembranecompromisedではなくGhostsの状態であることが示唆された。
アルコール殺菌 ：塩素殺菌と同じく、細菌細胞をアルコールに曝露することで膜を穿孔すると考えられている。 EMA-PCR法では、検出限界に至るアルコール濃度が培養法と比較して大きかったことから、 EMA-PCR法では膜の損傷を受けていないVNCをPCR増幅していることが示唆された。
加温殺菌 ：
温度によってEMA-PCRの効果が異なったことが膜損傷の指標となった。培養法とEMA-PCR法とでは検出限界に至る温度に差が生じたが、低温では加温時間に関わらずEMA-PCR法でも検出限界に至らず、培養法では検出が不可であった。このことから、EMA-PCR法では膜の損傷を受けていないGhostsとVNCをPCR増幅していることが示唆された。

○ ：correct
× ：false－ ：hardly existed：detection range

結論

培養結果

02.0E+00
0%

detection
method(4)’-A

0.0
0.2
0.3
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0

0
2.0E+00

加温殺菌 (ヒートブロック 65℃一定)

2.0.E+08

2.0E+01

N.D. →(4)’

24.0

2.0E+08(3)-B

SYTO9：生菌死菌を染色、PI(propidium iodide)：死菌を染色

加温殺菌 (ヒートブロック 15分一定)

培養結果

2.0E+01

UV intensity ( × 100 μJ/cm2)(4)

sample conc. (cfu/ml)

sample conc. (cfu/ml)-8-10

アルコールによる殺菌(2-propanol 15分)(3)-A-6：検出限界
dCt≒10 (死菌と比較して)

hypochlorite conc. (in ppm)

PI0.2-12-4

sample conc. (cfu/ml)-10(3)-2dCt (w/o-with EMA)

dCt (w/o-with EMA)

-2

一部Ghostsを含む偽陽性反応として検出される可能性があるものの、これまで不可能あったVNCを含む生菌の検出が可能であることが示唆された。
ただし、UV殺菌のような膜の損傷が小さいと考えられる殺菌法では適用が難しいこともあり、EMA-PCR法の特性を活かして実用化されることが望ましい。

EMA-PCR法の原理
EMA (Ethidium monoazide bromide)は核酸のインターカレーターとして働く色素で、可視光に曝露することで核酸に対する共有結合能を獲得する。
EMAは死菌(膜損傷菌)の細胞内に侵入し、光活性によってDNAに修飾、その結果、死菌由来のPCR増幅が抑制される。一方、生菌は膜の完全性により、EMAが細胞内部に侵入することができず、正常にPCR増幅する。EMA-PCR法は、EMAの能力を最大限活用した、細菌の膜完全性に基づく生死判別方法である。

参考文献

・精製DNA
生菌

・サンプル

死菌

1)
・EMAを添加・光照射・DNA精製・PCR+2)
3)

細菌：EMA

EMA-PCR法の概念図

光活性によってEMAとDNAが結合

生菌：PCR増幅
死菌：EMAによるPCR増幅阻害

4)

Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination withquantitative PCR. J Microbiol Methods. 2007 Aug;70(2):252-60.
Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification
techniques.FEMS Microbiol Lett. 2009 Feb;291(2):137-42.
Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR.
Biotechniques. 2003 Apr;34(4):804-8, 810, 812-3.
Ethidium monoazide (EMA) 処理とリアルタイムコンビネーションによる環境中のレジオネラ生菌のみを定量検出する方法に関する研究 -迅速・簡便な検査によるレジオネラ対策に係る公衆浴場の衛生管理手法に関する研究- 平成21年度 総括・分担研究報告書