病気診断のための局在プラズモンチップ
解析装置の開発中野幸一*

米 沢 裕 司 **近年，ヒトゲノムの解読をうけ，ゲノム産物であるタンパク質の解析による病気診断法の開発が期待されている。本研究では，血液中のタンパク質を定量することによって糖尿病の診断を行うことを目指し，局在プラズモンチップの解析装置の開発を行った。解析装置は，小型分光器，電動ステージ，ディスペンサ，制御・信号処理ソフトウェアなどから構成されており，サンプル液の分注や位置決めを自動的に行うことができる。さらに，チップの分光分析を行い，その結果からタンパク質の定量を自動的に行うことができる。
動 作 検 証 実 験 を 行 い ， 開 発 し た 装 置 を 用 い る こ と に よ っ て ， 1枚 の チ ッ プ で 多 く の 種 類 の タ ン パ ク 質 の 定 量を，簡便に精度良く行えることを確認した。
キーワード：局在プラズモン共鳴，解析装置，分光器，タンパク質，病気診断

Development of an Analyzer for Localized Surface Plasmon Resonance Chips for Disease Diagnosis
Kouichi NAKANO and Yuji YONEZAWA

Recent advances in the decoding of human genes have raised expectations for the development of a method ofdiagnosing diseases based on the analysis of protein, which is produced by genes. In this study, we developed ananalyzer for localized surface plasmon resonance chips to diagnose diabetes by measuring the amount of protein inthe blood. The analyzer consists of a compact spectrometer, a motorized stage, a dispenser, software for control andsignal processing, and other devices. The analyzer can dispense and position sample liquid automatically. It has
been confirmed through experiments that many kinds of protein can be promptly and precisely measured byspectrographic analysis of one chip.
Keywords：localized surface plasmon resonance, analyzer, spectrometer, protein, disease diagnosis

１．緒言

近年，ヒトゲノムの解読をうけ，ゲノム医科学情報を用いた診断法や，ゲノム産物であるタンパク質の解析による診断法の開発が期待されている。

ク質を解析するための局在プラズモンチップ解析装置の開発を行った。
タンパク質の解析法としては，電気泳動法や酵素免疫測定法などが知られている。しかし，これらは一糖 尿 病 の 診 断 に お い て は ， 従 来 ， 血 糖 値 や HbA1cな連の操作が複雑である，解析に時間がかかるなどの問どしか有用な測定項目がなかったが，これらの測定項題がある。また，これらの解析法では，多種のタンパ目では，糖尿病の大きな問題点である合併症の進行のク質を定量的かつ簡便に解析することはできない。ま

判定や予後を推定するには不十分であった。そこで我た，これらの解析法では染色や標識の作業が必要であ々は，血液中のゲノム情報を解析することにより，糖っ た 1)。

尿病の合併症の進行の判定や予後の推定を行うことを一 方 ， 近 年 ， タ ン パ ク 質 や DNA な ど の 生 体 分 子 の目指した。血液のゲノム情報を用いた診断は，患者の検 出 に 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 (SPR: Surface Plasmon

組織を採取する方法に比べ，患者に与える侵襲が少なResonance)に よ る 解 析 方 法 が 用 い ら れ て い る 。 SPR法

い。そして，かつ自動化・標準化に適しており，臨床は金や銀薄膜表面の電子の波であるプラズモンを光での現場で迅速に診断できるシステムの構築が可能にな励起させる方法であり，共鳴を起こす入射角の変化なる。本研究では，このようなシステムを構築して糖尿どを検出することにより，生体分子の測定を行うこと病の診断を可能にすることを目的に，血液中のタンパが で き る 2 ) 。 し か し ， SPR法 に よ る 測 定 で は ， タ ン パ

*

機械金属部

**

電子情報部

ク質等の生体分子を非標識で計測することができるが，Absorbance

一度に解析できる試料の数が少なく，解析に用いる装置 も 大 型 で あ る と い う 問 題 が あ っ た 1)。
こ れ に 対 し ， 局 在 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 (LSPR: Localized
Surface Plasmon Resonance)を 用 い た 解 析 方 法 が 注 目 されている。局在プラズモン共鳴は，金や銀などの金属

Wavelength

ナノ粒子に局在する共鳴であり，可視光波長域中に特図 1 局在プラズモンチップの概要

異 的 な 吸 光 が 発 生 す る こ と で 観 察 す る こ と が で き る 1)4)

。また，この吸光特性はナノ粒子の粒径や形状，ナノ粒子への吸着物の有無などに依存しており，吸光特

光ファイバー

分注ニードル
光学反射プローブ

チューブ
ＣＣＤカメラ性の変化を検出することにより，生体分子の測定を行

シリンジポンプ 小型分光器
ハロゲン照明

うことできる。そして，近年，局在プラズモン共鳴を
利 用 し た バ イ オ チ ッ プ (以 下 ， 局 在 プ ラ ズ モ ン チ ッ プ
ウェルプレートと 記 す )が 開 発 さ れ て お り ， こ の 局 在 プ ラ ズ モ ン チ ップを用いることにより，非標識で，定量的に，簡便に局在プラズモンチップ

データ処理
制御

解析

タンパク質を解析することができることが報告されてい る 1),3),4)。 さ ら に ， 局 在 プ ラ ズ モ ン チ ッ プ を 用 い れ

図 2

開発した解析装置の構成

図 3

開発した解析装置の外観

ば，１つのチップで多数のサンプル液を分析したり，多くの種類のタンパク質を分析したりすることも可能であり，タンパク質解析のスループットを大幅に向上
さ せ る こ と が で き る 1),3)。 し か し ， そ の 場 合 ， サ ン プ
ル液を精度良くチップ上に添加する必要があり，さらには，サンプル液の添加位置と吸光特性の分析位置とを精度良く一致させる必要がある。これらは手作業で行うには限界があり，計測精度の向上，計測の簡略化，迅速化のためにはこれらの工程の自動化が求められていた。
そこで，本研究では北陸先端科学技術大学院大学が 開 発 し た 局 在 プ ラ ズ モ ン チ ッ プ 1),3)を 対 象 に ， 分 光
特性の分析，位置決め，サンプル液の添加といった局在プラズモンチップによるタンパク質の解析に必要な合 さ れ た 場 合 ， 可 視 波 長 域 の 吸 光 特 性 が 変 化 す る (図一連の作業を自動的に行う装置を開発した。

1 右 )。 そ の た め ， こ の チ ッ プ に 対 し て 垂 直 に 光 を 照射し，その反射光の吸光スペクトルを測定することに

２．局在プラズモンチップ解析装置
２．１

局在プラズモンチップ1),3)

よ り ， 特 定 の タ ン パ ク 質 (抗 原 )の 定 量 を 行 う こ と が できる。

本装置が対象とする局在プラズモンチップの概要
を図 1 に示す。チップは，微粒子を金蒸着した基板上２．２の表面に並べ，その上に金を再び蒸着することにより解析装置の開発にあたっては，武蔵エンジニアリ

金 ナ ノ 周 期 構 造 を 形 成 し た も の で あ る (図 1 左 )。 そ しン グ (株 )製 デ ィ ス ペ ン サ 装 置 を 改 良 し ， さ ら に 制 御 ・て，局在プラズモンチップ表面へ抗体を固定化するこ

解析用ソフトウェアを開発することにより，局在プラと に よ り ， 特 定 の タ ン パ ク 質 (抗 原 )を 定 量 す る た め のズモンチップ解析の装置化を実現した。

装置の概要チップとして機能する。具体的には，このチップの表

開 発 し た 解 析 装 置 の 構 成 を 図 2に ， 解 析 装 置 の 主 要

面に，抗原溶液を添加し，抗原と抗体とが特異的に結部 の 写 真 を 図 3に 示 す 。 本 装 置 は 小 型 分 光 器 ， ハ ロ ゲ

ン光源，光学反射プローブ，電動ステージ，分注機構，パソコンなどから構成されており，装置上には局在プラズモンチップとサンプル液や試薬をあらかじめ入れておくためのウェルプレートを設置するスペースが設けられている。そして，分注ニードルによってウェルプレート中のサンプル液等を，局在プラズモンチップの任意の位置に分注することができる。この際の電動ス テ ー ジ 位 置 決 め 精 度 は 0.005mmと 高 精 度 で あ り ， また 30nlと い っ た 微 小 量 の 分 注 が 可 能 で あ る 。 さ ら に ，カメラによって分注位置を撮影しており，カメラ画像を処理することによって，分注位置のずれを精密に計測している。
また，光源からの光は光ファイバー，光学反射プローブを経由して局在プラズモンチップに照射される。

図 4 ソフトウェア起動直後の画面

この際，電動ステージによって位置制御を行うことによ り ， チ ッ プ 上 の 任 意 の 位 置 (例 え ば サ ン プ ル 液 の 分
注 位 置 )に 精 度 良 く 照 射 す る こ と が で き る 。 照 射 し た
光の反射光は光学反射プローブ，光ファイバーを経由して小型分光器に入射する。そして，小型分光器からの分光信号をパソコンで解析することにより，タンパク質の定量を行うことができる。
なお，解析装置の性能を決める重要な要素の一つは分光器である。分光器には①局在プラズモンを観測するのに十分な分解能と精度を有する，②分光器を制御するソフトウェアをユーザーが制作できる，③小型かつ安価である，といった特徴が求められる。これら

図 5

位置制御設定画面を 考 慮 し た 結 果 ， 本 解 析 装 置 で は OceanOptics社 の 小ン解析用ソフトウェアソフトウェアを起動すると図4型 分 光 器 USB2000を 用 い る こ と と し た 。 用 い た 分 光 器のような画面が表示され，測定した分光特性がリアルの 波 長 範 囲 は 400nm ～ 729nm で あ り ， 波 長 分 解 能 はタイムに表示される。また，積算時間，平均回数など

0.19nmで あ る 。 ま た ， こ の 分 光 器 は USB接 続 さ れ た パの分光特性の測定に関する設定や，スペクトルの補正，

ソ コ ン か ら 制 御 す る こ と が で き る 。 な お ， USB2000のピーク位置の検出，データの保存や読み出しなどを行

ほ か ， そ の 後 継 機 種 で あ る USB4000を 用 い る こ と も 可

う こ と が で き る 1),3)。

能である。

・位置制御機能
チップ上の任意の局在プラズモン解析を行うため

２．３

制御・解析用ソフトウェア

局在プラズモンチップの解析には位置制御や分光器の制御，信号処理といったソフトウェア処理が必要不可欠である。そこで，以下の機能を備える制御・解に，電動ステージの位置制御を行う機能を実装した。
本機能により，１枚の局在プラズモンチップに分注された複数のサンプル液を容易に解析することができる。
なお，解析位置の設定は，基準位置の座標値やサン プ ル の 数 な ど を 入 力 す る こ と に よ っ て 行 う (図 5)。

析用ソフトウェアの開発を行った。

もしくは，サンプル液の分注位置座標データから，自・小型分光器の制御機能動的に解析位置を設定することもできる。

局在プラズモンチップの光特性を測定するために・目的物質の定量機能必要となる，分光器の制御，分光器からのデータをパ

局在プラズモンチップの光特性を解析することにソコンに取り込む等の機能を実装した。局在プラズモより，特定のタンパク質などの目的物質の定量を行うための機能を実装した。これは，吸光スペクトルのピ0.8変化を算出するものである。そして，このピーク位置0.7の変化量から目的物質の定量を行うことができる。

0.6２．４

動作検証実験

開発した装置の動作検証実験を行った。まず，局在プラズモンチップの吸光スペクトルの計測を行った。

Absorbance[a.u.]

ーク位置を検出し，抗原抗体反応前後のピーク位置の0.50.40.30.20.1

図 6は ， 本 装 置 で 計 測 し た 局 在 プ ラ ズ モ ン チ ッ プ の 吸0400

光 ス ペ ク ト ル の 例 で あ る 。 波 長 540nm付 近 に 大 き な 吸450500550

光が見られ，局在プラズモン共鳴による特異的な吸光図 6を観測できることを確認した。
次に，電動ステージを用いて位置制御を行いなが600

650700750

Wavelength[nm]

局在プラズモンチップの計測例が期待できる。

ら，チップ上の任意の位置の吸光スペクトルを繰り返し 計 測 し た 。 そ の 結 果 ， チ ッ プ 上 の 300箇 所 以 上 の 吸
光特性を自動的かつ連続的に解析することができるこ謝とを確認した。なお，分光特性のデータ処理や解析に
要 す る 時 間 は ， 1サ ン プ ル あ た り （ ＝ 1箇 所 あ た り ），約 2秒 で あ っ た 。

辞本研究は，石川県の地域産学官連携豊かさ創造研
究開発プロジェクト推進事業「先端ゲノム医科学情報と連携したバイオデバイスによる実用診断システムのなお，局在プラズモンチップの開発元である北陸先端科学技術大学院大学において，本装置によるタンパク質の定量実験が行われている。その結果，本装置を用いることによって，高感度にタンパク質の定量がで
き る こ と ， そ し て ， 1枚 の チ ッ プ 上 で 同 時 に 多 く の 種類のタンパク質を定量したり，多数のサンプル液を定開発」で行ってきた研究の一部であり，金沢大学，北陸 先 端 科 学 技 術 大 学 院 大 学 ， (株 )ア ル プ ， (株 )キ ュ ービクス，石川県工業試験場の共同研究である。協力を頂いた関係各位に謝意を表する。また，ディスペンサ装置の改良にあたって協力を頂いた武蔵エンジニアリ
ン グ (株 )の 関 係 各 位 に 謝 意 を 表 す る 。

量したりできることを確認している。

参考文献
３．結言

1) 遠 藤 達 郎 ． 局 在 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 非 標 識 バ イ オ チ ッ

局在プラズモンチップを解析するための装置を開プの開発．北陸先端科学技術大学院大学学位論文．

発した。本装置により，局在プラズモンチップによるタンパク質の定量を簡便かつ高精度に行うことができ2006.
2) 堀 池 靖 浩 , 片 岡 一 則 .

る 。 ま た ， 1枚 の チ ッ プ 上 で 多 数 の サ ン プ ル 液 の 定 量が 可 能 で あ り ， 解 析 に 要 す る 時 間 も 1箇 所 あ た り 約 2秒

2003, p. 104.
3)と短時間である。さらに，サンプル液の分注からタンパク質の定量までの一連の工程は自動的に行われる。

Yonezawa,Y.;

Layer

なお，本装置は冒頭に述べたように，ゲノム情報

ゲノム情報に基づく糖尿病の診断に大いに役立つこと

Kim,D.;

Nagatani,N.;

Hiepa,H.M.;

Nakano,K.;

Tamiya,E.

Using

Localized

Surface

PlasmonResonance-Based Core-Sell Structured NanoParticle

きた。

置によって，血中の特定タンパク質の定量を行えば，Kerman,K.;

Reaction質の定量のスループットを大幅に向上させることがで装置の用途はこれに限定されるものではないが，本装Endo,T.;

Multiple Label-Free Detection of Antigen Antibody

このことから，本装置を用いることにより，タンパクによる糖尿病の診断を目的に開発したものである。本

バイオナノテクノロジー.

Nanochip.

Anal.

Chem.

2006,

vol.

78,p.6465-6475.
4)

Himmelhaus,M.;

Takei,H.

Cap-shaped

gold

nanoparticles for an optical biosensor. Sensors andActuators. 2000, B63, p. 24-30.