立石科学技術振興財団

助成研究成果集(第26号) 2017

細菌の走化性システムを利用する超高感度・マルチセンシング可能なバイオセンサの開発
Development of Highly Sensitive Biosensor for Multiple Amino Acid Sensing
Using Bacterial Chemotaxis
2157016

研究代表者

東北大学大学院医工学研究科

博士後期課程分部

共同研究者

東北大学大学院医工学研究科

教

田中

授

寛道
徹

転により直進遊泳，金属イオンなどの忌避物質[研 究 の 目 的]に対しては逆回転により方向転換を行う。細胞
近年のメタボロミクスの隆盛により血液中ア膜に存在する受容体がこれらの反応を引き起こミノ酸をバイオマーカーとして利用することがす対象となる化学物質 (走化性物質) を感知す注目されており，血中や尿中のアミノ酸の組成ると，その情報は細胞内シグナル伝達により増変化を調べることで病気の有無や病態の進行度幅され，べん毛の基部に存在するべん毛モー合いを評価する手法が開発されている。病院でターに伝わり，べん毛モーターを通じて細胞内の日常的な検体検査や家庭での健康管理への利に流入するプロトンと共役し回転方向を切り替用の観点から，このようなアミノ酸組成を調べえる。すなわち走化性システム自体が信号増幅る手法として高価な測定機器を必要とせず，迅/変換を備えた一つの化学センサであると言え速かつ簡便に測定が行える検査システムが求める。たとえば大腸菌のアスパラギン酸受容体られている。本研究では，細菌の持つ走化性シTar のアスパラギン酸に対する解離定数 Kd のステムを利用したマルチセンシング可能な高感値 は 〜1 μmol/L で あ る が，菌 は わ ず か 〜30度アミノ酸バイオセンサの開発を行い，医療シnmol/L の濃度にも応答し，かつ非常に広いダステムの土台を支える患者近辺での検査システイナミックレンジを有する [1]。さらに細菌の中ム (Point of Care Testing, POCT) の構築に貢には多種多様な受容体が存在し，例えばコレラ献することを目的とする。

菌はチロシンを除く 19 種のアミノ酸に対する受容体が確認されている。そこで誘引/忌避応[研究の内容，成果]

答の結果起きる脂質二分子膜内へのプロトン流入を捉えることで走化性物質であるアミノ酸の1．脂質二分子膜 FET センサによるアミノ酸高感度な検出が可能になると考えられる。

検出の原理

さらに本研究では POCT 対応の観点から，細菌は自身の生存に好ましい環境に向けて移高速応答と高集積化が可能なイオン感応型電動する走性と呼ばれるシステムを有し，特に化界効果トランジスタ (ISFET) をベースにし学物質に対する走性を走化性という。細菌の運たバイオセンサを開発する。ISFET は金属−動能はらせん状のべん毛を回転させることで得酸 化 物−半 導 体 接 合 電 界 効 果 ト ラ ン ジ ス タており，栄養素などの誘引物質に対しては順回(MOSFET) のゲート電極を取り払いイオン感― 1 ―立石科学技術振興財団

応膜を被膜したもので，測定溶液中のイオンなように pH 変化に対して理論値である Nernst

どの荷電物質を検出することができるセンサで応答 (59 mV/pH) に近い 57.3 mV/pH の閾値ある。以上の点を踏まえ，本研究で提案する細電圧変化 (ΔV TH) が得られた。これは fL オー

菌の走化性システムを利用した FET センサのダーのウェル体積ならばプロトン 1 個の変化に概要を図 1 に示す。

対して 1 mV の閾値電圧変化に相当する計算に

ISFET ゲート酸化膜上に高分子材料 (SU-なり，測定装置の分解能 (<5 μV) 以下であ8) による微小な井戸構造 (マイクロウェル)ることから目標に対して十分な感度を持っていを形成する。この開口部に脂質二分子膜を形成ることを確認した。また形成後にウェルを UVし，単一のアミノ酸受容体を持つ走化性システ硬化性樹脂で埋めることでウェルの有無によるム (膜タンパク質) を再構成することで対象アドレイン電流変化を確認した (図 3b)

ミノ酸の到来に伴うプロトン流入の開始・停止を ISFET により検出し，アミノ酸のセンシングを行う。

図2

図1

ISFET 上に形成した SU-8 マイクロウェルアレイ

脂質二分子膜 FET センサによるアミノ酸検出

2．ISFET 上へのマイクロウェルアレイ形成と電気特性評価
市販の ISFET を使用し，感光性ポリマーである SU-8 を用いたフォトリソグラフィプロセ
スにより ISFET 上へのマイクロウェル形成を行った。図 2 に作製した SU-8 マイクロウェルアレイを示す。ISFET ゲート酸化膜上に穴径25 μm，深さ 5 μm のマイクロウェルアレイを形成した後，ウェル内に気泡を含むことなく溶液中での測定を可能にするためエキシマ UV

図 3 (a) マイクロウェルアレイ付き ISFET の閾値電圧変化(b) マイクロウェルの有無によるドレイン電流の変化による表面親水化処理を行った。続いて半導体
パラメータアナライザを用い，異なる pH 溶液

3．Water-Oil-Water 型灌流システムによるに お け る ISFET の I D (ド レ イ ン 電 流)−V G

脂質二分子膜形成(ゲ ー ト 電 圧) 特 性 を 調 べ た。参 照 電 極 に は

ISFET 上マイクロウェルアレイへの脂質二Ag/AgCl 電極を用いた。その結果図 3a に示す

分子膜形成は Water-Oil-Water (W-O-W) 灌― 2 ―Tateisi Science and Technology Foundation

流システムにより行った。W-O-W 灌流によ形成可能かつ自動化・MEMS 化を目指したシる脂質二分子膜形成の概要を図 4 に示す。水溶ステムであり，バイオセンサとしての応用を見液・脂質分子を溶かした有機溶媒・水溶液の順据えたものとなっている。図 6 に W-O-W 溶で連続的に疎水性ポリマーのマイクロウェル上液灌流後の蛍光顕微鏡観察結果を示す。図 6bを灌流すると，Water-Oil 界面に並んだ脂質分の蛍光顕微鏡画像では ISFET ゲート酸化膜上子がジッパーのように閉じ合い，マイクロウェに形成したマイクロウェル部分が赤く写っていル開口部に脂質二分子膜が形成される 。本研ることから，ウェル上に脂質二分子膜が形成さ究では図 5 に示すように ISFET センサ上にポれ，蛍光色素がウェル内に閉じ込められているリイミドテープによる灌流チャンバを作製し，ことが確認できた。

[2]

シリンジポンプとフローセレクションバルブにより W-O-W 灌流を行った。この方法は既存

4．ISFET チップ樹脂封止パッケージングの脂質二分子膜形成手法と異なり，何度でも膜次に流路設計の自由度の向上と将来の並列化処理に向けたチップレベルセンシングを目指し，ISFET チップの樹脂封止パッケージングを行った。シリコンウェハに金配線を施した
後，Bosch プロセスによる Deep-RIE を行いチップと同サイズの貫通孔を作製した。この開口部に ISFET センサチップ部を埋め込み，ポリジメチルシロキサン (Polydimethylsiloxane,

図4PDMS) を注入して樹脂封止を行った (図 7)。

W-O-W 灌流による脂質二分子膜形成

図7図5

W-O-W 灌流システムを用いた脂質二分子膜 FET
センサ測定系

ISFET センサチップのシリコンウェハへの封止[今後の研究の方向，課題]
W-O-W 型灌流システムを用いて，ISFETゲート酸化膜上に形成したマイクロウェルに脂質二分子膜を形成することに成功した。しかし，
ISFET センサと灌流チャンバの接着不良に由来する膜形成の再現性・安定性に課題が残ることが分かった。現在，この問題を解決すべく，
樹脂封止した ISFET チップ上に SU-8 による図6

蛍 光 顕 微 鏡 に よ る 脂 質 二 分 子 膜 形 成 の 確 認 (a)W-O-W 灌流後の ISFET 上マイクロウェルアレイの明視野顕微鏡画像 (b) (a) の蛍光顕微鏡画像

強固な灌流チャンバの形成を試みている。今後
は脂質二分子膜を安定的に形成できるよう灌流― 3 ―立石科学技術振興財団

システムを改良した後，走化性システムによるSep. 1999.
[2]アミノ酸センシングを行う予定である。

R. Watanabe, N. Soga, D. Fujita, K. V Tabata, L.
Yamauchi, S. Hyeon Kim, D. Asanuma, M. Kamiya,
Y. Urano, H. Suga, and H. Noji, “Arrayed lipid[参考文献][1]bilayer chambers allow single-molecule analysis of

R. Jasuja, Y. Lin, D. R. Trentham, and S. Khan,“Response tuning in bacterial chemotaxis.,” Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 96, no. 20, pp. 11346‒51,― 4 ―membrane transporter activity.,” Nat. Commun.,vol. 5, p. 4519, Jan. 2014.