遺伝子解析法による微生物同定法－レジオネラ属菌の生菌迅速検出法を例にとって－

2013年9月11日
防菌防黴学会第40回年次大会
タカラバイオ（株） 吉崎美和

本日の内容• 遺伝子解析法について
遺伝 解析法– 遺伝子解析法の種類と用途– 遺伝子解析法の特徴• PCRによる生菌検出法について– EMA-PCR法の原理– LC EMA-qPCR法によるレジオネラ生菌検出• 遺伝子解析法の活用例

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •2遺伝子とは・・

バクテリア（O157、サルモネラ、セレウス菌 等）

DNA：デオキシリボ核酸
DNA

遺伝子

相補結合

A

T

C

G

DNA二重らせん構造
拡大

４種の物質
A

T

C

G

アデニン

チミン

シトシン

グアニン

拡大
細菌ゲノムや毒素遺伝子は、4種物質の並び配列が異なり、固有配列をもつ領域がある。その固有配列を検出することで特定の微生物検出ができる検出することで特定の微生物検出ができる。
2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio4種の物質からなるポリマー（重合体）
CG

GT

A

G

GTA

GC

CATCCAT

2013/9/11 •3

培養や生理試験による同定
有芽胞

好気嫌気桿菌
無芽胞

グラム陽性
陽好気

運動性

嫌気

非運動性

有芽胞
球菌
無芽胞

細菌

好気
嫌気

抗酸性
非抗酸性

カタラーゼありカタラ ゼなし
カタラーゼなし
極毛

運動性
好気発酵

桿菌
嫌気

グラム陰性

極毛

運動性

周毛

非運動性
弾力性

らせん菌
球菌
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非発酵

周毛

非運動性

好気
嫌気

剛直
ベーシックマスター微生物学（オーム社）
より一部改変して引用
2013/9/11 •4

培養法による検出
Species‐Specificな手法
Spec
es Spec cな手法
細菌A

増菌培養

細菌B

増菌培養

細菌C

細菌D

選択増菌培養選択増菌培養分離培養

選択増菌培養増菌培養

選択増菌培養分離培養同定試験

分離培養同定試験

分離培養

選択増菌培養同定試験

分離培養同定試験

 検出対象の菌種によって、使用する培地や手順が異なる。

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2013/9/11 •5遺伝子解析法による検出１【対象菌種】
 1種類
 検出目的の菌種が1種類に特定される場合“Universal”
Universal な手法【解析手法】
 PCRやリアルタイムPCR法による対象菌種特異的な検出
PCR

①qPCR

③②

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2013/9/11 •6遺伝子解析法による検出２【対象菌種】
 数種類
 状況から数種の菌種に絞り込める場合

 遺伝子解析はUniversalな手法→ 複数の菌種を同じ手法で検出可能【解析手法】
 PCRやリアルタイムPCR法による対象菌種特異的な検出
複数のPCR反応で複数菌種を同時検出

あるいは、Multiplex PCRでも大腸菌
赤痢菌

大腸菌

サルモネラ菌赤痢菌

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bioサルモネラ菌

リステリア菌黄色ブドウ球菌

黄色ブドウ球菌

2013/9/11 •7

遺伝子解析法による検出３【対象菌種】
 数10種類～
 食中毒菌全般など【解析手法】
 各種アレイ技術を応用して多数の菌種をスクリーニング
Primer Array

例えば・・ リアルタイムPCR用のプライマーを配置
 最最大96種を同時検出
種を 時検
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Microarray

マイクロアレイなら、数万のターゲットをスクリーニング可能

2013/9/11 •8

単一菌種の検出からスクリ ニングまで単一菌種の検出からスクリーニングまで
 複数種の病原体を一括してスクリーニング可能。
複数種の病原体を 括してスクリ ニング可能
Multiplex PCR

PCR

1

Primer Array

Primer Set～5

次世代シーケンス～16

Micro Array～96～数万<<
ターゲット数

検体数

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2013/9/11 •9特定遺伝子から集団まで 遺伝子の類似性で規定できる集団は、遺伝子の類似性で規定できる集団は、一括検出可能。
括検出可能。

＜科＞
ex.腸内細菌科菌群＜集団＞
ex.一般細菌＜属＞
ex. Legionella属菌＜種＞
C jejunij j i
ex. C.
PCR/qPCR＜病原因子＞
ex. ベロ毒素＜代謝活性等＞2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •10遺伝子解析法による同定【対象菌種】
 －－(Unknown) 対象菌種を絞り込めない場合

 遺伝子解析はU
遺伝子解析はUniversalな手法
e sa な手法→ 対象菌種を特定できない場合や未知の菌種も解析可能【解析手法】
 Ribosomal RNA領域の配列解析による微生物種の推定
このコロニーは何 ？

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2013/9/11 •11遺伝子解析法による菌株の識別
••

•

•

 遺伝子配列の詳細情報を利用
16S rRNA (Sequence, Mass)すると菌株の識別も可能– 近縁種や菌株の識別は難しい。
パルスフィールドゲル電気泳動 (PFGE)– 制限酵素処理後、電気泳動を行い、泳動パタ
制限酵素処理後 電気泳動を行い 泳動パターンをンを16S rRNA比較する。
MLVA(Multiple-locus variable-number tandemrepeat analysis)
VNTR– VNTR (Variable Number of Tandem Repeat)の数を比較する。
(M lti LocusLST i )MLST (MultiSequenceTyping)– 複数の遺伝子領域の配列情報を解析する。
– SequenceqTypeyp ((ST)を同定。
)– PFGEのようなフラグメント解析とは異なり、客観性がMLST高く、情報の共有が容易。また、系統解析も可能。

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2013/9/11 •12遺伝子解析法のまとめ
検出

病原性・薬剤耐性
病原性
薬剤耐性特異的遺伝子PCR/qPCR

病原因子
PCR/qPCR

同定
rRNA領域
Sequence
配列
Repeat配列
MLVA

全ゲノム
PFGE

菌株識別

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

Housekeeping遺伝子
遺伝子
MLST (Sequence)

2013/9/11 •13

主な遺伝子解析手法
PCR/Real/time PCR
• 病原因子遺伝子の検出• シーケンス対象領域の増幅

制限酵素処理／電気泳動• パルスフィールドゲル電気泳動
パルスフィ ルドゲル電気泳動• RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism

シーケンス解析
解析• 16S rRNA配列解析による菌種の推定• MLSTによる菌株の識別

 遺伝子解析手法の多くは、これらの組み合わせ。
 “Universal”“U il” な方法で、多様な菌種の解析に対応可能。
な方法で 多様な菌種の解析に対応可能
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2013/9/11 •14

遺伝子解析法の特徴
長所 迅速・簡便・客観的 多種類の菌種を同時に検査できる。
 遺伝子配列の詳細な解析により、菌種や菌株の識別も可能。

短所 通常、生菌と死菌を区別することはできない。
 毒素量などを測定することはできない。
生菌

死菌
生きていても、死んでいても、DNAは存在する。
どちらもPCR結果は陽性・・・。

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2013/9/11 •15

PCRによる生菌検出法
による生菌検出法「EMA PCR法」について「EMA‐PCR法」について
EMA‐PCRは、PCRにより生菌を選択的に検出できる画期的な方法です。
Live or Dead ??

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2013/9/11 •16

EMA PCR法とは？
EMA-PCR法とは？
• EMAとは？とは– Ethidium monoazide– 可視光の光照射によりDNAに共有結合するインターカレート色素
可視光の光照射によりDNAに共有結合するインタ カレ ト色素• EMA-PCR法とは？
– EMAの生菌と死菌への作用の違いを利用して、PCRにより生菌由EMAの生菌と死菌への作用の違いを利用して PCRにより生菌由来DNAを選択的に検出する方法。
• 2003年にNogva HKらが報告（Biotechniques.;34(4):804-813）– 細菌に対してEMA処理を行うと、細• 生菌では、細胞膜に阻まれてEMAは菌内部に浸透しない。
• 細胞膜が損傷している死菌には、EMAが浸透する。
• つまり、死菌のDNAのみEMAによる修飾を受け、PCR増幅不能となる。

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2013/9/11 •17

EMA PCR法の原理
EMA-PCR法の原理

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2013/9/11 •18

EMA-PCR法の実験例：
生菌選択的な検出（エンドポイントPCR）
E. coli 生菌および死菌についてEMA処理の効果を確認
M 1 2 34 5 M

M：pHY Marker1： 生菌 EMA処理（＋）
2： 生菌 EMA処理（EMA処理（－））
3： 死菌 EMA処理（＋）
4： 死菌 EMA処理（－）
5： Negative Control

E. coli 生菌または死菌：2×10^7個
EMA処理（Viable Bacteria Selection Kit 使用）
DNA抽出（NucleoSpin Tissue XS使用）
PCR検出（TaKaRa Ex Taq HS使用）
増幅サイズ：1002bp★EMA処理により、死菌由来のDNA増幅が抑制され、生菌のみが検出された。

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2013/9/11 •19

EMA-PCR法の実験例：
死菌の抑制効果（リアルタイムPCR）
レジオネラ死菌についてEMA処理の効果を確認
EMA(‐)

EMA処理（－）

EMA(+)

4035

Ct値

302520

EMA処理（＋）

151.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

菌数 (Log 10)

レジオネラ死菌：4×10^1～ 4×10^7個
EMA処理（Viable Bacteria Selection Kit 使用）
DNA抽出（NucleoSpin抽出（lTissue XS使用）使用）
qPCR検出（CycleavePCR Legionella (5S rRNA)
Detection Kit Ver.2.0使用）★少なくとも4×10^4個の死菌由来DNAの増幅を完全に抑制できることが確認された。
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2013/9/11 •20

EMA-PCR法の実験例：
生菌への影響評価（リアルタイムPCR）
レジオネラ生菌についてEMA処理の影響を確認
EMA(‐)

EMA処理（－）

EMA(+)

4035

Ct値

302520

EMA処理（＋）

15
1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

菌数 (Log 10)

レジオネラ生菌：4×10^1～ 4×10^7個
EMA処理（Viable Bacteria Selection Kit 使用）
DNA抽出（NucleoSpin Tissue XS使用）
qPCR検出（CycleavePCR Legionella (5S rRNA)
Detection Kit Ver.2.0使用）★EMA処理による検出感度の低下は認められなかった。
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2013/9/11 •21

さらに確実かつ高感度に
確「LC EMA‐qPCR法」について
EMA PCR法」について～レジオネラ属菌生菌迅速検出法への応用～
ジオネ 属菌生菌迅速検出法
応用2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •22

LC EMA-qPCR法とは？
EMA qPCR法とは？
LC EMA-qPCR法
q法
濃縮

２日間で結果判定ができます！
酸処理

液体培養
（Liquid Culture）（18時間）
液体培養（LC）による生菌の選択的増殖

EMA処理による死菌由来のPCR増幅抑制

EMA処理

DNA抽出

リアルタイムPCR

（30分）

（30分）

（90分）

リアルタイムPCRと２つの技術① 液体培養（LC: Liquid Culture）による生菌の選択的増殖② EMA処理による死菌由来DNAからのPCR増幅抑制を組み合わせた確実かつ高感度な“生菌遺伝子迅速検査法”です。

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •23

LC EMA-qPCR法の原理
EMA qPCR法の原理

Liquid Cultureによる生菌の増殖

EMA処理による死菌の抑制

Dead

Detection Limit

Li
Live
Liquid Culture (18 h)

EMA処理

 生菌は、液体培養により増殖し、EMA処理では変化しない。
 死菌は、液体培養により増殖せず、EMA処理で抑制される。
死菌は 液体培養により増殖せず EMA処理で抑制される2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •24

レジオネラ純培養菌を用いたモデル実験
レジオネラ生菌

レジオネラ死菌(1, 102, 104 cfu/ µl)(1, 102, 104 cfu/ µl)

95℃ 2分
95℃、2分培養前 (0 h)
液体培養による生菌増殖率

液体培養（18 h）
培養後 (18( 8hh‐))

EMA処理
EMA処理による死菌抑制効果

DNA抽出
EMA処理後(18 h+)qPCR

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •25

液体培養とEMA処理の効果
液体培養による生菌の増殖

EMA処理による死菌の抑制

生菌

死菌

20202525303010^21023510^4Ct

Ct10^410^210235

11404045

450h

18h‐

18h+0h

液体培養

18h‐

18h+

EMA処理

DeadLivee

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2013/9/11 •26

評価試験結果のご紹介
厚生労働科学研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業）
公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究研究代表者 倉 文明 国立感染症研究所 細菌第一部 主任研究官
分担研究報告書「液体培養（Liquid Culture）EMA‐qPCR法を用いたレジオネラ生菌迅速検査法の検討」
研究分担者

研究協力者

○ 烏谷 竜哉
荒井 桂子
磯部 順子
緒方 喜久代八木田 健司
泉山 信司
矢崎 知子
金谷 潤一
吉崎 美和

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

愛媛県立衛生環境研究所
横浜市衛生研究所
富山県衛生研究所
大分県衛生環境研究セ タ
大分県衛生環境研究センター
国立感染症研究所 寄生動物部
国立感染症研究所 寄生動物部
宮城県保健環境センター
宮城県保健環境センタ
富山県衛生研究所
タカラバイオ（株）ドラゴンジェノミクスセンター

2013/9/11 •27

評価試験結果１
アメ バ培養レジオネラを用いた検量線
アメーバ培養レジオネラを用いた検量線

厚生労働科学研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業）公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究 分担研究報告書より引用

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio＜レジオネラ1 CFU当りのコピー数＞
液体培養前
12コピー
18時間培養後270コピー
EMA処理後100コピー2013/9/11 •28

評価試験結果２
浴槽水等における平板培養法との比較(1)qPCR

LC EMA‐qPCR

LC EMA‐qPCR (0h, EMA‐)LC EMA‐qPCR (18h, EMA+)
5y = 0.3637x + 1.1555
R² = 00.1244
1244

LC qPCR 18h(EMA+) (loog CFU/100ml)

LC qPCR
R 0h(EMA‐) (logg CFU/100ml)

543210y = 0.7041x + 0.4479
R² = 0.6268
0 6268432100123Plate count (log CFU/100ml)

4501234

Plate count (log CFU/100ml)

厚生労働科学研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業）公衆浴場等における厚生労働科学研究費補助金（健康安全危機管理対策総合研究事業）公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究 分担研究報告書より引用
2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •29

5評価試験結果２
浴槽水等における平板培養法との比較(2) 浴槽水等浴槽水等113件について、平板培養法とLC件、平板培養法
EMA‐qPCR法を比較
q法を比較
 LC EMA‐qPCR法の定量結果について、5 CFU/100 ml以上を陽性とすると、感度95.5%、特異度75.4%の良好な結果が得られた。
厚生労働科学研究費補助金（健康安全・危機管理対策総合研究事業）公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究 分担研究報告書より引用

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •30

レジオネラ属菌の遺伝子検出法のまとめ
検査法

迅速性

生菌選択性

平板培養法

×

◎

標準法

qPCR

◎×

衛生状態の把握など＊EMA‐qPCR◎○迅速 クリ
迅速スクリーニング検査など
グ検査など

LC EMA‐qPCR○◎

迅速スクリーニング検査など＜使い分けのポイント＞
平板培養法が標準法であるのに対し、遺伝子検査法は、その迅速性を活かして、スクリーニング検査等への利用が期待されている。

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

用途* 死菌の検出については衛生の不備と解釈することで、結果を管理に反と解釈するとで、結果を管理に反映させることが可能である。（第3版レジオネラ症防止指針より）

2013/9/11 •31

タカラバイオにおけるシ ケンスデ タ量推移
タカラバイオにおけるシーケンスデータ量推移＞600 Gb（シーケンスデータ量 / RUN）

HiSeq
FLX
SOLiD
GAIIx

＞60 Gb＞30 Gb
3機種稼働

3 Gb

GS20受託開始
ドラゴンジェノミクスセンター
MPSS受託開始
遺伝子解析 設立
センター
17Mb

0.05Mb
1998-TGCA- NGS微生物

100 Mb

5Mb

2001

2003

2006

2008

2009

2010
November 29, 2012 •201132

次世代シ ケンサ による遺伝子解析
次世代シーケンサーによる遺伝子解析
病原性・薬剤耐性検出
特異的遺伝子/q
PCR/qPCR
病原因子を包括的に検出

次世代シ ケンサ なら、次世代シーケンサーなら、すべての解析をカバーできる

病原因子/qPCR/qPCR

同定

より正確かつ高精度な識別が可能に

rRNA領域
RNA領域
Sequence

Repeat配列
MLVA
全ゲノム
PFGE

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

菌株識別Housekeeping遺伝子
MLST (Sequence)

2013/9/11 •33

次世代シーケンサーの実用例１
腸管出血性大腸菌 O104
• O104:H4による欧州での大規模感染よる欧州
大規模感染– 2011年にドイツを中心に発生。HUS発症患者の割合が高く、死亡者は53名に上った 感染源はスプラウトとされているは53名に上った。感染源はスプラウトとされている。

• 原因菌の解析– 次世代シ
次世代シーケンサーにより、3日でdraft
ケンサ により、3日でdraft sequenceが得られ、さらに2日後には、first assemblyが完了。
– これらの配列情報を解析した結果、原因菌は新規のO104:H4変異
株で Stx2遺伝子を持つファ ジの感染により毒素産生性を獲得し株で、Stx2遺伝子を持つファージの感染により毒素産生性を獲得したと推測された。
Nat Rev Genet. 2012 Sep;13(9):601‐12.

次世代シーケンサーにより、原因菌の病原性因子等を迅速に特定。

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •34

“Future
Future directiondirection”
メタゲノム解析
増菌培養などを行わず、検体に含まれるすべてのDNAを解析する。
検体に含まれるすてのDNAを解析する。

次世代シーケンサーの進化 低コスト化
 Throughputの向上
 解析技術の発展

 培養なしでの解析
 培養が困難な菌の検出
 菌叢解析
Nat Rev Genet. 2012 Sep;13(9):601‐12.
2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •35

まとめNew !

＜遺伝子解析法＞
解析目的

手法

検出・スクリーニング
検出スクリ ニング

PCR Real time PCRなど
PCR,病原因子の検出

PCR, Real time PCRなど

菌種の推定

16S rRNA解析など

菌株の識別

EMA‐PCR法による生菌検出

New !
MLST, PFGEなど
次世代シーケンサーによる包括的な解析

 SimpleでUniversalな解析法であるが故に、適・不適もある。
 過信もせず、毛嫌いもせず、目的に適した手法を上手く活用するのがコツ。

2013防菌防黴学会 TaKaRa Bio

2013/9/11 •36