水研センター研報，第14号，21−85，平成17年
Bull. Fish. Res. Agen. No. 14, 21‑85, 2005

博士号論文

海藻の乳酸発酵に関する研究
内田基晴

＊1

＊2

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Motoharu UCHIDA＊1＊2

Abstract Marine bio-resources have been utilized mostly by catch by mankind. In future,
however, the marine bio-resources are expected to be highly utilized by developing novelﬁsh culture skills and food processing techniques. Fermentation skills are greatly contributing to food producing and processing industries today. However, most fermented products
are terrestrial origin and marine origin products are quite limited. Especially, a skill to ferment algal materials（plant materials of marine origin）has never been developed in the ﬁeld
of ﬁsheries industry.
The author ﬁrstly developed a skill to perform a lactic acid fermentation of seaweed.
The following is a summary of the results obtained by the present study.
1）strain B5201,
var.
strain Y5201, and-related strain strain Y5206 were isolated as predominant microorganisms in a fermented material of
spp. fronds.
2）A skill to perform lactic acid fermentation of seaweed was developed by a combinationaluse of cellulase and starter microorganisms that are composed of the above three isolates.
Production of single cell products at high eﬃciency from algal frond tissue was observed
during the fermentation of3）PCR-methods to estimate the predominance of the microorganisms added as a starter tocultures for seaweed fermentation were developed.
strain B5201 could be detectedby use of a species-speciﬁc primer set targeted for 16S rRNA gene. Yeast strains Y5201 andY5206 could be detected by use of an arbitrary synthesized primer OPA-3 and PCR-RAPD
method.
4）Single use of lactic acid bacteria as a starter was eﬀective for preventing the growth ofcontaminant microorganisms, while single use of yeast was not eﬀective. Lactic acid bacteria having homo-type fermentation such as
andshowed high predominating ability as well as
in fermentation cultures of5）Dietary eﬀect of fermented products of（marine silage）was demonstrated
by rearing trials with young pearl oyster6）Reduction of triacylglycerol concentration in serum and liver was observed for rats fed
the diet supplemented the fermented
product at 10 ％ level for three weeks, suggesting possible utilizations of fermented materials of seaweed as new food items.
Key Words: Fermentation, Seaweed, Lactic acid bacteria,

2005年1月21日受理（Received on January 21，2005）＊1
京都大学審査学位論文（掲載するに際し投稿規程に沿って一部修正した）＊2
瀬戸内海区水産研究所 〒739-0452 広島県佐伯郡大野町丸石2-17-5（National Research Institute of Fisheries and Environments of Inland Sea，
2-17-5，Maruishi，Ohno，Saeki，Hiroshima 739-0452，Japan）

内田 基晴目

次

的回収して利用しやすい資源として捉えることができる。統計量として把握されている世界の海藻生産量は，

第 章 序
第 章

論

FAO 発行の Yearbook によれば，1983年で褐藻類が海藻発酵試料中の微生物相の解析と海藻発酵
微生物の分離本28万 t），緑藻類その他が第 章 海藻の単細胞化・乳酸発酵技術の検討

1989；新崎，新崎，1978），中南米やアジア諸国にお発酵スターターとしての使用に適した微生物の検討
節

いて，古代の原住民が海藻を食べたり薬にしたりしていたと思われる史跡が知られており，また紀元前820

PCR 法を用いた菌種同定・検出技術の開発
第千 t（日本600t）と海藻が利用されてきた歴史を振り返ると（西澤，

第 節 大量調製，保存性の検証

第万されている（徳田ら，1987）。

第 節 発酵培養条件の検討
第 章

230万 t（うち日本の生産量33万 t），紅藻類が82万 t（日年頃の周の国では昆布の記述があり，海藻が古くから世界各地で食用として利用されてきたことが容易にう項

菌種特異的プライマーを用いた同定・検出かがえる。一方ヨーロッパにおいては家畜の飼料や作物の肥料として海藻が利用されてきた。さらに海藻そ第 項 PCR-RAPD 法による同定・検出のままではなく一部の成分を取り出して利用すること

第 節 乳酸菌・酵母の組み合わせの検討もなされ始め，19世紀にはカリウム，ヨウ素等のミネ

第 節 乳酸菌種の検討

ラル成分を利用する本格的な海藻灰工業がおこり，ま第 章 海藻発酵素材の応用的価値に関する研究

た海藻の主成分である多糖類を抽出して工業利用する

第 節 水産餌飼料としての検討ことも始まり，現在の海藻利用産業の中心を担ってい第 節 健康機能性食品素材としての検討る。一方，日本においても海藻を読み込んだ歌が万葉

第 章 総

括

集に多数あるなど，海藻が食用として古くから日本人

謝 辞に利用されてきたことがわかる。海藻は，現在に至っ

参考文献ても日本食を特徴づける健康イメージのある食材として重要な地位を保っているが，一方で海藻利用産業は，第１章 序

近年市場に飽和感があり，新しい利用法の開拓が強く論求められている。海藻の新しい利用法としては，抗腫
世界人口の増加，化石燃料資源の枯渇を背景とし

瘍作用，抗血圧作用，抗動脈硬化作用，抗血栓作用，て，近年，持続的な再生産が可能なバイオマス資源

抗菌作用等に着目した医薬品としての利用がさかんにを有効利用していくことの重要性が叫ばれている。と研究されており（西澤，1989；新崎，新崎，1978），

りわけ地球の 割を占める海洋に存在するバイオマス

将来経済的な効果に結びつくことが期待されるが，一資源は，陸上バイオマス資源に比べ，ヒトによってそ方でこのような方向での利用は，海藻成分の一部のみの利用が検討される機会に乏しく，未開拓な資源としを利用する場合が多く，海藻バイオマス資源の有効利て注目される（Mann，1973；大野，1996；徳田ら，用というも目的からは，少し焦点がずれる。

1987）。海洋全体における第一次生産量（炭素換算）

このような背景のなか，微生物の能力を借りて海藻は，その約93％が回転時間（turnover）が速い微細藻を発酵させて利用しようというアプローチは，藻体全類によるものと見積もられているが，バイオマス資源

体の有効利用につながる点，処理コストが安い点などとして評価した場合，全海洋植物バイオマスのから一般に経済的価値の低いバイオマス資源の利用法/

が大型藻類によるものと推定する報告もある（Smith，として注目される。しかし，陸上においては，植物性

1981）。大型藻類が生育しうる潮間帯・亜潮間帯・素材の発酵技術はかなり古くから存在し，多方面で普6

河口域の面積は，2 0×10 km で，全海洋面積の0 55及しているのに対し，海洋の植物性素材である海藻の％を占めるに過ぎないことから，単位面積あたりの発酵技術は，歴史が浅く，バリエーションに乏しい。

バイオマス存在量は微細藻類の約360倍に相当する

前述の海藻利用の歴史のなかで微生物による発酵が関（Smith，1981；徳田ら，1987）。また単位面積あたり与しているのは，肥料利用のための堆肥発酵とエネルの平均生産量（炭素換算）は，1800〜2000gC/m2/yr で，ギー利用ためのメタン発酵（Gunaseelan，1997）の

これは陸上で生産力の高い場として知られる熱帯降雨つに限られる。堆肥発酵の例としては，イタリアの林域に匹敵している（Daws，1981）。従って海藻バ

観光都市ベニスに大量繁殖するアオサの堆肥化を目指

イオマス資源は，高密度で存在していることから比較した最近の研究事例（Cuomo

2，1995）がある。

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
本事例では，アオサ藻体に木材チップ，藁，ピートモ

期待される。

ス等の副材を加え， 週間の微生物発酵をおこなって

本稿では，海藻試料より分離した乳酸菌，酵母をスいる。しかし，本研究では最終産物について肥料有効ターターとして利用して，セルラーゼによる糖化処理

成分の分析が行われているのに対し，微生物学的な観と組み合わせて著者が開発した海藻の乳酸発酵技術に点からの解析はほとんどなされていない。また，得ら関する知見と，本技術により得られる海藻発酵素材のれた発酵肥料の実用的価値も明らかでない。一方，メ今後の産業利用の可能性についてまとめる。

タン発酵によるエネルギー利用の検討は，最初アメリ
カにおいて1976年からアメリカエネルギー省およびガ第ス研究所の委託のもとで大規模に行われ，また日本に章

海藻発酵試料中の微生物相の解析と海藻発酵微生物の分離

おいても1981年から 年間，通商産業省の委託のもとで行われた。これらの研究のなかで，海藻を強力にメ

農林水産分野での人と発酵の関わりは多岐にわた

タン発酵させる菌の分離・培養に成功し，10〜100L

り，農業における堆肥製造や畜産業におけるサイレーの中間規模での発酵試験にも成功したが，副生品回収

ジ生産など食糧生産の場において発酵は，重要な役割

コストも含めてのエネルギー収支見積もりは，マイナを演じている。また，発酵は，食品素材に多様性を与え，スにとどまり，実用化へのネックとなっている（西澤，

民族文化の形成にも多大な影響を与えている（Ishige，

1989）。東南アジアでも，大量繁殖するアオサ類を基1993；石谷，1995；一島，1997）。食糧・食品生産に質としたメタン発酵が検討されたが，やはり研究レベ

関わる発酵産物は，動物性（特に乳）素材を発酵させルに留まっている（Sivalingam，1982）。以上概説したものと植物性素材を発酵させたものに分類することたように，海藻の利用の歴史の中で，発酵という言葉ができる（Fig. 1）。陸系生物素材については，動物

は，ほとんど実用的価値を発揮してこなかった。

性，植物性ともに発酵産物が豊富に存在する。しかし，次に，海洋微生物とその発酵利用という観点から概海洋系生物素材については，鰹節，魚醤油のように魚説する。海洋環境下においても，乳酸菌（Frantzmann

を発酵させた食品素材は，わずかながら存在するもの.，1991；Gatesoup，1999）， 酵 母（Taysi andの，植物性素材である海藻類，微細藻類を発酵させた

Uden, 1964；Uranol., 1998）等の発酵に関与しう

食品は，見当たらない（Steinkraus，1993）。また，る微生物が分布していることが既に知られている。最

農業の堆肥技術や畜産業のサイレージ飼料に相当する

近では，好・耐塩性，好・耐アルカリ性を特徴とする発酵技術を利用した肥料・飼料素材も水産分野にはみ

海洋乳酸菌

が分離

あたらない。これらの原因は，乳酸発酵やアルコール

され，海洋特有の乳酸菌の存在も知られるようになっ

発酵のような食糧生産分野に応用できる種類の発酵技

た（Ishikawa，2003）。海産酵母については，海術が，これまで海洋系の植物性素材を基質として充分藻が生育している場所において高頻度で分離されるこに開発・検討されていないことに起因すると考えられと（Fellる。

.，1960），海藻が分泌する有機物を利用できること（Suehiro and Tomiyasu，1962）が明ら

著者らは，これまで海藻を単細胞化することによかにされており，生態的に海藻と密接な関係にある海り，水産初期餌飼料素材として利用できないかとい洋における定住者であると位置づけることができる。

うテーマに取り組んできた。海洋環境中には，海藻

しかし，全体としてみれば，海洋環境から分離される葉体を分解する能力を有した細菌が広く分布してお微生物の大部分はグラム陰性菌であり，乳酸菌，酵母り（Uchida and Nakayama，1993；Uchida

等のグラム陽性菌の分布割合は，一般に非常に少ない。

1995），強力な海藻分解能を有する好気性の従属栄養

海洋環境から分離されたこれらの乳酸菌や酵母が，発細菌.，

AR06株（Uchida

酵分野で利用された例は，さらに限られる。近年，日.，2002）を葉体に作用させた実験から，海藻は微生

本国内において海洋より分離された酵母がパンや酒類

物による分解を受ける過程において細胞単位で壊れの製造に利用され話題となったが（小玉，2003），こ易いということを観察した（Uchida，1996；Uchida

れなどは海産微生物が発酵分野で利用された貴重な事

and Numaguchi，1996）。この細菌の分解作用により例といえる。この例で利用された菌は産生された単細胞性の海藻粒子は，アルテミアに対しであり，必ずしも海産酵母の典型種とはいえないが，今後さらに検討が行なわれることにより，て一定の餌料効果を有することが証明され（Uchida.，1997a；Uchida.，1997b），海藻を単細胞

陸生起源の微生物にない特徴を有する海産微生物が，化することにより，微細藻類の代替となるデトライタ

発酵に利用されて，発酵産業が多様化していくことがス性の餌料素材を得られないかという考えを持つに至内田 基晴Terrestrial

Marine

Natto

Beer

Bread

Plant
materials

CheeseAnimalmaterials

YogurtFish sauce
Katsuobushi

Fig. 1. Categories of fermented food products
った（Uchida，1999）。しかし，好気性従属栄養細菌

ゼ処理した新しいアオサ藻体に移植すると芳香が発生を海藻単細胞化餌料の生産に使用した場合，細菌自することが再現されることを認め，発酵らしき現象を身による消費のため餌料粒子の減耗が調製時および保誘発するためのスターターとして機能する微生物がこ存中におこり（Uchida.，1997a），保存性の向上の海藻試料中に存在していることが示唆された。しかをどうするかという点が実用化に向けての問題とされし，海藻の発酵に関する知見は，上述の通り極めて乏た。さらに海藻分解能を有する好気性従属栄養細菌をしく，また海藻に含有される糖質は一般に陸上の糖質使用して調製した餌料を開放系で投与した場合には，と大きく異なるため，ここで芳香臭の発生だけを頼り養殖ノリへの影響を考えるなどリスク評価という難しとして観察された発酵は，これまで知られているもの

い問題が生じる。そこでこれらの問題点を克服或いはと異なる全く新しい種類の発酵現象である可能性も考避けるために，海藻を従属栄養細菌により好気的に分えられた。そこで，海藻を発酵させるためのスタータ

解，即ち海藻に対して強制的腐敗ともいうべき処理をーとして利用できる未知の微生物を分離する目的で，して利用するのではなく，発酵処理をして利用するこアオサ発酵試料中の微生物相を培養できない微生物のとができないかという方向を検討した。しかし，海藻存在も視野に入れながら，詳細に調べることとした。

を発酵させることに関する研究としては，前述のようにエネルギー生産の分野におけるメタン発酵の例しか方法研究らしい前例がないのが現状であった。即ち我々の知る限り，海藻そのものを発酵させる技術としての乳酸発酵，アルコール発酵，酢酸発酵等は，これまでに

海藻発酵試料の調製
実験室において得られたアオサの発酵試料を数ヶ研究例がなく，糖質源を加えての検討例（テルモ株式

月ごとに継代した記録を Table

会社，1991等）が特許出願として数例あるのみであっるアオサ藻体は横浜市海の公園の砂浜で採取し，水た。

道水で洗って巻貝等，表面の付着生物を除去したも一方，上記の海藻を細菌により分解し単細胞化してのを使用した。発酵試料 No.

に示す。基質であおよび No.

は異なる

餌料素材化する研究を実施する過程で，対照餌料とし日に採取した新鮮なアオサ藻体を使用し，試料 No. 3て細菌を使用しないでセルラーゼ処理により単細胞化から No.

したアオサ試料を調製して飼育試験に供していたが，体を凍結（‑40℃）保存したものを使用して調製しこのセルラーゼ処理したアオサ試料を低温下に放置すた。試料 No. 1の調製は，まず藻体をると，芳香感のある発酵臭が自然発生する現象を実験

クレーブ処理した自然海水（SSW）に懸濁し，ミキ

室で偶然観察した。さらに，その発酵試料をセルラー

サー（MK-K75，National）で（A-E）までは，No.

と同じロットの藻
倍量のオートmm 角程度に裁断しStudies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 1. Transfer records of fermented

cultures#RRTQZKOCVGEQORQUKVKQPUQH7NXC EWNVWTGU YY%WNVWTGU &CVGQHRTGRP

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た。次にこの藻体懸濁物に，セルラーゼ（終濃度0 22

&GITCFGFHTQPFRTQFWEVUYGTGEQNNGEVGFYCUJGFCPFNGHVHQTOQPVJUCV͠

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FC[UCV͠+PEWDCVGFYKVJVJGUGGFEWNVWTG0QHQT
 FC[UCV͠

微生物の計数％ w/w，ONOZUKA R-10，ヤクルト本社）およびア

試料 No. 4および No. 5（A-E）について，培養後にワビアセトンパウダー上清液（酵素剤の使用が終濃度

微生物の計数を行なった。No. 5B については培養前

0 22％ w/w 相当になる量を蒸留水に懸濁させた後，の生菌数も測定した。微生物の計数は，直接計数法

GF/C で吸引ろ過して得た上清を使用，Sigma）を添（Porter and Feig，1980），MPN 法，寒天平板法によ加し， ℃で48時間インキュベートして単細胞化処理り行なった。直接計数法では，試料を適当な濃度に希を行なった。この分解産物約50g を倍量の SSW で釈後，DAPI 染色し，0 2μm 径のフィルター（PCMB，

回デカント洗浄し，280mL の SSW に懸濁したのち，

Nucleopore）上に集めて（U 励起）蛍光顕微鏡観察

500mL 容のポリカーボネート製遠心ボトル（Nalgene）

により行なった。MPN 法では，酵母エキス2 5g，ペに収容し，スクリューキャップを閉めた状態で， ℃

プトン5 0g，NaCl25g/L（pH6 9）の組成の液体培地

下で17ヶ月間放置した。試料 No. 2の調製は，藻体20を使用して 本立てで行なった（清水，1985a）。寒天％ w/w，セルラーゼ0 8％，マンニトール8 6％ にな

平板法による計数のうち一般従属栄養微生物は，標準

るよう SSW に懸濁し，寒天培地（日水製薬）に NaCl を℃下で48h 分解後，SSW で

回デカント洗浄した後，試料 No. 1を発酵種（スターター）として％ v/w 添加して，

℃下で

ヶ月

間培養を行なった。試料 No. 3の調製は，藻体裁断物
83％ w/w，セルラーゼ0 42％，アワビアセトンパウ
ダー懸濁液上清0 42％，SSW16％で懸濁し，93h 分解後，SSW で

濃 度 で 添 加 し た 培 地（SMA％，2 5％，％，SMA2 5，SMA）を使用して計数した。乳酸菌数は，BCP 加プレート
カウントアガール（日水製薬）に NaCl を％濃度で添加した培地（BCP

，BCP

％および
）を使用

℃下で

し，周辺が黄色になったコロニーを乳酸菌として計回デカント洗浄した後，試料数した。真菌類はサブロー培地（日水製薬）に抗生物

No. 2を0 5％添加して，20℃下で日間培養を行なっ質混液（各50mg/L 最終濃度，ストレプトマイシン，

た。発酵試料 No. 4と No. 5は，酵素分解と発酵培養の

硫酸カナマイシン，ペニシリン G カリウム，クロラ

過程を同時に実施した。即ち No. 4は，藻体を等量のムフェニコールおよび NaCl を
+

％および

％濃度

+

滅菌10％ NaCl 水溶液に懸濁し，裁断後，セルラーゼ

で添加した培地（SBR0 ，SBR5 ）を使用して計数

1 0％と試料 No. 3をした。好塩性従属栄養微生物は，マリンアガー 2216％の割合で添加し，20℃下で日間培養を行なった。No. 5A は，試料 No. 4を ％添（MA，Difco）を使用して計数した。生菌数測定のた加して No. 4と同様に調製した。No. 5B は，セルラーゼ，

めの MPN 培地，寒天平板の培養は，20℃で行なった。

NaCl，試料 No. 4を添加せずに No. 5A と同様に調製

NaCl の添加濃度を変えて測定した場合には，最も高した。No. 5C，No. 5D，
No. 5E は，それぞれ試料 No. 4，

い計数値を採用して記載した。酵母のタイプ別計数値

NaCl，セルラーゼだけを添加せずに No. 5A と同様には，SBR5 + 平板に形成されたコロニーを形体的特徴調製した。発酵が完了した試料は，次の植え継ぎに使から分類した後計数し，そのコロニーの細胞を適宜顕用するまで ℃下で保存した。

微鏡観察により確認して記載した。

内田 基晴分離微生物の簡易性状試験と16S rRNA 遺伝子の部分

ノール産生量を市販キット（F キット D 乳酸 /L 乳

塩基配列に基づいたタイピングと同定酸，F キットエタノール，Roche diagnostics）により

a）細菌分離株の分析

測定し，グルコースからの転換効率から判定した。生試料 No. 4および No. 5（A，D-E）については，計数に使用した BCP

プレートから20コロニーずつ無作為に選んで菌を分離した。試料 No. 5B については，

育温度，耐塩性試験（20℃）には MRS 培地を使用した。糖からの酸の産生試験は，API50CH（bioMerieux）
を使用した。

培養前の試料を計数した MA 平板上のコロニーから
20コロニー，培養後の試料を計数した SMA 平板上のコロニーから20コロニーを分離した。分離菌株についb）酵母分離株の分析
No. 4，No. 5A，No. 5C-E の各発酵試料について，ては，グラム染色，細胞の形態，運動性，菌体色素，

生 菌 数 の 計 数 に 使 用 し た SBR

O/F 試験，オキシダーゼ，カタラーゼ，寒天分解能，を 形 態 的 特 徴 か ら タ イ ピ ン グ し た 後， 各 タイ プ に

ゼラチン分解能，増殖速度，ガスの産生を調べ，清ついて数株ずつ合計10株酵母を分離した。さらに各

水のスキームにより簡易同定した（清水，1985b；河

試料について BCP合ら，1988；Sneath.，1989）。16S rRNA 遺伝子

ニーを10株ずつ無作為に分離した。次に全ての分離（16S rDNA）の塩基配列は，まず市販キット（Gen株について乳酸菌の場合と同じ市販キットを使用しとるくん，タカラ）により分離菌株のトータル DNAてトータル DNA を抽出し，これを鋳型としてユニを抽出した後，ユニバーサルプライマーセット27F（5バ ー サ ル プ ラ イ マ ー セ ッ ト P （5 -dATCTGGTT-

平板上のコロニー

平板上の酵母と思われるコロ-dAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ），および1492R

GATCCTGCCAGT-3 ） お よ び NS

（5 -dTACGGTTACCTTGTTACGA CTT-3 ）（Weis-CAGGTTCACCTACGGA-3 ）（Suzuki and Nakase，

burg

1999，Suzuki.，1991） を 使 用 し て PCR 法 に よ り16S

（5 -dTCCG-，1999）を使用して，乳酸菌の場

rDNA 断片を増幅した。PCR 反応は，反応液100μL

合同様，PCR により18S rRNA 遺伝子（18S rDNA）

あたり，10xPCR buﬀer；10μL，dNTP Mix；各200を増幅した。PCR 反応条件は，94℃でμM，Primer； 各

後，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 120秒のプログラム

μM，Taq DNA polymerase；

分保持した

2 5U，鋳型 DNA; 50ng の組成で実施した。反応条件

を25サイクルおこない，最後に72℃では，94℃でプログラムで行なった。NS8プライマーを使用して，分保持した後，94℃ 60秒，60℃ 45秒，分保持する

72℃ 90秒のプログラムを30サイクル行い，最後に72

こ の 部 分 塩 基 配 列（

℃で 分保持するプログラムで行なった。得られた約配列の1670-1850番目相当）を決定した。決定された

1 5kb の増幅産物の確認は，臭化エチジウム入り1 5％

塩基配列を基に分離株をタイプ分けし，タイプごと

アガロースゲル電気泳動により行なった。16S rDNAに統合データベース DDBJ/EMBL/GenBank に対しの部分塩基配列（

塩基配列の41-338番目相当）て BLAST 検索にかけ，最近縁種を特定した。さらの決定は，27F プライマーを使用して Dye Termina-に各タイプごとの代表株（菌株番号 Y5201，Y5206，

tor Cycle Sequencing Ready Reaction kit（Perkin

Y5318）については，ほぼ全長域の塩基配列を決定し，

Elmer）を使用してダイレクトシークエンシングによ最近縁種とのあいだの Similarity value を計算した。

り行なった。得られた塩基配列をもとに分離菌株を

Y5201株および Y5206株については，さらに以下の詳

タイプ分けした後，タイプごとに統合データベース

細な同定試験を実施した。形態学的性質および生理・

DDBJ/EMBL/GenBank に 対 し て BLAST 検 索 に か

生化学的性質試験は，Barnett

け，最近縁種を特定した。さらに各試料ごとの代表分（1998）および Nakase

離株（菌株番号 B4101，B5201，B5401，B5501）につた。栄養細胞および栄養（無性）生殖の観察は Difco

いては，ほぼ全長域の塩基配列（

塩基配列のBacto Yeast morphology agar お よ び Difco Bacto41-1492番目相当）を決定し，最近縁種とのあいだの

YM Broth（Becton Dickinson&Co.，MD） で 培 養 後Similarity value（一致した塩基数 / 決定した塩基数）に光学顕微鏡（位相差および微分干渉）で観察を行っを計算した。B5201株については，同定のためさらにた。液体培地は直径16mm 試験管に細胞形態の観察，胞子の形成，運動性，発酵形式，生て用いた。子嚢胞子形成試験は，Acetate agar（Mc-

育温度，耐塩性，糖からの酸の産生，GC 含量の各試Clary験を実施した（Sneath（Wickerham，1951）を用いて20℃，.，1989；柳田，1996；鈴塩基（1990），Yallow（1998）に従って実施し.，1959） お よ び/mL を分注し％ Malt extract agar
〜20日間の培木，1996）。発酵形式は，MRS 培地中を使用して30℃養を行った後，光学顕微鏡を用いて無染色で観察を行

40時間の菌体培養を行った後，乳酸産生量およびエタった。糖類発酵試験は，Fermentation basal medium

Studies on lactic acid fermentation of seaweed（Wickerham，1951）に糖基質をのみ％（ラフィノース，，％）終濃度として加え，ダーラム発酵管法に，のアクセッション番号は，それぞれ J01353，

より実施した。Fermentation basal medium にはブロ

AB013567，AB013590，AB013509，AB013553，

モチモールブルー（BTB）が pH 指示薬として含まれAB013532，AB013555である。決定された18S rDNAており，内管中のガスの発生とともに pH の低下も観

塩 基 配 列 を も と に 系 統 樹 を 作 成 し た。 進 化 距 離 は察可能である。25℃，28日間までの培養を行った。

Kimura の炭素化合物資化性試験は Difco Bacto Yeast Nitrogen

法（Saitou and Nei，
1987）により系統樹を作成した。

Base（Becton Dickinson&Co.）を用い，グルコ−ス

進化距離はプライマー結合部位およびアライメントギ

g 当量の炭素化合物を含む10倍濃度ストック溶液を調製し，ろ過滅菌を行った。このストック溶液0 5ml

パラメータ法（1980）により算出し，NJ

ャップを除いた領域を用い，Clustal W コンピュータ
ープログラム（Thompson.，
1994）にて計算した。

を直径16mm 試験管に4 5ml 分注した滅菌蒸留水に加え，供試培地とした。培養は25℃，21日間継続した。

海藻の発酵試験

窒素化合物資化性試験は液体培地法（Wickerham，

発酵試験に使用した海藻試料はワカメおよびマコ

1946，Wickerham，1951）により行った。培地としンブを除き，横須賀沿岸で採取したものを使用した。

て Difco Bacto Carbon Base（Becton Dickinson&Co.）

ワカメ試料のうち一つは，市販乾燥粉末（若みどり，を用い，窒素源とともに10倍濃度ストック溶液を調製

74μm メッシュ通過，理研ビタミン）を使用した。

し，ろ過滅菌を行った。このストック溶液0 5ml を直他の二つのワカメ試料は，岩手県産の生鮮物を横浜

径16mm 試験管に4 5ml 分注した滅菌蒸留水に加え，市内のマーケットで購入した。マコンブ試料は74μ

供試培地とした。培養は25℃， 日間継続した。シクm メッシュ通過の天日乾燥粉末を使用した。上記試

ロヘキシミド耐性試験は Difco Bacto Yeast Nitrogen

料のうち生試料は，凍結乾燥処理を行った後，ミキサ

Base に D-glucose を追加した液体培地に，終濃度0 01

ー（MK，National）単独もしくは乳鉢を使用した破％（w/v）となるように Cycloheximide を添加し，25℃，

砕を併用し，

日間培養を行った。酢酸生成試験は Custer s Chalk
培地プレート（％ glucose，0 5％ calcium carbon-

mm メッシュを通過する粉末として使用した。発酵試験は，12mm 容の滅菌試験管に海藻粉末0 5g，セルラーゼ（R-10，ヤクルト本社）0 1g を滅

ate を含む）を用い，25℃， 週間までの培養を行い，菌3 5％ NaCl 水溶液

数日おきに観察を行った。ビタミンフリー生育試験はた。これにVitamin-free Yeast base（Wickerham，1951） を 用

菌体懸濁液50μl ずつを加え，スクリューキャップを

い，25℃で培養を行い， 日目と 日目に観察を行っ

閉じた状態で，回転培養器（Rotator RT-550，タイテ

た。同時に対照用として，ビタミン類（myo-inositol，ック）にかけ，20℃， rpm で

calcium pantothenate，biotin，thiamine，hydrochlo-

体懸濁液は，乳酸菌（B5201）は MRS（Merck）で，ride，pyridoxine hydrochloride，niacin，folic acid，

酵 母（Y5201，Y5206） は Difco YM Broth（BectonmL とともに加えた培地で行っ種類（菌株 B5201，Y5201，Y5206）の日間培養した。菌-aminobenzoic acid，riboﬂavin）を添加した培地をDickinson&Co.）で20℃で前培養後，滅菌0 85％ NaCl

用い比較した。生育温度試験は％ glucose-peptone-

水溶液で OD660nm=1 0になるよう懸濁して使用した。

yeast extract broth お よ び Glucose-peptone-yeast

菌体懸濁液50μL に含まれる菌体数は，それぞれ2 5

extract agar（GYP agar）を用いて行った。試験温度

× 10 7 CFU（B5201），2 7 × 10 4 CFU（Y5201），6 0 ×

は37℃および35℃とした。

10 5 CFU（Y5206）であった。培養後の試料は，官能的臭気が，エステル様の芳香を有するものを＋，無臭もしくは海藻本来の臭いがするものを±，腐敗臭

塩基配列のアクセッション番号と系統解析
本研究で決定された塩基配列情報は，DDBJ に登がするものを−と評価した。さらに試料を遠心処理録 し た。 菌 株 番 号 B4101，B5201，B5401，B5406，（10 000xg，
10min）
して得た上清について市販キット（F

B5407，B5501，Y5201，Y5206，Y5318の塩基配列情

キット D 乳酸 /L 乳酸，F キットエタノール）によ

報のアクセッション番号は，それぞれ AB070606，

り D /L 乳酸，およびエタノール産生量を測定した。

AB070607，AB070608，AB070609，AB070610，

発酵試験は二本立てで行い，測定値は平均値で示した。

AB070611，AB070854，AB070855，AB070856 で あ結る。系統解析に使用した菌種
，

果

，
，

，

アオサ発酵試料の調製と植え継ぎ内田 基晴17ヶ月経過した試料 No. 1（Table 1）は，エステルで7 1×10 7 CFU/mL，次いで SMA2 5平板値が6 0×様の芳香を有していることが観察された。この試料を10 7 CFU/mL であり，乳酸菌が優占していると考えら

光学顕微鏡で観察すると単細胞化された多数のアオサれた。SBR粒子とともに桿菌，酵母，糸状菌様細胞粒子が観察さのうち98％以上が酵母のコロニーであった。このこと

れ，微生物が関与する発酵らしき現象がおこっているから，酵母も試料 No. 5A 中に優占しているとみなさものと推察された。試料 No. 1の一部をセルラーゼ処れた。試料 No. 4についても同様に乳酸菌と酵母の計理した新たなアオサ試料 No. 2に移植し培養すると，数値が高く，アオサの発酵には，乳酸菌と酵母が関与

芳香の発生が再現された。同様にヶ月間隔でしていることが示唆された。一方腐敗試料である No.

No. 1から No. 4まで，芳香の発生を誘起する能力を維

5B については，培養前には海藻の藻体に付着して存持したままで継代できた。試料 No. 5A は，アオサ懸在していたと推察される好塩性の細菌（MA 平板値）

濁液に NaCl，セルラーゼ，試料 No. 4の 要素を加えが1 0×10 5 CFU/mL のレベルで計数され，培養後もて調製し，芳香が発生したことより発酵することが観MA 平板値が8 2×10 8 CFU/mL で寒天平板法による察された。一方，試料 No. 5B は，上記要素を添加計数値のうちで最大を示した。また直接計数法によるせずに培養したところ，腐敗臭がおこった。試料 No.

値の2 0×10 9 cells/mL とは大きく開きがあることが5（C-E）は，〜

平板値は2 8×10 7 CFU/mL であり，そ要素のうち一つだけを添加せずに調発酵試料の場合と大きく異なっていた。試料 No. 4を製したところ，これらも同様に芳香の発生が観察され，スターターとして添加せずに調製した No .5C につい要素のうち 要素だけの添加でもアオサは発酵しうては酵母が1 2×10 8 CFU/mL で優占していた。またると考えられた。No. 1から No. 5までの ヶ月以上の

この No. 5C 試料の MA 値が1 2×10 8 CFU/mL と高い

期間，芳香の誘起の能力を維持したままでの継代が行が，MA 平板上のコロニーを無作為に 個採取して光われ，アオサ試料中には発酵スターターとして機能す学顕微鏡で観察したところ， 個全てが酵母のコロニる微生物の存在が示唆された。

ー（>80％）であることが観察された。即ち雑菌（混入菌）の生育は，おこっていないものと考えられた。
NaCl を添加せず調製した試料 No. 5D は，乳酸菌計数

試料中の微生物相の解析

値が2 3×10 8 CFU/mL と若干高めであること以外は，発酵試料中の微生物の計数値を Table 2に示す。
回継代を行なった試料 No. 5A について直ほぼ No. 5A と同じ傾向の微生物相を示した。セルラ

接計数法，MPN 法，寒天平板法における生菌数のーゼ無添加で調製した試料 No. 5E は，芳香の発生が最大値を比較するとそれぞれ6 6×10 7 cells/mL，5 4

弱いという傾向があったが，同じく乳酸菌と酵母が優

最初に

7

7

×10 cells/mL，7 1×10 CFU/mL と ほ ぼ 同 じ で あ占していた。

り，試料 No. 5A 中の微生物の大部分は，培養法による計数が可能であると考えられた。種々の寒天平板による計数値を見ると，BCP
Table 2.

平板による値が最大

5WRRNGOGPVU㧦

(GTOGPVGF4QVVGP

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0Q&
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試料 No. 4，No. 5A，No. 5D，No. 5E については，

Microbiota in the transfered Ulva cultures%WNVWTGU


細菌分離株のタイピングと同定

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



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%QWPVGFQP5$4 RNCVGURTGRCTGFCVFKHHGTGPV㧔㧕0C%NEQPEGPVTCVKQPU6JGNCTIGUVEQNQP[PWODGTKUUJQYP

%QWPVGFQP/CTKPG#ICT



Studies on lactic acid fermentation of seaweed
培養後の生菌数の計数に使用した BCP

平板から20た。培養後の No. 5B からの分離株は，12株が株ずつコロニーを無作為に分離した。No. 5B については，BCP， 株がより計数値が多かった SMA2 5平板か

-

， 株が

， 株が

に分

ら20株を無作為に分離した。また No. 5B については，類された。以上をまとめると発酵した試料においては，培養開始時の菌相を知るため，希釈試料を各種平板Ⅰ型が優占しており，
NaCl，
セルラーゼ，

培地に接種し，形成されたコロニー数の最も多かった

スターターの 要素を添加せず腐敗した試料において

MA 平板から無作為に20株を分離した。No. 5C につは，多様な腐敗性の細菌種が菌相を形成していた。

いては BCPから分離したコロニーはすべて酵母のⅠ型の代表株である B5201株について

もので細菌株は分離されなかった。分離株について性

詳細な性状試験を実施し，結果を Table 4に示した。

状試験を実施した結果を Table に示してある。No. 4，

B5201株は，胞子を形成しない非運動性の桿菌で，グNo. 5A，No. 5E から分離された細菌各20株は全て同ルコースを基質として乳酸を炭素換算で50％の効率で一のタイプであった。即ちグラム陽性の桿菌で，運動産生し，同時にエタノールと炭酸ガスを産生したこ

性がなく，菌体色素を産生せず，オキシダーゼ陰性，とから，ヘテロ型の乳酸発酵菌と考えられた。生育カタラーゼ陰性でグルコースを発酵的に利用した。し温度は，15℃と40℃で生育がみられ，45℃では生育したがって清水のスキーム（門田，多賀，1985）によるなかった。生育塩分濃度は2 5％および簡易同定の結果，属とされた。これら度で生育した。糖類の資化性試験では L-arabinose，

分離株の16S rDNA の部分塩基配列は100％一致した

esculin，fructose，galactose，gluconate，glucose，ので，

maltose，ribose，D-xylose，N-acethylglucosamine，

Ⅰ型と呼ぶこととした。No. 5Dから分離された20株のうち17株は，同様にⅠ型であったが，％ NaCl 濃

5-ketogluconate か ら 酸 を 産 生 し た。GC 含 量 は45 ％株（B5406，B5409）および（Mol）
で，決定された16S rDNA の塩基配列1475bp は，株（B5407）はそれぞれ，16S rDNA の部分塩基配列

最近縁種であるがⅠ型と異なっていたので，それぞれ

して99 8％の相同性を有していた。以上の結果から

Ⅱ型およびⅢ型とした。No. 5B の培養前試料からのB5201株は分離株については，13株が黄色―オレンジ色の菌体色

株，B5501株についても16S rDNA のほぼ全長域の塩素 を 有 し，基配列が決定されたが，B5201株の配列と同一であグループに分類された。残りの株および株は，それぞれ

および

り，同じ

に分類され

（D37785）に対と同定された。B4101株，B5401と考えられた。

Ⅱ型

である B5406株は16S rDNA の塩基配列（1487bp）がTable 3. Characterization and typing of bacteria isolated from Ulva-fermented cultures㪧㪿㪼㫅㫆㫋㫐㫇㫀㪺㩷㪺㪿㪸㫉㪸㪺㫋㪼㫉㫀㫊㫋㫀㪺㫊㪚㫌㫃㫋㫌㫉㪼㫊

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casei の配列と99 9％の相同性があり，グループの菌と考えられた。

Ⅲ型である B5407株は，同配列（1481bp）が，の配列と100％一致し，

きさが Type LR より少し小さく，表面が滑らかなタイプ（Type MS）のつに分かれた。Type LR のコ

ロニーの割合は，試料 No. 4で97％，No. 5A で84％，と考えられた。

No. 5D で50％，No. 5E で90％であった。試料 No. 5Cからの分離コロニーはすべて Type LR に類似していたが，そのうちの89％は少しだけ小さめであったので

酵母分離株のタイピングと同定
酵母の生菌数を調べる際，SBR0＋ 平板計数値の方＋が，SBR5 平板計数値より，若干大きい傾向があったType MLR とした。これらのコロニーの形態学的特徴からの分類は，18S rDNA の部分塩基配列からの分類の結果とよく符合した（Table 5）。

＋が，SBR0 平板上に形成された酵母のコロニーは外見Type LR は， ほ ぼ 球 形 の 細 胞 を 有 し， サ イ ズ がが類似していて区別がつかないのに対し，SBR5＋平板（2 7-5 4）×（2 7-6 0）μm で，多軸方向に出芽して栄養上のコロニーは，形態的特徴が明瞭で，肉眼観察によ増殖し，菌体色素を産生しない。Type LR の分離株

り つのタイプに分類できた。そこで発酵した試料にの18S rDNA の部分塩基配列は，100％一致したこと

ついて SBR5＋ 平板上のコロニーを形態的特徴から分から一つのタイプと考えられ，BLAST 検索の結果か類して計数した後，合計10株を分離することとした。

ら

試料 No. 5B からは，酵母のコロニーは分離できなか

LR と同じ形態学的特徴および細胞分裂の形式を示しった。試料 No. 4および No. 5（A，D，E）から分離たが，18S rDNA の部分塩基配列がされた酵母は，形成されたコロニーの大きさが相対っていたので的に大きく，丸いタイプ（Type LR）とコロニーの大は，短〜長楕円形細胞を有し，サイズが（1 2-3 2）×Ⅰ型とした。Type MLR は，Type箇所のみ異なⅡ型とした。Type MS

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 5. Typing and characterization of the yeast strains isolated from the Ulva-fermented cultures㪚㫌㫃㫋㫌㫉㪼㫊
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esculin，fructose，galactose，gluconate，glucose，の18S rDNA の部分塩基配列は，100％一致したこと

maltose，ribose，D-xylose を 各 々 唯 一 の 炭 素 源 とから一つのタイプと考えら，BLAST 検索の結果からして増殖し，35℃での増殖能を示さなかった。18S

Ⅰ型とした。

rDNA の塩基配列（1752bp）は，最近縁種の各発酵試料について BCP

平板からも10株ずつ酵に対して99 8％であっ母を分離して調べた。BCP

上の酵母のコロニーは，た。以上の性状試験の結果と系統解析（Fig. 2‑2）のその周辺が黄色化せず，大きさが細菌コロニーに比べ結果から Y5201株はて著しく大きいので容易に細菌コロニーと区別して分

された。

var.

と同定

離できた。試料 No. 4，No. 5（A，D，E）の場合は，

Y5206株は，偽菌糸を形成し，子嚢胞子の形成は観無作為に10コロニーを選択して分離した。一方，試料察されなかった。D-glucose，sucrose，D-galactose，No. 5C の場合は，時間が経つとコロニーの色が白か

maltose，lactose，raﬃnose を基質にした発酵性は示

ら少し暗色に変化するタイプ（Type WD）と変化しなさなかった。また，D-glucose，L-sorbose，D‑glucos-

いタイプ（Type W）に分類できたので区別して

amine，α，α trehalose，glycerol，D-sorbitol，株

ずつ分離した。BCP0平板からの分離株も SBR5＋平板

D-mannitol，からの分離株同様，

炭素源として増殖し，35℃での増殖能を示さなかっ

Ⅱ型，

Ⅰ型，

Ⅰ型の タイプであった。
Ⅰ型および

Ⅰ型の代表分-keto-D-gluconic acid を 各 々 唯 一 のた。18S rDNA の塩基配列（1750bp）は，最近縁種のに対して99 5％であった。以離株，それぞれ Y5201株および Y5206株についてさ上の性状試験の結果と系統解析（Fig. 2）の結果かららに詳細な性状試験を行なった結果を Table 6に示

Y5206株はもしくはその近縁種と同定す。Y5201株は，偽菌糸を形成せず，丸くて表面にされた。

Ⅱ型の代表株である Y5318株

凹凸のある子嚢胞子を形成することが観察された。

は，最近縁種D-glucose および sucrose に対して弱い発酵性を有す

var.

に対して99 5％，に対して99 4％であった。

内田 基晴Table 6. Characteristics of yeast strains Y5201 and Y5206

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Studies on lactic acid fermentation of seaweed
18S rDNA の塩基配列に基づく系統解析の結果（Fig.

褐藻類，緑藻類，顕花植物を含む全22種類の海藻基質

2），Y5318株は，に対してセルラーゼとともに混合接種して培養したと属の酵母と考えられた。

ころ，全ての海藻で，乳酸および / もしくはエタノー
海藻発酵試験

ルの産生が観察され， 種類の菌が発酵スターターとアオサ発酵試料中の優占種として分離された 菌株（B5201，Y5201，Y5206）を個々に前培養し，紅藻類，して機能することが確かめられた（Table
された乳酸は）。産生〜1 14g/100mL，エタノールは0 03〜

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Fig. 2. Phylogenetic analysis of the yeast isolates based on 18S rDNA
Table 7. Fermentation results on various kinds of seaweed with the addition of cellulase and the microbial consortium㪁㪈㪪㪼㪸㫎㪼㪼㪻㫊

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離した緑藻類，紅藻類，褐藻類の順に多かった。ワカメおよれる種であり，海洋固有の乳酸菌種ではない。一方，びマコンブは，褐藻類の中では例外的に乳酸生成量が分離された酵母のうち，少なくとも多かった。

は，陸上発酵素材から頻繁に分離さの方は，典型的な海産酵母として知られる
（Uden
考

察

.，1968）。海藻粉末を滅菌蒸留水もしくは滅菌食塩水に懸濁させ放置しておくと，特にスターターを添加しなくてもしばしば乳酸菌や酵母が出現して最初に実験室で偶然得られたアオサの発酵試料を継くることを観察することから，元々の海藻の葉体表面代した結果，発酵スターターとして安定に機能するこにはある頻度でこれらの乳酸菌や酵母が存在しているとが認められた。本研究の目的は，発酵スターターとと考えられ，今回分離された 種類の微生物も海藻起して機能しかつ安定に継代培養できる微生物の取得で源であると推察された。海産酵母については，藻類のあったので，アオサ試料の継代過程において，でき繁殖している場所に多く出現することが知られておりるだけ簡便に培養維持できるよう培養条件を改変して（Fell

いった。具体的には，藻体の分解と糖化のために使用を主に好気的に利用しながら生息していることが考えする酵素として当初セルラーゼとアワビアセトンパウられる。著者の観察では，海藻を粉末状にして懸濁し，

ダーとを併用して使用していたが，セルラーゼ単独で糖質が可溶化し易い状態で微好気的環境下に放置すれ使用できることを確認し，単独使用に変更した。次にば，必ずしもセルラーゼを使用しなくても乳酸菌が優基質としてアオサの生藻体ではなく冷凍保存された藻占してくることを経験しており，自然界でも海藻葉体体が使用できることを確認した。Tableが堆積したような嫌気的条件下では，局所的に乳酸・には No. 2〜 No. 4までの継代に際して継代用試料として使用した試料についてのみ培養条件を示してあるが，実際には，各継代時にデータとして示した以外の種々の培

エタノール発酵が起こっているものと予想される。
以上の結果をまとめると，アオサ発酵試料には乳酸菌養条件を試した。この継代を行なう過程で，セルラー
ゼ，NaCl，スターターの.，1960），自然界では藻類が生産する糖質

と酵母
からなる

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および

種類の微生物が優占してい要素の添加が有効である

ることが判明し，アオサ発酵の正体が，アルコール発

ことが経験的に感じられた。これらの 要素のうち一酵を伴う乳酸発酵であることが明らかになった。分離

つだけを欠如させて継代した実験から， 要素のうちされたの 要素だけでも芳香を伴う発酵は誘起しうることがをアオサ藻体に接種すると，芳香臭の発生とともに乳観察された。セルラーゼについては，これを添加しな酸およびエタノールが産生されることが観察され，いと芳香の発生が少なくなったことから，発酵の基質

種類の微生物が発酵スターターとして機能することがの生成に貢献していると考えられた。データとしては確かめられた。

種類の菌を別々に前培養した後，その一定量示していないが，実際，ワカメを基質にしてセルラー
ゼのみを添加すると，少なくとも glucose が生成して第 章 海藻の単細胞化・乳酸発酵技術の検討くることが確認されている。NaCl の添加効果は今回の実験からは明確に示されなかったが，NaCl を添加

第 節 発酵培養条件の検討

せずに調製した試料は，しばしばガスが発生したり，最初に得たアオサ発酵試料を継代していく過程で，腐敗臭が発生した。また，スターター試料を添加し発酵を安定に再現するためにセルラーゼ，発酵スター

なくてもター（微生物），NaCl の型の酵母が種類出現し，優要素を添加することが経験

占することを観察したことから，アオサの藻体表面に的に有効であった。このときセルラーゼ添加は，アオ型の酵母が，一定の頻度で存在していサの細胞壁成分であるセルロースを分解し，グルコー
ス等を生成することにより，乳酸発酵のための基質をることが示唆された。
乳酸菌と酵母が共存系を形成しやすいことは経験

提供する役割を果たしていると考えられ，いわゆる糖的に良く知られており（伊藤，1996），今回分離され化処理にあたると考えられた。実際の市販セルラーゼ

た種類の微生物を海藻発酵型微生物コンソーシア

はセルラーゼ以外の糖質分解酵素活性を含んでおり，ムと呼ぶこととした。最近 Ishikawa ら（2003）によ発酵の前段階での海藻試料の分解･糖化に関与する酵

り，好・耐塩性，好・耐アルカリ性を特徴とする乳酸素の種類が完全に理解されているわけではないが，菌が分離され，海少なくとも，セルラーゼの添加によりグルコースの生

洋乳酸菌という言葉が提案されているが，著者らが分成がおこり，乳酸の生成が始まる時期とリンクしてグStudies on lactic acid fermentation of seaweed
ルコースの蓄積量が低減することが確かめられているの粒子を単細胞性粒子（Single cell detritus, SCD）と（阿部私信）。一方，NaCl の添加は，非好塩性の海藻みなした。海藻粒子の重量濃度分布は，粒子が球形での腐敗に関与する細菌の生育を抑制するのに有効には比重がたらいていると推察された。

ーの粒子濃度と粒径データから計算した。次にスターであるという仮定をしてコールターカウンタ

一方，上記で多種類の海藻試料について，発酵基質

ターの添加効果を調べる目的で，セルラーゼ濃度を変となり得るか調べた際，ワカメにセルラーゼを添加すえて調製したワカメ懸濁液に微生物混液を添加して培ると乳酸発酵と並行して，非常に高い効率で藻体の単養を行った。微生物混液は，乳酸菌

細胞化がおこることを観察した。海藻を単細胞化すれ

B5201株（FERM BP-7301），酵母

ば，アルテミア等の懸濁物捕食者の餌飼料としての利用も期待できる（Uchidavar.

.，1997a；Uchida

Y5201 株（FERM BP-7302），
Y5206 株（FERM BP-7303） の.，1997b）。また，ワカメは，乾燥粉末として規格菌株で調製した。乳酸菌は MRS broth（Merck），の揃った試料が市販されており，入手も容易である。

酵母は YM broth（Difco）でそれぞれ20℃で前培養

これらのことから，本研究では，市販乾燥ワカメ粉末した後，菌体を遠心回収し，滅菌0 85％ NaCl 水でを基質として，第 章で分離された 種類の微生物を回遠心洗浄後，同液に OD660nm=1 0の濃度で懸濁した。

スターターとして利用して効率よく単細胞化しながらこ れ ら の 懸 濁 液 を B5201株
Y5201株

乳酸発酵させることを検討した。

mL（1 0×10 9 CFU），

5

mL（5 3×10 CFU），Y5206株

mL（1 2×7

10 CFU）の分量加えて微生物混液とした。全ての試
料は

材料と方法

本ずつ調製し，測定値は平均値で示した。

発酵試料の性状分析

発酵試料の調製
発酵試料の調製には，500mL 容のポリカーボネー

従属栄養微生物の計数は，標準寒天培地（SMA とト製遠心ボトル（Nalgene）をオートクレーブ滅菌し標記，日水製薬）で行った（乳酸菌，酵母の計数値をて使用した。ボトルに NaCl 水溶液180mL を入れ，市含む）。好塩性従属栄養微生物の計数は，1 5％寒天添

販ワカメ粉末（若みどり，粒径 mesh No. 200通過，

加 Marine broth 2216（MA，Difco）で行った（酵母

理研ビタミン）10 0g とセルラーゼ（R-10，ヤクルトの計数値を含むが乳酸菌の計数値は含まない）。乳酸

本社）を一定量懸濁して発酵試料とした。発酵試料は，菌の計数は，シクロヘキシミドを50mg/L 濃度添加し日に 回，手振りによる混合を数回行いながらスク

た BCP 加プレートカウントアガール（BCP，日水製

リューキャップを閉めた状態で，20℃下で静置培養を薬）で行い，周辺が黄変するコロニーを乳酸菌とみな行なった。最初に，スターター微生物を添加せずに，して計数した。酵母の計数は，ストレプトマイシン，

NaCl 濃度，培養温度，セルラーゼ濃度を各々個別に硫酸カナマイシン，ペニシリンＧカリウム，クロラム

変化させて，効率的な単細胞化のための適性条件を検

フェニコールを各50mg/L 濃度および NaCl を討した。NaCl 濃度の適否の評価は，海藻懸濁試料の度で添加したサブロー寒天培地（SBR

凝集性，粘性，固形分の安定性から評価した。凝集性で行った。酵母についてはコロニーの形態的特徴からの評価は，試料調製後24時間経過してもダマが解消しY5201型（クリーム色，表面が凹凸状，Y5206型よりない場合を＋＋，調製直後にはダマが存在するが，24大きい）と Y5206型とを区別して計数し，全酵母数に時間後には消失する場合を＋，調製直後からダマがな

対する Y5201型のコロニーの割合（％）を記載した。

い場合を−とした。粘性は，ボトルを逆さにしたとき，適宜，コロニーの一部を採取し，光学顕微鏡で細胞の試料内容物が下に移動しない場合を＋＋，少し振るこ形態を観察することにより，コロニーの形態的特徴かとにより数秒以内に下に移動する場合を＋，直ちに下らの分類が正しいことを確認した。コロニーの計数は，に移動する場合を−とした。浸透圧の関係でおこると考えられる海藻組織の脱水と収縮の度合いを評価する
ための固形分の安定性は，試料調製後枚組の寒天平板で行ない，％濃％，日水製薬）本立ての試料の計数値の平均値で示した。

日経過した時点でボトルの底面からワカメ固形分の上面までの高さ結果を測定し，試料液面の高さに対する比（％）で表記した。
ワカメ分解産物の粒子数および粒度分布は，コールタ

微生物を添加しない系での海藻の単細胞化条件の検討

ーマルチサイザーⅡ（Coulter Electronics）で140μm

最初に基質である乾燥ワカメの懸濁濃度をオリフィスを使用して測定した。5 8〜11 5μm 画分

w/v とした。これ以上濃い濃度で調製すると，ダマ％内田 基晴が出来安く，また粘性が高すぎるため，試料の一部

カメ粒子の60 1％−69 0％が単細胞化画分で占められを均一に採取して性状分析することが困難と考えられていた。
次にセルラーゼ濃度の影響を調べた。発酵試料は，た。
次に NaCl の添加濃度を検討した。溶解液の NaCl

3 5％ NaCl を添加した系で調製し，20℃で培養した。

濃度が ％以下の場合，乾燥ワカメ粉末は，非常に分散しにくく，試料全体の粘性が高いため，ダマを形成㪈㪅㪇㪜㪂㪇㪏

NaCl 濃度が3 5％以上の場合，浸透圧の影響によると

㪐㪅㪇㪜㪂㪇㪎

思われるワカメ組織の収縮が顕著におこり，10％濃度
NaCl 水を使用した場合，ワカメの固形分体積割合（％）
が，39％にまで減少した。このように組織の収縮による固層･液層分離は，発酵容器内での不均一な場の形
成につながり，発酵を不安定にする恐れがあると考えられた。以上の物性的特徴を考慮し，NaCl 濃度は
2 5‑3 5％に設定するのが好ましいと考えられた。
次に，NaCl 濃度を3 5％，セルラーゼ濃度を％に㪥㫆㪅㩷㫆㪽㩷㫇㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㫊㫀㫅㩷㪪㪚㪛㩷㪽㫉㪸㪺㫋㫀㫆㫅㩷㩿㪆㫄㫃㪀することが顕著であった（Table 8）。一方，溶解液の

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単細胞化粒子の生成効率を比較した。経時的に試料の

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で比較した。しかし，試料の粘性が高く，培養初期にはダマも存在するため，サンプリングが不正確になり易く，温度の違いによる単細胞化の効率の違いが明確に読み取れなかった（Fig. 3a）。そこで，ワカメ粒子の重量ベースの粒度分布データから5 8〜11 5μm 画分の粒子の重量割合を計算し，温度に対してプロットして示した（Fig. 3b）。この図から培養24時間後では，℃から20℃までの範囲で温度に依存して単細胞化粒子の割合が高く，20℃以上50℃までの範囲では，単細胞化粒子の割合はほぼ一定である傾向を示した。また
低温（ ℃）でも培養期間を長く取れば単細胞化の反応は進行し，14日後には ℃から50℃の範囲で最終的に，単細胞化の効率はほぼ一定となり，重量換算でワ

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一部を採取し，コールターカウンターで測定したとこられた。そこで単細胞化粒子の大きさに匹敵する5 8㪈㪋㩷㪻㪸㫐㫊

㪏㪅㪇㪜㪂㪇㪎

固定し，培養温度を ℃から50℃の範囲で変化させて，ろ，徐々にワカメ粒子が単細胞化していく傾向が認め㪍㩷㪻㪸㫐㫊

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Fig. 3. Eﬀect of culture temperature on the production eﬃciency of single cell detritus（SCD）fromon the concentration of particles per milliliter（a）and %weight proportion（b）of SCD. The
detrital particles in the range of 5 8-11 5μm in diameter were tentatively regarded as SCD. Mean ± SD（n=2）.

Table 8. Eﬀect of NaCl concentration of the culture medium for the productivity of the fermented
Undaria-SCD㪚㪿㪸㫉㪸㪺㫋㪼㫉㫀㫊㫋㫀㪺㫊㩷㫆㪽㩷㫋㪿㪼㪥㪸㪚㫃㩼㩷㩿㫎㪆㫍㪀㩷㫆㪽㩷㪺㫌㫃㫋㫌㫉㪼㩷㫊㫆㫃㫌㫋㫀㫆㫅㪁㪉㪬㫅㪻㪸㫉㫀㪸 㪄㫊㫌㫊㫇㪼㫅㫊㫀㫆㫅
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Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Fig. 4a にセルラーゼ濃度と SCD 粒子の生成数との関の最大重量割合は，セルラーゼ濃度１％以上の場合の係を示した。培養期間が 時間および24時間の短期間

数値を若干上回り67 3％〜71 1％であった。セルラーの場合，セルラーゼ濃度が ％までは，酵素濃度に相ゼ濃度関して SCD 粒子の生成数が増加し，酵素濃度合とも培養12日の間でほとんど変化がなかった。

％以％の場合は，SCD 生成数および SCD 重量割

上では，SCD 粒子の生成数は，ほぼ一定であった。

次に酵素使用濃度が0 25％試料区の培養過程にお培養期間が12日間と長いと酵素量が0 1〜0 5％の低濃けるワカメ粒子の粒度分布の経時変化を Fig. 5に示し

度試験区での SCD の生成数が増加し，SCD の最終生た。SCD 画分の重量割合は，培養12日目で全粒子中成数ではむしろ高濃度使用区を上回った。酵素使用濃の71 1％まで上昇した。

度が0 25％の場合で SCD の収量が最大となり，7 0×

Tableに，各試料の培養12日目における官能臭気

10 7 個 /mL であった。ワカメ発酵試料は高い粘性をおよび pH 値のデータを示した。官能臭気的には酵素有するため，温度条件について検討した折，SCD の使用量が生成量を個数濃度単位で測定すると，サンプリングの濃度0 5％の試料は，困難さによる誤差が出てくることが経験されたため，有し，他の 本は弱い芳香臭が感じられた。酵素濃度

SCD 画分（直径5 8〜11 5μm）粒子の重量割合（％）

〜〜0 25％の試料は，腐敗臭を発した。酵素
本のうち本は弱い腐敗臭を％の試料は，芳香臭を発した。pH 値は，各試料とも3 9〜5 8の範囲で低下していたが，腐敗か発酵かを区別する指標には必ずしもならなかった。Table

ラーゼ濃度 ％以上の場合，培養 日目で最大の重量

10に各試料の微生物相を調べた結果を示した。微生物

割合（65 4％〜66 3％）を示した。セルラーゼ濃度が相のデータは，官能臭気による腐敗の発酵の判定結果％より低い場合には最大重量割合に達するまでに12とよく相関した。腐敗と判定された試料は，一般生菌日間を要したが，セルラーゼ濃度が0 1％〜0 5％場合

数に対する好塩性従属栄養微生物の割合（％）が高く㩿㪸㪀㪏㪅㪇㪜㪂㪇㪎
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Fig. 4. Eﬀect of cellulase concentration（w/v）on the production eﬃciency of SCD in the culture waters prepared in the absence of the microbial mixture. The deﬁnition of the SCD fraction is the same as for Fig. 3.
The percent proportion（a）and the concentration（b）of SCD are plotted on the vertical axis, respectively.
Mean ± SD（n=2）.

内田 基晴のに対し，発酵と判定された試料においては，好塩㪘㪽㫋㪼㫉㩷㪊㪿

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性従属栄養微生物が検出されず，乳酸菌の割合が高い㪈㪇㪅㪇

（63 6％〜99 4％）傾向にあった。スターター微生物

㪏㪅㪇

を添加しない系においては，基質ワカメ由来と考えら

㪍㪅㪇

れる混入菌の増殖を抑制しかつワカメの単細胞化を達㪋㪅㪇

成するには，セルラーゼ濃度 ％以上の使用が必要と㪉㪅㪇考えられた。
㪅㪎

微生物を添加した系での海藻の単細胞化条件の検討

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微生物スターターを添加した系におけるセルラーゼ㪛㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㩷㫆㪽㩷㪻㪼㫋㫉㫀㫋㪸㫃㩷㫇㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㫊㩷㩿㱘㫄㪀

ゼ濃度と SCD 生成重量割合との関係を Fig. 6b に示㪘㪽㫋㪼㫉㩷㪉㪋㪿

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した。SCD 粒子数でみると，最初2 5×10 7 個 /mL（重ゼ濃度0 5％でも，SCD の生成数は5 7×10 7 個 /mL と

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セルラーゼ濃度0 5％のときに得られたが，セルラー
㪅㪇

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観察された。SCD の最大生成数5 9×10 7 個 /mL は，
㪅㪎ーゼ高濃度区（0 5％〜 ％）でむしろ減少することが

㪉㪅㪇

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添加区で最大となり，その後培養12日目には，セルラ

㪋㪅㪇

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/mL（重量割合63 0〜69 1％）へと全てのセルラーゼ

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量割合18 4％）から，培養高かった。SCD の重量割合でみると，セルラーゼ濃㪛㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㩷㫆㪽㩷㪻㪼㫋㫉㫀㫋㪸㫃㩷㫇㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㫊㩷㩿㱘㫄㪀

度 ％以上では，培養 日目には，ほぼ最大の値（64 3

㪪㪚㪛

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％〜70％）に達し12日目まで大きな変化はなかった。

㪘㪽㫋㪼㫉㩷㪈㪉㪻㪸㫐㫊㪈㪉㪅㪇

セルラーゼ濃度が0 25％および0 5％でも培養

日目

㪈㪇㪅㪇

で既にこれとほぼ同じ重量割合（59 5％〜63 8％）を㪏㪅㪇達成したが，培養12日にはさらに若干高い値（71 2％

㪍㪅㪇〜71 4％）を記録した。

㪅㪎

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度0 25％〜5 0％の試料は，エステル様の芳香臭がし，㪅㪐臭を発生し，腐敗と判定された。一方，セルラーゼ濃
㪅㪈

㪇㪅㪇
㪅㪋

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Table 11および Table 12に試料のその他の性状を記載してある。セルラーゼを添加しない試料は，腐敗

㪅㪈

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濃度と SCD 生成数との関係を Fig. 6a に，セルラー㪈㪋㪅㪇

発酵状態と判定された。官能的に腐敗とされた試料で㪛㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㩷㫆㪽㩷㪻㪼㫋㫉㫀㫋㪸㫃㩷㫇㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㫊㩷㩿㱘㫄㪀

は，pH 値が4 8および5 0であるのに対し，発酵とさFig. 5. Time course change in the weight distribution of
detrirus in the cultures containing
cellulase at a 0 25% level. Mean ± SD（n=2）

れた試料では，pH 値が4 1〜4 2と低い値を示した。
微生物的にはセルラーゼ濃度 ％の試料は，培養 日
目での微生物相が 本の試料間で大きくばらつき，微生物学的にみて不安定な系であることを暗示した。即ち，一つの試料は，一般生菌数の80 5％にあたる数がTable 9. Characteristics of the cultures prepared with diﬀerent concentrations of cellulase without the addition of the microbial mixture㪚㪿㪸㫉㪸㪺㫋㪼㫉㫀㫊㫋㫀㪺㫊㩷㫆㪽㩷㫋㪿㪼㪬㫅㪻㪸㫉㫀㪸 㪄㫊㫌㫊㫇㪼㫅㫊㫀㫆㫅㪁㪈㪩㫆㫋㫋㪼㪻㪆㪝㪼㫉㫄㪼㫅㫋㪼㪻㩿㫁㫌㪻㪾㪼㪻㩷㪽㫉㫆㫄㩷㫋㪿㪼㩷㫆㪻㫆㫉㪀㫇㪟㩷㫍㪸㫃㫌㪼
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Studies on lactic acid fermentation of seaweed
乳酸菌であったが，もう一方の試料では，一般生菌数

4 1〜4 2と腐敗した試料の pH 値4 8〜5 0より低い傾の92 9％が好塩性従属栄養微生物で占められていた。

向があった。スターターを添加した場合には，セル

官能臭気的に発酵状態と判定された試料では，乳酸菌

ラーゼ濃度が0 25％で充分腐敗を抑制することができが10 8 CFU/mL を超えるレベルで優占しており，一般た。酵素濃度が0 5％〜3 0％においては乳酸菌が2 4〜生菌数に対する乳酸菌数の割合が，85 5％〜111％で2 8×10 8 CFU/mL，酵母が1 1〜2 2×10 7 CFU/mL である一方，好塩性従属栄養微生物数は，3 6％〜8 0％

Y5201型酵母の全酵母に対する割合は78 1％〜81 6％であった。試料の pH 値の低下は，発酵した試料におであった。

いては，乳酸の生成によりおこると考えられるが，Table 10. Microbiota of the cultures prepared with diﬀerent concentrations of cellulase without the additionof the microbial mixture㪤㫀㪺㫉㫆㪹㫀㪸㫃㩷㪥㫆㪅㪁㪈㩿㪚㪝㪬㪆㫄㪣㪀

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㪊㪅㪇㪇

Fig. 6. Eﬀect of cellulase concentration（w/v）on the production eﬃciency of SCD in the culture waters preparedin the presence of the microbial mixture. The deﬁnition of the SCD fraction is the same as for Fig. 3. The percent
proportion（a）and the concentration（b）of SCD are plotted on the vertical axis, respectively. Mean ± SD（n=2）.

内田 基晴考察

スターターの使用は，乳酸発酵を安定に誘導するのに貢献し，セルラーゼの使用量を節約することを可能に

ワカメを基質にして，単細胞化・乳酸発酵させるするため，経済的に有利と考えられた。今回の実験で（Fig. 7）ための培養条件の検討を行った。検討結果

は，スターター使用時の酵素濃度の下限は0 25％までをまとめると基質濃度 ％，NaCl 濃度2 5％〜3 5％，しか検討していないが，より低濃度の0 1％でも発酵

セルラーゼ濃度0 25％（スターター使用時）〜 ％（スを達成できるか否かについては，後節で検討している。

ターター不使用時），培養温度20℃の条件下で安定

セルラーゼを ％濃度以上で使用した場合，培養期間に乳酸発酵がおこり，が長くなるにつれ SCD 生成数が若干低下することが日〜14日間の培養期間中に
7

×10 個

観察された。この傾向は，セルラーゼの使用濃度が高/mL（SCD の重量割合約70％）の濃度で得られた。

い程顕著であることから，SCD 粒子の生成が培養初

SCD 画分（直径5 8〜11 5μm）の粒子が約Table 11. Characteristics of the culture waters prepared at diﬀerent concentrations of cellulase withthe addition of the microbial mixture㪚㪼㫃㫃㫌㫃㪸㫊㪼㩼㩷㩿㫎㪆㫍㪀㩷㫆㪽㩷㪺㫌㫃㫋㫌㫉㪼㩷㫊㫆㫃㫌㫋㫀㫆㫅
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Table 12. Microbiota of the culture waters prepared at diﬀerent concentrations of cellulase with theaddition of the microbial mixture㪤㫀㪺㫉㫆㪹㫀㪸㫃㩷㪥㫆㪅㪁㪈㩿㪚㪝㪬㪆㫄㪣㪀
㪤㫀㪺㫉㫆㪹㫀㪸㫃㩷㪥㫆㪅㩷㩿㪚㪝㪬㪆㫄㫃㪀㪺㫆㫌㫅㫋㪼㪻㩷㪸㫋㩷㪛㪸㫐㩷㪌㩷㫆㫅㪑㪚㪼㫃㫃㫌㫃㪸㫊㪼㩼㩷㩿㫎㪆㫍㪀㩷㫆㪽㩷㪺㫌㫃㫋㫌㫉㪼㩷㫊㫆㫃㫌㫋㫀㫆㫅
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㩷㩷㩷㩷㪉㪅㪋㫏㪈㪇㪍㪃㩷㩷㪊㪅㪌㫏㪈㪇㪍㩷㩷㩷㩿㪰㪌㪉㪇㪈㪄㫃㫀㫂㪼㪆㪰㪼㪸㫊㫋㩷㩼㪀 㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩿㪈㪌㪅㪉㪀㪃㩷㩷㩿㪈㪌㪅㪏㪀㩷㩷㩷

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㩷㩷㩷㩷㪉㪅㪐㫧㪇㪅㪋㫏㪈㪇㪏㩷㩷㩷㩷㪈㪅㪉㫧㪇㪅㪋㫏㪈㪇㪎㩿㪋㪅㪉㫧㪇㪅㪏㪀㪏㩷㩷㩷㩷㪊㪅㪈㫧㪇㪅㪉㫏㪈㪇㩿㪈㪇㪏㫧㪏㪀
㩷㩷㩷㩷㪐㪅㪏㫧㪊㪅㪊㫏㪈㪇㪍㩿㪌㪊㪅㪇㫧㪈㪇㪅㪌㪀㩷㩷㩷㪉㪅㪏㫧㪇㪅㪊㫏㪈㪇㪏㩷㩷㩷㩷㩷㪉㪅㪇㫏㪈㪇㪎㪁㪌㩿㩷㪏㪅㪇㪀㪁㪌
㪏㩷㩷㩷㪉㪅㪋㫧㪇㪅㪊㫏㪈㪇㩿㪏㪌㪅㪌㫧㪈㪅㪌㪀㩷㩷㩷㪈㪅㪉㫧㪇㪅㪋㫏㪈㪇㪎㩿㪎㪏㪅㪈㫧㪈㪋㪅㪉㪀㩷㩷㩷㪉㪅㪍㫧㪇㪅㪊㫏㪈㪇㪏㩷㩷㩷㪐㪅㪉㫧㪈㪅㪐㫏㪈㪇㪍㩿㪊㪅㪎㫧㪈㪅㪈㪀㪏㩷㩷㩷㪉㪅㪏㫧㪇㪅㪉㫏㪈㪇㩿㪈㪇㪏㫧㪌㪀
㩷㩷㩷㪉㪅㪉㫧㪇㪅㪌㫏㪈㪇㪎㩿㪏㪈㪅㪍㫧㪇㪅㪉㪀㩷㩷㩷㩷㪉㪅㪊㫧㪇㪅㪈㫏㪈㪇㪏㩷㩷㩷㩷㪏㪅㪊㫧㪈㪅㪊㫏㪈㪇㪍㩿㪊㪅㪍㫧㪇㪅㪍㪀㪏㩷㩷㩷㩷㪉㪅㪌㫧㪇㪅㪍㫏㪈㪇㩿㪈㪇㪍㫧㪈㪐㪀
㩷㩷㩷㩷㪈㪅㪈㫧㪇㪅㪉㫏㪈㪇㪎㩿㪏㪇㪅㪎㫧㪇㪅㪐㪀㪁㪈㩷㪚㪿㪸㫉㪸㪺㫋㪼㫉㫀㫊㫋㫀㪺㫊㩷㫆㪽㩷㫋㪿㪼㩷㪺㫌㫃㫋㫌㫉㪼㫊㩷㪸㪽㫋㪼㫉㩷㪌㩷㪻㪸㫐㫊㩷㫆㪽㩷㫀㫅㪺㫌㪹㪸㫋㫀㫆㫅㩷㪸㫉㪼㩷㫊㪿㫆㫎㫅㪅㪩㪼㫊㫌㫃㫋㫊㩷㪽㫉㫆㫄㩷㫋㪿㪼㩷㫉㪼㫇㫃㫀㪺㪸㫋㪼㩷㪹㫆㫋㫋㫃㪼㫊㩷㫎㪼㫉㪼㩷㪻㫀㪽㪽㪼㫉㪼㫅㫋㩷㪸㫅㪻㩷㪸㫉㪼㩷㫊㪿㫆㫎㫅㩷㫀㫅㪻㫀㫍㫀㪻㫌㪸㫃㫃㫐㪅㩷㪝㫆㫉㩷㫆㫋㪿㪼㫉㩷㪻㪸㫋㪸㪃㩷㫄㪼㪸㫅㫊㫧㪪㪜㩷㪸㫉㪼㩷㪾㫀㫍㪼㫅㪅㪁㪊㪃㩷㪋㪃㩷㪍㪃㩷㪎㩷㪚㫆㫌㫅㫋㪼㪻㩷㫀㫅㩷㫋㪿㪼㩷㫊㪸㫄㪼㩷㫄㪼㫋㪿㫆㪻㩷㪸㫊㩷㪻㪼㫊㪺㫉㫀㪹㪼㪻㩷㫀㫅㩷㪫㪸㪹㫃㪼㩷㪈㪇㪅㪁㪌㩷㪪㫀㫅㪾㫃㪼㩷㫉㪼㫊㫌㫃㫋㩷㫆㫌㫋㩷㫆㪽㩷㫋㪿㪼㩷㫉㪼㫇㫃㫀㪺㪸㫋㪼㩷㪹㫆㫋㫋㫃㪼㫊㩷㫀㫊㩷㫊㪿㫆㫎㫅㪅㪁㪉㩷1) Decomposion to single cell detritus (SCD)by polysaccharide-degrading enzyme
Cellulase etc.

2) Lactic acid fermentation
with lactic acid bacteria and yeast
LAB Yeast

Sugar

Sugar

Sugar
Cell

Cell wall
SCD

SeaweedFig. 7. Seaweed fermentation process.

Studies on lactic acid fermentation of seaweed期（培養24h 〜日間）に急速に達成された後も，ワ）BCP 平板上では乳酸菌は周囲が黄変する小さなカメ粒子の分解･小型化がわずかずつ進行するためとコロニー，酵母は周囲が非黄変の大きなコロニーを推察された。セルラーゼを低濃度（0 1％〜0 5％）で形成するため，容易に区別して乳酸菌だけを計数す

使用した場合，培養12日目に SCD 生成数が最大になることが可能である。本研究においては，SMA 計

り，最大値はスターター使用の如何に関わらず，セ

数値に対する乳酸菌計数値（BCP 上で計数した乳

ルラーゼ濃度

％以上の場合の最大値

7×10 個 /mL

酸菌数）の割合（％）をもって，乳酸菌の優占度のをむしろ上回った。この理由は不明であるが，セルラ指標とした。一方，試料が腐敗し，混入菌の生育がーゼ濃度が低い場合，SCD の小型化がゆっくり進む

起こった場合には，非好塩性の従属栄養細菌の生育ため，粒径5 8μm を少し超える位の粒子が小型化しが起こっている場合と海藻葉体起源と考えられる好て SCD として計数されなくなる部分の割合が少なか塩性の従属栄養細菌の生育が起こっている場合の二ったという可能性が考えられる。セルラーゼ濃度が高通りが可能性として考えられる。前者の場合には，

いほど最終収率が低めになるという観察がこの考えを上述の乳酸菌の優占度という指標により，乳酸菌の支持する。尚 SCD 粒子数が低下しても SCD の重量割割合の低下として検出することができた。一方，後合はほとんど変化しなかった（Fig. 4，Fig. 6）。

者の場合には，マリンブロス平板（MA）上での計

試料が発酵したか腐敗したかの判断は，官能臭気に数値が高くなるので，SMA 計数値に対する MA 計より簡便に判断できたが，今後科学的な解析を進めて

数値の割合（％）を比較することで検出することがいくためには，客観的な指標が必要である。pH 値は，できた。ただし，その後の観察で Y5201，Y5206両

発酵で生成される乳酸により4 1〜4 2前後まで下がる

株の酵母が MA 上で小さなコロニーを形成しうるので，ある程度の指標として使用できると考えられたことが判明したため，MA 計数値から（Table 11）。しかし官能的に発酵したと考えられる場

加サブロー培地（SBR5％）計数値を差し引いた数合でも pH が5 3までしか下がっていない場合もあり

値を真の非好塩性従属栄養細菌として比較した方（Tableが，合理的と考えられたため，後節の菌相解析から），乳酸生成量も同時に測定した方が乳酸発％ NaCl 添

酵の進行の度合いを評価する上でより好ましいと考えはそうすることとした。

られた。データでは示していないが揮発性塩基性窒素）酵母 Y5201株および Y5206株はともに，MA 平板（VBN）も値を測定して比較したが，VBN の値は，上で小さなコロニーを形成する。従って Table 12

発酵･腐敗の違いにかかわらず，セルラーゼ使用量ににおける好塩性従属栄養微生物（Marine heterotro-

強く相関して値が増加し，発酵・腐敗を判別するため

phic）計数値（=MA 計数値）のうちのかなりの部の指標にはならなかった。

分は酵母の計数値に相当するものと推察される。し一方，発酵が達成されると菌相的に乳酸菌，酵母がたがって，好塩性従属栄養細菌数の真の値は，もっ優占するため，微生物相から発酵・腐敗を判別できなと少ないと考えられた。

いかという視点をもって微生物相の解析を行った。

今回，得られたワカメの単細胞化産物（SCD）は，

第 章において，海藻発酵試料中の微生物相の解析

粒径が微細藻類とほぼ同じ（5 8〜11 5μm）であるたを行った際，発酵した試料においては，直顕法によるめ，水産初期餌料としての利用が期待できる。ワカメ

計数値が寒天平板法による計数値とほぼ一致する傾向の SCD 粒子の産生濃度はを認めたため，今回の微生物相の解析は，寒天平板法

粒子サイズが近似している微細藻類餌料の場合と比較だけで行った。第 章と今節での寒天平板法による解

すると，イソクリシス（×10 7 個 /mL であった。
aﬀ.

）で

7

，パブロバ
×10 cells/mL（ 鳥 羽， 深 山，1993）

析の結果から経験されたことで，今後，微生物生菌数〜のデータを解析する場合に有用と思われる知見を以下（にまとめる：

Tatsuzawa and Takizawa，1995），テトラセルミス）で×10 6 cells/mL（瀬古，1984；）で×10 6 cells/mL（岡内，）発酵した試料においては，乳酸菌 B5201株，酵母（

Y5201株および Y5206株が優占し，混入菌の生育が1988）であり，これらの2 5〜17倍に相当する。また，抑制される。

培養に光，エアレーション等を必要としないなど培養）乳酸菌（B5201株），酵母（Y5201株および Y5206

条件の面で有利な点が多い。特に温度管理も厳密なも株）とも標準寒天培地（SMA），BCP 加プレートのを要求されない点は微細藻類餌料の場合に比べ大きカウントアガール（BCP）培地上にコロニーを形成な長所である。今後は大量培養の検討，保存性の確認，する。したがって，発酵した試料の場合，SMA 計

餌料効果の検証等をしていくことが必要と考えられ

数値と BCP 計数値は，ほぼ一致する。

る。餌飼料としての利用を考えた場合，畜産における内田 基晴サイレージ飼料のように植物性の素材を乳酸発酵させーゼ（R-10，ヤクルト本社）10 0g を添加し，よく混て利用している例は，著者の知る限り水産飼料の分野合した。これに微生物混液をスターターとして加えにおいてはない。特に，海藻を原料としていることかた。微生物混液は，乳酸菌

ら粗放的な増養殖環境での利用も考えられ，著者は，

株（FERM BP-7301）， 酵 母

今回開発した餌飼料素材をマリンサイレージと呼ぶこvar.

ととした。乳酸菌，

属細菌，酵母などの微生

B5201

Y5201 株（FERM BP-7302），
Y5206株（FERM BP-7303） の菌株で物が水産生物の生育に対して良い効果をもたらしたり

調 製 し た。 乳 酸 菌 は MRS broth（Merck），酵母は（Gatesoupe，1999；Rengpipat

YM broth（Difco）でそれぞれ前培養した後，菌体を.，1998；Ringo

and Gatesoupe，1998），病原菌の抑制に対して有効遠心回収し，滅菌0 85％ NaCl 水でに働く（Filho-lima.，2000）との科学的知見が近に OD660nm=1 0の濃度で懸濁した。これらの懸濁液を

年集積しつつある。本研究で開発された素材も，乳酸，Y5201株100mL（5 5B5201株100mL（5 0×1010 CFU）

菌，酵母を利用して調製しており，プロバイオティク

×10 7 CFU），Y5206株10mL（1 2×10 8 CFU）を加えてス方面での機能性の有無についても検証していく価値

微生物混液とした。発酵試料は，スクリューキャップが充分にあると思われる。

を閉めた状態で，20℃で静置培養した。非常に濃い基回洗浄後，同液

質濃度で調製したため，調製直後には一部ダマができていたため，最初の第 節 大量調製，保存性の検証
第節において，市販ワカメ粉末を利用して，単週間は日に数回手で振とう処理をおこない，ダマの解消を図った。

細胞化・乳酸発酵させることの条件検討がなされ，低コストで新たな水産飼料素材であるマリンサイレージ

発酵試料の性状分析（MS）が大量安定生産できることが示された。今後，

ワカメ分解産物の粒子数および粒度分布は，コールMS の実用化向けては，大量生産の検討，保存性の検

ターマルチサイザーⅡ（Coulter Electronics）で140証をしていくことが必要と考えられた。

μm オリフィスを使用して測定した。直径5 8-11 5μ

そこで，前節で200mL 規模で行なった MS の調製を今回10L 規模で実施することとした。使用するセル

m 画分の粒子を単細胞性粒子（SCD）とみなして粒子数と体積割合（％）を比較した。

ラーゼの使用量は，前節においてスターターを使用し従属栄養微生物の計数は，標準寒天培地（SMA とた場合に0 25％（w/v）まで低くしても安定に乳酸発

標記，日水製薬）で行った（乳酸菌，酵母も計数され酵が達成できることが示された。実用化に向けては，る）。好塩性従属栄養微生物の計数は，1 5％寒天添加

コストの面から酵素使用量をさらに低くすることが好Marine broth 2216（MA，Difco）で行った（酵母もましい。海藻単細胞化粒子（SCD）の生成量からいえ計数される。乳酸菌は，通常計数されない）。乳酸菌

ばセルラーゼを0 1％まで少なくしても SCD の最終収の計数は，BCP 加プレートカウントアガール（BCP，量には大きく影響しないことが確認されている（Fig.

日水製薬）で行い，直径の大きい酵母のコロニーを

4）。そこで本節では，セルラーゼ濃度を0 1％として除外した残りの全細菌のコロニー数を表記するとと試験を実施した。また基質ワカメの懸濁濃度は，前節もに，そのうち周辺が黄変したコロニーを乳酸菌としでの検討において分析のためのサンプリングを円滑にて乳酸菌の割合（％）を計算した。酵母の計数は，実施するために

NaCl を％濃度（w/v）での調製が最適とし％濃度で添加したサブロー寒天培地（SBR5，

たが，本節ではやはり実用化の観点からコスト要素を日水製薬）で行った。酵母については，前節同様，コ

重視し，懸濁可能な最大濃度である10％で実施した。

ロニーの形態的特徴から Y5201型と Y5206型とを区別

また得られた発酵産物について18ヶ月間の保存試験をして計数し，全酵母数に対する Y5201型のコロニーの実施した。

割合（％）を記載した。コロニーの計数は，枚組の寒天平板で行ない，平均値で示した。
材料と方法
結

果

発酵試料の調製
発酵試料の調製は，10L 容のポリカーボネート製ボトル（Nalgene）をオートクレーブ滅菌して使用した。

大量調製と保存性の検討
試料を経時的に分取して測定した性状分析の結果をL を入れ，市販ワ

Table 13に，体積粒度分布の測定結果を Fig. 8に示す。

カメ粉末（若みどり，理研ビタミン） kg とセルラ

培養開始時には乳酸が検出されず（<0 1g/L），pH

ボトルに3 3％濃度の滅菌 NaCl 水Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Fig. 8. Time course change of the volume distribution of Undaria products.

㪏㪌

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養開始時に SCD 画分（2 9〜11 5μm）の粒子数は3 8

㪌㪍㪅㪉

㪇
㪌㪇㪅㪋

で5 4g/L（D/L：2 1/3 3）とほぼ一定で推移した。培

㪉㪇
㪋㪋㪅㪎

日 目 で5 7g/L（D/L：1 9/3 8） を 記 録 し，18ヶ 月㪠㫅㫀㫋㫀㪸㫃

㪋㪇㪊㪏㪅㪐

が，18ヶ月目には4 3とやや上昇した。乳酸生成量は，

㪍㪇

㪊㪊㪅㪈

ヶ月目で4 1まで低下し安定した㪉㪎㪅㪋

えられた。pH 値は㪉㪈㪅㪍㪭㫆㫃㫌㫄㪼㩷㪻㫀㫊㫋㫉㫀㪹㫌㫋㫀㫆㫅㩷㩿㩼㪀株によるヘテロ型の乳酸発酵がおこっているものと考㪈㪌㪅㪏

日目にかけて㪋㪅㪊日目からガスの発生と pH 値の低下が観察され，乳酸菌 B5201

㪈㪇㪅㪈

値が6 4であったが，培養㪧㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㩷㪻㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㩷㩿㱘㫄㪀×10 7 cells/mL（体積割合2 3％）であったが，培養

㪎㪐㪅㪊

㪎㪊㪅㪌

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㪌㪍㪅㪉

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㪋㪋㪅㪎

㪊㪏㪅㪐

移した。

㪊㪊㪅㪈

2 5×10 8 cells/mL（体積割合87 3％）とほぼ一定で推㪉㪎㪅㪋cells/mL（体積割合93 1％），培養18ヶ月目に粒子数㪉㪈㪅㪍

ヶ月目に粒子数2 6×10 8

㪘㪽㫋㪼㫉㩷㪏㩷㪻㪸㫐㫊㪈㪌㪅㪏

（体積割合90 5％）
，培養

㪍㪇
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㪋㪇
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㪉㪇
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㪇
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ヶ月目に粒子数3 7×10 8 cells/mL

㪈㪇㪅㪈と増加し，培養㪭㫆㫃㫌㫄㪼㩷㪻㫀㫊㫋㫉㫀㪹㫌㫋㫀㫆㫅㩷㩿㩼㪀日目に粒子数1 1×10 8 cells/mL（体積割合53 8％）へ

㪧㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㩷㪻㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㩷㩿㱘㫄㪀

培養開始時のスターター投入前の生菌数は，一般

㪏㪌

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㪌㪍㪅㪉

㪌㪇㪅㪋

たが，乳酸菌のコロニーはそのうちの23 7％（1 4×

㪋㪋㪅㪎

㪇
㪊㪏㪅㪐

5 9×10 8 CFU/mL で，平板計数値の中で最大を示し

㪉㪇
㪊㪊㪅㪈

日目においては，BCP 計数値が㪉㪎㪅㪋㪧㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㩷㪻㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㩷㩿㱘㫄㪀

雑菌の混在が示唆された。酵母は，
10 8 CFU/mL）で，

㪎㪐㪅㪊

㪎㪊㪅㪌

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㪌㪇㪅㪋

㪋㪋㪅㪎

㪊㪏㪅㪐

が好塩性従属栄養細菌の計数値と考えられた。 日目㪇㪉㪎㪅㪋

が酵母であると仮定すると，残り9 5×10 7 CFU/mL

㪉㪇
㪉㪈㪅㪍

×10 8 CFU/mL であり，このうちの3 5×10 7 CFU/mL㪘㪽㫋㪼㫉 㪈㪏 㫄㫆㫅㫋㪿㫊

㪋㪇

㪈㪌㪅㪏

た。好塩性従属栄養微生物のみかけの計数値は，1 3

㪍㪇

㪋㪅㪊

型，13 5％が Y5206型であり，Y5201型が優占してい㪈㪇㪅㪈㪭㫆㫃㫌㫄㪼㩷㪻㫀㫊㫋㫉㫀㪹㫌㫋㫀㫆㫅㩷㩿㩼㪀

3 5×10 7 CFU/mL であり，そのうち76 9％が Y5201

㪊㪊㪅㪈

CFU/mL）。培養㪘㪽㫋㪼㫉㩷㪍㩷㫄㫆㫅㫋㪿㫊

㪋㪇

㪉㪈㪅㪍

値）とも検出されないレベルであった（<10 〜 <10

4

㪈㪌㪅㪏

3

㪍㪇

㪋㪅㪊

計数値）
，好塩性従属栄養微生物（MA 計数

㪈㪇㪅㪈

（SBR

㪭㫆㫃㫌㫄㪼㩷㪻㫀㫊㫋㫉㫀㪹㫌㫋㫀㫆㫅㩷㩿㩼㪀

生菌数（SMA 計数値），乳酸菌（BCP 計数値）
，酵母㪧㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㩷㪻㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㩷㩿㱘㫄㪀
Table 13. Time course change of the characteristics of fermented Undariaproducts㪚㪿㪸㫉㪸㪺㫋㪼㫉㫀㫊㫀㫋㫀㪺㫊㪞㪸㫊㩷㫇㫉㫆㪻㫌㪺㫋㫀㫆㫅㫇㪟㪣㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩷㩿㪛㪄㪆㪣㪄㪃㩷㪾㪆㪣㪀㪧㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㫊㩷㫀㫅㩷㪸㩷㪉㪅㪐㪄㪈㪈㪅㪌㱘㫄㩷㪽㫉㪸㪺㫋㫀㫆㫅㩷㩷㩷㪥㫌㫄㪹㪼㫉㫊㩷㩿㪺㪼㫃㫃㫊㪆㫄㪣㪀㩷㩷㩷㩿㪧㫉㫆㫇㫆㫉㫋㫀㫆㫅㩷㫆㫅㩷㫍㫆㫃㫌㫄㪼㩷㪹㪸㫊㫀㫊㪃㩷㩼䋩㪤㫀㪺㫉㫆㪹㫀㪸㫃㩷㪺㫆㫌㫅㫋㫊㩷㩿㪚㪝㪬㪆㫄㪣㪀㩷㩷㫆㫅㪠㫅㫀㫋㫀㪸㫃
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れるが，これは基質濃度をによる計数を省略した。 ヶ月目および18ヶ月目とげたことの影響が出て，発酵に関与する微生物が優も BCP 平板上のコロニーは，全て乳酸菌のコロニー占化するのに少し長めの時間を要したと解釈された。

6で，菌数的にはそれぞれ2 2×10 CFU/mL および7 95倍にして，酵素濃度を下しかし，徐々に乳酸菌・酵母の優占率が高まり，培養×10 CFU/mL と徐々に減少傾向にあった。同時期のヶ月目および18ヶ月目の測定においては，BCP 平

酵母の計数値は，それぞれ1 4×10 5 CFU/mL および板上のコロニーは全て乳酸菌とみなされるコロニー

4 7×10 5 CFU/mL で，全て Y5206型で占められていで占められていた。MA 計数値から SBR5計数値を差た。MA 計数値から SBR

計数値を差し引いた好塩

し引いた好塩性従属栄養細菌の計数値は， ヶ月目お性従属栄養細菌の計算上の数値は， ヶ月目および18

よび18ヶ月目でそれぞれ1 1×10 5 CFU/mL および8 0

ヶ月目でそれぞれ1 1×10 5 CFU/mL および8 0×10 4

×10 4 CFU/mL と見積もられたが，平板上のコロニー

CFU/mL であった。

の外観が均一であったことから，種類の微生物が優占していると考えられ，これらのコロニーを数個とっ考察て顕微鏡で観察した結果，全て酵母のコロニーであった。したがって，ヶ月目から18ヶ月目にかけての好ワカメを基質にして，単細胞化・乳酸発酵させるた

塩性従属栄養細菌の生菌数レベルは，検出レベル以下

めの培養条件の検討を10L 規模でおこなった。前節で（<10 4 CFU/mL）であったと考えられた。尚データでの200mL 規模での検討と同様，発酵は順調に達成さは示していないが，次節で開発された菌種特異的プラれた。前節での検討において好適とされた培養条件にイマーを使用した方法により，18ヶ月経過した試料か比べ，基質濃度を ％から10％へ，セルラーゼ濃度をら乳酸菌株を10株無作為に分離し，菌種同定したとこ

0 25％から0 1％へと変更したことにより，さらに低ろ，10株全てがコスト生産が可能になった。得られた SCD 画分の粒認され，菌種レベルでも微生物相的に安定に保たれて子数は最大で3 7×10 8 cells/mL（体積割合90 5％）のいることが確認された。

であることが確濃度で得られ，保存期間中も粒子数は，横這いか微減

以上，
10L 規模での高濃度での海藻発酵飼料素材（マで推移した。ほぼ粒子サイズが等しい微細藻類餌料のリンサイレージ）の生産が可能であることが示された。

場合と比較すると，イソクリシス（

保存性についても，20℃下で18ヶ月間の間，飼料とし

aﬀ.

，）で 〜 ×10 7 cells/mL（鳥羽，深山，1993）6て有効な SCD 画分（直径2 9〜11 5μm）の粒子数は，（瀬古，）
で ×10 cells/mL

ほぼ一定に保たれ，微生物的にも混入菌の生育なく保1984；Tatsuzawa and Takizawa，1995），テトラセ

たれることが示され，良好な保存性を有する飼料素材）で ×10 6 cells/mL（岡であると考えられた。尚，長期保存したマリンサイレ

内，1988）であり，これらの18 5〜123倍に相当し，ージが飼料価値を有するかどうかについては，本節で微細藻類の培養に比べて遥かに高濃度で餌飼料粒子を調製された試料を使用し，第生産できることが示された。尚，前節では，粒径5 6

コヤガイ初期稚貝への飼料試験を実施する（Uchida

パブロバ（
ルミス（

〜11 5μm 画分を SCD 画分としたが，本節では18ヶ章第節において，ア, 2004a）。

月という長期間での試験をするにあたり SCD の粒径が徐々に小型化することを考慮して，粒径2 9〜11 5

第μm 画分を SCD 画分とした。これに伴い本節では乳章

発酵スターターとしての使用に適した微生物の検討

酸菌もしくは酵母の細胞の一部が SCD 粒子として計数されている可能性がある。前節においてワカメ基質

第 節 PCR 法を用いた菌種同定･検出技術の開発

濃度

第 項 菌種特異的プライマーを用いた同定・検出％で検討した場合，SCD の最大生成濃度が5‑7
7（Fig. 4）であった。
×10 cells/mL で重量割合が67 3％
本節ではワカメ基質濃度10％での検討であるから，最大生成濃度はこれの倍の1‑1 4×10 8 cells/mL，重量第章において海藻の発酵スターターとして使用できる微生物コンソーシアムが得られ，海藻の乳酸発酵技術が開発された。第章においては，発酵試（体積）割合は前節と同じ67 3％程度が真の値である料の基質濃度，塩分濃度，培養温度等，物理化学的なと推定され，これを上回る部分が微生物細胞の計数に面での発酵条件の検討がされた（Uchida and Murata,

よるものである可能性がある。

2002）。海藻の乳酸発酵技術の確立に向けては，さら微生物相の解析結果では，培養日目の生菌数測定にスターターとして使用する微生物についての検討を

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
おこなうことが重要である。これまで 種類の微生物となった場合とを区別できる方法を考案する必要があをスターターとして投入し，芳香を発生すること，乳ると考えられた。このような必要性から，16S rDNA

酸菌・酵母が優占すること，乳酸が生成され pH が低のユニバーサルプライマーセット（27F, 1492R）と下することを指標として発酵の過程を評価してきた。

本の菌種特異的プライマーを組み合わせた Multiplex-

しかし，投入した微生物がスターターとして正常にPCR 法により，乳酸菌を菌種特異的に検出する方法

機能しているかどうか判断するには，発酵培養後の試を検討した。

料において，投入した微生物が優占していることを確認すべきと考えられる。また，スターターとして使用

方

法

する乳酸菌･酵母の組み合わせや種類を変えてみるな
ど様々な検討項目が考えられる。このような検討を加プライマーの設計

えるには，海藻発酵試料中の微生物相をできるだけ迅

以下の乳酸菌11種について菌種特異的プライマー

速かつ簡便にモニタリングする技術の開発が必要となの設計を検討するため，まず各菌種について DDBJ/る。微生物相を菌種もしくは株レベルで識別して検出

GenBank/EMBL データベースから16S rDNA の塩基するために近年，PCR 法を用いた様々なタイピング

配列情報を１件ずつ収集した：の手法が開発されてきている。乳酸菌のタイピングを（AB070607），（AF323677），

検討した例としては，16S rRNA 遺伝子（16S rDNA）（AJ272201）,

を標的とした菌種特異的プライマ−を用いる方法（Matsuki.，1998；Walter.，2001；Wang.，2000；Walter

イマ−を用いる方法（Song
ピング法（Tynkkynen（AY196979），（M58802），.，1996； 渡 辺 ら，1999），

16S-23S rRNA ITS 領域を標的とした菌種特異的プラ（Tynkkynen（AF243146）,（AB024300），（X61142），（M58814），.，2000），リボタイ（X68418），.，1999），PCR-RAPD 法（X95978）。次に Clustal W（Thompson，.，1999），パルスフィールドゲル電

1994）を使用して，上記塩基配列を多重整列し比較し

気 泳 動 法（Tankskanen.，1990；Tynkkynen

た。

.，1999）を使用する方法等が報告されている。本項

および

の場合は，

では，スターターとして使用した乳酸菌が発酵試料

原則として V 領域に逆向きに菌種特異的プライマ−中に優占しているか否か調べるために，比較的簡便でを設計した。

再現性の高い方法として，生菌数の計数に用いた寒天ては渡辺ら（1999）の設計したプライマーを使用した。

subsp.

につい平板上のコロニーを無作為に一定の株数だけ分離し，については，V

これらの株について16S rDNA を標的とした菌種特異異的部位がなかったので V 領域に設計した。これら的プライマ−を用いてタイピングする方法を検討するの菌種特異的プライマーはユニバーサルプライマーセ

領域に適当な特こととした。これまで報告された16S rDNA を標的とット（27F and 1492R）（Weisburg，
1991）と組み合わした菌種特異的プライマ−を用いる方法（Matsuki

せて使用した。

.，1999；Walter
Wang.，2000；Walter.，2001；.，1996；渡辺ら，1998）では，通常およびについては菌特異的部位が見つからなかったので準特本

異的部位 箇所を標的とする渡辺らの設計したプライセットの種特異的プライマーを設計してタイピング

マーを使用した。設計されたプライマーは BLAST 検に使用している。この方法を著者が試したところ，菌索により DDBJ/GenBank/EMBL データベース内で種が適合しなくて PCR 産物のバンドが得られない本種特異的であることを確認した。

来の陰性の場合の外に，鋳型 DNA の品質に問題があって PCR 産物が得られなかったと疑われる事例をし

菌株

ばしば経験した。菌相解析を行う場合，多くの菌株検実験に使用した菌株（

体をタイピングしなければならないため，PCR 増幅

YIT 0102 T ,のための鋳型 DNA の抽出法は，簡便な方法を採用しIAM 12477 T ,IFO15883 T ,T

なければならず，鋳型 DNA の品質が不充分になるこ

IAM 12473 ,とがありうることを前提として解析手法を開発するこYIT 0222 T ,とが必要であると考えた。そこで，検体が本当に陰性

subsp.

の場合と PCR 増幅の実行に問題があったために陰性

IFO 12005,
IAM 1118 T ,IFO 13951 T ,YIT 0081 T ,YIT 0181 T ,YIT 2094,

IAM内田 基晴13004 T ）の入手先は以下のとおりである：発酵研究ーと所（IFO，大阪），ヤクルト本社中央研究所（YIT，法の場合，標的遺伝子を含まない鋳型 DNA を対象と

東京）
， 分 子 細 胞 生 化 学 研 究 所（IAM， 東 京 ）。

して PCR 増幅を行った場合には，1 5kb だけの PCR

B5201株と組のユニバーサルプライマーセットを用いる方

B5406株は，著者の研究室産物が得られていることが電気泳動で確認された（デで分離された菌株で中央水産研究所（FRA，神奈川）ータを示さず）。したがって，PCR 産物が電気泳動ににそれぞれ菌株番号 FRA 000033および FRA 000035

よりとして寄託されてある（内田ら，2004）。

とうまくいってないなど別のところで問題があったと考して使用した IFO15883 T 株は，16S rDNA 遺伝子配え，結果をやり直すかあるいは除外して解析するべき列（と考えられた。

27-338番塩基部位）を著者の実験室で決定した結果，（型であったため，本も確認されない場合は，鋳型 DNA の調製が次に11種14菌株を対象として，プライマーの特異） と 記 載 し た。 乳 酸 菌 株 は，MRS（Merck）−1 5％ 寒天平板で培養した。

性 を 試 験 し た 結 果 を Table 15に 示 す。 プ ラ イ マ ー
B5201R1は，アニーリング温度を58℃にすることにより，菌種特異的に反応した。被検菌株のうち，IFO 15883 T に つ い て は，PCR 反応条件
菌 体 DNA の 抽 出 は，30μL の TE バ ッ フ ァ ー に特異的プラ

イマーに反応せず，

特異的プライマー

少量の菌体を懸濁させ，94℃で15分間加熱することに反応した。しかし，実験に使用したこの菌株の16Sで行い，加熱後の遠心（12000rpm，10分）上清

rDNA の部分塩基配列（大腸菌の27-338番めの塩基部

μL を鋳型 DNA として使用した。PCR 増幅は，MgCl2
mM, dNTP 混液 各200μ M, 鋳型 DNA

μL, プラ位）を決定した結果，の塩基配列と一致した。従って，プライマー LplanR1および LbC

イマー各1 0μM, DNA ポリメレース（Ex Taq, 宝酒は造）2 5U を含む100μl の反応液を添付バッファを用応したと考えられた。LbC

いて調製して行った。PCR の反応条件は，94℃で反応したが，痕跡程度のバンドであるため，判断の分保持後94℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃ 30秒を30サイク

支障はなかった。プライマー LbR

は，アニーリン

ル行い，最後に72℃で 分保持した。プライマーが充グ温度を58℃にすることにより，

の一部およ

および

に対して特異的に反
は，

の

株と

分な特異性を示さない場合には，アニーリング温度を56℃−60℃の範囲で‑℃刻みで変化させて特異性を検討した。増幅産物は，％アガロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロミドで染色して観察した。
結

果

各菌種について，菌種特異的プライマーとともに考案された検出のためのプライマーセットを Table 14に示す。

本の（準）特異的プライマーセット（LbC

/LCBC

, LbR

/LbR

, LbZ

/LCBC

）を用いて PCR 増幅を行った場合，もし鋳型 DNA
が 標 的 DNA を 含 ん で い た 場 合，0 35kb 0 45kb サ
イズの本の PCR 産物が得られた（Fig. 9, Lanes 5,6, 7, 8）。また，本の特異的プライマー（B5201R1,

LplanR1, LacidR1, LkfrR1, LferR1, LbD
LmenR1）と, STR,組のユニバーサルプライマーセットを用いて PCR 増幅を行った場合，もし鋳型 DNA が標
的 DNA を含んでいた場合，約0 5kb（STR-1の場合
のみ0 2kb）サイズと1 5kb の本の PCR 産物が得られた（Lanes 1, 2, 11, 14）。ただし，この場合1 5kb のバンドが，しばしば肉眼で観察されない場合も多かった（Lanes 3, 4, 9, 10, 12, 13）。 本の特異的プライマ

Fig. 9. PCR products for 11 species（14 strains）
of lactic acid bacteria with their speciﬁc primers.
Lanes: M; DNA size markers (sizes are shown to theleft), 1;
B5201, 2;
IFO12005, 3;
YIT 0102 T , 4;
IAM 12477 T ,T
5;IFO 15883 , 6; L. casei B5406, 7;
IAM 12477 T , 8;
IAM 12473 T , 9;T
IFO 13951 , 10;
YIT 0222 T , 11;
T
YIT 0081 , 12;
subsp.
YIT 0181 T , 13;
YIT 2094 T ,14;
IAM 13004 T . The PCR product of the lane 13 is shown with arrow to help visualobservation.

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 14. 16S rRNA-targeted speciﬁc primer sets for lactic acid bacteria㪫㪸㫉㪾㪼㫋㩷㫊㫇㪼㪺㫀㪼㫊㪧㫉㫀㫄㪼㫉

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Table 15.

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Reaction of PCR ampliﬁcation with 16S rRNA-targeted species-speciﬁc primer set㪩㪼㪸㪺㫋㫀㫆㫅㩷㫎㫀㫋㪿㩷㫋㪿㪼㩷㫊㫇㪼㪺㫀㪼㫊㪄㫊㫇㪼㪺㫀㪽㫀㪺㩷㫇㫉㫀㫄㪼㫉㩷㫊㪼㫋㪙㪌㪉㪇㪈㪩㪈 㪣㫇㫃㪸㫅㪩㪈
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内田 基晴びとの交雑反応を少なくし，PCR 産物のバ

（PCR-RAPD 法）
による酵母の同定・検出を検討する。

ンドの太さから区別することが可能であった。プラ
イマー LbZ

および LmenR1は特異的に反応した。

LacidR1および LbD

第 項 PCR-RAPD 法による同定・検出お

第１項において16S rRNA 遺伝子（16S rDNA）をと反応し，両者標的とした菌種特異的プライマ−を用いて，海藻発を区別することはできなかったが，その他の菌種に対酵試料中の乳酸菌を菌種レベルで検出する方法を開しては，反応しなかった。LkfrR1は，発した。しかし，酵母については，18S rRNA 遺伝子

およびと交雑反応したため，アニーリング温を標的とした菌種特異的プライマ−の設計は困難で度を58℃にしてみたが，充分に結果が改善されなかっあった。また上記の方法では，菌種ごとにプライマーた。そこで LbRを使用して PCR 増幅を行い，交を用意しなければならないという欠点がある。一方，を特異的に検出できると考PCR‑RAPD 法（Welsh and McClelland，1990）は，

よび

は，ともに

subsp.

雑検定することでえ ら れ た。LferR1は，および程度であった。STR

subsp.

任意の合成プライマーを使用して PCR 増幅を行うこと交雑反応したが，痕跡とができ，また種もしくは株レベルでのより下位のタはと交雑

イピングに使用できる可能性がある。

反応したが，痕跡程度であった。痕跡程度の交雑を示

本節では，市販の合成プライマーを使用して PCR‑

したものについては，交雑反応が疑われる種に対する

RAPD 法により，海藻発酵試料から分離される乳酸

特異的プライマーで交雑検定することで問題が解決す

菌および酵母をタイピングすることを検討した。
まず，ると考えられた。

スターターとして使用する

種類の微生物を識別できるかどうかを基準にプライマー候補を選択し，次に選考察択されたプライマーを用いて，乳酸菌および酵母の参照株を識別できるかどうか検証した。

海藻発酵試料中の乳酸菌相を種レベルで特定するため，菌種特異的プライマーを開発した。今回のプラ方

法

イマーを使用して以下の手順で細菌相を解析することができる。まず，標準寒天培地（SMA）を使用して合成プライマー

一般生菌数を計数する。次に SMA 上に形成されたコ

市販合成プライマー 12mer

ロニーを無作為に10個もしくは20個程度釣菌し，BCP

ー A01〜08，ベックス），10mer

加プレートカウントアガー（BCP）に移植する。BCP

オペロン社）および OPA上に形成されたコロニーの周辺が黄変したものを乳酸について検討した（P

種（コモンプライマ種（OPA-01〜08,

を改変した OPA-03-C〜 P16, Table 16）。

菌とみなし，一般生菌数中に占める乳酸菌の割合（％）
を算出する。さらに，黄変したコロニーを白金耳で採菌

株

り，TE バッファーに懸濁させ，菌体 DNA を加熱抽

以 下 の 菌 株 を 被 験 使 用 し た：

出する。この菌体溶解液の遠心上清FRA 000033（B5201 株）,

μL を PCR 反応の鋳型 DNA として使用し，各菌種特異的プライマ

IAM 1318,
IFO 12005,

海藻発酵試料中の細菌相に関して，乳酸菌の優占度と（=ATCC 12477）,-type）, IFO 15883 T ,（IAM1118 T ,種 特 異 的 プ ラ イマーを設計することを試 み た が，

IAM 12473 T ,IFO 13951 T ,DDBJ/GenBank/EMBL データベースから18S rDNA
T

YIT 0222 （=NRIC 1693）,の塩基配列情報を収集して検討したところ，18S rD-，
YIT 0081 T （=ATCC 14931）

NA の塩基配列の多様性が乏しく，種を識別するのは

subsp.

/D

領域が酵母の系統解析に有効とされ（Kurtzman and

IAM 12477 T ,FRA 000035（B5406 株）,

特定の菌種の優占度を明らかにすることができる。

困難であった。近年，26S rRNA 遺伝子の D

IFO 3960,
YIT 0102 Tーを用いて検査する。以上の手順を踏むことにより，酵母についても同様に18S rDNA を標的として菌11842）,

YIT 0181 T （=ATCC
YIT 2094, andIAM 13004 T ,Robnett，1998），塩基配列情報が充実してきたため，
var.

この部分を標的としてプライマーを設計することが考えられるが，本研究においては検討せず，次節で別法IAM 1082,

株）,

IAM 12209,

FRA 000046（Y5201
IAM 12834,

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 16. List of arbitrary synthesized primers tested for the PCR-RAPD analysis

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㩷㩷㪌㩾㪄㪘㪞㪫㪚㪘㪞㪚㪚㪘㪄㪊㩾

IAM 12837,

IAM 12838,

㪧㫉㫆㪻㫌㪺㫋㩷㪥㪸㫄㪼㪪㪼㫈㫌㪼㫅㪺㪼

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（Ta）はプライマーの Tm 値を参考に Table 14に示

sp FRA 000047（Y5206 株）,

した範囲で，温度を変えて PCR 増幅を行い，結果がIAM 12204,

良かったものを写真で示した。増幅産物は， ％アガ

JCM 1627,
IAM 4512,

Yakult,IFO 1213,

strainIFO 1517.

ロースゲルで電気泳動し，エチジウムブロミドで染色して観察した。
結菌体 DNA の調製

果

最初に P 〜 P16までのプライマーを使用して PCR
増幅の結果を比較した実験においては， 菌株（B5201

P〜 P16ま で の プ ラ イ マ ー を 使 用 し て，菌株

株 , Y5201株 , Y5206株）の菌体 DNA を市販キット（B5201, Y5201, Y5206） の 菌 体 DNA を 鋳 型 に し て（Gen とるくん，タカラ）を使用して，プロトコール

PCR 増幅を行った結果，Pに従って調製した。次にプライマーを OPA-03もしくのプライマーともアニーリング温度を35℃に設定したは OPA-03-C に絞り込んで，乳酸菌および酵母の基準

場合が，増幅産物が多く，バンドも明確であったため，株を対象として検出特異性を確認する実験において35℃での結果をまとめて Fig. 10に示した。全体的には，熱水抽出法により菌体 DNA を調製した。熱水抽

乳酸菌 B5201株の DNA を鋳型に使用した場合（レー

出法は，平板上のコロニーを，30μL の TE バッファン a）のバンドが少ない傾向にあった。P

ーに少量の菌体を懸濁させ，94℃で15分間加熱するこでの結果を見て，とで行い，加熱後の遠心（12000rpm，る P11（OPA-03）をプライマー候補として選択した。

分）上清

μL を鋳型 DNA として使用した。菌体の前培養は，

〜P

および P

〜 P16

〜 P16ま菌株とも複数のバンドが確認でき

次に，スターター

菌株に対して，一番結果の良乳酸菌株は，MRS（Merck）−1 5％ 寒天平板で，酵かったプライマー OPA-03を使用して，乳酸菌13株を母は，サブロー寒天培地で行った。

対象として PCR 増幅を行い比較した（Fig. 11）。実際に海藻試料中の細菌相を分析する場合には多数の菌株検体を取り扱わなければならないと想定される。そこ

PCR 反応条件
mM, dNTP 混液 各200μM,

で，今回の検討では，簡便な熱水抽出法により調製しμL, プライマー 各1 0μM, DNA ポリメ

た DNA を鋳型に使用したところ，B5201株についてレース（Ex Taq, 宝酒造 , 東京）2 5 U を含む100μL

Fig. 10で見られたような増幅産物のバンドが観察さの反応液を酵素製品に添付されたバッファーを用いてれなかった。また同じ調製して行った。PCR の反応条件は，94℃で分保場合も同様に増幅産物のバンドが観察されなかった。

持後94℃ 20秒 , Ta℃ 20秒，72℃ 30秒を30サイクル

B5201株については，確認のため再度 DNA の熱水抽行い，最後に72℃で 分保持した。アニーリング温度出を行い，同様の PCR 増幅を行ったが，結果は同じ

PCR 増幅は，MgCl2
鋳型 DNA

株の IAM 12005株の内田 基晴であった（結果を示さず）。一方，増幅産物が得られグ温度は，25℃，30℃，33℃で試し，最も結果の良たレーン

株のバンドパターンを，かった30℃での結果を Fig. 12に示した。プライマー

Fig. 10で観察された B5201株のバンドパターンと比OPA-03を使用した場合に比べ，バンド数が増えるな

較すると，約2 5kb，2 3kb，1 6kb のど，結果が改善されたが，依然として，の共通に観察され，本のバンドがを種レベルでタイプ分け

できているものと考えられた。一方，レーンのIAM 1082株の場合には，他の株にみられない約0 6kb のバンドが見られ，また2 5kb およの菌体 DNA を鋳型として増幅産物のバンドを得られなかったため（レーン， ），解析手法として不十分と判断された。
次にプライマー OPA-03を使用して，酵母の基準の株の株を対象に PCR を行った結果を Fig. 13に示す。鋳場合と若干異なっており，菌株の違いによる差異を検型 DNA は，熱水抽出法により得た菌体 DNA を使用

出することもできる場合があることを示唆した。しかした。参照株とした

し，鋳型 DNA の抽出条件が変わることにより，増幅にかけてバンドが得られないことがあるなど，結果の判定に不一方，Y5201株の場合（レーン

安定な要素があり，実用上問題があると考えられた。

ンドのうち上の 本と一番下の 本の計 本或いは上

熱水抽出法により調製した DNA を鋳型とすると，の 本と下の 本の計 本が一致しているようにも見び2 3kb の本のバンドの位置もレーン，

株は2 3kb から1 3kb

本のバンドを形成した（レーン
）は，上記

〜

）
。

本のバ

プライマー OPA-03を使用しても，PCR 増幅産物のバられるが， kb 付近とンド数が充分得られない場合もあるため，このプライ本観察され，参照株とは明確に区別された。Y5206株

マーの3 末端をは，18S rRNA 遺伝子の塩基配列に基づいた系統解析塩基削ったプライマー OPA-03-C を合成し，同様に PCR-RAPD 法を試した。アニーリンの結果からは，kb 付近にも別のバンドがに近縁であると

Fig. 10. PCR products obtained with primers P1 〜 P16. Total DNAs were prepared from
B5201（a）,
var.
Y5201（b）andsp. Y5206（c）using a commercial kit（Gentoru-kun）and used as templates for the PCR ampliﬁcation. Lanes M: DNA size markers.

Studies on lactic acid fermentation of seaweed

Fig. 11. PCR products for 10 species of lactic acid bacteria with a primer P11（OPA-03）. Lanes: M; DNA size
markers（sizes are shown to the left）, ;B5201, ;B5406, ;IAM 1082, 4;
IAM 1318, ;IFO 3960, ;IFO 12005, ;IAM 12477 T , ;IAM
12477 T , ;IAM 12473 T , 10;
IFO 13951 T .

Fig. 12. PCR products for 11 species（14 strains）of lactic acid bacteria with a primer P17（OPA-03-C）. Lanes:
M; DNA size markers（sizes are shown to the left）, ;B5201, ;IFO 12005, ;YIT 0102, ;IAM 12477 T;
IFO 15883 T , ;B5406, ;IAM
TT
12477 , ;IAM 12473 , ;IFO 13951T, 10;
YIT 0222 T , 11;
YIT
subsp.
YIT 0181 T , 13;
YIT 2094 T , 14;0081 T , 12;
IAM 13004 T .

Fig. 13. PCR products for 4 species（12 strains）of yeast with a primer P11（OPA-03）. Lanes: M; DNA size
markers（sizes are shown to the left）, ; Y5201, ; Y5206, ;IAM 12209, ;IAM
12834, ;IAM 12837, ;IAM 12838, ;IAM 12204, ;JCM
1627, ;
IAM 4512, 10;
strain Yakult, 11;
IFO 1213, 12;
IFO 1517.

内田 基晴いうことがわかっていたが，Sequence similarity が
99 5％（1750bp）しかなく，た（第sp. とされてい章）。しかし Y5206株の PCR-RAPD 法による増幅産物は，ン（レーンの他の参照株のパター）と一致していた。PCR-RAPD 法の結タイプの酵母が，比較的高頻度で分布していることが示唆されており（第章），種レベルより下位のレベルで識別できる今回の方法は，スターターとして投入された Y5201株を特異的に検出する目的に有効であると考えられた。

果は，ゲノム全体の情報を反映するため，増幅産物
パターンがの他の参照株と一致したことは，Y5206株がであることを示唆した。18S rRNA 遺伝子の塩基配列の相同性がと極めて高いーン

第 節 乳酸菌・酵母の組み合わせの検討
母（B5201株，Y5201株，Y5206株）からなるコンソのバンドパターン（レ

）も

（レーン

，

パターンと全く同じであった。

ーシアムが優占していることが判明したため，これら

）のバンド
の菌株間

（レーン ，10）あるいは，

最初に得られたアオサの発酵試料中には乳酸菌・酵種類を混合接種することで海藻の発酵技術を開発した（第，章）。それでは，これら種類の微生物の菌株間（レーンのうちのどれかを減らしてもスターターとして機能す

11，12）で比較した場合，バンドの位置はほぼ決まっるであろうか？また他の菌種の乳酸菌，酵母はスターているものの，個別のバンドの濃さが異なっているこ

ターとして使用可能であろうか？これらの点を検証すとが観察され，これらの情報を合わせて判断すれば，るため，前節において，海藻発酵試料中の微生物相を

これらの菌種については菌種レベルか場合によっては種レベルで解析する手法の検討をおこなった。その結株レベルでの識別が可能と考えられた。以上の結果か

果，乳酸菌については，菌種特異的プライマーを使用

ら，プライマー OPA-03を使用して酵母スターター株する方法，酵母については，ランダム合成プライマーの識別がある程度できるものと判断された。

を使用する PCR-RAPD 法を使用する方法が開発され
た。

考

察

そこで，

種類の微生物の組み合わせをいろいろ変えて接種し，乳酸発酵の達成度および混入菌の生育の16種類のプライマーを使用して PCR − RAPD 法に抑制の観点から，スターターとしての能力を評価した。

より，乳酸菌 B5201株，酵母 Y5201株および Y5206株

一方，応用面から考えると，将来，海藻発酵素材は，の特異的検出を試みた。市販キットを使用して粗精製

食品素材への利用が考えられる。その場合，使用するした菌体 DNA を鋳型に使用した場合，OPERON 社

微生物は，安全性に関する情報が乏しい野生分離株よのプライマー OPA-03を使用して，菌株間の検出がりも，食品として安全性に実績のある菌種を使用した可能と考えられた。次に乳酸菌，酵母の参照株を使用方が問題が少ない。そこで，食品産業で実績のある菌して同プライマーの検出特異性を調べた結果，市販キ種で，乳酸菌，酵母の組み合わせを人工的に構成し，ットを使用して調製した DNA を鋳型として使用した

ワカメの発酵スターターとして機能するかどうか調べ場合と異なり，熱水抽出法により調製した DNA を鋳た。

型とした場合，乳酸菌の場合で増幅産物の泳動バンドが得られない場合があるという問題が生じることが判方法明した。我々が海藻発酵試料の微生物相の解析に本法を適用することを考えた場合，多数の菌株について菌

スターター菌株の調製

種同定する必要があるため，実行可能な DNA の調製

これまでに海藻発酵試料から分離された野生型コ

法は，熱水抽出法に限られる。したがって，今回選択

ンソーシアムとヨーグルトや漬物等の発酵食品におしたプライマー OPA-03を使用して PCR-RAPD 法にいて実績のある菌種で任意に構成した食品型コンソより乳酸菌を菌種レベルで検出することは困難であるーシアムのと考えられた。さらに OPA-03を塩基短く改変した

プライマー OPA-03-C を使用することを検討したが，た。 前 者 は，L ：FRA 000033（B5201株）, Y

var.

PCR 増幅の結果が改善され，標的とする乳酸菌種によっては有効であると考えられたが，

B5201

種類のカテゴリーのスターターを検討し：

FRA 000046（Y5201株）および Y：sp.

FRA 000047（Y5206株）により構成される。後者は，株の検出に関しては有効でなかった。一方酵母につL：

IAM 10074も し く は

いては，Y5201株および Y5206株を種レベルで検出す

L：

IAM 12477 T と Y3：るのに有効であると考えられた。特に海藻表面には，

IAM 4512とにより構成されStudies on lactic acid fermentation of seaweed
るものとした。乳酸菌は MRS broth（Merck），酵母

し，第 章第 節で検討した菌種特異的プライマーをは YM broth（Difco）でそれぞれ前培養した後，菌体使用する方法により，菌種の特定を行った。酵母につを遠心回収し，滅菌0 85％ NaCl 水でいては，同様に生菌数測定に使用した SBR

回洗浄後，同

平板上

液に OD660nm=1 0の濃度で懸濁し，菌体懸濁液としのコロニーをまず形態学的特徴より，タイプ分けし，て使用した。それぞれの菌体懸濁液は，それぞれ8 3

各タイプのコロニーを無作為に10個ずつ分離し，同じ8

6

1 9×10 CFU/mL（Y 株），
×10 CFU/mL（L 株），

く第3 1×10 7 CFU/mL（Yの特定を行った。

株），9 9×10 8 CFU/mL（L株），1 6×10 9 CFU/mL（L章第節で検討した PCR-RAPD 法により菌種株），4 0×10 6 CFU/mL（Y 株）を含有する。

統計検定
乳酸菌の接種が好塩性細菌の生育を抑制するのに海藻の発酵条件

有効かどうか検定するため，好塩性細菌の生菌数の発酵試料の調製には，500mL 容のポリカーボネー

割合を， 種類の乳酸菌を接種した群と，乳酸菌非接

ト製ボトル（Nalgene）をオートクレーブ滅菌して使種群との間で比較した。最初にデータの分散の等質性用した。ボトルに3 5％ NaCl 水溶液180mL を入れ，を Levene test により確認した。次に Kruskal Wallis

市販ワカメ粉末（若みどり，理研ビタミン）10 0g とtest により，群間の分散に有意差があるかどうか検

セルラーゼ（R-10，ヤクルト本社）を0 2g 添加して定した。群間の分散に有意差があった場合，Games-

よく混合した。これにスターターとして各種菌体懸濁Howell test により，乳酸菌非接種群に対してどの試液をmL ずついろいろな菌体の組み合わせで添加し験群が有意に差があるかを検定した。酵母の接種が好た。発酵試料は， 日に 回，手振りによる混合を数

塩性細菌の生育に与える影響の有無も同様にして調べ回行いながらスクリューキャップを閉めた状態で，20た。ただし，Y5201株と Y5206株を組み合わせて接種℃下で14日間，静置培養をおこなった。菌を接種しなした試験群は，排除して検討した。これらの検定は，

いものを対照区とした。全ての試料は 本ずつ調製し市販検定ソフトウェア（SPSS 11. 0J, SPSS Inc.）を使た。

用して実施した。

発酵試料の性状解析

結果

ワカメ分解産物の粒子数および粒度分布は，コー
ルターマルチサイザーⅡ（Beckman Coulter, Inc.）でスターター組成の違いと発酵試料の性状

140μm オリフィスを使用して測定した。2 9〜11 5μ

スターター組成を変えて調製した海藻発酵試料の性m 画分の粒子を単細胞性粒子（Single cell detritus：

状分析結果を Table 17に示した。官能臭気的には，

SCD）とみなし，全粒度分布中における SCD 画分のスターター非接種の対照区試料および食品型コンソー

体積割合（％）を算出した。乳酸含量は，市販キット

シアムの菌種を接種した試料は腐敗臭を感じた。一（F kit L 乳酸，Roche Diagnostics）を使用して L −方，野生型コンソーシアムを接種した試験区のうち，乳酸のみ測定した。

酵母 Y5201株もしくは Y5206株を接種して調製した

非好塩性および好塩性微生物の生菌数は，それぞ

試料は，エステル様の芳香臭を発した。酵母を接種せれ，標準寒天培地（SMA，日水製薬）および Marine

ず乳酸菌 B5201株のみを接種した試験区（L ）は，Agar 2216（MA，Difco）を使用して計数した。乳酸

芳香も腐敗臭もなく，ほのかな酸っぱい臭気がし，菌は BCP 加プレートカウントアガー（BCP，
日水製薬）

乳酸が産生しているものと推察された。SCD 画分のを使用して，コロニー周辺が黄変したものを乳酸菌と海藻粒子の割合は，培養前2 3％であったが，みなして計数した。酵母は，サブロー寒天培地（日水の培養後には72 8％〜80 0％まで増加した。スタータ製薬）に NaCl を）で計数

ー非接種区では，同画分は75 4％であった。全体的にした。SMA 計数値に MA 計数値を加えた値から SBR

ほぼ一定の収量であり，スターター菌株の接種の有無

計数値を差し引いた値を総生菌数とし，総生菌数に対あるいは構成の違いに関わらず良好な SCD 生成量をする乳酸菌（BCP 計数値）
，酵母（SBR計数値）お示した。野生型コンソーシアムを使用して調製した試計数値）の割合料（L Y Y ）では，L‑ 乳酸が1 11g/L 産生され，％添加した平板（SBR

よび好塩性細菌（MA 計数値 SBR（％）を計算して比較した。

週間

pH が4 3まで低下した。乳酸菌 B5201株を単独あるい

生菌数の計数に用いた BCP 平板上に形成された黄は酵母と異なる組み合わせで接種した試料でも L 乳

色の乳酸菌のコロニーを無作為に10コロニーずつ分離酸が0 90‑1 00g/L で産生され，pH が4 3まで低下す内田 基晴Table 17. Characteristics of fermented Undaria-cultures prepared with diﬀerent compositions of starter microorganisms㪪㫋㪸㫉㫋㪼㫉㩷㪺㫆㫄㫇㫆㫊㫀㫋㫀㫆㫅㫊㪪㫋㪸㫉㫋㪼㫉㩷㪺㫆㫄㫇㫆㫊㫀㫋㫀㫆㫅㫊㪣㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩷㪹㪸㪺㫋㪼㫉㫀㪸㪠㫅㫀㫋㫀㪸㫃
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ることが観察された。一方，酵母だけを接種した試料

母，好塩性細菌の全生菌数に対する割合を算出して比（Y ，Y ，Y Y ） で は，L‑ 乳 酸 産 生 量 が 低 め

較した（Table 18）。予備試験の結果から Y5201株，

で，0 51〜0 67g/L で，pH は4 3〜4 6であった。スタ

Y5206株を含め，酵母は，SMA，MA，SBR

ーター非接種の対照区試料においても L‑ 乳酸産生量にコロニーを形成することがわかっている。一方，が，1 42g/L で，pH が4 3まで低下した。これは，ワB5201株，IAM10074株，IAM12477株を含め，乳酸菌

平板上

カメ原料に由来する乳酸菌が，たまたま増殖したためは SMA，BCP 上にコロニーを形成するが，MA 上にと考えられた。ただし，培養開始時においては，乳酸は特別な例を除いて肉眼観察できる大きさのコロニー菌は検出レベル以下（<10 3 CFU/mL, Table 4-2-2）でを形成しないことがわかっている。したがって，全生あった。食品型コンソーシアムの菌種を接種した結果

菌数の数＝ SMA 計数値＋ MA 計数値− SBR

では，ホモ型乳酸菌である

値で，好塩性細菌の数＝ MA 計数値− SBR

および

計数

計数値

を接種した試験区では，より多くの L‑ 乳

で，見積もることとした。自然に乳酸菌が増殖した対酸をそれぞれ2 94g/L および1 92g/L レベルで産生し，照区試料では，生菌数の65 7％を乳酸菌が占めていた。

pH もそれぞれ3 8および3 6に低下した。これらの乳しかし，対照区試料では，好塩性細菌の数も多く，酸菌にを併用して接種すると，L‑ 乳酸

46 0％と試験区の中で最大であった。野生型コンソー

産生量がそれぞれ2 39g/L および1 64g/L と少なめにシアムを使用して調製した試料（L Y Y ）では，

なり，pH は3 9および3 7であった。

乳酸菌が85 5％，酵母が7 6％，好塩性細菌が <0 1％を単独で接種すると，L‑ 乳酸産生量が0 44g/L で，pH はであった。乳酸菌 B5201株単独接種区（L4 5であった。

乳酸菌が82 4％，酵母が0 2％，好塩性細菌が0 3％で，）では，

B5201株の単独接種区は，混入菌の生育抑制に有効と
発酵試料中の微生物相考えられた。B520株と異なる酵母の組み合わせで調海藻発酵試料を植え継いだこれまでの経験から，海製した試料（L Y ，L Y ）では，乳酸菌が各々藻が順調に発酵すると，乳酸菌と酵母が優占すること

88 5％および94 1％，酵母がともに3 7％で好塩性細がわかっている。一方，試料が腐敗すると，好塩性の菌が各々 1 4％および0 5％で非常に少なかった。そ細菌の数が増加する傾向にある。そこで，乳酸菌，酵れに対して酵母だけを接種した試験区（Y ，Y ，

Studies on lactic acid fermentation of seaweedY Y ）では，好塩性細菌数が高く（11 8％〜27 4％），の生菌数が極めて小さいことは明らかと考えられた。

酵母だけの接種では，細菌相の制御は困難と考えられ

乳酸菌および酵母の添加が好塩性細菌の生育を抑制た。

を接種した試験区
（L ，
L Y ）
は，

する効果について，統計的に評価した（Table 19）。

乳酸菌が優占し（各々 126 6％，96 6％），酵母（ともまず乳酸菌添加の効果を検証するため，試験区を乳に <0 1％）と好塩性細菌（各々 0 7％，9 8％）が少

酸菌非添加群，B5201株添加群，なく，スターターとして適していると考えられた。

群，を接種した試験区（L ，L Y ）は，

添加群の

添加

群に分けた。また酵母添加の効果を検証するため，試験区を酵母非添加群，Table 17の分析データから乳酸発酵はしたと考えられ

Y5201株添加群，Y5206株添加群，たが，好塩性細菌数が比較的大きく（各々 34 5％，の

19 7％），スターターとしての適性は，B5201株に劣る

乳酸菌，酵母に基づく群分けとも各試験群間の好塩性と考えられた。

単独接種区の試料は，好細菌の生菌数のデータの等分散性が完全には保証され塩性細菌数が比較的大きく（25 0％），混入菌の生育なかったが，これを無視してノンパラメトリックな分を抑制する能力が劣ると考えられた。

は，

散分析をおこなった。まず，Kruskal Wallis test を実平板上施した結果，乳酸菌の添加の有無による生菌数の違いにはコロニーを形成しない。したがって，Table 18のは，有意（P<0 01）と判定され，酵母の添加の有無

酵母計数値は，の生菌数を代表していなによる生菌数の違いは，有意でない（P>0 05）と判を接種した試定された。次に Games-Howell test により，乳酸菌非験区において，SMA 計数値（乳酸菌と酵母の計数値

添加群と個別に比較してどの乳酸菌試験群に有意差がを含む）が BCP 計数値（乳酸菌だけの計数値）と同あるか検定した。その結果，B5201株添加群およびSMA 平板上にコロニーを形成するが，SBR

いと考えられた。しかし，

等かもしくはこれより小さいことから，

添加群群に分けた。Levene test により検定した結果，添加群に差があることが判明した（ともTable 18. Study on microbial ﬂora in the fermented Undaria cultures prepared with diﬀerent compositionsof lactic acid bacteria and yeast㪧㫉㫆㫇㫆㫉㫋㫀㫆㫅㩷㪹㪸㫊㪼㪻㩷㫆㫅㩷㫍㫀㪸㪹㫃㪼㩷㪺㫆㫌㫅㫋㫊㩷㩿㩼㪀㪭㫀㪸㪹㫃㪼㩷㪺㫆㫌㫅㫋㫊㩷㩿㪚㪝㪬㪆㫄㪣㪀㩷㪪㫋㪸㫉㫋㪼㫉㩷㪺㫆㫄㫇㫆㫊㫀㫋㫀㫆㫅㫊 㪥㫆㫅㪄㪿㪸㫃㫆㫇㪿㫀㫃㫀㪺㩷㫄㫀㪺㪅㪰㪼㪸㫊㫋㪟㪸㫃㫆㫇㪿㫀㫃㫀㪺㩷㫄㫀㪺㪅㩷㪣㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩷㪹㪸㪺㪅㪫㫆㫋㪸㫃㩷㫄㫀㪺㪅㪣㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩷㪹㪸㪺㪅㪰㪼㪸㫊㫋㪟㪸㫃㫆㫇㪿㫀㫃㫀㪺㩷㪺㫆㫅㫋㪸㫄㫀㫅㪸㫅㫋㩷㪹㪸㪺㪅㩿㪚㫆㫌㫅㫋㪼㪻㩷㫆㫅㩷㪪㪤㪘㪀 㩿㪚㫆㫌㫅㫋㪼㪻㩷㫆㫅㩷㪤㪘㪀 㩿㪚㫆㫌㫅㫋㪼㪻㩷㫆㫅㩷㪙㪚㪧㪀 㩿㪚㫆㫌㫅㫋㪼㪻㩷㫆㫅㩷㪪㪙㪩㪌㪀 㩿㪪㪤㪘㪂㪤㪘㪄㪪㪙㪩㪌㪀㪙㪚㪧㪆㪫㫆㫋㪸㫃㪪㪙㪩㪌㪆㪫㫆㫋㪸㫃㩿㪤㪘㪄㪪㪙㪩㪌㪀㪆㪫㫆㫋㪸㫃㪊㪊㪊㪊㪠㫅㫀㫋㫀㪸㫃
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Table 19. Analysis of variance to test diﬀerences in proportions of halophilic contaminant bacteria among the fermented Undaria cultures prepared with diﬀerent starter compositions㪤㫀㪺㫉㫆㫆㫉㪾㪸㫅㫀㫊㫄㫊㪣㪘㪙㪞㫉㫆㫌㫇㫊㩷

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内田 基晴に P<0 05）
。

それぞれ

株/

株，

株 /10株および

株 /10株であった。
菌種特異的プライマーを使用した菌種レベルでの乳酸験区（Y ）では，

菌相の解析

りの

菌数を計数する目的で調製された標準寒天培地上

株 /10株，を単独接種した試試料でのみ乳酸菌が優占し，残

試料では

が

株 /10株の割合で検出された。

に形成されたコロニーを無作為に10個選択し，新しい BCP 平板上に移植して純粋分離した後，第章第PCR-RAPD 法を使用した酵母菌相の解析

節で開発した菌種特異的プライマーを使用する方法

菌数を計数する目的で調製された SBR

寒天培地

により，乳酸菌の菌種を特定した（Table 20）。まず上のコロニーの形態学的特徴から，コロニーを Y

スターター非添加の対照区においても， 本立ての試（Y5201）型および Y料で，21に示した。コロニーの形態学的な特徴からのタイピがそれぞれ

株 /10株および株/（Y5206）型に分類して Table

株（陽性株数 / 試験株数）であった。一方，ングが正しいことを検証するため，形成されたコロを接種した試験区においては，酵母を同時に接種してニーを無作為に10個選択し，PCR-RAPD 法によるタいるか否かに関わらず，全ての試験区（L Y Y ，

イピングを平行して実施した。試験区 L Y Y

L ，L Y ，L Y ）において 本立て試料とも，

よび Y Yが10株 /10株の割合で検出された。一方，酵母を単独接種した試験区では，
が

株/

試料で

については，形態学的に Y

ロニーから10株，Y

お

とされたコ

とされたコロニーから10株を無作為に選んで PCR-RAPD 法により試験した。まずス株の割合で検出されたものの，他の試料でターター非添加の対照区，乳酸菌単独接種区（L ，は，酵母の組み合わせにかかわらず，乳酸菌が優占し

L ，L ），L Y

ない場合が多かった（

酵母が優占しなかった。次に野生型コンソーシアムを

試料中

試料）
。食品産業に実績のある乳酸菌種であるおよびを単独で接種した試験区においては，接種区および L Y

接種した L Y Y

区においては，区においては，コロニーの形態学的特徴から 本立ての試料において平均で Y 型がした菌種と一致する菌種の検出割合は，それぞれ10株

2 2％，Y/10株，法で調べた結果からは，これら Y 型とした株のそれ

株/

株および

っ た。 な お，

株 /10株，

株 /10株であIAM10074は，acidophi-

lus 特異的プライマーに反応せず，これらの乳酸菌にを併用した試験区（L
おいては，

Y

,L

Y

）に

特異的プライマーに反応したため，特異的プライマーで検出した結果を示してある。
およびの検出割合は，ぞれ

型が97 8％と見積もられた。PCR-RAPD

株 /10株（分類型が一致した株数 / 試験株数）

および

株/

株が Y

型であった。一方，Y型であった。一方，YYを接種した L Y区および区から分離された酵母は，形態学的特徴から >99％および >96％ Y型であるとされ，PCR-RAPD 法

Table 20. Results of identiﬁcation of lactic acid bacteria isolated from fermented Undaria using species-speciﬁc primers㪫㫐㫇㫀㫅㪾㩷㪹㪸㫊㪼㪻㩷㫆㫅㩷㪧㪚㪩㩷㫇㫉㫆㪻㫌㪺㫋㫊㪑㪪㫋㪸㫉㫋㪼㫉㩷㪺㫆㫄㫇㫆㫊㫀㫋㫀㫆㫅㫊㪥㫆㪄㫊㫋㪸㫉㫋㪼㫉㩷㪺㫌㫃㫋㫌㫉㪼㫊㩿㪮㫀㫃㪻㩷㫋㫐㫇㪼㩷㫊㫋㫉㪸㫀㫅㫊㪀㪣㪈㪰㪈㪰㪉㩷
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型と

した株のそれぞれ10株 /10株および10株 /10株が Y㪫㫉㫀㪸㫃㩷㪥㫆㪅㩷㪈㪫㫉㫀㪸㫃㩷㪥㫆㪅㩷㪉㪹㫉㪼㫍㫀㫊

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Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 21. Typing of yeast strains isolated from fermented Undaria based on morphological characterisitics
of the colonies and the PCR-RAPD products with the OPA-3 primer㪪㫋㪸㫉㫋㪼㫉㩷㪺㫆㫄㫇㫆㫊㫀㫋㫀㫆㫅㫊㪥㫆㪄㫊㫋㪸㫉㫋㪼㫉㩷㪺㫌㫃㫋㫌㫉㪼㫊㩿㪮㫀㫃㪻㩷㫋㫐㫇㪼㩷㫊㫋㫉㪸㫀㫅㫊㪀㪣㪈㪰㪈㪰㪉㪁㪉

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区およ

区から分離された酵母も，形態学的特徴から傾向とほぼ相関していた。乳酸発酵のタイプからいうとL（B5201）株は，ヘテロ型であり，L （IAM

10074）株および L（IAM 12477）株は，ホモ型で>99％ Y型であるとされ，PCR-RAPD 法による試

後者は前者に比べて，単位グルコース基質あたりの験でも，試料区とも，10株 /10株が Y型であると乳酸生成量が型とした株間で比較すると，混入菌（非接種菌）の生育の影響型であった。一方，両があるため，数値にばらつきが認められるものの，確認された。Y Yの区においては，Y

株 /10株が両試料とも Y

試料とも Yた。
いては，型とした株の10株 /10株が Y
IAM 4512株を接種した Y

試料において10株 /10株が Y確認されたが，残りの１試料では

型であっ
区にお

型であると

株 /10株が Y倍量である。L‑ 乳酸生成量を試験区

L1接種区（L Y Y ，L ，L Y ，L Y ）に比べ L

接 種 区（L ，L Y ） お よ び L

（L

Y

，L

）では，L‑ 乳酸が〜接種区倍量生成して型

おり，pH 値の低下幅も大きく，静菌効果の点で有利であるとされ，残りの 株は，その他の型に分類されと考えられた。一方，酵母単独接種区（Y ，Y ，

た。

Y

Y

，Y

）の L‑ 乳酸生成量は，0 44〜0 67 g/L

で乳酸菌接種区の L‑ 乳酸生成量に比べ少ない傾向に考察あった。スターター非接種区においては，L‑ 乳酸生
成量が1 42 g/L と予想外の高い値を示したが，これ野生型コンソーシアムおよび食品型コンソーシア

は，ワカメ基質由来の乳酸菌が試料中で増殖して優占ムについて，スターターの菌種組成を変えて接種ししたためと考えられた。寒天平板法により行った菌相て発酵を実施した。発酵処理後の単細胞粒子画分の体解析の結果からは，スターター非接種対照区において積割合（％）は，72 8％（Yも乳酸菌が出現することが観察されたが，その優占率区）から80 0％（LY区）であり，スターター非接種対照区の75 4％を含が65 7％であったのに対し，L 接種区（L Y Y ，め，全ての試験区で70％を超えており，スターターの

L ，L Y ，L Y ）においては，酵母の接種の組成が単細胞性粒子の生成効率に与える影響は，小さ有無にかかわらず，乳酸菌が高い優占率（82 4％〜

いと考えられた。乳酸生成量については，L‑ 乳酸し

94 1％）を示し，乳酸菌接種による菌相制御の効果か測定していないが，L‑ 乳酸産生量は，pH 値の低下が認められた。一方，酵母単独接種区（Y ，Y ，

内田 基晴Y Y ）においては，乳酸菌の優占率が下がり（5 8

×10 6 CFU（Y5201株）および6 2×10 7 CFU（Y5206株）％〜63 2％），MA 計数値から SBR

計数値を差し引で約16倍の差があることが影響していることが考えらいて得られる好塩性細菌数が高くなる（11 8〜27 4％）れる。なお，この菌体懸濁液は濁度を統一して調製し傾向にあり，酵母の単独接種では，混入菌の生育の抑てあり，菌体細胞のサイズと逆相関していると考えら

制は不十分と考えられた。食品型コンソーシアムを構れる。即ち菌体サイズは Y >Y

成する菌種を使用しての実験では，L 接種区（L ，した場合に定常期における細胞濃度は，Y

L Y ）では，L 試験区の場合と同様に高い乳酸菌なると予想される。したがって，菌体サイズの違いを

優占率（96 6〜126 6％）が認められ，食品産業で実反映していると解釈することもできる。試料中の微生績のある菌種でも，海藻発酵スターターとして使用で物の存在比を考える場合に，細菌と酵母の細胞サイズきることが示唆された。Lの違いも考慮して議論する必要がある。濁度 =

では，L

および L

接種区（L ，L Y ）での試験区より乳酸菌優占率が一した菌体懸濁液

であり，単独培養

mL に含まれる L

9

<Y

と

で統

細胞の数は1 6

低い（63 3〜89 6％）傾向が認められたが，このとき

×10 CFU であり，YのL

株が MA 平板上にコロニーを例外的に形成しこのことを考慮すると，例えば Y 試料および Y 試た可能性が考えられ，乳酸菌優占率が過少評価され料で CFU 値を基に算出した酵母の優占率が19 7％おている可能性がある。その根拠としては，Lおよびよび49 0％であることは，かなり酵母が高い優占率を

試料を MA 平板上に接種して，形成されたコ示している例であるという解釈も可能である。実際，

L Y

ロニーが，大部分直径が小さい（直径mm 以下），

白いコロニーで乳酸菌のコロニーの形態学的特徴に似の421倍，Y

の25 8倍である。

これらの試料について顕微鏡観察をすると，細菌細胞より酵母細胞がよく目立つ感じがある。
以上の結果を総括すると，Lていたためである。一方，Y 単独接種試験区（Y ）（B5201）株，Yでは，野生型コンソーシアムでの結果と同様，乳酸菌（Y5201） 株，Yの優占率が低い（48 1％）傾向にあった。

で，最初に海藻発酵スターターが開発されたが，乳酸菌 種 特 異 的 プ ラ イ マ ー を 使 用 し て，L1接 種 区菌L（Y5206） 株 を 混 合 接 種 す る 方 法の単独接種でも，混入菌の生育抑制の面で効果（L Y Y ，L ，L Y ，L Y ） で 優 占 し たが同程度認められること，また酵母の単独接種では，乳酸菌を同定した結果（Table 20），

細菌相の制御が充分でないことが明らかにされた。まも10株中10株が Lと同じ本立て試料と型であることがた，（L，ただし16S rDNA 塩基配列示され，優占率が極めて高いことが示された。一方はL 接種区（L ，L Y ）および L 接種区（L ，

なじみの深い菌種を海藻発酵試料の調製のためのスタ

L Y ）では，接種した菌種と同じ菌種と同定されーターとして使用できる可能性が示唆された。

る割合が，本立て試料区間でばらつき，L型），（L ）など食品産業にに比べ劣る傾向にあった。PCR-RAPD 法を使用し，酵母分離株の同定をした結果（Table 21）からは，Y単独

第 節 乳酸菌種の検討
第章第節において海藻の発酵スターターとし接種区（L Y ，Y ）および Y 単独接種区（L Y ，て使用できる微生物の組み合わせとして乳酸菌単独

Y ）においてそれぞれスターターとして添加したでの使用で問題がないこと，また乳酸菌の種類として菌種が10株中10株の割合で検出され，酵母の菌相をも必ずしも良く制御していることが示された。Y種も使用可能であることが示唆された（Uchida

単独接種区型の検出率は/10株と高かったものの残りの

.,

試験区

2004b）。乳酸菌は，発酵形式からホモ型，へテロ型

試料で10株に類別される（柳田，1996）。また，発酵基質との関（L Y ，L Y ，Y ） に お い て は，Yのみで酵母が優占し，YB5201株でなくとも他の乳酸菌

試料では

株 /10株

連から植物系，乳（動物）系という類別の仕方も提案されている（岡田，1996）。そこで，どのような種類であり，不安定な優占率であった。Y （）は非好塩性の菌種であり，ワカメ発酵試料が3 5％の乳酸菌が海藻発酵スターターとして適しているのか

NaCl の塩濃度下で調製したことが反映した可能性が興味がもたれる。一方，海藻を基質として乳酸発酵さ考えられた。また Y Y の混合接種区（L Y Y ，せて産業利用することを考えた場合，海藻基質を滅菌Y処理して使用することが必ずしも容易でない場合が多Y）においては，Y型が優占（96 5〜97 8％）以外の型い。例えば海藻をオートクレーブ殺菌すると，クロロ

は，概ね全体の ％以下であろうと推定された。試料

フィルが分解し，色落ちが著しく，応用的価値を下げ

中の酵母の存在比が Y 型より Y 型の方が多かった

ることが問題となる。したがって非滅菌処理の海藻基理由としては，最初の菌の接種量が質を使用することを前提として，海藻の発酵技術を開していることが確かめられ，Yおよび Y

mL あたり3 8

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
発することが重要となる。著者らは，入手が容易な市

ロー寒天培地（SBR，日水製薬）とそれぞれ混釈した。

販ワカメ乾燥粉末を基質にして発酵条件を検討してき各平板試料は，たが，ワカメ基質を滅菌処理せずそのまま使用した場

条件下で培養後，コロニーを計数した。計数後，各合，NaCl を添加しない条件下で発酵を実施すると，平板上に形成されたコロニーをしばしば試料が著しい発泡とともに急速に液状化し，rRNA 遺伝子（16S rDNA）の部分塩基配列を決定した。

チーズ様の独特の臭気を有する腐敗・変敗状態になる

塩基配列の決定は，第ことを経験した。このような腐敗･変敗試料では，乳の抽出および PCR 増幅を行って実施した。決定され酸菌の他に非乳酸菌の増殖が起こっていると疑われ，た塩基配列を基に分子系統樹を作成した。

枚ずつ調製し，20℃で週間，好気〜10個釣菌し，16S章と同様の方法で鋳型 DNA

基質由来の混入菌の増殖が充分抑制されていないためにおこる現象であると推察された。
そこで，基質として使用したワカメ試料に含まれる

供試乳酸菌
Table 22に示す11種14株の乳酸菌を14試料（a, b）

生菌相を調べるとともに，いろいろな乳酸菌株についの調製に使用した。これらのうちてワカメ基質に対して単独接種して，発酵が進行する

した IFO15883 T 株は，16S rRNA 遺伝子塩基配列（過程で優占化することにより，混入菌の生育を抑制す

27-338番塩基部位）が

として使用
型であり，

る能力に優れる菌種を検索することとした。スタータ

特異的プライマーにも反応しなかったため，ーとしての適性を判断するにあたり，第 章第 節に特異的プライマーで検出した。

おいて開発した菌種同定技術により，発酵後の試料中における接種菌種の優占率（％）を調べ，評価の基準として使用した。試験は，NaCl を添加した系としな

海藻発酵試料の調製
NaCl 添加ワカメ発酵試料（試料 No. 1a-14a）の調製には，ワカメ乾燥粉末（LS）

い系の両条件で行った。

g およびセルラーゼ（12S， ヤ ク ル ト 本 社， 東 京 ）40mg を 滅 菌 NaCl
方水溶液（3 5％ w/v）40mL とともに，50mL 容の PP

法

製遠チューブ（イワキ）に入れ，さらに菌体懸濁液
0 4mL を添加して，スクリューキャップを閉じた状

ワカメ基質中の菌相解析
市販ワカメ乾燥粉末（若みどり LS，粒径メッシ

態でよく振って混合した。菌体懸濁液は，乳酸菌をュ 200通過規格，理研ビタミン）0 2g を滅菌蒸留水

MRS（Merck, Darmstadt, Germany）
培地で前培養し，

10mL に懸濁し，あらかじめ調製し，60℃に保持して滅菌0 85％濃度 NaCl 水溶液でおいた30mL の標準寒天培地（以降 SMA と略記，日

塩水に対して OD660nm=1 0（7 3×10 7 〜1 1×10 9 CFU/

水製薬），
BCP 添加プレートカウントアガール（BCP，mL）の濃度で菌体を懸濁させて調製した。NaCl 非添日水製薬），マリンアガー（MA，Difco）およびサブ

加ワカメ発酵試料（試料 No. 1b-14b）の調製には，滅回遠心洗浄後，同食

Table 22. List of lactic acid bacteria used as a starter㪥㫆㪅㪣㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩷㪹㪸㪺㫋㪼㫉㫀㪸㪈 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㪹㫉㪼㫍㫀㫊 㩷㪙㪌㪉㪇㪈㩿㪔㪝㪩㪘㪇㪇㪇㪇㪊㪊㪀㪉 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㪹㫉㪼㫍㫀㫊 㩷㪠㪘㪤㩷㪈㪉㪇㪇㪌㪊 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㫇㫃㪸㫅㫋㪸㫉㫌㫄㩷 㪰㪠㪫㪇㪈㪇㪉㪫㩷㩿㪔㪘㪫㪚㪚㩷㪈㪋㪐㪈㪎㪀㪋 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㫇㫃㪸㫅㫋㪸㫉㫌㫄㩷 㪠㪘㪤㩷㪈㪉㪋㪎㪎㪫㪫㪌 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㪺㪸㫊㪼㫀 㩷㪠㪝㪦㩷㪈㪌㪏㪏㪊㪍 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㪺㪸㫊㪼㫀㩷 㪙㪌㪋㪇㪍㩷㩿㪔㪝㪩㪘㩷㪇㪇㪇㪇㪊㪌㪀㪫㪎 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㫉㪿㪸㫄㫅㫆㫊㫌㫊㩷 㪠㪘㪤㩷㪈㪈㪈㪏㪏 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㫑㪼㪸㪼㩷 㪠㪘㪤㩷㪈㪉㪋㪎㪊㪫㪐 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㪸㪺㫀㪻㫆㫇㪿㫀㫃㫌㫊 㩷㪠㪝㪦㩷㪈㪊㪐㪌㪈㪫㪈㪇 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㫂㪼㪽㫀㫉㩷 㪰㪠㪫㩷㪇㪉㪉㪉㪫㩷㩿㪔㪥㪩㪠㪚㩷㪈㪍㪐㪊㪀㪈㪈 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㪽㪼㫉㫄㪼㫅㫋㫌㫄 㩷㪰㪠㪫㩷㪇㪇㪏㪈㪫㩷㩿㪘㪫㪚㪚㩷㪈㪋㪐㪊㪈㪀㪫㪈㪉 㪣㪸㪺㫋㫆㪹㪸㪺㫀㫃㫃㫌㫊㩷㪻㪼㫃㪹㫉㫌㪼㪺㫂㫀㫀㩷 㫊㫌㪹㫊㫇㪅㩷㪹㫌㫃㪾㪸㫉㫀㪺㫌㫊㩷 㪰㪠㪫㩷㪇㪈㪏㪈 㩷㩿㪘㪫㪚㪚㩷㪈㪈㪏㪋㪉㪀㪈㪊 㪪㫋㫉㪼㫇㫋㫆㪺㫆㪺㪺㫌㫊㩷㫋㪿㪼㫉㫄㫆㫇㪿㫀㫃㫌㫊㩷 㪰㪠㪫㩷㪉㪇㪐㪋㩷㩿㪥㪚㪝㪙㩷㪉㪊㪐㪉㪀㪈㪋 㪣㪼㫌㪺㫆㫅㫆㫊㫋㫆㪺㩷㫄㪼㫊㪼㫅㫋㪼㫉㫆㫀㪻㪼㫊 㩷㪠㪘㪤㩷㪈㪊㪇㪇㪋㪫㪈㪌 㪥㫆㩷㪣㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩷㪹㪸㪺㫋㪼㫉㫀㪸㪈㪍 㪤㫀㫏㫋㫌㫉㪼㪁㪈㪁㪈㪚㪿㪸㫉㪸㪺㫋㪼㫉㫀㫊㫋㫀㪺㫊㩷㫆㪽㩷㫋㪿㪼㩷㫊㫋㫉㪸㫀㫅㫊㪠㫊㫆㫃㪸㫋㫀㫆㫅㩷㫊㫆㫌㫉㪺㪼㩷 㪝㪼㫉㫄㪼㫅㫋㪸㫋㫀㫆㫅㩷㫋㫐㫇㪼㪪㪼㪸㫎㪼㪼㪻
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最後に72℃で料区として調製した（試料 No. 15a，15b）。乳酸菌混分保持した。一部の菌種（，，，）に対する特合接種区（試料 No. 16a，16b）においては，1，3，5，7，

異的プライマーについては，アニーリング温度を58℃

8，9，10，11，12，13，14の各試験区に使用された菌に変えて PCR 増幅を行った。

の検出プライ

体懸濁液を36μL ずつ接種した。菌体接種後，発酵試

マーに陽性反応の株は，の検出プライ

料は，20℃下で毎日 回数秒間手で振って混合しながマーでクロスチェックを行い，陰性の株を

ら11日間培養を行った。発酵試料は，各 本立てで調した。増幅産物は， ％ アガロースゲルで電気泳動し，製した。

エチジウムブロミドで染色して観察した。

発酵試料の性状評価

発酵試料中の非乳酸菌種の解析と発酵後の試料について，臭気を官能的に評価し，発非 乳 酸 菌 の 生 育 と 腐 敗 臭 が 認 め ら れ た 試 料2b，酵臭および腐敗臭の有無を記載した。また，pH 値，

8b，9b，11b，12b，13b，15b について，生菌数測定

乳酸生成量，ガスの産生の有無，固形分含量（％），に使用した SMA 上に形成されたコロニーを生菌数，乳酸菌優占率（％）を測定した。乳酸生成量は，無作為に選択し，新しい BCP 平板に移植して分離し，

市 販 キ ッ ト（F kit D-/L- 乳 酸，Roche Diagnostics）

合計102株を得た。これらの分離株をコロニーの形態を使用して測定した。固形分含量（％）は，発酵試料

学的特徴から，C 型，S 型，その他に類別した。コロを１時間以上静置した後の，海藻固形分の容積の量をニーの形態学的特徴の観察による類別は，白金耳を使容器の側面についた目盛から読み取り，発酵試料全体

用して新しい BCP 平板にコロニーを画線後，20℃下の容積41mL に対する割合（％）で示した。従属栄養で日間培養した時点で行った。コロニーの直径が微生物の生菌数は，NaCl 添加発酵試料区については，〜mm，クリーム色，表面が滑らか，周辺に凹凸な

標準寒天培地（日水製薬）に2 5％濃度 NaCl を添加し，湿った感じの特徴を有するものを C 型，直径が〜30個した平板（SMA2 5）で，NaCl 非添加発酵試料区に‑10mm，白色，平坦，周辺が凹凸状，乾いた感じ

ついては標準寒天培地（SMA）で計数した。スターの特徴を有するものを S 型とした。次に C 型，S 型

ター非接種対照区（試料 No. 15a，15b）については，とされた菌株について，各試料ごとに 株ずつ合計11

優占種として生育してくる菌種を予想できないため，

株を代表株として選び，その16S rDNA の部分塩基配

BCP 添加プレートカウントアガール（BCP，日水製薬）

列を，第およびマリンアガー（MA，Difco）も併用して生菌基配列をもとに分子系統樹を作成した。

章と同様の方法で決定した。決定された塩数を測定した。SMA2 5平板もしくは SMA 平板上に形成されたコロニーから無作為に10菌株（× ）選択

塩基配列のアクセッション番号

週間培養後本研究で決定された塩基配列情報は，DDBJ に登録にコロニーの周囲が黄変するものを乳酸菌とみなし，した。分離菌株とそれぞれのアクセッション番号は，

全30分離株中の乳酸菌優占率（％）を算出した。

A0001（AB124858），A0002（AB124859），A0003

し，新しい BCP 平板に移植し，20℃で（AB124860），A0004（AB124861），A0005（AB124862），
発酵試料中の乳酸菌種の解析
各試料についてA0006（AB124863），A0007（AB124864），A0008

本立て試料から得られた合計30株の分離株について，第章第（AB124865），A0009（AB124866），A0010（AB124867），

節で開発した菌種

A0011（AB124868），A0012（AB124869），A0013

特異的プライマー（Table 14）を使用する方法で菌種（AB124870），A0801（AB124871），A1201（AB124872），を特定した。菌体 DNA の抽出は，30μL の TE バッ

A1301（AB124873），A0901（AB124874），A1205

ファーに平板コロニーから掻き取った少量の菌体を（AB124875），A0916（AB124876），A1308（AB124877）

懸濁させ，94℃で15分間加熱することで行い，加熱後で あ る。 系 統 解 析 に 使 用 し た 参 照 株 の 名 称 と ア クの遠心（12000rpm，10分）上清

セ ッ シ ョ ン 番 号 は，

μL を鋳型 DNA と
mM, dNTP 混

1457（X51928），

NCIMB

μL, プライマー 各1 0μM,

12899 T （X60607），

NCTC 11143

して使用した。PCR 増幅は，MgCl 2液各200μM, 鋳型 DNA

DNA ポリメレース（Ex Taq, 宝酒造，東京）2 5U を含む100μL の反応液を添付バッファーを用いて調製して行った。PCR の反応条件は，94℃で分保持後（X55063），（AJ577291），
T

IAM 12462 （D78312），（AF169537），，
IAM 12466 T（D16272）

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
IAM 13418 T （D16273），（AB048252），

発酵試料の性状比較

NCDO

最初に NaCl 添加条件下で調製したワカメ発酵試料（AF169495），の性状分析の結果を Table 24に示す。官能臭気によstrains B23284（AF169502），

る類別では，試料15a（スターター非添加対照区）の1769（X60646），

NRS-111（AF169526），NRS-1198（AF169528），

他，8a，9a，11a，13a で，NRS-800（AF169544），NRS-1691（AF169531），

敗臭が感じられた。腐敗臭はアミン系およびイオウ系

BD-87（AF169520），

strainの臭気が混ざっているように感じられた。pH 値は，（AF155955）

本試料の平均値の比較では，試験区の違いによる明

P-11（X90640），
である。

本のうち

〜

本で腐

瞭な傾向はなく，どの試験区も一律低い pH 値（4 0〜
4 9）を示したが，同じ試験区の結果本のなかで比較す

ると腐敗臭が感じられた試料は，pH 値がやや高めで，乳酸生成量も小さい傾向があった（データを示さず）。

ワカメ基質中に含まれる生菌数および菌種組成

乳酸生成量は，へテロ型乳酸菌試験区（1a，2a，12a）

最初に発酵試料の調製に使用されるワカメ基質中におよびスターター非添加対照区（15a）で少なく（0 45

含まれる生菌数を調べた（Table 23）。形成されたコ〜0 83 g/L），腐敗試料が観察された9a を除くホモ型

ロニーの大部分が不定形であること，寒天培地上だけ

乳酸菌試験区（3a，4a，5a，6a，7a，8a，9a）およびでなく培地中でのコロニーの形成が観察されること，

混合接種区（16a）で高い傾向にあった（1 64〜2 20

ワカメ粒子が培地中に存在して観察を妨げることなg/L）。ガスの産生は全ての試料で認められなかった。

どから，正確なコロニーの計数は困難であったが，最試料の液状化も認められなかったが，浸透圧の影響にも多くのコロニーが計数されたのは BCP 平板を使用よると推定される海藻固形分体積の減少が全ての試料23した場合で，概ね10 〜10 CFU/g であった。また，について認められた（発酵開始時に対する発酵終了時

BCP 上に形成されたコロニーは全て，周囲が黄色にの固形分体積率：70 7〜81 3％）。生菌数については，

変化しておらず非乳酸菌であると判断された。SMA

1 5×10 7 CFU/mL 〜13 3×10 8 CFU/mL の 範 囲 で 計

2数され，菌種の違いによる明瞭な傾向は認められな

CFU/g，20 CFU/g であった。SBR による計数では，かった。SMA 平板から分離された分離菌株（各試料

酵母，糸状菌は検出されなかった（< CFU/g）。

n=30）から推定した乳酸菌の存在比率（％）は，試および MA により見積もられた生菌数はそれぞれ10

生菌数の計数に使用した SMA から

株，MA から

験 区1a，2a で96 7 ％， 試 験 区3a 〜12a，14a，16a で

株，BCP から10株を分離した。これらの分離菌株

100％，試験区13a で60％，対照区（15a）で <3 3％でについて16S rDNA の部分塩基配列を決定し，これをあった。

もとに分子系統樹を作成した（Fig. 14）。分離された13菌株は，全て属細菌であり，のクラスター，の性状分析の結果を Table 25に示す。官能臭気によ株がのクラスター， 株が株が株がる類別では，試料15b（スターター非添加対照区）の他，のクラスター，のクラスター，その他がであった。

次に NaCl 非添加条件下で調製したワカメ発酵試料株

1b，2b，8b，9b，11b，12b，13b，14b で，本のうち 〜 本でチーズ臭もしくは腐敗臭が感じられた。
pH 値は，

本試料の平均値の比較では，4 3〜5 3の値を示し，NaCl 添加条件下で調製した試料に比べやTable 23. Viable number of microorganisms contained in the substrate of Undaria pinnatiﬁda product㪥㫆㪅㩷㫆㪽㩷㫀㫊㫆㫃㪸㫋㪼㫊㩷㪽㫆㫉㪪㫋㫉㪸㫀㫅㩷㪥㫆㪅㫇㪿㫐㫃㫆㪾㪼㫅㪼㫋㫀㪺㩷㪸㫅㪸㫃㫐㫊㫀㫊㪪㫋㪸㫅㪻㪸㫉㪻㩷㪤㪼㫋㪿㫆㪻㩷㪘㪾㪸㫉
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A0004
74
A0013
A0008
A0006
62
A0012

58
75

A0007
A0009
NRS-111 (AF169526)

58

NRS-800 (AF169544)
B. sphaericus B-23268T (AF169495)
B-23284 (AF169502)
87
B. fusiformis (AF169537)

100
87

NRS-1198 (AF169528)
NRS-1691 (AF169531)

86

BD-87 (AF169520)
B. circulans (D78312)

72

B. megaterium (D16273)
B. lentus (D16272)
89
100

98

A0010
B. subtilis (X60646)

B. atrophaeus (X60607)
A0005
A0002
72

A0003

89
B. pumilus (AB048252)
74

78
76

B. cereus NCTC 11143 (X55063)
A0001

77 B. thuringiensis (AF15955)
100

B. cereus (AJ57728)
A0011

B. thermospaericus (X90640)
Alicylobacillus cycloheptanicus (X51928)
0.1

Fig. 14. Neighbour-joining tree showing the phylogenetic relationships of the bacteria isolated from theLS product among the Bacillus groups. The analysis is based on 291 nucleotide sequences of 16S rRNA gene.
Conﬁdence limits estimated from bootstrap analysis（100 replications）appear at the nodes.
was designated as the outgroup species for the analyses. Nucleotide sequences obtained from
GenBank and used in the phylogenetic analyses were as follows:1457（X51928）,
NCIMB 12899 T （X60607）,
NCTC 11143（X55063）,（AJ577291）,
IAM 12462T（D78312）,（AF169537）,
IAM 12466T（D16272）,
IAM 13418T（D16273）,（AB048252）,
NCDO 1769（X60646）,（AF169495）,-like strains B23284（AF169502）, NRS-111（AF169526）,
NRS-1198（AF169528）, NRS-800（AF169544）, NRS-1691（AF169531）, BD-87（AF169520）,
strain P-11（X90640）,（AF155955）.

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 24.

Results of fermentation of Undaria pinnatiﬁda with NaCl-added cultures㪝㪼㫉㫄㪼㫅㫋㪼㪻㪚㫌㫃㫋㫌㫉㪼
㪘㪻㪻㪼㪻㩷㫃㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩷㪹㪸㪺㫋㪼㫉㫀㪸㪥㫆㪅㪆㪩㫆㫋㫋㪼㫅㪁㪈㪈㪸 㪣㪅㩷㪹㫉㪼㫍㫀㫊㪝㪆㪝㪆㪝㪉㪸 㪣㪅㩷㪹㫉㪼㫍㫀㫊㪝㪆㪝㪆㪝㪊㪸 㪣㪅㩷㫇㫃㪸㫅㫋㪸㫉㫌㫄㩷㪝㪆㪝㪆㪝㪋㪸 㪣㪅㩷㫇㫃㪸㫅㫋㪸㫉㫌㫄㩷㪝㪆㪝㪆㪝㪌㪸 㪣㪅㩷㪺㪸㫊㪼㫀
㪝㪆㪝㪆㪝
㪝㪆㪝㪆㪝
㪍㪸 㪣㪅㩷㪺㪸㫊㪼㫀㪎㪸 㪣㪅㩷㫉㪿㪸㫄㫅㫆㫊㫌㫊㪝㪆㪝㪆㪝㪏㪸 㪣㪅㩷㫑㪼㪸㪼㪝㪆㪩㪆㪩㪐㪸 㪣㪅㩷㪸㪺㫀㪻㫆㫇㪿㫀㫃㫌㫊㪝㪆㪝㪆㪩㪈㪇㪸 㪣㪅㩷㫂㪼㪽㫀㫉㪝㪆㪝㪆㪝㪈㪈㪸 㪣㪅㩷㪽㪼㫉㫄㪼㫅㫋㫌㫄㪝㪆㪝㪆㪩㪈㪉㪸 㪣㪅㩷㪻㪼㫃㪹㫉㫌㪼㪺㫂㫀㫀㩷 㫊㫌㪹㫊㫇㪅㩷㪹㫌㫃㪾㪸㫉㫀㪺㫌㫊㪝㪆㪝㪆㪝㪈㪊㪸 㪪㪅㩷㫋㪿㪼㫉㫄㫆㫇㪿㫀㫃㫌㫊㪩㪆㪩㪆㪩㪈㪋㪸 㪣㪅㩷㫄㪼㫊㪼㫅㫋㪼㫉㫆㫀㪻㪼㫊㪝㪆㪝㪆㪝㪈㪌㪸 㪥㫆㩷㫃㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩷㪹㪸㪺㫋㪼㫉㫀㪸㪝㪆㪩㪆㪩㪈㪍㪸 㪤㫀㫏㫋㫌㫉㪼㪁㪉㪝㪆㪝㪆㪝㪣㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㩼㪪㫆㫃㫀㪻㩷㫇㪸㫉㫋 㪭㫀㪸㪹㫃㪼㩷㪺㫆㫌㫅㫋㫊 㩼㪧㫉㫆㫇㫆㫉㫋㫀㫆㫅㩷㫆㪽㫇㪟 㫇㫉㫆㪻㫌㪺㫋㫀㫆㫅㩷㩿㪾㪆㪣㪀 㪞㪸㫊㪆㫋㫆㫋㪸㫃㩷㫍㫆㫃㫌㫄㪼㪁㪉 㩿㪚㪝㪬㪆㫄㪣㪀㪁㪊
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Table 25.

Results of fermentation of Undaria pinnatiﬁda with NaCl-less cultures㪣㪸㪺㫋㫀㪺㩷㪸㪺㫀㪻㪝㪼㫉㫄㪼㫅㫋㪼㪻㩼㪪㫆㫃㫀㪻㩷㫇㪸㫉㫋 㪭㫀㪸㪹㫃㪼㩷㪺㫆㫌㫅㫋㫊 㩼㪧㫉㫆㫇㫆㫉㫋㫀㫆㫅㩷㫆㪽㫇㪟 㫇㫉㫆㪻㫌㪺㫋㫀㫆㫅㩷㩿㪾㪆㪣㪀 㪞㪸㫊㪆㪩㫆㫋㫋㪼㫅㪁㪈㪆㫋㫆㫋㪸㫃㩷㫍㫆㫃㫌㫄㪼㪁㪉 㩿㪚㪝㪬㪆㫄㪣㪀㪁㪊
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や高い数値を示した。また，腐敗と判定された試料で，産生は，腐敗臭が認められた試料のうちのほぼ全てで高めの pH 値を示した。乳酸生成量は，へテロ型乳観察された（2b，8b 〜15b）。NaCl 非添加区では，浸酸菌試験区（1b，2b）およびスターター非添加対照

透圧の影響による海藻固形分体積の減少は観察されな区（15b）で少なく（<0 1〜0 43 g/L）
，ホモ型乳酸菌

かったが，ガスの産生した試験区（2b，8b 〜15b）では，試験区（3b，4b，5b，6b，7b，8b）および混合接種区

試料の液状化が観察され，海藻固形分体積の減少につ（16b）で高い傾向にあった（1 39〜1 85g/L）。ガスのながった（固形分体積率：41 1％〜81 3％）。生菌数に

内田 基晴ついては，6 2×10 7 CFU/mL 〜1 1×10 9 CFU/mL の腐敗試料に出現した菌種

範囲で計数され，接種菌種の違い，発酵 / 腐敗の違い

腐 敗 と 判 定 さ れ た 試 料 の う ち 試 料2b，8b，9b，による明瞭な傾向は認められなかった。乳酸菌の存在

11b，12b，13b，15b について生菌数計数時に調製し比率（％）は，試験区1b，で96 7％，2b で90 0％，3b

た BCP 平板からコロニーを分離し，コロニーの形態〜7b，14b，16b で100％，8b で76 7％，9b で33 3％，

学的特徴から10b，11b で96 7 ％，12b で63 3 ％，13b，15b で <3 3型（Type S），その他の型（Others）の つに類別し％であった。

た（Table 26）。 全102株 中，型（Type C），

型が16株で，これら菌種特異的プライマーを使用した菌種組成の解析結果

型 が64株，つの型で，全出現菌の78 4％を占めた。

各 試 験 区 か ら 分 離 さ れ た 合 計30株 を，BCP 平 板

コロニーの形態的特徴に基づいた Type C および上での酸産生能，菌種特異的プライマーを使用した

Type S への類別が正しいことを確認するため，TypePCR 試験にかけ，接種した菌と同一種の乳酸菌株，

C および Type S とされた菌株から接種した菌と種が異なる乳酸菌株，非乳酸菌株の験区ごとに代表株として選び，合計11株について16S

つに類別し，その割合を Fig. 15（NaCl 添加区），Fig.

rDNA の部分塩基配列を決定し，分子系統解析を行っ

16（NaCl 非添加区）に示した。NaCl 添加試料では，た（Fig. 18）。全11株のうち試験区1a 〜7a で接種した菌種の優占率が高く（90 0スター， 株が％〜100％），他の試験区（8a 〜14a）や対照区（15a）コロニーの形態からの分類結果と一致した。

では，極端に低かった（株ずつを各試株がのクラのクラスターに位置し，％〜13 3％）。NaCl 非添加試料でもほぼ同様の傾向が観察され，試験区1a 〜7a

考察で接種した菌種の優占率が高く（63 3％〜100％），他の試験区（8b 〜14b）や対照区（15b）では，極端に低かった（ ％〜20％）。高い優占率を示した菌種は，
，

，

，

で

乾燥加工された市販ワカメ粉末試料の生菌数を測定した結果，属細菌が10 2 〜10 3 CFU/g レベルで検出された。16S rDNA の部分塩基配列に基づいた系統解析の結果，無作為に分離した13株のうち，あった。

のクラスターに位置する菌が混合接種した試験区では，NaCl 添加試料（16a）でを占めたが，安全衛生上問題となる

優占の度合いが高かった菌種とその優占率は，
36 7％，

36 7％，

株と約半数

26 7

スターに位置する菌がのクラ株存在した。この菌株が，食％であった（Fig. 17）。一方，NaCl 非添加試料（16b）

中毒の原因種となりうる菌株であるかどうか現時点でで優占の度合いが高かった菌種とその優占率は，は不明であるが，ワカメ発酵産物の応用を考える場合

66 7 ％，
3 3％，

23 3 ％，に，この類縁菌を含めて，ワカメ基質由来の混入菌の生育を充分抑制することが安全上重要であ

3 3％であった。

㪚㫆㫄㫇㫆㫊㫀㫋㫀㫆㫅㫊㩷㫆㪽㪹㪸㪺㫋㪼㫉㫀㪸

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㪍㪇㩼
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㪇㩼
㪈

㪉

㪊

㪋 㪌 㪍 㪎 㪏 㪐 㪈㪇 㪈㪈 㪈㪉 㪈㪊 㪈㪋 㪈㪌㪚㫌㫃㫋㫌㫉㪼㫊㩷㫇㫉㪼㫇㪸㫉㪼㪻㩷㫎㫀㫋㪿㩷㪻㫀㪽㪽㪼㫉㪼㫅㫋㩷㫊㫋㪸㫉㫋㪼㫉㫊

Fig. 15. Proportion of bacteria identical at species level to the starter-added lactic acid bacteria
among 30 isolates（Results from NaCl-added cultures）

Studies on lactic acid fermentation of seaweed㪚㫆㫄㫇㫆㫊㫀㫋㫀㫆㫅㫊㩷㫆㪽㪹㪸㪺㫋㪼㫉㫀㪸

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㪐

㪈㪇 㪈㪈 㪈㪉 㪈㪊 㪈㪋 㪈㪌㪚㫌㫃㫋㫌㫉㪼㫊㩷㫇㫉㪼㫇㪸㫉㪼㪻㩷㫎㫀㫋㪿㩷㪻㫀㪽㪽㪼㫉㪼㫅㫋㩷㫊㫋㪸㫉㫋㪼㫉㫊㪚㫆㫄㫇㫆㫊㫀㫋㫀㫆㫅㫊㩷㫆㪽㩷㪹㪸㪺㫋㪼㫉㫀㪸

Fig. 16. Proportion of bacteria identical at species level to the starter-added lactic acid bacteria
among 30 isolates（Results from NaCl-less cultures）

㪈㪇㪇㩼
㪐㪇㩼
㪏㪇㩼
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㪈㪇㩼
㪇㩼

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㪣㪅㩷㫇㫃㪸㫅㫋㪸㫉㫌㫄㪣㪅㩷㪹㫉㪼㫍㫀㫊㩷㪈㪍㪸㩷㩿㪥㪸㪚㫃㪄㪸㪻㪻㪼㪻㪀㪈㪍㪹㩷㩿㪥㪸㪚㫃㪄㫃㪼㫊㫊㪀

Fig. 17. Proportion of bacteria in the fermented Undaria cultures prepared with starter-mixture
composed of 11 strains of lactic acid bacteria. Results from NaCl-added（left）and NaCl-less cultures（right）
Table 26. Typing of the bacterial isolates based on morphological characteristics of colony㪚㫌㫃㫋㫌㫉㪼㩷㪥㫆㪅㩷㪽㫆㫉㫀㫊㫆㫃㪸㫋㫀㫆㫅㩷㫊㫆㫌㫉㪺㪼㪥㫆㪅㩷㫆㪽
㫀㫊㫆㫃㪸㫋㪼㫊

㪉㪹
㪊
㪏㪹
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㪐㪹
㪉㪇
㪈㪈㪹
㪈
㪈㪉㪹
㪈㪈
㪈㪊㪹
㪊㪇
㪈㪌㪹
㪊㪇
㪫㫆㫋㪸㫃㩷㪥㫆㪅㩷㫆㪽㩷㫀㫊㫆㫃㪸㫋㪼㫊㪈㪇㪉㩷㩿㪈㪇㪇㪀㩿㪝㫉㪼㫈㫌㪼㫅㪺㪼㩷㩼㪀㪁㪈㪫㫐㫇㫀㫅㪾㩷㫆㪽㩷㫀㫊㫆㫃㪸㫋㪼㫊㩷㪹㪸㫊㪼㪻㩷㫆㫅㫄㫆㫉㫇㪿㫆㫃㫆㪾㫀㪺㪸㫃㩷㪺㪿㪸㫉㪸㪺㫋㪼㫉㫀㫊㫋㫀㪺㫊㩷㫆㪽㪁㪈㪺㫆㫃㫆㫅㫐
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㪫㫐㫇㪼㩷㪚
㪫㫐㫇㪼㩷㪪
㪊
㪇
㪇
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㪇
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㪈㪈
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㪇
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㪊
㪌
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㪥㫆㪅㩷㫆㪽㩷㫀㫊㫆㫃㪸㫋㪼㫊㪈㩷㩿㪫㫐㫇㪼㩷㪚㪀㪈㩷㩿㪫㫐㫇㪼㩷㪚㪀㪉㩷㩿㪫㫐㫇㪼㫊㩷㪚㪃㩷㪪㪀㪈㩷㩿㪫㫐㫇㪼㩷㪪㪀㪉㩷㩿㪫㫐㫇㪼㫊㩷㪚㪃㩷㪪㪀㪉㩷㩿㪫㫐㫇㪼㫊㩷㪚㪃㩷㪪㪀㪉㩷㩿㪫㫐㫇㪼㫊㩷㪚㪃㩷㪪㪀㪪㫋㫉㪸㫀㫅㩷㪥㫆㪅
㪘㪇㪉㪇㪈
㪘㪇㪏㪇㪈
㪘㪇㪐㪇㪈㪃㩷㪘㪇㪐㪈㪍㪘㪈㪈㪇㪉㪘㪈㪉㪇㪈㪃㩷㪘㪈㪉㪇㪌㪘㪈㪊㪇㪈㪃㩷㪘㪈㪊㪇㪏㪘㪈㪌㪇㪈㪃㩷㪘㪈㪌㪈㪊㪈㪍㩷㩿㪈㪌㪅㪎㪀 㪉㪉㩷㩿㪉㪈㪅㪍㪀㩷㪚㫆㫃㫆㫅㫀㪼㫊㩷㪽㫆㫉㫄㪼㪻㩷㫆㫅㩷㪙㪚㪧㩷㫇㫃㪸㫋㪼㫊㩷㫎㪼㫉㪼㩷㫆㪹㫊㪼㫉㫍㪼㪻㩷㪸㪽㫋㪼㫉㩷㪌㩷㪻㪸㫐㫊㪄㫀㫅㪺㫌㪹㪸㫋㫀㫆㫅㩷㪸㫋㩷㪉㪇㷄㪅㩷㪫㫐㫇㪼㩷㪚㪑㩷㪉䌾㪍㩷㫄㫄㩷㫆㪽㩷㪺㫆㫃㫆㫅㫐㩷㫊㫀㫑㪼㩷㫀㫅㩷㪻㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㪃㩷㪺㫉㪼㪸㫄㪄㪺㫆㫃㫆㫉㪼㪻㪃㩷㫊㫄㫆㫆㫋㪿㪄㫊㫌㫉㪽㪸㪺㪼㩷㪸㫅㪻㩷㫎㪼㫋㩷㪸㫇㫇㪼㪸㫉㪸㫅㪺㪼㪁㪊㩷㪫㫐㫇㪼㩷㪪㪑㩷㪌䌾㪈㪇㩷㫄㫄㩷㫆㪽㩷㪺㫆㫃㫆㫅㫐㩷㫊㫀㫑㪼㩷㫀㫅㩷㪻㫀㪸㫄㪼㫋㪼㫉㪃㩷㫎㪿㫀㫋㪼㪄㪺㫆㫃㫆㫉㪼㪻㪃㩷㪽㫃㪸㫋㪃㩷㫁㪸㪾㪾㫐㪄㫉㫆㫌㫅㪻㩷㪸㫅㪻㩷㪻㫉㫐㩷㪸㫇㫇㪼㪸㫉㪸㫅㪺㪼㪁㪉

内田 基晴

A1513
59

A1102

63

A1308

61

A0916

89

A1205
NRS-111 (AF169526)

70

56

NRS-800 (AF169544)
73

99

B-23284 (AF169502)
B. fusiformis (AF169537)
NRS-1198 (AF169528)

85

B. sphaericus (AF169495)
NRS-1691 (AF169531)

89

43

BD-87 (AF169520)

B. circulans (D78312)
70

B. megaterium (D16273)
B. lentus (D16272)
80

A1301
A0901

96

A0801

A0201
A1501
100 A1201

B. cereus (X55063)
B. thuringiensis (AF15955)
60

B. cereus (AJ57728)
99 B. atrophaeus (X60607)
73

B. subtilis (X60646)
B. pumilus (AB048252)

B. thermospaericus (X90640)
0.1

Alicylobacillus cycloheptanicus (X51928)

Fig. 18. Neighbour-joining tree showing the phylogenetic relationships of the bacteria isolated from the fermented Undaria products among the Bacillus groups. The analysis is based on 291 nucleotide sequences of 16S rRNA
gene. Conﬁdence limits estimated from bootstrap analysis（100 replications）appear at the nodes. Alicyclobacillus
cycloheptanicus was designated as the outgroup species for the analyses. Nucleotide sequences obtained from
GenBank and used in the phylogenetic analyses were the same as Fig. 14.

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
ると考えられた。ワカメ基質を加熱（オートクレーブ（VBN）濃度を測定して腐敗の指標とすることを第処理等）により滅菌処理すると，外観等，性状の劣化

章で予備的に検討した（データを示さず）が，セルラが著しいため，滅菌手段として使用することは困難でーゼ投入量に相関して高い値を示し，発酵した試料である。加熱以外の原理に基づく有効な滅菌手法も現在も高い VBN 値を示すことから，単純に腐敗を示す指のところ検討の段階にあり，滅菌処理しないワカメを標とはならなかった。ただし，アミン系物質の揮発量

基質として使用しながら，かつ混入菌の生育を抑制す

は，試料の pH 値に大きく影響されるため，pH 値がる技術を開発することが必要と考えられた。

低めになる発酵した試料では臭気の発生が抑制され，一方，前節においてワカメを発酵させるためのスタ

官能的評価に影響していることが考えられる。イオウ

ーターとして乳酸菌単独の使用が可能であることが示

系の臭気は，一般に閾値が低く，定量的評価のためにされた。そこで，本節では，多数の乳酸菌種について

はガスクロマトグラフィー等の機器分析の導入が必要

これをスターターとして単独使用して発酵試料を調製と考えられた。

し，スターターとして好適な菌種を検索することを目NaCl 非添加条件下での検討においては，チーズ臭，的とした。発酵が順調に達成されない場合におこる問

ガスの産生，液状化等の特徴を示す試料が，しばしば題として，腐敗臭もしくはチーズ様の独特の異臭の発観察され，NaCl 非添加の系では発酵が，不安定にな

生，ガスの産生と海藻固形成分の液状化，乳酸菌の優る傾向が認められた。NaCl 非添加条件下でも，接種占率（％）の低下，pH 値の低下が抑制されること等

した乳酸菌種と同一の菌種が高い頻度で優占していが予備試験で経験されたため，これらの項目に乳酸産ることが確認されたのは，

，

，および

を含む

生量の測定を加えた項目を指標として発酵を評価することとした。また前節の検討結果からは，スターター

，
試験区にお

いてであった（Fig. 16）。混合接種による試験では，の違いにより，発酵産物である単細胞性海藻粒子の生およびが優占しているこ

成率には，大きな違いがないことが観察されているたとが観察され（Fig. 17），これらの菌種が好適である

め，本実験では発酵状態を把握するための指標からはことが示される一方，ずした。細菌相の解析手法については，第 章で直接

下では，計数法で求めた発酵試料中の全菌数の値が寒天平板法

やや劣ると考えられた。スターターとしての適性が（SMA 平板使用）で求めた生菌数の値とほぼ一致し高いとされた，たことから，寒天平板法により生菌数を計数し，このよび

寒天平板から分離したコロニーについて分類同定を行

ホモ型乳酸菌であり，乳酸生成効率が高く，pH 低下

うことした。

作用が高いために良好な静菌効果を示したことが考え発酵条件としては，これまで NaCl を添加した系では，NaCl 非添加条件
やに比べ適性が

，

，

のうち

を除く

お
種は，

られる。一方，同じホモ型乳酸菌でありながら良好な

しか発酵を検討してこなかったが，食品分野等への静菌効果を示さなかった応用を考えると NaCl を添加しない条件下でも検討をび行っておくことが必要となる。本研究では，NaCl 添

1996）と呼ばれるもので，至適生育温度が30℃〜37℃

加と NaCl 非添加の両条件下での試験区を設定した。

付近と考えられる。例えば

NaCl 添加条件下での検討においては，（thermophilic）で45℃で成育するが，15℃では生育，

およは，いわゆる乳系乳酸菌（岡田，は，高温性を除く10種13菌株が高い乳酸菌率を示したが，接しないとされている（柳田，1996）。今回の発酵試料

種した乳酸菌種と同一の菌種が高い頻度で優占していの調製は20℃という低めの温度で検討しており，このることが確認されたのは，，，ことが評価結果に影響した可能性が考えられる。なお，

，および

を含む

試験区にお

乳酸菌スターターを添加した場合，その菌種自体がいてであった（Fig. 15）。腐敗臭が感じられる試料が優占化しない場合でも，他の菌種の乳酸菌が優占する

一部の試験区で観察されたが，チーズ臭，ガスの産ことを促進する傾向にあった（Fig 15：8a-12a, 14a；

生，液状化等は観察されなかった。混合接種区の試

Fig. 16：8b-12b, 14b）。

料も順調な発酵が達成され，および，NaCl 非添加の条件下で混入菌の生育が認められるが優占した（Fig. 17）ことは，と特有のチーズ臭の発生，ガス産生および液状化がおこれらの菌種が好適であることを示した単独接種試料

こる。ここでいうチーズ臭とは，酪酸臭に類似した臭での結果を支持した。腐敗臭については，官能的にア気であるが，本研究ではガスクロマトグラフィー等にミン系の臭気とイオウの臭気との両方が感じられた。

よる分析を行なっていないので正確なところは明らか

アミン系の臭気については，試料の揮発性塩基性窒素でない。チーズ臭の発生，ガス産生および液状化がお内田 基晴こる理由について究明するために，これらの現象が観縁菌および察された試料から102菌株を分離し，コロニー形状かであることは，これらの菌のどちらか或いは両方が，らの類別と，16S rDNA 部分塩基配列に基づく系統解

これらの現象に関与していることを示唆した。

析を行った。その結果，これらの試料には類縁菌およびは，最初に開発された野生型コンソーシアム（B5201，

類縁菌が優占して生育していることが明らかとなった。

類縁菌がともに非好塩性の菌種

Y5201，Y5206）をスターターとして使用して海藻発類縁菌酵試料を調製した場合，NaCl 非添加条件において，つのクラスターに類別されることが報告され混入菌の生育を充分に抑制できず，発酵産物に好まており（Nakamura，2000），今回ワカメ試料から分しくない臭気が付与されたり，離された類縁菌の位置を知るため，系

育による安全衛生上の問題が存在したりしたが，ホ統樹は，のクラスターの部分の参照株

モ型乳酸菌である

類縁菌の生
，

および

を充実させて作成した。系統解析の結果，今回ワカメを使用することにより，発酵過程においLS 試料および発酵試料から分離された菌株は，Naka-て，これら乳酸菌株が優占し，好ましくない臭気の発mura（2000）の報告における生の防止および混入菌の生育の抑制に極めて有効であ

第グループに属する NRS‑111株および NRS‑800株に最も近
く位置し，

った。

標準株である B‑23268株（第グループ）と別のグループに位置した。一方，B.

第 章 海藻発酵素材の応用的価値に関する研究

cereus 類縁菌はワカメ原料基質に10〜100 CFU/mL
存在し，NaCl 非添加条件下で培養した場合に優占し第 節 水産餌飼料としての検討
農業分野では，藁や雑草を堆肥化して作物栽培のてくるものと考えられた。現在までのところワカメ乾燥粉末試料を食品として利用したことで，際の土づくりに利用する。畜産分野では，乳酸発酵さによると思われる食中毒の発生は問題となっていな

せ，サイレージとして利用している。これらは，いずい。これは本菌種の生菌数のレベルが10 3 CFU/mL 以

れも経済的価値の低い植物素材を発酵処理して食糧生下と少ないこと，胞子として休眠状態で存在している

産に結びつける伝統的な技術であり，環境負荷の少なと考えられること，ワカメ粉末が乾燥状態で保存され，い持続可能な技術ということができる。一方，水産分食品として利用される場合も，細菌に生育の機会を与野では，発酵技術を利用して，魚介類の生産に結びつえない条件下で加工されるため等の理由からと考えらけている例は，極めて稀である。水産分野で発酵技術れる。しかし，発酵処理するなど，細菌に生育の機会が普及していないことの理由としては，海洋の植物性を与えてからの利用を考える場合には，食品の安全性

素材即ち藻類を発酵させる技術が知られていなかったを高めるという見地から，分離された類縁ことが考えられる。本研究で開発された海藻の乳酸発菌の性状について，今後さらに詳しく調べられる必要

酵技術は，初めての海洋の植物性素材を乳酸発酵させがある。特に分離された菌株が毒素株なのか非毒素株る技術であり，今後食料生産の分野で様々なかたちでなのかを明らかにすることは重要と考えられる。また，利用されることが期待される。著者らは，既に海藻組類縁菌がワカメ製品に混入して存在する理織を海洋細菌の分解能を利用して単細胞化することに由は，自然生育環境において元々葉体表面に存在しより，水産初期餌料としての価値を有するデトライタていたためなのか，あるいは加工工程で二次的な増殖

ス粒子を人為的に製造する技術を報告した（Uchida，が起こるためなのか興味が持たれる。

株は1996：Uchida and Numaguchi，1996）。 し か し， こ

ヘテロ発酵型の乳酸菌であるため乳酸発酵の進行に伴の手法で得られる餌料素材は，アルテミア等の懸濁

2い，CO を産生していると考えられるが，その産生量

物捕食者に対して飼料効果を有することが証明されが少ないためか，高濃度のワカメ粒子の含む発酵試料ているものの（Uchidaにおいては，ガスの発生は目視によって観察されなか

1997b），単細胞化の効率，保存性，安全性の点で改った。したがって本試験で一部の試料についてのみ観善の余地があり，実用化までに至っていない。一方，察されたガスの発生は，乳酸発酵以外の反応により産

今回著者が開発した海藻の発酵技術によれば，これ生しているものと推察された。試料が顕著に液状化しらていることを加味して考えると，ワカメの多糖が基質

ち，セルラーゼを使用してワカメ乾燥粉末を基質としとなり，炭酸ガスあるいはメタンガスが発生しているて発酵処理をした場合，海藻粒子全体の約70％（重量可能性が考えられる。ガスの産生および液状化が観察換算）を単細胞性粒子画分（直径5 8〜11 5μm）が占された試料から高頻度で分離された

める（Uchida and Murata，2002）。また20℃で18ヶ類.，1997a；Uchida.，

つの問題点が改善しているものと期待される。即Studies on lactic acid fermentation of seaweed
月間保存した後も直径2 9〜11 5μm 画分の粒子濃度

明暗周期）した対数増殖期後期〜定常増殖期初期の新が2 5×10 8 cells/mL のレベルを維持していた（第鮮な細胞を餌料として使用した。ワカメ試料（MS ，章第節）。安全性についても，乳酸菌，酵母は，病MS ，MS C）は，目合63μm のナイロンメッシュ

原性を有する種が極めて限られており，従属栄養型のでろ過しながら必要量をアコヤガイ初期稚貝に投与し海洋細菌を使用するよりは，安全であると考えられる。

た。

一方，水産増養殖の分野では，二枚貝を対象に使用できる大量安定供給できる餌飼料の開発が強く望まれ海藻発酵試料の性状評価て い る（Langdon and Siegfried，1984；Numaguchi

海藻発酵試料中の飼料粒子数は，140μm 径のオリand Nell，1991；Sorgeloos，1995）。そこで本研究第フィスを使用してコールターマルチサイザー（Beck-章第 節においては，海藻発酵素材の水産餌飼料とman Coulter, Inc.）で測定した。生菌数のうち従属栄

しての利用の可能性を探るため，ワカメ乾燥粉末を基

養微生物は，標準寒天培地（日水製薬，SMA と略記）

質として調製した単細胞化・乳酸発酵素材について，

およびマリンアガー 2216（Difco，MA）で計数した。

アコヤガイ初期稚貝を対象とした飼育試験により，そ乳酸菌は，BCP 加プレートカウントアガールで計数の飼料価値を評価した。

した。酵母は，サブロー寒天培地（日水製薬）に，
NaCl を方％濃度添加した平板培地（SBR5）で計数した。乳酸生成量は，市販キット（F キット D‑ 乳酸

法/L‑ 乳酸，Roche Diagnostics）を使用して測定した。
海藻発酵飼料および生物餌料の調製
第回目の飼育試験に使用したワカメ発酵試料（MS1）は，本研究第章第アコヤガイの飼育条件
第節の大量調製，保存性回飼育試験では，アコヤガイ初期稚貝（背縁長試験のところで野生型コンソーシアム（B5201株，

平均±標準偏差 4 59±0 41mm，25個体を測定して算Y5201株，Y5206株）をスターターとして10L 規模で出）15個体を調製されものを使用し，20℃下で ヶ月間保存した段育はエアレーションを行いながら実施し，水温27℃，

階で使用した。

塩分濃度33〜34‰であった。給餌は

第回目の飼育試験に使用したワカメ発酵試料（MS2）は，短期間で調製するため第回目の飼料のL 水槽に収容して12日間飼育した。飼

育水は，毎日日回行い，飼回全量を新しい海水（砂ろ過処理）と交換した。ワカメ発酵飼料（マリンサイレージ）投/ ，セルラーゼ濃

与 区 と し て，

×10 4 cells/mL/ 日，

度を 倍として新たに調製して飼料として使用した。

mL/ 日 お よ び

×10 3 cells/mL/ 日 の 量 で 投 与 し た

即ち，市販ワカメ乾燥粉末（若みどり，理研ビタミ

試 験 区 を 設 定 し た（ そ れ ぞ れ MS

調製法に比べ，海藻濃度条件が×10 4 cells/， / MS1，ン）20g およびセルラーゼ（ONOZUKA R-10，ヤク/10MS1）。

を予備試験の結果で最も成ルト本社） g を滅菌3 5％（w/v）濃度 NaCl 水溶液

績の良かった×10 4 cells/mL/ 日の条件で投与した360mL とともに，500mL 容のスクリューキャップ式

試験区をポジティブコントロールとして，また無給餌

遠心チューブ（ポリカーボネート製，Nalgene）に入れ，区をネガティブコントロールとして設定した。

さらに各菌体懸濁液

mL を添加して，スクリューキ

第回飼育試験では，別の産卵ロットで得たアコヤ

ャップを閉じた状態でよく振って混合した。菌体懸濁ガイ初期稚貝（背縁長平均 4 47〜4 95 mm，各水槽

液は，乳酸菌は MRS（Merck）培地で，酵母は YM

ごとに全15個体を測定して算出）を15個体ずつ水槽に

broth（Difco） で 前 培 養 し， 滅 菌0 85 ％ 濃 度 NaCl

収容し，水温27℃，塩分濃度32〜33‰の条件下で，第水溶液で回遠心洗浄後，同 NaCl 水溶液に対してOD660nm=1 0の濃度で菌体を懸濁させて調製した。使
用した菌体懸濁液は1mL 当たり，5 0×10 8 CFU（B5201
57回飼育試験と同様に飼育を行った。比較対照区として無給餌区，

区（，
×10 4 cells/mL/ 日）を設けた。
区（ ×10 3 cells/mL/ 日）/10株），5 5×10 CFU（Y5201株）及1 2×10 CFU（Y5206

ワカメ発酵飼料区としては，MS2（ ×10 4 cells/mL/株）の生菌数を含んでいる。菌体接種後，発酵試料日）および2 5MS （は，20℃下した。併用給餌区として MS を ×10 4 cells/mL/ 日

日間，静置培養を行った後冷蔵庫（

×10 3 cells/mL/ 日 を 給 餌 し た 試℃）に保管した。菌体だけを接種しない試料を対照と試料（MS C）として別に調製し，使用まで冷蔵庫

験区を設定した（MS（

非発酵試料（MS C）については，MS℃）に保管した。

は，改変

Erd-Schreiber 培地（沼口，1994）で培養（14h：10h

を×10 4 cells/mL/ 日）を設定

＋

/

）
。ワカメ
と同様の給

餌試験区を設定した（MS2C，2 5MS C，MS C ＋

内田 基晴/）。第回飼育試験では，各試験区して実施した。（SPSS 11 0J，SPSS Inc.）.

水槽，第 回飼育試験では，各試験区 水槽を使用した。

結

海藻発酵飼料の一般分析

果

海藻飼料の性状

市販ワカメ試料（若みどり，理研ビタミン）の一般

飼 育 試 験 に 実 施 し た 海 藻 飼 料（MS1，MS2，

分析を行った。発酵ワカメ試料については，3 5％濃MS2C） の 性 状 分 析 の 結 果 を Table 27に 示 し た。

度の NaCl を添加して調製してあるため，その乾燥物

MS1，MS2，MS2C は， 単 細 胞 化 画 分（ 直 径2 9〜の一般分析を行っても NaCl が濃縮されて灰分の値が11 5μm） の 粒 子 を そ れ ぞ れ2 6×10 8 /mL，1 2×

突出して大きくなり，発酵処理による成分変化の傾向

10 8 /mL，1 4×10 8 /mL 含 ん で い た。BCP で 計 数を読み取るのが困難であると考え，一般分析を行わなさ れ た 乳 酸 菌 数（ 乳 酸 菌 の ％ 割 合 ） は，2 2×10 6

かった。その代りに若みどりの製造工程において水洗，
CFU/mL（>98 5 ％），3 0×10 7 CFU/mL（>99 ％）浄を徹底して行い塩分含量を極力低減させた低塩規格<10 6 CFU/mL であった。SBR で計数された酵母生菌品である若みどり LS について発酵の前後で一般分析数（Y5206の％割合）は，1 4×10 5 CFU/mL（>97 6％），を行って比較した。粗タンパク質含量は Kjeltec Auto，<10 3 CFU/mL であった。
3 5×10 7 CFU/mL（>99％）1030 Analyzer で測定した。その他の成分の測定は，定法に従った（科学技術庁調査会，2002）。炭水化物

海藻発酵飼料の飼料効果と適性飼料濃度

含量は，全体から粗タンパク質，脂質，灰分の含量

Table 28に第を差し引いて表した。LS 発酵試料は，若みどり LS

区（

800g，セルラーゼ（ONOZUKA R-10，ヤクルト本社）
g，滅菌蒸留水

L，野生型コンソーシアム（B5201，

Y5201，Y5206）の菌体懸濁液（OD660nm=1 0）を各80
mL ずつ添加し，℃で日間前培養した後，20℃下回試料試験の結果を示す。

×10 4 cells/mL/ 日給餌）では，背縁長成長率205±12μm/ 日（平均±標準誤差），生残率
96 7±6 6％（平均±標準誤差）であった。一方，無給餌区では，背縁長成長率−26±
率100％であった。MS1区（/

乾燥して分析試料とした。一般分析は， 本試料立て

区（

で測定し，平均値で表した。

長率が69±11μm/ 日，−

飼育結果の統計解析
第，×10 cells/mL/ 日）

×10 4 cells/mL/ 日）および1/10MS1

で11日間本培養して調製した。LS 発酵試料は，凍結

±

MS1区（

μm/ 日，生残4

×10 3 cells/mL/ 日）では，それぞれ背縁長成±

μm/ 日および−13

μm/ 日で，生残率が100％，90 0％および90 0％であった。MS1の背縁長成長率は，無給餌区の同値に回飼育試験の結果の統計学的処理をするにあ比べ有意に（P<0 05）高く，飼料効果を示すものでたり，25個体のデータを基に算出した背縁長平均値をあった。検討した給餌濃度の中で，最も成績が良かっ全ての個体の背縁長初期値と仮定して，飼育終了時た給餌条件は，×10 4 cells/mL/ 日であった。

の背縁長サイズから差し引いて個体成長率を算出した。成長率は，各試験区水槽の個体成長率データ（n=27˜30）を合わせて平均値±標準誤差で示した。

海藻飼料の一般成分
一般成分分析の結果を Table 29に示した。発酵基回飼育試験の結果の統計学的処理をする際に質として使用したワカメ試料（若みどり）の乾物あたは，各試験区の全個体（15個体）の背縁長サイズを飼り一般成分は，粗タンパク質含量24 1±0 4％（平均±

育試験開始時に測定し，その平均値を飼育終了時の標準誤差 , n=

各個体の背縁長サイズから差し引いて 日あたりの個％，灰分28 4±0 0％であった。若みどり製品より前

体成長率を算出し，平均値±標準誤差で示した。各試

処理での水洗浄を徹底してある若みどりの低塩規格

験区内の個体成長率データの分散の等質性は，Leven

品（LS）は，粗タンパク質含量33 1±1 2％，粗脂肪

test により試験区間で比較し検定した。各試験区の平4 8±0 3％，炭水化物44 4％，灰分16 8±0 0％であっ

均成長率の差の検定は，分散分析により行った。分た。LS 発酵品では，粗タンパク含量34 4±0 1％，粗散分析は，まず Kruskal Wallis test を実施して，試

脂肪2 8±0 1％，炭水化物45 8％，灰分16 2±0 1％で，験区間に有意な差が存在するかどうか検定し，有意乳酸発酵処理による一般成分比の大きな変化はなかっ

差（P<0 05）が認められた場合には，さらに Games-

た。

第

）
，粗脂肪2 8±0 8％，炭水化物42 8

Howell test を実施して有意差を有する試験区を検出した。一連の統計検定は，市販統計解析ソフトを使用

併用給餌による飼育効果

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 27. Characteristics of the Undariadiets㪚㪿㪸㫉㪸㪺㫋㪼㫉㫀㫊㫀㫋㫀㪺㫊㫇㪟㪧㪸㫉㫋㫀㪺㫃㪼㫊㩷㫀㫅㩷㪸㩷㪉㪅㪐㪄㪈㪈㪅㪌㱘㫄㩷㪽㫉㪸㪺㫋㫀㫆㫅㩷㩷㩷㪥㫌㫄㪹㪼㫉㫊㩷㩿㪺㪼㫃㫃㫊㪆㫄㪣㪀㩷㩷㩷㩿㪧㫉㫆㫇㫆㫉㫋㫀㫆㫅㩷㫆㫅㩷㫍㫆㫃㫌㫄㪼㩷㪹㪸㫊㫀㫊㪃㩷㩼䋩㪤㫀㪺㫉㫆㪹㫀㪸㫃㩷㪺㫆㫌㫅㫋㫊㩷㩿㪚㪝㪬㪆㫄㪣㪀㩷㩷㫆㫅㪤㪪㪈㪁㪈㩿㪝㪼㫉㫄㪼㫅㫋㪼㪻㪀
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Table 28. Results of feeding trials of MS1 on young pearl oyster, Pinctada fucata martensii
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種類のワカメ試料について飼料効果を第回飼

餌 区（MS× 10 4 cells/mL/ 日 +3は，ワカメを単細胞化し×10 cells/mL/ 日 ） で は， 背 縁 長 成 長 率 が125±13

な が ら 乳 酸 発 酵 さ せ た 試 料 で あ り，MS C は， 単

μm/ 日，生残率が80 0％で両指標とも改善された。

細胞化処理だけを行い，生菌数が僅少である（BCPMS C 併 用 給 餌 区（MS C

計数値 : <10 6 CFU/mL）試料である。飼育成績の結+育試験で評価した。MS

果 を Table 30に 示 し た。
cells/mL/ 日給餌）および

区（
/10

×10 4

区（

×

×10 4 cells/mL/ 日

×10 3 cells/mL/ 日）においても，背縁長成長率が71±14μm/ 日，生残率が93 3％と飼育成績の改善が認められたが，改善の幅は，MS

試料10 3 cells/mL/ 日）においては，背縁長成長率（平均の場合程顕著ではなかった。MS±標準誤差）がそれぞれ168±33μm/ 日および11±10

も給餌量をμm/ 日，生残率がともに66 7％であった。無給餌対成長率が47±17μm/ 日および23±16μm/ 日で，生照区の背縁長成長率と生残率は，それぞれ−10±14μ

残率が66 7％および53 3％となり，飼育成績が上がる

4

m/ 日，53 3％であった。MS2区（ ×10 cells/mL/ 日）および MSC 区（

×10 4 cells/mL/ 日）では，背縁×10 4 cells/mL/ 日まで増やすと背縁長傾向が見られたが，併用給餌区のような良好な成績ではなかった。

長成長率がそれぞれ23±13μm/ 日および18±16μm/
日（対照区に対して有意差有り，P<0 05），生残率がそれぞれ53 3％および66 7％であった。MS

併用給および MS C と考察内田 基晴Table 29. Proximate analysis of Undariaproducts㪪㪸㫄㫇㫃㪼㫊
㩼㩷㪚㫉㫌㪻㪼㩷㫇㫉㫆㫋㪼㫀㫅 㩼㩷㪚㫉㫌㪻㪼㩷㫃㫀㫇㫀㪻 㩼㩷㪚㪸㫉㪹㫆㪿㫐㪻㫉㪸㫋㪼㩼㩷㪘㫊㪿㪮㪸㫂㪸㫄㫀㪻㫆㫉㫀
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Table 30. Results of feeding trials of MS2 and MS2C with young pearl oyster, Pinctada fucata martensii
㪫㫉㪼㪸㫋㫄㪼㫅㫋㫊㪟㫀㫅㪾㪼㩷㫃㪼㫅㪾㫋㪿㩷㩿㪤㪼㪸㫅㫧㪪㪛㪃㩷㫄㫄㪀㪝㪼㪼㪻㫀㫅㪾㩷㪺㫆㫅㪻㫀㫋㫀㫆㫅㫊㩷㩿㪺㪼㫃㫃㫊㪆㫄㪣㪆㪻㪸㫐㪀㪬㫅㪽㪼㪻㪚㪿㪸㪼㫋㫆㪺㪼㫉㫆㫊㪈㪆㪈㪇㩷㪚㪿㪸㪼㫋㫆㪺㪼㫉㫆㫊㪤㪪㪉㪤㪪㪉㪂㪈㪆㪈㪇㪚㪿㪸㪼㫋㫆㪺㪼㫉㫆㫊㫏㪉㪅㪌㩷㪤㪪㪉
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MS の単独投与では単独投与区のように

MS と略記）は大量安定生産できる新飼料素材であ

高い飼料効果は有していないと考えられた。対照区（無り（Uchida and Murata，2002），微細藻類の代替品

給餌区およびとしての利用が期待される。本研究では，MS のアコ

育試験の成績は，第ヤガイ初期稚貝に対する飼料効果を評価することをに低下している傾向が認められるが，この原因として目的とした。餌飼料素材としての価値を評価する場

は，飼育試験を開始するまでの稚貝の前飼育期間が合，投与した餌料の粒子数，重量或いは粗タンパク

回目の試験の方が長かったため，稚貝の活性が下がっ

質含量等の栄養成分に着目して基準化を行って単位投ていた可能性が考えられた。飼料の一般成分を乾重量

与量あたりの飼料効果という形で比較するのが一般的換算で比較すると，良好な飼料素材とみなされる区）で比較すると第回飼

回飼育試験の成績より全般的であるが，このような比較をする場合には，餌飼料をの成分組成は，粗タンパク質43 0％，粗脂

好適な濃度条件で投与して得られた飼育成績に基づか肪13 3％，炭水化物11 7％，灰分31 4％（日清オイリオ，

なければならない。そこで最初に MS の好適投与濃製品資料）である。この値と，本研究における MS の

4×10 cells/mL/ 日も

成分分析値とを比較すると，MS は，タンパク質のよ

しくはそれ以上の濃度での投与が好適と考えられた。

うな主要成分よりも脂質成分がまず不足する可能性度を知るための試験を行い，第回目の試験では，

×10 4 cells/mL/ 日の他，

4×10 cells/mL/ 日での投与を試験し，背縁長成長率
による評価では，

4

×10 cells/mL/ 日での投与の方が成績が良かったが，残餌による飼育水の汚れが著4

用給餌することにより，MS の飼料効果は大きく改善されることが回目の飼育試験で観察された。背延長

成長率の値だけで比較すると，併用餌料区（MS4×310 cells/mL/ 日 +×10 cells/mL/ 日 投と判断した。MS 投与区は無給餌区に比べ有意な成長与）の飼料効果は，（を示し，飼料効果を有することがまず確認された。単日投与）の74％であり，生残率では逆に上回っていた純に背縁長成長率の値だけで比較すると，MS（×（Table 30）。成分分析の結果とあわせて考察すると，

10 4 cells/mL/ 日投与）の飼料効果は，好適な餌料と少量の微細藻を併用給餌することにより，制限要因にしく，飼育水の状態からされる（

×10 cells/mL/ 日が最適が示唆された（Table 29）。一方，少量の微細藻を併

4×10 cells/mL/ 日投与）の34

×10 4 cells/mL/なっていた脂質等の栄養成分が供給されて，飼料効果％であった（Table 27）。調製後七ヶ月経過試料およが大きく改善したことが考えられる。一般に

び調製直後の試料でともに飼料効果が認められたが，をはじめ，飼料効果が高いとされる

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
餌料の大量安定供給は非常に難しい。したがって，今
回の

餌料のうち

Man

割程度を代替しても，餌料10割供給の飼育成績に近い飼育効果が得られるという観察は非常に注目される。今回のNutrients

Harvest

併用給餌による飼料効果の改善の部分は，シングル試
験での観察であるため，今後この部分を追試して確かめることが必要である。しかし，同様な併用給餌による飼育効果の顕著な改善は，他の海産餌料生物である
ワムシ（Rotifer）を対象にした飼育試験によっても観察しているところである（未発表）。発酵処理をした MS

Fish production(Bivalves etc.)と発酵処理をしていない MS2C の飼料効果を

Marine silage(Conversion to diets䋩

比較すると，統計的に有意ではないが全体的に MSの方が成績が優れる傾向があった。この理由として
飼料中の微生物の存在が関係していることが考えられる。細菌が懸濁物フィーダーであるワムシ（Douillet，

Seaweed(Ulva etc.)

Fig. 19. Concept of sustainable ﬁsh production system utilizing a fermentation skill of seaweed.

2000）や二枚貝（Douillet and Langdon，1994）に対して栄養源として貢献することは既に知られている。

型の食糧生産システムが構築されることとなる（Fig.

また他の研究例では，ある種の微生物の存在が，二枚19）。このような MS 化の技術を利用した海藻資源の貝の成育に対して単に栄養源としてではなくプロバイ

利用のかたちは，緒言で述べた農業での堆肥技術や畜

オティックな効果として貢献する可能性を認めている産業でのサイレージ技術と相通じるものがあり，今後（Riquelme.，1997）。 従 っ て， 本 研 究 に お い て

水産分野においても，植物性素材を発酵させて食料生も，発酵スターターとして使用され，飼料中の生菌と産に結び付けていく技術として確立されていくことがして存在する乳酸菌や酵母が，アコヤガイ初期稚貝の期待される（Uchida, 2003，内田，2003）。

生育に栄養源等として貢献した可能性が考えられた。
MS がプロバイオティクス的な効果を有するかどうか

第 節 健康機能性食品素材としての検討についても今後の研究によりさらに明らかにされてい日本人が海藻を食する習慣は，古い文献にも見られ，

くことが期待される。また MS は，他の海藻を原料基日本人が食する海藻の種類は20以上にものぼる。とり質としても調製が可能である。海藻は，種類によってわけワカメ（葉体組織の成分や構造が大きく異なるため，例えば褐

本人が日常において最も食する頻度の高い海藻の一つ

藻類と緑藻類とで餌飼料効果も大きく異なる可能性がである。ワカメは，元来，日本人に健康イメージのあある。ワカメの場合，アルギン酸多糖が単細胞粒子のる食材であるが，近年ワカメを配合した飼料を給餌さ

表面を被覆しているため，安定である反面，消化吸収せたラットにおいて，脂肪酸酸化系の肝臓酵素が亢進が悪い可能性がある。一方，緑藻類のアオサの場合，することが報告されており，ワカメが有する健康機能

このような多糖がない形の単細胞性粒子が得られるた性に関する科学的知見が集積しつつある（Murata

め，消化吸収がよいことが期待される。今後，アオサ.，1999；Murata, Wakame）は，日.，2002）。ワカメは，生あるを始め他の種類の海藻から調製された MS の餌飼料効

いは塩蔵品で流通し，野菜サラダや味噌汁の具として果も明らかにされていくことが望まれる。

食用に利用されるが，ワカメを発酵処理した類の食材

以上の考察においては，従来型の種苗栽培の現場には，これまで市場に見当たらない。

おいて現行餌料である微細藻の代替品として集約的な

一方，著者らが開発した発酵技術により得られる海利用を想定して議論を行ってきた。しかし，MS の利藻の乳酸発酵素材は（Uchida and Murata，2002），

用法としては，開放形において全くこれまでと異なる

Fig. 1において，これまで欠落していた海洋系の植物

粗放的な利用法を想定することも可能である。近年，性基質由来というジャンルの食品素材を提供するもの

内湾域において，アオサの大量繁殖が各地で報告されであり，今後，食品分野での利用が大きく期待される。

ている。アオサの藻体は，内湾域の窒素等の栄養塩を

一般に乳酸発酵食品については，その健康機能性につ吸収したものとみなされるのでこれを，MS 化してアいて多数の研究がなされており，整腸作用，血中コレ

サリ等の餌飼料として機能させ，二枚貝類や他の有用

ステロール低減作用，血圧降下作用，制癌作用，免疫

水産資源の生産に転嫁することができれば，物質循環賦活作用等様々な有用機能があることが報告されてい内田 基晴る（高野ら，1996）。したがって，海藻の乳酸発酵素

間の本培養を行った。本培養時には材の食品利用に向けてはその健康機能性を証明していを数回上下させて，スクリューキャップを閉じた状

くことが重要と思われる。

態でよく振って発酵試料の均一化を図った。菌体懸海藻発酵産物を食品として利用しようと考えた場合

日一回，容器濁液は，乳酸菌を MRS（Merck）培地で前培養し，には，低塩分あるいは塩分を含まない状態の発酵産物

滅菌0 85％濃度食塩水でであることが好ましい場合も多い。また健康機能性の対して OD660nm=1 0の濃度で菌体を懸濁させて調製し探索を動物を対象とした食餌試験により実施しようとた。菌体懸濁液

した場合には，海藻試料には，過度の塩分が含有され

8，
7 9×10 CFU（B5201株），6 4×10 8 CFU（B5406株）ていないことが求められる。海藻の発酵条件の検討に

5 5×10 6 CFU（Y5201株）及8 5×10 7 CFU（Y5206株）

あたっては，これまで NaCl を2 5〜3 5％濃度で添加である。発酵終了後，試料は直接凍結乾燥し，ミキサ

して微生物相を制御し易い条件下で発酵させることがーで粉砕後，メッシュ 200を通して配合飼料に使用し主に検討されており（Uchida and Murata，2002），

た。凍結乾燥前の海藻発酵試料について市販キット（F

塩分を添加しない条件下での発酵については知見に乏

kit D /L 乳酸，Roche Diagnostics）を使用して乳しい。

酸生成量を測定した。また凍結乾燥後の海藻発酵試料

回遠心洗浄後，同食塩水にmL 当たりに含有される生菌数は，

本研究では，まず野生型コンソーシアムをスタータについて生菌数の測定を行った。生菌数は，BCP 加

ーとして利用して NaCl を添加しない条件下での海藻

プレートカウントアガール（日水製薬，BCP）
で計数し，発酵試料の調製を検討した。次に得られたワカメ発酵

全コロニー数に対する黄色のコロニー数の割合を乳酸

素材を10％（w/w）配合した飼料をラットに摂食さ菌の割合（％）とした。酵母は，サブロー寒天培地（日せて，脂質代謝に及ぼす影響について検証した。

水製薬，SBR）で計数した。乳酸菌については，BCP上のコロニーを20個無作為に選んで分離し，第

方

法

章第

節の菌種特異的プライマーセットを使用して PCR
法により，分離菌中の接種菌と同じ菌種の割合を調べ

材

料

た。

ワカメ乾燥粉末は，市販製品（若みどり LS，理研
ビタミン）を使用した。セルラーゼは，ONOZUKA
R‑10（ ヤ ク ル ト 本 社 ） を 使 用 し た。 ス タ ー タ ー 微
生物は，中央水産研究所（横浜）に保存されてある

000046），

試験動物と試験飼料の調製
オス Sprague-Dawley 系統，

週令（体重70〜80g）のラットを㈱紀和実験動物研究所（和歌山）より購

B5201 株（=FRA 000033），

入して実験に使用した。ラットは，個別にステンレ

var.

ス製の網かごに収容され，空調設備のある部屋（温度Y5201 株（=FRA

sp. Y5206 株（=FRA 000047） およびB5406株（=FRA 000035）を

20℃〜22℃，湿度55〜65％，照明時から19時まで点灯）で，非精製飼料（NMF タイプ，オリエンタル酵使用した。パルミトイル CoA（16：0‑CoA），オレ母）で飼育が行われた。18日間の慣らし飼育の後，イル CoA（18：1-CoA）は Kawaguchi ら（1981）の個体ずつ 群に分け，精製基本飼料およびこれにワカ方法により調製した。アセチル CoA は，Sigma 製品

メ試料を10％含有する試験飼料を給餌した。試験試料（St. Louis）を使用した。

は，ワカメ10％に含有される各種栄養成分に相当する量を基本飼料から差し引いて成分調整をして調製した

海藻発酵素材の調製と性状分析
ワカメ発酵試料（Wakame-（Table 31）。差し引かれて減じた部分は，ショ糖添加
および Wakame-

量で補填した。Wakame 群の成分調整にあたっては，）の調製は，まずワカメ乾燥粉末 LS 800g およ飼料を配合する時点で，若みどり LS の成分分析値がびセルラーゼ（ONOZUKA R-10）g を滅菌蒸留水

不明であったため，予備試験で調べた別のワカメ粉末

L とともに，10 L 容のスクリューキャップ式タン

試料（栄養試験用，理研ビタミン）の分析値（粗タン

ク（ポリカーボネート製，Nalgene）に入れて混合し

パク含量25 7％，粗脂肪含量4 5％，灰分11 4％，繊維た。

3 4％）を参考として相当分のタンパク質含量をカゼ℃で一晩放置して，ダマの減少を図った後，ス

ターターとして 種類（
Y5206株 お よ び

群 : B5201株 Y5201株，

インで，脂質分をなたね油で調整した。ミネラル組成

群 : B5406株，Y5201株，Y5206については，ワカメに含まれるミネラル組成が不明で株）の菌体懸濁液各80mL ずつを添加して混合後，あるため，成分調整を行わなかった。ワカメ発酵℃で料（Wakame-

日間の前培養し，さらに続いて，20℃で

日および Wakame-

試）については，

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 31. Composition of the experimental diets ＊1+PITGFKGPVU㧔IFKGV&./GVJKQPKPG#+0XKVCOKPOKZVWTG#+0OKPGTCNOKZVWTG 
2QVCVQUVCTEJ
9CMCOG 9CMCOKFQTK.5 $TGXKU HGTOGPVGFYCMCOG%CUGK HGTOGPVGFYCMCOG%CUGKP%QPVTQN

9CMCOG 9CMCOGDTGXKU 9CMCOGECUGK

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5WETQUG
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
#DDTGXKCVKQPUWUGF%QPVTQN#+0FKGV9CMCOG#+0FKGVYKVJ
YCMCOG9CMCOGDTGXKU #+0FKGVYKVJDTGXKU HGTOGPVGFYCMCOG9CMCOGECUGK #+0FKGVYKVJECUGK HGTOGPVGFYCMCOG9CMQ2WTG%JGOKECN+PFWUVTKGU 1UCMC
1TKGPVCN;GCUV 6QM[Q4KMGPXKVCOKP 6QM[Q
#KMW 6QM[Q

発酵処理により，ワカメ試料の粗タンパク質含量が約

は，主にミトコンドリア画分に活性が存在しており％増大すること（Table 29）を加味して，Wakame（Schulz，1991），500xg 遠心肝臓ホモジネート上清画

区飼料組成からさらに0 1g 分のカゼインを減じたも分を測定に使用するとブランクが高くなり過ぎるといのとした。飼育開始時のラットの体重は220±8 7g（平う問題があるため，ミトコンドリア画分試料を使用し均±標準偏差）であった。実験動物の取り扱いに当たて酵素活性を測定した。カルニチンパルミトイルトラっては，中央水産研究所（横浜）実験動物取り扱い倫

ンスフェラーゼ活性は，Ide ら（1987）の方法に従い，理規定に添って実施した。

Triton X-100で可溶化したミトコンドリア画分を試料として測定した。本法によれば，カルニチンパルミ

酵素活性の測定

トイルトランスフェラーゼⅠの活性のみならず，ミト

実験終了後，ラットはジエチルエーテルで麻酔され，開腹の後，肝臓組織が手早く取り出された。約
ラット肝臓組織をコンドリア内膜に存在するカルニチンパルミトイルト

gのランスフェラーゼⅡの活性も含んで測定している可能

倍量の0 25 mol/L ショ糖液とと性がある。アシル CoA 脱水素酵素の活性は，フェナ

もにホモジネートし，500xg で10分間遠心処理した。

ジンメソサルフェイト（phenazine methosulfate）を

上清を分取し，さらに9000xg で10分間遠心処理し，第一電子受容体として使用し，その他の部分は Dom-

ミトコンドリア画分を得た。ミトコンドリア画分を，

mes and Kumnau（1976）
および Dommes

mmol/L EDTA および

mmol/L Tris-HCl（pH7 0）

を含む0 25mol/L ショ糖液で回洗浄し，最終的に同.（1981）の方法に従って測定した。アシル -CoA オキシダーゼ（EC 1 3 3 6）活性は，500xg 遠心肝臓ホモジネート

ショ糖液に対し，タンパク濃度が20〜25g/L になるよ

上清画分を使用して既報（Hashimoto

う懸濁した。グルコース− −リン酸脱水素酵素（ECIde

1.1.1.49）（Kelley and Letzien，1984），リンゴ酸脱パルミトイルトランスフェラーゼ活性測定のための基水素酵素（EC 1.1.40）（Hsu an Landy，1969），脂肪質としては，16：0−CoA（Kawaguchi

酸合成酵素（Kelley.，1986）の活性は，肝臓ホを使用し，アシル Co−A 脱水素酵素およびアシル

モジネートの9000xg 遠心上清を試料として測定した−CoA オキシダーゼの活性測定のための基質には，（Ide

16：0-CoA，18：1−CoA を使用した。3−ヒドロキシ.，1992）。

500xg10分間の遠心処理により得られた肝臓ホモジ
ネート上清画分は，カルニチンパルミトイルトラン.，1981；.，1987）の方法により測定した。カルニチン.，1981）

アシル−CoA 脱水素酵素活性の測定には，アセチル−CoA を使用した。

スフェラーゼ（EC 2 3 1 21）およびアシル -CoA 脱水素酵素（EC 1 3 99 3）を除く脂肪酸酸化系酵素の活

脂質分析

性測定に使用された。カルニチンパルミトイルトラ

肝臓および血清脂質は，Folch らの方法（1957）にンスフェラーゼおよびアシル Co-A 脱水素酵素の活性より抽出し，精製した。抽出されたトリアシルグリ

内田 基晴セロール，コレステロールおよびリン脂質の測定は，既報（Hara（P<0 05）。

.，1993）の方法に従った。血中のβ脂肪酸酸化関連物質であるアセト酢酸の血清中濃度−ハイドロキシブチレートの測定は，除タンパク質処

は， 有 意 で は な い が，Wakame 群，Wakame-

理した試料について酵素法により測定した（Ide and群および Wakame-Ontko，1981）。

146％，180％，107％と高い値を示した（Table 34）。

群とも対照群に比べそれぞれ

血清中β−ハイドロキシブチレート濃度も，対照群と統計解析

比べそれぞれ128％，132％，132％と高い値を示した。

全ての測定データは平均値（± SE）で示した。飼肝臓ミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸化の過程

料群間の分散分析は，Duncan の多範囲検定（Duncan，で，脂肪酸物質がミトコンドリア膜を通過する際のキ

1957；Steel and Torrie，1980）により行った。

ャリアとして機能するカルニチンの量は，総カルニチ
ン量および遊離カルニチン量の両者としも Wakame

結

果群，Wakame-

群および Wakame-群とも対照群に比べ増加していた。
ラット飼育試験の結果

肝 臓 中 の 脂 肪 酸 合 成 酵 素 活 性（Table 35） は，21日間のラット飼育期間において， 日あたり平均

Wakame 群，Wakame-群および Wakame-

摂餌量および総体重増加量は，試験群間で有意な差が群とも対照群より低く，とりわけ Wakame-

みられなかった（P>0 05，Table 32）。

対照群との間は，有意な差があった（P<0 05）。リン

血 清 中 ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル 値 は，Wakame-

群とゴ酸脱水粗酵素活性は，有意ではないが，Wakame

群が，対照群より有意に低かった（P<0 05，

群，Wakame-

群および Wakame-

群とも対Table 33）
。血中コレステロール値は，試験群間で差

照群より低い傾向であった。グルコース− −リン酸がなかった。肝臓中リン脂質は試験群間で差がなかっ

脱水素酵素活性は，Wakame 群，Wakame-

た。肝臓中トリアシルグリセロール値は，Wakame-および Wakame-

群とも対照群より有意に低く（P<0 05），Wakame-群および Wakame-

群 お よ び Wakame-が， 対 照 群 よ り 有 意に 低 く（P<0 05）， と り わ け Wakame-

群
群

群は

は，Wakame 群に比べても有意に低かった（P<0 05）。

Wakame 群に比べても有意に低かった（P<0 05）。

ペルオキシソームにおける脂肪酸のβ酸化系の律速

肝 臓 中 コ レ ス テ ロ ー ル 値 は，Wakameよび Wakame-群お酵素であるアシル−CoA オキシダーゼ活性は，16：が，対照群より有意に低かった−CoA および：−CoA を基質として測定した

Table 32. Body weight and food intake of rats fed a control diet or diets containing wakame（Wakame）
or fermented wakame（Wakame-brevis, Wakame-casei）＊1%QPVTQN$QF[ ‫ޔ‬I

 r

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9CMCOG

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/GCPXCNWGUQHDQF[YGKIJVCPFHQQFKPVCMGCTGPQVUKIPKHKECPVCOQPIVJGITQWRU 2 
D[&WPECP UOWNVKRNGTCPIGVGUV Table 33. Concentration of lipid components in the serum and liver of rats fed diets containing
wakame%QPVTQN
5GTWO OIONUGTWO
6TKCE[NIN[EGTQN%JQNGUVGTQN.KXGT OIINKXGT
6TKCE[NIN[EGTQN%JQNGUVGTQN
2JQURJQNKRKF

9CMCOGDTGXKU

9CMCOG

9CMCOGECUGK r  r C r  r CD r  r D r  r CD r  r  r C r  r  r CD r  r  r E r  r  r 

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CD

D

8CNWGUCTGOGCPr5'P&KHHGTGPVUWRGTUETKRVUKPCTQYKPFKECVGUKIPKHKECPVFKHHGTGPEGU
2D[&WPECP UOWNVKRNGTCPIGVGUV COQPIITQWRUDStudies on lactic acid fermentation of seaweed
Table 34. Concentration of compounds related to lipid oxidation in serum and liver of rats
+PUGTWO OOQNO.UGTWO
˴˴#EGVQCEGVCVG˴˴ǪJ[FTQZ[NDWV[TCVG+PNKXGT POQNINKXGT
˴˴6QVCNECTPKVKPG
˴˴(TGGECTPKVKPG%QPVTQN

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9CMCOGDTGXKU

9CMCOGECUGK r  r  r  r  r   r   r  r  r C
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8CNWGUCTGVJGOGCPUr5'P
&KHHGTGPVUWRGTUETKRVUKPCTQYKPFKECVGUKIPKHKECPVFKHHGTGPEGU 2D[&WPECP UOWNVKRNGTCPIGVGUV Table 35. Activities of enzymes（nmol/min/mg protein) involved in fatty acid oxidation in the liversof rats fed diet containing wakame and fermented wakame products（Wakame-brevis and Wakame）at 10% w/w ＊1, ＊2'P\[OGCEVKXKVKGU%QPVTQN

9CMCOG'P\[OGUKPXQNXGFKPNKRKFU[PVJGUKU KPNKXGT
˴˴(CVV[CEKFU[PVJGVCUG r  C r  CD
˴˴/CNKEGP\[OG r  r C
D r ˴˴)NWEQUGRJQURJCVGFGJ[FTQIGPCUG
 r 'P\[OGUKPXQNXGFKPNKRKFQZKFCVKQP KPNKXGT
˴˴#E[N%Q#QZKFCUG
5WDUVTCVG
˴˴˴˴㧦%Q# r  r ˴˴˴˴㧦%Q# r  r ˴˴#E[N%Q#FGJ[FTQIGPCUG
5WDUVTCVGCDE r ˴˴˴˴㧦%Q# r ˴˴˴˴㧦%Q# r  r CDCD r 
˴˴%CTPKVKPGRCNOKVQ[NVTCPUHGTCUG
 r ˴˴*[FTQZ[NCE[N%Q#FGJ[FTQIGPCUG
 r  D r  CD

9CMCOGDTGXKU

9CMCOGECUGK r  CD r E r  r  D r E r ˴ r  r E r r r r r  r  r
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 r r

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&KHHGTGPVUWRGTUETKRVUKPCTQYKPFKECVGUKIPKHKECPVFKHHGTGPEGU 2D[&WPECP UOWNVKRNGTCPIGVGUV 

両方の場合で，Wakame 群，Wakameび Wakame-

群およ群とも対照群より，わずかながら高い傾向を示したが，有意な差ではなかった（P>0 05）。
肝臓ミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸化系の律速酵素であるアシル Co‑A 脱水素酵素の活性は，16：−CoA を基質として測定した場合に，Wakame 群
および Wakame-

群で対照群より，有意に低い値を示したが（P<0 05），18：−CoA を基質として海藻飼料の性状
Table 36に飼料の配合に使用したワカメ（Wakame）
およびワカメ発酵試料（Wakameme-

および Waka-）の性状分析の結果を示した。発酵処理をしていない Wakame の乳酸含量は，<0 1mg/g であったが，発酵処理により得られた Wakameび Wakame-

およの乳酸含量は，発酵直後（乾燥前）で13 8 mg/g および <0 1mg/g であった。Wakame，

測定した場合には，試験群間で有意な差は認められな

Wakame-かった。

段階で乳酸菌（BCP 上で計数された乳酸菌の％割合）

および Wakame-

は，乾燥処理後の

肝臓ミトコンドリアにおける脂肪酸のβ酸化系にを，それぞれ <10 3 CFU/mL，2 7×10 8 CFU/mL（97 5

関わる別の酵素で，脂肪酸物質がミトコンドリア膜を％），6 4×10 8 CFU/mL（>99％）含んでいた。酵母の通過する際の輸送の速度に影響するカルニチンパルミ

生菌数は，いずれの試料においても検出されなかった

トイルトランスフェラーゼの活性は，Wakame-（<10 3 CFU/mL，<10 4 CFU/mL，<10 4 CFU/mL）。

群で Wakame-

Wakame-群より，有意に低い値を示したが試料で計数された，生菌のうち97 5（P<0 05），対照群および Wakame 群とは有意な差で％が乳酸菌で，その75％（20株中15株）がはなかった（P>0 05）。3−ハイドロキシアシル -CoA

で あ っ た。Wakame-

脱水素酵素活性は，Wakame-ち >99％が乳酸菌で，その44％（16株中群で対照群に比べ有意に高く（P<0 05），Wakame 群および Wakame群でも対照群より高い傾向にあった。

であった。

で 計 数 さ れ た， 生 菌 の う株）が

内田 基晴考察低減に有意差が認められ，ワカメを発酵処理すること
でコレステロール低減作用にも影響する可能性が考えラット試験において，Murata.（1999）は，乾られた。

燥ワカメを ％以上添加することで，血中および肝臓ラットの摂餌量および体重増加量には，試験群間中のトリアシルグリセロール値が低減することを観察

で差がなく，エネルギー消費の違いがトリアシルグしている。ワカメを10％添加した本研究においても，

リセロールおよびコレステロールの低減作用に関与し統計的に有意な差ではないものの，同様の傾向を認ているとは考えられなかった。ワカメが，脂質代謝にめた。一方，発酵処理したワカメを食餌させた試験群

影響する機構として，ワカメに含まれる食物繊維が脂のうち，Wakame-群については，Wakame 群

質化合物の小腸壁からの吸収を物理的に阻害して抑制よりも顕著に血中および肝臓中のトリアシルグリセロ

することが一般にいわれているが，本研究に使用したール値が低減することを観察しており，とりわけ肝臓

ワカメ発酵試料では，炭水化物（食物繊維）含量は，中のトリアシルグリセロール値の低減の度合いは，対非処理のワカメに比べ，減少傾向か少なくとも同レ

照群および Wakame 群に対して有意な差であった。

ベルと考えられる。またワカメ糖質の発酵の前後でのWakame-

分子量の変化について本研究では測定していないが，群についても，肝臓中のトリアシルグ

リセロール値の低減の度合いが，Wakame 群よりも

Wakame-大きい傾向があった。

藻懸濁液の粘土が急激に低下（液状化）することを観試料では，発酵の進行に伴って，海.（1999）の報告においては，ワカメ配

察しており，糖質の低分子化がおこっていることが示

合飼料の食餌がコレステロール値に対して明確な影響唆された。したがって，発酵ワカメ試験群（Wakame-

Murata群，Wakame-

を及ぼすことを観察していないが，本研究において群，群と同等かむしろ高い脂質化合物濃度の低減化作用の群）において肝臓コレステロール値の現象には，食物繊維による脂質化合物の小腸壁からのは発酵ワカメを配合した試験群（WakameWakame-

群）で観察された Wakame

Table 36. Characteristics of wakame（Wakame）, brevis-fermented wakame（Wakame-fermented wakame（Wakame）%JCTCEVGTKUVKEU#PCN[\GFDGHQTGHTGG\GFT[KPI.CEVKECEKF OII
.NCEVKECEKF&NCEVKECEKF#PCN[\GFCHVGTHTGG\GFT[KPI
2TQZKOCVGCPCN[UKU㧔OGCPr5&QPFT[DCUKU˴˴%TWFGRTQVGKP
%TWFGNKRKF
˴˴#UJ
˴˴%CTDQJ[FTCVG /KETQDKCNEQWPVKPI
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˴$%2EQWPVU˴ OGCPr5&%(7I ˴2TQRQTVKQP㧔㧕QH.#$2TQRQTVKQP  QHVJGENQPGUKFGPVKECNCVURGEKGUNGXGNVQVJGUVCTVGTWUGF.#$  0QUQHRQUKVKXGENQPGU㧛VGUVGFENQPGU
˴˴;GCUV  %(7I）and

9CMCOGDTGXKU

9CMCOGECUGK

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HGTOGPVGF7PFCTKC EWNVWTGUCPFVJGNCEVKECEKFEQPVCKPGFKPVJGUWRGTPCVCPVYCU%CTDQJ[FTCVG㧩㧔ETWFGRTQVGKP㧗%TWFGNKRKF㧗#UJ㧕.CEVKECEKFDCEVGTKC .#$ YCUEQWPVGFQP2NCVG%QWPV#ICTYKVJ$%2
2TQRQTVKQP  QHNCEVKECEKFDCEVGTKCYCUGUVKOCVGFD[VJGPWODGTUQH[GNNQYEQNQTGF
EQNQP[CICKPUVVQVCNEQNQP[

2TQRQTVKQPQHNCEVKECEKFDCEVGTKC .#$ YCUFGVGTOKPGFD[VJG2%4OGVJQFWUKPIVJG
URGEKGUURGEKHKERTKOGTUGVUFGXGNQRGFKPVJGRTGUGPVUVWF[UGEVKQP2CTV%QWPVGFQP5CDQWTCWFCICTRNCVG

Studies on lactic acid fermentation of seaweed
吸収の物理的阻害とは別の機構が関与しているものと代謝関連物質（アセト酢酸およびβ−ハイドロキシブ考えられた。

チレート）の増加，脂質合成関連酵素であるグルコー

血清中および肝臓中のトリアシルグリセロールの値

ス− −リン酸脱水素酵素活性の低下が最も顕著におは，小腸からの脂質化合物の吸収の他，肝臓におけるこったのが，Wakame-

脂質化合物の代謝により影響されると考えられる。従化物（糖質）成分の減少が，肝臓脂質代謝の変化に結って，ワカメ発酵試料を食餌させたことが肝臓におけびついたとする考えを支持する。一方，炭水化物含量

る脂質化合物の代謝即ち，合成速度と分解速度とにの低下が顕著であった影響与えた可能性が考えられる。本研究においては，

発酵調製過程において，試料が著しく液状化し大量の脂質代謝の合成系に関与する酵素である脂肪酸合成酵

ガスが発生したことが観察された。この液状化とガス素およびグルコース− −リン酸脱水素酵素の活性が化の現象は，炭水化物含量の変化の小さかった

低減されていることを観察し，肝臓における脂質代謝−発酵ワカメ試料においては，はっきりと観察されなの合成系が抑制されていることが示唆された。一方，

かった。このことから

脂質代謝の酸化系に関与する酵素であるアシル−CoAてはワカメの炭水化物の主成分である多糖の分解と低オキシダーゼの活性が対照区に比べ，若干高い傾向に分子化がおこり，最終的にガス化して失われたことにあること，血清中の脂質代謝関連物質であるアセト酢

より，成分組成の大きな変化がおこったと推察された。

酸およびβ−ハイドロキシブチレートの値が増加して従って，糖質成分量的減少だけではなく，低分子量化いること，肝臓ミトコンドリア内膜に存在し，ミトコによる影響も考慮する必要があると考えられた。次にンドリアにおいて脂質化合物が代謝される際に膜透過

脂質成分の関与の可能性について考察する。発酵ワカのためのキャリアとして機能するカルニチンの増加がメ試料において粗脂肪含量が増加している傾向が認め観察されており，肝臓における脂質代謝の酸化系も亢られる（非処理ワカメ試料4 8％，進していることが示唆された。

試料7 7％，

次に，発酵処理ワカメ群において非処理ワカメ群よ群であることは，炭水−発酵ワカメ試料はその−発酵ワカメ試料におい−発酵ワカメ−発酵ワカメ試料7 5％）。しかし，

別ロットで同様の製法により−発酵ワカメ試料

り肝臓の脂質代謝改善作用が顕著に観察された原因がを調製し，成分分析を追試したところ，粗タンパク含

何であるかについて考察するために，非処理ワカメ試量39 6％，粗脂肪5 4％，灰分19 8％，炭水化物35 1％料，−発酵ワカメとなり，粗脂肪の増加は，炭水化物の減少に伴う相対試料について性状分析を行い比較した。まず，発酵試的変化の範囲内に留まり，総量の変化は，必ずしも観料を特徴づける物質として，乳酸含量を比較した。

察されなかった。ただし脂肪酸組成等の個別成分の変非処理ワカメ試料では，乳酸が検出されなかったが化がおこっている可能性とその影響については，本研−発酵ワカメ試料および（<0 1mg/g），−発酵ワカメ試料では13 8mg/g

であり，大きく異なった。しかし一方，

究では検討を行っておらず不明である。ミネラル成分−発酵（灰分）については，発酵処理過程において，添加あワカメ試料では0 1mg/g と低レベルであった。肝臓

るいは減じる処理を行っておらず基本的に発酵によるトリアシルグリセロールの低減作用をはじめ脂質代謝変化はないため，関与の可能性は低いと考えられる。

の変化は，−発酵ワカメ試料でもおこっており，

なおラット飼料を配合する際，ワカメ試料の粗タンパ

乳酸を主原因物質として説明することは困難であっク質含量について実際の分析値33 1％とすべきところた。次に一般成分組成を比較した。最も大きな成分変を25 7％と見積もって成分調整を行ったため，タンパ

化は，炭水化物の減少と粗タンパク含量の増加であっ

ク成分の量的調整が正確に行われなかったことがあるた。本研究においては，海藻を発酵させるために，セが，飼料組成全体からみれば，Wakame 群においてルラーゼにより海藻の繊維成分であるセルロース類を対照群より粗タンパク質含量水準が0 74％上昇した程

分解してグルコース等に変換し，これを基質に乳酸発度であり，直接の影響を与えた可能性は小さいと考え酵をおこしている。したがって原理的に考えて炭水化られる。次にワカメ発酵試料の特徴として乳酸菌の菌物の減少は，糖質の減少を反映していると考えられ，体を含んでいることがある。非処理ワカメ試料は，菌

粗タンパク質含量の増加は，糖質の減少に伴う相対的体をほとんど含まないが（<10 3 CFU/g），

な変化と理解される。従って，糖質の減少が関与して酵ワカメ試料およびいることが最初に考えられる。炭水化物（糖質）含量の菌体を生菌として10 8 CFU/g 以上含んでおり，菌の変化が一番大きかったのは，体の摂取が脂質代謝に影響した可能性が考えられる。

−発酵ワカメ試料である。一方，本研究において，トリアシルグリセ
ロール値およびコレステロール値の低減，血清中脂質-発- 発酵ワカメ試料は，乳酸菌

しかし，これまで血圧降下作用については乳酸菌の菌体成分が有効であるとの報告があるが，ト内田 基晴リグリセライドやコレステロールの低減作用に効果が術をさらに深化させるため，発酵試料中の微生物相をあることは我々の知る限り知られていない（高野ら，PCR 法により，種レベルで検出する方法を開発し，1996）。本研究において使用した発酵ワカメ試料では，この方法を利用することで海藻の発酵スターターとし−発酵ワカメ試料において，非乳酸菌の混入がて好適な微生物の組み合わせと菌種を明らかにした。

BCP 平板上で2 5％レベルで認められており，また乳最後に，得られた海藻発酵素材を利用した種々の産業

酸菌コロニーの25％（20株中利用の可能性について検討した。得られた成果の概要

株）が

以外

の乳酸菌であるなど複数の菌種が混入しているという問題がある。

−発酵ワカメ試料についても乾燥処理後の試料では，非乳酸菌が検出されていないものの，乳酸含量が0 1mg/g と極端に低いことから，乾を述べる。
）発酵状態にある海藻（アオサ，spp.）試料の微生物相を調べ，乳酸菌

と

種類の酵母

var.

燥処理前の培養段階で例えば酢酸菌等の非乳酸菌の生および育がおこり菌相の一部を占めたことが疑われ，また，明らかにした。これら 種類の分離株を糖化酵素（セ菌種レベルでも株）ルラーゼ）とともにスターターとして接種する方法に留まっている。したがって，乳酸菌菌体の影響につで，紅藻類，褐藻類，緑藻類，顕花植物を含む海藻いて議論をすすめるには，混入菌の生育を認めないよ草類一般を乳酸・エタノール発酵させることができり菌相的に純粋な乳酸発酵試料を調製して，ラットにることを見出した。

食餌させ，脂質代謝改善作用が認められるかどうか調）分解の容易なワカメ（

べる必要があると考えられた。

質に使用することで，海藻葉体を高い効率で単細胞の割合は44％（16株中

本研究においては，発酵処理ワカメ食餌群においが優占していることを）を基化しながら乳酸発酵させる技術を開発した。

て，非処理ワカメ食餌群よりも顕著な脂質代謝改善）海藻発酵試料中の微生物相を PCR 法を用いて菌作用を認め，発酵ワカメ素材が，健康機能性が期待で種レベルで迅速同定できる技術を開発した。いろい

きる魅力ある新しい食品素材であることが示された。

ろな菌種の組み合わせのスターターをワカメに接種

今後，健康機能性が強化される原因の究明には，し，上記手法を用いて解析した結果，乳酸菌の単独あるいはのようなホモ型乳酸菌を使用でも発酵スターターとして機能すること，とり単独でスターターとして使用するなどにより，菌相制

わけホモ型乳酸菌の使用が，雑菌の成育を抑制する御が難しい NaCl 非添加条件下において，菌相的に純上で有効であることを明らかにした。

粋で品質の安定した発酵試料を調製して動物試験の追）海藻を単細胞化・乳酸発酵させて得た素材は，直試を行い，解析を進めていく必要があると考えられた。

径が約10μm であり，大量安定供給が困難な微細藻類の代替餌料としての利用が考えられる。ワカメ

第 章 総

括

から調製した海藻発酵飼料（MS）についてアコ

ヤ貝初期稚貝に対する飼料効果を実証した。少量の海洋生物資源の食糧・食品としての利用は，これま

微細藻類との併用給餌により，飼料効果が飛躍的にで主に捕獲（漁獲）によりなされてきたといえるが，高まる点が注目された。

今後は栽培増養殖，加工等の人為的工夫が加えられ，）海藻発酵素材に脂質代謝改善作用があることをラ

より高度な利用がなされていくものと考えられる。発ット試験により観察した。肝臓酵素の測定からグル酵技術は，長い歴史の中で人類が生み出した偉大な発コース明であり，食糧生産，食品加工にかかわる分野で人類るなど脂肪酸合成系の代謝が抑制される一方，脂社会に多大な貢献をしている。しかし，これら食糧・

肪酸 CoA のミトコンドリア膜の通過のキャリアで食品分野における発酵技術は，主に陸上生物素材を基あるカルニチン量が有意に増加するなど脂肪酸酸化

質として実践されており，海洋の生物素材を基質とし系の代謝亢進が示唆された。海藻発酵産物が健康機た例は極めて限られており，とりわけ植物性素材（藻能性が期待できる新しい食品素材であることを示し類）を基質とした発酵技術は，皆無に等しい。

た。

リン酸脱水素酵素の活性が有意に低下す

著者は，海洋起源の試料から乳酸菌・酵母を分離

以上の研究により，海藻草類一般を乳酸発酵させる

し，これを糖化酵素と組み合わせて使用することで，ための手法が開発され，スターターとしての使用に適海藻を乳酸発酵させる技術を開発した。さらに，海藻した微生物を明らかにした。今後さらに検討されるこを単細胞化する技術と組み合わせて，海藻を微粒子発とにより，海藻の乳酸発酵素材が餌飼料，食品素材等

酵素材に変換する技術を開発した。海藻の乳酸発酵技

多方面において利用されていくことが期待される。今Studies on lactic acid fermentation of seaweed
後の問題点としては，低塩分の不安定な条件下におい氏，甘粕英子氏，青木淳氏，中央水産研究所佐野陽子てはしばしば，発泡と異臭を特徴とする変敗現象が起氏，株式会社共和テクノス浅野久志氏，ご助言を頂いこるが，この変敗の機構について，

た中央水産研究所里見正隆博士，瀬戸内海区水産研究近縁種が関与している可能性があり，海藻発酵産物の安所寺脇利信博士に心から感謝致します。

全性の確保の観点から，今後，詳しく検討されていく

本研究は，農林水産技術会議事務局からパイオニアべきであろう。一方，この変敗による発泡がおこると，特別研究課題（H12-14, Grant No. PRPF1204）として海藻発酵産物が高タンパク素材に変化するため，逆に資金援助をして頂きました。関係者の方々に御礼申し

海藻資源の高度利用の観点からも注目される。

上げます。

属細菌の分解能を取り入れた分解・発酵技術の開
参考文献

発，メタン発酵を取り入れた高タンパク化発酵技術等が開発され，今後，海藻の発酵技術のバリエーションが増えることにより，海洋系植物性基質発酵産業という分野で新産業が創出されることが期待される。

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本研究を遂行するにあたり，ご理解を頂き，良い研

Cuomo V., Perretti I., Verde A., and Cuomo A., 1995:

究環境を与えて下さった中央水産研究所利用化学部池Utilization of

田和夫部長（現水産総合研究センター本部研究調査部

lagoon（Italy）: biotransformation in compost.
., 7, 479-485.

研究交流課長），良い研究環境を与えて下さるとともに健康機能性試験についてご指導下さった同部応用微生物研究室村田昌一室長に深甚なる謝意を表します。
また，二枚貝に対する飼育試験に関してご協力とご指導を頂きました 故 元中央水産研究所沼口勝之博士に感

rigita biomass in the Venice

Daws C. J., 1981: Marine Botany, John Wiley & Sons,
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Dommes V., and Kumnau W. H., 1976: A convenient
assay for acyl-CoA dehydrogenase.

謝と哀悼の意を捧げます。

., 71, 571-578.

本研究の推進にご理解を頂き，乳酸菌株の提供等ごDommes V., Baumgart C., and Kumnau W. H., 1981:

協力とご助言を頂きました株式会社ヤクルト本社中央

Degradation of unsaturated fatty acids in per-研究所石川文保博士，ヤクルト薬品工業株式会社坂田

oxisomes. Existence of 2, 4-dienoyl-CoA reduc-

博行氏，実験にご協力を頂きました株式会社グレース
里見理子氏にお礼申し上げます。

tase pathway.

., 256, 8259-8262.

Douillet P. A., 2000: Bacterial additives that consis-

研究全般に対してご指導ならびにご鞭撻を頂きましtently enhance rotifer growth under synxenic

た京都大学大学院内田有恒教授，同左子芳彦助教授，

culture conditions. 2. Use of single and multiple

福山大学工学部石田祐三郎教授，京都大学名誉教授

bacterial probiotics.

門田元博士，水産大学校食品生産学科芝恒男教授，前田俊道講師に深く感謝致します。

, 182, 241-248.

Douillet P. A., and Langdon C. J., 1994: Use of a probiotic for the culture of larvae of the Paciﬁc oys-

アオサの酵素分解に関して，ご助言を頂き，また実験にご協力頂きました長崎大学藤田雄二教授，酵素実験に関してご助言を頂きました三重大学荒木利芳教

ter（

Thunberg）.

119, 25-40.
Duncan D. B., 1957: Multiple range test for corre-

授，研究にご理解を頂き，情報発信の機会を与えて下lated and heteroscedastic means.

さった東京海洋大学

164-176.

能登谷正浩教授，酵母の同定試, 13,

験に関してご指導頂きました理化学研究所中瀬崇博士

Fell J. W., Ahearn D. G., Meyers S. P., and Roth E.

並びに鈴木基文博士に深く感謝致します。また海藻発J., 1960: Isolation of yeasts from Biscayne Bay

酵試料の応用的価値に関する知見を深めて下さること

Florida and adjacent benthic areas.

にご協力頂いた岩手県水産技術センター阿部孝弘研究
故員，株式会社ジャパンアクアテック 小倉理一元取締役社長，吉田満彦氏に感謝致します。
最後に，本研究を行う際，ご助力を頂いた佐藤洋子., 5, 336-371.
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