重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

研究課題名

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

フリガナ

オカダ

代表者名

岡田

ナオキ
直貴

所属機関（機関名）大阪大学大学院薬学研究科（役職名）教授氏

名（フリガナ）

所属機関・役職名

役割分担

藤澤隆夫
国立病院機構三重病院・院 経皮免疫療法の治療効果判定（フジサワタカオ）
長マーカーの探索
神山文男
コスメディ製薬株式会社・経皮免疫デバイスの製造・供（カミヤマフミオ）
代表取締役社長
給1. Ito S., et al.: Pharm. Res. 37(3): 35 (2020)
2. Kuwabara Y., et al.: JSA/WAO Joint Congress 2020 [Online Meeting,
September 17-20, 2020]
本助成金による発 3. Kuwabara Y., et al.: EAACI Annual Congress 2020 [Online Meeting, June 610, 2020]
表論文，学会発表
4. 山下 凌ら: 日本薬学会第 140 年会 [誌上開催, 2020 年 3 月 26-28 日]
5. Yamashita R., et al.: 第 48 回日本免疫学会学術総会 [静岡県 (浜松市), 2019年 12 月 11-13 日]
共同研究者

研究結果要約
アレルギー疾患における唯一の根治療法である免疫療法が食物アレルギーに対しても積極的に導入されるようになってきた。しかし、現行の免疫療法はアレルゲンを皮下注射法により頻回投与するものであり、注射針による疼痛があること、長期に定期的な通院が必要なこと、頻度は低いもののアナフィ
ラキシーショックなどの重篤な副作用の危険性があることから患者側、医療側の双方にとって容易に施行できる治療法とは言いがたい。本研究では、皮膚を傷つけることなく微量のアレルゲンを皮膚内に浸透させることのできる親水性ゲルパッチ (HG) を活用し、小児食物アレルギーに対する新規経皮免疫療法 (EPIT) の開発に取り組んだ。マウスモデル実験において、アレルゲン装填 HG を用いた EPIT が特異的 IgG 抗体 (アレルゲン中和抗体) の産生を誘導し、従来の皮下注射免疫と比較して特異的 IgE 抗体(アレルギー誘発抗体) の産生を低減できることを示した。これらの前臨床結果に基づいて、重症牛乳ア
レルギー患児を対象とした探索的臨床研究を実施したところ、牛乳アレルゲン装填 HG を適用した被験者 8 例のうち 4 例で症状誘発閾値が顕著に上昇し、経口免疫療法への移行を可能とした。また、奏効した患児においては血中特異的 IgE 抗体価の減少傾向と血中特異的 IgG4 抗体価の上昇傾向も認められ、HG を応用した EPIT が食物アレルギーに対する簡便な根治療法の確立に貢献できる治療戦略であることを実証した。

31

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

研究目的

拠に基づいて治療を行っているとは言いがたい

食物アレルギーの診断および管理法の進歩に面がある。そこで、EPIT の有効性評価および奏より患者の生活の質 (quality of life; QOL) は改

効機序解析に有用なアレルゲン特異的免疫療法

善しつつあるが未だ十分ではなく、なによりも根モデルの作出に取り組んだ。

治に至る治療法が存在しないことが問題である。

食物アレルギーに対する EPIT は、従来の皮下通常、小児の食物アレルギーは多くが成長と共に注射法 (subcutaneous immunotherapy; SCIT)、寛解するが、最近は寛解困難でアナフィラキシー

舌下法 (sublingual immunotherapy; SLIT)、経のリスクを抱えたまま持続する例が増えている。

口免疫療法 (oral immunotherapy; OIT)、などとそこで本研究では、ニーズの高い牛乳・鶏卵アレ比較して簡便で全身性の症状誘発リスクが低い

ルギーに対する安全で有効性の高い経皮アレル方法として期待されており、特に、OIT や SLIT

(epicutaneousが実施できない重篤な食物アレルギー患児など

ゲ ン 特 異 的 免 疫 療 法

immunotherapy; EPIT) の確立を最終目標とすに選択されるべき治療法と考えられる。本研究は、る。

食物アレルギーに対する新たな治療・予防・診断

将来的な医師主導治験への道筋をつけるため法の創出に繋がるトランスレーショナルリサーに、本研究では EPIT の安全性・有効性に関するチとして、その成果が日本発・世界初の EPIT 用

非臨床・臨床 POC データセットの収集を推進し貼付製剤の上市・臨床応用へと昇華されることをた。また、ここ数年来、免疫学ではアジュバント

目指している。

に関する数多くの分子レベルの知見が蓄積され、その免疫反応における重要性がクローズアップ

研究計画及び研究手法されてきている。アレルギー疾患に対する免疫療A.

アレルゲン装填親水性ゲルパッチ法においてもアレルゲンにアジュバント効果を(hydrophilic gel patch; HG) の作製およびもつ物質を加えることで、より免疫療法の効果を

長期安定性試験
１）HG の作製

上げ、同時にアレルゲン量を減らすことで副反応の危険性を回避できる可能性がある。そこで、

アクリレーツ/ビニルピロリドン共重合体、ヒEPIT に適用可能な経皮アジュバント候補物質のアルロン酸ナトリウム、乳酸オクチルドデシル、探索を行った。さらに、免疫療法はアレルギー治

グリセリンを 100 : 45 : 30 : 0.2 の重量配合比率

療のなかで唯一根治が期待できる治療法である

で酢酸エチル/アセトンに溶解し、ポリエチレンにもかかわらず、その奏効機序はいまだ十分に理

テレフタレート離型フィルムに厚さ 200 m で塗解されていない。その結果、免疫療法を行う際に、工した。塗工シートを室温 30 分間、80C、15 分

アレルゲン量や継続期間の妥当性などを評価す

間静置して有機溶媒を蒸発除去することで HGるようなバイオマーカーがなく、十分な科学的根

を得た。

32

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

２）アレルゲン装填 HG の作製

B.

OVA-HG の安全性試験

無菌条件 (クリーンベンチ内) で低エンドトキ

Hartley モルモットの左右の耳に交互に OVA-シン (< 1 EU/mg) ovalbumin (OVA)、ovomucoid

HG (1 mg OVA/patch) を 2 週間連日貼付し (貼(OVM)、Milk protein concentrate (MPC)、ある付 12 時間/日)、皮膚局所反応を観察した。また経いは AF647 標識 OVA を滅菌蒸留水に溶解し、時的に血清中 OVA 特異的 IgG, IgE 抗体価を測

HG (直径 1 cm の円形) の粘着面に 70 L ずつ滴定した。さらにこれらのモルモットに OVA 溶液

下した。液滴が HG に吸収されるまでクリーンベを 2 mg/kg で静脈内投与し、直腸温測定によりアンチ内に静置し、OVA-HG、OVM-HG、MPC-HG、ナフィラキシー反応を評価した。なお対照群のモあるいは AF647/OVA-HG とした。臨床研究用のルモットには、背部皮膚に OVA 溶液を 100

アレルゲン装填 HG は粘着面をタンパク質低吸g/100 L/head で皮下注射した。

着性離型フィルムで覆ったのち、アルミラミネー
C.

トパックに入れて密封した (Fig. 1)。

HG を用いた EPIT の免疫応答特性

１）OVM-HG を用いた経皮免疫応答解析
BALB/c マウスの除毛背部皮膚に OVM-HG (1mg/patch) を 24 時間貼付した。対照群には OVM
溶液 (100 g/100 L) を皮下注射した。これらの免疫操作を 1 週間隔で 4 回実施し、経時的に血清
中 OVM 特異的 IgG, IgE 抗体価を測定した。最終免疫 1 週間後に所属リンパ節 (dLN) を摘出し、調製した細胞懸濁液を OVM (1 mg/mL) で再刺激した。48 時間培養後の上清中 IL-2、IL-4、IL３）臨床研究用 OVM-HG および MPC-HG の長10、IL-13、IL-17、IFN-および TNF-を BioPlex マウスサイトカインアッセイを用いて定量

期安定性試験
臨床研究用 OVM-HG および MPC-HG を 4Cした。

で保存し、経時的に HG からの OVM または MPC

２）HG 貼付に伴う抗原提示細胞 (APC) の動態

溶出量を測定した。また、1 年間保存した臨床研

解析

究用 MPC-HG からの溶出液を DBA/2 マウスのBALB/c マウスの除毛背部皮膚に OVA-HG

背部に 100 g/100 L で皮下投与し、用時調製(200 g/patch) あるいは HG を貼付した。対照群

MPC 溶液を同様に投与した場合と血清中 MPCには PBS を皮下注射した。24 時間後にこれらの特異的抗体価を比較することで保存後の MPC のマウスから dLN 細胞を調製し、各種蛍光標識抗免疫原性を確認した。

体で染色した細胞をフローサイトメトリー解析

33

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得した。APC は、ランゲルハンス細胞 (LC; CD11c+,

イトメトリー解析により移入した OT-I 細胞およB220-, CD8-, CD205+, CD207+, CD326+) 、び OT-II 細胞の分裂増殖および活性化を解析し

CD207+ 真 皮 樹 状 細 胞 (dDC; CD11c+, B220-,た。

CD8-, CD205+, CD207+, CD326-)、CD207- dDC
D. 重症牛乳アレルギー患児に対する MPC-HG(CD11c+, B220-, CD8-, CD205+, CD207-) 、CD8α+ DC (CD11c+, B220-, CD8+)、形質細胞様を用いた経皮免疫療法

DC (pDC; CD11c+, B220+)、単球およびマクロフ

本臨床研究は、国立病院機構三重病院倫理審査

ァージを含むその他の CD11c+ 細胞 (CD11c+,

委員会の審査・承認を受けて実施した。

B220-, CD8-, CD205-, CD207-, CD326-) に分画

１）対象
経口負荷試験閾値が牛乳 1 mL 未満の重症牛乳した。

アレルギー患児 8 名 (3 歳～8 歳の男女)

３）HG により皮膚内送達された OVA のプロセ

(組み入れ基準)ッシング経路解析
BALB/c マウスの除毛背部皮膚に AF647/OVA-

・経口負荷試験で確定診断され、寛解傾向のな

HG (200 g/patch) を 貼 付 し た 。 対 照 群 に はい牛乳アレルギー患者
・経口負荷試験による閾値 (総負荷量) が牛乳

AF647/OVA 溶液 (10 g/100 L) を皮下注射し3 mL 以下の患者た。経時的にこれらのマウスから dLN 細胞を調・法的保護者の文書による同意を得られ、かつ製し、各種蛍光標識抗体で染色した細胞をフロー
サイトメトリー解析した。APC を上記 2)と同様

本人の意思確認ができた者(除外基準)に分画し、各種サブセットにおける AF647+ cells

・牛乳摂取状況が直近の 3 ヶ月間に大きく変の細胞数を算出した。
４）OVA-HG 貼付に伴う OVA 特異的 T 細胞へ化している者
・牛乳の経口免疫療法を中止してから 6 ヶ月の抗原提示解析
OVA 特異的 TCR トランスジェニックマウスで以内の者ある OT-I マウスから CD8+ T 細胞 (OT-I 細胞)

・何らかの免疫療法を行っている者

を、OT-II マウスから CD4+ T 細胞 (OT-II 細胞)・心疾患、肝疾患、腎疾患などがあり、現在治をそれぞれ単離し、eFluor 670 にて蛍光標識し療中の者

た後、C57BL/6 マウスに移入した。これらマウス・気管支喘息、アトピー性皮膚炎があり、現在の 除 毛 背 部 皮 膚 に OVA-HG (200 g or 1

コントロール不良の者

mg/patch) を貼付した。対照群には OVA 溶液

２）経皮免疫療法(20 g/100 L) を皮下注射した。3, 4, 5 日後にこ組み入れ基準を満たした患者に、1 mg MPC-

れらのマウスから dLN 細胞を調製し、フローサ

HG を夕刻の入浴後から翌朝起床後までの 12 時

34

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

間、健常皮膚に連日貼付した。貼付スケジュール

OVM-HG 群のほうが PL-HG 群より有意に大きは、1 mg MPC-HG を医師観察下で 1 時間貼付、かった。この試験において保存されていた治療前、副反応がないことを確認後、自宅で貼付継続した。

治療後 12 週、24 週、36 週、48 週における血清

治療期間中は患者が日誌で貼付部位の皮膚状態、検体を用いて、Th2 マーカーである TARC およ

その他の症状を記録するとともに、医師が 8 週毎

び高感度の特異的抗体測定法である DCP チップに貼付部位の状態を観察、二重盲検プラセボ対照法による OVM 特異的 IgE, IgG1, IgG4 抗体を測負荷試験 (DBPCPC)、採血を行った。治療は閾値定した。

レベルの上昇が確認されたときに完了とし、重大F.

な有害事象が発生した場合、牛乳またはカゼイン

経皮アジュバント候補物質のスクリーニンに特異的な IgE の急激な上昇が認められた場合、

グ
１）皮膚細胞における Toll-like receptor (TLR)

あるいは 24〜48 週間以上の治療後に閾値レベルの上昇が達成されなかった場合、は治療を中断しの発現解析た。閾値上昇に成功した被験者は、閾値に従ってマウス除毛背部皮膚と耳介皮膚から酵素処

牛乳の経口摂取を開始した。

理によって表皮細胞懸濁液および真皮細胞懸(主要評価項目)

濁液を調製した。各種蛍光標識抗体で染色した細胞をフローサイトメトリー解析した。

・治療前後における経口負荷試験閾値の変化

２）経皮アジュバント活性の評価

・安全性および有害事象

C57BL/6 および BALB/ｃマウスの除毛背部(副次評価項目)

皮膚に OVA (100 g) と各種アジュバント候補・治療前後における特異的 IgE, IgG, IgG4 抗物質 (Table 1) の混合溶液を装填した HG を 2

体価

週間隔で 3 回貼付した。本実験で用いたアジュ
E.

重症鶏卵アレルギー患者に対する経皮免疫

バント候補物質の用量は、感染症ワクチンやが療法における治療反応性予測マーカーの探んワクチンの基礎研究で用いられている投与索量を参考に設定した。経時的に血清中 OVA 特2017-18 年度に貴財団研究助成を受けて実施

異的 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2c, IgE 抗体価を測定した。

した重症鶏卵アレルギー患者に対する経皮免疫療法のランダム化プラセボ対照比較試験 (パイTable 1. TLR ligands as adjuvant candidate applicable for EPIT using HG.

ロット試験) では 22 名が登録され、11 名にTLR ligand

Description

M.W.

Dose

Target TLR

Pam3CSK4

Synthetic mimic of bacterial lipopeptide

1500 Da

20 g

TLR1/2OVM-HG、11 名にプラセボ (PL) HG が割り付

LTA-SA

Lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus

4000 – 8000 Da

100 gTLR2Poly I:C

Synthetic analogue of double stranded RNA

1500 – 8000 Da

50 g

TLR3

けられ、24 週間の治療が行われた。その結果、24

Imiquimod

Small molecule agonist

240 Da100 gTLR7

K3

Synthetic CpG-oligodeoxyribonucleotide

6300 Da

20 g

TLR9

週の時点で経口負荷試験閾値の変化量 (上昇) は35

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

G. OVA アレルギーモデルマウスと HG を用い

MAS683、グリセリン、界面活性剤、低分子量た経皮免疫療法治療モデル

ポリビニルピロリドン、を混合均一化し、乾燥後OVA 特異的 IgE トランスジェニック (Tg) マの厚さが 150 m となるよう PET フィルム上にウスの耳介皮膚に、片耳ずつ交互に 3 日間隔で 2塗布して 80C、30 分乾燥させた。

ヶ月間免疫治療した。EPIT 群では OVA 10 g を４）高分子物質および低分子物質の新規 HG 表

装填した HG を 6 時間貼付し、SCIT 群では OVA

面での挙動評価

0.1 g を皮下注射した。経時的に血清中 OVA 特

分子量 10,000 の FD10 (FITC 標識デキストラ

異的 IgG および IgE 抗体価を ELISA にて測定

ン) の水溶液を粘着層表面に滴下し、24 時間後、するとともに、耳介皮膚の局所反応および厚さをHG 断面の蛍光顕微鏡浸透性を評価した。また、評価した。背部皮膚を除毛した BALB/c に免疫治

分子量 829 の食用赤色色素 14 号の水溶液を粘着療後の血清を 10 倍希釈して皮内投与し、1%

層表面に滴下し、24 時間後、HG 断面の光学顕微

Evans Blue と 1 mg OVA の混合溶液を静脈内投鏡観察を行った。

与することで、受動的皮膚アナフィラキシー

５）吸水率測定(PCA) 誘発試験を実施した。また、治療後 OVA-

現行 HG と新規 HG を湿度 100%の環境に 24

IgE Tg マウスに 100 g OVA を静脈内投与する

時間放置した後、重量変化を測定してパッチの吸ことによるアナフィラキシー誘発試験を実施し水性を評価した。

た。
結果と考察
H. 新規 HG の探索・開発

A.

１）基剤の選択

アレルゲン装填 HG の作製および長期安定性試験

親 水 性 ア ク リ ル 粘 着 剤 2 種 (MAS683 とHG は、皮膚を傷つけることなく微量のアレル

MASCOS10) を用いて、グリセリンおよび界面

ゲンを皮膚内に送達し、アレルゲン特異的な免疫活性剤を添加して 2 種の新規 HG を作製した。

応答を誘導できる画期的なパッチ製剤である 1)

MAS683 は親水性モノマーとしてビニルピロリ(Fig. 1)。親水性アクリル系粘着剤をベースに、医ドンを有する。一方 MASCOS10 は親水性モノマ

薬品や化粧品などで使用されている安全性の高ーとしてアクリル酸を有する。

い基剤を混合して作製されており、厚さが約 200

２）添加剤の選択

m と薄く柔軟であるため皮膚表面に密着・追随

粘着物性を損なわない範囲でより水吸収性とすることができる。HG の皮膚粘着面にアレルゲ

水拡散性を向上させるため、各種親水性物質の添ン溶液を滴下すると、水は蒸発あるいはゲル内部加を検討した。

に浸透し、高分子のアレルゲンが HG 表面に濃縮

３）新規 HG の作製される。これを皮膚に貼付するだけで角質層が水36

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

和・膨潤し、アレルゲンが角質層下へと徐々に送(A)
Elution percentage to loaded dose

達される 2)。
EPIT において継続的に使用するアレルゲン装填 HG には長期間保存した際の品質安定性が求められる。臨床研究用 OVM-HG (1 mg あるいは

120
100

0.1 mg OVM/patch) は、保存 1 ヶ月後までは安

80
60

40
20

0

2 weeks

1 month

2 months

3 months

6 months

1 year

3 years

5 years

Storage period

定に OVM を溶出できたが、さらに保存を続ける

MPC-specific IgG antibody titer(Reciprocal log2 titer)(B)と OVM 溶出率が徐々に低下するとともに離型フ
ィルム側への OVM 吸着が認められた (Fig. 2)。
したがって、現状の臨床研究用 OVM-HG は 1 ヶ月以上の保存が難しく、さらなる長期保存を可能

14

12

10

MPC solution prepared at the time of use

8

MPC solution eluted from 1 year-stored MPC-HG

<6
0

1

2

3

4

Weeks after initial immunizationとするには HG 構成基剤あるいは OVM 装填方

Fig. 3. Stability of MPC-containing HG over long-term storage. (A) A dissolution test and protein
quantification was performed for MPC-HG. Dissolution rate was calculated for MPC-loaded in HG as 100%.
Data are expressed as mean  SEM of results from three MPC-HG. (B) Solution eluted from the MPC-HG
stored for 1 year was used to subcutaneously immunize DBA/2 mice at 100 g/100 l. As a control, DBA/2
mice were similarly immunized with MPC solution prepared at the time of use. MPC-specific IgG titer in serum
samples were measured by ELISA. Data are expressed as mean  SEM of results from three mice.

法の最適化が必要と考えられた。

B.

OVA-HG の安全性試験
モルモットは皮膚炎を起こしやすくアレルギ

ー誘発率が高い実験動物として知られている。
Placebo HG を連日貼付したモルモットにおいて臨床研究用 MPC-HG (1 mg MPC/patch) は、は、投与 14 日目まで貼付部位の耳介皮膚に目立保存 1 年後までほぼ 100%の MPC 溶出率を示しった外観所見は認められなかった。一方、OVA-

た (Fig. 3A)。また 1 年保存した MPC-HG から

HG を貼付したモルモットは耳介皮膚を掻き毟

の溶出液は、マウスにおいて用時調製した MPCり、貼付 5 日目から徐々に赤く腫上がり糜爛し溶液と同等の MPC 特異的抗体価を誘導できた

た。OVA-HG 貼付群の 14 日目における血清中(Fig. 3B)。これらの結果から、臨床研究用 MPC-

OVA 特異的 IgG 抗体価は、連日 OVA を皮下投

HG は少なくとも作製から 1 年後までは MPC の与した群と同等の誘導が認められたのに対し、免疫原性を維持したまま安定に保存できる製剤

OVA 特異的 IgE 抗体価は皮下投与群と比較してであることが確認された。

OVA-HG 貼付群では明らかな低値を示した。これらのモルモットに OVA 溶液を静脈内曝露した
ところ直腸温度が速やかに低下し、皮下投与群においては 4 匹中 2 匹が、OVA-HG 貼付群では3 匹中 2 匹が死亡した。これらの結果から、ア37重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

レルゲン装填 HG を同一部位に貼付し続ける、

影響を与えなかったが、皮膚常在性 APC サブセ

あるいは傷害された皮膚に貼付することで、アット (LC、CD207+ dDC、CD207- dDC) のポピ

レルゲンを皮下注射し続けた場合と同様にアレュレーション比を有意に増大させた。これらの現ルギー感作に至ることが示された。したがっ象は、OVA を装填していない HG を貼付したマて、アレルゲン装填 HG を用いた EPIT のヒトウスでも同様に認められた。一方、皮下注射免疫への適用においては、安全性に配慮した貼付部

したマウスにおいてはいずれの APC サブセット

位の選択とスキンケアの併用が重要であると考もポピュレーション比に変動を認めなかった。しえられた。

たがって、HG を用いた EPIT は、SCIT と比較して皮膚常在性 APC サブセットの dLN への遊C.

HG を用いた EPIT の免疫応答特性

走を亢進することが明らかとなった。

OVM-HG を貼付したマウスの血清中 OVM 特AF647/OVA-HG を貼付したマウスの dLN に異的 IgG 抗体価は、皮下注射群と同様に免疫回おいては、6 時間後から 12 時間後にかけて数の増加に伴って上昇した。皮下注射群において

AF647/OVA を捕捉した皮膚常在性 APC サブセ

は免疫 3 回後に OVM 特異的 IgE 抗体価が急激ットである LC、CD207+ dDC、および CD207-に上昇したのに対して、OVM-HG 群では緩やか

dDC の増加が認められた。また、リンパ節常在性な上昇を認めたのみであり、IgG 抗体価に対するAPC サブセットにおいても AF647/OVA 捕捉細IgE 抗体価の比は一定に保たれていた。また、こ胞数の増加が検出された。一方、AF647/OVA をれらのマウスから調製した dLN 細胞を OVM で

皮 内 注 射 し た マ ウ ス で は 、 dLN に お け る

再刺激したところ、皮下注射群では IL-2、IL-10、

AF647/OVA 捕捉 APC サブセットは 2 時間後に

IL-13 といったサイトカイン産生が検出されたのは増加しており、その後減少するプロファイルをに対して、OVM-HG 群においてはいずれも低値示した。皮下注射投与群では dLN におけるいず

あるいは検出限界以下を示した。これらの結果をれの APC サブセットにおいても AF647/OVA 捕まとめると、バリア機能が保たれた皮膚への HG

捉細胞数の顕著な増加は認められなかった。これを用いたアレルゲン投与は、皮下注射法と比較しらの結果から、EPIT に伴う免疫反応においては、てアレルゲン特異的 IgE 抗体や Th2 型サイトカ

dLN においてアレルゲンを捕捉した APC が惹起

インの産生を低く抑えることが可能であり、免疫する免疫イベントの寄与が SCIT による免疫反応

療法における副反応誘発リスクを低減できるとよりも大きいことが示唆された。さらに HG によ考えられた。

って皮膚内送達されたアレルゲンのプロセッシ

OVA-HG による経皮免疫は、dLN におけるリング経路は、① 皮膚組織においてアレルゲンをンパ節常在性 APC サブセット (CD8+ DC, pDC,

捕捉した皮膚常在性 APC サブセットが dLN へ

その他の CD11c+ cells) のポピュレーション比にと遊走し、その後リンパ節常在性 APC サブセッ

38

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

トにアレルゲンを受け渡している可能性、あるい発達する乳幼児期においてカルシウム不足は、骨は② 輸入リンパ管を通って皮膚から dLN に流や歯の成長に影響が大きい 3)。牛乳アレルギー患

れ込んできたアレルゲンを各種 APC サブセット

児を持つ親は、代替食により不足栄養素を補ってが捕捉している可能性、が考えられた。これら二いるものの、時間的・身体的・費用的な問題もあつの可能性のうち寄与の大きな経路を同定する

り親の QOL 低下を招きかねない。
本研究では、ヒトにおける EPIT の安全性・有ため、各 APC サブセットを枯渇できる遺伝子改用性を評価するため、重症牛乳アレルギー患児を変マウスを用いた検討を計画している。
OT-I 細胞を移入したマウスに OVA-HG を貼付対象とした探索的臨床研究を実施した。試験開始

したところ、OT-I 細胞の OVA 特異的分裂増殖は時における患児の臨床的特徴を Table 2 に示した。

OVA 皮下注射群と同様にほとんど認められなか

MPC-HG 貼付に伴い、蕁麻疹や発赤など局所のった。一方、OVA-HG を貼付した OT-II 細胞移皮膚症状は認められたものの、アナフィラキシー

入マウスでは、OVA を皮下注射した群と比較しショックなど重篤な副反応は全例において認めて移入 OT-II 細胞の分裂増殖が亢進しており、なかった。さらに EPIT 実施により、8 例中 4 例

EPIT が SCIT よりも抗原特異的 CD4+ T 細胞へ

においてアレルギー症状誘発閾値が上昇し、牛乳の抗原提示と活性化を促進することが示唆され

3 mL 以上を経口摂取することが可能となった

た。

(Fig. 4)。これは、タンパク量で牛乳 3 mL に相当
するバターを摂取できることを示し、バターの含

D. 重症牛乳アレルギー患児に対する MPC-HG

まれる多くの食品を経口摂取できるようになったことから大幅な QOL 改善につながったと考えを用いた経皮免疫療法
本邦において牛乳アレルギーは、鶏卵に次いでられ、EPIT の有効性が示された。これらの患児罹患者数が 2 番目に多く、乳幼児期に最も発症率においては、OIT に移行し継続的に治療を続けたが高い。牛乳アレルギーは、牛乳タンパク質に含ところ、100 mL 近くの牛乳を飲むことが可能とまれるカゼインが主要アレルゲンであり、これはなった。さらに milk、-lactalbumin (ALA)、-加熱処理をしてもアレルゲン免疫原性は変化し

lactoglobulin (BLG)、casein 特異的 IgE 抗体価ない。チーズやヨーグルトの発酵食品であってもは、EPIT 実施後緩やかに低下傾向を示し、一方、カゼインの免疫原性は変化しないため、牛乳アレ

ALA、BLG、casein 特異的 IgG 抗体価およびブ

ルギー患児は多くの乳製品を摂取することがで

ロック抗体として機能する IgG4 抗体価の上昇傾きない。牛乳アレルギーは、乳幼児期 (0 歳) に向が認められた。したがって EPIT は OIT が困

発症率が高く、その後加齢に伴い自然寛解するケ

難な重症アレルギー患児への導入部分としてもースが多いものの、牛乳アレルギー患児のカルシ

非常に効果的であり、OIT への移行を可能にする

ウム摂取量は健常児の半分以下であり、最も体が手段であると考えられる。

39

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

かに正常状態に戻ることが示された。
これらの探索的臨床研究のデータは、HG を応用した EPIT が簡便な食物アレルギー根治療法として非常に有望であることを示唆するとともに、試験中止につながった副反応を軽減するアプ
ローチを導入することができれば、本療法の恩恵にあずかる食物アレルギー患児を大幅に拡大できる可能性を示唆した。

E. 重症鶏卵アレルギー患者に対する経皮免疫療法における治療反応性予測マーカーの探索
24 週の治療後に負荷試験閾値が卵白 2 g 以上となった 7 例と 2 g を越えなかった 15 例で比較すると、12 週と 24 週の血清 TARC 値は閾値上
昇群で有意に高値であった。TARC の変動と閾値の間では有意な関連はみられなかった。本試験では試験期間中、アトピー性皮膚炎コントロールのためステロイド外用剤のプロアクティブ療法を行い、皮疹がほとんどない状態を維持できていたことより、血清 TARC 高値はアトピー性皮膚炎
残念ながら 32 週目において特異的 IgE 抗体価の状態を示さず、免疫療法による個体の免疫応答に著しい上昇が認められた 2 例 (ID 3, ID 7)、を反映している可能性が考えられた。

MPC-HG 貼付部位の蕁麻疹が頻回となった 1 例

次に、高感度の DCP チップ法で特異的抗体を(ID 6)、閾値の改善効果が得られなかった 1 例

測定したところ、特異的 IgE は有意な変動を示さ(ID 8) において本試験を中止した。milk および

なかったが、特異的 IgG および IgG4 はそれぞれ

casein 特異的 IgE 抗体価が急上昇した症例にお12 週、24 週に有意に上昇した。しかし、治療後いては、試験中止後特異的 IgE 抗体価の速やかなの負荷試験の閾値上昇の程度と IgG1、IgG4 抗体

減少を示した。以上のことから、EPIT の実施にの変化には明らかな関連は認められず、治療反応

より局所の皮膚反応やアレルゲン特異的抗体価性のマーカーとしては、さらなる検討が必要と考の上昇などの副反応が生じることも明らかとなえられた。

り、HG の使用を中止することでその症状は速や40

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

F. 経皮アジュバント候補物質のスクリーニン
グ
アレルゲン免疫療法は、治療が長期間に及ぶとともに時にアナフィラキシーショックなど重篤な副反応を誘発するなど、患者負担の大きな治療法であり、アレルゲン用量・投与回数・投与期間の低減と安定した免疫応答の保証が望まれてい

C57BL/6 マウスおよび BALB/c マウスに各種る。これらの問題を解決する方策として、免疫応

アジュバント候補物質を併用した OVA-HG を用

答を増強・修飾できるアジュバントの併用が挙げ

いて経皮投与すると、OVA 特異的 IgG 抗体価はられる。アジュバントを適用した HG 製剤の開発

すべてのアジュバント併用群において OVA 単独には、経皮投与によってアジュバント活性を発揮

群よりも高値を示し、またマウス系統間での差異できる候補物質を新たに探索・同定し、得られたは認められなかった。これら OVA 特異的 IgG 抗候補物質の安全性・有効性評価と活性機序の解明

体のサブクラス解析を行ったところ、OVA 単独を図る必要がある。本研究では経皮アジュバント

群は IgG1 抗体 (Th2 型 IgG サブクラス) のみが候補物質として、自然免疫と獲得免疫のクロスト

検 出 さ れ た の に 対 し て 、 Poly I:C 併 用 群 とークに重要な TLR を標的とするリガンド分子にImiquimod 併用群では BALB/c マウスにおいて着目した 4),5)。

Th1 型 IgG サブクラスの IgG2a が検出され、K3

まず、マウス皮膚細胞における TLR の発現を併用群では両マウス系統において Th1 型 IgG サ

解析したところ、APC として機能する LC およブクラス (IgG2c および IgG2a) の抗体価上昇がび dDC には TLR1 から TLR9 まで全ての TLR認められた。さらに OVA 特異的 IgE 抗体価は、発現が確認された (Fig. 5）。ケラチノサイトにおPam3CSK4 併用群、LTA-SA 併用群、Imiquimod

いては TLR3、7、8、9 の僅かな発現が認められ併用群において OVA 単独群よりも高値を示し、た。皮膚は病原体の侵入を防ぐ物理的バリアを構Poly I:C 併用群および K3 併用群では OVA 単独築しているだけではなく、病原体を排除する免疫群と同レベルであった。以上の結果をまとめると、学的バリアも備えており、皮膚に存在するこれら

Poly I:C (TLR3 ligand) お よ び K3 (TLR9の細胞が TLR を介して病原体の侵入を迅速に察

ligand) は、HG を応用した EPIT におけるアレ

知し、自然免疫の誘導を促していると考えられる。

ルゲン用量・投与回数・投与期間の低減が見込め

したがって、今回発現が認められた TLR に対す

るのみならず、アレルギー患者の Th2 型に傾いるリガンドを HG 製剤に適用することで、経皮アた免疫応答を Th1 型に偏向できる可能性をも有ジュバント効果が発揮されるものと予想された。

するアジュバントとして有望であると考えられた。

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重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

G. OVA アレルギーモデルマウスと HG を用い

H. 新規 HG の探索・開発
現行の HG は親水性アクリル樹脂を主剤とし、た経皮免疫療法治療モデル
OVA-IgE Tg マウスに EPIT および SCIT を実

グリセリンその他の低分子化合物を含むもので施したところ、SCIT 群の OVA-IgE Tg マウスである。アレルゲンの表面濃縮に優れ、食物アレルは血清中 OVA 特異的 IgG 抗体価が 3 週間で上昇

ギーに対する経皮免疫療法用デバイスとして多し始めたのに対し、EPIT 群では 4 週間後から抗くの薬理試験および臨床研究の用途に供されて体価の上昇が認められた。一方、OVA 特異的 IgE

きたが、本経皮免疫療法の臨床試験第 I 相への進

抗体価は両群ともに治療による影響を受けなか展をスムースにサポートするためには以下の課った。また、Th2 サイトカインである血中 IL-4

題に対する解決が望まれる。

濃度は SCIT 群・EPIT 群ともに無治療群と比較(1) 現行の HG ではアレルゲン水溶液を塗布しして低下が認められた。SCIT 群では、頻回のて乾燥させるまでの時間が長く、自動化およOVA 注射投与により耳介皮膚の炎症や肥厚が観び大量生産のためには改良が必要である。

察されたのに対し、EPIT 群では皮膚刺激性・傷(2) 現行の HG の支持体、離型フィルムを含めた害性は認められなかった。以上の結果から、HG

全体仕様は、クリーンブースでの手作業を意

はアレルゲン特異的 IgE 抗体価が高値に維持さ識したものであり、大量生産のためにはよりれた状態でも貼付部位皮膚に重篤な局所反応を

ふさわしい仕様とすることが必要である。

誘発することなく、SCIT と同様にアレルゲン特(3) 組成物として医薬品経皮投与実績を有する異的 IgG 抗体の産生を誘導することが示された。

添加剤のみからなる新しい親水性ゲルとす

免疫治療後の血清を回収して PCA 試験を実施しることにより、近い将来予想される正式の臨たところ、血清 10 倍希釈での Evans Blue 漏出床試験第 I 相への進展をよりスムースにする。

面積は SCIT 群で増加し、EPIT 群では減少が認

そこで今回、これらの条件を具備した臨床試験められた。免疫治療を実施した OVA-IgE Tg マウ

用 HG の大量安定供給を見据えた新たな HG のスに 100 g OVA を静脈内投与すると、無治療群開発に取り組んだ。

および EPIT 群と比較して SCIT 群では直腸温の

親 水 性 ア ク リ ル 粘 着 剤 2 種 (MAS683 とより大きな低下が認められた。これら OVA-IgE

MASCOS10) のいずれを用いた新規 HG も粘着

Tg マウスを活用した免疫治療モデルの結果から、物性は良好であった。HG を水中に浸漬して吸水

HG を用いた EPIT は従来の SCIT と比較して安率を測定したところ MAS683 のほうが優れてい

全性に優れる新規アレルゲン特異的免疫療法とたため、以降の検討で MAS683 を基剤として使して有望であることが示された。今後、本モデル用することとした。また添加剤としては、グリセの最適化検討を進めるとともに、HG を用いた

リンおよび界面活性剤以外に低分子量ポリビニ

EPIT の奏効機序の解析へと展開する予定である。

ルピロリドンを含有する組成がバランスの取れ

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重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得た粘着剤となることを見出し、新規 HG 組成物とて、遺伝子発現変動を RNA-seq 解析により、した。

アレルゲンの動態・局在・捕捉細胞を Flow

新規 HG は、高分子物質である FD10 を粘着

cytometry 解析あるいは蛍光イメージングに層の表面に濃縮することができ、低分子物質であより精査する。また、dLN 中における免疫イベ

る色素は粘着層の表面から全体に浸透させるこ

ントを健常マウスにアレルゲン装填 HG を貼とができた。また、現行 HG とほぼ同等の吸水性付した場合と比較検討する。これらの結果から能を有しており、物性的にも近似していた。今後、EPIT による減感作・脱感作に寄与すると考え薬理的評価を含めてさらに性能評価を行い、臨床られる免疫細胞あるいは免疫機能分子につい試験用の最終製剤へと完成させる予定である。

て、各種遺伝子改変マウスを用いた手法を組み合わせてより詳細な機能解明を進める。
(3) HG を用いた EPIT の大規模臨床研究

今後の研究活動について(1) 食物アレルギーモデルマウスにおける HG

本研究では重症牛乳患児に対するパイロッを用いた EPIT の有効性評価

ト試験において、摂取閾値上昇の効果およびブ

食物アレルギーモデルマウスの作成条件のロッキング抗体とされる特異的 IgG4 抗体の上最適化を継続するとともに、本モデルにおける昇効果を確認できた。また、重症鶏卵アレルギ

アレルゲン装填 HG を用いた EPIT による有ーに対するパイロット試験においても同様の効性を血中 sIgG/sIgE タイター比測定、経口負有効性が認められている。これらの結果は、HG

荷試験におけるアナフィラキシー誘発閾値評を応用した EPIT の大規模臨床試験を実施す

価 (体温変化、糞便観察)、経口負荷後の各種免る妥当性を示しており、今後は臨床研究法に則

疫学的パラメーター解析 (血中ヒスタミン値

った特定臨床研究として多施設でより多数例

変化、血中 TARC 値変化、肥満細胞・好塩基球の実施が望まれる。大規模臨床研究を行うための頻度・活性化状態、制御性 T 細胞の頻度、なには、アレルゲン装填 HG の大量生産体制の確ど) に基づいて検証する。また、EPIT の有効

立や総合賠償責任保険・普通傷害保険などに多性に対するアレルゲン用量ならびに貼付スケ

額の費用を要するため、十分な研究費を獲得す

ジュールについても検討する。ヒト食物アレルる必要がある。

ギーに近いモデルを確立することで前臨床研究をさらに推進し、早期の GLP 試験への展開

参考文献
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Matsuo K, Quan Y-S, Kamiyama F, Fujita(2) HG を用いた EPIT の奏効機序解明
食物アレルギーモデルマウスにアレルゲン

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装填 HG を貼付した際の貼付部位皮膚についtranscutaneous vaccination system using ahydrogel patch for viral and bacterial

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