食物アレルギー診断技術の開発

研究課題名

食物アレルギー診断技術の開発

フリガナ

ムラタ

代表者名

村田タカヒサ幸久

所属機関（機関名）東京大学（役職名）准教授
氏

大学院農学生命科学研究科

名（フリガナ）

応用動物科学専攻

所属機関・役職名

役割分担

共同研究者

大矢 幸弘
国立成育医療研究センター・患者の診断と採尿を行う。
（オオヤユキヒロ）
アレルギーセンター長
発表論文
・ Epithelial cell-derived prostaglandin D2 inhibits chronic allergic lunginflammation in mice. Maehara T, Nakamura T, Maeda S, Aritake K,Nakamura M, *Murata T. FASEB J. fj201802817R. 2019.
・ Comparison of urine and blood as a convenient and practical sample for
本 助 成金 によ る 発
estimating the contamination level of live cattle with radioactive cesium.
Sato I, Sasaki J, Satoh H, Natsuhori M, Murata T, Okada K. Animal Science
表論文，学会発表
Journal. 90(8):1090-1095. 2019.
・ L-PGDS-derived PGD2 attenuates acute lung injury by enhancing
endothelial barrier formation. #Horikami D, #Toya N, Kobayashi K, Omori
K, Nagata N, *Murata T. J Pathol. 248(3):280-290. 2019.
次ページへ続く
研究結果要約
食物アレルギーを診断するためには、医師が患者に抗原を食べさせて症状の有無を評価する「経口抗原負荷試験」行うが、この方法は大変な手間がかかる。治療法として知られる免疫療法では、症状が出ない少量の抗原を毎日食べることで、食べられる量を増やしていく。この方法も、大変な手間がかかり、治るまでに数年を要す。また途中で症状が出てしまうケースもある。安全かつ適切な食物アレルギーの診断や治療を実現するには、症状を常にモニタリングできる病態マーカーを見つける必要がある。申請者は子供からでも採取が簡単な尿の中に、アレルギー反応をおこす細胞として知られる肥満細胞が産生した PGD2 の代謝産物 PGDM が排泄されることを発見した。このマーカーを用いれば、血液を採取することなく、小さな子供でも安全かつ的確に、食物アレルギーの診断が可能となる。しかし、PGDM の濃度測定には質量分析装置を用いる必要があり、高い費用と時間がかかる、また、症状が認められても、尿中 PGDM 濃度が上昇していない偽陰性が少数ある、などの、解決すべき課題も見えてきた。本提案
では、①尿中 PGDM の抽出や測定方法の、高速化と最適化を行い、安く、早く、適切に PGDM 濃度測定が行えるように研究開発を行った。また、②症状がでていても PGDM が反応しない偽陰性が出る原因を明らかにするとともに、偽陰性の場合に応用できる、代替診断マーカーの探索も行った。

60

食物アレルギー診断技術の開発

本助成金による発表論文，学会発表の続き
・Therapeutic potential of D prostanoid receptor 1 signal enhancement in a murine model of foodallergy. #Nakamura T and #Hirai R, Tachibana Y, Masuko S, Nagata N, *Murata T. J Allergy

Clin Immunol. 143(6):2290-2293. 2019.
・ Hematopoietic prostaglandin D synthase-derived prostaglandin D2 ameliorates adjuvantinduced joint inflammation in mice. Tsubosaka Y, Maehara T, Imai D, Nakamura T, Kobayashi
K, Nagata N, Fujii W, *Murata T. FASEB J. fj201802153R. 2019.
・Urinary PGDM, a prostaglandin D2 metabolite, is a novel biomarker for objectively detecting
allergic reactions of food allergy. Inagaki S, Maeda S, Narita M, Nakamura T, Shimosawa T,*Murata T and *Ohya Y. J Allergy Clin Immunol. S0091-6749(18)30995-3.2018.
・5,6-DiHETE attenuates vascular hyperpermeability by inhibiting Ca2+ elevation in endothelial
cells. Hamabata T, Nakamura T, Tachibana Y, Horikami D, *Murata T. J Lipid Res. 59(10). 18641870. 2018.
学会発表
・質量分析を用いたアレルギー診断マーカーの探索 、村田幸久、日本化学会第 100 回春季大会
2020/3/22
・The role of Prostaglandin D2 synthase in retinal angiogenesis、堰八英里香、大森啓介、小林幸司、永田奈々恵、中村達朗、倉田薫里、植村明嘉、村田幸久、第 93 回日本薬理学会年会 2020/3/16
・プロスタグランジン D2 を毒仮説から考える、中村達朗、藤原祐樹、木田美聖、村田幸久、第 2 回
比較薬理学・毒性学会春季研究会 2020/1/25
・疾患における生理活性脂質の役割の解明と応用、大森啓介、前原都有子、藤原祐樹、宮崎悠介、藤井省太、堀上大貴, 山崎愛理沙、今井大貴、橘侑里、益子櫻、林亜佳音、濱崎雄太、木田美聖、小林唯、宮田佳奈、山本晃子、竹ノ内晋也、原口大雅、芦名功平、小林幸司、中村達朗、永田奈々恵、村田幸久、第 2 回比較薬理学・毒性学会春季研究会 020/1/25
・アトピー性皮膚炎モデルマウス及び患者における尿中脂質プロファイルの解析、永田奈々恵、濵﨑
雄大、稲垣真一郎、中村達朗、堀上大貴、山本貴和子、犬塚祐介、下澤達雄、橘侑里、成田雅美、大矢幸弘、村田幸久、第 2 回比較薬理学・毒性学会春季研究会 2020/1/25
・PGDM as a Specific Maker of Food Allergy, Takahisa Murata, Food Allergy Gordon Research
Conference 2020/1/7
・The profiling of lipid metabolites in the nasal lavage fluid of a murine model of allergic rhinitis,
Yuri Tachibana, Tatsuro Nakamura. Takahisa Murata, World Allergy Congress 2019,61

食物アレルギー診断技術の開発

2019/12/14
・The role of prostaglandin D2 in food allergy, Takahisa Murata,The 1st ToBEST symposium,
2019/11/15
・DBPCFC with N of 1 RCT and PGDM improve diagnostic accuracy of food allergies in a 9-yearold boy. Yusuke Inuzuka, Kiwako Yamamoto-Hanada, Motoko iwama, Kenji Toyokuni, Koji
Nishimura, Makoto Irahara, Fumi Ishikawa, Makiko Miyata, Miori Sato, Yumiko Miyaji,Mayako Saito, Tatsuki Fukuie, Masami Narita, Ichiro Nomura, Tatsuro Nakamura, Tatsuo
Shimosawa, Takahisa Murata, Yukihiro Ohya, Pediatric Allergy and Asthma Meeting (PAAM)
2019, 2019/10/17
・アレルギー性鼻炎モデルマウスの鼻汁における脂質メディエーターの産生量の変化、橘侑里、中村達朗 、荒井美乃、曽根正好 、村田幸久、第 162 回日本獣医学会学術集会、2019/9/10
・Mediator Lipidomics: Towards Comprehensive Metabolic Profiling of Eicosanoids and Related
Fatty Acids, Atsuhiko Toyama, Tatsuro Nakamura, Takahisa Murata,.The Omics Rebolution:
Beyond Genomics, 2019/9/8
Lipid profiling in nasal lavage fluid of a murine model of allergic rhinitis, Tatsuro Nakamura,
Yuri Tachibana, Takahisa Murata, The 68th Annual Meeting of Japanese Society of Allergology,
2019/6/15

62食物アレルギー診断技術の開発

研究目的

研究計画及び研究手法

食物アレルギーを確定診断するには、医師が患①

尿中 PGDM の高速・安価測定法の確立

者に抗原を食べさせて症状の有無を評価する「経１．尿の精製における、固相抽出カラムの素材の口抗原負荷試験」行う必要があり、手間がかかる。

開発と、充填容器の選択、吸着・洗浄・再溶

唯一の治療法と言える免疫療法では、確定診断に出過程を最適化する。可能な限り、特殊な機より決定された可食量以下の抗原を、毎日食する器（大型遠心機や減圧器）を要することなくことでその量を増やしていく。この方法も医師の精製できるキット形態をデザインする。

経験と勘によるところが大きく、寛解に数年を要

２．質量分析装置の測定メソッドの最適化とアす。また途中症状を誘発するリスクも伴う。安全プリケーション作製を同時に行う。

かつ適切な食物アレルギーの診断や治療を実現するには、指標となる病態マーカーの存在が必須②

偽陰性となる根拠の解明である。

１．成育医療研究センターにて経口抗原負荷試
験を行い、診断と尿中 PGDM 度測定を行う。

申請者は、小さな子供からでも採取が簡単な尿２．負荷開始と発症のタイミング、発現部位と強の中に、肥満細胞が多く産生する PGD2 の代謝産度に分けて詳細に評価して、回帰分析を行う。

物 PGDM が食物アレルギーに特異的かつ症状のこれにより、尿中 PGDM 濃度がどの臨床症程度に比例して排泄されることをマウスモデル状を大きく反映し、どの症状を反映しないか、を用いて発見した 1)。さらにこのマーカーがヒトを明らかにし、偽陰性がでる根拠を明らかにの経口抗原負荷試験の有用な診断指標になるこする。とも証明した 2)。しかし、①現在行っている質量３．他のアレルギー疾患患者の尿中 PGDM 濃度分析装置を用いた PGDM の濃度測定には、高いを測定し、特異性を改めて評価する。

費用と時間がかかる、また、②臨床症状が認められても、尿中 PGDM 濃度が上昇していない偽陰③性が少数ある（約 9％）、など本検査の実用化に向１．尿以外の他の体液中の PGD2 代謝産物濃度

代替診断法の開発を測定する。採取した標本の採取方法やタイけて、解決すべき課題も見えてきた。

ミング、 測定対象物質を再探索し、4 時間後の尿中 PGDM 濃度が反映できない臨床症状

本提案では、食物アレルギーの診断法の標準化と実用化を目標に掲げ、①尿中 PGDM の高速・を検出できる診断法を探す。

安価測定法の確立、②偽陰性となる根拠の解明、を目的として研究を行った。

63

食物アレルギー診断技術の開発

結果と考察度を測定できるようにした。

本助成研究の結果①

３．上記方法の validation を行った。具体的には

尿中 PGDM の高速・安価測定法の確立

１．尿中 PGDM 測定に特化したカラム素材の選尿への PGDM 添加回収試験を行い。測定の択と容器の選択を行い、抽出条件の最適化を日差変動、日内変動を計算した。また PGDM進めた。具体的には、尿の希釈率、希釈溶媒、の尿中保存安定性評価を行い、-20℃もしく内部標準物質選択と添加量調整、pH 整、溶は 4℃条件下であらば、1 週間再現性高く、出液の選択、カラム充填剤の選択、容量決定、尿を保存して PGDM の測定に供することがなどを行った。

できることを明らかにした。さらに、PGDM濃度測定に干渉する可能性がある尿中に排既存の市販品を用いた場合、前抽出に約 3 時泄される主要脂質の濃度測定も行った。

間を要し、PGDM の回収率は 1.4％と低かった。新たに開発した方法では、尿 20 標本を②3 ステップ、15 分で質量分析装置へアプライ

１．国立成育医療研究センターにて、経口抗原負できる。また、PGDM 回収率は 80％に大幅荷試験を行い診断と採尿を行い、東京大学にに改善することができた。また、回収率の向て、質量分析装置を用いた PGDM 度測定を上に伴い、測定に必要となる尿量も 0.1 ml で行った。その結果従来得られていた、測定レ可能となった。これらの成果により、将来実ンジ 1.14～17.7 ng/mg Cre とカットオフ値用化できるキット構成を決定することがで2.25 ng/mg Cre を再確認した。

偽陰性となる根拠の解明きた。
２．各患者の症状とタイミング等を勘案しなが２．抽出工程に加えて、測定に感度向上と高速化

ら、尿中 PGDM 濃度との回帰分析を行った。

を進めた。質量分析内のラインと測定プロト

その結果、尿中 PGDM 濃度に反映されやすコルをすべて見直し、洗浄工程を含めて、１い症状の順として、消化器（係数 6.9）、呼吸標本約 5 分で測定できるプロトコルを確立

器（係数 6.0）、皮膚（係数 4.8）が挙げられした。また、測定から結果、解析までを自動た。これらに比べて口腔症状の係数が小さかで行えるプログラム（マクロ）を作成した。

った。口腔のみに症状がでる患者に対して、尿中 PGDM が偽陰性となる可能性が考えら上記方法の改善やアプリケーションの確立れた。本計算の重相関係数は 0.51、自由度調により、測定条件の決定や、対象脂質の抽出、整済決定係数は 0.24 であった。

測定、解析に知識と技術を要する質量分析装置を用いて、誰でも容易に尿中の PGDM 濃３．偽陰性となった患者（症状あり、尿中 PGDM64食物アレルギー診断技術の開発濃度が 2 ng/mg 以下）の患者の尿を用いて、に成功した。唾液を用いた脂質の検出に関しては、偽陰性の原因を探るべく、他脂質の網羅的な引き続き検討を行っていく必要がある。

濃度測定を行った（158 種類）。その結果、一学会や論文発表等の予定部の患者では、PGD2 やその代謝産物以外のアトピー性皮膚炎の尿中 PGDM 濃度の推移に脂質濃度の上昇が観察された。現在その理由関しては、現在論文を投稿中である。またさらなを解析中である。

る脂質探索に関しても、論文投稿準備を進めてい４．尿中 PGDM の食物アレルギー特異性を評価る。

する目的で、アトピー性皮膚炎患者の診断と採尿を行い、尿中 PGDM 濃度を測定した。

③

今後の研究活動について

その 結 果、アト ピ ー性皮 膚炎 の患者 で は今後も、尿中 PGDM を用いた食物アレルギーPGDM 濃度の上昇は怒らないことを確認で検査技術の実用化を目指して研究を進めていく。

きた。

今後の課題として以下を挙げる。

代替診断法の開発〇PGDM の検査項目としての validation

１．上記結果で、口内症状のみが出た患者では、・これまでは自立排尿が可能な子供を対象と尿中 PGDM 濃度の上昇が確認されないケー

して診断と採尿を行ってきたが、乳幼児や大スが多かったため、唾液中の脂質濃度測定を人の経口抗原負荷試験の尿中 PGDM データ試みた。まず、唾液からの脂質抽出条件を改を集める必要がある。

めて検討した。その後、20 名の患者の唾液を・動物モデルや一部疾患の患者の尿を用いた、対象に、質量分析装置を用いた網羅的な脂質特異性評価は進めてきた。今後もこれを継続濃度測定を行った。その結果、唾液中に排泄する必要がある。

される複数の脂質濃度の上昇を確認するこ・また、経口抗原負荷試験のみならず、免疫療とができた。今後再現性の確認を急ぐととも

法中の尿中 PGDM 濃度測定を行いたい。症に、引き続き、標本採取方法や抽出方法、測状が出ない抗原の負荷量で、PGDM 濃度上定条件の検討、標的となる脂質の選択を進め昇を確認することができれは、非常に有用なていく。

指標になると期待している。

所期の結果は得られたか。また残された課題〇測定キットの開発

提案した実験は、ほぼ予定通りに行うことがで・本研究において、尿の前処理や質量分析装置きた。尿中 PGDM を用いた食物アレルギー診断を用いた測定の最適化や高速化に成功した。

技術の実用化に向けたデータの取得や技術革新

しかしより広く検査を広げるために、抗体を65

食物アレルギー診断技術の開発

・用いた検査キットの開発が必要である、Tachibana Y, Aritake K, Shimosawa T, Yatomi Y,

また、上記の様に乳幼児から尿を採取して検*Murata T. Scientific Reports. 7(1):17687.2017.

査に用いるために、オムツからの PGDM 抽Urinary PGDM, a prostaglandin D2 metabolite, isa novel biomarker for objectively detecting

出キットの作製も進める。

allergic reactions of food allergy. Inagaki S,Maeda S, Narita M, Nakamura T, Shimosawa T,

参考文献*Murata T and *Ohya Y. J Allergy Clin Immunol.

Prostaglandin D2 metabolite in urine is an index

S0091-6749(18)30995-3.2018.

of food allergy. Maeda S, Nakamura T, Harada H,66