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助成番号 140737
研 究 成 果 報 告 書（国立情報学研究所の民間助成研究成果概要データベース・登録原稿）
研究テーマ（和文） ＡＢ
研究テーマ（欧文） ＡＺ研究氏代表名者

ヒトのミトコンドリア NADP(H)濃度の決定要因 NAD キナーゼの修飾によるその活性制御の仕組み
Mechanism underlying the regulation of activity of human mitochondrial NAD
kinase, the determinant for NADP(H) concentration in mitochondria

ｶﾀｶﾅ ＣＣ姓） カワイ名） シゲユキ

研究期間 Ｂ

２０１４ ～ ２０１６ 年

漢字 ＣＢ

河井重幸

報告年度 ＹR

２０１６ 年

Shigeyuki

研究機関名

京都大学

ﾛｰﾏ字 ＣＺ Kawai

研究代表者 ＣＤ
所属機関・職名

京都大学 農学研究科 食品生物科学専攻 生物機能変換学分野・助教

概要 ＥＡ (600 字～800 字程度にまとめて下さい。)NADP+は、NAD キナーゼ（NADK)が触媒する NAD+のリン酸化反応により合成される。ヒトのミトコンドリア
局在型 NADK(NADK2)は、リン酸化修飾やアセチル化修飾で活性が制御される可能性があるが、その詳細は不明である。
本研究では、FLAG タグを導入した NADK2 でトランスフェクトしたヒト HEK293 細胞を、低グルコース環境や酸化ストレス存在下で培養し、NADK2 の in vivo でのリン酸化を Phos-Tag 解析で検出することを試みた。しかし、市販の PKA による in vito でのリン酸化は Phos-Tag 解析により検出されたものの、in vivoでのリン酸化は検出することが出来なかった。また、NADK2 と相互作用する Sirtuin を特定するために、FLAG タグを導入した SIRT3、SIRT4、SIRT5 の各々でトランスフェクトした HEK293 細胞と抗 FLAG 抗体を用いた免疫沈降実験を行ったが、目的のタンパク質は検出されなかった。他方、模倣リン酸化（リン酸化部位の候補である各 Thr または Ser 残基を Asp または Glu 残基に置換した）NADK2 組換え精製酵素（NADK2T183D、S188D、S289D、S289E、S294D、T357D、および S376D）を調製し、それらの in vitro における NADK活性の低下を観察した（同 S345D、S363D、および S367D の活性は変動しなかった）。特に、NADK2 S188Dの活性は完全に消失した。NADK2 Ser-188 のリン酸化は、複数のフォスフォプロテオミクス解析で検出されており、Ser-188 は NADK2 のホモログ間に特有な Motif 2 に存在するため、NADK2 の Ser-188 のリン酸化が NADK2 活性を負に制御する上で特に重要であると考えられた。

キーワード ＦＡ

NAD キナーゼミトコンドリア

リン酸化修飾（以下は記入しないで下さい。）
助成財団ｺｰﾄﾞ ＴＡ

研究課題番号 ＡＡ

研究機関番号 ＡＣ

シート番号- 1 -活性制御発表文献（この研究を発表した雑誌・図書について記入して下さい。）
論文標題ＧＢ

Significance of Ser-188 in human mitochondrial NAD kinase as determined byphosphomimetic and phosphoresistant amino-acid substitutions.

著者名 ＧＡ

Yutaka Kawabata, Kousaku

雑誌

雑誌名 ＧＣ

Biochem. Biophys. Res. Commun.

Murata, Shigeyuki Kawai

ページ ＧＦ691～695

論文標題ＧＢ

Shigeyuki Kawai

発行年 ＧＥ

201

5

巻号 ＧＤ

468

雑誌

著者名 ＧＡ
ページ ＧＦ

雑誌名 ＧＣ～発行年 ＧＥ

巻号 ＧＤ

論文標題ＧＢ
雑誌

著者名 ＧＡ
ページ ＧＦ

雑誌名 ＧＣ～発行年 ＧＥ

巻号 ＧＤ

発行年 ＨＤ

総ﾍﾟｰｼﾞ ＨＥ

発行年 ＨＤ

総ﾍﾟｰｼﾞ ＨＥ

著者名 ＨＡ
図書

書名 ＨＣ
出版者 ＨＢ
著者名 ＨＡ図書

書名 ＨＣ
出版者 ＨＢ

欧文概要 ＥＺ
NADP+ is synthesized through the phosphorylation of NAD + catalyzed by NAD kinase (NADK). Human
mitochondrial NADK (NADK2) is probably regulated through phosphorylation or acetylation, although
little is known about the regulation of NADK2.
In this study, it was initially attempted to detect phosphorylation of NADK2 in vivo. The human
HEK293 cells were transfected with FLAG-tagged NADK2 and the resultant cells were grown in several
conditions including a low-glucose medium or under oxidative stress. The Phos-Tag system was usedto detect phosphorylation; however phosphorylation was not detected, although in vitro
phosphorylation of NADK2 by authentic PKA was detected with the Phos-Tag system. In order to findthe Sirtuin that interacts with NADK2, the HEK293 cells were transfected with SIRT3, SIRT4, andSIRT5, all of which were tagged with FLAG. Although immunoprecipitation was conducted using α-FLAG and the lysates of the resultant cells, the interacting protein was not detected. Finally,
the purified recombinant NADK2, in which the putative phosphorylation site (Thr or Ser) wassubstituted with Asp or Glu, was prepared and the activity of the enzyme was measured. Activityof each of NADK2 T183D, S188D, S289D, S289E, S294D, T357D, and S376D was found down-regulated,
although that of each of NADK2 S345D, S363D, and S367D was normal. Especially, the activity wascompletely inhibited by substituting Ser-188 with an Asp. Moreover, Ser-188 was found highly
conserved in the primary structures of NADK2 homologs in higher animals. Ser-188 has been frequently
detected in human and mouse phosphoproteomics studies. Collectively, Ser-188 was strongly suggested
as the important phosphorylation site that downregulates NADK2.

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