大阪環農水研報

１：34〜40(2008)

Bull. Res. Inst. Env. Agr. Fish. Osaka １：34〜40(2008)

食品製造副産物を用いた高密度乳酸菌培養と乳牛への給与効果
平康博章・藤谷泰裕・瀬山智博・笠井浩司・西村和彦・三枝尚洋*・中野長久*

High Density Culture of Lactic Acid Bacterium by Utilizing Food Waste and Effect ofLactic Acid Bacterium Administration on Milk Cows
Hirofumi HIRAYASU, Yasuhiro FUJITANI, Tomohiro SEYAMA, Kouji KASAI, Kazuhiko NISHIMURA,
Naohiro MIEDA* and Nagahisa NAKANO*

Summary
The lactic acid bacterium, Lactobacillus plantarum (NBRC3070) was cultured in the solid media made by food wastes.
The fermented media contained over 1.0×10９ cfu/g of the L. plantarum and was preferred by lactating milk cows. The L.
plantarum administrated to the lactating milk cows suppressed the increase of IL-1β, IL-6 and GGT, values which areconsidered as markers of latent inflammation. Furthermore the administration significantly decreased BUN and MUN concentration and improved serum total protein content. These data suggest that the L. plantarum can ameliorate inflammationand protein metabolism of lactating milk cow.

Ⅰ．はじめに最近，乳酸菌等の微生物が動物の腸内細菌叢の調整効果を有することに加え３)，乳酸菌の細胞壁に含まれるβ-平成17年度に閣議決定された新たな「食料，農業、農1,3-グルカンが動物に対して免疫賦活効果や抗ストレ村基本計画」 に掲げられた食糧自給率の向上のためには，ス作用４,５)を持つことが明らかになったことから，乳酸飼料自給率の向上が不可欠である．また平成19年の「食菌の有用性が改めて注目されている．そこで，本研究で品循環資源の再生利用等の促進に関する法律」（食品リは，食品製造副産物を利用して、安価に乳酸菌を高密度

１)２)サイクル法）改正 により食品廃棄物の再生利用率の基に増殖させる技術を開発する．また乳牛への乳酸菌の給準が強化され，食品製造副産物の飼料利用が重要な課題

与試験を実施して乳牛への健康増進・免疫力向上効果をとなっている．食品製造副産物の飼料化および保存性向検証する．

上の方法として，乾燥よりも低コストな発酵によるサイレージ化が注目されているが，家畜の嗜好性，保存性のⅡ．材料および方法

高い高品質な食品製造副産物サイレージの生産には有用微生物を添加し発酵させることが有効である．
また，大規模集約化の進む畜産経営において，現在，１．食品製造副産物を利用した乳酸菌高密度培養（実験１）

牛の乳房炎をはじめとする感染による家畜の損耗が慢性

豆腐粕（事業所から排出されたものに酵母・グルコー化しており，生産農家の経済的損失が大きなものとなっスを噴霧 ６) して保存したもの），キャベツ屑，廃シラッている．これらは抗生物質等の抗菌剤や治療薬により対プ（栗のシラップ漬の残さ），小麦ふすま（飼料用）を処されているが，近年は食品の安全性への関心が強まっ原料に用いて培地を作製した．豆腐粕・小麦ふすま・シており，投与薬物の残留や抗生物質長期投与による耐性ラップをオートクレーブ（120℃・20分）して滅菌し，菌発生の懸念を払拭するために，安全で，損耗防止につキャベツ屑はミキサーで粉砕して流動状としたのち85℃・ながる免疫賦活効果を持つ機能性飼料の開発が強く求め30分加熱して殺菌した．クリーンベンチ内で，これらのられている．

原料を混合し固形培地とした．乳酸菌は糖分を主な栄養*大阪府立大学生物資源開発センター（Center for Research and Development of Bioresources Osaka Prefecture University）

平康他：食品製造副産物を用いた高密度乳酸菌培養と乳牛への給与効果
第１表．乳酸菌増殖用培地の原料割合（重量％）35

第２表．乳酸発酵飼料の調製条件

シラップ

豆腐粕

野菜屑

ふすま

条件１

原料を滅菌後，乳酸菌を植菌

培地１049546条件２

原料を滅菌せず乳酸菌を植菌培地２445546条件３

原料を滅菌せず，植菌もしない

培地３2037538培地４5019526培地５100000観察した．また飼料を与える位置を反転させて，延べ10頭分の試験結果を得た．

源として増殖するが，高濃度の糖分は水分活性の低下による生育阻害を招くことから７,８)，最適な糖分の添加

３．泌乳牛に対する高濃度乳酸菌の給与効果（実験３）

割合を検討するために第１表のようにシラップの配合泌乳ステージ中〜後期の乳牛５頭に対して，実験１，割合を変えて５種類の配合の培地を作成した．水分含２で使用した乳酸菌L. plantarumの給与の影響を調べた．

量 は 小 麦ふすまで調整して5 0 %に統一した．乳酸菌

MRS液体培地で培養・増殖させたL. plantarumを遠心しLactobacillus plantarum (NBRC 3070)をMRS液体培地（BDて回収し，生菌数が1.0×1010cfu/mlとなるよう生理食塩社）で前培養後，5.0×10７cfu/gとなるように固形培地に水に溶解して14日間毎日16時に経口給与した．給与量は添加し，滅菌ポリ袋に入れて真空パックして嫌気状態で給餌量1 0 kgあたり1 0 0 mlとした．すなわち生菌1 . 0 ×

遮光，24℃で静置培養した．

1010cfu/mlを飼料の１%与えた．給与開始日から給与終了

24時間後，培地中の乳酸菌生菌数を，MRS寒天培地（BD７日後まで，乳（朝・夕の搾乳時）と血液（朝１回）を社）を用いてコロニーカウント法で測定した．また，28

週１回採取して，乳生産性に対する影響，免疫能や健康日間にわたって同様に培養を行い，培地のpHをTwin pH状態に対する影響を調べた．乳成分は生乳検査所に測定メーターB-212（堀場製作所）で，有機酸（乳酸，酢酸，を依頼した．血中のIL-1β, IL-6はELISA（BIOSOURCE

蟻酸，プロピオン酸，酪酸，イソ酪酸，吉草酸，イソ吉Immunoassay Kit）によって測定し，その他の項目はフ草酸）濃度をHPLC（LaChrom Elite 有機酸（BTB法）分ジフィルム社ドライケム（DRI-CHEM3500V）で測定し析システム，HITACHI）で測定して培地の変化を検討た．乳については給与開始７日前にも採取し，給与期間した．

終了後も搾乳の可能な４頭（No.2〜5）については給与

２．高密度発酵飼料調製の実証と乳牛への嗜好性試験（実開始日から98日間，乳を14日間隔，血液を７日間隔で採験２）取した．

実験１で確立した乳酸菌培養方法によって，実用化を視野に入れて第２表のような条件で非滅菌環境でスケーⅢ．結果および考察ルアップした発酵飼料調製の実証試験を行った．実験１の結果からシラップ４%の配合割合で総重量20kgとなる

１．食品製造副産物を利用した乳酸菌高密度培養（実験よう飼料原料を混合し，発酵原料の滅菌程度により，乳１）酸発酵が優位になるか検討を行った．条件1 ，2 には培養24時間後，L. plantarumは，培地中のシラップの50mlのPBSに懸濁したL. plantarumを5×10７cfu/gとなる割合が0〜50%の間では1.0×10 ９cfu/g以上の密度に増殖よう添加した．条件３は乳酸菌を添加しない場合の対照した（第１図）．これは現在良質とされるサイレージ中サンプルとした．それぞれを２重にしたプラスチック袋の乳酸菌数1.0×10７cfu/g〜1.0×10８cfu/gを上回るものでに詰め，掃除機で内部の空気を抜き，24℃で48時間にわある．シラップ20%での培養においては最高3.2×10 11たって培養を行った．

cfu/gの生菌密度が得られた事例があった(Data not shown)．

発酵終了後，乳牛への嗜好性試験により，飼料としてシラップ50%では４%以下のものよりも増殖が低下し，の適性を調べた．乳酸菌給与試験に使用した牛とは別のシラップのみを培地としたときには乳酸菌生菌は検出で

泌乳牛５頭に対して，条件２で調製した乳酸菌発酵飼料

きなく（1.0×10 ５cfu/g以下）なった（第１図）．シラッとその原料である小麦ふすまの比較，または乳酸菌発酵

プ4―50%の間に乳酸菌増殖に最適な配合割合があるこ

飼料と日常給与している固形配合飼料（ハイフレークふとが推察された．シラップ50%以上での増殖低下の理由

じ，日本配合飼料株式会社）を比較するために、それぞには，水分活性の低下が菌の生育を妨げたことに加え，れ150mlカップ１杯分ずつ同時に供試牛の飼槽中央から他の原料由来の栄養素（微量元素等）が不足したことも左右それぞれ50cmの位置に提示し，採食行動を１分間考えられる７,８)．

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大阪府環境農林水産総合研究所研究報告第１号（2008）（a）

第１図．培地へのシラップ添加濃度と乳酸菌の増殖（b）
シラップ４%の配合で28日間の培養を行った結果，培養７日間は菌数（生菌数）は高密度を維持したが，10〜14日後から菌数（生菌数）が急激に低下し，21日後には10 ５cfu/g以下になった（第２図a）．このことから，この培養条件では，培地が高密度の乳酸菌生菌を含む飼料として利用できるのは調製後10日頃までであることが明らかになった．培地のpHは３日目には4.0まで低下した（第２図b）．培地中の有機酸は，乳酸，酢酸が10日前後まで（c）上昇を続け乳酸優勢で，その他の有機酸は検出されなかった（第２図c）．これらのことから，この乳酸菌発酵培地を飼料として利用するとき，発酵日数を調節することにより，家畜に対して生菌の効果あるいは有機酸の効果を選択的に引き出すことが可能であることが示された．
２．高密度発酵飼料調製の実証と乳牛への嗜好性試験（実験２）L.

plantarumを添加した条件１，２では24時間後にMRS寒天培地上のコロニーカウント数が10９cfu/gに達した（第３図a）．有機酸測定の結果、培地処理条件におけ第２図．乳酸菌の長期間培養における培地中の（a）菌数，（b）pH，（c）有機酸濃度の変化

る乳酸と酢酸の生成比率は同様のパターンを示し，培地の原料を殺菌処理するかしないかにかかわらず乳酸発酵40%が完食し，飼料原料としての嗜好性は問題ないと判が優勢となることが明らかになった（第３図b）．乳酸菌断できた（第４図）．

無添加の条件３でも48時間後には菌数が10９cfu/gに達し

３．泌乳牛に対する高密度乳酸菌の給与効果（実験３）

たが，条件１，２より乳酸の生成が少なく酢酸の生成が農林水産省の定める乳牛の乳房炎検査項目には乳汁中多く，pHも高い値を示した（第３図b）ことから，乳酸体細胞数、塩素量等があるが９)，本研究では乳汁中体細発酵が不十分であることが確認された．しかし，フリー胞数を測定した。乳酸菌給与終了後も91日目まで乳房炎

ク法による評価では，条件１・２は100点，条件３は90の診断基50万個/mlを超えた個体はなかった．試験期間

点で，乳酸・酢酸を除く酸はいずれの培地からも検出さが暑熱ストレスのかかる梅雨〜夏季（６月〜９月初旬）れず，今回使用した食品製造副産物を原料とすることであったにもかかわらず，体細胞数の増加抑制に効果がによって乳酸菌を添加しなくとも良好な発酵飼料が調あったことが期待されるが，乳酸菌給与の前後における整できるという評価になった．今後、添加したL.

変化は顕著でなく，今回の結果からは乳酸菌給与が乳房plantarumが飼料の品質および家畜への給与効果に及ぼ炎発症予防に直接関与したかは明らかにならなかった（第す影響を詳細に検討する必要がある。

５図a）．また強い炎症や組織の壊死によって上昇する急嗜好性試験の結果，小麦ふすまに対して，乳酸菌発酵性炎症性タンパク質CRP10)も高値を示さなかった（第６飼料は先に摂食される傾向にあり，嗜好性が高いと判定

図a）．今回の研究では，各種の炎症によって増加し，された．市販の配合飼料と比較した場合，観察時間内にCRPに先んじて上昇する炎症性サイトカインIL- 1 b,

平康他：食品製造副産物を用いた高密度乳酸菌培養と乳牛への給与効果
（a）

（b）

（c）

（d）

37

第３図．発酵飼料中の（a）生菌数，（b）pH，（c）乳酸，（d）酢酸

（a）

（b）

第４図．乳酸菌発酵飼料（培地）の嗜好性試験
IL-610)についても測定した．これらは給与期間中低位で推移したが，56日目以降に牛群の一部の個体で上昇するなど変動がみられ（第６図b, c），特にIL-6は56-70（c）

日のNo.3やNo.5にみられるように乳汁中体細胞数が上昇するよりも１週間程度先んじて上昇する動きを示すことがあった．このことから，IL-1β, IL-6は乳房炎等の臨床症状としては表れない軽度の炎症・ストレスの指標としての可能性が期待された．個体NO.2は試験期間を通じて，IL-1β, IL-6が他の個体よりも高い値を取っていた．NO.2 は肝臓の炎症や損傷によって上昇するGOT11)の値もやや高値を示しており（第６図d），何らか

第５図．泌乳牛の乳生産性に対する乳酸菌給与の影響.の炎症・ストレスによる負荷があったと考えられた．こ（a）乳汁中体細胞数，（b）MUN，（c）乳脂率No.は個体番号，両矢印は乳酸菌給与期間，編掛け部は生理的範囲の目安を示す．の個体は試験期間中，乳房炎や外傷による感染症の症状

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大阪府環境農林水産総合研究所研究報告第１号（2008）
（a）

（b）

（c）

（d）

（f）
（e）

（h）

（g）

第６図．泌乳牛の血中成分に対する乳酸菌給与の影響.
（a）CRP,（b）IL-6,（c）IL-1β,（d）GOT,（e）GGT,（f）BUN,（g）総タンパク質,（h）アルブミン.
No.は個体番号，両矢印は乳酸菌給与期間，編掛け部は生理的範囲の目安を示す．

は見られなかったが，最終分娩後（試験開始７ヶ月前）で高かったが，給与後正常範囲に移行した（第６図e）に子宮内膜炎および子宮蓄膿症を発症しており，その影ことからも，L. plantarumが乳房炎等の臨床症状には表響が残っていた可能性がある．乳酸菌給与以前のIL-1β,れない軽度の炎症・ストレス負荷の軽減効果をもつこIL-6は測定していないが，No.2のIL-1β, IL-6が乳酸とが期待できる．

菌給与終了後の観察期間に高い値を示したことから，乳また，反芻胃内のタンパク質の代謝状態を示す

酸菌給与が抗炎症作用やストレス緩和作用を示しIL-1β,MUN11)が乳酸菌給与７日で有意に減少（One-way

IL-6の上昇を抑えていたことが考えられる．GOTと同

repeated ANOVA, Tukey法, [P<0.05], 以下同じ）した．給

じく肝臓の炎症で上昇するGGT11)が乳酸菌給与前にNo.3

与７日目から14日目にかけては若干上昇したが有意な変平康他：食品製造副産物を用いた高密度乳酸菌培養と乳牛への給与効果39化ではなく、給与終了後１週間経過した21日目には14日行うことで乳酸菌の感染症に対する効果が解明できるこ目に比べて有意に上昇した（第５図b）．BUNもMUNととが期待される．

同様に推移し，給与１週間で有意に減少し，給与終了後

本研究はＪＳＴ産学共同シーズイノベーション化事業に有意に上昇した．また観察期間を通じて大きく変動し顕在化ステージ，事業名「乳酸菌等による牛の乳房炎等た（第６図f）．このことから，ルーメン内の微生物活性防疫効果発現の解明」の一部として行ったものである．の変動は大きく，その変動は比較的短い間隔であると考えられる．本試験では給与後に乳酸菌の働きによりルーⅣ．摘要

メン中の窒素化合物が分解吸収されて一時的にMUNが下がったと考えられる12)．したがって，ルーメン内の消合成培地に比べて安価な食品廃棄物を用いて，乳酸菌化・発酵のバランスが崩れて尿素態窒素濃度が高まってL. plantarumを1×10９cfu/g以上含み乳牛の嗜好性の良いいるとき，本実験のように高濃度の乳酸菌を給与するこサイレージを安定的に調製できる技術を開発した．これとで瞬時にタンパク質代謝を改善できる可能性が見込めは現在良質とされているサイレージ中の乳酸菌数1.0×た．全身の短期的なタンパク質代謝状態を示す血中の総10 ７cfu/g〜1.0×10 ８cfu/gを上回るものである．またL.

タンパク質は個体No.5で給与開始時に低かったが，給与plantarumの泌乳牛への給与によってMUN，BUNが有意１週間後から正常値に近づき，供試牛群におけるばらつに低下し，血中総タンパク質量や肝臓のGGT値が改善

きも有意（等分散のF検定，[P<0.05 ]，以下同じ）に減した個体が見られたことから，この乳酸菌がタンパク質少した（第６図g）．このことからも，L. plantarum給与が、代謝の調整等の効果を持つことが期待できる．

ルーメン内微生物活性と窒素代謝のバランスを調節して、タンパク質代謝を改善することが期待できることが示唆

Ⅴ．引用文献された．長期的なタンパク質代謝の状態を示すアルブミ
１）農林水産省（2007）．食料，農業，農村基本計画.

ンは変動しなかった（第６図-h）．
乳脂率については，乳酸給与前に低値であったNo.3の

２）食品循環資源の再生利用等の促進に関する法律.

値が上昇し，給与期間の２週間にわたり，供試牛群にお３）光岡知足（2001）．乳酸菌，腸内フローラと健康−

いて乳脂率のばらつきが給与前に比べて有意に小さくな

海外における最近の研究成果と今後の展望．食品工った．給与終了後は，供試牛群において乳脂率のばらつ

業．44：17〜45.

きが再び有意に大きくなった．（第５図c）．このことから，L. plantarumがルーメン内の微生物活性を調整して，乳脂率を高位正常域に安定させたことが考えられる．

４）宿前利郎.（2000）．真菌β-1,3-グルカンの構造と生物活性．薬学雑誌．120：413〜431.
５）Yoshizawa M, Yokoyama K, Nakano Y, Nakamura

乳量，乳中無脂固形分，乳タンパク質率，乳糖，また血H.Protective effects of barley and its hydrolysates on

中の電解質，血糖値，総コレステロール，カルシウム，gastric stress ulcer in rats. Yakugaku Zasshi. 2004

リンの値は試験期間中，泌乳生理範囲内の値で推移し，Aug;124(8):571-5.

大きく変動しなかった（Data not shown）．
以上の結果から，豆腐粕，キャベツ屑，廃シラップを６）西村和彦・奥村寿章・崎元道男・亀岡俊則（2002）.
豆腐粕へのワイン酵母と糖の散布による飼料化. 大含む培地で乳酸菌L. plantarumを高濃度に増殖させ，良阪府立農林技術センター研究報告．38：42〜49.

質なサイレージとして利用できること，また，この乳酸

７）金子勉・森田英利・阿部敬悦・内田金治・山本直之・菌は乳牛の健康維持に対する効果が期待できることが明森下隆(1996)．乳酸菌の科学と技術.学会出版セン

らかになった．本研究では乳酸菌は食品製造副産物中でター．89〜132.

1.0×10 cfu/gのオーダーまで増殖したが，MRS液体培地
９による乳酸菌培養では乳酸菌は1×1010cfu/g以上に増殖する13)．そのため食品廃棄物を用いた固体培地においてさらに高密度に増殖させるため，原料の配合比率，微量栄養素，pH調整等

８,14)

今後条件検討の余地がある．乳酸

８）高橋治男（2004）．食品のストレス環境と微生物―
その挙動と検出―．サイエンスフォーラム．161〜
171.
９）農林水産省経済局（2005）．家畜共済における臨床病理検査要領. 全国農業共済協会．329.

菌の給与試験に関しては，今回は元々良好な飼育管理の10）Simon, L., Gauvin, F., Amre, D.K., Saint-Louis, P.,下，試験期間中乳房炎等感染症の発症の可能性が低い牛

Lacroix, J.（2004）. Serum procalcitonin and C-reactive群での試験であった．今後，供試牛を増やした大規模試

protein levels as markers of bacterial infection: a験や乳房炎等感染症発生リスクの高い牛群での試験等を

systemic review and meta-analysis. Clin. Infect. Dis.

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大阪府環境農林水産総合研究所研究報告第１号（2008）
39:206-17.

11）岡田啓司（2001）．生産獣医療システム 乳牛編３．
農村漁村文化協会．25〜65.
12）Sannes, R.A., Messman, M.A., Vagnoni, D.B.（2002）.

S., Corsetti, A., Gobbetti, M.（2000）. Purification andcharacterization of novel antifungal compounds from thesourdough Lactobacillus plantarum strain 21B. Appl.
Env.Microb.66:4084-4090.

Form of rumen-degradable carbohydrate and nitrogen on14）Ohara, H., Hiyama, K. and Yoshida, T.（1992）. Non-microbial protein synthesis and protein efficiency ofcompetitive product inhibition in lactic acid fermentation

dairy cows.J.Dairy.Sci.85:900-908.

from glucose.Appl.Microbiol.Biotechnol.36:773-776.

13）Lavermicocca, P., Valerio, F., Evidente, A., Lazzaroni,