【ウェブ講座⑩】

統合オミックス解析のはなし

生命現象が分子のことばで解釈されるようになってから６０年になることは前講座で述べました。この間、組換え DNA 技術から始まった分子生物学的技術の発展には目を見張るものがあります。なかでも、今から 10 年前に創出された超高速の「次世代型シーケンサー」は “生命をシステムとして捉える”という新しい生命科学をブレイクスルーしたのです。
微生物学分野の研究者である筆者も、その次世代型シーケンサーの奔りのインパクトに痺れたものです。
“検体から菌を分離培養しないで、検体丸ごとから DNA を抽出して菌種を同定する”ことが可能になり、それまでほとんどが培養不可能であった腸内細菌の全菌種（細菌叢）が明らかになりました。このことは、サイエンスばかりでなく、医療の診断・治療・検査部門にまで大変革を与えたのです。
オミックス(omics)は、総体を調べる技を表すことばで、生体内分子を網羅的に調べることをオミックス解析といいます。対象が遺伝子 DNA の場合をゲノミクス、転写物 mRNA の場合をトランスクリプトミクス、タンパク質の場合をプロテオミクス、代謝産物の場合をメタボロミクスと呼んでいます。統合オミックス解析は、これらの個々のオミックス解析を統合し、これに生体の表現型の解析を組み合わせて個体の生命現象を包括的に調べるという新しい解析法です（図１）。この解析を支えたのが次世代型シーケンサーです。

細胞転写DNA(genome)

翻訳mRNA(transcriptome)

分解
タンパク質(proteome)

代謝産物(metabolome)

表現型
解析

生命分子の各オミックス解析

統合オミックス解析

図１ 統合オミックス解析の概要●ゲノム解析
細胞内にある DNA がもつ４種類の塩基（A, T, G, C, の略号で示される）の文字配列を遺伝情報とよび、この遺伝情報の総体をゲノム（genome）といいます。ゲノム解析はゲノムの塩基配列を解読することです。
「サンガー法」 １） と呼ばれる解析法が最も一般的で、その原理の概要を図で説明します（図２）。反応液中に含まれる酵素（ DNA ポリメラーゼ）は、解読したい DNA を鋳型とし、４種

図２ サンガー法によるゲノム解析(ネット画像より転載)

類の単量体（ヌクレオチド）を結合させることにより、それと同じ配列の DNA を合成します。このとき、その反応液中に異なった蛍光色素で標識した４種類の単量体アナログを少量加えておきます。この色素付きアナログが結合すると、そこで反応が停止して様々な長さの色素付き DNA 断片の混合物が得られます。混合物は第１世代 DNA シーケンサー（従来型）を用いて解析します。本装置は、DNA のもつ荷電を利用した分離法である電気泳動、蛍光色素の検出器、読み取り配列を処理するための情報技術が一体化されています。DNA は短いほど早く色素検出器に到達するので、この色素の順番から塩基の配列が解ります。
●トランスクリプトーム解析
トランスクリプトーム（transcriptome）は、細胞内で DNA から転写された mRNA の総体のことです。ゲノムは生物のすべての細胞で均一なのですが、転写 mRNA は組織、異なった環境や時間で発現する数や量に違いがあります。そこで、調べたい状態の細胞の全 mRNA とコントロール細胞の全 mRNA をそれぞれ異な抽出 mRNA１った蛍光色素（cy3：緑色、cy5：赤色）で標識し、抽出 mRNA２一緒にしてスライドグラス上に貼った全遺伝子の１本鎖相補 DNA （cDNA）（DNA マイクロ●●●-cy3色素
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●-cy5色素アレイとよぶ）に結合させます（DNA の性質で●●相補性のある配列と結合することをハイブリダイズという）。このハイブリダイズしたアレイ

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混合の蛍光色素の強さを検出器で検出します。発現した mRNA の数や量の増減を網羅的に比ハイブリダイズ較することができます（図３）。この解析法をcDNAのマイクロアレイ

DNA マイクロアレイ解析といい、同一個体で蛍光色素検出器で解析

図３ DNA マイクロアレイ解析

あっても組織ごと、または環境変化に対応し解析例た細胞の働きが解るのです。

●プロテオーム解析
プロテオーム（proteome）は、細胞内にあるすべてのタンパク質の総体のことで、その瞬間に発現しているすべてのタンパク質を意味します。多くのタンパク質は、いろいろな修飾を受けて複数の働きをしたり、一種が複数個で働いたり、他のタンパク質と複合体を作って働いたり、というように多様性をもち、栄養素を代謝する酵素として生物の生命現象の中心的な役割を担っています。
細胞内の総タンパク質の発現を調べるには、まず二段階の電気泳動による二次元電気泳動法でタンパク質を分離します。この手法は、一次元目はタンパク質の等電点（荷電が見かけ上ゼロになるときの溶液のpH）、二次元目は分子量によりタンパク質を分離します。泳動後のゲルは、銀染色や蛍光染色で染めてタン図４ 精密質量分析装置 EC-MS （ネット画像より転載）
二次元電気泳動で分離した試料（A）は質量分析（B, C）され、各クロマトピーク（D）は内蔵標準データから同定される。

パク質のスポットを検出します。現在は再現性と解像度に優れた固定化 pH 勾配（Immobilized pH Gradient,IPG）法を一次元目の泳動に用いることが多くなっています。これは分離能が非常に高いので、細胞の全タンパク質を数千以上にもおよぶスポットに分離することができます。回収したスポットは、一体化されている質量分析法（MS：mass spectrometry）（EC-MS）にて質量（重さ）を測定し、内臓データからタンパク質を同定します（図４）。また、試料を分離するための液体クロマトグラフ（LC）と、分子の質量（重さ）を測定するマスクロマトグラフ（MS）から構成されるオンライン化された精密質量分析装置（LC-MS）もよく利用されています。
●メタボローム解析
生体内に存在する代謝によって作り出される糖や有機酸、アミノ酸、脂肪酸などの低分子化合物の数千種類におよぶ総体を網羅的に解析することがメタボローム解析です。代謝物の動態はもっとも生体の表現型に近い状態を表しています。従って、未知の代謝産物の同定はとても重要です。プロテオーム解析と同様に、代謝産物は物質の種類により各種の分離法（ガスクロマトグラフ、高速液体クロマトグラフ、電気泳動など）で分けられた後、高感度な質量分析法（GC-MS:ガスクロマトグラフ質量分析、LC-MS:高速液体クロマトグラフ質量分析、MS-MS:タンデム質量分析、EC-MS:キャピラリー電気泳動質量分析など）で解析されます。解析ソフトとバイオインフォーマティクス技術が必要となるため、外部機関と連携した受託分析も行われています。
●マイクロバイオーム解析

細菌叢より DNA 抽出

多くの微生物群が培養できないため、その全容が不明であった環境や動物の消化管や皮膚などに生息アダプターFする微生物叢（マイクロバイオーム）の遺伝子情報を網羅的に解析することをマイクロバイオーム解析といいます。その方法はメタゲノム解析、16S 系統解析２）とも呼んでいます（図５）。本法は、細菌だけがもつ16S リボソーム RNA は種により可変する領域（v1-v9）があることを利用して、菌叢 DNA から 16S 遺伝子を増幅してその配列を解読し、コンピューターによるBLAST（DNA の塩基配列やタンパク質のアミノ酸配列プライマーF

プライマーR アダプターR

タグ

16S rRNA
V1 V2

V3 V4

V5V6 V7 V8

V916S rRNA の V 領域プライマー設計
PCR 増幅・ライブラリ作製・次世代シーケンサーによる配列取得
・クラスター解析・機能予測・機能比較など
・ＢLAST 検索にて菌種同定・系統分類

図５ 16S 系統解析のスキームプログラム）検索で菌種を同定します。
●個々の網羅的解析を統合したオミックス解析

従来型の解析

統合オミックス解析

上記の個別オミックス解析は、どれも分離技術と検出器と情報処理が一体化されており、データがデジタル化（カタログ化）されています。このことからも、本法では「ロボット技術」や「情報技術」の発展が大きく寄与していることが分かります。本法は、全分子ごとに分子次世代型シーケンサー間、機能間のデータを統合・比較し、そのネットワークを構築することや未知のネットワークを見出すことを可能

図６ 統合オミックス解析のスキーム(ネット画像参考)

にしました（図６）。これを「統合オミックス（トランスオミックス）解析」３）といいます。
解析に用いられる次世代シーケンサーは塩基配列のみを解析する従来型サンガー法 DNA シーケンサー（第１世代シーケンサー）が進化を遂げ、新たなコンセプトにより超高速で塩基配列を解読する装置のみ
ならず、トランスクリプトームやメタゲノムのオミックス解析装置を合体させた次世代型シーケンサー４）として開発され、現在、第５世代型まで進化が進んでいます（表１）。人類の叡知は止まることがありません。
表１ 次世代型シーケンサーの進化とその特徴
世代

製品

特徴

解読できる鎖長処理能力（１日当り）

第１世代

ABI などサンガー法による塩基配列解読技術を4 色の蛍光色素で標識したジデオキシヌクレオチドを用いて、ロボット技術によるキャピラリー電気泳動と蛍光検出と情報技術による塩基同定までを自動化した装置で解析する。 読み取り精度が高く読み取り長も長いという利点がある
が、大腸菌に DNA 断片をクローニングする必要があるため、人的・時間的コストを要する。

500-700 塩基

920-3.4K 塩基

第２世代

ロッシュ
イルミナ
ABI

短い DNA 断片を増幅し、これを鋳型にポリメラーゼで合成する際の光シグナルを検出する。

400 塩基75×2 塩基35×50 塩基80M-300M 塩基

第３世代

ヘリコスなど１分子の短い DNA 断片を鋳型にポリメラーゼで合成する際の光シグナルを、リアルタイムに検出する。

35×50 塩基1.4G 塩基第４世代

パシフィックバイオサイエンスなど

１分子の DNA を鋳型にポリメラーゼで合成する際の光シグナルを、時間または位置の分解能を利用して高速に検出する。

5K-12K 塩基

2.4G 塩基第５世代

ナノポアなど１分子の DNA を物理的方法で直接検出する。

10K-1M 塩基∞

800G 塩基以上（科学 2009,79(2):240-244 参考）

以上、現在進んでいる JAXA/東京大学/女子栄養大学の共同研究、通称“大野テーマ（免疫）”において行われているオミックス解析を中心にやさしく解説しました。
【参考文献と参考図書】
１） Sanger F. and Coulson AR. 1975, A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNApolymerase. J Mol Biol. 94(3):441-448.
２） Shendure J. and Ji H. 2008, Next-generation DNAsequencing. Nat. Biotechnol., 26:1135-1145.
３） Yugi K. et al. 2016, Trans-Omics: How To Reconstruct Biochemical Networks Across Multiple 'Omic' Layers.
Trends Biotechnol., 34(4):276-290.
４） 五條堀孝ら. 2009, 「日本は次世代シーケンサーにどう取り組むか」 科学 79(2):240-244.

（執筆：太田敏子）