ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

研究課題名

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

フリガナ

サトウ

代表者名

佐藤リエ
里絵

所属機関（機関名）国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部門（役職名）上級研究員
氏

共同研究者

名（フリガナ）

近藤康人（コンドウヤスト）
手島玲子（テシマレイコ）

所属機関・役職名

役割分担

学校法人 藤田学園 藤田 ソバアレルギー患者の診断・医 科 大 学 ば ん た ね 病 院 問診、収集した血清の抗体価
小児科 教授の調査
学校法人 加計学園 岡山
ソバアレルゲンコンポーネン
理科大学 獣医学科 食品
トの消化性試験
衛生講座 教授

本 助 成金 によ る 発
国際誌への投稿に向け準備中である。
表論文，学会発表

研究結果要約ソバ（Fagopyrum esculentum Moench）はアミノ酸バランスの良い（アミノ酸スコア 100）タンパ
ク質や、脂質、食物繊維、ビタミン、および抗酸化作用等を持つルチンの豊富な作物である。一方でソバは、ごく微量でアナフィラキシーなど重篤な症状を引き起こすことから、日本では特定原材料として加工食品への表示義務が課されている。ソバは日本だけでなく世界各地で食べられている食品であり、ソバアレルゲンの低減は重要な課題である。ソバアレルギーの原因物質であるソバアレルゲンはすでに複数同定されている。我々はアナフィラキシーの原因アレルゲンであるとの報告のある Fag e 2 について解析を進めてきており、一部のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換すると消化耐性が低下することを示すとともに、エピトープ配列の同定を行ってきた。本研究では、ソバアレルゲンと、症状およびソバ特異的 IgE 抗体価との関連性を調査し、Fag e 2 と BW10kDa との両方に結合活性を示す患者血清は、比較的高いソバ特異的 IgE 抗体価および重篤な症状を示すものであることがわかった。また、そば乾麺を調理した際、調理後のアレルゲンの消化性が変化する可能性を示した。今後、これらのアレルゲンのアレルギー誘発性を明らかにすることで、ソバアレルギーのより正確な診断や低アレルゲン食品の開発、ならびに低アレルゲン品種の作出に貢献したい。

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ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

研究目的を持つルチンも豊富な食品である。一方でソバは、現在、患者が食物アレルギーを引き起こさないごく微量でアナフィラキシーなど重篤な症状をようにする方法は、原因食品の摂食を避けること、引き起こすことから、日本では特定原材料としてである。我々が避けるべき原因食品を知るために加工食品への表示義務が課されている。また、ソは、正確な診断が必要とされる。近年、食物アレ

バアレルギーは寛解されにくいことが知られてルギーの原因物質である食物アレルゲンに関し、いる。

1 種類の原因食品には複数のアレルゲンが含まれソバアレルゲンはすでに複数同定されており 1,ること、患者によって反応するアレルゲンが異な2)、Fag e 2 はアナフィラキシーの原因アレルゲること、および、どのアレルゲンに反応するかにンであるとの報告がある 3)。我々は Fag e 2 につよって症状に差異が生じることがあること、など

いて解析を進めてきており、一部のアミノ酸残基が明らかになってきた。そこで、個々のアレルゲを他のアミノ酸残基に置換すると消化耐性が低ン（アレルゲンコンポーネント）を同定すること下することを明らかにするとともに、エピトープと、それぞれがどのような症状の原因アレルゲン配列の同定を行ってきた 4, 5)。本研究では、①ソであるか関連付けることが、より正確な診断に繋バアレルゲンと症状およびソバ特異的 IgE 抗体

がると期待され、症状と関連付けられたアレルゲ価との関連性、②調理加工等がソバアレルゲンのンコンポーネントに対する特異的 IgE 抗体価を消化性に及ぼす影響、③Fag e 2 における変異が測定する食物アレルギー検査である Component

消化性・アレルギー誘発性に及ぼす影響、を解明

Resolved Diagnosis (CRD) の確立が進んでいる。

し、ソバアレルゲン改変を目指す。本研究で得ら

実際、小児に症例の多い乳や、重篤な症状で知られる成果は、ソバアレルギーの CRD の確立や低れる小麦や落花生で CRD を実施し、従来の検査アレルゲン食品の開発、低アレルゲンソバ品種の法のみの場合と比べ、さらに正確な診断を行うこ作出に貢献すると期待される。とができることが示されてきている。また、CRDによる検査結果を踏まえ、アレルゲンコンポーネ研究計画及び研究手法

ントを低減できる加工・調理法の確立やテーラー①

ソバアレルゲンと症状との関連性メイド低アレルゲン食品の開発、またアレルゲン症状の履歴やソバ特異的 IgE 抗体価の明らかコンポーネントを欠失・低減した作物品種の育成な血清を用い、ソバアレルゲンの中でも Fag e 2、に対するニーズも高まっている。

BW10kDa、および Fag e 4 に注目し、これらアソバ（Fagopyrum esculentum Moench）はタレルゲンと症状およびソバ特異的 IgE 抗体価とデ科ソバ属に属する作物で、アミノ酸バランスのの関連を調査する。方法としては、これまでにソ良い（アミノ酸スコア 100）タンパク質を含み、バアレルギーに関連して我々が収集した血清と、脂質や食物繊維、ビタミン、および抗酸化作用等

ソバから抽出したタンパク質画分とを用いたウ46

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索ェスタンブロットにより、各患者血清とソバタン

法はヒト FcεRI を発現させたラット培養マストパク質画分中のタンパク質との反応性を確認す細胞株（RS-ATL8）の転写因子（NF-AT）活性化る。

をルシフェラーゼアッセイにて検出する in vitro試験法で、高感度・高特異性で、より臨床に近い②調理加工等がソバアレルゲンの消化性に及形で FcεRI の架橋によるマスト細胞活性化を測ぼす影響定できる。本研究では、-80℃で保存可能な患者血アレルゲンは分子量や含有量、消化性などの性清中 IgE と、Fag e 2 変異体との反応性を EXiLE質がそれぞれ異なる。また、消化性は熱や圧によ法で検出し、Fag e 2 のエピトープのどのアミノり変化する場合がある。そこで、ソバアレルゲン酸残基がアレルギー反応の惹起に影響するか調としてすでに報告されているもののうち、Fag e査する。

2、BW10kDa、および Fag e 4 に注目し、調理加工等の処理前後で消化性が変化するかどうかを結果と考察調査する。検出は、市販されているそば麺から抽

１）ソバアレルゲンと症状との関連性出したタンパク質画分と、Fag e 2、BW10kDa、

現在、一般に栽培・流通しているソバは、他殖および Fag e 4 の 3 種類のソバアレルゲンに対す性品種である。他殖性品種では、種子１粒ごとにる特異的抗体とを用いたウェスタンブロットに遺伝的背景が異なっている。本研究では、その他て行う。

殖性品種の１つであるキタワセソバ（③Fagopyrum

esculentum

Moenchcv.

Fag e 2 における変異が消化性・アレルギー

Kitawase-soba）を材料として用いた。キタワセ

誘発性に及ぼす影響

ソバの種子複数粒を粉砕し、得られた粉末にFag e 2 は消化耐性を示すアレルゲンである 3)

milli Q で 2 倍希釈した 2×Laemmli Sample

が、Fag e 2 を構成するアミノ酸残基のうち、一Buffer (BIO-RAD)を加え、Rotator を用いて 4℃部のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換にて転倒撹拌することで、タンパク質を抽出した。

すると、消化耐性が低下（消化性が向上）するこ得られたタンパク質抽出液は遠心し上清を取りとを我々はすでに報告している 4)。また、我々は分け、フィルターを用いてろ過後、ソバタンパク

すでに Fag e 2 のエピトープ配列を同定している質画分とした。得られたタンパク質画分のタンパ

5)。そこで、本研究では、Fag e 2 の IgE エピト

ク 質 濃 度は BCA Protein Assay Kit (Thermoープ配列を他のアミノ酸残基に置換すると消化Fisher) を用いて測定し決定した。得られたタン性やアレルギー誘発性が変化するかを調査する。

パク質画分は電気泳動にて分離し、分離したタンアレルギー誘発性の調査に用いる EXiLE（IgE

パク質は PVDF 膜に転写した。転写後の膜は我々Crosslinking-induced Luciferase Expression）

が作成した Fag e 2、BW10kDa、あるいは Fag e47

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

4 特異的抗体を用いてウェスタンブロットに供し(ii)商品に記載されている調理法に従い茹でたもた。その結果、Fag e 2、BW10kDa、および Fagの（通常調理）、および、(iii)圧力鍋を用いて茹でe 4 特異的抗体との結合活性を示すバンドが観察たもの（高圧調理）、の 3 種類を準備した。通常されたことから、材料として用いたキタワセソバ

調理および高圧調理のそば麺は、凍結乾燥後、粉から抽出したソバタンパク質画分は、今回の検出砕し、粉末とした。粉末からのタンパク質画分の対象である Fag e 2、BW10kDa、および Fag e 4抽出は①と同様に行った。得られたタンパク質画を含んでいることがわかった。次に、この膜と、分は Takagi et al. (2003) 6)の方法に従い、消化試我々がソバアレルギーに関連して収集した血清験に供した。消化試験後のサンプルは電気泳動にとを用いたウェスタンブロットを行った。その結て分離後、ゲルを coomassie brilliant blue 染色

果、各患者血清とソバタンパク質画分中のタンパおよび銀染色にて可視化するとともに、PVDF 膜ク質との反応性はそれぞれ異なっていた。Fag eに転写し、Fag e 2、BW10kDa、および Fag e 42 および BW10kDa に結合活性を示す患者血清の 3 種類のソバアレルゲン特異的抗体を用いたは複数見られたが、Fag e 4 に結合活性を示す血ウェスタンブロットにて、Fag e 2、BW10kDa、清は見当たらなかった。Fag e 4 との結合活性をおよび Fag e 4 を検出した。その結果、Fag e 4示す患者血清を見つけることができなかった理については、ほとんど検出できなかった。この原由の１つに、Fag e 4 の分子量が小さく、検出が因として、①の結果と同様、Fag e 4 の分子量がうまくできていない可能性があることが挙げら

小さく、検出がうまくできていない可能性があり、れる。次に、この結合活性と、各患者の症状およ検出系の改善の必要がある。また、Fag e 2 は、びソバ特異的 IgE 抗体価を比較したところ、Fag乾麺と比べ、通常調理により消化性が高まる傾向

e 2 と BW10kDa との両方に結合活性を示す患者が見られたのに対し、BW10kDa は、通常調理で血清は、比較的高いソバ特異的 IgE 抗体価を示は消化性が変化しない傾向が見られた。このことし、重篤な症状を示すものである可能性が示唆さは、BW10kDa は比較的消化耐性の高いアレルゲれた。

ンである可能性を示している。

２）調理加工等がソバアレルゲンの消化性に及

３）Fag e 2 における変異が消化性・アレルギー誘発性に及ぼす影響

ぼす影響
消化耐性についてすでに報告されている Fag e①において、Fag e 2 と結合活性を示すことが2 のほか、消化性などの性質が不明な BW10kDaわかった患者血清を用い、EXiLE 法にてアレルや Fag e 4 に注目し、調理加工等の処理前後で消ギ ー 誘 発 性 評 価 を 行 っ た 。 EXiLE 法 は化性が変化するかどうかを調査した。材料として、

Nakamura et al. (2010) 7)に従い行った。予備試

市販のそば乾麺を用い、(i)調理する前のそば乾麺、験として、キタワセソバから抽出したタンパク質48

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索画分を EXiLE 法に供した。その結果、健常者血析を進めて行きたいと考えている。

清と比較して、ソバアレルギー患者血清の中に、キタワセソバタンパク質の濃度依存的に反応性参考文献を示す血清があることがわかった。次に、キタワ1)

近藤康人、宇理須厚雄、和田映子、鶴田光敏、

セソバタンパク質画分の代わりにリコンビナン

矢崎雄彦、山田一恵、増田進、森田豊. そばト Fag e 2 野生型を用いて同様の実験を行ったと

主要アレルゲンの Immunoblotting 法によころ、濃度依存的にリコンビナント Fag e 2 野生る検討. アレルギー. 1993; 42(2): 142-148.
2)型と反応性を示す血清は見られなかった。したがUrisu A, Kondo Y, Morita Y, Wada E,
Tsuruta M, Yasaki T, Yamada K, Kuzaya H,って、本研究の目的である、Fag e 2 における変異がアレルギー誘発性に及ぼす影響を評価する

Suzuki

M,ことができなかった。

Identification of a major allergen of
buckwheat

Titaniseeds

K,
byKurosawa

K.

immunoblotting

methods. Allergy Clin Immunol News.

今後の研究活動について

1994; 6: 151-155.

Fag e 4 については、はっきりとした検出結果

3)を得ることができなかった。これについては、検Tanaka K, Matsumoto K, Akasawa A,Nakajima T, Nagasu T, Iikura Y, Saito H.

出に用いるタンパク質濃度の改善や、検出系の検Pepsin-resistant 16-kD buckwheat protein

討・改良を行い、追試を行う予定である。また、

is

リコンビナント Fag e 2 を用いた Fag e 2 のアレ

associatedwithimmediatehypersensitivity reaction in patients with

ルギー誘発性評価ができなかった点については、

buckwheat

今回解析に用いた患者血清が Fag e 2 以外のアレ

Immunol. 2002; 129(1): 49-56.
4)ルゲンに結合することによりアレルギー誘発性

allergy.

IntArchAllergy

Satoh R, Koyano S, Takagi K, Nakamura R,に関与している可能性、および、リコンビナント

Teshima R, Sawada J. ImmunologicalFag e 2 が native の Fag e 2 とは異なる立体構造

characterization and mutational analysisof the recombinant protein BWp16, a majorを取っている可能性が考えられ、さらなる検討がallergen in buckwheat. Biol Pharm Bull.

必要である。また、ソバは他殖性作物であり、あ2008; 31(6): 1079-1085.

る１つのソバ品種であっても、その中には複数の5)遺伝的背景、すなわち変異を含んでいる可能性がSatoh R, Koyano S, Takagi K, Nakamura R,
Teshima R. Identification of an IgE-ある。したがって、今回解析に用いたリコンビナ

binding epitope of a major buckwheat

ント Fag e 2 が、今回解析に用いた患者血清の結allergen, BWp16, by SPOTs assay and合できる配列を持っているかどうかについてもmimotope screening. Int Arch Allergy

検討し、Fag e 2 のアレルギー誘発性に関する解Immunol. 2010; 153(2): 133-140.

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ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

6)

7)

Takagi K, Teshima R, Okunuki H, Sawada

Nakamura R, Tsuge I, Urisu A, Teshima R.

J.

vitro

A convenient and sensitive allergy test: IgEdigestibility of food proteins and effect ofcrosslinking-induced luciferase expression

preheating on the digestion. Biol Pharmin cultured mast cells. Allergy. 2010;

Bull. 2003; 26(7): 969-973.

65(10): 1266-1273.

Comparative

studyofin

Nakamura R, Uchida Y, Higuchi M,50