重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究

研究課題名

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究

フリガナ

フジサワ タカオ

代表者名

藤澤 隆夫

所属機関 （機関名） 国立病院機構三重病院（役職名） 院長
氏 名 （フリガナ）
共同研究者

所属機関 ・ 役職名

役割分担中川晋作 （ナカガワシンサク）

大阪大学薬学研究
動物モデルでの検討
科 ・ 教授

神山文男 （カミヤマフミオ）

コスメディ製薬株式
経皮免疫デバイス製造
会社 ・ 代表取締役

本 助 成 金 に よ る 発 無し （無作為二重盲検負荷試験に続き、 長期試験に移行して、 キーオープンは行
表論文， 学会発表 われていないため、 公表は行われない）

研究結果要約
食物アレルギーに対する治療は未だ確立されておらず、 最近試みられている経口免疫療法も効果が不十分であるだけでなく、 アレルギー副反応が避けられないことより標準的治療とはなっていない。 そこで、本研究では新規治療として、 経皮免疫療法を開発し、 実用化を目指すこととした。 経口負荷試験閾値が低く、 寛解傾向がない重症鶏卵アレルギー患者 （4 ～ 15 歳） を対象に卵白主要抗原であるオボムコイド(OVM) を装填した新規経皮免疫デバイス、 親水性ゲルパッチ （Hydrogel patch:HG） を毎日 12 時間貼付し、 24 週間継続する経皮免疫療法の有効性と安全性をランダム化二重盲検プラセボ対照試験で検証するものである。 試験に先立ち、 まず OVM-HG 作製方法の検討、 安定性試験を行い、 製造 ・ 供給体制を確立した。 続いて、 平成 28 年 7 月 4 日より試験開始、 平成 29 年 4 月 30 日まで （10 ヶ月間） に37 名の一次登録があり、 うち二重盲検プラセボ対照傾向食物負荷試験で組み入れ基準を満たした 22 名に OVM-HG またはプラセボ HG を 1：1 で割り付けた。 これまでに 20 名が試験完了して長期試験に移行、2 名は試験継続中である。 長期試験終了後にキーオープンして、 有効性の判定を行う予定のため有効性はまだ明らかでないが、 安全性については軽度の局所反応以外は認めなかった。 また、 鶏卵アレルゲン
HG の免疫原性をマウスで検討し、 アレルゲン皮下投与に比べて、 IgE 抗体を産生させにくいこと、 アジュバントである K3 （CPG-ODN） との併用で、 さらに Th1 反応を誘導しやすいことを明らかにした。

22

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究

研究目的

免疫療法のパイロット研究を行い、 今後の大規

近年、 食物アレルギーは著しく増加、 学校に模臨床試験の基礎データを得ることを目的とす

おける誤食によるアナフィラキシー死亡事故などる。 また、 奏効メカニズムについて、 動物モデ大きな社会的問題にもなっている。 診断およびルを用いて、 免疫学的解析を行う。

管理法は進歩して、 食物アレルギー患者のＱＯＬは改善しつつあるが、 未だ十分ではなく、 とく研究計画及び研究手法に、 根治に至る治療法が存在しないことが問題

１） 抗原を効果的に経皮送達できる親水性ゲルである。 通常、 小児の食物アレルギーは多くがパッチデバイスの確立と臨床研究のためのパッ成長と共に寛解するが、 最近は、 寛解困難でチ製造アナフィラキシーのリスクを抱えたまま持続する

親水性ゲルパッチのコンセプトは以下の通り例が増えている。 これらの患者に対して、 経口である。 親水性の粘着性基剤からなる基剤部表免疫療法が試みられるようになり、 一定の効果面に抗原蛋白質を水溶液として均一に添加するは認められているものの治療に反応しがたい難と溶媒である水は蒸発あるいは内部拡散により治例が残ると共に、 治療中に少なからぬアレル表面からは消失する一方、 親水性基剤表面にギー症状誘発があるという副反応のリスクから、は抗原蛋白質が高度に濃縮される。 基剤は架1)

一般的治療とはなりがたいのが現状である 。

橋された親水性ゲルであり高分子物質であるア

そこで、 本研究では、 新規治療として、 より安レルゲンなどの内部拡散は起こらない構造とす

全で有効性の高い経皮免疫療法の開発をめざる。 これを皮膚に貼付すると、 表面の蛋白質はす。 とくに、 食物アレルギーの中で最も頻度の濃縮されて皮膚に対して大きな濃度勾配を有す高い鶏卵アレルギーを対象とする。

るがゆえに抗原が皮膚内へ拡散し薬効を発揮

皮膚はランゲルハンス細胞など免疫細胞が豊する。 親水性ゲルによる皮膚表面湿潤効果 （い富で、 適切に抗原投与を行えば、 効率的に耐わゆるＯＤＴ効果） もアレルゲンなどの内部拡散性誘導できる可能性をもつ臓器である。 これまを助長する。 このコンセプトを実現するために、で、 いくつかのパイロット研究が行われ、 その皮膚安全性試験 （皮膚一次刺激性試験、 皮膚臨床的有効性も示唆されているところであるが、感作性試験、 細胞毒性試験） により皮膚安全エビデンスは未だ十分ではない。 さらに、 免疫性が既に確認された親水性アクリル粘着剤誘導物質 （本研究では、 卵白抗原） を安定しHiPAS10 （コスメディ製薬開発） を用いた。 さらて 皮 内 に 到 達 さ せ る Drug Deliveryに、 皮膚に一定の時間安定に貼付するためにSystem(DDS) も重要である。 大阪大学とコスメは保護粘着テープとして、 可塑剤として乳酸オディ製薬はいくつかの DDS を開発して、 化粧クチルドデシルを含有する架橋型アクリル粘着品では実用化、 ワクチンでも有効性 ・ 安全性の剤が支持体上に塗布されたテープを作成した。

実証をしている 2-4)。 本研究では、 このデバイ臨床研究に供したデバイスにおける保護粘着テスを用いて、 重症鶏卵アレルギーに対する経皮ープの粘着力は日本薬局方収載の粘着力試験− 23 −

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究（除外基準）

法 ( プローブタック法 ) で測定した。

1) 大豆と牛乳アレルギーの両方がある者。
２） 鶏卵アレルゲン装填親水性ゲルパッチの作

2) 鶏卵の対象食品に対する摂取状況 （食事内成と安定性試験容） が直近の 3 ヵ月間に大きく変化している者。

アレルゲン装填親水性ゲルパッチ （hydrogel3) 心疾患、肝疾患、腎疾患などの既往歴があり、patch:HG） は、 蒸留水 (distilled water; DW)

現在治療中の者。に オ ボ ム コ イ ド (ovomucoid; OVM, Sigma-4) 気管支喘息、 アトピー性皮膚炎があり、 現在

Aldrich, St Louis, MO) 或いはオボアルブミン

コントロール不良の者(ovalubumin; OVA,J. K. International, Tokyo,（試験方法） 二重盲検プラセボ対照平行群間ラJapan) 並びに各種アジュバントを無菌条件下でンダム化比較試験

HG に滴下し、 室温乾燥することで調製した。

同意取得後、 鶏卵の 2 重盲検食物負荷試験

OVM 装填 HG (1 mg あるいは 0.1 mg OVM)

（D o u b l e - b l i n d p l a c e b o - c o n t r o l l e d f o o dの貼付面をタンパク低吸着性の離型紙で覆い、

challenge:DBPCFC） で低閾値 （最終摂取量が遮光 ・ 防湿のためアルミラミネートパックに入れ加熱全卵 2g 以下で誘発症状） であることが確て密封した。 4℃で保管し、2 週、1 ヵ月、2 ヵ月、認された後に、 1. プラセボ群、 2. OM パッチ群

3 ヵ月後に HG からの OVM 溶出率を測定した。に無作為化割付を行う。 1 日 12 時間を連日貼溶出試験は、 離型紙を剥がした貼付面を下に付し、 24 週間継続する。 まず、 低濃度 OM パ

して HG を PBS 500 μL/well の入ったタンパク

ッチ （OM パッチ 0.1mg） にて治療開始後 2 週

低吸着性 24 穴プレート (MD24 with LID Low

間後に外来受診、 貼付による症状が安定してcell binding; Thermo Fisher Scientific, Waltham,

いれば、 高濃度のパッチ （OM パッチ 1） へ変

MA) に浮かべ、 1 時間、 34℃、 200 rpm で振と更し、 試験を継続する。 最初の貼付の際、 貼うした後、 溶液中の OVM を Coomassie Protein

付後 1 時間、 観察し、 全身症状がないことを確

Assay Reagent (Thermo Fisher Scientific) を用認する。 計 24 週間、 貼付を継続後に、 再度いて定量した。

鶏卵の DBPCFC を行い、 閾値の変化を検討する。 また、 経皮感作を防ぐため、 貼付部位の湿３） 重症鶏卵アレルギー患者に対する経皮免疫

疹はステロイド外用薬と保湿剤により完全にコン療法の臨床試験トロールした。

（試験組み入れ基準）
1) 同意取得時に 4 歳以上 15 歳以下の男女。

（ランダム化割り付け）

2) 鶏卵アレルギーを持つ者。

研究参加者は、 2 次登録後にデータセンター

3) 鶏卵アレルギーの寛解傾向がない者。

にて、 以下を治療群と対照群におよそ 1 ： 1 の4) 経口負荷試験による閾値が加熱全卵 2g 以比でランダムに割付けた。

下の者。

（主要評価項目）− 24 −

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究1）治療開始 24 週後の負荷試験閾値の変化（治所属リンパ節 ( 上腕リンパ節、 腋下リンパ節、療前閾値からの変化量）

鼠蹊リンパ節 ) を回収し、 staining buffer (0.5%2） 安全性 （局所反応および全身の即時型アレFBS、 0.05% NaN3 を含む PBS) を用いて細胞懸ルギー反応、 その他）濁液を作製した。 Rat anti mouse CD16/CD32（副次評価項目）

blocks-Fc binding を添加し、 氷上で 30 分間イ1) プリックテストの膨疹径 2) 卵白 / オボムコイン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後、 APC labelled pro5

ド特異的 IgE 抗体、 IgG4 抗体の変化、 好塩基

MHC pentamer H-2kb SIINFEKL (Proimmune,球活性化試験の変化

Ltd., Oxford, UK) 添加し、 室温で 30 分間反応
さ せ た。 FITC Rat anti-mouse CD8 (clone４） 鶏卵アレルゲン装填親水性ゲルパッチの免KT15, MBL)、 PE-C ｙ 5 Rat anti mouse CD19

疫誘導効果とアジュバント探索 （動物モデル）(clone 6D5, Proimmune)、 LIVE/DEAD Fixable1） マウスの経皮免疫

Aqua Dead cell Stain (Thermo Fisher Scientific)

ア レ ル ゲ ン 経 皮 免 疫 (epicutaneousを添加し、 氷上で 30 分間インキュベーションしimmunization; EPI) は、 BALB/c マウスの除毛た。 染 色 後、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー (Gallios;

背部皮膚に、 OVM (1 mg) 装填 HG を 24 時間Beckman Coulter) とデータ解析ソフト (Flowjo;貼付した。 対照群には背部に OVM 溶液 (100TOMY DIGITAL BIOLOGY) を用いて解析を行μg/100 μL) を 皮 下 注 射 (subcutaneousった。

immunization; SCI) した。 これらの免疫操作は 1週間隔で 4 回行い、 経時的にマウスの眼窩静結果と考察脈叢から採血して血清を得た。 アジュバント探１） 抗原を効果的に経皮送達できる親水性ゲル

索 に お い て は、 マ ウ ス 除 毛 背 部 皮 膚 にパッチデバイスの確立と臨床研究のためのパッOVA(100 μ g) と各種アジュバントの混合溶液をチ製造装填した HG 貼付を 2 週間隔で 3 回行い、 経臨床試験および動物実験に使用可能なパッチ

時的にこれらのマウスにおける眼窩静脈叢からを以下の仕様で作成した。 （Fig.1）

血液を採取することで、 血清を得た。 使用した

親水性ゲルシート ： 面積 1cm2 の円形

ア ジ ュ バ ン ト は Pam3CSK4 20 μg/ パ ッ チ、

親水性ゲル ： 可塑剤として乳酸オクチルドデシ

LTA-SA 100 μg/ パッチ、 Poly I:C 50 μg/ パ

ルとグリセリンを含有する架橋型アクリル粘着剤

ッチ、 Imiquimod 100 μg/ パッチ、 K3(CpG-が支持体上に塗布されたシート 厚さ ： 160 ～ODN) 20 μg/ パッチである。

190 μm2） 免疫学的評価

支持体 ： ポリエステルフィルム、 厚み 26 μm、血清中アレルゲン特異的抗体価 （IgE, IgG）

色調白色

は enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

保護粘着テープ ： 直径 30mm の円形、 可塑剤によって測定した。 K3 を併用免疫したマウスのとして乳酸オクチルドデシルを含有する架橋型− 25 −

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究

アクリル粘着剤を支持体上に塗布、 厚さ ： 50

おそらく HG 表面に HG 構成成分であるグリセ～ 60 μm

リンが溶出し、 これが OVM とともに離型紙側へプローブタック値 ： 2.3 Nと吸着していることが原因と考えられる。 今後、グリセリンの代替となる湿潤剤を構成基剤としたHG を使用するなど、 HG の構成成分を最適化する予定である。

Fig.1 Hydrogel (HG) patch３） 重症鶏卵アレルギー患者に対する経皮免疫２） 鶏卵アレルゲン装填親水性ゲルパッチの作療法の臨床試験

成と安定性試験（試験登録患者）

アレルゲン装填 HG の製剤安定性 ・ 長期保

平成 28 年 7 月 4 日より試験を開始、 平成 29

存性を保証するため、 アレルゲン装填 HG を冷年 4 月 30 日までの 10 ヶ月間に、 組み入れ基蔵保管し定期的にアレルゲン溶出量を測定し準 1),2),3) を満たした患者 37 名 ( 男児 26 名、た。 OVM (1 mg 及び 0.1 mg) 装填 HG におい

女児 11 名、 平均年齢 6.8 歳 ) が一次登録さては、 保管一か月まで安定的に保存できることれた。 そのうち、 DBPCFC にて組み入れ基準が示されたが、 保管一か月以降 OVM (1 mg)

3) を満たした患者は 22 名 ( 男児 16 名、 女児

装填 HG において、 OVM 溶出率が徐々に低6 名、 平均年齢 6.4 歳 ) で、 試験治療または下するとともに、 離型紙側への OVM 吸着が認プラセボがランダムに割り付けられた。 組み入められた。 つまり OVM 装填 HG においては一れされなかった患者は 15 名 ( 男児 10 名、 女か月以上の長期保管が難しいことが明らかとな

児 5 名、 平 均 年 齢 7.6 歳 ) で、 内 訳 はった (Fig. 2)。

DBPCFC 陰性 11 名、DBPCFC 完遂できず 1 名、試験継続希望せず 3 名であった。
（試験経過）
割り付けられた 22 名は順調に試験を継続して、 平成 29 年 9 月 30 日時点で 24 週間の治療を終了し、 2 回目の DBPCFC を完了した者
は 20 名で、 平成 29 年度の研究計画による長期試験参加に同意され、 長期試験 （実薬貼付または経口摂取） に移行した。 残り 2 名は試験継続中である。
長期試験を行うため、 キーオープンは行っていないので、 主要評価項目、 副次評価項目のデータは未だ得られていないが、 24 週を終了し− 26 −

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究

た 20 名のうち、 5 名は負荷試験における閾値とから、 OVM 特異的 IgE 抗体産生が誘導されが加熱全卵 2g を超えて経口摂取に移行した（経にくい可能性が示唆された (Fig. 3C)。 したがっ口摂取群）。 15 名は全員が実薬で、 低濃度て、 HG 製剤は装填アレルゲン特異的な免疫応OM パッチ（OM パッチ 0.1mg）を 2 週間貼付後、答を誘導するとともに、 SCI と比較して EPI は特高濃度のパッチ （OM パッチ 1） を継続した （ラ異的 IgE 抗体産生の急激な誘導が起こりにくい

ンダム化比較試験でプラセボパッチであった例ことが明らかとなった。

は 24 週貼付群、 OM パッチであった例は 48 週貼付群となり、 これら 2 群を比較する）。 平成
28 年 9 月 30 日までに 5 名が 48 週の貼付を終了し、 うち 3 名が加熱全卵 2g の閾値を超えた。
（安全性）
貼付局所の発赤が認められた例があったが、局所以外の反応や重篤な有害事象は認められなかった。
長期試験は平成 30 年 3 月末日で全例で完了予定であり、 その後、 キーオープンと解析を行い、 次年度にプラセボ対照試験ならびに長期試験の結果を報告予定とする。

４） アレルゲン装填 HG の貼付に伴う免疫誘導効果
1) 抗体産生

2) アジュバントの探索

OVM 装填 HG は、 patch 法により EPI するだ

HG において適用可能なアジュバントをマウス

けで SCI 群と同様に免疫回数に依存した血清2 系統にてスクリーニングした。 OVA とアジュバ

中 OVM 特異的 IgG が観察された (Fig. 3A)。

ントを装填した HG を用いて経皮免疫をしたとこ

また SCI 群において、 免疫三回後に OVM 特ろ、 OVA 特異的 IgG 抗体産生はすべてのアジ異的 IgE 抗体価が急激に上昇した一方、 EPI

ュバント併用群において OVA 単独群よりも高い群においては特異的 IgG 抗体価の上昇に伴い抗体価を示した (Fig. 4A)。

緩やかな特異的 IgE 抗体価の上昇が観察され

IgG サブクラス解析において、 OVA 単独群はた (Fig. 3B)。 そこで、 OVM 特異的 IgE と IgG

IgG1 抗体のみが検出されるのに対し、 K3 にお抗体価を比率で表したところ、 SCI 群は一過性

いては両系統とも IgG ２ｃあるいは IgG ２a の高に IgE 抗 体 の 比 率 が 上 昇 し て い る の に 対 し、い抗体価を示したことから Th1 型免疫応答を誘EPI 群においては常に一定の比を示しているこ導していると考えられる (Fig. 4B)。 他のアジュ− 27 −

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究

バント併用群である Poly I:C や Imiquimod にお以上の結果より、 K3 および Poly I:C が HG にいても IgG ２a の抗体産生が認められたが優位適用可能なアジュバントとして有望であり、 免疫な差は認められなかった。 さらに IgG 抗体価と増強効果や Th1 偏向性のみならず、 OVA 特同様に IgE 抗体価の測定を行ったところ、Poly I：異的な IgE 依存性アレルギー反応は誘発されC および K3 において OVA 特異的 IgE 抗体産にくいと考えられるこから、 HG を用いたアレル生は OVA 単独群と変わらなかった (Fig. 4C)。

ゲン免疫療法において、 適当なアジュバントに− 28 −

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究

さらに K3 の活性機序を精査するため、 OVAなる可能性が見いだされた。

および K3 装填 HG を用いて WT (C57BL/6) あ3) K3 アジュバントの免疫活性

るいは TLR9KO マウスの背部皮膚に経皮免疫K3 における HG 上での存在状態を凍結切片し た。 WT に お い て は K3 を 併 用 す る こ と で、にて確認した。 蛍光顕微鏡で観察したところ、OVA 単独群よりも優れた免疫応答が誘導された

K3 は、 抗原同様に HG 表面に高度に濃縮され一 方、 TLR9KO で は K3 併 用 の 有 無 で OVAた状態を保っていることが明らかとなった (Fig.

特異的抗体価に変化は認められなかった (Fig.

5A)。

5B)。
以上の結果より、 K3 は TLR9 を介したアジュバント活性を行っていることが明らかとなった。
また IgG サブクラス解析により K3 併用群が Th1型優位の免疫応答であることから、 OVA 特異的 CD8 陽性 T 細胞をフローサイトメーターにて解 析 し、 細 胞 性 免 疫 の 誘 導 有 無 を 評 価 し た(Fig. 5C)。 しかしながら K3 併用群において、OVA 特異的 CD8 陽性 T 細胞は検出できなかったことから、 他の機序も検討する予定である。

今後の研究活動について
本研究では重症鶏卵アレルギー患者への経皮免疫療法を確立するために、 １） 経皮免疫デバイスの作製 ２） 探索的ランダム化比較臨
床試験 ３） 新デバイスによる経皮免疫の動物モデルでの評価を行い、 鶏卵主要抗原オボムコイドを装着した親水性ゲルパッチを実用化し、臨床試験を開始、 またマウスでの免疫原性を詳細に明らかにした。 現在、 臨床試験は継続中であり、 さらに長期試験も実施中である。
引き続く研究の予定は以下の通りである。

１） 親水性ゲルパッチの大量生産体制の確立
現在は手作業での作製であるが、 今後のさらなる実用化のため、 製造の自動化を行う。 （平− 29 −

重症鶏卵アレルギーに対する経皮免疫療法の有効性と安全性に関する研究

物アレルギー診療ガイドライン )成 29 年 7 月に製造体制を完成した。）

2) Matsuo K, Ishii Y, Quan YS, Kamiyama F,２） 長期臨床試験の完遂
平成 29 年 4 月末日にランダム化比較臨床試

Asada H, Mukai Y, Okada N, Nakagawa S.

験組み入れを終了して、 長期の治療の有効性

Compositional optimization and safetyを評価するため、 実薬を用いたオープンラベル

assessment of a hydrogel patch as aの長期試験を行っているところである。

transcutaneous immunization device. Biol３） 食物アレルギーモデル動物の治療実験

Pharm Bull 2011; 34: 1835-1840. （ハイドロゲルパッチの基礎的検討）

食物アレルギーの動物モデルを作製して、 経3) Matsuo K, Ishii Y, Quan YS, Kamiyama F,

皮免疫療法の有効性と免疫学的奏効メカニズムを探索する。

Mukai Y, Okada N, Nakagawa S.

４） 医師主導治験の準備

Characterization of transcutaneous protein

実用化を目指して、 医師主導治験体制整備

delivery by a hydrogel patch in animal,を行う。 上記 3) を含み、 治療薬の GLP 基準非human, and tissue-engineered skin models.

臨床試験を行い、 PMDA の対面相談までの準Biol Pharm Bull 2011; 34: 586-589. （ハイドロ備を行う。

ゲルパッチの基礎的検討）
4) M atsuo K, Ishii Y, Kawai Y, Saiba Y, Quan

参考文献

YS, Kamiyama F, Hirobe S, Okada N,1) E bisawa M, Ito K, Fujisawa T, Committee for

Nakagawa S. Analysis of transcutaneousJapanese Pediatric Guideline for Food Allergy

antigenic protein delivery by a hydrogelTJSoPA, Clinical Immunology TJSoA.

patch formulation. J Pharm Sci 2013; 102:

Japanese guidelines for food allergy 2017.

1936-1947. （ハイドロゲルパッチの基礎的検Allergol Int 2017; 66: 248-264. ( わが国の食討）− 30 −