特集

検出技術：天然変性タンパク質の構造生物学
小田
天然変性タンパク質とは隆 1*・齋尾智英 2性タンパク質は決まった構造をとらないのだから構造を解析することは意味のないようにも思われるかもしれな

Anfinsen がリボヌクレアーゼの自発的な折れ畳まりをい．しかし，実際には折れ畳まったタンパク質ほど安定発見して以来，長い間，タンパク質はポリペプチド鎖がではないものの，何かしらとりやすい構造（動的な構造）一定の立体構造に折れ畳まることで機能すると信じられをとることで天然変性タンパク質は機能しているはずでてきた．しかし，Wright らの論文 1) に代表されるように，ある．そのような柔らかな構造は従来の結晶構造解析や，2000 年頃から生理的条件下で一定の構造に折れ畳まっていないタンパク質：天然変性タンパク質（Intrinsicallydisordered protein：IDP）にも重要な機能があることが知近年発展の目覚ましいクライオ電子顕微鏡法においてもられるようになり，タンパク質研究に大きなパラダイム

子小角散乱法（SAXS/SANS），NMR，高速原子間力顕シフトをもたらした．天然変性タンパク質は特に真核生微鏡法（HS-AFM）について紹介し，LLPS 研究への応物の核内タンパク質に多いとされる．これらのタンパク用の可能性について議論する．

質の多くは分子全体が天然変性状態なのではなく，複数の折れ畳まったドメインが天然変性領域でつながれたマ解析困難である．本稿では天然変性タンパク質の柔らかい構造を解析する手法として期待される X 線および中性X 線小角散乱法（Small angle X-ray scattering：SAXS）（または領域）は構造の柔軟性により複数のパートナーSAXS は試料（ここではタンパク質や核酸の水溶液）に X 線を照射し，散乱 X 線の角度分布（I(q)）から試料に対して自身の形を変えて相互作用し，細胞内シグナル中の散乱体（タンパク質や核酸分子）の構造情報を得る伝達のハブとして機能するものも多い．天然変性タンパ手法である．SAXS では散乱体の慣性半径（Rg）や最大

ク質には偏ったアミノ酸組成や繰り返し配列を持つもの

長（Dmax）な ど の 構 造 パ ラ メ ー タ ー が 得 ら れ る ほ か，も多く，それらは低複雑性タンパク質（Low complexity：Kratky plotによりそのタンパク質が折れ畳まっているか，LC）とも呼ばれる．特に，液−液相分離（Liquid-liquid
phase separation：LLPS）では，LC による多価の相互作変性状態であるかを定性的に知ることができる．

用が相分離に深く関わるとされている．天然変性タンパ

ように大きく揺らいだ構造であっても，水溶液中での構造ク質の相互作用様式としてもっともよく知られるのは，情報を得ることができる．SAXS データ（I(q)）をもとにルチドメインタンパク質である．天然変性タンパク質

X 線結晶構造解析とは異なり，天然変性タンパク質の結合とカップルした折れ畳まり（Coupled folding andbinding）で，折れ畳まったドメインに天然変性タンパク質が結合すると，天然変性タンパク質が構造を形成するというもので，転写因子 CREB タンパク質のリン酸化型キナーゼ誘導性ドメイン（Phosphorylated kinase inducible
activation domain：pKID）と CREB 結合タンパク質の KIXドメイン（KID binding domain）の例などがよく知られる 2)．しかし，構造形成するのは全長タンパク質のうち一部の領域であり，分子全体としては揺らぎを保ったままである．また近年では，天然変性タンパク質同士が，固い構造を形成することなく，強固な結合をする例も報告されている 3)．つまり，天然変性タンパク質がすべて，相互作用により固い構造を形成するのであれば，結晶構造解析のような従来の手法でも解析できるが，むしろそうでない場合も多いのである．このように書くと天然変
著者紹介

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図 1．天然変性領域を持つマルチドメインタンパク質の SAXS
解析．溶液中でのさまざまな構造に由来する散乱曲線の平均が実測データとして観測される．EOM などのアンサンブル解
析法では各モデル構造から散乱曲線を計算し，実測データを再現できるモデルの組合せと存在比比率を探索する．

立教大学理学部生命理学科（助教） E-mail: takashi506@rikkyo.ac.jp
北海道大学大学院理学研究院化学部門（助教）

生物工学

第98巻第5号（2020）

相分離生物学：相分離メガネのススメ
天然変性タンパク質の揺らいだ構造を解析する手法としてを変えたりすることでタンパク質や核酸からの散乱と溶は Ensemble optimization method（EOM） や BILBOMD ，媒からの散乱のコントラストを自由に変えることが可能

MultiFoXS7) などがある．詳細は異なるものの，これらである（図 2）．SAXS の項では説明しなかったが，試料の手法では，天然変性領域のモデル構造をランダムに多水溶液からの散乱には目的タンパク質からの散乱と溶媒数作製し，その中から実測の散乱データを再現できるよからの散乱が含まれており，別に測定した溶媒のみの散うな少数の構造の組合せ（アンサンブル）を探索する．

乱を差し引くことで標的タンパク質からの散乱を得てい図 1 に示す例は二つの折れ畳まったドメインが天然変性る．図 2B に示す，40 ％ D2O の溶媒中では，軽水素体領域でつながれたタンパク質である．MultiFoXS 解析でタンパク質からの散乱と溶媒からの散乱のコントラスト

は，二つのドメインが接近した構造が高い存在比で得らが 0 になるため，差し引き後には重水素化タンパク質か

4,5)6)れドメイン同士が相互作用して機能していることが予測

らの散乱のみが残る．つまり特定のサブユニットを不可される．このように動的な構造であっても取り得る構造に視化でき，解釈の任意性を減らすことが可能である．こある程度の偏りがあれば検出することができ有効である．の方法はコントラスト同調法と呼ばれ，タンパク質−タ

しかし，SAXS とこれらの解析手法には問題点もある．

ンパク質複合体のほか，タンパク質− DNA 複合体の解一つは分解能の低さである．SAXS で得られる構造情報析などにも利用されている 9,10)．また，BSA や Ficoll なは分解能が低いことに加えて，これらの解析手法では天どのクラウダー分子をコントラスト変調法で不可視化

然変性タンパク質が取り得る構造を少数の構造アンサンし，目的タンパク質の散乱のみを観測することで，人工ブルで代表させている．そのため，図 1 の例ではドメイクラウディング下での構造を希薄溶液中と比較した報告

ン間の相対配置を推定することはできても相互作用の詳例もあり 11–13)，LLPS 液滴のような高濃度下でのタンパ細を知ることはできない．相互作用や天然変性領域の局ク質の動態解析への応用が期待できる．

所的な構造情報（二次構造）は NMR や分子動力学計算

また，NMR の分野で開発の進められてきたプロテイ（Molecular dynamics：MD）など，他の手法で補える可能

ンライゲーション技術を応用すれば，重水素化したドメ性がある．古典的な MD 計算では天然変性タンパク質のインと重水素化していないドメインを連結し，区分重水非常に大きな構造揺らぎを再現することは困難であった素化したタンパク質を作製することも可能と考えられが，近年では計算手法や計算機の発達により，徐々に解る．このタンパク質を用いれば天然変性領域を持つマル決しつつある．たとえば，粗視化 MD 計算ではアミノ酸チドメインタンパク質であっても，着目する部分からの1 残基を 1 粒子として計算することで計算コストを大幅に低減し，マイクロ秒からミリ秒という長いスケールでの大規模な構造揺らぎを再現することが可能となり，SAXS と合わせた解析例も報告されている 8)．もう一つの問題は解釈の任意性である．SAXS ではすべてのドメイン，天然変性領域からの散乱がたった一つの散乱曲線に集約されて観測される．特に複数のタンパク質や核酸からなる複合体では解釈の任意性が高いため，複合体全体が，コンパクトか？伸びた構造か？という大雑把な解釈はできるものの，個々のサブユニットの詳細な構造を議論することは難しい．これを解決する手法として次項に示す中性子小角散乱法があげられる．
中性子小角散乱法（Small angle neutron scattering：SANS）

SANS の原理は SAXS とよく似ているが，X 線ではなく中性子を用いる．X 線との最大の違いは，軽水素（H）と重水素（D）で中性子の散乱能（散乱長密度）が大きく異なることである．そのため，標的タンパク質や核酸を重水素化したり，溶媒中の重水（D2O）/ 軽水（H2O）比
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第5号（2020）

図 2．SANS におけるタンパク質，DNA と溶媒の散乱長密度．
A）溶質の散乱長密度（棒グラフ）と溶媒（D2O/H2O 混合物）の散乱長密度（横線）．溶質と溶媒の差分がその条件でのコントラストとなる．B）タンパク質と溶媒のコントラストの模式図．
折れ畳まったタンパク質（楕円）と天然変性タンパク質（ひも）の複合体を例に図示する．タンパク質と溶媒の散乱長密度を色の濃淡で表す．40 ％ D2O 溶媒中では 0 ％重水素化タンパク質が不可視化される（コントラスト同調）．100 ％ D2O 溶媒中
では 75 ％重水素化タンパク質が不可視化される（逆転コントラスト同調）．

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特集

散乱を取得することができ，解釈の任意性を減らし，全られる SAXS，SANS，NMR とは異なり，実空間で一長タンパク質の揺らいだ構造を解析することができるはつひとつの分子の構造を直接観察できるという利点もあずである．現在，筆者らのグループではそのような手法る．そのため，天然変性領域を持ったマルチドメインタの開発を進めている．

17)，ンパク質の構造の観察にも利用されており（図 3）

SANS はビームの強度が弱く，精度の高いデータを得るためには SAXS と比べて高濃度のサンプルを大量に必LC タンパク質の構造的特徴の検出にも利用できると期待される．また，ごく最近 LLPS 液滴の観察例も報告さ要とすることが最大の欠点であった．しかし，近年では

れ 18)，この分野での応用が期待される．

中性子ビームの大強度化が図られ，徐々に改善しつつある．SANS データの精度を低下させる非干渉性散乱についても解決の手法が開発されている．軽水素は重水素と核磁気共鳴法（Nuclear magnetic resonance：NMR）比べてはるかに大きな非干渉性散乱を起こすが，非干渉溶液中の分子を原子分解能で観測することができる溶性散乱は構造情報を与えず，バックグラウンドノイズと液 NMR 法は，運動性が高い分子の観測に優れ，実際になる．通常のコントラスト同調法では 40 ％ D2O 溶媒で多くの天然変性タンパク質の構造解析や相互作用解析に実験を行うため，60 ％の H2O 由来の非干渉性散乱が大き適用されている．タンパク質の NMR においては，1H 核

では，に加え，15N や 13C などの安定同位体によって観測対象75 ％重水素化したタンパク質と重水素化していないタンパク質の複合体を調製し，100 ％ D2O 溶媒中で SANS 測定を行う．この条件では 75 ％重水素化タンパク質が不可となるタンパク質を標識することによって，多次元NMR スペクトル利用した高分解能な観測が可能になる．NMR 観測においては，安定同位体標識パターンや視化され，重水素化していないタンパク質のみ観測でき測定方法などを適切に設定することによって，タンパク（図 2B 右），しかも 100 ％ D2O 溶媒中であるため非干渉性質の特定の部位を選択的に観測することが可能であり，散乱によるノイズを大きく低減させることが期待できる．

アミノ酸残基レベルでの相互作用解析やダイナミクス解い．近年開発された逆転コントラスト同調法

14)

高速原子間力顕微鏡法（High speed atomic force microscopy：HS-AFM）

HS-AFM は基板上に 緩く 固定化したタンパク質分析，さらには原子分解能での立体構造解析も可能である．
以下に，NMR を用いた解析の特徴について，特に，1．
相互作用解析，2．立体構造解析，3．ダイナミクス解析，出することでタンパク質分子の形状を観察できる．固定

4．夾雑環境下の観測，について簡単に紹介する．
1．相互作用解析
安定同位体標識されたタンパク
質の NMR スペクトルをリガンドの滴下前後で測定し，化という制限はあるものの，一度目的タンパク質を基盤リガンドとの結合に伴う信号の変化を評価することで，上に固定化してしまえば，観察自体は水溶液中で行うこリガンドの結合部位についての情報を得ることがでとができ，基質やリガンドを加えたり溶液条件を変化さきる．NMR 相互作用解析においてもっとも多く用いせたりしてタンパク質の構造変化をミリ秒から秒程度のられるのが，2 次元 1H-15N HSQC（heteronuclear single

時間分解能で観察できる．つまりタンパク質が構造を変quantum correlation）スペクトルである．ここではタン化させながら機能している様子をリアルタイムで観察でパク質のアミド基の信号を観測し．残基レベルで相互作きるという大きな利点がある．この利点を利用し，ミオ用を解析する（図 4）．このような解析は，変性タンパク子を探針でなぞり，試料と探針の間に働く原子間力を検シ ン が ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト に 沿 っ て 歩 く 様 子 や，

CRISPER-Cas9 による DNA の切断の様子などが観察されている 15,16)．また，多数の分子の平均の構造情報が得

図 3．HS-AFM による天然変性タンパク質の観察．二つの折れ畳まったドメインが天然変性領域でつながれたタンパク質の観察例を示す．二つのドメインの相対位置が時間とともに変化している様子が見える．

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図 4．NMR による変性タンパク質の解析

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質とシャペロンの相互作用の解析 19,20) や，Yoshizawa ら体標識による選択的観測は有効であると予想される．

が報告した LC タンパク質と LLPS 制御因子の相互作用

おわりに解析 21) にも適用されている．

2．立体構造解析

天然変性タンパク質であっても，従来，固い立体構造（静的構造）に基づいて考えられその立体構造は完全にランダムではなく，一過的にあるてきたタンパク質の機能は，天然変性タンパク質に代表特定の高次構造をとったマイナー状態が存在する場合もされるように動的構造と結びつけて理解されるように多い．このようなマイナー状態や構造多型，その状態間なってきた．柔らかい構造から機能を理解することは依の存在比の調節がタンパク質の機能制御に重要である場然として困難な課題であるが，本稿で紹介した各手法を合も多い ．NMR は，このような動的な立体構造の解析相補的に利用し発展させることで，天然変性タンパク質22)に優れたツールである．特に，常磁性効果を用いた NMRが機能している様子を捉えることができると期待されによって，変性タンパク質の構造多型のそれぞれの立体る．また，LLPS においては天然変性タンパク質の構造構造を明らかにするアンサンブル解析法が提案されていの柔らかさに加えて，高濃度下での多数の分子間の弱い．従来の NMR 立体構造解析では，原子核間距離な相互作用などさらなる問題が考えられる．相分離というる

23)

どの束縛情報に基づいて，1 種の立体構造を仮定して構状態 が機能とどのように結びついているかを解明す造決定を行うが，柔軟で動的な立体構造を持つ天然変性るためには，これらの手法のさらなる発展が必要である．

タンパク質への適用は困難である．アンサンブル構造解謝析法は，水溶液中でさまざまな状態をとる天然変性タンパ
ク質の 真の姿 を捉えるうえで有効な手法である．前述の SAXS データと組み合わせた解析もなされている ．
23)

3．ダイナミクス解析

NMR 緩和解析によって，天然変性タンパク質の運動性を残基レベルで解析することが可能である．このような解析は，特に LLPS 液滴中の LC

本稿執筆にあたり，HS-AFM 画像を提供いただいた金沢大学古寺哲幸教授，安藤敏夫教授，九州大学石野園子准教授，石野良純教授および中性子小角散乱解析について情報提供いた
だいた京都大学複合原子力科学研究所井上倫太郎准教授，杉山正明教授，横浜市立大学佐藤衛教授にお礼を申し上げます．

文

タンパク質の状態を評価するうえでも有効である 24,25)．

RNA 結合タンパク質である FUS（fused in sarcoma）はLC ドメインにより液滴を形成することが知られている
が，LC ドメインを対象とした NMR 緩和解析によって，LLPS 液滴中の LC ドメインが disorder の状態であることが報告されている 24,25)．一方で，溶液 NMR では，運動性が高い分子が優先的に観測されるという特性のため，多量体を形成した分子は検出されにくいという問題もある．特に LLPS 液滴については，LC ドメインの多量体形成の報告もあるため 26)，液滴中の分子の観測においては，手法開発も含めたさらなる検証が必要である．

4．夾雑環境下での観測

NMR では，安定同位体標識したタンパク質から信号を選択的に取得することで，夾雑環境下であっても特定の分子を選択的に観測することが可能である．この特性は，クラウディング環境下や細胞内のタンパク質の直接観測 27) だけではなく，LLPS液滴中の分子の観測においても有益である．LLPS 液滴中のタンパク質の立体構造解析においては，これまでは単一のタンパク質によって形成された LLPS 液滴を対象とした研究がほとんどであったが，実際の細胞内でのLLPS は，複数のタンパク質や核酸などが取り込まれた複雑な環境である．今後，このように複数の分子によって形成される LLPS 液滴を解析するうえでも，安定同位
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辞

1)
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3)
4)
5)
6)
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8)
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15)
16)
17)
18)
19)
20)
21)
22)
23)
24)
25)
26)
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