フジタ技術研究報告第４５号 200９年

モエジマシダのヒ素吸収特性-放射光マイクロ蛍光Ｘ線分析を用いた As 動態の可視化北島

概信行

要

ファイトレメディエーションは、植物を用いて環境汚染を低減・除去する技術である。イノモトソウ科のシダ植物である
モエジマシダ（ Pteris vittata L. ）は、その地上部に As を高濃度で蓄積できる能力を有しており、実際の汚染サイトを対象とした浄化に利用され始めている。
毒性重金属元素である As を高濃度に蓄積しながら胞子を形成し、生活環を完結しうるモエジマシダの高集積能は、きわめて特異的なものであり、それを可能としている機構には未解明の点が多い。筆者の参加する研究グループでは、非破壊分析法としての蛍光 X 線分析を主な研究手法として用いており、放射光マイクロビームを用いた蛍光 X 線イメージングと蛍光 XANES 測定を行っている。この手法を用いることで、植物体内の元素分析と化学状態の評価が位置情報を伴った形で可能となる。ここでは、放射光を X 線源としたマイクロ蛍光 X 線分析によって、As 高集積植物であるモエジマシダの主たる As 蓄積部位である地上部羽片での As 分布と As の価数を調査した結果について報告する。

Measurement of arsenic distribution in a frond of a hyperaccumulator fern
Using SR-XRF analysis
Abstract
Phytoremediation, the technology using plants to reduce or remove pollutants fromenvironment, is attractive because of its low cost and low environmental impact. Pteris
vittata L. is a well known arsenic hyperaccumulating fern. The fern is a strong candidate foruse in commercial phytoremediation and has already been used to clean up a number ofarsenic-contaminated sites.
It is peculiar that P. vittata can complete its lifecycle despite hyperaccumulating arsenic, atoxic heavy metal, in its plant body. To reveal the mechanism of hyperaccumulation, eachprocess of metal accumulation must be understood as a continuous flow of the element
between the plant tissues and/or individual cells. For this purpose, synchrotron radiation Xray fluorescence analysis is very useful. This report shows the distribution of arsenic infronds of P. vittata examined by SR-XRF imaging, and the valence change in a plant body
revealed by the As-K edge μ-XANES spectra.

キーワード：モエジマシダ ヒ素 ファイトレメ
デイエーション 放射光蛍光 X
線分析－7－フジタ技術研究報告 第 45 号

§１．はじめに

なお、本研究は、東京理科大学中井研究室と共同で実施したものである。また、今回、報告する試験結果は「第12 回地下水・土壌汚染とその防止対策に関する研究集

ファイトレメディエーションは、植物を用いて環境汚染を会」にて発表したものである。

低減･除去する技術である。重金属元素による汚染を対象としたファイトレメディエーションでは、根から吸収され§２．試験方法

た汚染物質が植物体中に蓄積する現象を利用する。すなわち、汚染された土壌、水質で植物を栽培し、重金属を蓄積した植物体を搬出することによって浄化対象の土

2.1 モエジマシダの栽培

壌、水質から重金属を除去する手法である。このときの重実汚染土壌（As の全含有量 480mg/kgDW）を 3 号

金属除去量は、植物体生産量と植物体中の重金属濃度のポリポット（上部直径 9cm）に乾土換算で 250ｇずつ充との積で表される。したがって、ファイトレメディエーション

填し、胞子散布から 6 ヶ月を経過したモエジマシダをポッを効果的に実施するためには、安定した高いバイオマス

ト当たり 1 株植えつけた。汚染土壌に移植した後に 3 週生産量が確保できる栽培植物の中から重金属吸収能の間を経過した株を放射光蛍光 X 線イメージングと蛍光高い品種を選抜して利用するやり方の他に、特定の重金XANES スペクトル測定に供した。
栽培は人工光型ファイトトロン内で行い、照度 5、属を高レベルで吸収・蓄積する能力のある植物種（高集000lux(照明時間 16 時間)、昼温 27.5℃、夜温 22.5℃積植物）を探索して汚染浄化に適用する方法がある。
植物それ自体の持つ吸収・蓄積能力を利用するファイにて管理した。相対湿度は、湿度センサー出力に対応した加湿器によって 70～80％に調整した。

トレメディエーションでは、土壌中重金属のうち移動性が大きい化学形態のものが吸収・除去されるため、汚染拡散リスクの低減に有効であると考えられる。重金属吸収能

2.2 放射光蛍光 X 線イメージングの高い栽培作物を利用する手法では、栽培管理のため放射光をＸ線源とした 2 次元の蛍光 X 線イメージングの体系が確立されており、植物体生産量の予測が立てやは、高エネルギー加速器研究機構（茨城県つくば市）のすいという利点がある。一方、高集積植物の利用についフォトンファクトリー（PF）のビームライン BL－4A にて実ては、その特殊な吸収・蓄積能によって高い効率での汚施した。イメージングでは、対象とした範囲に応じた解像染除去が期待できるが、現状では野生植物であるものが度を選択し、200μm サイズのビームと 5μm 程度のマイ多く、安定した多収量を得るための栽培手法の確立に多クロビームを使い分けて段階的に測定を実施した。すな

大な努力を要する。

わち小羽片全体を対象とした広範囲の測定では 200μm

筆者は、高集積植物が重金属元素を根から吸収し、地×200μm サイズの X 線ビームを使用し、羽片断面にお上部へ移行・蓄積する機構の解明を目的として研究を実ける細胞レベルのイメージングでは 5.5 μm×3.5μm の施している。本研究で対象とした重金属は As で、イノモマイクロビームを用いた。

トソウ属の植物であるモエジマシダ（ Pteris vittata L.）

励起にもちいる X 線は As に対して励起効率の良いがその高集積植物として報告されている 1)。筆者の参加エネルギーに設定し、この X 線を試料に照射して発生しする研究グループでは、非破壊分析法としての蛍光 X 線た蛍光 X 線を Si（Li）半導体検出器を用いて測定した。

分析を主な研究手法として用いており、放射光マイクロビ

200μm×200μm のビームサイズを用いた測定では、中ームを用いた蛍光 X 線イメージングと蛍光 XANES 測軸から切り離した小羽片をアクリル製ホルダーに貼り付け、定を行っている 2、3、4、5、6)。これらの測定によって、植物体ホルダーを X-Y ステージに固定して、パルスモーター制内の元素分析と化学状態の評価が位置情報を伴った形

御によって試料表面を XY 方向に走査した。この測定でで可能となることから、植物組織の構造に対応した生理は株元からの出現順に発達ステージの異なる羽片 4 種機能を理解するうえで、極めて有効な研究手段となる。放類を対象とした。具体的には①古い羽片のうち胞子嚢を射光蛍光 X 線分析によって得られる知見は、植物生理の着生しないもの（Old 胞子なし）、②古い羽片（Old）、③観点から意義深いものであるうえに、実際の浄化サイトに成熟した羽片（Mature）、④新しい羽片（Young）の 4 種おける栽培管理や浄化予測に資するものと考えている。

類である。

ここでは、放射光を X 線源としたマイクロ蛍光 X 線分

5.5 μm×3.5μm サイズのマイクロビームでは、Mature析によって、As 高集積植物であるモエジマシダの主たるの羽片周縁部にある胞子嚢着生部位を測定対象として、As 蓄積部位である地上部羽片での As 分布と As の価スライサー（HS-1 日本分光）を用いて作成した切片（厚数を調査した結果について報告する。

さ約 200μm）をアクリル製ホルダーに貼り付けて、試料断－8－

モエジマシダのヒ素吸収特性-放射光マイクロ蛍光Ｘ線分析を用いた As 動態の可視化-

参照試料のピークトップの値と比較する。本報告で対象と面の走査を行った。

した As については、参照試料として 3 価の As には2 次元で得られた蛍光 X 線強度を、測定範囲中の最強点を赤、最低点を青とした 256 階調のカラースケール

As2O3 を 5 価のものとしては H3AsO4 をそれぞれ用いてに対応させて元素分布の表示画像とした。

X 線吸収スペクトルを測定した結果、スペクトルのピークトップに 4eV 程度の明瞭なケミカルシフトが認められた。

2.3 非破壊分析による As の価数評価

そこで、これらの参照試料と実試料の XANES スペクトルモエジマシダ植物体に含まれる As の価数評価は、PFを比較することによって、試料に含まれる As の価数評価の BL-12C にて As K-edge(11.867keV)の X 線吸収端を行うこととした。

近傍構造（XANES）スペクトルの測定によって行った。各

価数評価に用いた X 線ビームのサイズは約 1mm で元素の X 線吸収スペクトルは、酸化・還元や近接原子のあり、ポットに植えつけたままの状態のモエジマシダをビ影響によって起こる電子構造の変化を反映してシフトを生ームラインの実験ハッチ内に持ち込み、X 線ビームと光じる。価数評価を行う場合には、価数が既知である化合軸を合わせたレーザーポインターによって照射位置を設物を参照試料として X 線吸収スペクトルを測定し、試料定し XANES スペクトルの測定を行った。

から得られたスペクトルにおけるピークのエネルギー値を④ Young

AsKCaKCaKCaK

Ca③ MatureAs② OldAs① Old 胞子なしAs低高規格化強度

図１ 発達ステージの異なる小羽片の 2 次元蛍光 X 線イメージング結果
X 線エネルギー：16.5keV
X 線ビームサイズ：200×200 μm
走査幅：200×200 μm
測定時間：3 秒/ピクセル
測定領域：100×32 ピクセル
各元素の蛍光 X 線強度を規格化し、相対的なカラースケールで表示している。赤は強度が強く、青は低いことを示す。

－9－

フジタ技術研究報告 第 4５号§3．結果および考察に一様に分布していた。
モエジマシダでは、小羽片周縁に沿って胞子嚢が着生

3.1 小羽片の 2 次元蛍光 X 線イメージングする。すなわち、Old、Mature、Young で As の局在が

図１にモエジマシダ小羽片の 2 次元蛍光 X 線イメー

認められた領域は、胞子嚢を含むかあるいはそのごく近ジングの結果を As、K、Ca の各元素について示した。

傍の領域である。しかし、As 汚染土壌で栽培したモエジ

まず、As の分布について、小羽片の発達ステージごとマシダにおいて胞子形成の阻害が認められることはない。にみると、図中①に示した Old 胞子なしでは葉脈に沿そこで、この胞子嚢着生部位に着目し、組織切片横断面って As が分布し特に主脈で高い蛍光 X 線強度が測における As 分布を、X 線マイクロビーム（ビームサイズ定されたのに対して、胞子を着生する Old、小羽片周5.5 μm×3.5μm）によって測定した。
図 2 にそのイメージング結果を示した。図中（b）にみら縁部に As の濃集が認められた。
これらの結果から、As は小羽片の組織全体に一様にれるように As は胞子嚢基部に相当する領域に特に高濃分布するのではなく局在していることが明らかになり、度で蓄積されていることが明らかとなった。また、K、CaAs の濃集する領域が小羽片の発達ステージに応じてといった必須栄養元素が胞子嚢にも分布している（図中異なることが判った。また、K、Ca の必須栄養元素では(c)、（d））のに対して、As では胞子嚢への移行が強く抑Old 胞子なし、Old、Mature で葉脈に沿った分布が制されているという極めて興味深い結果が得られた。

認められたのに対して、Young では少羽片の組織全体

偽包膜

胞子嚢
側糸羽片葉肉組織(a) 胞子嚢周辺の顕微鏡写真(b) As

黄色の枠はイメージングを行った領域を示す。

(c) K(d) Ca

図 2 マイクロ X 線ビームを用いた、胞子嚢周縁部の 2 次元蛍光 X 線イメージング
X 線エネルギー：16.5keV
X 線ビームサイズ：3.5×5.5 μm
走査幅：3.5×5.5 μm
測定時間：1 秒/ピクセル
測定領域：180×125 ピクセル
各元素の蛍光 X 線強度を規格化し、相対的なカラースケールで表示している。赤は強度が強く、青は低いことを示す。

－10－モエジマシダのヒ素吸収特性-放射光マイクロ蛍光Ｘ線分析を用いた As 動態の可視化-(h)小羽片先端(i)羽片先端(h)胞子(i)小羽片先端(j)枯死葉(i) 胞子嚢周辺(g)小羽片基部(g)羽片基部(h)小羽片先端(f)中軸上部(f)中軸上部

規格化強度(g) 小羽片基部(f)中軸上部(e)中軸中部(e)中軸中部(e)中軸中部(d) 葉柄(c) 土壌(d)葉柄(d)葉柄5cm(b) As(V)(a) As(III)11840

1186011880
Energy / eV

図 3 As K-edge XANES スペクトルの測定結果(a) As2O3 (b)H3AsO3(c)栽培土壌(d)～ (i)モエジマシダ羽片上の測定結果

栽培に用いた実汚染土壌のスペクトル（図中の(C)） か

3.2 As の価数評価
図 3 に蛍光法で測定した As K-edge XANES スペク

ら、土壌に含まれる As は 5 価であると判断された。しかトルを示した。先に述べたように、価数が既知である As

し、植物体に吸収された後の As では、XANES スペクト化合物（図中（a）As2O3 ：AsⅢ (b)H3AsO3 ：AsⅤ）からルのピークが低エネルギー側にシフトしており（図中(d)～得られた XANES スペクトルにおけるピークトップのエネ(i)）、As が 3 価に還元されたことを示している。また、図

ルギー値を基準として、試料から得られたスペクトルと比中に見られるように（d）葉柄から(f)中軸上部にかけては 3較することによって試料に含まれる As の価数評価を行っ価と 5 価の As が共存しているのに対して、(g)小羽片基ている。

部から(i)胞子嚢では 3 価の As が主体であった。一方、－11－フジタ技術研究報告 第 4５号

図中（j）に示したように枯死葉に含まれている As は 5 価であった。生物に対する As の毒性はその化学形態によって大きく異なっており、一般に 3 価の As 化合物における急性毒性は 5 価の化合物よりも高い 7)。ここに示した
モエジマシダ体内での As 還元は奇妙でかつ興味深い現象である。この As 還元作用と As の吸収・移行・蓄積の各過程との関連性を解明していくことが、モエジマシダによる As 高集積機構を本質的に理解していく上で重要な事柄であると考えている。
なお、ここではスペースの都合で紹介できなかったが、我々は高輝度光科学研究センター(JASRI) SPring-8（兵庫県佐用郡）の BL-37XU でも 1μm サイズのマイク
ロビームを用いて高解像度の測定を行っており、細胞レベルでの元素分布と化学状態の知見が得られつつある。
生体におけるヒ素化合物の吸収、輸送に関しては、まだ未解明の部分が多い。植物の生理機能とあわせて理解するためには、できるだけ非破壊測定が望ましいことから、今後も放射光を利用した X 線分析の活躍が期待される。

参考文献
1） Ma, L.Q. et al.， Nature，409，p.579，2001
2 ） A. Hokura et al. ， Journal of Analytical Atomic
Spectrometry， pp. 321-328，2006
3） 北島信行ら， X 線分析の進歩 37，pp.301-310，2006
4） 保倉明子ら， 日本分析化学会第 66 回分析化学討論会
講演要旨集，p.3，2005
5） N. Kitajima et al.， Proceedings of XRM2005，IPAP
Conference Series，in press
6 ） R. Onuma et al. ， Proceedings of XRM2005 ， IPAP
Conference Series，in press7） 藤永太一郎 監修:海と湖の化学，京都大学学術出版会，
pp.332-342，2005

ひ と こ とモエジマシダを利用したヒ素汚染土壌のファイトレメディエーションは、研究開発から実用化のフェーズに移行しています。今後も本技術の普及、拡大に北島 信行努めます。

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