【研究報告】（自然科学部門）

原虫寄生ウイルスを利用したクリプトスポリジウム原虫の疫学および検出系の開発

村越

東京大学農学生命科学研究科（現緒言

帯広畜産大学

日本学術振興会

ふみ博士課程特別研究員（PD））

7）科）に着目した。このウイルスは、RNA（

ク リ プ ト ス ポ リ ジ ウ ム 原 虫 の 中 で も、 特 にポリメラーゼをコードする dsRNA1 とカプシドタンパク（以下 .

）は、様々な質をコードする dsRNA2 を持つ。RNA ウイルスは塩基哺乳類の腸管に寄生し、重篤な下痢症を呈す。新興感染

配列の校正機能を持たないためにその宿主である原虫の症である本原虫症は発展途上国のみならず先進国でも深遺伝子よりも変異が入りやすい。そこで本原虫共生ウイ刻な問題である。その理由として、本原虫の外環境耐性ルスである CSpV1 の遺伝子配列を本原虫の感染地推定型の形態である「オーシスト」は、浄水、下水の消毒にに用いることか調べた。

用いられる塩素消毒に対して強い耐性を持つことが挙げ実験方法られる。日本においては、1994 年に神奈川県で 400 人、1996 年に埼玉県で 8,700 人もの、飲料水を介した集団感北海道（釧路、石狩、足寄）、岩手県、沖縄県、鹿児島染が発生している。さらに、河川や未処理の飲用水から県（種子島）において採取されたも本原虫は日常的に検出されており、飲料水から本原虫よび、日本の基準株である症に感染するリスクは本国でも無視できないことは明ら供試した。集めたかである。畜産の現場においても本原虫症は問題となる。

によってオーシスト（虫体）を精製し、そこから DNA お感染子牛は、激しい下痢による生育不良や斃死を引き起よび RNA を抽出した。DNA 配列によって、得られた原こすとともに、何百万もの原虫を糞便中に排出する。 .

虫が .

陽性糞便おHNJ-1 株を実験に陽性糞便からショ糖浮遊法

サブタイプ IIa であることを確認した後、は河川や接触を介してヒトや子牛に経口感染すウイルス RNA を逆転写、配列を増幅することにより、る。本原虫症に対する有効な薬剤は存在しないため、症

CSpV1のdsRNA1および dsRNA2 領域の配列を解読した。

状を軽くする対症療法のみとなる。したがって、発生源

その後、MEGA6.0.6 を用いて ML 系統樹を作成した。の迅速な特定による対策の必要性が訴えられている。
クリプトスポリジウム原虫の発生源の特定には、本原

結虫の 60 kDa glycoprotein（GP60）遺伝子が用いられる。

1.

GP60 遺伝子の配列多様性により、

果
CSpV1 は本邦の .に高頻度に保持されていたは IIa〜IIiまでの 8 種のサブタイプに分かれることが知られ、セリ合計 24 個の .

1）陽性検体を得た（北海道：11ンのリピート数によって更に詳細に分けられる 。しか検体、岩手県：5 検体、沖縄県：5 検体、鹿児島県：2 検し、本邦において行われた疫学調査の結果、本原虫のサ体、HNJ-1 株）。そのサブタイプを解析した所、全ての.

ブタイプは全て IIaA15G2R1 サブタイプ（IIa サブタイプ

伝子に基づいたサブタイピングにおいて本邦の .

であり、15 個の TCA、2 個の TCG 繰り返し配列を持つサブタイプ）であることが報告されているのサブタイプは IIaA15G2R1 であり、GP60 遺2–6）は、ほぼクローナルであるという既報が裏付けられた。

。したがって、GP60 遺伝子に代わる、詳細に発生源を特定できるさらに、 .

サブタイピング遺伝子が求められている。

ス配列が検出されたため、本ウイルスが原虫検出系に使

本実験では陽性検体全てから CSpV1 のウイル用できることが示唆された。また、 .に 共 生 し て い る dsRNAの DNAを標的とした PCR 解析において CSpV1 の配列は検出さvirus である Cryptosporidium parvum virus 1（CSpV1）
1

村越ふみれなかったため、CSpV1 は宿主ゲノムに組み込まれて配列の系統樹は大きく北海道、北海道以外のクレードにはおらず、ウイルスとして、 .

が保持している分かれた。さらに、本州・沖縄・鹿児島クレードにおいことが示唆された。本研究によって得られた CSpV1 配て、沖縄由来、鹿児島由来、岩手由来の検体はそれぞれ列は GenBank のデータベースに登録した（LC014992–サブクレードを形成した。CSpV1 の dsRNA1 の配列をLC015015）。

用いた系統樹は、宿主であるの検出地域を反映していることが明らかとなった。
CSpV1 の dsRNA1 配列の系統解析

2.

CSpV1 の dsRNA2 配列の系統解析

3.

dsRNA1 について、ORF のほぼ全長である約 1570 bpの配列を解読した。配列中には、サンプルごとに様々なdsRNA2 について、ORF のほぼ全長である約 950 bp の塩基置換がみられたが、そのほとんどは同義置換であっ配列を解読した。dsRNA1 と比較して塩基置換の数が少た。図 1 は、日本、アメリカ、オーストラリアで検出さなく（~8 塩基置換）、dsRNA2 の系統樹では感染地推定れた .

は行えなかった。に存在するCSpV1のdsRNA 配列（113 bp）を用いた系統樹である。その結果、日本のサンプルは日考本のクレードを形成した。したがって、dsRNA1 配列の察の検出地が国レベルで推定

図 2 において、本州・沖縄・鹿児島クレードに石狩とできることが明らかとなった。そこで、更に詳細に調べ釧路由来の検体が含まれたが、ブートストラップの値はるため、ORF のほぼ全長である 1446 bp を用いて系統樹低いため、2 検体については由来地域の議論はできなかっを作成した（図 2）。その結果、本邦で検出された CSpV1た。今後、検体を増やして系統樹を形成することによっ系統樹によって、 .て、この問題は解決する可能性がある。種子島由来の
LC015012 は北海道由来の検体とクレードを形成した。
興味深いことに、種子島の畜産農家は北海道から子牛を購入しているため、本結果は北海道のが、子牛によって種子島に運ばれたことを反映している可能性がある。また、北海道にて検出された CSpV1 配列は地域ごとにサブクレードを形成しなかった。その理由として北海道は畜産が盛んであり、地域をまたいで子牛が出入りし、その子牛とともに、および CSpV1 が移動していることによるものだと予想された。
本 研 究 に お い て、CSpV1 の 配 列 情 報 を 用 い、 .
感染地の推定が行えることが明らかとなった。
今後は更なる解析を行い、短期的なの移動が、CSpV1 によって推定できるかを確かめていく必要がある。
要約
ヒトおよび家畜に下痢症を引き起こすことで問題となるクリプトスポリジウム原虫は、しばしば大規模な集団感染を引き起こすが、本邦の原虫株に適用可能な発生源の迅速な特定ツールは存在しない。そこで、本
図1

原虫に共生している 2 分節の dsRNA ウイルスである、

アメリカ、オーストラリア、日本のから検出された、CSpV1 dsRNA1 の ML 系統樹。130 bp の塩基対を解析に用い、ブートストラップ値は 50％以上の値が得られたもののみを表記した（塩基置換モデルおよびパラメーター：T92＋Γ）。

Cryptosporidium parvum virus 1（CSpV1）に着目した。
本原虫ウイルスはポリメラーゼをコードする dsRNA1とカプシドタンパク質をコードする dsRNA2 を持つ。
2

原虫寄生ウイルスを利用したクリプトスポリジウム原虫の疫学および検出系の開発

図2

日本のから検出された、CSpV1 dsRNA1 の ML 系統樹。130 bp の塩基対を解析に用い、ブートストラップ値は 50％以上の値が得られたもののみを表記した（塩基置換モデルおよびパラメーター：T92＋Γ＋I)。

疫学調査の結果として、たクレードを形成した。以上から、CSpV1dsRNA を用陽性サンプル全てにおいて CSpV1 が検出され、本ウイルスが原虫の疫学に用い、 .

感染地の推定が行えることが明らかといることができることが示唆された。そこで、日本の標なった。

準株である HNJ-1 株および、ウシ糞便から採取した北海道、岩手県、沖縄県、鹿児島県由来の

謝

陽性検

辞
本研究を遂行するにあたり、助成を賜りました公益財

体における CSpV1 の dsRNA 配列から ML 系統樹を作成した。日本由来団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

から検出された CSpV1 配列はオーストラリアや米国から検出された由来の文

CSpV1 配列と異なるクレードを形成し、本ウイルス配列によって、由来国が明らかになることが示唆された。更

献1） L. Xiao:., 124, 80–89, 2010.
2） Z. L., Wu, et al.:., 69, 4720–4726,2003.
3） N. Abe, et al.:., 99, 303–305, 2006.
4） M. Ichikawa-Seki, et al.:., 64, 161–166, 2014.
5） F. Murakoshi, et al.:., 75, 837–840, 2013.
6） F. Murakoshi, et al.:., 175, 353, 2014.
7） M. L. Nibert, et al.:., 154, 1959–1965, 2009.に細かく解析を行うと、本邦で検出された CSpV1 配列の系統樹は大きく北海道、北海道以外のクレードに分かれた。さらに、北海道以外のクレードは、岩手および沖
縄・種子島サブクレードに分かれ、沖縄検体もまとまっ3