【研究報告】（自然科学部門）

システインとポリフェノールの協働による食肉新鮮色の維持研究増田晃

四国大学生活科科学部管理栄養士課程（現 四国大学生活科科学部管理栄養士課程
緒言子

講師准教授）を試み、ミオグロビンの鮮赤色を反映した食肉の新鮮色の維持技術の確立を目的とした研究を行った。

グローバリゼーションの流れから、食品も国境を越えて流通している。鮮度が問題となる生鮮食品も例外ではなく、生鮮食品を新鮮なまま流通させるための品質管理実験方法技術の重要性は増しているといえる。食肉は世界共通のMetMb からの MbO2 生成および維持実験

生鮮食品であり、その鮮度は消費者によって色の鮮やかマイクロプレートのウェルに、試験サンプル（ポリさで判断され、変色は食肉成分の酸敗開始を意味すフェノール）の DMSO 溶液，MetMb 緩衝溶液、システ

1）る 。食肉の新鮮さを示す鮮赤色は、食肉中の色素タンインの水溶液、およびリン酸緩衝液（pH 7.4）を入れ、パク質・ミオグロビンの 2 価鉄イオンに酸素が配位したマイクロプレートリーダー内にて、37℃で 2 時間インオキシミオグロビンによる。ミオグロビンはそれほど安キュベートし、500 nm および 582 nm の吸光度を経時的定ではなく、徐々に鉄が 3 価に酸化され、褐色のメトミに測定した。各ウェルの MbO2 と MetMb 濃度は、MbO2オグロビンとなり、商品価値と品質を低下させる。した（μmol/L）＝（89.7×A582）−（32.9×A500） 式、 お よ び

がって食肉製造から消費の間に、オキシミオグロビンがMetMb（μmol/L）＝60−MbO2（μmol/L）式から算出し，示す赤色状態を保持することは食品科学上重要な課題で機能は MbO2 生成率として表した。

ある。最近では、流通経路の複雑化に加え、変色劣化のHPLC および LC-MS による MetMb 還元反応におけるカ速い魚肉の取り扱いも多くなり、本問題の解決に繋がるフェ酸の経時的分析研究の必要性は増している。
一方、植物には多様なフェノール成分が含まれ、それカフェ酸 DMSO 溶液とシステイン水溶液を用い、そらは高い抗酸化性と還元性を有する機能性成分・ポリの他の実験条件は上記と同様にマイクロプレートリーフェノールとして着目されている。しかしポリフェノー

ダー中、37℃でインキュベートした。1 時間間隔で反応

ルは高い還元反応性ゆえに物質としては不安定性で、そ液 を 以 下 の 条 件 で 分 析 し た。
： カ ラ ム、 コ ス モ シ ルの利用には注意が必要である。高い還元力を示すポリ

5C18-AR-II（4.6 mm×250 mm、5 μm）； 流 速，1.0 mL

フェノールは褐色のメトミオグロビンの 3 価の鉄を 2 価/min; 溶媒 A, 1％酢酸水；溶媒 B, アセトニトリル；グラに還元する能力がある。しかし、その反応によって生じ

ジ エ ン ト 条 件：100％ ま で 5〜100％ 直 線 勾 配 の 溶 媒 Bたポリフェノールの酸化物は、鮮赤色のオキシミオグロ（40 分間）。検出；280 nm。反応混合物中のカフェ酸おビンの酸化を促進してしまう、いわゆるプロオキシダン

よびその誘導体の濃度は絶対検量線法を用いて計算しト効果が生じ、結局ポリフェノール単独では、オキシミた。LC-MSE 分析により各生成物を推定した。

オグロビンの維持は困難で、食肉の鮮赤色を保つことはできないことが知られている2）。

MetMb 還元反応におけるシステインおよびシスチンの定量分析

そこで、本研究では、ポリフェノールによるミオグロ反応中のシステインの定量は改良エルマン法を用いてビンの還元鮮赤色維持を目指して、ミオグロビンに対するポリフェノールのプロオキシダント作用を詳細に解明行った。1 時間間隔で上記反応液から 20 μL を取り、リし、その知見に基づき、高い求核性置換基のチオール基ン酸緩衝液（pH 7.4）、蒸留水、および 5,5 ′-ジチオビスを有するアミノ酸であるシステインにより制御すること（2-ニトロ安息香酸）溶液を添加し 23℃で 5 分間撹拌し1増田晃子

た 後、 こ の 溶 液 10 μL の HPLC 分 析 を 行 い 生 成 し た阻止できると考えた。ところでチオール基は硫黄原子の2-nitoro-5-hydrosulfulylbenzoic acid を以下の条件で定量性質から、水酸基と比べて遥かに求核性が高い。そこでした。
：カラム，コスモシル 3C18-EB（3.0 mm×150 mm,チオール基を有する食品成分であるシステインを用い3 μm）。流速 0.3 mL/min。溶媒 A，0.1％リン酸水溶液；て、ポリフェノールによる MetMb の還元と MbO2 の酸

溶媒 B，アセトニトリル；グラジエント条件：0〜100％化防止を同時に達成できるかを検討した。図 1 にシステ（30 min）; 10.5 分の保持時間ピークを 330 nm で検出。シイン存在および非存在下での各種ポリフェノール（600

スチンの定量は Mizuta の方法に従い、追加の反応液または 300 μmol/L）による MetMb 還元 MbO2 化能を測

20 μL に塩化ベンゾイル CH3CN 溶液、およびトリエチル定した結果を示した。図 1 のデータから、多くのポリアミン CH3CN 溶液を 0℃で攪拌しながら加えた。1 時間

フェノールは、単独で十分な MetMb 還元活性を示すこ

後、反応混合物の 10 μL を以下の条件で HPLC により分とはなかった。しかしながらシステインを共存させた系

析 し た。 カ ラ ム： コ ス モ シ ル 5C18-AR-II（4.6 mm×では、顕著な還元活性を示すポリフェノールが存在する

250 mm, 5 μm）；流速 0.5 mL /min。溶媒 A, 0.1％トリフことがわかった。またシステイン自体の MetMb 還元活

ルオロ酢酸水；溶媒 B, アセトニトリル；グラジエント性は非常に弱いものであったので、この還元性はシステ

条件：溶媒 B10〜100％（50 分）；検出，254 nm。

インの効果が単純に合わさったものではない。なお、システインの共存下で顕著に還元能を示したポリフェノー

結果と考察

ルはカフェ酸、ジヒドロカフェ酸、ヒドロキシチロソー

これまでの研究において、MbO2 に添加したポリフェルであった。これらの物質は共通のカテコール構造を有ノールが MbO2 のメト化を促進することがわかっていし、強い還元性を示しながらオルトキノン体に容易に変る。フラボノールに属するケルセチンは、メト化率が完化する抗酸化性の強いポリフェノールとして知られてい全ではなく 70％程度の MbO2 生成能であった。この理由る。このオルトキノン構造の求電子性が MbO2 を不安定を解析したところ、フラボノールはポリフェノールが酸化する可能性があるが、そこにシステインが存在すると化されることによって生じるキノン性物質が比較的速く求核性のチオール基がすばやくキノンに付加することで消失し、結果として、MbO2 酸化促進能を示さなくなる

MbO2 の不安定性を誘発しない物質になると考えられ3）ことが判明した 。その消失反応の鍵となるのは、不安る。この想定機構を実証するために、カフェ酸を用いて定中間体への水の求核付加であるため、その反応をよりさらなる検討を加えた。

速く進めることができれば、効率的に MbO2 酸化促進を

図1

図 2 に、マイクロプレートの各ウェルで、カフェ酸おシステイン共存下におけるポリフェノールのメトミオグロビン還元能
Mean±SD、 ＝32

システインとポリフェノールの協働による食肉新鮮色の維持研究

図3
図2HPLC プロファイル

システイン共存下でカフェ酸によるメトオグロビン還元反応を2 時間行い、反応生成物を HPLC で分析した。

システイン共存下におけるカフェ酸のメトミオグロビン還元能

0〜2400 μM のマトリックスデータ、測定 2 回の平均値。

よびシステインとも濃度を変化させて MetMb 還元反応を行い、プレートリーダーで吸光度を同時に読み取る方法で測定した MetMb の還元能のマトリックスデータを示した。得られたデータから、純粋なカフェ酸およびシステインは、2400 μmol/L までの間、濃度依存的に活性を示すが、その効率は高くないことがわかった。一方、カフェ酸とシステインの混合系は、顕著な還元活性を示した。カフェ酸とシステイン共存下でのそれぞれの最適濃度を見積もると、カフェ酸では、600〜2400 μmol/L に対 し、 シ ス テ イ ン で は、600 μmol/L で あ る こ と が わかった。一般的に活性物質は濃度依存的に効果が高くなると考えられる。しかし、カフェ酸が共存する本実験においては、システインが濃度依存的でなく、結果として、カフェ酸およびシステインがいずれも MetMb の濃度 60 μmol/L の 10 倍である、600 μmol/L が最適であった。
次に、MetMb 還元反応時に生成するカフェ酸およびシステイン由来の生成物の分析を行った。最適条件であるシステインとカフェ酸（各 600 μmol/L）の存在下でMetMb の還元反応を行い、その生成物を HPLC 分析した。図 3 に 2 時間反応後の HPLC プロファイルを示した。
その結果、原料のカフェ酸以外に、7.6 および 8.1 分の保持時間を有する二つの生成物ピークを検出した。これら
ピ ー ク の 化 合 物 を LC-MS 分 析 し、 ピ ー ク 1 は−298.0384［M−H］、ピーク 2 は

図4：−：298.0400［M−H］

システイン共存下でのカフェ酸のメトミオグロビン還元
反応の経時的分析

A; オキシミオグロビン生成率。B；カフェ酸とシステインの残存量、およびシスチン生成量（シスチンは 2 または 3 時間後のみ測定）。C; 反応生成物量（図 3 のピーク 1、ピーク 2 について）
A〜C のデータとも測定 2 回の平均値。の分子関連イオンが検出され、そのマスユニットの値から、両化合物の分子式が C12H13NO6S であることが判明
3増田晃子要した。この分子式から 2 つの生成物がカフェ酸とシステ

約インの等モルカップリング生成物であることを示唆されポリフェノールは抗酸化性を示すことが知られている

た。

が、食肉色素のミオグロビンに対しては酸化を促進し、図 4 には、MetMb 還元による MbO2 生成反応におけるメト化し褐色化させることが報告されている。

カフェ酸、システイン、および 2 つの生成物とシステイ

本研究により、システインをポリフェノールと共存さンから生成する可能性のあるシスチンの濃度を経時的にせると、ミオグロビンの酸化的褐色化が防止できること測定した結果を示した。図の A に示すように、MetMbがわかった。反応生成物からこれらの機構を検討したとは 2 時間で還元されて MbO2 を生成し、その後一時間ほころ、ポリフェノール単独では、抗酸化性を示す際に生ぼ保持された。一方、図の B に示した様に、カフェ酸成するキノン体がミオグロビンの酸化的褐色化を促進すは、MetMb 非存在下の実験と比べて、2 時間の間に明るが、求核性の高いチオール基を有するシステインの存らかに減少することが判明した。しかし、その減少量は在下では、システインがポリフェノールと反応するた100 μmol/L 程度にとどまった。一方、システインに関め、キノン体による食肉色素のメト化が回避されると考しては反応時間に伴い減少することがわかり、その減少えられた。

速度は MetMb 非存在下の条件よりも遥かに速く、2 時すなわち、食品成分であるポリフェノールとシステイ間でほぼなくなることがわかった。システインの減少にンの協働により褐色の食肉の色が還元されて鮮赤色とす伴う生成物は酸化物のシスチンと予想されたことから、ることができ、またその色が維持されることを明らかにシステイン消滅時のシスチンの定量を行い、主な生成物した。

をシスチンと確認した。反応開始後 1 時間で合わせて謝100 μmol/L 程度のカフェ酸システイン付加物が生成し、辞その後 1 時間維持された後減少を示した（図 4C）。以上

本研究の遂行にあたり、公益財団法人三島海雲記念財の経時的分析結果から、カフェ酸は MetMb を効果的に団より助成金を賜りました。ここに記して、関係各位に還元し MbO2 とすることができ、その際発生するカフェ厚く御礼申し上げます。

酸キノンが MbO2 を不安定化する前にシステインと反応
文することでカフェ酸システイン付加物に変化し、その物質が存在する限り MbO2 の酸化的褐変化（メト化）を起

献

1） A. R. Mancini, C. M. Hunt:2） T. Masuda, et al.:2013.
3） M. Inai, et al.:4） 本田沙理ほか：

こさず、鮮赤色が維持されることがわかった。なお、本研究成果を含む一連の研究については、一部公表、報告
4）

した 。

4, 71, 100–121, 2005.
, 61, 1097–1104,, 62, 893–901, 2014.
, 57, 29–34, 2015.