〔生物工学会誌

第 87 巻第2号

66–71．2009〕

平成20 年度 生物工学奨励賞（江田賞）受賞

清酒醸造における酵母ミトコンドリアの役割の解析とその育種への応用
北垣 浩志
Analysis of the Role of Yeast Mitochondria during Sake Brewing
and Its Application for Breeding of a Novel Yeast Strain
Hiroshi Kitagaki (Fundamental Research Division, National Research Institute of Brewing, 3-7-1
Kagamiyama, Higashihiroshima, Hiroshima 739-0046, Present address: Faculty of Agriculture, SagaUniversity, 1 Honjo-cho, Saga 840-8502) Seibutsu-kogaku 87: 66–71, 2009.

はじめに清酒は，水と蒸した米およびそれから製造した麹を，ミトコンドリアは酸素呼吸により多様な炭素源を資化するための細胞内小器官である酵母を増殖させた酒母に対して三段階に分けてタンクに

ミトコンドリアは太古，好気性細菌でリケッチアに近投入し，そのままタンクの中のもろみを 20 ～ 30 日程度

縁の α プロテオ細菌が真核生物に取り込まれて細胞内共醸造させることで製造される日本古来の伝統酒である．

生したと考えられている細胞内小器官である．ミトコン

この間，タンクの中は酵母自身が発生する二酸化炭素ガ

ドリアは二枚の脂質二重膜に囲まれており，細菌としてスで満たされ，また醸造期間中何回か蔵人が櫂棒でタン

太古，真核生物に取り込まれたときの膜トポロジーを現

クの中のもろみをかき混ぜることはあるものの，それも在も保持している．細胞内共生説を支持するように，ミ空気を多量に巻き込むような形で行われることはない．

トコンドリアには独自の DNA や脂質（カルジオリピン）

そのため，醸造初期には米粒や麹の粒に含まれる酸素がが見いだされる．ミトコンドリアの一義的な役割は酸素物理的に溶解することで放出されることや櫂入れの操呼吸によるエネルギー（ATP）の生産である．酸素呼吸

作，原料の投入などにより2–4 ppmの酸素が存在するが，と は 解 糖 系 や TCA サ イ ク ル で 生 産 さ れ た NADH やこれらの酸素が醸造初期にもろみから消費・放出された

FADH2，コハク酸の還元力を，ミトコンドリア内膜に局後は，酸素濃度は 0–5 ppb というきわめて低い濃度に達在する電子伝達系を通じて酸素に受け渡し，この過程でする 1)．また，麹菌が生産する米のデンプンを溶解およ生じたミトコンドリア内膜を境にした H+ の勾配を使っび分解する糖質分解酵素が醸造中に働くおかげで，醸造てエネルギー物質である ATP を生産する過程である．酸の途中でもろみ中には最高 10％近くのグルコース濃度

素呼吸は acetyl-CoA から TCA cycle を経てエネルギーをとなり，醸造終了までは常にグルコースが存在する．

取り出すことができるため，酸素呼吸を使えば生物はエ

醸造の初期ではある程度の酸素がステロールや不飽和脂肪酸の生合成に必要ではある 2) ものの，初期以降では，清酒醸造中の酵母は，醸造途中で高泡に付着する少数の酵母を除けば，極端な低酸素，高糖濃度という環境に長期間曝されていると言える．

タノールや酢酸，グリセロールなどさまざまな炭素源を資化して増殖することができる．
酵母は発酵時にはミトコンドリアの発達を抑制する
上記のミトコンドリアを使った酸素呼吸と対比されるのが，ミトコンドリアを経ないで細胞質で行われる発酵

著者紹介
著者紹介

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独立行政法人酒類総合研究所（主任研究員）
現，佐賀大学大学院農学研究科（准教授） E-mail: ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp

生物工学

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である．発酵においては，酸素呼吸と違ってグルコースは，発酵から呼吸に変換するときに一気に発達するミトやフルクトースなど単純な炭素源しか資化することがでコンドリアは，他の膜から発生するのか，細胞の中の水きない．こうした糖は細胞内に取り込まれたあと細胞質溶性の部分から突如発生するのかというものであった．

において解糖系で代謝され，途中で生産された還元力はまず，無酸素条件においては酵母ミトコンドリアの構造

ミトコンドリアの電子伝達系を介さずに細胞質でアセトは観察できないので，ミトコンドリアは突如発生するとアルデヒドなどに受け渡される．還元力がアセトアルデ主張する研究が報告された 6)．しかしその後，染色方法

ヒドに受け渡された場合，エタノールが生産されるため，を変えて無酸素条件の酵母からミトコンドリア様の構造

エタノール発酵と呼ばれる．清酒酵母を含めたSaccharo-

を 見 い だ し，こ れ を 不 完 全 な 構 造 し か 持 た な い も のmyces cerevisiae は通性嫌気性菌 facultative anaerobes に分“promitochondria”と解釈する研究が発表された 7) こと類され 3)，酸素呼吸と発酵の二つのエネルギー獲得方式

から，ミトコンドリアは発酵から呼吸に変換するときにを環境に応じて使い分ける生物である．酵母は，少なく他の膜から発生するだろうという理解が共有されるようとも制御された培養条件では，グルコースが 0.5％以下になった（ただし現時点においても，ミトコンドリアがで 4) かつ酸素濃度が 0.5 mM（16 ppb）以上 5) であればどの膜から発生するのかという疑問は根本的には解決

ミトコンドリアを発達させ酸素呼吸を盛んに行うが，こされていない 8)）．この promitochondria には NADH-れらの条件の両方を満たさなければミトコンドリアの発ferricyanide reductaseの活性があるがミトコンドリアの達と酸素呼吸を抑制し発酵を行う．したがって，清酒醸

Nde1p あるいは Nde2p，Ndi1p の活性ではなく混入した造においては，初期以外のほとんどの期間，酵母は発酵

microsomal NADH-cytochrome b5 reductaseの活性由来を行う環境に曝されていると言える．とする 9) 研究結果，電子伝達系阻害薬 KCN で部分的にミトコンドリア制御は自然界での酵母の生き残りに有利である

阻害される酸素消費能があるがこの酸素消費能は電子伝達系阻害薬 antimycin A では阻害されないとする研究結果 10)，酸素消費能はあるがステロールの合成活性由来と上記のようなミトコンドリアの制御は，自然界においする研究結果 10)，電子伝達系の成分である cytochrome cて次のように酵母の生き残りに有利であることから，ゲやユビキノンは含まれるが量は非常に少ないとする研究

ノムに進化の歴史の中で固定されてきたと考えられる．

結果 11,12) など，解釈の難しい結果が多数報告されていグルコースが豊富で酸素がないときには酵母はミトコンる．また研究手法にも，生化学的解析をするのにミトコ

ドリアの発達を抑えて発酵をすることになり，その結果ンドリアを部分的にしか精製していない 9)，ミトコンド

エタノールを生成し，他の微生物にダメージを与えてそリアの構造は数分で劇的に変わるのにその構造を染色にの間に増殖する（酵母はエタノールに他の微生物よりもより観察して結論を導いている 13)，ミトコンドリアを明強い）．グルコースを資化し尽くし，かつ酸素が存在すれ確に峻別する手法がない 6,7) などの問題があり，無酸素ば，ミトコンドリアを発達させて代謝系を酸素呼吸に転状態における酵母ミトコンドリアの存在や構造，機能に換し，エタノールを炭素源として資化して増殖する．い

関して明確な認識は形成されていなかったと考えていよいよすべての炭素源がなくなったら，胞子を形成してる．こうした基礎微生物学的研究だけでなく，産業微生休眠状態に入り次の栄養源に出会うのを待つ．このよう物学的研究においても，リンゴ酒醸造において酵母のミに，グルコース濃度が高く酸素がないときにはミトコン

トコンドリア電位ポテンシャルを rhodamine123 色素でドリアの発達を抑制し，グルコースがなくなり酸素呼吸調べた結果検出できず，ミトコンドリアの構造も共焦点が可能なときにはミトコンドリアを発達させるような株

レーザー顕微鏡で観察できなかったことから，リンゴ酒は，糖の豊富な微小環境で他の微生物との競争に勝ち残醸造中の酵母にはミトコンドリアは存在しないだろうとる性質を持つことになる．結果として現在自然界で生き議論されている 14)．1970 年代初頭にも通気培養した酵母残っている酵母は，すべてそのような制御ができる株だの発酵特性を検討する中で清酒醸造中の酵母の呼吸活性けになっていると考えられる．

について議論されている 15) が，清酒醸造中の酵母ミトコ

酸素呼吸の起こらない状態でのミトコンドリア

ンドリアの存在についての明確な結論は記述されていな
い．また近年になって，ミトコンドリアに局在する TCA酵母が酸素呼吸時にミトコンドリアを発達させ発酵時サイクルの因子の遺伝子を破壊すると醸造される清酒のにミトコンドリアの発達を抑制することは古くから電子組成が変わることから清酒醸造の前半において TCA サ

顕微鏡を使って見いだされ，そのメカニズムは多くの微イクルが有機酸の代謝を担っていることを明らかにした生物学者の興味を集めてきた．当初，微生物学者の興味研究が発表されている 16)．しかしながら，清酒醸造中に2009年

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酵母ミトコンドリアが存在しているのか，存在するとすればその構造はどのようなものかについての知見はない．よって，清酒はおろか産業的なアルコール醸造過程において，酵母ミトコンドリアの存在と構造に関する明確な知見はこれまでなかったと言える．
物質代謝・生物現象の場としてのミトコンドリア
微生物学的な観点からのミトコンドリア研究とは独立に，医学的な観点からのミトコンドリアの研究については 1990 年代から 2000 年代にかけて全世界で多くのresource が投入された．こうした動きは，ヒトの病気の実に数十％がミトコンドリアに起因するという多くの研究結果から，ミトコンドリア研究が社会的に意義のある研究と認識されたことによると思われる．これらの研究によりミトコンドリアはたとえばアポトーシス（細胞の自殺）17) や活性酸素の発生 18)，老化 19)，ガン細胞において解糖系が昂進する Warburg 効果 20,21) などの細胞全体

図 1．ミトコンドリアの 3 次元構造 29)．ジリスの CA1 放線状層の 7 つの隣り合う dendritic segments におけるミトコンドリアの 3 次元構造を示す．それぞれの節は巨大な枝分かれしたミトコンドリアを含む．
（文献 29より許可を得て転載）

片化の因子を遺伝子破壊すると融合状態となり，ミトコの運命を制御する機能，また各種有機酸の合成・代謝 22)，

ンドリア融合の因子を遺伝子破壊すると断片化状態にな

リン脂質の一種である phosphatidylserine の合成 23)，糖るが，ミトコンドリア断片化と融合の両方の因子を破壊

結合型スフィンゴ脂質の分解 8)，アミノ酸であるスレオ

すると野生株と同じ形態になることから，ミトコンドリ

ニンやセリン 24)，ロイシンやイソロイシン，バリン 25)，アの形態は断片化と融合の動的な平衡の上に成り立ってプロリン，アルギニン 26) やグルタミン酸 27,28) の合成・分いると考えられている．こうしたミトコンドリアの形態解などの役割を持つことや，尿素サイクルの一部の酵素は外部の刺激によってダイナミックに変化し，哺乳類でがミトコンドリアに局在すること 26) など各種物質の合はアポトーシスを起こす刺激に細胞が曝されると速やか成・分解・代謝の場となっていることが明らかにされてに断片化しアポトーシスを制御していることが多くの報きた．現在の生物学者の中では，ミトコンドリアは酸素

告 17) で明らかにされている．

呼吸のためだけの細胞内小器官ではなく，広範な生物現象や物質代謝において中心的な役割を持つ細胞内小器官であるという認識が形成されていると考えている．
ミトコンドリアの形態は急速にかつダイナミックに変化する

清酒醸造において酵母ミトコンドリアは途中で断片化し，最後まで存在する
清酒醸造は初期の期間以外，高糖濃度，低酸素というまさに発酵の状態で行われ，これはミトコンドリアの発達しない条件に合致する．しかし，独立行政法人酒類総ミトコンドリアは哺乳類での電子顕微鏡による観察結合研究所において清酒醸造中の酵母のすべての遺伝子の果などから，豆状の形態をしたものとして描かれること発現プロファイルを解析した結果 31)，清酒醸造の最後まが多いが，実際にはつながった構造も取り，それらは相互でミトコンドリアの遺伝子群は一定の発現を示していにまるでありの巣のように相互に連結している（図 1）29)．

た．そこで，ミトコンドリアの物質代謝や生物現象におまた，ミトコンドリアは非常にダイナミックな構造体でける役割の重要性を鑑み，清酒醸造における酵母ミトコ

あり数分で断片化・融合や移動を実行する．ミトコンド

ンドリアの存在と構造を調べることとした．ミトコンド

リアは細胞内共生したバクテリアの名残である内膜と，リアは数分でその構造を変化させてしまうため，ミトコそれを包む宿主側の膜である外膜とで構成されている

ンドリアの膜ポテンシャルを利用した染色法や密度勾配が，これらは脂質二重膜でできている非常に柔らかい構を利用した精製法は適していないと思われたので，蛍光造物であり，外膜や内膜に局在する多くのタンパク質にタンパク質 GFP でミトコンドリアを可視化し，清酒醸造よってその構造を制御されている．これらの中にはミト中ほぼ real time にミトコンドリアを観察することにしコンドリアの断片化と融合を制御するタンパク質群があた．ミトコンドリアに移行する GFP を持った酵母で清酒り，ミトコンドリアの形態はこれらのタンパク質の動態を醸造して GFP の蛍光を観察すると，醸造初期には栄養により実質的には決定されている 30)．ミトコンドリア断増殖時と同じくフィラメント状の形態をしているが，醸68

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図3．清酒酵母のfis1遺伝子破壊株はネットワーク状のミトコンドリアを醸造の最後まで維持する．清酒酵母 fis1 破壊株にミトコンドリアへ移行するGFP を保持させ，清酒を醸造して経時的にGFP を蛍光顕微鏡で観察した．

図4．清酒酵母fis1 遺伝子破壊株で醸造した清酒は多くのリンゴ酸を含む．清酒酵母と清酒酵母 fis1 遺伝子破壊株で清酒を醸造し，有機酸組成をHPLCで測定した．値はひとつの株について3 回のHPLC 測定の平均値 ±SEMである．
図 2．清酒醸造中に酵母ミトコンドリアは断片化する．ミトコ
ンドリアへ移行する GFP を持った酵母で清酒を醸造し，経時的にGFP を蛍光顕微鏡で観察した．観察はサンプリングしてからすぐに直接スライドグラスに載せて行った．

影響を及ぼすかを調べるため，FIS1 遺伝子を破壊した清酒酵母を用いて清酒を醸造し，その有機酸組成を測定した．その結果，生成した清酒の有機酸組成は親株と比べて全般に変化しており，特にさわやかな酸味を持つリン造が進むに従って断片化していくことが明らかとなった

ゴ酸の含量が約 2 倍に増加していることがわかった（図 2）．また，その構造は醸造の最後まで観察すること（図 4）34–36)．この結果は，清酒醸造において酵母ミトコができた．この研究は，すべてのアルコール醸造で酵母ンドリアの形態が清酒醸造中の有機酸の代謝に影響を与ミトコンドリアの存在と構造を明らかにした初めての報えることを初めて明らかにすると同時に，ミトコンドリ告であった 32,33)．

アの形態が変化した株さえ選抜すればリンゴ酸を高生産

酵母ミトコンドリアの断片化は清酒醸造中の有機酸の代謝を制御する
次に清酒醸造で観察されたミトコンドリアの断片化のする酵母を育種できることも示している 37)．
酵母ミトコンドリアの断片化は清酒醸造中の酵母の死滅を制御するメカニズムを明らかにするための解析を行った．ミトコ

上記のfis1遺伝子破壊株を清酒醸造中に観察した結果，ンドリアの外膜に局在する膜貫通型タンパク質である

fis1 遺伝子破壊株は野生株と比べて醸造末期で早く死滅

Fis1pは，ミトコンドリアの断片化を実行するMdv1pおよしていくことが明らかとなった．この結果から，清酒醸

び Caf4p, Dnm1p を細胞質からミトコンドリア表層へリ造中の酵母ミトコンドリアの断片化は清酒醸造中の酵母クルートする役割を持つ．FIS1 を遺伝子破壊した酵母での死滅を制御していると考えられた．そこで，fis1 破壊は清酒醸造中に酵母ミトコンドリアが断片化しなかった株の清酒醸造における生存率の低さの原因を解析するこ（図 3）ことから，Fis1p が清酒醸造中の酵母ミトコンドととした．それまでに，過酸化水素や酢酸による死滅にリアの断片化に必須であることが明らかとなった．

おいて，Fis1p を介したミトコンドリアの断片化が酵母

次にこの Fis1p を介した清酒醸造における酵母ミトコのアポトーシスを制御していることが報告されおり 38)，

ンドリアの断片化が清酒醸造中の物質代謝にどのようなこれらの刺激に対して fis1 遺伝子破壊株は高感受性であ

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図 5．fis1 遺伝子破壊株はエタノールに感受性である．BY4743の親株とアポトーシスに関連する各種の遺伝子破壊株を 21％
エタノールで処理し，3 時間後に colony forming unit を測定した．生菌率はエタノール処理前の細胞数と比較することで算出した．値は3 回の独立した実験の平均値 ±SEM である．

図6．Fis1pを介したミトコンドリア断片化経路はエタノール誘導アポトーシスを制御する．エタノールで酵母を処理したところ，ミトコンドリアが断片化し，一部の細胞で活性酸素の増加，新規タンパク質合成阻害剤による細胞死の抑制，染色体・DNAの分解，核の凝縮・分断化など各種アポトーシスの表現型が観察され，これらの特徴は fis1 破壊株で昂進しておりカスパーゼ活性依存的な細胞死が観察されたことから，Fis1p を介したミトコンドリア断片化経路はエタノール誘導アポトーシスを制御すると考えられた．

ることが知られていた 38)．清酒醸造における fis1 破壊株の死滅も，これらの結果と文献情報から考えると，少な
くとも一部はアポトーシスの特徴を持つのではないかという仮説を立て，解析を行った．清酒もろみは固液共存系であり，定量的解析を行うのが難しかったため，表現型を明瞭にするために酵母を YPD 液体培地で通気培養した後，エタノールで処理を行った．通気培養した fis1破壊株を親株とともにエタノールで処理して生存率をcolony forming unitで測定したところ，確かに明瞭にエタノールに対して感受性であることが確認できた（図 5）．
さらにこの条件においてエタノールで処理した酵母のアポトーシスの表現型を調べたところ，ミトコンドリアの断片化，タンパク質の新規合成阻害剤による細胞死の抑図 7．ミトコンドリア研究を清酒へ．基礎研究で蓄積されたミトコンドリア生物学の知見を清酒醸造に応用することで，今後新たな醸造酵母の育種や物質代謝の改変が可能になると期待される．

制，核の凝縮・分断化，染色体や DNA の分解，活性酸素の発生など，一部の細胞は各種アポトーシスの表現型をついて解析し，酵母ミトコンドリアの形態をターゲット示し，さらに fis1 破壊株においてはこれらの表現型が亢とした有用清酒酵母の育種が可能であることを示した．

進しているとともにアポトーシスの中心的因子であるカ

今後，本研究結果を参考に，ミトコンドリアにおけるさスパーゼの阻害剤によりエタノール誘導死の一部が抑制

まざまなイベントや物質代謝をターゲットとした清酒酵された．これらの結果から，通気培養条件においてはエ母の育種や，酵母ミトコンドリアにおける物質代謝を考

タノール誘導死の一部はミトコンドリア断片化経路慮した技術開発（図 7）に少しでも役立てていただけれFis1p を介したアポトーシスの側面を持つと考えられた

ば望外の喜びである．

（図 6）39)．アポトーシスにおいては活性酸素が重要な役
割を持つことから，酸素のほとんどない清酒醸造において起きる酵母の死滅のうちどれくらいがアポトーシスの特徴を示すのかは解析方法の難しさもありまだ結論が得られていないが，育種株の現場への応用を考えると，アポトーシス関連の因子を操作することで fis1 遺伝子破壊株のエタノール感受性を改善することが考えられる．
以上，清酒醸造において酵母ミトコンドリアは最後まで存在し，途中で断片化するという観察結果から，ミトコンドリアのこの現象に付随する物質代謝・生物現象に70

本研究は，以下に示す多くの先生方のご指導及び共同研究者の方々のご協力によって進めることができました．この場を借りて深く感謝申し上げます．ミトコンドリアの基本的な研究知
識や手法については，米国サウスカロライナ医科大学のハヌン教授とオベイド教授，コワート研究准教授，ミトコンドリアの可視化については基礎生物学研究所の岡本浩二博士，米国ユタ大学のショー教授，有機酸の測定については独立行政法人酒類総合研究所の磯谷敦子主任研究員，アポトーシスの研究手法については広島大学大学院生物圏科学研究科の船戸耕一准教授，
渡邉有氏並びに独立行政法人酒類総合研究所の荒木義雄博士
及び周延博士，一倍体株の作製については広島大学大学院先端

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物質科学研究科博士課程の加藤拓氏，清酒酵母の栄養要求性株については山口大学大学院医学系研究科の赤田倫治教授，育種のターゲットの選定については独立行政法人酒類総合研究所の平松順一理事長および三上重明醸造技術基盤研究部門長にご指導いただき，深く感謝申し上げます．大阪国税局鑑定官室勤務時に清酒醸造指導の基本的なノウハウ及び現場に即した研究をご指導いただいた井本吉彦主任鑑定官（現国税庁鑑定企画官），川瀬直樹主任鑑定官（現福岡国税局鑑定官室長），筒井，神谷昌宏主任鑑定
謙之主任鑑定官（現広島国税局鑑定官室長）
官（現名古屋国税局鑑定官室長），岩槻安浩鑑定官（現金沢国税局鑑定官室長），津川光昭元大阪国税局鑑定官室長，土井清太郎元大阪国税局鑑定官室長，清酒業界の杜氏，蔵人，技術者，研究者，経営者の皆様に感謝申し上げます．また酵母研究の基本的な考え方や研究の基本をお教えいただいた東京大学大学
院農学生命科学研究科の山崎眞狩教授（現・日本大学大学院生物資源科学研究科教授），依田幸司教授，有岡学准教授，門倉広博士（現奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科
グローバル COE 国際リサーチフェロー），生化学的研究の進め方をご指導いただいた東京大学大学院総合文化研究科石浦章一教授，東京大学分子細胞生物学研究所の冨岡茂雄博士，独立行政法人酒類総合研究所において研究全般にご指導いただいた遺伝子工学研究室室長（現鹿児島大学大学院農学研究科教授）の伊藤清博士にこの場をお借りして感謝申し上げます．紙幅のためすべて記載することはできませんが，東京大学，国税庁，鑑定官室，酒類総合研究所，サウスカロライナ医科大学で一緒に仕事をしたすべての皆様に何らかの形でお世話になりました．深く御礼申し上げます．
最後に，醸造酵母の基本的な知識，分子生物学的な酵母の研究を進めるための知識及び研究手法，研究全般に対する考え方を長年メンターとして丁寧にご指導いただいた，独立行政法人
酒類総合研究所醸造技術基盤研究部門特別研究プロジェクトチームリーダーの下飯仁博士に心から御礼申し上げます．
なお，ここに記載した研究のほとんどは独立行政法人酒類総合研究所において行ったものであることを申し添えます．
本研究の一部は野田産業科学研究所の助成により行われたものであり，この場をお借りして感謝申し上げます．

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