トピックス
XFEL 時分割構造解析法を用いたチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ経路開閉機構の解明
島田敦広
岐阜大学応用生物科学部

久保〒5011193 岐阜県岐阜市柳戸 11

稔

理化学研究所放射光科学総合研究センター〒6795148 兵庫県佐用郡佐用町光都 1 丁目 11

馬場清喜(公財)高輝度光科学研究センター

要 旨〒6795198 兵庫県佐用郡佐用町光都 1 丁目 11

X 線自由電子レーザー（XFEL）の高輝度極短パルスという特徴を利用することで，光励起による酵素の反応誘起法と組み合わせたポンププローブ時分割構造解析が可能になった。我々はこの手法を用いて，呼吸鎖末端酸化酵素であるチトクロム酸化酵素（CcO）の一酸化炭素の光解離に伴う立体構造変化を捉えることに成功し，プロトンポンプ経路の開閉機構を明らかにした。本トピックスでは，XFEL 時分割構造解析の今後についても議論したい。

1. はじめに

2. 研究背景タンパク質の高分解能立体構造を決定することは，生命チトクロム酸化酵素（CcO）はミトコンドリア呼吸鎖の現象を化学的に理解すると同時に創薬などへの応用という末端に存在し， 13 のサブユニットからなる分子量約 210

点でも重要である。タンパク質の立体構造を得る方法には

kDa の膜タンパク質である（ Fig. 1A ）。本酵素は，呼吸鎖X 線や中性子による回折法，クライオ電子顕微鏡を用いの上流からチトクロム c によって伝達されてきた電子とマ

た単粒子再構成法，核磁気共鳴（ NMR）法など幾つか存

トリクスのプロトンを利用して酸素を水へと還元す在する。しかし，いずれの方法においてもこれまで構造のる24) 。さらに，この還元反応と共役してプロトンをマト決定されてきた大部分はいわゆる安定な状態の静止画構造

リクス（N-side）から膜間腔（P-side）へと H-pathway とであった。もしタンパク質による反応過程を直接動画とし呼ばれるプロトン輸送経路を介してポンプすることで，高て観察することができれば，その反応機構を正確に理解す

効率な ATP 合成に利用されるプロトン濃度勾配と膜電位ることが可能である。そのために，従来の測定方法に比べを生み出している（ Fig. 1B ）。 CcO の反応機構を明らかにて時間分解能の高い測定方法が求められてきた。

することは，酸素還元反応とプロトンポンプの共役機構を2012 年より供用運転している SACLA で利用可能な X

線自由電子レーザー（XFEL）は，1011 のフォトンを含む

明らかにするということであり，生体エネルギー分野における最重要課題であり続けている。

パルス幅が数フェムト秒（fs）の X 線を照射可能である。

1995年にウシ心筋由来 CcO の二量体の結晶構造が月原

こ の XFEL と 同 期 し た可 視 レ ー ザー 光 を 利 用 する こ と吉川らによって初めて2.8 Å 分解能で報告されてから，で，可視レーザー光をポンプ光， XFEL をプローブ光とCcO の反応機構に関する理解は飛躍的に進んだ5)。CcO はして利用する高い時間分解能でのポンププローブ実験が可

4 つの酸化還元金属中心（CuA, heme a(Fea), CuB, heme a3

能となった。つまり，ポンプ光とプローブ光の照射間隔を(Fea3））を持ち，CuB と heme a3 によって酸素還元中心が様々に変化させながらデータを収集することでタンパク質

形成されている（ Fig. 1B ）。振動分光学的な解析と種々のによる反応をコマ送りの動画として捉える，時分割構造解

酸素アナログとの複合体結晶構造解析から，酸素はまず析が可能となった。本トピックスでは，呼吸鎖末端酸化酵

CuB へ結合した後に Fea3 へ安定に結合して直ちに 4 電子素であるチトクロム酸化酵素の反応機構を XFEL 時分割

還元されることが分かっている24) 。その後チトクロム c

構造解析法によって明らかにした過程と結果について説明から CuA， heme a を介して電子が酸素還元中心へ伝達さする1)。

れる毎に，1 等量のプロトンが水チャネルと水素結合ネッ
トワークから成る H-pathway を通ってポンプされる68)（Fig. 1B）。このプロトンポンプ過程ではプロトンを一方向226 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3
(C) 2018 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

トピックス ■ XFEL 時分割構造解析法を用いたチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ経路開閉機構の解明

Fig. 1(Color online) The structure of the H-pathway in CcO. (A) The location of the H-pathway in the X-ray structure ofbovine heart CcO which is dimeric in the crystalline state1). (B) The structure of the H-pathway. The locations of thewater channel and the hydrogen-bond network composing the H-pathway are shown by the blue and red curves. The
short hydrogen bond network (a grey area) connects the hydrogen bond network of the H-pathway and the proton
storage site (the blue area). A water molecule in the proton storage site marked by HOH 10 forms a hydrogen bondto H291. (C) The structure of the water channel. Helix X structures of the closed structure with two bulges at S382
and M383 and the open structure with one bulge at V380 are given in the right and left panels. These bulges aremarked by red dotted lines. Water cavities marked by brown cages were calculated with a probe radius of 1.2 Å.

Fig. 2(Color online) The reaction cycle of CcO indicated by O2 reduction center.

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 227

へのみ輸送するため， CcO 内部にはプロトンの逆流防止

じる前に CcO 内部に蓄えられる必要があり，実際， CcO機構が存在すると予想されてきた。

内部に 4 等量のプロトンを一時的に貯蔵可能な， H-path-

1 反応サイクル中で CcO は酸素還元中心の構造で特徴

way と水素結合ネットワークでつながった水クラスター付けられた比較的安定な 6 つの中間体を経ることが知ら領域が確認されている9)（Fig. 1B）。これらの結果から，一れており，1 反応サイクルあたり 4 等量のプロトンをポン

度に 4 等量のプロトンを取り込んだ後は酸素還元中心へプする（ Fig. 2 ）。ウシ心筋から精製結晶化した CcO はの電子伝達に伴う静電的な反発力を利用して，タンパク質

休止酸化型構造を取っており，この CcO 結晶を還元処理

内部に大きな構造変化を起こすことなく高効率なプロトンすることで完全還元型結晶を調製することができる。休止

ポン プを 行っ ている こと が予想 されて いる 。こう した酸化型と完全還元型，および種々の酸素アナログとの複合体の高分解能立体構造解析から， H-pathway の水キャビティーがその近傍に存在するヘリックス構造（ helix X ）の構造変化（ open 構造 Z closed 構造）によって消失することで H-pathway を閉じていることが明らかとなり，酸素還元中心にリガンドが存在する場合は H-pathway は閉
じていることが強く示唆された（Fig. 1C)9,10)。つまり，反応サイクル中で H-pathway が開いているのは完全還元型
状態だけであり，酸素の結合した A 型以降では H-pathway は既に閉じているということである（Fig. 2）。したがって，ポンプされる 4 等量のプロトンは H-pathway が閉

Fig. 4

Fig. 3(Color online) The scheme of CO migration in O2 reduction
center.

(Color online) SF-ROX method using PVA coated crystal. (A) The experimental layout of pump probe analysis.
(B) The scheme of XFEL irradiation step in SF-ROX. To avoid the eŠect of XFEL radiation damage, each XFEL
irradiation point is separated with 10 mm in the horizontal direction and with 100 mm in the longitudinal direction.

228 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

トピックス ■ XFEL 時分割構造解析法を用いたチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ経路開閉機構の解明

CcO による高効率プロトンポンプ機構を保証するには，
CcO 内部に 4 等量のプロトンが取り込まれた後に直ちに
H-pathway の水チャネルが消失する必要があるが，そのタイミングについては謎であった。そこで， XFEL 時分割構造解析によって水チャネル領域の構造変化過程を捉えることとした。

3. CcO を用いた XFEL 時分割測定法
3.1

一酸化炭素結合還元型 CcO の利用

H-pathway の水チャネルが閉じるタイミングを，生理学的な基質である酸素を使って直接調べることは容易ではない。結晶中の XFEL が照射される箇所全ての CcO 分子へ任意のタイミングで酸素を同時に結合させなければならないし， 1 つの結晶につき XFEL を照射できるのは 1 度きりである。これは， XFEL を照射すると照射箇所のタンパク質分子が壊れてしまうことと，一旦酸素が結合して還元反応の始まった CcO 結晶は還元型状態まで再び戻る
かどうか分からないからである。そこで，擬似的な A 型（酸素結合型）である一酸化炭素（ CO ）結合還元型 CcOの結晶を用いることにした10)。
CO 結合還元型 CcO は，休止酸化型 CcO を CO 飽和した還元剤で処理することで安定に調製できる。さらに，結合している CO は可視レーザー光によって CcO の酸素還元中心から解離したのちに再結合することが知られている。したがって， CO 結合還元型 CcO へポンプ光として可視レーザー光を照射したのちに XFEL を照射することで， CcO からの CO 解離過程を追跡することが可能であFig. 5CO ligand dynamics initiated upon CO photolysis of CcO inthe crystalline phase at 4°
C. (A) Time-resolved IR diŠerence
spectra upon CO photolysis. Each diŠerence spectrum was
obtained by subtracting the probe-only (CO-bound) spectrum. (B) Temporal changes in the Fe-CO and Cu-CO intensities.

る（Fig. 3）。つまり，酸素結合過程の逆過程を時分割構造
解析によって追跡することで，還元型 CcO の酸素結合に伴う構造変化過程を解析することが可能ということであを薄く張ったループで CO 飽和還元溶液中の結晶をすくいる。また，光解離した CO は還元型 CcO 結晶へ再結合す上げたのち，素早くゴニオメーター上へセッティングし調るため， XFEL の照射位置を照射ダメージの影響のない

温湿気流下に置くことで， CcO 結晶を 30 分以上安定に維位置までずらせば，同じ結晶を使用して複数回のポンププ持可能である。結晶へ吹き付ける調温湿気流は窒素ガスをローブ測定が可能であるという利点もある。

用いており，懸案である嫌気条件下での測定も可能とし非凍結状態での測定条件の決定

湿度はほぼ100まで設定できるため，PVAによってコーた。また，温度は 4°
Cから20°
Cまで設定可能であり，かつ

3.2

ポンププローブ時分割測定を行う上で，反応励起に伴う結晶中でのタンパク質の構造変化を可能とするためにタンティングされた結晶を急激に乾燥させることなくループ上に固定して非凍結条件下で測定を行うことができた。

パク質結晶は非凍結状態でなければならない。しかし，非凍結状態のタンパク質結晶はゴニオメーター上で乾燥する

3.3 ポンププローブ間隔の決定ため，結晶性へ深刻なダメージを与え分解能の著しい低下

実際にポンププローブ実験を行う前に，オフラインでのをもたらす。さらに， CcO は温度に対する感受性が高く

ポンプ光照射条件の決定も必要である。具体的には， CO

できるだけ低温での測定が望ましい。また，CO 結合還元

結合還元型 CcO 結晶に対して CO を100光解離させるの型状態の CcO はポンプ光によって CO が解離して再結合に必要なポンプ光のエネルギーの決定や，ポンプ光とプする前に酸素が結合してしまう可能性もあるため，測定環

ローブ光の照射間隔（ Dt）の決定を行う必要がある。 CO

境はできるだけ嫌気条件が求められた。これらの条件を解の結合と解離に伴って CcO は 590 nm と 620 nm の波長に決するために， JASRI の馬場熊坂によって開発された大きな吸収スペクトル変化を示す。そこで，ポンプ光の照HAG 法を用いた11)。ポリビニルアルコール（PVA）溶液

射エネルギーに対して CcO の可視吸収スペクトルの変化

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 229

Table 1

Statistics of intensity data collection and structure reˆnement.

States

Dark

20 ns

100 msNo. of crystals

40

24

43

No. of images

5,201

4,350

4,232

Space group
Cell (a, b, c)

RsplitP 212121184.9, 208.5, 177.9
25.002.20(2.242.20)
33,213(16,601)
97.0(97.1)
105.91(26.32)
15.27(2.98)
0.1278(0.2296)

P 212121185.8, 209.5, 179.5
14.992.40(2.442.40)
266,141(10,691)
98.2(79.6)
63.23(4.61)
6.28(2.29)
0.1624(0.4131)

P 212121185.0, 208.8, 178.0
24.992.20(2.242.20)
336,147(15,196)
96.9(88.4)
70.89(5.72)
11.78(2.44)
0.1677(0.3812)

CC1/2

0.9635(0.8250)

0.9576(0.4967)

0.9429(0.5907)

17.20
20.89
2.04

18.19
22.97
1.83

17.29
21.00
1.97

Resolution range (Å)
No. of unique re‰ections
Completeness ()Redundancy〈I/s(I)〉

Rwork ()Rfree ())R.m.s.d bond angle (°R.m.s.d bond length (Å)
Averaged Bfactor (Å2)

Proteins
Heavy metals
Lipids and detergents

0.0179
A†
53.9
42.3

WatersAll atoms

0.0134
B†
62.5
50.3

A†
64.7
53.1

0.0163
B†
74.4
60.5

A†
59.3
47.4

B†
69.8
56.2

99.8

114.7

111.1

68.8
61.1

84.4
72.7

80.0
68.0

Crystals, each with a maximum width and a maximum thickness of 500 mm and 100 mm, respectively, were rotated by 0.1°and translated
by 50 mm after each shot.
† A and B indicate two independent enzyme molecules in an asymmetric unit.

量をプロットすることで，完全に CO が光解離するのに必3.4

XFEL 回折像の収集と解析

要なポンプ光のエネルギーを決定した。また，大型の結晶

XFEL の照射毎に結晶を回転させて still の回折像を多を回転させながら測定を行う際，角度によってポンプ光の

数 集 め る 方 法 （ SF ROX 法 )13) に よ っ て 測 定 を 行 っ た

結晶中を通過する光路長が変化するため，結晶を 60°
回転（ Fig. 4B ）。 詳 細 は 省 く が ， 集 め た 画 像 か ら プ ロ グ ラ ム

させた状態での測定も行った。その結果，CO の光解離に

cxi.index14) によって指数付けと積分を行ったのちに，プは 200 mJ の エ ネ ル ギ ー で 十 分 で あ る こ と が 決 定 で き た

ログラム prime15)によって精密化と指数強度の計算を行っ（実際の XFEL 時分割実験に際しては両方向から100 mJ ず

た。その結果，ポンプ光照射なし（ Dark ）と Dt ＝ 20 ns

つ結晶に対して照射した（ Fig. 4A））。次に， CO 結合還元および 100 ms の各データについてそれぞれ 2.2, 2.4, 2.2 Å

型結晶を用いた時分割赤外分光解析12) によって，ポンプ

分解能での構造決定に成功した（Table 1）（Dark，20 ns，

光照射による CO の挙動を確認した。CO 結合還元型 CcO。
100 ms それぞれの PDB ID は 5X1F，5X1B および 5X19）

結晶に対するポンプ光照射前後の差スペクトルを解析する
ことで， CO が酸素還元中心内のどこに結合しているのか，または酸素還元中心から解離してしまっているのかを判断できる。実際には CcO の酸素還元中心を構成する

4. CcO の XFEL 時分割測定結果
4.1

酸素還元中心内での CO の移動

Fea3 及び CuB に結合した CO の伸縮振動バンドの強度変Fo Fc 電 子 密 度 マ ッ プ を 計 算 し た と こ ろ ， Dark で は化を20 ns から400 ms まで追跡した（Fig. 5A）。その結果，

Fea3 に結合した CO のピークがはっきりと確認され， 20

ポ ン プ 光 照 射 20 ns 後 の 時 点 で 既 に CO は Fea3 か ら CuB

ns では CuB 側に確認されたが， 100 ms では CO のピークへと完全に移動しており，さらに100 ms 後には76の COが3.5 s レベルでは確認されなかった（Fig. 6A）。各ポンプ

が酸素還元中心外へと解離し，100 ms 後に再び Fea3 へと

プローブデータから Dark のデータを引いた FoFo 電子密

CO が再結合していることがわかった（Fig. 5B ）。 CO の酸度マップから，よりはっきりとポンプ光照射後の CO の軌

素還元中心からの解離は 76 以上確認できなかった。こ跡が確認できた（ Fig. 6B ）。さらに各構造における CO のの結果から，CO が CuB へと移動している状態，および最占有率を比較するために， CcO の構造において普遍的にも酸素還元中心から CO が解離している状態の 2 つ（Dt＝占有率 100 で存在する水分子（ heme a および heme a3

20 ns および100 ms）について構造決定を行うこととした。

のプロピオン酸基にそれぞれ結合している水分子）のピー

230 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

トピックス ■ XFEL 時分割構造解析法を用いたチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ経路開閉機構の解明

Fig. 6(Color online) Structures of the O2 reduction center of the CO-bound fully reduced state at dark and at 20 ns and
100 ms after the photolysis. (A) Fo-Fc diŠerence electron density maps at 3.5 s and structural models are illustrated. Purple, blue and light-blue spheres represent iron ions, copper ions and oxygen atoms of water molecules,
respectively. CO, water 1 and water 2 were not included in the structure reˆnement. (B) The Fo(20 ns or 100 ms)-Fo(dark) diŠerence electron density maps at ＋5.0/－5.0 s level are shown as green/red mesh. The diŠerence density maps show the directions of CO and CuB movements given by red and blue arrows, respectively. (C) Geometries of CO in the O2 reduction site in the structures measured at dark and at 20 ns and 100 ms after photolysis.
Thick gray line at the top of each structure shows the CuB coordination plane consisting of three imidazole nitrogen atoms.

ク値の平均値と CO のピーク値の割合を求めた（Table 2）。

Table 2The peak height of CO molecule at O2 reduction site.

その結果， Drak， 20 ns， 100 ms の CO のピーク値はそれ
ぞれ 1.337 ， 0.994 ， 0.222 であった。赤外分光の結果から
20 ns で は CO は CuB に 100  結 合 し て い る こ と か ら ，Dark に比べて低い 20 ns の 0.994 という値は， CuB に結合した CO の温度因子が高いことに起因していると考えられる。これらの結果から，占有率を計算すると， Dark および 20 ns では CO は 100 酸素還元中心に存在しており，
100 ms では 76 の CO が酸素還元中心外へと解離していることが明らかとなった。この結果は赤外分光の結果とも一致している。

Reference water molecules
Water1 (heme a) (e－/Å3)
Water2 (heme a3) (e－/Å3)
Average (e－/Å3)
CO at Fea3 (e－/Å3)
CO at CuB (e－/Å3)
Ratio (CO/monitor)
Occupancy of CO ()
IR
Xray

Dark

20 nsec

100 msec

0.472
0.472
0.472

0.269
0.373
0.321

0.395
0.406
0.401

1.337

0.319
0.994

0.089
0.222

100.0
100.0

100.0
100.0

24.0
22.3

0.631

Fo(20 ns)Fo(dark) の電子密度図から， 20 ns では CuB 近傍の heme a3 とは反対側に大きなネガティブのピークが確認され， CuB が heme a3 側へ動き， Fea3 CuB 間の距離が狭 く な っ て い る こ と も 確 認 さ れ た 。 CuB に は H240 ，る平面内に存在する平面三角形構造をとる。一方で， 20

H290 ， H291 の 3 つのヒスチジンの N 原子が配位しておns では CuB が Fea3 側へ近づくことでこの平面から大きくり，Dark では CuB がこの 3 つの N 原子によって形成されずれている（Fig. 6C）。Cu を含むこの平面三角形構造は非放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 231常に安定であり，4 配位構造をとりづらい。このことから，
CO が CuB に結合するためには， Cu が安定な平面三角形

構造からずれる必要があることを示している。 100 ms では CuB が再び平面三角形構造に近づいていることから，
酸素還元中心に CO が入って来る前には，まず CuB の平面三角形構造からのずれが生じることで CO への親和性が上がっていることが示唆された。

4.2

heme a 3 の構造変化

heme a3 はプロピオン酸基とヒドロキシファルネシルエ

チル基が周囲のアミノ酸残基と水素結合などの相互作用を形成することで強く固定されているため，大きな構造変化を起こさない。しかし，CO の光解離に伴って heme a3 のC ピロール環にあるビニル基がわずかにシフトすることが分かった（ Fig. 7A ）。このビニル基は， H-pathway の水キャビティー消失に関与する helix X に属する L381 と非常に近い位置に存在している。完全還元型（PDB ID: 5B1B），
Dark，20 ns， 100 ms の構造を重ね合わせて，完全還元型

構 造 （ open 構 造 ） の helix X の L381-Cb と ， 各 構 造 のheme a3 のビニル基の C 原子（ Fig. 7A の CAC ）間の距離を測定すると， Dark では 3.06 Å ， 20 ns では 3.13 Å ， 100

ms と完全還元型では 3.37 Å であり， CO の光解離に伴って L381 から離れるように一方向へシフトしていることが分かった（ Fig. 7B ）。 Dark と 20 ns では open 構造である
helix X の L381-Cb とビニル基の CAC 間の距離は構造的に近すぎて不安定であり，L381 の構造変化を誘起することで helix X を open 構造から CO 結合型構造（ closed 構造）へと変化させていることが考えられた。言い換えると，完全還元型（もしくは100 ms）に CO が結合していく
ことで heme a3 のシフトが誘起され，ビニル基の CAC とL381-Cb が構造的に不安定な距離まで近づくということである。その結果， L381 を含む helix X が open 構造から
closed 構造へ大きな構造変化を起こす。実際に Dark のL381-Cb と 20 ns の heme a3 ビ ニ ル 基 の CAC 間 の 距 離 は
4.0 Å 以上離れており，構造的に安定である（Fig. 7C）。このことから， helix X の構造変化は CO が heme a3 に含まれる Fea3 ではなく， CuB に結合した時点で誘起されることが強く示唆された。

4.3

helix X の構造

Fig. 7(Color online) Structural comparison of heme a3 region in
the structures measured at dark and at 20 ns and 100 ms after
the photolysis. (A) Each structure is superposed on that of
the fully reduced ligand-free state (PDB ID, 5B1B) by leastsquares ˆtting of the main chain atoms of subunit I. Red,
green, light-blue and blue colors indicate the structures measured at dark, at 20 ns and 100 ms after photolysis and at theligand-free fully reduced state, respectively. The light blue
sphere denotes the location of Water 2 shown in Fig. 6A.
Amino acid side chains interacting with the heme a3 byhydrogen bonds are drawn in thick stick models for the fully
reduced state. The characters, A, B, C and D, in the heme
designate the PDB naming of the pyrrole rings. The CAC
marks one of the carbon atoms of the vinyl group covalently
bounded to the C-ring. (B) A close-up of the vinyl group
regions in panel A. The structures of heme a3 and Ca drawings of protein regions at dark, 20 ns and 100 ms are illustrated using the same color code as in panel A. Helix X of theligand-free fully reduced state (the open strucrture) is illustrated by a thin stick model. The distances between CAC andthe b carbon of L381 at 20 ns (green) and 100 ms (blue) are
given by the digits with arrows. (C) Heme a3 in the structures measured at 20 ns after photolysis. Helix X structure
measured at dark (the closed structure) is illustrated by a red
stick model.

helix X の構造を決定するために， open 構造と closed

構造をそれぞれ固定した状態で Fo Fc 電子密度マップを計算し，その残余電子密度を確認した。 Dark と 20 ns で

lix X 構造が closed / open のいずれの場合でも残余電子密は helix X に closed 構造を固定して計算を行った場合に度が確認されたことから，closed 構造と open 構造の多型

は残余電子密度が確認されなかったが， open 構造を固定構造を取っていると考えられた（Fig. 8A，B）。主鎖の温度

した場合は closed 構造の存在する位置に大きな残余電子因子が同程度になり，かつ残余電子密度が最も無くなるよ

密度が確認された（ Fig. 8A ， B ）。このことから， Dark と

うに closed 構造と open 構造の占有率を精密化した結果，

20 ns の helix X は closed 構造であり，水キャビティーのclosed 構造と open 構造の占有率がそれぞれ 0.55 ， 0.45 で消失によって H-pathway は閉じている。100 ms では，he-あると決定された（ Fig. 8C ）。 100 ms の構造では，酸素還232 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

トピックス ■ XFEL 時分割構造解析法を用いたチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ経路開閉機構の解明

Fig. 8(Color online) Fo-Fc diŠerence electron density maps of structures measured at dark and at 20 ns and 100 ms after the photolysis. The structure factors of Fc were calculated from the closed and open structures of helix X withtwo bulges at S382 and M383 (A) and with one bulge at V380 (B), and the Fo-Fc diŠerence electron density maps
were drawn at 3.5 s together with the closed and open structures of helix X, respectively. The red circles mark thelocation of these bulges. (C) The Fo-Fc diŠerence electron density map of the structure measured at 100 ms after
photolysis where structure factors of Fc were calculated with multiple structures of helix X (55 closed structureand 45 open structure) and drawn at 3.5 s together with the open and closed structures of helix X.

元中心の CuB に結合している CO の占有率は24であり，ステムの存在が明らかとなった（Fig. 9）。酸素還元中心に

CuB への CO の結合と helix X の closed 構造への構造変化

リガンドが存在しない状態では helix X は open 構造をとが完全に同期して起こるならば， 100 ms では closed 構造っており， heme a3 のビニル基と L381 との距離も構造的の helix X の占有率は24であるはずである。このことかに妥当である。この状態では Fig. 9A にメッシュで示されら， CO の CuB からの解離と helix X の構造変化は完全にたような水キャビティーが存在し，プロトンは H3O＋ のは同期していない。しかし，100 ms で helix X が多型構造状態でこのキャビティーを介して輸送されると考えられる。

をとっていることから， CcB からの酸素還元中心外へのCO が酸素還元中心の CuB へ結合すると，heme a3 がシフ

CO 解離が helix X の closed 構造から open 構造への構造

トしビニル基と L381 の距離が短くなり構造的に不安定に変化を誘起していることは明らかである。

なる（Fig. 9B）。この構造的不安定さを解消するために helix X が大きく構造変化を起こすと， S382 が水キャビテ

4.4

プロトン逆流防止機構

ィーへ突き出しこの水キャビティーが消失する（Fig. 9C）。

CO 光解離に伴う構造変化から， CO の酸素還元中心へ

その後 CO は Fea3 側へ移動する（ Fig. 9D ）。この水キャビの結合に伴う heme a3 のシフトと helix X の構造変化およ

ティーが消失することで，水分子が H-pathway の水チャ

び H-pathway の水キャビティーの消失にいたるリレーシ

ネル上流まで侵入することを防ぎ， CcO 内部へ一旦取り

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 233原子によって構成される平面三角形構造から CuB がずれることによって起きる（4.1参照）。したがって， CO の結合前に CuB の構造変化を誘起する機構が存在するはずである。 CuB に配位している 3 つのヒスチジンの 1 つである H291 は，プロトン貯蔵部位である水クラスター中の水分子と水素結合を形成している（ Fig. 1B および Fig. 10 ）。
このことから，水クラスター内に 4 等量のプロトンが入ってきたことを，H291 が感知することで CuB の構造変化を誘起している可能性が考えられる。この仮説に基づいて
CcO による酸素還元反応と共役したプロトンポンプ機構のモデルを考察する。
まず， H-pathway の水チャネルを通って H3O＋ の状態
で 4 等量のプロトンが水クラスターまで運搬される（ Fig.
10A）。水クラスター内に 4 等量のプロトンが取り込まれたことが水分子との水素結合を介して H291 へ伝わると，
CuB の平面三角形構造が歪むことで CuB の酸素への親和性が高くなる（Fig. 10B）。次に，CuB へ酸素が結合すること で 酸 素 還 元 中 心 の heme a3 が シ フ ト し ， ビ ニ ル 基 と
L381 間の距離が構造的に不安定になる。この不安定さを解消するために helix X が大きく構造変化を起こし水チャ
ネル内の水キャビティーの 1 つが消失する。これによって水分子が水チャネルの上流まで侵入することを阻害する（ Fig. 10C）。水チャネルが消失することで H-pathway が閉
Fig. 9(Color online) The atomic process of the water channel
closure upon CO binding to the O2 reduction site. Hemes a
and a3, CO and the residues 380386 of the helix X are drawn
by stick models. The purple, green and pink structures
denote the open and CO-bound at CuB and at Fea3 states,
which are detectable in the ligand-free fully reduced state, at
20 ns after the photolysis and at dark, respectively. Nitrogen,oxygen and sulfur atoms are indicated by blue, red and yellow colors, respectively. Red and blue spheres are Fea, Fea3
and CuB. Side chains of the residues 380, 385 and 386 are excluded from the models for simplicity. The location of thewater channel in each panel is marked by the dotted allow
and the brawn cage. (A) The structure of reduced state
where the water channel is open as indicated by the cage. (B)A predicted structure constructed by introducing heme a3
structure at 20 ns after the photolysis (in which CO is at
CuB) into the arrangement in the ligand-free fully reduced
state, suggesting that CO binding to CuB induces a signiˆcantshift of vinyl group of heme a3 toward L381. (C) The experimentally obtained X-ray structure at 20 ns after the photolysis, showing signiˆcant conformational changes in
L381and bulge formation at S382 and M383, as marked by
red circles. (D) The dark structure. After closing the channel, CO migrates to Fea3 from CuB without any conformational change in helix X.

じると酸素が CuB から heme a3（Fea3）へ移動し，直ちに
heme a（Fea）から 1 等量の電子が供給される。この電子伝達によって Fea の電荷が 2 ＋ から 3 ＋ へと変化し，静電的な反発によって水クラスター内のプロトンが H-pathway へと移動する。水チャネルは閉じているので，プロトンは逆流することなく水素結合ネットワークを通って
P-side へとポンプされる（Fig. 10D）。

本反応機構モデルの構築を可能とした， CuB から helix
X の構造変化に至るリレーシステムの発見は，ポンププ

ローブ時分割構造解析でしか明らかにできなかった成果である。この研究結果によって， CcO の高効率プロトンポンプ機構を保証するプロトン逆流防止機構を解明することができた。

5. 今後の展望
XFEL 時分割解析でしか得られないタンパク質の反応

中間体構造はタンパク質の反応機構を理解するのに非常に重要である。実際に CcO 以外にもバクテリオロドプシンや光化学系 II などで XFEL 時分割解析によって顕著な成果があげられている1618) 。一方で，現状では励起光の照込まれたプロトンが水分子を介してマトリクス側へ逆流す

射によってのみ反応を誘起可能なタンパク質に測定対象がることを防いでいると考えられる。

限定されがちである。多くの一般的な基質を代謝する酵素にまで測定対象を広げるためには，結晶中のタンパク質分

4.5

CcO によるプロトンポンプ機構

CO の CuB への 結合は， CuB と 3 つのヒス チジンの N

234 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

子に同時に基質を結合させて酵素反応を同期させる方法が必要である。有力な手法の 1 つはケージド化合物を利用

トピックス ■ XFEL 時分割構造解析法を用いたチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ経路開閉機構の解明

Fig. 10(Color online) A schematic representation of the water channel closure mechanism. (A) The water channel
closure system in which the O2 reduction site composed of CuB and Fea3 is in the fully reduced state under turnover conditions. The Mg-containing H2O cluster is the H＋-storage site which connects with CuB via H291 and aˆxed water molecule (HOH10 in Fig. 1) in the storage site. The heme a3 vinyl group is in van der Waals contact
with L381. Protons are transferred by H3O＋ through the open water channel. (B) Increase in the O2-a‹nity of
CuB1＋ by distortion of the regular trigonal coordination of CuB1＋ by protonation of the ˆxed water upon full
protonation of the Mg-containing H2O cluster. (C) Closure of the water channel upon O2 binding to CuB as follows; (i) migration of the plane of heme a3; (ii) structural change of L381; and (iii) formation of the bulge at
S382 to close the channel. (D) Proton pump after the channel closure. After migration of O2 to Fea3, Fea2＋ is oxidized to pump protons.

する方法であろう。励起光の照射によって基質分子を放出される20)。この方法では送液スピードを変更することで，するケージド化合物を十分量タンパク質結晶中に浸透させ

XFEL 照射位置に到達するまでの時間を変化させて時分ておけば，励起光を照射することで結晶中に基質が一斉に割測定を可能とする。しかし，この方法の場合は基質が素放出され酵素－基質反応を同期可能である。一酸化窒素還早く結晶中へ浸透しなければならないため結晶サイズがか

元 酵 素 （ NOR ） で は NO の ケ ー ジ ド 化 合 物 を 利 用 し たなり小さいことが求められる。また，結晶中への浸透時間

XFEL 時分割構造解析に成功している19) 。ケージド化合も考慮すれば，ns や ms タイムスケールでの時分割測定は物を利用した時分割測定では，励起光の照射によってケー難しく測定サンプルを選ぶであろう。いずれの方法であっジド化合物は分解してしまうため， 1 つの結晶に対して 1ても微結晶を用いるため，大型結晶を使用する場合に比べ度しか XFEL を照射できない。そのため大型結晶を用いて高分解能データを得るのがより一層難しくなる。しかる SFROX 法では測定効率が悪い。そこで，高粘度媒体

し，タンパク質による化学反応を理解するためには 2.0 Å

や反応溶液と混合した微結晶を連続して XFEL 照射位置を超えるような高分解能データが求められる。そのためにまで送液することでランダムな配向の回折像を大量に集めは良質な微結晶標品の調製とともに，SACLA など XFELる方法（ SFX 法）の利用が現実的である17,18) 。 SFX 法は照射施設の改良によるさらに高輝度の XFEL も求められ世界的に広く利用されている方法であり，解析プログラム

る。今後， XFEL の輝度が高くなるに伴い使用出来る結も急速に発展充実しており今後ますます利用されるよう晶サイズも小さくなることから，時分割構造解析の対象タになると思われる。他にも，基質溶液と微結晶溶液を素早

ンパク質は増えるのではないか。それによって多くの反応

く混合し，連続して XFEL 照射位置へ送液する方法も考

中間体の構造が解明されることを期待している。

案されており，励起光照射を必要としない方法として期待

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 235

謝辞
CcO の大型結晶を調製していただいた兵庫県立大学生

13)

命理学研究科の新澤－伊藤恭子准教授に感謝いたします。
また，時分割測定データの解析に際して多大な貢献をしていただいた理研 SPring-8 センターの山下恵太郎研究員に感 謝 い た し ま す 。 HAG 法 に よ る 条 件 検 討 は SPring-8

14)BL38B1 の課題番号 2014A1293, 2014B1483, 2015A1115,
2015B2115 および 2016B2732 にて行った。 SACLA BL3

で の 時 分 割 デ ー タ の 収 集 は ， 課 題 番 号 2014A8036 ，2014B8055 ， 2015A8030 ， 2015A8053 ， 2015B8032 ，2015B8051 ， 2016A8034 ， 2016A8050 ， 2016B8053 お よび 2016B8070 に て 行 っ た 。 本 研 究 は JSPS 科 研 費26291033 ， 15K18493 ， 15H03841 および 15H01055 からの助成を受けたものである。また，本研究は MEXT X 線
自由電子レーザー施設重点戦略課題， JST CREST ， JST

15)

PREST ，工作機械技術振興財団からの助成を受けたもの
16)

である。

参考文献
1)

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236 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

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R. A. Tuckey, P. Yu, M. Dyba, S. G. Tarasov, U. Weierstall,
T. D. Grant, C. D. Schwieters, J. Zhang, A. R. Ferr áeD'Amar áe, P. Fromme, D. E. Draper, M. Liang, M. S.
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トピックス ■ XFEL 時分割構造解析法を用いたチトクロム酸化酵素のプロトンポンプ経路開閉機構の解明

著者紹介
島田敦広

馬場清喜

岐阜大学応用生物科学部 助教
E-mail: ashima＠gifu-u.ac.jp
専門構造生物学，酵素化学［略歴］
2013 年 5 月大阪大学大学院理学研究科博士後期課程単位取得退学。博士（理学）。
2013 年 6 月兵庫県立大学生命理学研究科特任助教。2017年 4 月より現職。

高輝度光科学研究センター 研究員
E-mail: baba＠spring8.or.jp
専門放射光構造生物学［略歴］
2004 年 3 月千葉工業大学大学院工学研究科工業化学専攻博士後期課程修了。博士（工学）。 2004 年 4 月千葉工業大学特別研究員， 2006 年 4 月大阪大学特認研究員，2007年 4 月理化学研究所研究員，2007年 5月より現職。

久保稔

理化学研究所放射光科学総合研究センター
専任研究員
E-mail: minoru.kubo＠riken.jp
専門時間分解振動分光，生体分子のダイ
ナミクスを見るための手法開発［略歴］
2003 年 北 海 道 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 修了。博士（理学）。岡崎統合バイオサイエ
ンスセンター IMS フェロー，JSPS 海外特別研究員（ノースイースタン大学），兵庫
県立大学特任准教授などを経て，2014年 4月より現職。

XFEL time-resolved analysis revealed what drives
the closure of the proton pumping pathway incytochrome c oxidase
Atsuhiro SHIMADA
Minoru KUBO
Seiki BABA
Abstract

Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University, Gifu 5011193, JapanRIKEN SPring-8 Center, Sayo-gun 6795148, Japan
Japan Synchrotron Radiation Research Institute, Sayo-gun 6795198, Japan

Especially high ‰ux and short pulse-width of XFEL enables us to perform the pump-probe time
resolved structural analysis in combination with the method of inducing enzymatic reaction by
light irradiation. By using this pump-probe time resolved method, we successfully revealed thatthe open/closed mechanism of proton pumping pathway of cytochrome c oxidase (CcO), terminal oxidase in mitochondrial respiratory chain. In this topic, we want to discuss the future of XFEL
time resolved analysis.

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 237