博士学位論文
氏名(本籍)

大野 美紗（神奈川県）

学位の種類

博士（工学）

学位記番号

博甲 第１４０号

学位授与年月日

平成 ２８ 年 ３月 ３１日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項

学位論文題目
ほ乳類キチナーゼとキチナーゼ様タンパク質mRNA レ ベ ル の 定 量 法 の 確 立 と そ の 発 現 レ ベ ルの解析

論文審査委員

主査

小山 文隆 教授

副査

今村 保忠 教授〃

南雲 紳史 教授〃

佐藤 光史 教授〃

平 秀晴 岩手大学名誉教授〃〃

工学院大学大学院

博士学位論文

ほ乳類キチナーゼとキチナーゼ様タンパク質mRNA レベルの定量法の確立とその発現レベルの解析

工学研究科

化学応用学専攻

博士後期課程生命工学研究室
学籍番号bd13001

氏名

大野 美紗

指導教員

小山 文隆 教授

目次
第 Ⅰ 章 序論.......................................................................................................................... 4
第 1 節 キチン ..................................................................................................................... 4
第 2 節 キチナーゼ ............................................................................................................ 4
第 3 節 キチナーゼ様タンパク質 ....................................................................................... 5
第 4 節 研究目的................................................................................................................ 5
第 Ⅱ 章 一つの標準 DNA を用いた定量 PCR によるキチナーゼ mRNA レベル：酸性
ほ乳類キチナーゼはマウスの胃で主要な転写産物である...................................................... 7
第 1 節 序論........................................................................................................................ 7
第 2 節 実験材料と実験方法 ............................................................................................. 7
RNA と cDNA の調製 ..................................................................................................... 7
Real-time PCR .................................................................................................................... 8
標準 DNA の作成 ............................................................................................................ 8
五つの全コード領域をカバーしている cDNA の調製 .................................................... 9標準曲線 ............................................................................................................................ 9Real-time PCR による mRNA の定量............................................................................. 9
第 3 節 実験結果 .............................................................................................................. 10
新規 qPCR 法の確立 ..................................................................................................... 10
マウス標準 DNA の作成 ................................................................................................ 10標準曲線と qPCR システムの検証 ................................................................................ 11
マウス組織における Chit1 と AMCase の発現 ............................................................ 11
肺と胃組織での Chit1 と AMCase の mRNA レベル ............................................... 12
第 4 節 考察...................................................................................................................... 12
第 5 節 要約 ...................................................................................................................... 14
第 Ⅲ 章 Real-time PCR によるヒトとマウス組織のキチナーゼ mRNA レベルの定量：胃組織における酸性ほ乳類キチナーゼの種特異的発現 ......................................................... 24
第 1 節 序論...................................................................................................................... 24
第 2 節 実験材料と実験方法 ........................................................................................... 24
RNA と cDNA の調製 ................................................................................................... 24
Real-time PCR .................................................................................................................. 24
ヒト標準 DNA の作成 ..................................................................................................... 25
完全コード領域をカバーしている五つのヒトの cDNA の調製 ..................................... 25
Real-time PCR による mRNA の定量........................................................................... 25
ヒト-マウス複合型標準 DNA の作成 ............................................................................. 25
抗体調製 .......................................................................................................................... 26
マウスの胃のタンパク質の調製とヒトの胃の可溶化液 .................................................... 261

キチナーゼの酵素活性 ................................................................................................... 26
ウェスタンブロット .............................................................................................................. 26
第 3 節 実験結果 .............................................................................................................. 27
Real-time PCR システムの確立と検証 ........................................................................... 27
正常ヒト組織における Chit1 と AMCase の発現 ......................................................... 28
正常ヒト肺と胃組織での Chit1 と AMCase の発現レベルの解析 ............................... 28
ヒト-マウス複合型標準 DNA を使った定量システムの検証 ......................................... 28
Chit1 と AMCase mRNA レベルのヒトとマウス組織での比較 ..................................... 29
胃組織におけるタンパク質レベルの解析 ....................................................................... 30
第 4 節 考察...................................................................................................................... 31
第 5 節 要約 ...................................................................................................................... 32
第 Ⅳ 章 キチナーゼ様タンパク質を識別するための定量 real-time PCR システムの確
立：触媒的に不活性な breast regression protein-39 と Ym1 はマウスの肺で恒常遺伝子である ........................................................................................................................................... 46
第 1 節 序論...................................................................................................................... 46
第 2 節 実験材料と実験方法 ........................................................................................... 46
RNA と cDNA 調製 ....................................................................................................... 46
Real-time PCR のためのプライマーの選択 ................................................................... 46
マウス Refs/CLPs 標準 DNA の作成 .......................................................................... 47
完全コード領域を含む BRP-39，Ym1，Ym2 cDNA の調製 ....................................... 47
標準曲線の作成と mRNA の定量 ................................................................................ 47
統計解析 .......................................................................................................................... 48
第 3 節 実験結果.............................................................................................................. 48
CLPs 定量のための qPCR システムの確立 ................................................................. 48
マウス Refs/CLPs 標準 DNA の作成 .......................................................................... 48
pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA の評価 ............................................. 48
標準曲線と qPCR システムの検証 ................................................................................ 49
正常なマウス組織における CLPs の発現 ..................................................................... 50
マウスの肺と胃組織における CLPs の mRNA レベルの比較 .................................... 50
第 4 節 考察...................................................................................................................... 51
第 5 節 要約 ...................................................................................................................... 52
第 Ⅴ 章 一つの標準 DNA を用いた正常なヒト組織における YKL-40 の定量 Realtime PCR 解析とほ乳類キチナーゼ mRNA との比較 ......................................................... 65
第 1 節 序論...................................................................................................................... 65
第 2 節 実験材料と実験方法 ........................................................................................... 65
RNA と cDNA 調製 ....................................................................................................... 65
Real-time PCR のためのプライマーの選択 ................................................................... 65
2

ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA の作成 ........................................................................... 65
完全コード領域をカバーしている YKL-40 cDNA の調製 ........................................... 66
qPCR を使った標準曲線の作成と mRNA の定量 ....................................................... 66
第 3 節 実験結果 .............................................................................................................. 66
YKL-40 mRNA 定量のための qPCR システムの確立 ................................................ 66
ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA の作成と qPCR システムの検証 ................................. 66
正常なヒト組織における YKL-40 mRNA の発現レベル .............................................. 67
正常なヒト組織における YKL-40 mRNA レベルの比較 .............................................. 67
第 4 節 考察 ...................................................................................................................... 67
第 5 節 要約 ...................................................................................................................... 68
第 Ⅵ 章 総合考察................................................................................................................ 76
第 Ⅶ 章 結論........................................................................................................................ 78
参考文献 .................................................................................................................................. 79
謝辞 .......................................................................................................................................... 86

3

第 Ⅰ 章序論

第 1 節 キチン
キチンは，N-アセチル-D-グルコサミン (GlcNAc) が β-1,4 結合した直鎖の高分子化合物で，自然界で二番目に多い多糖である（図 1.1）[1]。キチンは，真菌，甲殻類，昆虫の主要な構成成分として不可欠な要素であり [1,2]，外敵からの防御として機能する。またこれらの生物は，キチンを分解し，エネルギー源として利用すると考えられている [3]。キチンは，まれに動物の餌に含まれている。しかし，キチンは消化システムで分解されないと考えられているため，食物繊維とみなされている。

図 1.1 キチン第 2 節 キチナーゼ
キチナーゼは，高分子キチンの β-1,4 グリコシド結合を加水分解する。ほ乳類はキチンやその合成酵素を生産しないが，ヒトとマウスはキトトリオシダーゼ(chitotriosidase，Chit1) と酸性ほ乳類キチナーゼ (acidic mammalian chitinase，
AMCase) の二種類の活性のあるキチナーゼを発現している [2,4]。両酵素は，糖質加水分解酵素ファミリー 18 に属している [the carbohydrate active enzymes (CAZy)
database, http://www.cazy.org/] [5,6]。キチナーゼのファミリー 18 の触媒作用に関わるコン
センサス配列は，DXXDXDXE で，E が触媒残基と考えられている [7-9]。
Chit1 は，ほ乳類で最初に精製，クローン化されたキチナーゼである [10,11]。
AMCase は，ほ乳類で二番目に見出された活性のあるキチナーゼで，Chit1 の代償的な酵素と考えられている。AMCase は，酸性の等電点であることから名づけられた[12,13]。
Chit1 と AMCase は，分子量約 50 kDa のタンパク質として細胞外に分泌される。両タンパク質は，N-末端に触媒ドメイン，ヒンジ（分子上の折れ曲がる可動部）領域，C-末端にキチン結合ドメインの三領域からなる [11,12]。マウス AMCase
は，Chit1 に対し，52% の同一性と 60% の類似性がある [7]。これらの構造上の類似性にも関わらず，これら酵素は酸性 pH での酵素化学的作用に関して著しい差異がある。AMCase は，特徴的な至適 pH を有し，それは pH 2 であり，（明確ではないけれども）二番目の至適 pH を pH 4～7 にも有する [12]。他方 Chit1 は，pH 54

付近に至適 pH を有する [10,14]。
第 3 節 キチナーゼ様タンパク質
キチナーゼ様タンパク質 (Chitinase like proteins, CLPs) は構造的にキチナーゼと相同であるが，キチンを分解する能力が欠損している [10,11]。CLPs は，ほ乳類キチ
ナーゼと同様に，糖質分解酵素ファミリー18 に属する [5-8]。CLPs における活性の欠損は，進化の過程でコンセンサス配列の触媒残基が変異したためであると一般的に考えられている [7-9]。
マウスとヒトで，複数種類の CLPs が同定されている [15-26]。マウスは，主にbreast regression protein-39 (BRP-39) [chitinase 3-like-1 (Chi3l1)，38-kDa glycoprotein(gp38k) ともよばれる]，Ym1 (Chi3l3)，Ym2 (Chi3l4) を発現している。一方，ヒトは，BRP-39 のヒト相同体である YKL-40 (CHI3L1，human cartilage glycoprotein-39)を発現しているが，Ym1 と Ym2 を合成していない [15-22]。
BRP-39 と YKL-40 は，マクロファージ，軟骨細胞，腫瘍細胞を含む様々な細胞で分泌されている糖タンパク質である [15,22,27,28]。マウス BRP-39 のアミノ酸配
列は，YKL-40 のアミノ酸配列と 73% が同一である [27,28]。最近の研究で，BRP39 と YKL-40 は機能的に同じであることが示された [29]。Ym1 は，Ym2 と高い
配列同一性 (91%) を有するが，これらのタンパク質は異なる発現パターンを示すことが報告されている [17,18,21]。
第 4 節 研究目的
ほ乳類キチナーゼと CLPs は，様々な疾患状況の患者でレベルが上昇するので，かなり注目を集めている。
Chit1 レベルはゴーシェ病，慢性閉塞性肺疾患 (chronic obstructive pulmonary
disease, COPD)，アルツハイマー病および喫煙者で増加する [30-33]。AMCase の発
現と活性は，喘息モデルマウスのアレルギー性気道応答で増加する [34]。キチン
は，AMCase の発現とアレルギーや喘息に関係する免疫細胞の動員を誘導する[35]。さらに，いくつかのヒト AMCase の遺伝子多型は，気管支喘息に関係している [36,37]。これらのほ乳類キチナーゼは，キチン含有病原体に対する生体防御として働くと考えられている [2,38]。
BRP-39/YKL-40 のレベルは，喘息，COPD，嚢胞線維症，関節リウマチ，炎症性腸疾患，アルコール性肝硬変，様々なタイプの悪性腫瘍それぞれで上昇する [3949]。Ym1 は，寄生虫感染症による炎症で合成される [43]。Ym1 と Ym2 は，アレルギー肺炎症で発現する [50]。
これらの結果は，キチナーゼと CLPs が様々な病態生理的状況下で重要な役割を果たしていることを強く示唆する。しかし，キチナーゼと CLPs の医学的・生理学的役割は，未だ十分に解明されていない。
5

本研究では，ほ乳類キチナーゼと CLPs の生体内での制御を考える重要な手掛かりを mRNA から得ることを目的とした。まず，新規定量 real-time PCR システムを開発した。そして，キチナーゼ，CLPs，対照遺伝子の mRNA レベルを定量し，比較を行った。

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第 Ⅱ 章一つの標準 DNA を用いた定量 PCR によるキチナーゼ

mRNA レベル：酸性ほ乳類キチナーゼはマウスの胃で主要な転写産物
である
第 1 節 序論
定量 real-time PCR（quantitative real-time PCR，以下 qPCR）の開発は，mRNA の定量における重要な進歩で，目的の特定遺伝子の発現を分子レベルで定量することを可能にした。この技術を使った非常に低レベルの mRNA 定量については多くの報告がある。それは，qPCR が，一細胞の mRNA を検出するのに十分な感度を持つことによる [51-54]。一般的な real-time PCR では，注目している遺伝子の発現レベ
ルを，すべてのサンプルでほぼ同じレベルで発現していると考えられているハウス
キーピング遺伝子の発現レベルで標準化している。しかし，real-time PCR は，同一の尺度で，複数の遺伝子の発現レベルの定量ができないため，その目的のためには広く使われていない。そこで本章では，複数遺伝子間の mRNA レベルを同じスケー
ルで比較出来る新規 qPCR システムを開発した。このシステムは，ターゲットとする遺伝子の cDNA 断片を連結して作成した DNA を標準として用いた。
第 2 節 実験材料と実験方法
RNA と cDNA の調製
この研究で，転写物のマウス組織分布を調べるため，Mouse Total RNA Master
Panel (Clontech Laboratories 社) を使用した。四種類の胎生期と八種類の成体組織を分析した。さらに，三ヶ月齢のオスのマウスの肺，胃からそれぞれ total RNA を調製した。C57BL/6J マウス (CLEA Japan) は，理化学研究所脳科学総合研究センターの動物施設で飼育された。全ての動物実験は，施設の実験指針を順守して行われた。動物実験のプロトコールは，理化学研究所脳科学総合研究センターの動物実験
倫理委員会での承認を受けている（承認番号 No. H19-2B013）。すべての外科的実験
は，麻酔薬としてジエチルエーテルを使って麻酔して行われた。そして，動物の苦痛を最小限にするように処置された。これらの組織は，mRNA 調製のため，理化学研究所脳科学総合研究センターの宮崎晴子博士と貫名信行チームリーダーから提供された。Total RNA は，メーカーの推奨するプロトコールに従って，TRIzol Reagent(Invitrogen 社) を用いて肺，胃から調製した。わずかに混入するゲノム DNA を除去するため，total RNA サンプルをメーカーのプロトコールに従って，RQ1 RNase-Free
DNase (Promega 社) で処理した。核酸の濃度は，BioPhotometer Plus (Eppendorf 社)
を用いて 260 nm の吸光度から求めた。次に，ランダムヘキサマーをプライマーとして total RNA (3 µg) を鋳型に cDNA を合成した。反応液 (15 µl) は，酵素バッファ7

ー [終濃度は 50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，75 mM KCl，3 mM MgCl2]，ランダムヘキサ
マー (Takara Bio 社) 100 ng，10 mM DTT (Invitrogen 社)，0.5 mM deoxynucleotide
triphosphates (dNTPs) より構成される。この反応液を 60 °C で 5 分間加熱し，37 °C
で 5 分間保温後，組換えマウス白血病ウイルス逆転写酵素 (MuLV-reverse
transcriptase, Invitrogen 社) を 200 U を加え，さらに 37 °C で 45 分間保温した。この逆転写反応は，95 °C で 5 分間の加熱で停止した。
Real-time PCR
Real-time PCR のプライマーは，Primer Express Software (Applied Biosystems 社) のデフォルト設定で自動的に設計し，その合成は Sigma-Genosys に依頼した (SigmaAldrich 社)。PCR 反応は，2 x SYBR Green Master Mix (Brilliant II SYBR Green QPCR
Master Mix，Agilent 社)，マウス cDNA 2.7 ng または適当な標準 DNA の希釈液，キチナーゼ，ペプシノーゲン C，グリセルアルデヒド 3 リン酸脱水素酵素(GAPDH)，β-アクチンの プライマーから構成され，最終液量 13 µl で行った。標準的な real-time PCR は，Mx3005P (Agilent 社) を用いて行った。反応は，95 °C 10 分
で DNA の変性とポリメラーゼ活性化を行った後，95 °C 1 分，55 °C 30 秒，72 °C
1 分で，この PCR 反応を 40 サイクル行った。反応産物の熱融解曲線は，PCR 増
幅後に MxPro QPCR Software version 4.10 (Agilent 社) で作成した。PCR 産物は，10% ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し，Luminescent Image Analyzer (ImageQuant
LAS 4000, GE Healthcare 社) で分析した。PCR 反応液を ExoSAP-IT (USB Products社) で，メーカーのプロトコールに従って処理を行い，未反応のプライマーとdNTPs を除去した。ABI PRISM Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit と 3130
Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社) を用いて産物の塩基配列を決定した。Realtime PCR のために選択したプライマーの塩基配列は，表 2.1 に示した。
標準 DNA の作成
Real-time PCR によって転写産物のレベルを定量するためのマウス標準 DNA (913塩基対) は，次のように作成した。AMCase，Chit1，ペプシノーゲン C，GAPDH，β-アクチンの PCR ターゲット領域に，隣接した 9-120 塩基領域を加えた cDNA 断
片を，BglII，XhoI，PstI，NotI（5’-または 3’-末端に）の制限酵素部位を含むオリゴ
ヌクレオチドプライマーと KOD Plus DNA polymerase (Toyobo 社) を用い，メーカーのプロトコールに従って，マウスの胃から調製した cDNA から増幅した。フォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列を表 2.2 に記載した。PCR 産物
は，Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega 社) を使って精製し，該当する制限酵素で処理を行った。得られた DNA 断片それぞれをアガロースゲル電気泳動と上述の Clean-Up System を使って精製し，T4 DNA リガーゼ (Toyobo 社) で連結した。得られた DNA 断片は，フォワードプライマー 5’8

GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3’ とリバースプライマー 5’TGGGTACATGGTGGTACCACCAGACAGCAC-3’ を用いて KOD Plus DNA
polymerase で増幅した。増幅した DNA の 3’末端に Takara Taq HS (Takara Bio 社)
を使って dA を付加し，上で述べた手順で精製した。得られた DNA は，TA cloning
で pGEM-T Easy ベクター (Promega 社) にクローン化した。得られたプラスミドの塩基配列は，ABI PRISM Big-Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit と 3130 Genetic
Analyzer (Applied Biosystems 社) を使って確認した。五つの cDNA 断片からなる直鎖化した DNA は，同じプライマーで KOD Plus DNA polymerase を使った PCRで，プラスミド DNA から再び増幅して調製した。増幅した DNA 断片は，上で述べたように精製，定量し，標準 DNA として使用した。
五つの全コード領域をカバーしている cDNA の調製
Real-time PCR による絶対定量法を検証するため，表 2.3 に記載したプライマーを用いて全コード領域 cDNA を調製した。二つのキチナーゼ (Chit1 と AMCase)，
対照遺伝子 (GAPDH，β-アクチン，ペプシノーゲン C) の五つの全コード領域をカバーする cDNA は，マウスの胃の cDNA から KOD Plus DNA polymerase で増幅し，pGEM-T Easy ベクターに TA クローニングにより挿入した。その cDNA の塩
基配列を決定し，図 2.1 の配列であることを確認した。サブクローニングした断片
は，同じプライマーを使ってプラスミド DNA から再び増幅し，全コード領域
cDNA として使用した。
標準曲線
複数の遺伝子の cDNA 断片から構成される標準 DNA のモル濃度は，溶液濃度と分子量に基づいて計算した。段階希釈は，Ct (Threshold Cycle，Ct =閾値と増幅曲線が交わる点) が約 13 サイクルで得られる標準 DNA の濃度で調製した。標準 DNA
は，1 分子から 1,000 万分子の範囲で 10 倍ずつ段階希釈を行い，使用するまで一定量を -20 °C で凍結保存した。
Real-time PCR による mRNA の定量
それぞれのサンプルは三度増幅し，それぞれの実験は少なくとも二回繰り返した。標準曲線を用いて，Chit1，AMCase，GAPDH，β-アクチン，ペプシノーゲン C
mRNA の分子数を MxPro QPCR Software version 4.10 によって自動的に外挿で求めた。全ての値は，total RNA 10 ng あたりの分子数として表した。Ct 値は，MxPro
QPCR Software で計算した。

9

第 3 節 実験結果
新規 qPCR 法の確立
マウスキチナーゼの重要性を研究する上で重要なステップは，キチナーゼ転写物の発現レベルを信頼性高く定量する方法の確立である。ごく微量から多量に存在す
る mRNA の検出の目的には，現在の real-time PCR が最も感度の高い定量法である。まず，Chit1 と AMCase 遺伝子の遺伝子発現レベルを比較することを考えた（図 2.2）。
キチナーゼの発現レベルを客観的に評価するため，ほとんどの組織や細胞において高いレベルで発現することが知られている二つのハウスキーピング遺伝子である，GAPDH と β-アクチン，を対照として使用した [55]。さらに，ペプシノーゲン
C（別名プロガストリックシンとして知られている）を胃での対照遺伝子として用いた。ペプシノーゲン C は，消化酵素として機能するアスパラギン酸プロテアーゼであり，胃で生産される。この酵素は，胃液の主要な成分である [56]。これら三つの対照遺伝子を使って，Chit1 と AMCase の遺伝子発現レベルを評価した（図 2.1）。
まず，qPCR のためのプライマーを設計し，そのプライマーから増幅した産物が一つの熱融解温度 (Tm) を示すか，10% ポリアクリルアミドゲルで一つのバンドかどうか，で適合性を評価した。そして，産物の塩基配列も検証した。
プライマーの特異性を調べるために，それぞれの PCR 産物を四種類の胎生期と八種類の成体組織からなるマウス組織 cDNA 混合液を鋳型に実際の real-time PCR
条件の下で増幅し，分析した。図 2.3A-E に示すように，Chit1 (Tm =79.7 °C)，
AMCase (Tm = 79.1 °C)，GAPDH (Tm = 81.4 °C)，β-アクチン (Tm = 82.0 °C)，ペプシ
ノーゲン C (Tm = 81.4 °C) で一つのピークが見られた。
PCR 反応終了後，10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動で産物を分析した。ゲル電気泳動では，それぞれ Chit1 (69 bp)，AMCase (81 bp)，GAPDH (77 bp)，β-アクチン (71 bp)，ペプシノーゲン C (82 bp) で期待サイズに明確な一つのバンドが認められた（図 2.3F）。PCR 産物のヌクレオチド配列は，実験方法で述べた手順で直接決定した。以上の結果から，これらの PCR 産物がターゲット cDNA から増幅することを確認した（図 2.4B）。このことは，PCR 産物がターゲット cDNA から特異的に増幅されており，本研究の実験条件下では，ミスプライミングは無視できる範囲
であることを示している。
マウス標準 DNA の作成
同じスケールで二つのキチナーゼと三つの対照遺伝子の発現レベルを定量し，比較することを考えた（図 2.2）。この目的のため，正確な定量のための標準 DNA を作成し，それを用いた qPCR システムを確立した（図 2.4A）。五つの遺伝子断片を
1 分子ずつ連結した real-time PCR のための標準 DNA を作成した。その後，連結した DNA 断片をベクターにクローン化した（図 2.4A）。913 塩基対の標準 DNA
10

は，PCR ターゲット領域をカバーし，隣接する 9-120 塩基領域を加えた五つのcDNA 断片と BglII，XhoI，PstI，NotI の制限酵素部位を含んでいる（図 2.4A）。
標準曲線と qPCR システムの検証
両キチナーゼと対照遺伝子の mRNA の定量は標準曲線に依存している。標準DNA の希釈系列は標準曲線を作成するために使用した。この標準曲線を使って，五種類の mRNA を分析するために用いる real-time PCR による定量性を比較，評価した。それぞれの標準曲線は，五つの異なったプライマーを使って，標準 DNA を 10倍ずつ段階希釈して作成した（図 2.5A-E，左図）。
指数関数的増幅は広いレンジで維持され，7 桁の広範囲にわたって測定が可能だ
った（図 2.5A-E，左図）。五つの cDNA 断片からなる標準 DNA を用いることによって，標準曲線を作成するために使うそれぞれの希釈を五つの遺伝子全てに割り当てることができた（図 2.5A-E，右図）。
標準曲線が五つの遺伝子に対して絶対的に等量になっていることを示すために，
全コード領域をカバーしている既知濃度の cDNA を増幅し，未知試料として解析した。この分析は，希釈液が期待量得られているかを確認するために行った。図2.5A-E の右に示すように，標準曲線を作成するために使った量と等しい量の希釈にみられた（図 2.6）。この方法で少量の転写物から多量の転写量が定量できることから，real-time PCR の感度と信頼性を確認することができた。このことは，このqPCR 法は，広いダイナミックレンジでの定量が可能で，高い正確性，高感度であることを示している（図 2.5A-E，右）。従って，ここで確立した qPCR システム
が，同じスケールで，二つのキチナーゼ遺伝子と対照遺伝子の発現について信頼性の高い値を与えることが分かった。
マウス組織における Chit1 と AMCase の発現
四種類の胎生期と様々な成体組織から抽出した total RNA を，単一の標準 DNAを用いた qPCR 法で解析した（図 2.4）。結果は，total RNA 10 ng あたりの分子数として表した（図 2.7）。
Chit1 と AMCase mRNA は，マウス組織で広く発現していた（図 2.7A，2.7B）。
両キチナーゼの発現パターンにおいて，明らかな組織特性があることが分かった。
Chit1 mRNA の高い発現レベルは，マウスの胃（図 2.7A，上図）で，次いで，目と肺において検出された。Chit1 mRNA は，他の組織で低レベルながらも容易に検出できた（図 2.7A，下図）。AMCase mRNA は，胃で極めて高く発現し，次いで顎下腺においても高い発現レベルで検出され（図 2.7B 上図），他の組織でも発現していた（図 2.7B，下図）。
次に，AMCase の Chit1 に対する比を求めた。それぞれの mRNA のコピー数を同一の標準 DNA の希釈液を使って定量した。その結果，AMCase mRNA が主に胃11と顎下腺で極めて高いレベルで発現していることを見出した（図 2.7C，上図）。本
研究で調べた他の組織は，AMCase が Chit1 より多く発現していた。また Chit1 がAMCase よりも優勢に発現していたのは目のみであった（図 2.7C，下図）。
肺と胃組織での Chit1 と AMCase の mRNA レベル
ほ乳類キチナーゼに関わる多くの研究は，肺組織を用いて病態生理学的に行われている。本研究では，AMCase mRNA がマウスの胃組織で特異的に発現していることを示した（図 2.7）。ここで，三ヶ月齢のマウスの肺と胃組織から抽出した cDNA(n=5) を用いてキチナーゼと対照遺伝子の mRNA レベルの比較を行った。その定量
結果は，total RNA 10 ng あたりの分子数として表した（図 2.8）。
Chit1 のレベルを 1.0 としたとき，各 cDNA の相対的な発現量は，マウスの肺でAMCase 14，GAPDH 196，β-アクチン 681 だった（図 2.8A）。この結果は，肺組織で Chit1 より AMCase が多く発現しているが，AMCase の mRNA レベルはハウス
キーピング遺伝子のレベルよりも低いことを示している。
胃組織において，Chit1 の mRNA レベルを 1.0 としたとき，それぞれの相対的発現レベルは AMCase 721，ペプシノーゲン C 2,261，GAPDH 61，β-アクチン 127だった（図 2.8B）。GAPDH と β-アクチン 遺伝子はよく知られたハウスキーピング
遺伝子で，ほとんどの組織と細胞で常に高いレベルで発現している。ペプシノーゲ
ン C は，消化酵素として機能するアスパラギン酸プロテアーゼであり，胃において生産され，胃液の主要な成分である [56]。AMCase mRNA の発現レベルは，
GAPDH や β-アクチンのレベルよりかなり高く，ペプシノーゲン C のレベルに匹敵した。この結果は，胃の AMCase は胃粘膜で主要な転写産物であり，この酵素は胃において生理的に重要な役割を果たしている可能性を示す。
第 4 節 考察
Chit1 と AMCase はゴーシェ病，キチン含有病原体に対する生体防御の役割を果たしていると考えられている [2,38]。さらに，AMCase はアレルギー炎症において，インターロイキン 13 のエフェクター応答に寄与している [34]。これらキチン
分解酵素は，喘息モデルマウスでのアレルギー性気道反応の病態生理で重要な役割をしていると考えられている。しかし，生体内での Chit1 と AMCase の発現レベルについてはあまり知られていない。mRNA の定量は，有用で生物医学的に重要な情報を提供し得る。本研究において，同一の尺度で二つのほ乳類キチナーゼの mRNA
レベルの定量とこれらのレベルを対照遺伝子のレベルと比較することができる新規
qPCR システムを確立した。
Real-time PCR は，目的の特定遺伝子の発現を分子レベルで定量することが可能である。この技術を使った mRNA 定量については多くの報告がある。しかし，この方法は同一の尺度での複数の遺伝子の定量ができないため，その目的には広く使わ12れていない。本研究では，五つの cDNA 断片（長さはそれぞれ約 200 塩基対）で構成されている標準 DNA を作成した。これらの断片は，二つのキチナーゼ，二つのハウスキーピング遺伝子そして一つのマーカー遺伝子 cDNA 断片からなり，等量ずつ連結した（図 2.4A）。現在，最も一般的なハウスキーピング遺伝子として使われるのは GAPDH と β-アクチンで，本研究では PCR 増幅の内部コントロールであり対照遺伝子として用いた。さらに，胃で高いレベルで発現しているため，胃のマーカー遺伝子としてペプシノーゲン C を用いた [56]。この方法は，total RNA 10 ng
あたりの Chit1 と AMCase mRNA と対照遺伝子 mRNA の分子数 (molecules/10 ng)の絶対定量を可能にした（図 2.7，2.8）。
相対定量法は，この章で示したような検量線が必要ないため絶対定量より容易に行える。相対定量において，目的遺伝子の mRNA レベルは，ハウスキーピング遺伝子の mRNA レベルで割って，比較される [57]。しかし，この定量法では同一の尺度で異なった遺伝子のレベルを比較することができない。本研究で確立した方法
は，標準 DNA の作成や検証過程に関して複数のステップが必要であるが，この方法は遺伝子間を直接比較できる遺伝子発現データが得られる（図 2.7，2.8）。この章で確立した新規 qPCR 法は，定量性において，広いダイナミックレンジ，高感度である。さらに，転写産物の発現レベルの定量ができたことは，この方法の感度と信頼性が高いことを示している（図 2.5）。この定量法は，同一の尺度で複数遺伝子間の mRNA レベルの定量と比較にとてもよく適している。確立した方法は，医用生
体工学や臨床サンプルにも適用可能である。
この研究で，AMCase mRNA がマウスの胃においてハウスキーピング遺伝子よりもかなり高いレベルで合成されていることを見出した（図 2.7，2.8）。そして，
AMCase の mRNA レベルは，胃液の主要な成分であるであるペプシノーゲン C のレベルに匹敵すること（図 2.8B），胃に加えて，顎下腺も AMCase mRNA が大量に発現していることを示した（図 2.7）。ほ乳類キチナーゼ mRNA の合成に関し，マウスにおいて，胃と顎下腺はどちらも AMCase が大量に生産されている組織として注目すべきである。
胃は，胃粘膜から塩酸が分泌され，ペプシンによるタンパク質の消化のために約
pH 2 の極酸性状態になっている [56,58]。マウス AMCase は，顕著な酸安定性を示
し，pH 2.0 で最大活性を示すことが知られている。これらの点において，マウス
AMCase は他の酵素とは明確に異なる [12]。マウス AMCase の酸性状態における特徴的な pH 安定性と酸依存性は，極酸性条件下でのキチン物質の効率的な分解を可能にする。AMCase がマウスの胃において極めて高いレベルで発現しているという
結果は，この酵素が胃での食物消化で機能している可能性がある。野生のマウスは，昆虫のようなキチン含有物を食べている。一方，実験動物施設で飼育している
マウスは，細胞壁にキチンを含んでいる乾燥ビール酵母を含む人工飼料を食べている。従って，AMCase はおそらく胃内容物中において，高分子量キチンを分解する
13

消化酵素として機能していると推測される。
最も高い Chit1 mRNA レベルもマウスの胃で認められた。しかし，胃においてのChit1 のレベルは AMCase の 1/721 であった。また，二つのハウスキーピング遺伝
子の発現レベルよりも低かった（図 2.8A）。さらに Chit1 は，胃液の約 pH 2 の条
件下ではキチナーゼ活性を示さない [10,14]。Chit1 は，胃や小腸の非腺部分のような中性付近の pH 領域で発現することが示されている [13]。従って，Chit1 は，マウスの胃においてキチナーゼ活性に寄与していないと考えられる。
AMCase は胃や顎下腺で非常に高いレベルで発現していた。他方，この研究で調べた他のすべての組織では，Chit1 と AMCase mRNA は低いレベルだった。Chit1と AMCase mRNA の発現レベルは，これらの組織ではハウスキーピング遺伝子のレベルよりも低かった。Chit1 は，pH 5 付近に広い至適 pH を示す [10]。他方，
AMCase の主要な至適 pH は pH 2 で，第二の至適 pH は pH 4-7 である。
AMCase は，この二番目の至適 pH では pH 2 での 30% 未満のキチナーゼ活性を保持しているに過ぎない [12]。Chit1 と AMCase は，どちらもエンド型キチナーゼとして作用すると考えられており，天然のキチンを分解し，キトビオースを生産す
る [12,59]。AMCase は，マウスの多くの組織で Chit1 よりも優勢な発現をしている
が，両酵素はおそらくマウス組織でキチン分解活性において著しい差はないと考えられる。
Chit1 mRNA は，発育段階の組織で徐々に発現が増加していることが分かった。
AMCase mRNA は目以外のマウス組織において，Chit1 mRNA よりも多く発現していた。この結果は，Chit1 の遺伝子発現が発育段階で特異的に制御される可能性を示
し，Chit1 が個体発生において役割を果たす可能性を示唆している。
ほ乳類はキチンとその合成酵素を生産しないが，絶えず，キチン含有寄生虫や病
原体にさらされている。キチンは，それらの病原体の主要構成成分である。ほ乳類
キチナーゼの基質は，おそらく真菌，寄生虫，線虫などに由来する環境性のキチンであろう。両酵素は，肺において，気道アレルギーを誘導するカビやダニのようなキチン含有病原体に対する生体防御メカニズムの一部として作用していると考えられる。さらに，マウス胃における AMCase は，食物消化で重要な役割を果たしていると考えられる。
第 5 節 要約
キチナーゼは，甲殻類，昆虫，真菌類の主な構成要素であるキチンの β-1,4 グリコシド結合を加水分解する。ほ乳類はキチンとその合成酵素を生産しないが，活性のある二種類のキチナーゼ，Chit1 と AMCase，を発現している。これらのほ乳類キチナーゼはゴーシェ病，アルツハイマー病，喘息などのいくつかの病態状況で発現が増加するので，注目されている。しかし，Chit1 と AMCase がそれらの病気の病
態生理にどのように寄与するかは未決定のままである。Chit1 と AMCase mRNA レ
14

ベルを定量し，良く知られている対照遺伝子の発現レベルと比較することで，両キチナーゼの生物医学的に重要な情報を収集することができる。最初に mRNA レベ
ルを定量しようとする目的遺伝子の cDNA 断片を 1 モルずつ結合して標準 DNAを作成し，それを標準物質とした新規 qPCR システムを確立した。このシステム
は，キチナーゼと対照遺伝子の発現レベルを同じスケールで定量し，遺伝子間で発現を比較することを可能にした。次に，AMCase mRNA が，マウスの胃で，極端に高いレベルで合成されていることを見出した。マウスの胃での AMCase mRNA レベ
ルは，ハウスキーピング遺伝子の発現レベルの 7-10 倍で，胃液の主要成分である
ペプシノーゲン C mRNA の発現レベルに匹敵した。このことから，AMCase mRNA
はマウスの胃で主要な転写産物の一つであることが分かった。この結果は，AMCase
が胃の内容物中で高分子量キチンを分解する消化酵素として機能し，そしてキチン含有病原体に対する生体防御の一部として働いている可能性を示唆する。

15

表 2.1. Real-time PCR プライマー の塩基配列
AMCase_Fw: TTTTGGCAGTGCATCAATGG
AMCase_Rv: GCAGCAATTACAGCTGGTATCAA
Chit1_Fw: CGGCAGGAACTAAATCTTCCAT
Chit1_Rv: TGGGCGTGGCTCAGGTATPep C_Fw: TGCCAAGGCATTGTAGACACA
Pep C_Rv: CTCCTATGGTCTGCAGAAGTTCATTGAPDH_Fw: TGTGTCCGTCGTGGATCTGAGAPDH_Rv: CCTGCTTCACCACCTTCTTGA
β-アクチン_Fw: ACGGCCAGGTCATCACTATTG
β-アクチン_Rv: CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA

表 2.2. マウス標準 DNA を作成するために用いたプライマーの塩基配列
Quant_AMC_Fw: CATGGAATTCGGAGGCAGTGGATTCTGTGCCGACA
Bgl_quant_AMC_Rv: TGACAGATCTTGGCCAGTTGCAGCAATTACAGCTG
Bgl_quant_Pep C_Fw: CATGAGATCTTGGCAACCAGGCCTCTGGCTGGTGC
Xho_quant_Pep C_Rv: TGACCTCGAGACAAAATACTGTCCATACTCTCCTT
Xho_quant_Chit1_Fw: CATGCTCGAGTGGACTTGGATGACTTCAAGGGTTC
Pst_quant_Chit1_Rv: TGACCTGCAGTAGCCCTGGGCTGGGTCCCTGCTCT
Pst_quant_GAPDH_Fw: TGACCTGCAGGAGCTGAACGGGAAGCTCACTGGCA
Not_quant_GAPDH_Rv: TCGAGCGGCCGCTCCTCAGTGTAGCCCAAGATGCC
Not_quant_β-アクチン_Fw: TCGAGCGGCCGCCGAGCAGGAGATGGCCACTGCCG
Quant_β-アクチン_Rv: TGACAGATCTTGGGTACATGGTGGTACCACCAGAC

表 2.3. PCR で完全コード cDNA を増幅させるためのプライマーの塩基配列
Full_AMCase_FW: CATGGAATTCCGGGAGGAACGATGGCCAAGCTACT
Full_AMCase_Rv: GTGACCTCGAGCTGGCCAGTTGCAGCAATTACAGC
Full_Chit1_Fw: CATGGAATTCGGAACAAGTTGTAGAGCTCTCGGCT
Full_Chit1_RV: GTGACCTCGAGCGCTCCAGGTACAACATTTGCAAG
Full_Pep C_Fw: GCTCGAAGTGATTTCTTCCAGTGAG
Full_Pep C Rv: GCGGGGCAGATGGGACAGGCTGAGG
Full_GAPDH_Fw: GTGCAGTGCCAGCCTCGTCCCGTAG
Full_GAPDH_Rv: ATTCAAGAGAGTAGGGAGGGCTCCC
Full_β-アクチン_Fw: GCGTCCACCCGCGAGCACAGCTTCT
Full_β-アクチン_Rv: GGAGTGGGGGTGGCTTTTGGGAGGG
16

17

18

図 2.1. 完全コード cDNA の塩基配列と分子量
Chit1 は 1,622 塩基対，AMCase は 1,462 塩基対，GAPDH は 1,185 塩基対，βアクチンは 1,585 塩基対，ペプシノーゲン C は 1,300 塩基対である。開始コドンである ATG は，太字で強調した。翻訳領域は，下線で示す。

図 2.2. 五つの遺伝子発現レベルを比較するための研究方針
Chit1 と AMCase 遺伝子の発現レベルを比較した。キチナーゼレベルを評価する
ため，ほとんどの組織や細胞で常に高いレベルで発現している二つのハウスキーピ
ング遺伝子である GAPDH と β-アクチンを用いた。さらに，胃粘膜の主要成分であるペプシノーゲン C を胃組織での対照遺伝子とした。これら三つの対照遺伝子を用いて，マウス組織での Chit1 と AMCase の遺伝子発現レベルを評価した。

19

図 2.3. Real-time PCR 用のプライマー適合性の評価
PCR プライマーは，PCR 産物の Tm が均一であるか (A-E)，10% ポリアクリル
アミドゲルで一つの PCR 産物を与えるか (F) をもとに選別した。プライマーの特異性を検証するため，マウス組織 cDNA の混合液を鋳型として五つの遺伝子のPCR 産物の熱融解曲線を検討した。PCR 産物は，10% ポリアクリルアミドゲル電
気泳動後，エチジウムブロマイド染色で分析した。

図 2.4. 標準 DNA の作成(A) Real-time PCR で使用する標準 DNA の模式図。AMCase，ペプシノーゲン
20

C，GAPDH，β-アクチン cDNA のターゲット領域と隣接する配列と制限酵素部位を有する断片を増幅し，得られた DNA 断片を一分子ずつ連結し，クローニングベク
ターにクローン化した。プラスミド DNA から直鎖化した標準 DNA を増幅し，標準 DNA として使用した。(B) 標準 DNA の塩基配列。標準 DNA は 913 塩基対で，隣接する 9-120 塩基領域を加えた PCR ターゲット領域（太字下線で示した）をカバーする五つの cDNA 断片を含んでおり（異なる色で示した），BglII，XhoI，
PstI，NotI（太字斜字体）の制限酵素部位を含んでいる。

図 2.5. 標準 DNA を使った qPCR システムの確立と検証検証した DNA は次のとおりである。(A) Chit1，(B) AMCase，(C) GAPDH，(D) βアクチン，(E) ペプシノーゲン C。（左図） 各ターゲット遺伝子のプライマーを使った標準 DNA の各 10 倍の希釈系列での qPCR で定量した。（右図） 五つのcDNA 断片を含む標準 DNA を使った標準曲線（茶色○）。また，完全コード cDNAの定量を各遺伝子のプライマーを使って行った。ターゲット cDNA を既知濃度の完
全コード cDNA の希釈から増幅し（図 2.6 参照），その後未知サンプルとして分析した（青色◇）。ここで検証した標準曲線と完全コード cDNA の希釈が同じ量であることが確認できた。

21

図 2.6. 各ターゲット遺伝子のプライマーを使って既知濃度の完全コード cDNA の
10 倍の希釈系列での qPCR による定量

図 2.7. マウス組織における Chit1 と AMCase mRNA の発現
マウス組織における Chit1 (A) と AMCase (B) mRNA の定量。両キチナーゼ標準
鋳型 DNA を使って qPCR で定量した。得られたすべての値は，total RNA 10 ng あたりの分子数で表した。(C) AMCase の Chit1 に対する比。全ての mRNA コピー数
は，同じ標準 DNA の希釈をもとに算出した。図の縦軸は，上は実数値で，下は対数値で示している。

22

図 2.8. 肺と胃組織における Chit1，AMCase そして参照遺伝子 mRNA の分析
三カ月齢のマウスの肺 (A) と胃 (B) 組織（それぞれ n=5）から調製した cDNAを用いて五つの遺伝子の発現レベルを qPCR で定量した。図の縦軸は，上は実数値で，下は対数値で示している。

23

第 Ⅲ 章Real-time PCR によるヒトとマウス組織のキチナーゼ

mRNA レベルの定量：胃組織における酸性ほ乳類キチナーゼの種特異的発現
第 1 節 序論
ヒトにおいて，ほ乳類キチナーゼの発現と炎症性疾患状態との関連が示されている。Chit1 の発現は，ゴーシェ病，COPD，喫煙者，アルツハイマー病で上昇する[30-33]。AMCase は，喘息モデルマウスのアレルギー性気道応答で増加する [34]。
また，AMCase の発現は高分子量キチンによって誘導される [35]。さらに，AMCaseの遺伝子多型は，ヒトの気管支喘息に関係している [36,37]。しかし，ほ乳類キチナーゼの病態生理学的な役割はわかっていない。第 Ⅱ 章で，同じスケールでキチナーゼと参照遺伝子の発現レベルの定量と比較をするため，一つの標準 DNA を使った qPCR システムを確立した [61]。その方法での定量結果は，AMCase mRNA が，マウスの胃で主要な転写産物であり，ペプシノーゲン C の発現に匹敵するレベルで発現していることを示した [61]。本章では，正常なヒト組織でのほ乳類キチナーゼの発現レベルを調べるために，確立した方法を応用した。さらに，ヒトとマウス組
織間で複数遺伝子の mRNA レベルを比較するために，ヒト-マウス複合型標準
DNA を使った定量システムを確立し，それぞれの発現レベルを定量した。
第 2 節 実験材料と実験方法
RNA と cDNA の調製
この研究では，Mouse Total RNA Master Panel と Human Total RNA Master Panel II(Clontech Laboratories 社) を使用した。さらに，三ヶ月齢のオスのマウスの唾液腺，小腸，大腸から RNA を単離した。C57BL/6J マウスは，RIKEN 脳科学研究所の動物施設で飼育された。マウスからの mRNA 調製は第 Ⅱ 章第 2 節に記載したように行った。
Real-time PCR
Real-time PCR のプライマーは，Primer Express Software で設計し，その合成はSigma-Genosys に依頼した (Sigma-Aldrich 社)。PCR 反応は，第 Ⅱ 章に記載した通りに行った。反応産物の熱融解曲線は，PCR 増幅後に MxPro QPCR Software version
4.10 で作成した。ここで qPCR のために選択したプライマーの塩基配列は，表 3.1
に示した。

24

ヒト標準 DNA の作成
ヒトの遺伝子の標準 DNA の作成と完全コード領域をカバーした五種類のヒトのcDNA の調製は，第 Ⅱ 章に記載した方法で行った。
標準 DNA の作成に用いたプライマーは，表 3.2 に記載した。PCR 産物は，該当する制限酵素で処理を行い，T4 DNA リガーゼ を使って結合した。連結した DNA
断片は，フォワードプライマー 5’CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3’ とリバースプライマー 5’CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3’ を使って増幅し，pGEM-T Easy ベ
クターにクローン化した。検証した cDNA の配列は，図 3.1 に示す。標準 DNA（1,396 塩基対）は，同じプライマーを使って PCR でプラスミド DNA から再び増幅して調製した。
完全コード領域をカバーしている五つのヒトの cDNA の調製
ヒトの完全コード cDNA は，表 3.3 に記載したプライマーを使って PCR で増幅し，pGEM-T Easy ベクターにサブクローニングをした。cDNA の配列は，第 Ⅱ 章と同様にシークエンスによって決定した（図 3.2）。サブクローニングした断片は，同じプライマーを使ってプラスミド DNA から再び増幅し，完全コード領域のcDNA として使った。
Real-time PCR による mRNA の定量
第 Ⅱ 章で記載した通り，構成されるヒト標準 DNA のモル濃度を計算した。標準 DNA は，100 分子から 1,000 万分子の範囲で 10 倍ずつ段階希釈を行い，使用するまで一定量を -20°C で凍結保存した。mRNA の定量は，第 Ⅱ 章で記載した通りに行った。それぞれのサンプルは三度増幅し，それぞれの実験は少なくとも二回繰り返した。
ヒト-マウス複合型標準 DNA の作成
この章での qPCR によって転写レベルの定量に使ったヒト-マウス複合型標準DNA（2,305 塩基）は，以下の通りに作成した。3’ 末端に EcoRI の制限酵素部位を含むマウスの標準 DNA をフォワードプライマー 5’GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3’ とリバースプライマー 5’CATGGAATTCTGGGTACATGGTGGTACCACCAGA-3’ を使って PCR で増幅した。
5’ 末端に EcoRI の制限酵素部位を含むヒトの標準 DNA（図 3.1）も同様に調製した。PCR 産物は，EcoRI で処理し，アガロースゲル電気泳動により精製し，T4
DNA リガーゼ を使って連結させた。連結した断片は，フォワードプライマー 5’GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC-3’ とリバースプライマー 5’CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3’ を使って PCR で増幅した。得ら
25

れた DNA は，pGEM-T Easy ベクターにクローン化した。DNA の検証した配列は
図 3.3 に示す。直線化したヒト-マウス複合型標準 DNA は，同じプライマーを使ってプラスミド DNA から PCR で再び増幅し，調製した。標準曲線を作成し，第 Ⅱ章で述べた通りに mRNA の定量を行った。
抗体調製
マウスとヒト AMCase に特異的なウサギのポリクローナル抗体を作製した。Cysペプチド（マウス AMCase は KADGLYPVADDRNAFWQC，ヒト AMCase は
RANGLYPVANNRNAFWHC）は，C 末端システインを用いてキーホールリンペット
ヘモシアニン (KLH) に結合した。ウサギの抗体は，抗原を Sulfolink (Pierce 社) に
システインを介して結合させ，血清からアフィニティー精製した。それぞれの抗体の特異性は，ウエスタンブロッティングにより確認した。
マウスの胃のタンパク質の調製とヒトの胃の可溶化液
三ヶ月齢のマウス (C57Bl/6J) の胃を，氷上で，10 倍量の 150 mM NaCl とプロテアーゼ阻害剤 (Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet, Roche Diagnostics 社) を含
む 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) で，テフロン-ガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズした。破砕物は 17,000 x g で 4℃，10 分間遠心し，可溶性画分を回収した。正常なヒト胃組織の全タンパク質の抽出液は，Novus Biologicals 社より購入した [Cat. no. NB820-59263; Whole Normal Fundus Stomach Tissue Lysate (Adult
Normal)]。それぞれのタンパク質は，Protein Assay (Bio-Rad 社) で定量した。
キチナーゼの酵素活性
キチナーゼの酵素活性は，Chitinase Assay Kit, Fluorimetric (Sigma-Aldrich 社) を使って測定した [10,12,13,30]。遊離した 4-methylumbelliferyl β-D-N, N'-diacetylchitobiose(4MU-chitobiose) と 4-methylumbelliferyl β-D-N, N', N''-triacetylchitotriose (4MUchitotriose) は，分光蛍光光度計 (RF-5300PC, Shimazu 社) を用いて，励起波長 360nm，蛍光波長 450 nm で測定した。遊離した 4MU の量は，4MU (Sigma-Aldrich社) で作製した標準曲線を使って算出した。
ウェスタンブロット
胃の可溶性タンパク質 12.5 µg を 10% SDS ポリアクリルアミドゲルでに分離した [62]。電気泳動で分離したタンパク質を PVDF メンブレン (Immobilon-P,
Millipore 社) に電気泳動的に転写し，上記の抗ヒト AMCase 抗体，または，抗マウス AMCase 抗体，続いて，抗ウサギ IgG (H+L) 抗体 (Jackson ImmunoResearchlaboratories 社) と反応した。目的タンパク質に結合した抗体を Immobilon Western
Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore 社) を用い検出し，Luminescent Image
26

Analyzer で解析した。コントロールとして，モノクローナル抗体である抗 β-アクチン抗体 (clone AC-15) (Sigma-Aldrich 社)，続いて，抗マウス IgG 抗体 (H+L)(Jackson ImmunoResearch laboratories 社) と反応した。先に述べたように抗体を検出し，解析した。
第 3 節 実験結果
Real-time PCR システムの確立と検証
正常なヒト組織における Chit1 と AMCase 遺伝子の発現レベルを次の対照遺伝子を使って解析した（図 3.4A）。対照遺伝子は第 Ⅱ 章のマウスでの解析と同様に，二つのハウスキーピング遺伝子 (GAPDH と β-アクチン)，ペプシノーゲン C を用いた。ペプシノーゲン C は，マウスの胃において AMCase mRNA レベルが，ペプ
シノーゲン C のレベルに匹敵したためである [61]。
qPCR のためのプライマーを設計し，そのプライマーから増幅した産物が一つの熱融解温度 (Tm) を示すか，10% ポリアクリルアミドゲルで一つのバンドかどうか，でプライマーを評価した。そして，産物の塩基配列も確認した。図 3.5A-E に示すように，五つの cDNA の解離曲線それぞれで一つのピークが見られた。ゲル電気泳動では，それぞれ Chit1 (54 bp)，AMCase (61 bp)， GAPDH (56 bp)，β-アクチン(56 bp)，ペプシノーゲン C (60 bp) で期待サイズに明確な一つのバンドが認められた（図 3.5F）。従って，目的の PCR 産物がヒト組織 cDNA 混合液からここで選択したプライマーによって増幅したことが分かった。
次に，qPCR のための標準 DNA を，五つの cDNA 断片を 1 分子ずつ連結させて作成した（図 3.1，3.4B）。1,396 塩基の標準 DNA は，PCR ターゲット領域をカバーし，隣接する 66-143 塩基領域を加えた五つの cDNA 断片と BglII，SalI，XhoI，
NotI の制限酵素部位を含んでいる（図 3.1，3.4B）。
両キチナーゼと対照遺伝子の mRNA の定量には，標準曲線が必要である。まず，その標準曲線を使って，real-time PCR の定量性を検証した。それぞれの標準曲
線は，五つの異なるプライマーを使ってヒト標準 DNA を 10 倍希釈ずつ段階希釈して作成した（図 3.1A-E，赤●）。
標準曲線が絶対的に等量になっていることを示すために，ヒトの全コード領域をカバーしている既知濃度の cDNA を増幅し，未知試料として解析した。この解析
は，希釈液が期待量得られているかを確認するために行った。図 3.6A-E に青◇で示すように，標準曲線と完全コード cDNA の希釈が同じ量であることが確認できた。
第 Ⅱ 章の方法を応用した方法でも，real-time PCR の敏感性と信頼性を確認する
ことができ，定量化のダイナミックレンジ，高い正確性，高感度であることを示している（図 3.6A-E）。従って，応用した real-time PCR 法は，同じスケールで，ヒトの二つのキチナーゼ遺伝子と三つの対照遺伝子の発現について信頼性の高い値を与える
27

ことを確認できた。
正常ヒト組織における Chit1 と AMCase の発現
様々な正常ヒト組織の total RNA を一つの標準 DNA を使った定量 qPCR 法で解析した（図 3.4）。結果は，total RNA 10 ng あたりの分子数として表した（図 3.7，
3.8）。
Chit1 と AMCase mRNA は，ヒト組織で広く発現していた（図 3.7A，3.7B）。
Chit1 mRNA はヒトの肺で最も高く，次いで脾臓，胎児の肝臓，胸腺であった（図3.7A）。AMCase mRNA は肺で高いレベルで，次いで胎児脳，肝臓，甲状腺の順に検出された（図 3.7B）。AMCase mRNA は，マウスの胃で非常に高いレベルで発現していたが，ヒトの胃では，肺，胎児脳，胎児肝臓，甲状腺，心臓のレベルよりもはるかに低かった（図 3.7B）。他の組織において，Chit1 と AMCase mRNA は低レベ
ルであったが，容易に検出できた（図 3.7A，3.7B）。
AMCase と Chit1 mRNA レベルを比較すると，両 mRNA は脾臓と胎児肝臓で比較的高く発現していた。一方，胎児脳，前立腺，肝臓は，Chit1 より AMCase が多く発現していた。
正常ヒト肺と胃組織での Chit1 と AMCase の発現レベルの解析
第 Ⅱ 章と同様に，ヒト肺と胃組織でのキチナーゼと対照遺伝子の発現レベルを比較した（図 3.8）。ヒトの肺組織において，Chit1 レベルを 1.0 としたとき，各cDNA の相対発現レベルは，AMCase 0.8，GAPDH 39，β-アクチン 343 だった（図3.8A）。Chit1 と AMCase mRNA は正常なヒトの肺で同じくらいのレベルで発現していたが，Chit1 の発現レベルは 二つのハウスキーピング遺伝子のレベルよりはるかに低かった。
ヒトの胃組織において，Chit1 レベルを 1.0 としたとき，それぞれの相対的発現レベルは AMCase 1.5，GAPDH 323，β-アクチン 1,736，ペプシノーゲン C 3,962 だった（図 3.8B）。AMCase mRNA は Chit1 と同等のレベルであった。Chit1 とAMCase の mRNA レベルは，ヒトの胃組織において GAPDH と β-アクチンの発現レベルよりかなり低かった。これらの結果から，ヒト組織において，全体の Chit1と AMCase mRNA レベルは比較的低く，AMCase の胃での発現レベルはヒトとマウスでかなり異なっていることがわかった。
ヒト-マウス複合型標準 DNA を使った定量システムの検証
次に，qPCR 法を使ってヒトとマウス組織で，同じスケールで二つのキチナーゼの発現レベルを比較する（図 3.9A）。そこで，qPCR で用いるヒトとマウスの標準
DNA を結合した，ヒト-マウス複合型標準 DNA を作成した（図 3.3B）。得られた
2,305 塩基対の標準 DNA は，ヒトとマウス遺伝子の PCR ターゲット領域をカバー
28

し，隣接する領域に 9-143 塩基加えた十個の cDNA 断片を含んでいる（図 3.3）。
標準曲線を使った qPCR 法の検証結果は，図 3.10，3.11，3.12 に示す。ヒト-マウス複合型標準 DNA の希釈液は，標準曲線を作成するために 10 倍ずつ段階希釈して作成した（図 3.10，ヒト，赤●；マウス，紫▲）。ヒトの全コード領域をカバーしている既知濃度の各 cDNA と同じ量であることが確認できた（図 3.10A-E）。同様に，マウスの五つの遺伝子もマウスの全コード領域をカバーしている既知濃度の各 cDNA と同じ量であることが確認できた（図 3.11A-E）。さらに，二つの標準曲線と既知濃度のヒトとマウスの完全コード cDNA の二つの希釈曲線は一致した（図3.12A-E）。従って，確立したヒト-マウス複合型標準 DNA を使った qPCR 法は，同一のスケールで四つのキチナーゼ遺伝子と六つの対照遺伝子の発現について信頼できる解析ができる（図 3.9B）。
Chit1 と AMCase mRNA レベルのヒトとマウス組織での比較
本研究では，Human Total RNA Master Panel II と Mouse Total RNA Master Panel(Clontech Laboratories 社) を使用した。ヒトとマウスで重複した組織が四つ（肺，肝臓，腎臓，脾臓）あり，喘息とゴーシェ病に関係している。マウスの胃組織のキチ
ナーゼの発現に顕著な違いがあったので，ヒトとマウスで消化器官である唾液腺，胃，小腸，大腸におけるキチナーゼの発現レベルを調べた。ヒト組織において，ヒト-マウス複合型標準 DNA（図 3.9B）を用いて発現レベルを定量し，比較した結果を図 3.13 に示した。
Chit1 mRNA は，マウスの胃で最も高い発現レベルで，次いでヒトの肺組織だった。全体的に見て Chit1 mRNA は，ヒト組織の方が高いレベルで発現していた（図3.13A）。AMCase mRNA の最も高い発現レベルは，マウスの胃で，次いでマウスの唾液腺で高かった（図 3.13B）。ヒト組織で AMCase は低かった（図 3.13B）。小腸と大腸における Chit1 と AMCase mRNA レベルは，ヒトとマウス組織でとても低かった（図 3.13）。この結果は，以前報告されたノーザンブロット解析で得られた結果と一致した [12,13]。
次に，ヒトとマウスの肺と胃組織から抽出した cDNA を使ってキチナーゼと対照
遺伝子の発現レベルを比較した（図 3.14）。肺組織でヒト Chit1 レベルを 1.0 としたとき，それぞれの相対的発現レベルは，マウス Chit1 0.3，ヒト AMCase 0.3，マウ
ス AMCase 7 であった（図 3.14A）。マウス AMCase は，マウスの肺で高く発現していた。ヒト肺の Chit1 レベルは，マウスの肺より 3 倍高かった。Chit1 とAMCase レベルは，GAPDH と β-アクチン遺伝子より著しく低かった（図3.14A）。
胃組織において，ヒト Chit1 レベルを 1.0 としたとき，それぞれの相対的発現レ
ベルは，マウス Chit1 10，ヒト AMCase 0.7，マウス AMCase 1,978 であった（図3.14B）。マウスにおける AMCase の mRNA レベルは，GAPDH と β-アクチンより29

高かく，ペプシノーゲン C のレベルに匹敵した。一方，ヒトの胃での AMCasemRNA は，とても低かった。胃において，ヒト AMCase の発現レベルを 1.0 としたとき，マウス AMCase の相対発現レベルは 2,826 だった。
胃組織におけるタンパク質レベルの解析
ヒトとマウスで mRNA レベルの差がタンパク質レベルに反映されているかどうか調べるために，胃組織におけるキチナーゼの酵素活性を分析した。まず，マウスとヒトの胃組織で AMCase の活性を解析した。マウス AMCase は，おもな至適
pH が pH 2 で，第二の至適 pH は pH 5 付近である。一方，ヒトの AMCase は，
pH 2～pH 5 の広い至適 pH を示す。そこで，人工基質である 4MU-chitobiose を用いてキチン分解活性を，pH 2.0 と pH 5.0 で測定した [12,13]。マウスの胃の抽出液において，pH 2.0，次いで pH 5.0 で強いキチン分解活性を検出した。一方，pH 2.0
でヒトのキチン分解活性は検出されなかった。また，pH 5.0 で活性は低かった（図3.15A，左図）。
Chit1 の酵素活性を pH 5.2 で 4MU-chitotriose を使って測定した [12,13,30,63]。
また，Chit1 活性の影響を見るため，4MU-chitotriose を使って pH 2.0 でキチナーゼ
活性を分析した。4MU-chitotriose に対して強いキチナーゼ活性を pH 2.0 でマウスの胃の抽出液で検出した（図 3.15A，右図）。また，弱いキチナーゼ活性を pH 5.2 でも検出した（図 3.15A，左図）。AMCase は，二つ目の至適 pH が pH 5 付近である
ので，pH 5.2 のほとんどのキチン分解活性は，おそらく Chit1 というよりはむしろ
AMCase と考えられる。また，この結果は，マウス AMCase が基質として 4MUchitotriose を pH 2.0 で加水分解できることも示している。以上のことから，マウスの胃におけるキチナーゼ活性の大部分は，AMCase 活性である。ヒトの胃の抽出液においては，pH 2.0 と pH 5.2 でのキチン分解活性のレベルをとても弱いが，検出可能なレベルであった（図 3.15A，右下図）。pH 5.2 でのキチナーゼ活性は，pH 2.0の活性に匹敵し，このことは，ヒトの胃で Chit1 が発現していることを示す。
AMCase に対する抗体を使ったウエスタンブロッティングでタンパク質の発現レベルを解析した。AMCase 抗体は，すでに報告されたマウスペプチド [35] に相当す
るヒトペプチドに対して作製した。抗マウス AMCase 抗体は，マウスの胃の抽出液で強い一つのバンドを認識した（図 3.15B，左図）。同様に，抗ヒト AMCase 抗体
もマウスの抽出液で一つのバンドを認識した（図 3.15B，右図）。しかし，ヒト胃の抽出液では，少し分子質量が高いバンドがヒトとマウスの抗体でわずかに検出された（図 3.15B）。ヒト胃の抽出液で 4MU-chitobiose を使った pH 2.0 か pH 5.0 のど
ちらにも著しいキチナーゼ活性がなかったため，これらのバンドは，ヒト AMCaseではないと考えられる。従って，マウスとヒトの胃組織でキチン分解活性と相対的なタンパク質発現レベルは，mRNA レベルで得られたデータと一致した。
30

第 4 節 考察
ヒトにおいて，ほ乳類キチナーゼの発現と炎症性疾患状態との関連が示されている [3037]。しかし，ほ乳類キチナーゼの病態生理学的な役割はわかっていない。ヒト組織でこれらのキチナーゼの発現レベルを研究するため，第 Ⅱ 章で確立した方法を応用した。さらに，ヒトとマウス組織でキチナーゼの発現レベルを評価するため，一つのヒト-マウス複合型標準 DNA を使った定量システムを開発し，定量した。ここで確立した方法は mRNA の検出に十分な感度であり，ヒトとマウス組織で，同じスケ
ールでキチナーゼの遺伝子発現パターンの網羅的な解析を可能にした。
定量結果から，ヒトとマウスの肺組織で Chit1 は，相対的に高いレベルで，互いにほとんど同程度の発現レベルであった。これは，Chit1 mRNA の発現レベルがヒトとマウス間で保存されていることを示す。肺において Chit1 は，真菌やダニのようなキチン含有病原体に対して保護する生体防御の一部として作用していると考えられている [63]。ヒトとマウスにおける Chit1 の遺伝子発現レベルの保存は，肺における Chit1 の生理学的重要性を示唆している。
胃におけるキチナーゼの発現は，特に重要である。AMCase mRNA は，マウスの胃で非常に高いレベルで合成されるが，ヒトの胃ではそうではなかった（図3.14B）。ヒトの胃における AMCase mRNA レベルは，マウスの胃の約 1/2,800 であった。ペプシノーゲン C と二つのハウスキーピング遺伝子は，ヒトとマウスの胃組
織でとても高いレベルで発現していた（図 3.14B）。従って，ヒトの胃における
AMCase mRNA の低い発現は，cDNA 調製中の RNA の分解によるものではない。
従って，胃組織における AMCase の発現レベルは，ヒトとマウスで著しく異なる。
胃は，食物の分解や有害な生物に対抗する保護の基本的な役割を果たす重要な器官である。胃では塩酸が分泌され，ペプシンによるタンパク質の分解に適切な酸性状態 (pH=~2) になっている [56,58]。マウス AMCase は，著明な酸安定性を示し，
pH 2 で最も活性が高い [12]。マウスの胃は，非常に多くの AMCase を合成する（図 3.15）。AMCase は，マウスの胃でキチン含有食物を分解する消化酵素として機能できるだろう。
一方，ヒトの胃で，AMCase のレベルは比較的低かった（図 3.13，3.14，3.15）。
これは，現代のヒトはキチン含有食物をたくさん食べないため，発現が低いと考えられる。従って，ヒトの胃で，AMCase がキチン含有生物に対する防御に役割を果たさないことを示唆する。多くの胃の病気は，外来生物による感染と関連している。Helicobacter pylori の感染などは内在性 AMCase の活性と相関するだろう[64]。従って，AMCase の低いレベルがヒトの胃の疾患に関与するかどうか，検討の必要がある。
高いキチン分解活性は，マウスの胃と腸の抽出液で検出されている [12]。ヒトとマウスの胃でキチナーゼの発現レベルで顕著な違いがあるので，これらのキチナー
ゼの発現レベルを唾液腺，小腸，大腸を含む消化器官で検討した。その結果，小腸31

と大腸で Chit1 と AMCase mRNA レベルは，ヒトとマウスの組織でとても低かった
が，マウスの唾液腺と胃は高いレベルで両キチナーゼ mRNA を生産した（図3.13）。マウスの腸のほ乳類キチナーゼタンパク質は，おそらく唾液腺や胃のような消化管に由来するだろう。これは，以前 Boot らが示した概念と一致する [12,13]。
肺組織で Chit1 遺伝子の発現レベルは，ヒトとマウスで保存されている。一方，胃組織で AMCase の発現レベルは種特異的である。これは，肺における Chit1mRNA の発現制御は進化で保存されていたが，一方，ヒトの胃で AMCase の発現の減少は，遺伝子の発現抑制によるものと考えられる。
第 5 節 要約第 Ⅱ 章で，一つの標準 DNA を使った qPCR システムを確立し，マウス
AMCase mRNA が，正常マウスの胃で非常に高いレベルで合成されていることを示した。本章では，この方法を正常なヒト組織におけるキチナーゼ mRNA の定量に応用した。そして，正常なヒト組織で両キチナーゼ mRNA レベルは，広く発現していることを見出した。Chit1 mRNA は，ヒトの肺で高く発現していた。一方，
AMCase は正常なヒトの胃で低い発現だった。これらの mRNA レベルは，ヒト組織において，ハウスキーピング遺伝子のレベルよりも著しく低かった。AMCase の発現レベルがヒトとマウスの胃で著しく異なるため，ヒト-マウス複合型標準 DNAを使った qPCR システムを確立し，ヒトとマウス組織における mRNA レベルを比較した。その結果，Chit1 は正常なヒトとマウスの肺で同じレベルで発現していたことが分かった。一方，ヒトの胃で AMCase の発現レベルは，マウスの胃の発現レベ
ルより著しく低かった。これらのヒトとマウスの胃での mRNA の違いは，キチン分解活性とタンパク質発現レベルの違いに反映されていた。従って，胃でのAMCase の発現レベルは種特異的である。

32

表 3.1. ヒト遺伝子の real-time PCR の塩基配列
H_Chit1_Fw: GTCAACTCGGCCATCAGGTT
H_Chit1_Rv: CAAGGTCAAGGCCGTCAAA
H_AMCase_Fw: CCCTAATCTCCACCCTGAAGAA
H_AMCase_Rv: AGCTGGAGCCGTGCAACTT
H_GAPDH_Fw: ATGGAAATCCCATCACCATCTT
H_GAPDH_Rv: CGCCCCACTTGATTTTGG
H_β-アクチン_Fw: TGGATCAGCAAGCAGGAGTATG
H_β-アクチン_Rv: GCATTTGCGGTGGACGAT
H_Pep C_Fw: TTCCCTCTGCCACCTTCCT
H_Pep C_Rv: CGACTCCCACGGTGCAGTA

表 3.2. ヒト標準 DNA を作成するために用いたプライマー
Eco_quant_H_AMCase_Fw: CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATGA
Bgl_quant_H_AMCase_Rv: TGACAGATCTGCATTTCTGTTATTTGCCACGGGGT
Bgl_quant_H_Pep C_Fw: TGACAGATCTGCAGGCCACAGGGGCCCAGGAGGATSal_quant_H_Pep C_Rv: TGACGTCGACCCCAAGTCGTAGACGGAATAGTAGG
Sal_quant_H_Chit1_Fw: TGACGTCGACTCTCTACCAGGAGTTCAATGGCCTG
Xho_quant_H_Chit1_Rv: TGACCTCGAGCTGCTGGAAGGCATTGGCCAAGTCC
Xho_quant_H_GAPDH_Fw: TGACCTCGAGGCCATCAATGACCCCTTCATTGACC
Not_quant_H_GAPDH_Rv: TCGAGCGGCCGCTGGGGGCATCAGCAGAGGGGGCA
Not_quant_H_β-アクチン_Fw: TCGAGCGGCCGCATGCAGAAGGAGATCACTGCCCT
Quant_H_β-アクチン_Rv: CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG

33

図 3.1. ヒト標準 DNA の塩基配列
5’ 末端に EcoRI の制限酵素部位を含むヒト標準 DNA（1,396 塩基対）と隣接す
る 60-143 塩基領域を加えた PCR ターゲット領域（太字下線）をカバーする五つの
cDNA 断片を含む（異なる色で示した）。さらに，BglII，SalI，XhoI，NotI（太字斜字体）の制限酵素部位を含んでいる。

表 3.3. PCR で完全コード cDNA を増幅させるためのプライマー
H_entire_Chit1_Fw: CATGGAATTCGGACCTGGAAAGCTGGTTTGTATGG
H_entire_Chit1_Rv: GTGACCTCGAGCATTCCAGGTGCAGCATTTGCAGG
H_entire_AMCase_FW: GCTACGGAATTCAACCATGACAAAGCTTATTCTCC
H_entire_AMCase_Rv: GTGACCTCGAGCTGCCCAGTTGCAGCAATCACAGC
H_entire_GAPDH_Fw: CCATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGT
H_entire_GAPDH_Rv: TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGGCC
H_entire_β-アクチン_Fw: CACCATGGATGATGATATCGCCGCG
H_entire_β-アクチン_Rv: CGCCTAGAAGCATTTGCGGTGGACG
H_entire_Pep C_Fw: CTCTGTGGCCAGTTGGGGACCAGCA
H_entire_Pep C Rv: TCTAGGCGGCAGTGGCAAAGCCTAC

34

35

36

図 3.2. ヒトの完全コード cDNA の塩基配列と分子量
Chit1 は 1,471 塩基対，AMCase は 1,456 塩基対，GAPDH は 1,010 塩基対，βアクチンは 1,135 塩基対，ペプシノーゲン C は 1,195 塩基対である。開始コドンである ATG は，太字で強調した。翻訳領域は，下線で示す。

図 3.3. ヒト-マウス複合型標準 DNA の塩基配列
ヒトとマウス標準 DNA は，EcoRI 部位を使って連結した（大文字，太字，斜体で示した），DNA 断片を一対一の割合で連結し，その後，ヒト-マウス標準 DNA として使った。2,305 塩基対の DNA は，十個の cDNA 断片を含む（異なる色で示した），PCR のターゲット領域（太字，下線で示した）とヒトとマウス遺伝子の隣接した 9-143 塩基領域をカバーしており，適切な制限酵素部位を含む（太字斜体）。

37

図 3.4. ヒトの五つの遺伝子発現レベルを比較するための研究方針(A) Chit1 と AMCase 遺伝子の発現レベルを比較した。キチナーゼレベルを評価するため，二つのハウスキーピング遺伝子（GAPDH と β-アクチン）と胃組織での対照遺伝子としてペプシノーゲン C を用いた。これら三つの対照遺伝子を用いて，ヒト組織での Chit1 と AMCase の遺伝子発現レベルを評価した。(B) qPCR で使う
標準 DNA の模式図。AMCase，ペプシノーゲン C，Chit1，GAPDH，β-アクチンのターゲット断片は，それに隣接する配列，制限酵素部位を含み，一対一の割合でDNA 断片を連結した。そして，ヒト遺伝子の解析の標準 DNA として使った。

図 3.5. ヒトの qPCR システムに適したプライマーの評価
ヒトの解析のための PCR プライマーは，PCR 産物の Tm が一つであるか (AE)，10% ポリアクリルアミドゲルで一つの PCR 産物を与えるか (F) をもとに選別した。プライマーの特異性を検証するため，ヒト組織 cDNA の混合液を鋳型として五種類の遺伝子の PCR 産物の熱融解曲線を検討した。PCR 産物は，10% ポリアク
リルアミドゲル電気泳動後，エチジウムブロマイド染色で分析した。
38

図 3.6. ヒト組織の解析のための qPCR システムの発展と検証解析した cDNA は次の通りである。A は Chit1，B は AMCase，C は GAPDH，D
は β-アクチン，E はペプシノーゲン C。標準曲線は，五つのヒトの cDNA 断片を含む標準 DNA を使って作成した（赤色●）。さらに，ヒトの完全コード cDNA の
定量は，それぞれの遺伝子のプライマーを使って行った。ターゲット cDNA は，既知濃度の完全コード cDNA の希釈液から増幅し，未知試料として解析した（青色◇）。ここで検証した標準曲線と完全コード cDNA の希釈が同じ量であることが確認できた。

図 3.7. 正常ヒト組織における Chit1 と AMCase mRNA の発現
39

ヒト組織における Chit1 (A) と AMCase (B) mRNA の定量。両キチナーゼ標準鋳型 DNA を使って qPCR で定量した。すべての値は，total RNA 10 ng あたりの分子数で表した。

図 3.8. 肺と胃組織における Chit1，AMCase，対照遺伝子 mRNA の解析
正常なヒトの肺 (A) と胃 (B) 組織から調製した cDNA を用いて五つの遺伝子の発現レベルを qPCR で定量した。図の縦軸は，上は実数値で，下は対数値で示している。図中の値は，ヒト Chit1 遺伝子の発現レベルを 1.0 としたときの相対発現レベルを示している。

図 3.9. ヒトとマウス組織の Chit1 と AMCase レベルを比較するための研究方針(A) ヒトとマウス組織における Chit1 と AMCase 遺伝子の発現レベルを比較した。(B) 定量に使ったヒト-マウス複合型標準 DNA の模式図。ヒトとマウスの標準
DNA は，EcoRI 部位を使って一対一の割合で連結した。その後，ヒト-マウス標準40

DNA として使用した。

図 3.10. ヒト遺伝子の解析のためのヒト-マウス複合型標準 DNA を使った qPCRシステムの発展と検証解析したヒト DNA は次の通りである。(A) Chit1，(B) AMCase，(C) GAPDH，(D)β-アクチン，(E) ペプシノーゲン C。標準曲線は，五種類のヒトの cDNA 断片を含む複合型標準 DNA を使って作成した（赤●）。さらに，ヒトの完全コード cDNAの定量は，それぞれの遺伝子のプライマーを使って行った。ターゲット cDNA は，既知濃度の完全コード cDNA の希釈液から増幅し（図 3.2），その後，未知試料として解析した（青◇）。ここで検証した標準曲線と完全コード cDNA の希釈が同じ量であることが確認できた。

41

図 3.11. マウス遺伝子の解析のためのヒト-マウス複合型標準 DNA を使った qPCRシステムの発展と検証
図 3.10 に示したのと同様の実験をマウス遺伝子で行った。標準曲線は，五つのマ
ウスの cDNA 断片を含む複合型標準 DNA を使って得た（紫▲）。さらに，マウスの完全コード cDNA の定量は，それぞれの遺伝子のプライマーを使って行った。ターゲット cDNA は，既知濃度の完全コード cDNA の希釈液から増幅し（図 3.2），
その後，未知試料として解析した（緑の×）。ここで検証した標準曲線と完全コード
cDNA の希釈が同じ量であることが確認できた。

42

図 3.12. 標準 DNA を使った qPCR システムの発展と検証
図 3.10 と図 3.11 の結果を重ねた。低量と大量のヒトとマウスの転写産物の定量
は，qPCR システムの感度と信頼性の検証を可能にした。ヒト-マウス複合型標準
DNA を用いた qPCR システムは，広い定量のダイナミックレンジ，高い正確性，高感度であることを示している。

図 3.13. ヒトとマウス組織での Chit1 と AMCase mRNA の発現
八種類のヒトとマウス組織における Chit1 (A) と AMCase (B) mRNA の発現レベ
ルを複合型標準 DNA を使って qPCR で定量した。塗りつぶしてあるバーはヒト組
織，斜線のバーはマウス組織である。得られたすべての値は，y 軸に total RNA 1043

ng あたりの分子数で表した。図の縦軸は，上は実数値で，下は対数値で示している。

図 3.14. ヒトとマウスの肺と胃組織での発現レベルの解析
正常なヒトとマウスの肺 (A) と胃 (B) 組織から調製した cDNA を使って検出した五つの発現レベルは，qPCR で定量した。塗りつぶしてあるグラフはヒト組織，
斜線のグラフはマウス組織である。図の縦軸は，上は実数値で，下は対数値で示している。図中の値は，ヒト Chit1 遺伝子の発現レベルを 1.0 としたときの相対発現レベルを示している。

図 3.15. マウスとヒトの胃組織におけるキチナーゼ活性とタンパク質発現レベル44

(A) マウスとヒト胃組織の抽出液におけるキチン分解活性。（左）合成キチン基質である 4MU-chitobiose を使って AMCase の活性を検出した。pH 2.0 と pH 5.0 でキチン分解活性を y 軸に示した。（右）Chit1 活性は，4MU-chitotriose を使って pH
5.2 で測定した。AMCase 活性も pH 2.0 で測定した。全てのグラフの値は，三回測定した平均値であり，複数実験の代表である。(B) マウスとヒト AMCase のウエス
タンブロッティングの結果。タンパク質は，SDS ポリアクリルアミドゲルで分離した。ウエスタンブロッティングで，抗ヒト AMCase 抗体または抗マウス AMCase
抗体を使って。胃の可溶性タンパク質 (12.5 µg) は，SDS ポリアクリルアミドゲル
で分離し，メンブレンに転写した。その後，AMCase 特異的抗体で標識した。

45

第 Ⅳ 章キチナーゼ様タンパク質を識別するための定量 real-time

PCR システムの確立：触媒的に不活性な breast regression protein-39と Ym1 はマウスの肺で恒常遺伝子である
第 1 節 序論
CLPs はキチナーゼに構造が似ているが，キチナーゼ活性が欠損しているタンパク質である [7,8]。マウスでは，主に三種類 (BRP-39，Ym1，Ym2)，ヒトは一種類 (YKL40) の CLPs が同定されている。これらほ乳類の CLPs の発現と炎症性疾患と関連が注目されている [8,29,65]。しかし，これらのタンパク質の疾患への寄与はわかっていない。また，CLPs はキチン分解活性が欠損しているため，それらの生物学的特徴は部分的にしか明らかにされていない [2]。
第 Ⅱ 章と第 Ⅲ 章でキチナーゼと参照遺伝子の発現レベルを定量するために，一つの標準 DNA を使った qPCR システムを確立した [61,67]。この方法は，同じスケールで，複数遺伝子の発現レベルを定量し，比較することを可能にした。そこ
で，本章では，同じスケールで，BRP-39，Ym1，Ym2 それぞれの mRNA を定量するための qPCR システムを確立した。さらに，それらの発現レベルを，細胞機能を維持するためにすべての組織で恒常的に発現しているハウスキーピング遺伝子のmRNA レベルと比較した。

第 2 節 実験材料と実験方法
RNA と cDNA 調製
この章での qPCR 分析は，Minimum Information for Publication of Quantitative RealTime PCR Experiments (MIQE) ガイドに従って設計した [71,72]。
この研究では，Mouse Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories 社) を使用した。さらに，第 Ⅱ 章で調製したマウスの肺と胃組織の mRNA を使った。
Real-time PCR のためのプライマーの選択
Real-time PCR のためのプライマーは，第 Ⅱ 章で述べた通りに設計し，SigmaGenosys に依頼し合成した (Sigma-Aldrich 社)。PCR 反応と反応産物の融解曲線は，第 Ⅱ 章に記載した通りに行った。この章で用いた qPCR のために選択したプライマーの塩基配列は，表 4.1 に示した。Chit1，AMCase，ペプシノーゲン C，GAPDH，βアクチンのプライマーは，第 Ⅱ 章で報告したものを使った [61]。

46マウス Refs/CLPs 標準 DNA の作成
BRP-39，Ym1，Ym2 の PCR のターゲット領域に隣接する領域 11-137 塩基を付加したをカバーしている cDNA 断片は，PCR によって，マウス組織 cDNA の混合液から増幅した。使用したプライマーは，表 4.2 に記載した。その後，該当する制限酵素で切断し，T4 DNA リガーゼ を使って連結した。連結した断片は，
EcoRI_Ym1_Fw プライマーと Ym2_Rv プライマー（表 4.2）を使って PCR で増幅し，得られた断片は CLPs 標準 DNA とした。
その後，マウス遺伝子の五種類の対照遺伝子 (Refs) と三つの CLPs を連結した
Refs/CLPs 標準 DNA を次のように作成した。AMCase/ペプシノーゲン
C/Chit1/GAPDH/β-アクチンから成る，3’ 末端に EcoRI 制限部位を含むマウス Refs
標準 DNA は，PCR で第 Ⅱ 章で作成したマウスキチナーゼの標準 DNA から増幅した [61]。CLPs とマウス Refs 標準 DNA は，EcoRI で処理し，T4 DNA リガー
ゼを使って連結した。連結した断片は，Quant_mouse_AMCase_Fw プライマーと
Ym2_Rv プライマー（表 4.2）を使って増幅し，pGEM-T Easy ベクターにクローン化した。得られたプラスミドの塩基配列の決定は，第 Ⅱ 章と同様に行った。マウ
ス Refs/CLPs 標準 DNA (1,597 塩基；図 4.1A，4.2) は，同じプライマーを使って，プラスミド DNA から PCR で再び増幅し，調製した。
pGEM-T Easy ベクター配列を含む Refs/CLPs 標準 DNA (4,629 塩基 ; 図 4.3B，4.4)
は，BglII_BRP-39_Fw プライマーと BglII_Ym1_Rv プライマー（表 4.2）を使って，プラスミ
ド DNA から PCR で調製した。
完全コード領域を含む BRP-39，Ym1，Ym2 cDNA の調製
BRP-39，Ym1，Ym2 の完全コード cDNA は，表 4.3 に記載したプライマーで，BRP-39 と Ym1 はマウスの肺，Ym2 は胃組織 cDNA から増幅し，pcDNA3.1/V5His C ベクター (Invitrogen 社) にクローン化した。cDNA の塩基配列は，第 Ⅱ 章と同様に決めた（図 4.5）。サブクローニングした断片は，同じプライマーを使って（図 4.5）プラスミド DNA から再び増加し，完全コード領域 cDNA として使った。
標準曲線の作成と mRNA の定量
第 Ⅲ 章と同様に，標準 DNA は 100 から 107 分子の範囲で 10 倍ずつ段階希釈を行い，使用するまで -20 °C で冷凍保存した。
PCR 反応は，95 °C で 10 分で DNA の変性とポリメラーゼ活性化を行った後，
95 °C 30 秒で変性，55 °C 30 秒でアニーリング，72 °C 10 秒で伸長する反応を 40
サイクル行った。mRNA の定量は，第 Ⅱ 章で記載した通りに行った。それぞれのサンプルは三度増幅し，それぞれの実験は少なくとも二回繰り返した。

47

統計解析
データは，平均値±標準偏差 (SD) で示した。Student’s t 検定を用いて mRNA レベルの統計解析を行った。統計学的有意性は，p<0.05 と設定した。
第 3 節 実験結果
CLPs 定量のための qPCR システムの確立
正常マウス組織における CLPs 遺伝子の発現レベルを定量し，CLPs とほ乳類キチナーゼ，対照遺伝子の mRNA を比較するため（図 4.6），qPCR システムを確立した。まず，BRP-39，Ym1，Ym2 mRNA レベルを解析するためにプライマーを設計した（表 4.1）。Ym1 は，Ym2 と核酸配列同一性 94% を示す（図 4.7）[21]。ミ
スプライミングを防ぐために，3’ 末端領域がユニークなリバースプライマーを設計した（図 4.7，表 4.1）。しかし，Ym1 と Ym2 は非常に高い配列相同性を有するため，Ym1 と Ym2 で高い相同性のあるフォワードプライマーしか選べなかった（図4.7，表 4.1）マウス組織 cDNA 混合液から設計したプライマーを使って増幅した産物が一つの熱融解温度 (Tm) を示すか，10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動で一つのバンドかどうか，で評価した。図 4.8A-C に示すように，Ym1 (Tm =76.3°C),
Ym2 (Tm = 77.3°C) そして BRP-39 (Tm = 80.8°C) で一つのピークが見られた。図4.8D は，Ym1 (65 bp)，Ym2 (65 bp)，BRP-39 (57 bp) PCR 断片の予想サイズで明確な一つのバンドが認められた。これらの結果から，目的の PCR 産物がマウス組織
cDNA 混合液からここで選択したプライマーによって増幅したことが分かった。
マウス Refs/CLPs 標準 DNA の作成
標準 DNA は正確な三つの CLPs の定量に必要な qPCR システムを設計した。二つのキチナーゼと対照遺伝子として二つのハウスキーピング遺伝子（GAPDH と βアクチン）とペプシノーゲン C を使用した。CLPs mRNA のレベルを評価するために，GAPDH と β-アクチンが恒常的にほとんどの組織で高いレベルで発現するために使用した [55,68-70]。さらに，ペプシノーゲン C を胃における対照遺伝子として選択した。これらの対照遺伝子を使用して，三種類の CLPs とキチナーゼの遺伝子
mRNA レベルをマウスの組織で評価した。CLPs 標準 DNA を五種類の対照遺伝子
cDNA と一対一の割合で結合し，この DNA 断片を pGEM-T Easy ベクターにクローン化した。1,597 塩基長の DNA は五つの対照遺伝子 (Refs) と三つの CLPs cDNA断片を含む。PCR のターゲット領域の隣接領域の 9-146 塩基，そして制限酵素部位を含む（図 4.1，4.2）。この章において，標準 DNA を Refs/CLPs 標準 DNA と呼ぶ。
pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA の評価
次に，八遺伝子のプライマーを使ってターゲットの cDNA がマウス Refs/CLPs48

標準 DNA から増幅されるかを検討した。Ym1 プライマーは，一つの融解温度と10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動で一つのバンドで示すことから，一つの産物が得られた（図 4.1B，4.1D）。しかし，Ym2 プライマーによる増幅産物は，熱融解曲線のピークが三つ認められ，さらに，複数のバンドが得られた（図 4.1C，
4.1D）。従って，Ym2 プライマーで，マウス Refs/CLPs 標準 DNA から複数の産物が増幅された。この問題を克服するため，NCBI Blast Search (2 blast search;
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=MegaBlast&PROGRAM=blastn&BLAST_PR
OGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&DATABASE=n/a&QUERY=&SUBJECTS=) を使って標準 DNA の塩基配列と Ym2 フォワードプ
ライマーを比較した。その結果，Ym2 フォワードプライマーは，Ym1 にアニーリングできることが分かった（図 4.7）。また，AMCase cDNA にクロス反応しうることが分かった。一方，Ym1 と Ym2 は，BRP-39 と Chit1 との配列類似性はなかった。従って，Ym2 cDNA の増幅に加えて，二つの cDNA (Ym1/BRP-39/Ym2 とAMCase/Pep C/Chit1/GAPDH/β-アクチン/Ym1/ BRP-39/Ym2) が Ym2 プライマーを使って標準 DNA から増幅されたと考えられる。この問題は，アニーリング温度の変更では解決できなかった。
多くの qPCR 解析での研究では，プライマーを，イントロンをまたがるかイント
ロン/エクソンの境界で設計している [73]。本研究で，マウス Refs/CLPs 標準 DNA
を pGEM-T Easy ベクターにクローン化した（図 4.3A）。AMCase/Ym1 と Ym2 断片との間の距離を広げるため，pGEM-T Easy ベクター配列を含む直鎖化した標準
DNA を調製した。これは，BglII_BRP-39_Fw プライマーと BglII_Ym1_Rv プライ
マーを使った PCR で，BRP-39/Ym2/pGEM-T Easy/AMCase/Pep C/Chit1/GAPDH/β-ア
クチン/Ym1 を含む（図 4.3，表 4.2）。この標準 DNA は，pGEM-T Easy 付マウス
Refs/CLPs 標準 DNA と呼ぶ（図 4.3B）。次に，Ym2 プライマーがこの標準 DNA
から一つの Ym2 cDNA を増幅するか検討した。ミスプライミング増幅を避けるため，qPCR プログラムのアニーリング時間と伸長時間を短くした（55°C で 30 秒，
72°C で 10 秒）。PCR を行った後，Ym1 産物と同様に（図 4.3C，4.3E），Ym2 の産物も一つの融解温度（図 4.3D）と 10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動で予想サイズの一つのバンド（図 4.3E）を与えた。つまり，Ym2 プライマーは，pGEM-T
Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA から一種類の産物を与えた（図 4.3B，4.4）。
従って，pGEM-T Easy 配列（約 ~3 kbp）は，PCR 反応においてイントロンのような役割を果たした。以降，pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA を標準
DNA として使用した。
標準曲線と qPCR システムの検証
この定量システムで三つの CLPs と五種類の対照遺伝子 mRNA を正確に定量できるか，検証した。pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA（図 4.3B，4.4）49

の段階希釈液は，標準曲線を作成するために使用した。それぞれの標準曲線は，八種類の異なるプライマーを使って，標準 DNA を 10 倍ずつ段階希釈して作成した。
標準曲線が八種類の遺伝子に対して絶対的に等量になっていることを示すために，全コード領域をカバーしている既知濃度の cDNA（図 4.5）を増幅し，未知試料として解析した。標準曲線を作成するために用いた量と全コード領域をカバーしている既知濃度の各 cDNA の量が同じであることが確認できた（図 4.9A-H）。
正常なマウス組織における CLPs の発現
四種類の胎生期と様々な成体組織から抽出した total RNA を，pGEM-T Easy 付マ
ウス Refs/CLPs 標準 DNA を用いた qPCR システムで分析した（図 4.3B，4.4）。結果は，total RNA 10 ng あたりの分子数として表した（図 4.10）。BRP-39，Ym1，
Ym2 mRNA は，マウス組織において広く発現していた（図 4.10 A-C）。CLPs mRNAの発現パターンにおいて，明らかな組織特性が認められた。BRP-39 mRNA の最も高い発現は肺で，次いで 7 日目の胎児，目，胃，17 日目の胎児だった（図4.10A，上と下の図）。同様に，Ym1 mRNA の最も高い発現はマウスの肺で，次いで7日目の胎児だった（図 4.10B，上図）。一方，Ym2 mRNA の最も高い発現はマウスの胃で，次に肺であった（図 4.10C，上図）。その他の組織では，Ym1 と Ym2mRNA は低いレベルであったが，バックグラウンドより高く，容易に検出できるレベルだった（図 4.10B，4.10C，下図）。BRP-39，Ym1，Ym2 mRNA のレベルを比較したところ，BRP-39 と Ym1 は肺で高いレベルで合成されていた（図 4.10）。
マウスの肺と胃組織における CLPs の mRNA レベルの比較
BRP-39 と Ym1 mRNA は肺で，Ym2 mRNA は胃で発現が最も高かった（図 4.10）。
そこで次に，CLPs と二つのキチナーゼ，ペプシノーゲン C の mRNA レベルをマ
ウスの肺と胃組織 cDNA を用いて比較した。
図 4.11A は，マウスの肺組織における定量結果を示す。Chit1 は，肺組織で深く研究されたほ乳類キチナーゼである。マウスの肺組織において，Chit1 のレベルを1.0 としたときの cDNA の相対発現レベルは， BRP-39 は 78，Ym1 は 50，Ym2
は 0.3，AMCase は 7.0，GAPDH は 81，β-アクチンは 292 であった（図 4.11A）。
肺組織で，BRP-39 と Ym1 mRNA は，活性のあるキチナーゼである Chit1 とAMCase よりも高い発現レベルだった (p < 0.01)。さらに，マウスの肺組織におけるRBP-39 と Ym1 の mRNA レベルは，ハウスキーピング遺伝子である GAPDH のレベルに匹敵した。このことは，BRP-39 と Ym1 はマウスの肺で大量に転写されていることを示す。図 4.11B は，マウスの胃組織における定量結果を示す。マウスの胃組織において，Chit1 のレベルを 1.0 にしたとき，それぞれの相対発現レベル
は，BRP-39 は 0.05，Ym1 は 0.03，Ym2 は 0.6，AMCase は 473，GAPDH は50

34，β-アクチンは 65，ペプシノーゲン C は 1,443 であった（図 4.11B）。胃組織
は，BRP-39 と Ym1 mRNA が Chit1 より低いことが分かった (p < 0.01)。Ym2
mRNA は，胃で高い発現だったが，Chit1 より低かった。
第 4 節 考察第 Ⅳ 章では，CLPs の mRNA レベルの解析に第 Ⅱ 章で確立した方法を応用した [61]。Ym1 と Ym2 の塩基配列がとても似ているので，Ym1 と Ym2 プライマーが互いにミスプライム反応する懸念があった。しかし，設計した Ym1 プライマーと Ym2 プライマー は区別でき，マウス組織 cDNA 混合液から目的の cDNA を増幅できた (図 4.3)。Ym1 と Ym2 のリバースプライマーは，PCR 効率に強く影響を与える 3’末端領域にユニークな配列を含んでいる。一方，フォワードプライ
マーは，Ym1 と Ym2 cDNA 間でよく似ている（図 4.7）。この結果は，これらのcDNA の塩基配列が類似していても，フォワードプライマーまたは，リバースプラ
イマーのどちらか一方が，ターゲット cDNA を特異的に増幅するためにユニークな配列を含めば区別して増幅することができることを示した。この概念は，Ym1 とYm2 のように，互いに塩基配列がよく似ている他の分子の定量に応用することができる。
マウス Refs/CLPs 標準 DNA の検証において，マウス Refs/CLPs 標準 DNA を
Ym2 プライマーを用いて増幅すると，複数の産物が得られた。この結果は，
Ym1/AMCase と Ym2 間のクロス反応であると考えられた（図 4.1C，4.1E）。通常
は，qPCR のプライマーを設計するとき，混入したゲノム DNA からの非標的産物の増幅を避けるために，増幅する目的の領域にイントロン配列を含む [73]。一般的に，ほ乳類のイントロンは約 3 kbp 以上の長さであるため，目的の cDNA と比較して，ゲノム配列を PCR で増幅するのは困難である。マウス Refs/CLPs 標準
DNA は，pGEM-T Easy ベクター（約 ~3 kbp，図 4.3A）にクローン化していたので，PCR で Ym1 と Ym2 の間に pGEM-T Easy ベクター配列を含む直鎖化したマ
ウス Refs/CLPs 標準 DNA を調製した（図 4.3A，4.3B）。さらに，qPCR のプロトコールを変更した（アニーリング 55 °C で 30 秒，伸長反応 72 °C で 10 秒）。
pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA の検証から，Ym1 と Ym2 をそれぞれ区別して定量できる（図 4.9）。これにより，Ym2 プライマーのクロス反応の問題を克服した。
確立した定量法を用いて定量した結果，BRP-39，Ym1，Ym2 の遺伝子発現パター
ンの結果は，以前の報告と一致した [15,21,50]。BRP-39 と Ym1 mRNA は，同じ発現パターンであり，Ym1 mRNA は，マウスの肺で高いレベルで発現した（図4.10A, 4.10B）。一方，Ym2 mRNA は胃，次に，肺の順の発現レベルだった。Ym1と Ym2 は高い配列相同性を示すが，その mRNA の発現パターンは異なっていた。マウスの肺における mRNA レベルの順序は，GAPDH ≈ BRP-39 ≈ Ym1 >51

AMCase > Chit1 > Ym2 であった。
マウス肺組織において，BRP-39 と Ym1 の mRNA レベルが活性のあるキチナー
ゼである Chit1 と AMCase より高かいことがわかった。BRP-39 と Ym1 mRNA のレベルは，GAPDH のレベルに匹敵した。活性のあるキチナーゼの mRNA レベルと比較して，BRP-39 と Ym1 mRNA レベルは，マウスの肺で高く発現している。さらに，BRP-39 と Ym1 mRNA はマウスの肺で共発現しているように見える（図4.10A，4.10 B）。Qureshi らは，BRP-39，Ym1，Ym2 が炎症を促進した初期の腫瘍モデルで過剰に発現していたと報告した [74]。彼らは，これらの CLPs が組織リモ
デリングと免疫応答を増加する役割があることを示した [74]。BRP-39 と Ym1 はキチン分解活性を欠いているが，マウス肺でのこれらの高い mRNA の発現は，生
物学的防御として生理学的重要性を示唆している。
胃での Ym2 mRNA の発現は，Chit1 と AMCase より低かったが，BRP-39 とYm1 mRNA レベルと比較して高い発現だった（図 4.11）。Ym1 の機能はまだ知られていないが，表面プラズモン共鳴を用いた解析で，Ym1 がキトビオース，キトト
リオース，キトテトラオースに結合できることが証明されている [21]。さらに，ヘ
パリン／ヘパラン硫酸は，Ym1 のリガンドである可能性が示唆されている [21]。
Ym2 も Ym1 に密接に関連している機能未知のタンパク質である [17]。胃でのAMCase とともに Ym2 mRNA の高い発現は，食物消化や胃の防御メカニズムに関与している可能性を示唆している。
最近の研究で，病気のマウスやヒトの肺で BRP-39/YKL-40 mRNA またはタンパ
ク質の発現レベルの増加は，発現の脱制御の結果であろうと報告されている [2,8]。
さらに，BRP-39 遺伝子を欠損し，YKL-40 遺伝子を導入したマウスを使って，これらタンパク質が機能的に同じであり，組織リモデリング，細胞死経路の制御と気道閉塞において同じ役割をしていることが示された [29]。さらに，BRP-39 は，インターロイキン(IL)-13 受容体 α2 を介した細胞死，炎症とリモデリングのコントロールによる細菌除去が促進される細菌感染症で誘導される [76,77]。本研究で確立した
qPCR システムを使って，CLPs mRNA レベルをマウス組織でほ乳類キチナーゼと比較することができた。この解析は，特に，マウスモデルを使った生体病理学的研究において CLPs の生物学的機能の解明につなげることができるだろう。
第 5 節 要約
マウスは，キチナーゼと高い相同性があるがキチン分解活性が欠損している CLPsを生産している。マウスは，主に BRP-39，Ym1，Ym2 の三種類の CLPs を発現している。最近，CLPs は，喘息，アレルギー，関節リウマチ，悪性腫瘍などの病気
で，発現が上昇するため，かなり注目されている。CLPs の正確な機能はほとんど知られていないので，病気でのそれらの発現レベルの上昇の重要性を解明する必要がある。BRP-39，Ym1，Ym2 の定量は，CLPs の生体内での制御の洞察を得るために
52

重要なステップである。第 Ⅱ 章で確立した qPCR システムを発展させ，Ym1 とYm2 を区別して定量できる方法を確立した。正常なマウス組織を，pGEM-T Easy
付マウス Refs/CLPs 標準 DNA を使った qPCR システムで分析した。BRP-39 とYm1 mRNA は，マウスの肺で大量に発現していた。一方，Ym2 mRNA は胃で，次に肺で高い発現をしていた。マウスの肺における BRP-39 と Ym1 mRNA の発現レ
ベルは，二つの活性のあるキチナーゼよりも高く，GAPDH に匹敵するレベルであった。このことから，キチナーゼ活性のない BRP-39 と Ym1 は，マウス肺において構成的な遺伝子であることを示す。

53

表 4.1. Real-time PCR プライマーの塩基配列
Ym1_Fw: TCTGGTGAAGGAAATGCGTAAA
Ym1_Rv: GCAGCCTTGGAATGTCTTTCTC
Ym2_Fw: TCTGGTGCAGGAAATGCGTAAA
Ym2_Rv: GCAGCCTTGGAATGTGGTTCAAAG
BRP-39_Fw: CCAGCCAGGCAGAGAGAAAC
BRP-39_Rv: GCCACCTTTCCTGCTGACA

表 4.2. 標準 DNA を作成するために用いたプライマー
EcoRI_Ym1_Fw: CATGGAATTCATTCCTTCGTCAATATAACTTTGAT
BglII_Ym1_Rv: TGACAGATCTCCTGAATATAGTCAAGAGACTGAGA
BglII_BRP-39_Fw: CATGAGATCTACAAAGGAGGTCCAGCCAGGCAGAG
XhoI_BRP-39_Rv: TGACCTCGAGTGGCCTGTGATTTGGCGCCAGACTCXhoI_Ym2_Fw: GTACCCTGGGTCTCGAGGAAGCCCTC
Ym2_Rv: CATGGAGCTCTCTCCAGTGTAGCCATTCTTAGGAT
Quant_Mouse_AMCase_Fw: GTGGATTCTGTGCCGACAAAGCAGATGGCC

図 4.1. マウス Refs/CLPs 標準 DNA の作成と検証(A) Real-time PCR 解析で用いたマウス Refs/CLPs 標準 DNA の模式図。EcoRI を含む CLPs と対照遺伝子 (Refs) のそれぞれの標準 DNA を EcoRI で処理し，連結した [61,68]。その後，得られた断片は pGEM-T Easy ベクターにクローン化した。
直鎖化した標準 DNA は，プラスミド DNA から増幅した。標準 DNA が一つの熱融解温度を与えるかどうか調べるために，マウス Refs/CLPs 標準 DNA を Ym1 プ
54

ライマー (B) と Ym2 プライマー (C) を使って増幅した。(D) Ym1 と Ym2 のPCR 産物は，10% ポリアクリルアミドゲル解析で調べた。(E) 複数の産物が，Ym2
プライマーでマウス Refs/CLPs 標準 DNA から増幅された。ピンクの矢印は，Ym2
プライマーを示す。線は，推定上の増幅した DNA 産物を示している。

図 4.2. マウス Refs/CLPs 標準 DNA の塩基配列
マウス Refs/CLPs 標準 DNA（1,597 塩基対）は，隣接する 9-146 塩基領域を加えた PCR ターゲット領域（太字下線）をカバーする八種類の cDNA 断片を含んでおり（異なる色で示した），BglII，XhoI，PstI，NotI，EcoRI（太字斜字体）の制限酵
素部位を含んでいる。

55

図 4.3. pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA の調製と検証(A) pGEM-T Easy ベクターにクローン化したマウス Refs/CLPs 標準 DNA の略図。(B) pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA は，BRP-39 フォワードプラ
イマー（青矢印）と Ym1 リバースプライマー（赤矢印）を使ってプラスミド DNA
から PCR で増幅した。この標準 DNA から Ym1 (C) と Ym2 (D) プライマーでYm1 と Ym2 cDNA を増幅し，これらの PCR 産物を 10% ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で解析した (E)。横軸は熱融解温度，縦軸は蛍光強度の一次微分した値で表した (C，D)。

56

57

図 4.4. pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA の塩基配列
pGEM-T Easy 配列を含むマウス Refs/CLPs 標準 DNA（4,627 塩基対）は，
pGEM-T Easy ベクター（黒字）と PCR ターゲット領域（太字下線）と隣接する 9146 塩基領域を加えた八種類の cDNA 断片を含んでおり（異なる色で示した），
BglII，XhoI，PstI，NotI，EcoRI（太字斜字体）の制限酵素部位を含んでいる。

表 4.3. 完全コード cDNA を PCR で増幅させるためのプライマー
Entire_BRP-39_Fw: CATGGGATCCGTGGAGCCTAAGGAAGAGGCCCTGA
Entire_BRP-39_Rv: TGACCTCGAGCAGCCAGGGCATCCTTGATGGCGTT
Entire_Ym1_Fw: CATGGAATTCAATCCTGAAGACACCATGGCCAAGC
Entire_Ym1_RV: TCGAGCGGCCGCATAAGGGCCCTTGCAACTTGCAC
Entire_Ym2_FW: CATGGAATTCAATCCTGAAGACACCATGGCCAAGC
Entire_Ym2_RV: TCGAGCGGCCGCAAGCTCCCCTCGATAAGAGGCCT

58

59

図 4.5. BRP-39，Ym1，Ym2 の完全コード cDNA の塩基配列と分子量
BRP-39 は 1,243 塩基対，Ym1 は 1,231 塩基対，Ym2 は 1,243 塩基対である。
開始コドンである ATG は，太字で強調した。翻訳領域は，下線で示す。

図 4.6. マウス CLPs とキチナーゼの遺伝子発現レベルを比較する研究方針
マウスの不活性の CLPs (BRP-39，Ym1，Ym2) mRNA の発現レベルを，定量し，比較した。その後，CLPs と活性のあるキチナーゼ，Chit1 と AMCase，ハウスキー
ピング遺伝子の mRNA レベルを比較した。

60

図 4.7. Ym1 と Ym2 の塩基配列の比較
Ym1 と Ym2 プライマーの塩基配列をピンク字に下線で示す。

61

図 4.8. qPCR の CLPs プライマー の適合性の評価
PCR プライマーは，Tm が一つであるか (A-C)，10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動で一つの PCR 産物を与えるか (D) をもとに選別した。縦軸は，横軸に融解
温度，縦軸に蛍光強度の一次微分した値で表した (A-C)。プライマーの特異性の検証のため，マウス組織 cDNA 混合物を鋳型として三つの遺伝子の PCR 産物の熱融解曲線を検討した。PCR 産物は，10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動後，エチジ
ウムブロマイド染色で解析した (D)。

図 4.9. マウス組織解析のための qPCR システムの検証(A) BRP-39，(B) Ym1，(C) Ym2，(D) Chit1，(E) AMCase，(F) GAPDH，(G) β-アクチン，(H) ペプシノーゲン C。標準曲線は，八種類のマウス cDNA 断片を含む
pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準 DNA を使って得た（赤●）。さらに，マウ62

ス完全コード cDNA の定量を各遺伝子のプライマーを使って行った。目的の cDNA
は，既知濃度の完全コード cDNA の希釈液から，増幅し，続いて未知試料として分析した（青◇）。ここで検証した標準曲線と完全コード cDNA の希釈が同じ量であることが確認できた。データは，三回の測定の平均値±SD として示した。

図 4.10. マウス組織における BRP-39，Ym1，Ym2 mRNA 発現
マウス組織における BRP-39 (A)，Ym1 (B)，Ym2 (C) mRNA の定量結果。CLPsの mRNA レベルを八種類のマウス遺伝子を含む標準 DNA (pGEM-T Easy を有する
マウス Refs/CLPs 標準 DNA) を使って qPCR で定量した。図の縦軸は，上は実数値で，下は対数値で示している。データは，三回の測定の平均値±SD で示した。

63

図 4.11. 肺と胃組織における BRP-39，Ym1，Ym2，対照遺伝子 mRNA の分析
三ヶ月齢のマウスの肺 (A) と胃 (B) 組織（それぞれ n=5）から調製した cDNAを用いて，八種類の遺伝子の mRNA レベルを qPCR で定量した。図の縦軸は，上は実数値で，下は対数値で示している。データは，五つのサンプルの平均値±SD として示した。*p < 0.05; **p < 0.01。

64

第 Ⅴ 章一つの標準 DNA を用いた正常なヒト組織における YKL-40の定量 Real-time PCR 解析とほ乳類キチナーゼ mRNA との比較
第 1 節 序論
YKL-40 のアミノ酸配列は，BRP-39 と 73% 同一性があり [26,27]，最近の研究
で，これらのタンパク質は機能的に同じであると示されている [28]。キチナーゼ活性を欠損しているにもかかわらず，YKL-40 は複数の炎症性の病気に関係がある[80]。また，最近の研究で，二つのほ乳類キチナーゼの発現レベルと炎症状態の関係が報告されている [30-33,36,37]。そこで，ほ乳類キチナーゼ，ハウスキーピング 遺伝子と YKL-40 の mRNA レベルの比較は，YKL-40 の生体内の制御の理解へ重要なステップである。
第 Ⅱ～Ⅳ 章で，CLPs，キチナーゼ，対照遺伝子の mRNA レベルを定量するために，一つの標準 DNA 分子を使った qPCR システムを確立した [61,67,81]。この方法は，同じスケールで複数遺伝子の mRNA レベルの解析を可能にした。本章では，ヒト組織において，YKL-40 mRNA レベルの定量のために qPCR システムを応用した。さらに，そのレベルとキチナーゼと対照遺伝子の mRNA レベルを比較した。
第 2 節 実験材料と実験方法
RNA と cDNA 調製
Human Total RNA Master Panel II と Human Stomach Total RNA (Clontech Laboratories
社) を使用した。mRNA の調製は第 Ⅱ 章と同様に行った。
Real-time PCR のためのプライマーの選択
Real-time PCR のためのプライマーは，第 Ⅱ 章で述べた通りに設計し，商業的に合成した。PCR 反応と反応産物の融解曲線は，第 Ⅱ 章に記載した通りに行った。
Real-time PCR のために選択したプライマーの塩基配列は，表 5.1 に示した。
Chit1，AMCase，ペプシノーゲン C，GAPDH，β-アクチンプライマーは第 Ⅲ 章に記載したものを使用した [61,67,81]。
ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA の作成
本章では，標準 DNA をヒト Refs/YKL-40 標準 DNA と呼ぶ。1,581 塩基対のヒ
ト Refs/YKL-40 標準 DNA（図 5.1）は，次のように構築した。PCR ターゲット領
域に隣接した領域を加えた YKL-40 cDNA 断片を，PstI の制限酵素部位を含む
Pst_YKL-40_Fw プライマーと Quant_YKL-40_Rv プライマー（表 5.2）を使って，ヒト組織 cDNA 混合液から増幅した。AMCase/ペプシノーゲン C/Chit1/GAPDH/β65

アクチンから成るヒト Refs 標準 DNA [67] は，Quant_Human_AMCase_Fw プライ
マーと PstI_Human_アクチン_Rv プライマー（表 5.2）を使って PCR で増幅した。両 PCR 産物を PstI で処理し，T4 DNA リガーゼを使って連結し，pGEM-T
Easy ベクターにクローン化した。挿入した cDNA を含むプラスミドを選択し，配列決定した。ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA は，同じプライマーを使って PCR によってプラスミド DNA から再び増幅し，調製した（図 5.1）。
完全コード領域をカバーしている YKL-40 cDNA の調製
YKL-40 の完全コード領域をカバーする cDNA は，ヒト組織 cDNA 混合液から
表 5.3 に記載したプライマーを使って PCR で増幅した。増幅産物は，pGEM-T
Easy ベクターにサブクローニングし，配列確認した（図 5.2）。サブクローニングした断片は，M13_Fw プライマーと M13_Rv プライマー（表 5.3）を使ってプラスミ
ド DNA から再び増幅し，全コード領域 YKL-40 として使用した。
qPCR を使った標準曲線の作成と mRNA の定量
PCR 反応と mRNA の定量は，第 Ⅳ 章と同様に行った。それぞれのサンプルは三度増幅し，それぞれの実験は少なくとも二回繰り返した。
第 3 節 実験結果
YKL-40 mRNA 定量のための qPCR システムの確立
第 Ⅱ 章で，マウス組織で二つのほ乳類キチナーゼの mRNA レベルの定量とそれらのレベルを対照遺伝子と比較することができる qPCR システムを確立した[61,67,81]。本章において，YKL-40 のレベルを定量し，活性のあるキチナーゼである Chit1 と AMCase，ハウスキーピング遺伝子である GAPDH と β-アクチンと比較することを目的とした（図 5.3A）。最初に，YKL-40 を定量するためにプライマーを設計し（表 5.1），その適合性を一つの熱融解温度 (Tm) を示すか，10% ポリア
クリルアミドゲルで一つのバンドかどうか，で評価した（図 5.3B，5.3C）。YKL-40
断片は，YKL-40 プライマーでヒト組織 cDNA 混合液から増幅することを確認した（図 5.1）。
ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA の作成と qPCR システムの検証
これまでと同様に，YKL-40 と五種類の対照遺伝子が，正確に定量できるか調べた（図 5.4A-F）。それぞれの標準曲線は，六種類の異なったプライマーを使って，ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA を 10 倍ずつ段階希釈して作成した（図 5.4A-F，赤●）。次に，標準曲線が絶対的に等量になっていることを示すために，全コード領域をカバーしている既知濃度の cDNA（図 5.2）を増幅し，未知試料として解析した。標準曲線を作成するために用いた量と全コード領域をカバーしている既知濃度
66

の各 cDNA の量が同じであることが確認できた（図 5.4A-F，青◇）この結果か
ら，ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA を使って同じスケールで YKL-40 と対照遺伝子を定量できる。
正常なヒト組織における YKL-40 mRNA の発現レベル
生体内での YKL-40 遺伝子発現制御を研究するため，21 種類の正常ヒト組織から抽出した total RNA を，ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA を用いた qPCR 法で解析した（図 5.3D，5.1）。ヒト組織のサンプルは，1~64 人のコーカサス人から集められた。胎児の脳 n=59，脳全体 n=1，小脳 n=10，唾液腺 n=24，胎児の肝臓 n=63，肝臓 n=1，肺 n=3，心臓 n=3，胃 n=1，大腸 n=1，腎臓 n=1，胎盤 n=15，骨格筋
n=2，脾臓 n=12，精巣 n=39，副腎 n=62，胸腺 n=2，甲状腺 n=64，気管 n=22，子宮 n=8，前立腺 n=12。YKL-40 mRNA はヒト組織全体で広く発現しており（図5.5），肝臓，次に，腎臓，気管，肺組織で高いレベルで検出したことを見出した（図5.5，上図）。残りの組織において，YKL-40 mRNA は低い発現だったが，検出可能なレベルであった（図 5.5，下図）。
正常なヒト組織における YKL-40 mRNA レベルの比較
次に，正常なヒト組織における YKL-40，Chit1，AMCase，GAPDH，β-アクチンの mRNA レベルを比較した（図 5.6，5.7）。図 5.6 は，YKL-40 mRNA レベルがChit1 レベル 10 倍以上である 10 種類のヒト組織を示す。Chit1 の発現レベルを1.0 とした場合，YKL-40 の相対発現レベルは，腎臓 453，肝臓 345，気管 59，心臓 58，子宮 46，唾液腺 38，小脳 21，胎盤 19，胎児の脳 17，脳 13 であった
（図 5.6）。腎臓と肝臓で Chit1 と比較したとき，YKL-40 mRNA の発現は 100 倍以上の高いレベルであるので，これらの組織で活性のあるキチナーゼより発現が優勢であった（図 5.6A，5.6B）。しかし，その YKL-40 のレベルは，ハウスキーピン
グ遺伝子のレベルより著しく低かった（図 5.6A，5.6B）。図 5.7 は，Chit1 のレベ
ルの 10 倍未満か同等のレベルの 11 組織を示している。Chit1 の mRNA レベルを1.0 としたとき，YKL-40 の相対発現レベルは，胃 8.6，前立腺 6.7，骨格筋 3.7，
脾臓 2.7，胎児の肝臓 2.5，胸腺 2.2，精巣 2.1，大腸 1.8，副腎 1.6，甲状腺 1.4，
肺 1.1 である（図 5.7）。骨格筋，精巣，大腸，副腎組織は，YKL-40 mRNA より
AMCase が多く発現していた（図 5.7C，G，H，I）。肺において，YKL-40 のmRNA レベルは，Chit1 のレベルと同じであった（図 5.7K）。
第 4 節 考察第 Ⅱ 章と第 Ⅲ 章の研究で，マウスとヒト組織において，Chit1 と AMCase のmRNA レベルを定量し，比較した [61,67]。第 Ⅳ 章では，マウス組織で CLPs のレベルを解析するためにを確立した定量法を応用した [81]。Ym2 プライマーのクロ67

ス反応による非特異的な断片の増幅を防ぐために，イントロンのような挿入として
Ym1 と Ym2 cDNA の間に位置している pGEM-T Easy ベクター配列を含む直鎖化した DNA 分子を調製し，qPCR のプロトコールを変更した（アニーリング 55°C
で 30 秒，重合 72°C で 10 秒）[81]。pGEM-T Easy 付マウス Refs/CLPs 標準
DNA の検証をしたところ，Ym1 と Ym2 それぞれ区別して定量することができた[81]。そこで，ヒト組織での YKL-40 レベルの解析のための方法を応用した。Refs
標準 DNA に YKL-40 プライマーはクロス反応しないため，ベクター配列を除いた
ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA を使った。
YKL-40 mRNA レベルは，ヒトの肝臓，続いて腎臓で高かった（図 5.5）。肝臓と腎臓の RNA サンプルは，それぞれ一個体から得たので，このデータは，より多くのサンプルで確認する必要がある。マウスの肺における BRP-39 mRNA レベルは，二つの活性のあるキチナーゼより高く，GAPDH に匹敵した [81]。これに対して，
YKL-40 mRNA はヒトの肺で過剰発現していなかった（図 5.5）。従って，肺組織における BRP-39/YKL-40 の発現は種特異的である。
この研究において，ヒトの 21 組織において，YKL-40，ほ乳類キチナーゼ，二つのハウスキーピング遺伝子 mRNA の発現レベルの割合を明らかにした（図 5.6，5.7）。YKL-40 mRNA の発現は，Chit1 と比較たとき，肺を除く 20 組織において高かった（図 5.6，5.7）。多くの研究は，炎症性疾患において YKL-40 の発現が上昇したことを示しており [39-49,65,79]，これは組織のリモデリングに関連していると考えられている [28,45]。従って，組織防御における YKL-40 と他の CLPs の重要性は，キチン分解活性と関係ないと考えられる。これらのデータは，YKL-40 とキチナーゼの生体機能の理解や病態生理学的研究に役立つと考えられる。
BRP-39 欠損 YKL-40 トランスジェニックマウスを使って，これらのタンパク質が機能的に同等であり，組織リモデリング，細胞死経路の制御，気道閉塞において同じ役割をしていることが証明されている [29]。さらに，BRP-39 は，インターロイキン(IL)-13 受容体 α2 を介した細胞死，炎症とリモデリングのコントロールによる細菌除去が促進される細菌感染症で誘導される [76,77]。本章の研究で示した定量システムは，上述したような異なる病的過程によって影響される組織の YKL-40mRNA レベルを解析するために使うことができ，病態生理学的研究でキチナーゼとCLPs の生体機能の解明につながると考えられる。
第 5 節 要約YKL-40 は，CLPs の一つである。YKL-40 mRNA とそのタンパク質レベルが，喘息，嚢胞線維症，関節リウマチ，悪性腫瘍を含む複数の病気で上昇すると報告されている。この章で，ヒトの正常組織で YKL-40 mRNA レベルを定量し，キチナーゼとハウスキーピング遺伝子と比較した。様々な正常ヒト組織から cDNA を作成し，ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA の qPCR システムを使って YKL-40 mRNA の発現レ
68

ベルを解析した。YKL-40 は，ヒト組織において広く存在していることを見出した。一方，その mRNA の発現パターンは明白な組織特異性を示す。高い YKL-40mRNA レベルは，肝臓，次いで腎臓，気管支，肺で検出した。腎臓と肝臓におけるYKL-40 mRNA レベルは，Chit1 のレベルより 100 倍以上高かった。本研究では，初めて正常ヒト組織におけるほ乳類のキチナーゼに対する YKL-40 mRNA の相対発現レベルの総合的な分析結果を示した。

69

表 5.1. Real-time PCR プライマーの塩基配列
YKL-40_Fw: GGCTTCTTCTGAGACTGGTGTTG
YKL-40_Rv: GAACCGGCCTGGAATTCC

図 5.1. ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA の塩基配列
ヒト Refs/YKL-40 標準 DNA（1,581 塩基対）は，隣接する 44-143 塩基領域を加えた PCR ターゲット領域（太字下線で示した）をカバーする六種類の cDNA 断片を含んでおり（異なる色で示した），BglII，SalI，XhoI，NotI，PstI（太字斜字体）の
制限酵素部位を含んでいる。

表 5.2. 標準 DNA 作成のために使ったプライマー
PstI_YKL-40_Fw: TGACCTGCAGTACATGTTGAGGCTGGGGGCTCCTG
Quant_YKL-40_Rv: CATGGAATTCTCTCATAGTAGGCAAGGGTCCCTGC
Quant_Human_AMCase_Fw: CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATGAPstI_Human_アクチン_Rv: TGACCTGCAGCAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAA

70

表 5.3. PCR で完全コード cDNA を増幅させるためのプライマー
Entire YKL-40_Fw: CATGGGATCCCCTGTCTAGGTAGCTGGCACCAGGA
Entire YKL-40_Rv: TGACCTCGAGCCGTTGCAGCGAGTGCATCCTTGAT
M13_Fw: GTTTTCCCAGTCACGAC
M13_Rv: CAGGAAACAGCTATGAC

図 5.2. YKL-40 の翻訳領域の塩基配列と分子量
塩基配列は，1,499 塩基対である。開始コドンである ATG は太字で強調した。
YKL-40 の翻訳領域は，下線で示す。

71

図 5.3. YKL-40，キチナーゼ，ハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現レベルを比較するための研究方針と Refs/YKL-40 標準 DNA の作成(A) YKL-40 mRNA レベルを定量し，続いて YKL-40，活性のあるキチナーゼ(Chit1 と AMCase)，ハウスキーピング遺伝子 (GAPDH と β-アクチン) を比較した。(B), (C)：Real-time PCR のプライマーの適合性の評価。プライマーは，一つの熱融解温度を示すかどうか (B)，10% ポリアクリルアミドゲルで一つの PCR 産物を与えるか (C) をもとに評価した。横軸は熱融解温度，縦軸は蛍光強度の一次微分した値で表した (B)。PCR 産物は，10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動後，エチジ
ウムブロマイド染色で分析した (C)。(D) Real-time PCR で使用するヒト Refs/YKL40 標準の模式図。

72

図 5.4. ヒト組織解析のための qPCR システムの検証(A) YKL-40，(B) Chit1，(C) AMCase，(D) GAPDH，(E) β-アクチン，(F) ペプシノ
ーゲン C。標準曲線は，六つのヒト cDNA 断片を含むヒト Refs/YKL-40 標準
DNA を使って作成した（赤色●）。さらに，ヒト完全コード cDNA の定量を各遺伝
子のプライマーを使って行った。目的の cDNA は，既知濃度の完全コード cDNAの希釈液から増幅し（図 5.2 参照），続いて未知試料として分析した（青◇）。ここで検証した標準曲線と完全コード cDNA の希釈が同じ量であることが確認できた。
データは，三回の独立した測定の平均値±SD で示している。

73

図 5.5. 正常なヒト組織における YKL-40 mRNA の発現
YKL-40 の mRNA レベルをヒト Refs/YKL-40 標準 DNA を使った qPCR で定量した。図の縦軸は，上は実数値で，下は対数値で示している。ヒト組織のサンプルは，
1~64 人のコーカサス人から集めたサンプルである。胎児の脳 n=59，脳全体 n=1，
小脳 n=10，唾液腺 n=24，胎児の肝臓 n=63，肝臓 n=1，肺 n=3，心臓 n=3，胃
n=1，大腸 n=1，腎臓 n=1，胎盤 n=15，骨格筋 n=2，脾臓 n=12，精巣 n=39，副腎
n=62，胸腺 n=2，甲状腺 n=64，気管 n=22，子宮 n=8，前立腺 n=12。

図 5.6. YKL-40 mRNA レベルが Chit1 のレベルの 10 倍以上高いヒト組織
qPCR を使った次の組織における五種類の遺伝子の発現解析。(A) 腎臓， (B) 肝臓，(C) 気管，(D) 心臓，(E) 子宮，(F) 唾液腺，(G) 小脳，(H) 胎盤，(I) 胎児の肝臓，(J) 脳全体。すべての値は，total RNA の 10 ng あたりの分子数として表している。それぞれ対数値で示している。Chit1 の mRNA レベルを 1.0 とした場合の相対発現レベルを図中に示した。ヒト組織は，腎臓 n=1，肝臓 n=1，気管 n=22，心臓
n=3，子宮 n=8，唾液腺 n=24，小脳 n=10，胎盤 n=15，胎児の脳 n=59，脳全体
n=1。

74

図 5.7. YKL-40 mRNA レベルが Chit1 の mRNA レベルと同等または 10 倍未満のヒト組織(A) 胃，(B) 前立腺，(C) 骨格筋，(D) 脾臓，(E) 胎児の肝臓，(F) 胸腺，(G) 精巣，(H) 大腸，(I) 副腎，(J) 甲状腺，(K) 肺。すべての値は，total RNA の 10 ng あたりの分子数として表しており，それぞれ対数値で示している。Chit1 の mRNA レ
ベルを 1.0 とした場合の相対発現レベルの数字を図中に示す。ヒト組織は，胃，
n=1; 前立腺，n=12; 骨格筋，n=2; 脾臓，n=12; 胎児の肝臓，n=63; 胸腺，n=2; 精巣，n=39; 大腸，n=1; 副腎，n=62; 甲状腺，n=64; 肺，n=3。

75

第 Ⅵ 章総合考察

ほ乳類キチナーゼと CLPs の mRNA やタンパク質のレベルの増加は，多くの炎症性の状態で知られている [8,29,65]。Chit1 のレベルは，ゴーシェ病，喫煙者，慢性閉塞性肺疾患 (COPD) 患者，アルツハイマー病で上昇する [30-33]。AMCase の発現と活性も，喘息モデルマウスや重合体キチン投与によるアレルギー性気道応答で増加する [34,35]。BRP-39/YKL-40 のレベルは，喘息，慢性閉塞性肺疾患(COPD)，嚢胞線維症，関節リウマチ，炎症性腸疾患，アルコール性肝硬変，様々なタイプの悪性腫瘍それぞれで上昇する [39-49]。Ym1 は，寄生虫感染症による炎症で合成される [43]。Ym1 と Ym2 は，アレルギー肺炎症で発現する [50]。従って，キチナーゼと CLPs は，多くの病態生理学的状態で重要な役割をしていると考えられている [2,8,66]。しかし，これら病気の病態生理学的にキチナーゼと CLPsの役割はほとんどわかっていない。mRNA の定量は，有用で生物医学的に重要な情報を提供する。本研究において，同一の尺度でキチナーゼと CLPs mRNA レベルの定量とこれらのレベルを対照遺伝子のレベルと比較することができる定量 real-time
PCR (qPCR) システムを確立した。
これまでほ乳類キチナーゼと CLPs の発現制御は，ノザンブロッティング，semiquantitative PCR と real-time PCR を使って行われた [12,14,17,18,21,31,34,35,60,64]。
これらの方法は，遺伝子発現パターンの解析には利点があるが，同じスケールで異なる遺伝子の転写産物のレベルを比較できない。本研究では，同一の尺度で mRNA
レベルの定量と比較することができる qPCR システムを確立した。まず，目的のcDNA 断片を等量ずつ連結した標準 DNA を作成した。ハウスキーピング遺伝子として GAPDH と β-アクチンで PCR 増幅の内部コントロールであり対照遺伝子として用いた。さらに，胃のマーカー遺伝子としてペプシノーゲン C を用いた [56]。
確立した定量法は，定量性において，広いダイナミックレンジ，高感度を与え，医用生体工学や臨床サンプルの評価にも適用可能である。
キチナーゼと CLPs mRNA の発現は，様々な病気の状態で誘導されている。本研
究で確立した定量システムを使って，ヒトとマウス組織のキチナーゼと CLPsmRNA レベルを比較することができた。この分析は，これらキチナーゼと CLPs の
生物学的機能，病態生理学的研究についての理解の助けになるだろう。また，ほ乳類キチナーゼと CLPs の発現制御の研究をすすめることで，これら酵素の病理学的役割への洞察を得られる可能性がある。
二つのほ乳類活性のあるキチナーゼ（Chit1 と AMCase）は，組織特異的と種特異的な発現を示した。Chit1 mRNA の発現レベルはヒトとマウスの肺組織で，互いにほとんど同程度で，相対的に高いレベルで発現していたことから，Chit1 mRNA の発現レベルが保存されていることが分かった。マウスの胃において AMCase がハウ
スキーピング遺伝子よりもかなり高いレベルで合成され，胃液の主要な成分である
76

ペプシノーゲン C のレベルに匹敵することを見出した（図 2.8B，3.14B）。しかし，ヒトの胃では AMCase の過剰な発現は見られなかった（図 3.14B）。このことから，マウス AMCase の遺伝子発現には，ペプシノーゲン C と同じ転写因子が関与していることが考えられる。しかし，キチナーゼと CLPs 遺伝子のプロモーター
領域の詳細な特徴づけ，cis- と trans- 的に作用する転写因子は同定されていない。
今後，これらのタンパク質の選択的発現を理解するには，これらの特徴づけや同定が必要だろう。
ヒトとマウスの AMCase は，アミノ酸配列同一性 81%，類似性 90% である。これまでの研究で，マウス AMCase とヒト AMCase の至適 pH が異なる [12,37]。両分子は非常によく似た分子であるにも関わらず，遺伝子の発現パターンや酵素活性における至適 pH が異なっている。また，ヒト AMCase の遺伝子多型が，気管支喘息に関係していると報告されている [36,37] 。AMCase の生体内での機能を解明する
ために，マウスとヒトの AMCase の酵素としての特徴を比較し，解析する必要があると考えられる。
CLPs の mRNA レベルの解析の結果，BRP-39 と Ym1 mRNA は，同じ発現パターンを示すことを見出した（図 4.10A，4.10B）。Ym1 と Ym2 は高い配列相同性を示すが，mRNA の発現パターンは異なっていた。マウス肺組織において，BRP-39と Ym1 の mRNA レベルが活性のあるキチナーゼより高く GAPDH のレベルに匹敵した（図 4.11）。これに対して，ヒトの肺では，BRP-39 のヒト相同体である
YKL-40 は過剰に発現していなかった（図 5.7）。このことから，肺組織におけるBRP-39/YKL-40 の発現は，種特異的であることが示唆された。また，これまで，
CLPs の発現が炎症性疾患において上昇することが報告されており [3949,65,74,79]，組織リモデリングに関連していると考えられている [28,45,74]。本研究結果で，正常状態で高く発現しているということは，組織構築に関連していると考
えられる。

77

第 Ⅶ 章結論

マウスにおいて，二つのキチナーゼと二つのハウスキーピング遺伝子，ペプシノ
ーゲン C を等量ずつ連結した標準 DNA を使って，同じスケールで mRNA レベルを評価するための qPCR システムを確立した。この qPCR システムは，ヒト組織での定量やヒトとマウス組織間のレベルの比較，配列がよく似た分子（Ym1 とYm2）を区別して定量するために発展させることができた。AMCase は主にマウスの胃で多量に発現しており，胃液の主要な消化酵素であるペプシノーゲン C mRNAに匹敵するレベルであった。しかし，ヒトの胃での AMCase の過剰な発現は見られなかった。AMCase のヒトとマウスの胃での mRNA レベルの違いは，キチン分解
活性とタンパク質発現レベルの違いに反映されていた。従って，胃での AMCase の発現レベルは種特異的でり，AMCase はマウスの胃で主要な転写産物であることが分かった。また，三つの CLPs mRNA の発現では， BRP-39 と Ym1 はマウスの肺で最も高く発現していた。その発現レベルは，活性のあるキチナーゼよりも高く，
ハウスキーピング遺伝子である GAPDH のレベルに匹敵した。従って，BRP-39 とYm1 は，マウスの肺において恒常的な遺伝子である。一方，正常なヒトの肺において，BRP-39 の相同体である YKL-40 の発現は低かった。このことから，BRP39/YKL-40 の発現レベルは，種特異的であると考えられる。本研究で示したデータ
は，これらキチナーゼと CLPs の生物学的機能，病態生理学的研究についての理解につながるだろう。

78

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謝辞
本研究を遂行するにあたり，6 年間熱心なご指導を頂き終始暖かく，真剣に見守って下さった小山文隆教授に心から感謝致します。
本学位論文の副査を担当していただき，適切なご意見ご助言をいただきました今
村保忠教授，南雲紳史教授，佐藤光史教授，平秀晴岩手大学名誉教授に深く感謝いたします。
日頃から多くの知識や示唆を賜り，惜しみないご協力を頂いた菅原康里准教授，
坂口政吉講師に深く感謝を致します。
私が，研究室にいる間，共に実験を行い，助けてくださった大川一明さん，貴田雄太さんをはじめ生命工学研究室の皆様，有難うございました。
最後になりましたが，どんな時でも温かく応援してくれ，援助してくれた両親に深く感謝します。

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