牛乳脂肪球皮膜物質による高コレステロ

ル

血築防御効果に関する研究
日本獣医畜産大学
獣医内科学教室教授

本好茂

λノ講師

佐向敏紀

乳学教室

助制受

伊藤整

獣医衛生学教室助教授

鎌田信

獣医公衆衛生学助教授

林

E 利

C
疾
血清コレステロール濃度が、動脈硬化への発生欄字へのヨ!き金となり冠動脈性i
患発症との聞の関係は、昭和 6
1
年度の厚生省主主i態調査でも、明らかにされている。血LDL) ーコレステロール濃度を低下させる事
清中の、特に低密度リボタンパク質 (は、ごのリスクからのがれるもっとも有効な方策であり、食物による高コレステロー
ル症の予防や改善は、非常に重要な手段となりうる。多くの食品素材の中でも、特に牛乳には、栄養源以外の合目的性をもった各種活性構造物質が含まれている可能性は大きい。継続的な牛乳脂肪(バター)の多量摂取は、血清コレステロール濃度の上昇を招来するが、同量の脂肪を含むクリームの場合には、コレステロールの上昇は全く認められない事がボランテアによる人間血祭コレステロールで確かめられている。との事実はクリームの表面構造を形成している脂肪球皮膜成分 (MFGM) 中に降コレステロール作用がある可能性を示唆するものであり、動脈硬化防禦への一助となる可の降コレステロール効果を調べる能性を秘めている。今回、クリームおよび MFGMとともに、 MFGMの電気泳動による理化学的検索を行った。

実験方法

1.試料 (MFGM) の誠製
Kanno ら2)の方法により調製した。すなわち生クリームを、 3倍量の蒸溜水で 4回洗浄し、洗浄クリームを、4'cでー娩エージング後、小型のダイヤモンド型ステンレ‑205

スチャーンを用いてチャーニンク する。バターミルクを集め硫安半飽和になるように9図形硫安を加え、塩析後、一晩放置し、 3000rpm30分間遠心分離する。上層の凝集部を集め、 B
aC
12で陰性の反応が得られるまで 4'Cで蒸溜水に対し透析し、凍結乾燥保存した。なお以上の操作をFig'l に表図した。電気泳動用の可溶化試料については、上記で調整した MFGMをもとに Kanno" の方法により行った。すなわち調製したMFGMを、等量の 0.
3Mジヨードサリチル酸リチウム、 0.
1M Tris寸ICL緩衝液(pH1.
5)に懸濁する。 4'Cで30分間樹宇し、 4000Xgで60分間遠心分離する。上澄液を集め、透析し、凍結乾燥したものを電気泳動に供した。

2. SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法
Baschら'4の方法に準拠した。 15%ポリアクリルアミドゲルを用い、 0.03%SDSTris-g1ycine 緩衝液 (pH8.3) でスラフr~cm当たり、1 mAの電流で 15時間泳動した。ゲルは、一部を蛋白染色のため 0.
03%クマシブルーで染色し、 10%メタノール含有 7%酢酸で脱色した。また残りのー告日は、糖染色のため 12.5%TCAゲルスラブの蛋白を'5固定化し、 PAS染色を行った 。

3. 実験飼料実験に用いた飼料の高白或をTab1e 1に示した。主タンパク源、はカゼインとし、血祭コレステロールレベルを上昇させるため、 0.
5%コレステロールと 0.
25%コール酸ナトリウムを添加したものを基本飼料とし、対照群に与えた。試開平には基本飼料にクリームを 20%(1群)、 MFGM成分 3% (耳群)の割合で添加したものをそれぞれ与えた。クリームおよび MFGMを添加した実験飼料については窒素レベル、脂質量が同等になるようにカゼイン、バターで調整した。

4. 実験動物

4週齢の S
prague‑Daw
1ey(SD)系雄ラット(日本クレア)を使用した。一群 10匹とし、個別ゲージで 12日間飼育し、飼育期間中の食餌と水は自由に摂取させた。実験‑206開始時の体重は 70‑80gであった。

5. 血祭中のコレステロール・トリグリセライドの分析
飼育 6日目、 12日目のラットからエーテル麻酔下で心臓採血し、直ちに遠心分離(3000rpm20分間)して血祭を得た。血禁中の総コレステロールは、コレステロー
ルオキシダーゼによる和光Cholestero1E‑testキット、 トリグリセライドは GPO
p ークロルフェノール発色による和光 Trig1ycerideG‑t
田 t
キットおよひ高密度

リボタンパク (HDL)ーコレステロールはへパリンーマンガン沈織による和光 H D

L Cholesterol‑testキットを用いてそれぞれ測定した。また、糞中の膨質量は凍結乾燥糞にメタノールクロロホルム:水 (1:1:1) を加え抽出乾回したもので測定した。糞中のコレステロールについては則、車忽桑糞を 1N NaOH/エタノール(1・9)でけん化し、 i慮過後の様液を蒸発乾固し、さらに 1N NaO
Hに溶解後、 n‑ヘキサンで 3回抽出した。ヘキサンを溜去後、コレステロール値を定量した。

結果および考察
血ま豊中の脂質代謝改善に及ぼすクリームと MFGMの効果を離乳後の雄ラットを用いて比較検討した。
洗浄クリームから調製した M F G Mの成分分析ならびに電気泳動による浬化学的上が脂質と蛋白質で占められている事がわかった。
検索を行った。その結果、 97%ιL
さらに、その構成割合をみると、脂質が約48.8%、蛋白質が 49%そして炭水化物が1.05%であった (Tab12) 0 MFGMの蛋白構成は、一般に複数の蛋白からなっておりその多くは糖蛋自の形で存在している 7)。ごれらの膜蛋自のいずれにコレステロー
ル抑制効果があるのか否か、興味がもたれるが、それらを調べていく上にはあらかじめ構成蛋自の予備知識を得ておくことが必要と考えられた。そこで今回は、膜の可溶化に選択性を持つとされるジヨードサリチル酸リチウムを用いて MFGM蛋白を可溶化し、 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動で構瑚真蛋白を分解した結果、 Fig.

2に示したように蛋白バンドは約 12本程度、そのうち PAS染色による糖蛋白バンドについては、太いバンドが 2本、細いバンドが 2本、計 4本のバンドが認められた。

207

動物実験では、対照試料 (Table1) を与たえものを対照群とし、ごれにクリームを20%およびMFGM成分を 3 %添加したものをそれぞれ実験 I群と E群とした。実験期間は 12日間とした。体重と摂取量を毎日記録するとともに糞の性状を観察した。
対照群と実験群(1とE群)の体重および摂食量には有意差は認められなかった。ごの事は、今回用いたクリームと MFGM成分の投与量が、ラットの発育に悪影響を及ぼさないという事を示すものであった。
糞の性状を対照群と実闘宇で比較すると、両実験群共に糞の軟化が顕著で、その色調は黄白色を呈していた (Fig.
3) [略]。実験群にお付るとの糞の性状は、脂質の糞中への排池増加を表しているものと考えられた。事実、乾燥g 当たりの糞中脂質量の測定結果をみると、対照群の 73.
5mgに対してクリーム投与群(実験 I群)が 1
17mg
そして MFGM投与群(実験 II群)が 166mgと有意に高くなっていた (Table 3) 。
さらにまた、対照群、実験 I群および II群ほおける車幻操g 当たりの糞中コレステロール量についても、それぞれ8.
5mg、28.7mg
および34.
7mgと実験群の方が高い値を示していた(Table 3) 。ごれらの所見は、クリーム、特にクリームから調製したM F G
M成分が腸管から脂質やコレステロールの吸収を阻害するという事を示唆していた。

高コレステロール飼料を与えた対照群の血祭総コレステロール濃度(平均値)は、臼数の経過に伴って増加を示した (Fig.4)。一方、実験群は増加の割合均可尽く、 12日
自の実験 I群 ( 130mg/dl)と実験 I
I群 ( 150mg/dl) の値は対照群の値( 250mg/P<0.
05)。
dl) に比べ有意に低くなっていた (以上の様に、クリームやMFGM成分の投与が高コレステロール食ラットの糞中脂質とコレステロールの却時世を増加させる事およひ血祭総コレステロールj農度の上昇をe抑制するという事は、ごれらの物質、特に MFGM成分がラットの脂肪代謝の改善に有効に作用しているという事を示していた。今後は、 MFGM
成分の降コレステロー
ル作用のメカニズムについて詳細な研究均泌要である。

‑
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ositionof diet(苦}Table 1 C

Casein22
Mineralmixture 3.5
Vltaminmixture 1.2
L持rd(Butter)
10
Cholesterol
Sodium cholate
Cellulose
Sucrose0.5
0.25
359.55100‑209ーTab1e2 Gross composition of bovine
mi1k fat globu1e membrane

Composition

主 of tota1 mi1k fat

globu1e membrane
Protein

48.8

Lipid

49.0
1.05

Hydrocarbon

Va1ues were the mean of three preparations

Tab1e 3 Fat and chorestero1 1eve1s of・rat s feces

GroupFat

Chorestero1(mg/g feces)
Contro1

73.5

8.5

I117.128.8

I工

166.0

34.8

Contro1 : Chow(Tab1e 1)
I
工I

Cream 20告: Bovine mi1k glob1e membrane 3圭

210ーCo
賀町arcia1 45
事 raw cream
Washed four times with three
volumes of water
Washed cream
Churned with 1aboratory dia
皿 ond

・

churn after aging overnight(4 C)

Mi1k fat

Membrane‑containing serum
Sa1ted out by adding so1id
ammonium sulfate to give
half saturation.
Centrifuged for 30 皿 in at
3000 rpm.
Floated layer
Dialyzed against deionizedwater
Freeze‑dried

Milk fat glouble membrane

Fig. 1 Preparative procedure for fat‑globule men
曲 rane fraction‑211

CBPAS~司自ORIGIN

鴨十Fig.2 SDS‑PQ1sacrylamide gel electrophoresis
pattern of bovine milk fat globle membrane.
The electrophoresis was carried out in 15 %polyacrylamide gel at pH 8.3 with a current of
1 mA/gel/cm for 15 hr. Sample was applied 6.2fg/lanein the slab electrophoresis apparatus.
CB: Proteins stained with Coomassie brilliant
hlue
PAS:

Glycoproteinsstained with periodic acid

Schiff reagent

一212ー(mg/dl)

Plasma cholesterol

300200100。

12l

HDL‑cholesterol。
126Triglyceride。
612

Feeding days
Fig~ 4 Effect .
of cream and MFGM on ch01ester01 1eve1s
Contr01 group
IgroupIIgroup

亡二コ
石 市 白 川

‑
泊。

三.
.
.
.
.
.
;
‑;
':.
‑

‑213‑