2021年産官学・ＨＵＢ構想第２回シンポジウム

アフリカの農業を救う！
藍藻を用いたストリゴラクトン生産
東京農業大学 生命科学部 バイオサイエンス学科
准教授 渡辺 智
2021年12月16日

1藍藻（シアノバクテリア）
Synechococcus elongatus PCC 7942

 光合成をする微生物

CO2を吸収して、炭水化物と酸素をつくる

地球生態を支えている
一次生産者：プランクトンや魚のえさ

チラコイド膜光化学系複合体
http://www.genome.jp/kegg/pathway/ko/ko00195.html

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藍藻を用いたゼロエミッション型細胞工場の創製
医薬・農薬原料
香料

太陽光と二酸化炭素で生きる
シアノバクテリアを利用して環境負荷の少ない物質生産に挑戦！

藍藻工場

素材生産
（硫酸多糖）

色素生産
フィナンシェ（アウトリーチ活動）

絵、西内としお3農生研 大学院先導的プロジェクト

アフリカ農業を救う
ストリゴラクトン高生産系の構築と高活性類縁体の創出
坂田洋一、伊藤晋作、渡辺智 （バイオサイエンス学科）
橘隆一（森林総合科学科）
大島宏行（農芸化学科）
對馬誠也（分子微生物学科）
川田紘次郎、坂巻裕（バイオサイエンス専攻、院生）

4アフリカにおける根寄生植物の脅威
根寄生植物汚染度
重度
中程度
軽度

 アフリカの主要穀物であるトウモロコシやソルガム、イネなどに寄生する。
 アフリカで7000万ヘクタール以上の農地が汚染されている（日本の総面積の２倍！！）。
 100億ドルの経済的損失
 マラリア、エイズと並ぶアフリカの三大問題と言われている。
 現状で有効な解決策はない

Strigahermonthica
Adapted from Ejeta, G. and Gressel, J. (eds) (2007) Integrating new technologies for striga
control: towards ending the witch-hunt. World Scientific Publishing, Singapore; Image sources:
USDA APHIS PPQ Archive, Florida Division of Plant Industry Archive, Dept Agriculture andConsumer Services.

Striga asiatica

Image courtesy of International Institute of Tropical Agriculture (IITA)

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ストリゴラクトンとは？
 植物ホルモンの一つ（10 pg/イネ根1g）
 枝分かれ抑制作用
 βカロテンから4つの反応を経て合成（葉緑体、小胞体）

根寄生植物（ストライガ、オロバンキ）の発芽誘導物質

4DO
（天然型）
30, 000円/mg

GR24（有機合成）
4,000円/mg☞自殺発芽法に利用できる
根寄生植物種子ストリゴラクトン
処理
発芽

問題点

枯死

現在、合成方法が化学合成のみ
植物からの天然ストリゴラクトン分泌量は微量
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ストリゴラクトン合成経路
β-カロテン
D27

葉緑体

9-シス-β-カロテン
CCD79-シス-β-アポ-10’カロテナール

CCD8カーラクトン(CL)CYP722C

5-DS

CYP711A2

MAX1カーラクトン酸

小胞体

4デオキシオロバンコール (4DO)
CYP711A3(＋)-ストリゴール

メチルカーラクトン

オロバンコール

ストリゴラクトン

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ストリゴラクトン合成経路
β-カロテン
D27

葉緑体

9-シス-β-カロテン
CCD7

藍藻

9-シス-β-アポ-10’カロテナール

CCD8カーラクトン(CL)CYP722C

5-DS

CYP711A2MAX1

葉緑体の祖先生物
葉緑体と同様の細胞内環境
光とCO2を利用して成長

カーラクトン酸

4デオキシオロバンコール (4DO)
CYP711A3(＋)-ストリゴール

メチルカーラクトン

オロバンコール

ストリゴラクトン

藍藻 Synechococcus elongatus PCC 7942
電子顕微鏡写真

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藍藻を用いたカーラクトン生産
藍藻 Synechococcus elongatus PCC 7942

LC/MS/MS解析

β-カロテン
9-シス-β-カロテン

9-シス-β-アポ-10’-カロテナール

CLのフラグメントイオンパターン(Setoet al.)

発現ベクター

カーラクトン
細胞外に排出される「シアノバクテリアを用いたカーラクトン生産」 特願2020-22999

藍藻から抽出したCLのフラグメント
イオンパターン
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藍藻を用いたカーラクトン生産
CL生産量

菌体内/外のCL存在量

培養上清

細胞破砕 酢酸エチル抽出cell

8×105

sup

6×105
4×105
2×1050

n.d.

n.d.

EV-

EV+ SL3- SL3+100

CL (ng/gFW)

細胞

Area value

回収

80
60
40
200

n.d.

n.d.

EV-

EV+SL3-酢酸エチル抽出 濃縮 sup
濃縮 cell

SL3+

IPTG（-/+）• 培養３日で菌体１gあたり約80 ng の CLを生産→シロイヌナズナ（Col-0）
イネ（Shiokari）

約300 pg/gFW 250倍
約100 pg/gFW 800倍• 藍藻からCLが菌体外に排出されていることを確認「シアノバクテリアを用いたカーラクトン生産」 特願2020-22999

10根寄生植物の発芽刺激活性の確認
根寄生植物ヤセウツボ（Orobanche minor)

2020年 5月 9日

ヤセウツボ@多摩川
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根寄生植物の発芽刺激活性の確認
根寄生植物ヤセウツボ（Orobanche minor) 種子
CL含有藍藻培養液により作成した寒天プレート

発芽種子

藍藻由来のCLは発芽活性を有することを確認

総種子数

発芽種子数

発芽率

CL生産株寒天1,432322.23%

空ベクター
寒天

1,23600%

伊藤晋作 准教授（バイオサイエンス学科）
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イネの分けつ抑制活性の確認
d10-1 (ストリゴラクトン生合成変異体) へのSL3株培養液の効果
Mock

SL3株培養液(カーラクトン)

伊藤晋作 准教授（バイオサイエンス学科）

第二分けつ

実験手順：
SL3株培養液を酢酸エチルで抽出、濃縮したものを約100mLのイネ水耕用培地に懸濁し、発芽1週間のd10-1を水耕用培地で1週間生育させ、測定した。

SL3株培養液で処理したイネは第二分けつ伸長が抑制された。
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ストリゴラクトン合成経路β-カロテン
D27

葉緑体

9-シス-β-カロテン
CCD7

藍藻

9-シス-β-アポ-10’カロテナール

CCD8カーラクトン(CL)CYP722C

5-DS

CYP711A2

MAX1カーラクトン酸

小胞体

4デオキシオロバンコール (4DO)
CYP711A3(＋)-ストリゴール

メチルカーラクトン

オロバンコール

ストリゴラクトン

酵母
ストリゴラクトン合成酵素の活性化
14藍藻-酵母によるストリゴラクトン生産
酵母 Saccharomyces cerevisiae WAT11

藍藻 S. elongatus PCC 7942
β-カロテン

小胞体

9-シス-β-カロテン

ストリゴラクトン(4デオキシオロバンコール)

9-シス-β-アポ-10’-カロテナール

ATR1

取り込み

CYP711A2

カーラクトン
細胞外に排出「シアノバクテリアおよび酵母によるストリゴラクトン生産方法」 特願2021-164871

15藍藻-酵母によるストリゴラクトン生産
実験手順

SL (4-deoxyorobanchol: 4DO)藍藻CL生産株を培養し、誘導剤添加でCL生産

酢酸エチルで抽出

4DO (ng/L)

藍藻CL生産株培養液（カーラクトン含有）と一緒にCYP711A2発現酵母を培養
19 h

1600
1200

1.1±0.1 ng/L

800
4000LC/MS/MSで測定

CL
原液

CL（1/2） 5倍希釈
CL（1/5）2倍希釈

シアノ培養液の希釈率• 培養4日で菌体１gあたり約130 ng の ストリゴラクトンを生産→イネ（Shiokari）約10 pg/gFW 13,000倍

根寄生植物（ストライガ）の発芽刺激活性を確認「シアノバクテリアおよび酵母によるストリゴラクトン生産方法」 特願2021-164871

16根寄生植物の発芽刺激活性の確認
ストリゴラクトン (GR24) 入り寒天培地で2週間インキュベート

Striga hermonthica
100706050403020100Germination (%)

Germination (%)

Orobanche minor （別名ヤセウツボ）• ハマウツボ科（ストライガ と同科）
• 日本では外来種として定着• ストライガ と比較して寄生力は弱い
806040200

GR24 (nM)

GR24 (nM)

シアノバクテリアによるCL生産量 (100 nM) より低濃度で発芽を確認
17カーボンニュートラル
低炭素化社会に貢献

まとめ

組換え藍藻と酵母を用いることで、短期間で、大量にストリゴラクトンを生産
さらに多様なストリゴラクトン生産にチャレンジ
カーラクトン(CL)CYP722C

5-DS

CYP711A2

MAX1

ストリゴラクトン

カーラクトン酸

4デオキシオロバンコール (4DO)
CYP711A3(＋)-ストリゴール

メチルカーラクトン

オロバンコール
18実用化に向けた課題と企業への期待
スケールアップ：
生産効率を保ちつつ、大規模に生産各ステップ（培養、精製）の簡便化：
直接アフリカの土壌に散布？
植物工場のシステムを利用できないか？
製剤化（農薬、製薬企業との共同研究）
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