ナノ結晶をプローブとした X 線 1 分子計測法
佐々木裕次

財 高輝度光科学研究センター


戦略的創造研究推進事業

要旨

生物医学グループ

佐々木チーム

科学技術振興機構〒6795198 兵庫県佐用郡三日月町光都 111生理条件下での in vivo 1 分子計測は分子生物学において非常に重要な情報を得ることのできる究極的計測手段である。しかし，可視光を利用する高感度 1 分子計測である 1 分子蛍光共鳴エネルギー移動法でさえも，分子内の微少な構造変化をモニターすることは難しい。ここでは X 線を用いた 1 分子計測法による DNA 分子や他の生体分子，特に膜タンパク質分子の分子内構造変化の測定例を示す。例としてバクテリオロドプシン（bR）の35番アミノ酸残基の運動結果を紹介する。測定の結果，0.73±0.48 Å という高精度の構造変化を計測することができた。計測された瞬間的な構
造ジャンプは，通常のブラウン運動の14倍の分子揺らぎ幅に相当した。この変化はすでに解析されている bR の 3 次元構
造情報から類推される構造変化時の35 番アミノ酸残基の変位量と一致するものであった。このような結果が得られたことは，膜タンパク質の in vivo 動的 1 分子計測へ向けての重要な 1 歩と言える。

1. 1 分子が注目され始めた

測学という分野が独立に成立し始めている。

1990年代前半までの 1 分子計測では，1 分子の機能に重生命現象を解析する上で，関与する機能性生体 1 分子

要な情報を確かに得てはいたが，1 分子の蛍光強度を精確の挙動を in vivo 環境下で Å 精度の計測をしたいと考えるに計測して得られたデーターは少なかった。それが一変しことは極めて当然である。生命科学が取り扱う現象すべてたのが，船津らの ATP 1 分子計測である5) 。まさに蛍光が，分子レベルで発現し分子レベルで解釈される。所謂，1 分子を検出して，機能性生体分子のメカニズム解析に役生物学が分類学や生物化学から分子生物学に躍進した 20

立てた最初の論文と言って良い。その後，多くの類似の研

世紀初頭において 1 分子の重要性は再認識されたと言え究がなされ69)，現在では目的に合致した標識法が確立さる。しかし，分子生物学の登場から半世紀も経った後に 1れた。例えば，高速の時系列データーが必要な場合は，1分子計測は登場した。なぜなら，計測手段は多くの要因が分子蛍光に拘ることはなく，目的生体分子の機能を損なう

重なって発展する分野であり，発想だけで実現できる分野

ことのないように多くの蛍光分子を目的分子周辺に標識すではないからである。光源系，検出系，標識法，分析検出る。また，構造変化及び分子移動を詳細に計測したい場合

手法，そして試料調製手法と多くの分野の発展がなければは，1 分子の蛍光中心位置をゆっくりと計測する。このよ

1 分子検出は実現できなかった。1 分子計測の歴史が，可うに 1 分子の機能解析が目的なので，1 分子の蛍光分子を視光領域の光を用いた計測法から始まったのも，高強度のモニターすることに固執することなく，色々な状態での 1

光源と極めて感度の良い検出器があったからである。

分子機能計測が今の 1 分子計測の流れであり，その流れ

可視光を用いた 1 分子計測の歴史は，企業分光学者 T.

は生物の機能解析の一手段として 1 分子計測を考えた場

Hirschfeld1)によって 1970 年初頭に始まった。そして生体合，正しい判断と言える。闇雲に 1 分子を検出する事の分子に蛍光分子を標識して分子運動観察をする研究が 10

みに価値を見いだすのは，生物物理学の研究ではなく，純年後の 1980 年初頭に日本において行われた24)。このよう

粋分析科学のジャンルの仕事となる。

に T. Hirschfeld の研究成果以来，この研究を純粋な分析

ここで紹介する X 線 1 分子計測法も， X 線でダイレク

分光学の成果としてではなく，生物系でも利用価値のあるトに 1 分子挙動を計測している訳ではない。 X 線の物質

成果として認識するのに 10 年もの時間がかかったのは意に対する散乱断面積から考えると，第 3 世代の大型放射外である。つまり，生体分子の機能解析に 1 分子計測が光強度レベルでは常識的には不可能である。 X 線 1 分子

極めて明確な回答を得る唯一の方法であるという点を意識計測の特徴は，上記のような可視光（ 300 nm 800 nm ）するのに時間を費やさなければならなかった4)。ただ 1 分を用いた 1 分子検出法ではなく，それよりも波長が千分子を計測するのではなく，生体系の機能の根幹を理解するの 1 程度短い X 線領域の光（2 nm 0.01 nm ）を用いていための方法として 1 分子計測が再認識されて実際に利用るので，極めて高精度に分子内運動をモニターできる点にされ始めた。現在は，多くの分野を巻き込んで 1 分子計ある。可視光で 1 分子の動きを見る方法は，ビデオエン放射光 May 2005 Vol.18 No.3 ● 165(C) 2005 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Researchハンス法10)等の利用もあって，可視光（300 nm 800 nm ）1 分子計測系であることに違いはない。

の波長域を用いていても数 nm の精度で分子運動をモニターできる。特に 1 分子蛍光共鳴エネルギー移動法（Sin-gle Molecular Fluorescence Resonance Energy Transfer

2. 結晶性ナノプローブを検出する X 線
1 分子計測法

Method: SMFRET）は，蛍光分子の選択にもよるが，1
nm 以下の分子内移動距離を計測できる可能性がある11)。

1 分子の運動が計測可能でかつ位置決定精度 pm レベル

しかし， SM FRET の問題点は，蛍光 1 分子自身が化学が実現すれば，機能性タンパク質分子の分子内運動が正確

環境に敏感すぎて信号強度が非常に不安定になる点にあにモニターでき，機能発現に伴う微小な構造変化情報が得る。この特性は利用法によっては利点になるが，生体分子られる。しかし，多くの研究者は，“X 線を用いて 1 分子内の局部的な化学環境まで正確に理解できていない現状でを検出できるのか”という疑問を持つ。それは，物質とは問題点となる。また，生体分子内部の構造変化をモニ

電磁波との散乱断面積の大きさは，波長に比例するというターしようとすると，多くのタンパク質分子が10 nm 程度

常 識か らの 当然 の疑問 であ る。 無論 ， X 線の 発光， 吸の大きさと考えると，その十分の一である 1 nm 動くと言収，散乱現象を用いて 1 分子を直接的に検出することは

うのはかなりの大きな運動となる。内部運動を精確にモニ第三世代大型放射光施設を用いて数時間の積算をしたとしターしようとするならば，その一桁下の精度は必要となろても難しい。私は X 線の物理現象で一番高感度な現象，う。そこで X 線の登場となった。後述するが位置決定精つまり X 線回折を利用した，時分割回折 X 線追跡法

度はなんと～1 pm である。つまり，0.001 nm の測定精度（DiŠracted X-ray Tracking: DXT）が 1 分子検出の可能性が現実のものとなった。

があると考えた。 X 線 1 分子計測法のアイデアは単純で正確な理論式ではないが，波長 l とすると 1 分子計測

ある（Fig. 1 ）。まず，直径数 nm 程度の極微ナノ結晶をタの位置決定精度は，～l/100まで可能である12)。可視光領

ンパク質分子にその機能を損なわないように標識する。そ域が 300 800 nm とすると数 nm の位置決定精度は合点がして，極微ナノ結晶からのラウエ斑点を指標に，着目したいく。これを X 線の波長（＝20.01 nm）に置き換えて考タンパク質分子の動きを時分割（～ms 程度）トレースす

えると，pm オーダーの位置決定精度が出ることになる。

る。 Fig. 1 には，目的 1 分子ユニットの一部に構造変化がこのようにして，可視光を利用した計測方法の限界を認識

あると，その部位に標識されているナノ結晶がその構造変し，分子内構造変化情報の重要性を考えて， X 線 1 分子化と同期して変位し，ナノ結晶からのラウエ回折斑点の方

計測は登場した13)。

向を変化させるという例を示している。ここで注意しなけ

付け加えておくが， SM FRET が最近になって多くのればならないのは，検出しているのは標識されたナノ結晶

生体 系に おい て使 用さ れる よう にな った1416) 。 特に inの方位であり，分子自身の方位や並進運動ではない。従っvivo での計測は予想以上に利用され始めてきた。これは，て，ここでは，ナノ結晶の運動とナノ結晶が標識された目

比較的安定な FRET を起こす蛍光分子群が市販され始め的分子内の部位（被標識部位）が同様の運動をしているとた事と，モニターしようとしているスケールが 2 10 nm

いうことが大前提となる。これは，ナノ結晶と被標識部位程度に特化している点に注目すべきである。今後，それ以の距離，結合状態に依存すると予想される。この前提の検下の精度を目標とした実験もより安定な蛍光分子群が普及

証は，各条件下で計測して行なうしかない。今のところ，され始めれば， 1 nm レベルもしくはそれ以下の分子内構比較的広い条件下でこの前提は成立していることが分かっ

造変化も計測可能になるかもしれない。今後も注目されるている。

Fig. 1

Schematic drawing of the single molecular detection system using x-rays (not to scale). DiŠracted X-ray Tracking(DXT) monitors the behavior of a single special domain with the guidance of diŠraction spots from thenanocrystal which is tightly coupled to the special domain. In DXT, we directly monitor the rotating motions of
the labeled nanocrystal.

166 ● 放射光 May 2005 Vol.18 No.3

ナノテクノロジー特集 ■ ナノ結晶をプローブとした X 線 1 分子計測法

以上のように，ここで議論する X 線 1 分子計測法は，厚さ70 mm）の上に生体分子をソフトに化学固定する。固直接的に 1 分子の動きを X 線検出する方法ではない。最定法はいくつかの方法が開発されている21,22)。典型的な例

近議論されている17) 自由電子レーザー等の次世代大型放を DNA 分子やミオシン分子の基板固定で説明する（ Fig.

射光 施 設を 用 いた 1 分子 構 造解 析 とは 異 質の も の であサイトを基板表面に修飾
2 参考）。Fig. 2(a)では DNA の 5′る。しかし，この究極的な方向の研究は， X 線だけではしている。最近では DNA 分子を合成して使用することがなく電子線の単粒子解析法18) や NMR の 1 分子バージョ

サイトへ活性部位（例えば SH 基等）を導入
多いので，5′ン と も 言 え る 磁 気 共 鳴 力 顕 微 鏡 （ Magnetic Resonance

することは難しくない。Fig. 2(c)は，ミオシン分子を基板

Force Microscopy: MRFM ） の 目 指 す 1 分 子 構 造 決 定

固定した例である。この場合，末端部分（ N 末端や C 末

法19,20)，それに計算科学が推し進める 1 分子構造予想の流端）に活性な SH 基や His-tag 基などを遺伝子導入する方

れを見ても必然的であり，ある意味では X 線分野はまだ法が利用される。 His-tag 基の導入は，変異体を精製する

遅れていると言ってもよい。これから 10 年以内には，上過程で最近頻繁に利用されているので，特別な変異体の作記の中で 1 分子構造を決定できる方法論が選択されるで製を必要としない。問題は SH 基の導入である。変異体導あろう。その時の選択基準は，高分解能計測であることは入された SH 基は一般に活性が高く，他の同一分子と SS

自明として，より多くの研究者に提供されやすい環境での結合を作ってしまうので，DTT 等の酸化防止剤を共存さ方法論となるであろう。この点からも，生体系をダーゲッ

せて試料保存しなければならない。ただし，基板と変異体

トとする方法論の研究において，多くの研究者が手軽に使を反応する際は，これらの酸化防止剤自身が優先的に基板

える計測手段であるという条件は，益々重要な因子として表面と反応する場合が多いので，サンプル溶液から低分子認識し，新しい計測手段の研究に携わらなければならない除去などを反応直前に行わなければならない。
正確な生体分子の基板への配向性を必要としない系の場と言える。

合は，二価性試薬を用いて生体分子内の活性なアミノ基な3. 生体 1 分子のソフトな基板固定

ど（非特異的固定）を介して基板固定する場合もある。基板固定で注意する点は，目的分子と基板表面の間を直接接Fig. 1 のような X 線 1 分子計測を成功させるためには，触させない程度に基板修飾分子で空間を空けることであ 生体 1 分子ユニットの3 つの技術的ポイントがあった。

る。直接結合させることでタンパク質分子自身の構造に歪 1 分子に対して 1 ナノ結晶を 1 対 1
ソフトな基板固定

みが入り，保持する機能が劣化することが多く報告されて 良質のナノ結晶作製である。
に標識する方法，及びいる。しかし，空けすぎると極端な言い方をすれば，水溶 については，水溶液中を拡散，ブラウン運動している


液中に存在している時の自由運動と同様の運動となり計測

分子にナノ結晶を標識しても，現在の放射光のフラックス

不可能となってしまう。上記空間は目的分子や固定する残量ではナノ結晶からの X 線回折斑点を実時間（最低ビデ

基位置に依存して異なる。またここで注意する点は，このオレート速度で）測定することは不可能である。従って，固定法が X 線 1 分子計測法の必須条件ではないと言う点

X 線を非常に良く透過する石英基板（通常利用するのはである。検出される X 線回折斑点の感度が向上すれば，Fig. 2(a) Schematic drawing of the x-ray single-molecular detection system for individual DNA molecules in aqueous
solutions (not to scale). DXT traces the displacement of the single diŠracted x-ray spot from the one-dimensional
Si/Mo nanocrystal, which is linked to the individual DNA molecules. The diameter of the nanocrystal and the
DNA molecule are about 30 nm and 2.53 nm, respectively. (b) Schematic drawing of the sample of physical adsorbed Si/Mo nanocrystals on the Au/quartz. (c) DXT monitors the behavior of a single lever arm domain withthe guidance of diŠraction spots from the nanocrystal which is tightly coupled to the observed lever arm domain.
The N-terminal of the myosin molecule is bound to the surface of the quartz substrate. The C-terminal of the individual myosin molecule is reacted with the single nanocrystal.

放射光 May 2005 Vol.18 No.3 ● 167

処理前の大きさに比べて倍近くに大きくなってしまう。
この処理を X 線 1 分子計測法で利用すると問題が起こるかもしれない。現在検討中であるが， X 線 1 分子計測法で以前ポリマーの動的挙動を実験した際には13) ，当然ながらその動的な挙動が確認されている。つまり，ポリマー層を目的生体分子とナノ結晶の間に挿入することになるので，ポリマーの動的挙動を付加した情報しか X 線 1
分子計測では得られなくなる。現在，より短いポリマーで分散特性が維持できないかを検討しているが，極めて短くして（例えば数 nm ）分散性が残るのであれば，この有効Fig. 3(a) The number of reacted sites with the labeled nanocrystal
is expected to single site in the observed protein molecular
unit. In order to control the number of labeling cysteine sites
in protein molecules, we utilized a mercury compound to occupy the remaining cysteine sites. (b) Individual ‰uorescentsemiconductor nanocrystals (Quantum Dots: QDs) is encapsulated in the hydrophobic core of a micelle composed of a
mixture of n-poly (ethyleneglycol) phosphatidylcholine(PEGPE) and phosphatidylcholine (PC) to be solubilized
in aqueous solutions. The part of red circle is only reactedwith the protein molecules.

な表面処理工程を利用できるかもしれない。この処理が可能になれば，ナノ結晶に目的生体分子を 1 つの結合サイトで反応させる処理法の確立も可能性が出てくる。
目的生体分子へのラベル反応は極めて単純である。現段
階では，安定的に水溶液中に存在するナノ結晶と基板上に固定された生体分子を 210 時間程度 510°
C程度でインキュベーションし，その後，バッファーでソフトにかつ何度もよく洗い流すという単純なプロトコルにしている。この際注意する点は，洗い流すのであって洗い溶液を基板にたたきつけるように洗浄してはならない。比較的ソフトに基より高速の計測が可能となり，水溶液中を浮遊している分板固定しているためか，簡単に剥離することが確認されて子の分子内運動も計測できる。

 に関しては，次の章で説明する。
いる。

 に関しては現在のところ，完全には解決していない。


理想的には目的 1 分子に標識されるのはナノ結晶 1 つで

4. ナノ結晶作製

なければならない。それも目的分子中の 1 つのサイトを介してである（Fig. 3 参考）。本研究で用いているナノ結晶

最初に X 線 1 分子計測の実験に用いたナノ結晶は，サは金結晶であり，金は X 線回折の検出感度が高いばかり

イズが非常に揃っている市販された金コロイドであった。

ではなく，金表面と SH 基との共有結合が有効に利用でき

金コロイドは免疫電子顕微鏡等でかなり利用されており，る。金表面は無数の活性サイトを持っているので，複数のナノ結晶自身の格子像も確認されている比較的結晶性が良

システインとの反応が進むことが容易に予想される。現状

いと考えられていた結晶体であるが，実際に SPring-8 では，金表面の汚れのためにそれほどの多くの活性サイトを

ラウエ像を取ると，金コロイドから回折斑点はほとんど得

金ナノ結晶表面に考えなくてもよいらしく，将来的には活ることができなかった。これは，物質に対する電子線と性表面をこちらが指定した表面電荷になるように金表面化

X 線の散乱断面積の違いを如実に表わした結果として理学修飾を施して，完全に 1 つの反応分子のみを金ナノ結解できる。従って， X 線を用いる場合は，ナノレベルの晶表面に修飾することを目指している。

良質の結晶体を自作するしかなかった。

最近多く利用され始めた極めて高効率に蛍光発光する量

より良質の結晶を作製すべく，一次元及び三次元結晶の子（ナノ）ドット23,24)の表面修飾法は非常に参考になる。

自作を行なった。主に 2 つの方法を考案した。1 つ目は X

元々ナノサイズの粒子は，表面イオンによる反発で水溶液

線の反射鏡に使用されている多層膜（ Mo / Si 系）をナノ中になんとか分散状態で保持できていた。しかし，イオンレベルのドライエッチングにより切り出した多層膜ナノ粒

強度の高い生体環境下では，容易に凝集し沈殿してしまう子である（ Fig. 4 ( a ））。最終的に基板から多層膜粒子を切現象が以前より知られていた。そこで多くの研究者が行っり離さなければならないので，その際の工夫は厄介である

たのは，非特異的吸着が少なく，生体環境下においても分が 高 反 射 率 で 直 径 30 nm の 多 層 膜 粒 子 の 作 製 に 成 功 し散状態を長時間保持できる表面処理法を探すことであった13,25) 。 こ の 結 晶 は ， 電 顕 写 真 を 見 て も 分 か る よ う にた。結果的に，ヘテロ 2 官能性ポリエチレングリコール（Fig. 4(b）），ナノ領域で比較的平坦な平面を持っている。

をナノ粒子の表面処理剤に用いることで，反応性を持った

これは，ナノ結晶の検出に X 線回折だけでなく， X 線全安定なナノドットを得ることができた（ Fig. 3 ( b ））。ここ

反射現象も利用できることを示唆している。 X 線の全反で取り扱っているナノドットは直径 5 10 nm 程度の粒子射現象は今使用している硬 X 線領域よりも軟 X 線領域にで，その外側の表面処理に用いたポリマーの長さは，48おいて有効な反射強度を得ることが期待できる。軟 X 線

nm 程度である。従って処理後のナノドットの大きさは，

1 分子計測の有用なプローブとなる可能性を示唆した結果

168 ● 放射光 May 2005 Vol.18 No.3

ナノテクノロジー特集 ■ ナノ結晶をプローブとした X 線 1 分子計測法と考えられる。また，このようなナノレベルの局部的な平を利用した方法である。単結晶 NaCl ( 100 )基板面上に連滑表面は，水溶液中で作製する金コロイドの一種において続膜になる前段階の状態まで金を 0.001 0.01 Å / s でゆっも最近確認されている26) ので，水溶液中でのプローブ作

くり真空蒸着する。そうすると金は不連続膜（アイランド）製の可能性も残されているかもしれない。

状態でエピタキシャル成長する。金結晶が成長している

2 つ目の方法は，結晶性の良い薄膜を作製するために無間，基板の温度は 375 °C 付近に保持しておく。そうする

機材料において応用されている現象，エピタキシャル成長と，膜厚 1 nm で直径 20 30 nm の金ナノ結晶が完成する（ Fig. 5 ）。特記することは，エピタキシャル成長をこのようにナノ結晶（粒子）を作製するために積極的に利用した例は本実験が初めてという点である。しかし問題点があった。この金ナノ結晶や先の多層膜ナノ粒子はいずれも真空中で作製したので，これらの結晶を水溶液で使用するために基板から剥離させると，一瞬にして凝集が開始し 1 分
子への標識などは不可能であった。そこで，その凝集の原因であるナノ結晶表面の疎水性を親水性に変えるために界面活性剤を比較的高濃度（1050 mM ）添加して安定なナノ結晶含有水溶液とした（Fig. 5）。この界面活性剤自身がこの後の生体分子との反応効率に影響しないことは確認済みである。

Fig. 4

Cross-sectional view of the fabricated substrate to make theartiˆcial nano-particles. Silicon dioxide beads were used as amodel protective coating array because the rate of the reactive ion etching with SiO2 is much lower than that of the Si/
Mo multilayer. The diameter of the SiO2 beads is about 0.1
mm. A thin polymer (polymethylmethacrylate: PMMA) ˆlm
was used to separate the Si/Mo multilayer from the silicon
substrate. The Image of Scanning Electron Microscope isshown the Si/Mo nano-particles on the Si substrate after thereactive ion etching (RIE). Although the etching rate of
SiO2 with oxygen is smaller than that of Si/Mo multilayer,
there are the nano-particles of the Si/Mo multilayer under
SiO2 beads. The part of square-box is assigned to the nanoparticles of the Si/Mo multilayer in SEM images. The scale
bar at bottom right shows 200 nm.

Fig. 5

この NaCl 基板上でのエピタキシャル成長工程において重要な因子は，今までの実験結果より以下の 4 点になる。
あ 蒸着時の蒸着速度
い 蒸着時の基板温度
う アニーリング温
え アニーリング時の圧力である。
あ
い は無機材料的な発度
う
え は予想できなかった。当想からすぐに理解できるが，

初は，蒸着した後すぐに800度前後のアニーリング温度へ昇温させた。そうすると蒸着したはずの金薄膜（紫色）が全く基板上に存在しなかった。NaCl が真空中で高温にさらされたために昇華されたのだ。それで一度真空状態から出して，別のアニーリング装置内で再加熱を行うことにした。現状は数 MPa 程度にしか加圧できないが，アニーリ

We used gold nanocrystals (thickness＝10 nm ) fabricated by vacuum-evaporation on NaCl (100) surface at 800°
C for 5 min. The gold nanocrystals were separated from a NaCl substrate (10×10×1 mm) by the solution (50mM Tris/HCl, pH＝8.0) containing some detergents. We conˆrmed that the diameter of a gold nanocrystal is 20
30 nm by Scanning Electron Microscope, Atomic Force Microscope, and Dynamic Light Scattering. The AFM
image is shown.

放射光 May 2005 Vol.18 No.3 ● 169

ング温度と加圧は明らかに正の関係があり，アニーリング
後のナノ結晶の粒径にはそれほど大きく影響しないことが分かった。これらの実験結果より，より小さな粒径での完
全ナノ結晶を作製するためには，最初の蒸着時に，より小さいアイランド状態を形成させ，再加熱（アニーリング）
時には，できるだけ高圧状態で NaCl の昇華をできるだけ減らした状態で温度を上昇させ， Au の蒸発量を減らすことが重要であると分かった。

5. 実験装置
本実験では，ある領域内のブラック角すべてで反射が可能でなければ，生体分子に標識された金ナノ結晶の回折斑
点を連続的に検出することは不可能なので，連続波長帯を持った白色 X 線が必要となる。従って，白色でかつ集光能力を持った大型放射光施設 SPring-8 の BL 44B2 にて

Fig. 6

実験を行うことにした。本来白色特性というのは，放射光光源の特徴であるから，白色を利用する実験方法は正に放射光でなければ実験できない方法論であると言える。デー
ターは，数 ms レベルのパルス X 線光源を使用して，ビデオレート程度で 1 2 秒間計測した。検出系は， X 線を
可視蛍光に変換する X 線イメージングインテンシファイ
ヤー V5445P を使用。可 視蛍光は CCD カメ ラにて検出

The photograph of the instrumental arrangement for
DiŠracted x-ray tracking method. We used the white X-ray
mode (Laue mode) of beamline BL44B2 (RIKEN Structural
Biology II, SPring-8, Japan) to record Laue diŠraction spots
from nanocrystals. Photon ‰ux at the sample position is estimated to be about 1015 photon/s/mm 2 in the energy range
from 7 kV to 30 kV. The x-ray focal beam size is 0.2 mm(horizontal)×0.2 mm (vertical). A diŠraction spot wasmonitored with an X-ray image intensiˆer (Hamamatsu
Photonics, V5445P) and a CCD camera (Hamamatsu Photonics, C488082) with 656×494 pixels.

（ Fig. 6 ）。この検出システムがビデオレイトのリアルタイ
ムイメージングを可能にした（12 秒間連続計測）。
サンプルは，厚さ約 7 10 mm の水溶液層を挟んで片側を X 線透過フィルムで封をしている。フィルムは，耐放識によって計測したい分子の運動特性が変化しないように最大の注意を払う。

射性の高いポリイミドフィルムを使用した。このポリイミ

分子の運動は大まかに 2 種類ある（ a と b ）。現在の実ドフィルムは比較的薄膜が均一でフィルム表面を清浄化し

験配置は透過型ラウエ計測なので，a 型の運動に対してのやすく，よく X 線実験で利用されている。基板側は，両み非常に感度良く計測できる。Fig. 2(b)では，もしナノ結面研磨した石英基板（厚さ70 mm）を用いた。石英基板自晶に DNA 分子が修飾されずに物理吸着した場合を表わし

身に化学修飾をして，生体分子を吸着させることもある

た。また，同様に物理吸着している場合でも，回折条件がが，金を蒸着して基板として使用することもある。この場満たされずに回折 X 線が得られない場合も考えられる。

合の金は，アモルファス状態なので X 線の回折スポット

つまり， X 線 1 分子計測法では， X 線照射内にナノ結晶を発生したりはしない。

があっても回折条件が満たされない場合はナノ結晶の存在

サンプルの温度制御は可能で，通常 05°
C設定下にて行を確認することはできない。また，ナノ結晶が存在して結なわれた。1 秒間の照射実験を何度も繰り返し，各運動を晶方向も検出できる方向に向いていたとしても，その結晶

統計処理して既知のブラウン運動と比較検討を行うのが基性が良くなければ検出することはできない。感度的に極限本的なデーター収集法である。

で計測しているので，ナノ結晶の結晶性は極めて重要である。

6. 吸着 DNA 分子ブラウン運動計測（生体高分子モデル実験）

新しい計測法の測定限界を実験的に決定することは，これから計測対象になるサンプル系を明確化できるだけでな
く，解析上も重要な因子の決定となる。 X 線 1 分子計測

X 線 1 分子計測を生体分子に適応する最初の例として

法の測定限界は，Fig. 2(b)の例を利用して決定された。確DNA 分子を用いた。設計しやすく構造も既知で単純だか認された回折斑点の安定性を計測することにした。 50 点

らである。 Fig. 2 ( a )のように，直径 40 50 nm 程度の多層程度の回折斑点を観察した結果， 1 秒間に 2u ＝ 1.5 mrad

膜ナノ粒子を計測したい DNA 1 分子（図では短い塩基列以内の安定性が確認され，この数値をもし長さ 6 nm の末端）を持った DNA 分子）の興味ある部位（ここでは 5′

DNA 分子の最小運動値として表わすのであれば， 4.5 pmに化学的に標識する。その際，分子の固定とナノ結晶の標という数値を得ることができる。この数値は原子直径の約170 ● 放射光 May 2005 Vol.18 No.3

ナノテクノロジー特集 ■ ナノ結晶をプローブとした X 線 1 分子計測法

Fig. 8

Schematic drawing of the cross-sectional view of DXT in thecase of BR S35C. DXT monitors the spots of diŠracted xrays from individual nanocrystals that are tightly labeledwith individual BR S35C. Samples containing the immobilized BR S35C were ˆlled with the oxygen scavenger system(25 mM glucose, 14 mM 2-mercaptoethanol, 10 nM catalase
and 2.5 mM glucose oxidase) in 50 mM MOPS (pH 7.0).
The ratio of BR molecules to nanocrystals to be one to one isable to be realized because Hg compound (PCMB) ˆrst
labelled with excess sulfhydryl groups in BR S35C.

るために，より in vivo に近い状態で機能性タンパク質分子の機能発現に伴う 1 分子動的挙動計測を試みた27) 。機
能性タンパク質分子の中で，極めて魅力的なのは細胞の内Fig. 7

Examples of the diŠracted spots from the single Si/Mo
nanocrystal which is linked to the adsorbed DNA molecules
in aqueous solutions appeared as brightly shining dots
(white-blue). Frames are spaced at 180-ms intervals. The
total observation time was 1 s.

側と外側の調製機能として極めて重要な役目を担っている
膜タンパク質分子である。今回のサンプルは光反応系の代表的な膜タンパク質分子，Bacteriorhodpsin (bR) である。

bR は分子内に有するレチナール分子が特定波長（568 nm）を吸収し異性化することで，プロトンポンプとしての機能を発現する。本実験では， bR1 分子の特定部位（アミノ1/100 の長さに相当する。注意しておきたいが，この数値

酸35残基目）に SH を導入した変異体を用いて，アミノ酸

は， X 線 1 分子計測によって測定された回転運動の変位

35 残基が存在する A B ループ部位に，そこから少し距離をある点を支点に並進運動に変換した場合の数値である。

のある部位に位置するレチナール分子の光励起に伴う構造

この剛体モデル的数値換算が成立しない場合は，より小さ

変化がどのように伝達されるかを計測した（Fig. 8）。

な運動をモニターしていることになる。分子の熱揺らぎ等

従来の bR の構造変化計測は，レチナール部位が赤外及を考えると，この並進運動に換算した数値はかなり実測地

び可視域の吸収帯を持っているために，分光学的な考察かに近い値と考えているが，直接測定したわけではないこと

ら構造変化を推測してきた。その後，多くの状態におけるは注意を要する。

bR 立体構造解析が行われ，その構造比較より，分子全体

Fig. 7 は実際に DNA 分子が水溶液中でブラウン運動しに渡る構造変化がかなり詳細に分かってきた。しかし，立ている間に計測された回折斑点の運動である。各フレーム

体構造を決定している場は，3 次元結晶構造状態であり，間は0.25秒。1 秒間の観察結果を示した。2u 方向のみに回bR が生理条件下で存在する紫膜内での構造変化とは異な折斑点が運動しているのが分かる。今まで回折像が動画とるのではないかという疑問は残る。ここでの実験は，そのして利用できるのではないかと認識された例はほとんどな疑問に回答を与えるサンプル条件に近いかもしれない。

く， X 線 1 分子計測法の発想がいかに意外性のある方法
かこのデーターからも理解できる。

Fig. 8 のようにこの bR 実験では，立体構造を正常な状態に維持して実験を行えるように，2 次元配向した天然の生体膜，つまり紫膜自身を基板に一方向から固定し，SH7. バクテリオロドプシンの光励起ブラウン
運動計測（膜タンパク質分子への応用）基を導入した変異体を使用して，金のナノ結晶を特異的な部位に標識させた。Fig. 8 でわかるように最密充填状態の

bR とナノ結晶を 1 対 1 の比で標識するために余分な SH
本計測法の最終目標である in vivo 1 分子計測を実現す

基を水銀化合物でつぶした。水銀化合物の反応時間は，1

放射光 May 2005 Vol.18 No.3 ● 171

Fig. 9Displacement of u (Du570 and Du400) of observed diŠracted spots with ～570-nm and ～400-nm lights.

3 時間の間で30 分事にナノ結晶からの回折斑点数で決定した。反応時間 3 時間では，全く回折斑点が検出かれなかったことより，2 時間程度の反応時間とした。確認のために水銀化合物を反応させない条件でも実験を行った。

Fig. 8 からも分かるように，各分子の構造変化の向きは，膜内で一方向ではないので， bR 1 分子に二股，三股にまたがっている 1 つのナノ結晶には複雑な引っ張り運動が付加されると予想される。実験結果では，予想通りで以下に示すような統計処理に耐えうるような計測結果は得ることができなかった。反応サイトの数やその方向性を制御できたら，分子間綱引き計測が可能となるかもしれない。

Fig. 9 に示すように，水銀化合物を 2 時間反応させた結果では， 560 nm の可視光を数 ms 照射した場合，回折斑
点は14.6±9.7 mrad（70点の回折斑点からの平均値）のジャンプを示すことが分かった。これは標識されている A 

B ループが剛体として運動したとすると， 0.73 ± 0.48 Åの変換に換算できる。つまりこの数値は，統計処理した結果においても DXT によって 1 Å 以下の構造変化が測定できたことになる。剛体的運動は過程しているが，DXT 法の驚異的な運動検出精度を証明したことになる。確認実験として， 560 nm の可視光以外の波長（例えば， 400 nm

Fig. 10

Curves of mean square displacement ( Du2) of the observed
diŠraction spots from the labeled nanocrystals as a functionof time interval Dt among three regions for analyses ofBrownian motions. Six symbols represent the experimental
results for 70 diŠracted spots, while solid curves show thetheoretical curve ˆttings.

や 700 nm ）では，このジャンプがないことを計測した（Fig. 9）。
一般に，ブラウン運動を解析するためには，分子の運動

ウン運動に影響を与えていないことを示している。

に関わる測定値の MSD (Mean Square Displacement) 曲

このように，膜タンパク質分子の運動計測に DXT が有線を表示することで議論される。Fig. 10 では，光励起前後

効であることを示すことができた。今後，レチナールタンのブラウン運動を評価してみた。意外だったのは，bR 自

パク質，つまり G タンパク質共役型レセプターや， K チ

身，紫膜の中にあるという意味では天然状態に近いが，基ャネル， Ca チャネル等の重要なチャネルタンパク質系の板に固定しているという点では，ブラウン運動になんらか

運動情報を実際に計測し，近い将来において， in vivo での影響が及んでいても不思議ではないのだが，結果は Fig.

もその運動が Å 以下の精度で計測する予定である。

10 にあるように直線近似できる MSD 曲線が得られた。無in vivo での一番の問題点は，膜タンパク質分子が生体論，物理的に吸着させているのであるから，長時間 MSD

膜内を 2 次元的にブラウン運動することである。前述し曲線を計測していれば，この直線近似からはずれる。しかたが，現状の放射光の X 線強度では，全く自由なブラウ

し，1 秒間もの間この直線性が得られたと言うことは，こン運動をしている場合は明確な回折斑点を得ることはできの時間内においてはこの吸着状態が，物理的になんらブラない。同様に生体膜を自由に動いている膜タンパク質分子

172 ● 放射光 May 2005 Vol.18 No.3

ナノテクノロジー特集 ■ ナノ結晶をプローブとした X 線 1 分子計測法も検出できない。これは DXT の限界というよりも，現況

間違い無く単色利用へ移行することになる。では，考え方の X 線強度からくる限界である。証拠に，粘性を非常にを 変 えて 単 色光 源 を用 い た 1 分 子計 測 は可 能 で あろ う
答えは可である。2 つの方法がある。ナノスーパー

上げた状態において，ナノ結晶をその溶液に溶かすと，そかの全く自由なブラウン運動はリアルタイムで計測すること

ミラーの利用と全反射現象の利用である。多層膜のナノ粒が可能となる。現状では，目的の膜タンパク質分子を 2子を作製した時13) ，実際に反射の強度を得るために必要

次元的拡散運動ができないようにトラップして（基板固定であった層数は 3 ― 4 層であった。 1 つの波長に対して 3も一種のトラップ法），計測すれば現状でも計測可能であ層を考えると， 10 層程度の総数の中で少々 d スペースにる。また，ナノ結晶の表面に疎水的特性が残っているの

幅を持たせ， 1 つの波長でも幅のある回折角度が得られで，タンパク質分子に吸着した後でも，生体膜の中にナノる。当然，多層膜のナノ粒子が，最低でも3050 nm 程度

結晶の疎水面が進入しようとする場合があることが確認さの粒径が必要であったことを考えると， 100 nm 程度の粒れており，ナノ結晶の疎水面を完全に親水化するプロセス

径になると予想されるが，信号の S /N 比の向上を考慮すをこれから構築する必要がある。それと同時に，ナノ結晶

るともう少し小さくても検出可能になるかもしれない。

の反応サイトを 1 点に絞ることで，膜タンパク質系の方

もう一つの全反射現象の利用は，ラボレベルの強度におに今回のように水銀化合物を修飾しなくても，1 対 1 の修

ける実験の可能性を検討するために研究を行ってきた。全飾反応が可能になるように，ナノ結晶の表面処理法の構築

反射現象は，全反射臨界角以下では単色化した X 線でもは，今後の DXT の根幹の問題を解決するキーとなると考角度に幅があることから，その利用が可能となる。現状でえている。

は，充分な全反射スポットが得られるナノミラーの作製が困難であることが分かっている。全反射の臨界角を利用し

8. 白色光から単色光の利用へているので，できるだけ大きい臨界角を得ることのできる材料系を選択する必要がある。条件は 2 つで，平坦な表

現状の X 線 1 分子計測法は，標識したナノ結晶の方位面をナノエッチング加工後でも保持している事。次には電をブラック反射によって検出しているので，励起光である子密度ができるだけ大きい元素で構成することである。検放射光は，あるエネルギー幅（波長幅）を持っている必要

討したのは Si, Au, Pt である。Siは平滑平面が得やすいたがあ る 。し か し， 白 色光 を 使 用す る 上で 欠 点が 3 つあめで，あとの 2 元素は電子密度が高いためである。結果る。まず第一点は，放射光は本来白色光を発生している

的に， Au, Pt は平滑なナノ平面を得ることができなかっが，最下流まで白色光を採り出しているビームラインは非た。これは原理的には可能と思われるので今後の課題であ

常に少ない。これは本計測法を利用する側としては欠点とる。全反射斑点の検出に成功したのは， Si ナノミラーだなる。第二点は，サンプル系へのダメージの問題である。

けであった。それも粒径100 nm と予想よりも大きい粒径

今後放射光がより高輝度化すればするほど，この問題は大でなければ反射斑点を検出できなかった。

きな障害になる。本実験でも， 7 30 KeV の幅のエネル

これらの結果から，狭い（エネルギー幅 1 以下）幅

ギーが生体分子にあらゆる時間帯照射されている。しかの単色光を用いる場合は，標識するナノ粒子が100 nm 程

し，回折斑点を発生させているのは，ほんの一部の波長帯度の大きさになってしまうので，この大きさでも運動か計だけである。完全な X 線の単色化で回折点を追跡するの測できる系に限って現状利用可能となる。いずれにしては，サンプル自身に回転運動等を導入しない限り無理であも， X 線光源側の高輝度化とナノ粒子の作製技術の進展

るが，現状まで広げる必要はなく，狭くした方が明らかにがなければ，単色光を用いた X 線 1 分子計測法を多くのダメージは軽減できる。最後の問題点は，信号の S /N 比系に利用することにはまだ時間がかかる。大切な点は，原である。全く同じフラックスで比較したことはないが，理的には可能であるという認識である。

SPring-8（BL40XU）では，アンジュレーターからの準単色化（エネルギー幅 2 ）したビームを使用することが

9. これからの 1 分子計測

でき，その信号の S / N 比は極めて良好で，より小さいナ
ノ結晶も測定できる（直径15 nm 程度）。

X 線 1 分子計測の課題は 3 つある。一つ目は放射光に

実際に BL40XU での実験では， BL44B2 では，再現性

より生体分子損傷効果の評価である。現状は損傷が最小限の高い計測結果は 2 秒間が最長であったが， BL40XU でになるように実験を行なっているが，現状よりも長時間のは，68 秒程度の計測が可能であることを確認した。確か連続実験が必要になる場合や，高強度の X 線を利用しなに，エネルギー幅が狭いので，激しいブラウン運動をする

ければならない場合，この効果は無視できなくなり定量的分子系では追跡していた回折斑点が，測定時間内に測定視な評価が必要となるであろう。前記の bR の実験において野から外れてしまうことがよく起こる。その場合は，カメ

も，計測時間内の破壊を目立たなくするために，ラジカル

ラ長を短くする等の対応で十分計測できることが分かった。

スカベンジャを水溶液に混入させている。根本的に破壊現以上の問題点を解決するためにも，現状の白色利用は，象を無くすることは困難であるが，できるだけ破壊時間を

放射光 May 2005 Vol.18 No.3 ● 173

同 時 に 1 箇所 の み の計 測 にな っ てい る が， 可 視 領域 の

FRET 等の計測では， 2 点間の距離変化等の情報が得られ，分子間相互作用を解析する上では，2 点以上の同時計
測の必要性は増していくと思われる。高速性という意味では， ms レベルの早さにおける興味ある生命現象は極めて多いので，ここ数年はこの領域がターゲットとなるであろう。逆な意味で 1 日―1 ヶ月の長時間観察も面白いトピッ
クスと成り得る。

1 分子のみをターゲットとした 1 分子 3 次元構造解析も
電子顕微鏡や次世代放射光を用いた X 線技術で研究が開始されているが，生き残るのは間違いなく分解能が高い方である。最低分解能 23 Å は必要である。
Fig. 11

Schematic drawing of the idealistic nano-sized primary Xray beam to the labeled nanocrystal. There are no directly
radiations of the individual observed protein molecular units.

以上のように 1 分子で構造から機能に至までの情報が得られる方向へ研究が加速している。また測定環境として
は ， 間 違 い な く in vitro か ら in vivo へ 移 行 し て い る ので，その可能性を加味した計測方法がより発展し利用されるようになる。ナノ計測の今後は，“ 1 分子”と“機能メ遅らせるような工夫はこれからもされるであろう。
二つ目は装置の規模である。可視光等の 1 分子計測技

カニズム”いうキーワードを中心に研究が多くの波長帯，多くのプローブを用いて行われていくであろう。

術は Lab レベルの大きさの装置が大半であるが， X 線 1
分子計測は大型放射光施設が必要となる。立命館大学のよ謝辞

うな実験室レベルの小型放射光装置の開発28) が進んでい本研究は，その初期段階を科学技術振興事業団個人研究るので，小型光源の利用も検討している。また，硬 X 線

推進事業さきがけ研究 21 の研究助成により推進された。

よりも軟 X 線の光源施設の方が小規模になるのでその検また，平成 13 年度から，同事業団戦略的基礎研究推進事討も行いたい。軟 X 線領域は，集光技術も利用できるの業において 5 年間の研究助成をいただいている。同推進で，Fig. 11 のように標識したナノ粒子だけ照射して，目的事業の関係者である研究総括の大島泰郎氏を初め，研究事の生体分子にはほとんど照射されない理想的な非破壊計測

務所の五十嵐孝司氏，河辺堅三氏，斎藤律子氏，左海史子

が可能になるかもしれない。また， X 線よりも散乱断面

氏には日頃よりお世話になっている。本研究推進にあた積が104 程度大きい電子線を用いた 1 分子計測も検討を開り， SPring-8 /JASRI の八木直人氏，鈴木芳生氏にはアイ始した。電子線は X 線よりも単色化技術が進んでおり，

デア当初から討論をしていただいた。この場をお借りして逆に白色化するのは現状の装置構成を考えると難しい。そ感謝したい。また，足立伸一氏，谷口彬雄氏，奥村泰章

れで入射角度の高速スキャン等の利用で，単色でも幅のあ氏，岡俊彦氏，井上勝晶氏，宮崎拓也氏，植木龍夫氏，大る回折斑点の検出が可能ではないかと考えている。走査型

石昇氏，須田斎氏にもこの場をお借りして感謝したい。

電子顕微鏡（ SEM ）のオプション機能として電子線 1 分

参考文献

子計測が可能となれば，より多くの利用者に回折現象を用いた 1 分 子 計 測技 術 を提 案 でき る こと に なる 。 問 題点
は，放射光同様にサンプルダメージである。かなり定量的な解析が今まで行われてきているので（0.10.2 electron /Å が非破壊最大照射量)29)，この値を基準に検討していきたい。
最後の第三番目は，やはりナノ結晶の大きさを現状より小さくしたい。より in vivo 計測に近いことを測定し始め
ると，ナノ結晶が大きいと他の分子との相互作用がより問題となる。直径 5 10 nm 程度が目標である。先述しているがナノ粒子の表面処理も大きな問題なので，表面処理に

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)

関する研究も進めなければならない。

1 分子計測全般の研究動向としては，より高精度でより8)高速な動的構造情報が得られる計測方法が登場することが9)考えられる。現状 X 線 1 分子計測は生体分子内の運動は174 ● 放射光 May 2005 Vol.18 No.3

T. Hirschfeld: Appl. Opt. 15, 2965
2966 (1976).
H. Nagashima and S. Asakura: J. Mol. Biol. 136, 169
182
(1980).
S. Matsumoto, K. Morikawa and M. Yanagida: J. Mol. Biol.
152, 501516 (1981).
T. Yanagida, M. Nakase, K. Nishiyama and F. Oosawa: Na60 (1984).
ture 307, 58
T. Funatsu, Y. Harada, M. Tokunaga, K. Saito and T.
Yanagida: Nature 374, 555 (1995).
R. D. Vale, T. Funatsu, D. W. Pierce, L. Romberg, Y. Harada and T. Yanagida: 380, 451 (1996).
A. Ishijima, H. Kojima, T. Funatsu, M. Tokunaga, H.
Higuchi, H. Tanaka and T. Yanagida: Cell 92(2), 161(1998).
H. Noji, R. Yasuda, M. Yoshida and K. Kinosita Jr.: Nature
386, 299 (1997).
R. Yasuda, H. Noji, K. Kinoshita Jr. and M. Yoshida: Cell

ナノテクノロジー特集 ■ ナノ結晶をプローブとした X 線 1 分子計測法

10)
11)

12)
13)

14)

15)
16)

17)
18)
19)
20)
21)
22)
23)

24)

25)

93, 1117 (1998).
B. J. Schnapp, R. D.Vale, M. P. Sheetz and T. S. Reese: Cell
40, 455462 (1985).
T. Ha, T. Enderle, D. F. Ogletree, D. S. Chemla, P. R. Selvinand S. Weiss: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(13), 6264
(1996).
S. Weiss: Science 283, 16761683 (1999).
Y. C. Sasaki, Y. Suzuki, N. Yagi, S. Adachi, M. Ishibashi, H.
Suda, K. Toyota and M. Yanagihara: Phys. Rev. E. 62, 3843
3847 (2000); Y. C. Sasaki, Y. Okumura, S. Adachi, Y.
468,
Suzuki and N. Yagi: Nucl. Instrum. Methods. A467
1052 (2001); Y. C. Sasaki, Y. Okumura, S. Adachi, H.
1049
Suda, Y. Taniguchi and N. Yagi: Phys. Rev. Lett. 87, 248102
1 248102
4 (2001).
T. Na, A. Squire, G. Hansra, F. Bornancin, C. Prevostel, A.
Hanby, W. Harris and P. J. Parker: Science 283, 2085
(1999).
E. A. Jares-Erijman and T. M. Jovin: Nature Biotchnology
21(11), 1387 (2003).
L. S. Churchman, Z. Okten, R. S. Rock, J. F. Dawson and J.
A. Spudich: Proc. Natl. Acad. of Sci. USA 102(5), 1419
(2005).
R. Neutze, R. Wouts, D. vander Spoel, E. Weckert and J.
Hajdu: Nature 406, 752 (2000).
T. Nakagawa, Y. Cheng, E. Ramm, M. Sheng and T. Walz:Nature 433, 545 (2005).
H. J. Mamin, R. Budakian, B. W. Chui and D. Rugar: Phys.
Rev. Lett. 91, 207604/1 (2003).
D. Rugar, R. Budakian, H. J. Mamin and B. W. Chui: Nature
430, 329 (2004).
Y. C. Sasaki, Y. Suzuki and T. Ishibashi: Science 263, 62
64(1994).
Y. C. Sasaki, K. Yasuda, Y. Suzuki, T. Ishibashi, I. Satoh, Y.
1848 (1997).
Fujiki and S. Ishiwata: Biophys. J. 72, 1842
D. R. Larson, W. R. Zipfel, R. M. Williams, S. W. Clark, M.
P. Bruchez, F. W. Wise and W. W. Webb: Science 300, 1434
(2003).
X. Michalet, F. F. Pinaud, L. A. Bentolila, J. M. Tsay, S.
Doose, J. J. Li, G. Sundaresan and S. Weiss: Science 307,
538 (2005).
Y. Okumura, Y. Taniguchi and Y. C. Sasaki: J. Appl. Phys.

92, 74697474 (2002).
Y. Sun and Y. Xia: Science 298, 21762178 (2002).
Y. Okumura, T. Oka, M. Kataoka, Y. Taniguchi and Y. C.
Sasaki: Phys. Rev. E, 70, 021917/1 (2004).
28) News in brief, Nature 434, 8 (2005).
29) R. Henderson: Quarterly Rev. Biophysics 28(2), 171(1995).

26)
27)● 著者紹介 ●佐々木裕次
財 高輝度光科学研究センター
主幹研究員
E-mail: ycsasaki＠spring8.or.jp
専門計測方法論［略歴］
財 高輝度光科
SPring-8 大型放射光施設
学研究センター放射光研究所主幹研究員。（兼任）科学技術振興機構戦略的基礎研究推進事業（ JST / CREST ）“蛋白質の構造機能と発現メカニズム”佐々木チーム研究代表者。 1991 年東北大学
大学院工学研究科博士課程修了（工学博株 日立基礎研究所，こ士）。1991 年からの間に 199394 年東北大金属材料研究所
受託研究員，1997 98 年東京大学薬学部
受託研究員，1998 01 年科学技術振興事
業団さきがけ研究 21 “素過程と連携”
領域研究員，20002002 年大阪大学蛋白質研究所蛋白質機能評価研究部門教授兼務。 2003 年より現職。主な（趣味）研究は全く新しい計測方法論の考案及び実証。著書は“ X 線分析最前線”（共著，
アグネ技術センター）。

Single molecular detection system using X-rays
Yuji C. SASAKI

SPring-8/JASRI, JST/CREST SASAKI-team111 Kouto, Mikaduki, Sayo, Hyogo 6795198, JAPAN

Abstract In-vivo measurements of dynamical conformational changes in single-biomolecules under functional conditions have had a tremendous impact on molecular and cell biology. However, even single-molecule‰uorescent resonance energy transfer cannot easily monitor the intramolecular dynamics in cell systems due
to shortcomings in monitoring precision. Here we report dynamical observations of intramolecular conformational changes in a single DNA molecules and protein molecules, especially membrane protein (Bacteriorhodopsin: bR) using diŠracted x-ray tracking (DXT), which is a new single molecule experiments with xrays, monitors the rotating motions, rather than the translational motions of a labeled nanocrystal. In bR experiments, the position of BR's 35th amino acid, which is located farthest from retinal, exhibits a momentary
positional jump of 0.73±0.48 Å due to the expression of its function. The average width of this jump is about
14 times larger than that of thermal Brownian motion and agrees with estimated movements from known Xray crystallography data. This result is an important step toward to in-vivo observations of single-molecularconformational changes in membrane proteins.

放射光 May 2005 Vol.18 No.3 ● 175