


放射光第巻第号

(

)

トピックス

硬 X 線位相差顕微鏡による植物生体試料の観察篭島 靖1，横山佳行1，新美敏弘1，伊吹高志1，
津坂佳幸1，松井純爾1，高井健吾2，相野公孝3
1姫路工業大学大学院理学研究科
，2高輝度光科学研究センター，3兵庫県立中央農業技術センター

Hard X-ray Phase-Contrast Microscopy for Observing Biological Specimens
Yasushi KAGOSHIMA1, Yoshiyuki YOKOYAMA1, Toshihiro NIIMI1, Takashi IBUKI1,
Yoshiyuki TSUSAKA1, Junji MATSUI1, Kengo TAKAI2 and Masataka AINO3
1Graduate School of Science, Himeji Institute of Technology, 2Japan Synchrotron Radiation Research Institute,
3Hyogo Prefectural Agricultural Institute
Abstract
Phase-contrast hard X-ray microscopy of Zernike's method for observing transparent biological specimens is describedin both terms of theory and experiments. According to theoretical calculation, an image contrast as high as 1 may be expected even for a very thin protein structure of a 100 nm thickness in a water background at such high photon energy as 10
keV, although the absorption contrast is almost zero. Further, the phase-contrast hard X-ray microscopy requires smaller
dosage necessary to image the protein structure in the water background than the dosage required by the absorption-contrast soft X-ray microscopy when the water background thickness becomes thicker than approximately 14 mm. We haveconstructed a phase-contrast microscope using Fresnel zone plates as X-ray lenses at BL24XU of SPring-8 and succeeded
in imaging transparent biological specimens with a spatial resolution of approximately 500 nm. We have also succeeded in
obtaining positive- and negative-contrast images in the reverse contrast with phase plates to shift the phase by one-quarterand three-quarters of a period. These results demonstrate that the phase-contrast hard X-ray microscopy may open a way
to observe ˆne structures of thick biological specimens in their natural living state.

.

察が期待できる。

はじめに
硬 X 線顕微鏡は，空間分解能では電子顕微鏡はもちろ

以上のような観点から，我々は硬 X 線位相差顕微鏡でんのこと軟 X 線顕微鏡にも現状ではとても敵わないが，期待される像のコントラストの理論的検討を行い，併せて比較的厚い試料を非破壊で観察できる，試料の前処理が簡

生体試料のその場観察を目指して SPring-8 の兵庫県ビー便である，試料環境の選択の自由度が高いなど，幾つかの

ムライン（BL24XU)4)において，その開発を進めてきた。

優れた特徴を持っている。しかしながら，生体試料の微細これまでに空間分解能約 500 nm の顕微鏡を開発し5) ，生

構造観察に用いることを考えた場合，生体試料はほとんど体試料の正負のコントラストによる位相差像の取得に成功

軽元素で構成されるために，従来の吸収コントラストでのしている6)。本稿では，硬 X 線位相差顕微鏡の原理，期待観察は事実上不可能である。一方，Zernike （ゼルニケ）

される像のコントラストと吸収線量，開発した位相差顕微によって発明された位相差顕微鏡1)（ゼルニケ型位相差顕鏡の光学系，性能評価及び実際の試料を観察した例につい微鏡）は，可視光領域で透明な試料を観察するために用いて述べる。

られており，これを硬 X 線に適用すれば生体試料の微細構造の観察が可能となるかもしれない2)。特に，硬 X 線領

.

域では d が b より 2 ないし 3 桁大きいので，期待される

. ゼルニケの位相差法の原理

硬 X 線領域の位相差顕微鏡

像のコントラストを検討してみる価値が十分にある。軟入射光の位相は変えるが，振幅は変えない物体を位相物

X 線領域でのゼルニケ型位相差顕微鏡は Schmahl らによ体（phase object ）という。検出器は強度しか検出できなって実現されているが3)，軟 X 線では吸収像でも十分高いいので，入射光の振幅変化すなわち吸収は判別できても，

コントラストが得られるので，位相差像は吸収像に対する位相変化に関する情報は得ることができない。位相変化に付加的な情報を与えるに過ぎない（波長によってはコント

関する情報を得るためには，特殊な工夫を凝らした観察方

ラストの向上と吸収線量の低減が図れるという利点はあ法を用いて位相変化を強度変化に変換しなければならず，る）。また，硬 X 線ではそもそも吸収コントラストが限りその一つにゼルニケの位相差法がある。ここでは，ゼルニなくゼロに近いため，吸収像では見えない透明なものを可ケの位相差法の原理について簡単に説明する。以下の議論

視化するという，本来の意味での位相差顕微鏡になる。さにおいては，ゾーンプレートをレンズとする結像系は無収らに，吸収がほとんど無いことは吸収線量が小さいことを差光学系であり，ゾーンプレートの回折効率や画像検出器

意味しているので，軟 X 線に比べて低い吸収線量での観の検出効率は全て100であることを前提とする。Figure2
1
姫路工業大学大学院理学研究科 〒6781297 兵庫県赤穂郡上郡町光都 3
58
0230 FAX: 0791
58
0236 E-mail: kagosima＠sci.himeji-tech.ac.jp
TEL: 0791

――(C) 2002 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

放射光第巻第号()＝|U b′|2＝|U0|2a2
Ib ′
＝|U′
|2＝|U0|2･e－m t ･[a2＋2{1－a cos a－cos qsI′s s＋a cos (a－qs)}](4)

qs≪1 の時は，（4)式は近似的にFigure 1.

＝|U0|2･e－m t ･[a2＋2aqs･sin a]
I′

(5)

s s

Principles of Zernike's phase contrast method.

となり，位相差法によって観測すると，物体による位相変

1 にコヒーレント照明におけるゼルニケの位相差法の光学化が強度変化に変換され，像面の任意の点における強度は系を示す。 Figure 1 に示すように，入射光，試料の無い（付加的な定数を除き）物体の対応する位置の位相変化 qs

部分（バックグランド）の試料面透過後，試料透過後，結に比例することになる。特に，最大のコントラストを与え像面におけるバックグランド像と試料像の複素振幅をそれる a＝(p/2 ), (3p/2) の時は，それぞれポジティブコント

とする。試料の複素屈折率を ns(＝1
ぞれ U0, Ub, U, Ub′, U′

ラ ス ト （ Positive contrast ）， ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ラ ス ト－ds－ibs），厚さを ts とし，入射光の波長を l とすれば，（ Negative contrast ）と呼ばれ( 5 )式の括弧内は a2 ± 2aqsとなる。ポジティブコントラストでは符号が“＋”であり，

U b＝ U 0･ e
U ＝ U 0･ e
＝Ub･e

2p
－i
ts
l

－i

物体の存在する部分がバックグランドに対して明るくな
り，ネガティブコントラストでは逆の関係になる。位相板

2p(1 －ds－ ibs)ts
l

ms
－ ts
2

･eiq

の吸収により，入射光が a2(a 1 ) になるので 0 次光の強(1)sとなる。ただし， ms (＝ 4pbs / l ) は試料の線吸収係数， qs(＝2pdsts/l) は試料によって生ずる入射光のバックグラン
ドに対する位相変化である。添字 b はバックブランドを意味している。光学の原理としてよく知られているように，結像レンズの後側焦平面（ Back focal plane ）には，物体のフーリエスペクトルが生ずる。ゼルニケの位相差法の原理は，後側焦平面に位相板を置き，0 次のスペクトル（ 0 次光）にのみ位相変調を与えることにより，像面でのコントラストを向上させることである。（ 1 )式を次の( 2 )式 の よ うに 変 形 す る と ， 括 弧 内 第 一 項 の ``1'' が 0 次 光を，第二項と第三項の ``eiq － 1'' が回折光を表しているこ
s

とになる。

度が弱まり像自体は暗くなるが，（5)式の括弧内第二項の第一項に対する比は± qs / a なので，感度が 1 / a に向上し像のコントラストは増大する。
高い位相検出能力を持つ位相差法にも幾つかの欠点がある。その一つは，像の強度分布が物体の位相分布に比例するのは，位相差が小さい場合限られることである。実際硬X 線領域でも，試料によっては必ずしもこの条件が満足されないことがあるので，得られた像の解釈には十分注意を払う必要がある。また，位相差が p / 2 ならばコントラ
ストは生じず，p/2 より大きければ明暗が反転する。もう一つの欠点は，非常に粗い構造（低周期構造）の位相物体
では，±1 次回折光が 0 次光のすぐ近くで生ずるために±

1 次回折光を 0 次光に対して空間的に分離するのが難しいことである。3 つ目に，位相物体の縁の部分にハローと呼ばれる光の滲みが生ずるために，境界近傍の微細な構造がU＝Ub･e－

良く見えないという性質がある。

ms
ts
2

i qs

･(1＋e －1)

(2)

. 像のコントラスト
実際に X 線で位相差顕微鏡を構成した場合，どれくら

結像面での複素振幅は，全スペクトルすなわち 0 次光といのコントラストが期待できるのかを見積もっておく必要

回折光の複素振幅の和であるから，位相板の振幅透過関数がある。位相板の複素屈折率を np(＝1－dp－ibp），厚さをを A ＝ aeia （ a と a は実数）として，位相板を 0 次光のみ

tp とすれば，位相板の振幅透過関数 A は，は，に作用させた時の結像面での複素振幅 Ub′
, U′
m
－ t
2pdp
mp
(m＝1, 3), a＝e 2
tp＝
l
2
p

＝Ub･aeU b′＝U b･e
U′

－

p

a＝qp＝

ia

ms
ts
2

･(aeia＋eiq －1)
s

(3)

から

となる。強度は複素振幅の絶対値の二乗であるから，観測される像の強度は次式となる。

A＝aeia
＝±ie

――

－

m bp
p
2d p

(6 )




放射光

第巻第号()

ントラストに対応する。添字 p は位相板を意味している。

Figure 2 に示すように，試料が均質なバックグランド中に存在する場合，（4 )式の像の強度は次式に示すようになり一般的な式に書き換えられる。

－ m (t －t)－m t
･e
I′
b＝ e
b

b

b

－

m bp
p
dp

[

＝e－m (t －t)－mt･ 2{1－cos (q－qb)}＋eI′bFigure 2. Case when a sample with the thickness of t and the linear
absorption coe‹cient of m exists in a uniform background with the
thickness of tb and the linear absorption coe‹cient of mb.

±2 sin (q－qb)･e

mb p
p
2dp

m bp
p
dp

]

(7 )

合の像のコントラストを与える式は，次式となる。

コントラスト，m＝3 で符号が“－”の時がネガティブコ

－Ib′
|
|I ′
＋Ib′
I′

| [

e－mt 2{1－cos (q－qb)}＋e

＝

－

－

（7)式から，均質なバックグランド中に試料が存在する場となる。ここで，m＋1 で符号が“＋”の時がポジティブ

Cp ＝

b

e

－ mt

[2{1－cos (q－q )}＋e
b

－

mb p
p
dp

m bp
－
p
dp

さらに，

±2 sin (q－qb)･e±2 sin (q－qb)･e

－

mb p
p
2 dp

m bp
－
p
2d p

－

m bp
p
dp

－

m bp
p
dp

]
|
]＋e ･e－e－m t･eb－ m bt(8 )像のコントラストを計算した結果である。位相差像のコントラスト（ポジティブコントラストとネガティブコントラ
スト）を左縦軸に，吸収コントラストを右縦軸に示した。

2pq－qb＝ (d－db)t≪1, mt≪1l

位相板の材質はタンタルとし，全エネルギー範囲で位相板の厚さが位相差 p/2（ポジティブコントラストの場合）まと仮定すれば(8)式は近似的にたは 3p /2 （ネガティブコントラストの場合）を与える厚さとなるように計算している。5～15 keV のエネルギー範|(mbt－mt)･e

Cp ＝

m bp
－
p
2 dp

(2－mbt－mt )･e|

囲にわたって，1 前後のコントラストが期待できること±2(q－qb)(1－mt )

－

m bp
p
2d p

(9)

±2(q－qb)(1－mt )がわかる。ポジティブコントラストよりネガティブコント
ラストの方が高いのは，位相板の吸収が後者の方が大きいからである。 10 ～11 keV に見られる不連続構造は位相板となる。硬 X 線で水溶液中の薄い軽元素試料を観察する
時，この仮定は多くの場合成り立つが，比較的厚い試料などこの仮定が成り立たない場合は(8)式をそのまま使えばよい。（ 8 ），（ 9 )式からわかるように，均質なバックグラ
ンド中に試料が存在する場合の像のコントラストはバック
グランドの厚さ tb によらない。従って，例えば水中の生体試料の場合は水の厚さはコントラストに関係しないことになり，このことが硬 X 線を用いる大きなメリットとなる。
次に，生体試料の観察を前提として，どれくらいのコン
トラストが得られるか計算した例を示す。 Figure 3 は水中に100 nm 厚のタンパク質が存在するときに期待されるであるタンタルの L 吸収端である。我々は，100 mm 厚の
水の透過率が 5 以下という基準で，入射 X 線のエネル
ギーを 10 keV に設定したが，タンタルの L3 吸収端が 9.9

keV なので，この入射 X 線ではタンタルが最も高いコン
トラストを与える位相板の材料である。
. 吸収線量

X 線顕微鏡を用いて生体試料を観察する場合，像のコントラストだけではなく試料の吸収線量についても検討しておく必要がある。吸収線量は，物体の像の観察に必要なSN 比によって決めることができ，軟 X 線顕微鏡の場合について，Rudolph らによって詳しく検討されている8)。彼
らによれば，厚さ t ，断面積 S ，線吸収係数 m ，密度 r の物体が，同じ厚さで線吸収係数 mb の均質な物質（バック

――

放射光

第巻第号()

Figure 3. Expected image contrast of phase-contrast microscopy
for a specimen of a 100-nm-thick protein feature in a water background. The elemental composition and the density of the protein
are assumed to be C94H139N24O31S and 1.35 g/cm 3 3). The opticalconstants from Henke et al.7) are used in the calculation. For comparison, the absorption contrast is also shown. Image contrast of
about 1 can be expected by tuning the photon energy to the L3 absorption edge of tantalum (9.9 keV) even though the absorption
contrast is almost zero.

Figure 4. Dosage necessary to image a 100-nm-thick protein feature in a water background as a function of the water backgroundthickness both for soft x-rays and hard x-rays.

グランド）中に存在するとき，与えられた SN 比で物体の像を観察するのに必要な吸収線量 D(Gy) は，次式となる。
2

D＝( NS ) lrhcSt e e (1－e ) I(′I(′I－′＋I I′)′)mbt mptp

－ mt

b

b

b

2

(10)

ここで， mp と tp は位相板の線吸収係数と厚さ， I ′
と I′
b は

Figure 5. Optical system of the hard X-ray phase-contrast microscope developed in the beamline BL24XU of the SPring-8. Synchrotron radiation from the undulator is monochromatized by a silicon
double crystal monochromator. The photon energy is tuned to 10
keV so that the expected image contrast can be enhanced as shown in
Fig. 3. The absorption-contrast image can also be taken by removing
the phase plate.

物体とバックグランドの像の強度であり，h はプランク定数， c は光速である。検出器やゾーンプレートの効率は100，すなわち装置系での損失は無いものと仮定していX 線とで逆転する。このように，吸収線量を抑えるといる。（ 10 )式は，物体とバックグランドの厚さが同じ場合

う観点では，水の厚さが厚い場合に硬 X 線を用いた方がの吸収線量を与えるものであるが，彼らの理論を Fig. 2有利となる。

に示すようなより一般的な場合，すなわちバックグランドの厚さが物体の厚さと異なる場合に適用すると，吸収線量

D は(10)式より emb( tb － t )2倍だけ大きくなる。ここで tb はバ.

SPring-の BLXU における X 線位相差顕微鏡

. 光学系

ックグランドの厚さであり，物体はバックグランドの厚さ

X 線位相差顕微鏡の開発は， SPring-8 の兵庫県ビーム

方向の中央にあると仮定している。従って，バックグラン

ライン（BL24XU)4)の実験ハッチ C において進めている。

ドが厚くなれば，与えられた SN 比で物体の像を観察する

Figure 5 にその光学系を示す。図には示してないが，光のに 必 要 な吸 収 線量 も 増 大す る こ とに な る。 Figure 4

源から30 m の位置に開口 1 mm×1 mm のフロントエンド

は，水中に 100 nm 厚のタンパク質が存在する時に， SN

スリットがある。アンジュレータ光は，シリコン二結晶分比を 3 で観察する場合に必要な吸収線量を水の厚さの関

光器（ 111 反射，水平偏向）によって 10 keV に単色化さ数として，軟 X 線（ SX ）と硬 X 線（ HX ）について示し

れ，実験ハッチ C に導かれる。フロントエンドスリット

たものである。軟 X 線では吸収コントラストで，硬 X 線の開口と分光結晶によって決まる分光光のエネルギー分解

ではネガティブコントラストで観察する場合についての値

能 DE/E は約2.1×10－4 である。顕微鏡の主要部は，輪帯である。 X 線のエネルギーとしては，軟 X 線と硬 X 線に状絞り（Annular Aperture），集光ゾーンプレート（CZP），

ついてそれぞれ代表的な 3 種類のエネルギーを選んだ。

ピ ンホ ール ，対物 ゾー ンプ レート （ OZP ）及 び位相 板

軟 X 線では水の厚さが増すにつれて吸収線量が急激に増（Phase Plate）からなっている。これは，ゲッチンゲン大

大するのに対して，硬 X 線では水の厚さに関わらず吸収学のグループが開発した軟 X 線位相差顕微鏡3)と本質的に線量はほぼ一定であることがわかる。また，水の厚さが約は同等のものである。唯一の違いは，軟 X 線顕微鏡では14 mm 以上になると，吸収線量の大小関係が軟 X 線と硬CZP とピンホールからなる照明系が線形分光器（ linear

――




放射光

Table 1. Parameters of CZP and OZP. The zone plate material istantalum. Since the optimized tantalum thickness is 2.4 mm at 10
keV5), the thickness of the CZP is not thick enough at present1
CZP

OZP

Radius of innermost zone; r1 (mm )

15.8

5.0

Number of zones; NOuter diameter; D (mm)

1000
1000

100
100

Outermost zone width; drN (nm)
Focal length ＠10 keV (mm)

250

250

第巻第号()

後側焦平面に位相板を置くことを説明した。 Figure 1 は平行ビームによるコヒーレント照明という最もシンプルなケースで，この場合 0 次光にのみ位相変化を与える位相板の形状は円形である。一方， Fig. 5 に示すような臨界照明系では，集光レンズの前に輪帯状絞りを置き，それと相似形の位相板を対物レンズの後側焦平面上に置くことによ り 0 次 光の み に 位相 変 化を 与 える 光 学系 が 用 いら れ

Thickness of zones (mm)

2013
0.61

202
2.4

る。用いた輪帯状絞りと位相板の外径と内径はそれぞれ

Calculated diŠraction e‹ciency ＠10 keV ()

4.5

20.8

りには厚さ100 mm のタングステン板をレーザ加工したも800 mm, 600 mm 及び 77.7 mm, 58.3 mm である。輪帯状絞のを用いた。位相板はタンタル製で，その厚さは 10 keV
での位相シフトがポジティブコントラストでは p/2，ネガ

monochromator）の役割を果たしている9)のに対し，我々ティブコントラストでは 3p / 2 になるように，それぞれの顕微鏡では結晶分光器によって入射光が予め分光されて1.33 mm と 3.97 mm とした。 10 keV の X 線に対する透過いることである。線形分光器ではエネルギー分解能を上げ率は，それぞれ59.2，20.8である。位相板を光軸からるにはピンホールの開口を小さくする必要があるため9)，外せば吸収コントラスト像を取得できるので，吸収コント

結果としてピンホールと試料間のワーキングディスタンス

ラスト像と位相コントラスト像の比較は容易にできる。

が制限されてしまう。一方，入射光が単色光なら比較的大. 吸収コントラストによる標準試料の観察

きな開口のピンホールが利用できるので，ワーキングディ

顕微鏡の性能を見積もるために，位相板を用いない条件

スタンスを大きく取ることができる。CZP と OZP の変数

すなわち吸収コントラストモードで標準的な試料の観察をを Table 1 に示す。ゾーンプレートの材質はタンタルで行った。 Figure 6 に銅の# 2000 メッシュの顕微鏡像を示ある。ゾーンプレートの加工に関しては，参考文献を参照

す。メッシュ線幅は約 5 mm なので，空間分解能はサブミ

されたい10)。

クロンに達していることがわかる。また，メッシュ線の縁

ゾーンプレートの光学特性については，本学会誌に詳細の微細な凹凸構造も観察できており，高空間分解能が達成に解説してあるので11) ，ここでは顕微鏡で最も重要な性されている。 CZP は試料位置に光源の縮小像を形成し，能である空間分解能についてのみ触れることにする。ゾー

臨界照明系ではこの光源の縮小像が試料の照明領域となンプレートをレンズとする顕微鏡の空間分解能 D は次式る。幾何光学的に決まる光源の縮小像の大きさ，すなわちで与えられる。

照明領域の大きさは，光源の大きさに光源と CZP 間及びCZP と試料間の距離の比（縮小率）を掛けたものとなる。

D＝1.22drN(11)

第三世代放射光源では，光源サイズが極めて小さく，また光源から実験装置までの距離が大きいため必然的に縮小率

ここで，drN はゾーンプレートの最外輪帯幅である。空間が大きくなってしまう。結果として，試料の照明領域が必

分解能は入射光の波長によらずゾーンプレートの最外輪帯

要以上に狭くなってしまうという問題が起こる。この問題

幅 drN のみで決まるので，ゾーンプレートをより微細に加を解決するために，米国 Lawrence

工すれば，より高い空間分解能が得られることになる。現

Laboratory (LBNL) の Center for X-Ray Optics (CXRO)

状は，加工上の限界で制限されている。例えば， 10 keVの X 線顕微鏡グループが考案した，露光中に CZP を 2 次

Berkeley

Nationalの X 線で最も高い回折効率が得られるタンタルの厚さは2.4 mm であるが5)，アスペクト比（ゾーンの厚さと幅の比）の限界が10 程度のため，最外輪帯幅は250 nm 程度が限界となる。ただし，回折効率を犠牲にすれば，最外輪帯幅が50 nm の ゾ ー ン プ レ ー ト を 製 作 す る こ と は で き る10) 。

Table 1 に示したように， OZP の最外輪帯幅は 250 nm な
ので，理想的な空間分解能として約 300 nm が期待できる。光学系の倍率は，実験ハッチの大きさで制限され，9倍である。画像検出器には浜松ホトニクス社製のズーミン
グ管を用いている。ズーミング管の空間分解能は 500 nm
より高いので12)，9 倍という低倍率でも十分空間分解能を評価することができる。

2.1 では，位相差法を実現するためにゾーンプレートのFigure 6. Magniˆed image of copper #2000 mesh. The exposure
time was 10 min. The photon energy was 10 keV. The total magniˆcation of the microscope system was ×450 (optical system ×9, image detector ×50).

――

放射光

第巻第号()

元的に走査する方法13) を採用した。走査の振幅は垂直

日亜化学工業 Type NP 3010 ）で，視野を変えて 2 画像

水平両方向ともピンホールサイズ（50 mm ）より大きくなを示した。Figure 6～8 に示した顕微鏡像より，開発した

るように± 30 mm とし， CZP を載せたパルスステージを

X 線顕微鏡は極めて良好な性能を達成していることがわ

露光 中 2 次 元 的に 周 期的 に 連続 走 査し た 。そ の 結 果，

かる。

Fig. 6 に示すように直径約 40 mm の均一な照明が達成で

. 位相差コントラストによる軽元素試料の観察きた。

ここまで示した顕微鏡像は吸収コントラストで観察した

次に，どれくらいの微細構造まで解像可能かを調べた。

ものであるが，吸収コントラストでは観察できない透明な

我々は，OZP は自身の最外輪帯幅程度の Line & Space ま

試料を観察できることが位相差顕微鏡の最大の特長であでは解像できることを経験的に学んでいるので，この経験る。ここでは，軽元素で構成されている生体試料への応用に従えば 250 nm の Line & Space まで解像できることがとして，植物病原菌の観察を行った例を示す。観察した試期待される。そこで， OZP と同じ仕様のゾーンプレート

料は Curvularia の分生子である。Figure 9 にその X 線顕を試料として観察 した。 Figure 7 にその 結果を示す。

微鏡像を示す。（a )の吸収コントラスト像では分生子の存

Figure 7 はゾーンプレートの最外周付近の拡大像であり，在が辛うじて確認できる程度であるが，その内部構造は不250 nm の Line & Space まで解像可能であることが確認明瞭である。一方，（b )のポジティブコントラスト像及びできた。従って，極めておおまかには約500 nm の空間分(c )のネガティブコントラスト像では，分生子の外形が明解能を達成できたことになる。視野約40 mm，空間分解能

瞭に認識でき，内部構造も見て取れる。特にネガティブコ

約500 nm という性能のもと，金属微粒子を観察した結果

ントラスト像ではより高いコントラストが得られており，を Fig. 8 に示す。試料は蛍光粉末（成分，Gd2O2STb，

分生子が隔壁によって仕切られた 4 つの細胞からできていることが判別できる。また，ポジティブコントラスト像
では分生子の構造体部分が明るく（強度が強く）なり，ネ
ガティブコントラスト像では構造部分が暗く（強度が弱く）なっている。ネガティブコントラスト像の方がコントラス

Figure 7. Magniˆed image of the outermost region of a sample
zone plate having the same speciˆcation of the OZP. A 250 nm lineand-space pattern was well resolved. The exposure time was 10 min.
The photon energy was 10 keV. The total magniˆcation of the
microscope system was ×1080 (optical system ×9, image detector×120).

Figure 8. Magniˆed image of phosphor powder (composition, Gd2
O2S:Tb, NICHIA Chemical Industries, Ltd., Type NP3010). The
exposure time was 5 min. The photon energy was 10 keV. The total
magniˆcation of the microscope system was ×450 (optical system
×9, image detector ×50).

Figure 9. X-ray micrographs of the conidium of Curvularia species: (a) absorption contrast image, (b) positive contrast image and (c) negative contrast image. The structure of the specimen are well observed in (b) and (c), while thestructure can be seen with little contrast in (a). Further, the image contrast is reversed between (b) and (c) as expected in eq. (7). The exposure time was 3 min. The photon energy was 10 keV. The total magniˆcation of the microscope system was ×450 (optical system ×9, image detector ×50).

――




放射光

第巻第号()の両コントラストで位相差コントラスト像を取得することに成功した。空間分解能は必ずしも十分ではないが，硬X 線領域においても位相差顕微鏡により生体試料の観察が可能であることを示した。より微細な構造をもつ試料に適用するために空間分解能の向上に取り組んでおり，現在

100 nm の Line & Space まで解像可能な光学系の開発に
Figure 10. A montage X-ray micrograph of the same specimen in
Fig. 9. It was produced by increasing the magniˆcation of the image
detector, taking images separately, and then combining them usinggraphic software. The intensity changes caused by the optical thickness variation in the specimen can be recognized. The exposure time
was 5 min for each separated image. The photon energy was 10 keV.
The total magniˆcation of the microscope system was ×1800 (optical system ×9, image detector ×200).

成功している14) 。今後は，水溶液中の試料の観察を可能にする試料セルの開発や，得られた像を定量的に解釈する方法の研究に取り組んでいく予定である。
参考文献
1)
2)

トが高いことは， Fig. 3 で示した結果と一致しており，
またポジティブコントラスト像とネガティブコントラスト
像ではコントラストが反転することは，（7)式から予測される通りの結果となっている。これらの結果から，開発し3)

た X 線位相差顕微鏡においては，位相差コントラストの生成メカニズムは理論から予測される結果とよく整合して4)いることが確認できた。

Figure 7 で示したように吸収コントラスト像で250 nmの Line & Space まで 解像できているこ とを考えると，

5)Fig. 9 の像質はやや低いように感じられる。実際，Fig. 9では検出器の倍率が解像度を制限しており，検出器の倍率6)を上げると像質が向上し，より精度の高い拡大像が得られる。ただし，検出器の倍率を上げると視野が狭くなり試料全体を観察できなくなる。そこで，試料の位置を変えながら数枚露光し，それらをモンタージュ写真のように結合さ7)8)せて試料全体の拡大像を得る方法を採用した。Figure 10
は，そのようにして得られた Curvularia のネガティブコ

9)

ントラストの顕微鏡像である。光学的厚さ（dt ）の変化に10)起因する強度変化が明瞭に観察できており，細胞壁部については 40 前後という極めて高いコントラストが得られた。Figure 10 は本手法が生体試料の微細構造の観察に有

11)
12)

効であることを示していると言えよう。
13)

.

まとめ
空間分解能において，光学顕微鏡に匹敵する硬 X 線顕14)微鏡を開発した。生きた生体試料の観察を可能にするためにゼルニケの位相差法を導入し，植物病原菌について正負――

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