トピックス
X 線コントラスト変調法によって明らかになった
膜蛋白質と燐脂質の相互作用のダイナミクス
豊島

近

東京大学

分子細胞生物学研究所（現定量生命科学研究所) 〒1130032 東京都文京区弥生 111

乗松良行
東京大学

要 旨

分子細胞生物学研究所（現定量生命科学研究所) 〒1130032 東京都文京区弥生 111

X 線溶媒コントラスト変調法を開発し Ca2＋ ポンプ結晶に適用した結果，これまでは 1, 2 分子しか見えなかった
Ca2＋ ポンプを取り囲む燐脂質すべて（～45分子）を解像できた。その結果，膜蛋白質には燐脂質の「錨」として共に動くアミノ酸残基と膜に浮かぶための「浮き」となる残基が配置されており，両者の間に緊密な連携があること，
脂質二重膜もイオン輸送メカニズムの一部として組み込まれていることが分かった。

1. はじめに結晶化技術と蛋白質大量発現技術，電子顕微鏡技術の進歩によって，膜蛋白質そのものに関する我々の知識は飛躍的に増大したが，その一方で，膜蛋白質が活動する場である脂質二重膜そのもの，或いはその構成成分である燐脂質（＋コレステロール）と蛋白質の相互作用に関する知識は極めて限定されている1) 。これまで，膜の厚さは塩基性（正の荷電を持つ）アミノ酸残基（リジン（Lys），アルギ
ニン（Arg））やトリプトファン（Trp）によって影響を受け「蛋白質脂質ミスマッチ（予想される疎水性部分の長さが蛋白質側と脂質二重膜側で異なる）」が起こること，
また，LysArg は膜の疎水性部分から長い側鎖を伸ばして（snorkeling と言う）燐脂質の燐酸部分と強く結合すること（ Fig. 1 左)2) ， Trp はおそらくカルボニル基と水素結合を作ること（Fig. 1 右下），また，燐脂質頭部の種類や脂肪酸部の長さは安定性や活性に影響を与えることはわかっ

Fig. 1(Color online) Schematic illustration to show polar interactions between protein residues (arginine (Arg), lysine (Lys),
tryptophan (Trp)) and phospholipids (phosphatidylcholine(PC) in this case) that constitute the lipid bilayer. The acyl
chain of phospholipid varies between 1420 carbon chain
and partially cut out in this ˆgure.

ていたが， 45 年前に提出された「流動モザイクモデル｣3)からの本質的な進歩はなかったと言える。
それは，個々の燐脂質を解像できるレベルで生体膜を可上，いたし方のないことではあるが，このような結晶解析

視化する技術がなかったため，端的には，膜蛋白質そのもはすべて誤りを含んでいることは忘れてはなるまい。実

のの構造決定には大変威力のあった X 線結晶解析が脂質際，比較的低分解能領域の寄与が大きい（熱運動の激しい）二重膜の可視化には無力であったためである。それには幾ループ部分ではモデルが間違っていることもある（筆者のつかの理由がある。第一に，燐脂質の柔軟性によってその経験的事実）。

回折強度の大部分は 1/10 Å－1 以下の低角部分に限定されそれでは，（ 0, 0, 1 ）反射のような最低角からのすべてるが（Fig. 2），通常の結晶解析では極低角の反射強度の測の反射強度を測定すれば十分かというと，残念ながらそう

定は行なわないし，そもそも蛋白質の原子モデルの構築のではない。このような低角領域では脂質二重膜に由来する

ためには不必要である。さらに，通常の解析では脂質二重反射 強度 は蛋 白質に 由来 する強 度より 大き くなる ため膜の存在は無視し，蛋白質の外側は均一な溶媒で満たされ（ Fig. 2 ），反射点の位相は蛋白質に由来する位相とは大きているものと仮定して精密化を行なう。これは蛋白質結晶

く異なるからである。実際，すべての反射点を用い，蛋白中の脂質二重膜の現実的モデルを簡単には構築できない以質原子モデル由来の位相で電子密度図を書いてみると，膜212 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3
(C) 2018 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

トピックス ■ X 線コントラスト変調法によって明らかになった膜蛋白質と燐脂質の相互作用のダイナミクス

は見事に消し去られている（ Fig. 3b ）。部分的に低角を入質を解像できるほどの信号が回折パタン中に存在するのかれたときに見える電子密度（Fig. 3c）は，堂々と論文にな

自信はなかった。

ったりしているが4)，雑音に過ぎない。
実際，通常の結晶解析では，蛋白質の膜貫通領域と直接接触している ˆrst layer の燐脂質すら解像されず，蛋白質のセグメント間（膜貫通へリックス間の隙間とか，隣接す

2. 脂質二重膜の可視化によって理解されたことる蛋白質分子との隙間とか）に挟まれて固定されている場

脂質二重膜を可視化しようと考えたのは，不完全な結晶合にのみ解像される。すなわち，アクアポリン 0 の二次解析に不満だったためだけではない。私たちは Ca2＋ ポン

元結晶のような例外的な場合を除き， ˆrst layer の燐脂質

プ SERCA1a を 対 象 に ， そ の 反 応 過 程 の ほ ぼ 全 体 を カのせいぜい 2, 3 分子が解像されるに過ぎない5)。筆者にしバーする 10 状態の結晶構造を決定し，イオン能動輸送機ても， X 線溶媒コントラスト変調法による脂質二重膜の構の原子構造に基づく理解を推進してきた6)。その結果，可視化に成功し（ Fig. 3a ），燐脂質頭部の原子モデルの構膜貫通へリックスは膜に垂直な方向にも 10 Å 以上動くこ

築と精密化がうまくいくまでは，そもそも ˆrst layer 燐脂と，脂質二重膜はポンプのメカニズムの一部として組み込まれているらしいことは理解された7) 。しかし，たとえば，膜貫通へリックスの大きな動きに対し燐脂質は追随して一緒に運動するのか，そもそも二重膜はどれほど凸凹しているのか， 10 本ある膜貫通へリックスのうち M7 M10
はほとんど構造変化を起こさないから反応サイクル中，ずっと同じ向きで膜に挿入されると考えてよいのか，といった基本的疑問には答えるすべがなかった。従って，イオン
ポンプの原子構造に基づく機能の理解のためには，少なくとも，ˆrst layer の燐脂質分子すべてを解像し相互作用の詳細を知る必要がある。つまり，当たり前のことなのだ
が，膜蛋白質を理解するためには脂質二重膜をも知る必要があり，構造決定のための実験的手法を確立する必要があると確信するに至った。
そこで，脂質二重膜の可視化のために X 線溶媒コント
ラスト変調を利用することを考え，方法論的開発とデータ収集を行ってきた。研究は 15年かけて完成し， Ca2＋ ポン

Fig. 2(Color online) Contribution of the lipid bilayer to the structure factor at 0 (black line) and 45 (purple line) iohexol. Electron density of protein matches with the solvent
around 45 iohexol, making the contribution of the lipid
bilayer more visible. The eŠect of iohexol is appreciable at
Bragg spacing of 10 Å or larger. Note that the contributionof the lipid bilayer exceeds 50 at Bragg spacing of 15 Å
(0.07 Å－1) or larger.

Fig. 3プの 4 つの状態（ Ca2＋ 結合直後の E1  2Ca2＋ ， ATP から蛋白質への燐酸転移反応の遷移状態であり細胞質側ゲー
トは閉位置にある E1 ～ P  ADP  2Ca2＋ ，膜内に結合していた Ca2＋ を小胞体内腔側に放出した直後であり蛋白質に結合した燐酸の加水分解反応の遷移状態である E2～P，
Ca2＋ を放出し終わった後の安定状態 E2）に関し，脂質二(Color online) Electron density maps of the Ca2＋-pump in the E1～P･ADP･2Ca2＋ state, viewed parallel to thebilayer, showing the eŠects of the lowest resolution structure factors. Contoured at 0.7 s. a, Using phases obtained by solvent contrast modulation; b and c, using phases derived from a protein atomic model alone. Shortwhite bars in a indicate the positions of the phospholipid head groups.

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 213

重膜を可視化することができた7)。これまでの結晶解析では蛋白質の隙間に挟まれた脂質 1, 2 分子しか解像できなかったが， Ca2＋ ポンプを取り巻く個々の燐脂質をすべて（蛋白質一分子あたり約45個）解像することに成功し，燐
脂質頭部の原子モデルを置くことができた。さらに，低角の位相はコントラスト変調から，高角の位相は原子モデルからとなるように位相を結合することで，3.2 Å 分解能での通常の結晶学的精密化にも成功し（ Fig. 4a ），得られた原子モデルを分子動力学シミュレーションにより確認することもできた（ Fig. 5b ）。この結果，ポンプ蛋白質と燐脂質の相互作用の詳細が明らかになり，これまで燐脂質を同じように固定すると考えられてきた Lys/Arg と Trp /Tyrが明確に異なった役割を持ち協働していることなど，まったく新しい知見が得られた。つまり，脂質二重膜は膜蛋白質を浮かべている単なる海のようなものではなく，機能発
現に能動的に係わっていること，そのため，燐脂質をも含む系全体の原子モデルからメカニズムを考える必要がある
ことが明確になった。今や，蛋白質を構成するアミノ酸残基に通し番号がつけられているように， Ca2＋ ポンプに関しては，燐脂質にも通し番号をつけて議論できるようになったのである（Fig. 4）。この成果8)は Nature 誌（2017年 5月 11日号）の表紙にもなり， News & Views9) でも単独紹介された。膜蛋白質の構造生物学における本質的な進展といえよう。

Fig. 5

Fig. 4(Color online) First layer phospholipids that surround thetransmembrane region of the Ca2＋-pump. Atomic models ofphospholipids (from the head group to the carbonyl groupof phosphatidylcholine; sticks with orange spheres for phosphorous atoms) are based on electron density maps derived
from X-ray solvent contrast modulation. Blue and grey nets
in a represent 2|Fo|-|Fc| electron density maps calculated
at 3.2 Å resolution with combined phases and contoured at
0.7 s (grey) and 1.0 s (blue). Cylinders represent a-helices.
Small numbers in purple identify phospholipids, and those initalics transmembrane helices (M1-M10). K stands for lysine; R, arginine; Q, glutamine; W, tryptophan. Purple
broken lines represent likely hydrogen bonds. The ruler inthe margin of a shows the distance from the bilayer centre.

(Color online) a, A change in orientation of the entire Ca2＋-pump molecule (18.4°) caused by the binding of
ATP and transfer of the phosphate to the pump protein. Placed so that the planes approximating the positions of
the phosphorous atoms (horizontal solid lines) become horizontal in each crystal form. Inclined dotted lines
show the corresponding planes in the conventional alignment with the M7-M10 helices, which do not undergo arearrangement in the reaction cycle. Cyan surfaces show contrast modulation electron density maps for bilayers
calculated at 4.5 Å resolution and contoured at 0.44 e－/Å3. Atomic models for a phospholipid molecule (PL23)
around M1′, an amphipathic helix, and that (PL13) near M10 in the cytoplasmic lea‰et are shown in sticks (alsoboxed) in E1～P･ADP･2Ca2＋. b, A full atomic model of the Ca2＋-pump and the ˆrst layer phospholipids after a
100 ns molecular dynamics simulation, viewed from the opposite direction to that in a. Orange spheres represent
phosphorous atoms in the phospholipid head groups. The side chains of Arg/Lys and Trp/Tyr appear as dark
blue and magenta sticks, respectively.

214 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

トピックス ■ X 線コントラスト変調法によって明らかになった膜蛋白質と燐脂質の相互作用のダイナミクス

以下に主な結果をまとめる。
膜は決して平らではなく（ Fig. 4a ），厚さ（燐脂質頭白質による回折振幅を分子量100程度の重原子が変化できる割合はごく小さい。特に，本課題の場合，脂質二重膜か部の燐酸基間の距離）も（ 30.9 ～ 33.4 Å  Fig. 5a ），蛋白らの寄与は蛋白質からの寄与の 2 倍程度あり，重原子に質を取り囲む燐脂質の数（ 44 ～ 48 ）も反応サイクル中でよる寄与は更に小さくなる。より深刻かもしれない問題変化する。それに伴って最適の位置に戻そうとする力が働は，重原子が非特異的に或いは小さい占有率で多数の場所

くはずで，その力は構造変化の駆動力として使われているに結合することであり，それがどの程度反射強度に影響を可能性がある。

与えるかは見積もれない。実際，重原子が特定の場所に結膜貫通へリックスの運動に伴い，膜内から側鎖を伸ば合していてもいなくても，溶媒の電子密度は変化し散乱強している Lys Arg と結合している脂質（ Fig. 1, 4a）は一

度は溶媒の電子密度の二次函数として変化する（Fig. 6b）。

緒に動く。特に，へリックスの垂直な運動に追従し局所的

また，通常の結晶化条件下では二次函数が極小になる密度な歪を生み出す。それは，へリックスを元の位置に戻す力

から大きくずれているため，散乱強度は溶媒の電子密度のとして働くだろう。

変化に非常に敏感である（コントラスト効果）。

一方，膜外（細胞質側）から燐脂質と結合する Arg

溶媒コントラスト変調法は，蛋白質の概形の決定手段とは相手となる燐脂質を変え，その燐脂質をコンフォメーシして開発されたが，中性子回折により膜蛋白質結晶中の界ョン変化の際の「錨」として使っている（Fig. 1 右上，4b

面活性剤ミセルを可視化するための標準的な方法となっの R324）。

た11) 。溶媒の散乱能（ X 線であれば電子密度）を変えれ膜に対する蛋白質の向きを決めるのは主として Trp

ば，対象とするものの見え方は大きく変わる。もし蛋白質である（Fig. 5）。Trp は溶媒と脂質の界面に存在し10)「浮を取り囲む溶媒の密度を蛋白質の密度と一致させれば，蛋き」の役割を持つ。これまでに想定されていたように燐脂

白質と溶媒は区別がつかなくなり，密度が異なる他の部分

質のカルボニル基と水素結合を作る（ Fig. 1 右下）わけで（界面活性剤のミセルや脂質二重膜など）だけが見えるたはなく広い範囲をカバーするので，膜面に沿ったへリック

め，モデリング可能に成る。しかし，精密化の方法は無スの大きな動き（＞20 Å）にも適している

く，情報量はごく少なかった。一方，このような変化は，

膜貫通へリックスの運動に伴って，へリックスの疎水

回折強度の変化として反映されるだろうから（ Fig. 6a ），性の部分が溶媒に露出しないように，また親水性部分が脂その変化分を差し引くことができれば，固定部分（つまり質二重膜の疎水性部分に露出しないように，蛋白質側は複蛋白質＋脂質二重膜）の密度情報が得られると期待でき

雑な構造変化を起こす。特に注目すべきは，分子全体の傾る。だが，溶媒密度変化による回折強度変化から出てくる

きが20°近く変化することである（Fig. 5a）。このときには，位相（Du iso）は，必要としている，試料全体或いは固定

4 つの Trp 残基のベルトが形成され，いつも膜面と平行部分の位相と直接的には結びついていない（ Fig. 6a ）。従になっていた。 Trp が脂質二重膜の両方の層にあるのはって，コントラスト変調から出てくる位相は，答えが正し

M10 付近に限られ，そこが分子全体の傾斜の際の軸となっていると考えられる。膜に垂直な方向へ大きく動くのは分子のほぼ反対側にある M2 であるから，これは，小さな傾きの変化で大きな運動を許すためのメカニズムなのであろう。

3. 溶媒コントラスト変調法
さて，以下では脂質二重膜の可視化のための方法論を少し議論しておきたい。ここでの具体的課題は，第一に，
1/ 10 Å－1 より低角の反射に対し正しい位相を実験的に与えることである。この目的のためには二つの方策が考えられ，一つは標準的な(i)多重同型置換法（ multiple isomorphous replacement; MIR）であり，もう一つは(ii)溶媒コ

ントラスト変調法（solvent contrast modulation）である。
( i)の多重同型置換法では，重原子を含む溶液に蛋白質結晶を浸漬し，異なる位置に結合した重原子による反射強度の変化から位相を決定する。 X 線結晶解析における位相決定のための標準的方法であるが，極低角での位相決定には幾つかの問題点がある。元来，分子量 10 万を越える蛋Fig. 6(Color online) a. A diagram showing the relationshipbetween the observed diŠraction intensity and the structure
factor from protein plus bilayer and that of solvent. The
intensity of each re‰ection should vary as a quadratic function of solvent electron density〈rsolvent〉(j), in which j isthe concentration of the contrast modulation medium, as inb. The diagram shows three diŠerent concentrations (j＝10,
40, 70). usolvent represents the phase part of Fsolvent, etc. b.
Squares of structure factors of acentric re‰ections,|F(－3, 1, l)|2, plotted against solvent electron density.
Curves are least squares ˆts to the experimental data.

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 215いかどうかの検証には使えるにしても，それ以外には使い分解能の点からはよさそうなのだが，分子間の隙間に深く難い。そのため，初期位相（つまり，脂質二重膜のモデル）

入りこむ結果，結晶格子を破壊する傾向が強いように思がどうしても必要となるが，それを用いて初期電子密度図う。従って，抗凍結剤としては glucose よりも sucrose のを計算できれば，蛋白質部分と溶媒部分の ‰attening を使方が一般に優れている。実際，非常に有用であることが判って，位相改良ができそうに思える。

明したのは， iohexol である（ Fig. 8  Histodenz としてシ

ここで極めて有効であったのが，溶媒置換率（Pex と表グマから売られている)13)。この物質は X 線造影剤として記する）という概念を導入したことである（ Fig. 7)8) 。試開発されたものであり，密度勾配遠心などにも使える。溶料中のすべての点の電子密度は溶媒の電子密度に依存せず解度は極めて高く，80 (w/v）を越える。実際，iohexol

一定であるか，溶媒電子密度の一次函数として直線的に変濃度を 0 80 （ w / v ）の範囲で可変できる場合もあった化すべきであると考えられる。その傾きを Pex とする。蛋（しかし，これだけ変化できても，溶媒の電子密度の変化

白質や脂質二重膜の内部では Pex は 0 であり，溶媒部分はは0.1 e－/Å3 にとどまる（Fig. 7））。問題はこの分子の大き1 ，境界領域では 0 と 1 の間の値をとるとするものであさであり，実効的な分解能は 5 Å 程度にとどまると考える。初期的には蛋白質部分の電子密度は原子モデルから計られる8) 。溶媒置換率の ‰attening をかけてよいのは蛋白算される値にし，溶媒部分の平均電子密度は溶媒の密度を表面からどれくらいかは実験的に決定すべきパラメータで測定して得られた値に設定する。脂質二重膜に関しては膜あるが，表面から5.2 Å 離れれば溶媒置換率を 1 としてよに垂直な方向のみに電子密度が変化する一次元単純モデル

いことが判明した。このことは， iohexol のサイズと整合からスタートする。Pex のマップを計算し，蛋白質部分はしている。

0 に，溶媒部分は 1 に値を制限するとともに，平滑化する

このように X 線コントラスト変調ではコントラストのことによって雑音を減らすことができる。これによって，可変範囲が狭く， Fig. 7 のように，極狭い範囲のデータか

データセット間の整合をとることができるようになり，ら直線の傾きと y 切片を求めることになっている。従っデータの冗長性を位相改良にうまく結びつけることができて，高精度の回折強度データの測定が要求される。幸運でた。

あったことは，Ca2＋ ポンプの結晶化に必要であった poly-

コントラスト変調剤としては幾つかの可能性が考えられ

ethylene glycol の濃度は低く，溶媒コントラスト変調のる。脂質二重膜の可視化を目指す以上，燐脂質頭部の燐酸

可変範囲が広かったことである。また，上述のようにコン基と結合する物質は避けたい。従って，正の荷電を持った

トラスト変調剤の大きさから来る制限もある。しかし，逆イオ ン性物 質は 最初の 試み から除 外すべ きで あろ う。

に，この大きさの制限から，5 Å より高分解能の回折強度

Fourme ら は 電 子 顕 微 鏡 法 で あ る 程 度 の 実 績 の あ る ，は溶媒密度に依存しないと期待され，原子モデルを用いた

aurothioglucose を提案していた12) 。我々も試したが，こ絶対スケーリングが可能のはずである。実際，既に高分解の化合物は照射損傷が激しく，溶解度も高くない上に，結能で構造決定した Ca2＋ ポンプ蛋白質の原子モデルを用

晶格子を破壊することが判明した。分子量の小さい物質はい，初期的な温度因子の補正，同型性の評価も可能であった。これは， X 線を用いることの非常に大きな利点である。
一方で，マスクの問題は深刻である。現状の精密化プロ
グラムでは原子モデルの外側を一定の電子密度で埋めることしかできない。従って，蛋白質＋脂質二重膜領域の中は原子モデルで埋まらない限り，真空である。且つ原子モデルで乱れた構造（「一様な密度」と言ってもよいが）を表

Fig. 7(Color online) Solvent exchange probability. Electron density r at point (x, y, z) in the structure should change linearly(or should be constant) as a function of solvent electron
density, depending on the ``solvent exchange probability''
Pex at that point. The range of electron density that can bemodiˆed by 080 iohexol (i.e. 0.1 e－/Å3) is indicated.

216 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

Fig. 8(Color online) Chemical structure of iohexol13). This compound can be dissolved in water to ＞80 (w/v) and can increase the electron density of the solvent by 0.10 e－/Å3.

トピックス ■ X 線コントラスト変調法によって明らかになった膜蛋白質と燐脂質の相互作用のダイナミクス

現するのは極めて困難である。そのために，部分的な脂質あり， SPring-8 の長期課題がなければ実行不可能な研究

二重膜の原子モデルでは，通常の精密化プログラムを用いであった。

た場合， 極低角まで含 めると R 因子 はかえって 悪くな

理論的にはすべての反射点の回折強度は溶媒電子密度のる。そのため，電子密度図（Fig. 4a）の計算には極低角は二次函数として変化するので12)，1 つの状態の構造決定に

コントラスト変調による位相，高角は原子モデルによる位

は最低 3 つ（実際には 10 点程度）の溶媒密度での測定が相を用いるように phase combine した構造因子を使う必必要である（ Fig. 6b ）。結晶はすべて微量透析法で得られ要がある。

たものであり，再現性も非常に良好であった。一つの成分だけの変化は容易であり，且つ，厳密な制御が可能であっ4. データ収集に関して

たことも大きかった。結晶を拾うときの乾燥の問題も低温
室（ 10 °C ）で行なうことで解決できた。但し，高濃度の最 初 期 （ 2002 年 頃 ） の 予 備 的 実 験 は SPring-8 のiohexol 存在下で結晶を拾うことは，溶媒が相当に粘稠にBL40B2 を用いて行なったが，有用なデータが得られるよなり，且つコントラストマッチングのために結晶が見えなうになったのは，清水伸隆博士，酒井久伸博士の協力を得くなることもあるので熟練を要する。顕微鏡下で余分の溶て BL41XU で He パスを設置し，カメラ長 600 mm で大媒をこよりで吸い取ると，バックグラウンドは下がり，マ

面積イメージングプレート X 線検出器 R-Axis V を用いる

ウントした後の視認性も向上する。

ことによって，すべての反射強度の収集が行なえるようになってからである（2004年，Fig. 9）。原子モデルを用いた
スケーリングを可能にするよう 3～4 Å 分解能の反射点も

5. おわりに含め，検出器を飽和させること無く極低角の反射強度を測本研究で用いた X 線溶媒コントラスト変調法は，大き定しようとすると， 20 bit でも不足であり，露光を 1 / 10

な揺らぎを持った構造を可視化するために有用な方法であ程度にして再露光する必要があった。そのために， CCD

るが， X 線溶媒コントラスト変調法は万能ではない。初が検出器として使えるようになっても R-Axis V を使う必

期位相を必要とするし，高濃度の polyethylene glycol を要があり，異様に時間のかかる実験であった（結晶系が沈殿剤として結晶化している場合には，溶媒コントラスト

C2 であったため，180フレーム×2 分＝6 時間）。現在は 2

変調の余地はない。さらに，コントラスト変調剤の大きさ

次元フォトンカウンティング検出器 PILATUS が導入さによる分解能の問題があり，溶媒の電子密度の可変範囲がれたおかげで測定時間そのものは大幅に（ 10 分以下に）狭いことによる精度の問題もある。本来，そのような問題短縮されたが，‰ux を減らして数え落としがないようにしのない H2O/D2O によるコントラスト変調が可能な中性子ても，部分的には 2～3 条件での測定が必要なフレームが回折に発展されるべきものであるが，ビーム強度の問題はまだ深刻であり，巨大結晶が必要である。そこで，多重同型置換法のデータ収集を工夫して低角の位相情報を得る手段を確立することも考えている。いずれにせよ，低角の位相決定の問題を克服し，脂質二重膜からプロトンまでを含む真の構造生物学を展開したい。
謝辞
本 研 究 は 科 学 研 究 費  特 別 推 進 研 究 （ 19002013 ，23000014 ） を 得 て SPring-8 の 長 期 課 題 （ 2009B0025 ，2012B1486 ， 2013A0049 ）の一部としてなされたものである。データ収集に当たっては SPring-8 ， BL41XU の歴
代の担当者，特に，清水伸隆博士，酒井久伸博士，長谷川
和也博士，奥村英夫博士には，絶大なご支援をいただいた。ここに記して御礼申し上げたい。また，結晶を作製してくれた杖田淳子さん，平田絢美さん，岩澤志穂さん，
データ収集を手伝ってくれた研究室のメンバーにも感謝し
Fig. 9

X-ray diŠraction pattern of a Ca2＋-pump crystal soaked in abuŠer containing 60 (w/v) iohexol. Recorded to 3.0 Åresolution with an R-Axis V imaging plate detector at
BL41XU, SPring-8. The crystal has a P41212 symmetry withthe unit cell parameters of a＝b＝71.56 and c＝586.14 Å. Inset shows a magniˆed view of the boxed area of the corresponding frame with a reduced exposure.

たい。

参考文献
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23 (1982).

著者紹介
豊島

乗松良行

近

東京大学 定量生命科学研究所 教授
E-mail: ct＠iam.u-tokyo.ac.jp
専門構造生物学［略歴］
1983 年 3 月 東京大学大学院理学系研究科物理学専攻博士課程修了。理学博士。東京 大学 理学 部助 手（ 物理 学教 室 ），英 国
MRC 分子生物学研究所研究員，理化学研
究所国際フロンティア研究員，東京工業大学理学部（生命理工学部）助教授を経て1994 年 5 月 よ り 分 子 細 胞 生 物 学 研 究 所（現定量生物科学研究所）教授，現在に至る。

株式会社タダノ 技術研究所
専門X 線結晶構造解析［略歴］
2010 年，東京大学理学系研究科物理学専
攻 博士後期課程修了。博士（理学）。
富士通株式会社での勤務を経て，2014 年から東京大学分子細胞生物学研究
所特任研究員。
2017年から株式会社タダノに勤務。

Dynamics of interactions between a membraneprotein and phospholipids as revealed by X-ray
solvent contrast modulation
Chikashi TOYOSHIMA

Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo（Current: Institute for Quantitative Biosciences, The University of Tokyo）
111 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 1130032, Japan

Yoshiyuki NORIMATSU

Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo（Current: Institute for Quantitative Biosciences, The University of Tokyo）
111 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 1130032, Japan

Abstract

Our knowledge on the protein-phospholipid interaction was very limited because conventional Xray crystallography can resolve only one or two phospholipids per membrane protein. By developing X-ray solvent contrast modulation, we have succeeded in visualising the entire ˆrst layer phospholipids (ca. 45 molecules) that surround the transmembrane region of the Ca2＋-pump crystallised in four diŠerent states. The electron density maps clearly show that the pump protein possesses amino acid residues that work as anchors of phospholipids and those work as membrane‰oat. We now see tight interplay between those residues and phospholipids and that the lipid
bilayer actively plays an important role in the mechanism of ion pumping.

218 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3