〔生物工学会誌

第 87 巻第1号

9–15．2009〕

平成20 年度 生物工学奨励賞（江田賞）受賞

清酒醸造工程における酵母のペプチド輸送調節と，その機構に着目した酵母の育種
山田翼

Peptide Transport Regulation of Saccharomyces cerevisiae in Sake Brewing,and Isolation of the Mutant of Sake Yeast That Paid Attention to the Mechanism
Tasuku Yamada (General Research Laboratory of Kiku-Masamune Sake Brewing Co. Ltd, 1-8-6 Uozakinishimachi Higashinada-ku Kobe 658-0026) Seibutsu-kogaku 87: 9–15, 2009.

はじめに
清酒醸造の主発酵工程である醪は開放発酵系であるため，酒造に悪影響を及ぼす雑菌に汚染される危険性が高

プチド取込能が低下した新しいタイプの清酒酵母の育種について紹介する．
生那を用いた醪のペプチド濃度に与える酵母の影響 13）

いが，充分量の酵母と乳酸を含んだ酒母とそれに続く三清酒醸造において醪に使用する時の生那のアミノ酸度段仕込によって安定な醸造を可能にしている．酒屋万流は 6 ～ 7 程度であり，速醸那は 2 前後である．酒母歩合をと言われるように酒母にもさまざまな製法が存在する

7％として，使用醪の差がそのまま生成酒に移行するとが，乳酸の取得方法により2 つのグループに大別される．

仮定すると，生那を用いた酒のアミノ酸度は速醸那より一つのグループは乳酸菌によって乳酸を生成させる伝統も 0.3 程度高くなる．生成酒においてアミノ酸度 0.3 の違的な手法で生那系酒母と呼ばれており，もう一つは速醸いはかなり大きな差である．そこで，当社醸造蔵で製造系酒母と呼ばれる仕込時に醸造用乳酸を添加する方法した生那と速醸那の酒母を用いて，実験室で全く同じ条で，近代になって開発された手法である．生那系酒母は件で醪を仕込み，経日的に遊離アミノ酸濃度とペプチド微生物管理が複雑で製造日数も長いために，現在では速態アミノ酸濃度を測定した．その結果，使用時には生那醸系酒母が主流となっているが，生那系酒母には培養しの遊離アミノ酸濃度は速醸那の 4 倍ほどあったが，段仕た酵母のアルコール耐性が高いことや枯らしがきく等の込を経るに従いその差は小さくなり，留 2 日目以降はほ特徴があり 1,2），また生那系酒母特有の風味があるとも言

とんど同じ濃度で推移した．一方，ペプチド態アミノ酸われているので，一部の醸造蔵では使用されている．

濃度は使用時には生那の方が速醸那に比べて 2/3 ほどし

生那系酒母の特徴の一つとして酒母完成時のアミノ酸かなかったが，仲仕込から留仕込の間に逆転し，留仕込度が速醸系酒母の 3 倍ほどになることが知られており，後は生那醪の方が 5 mM 程度高いまま推移した（図 1）．

その原因について以前から多くの研究がなされ 3–8)，近年

この現象は段仕込による希釈効果では説明できない．清その機構の全容がほぼ明らかになった 9,10)．アミノ酸度

酒醪中では溶出する遊離アミノ酸やペプチド態アミノ酸が高い生那系酒母であるが，生那系酒母を用いて醪を仕の 1/3 から 1/2 は酵母により取り込まれるので 14），まず酵込み醸造した酒がアミノ酸度の高い，雑味の多い酒にな母の影響を検討するために生那と速醸那を用いて通常のるとは言われていない 11,12)．本稿では，その原因が酵母発酵系の醪と酵母を除いた溶解系の醪を作製し，三段仕のペプチド取込能の変化にあることを示すとともに，ペ込時における遊離アミノ酸濃度とペプチド態アミノ酸濃著者紹介

菊正宗酒造株式会社総合研究所（課長代理） E-mail: ta-yamada@kikumasamune.co.jp

9図 1．生那を用いた清酒醪と速醸那を用いた清酒醪の遊離アミノ酸およびペプチド態アミノ酸の濃度経過．▲，生那を用いた
醪のペプチド態アミノ酸；△，速醸那を用いた醪のペプチド態アミノ酸；●，生那を用いた醪の遊離アミノ酸；○，速醸那を用いた醪の遊離アミノ酸．

図 3．アミノ酸培地で培養した酵母（■）とペプチド培地（□）
で培養した酵母の遊離アミノ酸（Leu, Glu）およびペプチド（Gly-Leu, Glu-Glu）の取込能．ペプチド培地は Wickerham の最小培地の窒素源を米のタンパク質を米麹から精製したの酸性プロテアーゼで分解したものに置き換え作製した．アミノ酸培地は Wickerham の最小培地の窒素源をペプチド培地のアミノ酸組成を参考にして遊離アミノ酸を添加して作製した．使用
酵母はキクマサ酵母（Km601），培養条件は 15°C，4日．

れた（図 3）．したがって，生那のような高濃度の遊離アミノ酸が存在する環境で生育した酵母はペプチド取込能が抑えられるために，醪での酵母増殖期にペプチドをあまり取り込まず，結果として生成酒中のペプチド態アミノ酸濃度が高くなる可能性が考えられた．
酵母のペプチド取込能がアミノ酸よって抑えられる現象をさらに詳細に検討するために，ペプチド輸送体を破図2．発酵系の醪 (A)と酵母を除いた溶解系の醪(B)の三段仕込時における遊離アミノ酸濃度およびペプチド態アミノ酸濃度
経過．▲，生那を用いた醪のペプチド態アミノ酸；△，速醸那を用いた醪のペプチド態アミノ酸；●，生那を用いた醪の遊離アミノ酸；○，速醸那を用いた醪の遊離アミノ酸．

壊した清酒酵母を作製した．これまでに報告されている酵母のペプチド輸送体にはジペプチドやトリペプチドを取り込む PTR2 ともう少し大きなオリゴペプチドを取り込む OPT1 が存在することが知られている 16,17)．しかし，清酒に含まれるペプチドは低分子のものがほとんどであ度の推移を比較した．その結果，溶解系の醪では仲仕込ること 18,19)，また清酒醪のような酸性条件下では麹の酸から留仕込の間に生那を用いた醪のペプチド態アミノ酸性プロテアーゼは米の貯蔵タンパク質をすばやくジペプ

濃度が速醸那を用いたものより多くなる現象は見られなチドやトリペプチドに分解する 9) ことから PTR2 が清酒かった（図 2）．したがって，この現象には酵母による遊醪における酵母の主要なペプチド輸送体である可能性が離アミノ酸やペプチドの取り込みが大きく関わっている高いと考え，協会 7 号酵母の単相体（ATCC44893 株）のと考えられた．

PTR2 破壊株（Δ ptr2 株）を作製した．Δ ptr2 株は調べた

清酒酵母のペプチド輸送に対するアミノ酸の影響 15）
生那を用いた醪のペプチド態アミノ酸濃度が速醸那を限りのジ・トリペプチドの取込能をほとんど失い，またΔ ptr2 株で仕込んだ清酒のペプチド態アミノ酸濃度は親株に比べて著しく増えたことから，PTR2 が清酒醪にお用いたものよりも高くなる現象に酵母が関わっているとける酵母の主要なペプチド輸送体であると考えられた．

考えられたので，生那のように遊離アミノ酸濃度が高い

そこで，PTR2 の発現が，培地に含まれるペプチドとア液体培地で培養した酵母と，速醸那のようにペプチド態ミノ酸割合に影響されるかどうか検討したところ，培地アミノ酸の方が遊離アミノ酸よりも多く含まれる液体培のアミノ酸の割合が高くなるにしたがって，PTR2 の発地で培養した酵母の遊離アミノ酸（Leu, Glu）の取込能現は抑えられ，ペプチド取込能は低下していた（図 4）．とペプチド（Gly-Leu, Glu-Glu）の取込能を比較した．

したがって，酵母のペプチド取込能がアミノ酸よって抑その結果，遊離アミノ酸の取込能はどちらの培地で培養えられる現象は PTR2 の発現レベルで制御されているとした酵母も差がなかったのに対し，ペプチドの取込能は考えられた．

遊離アミノ酸濃度が高い培地で培養した酵母では抑えら
10

PTR2 の発現を抑えるのはすべてのアミノ酸か一部の
生物工学

第87巻

チンの計 22 種）を添加した培地でそれぞれ培養した酵母（協会 701 号：K-701 株）の PTR2 発現とペプチド取込能を測定した．図5に示すように，グルタミン（Gln），アスパラギン（Asn），セリン（Ser）を添加したときはアミノ酸無添加の培地で培養した酵母に比べて PTR2 発現が低下し，それととともにペプチド取込能も大きく減少していたが，リジン（Lys）やアルギニン（Arg）を添加した
ときには PTR2 発現の低下は見られないにもかかわらずペプチド取込能は低下していた．また，トリプトファン（Trp）やヒスチジン（His）を添加すると PTR2の発現は上昇するが，ペプチド取込能が上昇することはなかった．
このようにアミノ酸が清酒酵母の PTR2 発現やペプチド取込能に与える影響はアミノ酸の種類によって異なると考えられた．Asn を添加した場合に関して添加濃度が
図 4．アミノ酸 / ペプチド比が異なる培地で培養した酵母のPTR2 発現(A)とペプチド取込能(B)．各培地のペプチド態アミノ酸と遊離アミノ酸の比は以下のとおり：レーン 1，42 mM：
2 mM；レーン2，21 mM：23 mM；レーン3，11 mM：33 mM；
レーン 4，0 mM：44 mM．使用酵母はK-701，培養条件は 15°C，
3 日．

PTR2 発現やペプチド取込能に与える影響を検討したところ，培地に 2 mM の Asn を添加すると PTR2の発現が低下し，それに伴いペプチド取込能も半分以下に低下した（図 6）．Gln や Ser を添加した場合でも同様の結果が得られた．当社季節蔵において測定した使用時の生那の Asn，Ser ，Gln の濃度はそれぞれ 1.9 mM，3.0 mM，1.8 mM

アミノ酸なのかを検討するために，最少培地に 5 mM のであり，速醸那ではそれぞれ 0.19 mM，0.4 mM，0.3 mM

各アミノ酸（タンパクを構成する 20 種のアミノ酸と清酒であった．したがって，2 mM 程度以上のこれらのアミ中に著量含まれる γ- アミノ酪酸（GABA）およびオルニノ酸の存在が生那で育った酵母のペプチド取込能の低下

図 5．酵母の PTR2 発現およびペプチド取込能に与える培地への添加アミノ酸の影響．Yeast Nitrogen Base w/o amino acids andammonium sulfate にcomplete supplement mixture（CSM）および 2％グルコースを加えた培地を基本培地（アミノ酸無添加）としそれぞれ 5 mMの各アミノ酸を添加した培地で 15°C，3 日培養した酵母（K-701）のPTR2 発現(A)およびペプチド取込能(B)を測定した．

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11図6．酵母の PTR2 発現およびペプチド取込能に与える Asn濃度の影響．実験条件は図5 と同様．

図 8．PTR2 プロモーター領域のレポーターアッセイ．デリー
ションした PTR2 プロモーター領域と大腸菌の lacZ を融合したプラスミドを作製し ATCC44893 株に導入した形質転換株を15°C でA660 が 1.0 に達するまで培養後 β- ガラクトシダーゼ活性を測定した．培地は基本培地（）および基本培地に 10 mMのAsn（）もしくは Lys（）を添加したものを使用した．

モーター領域の影響を検討するために，PTR2 プロモー
ター領域のデリーションシリーズとlacZを融合したプラスミドを作製し，ATCC44893 株に導入してそのレポーター活性を調べた（図 8）．Asn を添加するとレポーター活性が大きく落ち，Lys 添加では落ちなかったことから，
Lys は PTR2 発現抑制によらずにペプチド取込能を低下させていることが証明された．また，Asn による発現抑制はPTR2のATGから上流400bpまで存在すれば起こることから，この間に Asn による抑制を感知する領域が存在すると考えられた．また，−770 から −600 の間を欠失するとレポーター活性が大きく低下することから，この間に PTR2 の発現を大きくエンハンスする領域が存在すると考えられた．
以上のように，生那を用いた醪のペプチド濃度が高く
図7．酵母の PTR2 発現およびペプチド取込能に与える Lys濃度の影響．実験条件は図5 と同様．

なるという現象は，生那中に著量含まれる一部のアミノ酸が清酒酵母の PTR2 発現を抑制するためにペプチド取込能の低下が起こり，酵母増殖期にペプチドをあまり取に影響を与えていると考えられた．一方，Lys を添加した場合は PTR2 の発現はあまり低下せずに，ペプチド取込能のみが低下した（図 7）．季節蔵において測定した使り込まなくなることが主因で起こると考えられた．
ペプチド取込能低下酵母の育種 21)

用時の生那および速醸那のLys濃度はそれぞれ0.2 mMと生那酵母の特徴の一つとしてペプチド取込能が低下し0.4 mM であったため，Lysが生那で育った酵母のペプチていることが明らかになったので，ペプチドが多い，生ド取込能の低下に影響を与えているとは言えないが（た那タイプの清酒を簡便に醸造するために，ペプチド取込だし，Lys は酵母が最もよく取り込むアミノ酸である 20)能低下酵母の育種を検討した．ペプチド取込能低下酵母

ため，生那で育った酵母は大量の Lys を取り込んだ可能として前節で示した Δ ptr2 株があげられる．Δ ptr2 株で仕性はあり，それがペプチド取込能に影響を与えている可込んだ清酒は親株で仕込んだ清酒に比べて遊離アミノ酸能性も否定はできない），アミノ酸による酵母のペプチド濃度が低く，ペプチド態アミノ酸濃度は非常に高かった．

取込能低下には PTR2 発現抑制以外の経路も存在するこ

清酒中のペプチドの中にはさまざまな機能性を持つペプとを示している．

チドが存在すると報告されているので 22,23) Δ ptr2 株のよアミノ酸による PTR2 発現抑制に関して PTR2 プロ
12

うなペプチド取込能が低下した酵母で清酒を醸造すれ
生物工学

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図9．ユビキチン－プロテアソーム系による酵母の PTR2 の発現制御機構．培地に特定のジペプチドが存在しない条件ではPTR2発現はCup9pにより抑制されている(A)．培地に特定のジペプチドが存在すると活性化された Ubr1p により Cup9p はユビキチン化され分解されるため，PTR2発現は脱抑制される(B)．

ば，機能性の面でも味覚的にも特徴のある清酒を醸造することが可能であると考えられた．しかし，嗜好品であ図 10．銅耐性によって選抜した変異株の PTR2 発現 (A) とペプ
チド取込能 (B)．レーン 1，Cu4；レーン 2，Cu20；レーン 3，Cu32；レーン 4，Cu34；レーン 5，Km601（親株）．実験条件
は図5 の基本培地と同様．

ペプチド取込能低下酵母によるペプチドが多い
清酒の醸造 21)

る清酒の醸造において遺伝子破壊株を用いることは消費者の理解を得ることが難しい．そこで，突然変異によっペプチド取込能低下酵母が得られたので，実験室レベてペプチド取込能が低下した酵母を取得することとした．

ルでの清酒の試験醸造を行った．その結果，PTR2 発現

PTR2 の発現は転写因子 Cup9p により抑制される（図の低下に伴ってペプチド取能が低下した株（Cu4 株）も，9A）24)．Cup9p は ジ ペ プ チ ド 存 在 下 で 活 性 化 さ れ る

PTR2 発現が低下することなくペプチド取込能だけが低Ubr1p によってユビキチンを付加され，これを認識した下していた株（Cu32 株）も生成酒のペプチド態アミノプロテオソームにより分解される（図 9 B）25)．したがっ酸濃度は親株の約 1.5 倍に増加しており，本ペプチド取て，清酒醪のような多量のジペプチドが存在する環境で込能低下株を使用することによってペプチドの多い清酒は Cup9p は分解されているため，PTR2 の発現は脱抑制が醸造可能であることが確認された（表 1）．逆に遊離アされ，酵母はペプチドを取り込めるようになっている

ミノ酸濃度は親株の約 0.6 倍に低下した．これは，ペプ（図 9B）．そのため，米のタンパクから生成したペプチドチドを利用することができなくなった酵母がアミノ酸をの半分近くは酵母に取り込まれてしまい，清酒には移行代わりに多く利用したためと考えられる．また，ペプチしない．また，Cup9p は呼吸条件下での銅耐性獲得に関

ド取込能低下株は醪初期に発酵が停滞したため発酵日数与していることも知られている（図 9 A）26)．そこで，ジが 2 ～ 3 日延びた．これは通常の清酒酵母ならば，米の溶ペプチドが存在する呼吸条件下で銅耐性のある酵母を取得すれば Cup9p が分解されないため，PTR2 が常に抑制され，ペプチド取込能が低下した酵母が得られると考えた．
上記理論をもとに清酒酵母（キクマサ酵母：Km601）

表1．ペプチド取込能低下酵母を用いた清酒小仕込試験の成分分析
Cu4を親株としてメタンスルホン酸エチル（EMS）で変異処

Cu32

Km601

理後，ジペプチドが存在する呼吸条件下で銅耐性のある醸造日数

181715ものを選択してきたところ，選択してきたほとんどの酵

日本酒度−17.8−14.9−15.8

母のペプチド取込能は親株に比べて顕著に低下していアルコール濃度（％）

16.417.116.1た．
特にペプチド取込能が低下した4株についてPTR2発酸度（ml）

4.74.63.7

現を測定したところ，1 株は予想通り PTR2発現も低下しアミノ酸度（ml）

1.91.82.2

遊離アミノ酸濃度（mM）

14.513.321.5

ペプチド態アミノ酸濃度（mM）

47.8

46.2

30.6ていたが，あとの 3 株は PTR2発現が低下することなく，ペプチド取込能だけが低下していた（図 10）．
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13解が進んでいないためにアミノ酸不足になる醪初期にもおわりにペプチドを利用することによって増殖できるのであるが，ペプチド取込能低下酵母はペプチドを利用できない

本研究では生那造りで見られる高いアミノ酸度が清酒ため，窒素源を得られず，増殖が遅れたためであると考

酵母のペプチド取込能を抑制し，醪や酒質にも影響を与えられる．

えることをペプチド輸送体遺伝子（PTR2）の発現レベ短鎖ペプチドが持つ機能性の中で有名なものに血圧をルから明らかにした．また，簡便にペプチド取込能低下正常に保つ効果が期待されるアンギオテンシン変換酵素酵母を取得する方法を確立し，その変異株を用いて味覚（ACE）阻害活性がある 27)．これは，人の血圧制御シス的にも機能性の面からも特徴があるペプチドが多い清酒テムの中で最も重要であるといわれているレニン・アンの醸造を可能にした．

ギオテンシン系のキー酵素であり，血圧を高めに誘導す

一般的な清酒にはペプチドは0.12～0.25％ほど含まれる ACEを阻害する活性である．そこで我々は，ペプチドている．この含量は水，アルコール，糖類に次いで，遊取込能低下酵母（Cu32 株）を用いて醸造したペプチド

離アミノ酸や有機酸とほぼ同じ程度であり，ペプチドはが多い酒の ACE 阻害活性を親株（Km601 株）で醸造し清酒のかなり主要な成分である．しかし，これまで清酒た酒と比較した（表 2）．なお，ACE阻害活性を測定するにおける意義はあまり分かっていなかった．これはペプ

際，アルコールが夾雑すると正確に活性を測定することチドの多様性とそれに伴う個々のペプチドの量的少なさができないので，サンプルは清酒を凍結乾燥後，蒸留水によるものと思われる．現在，分析技術は日々進歩し，により元の容量に戻したものを用いた．また表 1 とペプそれを解析するソフトウェアも進歩している．清酒におチド態アミノ酸濃度が異なるのは，まったく別の機会にける多様なペプチドもその意義や有用性を更に解明する

異なる原料米を用いて醸造した酒であるためである．

ことができると期待される．

ACE 阻害活性は実験に用いた反応系において ACE 活性を 50％阻害する清酒（脱アルコールし，元の容量に戻した清酒）の量もしくはペプチド態アミノ酸濃度で表した．その結果，Cu32 株で醸造した酒は親株を用いて（IC50）醸造した酒と比べて 1/3 以下の量（1.5 μl/5.4 μl）で親株を用いて醸造した酒と同等の ACE 阻害活性を示した．また，この活性を生成酒に含まれるペプチド態アミノ酸濃度で見てみてみると，ペプチド高含有酒で 5.9 mM，対照酒で 11.9 mM であった．これまでに ACE阻害活性が確認された低分子ペプチドのIC50 は0.2 μM～20 μM程度であるため 28)，清酒に含まれるペプチドのうち ACE 阻害活性を示すものは数百から数千種類にひとつであることが伺える．しかし，本法によって醸造されたペプチド高含有清酒のペプチド態アミノ酸濃度当たりの ACE 阻害活性が通常の清酒に比べて 2 倍以上高かったということは，数百種類にひとつしか存在しない血圧を正常に保つペプチドが選択的にこのペプチド高含有清酒に残存していることを示している．
表2．生成酒のACE阻害活性
ACE 阻害活性（IC50）

酵母

生成酒中のペプチド態アミノ酸濃度（mM）

Cu3259.1

1.55.9Km601

33.15.411.9

サンプル溶液 ペプチド態アミノ当たり *（ml） 酸当たり（mM）* 本実験の反応系で ACE 活性を 50％阻害するのに必要なサンプルの量

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本研究の機会と御鞭撻を賜りました菊正宗酒造株式会社元常務取締役 原昌道博士，執行役員総合研究所長 溝口晴彦博士，生産部長 家村芳次博士，生産部課長 古川恵司博士をはじめとする関係各位に深く感謝申し上げます．本賞受賞に際しまして学会への推薦をしていただきました白鶴酒造株式会社
松永將義研究開発室室長に厚く御礼申し上げます．また，本研
究は身近に生那造りを行う酒造蔵が存在したからこそ可能であった研究です．生那造りを守り続けている当社生産部をはじめ嘉宝蔵の皆様に深く感謝いたします．

文献1) 溝口晴彦，池田 朋，原 昌道：生物工学, 72, 355–361(1994).
2) 佐藤俊一，田中裕之，山崎教和，梁瀬文弘，下飯 仁，斉藤和夫，家藤浩幸，蓼沼 誠：醸協, 84, 183–187 (1989).
3) 杉田 脩，国定則之，蔭山公雄：酵工学 , 34, 138–148(1956).
4) 秋山裕一：農化, 33, 1–6 (1959).
5) 秋山裕一，千野潤雄：醸協 , 54, 696–691 (1959).
6) 鈴木明治，布川弥太郎，馬場国男，伊藤雄太郎：醸協，53, 532–529 (1958).
7) 布川弥太郎，西谷尚道，鈴木明治：醸協，54, 342–335(1959).
8) 竹内五男，中村精二：醸協，63, 1155–1158 (1968).
9) Iemura, Y., Yamada, T., Takahashi, T., Furukawa, K.,
and Hara, S.: J. Biosci. Bioeng., 88, 276–280 (1999).
10) Iemura, Y., Takahashi, T., Yamada, T., Furukawa, K.,
and Hara, S.: J. Biosci. Bioeng., 88, 531–535 (1999).
11) 関東信越国税局鑑定官室：醸協，56, 1168–1174 (1961).
12) 関東信越国税局鑑定官室：醸協，57, 1111–1117 (1962).
13) Iemura, Y., Yamada, T., Takahashi, T., Furukawa, K.,
and Hara, S.: J. Biosci. Bioeng., 88, 679–681 (1999).

生物工学

第87巻

14) 家村芳次，片岡浩平，原 昌道：醸協, 91, 130–135 (1996).
15) Yamada, T., Furukawa, K., Hara, S., and Mizoguchi, H.:J. Biosci. Bioeng., 99, 383–389 (2005).
16) Perry, J. R., Basrai, M. A., Steiner, H. Y., Naider, F., andBecker, J. M.: Mol. Cell. Biol., 14, 104–115 (1994).
17) Hauser, M., Narita, V., Donhardt, A. M., Naider, F., andBecker, J. M.: Mol. Membr. Biol., 18, 105–112 (2001).
18) 高橋 暲，能勢惟一：酵工学，35, 318–320 (1957).
19) 北本勝ひこ，梶原勝之，大場俊輝，難波康之祐，中村欽一：醸協，77, 665–669 (1982).
20) 秋田 修，大場俊輝，中村欽一：醸協, 81, 403–408 (1982).
21) Yamada, T., Furukawa, K., Hara, S., and Mizoguchi, H.:J. Biosci. Bioeng., 100, 460–465 (2005).
22) Saito, Y., Wanezaki, K., Kawato, A., and Imayasu, S.: Bio-2009年

第1号

sci. Biotech. Biochem., 58, 812–816 (1994).
23) Saito, Y., Ohura, S., Kawato, A., Suginami, K., and Imayasu, S.: J. Agric. Food Chem., 45, 720–724 (1997).
24) Byrd, C., Turner, G. C., and Varshavsky, A.: EMBO J.,
17, 269–277 (1998).
25) Turner, G. C., Du, F., and Varshavsky, A.: Nature, 405,579–582 (2000).
26) Knight, S. A., Tamai, K. T., Kosman, D. J., and Thiele,
D. J.: Mol. Cell. Biol., 14, 7792–7804 (1994).
27) Maruyama, S., Nakagomi, K., Tomizuka, N., Suzuki, H.:Agric. Biol. Chem., 49, 1405–1409 (1985).
28) Fujita, H., Yokoyama, K., Yoshikawa, M.: J. Food Science,
65, 564–569 (2000).

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