【研究報告】（自然科学部門）

上皮タイトジャンクション制御に立脚した消化管保護食品の創製

鈴木

広島大学大学院生物圏科学研究科
1.

緒

言

卓

弥准教授

実験方法

2.

2.1. 大腸炎マウスの回復におけるナリンゲニン類の役

外来異物に常に暴露されている消化管は、異物に対す割の解析

る寛容と排除応答の平衡バランスを維持し、その恒常性を守っている。換言すれば、消化管はその平衡バランス

Balb/C マウス（7 週齢、オス、 ＝6）にデキストランを乱すリスクを常に内包し、日常的なストレスや体調不硫酸ナトリウム（DSS、2％）を 6 日間飲水させ、実験良などによっても軽微な炎症を引き起こし、疾患の引き的大腸炎を発症させた。その後、すべてのマウスに蒸留金になりうると考えられる。なかでも炎症性腸疾患は、水を与え、11 日間の回復期間を設けた。回復期間中、消化管に原因不明の炎症をおこす慢性疾患の総称であマウスには通常食、ナリンゲニン添加食（0.3％）、ナリり、近年、日本を含めた先進国において、その罹患者数

ンギン添加食（アグリコン換算で 0.3％）を与えた。まは増加の一途をたどり、その予防法の開発は、医学的・た DSS を飲水させず、通常食を摂取させた正常対照群

社会的な課題の 1 つとなっている。

も設けた。試験期間中は、体重と大腸炎クリニカルスコ

消化管の恒常性を守る最も重要な因子の 1 つは、異物ア（下痢、血便の状態から算出）を記録した。試験期間の侵入を制限する消化管バリア機能である。消化管バリ終了後、大腸を採取し、大腸長、ウェスタンブロット法

アが損傷すると、異物の侵入が容易となり、炎症を引きによる TJ タンパク質発現量、定量 PCR 法によるサイト起こすリスクが増大する。これまでに我々は、消化管バカイン発現量の解析を実施した。

リアの主要構造であるタイトジャンクション（TJ）を2.2. 大腸炎マウスの組織培養法を用いたナリンゲニン制御する食品成分の役割とその分子機構を探索してきによる回復作用の解析た。なかでも、ポリフェノール類の一部が TJ バリア機能を強く増強することを世界に先駆けて報告し、さらBalb/C マ ウ ス（7 週 齢、 オ ス、 ＝6） に DSS（2％）に、ケルセチンやナリンゲニンが炎症性腸疾患に予防的を 6 日間飲水させ、実験的大腸炎を発症させた。エーテ1–3）。しかしながら、消化管ル麻酔下にて大腸組織を摘出し、内容物を生理的食塩水

バリアの損傷や炎症の回復におけるポリフェノールの役で洗浄後、大腸をシート上に開いた。約 5 mm 片の長さ割は全く不明であり、具体的な臨床応用や機能性食品のに細断し、24 ウェルプレートにて 37℃、5％二酸化炭素創製を遅らせている要因となっている。

存在下で 24 時間培養した（ダルベッコ改変イーグル培に作用することも見出した

そこで本研究は、消化管のバリア損傷と炎症の回復に

地、10％ 牛 胎 児 血 清）。 こ の と き 培 養 液 中 に 0、100、おけるポリフェノールの役割を明らかにすることを目的

200 μM のナリンゲニンを添加した。ウェスタンブロッとした。予備的な検討により、ケルセチンとナリンゲニト法による TJ タンパク質発現量、定量 PCR 法によるサンの作用を解析したところ、ナリンゲニンにより明確なイトカイン発現量の解析を実施した。

作用が観察されたため、特にナリンゲニンとその配糖体2.3.

ナリンギンに着目して研究を進めた。

マウス大腸内のナリンゲニン代謝物の解析

Balb/C マ ウ ス（7 週 齢、 オ ス、 ＝6） に DSS（2％）
を 6 日 間 飲 水 さ せ、 こ の と き ナ リ ン ゲ ニ ン 添 加 食（0.3％）、ナリンギン添加食（アグリコン換算で 0.3％）を与えた。また、DSS を飲水しない組み合わせも行っ
1

鈴

図1

木卓

弥

大腸炎マウスの体重変化

Balb/C マウスに 2％DSS を 0〜6 日目まで飲水させた後、7〜17日目まで蒸留水を与えた。正常対照群には実験期間を通して蒸留水を与えた。0〜6 日目は、すべてマウスに基本飼料を与えた。7〜17 日目には、それぞれの試験食を与えた。体重を毎日測定し、0 日目からの体重変化（g）を示した。数値は、平均値±標準誤差で示した（同一のアルファベットを共有しない群間に有意差あり、 ＜0.05、Tukey–Kramer 検定）。
図2た。大腸の内容物を採取し、ナリンゲニン、ナリンギ

大腸炎マウスの大腸組織タイトジャンクションタンパク
質発現量Balb/C マウスに 2％DSS を 0〜6 日目まで飲水させた後、7〜17日目まで蒸留水を与えた。正常対照群には実験期間を通して蒸留水を与えた。0〜6 日目は、すべてマウスに基本飼料を与えた。7〜17 日目には、それぞれの試験食を与えた。試験期間終了後に大腸を採取し、ウェスタンブロット法により、CLDN-3と JAM-A の発現量を解析した。数値は、平均値±標準誤差で示した（同一のアルファベットを共有しない群間に有意差あり、 ＜0.05、Tukey–Kramer 検定）。

ン、その代謝物を超高速液体クロマトグラフィー質量分析（UPLC/MS）にて解析した。解析した代謝物は、過去 の 報 告 を 参 考 に し て Eriodictyol、Phloroglucinol（PG）、4 - hydroxyphenyl propionic acid（HPA）、3-phenylpropionic acid（PA）、4-hydroxybenzoic acid（HBA）、2,4,6-trihydroxybenzoic acid（TBA）とした。

た。大腸長は、DSS 投与により有意に低値を示したが、2.4.

マクロファージを用いたナリンゲニンおよび代謝ナリンゲニンとナリンギンの摂取により DSS 群に比べ物による TNF-α産生抑制作用の解析て高値傾向を示した。ウェスタンブロット法による TJマウス由来マクロファージ RAW 264.7 細胞を用いた。

タンパク質発現解析では、DSS 投与により、Claudin-324 ウェルプレートに細胞を播種し、2 日間培養後に実験と JAM-A が有意に低下したが、ナリンゲニンとナリンに 用 い た。 炎 症 状 態 の 誘 導 の た め、LPS（10 ng/mL）

ギンの摂取により高値また高値傾向を示した（図 2）。に よ り 刺 激 し、 刺 激 6 時 間 後 に 培 養 上 清 を 採 取 し、DSS 投与により、炎症性サイトカインの TNF-α、IFN-ELISA 法により TNF-α 産生量を測定した。この LPS 刺γ、IL-6、IL-17A が有意に高値または高値傾向を示した

激の 1 時間前にナリンゲニン、HPA（0、50、100 μM）が、TNF-α、IFN-γ、IL-6 はナリンゲニンとナリンギンを培養液中に添加し、TNF-α 産生量への影響を評価しの摂取により低値傾向を示した（図 3）。

た。
3.2. 大腸炎マウスの組織培養法を用いたナリンゲニン結3.
3.1.

による回復作用の解析

果大腸炎マウスの回復におけるナリンゲニンの役割

大腸炎マウスの大腸組織を培養したところ、培養 24の解析

時間後において、正常対照群に比べて、TNF-α、IL-6DSS 投与により、マウスの体重は減少したが、回復期が有意に高値を示し、TJ タンパク質の ZO-1、Occludin、間 8 日目から徐々に増加した（図 1）。回復期間 11 日目

JAM-A、Claudin-3 は有意に低値を示した（図 4）。培養（最終日）において、ナリンギンとナリンゲニンを摂取液中へのナリンゲニンの添加は、TJ タンパク質の発現した群の体重減少率は、DSS 群に比べて高値傾向を示し量にはほとんど影響しなかったが、TNF-α の発現量を2

上皮タイトジャンクション制御に立脚した消化管保護食品の創製

図4

培養したマウス大腸組織のサイトカイン発現量Balb/C マウスに 2％DSS を 6 日間飲水させた後、大腸組織を採取した。組織片をナリンゲニン（0、100、200 μM）を含む培養液で培養後、定量 PCR 法により TNF-α 遺伝子発現量を解析した。数値は、平均値±標準誤差で示した（同一のアルファベ ッ ト を 共 有 し な い 群 間 に 有 意 差 あ り、 ＜0.05、Tukey–Kramer 検定）。

3.4.

マクロファージを用いたナリンゲニンおよび代謝物による TNF-α産生抑制作用の解析

Raw264.7 細 胞 へ の LPS 刺 激 は、TNF-α 産 生 量 を 約500 倍程度上昇させた。HPA 添加は、この TNF-α 上昇にほとんど影響しなかったが、ナリンゲニンは約 3 割程度減少させた（図 6）。
4.

考察

本研究では、ナリンゲニンとナリンギンは、大腸炎によって損傷した上皮 TJ バリア、上昇したサイトカイン
図3

大腸炎マウスの大腸組織サイトカイン発現量を正常状態に戻すことを促進することにより、大腸炎のBalb/C マウスに 2％DSS を 0〜6 日目まで飲水させた後、7〜17日目まで蒸留水を与えた。正常対照群には実験期間を通して蒸留水を与えた。0〜6 日目は、すべてマウスに基本飼料を与えた。7〜17 日目には、それぞれの試験食を与えた。試験期間終了 後 に 大 腸 を 採 取 し、 定 量 PCR 法 に よ り、TNF-α、IL-6、IFN-γ の発現量を解析した。数値は、平均値±標準誤差で示した（同一のアルファベットを共有しない群間に有意差あり、＜0.05、Tukey–Kramer 検定）。

回復を早めたことが提案された。しかしながら、大腸炎
マウスの組織培養法においては、TJ タンパク質へのナリンゲニンの作用はほとんど認められず、TNF-α のみが抑制された。これは、培養時間が 24 時間であり、摂食試験に比べると短時間であったことが原因の 1 つと考えられるが、ナリンゲニンとナリンギンがより速やかにTNF-α 抑制作用を発揮することも示唆された。一方で、摂食されたナリンゲニンやナリンギンは、腸内細菌によ減少させる傾向を示した。

る代謝を受け、種々の代謝物に変換されることが知られ
3.3.

マウス大腸内のナリンゲニン代謝物の解析ている。マウスの大腸内に HPA が高濃度で検出された

ナリンゲニンとナリンギンを摂取させたマウスの大腸ため、Raw264.7 細胞において、ナリンゲニンと HPA の内には、Eriodictyol 以外のいずれの代謝物も検出され

影 響 も 解 析 し た と こ ろ、 ナ リ ン ゲ ニ ン は LSP に よ る

た。なかでも HPA は DSS の飲水に関わらず、高濃度にTNF-α 産生を抑制したが、HPA には作用が認められな蓄積していた（300〜1000 μmol/kg 内容物、図 5）。

かった。新たな消化管保護食品の創成および臨床応用のためには、今後ヒトにおける効果の検証が必要である。

3

鈴

図5

木卓

弥

マウス大腸内容物中のナリンゲニンおよび代謝物の濃度

Balb/C マウスに 2％DSS を 6 日間飲水させた後、大腸内容物組織を採取した。マウスには、ナリンゲニンあるいはナリンギンを含む飼料を与えた。大腸内容物中のナリンゲニン、その代謝物を超高速液体クロマトグラフィー質量分析計により解析した。数値は、平均値±標準誤差で示した（同一のアルファベットを共有しない群間に有意差あり、 ＜0.05、Tukey–Kramer 検定）。

ウスの大腸組織培養では、ナリンゲニンは TJ タンパク質よりも TNF-α 発現量をより明確に調節した。超高速液体クロマトグラフィー質量分析計により、マウス大腸内のナリンゲニン代謝物を解析したところ、ナリンゲニンそのものに加えて、HPA が腸内に多く蓄積することが示された。マウスマクロファージ Raw264.7 細胞をLPS 刺激した炎症モデルでは、HPA はほとんど影響がなかったが、ナリンゲニンが明確に TNF-α 産生を抑制した。以上の結果から、ナリンゲニン類は大腸炎の回復
図6に一定の役割を持ち、その作用機序は上皮 TJ バリア損

マウスマクロファージ Raw264.7 細胞の TNF-α 産生量

傷の回復とマクロファージなどの免疫細胞におけるRaw264.7 細胞を LPS（10 ng/mL）で刺激したのち、6 時間後に培養上清を採取し、ELISA 法にて TNF-α 産生量を測定した。
LPS 刺激の 1 時間前に、培地中にナリンゲニン（0、50、100 μM）を添加した。数値は、平均値±標準誤差で示した（同一のアルファベットを共有しない群間に有意差あり、 ＜0.05、Tukey–Kramer 検定）。

TNF-α 産生抑制が関わることが提案された。また、TJバリアの回復に比べて、TNF-α 抑制作用はより短時間で発揮されることが示された。
謝

5.

要約

辞
本研究を遂行するにあたり、公益財団法人三島海雲記念財団による研究助成を賜りました。同財団関係者の皆本研究は、大腸炎時の上皮バリア損傷と炎症の回復に様に深く感謝の意を表します。

おけるナリンゲニン類の役割を探索することを目的とした。大腸炎マウスの回復期にナリンゲニン、ナリンギン

文を摂取させたところ、体重と大腸長の回復が認められ、これらナリゲニン類は大腸炎の回復を早めることが示唆

献1） S. Noda, et al.:
2013.
2） S. Noda, et al.:2012.
3） T. Azuma, et al.:

された。このとき TJ タンパク質の Claudin-3 と JAM-Aの回復、TNF-α や IL-6 の抑制も認められた。大腸炎マ4, 57, 2019–2028,, 60, 4628–4633,, 143, 827–834, 2013.