【論文】

酸味の強い大分県産酵母の解析― 醸造した清酒の味認識装置による分析およびゲノム解析 ―

【要陶山

明子１）

野田涼風１）

岡本啓湖２）

麻生益直３）

旨】
大分県産酵母 KET００２ 株を用いた清酒の品質向上を目的として、大分県産酵母の性質の改良を行っている。味認識装置を用いた分析により KET００２ 株を使用した清酒はきょうかい酵母９０１号を用いた清酒より酸味が著しく高く旨味は低いことが明らかになった。次に KET００２ 株の酸味産生に関与する遺伝子の同定を目的とし全ゲノムリシーケンス解析を行い、TCA サイクル関連遺伝子、糖トランスポーター、GID（glucose induced degradation deficient）複合体構成遺伝子を候補として選抜した。

【キーワード】大分県産酵母

緒

味認識装置

有機酸

全ゲノム解析

GID 複合体言

大分県産酵母 KET００２ 株は、大分県酒造協同組合と別府大学との共同研究により大分県内の酒造会社の酒粕から分離した酵母である１，２）。KET００２ 株を使用した清酒の成分をきょうかい酵母９号のものと比較すると酸度が強く、アミノ酸度が少なく、グルコース濃度は更に少なく、官能試験の総合評価はきょうかい酵母より低い結果であった３，４）。そこで本研究室では大分県産酵
母を用いた清酒の品質向上を目的として、大分県産酵母の性質の改良を行っている。
近年、次世代シーケンサー装置の性能向上とともに安価かつ短時間で全ゲノムシーケンスが可能となっている。きょうかい酵母７号の全ゲノム解析５）を皮切りに醸造用酵母の解析が進んでいる６）。
本研究では、KET００２ 株を用いた清酒について味認識装置による分析を実施して味を数値化し、きょうかい酵母を使用した清酒と比較した。その結果、酸味が著しく高いことが明らかになったことから、KET００２ 株による強い酸味の産生に関与する遺伝子の同定を目的として、きょうかい酵母７号をリファレンス配列とした KET００２ 株の全ゲノム解析を行った。

１）

別府大学食物栄養科学部発酵食品学科、２）福岡女子短期大学、３）大分県酒造協同組合

１０１

実験方法
１．供試菌株大分県産酵母 KET００２ 株およびきょうかい酵母９０１号（K９０１株）を使用した。
２．培地および培養条件
酵母は YPD 培地（２％D-グルコース、２％Polypeptone、１％Yeast Extract）を用いて２６℃で振とう培養（１８０ min−１）、または YPD 寒天培地（YPD 培地、３％寒天）で２６℃で培養した。
３．清酒小仕込み試験
３段仕込みにより清酒を醸造した。添仕込として蒸米３５ g、麹米１５ g、水５０ mL、酵母（７×１０８cells）を加え撹拌した。１５℃で１２時間静置した後、均一に攪拌し、そのまま１日置いた（踊り）。仲仕込みとして蒸米６０ g、麹米１５ g、水１００ mL を加え、均一に攪拌した後、１８時間静置し、再度均一に攪拌した。留仕込として蒸米１００ g、麹米２５ g、水１７５ mL を加え、均一に攪拌した後、１５℃で２１日間発酵させた。発酵終了後、もろみを遠心分離（８,５９０×g 、１５分）し、得られた上清をろ過したろ液を清酒とした。
４．官能検査本学学生（２１〜２２歳）６名（女子２名、男子４名）を対象に実施した。清酒をブラインドで供し、評価用紙に自己記入する方法で回答を得た。評価項目は、印象、甘辛、濃淡、総合とし、次のような段階評価とした。
印象：

快い

中庸

不快

甘辛：

薄辛

辛口

中庸

甘口

甘難

濃淡：

薄い

淡麗

中庸

濃醇

諄い総合：

優良

良好

中庸難

また、味の印象について自由記述で回答を得た。
５．味認識装置による分析
測定には味認識装置 SA４０２B（インテリジェントセンサーテクノロジー）を用いた。基準液（３０mM 塩化カリウム、０．
３ mM 酒石酸）の３倍希釈液を用いて、２倍希釈した清酒を試料とした。
６．全ゲノムシーケンス
酵母のゲノムは Gen とるくん （酵母用）High Recovery（タカラバイオ）を使用して抽出した。全ゲノムリシーケンスは、ジーンウィズ社に依頼した。
次世代シーケンシングライブラリーの調製は、各サンプルについて、１００ ng のゲノム DNAを超音波処理（Covaris S２２０）によりランダムに５００ bp 以下に断片化した。フラグメントは、エンドプレップ酵素ミックスで処理し、１回の反応で５ リン酸化および dA テーリング、続いて両端へのアダプター付加を行った。VAHTS DNA クリーンビーズを使用し、〜４７０ bp のフラグメント（おおよそのインサートサイズは３５０ bp）を回収した。次に、P５および P７プライマーを使用して、各サンプルを PCR で増幅した。シーケンスは、２×１５０ペアエンド（PE）構成を使用して illumina HiSeq/NovaSeq を用いて実施した。

１０２

酸味の強い大分県産酵母の解析― 醸造した清酒の味認識装置による分析およびゲノム解析 ―データ解析は以下のソフトを使用した。Cutadapt（V１．
９．
１）を使用してアダプターのシーケンス、PCR プライマー、塩基配列不明（N）が１０％を超えるリード、およびクオリティ２０未満の塩基データを削除した。BWA（V０．
７．
１７）を使用して、クリーンなデータをリファレンスゲノ
ムにマッピングした。マッピング結果は重複を削除するために Picard（V１．
１１９）で処理した。
GATK（V３．
８．
１）ソフトウェアを使用して SNV/InDel を検出した。SNV/InDel のアノテーショ
ンは Annovar（V２１ Apr２０１８）により実施した。Breakdancer と CNVnator を使用してゲノム構造変異分析を行った。

実験結果および考察
１．KET００２ 株およびきょうかい酵母９０１号を用いた清酒の呈味の比較（１）官能試験
先行研究３，４）における官能試験の評価項目は、外見、香り、味、商品化の可能性、総合評価であった。本研究では味認識装置の分析結果との比較のため、味に関する評価項目を印象、甘辛、濃淡の３種類に増やして設定し官能試験を実施した。６名のパネラーによる KET００２ 株および
K９０１株を用いた清酒の官能試験結果を図１に示す。清酒の印象について、K９０１株は中庸が、KET００２ 株は不快が最も多かった。また K９０１株について甘辛は中庸〜薄辛（水っぽい）であり、パネラー全員が淡麗と評価した。KET００２ 株について甘辛と濃淡はパネラーによるばらつきが大きかったが辛口、中庸から濃醇との評価が最も多かった。総合評価は両者とも中庸の評価が最も多かったが、K９０１株は良好２名、難０名であるのに対して KET００２ 株は良好１名、難２名であり、K９０１株の方が高い評価となった。自由記述では K９０１株はなめらか、後味が良い、上品（各１名）、KET００２ 株は酸っぱい（３名）、辛い（１名）という回答であった。以上の結果から、KET００２ 株を用いた清酒は味の酸っぱさが不快な印象を引き起こしていることが考えられる。

図１ KET００２株および K９０１株を用いた清酒の官能試験結果

１０３

（２）味認識装置による分析
味認識装置による清酒の分析結果を図２に示す。KET００２ 株は K９０１株より著しく強い酸味を示し、この結果は官能試験結果において酸っぱい、辛いと評価したパネラーが多い（６７％）ことと一致した。
塩味については、清酒では有機酸塩による「濃醇感」の評価に活用できる可能性が報告されている７）。KET００２ 株の方が若干高い数値を示すため濃醇感が高いと考えられ、官能試験結果と一致した。
旨味については KET００２ 株の方が低く、旨味コクについてもわずかに低かった。
苦味雑味、渋味刺激、塩味、苦味、渋味についてはほとんど差がなかった。

図２ 味認識装置による清酒の分析結果

味認識装置では、酸味はクエン酸や酒石酸が呈する酸味を測定し、旨味はアミノ酸、核酸などが呈する旨味を測定していることから、KET００２ 株は有機酸産生量が K９０１株より著しく多く、アミノ酸、核酸などの旨味成分の生産が少ないと考えられる。KET００２ 株を用いた試醸清酒の成分分析を行った先行研究では、きょうかい９号（K９株）を用いた試醸清酒と比較すると KET００２ 株のコハク酸濃度は１．
６倍、アミノ酸度は０．
９３倍であった４）ことから、味認識装置の分析結果は成分分析結果とも一致していることが示唆された。
２．KET００２ 株のゲノム解析
KET００２ 株による強い酸味の産生に関与する遺伝子の同定を目的として、きょうかい酵母７号をリファレンス配列とした KET００２ 株の全ゲノムリシーケンス解析を行った。illumina HiSeq
シーケンスシステムにより、平均リード長１４９.２bp、リード数１６,４１２,３０６を得、推定ゲノム全長の９９.８３％をカバーした。
SNP（一塩基多型）と Indel（塩基の挿入または欠損による遺伝的変異）は全ゲノムの２,９１５ヶ所であり、表１にそれらの突然変異分布を示す。

１０４

酸味の強い大分県産酵母の解析― 醸造した清酒の味認識装置による分析およびゲノム解析 ―表１ KET００２ 株の SNP および Indel 突然変異分布※１：１kb upstream of one gene while１kb downstream of another gene
※２：５ UTR region of one gene while３ UTR region of other gene

Categories

Number of mutation sites

exon region

１,６０６

intergenic region

２１１intron area

２０splicing site

０exon region, splicing site

０ncRNA exon region

０ncRNA intron region

０ncRNA splicing site

０3ʼ UTR region of ncRNA

０5ʼ UTR region of ncRNA

０1 kb upstream of the gene４６９1 kb downstream of the gene２３７upstream ; downstream※１３７２3ʼ UTR region of gene０5ʼ UTR region of gene

０UTR5 ; UTR3※２０Total number of mutation sites

２,９１５

エキソン領域の SNP は変異部位による機能変化に応じて、アミノ酸が置換する変異（非同義変異、non-synonymous mutation）、アミノ酸が置換しない変異（同義変異 synonymous mutation）、ストップコドンが生じる変異（stop gain mutation）、ストップコドンを失う変異（stop lossmutation）に分類できる。KET００２ 株の SNP は２,６１７ヶ所であり、そのうちエキソン領域は１,５３８ヶ所であった。SNP 型の分類を表２に示す。
表２ KET００２ 株の SNP 型の分類

Type of SNP

non-synonymoussynonymousstop gainstop loss

Number ofmutation sites

７１３８１３１０２

同様にエキソン領域の Indel はフレームシフト（frame shift）変異の有無によって non-frame
shift deletion、frame shift deletion、non-frame shift insertion、frame shift insertion に分類できる。KET００２ 株の Indel は２９８ヶ所であり、そのうちエキソン領域は６８ヶ所であった。Indel 型の分類を表３に示す。
表３ KET００２ 株の Indel 型の分類

Type of Indelnon- frame shiftdeletion

frame shiftdeletionnon-frame shift
insertionframe shift
insertion

Number ofmutation sites

１９２６３２０１０５次に KET００２ 株において有機酸生成に影響を及ぼす遺伝子の探索を試みた。タンパク質のアミノ酸配列に変異が生じるnon-synonymous mutation、stop gain mutation、stop loss mutation、frame shift deletion、frame shift insertion は全ゲノム中に７７１ヶ所存在しており、これらの中に有機酸生成に関与する遺伝子が含まれているか解析した。
解糖系関連遺伝子（ HXK１、PGI１、PFK１、TDH１、PGK１、GPM１、ENO１、ENO２、PKY２ ）については SNP または Indel の変異は認められなかった。糖新生関連遺伝子（ FBP１、ICL１、

MDH２、PCK１ ）にも変異は認められなかった。
TCA サイクル関連遺伝子については、クエン酸をイソクエン酸に変換する反応を触媒する酵
素アコニターゼをコードしている ACO２ 、フマル酸をリンゴ酸に変換する反応を触媒する酵素フマラーゼをコードしている FUM１ に SNP が存在した。KET００２ 株は２倍体であるため、２本の染色体の両方に変異をもつホモ接合型変異と、片方のみ変異を持つヘテロ接合型変異がある。
ACO２ はホモ接合型変異であり、 FUM１ はヘテロ接合型変異であった。
糖トランスポーター関連遺伝子については HXT６ に３ヶ所、 HXT４ に２ヶ所、 HXT５ に１ヶ所の SNP（すべてヘテロ接合型変異）が存在し、 HXT７ には frame shift insertion（ホモ接合型変異）が存在した。アミノ酸合成経路では、トリプトファン合成に関与する TRP５ （ヘテロ接合型変異）やロイシン合成に関与する LEU２ （ホモ接合型変異）に SNP が存在した。
GID（glucose induced degradation deficient）
複合体の構成要素であるVID２４変異株（Gly１３１Arg）と VID２８ 破壊株はリンゴ酸高生産となる報告８）があるため、GID 複合体を構成する遺伝子群（ VID２４、VID３０／GID１、RMD５／GID２、VID２８／GID５、GID７、GID８、FYV１０／GID９ ）について変異の有無を調べた。その結果、 VID２８ に SNP（ヘテロ接合型変異）が存在したため、 VID２８の SNP が KET００２ 株の酸味の強さに寄与している可能性が示唆された。

まとめ
大分県産酵母 KET００２ 株を用いた清酒は、きょうかい酵母を用いた清酒より官能試験の評価が低かった。そこで味認識装置による分析を行い味覚を数値化して、それぞれの清酒の味を解析した。その結果、KET００２ 株を用いた清酒は K９０１株のものより、酸味が著しく高く、旨味が低いことが明らかになった。その他の味覚項目にはほとんど違いが認められなかったため、総合評価が低い要因は酸味と旨味であることが示唆された。旨味が低いため、味の印象として「酸っぱい」ことしか残らないと推察される。酸味が強いことは KET００２ 株の大きな特徴であるため、その性質は活かしつつ消費者が不快感を持たない程度に酸味を抑え、さらに旨味を増やすよう菌株の改良を行い、大分県産酵母の品質改良を目指す。
次に KET００２ 株による強い酸味の産生に関与する遺伝子の同定を目的として、全ゲノム解析を行った。アコニターゼをコードしている ACO２ 、フマラーゼをコードしている FUM１ 、糖トランスポーターである HXT６、HXT４、HXT５、HXT７ 、トリプトファン合成に関与する TRP５ 、ロイシン合成に関与する LEU２ 、GID複合体の構成要素である VID２８ に変異が存在した。今後、これらの遺伝子破壊株を作成し酸生成量を解析することで遺伝子の同定を行い、KET００２ 株の改良に役立てていく。

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酸味の強い大分県産酵母の解析― 醸造した清酒の味認識装置による分析およびゲノム解析 ―参考文献
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２．木村

奬：酒粕由来 DC 染色性分離菌株を用いた１５℃での清酒醸造に関する研究、２０１４年度別府大学卒業論文

３．小野

KET００２）の小仕込み製造清酒の清酒酵母協会９号との品質及浩輝：大分県酒造組合選抜酵母（ハ―４，び特性比較、２０１６年度別府大学卒業論文
４．藤原

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７．
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６．赤尾，
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７．豊田健太郎ら：味覚センサーを用いた清酒の後味評価、 J. Brew. Soc. Japan. ，
８．根來

，
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