医療保健学研究短８号：19-25頁（2017）
ISSN 2185-2227

報

生後発達に伴うマウス小脳皮質の外顆粒層の消長と１型ヒストン脱アセチル化酵素免疫陽性反応の変化
松嶋美正1，漆畑俊哉1，澤田和彦21

つくば国際大学医療保健学部理学療法学科
2

保健栄養学科────────────────────────────────────────────
【要 旨】生後４〜21日齢のマウス小脳の外顆粒層の消長と１型ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC1)の発現動態について免疫組織化学的に検討した。小脳皮質において増殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞からなる外層と、神経細胞核抗原(NeuN)陽性細胞からなる内層で構成される外顆粒層は、生後14日齢まで観察された。外顆粒層では分裂細胞は外層の PCNA 陽性細胞にみられ、その頻度は４日齢で高く、齢とともに減少した。生後14日齢では外顆粒層の外層および内層はともに薄くなり、分裂細胞は観察されなくなった。HDAC1 陽性反応は、生後４〜10日は外顆粒層の外層および内層でみられ、生後７日齢以降は NeuN 陽性内顆粒細胞でも観察された。以上の結果から、エピジェネテ
ィクス制御に関与する HDAC1 は、発生中の小脳では増殖・分化過程の外顆粒細胞で発現され、外顆粒層消失後は皮質神経細胞で発現されることが明らかになった。
キーワード：エピジェネティクス，HDAC，小脳，免疫組織化学────────────────────────────────────────────
序論

能への関与が注目されている(Noroozian,2014)。これら神経発達障害では障害の重症度

小脳は姿勢維持、平衡覚調節、筋の協調運動の調節など、感覚と運動機能を統合する働きをにもよるが、療育が認知機能の回復に一定の効果があると考えられている。

もつ(Altman and Bayer, 1997)。近年では、自エピジェネティクスとは、DNA のメチル化閉症や統合失調症といった神経発達障害においやヒストンのアセチル化など DNA 塩基配列のて小脳の形態的･機能的異常が報告されており変化を伴わない遺伝子転写調節が細胞の世代を(Kulynych et al., 1997; Vogeley et al., 2000;

超えて受け継がれることをいう。小脳形態形成

Levitt et al., 2003; Sallet et al., 2003; Harden etの研究は、自然発生ミュータントや遺伝子改変

al., 2004; Stoodley, 2016)、また、小脳の認知機動物を用いて遺伝因子からその解明を試みる研─────────────────────
連絡責任者：澤田和彦〒300-0051 茨城県土浦市真鍋6-8-33
つくば国際大学医療保健学部保健栄養学科
TEL: 029-883-6032
FAX: 029-826-6776
E-mail: k-sawada@tius-ac.jp

究が主流であったが、近年、DNA メチル化、microRNAs、皮質神経細胞死(Marzban et al.
2015)、sonic hedgehog およびその関連因子の発現動態(Yoo et al. 2013; Tichy et al. 2015)などエピジェネティクスという観点からの研究も進められている。本研究では、小脳皮質の組織20

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構築過程における外顆粒細胞の消長とエピジェUK)、神経細胞マーカー抗体であるウサギ抗神ネティクス制御に関わる１型ヒストン脱アセチ

経細胞核抗原(NeuN)抗体(ABN78; Millipore)、ル化酵素(HDAC1)の発現動態について免疫組織

マウス抗 HDAC1 抗体(HDAC1-21) (ab12168;

化学的に調べ、小脳皮質を構成する神経細胞のAbcam)を用いた。

分化および皮質形態形成への HDAC1 発現を介したエピジェネティクス機構の関与を明らかにすることを目的とした。

免疫蛍光三重染色────────
免疫染色は、浮遊切片として以下(1)〜(19)の手順で行った。抗原賦活化を除いたすべての材料と方法工程において反応は室温で行った。(1)切片をAntigen Retrieval Reagent UNIVERSAL(R&D動 物───system, Minneapolis, MN, lot #950512)中で湯煎にて90℃で30分間、加熱処理し、抗原を賦活

本実験は、つくば国際大学動物実験委員会で化させた。(2)PBS で３回洗浄した。(3)一次抗実験計画の承認後に実施した。生後４<7<10<14<体漓を添加し、一晩インキュベートした。

21日齢の雄マウス(各２例)を日本エスエルシー(4)PBS で３回洗浄した。(5)二次抗体漓を添加株式会社(静岡)から購入した。動物に過剰容量し、２時間インキュベートした。(6)PBS で３(400µg/g体重)の抱水クロラール(和光純薬工業,回洗浄した。(7)蛍光標識 streptavidin 液漓を大阪)を腹腔内投与し、４%パラホルムアルデ添加し、１時間インキュベートした。(8)PBSヒド溶液(pH 7.4)で経心性に灌流固定した。小で３回洗浄した。(9)Avidin 液(1:50)(Vector

脳を取り出し、同固定液で２日以上浸漬固定しLabs., Inc., Burlingame, CA)を添加し、１時間た。

インキュベートした。(10)PBS で３回洗浄した。(11)一次抗体滷を添加し、一晩インキュベ

組織切片の作製───────ートした。(12)PBS で３回洗浄した。(13)二次抗体滷を添加し、２時間インキュベートした。

小脳を30％スクロース／リン酸緩衝食塩水(14)PBS で ３ 回 洗 浄 し た 。(15)蛍 光 標 識(PBS)溶液に一晩浸した後、超低温槽中−70℃

streptavidin 液滷を添加し、１時間インキュベ下でOCTコンパウンド(サクラファインテック･ートした。(16)PBS で３回洗浄した。(17)切片ジャパン、東京)に包埋した。40µm厚の前頭断を APS コートスライドグラス(FF-801; 松浪硝

凍結切片を冷エレクトロフリーズ(MC-802A, ；子工業, 大阪)に載せて乾燥させ、貼り付けた。

大和光機工業, 埼玉)を装備したリトラトーム(18)スライドグラスを PBS に２分間浸した。

(REM-700；大和光機)を用いて作製した。

(19)グリセリン(和光純薬)を封入剤として切片をカバーガラスで封入した。

一次抗体
────

免疫染色は、PH3/PCNA/NeuN とHDAC1/PCNA/NeuN の２種類の蛍光三重染色を行っ一次抗体は、小脳外顆粒細胞マーカー抗体でた。PH3/PCNA/NeuN 三重染色では、一次抗あるマウス抗増殖細胞核抗原(Proliferating cell体漓として抗 Neu N抗体(1:1,000)を、一次抗nuclear antigen; PCNA)抗体(MAB424R;体滷として抗 PCNA 抗体(1:1:000)と抗 PH3 抗

Millipore，Billerica, CA, USA)、分裂M期細胞体(1:1,000)の混合液を使用した。二次抗体漓とマーカー抗体であるラット抗phospho-Histone

してビオチン標識抗ウサギ IgG (1:200)(BA-H3 (PH3)抗体(ab10543; Abcam, Cambridge,1000; Vector Labs)を、二次抗体滷としてビオ松嶋美正 他／医療保健学研究８号：19-25頁（2017）21

チン標識抗ラット IgG (1:200)(BA-4000;(S-2000; フナコシ, 東京)/0.1% Triton X-100

Vector Labs)と Alexa 488(緑色蛍光色素)標識(Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA)/抗 マ ウ ス IgG(1:500)(A21202; MolecularPBS 溶液を、一次抗体滷の希釈には Biotin 液

Probes, Eugene, OR, USA)の混合液を使用し(1:50)(Vector Labs)/PBS 溶液をそれぞれ用いた。また、蛍光標識 streptavidin 液漓(抗 NeuNた。また、二次抗体漓と滷、Texas red および抗体を可視化)には、Texas Red(赤色蛍光色素)

AMCA 標識 streptavidin の希釈には、PBS を標識 streptavidin 液(1:100)(Vector Labs)を、用いた。

蛍光標識 streptavidin 液滷(抗 PH3 抗体を可視蛍光染色された切片で、小脳半球の皮質を蛍化)には、AMCA(青色蛍光色素)標識 streptavidin

光顕微鏡(Axio imager A1; Zeiss, Gottingen,液(1:100)(Vector Labs)を用いた。

Germany)を用いて観察し、蛍光画像を取得した。

HDAC1/PCNA/NeuN 三重染色では、一次抗体漓として抗 HDAC1 抗体(1:1,000)を、一次抗体滷として抗 PCNA 抗体(1:1:000)と抗 NeuN結果抗体(1:1,000)の混合液を使用した。二次抗体漓
としてビオチン標識抗マウス IgG(1:200)(BA1000; Vector Labs)を、二次抗体滷としてビオPH3/PCNA/NeuN 免疫蛍光三重染色────────────────────

チン標識抗ウサギ IgG (1:200)(BA-9200;

染色は両側の小脳半球で行い、その結果は左Vector Labs)と Alexa 488 標識抗マウス IgG

右で差がなかった。また、使用した各齢２例の(1:500)の混合液を使用した。また、蛍光標識マウスにおいて同等の結果(再現性)が得られた。

streptavidin 液漓(抗 HDAC1 抗体を可視化)

生後４日齢のマウスでは、小脳半球の外顆粒層には、Texas Red 標識 streptavidin 液(1:100)

は、外層2/3が PCNA 免疫陽性を、内層1/3が(Vector Labs)を、蛍光標識 streptavidin 液滷

NeuN 免疫陽性を示した(図１A)。分裂M期細(抗 NeuN 抗体を可視化)には、AMCA 標識胞マーカーである PH3 に対する免疫陽性反応streptavidin 液(1:100)(Vector Labs)を用いた。

は、外顆粒層外層の PCNA 陽性細胞でみられた一次抗体漓の希釈には、10%正常馬血清(NHS)

ほか、内顆粒層では中大型の NeuN 陰性細図１．生後４〜21日齢マウスの小脳半球の PH3/PCNA/NeuN 免疫蛍光三重染色。
oE, 外顆粒層外層；iE, 外顆粒層内層；M, 分子層；IG, 内顆粒層
（カラーの図は、http://www.ktt.ac.jp/tiu/hs-study/posted-images/hsstudy8-1.jpg からダウンロードして下さい。）

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胞でも観察された(図１A)。外顆粒層の外層察されなくなった(図2B-D)。また、７日齢に(PCNA 陽性)および内層(NeuN 陽性)の厚さはは、内顆粒層の一部の NeuN 陽性内顆粒細胞で10日齢までほぼ同じであったが(図１B,C)、外弱い HDAC1 陽性が出現した(図２B)。その後、層中の分裂細胞(PH3 陽性)の頻度は齢とともにNeuN 陽性内顆粒細胞での HDAC1 陽性は齢と少なくなった(図１B,C)。また、内顆粒層ではともに強くなり、21日齢ではほとんどの NeuN

NeuN 陽性内顆粒細胞の数が21日齢まで齢とと陽性内顆粒細胞が強い HDAC1 陽性を呈するよもに増加したが(図１B-E)、NeuN 陰性細胞のうになった(図２E)。

分裂(PH3 陽性)は７日齢まで観察され(図１B)、10日齢以降ではみられなくなった(図１C-E)。
14日齢では、外顆粒層は PCNA 陽性の外層と考察

NeuN 陽性の内層から成るものの、その厚さは劇的に薄くなり、外層では分裂細胞(PH3 陽性)発生中の小脳では、皮質の最外層に外顆粒層もみられなくなった(図１D)。さらに21日齢でが一時的に出現し、皮質の内顆粒層を形成するは、外顆粒層は完全に消失した(図１E)。

神経細胞(内顆粒細胞)の供給源になっている(Fujita et al., 1966; Altman, 1969, 1972)。外顆HDAC1/PCNA/NeuN 免疫蛍光三重染色───────────────────────

粒層はさらに神経前駆細胞からなる外層と分化中の遊走前神経細胞からなる内層に分けられる

染色は両側の小脳半球で行い、その結果は左(Tanaka and Marunouchi, 1998)。本研究では、右で差がなかった。また、使用した各齢２例の外顆粒層の外層を抗 PCNA 抗体によって、内層マウスにおいて同等の結果(再現性)が得られた。

を抗 NeuN 抗体によって標識することで小脳皮生後４日齢の小脳半球の皮質では、HDAC1 免質の外顆粒細胞の消長を免疫組織化学的に明ら

疫陽性は、外顆粒層の外層(PCNA 陽性)およびかにした。外顆粒層外層の PCNA 陽性神経前駆内層(NeuN 陽性)の両方でみられた(図２A)。

細胞の分裂は、生後10日齢を境にみられなくな外顆粒層の外層および内層における HDAC1 陽り、同時に外顆粒層の厚さも劇的に薄くなった。

性は、外顆粒層が急激に薄くなる14日齢では観マウス小脳では、外顆粒層神経前駆細胞のアポ

図２．生後４〜21日齢マウスの小脳半球の HDAC1/PCNA/NeuN 免疫蛍光三重染色。
oE, 外顆粒層外層；iE, 外顆粒層内層；M, 分子層；IG, 内顆粒層
（カラーの図は、http://www.ktt.ac.jp/tiu/hs-study/posted-images/hsstudy8-2.jpg からダウンロードして下さい。）

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トーシスの頻度が生後９日齢に最も高いことか

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参考文献

ら(Tanaka and Marunouchi, 1998)、本研究における10日齢以降の外顆粒層の急激な消失は、

Altman J (1969) Autoradiographic and histological外顆粒層を構成する神経前駆細胞の分化･遊走だ

studies of postnatal neurogenesis. III. Dating the

けでなく、自身のプログラム細胞死も関与してtime of production and onset of differentiationいることが示唆された。

of cerebellar microneurons in rats. J Comp Neurol

Yoo et al. (2013) は、生後10日齢のマウス小136: 269-294.

脳の外顆粒層においてにエピジェネティクス制

Altman J (1972) Postnatal development of the cerebellar

御因子である HDAC1 の強い免疫陽性反応を観

cortex in the rat. I. The external germinal layer

察した。本研究では、発生中の小脳においてand the transitional molecular layer. J CompHDAC1 発現が生後４〜10日齢の外顆粒層の外Neurol 145: 353-397.

層および内層の両方でみられることを免疫組織

Altman J, Bayer SA (1997) Basic cellular organization

化学的に明らかにした。この様に外顆粒細胞のand circuitary of the cerebellar cortex. In: J.

増殖･遊走および細胞死が盛んな齢で HDAC1 発

Altman, & S. A. Bayer (Eds), Development of

現がみられたことは、HDAC1 が外顆粒層の維

the cerebellar system (pp. 26-43). Boca Raton,持と消失の両方に関与している可能性を示してUSA: CRC press.

いる。HDAC1 は、HDAC3 との共発現で神経Bardai FH, Price V, Zaayman M, Wang L, D’Mello

細胞死を誘導し、HDAC9 との共発現で神経細SR (2012) Histone deacetylase-1 (HDAC1) is a胞の生存を維持させる(Bardai et al., 2012)。今molecular switch between neuronal survival

後は、外顆粒層消長の分子メカニズムを明らか

and death. J Biol Chem 287: 35444-35453.にするために、外顆粒層における HDAC3 や

Fujita S, Shimada M, Nakamura T (1966) 3H-Thymidine

HDAC9 の発現や、外顆粒細胞のアポトーシス

autoradiographic studies on the cell proliferationについても調べる必要がある。

and differentiation in the external and the

本研究では、発生中の小脳皮質において外顆粒層の神経前駆細胞の増殖制御にエピジェネテ

internal granular layer of the mouse cerebellum.
J Comp Neurol 128 191-208.

ィクス因子である HDAC1 が関与している可能Harden AY, Jou RJ, Keshavan MS, Varma R, Minshew性が示された。このようなエピジェネティクス

NJ (2004) Increased frontal cortical folding in機構の小脳発生への関与は、近年注目されていautism: a precliminary MRI study. Psychiatry

る小脳の形態的･機能的な異常が関与する神経発Res 131: 263-268.

達障害について，細胞発生レベルでの解明を可Kulynych JJ, Luevano LF, Jones DW, Weinberger DR能にする。本研究結果は、神経発達障害の成因(1997) Cortical abnormality in schizophrenia:

解明だけでなく、療育を含め外的環境要因によan in vivo application of the gyrification index.

る刺激の有効性を細胞発生レベルで示すことにBiol Psychiatry 41: 995-999.

なり、障害の種類や重症度に合った適切な療育

Levitt JG, Blanton RE, Smalley S, Thompson PM,法の開発や創薬に繋がる可能性を秘めている。

Guthrie D, McCracken JT, Sadoun T, Heinichen
L, Toga, A. W. (2003). Cortical sulcal maps inautism. Cerebral Cortex 13: 728-735.

謝辞Marzban H, Del Bigio MR, Alizadeh J, Ghavami S,
Zachariah RM, Rastegar M (2015) Cellular

本研究は、平成27年度つくば国際大学共同研究費の助成により行われた。

commitment in the developing cerebellum.
Front Cell Neurosci 8:450.

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Noroozian M (2014) The role of the cerebellum incognition: beyond coordination in the central

８号：19-25頁（2017）85-88.
Tichy J, Zinke J, Bunz B, Meyermann R, Harter PN,nervous system. Neurol Clin 32: 1081-104.

Mittelbronn M (2015) Expression profile of sonicSallet PC, Elkis H, Alves TM, Oliveira JR, Sassi E,

hedgehog pathway members in the developing

de Castro CC, Busatto GF, Gattaz WF (2003).

human fetal brain. Biomed Res Int. 2015: 494269.

Reducedcortical folding in schizophrenia: anVogeley K, Schneider-Axmann T, Pfeiffer U, Tepest

MRI morphometric study. Am J Psychiatry 160:R, Bayer TA, Bogerts B, Honer WG, Falkai P

1606-1613.

(2000). Disturbed gyrification of the prefrontal

Stoodley C (2016) The cerebellum and neurodevelopmental disorders. Cerebellum 15: 34-37.
Tanaka M, Marunouchi T (1998) Immunohistochemical

region in male schizophrenic patients: a morphometric postmortem study. Am J Psychiatry 157:
34-39.

analysis of developmental stage of external

Yoo JY, Larouche M, Goldowitz D (2013) The expression

granular layer neurons which undergo apoptosisof HDAC1 and HDAC2 during cerebellar corticalin postnatal rat cerebellum. Neurosci Lett 242:

development. Cerebellum 12: 534-546.

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Short Communication

Ontogenetic trajectories of external granular layer and expressionof histone deacetylase 1 immunoreactivity
in the mouse cerebellar cortex
Yoshimasa Matsushima1, Toshiya Urushihata1, Kazuhiko Sawada2
12

Department of Physical Therapy

Department of Nutrition, Faculty of Medical and Health Sciences, Tsukuba International University

Abstract
The present study examined immunohistochemically changes in laminar aspects and histone deacetylase 1(HDAC1) expression in the mouse cerebellar cortex during postnatal days (PDs) 4 to 21. The external
granular layer (EGL) was divided into two substrata during PDs 4 to 10: outer substratum defined byproliferating nuclear antigen (PCNA) immunostaining; and inner substratum defined by NeuN
immunostaining. Phospho-Histone H3-immunoreactive mitotic calls were observed in the PCNAimmunopositive EGL outer substratum. They were most frequent at PD 4, declined gradually with postnatal
ages, and then disappeared by PD 14 by drastically thinning of both outer and inner substratum. HDAC1
immunostaining appeared in both outer and inner substrata of the EGL during PDs 4 to 10, and was also
found in NeuN-immunopositive neurons in the internal granular layer at PD 7 and thereafter. The present
results suggest that HDAC1, which is known to be involved in epigenetic regulation, is expressed inproliferating and differentiating EGL cells and also in differentiated cerebellar cortical neurons following thedisappearance of the EGL.
Keywords: epigenesis, HDAC, cerebellum, immunohistochemistry