先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発
大阪大学微生物病研究所

村上良子

Inherited GPI deficiency (IGD) is caused by the mutations of the genes involved in the GPI biosynthesis. There are atleast 150 kinds of GPI anchored protein in the mammalian cell, and they play various important roles, such as neurologicaldevelopment. IGD patients are often suffered from developmental delay and interactable seizures and in severe cases, someof them have ichthyosis. In the skin specific Piga KO mice, secretion of glucosylceramide (GlcCer), packed into the lamellar
bodies of keratinocytes was impaired, leading to disruption of skin barrier function, which caused the early neonatal death.
PIGA is the catalytic component of the GPI-N-acetylglucosaminyltransferase, the first step enzyme of GPI biosynthesis. Thisphenotype is similar to ABCA12 KO mouse model, in which GlcCer could not be packed into the lamellar body, leading to
the defect in secretion of GlcCer. To elucidate the mechanism of the defect in the secretion of GlcCer in the Piga KO model,
we made the PIGA knockout and its PIGA rescued HaCaT cell, a human keratinocyte cell line. We also made the ABCA12KO cell to compare the phenotypes. Anti-GlcCer antibody could not show the clear localization in the either cell, howeveranti-ceramide antibody showed difference in the localization of ceramide between in Piga KO and its rescued cells and moreclearly in ABCA12 KO cells. According to these evidences, we will further investigate the pathogenic mechanism of ichthyosis in PIGA deficiency and develop its treatment using synthesized GlcNAcPI, the first step product.

1．緒

皮膚における GPI アンカーの役割を調べるために、K 5 -言Cre マウスと Pigafloxed マウスを交配することにより表皮哺乳細胞では GPI（glycosylphosphatidylinositol）という特異的な Piga ノックアウト（KO）マウスを作製した。完全糖脂質で細胞膜につながれている GPI アンカー型タンパク欠損となるオスのマウスは乾燥した皺の多い皮膚を呈し、質（GPI-AP）が約 150 種知られており、酵素や受容体、接生後数日で死亡した。表皮のバリア機能の消失によって水着因子、補体制御因子など受精、個体発生、神経発達、免分保持能が低下し、角質細胞の水和が阻害されて古い角質疫機能などにおいて重要な働きをしている。GPI-AP は小層がはがれないため、角質が著しく肥厚していた 4）。その胞体（ER）でタンパク質部分と GPI が別々に合成され、完後の解析により角質細胞内に形成される層板顆粒成した GPI が GPI 付加シグナルを持つ前駆タンパク質のカ（lamellar body）の異常や分泌される lamellar body の消失

ルボキシル末端に付加される。その後も小胞体とゴルジ体など GPI-AP が、表皮の正常な分化に必須であることが明で修飾を受け、細胞膜のコレステロールに富む領域に運ば

ら か に な っ た 5）。 こ の 症 状 は、 重 篤 な 皮 膚 疾 患 で あ るれる。このような GPI-AP の生合成と修飾に 30 個の遺伝

Harlequin-type ichthyosis の病態に極めて類似している。

1）子が関与している 。先天性 GPI 欠損症（IGD）は近年見つ

この疾患は脂質のlamellar bodyへの輸送に関わるABCA12かった潜性遺伝性疾患で、これらの遺伝子に変異がおこり（ATP Binding Cassette Subfamily A Member）12）遺伝子の重要な機能を担う種々の GPI アンカー型タンパク質（GPI-変異によっておこることが知られている 6）。角質層の直下AP）の細胞膜上の発現低下や構造異常により、精神運動発に あ る 顆 粒 層 に 存 在 す る lamellar body は、TGN（trans

達の遅れ、てんかん、多臓器奇形などを来す

2 , 3）。現在まGolgi network）に由来するとされているが、その内部にグでに海外で約 400 例、国内で約 50 例の報告がある。厚労ルコシルセラミド（GlcCer）やスフィンゴミエリンを取り省難治性疾患の研究班により診療ガイドラインを作成し、込み、角層と顆粒層の界面に放出する。放出されたグルコ

2017 年より指定難病に認定され、2018 年より小児慢性特シルセラミド、スフィンゴミエリンは，酸性型の β- グル定疾病となっている。

コセレブロシダーゼとスフィンゴミエリナーゼによりそれ

本研究では重症例でしばしば見られる魚鱗癬様の皮膚病

ぞれ加水分解を受け、セラミドに変換される。生成したセ3）

ラミドは脂肪酸やコレステロールとラメラ構造体を作り、変 の病態解析と治療法の開発を目的とした。以前我々は、表皮透過バリアを形成する 7）。これらの脂質の合成と分泌過程に GPI-AP が何らかの形で関わっていると考えられ、表皮における GPI-AP の機能の解明が、両疾患の病態解明
Patholog ica l a na lysis of ichthyosis
associate with Inherited GPI deficiencyにつながる可能性がある。

Yoshiko Murakami
Research Institute for Microbial Diseases− 164 −

先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発

2. 方

2. 2.

法

まずヒト表皮角化細胞株である HaCaT 細胞を使って in2. 1.

vitro の実験系を樹立した。Cas 9 と guideRNA を発現する

PIGA は GPI 生合成の最初のステップに関係する X 染色ベクター（px 330 Addgene # 42230）に PIGA 遺伝子のター体上の遺伝子で、その変異により機能が低下すると、すべゲット配列（ACACTCTCTCGGGTTAGCCC）を挿入したての GPI-AP の細胞表面における発現が低下する 1）。ドイプ ラ ス ミ ド を リ ポ フ ェ ク シ ョ ン（lipofectamine 2000 ,ツ の グ ル ー プ と の 共 同 研 究 に よ り PIGA の 産 物 で あ る

Thermo Fisher Scientific）により HaCaT 細胞に導入してGlcNAcPI を合成した（図 1 A）
。PIGA 欠損の HEK 293 細PIGA をノックアウトし、PIGA KO クローン # 11 , 12 を胞を無血清培地に 2 µM の GlcNAcPI を加えた培養液で 24樹立した。フローサイトメトリー解析により、野生株の細時間培養し、フローサイトメトリーにより GPI-AP の発現胞表面に発現する GPI-AP が KO 細胞で欠損していることの回復を解析した。GlcNAcPI は効率よく次のステップのを確認した。さらに KO 細胞に PIGA cDNA をレトロウイ

PIGL の基質として使われ GPI-AP である CD 59 と DAF のルスベクター（pLIB-hyg-FLAG-PIGA）を使って導入し発現が正常の 60 ％まで回復した（図 1 B）8）。フローサイトた後、ハイグロマイシン 200 µg/ml を含む選択培地で培養

メ ト リ ー 解 析 に は mouse anti-human CD 59（5 H 8），

してレスキュー細胞を作製し、正常コントロールとした（図-DAF（IA 10 , Biolegend）と 2 次抗体として Phycoerythrin2）。次に GlcNAcPI の効果を確認するために、2 . 1 . と同conjugated anti-mouse IgG を使用した。

様の方法で培養液中に加えて細胞膜上の GPI-AP の回復を

図1 A

合成GlcNAcPI（18 : 0 , 18 : 1）の構造

図1B PIGAKOのHEK 293細胞を無血清培地に2 µMのGlcNAcPIを加えた培養液で24時間培養後フローサイトメトリーによりGPI-AP（CD 59 , DAF）の発現の回復を解析した。

図2

PIGA KOとPIGAをレスキューしたHaCaT細胞のフローサイトメトリー解析− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 解 析 し た（ 図 3）
。FLAERdonkey anti-rabbit IgG（Jackson），Alexa 488 conjugated（fluorescent-labeled inactive toxin aerolysin,goat anti-mouse IgG（Biolegend）を使って、その局在の違CEDARLANE）は GPI-AP に 結 合 す る 毒 素 の 変 異 体 にいを顕微鏡で観察した（KEYENCE BZ-X 800）
。メタノー

Alexa 488 の蛍光ラベルを付加したプローブで、GPI-APルあるいはパラホルムアルデヒド（PFA）で固定した細胞の 発 現 量 を 示 す。CD 109 の 発 現 は mouse anti-CD 109

は Anti-GlcCer, -Cer による免疫染色に適さないことがわ（Biolegend）を使用して解析した。

か っ た の で、 既 報 の 手 法 を 踏 襲 し て 無 固 定 で 0 . 1 %TritonX 100 , 1 % donkey serum in PBS で処理して 1 次抗

2. 3.

体、2 次抗体で 2 段階で染色し、4 % PFA で後固定して観細胞内 GlcCer の蓄積を比較観察するため HaCaT 細胞の察した。

ABCA 12 遺伝子のKO 細胞クローンを 2 . 2 . と同様の方法で３．結作 製した。ターゲットサイトは 2 箇 所 設 計し（5’ -CAAAGGATTCG GGGCAATAT, 5’ -AAACAGAAAAG T C G T果

3. 1.

CAAGC）、KO 細胞クローンを樹立したのちに、ゲノムの配列PIGA欠損のHEK293 細胞の培養液に合成したGlcNAcPI

を読んで完全なKO 細胞であると確認できた細胞クローンを 2 µM 加えたところ図 1 B のように GPI-AP である CD 59 ,# 27 , 30 を ABCA 12 KO 細胞として使用している。

DAF が、ともに正常の 60 % まで発現量が回復した。これ

2. 4.

（11）: 2297 - 2306）。に関連する結果は報告した（ACS Chem Biol. 2021 19 ; 16
この３種類の細胞（PIGA KO + PIGA rescued, PIGA
KO + empty vector, ABCA 12 KO ）における GlcCer の局

3. 2.

在を確認するために、角化細胞に分化させる条件を検討しHaCaT 細胞膜上に発現する GPI-AP が PIGA KO クロー

た。HaCaT 細胞は高 Ca の濃度で角化細胞に分化すること

ンでは完全にその発現が消失し、さらに PIGA cDNA を9）が知られている 。異なる Ca 濃度で細胞を培養して形態導入することによって発現が完全に回復していることを示を観察した結果、角化細胞に分化させる高 Ca の条件をす（図 2）。

2 . 8 mM とし、分化しない低 Ca の条件を 0 . 03 mM とした。

さらに 3 . 1 . と同様に合成基質 GlcNAcPI 3 µM の添加に低 Ca の条件は Ca 添加のない DMEM 培地に透析した FCS

より、GPI-AP である CD 59 と DAF の発現が正常の 10 ％を 10 % 加えたものに CaCl 2 を加えて final 0 . 03 mM とした。

程度まで回復することがわかった。回復の効率は HEK 293細胞に比べて低かったが、ピークとなる時間は 24 時間と2. 5.

同じであったことから、取り込みの効率、あるいは小胞体これらの３種の細胞を、poly-L-Lysine をコートしたカバーグラス上で培養し、高 Ca の条件で角化細胞に分化さでの利用の効率が HEK 293 細胞に比べて低いと考えられる（図 3）。

せた上で、rabbit anti-GlcCer（RAS_ 0011 , Glycobiotech）
mouse anti-ceramide（-Cer）（C 8 1 0 4 , Sigma），rabbit
anti-keratin1（Biolegend），2 次抗体としてFITC conjugated

3. 3.
ABCA 12 KO の作製と完全なノックアウト細胞である

図 3 PIGAKO HaCaT 細胞を無血清培地に 3µM の GlcNAcPIを加えた培養液で 24 時間培養し、フローサ
イトメトリーによりGPI-AP（CD59, DAF）の発現を解析した。

− 166 −

先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発ABCA 12 KO については既報のデータの再現性は得られことをゲノム配列の解析により確認した（図 4）。

ず、PIGA KO とレスキュー細胞の間にも局在のパターン

3. 4.に差は見られなかった。一方セラミドの分布については、

文献によると正常の角質細胞では GlcCer の分布が細胞PIGA レスキュー細胞では一部細かい繊維状の染色が目立質全体に分布しているのに対し、ABCA 12 遺伝子に変異つ細胞はあるが、主に細胞膜と細胞質に dot 状に分布してをもつ Harlequin-type ichthyosis の患者の角質細胞ではいるのに対し、PIGA KO 細胞（# 11 , 12）では繊維状の染GlcCer が lamellar body に運ばれずに核の周囲の塊として色パターンの細胞の割合が増加しており、ABCA 12 KO存在し、分布に異常をきたしている。

（# 27 , 30）ではほぼすべての細胞が網目状に伸びた荒い繊作製した ABCA 12 KO 細胞の GlcCer とセラミドの分布

維 状 の 染 色 パ タ ー ン を 示 し て い た。PIGA KO 細 胞 にを positive control として３種類の細胞の免疫染色のパタ

GlcNAcPI 3 µM を添加するも、明瞭な変化はみられなかーンを比較した。GlcCer は図 5 A のように染色が弱く、った（data not shown）。

図4

ABCA 12 KO細胞のゲノムのターゲットサイトの解析

図5 A PIGAKO 細胞（# 11）、そのレスキュー細胞、ABCA12 KO細胞（# 27）を高Caの条件で分化させてanti- GlcCer 抗体でGlcCerの局在を確認した。他のクローンも同様であった。

図5 B PIGAKO 細胞（# 11）とそのレスキュー細胞、ABCA12 KO細胞（# 27）を高Caの条件で分化させてanti- Cer antibodyでCerの局在を確認した。他のクローンも同様であった。

− 167 −コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

いは GPI 中間体と GlcCer の ER からゴルジ体への輸送が連4 . 考察および総括動している可能性を示唆している 13）。

セラミドは小胞体で合成され、多くは小胞輸送によりゴ

今後は HaCAT 細胞におけるセラミドの分布の違いを、ルジ体に運ばれ、細胞質側で GlcCer に合成されて細胞膜オルガネラマーカーを加えて解析し GPI 欠損による病態をの ラ フ ト に 運 ば れ る。 一 部 の セ ラ ミ ド は Ceramide解明する。角化細胞は基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、角Transport protein（CERT）により小胞体膜から引き抜か質細胞と分化していくが、lamellar body を分泌するのはれてゴルジ体に運ばれ、内腔にフリップしたのちにスフィ顆粒細胞である。HaCaT 細胞はヒト角化細胞株で、有棘ンゴミエリンに合成されて、同様に細胞膜のラフトに運ば細胞、顆粒細胞、角質細胞のいずれにも分化できるとされ10）。lamellar body は TGN 由来の小胞であるとされてている。それぞれの分化マーカーが知られているので顆粒いるが、その内部に GlcCer やスフィンゴミエリンを蓄積細胞に分化させた上で、GlcCer やセラミド、ABCA 12 のしており角層に分泌されたのちに酵素により再びセラミド分布を観察するとともに、western blot によりそれらの量と な っ て 皮 膚 の バ リ ア 機 能 を 発 揮 す る。ABCA 12 はを比較する。また電子顕微鏡により lamellar body の形態

lamellar body の膜上にあって GlcCer のトランスポーター、を３者で比較する。NBD ラベルのセラミドをこれらの細あるいは GlcCer をゴルジ体膜の細胞質側から内腔側に移胞に投与し、その局在や運搬、GlcCer への変換を確認する。

れる11）、実証されておらず、そHaCaT 細胞は３次元培養できるので、マウスのフェノタの 作 用 部 位 は 明 ら か で な い。ABCA 12 が 欠 損 す る とイ プ が 再 現 で き る か を 確 認 す る。 今 回 は in vitro で のlamellar body に GlcCer が積み込まれず、その結果角層のGlcNAcPI の投与による効果が見えなかったので、マウスセラミドが欠損し皮膚のバリア機能が障害される。本プロの実験までは進めなかったが、上記により病態解析が進めジェクトではヒトの皮膚の角質細胞から樹立された細胞株

ば、効果判定の指標がよりはっきりするので、それをもとHaCaT 細胞をモデル細胞として使用して前述のように３に GlcNAcPI の投与による治療を試みる。

す働きがあるとされているが種の細胞株を樹立し、主に GlcCer とセラミドの局在を観察することでそのフェノタイプを解析した。GlcCer の局謝辞在に関しては、抗体に問題があり解析が困難であった。既本研究を遂行するにあたり、御援助を賜りました公益財報によると ABCA 12 変異角質細胞では GlcCer は細胞の核

団法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝を申し

周囲に局在するとされている 6）。蛍光標識したセラミドを上げます。

外から加えると、核周囲に集結することが報告されているが、その分布は CERT の分布に一致する 12）。すなわち核（引用文献）

周囲の集積はゴルジ体での蓄積の可能性が高い。TGN か1） Kinoshita, T. Biosynthesis and biology of mammalian

ら生じる小胞、Lamellar body に GlcCer が積みこまれない

GPI-anchored proteins. Open Biol 1 0, 1 9 0 2 9 0, doi: 1 0.

せいであると考えられる。一方で荒い繊維状の染色パター

1098/rsob. 190290（2020）．

ンを示した ceramide の局在は、ER の可能性が考えられる

2） Kuki, I., Yukitoshi Takahashi, Shin Okazaki, Hisashi

が ER マーカーの局在と比較する必要がある。GlcCer の輸

Kawawaki, Eiji Ehara, Norimitsu Inoue, Taroh

送障害のためにその前のステップのセラミドの輸送も障害

Kinoshita and Yoshiko Murakami Case report on

されている可能性がある。角層に含まれる 7 種のセラミド

vitamin B6 responsive epilepsy due to inherited GPI

は６種のグルコシルセラミドとアシルグルコシルセラミド

deficiency. Neurology 81, 1467-1469., doi: DOI: 10. 1212/（Epidermoside）から産生されるが、スフィンゴミエリン

WNL. 0b013e3182a8411a（2013）．

からは 2 種のセラミドの産生にとどまる。グルコセレブロ

3） Tanigawa, J., Mimatsu, H., Mizuno, S., Okamoto, N.,

シダーゼの異常によるゴーシェ病においてはグルコシルセ

Fukushi, D., Tominaga, K., Kidokoro, H., Muramatsu,

ラミドからセラミドを産生できず皮膚透化バリアの形成不Y., Nishi, E., Nakamura, S., Motooka, D., Nomura, N.,

全を起こす。一方スフィンゴミエリナーゼの異常によるニHayasaka, K., Niihori, T., Aoki, Y., Nabatame, S.,ーマン・ピック病においては皮膚症状は報告されていない。

Hayakawa, M., Natsume, J., Ozono, K., Kinoshita, T.,

すなわちグルコシルセラミド由来のセラミドがバリア形成

Wakamatsu, N. & Murakami, Y. Phenotype-genotype7）に重要であることがわかる 。GlcCer から産生される角層correlations of PIGO deficiency with variableのセラミドのアミド基に付加されている脂肪酸は多くがphenotypes from infantile lethality to mild learning

C 22 から C 26 の長鎖脂肪酸である 7）。GPI 生合成の初期

difficulties. Hum Mutat 38, 805-815, doi: 10. 1002/humu.の遺伝子の欠損細胞で長鎖脂肪酸を含む GlcCer が減少し23219（2017）．ているというリピドミクスのデータがあり、GPI-AP ある4） Tarutani, M., Itami, S., Okabe, M., Ikawa, M., Tezuka,− 168 −

先天性 GPI 欠損症に合併する魚鱗癬の病態解析と治療法の開発

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