特集

生命現象の操作と可視化のための細胞内人工相分離ツール
吉川
1．はじめに

優 1・吉井達之 2・築地真也 1,2*化合物を作用させると，タンパク質が高次に自己集合（クラスタリング）し，細胞内で相分離するという仕組

近年，さまざまなタンパク質や RNA が自己集合するみとなっている．このような人工相分離制御システムのことで液−液相分離し，細胞内に液滴やゲル状の構造体

大きな利点は，天然タンパク質の生理的な（細胞まかせ（ここでは，特に断りのない限り，ゲル状の構造体も液の）相分離とは異なり，クラスタリングの際の分子間相滴と呼ぶ）を形成することが明らかとなってきた 1)．細互作用の価数や強さなど，相分離に重要なパラメーター

胞は，生体分子を液滴にしたり溶解したりすることで，を自由に調節できることにある．また，任意のタイミン

転写，翻訳，シグナル伝達など，さまざまな生命現象をグで相分離を誘導（または解消）することができるため，調節しているようである．このような細胞内相分離の重細胞内での液滴形成やそのあとの融合・成熟過程をリア要性が明らかになるにつれ，細胞内液滴の化学・物理的ルタイムに追跡するうえでも有用であり，細胞内相分離特性や，液滴が制御する生命現象・疾患の理解へ向けたのボトムアップ的な理解に大きく寄与するものと期待さ研究がここ数年で勢いを増している．一方，細胞にストれる．

レスや刺激を与え，その結果生じる液滴を観察するだけ

optoDroplet

Shin らは，光で細胞内に人工の液滴

では，液滴の形成メカニズム，物性，細胞内での役割なを形成させることのできる「optoDroplet」システムを開どを詳細に解析することは難しい．そのような中，近年，発した（図1A）2)．分子設計としては，N末端にFUS（Fused

細胞まかせ ではなく，光や小分子化合物を用いて，れるようになってきた．さらには，相分離するタンパクin sarcoma）や TDP43（TAR DNA-binding protein of 43kDa）などの天然変性タンパク質由来の LC ドメインを配置し，その C 末端に観察用の蛍光タンパク質，さらに質を人工的に設計することで，細胞内でのタンパク質―

青色光に応答してホモ二量体を形成するシロイヌナズナ

タンパク質間相互作用を検出する技術や，細胞内のシグ由来の光受容タンパク質 CRY2（Cryptochrome-2）を連ナル分子を制御するツールなども開発されるようになっ結する．このタンパク質は，暗所では相分離しないが，てきた．本稿では，そのようなケミカルバイオロジーや光照射によって CRY2 が二量体を形成すると，LC ドメ合成生物学の視点からエンジニアリングされた「人工相インを介した分子間多点相互作用によりクラスタリング分離ツール」に焦点を当て，それらの分子設計と応用例

し，細胞内に液滴を形成する．optoDroplet では，照射について紹介する．

する光の強さや照射時間をコントロールすることでクラ細胞内の液滴形成を人為的に操作するという試みが行わ

2．細胞内相分離の人工制御システム

スタリングするタンパク質量を自在に調節することができる．また，CRY2 は光照射を止めると単量体に戻るた細胞内で見られる天然タンパク質の相分離（液滴形成）

め，optoDroplet は可逆的なシステムとなる．たとえば，は動的かつ細胞内環境に依存する現象であり，それをそのまま解析するだけでは，細胞内液滴の物理化学的特性FUS の LC ドメイン（FUSLC）と CRY2 の融合タンパク質（FUSLC-mCherry-CRY2）を細胞に発現させた実験では，や生理機能を明らかにするのは難しい．その突破口とな

青色光を数分間照射することで，細胞全体に拡散しているのが，光や化合物に応答して相分離する人工設計タン

た mCherry の蛍光が徐々に多数の輝点となって細胞全パク質を用いるというケミカルバイオロジー的手法であ体に現れた．この輝点は，光退色後蛍光回復（FRAP）る．これらの手法では，1）低複雑性（LC：low complexity）

実験で素早い蛍光回復を示すことから，流動性の高い液ドメインなどのオリゴマー形成タンパク質と，2）光あ−液相分離した液滴であることが確認された．また，光るいは化合物によって二量化（もしくは多量化）するド照射を停止すると液滴は再溶解し，液滴の形成と解消をメインを融合した融合タンパク質を用いる．これを細胞何度も繰り返すことができた．一方，大変興味深いことに発現させるだけでは液滴を形成しないが，光もしくはに，強い光を長時間照射した場合や，CRY2 を変異体（光* 著者紹介 名古屋工業大学大学院工学研究科（教授） E-mail: stsukiji@nitech.ac.jp12246

名古屋工業大学大学院工学研究科共同ナノメディシン科学専攻
名古屋工業大学大学院工学研究科生命・応用化学専攻

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相分離生物学：相分離メガネのススメ

図 1．細胞内相分離の人工制御システム．（A）optoDroplet.（B）PixELLs.（C）iPOLYMER.

によってオリゴマー化する CRY2olig3)）に置き換えるこ

光を照射するとそれが解離する性質を持つ．Dine らはとで，クラスタリングをより強化した場合では，液滴でこの光応答性に着目し，FUS の LC ドメインを融合したはなく，不定形な相分離構造体が形成された．この相分とからゲル状態に近いことが示された．さらに，一度ゲFUSLC-FusionRed-PixD および FUSLC-Citrine-PixE を設計した．これらを細胞に共発現させると，FUSLC を介した 相 互 作 用 と PixD/PixE 複 合 体 の 形 成 に よ っ て 両ル状構造体になってしまうと，光照射を止めても再溶解コンストラクトがクラスタリングし，細胞全体に多数のは起こらず，不可逆な凝集体に成熟してしまうことが明液滴が形成された．また，これらの液滴は青色光の照射らかとなった．このように，optoDroplet では光照射のによって消失した．大変面白いことに，細胞の一部の領強度や時間，またタンパク質の相互作用の強さといった域の液滴を残す形で光照射を行った場合，液滴を消失さパラメーターを振ることで，用いている LC ドメインがせた領域（光照射領域）では液滴の再形成が起こりにく離構造体は，FRAP 実験で蛍光がほとんど回復しないこどのような条件で液滴を形成し，どのような条件を境目くなり，液滴の空間配置（細胞内分布）が長時間（〜 2 時として不可逆的な凝集体に成熟するのかなどを詳細に調間程度）にわたって細胞内に残り続けることが分かった．

べることが可能となる．特に，FUS タンパク質をはじ

このことは，液滴が細胞内分子の空間パターンを保持すめとする自己集合性タンパク質が細胞内で異常な不可逆るための 記憶素子 として働いている可能性を示して的凝集体を形成することは，神経変性疾患の原因になるいる．液滴の分布が細胞内シグナルの空間分布や非対称と考えられているため，そのメカニズムに迫ることので性の獲得に重要な働きをしているのだとすると，それはきる optoDroplet は病理学的研究においても非常に有用実に新しい概念である．

iPOLYMERなツールとなる．

PixELLs

optoDropletやPixELLsのように光で前項のoptoDropletは光照射によって相分相分離を制御するシステムだけでなく，小分子化合物で離を誘導するシステムであるため，細胞内に液滴を長時液滴の形成を誘導する技術も開発されている．その代表間作るのには不向きであった．この問題を解決するため例が，Nakamura らによって考案された「iPOLYMERに，Dine らは，暗所下で液滴を形成し，光照射によって（intracellular production of ligand-yielded multivalent

それが崩壊（溶解）するシステムとして「PixELLs（Pixるために考案された．このシステムでは，シアノバクテenhancers）」である（図 1C）5)．このシステムでは，タンパク質 FKBP（FK506-binding protein）を複数タンデムに連結した poly-FKBP と，タンパク質 FRB（FKBP12rapamycin-binding domain）を複数連結した poly-FRB という二種類のコンストラクトを用いる．FKBPとFRBは，リア由来の光受容タンパク質 PixD とその結合タンパク小分子ラパマイシンの存在下でヘテロ二量体を形成す質 PixE のペアを使用する．PixD と PixE は，暗所下にる．したがって，poly-FKBP と poly-FRB を細胞に共発おいて，10：5 の高次ヘテロ複合体を形成するが，青色現させ，任意のタイミングでラパマイシンを添加すると，evaporates from liquid-like droplets in light）」を開発した（図 1B）4)．PixELLs は，細胞内シグナルの空間パターンや非対称性の形成・維持における液滴の役割を解析す

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特集

図 2．相分離を利用したタンパク質間相互作用検出．（A）Fluoppi.（B）SPARK.

FKBP と FRB のポリマー間で多点架橋が起こり，相分ができる点にあり，既存の FRET などの手法と比較して離する．この手法で生じる相分離構造体は液滴というよも非常に明確なシグナル変化を得ることができる．

りは，より流動性の低いヒドロゲルに近い性質を示してス顆粒マーカーではないタンパク質（ribosomal P antigen）

Fluoppi
Watanabeらによって開発された「Fluoppi（Fluorescent PPI-visualization）」システムは，生細胞内の PPI をリアルタイムかつ簡便に検出できる画期的なツールである（図 2A）6)．このシステムでは，ホモオリゴマーを形成する PB1（Phos and Bem1）ドメインと，ホモ四量体を形成する緑色蛍光タンパク質 AzamiGreen（AG）に，相互作用を調べたいタンパク質 X と Y をそれぞれ融合する．X と Y が相互作用する場合には，PB1 オリゴマーと AG テトラマーが架橋されて液滴となり，AG の緑色蛍光が輝点として観察される．たとえば，p53と MDM2（Murine double minute 2）は細胞内で相互作用することが知られるが，PB1-p53 と AG-MDM2 を細胞には 含 ま れ て い な い こ と が 分 か っ た． こ の こ と は，共発現させると，液滴を形成し，輝点が観察された．そiPOLYMER によって人為的に構築した シンセティッ

こへ p53-MDM2 の PPI 阻害剤を加えると，輝点は消滅し，

クな ストレス顆粒が天然ストレス顆粒と類似の機能をAG の蛍光は細胞全体に分布した．このように，Fluoppiシステムは，細胞内での PPI を検出できるばかりでなく，PPI 阻害剤の評価にも利用できる．また，Fluoppi シス
テムは拡張性が高く，AG を別の四量体蛍光タンパク質に置き換えることで検出波長を変えたり，AG のモノおり，RNA 顆粒のようなゲル状のメンブレンレスオルガネラの人工模倣物として利用することができる．たとえば，Nakamura らは，ストレス顆粒を構成するタンパク質である TIA-1（T-cell intracytoplasmic antigen-1）のRNA 結合ドメインを poly-FRB に融合したタンパク質と YFP-poly-FKBP を細胞に共発現させ，ラパマイシンによってそれらを相分離させた．面白いことに，この相分離構造体の内部にはストレス顆粒マーカーとして知られる複数のタンパク質［G3BP1（Ras GTPase-activatingprotein-binding protein 1）など］が含まれており，ストレ示すことを示している．iPOLYMER は今後，RNA 顆粒をはじめとする，さまざまなゲル状メンブレンレスオル
ガネラの細胞内特性や機能を解析するための有用なツールになるであろう．

3．相分離を利用したタンパク質間相互作用検出
近年では，相分離現象を巧みに利用することで，生きた細胞内のタンパク質―タンパク質間相互作用（proteinprotein interaction：PPI）や酵素活性を検出・可視化する

マー変異体を用いたりすることで標的タンパク質のホモオリゴマー化を検出することも可能である．

SPARK
Zhang らが開発した「SPARK（Separationof Phases-based Activity Reporter of Kinase）」は Fluoppiの発展型と言えるもので，相分離を利用して特定のリン分析ツールの開発も報告されている．たとえば，タンパ酸化酵素（キナーゼ）の活性を追跡可能なシステムとなっク質 X と Y が相互作用すると液滴を形成するといったシている（図 2B）7)．分子設計としては，標的キナーゼのステムで，液滴の形成を蛍光観察することで，タンパク基質配列を X，リン酸化された基質に結合するドメイン

質 X と Y の相互作用を検出することできる．このようなを Y として，それぞれを別のホモオリゴマー形成タンパ

相分離を利用した検出法の利点は，レポーター分子が液ク質に連結させる．これらを共発現させると，基質をリ滴として濃縮される（輝点となる）ことで高感度な検出

ン酸化するキナーゼが活性化している場合でのみ，X が248

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図 3．人工相分離構造体を用いた細胞内分子制御．（A）LARIAT.（B）SYNPAC.

リン酸化され，そこに Y が結合することで相分離するとこのシステムでは，光受容タンパク質 CRY2 とその結合いう仕組みになっている．たとえば，キナーゼ ERK に（Calcium and integrin-binding protein 1）
タンパク質CIB1

対する SPARK プローブ（ERK-SPARK）を用いることで，EGF による刺激後の細胞内 ERK の活性化と不活性化をの ペ ア を 利 用 す る． ま ず， ホ モ 12 量 体 を 形 成 す る

液滴の生成と消失によって追跡することが可能であった．
また，ERK-SPARK を発現した遺伝子組換えショウジョウバエを用いることで，in vivo 組織中の ERK 活性を検出できることも示されている．

CaMKIIα に CIB1 を融合し，それを細胞内に発現させることで，12 分子の CIB1 を提示した多量体タンパク質（CIB1-MP）を構築する．一方，標的タンパク質は CRY2との融合タンパク質（CRY2-POI）として細胞に共発現させる．暗所下では，CRY2-POI は単量体として細胞質相分離を利用した PPI 検出法では，あくまでも液滴の中を拡散し，正常な機能を果たす．そこへ青色光を照射形成を観察するため，PPI やキナーゼ活性の空間情報をすると，CRY2 は二量化すると同時に CIB1 と結合し，正確には反映しないことが欠点としてあげられる．しかCRY2-POI と CIB1-MP がクラスタリングすることで相し，人工相分離を利用した検出系は，培養細胞や in vivo分離する．標的タンパク質はこの相分離構造体の中にトでの分子間相互作用を簡便かつ高い信頼度で高感度に検ラップされるため，活性を失う．実際に，LARIAT システ

出・可視化するための強力な新しいアプローチとして重ムを用いることで，Tiam1，Vav2，Rac1，さらにはチュー要である．

ブリンなどのさまざまなタンパク質の活性を光で不活性

4．人工相分離構造体を用いた細胞内分子制御化できることが示された．LARIAT は，（optoDroplet と同様）光照射を止めると相分離状態が解消されるため，細胞内の狙ったタンパク質の機能を制御する手法の開細胞内のさまざまなシグナル分子を高い時空間分解能で発は，ケミカルバイオロジーの重要課題の一つである．

可逆的に光制御可能な強力なオプトジェネティクスツーしかし，タンパク質は構造・機能・機能発現機構が多様ルとして注目されている．

であるため，さまざまなタンパク質の機能制御に適用可

SYNPAC

核小体や RNA 顆粒などで見られるよう能な汎用的な手法の開発は今なお難しい．一方，細胞は，に，細胞は相分離によってできたメンブレンレスオルガネ

特定の分子を液滴（相分離構造体）に閉じ込めるというラの中でさまざまな生命現象を制御している．もし細胞原理を用いて，実にさまざまなタンパク質の機能を制御内に完全人工の相分離構造体を作ることができれば，そしている．これをヒントに，相分離構造体を利用するこ

こを「人工場（人工オルガネラ）」として利用した新しい生とでタンパク質活性を制御するという新しい試みが行わ体分子制御法が創出できるかもしれない．筆者らは現在，れるようになってきた．

このような発想のもと，生細胞内にさまざまな分子を制御LARIAT
相分離を利用したタンパク質活性制御の先駆けは，Lee らが考案した「LARIAT（light-activatedreversible inhibition by assembled trap）」である（図3A）8)．

可能な人工場を作ることに挑戦している．筆者らは，人工生物工学

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場を構築するための戦略として，自己集合して相分離するように設計した人工タンパク質を利用しており，そのよう249

特集にして作製したタンパク質ベースの人工場を「SYNPAC開発を鋭意展開中である．

（synthetic protein-assembled compartments）」と呼んでいおわりにる（図 3B）．たとえば，先述の Fluoppi システムを参考に，
二 種 類 の ホ モ オ リ ゴ マ ー タ ン パ ク 質（PB1 と AG）と本稿で紹介したように，タンパク質の相分離をエンジFRB をタンデムに連結したコンストラクトを設計した．
これを細胞に発現させることで，FRB を内包した SYNPACニアリングすることで，細胞内相分離を理解するためのを細胞内に構築することができた．一方，活性を制御し作する新しいケミカルバイオロジーツールが開発できる

たい標的タンパク質には FKBP を融合し，それを同じ細ようになってきた．今後，相分離生物学の発展に伴い，胞に共発現させる．初期状態では，標的タンパク質は細生命研究における人工相分離ツールの重要性と可能性は合成生物学的ツールや，生体分子プロセスを可視化・操胞質に局在するが，そこへラパマイシンを添加すると，ますます高まっていくであろう．人工相分離ツールの開FKBP と FRB の 二 量 化 に よ っ て 標 的 タ ン パ ク 質 をSYNPAC に急速に取り込むことができた．SYNPAC に発は今まさに黎明期を迎えようとしており，今後どのよ取り込まれた標的タンパク質は周囲から隔離されることみである．

うな革新的なツールがデザインされていくか非常に楽しでその機能を発現できなくなる．実際に筆者らは，この文システムを用いることで，Vav2 や Sos といった GEF タンパク質を望みのタイミングで不活性化できることを実証した（論文投稿準備中）．SYNPAC の方法論では，さまざまなタンパク質やドメインをモジュール的に組み込むことで，さまざまな機能を搭載した人工場を生細胞内に構築することができるであろう．現在筆者らは，このコンセプトのもと，生きた細胞や動物個体内のタンパク質や RNA を制御するユニークな SYNPAC システムの250

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献

白木賢太郎：相分離生物学，東京化学同人 (2019).
Shin, Y. et al.: Cell, 168, 159 (2017).
Taslimi, A. et al.: Nat. Commun., 5, 4925 (2014).
Dine, E. et al.: Cell Syst., 6, 655 (2018).
Nakamura, H. et al.: Nat. Mater., 17, 79 (2018).
Watanabe, T. et al.: Sci. Rep., 7, 46380 (2017).
Zhang, Q. et al.: Mol. Cell, 69, 334 (2018).
Lee, S. et al.: Nat. Methods, 11, 633 (2014).

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