

放射光第巻第号()

放射光ニュース
Sakabe カメラを用い，オシレーション法により反射デー

新博士紹介

タを収集した。クラミドモナス Rubisco の結晶は空間群

P21，格子定数は a＝129.2, b＝174.8, c＝222.3 Å, b＝97.8

溝端栄一（RIKEN GSC）

.

氏名

.

論文提出大学

大阪大学°であった。位相および構造決定は，ホウレンソウ Rubis-.

学位種類

博士（工学）

co の立体構造をサーチモデルとした分子置換法によりお2003年 3 月

こなった。本結晶の非対称単位は非常に大きく，Rubisco

.

取得年月日

.

題目

.

使用施設

.

要旨

植物の改良を目指した葉緑体蛋白質の構造と機2 分子と水分子 1 万個から構成されていた（分子重量能の研究

1,300 kD ）。最終的に，分解能 1.84 Å, Rcryst＝ 15.2  , RfreeKEKPF BL18B＝18.1で精密化を完了した。
［結果と考察］クラミドモナス Rubisco の全体的なサブユニット配置［序］
全ての生物の構成成分である有機炭素は，源をたどればは， L と S サブユニット 2 つずつから成る単位（ L2S2 ）植物が光合成によって生産した炭水化物に由来している。

が非結晶学的 4 回軸によって関係付けられる構造をとっ光合成における大気 CO2 の固定は，還元的ペントースリていた（Fig. 1 ）。これは，以前に解かれた他の 16 量体型ン酸サイクルの初発反応を担う酵素，リブロース1,5 ビの Rubisco と同様であった。また，触媒部位を有する Lスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（ Rubisco 

サブユニットの構造も他の Rubisco と良く似ていた。一ルビスコ）によって行われる。Rubisco は L サブユニット

方，S サブユニットには，他の Rubisco とは異なる独特のと S サブユニットが 8 個ずつ会合した分子重量 550 kDa

部分構造がみられた（Fig. 2 ）。この特徴的な構造が L サの巨大蛋白質である。本酵素はリブロース1,5 ビスリン

ブユニットと相互作用することで，緑藻 Rubisco に特徴酸に CO2 を付加して 2 分子の 3ホスホグリセリン酸を生的な活性（例えば高等植物よりも高い比活性と低い基質親成する CO2 固定反応だけでなく，CO2 の代わりに O2 を付和性）が実現されていると考えられた。

加して 3 ホスホグリセリン酸と 2ホスホグリコール酸を最も興味深い結果は，本酵素に複数の修飾アミノ酸残基1 分子ずつ生成する O2 固定反応も触媒する二機能的な酵素である。Rubisco の最も重要な特徴は，光合成反応を律速することで植物成長を制限していることである。そのため，高機能 Rubisco を設計して農作物に導入することができれば，農作物の生産効率を向上させることが可能となる。これを実現するためには，本酵素の構造機能相関を理解することが必要である。
これまで筆者は，複数の光合成生物由来の Rubisco の生化学的構造生物学的な研究を行ってきた13) 。ここでは，緑藻由来 Rubisco の構造研究を紹介したい。Rubiscoの立体構造は高等植物，ラン藻，紅藻，光合成細菌，始原Figure 1. Overall structure of Chlamydomonas Rubisco. (a)Viewing down the non-crystallographic 4-fold axis which runs
parallel to the solvent channel. (b) Viewing perpendicular to (a).

菌由来のものが報告されてきた。しかし，植物界における巨大な分類群の一つである緑藻類の Rubisco の構造は未解明であった。そこで，代表的な緑藻，クラミドモナスのRubisco の X 線結晶構造解析を行った1)。
［結晶化と構造解析］
クラミドモナスの細胞を大量培養し，細胞抽出液からRubisco を精製した。 Rubisco の結晶化条件を検索したところ，2.5 ml の蛋白質溶液（80 mM HepesKOH pH 8.0,1 mM EDTA, 5 mM DTT, 20 mM MgCl2, 40 mMNaHCO3 ） と 2.5 ml の リ ザ ー バ ー 溶 液 （ 80 mM Hepes 
KOH pH 8.0, 1 mM EDTA, 20 mM MgCl2, 7 PEG4000,30 glycerol）からなるドロップを用いたハンギングドロップ蒸気拡 散法により， 20 °C で 再現よく結 晶が得られた。回折強度の測定は KEK PF の BL18B で行った。検出器にはラージイメージングプレートを装着した

Figure 2. S-subunits from (a) Chlamydomonas (green alga), (b)spinach (higher plant), (c) Synechococcus PCC6301 (cyanobacterium ) and (d) Galdieria partita (red alga).

――(C) 2003 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

放射光第巻第号

()ていた 。一方， 103 105 番目のアミノ酸配列Tyr ( 4 hydroxy Pro )Ile は，興味深いことに，これまでに報告されている認識配列とは全く異なっていた。クラミドモナ
スの細胞壁は hydroxy Pro に富んだ糖蛋白質によって構成されている。これまでに，この糖蛋白質の合成に関与すると考えられる 2 種類のプロリル 4 ヒドロキシラーゼが報 告さ れて いる 。今 回， ク ラミ ドモ ナス Rubisco に 4 hydroxy Pro が見出されたことは，クラミドモナスの葉緑体に，細胞壁合成を行うものとは異なるタイプのプロリ
ル 4 ヒドロキシラーゼが存在することを意味している。
なお，これら 2 つの 4 hydroxy Pro はいずれも触媒部位
Figure 3. The omit maps ( FoFc, contoured at 3.5s) of post-translationally modiˆed residues of Chlamydomonas Rubisco. The stickmodels ˆtted in the electron-density maps are (a) NamethylMetS1,(b) 4hydroxyProL104, (c) 4hydroxyProL151, (d) Sgmethyl
CysL256, (e) SgmethylCysL369, and (f) ThrL471. The arrows
show the additional electron densities by modiˆcations.

から約 20 Å も離れており， Rubisco 触媒作用に積極的な影響を与えている可能性は考えにくい。L サブユニットのフォールディングに何らかの関与をしているのかもしれない。

L サブユニットの 256 と 369 番目のアミノ酸残基は Sg 
methylCys と推定された（Fig. 3 (d), (e））。これらの残が見出されたことである（ Fig. 3 ）。 S サブユニットの N基はサブユニット表面に位置しているので，この翻訳後修末 端 の Met 残 基 は ， 末 端 窒 素 が メ チ ル 化 さ れ た Na 

飾は L サブユニットの Cys 残基が他の蛋白質の Cys 残基

methylMet であることが電子密度から推定された（Fig.と非特異的なジスルフィド結合を形成してしまうのを阻害3(a））。高等植物 Rubisco では MetS1 と LysL14（S と L でするのに役立っているのかもしれない。この翻訳後修飾がサブユニットの種類を示す）は，それぞれ， Na methyl 

どのようなメカニズムで行われているかは一切不明である。

MetS1 と Ne trimethyl MetL14 へ翻訳後修飾されること

L サブユニットの 471 番目の残基は DNA 配列から Thrがわかっている。エンドウとタバコは，この二つのメチルと推定されていた。しかし，この Thr の Og のすぐ隣に強化を同時に触媒する二機能的なメチルトランスフェラーゼ

い電子密度が観察され，何らかの修飾を受けていることがを有している。ホウレンソウは MetS1 の Na メチル化の明らかとなった（ Fig. 3 ( f ））。 Thr の Og の翻訳後修飾にみを行う酵素を持っている。クラミドモナスにおいてははメチル化やグリコシル化などが考えられ，今回の電子密MetL14 の Ne トリメチル化は起こらないことが知られて度だけから修飾の種類を推定することはできなかった。現いたことから， Na methyl MetS1 の存在は，クラミドモ在，この残基を含むペプチドを調製し，質量分析により修ナスがホウレンソウ型のメチルトランスフェラーゼを有し飾の種類を同定する実験を行っている。ThrL471は，活性ていることを示唆している。なお，Naメチル化は Rubis-中心残基一つ LysL334を有するフレキシブルループとフco の 4 次構造形成に関与していることが高等植物 Rubis-ァンデルワールス相互作用をしている。よって，この翻訳co の研究で指摘されている。

後修飾は Rubisco の触媒作用に何らかの影響を与えていL サブユニットの 104 と 151 番目の残基は 4 hydroxy ると考えられる。

Pro と推定された（Fig. 3(b), (c））。4hydroxyPro はコラーゲンやエクステンシンなどの構造蛋白質に見出されて参考文献

きたアミノ酸である。Rubisco のような酵素，あるいは，

1)

葉緑体において見出された例は筆者の知る限り存在しない。一部の微生物を除いて，一般に 4 hydroxy Pro はプ
ロリル 4 ヒドロキシラーゼによる翻訳後修飾によって生成される。プロリル 4 ヒドロキシラーゼは幅広い基質特異性を有しているが，最も一般的な認識配列はGlyPro

E. Mizohata, H. Matsumura, Y. Okano, M. Kumei, H. Takuma, J. Onodera, K. Kato, N. Shibata, T. Inoue, A. Yokota andYasushi Kai: J. Mol. Biol. 316, 679 (2002).
2) Y. Okano, E. Mizohata, Y. Xie, H. Matsumura, H. Sugawara,
T. Inoue, A. Yokota and Y. Kai: FEBS Lett. 527, 33 (2002).
3) E. Mizohata, M. Anwaruzzaman, H. Okuno, K.-I. Tomizawa,S. Shigeoka, Y. Kai and A. Yokota: Biochem. Biophys. Res.
Commun. 301, 591 (2003).

Proである。L サブユニットの150152番目のアミノ酸配列Gly(4hydroxyPro)Proは，その認識配列に相当し――（受付番号）