トピックス
胃プロトンポンプの結晶構造解析によって明らかになった H＋ 排出機構
阿部一啓
名古屋大学細胞生理学研究センター

要 旨

大学院創薬科学研究科〒4648601 名古屋市千種区不老町

胃プロトンポンプ（H＋, K＋-ATPase）は胃の内部を酸性化する P 型 ATPase に分類される膜タンパク質であり，それゆえ胃酸に関連する疾患のドラッグターゲットである。我々は H＋, K＋-ATPase と vonoprazan もしくはSCH28080がそれぞれ結合し，胃内腔側にゲートが開いた状態の2.8 Å 分解能結晶構造 2 つについて報告する。2 種類の薬剤の結合部位は，部分的にオーバーラップはしているもののそれぞれ明確に区別される形で，イオン結合サ
イトから胃内腔へと繋がるイオンの通り道の真ん中に結合し，まさにこれをブロックしていた。結晶構造から，イオン結合サイトにおいて保存されたリジン残基が，2 つの近接するグルタミン酸に向けて結合する様子が観察された。この特徴的な荷電アミノ酸の配置によって Glu820の pKa 値が低下し，胃の内部の pH 1 という強酸性環境に向けてであっても H＋ を遊離できることが示唆された。

すなわち E1, E2 およびそれぞれが自己リン酸化された

1. はじめにE1P, E2P という異なるコンフォメーションを遷移するこ

食物消化時に我々の胃の内部は pH 1 もの強酸性環境にとで達成される。 ATP によって駆動される細胞外（胃内曝される。これはタンパク質の消化や外部からの病原体に腔）への H＋ の放出および細胞内への K＋ の輸送における対するバリアとして生理的に重要である。しかしながら，化学量論は，中性状態では 1 分子の ATP 加水分解当たり

胃酸過多は胃潰瘍や逆流性食道炎といった症状を引き起こ

2H＋  2K＋ であるが，胃内部の酸性化に伴って 1H＋ 

す。また，胃癌のリスクファクターであるピロリ菌の除菌

1K＋ へと変化すると考えられている2)。

には，抗生物質と共に胃酸抑制剤が用いられる。Omepra-

H＋, K＋-ATPase は， 2 つのサブユニットから構成されzole 等に代表される PPIs (Proton Pump Inhibitors）や，ている。触媒機能を持った a-subunit は，類縁の P2-type

最近開発された新しいクラスの薬剤， vonoprazan を含む

ATPase である Na＋, K＋-ATPase3)や sarco(endo)plasmic

P-CABs (Potassium (K＋)-Competitive Acid Blockers）

reticulum Ca2＋-ATPase (SERCA, ref. 4）と高い相同性をは，どちらも胃酸に関連する病態の治療に用いられてい持つ。この a-subunit はイオン結合サイトを内包する10本る。胃 H＋, K＋-ATPase は，過度の胃酸分泌治療薬の分子の膜貫通ヘリックス（ M1 M10 ）と， 3 つのドメイン―

ターゲットである。

Actuator (A), Phosphorylation (P), Nucleotide-binding

H＋, K＋-ATPase が行うイオン輸送反応（Fig. 1）は，他( N ）ドメイン―からなる細胞質領域で構成されている。

の P 型 ATPase 同様， Post-Albers タイプの反応機構1) ，これに加え， H＋, K＋-ATPase は b-subunit を必要とし，これらが 11 で会合した a
b 複合体として機能発現する。
H＋, K＋-ATPase は，中性の細胞質溶液（pH 7）から胃内部の酸性溶液（ pH 1 ）へと H＋ を輸送するが，これは100 万倍の H＋ 濃度差に相当する。特に pH 1 の溶液へとH＋ を放出するのは，アミノ酸だけで構成されるタンパク質としてはかなりチャレンジングな仕事である。なぜなら，
H＋ の 結 合 や 解 離 に 関 わ る 酸 性 ア ミ ノ 酸 の 酸 解 離 定 数（ pKa ）は通常 3～ 5 程度であり，これは pH 1 の溶液へのH＋ の放出が殆ど起こらないことを意味するからである。

この問題は，今から40年以上前にこの分子が発見5)されて以来，長い間の謎であった。
Fig. 1

Transport cycle of the gastric H＋, K＋-ATPase.

放射光 Sept. 2018 Vol.31 No.5 ● 325(C) 2018 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

では，高分解能の回折点を与えるに十分な結晶性を得るの

2. 三次元結晶化
2.1は難しいであろう。より密な結晶パッキングを達成する為

二次元結晶から分子パッキングを考えるに は ， 他 の P 型 ATPase の 三 次 元 結 晶 に 見 ら れ る よ う

これまで著者は，ブタの胃袋から精製したタンパク質標に，脂質膜中にもう一つ分子をさかさまに入れてやるのが品を 用いて 二次 元結晶 を作 製，電 子線結 晶学 によ って理想的であろう（ Fig. 2a ，破線）。しかしながら，この段

H＋, K＋-ATPase の構造解析を行い， H＋, K＋-ATPase の階ではそれは難しかった。ベータサブユニットの細胞外ド

生理的に重要な機能を幾つか明らかにしてきた68) 。しかメインには，6 か所の糖鎖付加サイトがあり，天然物（ブしながら，これらの立体構造は，最も良い場合でも 6.5 Åタ胃）から調製した標品では， b-subunit の core weight

分解能であり，カチオン輸送メカニズムの詳細を理解するが約 35 kDa であるにも関わらず， SDSPAGE 上では 70

為には不十分であった。電子線結晶学（電子顕微鏡）は，

90 kDa の位置にブロードなバンドを与えるほど大量の糖

アクアポリンやアセチルコリン受容体の原子分解能での構

鎖付加を受けている。さらに悪いことに，この糖鎖構造は

造解析9,10)や，また近年の単粒子解析の爆発的な普及11)か

胃の内部に面していることもあり非常に強固な構造物を形らもわかるように，アミノ酸が判別できる程度の分解能の成しており，タンパク質が未変性の状態では，試した限り

構造情報を十分抽出できるはずである。にもかかわらず，

ではあるがエンドグリコシダーゼ等の酵素によって全く切

H＋, K＋-ATPase の二次元結晶が高分解能に届かなかった

断されない。つまり，図示した位置に大きな構造物があるのはなぜであろうか

為に（ Fig. 2a, Glycans ），タイトなパッキング，さらには二次元結晶のパッキングを見ると，そのヒントが隠されていた（ Fig. 2a ）。 H＋, K＋-AT-

三次元結晶へと積層することが出来ないと考えられた。

Pase の 二次元 結晶は ， 1 層 の脂質 膜に H＋, K＋-ATPaseが再構成されており，この膜が上下さかさまに重なり，お2.2

BacMam システムによる組み替え体の大量発現

互いの細胞質領域のみで結晶コンタクトを形成している

この問題を解決する為に，豚胃タンパク質標品ではな（Fig. 2a，矢尻）。一方で脂質膜中および細胞外領域に結晶

く，培養細胞で発現した組み替え体を利用した。まず始めコンタクトは皆無である。このようなルーズなパッキングに膜タンパク質の構造解析に実績のある昆虫細胞による発現を試みたが，発現量は非常に低いものであった（Fig. 3b,Sf9 ）。哺乳類の P 型 ATPase は活性発現にコレスレロー

ルを要求するものがあり， H＋, K＋-ATPase はコレステロールを持たない昆虫細胞では上手くフォールディングできないと考えられた。そこで，哺乳動物由来の培養細胞を宿主として，改変したバキュロウイルスを媒介して目的タ
ンパク質を発現させる BacMam システム12) （ Fig. 3a ）による発現を検討したところ，大幅な発現量の増加が認められた（Fig. 3b）。肝心の b-subunit の糖鎖修飾の問題は，糖鎖 の 成 熟 過 程 に 必 要 な 酵 素 GnT1 を 欠 損 し た 株（ HEK293 細胞 GnT1－ 株）を使用することで解決した。
この細胞株では，発現するすべてのタンパク質に付加された糖鎖がすべて high-mannose 型となる為，標品にエンドグリコシダーゼ（ EndoH ）を添加することで容易に切断できる13)。
上記の発現系を用いて，精製に利用するアフィニティー
タグや b-subinit に 6 か所ある N 型糖鎖を除去した精製標品を，1 L の培養スケールあたり，約0.3 mg 得ることができた。結晶化は， 10 mg / ml 程度まで濃縮したサンプル
Fig. 2(Color online) Learned from 2D crystal structures.
a, Cryo-EM map of H＋, K＋-ATPase 2D crystal in BYK99bound E2P state15). Gray circles indicates expected volumeof glycans at the ecto-domain of the b-subunit. Dotted circle
indicates the empty space between H＋, K＋-ATPase molecules. b, Cryo-EM map of the H＋, K＋-ATPase cytoplasmic
domains. Circle indicates the position of N-terminal Lys36 in
the superimposed homology model6). c, Molecular packingof the H＋, K＋-ATPase in its 3D crystal. d, X-ray diŠractionof the vonoprazan-bound crystal.

326 ● 放射光 Sept. 2018 Vol.31 No.5

を，あらかじめガラスチューブの壁にフィルム状に乾固させたリン脂質（DOPC）と一晩撹拌混合したものを用いることで14) ，他の P 型 ATPase と同様に Type I（二次元結
晶が 三次 元方 向に積 層し たもの ）の三 次元 結晶を 得た（Fig. 2c）。

2.3

結晶の改善

始めのうちは野生型の H＋, K＋-ATPase を用いることでトピックス ■ 胃プロトンポンプの結晶構造解析によって明らかになった H＋ 排出機構

針状結晶が得られたが，分解能は針状結晶の長軸方向で最デル15) をサーチモデルとした分子置換によって行い，最も良く 5 Å 程度であり，これと垂直な方向は 20 Å 程度の

終的に 2.8 Å 分解能（ Rw ＝ 23.7, Rf ＝ 28.8 ）の構造を得る

非常に異方性の強い回折を与えた。溶液条件のリファインことができた16)。

メントを繰り返したが，分解能および結晶の形状に大幅な改善は見られなかった。ここで，再び二次元結晶の構造に

3. H＋, K＋-ATPase の結晶構造学ぶことになる。 6.5 Å の電子顕微鏡のマップ6) では， 36

H＋, K＋-ATPase の全体構造（Fig. 4）は，一次配列の相番目より N 末端側がディスオーダーしていた（ Fig. 2b）。

同性が 60 以上である Na＋, K＋-ATPase と非常によく似

この部分の構造が不定形な為に結晶の一方向が極端に悪いていた。細胞質側には ATP の加水分解に関わる 3 つの大という可能性を考慮し， N 末端の欠損変異体をいくつか

きなドメイン（A, P, N ドメイン）が存在し，膜貫通領域作成した。検討の結果， 12 残基， 24 残基欠損ではあまりには a-subunit から 10 本， b-subunit からは 1 本の膜貫通変化がないが， 36 残基および 48 残基を欠損した変異体をヘリックス，細胞外領域（胃内腔側）には b-subunit の用いることで，六角柱に近い形状の，野生型の針状結晶とEcto ドメインが存在する。 6 つある N 型糖鎖付加サイト

比較して大きな結晶が得られ，大幅な分解能の改善が見らのうち 3 つに N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）をモデれた。比較的大きくなったとはいえ，初期に得られた結晶

ルすることができた。また，膜貫通領域には 2 つのリン

サイズは長い方で 100 mm 程度，厚さ方向は 10 20 mm 程脂質（DOPC）と 1 つの界面活性剤（C12E8）と思われる度であり， SPring 8 の BL32XU, BL41XU のマイクロフ

密度が観察された。結晶パッキング（Fig. 2c）からも推定ォーカスビームを用いたヘリカルスキャンによってデータされる通り， H＋, K＋-ATPase は結晶の bc 面方向で脂質収集を行った。若干の異方性は残すものの， 48 残基欠損

層に再構成されており，これが重なるように三次元結晶を

変異体は分解能の良い方向で2.3 Å の回折点を観察できる

形成している。

程度まで改善することができた（ Fig. 2d ）。位相付けは，

この結晶は，リン酸アナログであるフッ化ベリリウム

以前に電子顕微鏡の構造に基づいて作成したホモロジーモ（BeF－
CAB (vonoprazan, SCH28080を別々に結晶3 ）と P化）存在下で生成したので，胃酸抑制剤が最も高い親和性で結合する E2P 状態（それぞれ（von) E2BeF, (SCH)
E2BeF と表記する）であると考えられた（Fig. 1）。結晶構

造には，P ドメインの活性中心に BeF－
3 が結合しており，
膜貫通領域に存在するカチオン結合サイトと胃内腔を繋ぐカチオンの通路部分には PCAB が結合していた。細胞質ドメインの相対位置や，カチオン輸送のゲートが胃内腔（細胞外）に向けて開かれていることから，この構造はプ

Fig. 3(Color online) BacMam expression system.
a, Schematics of the BacMam expression system. Flag-tag
and eGFP follewd by a TEV protease recognition sequence,
were attached to the amino-terminal of the a-subunit of H＋,
K＋-ATPase, and cloned into a custom-made vector based on
previous report. The ab-complex of H＋, K＋-ATPase was
successfully expressed in the plasma membrane using
baculovirus-mediated transduction of mammalian HEK293S
GnT1－ cells. b, Speciˆc ATPase activities in the crude membrane fractions from indicated expression trials.

Fig. 4(Color online) Crystal structure of the gastric proton
pump16).
a, Overall structure of the H＋, K＋-ATPase (von)E2BeF
state (PDB code: 5YLU).

放射光 Sept. 2018 Vol.31 No.5 ● 327

ロトンを吐き出した直後の luminal-open E2P 状態に相当することが分かった。

4. PCAB 結合部位

5. ゲーティングを司る留め金（latch）
他 の P 型 ATPase や ， H＋, K＋-ATPase の 電 子 線 結 晶
学による構造解析から，胃内腔（細胞外）への輸送イオン

今回構造解析した 2 種類の P-CAB17,18) は，どちらも胃のゲーティングの際に引き起こされる構造変化はよく理解

内腔に向けて口を開けた輸送カチオンの通り道の中ほどされている20,21)。胃内腔へ開いたゲートから対向輸送イオに，部分的にはオーバーラップしているものの明確に区別ンである K＋ が侵入，カチオン結合サイトに結合することできる形で結合していた。このカチオンの通り道を塞ぐよに端を発し，M12 および M34 のヘリックスが動くこと

うな結合様式は，これらの阻害剤による K＋ 競合的な阻害でゲートは閉じられる。 M1 2 は A ドメインへと繋がっ様式をよく説明するものである（Fig. 4）。

ており， TM 領域での構造変化が細胞内の A ドメインに

電子密度図は，これら化合物の官能基の位置や配向を特伝わることで，このドメインが P ドメインに対して相対定するのに十分な解像度を持っていた。それぞれの P 

的に回転し，P ドメインに結合したリン酸が加水分解され

CAB の結合に対し共通して重要なアミノ酸や，片方の結る。このようなゲートを閉じる一連のアロステリックな過合にだけ重要なものがいくつか見つかり，これは変異体に程において鍵となるのは，M12 ヘリックスの上下運動でよる P CAB の 親和 性測 定によ って 裏付 けら れた （ Fig.

ある。ゲートが開いているときに，M12 は細胞質側に存5）。例えば Tyr799を Ala に変異させると両方の化合物に在しているが，ゲートが閉じるときには胃内腔側へとスラ

対する親和性を著しく低下させたが19) ， TM2 に存在するイドする。今回構造解析された，胃内腔側のゲートが開い

Asn138 を，よりかさ高い Phe に変異させた場合，この側た状態である薬剤結合構造では，M1 の Ile119が，ちょう

鎖付近に官能基が結合しているSCH28080に対する親和性

ど留め金のように， M4 に存在する Met334 と折り重なるを著しく低下させたが15) ， vonoprazan に対する親和性にようにして存在し，TM12 ヘリックスが胃内腔側へとスは殆ど影響しなかった16)。薬剤と H＋,K＋-ATPase との結ライドするのを防いでいるように見えた（Fig. 6ab）。もし合は，どちらの場合も殆ど疎水的なものであった。タンパ

そうであれば，これらの側鎖のうちのどちらかをより小さ

ク質 部分の 結合 サイト にす っぽり とはま り込 むこ とでな Ala に置換することで，M12 ヘリックスが細胞質側に（ Fig. 5cd ），薬剤の周囲から水が排除され，薬剤の結合に留まることが出来ずに胃内腔側へと自発的にスライドし，とって好ましいエントロピーの上昇を与える。このような細胞外側へのゲートは閉じるはずである。ゲートが閉じる

結合様式は，殆どの酸性アミノ酸が電荷を持たないと考えと，上述の通りそのシグナルは A ドメインへと伝播し，られる pH 1 という溶液中においてリーズナブルである。

最終的には脱リン酸化が誘起される。野生型においてこの脱リン酸化反応は，K＋ が結合することで引き起こされるので（ Fig. 1 ），野生型の場合， ATPase 活性は K＋ 非存在
下 で は 非 常 に 低 く ， K＋ 濃 度 に 依 存 し て 上 昇 し て い く

Fig. 6
Fig. 5(Color online) P-CAB binding to the H＋, K＋-ATPase.
Vonoprazan-bound structure (magenta) is shown with superimposed SCH28080 (green), viewed from approximately
parallel to the membrane plane (a) or perpendicular to themembrane plane from the luminal side (b). Cross sections of
the P-CAB-binding sites (c, vonoprazan, d, SCH28080) perpendicular to the membrane plane.

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(Color online) A gating latch.
Comparison of the luminal-open E2P ((von)E2BeF) and luminal-closed E2P (E2AlF, determined by cryo-EM). Ile119
and Met334 are shown as sticks. Arrows indicate the displacement of the Ile119 and Met334 from the luminal-open
to the luminal-closed forms, viewed from the luminal side(a) and parallel to the membrane plane (b). c, K＋-dependent ATPase activities of the wild-type and indicated mutant
enzymes.

トピックス ■ 胃プロトンポンプの結晶構造解析によって明らかになった H＋ 排出機構

（ Fig. 5c）。これとは対照的に， Met334Ala や Ile119Ala 変
異体では K＋ 濃度に依存しない constitutive-active な ATPase 活性が観測された（ Fig. 6c ）。一方で， Ile119Met や
Met334Ile 及び双方を入れ替えた変異体では，野生型と同様の K＋ に依存した ATPase 活性の上昇が見られた。こ
れらの結果は，Ile119と Mert334の疎水的な相互作用が，M12 ヘリックスの胃内腔側へのスライドを防ぐ『留め金』（latch）のような機能を果たし，ゲーティングと脱リン酸化の共役に重要な役割を担っていることを示している。従って，上記のような相互作用が観察された今回の立体構造
は，決して薬剤の結合によって誘発された人工的なコンフォメーションではなく，多くのタンパク質の薬剤結合構造がそうであるように，薬剤の結合がそのタンパク質が生体内で取りうる一状態に結合しこれを安定化することで得られた，胃内腔側へのゲートが開いた状態を捉えていると考えられる。

6. H＋ を吐き出すメカニズム
Post-Albers 機構によれば（Fig. 1), luminal-open E2P 状

態は，H＋ を胃内腔へと輸送した直後，細胞外から対向輸
送イオンの K＋ が結合する直前の状態ということになる。
事実，カチオン結合サイトは，仮に構造中に結合している

Fig. 7(Color online) Cation binding site.
a, Sequence alignment of the indicated transmembrane
helices among related P2-type ATPases. b, c, Close-up of thecation-binding site in H＋,K＋-ATPase (von) E2BeF in stick
representation, viewed approximately perpendicular to themembrane from the cytoplasmic side (b) and parallel to themembrane from the TM4 side (c). Dotted lines are shown
between residues within 3.5 Å between neighboring atoms,
presumably making hydrogen bonds or an electrostatic interaction (Lys791-Glu820). d, K＋-dependence of the speciˆc
activities of indicated mutants.

PCAB を取り除くと，通路を介して胃内腔の溶液と繋がっている。胃から調製した小胞を用いた H＋ 輸送に関する過去の報告によれば，H＋, K＋-ATPase は中性状態においを結 合し た状 態であ ると 考えて よいで あろ う。従 ってて， 1 分子の ATP 加水分解と共役して， 2 つの H＋ と 2

Glu820は Glu795と水素結合を形成している。この他にも，

つの K＋ を対向輸送する。しかしながら， ATP の加水分

Glu820は Asn792や近傍の水と水素結合を形成しており，解から得られる自由エネルギーによる制限から，胃の内部

Glu820 を中心とした水素結合ネットワークが形成されてが pH 3 以下の酸性条件下では，対向輸送される H＋ / K＋いる。これに加えて， Lys791 のアミノ基が， Glu820 と塩の数はそれぞれ 1 つにならざるを得ない2)。このように輸橋を形成できる距離（ 3.1 Å ）に存在していた。このよう

送化学量論が細胞外の pH によって変化する為には，pKaに，周りから多くの極性相互作用を受けている Glu820のの異なる 2 つの H＋ 結合サイトが必要であるが，詳細はカルボキシル基が置かれる特異な環境によって，これの一切不明であった。

pKa 値が大きく下がる（つまり H＋ が解離しやすくなる）

H＋, K＋-ATPase や Na＋, K＋-ATPase を 対 象 と し た 過去の変異体解析から，M4, M6 に存在する幾つかの酸性アことが示唆され， Glu820 は H＋ を放出するサイトの有力な候補と言える。

ミノ酸がカチオンの輸送に関わることが知られていたが，このような酸性アミノ酸の近接構造は，多くの酵素の活

この他に M5 のリジンの関与が指摘されていた（Fig. 7a）。

性中心に見られる。H＋, K＋-ATPase 同様胃で働くタンパ

このリジン（Lys791）は，H＋, K＋-ATPase にのみ普遍的

ク質，消化酵素ペプシンもその一つである。ペプシンの場に保存されており，Na＋,K＋-ATPase や SERCA ではセリ合，活性中心に存在する 2 つのアスパラギン酸が2.5 Å のンに置換されている。カチオン輸送サイトに存在する唯一距離にあり，互いの pKa を大きく変化させることで触媒の塩基性アミノ酸として， Lys791 は H＋, K＋-ATPase の機能を発揮する（実験的に求められた pKa 値が，それぞH＋ 輸送等重要な性質に関わることが指摘されてきた9)。

れ4.5, 1.2である）。また，ペプシンの外側に存在する酸性

カチオン結合サイトの構造（ Fig. 7bc ）で，まず目を引

側鎖のいくつかは，多くの水素結合や塩橋によって，胃のくのは，非常に近接した 2 つのグルタミン酸， Glu795 と中の酸性環境でも電離状態を保つことで，ペプシンが水和

Glu820 である（距離 2.5 Å ）。これら酸性アミノ酸は通常した状態に寄与していると考えられている22)。

負に帯電しているので，両者の近接構造は少なくともどち

もう一つのグルタミン酸， Glu343 であるが，こちらもらか 1 つがプロトネーションされていることを意味する。

P2-type ATPase では高度に保存されており，カチオン輸

Glu795Gln 変異体は野生型とほぼ変わらない活性プロフ

送への関与が報告されている。構造を見ると， Glu343 は

ァイルを示すことから（ Fig. 7d ），この場合 Glu795 が H＋

Lys791 （ 7.4 Å ）や他のグルタミン酸（ Glu795 と Glu820

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との距離がそれぞれ 5.7 Å と 4.7 Å ）と，離れた位置にあり，従って胃の内部が酸性の場合には H＋ を解離せず，弱酸性～中性状態のときにのみ H＋ を放出できると考えられる。
これらのグルタミン酸（Glu343, Glu795, Glu820）は，
H＋, K＋-ATPase に普遍的に保存されているが，Glu820は，
Na＋, K＋-ATPase や non-gastric

H＋,

K＋-ATPase （ a2isoform ， H＋ と 同 様 に Na＋ を 輸 送 す る と も 言 わ れ て いる）においては，これより短いアスパラギン酸に置換されている。より長いグルタミン酸であることが，H＋ の親和性を下げるために周りの極性基と相互作用するという点で有利なのかもしれないし，また H＋ と Na＋ の特異性にも関わる可能性がある。

7. Rb＋ 結合構造
H＋ を排出した後， H＋, K＋-ATPase は細胞外（胃内腔側）から対向輸送イオンである K＋（もしくはその同族体である Rb＋ ）をカチオン結合サイトに取り込み，これがE2P の脱リン酸化を促進することで輸送反応サイクルが進行する。今回の結晶化条件（200 mM RbCl, pH 6.5）においては，過去の報告に基づくならば 2 つの H＋ と交換する形で 2 つの Rb＋ が結合することが期待される。しかしながら，SCH28080結合構造には，カチオン結合部位近傍に Rb＋ が 1 つだけ結合していた（ Fig. 8ab ）。結合した
Rb＋ は主鎖のカルボニル基を含む幾つかの酸素原子によって配位されているが，その配位状態はどちらかというと非対称的であり， Na＋, K＋-ATPase の K＋ 閉塞構造（ K＋)2 E2 P で見られるような理想的な 6 ～ 8 配位とは対照的であった23)。H＋, K＋-ATPase の構造に基づいて計算した
partial valence (Rb＋ 結合位置において想定される価数，
0.41 ） は Na＋, K＋-ATPase の K＋ 閉 塞 構 造 に お け る 値

Fig. 8(Color online) Rb＋-bound (SCH)E2BeF structure.
a,b, Close-up view of the cation-binding site in H＋,K＋-ATPase (SCH)E2BeF viewed perpendicular to the membranefrom the cytoplasmic side (a) and parallel to the membranefrom TM4 side (b). Bound Rb＋ (purple) and water molecules (red) are indicated. c, d, K＋-occluded (K＋)2E2-MgF
state of Na＋, K＋-ATPase23) (light grey, PDB code: 2ZXE)
is superimposed on the Rb＋-bound (SCH)E2BeF state of
H＋, K＋-ATPase (PDB code: 5YLV, color ribbons). Pink
spheres (site I and II) indicate bound K＋ in the Na＋, K＋ATPase structure. Arrows indicate displacement of the TM4luminal portion from the luminal-open to the luminal-closed
form. e,f, Comparison of the cation-binding site between
Rb＋-bound (SCH)E2BeF (color ribbons) and (von) E2BeF(wheat, showing the inclination of Glu820 side chain
towards Rb＋ accompanied by Rb＋ binding (arrow).

（site I: 1.04, site II: 0.70）と比較して有意に低く，H＋,K＋-ATPase の（ SCH ) E2BeF 構造における Rb＋ の親和性は，本来 Rb＋ を閉塞するコンフォメーション（例えば（ Rb＋)E2P や（ Rb＋)E2 等）と比較して低いことが想定される。

を模倣していると考えられる。
それでは， Rb＋ の結合が，この後にどのような分子イ
ベントを引き起こすのであろうか

Na＋, K＋-ATPase の K＋ 閉塞構造23) との比較によると（Fig. 8cd），H＋, K＋-ATPase

Rb＋ が結合していない，（ von ) E2BeF との比較によると（ Fig. 8ef ）， Rb＋ の(SCH)E2BeF における Rb＋結合によって Glu820 が Rb＋ に向けて傾く様子が見られ結合位置は1.3 Å 程度ずれている。これは主に，二つの構る。過去の報告によれば，グルタミン酸の電荷を中和した＋＋造における M4 の位置の違いが影響している。 Na , K -変 異 体 Glu820Gln に お い て ， K＋ に 依 存 し な い ATPase

ATPase の構造では luminal gate に相当する M4 がゲート活性を示す表現型が報告されている24) （ Fig. 7d ）。この解を閉じるように動くことで K＋ を閉塞している。しかしな

釈 は ， Glu820Gln 変 異 体 が ， K＋ の 正 電 荷 に よ っ てがら， H＋, K＋-ATPase の場合，本来であれば Rb＋ の結Glu820 の負電荷が中和される状態，つまり常に K＋ が結合によってゲートが閉じるべきところを， SCH28080 が合した状態を模倣する為である，とされている。これらのM4 の動くべき位置に結合している為にゲートを閉じるこ

結果から， H＋, K＋-ATPase の Rb＋ 閉塞構造では， Rb＋とができない。この為に Rb＋ が本来閉塞されるべきコン

が Glu820側へ動いた位置に閉塞されることで， Glu820とフォメーションをとることが出来ないと考えられる。従っLys791 の塩橋が分断されるのではないか，と推測されて，H＋, K＋-ATPase(SCH)E2BeF構造は，H＋ 排出後にる。では，余剰の正電荷である Lys791の側鎖はどうなる

Rb＋ が結合した直後，閉塞状態を誘起する priming stateのであろうか。カチオン結合サイトにおいて， Lys791 を

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トピックス ■ 胃プロトンポンプの結晶構造解析によって明らかになった H＋ 排出機構

Fig. 9(Color online) A model for H＋ extrusion by the gastric proton pump.

挟んで Glu820 のちょうど反対側に Asp824 が存在する。

く胃酸抑制剤，そして近縁の P 型 ATPase の多くの結晶

この側鎖の電荷を中和した変異体 Asp824Asn の活性を測

構造がなければ，今回の結論は決して導き出されない。改定 す る と ， Glu820Gln 同 様 に K＋ に 依 存 し な い ATPase

めて，これまでの研究データの含蓄に感嘆するとともに，活性が観測された（Fig. 7d）。この結果は Asp824の負電荷

この結論に近いものを予測した G. Sachs や K. Munson のが Lys791の正電荷によって中和された状態を模倣してい慧眼25) に畏敬の念を禁じ得ない。結晶構造は道の終わり＋ 閉塞状態

では決してないが，道の終わりにたどり着くために『マッると解釈できる。この仮説は，しかしながら Kの構造解析によって検証されるべきであるが，上述の H＋プ』が非常に有用であるのも事実である。細胞膜を隔てたを押し出すという重要な働き以外にも， Lys791 は K＋ の

100 万倍の H＋ 濃度勾配を分子レベルで理解するために結合を関知して反応サイクルを次に進めるという役割をもは，どのように H＋ が押し出されるか，だけでは不十分で担っている可能性がある。

ある。押し出される仕組みが理解できたことで，今度は

8. H＋ 排出モデル
細胞内から取り込まれた H＋ を閉塞した E1P 状態において，カチオン結合サイトに存在する 3 つのグルタミン『どのように中性の（ H＋ 濃度の薄い）溶液から H＋ だけを汲み上げるのか』という逆の疑問が浮上してくる。ダイナミックに構造変化する胃プロトンポンプ作動機構の理解には，まだまだ残されたピースが多い。

酸はすべて H＋ を結合した状態にあると考えられる（ Fig.
9a）。これが構造変化によって E2P 状態，すなわち細胞外

謝辞（胃内腔側）にゲートを開いた状態になると（ Fig. 9b ），本研究の遂行に当たりご尽力頂きました，名古屋大学細Glu820に Glu795が近接し pKa 値を低下させる。これに加胞生理学研究センターの入江克雅博士，中西華代博士，藤えて正電荷を持つ Lys791のアミノ基が相互作用すること

吉好則博士，谷口真由美氏，ロックフェラー大学の鈴木博で，もはや Glu820 は H＋ を保持することができず，外部

視博士に感謝致します。本稿で使用した図の一部は中西華溶液の pH に関わらず，H＋ が解離する。Glu795はイオン代博士より提供頂きました。本研究の開始初期からご尽力

輸送経路の壁に露出しており， Glu820 から押し出された頂きました北海道大学の谷口和彌博士に感謝致します。

H＋ が，おそらく水素結合を経て，ちょうどビリヤードの参考文献

玉が押し出されるように 1 つだけ遊離する。 Glu343 は，それ自身の pKa （ 3 ～ 4 ）に依存してプロトンを 1 つ解離する。このメカニズムは，胃内腔が酸性になるにつれてイ
オン輸送化学量論が 2 個から 1 個へと変化するという仮説2) と矛盾しない。 H＋ を排出した後， H＋, K＋-ATPase
は K＋ を結合することで，反応サイクルが進行する。 K＋が Glu820に配位することで（Fig. 9c），Lys791との塩橋が解離し，閉塞状態（Fig. 9d）へと移行すると考えられる。

9. おわりに『H＋, K＋-ATPase がどのようにして pH 1 の胃酸に対して H＋ を放出するのか』という長年の謎に対して，構造的な証拠を示すことができた。この間に多くの研究者が必死に積み重ねてきた機能解析のデータや，阻害剤として働

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著者紹介阿部一啓
名古屋大学細胞生理学研究センター/大学
院創薬科学研究科 准教授
E-mail: kabe＠cespi.nagoya-u.ac.jp
専門生化学，P 型 ATPase，膜輸送体［略歴］
2004 年 北海道大学大学院理学研究科化学専攻博士後期課程 修了， 20032009 年
日本学術振興会特別研究員（ DC2, PD 京
都大学大学院理学研究科）， 2009 2012 年
社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム
特別研究員， 2012 年 京都大学特定研究員， 2013 2016年 名古屋大学細胞生理学
研究センター/大学院創薬科学研究科 助教，2016年より同所属 准教授。

The H＋ extrusion mechanism revealed by crystal
structures of the gastric proton pumpKazuhiro ABE1,2
Abstract

1Cellular and Structural Physiology Institute (CeSPI), 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Nagoya University, Nagoya 4648601, Japan

Gastric proton pump, H＋, K＋-ATPase, is a P-type ATPase responsible for the gastric acidiˆcation,and is thus an important drug target for treating gastric acid-related diseases. We present the
crystal structures of the H＋, K＋-ATPase in complex with two acid blockers, vonoprazan and
SCH28080, in the luminal-open E2P state. These drugs have partially overlapped, but clearly distinguishable binding modes, which are deˆned in the middle of a conduit running from the gastriclumen to the cation-binding site. The crystal structures also revealed a conserved lysine residue
that points to the juxtaposed carboxyl residues in the cation-binding site. The unusual conˆguration of the cation-binding site enables the extrusion of a single proton into the pH1 solution of thestomach, which corresponds to a million-fold proton gradient across the membrane, the highest
known cation gradient in any mammalian tissue.

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