トピックス
連続フェムト秒結晶構造解析が書き換える
銅含有亜硝酸還元酵素の反応機構
福田庸太
大阪大学工学研究科

井上〒5650871 大阪府吹田市山田丘 21

豪大阪大学工学研究科〒5650871 大阪府吹田市山田丘 21

溝端栄一
大阪大学工学研究科

要 旨〒5650871 大阪府吹田市山田丘21

われわれはこれまで，亜硝酸イオンを一酸化窒素に一電子還元する銅含有亜硝酸還元酵素（CuNIR）の構造生物学的研究をおこなってきたが，シンクロトロン X 線を用いた回折強度データ収集では測定中にタンパク質内部の銅中心が迅速に還元され，その周辺構造が変化してしまう問題があった。そこで，X 線自由電子レーザーを用いた連続
フェムト秒結晶構造解析により，銅中心の還元反応がおこる前の CuNIR の休止状態および基質結合状態のすがたをとらえることにした。得られた新しい構造に基づき，銅中心の還元反応にともなうプロトン移動機構の詳細なモデルを提案することができただけでなく，酵素反応時の亜硝酸イオンの構造変化に関する知見も得られた。

X 線結晶構造解析には，深刻な問題があった。強力な放1. はじめに射光 X 線が結晶中で水和電子を発生させ，これが金属イ

1.1 金属，タンパク質，X 線

オンを迅速に還元してしまう現象， X 線光還元（ X ray

金属は，美しい装飾品としてだけでなく，その頑丈さか

photoreduction）が起こるのである2,3)。酸化状態と還元状

ら道具や貨幣，武器の材料にもなる。他の民族が利用でき態とで，金属中心の配位構造は異なるため，回折データ収ない金属を利用できるようになれば，争いにおいて優位に集中の金属周りの構造変化は避けられない。

立つこともできる1)。人類の歴史は金属とともにあったと言っても過言ではなかろう。自然はしかし，人類が金属の

1.2

銅含有亜硝酸還元酵素（CuNIR）をめぐる問題

有用性に気づくはるか以前から，それを利用してきた。光

大気中の分子状窒素は，窒素固定によりアンモニアやア

合成，呼吸，酵素反応といった，生命を生命たらしめる多ンモニウムイオンの形で土壌や水中に蓄えられる。これら

くの化学反応は，金属イオンを含むタンパク質（金属タンの化合物が硝化作用によって窒素酸化物へと変換され，さパク質）によっておこなわれている。タンパク質はいくつ

らに脱窒と呼ばれる微生物の働きによって分子状窒素にまものアミノ酸が連なったもので，多くは独自の決まった立で段階的に還元されることで，地球における窒素循環の環体構造を持ち，その構造と機能は密接に関わっている。金は閉じられる。近年，固定された窒素を大気中へ戻す脱窒

属タンパク質の場合，金属中心周辺の構造はとりわけ，機過程が重要視されつつある，というのは，金属触媒を用いわ能の発現にとって重要である。 20 世紀中頃に John Ken-て窒素と水素からアンモニウムを人工的に合成する

drew と Max Perutz が そ れ ぞ れ myoglobin と haemoglo-

Haber Bosch 法の発明以来，固定される窒素量が爆発的

bin の X 線結晶構造解析に成功したのを皮切りに，さまざに増 え， 窒素 循環の バラ ンスが 崩れつ つあ るため であ

まなタンパク質の構造が明らかにされてきた。初めて構造る4) 。脱窒過程のうち特に注目されているもののひとつ解析されたタンパク質が鉄を含む金属タンパク質だったこは，亜硝酸イオン（ NO2－）を反応性の高い有毒な一酸化とは，偶然ではないかもしれない。生体内で重要な機能を窒素ガス（ NO ）に一電子還元する反応（ NO2－ ＋ 2H＋ ＋担っている金属タンパク質は，比較的大量に存在し，安定

e－ → NO ＋ H2O ）で，異化型の亜硝酸還元酵素（ nitrite

であることが多いため，初期の結晶学の標的としてうってreductase: NIR）によって触媒される。NIR はヘム鉄を含つけであっただろう。 20 世紀後半に放射光の利用が可能

むものと，銅を含むものに大別されるが，われわれはこれになると，金属タンパク質内の精密な配位構造も高分解能まで，後者，すなわち銅含有亜硝酸還元酵素（ CuNIR ）で決定することができるようになり，研究は急速に進展しに着目し，構造生物学的研究をおこなってきた。

た。しかし，そうした放射光を用いた金属タンパク質のCuNIR は分子量 37,000 程度の同一のサブユニットから

放射光 March 2017 Vol.30 No.2 ●53(C) 2017 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Researchなる 3 量体構造をとり，各分子に 2 つの銅結合部位を有分光学的データや計算化学的データ，モデル錯体の構造はしている5) 。われわれが研究に用いた Alcaligenes faecalis

どれも， N 原子のみが銅に配位したエンドオン型が中間由来 CuNIR の構造を Fig. 1 に示す。 2 つの銅部位は配位体であることを強く示唆している11)。

構造の違いから明瞭に区別される。外部からの電子受容部

多くの結晶構造が決定されているにもかかわらず，なぜ位であるタイプ 1 銅（T1Cu）は，2 つのヒスチジン（His），

反応機構が完全には解明されていないのだろうか。それに1 つのシステイン（Cys）， 1 つのメチオニン（ Met）が配はやはり X 線光還元が関わっている。回折データ収集時

位している。T1Cu はもういっぽうの銅部位であるタイプに CuNIR 中の銅サイトで X 線光還元が起こることは，顕2 銅（T2Cu）と，136番目のシステイン（Cys136）と135

微分光の結果が示しており15) ，基質結合型の結晶から回番目のヒスチジン（ His135 ）の間のペプチド結合を介し折データを集めている最中に NO2－ が NO や副生成物のて直結しており，T1Cu が受け取った電子はここを伝って水分子に変換され，活性中心周りの電子密度の解釈が困難

T2Cu へと流れる。 T2Cu は活性部位で，サブユニットどになることもわかっている15)。当然，NO 結合型構造でもうしの間に位置し， 3 つの His が配位している。 T2Cu の同じ問題があるだろう。したがって，これまでのシンクロ

上部には，1 つの水分子によって架橋された98番目のアス

トロン結晶構造解析（ Synchrotron

パラギン酸（Asp98）と255番目のヒスチジン（His255）

lography: SRX）の結果は，酵素本来のすがたを反映してが保存されており，これらの残基は触媒活性，とりわけ基いるとは言い難く，それらを基に反応機構を議論すること

質へ のプロ トン 供給に 寄与 してい ること が知 られ ていは難しいのである。

Radiation

Crystal-

る6,7)。
CuNIR は日本のグループによって発見された酵素だが8)，最初の結晶構造は海外のグループによって報告された5)。その後，海外のグループは基質や生成物との複合体構造をつぎつぎと決定し9,10)，CuNIR の反応機構はほとん2. 連続フェムト秒結晶構造解析（SFX）がとらえた無損傷構造
2.1 SFX が変えるタンパク質結晶学

ど解明されたかに思われてきた。しかし実際は，いくつもX 線自由電子レーザー（Xray Free Electron Laser:の疑問が残っている11) 。（ i )変異体を用いた活性測定の結XFEL）の登場によって，状況は一変した16)。1 枚の回折果などから，活性中心に保存された Asp と His がプロトパターン像を得るのに，通常，秒オーダーで X 線を照射

ン移動に関わっていることは明らかだが，その詳細な役割しなければならない SRX では，データ収集時間が，化学は不明である。（ ii ) T1Cu から T2Cu への分子内電子移動反応による原子の再配置が起こるよりも有意に長い。強力はプロトン移動と共役している，すなわちプロトン共役電なシンクロトロン X 線の照射によってタンパク質内部の子移動であることが示されており12,13)，NO2－ が T2Cu に

化学結合は容易に開裂したり結合長が変化したりするので，配位すると分子内電子移動が促進されることもよく知られSRX で得られるのは“ X 線損傷を受けた”構造である。

ているが13,14)，その機構は完全に理解されているわけではいっぽう XFEL が生み出す超高輝度かつフェムト秒オーない。（ iii ) CuNIR と生成物である NO との複合体の結晶

ダーの極短パルス X 線を用いれば，原子の再配置がおこ構造では， NO の N 原子と O 原子のどちらも T2Cu に配る前の，すなわち“無損傷状態”の情報を記録することが位したサイドオン型構造が観察されたが9,10)，溶液中でのできる。もちろん，金属中心の還元にともなう構造変化前Fig. 1(Color online) Structural overview of CuNIR (PDB code ID 1AS7, ref 9). The ribbon model of the overall structure is shown on the left side, and the structures around copper atoms (brown spheres) are shown by the stickmodel on the right side. Water molecules (red spheres) aligned from the catalytic site to the molecular surface arethought to be a proton channel 15). Dashed yellow and black lines show hydrogen bonds and coordination bonds,
respectively.

54 ● 放射光 March 2017 Vol.30 No.2

トピックス ■ 連続フェムト秒結晶構造解析が書き換える銅含有亜硝酸還元酵素の反応機構の原子の位置情報も得られるから，金属タンパク質の結晶構造解析に新たな道が開かれたことを意味する。既に，クライオループに固定した大型結晶を回転させながら
XFEL ビームを十分離れた間隔で多数照射しデータを収集する連続フェムト秒回転結晶構造解析（Serial Femtosecond Rotational Crystallography: SFROX）を用いて，シトクロム c 酸化酵素17)や光合成系 II18)といった金属タンパ
ク質の無損傷構造解析がおこなわれており， XFEL 結晶学の威力が示されてきた。 XFEL ビームを用いた他の結晶学的手法としては，多数の微結晶へ連続的にビームを照射し てデー タを 収集す る連 続フェ ムト秒 結晶 構造 解析（Serial Femtosecond Crystallography: SFX）がある16)。
これは，大きな結晶の作製が困難な膜タンパク質に応用でき19) ，時分割測定にも適した手法として期待されているのだが20,21) ， SFX のもうひとつの利点として，常温で測定ができる，ということが挙げられる。 SRX では， X 線損傷を低減するために結晶を液体窒素などで凍結させ，100 K 程度の極低温で測定をおこなうのが一般的である。

Fig. 2(Color online) Structural change of His255. Carbon atoms
in the SFX structure and the SRX structures are coloredmagenta and yellow, respectively. Gray meshes are 2mFo
DFc maps around His255 at 3.0 s (left: SFX; right: SRX).
The lower ˆgure shows switching of hydrogen bonds (dashedlines).

しかし，結晶を凍結させる際に，アミノ酸残基の立体配座22) や酵素基質複合体における結合様式23) が室温での構造から著しく変化する例が報告されている。こうした人工

さて， His255 の Nd 原子上の H 原子は，銅中心の還元的な構造変化は，誤った反応機構の提唱につながりかねなにともない，水素結合の相手を 279 番目のグルタミン酸

いため22) ，近年では室温以上の温度での測定がさかんに（ Glu279）の主鎖カルボニル O 原子から 280番目のスレオおこなわれているが，当然ながら放射線損傷が激しく，解ニン（ Thr280 ）の側鎖水酸基 O 原子へと変えることがわ析可能なデータを得るのにいくつもの結晶が必要なこともかったわけであるが，この水素結合の組み換えに関わる多い。 SFX を使えば，これらの問題を気にすることな

Glu279（種によってはグルタミン（Gln）の場合もある）

く，室温でデータ測定がおこなえるのである。

と Thr280 （種によってはセリン（ Ser ）の場合もある）の組は，これまで知られている全ての CuNIR に保存され2.2 銅中心の酸化還元状態の変化にともなうプロトン移動機構の解明ているだけでなく，A. faecalis から系統的に隔たった好熱

われわれは日本の XFEL 施設である SACLA において，SFX 構造と SRX 構造の比較でも同じような His の構造変2～10フェムト秒のパルス X 線を用い，脱窒菌 A. faecalis

化を観測できたため25)，これは CuNIR に普遍的な現象だ

由来の CuNIR の構造決定をおこなった24) 。得られた 2.0と 思 わ れ る 。 実 の と こ ろ ， T2Cu が 還 元 さ れ る こ と でÅ 分解能の SFX 構造と， SRX によって決定した 1.2 Å 分

His255 が構造変化するという仮説は，電気化学的なデー解能 の構造 を比 較する と， 保存さ れた活 性残 基で あるタに基づいて， 1999 年に大阪大学のグループが提唱してHis255 の構造の違いが明らかになった。つまり， His255

いたのだが14) ， SRX を用いたこれまでの構造解析ではのイミダゾール環周りの 2mFo DFc マップと呼ばれる電His255 の有意な構造変化が検出されなかったため，長ら子密度マップが示すように， X 線光還元の影響を受けた

く顧みられることがなかった。今回の結果は，この仮説をSRX 構造では，SFX 構造に比べ，His255のイミダゾール

支持するものである。

菌 Geobacillus thermodenitriˆcans 由 来 の CuNIR を 用 い た

環が20度ほど回転していた（Fig. 2）。なお，Fo と Fc はそ

His255 のイミダゾール環の回転が亜硝酸還元反応に重れぞれ，実験データから直接得られた構造因子とモデル構要であることを確かめるため，Thr280をバリン（Val）ま造から計算された構造因子を意味し， m と D は重みづけ

たは Ser に変異させた T280V 変異体と T280S 変異体をのための係数である。観測値| Fo |ではなく， 2m | Fo |作製した。 T280V 変異体では， His255が回転して水素結

D|Fc|を係数としてフーリエ合成による電子密度の計算を合を組み替えることができない。いっぽう T280S 変異体

おこなうと， Fc の計算に使われた構造モデルには含まれでは水素結合のスイッチングはおこなえるものの，Ser のていない（が，実際にはモデルに含まれねばならない）原

水酸基は Thr の水酸基よりも可動性が高いため，必ずし

子周りの電子密度がよりはっきりとあらわれるため， X

も水素結合の受け手になるとは限らない。天然の CuNIR

線結晶構造解析では 2mFo DFc マップに基づいて構造モ

で も Thr の か わ り に Ser を 有 し て い る も の が 存 在 す る

デルを構築していく。

が，その結晶構造を見ると，Ser が His と水素結合できな

放射光 March 2017 Vol.30 No.2 ●55

い構造を取りうることがわかる26) 。変異体を用いた亜硝が存在することがわかった（ Fig. 4a ）。さまざまなモデル

酸還元活性測定の結果，T280V 変異体では野生型の20，を検討した結果，占有率100の亜硝酸分子をひとつ配置

T280S 変異体では野生型の 29 の活性しかないことが明したモデルを用いた場合に mFoDFc マップと呼ばれる電らかになり，やはり His255のイミダゾール環の回転が活子密度マップ中の差電子密度が最も少なくなった。 m |Fo|D|Fc|を係数としてフーリエ合成による電子密度の計算性に寄与していることが支持された。
銅中心の還元による His255 のイミダゾール環の回転をおこなうと，あるべきモデルがない位置に正の電子密度は，なぜ重要なのだろう。われわれは，「His255は銅の還が，モデルがあるべきでない（が，モデルの置かれている）

元反応にともなうプロトン移動のスイッチである」という位置に負の電子密度が観測される。したがって，差電子密説を新たに提唱したい。カルボニル O 原子に比べると，度が最も少ないということは，亜硝酸分子をひとつ配置す

水酸基 O 原子の電気陰性度は小さいため，銅中心の還元るモデルが最も妥当だということを示唆しており，われわに付随する水素結合相手の交換後，H 原子は Nd 原子によれは無損傷の NO2－ 複合体構造が得られたと判断した。

り引きつけられることになるだろう。そのため，反対に

最終的に1.6 Å 分解能という，配位子の幾何構造を議論す

His255 の Ne 原子上の H 原子は， His255 と Asp98 の間にるのに十分な高分解での構造が得られ，この SFX 構造

存在する架橋水分子へと受け渡されることになり，と ， わ れ わ れ が 新 し く 決 定 し た 高 分 解 能 （ 1.3 Å ） のHis255からのプロトンの放出が促進されるのである（Fig.

NO2－ 複合体 SRX 構造（ Fig. 4b ）を比較すると，基質の3）。そして架橋水分子（あるいはさらにAsp98）を介して配位構造に違いが見られた。すなわち， SFX 構造では直NO2－ にプロトンが供給されると考えられる。架橋水分子

立型（ vertical mode ）で配位していた NO2－ が， SRX 構を介した His255からのプロトン移動が，近年の密度汎関

造では準サイドオン型（ near side-on mode ）をとってい数法を用いた計算27,28)でも支持されているのは興味深い事た（ Fig. 4c）。なお，Fig. 4a と 4b では，亜硝酸の電子密度実である。

をはっきりと示すために，亜硝酸分子を除いた構造を用い2.3 亜硝酸イオンは完全酸化型の T2Cu には直立型で配位する密度が，正の電子密度として mFoDFc マップに現れてい次にわれわれは，CuNIR と NO2－ との複合体の SFX を上にも述べたが， SRX の低温データ測定では結晶の温おこなった。与えられたビームタイムに限りがあり，満足度を急激に下げる際に基質の結合状態が変化することがあできるデータ収集ができなかった休止状態構造の時とは異りうる23)。そこで念のため，室温でも SRX 構造を決定しなり，複合体構造については十分な量のデータを得られた

たが，やはり NO2－ は準サイドオン型に近い配位様式をため，東京大学の中根崇智氏が Cu 原子の異常散乱を利用呈していた。また，過去に決定されていた NO2－ 複合体

した単波長異常散乱法（Single

Anomalous

SRX 構造は全て，準サイドオン型の配位様式であった。

DiŠraction: SAD）での位相決定を試みた。今回の CuNIR

このことからわれわれは，銅中心の還元に続いて， NO2－の結晶は空間群 P212121 に属し，結晶学的非対称単位中にの配位様式が変化するのだと考えた。

て計算した mFoDFc マップを示している。亜硝酸の電子

wavelength

る。

3 量体をひとつ，すなわち銅結合部位を 6 つ有するが，そでは，NO2－ が倒れこむように構造変化することでなにの全ての銅部位が特定され，さらに，全1026残基中，838が起こるのだろう。まず，NO2－ と T2Cu の軌道の重なり残基について自動トレースによってポリアラニンモデルがかたが変化し， N O 結合の開裂を引き起こすのだと考え構築できた。これは， SFX で得られたデータ用いた，天られる。また， NO2－ が構造変化すると His255 に近接す

然の重原子結合サイトによる SAD での位相決定の最初のるた め， イミ ダゾー ル環 を回転 させた 構造 のほう が，例となった。

His255 の立体障害は少なくなるだろう。すなわち，既に解析を進めると，T2Cu の上に，おにぎり形の電子密度

Fig. 3

述べた銅中心の還元にともなう His255の回転が有利にな(Color online) Proposed mechanism of e‹cient proton transfer driven by His255. Dashed lines represent H
bonds. Thin black arrows illustrate the directions to which H atoms are attracted.

56 ● 放射光 March 2017 Vol.30 No.2

トピックス ■ 連続フェムト秒結晶構造解析が書き換える銅含有亜硝酸還元酵素の反応機構

Fig. 4(Color online) NO2－ binding modes. (a) Nitrite in the SFX structure. The sigmaAweighted 2mFoDFc (1.0 s)
and omit mFoDFc (4.5 s) maps are shown as gray and red meshes, respectively. Hbonds (yellow) and coordination bonds (black) are represented by dashed lines. Carbon, nitrogen, oxygen and Cu atoms are colored cyan,
blue, red and brown. (b) Nitrite in the SRX structure (monomer A). 2mFoDFc (1.5 s) and omit mFoDFc (6.5s) maps are shown as gray and red meshes, respectively. Hbonds and coordination bonds are represented as ina). Carbon, nitrogen, oxygen and Cu atoms are colored magenta, blue, red and brown. (c) Comparison between
the SFX (magenta) and SRX structures.

るということであり，これは，NO2－ が T2Cu に配位した
ときに分子内電子移動が促進される事実と無関係ではない，とわれわれは考えている。

3. おわりにこれからの課題

今回われわれは， SFX という新たな手法を利用して無損傷構造を決定することで，より詳細な酵素反応機構に迫

2.4 Asp98はダイナミックな構造変化をするか？

りうることを示した。今後，時分割 SFX をおこなうこと

Samar Hasnain らのグループは，T2Cu 上部に存在するができれば， CuNIR 中での亜硝酸還元反応の全過程を追Asp98 が 大 き く 異 な る 2 つ の 立 体 配 座 ― 近 位 構 造

うことが可能になるかもしれない。生成物である NO の（Proximal conformation: P 構造）と門番構造（Gatekeep-

配位構造がサイドオン型なのかエンドオン型なのかについ

er conformation: G 構造)―を取り，特に基質が結合しては依然議論が絶えないが，時分割 SFX が答えを与えてたときに G 構造の割合が増えることを， CuNIR の原子分くれる可能性はおおいにある。

解能構造を決定することで明らかにし10)，Asp98の構造変

ところで，金属原子の電子構造は XFEL ビーム照射後化は活性に寄与しているという説を提唱してきた。ところ

数フェムト秒以内に変化するとされており31) ，タンパクが，そのような劇的な構造変化は CuNIR の多くの結晶構

質中の鉄硫黄クラスターについて，照射から数 10 フェム

造では見られないばかりか，ある種の CuNIR では立体障

ト秒以内に構造変化の起こる事例が示されている32) 。ま害的に G 構造を取ることがそもそも不可能ですらある29)。

た，シミュレーションによれば， XFEL ビーム照射が引Hasnain らの結晶構造でも G 構造は周辺残基と 3 Å 以内

き起こすクーロン爆発によって，タンパク質分子内の原子の近さにあり，かなり無理のある構造のように思える。今の位置は10フェムト秒程度でも変化する33)。したがって，

回われわれは， SFX を用いて常温での無損傷構造を決定

SFX 構造が真に無損傷構造であるかどうかは，今後さらしたわけだが， s レベルを 0.2 まで下げた 2mFo DFc マッに詳しく検討されねばならないだろう。今一つの問題は，

プでも，G 構造の電子密度は観察されなかった。したがっわれわれの研究を含め， XFEL を用いたタンパク質結晶て， G 構造は X 線損傷や結晶凍結などの人為的操作が生学は今のところ，生化学的分光学的データをもとに予測

みだしたものの可能性がある。もちろん，酵素反応中にされたモデルとの辻褄あわせに努めていることである。た

Asp98が全く動かない，とはわれわれも考えておらず，効

しかに，これまで提唱されてきたモデルを構造解析によっ率的な触媒作用のためにある程度の動きはあるのだろう。

て可視化し，実証することには重要な意味がある。しかし，

彼らは最新の報告でわれわれの論文を引用してはいるもの

XFEL の特性を活かして全く未知の現象を発見できたとの30)，われわれのデータへの言及はない。

きこそ，本当に新しい研究の幕開けといえるのではないだ

放射光 March 2017 Vol.30 No.2 ●57

ろうか。われわれはこの可能性の開拓に向け，日夜研究に勤しんでいるところである。
謝辞

8)
9)
10)

本研究は，元大阪大学工学研究科修士課程学生 Tse Ka
Man 氏，東京大学の中根崇智氏，井上茂之博士，濡木理教授，大阪大学蛋白質研究所の鈴木守准教授，理化学研究

11)
12)

所の平田邦生博士，菅原道泰博士，南後恵理子博士，岩田想教授，矢橋牧名博士，京都大学の中津亨准教授，桝田哲

13)

哉助教，高エネルギー加速器研究機構の湯本史明特任准教授，松垣直宏准教授，浦項工科大学校の Changyong Song准教授，高輝度光科学研究センターの登野健介博士，城地
保 昌 博 士 ， 亀 島 敬 博 士 ， 初 井 宇 記 博 士 ， University ofKonstanz の Kay Diederichs 教 授 ， University of British
Colombia の Michael E. P. Murphy 教 授 と の 共 同 研 究 である。この場を借りてお礼を申し上げる。 SFX のデータ
収集は SACLA BL3（課題番号2013B8045, 2014B8050,
2015A8026, 2015A8048, 2015A8049 and 2015B8047）で，SRX データの収集は SPring 8 BL26B1 / B2 ， BL38B1 ，BL32XU および BL44XU にておこなった。これらのビー

ムラインに関わる全てのスタッフとエンジニアの皆様に感謝申し上げる。CuNIR の活性測定は University of British
Colombia の Angele Arrieta 氏にお世話になった。また，

本研究は，文部科学省 X 線自由電子レーザー重点戦略研
究課題「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発」

14)
15)
16)
17)
18)
19)
20)
21)
22)
23)

および JSPS 科研費 15K18487 の支援を受けて実施した。
計算解析は SACLA に併設された HPC システムおよびミ24)

ニ京スーパーコンピュータシステムを利用して実行した。

参考文献
1)
2)

3)

4)
5)
6)

7)

J. Diamond: Guns, Germs, and Steel: the Fates of Human
Societies, (W.W. Norton, 1997).
J. Yano, J. Kern, K. D. Irrgang, M. J. Latimer, U.
Bergmann, P. Glatzel, Y. Pushkar, J. Biesiadka, B. Loll, K.
Sauer, J. Messinger, A. Zouni and V. K. Yachandra: Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 102, 12047 (2005).
I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A. M. Stock, S. A.
Maves, D. E. Benson, R. M. Sweet, D. Ringe, G. A. Petsko
and S. G. Sligar: Science 287, 1615 (2000).
N. Gruber and J. N. Galloway: Nature 451, 293 (2008).
J. Godden, S. Turley, D. Teller, E. Adman, M. Liu, W.
Payne and J. LeGall: Science 253, 438 (1991).
M. J. Boulanger, M. Kukimoto, M. Nishiyama, S.
Horinouchi and M. E. Murphy: J. Biol. Chem. 275, 23957(2000).
K. Kataoka, H. Furusawa, K. Takagi, K. Yamaguchi and S.
Suzuki: J. Biochem. 127, 345 (2000).

58 ● 放射光 March 2017 Vol.30 No.2

25)
26)
27)
28)
29)

30)
31)
32)
33)

H. Iwasaki, S. Shidara, H. Suzuki and T. Mori: J. Biochem.
53, 299 (1963).
EI. Tocheva, FI. Rosell, AG. Mauk and ME. Murphy:
Science 304, 867 (2004).
S. V. Antonyuk, R. W. Strange, G. Sawers, R. R. Eady and
S. S. Hasnain: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 12041(2005).
A. C. Merkle and N. Lehnert: Dalton Trans 41, 3355 (2012).
S. Brenner, D. J. Heyes, S. Hay, M. A. Hough, R. R. Eady,S. S. Hasnain and N. S. Scrutton: J. Biol. Chem. 284, 25973(2009).
N. G. Leferink, C. Han, S. V. Antonyuk, D. J. Heyes, S. E.
Rigby, M. A. Hough, R. R. Eady, N. S. Scrutton and S. S.
Hasnain: Biochemistry 50, 4121 (2011).
K. Kobayashi, S. Tagawa, Deligeer and S. Suzuki: J.
Biochem. 126, 408 (1999).
M. A. Hough, S. V. Antonyuk, R. W. Strange, R. R. Eadyand S. S. Hasnain: J. Mol. Biol. 378, 353 (2008).
H. N. Chapman, P. Fromme, A. Barty, T. A. White, R. A.
Kirian and A. Aquila et al.: Nature 470, 73 (2011).
K. Hirata, K. ShinzawaItoh, N. Yano, S. Takemura, K.
Kato and M. Hatanaka et al.: Nat. Methods 11, 734 (2014).
M. Suga, F. Akita, K. Hirata, G. Ueno, H. Murakami and Y.
Nakajima et al.: Nature 517, 99 (2015).
W. Liu, D. Wacker, C. Gati, G. W. Han, D. James and D.
Wang et al.: Science 342, 1521 (2013).
C. Kupitz, S. Basu, I. Grotjohann, R. Fromme, N. A.
Zatsepin and K. N. Rendek et al.: Nature 513, 261 (2014).
J. Tenboer, S. Basu, N. Zatsepin, K. Pande, D. Milathianaki
and M. Frank et al.: Science 346, 1242 (2014).
J. S. Fraser, M. W. Clarkson, S. C. Degnan, R. Erion, D.
Kern and T. Alber: Nature 462, 669 (2009).
D. A. Keedy, H. van den Bedem, D. A. Sivak, G. A. Petsko,
D. Ringe, M. A. Wilson and J. S. Fraser: Structure 22, 899(2014).
Y. Fukuda, K. M. Tse, T. Nakane, T. Nakatsu, M. Suzuki
and M. Sugahara et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113,2928 (2016).
Y. Fukuda, K. M. Tse, M. Suzuki, K. Diederichs, K. Hirata
and T. Nakane et al.: J. Biochem. 195, 527 (2016).
T. J. Lawton, K. E. Bowen, L. A. Sayavedra-Soto, D. J. Arp
and A. C. Rosenzweig: J. Biol. Chem. 288, 25575 (2013).
Y. Li, M. Hodak and J. Bernholc: Biochemistry 54, 1233
(2015).
M. Lintuluoto and J. M. Lintuluoto: Biochemistry 55, 4697
(2016).
Y. Fukuda, K. M. Tse, M. Lintuluoto, Y. Fukunishi, E.
Mizohata, H. Matsumura, H. Takami, M. Nojiri and T.
Inoue: J. Biochem. 155, 123 (2014).
S. Horrell, S. V. Antonyuk, R. R. Eady, S. S. Hasnain, M. A.
Hough and R. W. Strange: IUCrJ 3, 271 (2016).
S. K. Son, H. N. Chapman and R. Santra: Phys. Rev. Lett.
107, 218102 (2011).
K. Nass, L. Foucar, T. R. Barends, E. Hartmann, S. Botha
and R. L. Shoeman et al.: J. Synch. Rad. 22, 225 (2015).
R. Neutze, R. Wouts, D. van der Spoel, E. Weckert and J.
Hajdu: Nature 406, 752 (2000).

トピックス ■ 連続フェムト秒結晶構造解析が書き換える銅含有亜硝酸還元酵素の反応機構

著者紹介
福田庸太

井上

大阪大学大学院工学研究科応用化学専攻
助教
E mail: y _ fukuda ＠ chem.eng.osaka u.
ac.jp
専門生物無機化学［略歴］
2014 年 3 月大阪大学大学院工学研究科博士後期課程修了。博士（工学）。 2014 年 4月コロンビア大学ポストドクトラルフェ
ロー。2016年 4 月より現職。

大阪大学大学院工学研究科応用化学専攻
教授
Email: inouet＠chem.eng.osakau.ac.jp
専門構造生物化学［略歴］
1994 年 3 月大阪大学大学院工学研究科博士後期課程修了。博士（工学）。
1994 年同工学部助手， 1999 年同工学部講師， 2002 年同工学研究科准教授， 2008 年より現職。 2001 2004 科学技術振興機構
さきがけ研究員兼務。

豪

溝端栄一
大阪大学大学院工学研究科応用化学専攻
講師
E mail: mizohata ＠ chem.eng.osaka u.
ac.jp
専門構造生物学，シリアルフェムト秒結
晶学［略歴］
2003 年 3 月 大阪大学大学院工学研究科
物質化学専攻博士後期課程修了。博士（工学）。
2003 年 4 月 理化学研究所横浜研究所リサーチアソシエイト。
2005 年 11 月 インペリアルカレッジ
ロンドン客員研究員。
2006 年 9 月 ERATO 岩 田 ヒ ト 膜 受 容 体
プロジェクト英国サイト研究員（兼務）。
2007 年 7 月 ダ イ ヤ モ ン ド  ラ イ ト 
ソース協力研究員（兼務）。
2009 年 4 月 大阪大学大学院工学研究科
応用化学専攻助教。
2015年 4 月より現職。

放射光 March 2017 Vol.30 No.2 ●59Serial femtosecond crystallography revises reaction mechanism of copper-containing nitrite
reductase
Yohta FUKUDA

Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Osaka University, 21 Yamadaoka, Suita, Osaka 5650871, Japan

Tsuyoshi INOUE

Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Osaka University, 21 Yamadaoka, Suita, Osaka 5650871, Japan

Eiichi MIZOHATA

Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Osaka University, 21 Yamadaoka, Suita, Osaka 5650871, Japan

Abstract

We have studied copper-containing nitrite reductase (CuNIR), which catalyzes one electron
reduction of nitrite to nitric oxide, using structural biological techniques; however, copper centersin the enzyme are rapidly reduced by synchrotron X-ray irradiation and easily change their structures. To determine CuNIR structures in resting and substrate-binding states before reduction ofcopper centers, serial femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers was utilized.
Not only was a detailed model of redox-coupled proton transfer proposed based on new structures, but insight into a structural change of nitrite in the enzymatic reaction was obtained.

60 ● 放射光 March 2017 Vol.30 No.2