材料表面−生体分子相互作用の直接解析に基づく生体適合性の発現機構の解明
九州大学大学院工学研究科

高原淳

The n-octadecyltrichlorosilane (OTS, CH3(CH2)17SiCl3), the [2-(perfluorooctyl)ethyl]trichlorosilane (FOETS,CF3(CF2)7CH2CH2SiCl3) and their mixed monolayers were used as the model surfaces for the study of protein
adsorption mechanism. The ATR-FT IR flow cell study on protein adsorption behavior revealed that the adsorption
amount of bovine serum albumin (BSA) onto each OTS and FOETS monolayer increased remarkably in an initialstage of adsorption experiment and attained an equilibrium within a few minutes at pH=7.5. In the case of the (OTS/FOETS) mixed monolayer, the amount of protein adsorption was apparently suppressed in comparison with thecase for the OTS and the FOETS monolayers. The atomic force microscopic (AFM) observation of BSA adsorption
behavior onto monolayer surface in a BSA solution at pH=7.5 showed that BSA was preferentially adsorbed onto theFOETS phase of the (OTS/FOETS) mixed monolayer. In contrast, the selective adsorption of BSA onto the FOETS
phase was not observed at the isoelectric point of BSA (pH=4.7). The interaction between BSA and the surface of(OTS/FOETS) mixed monolayer was evaluated on the basis of the adhesion force measurement by AFM.
When
the gold-coated tip was used as a control experiment, the adhesion force between tip and surface was less than 1 nN.
In the case of the BSA immobilized tip, the adhesion force was ca. 5 nN and showed multiple minima in retract curve
because of the multi-point contacts of BSA with the monolayer surface or the chain unfolding of BSA.

面が必要となる。

１ 緒 言

一般に、両親媒性化合物からなる単分子膜は、人工材料が体液と接触した場合、材料表面には膜調製を水面上で行うため、分子レベルでの配向まず体液中のタンパク質が吸着し、その後、細胞制御が可能である。しかしながら、環境の変化にとの相互作用が起こる。このため、材料表面の化伴い表面構造が不安定になるため、特に水中での学構造すなわち親水性、疎水性、荷電、結晶性及応用には耐えることが出来ない。著者らは、水面びミクロ相分離構造などがどのようにタンパク質上で有機シラン化合物を重合し、基板上に固定化吸着挙動に影響するかを解明することは抗血栓性するという新規な高分子化単分子膜調製法で水中材料をはじめとする生医学材料を設計するためのでも安定な疎水性表面が形成できることを見いだ

基礎的な知見となる。高分子表面への生体成分のした２−８）。有機シラン単分子膜は分子間で二次元吸着に関する研究が活発に行われているが、医用的に重合し、さらに単分子膜と基板の間に共有結材料として最も実用化が進んでいるセグメント化合及び多重の水素結合を形成するため、環境変化ポリウレタンなどの多相系高分子では表面構造がに対して安定で表面構造再編成を示さない単分子環境に依存して再編成を示すため、表面構造の制膜を形成する２）。したがって、ラングミュアー法

御は極めて困難である１）。高分子材料の生体適合により調製された有機シラン単分子膜は、タンパ性の発現機構を解明するためには、表面組成が明ク質吸着挙動の研究における高分子モデル表面と確で、表面構造の経時変化のない安定なモデル表して非常に有用である。

Elucidation of Mechanism of Biocompatibility on the basis of the Direct
Analysis of Interaction between Materials
Surface and Biological Components
Atsushi Takahara
Graduate School of Engineering,
Kyushu University,Higashi-ku,
Fukuoka 812-8581, Japan

本研究では、表面構造を制御した安定な固定化
有機トリクロロシラン単分子膜をラングミュアー法により調製し、その表面へのタンパク質の吸着挙動を多重全反射赤外吸収分光（ATR− FT− IR）
フローセル測定及び原子間力顕微鏡（AFM）観察に基づき評価した。さらにタンパク質修飾カンチ−2−材料表面ー生体分子相互作用の直接解析に基づく生体適合性の発現機構の解明

レバーを用いて探針と有機トリクロロシラン単分ルで平滑な表面構造を有することが明らかであ

子膜表面間に働く力を評価した。

る。Fig. ２は（OTS/FOETS）⒜（25/75）、⒝（50/50）及び⒞（75/25）混合単分子膜の AFM 像である。

２ 実 験

基板上に単分子膜が固定化されていることをＸ線

有機シラン化合物としてアルキル基を疎水基に光電子分光測定及び多重全反射赤外分光測定によ有する n-octadecyltrichlorosilane（OTS）、及び表（OTS/FOETS）混合単分子膜は海り確認した２）。

面自由エネルギーの低いフルオロアルキル基を疎島状のドメイン構造を示した。AFM 像の高さプ

水基に有する［2−（perfluorooctyl）ethyl］trichloro-

ロファイルより評価した島状ドメインとマトリクsilane（FOETS）を用いた。Fig. １はラングミュア

スの高さの差は約 1.3nm であり、これは OTS とー法による有機シラン単分子膜の調製過程の模式FOETS の分子長の差に対応している。また、島図である。水面上で重合した OTS、FOETS 単分状ドメインの数及び寸法は OTS の分率とともに子膜及び（OTS/FOETS）混合単分子膜を垂直引増加した。島状ドメインの占める面積比は π− A

き上げ法により水酸化処理を施したシリコンウェ曲線からの分子極限占有面積より計算される OTS２−８）。フローセル成分の面積比と一致した。これらの事実から円を組み込んだ赤外吸収装置を使用し、ATR− FT−

柱状ドメインは OTS 成分であり、マトリクスはハー上に移し取り、固定化した９、10）

IR 法

により単分子膜の表面と牛血清アルブミ

FOETS 成分であると結論できる。また、Fig. ２ン（BSA）の相互作用を検討した。表面に単分子⒞の（OTS/FOETS）（75/25）混合単分子膜の場合、膜を固定化したシリコンプリズムをフローセルにOTS の分率が 75 モル％でも OTS 成分はマトリク−１）をスを形成せず、依然として円形のドメインを形成流動させ、赤外吸収差スペクトルの経時変化を追した。さらに、（OTS/FOETS）（75/25）混合単分設置し、BSA リン酸緩衝溶液（10mg・mL４）跡した 。また、AFM 観察によりタンパク質吸子膜の OTS 成分の結晶化が ED 像観察により確着挙動を評価した。単分子膜を固定したシリコン認された。結晶（10）面間隔は約 0.42nm であり、−１の BSA 溶液に浸漬し、OTS 単独単分子膜のそれとよく一致した。また、

BSA 溶液浸漬後の試料を空気中で乾燥後、タッピアルキル基を有するシラン化合物同士の混合単分子

ングモードで AFM 観察を行った。BSA と（OTS/膜である（OTS/n− dodecyltrichlorosilane（DDTS）FOETS）混合単分子膜との相互作用はリン酸緩衝（非晶性））混合単分子膜においても、相分離構造

液中での BSA 固定化探針と単分子膜表面間に働が確認された４）。これらの結果より、OTS 成分のくフォースカーブ測定に基づき評価した。金蒸着結晶化が（OTS/FOETS）混合単分子膜の相分離のした AFM のカンチレバーチップの表面に 3,3−ジ駆動力であると結論できる。

ウエハーを 20µg・mLチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（DSP）を吸着させ、さらに BSA を DSP と反応させ固定化した

３. ２ ATR− FT− IR フローセル法による単分子膜表面への BSA 吸着挙動の評価

11）。

ラングミュアー法により調製した有機トリクロ

３ 結果と考察

ロシラン単分子膜は、分子配向が制御されており、

３. １ 混合単分子膜の表面構造

環境変化に対して安定な表面構造を有するため、

電 子 線 回 折（ED）像 観 察 に よ り、OTS 及 びタンパク質の吸着実験に適している。有機トリク

FOETS 単分子膜は室温においてそれぞれ結晶性

ロロシラン単分子膜と BSA の相互作用を ATR−２−８）。まFT− IR フローセル法に基づき検討した。OTS 及た、AFM 観察よりこれらの単分子膜は nm レベ

び FOETS 単分子膜及び（OTS/FOETS）混合単分及び非晶性であることが明らかとなった−3−

Fig. １ Schematic representaion of preparation process of organotrichlorosilane monolayer.

−4−

材料表面ー生体分子相互作用の直接解析に基づく生体適合性の発現機構の解明

Fig. ２ AFM images of the (OTS/FOETS) ⒜ (25/75), ⒝ (50/50), ⒞ (75/25) mixed monolayers.

Fig. ３ Variation of amount of adsorbed BSA on the surfaces of the OTS, FOETS monolayers and (OTS/FOETS)
mixed monolayer immobilized onto the Si IRE with time.

子膜をシリコン単結晶の内部反射エレメント上に垂直引き上げ法により固定化した。Fig. ３は ATR− FT− IR フローセル法により評価した種々の有機
トリクロロシラン単分子膜表面への BSA の吸着量の経時変化である５、６）。流動させた BSA の溶液濃度は、10mg mL1550cm−１である。BSA の吸着量は、−１に観測される amide Ⅱの吸収強度からFig. ４ ⒜ Tapping mode AFM image of the OTS monolayer
surface after exposure to a BSA 0.1mg mL −１ solution inPBS (pH=7.5) at 293 K for 10 min and ⒝ the height profile
along the line shown in ⒜ .

計算した。有機トリクロロシラン単分子膜表面への BSA 吸着量は吸着初期から高い値を示し、10とが明らかとなった。これは、（OTS/FOETS）

分以内で吸着平衡に到達した。OTS 及び FOETS混合単分子膜表面が表面自由エネルギーの異な単分子膜表面への BSA の平衡吸着量は 0.18 〜る相から構成される相分離構造を有しているこ（OTS/FOETS）
0.20µg cm−２であったのに対し、とと相関があると考えられる。この吸着機構に関−２混合単分子膜では 0.05µg cm程度であり、相分離単分子膜表面への BSA の吸着は抑制されるこ

しては、AFM 観察の結果に基づき次節で詳細に議論する。

−5−

３. ３ AFM 観察による有機トリクロロシラン単スにより除去されると考えられる。以上の結果は、分子膜表面への BSA 吸着挙動の評価

BSA は OTS 単分子膜表面へ end− on の状態で吸OTS 及び FOETS 単分子膜及び（OTS/FOETS）

着していることを示唆している。

混合単分子膜表面への BSA の吸着状態（分布及Fig. ５⒜は、0.1mg mL −１BSA の PBS 溶液へび配向状態）の AFM 観察を行った。Fig. ４⒜は、室温で 10 分間浸漬した後の FOETS 単分子膜表−１

BSA の PBS 溶液へ室温で 10 分間面のタッピングモードでの AFM 像及び ⒝白線部浸漬した後の OTS 単分子膜表面のタッピングモ分の高さプロファイルである。AFM 像より BSAードでの AFM 像及び ⒝ 白線部分の高さプロフは FOETS 単分子膜表面に均一に吸着することがァイルである。像中明るい部分は OTS 単分子膜明らかである。吸着層の厚みを評価するため、コ表面に吸着した BSA に相当する。Fig. ４⒜より、ンタクトモードでカンチレバーに斥力をかけた状

BSA は OTS 単分子膜表面に二次元網目状に吸着態で走査を行うことにより吸着した BSA を除去することが明らかとなった。また、Fig. ４⒝より、し穴を形成させた（Fig. ５⒞）。像中暗い部分はBSA 吸着層の厚みは約 14nm であった。X 線構造

FOETS 単分子膜表面に対応する。Fig. ５⒟ はそ

0.1mg mL2

解析に基づき BSA は 4.1×14.1nm の回転楕円体であることが明らかにされている12、13）。本吸着実のラインプロファイルである。BSA 吸着層の厚さは約 4nm であったことから、BSA は FOETS 単

験では BSA を有機トリクロロシラン単分子膜表分子膜表面に side− on の状態で吸着していること面へ吸着した後、PBS によりリンスを行っているを示唆している。

ため、弱い相互作用で吸着している BSA はリン

OTS 及び FOETS 単分子膜の単独系での吸着

Fig. ５ Tapping mode AFM image of the FOETS monolayer surface after exposure to a BSA 0.1 mg mL −１ solution in PBS(pH=7.5) at 293 K for 10 min and ⒝ the height profile along the line shown in ⒜ . The square hole at center of the image
shown in ⒞ was formed by operateing AFM in the constant mode at repulsive imaging force. ⒟ The height profile along theline shown in ⒞ .

−6−材料表面ー生体分子相互作用の直接解析に基づく生体適合性の発現機構の解明

挙動について以下議論する。FOETS 単分子膜はOTS 単分子膜より表面自由エネルギーが低いた
め、FOETS 単分子膜の水との界面自由エネルギーは OTS に比べて大きい値となる。FOETS 単分子膜表面に BSA は side− on の状態で吸着するた
め、BSA 分子と FOETS 単分子膜表面との接触面積は end− on の状態で吸着する OTS 単分子膜の場合のそれと比較して大きい。また、CD スペク
トル測定より、BSA は界面自由エネルギーが大
きい FOETS 単分子膜への吸着の場合の方がより大きなコンホメーション変化が生じていることが明らかになっている６）。したがって、BSA 分子はOTS 単分子膜表面と比較して、FOETS 単分子膜表面へより強固に吸着していると結論できる。
Fig. ６ ⒜ は、0.1mg mL− １ BSA の PBS 溶 液（pH=7.5）へ室温で 10 分間浸漬した後の (OTS/FOETS) 混合単分子膜表面のタッピングモードでの AFM 像及び ⒝ 白線部分の高さプロファイルである。BSA は side− on の状態で FOETS 相のみに選択的に吸着した。ATR− FT− IR フローセル法から得られた結果と対応させるため、BSA の濃度を 10mg mL−１として同様な観察を行った結果、0.1mg mL−１の場合と同様、BSA の FOETS 相へ
６）

Fig. ６ ⒜ Tapping mode AFM image of the OTS monolayer
surface after exposure to a BSA 0.1 mg mL −１ solution in
PBS (pH=7.5) at 293 K for 10 min and ⒝ the height profile
along the line shown in ⒜ .

態に大きな影響を与えると考えられる。さらに、（OTS/の選択吸着が観測された 。このように、疎水性の単分子膜表面と水との間の界面自由エネ

FOETS）混合単分子膜における FOETS 相へのルギーを極小にするために、BSA が単分子膜表面BSA の選択吸着は BSA の溶液濃度に強く依存しに吸着する際、大きなコンホメーション変化が生ない。また、in situ AFM 観察より、FOETS マトじる必要がある。Fig. ７は（OTS/FOETS）混合単リクス上の BSA の吸着面は時間とともに増加す

分子膜における BSA の FOETS 相への選択吸着るが、OTS ドメイン上には BSA の吸着はほとん過程の模式図である。
（OTS/FOETS）混合単分子

ど起こらないことが明らかとなった。これらの結膜の場合、OTS 相あるいは FOETS 相への BSA

果より、（OTS/FOETS）混合単分子膜表面におけの吸着挙動は、BSA と単分子膜表面との相互作る BSA の吸着の抑制は BSA の FOETS マトリク用と吸着された BSA と溶液中に存在する BSA とスへの選択吸着に起因すると結論できる。の静電的反発に依存すると予想される。吸着の初タンパク質分子と単分子膜表面間における相互期過程において、BSA が FOETS 相に吸着される作用の強さは疎水基を水界面に配向した有機トリと、OTS 相に吸着した場合と比較してより大きなクロロシラン単分子膜の場合、疎水性相互作用に界面自由エネルギーの低下が生じるため、FOETS強く依存する。また、BSA の等電点は pH=4.7 付相への優先的な吸着が生じる。吸着の進行に伴い、近であり、pH=7.5 では BSA は負に荷電している

FOETS 相に吸着した BSA はコンフォメーションため、BSA 分子間のイオン反発は BSA の吸着状変化することで定常状態に到達する。一方、OTS−7−

Fig. ７ Schematic representation of preferential adsorption of BSA onto the FOETS phasein the (OTS/FOETS) mixed monolayer.

相においては BSA と OTS 単分子膜表面間の弱い的反発がない状態では、BSA 分子は OTS 相及び疎水性相互作用及び FOETS 相に吸着された BSAFOETS 相に均一に吸着することが明らかとなっと溶液中にある BSA との間の静電的反発のため、た。この結果は、混合単分子膜表面の BSA 吸着

BSA は end-on で吸着し接触めｎ積と吸着相互作において、BSA 分子間の静電的反発は、選択吸着用はより小さい。このため、OTS 相に吸着したの発現の重要な要因であることを示している。しBSA はリンスにより容易に除去され、OTS 相へたがって、（OTS/FOETS）混合単分子膜におけるの BSA の吸着はほとんど観測されなかったと考pH=7.5 での BSA の FOETS 相への選択吸着は、えられる。

単分子膜表面と水溶液間の界面自由エネルギーのこの選択吸着機構を確認するため、BSA の等電点である pH=4.7 の条件で（OTS/FOETS）混合単極小化と負に荷電した BSA 分子間の静電的反発により発現していると結論できる。

分子膜表面への BSA の吸着挙動を評価した。Fig.
８⒜は、0.1mg mL −１ BSA の PBS 溶液（pH=4.7）

３. ４ タンパク質と相分離表面間に働く力

へ室温で 10 分間浸漬した後の（OTS/FOETS）混AFM はチップと表面に働く力を高精度で検出

合単分子膜表面のタッピングモードでの AFM 像することが出来る。AFM を用いて BSA 固定化チ及び ⒝ 白線部分のラインプロファイルである。

ップと単分子膜表面間に働く力を測定した。Fig.

等電点 pH=4.7 の場合、pH=7.5 と同じ吸着時間

９はリン酸緩衝液中で AFM により測定した金蒸

では、BSA はより速い速度で単分子膜表面に吸着チップ及び BSA 固定化チップと混合単分子膜着した。また、Fig. ８より明らかなように、静電の OTS 相と FOETS 相との間働く典型的なフォ−8−材料表面ー生体分子相互作用の直接解析に基づく生体適合性の発現機構の解明

Fig. ９ Force-distance curves between AFM tip and OTS
or FOETS phase in PBS. ⒜ unmodified tip ⒝ BSA immobilized tip.

Fig. ８ ⒜ Tapping mode AFM image of the (OTS/FOETS)
mixed monolayer surface after exposure to a BSA 0.1
mg mL −１ solution in PBS (pH=4.7) at 293 K for 10 minand ⒝ the height profile along the line shown in ⒜ .

4 結 論
ラングミュアー法により（OTS/FOETS）混合単分子膜を調製すると相分離構造が形成されることを見いだした。この海島状相分離構造形成には構ースカーブである。チップと単分子膜との相互作

成成分の結晶化挙動が非常に重要な因子であるこ用はチップが単分子膜表面から離れていく際の凝とを明らかにした。ATR− FT− IR フローセル法及着力から評価できる。BSA を固定化していない金び AFM 観察により、混合単分子膜への BSA 吸蒸着チップの場合、凝着力が 1 nN 以下であったが、着挙動において、単分子膜表面と水溶液間の界面BSA 固定化チップを用いた場合は 5 nN 程度であ自由エネルギーの極小化と負に荷電した BSA 分った。また、金蒸着チップでは凝着力が単一ピー子間の静電的反発により、選択吸着が発現される

クを示すが、BSA 固定化チップでは多数の極小値ことを明らかにした。

を示した。これは BSA 分子の単分子膜表面との多点接触あるいは BSA の分子鎖の unfolding と関参考文献連するものと考えられる。これらの結果は、BSA１）A. Takahara, N. J. Jo, and T. Kajiyama, Surfaceと OTS 相あるいは FOETS 相の間に働く凝着力

Molecular Mobility and Platelet Reactivity ofの値には大きな差はなく、むしろ pH ＝ 7.5 でのSegmented Poly(etherurethaneureas) with

BSA の負の帯電による FOETS マトリクスに吸着

Hydrophilic and Hydrophobic Soft Segment

した BSA と溶液中の BSA の靜電的反発が BSA

Components, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1, 19,の FOETS 相への選択吸着と関連していることを1989.

示唆している。

２）S. R. Ge, A. Takahara and T. Kajiyama,
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