研 究 課 題

酸化ストレスと遺伝子発現	
 

研究代表者

早川	
  浩（機能生物化学講座・生化学分野・教授）

	
 
要約
	
  我々は本研究で酸化 RNA に特異的に結合するタンパク質 Auf1/HNRNPD を同定し以下の点を明らかにした。
	
  細胞粗抽出液中の Auf1 タンパク質は 8 オキソグアニンを認識し特異的に結合する。ただし、精製された組み換え Auf1 タンパク質は、それ自体のみでは酸化 RNA への特異的結合能を示さず、これに細胞抽出液を加えることで特異的な結合能が回復する。これらのことから Auf1 タンパク質はそれ以外の因子と複合体を形成するなどして特異的結合能を獲得しているものと考えられる。
	  Auf1 を欠損する変異株を２種類の方法でヒト細胞株 HeLa 細胞と Nalm6 株から構築した。
これら変異株は正常な状態でも若干の増殖抑制がみられ、酸化ストレス下において mRNAの分解が部分的に抑制される。このことから Auf1 タンパクは酸化 mRNA の分解に関わっていると考えられる。
	
 
研究目的
	
  酸素は生命活動に不可欠であるが、一方で生体成分を酸化し悪影響を及ぼす。中でもDNA や RNA の酸化は発がんや老化を引き起こす原因になると考えられる。それに対し生体はこれらの酸化を防ぐ様々な装置を有している。	
 	
  酸化ストレスにより核酸は酸化され様々な酸化修飾塩基が生じるが、その中で最も重要なのはグアニン塩基の酸化体である８オキソグアニン（8oxoG）の形成である。８オキソ
グアニンはシトシンのみならずアデニンとも塩基対合（誤対合）が出来るため遺伝情報の伝達過程でエラーを引き起こす。（図１）	
 

	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  図１	
 

	
 

したがって８オキソグアニンが DNA 上に生じた場合には上記の誤対合により突然変異を、さらには発がんを引き起こすことが知られ、研究が非常によく進められている。一方、RNA上に生じた場合には誤転写・誤翻訳を通じて異常タンパクの合成を引き起こすことを我々は大腸菌の系ではじめて報告したが、最近この８オキソグアニンを含む RNA と老化との関連が注目されている。即ち、アルツハイマー患者や老化マウスの脳神経細胞で８オキソグ
アニンを含む RNA が蓄積しているという事実である。８オキソグアニンを含む RNA は異常タンパクの合成を起こすが、これらの疾患でも異常タンパクの出現が特徴的である。また、酸化された RNA は分解され、尿中などに８オキソグアニンを含むヌクレオシド、８オ
キソグアノシンとして排泄されると考えられるので老化の指標として期待できる。	
  	
 
	
 
	
  生体内で酸化 RNA を防ぐ機構には２つの仕組みが考えられる。（図２）１）RNA 合成時の基質となる酸化ヌクレオチドを分解し、RNA 中に 8oxoG が取り込まれないようにする仕組み。
２）RNA の直接酸化によって生じた 8oxoG を含む RNA に対する排除系。

図２

	  本研究においては上記のうち２）に関わる因子をヒト細胞から同定・解析し、哺乳動物
細胞における酸化ストレス下の遺伝子発現の品質管理機構の全貌を明らかにすることを目
的とする。

方法

	
  これまでの研究から、酸化 RNA を特異的に認識するタンパク質として Auf1 をすでに同定していたが、この詳細な生化学的解析を行う為、８オキソグアニンを含む新規合成オリ
ゴプローブを作成した。これまでのプローブが酵素反応を利用し、試験管内で酸化した
RNA とビーズを polyA:polyT のアニーリングにより結合したものであるに対し、今回は全て化学合成によるもので①収率が優れ品質が安定している。②共有結合あるいは、ビオチ
ン・ストレプトアビジンの親和性を利用して RNA をビーズに安定に結合させることからプローブ自身が安定。	
  ③さらに完全に合成オリゴヌクレオチドであることから RNA 配列についても自由にデザインできることなど多くの利点がある。（図３）	  Auf1 タンパクの生物学的機能を明らかにするために、今回２つの方法でノックアウト細胞株を構築した。①相同組み替え能力の高いヒト Nalm6 細胞株を用いた遺伝子破壊法。
Nalm6 株はリンパ球由来(Pre B cell)で、ほぼ２倍体の染色体をもつヒト細胞株から古典的方法で相同染色体の両方を薬剤耐性遺伝子に置き換えた変異株を構築した。（図５）②ゲノム編集技術を用いた遺伝子破壊法の１つである TALEN 法により、FokI ヌクレアー
ゼと DNA 結合タンパク質を融合した人工ヌクレアーゼにより、HeLa 細胞中の複数の AufI
染色遺伝子を一気に破壊する方法。（図６）これらの方法により AufI 遺伝子を破壊した細胞株を独立に樹立し、その性状を野生株と比較することで Auf1 の機能を解析した。
	
 
結果と考察	 １）Auf1 タンパクの解析
細胞液中の Auf1 タンパクは８オキソグアニンを含む RNA に特異的に結合する	
 	
  ８オキソグアニンを含む任意の配列を持つ合成オリゴマーを用いてアガロースビーズあるいはストレプトアビジンビーズに結合させた。コントロールとしては同一配列をもち８オキソグアニンの代わりに通常のグアニンを含むオリゴマーを用いた。まずこの新規プローブがデザイン通りに完成しているかどうかについて８オキソグアニン特異的抗体を用いて検証した。図３の A に示すように特異抗体は８オキソグアニンを含むオリゴマープロー
ブのみに結合し、コントロールプローブには全く結合しない。ことからデザイン通りのプ
ローブが完成したことを確認できた。
	  次にこのプローブを用い酸化 RNA 結合タンパクとして同定した AufI タンパクが８オキ
ソグアニン特異的に結合するかどうかを調べた。 図３の B に示されるように AufI タンパ
クは８オキソグアニンを含むオリゴマーを結合させたビーズのみに結合し、コントロールのオリゴマービーズにはほとんど結合しなかった。このことから細胞液中の AufI タンパクは８オキソグアニンを含む RNA に特異的に結合することが明らかとなった。なお AufI タンパクにはスプライシングにより４つのバリアントがあることが知られているが、HeLa 細胞で検出される全てが８オキソグアニンを含むオリゴマーに特異的に結合することも確認
できた。	
  	
 

	
  	
  	
  	
  	
 

	
 

	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  図３	
 
精製された組換え Auf1 タンパクはそれ自身だけでは酸化 RNA に特異的に結合出来ず細胞性因子の助けを必要とする	 	
  ４つのスプライシングバリアントを大腸菌で組換えタンパクとして大量生産させ精製した。これらの精製 AufI タンパクはそれ自身のみでは酸化 RNA 特異的な結合能を示さないが、これに細胞抽出液を混ぜると特異的結合能が回復することが判った（図４）。	
 
図３
zu

	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  図４	
 

このことから、AufI タンパクは未知の細胞性因子と複合体を形成するか、あるいは未知の細胞性因子により修飾を受けて、酸化 RNA 特異的な結合能を獲得することが考えられる。
（論文１）現在この未知の因子の同定を進めている。	
 	 １）Auf1 欠損変異株の解析
相同組替え法によるヒト Nalm6 細胞株からの AufI ノックアウト細胞株の樹立	
 	
  下図に示すターゲットベクターを細胞に導入後、２種類の薬剤耐性遺伝子による選択を行い、AufI 遺伝子欠損株を分離した。	
 

	
 
図５	
 
TALEN 法によるヒト HeLa 細胞株からの AufI ノックアウト細胞株の樹立	
 	
  下図に示すターゲットベクターを細胞に導入後、薬剤耐性遺伝子による選択を行い HeLa細胞から AufI 遺伝子欠損株を分離した。

	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  図６

	
  いずれの方法で分離された変異株も、全ての AufI タンパクを欠損することがウエスタン
ブロットで確認された。（図７）	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
図７	
 
Auf1 変異株は増殖遅延を示す	 	
  それぞれの方法で分離された独立の変異株について増殖能を調べたところ、野生株に比べ増殖遅延が認められた。なお、Nalm6 株からは一方の染色体のみが欠損したヘテロ細胞株が樹立されているが、この株は野生型と完全欠損株の中間の増殖を示す。（図８）	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
  	
  図８	
 
Auf1 変異株は酸化ストレス下 mRNA の分解が抑制される	 	  Auf1 タンパクが８オキソグアニンを含む酸化 RNA へ特異的に結合し、これが酸化 RNAの選択的分解を誘導するとの仮説に立てば、Auf1 欠損細胞では酸化ストレス下、mRNA の分解が抑制されることが予想される。そこで、今回分離した AufI 遺伝子欠損株を用いて以

下の実験を行った。
	
  野生株と AufI 欠損株を様々な濃度の過酸化水素水を含む培地で、酸化ストレス下に培養し継時的に GAPDH	  (glycelaldehyde-3-phosphate dehydrogenase) の mRNA の量をリアルタ
イム RT-PCR で定量した。なお GAPDH の mRNA は 24 時間以上の半減期をもつ比較的安定な mRNA であることが知られている。

図９

	  図９に示すように、２mM の過酸化水素存在下で培養すると６時間後に GAPDH の mRNA
は６割程度まで分解される。一方、過酸化水素の無い状態では安定に保たれる。この条件
を用い、分離された変異株と野生株で酸化ストレス下の mRNA の量を比較した結果を図 10
に示す。

	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  図 10	
 HeLa 細胞由来の変異株では野生株に比べ、酸化ストレス下における GAPDH mRNA の分解

が部分的に抑制されていることが確認された。そこで、この現象がそれ以外の mRNA や、
独立に分離された Nalm6 由来の AufI 欠損株でも共通に認められるかどうかをさらに確認した。図 11 に示されるように、GAPDH 以外の３つの mRNA(ACTB, YWHAZ, TFRC)についても、また Nalm6 由来の変異株についても同様な現象が共通に認められた。これらのことから AufI タンパクは予想通り、酸化 RNA の選択的分解に関与すると考えられる。
（論文１）

図 11
	
 
	
 
	
  	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
図 11	
 
３）Auf1 以外の酸化 RNA 排除機構
	  Auf1 変異株で酸化 mRNA の分解が部分抑制的であることは、別の酸化 RNA の分解に関わる経路が存在することを示唆する。（図 12）この点について現在、２つの可能性を検討中である。	
 
	
 
	
 
図 12	
 

図 12
	
  １つは AufI 以外に酸化 mRNA を特異的に認識するタンパクが存在しないかどうかについてである。現在 AufI 欠損株を用いて検索を進めているが、その結果として AufI 以外に
８オキソグアニンを含むオリゴマーに特異的に結合する新規タンパクが検出されている。
（図 13、未発表データー）	
 
	
 

	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  図 13	 	  もう１つの可能性として、酸化 RNA を過剰に蓄積した細胞の選択的排除、Apoptosis が考えられる。
（図 13）現在、その可能性についても示唆するデーターが得られつつある（未発表データー）	
 	 	  酸化 RNA の蓄積と老化や疾患との関係については、いくつかの状況証拠があがりつつある。老化モデルマウス SAMP8 系統やヒトのアルツハイマー(AD)患者由来の組織を用いた病理学組織学的解析から、酸化 RNA がこうしたマウスやヒトの脳の海馬域で蓄積していることが明らかになってきた。図 14 は共同研究者である北京医院のグループによる解析結果の一例で、AD 患者の海馬に酸化 RNA が蓄積している。（論文３、５）	
  	
 

	
 
	
  	
  図 14	 さらに北京医院のグループは、老化したマウスやサル (Macaca mulatta) の尿中には酸化RNA の分解産物と考えられる８オキソグアノシンが増加していることも明らかにしている。この尿中の８オキソグアノシン増加は老化モデルマウスである SAMP8 系統でも確認されている。（図 15）これらのことから尿中の８オキソグアノシンは老化の有効なマーカーとして今後期待できる。（論文４、６）	
  	
 
	
 

図 15	
 

現時点で海馬領域の酸化 RNA の蓄積と老化や神経細胞変性との直接の関係を示すデータ
ーはない。今後は図２に示したような、酸化 RNA の蓄積が老化や神経細胞変性を実際に誘導するのかどうかを明らかにすることが必要とされる。

発表論文* 査読有り1. *Ishii, T., Hayakawa, H., Sekiguchi, T., Adachi, N., Sekiguchi, M. (2015) Role of Auf1 inelimination of oxidatively damaged messenger RNA in human cells. Free Radical Biology &Medicine 79, 109–116.
2.

*Sekigucgi, T, Ito, R., Hayakawa, H, Sekiguchi, M. (2013)

Elimination and Utilization of

Oxidized Guanine Nucleotides in the Synthesis of RNA and its Precursors.

J. Biol. Chem.

288, 8128-35.
3.

*Nie, B., Gan, W., Shi, F., Hu, GX., Chen, LG., Hayakawa, H., Sekiguchi, M., Cai, JP. (2013)
Age-dependent accumulation of 8-oxoguanine in the DNA and RNA in various rat tissues.
Oxidative Medicine and Cellular Longevity.

ID 303181,

http://dx.doi.org/10.1155/2013/303181 (2013)
4.

*Shi, F., Nie, B., Gan, W., Zhou, XY., Takagi, Y., Hayakawa, H., Sekiguchi, M., Cai, JP.
（2012） Oxidative damage of DNA, RNA and their metabolites in leukocytes, plasma andurine of Macaca mulatta: 8-oxoguanosine in urine is a useful marker for aging. Free Radic Res.
46, 1093-98.

5.	
  *Shi, F, Gan, W., Nie, B., Takagi, Y., Hayakawa, H., Sekiguchi, M., Cai, JP. (2012) Greater
nucleic acids oxidation in the temporal lobe than the frontal lobe in SAMP8.

Neuroreport. 23,

508-512.
6.

*Gan, W., Nie, B., Shi, F., Xu, X. , Jianchang Qian, J. , Takagi, Y., Hayakawa, H., Sekiguchi,
M., Cai, JP. (2012) Age-dependent increases in the oxidative damage of DNA, RNA and their
metabolites in normal and senescence-accelerated mice analyzed by LC-MS/MS: urinary
8-oxoguannosine as a novel biomarker of aging.

Free Radical Biology & Medicine 52,

1700-1707.	
 7.

*Zhang, LQ., Dai, DP., Gan, W., Takagi, Y., Hayakawa, H., Sekiguchi, M., Cai, JP. (2012)
Lowered Nudix type 5 (NUDT5) expression leads to cell cycle retardation in HeLa cells.

Mol.

Cell. Biochem. 363, 377-384.

学会発表
1. Hayakawa H., Ishii, T., Sekiguchi, M. (2017) Human proteins that recognize oxidative RNA
damage. Oxidative Stress & Disease, Gordon Research Conferences (Lucca, Italy).
2. 石井健士、早川浩、関口猛、関口睦夫（2016）酸化損傷 mRNA の代謝に関わる新規因子の探索．第 39 回日本分子生物学会年会（横浜）．	
 3. 早川浩	 (2016)	
 酸化ストレスと RNA の品質管理機構.	
 第 88 回日本遺伝学会（三島）．	
 4. 関口猛、石井健士、早川浩、古野伸明、小林英紀、関口睦夫（2016）毒性物質の排出における出芽酵母 Gtr1 タンパク質の働き．第 39 回日本分子生物学会年会（横浜）．
5. 橋口一成、石井健士、早川浩、関口睦夫（2015）遺伝子破壊細胞株を用いたヒト Nudix
ファミリ―タンパク質の機能解析．第 38 回日本分子生物学会・第 88 回日本生化学会
大会合同大会（神戸）．
6. 早川浩	 (2015)	
 酸化 RNA 損傷を認識するヒトタンパク.	
 第 44 回日本環境変異原学会大会（福岡）。	
 7. 関口睦夫、伊東理世子、関口猛、早川浩、井口八郎（2015）変異原性ヌクレオチドはどこへ行くのか？	
  日本遺伝学会第 87 回大会（仙台）．
8. Hayakawa, H., (2013) Proteins that recognize oxidative RNA damage.

第 86 回日本生化学会大会、インターナショナルシンポジウム:	
 Gene Expression under Oxidative Stress
03-1IS15a	
  横浜、2013 年、９月	
  	 研 究 課 題

酸素ストレスと核酸の酸化	
 

研究代表者

関口	
  睦夫	
  	
  	
  	
  	
  	
  （先端科学研究センター・教授）

	
 
要約
	
  細胞の代謝に伴って生じる活性酸素分子種によって種々の生体成分が酸化されるが、核酸を構成するグアニン塩基の酸化は特に重要である。グアニンの酸化体である 8-オキソ-7,8-ジヒドログアニン（8-オキソグアニンと略する）はシトシンのみならずアデニンとも対合するので、それが DNA 中に生じると突然変異、RNA 中に生じると遺伝子発現の異常をひき起こす。生物はこれを防ぐためにいくつかの独立に働く機構をもっているが、中でも酸化ヌクレオチドを特異的に分解する機構は重要である。この働きを荷っているのが、大腸菌では MutT タンパク質である。本研究ではこれまでよく研究されていなかった MutTによるリボヌクレオチドプールの浄化とその生物学的意義を明らかにした。ヒトには MutTに相当するタンパク質が 3 種存在するので、それらの活性を MutT と比較しつつその生理学的意義について検討を行った。

研究目的	
  生物は酸素を利用して生命活動を営んでいるが、その過程で生じる活性酸素分子種（Reactive Oxygen Species, 以下 ROS と略する）は特に反応性が高く、生体内の様々な物質を酸化するので、酸素ストレスの主要な原因となっている。
	
  酵母からヒトに至るまで真核生物の細胞では、ミトコンドリア内膜に存在する呼吸鎖電子伝達系が物質の酸化とエネルギーの変換を荷っている。そこには多数のタンパク質で構成された超分子複合体があり、その中を電子が移動しつつ最終的に ATP を生産している。
この電子の流れは厳密に制御されており、ほとんど複合体の外へ出ることはないが、ごく一部が漏出して周囲の酸素分子と反応して一重項酸素（スーパーオキシド； O2•）を生じる。O2•は細胞内のスーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide dismutase; SOD）の働きによって H2O2（過酸化水素）に変えられる。H2O2 はさらにヒドロキシルラジカル（•OH）に変化するが、この反応は細胞内に存在する F+++の F++への変換（Fenton 反応）とカプルして進む。H2O2 はそれ自体の酸化力は低いが、それからつくられる•OH はきわめて強い酸化力をもっており、これによってタンパク質や核酸、リピドを含む多くの生体物質が酸化される。
O2•、H2O2、•OH などの分子は総括して ROS と呼ばれるが、その中で酸素ストレスの主因になるのは、•OH とみなされている。
	
  ROS は正常状態でもある程度つくられるが、細胞が放射線や環境中の化学物質にさらされた時に増加することが知られている。おそらく放射線や化学物質の効果の相当部分は
ROS の生成を通じて起こると考えられる。ある種の遺伝性疾患においても、その異常が ROSの生成と関連して起こることが知られている。
	
  ROS によっては様々な生体構成成分が酸化されるが、中でも遺伝情報をもつ核酸の酸化は深刻である。核酸を構成する様々な塩基が ROS によって酸化されるが、特にグアニン塩
基は酸化されやすく、その結果生じる 8-オキソグアニンは突然変異原性をもっている。8オキソグアニンはシトシンだけでなくアデニンとも対合し得るので、それによって GC 塩
基対は TA 塩基対に変化する。メッセンジャーRNA 上のグアニンが 8-オキソグアニンに変わった場合には、それはアデニンとして機能するので、それからつくられるタンパク質のその部位は本来とは異なるアミノ酸で占められることになり、それによって表現型の異常が起こる。
	  生物はこのような遺伝情報の変化を抑えるための機構をもっている。その第一段階で働
くのは、核酸合成の基質となる前駆体ヌクレオチドのプールから 8-オキソグアニンを含む
ヌクレオシド三リン酸を選択的に分解する機構である。もし DNA 中に 8-オキソグアニンが生じたり、あるいは 8-オキソグアニンを含むヌクレオチドが DNA にとり込まれた場合には、除去修復の機構が働く。もし 8-オキソグアニンがとり除かれずそのまま DNA が複製過程に入った場合には、それを認識して細胞ごと排除するアポトーシスの機構が働くと考えられる。このように DNA 中に 8-オキソグアニンが生じた場合には 3 段階の機構が働いて遺伝子の安定性を保つと考えられるが、RNA 中に生じた場合には別の機構が働くと考えられる。RNA 中に生じた 8-オキソグアニンの量が比較的少ない場合には RNA の選択的分解が起こると考えられるが、メッセンジャーRNA 中に多量の 8-オキソグアニンが生じた
場合には細胞死によってその細胞を排除することが考えられる。RNA で働くこれらの機構
は最近福岡歯科大学のメンバーによって発見されたもので、その機構の詳細や生物学的意
義については早川浩の担当する項目を見て欲しい。

	
  	
  	
  	
 

図 1 発がんや老化を抑える生体の機構	  図 1 は上に述べた諸機構を示したものであるが、私達はヌクレオチドレベルで働く機構（図 1 の黄色で示した部分）について研究してきた。そこでは哺乳動物細胞から分離した酵素の働きを中心とした研究と、大腸菌を用いて分子遺伝学的、生化学的解析が含まれている。以下それらを 3 つの項目に分けて順次述べる。なお実験方法は多岐にわたるので、それぞれの論文にあたって欲しい。	
 
	
 
結果	
 
	
 
(1) 酸化グアニンを含む核酸前駆体ヌクレオチドの選択的分解―ヒト MTH1、MTH2、MTH3 タンパク質の働き	 	
  私達は先に、大腸菌の MutT タンパク質は酸化されたグアニンを含む DNA および RNA
合成前駆体を分解する活性をもつことを明らかにした（Maki & Sekiguchi (1992) Nature, 355,
273; Taddei, Hayakawa et al. (1997) Science 278, 128）。ヒトには MutT に対応する酵素が少な
くとも 3 種存在しており、それらは MTH1（MutT Homologue 1）、MTH2、MTH3 と名付けられた。それらのタンパク質の一次構造はよく似ているが、果たして MutT と活性面でどの程度類似しているかを調べることにした。ヒトの酵素をコードする cDNA をプラスミド・ベクターを用いて大量生産し、N 末端につけた His タグを利用して精製した。それらのタンパク質を 8-oxo-dGTP または 8-oxo-dGDP を含む反応液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 80µg/µl BSA, 8 mM MgCl2 40 mM NaCl, 5 mM DDT, 2% グリセロール）中で 37°C で反応させたところ、図 2 で示す結果が得られた。
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 

図 2 ヒト MTH1、MTH2、MTH3 の 8-oxo-dGTP と 8-oxo-dGDP に対する作用	
  MTH1 は 8-oxo-dGTP をモノリン酸に分解する強い活性をもっているが、8-oxo-dGDP に対しては作用しない。それと反対に MTH3 は、8-oxo-dGDP をモノリン酸に分解したが、8-oxo-dGTP に対しては分解活性を示さなかった、一方 MTH2 は 8-oxo-dGTP と 8-oxo-dGDPをほぼ同じ効率で分解した。この点で MTH2 は大腸菌 MutT と同じ基質特異性を示した。
	  MutT タンパク質は 8-オキソグアニンを含むリボヌクレオチドに対してもデオキシヌク
レオチドと同じように作用することが知られている。この点についても調べたが、MTH1と MTH2 の 8-oxoGTP に対する作用は 8-oxoGTP に対する場合の約 5％と低かった。それに対し MTH3 は 8-oxoGDP を 8-oxo-dGDP と同じ程度に効率よく分解した。
	  ヒトには Nudix ファミリーと呼ばれるよく似たアミノ酸配列をもつタンパク質が約 20 種存在する。それらを配列の共通性を指標に並べると、MTH1、MTH2、MTH3 はお互い非常によく似ていることがわかる（図 3A）。MutT と類似のタンパク質は大腸菌の他に発芽酵母（S. cerevisiae）や線虫（C. elegans）にも存在する（図 3B）。ヒトの NUDT5 も 8-oxo-dGTPを分解する活性をもっているが、その作用 pH の範囲は著しくアルカリ性であるので、生理的意義は低いと考えられる。
	
  	
  	
  	
 

図 3 ヒトの Nudix 群タンパク質の類似度（A）と MutT に似た活性をもつ他の生物種の酵素の一次構造の比較（B）斜線で示した部分はよく保存された領域である。

	  上記の研究結果は次の論文に発表した。
	  Y. Takagi, D. Setoyama, R. Ito, H. Kamiya, Y. Yamagata & M. Sekiguchi (2012) Human MTH3
(NUDT18) protein hydrolyzes oxidized forms of guanosine and deoxyguanosine diphosphates.
Comparison with MTH1 and MTH2. J. Biol. Chem. 287, 21541-21549.

(2) 酸素ストレス下の遺伝子発現の異常を抑えるタンパク質の探索	
 	
  転写に際し、DNA 上のシトシンに対する塩基として mRNA にはグアニンが入るが、もしそこに 8-オキソグアニンが入ると本来のアミノ酸配列と異なるアミノ酸がタンパク質中に入ることになる。このような稀に起こる転写の異常を検出するため、私達は lacZ 遺伝子のアンバー変異を用いた実験系を構築した。図 4 はそれを示したものである。ここでは野生型とそれから由来する 3 種の変異型それぞれについて、上から遺伝子型（Genotype）、DNAのコドンの塩基配列、それからつくられる mRNA の塩基配列、それと対合する tRNA のア
ンチコドンの配列、つくられる LacZ タンパク質の相対量を示すモデル、そのような菌をX-gal と IPTG を含む平板上で培養した時に生じるコロニーの色を示している。野生型の
lacZ+の場合は完全な β-ガラクトシダーゼが大量につくられるので、コロニーはブルーを呈
する。
	
  	
  	
  	
 

図4

8-オキソグアニンによる lacZ 遺伝子の発現異常	  BT369 株では lacZ 遺伝子の 486 番目のコドンに CG→TA 変異が生じているが、その場合mRNA 上のコドンは UAG となり、ペプチド鎖の延長はそこで停止する。そこでは、β-ガラ
クトシダーゼ活性をもつ完全な LacZ タンパク質はつくられないので、コロニーの色は白色となる。lacZ am に加え mutT 欠損変異をもつ BT370 株では、8-oxo-dGTP が DNA 前駆体プール中に蓄積するので、その結果一部の mRNA の U が入るべきところに 8-オキソグアニン

（°G）が入ることになる。°GAG コドンには Glu-tRNA が対合し得るので、遺伝子発現の部分的な抑制が起こり、僅かではあるが正常な LacZ タンパク質がつくられる。その結果コロ
ニーの色はごくうすいブルーを呈することになる。BT370 株で RNA 中に入る 8-オキソグ
アニンの量は比較的低いが、もし 8-オキソグアニンをより大量につくるような変異が導入された場合には発現量はさらに増加するはずである。そのような効果を起こす遺伝子変異を集めて解析することにより、8-オキソグアニンの代謝に関わる新規の酵素活性や遺伝子を同定することが可能となる。
	  私達はこのようなモデルに従って多数の BT370X-株を分離し、X 遺伝子の同定を試みた。
上のモデルに従えば、X 遺伝子の効果は mutT +の状態、あるいは muT でも酸素のない状態−

ではみられないはずである。このような条件に適合する X-遺伝子を欠く 5 株を分離し、その解析を行った。その結果 RNA ポリメラーゼの β および β’サブユニットをコードする遺伝子 rpoB と rpoC とグアニル酸合成酵素をコードする遺伝子 gmk に変異をもつものがみつかった。
	  図 5 はそれらの遺伝子変異によって酸素ストレス下に発現異常が抑制されることを示したモデルである。
	
  	
  	
  	
 

図 5	
  グアニンヌクレオチドの代謝経路（左）と遺伝子発現の抑制	  上記の結果は次の論文にまとめて発表した。
	  H. Inokuchi, R. Ito, T. Sekiguchi & M. Sekiguchi (2013) Search for proteins required for accurate
gene expression under oxidative stress. Roles of guanylate kinase and RNA polymerase. J. Biol.
Chem. 288, 32952-32962.

(3) 酸化されたグアニン・ヌクレオチドを RNA やその前駆体から排除する酵素系	 	  上記の結果を生化学的に裏付けるために、大腸菌からグアニル酸合成酵素とヌクレオシ
ド二リン酸キナーゼをそれぞれ精製し、その標品を用いて 8-オキソグアニンを含むヌクレ
オチドがいかにして RNA 合成から排除されるか調べた。
	  図 6 は大腸菌のグアニル酸キナーゼの 8-オキソグアニンを含むリボヌクレオシド二リン酸およびデオキシリボヌクレオシド二リン酸に対する作用をみたものである。A と B は実際の反応結果、C と D はそのような反応を時間をおって示したものである。この結果は大腸菌の 8-オキソグアニンを含むリボヌクレオシド二リン酸とデオキシリボヌクレオシド二リン酸は共にグアニル酸キナーゼでリン酸化されないことを明確に示している。これはグアニル酸キナーゼが正常と酸化型のヌクレオチドを厳密に選別し、酸化されたグアニンがDNA と RNA の合成に利用されるのを防ぐ機能を果たしていることを示している。
	  図 7 はヌクレオシド二リン酸から三リン酸への合成に関わるヌクレオシド二リン酸キナーゼについて、基質特異性の検証を行ったものである。この場合は正常型、酸化型のヌク
レオチドはほぼ同じ効率でリン酸化されており、両者の間に大きな違いはみられない。いったん二リン酸の状態になると 8-オキソグアニンは核酸合成に利用され得ることを示して
いる。

	
 
	
  	
 
	
 
	
 
図 6	
  グアニル酸キナーゼによる酸化グアニンを含むヌクレオチドの排除

	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

図 7 ヌクレオシド二リン酸キナーゼによる酸化グアニンを含むヌクレオチドのリン酸化	  上記の結果は下記の論文に発表した。	
 	
  T. Sekiguchi, R. Ito, H. Hayakawa & M. Sekiguchi (2013) Elimination and utilization of oxidized
guanine nucleotides in the synthesis of RNA and its precursors. J. Biol. Chem. 288, 8128-8135.

考察	  核酸を構成する塩基の中でグアニンは酸化をうけやすく、その結果生じた 8-オキソグア
ニンは塩基ミス対合をひき起こすので、遺伝情報の改変をひき起こす。このような事態を防ぐため、生物は少なくとも 3 段階で働く機構をもっている。その第 1 段階で働くのは酸化されたグアニンである 8-オキソグアニンを含むヌクレオチドの DNA ヌクレオチドプー
ルと RNA ヌクレオチドプールからの排除である。大腸菌では MutT タンパク質が働いているが、ヒトでは MutT に対応するものとして MTH1、MTH2、MTH3 の 3 種のタンパク質が存在する。私達はこれらのヒトの酵素を均一なレベルまで精製し、その基質的特性や反応性などを調べた。その結果ヒトの細胞では MTH1 が主要な役割を果たしているが、MTH2も補完的に働いている可能性が示唆された。MTH3 はヌクレオシド三リン酸には作用しな

いので、遺伝子安定性に対する寄与は低いものと考えられる。この問題をさらに明確にす
るにはそれぞれの酵素を欠く細胞を作出し、その突然変異率を調べる必要がある。この研究は本学の橋口らによって現在進められており、その結果をふまえて考察する必要がある。
	  DNA 中に酸化グアニンが生じた場合は突然変異が起こるので、これまでよく研究されてきたが、RNA 中に 8-オキソグアニンが存在する場合については余りよく調べられてこなかった。RNA の場合遺伝子発現の異常が起こることが示されているが	  、たとえ部分的に発現異常が起こったとしても個体全体には余り影響がないと考えられてきたからである。しかし RNA の異常は長い期間のうちには老化の促進や神経活動の異常をきたす可能性があり看過できない問題である。私達はこの問題に対する最初のアプローチとして、リボヌク
レオチド・プール中の酸化グアニンの動態について、生化学と分子遺伝学の両面から解析を試みた。研究はモデル生物である大腸菌を用いて行ったが、細胞は RNA 前駆体となるヌクレオチド・プールから 8-オキソグアニンを含むリボヌクレオチドを排除するシステムをもっていることが明らかとなった。さらに 8-オキソグアニンの生成が遺伝子発現の異常を起こすことも明確に示すことができた。
	  図 1 に示したように、生物は 8-オキソグアニンを DNA および RNA から排除するためのシステムをもっている。その第一段階で働くのが、ここで示したヌクレオチドレベルの機構であるが、核酸レベル、細胞レベルで働く機構についてもさらに研究することが必要である。これまで RNA 中に塩基障害が生じた場合については余り研究されてこなかったが、生命の長いスパンからみると RNA の異常は大きな問題となる。これについては早川浩、石井健士らのグループで精力的に研究が進められている。
	  核酸塩基の酸化をひき起こす酸素ストレスおの大もとは何であろうか。大腸菌を無酸素状態で培養した場合には、たとえ mutT 遺伝子がなくても酸化グアニンは生じないので、酸素ストレスの主因は呼吸鎖から漏出する電子に起因する ROS の生成によると考えられる。
この過程に関与するタンパク質の遺伝子に変異を起こし、分子遺伝学的に解析することによって、ROS の作用の実態を明らかにすることができると考えられる。ROS の生成や代謝に関わる酵素系を明らかにすることによってはじめて ROS をコントロールし、それによってひき起こされる有害な生物学的効果を防ぐ手だてを考えることができよう。そのような方向に向かって今後研究を進めたいと考えている。

発表論文*Fujikane R., Komori K., Sekiguchi M., Hidaka M. (2016) Function of high-mobility group A
proteins in the DNA damage signaling for induction of apoptosis. Sci. Rep. 6, 31714.
*Evans M.D., Mistry V., Singh R., Gackowsku D., Róźalski R., Simek-Gorecka, A., Phillips D.H.,

Mullemders L., Pines A., Nakabeppu Y., Sakumi K., Sekiguchi M., Tsuzuki T., Bignami M.,Oliński R. Cooke M.S. (2016) Nucleotide excision repair of oxidized genomic DNA is not a sourceof urinary 8-oxo-7,8-dihydroguanosine. Free Radic. Biol. Med. 99, 358-391.
*Ishii T., Hayakawa H., Sekiguchi T., Adachi N., Sekiguchi M. (2015) Role of Auf1 in eliminationof oxidatively damaged messenger RNA in human cells. Free Radic. Biol. Med. 79, 109-116*Sano S., Sakagami R., Sekiguchi M., Hidaka M. (2013) Stabilization of MAPO1 by specificbinding with folliculin and AMP-activated protein kinase in O6-methylguanine-induced apoptosis.
Biochem. Biopys. Res. Commun. 430, 810-815.
*Inokuchi H., Ito R., Sekiguchi T., Sekiguchi M. (2013) Search for proteins required for accurate
gene expression under oxidative stress: Role of guanylate kinase and RNA polymerase. J. Biol.
Chem. 288, 32952-32962.
* Nie B., Gan W., Shi F., Hu G.X., Chen L.G., Hayakawa H., Sekiguchi M., Cai J.-P. (2013)
Age-dependent accumulation of 8-oxoguanine in the DNA and RNA in various rat tissues. Oxid.
Med. Cell Longev., doi: 10.1155/2013/303181.
* Sekiguchi T., Ito R., Hayakawa H., Sekiguchi M. (2013) Elimination and utilization of oxidized
guanine nucleotides in the synthesis of RNA and its precursors. J. Biol. Chem., 288, 8128-8135.
*Sekiguchi M. (2012) My path toward DNA repair. DNA Repair 11, 605-615.
* Fujikane R., Sanada M., Sekiguchi M., Hidaka M. (2012) The identification of a novel gene,
MAPO2, that is involved in the induction of apoptosis triggered by O6-methylguanine. PLoS ONE 7,
e44817.
* Shi F., Gan W., Nie B., Takagi Y., Hayakawa H., Sekiguchi M., Cai J.-P. (2012) Greater nucleic
acids oxidation in the temporal lobe than the frontal lobe in SAMP8. NeuroReport 23, 508-512.
* Shi F., Nie B., Gan W., Zhou X.Y., Takagi Y., Hayakawa H., Sekiguchi M., Cai J.-P. (2012)
Oxidative damage of DNA, RNA and their metabolites in leukocytes, plasma and urine of Macaca
mulatta: 8-oxoguanosine in urine is a useful marker for aging. Free Radic. Res. 46, 1093-1098.
* Takagi Y., Setoyama D., Ito R., Kamiya H., Yamagata Y., Sekiguchi M. (2012) Human MTH3
(NUDT18) protein hydrolyzes oxidized forms of guanosine and deoxyguanosine diphospahtes:
Comparison with MTH1 and MTH2. J. Biol. Chem. 287, 21541-21549.
* Zhang L.Q., Dai D.P., Gan W., Takagi Y., Hayakawa H., Sekiguchi M., Cai J.-P. (2012) Lowered
Nudix type 5 (NUDT5) expression leads to cell cycle retardation in HeLa cells. Mol. Cell Biochem.
363, 377-384.
* Gan W., Nie B., Shi F., Xu X. M., Takagi Y., Hayakawa H., Sekiguchi M., Cai J. P. (2012)
Age-dependent increases in the oxidative damage of DNA, RNA, and their metabolites in normal

and senescence-accelerated mice analyzed by LC-MS/MS: Urinary 8-oxoguanine as a novel
biomarker of aging. Free Radic. Biol. Med. 52, 1700-1707.
* Lim T.-H., Fujikane R., Sano S., Sakagami R, Nakatsu Y., Tsuzuki T., Sekiguchi M., Hidaka M.
(2012) Activation of AMP-activated protein kinase by MAPO1 and FLCN induces apoptosis
triggered by alkylated base mismatch in DNA. DNA Repair 11, 259-266.
	
 

	
 

学会発表	
 
石井健士、早川浩、関口猛、関口睦夫（2016）酸化損傷 mRNA の代謝に関わる新規因子の探索．第 39 回日本分子生物学会年会（横浜）．
橋口一成、梅津桂子、関口睦夫（2016）ヒト Nudix ファミリータンパク質によるゲノム安定化維持機構の解析．第 39 回日本分子生物学会年会（横浜）．
武石幸容、藤兼亮輔、高橋達郎、関口睦夫、日高真純（2016）ミスマッチ修復依存のアポ
トーシス誘導に関わるクロマチンリモデラーの機能．第 39 回日本分子生物学会年会（横浜）．
関口猛、石井健士、早川浩、古野伸明、小林英紀、関口睦夫（2016）毒性物質の排出における出芽酵母 Gtr1 タンパク質の働き．第 39 回日本分子生物学会年会（横浜）．
伊東理世子、橋口一成、関口睦夫（2015）活性酸素による突然変異の生起とその抑制．第38 回日本分子生物学会第 88 回日本生化学会大会合同大会（神戸）．
橋口一成、石井健士、早川浩、関口睦夫（2015）遺伝子破壊細胞株を用いたヒト Nudix ファミリ―タンパク質の機能解析．第 38 回日本分子生物学会・第 88 回日本生化学会大会合
同大会（神戸）．
藤兼亮輔、関口睦夫、日高真純（2015）O6 メチルグアニンによりひき起こされるミスマッ
チ修復依存のアポトーシス誘導に関わる新規因子の同定．第 38 回日本分子生物学会・第88 回日本生化学会大会合同大会（神戸）．
武石幸容、藤兼亮輔、関口睦夫、日高真純（2015）ミスマッチ修復に依存したアポトーシ
ス誘導に関わるクロマチン動態の解析．第 38 回日本分子生物学会・第 88 回日本生化学会
大会合同大会（神戸）．
関口睦夫、伊東理世子、関口猛、早川浩、井口八郎（2015）変異原性ヌクレオチドはどこへ行くのか？	
  日本遺伝学会第 87 回大会（仙台）．
Sekiguchi M. (2015) Molecular tactics to escape from the threat of oxidation RNA damage. Tomas
Lindahl Conference on DNA Repair. (Oslo, Norway).
伊東理世子、井口八郎、関口猛、関口睦夫（2013）大腸菌における 8-オキソグアニンを含むヌクレオチドの排除機構．日本遺伝学会第 85 回大会（横浜）．
日高真純、佐野しおり、坂上竜資、関口睦夫（2013）アポトーシス誘導過程の MAPO1 の安定化は FLCN と AMPK により制御される．日本遺伝学会第 85 回大会（横浜）．
佐野しおり、坂上竜資、関口睦夫、日高真純（2012）アポトーシス誘導過程における MAPO1タンパク質の安定化．第 35 回日本分子生物学会年会（福岡）．
日高真純、佐野しおり、藤兼亮輔、林徳豪、坂上竜資、中津可道、續輝久、関口睦夫（2012）
発がんを抑制するアポトーシスの誘導機構．第 35 回日本分子生物学会年会（福岡）．
Fujikane R., Sanada M., Sekiguchi M., Hidaka M. (2012) The identification of a novel gene,
MAPO2, that is involved in the induction of apoptosis triggered by O6-methylguanine. The 8th 3R
Symposium (Awaji, Japan).
日高真純、林徳豪、藤兼亮輔、佐野しおり、坂上竜資、中津可道、續輝久、関口睦夫（2012）
MAPO1 と FLCN による AMPK の活性化はアポトーシスを誘導する．日本遺伝学会第 84
回大会（福岡）．
Sekiguchi M (2012) Molecular mechanisms for accurate gene expression under oxidative stress.
US-Japan DNA Repair Meeting (Virginia, USA).

研 究 課 題

発がんを抑えるアポトーシスの機構

研究代表者

日高真純（細胞分子生物学講座・分子機能制御学分野・教授）

要約

DNA 上に生じた修飾塩基 O6-メチルグアニンは DNA 複製過程でチミン塩基との誤対合を形成し、突然変異さらには発がんをひき起こす原因となる。しかし、高等生物はこの誤塩基対合を持つ細胞にアポトーシスを誘導し個体から排除することで変異細胞の出現を抑制している。我々はジーントラップ法を用いた遺伝学的スクリーニングにより、このアポ
トーシス誘導に関わる新規因子として MAPO1（O6-methylguanine-induced apoptosis 1）とHMGA（high mobility group A）を同定した。
MAPO1 は細胞質に局在し、発がん抑制因子の一つである FLCN と細胞内のエネルギー
感知キナーゼである AMPK と相互作用する。siRNA を用いた Ampkα あるいは Flcn 遺伝子
ノックダウン細胞では、アルキル化剤処理後のサブ G1 細胞の出現が顕著に抑制されたことから、AMPK と FLCN も MAPO1 同様にアポトーシス誘導に必要であることが示された。
また、AMPK-MAPO1-FLCN 複合体のアポトーシス誘導過程での動態を免疫沈降法およびイムノブロット法により解析したところ、AMPKα はアポトーシス誘導後に MAPO1-FLCN複合体から解離し、それに伴い MAPO1 がタンパク質レベルで安定化することが明らかになった。MG132 を用いた実験により、MAPO1 タンパク質の安定性にはプロテアソームに依存したタンパク分解系が深く関わっていることを示し、その分解には、b−TRCP と CK1（casein kinase 1）に依存したユビキチン／プロテアソーム系が関与していることも明らかにした。
HMGA は非ヒストンのクロマチン結合タンパク質で、HMGA1 と HMAGA2 からなるファミリーを構成している。ジーントラップ法により得られたマウス由来 Hmga2 遺伝子欠損
細胞はコントロール細胞と比べてアルキル化剤処理に対して抵抗性を示し、コントロール細胞で見られるカスパーゼ３の活性化が顕著に低下していた。さらに、ヒト由来細胞において HMGA1 と HMGA2 遺伝子に対する siRNA を導入したところ、HMGA1 あるいは HMGA2
遺伝子のノックダウン細胞はコントロール細胞に比べてアルキル化剤処理に対して抵抗性を示し、カスパーゼ９の活性化が有意に低下していた。また、DNA 損傷応答シグナリンン
グにかかわる ATR/CHK1 のリン酸化の低下が観察された。
これらの結果より、O6-メチルグアニンが引き起こすアポトーシス誘導過程では、HMGA
ファミリータンパク質は損傷認識直後の初期ステップで、また、MAPO1 はその後の DNA
損傷応答シグナリング経路において重要な機能を担っていることを明らかにすることがで

きた。

研究目的

環境中の酸素や化学物質は生命活動にとって不可欠なものであるが、そこから生じる活性酸素や変異原物質はゲノム DNA を傷つけ、がんや老化をひき起こす原因となる。DNA
損傷のひとつである修飾塩基 O6-メチルグアニンは、DNA 複製過程でチミンとの塩基ミス対合を形成するため、２回の DNA 複製反応を経ることにより G:C から A:T への突然変異を引き起こす（図１）。このような突然変異を抑制するために、生物は少なくとも 2 つの防御策を持っている。一つが O6-メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（MGMT）による DNA 修復反応で、二つめがミスマッチ修復（mismatch repair：以下 MMR と略記）タン
パク質に依存したアポトーシス反応である。MMR タンパク質を欠損した細胞においては突然変異の蓄積が起こること、また、MMR 遺伝子が不活化されたノックアウトマウスでは発がん頻度の上昇が起こることから、この機構の解明は突然変異と発がんの抑制機構の解明に繋がると考えられる。そこで我々は、本アポトーシスの活性化機構の解明を目的として、アポトーシス誘導の初期反応を生化学的に解析し、ヒト細胞のクロマチン上において MMR タンパク質が複合体（MSH2, MSH6, MLH1, PMS2 の四量体）を形成して O6-メチ
ルグアニンを含む DNA 損傷を認識していることを明らかにした（Hidaka et al., Nucl. Acids
Res., 33, 5703-5712, 2005）。それと同時に、MMR タンパク質が Proliferating Cell Nuclear
Antigen (PCNA)との相互作用を通して DNA 複製反応中に DNA 損傷を認識していることも

DNA 
(MNU)


CH 3
G C

G C


DNA

CH 3
G T


DNA

A T

MGMT

DNA

MSH2

MSH6

MLH1

PMS2





MMR 



図１．アポトーシス誘導による突然変異ならびに発がんの抑制機構示した。その後、DNA 損傷の認識後に機能する新規アポトーシス誘導因子の網羅的な同定を目指し、遺伝学的スクリーニングを行ってきた。本研究では、生化学的ならびに遺伝学的解析によりアポトーシス誘導因子を新規に同定し、O6-メチルグアニンが引き起こす細胞
死誘導経路の分子機序を包括的に明らかにし、その発がん抑制の分子機構を解明することを目的とする。

方法

遺伝学的解析における宿主細胞には O6-メチルグアニンを特異的に修復する酵素 MGMT
（O6-methylguanine DNA methyltransferase）を欠損した YT102 細胞を用いた。この細胞はアルキル化剤に対して高い感受性を示すが、MMR タンパク質（例えば MLH1）のようにアポトーシス誘導で機能するタンパク質を同時に欠損した細胞は、アポトーシスを誘導できな
くなりアルキル化剤に対して抵抗性を獲得する。我々は、この表現系をアポトーシス誘導
欠損細胞のスクリーニング法に利用した（図２）。まず、プロモーター領域を欠いたハイグ
ロマイシン耐性（HygR）遺伝子をもつレトロウイルスベクターをアルキル化剤 N-メチル-Nニトロソウレア（MNU）に対し感受性である Mgmt 欠損細胞に由来する YT102 細胞へ感染させる。一次スクリーニングではハイグロマイシン耐性株を選択し、任意の遺伝子が破壊された遺伝子破壊株ライブラリーを構築する。その際、ベクター上に SA（splicing acceptor）
配列と IRES 配列を持たせることで、ベクターがゲノム上のイントロン領域に挿入され場合、また、いずれのリーディングフレームで挿入され場合おいても HygR 遺伝子の転写と翻訳が/'0! .%*"&2

pA

HygR

IRES SA

5'LTR

Mgmt

3'LTR


+'2$% 

%"-2(1#3 , ),-24Hyg

%"-2(1#MNU

+'2$%+'2$% 






Hyg

Hyg



MNU





図２、ジーントラップ法によるアポトーシス誘導欠損細胞のスクリーニング法

なされ、効率的に遺伝子トラップができるように工夫した。その後の二次スクリーンニン
グでは遺伝子破壊株ライブラリーをアルキル化剤 MNU で選択し、その中から MNU に抵抗性を示す変異細胞株を単離する。このようにして得られた MNU 耐性変異細胞株はアポトーシス誘導遺伝子が破壊されている可能性が高く、破壊された遺伝子は薬剤耐性遺伝子のDNA 配列情報を手がかりとした Inverse-PCR 法にて容易に同定することができる。同定した遺伝子のアポトーシス誘導における機能は、分子生物学的、ならびに細胞生物学的な解析により検証を行う。

結果

１．アポトーシス誘導で機能する新規 MAPO1 タンパク質複合体の同定
我々は、図２に示した遺伝学的スクリーニングにより新規アポトーシス誘導因子 MAPO1(O6-methylguanine-induced apoptosis 1)を同定した（Komori et al., Oncogene, 28, 1142-1150,
2009）。MAPO1 はヒトから線虫まで種を超えて高度に保存されたタンパク質で細胞質に局在する。免疫沈降法によりそのタンパク質相互作用を解析したところ、MAPO1 は FLCN
(Follicuin) と AMPK (AMP-activated protein kinase)と相互作用することが明らかになった（図３）。FLCN は BHD（Birt-Hogg-Dube）症候群（皮膚、肺、腎臓等の臓器で高頻度に腫瘍を生じる）の原因因子であり、AMPK は細胞の増殖制御において重要な機能を担うリン酸化酵素である。このことからも、MAPO1 がタンパク質の相互作用を介して、発がん抑制において重要な機能を担っていることが推察される。

A

input

IP-Flag

V

V

M

B

M

Flag-MAPO1

HA-FLCN

FLCN

Flag-MAPO1

AMPKa

AMPKa

input

IP-HA

M

M

FM

FM

図３、免疫沈降法による MAPO1 タンパク質の相互作用解析

そこで、MAPO1 との相互作用因子のアポトーシス誘導における機能を解析するために、
siRNA を用いた遺伝子発現抑制実験を行った。Ampkaあるいは Flcn 遺伝子に対する siRNA

をそれぞれ独立に２種類導入したところ、いずれの場合でも両遺伝子の効率的な発現抑制が観察された（図４A）。フローサイトメーターにより細胞死の指標となるサブ G1 細胞の出現を解析したところ、Ampkaあるいは Flcn 遺伝子ノックダウン細胞では、アルキル化剤
処理後のサブ G1 細胞の出現が顕著に抑制された（図４B）。このことから、AMPK と FLCN
も MAPO1 同様にアポトーシス誘導に必要であることが示された（Lim et al., DNA Repair, 11,A

B
siFlcnsiCont #1#2

FLCN
b-actin

Sub-G1 population (%)

259-266, 2012）。
30

MNU (-)

20

10siAMPKa
siCont #1
AMPKab-actin#2

Sub-G1 population (%)

030

MNU (+)

20

**
10

0

*

*

Cont Mapo1 #1 #2
Flcn

*

*

#1

#2

AMPKa

図４、siRNA を用いた FLCN と AMPK の機能解析

２．アポトーシス誘導過程での MAPO1 タンパク質の安定化
アポトーシス誘導過程での MAPO1 の発現レベルをイムノブロット法により解析したところ、MAPO1 タンパク質は細胞のアルキル化剤（MNU）処理後に経時的に上昇し、72 時
間後には未処理時に比べて約 2.1 倍に増加することが分かった（図５Ａ）。このタンパク質
レベルの変動の調節のしくみを調べるために、FLAG-MAPO1 を安定に発現する細胞のプロ
テアソーム阻害剤 MG132 による処理を行った。図５Ｂに示すように、MAPO1 のタンパク
質レベルは MG132 処理６時間後と１２時間後に有意に増加した。同様な増加は、ユビキチ
ン／プロテアソームに依存して恒常的に分解されていることが知られている p53 タンパク質においても観察された。これに対して、FLCN と AMPKaのタンパク質レベルは MG132
処理後も変動しなかった。この結果は、MAPO1 はプロテアソーム依存的に定常的に分解されているが、アポトーシス誘導時には安定化されることを示唆している（Sano et al.,Biochem. Biophys. Res. Commu., 430, 810-815, 2013）。その後の解析により、MAPO1 の分解には、b−TRCP と CK1（casein kinase 1）に依存したユビキチン／プロテアソーム系が関与していることも明らかにした（Nagashima et al., Oncotarget, doi: 10.18632/oncotarget.14221,
2016）。

A

MNU(-)
0

24

48

MNU(+)
72

24

48

B

72 ( 	)MAPO1

FLAGMAPO1

FLCN

FLCN

AMPKα

MG132(-)

MG132(+)

0

0

6

12

6

12 ( 	
)

AMPKα

GAPDH

p53
GAPDH

図５、アポトーシス誘導過程における MAPO1 の安定化

３．FLCN と AMPK の MAPO1 タンパク質安定化への影響
MAPO1 は FLCN と AMPK と相互作用することが分かっているので、これらの相互作用
因子は MAPO1 の安定化に関与することが考えられる。そこで、これらの遺伝子に特異的な siRNA を細胞内へ導入し、FLCN ならびに AMPKa遺伝子発現抑制時の MAPO1 のタンパ
ク質レベルをイムノブロット法により解析した。その結果、図６に示すように、コントロールの siRNA を導入した細胞（siCONT）の定常時の MAPO1 レベルを１とすると、そのレベルは MNU 処理７２時間後に図５Ａの結果と同じく約２倍に上昇した。興味深いことに
FLCN ノックダウン細胞（siFLCN）では、MNU 未処理時の MAPO1 レベルがコントロールと比べて約４１％に減少し（*P<0.01）、MNU 処理後もその増加はほとんど観察されなかった。それに対して、AMPKaノックダウン細胞（siAMPKa）では、MNU 未処理時においてもコントロールレベルの約２倍に増加し（*P<0.01）、MNU 処理後のレベルはさらに上昇した。これらの結果は、FLCN は MAPO1 の安定化に関してポジティブに、AMPK は逆にネガティブに関与していることを示唆している。

	

6

MAPO1

4
2
0

MNU

-

+

-

siCONT+-

siFLCN+siAMPKα

図６、MAPO1 レベルへの FLCN-と AMPKa-ノックダウンの影響

４．アポトーシス誘導過程での AMPK-MAPO1-FLCN 複合体の変動
アポトーシス誘導過程における MAPO1 の FLCN と AMPK との物理的な相互作用の変動を解析するために、FLAG-MAPO1 を安定に発現する細胞を MNU 処理し、その後７２時間までの細胞抽出液（Input）を用いて抗 FLAG 抗体ビーズによる免疫沈降実験を行った。図７に示すように、今までの報告通り MNU 未処理の条件（０時間）では MAPO1 は FLCNと AMPKaの両者と相互作用し、複合体を形成していることが観察された。MNU 処理後もMAPO1 と FLCN の安定な相互作用は保たれたが、AMPKaは MAPO1 からゆっくりと解離
し 、 ７ ２ 時 間 後 に は そ の 相 互 作 用 は 著 し く 低 下 す る こ と が 見 出 さ れ た 。 AMPK のMAPO1-FLCN 複合体からの解離が MAPO1 タンパク質の安定化、ならびにアポトーシス誘導の活性化と密接に関連している可能性が考えられる。

Input
0

24

48

IP (FLAG)
72

0

24

48

72 ()FLAGMAPO1
FLCN
AMPKα
GAPDH

図７、アポトーシス誘導過程における MAPO1 の FLCN と AMPKaとの相互作用の変動

５．新規アポトーシス誘導因子 HMGA2 の同定
我々は図２に示した遺伝学的スクリーニングにより、アルキル化剤 MNU に耐性を示す
マウス由来の突然変異体を複数クローン単離している。そのうちの一つのクローン KH101
は Mapo1 遺伝子に欠損を生じた変異体であり、上記解析によりその遺伝子の機能を明らかにしたわけであるが、ここでは別のクローン KH102 に着目した。図８に示すように、KH102
細胞は親株である YT102 細胞に比べて有意に MNU に対する抵抗性を示し、その際に、カスパーゼ３の活性化が顕著に低下したことから、このクローンはアポトーシス関連遺伝子に欠損を持つ変異体であることが強く示唆された。そこで、Inverse-PCR 法によりこのクローンにおける変異遺伝子を決定したところ、新たなアポトーシス誘導遺伝子として Hmga2
遺伝子が同定された。

A

B
 

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






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 


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 

 

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 

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 



図８、アポトーシス誘導欠損変異株 KH102 の単離とその解析

６． HMGA ファミリータンパク質のアポトーシス誘導経路での機能解析
HMGA2 は HMGA1 とともに HMGA（high-mobility group A）ファミリーを構成し、クロマチンの構造変化、また、それを介した転写制御に関わっていることが知られている非ヒ
ストンのクロマチン結合タンパク質である。そこで、ヒト由来細胞での HMGA ファミリー
タンパク質のアポトーシス誘導における機能を明らかにするために、我々は HMGA1 とHMGA2 遺伝子に特異的な siRNA を用いて、それぞれの遺伝子を単独で、あるいは両遺伝子を同時にノックダウンした細胞を作出し、それらの細胞のアルキル化剤に対する感受性を解析した。図９に示すように、HMGA1 あるいは HMGA2 遺伝子を単独でノックダウンした細胞（siA1、siA2）はともにコントロール細胞（siCont）に比べて有意な耐性を示し、両遺伝子を同時にノックダウンした細胞（siA1&A2）はより高い抵抗性を示すことが明らかとなった。これらの結果より、HMGA1 と HMGA2 はどちらもアポトーシス誘導において重要な働きをしており、それぞれが相加的に機能していることが示唆された。

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









 図９、HMGA ノックダウン細胞が示すアルキル化剤抵抗性

HMGA ノックダウン細胞が示す薬剤耐性能とアポトーシス誘導との関連を明らかにするために、アルキル化剤処理後のカスパーゼ９の活性化をそれぞれのノックダウン細胞において解析を行った。図１０に示すように、コントロール細胞においては MNU 処理後７２時間以降にカスパーゼ９の活性化を示す Cleaved-caspasep-9 がはっきりと検出された。それに対して３種類の HMGA ノックダウン細胞においては、MNU 処理後９６時間経過しても弱いシグナルしか検出できなかった。これらの結果は、HMGA ノックダウン細胞では DNA
損傷に応答したアポトーシス誘導能が顕著に低下していることを示している。

    
  



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  



 
  



  b

図１０、HMGA ノックダウン細胞におけるカスパーゼ９活性アポトーシス誘導の初期過程においては、MMR タンパク質複合体による損傷の認識後に ATR/CHK1 キナーゼの活性化を始めとする DNA 損傷応答が引き起こされることが知られている。そこで、HMGA ファミリータンパク質のアポトーシス誘導経路における役割を明らかにするために、上記ノックダウン細胞における CHK1 のリン酸化をイムノブロット
法により解析した。図１１で見られるようにコントロール細胞（siCont）では MNU 処理後
２４時間で CHK1 のリン酸化が強く検出され、４８時間ではさらに上昇していた。それに対して、HMGA ノックダウン細胞においてはいずれのタイムポイントにおいても CHK1 のリン酸化が顕著に低下していた。また、HMGA ノックダウン細胞においても MMR 損傷認
識タンパク質複合体はコントロール細胞と同様に形成されていることを確認している。これらの結果から、HMGA は MMR 複合体による損傷認識直後の初期過程において、DNA 損
傷応答シグナルの活性化において重要な機能を担っていることが強く示された。



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  







 




 




   ! 

図１１、HMGA ノックダウン細胞における CHK1 の活性化

考察

本研究において、我々はレトロウイルスベクターを用いたジーントラップ法によりアルキル化剤に耐性を示す突然変異株を多数分離し、その解析により O6-メチルグアニンが引き起こすアポトーシス誘導因子として MAPO1 と HMGA ファミリータンパク質を新規に同定した。
MAPO1 はそれまで未解析な機能未知のタンパク質であったため、我々はその遺伝子をO6-methylguanine-induced apoptosis 1 と命名し論文に発表した。これとは別に Hasumi らは
BHD（Birt-Hogg-Dube）症候群の原因タンパク質である FLCN（Folliculin）と相互作用する因子を探索し、２種類のタンパク質 FNIP1 と FNIP2（folliculin-interacting protein 1 & 2）を

同定した（Baba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 15552–15557, 2006; Hasumi et al., Gene,
415, 60–67, 2008）。このように全く独立に同定されてきた MAPO1 と FNIP2 であるが、タン
パク質の一時構造を比較したところ MAPO1 と FNIP2 は同じタンパク質であることが判明
し、MAPO1 は細胞内において発がん抑制タンパク質である FLCN と複合体を形成して機能していることが推察された。免疫沈降法による実験を行ったところ、MAPO1 は確かに細胞内で FLCN と相互作用すること、それに加えて、細胞内のエネルギーレベルを感知する
AMPK（AMP-activated protein kinase）とも相互作用することが明らかとなった。siRNA を用いた遺伝子ノックダウン実験により、FLCN と AMPKaはともにアポトーシス誘導において機能することも明らかとなり、MAPO1-FLCN-AMPK 複合体がアポトーシス誘導の制御において重要な機能を担っていることが強く示唆された。興味深いことに細胞内の MAPO1は定常状態では CK1 と SCFb-TRCP を介したユビキチン／プロテアソーム系により分解され、低レベルに抑えられているが、DNA 損傷応答に伴い MAPO1 はこの分解を逃れ、そのタン
パク質レベルが上昇することが明らかとなった。安定化した MAPO1-FLCN 複合体がアポ
トーシス誘導のシグナル伝達において重要な機能を担っていると考えられる。現在のところ、MAPO1 がアポトーシスの誘導刺激によりどのようにして安定化するのかは分かっておらず、その仕組みの解明は今後の課題である。また、前述の FNIP1 は MAPO1/FNIP2 と同様 に FLCN と 複 合 体 を 形 成 し て 機 能 し て い る 。 FNIP1 タ ン パ ク 質 の 一 時 構 造 はMAPO1/FNIP2 のそれとの相同性が極めて高く、その構造上にb-TRCP の認識コンセンサス
配列も見出され、MAPO1 と同様なタンパク質安定性の制御を受けていると推察される。今後は、FNIP1-FLCN 複合体がアポトーシス誘導において機能しているのか、もし機能しているのなら MAPO1-FLCN 複合体との機能の共通性と相違性についても明らかにしたいと考えている。
ジーントラップ法を用いたスクリーニングによって得られた突然変異体の解析をさらに進めることで、新たなアポトーシス誘導因子として HMGA が同定された。HMGA ファミ
リータンパク質は HMGA1 と HMGA2 から構成された非ヒストンのクロマチン結合タンパ
ク質で、３つの AT-hook とよばれる DNA 結合ドメインと C 末端側に酸性アミノ酸に富んだ領域を持つ。HMGA は単独では転写調節因子としての活性は持たないものの、C 末端の酸性領域で他の転写調節因子と結合することで、クロマチンリモデリング、ならびに遺伝
子発現の制御に関わると考えられている。興味深いことにジーントラップ法により得られた変異株 KH102 細胞において、ウイルスベクターは Hmga2 遺伝子の第三イントロン（AT-hook をコードする領域と酸性領域をコードする領域の間に位置する）に挿入されており、この細胞では C 末端側の酸性領域を欠いた truncated form の Hmga2 を発現していると考えられる。この細胞がアポトーシス誘導能を欠損しているということからも、その誘導活性には HMGA の C 末端側の酸性領域を介したタンパク質の相互作用が重要であることが推察される。実際にヒトの腫瘍においても、HMGA2 の遺伝子再編により C 末端側を欠失した truncated form の HMGA2 発現している症例が見出されている。今後は、HMGAの C 末端側の酸性領域を介してクロマチン上にリクルートされてくる因子を同定し、そのアポトーシス誘導における機能を明らかにしていきたい。
最後に、本研究により明らかにした O6-メチルグアニンが引き起こすアポトーシス誘導経路のモデルを図１２にまとめる。HMGA ファミリータンパク質は MMR タンパク質複合体による損傷認識の直後のクロマチン上で機能し、ATR や CHK1 のリン酸化を始めとする
DNA 損傷応答シグナルの発信において重要な役割を担っていると考えられる。MAPO1 複合体はその下流のシグナル伝達系において機能し、ミトコンドリアの膜の脱分極、ならびにそれに伴うカスパーゼの活性化を引き起こすことで、アポトーシスが実行されると考えている。今後は、HMGA ならびに MAPO1 複合体の作用機序を分子レベルで明らかにてい
きたいO6-meG:T%!
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図１２、DNA 損傷が引き起こすアポトーシス誘導経路

発表論文

1.

Nagashima K., Fukushima H., Shimizu K., Hidaka M., Hasumi H., Ikebe T., Fukumoto S.,
Okabe K., Inuzuka H. (2016) Nutrient-induced FNIP degradation by SCFβ-TRCP regulates
FLCN complex localization and promotes renal cancer progression. Oncotarget, doi:
10.18632/oncotarget.14221.

2.

Fujikane R., Komori K., Sekiguchi M., Hidaka M. (2016) Function of high-mobility groupA
proteins in the DNA damage signaling for the induction of apoptosis. Sci. Rep., 6, 31714; doi:
10.1038/srep31714.

3.

Hidaka M. (2014) Induction of apoptosis to eliminate cells carrying mutation-evoking DNA
lesion. Rad. Biol. Res. Commun., 49, 73-84.

4.

Sano S., Sakagami R., Sekiguchi M., Hidaka M. (2013) Stabilization of MAPO1 by specificbinding with folliculin and AMP-activated protein kinase in O6-methylguanine-induced
apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 430, 2, 810-815.

5.

Fujikane R, Sanada M, Sekiguchi M, Hidaka M. (2012) The identification of a novel gene,
MAPO2, that is involved in the induction of apoptosis triggered by O6-methylguanine.

PLoS

ONE, 7, 9, e44817.

6.

Lim TH., Fujikane R., Sano S., Sakagami R., Nakatsu Y., Tsuzuki T., Sekiguchi M., Hidaka M.
(2012) Activation of AMP-activated protein kinase by MAPO1 and FLCN induces apoptosis
triggered by alkylated base mismatch in DNA. DNA Repair, 11, 259-266.

図書
なし

学会発表
1.

林田元気、中津可道、日高京子、藤兼亮輔、日高真純、釣本敏樹、續輝久 (2016) ヒト細胞由来ミスマッチ修復遺伝子変異体の作製とその解析.
年会（横浜）

第 39 回日本分子生物学会

2.

宋穎霞、日高京子、中津可道、織田信弥、林田元気、藤兼亮輔、日高真純、續輝久 (2016)
CRISPR/Cas9 を用いた DNA ポリメラーゼ δR506H 突然変異の MSH2 欠損 HeLa 細胞へ
の導入.

3.

第 39 回日本分子生物学会年会（横浜）武石幸容、藤兼亮輔、高橋達郎、関口睦夫、日高真純 (2016) ミスマッチ修復依存のア
ポトーシス誘導に関わるクロマチンリモデラーの機能.

第 39 回日本分子生物学会年

会（横浜）

4.

Fujikane R., Komori K., Sekiguchi M., Hidaka M. (2016) Function of high-mobility group A
proteins in DNA damage signaling for the induction of apoptosis triggered by
O6-methylguanine. The 10th 3R Symposium, Matsue, Japan.

5.

Hayashida G., Nakatsu Y., Hidaka K., Fujikane R., Hidaka M., Tsurimoto T., Tsuzuki T.
(2016) Development of assay systems to characterize the variants of mismatch repair factor
MSH2 found in Lynch syndrome. The 10th 3R Symposium, Matsue, Japan.

6.

藤兼亮輔、関口睦夫、日高真純. (2016) アルキル化剤によって引き起こされるアポトー
シスに関わる新規因子の同定と解析.

7.

武石幸容、藤兼亮輔、関口睦夫、日髙真純. (2016) アポトーシス誘導過程に起こるクロマチン構造変化の解析.

8.

第 23 回日本歯科医学会総会（福岡）

第 23 回日本歯科医学会総会（福岡）Hayashida G., Nakatsu Y., Hidaka K., Fujikane R., Hidaka M., Tsurimoto T., Tsuzuki T.
(2016) Characterization of mismatch repair factor MSH2 variants found in Lynch syndrome.
日本放射線影響学会第 59 回大会（広島）9.

Hayashida G., Nakatsu Y., Hidaka K., Fujikane R., Hidaka M., Tsuzuki T. (2016)
Development of in vitro assay system to characterize the variants of mismatch repair factor
MSH2 found in Lynch syndrome. 第 75 回日本癌学会学術総会（横浜）10. Fujikane R., Takeishi Y., Sekiguchi M., Hidaka M. (2016) A novel function of HMGA family
proteins in the induction of apoptosis triggered by O6-methylguanine in DNA. 第 75 回日本癌学会学術総会（横浜）11. 藤兼亮輔、関口睦夫、日高真純. (2015) O6 メチルグアニンによりひき起こされるミスマッチ修復依存のアポトーシス誘導に関わる新規因子の同定.

第 38 回日本分子生物学会年会（神戸）12. 武石 幸容、藤兼 亮輔、関口 睦夫、日高 真純. (2015) ミスマッチ修復に依存したアポ
トーシス誘導に関わるクロマチン動態の解析.

第 38 回日本分子生物学会年会（神戸）

13. 日高京子、中津可道、日高真純、續輝久. (2015) 心臓発生に影響する遺伝毒性物質スクリーニングをめざした多能性幹細胞分化系の開発.

第 44 回環境変異原学会 （福岡）

14. 藤兼亮輔、関口睦夫、日高真純. (2014) ミスマッチ修復タンパク質依存のアポトーシス
誘導における HMGA2 の機能.

第 37 回日本分子生物学会年会 （横浜）

15. 日高真純、佐野しおり、坂上竜資、関口睦夫. (2013) アポトーシス誘導過程の MAPO1の安定化は FLCN と AMPK により制御される.

第 85 回大会日本遺伝学会

（慶応義

塾大学）

16. 佐野しおり、坂上竜資、関口睦夫、日高真純. (2012) アポトーシス誘導過程における
MAPO1 タンパク質の安定化.

第 35 回日本分子生物学会年会 （福岡）

17. 日高真純、佐野しおり、藤兼亮輔、林徳豪、坂上竜資、中津可道、續輝久、関口睦夫.
(2012) 発がんを抑制するアポトーシスの誘導機構.

第 35 回日本分子生物学会年会（福岡）

18. Fujikane R., Sanada M., Sekiguchi M., Hidaka M. (2012) The identification of a novel gene,
MAPO2, that is involved in the induction of apoptosis triggered by O6-methylguanine. The 8th
3R Symposium, Awaji, Japan.

19. 日高真純、林徳豪、藤兼亮輔、佐野しおり、坂上竜資、中津可道、續輝久、関口睦夫.
(2012) MAPO1 と FLCN による AMPK の活性化はアポトーシスを誘導する.
会日本遺伝学会 （福岡）

第 84 回大特許なし

研 究 課 題

クロマチンリモデリングファクターとゲノムの安定な維持	
 

研究代表者

梅津	
  桂子（機能生物化学講座・生化学分野・教授）

	
 
要約
	
  酵母のクロマチンリモデリングファクターRdh54 は、従来考えられていた相同組換えにおける機能のみならず、セントロメア領域を介してゲノムの安定化に寄与することを見出し、この新規の機能について解析を進めている。本研究では、Rdh54 が直接セントロメア
特異的なタンパク質 Cse4 と相互作用する事を明らかにし、さらに、それぞれのタンパク質における結合領域を特定した。Rdh54 のホモログ Rad54 も Cse4 と相互作用するが、Cse4を断片化して解析すると Rdh54 のみと特異的に結合する領域が得られ、最終的には Cse4
中央部の 21 アミノ酸残基に特定された。この領域にアミノ酸置換を導入した解析により、結合には領域内の複数の Lys 残基の正の荷電が関与していることが示唆された。一方、
Rdh54 の Cse4 結合領域は中央部の約 300 アミノ酸残基となり、ヒストン H3 との結合領域とは異なることが分かった。以上のことから、クロマチンリモデリングファクターRdh54
がセントロメア特異的なタンパク質 Cse4 との相互作用を介して、ゲノムの安定な維持に関与することが示唆された。
	
 
研究目的
	
  転写や DNA 修復、複製等、染色体上で生物機能が営まれる際には、クロマチン構造を解消し、ゲノム DNA を表出させる必要がある。ヒストンやその他の DNA 結合タンパク質をゲノム DNA から外すことをクロマチンリモデリングと呼び、それぞれの生物機能毎に特異的なクロマチンリモデリングファクターが存在することが知られている。酵母には 11 種類のクロマチンリモデリング因子が存在するが、この内、Rad54 と Rdh54 は Swi/Snf ファミリーに属するクロマチンリモデリングファクターであり、共に相同組換えに関与している。
Rad54 については試験管内ヌクレオソームリモデリング活性に加え、ヒストン H3 と直接相互作用することも報告されている。我々の研究室では、酵母二倍体細胞を用いたゲノム安定性の解析から、相同組換えが欠損している Rad52 の欠失株において、Rdh54 をさらに欠損させるとゲノム変化の中でも特に染色体喪失が上昇することを見出した（図１Class A）。
さらにこの株では、セントロメア配列に依存してプラスミド喪失が上昇する（図２）ことから、Rdh54 はセントロメア領域を介して染色体の安定化に寄与することが示唆された。
Rdh54 はキネトコアタンパク質と共局在するとの報告があることから、Rdh54 の新規機能について、Rdh54 がセントロメア特異的なヒストン H3 バリアントである Cse4 と相互作用

することで作用しているとの作業仮説を立てた。つまり、Cse4 を含むセントロメア特異的
ヌクレオソーム構造のクロマチンリモデリングに Rdh54 が必要とされるのではないかとの仮説である。そこで本研究では、Rdh54 と Cse4 が特異的に相互作用するのかについて、細胞内および試験管内で検証した。

	
 
図 １ 	
  rad52 rdh54 株 の 二 倍 体 細 胞 で は

図 ２ 	
  Rdh54 は セ ン ト ロ メ ア 依 存 的 に

染色体喪失が特に増加する	 プラスミドを安定化する	 Class A

(Chromosome loss)

800
43x

47x

120x
110x

600
500

29x

400

78x

25x

61x

300
200

0

1

19.4

1x

1x

RAD52

rad52

RAD52

rad52

wt/wt
rad52/rad52
rad52/rad52 rdh54/rdh54

0.1

4.5x

0

5

10

15

(Interchromosomal (Intrachromosomal
recombination)
recombination &point mutation)
2.2x

2.0x

20

25

No. of generations

B

Diploid

Class C

12

Frequency (x10-5)

10.6

0.01

2.4x

Class B

15

6.84
10

20

pKY4 (ARS-CEN)

pKY3 (ARS)
14.5% loss per generation

100

100

16

13.7

12

14.3

9.75
7.70

8
4.03

4

14.6

2.70

3.07

4.90

7.01

5.46

9
6

0

15x
1x

0

RAD52

rad52

RAD52

rad52

MAT α

3

28

0.1x 0.1x 0.1x

RAD52

rad52
wt

rad54

1x

1.0x

RAD52
rdh54

0.6x 0.3x 0.9x

rad52

% loss per generation

Frequency (x10-5)

700

Plasmid loss rate(% loss per
generation)

A
Plasmid maintaining frequency (%)

Total LOH

pKY4 (ARS-CEN)

pKY3 (ARS)
21.4

21.0

24

18.5

20
16

11.0

15.314.5

12
8
4
0

1.41

2.53

1.83 2.35

RAD52

3.21 2.47

rad52
wt

rad54

RAD52
rdh54

rad52

方法
A. 細胞内局在解析
	  酵母細胞内で、Rdh54 の C 末端に YFP（Yellow Fluorescence Protein）を融合させた
Rdh54-YFP、ならびに、Cse4 の C 末端に CFP（Cyan Fluorescence Protein）を融合させた
Cse4-CFP を同時に発現させ、蛍光顕微鏡でそれぞれの局在を観察した。

B. 試験管内相互作用解析
	  酵母の Rad54 と Rdh54、及びそれぞれを断片化した部分ポリペプチドについては、His
タグもしくは MBP タグを N 末端に付加したポリペプチドとして大腸菌で過剰発現し、Ni2+
ビーズもしくはアミロースビーズを用いて精製した。ヒストン H3 と Cse4、及びそれぞれを断片化した部分ポリペプチドについては、GST タグを N 末端に付加したポリペプチドとして大腸菌で過剰発現し、グルタチオンビーズを用いて精製した。精製標品を混和後、グルタチオンビーズでプルダウンし、SDS-PAGE と CBB 染色により相互作用を観察した。必要に応じてタグに対する抗体によるウェスタンブロッティングを用いた（図８、括弧内）。
	 結果と考察	
 A. 細胞内局在解析
	  Rdh54 は酵母細胞内で Rdh54 はキネトコアタンパク質である Mtw1 と共局在することが知られている。そこで、Rdh54 が酵母細胞内でセントロメア特異的なヒストン H3 バリアントである Cse4 と共局在するか検討した。Rdh54 の C 末端に YFP を融合させた Rdh54-YFPを、同時に Cse4 の C 末端に CFP を融合させた Cse4-CFP を酵母で発現させて、蛍光顕微鏡
でそれらの局在を観察した。酵母細胞内でセントロメアは核内の中央付近の一部分に集まる（セントロメアクラスタリング）。図３に示すように、Rdh54 と Cse4 の共局在が観察された。
図３	
  細胞内で Rdh54 は Cse4 と共局在する

Bright field

Rdh54-YFP

Cse4-CFP

Merge

B. 完全長タンパク質間の相互作用解析
クロマチンリモデリングファクターRdh54 とセントロメアとの関係を明らかにするため、Rdh54 とセントロメア特異的ヒストン H3 バリアント Cse4 の相互作用を検討するとともに、対象実験としてそれぞれのホモログ Rad54 とヒストン H3 を加えて解析を行なった。既に報告されている Rad54 とヒストン H3 の相互作用に加え、Rdh54 とヒストン H3、Rad54 とCse4、Rdh54 と Cse4 間の相互作用が明らかとなった。図４には Rad54 と Cse4、Rdh54 とCse4 の免疫共沈降の結果を示す。

図４	
  試験管内で Rdh54 と Cse4 は共沈降する

Ｃ. Cse4 の Rdh54 特異的結合領域の特定
Rdh54 と Cse4 間の相互作用について、Cse4（全長 229 アミノ酸残基）を断片化し Rdh54と特異的に結合する領域を免疫沈降実験により解析し（図５）、以下の結果を得た。
○ Cse4 の 109 番目から 129 番目のアミノ酸残基で Rdh54 と強い相互作用を示した（図５）。
○ 上記 21 アミノ酸残基中の４つのリシン残基をアラニン残基に変換すると Rdh54 との相互作用は失われるが、アルギニン残基への変換では元と同様の相互作用を示した（図６）。
Rdh54 との相互作用にはこの Cse4 領域の正の荷電が重要であることが示唆される。
○ 上記 21 アミノ酸残基が含まれる領域はα-へリックス構造を取っている可能性が高い組

成を示すことから、Edmundson wheel blot によりα-へリックス上のアミノ酸残基の配置を解析したところ（図７）、Rdh54 との相互作用の中心となる４つのリシン残基は全てα-へリックスの特定のサイドに集まっていることが分かった。Cse4 の特定の面が Rdh54との結合に関わっていることが示唆される。
○ 特定された Rdh54 との相互作用領域のポリペプチドに対して Rad54 は相互作用を示さず、この領域は Rdh54 に対して特異的に相互作用することが分かった。
○ Rdh54 との相互作用領域はヒストン H3 には該当する領域が無く、また、必須遺伝子 CSE4中の必須領域にも該当しない。
○ Rad54 と Cse4 との相互作用については、ヒストン H3 ホモログ領域を含めた領域が必要であり、Rad54 とヒストン H3 の相互作用を反映したものである可能性がある。

図５	
  Cse4 の Rdh54 特異的結合領域の同定	
 図６	  Cse4 の Rdh54 特異的結合領域のアミノ酸置換解析

図７	  Cse4 の Rdh54 特異的結合領域の構造解析（Edmundson wheel plot）

D. Rdh54 の Cse4 特異的結合領域の特定	
 上記 C で特定された Cse4 の 21 アミノ酸残基からなるポリペプチドに対して、Rdh54（全長 924 アミノ酸残基）を断片化して免疫沈降実験により解析した（図８）。Cse4 と特異的に結合する Rdh54 の領域について以下の結果を得た。
	 図８	  Rdh54 の Cse4 特異的結合領域の同定

	 ○ Rdh54 の 301 番目から 600 番目のアミノ酸残基で Cse4 断片と相互作用を示した。ただし、完全長よりも相互作用は弱い。
○ 上記 300 アミノ酸残基のポリペプチドについて、特に酸性アミノ酸残基の存在に着目して断片化解析を行なったが、同等の相互作用を示す断片は特定できなかった。	
 ○ 上記の相互作用領域は Rdh54 のヒストン H3 との相互作用領域とは異なっていた。	
 	 以上、図３-８の結果より、Rdh54 と Cse4 とは互いに特異的な領域によって相互作用する
ことが示された。

E. クロマチンリモデリングファクターのタンパク質量の解析
	  RAD54 遺伝子は放射線感受性変異株の原因遺伝子として取得され、生化学的な解析からクロマチンリモデリングファクターをコードしていることが明らかとなっている。一方、
RDH54 遺伝子は DNA 配列が RAD54 遺伝子に似ているホモログとして同定されたものである。我々の研究室で明らかになった rdh54 変異株における染色体喪失の上昇は、rad54 変異
株では観られない。これら変異株の表現型の違いが、細胞内における Rad54 と Rdh54 の発
現パターンが関与する可能性を調べる為に、細胞内でのタンパク質量について比較した。
Rad54 の発現は DNA 損傷剤により誘導されることが知られているので、酵母細胞培養液にMethyl methan sulfonate (MMS)を添加して経時的に細胞のサンプリングを行い、Rad54 とRdh54 のそれぞれのタンパク質量を Western blot 法により観察した。図９に示すように、
Rad54 は MMS 刺激によりそのタンパク質量の増加が認められた。一方、Rdh54 は常に一定量存在し、MMS 刺激によるそのタンパク質量の増加は認められなかった。Rad54 と Rdh54の役割分担について、タンパク質間の相互作用以外にも、タンパク質量の制御が関与している可能性が示された。

図９	
  DNA 損傷を誘導した細胞内の Rad54／Rdh54 タンパク質量	  本研究では、酵母のクロマチンリモデリングファクターである Rdh54 とセントロメアとの関連を検討した。試験管内での免疫沈降反応により、Rdh54 とセントロメア特異的なヒストン H3 バリアントである Cse4 との直接的な相互作用が認められ、それぞれ特異的結合
領域を特定することができた。Rdh54 は Cse4 を介してゲノムの安定な維持に関与する新規機能を持つとの我々の仮説に一致する結果である。また、同様の実験で、新たに Rdh54 とヒストン H3 との直接的な相互作用も認められた。この相互作用を担う領域は今回特定された Rdh54-Cse4 相互作用領域とは異なることから、上記の新規機能とは別の Rdh54 のRad54 に対するバックアップ作用と関連するものかもしれない。Rdh54 の細胞内局在は、
セントロメアクラスターと核全体とに分かれており、それぞれ、Cse4 と相互作用する Rdh54、
並びに、ヒストン H3 と相互作用する Rdh54 とに対応していると考えられる。試験管内の相互作用と細胞内で観られ共局在とが一致したものとと捉えることができる。
	  本研究により酵母 Cse4 の Rdh54 相互作用には中央部の 21 アミノ酸残基からなる領域が重要であり、領域中のリシン残基の正の電荷が Rdh54 との結合に必須であることを示した。
領域中の４つのリシン残基は Edmundson wheel blot によると Cse4 タンパク質の同じ面に並んでいることも分かった。ヒトにも Cse4 と Rdh54 のホモログがそれぞれ存在するが、ヒト
Cse4 ホモログの CENP-A には今回特定した領域と相同性の高い配列は認められない。しかしながら、興味深いことに CENP-A の N 末端テール領域に酵母で観られた配列と同様の配置を取る３つのリシン残基が認められることが分かった（図 10）。この領域は酵母の N 末
端テール領域との相同性が高い領域でもある。ヒト CENP-A では酵母 Cse4 の Rdh54 結合
領域とテール領域が融合した形を取っている可能性が考えられる。
	
  酵母においてクロマチンリモデリングファクターがセントロメアに関連するゲノム安定性に関与するという報告はあるが、直接セントロメア特異的タンパク質と相互作用するとの報告はなく、本研究が初めてのものとなる。今回の結果より、必須遺伝子 CSE4 について Rdh54 との相互作用を特異的に失った機能分離変異株が作成できる可能性が示された。
この変異株の作製・解析を通じて Rdh54-Cse4 の相互作用とゲノム安定性との関係を特定することができると考えている。

図 10	
  酵母 Cse4 とヒト CENP-A のアミノ酸配列の比較

酵母 Cse4 (109-129): DRYVRQKRREKQRKQSLKRVE

ヒト CENP-A N-helix (43-63): RRQGWLKEIRKLQKSTHLLIR

酵母 Cse4 N-helix (134-154): PSELALYEIRKYQRSTDLLIS

発表論文＊Hayashi, M., Umezu, K. (2017) Homologous recombination is required for recovery fromoxidative DNA damage. Genes Genet. Syst	
 (in press).

＊石橋一成、林道夫、梅津桂子 (2015) Wrn 遺伝子ノックダウンは酸化ストレスによる細胞死を増強する. 福岡歯科大学学会雑誌 40, 103-111.
	
 
学会発表	
 
橋口一成，梅津桂子，関口睦夫 (2016) ヒト Nudix ファミリータンパク質によるゲノム安定性の維持機構の解析．第 39 回日本分子生物学会年会（横浜）．	
 	
 梅津桂子，林	  道夫	
 (2015) ヌクレオチド損傷の発生と制御の機構．日本遺伝学会第 87 回大会
（仙台）．
	
 
林道夫，石橋一成，梅津桂子 (2014) 酵母のセントロメア特異的ヒストン H3 バリアント
Cse4 を介したクロマチンリモデリング因子 Rdh54 の新規機能．第 37 回日本分子生物学会
年会（横浜）．	
 

林道夫，石橋一成，梅津桂子 (2013) クロマチンリモデリング因子とゲノムの安定な維持：
Cse4 を介した Rdh54 の機能．第 36 回日本分子生物学会、神戸．

石橋一成，林道夫，梅津桂子 (2013) 酸化ストレスによるアポトーシス：ウェルナー症候群
原因遺伝子ＷＲＮの欠損による増強．第 36 回日本分子生物学会、神戸．
	 研 究 課 題

環境因子の遺伝系への作用	 	
 口腔粘膜の老化機構と発がんとの関係についての研究	
 

研究代表者

	
  池邉	
  哲郎（口腔・顎顔面外科学講座・口腔外科学分野・教授）

その	
 
要約
	
  口腔がんは口腔粘膜の扁平上皮細胞（ケラチノサイト）の遺伝子変異によって生じると考えられている。がん化に際して重要なゲノム上のイベントの１つは、がん抑制遺伝子の不活性化である。このようながん抑制遺伝子の１つに p16INK4a がある。p16INK4a は CDK4を抑制することによって細胞周期にブレーキをかけて細胞増殖を抑制する。p16INK4a は、
一方で、細胞老化マーカーとの報告もある。細胞老化とは不可逆的な細胞周期停止を意味
し、がん化の防御機構であるとの考え方もある。従って、口腔がんは p16INK4a の発現抑制または不活性化を通じて、細胞老化が抑制された状態であると考えられる。
そこで、環境因子として活性酸素（酸化ストレス）に着目し、活性酸素曝露時のケラチ
ノサイトおよび口腔扁平上皮癌細胞（OSCC）における p16INK4a の発現を調べ、p16INK4aの抑制機構として、エピジェネティック制御（p16INK4a のプロモーター領域のメチル化レベル）を調べ、ケラチノサイトの細胞老化制御機構を研究した。	
 また、folliculin (FLCN)と FNIP との複合体（FLCN 複合体）は欠失すると腎臓腫瘍が生じ、BHD 症候群にみられる腎臓腫瘍のがん抑制遺伝子と考えられている。FLCN や FNIPが減少すると mTORC が lysosome に結合し細胞周期が進行することが考えられている。
しかし、FLCN 複合体の発現量を調節するメカニズムは不明であった。mTORC は、一方で、老化促進因子である。FLCN 複合体の量調節メカニズムの研究は、がん化と細胞老化との相互作用の解明にもつながるであろう。そこで、環境因子としての栄養に着目し、低栄養から高栄養への変化による FNIP の量的変化と mTORC の局在の変化との関連、さらに腫瘍形成への影響を調べ、FNIP のがん抑制因子としての機能を検討した。
	 
研究目的【研究１】正常ケラチノサイトを活性酸素（H2O2）で刺激した際に細胞老化マーカーの発現を調べることによって細胞老化が生じるか否かを調べる。特に、p16INK4a の発現を解析し、その発現がエピジェネティック制御を受けているか否かを検討する。同様に OSCC でも解析し、がん細胞では p16INK4a のエピジェネティック制御の有無を明らかにする。	
 【研究２】がん細胞を低栄養および高栄養で培養し、FLCN と FNIP からなる FLCN 複合体の制御機構（E3 ユビキチンリガーゼを介したユビキチン・プロテアソーム分解系による制御）とがんおよび老化に関わるキナーゼ mTORC との相互作用を調べ、FNIP2 ががん抑制因子であるとともに老化制御因子である可能性を検討する。

方法
【研究１】
１）正常ケラチノサイト（NHEK）と口腔扁平上皮癌細胞とを過酸化水素で処理し、細胞老化マーカーSA-β-galactosidase の発現を調べる。
２）正常ケラチノサイト（NHEK）と口腔扁平上皮癌細胞とを過酸化水素で処理し、p53TP53、
p21cip1、p16INK4a の発現を RTPCR および Western blotting で解析する。
３）正常ケラチノサイト（NHEK）と口腔扁平上皮癌細胞とを過酸化水素で処理し、DNA
メチル化酵素 DNMT1 の発現を RT-PCR および Western blotting で解析する。
４）正常ケラチノサイト（NHEK）と口腔扁平上皮癌細胞とをメチル化インヒビター5-Azac
で処理し、p53TP53、p21cip1、p16INK4a の発現を RT-PCR および Western blotting で解析する。
５）正常ケラチノサイト（NHEK）と口腔扁平上皮癌細胞とを過酸化水素で処理し、p16INK4a
遺伝子プロモーターのメチル化レベルを解析する。
６）分化程度の異なる口腔扁平上皮癌細胞のケラチン 13 遺伝子発現と同遺伝子のクロマチン修飾（ヒストン修飾）とを比較する。
【研究２】
１）HeLa,293T 細、BHD 患者由来の UOK257 細胞を培養し、細胞増殖刺激（老化促進刺激）と細胞増殖抑制（老化抑制）との状態を培地の栄養状態で調節するため、低栄養の際は FBS	 Free	 DMEM,グルコースアミノ酸欠乏培地を、高栄養の際は 10%FBS 添加	 DMEM を使用した。	
 ２）培地を低栄養から高栄養に変化させることによって FLCN と FNIP の発現量（Western
blotting）、FLCN と FNIP の結合（免疫沈降法）、mTORC の活性化を解析した。
３）FNIP の量的制御がユビキチン・プロテアソーム系によって調節されている（高栄養ではプロテアソームによって FNIP が分解される）ことを、E3 ユビキチンリガーゼと FNIPとの相互、特に、E3 ユビキチンリガーゼの 1 つである SCF 型（Cullin1、SKP1,RBX1、
FBOX）と FNIP2 との相互作用を免疫沈降法で検討した。
４）FNIP2 が結合する FBOX であるβ-TRCP との結合機構、特に結合に必要な FNIP2のリン酸化酵素を検討した（FNIP のリン酸化によって E3 ユビキチンリガーゼが結合し、FNIP がプロテアソームによって分解される）。
５）低栄養から高栄養にすることによって FNIP が分解されることによって mTORC がlysosome に移行することを免疫染色によって検討した。また、β-TRCP をノックダウン
することによって FNIP が安定化して mTORC が lysosome に移行できないことを検証した。さらに、FNIP のノックダウンによって mTORC は lysosome に安定的に局在することを調べた。
６）BHD 患者由来の細胞 UOK257 に FNIP2 を導入してレスキューした細胞と親細胞と戸で、細胞増殖およびヌードマウス移植した際の腫瘍形成を検討した。

	
 
結果と考察	
 【研究１】（１）SA-β-galactosidase（SA-β-gal）の発現：過酸化水素処理により NHEK の SA-β-gal発現が見られたのに対し SCC では SA-β-gal 発現が見られなかった。NHEK は ROS により細胞老化するが、がん細胞は細胞老化しないことが示された。

	
  	
  	
 
（２）p53TP53、p21cip1、p16INK4a の発現：過酸化水素処理によって、NHEK と SCC ともに p53TP53の発現に変化はなかった。しかし、p21cip1 と p16INK4a の発現は NHEK で上昇し、SCC では変化がなかった。p21cip1 と p16INK4a とは共に細胞老化による細胞周期停止に関与していることが報告されているため NHEK では ROS により細胞老化が生じ、SCC は細胞老化しないことを反映している。

	 （３）DNMT1 の発現：過酸化水素処理によって NHEK の DNMT1 発現が抑制されたが、SCC の DNMT1 発現には変化がなかった。NHEK では ROS により遺伝子のメチル化レベルが減少することが示唆された。

（４）メチル化インヒビター5-Azac の効果：5-Azac で細胞を処理すると、NHEK では p21cip1と p16INK4a の発現が上昇したが、SCC では変化がなかった。ROS による p21cip1 と p16INK4a の発現、つまり細胞老化には遺伝子のメチル化が関与していることが考えられた。

	 （５）p16INK4a のプロモーター領域のメチル化：過酸化水素処理によって、NHEK では p16INK4a
プロモーター領域のメチル化レベルの低下が見られたが、SCC では変化が見られなかった。

	
 
	
 
	
  以上のような結果から、以下のような細胞老化とがん化との相互作用が示唆された。

	
 

【研究２】
（１）栄養状態依存的に FNIP タンパクはユビキチンプロテアソーム機構による量的制御を受けている。
①栄養状態の変化における FLCN 複合体の経時的なタンパク発現の変化をウェスタンブロ
ッティング法で確認したところ、FLCN は変化がなかったのに対し、FNIP は高栄養状態でタンパクが減少した。その際に FNIP の減少に相反するように mTOR シグナル活性化の指標である mTOR、S6K のリン酸化を認め mTOR シグナルの活性化を認めた。
②プロテアソーム阻害剤である MG132 を投与することでタンパクの減少及びリン酸化の抑制を認めました。

	 （２）FNIP2 は SCF(	 SKP1	 -	 Cullin1	
 -	
 FBOX	 )型 E3 ユビキチンリガーゼと相互作用する	 ①Cullin リング複合体の共通のコンポーネントである cullin ファミリーと FNIP2 の相互作用を免疫沈降法(IP)にて検討したところ、Cullin1 と FNIP2 の特異的な結合を認めた。	
 ②Cullin1 は SKP1,RBX1,FBOX からなる SCF コンプレックスを形成することが報告されているが、SCF コンプレックスの共通のコンポーネント
で あ る 、 SKP1,RBX1 とFNIP2 との相互作用を確認したところそれぞれ結合を認めた。	
 ③Cullin1 特異的 shRNA にてノックダウンすること
で FNIP2 のタンパク発現が上昇した。	
 	 （３）FNIP2 は SCFβ-TRCP と相互作用する	 ①代表的な FBOX タンパクのノックダウンを行ったところ、b-TRCP のノックダウンにて特異的に FNIP2 の発現が上昇した。	
 ②β-TRCP と FNIP2 との相互作用を	
 IP を行い検討したところ結合を認め、内在性タンパクにおいても同様の結果となった。	
 ③β−TRCP の基質認識配列にポイントミューテーションを入れた変異型のβ−TRCP では
FNIP2 と の 結 合 が見られなった。	
 	 	 （４）FNIP2 は CK1によるリン酸化依
存的に SCFβ-TRCP による量的制御を受ける	
 ① β−TRCP の 認 識
配列に、FNIP2 の一
時配列内にデグロンと呼ばれる β−TRCP 認識配列の存在を確認したため、この配列を利用し、β-TRCP が FNIP2 を特異的に認識しているかを明らかにする目的で、FNIP２の３箇所のセリン残機をアラニンに置換したリン酸化しない変異型の FNIP2	
 3A を作成し検討を行った。その結果、WT で見られた β−TRCP と FNIP2 との結合は 3A では見られなくなった。	
 ②FNIP2 をリン酸化する可能性があるキナーゼを網羅的に検証したところ、CK1 によるリン
酸化依存的に FNIP2 の分解を認めた。また、この分解は 3A では見られなった。	
 ③タンパクの半減期を比較したところ、WT に比べて 3A では明らかな半減期の延長を認め、ユビキチンアッセイでは WT で見られたユビキチン化が 3A では見られなった。	
 

	
 

	
 

	
 
	
 
（５）FNIP の量的制御は mTOR の Lysosome への局在化に影響する	
 ①shRNA にて β−TRCP をノックダウンした細胞では、FNIP が安定化するとともに mTOR シグ

ナルの減弱を認めた。	
 	
 ②低栄養状態及び β-TRCP ノックダウン細胞では FLCN が Lysosome に局在し、mTOR は解離した。	
 	  左側が FLCN とリソソームのマーカーである LAMP1 の局在、右側が mTOR と LAMP1 の局在を表す。FLCN,mTOR は赤色、LAMP1 は緑色、共局在した部分は黄色で表す。	
 	
  コントロールでは、定常状態では FLCN と LAMP1 は解離したが、低栄養状態の際は FNIPが安定であり、FLCN と LAMP1 の共局在を認めた。また、栄養を戻すことで FNIP は不安定化し共局在の消失を認めた。mTOR と LAMP1 は FLCN とは反対に、定常状態で共局在を認め、低栄養状態では解離した。また、栄養を戻すことで再度共局在を認めた。	
 	  これに対して、β−TRCP のノックダウンでは、FNIP2 の分解が行われないため栄養状態に関わらず FLCN と LAMP1 の共局在を認め、mTOR と LAMP1 の解離を認めた。	
 	 （６）FLCN 複合体の量的制御機構が腫瘍増殖へ及ぼす機能解析	 BHD 患者由来の FLCN が欠損している腎臓がん細胞株である UOK257、UOK257 に FLCN をレ
スキューした UOK257-2、UOK257-2 に対して FNIP1,2 をノックダウンした細胞、ノックダウ
ン後に野生型の FNIP2、変異型の FNIP2	
 3A を発現させた細胞を作成し実験した。	
 ①FNIP の安定化は腫瘍細胞の増殖を抑制する	 	
  UOK257 に対して、FLCN をレスキューした UOK257-2 では細胞増殖が抑制された。また、UOK257-2 においては、FNIP のノックダウンにより細胞増殖は促進され、FNIP2 のレスキュ
ー、特に安定型 FNIP2 の発現により有意に増殖が抑制された。	
 （７）FNIP の安定化は腫瘍増殖能を抑制する	
 ①ヌードマウスに対して異種組織片移植実験を行い、経日的に腫瘍のサイズを測定した。その結果、FLCN が欠損した UOK257 に対して FLCN をレ
スキューした UOK257-2 では腫瘍の増殖能が抑制された。	
 	
 ②UOK257-2 では FNIP をノックダウンすることで腫瘍の増大を認め、FNIP2 のレスキュー、
特に安定型の FNIP2 を発現させた細胞では明らかな腫瘍抑制を認めた。	
 この腫瘍でのタンパク発現を確認したところ、mTOR シグナルの減弱を認めた。	
 

	
 
	
 
低栄養状態による FNIP の安定化は、FLCN とリソソームの結合を促し mTOR とリソソームを解離させて mTOR シグナル活性を減弱させることで腫瘍増殖を抑制する。しかし、高栄養状態では SCFβ−TRCP によって FNIP が分解され、FLCN とリソソームの結合が解離し、mTORとリソソームが結合することで mTOR シグナルが活性化し腫瘍の増殖を促進している可能性が示唆された。	
 

	
 
	
 
発表論文
1.

Okamoto Y, Ohkubo T, Ikebe T, Yamazaki J. Blockade of TRPM8 activity reduces theinvasion potential of oral squamous carcinoma cell lines. Int J Oncol 40: 1431-1440, 2012.

2.

Ikebe T, Yamasaki K, Takamune Y, Nakayama H, Shinohara M.

Reduced expression of

nuclear factor kB in oral mucosa undergoing preoperative chemoradiotherapy. Oral Science Int
9: 33-37, 2012.

3.	
  Fukawa T, Kajiya H, Ozeki S, Ikebe T, Okabe K. Reactive oxygen species stimulates epithelial
mesenchymal transition in normal human epithelial keratinocytes via TGF-beta secretion. Exp
Cell Res 318: 1926-1932, 2012.

4.	
  Tanaka T, Nakayama H, Yoshitake Y, Irie A, Nagata M, Kawahara K, Takamune Y, Yoshida R,
Nakagawa Y, Ogi H, Shinriki S, Ota K, Hiraki A, Ikebe T, Nishimura Y, Shinohara M. Selective
inhibition of nuclear factor-κB by nuclear factor-κB essential modulator-binding domain peptide
suppresses the metastasis of highly metastatic oral squamous cell carcinoma. Cancer Sci 103:455-463, 2012.

5.	
  Ota N, Izumi K, Okamoto Y, Toshitani K, Nakayama K, Fukuzawa H, Ozeki S, Ikebe T.
Tapia’s syndrome following the orthoghathic surgery under general anaesthesia. Journal ofand Maxillofacial Surgery, Medicine, and Pathology 25:52-54, 2013.

Oral

6. Sasaki M, Kajiya H, Ozeki S, Okabe K, Ikebe T.

Reactive oxygen species promotes cellularsenescence in normal human epidermal keratinocytes through epigenetic regulation of p16INK4a.
Biochem Biophys Res Commun 452: 622-628, 2014.

7. Nagaoka Y, Kajiya H, Ozeki S, Ikebe T, Okabe K.
acid-induced osteoclastogenesis inhibition.

J Dent Res 94 (4): 594-601, 2015

8. Naganuma K, Hatta M, Ikebe T, Yamazaki J.
oral squamous cell carcinoma.

Mevalonates restore zoledronic

Epigenetic alterations of the keratin 13 gene in

BMC Cancer 14:988, 2014

doi:10.1186/1471-2407-14-988

9. Katsumata Y, Kajiya H, Okabe K, Fukushima T, Ikebe T.

A salmon DNA scaffold promotes

osteogenesis through activation of sodium-dependent phosphate cotransporters

Biochem Biophys

Res Commun 468: 622-628, 2015.

10. 池邉哲郎	  	
  総説：細胞競合と口腔科学への展望	
  	  日本口腔科学会雑誌（日口科誌）	
 
65 (4) : 309-319, 2016.

11. Nagashima K, Fukushima H, Shimizu K, Yamada A, Hidaka M, Hasumi H, Ikebe T,
Fukumoto S, Okabe K, Inizuka H.

Nutrient-induced FNIP degradation by SCFβ-TRCP

regulates FLCN complex localization and promotes renal cancer progression
Oncotarget (in press)

図書	
 
なし	
 
	
 
学会発表	
 
1.

佐々木三奈、長岡良礼、永沼香織、太田信敬、府川晃久、中山修二、山下善弘、大関	
 悟、池邉哲郎	  	  酸化ストレスに対するがん抑制遺伝子を介した細胞老化誘導作用	  	
  第 67 回日本口腔科学会学術集会	
  2013 年 5 月 23 日	
  宇都宮市2.

佐々木三奈、森	  紘一郎、永嶌勝之、田中文恵、長岡良礼、永沼香織、勝俣由里、太田信敬、府川晃久、利谷幸治、橋本憲一郎、泉	  喜和子、内田竜司、池邉哲郎、大関	 悟	
  	  正常角化上皮細胞の上皮間葉移行における IKKalpha シグナルの関与	  	  第 68 回日本口腔科学会学術集会	
  2014 年 5 月 8 日	
  東京都

3.

佐々木三奈、永沼香織、竹山顕子、勝俣由里、太田信敬、府川晃久、岡本愛彦、橋本
憲一郎、池邉哲郎、大関	  悟	  	  酸化ストレスに対するがん抑制遺伝子 p16 の発現調節を介する細胞老化誘導作用	  	
  第 32 回日本口腔腫瘍学会学術集会	
  2014 年 1 月 24 日	
  札幌市
	
 
特許	
 
なし	
 
	
 

研 究 課 題
研 究 代 表者

顎骨の老化とコラーゲン
佐

藤 博

信

（咬合修復学講座・冠橋義歯学分野・教授）

要約
咀嚼機能による特有な力学的環境にある顎骨は、リモデリングのスピードが速いなどの特有の代謝を営んでいる。その代謝の最終産物であるコラーゲンは骨に柔軟性を与え、コラーゲンの翻訳後修飾であるリジンの水酸化の程度は骨の質的性状を左右する。ヒト献体の下顎骨、上腕骨および大腿骨のコラーゲン量（µg/mg 乾燥骨）とリジンの水酸化の程度（水酸化リジン量：mol/mol コラーゲン）を定量分析したところ、下顎骨は特有のコラー
ゲン性状を有することがわかった。いずれの骨においてもコラーゲン量と水酸化リジン量に加齢変化も性差も認められなかった。下顎骨のコラーゲン量は多く，反対に水酸化リジ
ン量は少なかった。コラーゲン量と水酸化リジン量には大きな個人差があったが、下顎骨の水酸化リジン量では個人差が小さかった。また、下顎骨に焦点を当て、残存歯数と骨基質の関係を調べたところ、残存歯数は加齢とともに減少するが、ミネラル量（骨灰量）、コ
ラーゲン量および水酸化リジン量の多い群と少ない群の間に残存歯数の統計学的有意差は認められなかった。しかしながら、コラーゲン量の多い群では少ない群と比べて残存歯数は 2 倍近く多かった。下顎骨はコラーゲン量が多く、かつコラーゲンのリジン残基の水酸化の程度が低く、これらの性質が四肢骨と比べて柔軟性を与えている可能性があり、コラーゲンの性状が歯の寿命に少なからず影響している可能性が推察された。

研究目的
顎骨は他の全身の骨と同様に、骨量とその加齢変化に大きな個体差を示す。骨には部位特異性があることが知られており、その特異性には力学的因子が大きく寄与する。顎骨に加わる力のほとんどは歯を介しており、咀嚼によって加わる力は歩行時の下肢骨に加わる力の 2 倍ほどで、またクレンチングによって頻繁に、かつ複雑な方向に力が加わることから、顎骨は力学的に四肢骨とは異なった環境下にあるといえる。顎骨は四肢骨よりもリモデリングスピードが速く（イヌでは、下顎骨で 6 倍、上顎骨で 3 倍速い）
、mesenchymal stem
cell の骨形成能が高いことが報告されており、それらは顎骨特有の環境因子が関係していると考えられている。
骨代謝の最終産物であるコラーゲンは骨の骨格を担う基質タンパクであり、ミネラルが硬さを与えるのに対し、コラーゲンは柔軟性を与える。コラーゲンはその量のみならずコ
ラーゲンの質的性状によって骨強度に大きく影響する。コラーゲンの翻訳後修飾の程度はコラーゲン分子の集合性に影響を与え、引き続き起こる分子間の架橋とコラーゲン線維形成に影響する。ミネラルはコラーゲン分子によって構築されたテンプレートの性状によって、その沈着と成長に影響を受けるため、結果として骨の強度が左右される。コラーゲン
翻訳後修飾の一つであるリジン残基の水酸化は lysyl hydroxylase（LH）の酵素活性によって特異的に起こり、形成された水酸化リジンにさらに酵素特異的な糖鎖の添加がなされ、その結果コラーゲン線維の形成が制御される。骨が脆弱化する骨粗鬆症や骨形成不全症の骨ではこのリジン残基の水酸化の程度が大きくなることがヒトの知見で明らかにされており、我々は骨粗鬆症モデルマウスの下顎骨でリジン残基の水酸化の亢進と同時にコラーゲ
ン線維が狭小化していることを明らかにした（Tokutomi et al. Connective Tissue
Research 2008;49:361-366）。
以上のように、コラーゲンはその量とリジン残基の水酸化の程度が骨基質の性状に影響を与えることから、四肢骨とは異なる環境下にある顎骨がその環境に適合した特有のコラーゲン性状を有していると推測される。その特有な性状を理解することはエビデンスをベースとした歯科医療の発展に大きな意味を持つ。本研究の目的は、ヒト献体の下顎骨のコ
ラーゲン量とコラーゲンリジン残基の水酸化の程度をアミノ酸分析によって定量し、上腕骨と大腿骨のそれらと比較することにより、顎骨コラーゲンの特異性を明らかにすることであり、さらにコラーゲンの性状が歯の喪失に関連している可能性を調べることである。

方法
福岡歯科大学に教育と研究のために提供された献体 49 体（男性 28 体、女性 21 体）の下顎骨（n=48）、上腕骨（n=48）および大腿骨（n=46）を研究に供した。それぞれ研究の対象部位として頻用され、かつ皮質骨と海綿骨の割合が近似する下顎骨オトガイ部、上腕骨と大腿骨の近位骨端頸部の皮質骨を研究の対象部位とした。採取した皮質骨を液体窒素下で微粒子に粉砕し、凍結乾燥させた。乾燥試料をアミノ酸分析に用い、ハイドロキシプロリ
ン（Hyp）量からコラーゲン量（µg/mg 乾燥骨）を算出し、ハイドロキシリジン（Hyl）量からコラーゲン 1 分子当たりのリジン残基の水酸化の程度（Hyl mol/mol コラーゲン）を算出した。各骨におけるコラーゲン量とリジン残基の水酸化の程度の個人差の程度と加齢変化を調べ、また３骨間の量的比較と２骨間の相関関係を調べた。量的比較には Kruskal-Wallis
検定を、相関関係の検査には Pearson の相関係数を用いた検定を行った。
また、下顎骨に焦点を当て、ミネラル量（骨灰量）、コラーゲン量および水酸化リジン量の多い群と少ない群の残存歯数を比較した。年齢、性別、ミネラル量、コラーゲン量および水酸化リジン量を共変数とした共分散分析（ANCOVA）によって、統計学的有意差を調べた。

結果（結果と考察）
１．下顎骨、上腕骨および大腿骨のコラーゲン量と加齢変化
コラーゲン量はいずれの骨においても大きな個人差が認められ、性差と加齢変化は認められなかった（図１）。コラーゲン量は下顎骨、上腕骨、大腿骨の順に多く、下顎骨と大腿骨の間に有意差が認められた。

図１．下顎骨、上腕骨および大腿骨のコラーゲン量と加齢変化

図２．コラーゲン量の２骨間の相関関係
また、２骨間の相関関係はいずれの組み合わせでも相関係数が低く、明らかな関連は認められなかった（図２）。この非相関性は下顎骨、上腕骨および大腿骨のそれぞれの異なった力学的環境を反映している可能性があり、同一検体で下顎骨のコラーゲン量が多ければ、大腿骨でも多いというような単純な推測が必ずしもできないことが示された。

２．下顎骨、上腕骨および大腿骨のリジン残基の水酸化の程度と加齢変化
リジン残基の水酸化の程度はいずれの骨においても性差と加齢変化が認められなかった。
上腕骨と大腿骨においては大きな個人差が認められたが、下顎骨での個人差は非常に小さかった（図３）。また、リジン残基の水酸化の程度は、上腕骨と大腿骨が同レベルであったのに対し、下顎骨では有意に低いレベルであった。

図３．下顎骨、上腕骨および大腿骨のリジン残基の水酸化の程度

図４．リジン残基の水酸化の程度の２骨間の相関関係

２骨間の相関関係は下顎骨と上腕骨、下顎骨と大腿骨の間では低い相関係数を示したが、上腕骨と大腿骨の間ではやや相関性を思わせる相関係数（r=0.20、p=0.19）であり、特に男性では有意な相関性が示された（図４、r=0.46、p=0.02）。このことから、上腕骨や大腿骨で大きな個人差を示すリジン残基の水酸化の程度は、下顎骨では有意に低いレベルとなり、個人差が小さくなる様相が明らかとなった。

３．下顎骨のミネラル量と残存歯数の加齢変化と性差
下顎骨の骨基質中に占めるミネラル量に個人差は小さく、加齢変化は認められなかった（図５：r=0.24、p=0.11）。一方、残存歯数には大きな個人差があり、加齢に伴った減少が認められた（図５：r=-0.45、p=0.001）。ミネラル量と残存歯数には男女間で有意な相違は認められなかった（表１）。

図５．下顎骨のミネラル量と残存歯数の加齢変化

表１．下顎骨のミネラル量、コラーゲン量、水酸化リジン量および残存歯数の性差

４．ミネラル量、コラーゲン量および水酸化リジン量と残存歯数の関係
ミネラル量、コラーゲン量、水酸化リジン量をそれぞれ平均値よりも多い群と少ない群に分け、両群間の残存歯数を比較した（表２）。ミネラル量、コラーゲン量、水酸化リジン
量のいずれにおいても、両群間に有意な残存歯数の相違は認められず、共変数の中で唯一年齢が残存歯数と有意に関連していた。残存歯数には大きな個人差があり、有意な相違は認められなかったものの、コラーゲン量の多い群の残存歯数（4.90 本）は少ない群（2.55

本）の２倍近くであった。歯の喪失には多因子が関与しており、年齢のようなメジャーな
因子ではないが、骨基質中のコラーゲン量は少なからずマイナーな因子と歯の寿命に関与している可能性が暗示された。
表２．ミネラル量、コラーゲン量、水酸化リジン量、年齢、性別と残存歯数の関係

考察
ヒトの下顎骨は四肢骨と比べて、骨基質中のコラーゲン量が多く、かつコラーゲンの翻訳後修飾の一つであるリジン残基の水酸化の程度が少なく、個人差も小さいことが明らかとなった。ヒトにおいて骨粗鬆症や骨形成不全症などの骨基質が脆弱化する骨疾患ではリジン残基の過剰な水酸化が起こり、現在のところ骨疾患においてリジン残基の水酸化が減少する病変は存在しない。このリジン残基の水酸化は、粗面小胞体でコラーゲンが翻訳され、α1 鎖 2 本と α2 鎖 1 本が 3 重らせん構造を形成する間のみで起こる。従って、リジン残基の過剰な水酸化は（１）リジンの水酸化反応を媒介する lysyl hydroxylase の過剰な発現
あるいは活性の亢進によって起こるか、（２）粗面小胞体に存在するコラーゲンシェペロン
分子群やその他のコラーゲン翻訳後修飾を媒介する酵素群の発現あるいは活性の低下による 3 重らせん形成の遅延によって起こる。過剰に作られた水酸化リジン残基にglycosyltransferase family 25 domain の働きによってガラクトースが結合し、さらに lysylhydroxylase 3 の働きによってグルコースが結合し、2 つの糖鎖が結合した水酸化リジンがコラーゲンが細胞外に分泌された後に起こるコラーゲン分子間の結合を阻害することによって、コラーゲンの線維形成を抑制する。今回、明らかな骨疾患を有した検体を使用していないため全ての検体のリジン残基の水酸化の程度はヒトにとって正常の範囲と推測される
ものの、リジン残基の水酸化の程度が少ないほどコラーゲン線維が太いと推測され、下顎骨においてコラーゲン量が多かった現象はこの現象をうまく説明できる。また、下顎骨においてリジン残基の水酸化が少ない傾向を示したうえで、四肢骨と比べて個人差が小さかったことは、四肢骨に比べてコラーゲン線維がより良い状態を呈しているのかもしれない。

顎骨は、他の全身骨と比べて、力学的負荷を頻繁に、多方向に、かつ瞬間的に大きく受けるとされており、それに対応するためにリモデリングが活発であり、力学的に対応できる
ベストな状態を保つ必要があるとされている。本研究結果はその要件の一端を示すものと考えられる。
下顎骨の骨基質中のミネラル量とコラーゲンのリジン残基の水酸化の程度には大きな個
人差が認められなかった半面、コラーゲン量には大きな個人差が認められた。歯の喪失は加齢変化の一つの現象であり、本研究でも年齢の増加と歯の喪失に強い相関が認められた。
一方で有意な相違はなかったものの、平均値よりも多いコラーゲン量のグループの残存歯数が平均値よりも少ないコラーゲン量のグループの 2 倍近い値を示したことは、歯の喪失が様々な因子の関与の最終産物として現れた数値という点を考慮した場合、非常に興味深
いデータといえる。これらを明らかにするには多数の検体を必要とし、また検体の条件を絞るなどしたさらなる検討が必要である。
今回行った骨サンプルを用いた生化学的分析は歯科領域に応用するだけでなく、骨粗鬆症などの骨疾患の診断に役立つ可能性がある。また、リジン残基の水酸化の程度やコラー
ゲン線維形成と粗面小胞体に存在するコラーゲンシャペロン分子群、コラーゲン翻訳後修
飾関連酵素群の発現や活性およびコラーゲン線維形成に関与するデコリンやⅤ型コラーゲ
ンの発現との関係を明らかにできれば、それらが骨基質の脆弱性を診断する重要なツールとなり、将来、顎骨の骨基質の質的性状と顎骨の吸収や歯の喪失との関係を明らかにできる可能性を秘めている。

発表論文
1.

Sato, A., Kajiya, H., Mori, N., Sato, H., Fukushima, T., Kido, H., Ohno, J. (2017) Salmon DNA
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2.

Matsuka, Y., Hagiwara, Y., Tamaki, K., Takeuchi, H., Fujisawa, M., Ono T., Tsukiyama, Y.,
Nagao K., Tsuga, K., Aita, H., Kondo H., Fueki, K., Tsukasaki, H., Nishigawa, K., Ozawa, S.,
Kuwatsuru, R., Minakuchi, H., Iinuma, T., Matsuura, T., Ishibashi, K., Fujii, S., Hirai, T.,
Sasaki, K., Yatani, H., Igarashi, Y., Sato, Y., Ichikawa, T., Yamamori, T., Kuboki, T., Baba, K.,
Koyano, K., Sato, H., Matsumura, H. (2017) Reliability and validity of the patient
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3.

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6. 都築尊、香川豊宏、佐藤博信、阿南壽、桝尾陽介、湯浅賢治、高橋裕、北村憲司.（2015）
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16. 新田悟、松浦尚志、片渕三千綱、佐藤博信．
（2012）ジルコニアコーピングのカラーの高さが前装陶材の破折強度に及ぼす影響. 日本補綴歯科学会誌 4，411-418．

図書
1. 佐藤博信、松永興昌．（2017）第 5 章口腔インプラント治療の実際、Ⅲ補綴術式、５．
暫間上部構造の作製、赤川安正他編 よくわかる口腔インプラント学第３版. 東京：医歯薬出版、p.177－181
2. 佐藤博信、篠崎陽介．
（2016）第４章これからの歯科治療 デジタル時代の歯科治療①
セラミックでお口とからだにやさしい治療を、第２３日本歯科医学会総会記念誌編集
員会 お口からはじめましょう からだの健康. 東京:医歯薬出版、p.50-51
3. 松浦尚志、佐藤博信．
（2016）第２章かみ合わせとからだの健康 かみしめとからだの
健康 くいしばりにご注意を、第２３日本歯科医学会総会記念誌編集員会 お口からはじめましょう からだの健康. 東京:医歯薬出版、p.32-33
4. 松浦尚志、佐藤博信．（2016）15－5 ブリッジの装着、新臨床研修医歯科医ハンドブッ
ク. 東京:医歯薬出版、p.230-231
5. 松浦尚志、佐藤博信．（2016）15－4 ブリッジの試適、新臨床研修医歯科医ハンドブッ
ク. 東京 医歯薬出版、p.228-229
6. 松浦尚志、佐藤博信．（2016）15－3 ブリッジのための印象採得、新臨床研修医歯科医
ハンドブック. 東京:医歯薬出版、p.226-227
7. 都築尊、佐藤博信．（2016）15－2 ブリッジのための歯冠形成、新臨床研修医歯科医ハンドブック. 東京:医歯薬出版、p.224-225
8. 松浦尚志、佐藤博信．（2016）13－9 小臼歯部のハイブリットレジン CAD/CAM 冠、新臨
床研修医歯科医ハンドブック. 東京:医歯薬出版、p.216-217
9. 松永興昌、佐藤博信．（2016）13－7 歯冠補綴物の装着、新臨床研修医歯科医ハンドブック. 東京:医歯薬出版、p.212-213
10. 松永興昌、佐藤博信．（2016）13－6 歯冠形成後の印象採得、咬合採得、新臨床研修医
歯科医ハンドブック. 東京:医歯薬出版、p.210-211
11. 松浦尚志、佐藤博信．（2016）13－5 部分被覆冠の歯冠形成、新臨床研修医歯科医ハンドブック. 東京:医歯薬出版、p.208-209
12. 松浦尚志、佐藤博信．（2016）13－4 クラウンの歯冠形成、新臨床研修医歯科医ハンドブック. 東京:医歯薬出版、p.204-207
13. 佐藤博信、松浦尚志．（2015）診察、検査、診断、処置、會田雅啓他 冠橋義歯補綴学
第１版. 東京:永末書店、p.71－78
14. 佐藤博信、松浦尚志、澤瀬隆．
（2015）１．口腔インプラントの基本構造、２．口腔インプラント補綴処置をするにあたって、會田雅啓他編 冠橋義歯補綴学第１版. 東京:
永末書店、p.241－247
15. 佐藤博信．
（2013）インプラントとＱＯＬ－ＱＯＬを長期に維持するためのインプラン
ト治療戦略－、お口の健康、全身元気、第 22 回日本歯科医学会総会準備委員会編 歯界展望 2013 特別号. 東京:医歯薬出版、p.81

学会発表
1. 瀬尾晧、宮園祥爾、松浦尚志、佐藤博信、稲井哲一朗（2016）ケラチノサイトの３次元培養におけるカルシウム、アスコルビン酸、KGF の作用．第 43 回福岡歯科大学学会
総会（福岡）
2. 宮園祥爾、瀬尾晧、松浦尚志、佐藤博信、稲井哲一朗（2016）気液界面培養、液浸培
養におけるタイトジャンクションタンパク質の局在．第 43 回福岡歯科大学学会総会（福岡）
3. 瀬尾晧、宮園祥爾、松浦尚志、佐藤博信、稲井哲一朗（2016）ケラチノサイトの３次元培養におけるカルシウム、アスコルビン酸、KGF の作用．日本バイオマテリアル学会
シンポジウム 2016（福岡）
4. 松浦尚志、有馬裕子、山口雄一郎、佐藤博信（2016）骨粗鬆症におけるコラーゲンの翻訳後修飾と線維形成．第 23 回日本歯科医学会総会（福岡）5. 瀬尾晧、松浦尚志、佐藤博信、稲井哲一朗（2016）ケラチノサイトの 3 次元培養系における角化、重層化の解析．第 15 回日本再生医療学会総会（大阪）6. 瀬尾晧、松浦尚志、佐藤博信、稲井哲一朗（2015）ケラチノサイトの 3 次元培養系にかかわる因子の解析．第 42 回福岡歯科大学学会総会（福岡）7. Matsuura, T., Seo, A., Inai, T., Arima, Y., Sato, H. (2015) A 3D keratinocyte
culture model creating keratinized epithelial equivalents. 16th Meeting of theInternational College of Prosthodontists (Seoul)
8. 瀬尾晧、松浦尚志、佐藤博信、稲井哲一郎（2015）完全合成培地によるケラチノサイ
トの培養系の確立．平成 27 年度日本補綴歯科学会九州支部学術大会（福岡）9. 松浦尚志、瀬尾晧、有馬裕子、稲井哲一郎、佐藤博信（2015）ケラチノサイト単独培
養による口腔粘膜角化モデル．第 124 回日本補綴歯科学会学術大会（大宮）．
10. 松浦尚志、佐藤博信（2014）上下歯列接触癖（TCH）の軽減を確実に見極めるための小装置．第 27 回日本顎関節学会学術大会（福岡）11. 松浦尚志、佐々木美智子、水町栄美理、片渕三千綱、佐藤博信（2013）下顎骨の主要
骨基質成分の部位特異性 －四肢骨との比較－．日本口腔インプラント学会第 30 回九
州支部学術大会（別府）12. 松浦尚志、佐々木美智子、片渕三千綱、徳富健太郎、石川美咲、新田悟、水町栄美理、
佐藤博信（2012）骨コラーゲンが歯の寿命に寄与する可能性．第 121 回日本補綴歯科学会学術大会（横浜）13. 松浦尚志、片渕三千綱．徳富健太郎、新田悟、佐藤博信（2012）ヒト献体下顎骨における骨基質中のコラーゲン量と残存歯数の関係．日本口腔インプラント学会第 29 回九
州支部学術大会（宮崎）

特許
なし

研	
 究	
 課	
 題	
 

腫瘍の転移と内皮細胞の応答	 研 究 代 表 者	
 沢	
  禎彦（生体構造学講座・機能構造学分野・教授）	
 

	
 
要約	
 
	
  リンパ管内皮細胞抗原ポドプラニンは、口腔ガン、悪性中皮腫およびグリオブラストー
マが過発現する。今回、口腔ガンではポドプラニンの発現の強さと組織学的悪性度およびリンパ管転移が相関すること、リンパ管内皮細胞との接着によりポドプラニンの発現が増大すること、ポドプラニン陽性口腔ガンのリンパ管内皮細胞に対する接着はポドプラニン
陰性細胞より強く、接着は NZ-1.2 によって阻害され、血小板で促進すること、ポドプラニ
ン抗体が転移の阻止に有用である可能が示された。本研究では、抗マウスポドプラニン抗体（PMab-1）ならびに抗ヒトポドプラニン抗体（NZ-1.2）を開発し（MBL,	
 Millipore など
で販売）、ポドプラニンコンディショナル KO マウスを樹立した。	
 
	
 
研究目的	
 
	
 
１．研究開始当初の背景	
 １）リンパ管内皮細胞における免疫機能分子の発現について	 	  申請者はこれまで、リンパ管が toll-like	
 receptor で細菌成分を認識し白血球接着因子と貪食細胞特異的ケモカインを発現することによりリンパ節求心性の免疫学的応答を促進する可能性を示した。	
 ２）ポドプラニンの分子生物学的解析	
  	 	
  共同研究者の加藤は、膠芽腫や肺扁平上皮癌が発現するムチン型蛋白ポドプラニンの分子構造を明らかにした。ポドプラニンは血小板 CLEC-2 と結合すること、ポドプラニン陽性
腫瘍細胞は血小板に隠れて免疫細胞から逃れることを見出した。	
 	
 ２．研究の目的	 	  ポドプラニンは口腔扁平上皮癌の浸潤領域に強く発現し、リンパ節転移に相関する多くの報告がなされている。本研究では、扁平上皮癌が血小板を介してリンパ管内皮細胞に結合する可能性、ポドプラニンが扁平上皮癌の内皮細胞への接着を促進させる可能性、ポド
プラニンが腫瘍細胞に癌幹細胞形質を誘導する可能性を検討した。	
 
	
 
	
 

方法	
 
	
 
１．腫瘍細胞のリンパ管内皮細胞への CELC2-PLAG 複合体を介した接着の解明	
 	 １）市販の口腔扁平上皮癌細胞株 HSC3 にポドプラニン遺伝子を導入した HSC3-PDPN を用いた。	
 ２）マトリゲルにて培養したヒトリンパ管内皮細胞に対する HSC3-PDPN の浸潤試験とポド
プラニン遺伝子特異抗体による接着阻害試験を行った。	
 ３）マウスポドプラニン遺伝子により作製したトランスジェニック B6 マウス頬粘膜下にポドプラニンを強く発現する B6 由来マウスメラノーマ B16-F10 を移植、組織切片を作製し、リンパ管と移植細胞を二重免疫染色した。	
 	
 ２．リンパ管内皮細胞に CELC2-PLAG を介して接着した腫瘍細胞の癌性形質発現の解析	 	 １）ヒトリンパ管内皮細胞と HSC3-PDPN を共培養し増殖・浸潤能を検討した。HSC3-PDPN
をヌードマウス頬粘膜下に移植、肺転移細胞を分離培養し、癌形質発現を分析した。	
 ２）マウスリンパ管内皮細胞とマウスメラノーマ B16-F10 を移植、組織切片を作製し、リンパ管と移植細胞を二重免疫染色した。	
 	
 結果と考察	 	 １）ポドプラニンを介した接着とポドプラニン依存性リンパ行性転移	 	
  HSC3-PDPN は接着と浸潤が HSC3 より有意に増大し、ポドプラニン特異抗体によって阻害された。ヌードマウス頬粘膜下に移植した HSC3-PDPN について、我々が新しく開発した抗ヒトポドプラニン抗体 NZ-1.2 による肺転移阻止効果が見られた（投稿準備中）。	
 	 ２）リンパ節転移した移植細胞のポドプラニン依存性癌性形質発現の解析	 	
  ヌードマウスの頬粘膜下に移植し、顎下リンパ節を摘出して移植細胞を分離培養した結果、増殖・浸潤能、また MMP1 と MMP3 の産生が飛躍的に増大することが明らかとなり、ポドプラニン発現細胞は基底膜分解を促進させることで転移能が高くなる可能性が考えられた（投稿準備中）。	
 
	
 
	
 

３）新規抗ポドプラニン抗体の開発	 	
  東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野加藤幸成教授との共同研究により、	
 １）マウスとヒトポドプラニンの血小板結合性 PLAG 領域を特異的に認識する新しい抗体を開発した：①ラット抗マウスポドプラニン抗体（PMab-1）、②ラット抗ヒトポドプラニン抗体（NZ-1.2）、PCT/JP2010/067141）（MBL,	
 Imgenex,	
 Sigma,	 Millipore	
 で販売）。	
 ２）podoplanin 特異的新規抗体 LpMab-17 を共同開発した。	
 	 ４）健常個体の頭頚部正常組織におけるポドプラニンの発現	
 	
  抗ポドプラニン抗体による治療を考えた時に、健常個体におけるポドプラニン発現組織を精査する必要がある。ヒトとマウスの組織検索の結果、唾液腺筋上皮、歯胚上皮と象牙質形成期の象牙芽細胞、神経周皮細胞および脈絡叢上皮と軟膜におけるポドプラニン発現が新たに見出された。	
 
	
 

	
 

	
 

	
 

	
 

	
 

	
 

	
 

	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

５）口腔ガン糖鎖特異的ポドプラニン抗体陽性率の組織学的悪性度との相関	
 	
  札幌医科大学口腔外科学教室宮崎晃亘准教授との共同研究により、加藤幸成教授の開発した口腔ガン糖鎖特異的ポドプラニン抗体 cancer	
 specific	
 monoclonal	
 antibody	
 CASMAB（リンパ管内皮などのポドプラニンとは反応しない）の陽性率が、組織学的悪性度およびリンパ管転移と相関することを明らかにした（投稿準備中）。	
 

	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

６）ポドプラニンコンディショナル KO マウスの樹立	
 	  ポドプラニン全身 KO（KO1st）、およびコンディショナル KO マウスを樹立した。Wnt1-Creとの交配で、神経堤外胚葉由来細胞のポドプラニンがノックアウトされたマウスの作出に成功し、象牙芽細胞、顔面骨などのポドプラニンの削除を確認したが、フェノタイプは出なかった。ポドプラニン全身 KO マウス（生下時致死）の肺では TTF1 陽性２型肺胞上皮か
ら１型肺胞上皮が分化せず、肺が萎縮したままであることを見出した（投稿中）。	
 
	
 

	
 
	
 

	
 
	
 
	
 

原著（欧文）網掛けは学位指導論文	
 1. Maruo, N., Sakagami, R., Yoshinaga, Y., Okamura, K., Sawa, Y. Differentiation of Apical Bud Cells in a
Newly Developed Apical Bud Transplantation Model Using GFP Transgenic Mice as Donor. PLoS One.
2016; 11(3): e0150766.
2. Kato Y, Ogasawara S, Oki H, Honma R, Takagi M, Fujii Y, Nakamura T, Saidoh N, Kanno H, Umetsu M,
Kamata S, Kubo H, Yamada M, Sawa, Y., Morita K, Harada H, Suzuki H, Kaneko MK. Novel
Monoclonal Antibody LpMab-17 Developed by CasMab Technology Distinguishes Human Podoplaninfrom Monkey Podoplanin. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother. 2016;35(2): 109-116.

3. Hatakeyama,Y., Hatakeyama, J., Oka, K., Tsuruga, E., Inai, T., Anan, H., Sawa, Y. Immunohistochemical
Study of Amelogenin and Lysosome-Associate Membrane Proteins (LAMPs) in Cartilage. International
Journal of Morphology. 2014; 32(2): 618-626.
4. Tatsuoka, M., Oka, K., Tsuruga, E., Sawa, Y., Ozaki, M. Immunohistochemical expression of Fibrillin-1
and Fibrillin-2 during tooth development. Periodontal Res. 2015;50(6): 714-720.
5. Otawa, M., Tanoue, R., Kido, H., Sawa, Y., Yamashita, J. Intermittent administration of parathyroid
hormone ameliorates periapical lesions in mice. J Endodontics. 2015; 41(5): 646-651.
6. Sawa, Y., Takata, S., Hatakeyama, Y., Ishikawa, H., Tsuruga, E. Expression of toll-like receptor 2 inglomerular endothelial cells and promotion of diabetic nephropathy by Porphyromonas gingivalis
lipopolysaccharide. PLoS One 2014; 9(5): e97165.
7. Fujita, T., Tsuruga, E., Yamanouchi, K., Sawa, Y., Ishikawa, H. Microfibril-associated glycoprotein-1
controls human ciliary zonule development in vitro. Acta Histochem Cytochem. 2014; 47(1): 11-17.
8. Hatakeyama, Y., Matsuda, Y., Hatakeyama, J., Oka, K., Anan, H., Tsuruga, E., Inai, T., Ishikawa, H.,
Sawa, Y. The effect of growth differentiation factor-5, 6, 7 in chondrogenic cell differentiation of
ATDC-5. American J BioScience. 2014; 2(5): 188-192.
9. Tomooka, M., Kaji, C., Kojima, H., Sawa, Y. Distribution of podoplanin-expressing cells in the mousenervous systems. Acta Histochem Cytochem. 2013; 46(6): 171-177.
10. Kawagoe, M., Tsuruga, E., Oka, K., Sawa, Y. Ishikawa H. Matrix metalloproteinase-2 degrades fibrillin-1
and fibrillin-2 of oxytalan fibers in the human eye and periodontal ligaments in vitro. Acta Histochem
Cytochem. 2013; 46(5): 153-159.
11. Hatakeyama, Y., Hatakeyama, J., Oka, K., Tsuruga, E. Inai, T., Sawa, Y. Immunohistochemical study oflysosome-associated membrane proteins during periodontal ligament development. J Hard Tissue Biol.
2013; 22(2): 233-240.
12. Takata, S., Sawa, Y., Uchiyama, T., Ishikawa, H. Expression of Toll-Like Receptor 4 in Glomerular
Endothelial Cells under Diabetic Conditions. Acta Histochem Cytochem. 2013; 46(1): 35-42.

13. Nishimura, S., Inada, H., Sawa, Y., Ishikawa, H. Risk factors to cause tooth formation anomalies inchemotherapy of pediatric cancers. Eur J Cancer Care. 2013; 22(3): 353-360.
14. Uchiyama, T., Takata, S., Ishikawa, H., Sawa, Y. Altered dynamics in the renal lymphatic circulation oftype 1 and type 2 diabetic mice. Acta Histochem Cytochem. 2013; 46(2): 97-104.
15. Nakatomi, Y., Tsuruga, E.,* Yamauchi, Y., Kawagoe, M., Yamanouchi, K., Nakashima, K., Sawa, Y.,
Ishikawa, H. Intracellular interaction of EMILIN-1 with fibrillin-1 in human periodontal ligament cells.
Orthodont Waves. 2012; 71(2): 66-69.
16. Kaji, C., Tomooka, M., Kato, Y., Kojima, H., Sawa, Y. The expression of podoplanin and classicalcadherins in the mouse brain. J Anat. 2012; 220(5): 435-446.
17. Oka, K., Morokuma, M., Imanaka-Yoshida, K., Sawa, Y., Isokawa, K., Honda, M.J. Cellular turnover inepithelial rests of Malassez in the periodontal ligament of the mouse molar. Eur J Oral Sci. 2012; 120(6):484-494.
18. Tsuruga, E., Oka, K., Hatakeyama, Y., Isokawa K., Nakatomi,Y., Sawa,Y. Immunohistochemical
examination of latent transforming growth factor-beta binding protein 2 negatively regulates coalescenceof oxytalan fibers induced by stretching stress. Connect Tiss Res. 2012; 53(6): 521-527.
19. Kaji, C., Tsujimoto, Y., Kaneko, M.K., Kato, Y., Sawa, Y. Immunohistochemical examination of novel
rat monoclonal antibodies against mouse and human podoplanin. Acta Histochem Cytochem. 2012; 45(4):227-237.
20. Kaneko, M,K., Kunita, A., Abe, S., Tsujimoto, Y., Fukayama, M., Goto, K., Sawa, Y., Nishioka, Y., Kato,
Y. A chimeric anti-podoplanin antibody suppresses tumor metastasis via neutralization andantibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Sci. 2012; 103(11): 1913-1919.
21. Oka,K., Honda,J.M., Tsuruga,T., Hatakeyama,Y., Isokawa, K., Sawa, Y. Roles of collagen and periostin
expression by cranial neural crest cells during soft palate development. J Histochem Cytochem. 2012;
60(1): 57-68.
22. Yamanouchi, K., Tsuruga, E., Oka, K., Sawa, Y., Ishikawa, H. Fibrillin-1 and fibrillin-2 are essential forformation of thick oxytalan fibers in human non-pigmented ciliary epithelial cells in vitro.Roles ofcollagen and periostin expression by cranial neural crest cells during soft palate development. Connect
Tiss Res. 2012; 53(1): 14-20.

国際学会	
 1.

Takata, S., Kajiwara, K., Ishikawa, H., Sawa, Y. J. Dent. Res. 94(S). 94th International Association of
Dental Research, Seoul, JUN 2016.

2.

Kajiwara, K., Takata,S., Ishikawa, H., Sawa, Y. J. Dent. Res. 94(S). 94th International Association of
Dental Research, Seoul, JUN 2016.

3.

Kaji, C., Takara, K., Kojima, H., Sawa, Y. J. Dent. Res. 94(S). 94th International Association of Dental
Research, Seoul, JUN 2016.

4.

Takara, K., Kaji,C., Ishikawa, H., Sawa, Y. J. Dent. Res. 94(S). 94th International Association of
Dental Research, Seoul, JUN 2016.

5.

Maruo, S., Kajiwara, K., Ishikawa, H., Sawa, Y. J. Dent. Res. 94(S). 94th International Association of
Dental Research, Seoul, JUN 2016.

6.

Takenawa, S., Kajiwara, K., Ishikawa, H., Sawa, Y. J. Dent. Res. 94(S). 94th International Associationof Dental Research, Seoul, JUN 2016.

7.

Sawa, Y. Takata S, Ishikawa H, Hatakeyama Y, Tsuruga E. Promotion of nephropathy by
Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide in diabetic kidney. J. Dent. Res. 92(S). 92th International
Association of Dental Research, Cape Town, JUN 2014.

8.

Takata,S., Kajiwara, K., Ishikawa, H., Sawa, Y. Promotion of diabetic nephropathy by Porphyromonas
gingivalis LPS. 62th Annual Meeting of Japanese Association for Dental Research. Osaka, DEC 2014.

国内学会
1.

高良憲洋, 畠山雄次, 小島寛, 沢禎彦.日本解剖学会第 72 回九州支部学術集会,長崎市,
2016 年 10 月.

2.

沢禎彦．日本歯科医学会, 福岡市, 2016 年 10 月

3.

梶原弘一郎, 高田俊輔, 沢禎彦, 石川博之. 日本歯科医学会, 福岡市, 2016 年 10 月

4.

鴨頭奈央子, 藤田隆寛, 中島一記, 松田裕子, 畠山純子, 畠山雄次, 沢禎彦, 石川博之.
Wheat Germ Agglutinin(WGA)によるヒト歯根膜線維芽細胞由来オキシタラン線維の検出の検討. 第 58 回歯科基礎医学会学術大会, 札幌市, 2016 年 8 月. J Oral Biosci Suppl,
P446.

5.

松田裕子, 畠山雄次, 中島一記, 鴨頭奈央子, 畠山純子, 沢禎彦, 石川博之. ペプチド
固相合成法(F-moc 法)により作製された LRAP の軟骨および骨形成に与える影響. 第57 回歯科基礎医学会学術大会, 新潟市, 2015 年 9 月 J.Oral Biosci.Suppl.,2015, P410,

6.

髙田俊輔, 梶原弘一郎, 沢禎彦, 石川博之. 糖尿病マウス腎糸球体における歯周病原菌由来 LPS による TLR2/4 依存性サイトカイン発現. 日本顕微鏡学会第 70 回記念学術講演会. 千葉市, 2014 年 5 月

7.

髙田俊輔, 梶原弘一郎, 沢禎彦, 石川博之. Severe Periodontal Disease exacerbate Diabetic
Nephropathy through Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. 第 57 回春季日本歯周病学会学術集会. 岐阜市, 2014 年 5 月

8.

畠山雄次,松田裕子,畠山純子,岡暁子,阿南壽,稲井哲一朗,石川博之, 沢禎彦.軟骨細胞動態における Growth/Differentiation Factors の機能的差異に関する検討. 第 56 回歯科基礎医学会学術大会, 福岡市, 2014 年 9 月 J.Oral Biosci. Suppl.,2014, P193

9.

畠山雄次, 北河憲雄, 稲井哲一朗, 沢禎彦. 無線 LAN を活用したｅラーニングによる組織学実習に対する学生の評価. 第 33 回日本歯科医学教育学会学術大会. 北九州市,
2014 年 7 月

10. 髙田俊輔, 梶原弘一郎, 石川博之, 沢禎彦. 歯周病原菌由来 TLR リガンドによる糖尿病性腎症の促進. 第 56 回歯科基礎医学会, 福岡市, 2014 年 9 月
11. 吉良迪子, 板家智, 尾崎正雄, 岡暁子, 沢禎彦. オキシタラン線維形成における歯原性上皮細胞の関与. 第 56 回歯科基礎医学会, 福岡市, 2014 年 9 月
12. 丸尾直樹, 岡村和彦, 沢禎彦, 坂上竜資. マウス下顎切歯歯胚の幹細胞における Sox2
および Oct4 の発現. 第 56 回歯科基礎医学会. 福岡市, 2014 年 9 月
13. 畠山雄次, 松田裕子, 畠山純子, 岡暁子, 阿南壽, 稲井哲一朗, 石川博之, 沢禎彦.軟骨
細胞動態における Growth/Differentiation Factors の機能的差異に関する検討. 第 56 回歯科基礎医学会, 福岡市, 2014 年 9 月

14. 髙田俊輔, 梶原弘一郎, 石川博之, 沢禎彦. 歯周病原性 LPS による TLR を介した糖尿病性腎症の促進について. 第４１回福岡歯科大学学会総会, 福岡市, 2014 年 12 月
15. 川越慈, 敦賀英知, 石川博之, 沢禎彦. ヒト無色素毛様体上皮細胞およびヒト歯根膜
線維芽細胞におけるオキシタラン線維の分解過程. 第４１回福岡歯科大学学会総会,
福岡市, 2014 年 12 月
16. 髙田俊輔, 梶原弘一郎, 沢禎彦, 石川博之. Porphyromonas gingivalis 由来 LPS は腎糸球体の TLR2/4 を介して糖尿病性腎症を促進する. 第 73 回日本矯正歯科学会大会, 福岡
市, 2014 年 10 月
17. 高田俊輔,内山貴誠,敦賀英知,畠山雄次,石川博之, 沢禎彦. 糖尿病環境下の腎糸球体内皮細胞における TLR2 と TLR4 の発現. 第 55 回歯科基礎医学会学術大会・総会, 岡山
市, 2013 年 9 月
18. 内山貴誠, 高田俊輔, 石川博之、沢禎彦. Ⅰ型とⅡ型糖尿病マウスにおける腎リンパ管増生について. 第 51 回日本糖尿病学会九州地方会. 沖縄市, 2013 年 11 月
19. 高田俊輔,内山貴誠,敦賀英知,畠山雄次,石川博之, 沢禎彦. 糖尿病環境下の腎糸球体における Toll-like receptor(TLR)2 と 4 の発現. 第 51 回日本糖尿病学会九州地方会, 沖縄
市, 2013 年 11 月
20. 内山貴誠, 高田俊輔, 石川博之, 沢禎彦. Ⅰ型とⅡ型糖尿病モデルマウスにおける腎リンパ管新生について. 第 40 回福岡歯科大学学会総会. 福岡市, 2013 年 12 月
21. 高田俊輔, 内山貴誠, 石川博之, 沢禎彦. 糖尿病モデルマウスの腎糸球体における
TLR2 と TLR4 の発現.第 40 回福岡歯科大学学会総会. 福岡市, 2013 年 12 月
22. 川越慈, 山之内香, 中冨佑香, 中島一記, 敦賀英知, 沢禎彦, 石川博之. ヒト歯根膜線
維芽細胞によるオキシタラン線維の分解過程. 第 8 回九州矯正歯科学会学術大会, 小
倉市, 2013 年 2 月
23. 山之内香, 敦賀英知, 沢禎彦, 石川博之. 歯根膜オキシタラン線維形成におけるMAGP-1 の機能. 第 56 回春季日本歯周病学会学術大会.東京, 2013 年 5 月
24. 川越慈, 敦賀英知, 沢禎彦, 石川博之. ヒト歯根膜オキシタラン線維の分解機構. 第 56回春季日本歯周病学会学術大会. 東京, 2013 年 5 月
25. 藤田隆寛, 山之内香, 中冨佑香, 中島一記, 敦賀英知, 沢禎彦, 石川博之. オキシタラ
ン線維の形成機構における MAGP-1 の機能解析. 第 72 回日本矯正歯科学会大会. 長野
市, 2013 年 10 月
26. 川越 慈, 山之内香, 中冨佑香, 中島一記, 敦賀英知, 沢禎彦, 石川博之. ヒト歯根膜オ
キシタラン線維の改造機構. 第 72 回日本矯正歯科学会大会. 長野市, 2013 年 10 月
27. 山之内香, 川越慈, 中冨佑香, 中島一記, 敦賀英知, 沢禎彦, 石川博之. ヒト無色素毛

様体上皮細胞によるオキシタラン線維形成の解析. 日本解剖学会第 69 回九州支部学術集会. 鹿児島市 2013 年 11 月
28. 西村紗和, 沢禎彦, 稲田浩子, 上田耕一郎, 石川博之, 水田祥代. 小児がん治療後の歯科的長期フォローアップ. 第 55 回日本小児血液・がん学会学術集会シンポジウム. 福
岡市 2013 年 12 月
29. 加地千晶, 友岡みわ, 畠山雄次, 敦賀英知, 小島寛, 沢禎彦. 正常マウスグリア細胞が発現するポドプラリンとカドヘリン. 第 118 回日本解剖学会総会・全国学術集会. 高
松市 2013 年 3 月
30. 高田俊輔, 内山貴誠, 敦賀英知, 畠山雄次, 石川博之, 沢禎彦. 糖尿病環境下の腎糸球体における TLR2 と TLR4 の発現について. 第 118 回日本解剖学会総会・全国学術集会. 高松市 2013 年 3 月
31. 内山貴誠, 高田俊輔, 敦賀英知, 畠山雄次, 石川博之, 沢禎彦. 糖尿病モデルマウスの腎リンパ管増生について.第 118 回日本解剖学会総会・全国学術集会. 高松市 2013 年 3月
32. 高田俊輔, 内山貴誠, 敦賀英知, 畠山雄次, 石川博之, 沢禎彦. Expression of toll-likereceptors in glomerular endothelial cells under diabetic conditions. 第 38 回日本微小循環学会総会.東京, 2013 年 2 月
33. 高田俊輔, 内山貴誠, 石川博之, 沢禎彦. 糖尿病モデルマウス腎糸球体における TLR2と TLR4 の発現. 第 28 回日本糖尿病合併症学会. 旭川市, 2013 年 9 月
34. 内山貴誠, 高田俊輔, 敦賀英知, 畠山雄次, 石川博之, 沢禎彦. Ⅰ型とⅡ型糖尿病モデ
ルマウスにおける腎リンパ管新生. 第 55 回歯科基礎医学会学術大会・総会. 岡山市,
2013 年 9 月

科学研究費補助金
代表	
 1. 2010-2012 日本学術振興会科学研究費補助金・基盤研究（Ｂ）,	
 22390345 リンパ管内微小環境における
CLEC2-PLAG 複合体の癌性形質誘導に関する研究,	
 19,890 千円.	
 2. 2011-2012 日本学術振興会科学研究費補助金・挑戦的萌芽研究, 23659884	
 PLAG―免疫グロブリンキメ
ラ蛋白による抗腫瘍免疫の誘導,	
 3,640 千円. 	
 3. 2013-2014 日本学術振興会科学研究費補助金・挑戦的萌芽研究, 25670803 口腔微生物由来の血中
TLR リガンドに起因する糖尿病性腎症の促進機構の解明,	
 3,770 千円.	
 4. 2015-2017 日本学術振興会科学研究費補助金・基盤研究（Ｂ）, 15H05060 口腔微生物由来血中 TLR リ
ガンドによる糖尿病性腎症の発症機構の解明と予防への展開,	
 14,560 千円(-2016.	
 2017 年度は含ま
ず).	
 
	
 
分担	
 
1. 日本学術振興会科学研究費補助金・基盤研究（Ｃ）15K11358 創傷治癒培養モデルを用いた口蓋裂術
後瘢痕形成の制御に関する研究（研究代表者：石川博之・福岡歯科大学）, 分担額 700 千円／総額
4,810 千円．	
 2. 日本学術振興会科学研究費補助金・基盤研究（Ｃ）15K11333 矯正学的持続的機械ストレス環境におけるポドプラニン依存性骨再生機構に関する研究（研究代表者：金井壮律・北海道大学）, 分担額 900 千円／総額 4,940 千円．	
 

研 究 課 題

脳血管障害と免疫・酸化ストレス	
 

研究代表者

大星 博明（総合医学講座・内科学分野・教授）

	
 
要約
	
  脳虚血発症後に脳血流以外の因子が脳梗塞を増悪させることが示唆されている。我々は最近、脳梗塞増悪過程におけるインターロイキン(IL) 23-17 axis の重要性を明らかにしており、本研究は、脳梗塞における免疫応答や血液脳関門破綻等の炎症反応のさらなる機構解明を目的とした。まず、脳虚血早期における自然免疫機構の役割についての解明を試み、
Toll 様受容体 TLR2 と TLR4 およびその下流シグナル MyD88 が IL23 の産生に寄与することを明らかにした。また、傷害脳組織から放出されて TLR2/4 を刺激する物質が、従来抗酸化物質と認識されてきた peroxiredoxin (PRX) family であり、新規の damage-associatedmolecular patterns (DAMPs)として、脳虚血後の炎症惹起物質として働くことを明らかとした。
さらに脳梗塞の修復過程における innate immunity の役割について解析を行い、脳虚血後期に虚血巣に浸潤する骨髄由来のマクロファージが、虚血組織に存在する PRX を中心とした
DAMPs の除去に寄与することを明らかにし、浸潤マクロファージの活性化機構について分子生物学的な解析を行った。また、脳血管障害の病態で重要な役割を示す血液脳関門の主要構成成分である周皮細胞について、脳虚血病態での活性化機構に関する新知見を得た。
	
 
研究目的
	
  脳血管障害は、我が国の主要死因であるのみならず、寝たきりや要介護となる第１位の原因であり、国民病として高齢化社会を迎えてますます臨床的な重要性を増している。しかしながら、その後遺症を軽減する画期的な治療法は未だ開発されていない。脳血管障害の７割を占めている脳梗塞は、急性期に拡大・増悪し、時に致死的状態をもたらすが、近年急性期脳梗塞における分子機構・シグナル伝達が徐々に明らかになり、脳虚血発症後に脳血流以外の因子が脳梗塞を拡大・増悪させることが示唆されている。また、脳梗塞における免疫応答の役割が注目されてきているが、我々は最近、脳梗塞増悪過程におけるイン
ターロイキン 23-17 axis の重要性を明らかにしている(Nat Med 2009)。本研究は、遺伝子改変動物ならびに遺伝子導入法等を用い、脳梗塞における免疫応答や脳梗塞を増悪ならびに修復において作用する炎症の機構を解明し、新たな治療標的を探究することを目的とした。	
 方法	  これまでの研究で、脳梗塞の増悪機構における免疫応答、特に IL23-IL17 axis の活性化を1もたらす炎症シグナルを検討してきた。すなわち、初期免疫応答に関連するシグナルの遺伝子改変動物を用い、脳虚血早期の段階における自然免疫機構の役割を探求してきた。本
研究ではまず Toll 様受容体(TLR)やその下流シグナルの遺伝子改変動物とその免疫担当細胞を用い、IL23 の発現誘導をもたらす刺激について検討した。脳虚血の作製には、栓糸閉塞モデルを用い、脳血流量などの生理学的パラメーターを測定し、再現性に優れた脳虚血を作製した。治療効果を判定するために、組織傷害のみならず、神経機能への影響も評価した。
	  近年、種々の炎症性疾患での重要性が注目されている	
 IL17 であるが、我々は IL17 を産生する細胞が虚血脳で増加し、その浸潤には IL23 の刺激が必要であること、IL17 産生細胞が当初想定された CD4 陽性 Th17 細胞ではなく、γδT 細胞であること、しかも、その浸潤が脳虚血後３日をピークとすること、さらに、脳虚血導入１日後からの治療開始による IL17の抑制であっても脳梗塞を縮小できることを報告している(Nat Med 2009)。本研究では、この IL17 の発現をもたらす上流シグナルを解明するために、遺伝子改変動物を用い、FACS
解析などを駆使して検討を行った。さらに、培養樹状細胞を用いた刺激実験による解析も
行った。	
 
	
  つぎに、脳虚血が惹起する炎症反応を終息させる機構を解明するため、脳虚血作製後後期に炎症細胞を回収・培養し、炎症惹起物質の排出作用を有する細胞の同定を行った。さらにその分子機構を解明するために、炎症細胞のマイクロアレイ解析や遺伝子導入を用いた検討を行い、候補遺伝子の改変動物を用いた in vivo での脳虚血損傷後の修復機転の検討を行った。	 	 結 果 と 考 察 	 TLR2/4 の脳梗塞増悪への影響	
 	
  TLR2 および TLTR4 の遺伝子欠損マウスでは、脳虚血による組織障害および神経学的異常が野生型と比較して有意に軽減していた。これら遺伝子改変マウスの虚血脳に浸潤した炎症細胞での炎症性サイトカインの発現を検討すると、IL23 の産生は TLR2 および TLR4のノックアウトマウスでは著明に低下していた（図１）。	
  	
 
	
  	
  図１	
  虚血脳の炎症細胞での IL23 誘導は TLR2/4 に依存する	
 

	
 
2

新規 DAMPs の同定	 
	
  遺伝子改変マウスの骨髄由来樹状細胞を用いて虚血脳の抽出液で刺激すると、IL23 産生を誘導できること、脳抽出液を熱処理や蛋白分解酵素処理することで誘導の活性は消失することなどから、15〜25kDa のタンパクが活性化物質であることが判明した。さらに質量分析による解析などによって、IL23 を誘導する物質が、抗酸化作用を有するタンパクとして知られるペルオキレドキシン(peroxiredoxin: PRX)ファミリーであることを同定した。
PRX はチオレドキシンとともに過酸化水素を中和し、以前はチオレドキシンペルオキシダーゼと呼ばれており、含有量は特に脳組織で多く、細胞内に生じた活性酸素種である過酸
化水素を分解することによって細胞を保護すると考えられてきた。	
 	
  脳虚血発症 12 時間後の梗塞巣では PRX が強く発現誘導されるが、今回我々は新たに、脳虚血後に障害神経細胞内で発現した PRX が、細胞外に遊離すること、遊離した PRX は浸潤マクロファージに認識されること、PRX が TLR 依存性に細胞障害を引き起こすことを示し、PRX が danger signal、すなわち、damage-associated molecular patterns (DAMPs)として機能し、浸潤血液細胞の活性化により炎症を惹き起こすことを明らかにした（図 ２ ）。	
 
	
 
	
  	
  図２	
  脳虚血後に傷害神経細胞(TUNEL 陽性)より放出された peroxiredoxin (PRX)はマ
クロファージ(F4/80)に認識される	
 

	
 

3

PRX 阻害による脳梗塞治療効果	
 	
  PRX ファミリーは 1 から６まで存在し、PRX1 と PRX2 は特に構造相同性が高い。脳抽出液の検討から PRX5 と PRX6 が最も刺激活性が高いことが認められ、PRX1,2 も刺激していることが予想された。また、α３ヘリックス部分の構造がたもたれており、同部分が IL-23の誘導に重要であることも判明した（図３）	
 
	
 
	
  	
  図３	
  Peroxiredoxin family の相同性	
 

	
 
	
 
	
  そこでこれらの抗体を作製して治療効果を検討すると、著明な脳梗塞縮小効果が認められ（図４）、PRX 抗体による脳梗塞縮小効果は、脳虚血後 12 時間後の投与でも認められた。	
  	
 
	
 
	
  図４	
  Peroxiredoxin 阻害による脳梗塞治療効果	
 

	
 
	
 

4

	
  今回我々は、脳内に浸潤したマクロファージが、虚血障害に陥った脳神経細胞から放出された PRX によって TLR 依存的に活性化され、さらなる組織傷害に寄与することを明らかにした(Nat Med 2012)。虚血脳に浸潤したマクロファージが産生する IL23 は、マクロフ
ァージに遅れて脳内に浸潤するγδT 細胞に作用して IL17 の産生を誘導することにより、亜急性期の免疫応答を制御することをわれわれは既に明らかにしている(Nat Med 2009)が、今回の検討で、その上位シグナルとして PRX が DAMPs として作用することを明らかにした。（図５）。	
 
	
  	
  図５	
  Damage-associated molecular patterns (DAMPs)としての peroxiredoxin の作用	 	 このような炎症性免疫応答のメカニズムをさらに解明し、特異的な治療標的を明らかにすることは、脳梗塞に有力な治療法の開発に結びつくと考えられる。	
 	
 脳虚血後期の脳内炎症細胞	
 	  つぎに、脳虚血後期(3 日後)の脳組織から炎症担当細胞を抽出し、脳虚血におけるミク
ログリアとマクロファージの役割を検討した。抽出した単球系貪食細胞を標識した PRX な
どの DAMPs と反応させると、内部へ取り込むことを確認した（図６）。	
 
	
  	
  図６	
  虚血脳へ浸潤した単球系貪食細胞による DAMPs の取り込み	
 

	
 

5

	
  また、この浸潤細胞を FACS で CD45 および CD11b の発現状態で分離し、DAMPs への反応を解析すると、CD45 陽性 CD11bhi のマクロファージに相当する細胞群は、CD45 陽性CD11bint のミクログリアや他の細胞群と比較し、高率に標識した DAMPs と結合していることを明らかとし（図７）、浸潤マクロファージが炎症修復機構に寄与することが示唆され
た。	
 
	
 
	
  	
  図７	
  虚血脳のマクロファージとミクログリアによる DAMPs の取り込み	 	 	  この DAMPs 取り込みの機構をさらに解明するために、培養系マクロファージ(RAW
264.7)を用い、変異刺激を加えることで、取り込み機能を喪失した変異株を作製した（図
８）。	
 
	
 
	
  	
  図８	
  変異による培養マクロファージの DAMPs 取り込み機能の喪失	
 

	
 
	
 
	
  この変異株についてマイクロアレイを用いて遺伝子解析を行い、発現低下を示す遺伝子をスクリーニングし、膜蛋白と転写因子の候補遺伝子を同定した(図９)。	
 
	
 

6

	
  	
  図９	
  変異培養マクロファージのマイクロアレイによる遺伝子解析	
 

	
 
	
 
	
  これらの候補遺伝子について、レンチウイルスベクターを用いて変異培養マクロファー
ジに候補遺伝子を導入し、PRX の取り込み機能に関与する遺伝子を探索した。その結果、
マクロファージスカベンジャー受容体である MSR1 と MARCO および転写因子である
MafB が PRX 取り込みに重要な遺伝子であることが明らかになった(図 10)。	
 
	
 
	
 
	
  	
  図 10	
  変異培養マクロファージへの候補遺伝子導入による機能解析	
 

	
 
	
 
	
  脳虚血後に脳内に浸潤したマクロファージの MSR1 と MARCO の発現量を検討し、MSR1
は脳虚血 3 日後に増加するが、MARCO は変化がないことを明らかとし（図 11）、MSR1の活性化の重要性が示唆された。	
 
	
 

7

	
  	
  図 11	
  脳虚血後の脳内浸潤マクロファージの遺伝子発現	 	 	  また、MSR1 と MARCO を遺伝子改変動物および中和抗体を用い、in vivo の系でもPRX の取り込みが抑制され、その作用が MARCO よりも MSR1 でより著明であることを明らかにした（図 12）(Nat Med, in press)。	
 
	
 
	
  	
  図 12	
  遺伝子改変動物および抗体による DAMPs 取り込み抑制効果	
 

	
 
	
 
脳虚血による周皮細胞の集簇	 	
  血液脳関門で重要な役割を果たす周皮細胞(pericyte)の脳虚血での病態について検討を8

行った。脳虚血を作製すると１日後から次第に梗塞巣の周囲に PDGFRβ陽性の周皮細胞が集簇してくる（図 13）	 	 	  図 13	
  梗塞巣周囲への周皮細胞の集簇	
 

Day 1

	
 

Day 3

Day 3

IschemicCore

PDGFRβ	 	  この周皮細胞の集簇の機構を解明するために、in	
 vivo の脳虚血モデルおよび培養細胞を用いて増殖刺激についての検討を行った。脳虚血 3 日後の血管内皮では、周皮細胞の増殖シグナルである PDGF-B の発現が著明に亢進し、培養内皮細胞への低酸素刺激でもPDGF-B の発現が亢進した（図 14）。	
 	  	  図 14	
  梗塞巣周囲への周皮細胞の集簇	
 

内皮

Day 3

	
 

	
 

9

	
  また、虚血早期には PDGFRβ陽性の周皮細胞および内皮細胞(Lectin 陽性)、神経細胞(NeuN 陽性)での basc FGF (bFGF)の発現が亢進していた（図 15）。	
 
	
 
	
  	
  図 15	  脳梗塞組織での bFGF の発現	
 

	
 
	
 
	
  bFGF の周皮細胞増殖への影響について、培養周皮細胞を用いて検討すると、bFGF は周皮細胞の PDGFRβの発現を亢進させ、その効果は FGF 受容体阻害薬(SU5012)で抑制された（図 16）。	
 
	
 
	
  	
  図 16	
  周皮細胞の PDGFRβ発現に対する bFGF の効果	
 

	
 

10

	
  また、周皮細胞の遊走機能に対する bFGF の効果を micration assay で検討すると、PDGFの存在下に bFGF が周皮細胞を遊走させ、その効果は FGF 受容体阻害薬や PDGFRβ阻害薬(Sunitinib)で抑制されることを明らかにした（図 17）。	
 
	
 
	
  	
  図 17	
  周皮細胞の遊走機能に対する bFGF の効果	 control*

bFGF
10ng/ml††bFGF +SU5402†
PDGF-BB	 	 	  これらの検討より、脳虚血において血管新生や血管透過性保護、免疫応答などの重要な働きが示されている周皮細胞の脳虚血時の動態について、内皮や神経細胞のみならず周皮細胞自身がその増殖や遊走を促進する機能を有していることが示唆された。	
 	
  今 後 も こ の よ う な 脳 虚 血 時 の 炎 症 ・ 免 疫 応 答 に 対 す る 詳 細 な 解 明 を 行 う こ と で 、therapeutic time window の広い脳血管障害の治療法の開発に結びつくことが期待される。	
 発表論文
1. Shichita, T., Ito, M., Kimura, A., Morita, R., Komai, K., Noguchi, Y., Ooboshi, H., Koshida, R.,
Takahashi, S., Kodama, T., Yoshimura, A. Mafb prevents excess inflammation after ischemic
stroke by accelerating clearance of danger signals through MSR1. Nat. Med. in press.

2. Yamada, S., Tsuruya, K., Tokumoto, M., Yoshida, H., Tatsumoto, N., Ooboshi, H., Kitazono, T.
(2017) Total phosphate elimination is negatively associated with increased serum fibroblast
growth factor 23 levels in patients who undergo peritoneal dialysis. Ther. Apher. Dial. 21,

11

71-78.

3. Nakamura, K., Arimura, K., Nishimura, A., Tachibana, M., Yoshikawa, Y., Makihara, N.,
Wakisaka, Y., Kuroda, J., Kamouchi, M., Ooboshi, H., Kitazono, T., Ago, T. (2016) Possible
involvement of basic FGF in the upregulation of PDGFRβ in pericytes after ischemic stroke.
Brain Res. 1630, 98-108.

4. Yamada, S., Tokumoto, M., Tatsumoto, N., Tsuruya, K., Kitazono, T., Ooboshi, H. (2016) Verylow protein diet enhances inflammation, malnutrition, and vascular calcification in uremic rats.
Life Sci. 146, 117-123.

5. Yamada, S., Tokumoto, M., Ooboshi, H. (2016) Pseudohyperchloraemia caused by long-term useof analgesic containing bromovaleryl urea. Nephrology (Carlton) 21, 161-162.

6. Yamada, S., Tsuruya, K., Yoshida, H., Tokumoto, M., Ueki, K., Ooboshi, H., Kitazono
T. (2016) Factors associated with the serum myostatin level in patients undergoing
peritoneal dialysis: potential effects of skeletal muscle mass and vitamin D
receptor activator use. Calcif. Tissue Int. 99, 13-22.

7.	
 山野貴史，杉野赳浩，内藤徹，中島與志行，大星博明，中川尚志.	
 (2016)	
 介護老人保
健施設における肺炎患者の嚥下機能の解析.嚥下医学.	
 5,	
 230-236.	
 8. Yamada, S., Tsuruya, K., Tokumoto, M., Yoshida, H., Hasegawa, S., Tanaka, S., Eriguchi, M.,
Nakano, T., Masutani, K., Ooboshi, H., Kitazono T. (2015) Fibroblast growth factor 23, but
not parathyroid hormone, is associated with urinary phosphate regulation in patients onperitoneal dialysis. Ther. Apher. Dial. 19, 73-80.

9. Yamada, S., Tatsumoto, N., Tokumoto, M., Noguchi, H., Ooboshi, H., Kitazono, T., Tsuruya, K.
(2015) Phosphate binders prevent phosphate-induced cellular senescence of vascular smoothmuscle cells and vascular calcification in a modified, adenine-based uremic rat model. Calcif.
Tissue Int. 96, 347-358.

10. Nakamura, K., Ago, T., Tsuchimoto, A., Noda, N., Nakamura, A., Ninomiya, T., Uchiumi, T.,

12

Tsuruya, K., Kamouchi, M., Ooboshi, H., Kitazono, T. (2015) A CADASIL-like case with anovel noncysteine mutation of the NOTCH3 gene and granular deposits in the renal arterioles.
Case Rep. Neurol. Med. 2015, 431461.

11. Yamada, S., Tokumoto, M., Taniguchi, M., Toyonaga, J., Suehiro, T., Eriguchi, R., Fujimi, S.,
Ooboshi, H., Kitazono, T., Tsuruya, K. (2015) Two years of cinacalcet hydrochloride
treatment decreased parathyroid gland volume and serum parathyroid hormone level in
hemodialysis patients with advanced secondary hyperparathyroidism. Ther. Apher. Dial. 19,
367-3677.

12. Yamada, S., Tsuruya, K., Tokumoto, M., Yoshida, H., Ooboshi, H., Kitazono, T. (2015) Factors
associated with serum soluble inhibitors of Wnt-β-catenin signaling (sclerostin anddickkopf-1) in patients undergoing peritoneal dialysis. Nephrology (Carlton) 20, 639-645.

13. Fukuda, K., Kai, H., Kamouchi, M., Hata, J., Ago, T., Nakane, H., Imaizumi, T., Kitazono, T.,
FSR Investigators; steering committee of the Fukuoka Stroke Registry included (Ooboshi H).
(2015) Day-by-day blood pressure variability and functional outcome after acute ischemic
stroke: Fukuoka Stroke Registry. Stroke 46, 1832-1839

14. Yamada, S., Tokumoto, M., Tsuruya, K., Tatsumoto, N., Noguchi, H., Kitazono, T., Ooboshi, H.
(2015) Fetuin-A decrease induced by a low-protein diet enhances vascular calcification inuremic rats with hyperphosphatemia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 309. F744-F754.

15. Ishitsuka, K., Kamouchi, M., Hata, J., Fukuda, K., Matsuo, R., Kuroda, J., Ago, T., Kuwashiro,T., Sugimori, H., Nakane, H., Kitazono, T., FSR Investigators (Ooboshi H). (2014) High bloodpressure after acute ischemic stroke is associated with poor clinical outcomes: Fukuoka Stroke
Registry. Hypertension 63, 54-60.

16. Kiyohara, T., Kamouchi, M., Kumai, Y., Ninomiya, T., Hata, J., Yoshimura, S., Ago, T., Okada,Y., Kitazono, T., Fukuoka Stroke Registry Investigators (Ooboshi H). (2014) ABCD3 andABCD3-I scores are superior to ABCD2 score in the prediction of short- and long-term risksof stroke after transient ischemic attack. Stroke 45, 418-425.

13

17. Matsuo, R., Ago, T., Hata, J., Kuroda, J., Wakisaka, Y., Sugimori, H., Kitazono, T., Kamouchi,M., FSR Investigators (Ooboshi H). (2014) Impact of the 1425G/A polymorphism of PRKCH
on the recurrence of ischemic stroke; Fukuoka Stroke Registry. J. Stroke Cerebravasc. Dis. 23,
1356-1361.

18. Wakisaka, Y., Ago, T., Kamouchi, M., Kuroda, J., Matsuo, R., Hata, J., Gotoh, S., Isomura, T.,
Awano, H., Suzuki, K., Fukuda, K., Okada, Y., Kiyohara, Y., Ooboshi, H., Kitazono, T.,
REBIOS Investigators. (2014) Plasma S100A12 is associated with functional outcome after
ischemic stroke: Research for Biomarkers in Ischemic Stroke. J. Neurol. Sci. 340, 75-79.

19. Yamada, S., Tokumoto, M., Tatsumoto, N., Taniguchi, M., Noguchi, H., Nakano, T., Masutani,K., Ooboshi, H., Tsuruya, K., Kitazono, T. (2014) Phosphate overload directly induces
systemic inflammation and malnutrition as well as vascular calcification in uremia. Am. J.
Physiol. Renal Physiol. 306, F1418-F1428.

20. Matsuo, R., Kamouchi, M., Ago, T., Hata, J., Shono, Y., Kuroda, J., Wakisaka, Y., Sugimori, H.,
Kitazono, T., FSR investigators (Ooboshi H). (2014) Thrombolytic therapy with intravenous
recombinant tissue plasminogen activator in Japanese older patients with acute ischemic
stroke: Fukuoka Stroke Registry. Geriatr. Gerontol. Int. 14. 954-959.

21. Namura, S., Ooboshi, H., Liu, J., Yenari, M. A. (2013) Neuroprotection after cerebral ischemia.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 1278, 25-32.

22. Yamada, S., Tokumoto, M., Ohkuma, T., Kansui, Y., Wakisaka, Y., Uchizono, Y., Tsuruya, K.,
Kitazono, T., Ooboshi, H. (2013) Slowly progressive and painless thoracic aortic dissection
presenting with a persistent Fever in an elderly patient: the usefulness of combined
measurement of biochemical parameters. Case Rep. Med. 2013, 498129.

23. Abe, K., Uchiyama, S., Matsubara, E., Muramatsu, S., Atsuta, N., Kitagawa, K., Iguchi, Y.,
Ooboshi, H., Kaji, R., Terao, Y. (2013) IT network establishment for neuropatients. Rinsho
Shinkeigaku 53, 1155-1158.

24. Shichita, T., Ago, T., Kamouchi, M., Kitazono, T., Yoshimura, A., Ooboshi, H. (2012) Novel

14

therapeutic strategies targeting innate immune responses and early inflammation after stroke. J.
Neurochem. 123S2, 29-38.

25. Shichita, T., Hasegawa, E., Kimura, A., Morita, R., Sakaguchi, R., Takada, I., Sekiya, T.,
Ooboshi, H., Kitazono, T., Yanagawa, T., Ishii, T., Takahashi, H., Mori, S., Nishibori, M.,
Kuroda, K., Akira, S., Miyake, K., Yoshimura, A. (2012) Peroxiredoxin family proteins are key
initiators of post-ischemic inflammation in the brain. Nat. Med. 18, 911-917.

26. Arimura, K., Ago, T., Kamouchi, M., Nakamura, K., Ishitsuka, K., Kuroda, J., Sugimori, H.,
Ooboshi, H., Sasaki, T., Kitazono, T. (2012) PDGF receptor ß signaling in pericytes following
ischemic brain injury. Curr. Neurovasc. Res. 9, 1-9.

27. Kuwashiro, T., Sugimori, H., Ago, T., Kamouchi, M., Kitazono, T., FSR Investigators (Ooboshi
H). (2012) Risk factors predisposing to stroke recurrence within one year of non-cardioembolic
stroke onset: the Fukuoka Stroke Registry. Cerebrovasc. Dis. 33, 141-149.

学会発表
1.

ASL	
 MR 灌 流 画 像 に お け る Bright arterial appearance の 意 義 . 金澤有華，荒川修治，
森岡隆人，吾郷哲朗，北園孝成、大星博明.	
 第 59 回日本脳循環代謝学会学術集会,	
 徳島,	
 11 月	 2016.

2.

The protective effects of caloric restriction on phosphate-induced calcification via the
upregulation of SIRT1 in human vascular smooth muscle cells. Tokumoto M, Yamada S,
Tsuruya K, Kitazono T, Ooboshi H. ASN Kidney Week 2016, Chicago, November 2016．

3.

Prevalence, predictors and cardiovascular risk of apparent treatment-resistant hypertension inhemodialysis patients: the Q-Cohort Study.	
 田中茂	
  二宮利治	  谷口正智	  藤﨑毅一	  徳本正憲	  平方秀樹	  大星博明	  鶴屋和彦	  北園孝成,	 第 61 回日本透析医学会総会、大
阪,	
 6 月	
 2016.

4.

Secular trends in the incidence of end-stage renal disease and its risk factors in IgA
nephropathy.	
 田中茂	
  二宮利治	  片渕律子	  升谷耕介	  土本晃裕	  徳本正憲	
  平方秀

15

樹	
  大星博明	  鶴屋和彦	  北園孝成,	 1979-2010,	
 第 59 回日本腎臓学会総会横浜,	
 6月	
 2016.

5.

Neurovascular protection による創薬. 大星博明.	
 第 57 回日本神経学会総会	
 シンポジウ
ム,	
 神戸,	
 5 月	
 2016.

6.

A pivotal role of peroxiredoxin in the evolution of brain infarction. Ooboshi H, Shichita T,
Yoshimura A. 25th European Stroke Conference, Venice, April 2016.

7.

自然免疫を標的とした脳梗塞治療. 大星博明.	
 第 27 回日本脳循環代謝学会総会	
 シンポジウム,	 富山,	
 10 月	 2015.

8.

Very low protein diet enhances vascular calcification by increasing Ca-Pi-precipitates anddecreasing fetuin-A in uremic rat model. Yamada S, Tokumoto M, Ooboshi H. NAVBO
Vascular Biology 2015, Hyannis, October 2015.

9.

Comparative effectiveness of oral and injectable vitamin d receptor activator on infectionmortality in hemodialysis patients: the Q Cohort Study. Tanaka S, Ninomiya T, Taniguchi M,
Tokumoto M, Hirakata H, Ooboshi H, Tsuruya K, and Kitazono T. ASN Kidney Week 2015,
San Diego, November 2015．

10.

The reduced osteopontin expression and the increased calcium phosphate nanoparticle
precede the calcification by phosphate load with normal fasting glucose level in humanvascular smooth muscle cells. Tokumoto M, Yamada S, Tsuruya K, Kitazono T, Ooboshi H.
ASN Kidney Week 2015, San Diego, November 2015．

11.

Neurovascular unit を守る治療研究最前線－主に免疫細胞の立場から. 大星博明.	
 第 56
回日本神経学会総会	
 シンポジウム,	
 新潟,	
 5 月	
 2015.

12.

Differential effects of dietary phosphate restriction and protein restriction on malnutrition,
inflammation and vascular calcification in uremic rats. Yamada S, Tokumoto M, Tatsumoto N,
Ooboshi H, Tsuruya K, and Kitazono T. ASN Kidney Week 2014, Philadelphia, November
2014．

16

13.

The direct inhibitory effect of etidronate disodium hydrate on progression ofphosphate-induced calcification in human vascular smooth muscle cells. Tokumoto M, YamadaS, Fujino T, Tsuruya K, Kitazono T, Ooboshi H. ASN Kidney Week 2014, Philadelphia,
November 2014．

14.

Innate immune response as a novel therapeutic target of brain infarction. Ooboshi H. ICDI
Symposium 2014, Ghent, September 2014.

15.

Basic fibroblast growth factor after ischemic stroke in diabetic patients - Research for
Biomarkers in Ischemic Stroke (REBIOS) -. Nakamura K, Ago T, Arimura K, Makihara N,
Nishimura A, Matsuo R, Kuroda J, Wakisaka Y, Isomura T, Awano H, Suzuki K, Okada Y,
Kamouchi M, Kiyohara Y, Ooboshi H, Kitazono T. International Stroke Conference 2014, San
Diego, February 2014.

16.

The expression of pericyte PDGFRβ is regulated by basic FGF after ischemic stroke Research for Biomarkers in Ischemic Stroke (REBIOS) -. Nakamura K, Arimura K, Ago T,
Makihara N, Isomura T, Watabe W, Awano H, Suzuki K, Kamouchi M, Kiyohara Y, Ooboshi
H, Kitazono T. Neuroscience Meeting 2013, San Diego, November 2013.

17.

Phosphate overload induces systemic inflammation, malnutrition, and vascular calcification inuremia. Yamada S, Tokumoto M, Taniguchi M, Tsuruya K, Ooboshi H, and Kitazono T. ASN
Kidney Week 2013, Atlanta, November 2013．

18.

The combined therapy with calcitriol and a calcimimetic agent, R568, ameliorates
phosphorus-induced calcification with altered expression of SIRT1 and ALP in human vascularsmooth muscle cells. Tokumoto M, Yamada S, Fujino T, Tsuruya K, Kitazono T, Ooboshi H.
ASN Kidney Week 2013, Atlanta, November 2013．

19.

脳梗塞発症後の糖尿病患者における basic FGF の上昇:	
 Research for Biomarkers in
Ischemic Stroke (REBIOS). 中村晋之、吾郷哲朗、有村公一、牧原典子、粟野秀人、鈴木一夫、清原裕、鴨打正浩、大星博明、北園孝成. 第 26 回日本脳循環代謝学会総会、札幌、2013 年 11 月．

17

20.

脳梗塞後の S100A12 血漿濃度は昨日予後不良と挿管する：Research for Biomarkers in
Ischemic Stroke. 脇坂義信, 吾郷哲朗, 鴨打正浩, 磯村哲, 粟野秀人, 鈴木一夫, 岡田靖,清原裕, 大星博明, 北園孝成. 第３8 回日本脳卒中学会総会、東京、2013 年 3 月.

21. Extracellular newly identified receptor for advanced glycation endproducts binding protein(EN-RAGE) predicts the outcome in patients with acute ischemic stroke: Research for
Biomarkers in Ischemic Stroke. Wakisaka Y, Ago T, Kamouchi M, Kuroda J, Matsuo R, Gotoh
S, Watanabe W, Isomura T, Awano H, Suzuki K, Fukuda K, Okada Y, Kiyohara Y, Ooboshi H,
Kitazono T. International Stroke Conference 2013, Honolulu, February 2013.

22. Innate immunity as a novel therapeutic target of brain infarction. Ooboshi H. TranspacificWorkshop on Stroke. New Orleans, October 2012.

23. 大星博明: Immune response as a novel therapeutic target of brain infarction. 第 44 回日本動脈硬化学会、福岡、2012 年 7 月.

18

タイトル
研究代表者

IL-10産生性制御性T細胞を用いた新しい眼炎症治療戦略
川野庸一（眼科）

要約
実験的自己免疫性ぶどう膜炎(EAU)を用いて、IL-12サイトカインファミリーに属するIL-27
およびIL-35の眼炎症に及ぼす効果について解析をおこなった。EAUにおいては炎症後期の沈静期に向かってIL27とIL10の発現が増加していた。またrIL-27は炎症初期のTh1誘導・炎症後期のTh17抑制、IL-35は炎症初期Th1抑制・炎症各期においてTh17の抑制作用があり、両サイトカインともに眼炎症を抑制する可能性が示された。
次にぶどう膜炎患者、及びぶどう膜炎症状を呈する眼内悪性リンパ腫患者の硝子体手術によって得られた硝子体液中の可溶型サイトカイン濃度を測定した。IL-10、sIL-2Rα、sVEGFR1、sVEGFR2、sTNFR1、sTNFR2の濃度が眼内リンパ腫群でぶどう膜炎群及び対象群よりも有意に高かった（p < 0.05）。一方、sIL-1R1、sIL-1R2、sIL-4Rはぶどう膜炎群で眼内リンパ腫群よりも濃度が有意に高かった（p < 0.01）。sIL-6Rは眼内リンパ腫群で対象群と比し有意に上昇していた（p < 0.01）。sVEGFR1とsVEGFR2の濃度が転移性（中枢神経系以外原発）で中枢神経系原発の眼内悪性リンパ腫よりも高かった。
さらに硝子体手術を行い得られた灌流液を収集し、遠心し上清を捨てた残りの固形物検体を用いてリアルタイムPCRを行った。対象は7名の男性、13名の女性の20眼で、15眼は特発性黄斑上膜、5眼は黄斑円孔を有していた。サイトカインなどの19因子の発現レベルを比較した結果、黄斑円孔に比べ特発性黄斑上膜を有する眼において炎症や血管新生、創傷治癒に関わる7因子の発現上昇を認めた。このように、硝子体灌流液を用いて行うリアルタイム
PCRによる検討は、低眼圧を起こすリスクを伴うことなく解析することができ、また特発性黄斑上膜だけでなく続発性黄斑上膜などの疾患に対しても関与因子究明に有用であると考えられた。

研究目的
内因性ぶどう膜炎は自己免疫性疾患で、種々の転帰により失明に至ることもある重要な
難治性眼疾患であり、小児にはまれで加齢に伴って発症してくる。特に視力予後が不良であったベーチェット病によるぶどう膜炎に対しては、近年サイトカインの1つである
TNF(腫瘍壊死因子)-αを標的とした生物製剤（インフリキシマブ）が導入されたことにより、その予後は劇的に改善した。眼炎症の制御にこのような生物製剤が有用であることが示され、今後も新たな治療のターゲットを探ることを目的として眼炎症におけるサイトカイン
及びそのレセプターの動きを探ることを課題とした。
IL-12関連サイトカインであるIL-23, IL-27は活性化した樹状細胞から産生され、CD4陽性T細胞の分化に深く関わることが知られる。IL-12, IL-23, IL-27はそれぞれIFN-γを産生し細胞性免疫(Th1)の誘導に関与する。IL-23はIL-17を産生し炎症性疾患の病態形成に関与する
Th17と呼ばれる細胞集団の分化を促進し、炎症誘導に関わる。共同研究者の吉村らは、実験的自己免疫性ぶどう膜炎（Experimental autoimmune uveoretinitis, EAU）のモデルを用いて、ぶどう膜炎におけるTh17の関与について解析してきた(Rheumatology (Oxford). 2009
Apr;48(4):347–54.Int Immunol. 2008 Feb;20(2):209–14)。またIL-27は初期にはTh1を誘導する
一方、IL-23により誘導されたTh17細胞のサイトカイン産生を抑制することを明らかにしてきた(J Immunol. 2006 Oct 15;177(8):5377–85)。また近年IL-27のもつ免疫抑制作用の一部は、活性化CD4陽性T細胞から産生される免疫抑制性サイトカインであるIL-10の産生が誘導されることによることが示された。これらの背景に基づき、今回我々はEAUを誘導後、炎症が発生し沈静化していく期間における経時的なIL-27、IL-10の眼内、及びリンパ節における発現の経過を解析した。また、同じIL-12関連サイトカインであり、近年その免疫抑制作用が注目されてきているIL-35に着目、EAU誘導後、経時的にリンパ球を採取しIL-27と比較する形でIL-35の役割について検討を行った。
（実験Ⅰ．実験的自己免疫性ぶどう膜炎モデル）
次にぶどう膜炎の免疫療法の臨床応用を検討するにあたって、実際のぶどう膜炎患者の眼内における炎症の発症や抑制のメカニズムを探ることも必要である。眼球内という生体の中では小さな臓器の変化は、血液中の種々の変化は一般に捉えにくい。一方、種々の眼疾患において、硝子体手術時に得られる硝子体液からは、眼局所の病態をより反映する情報が得られる。ぶどう膜炎患者の硝子体中の種々の炎症にかかわるサイトカインを検討する
ことで、眼局所での炎症の病態を捉えること最終的な目的とした。今回はぶどう膜炎患者と、ぶどう膜炎症状で発症する疾患として特に眼科領域で注目されている眼内悪性リンパ腫患者の硝子体手術時に得られた硝子体液の可溶型サイトカイン濃度を測定した。（実験Ⅱ．ヒト硝子体液を用いた検討）また、このような硝子体液を採取する場合、サイトカイン等の硝子体中の濃度、活性を測定するには手術時に眼内に灌流液が入らない状態でまず硝子体切除を行う必要があり、検体採取時に生じる低眼圧による眼合併症のリスクが問題になる。そこで、より安全な方法
として、硝子体内容と眼内灌流液が混在した状態で採取される硝子体灌流液を収集し、遠心し上清を捨てた残りの固形物検体を用いてリアルタイムPCRを行い、各サイトカインの発現を調べ、病態との関連を調べる試みを行った。
（実験Ⅲ．ヒト硝子体手術時の灌流液の沈渣を用いた検討）
研究方法
Ⅰ.実験的自己免疫性ぶどう膜炎（Experimental autoimmune uveoretinitis, EAU）モデル
6週齢のC57BL/6マウスにInterphotoreceptor retinoid binding protein (IRBP)由来ペプチドおよびComplete Freund’s Adjuvant (CFA)を用いてEAUを誘導後0, 7, 14, 21日目に眼球、所属リンパ節および脾臓を摘出し磁気ビーズシステムを用いてCD4陽性T細胞を精製、抗CD3抗体お
よびIRBP刺激下でマイトマイシンC処理後脾細胞と共に培養した。眼内浸潤リンパ球に関してはIL-27P28とIL-10の発現をFACSおよびPCRにて検討した。リンパ節、脾細胞に関して
はリコンビナントIL-27(rIL-27)およびrIL-35を添加し、IFN-γ, IL-17産生を3日後にELISAで、7日後にFACSを用いて検討した。また転写因子の発現をPCRにて検討した。
Ⅱ. ヒト硝子体液を用いた検討
ぶどう膜炎患者、及びぶどう膜炎症状を呈する眼内悪性リンパ腫患者の硝子体手術によって得られた硝子体液中の可溶型サイトカイン濃度を測定した。2008年1月から2015年6月まで九州大学病院眼科で硝子体手術が施行された眼内悪性リンパ腫21眼、内因性ぶどう膜炎
20眼、対照（黄斑前膜）21眼を対照群とし、手術時に採取した硝子体液中のsCD30、sIL-1R1、sIL-1R2、sIL-2Rα、sIL-4R、sIL-6R、sgp130、sRAGE、sTNFR1、sTNFR2、sVEGFR1、sVEGFR2、
sVEGFR3、IL-10、IL-6、VEGF-A、Placenta growth factor (PlGF)、VEGF-C、VEGF-D、TNF-αの濃度をHuman Soluble Cytokine Receptor panel（Millipore）またはHuman Cytokine/Chemokine
Panel 1で測定した。眼内悪性リンパ腫群では、sTNFR1、sTNFR2、sVEGFR1, sVEGFR2,
sIL-2Rαの濃度について、網膜下浸潤病変の有無、脳病変の有無、原発部位（中枢神経系と非中心神経系）との関連、さらにsIL-2Rαの濃度については、硝子体セルブロック由来薄切免疫染色標本を用いて硝子体中CD3陽性細胞の割合との相関についても調べた。

Ⅲ. ヒト硝子体手術時の灌流液の沈渣を用いた検討
特発性黄斑上膜15眼、黄斑円孔患者5眼の硝子体手術を行い得られた眼内灌流液を収集し、遠心し上清を捨てた残りの固形物検体を用いてリアルタイムPCRを行った。サイトカイン、
転写因子などの19因子：IL-6, IL-17A, TGFβ1, TGFβ2, TNF, interferon-γ (IFNG), VEGF-A、chemokine C-C motif ligand 2 (CCL2), CCL5,

chemokine C-X-C motif ligand 1 (CXCL1),CXCL10, v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A (RELA), signal transducer
and activator of transcrip- tion 3 (STAT3), etinoic acid receptor-related orphan receptor gamma(RORC), T-box protein 21 (TBX21), actin, alpha 1, skeletal muscle (ACTA1), glial fibrillary acidic
protein (GFAP), tenascin C (TNC), periostin (POSTIN)の発現レベルを比較した。

結果と考察
Ⅰ.

実験的自己免疫性ぶどう膜炎（Experimental autoimmune uveoretinitis, EAU）モデル

EAU誘導後、経時的に採取、精製したCD4陽性T細胞において、IL-27p28およびIL-10の発現はFACSによる解析ではday21まで徐々に増加していた。（図１）PCRによる発現では同様の傾向が見られた。IL-27がIL-10を産生しEAU炎症を抑制している可能性があると考えられた。また各時期のリンパ球をin vitroでr-IL27で刺激すると、IL-10の発現は対象に比較して増加した。（図2）
また EAU各期の所属リンパ節・脾臓から精製したCD4細胞をrIL-27、rIL-35で刺激しまたIFN-γ, IL-17、転写因子の発現をPCRにて検討した（図３）。またIFN-γ, IL-17産生を3日後にELISAで、FACS（図４）を用いて検討した。rIL-27刺激によってTh1特異的転写因子(T-bet)の発現上昇およびTh17特異的転写因子(RORγt)の発現減弱がみられた。 rIL-35ではEAU初期に於いてのIFN-γ産生抑制およびEAU各期において有意にIL-17の発現を抑制がみられた。ELISAでも同様の効果が見られた。
以上より、IL-27は炎症初期のTh1誘導・炎症後期のTh17抑制、IL-35は炎症初期Th1抑制・炎症各期においてTh17の抑制作用があり、両サイトカインともに眼炎症を抑制する可能性が示唆された。現在in vivoにおけるサイトカインの効果に関する検討をすすめている。

図１

day

図２

図３

図４

Ⅱ. ヒト硝子体サンプルを用いた検討
硝子体液中の可溶性サイトカインレセプター濃度を対照群（黄斑上膜患者 21 眼）ぶどう膜炎群（20 眼）眼内リンパ腫群（21 眼）で比較した。リンパ腫症例は全例 DLBCL（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）と診断されていた。 IL-10、sIL-2Rα、sVEGFR1、sVEGFR2、
sTNFR1、sTNFR2 の濃度が眼内リンパ腫群でぶどう膜炎群及び対象群よりも有意に高かった（p < 0.05）。 一方、sIL-1R1、sIL-1R2、sIL-4R はぶどう膜炎群で眼内リンパ腫群よりも濃度が有意に高かった（p < 0.01）。sIL-6R は眼内リンパ腫群で対象群と比し有意に上昇していた（p < 0.01）。
（表１）次に、眼内リンパ腫群の 21 例を検討した。 症例の背景を（表２）に示したが、眼や脳の中枢神経系原発の症例と他臓器のリンパ腫に続発した眼内リンパ腫の症例があった。

また網膜下病変が見られる症例と、硝子体混濁のみの症例があった。
硝子体内の sVEGFR1 と sVEGFR2 の濃度が転移性（中枢神経系以外原発）眼内リンパ腫の患者で中枢神経系原発のリンパ腫患者よりも高かった。（図５）sVEGFR1, sVEGFR2 は転移性悪性リンパ腫のマーカーや治療標的となる可能性が示された。
また、sIL-2Rα の濃度が網膜下腫瘤型（混合型）で高く、IL-10 も高い傾向にあった。
（図６）IL-10 高値かつ、sIL-2Rα 上昇例では網膜下病変の存在が示唆された。
網膜下腫瘤型では硝子体中の T リンパ球の数が多く、sIL-2Rα の値と相関していた。
（図 7）
網膜下浸潤に腫瘍特異的 T リンパ球や制御性Ｔ細胞などが関わっている可能性が示された。

表1

硝子体液中の可溶性サイトカインレセプター濃度
対象 (n = 21)

リンパ腫(n = 21)

ぶどう膜炎 (n = 20)

P ValuesIL-1R1 (ng/mL)

0 (0-0.826)

0 (0-0)‡‡1.23 (0.986-1.37)§§<0.001*sIL-1R2 (ng/mL)

0 (0-0)0 (0-0)‡‡2.66 (1.08-4.13)§§<0.001*sIL-2Rα (ng/mL)

0 (0-0)3.40 (1.35-11.1)§§, ‡0.630 (0.098-2.55)§§<0.001*sIL-4R (ng/mL)

0 (0-0)0 (0-0)‡‡1.35 (1.17-1.63)§§<0.001†sIL-6R (ng/mL)

2.01 (1.10-3.09)

5.94 (3.61-13.3)§§

3.37 (1.85-5.13)<0.001*

sgp130 (ng/mL)

42.8 (27.7-53.9)

74.7 (45.7-105.0)§§

92.0 (75.8-112.3)§§<0.001*sTNFR1 (ng/mL)

1.40 (0-2.80)

9.55 (5.45-16.0)§§, ‡3.22 (2.06-4.58)§<0.001*sTNFR2 (ng/mL)

4.32 (2.51-5.95)

92.3 (28.8-184.8)§§, ‡‡14.1 (7.41-32.9)§§<0.001*sVEGFR1 (ng/mL)

153.5 (54.1-198.8)

404.3 (247.3-792.5)§§, ‡‡118.5 (101.1-141.0)<0.001*sVEGFR2 (ng/mL)

17.3 (14.5-21.9)

41.4 (22.2-58.3)§§, ‡‡14.4 (13.3-16.6)<0.001*

IL-6 (ng/mL)

0 (0-0.177)

0.853 (0.344-1.65)§§

1.32 (0.695-1.68)§§<0.001*

IL-10 (ng/mL)

0.020 (0-0.118)

57.2 (20.5-110.1)§§, ‡‡0.089 (0.009-0.225)<0.001*

TNF-α (pg/mL)

0 (0-0)0 (0-0)0 (0-0)0.26*

VEGF-A (pg/mL)

0 (0-1036.6)

0 (0-1068.7)

0 (0-1098.3)

0.80*

PlGF (pg/mL)

0 (0-114.3)

145.7 (0-269.9)

155.6 (0-602.8)

0.064*

VEGF-C (pg/mL)

0 (0-41.1)

0 (0-1099.2)

0 (0-532.3)

0.28*

表2

眼内リンパ腫の患者データ

症例

性

診断時年齢

原発巣

左右

眼内病変の部位

脳病変

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

F
F
F
M
M
F
F
M
M
M
F
M
M
F
F
F
F
M
M
F
F

51
68
55
63
61
80
80
60
45
69
73
59
38
69
67
75
73
78
68
74
79

眼
眼
眼
脳
脳
眼
脳
眼
眼
脳
脳、眼
脳
脳
脳
眼
眼、腹部
副鼻腔
胸壁
睾丸
乳腺
腸管

右
右
右
右
右
左
左
右
右
右
右
右
左
右
右
左
右
右
左
右
右

網膜下、硝子体
硝子体
網膜下、硝子体
網膜下、硝子体
硝子体
網膜下、硝子体
網膜下、硝子体
硝子体
網膜下、硝子体
硝子体
硝子体
硝子体
網膜下、硝子体
硝子体
硝子体
網膜下、硝子体
硝子体
硝子体
網膜下、硝子体
網膜下、硝子体
硝子体

有
無
無
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
無
有
有
有
無
無

再発病巣と
期間（月）
脳（16）
無
無
眼（10）
眼（20）
脳（12）
眼（17）
脳（25）
脳（48）
眼（72）
脳（16）
眼（33）
眼（6）
眼（35）
脳（4）
無
脳（102）
眼（18）
脳（96）
眼（59）
眼（19）

予後
死亡（38）
生存
生存
生存
生存
生存
死亡（44）
不明
死亡（70）
死亡（120）
死亡（25）
不明
生存
生存
生存
生存
生存
生存
死亡（132）
死亡（32）生存図５

sVEGFR1sVEGFR2

中枢神経系

転移性

中枢神経系

網膜下腫瘤型

硝子体混濁型

IL-10

転移性

中枢神経系

転移性

図６

（混合型）

網膜下腫瘤型（混合型）

硝子体混濁型

図7#

P < 0.01

Mann–Whitney’s U-test.

網膜下腫瘤型

硝子体混濁型（混合型）

Spearman’s rankcorrelation coefficientⅢ. ヒト硝子体手術時の灌流液の沈渣を用いた検討
黄斑円孔および特発性黄斑上膜患者の背景を表３に示した。年齢分布で有意差がみられた
が、性差、手術時間には差は無かった。
表４に硝子体手術時の眼内還流液の沈渣から検出されるサイトカインなどの19因子の発現レベルを比較した結果を示す。黄斑円孔に比べ特発性黄斑上膜を有する眼において炎症や血管新生、創傷治癒に関わる7因子

interleukin 6 (IL6), tumor growth factor B2 (TGFB2),

vascular endothelial growth factor A (VEGFA), chemokine C-X-C motif ligand 1 (CXCL1), v-rel
avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A (RELA), glial fibrillary acidic protein(GFAP), and tenascin C (TNC) の発現上昇を認めた。
表５には特発性黄斑上膜を有する眼における7つの発現上昇遺伝子間のスピアマンの相関
関係解析結果を示した。図８にはこのスピアマンの相関解析のプロットデータを示した。
3つの遺伝子(IL6、CXCL1、RELA) はTGFB2遺伝子と正の相関関係があり、他の3つの遺伝子(VEGFA、GFAP、TNC)はそれぞれにおいて相関が見られた。これらの結果より、我々は腫瘍成長因子B2と3つの因子(インターロイキン6、CXCL1、NF-κB)が線維化に関わるグリア線維性酸性タンパク質陽性細胞を刺激し、血管新生因子(血管増殖因子AやテネイシンC)が特発性黄斑上膜形成を増強させていると仮説を立てた。
（図９）
このように、硝子体灌流液を用いて行うリアルタイム PCR による検討は、低眼圧を起こす
リスクを伴うことなくサンプルを解析することができる。

特発性黄斑上膜だけでなくぶ

どう膜炎などの炎症性疾患に対しても関与因子究明に有用であると考えられた。

表３

黄斑円孔と特発性黄斑上膜の患者背景
黄斑円孔

特発性黄斑上膜

人数、名(%)

515

年齢、平均(標準偏差)、 歳

61.8 (5.84)

71.5 (6.59)< 0.05†
0.61‡

性別、名
男性、 7

1

6

女性、 134

9

61 (14)61 (12)

手術時間、平均(標準偏差)、分

P 値

0.98†

表４ 灌流液の沈渣におけるサイトカインや他の遺伝子発現レベル
遺伝子

相対定量法
ΔCt (標準偏差)

ΔΔCt (標準偏差)

比率; 2-ΔΔCt

P 値

黄斑上膜

黄斑円孔

IL6

8.63 (1.62)

10.8 (1.48)-1.96 (0.136)

4.4< 0.05‡

IL17A

検出されず

検出されず

非該当

非該当

非該当

TGFB1

3.66 (1.10)

3.57 (0.927)-0.0112 (0.254)

0.94

0.83†

TGFB2

4.65 (0.961)

7.63 (2.19)-3.26 (1.48)

7.9< 0.001‡

TNF

8.81 (1.46)

8.75 (1.11)

0.330(0.662)

0.96

0.90†

IFNG

16.5 (1.48)

15.3 (3.12)

0.616 (1.99)

0.43

0.49‡

VEGFA

3.45 (1.03)

6.58 (1.20)-3.27 (0.317)

8.7< 0.001‡

CCL2

4.82 (1.45)

4.02 (1.75)

0.919 (0.302)

0.57

0.42†

CCL5

9.88 (1.36)

8.90 (3.00)

0.658 (1.53)

0.51

0.20‡

CXCL1

6.87 (1.71)

8.80 (1.14)-2.26 (0.0509)

3.8< 0.01‡CXCL1012.0 (1.86)

9.32 (1.26)

2.88 (0.766)

0.16

0.29‡

RELA

7.83 (0.783)

8.47 (0.321)-0.980 (0.449)

1.6< 0.05‡

STAT3

6.82 (0.585)

7.31 (0.805)-0.393 (0.104)

1.4

0.25†

RORC

13.0 (1.33)

12.7 (1.25)-0.0011 (0.339)

0.83

0.99†

TBX21

12.1 (1.67)

11.4 (2.63)

0.235 (1.02)

0.61

0.41†

ACTA1

検出されず

検出されず

非該当

非該当

非該当

GFAP

0.658 (1.24)

2.14 (1.04)-1.46 (0.0919)

2.8< 0.05‡TNC

2.91 (2.10)

5.45 (0.959)-2.96 (0.308)

5.8< 0.005‡

POSTN

14.8 (2.29)

8.47 (0.740)#

5.23 (1.15)

0.013

0.26‡

表５

特発性黄斑上膜患者おける7つの発現上昇遺伝子間のスピアマンの相関関係解析
スピアマンの相関関係
ρP 値

IL6 vs. TGFB2

0.762< 0.005

IL6 vs. VEGFA

0.110

0.72

IL6 vs. CXCL1

0.423

0.15

IL6 vs. RELA

0.300

0.31

IL6 vs. GFAP

0.189

0.56

IL6 vs. TNC

0.209

0.49

TGFB2 vs. VEGFA

0.05190.85

TGFB2 vs. CXCL1

0.648< 0.01TGFB2 vs. RELA

0.597

< 0.05TGFB2 vs. GFAP

0.260

0.37

TGFB2 vs. TNC

0.385

0.16

VEGFA vs. CXCL1-0.281

0.31

VEGFA vs. RELA

-0.0680

0.81

VEGFA vs. GFAP

0.624

< 0.05

VEGFA vs. TNC

0.686< 0.005

CXCL1 vs. RELA

0.476

0.073

CXCL1 vs. GFAP

-0.0882

0.76

CXCL1 vs. TNC

0.129

0.65

RELA vs. GFAP

0.199

0.50

RELA vs. TNC

0.335

0.22

GFAP vs. TNC

0.705< 0.005図８

図９
特発性黄斑上膜眼において有意に発現上昇した 7 つの遺伝子間の推定される関係

発表論文*Myojin, S., Yoshimura, T., Yoshida, S., Takeda, A., Murakami, Y., Kawano, Y., Oshima, Y.,
Ishibashi, T., Sonoda, KH. (2016)

Gene Expression Analysis of the Irrigation Solution Samples

Collected during Vitrectomy for Idiopathic Epiretinal Membrane PLoS ONE 11(10): e0164355,
2016.

*Takeda, A., Yoshikawa, H.,

Fukuhara, T.,

Hikita, S-H., Hijioka, K.,

Hisatomi, T., Kimura, K. , Yoshida, S., Kawano, Y.,

Otomo, T., Arita, R.,

Sonoda, KH., and Ishibashi, T. (2015)

Distinct profiles of soluble cytokine receptors between B-cell vitreoretinal lymphoma and uveitis.
Invest Ophthalmol Vis Sci., 56(12) 7516-7523. 2015

* Takeda, A., Hasegawa, E., Fukuhara, T., Hirakawa, S., Yamada, H., Yang, Y.,
Yoshimura, T., Hisatomi, T., Oshima, Y., Yoshida, H., Sonoda, KH., Ishibashi T. (2014)
EBI3 is pivotal for the initiation of experimental autoimmune uveitis.

Exp Eye Res. 2014 Jun 11;125C:107-113.
*Yang, Y., Takeda A,, Yoshimura, T., Oshima, Y., Sonoda, KH., Ishibashi, T.(2013)
IL-10 is significantly involved in HSP70-regulation of experimental subretinal fibrosis.

PLoS One. Dec 20;8(12):e80288

学会発表
武田 篤信，吉川 洋，有田 量一，肱岡 邦明，疋田 伸一，清武良子、木村和博、吉田 茂
生，川野 庸一，石橋 達朗, 園田 康平 (2016) 眼内リンパ腫と可溶型 IL-2 受容体との関連について、第 70 回 日本臨床眼科学会 (京都市)疋田伸一、武田篤信、清武良子、大友孝昭、肘岡邦明、川野庸一、石橋達朗、園田康平 (2016)
結核性ぶどう膜炎の診断とＴ-SPOT・クオンティフェロン(QTF)検査の有用性に関する検討、第 120 回

日本眼科学会総会 （仙台市）

武田 篤信，吉川 洋，有田 量一，肱岡 邦明，疋田 伸一，大友 孝昭，吉田 茂生，川野 庸
一，園田 康平，石橋 達朗,(2015) 網膜硝子体悪性リンパ腫及び内因性ぶどう膜炎の可溶型サイトカイン受容体濃度の検討、第 119 回

日本眼科学会 (東京)

清武良子、武田 篤信，川野庸一、大友孝昭、疋田 伸一，大友 孝昭，塚本浩、有吉洋二郎，園田 康平，石橋 達朗(2015)

インフリキシマブからアダリムマブへの変更が眼症に有効であったベーチェット病の 1 例、第 69 回 日本臨床眼科学会（東京）

平川沙弥香、吉村武、武田篤信、大島裕司、川野庸一、石橋達朗. (2014)

実験的自己免疫性ぶどう膜炎における IL-27 および IL-35 の役割. 第 118 回日本眼科学会総会、(東京)

研 究 課 題

口腔上皮細胞の分化にともなうゲノムのエピジェネティックな変化研究代表者

坂上竜資（口腔治療学講座・歯周病学分野・教授）

要約
口腔内に特徴的な上皮の代表としては、口腔粘膜と歯原性上皮系組織とがある。この２つの系について恒常性維持のメカニズムと、老化と分化にいたるメカニズムについて検討した。まず口腔粘膜上皮のエピジェネティクな変化については、①上皮の角化を解析する三次元モデルを構築し（文献６）、②上皮における CLCA 発現における分子機構の一端を解明し（文献３）、さらに③口腔粘膜上皮の加齢にともなうトランスクリプトー
ム解析を行った。次に歯原性上皮系組織については、生涯にわたって歯が伸び続ける齧
歯類の切歯根尖組織 apical bud に着目し、④組織幹細胞として Sox2 と Oct4 の発現が恒常的に維持されることを免疫組織学的に確認し、⑤この細胞の分離培養を試み、⑥腎移植することで硬組織を形成することを確認した。さらに⑦GFP 遺伝子導入マウスのapical bud を野生型マウスの apical bud に外科的に移植してこれら特定の細胞の分化を追跡し、細胞塊は上皮間葉転換後に歯の構造の一部として取り込まれていることを明らかにした（文献２）。われわれが開発した in vivo の移植実験は、歯の発生の仕組みを解明するのに役立つ可能性がある。
研究目的
口腔内に特徴的な上皮の代表としては、口腔粘膜と歯原性上皮系組織とがある。われわれはゲノムおよびエピジェネティックな変化に着目し、口腔粘膜上皮と歯原性上皮のそれぞれの動態について検索した。本研究の目的は、この２つの系によって、恒常性維
持のメカニズムと、老化と分化にいたるメカニズムを検討することである。
（１）口腔粘膜上皮のエピジェネティックな変化について
口腔粘膜上皮は消化管の入り口で生体の最外層に位置しており、感染に対するバリアとして機能する。表皮には、角化上皮と粘膜上皮があり、口腔内では部位特異的に両者が分布している。口腔内の角化上皮の分布異常は歯周炎の進行に影響を与えるので、粘膜上皮で被覆された領域に角化上皮を移植する治療も行われている。これらのことから、口腔上皮細胞の発現遺伝子を網羅的に解析し、角化上皮細胞に特異的に発現する遺伝子を調べ、これらの遺伝子産物を口腔内感染症の疾患感受性あるいは老化のマーカー分子と関連づけて捉えることは意義があると考えられる。この目的で、①上皮の角化を解析する三次元モデルの構築、②上皮における CLCA 発現の分子機構、③口腔粘膜上皮の加1

齢にともなうトランスクリプトーム解析について調べることとした。
（２）齧歯類切歯における歯原性の上皮の動態について
ヒトの歯根の発生においては口腔上皮細胞が嵌入し、これがやがて歯原性の上皮として歯の構造の一部を形成する。口腔内に特徴的な歯原性の上皮としては、エナメル上皮、
星状網、Hertwig 上皮鞘（Hertwig’s Epithelial Root Sheath、以下 HERS）、Malassez の上皮遺残（Epithelial cell rests of Malassez、以下 ERM）、接合上皮などがあり、さらにエナメル上皮はエナメル質をつくるタンパクを分泌するという特徴がある。ヒトにおいては、歯の幹細胞ともいうべき歯の形成を司る器官は、歯の形成時の最根尖の上皮組織に含まれていると考えられる。一方、齧歯歯類の切歯においては、組織幹細胞はほとんどその位置を変えず、上顎も下顎も伸び続けて細胞を提供し続ける。この意味において、この齧歯類切歯に認められる歯髄幹細胞は老化に伴う影響を最も受けにくい組織の一つと考えることができる。この研究を極めることによって、分化や老化の影響を受けにくい、恒常性を誘導する遺伝的な背景が明らかにできる可能性がある。
HERS は歯乳頭と歯小嚢の間を分断するように根尖方向に伸び、歯乳頭の細胞を分化させて象牙芽細胞を誘導する。さらに HERS 細胞は、歯小嚢の間葉系細胞をセメント芽細胞に分化させ、このセメント芽細胞は断裂した HERS の隙間を通って歯根面上にセメ
ント質を形成する。HERS は、最終的に歯根膜中に ERM となるが 1)、一部はアポトーシ
スに至る。歯根膜中に残された ERM の働きは、(1) 歯根膜腔の維持、(2) 根吸収とアン
キローシスの防止、(3) 歯根膜の恒常性の維持、(4) 無細胞セメント質の形成誘導など多岐にわたると考えられている。
近年、HERS 細胞そのものが上皮間葉転換(Epithelial-Mesenchymal Transition、以下 EMT)を起こしてセメント芽細胞に分化するという説が提唱されている。in vitro の実験系においては、この説を支持するような多数の報告が出されている。しかしセメント芽細胞に分化する HERS 細胞は無いとする研究もあり、未だ結論が出ていない。
歯の発生と歯周組織の再生において重要と考えられる HERS と ERM の役割について、
特に HERS 細胞の EMT に着目した。
これらの目的で、④Sox2 と Oct4 の胎生期から幼若マウスに至る動態、⑤Apical bud

細胞の分離培養、⑥Apical bud 細胞塊の腎移植、⑦GFP 産生 Apical bud の移植について調べることにした。
材料と方法（１）口腔粘膜上皮のエピジェネティックな変化について①上皮の角化を解析する三次元モデルの構築について
当教室の村上助教は、薬理学の山﨑教授の元で上皮と線維芽細胞からなる再構築モデ
2

ルを作成した。具体的には、初期培養された線維芽細胞上で上皮細胞を培養し、培養液の液面を下げて表層を半乾燥状態におくことで上皮が角化することを確認した。さらにエピガロカテキン（EGCG）を添加することによって、上皮の角化が亢進するかどうかを検索した（文献６）。
② 上 皮 に お け る CLCA 発 現 の 分 子 機 構 に つ い て
また当教室の廣松助教が、同様に山﨑教授の指導の元でマウス上皮細胞株におけるCLCA 遺伝子の発現制御機構の解明に挑んだ

CLCA 遺伝子は 1991 年に初めて認識されて以来、動物や植物を通して多くの CLCA ファミリーが発見され、研究が進められてきておいる。ヒトにおいては腸粘膜上皮、肺、気管、乳腺上皮において粘液分泌に関わることなどが明らかにされてきているが、依然として発現制御機構や生物学的、病理学的機能については詳細不明な点が多く残る。培養上皮細胞には、マウスケラチノサイト株
Pam212 を用いた。mCLCA2 転写活性の検討について、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。NF-kB p65 の標的 DNA への結合は、クロマチン免疫沈降 (ChIP) および
ELISA 法を応用した転写因子アッセイによって検討した。発現については RT-PCR および蛍光免疫染色にて検討を行った。NF-kB の関与について検討を行なうために、活性化を促す TNF-αと活性会を阻害する CAPE を用いた（文献３）。
③口腔粘膜上皮の加齢にともなうトランスクリプトーム解析について
4 週齢と 2 年齢の同腹マウスをサクリファイスした後、直ちに口蓋角化歯肉組織を採取し、液体窒素にて急速冷凍、通法にしたがって mRNA を抽出後、ｃDNA 合成を行なって DNA マイクロアレー解析にてトランスクリプトームを比較した。
（２）齧歯類切歯における歯原性の上皮の動態について④

Sox2 と Oct4 の 胎 生 期 か ら 幼 若 マ ウ ス に 至 る 動 態 に つ い て

胎生 15，17，19 日齢，生後 2，4 日齢のマウスから下顎切歯を含むように組織を単離し、直ちに 10％ホルマリンに固定し、通法に従い切片の作製を行った。HE 染色にて組織部位を確認後、Sex-determining region Y-box 2 (Sox2)陽性細胞の局在と密度を免疫組織化学的に調べた。
⑤ Apical bud 細 胞 の 分 離 培 養 の 試 み
生後 4-7 日齢のマウスから下顎切歯を含む組織を単離し、ディスパーゼ処理を行なって上皮と歯小嚢を分離し、Apical bud の培養に最も適した条件を検索した。
⑥ Apical bud 細 胞 塊 の 腎 移 植3

生後 2 日齢マウスから摘出した Apical bud 組織の異所性硬組織形成能について調べた。摘出組織を 4 週齢マウスの腎臓皮膜下に移植して１２週間飼育後、マイクロ CT 装置を用いて移植部位に形成された石灰化物の量とサイズを評価した。
⑦ GFP 産 生 Apical bud の 移 植 に つ い てレシピエントとして生後 4 週齢 C57BL/6 マウスの下顎切歯根尖部周囲骨を頬側から開窓し、下顎切歯の apical bud を含む根尖組織を切除した。ドナーとして生後 7 日
齢グリーンマウス C57BL/6-tg(CAG-EGFP)の apical bud を含む根尖組織を 200 µm のサイズで採取した。採取した組織をレシピエントの同部位へ移植後、2、4、12 週で川本法にて非脱灰凍結切片を作製し、抗 podoplanin 抗体で免疫蛍光染色後、蛍光・共焦点レーザー顕微鏡で検索した（文献２）。
結果と考察①上皮の角化を解析する三次元モデルの構築について
上皮の角化を更新させる遺伝子発現機構についてカスパーゼ 14 に着目し、エピガロ
カテキン EGCG 刺激によりこの亢進をみた。ラットでは皮膚と口蓋粘膜は正角化、頬粘膜は正角化〜錯角化、食道粘膜は錯角化した重層扁平上皮であることが示された。また、皮膚と同様に口腔粘膜の有棘層・顆粒層にも caspase-14 と filaggrin が局在した。さらに、頬粘膜と比較すると口蓋粘膜でその発現は多いことが明らかになった。本再構築
モデルにおいて EGCG により有線層と頼粒層の caspase-14 と filaggrin の発現が増加した。また、口重量粘膜由来のモデルにおいて EGCG の効果が強いことが示され、ラット口腔粘膜にも皮膚と類似した角化層の構築機構があると考えられた。また、口腔粘膜再構築モデルにおける分化と角化は、in vivo と類似しており、角化メカニズムの解明
または角化因子の有効性を検討するモデルとして十分利用可能であることが示唆された。さらに、本再構築モデルにおいて、EGCG によって分化と角化が促進されることから、EGCG が治癒促進に有効であることが示唆された。EGCG を歯周外科処置に応用することによって、手術部位の治癒促進への展開が期待できると思われた（文献６）。
② 上 皮 に お け る CLCA 発 現 の 分 子 機 構 に つ い て
CLCA2 の活性化には、NF-ｋB による転写調節が働いていることを明らかにした。また、
NF-kB がもたらす生理現象は細胞増殖、アポトーシス、炎症など多様であり、CLCA2 がbasal な NF-kB 活性の結果として、上皮細胞において重要な機能を担っている可能性が考えられた。CLCA2 の発現は NF-kB の活性によって制御されており、Ca2 + による mCLCA2発現の上昇には、NF-kB を介した制御とは異なる他の転写制御因子も関与していると考えられた（文献３）。
4

③口腔粘膜上皮の加齢にともなうトランスクリプトーム解析について
2 年齢マウスでは、4 週齢マウスに比較して 1068 の遺伝子の発現量が有意に増加し、1103 の遺伝子の発現量が有意に減少していた。残りの 43110（95.21%）の遺伝子に有意な発現量の変化は認めなかった。また、周囲組織と比較した相対発現量が有意に高い遺伝子は、角化に関連するケラチンや関連タンパク質をコードするものが多かった。これ
らの遺伝子では、4 週齢マウスに比較して 2 年齢マウスにおいて相対発現量が減少する
遺伝子が多いことがうかがわれた。
角化口蓋歯肉上皮組織のトランスクリプトームに加えて、角化しない口腔粘膜上皮組織、中間的な形質を有する接合上皮、ならびにこれらの形質の維持に関わると考えられている上皮下結合組織のトランスクリプトームを調べ、相互に比較することで、口腔上皮のトランスクリプトームの特徴を網羅的に明らかにしたい。また、この解析からター
ゲット遺伝子を絞り込んで「加齢による発現変化とゲノムのエピジェネティックな変化との相関の探求、自然発症する歯周炎の組織学的、細菌学的な表現型の変化の探求」につなげたい。
④

Sox2 と Oct4 の 胎 生 期 か ら 幼 若 マ ウ ス に 至 る 動 態 に つ い て転写の調節やクロマチン構造の調節に重要な転写因子の一つである Sox2 のマウス下顎切歯における発現部位と発現量の経時的変化を免疫染色および Real time PCR にて評価した。胎生期から生後までの間に、マウス下顎切歯のエナメル質形成に関与する
Apical bud に限局して次第に発現するようになることが分かった。さらに、Sox2 と共同して働くと報告されている Oct4 についても評価を行い、Sox2 と Oct4 の共局在を共焦点顕微鏡にて確認した。
免疫染色と共焦点レーザー顕微鏡を用いて、胎生ならびに幼若マウスの口腔組織において Sox2 の発現部位とその経時的変化を免疫組織化学的に検索したところ、胎生期および生後マウスにおいて Sox2 発現細胞は口腔粘膜上皮や歯胚に局在していた。また生後１年齢においても、Sox2 は Apical bud 部に限局して発現することを見出した。さらに Oct4 については、Sox2 と同様に幹細胞と思われる位置において強発現していることを観察した。

⑤ Apical bud 細 胞 の 分 離 培 養 の 試 み
Apical bud 細胞の培養については、以下の条件で成功した。Apical bud と周囲の線
維芽細胞を含む根尖部の細胞を初期培養した場合、約１週間でアウトグロウスし、周囲に線維芽細胞を配した上皮細胞塊が形成された。しかし Apical bud 部の上皮系組織のみを取り出し、無コート、またはコラーゲンタイプ I のコートされたディッシュではア5ウトグロウスしなかった。Apical bud のみを取り出し、マトリゲルでコートされたディッシュではアウトグロウスが可能で、３週間で３-５mm の大きさにまで拡がった。また、Apical bud のみを取り出し、MEF（マウス胎仔線維芽細胞）上に置くと、マトリゲ
ルコートとほぼ同じペースでアウトグロウスした。しかしコラゲナーゼ処理を行なって細胞をバラバラにした場合には、どの条件であっても生長しなかった。また、継代操作に伴って細胞をバラバラにした場合も生長しなかった。
⑥ Apical bud 細 胞 塊 の 腎 皮 膜 下 へ の 移 植
２週齢マウスから採取した Apical bud を、４週齢マウスの腎の皮膜下に移植したと
ころ、１２週後にマイクロ CT 画像上で石灰化物の形成がが認められた。腎臓に移植した Apical bud には石灰化物は含まれていないので、Apical bud には硬組織形成能を持
つ細胞が含まれることが示された。
⑦ GFP 産 生 Apical bud の 移 植 に つ い てレシピエントの細胞をドナー由来 GFP 陽性細胞に置換し、細胞の動態を経時的にトレースした。また分化した細胞の形質を判別するために podoplanin に対する免疫蛍光染色を行った。podoplanin はリンパ管に見られる独特な細胞表面マーカーであるが、podoplanin 染色と HE 染色とを合わせて見ることによって、エナメル芽細胞、象牙芽細胞、apical bud のような特異的な細胞形質を持った細胞の識別が可能となった。
実験には apical bud を含む、根尖から 200 µm の大きさの移植片を使用した(Fig.1)。
摘出されたドナーの歯小嚢は実体顕微鏡下で可能な限り除去した。移植手術後 2 週間で移植した緑色蛍光細胞は生着し切端方向に向かって約 3ｍｍ遊走していた(Fig.2)。切歯の唇側において、レシピエントとドナー由来の構造が切端側と根尖側にそれぞれ見られた。 緑色蛍光細胞は下顎切歯の唇側にのみ見られ、エナメル芽細胞、象牙芽細胞、歯髄細胞に観察された。podoplanin は apical bud、前エナメル芽細胞、象牙芽細胞、神経鞘に観察された。切歯の根尖端において、移植された緑色蛍光組織はダメージを受けることなく生着し、正常像に近い連続した構造を切縁方向にのばしていた(Fig.2)。
移植手術後 12 週では、舌側の緑色蛍光細胞は象牙質の近くのセメント質内に封入されていた(Fig.3)。それらは、有細胞セメント質のみに位置し、歯根膜付近や歯根膜腔内には認められなかった。これらの緑色蛍光セメント細胞様細胞は HERS 由来の細胞と考えられた。この細胞が、類セメント質を分泌するセメント芽細胞/セメント細胞に分化しているのか、セメント質に埋められた上皮系細胞のままなのかは検証していない。
しかしながら、その位置と形態からセメント芽細胞/セメント細胞に分化している可能性が高いと考えている。さらなる理解を得るためにセメント芽細胞/セメント細胞に特異的な分子マーカーを使用する必要がある（文献２）。

6

Figure 1.

１週齢 C57BL/6-Tg (CAG-EGFP)マウス下顎切歯の緑色蛍光像。

(A)

C57BL/6-Tg (CAG-EGFP) mouse (green mouse、上)と C57BL/6 mouse (wild type、下)、黄色破線部で移植片を切断し移植した。
(B)

A を蛍光顕微鏡で観察。green mouse だけが発光している。

(C)

Green mouse 下顎切歯の矢状断の HE 染色像。＊は apical bud。黄色破線は移植時の切断部位。
(D)

C を蛍光顕微鏡で観察。

スケールバー: A, B 200 μm; C, D 100 μm.

78Figure 2.

移植手術後 2 週における下顎の非脱灰凍結矢状切片。

各々のパネルにおいて上が舌側、下が唇側、左が切端側、右が根尖側。
(A)

HE 染色像。切歯の舌側に象牙芽細胞(OB)、象牙質(黒矢印)、歯根膜(PDL)、唇側に象牙芽細胞(OB)、象牙質(黒矢印)、エナメル質(黒矢頭)、エナメル芽細胞(AB)を示す。
(B)

A の蛍光組織像。緑色蛍光細胞が下顎切歯の唇側半分に現われている。緑色蛍

光はエナメル芽細胞(AB)、象牙芽細胞(OB)、歯髄細胞(DP)で観察される。
(C)

A の蛍光組織像。podoplanin 発現が apical bud(*)、前エナメル芽細胞(PAB)、象牙芽細胞(OB)、神経鞘(白矢頭)で観察される。
(D)

GFP の緑色蛍光、podoplanin、DAPI の青色蛍光の重ね合せ。

(E)

A(a)の中倍率像。apical bud(*)、前エナメル芽細胞(黒矢頭)、歯髄細胞(DP)、象牙芽細胞(OB)、エナメル芽細胞(AB)が観察される。
(F)

E の蛍光組織像。緑色蛍光が apical bud (*)、前エナメル芽細胞(白矢頭)、エナメ

ル芽細胞(AB)、象牙芽細胞(OB)、歯髄細胞(DP)、歯髄の毛細血管(白矢印)に見られる。
(G)

E の蛍光組織像。podoplanin 抗体での免疫反応。Apical bud(*)、前エナメル芽細胞(白矢頭)、象牙芽細胞(OB)において強く、エナメル芽細胞(AB)と前象牙芽細胞(外枠矢印)において弱く発現している。
(H)

GFP の緑色蛍光、podoplanin、DAPI の青色蛍光の重ね合せ。

スケールバー: A-D 500 μm; E-H 100 μm.

910Figure 3. 移植手術後 12 週における下顎の非脱灰凍結矢状切片。
各々のパネルにおいて上が舌側、下が唇側、左が切端側、右が根尖側。
(A)

HE 染色像。切歯の舌側に歯根膜(PDL)、セメント質(C)、象牙質(D)、象牙芽細胞(黒矢印)、歯髄(DP)、唇側に象牙芽細胞(OB)、象牙質(D)、エナメル質(E)、エナメル芽細胞(黒矢印)を示す。
(B)

A の蛍光組織像。green mouse 由来細胞の遊走を示す。唇側のエナメル芽細胞(白矢印)と舌側のセメント質(外形矢頭)に緑色蛍光を認める。
(C)

A の蛍光組織像。podoplanin 発現が神経鞘(＊)、象牙芽細胞(白矢頭)、エナメル芽細胞(白矢印)に観察される。エナメル質基質(＊＊)に交差反応が見られる。
(D)

緑色蛍光、podoplanin、DAPI の青色蛍光の重ね合せ。

(E)

A(a)の中倍率像。歯根膜(PDL)、セメント質(C)、象牙質(D)。

(F)

E の蛍光組織像。緑色蛍光細胞はセメント質中に認めるが、歯根膜中には認め

ない。
(G)

E(b)の高倍率像。セメント質(C)、象牙質(D)。

(H)

G の蛍光組織像。GFP の緑色蛍光、DAPI の青色蛍光の重ね合せ。セメント質中にセメント細胞様細胞を認める。セメント質(C)、象牙質(D)。
スケールバー: A-D 500 μm; E-F 100 μm; G-H 100 μm.

11

HERS が EMT を起こしてセメント芽細胞に分化することを支持する研究は、in vitro とin vivo の実験で多数報告されている。最初の報告は、Webb らが 1996 年に、ラット臼歯の無細胞セメント質形成時のセメント芽細胞における keratin と vimentin の 免疫組織化
学的な共局在を示したものである。彼らは、これらが HERS 由来であるとし、無細胞セ
メント質は HERS 由来の細胞がつくる可能性があるとした 。
Zeichner-David ら(2003)は、不死化遺伝子の活性を調節できる遺伝子改変マウスの臼歯から HERS 細胞を分離し、HERS 由来のセルラインを作成した。これらの細胞は、当初
ameloblastin などのエナメル関連タンパクを分泌していたが、次第に形態を変えて無細胞セメント質の構造に似た石灰化を伴う細胞外基質を分泌するようになった。彼らはこの所見から、無細胞セメント質は HERS 由来のセメント芽細胞から形成され、有細胞セ
メント質は神経堤由来のセメント芽細胞から形成されているという仮説を提唱した。
Sonoyama ら(2007)はヒト HERS 細胞を不死化してセルラインとして確立し、in vitro にてその性質を調べた。その結果、HERS 細胞は歯根膜幹細胞 periodontal ligament stem cellを分化させて石灰化ノジュールを作らせることができた。また HERS 細胞はエナメルタ
ンパク、cytokeratin、vimentin、E-cadherin など、セメント質・骨に関連するタンパクのマーカーを同時に発現した。さらに TGF-β1 により処理した HERS 細胞は PI3K/AKT 経路を活性化して EMT を生じた。48 時間にわたる TGF-β1 処理後の HERS 細胞をマウス皮下に移植すると、セメント質様の石灰化物を認めることができた。
Huang ら(2009)は、K14-Cre;R26R マウスを用いた実験で、keratin14 陽性の HERS 細胞がβgal 陽性となる仕組みを作って臼歯部におけるセメント質形成を調べた。その結果、根尖近くのセメント質中にβgal 陽性細胞を多数認め、彼らは HERS 細胞がセメント芽細胞に分化したと結論づけた。さらに根分岐部では、βgal 陽性細胞はセメント質表層のみに認められ、根尖部分でのセメント質形成や、無細胞セメント質の形成とは異なった
複数のセメント質形成のメカニズムが存在すると考えた 。
Akimoto ら(2001)は、HERS 由来のセルラインを用いて、in vitro にて遺伝子発現とタン
パク発現を調べた。その結果、vimentin と N-cadherin などの間葉系細胞マーカー、
cytokeratin14, E-cadherin, p63 などの上皮系幹細胞マーカーをともに認めた。さらに TGFβの刺激によって、多くの間葉系マーカーとともに、snail1、snail 2 などの EMT マーカ
ーをとらえた。これらの結果から HERS 細胞が歯根形成時に EMT を起こす可能性が示された。
このように多くの in vitro における研究で、HERS 細胞がセメント芽細胞に分化する可能性が示されている。また有細胞セメント質と無細胞セメント質は、異なる由来の細胞が異なるメカニズムによって形成している可能性が示唆されている。

12

歯根発生時における歯小嚢に対する HERS の関与は広く認められるところであるが、HERS 細胞が EMT を生じてセメント芽細胞に分化しているとする確証は未だにない。Luan
ら(2006)は、マウス臼歯の歯根面の観察において、HERS/ERM 細胞のマーカーとして
keratin14 を用いた。セメント質中に keratin14 陽性の上皮系細胞を多数認めたが、これらは HERS 細胞がセメント芽細胞に分化したのではなく、石灰化していくセメント基質に封じ込められて取り込まれた結果であるとした 9)。ERM の多くは、セメント質表面に近い位置に留まってはいるが、セメント質形成に強く関わってはいない 9)。彼らの研究
は根表面の上皮細胞はセメント質に結合している可能性があるという Lester(1969)の見解を裏付けるものであった。また比較発生学的な見地から HERS 細胞の機能について検証するために、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、齧歯類、ヒトなどの歯を免疫組
織化学的に調べた結果、HERS 細胞は歯根膜腔の制御と維持に大きく関わっていることが示唆された。
Hirata と Nakamura(2006)は マウス臼歯を用いて 、keratin-osteopontin の共局在または
keratin-bone sialoprotein の共局在を有細胞セメント質形成において認めなかったことを報告した。Yamamoto ら(2009)もラット臼歯部の組織切片を用いて免疫組織化学染色を行い、セメント芽細胞のうちに keratin-vimentin の共局在や、Runx2-keratin の共局在を認めなかったとし、上皮系細胞が間葉系細胞に分化したり、石灰化したりする所見はなかったとした。セメント質中の keratin 陽性細胞はセメント芽／セメント細胞ではなく、セ
メント質形成の過程でセメント質中に取り残された HERS 細胞と考えた。有細胞、無細胞のセメント質にかかわらず、HERS 細胞がセメント芽細胞に分化することはなく、従来の学説通り歯小嚢の細胞がセメント芽細胞に分化すると結論づけた。
以上のように in vivo 研究では、未だ明確な結論が出ていない。これは、研究手法の限界に由来する問題でもあるとわれわれは考える。なぜなら in vivo 研究の多くは、HERS
細胞の同定方法として、抗 keratin 抗体を用いるか、遺伝子改変マウスを用いて keratin
産生細胞を LacZ で見出す方法を採用しているからである。このためもし HERS 細胞の
EMT が進んで keratin 産生がなくなると、追跡不能となる危険性がある。従来の実験方法では、keratin 陽性の HERS 由来細胞は確認可能であるが、keratin 陰性となった細胞は確認できない可能性がある。
そこでわれわれは、HERS 細胞の由来を GFP マウスとし、これをワイルドタイプのマウスに移植して GFP の緑色蛍光を頼りに HERS 細胞の動態を追跡するという実験手法実験部位としては、生涯にわたり伸長し続ける下顎切歯を選んだ。
齧歯類上下顎切歯は独特な解剖学的構造をしている。エナメル質構造が唇側に形成され、舌側に歯根膜が形成される。切歯の最根尖側は、もともとは Labial cervical loopと呼ばれていたが、Harada らによって新たに apical bud と名付けられた特別な上皮系細胞集団がある 。apical bud には、爪や毛包と同様に多能性細胞と幹細胞 niche が存在することが証明されている。 apical bud はマウス臼歯やヒトの歯の発生段階におけ13

る cervical loop のアナログとみなされている。この組織を移植材料として利用することは上皮間葉相互作用と細胞の分化を研究するための理想的なモデルになると考えられた。
今後の研究では、移植の精度をさらに高めるために、移植片に酵素処理を行い、単離された apical bud のみを移植する予定である。我々はこの新たなアプローチで、HERS 細胞の歯根発生時の役割の詳細を追跡できることを期待している。
歯周組織再生療法においては、セメント質再生をともなう歯根膜再生が目指すべきゴールとなっている。セメント質は石灰化した歯周組織であり、歯根膜の主繊維の一端がSharpy 線維として入り込み、もう一端は歯槽骨に入り込んで歯を保持するのに役立つ。
セメント質の形成と恒常性の維持には、HERS と ERM の細胞が深く関わっているが、詳細については未だ不明である。HERS 細胞が EMT を生じてセメント芽細胞になるかどうかについても、さらなる検証が必要である。
近年、HERS 細胞による歯小嚢細胞の分化誘導は、Wnt 経路を介するという報告がなされている。歯小嚢細胞は HERS 細胞との共培養によって、bone sialoprotein や osteocalcinなどのセメント芽細胞への分化に関連したマーカーの発現が確認されている。HERS 細胞は canonical Wnt リガンドを発現している可能性もあり、この方面での研究が進んでいる 23）。本レビューでは HERS と ERM の細胞がセメント芽細胞に分化する可能性を示したが、歯周組織再生療法においてはそれ自身が分化することよりも、周囲の間葉系細胞を分化させる機能の方がより重要であるかもしれない。
HERS 細胞には、上皮系の幹細胞に関係する遺伝子や、Oct-4、Nanog、SSEA-4 などの胚性幹細胞マーカーを認めるとの報告もあり、将来的には HERS や ERM などの細胞をソースとした歯周組織再生療法へと発展する可能性がある。

動物実験は福岡歯科大学動物実験指針に基づき、「動物の愛護及び管理に関する法律の一部を改正する法律」を遵守した上で、動物実験委員会の承認に沿って行われています。

発表論文
1 * 丸尾直樹, 坂上竜資(2016) Hertwig 上皮鞘の細胞はセメント芽細胞に分化するか.
日本歯周病学会会誌, 58.2 : 58-64.
2 * Maruo N,Sakagami R, Yoshinaga Y, Okamura K, Sawa Y (2016) Development of an apical bud
differentiation model using transgenic mice expressing green fluorescent protein as donor, PLoS
14

ONE 11(3): e0150766. doi:10.1371/journal.pone.0150766.
3 * Hiromatsu R, Hatta M, Okamura K, Sakagami R, Yamazaki J (2015) NF-kB-regulatedtranscriptional control of CLCA in a differentiated mouse keratinocyte line, J Derm Sci,
Jun;78(3):189-96. doi: 10.1016/j.jdermsci.2015.03.007.

4 * Morotomi T, Kitamura C, Okinaga T, Nishihara T, Sakagami R, Anan H (2014) Fever-Range
Heat Stress Induces Thermotolerance in Odontoblast-leneage cells,

Archives of oral biology,

59: 741-748.
5 * Nishida E, Miyaji H, Takita H, Kanayama I, Tsuji M, Akasaka T, Sugaya T, Sakagami R,
Kawanami1 M (2014) Graphene oxide coating facilitates the bioactivity of scaffold material fortissue engineering, Jpn. J. Appl. Phys, 53 06JD04 doi:10.7567/JJAP.53.06JD04.
6 * Murakami H, Okamura K, Aoki S, Sakagami R, Yamazaki J. (2013) Association of caspase-14
and filaggrin expression with keratinization of the oral mucosa and reconstruction culture rat
models.. Journal of Periodontal Research, 査読有 doi: 10.1111/jre.12152.
7 * Mori, N., Ohno, J., Sakagami, R., Hayakawa, T., Fukushima, T. (2013) Cell viabilities andbiodegradation rates of DNA/protamine complexes with two different molecular weights of DNA.
J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 101: 743-751.
8 * Ohgi, K., Kajiya, H., Okamoto, F., Nagaoka, Y., Onitsuka, T., Nagai, A., Sakagami, R., Okabe, K.
(2013) A novel inhibitory mechanism of nitrogen-containing bisphosphonate on the activity of Clextrusion in osteoclasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 386: 589-598.
9 * Sano, S., Sakagami, R., Sekiguchi, M., Hidaka, M. (2013) Stabilization of MAPO1 by specificbinding with folliculin and AMP-activated protein kinase in O⁶-methylguanine-induced apoptosis.
Biochem Biophys Res Commun, 430:810-815.
10 * Lim TH, Fujikane R, Sano S, Sakagami R, Nakatsu Y, Tsuzuki T, Sekiguchi M, Hidaka
M.(2012) Activation of AMP-activated protein kinase by MAPO1 and FLCN induces apoptosis
triggered by alkylated base mismatch in DNA.. DNA Repair (Amst). 211: 259-266.

15

学会発表
1 吉永泰周, 金子高士, 坂上竜資. (2016) 重度歯肉退縮を伴う広汎型重度慢性歯周炎患者に対して根面被覆を施した 10 年経過症例. 第５９回春季日本歯周病学会 (鹿児島)
2 Ohgi K, Kajiya H, Okamoto F, Sakagami R, Okabe K. (2016) Effects of dyslipidemia on
osteoclastogenesis. 第５８回歯科基礎医学会 (札幌)
3 村上弘, 有田晴一, 岡村和彦, 八田光世, 吉永泰周, 山崎純, 坂上竜資. (2016) 口腔粘膜の角化における caspase 14 と filaggrin の役割. 第２３回日本歯科医学会 (福岡)
4 森南奈, 松本彩子, 鍛治屋浩, 大野純, 坂上竜資, 福島忠男. (2016) 異なる DNA の長さによる細胞毒性と生体分離性について. 第２３回日本歯科医学会 (福岡)
5 大城希美子, 鍛治屋浩, 岡本富士雄, 坂上竜資, 岡部幸司. (2016) 破骨細胞におけるTLR (Toll like receptor) を介した脂質異常症の影響. 第２３回日本歯科医学会 (福岡)
6 北村正博, 川浪雅光, 古市保志, 藤井健男, 國松和司, 坂上竜資, 濱地貴文, 原宣興,
野口和行, 横山聡, 村上伸也. (2015) FGF-2 歯周組織再生試験（プラセボ対照・第Ⅲ相検証的試験）-有効性評価-. 第５８回日本歯周病学会 (浜松)7 山田聡, 川浪雅光, 古市保志, 藤井健男, 國松和司, 坂上竜資, 大前政利, 所司慶太,
北村正博, 村上伸也. (2015) FGF-2 歯周組織再生試験（プラセボ対照・第Ⅲ相検証的試験）-安全性評価-. 第５８回日本歯周病学会 (浜松)8 村上弘, 有田晴一, 岡村和彦, 八田光世, 丸尾直樹, 坂上竜資, 山崎純 (2014) 口腔粘膜の角化におけるフィラグリンとカスパーゼ１４の役割. 第５６回歯科基礎医学会 (福岡)9 廣松亮, 八田光世, 坂上竜資, 山崎純. (2014) マウスケラチノサイトにおけるＣＬＣ
Ａ遺伝子の発現調節因子. 第５６回医科基礎医学会. (福岡)
10 丸尾直樹, 岡村和彦, 沢禎彦, 坂上竜資. (2014)マウス下顎切歯歯胚の幹細胞におけるＳｏｘ２およびＯｃｔ４の発現. 第５６回歯科基礎医学会 (福岡)
11 大城希美子, 永井淳, 森南奈, 村上弘, 佐野しおり, 坂上竜資. (2014) 脂質異常による
16

破骨細胞への影響. 第 57 回日本歯周病学会 (神戸)12 森南奈, 永井淳, 大城希美子, 鬼塚得也, 福島忠雄, 坂上竜資. (2014) 異なる分子量を用いた DNA/プロタミン複合体の基礎的性質. 第５７回日本生理学会 (岐阜)
13 村上弘, 岡村和彦, 坂上竜資, 青木茂久, 山崎純. (2014)ラット口腔粘膜再構築モデル
における緑茶成分の角化促進効果. 第８７回日本組織培養学会 (東京)
14 廣松亮, 八田光世, 山崎純, 坂上竜資. (2013) マウスケラチノサイト株における CLCAの NF-ｋB による転写制御. 第１４２回日本歯科保存学会 (北九州)
15 Mori N, Washino K, Iwata T, Yoshida T, Fukushima T, Sakagami R, Yamato M, Okano T. (2013)
Optimal conditions for creating rat periodontal ligament-derived multipotent mesenchymal
stromal cell (RPDL-MSC) sheets . 12thCELL TRANSPLANT SOCIETY (Milan Italy)
16 Ohgi K, Kajiya H, Okamoto F, Tsusumi T, Onitsuka T, Nagai A, Sakagami R, Okabe K (2012)
Bisphosphonate as a novel target to the Clcn7 Cl- transporter in osteoclasts. 第 89 回日本生理学会大会 (松本)
17 村上 弘, 岡村 和彦, 坂上 竜資, 山﨑 純 (2012) ラット口腔粘膜再構築系における重層化・角化上皮でのカスパーゼ 14 の発現. 第 85 回日本薬理学会年会 (京都)18 Murakami H, Okamura K, Sakagami R, Yamazaki J (2012) Expression of caspase-14 instratified and cornified epithelium in a rat oral mucosal reconstruction model. 第 85 回日本薬理学会年会 (京都)
19 丸尾直樹, 岡村和彦, 谷口邦久, 坂上竜資 (2012) マウス下顎切歯根尖部の多能性幹細胞における Sox2 の発現. 第 39 回福岡歯科大学学会 (福岡)20 廣松 亮, 八田光世, 坂上竜資, 山崎 純 (2012) 培養上皮細胞における Cl-チャネル調節因子の遺伝子発現解析. 第 54 回歯科基礎医学会学術大会 (郡山)
21 大城希美子, 岡部幸司, 鬼塚得也, 永井 淳, 坂上竜資 (2012) 窒素含有ビスフォスフォネート (NBPs) は破骨細胞 ClC7 型 Cl-輸送体 (Clcn7) の機能を抑制する．第 55 回日本歯周病学会春季学術大会 (札幌)17

22 村上 弘, 岡村和彦, 山崎 純, 坂上竜資 (2012) Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) による口腔粘膜の分化に対する影響． 第 55 回日本歯周病学会春季学術大会 (札幌)
23 佐野しおり, 坂上竜資, 関口睦夫, 日高真純 (2012) アポトーシス過程における
MAPO1 の安定化. 第 35 回日本分子生物学会年会 (福岡)24 Sakagami R, Nagai A, Kaneko N (2012) Surface roughness of curettes sharpened by diamonddressers. American academy of periodontology 98th annual meeting (Los Angels)
25 Nagai A, Sakagami R (2012) Phylogenetic mapping of chronic periodontitis–associatedmicrobiota to the human microbiome. American academy of periodontology 98th annual meeting(Los Angels)18

研 究 課 題

プロバイオティクスと口腔疾患

研 究 代 表者

廣藤卓雄（総合歯科学講座・総合歯科学分野・教授）

要約
乳酸菌には、免疫賦活化作用、コレステロール低減作用、抗菌作用など、生体防御機能を発揮する菌株が多く、近年これらを腸内環境だけでなく口腔環境の健全化に利用しようという動きが出ている。われわれは健常人ボランティアを対象としたランダム化比較試験
で、喫煙群においてプラーク付着と歯周ポケットの改善が報告された乳酸菌 Lactobacillus
salivarius WB21 (Ls WB21) 株に着目し、本菌の口臭抑制効果を調べたところ、多くの口臭患者が 2 週間の継続摂取で口臭の改善を示した (Iwamoto T et al. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod, 110:201-208, 2010)。この研究は非盲検試験であったため、本研究では Ls WB21 配合タブレットの口臭抑制効果を明らかにするために、口臭患者を利用した
二重盲検ランダム化クロスオーバー試験を実施した (文献 9)。その結果、Ls WB21 期ではプラセボ期に比較して揮発性硫黄化合物 (volatile sulfur compounds, VSCs) と歯周ポケットが有意に改善した。群内比較では Ls WB21 期にはプロービング時出血率 (bleeding on
probing, BOP) が有意に減少したが、プラセボ期には変化がみられなかった。このように
Ls WB21 タブレットには口臭と歯周組織の改善効果があることが明らかになった。
また、タブレットで誤嚥の危険性がある障害者や高齢者への応用を想定し、Ls WB21 配合オイルを開発し、その効果を臨床的に検討した (文献 19)。歯周病患者を対象としたプラ
セボ対照二重盲検比較試験を行ったところ、Ls WB21 配合オイル群ではプラセボオイル群に比較して、4 週間の介入期間における BOP の改善率が有意に優れていた。
乳酸菌は酸を産生し、う蝕病巣より分離されることから、う蝕への関連性が示唆されている。そこで 2 種類の乳酸菌配合タブレット (Ls WB21 配合タブレットおよび Ls TI2711 配
合タブレット) の摂取直後のう蝕リスク因子の変化を調べたところ、いずれもう蝕リスク因子を増加させることはなく、LS WB21 タブレットではミュータンス菌数の減少が、Ls
TI2711 タブレットでは刺激唾液量と唾液緩衝能の増加がみられ、う蝕リスク因子に対して抵抗性を示す傾向があった。
乳酸菌でない様々な口臭抑制剤についても、口臭や口腔内環境に与える影響を調べる必要がある。本研究では、ヒノキチオール配合口腔ケア用ジェル、塩化セチルピリジニウム(抗菌成分)・グリチルリチン酸二カリウム (組織修復成分)・キキョウエキス (唾液分泌促進成分) の 3 種の有効成分を配合したトローチ、亜鉛イオンについて、口臭や口腔内環境、口腔内細菌叢に与える影響を調べ、研究成果を報告した (文献 8, 12)。

1

さらに、乳酸菌 Enterococcus faecium (Ef) WB2000 株に関しては、齲蝕原因菌であるミュータンスレンサ球菌に対して、増殖抑制作用及び付着抑制作用があることを報告した(Int. J. Dent, 2011:2011:834151)ことから、歯周病原細菌であり口臭成分を産生する

Porphyromonas gingivalis (Pg) に対する Ef WB2000 株の影響を調べたところ、Pg の増殖
及び VSC 産生に対する Ef WB2000 株の抑制作用が認められた(文献 2)。
また、人種間、環境の違いやを検討するために、Ls WB21 配合タブレットが口臭およびインド人の口腔環境に与える影響について調査したところ、インドにおいても Ls WB21 配
合タブレットの口臭および口腔環境の改善効果が示唆された。
また、歯科のない地域密着型急性期病院への訪問歯科介入の実態調査によると、歯科介入による口腔機能の維持管理が高齢入院患者の全身状態の維持へ重要性な役割を果たしていることが示唆された(文献 5)。
研究目的
近年、数多くの介護老人保健施設や福祉施設が開設され多くの要介護高齢者・障害者が入所している。この領域において、口腔内の歯牙や歯周組織の病的悪化が、口臭、味覚障
害、口腔機能や嚥下機能の低下を招き、誤嚥性肺炎や低栄養、認知症の進行につながるとされ、口腔ケアを含めた歯科治療の重要性が強く示唆されている。特に、口臭は要介護高齢者・障害者の口腔内環境の状態を示す指標として着目されている。本研究の目的は、口腔内にプロバイオティクスの概念を取り入れ、要介護高齢者・障害者に、口腔ケアと併用
して安全性も確認されている有用性の高い乳酸菌の有効的な投与方法を確立し、乳酸菌を
口腔内細菌叢と共存させることにより口腔内細菌叢を変化させ、歯周疾患などを含めた口腔内の健康状況を改善させるとともに、そのことによる全身的健康の改善を図るものである。
まず、すでに口臭患者を対象とした非盲検試験において口臭への有効性を報告した乳酸菌 Lactobacillus salivarius WB21 株を用いて、従来のタブレットタイプから舐めることが不可能な患者への利用を考慮したオイルタイプを開発し、歯周病患者に対し、プラセボを対照とした二重盲検ランダム化比較試験を実施した。タブレットについては前回の研究が非盲検試験であったため、口臭患者に対し、プラセボを対照とした二重盲検クロスオーバー比較試験を実施し、口臭への有効性を確認した。元来乳酸菌は進行したう蝕病巣より分離されることが知られており、酸を産生することから、利用する乳酸菌がう蝕に与える影響を確認しておく必要がある。そのため、乳酸菌配合タブレットの摂取前後におけるう蝕リ
スク因子の変化を調べた。また、乳酸菌以外の口臭抑制剤についても、効果の程度や口腔内環境に及ぼす影響について十分に検討されたものは少ない。本研究では、ヒノキチオー
ル配合口腔ケア用ジェル、塩化セチルピリジニウム・グリチルリチン酸二カリウム・キキ

2ョウエキスの 3 種の有効成分を配合したトローチ、塩化亜鉛水溶液について、口臭や口腔内環境、口腔内細菌叢に与える影響を調べた。また、乳酸菌 Enterococcus faecium (Ef)
WB2000 株には、齲蝕原因菌であるミュータンスレンサ球菌に対して、増殖抑制作用及び付着抑制作用があることを報告した (Int J Dent, 2011:2011:834151)ことから、歯周病原細菌であり口臭成分を産生する Porphyromonas gingivalis (Pg) に対する Ef WB2000 株の影響を調べた。さらに、これまでに口臭患者を対象としたクロスオーバー比較試験を実施し、Lactobacillus salivarius WB21 株 (Ls WB21) 配合タブレットの継続摂取が口臭や歯周組織を改善することを報告した (OOOO 2014;117:462–70)。人種や社会習慣により免疫機能や細菌叢は変化するため、乳酸菌摂取の効果にも違いが生じる可能性がある。本研究では、インドの JSS Dental College & Hospital (Mysuru) にて open-label 試験を実施し、Ls WB21
配合タブレットの摂取が口臭および口腔環境に与える影響を調べた。
また、高齢者が多く入院する歯科のない地域密着型急性期病院への訪問歯科介入の実態調査を行い口腔管理の重要性を調査した。
方法①Ls WB21 配合オイルの開発と口腔内環境に与える影響の検討
Ls WB21 配合オイルの作製は、わかもと製薬株式会社に依頼した。一般開業歯科医院の初診患者 42 名に対して、プラセボを対照とした二重盲検ランダム化比較試験を実施した。
一日 3 回毎食後、舌背中央部にオイルを 5 滴滴下し、舌を使ってオイルを口腔内にまんべ
んなく行き渡るように指示した (4 × 108 CFU/day)。オイルの摂取は 2 週間継続し、実験開始前と開始 2 週間後に口腔内診査と唾液採取を行った。実験期間中には口腔清掃習慣を変えないように指示した。また実験期間中は抗菌薬服用と歯科治療を禁止した。歯式、歯周ポケット、BOP、刺激唾液量、pH、唾液中の細菌数を調べた。さらに唾液サンプルについて T-RFLP 法を用いて菌叢解析を行った。
②Ls WB21 配合タブレットの口臭抑制効果
口臭を主訴として福岡歯科大学医科歯科総合病院口臭クリニック科を受診した真性口臭症患者 26 名に対して、ランダム化二重盲検プラセボ対照クロスオーバー試験を行った。被験者を 2 群 (A 群および B 群) に無作為に割り付けし、第 1 期として A 群には Ls WB21 配
合タブレット (2 × 109 CFU/day) を B 群にはプラセボを連続して 2 週間 1 日 3 粒摂取した。
その後 2 週間の休薬期間を経て、第 2 期として、A 群にはプラセボを、B 群には Ls WB21
配合タブレットを 2 週間摂取した。両摂取期間の前後に、口臭検査と口腔内診査を実施した。検査当日は、起床時より飲食、歯面清掃、喫煙などの口腔活動を禁止した。

3

③Ls WB21 配合タブレットのう蝕リスクに対する影響
福岡歯科大学 6 年生 64 名を対象とした非盲検ランダム化比較試験を実施した。被験者をくじ引きにより無作為に 4 群にわけ、Ls WB21 配合タブレット、Ls TI2711 配合タブレット、
比較対象品として Streptococcus mutans に対する抗体を配合したオーバルゲン DC 配合タブ
レット、キシリトール配合タブレットのいずれかを割り当てた (表 1)。タブレットは噛まずに舐めるよう指示し、摂取前と摂取 10 分後のミュータンス菌数、乳酸菌数、刺激唾液量、唾液 pH、唾液緩衝能の変化を評価した。

④ヒノキチオール配合ジェルによる口腔清掃が口臭に与える影響
福岡歯科大学医科歯科総合病院口臭クリニック科を受診した真性口臭症患者 18 名に対して、ランダム化比較試験を行った。被験者は無作為にヒノキチオール配合ジェル群 (実験群、9 名) とヒノキチオール無配合ジェル群 (対照群、9 名) に割り当てられた。口腔清掃は 1 日 3 回 (毎食後)、以下の通りに行うよう指示した。1) 歯ブラシにジェルを 1 cm 取る、2) 歯と歯肉の清掃を 3 分間行う、3) 舌ブラシで 5 回舌清掃を行う、4) 歯磨き終了後
ゆすいだ後に、再度ジェルを 2cm 指に取り、口腔内全体にマッサージしながら広げ、清掃
後 30 分は飲食をしない。使用開始前 (ベースライン) と 4 週後に、口臭検査と口腔内診査を実施した。

⑤3 種の有効成分を配合した口腔咽喉薬の口臭抑制効果
福岡歯科大学 6 年生 82 名を対象とした非盲検ランダム化比較試験を実施した。被験者はくじ引きでランダムに 4 群にわけられ、1 錠あたり塩化セチルピリジニウム (CPC) 1 mg、グリチルリチン酸二カリウム 2.5 mg、キキョウエキス 20 mg (原生薬換算量: 80 mg) の 3 種の有効成分を配合した口腔咽喉薬 (ローズウインド)、CPC 1 mg のみを配合した口腔咽喉薬(プロテクトドロップ)、有効成分を配合しない清涼菓子 (フリスク)、水による洗口のいず
れかが割り当てられた(表 2)。摂取あるいは洗口前後に、口臭、舌保湿度、刺激唾液量、唾
液 pH、唾液緩衝能の変化を調べた。口臭の少ない被験者が多いため、口臭測定前に 1 mM
メチオニン水溶液で洗口し、誘発した VSCs 濃度が 80 ppb 以上の場合を解析対象とした。

4

⑥ヒト口腔内細菌叢に対する亜鉛イオンの影響
まず福岡歯科大学歯学部学生 21 名を対象に、短期介入実験を行った。市販水で 3 日間洗口、続いて 3 日間のウォッシュアウト期間を挟んで、0.1%塩化亜鉛溶液で 3 日間洗口を行った。洗口は一日 3 回、5 mL 液で 1 分間実施した。洗口開始前日と 3 日目の終業後、3 日
目は昼食後の洗口から 5 時間後に、刺激唾液を採取した。唾液サンプルから抽出した細菌
DNA を抽出し 16S rRNA 遺伝子を利用した高速シーケンス解析法によって細菌構成の決定を行った。分析では検出率 0.3%未満の菌種を解析対象外とした。
次に、福岡医療短期大学学生 20 名を対象として、長期介入実験を実施した。被験者は、0.3%塩化亜鉛溶液 5 mL で一日 3 回、4 週間洗口を行った。洗口開始前と 4 週間後の終業後に、飲食および洗口から 4 時間以上経過した条件で刺激唾液を採取した。唾液より抽出した細菌 DNA から、16S rRNA 遺伝子を PCR によって増幅し、高速シーケンス解析法によって 1150 万リード数 (約 2.8 億塩基) の配列が得られた。OTU 解析後、口腔内細菌 16S rRNA
塩基配列データベースを用いて相同性検索を行い、菌叢解析を行った。
⑦Pg の増殖及び揮発性硫黄化合物(VSC)産生に対する Ef WB2000 株の抑制作用
Pg ATCC 33277 株の増殖に対する乳酸菌の影響を調べた。供試菌株は、Ef WB2000 株、Streptococcus salivarius (Ss) JCM 5707 株、Lactobacillus salivarius (Ls) CIP 103140
株、L. reuteri (Lr) JCM 1112 株である。Pg ATCC 33277 株 (1×107 colony forming unit
(CFU)/mL) と乳酸菌 (1×106 CFU/mL) とを混合後、嫌気培養し、6 時間後、12 時間後、24時間後に生菌数を測定した。また、Pg の VSC 産生に対する作用に関しては、Pg 5 株 (ATCC33277 株、W50 株、W83 株、臨床分離株 2 株) の VSC 産生に対する Ef WB2000 株の影響を調べた。Pg (1×107 CFU/mL) と Ef WB2000 株 (1×106 CFU/mL) とを混合後、嫌気培養し、24時間後、48 時間後に生菌数及び培養液の硫化水素濃度とメチルメルカプタン濃度をガスク
ロマトグラフ (Model GC2014, 島津製作所) を用いて測定した。

5

⑧Ls WB21 配合タブレットが口臭およびインド人の口腔環境に与える影響
インドの真性口臭患者 24 名 (生理的口臭 12 名、歯周病口臭 12 名) を対象とし、Ls WB21
配合タブレットを一日 3 回食後に舐めるように指示した。0、2、4 週目に口臭 (官能検査)と口腔内診査を行った。本研究は JSS Dental College & Hospital の倫理審査委員会の承認を得て実施した。
⑨歯科のない地域密着型急性期病院への訪問歯科介入の実態調査

2014 年 5 月から 2015 年 3 月までの 11 ヶ月間に近隣急性期病院にて訪問歯科診療を行った 28 歳から 101 歳までの男女 79 名（男 29 名、女 50 名、平均年齢 81.4±11.9歳）を対象とした。対象患者において，障害老人の日常生活自立度，入院にかかる
主病名や既往歴，歯科処置の種類，訪問回数，転帰，重度肺炎により死亡した患者の歯科介入の有無と在院日数との関係について後方視的調査を行った。調査にあたり，患者氏名，ID，生年月日等の個人情報は事前に削除し，個人を特定できないよ
うに処理した。患者もしくは患者家族への説明および同意のもと行った。
結果と考察①Ls WB21 配合オイルの開発と口腔内環境に与える影響の検討
Ls WB21 群は 20 名、プラセボ群は 22 名であった。年齢、性別、実験開始前の臨床および細菌パラメータの群間比較において、統計学的有意な差はみられなかった。実験開始前と2 週間後の臨床パラメータの変化について解析したところ、両群とも BOP の減少と刺激唾
液量の増加が有意に認められた。続いて BOP の変化について群間比較を行ったところ、Ls
WB21 群はプラセボ群に比較して BOP が有意に減少しており、本菌の炎症改善能力を確認することができた (図 1)。唾液中の菌数解析では、全菌数が WB21 群で有意に減少した。
また有意差はないが、Ls WB21 群では歯周病細菌 Prevotella intermedia, T. forsythensis,
Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum の菌数が減少した。これに対してプラセボ群では歯周病細菌の減少はみられず、P. intermedia においては有意に増加した。L. salivarius 菌
数は Ls WB21 群で有意に増加したが他の口腔内細菌に対して菌数は少なく、過剰増殖は認められなかった。T-RFLP 解析による菌叢解析では、Ls WB21 投与によって特徴的に増減す
る菌種は認められなかった。

6

図 1. BOP の減少率. * P < 0.05.

②Ls WB21 配合タブレットの口臭抑制効果
実験期間中に脱落した者 1 名と抗菌薬を服用した者 2 名を分析対象外とし、23 名 (男性 4名、女性 19 名、平均年齢 44.3±11.6 歳) について比較分析を行った。両群ともに Ls WB21
配合タブレット摂取期間はプラセボ摂取期間と比較して、VSCs と歯周ポケット平均値に有意な減少を認めた (図 2, 表 3)。

図 2. VSCs の変化

VSCs を 3 成分に分類し Ls WB21 摂取期間とプラセボ摂取期間を比較した結果、Ls WB21
摂取期間のほうが硫化水素濃度とメチルメルカプタン濃度において有意な減少が観察された。硫化水素とメチルメルカプタンは口腔由来の主要な口臭成分であり Ls WB21 が口腔由来の口臭に対して抑制作用を示すことが示唆された。歯周ポケットを 4 ミリ以上、5 ミリ
以上、6 ミリ以上の部位数にわけて Ls WB21 摂取期間とプラセボ摂取期間を比較した結果、

7

Ls WB21 摂取期間では 6 ミリ以上のポケット数において有意な減少、5 ミリ以上のポケッ
ト数においても減少傾向を示した。官能検査、BOP、舌苔付着量、唾液流出量においては両期間ともに改善し、両者間に統計学的な違いがみられなかった。乳酸菌 Ls WB21 配合タ
ブレットの摂取は、VSC レベルの減少、特に口腔由来の口臭として重要な硫化水素とメチ
ルメルカプタンの減少、5 ミリ以上の歯周ポケットの減少をもたらし、口臭予防や口臭治療の一助となる可能性が示唆された。

③Ls WB21 配合タブレットのう蝕リスクに対する影響
Ls WB21 配合タブレット群、Ls TI2711 配合タブレット群、オーバルゲン DC タブレット
群では、いずれもキシリトールタブレット群に比較してミュータンスレベルを抑える傾向がみられた (図 3)。Ls WB21 配合タブレット群とキシリトールタブレット群の間に統計学的有意差が認められた。乳酸菌レベルについては、Ls WB21 配合タブレット群および Ls
TI2711 配合タブレット群では、顕著に唾液中の乳酸菌数が増加し、オーバルゲン DC タブ
レット群、キシリトールタブレット群との間に統計学的有意差がみられた。これらのタブ
レット摂取では生きた乳酸菌が作用していることが確認された。刺激唾液量については、
Ls TI2711 配合タブレットで増加し、キシリトールタブレットとの間に統計学的有意差がみられた。タブレットを舐めることにより唾液量が増加すると予想していたが、Ls WB21 配
合タブレットとオーバルゲン DC タブレットでは唾液増加はみられなかった。唾液 pH につ
いては、いずれの群もタブレット摂取後に唾液 pH の増加がみられ、群間で統計学的有意差はみられなかった。唾液緩衝能については、キシリトールタブレット群で唾液緩衝能の減少がみられた。これに対し Ls TI2711 タブレット群とオーバルゲン DC タブレット群では増加傾向がみられ、キシリトールタブレット群との間に統計学的有意差を認めた。
Ls WB21 配合タブレットでは摂取後にミュータンスレベルの減少が、Ls TI2711 配合タブ
レットでは刺激唾液量と唾液緩衝能の増加がみられ、これらのタブレット摂取はう蝕リス
クに対して抵抗性を示すことがわかった。

8

図 3. ミュータンスレベルの変化. P < 0.05.

④ヒノキチオール配合ジェルによる口腔清掃が口臭に与える影響
ベースライン解析において、実験群と対照群の間に口臭レベルと口腔内状態の統計学的違いはみられなかった。ベースラインと 4 週後の結果を比較したところ、口臭検査においては、実験群で官能検査スコア、硫化水素濃度、メチルメルカプタン濃度に有意な改善が、対照群で官能検査スコアに有意な改善が認められた (図 4)。特に実験群では 2 名が、官能検査スコアで「口臭なし」と判定するスコア 1 以下に改善した。口腔内診査においては、実験群で平均歯周ポケット、BOP の割合、プラーク付着指数の有意な減少がみられた。一方、対照群では BOP の割合に若干の改善があったものの、統計学的有意差はみられなかった。舌苔スコアと舌表面の保湿度については、両群ともに変化しなかった。ヒノキチオー
ル配合口腔ケア用ジェルによる口腔清掃は、歯周組織の状態を改善することによって口臭の改善に寄与すると考えられる。

9

図 4. 官能検査スコア (上) と硫化水素 (左) とメチルメルカプタン (右) の変化⑤3 種の有効成分を配合した口腔咽喉薬の口臭抑制効果
口臭測定値はすべての群で減少した。ローズウインド群、プロテクトドロップ群、フリ
スク群では摂取前後に統計学的有意差がみられ、いずれも水よりも優れた口臭抑制効果があることがわかった (図 5)。ローズウインド群とプロテクトドロップ群においては、通常口臭がないとみなす 100 ppb 以下に改善し、CPC による抗菌作用が考えられる。

図 5. VSCs レベルの変化. P < 0.05.

舌保湿度はローズウインド群で増加傾向を示した。キキョウエキスには止渇作用があると言われる。口腔乾燥は口臭の一因であると考えられており、ローズウインドでは保湿向上による口臭抑制効果の持続性が期待される。またローズウインドでは唾液 pH に、プロ
テクトドロップでは唾液緩衝能に、それぞれ摂取後に有意な増加がみられ、これらは唾液
機能を正常化し、口腔内環境の健全化に働くことが示唆された。

⑥ヒト口腔内細菌叢に対する亜鉛イオンの影響
短期介入実験において、3 日間の塩化亜鉛溶液による洗口前後の菌の変動を調べたとこ
ろ、18 菌種が増加、
18 菌種が減少した。顕著に増加した菌種は Actinomyces 属や Streptococcus

10属などの口腔常在菌であった。Porphyromonas 属や Fusobacterium 属などの VSC 産生菌は統計学的に有意に減少し、塩化亜鉛洗口が口臭のコントロールに有用であることが示された。
また P. gingivalis との凝集関係が知られる S. gordonii も有意に減少した。亜鉛イオンは P.
gingivalis のタンパクと結合することによって P. gingivalis と S. gordonii の共凝集を阻害するという研究報告があり、亜鉛イオンが菌叢変動に間接的にも作用している可能性が示唆された。
2 ヶ月の長期介入では、Terrahaemophilus aromaticivorans、Porphyromonas 属細菌、Fusobacterium nucleatum、Corynebacterium durum などが減少し、口臭の原因菌として報告されている菌種が複数含まれていた。一方、Rothia 属、Actinomyces 属などに増加する菌種が見られた。しかし、全体として細菌叢構成種における大きな変動は見られず、亜鉛イオンの影響を受ける種は一部に限られることが判った。口臭の原因菌として知られているもの
が複数減少することが明らかになり、亜鉛イオンは揮発性硫化物と結合するだけでなく、口臭原因菌の生育を抑えることでも口臭を抑制する効果をもたらさすことが示唆された。

⑦Pg の増殖及び VSC 産生に対する Ef WB2000 株の抑制作用
図 6 に示すように、Ef WB2000 株は Pg ATCC 33277 株との混合培養により、培養 6 時間
後において、Pg ATCC 33277 株の生菌数を 1×103 CFU/mL 以下まで減少させた。一方、他の乳酸菌 (Ss JCM 5707 株、Ls CIP 103140 株、Lr JCM 1112 株) は、培養 6 時間後におけるPg の生菌数はほとんど減少させず、培養 12 時間後に 1×103 CFU/mL 以下まで減少させた。
乳酸菌の生菌数を調べたところ、Ef WB2000 株は他の 3 株よりも増殖が早いことがわかった。Ef WB2000 株は Pg と混合培養することによって、24 時間後にはいずれの Pg 株についても生菌数を 1×103 CFU/mL 以下まで減少させた(図 6)。
ガスクロマトグラフを用いた培養液の VSC 濃度分析では、いずれの Pg 株についても培養
48 時間におけるメチルメルカプタン濃度の顕著な抑制が認められた(図 7)。Ef WB2000 株は他の 3 種の乳酸菌株に比べて増殖が早かったことから、Pg の増殖をより早く抑制したと考えられる。メカニズムとしては、乳酸菌が Pg の増殖に必要な栄養素を奪ったことや、乳酸菌が産生する有機酸によって培地 pH 値の低下が起こったことが予想される。また Pg の増殖が抑制された結果、メチルメルカプタンの産生が抑制された。Ef WB2000 株は、歯周病や口臭の予防に役立つと考えられる。

11

図 6. P. gingivalis の生育に対する E. faecium WB2000 株の影響.

図 7. 培養 48 時間後のメチルメルカプタン濃度.

⑧Ls WB21 配合タブレットが口臭およびインド人の口腔環境に与える影響
3 名の脱落者を除く生理的口臭 10 名、歯周病口臭 11 名について結果を分析した。どちらの群においても、検査を重ねる度に、官能検査スコア、プラーク付着指数、平均歯周ポ
ケット、プロービング時出血の割合、舌苔付着スコアは減少し、刺激唾液量は増加した(図 8)。インドにおいても Ls WB21 配合タブレットの口臭および口腔環境の改善効果が示唆された。

図 8. 乳酸菌 WB2000 タブレット摂取による口臭および口腔環境の変化. 上段: 生理的口臭, 下段: 歯周病口臭.

12

⑨歯科のない地域密着型急性期病院への訪問歯科介入の実態調査

この急性期病院で歯科介入を依頼された患者は 79 人で， 65 歳以上の高齢者が75 人と 95.0%を占め，そのうち寝たきりの患者は 89.4%とほとんどであった。入院に至る主病名は肺炎が最も多く，心不全，骨折と続いた。歯科処置内容は専門的口腔ケアが最も多く，義歯関連処置（調整・修理・新製），歯牙固定・鋭縁削合と続いた。さらに，介入患者の転帰としては，他院や介護保険施設への転院が最も多く，死亡，自宅への退院と続いた。死亡原因は重度肺炎によるものが最も多く，そのう
ち歯科介入のあった患者は歯科介入のない患者に比べて，在院日数（生存日数）が有意に延長していることが判明した。以上の結果より，歯科介入による口腔機能の維持管理が高齢入院患者の全身状態の維持へ重要性な役割を果たしていることが示唆された。

発表論文

1. ＊Ishii A, Yoneda M, Suzuki N, Haraga M, Yamada K, Morita H, Hirahashi K, Koga C, Inoue
Y and Hirofuji TConsciousness and Knowledge of Nursing Home Workers about Oral Malodor.

Journal of Oral Hygiene & Health in press
2. ＊Nao Suzuki, Takuya Higuchi, Masato Nakajima, Akie Fujimoto, Hiromitsu Morita, Masahiro
Yoneda, Takashi Hanioka, and Takao Hirofuji（2016） Inhibitory Effect of Enterococcus faecium
WB2000 on Volatile Sulfur Compound Production by Porphyromonas gingivalis.
International Journal of Dentistry;2016:8241681
3. ＊Suzuki N, Fujimoto A, Yoneda M, Watanabe T, Hirofuji T, Hanioka T. （2016） Resting
salivary flow independently associated with oral malodor.

BMC Oral Health. 2016 Jul

19;17(1):23. doi: 10.1186/s12903-016-0255-3
4. ＊M. Yoneda, M.a Yamada, N. Suzuki, R. Uemura, A. Fujimoto, H.Fukuchi, H. Morita, K.
Yamada, T. Matsuo, A. Ishii, C. Koga, T. Hirofuji. （2015）

Halitosis patients at a newly

established satellite dental hospital: Analysis of patients and the role of dental hygienists.
International Journal of Clinical Preventive Dentistry. 11 (1), 7-14
5. ＊森田浩光，山口真広，藤本暁江，縄田和歌子，湯川成美，牧野路子，加藤智崇，瀧内博也，米田雅裕，内藤徹，廣藤卓雄（2015） 歯科診療部門を持たない地域密着型急性期
病院への訪問歯科介入の活動報告. 老年歯科医学30（3）337-342

6. ＊Chihiro Koga, Masahiro Yoneda, Keisuke Nakayama, Satoru Yokoue, Mariko Haraga,
Tomoko Oie, Arisa Suga, Fumiko Okada, Hiroshi Matsuura, Fumitake Tsue, Nao Suzuki and13

Takao Hirofuji. （2014）The detection of Candida species in patients with halitosis.
International Journal of Dentistry. 2014 :857647, doi: 10.1155/2014/857647
7. ＊ Tetsuyo Nishihara, Nao Suzuki, Masahiro Yoneda and Takao Hirofuji. （2014）
Effects of Lactobacillus salivarius-containing tablets on caries risk factors: a randomized open-label
clinical trial.

BMC Oral Health 2;14:110. doi: 10.1186/1472-6831-14-110

8. ＊仲西宏介、鈴木奈央、米田雅裕、山田潤一、廣藤卓雄（2014）臭除去を効能とする口腔咽喉薬 (トローチ剤) の臨床的評価、日本歯科保存学雑誌、

57 (4): 293-300,

9. ＊Suzuki N, Yoneda M, Tanabe K, Fujimoto A, Iha K, Seno K, Yamada K, Iwamoto T, Masuo Y,
Hirofuji T. （2014） Lactobacillus salivarius WB21-containing tablets for the treatment of oralmalodor: a double blind, randomized, placebo-controlled crossover trial.
Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology 117(4):462-470.
10. ＊Suzuki N, Yoneda M, Haruna K, Masuo Y, Nishihara T, Nakanishi K, Yamada K, Fujimoto A,
Hirofuji T. （2014） Effects of S-PRG eluate on oral biofilm and oral malodor.
Archives of Oral Biology, 59(4):407-413.
11. ＊Nakano Y, Takeshita T, Kamio N, Shiota S, Shibata Y, Suzuki N, Yoneda M, Hirofuji T,
Yamashita Y. S（2014）upervised machine learning-based prediction of oral malodor based on the
microbiota in saliva samples.

Artificial Intelligence in Medicine 60(2014):97-101.

12. ＊Iha K, Suzuki N, Yoneda M, Takeshita T, Hirofuji T.（2013） Effect of mouth cleaning withhinokitiol-containing gel on oral malodor: a randomized, open-label pilot study.
Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology 116(4):433-439,
doi:pii:S2212-4403(13)00276-9.10.1016/j.oooo.2013.05.021.
13. ＊石井綾子、米田雅裕、鈴木奈央、廣藤卓雄、井上勇介、福岡医療短期大学歯科衛生学科臨床実習生の医療安全についての意識調査、日本歯科医学教育学会雑誌、29(2)122-127..
14. ＊米田雅裕、畑野優子、鈴木奈央、内藤 徹、廣藤卓雄（2013）学生によるシナリオ作成を導入した医療面接実習、研究報告、日本歯科医学教育学会雑誌、29 巻第 1 号, 32-38 .
15. ＊Yoneda M, Kashio N, Uchida H, Suzuki N, Matsuura H, Naito T, Koga C, Yasukochi H,
Matsuura M, Hirofuji T. Awareness among dental hygienists with regard to treatment options forhalitosis. International Journal of Clinical Preventive Dentistry ,2012, 8(3):173-179.
16. ＊米田雅裕、古賀千尋、鈴木奈央、高向和宣、内藤 徹、豊村研吾、金光芳郎、
廣藤卓雄（2012）口臭恐怖のため精神科病院での入院加療を要した症例、

日本歯科心身医学会雑誌、27(1, 2) 31-36.
17. ＊畑野優子、鈴木奈央、米田雅裕、廣藤卓雄（2012）乳酸菌配合歯磨剤 (アバンビーズ)の口腔衛生改善効果についての臨床研究、日本歯科保存学雑誌

1455(3):219-226.

18. ＊Yoneda M, Suzuki N, Masuo Y, Fujimoto A, Iha K, Yamada K, Iwamoto T, Hirofuji T.
（2012） Effect of S-PRG eluate on biofilm formation and enzyme activity of oral bacteria.
International Journal of Dentistry, 2012, ID814913, 6 pages, doi:10.1155/2012/814913.
19. ＊Suzuki N, Tanabe K, Takeshita T, Yoneda M, Iwamoto T, Oshiro S, Yamashita Y, Hirofuji T.
（2012）＊Effects of oil drops containing Lactobacillus salivarius WB21 on periodontal health andoral microbiota producing volatile sulfur compounds. Journal of Breath Reseach, Mar;6(1):017106.
Doi:10.1088/1752-7155/6/1/017106.
20. ＊Takeshita T, Suzuki N, Nakano Y, Yasui M, Yoneda M, Shimazaki Y, Hirofuji T, Yamashita Y.
（2012）Discrimination of the oral microbiota associated with high hydrogen sulfide and methyl
mercaptan production.

Scientific Reports, 2:215, 2012. DOI: 10.1038/srep00215.

21＊Masuo Y, Suzuki N, Yoneda M, Naito T, Hirofuji T. （2012）Salivary -galactosidase activity
affects physiological oral malodor.

Archives of Oral Biology, Jan 57(1):87-93..

22.Yoneda M, Suzuki N, Mocedo SM, Fujimoto A, Iha K, Koga C, Matsuura M, Hirofuji T.
（2012）The variable etiology of oral pathologic halitosis: a case series.
Smile Dental Journal 7 (3) 50-56.

総説
23. ＊Suzuki N, Yoneda M, Hirofuji T. (2013) Mixed red-complex bacterial infection inperiodontitis. Int. J. Dent. Volume 2013, Article ID 587279, doi: 10.1155/2013/587279, 6
pages,

著書
24. N. Suzuki, M. Yoneda, T. Hirofuji.（2015）. “Evidence based control of oral malodor” in thebook “Emerging Trends in Oral Health Sciences and Dentistry”

InTech (Croatia); ISBN

978-953-51-4168-6,http://dx.doi.org/10.5772/59229, pp801-pp816

25. Suzuki N, Yoneda M, Hirofuji T.（ 2012）Relationship between oral malodor and oral
microbiota. Oral Health Care-Prosthodontics, Periodontology, Biology, Research and Systemic
Conditions.

InTech, (ISBN 978-953-51-0040-9), pp121-130

学会発表
1.永原加那絵, 藤本暁江, 谷口奈央, 桝尾陽介, 山田和彦, 森田浩光, 米田雅裕, 廣藤卓雄.
（2016）洗口剤の薬用成分が口臭におよぼす影響について. 第 9 回日本総合歯科学会総会・15

学術大会, 11.19-20. (岡山市)
2.谷口奈央, 別府理智子, 廣藤卓雄, 米田雅裕, 埴岡隆, 篠原徹雄. （2016） Helicobacter
pylori 除菌治療に伴う口臭と口腔内環境の変化. 第 23 回日本歯科医学会総会, 10.21-23. (福岡市)
3.藤本暁江, 谷口奈央, 米田雅裕, 森田浩光, 渡辺猛, 埴岡隆, 廣藤卓雄. （2016）口臭における唾液分泌量と口腔粘膜水分量の関連性について.
第 23 回日本歯科医学会総会, 10.21-23. (福岡市)
4.藤本暁江, 谷口奈央, 米田雅裕, 森田浩光, 埴岡隆, 廣藤卓雄. （2016）口腔の乾燥状態が口臭におよぼす影響について. 第 7 回日本口臭学会学術大会, 6/18-19. (名古屋)
5.森田浩光, 牧野路子, 桝尾陽介, 谷口奈央, 米田雅裕, 内藤徹, 廣藤卓雄. （2016）歯科診
療部門のない地域密着型急性期病院への院外訪問実習の試み. 第 35 回第 35 回日本歯科医学教育学会総会および学術大会, 7/1-2. (大阪)
6.樋口拓哉, 谷口奈央, 藤本暁江, 米田雅裕, 埴岡隆, 廣藤卓雄. （2016）Porphyromonas
gingivalis の増殖及び揮発性硫黄化合物産生に対する Enterococcus faecium WB200 株の抑制作用. 第 144 回日本歯科保存学会 2016 年度春季学術大会, 6/9-10. (栃木県)
7.井上絵梨, 米田雅裕, 瀬野文, 萩尾佳那子, 瀬野恵衣, 藤本暁江, 玉川俊行, 谷口奈央, 山
田和彦, 森田浩光, 廣藤卓雄. （2015）歯科衛生士臨床実習生の口臭に関する知識および意識について. 第８回日本総合歯科学会総会・学術大会, 11/20-22. (東京)
8.Masuo Y, Yoneda M, Taniguchi N, Fujimoto A, Yamada K, Morita H, Hirofuji T. （2015）
Acceptance of patients from two dental hospitals to receive dental treatment performed by dental
students. 第 63 回国際歯科研究会日本部会・学術大会, 10/30-31. (福岡市)
9.谷口奈央, 中野善夫, 松尾忠行, 米田雅裕, 埴岡隆, 廣藤卓雄. （2015）塩化亜鉛溶液による長期洗口が唾液の細菌構成に与える影響. 第 6 回日本口臭学会学術大会, 7/4-5. (新潟市)
10.藤本曉江, 谷口奈央, 米田雅裕, 森田浩光, 廣藤卓雄, 埴岡隆. （2015）唾液分泌量と口腔粘膜水分量が口臭に与える影響. 第 6 回日本口臭学会学術大会, 7/4-5. (新潟市)
11.多田隈寛美, 森田浩光, 山口真広, 藤本曉江, 菅亜里沙, 牧野路子, 桝尾陽介, 脇勇士郎,
米田雅裕, 内藤徹, 廣藤卓雄. （2015）急性期病院への周術期口腔機能管理を含む訪問歯科介入の実態調査. 第 24 回日本有病者医療学会総会・学術大会, 5/20-22. (旭川市)
12.中野善夫, 谷口奈央, 米田雅裕, 廣藤卓雄, 横瀬勝美, 桑田文幸. （2014）ヒト口腔内細菌叢の構成に対する亜鉛イオンの影響. 第 85 回日本生化学会大会, 12/14-16. (福岡市)
13.上村吏絵, 米田雅裕, 草場裕美, 岩村裕美, 杉本由紀子, 大家知子, 鈴木奈央, 廣藤卓雄.
（2014）福岡歯科大学口腔医療センター口臭クリニックの患者分析.
第 57 回日本歯周病学会 2014 春季学術大会, 5/22-24. (岐阜市)1614.喜多裕大, 米田雅裕, 鈴木奈央, 藤本暁江, 森田浩光, 山田和彦, 桝尾陽介, 廣藤卓雄.
（2014） 口臭測定と細菌検査を行いモチベーションの向上に努めた症例.
第 7 回日本総合歯科学会総会・学術大会, 11.29-30. (大坂市)
15.山田美和, 米田雅裕, 鈴木奈央, 藤本暁江, 森田浩光, 山田和彦, 桝尾陽介, 廣藤卓雄.
（2014）口臭患者の分析および歯科衛生士の役割についての検討.
第 7 回日本総合歯科学会総会・学術大会, 11.29-30. (大坂市)16.鈴木奈央, 中野善夫, 松尾忠行, 米田雅裕, 廣藤卓雄. （2014） ヒト口腔内細菌叢に対する亜鉛イオンの影響. 第 56 回歯科基礎医学会学術大会・総会, 9.25-27. (福岡市)
17.藤本暁江、谷口奈央、伊波幸作、米田雅裕、山田和彦、瀬野恵衣、廣藤卓雄（2014）ヒノキチオールの Porphyromonas gingivalis に対する抗菌作用と口臭改善効果について、第 55 回日本歯科医療管理学会総会・学術大会、7.18-20. （札幌市）
18.仲西宏介、鈴木奈央、藤本暁江、伊波幸作、瀧井 慶、福地浩文、米田雅裕、廣藤卓雄（2014）口臭の除去を効能とする口腔咽喉薬の臨床的評価、
第 5 回日本口臭学会、7.5-6. （東大阪市）
19.山田潤一、鈴木奈央、仲西宏介、伊波幸作、藤本暁江、瀧井 慶、米田雅裕、山田和彦、
桝尾陽介、萩尾佳那子、廣藤卓雄（2014）3 種の有効成分を配合した口腔咽喉薬の口臭抑制効果、第 140 回日本歯科保存学会春季学術大会、6.19-6.20. （大津市）
20.西原哲世、鈴木奈央、藤本暁江、米田雅裕、田邊一成、山田和彦、岩元知之、安 忠大、
伊波幸作、瀬野恵衣、廣藤卓雄（2014）乳酸菌配合タブレットがう蝕リスク因子に与える影響の臨床的評価、第 140 回日本歯科保存学会春季学術大会、6.19-6.20. （大津市）
21.瀬野恵衣、大野純、山田和彦、谷口奈央、廣藤卓雄（2014）ラット歯肉炎モデルでの免疫応答—なぜ臨床的態度に違いが出るのか？、
第 140 回日本歯科保存学会春季学術大会、6.19-20. （大津市）
22.鈴木奈央、米田雅裕、田邊一成、廣藤卓雄（2014）乳酸桿菌 Lactobacillus salivarius 配合
タブレットがう蝕リスク因子に与える影響、
第 63 回日本口腔衛生学会総会、5.29~5.31. （熊本市）
23.上村吏絵、米田雅裕、草場裕美、岩村裕美、杉本由紀子、大家知子、鈴木奈央、
廣藤卓雄（2014）福岡歯科大学口腔医療センター口臭クリニックの患者分析、
第 57 回日本歯周病学会春季学術大会、5 月 22-24 日（岐阜市）
24.瀬野恵衣、大野純、山田和彦、谷口奈央、廣藤卓雄（2013）ラット全身性免疫応答モデ
ルにおける歯肉炎の病態、第 139 回日本歯科保存学会秋期学術大会、10.17-18.（福岡市）
25.瀬野恵衣、大野純、山田和彦、谷口奈央、谷口邦久、廣藤卓雄（2013）オートファジーと cancer sphere 形成能の関連、第 40 回福岡歯科大学学会、12.15, （福岡市）

17

26.岩元知之、鈴木奈央、米田雅裕、山田和彦、桝尾陽介、藤本暁江、伊波幸作、瀬野恵衣、
廣藤卓雄（2013）プロバイオティクスを用いた口腔疾患の予防管理への取り組み、
第 29 回日本歯科人間工学会、11.22-23.（名古屋市）
27.瀬野恵衣、大野純、山田和彦、谷口奈央、廣藤卓雄（2013）総合歯科診療科における細胞診の実践、第 6 回総合歯科協議会、11.16-17. （東京都）
28.伊波幸作、鈴木奈央、米田雅裕, 山田和彦, 岩元知之, 桝尾陽介, 藤本暁江, 瀬野恵衣, 春
名一人, 安 忠大, 入江丹佳子, 西原哲世, 仲西宏介, 廣藤卓雄（2013）ヒノキチオール配合
ジェルを用いた口腔ケアの口臭改善効果、第 6 回総合歯科協議会、11.16-17. （東京都）
29.藤本暁江、米田雅裕、鈴木奈央、内藤 徹、山田潤一、廣藤卓雄（2013）口臭恐怖のため精神科病院での入院加療を要した症例、
第 139 回日本歯科保存学会、10.17-10.18.（秋田市）
30.春名一人、鈴木奈央、米田雅裕、山田潤一、桝尾陽介、西原哲世、仲西宏介、山田和彦、
岩元知之、藤本暁江、伊波幸作、瀬野恵衣、安 忠大、入江丹佳子、廣藤卓雄（2013）S-PRG
溶出液が口腔バイオフィルムと口臭に及ぼす阻害作用、
第 139 回日本歯科保存学会、10.17-10.18. （秋田市）
31.Suzuki N, Yoneda M, Tanabe K, Fujimoto A, Iha K, Seno K, Iwamoto T, Yamada K, Masuo Y,
Haruna K, and Hirofuji T, （2013）Improvement of oral malodor using Lactobacillus salivarius
WB21-containing tablets, WCPD, 10.9-12、（ Budapest city, Hungary）
32.藤本暁江、鈴木奈央、米田雅裕、伊波幸作、山田和彦、岩元知之、桝尾陽介、瀬野恵衣、
廣藤卓雄（2013）口臭関連細菌に対するヒノキチオールの抗菌作用とヒノキチオール配合
ジェルによる口腔ケアの口臭改善効果、第 4 回日本口臭学会、7.13, 14. (横浜市)
24.伊波幸作、鈴木奈央、米田雅裕、山田和彦、岩元知之、桝尾陽介、藤本暁江、瀬野恵衣、
春名一人、安 忠大、入江丹佳子、西原哲世、仲西宏介、廣藤卓雄（2013）ヒノキチオー
ル配合ジェルを用いた口腔ケアが口臭及び口腔内環境に与える影響、
第 138 回日本歯科保存学会春季学術大会、6.27, 28. (福岡市)
25.松浦洋志、米田雅裕、鈴木奈央、岡田芙美子、藤本暁江、廣藤卓雄（2013）長期間悩まされていた口腔異常感が口腔乾燥に対する処置で消失した症例、
第 138 回日本歯科保存学会春季学術大会、6.27, 28. (福岡市)
26.中野善夫、鈴木奈央、米田雅裕、廣藤卓雄、横瀬勝美、桑田文幸（2012）ヒト口腔内細菌叢の構成に対する亜鉛イオンの影響、第 85 回日本生化学会大会 ，12.14-16. (福岡市)
27.杉本由紀子、米田雅裕、鈴木奈央、廣藤卓雄（2012）不適合修復物の除去および歯周外科により口臭が完全に消失した症例、第 55 回日本歯周病学会学術大会 、9.23, (つくば市)
28.松浦洋志、米田雅裕、鈴木奈央、内藤 徹、廣藤卓雄（2012）口臭治療についての意識18

—歯科衛生士を対象とした調査結果—、
第 137 回日本歯科保存学会秋季学術大会、11.22-23. (広島市)
29.桝尾陽介、鈴木奈央、米田雅裕、安 忠大、仲西宏介、藤本暁江、伊波幸作、瀬野恵衣、
山田和彦、岩元知之、廣藤卓雄（2012）S-PRG 溶出液と S-PRG 配合歯面研磨剤の口腔バイ
オフィルムへの影響、第 137 回日本歯科保存学会秋季学術大会、11.22-23, 2012. (広島市)
30.伊波幸作、鈴木奈央、藤本暁江、米田雅裕、山田和彦、岩元知之、桝尾陽介、西原哲世、
金子元気、春名一人、廣藤卓雄（2012）ヒノキチオール配合口腔ケア用ジェルによる口腔清掃の口臭改善効果、第 137 回日本歯科保存学会秋季学術大会、11.22-23. (広島市)
31.桝尾陽介、鈴木奈央、米田雅裕、安 忠大、仲西宏介、藤本暁江、伊波幸作、瀬野恵衣、
山田和彦、岩元知之、廣藤卓雄（2012）S-PRG イオン溶出液と S-PRG 配合歯面研磨剤の口腔バイオフィルムへの影響、第 39 回福岡歯科大学学会総会、11.18. (福岡市)
32.伊波幸作、鈴木奈央、藤本暁江、米田雅裕、山田和彦、岩元知之、桝尾陽介、西原哲世、
金子元気、春名一人、廣藤卓雄（2012）ヒノキチオール配合口腔ケア用ジェルによる口臭改善効果の臨床研究、第 39 回福岡歯科大学学会総会 、11.18. (福岡市)
33.加塩奈津希、米田雅裕、内田初美、鈴木奈央、内藤徹、縄田和歌子、黒田美和子、力武紗由美、廣藤卓雄（2012）口臭治療に関する歯科衛生士の意識調査、
第 39 回福岡歯科大学学会総会 、 11.18. (福岡市)
34.米田雅裕、古賀千尋、鈴木奈央、内藤 徹、廣藤卓雄（2012）福岡歯科大学口腔医療センター口臭科の患者解析および口臭恐怖症の 1 症例、第 27 回日本歯科心身医学会総会・学術大会、9 月 1 日、2 日、（川越市）
35.藤本暁江、鈴木奈央、米田雅裕、伊波幸作、田邊一成、山田和彦、岩元知之、桝尾陽介、
廣藤卓雄（2012）真性口臭症における Lactobacillus salivarius WB21 株配合錠菓の有用性の検討、第 3 回日本口臭学会、7 月 7, 8 日、（東京都）
36.鈴木奈央、中野善夫、米田雅裕、横瀬勝美、桑田文幸、廣藤卓雄（2012）塩化亜鉛溶液の洗口による口腔内細菌叢の変動、第 3 回日本口臭学会、7 月 7, 8 日、（東京都）
37.鈴木奈央、中野善夫、畑野優子、米田雅裕、横瀬勝美、桑田文幸、廣藤卓雄（2012）塩化亜鉛曝露による口腔細菌構成の変化、第 136 回日本歯科保存学会春季大会、6 月 28, 29 日、（宜野湾市）
38.藤本暁江、鈴木奈央、米田雅裕、田邊一成、山田和彦、岩元知之、桝尾陽介、伊波幸作、
廣藤卓雄（2012）Lactobacillus salivarius WB21 株配合錠菓の口臭抑制効果についての臨床研究〜ランダム化二重盲検プラセボ対照クロスオーバー試験〜、第 136 回日本歯科保存学会春季大会、6 月 28, 29 日、（宜野湾市）

19

39. 加塩奈津希、米田雅裕、内田初美、鈴木奈央、内藤 徹、村上早苗、安河内ひとみ、

廣藤卓雄（2012）口臭治療に関する歯科衛生士の意識調査、
第 55 回日本歯周病学会春季大会、5 月 17-19 日、
（札幌市）

20

研 究 課 題

加齢に伴う口腔環境の変化

研究代表者

米田雅裕

（総合歯科学講座・総合歯科学分野・教授）

要約
歯科の二大疾患である齲蝕と歯周病は、共に口腔内微生物によって起こる感染症である。
デンタルプラークすなわち口腔バイオフィルムは、複雑な細菌間相互作用によって作られ、さまざまな菌由来の病原因子を有する。界面機能性ガラス surface pre-reacted glass-ionomer(S-PRG) は各種イオンを徐放することが知られており様々な生物活性が認められている。
わ れ わ れ は 口 腔 細 菌 に 対 す る 影 響 を 調 べ 下 記 の 結 果 を 得 た 。 S-PRG 溶 出 液 はPorphyromonas gingivalis のプロテアーゼ活性、ゼラチン分解活性を抑制し、Fusobacterium
nucleatum との共凝集を阻害した。グラム陽性菌によるバイオフィルム形成を抑制したが、
-ガラクトシダーゼに対する作用は認められなかった。唾液中の細菌によるバイオフィル
ム形成を阻害し、形成された唾液バイオフィルムを破壊する能力も認められた。
さらに、S-PRG イオン溶出液は水に比べて優れた口臭抑制能と持続性を有することが明らかになった。硫化水素 (H2S) 発生装置を利用して S-PRG イオン溶出液及び S-PRG フィ
ラーの滴下による気相と液相の H2S 濃度変化を調べたところ、S-PRG イオン溶出液による
H2S 発生抑制には pH の変動が関与していることが示唆された。
以上の結果から S-PRG はう蝕や歯周炎、口臭の予防に効果があると考えられる。そして加齢に伴う口腔環境の変化に対応し口腔環境の改善に貢献すると期待される。

研究目的
加齢に伴い口腔内環境は徐々に変化するが、その環境悪化を促進する因子として口腔内細菌の影響が考えられる。歯科の二大疾患である齲蝕と歯周病も、共に口腔内微生物によって起こる感染症である。デンタルプラークすなわち口腔バイオフィルムは、複雑な細菌間相互作用によって作られ、さまざまな菌由来の病原因子を有する。
界面機能性ガラス surface pre-reacted glass-ionomer (S-PRG) はデンタルプラークに強い歯科材料として注目されており、これまでに S-PRG 配合レジンの抗プラーク作用や、S-PRG
含有根管充填剤の抗菌作用が報告されている。その有効因子のひとつとして、S-PRG のイ
オン徐放性が示唆されている。S-PRG はフッ素、ホウ素、ストロンチウム等様々なイオンを放出することが知られており、細菌の生物活性に影響をおよぼしていると考えられる。
本研究では細菌の病原性や口臭を S-PRG で抑制することを検討した。主な目的は以下の通りである。

1. 細菌の酵素活性、バイオフィルム形成に対する抑制効果の検討①P. gingivalis のプロテアーゼ活性に対する作用
歯周病原性細菌 P. gingivalis が産生するプロテアーゼは、本菌の最も重要な病原因子である。本菌のプロテアーゼ活性に対する S-PRG 溶出液の影響を調べる。
②P. gingivalis のゼラチン分解活性に対する作用
ゼラチン分解能は歯周組織の破壊に重要であるが、歯質に対しては修復物の脱離を促進する因子として作用する。P. gingivalis のゼラチン分解活性に及ぼす S-PRG 溶出液の影響を調べる。
③P. gingivalis と F. nucleatum の共凝集に対する作用
共凝集は細菌の組織への定着を促進する因子として重要である。主要な歯周病原性細菌同士の凝集に及ぼす S-PRG 溶出液の影響を調べる。
④-ガラクトシダーゼに対する作用
-ガラクトシダーゼは、グラム陽性球菌のグリコシダーゼのひとつで、細菌の定着や細胞侵入に関与し、肺炎球菌 Streptococcus pneumoniae においては病原性のひとつとしても重要である。口腔内細菌では、S. salivarius, S. mitis, S. gordonii などの歯面初期付着細菌
やう蝕原因菌である S. mutans に本酵素活性があることが知られている。本研究では、
Escherichia coli 由来の-ガラクトシダーゼを利用して、S-PRG 溶出液の影響を調べる。
⑤口腔バイオフィルム形成に対する作用
口腔バイオフィルム形成の初期段階に関係する細菌について、ペリクルへの付着に対する S-PRG 溶出液の影響を調べる。また、唾液中の細菌によるバイオフィルム形成の抑制やすでに形成されたバイオフィルムの破壊能力についても検討を加える。
⑥S-PRG 配合歯面研磨剤 (PRG イオンサプライ) が口腔バイオフィルムに与える影響とそのメカニズムを探る
２．口臭の抑制効果の検討①S-PRG イオン溶出液が口臭に与える影響とそのメカニズムを探る②S-PRG イオン溶出液による洗口の口臭抑制効果と持続性を臨床的に評価する③S-PRG イオン溶出液による硫化水素発生抑制作用のメカニズムを探る
・溶出イオンの硫化水素発生に対する直接的反応の評価
・硫化水素発生装置を用いた S-PRG イオン溶出液滴下による液相と気相の硫化水
素濃度の変化方法
1. S-PRG イオン溶出液が歯周病原性細菌におよぼす影響を調べる

1-1．S-PRG 溶出液の作成
S-PRG フィラーを蒸留水中で 24 時間攪拌後、遠心、濾過により水溶性成分を回収。本
lot の状態は下記の通りである。pH7.3、Al: 1.5ppm, B: 890.5ppm, Na: 368.2ppm, Si:
6.0ppm, Sr: 78.4ppm, F: 105.0ppm
1-2．P. gingivalis のプロテアーゼに対する作用
P. gingivalis ATCC 33277 株を超音波破砕し、遠心後の上清をプロテアーゼサンプル（P.gSE）とした。酵素活性は、Bz-Arg-pNA 塩酸塩（BAPNA）を基質に用いた発色反応により評価した。反応液の組成は、1 mM BAPNA, 0.2 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2,
10 mM L-cysteine, 1/10 P.g SE, distilled water（dw）or S-PRG 溶出液である。S-PRG を添加した場合としない場合で、5 分ごとに 30 分間、吸光度の変化を調べた。
1-3．P. gingivalis のゼラチン分解活性に対する作用
P.g SE に dw または S-PRG 溶出液を加え段階希釈した。ゼラチンコーティングしたエックス線フィルム（Kodak Ultraspeed）に 20l ずつスポットし、湿度 100%の状態で 37℃、２時間インキュベートした。フィルムを流水下で水洗後、スポットした表面が剥離した場合をゼラチン分解活性ありと判定した。
1-4．P. gingivalis と F. nucleatum の共凝集に対する作用
P. gingivalis ATCC 33277 株と F. nucleatum ATC25586 株を液体培養し共凝集バッファーで洗浄した。dw または S-PRG 溶出液で希釈した共凝集バッファーに懸濁し両者を混合した。凝集結果の判定は S.A.Kinder らの方法に準じて肉眼で行った。
1-5．-ガラクトシダーゼに対する作用
E. coli 由来-ガラクトシダーゼを利用し、o-nitrophenyl--D-galactopyranoside を基質に用いた発色反応で吸光度を測定した。反応液の 10%あるいは 50%を S-PRG 溶出液に置換し、反応直後と反応 1 時間後に吸光度測定を行った。対照群として、S-PRG 溶出液を dw に置換した反応液と標準曲線作製用の最適緩衝液を使用した反応液を用いた。
1-6．口腔バイオフィルム形成に対する作用
S. mutans JCM 5705 株、Enterococcus faecium WB 2000 株について、96 穴マイクロプレートを利用したプラーク形成実験を行った。唾液で表面処理したウェルに、吸光度OD660 = 1 に調製した細菌を 20 µl と段階希釈した S-PRG 溶出液を含む培地を 160 µl を添加し、37ºC で 16 時間嫌気培養した。浮遊細菌を除去し、洗浄・乾燥後、0.25% safraninで染色し吸光度を測定した。また唾液中の細菌によるバイオフィルムについても検討を加えた。健常人５人の安静時唾液を混合したものを唾液サンプルとして使用し、上記と同様にバイオフィルムを観察した。形成されたバイオフィルムの破壊実験は下記の通り行った。唾液バイオフィルムが形成されたマイクロプレートに S-PRG 溶出液を加え 37ºC で 24 時間嫌気培養、上清を除去したのち吸光度を測定した。
1-7. S-PRG 配合歯面研磨剤 (PRG イオンサプライ) が口腔バイオフィルムに与える影響
PRG イオンサプライによる歯面研磨後の持続的なイオン放出効果が口腔バイオフィル
ムの形成に与える影響を評価するために、まず PRG イオンサプライ 0 (0%), 1-1 (1%),
1-5 (5%), 1-30 (30%) を滅菌綿棒で 96 マイクロウェルプレートに均一に塗布し、人口唾液 4)で洗浄後、安静時唾液 : 人工唾液 = 1 : 10 の割合で反応液を作製し、嫌気的条件
37℃で一日 2 回人工唾液を交換し、72 時間後に形成されたバイオフィルムを 0.25%サ
フラニンで染色し評価した。
２．S-PRG イオン溶出液が口臭に与える影響とそのメカニズムを探る
2-1. S-PRG イオン溶出液による洗口の口臭抑制効果の持続性を臨床的に評価する
これまでに、1 mM メチオニン洗口により誘発させた口臭に対して S-PRG イオン溶出液による洗口の影響を調べ、水による洗口よりも優れた抑制効果があることを報告した 2)。本研究では、S-PRG イオン溶出液による洗口の口臭抑制効果の持続性を評価するために、メチオニン洗口による誘導なしに S-PRG イオン溶出液 10 mL で 1 分間洗口し、15 分ごとに 1 時間後まで、口臭の変動をガスクロマトグラフィー (GC-2014, 島津製作所) で口臭の主成分である硫化水素とメチルメルカプタンを測定することにより評価した。比較対象として、水とハイザック N リンス (ビー・ブランド) 各 10 mL を用いた。ハイザック N リンスは成分に塩酸クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウ
ム、塩化亜鉛などを含んでおり、優れた口臭抑制作用を持つことが知られる洗口剤である。洗口実験は、齲蝕及び歯周病を持たない健常な被験者を対象に、食事から少な
くとも 2 時間経過した条件で実施した。
2-2. 溶出イオンの硫化水素発生に対する直接的反応の評価
口臭の主成分である硫化水素やメチルメルカプタンなどの揮発性硫黄化合物は、口腔内細菌によるタンパク分解過程の最終産物として生じる。口臭抑制作用が知られる銀や亜鉛などの金属イオンは、口腔内細菌に対する抗菌作用の他に、硫化物イオンと化学的結合し揮発化を抑えることにより、口臭を抑制すると考えられている。我々は、
S-PRG 溶出イオンのうち金属イオンであるストロンチウムイオン (Sr2+) やアルミニ
ウムイオン (Al3+) に同じメカニズムによる口臭抑制作用があるのではないかと仮定
し、NaHS 溶液と SrCl2 溶液あるいは AlCl3 溶液を混合し、H2S 発生に対する影響を調べた。H2S 濃度測定にはガスクロマトグラフィー (GC-2014, 島津製作所) を用いた。
比較対象として、水と ZnCl2 溶液を用いた。
2-3. 硫化水素発生装置を用いた S-PRG イオン溶出液滴下による液相と気相の硫化水素
濃度の変化

硫化水素発生装置により、H2S 標準液 (H2S 濃度 500 ppb) を調製し、S-PRG イオン溶
出液 0.5 mL、S-PRG フィラー0.1 g、球状シリカ 0.1 g、炭酸水素カリウム 0. 1 g をそれぞれ添加し、3 時間攪拌し、1 時間ごとに気相の H2S 濃度をガスクロマトグラフィー(GC-14B, 島津製作所) にて測定した。液相の H2S 濃度の測定は、S-PRG イオン溶出液を滴下した反応液についてはガスクロマトグラフィーを用いて、S-PRG フィラーを投入した反応液についてはメチレンブルー法を用いて行った。また 3 時間後における液相の pH を測定した。

結果と考察
１．細菌の酵素活性、バイオフィルム形成に対する抑制効果①P. gingivalis のプロテアーゼに対する作用
図１に 0.05 g の P. gingivalis ATCC 33277 株より調製したプロテアーゼの反応を示す。
S-PRG 溶出液を添加した場合は、添加しない場合に比べて反応曲線が大きく変化し、活性が抑制されている傾向がみられた（図 1-1）。一方、0.08~0.1 g の菌体より調製したプロテアーゼの反応では、高濃度のプロテアーゼのため 5 分後に完全反応したと思わ
れ、S-PRG 溶出液を添加した場合と添加しない場合で違いがみられなかった（データ非表示）。また、P. gingivalis の２つの株（ATCC33277 株、381 株：図 1-2）について同様の結果が得られた。プロテアーゼ活性抑制のメカニズムは今後検討する必要がある
が、S-PRG から溶出したイオンが酵素の活性中心に作用している可能性がある。
②P. gingivalis のゼラチン分解活性に対する作用
反応液に S-PRG 溶出液を 40%以上加えると、P.g SE のゼラチン分解活性が抑制された（図 1-3）。ゼラチン分解活性は歯周組織に影響をおよぼすが、歯の修復物の脱離にも関係すると考えられている。S-PRG が歯周炎の進行予防や修復物の寿命延長にも役立つ可能性がある。
③P. gingivalis と F. nucleatum の共凝集に対する作用
共凝集バッファー希釈時に dw を S-PRG 溶出液に置換すると P. gingivalis と F. nucleatumの共凝集が抑制された（図 1-4, 5）。共凝集はバイオフィルムの成長や成熟に関係すると考えられている。S-PRG は本活性を抑制することによりプラーク付着の阻害や歯周炎の発症抑制に貢献している可能性がある。
④-ガラクトシダーゼに対する作用
図 1-６に、反応液の 50%を S-PRG 溶出液で置換した反応液を段階希釈したサンプルの、反応直後 (A) と 1 時間後 (B) の結果を示す。S-PRG 溶出液と dw を使用した場合は、
最適緩衝液を利用した場合に比較して若干反応が弱まるが、両者の間に違いはみられなかった。10%の S-PRG 溶出液を含む反応液についても同様の結果であった。S-PRG
溶出液は、短時間に-ガラクトシダーゼ活性を左右する作用はないと思われた。
⑤口腔バイオフィルム形成に対する作用
S. mutans JCM 5705 株 (図 1-7A) と E. faecium WB2000 株 (図 1-7B) で、S-PRG 溶出液
添加によりバイオフィルム形成が抑制された。ただ、細菌の種類によって抑制の程度が異なったが、これは金属イオンに対する菌の感受性や結合性の特異性の違いによって現れた可能性がある。S-PRG 溶出液によるバイオフィルムに対する抑制は唾液のバ
イオフィルムにおいても認められた。S-PRG 溶出液は濃度依存的に唾液バイオフィル
ムの形成を抑制した (図 1-8A)。また、S-PRG 溶出液は形成されたバイオフィルムを破壊する能力を有することも明らかになった (図 1-8B)。S-PRG は口腔内のプラークに常に接する場所に使用されており、バイオフィルム抑制作用があることは S-PRG 含有の材料がう蝕予防や歯周疾患予防に直接役立っていると考えられる。
⑥S-PRG 配合歯面研磨剤 (PRG イオンサプライ) が口腔バイオフィルムに与える影響
PRG イオンサプライのバイオフィルム形成に与える影響についても、濃度依存的にバ
イオフィルム形成阻害がみられた (図 1-9)。特に 1-5 (5%) と 1-30 (30%) は、S-PRG 無配合の PRG イオンサプライ 0 と比較して統計学的に有意な阻害作用を認めた。この実験から、PRG イオンサプライ 1-5 あるいは 1-30 で歯面清掃をおこなった場合、長期的(72 時間) にデンタルプラークの蓄積を抑えることができることが示唆された。
２．S-PRG イオン溶出液が口臭に与える影響とそのメカニズムを探る①S-PRG イオン溶出液洗口による口臭抑制効果
図 2-1 に、ベースラインを 1 とした時の硫化水素とメチルメルカプタンの変動を示す。
S-PRG イオン溶出液による洗口直後、硫化水素およびメチルメルカプタンは大きく減
少した。その効果は水による洗口に比べてやや強い程度だった。その後 S-PRG イオン
溶出液による洗口では、硫化水素もメチルメルカプタンも水による洗口に比べて低いレベルで推移した。ハイザックは洗口後 30 分間いずれの物質も検出されなかった。揮
発性硫黄化合物は、水溶性であるので、水による洗口でも抑制される。しかしながら
15 分後には元の値に戻ってしまった。このように、S-PRG イオン溶出液は水による洗口に比べて、口臭成分を低い値に抑えることがわかった。
②S-PRG イオン溶出液による硫化水素発生抑制作用のメカニズムを探る②－1 溶出イオンの硫化水素発生に対する直接的反応の評価
図 2-2 に水、S-PRG イオン溶出液、SrCl2 溶液、AlCl3 溶液、ZnCl2 溶液を NaHS 溶液に加えた後の H2S 発生濃度を示す。ZnCl2 溶液はほぼ完全に H2S 発生を抑制した。S-PRG
イオン溶出液は水に比べて H2S 発生を約 25%抑制した。一方、溶出イオンを含む SrCl2

溶液および AlCl3 溶液を加えても H2S の発生は全く抑制されなかった。これらの実験結果から、S-PRG イオン溶出液による口臭抑制メカニズムは、溶出イオンの硫化物イオンへの化学的結合によるものではない可能性が出てきた。
②-2 硫化水素発生装置を用いた S-PRG イオン溶出液滴下による液相と気相の硫化水素
濃度の変化
S-PRG イオン溶出液を投入後、気相中の H2S 濃度は約 20%減少し液相中の H2S 濃度は約 2%増加した (図 2-3)。S-PRG イオン溶出液投入後のストロンチウムイオンおよびH2S の量関係はストロンチウムイオンが過剰になっていることから、溶出イオン種による H2S 濃度への関与は低いものと考えられた。
次に、S-PRG フィラー、球状シリカ、炭酸水素カリウムを投入し、同様の実験を行ったところ、気相中の H2S 濃度が S-PRG フィラーの反応液で約 80%、炭酸水素カリウムの反応液で約 90%減少していた (図 2-4)。液相中の H2S 濃度は、S-PRG フィラーの反応液で約 20%、炭酸水素カリウムの反応液で約 12%増加した。S-PRG イオン溶出液に比べて S-PRG フィラーでより変化が大きい理由として、S-PRG フィラーによる反応の持続性が考えられた。反応 3 時間後の液相の pH を測定したところ、S-PRG フィラーおよび炭酸水素カリウムを投入した反応液で pH の上昇がみられ、一方 H2S 濃度が変化しなかった球状シリカの反応液では pH の変化もみられなかった。これらの結果から、pH が上昇することにより気相中の H2S 濃度が低下した可能性が示唆された。すな
わち、H2S の酸解離定数 (pKa1) は 6.88 であるため、液相の pH が上昇するとイオンが解離する方向に平衡が傾き、pH > 6.88 の環境では液相中の遊離 H2S が減少し、気相中の H2S が液相に移動する可能性がある。S-PRG イオン溶出液は弱アルカリ性を示すため、この仮説は実験結果に矛盾しないと考えられる。
以上の結果から S-PRG はう蝕や歯周炎、口臭の予防に効果があると考えられる。そして加齢に伴う口腔環境の変化に対応し口腔環境の改善に貢献すると期待される。

発表論文
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学会発表
1. Antibiofilm activity of surface pre-reacted glass ionomer (S-PRG) filler. A. Fujimoto, M. Yoneda,
N. Suzuki, Y. Masuo, H. Morita, T. Oie, C. Koga, T. Hirofuji. IADR General Session in Boston,
Mass, USA, March 11-14, 2015.
2. S-PRG 溶出液と S-PRG 配合歯面研磨剤の口腔バイオフィルム形成への影響
鈴木奈央、米田雅裕 他

桝尾陽介、

日本歯科保存学会 2012 年度秋季学術大会（第 137 回）、広島、2012

年 11 月3. S-PRG 溶出液が口腔バイオフィルムと口臭に及ぼす阻害作用

春名一人、鈴木奈央、米田雅裕 他

日本歯科保存学会 2013 年度秋季学術大会（第 137 回）、秋田、2013 年 10 月

藤本暁江、米田雅裕、鈴木奈央、桝尾陽介、山田和彦、森田浩光、廣藤卓雄、S-PRG イオ
ン溶出液が口腔内細菌バイオフィルムにおよぼす影響、日本歯科保存学会、北九州市、
6.25–26, 2015.

特許
なし

図

表

図１-1. 0.05 g の P. gingivalis ATCC 33277 株より調製したプロテアーゼの反応AB

図 1-2.

P. gingivalis の２つの株のプロテアーゼに対する影響（左: ATCC33277 株、右: 381 株）

AB

図 1-３（A：ゼラチンフィルムの様子

B：ゼラチン分解活性の抑制結果）

図 1-４．共凝集の様子

図 1-５．S-PRG 溶出液による共凝集の抑制

AB

図 1-６. 50% S-PRG 反応直後 (A) と 50% S-PRG 反応 1 時間後 (B)A

S. mutans JCM 5705

B

E. faecium WB2000

図 1-７. S-PRG 溶出液のバイオフィルム形成への作用A唾液バイオフィルム形成阻害

B 唾液バイオフィルムの破壊

図 1-8. S-PRG 溶出液の唾液バイオフィルムへの作用。

＊

図 1-9

PRG イオンサプライのバイオフィルム形成阻害能P < 0.05

vs PRG イオンサプライ

A 硫化水素B メチルメルカプタン

図 2-1. 水、S-PRG イオン溶出液、ハイザックの洗口による、口気中の硫化水素 (A)およびメチルメルカプタン (B) の変動

図 2-2. 水、S-PRG イオン溶出液、SrCl2 溶液、AlCl3 溶液、ZnCl2 溶液を NaHS 溶液に加えた後の H2S 発生濃度

図 2-3. S-PRG イオン溶出液投入後の気相中および液相中の H2S 濃度の変化

図 2-4. S-PRG フィラー、球状シリカ、炭酸水素カリウム投入後の気相中の H2S 濃度
および pH の変化