2021 東京農業大学「産官学・地域連携HUB構想」 第２回シンポジウム
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農大の実学＝総合知が築く「食・農・環境」の未来

学内プロジェクト研究成果報告
農大発 食・農・環境の未来を豊かにする実学研究

きのこ細菌病の病原因子を生分解する新規生物防除機構

横田 健治
東京農業大学 応用生物化学部 農芸化学科

共同研究者
篠原 弘亮 教授
東京農業大学 農学部 農学科

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Pseudomonas tolaasiiによるきのこ細菌病害
病原菌︓Pseudomonas tolaasii
対象︓各種きのこ
症状︓子実体の褐変、軟腐、へこみ

国内

世界

 栽培きのこ類の生産額は2,256億円 1)
 国内においては本病害に対する化学農薬の登録は無く、野外で栽培を⾏うシイタケの原⽊栽培ではその管理がままならない状況 2)
 栽培きのこ類の世界市場は167億USD (1兆7,000億円規模) 3)
 世界各国のマッシュルーム栽培で多く確認され、特にヨーロッパ諸国での発生率は作物重量のおおよそ10〜15％、多いときには50％を超える 4)1) 農林⽔産省, 2018; 2) 有馬ら, 2019; 3)https://www.marketsandmarkets.com/PressReleases/mushroom-cultivation.asp; 4) Osdaghi E et al., 2019

Pseudomonas tolaasiiによるきのこ細菌病害
発病メカニズム
Pseudomonas
tolaasii

抗菌性環状リポペプチド
Tolaasin I
分泌Tolaasin生合成遺伝子破壊株は、きのこに対する病原性を失う
Henkels et al. 2014

Tolaasinがきのこ腐敗病の病原因子

Pseudomonas tolaasiiによるきのこ細菌病害発病メカニズム
Pseudomonas
tolaasii

抗菌性環状リポペプチド
Tolaasin I
分泌

国内において、本病害に対する登録農薬は無い生物防除剤の開発研究

Pseudomonas tolaasiiによるきのこ細菌病害発病メカニズム
Pseudomonas
tolaasii

抗菌性環状リポペプチド
Tolaasin I
分泌

従来の生物防除戦略• 拮抗細菌による生育阻害
Sahin . 2005

• バクテリオファージによる溶菌
Nguyen et al.
2012

新たな生物防除戦略• 毒素tolaasinの直接的な解毒• 薬剤耐性菌の出現がない

生物防除剤として新しい概念

Tolaasinきのこ細菌病の病原因子を生分解する新規生物防除機構- Tolaasin解毒細菌の探索- K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構- Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性- M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構

きのこ細菌病の病原因子を生分解する新規生物防除機構- Tolaasin解毒細菌の探索- K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構- Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性- M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構

Tolaasin解毒細菌の探索
細菌の分離

Tolaasin解毒能試験
Tolaasin

健全なシイタケ子実体＋542 菌株

解毒ジャガイモ塊茎切⽚解毒細菌のスクリーニング

Tolaasin解毒細菌の探索

Microbacterium sp. K3-5を含む8属12菌株にtolaasin解毒活性を確認

きのこ細菌病の病原因子を生分解する新規生物防除機構- Tolaasin解毒細菌の探索- K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構- Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性- M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構

K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構
Tolaasin

HPLC

培養上清4h 静置

遠⼼分離

上清

上清中のtolaasin I 除去率(%)= 100ー

菌体処理後tolaasin
Iピーク面積値
菌体処理前tolaasin
Iピーク面積値

溶液中のtolaasin定量
Tolaasin I4000

× 100

Intensity (×104)

24時間培養K3-5培養液

菌体懸濁液3000ピーク面積値の算出

2000
1000
03456Time(min)78

上清中のtolaasin I 除去率(%)

K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構* 菌体外にtolaasin解毒因子を分泌しない菌体懸濁液

培養上清Mean ± SE, n = 3, * ＝ p < 0.01 by Student’s T-test

 菌体でtolaasinを解毒する

K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構
LC-MSクロマトグラム
K3-5株菌体懸濁液
処理前

Intensity（×104)

4000
3000

Tolaasin Im/z 994 [M+2H]2+

Tolaasin Im/z 994 [M+2H]2+

加⽔分解

2000
1000
0345678Time(min)K3-5株菌体懸濁液処理後

Intensity (×104)

4000

開環Tolaasin Im/z 1003[M+2H]2+3000Tolaasin Im/z 994 [M+2H]2+2000
1000
03456Time(min)78

開環Tolaasin Im/z 1003[M+2H]2+

毒性なし

K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構
Tolaasin Im/z 994 [M+2H]2+開環Tolaasin Im/z 1003[M+2H]2+エステル結合の加⽔分解による開環菌体との相互作用
Microbacterium sp. K3-5 菌体

K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構

きのこ細菌病の病原因子を生分解する新規生物防除機構- Tolaasin解毒細菌の探索- K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構- Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性- M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構

Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性K3-5株が持つtolaasin解毒活性がMicrobacterium属に共通した特徴であるか︖

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Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性すべての菌株において、tolaasinは除去されなかった菌体懸濁液すべての菌株において、上清中のtolaasinが除去された

上清中のTolaasin I 除去率(%)

培養上清Mean ±SE, n=31007550250

Microbacterium spp. (各種の基準株を使用）

Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性
Microbacterium 属菌体にtolaasin が吸着する
上清中のtolaasin
上清中のtolaasin の除去

菌体
菌体へのtolaasin の吸着・除去＝解毒︖

菌体

Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性菌体懸濁液にtolaasin添加

4h静置

上清を取り除く

菌体を再懸濁…
…

段階希釈を⾏うジャガイモ塊茎切⽚に添加Tolaasin添加後24時間のジャガイモ塊茎切⽚

Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性最小褐変消失濃度(精製tolaasin：2μM）

褐変希釈倍率Log2(x)01234567

この方法を用いて、tolaasin処理した菌体の毒素活性を評価した

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Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性Mean=±SE, n=6, ND=not detected

毒素活性 (Log2(x))

76543210

Microbacterium spp. (各種の基準株を使用）

多くの菌株で4時間処理後もtolaasinの毒素活性を保持Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性
Tolaasinのみ

M. foliorum 菌体+ tolaasin

M. paraoxydans 菌体+ tolaasin

きのこ子実体においても、M. foliorumは tolaasin解毒活性を示した

Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性
Tolaasin解毒能なし

Microbacterium属

毒性保持

菌体への吸着生物防除活性×Tolaasin解毒能あり
菌体細胞

K3-5
M .barkeri
M. oxydance
M. foliorum

解毒

生物防除活性 〇Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性

Tolaasinの菌体への吸着・除去≠解毒26

きのこ細菌病の病原因子を生分解する新規生物防除機構- Tolaasin解毒細菌の探索- K3-5のtolaasin解毒活性の局在と解毒機構- Microbacterium属基準株のtolaasin解毒活性- M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構

M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構
毒素活性 (Log2(x))

7Mean ±SE, n=6, ND=not detected

6543210Microbacterium spp. (各種の基準株を使用）

Microbacterium 属 基準株30菌株のうち顕著に高い解毒活性を示した
M. foliorum NBRC 103072T 株について解毒機構を詳細に解析

M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構
LC-MSクロマトグラム

菌体処理後上清中にK3-5株とは異なる未同定ピークが検出された

M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構
m/z 727.43[M+H]+Tolaasinの一次構造

m/z 639.91[M+2H]2+加水分解

βhyd: β-hydroxyoctanoic acid, Dab: 2,4-diaminobutyric acid; Hse: homoserine; Δbut: 2,3-dehydro-2-aminobutyric acidM. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構
Tolaasinの一次構造

2箇所で加水分解② ①βhyd: β-hydroxyoctanoic acid, Dab: 2,4-diaminobutyric acid; Hse: homoserine; Δbut: 2,3-dehydro-2-aminobutyric acid

Intensity

①N末端側
①C末端側
②C末端側Time (minute)②N末端側

M. foliorum
菌体処理後

M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構
Tolaasinの一次構造

2箇所で加水分解② ①

K3-5による分解箇所

βhyd: β-hydroxyoctanoic acid, Dab: 2,4-diaminobutyric acid; Hse: homoserine; Δbut: 2,3-dehydro-2-aminobutyric acid

Intensity

①N末端側
①C末端側
②C末端側

Time (minute)②N末端側

M. foliorum
菌体処理後

M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構
LC-MSクロマトグラム

酵素の可溶化プロトコル

Tolaasin I

M. foliorum NBRC 103072T
菌体

Tolaasinのみ
Intensity

0.5% Triton X-100
により懸濁Tolaasin I分解産物

菌体処理

遠心分離

Triton X-100
抽出物処理

可溶性画分を回収
Time (min)Tolaasin分解活性評価

菌体のTriton X-100処理によるtolaasin分解酵素の可溶化を確認した

M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構

分解産物 （N末端側)
分解産物 (C末端側)Mean ± SE, n = 3

Tolaasin I
Tolaasin I ピーク面積値(×104)

Tolaasin I ピーク面積値(×104)

Tolaasin I

Tolaasin I 分解産物ピーク面積値(×104)

菌体懸濁液
分解産物 （N末端側)
分解産物 (C末端側)

Tolaasin I 分解産物ピーク面積値(×104)

酵素抽出液

M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構
菌体懸濁液

菌体へのtolaasin吸着は加水分解に先立って起こる

Tolaasin I ピーク面積値(×104)

Tolaasin I
分解産物 （N末端側)
分解産物 (C末端側)

Tolaasin I 分解産物ピーク面積値(×104)

Mean ± SE, n = 3

M. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構

37
T
M. foliorum NBRC 103072 のtolaasin解毒機構

まとめ●Microbacterium sp. K3-5及びM. foliorum NBRC 103072Tのtolaasin解毒機構- 菌体への高いtolaasin吸着能- 菌体でのtolaasin加水分解反応＝tolaasin解毒能

病原因子の生分解＝薬剤耐性菌の出現の可能性がない→持続可能なきのこ栽培法における防除法として期待

謝辞
共同研究者
篠原 弘亮 教授

東京農業大学 農学部 農学科

富田 駿 博士

産業技術総合研究所（東京農業大学大学院農芸化学専攻）

有馬 忍 博士

大分県農林⽔産研究指導センター

農芸化学科教員五十君

靜信 教授 梶川揚申 教授

辻井 良政 教授

農学部 農学科 植物病理学研究室の皆さん
応用生物科学部 農芸化学科 応用微生物学研究室の皆さん

須恵 雅之 准教授

本発表関連の業績【学術論⽂】
1. Insights into detoxification of tolaasins, the toxins behind mushroom bacterial blotch, by Microbacterium
foliorum NBRC 103072T. Shun Tomita, Akinobu Kajikawa, Shizunobu Igimi, Hirosuke Shinohara, Kenji Yokota.
PhytoFrontiers. 2021
2. Adsorption of Tolaasins, the Toxins Behind Mushroom Bacterial Blotch, by Microbacterium spp. is Insufficientfor Its Detoxification. Tomita S, Hirayasu A, Kajikawa A, Igimi S, Shinohara H, Yokota K. Curr Microbiol. 2020
Jun;77(6):910-917. doi: 10.1007/s00284-020-01884-w
3. Detoxification process of tolaasins, lipodepsipeptides, by Microbacterium sp. K3-5. Tomita S, Sue M, Kajikawa
A, Igimi S, Shinohara H, Yokota K. Biosci Biotechnol Biochem. 2018 Aug;82(8):1455-1458. doi:
10.1080/09168451.2018.1460575
4. 栽培シイタケの細菌叢解析とトラシン解毒細菌の分離およびPseudoxanthomonas属細菌のトラシン解毒機作. 横田健治, 七海隆之, 富田 駿, キム オッキョン, 根岸寛光, 篠原弘亮. 日本きのこ学会誌 25(4) 129 – 133 2018
【解説】
きのこを褐変化させる毒素tolaasinを解毒する細菌 横田健治・富田駿・篠原弘亮 バイオサイエンスとインダストリー
79 ( 3 ) 214 - 215 2021年05月【受賞】
富田 駿 2019 (平成31) 年度 日本植物病理学会 学生優秀発表賞