解 説
生物細胞の低温 X 線回折イメージング
中迫雅由1,2，高山裕貴1,2,，小林 周1,2，山本隆寛1,2，大出真央1,2，
岡島公司1,2，苙口友隆1,2，山本雅貴2
1慶應義塾大学理工学部物理学科〒2238522

神奈川県横浜市港北区日吉 3141

2理化学研究所播磨研究所放射光科学総合研究センター放射光利用システム開発研究部門〒6795148
現所属

要 旨

兵庫県佐用郡佐用町光都 111

兵庫県立大学大学院物質理学研究科

X 線光学分野〒6781297 兵庫県赤穂郡上郡町光都 321

X 線回折イメージングは，結晶化が原理的に不可能な生体非結晶粒子の立体構造解析に適した手法である。回折パ

ターンからは，入射 X 線方向への粒子の投影構造が得られ，さらに，トモグラフィー実験によって三次元電子密度を再構成できる。X 線の透過性により，電子顕微鏡では観察できない500 nm 以上の大きさを持つ生体粒子の内部構
造全体を，超解像顕微鏡を超える分解能で観察可能である。本稿では，X 線回折イメージングによる細胞などの三次元構造解析に焦点を当てながら，現在の実験及び解析方法の到達点を示す。

期の染色体形成メカニズムには，依然として不明な点が多

1. はじめにい4)。また，細胞内での化学信号伝達が分子衝突のみで行

大きさ 1～10 mm 程度の生物細胞は，高度かつ多階層的われているのか，あるいは，予め生体分子が集積された形に組織化された細胞内小器官で構成され，その機能空間内で進行するのかといった素朴な問題も未解明である。細胞には生命現象の素過程を担う生体分子が集積されている。

や細胞内小器官全体を，加工や修飾なしに，数十 nm の解

現代生物学は，遺伝子産物である生体分子の機能，構造，

像度で可視化できるイメージング技術があれば，これらのダイナミクスや細胞内動態を可視化することで，様々な時問いに答えることができる可能性がある。

空間階層についての理解を進め，細胞における生命現象発

本 稿 で 取 り 上 げ る X 線 回 折 イ メ ー ジ ン グ （ X-ray

露のスキームを理解しようと発展してきた。その過程で，

diŠraction imaging: XDI）は，1999年に実証実験がなされ蛍光顕微鏡や電子顕微鏡などのレンズを用いるイメージン

た新しい構造解析法である5,6) 。 XDI 実験では，高い空間グ手法が大きな貢献をなしてきた。

コヒーレンスを持つ X 線（理想的には，単色平面波）を

蛍光顕微鏡やその発展型である超解像顕微鏡では，特定試料粒子に照射し，高い空間分解能を持つ検出器で得られの生体分子に結合させた蛍光色素分子や蛍光蛋白質からのる回折パターンの構造振幅から，反復的位相回復法7)を用

蛍光発光を観測し，測定イメージに対する演算を通じて回

いて，粒子の入射 X 線方向への投影電子密度を復元する

折限界を超えた測定が可能となっている1) 。しかしなが（ Fig. 1 ）。 透過性の高い 短波長 X 線 を用いる場合 ， XDI

ら，蛍光分子ラベルした数種類の標的分子の位置のみが高は，電子顕微鏡の適用範囲を超えた厚みをもつ細胞丸ごとい解像度で得られるものの，細胞全体を同じ分解能で眺めの三次元構造を，非侵襲かつ光学顕微鏡で到達不可能な解ているわけではない。透過型電子顕微鏡では， 200 300

像度で可視化できる可能性がある8)。

keV の運動エネルギーを持つ電子を試料に照射し，弾性

現在，コヒーレント X 線は SPring8 のような第三世代

散乱電子波を結像させることで，試料の実像を得る2)。しシンクロトロン放射光施設や X 線自由電子レーザー（ X-

かしながら，電子線の透過性は低く，また，多重散乱を起ray free electron laser: XFEL）施設で利用することができこしやすいため，信頼のおける試料の厚さは 100 nm 程度

る よう にな った 。シ ン クロ トロ ン放 射光 （ synchrotronとなっており，細胞の内部構造を観察する場合には，架橋

radiation: SR）を用いる実験では，試料を低温に保つこと剤処理した細胞をレジンなどで固定後，超薄切片化する必で放射線損傷を低減しながら，トモグラフィーによって細要がある3)。

胞一個の三次元構造を 100 nm を超える分解能で可視化でこれら洗練されたイメージング手法を用いても，直接観きる9) 。また， XFEL を用いる場合には，試料が XFEL

察が困難な空間階層が存在する。例えば，細胞核内での核パルスで破壊されるものの10) ，入射 X 線に対して様々な酸の格納形態を数十ナノメートル分解能で直接可視化する配向にある試料粒子を大量に用意し， XFEL パルスに対ことは現在でも困難であり，核内での核酸分布や細胞分裂

して試料粒子を次々に投入することで，それら粒子に共通

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 189(C) 2018 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

F(S)は，構造振幅 |F(S)| と位相 a(S)で記述されるが，実験では回折強度しか観測できないため，構造因子の逆Fourier 変換によって電子密度分布を再構成するには，測定で失われた位相を知る必要がある（構造解析における位相問題）。また，双極子放射は見かけ上弾性散乱であり，入射伝播ベクトルと散乱伝播ベクトルの大きさが等しくなるため，観測される回折パターンは，逆空間の半径 1 / lの反射球（ Ewald 球）と交差する強度分布に限られる。
単色 X 線を用いる実験では，試料を入射 X 線に対して回転することで Ewald 球と逆空間強度分布の交差を変化させて，強度分布を測定する。

2.2
Fig. 1(Color online) A Schematic illustration of XDI experiment.
A spatially isolated specimen particle is irradiated by X-rays
with the high spatial coherence. A beam stop is placed in
front of an area detector to absorb the direct X-ray beam.
The diŠraction pattern is composed of a number of speckle
peaks. The sizes of speckle peaks are approximately thereciprocal of particle sizes viewed along the direction of theincident X-ray beam. The magnitude of scattering vector isdeˆned as S＝2 sin u/l.

入射 X 線強度と分解能

古典電子半径に由来する試料の散乱断面積の小ささを克服するには十分な強度を持つ入射 X 線を用いる必要がある。現在，生物細胞試料について50 nm 程度の分解能までのスペックル回折パターンを得たい場合，数十～数百秒の露光が可能なシンクロトロン放射光実験では，数ミクロン
サイズの細胞を，またシングルショットで粒子が壊れてし
ま う SACLA で は ， 集 光 XFEL 強 度 と パ ル ス の 断 面 積（半値幅で 1.5 mm 程度）の制限から，～ 1 mm 程度の粒子が必要となっている。

な三次元電子密度分布を描き出すことができるようになっ

XDI 実証実験に続いて，2001年に，XFEL と XDI を組ている11) 。本稿では，我々が過去 10 年にわたって独自にみ合わせることで蛋白質分子の単粒子構造解析が可能にな

開発してきた技術及び解析手法8) を用いた， SR XDI やる と い う シミ ュ レ ー ショ ン が 報 告 さ れた12) 。 同 論文 で

XFELXDI による生物細胞構造解析の現状を紹介する。

は，入射 X 線強度に関する記述があいまいであったことから，今日でもなお， XFEL を用いて蛋白質分子の単粒

2. XDI による細胞の三次元構造解析
2.1

XDI 実験8)

子解析が可能と考える研究者がいる。ここでは，その可能性について検討しておきたい。波長 0.1 nm ，オーバーサ
ンプリング比 4 の条件下で，分子量 30 万の蛋白質分子複単色平面波 X 線を物質に照射すると，その電場によっ

合体（サイズ10 nm）の構造解析を可能とする回折パターて物質内の電子が振動運動し，入射 X 線と同じ波長の X

ン取得に必要な入射 X 線強度を，式( 1 )を用いて見積も線が生じる（双極子放射)。双極子放射波（散乱波）は，る。複合体の総電子数は 2 × 105 程度であり，距離を 1 とMaxwell 方程式の線形性に従って足し合わされ，照射領した前方散乱強度は，域の物質内電子密度分布に起因した‘スペックル（speckle）’と呼ばれる細かな干渉縞が生じる（Fig. 1）。波長 l，

強度 I0 の単色平面波 X 線を試料に入射した場合，試料から十分遠い距離 R において，回折角 2u の散乱ベクトル S

I(0)＝I0(2.8×10－6 nm)22 1
0.1 nm×0.1 nm
2×105
4×10 nm×10 nm
nm2

|

|

＝I0×7.84×10－6で観測される回折強度 I(S) は，次式で与えられる。
となる。この分子の立体構造を 0.2 nm 程度の分解能で解2(slA) F(S)F(S) RP
F(S)＝ r(r) exp (2piS･r)d r＝|F(S)|exp[ia(S)] (1)f
I(S)＝I0r 2e23

析する場合を考える。散乱強度が蛋白質を構成する原子の原子散乱因子の散乱角依存性に起因して，高い分解能で回折強度が大きく減衰することから，前方散乱では 106程度の X 線が望まれる。これを実現するには，分子 1 個の断面積100 nm2 に1011以上の入射 X 線光子（1011/100 nm2＝は古典電子半径（2.8179×10－15 m），s は後述

1015 / 106 nm2 ） が 必 要 で あ る 。 現 在 ， SACLA の BL3するオーバーサンプリング比，P は入射波の偏光因子であEH4 で利用できる光子数は 1010 / 106 nm2 程度なので，試

ここで，reる。 F ( S )は構造因子で， X 線照射野にある粒子の電子密料に入射する X 線光子数を 5～6 桁増強させることが必要

度 分 布 r ( r ) の Fourier 変 換 と し て 表 さ れ る 。 構 造 因 子になる。そのため，現状，巨大な蛋白質や蛋白質複合体の

190 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

解説 ■ 生物細胞の低温 X 線回折イメージング

構造解析は，近年大きな発展を遂げた透過型電子顕微鏡をs ＝ s xs y＞ 2用いて行うことが主流となっている。

( 4)

単純に光子数を増強させるだけではなく，超強光子場による 原子損 傷に ついて も配 慮する 必要が ある 。現 状のであれば，中心対称性に起因する情報欠落を補って，投影

XFEL を用いる結晶解析においては， XFEL 照射で得ら電子密度を得ることができる。この条件を oversampling

れる回折パターンから予想される原子散乱因子が理論値に（OS）条件，s を OS 比と呼ぶ15)。

比べて小さいという指摘がある13)。完全な DiŠraction be-

XDI の構造解析では，OS 条件で得た構造振幅に反復的

fore destruction 実現のためには，現状の 10 fs 程度より十

位相回復アルゴリズム7)を適用することで投影電子密度を分に短いパルス幅が必要になるであろう。波長 0.1 nm の再生している。同アルゴリズムでは，実空間と逆空間を

10 fs パルスの場合，古典的には，約 3000回の電子振動に

Fourier 変換と逆 Fourier 変換によって交互に往来しながよる双極子放射が発生しているが，パルス幅を極端に短く

ら，算出された投影電子密度や構造振幅に拘束条件（con-

した場合，そもそも Thomson 散乱が起こるのかという時

straint）を課して投影電子密度を回復する。計算された投間幅にまで達するかもしれない。

影電子密度の中で粒子が存在する領域（ support ）に対する拘束条件のかけ方が異なるアルゴリズムが提案されてい2.3

位相回復の概要

る。本来，粒子のみが電子密度を持つため，粒子投影像形細胞などの XDI 実験では， Ewald 球を平面と見做すこ状を support とすることで位相回復速度や精度の改善が見とができる極小角領域で回折パターンを記録しているの込まれる。この点を積極的に考慮したのが Shrink-wrap

で，構造振幅と電子密度の間には，投影定理14) が成り立（SW）アルゴリズムである16)。我々の場合，hybrid-input-つ。投影定理によれば，三次元電子密度の投影像の二次元

output（ HIO）アルゴリズム7)による反復的位相回復計算

Fourier 変換は，逆空間原点を通過する一断面となる。

サイクル中で SW によって動的に最適サポート領域を更新する位相回復プログラムを用いている17)。

frP(x, y) exp [2pi(Sx x＋Sy y)]dx dyF(Sx, Sy, Sz＝0)＝

x, y

f

rP(x, y)＝r ( x , y , z) d z(2)z

回折強度が弱くノイズを多く含む生体粒子等の回折パターンからの位相回復の確からしさを向上させるため，
Oversampling smoothness（ OSS）アルゴリズム18)が考案された。このアルゴリズムでは，ノイズの影響を排除するために，散乱ベクトル長が大きいほど強度が減衰するよう

よって，逆空間原点を通り入射方向に垂直な平面の構造因なフィルタを施し，ノイズが少ない低角領域に重みをもた子 F( Sx, Sy)は，試料粒子内電子密度分布 r (r)を入射方向せる。位相回復サイクルの初期段階では HIO アルゴリズ(Sz)に投影した電子密度 rP(x, y)の Fourier 変換となる。

ムと似た処理を施し，サイクルが進むにつれてフィルタをビーム照射野に完浴された試料粒子の投影電子密度 rP変化させる。

( x, y )を Nx × Ny ピクセル（ピクセルサイズ，あるいは解像度 Dx, Dy ）で書き表す場合，散乱ベクトル（ Sx, Sy）で指定される検出器上の任意ピクセルで観測される構造振幅

2.4

位相回復投影電子密度の選択実験で得られる回折パターンには，ビームストップによる前方散乱とその周辺スペックルの欠損，強い回折 X 線

はに対する検出器の飽和，X 線検出における Poisson ノイズ|F(Sx, Sy, Sz＝0)||

Nx－1 Ny－1＝ ∑ ∑ rP(x, y) exp
x＝ 0

y ＝0

が生じている。このため，一度の位相回復計算で得られる[2pi(S Nx ＋S Ny )]DxDy| (3)
x

y

x

y

電子密度は，必ずしも正しいものであるとは限らない。そのため，実験で得られる回折パターンに対しては， 1000
回程度の独立した位相回復計算を行い，その中から最も確と与えられる。いろいろな（Sx, Sy）で構造振幅を測定し，からしいものを選択する必要がある。

連立方程式数（検出器ピクセル数）が Nx×Ny 以上であれ
ば， rP (x, y )を求めることができる。試料粒子に異常散乱

2.4.1

主成分分析と分類19)原子が含まれないか，あるいは，その吸収端から遠く離れ

反復的位相回復で得られた投影電子密度が L × M ピク

たエネルギーをもつ X 線を用いる場合，回折パターンのセルの画像である場合，各ピクセルの電子密度を変数とす

Friedel 対称性（|I(S)|＝|I(－ S)|）によって，方程式数れば，一枚の投影電子密度は J＝ L×M 次元の画像超空間(N ×2 N )となる。これに対して，回折パターンを，の一点として表現できるので，独立した位相回復計算で得

は

x

y

Sx 方向に sx(sx＞1)倍かつ Sy 方向に sy(sy＞1)倍で測定す

た N 枚（通常 1000枚）の画像は，ピクセル番号を列，画像番号を行とする行列で表現される。

る場合，

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 191 c11 Q c1 J 

C＝ R U R
cN 1 Q cN J



( 5)

この行列に対する主成分分析により，低次元主成分空間での電子密度図の分布を可視化し，K-means clustering 法によって電子密度図を分類後，最もふさわしいものを選択する（Fig. 2(a)）。
実験で得られた回折パターンについては，まず，確からしいサポートを探すべく，独立した HIOSW 位相回復計
算で得られる 1000 枚の投影電子密度に対して上記の多変量解析プロトコルによって，最も確からしいサポートを定める。次に，このサポートに対して OSS による1000回の独立した位相回復計算を行い，多変量解析プロトコルによって尤もらしい内部構造を探索する。二段階の解析では，
計 2000 回におよぶ位相回復計算を行う。分類されたクラスの中から，スペックルパターンから推定される粒子サイ
ズ，結晶学的 R 因子，phase retrieval transfer function（ PRTF ）やクラスを構成する画像数等を頼りに，細胞試料らしいものを選択する。

2.4.2

Manhattan 距離を用いる電子密度図の選択20)

主成分分析とクラスタリングによる電子密度図を分類しても，指標が良好で出現頻度が高いクラスが必ずしも正し
い電子密度図を与えるわけではない。このため，多変量解
析は，回復された電子密度図の分類には適するが，最終的な成否の判定を自動で行うには難がある。
以下の規格化された Manhattan 距離（以下では，単にManhattan 距離と呼ぶ）が位相回復の成否を判定するのに有効であることが明らかになり，生体粒子の回折パター
Fig. 2(Color online) (a) A result of the multivariate analysis for
1,000 projection electron density maps retrieved from a
diŠraction pattern of ten gold colloidal particles with the diameter of 250 nm. After principal component analysis, eachdensity map is represented as a point in the plane spanned by
the two principal components (black dots). Among threemajor clusters labeled a, b, and g, only cluster a give the correct projection electron density maps. The red dots indicate
maps selected by the Manhattan distance analysis in panel(b). (b) The Manhattan distance of 999 projection maps
calculated for a most probable one. The red dots indicate theManhattan distance values of correct maps shown in the inset, while the black dots are those of failed calculations. In
most cases, the retrieved maps with the Manhattan distancesmaller than 0.2 are probable. When the maps wererepresented in the plane of the two principal components inpanel (a), they overlap to the most probable cluster a.
Panels are reused from [doi: 10.1107/S1600577517008396]
after modiˆcation with permission from The International
Union of Crystallography

ンからの位相回復にも適用されつつある。二つの投影電子密度に対して Manhattan 距離は以下のように定義される。

∑|ri(x, y)－rj(x, y)|
Tij＝

x, y

|

∑ ri(x, y)＋rj(x, y)
x, y

|

( 6)

これは，二つの電子密度を構成するピクセルごとに，電子密度の差異を足し合わせ，二つの電子密度図の総電子数で規格化したものである。
個々の形状やサイズが予め判っている金属材料粒子のクラスターからの回折パターンに対して位相回復を行ってみると，正しい電子密度同士の Manhattan 距離は0.2以下の値となるのに対して，間違った電子密度図同志，あるいは，正しい電子密度図と間違った電子密度図の組が与える
Manhattan 距離は， 0.4 0.9 の大きな値になることが経験的に明らかになった。これは，ほぼ正しい位相の組から計算される投影電子密度は相互に類似しているが，不正解の192 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

解説 ■ 生物細胞の低温 X 線回折イメージング

投影電子密度は大きく異なることを示唆している（ Fig. 2

れる Fourier Shell Correlation（FSC)14)

(b)）。
)･F 
)
Re ∑ F1(S ′2(S ′通常，二つの電子密度の相似性を評価する場合，相関係数を用いることが多い。相関係数は，画像空間における画∈S
S′

FSC(S)＝|| |∑ F1(S ′)像点を表現する多次元ベクトルの内積に相当しており，細

∈S
S′

2

|

∑ F2(S ′)

∈S
S′

2

( 7)

かな電子密度図の差異よりは，ベクトルの向きが似ているかどうかを反映している。それに対して， Manhattan 距を用いる。 F1( S ′)， F2 ( S ′)は，データを二分割して再構

離は，電子密度の細かな差異を反映し，相関係数が高い場成される二つのモデルの三次元構造因子である。FSC(S)合でも異なる画像として認識できると考えられる。多変量が 0.143 （＝ 1 / 7 ）となる S を分解能とする場合が多い。

解析で次元削減された主成分ベクトル平面から選択される

これは位相の不確か さが 60 度程度であることに対応す確からしい電子密度図の集団と，小さな Manhattan 距離る24)。

を与える組がほぼ一致することから（ Fig. 2 ( a )），一つの回折パターンに対する多数回の位相回復電子密度について
相互に規格化された Manhattan 距離を計算すれば，正しい電子密度の組を自動で推定できるであろう。

3. 低温 XDI 実験用凍結水和試料作製
3.1

低温 XDI 実験はなぜ必要か？

XDI は，室温下真空中に置かれた細胞やオルガネラの2.5

三次元電子密度の再構成

構造解析に適用されてきた25,26)。散乱断面積の小さな細胞試料粒子が，入射 X 線に対して，その特徴的構造を眺

等の生体試料に対する X 線回折実験では，試料を真空中めることのできる特別な配向にある場合，試料の三次元構に設置し，空気からの散乱や空気による吸収を低減させる造について何らかの推定をなすことは可能である21,22)。しことが要求される。しかし，真空中に置かれた生体粒子

かしながら，そのような特別な場合を除いて，粒子の立体は，乾燥，低圧下の発泡や断熱膨張などにより，生来の構構造に言及するには，三次元電子密度が不可欠である。こ造破壊が生じる可能性が高い。さらに放射線損傷を受けるのために，入射伝播ベクトルに対して様々な配向にある粒ために，得られた電子密度分布に生物学的価値があると考子の回折パターンを多数取得する必要がある。最初に提案えるのは難しい。室温湿潤環境下での測定も試みられていされた XDI での構造解析では，逆空間での三次元 OS 比るものの27) ，放射線損傷による二次的破壊産物を見るこを満足できる空間分解能で構造振幅分布を再構成して三次とになる。このような問題を克服するには，試料粒子を非元反復的位相回復にて粒子の三次元電子密度を再現できる

破壊的に低温凍結し，低温下で回折実験を実施可能な回折とされていた12)。

装置や試料作製方法の開発が必要である。

我々は，スペックルパターンが，試料の微細な変化に頗

蛋白質の低温 X 線結晶構造解析や電子顕微鏡観察で示る敏感であることを考慮して，各回折パターンから投影電されてきたように，急速凍結によって，水和凍結状態の生子密度を回復し，電子顕微鏡で開発された単粒子解析14,23)体粒子試料が作成できることから，水和凍結試料を作成すを用いて三次元電子密度を再構成するという手順も提案しれば，低温真空環境で回折実験を行える。医学分野での凍ている17)。SR トモグラフィー実験では，単一の試料粒子

結保存細胞を用いた人工授精や，分子生物学分野での細胞を回転させながら回折パターンを得，それぞれの回折パ

凍結保存などで明らかにされているように，凍結細胞が室

ターンについて位相回復によって投影電子密度図を得，従温に戻ると，生命活動を再開できることから，急速凍結は

来の三次元位相回復法や back-projection 法14) を用いて三細胞の生命活動を一時的に停止していると考えられる。細

次元電子密度図を再構成する。

胞は，時々刻々その構造や形態を細胞周期に応じて変化さ試料粒子が一度の照射によって破壊されてしまう

せているので，低温凍結は，特定の状態にある大量の細胞

XFELXDI 実験では，粒子の均一性を担保したうえで，の活動を一時停止して XDI 実験に供するには頗る有効な試料粒子を薄膜上に散布後，スキャンによって回折パター方法であると言える。

ンを得る（5.2参照）。粒子の薄膜上での配向はランダムであると考えられるので，どの方向から粒子に X 線が照射

3.2

湿潤環境下での水和凍結試料作製されたのかを common line 法14)によって決定して Fourier

生体試料粒子は大きくても10 mm であるため，試料作製

Reconstruction 法14) などで三次元像を再構成する。一度時の乾燥防止措置は極めて重要である。これまでに開発しの試行で得る初期モデルはかなり大雑把なものであるため，た蛋白質結晶用の湿度制御技術28) を拡張し，湿度制御空projection matching 法14) などによって配向を精密化し，気環境下で，試料粒子を取り扱いながら低温凍結可能なシ同様な処理で新たな三次元構造を再構成するサイクルを繰

ステムを構築した29) （ Fig. 3 ( a )）。窒化珪素膜のような薄り返す。

膜に試料粒子を吸着させ，余剰な溶媒をブロッティングと再構成された電子密度図の有効分解能は，以下で定義さ

湿度制御下での蒸散によって最小化し，試料の乾燥を防ぎ

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 193

ながら液体エタン冷却装置によって粒子試料を薄膜ごと急速凍結する。試料粒子担体として使用する窒化珪素膜は疎水性が高く，細胞等を十分に吸着できないため，真空蒸着装置を用いて炭素薄膜を成膜後，ポリリジン層を塗布して，細胞試料への親和性を高めておく（Fig. 3(b))30)。
トモグラフィー実験用には，試料粒子一個をマイクロキャピラリーに吸引し，シリコンフレームに張られた窒化珪
素薄膜の中心付近に置く。余剰な溶媒を微細な濾紙やマイクロキャピラリーで取り除き，さらに，相対湿度を下げて，余剰な水分を蒸散させ29) ，実験での試料位置確認を容易にするために，シリコンフレームに対する相対位置を記録する。もともと，試料溶媒の緩衝液濃度は低いので，これによって細胞試料等が浸透圧変化で収縮することは無い。ただし，培養温度と作業を行う温度での温度差による細胞の劣化を防ぐために，細胞を作業温度で培養して，予め馴らしておく必要がある。 XFEL XDI 実験では，試料粒子の懸濁液を薄膜上に滴下し，粒子がポリリジン層へ吸着したころを見計らって余剰な水分を除去する。試料板周辺の 湿度 を KCl 溶液等 で保 ちなが ら特 製シ ャーレ に移し，スピンコーターで余剰な液を除く方法が簡便で迅速である。
試料の冷却では，薄膜を含む試料板全体を冷却するので，低温窒素ガスに比べて冷却速度が勝る液体エタンを用いる（ Fig. 3 ( c )）。液体エタンは，温熱物体を入れても発泡せず，熱伝達率が高い。冷却効率は投入速度に依存し，リニアガイドを用いて 1 m / s 程度の速さで試料を液体エ
タン中に投入すると， 200 K / 10 ms 程度の冷却速度が得られる。急速凍結やその後の試料取り扱いでは，エタンの凝固点（ 90 K ）が液体窒素温度よりも高いことや，デュワー内での温度分布などに注意を要する。凍結後は，試料を液体エタンから持ち上げ，動作距離が長い望遠鏡を用いて試料の凍結状態を確認する。凍結した試料板は専用の塩化ビニル製保存容器に挿入して保存するが，試料保存室
は，試料板の薄膜面が接触壁面に接触することが無いように加工する（Fig. 3(c)）。

3.3

回折装置真空槽への搬送8,31,32)

XDI 実験では，次項以降で述べる低温試料固定照射装置を利用している。装置は，試料を大気中から10－4 Pa 程Fig. 3(Color online) (a) A system for preparing specimens for
XDI experiments at cryogenic temperature. The system iscomposed of humidity controlling chamber (1), lightmicroscopy (2), moist air generator (3), monitors (4, 5)
and liquid ethane cooling device (6). (b) The humidity controlling chamber is composed of a tube supplying moist air(7), micro-injector mounted on a micro-manipulator (8),pincette (9), pincette carrier (10). The inset illustrates the
specimen preparation for XFELXDI experiments. (c) A‰ash-cooling device. A pincette (9) ˆxed to a slider isplunged into liquid ethane (11) produced inside an aluminum cup cooled by liquid nitrogen (12). Cooled specimen
disks are put into storage container (13) in liquid nitrogen.

194 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3度に保たれた回折装置の真空槽へ搬入するため，ロード
ロックチャンバーを備えている31,32)。凍結試料は，液体窒素中で専用ホルダーに固定し，液体窒素中からロードロックチャンバーへの移動では，昇温と結霜を避けるための専用キャリアーを用いる31,32)。キャリアーは，運搬用フレームと，フレーム内への外気の侵入を防ぐ遮蔽で構成され，遮蔽を液体窒素中や真空中で開放操作して，ホルダーの着脱を行う。液体窒素中で試料ホルダーを装填後に遮蔽を閉じたキャリアーを，大気開放状態のロードロックチャンバーに設置する。チャンバー内を真空にし，結解説 ■ 生物細胞の低温 X 線回折イメージング

露の心配がなくなったところで遮蔽を上げ，真空槽とチャして少しずつ回転させながら回折パターンを露光して（トンバー間のゲートバルブを開放し，直線導入機を改造しモグラフィー），各配向での回折パターンを得ることで細た搬送ロボットが，試料ホルダーを低温試料ステージに搬

胞の三次元電子密度を再構成する。

送設置後退する31,32)。

4.1

4. 放射光 X 線を用いる低温トモグラフィー
XDI 実験8,31)

低温試料固定照射装置8,31)

同装置の真空槽内には，液体窒素を溜めて試料を低温に保つための低温ポット，低温ポットの回転と並進制御を行
うための精密ゴニオメーター（回転軸上に水平二軸と垂直

ここでは， SPring 8 の BL29XUL33) での低温試料固定

一軸で構成），大気中から真空中に冷却試料を結露や温度照射装置『壽壱号』31)を用いた低温トモグラフィー XDI 実

上昇なしに真空槽内に輸送するためのロードロックチ

験を紹介する（Fig. 4）。実験では，試料を低温に保つことャンバーと直線導入機，低温ステージに液体窒素供給するにより，放射線損傷を大きく低減しながら，一個の細胞試

デュワー，上流光学系からの寄生散乱を低減させるための料を長時間測定できる。そのため，試料を入射 X 線に対二組のシリコン製スリット，試料位置を視認するための望Fig. 4(Color online) (a) A view of experimental setup for tomography XDI at BL29XU of SPring8. Devices from theleft (upstream) to right (downstream) are a chamber of pinhole to produce spatially coherent X-ray beam (1),
KOTOBUKI1 diŠraction apparatus (2), vacuum pipe (3), a chamber of beam stop (4), and a pixel array detector (5). (b) Inside the vacuum chamber of the apparatus, a cryogenic pot (6) is mounted on a goniometer.
Liquid nitrogen is supplied by a cupronickel capillary (7) and evacuated from the pot through a ‰exible tube (8)connected to a vacuum pump outside the vacuum chamber. A cooled specimen holder (9) is delivered from aload-lock chamber to the pot by using a transfer rod with claws and folk at the tip (10). Parasitic scattering fromupstream optics are reduced by a slit placed near the specimen (11). (c) A diŠraction pattern from a single bacteria cell. The upper right panel shows a projection electron density map retrieved directly from the diŠraction amplitude alone. By applying the single particle analysis for more than 100 projection maps, the three-dimensional
structure of a bacteria cell is reconstructed at a resolution of 130 nm (lower right). The scale bar indicates 1 mm.

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 195

遠鏡二台， X 線ビームに対して装置全体を位置調整するための定盤から構成されている（ Fig. 4 ( a )）。低温ポット可能である。
一例として，分裂期にある真核細胞バクテリアからの回に液体窒素を供給するキュプロニッケルキャピラリー管

折パターンを示す（ Fig. 4 ( c )）。個々のスペックルが明瞭

や，外部の真空ポンプに接続してポットを減圧するためのに分離できており，高い空間コヒーレンスを持つ X 線を

フレキシブル排気パイプは，回転に伴うストレスがポット入射できたことが判る。寄生散乱の除去と小さなビームスと配管の双方に伝わらないように渦巻き状にポット周辺にトップを用いて，極小角までの回折パターンを得ることが配置してある。

できるので，比較的容易にその場で正解像を回復できる。
図に示した約 130 nm 分解能での電子密度には，葉緑体や4.2

光学系の調整8)

実験では，回折強度の入射 X 線波長依存性や検出器の核に由来すると考えられる電子密度が見いだされた。
投影電子密度一枚では，細胞内の構造を十分に議論する

量子効率を考慮して，エネルギー 5.5 keV の X 線（波長

こ と は 困 難 な た め ， ト モ グ ラ フ ィ ー CXDI 実 験 に よ っ0.225 nm ）をモノクロメーターによって選択し，モノクの範囲て，三次元電子密度を得る。低温ポットは± 170 °

ロメーターからの高調波を 2 枚の X 線ミラーによって低で回転可能であり，1.5°
ないし 3°の角度ステップで回折パ減する。SPring8 で得られる X 線は，ほぼカオス光であターンを収集することで， 100 nm 程度の分解能で三次元る た め ， 試 料 位 置 上 流 約 1.95 m に ， 直 径 38 mm の ピ ン

電子密度の再構成に成功している35) 。得られた三次元電ホールを設置し，そこから得られる回折パターン中心付近

子密度図には，核や葉緑体に対応する 3 つの房が認めらの波面が揃った（高空間コヒーレンス）領域に試料を置いれた。さらに高分解能の回折パターンを取り込んで細胞丸て回折パターンを収集する31) 。ビームプロファイルと波ごとの構造を50 nm 以上の分解能で議論できると期待され面の様子は，予め， Fresnel-KirchhoŠ 積分方程式34) を用ている。

いて予測し，ナイフエッジスキャンでビームプロファ

シンクロトロン放射光を用いた構造解析における分解能

イルを測定して，高コヒーレンス領域を見定める。生体試の限界について議論がなされており，その限界は10 nm で料の実験に先立ち，立方体形状の酸化銅粒子からの回折パあろうとされている36) 。現在の実験条件では， 6 mm サイ

ターンを露光し，ピンホールで得られる X 線ビームの空

ズの細胞について， 2700 s 露光で 20 nm を超える領域ま間コヒーレンスを確認する。

でスペックルパターンを得ることができるので，今後，そ測定領域は極小角散乱であるため，ダイレクトビームの限界に迫れる可能性がある。

近傍のバックグラウンドおよび上流光学系からの寄生散乱を二組のスリットで低減する。試料位置で 3.1 × 109 X 線
光子/ 20 mm2 / s 程度の X 線強度を利用できるが，この X
線強度では，後述のトモグラフィー実験での試料の放射線

5. X 線自由電子レーザーを用いる低温
CXDI 実験8)

損傷は十分に 小さい。カメラ 長は約 6 m であり， 1 × 1

SR 光とは異なり，XFEL パルスは超強光子場であるた

mm2 角のビームストップをピクセルアレイ検出器 EIGER

め，パルス通過後には原子内束縛電子が剥ぎ取られ，残さ( Dectris 社) の前に置くことで， 0.22 mm－1 （実空間分解

れた原子核間の静電反発によって原子団がクーロン爆発を

能 4.4 mm ）から 50 mm－1（ 20 nm ）までの回折パターンを起こす10)。101011 photons/4 mm2/pulse 程度の X 線を用い記録する。

る SACLA での CXDI 実験では，形状既知粒子の回折パ
ターンから予想される電子密度が回復されるため，電子が4.3

トモグラフィー XDI 実験8)

双極子放射を生じ，原子が壊れる前に回折が生じる

試料作製時に顕微鏡下で記録した試料位置を頼りに，動と考えられる37)。このように，（diŠraction before destroy）

作距離の長い望遠鏡で視認しながら，低温ポットに搬送さ

XFEL を用いた XDI 実験は破壊的測定であるため，試料れた試料板上の試料粒子をビーム位置に移動させる。ス粒子を順次照射野に投入し， 30 Hz で供給される XFEL

テージを鉛直及び水平方向にスキャンしながら 1 秒露光

パルスを漏らさずに利用できる回折装置が必要となる。得

で回折パターンを得，最適な露光位置を決定して構造解析られる回折パターンからは，試料粒子個々の投影電子密度

用露光を行う。試料高さでのゴニオメーターの回転に伴うが得られるが，それらから再構成される三次元電子密度

回転軸由来の揺動を考慮し，1.5～3.0度程度の回転毎に，は，多数粒子の平均構造となる点が， SR XDI 実験とは最適な露光位置に試料を置くことを繰り返す。露光時間は異なる。

試料粒子サイズに依存するが， 6 mm 程度の細胞 1 個の場
合，60 s（ 5 s 露光 12 frames）で， 1/30 nm－1 分解能まで

5.1

回折装置8,32)のスペックルパターンを信号対雑音比 3 以上で露光して我々は XFELXDI 実験用低温試料固定照射装置『高砂いる。 6 mm 程度の細胞を 600 秒露光した場合には， 1 / 20六号』78) を開発実用化し， SACLA の BL338) EH4 にて

nm－1 分解能までのスペックルパターンを記録することが実験を行ってきた（ Fig. 5 ( a )）。この装置は，基本的に壽196 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

解説 ■ 生物細胞の低温 X 線回折イメージング

壱号と同様な構成であるが， 30 Hz で供給される XFEL
パルスをもれなく利用するために，低温ポットは，最大50 mm / 33 ms の 速 さ で の ス キ ャ ン が 可 能 な 高 速 並 進 ス

テージに搭載されている。また，真空槽への試料交換回数を減らすため，低温保持しながら一度に 12 個の試料ホル
ダーを真空槽内に設置できるコンテナーを用い，真空槽内にはコンテナーを常に液体窒素温度程度に保つための専用
低温ポットを設置してある（Fig. 5(b)）。
X 線回折パターンは 2 台の MPCCD 検出器39) で記録する。生体粒子試料からの回折パターン記録には広いダイナ
ミックレンジが要求される。そのため，1 台の検出器を試
料下流 1.6 m に設置して広角領域の回折パターンを記録
し，もう一台の MPCCD 検出器を3.2 m 下流に設置し，その直前に 2.5 × 2.5 mm2 のビームストップ，アルミニウム
製アテネーターの順に設置して，極小角領域の回折パターンを記録している（ Fig. 5 ( a )）。この構成により，検出器
単体では狭いダイナミックレンジを拡大している32)。

5.2

光学系調整8,31,32)

エネルギー5.5 keV の X 線（波長0.225 nm）を，KB ミ
ラ ー に よ っ て 約 1.5 mm × 1.5 mm 程 度 の サ イ ズ に 集 光 して40)，試料粒子に照射する。X 線強度は 1010 photons/2×
2 mm2/pulse 程度となる。上流光学系からの寄生散乱を，集光位置直近上流においたシリコンブレードを調整して極力低減すれば，ビームストップ周辺の寄生散乱 X 線光子数を100 X 線光子/pixel 程度の測定に影響しないレベルまで低下させ，約 500 nm の小角分解能を実現できる41)。しかしながら，現在の KB 集光光学系の設計値からは，これ以上の小角分解能の向上は難しい。多くの細胞試料では，極小角のスペックルパターンが欠損するため， SR XDI
実験に比べて位相回復が困難となり， 2.4で述べたような解析手法が必要となる。実際，一回のビームタイムで得られた良質な回折パターンの位相回復には，スーパーコンピ
ューターを用いて数か月を要している。
測定に先立っては，静電分注装置によって一様に散布した金コロイド粒子からの回折パターンを記録し， XFEL
パルス毎のコヒーレンスがほぼ完全であることを確認する。この解析では， Speckle Visibility Spectroscopy42) において正しく空間コヒーレンスを評価できる理論を用いる43) 。これまでのところ， KB ミラーを適切に調整すれば，試料位置での集光 XFEL パルスの空間コヒーレンス
はほぼ完全であった。

5.3

測定と構造解析8,41)

集 光 XFEL パ ル ス は ， 一 度 の 入 射 で 試 料 粒 子 を 破 壊し，さらに，集光ビームの裾野が鉛直方向，水平方向に十字状 20 mm 程度に伸びて，周辺にも放射線損傷をもたらす43)。常に新鮮な試料粒子を集光位置に供給するために，
25 mm / 33 ms 以上の速さで窒化珪素膜を高速並進移動さFig. 5(Color online) (a) A view of XFELXDI experiment at
BL3 of SACLA. Devices from the left (upstream) to theright (downstream) are the TAKASAGO6 diŠraction apparatus (1), the MPCCD-Octal detector (2), and the
MPCCD-Dual detector (3). (b) A view inside the vacuum
chamber of the apparatus. A cooled container carrying 12
specimen holders (4) are delivered from the load-lock chamber to a pot (5) to maintain the temperature of the container. Each specimen holder is mounted to or dismounted fromthe pot (6) on the fast-translation stage (7) by using two
stick devices located behind the two pots (8). (c) The timecourse of the cumulative number of XFEL shots used (blackline) in a beam time. The automatic data processing suite
extract tentatively diŠraction patterns with signal-to-noise
ratios better than a threshold value (red line). The numberof diŠraction patterns, the electron density maps from whichconverged in the phase retrieval (PR) calculations, is lessthan 20 (blue line) of the total number of XFEL pulses
used.

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 197

Fig. 6

(Color online) A diŠraction pattern (left), a projection electron density map retrieved from the diŠraction pattern (center) and a reconstructed three-dimensional density map (right) of cyanobacteria cell. The left and center
panels are reused from [doi: 10.1107/S1600577516007736] after modiˆcation with permission from The International Union of Crystallography

せる。9 枚の窒化珪素薄膜窓を持つ試料板12枚について，
スキャン露光を行えば，試料ホルダー交換やカセット装填

6. おわりに作業を含めて，1 時間で平均31000ショットの XFEL パル

CXDI はまだ未成熟な段階にあり，特に，X 線自由電子

スを利用できる（ Fig. 5 ( c )）。大量の回折パターンの処理

レ ー ザ ー を 用 い た CXDI で は ， 位 相 回 復 に お け る 問には，独自に開発したデータ処理ソフトウェアスイーツ

題19,49,50)や，異なる個体からの構造情報に関する検討51)が『四天王』等を用いる44,45)。これまでに，アミロイド41,46)，必要である。シンクロトロン放射光を用いた低温 CXDI

真 核 細 胞 バ ク テ リ ア の 葉 緑 体21,22) ， 出 芽 酵 母 の 細 胞

トモグラフィー実験からは，超解像顕微鏡のデータを凌駕

核41,47)，シアノバクテリア30,48)等を測定した。

する構造情報が細胞やオルガネラに対して得ることができ

ここでは，細胞試料に対する実験例として，シアノバク

るようになってきた。位相拡張や照射線量52) ，得られるテリアからの回折パターンを示す（Fig. 6）。生物学の共生

三次元電子密度の精密化のための理論構築が必要であるも説によれば，シアノバクテリアが他の生物と融合して原始のの，現在の技術を更に高度化することで，バイオイメー

的な真核バクテリアが誕生したと考えられている。真核細ジングの新たな展開が期待される。

胞バクテリアの葉緑体に対する XFEL XDI 実験から， C字型をしたチラコイド膜の集積体を見出しているが21) 。

謝辞

シアノバクテリアがそのような真核細胞バクテリアの葉緑

回折パターンの処理や位相回復では，慶應義塾大学の関体に転化したとすれば，シアノバクテリアも同様の葉緑体

口優希博士，橋本早紀氏が作成したソフトウェアを用い構造が存在すると期待される。しかし，シアノバクテリア

た。装置製作で御助力いただいていた株式会社理学相原精

丸ごとの構造をありのままに解明する技術が無く，進化的機，仁木工芸株式会社，神津精機株式会社に謝意を表しま

相関を物質分布の観点から調べることはなされてこなかっす。 SPring 8 での回折実験では，理化学研究所の香村芳た。

樹博士に，SACLA での実験では，登野健介博士，亀島敬

培養したシアノバクテリア懸濁液の動的光散乱から，シ博士，城地保昌博士，犬伏雄一博士，金徹坤氏をはじめとアノバクテリアの大きさが，集光 XFEL ビームに完浴でする SACLA エンジニアリングサポートチームに御助力きることが明らかとなったので30) ，シアノバクテリア細を頂いた。低温 XDI 実験技術の開発及び構造解析は，文胞を窒化珪素膜に散布凍結して実験に供した。 Fig. 6 に示部科学省からの X 線自由電子レーザーキーテクノロジー

したような回折パターンを収集し，良質な投影電子密度図

課題， X 線自由電子レーザー利用重点課題，日本学術振884 枚から，有効分解能 150 nm 分解能で三次元電子密度興会からの新学術領域研究（jp23120525，jp25120725），

図を再構成した48) 。再構成されたシアノバクテリアの大萌 芽 研 究（ jp17654084 ， jp24654140 ）， 基 盤研 究 （ A ）きさは 750 nm 程度であり，測定前に動的光散乱法で調べ（ jp16H02218）の支援を受け， SPring8 RIKEN BL ビー

た流体力学的粒子サイズ（ 760 nm ）とよく一致する30) 。

ムタイム（Proposal Nos. 20090097, 20100035, 20110006,

内部の電子密度分布は非一様で，大まかには厚みのある C

20140096, 20150098, 20160084），SACLA ビームタイム

型形状を呈していた。また，C 型の電子密度分布の中心付（ Proposal

近には電子密度の高い大きさ 200 nm 程度の楕円状領域が2013B8049,

Nos.

2012A8005,

2014A8033,

2012B803,

2013A8043,

2014B8052,

2015A8051,存在した。C 型形状部分は，真核細胞バクテリアの葉緑体

2015B8049, 2016A8048, 2016B8064, 2017A8015）においと形状や大きさが酷似していた。

て実施した。位相回復計算をはじめとする構造解析には，

198 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

解説 ■ 生物細胞の低温 X 線回折イメージング

SACLA の mini-K スーパーコンピューターを用いた。
23)

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放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 199

著者紹介
中迫雅由

大出真央

慶應義塾大学理工学部物理学科教授，理化学研究所播磨研究所放射光科学研究セン
ター客員主管研究員
E-mail: nakasako＠phys.keio.ac.jp
専門細胞の X 線ナノイメージング［略歴］
1990 年，東北大学大学院理学研究科物理学第二専攻博士後期課程単位取得退学。
1990 年，東京大学薬学部助手。 1994
年，理化学研究所研究員。 1997 年，東京大学分子細胞生物学研究所講師。 1996 1999 年， JST さきがけ兼務研究員。 2002
年，慶應義塾大学理工学部物理学科助教授。
2005 年より現職。趣味は宇宙戦艦ヤマト
2199，旧仮面ライダーカード収集。

慶應義塾大学理工学研究科博士課程 2
年，理化学研究所播磨研究所放射光科学研究センター研修生
専門生体高分子のイメージング

高山裕貴
兵庫県立大学大学院物質理学研究科 X 線
光学分野 助教，理化学研究所播磨研究所
放射光科学研究センター客員研究員
E-mail: takayama＠sci.u-hyogo.ac.jp
専門X 線回折イメージング［略歴］
2013 年，慶應義塾大学理工学研究科博士課程修了。 2013 年，理化学研究所基礎科学特別研究員。2016年より現職。

小林周

理化学研究所播磨研究所放射光科学研究センター基礎科学特別研究員
E-mail: amane.kobayashi＠riken.jp
専門X 線回折イメージング［略歴］
2018 年，慶應義塾大学理工学研究科博士
課程修了。

山本隆寛
慶應義塾大学理工学研究科修士課程 2
年，理化学研究所播磨研究所放射光科学研究センター研修生
専門X 線回折イメージング

200 ● 放射光 May 2018 Vol.31 No.3

岡島公司
慶應義塾大学理工学部物理学科特任助教，
理化学研究所播磨研究所放射光科学研究センター客員研究員
E-mail: okajima＠phys.keio.ac.jp
専門植物の光形態形成［略歴］
2006 年，東京大学大学院総合文化研究科
広域科学専攻博士課程修了。 2006 年，大阪府立大学プロジェクト研究教員， 2015
年から現職。

苙口友隆
慶應義塾大学理工学部物理学科専任講師，
理化学研究所播磨研究所放射光科学研究センター客員研究員
E-mail: oroguchi＠phys.keio.ac.jp
専門計算生物物理［略歴］
2007 年，東京大学大学院理学研究科物理学専攻博士課程修了。 2007 年，横浜市立大学生体超分子システム科学専攻博士研究員。 2011 年，慶應義塾大学理工学部物理学科助教。2015年より現職。

山本雅貴
理化学研究所播磨研究所放射光科学総合研究センター放射光利用システム開発研究部
門部門長
E-mail: yamamoto＠riken.jp
専門第三及び第四世代放射光を用いた生体分子粒子に対する X 線回折実験技術
および構造解析方法の開発［略歴］
1991 年，大阪大学大学院理学研究科高分子専攻博士後期課程修了。 1991 年，理化学研究所研究員。 2004 年，理化学研究所
播磨研究所研究技術開発室室長， 2008 年より現職。 2005 年より兵庫県立大学大学
院生命理学研究科客員教授。趣味は近隣散歩，鉄道。

解説 ■ 生物細胞の低温 X 線回折イメージング

X-ray diŠraction imaging of biological cells at low
temperature
Masayoshi NAKASAKO1,2, Yuki TAKAYAMA1,2, Amane KOBAYASHI1,2,
Takahiro YAMAMOTO1,2, Mao OIDE1,2, Koji OKAJIMA1,2,
Tomotaka OROGUCHI1,2, Masaki YAMAMOTO2
1Department of Physics, Faculty of Science and Technology, Keio University

3141 Hiyoshi, Kohoku-ku, Kanagawa, Yokohama 2238522, Japan
2Infrastructure Research Group, Synchrotron Radiation Research Center, Harima Institute, RIKEN

111 Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo 6795148, Japan
present address
Graduate School of Material Science, University of Hyogo, 321 Kouto, Kamigori-cho, Ako-gun, Hyogo
6781297, Japan

Abstract

X-ray diŠraction imaging is used to visualize the structures of biological non-crystalline particles
without chemical labeling and sectioning. The projection structures of specimen particles are
retrieved from the structure amplitudes of diŠraction patterns. Furthermore, the three-dimensional structures are reconstructed from tomography experiments. Due to the penetration powerof X-rays with short wavelength, X-ray diŠraction imaging allows us to visualize the structures ofcells with the dimensions more than 500 nm at resolution better than 100 nm. In this review, wereport the current status of our X-ray diŠraction imaging experiments and structure analyses.

放射光 May 2018 Vol.31 No.3 ● 201