放射線療法後の皮膚障害ケアに関する基礎的検討

独立行政法人放射線医学総合研究所重粒子医科学センター 先端粒子線生物研究プログラム

中 山文 明The influence of radiation therapy on skin barrier functions remains unknown. In this study, skin barrier-associatedproteins were examined after irradiation. As a result, skin moisture and the expression of skin barrier-associated protein
loricrin were decreased after irradiation at a relatively low dose, whereas filaggrin proteins increased in skin after irradiation.
These findings suggest that decreased loricrin proteins play an important role in the pathogenesis of radiation skin injuries.

１．緒る。そして、放射線療法後の皮膚障害に有効な治療法や新た言なスキンケア製品の開発に有用な動物モデル指標を見出す。

重粒子線治療などの新しい放射線療法や、IVR を使った

２．実

血管内治療など、医療現場における放射線の利用がますます盛んになっている。今日では病巣へ放射線を集中させる

2 .1

験

各毛周期における放射線脱毛の線量の検討技術が発達し、正常組織への影響は少なくなっており、皮７週齢のオスBALB/cマウスを日本クレアより購入しSPF

膚潰瘍などの重篤な皮膚障害も極めて稀である。しかしなで飼育した。７週齢マウスの毛はすべて休止期（Telogen）でがら、脱毛や乾性落屑などの比較的軽度な放射線皮膚障害あるが、抜毛によりすべて成長期（Anagen）に同調・誘導では依然として発生し、美容的な問題として患者に大きな負きる。そこで背部より抜毛後６日目、毛包がAnagenVIの毛担となっている。また、放射線皮膚障害の病態は十分に解包周期になった時に、セシウム線源（Gammacell 40, Atomic

明されておらず、有効な治療法も確立していない。一方、Energy of Canada, Ottawa, Canada）を使ってガンマ線を全身これらの研究に必要な放射線皮膚障害の評価方法も存在し照射した。照射方法は、マウスを無麻酔でプレキシガラスのなかった。そこで、我々は、放射線脱毛における毛包障害

円形容器に入れ、0.57Gy/分の線量率で4 ～ 12Gyを１回照を検討し、化学療法による毛包障害と同様の組織学的なパ射した。抜毛後14 日まで背部皮膚を観察し、発毛を認める

ラメーターを使って評価できることを明らかにし、放射線線量を決定した。

1）

毛包障害の評価方法を確立した 。
皮膚バリア機能に関係する構造として、cornified cell envelope

2.2

放射線毛包変性の組織学的検討

は角質細胞の細胞膜を裏打ちし、loricrin や involucrin な

マウスは皮膚を 10 % 中性緩衝ホルマリンで固定後、パどで構成されている。filaggrin もその構成蛋白質の一つだ

ラフィン包埋切片を作成し、HE 染色を行った。そして、が、表皮の顆粒層で profilaggrin として生合成された後、以前報告した 1）放射線毛包障害の評価方法に基づき、これ脱リン酸化や限定加水分解により filaggrin となり、さらにらの組織標本から各放射線障害パラメーターを測定した。

分解されて天然保湿因子となる。最近、filaggrin 異常と尋

すなわち、表１は、化学療法による変性毛包の分類 4）を参2）

3）

常性魚鱗癬 やアトピー性皮膚炎 の病因との関連性が明考に、AnagenVI の毛包に 12 Gy を照射し、3 . 5 日までの経らかになった。一方、放射線皮膚障害においても皮膚の乾時的な毛包変性に対して、その特徴を明らかにしたもので燥傾向が顕著だが、放射線と皮膚バリア機能の関係は未だある 1）。特に、（1）
毛包の dermal papilla と bulb の直径比、（2）

不明である。

bulb の直径、（3）毛包の長さの比較が変性毛包の評価に有

本研究では、放射線毛包障害の評価に基づき、マウスモ用であった。すなわち、初期変性成長期（early dystrophicデルの照射線量を検討する。そのモデルを用いて皮膚バリアanagen）では、bulb 径がわずかに縮小する程度で、他に機能に対する放射線による影響を組織・分子レベルで解析す

変 化 は 認 め ら れ な か っ た。 中 期 変 性 退 行 期（middystrophic catagen）では、bulb 径がさらに縮小する一方、Basic Study of Skin Injury Care afterRadiotherapy
Fumiaki Nakayama
Advanced Radiation Biology Research
Program, Research Center for Charged
Particle Therapy, National Institute ofRadiological Sciences

DP/bulb 比と毛包の長さが増大した。晩期変性退行期（latedystrophic catagen）では、DP/bulb 比がさらに増加するが、毛包の長さは急速に短縮した。

2.3

皮膚水分率の測定

マウス背部より抜毛６日後、毛周期が成長期となった背− 134 −放射線療法後の皮膚障害ケアに関する基礎的検討

部皮膚に対して、６Gy のガンマ線全身照射を行い、肌湿2.5

Western Blotting

度計（SR- 101、ロゼスター）で４点３回ずつ 24 時間おきにマウス背部より抜毛６日後、12 Gy のガンマ線全身照射４日間測定し、皮膚水分率の平均値を算出した。なお、実を行い、照射 24、48、84 時間後に皮膚を採取し液体窒素

験中のマウスの飼育環境は室温 22 . 9 ～ 23 . 0℃、湿度 50 ～にて凍結した。約５mm 3 の凍結皮膚組織片を BioMasher

51 % と一定であった。

III（Nippi, Tokyo, Japan）で電動攪拌機（Nippi）を用いてホモジナイズし、100 µl の lysis バッファーに溶解させた。

2.4

皮膚バリア機能関連蛋白の免疫組織化学染色

そ の lysate を Bio-Rad Protein Assay（BioRad）で 蛋 白 定

マウス背部より抜毛６日後、６Gy のガンマ線全身照射

量 し、30 µg の 皮 膚 lysate を ミ ニ プ ロ テ ィ ア ン TGX ゲ ルを行い、照射後３日の皮膚を採取した。採取した皮膚は（any KD、BioRad）で１次元蛋白質電気泳動を行った。

10 % 中性緩衝ホルマリンで固定後、パラフィン包埋切片を作成

PVDF 膜に転写後、５% スキムミルクでブロッキングし、抗し、HE染色を行った。さらに、パラフィン包埋切片を脱パラfilaggrin 抗 体、 抗 loricrin 抗 体 及 び 抗 b- actin 抗 体（4967、フィン後、２% 過酸化水素／メタノール溶液に室温で 30Cell Signaling）を反応させ、２次抗体として抗ウサギ IgG-分反応させて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックさせ

HRP（NA 934、GE Healthcare）を反応させた。最後に ECLた後、0 . 01 M クエン酸に浸して 120℃ 15 分のオートクレ

select Western Blotting Detection System（GE Healthcare）

ー ブ で 抗 原 賦 活 処 理 を 行 っ た。 組 織 中 の マ ウ ス IgG をで発光させ、LAS - 4000 mini（Fujifilm）で検出した。

VECTOR M.O.M. immunodetection kit を用いてブロック３．結した後、抗 loricrin 抗体（PRB - 145 P、Covance）を反応させ、抗ウサギ IgG-biotin 抗体を２次抗体として反応させた後、3 .1

果成長期における6 Gy 照射後の発毛障害

VECTASTAIN Elite ABC キット（Vector Laboratories）を抜毛により誘導された成長期の毛包は、抜毛後 6 日目に使って DAB で発色させた。一方、抗 filaggrin 抗体（PRB -は AnagenVI となっている。この成長期毛包に４, ６, ８417 P、Covance）による免疫組織化学染色では、コンパウ

Gy のガンマ線照射を行い８日後の発毛を観察した（図１）。

ンドで包埋した皮膚凍結切片を４% パラホルムアルデヒド

その結果、非照射マウスでは著明な発毛が観察され、４で固定し、上記と同様に染色した。

Gy 照射マウスでも非照射群と比べて短いながらも発毛が

表 1 放射線毛包障害のパラメーターと毛包変性の分類− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

認められた。一方、６Gy と８Gy の照射では発毛が認めらラメーターの数値と矛盾しなかった。３日目の変性毛包のれず、その背部皮膚に多数のしわを認め、点状の紫斑が散状態は、表１の３つのパラメーターに基づいて判定すると、発していた。

10 ～ 12 Gy は晩期変性退行期、６～８Gy は中期変性退行期、４Gy は初期変性退行期と同程度の数値だった（図２）。

3 . 2 成長期毛包に対する放射線照射後の障害パラメー
ターの変化

3.3

照射後の皮膚水分量低下

今回、抜毛後６日目の AnagenVI の毛包に対して４～６Gy 照射後の皮膚にしわが発生していることから、皮12 Gy のガンマ線照射し、照射後８日（抜毛後 14 日）まで観膚水分量の低下が疑われた。そこで、抜毛後６日目の察し、その背部皮膚組織標本を、表１の毛包変性のパラメ

AnagenVI の毛包に対して、６Gy のガンマ線を照射し、ーターに基づき解析した。その結果、照射後４日目まで、24 時間ごとに皮膚水分率を測定した。

（1）DP/bulb 比は１日目には非照射では減少するのに対しその結果、皮膚水分率はガンマ線６Gy 照射後３日まではて、４～ 12 Gy のすべて照射群では線量依存性に増加した。

不変であったが、４日目に有意に低下した（図３）。

３日目には 10 ～ 12 Gy ではさらに増加したのに対して、４～ 8 Gy では減少に転じ、４Gy と６Gy は８日目には０Gy と同じ値になった。

3 . 4 照射後のバリア機能関連蛋白質の皮膚における発現変化（2）bulb 径は１日目に０Gy では不変だったのに対して、４６Gy 照射３日後の皮膚に対する HE 染色では、表皮構造～ 12 Gy のすべての照射群でほぼ同程度に低下した。３に大きな変化を認めなかった。しかしながら、loricrin は非日目には 10 ～ 12 Gy ではさらに減少したが、４～８Gy で照射皮膚では表皮顆粒層付近に限局して強発現していたが、は 3 日目には横ばいとなった。そして、４Gy と６Gy では照射によりその発現が著明に減少し、ほぼ消褪していた。

８日目には増加に転じ、４Gy の群は０Gy と同じ値にな

一方、皮膚バリア機能関連蛋白質である filaggrin は、非照った。８Gy 照射群は、８日目でも横ばいであった。

射皮膚では表皮顆粒層付近に限局して発現していたものが、（3）毛包の長さは、３日目には 10 Gy と 12 Gy 群は減少した。

照射によりその発現が基底層と有棘層、および角層の一部

４Gy と６Gy 群は増加してゆき、８日目には０Gy の長さに及び、filaggrin の発現部位が著しく拡大していた（図４）。と同じになった。
３つのパラメーターは、４～８Gy 照射群は０Gy 群と 103 . 5 照射後のバリア機能関連蛋白質発現の経時的変化～ 12 Gy 照射群の中間の値を取る傾向にあった。４Gy 照

マウスに 12 Gy 照射し、経時的にサンプリングを行い射群では８日目までに３つのパラメーターすべてが０Gy

western blotting で検討した。その結果、profilaggrin 及び群と同じになり、４Gy 群で発毛を認めていることは、パその中間体は 48 時間まで減少していったが、84 時間で増図１

成長期毛包の放射線障害

図２− 136 −成長期毛包の放射線障害指標の推移

放射線療法後の皮膚障害ケアに関する基礎的検討

加に転じていた。一方、filaggrin の発現量は 48 時間で軽度増加し、84 時間でむしろ著明に増加していた。保湿成分になる filaggrin 分解産物も照射後徐々に増加していった。loricrin の発現は western blotting でも非照射では強発現しているのが示されたが、照射後 24 時間でも明らかな減少を認め、その後も経時的に減少を続け、今回検討した 84 時間では著減していた（図５）。

４．考察

本研究のマウスモデルでは、毛包成長期に対して４Gyのガンマ線照射では照射８日後で発毛が認められるが、６Gy 以上の線量では発毛を認めなかった。我々が提案した
図３

照射後皮膚水分量の減少

変性毛包の組織学的パラメーターに基づいて照射３日目の毛包を評価すると、４Gy は初期変性退行期、６～８Gy は

図４

照射後のバリア機能関連蛋白質の皮膚免疫組織化学染色

図５

照射後の皮膚バリア機能関連蛋白発現の western blot 解析− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

中期変性退行期と分類され、６～８Gy 照射群の方が４Gy（引用文献）群より後期の変性毛包であったが、10 ～ 12 Gy 照射群の晩

１）Nakayama F, Hagiwara A, Kimura M, Akashi M,

期変性退行期よりは早期の変性であった。この中期変性退Imamura T: Evaluation of radiation-induced hair行期を誘発する６Gy 以上の照射条件では、皮膚にしわもfollicle apoptosis in mice and the preventive effects of生じ皮膚の水分量の減少が示唆された。実際に皮膚水分率

fibroblast growth factor- 1 , Exp Dermatol, 18 , 889 - 892 ,は、６Gy 照射後４日目より有意な減少が認められた。

2009 .

皮膚バリア機能に関係するloricrinは、cornified cell envelope２）Smith FJ, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A,（CE）構成蛋白質の一つで、表皮ではそれに由来する部分がSandilands A, Campbell LE, Zhao Y, Liao H, Evans

CE成分の70%を占めるなど、主要成分となっている。しかAT, Goudie DR, Lewis-Jones S, Arseculeratne G,

しながら、loricrin欠損マウスでは、出生時には赤い半透明

Munro CS, Sergeant A, O'Regan G, Bale SJ, Comptonの光沢のある皮膚となるものの、他のCE成分が短期間にJG, DiGiovanna JJ, Presland RB, Fleckman P, McLean

loricrinの機能を補うことにより、皮膚バリア機能低下の所

WH: Loss-of-function mutations in the gene encoding

見に乏しい 5）。今回、放射線照射により、マウス表皮におけfilaggrin cause ichthyosis vulgaris, Nat Genet, 38 , 337 -るloricrin蛋 白 の 著 明 な 減 少 が 明 ら か に な っ た。 一 方、

342 , 2006 .

filaggrinが増加している所見は、照射後４日目に認められた

３）Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Zhao

皮膚水分率の軽度低下が、loricrinの減少に由来することをY, Liao H, Lee SP, Goudie DR, Sandilands A, Campbell示唆した。loricrin欠損マウスのwestern blottingでは、大きLE, Smith FJ, O'Regan GM, Watson RM, Cecil JE, Baleなfilaggrinの変化は認められていないと報告されているが、

SJ, Compton JG, DiGiovanna JJ, Fleckman P, Lewis-新たなprofilaggrinのバンドが検出されていることから 、Jones S, Arseculeratne G, Sergeant A, Munro CS,filaggrinもloricrin減少に補完的に作用している可能性がある。

El Houate B, McElreavey K, Halkjaer LB, Bisgaard

ヒトの放射線皮膚障害では３～ 10 Gy で紅斑が生じ、８H, Mukhopadhyay S, McLean WH: Common loss-of-5）～ 12 Gy で乾性落屑と呼ばれる皮膚症状が生じる 。一方、

function variants of the epidermal barrier protein

ヒトの脱毛は３Gy 以上で生じることから、今回マウスモfilaggrin are a major predisposing factor for atopic

デルで示した６Gy 照射による毛包障害と皮膚症状は、ヒdermatitis, Nat Genet, 38 , 441 - 446 , 2006 .

6）

トの脱毛と紅斑に相当する軽度の障害と考えられた。ヒト４）Hendrix S, Handjiski B, Peters EM, Paus R: Aの紅斑は乾性落屑より軽い病態であり、今回のマウス皮膚

guide to assessing damage response pathways of the

モデルでは、明らかな発赤は認められなかったものの、皮hair follicle: lessons from cyclophosphamide-induced

膚水分率の低下と loricrin 減少という皮膚バリア機能の低alopecia in mice, J Invest Dermatol, 125 , 42 - 51 , 2005 .

下が認められた。よって、皮膚バリア機能関連蛋白は、軽５）Koch PJ, de Viragh PA, Scharer E, Bundman D,

度の放射線皮膚障害でも変動し、その発症に関与している

Longley MA, Bickenbach J, Kawachi Y, Suga Y, Zhou

可能性が考えられた。

Z, Huber M, Hohl D, Kartasova T, Jarnik M, Steven

５．総AC, Roop DR: Lessons from loricrin-deficient mice:括compensatory mechanisms maintaining skin barrier

軽度の放射線皮膚障害でも、皮膚バリア機能関連蛋白でfunction in the absence of a major cornified envelope

ある loricrin の著明な発現低下が認められ、皮膚水分量のprotein, The Journal of cell biology, 151 , 389 - 400 , 2000 .

低下に関与していることが示唆された。そして、皮膚バリ

６）IAEA. Diagnosis and treatment of radiation injuries.

ア機能の変化は、放射線皮膚障害の潜在的な病因であるこIn: Safety Reports Series No. 2 . Vienna: The Agency;とが示唆され、放射線皮膚障害に有効な治療法や新たなス1998 . p. 10 .

キンケア製品の開発のための有用な指標となることが示された。

− 138 −