ヒト iPS 細胞を利用して、表皮角化細胞の様々な刺激に対する反応性にフィラグリン遺伝子の変異が与える影響について検討する
東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科皮膚科学分野

井川健

Previously, we have already successfully generated transgene-free and mutation-free human iPSCs (hiPSCs) fromhuman dermal fibroblasts by using the piggyBac transposon system. Moreover, we successfully differentiated these hiPSCs
into epidermal keratinocytes (iKCs; induced keratinocytes).
Incidentally, recent advances in the development of genome editing technologies based on programmable nucleases
such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator–like effector nucleases (TALENs) and the clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated nuclease Cas 9 (CRISPR/Cas 9 ) have substantially improved ourability to make precise changes in the genomes of human cells.
With our established systems of obtaining iKCs from hiPSCs and new technology of programmable nucleases, especially
CRISPR/Cas 9 system, we tried to clarify the precise effects of filaggrin gene (FLG) mutations in keratinocytes.
A guide RNA that targeted appropriate site of human FLG was designed by web-based tool and cloning into thebackbone vector of CRIPSR/Cas 9 (hFLG-CRISPR/Cas 9 ). We transfected hFLG-CRISPR/Cas 9 into hiPSCs and obtained
the several clones of hiPSCs which possessed random mutations in FLG. Then, original hiPSC and FLG-mutated hiPSCs
were differentiated into epidermal keratinocytes using our established protocols and we obtained the normal iKCs and FLGmutated iKCs. Under this condition, we can compare the phenotypes of normal and FLG-mutaed iKCs of the same genetic
background.
Thus, the results obtained from this system should be "true" meanings of FLG mutation in keratinocytes and should be
important information for the understanding of AD pathogenesis.

１．緒

業績によってノーベル賞を受賞して以降、このシステムを言利用した研究は驚くべきスピードで発展しており、また、アトピー性皮膚炎は慢性に経過する炎症性皮膚疾患としそのシステムを臨床に応用しようとする試みは世界中で進てよく知られているが、難治であることもあり、常にその行している。そのような中で、我々も、リプログラミング病態メカニズムの解明、治療法の開発の対象となっている因子を、トランスポゾンベクターを利用して細胞に導入し、疾患である。近年、このアトピー性皮膚炎の少なくない

ヒト iPS 細胞を作製することに成功している 3）。また、そpopulation において、フィラグリン遺伝子の変異が見いだのヒト iPS 細胞を、表皮角化細胞に分化させ、さらには誘される（10 ％～ 30 ％）ことが報告されている。フィラグリ導された表皮角化細胞を in vitro において重層化させ、再ンが皮膚のバリア機能を構成するタンパク質の一つである構成表皮類似の構造を作ることも可能としている 3）。

ことから、この遺伝子の変異とアトピー性皮膚炎の発症に本研究では、我々が確立したヒト iPS 細胞作製から表皮は大きな意味合いがあるとされており、そのことについて角化細胞誘導、再構成表皮類似構造の作製というシステム

1）

様々な研究がなされている 。しかしながら、その遺伝子と、遺伝子改変技術を組み合わせ、フィラグリン遺伝子変に異常があることと、個々の細胞（ここでは標的となる細異があることによる表皮角化細胞の機能に関して、様々な胞は表皮角化細胞である）のふるまいに異常がみられるの外来性の刺激（炎症性刺激や感染症関連の刺激など）に対すかどうか、ということを、本当の意味で詳細に検討するこる反応性への影響という面から、詳細に検討することを目とについては、これまで検証できるシステムがなく、行わ的としている。

れていなかった。

2. 方

ところで、2006 年に京大の山中らによって、iPS 細胞の確立が報告 2） されて以降、また、2012 年に山中らがこの法

2 . 1. フィラグリン遺伝子変異の有無のみに違いのある一組のヒトiPS 細胞の作製
このためには、ヒト iPS 細胞において、ある程度の自在

Examination of 'true' meanings of filaggrin
mutation in keratinocytes for various
external stimuli
Ken Igawa
Department of Dermatology, Tokyo Medicaland Dental University

性をもって、遺伝子変異を導入するシステムの確立が必須である。ヒト ES 細胞 /iPS 細胞における遺伝子改変は、マウス ES 細胞 /iPS 細胞におけるそれに比して困難であるとされていたが、近年の技術の進歩により、人工ヌクレアー
ゼを利用することによって、比較的自在に行うことができ− 52 −

ヒト iPS 細胞を利用して、表皮角化細胞の様々な刺激に対する反応性にフィラグリン遺伝子の変異が与える影響について検討するるようになっている（ゲ ノ ム 編 集 ）4）。本 研 究 に お い て は確立したもの）を利用して、3 次元培養皮膚モデル作製を

CRISPR/Cas 9 を利用して遺伝子改変を行った。

行った。カルチャーインサートにまず分化誘導された線維導入する変異は、本来は、実際のアトピー性皮膚炎患者芽細胞を播種し、数日培養を行う。培養液を変更し、線維でみられるフィラグリン遺伝子変異をそのまま導入するべ芽細胞が重層し、真皮部分を形成するようにする。その後、

きであるが、システムの確立も同時並行で行う必要もあり、真皮部分の上部に iPS 細胞から誘導された表皮角化細胞をまた、黒白はっきりとした結果を得ることも考えて、まず播種し、さらに培養液を変更。数日培養後、表面を空気暴はフィラグリン遺伝子をノックアウトすることを目的とし露し、角化細胞の重層と角化を促した。

た。フィラグリン遺伝子において、設定した標的配列を認

3. 結識するガイド配列を作製し、CRISPR/Cas 9 発現ベクターにクローニングする。このベクターをヒト iPS 細胞に導入し、DNA の 2 重鎖切断後の non homologous end joining

3 . 1. フィラグリン遺伝子変異を有するヒトiPS 細胞の樹立（NHEJ）を利用したランダムな変異挿入がなされたヒトiPS 細胞を採取してくる。

果トランスポゾンシステムを利用して作成したヒト iPS 細胞において、CRISPR/Cas 9 のシステムを使うことによって、フィラグリン遺伝子にヘテロで欠失をもつものを数種

2 . 2 . 表皮角化細胞への分化プロトコールの確認類樹立した（図 1）。iPS 細胞の状態においては、形態的なこのようにしてフィラグリン遺伝子に変異を導入した変化はみられない。

（ノックアウトした）ヒト iPS 細胞を、これまでに確立したプロトコールに従って表皮角化細胞に分化させる。さらに3 . 2 . 表皮角化細胞への分化プロトコールの確認

は、変異を導入していないオリジナルの iPS 細胞も表皮角

これまでに我々を含めて報告にある表皮角化細胞分化プ化細胞へ分化させ、この二つの表皮角化細胞をもって互いロトコールに従って、ヒト iPS 細胞を分化させたところ、の差異を検討する。近年、表皮角化細胞への分化プロトコことごとく失敗、という結果になった。そのため、ヒトールは我々も含めて確立されたと考えられていたが、もうiPS 細胞から表皮角化細胞を誘導するプロトコールについ一度そのプロトコールについて検討、確認を行うこととして再確認を行った。以前確立したプロトコールを改変してた。

（詳細は省く）検討したところ、図 2 に示すように、得られた細胞においては、表皮角化細胞の遺伝子発現が確認され

2 . 3 . ヒトiPS 細胞由来の線維芽細胞の誘導た。少なくとも表皮角化細胞の系に分化していることを確確立したヒト iPS 細胞から、線維芽細胞を誘導した。既認した。に報告されている方法 5）を参照して作製した。

ただし、このプロトコールは、以前のプロトコールの半分の日程であり（2 週間程度）、それ以上の継続培養を続け2 . 4 . ヒトiPS 細胞由来の線維芽細胞と表皮角化細胞を利用した 3 次元培養皮膚モデルの確立ることが不可能であり、さらに、継代も不可能であった。

ヒト iPS 細胞由来の線維芽細胞と表皮角化細胞（以前に図1

図2− 53 −コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

3. 3.

我々が確立しているシステムとゲノム編集技術を利用した遺伝子変異挿入を組み合わせると、他の遺伝子背景は同

ヒト iPS 細胞から、すでに報告されている方法により線じで、標的の遺伝子、ここではフィラグリン遺伝子を選択

維芽細胞（様細胞）を誘導することができた（図 3）。

したが、その変異があるかどうかのみに違いのある、一組

3. 4.の iPS 細胞を得ることができる。この一組の iPS 細胞をこ以前に、すでにプロトコール（フル）によって分化誘導し、れまでに確立した方法に従って表皮角化細胞へ分化させる

保存しておいた表皮角化細胞と、今回、誘導した線維芽細ことによって、はじめて、フィラグリン遺伝子の変異のみ胞（様細胞）を利用して、図 4 に示すような、真皮様構造のに違いがあり、他はすべて同じ、という表皮角化細胞を得上に、重層化した表皮様構造をもつ構造物を作製することることができる。
この一組の表皮角化細胞について、様々な外来性の刺激に成功した。

に対する反応性の違いを比較検討することによって、フィ４．考察／５．まとめ

ラグリン遺伝子の変異が表皮角化細胞のふるまいに与える影響を、本当の意味で詳細に検討することができることに本研究は、ヒト iPS 細胞を用いて、フィラグリン遺伝子なる。に変異があることが、アトピー性皮膚炎にどのような意味

今回の研究では、表皮角化細胞の分化プロトコールの見合いをもつのか、ということを正確に評価する、というこ直し、ならびに、研究者の所属が変わったことによる影響とにつながることを期待して行ったものである。

図3

図4− 54 −ヒト iPS 細胞を利用して、表皮角化細胞の様々な刺激に対する反応性にフィラグリン遺伝子の変異が与える影響について検討するもあって、フィラグリン遺伝子変異の有無による外部刺激（引用文献）

への反応の違いについてまでは検討することができなかっ

1） Irvine AD, McLean WH, Leung DY: Filaggrin

たが、それを検討するための前段階までは到達することがmutations associated with skin and allergic diseases. Nできたと考えている。

Engl J Med 2011;365:1315-1327.

表皮角化細胞のシングルセルの状態における、細胞のふ2） Takahashi K, Yamanaka S: Induction of pluripotent

るまいを検討するのみならず、今回の研究で成功したよう

stem cells from mouse embryonic and adult fibroblastに、より、正常の皮膚構造に近い状態（3 次元培養皮膚様cultures by defined factors. Cell 2006;126:663-676.

構造）において検討を行う用意ができたことは大きいと思3） Igawa K, Kokubu C, Yusa K, Horie K, Yoshimura Y,
Yamauchi K, Suemori H, Yokozeki H, Toyoda M,

われた。
ただし、先にも述べたように、表皮角化細胞への分化がKiyokawa N, Okita H, Miyagawa Y, Akutsu H,

うまく行われない状況がしばらく続いており、改変したプ

Umezawa A, Katayama I, Takeda J: Removal of

ロトコールで得られた表皮角化細胞（様細胞）は、継代培養reprogramming transgenes improves the tissueが不可能であり、3 次元培養にもっていくことも不可能でreconstitution potential of keratinocytes generatedある。この部分においては、さらなる改変が必要であり、from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells

引き続き行う検討においては、しばらくの間は、シングル

Transl Med 2014;3:992-1001.
4） Kim H, Kim JS: A guide to genome engineering with

セルの状態においての検討、ということになる。
このように、本研究は、アトピー性皮膚炎においてフィprogrammable nucleases. Nat Rev Genet 2014;15:321-334.

ラグリン遺伝子の変異がもつ本当の意味に迫ることが可能

5） Itoh M, Umegaki-Arao N, Guo Z, Liu L, Higgins CA,となることにつながり、さらに、その遺伝子変異が表皮角

Christiano AM. Generation of 3D skin equivalents fully

化細胞において存在することの本来の意味を知ることがでreconstituted from human induced pluripotent stem

きると思われ、コスメトロジーにも大きな意義をもつ成果

cells（iPSCs）.PLoS One. 2013 Oct 11; 8 (10): e77673.となったと考える。

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