ヒト嗅覚受容体センサーによる匂いのデジタル化を応用した
香水設計手法の確立
大阪大学産業科学研究所

立松健司

Smell sensory testing is very important in the development of a wide range of odor-related products such as cosmetics,
foods, and air fresheners. However, the accuracy of the sensory test is limited to human ability, and both of reproducibility
and throughput are low. In addition, it was difficult to share odor information across time and space. Since a perfumer needs
to memorize many odors, the training period is at least 5 years, usually 10 years, which is very costly to grow. On the otherhand, chemical odor sensors and gas chromatography are detection methods based on the structure of compounds, and it
is impossible to directly link these measurement data with the sensory test results. Our group created an olfactory receptor
sensor using cultured cells expressing all 388 subtypes of human olfactory receptors, and which was able to quantify all theodors that humans can perceive. In this study, the odor of commercially available perfume was measured and quantified by
the olfactory receptor, and the odor of perfume was quantified. In the future, this technology will be able to transform fragrance blending that relies on experiences and intuitions into evidence-based blending.

1．緒

きないような分子を匂い分子と区別して解析対象から除外言することが不可能である。そのため従前の香り解析装置は、近年の生活水準向上に伴い、香り関連製品は、アロマやたとえばコーヒーの香調といったようなごく限られた範囲

香粧品、芳香剤や消臭剤、食品香料などだけではなく匂い内での応用にとどまり、ヒト嗅覚の主観と結びつけること環境関連製品を含めて大きな市場を形成している。様々なが困難であった。一方で視覚については、ヒトの赤・緑・青・製品の香り付けにおいて、適切な香調を作り出す際には、白の光を検出する 4 種類の光受容タンパク質の応答強度とこれまで官能試験が中心的な役割を果たしてきた。官能試

その位置情報に由来する情報から構成されており、視覚情験においては、「ウッディー」や「スモーキー」
といった匂い報をヒトの光受容タンパク質と関連するわずかな数値質を言語化して、これらの匂いの特徴を持つ“基準臭” を調（RGB ＋明度＋座標）で表現可能であり、すでに視覚は時合により設定し、各基準臭と検査対象物を嗅ぎ比べて、多空間を超えた情報伝達に成功している。映像に関係する産くの場合 6 段階の匂い強度で匂い質を評価、記録している。

業の規模は、香り関係の産業に比して巨大である。嗅覚にこのような言語表現を介在させた記録は検査者のそのときおける匂い分子の識別は、嗅覚受容体の立体構造に依存しの体調や個人差による影響を排除できず、正確な嗅覚情報ており、匂い分子をヒトの嗅覚と同様に検出するためにはの数値化、記録は困難であり、時間、空間を超えた香りのヒトの嗅覚受容体を用いることが最も正確である。そこで、伝達は不可能であった。また、多種多様な匂いを嗅ぎ分けいくつかの研究グループでは、ヒトの嗅覚受容体そのものて適切な言語表現に置き換えることができる熟練した調香をセンサー素子として、匂いを数値化することを目指して師の育成には、10 年以上の教育期間がかかり、それにとおり、先行している米国デューク大学の松波らを含む多くもなうコストも問題となる。以上のような官能試験の問題のグループは、嗅神経の細胞内シグナル伝達経路（図 1）を点を解決するために、機器分析により客観データとして香培養細胞において模倣している 1）。

りを記録することを目指して、多数の電気センサー素子を哺乳動物の嗅神経細胞は、それぞれ 1 種類の嗅覚受容体アレイ化したもの（例：島津製作所、におい識別装置 FF-を発現している。嗅覚受容体は 7 回膜貫通型の G タンパク2020）やガスクロマトグラフィー（例：アルファ・モス、質共役型受容体（G protein coupled receptor, GPCR）であフラッシュ GC ノーズ Heracles NEO）を用いたものが開り、嗅覚受容体サブタイプの総数は、ヒトで 388 種 2）と報発、市販されている。しかしながら、これらは化合物の構告されている。嗅神経において嗅覚受容体が匂い分子によ造に基づく検出方法であり、原理的にヒトが嗅ぐことがでり刺激されると嗅覚受容体に特異的な Gαolf がアデニル酸シ
ク ラ ー ゼ を 活 性 化 し、 細 胞 内 の cAMP 濃 度 が 上 昇 し、Establishment of perfume design method
applying odor digitization by humanolfactory receptor sensor
Kenji Tatematsu
Department of Biomolecular Science andReaction, The Institute of Scientific andIndustrial Research (ISIR), Osaka University

CNG チャネル（cyclic nucleotide gated channel）が開き、細胞外カルシウムイオンが流入するという多段階のシグナ
ル増幅を経て最終的には活動電位を発生する。また嗅神経内のカルシウム応答以外のシグナル伝達経路では、PKA（Protein kinase A）は cAMP と結合して活性化され、転写因子 CREB（cAMP response element-binding protein）の− 145 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図１

嗅神経の細胞内シグナル伝達経路リン酸化を触媒し、CREB による転写が活性化されている。

レポーター遺伝子アッセイにおける弱点を解消するために、松波らをはじめとして多くの研究グループは、CREB 結合

私たちはまず嗅神経細胞内の匂いシグナル伝達経路を模倣配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポーターした培養細胞を作製した。この嗅神経模倣細胞は、ルシフを用いて、ヒト嗅覚受容体約 400 種類すべてを網羅した匂ェラーゼレポーター遺伝子アッセイに用いられているのとい分子に対する嗅覚受容体レパートリーの解析を行ってい同様の細胞にさらに CNG を発現させたものである。このる 。しかしながらルシフェラーゼレポーター遺伝子アッ細胞の培地に匂い分子を添加し、匂い分子が嗅神経模倣細セイは、レポーター遺伝子の転写と翻訳の時間が必要であ胞の発現する嗅覚受容体に結合したときは、嗅神経と同様るために様々な問題をともなう。まず、官能において重要に細胞外のカルシウムイオンが流入して細胞内カルシウムな嗅覚受容体応答の経時変化の情報は得られず匂いに対すイオン濃度が上昇する。細胞内カルシウムイオン濃度は、る嗅覚受容体の応答強度のみの情報しか得られない上に、細胞に事前導入したカルシウムイオン蛍光指示薬で定量で後述するネガティブフィードバックによる匂いへの馴化もきるため、脳に伝わる嗅神経の情報と同義の匂い情報をリ検出できないことが弱点である。極性が小さい匂い分子種

アルタイムに蛍光輝度として検出できる。また、この細胞は多く、これらの匂い分子はレポーター遺伝子の発現を待は嗅神経と同様にカルモジュリン（Calmodulin）、ホスホつ間に細胞培養液から蒸散してしまう問題もある。またチジエステラーゼ（Phosphodiesterase, PDE）、カルモジュリ

オールのような反応性の高い匂い分子は、数時間の培養時ンキナーゼ II（Calmodulin kinase II, CaMK II）、カルシウ間でも化学反応により異なる分子種へと転換されて、反応ムイオン排出システムを持ち、嗅神経と同様に匂い分子に前と異なる嗅覚受容体が応答してしまうこともある。極性対する応答後のネガティブフィードバックが観察される。

が小さく分子量も小さな匂い分子は、細胞膜透過性が高い

私たちの研究グループでは、この細胞に 388 種のヒト嗅覚ために嗅覚受容体以外の細胞内シグナル伝達経路に干渉す受容体全サブタイプを発現させて、各受容体サブタイプ発ることも考えられる。このルシフェラーゼレポーター遺伝

現細胞を 20 × 20 区画のグリッドに整列化したヒト嗅覚受子アッセイは、ウェルプレートで実施されており、各ウェ容体発現細胞アレイを開発し 3）、ヒト嗅覚受容体センサー

ルへの細胞播種とウェルごとに異なる嗅覚受容体サブタイと命名した（図 2）。

1）プの発現プラスミドを導入する手順が必要とされるためにヒト嗅覚受容体センサーは、嗅神経細胞と同様に匂い分測定の準備が非常に煩雑であった。これらルシフェラーゼ

子添加直後から細胞が応答し、なおかつ応答の開始から収− 146 −ヒト嗅覚受容体センサーによる匂いのデジタル化を応用した香水設計手法の確立

図２

嗅覚受容体センサーと取得されたデータ

図3

嗅覚受容体センサーによる香水の測定結果

束までは数分間であるため、ルシフェラーゼレポーター遺いて調製し、前記のスライドガラスのグリッド区画ごとに伝子アッセイに比べると匂い分子の細胞内への浸透により1 種類の嗅覚受容体発現プラスミドからなるリポプレック

惹き起こされる偽陽性や偽陰性、匂い分子の蒸発や変性のスを印刷した。このスライドガラスに嗅神経模倣細胞を播影響は低減されており、なおかつヒト嗅覚受容体レパート

種し 10 %（v/v）ウシ胎児血清を含む Dulbeccoʼs Modified

リーをハイスループットに解析することを可能としている。

Eagle Medium で培養し、スライドガラス上のリポプレッ

また、匂い応答の時間軸の情報が得られるため、匂いの刺クスをエンドサイトーシスにより細胞へ導入し、ヒト嗅覚激性や余韻といった官能との関連付けにおいて重要なデー受容体を細胞に発現させてヒト嗅覚受容体センサーとした。

タが得られることも期待されている。ヒト嗅覚受容体センサーのこれらの特性により、これまでにない切り口で匂い2. 2. ヒト嗅覚受容体センサーによる香水の測定。

関連製品・サービスを提供できる。そこで本研究では市販

リ ン ゲ ル 液［140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ,香水の匂いをヒト嗅覚受容体センサーにより測定して、香1 mM MgCl 2 , 50 mM HEPES（pH 7 . 2），1 mM ピルビン酸

水に応答する嗅覚受容体を明らかにし、香水の調香に資すナトリウム］でスライドガラス上の細胞を洗浄した後、細ることを目指した。

胞内のカルシウムイオン濃度の変動を測定するためにカル

２．方シウムイオンの蛍光指示薬 Calbryte 520（AAT Bioquest）

法を溶解したリンゲル液でスライドガラスを 30 分間インキュ

2. 1. ヒト嗅覚受容体センサーの作製ベーションした。その後リンゲル液を 3 分間、50 分の 1

スライドガラス上に 20 × 20 区画のグリッドを疎水性イに希釈した香水ポールスミス エクストリーム メン オード

ン ク で 形 成 し た。 次 に Lipofectamine（Thermo Fisher

トワレを 2 分間、リンゲル液を 5 分間スライドガラスに灌Scientific）とヒト嗅覚受容体発現プラスミドからなるリポ流し、灌流中のヒト嗅覚受容体センサーの蛍光を蛍光顕微

プレックスをヒト嗅覚受容体の全サブタイプ 388 種類につ鏡により 1 . 5 秒間隔で撮影した。

− 147 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

３．結では、同じ嗅覚受容体を持つ複数の嗅神経の嗅覚受容体応

果

答の情報は、糸球体により束ねられてから大脳に伝達され香水溶液灌流前の蛍光強度を 100 %（F 0）としたときの灌るが、私たちのヒト嗅覚受容体センサーは、一つ一つの嗅流時の最大蛍光強度時の蛍光強度（F）の変化率（ΔF/F 0）を神経模倣細胞の応答を画像として記録はしているが、各細疑似カラーで示す（図 3 A）
。香水に応答した嗅覚受容体の胞の応答を束ねるような数値化は行っていない。今後、画

サ ブ タ イ プ は、OR 2 W 1、OR 1 A 1、OR 5 P 3 で あ っ た。

像処理を工夫することにより、画像の中でノイズに埋もれ

図 3 B に応答した嗅覚受容体の蛍光強度変化率をグラフでているかもしれない多数の嗅神経模倣細胞の応答を検出す示した。応答したすべての嗅覚受容体において、香水灌流ることが課題として考えられる。

直後から蛍光輝度の上昇がみられた。また、OR 2 W 1 と香水は、速度の異なる多数の香料から構成されており、OR 5 P 3 は香水を除いた後 4 分以内に香水添加前の蛍光強その香調は蒸発開始から時間の短い順にトップノート、ミ度に復帰したのに対して、OR 1 A 1 は香水を除いた後も 5ドルノート、ラストノートと呼称される。香水は、時間の分間以上経過しても香水添加前の蛍光強度に復帰せず、嗅経過にともない様々な香調を楽しめるように匂い分子種ご覚受容体ごとに細胞内のカルシウムイオン濃度の経時変化とに異なる蒸発速度を考慮に入れて様々な匂い分子を組みが異なる結果となった。

合わせて設計されている。今回の本香水の測定では、香水４．考に含まれる全ての匂い分子を同時に測定しているが、香水察の分留を行うことによりトップノート、ミドルノート、ラOR 2 W 1 と OR 1 A 1 は、1- へプタノン、1 -オクタンチオ

ストノートを分けて測定することが可能となるであろう。

ール、β -シトロネロールなど、幅広い官能基を持つ匂い

また分留により香水のアルコール濃度を下げることにより、分子に応答し 、匂い分子としては比較的長い炭素鎖の部より希釈率の低い高濃度な香水をヒト嗅覚受容体センサー

分で匂い分子を認識しているかもしれない。両嗅覚受容体で測定できるかもしれない。

4）

共に今回測定した香水（以下、本香水）に含まれるリナロー
ルやシトロネロールに応答した可能性は高い。OR 5 P 3 は、

現在、嗅覚受容体の細胞内シグナル伝達経路に介入して、ネガティブフィードバック経路を抑制することにより、匂クマリンに応答することが報告されており 、本香水にもい分子に対する感度を上昇することを試みている。これまクマリンが含まれているためこれを検出した可能性が高い。

でのところ PDE 阻害剤の IBMX や CaMK II 阻害剤 KN- 62

また OR 5 P 3 は、1 - オクタノールのような長い炭素鎖を持を 用 い る こ と に よ り（ 図 1）
、 ヒ ト の 嗅 覚 検 知 閾 値 が、つ匂い分子を応答し、嗅覚受容体をその応答する匂い分子

78 ppt であるところ 7）、ヒト嗅覚受容体センサーで 4 L 空の構造をもとにしてクラスタリングすると OR 5 P 3 は、気中の濃度 10 ppt のイソ吉草酸に対する嗅覚受容体応答のOR 2 W 1 や OR 1 A 1 と相関が高いことが示されており 5）、検出に成功している 8）。香水の測定にもこれら阻害剤を用

これらの嗅覚受容体は共通の匂い分子に応答している可能いることにより、より多くの嗅覚受容体応答を検出できる性がある。

はずである。

4）

今回の測定では、３種類の嗅覚受容体の応答が検出され５．総たが、本香水の成分表示では 12 種以上の純品香料が含ま括れていることが示されており、香調の複雑さからもこの香嗅覚受容体センサーによる香水の測定により、香水設計

水を嗅いだときのヒトの嗅覚では、より多くの嗅覚受容体（調香）のリバースエンジニアリングや測定データに基づくが応答していると思われる。本来応答すべき嗅覚受容体の理論的な香水調香の可能性を示すことができた。

応答を今回検出できなかった原因としては、まず香水の成分が挙げられる。本香水を 50 分の 1 に希釈してから測定（引用文献）しているものの嗅覚受容体への香水主成分であるアルコー

1） Mainland J. D., Li Y. R., Zhou T., Liu W. L. L.,ルの干渉は否定できない。また、本香水に含まれるゲラニ

Matsunami H. Human olfactory receptor responses to

オールは、それ自体が匂いを持つが同時に CNG 阻害能もodorants. Sci. Data, 2, 150002, 20156）

あわせ持つことが報告されており 、ヒト嗅覚受容体セン2） Niimura Y., Nei M. Evolution of olfactory receptor

サーの感度を下げて、その結果として応答の検出に成功で

genes in the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci.

きた嗅覚受容体の種類が減少した可能性がある。他の原因

U.S.A, 100, 12235-40, 2003

としては細胞の構造や神経回路の有無の違いが挙げられる。
嗅神経には複数の線毛があり、ここに多数の嗅覚受容体分3） 黒田俊一

匂いの定量方法、それに用いる細胞及びその細胞の製造方法。特願 2019-536790

子が局在しているが、嗅神経模倣細胞は線毛を持たないた

4） Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H.,

めに表面積は嗅覚受容体に比べて小さい。嗅覚の神経回路

Mainland, J. D. Odor Coding by a Mammalian Receptor− 148 −

ヒト嗅覚受容体センサーによる匂いのデジタル化を応用した香水設計手法の確立

Gen. Physiol. 133, 583-601, 2008

Repertoire. Sci. Signal. 2, ra9-ra9, 20095） Audouze K., Tromelin A., Le Bon A. M., Belloir C.,
Petersen R. K., Kristiansen K., Brunak S., Taboureau O.

7） 永田好男

三転比較式臭袋法による臭気物質の閾値測定結果。日本環境センター所報 17, 77-89, 1990

Identification of odorant-receptor interactions by global

8） Lian Y., Tatematsu K., Sakai H., Sato S., Kuroda S.

mapping of the human odorome. PLoS One. e9 3 0 3 7.

Improving the sensitivity of odor molecule detection in2014

olfactory receptor-expressing cells. 日 本 農 芸 化 学 会

6） Takeuchi H., Ishida H., Hikichi S., Kurahashi. T.

2021 年度大会

Mechanism of olfactory masking in the sensory cilia. J.

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