グリコシダーゼの機能改変によるプレバイオティックオリゴ糖の効率的合成法に関する研究

芦田

京都大学大学院生命科学研究科緒久准教授

4)認している 。一方、GNB については現在のところ大言

ビフィズス菌はヒトの腸管に生息する善玉菌の代表的量調製が困難であるため、ビフィズス菌増殖効果は未検菌種であり、経口投与により宿主に良い影響を与えるプ

討であるが、LNB と同等かそれ以上の効果が期待されロバイオティクスとしてもよく知られている。ビフィる。なぜなら GNB 代謝の鍵となる ABC 型のトランスポー

ズス菌は糖質の乏しい腸管下部に適応するために、ヒターの糖結合タンパク質や菌体内の GNB/LNB ホスホリトの消化酵素により分解されない難消化性の糖質を利ラーゼは GNB の方に特異性が高いからである。

用するためのグリコシダーゼを豊富に有している。そエンド–α– N – アセチルガラクトサミニダーゼと GNB/のひとつがエンド–α– N– アセチルガラクトサミニダー

LNB トランスポーターは、分布は限られるものの腸内ゼ（Endo-α–N –acetylgalactosaminidase; EngBF）である。の悪玉菌や日和見感染菌にも見られる。しかしながら、ビ フ ィ ズ ス 菌 Bifidobacterium longum subsp. longum

その両者を持ち合わせる菌はほぼビフィズス菌に限定さや B. bifidum が 持 つ EngBF は、 消 化 管 上 皮 細 胞 か られることが各種の腸内細菌のゲノム情報から明らかで産生されるムチンのコア 1 型の O 結合型糖鎖（Galβ1–ある。筆者らは EngBF が糖転移反応を触媒することをGalNAcα1–Ser/Thr）に作用し、ガラクト N ビオース（Galすでに見出しており 、この反応を利用して GNB が他

β1–3GalNAc; GNB）を遊離させる

5)

1,2)

。遊離した GNB はの糖にα結合した 3 糖を調製すれば、Endo-–α–GalNAc–GNB およびラクト N ビオース I（Galβ1–3GlcNAc; LNB）

ase と GNB トランスポーターの両方を持つ腸内細菌、に特異的な ABC 型のトランスポーター

3)により菌体内すなわちビフィズス菌によってのみ資化される、非常にに取り込まれ、菌体内の GNB/LNB ホスホリラーゼによ選択性の高いビフィズス増殖因子になりうることが期待り代謝される。β1–3 結合のガラクトースは腸内細菌一される。

般に見られるβ–ガラクトシダーゼにより分解されにく

最近、筆者らは EngBF の結晶構造を明らかにした（図 1）

いため、この 2 糖はビフィズス菌に選択性の高い増殖6)因子、すなわちプレバイオティクスとしての応用が期待

改変により、糖鎖転移活性の強い変異体酵素を創成するされる。LNB については、in vitro の培養実験により、ことを目的とする。そして、より安価な糖鎖供与体の調ビフィズス菌を選択的に増殖させる効果があることを確

製方法を検討し、変異体酵素を組み合わせることによる

図１。そこで、本研究では構造情報に基づく本酵素の機能EngBF の立体構造モデル
1

芦田

久

プレバイオティックオリゴ糖の実用的生産技術を検討す

10/300 GL（GE Healthcare） に よ り 精 製 し、Microconる。

YM–10 を用いて濃縮、脱塩およびバッファー置換をおこなった。精製標品は SDS-PAGE で純度を確認した。

方法

1. 変異体酵素の作製

2. 転移反応

Bifidobacterium longum subsp. longum JCM 1217 由

Galβ1–3GalNAcα1–pNP（3.3 mM）を 500 mM Glc 存在

来 EngBF の 全 長 1966 ア ミ ノ 酸 の う ち 340–1528 ア

下で 50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.0) 中で EngBF

ミノ酸部分をコードする遺伝子を含むベクター pET–と反応させた。反応液を Shodex Asahipak NH2P-50 4EEngBF–del を鋳型にして部位特異的変異を導入し、各カラムを用いた順相 HPLC に供し、アセトニトリル：水種の変異体酵素を大腸菌 BL21（λDE3）で発現させた。

（3:1）で溶出し、溶出されたアミノ糖を 214nm の吸収酵素は His–Spin Trap （GE Healthcare）と Superdex 200をモニターすることで生成した加水分解産物（2 糖）と

図２

EngBF の活性中心付近のアミノ酸残基

A. 触媒残基；B. 第一変異導入候補残基；C. 第二変異導入候補残基。
2

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糖転移産物（3 糖）を定量した。TLC 分析は、シリカゲ

辺 に 存 在 す る W748、W750、Y787、H835、Y842、ルプレート（Merck）を用いて、1– ブタノール：酢酸：W893 に着目し（図 2C）、それぞれのアラニン置換体水（2:1:1）で展開し、ジフェニルアミン – アニリン試薬を作製した。糖転移活性を評価したところ、H835A、で糖を発色させた。

Y842A、W893A の３変異体が野生型の 3.3、2.5、3.3倍の高い転移活性を示した。これらの残基のアラニン以外の残基への変異では、さらに良い変異体は得られな

3. GNB の DMT 誘導体化
GNB は GNB/LNB ホスホリラーゼの逆反応を用いて酵かったので、第一群の変異と第二群の変異を組み合わせ素合成されたものを、北岡本光博士 ( 食品総合研究所 )た二重変異体を作製した。その結果、H835A/W836Fより供与いただいた。DMT 誘導体化は、DMT–MM (4,6–と W836F/W893A のふたつの二重変異体が野生型のdimethoxy–1,3,5–triazin–2–yl 4–methyl morpholinium

4.5 倍、4.2 倍の糖転移活性を示した。糖転移反応の経chloride) と GNB を水溶液中で混合したのち、余剰の時変化を調べたところ、特に前者においては早い糖転移

DMT–MM と未反応の GNB を Sephadex G–25 を用いた反応とともに、転移産物の加水分解反応が抑えられていゲル濾過により除去した。

る事が明らかになった（図 3）。消費した供与体基質 Gal
β1–3GalNAcα1–pNP に対する糖転移産物の収率は、野生型酵素の 19% に対して 85% に向上していた。

4. 天然基質を供与体とした転移反応
グ リ コ マ ク ロ ペ プ チ ド（GMP, Tatua Nutritional 社製）は（株）メグレ・ジャパンより供与していただいた。

2. DMT 誘導体の糖供与体としての利用

GMP (90 mg/ml) はあらかじめ SiaBb2（80 μg/ml）で処

糖やオリゴ糖の DMT（4,6–dimethoxy–1,3,5–triazin–2–理し、シアル酸を切断したのち、透析により除去した。

yl）誘導体化は、水酸基の保護が不要で、水溶液中でア33 mg/ml のアシアロ GMP を 500 mM Glc 存在下で 50ノマー水酸基への反応が選択的に進行することから、グmM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）中で EngBF と反応リコシダーゼの新たな基質として有用である。GNB のさせた。3 倍量のエタノールを加え反応を止め、遠心分DMT 誘導体が EngBF の基質になるか否か、また糖転移離により上清を得て、順相 HPLC にて分析した。

反応の供与体として適当か否かを評価した。まず野生型酵素を用いて糖転移反応液を HPLC で分析したところ、結果1. 糖転移活性の向上した EngBF 変異体酵素の創成
EngBF はアノマー保持型の酵素であり、ふたつの酸性触媒残基、すなわち酸塩基触媒残基である E822 と求核残基である D789 が活性中心を形成している（図2A）。酵素反応生成物である GNB（Galβ1–3GalNAc）とのドッキング解析の結果、ふたつの触媒残基の近傍には
W836、W823、N793 といった側鎖の大きなアミノ酸が存在しており、糖転移反応における受容体基質の進入を阻害していることが予想された（図 2B）。そこで、これらのアミノ酸を第一変異導入候補残基群として、それぞれをアラニンに置換した変異体を作製した。Galβ1–3GalNAcα1–pNP を供与体基質、Glc を受容体基質として糖転移反応をおこなった結果、W836A 変異体が野生型の約 1.5 倍の糖転移活性を示した。続いて、W836残基を他の全ての種類のアミノ酸に置換した変異体を作

図３製したところ、W836F、W836M、W836Y がそれぞれ変異体酵素による糖転移反応の経時変化

Galβ1-3GalNAcα1-pNP を供与体、Glc を受容体とした糖転移反応野生型の 3.7、3.2、3.2 倍の糖転移活性を示した。

液を経時的にサンプリングし、順相 HPLC で分析した。糖転移産

次に、第二変異導入候補残基群として活性中心周物である 3 糖のピーク面積を縦軸に示す。
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約 19 分の保持時間に糖転移産物である 3 糖のピークが在する糖タンパク質や糖ペプチドを利用できれば、安見られた（図 4A）。TLC で分析したところ、確かに 3 糖全かつ安価な糖転移産物が得られる。そこでコア 1 型の位置にスポットが検出された（図 4B）。次に、野生型、糖鎖を含む糖タンパク質として、グリコマクロペプチ

W836F、H835A/W836F、W836F/W893A の 4 種 のド（GMP）に着目した。GMP はチーズ製造中に生成する酵素を用いて糖転移反応の経時変化を見たところ、野生

κ–カゼインの分解物で、チーズホエイの主成分である型ではごくわずかの糖転移産物しか検出されないのに対が、利用は限定されている。64 アミノ酸からなり、Oし、W836F では消費した供与体の約 10% の糖転移産結合型糖鎖の付加を受ける可能性のある Ser/Thr を 10物 が、H835A/W836F と W836F/W893A の 二 重 変 異残基有する。糖鎖構造については、シアル酸が 1 残基体酵素では約 50% の糖転移産物が得られ、二重変異体または 2 残基付加したコア 1 型構造 （± Siaα2–3Galβ酵素では転移産物の加水分解がきわめてゆるやかであっ1–3（± Siaα2–6)GalNAcα1–Ser/Thr）が主成分で、一部た（図 4C）。

シアリル Tn 構造（Siaα2–6GalNAcα1–Ser/Thr）が含まれる。EngBF はシアリル化されたコア１構造には作用3.

しないので、あらかじめシアル酸を除去する必要がある。

天然糖タンパク質の糖供与体としての利用

そこで B. bifidum JCM 1254 株のゲノム中を探索したと化学法によって合成された化合物ではなく、天然に存図４DMT 誘導体基質を用いた糖転移反応

A. GNBα1-DMT を供与体、Glc を受容体とした糖転移反応液の順相 HPLC 分析。ピーク①は加水分解産物、ピーク②は糖転移産物。
B. 糖転移産物の TLC。レーン 1, GNBα1-DMT；レーン 2, GNB；レーン 3, Glc；レーン 4, パネル A のピーク①；レーン 5, パネル A のピーク②。
C. 各種変異体酵素を用いた糖転移反応の経時変化。
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ころ GH33 シアリダーゼドメインを持つ遺伝子 siaBb2られる。GMP を供与体基質とする場合には、本研究でを見出し、これをクローニングし大腸菌でリコンビナン作製した多くの変異体酵素を再度検討する必要があると

7)

ト酵素 SiaBb2 を発現させた 。野生型 EngBF を GMP考えられる。に作用させたところごくわずかの GNB しか遊離しなかったが、GMP をあらかじめ SiaBb2 処理することに

要

約より GNB の遊離が観察された。GMP の遊離量は、野生EngBF の構造情報に基づき活性中心付近のアミノ酸型および H835A/W836F 変異体酵素を用いた場合でほ残基をターゲットとした部位特異的変異導入により、糖ぼ同等であり、GMP 1 g あたり 41 mg の GNB が得られ転移活性の向上した EngBF 変異体を創成することに成た。しかしながら、H835A/W836F 変異体による GNB功した。最も糖転移活性の強い H835A/W836F 変異体の遊離速度は野生型酵素に比べてきわめて遅かった。Glc

では、使用した供与体基質 Galβ1–3GalNAcα1–pNP のを受容体に用いた糖転移反応をおこない HPLC で分析し85% が糖転移反応に利用され、糖転移産物の再加水分たところ、糖転移産物の最大値は野生型酵素と H835A/解はきわめて低く抑えられていた。本変異体酵素のビW836F 変異体酵素で顕著な差は見られなかった。

フィズス菌増殖オリゴ糖合成への応用が期待される。

考謝察EngBF の活性中心付近の、特にアグリコン側の認識

辞
本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公益財に関わることが予想される残基に着目し、各種の変異体団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

酵素を作製し、糖転移活性の向上を試みた。その結果、二重変異体酵素 H835A/W836F において、野生型酵素

文に比べ著しい転移活性の向上が見られた。転移活性の

1) K. Fujita et al.: J. Biol. Chem ., 280, 37415-37422, 2005.

献2) H. Ashida, et al.: Glycobiology , 18, 727-734, 2008.

向上は、合成基質である Galβ1–3GalNAcα1–pNP と Gal

3) R. Suzuki, et al.: J. Biol. Chem ., 283, 13165-13173, 2008.

β1–3GalNAcα1–DMT を用いた場合には観察されたが、4) M. Kiyohara, et al.: Biosci. Biotech. Biochem ., 73, 1175-

天然基質であるアシアロ GMP を用いた場合には顕著で1179, 2009.

はなかった。この理由は、アグリコン側の認識残基を改

5) H. Ashida, et al.: Glycoconj. J ., 27, 125-132, 2010.
6) R. Suzuki, et al.: J. Biochem. (Tokyo) , 146, 389-398, 2009.

変しすぎたため、アグリコンが Ser または Thr である天

7) M. Kiyohara, et al.: Glycobiology , 21, 437-447, 2011.

然基質への加水分解作用が低下したためであろうと考え

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