【研究報告】（自然科学部門）

食品機能成分によるマクロファージのフェノタイプ制御を介した肥満関連疾患の予防・治療戦略藤原章

熊本大学大学院生命科学研究部緒雄講師

実験方法

言

Cell-ELISA

マクロファージは体内の老廃物の処理や、微生物、ウイルスなどの病原体や腫瘍細胞に対する防御機能を担っ

96well プレートに播種した human monocyte-derivedており、感染症やガンなどの病態には、マクロファージ

macrophages（HMDMs）に、IL-10 存在下で試験化合の活性化が深く関わっている。その一方で、過剰なマク物（30 μM）を添加し、24 時間培養後、4％ PFA にて固ロファージの活性化は、逆に多くの病気の発症に関わる定した。ブロッキング後、1 次抗体として anti-humanことも知られている。近年、マクロファージの活性化機

CD163 antibody（AM-3K） を、2 次 抗 体 と し て HRP-構には、古典的活性化経路とオルタナティブ活性化経路

goat anti-mouse IgG antibody を使用することで CD1631）が存在することが明らかとなってきた 。すなわち、炎の発現を測定した。

症惹起性に機能する古典活性化マクロファージ（M1 マサイトカインの測定クロファージ）と、抗炎症性、組織修復性に機能するオ96well プレートに播種した HMDMs に、ガン細胞のルタナティブ活性化マクロファージ（M2 マクロファー1）

ジ）の 2 種類に大別される 。このようなマクロファー培養上清（TCS）存在下で試験化合物（30 μM）を添加

ジの活性化の違いは、様々な疾患の病態形成や消長と深し、24 時 間 培 養 後、LPS 含 有 培 地（100 mL/well） にく関連するため、マクロファージの活性化制御により、置 換 し た。 さ ら に、24 時 間 培 養 後、 培 養 上 清 を 回動脈硬化やメタボリックシンドローム、ガンなどの病態

収 し、 培 養 上 清 中 の IL-10, IL-12 の 濃 度 を ELISA kitの予防や治療が可能であると考えられている。粥状動脈（eBioscience）にて測定した。

硬化症では、変性脂質を取り込み泡沫化したマクロウエスタンブロット法ファージが集積し壊死に陥ることで粥腫破綻がおこり、心筋梗塞や脳梗塞などの急性期病変が惹起される。このHMDMs に試験化合物（30 μM）を添加し、24 時間培

粥状動脈硬化巣の形成には、炎症性機序が関わることが養後に調製した細胞溶解液を SDS-PGDE にて分離後、周知の事実であり、M1 マクロファージが優位を占めてPVDF 膜に転写した。スキムミルクにてブロッキングをいる。また、肥満形成においても脂肪組織内のマクロ行った後、1 次抗体（anti-phospho-Stat3 antibody, anti-ファージが関与することが知られており、肥満脂肪内のStat3 antibody, anti-β-actin antibody）および、2 次抗体

マクロファージも M1 優位であると報告されている。つ（HRP-goat anti-rabbit IgG antibody, HRP-goat anti-まり、動脈硬化やメタボリックシンドローム病態では、

mouse IgG antibody）を使用し検出した。

マクロファージの活性化状態を M1 から M2 に転換できれば、M2 マクロファージの抗炎症性作用を介した病態

脂肪細胞とマクロファージの共培養系におけるアディポの改善が期待できる。そこで、本研究では、食品由来成ネクチンの測定分のマクロファージ活性化制御作用を評価し、マクロ試験化合物（30 μM）で 24 時間刺激したマウスマクロファージの活性化状態を M2 へ変換することのできる食ファージ細胞株（RAW cell）をマウス 3T3-L1 脂肪細胞品由来成分を明らかにすることで、それら化合物の動脈と 24 時間共培養し、培養上清中のアディポネクチン濃硬化やメタボリックシンドロームに対する予防効果の検度を Mouse Adiponectin ELISA kit（CycLex Co）にて証を目的とした。

測定した。
1藤原章

統計学的解析

雄を 増 加 さ せ た（図 2）。 ゆ え に、Kakkalide お よ び
Actheoside はマクロファージの活性化を M2 にシフトす

グラフに示した数値は、すべて平均値±誤差で表記した。 有 意 差 検 定 は Mann–Whitneyることが示唆された。

-test お よ び Non-

repeated measures ANOVA を行い、各群のデータが等次に、Kakkalide ならびに Actheoside のマクロファー分散であるとみなした場合、危険率が 5％であるとき、ジ活性化制御メカニズムを明らかにする目的で、それら統計学的に有意差ありと評価した。

化合物のマクロファージにおける STAT3 の活性化に対する作用を検討した。近年、転写因子である STAT3 の結果活性化は、マクロファージの M2 活性化に深く関与してまず、保有する天然化合物（約 200 種類）を用いてマいることが知られているため、STAT3 を活性化するこ

クロファージの M2 活性化を促進する化合物のスクリーとでマクロファージの活性化状態を M2 に制御すること

ニ ン グ を 行 っ た。 方 法 と し て は、 ヒ ト 単 球 由 来マクが可能となる。結果を図 3 に示すが、Kakkalide ならびロ フ ァ ー ジ（HMDMs） に 天 然 化 合 物 を 添 加 し、M2に Actheoside は、マクロファージの STAT3 を活性化しマーカーである CD163 の発現を指標として評価した。

た。ゆえに、Kakkalide ならびに Actheoside は、STAT3

そ の 結 果、Kakkalide, Stevioside, Isoquercetin お よ びを活性化することでマクロファージの M2 分化を促進す

Actheoside に CD163 の発現誘導が認められた（図 1）。

ることが示唆された。

そこで次に、これら 4 つの化合物のマクロファージ活脂肪組織浸潤マクロファージはインスリンの作用を阻性化マーカーサイトカインである IL-10（M2 マーカー）害する炎症性サイトカインを産生し、肥満者における脂および、IL-12（M1 マーカー）の分泌に対する作用を評肪細胞からのアディポネクチン分泌を阻害することで、価した。その結果、すべての化合物は、M1 マーカーで炎症およびインスリン抵抗性に関与していることが知らある IL-12 の分泌には影響を与えなかったが、Kakkalideれている。したがって、化合物で刺激されたマクロおよび Actheoside は、M2 マーカーである IL-10 の分泌ファージが抗炎症性の M2 マクロファージに誘導されれば、その抗炎症機能によって脂肪細胞からの善玉アディポサイトカインであるアディポネクチン分泌が改善すると考えられる。そこで、マクロファージの M2 活性化を介した Kakkalide および Actheoside の脂肪細胞への効果を明らかにする目的で、これら化合物で刺激した RAW細胞（マウスマクロファージ細胞株）と 3T3-L1 脂肪細胞（マウス脂肪細胞）を共培養し、脂肪細胞からのアディポネクチン分泌を評価した。その結果、アディポネクチン分泌は 3T3-L1 脂肪細胞の単独培養と比較して、RAW 細胞との共培養によって有意に減少したのに対し、Kakkalide ならびに Actheoside で刺激した RAW 細

図1

CD163 の発現を促進する化合物のスクリーニング

図2

胞との共培養では 3T3-L1 脂肪細胞からのアディポネク

マクロファージの IL-10 および IL-12 の分泌に対する候補化合物の作用2食品機能成分によるマクロファージのフェノタイプ制御を介した肥満関連疾患の予防・治療戦略とが明らかとなった。肥満は慢性炎症疾患であることが知られており7）、ヒトおよびマウスにおいて、体重増加とともに adipose tissue macrophages（ATMs）は脂肪組織に蓄積し、その数はインスリン抵抗性の指標と相関する。一方、体重減少に伴って ATMs の数および炎症性マーカーは共に減少する7）。また、ATMs は脂肪細胞のインスリン抵抗性をもたらす TNF-α, IL-6 の脂肪組織における供給源である7）。健常状態において脂肪組織中の ATMs は M2 マクロファージのマーカーを発現する
図3が、肥満における ATMs では M2 マーカーの発現は低下

マクロファージの STAT3 活性化に対する候補化合物の作用し、逆に M1 マクロファージに関連する遺伝子の発現が誘導されている7）。つまり、肥満では M1 マクロファージ優位であり、その脂肪組織に浸潤している M1 マクロファージが脂肪組織の炎症およびインスリン抵抗性を誘導することが知られている。したがって、脂肪組織中のマクロファージの活性化状態を M1 から M2 へシフトすることは、2 型糖尿病の新しい治療戦略となりうると考えられる。本研究では Kakkalide ならびに Actheoside がマクロファージの分化・活性化状態を M2 へシフトすることを明らかにし、マクロファージを介した間接的な作

図4用によって脂肪細胞の機能を改善することを明らかにしマクロファージと脂肪細胞の共培養系におけるAdiponectin 分泌に対する候補化合物の作用た。
今 後、Kakkalide な ら び に Actheoside に よ る マ ク ロチン分泌が改善した（図 4）。ゆえに、Kakkalide ならびファージの活性化制御メカニズムの詳細が明らかになるに Actheoside はマクロファージの M2 活性化を介して脂ことで、Kakkalide ならびに Actheoside といった化合物

肪細胞からのアディポネクチン分泌を改善することが示によるマクロファージの分化・活性化制御が、糖尿病、唆された。

慢性炎症性疾患、心血管疾患、およびメタボリックシン
ドロームに対する新しい治療戦略の一つになると期待し考察ている。

近年、マクロファージの活性化制御が病態の改善や治要

療 に 有 効 で あ る と 考 え ら れ て い る。 例 え ば、 マクロ約

ファージの M2 活性化抑制を介したガン治療という試み

本 研 究 で は、Kakkalide な ら び に Actheoside がもなされており、最近、我々もマクロファージの M2 活

STAT3 を活性化し、マクロファージの活性化状態を抗性化を抑制（M1 活性化への誘導）する Soyasapogenol

炎症性の M2 タイプへシフトすることを明らかにした。

や Corosolic acid、Onionin A といった天然化合物を同

ま た、 こ れ ら 化 合 物 に よ り M2 へ シ フ ト し た マ ク ロ

定 し、 こ れ ら 化 合 物 が 動 物 モ デ ル に お い て、 マクロファージが脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌を改ファージの活性化を制御することで、皮下腫瘍サイズの善したことから、Kakkalide ならびに Actheoside はマク減少ならびに腫瘍の肺転移を抑制することを明らかにしロファージの活性化制御を介した間接的作用により脂肪2–6）

細 胞 機 能 を 改 善 す る こ と が 示 唆 さ れ た。 ゆ え に、

本研究では、Kakkalide ならびに Actheoside の抗炎症

Kakkalide ならびに Actheoside は、炎症性マクロファー性マクロファージである M2 マクロファージへの活性化ジが関与する慢性炎症疾患や心臓血管疾患に対して、マ誘導作用を検討した。これら化合物は、マクロファージクロファージの活性化制御という新たなメカニズムでのの STAT3 を活性化することで M2 活性化を誘導するこ治療戦略となりうる可能性が考えられた。

た。

3藤謝原章雄

文

辞本研究を執行するにあたり、研究助成を賜りました公

献1） S. Gordon, et al.:
2） Y. Fujiwara, et al.:3） H. Horlad, et al.:20134） Y. Fujiwara, et al.:
5） T. Junko, et al.:
6） Y. Fujiwara, et al.:
7） C. N. Lumeng, et al.:8） K. Kadowaki, et al.:5090–5094, 2006

益財団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様に深く感謝致します。また平成 28 年熊本地震に際しまして多くの皆様からお見舞いや励ましを頂きました。心から感謝申し上げます。

4, 3, 23–35, 2003., 102, 206–211, 2011., 57, 1046–1054,, 19, 594–605, 2015., 6, 29588, 2016., in press., 117, 175–184, 2015., 91,