化粧品用無機ナノ材料の遺伝毒性作用の解明

大阪府立大学理学系研究科生物科学専攻分子細胞遺伝学分野

八木孝司

Titanium dioxide (TiO2) is widely used as an ultraviolet-scattering substance in cosmetics. Here, we investigated effectsof particle sizes and surface modifications of TiO2 NPs on their genotoxicity to human skin fibroblast and keratinocyte
cells with the micronucleus (MN) assay. Induction of DNA strand breaks and reactive oxygen species (ROS) were alsomeasured to elucidate the mechanism of the toxicity. Three types of TiO2 NPs (35 nm and 1000 nm) with different surface
coating (Al(OH)3-coated-, Al(OH)3/C17H35COOH-coated-, and plain-TiO2 NPs) were examined. All TiO2 NPs induced MN
in both cells in a dose-dependent manner. Plain-TiO2 NPs (35 nm) induced more MN, DNA-strand breaks and ROS thanother two coated-TiO2 NPs. Small TiO2 NPs (35 nm, plain) were more genotoxic than large TiO2 NPs (1000 nm, plain). The
ROS production was closely correlated with the cellular uptake of the TiO2 NPs. These results indicate that difference in abalance of the particle size and surface properties of TiO2 NPs affects their cellular uptake, and causes different levels ofgenotoxicity.

１．緒って直接皮膚の細胞に接触し、可視光線および近紫外光の言曝露を受ける。

ナノサイズの微小粒子の毒性が懸念されている。これまこのような背景のもと、表面処理の異なる酸化チタンナ

で物質の毒性発現のメカニズムは、物質が生体高分子と相ノ 粒 子（TiO2 NPs） を 皮 膚 由 来 の 2 倍 体 培 養 角 化 細 胞互作用する化学反応であったが、近年、生体分子との反応（keratinocyte）および線維芽細胞（fibroblast）に曝露し、遺性のない無機物質であっても細胞毒性を持つことが報告さ

伝毒性の有無を小核誘導試験によって調べた。またその毒れ始めた。この毒性は物質の化学組成の他に、大きさと形性メカニズムを明らかにするために DNA 鎖切断と活性酸状に依存する。一般の細胞の大きさは 30 µm 程度であり、素誘導をそれぞれアルカリコメットアッセイと蛍光発光に

1,000 nm 以下の大きさの固体は細胞の貪食作用によってよって検出した。同様の方法で直径 35 nm と 1000 nm の細胞に取り込まれる。たとえば直径約 10 〜 100 nm の銀粒

TiO2 NPs（表面無処理）の遺伝毒性を比較した。これらの子を細胞に曝露すると、銀粒子は容易に細胞に取り込まれ結果、TiO2 NPs の遺伝毒性の強さは、その細胞へ取り込てアポトーシスを起こす。この機構は短波長の可視光（まみ量に比例することが明らかとなった。

たは UVA）との相互作用であることが明らかにされ、活性２．実酸素分子種が DNA 鎖を切断すると考えられている。また
幅数 nm・長さ約 100 nm の針状の多層カーボンナノチュ

験

2. 1. 材料ーブは暗所でも活性酸素分子種を介して細胞の DNA 鎖を

TiO2 NPs は、直径 35 nm、結晶構造はルチル型。粒子切断することが知られる。このメカニズムはアスベストの表面処理は Al（OH）3（親水処理）、Al（OH）3/ ステアリン

発癌メカニズムとの共通性で注目されている。

酸（撥水処理）、無処理の 3 種類である。比較対象として表化粧品には多種類のナノサイズの物質が使用されている。

面無処理の直径 1,000 nm TiO2 NPs も用いた。細胞はヒト

たとえばカオリンは化粧品の基礎的成分、二酸化チタンや健常人皮膚由来 2 倍体の角化細胞 HEKn および線維芽細胞

酸化亜鉛は紫外線防御剤として、マイカは光沢剤として使FJ で、それぞれ Humedia-KG2 および RPMI1640 培地で、用される。さらにそれぞれが副成分によって種々の色彩を37 ℃、5 ％炭酸ガス条件で培養した。

呈していたり、人工的に着色されたり、表面が親水加工や撥水加工されたりしている。これらのナノ粒子は化粧によ2. 2. 方法
細胞処理時の TiO2 NPs の性質：培地に懸濁した TiO2 NPs

Genotoxicity of inorganic nanomaterials
used for cosmetics
Takashi Yagi
Laboratory of Molecular and CellularGenetics, Department of Biology, Graduate
School of Science, Osaka Prefecture
Universityのゼータ電位を電気泳動光散乱法（レーザードップラー法）、粒子径を動的光散乱法（光子相関法）によって測定した。TiO2 を HEKn 細胞と FJ 細胞に処理し、6 時間後の細胞の状態をレリーフコントラスト顕微鏡で観察した。
小核の誘発：105 個の細胞を 6 cm 培養皿に播種し、上記 3種類の TiO2 NPs を 0.1、1、10、100 µg/mL の濃度で 6− 123 −コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

時間処理した。細胞を 42 時間培養後、カルノア固定し、子径 DLS を動的光散乱法（光子相関法）を用いて測定した。

低張処理後スライドグラスに滴下、アクリジンオレンジ

これらの結果を表１にまとめた。

染色し、蛍光顕微鏡で小核を有する細胞の割合を求めた。

TiO2 NPs 処理後の HEKn 細胞と FJ 細胞をレリーフコン

DNA 鎖の切断：10 個の細胞を 6 cm 培養皿に播種し、上トラスト顕微鏡で観察し、その写真を図１に示す。TiO2

記 3 種類の TiO2 NPs を 10 および 100µg/mL の濃度でNPs が発する青い蛍光によって、TiO2 NPs は 35nm- 表面１時間処理した。細胞を剥離し、アルカリアガロースに無処理＞ 35 nm-Al（OH）3 表面処理＞ 35 nm-Al（OH）3/ ス

包埋後スライドグラスに接着してアルカリ電気泳動した。

テアリン酸表面処理＞ 1000nm- 表面無処理の順に、細胞細胞をサイバーグリーン染色後、蛍光顕微鏡でコメットに多く付着している（または取り込まれている）ことがわかテールの大きさ（tail DNA）を測った。

った。

5

活性酸素（ROS）の誘導：105 個の細胞を 6 cm 培養皿に播種し、3 種類の TiO2 NPs を 10 および 100µg/mL の濃度

3. 2. 小核の誘発で１時間処理した。剥離した細胞をH2DCFDAで処理し、角化細胞と線維芽細胞において、無処理でも小核は低頻発生する蛍光をイメージングサイトメーターで測った。

度で発生したが、TiO2 NPs を処理すると濃度に依存してTiO2 NPs の細胞内取込：105 個の細胞を 6 cm 培養皿に播より高頻度に小核を誘発した。図２に誘発された小核の例

種し、3 種類の TiO2 NPs を 10 および 100µg/mL の濃度を示す。表面無処理の 35 nm TiO2 NPs は 35 nm- 表面無処で１時間処理した。剥離した細胞をフローサイトメータ

理＞ 35 nm-Al（OH）
3 表面処理≥ 35 nm-Al（OH）
3/ ステアーにかけて forward scatter と side scatter を測定し、後リン酸表面処理＞ 1,000 nm- 表面無処理の順に、より高頻者を TiO2 NPs の細胞内取り込み量の指標とした。

度で小核を誘発した（図 3）。

３．結果

3. 3. DNA 鎖の切断（アルカリ性コメットアッセイ）

3. 1. 細胞処理時の TiO2 NPs の性質

アルカリ性コメットアッセイの結果の一例を図 4 に示す。

無血清 Medium 中の TiO2 NPs 懸濁液のゼータ電位と粒表1角化細胞においても線維芽細胞においても、表面処理の異TiO2 NPs の物理的性質

図１ TiO2 NPs（100 µg/mL）処理した HEKn、FJ 細胞のレリーフコントラスト顕微鏡画像。TiO2 NPs が青い蛍光を発している。

− 124 −

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図２ TiO2 NPs によって誘発された小核の例。細胞に TiO2 NPs（35 nm-plain, 100 µg/mL）処理した HEKn（左）と FJ（右）細胞

図３ 角化細胞および線維芽細胞における、表面処理の異なる３種類の TiO2 NPs による小核誘発。3 回の独立した観察の平均値 ±SD を表す。* 溶媒対照群と比較して有意差あり（p<0.01）、a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k 異文字間で有意差あり（p<0.01）（Tukey-Kramer 法）。縦軸は観察した細胞 1,000 個あたりの小核保有細胞出現頻度を示す。
CT は溶媒コントロール。 MMC はマイトマイシン C（陽性コントロール）。

図４

アルカリ性コメットアッセイの例。左：角化細胞（HEKn）、右：線維芽細胞（FJ）− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

なる 3 種類の TiO2 NPs は処理濃度に依存してより多くの3. 4. 活性酸素（ROS）の誘導DNA切断（tail DNA）を引き起こした。TiO2 NPsは 35 nm- 表Tali イメージングサイトメーターを用いた細胞内 ROS 誘面無処理＞ 35 nm-Al（OH）3 表面処理＞ 35 nm-Al（OH）3 /導量測定の一例を図 6 に示す。H2DCFDA が ROS によっステアリン酸表面処理＞ 1,000 nm- 表面無処理の順に、よて酸化され DCFDA となり蛍光を発する。角化細胞およびり多くの DNA 切断を起こした（図 5）。

線 維 芽 細 胞 に お い て、3 種 類 の TiO2 NPs は 10 お よ び

図５ 角化細胞（HEKn）および線維芽細胞（FJ）における、アルカリ性コメットアッセイによって測定した
TiO2NPs による DNA 切断。独立した 3 回の % Tail DNA の平均値 ±SE。* 溶媒対照群と比較して有意差あり（p<0.01）、a, b, c, d, e, f, g, h, i 異文字間で有意差あり（p<0.01）。

図６角化細胞（HEKn）（左）および線維芽細胞（FJ）（右）における TiO2 NPs100 µg/mL 処理後の ROS 蛍光量− 126 −化粧品用無機ナノ材料の遺伝毒性作用の解明

100µg/mL 処理によって ROS を誘導することがわかった。

４．考TiO2 NPs は 35 nm- 表面無処理＞ 35 nm-Al（OH）3 表面処
理＞ 35 nm-Al（OH）
3 / ステアリン酸表面処理＞ 1,000 nm-

察酸化チタンナノ粒子（TiO2 NPs）は白色顔料や紫外線散表面無処理の順に多くの ROS を誘導した（図 7）。

乱剤として日焼け止め等の化粧品に使用されている。また、

3. 5. TiO2 NPs の細胞内取込

粧品もある。本研究では、表面処理の違いと遺伝毒性との無機系・有機系の表面処理を施された TiO2 NPs を含む化
TiO2 NPs を 10 および 100 µg/mL、1 時間処理後、フロ関係を明らかにした。また同時に、表面無処理で直径が異ーサイトメーターを用いて forward scatter と side scatterなる 2 種類の TiO2 NPs の遺伝毒性も比較した。化粧品がを測定した（図 8）。前者は細胞の大きさを反映する。後者

直接皮膚に接触することを考慮し、ヒト皮膚二倍体細胞（線は細胞内に取り込まれた TiO2 NPs の量を反映する。全細維芽細胞および角化細胞）を用いて小核試験を行った。そ胞数のうち赤の横線より上に分布している細胞の割合は、の結果、Al（OH）
3 表面処理、Al（OH）
3 / ステアリン酸表

100 µg/mL TiO2 、35 nm-Al（OH）3 表面処理、35 nm - Al

面処理、表面無処理の、どの TiO2 NPs（粒子径が 35 nm）（OH）3 / ステアリン酸表面処理、35nm- 表面無処理、1,000も濃度依存的に小核を誘導した。特に表面無処理の粒子にnm- 表面無処理、溶媒対照の順に、HEKn 細胞では 63.0 ％、よる小核誘発頻度が最も高かった。またアルカリコメット

60.5 ％、90.0 ％、42.6 ％、9.2 ％であり、FJ 細胞では 86.1 ％、アッセイにより、表面無処理の TiO2 NPs が最も DNA 鎖33.6 ％、91.0 ％、31.2 ％、0.3 ％であった。

切断を誘発することがわかった。さらに、ROS 産生能を、すなわち、角化細胞および線維芽細胞において、表面無蛍光試薬を用いて調べたところ、表面無処理の TiO ₂ NPs処理の TiO2 NPs が最も取り込まれ、次いで Al（OH）3 処が最も ROS を誘導した。NPs の小核誘発能、DNA 切断量、理が取り込まれやすく、Al（OH）
3 / ステアリン酸処理は取ROS 産生量と細胞への取り込み量の関係を調べた結果、り込まれにくいことがわかった。表面無処理の 1,000nm

それらに正の相関が見られた（図 9）。

TiO2 NPs が最も取り込まれにくいことがわかった。

以上のことから、TiO2 NPs のヒト皮膚二倍体細胞に対図７ 角化細胞（HEKn）および線維芽細胞（FJ）における、TiO2 NPs による細胞内 ROS 産生量。独立した 3 回の %Tail DNA の平均値 ±SE。 * 溶媒対照群と比較して有意差あり（p<0.01）、a, b, c, d, e, f, g , h, i, j, k 異文字間で有意差あり（p<0.01）。縦軸はコントロールでの ROS 産生量を１としたときの相対値を示す。

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

する遺伝毒性の違いは、表面特性による細胞内への取り込すると考えられる。培養液（pH 7）中の TiO2 NPs 粒子のゼまれやすさに起因することが示唆された。細胞は培養液中ータ電位は親水性 NPs で大きいことがわかり、TiO2 NPsで負荷電していることから、TiO2 NPs の細胞への取り込が凝集していることを示し、顕微鏡観察でもそのことがわ

まれ易さは、粒子の親水性の他に、粒子表面電荷にも依存かった。親水性で凝集性が高い 35 nm NPs は多くの ROS

図８

フローサイトメーターによる TiO2 NPs の細胞内取込量（side scatter）の測定。上：角化細胞（HEKn）、下：線維芽細胞（FJ）− 128 −

化粧品用無機ナノ材料の遺伝毒性作用の解明を産生し、DNA 損傷および小核を誘導していた。これは1,000 nm NPs は 35 nm NPs と比べて、大きさの点で細胞TiO2 NPs が凝集することによって、細胞あたりの取り込膜透過性が低く、遺伝毒性が低いと考えられる。本研究結み量が増え、細胞内 ROS 産生量とそれによる DNA 損傷量

果から導かれる TiO2 NPs の ROS を介した小核誘導のメカが増え、高頻度で小核を誘導すると説明できる。撥水性のニズムを図 10 に示す。

NPs は凝集性が低く、細胞膜透過性も低いと考えられる。

図９（HEKn）、下：線維芽細胞（FJ）
TiO2 NPs の ROS 産生量、DNA 損傷性、小核頻度と細胞への取り込みとの相関。上：角化細胞

図 10

TiO2 NPs による小核誘導のメカニズム− 129 −