皮膚組織修復におけるリン脂質局在制御機構の役割
京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻

原雄二

Membrane repair is the fundamental process that is essential for maintaining the homeostasis of live cells. Phospholipids’
distribution has been thought to be dramatically changed during membrane repair, but the detailed mechanisms underlying
the membrane repair is still elusive. To elucidate the role of phospholipids’ distribution in membrane repair, we havefocused on phospholipid flippase that can translocate specific phospholipids from the outer to the inner leaflets of biologicalmembranes, thus generating asymmetric distribution of phospholipids. We first established cell lines lacking phospholipid
flippase by the CRISPR/Cas 9 system, and performed membrane damage assays using a membrane-impermeable dye (FM 1 43 ) or GFP-tagged membrane repair proteins expressed in the phospholipid flippase-deficient cell lines. Phospholipid
probes were also utilized to elucidate the role of phospholipids’ localization in membrane repair. Our results revealed
that continuous influx of FM 1 - 43 was observed in phospholipid flippase-deficient lines after introduction of membrane
damages. Accumulation of one of membrane repair-related proteins to damaged sites was affected in the flippase-deficient
cells, suggesting that the membrane repair was affected by deficiency in the phospholipid flippase. Moreover, during thecourse of this project, we identified PIEZO 1 , a mechanosensitive cation channel that is activated by membrane tension, asa downstream target of phospholipid flippase-dependent phopsholipids’ localization. Our results indicate that phospholipid
flippase plays a role in the membrane repair system, thus providing the therapeutic strategies for a variety of diseasesincluding skin diseases.

1. 緒

あるリン脂質分子群に焦点をあてた「膜修復素過程の包括言的理解」が進んでいないことが大きな要因と言える。例え生体膜は、生命の基本単位である細胞を形づくる構造体

ば膜修復関連タンパク質群による膜損傷後の意義、膜修復である。形質膜の構造が損なわれると、細胞における恒常時における脂質分子群の動態等が未解明であること等が挙性が破綻し、筋ジストロフィーをはじめ様々な疾患が惹起げられる。

1）

される 。形質膜に対する損傷は骨格筋だけでなく皮膚等

そこで、本研究では皮膚を構成する上皮細胞における膜修復機構に焦点をあてた。特に皮膚への損傷時に膜リン脂様々な組織で見られる。
機械刺激や炎症等により惹起される形質膜損傷を認識し、直接修復する機構については、脂質結合ドメインを有する
2）質分子そのものの動態やリン脂質分子局在を制御するタン
パク質群の機能解析を行うことで、皮膚修復機構解明を目タンパク質 Dysferlin の発見により端を発した 。同タン指した。具体的にはリン脂質の形質膜内層・外層間の輸送

パク質が筋線維内の小胞とともに形質膜損傷部位に集積し、を制御するリン脂質輸送体群に着目した。リン脂質輸送体2+カルシウムイオン（Ca ）依存的に損傷が修復される仮説がは外層から内層にリン脂質を輸送するフリッパーゼ、両方提唱され、脂質結合タンパク質群が膜ダメージ認識に関与向に輸送するスクランブラーゼ、内層から外層に輸送する

3）すると報告がなされている 。一方、皮膚をはじめとするフロッパーゼからなり、これらの役割によりリン脂質の局上皮細胞に対する保護・修復機構は、組織の構造・機能恒在は決定される。興味深いことに、哺乳動物細胞では内層常性維持に必須である。これまでに損傷部位に集積する免側にホスファチジルセリンやホスファチジルエタノールア

疫細胞から産生されるサイトカイン等の液性因子等様々なミン等が、外層側にホスファチジルコリンやスフィンゴミ修復関連因子が同定されてきた 4）。しかし膜修復におけるエリンなどが局在し、非対称分布を形成する 5）。

分子機構の詳細は依然明らかではない。それは、膜構造・以上の観点のもと、本研究ではリン脂質輸送体が小胞融機能破綻を主原因とするにも関わらず、形質膜構成因子で合時のリン脂質局在の制御を行うことで、皮膚細胞における修復に関与するという作業仮説を提唱し、検証を目指した。申請者のこれまでのバックグラウンドをもとに、まずRole of phospholipid translocases inskin repair
Yuji Hara

モデル系として筋芽細胞株を用いた解析を行うことで、皮膚をはじめとする修復過程におけるリン脂質動態の役割の解明を目指した。

Graduate School of Engineering, Kyoto
University− 132 −皮膚組織修復におけるリン脂質局在制御機構の役割

2. 実索するため、骨格筋線維に対して溶解作用を有するカルジ験

オトキシンを用い、その後の再生過程への効果を検討した。

2 . 1. リン脂質フリッパーゼの欠損細胞株の樹立
CRISPR/Cas 9 法により樹立を行った。各遺伝子配列に

2 . 6 . リン脂質フリッパーゼにより制御されるイオンチャネル群の同定および解析

対するターゲット配列を CRISPR-direct を用いて設計し、リン脂質の非対称分布により制御を受けるイオンチャ

pX 330 ベクター（Addgene）に該当配列を組み込むことでネルとして、我々はカルシウム透過型イオンチャネルの設計を行った。C 2 C 12 細胞株（ATCC）へ pX 330 - ターゲ関与を検討した。筋芽細胞に発現するイオンチャネルをット配列 -PGK-puromycin カセットを組み込んだベクタ

qRT-PCR 法にて同定後、各イオンチャネルについてアゴーを、ViaFect（Promega）を用いてトランスフェクショニスト刺激後のイオンチャネル活性の計測を行った。今ンした。その後 Puromycin 耐性細胞について、単一細胞回着目したイオンチャネルとして PIEZO 1 が挙げられるが、クローニングを行い、ゲノム DNA を鋳型としたゲノミッ

PIEZO1 特異的アゴニストYoda 16）を用いて、カルシウム指ク PCR を行い、得られた PCR 産物について各遺伝子配列

示薬Fura- 2 を用いてカルシウム測光を行った。

リ ン 脂 質 フ リ ッ パ ー ゼ 欠 損 筋 芽 細 胞 株 に つ い て、をダイレクトシーケンシングすることで、各遺伝子欠損を確認し細胞の樹立を行った。

3. 結果

3 . 1. 培養細胞系におけるリン脂質輸送体の機能解明

2 . 2 . 細胞膜修復アッセイの構築

本研究遂行にあたり、我々は膜外層から内層にリン脂質膜損傷導入系として、マイクロマニピュレーターにより分子を輸送する「リン脂質フリッパーゼ」に着目した。リン

微小ガラス管を操作し、細胞膜への損傷を与えた。二光子脂質フリッパーゼは主要ユニットである P 4 -ATPase、補顕微鏡（LSM 780 ; Zeiss 社）下にて二光子パルスレーザを用助ユニットである CDC 50 の各ファミリーよりなる（図 1）。

いる方法、あるいはマイクロマニピュレーターにて微小ガ研究の端緒として、申請者の研究バックグラウンドとしてラス端にて細胞膜にダメージを与える方法を試みた。膜骨格筋における幹細胞として機能する筋芽細胞に着目し、修復に関わる因子群の挙動観察のため、膜修復関連因子検討を行った。筋芽細胞は互いに融合することで、筋管と（MG 53 , ESCRTIII 複合体 , Annexin）について、各 GFP 融よばれる多核の構造体を形成し、筋線維へと成熟する。リ合タンパク質の集積を評価した。

ン脂質フリッパーゼの発現プロファイルを検討したところ、
P 4 -ATPase、CDC 50 各ファミリーにて高発現する分子と2 . 3 . リン脂質フリッパーゼ欠損マウスの樹立

して、Atp 11 a および Cdc 50 a 各遺伝子の同定に成功した。

リン脂質フリッパーゼ（Atp11 a）欠損マウスについては、その結果をもとに筋芽細胞株にて各遺伝子欠損株の樹立

Wellcome Trast Sanger Institute より購入した。同遺伝子を CRISPR/Cas 9 法にて行い、その機能解析を行った。まの全身性欠損により胎生致死に至ることから、コンディシず筋芽細胞からの分化能を検討した。低血清培地による筋ョナル遺伝子欠損システムとして、Cre-LoxP システムにて、管形成の誘導後、野生株では細長い筋管構造を呈するのに筋芽細胞特異的な Creレコンビナーゼ（Myf5-Cre）を用いて、対し、各分子欠損株では異常な構造体の形成が認められた。

同マウスの解析を試みた。

タイムラプス観察の結果、野生株では秩序だった融合過程に続き、長軸方向へ正しく伸長する様子が観察された。一2 . 4 . 遺伝子欠損細胞株の増殖能アッセイ

方、リン脂質フリッパーゼ欠損株（Atp 11 a, Cdc 50 a 各欠

リン脂質フリッパーゼ欠損細胞の増殖能を検討するため、損細胞）では、細胞同士の融合の異常な亢進、および融合同遺伝子欠損マウスより筋芽細胞を単離し、培養を行った。

後に細胞極性を失うことで、長軸方向への伸長が損なわれコンフルエントになるまで同細胞を培養し、スクラッチアッセイを行い、その後の増殖能について観察を行った。また、増殖過程の観察のため、筋芽細胞株を用いて、京都大学医学研究科の共通施設に設置されているインキュベーター型顕微鏡（Olympus LCV110）を用いてタイムラプス観察を行った。

2 . 5 . リン脂質フリッパーゼ欠損マウスの解析
リン脂質フリッパーゼ（Atp11 a）欠損マウスについて、その表現型解析を行った。組織における修復能への影響を探− 133 −

図1

リン脂質フリッパーゼコスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

ることが示された。この結果より、リン脂質フリッパーゼついて解明を試みた。これらの欠損細胞株では細胞形態のは細胞極性の形成に関わりうることが示唆された。

著しい変化が生じたことから、細胞骨格が関わることが想

さらに我々はリン脂質フリッパーゼの下流にて機能する定された。また先行研究により、筋管細胞での形質膜直下分子の同定を試みた。特に膜融合過程では、融合する細胞でのアクトミオシン（アクチン - ミオシン複合体）の形成が、同士で押し合うことに伴い膜張力が増強し、この力学的秩序だった細胞形態に関わることが示された。実際、アクな刺激が融合促進に関わることが想定されている 7）。そこ

チンの重合をファロイジンにて、およびミオシンの集積をで我々は膜張力を感知する分子群とリン脂質フリッパー抗ミオシン（NMIIA）抗体にて検出したところ、野生型でゼが機能的に関わると作業仮説を立てた。特に、膜張力感は形質膜直下での集積が認められたが、各欠損株ではそ知に関わり細胞質内でのシグナル伝達をもたらす機械受の集積が消失することが示された。アクトミオシン形成

容イオンチャネルに焦点を当てた。機械受容イオンチャには、低分子量 G タンパク質 RhoA および Rho キナーゼがネルは細胞膜の張力や、細胞骨格からの力を感知して活活性化され、MLC 2（ミオシン軽鎖）のリン酸化を経ても性化されることが知られており、多くのイオンチャネルがたらされる。そこで各欠損株にて、アクトミオシン形成該当すると考えられている。特に筋芽細胞株 C 2 C 12 におをレスキューするために、上記経路を活性化させることいて、PIEZO 1、TRPM 7、PKD 2 などの発現が認められとした。RhoA 活性化剤 CN 03、およびミオシン活性化剤た。これらのうち、PIEZO 1 イオンチャネルはリン脂質フCalyculinA を添加すると、リン脂質フリッパーゼ欠損あリッパーゼ欠損により、その機能が大きく減弱することをるいは PIEZO 1 欠損細胞株で見られた筋管形態の異常が、明らかにした（図 2）。同イオンチャネルアゴニストである少なくとも部分的にレスキューされた。以上の結果より、

6）

Yoda 1 を添加すると、野生株では急激なカルシウム上昇

我々は「リン脂質フリッパーゼによるリン脂質の細胞膜間が見られるのに対し、Atp 11 a 欠損細胞では同チャネル活の輸送は、PIEZO 1 イオンチャネルにより感知され、様々性の減弱が、さらに Cdc 50 a 欠損細胞では、ほぼ完全に同な細胞機能をもたらす」という「フリップ・フロップチャネル活性が消失することを明らかにした（図 3）。さらッチ機構」を提唱した 。

スイ8）に Piezo 1 欠損細胞では、細胞同士の融合が促進し、かつ融合後の形態が損なわれた。以上の結果より、リン脂質フ3 . 2 . 細胞遊走におけるリン脂質フリッパーゼの役割

リッパーゼによるリン脂質動態は、機械受容イオンチャネ

リン脂質フリッパーゼは、リン脂質の細胞膜間の挙動

ルの活性を正に制御することが示された。

を制御することにより、多様な役割を担うと考えられて続いて、リン脂質フリッパーゼ、PIEZO 1 の下流経路に図2きた。実際我々は、リン脂質フリッパーゼの一つであるリン脂質フリッパーゼと機械需要イオンチャネル PIEZO1 の機能的連関

図3

リン脂質フリッパーゼ欠損細胞でのカルシウム測光− 134 −皮膚組織修復におけるリン脂質局在制御機構の役割

ATP 8 A 1 が、CHO-KI 細胞での細胞遊走に関わることを9）

ことに、野生型と比較して細胞遊走能の減弱が認められた示した 。ATP 8 A 1 のノックダウンにより細胞遊走能が（図 4）。また筋芽細胞株 C 2 C 12 を用いた解析により、特著しく減弱すること、さらにこの下流経路として Rac 1 がに Cdc 50 a 欠損細胞株ではラメディポディア（葉状仮足）の関わることを明らかにした。これらの知見のもと、我々形態に変化が見られた。リン脂質フリッパーゼは CDC 50

はリン脂質フリッパーゼ ATP 11 A が筋芽細胞の細胞遊走ファミリーの存在下、正しく局在し機能を果たすことから、能を制御する可能性を追究した。Atp 11 a 欠損マウスより筋芽細胞にて唯一発現する Cdc 50 a を欠損すると、リン脂単離した筋芽細胞にて、コンフルエントになるまで培養質フリッパーゼの機能はほぼ欠損すると考えられる。以上し、スクラッチ後の細胞増殖能の検討を行った。興味深いの結果より、リン脂質フリッパーゼは形質膜のリン脂質動態を介して、細胞遊走を正に制御すると考えられる。

3 . 3 . 膜修復機構におけるリン脂質フリッパーゼの役
割
リン脂質フリッパーゼの役割をさらに明らかにするため、我々は膜損傷の修復機構への関連に着目した。形質膜は細胞を外界から隔てる役割を有しており、その構造破綻により内容物の漏出等により細胞死が引き起こされる。細胞死を防ぐため、前述のとおり細胞内には内在性の修復機構が備わっている。特に細胞膜直下の微小小胞が損傷を感知して損傷部位に集積・融合することで、細胞膜が修復される機構が知られている。膜修復機構には ⒜ 膜損傷認識因子群による、膜損傷部位への小胞集積および ⒝ 小胞集積後の膜構造の再編成という機構が考えられている 1 , 3）。

上記の背景のもと、リン脂質フリッパーゼ欠損細胞における膜修復機構の影響について検討を行った。膜損傷認識因子として MG 53、膜構造の再編成に関わる因子として ESCRTIII 複合体を例として、それぞれの損傷部位への集積の検討を行った。膜ダメージとしてリン脂質フリッパーゼ欠損株では MG 53 の挙動は野性型と変わりなかった。
図4

リン脂質フリッパーゼ欠損細胞での遊走能評価

図5

一方 ESCRTIII 複合体の集積については、野生型は一過的

CDC50A 欠損株における膜修復機能の低下− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019に集積が解離した（すなわち膜修復が完了した）のに対し、皮膚における触覚感知においては、PIEZO 1 のホモログで同欠損株では ESCRTIII 複合体は解離せず、損傷部位にとある PIEZO 2 が関与することが報告されている 12）。本研

どまったままであった。このことから、リン脂質フリッパ究をさらに発展させ、リン脂質動態を介したイオンチャネーゼは膜修復機構に関与する可能性が示唆された（図 5）。

ル活性化が皮膚組織の恒常性に関わるという「フリップ・リン脂質フリッパーゼはホスファチジルセリン、ホスフフロップスイッチ」機構の解明を目指したい。

ァチジルエタノールアミン（PE）等のアミノリン脂質を基また、本研究では、リン脂質フリッパーゼは膜損傷に対質として、細胞外層から内層への輸送を行う。我々はこれする修復過程に関わること、さらに膜修復機構のうち、主まで外層に露出した PE を特異的に検出する環状ペプチドに膜構造の再編成に関わることを明らかにした。これまで、

9）（Ro 09 - 0198） を用いて研究を行ってきた。興味深いこ

膜修復機構は関連するタンパク質群の同定・解析が主であとに Ro 09 - 0198 はその添加により細胞毒性を示す。我々った。本研究により、リン脂質動態機構が膜修復機構に関は同試薬を用いることで、膜構造の変化を介して細胞毒性わることが示されたことから、膜リン脂質そのものも膜修を示すこと、膜修復タンパク質群の特異的な集積を示すこ復機構に関わることが示された。細胞膜損傷時から修復過とをそれぞれ明らかにした。

程において、膜の物性が著しく変化することが想定されて4. 考いる。本研究をさらに発展させ、リン脂質フリッパーゼと察

膜物性の相関についても明らかにする必要があり、今後の細胞膜を構成するリン脂質は、膜外層および内層間で異研究が待たれる。

なる局在を示すことが想定されている。この特異的な局在

5. 総により、細胞遊走、細胞分裂、細胞死過程等、様々な細胞括機能に関わると想定されてきた 10）。本研究ではリン脂質膜損傷は細胞の恒常性を破綻させることから、膜修復機挙動を司るリン脂質輸送体のうち、特に外層から内層に特構はきわめて重要な役割を果たしている。今後、リン脂定のリン脂質を輸送するリン脂質フリッパーゼに着目した。

質フリッパーゼ依存的な膜修復機構のさらなる解明（下流申請者の研究バックグラウンドの関係上、まず筋芽細胞を因子群の同定、遺伝子欠損マウスの解析等）を行うことで、用いた解析を試みることで、皮膚上皮細胞との共通性を示皮膚細胞においてもその寄与を明らかにすることで、コスす現象について着目した。皮膚には幹細胞が存在し、高いメトロジー分野への進展に微力ながら貢献したい。

再生能を有すると考えられている。筋芽細胞においても幹最後になりましたが、多大なるご援助を賜りました公益細胞（筋衛星細胞）の存在により、絶え間ない筋収縮に伴う財団法人コスメトロジー研究振興財団様にこの場をお借り筋線維へのダメージに応じて、高い再生能を有する。本研して心より御礼申し上げます。

究では、リン脂質フリッパーゼがいかに筋線維再生に関わるのか解明を試みた。その結果、リン脂質フリッパーゼの（引用文献）

一つ ATP 11 A および補助ユニット CDC 50 A 複合体が、秩1）Davies KE et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 7: 762-773,

序だった筋管形態形成に関わることを明らかにした。その2006.

過程で、フリッパーゼの下流分子として、機械受容イオン

2）Bansal D et al., Nature, 423:168-172, 2003.

チャネル PIEZO 1 が膜張力を感知して活性化することで、3）Cai C et al., Nat Cell Biol. 11: 56-64, 2009.

細胞骨格の再編成がもたらされることをそれぞれ見出した。

4）Gurtner GC et al., Nature. 453: 314-321, 2008.

PIEZO 1 は上皮細胞や血管内皮細胞に高発現することが知5）Murate M et al., J Cell Sci. 128: 1627-1638, 2015.

られており、上皮機能の維持および血管形成および機能に6）Choung S-Y et al., Biochim Biophys Acta 940: 180-

関わることが報告されている

11）。当研究により、上皮細197, 1988.

胞での機能においても、リン脂質フリッパーゼが機能する

7）Kim JH et al., Dev. Cell 32: 561-573, 2015.

ことで、膜張力などの物理的な力を感知するイオンチャネ8）Tsuchiya M et al., Nat. Commun, 2049, 2018.

ル PIEZO 1 の活性が制御されることが示唆される。

9）Kato U et al., J Biol Chem, 288: 4922-4934, 2013.

一方、予備検討により、リン脂質フリッパーゼ欠損に伴10）van Meer G et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 9 : 112 - 124 ,2008 .

い、PIEZO 1 以外のイオンチャネルも活性制御されることを見出している。皮膚組織において、
PIEZO1 以外にも様々

11）Wu J et al., Trends Biochem Sci, 42 , 157 - 171 , 2017 .

なイオンチャネルが発現されると考えられている。また、

12）Ranade SS et al., Nature. 516 : 121 - 125 , 2014 .

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