皮膚表皮保湿成分セラミドの脂質シグナリング分子としての作用メカニズムの解明
九州大学大学院理学研究院化学部門

谷

元 洋

Ceramide, the backbone of membrane sphingolipids, is now recognized as an intracellular lipid second messenger that
regulates various signal transduction systems including apoptosis. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, accumulationof intracellular ceramide causes strong growth defect. In this study, we screened yeast mutant strains showing abnormal
sensitivity against ceramide accumulation. It was found that deletion of IRA2 gene encoding GTPase-activating protein or
PDE2 gene encoding cyclic AMP phosphodiesterase, which negatively regulate Ras-cAMP-PKA signaling pathway, causes
high sensitivity against the growth inhibition induced by ceramide accumulation. On the contrary, deletion of RAS2 geneencoding small GTPase causes resistance against the growth inhibition. These results suggested functional relationshipbetween ceramide signaling and Ras-cAMP-PKA pathway.

１．緒

その特異的阻害剤である Aureobasidin A（AbA）、または言Aur 1 p の発現抑制によって、強力な生育阻害が引き起こ

皮膚表皮の角質層には、水分漏出を防止する脂質バリアされることが知られている。この生育阻害の原因は、①中が存在する。この脂質バリアの構成成分の半分以上を占め

間代謝産物であるセラミドの細胞内蓄積と、②複合スフィているのがセラミドであり、セラミドは近年では化粧品成ンゴ脂質（IPC, MIPC, M（IP）2 C）の減少であると考えられ分としても大変注目されている（セラミドは、生体膜脂質ている。研究代表者らは、以前に AbA が誘導する生育阻二重層を構築するスフィンゴ脂質の疎水性部分に相当する害に対して、高感受性を示す酵母遺伝子変異株を 18 株、構造である（Fig. 1））。一方で、セラミドは細胞内におい及び抵抗性を示す酵母遺伝子変異株を１株同定している2 , 3）。て微量に生成されることによって、細胞死（アポトーシス）、これらの変異株の解析を通して、セラミドの脂肪酸鎖の鎖細胞分化、細胞増殖を制御する細胞内脂質シグナリング分長が変化することで、その細胞毒性が顕著に変化すること子として機能することが、多くの文献によって報告されてを明らかにした 3）。また、セラミドの長鎖塩基部分の C 4

いる 1）。しかしながら、セラミドのシグナリング分子とし位の水酸基が消失することで、セラミドの毒性が減少するての分子レベルでの作用メカニズムに関しては、不明瞭なこと、一方で脂肪酸部分の a-水酸化がなくなるとセラミ点が多く混沌としているのが現状である。本研究では、セドの毒性が上昇することを明らかにした 4）。このように、ラミドシグナリングの分子メカニズム解明を目的とし、出特定の酵母変異株の Aur 1 p 阻害剤に対する感受性の変化

芽酵母 Saccharomyces cerevisiae をモデル生物として用いを調べることで、セラミドの構造と生理機能の相関関係がた解析を試みた。

明らかとなってきた。

２．実

本研究で研究代表者らは、テトラサイクリン調節プロモ験

ーター 5）を組み込むことでドキシサイクリンによって出芽酵母の複合スフィンゴ脂質は、イノシトールリン酸

Aur 1 p の発現抑制が可能な酵母変異株（tet-AUR 1 株）をを頭部に持ったイノシトールホスホリルセラミド（IPC）を用いて、Aur 1 p 発現抑制が誘導する生育阻害に対して、基本構造としており、これにマンノース、さらにイノシト

高感受性を示すような変異遺伝子の探索を試みた。探索にールリン酸が付加した MIPC, M（IP）（Fig. 2）。
2 C が存在するは、酵母非必須遺伝子約 4800 個がそれぞれ破壊された酵

これらは哺乳動物におけるスフィンゴミエリンやスフィンゴ糖脂質に相当すると考えられている。酵母においてセラミドを IPC に変換する酵素（Aur 1 p）は生存に必須であり、

Molecular mechanism of moisturizing
factor, ceramides, as a lipid signaling
molecule
Motohiro Tani
Department of Chemistry, Faculty ofSciences, Kyushu University− 118 −

Fig. 1

スフィンゴ脂質の基本構造

皮膚表皮保湿成分セラミドの脂質シグナリング分子としての作用メカニズムの解明

母遺伝子ノックアウトライブラリー 6）を用いた。酵母遺伝

え継ぎには、384 ピンのレプリケーターを用いた。これに子ノックアウトライブラリーのそれぞれの株に tet-AUR 1

よって１枚の寒天プレート上で最大 384 株の菌株の操作をの変異を導入した二重変異株（tet-AUR 1 xxx D 株（xxx は任行うことが可能となる。このようにして作製された二重変意の非必須遺伝子））を網羅的に作製した。網羅的作製は、異株（tet-AUR 1 xxx D 株）のドキシサイクリンに対する感7）

Tong and Boone の方法 に従って行った。具体的には、受性を調べた。

Mata 型 tet-AUR 1 株と Mata 型の酵母遺伝子ノックアウ

３．結

トライブラリー株をかけ合わせ、二倍体を作製、その後胞果培地にて単離するという方法である（Fig. 3）。一度に 4800

3 .1 Aur 1p 発現抑制に対して高感受性を示す遺伝子の探索株のすべてに関して二重変異株を作製するために、菌の植酵母非必須遺伝子 4800 個のそれぞれが欠損した株に tet-子形成を誘導し、二重変異が導入されている一倍体を選択

Fig. 2出芽酵母のスフィンゴ脂質の生合成経路

Fig. 3

tet-AUR1 xxxD 二重変異株の網羅的作製− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

AUR 1 を導入した二重欠損株を網羅的に作製し、384 ピン

Ras 2 p は、アデニル酸シクラーゼである Cyr 1 p を活性化

レプリケーターを用いて、これらの株をドキシサイクリン

す る こ と で 細 胞 内 cAMP 量 を 増 大 さ せ PKA（Tpk 1 ,０または 0 . 1 mg/ml を含む合成培地に植え継ぎ、生育の観Tpk 2 , Tpk 3）を活性化させる（Fig. 5）。Ras-cAMP-PKA察を行った（ドキシサイクリン 0 . 1 mg/ml は、tet-AUR 1 単

シグナル伝達経路は、酵母の細胞周期の調節による増殖制

独変異株が顕著な生育阻害を示さない濃度である）。その御、グルコース応答、ストレス応答等において重要な役割

結果、低濃度ドキシサイクリン処理によって顕著にコロニを果たしている 8）。

ーサイズが小さくなる二重変異株を最終的に 10 個同定しtet-AUR 1 ira 2 Δ の二重変異株は、tet-AUR 1 単独変異た。これらの高感受性変異株の変異遺伝子には、小胞輸送株が非常に弱い生育阻害しか示さないドキシサイクリン濃に関与する遺伝子が 4 個、スフィンゴ脂質の構造修飾に関度（0 . 7 mg/ml）で生育が殆ど観察されなくなった。このよわる遺伝子が１個（SCS 7）、細胞内情報伝達系に関わる遺うな高感受性は Aur 1 p 阻害剤 Aureobasidin A を用いた時伝子が１個（IRA 2）、ホスホイノチシド脱リン酸化酵素がにも同様に観察されたことから、Aur 1 の機能阻害に対し１個（SAC 1）、機能未知遺伝子が３個、含まれていた。て IRA 2 欠損株は高感受性を示すことが明らかになった。

SAC 12）、SCS 7 4） に 関 し て は、 以 前 に Aur 1 p 阻 害 剤

次に Ras-cAMP-PKA シグナル経路に関わるその他の因子

Aureobasidin A に高感受性を示す遺伝子としても同定さの 欠 損 株 に 関 し て も 同 様 の 解 析 を 行 っ た。 そ の 結 果、れたものである。今回は、この中で低分子量 G タンパク質

RAS 2 欠損は tet-AUR 1 株のドキサイクリンによる生育阻活性化 GTPase（GAP）をコードする IRA 2 遺伝子に注目害に対する抵抗性を引き起こすことがわかった（Fig. 6）。

をした。

また cAMP のホスホジエステラーゼをコードする PDE 2欠損によって、IRA 2 欠損と同様に、Aur 1 p 発現抑制に対3. 2 Aur1p 発現抑制による生育阻害とRas-cAMP-PKAシグナル経路との関連性して高感受性を示すことが判明した（Fig. 6）。これらの結Ira 2 p は、低分子量 G タンパク質である Ras 1 p, Ras 2 p

cAMP-PKA 経路が活性化されると、Aur 1 p 発現抑制に対を GTP 結合型から GDP 結合型の不活性型へと変換する

し て 高 感 受 性 と な る が、 逆 に RAS 2 欠 損 に よ っ て Ras-GAP として知られている（Fig. 5）。酵母において Ras 1 p,cAMP-PKA 経路が抑制されると抵抗性となることが考え

Fig. 4 tet-AUR1 株の 10µg/mlドキシサイクリン（Dox）添加による生育阻害

Fig. 5 出芽酵母の Ras-cAMP-PKA シグナ
ル伝達経路

Fig. 6

果 よ り、IRA 2 あ る い は PDE 2 が 欠 損 す る こ と で Ras-

Ras-cAMP 経路因子の欠損株の Aur1p 発現抑制に対する感受性− 120 −皮膚表皮保湿成分セラミドの脂質シグナリング分子としての作用メカニズムの解明られた 9）。

ルチコピーサプレッサー）の同定を試みた。Aur 1 p 発現抑Aur 1 p の発現抑制あるいは活性阻害は、複合スフィン制株、tet-AUR 1 株、に酵母染色体 DNA 断片がランダム

ゴ脂質の減少及びセラミドの蓄積を誘導することで生育阻にマルチコピープラスミドに挿入された酵母染色体 DNA害を誘導する。そのため IRA 2 あるいは PDE 2 遺伝子欠損

ライブラリーをトランスフォーメーションし、高濃度のドによる高感受性が、このどちらのスフィンゴ脂質代謝異常キシサイクリン（10 mg/ml（tet-AUR 1 株が殆ど増殖できに起因するものなのか不明瞭である。一方で、長鎖塩基ない濃度（Fig. 4）））に暴露した。生育が確認された株を（pyhtosphingosine, dihydrosphingosine）に脂肪酸を転移

Aur 1 p 発現抑制に対する抵抗性株とし、導入されていたしてセラミドを合成する酵素（Lag 1 p, Lac 1 p）を阻害する

酵母染色体 DNA ライブラリーの配列の解析を行った。そと、セラミドの生合成が抑制され、複合スフィンゴ脂質のの 結 果、 ス ト レ ス 応 答 転 写 因 子 を コ ー ド す る MSN 2 を量が減少することで、酵母の生育が抑制される（Fig. 2）。

Aur 1 p 発現抑制に対するマルチコピーサプレッサーとしそこで、セラミド合成酵素の調節サブユニットであるて同定した（Fig. 7 A）
。MSN 2 のマルチコピーサプレッサ

Lip 1 p の発現抑制株、tet-LIP 1 株、tet-LIP 1 ira 2 D 株、及ー効果は、Aur 1 p 特異的阻害剤 Aureobasidin A が誘導すび tet-LIP 1 ras 2 D 株を用いて、複合スフィンゴ脂質減少る生育阻害に対しても確認された。一方で、セラミド合成が誘導する生育阻害に対する IRA 2、RAS 2 遺伝子欠損の抑制株（tet-LIP 1 株）の生育阻害は、レスキューしないこ影響を調べた。tet-LIP 1 株は、ドキサイクリン 10 mg/mlとから、MSN 2 はセラミド蓄積に対するサプレッサー遺を作用させることで弱い生育低下を示したが、同様の生育

伝 子 あ る こ と が 考 え ら れ た。 さ ら に、tet-AUR 1 株 に低下パターンは tet-LIP 1 ira 2 D 株、tet-LIP 1 RAS 2 D 株に

MSN 2 及びそのパラログである MSN 4 が欠損した三重変おいても観察された。この結果より、IRA 2 あるいは RAS 2異株（tet-AUR 1 msn 2 D msn 4 D 株）は、ドキシサイクリ

欠損は、複合スフィンゴ脂質減少による生育阻害に対してンによる Aur 1 p 発現抑制に対して高感受性を示すこともは 影 響 し な い こ と が わ か っ た。 す な わ ち、Ras -cAMP-

判 明 し た（Fig. 7 B）
。 こ れ ら の 結 果 よ り、Msn 2 p 及 び

PKA 経路の活性化によって、Aur 1 p 抑制が誘導するセラMsn 4 p がセラミド蓄積に対して、細胞をプロテクトするミド蓄積に対して高感受性を示すことが示唆された。

ための転写因子であることが強く示唆された。

４．考察

3 . 3 Aur 1p 発現抑制に対して抵抗性を示すマルチコピーサプレッサーの探索と解析

今回、出芽酵母を用いて Aur 1 p 発現抑制に対する高感

Aur 1 p 発現抑制に対する高感受性株に続いて、逆に抵受性及び抵抗性株の網羅的探索を行った結果、Ras-cAMP-抗性を示す株の探索を行った。具体的には過剰発現によっPKA シグナル伝達経路が、セラミド代謝異常が誘導するて Aur 1 p 発現抑制に対する抵抗性を引き起こす遺伝子（マ生育阻害と密接に関連することを示唆された。すなわち、Fig. 7 MSN2 過剰発現、MNS2, MSN4 欠損が Aur1p 発現抑制による生育阻害に及ぼす影響− 121 −コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Ras-cAMP-PKA 経路が活性化されるような変異を導入す

３）Tani M, and Kuge O, : Defect of synthesis of very long-ると Aur 1 p 抑制が誘導するセラミド蓄積に対して高感受chain fatty acids confers resistance to growth inhibition

性を示すが、Ras-cAMP-PKA 経路が抑制されるような変by inositol phosphorylceramide synthase repression in

異を導入した場合、逆に抵抗性を示すことが確認された。

yeast Saccharomyces cerevisiae. J Biochem. 148 , 565 - 571 ,Ras-cAMP-PKA 経路は、生育維持に必須であり、ストレ2010

ス応答、細胞周期の調節に関与する重要なシグナル伝達系

４）Tani M, and Kuge O, : Hydroxylation state of fatty acidである。セラミド代謝異常によって、実際に Ras-cAMP-and long-chain base moieties of sphingolipid determine

PKA 経路が活性化されているのか、抑制されているのか

the sensitivity to growth inhibition due to AUR 1に関しては今後の重要な課題である。一方で、Aur 1 p 発

repression in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys

現抑制に対するマルチコピーサプレッサーを探索した結果、

Res Commun. 417 ( 2 ), 673 - 678 , 2012

ストレス応答転写因子をコードする MSN 2 を同定した。

５）Belli G, Gari E, Aldea M and Herrero E, : Functional

ま た、 予 備 的 な 実 験 で は あ る が、Aur 1 p 特 異 的 阻 害 剤

analysis of yeast essential genes using a promoter-

Aureobasidin A で 細 胞 を 処 理 す る こ と で、GFP 融 合

substitution cassette and the tetracycline-regulatable dual

Msn 2 p が核移行することが観察されている。このことをexpression system. Yeast. 14 , 1127 - 1138 , 1998

併せると Aur 1 p 発現抑制が誘導する生育阻害の際に、ス６）Winzeler EA, Shoemaker DD, Astromoff A, Liang H,トレス応答因子である Msn 2 p が活性化されることで生育

Anderson K, Andre B, et al, : Functional characterization

阻害を抑制していることが考えられる。さらに興味深いこof the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallelとに、Msn 2 p は PKA でリン酸化されることでネガティブ

analysis. Science. 285 , 901 – 906 , 1999

な調節を受けることが報告されている 。今後、セラミド

７）Tong AH, and Boone C, : Synthetic genetic array

代謝異常下における Ras-cAMP-PKA 経路と Msn 2 p によるanalysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol.

ストレス応答の役割を更に詳しく明らかにすることで、セ313 , 171 - 192 , 2006

10）

ラミドの細胞内シグナル伝達系に及ぼす影響を詳細に解明

８）Vandamme J, Castermans D, and Thevelein JM, :していきたい。また、今回調べた変異株以外に、スクリー

Molecular mechanisms of feedback inhibition of protein

ニングで見つかって来たその他の変異株に関しても、詳細

kinase A on intracellular cAMP accumulation. Cell

な解析を順次進めて行きたい。

Signal. 24 , 1610 - 1618 , 2012９）川口 諒太郎、久下 理、谷 元洋 . IPC 合成酵素発現抑制（引用文献）に対して高感受性を示す酵母変異株の同定と解析 , 2012

１）Hannun YA, and Obeid LM, : Principles of bioactive

年度 日本生化学会大会講演要旨集 .

lipid signalling: lessons from sphingolipids. Nat Rev Mol10）Görner W, Durchschlag E, Martinez-Pastor MT,Estruch F, Ammerer G, Hamilton B, Ruis H, and Schüller

Cell Biol. 9 , 139 - 150 , 2008
２）Tani M, and Kuge O, : Requirement of a specific group

C, : Nuclear localization of the C 2 H 2 zinc finger proteinof sphingolipid-metabolizing enzyme for growth of yeast

Msn 2 p is regulated by stress and protein kinase A

Saccharomyces cerevisiae under impaired metabolism ofactivity. Genes Dev. 15 , 586 - 597 , 1998

glycerophospholipids. Mol Microbiol. 78 , 395 - 413 , 2010

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