毛包、汗腺、皮脂腺など皮膚附属器官の形成に関わる
細胞内シグナル伝達経路の解明
東京大学医科学研究所

井癌・細胞増殖大部門

上

分子発癌分野純 一 郎

Tumor necrosis factor receptor (TNFR)-associated factor 6 (TRAF6) transduces signals from members of the Toll/interleukin-1 (IL-1) receptor and members of the TNF receptor super family including CD40 and RANK. We havereported recently that TRAF6 deficiency results in defective development of epidermal appendices including guard
hair follicles and sweat glands. Furthermore, our results suggest that this defect may be due to the impaired signalingof EDAR, XEDAR or TROY, members of the TNFR super family expressed in skin. Although TRAF6 plays a crucialrole in formation of the skin appendices, the molecular mechanisms underlying regulation of TRAF6 are largely
unknown. Thus, we began to search for proteins that bind to and activate TRAF6. We have identified TIFA, a TRAFinteracting protein with a forkhead-associated (FHA) domain. The FHA domain is a motif known to bind directly tophosphothreonine and phosphoserine. In transient transfection assays, TIFA activates NFκB and JNK. However, TIFA
carrying a mutation that abolishes TRAF6 binding or mutations in the FHA domain that are known to abolish FHA
domain binding to phospho-peptide fails to activate NFκB and JNK. TIFA, when overexpressed, binds both TRAF6
and IRAK-1 and significantly enhances the IRAK-1/TRAF6 interaction. Furthermore, analysis of endogenous proteinsindicates that TIFA associates with TRAF6 constitutively, whereas it associates with IRAK-1 in an IL-1 stimulationdependent manner in vivo. Thus, TIFA is likely to mediate IRAK-1/TRAF6 interaction upon IL-1 stimulation. These
results suggest that TIFA may be involved in signaling that leads to the development of skin appendices. In such acase, TIFA could be important target molecule for drugs that affect skin condition. Inhibition of TIFA or TRAF6 may
reduce the number of hair follicles. In contrast, activation of TIFA or TRAF6 may increase their number. Thus, TIFA
and TRAF6 could be target molecules for developing compounds that could used by hairy or bald-headed persons.

１．緒るシグナル伝達因子に４）遺伝子レベルで異常が存在すること言が報告されている。すなわち、EDA → EDAR → EDARADD

毛包、汗腺、皮脂腺などいわゆる皮膚附属器官の形成のと伝達されるシグナルが皮膚附属器形成に必須であることを分子機構は、不明な点が多い。我々は最近、細胞内シグナ示している。一方で、皮膚には EDAR に類似した受容体分子

ル伝達因子 TRAF6 の遺伝子欠損マウスを作成し、その表

XEDAR ５）や TROY ６）が発現しておりやはり皮膚附属器形成

現型の一つがヒト遺伝性疾患である無汗性外胚葉形成不全に関与していると考えられている。我々の実験から TRAF6症（Hypohidrotic ectodermal dysplasia:HED）のモデル

はいずれの受容体からのシグナルにも関与していると判断さマウスである Tabby（Ta），downless（dl），crinkled（cr）

れることから１）、TRAF6 のシグナル伝達機構を解明することといった変異マウスに酷似していることを報告した１）。こにより本研究の目的が達成されると考えた。我々は、TRAF6の疾患を有するヒトやマウスでは汗腺や皮脂腺などの顆粒

シグナルの解明を目指し、TRAF6 に結合し TRAF6 の活性を分泌腺、毛包の形成が著しく阻害されている。本研究では、制御する分子を探索してきた。新規 TRAF6 結合分子の同定

これら皮膚附属器官の形成機構を TRAF6 を中心に明らかに関して以下に報告する。

にし皮膚を標的とする化粧品の開発、皮膚に副作用を有す

２．実

る化粧品の改良及び、毛生え薬や脱毛剤の開発などの基礎

2.1となる成果を挙げることを研究目的とした。

験

酵母 two-hybrid スクリーニングとノザーンブロッティング

前述の HED のモデルマウス Ta では EDA と呼ばれる
２）

TNF ファミリーリガンドタンパク質に 、dl では EDAR と

全長マウス TRAF6 を pBD-GAL4-Cam（Stratagene, La呼ばれる TNF 受容体ファミリータンパク質に３）、さらに cr

Jolla, CA）にサブクローニングし餌として pAD - GAL4-2.1

では EDAR の細胞質領域に結合する EDARADD と呼ばれ（Stratagene）で作成した ICR マウス（８−週齢メス）骨髄Identification of signal transduction
pathways involved in formation of skinappendices including hair follicles, sweat
glands and sebaceous gland.
Jun-ichiro Inoue
Division of Cellular and Molecular Biology
Department of Cancer Biology
Institute of Medical Science, University ofTokyo

cDNA ライブラリーをスクリーニングした。ヒトTIFA cDNA
はヒト B-cell cDNA ライブラリーからクローニングした。マウス
及びヒトTIFA の配列については DDBJ/EMBL/GenBank に
accession number AB062111 及び AB062110 として各々登録した。マウス組織 RNA ブロット（Clontech, Palo Alto, CA）
を [32P]- ラベル全長マウス TIFA cDNA または β-actin cDNA
で 65 ℃においてハイブリダイズした。フィルターは 0.5 X− 85 −

と 20µl の kinase buffer（20mM HEPES pH7.5, 20mM

SSC, 0.2（w/v）% SDS、65℃、30 分洗浄した。

MgCl2, 5µCi [γ-32P]ATP（3000Ci/mmol））の中で 30℃、302.2 GST 沈降アッセイ、免疫沈降アッセイ、ウェス
ターンブロッティング

分反応させた。

３．結GST 沈降アッセイでは、まず HEK293T 細胞に図に示した組み合わせと量で遺伝子導入した。36 時間後、細胞3.1

果TRAF6 結合タンパク質としての TIFA の同定

を 500 µl の TNE buffer（50mM Tris-HCl pH8.0, 1% NP-

TRAF6 を餌として酵母 two-hybrid 法によりマウス骨40, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM dithiothreitol）

髄 cDNA ライブラリーをスクリーニングして 184 アミノ

破砕後、遠心し未破砕細胞を除去した sup を得、それを酸からなるタンパク質をコードする cDNA を得た。この細胞破砕液とした。細胞破砕液を Glutathione-Sepharose

タンパク質が動物細胞内で TRAF6 と結合すること、一過（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）と混合性の遺伝子導入により NFκB や JNK を活性化すること及し，吸着複合体を 8.5% polyacrylamide/SDS ゲルで分離

び分子中央に Forkhead-associated（FHA）ドメイン７）をした。免疫沈降アッセイでは同様に調製した細胞破砕液に有することから、このタンパル質を TRAF-interacting

示 さ れ た 抗 体 と protein G-Sepharose（Amersham

protein with an FHA domain（TIFA）と呼ぶことにした

Pharmacia Biotech）を混合した。免疫沈降複合体を 10 %（Fig.1 A, C, D）８）。ノザーンブロット解析から TIFA はまたは 12.5% polyacrylamide/SDS ゲルで分離した。各々脾臓に非常に多く発現し他の組織での発現は低かったのタンパク質の発現チェックの場合は細胞破砕液をそのま（Fig.1 B）。FHA ドメインは 60 から 100 アミノ酸からなま用いた。ゲルで分離されたタンパク質は PVDF メンブ

り主に真核細胞の核において細胞周期、DNA 修復や転位

レン（Millipore, Bedford, MA）にトランスファーした後、に関与するタンパク質に同定されている９）,10）。さらに重要な特異抗体と適当な horseradish peroxidase（HRP）- ２次

ことに FHA ドメイン中にはリン酸化セリンやリン酸化ス

抗 体、ECL Western blotting system（Amersham

レオニン残基に直接結合する機能を有するものが報告されPharmacia Biotech）を用いて同定した。

ていることである 11）,12）。これはちょうど SH2 ドメインがリン酸化チロシンに結合することがシグナル伝達で重要な2.3 リコンビナント TIFA タンパク質のゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる分離
Maltose-binding protein（MBP）-TIFA 融合タンパク役割を果たしていること 13）を考えると TIFA の機能解析により TRAF6 のリン酸化が関与する新しい制御機構の解明につながる可能性を示唆する。

質（MBP-TIFA）を E. coli BL21 で発現させ Amylose-

TIFA による NFκB や JNK 活性化における TRAF6 のresin（New England BioLabs, Beverly, MA）をもちいて関与を解明するため、TIFA における TRAF6 結合部位をアフィニティー精製した。MBP-TIFA（24µg）を 2.4U の同定した。種々の TIFA 欠失変異体を用いた結合実験か

PreScission Protease（Amersham Pharmacia Biotech）

ら TIFA の C- ドメインが TRAF6 との結合に十分である

で 4℃、4 時間反応させ MBP と TIFA の境界を切断した。

ことが判明した（Fig.2A, B）。さらのその C- ドメイン内

その反応液を Superdex 75 column（0.32×30cm）にて分にこれまで CD40, RANK, IRAK-1 で同定された TRAF6

離し、各々のフラクションを 10 % polyacrylamide-SDS ゲ

結合配列 XXPXEXX-（armatic/acidic）に合致する配列

ルで分離した。ゲルをクマシー染色しタンパク質を同定した。

が存在していた 14）。我々はすでに CD40 と TRAF6 との結合実験から結合配列中の E を A に置換するとその結合能2.4 ルシフェラーゼリポーターアッセイと JNK の invitro キナーゼアッセイ

が全く喪失することを明らかにしている 15）。そこで TIFAHEK293T 細胞に１ng の 3xκB-luc または 3xMκB-luc

ろ TRAF6 結合能が喪失すると同時に TIFA による NFκB

（mutant κB sites）, 10ng の β-actin-β-gal と図に示されたや JNK の活性化能もなくなった（Fig.2C, D）。即ち、こ種々の発現プラスミドを遺伝子導入した。36 時間後、ルの結果は TIFA のシグナル伝達に TRAF6 との結合が必シフェラーゼ活性を Luciferase Assay System（TOYO須であることを示している。次に FHA ドメインの機能をINK, Tokyo）で測定した。また β-galactosidase 活性を測解析した。そのために TIFA の 50 番目のグリシンをグル定し遺伝子導入効率の換算に用いた。JNK キナーゼアッ

タミン酸にしかつ 66 番目のセリンをアラニンに置換した

セイでは、まず HEK293T 細胞に 10ng の pEF-T7-JNK と（G50ES66A）変異体を作成した。なぜならば、FHA ドメ

図に示した量の pME-FLAG-TIFA を遺伝子導入した。36インを持つシロイヌナズナの KAPP タンパク質において

時間後 His-JNK を抗 T7 抗体で免疫沈降後、2µg の GST-

同じ変異体が本来の結合相手であるリン酸化タンパク質にc-JUN（1-89）融合タンパク質（New England BioLabs）

結合しないことが報告されているからである 16）。興味あの同配列に同様の変異を導入した（E178A 変異体）とこ− 86 −

毛包、汗腺、皮脂腺など皮膚附属器官の形成に関わる細胞内シグナル伝達経路の解明ることに G50ES66A 変異体は TRAF6 と結合するもののシグナルを伝達することが報告されている 17）。また同じ

NFκB や JNK の活性化能を持っていなかった（Fig. 2C, D）。

TRAF ファミリーである TRAF2 の結晶解析から TRAF2

この結果は TIFA のシグナル伝達において TRAF6 とのはホモ３量体であると考えられている 18）。従って我々は結合は必須であるが、十分でなく FHA ドメインの何らか

TIFA が TRAF6 の 多 量 体 形 成 を 促 進 す る こ と に よ りの機能が必要であることを示唆している。

TRAF6 を活性化するという仮説を立てた。この仮説を検討するためまず TIFA 自身の多量体形成とその活性との関

3.2 TRAF6 活性化における TIFA の自己集合能の関与係を検討した。GST-TIFA と FLAG-TIFA と共発現させTRAF6 を細胞内で強制的に多量体形成させると下流にGST 沈降法により検討したところ TIFA は自己集合するこ

Figure 1
TIFA contains an FHA domain and activates NFκB and JNK. (A) Diagram of the overall structure of
TIFA and alignment of the FHA domain of TIFA with that of other proteins. Amino acids identical or similar inleast six proteins are indicated by gray boxes. Asterisks indicate amino acids selected for site-directed mutagenesis. (B) Multiple-tissue Northern blot. A mouse multiple-tissue Northern blot (Clontech) was probed with a cDNA
fragment of mouse TIFA (upper) or β-actin (lower). (C) Activation of NFκB by TIFA. HEK293T cell were transfected with 1 ng of 3xκB-luc or 3xMκB-luc (mutant κB sites), 10 ng of β-actin-β-gal and the indicated amounts of
TIFA expression plasmid. Thirty-six hours after transfection, luciferase assays were performed. The results shown
are the mean of duplicate experiments. (D) Activation of JNK by TIFA. HEK293T cells were transfected with 10
ng of pEF-T7-JNK and the indicated amounts of pME-FLAG-TIFA. Thirty-six hours after transfection, His-JNK
was immunoprecipitated with anti-T7 antibody. Immunoprecipitates were subjected to an in vitro kinase assay using GST-Jun as a substrate. The results shown were representative of duplicate experiments.

− 87 −

とが明らかとなった（Fig. 3A）。さらに種々の欠失変異体

さを調べるため大腸菌で TIFA 及びその G50ES66A 変異を用いて検討したところ自己集合能には FHA ドメインと体のリコンビナントタンパク質を発現後精製しC ドメインが両方とも必要でこれは欠失変異体の NFκB

Superdex75 ゲルろ過カラムで解析した（Fig. 3B）。そのや JNK の 活 性 化 能 と 一 致 し た（Fig. 2C, 3A）。 即 ち、

結果、TIFA の野生型が３量体に相当する大きさのところ

TIFA の自己集合能が TRAF6 の活性化に必要であることに溶出されたのに対して G50ES66A 変異体は５量体あるが強く示唆された。ところが G50ES66A 変異体においていは６量体に相当する大きさのところに溶出された。従っNFκB や JNK の活性化能がないのに自己集合能があるこて TRAF6 の活性化には TIFA の３量体形成が必要であとから、単に TRAF6 と結合して自己集合するのでは十分

りそれよりも大きい複合体を形成した場合には TRAF6 をでないことがあきらかとなった。そこで自己集合体の大き活性化できないと考えられた。

Figure 2
Both the TRAF6 binding site and the intact FHA domain are required for TIFA-induced activationof NFκB and JNK. (A) Structure of TIFA and its mutants and alignment of TRAF6 binding sites. (B) Identification of the TRAF6 binding site in TIFA. HEK293T cells were cotransfected with pME-GST-TIFA or pMEGST-TIFA mutant and pME-FLAG-TRAF6. Thirty-six hours after transfection, cell lysates were subjected to
GST pull-down assay. (C) Activation of NFκB by TIFA mutants. HEK293T cell were transfected with 1 ng
of 3xκB-luc or 3xMκB-luc (mutant κB sites), 10 ng of β-actin-β-gal and 5 µg of expression plasmid for TIFA
or its mutants. Thirty-six hours after transfection, luciferase assays were performed. Results shown are themean ± sd of triplicate experiments and are representative of two independent experiments. (D) Activationof JNK by TIFA mutants. HEK293T cells were transfected with 10 ng of pEF-T7-JNK and the indicatedamounts of expression plasmid for TIFA or its mutants. Thirty-six hours after transfection, His-JNK was immunoprecipitated with anti-T7 antibody. Immunoprecipitates were subjected to in vitro kinase assay using
GST-Jun as a substrate. The results shown are representative of duplicate experiments.

− 88 −

毛包、汗腺、皮脂腺など皮膚附属器官の形成に関わる細胞内シグナル伝達経路の解明

3.3

TIFA による TRAF6 と IRAK-1 の相互作用の促進

合することから FHA ドメインの標的リン酸化タンパク質

これまでの実験から TIFA は TRAF6 の上流で働くとが存在するとしても IRAK-1 ではないと考えられた。つぎ考えられたので、既に報告されている TRAF6 の上流分子に TIFA が TRAF6 と IRAK-1 の両方に結合することからと TIFA の結合を調べたところ IRAK-1 と結合した（Fig.

TIFA が TRAF6 と IRAK-1 との結合を促進する可能性を4A）。しかし、G50ES66A 変異体も IRAK-1 と効率良く結検討した。一定量の TRAF6 と IRAK-1 を発現させそこにFig. 3Self-association of TIFA. A, Identification of the domain required for TIFA self-association. GST-TIFA
or its mutants were coexpressed with FLAG-TIFA or FLAG-G50ES66A in HEK293T cells. GST pull-down
assays were performed, and coprecipitated FLAG-TIFA was analyzed by Western blotting with anti-FLAG
antibody. B, Oligomer formation of recombinant TIFA protein and that of mutant TIFA protein. MBP-TIFA(24 µg, upper) or MBP-TIFA-G50ES66A (lower) was cleaved with 2.4 U of PreScission Protease (GST-3C)
at 4℃ for 4 hr. The reaction mixture was applied to a Superdex 75 column, and fractions (20 µl) were collected. Fractions were analyzed on 10% polyacrylamide-SDS gel and proteins were visualized by coomassie
brilliant blue staining. Arrows indicate the elution profile of the molecular-weight marker proteins (158 kDa,
γ-globulin; 44 kDa, ovalbumin; 17 kDa, myoglobin) and the position of the void volume.

− 89 −

TIFA の量を変えて加えた場合での TRAF6 と IRAK-1 と成し、内在性 TIFA が TIFA cDNA から発現するタンパの結合を調べたところ、TIFA が存在しない場合に比較しク質と一致することを確認した。IL-1 刺激有無で内在性て TIFA の適当量添加により顕著に両者の結合が増加しTRAF6 と TIFA の結合を調べたところ両者の結合は刺激た（Fig. 4B）。 こ の 結 果 は TIFA が シ グ ナ ル 伝 達 時 にに依存せず恒常的であることが明らかとなった（Fig. 5A）。

TRAF6 と IRAK-1 の相互作用を促進する可能性を示唆し

つぎに IRAK-1 と TIFA の結合を調べた。まず FLAG-ている。次にこのことが生理的条件下に in vivo で再現さ

TIFA を発現するレトロウイルスベクターをマウス胎児線れるか否かを検討した。まず抗 TIFA 抗体をウサギで作

維芽細胞に感染させた。この際 FLAG-TIFA の過剰発現

Figure 4
TIFA enhances the association of TRAF6 andIRAK-1. (A) Interaction of TIFA with IRAK-1. HEK293T cells
were cotransfected with pME-GST-TIFA, pME-GST-TIFA
mutant or pME-GST and pEF-IRAK-1. Thirty-six hours after
transfection, cell lysates were subjected to GST pull-down
assay. (B) TIFA links TRAF6 to IRAK-1. HEK293T cells were
cotransfected with 0.2 µg of pME-FLAG-TRAF6 and/or pEFIRAK-1 and increasing amounts of pME-Myc-TIFA. FLAGTRAF6 was immunoprecipitated with anti-FLAG antibody.

Figure 5
Interaction of TIFA with TRAF6 and IRAK-1 invivo. (A) Interaction of TRAF6 with TIFA in 70Z pre-B cells.
Lysates prepared from 70Z cells with (+) or without (-) IL-1
stimulation (20 ng/ml, 5 min) were immunoprecipitated witheither anti-TIFA, control rabbit IgG or anti-TRAF6 antibody.
Immunoprecipitates were analyzed by Western blotting with
anti-TIFA, anti-IRAK and anti-TRAF6 antibodies. Lysates
prepared from HEK293T cells transfected with pME-TIFA
or control vector were analyzed on identical gels. Open andsolid arrowheads indicate the Ig light chain and non-specificbands, respectively. (B) IL-1 stimulation-dependent interactionof TIFA and IRAK-1 in MEF cells. Wild-type MEFs were infected with retrovirus expressing FLAG-TIFA or control virus.
Both types of MEFs were unstimulated (-) or stimulated (+)
with IL-1 (20 ng/ml, 5 min). Anti-FLAG antibody immunoprecipitates were analyzed by Western blotting with anti-IRAK
antibody. Solid arrowhead indicates Ig light chain. Lysates
were also subjected to immunoblotting directly to analyze
IRAK-1 expression.

− 90 −

毛包、汗腺、皮脂腺など皮膚附属器官の形成に関わる細胞内シグナル伝達経路の解明を避けるためウイルス量を低く設定した。その結果内在性

４．考FLAG-TIFA の発現は内在性 TIFA の約３倍であり、無察

刺 激 時 の NFκB や JNK の 活 性 化 も 起 こ っ て お ら す、

これらの結果から IL-1 刺激において TRAF6 と結合しFLAG-TIFA を内在性 TIFA と考えて実験を進めて良いてシグナル伝達に関与する分子 TIFA を同定できたと考と判断した。IL-1 刺激有無において TIFA を免疫沈降しえる。また、IL-1 と同様に IRAK-1 や TRAF6 が関与する

共沈してくる IRAK-1 を調べたところ、両者は無刺激時にTLR シグナルにおいても TIFA が関与することが十分には結合しておらず、刺激依存的に結合することが明らかと考えられる。実際、TIFA-DN は TLR4 による NFκB 活性

なった（Fig. 5B）。さらに TIFA と共沈する IRAK-1 がリ化を抑制する。また、内在性 TIFA が恒常的に TRAF6

ン酸化 IRAK-1 であることから、IRAK-1 が刺激により受と結合していることから皮膚附属器形成に関与する

容体複合体にリクルートされた後に複合体から解離してきEDAR, XEDAR, TROY などのシグナルに TIFA が関与す

た IRAK-1 が TIFA と結合すると考えられた。IRAK-1 はる可能性も十分に考えられ現在解析中である。

IRAK-4 によりリン酸化されるともに複合体から解離しTRAF6 と結合すると考えられている 19）。

毛包、汗腺及び皮脂腺などの皮膚から派生する皮膚付属器は、外胚葉由来の表皮の細胞と中胚葉由来の真皮との細胞とのシグナルの相互のやり取りによって形成される。近3.4 NFκB 活性化における TIFA/IRAK-1/TRAF6 の
位置関係

年、皮膚付属器形成に必須な細胞間や細胞内シグナル伝達

さらに NFκB 活性化シグナルにおける TIFA/IRAK-1/

機構は今だ不明な点が多い。また発生学的な観点とは別

TRAF6 の位置関係を確認するためドミナントネガティブに、臨床的にも、毛髪を喪失した患者、火傷などで皮膚を変異体（DN）として機能する G50ES66A 変異体の NFκB

失った患者、あるいは遺伝的疾患で皮膚付属器に欠陥が存活性化に与える影響を NFκB- ルシフェラーゼリポーター

在する患者などにおいて皮膚付属器を再生することは、患

プラスミドを用いて行った。IL-1 受容体、TLR4 による者の日常生活の QOL（Quality of Life）を高める意味で重NFκB 活性化は TIFA-DN により抑制されたが TNFα に要である。前述にように皮膚付属器形成に TRAF6 を介す

よる NFκB 活性化には影響がなかった（Fig. 6A）。TNFα

るシグナルが必須である。また最近、毛包原基形成のかなのシグナルには TRAF6 が関与しないことからこの結果はり 初 期 の 段 階 で TNF 受 容 体 フ ァ ミ リ ー で あ る

TIFA が TRAF6 特異的に働くことを強く示唆するもので

EDAR → TRAF6 シグナルが働いていることを見い出しある。次に TRAF6 の上流で働く MyD88, IRAK-1 によるた 20）。即ち表皮細胞における TRAF6 シグナルは皮膚付

NFκB 活 性 化 は 抑 制 さ れ た が、TRAF6 の 下 流 で 働 く

属器形成におけるキーポイントであり、TRAF6 の活性化

TAK1 による NFκB 活性化は抑制されなかった（Fig. 6B）。

を人工的に制御することにより皮膚付属器の人為的形成

これは「TIFA が IRAK-1 と TRAF6 の間で働く」という（再生）を可能にすると考えられる。本研究から明らかに考 え を 指 示 す る も の で あ る。 と こ ろ が TRAF6 に よ る

なったように TIFA は TRAF6 の活性化因子と考えられ

NFκB 活性化は TIFA-DN によりさらに活性化されてしま

しかもタンパク質としては分子量が小さい。従って、もしった（Fig. 6C）。これはおそらく TRAF6 がある程度活性

適当な方法で TIFA タンパク質を皮膚細胞内に導入でき化されていると TIFA-DN である G50ES66A 変異体でもるならば毛包や汗腺の人為的な形成も可能になると考えら

TRAF6 結合能と自己集合能があるため TRAF6 をさらにれる。従来活性化型 β-catenin の発現による毛包形成が報活性化できると考えられる。従って、「TIFA が IRAK-1

告されているが、そのあとにそこから腫瘍が発生していと TRAF6 の間で働く」という考えに特に矛盾しないと考る。本申請では TRAF6 シグナルを適時 OFF にすることえられる。次に TIFA のよる NFκB 活性化に他のシグナにより腫瘍発生の抑制を実現し得る可能性もあり、検討す

ル伝達因子の DN がどのような影響を及ぼすかを解析しる価値が十分に存在すると考えられる。また、化粧品におた。MyD88-DN は何も影響を与えなかったが、TRAF6-

いては特に皮膚に悪影響を与えるものは避けなければなら

DN, TAK1-DN, Ubc13-DN は TIFA のよる NFκB 活性化ない。例えば、それが TIFA/TRAF6 経路を活性化してを抑制した。また TIFA の上流と思われる IRAK-1 の DN

しまう作用があれば、毛包形成が起こり毛深くなってしまも抑制した（Fig. 6D, E）。たとえ上流であっても TIFA

う可能性も考えられる。従って、今後開発された化粧品にの活性化に必要なプロセス（例えば３量体形成）を IRAK-

ついて TIFA/TRAF6 経路に何らかの影響を与えないか

1-DN が抑制することは考えられる。従っていずれの結果チェックすることが必要かもしれない。

に関わるタンパク質が同定されているが、その詳細な分子も「TIFA が IRAK-1 と TRAF6 の間で働く」という考えを指示するものである（Fig. 6C）。

− 91 −

Figure 6
TIFA functions upstream of TRAF6 and downstream of IRAK-1. (A) HEK293T cells or HepG2 cells
were transfected with 3xκB-luc and increasing amounts (0, 3 or 10 µg) of pME-GST-G50ES66A. Thirty
hours after transfection, cells were either stimulated with TNFα(10 ng/ml, HEK293T) or IL-1 (20 ng/ml,
HepG2) for 6 hr. (B, C) HEK293T cells were transfected with an expression plasmid encoding one of the
NFκB activators including MyD88, IRAK-1, TAK1/TAB1 or TRAF6 in the presence of increasing amounts(0, 3 or 10 µg) of pME-GST-G50ES66A. (D, E) HEK293T cells were transfected with 0.1 µg of pME-TIFA
in the absence or presence of expression vector encoding MyD88(152-296), IRAK-1(1-211), TRAF6(275530), TAK1(K63W) or Ubc13(C87A). Thirty-six hours after transfection, luciferase activity was measured.
Relative values in which the fold activation in the absence of each dominant-negative mutant was set to
100 (A, B, D, E) or in which the luciferase activity with reporter alone was set to 1 (C) are shown. Results
shown are the mean ± sd of triplicate experiments and are representative of two independent experiments.
(F) hypothesis of the TIFA-mediated signal pathways.

− 92 −

毛包、汗腺、皮脂腺など皮膚附属器官の形成に関わる細胞内シグナル伝達経路の解明（引用文献）

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