精神神経学雑誌

第 114 巻 第 9 号（2012) 1018‑1022 頁

精神医学のフロンティア

反復経頭蓋磁気刺激によるラット海馬における神経細胞新生の増加
上山栄子 ，鵜飼聡 ，小川朝生 ，山本雅清 ，川口俊介 ，石井良平 ，篠崎和弘
Eiko Ueyama, Satoshi Ukai, Asao Ogawa, Masakiyo Yamamoto, Shunsuke Kawaguchi,Ryouhei Ishii, Kazuhiro Shinosaki

うつ病に対する反復経頭蓋磁気刺激（rTM S）の作用機序はいまだ解明されていないが，最近の動物を用いた研究からは，海馬の神経細胞新生が抗うつ薬や電気けいれん療法を含む種々のうつ病治療の効果発現に関与している可能性が示唆されている．そこで，本研究では連日の rTMS がラットの海馬の神経細胞新生に及ぼす効果について検討した．強制水泳試験を用いて抗うつ効果が報告された先行研究に準じて直径 70mm の 8の字コイルを用い，刺激強度は同規格の rTMS 装置の最大出力の70％，刺激頻度は 25Hz，刺激時間を 10秒とした．先行研究の 5日間よりも長い 14日間連日，1日1回の bromodeoxyuridine（BrdU）の投与と 1,000発 日の rTMS を施行した後，海馬歯状回における細胞増殖について免疫組織化学的に検討した．rTMS 施行群では，海馬歯状回における BrdU陽性細胞が sham 刺激群に比 して有意に増加していた．結果は連日の rTMS によって海馬の神経細胞新生が増加することを示すとともに，この増加が抗うつ効果に関与している可能性を示唆する．
索引用語：神経細胞新生，海馬，経頭蓋磁気刺激，ラット，うつ病

は じ め にそのような中で，海馬での神経細胞新生が種々反復経頭蓋磁気刺激（repetitive transcranialのうつ病の治療効果発現に，中心的ではないかもmagnetic stimulation : rTM S）は非侵襲的に反しれないが，関与している可能性を示唆する報告

復して脳を電気刺激する技術の 1つである．現在，がある ．例えば，マウスの脳の一部に X 線を種々の精神・神経疾患に対して rTM S を用いた照射して海馬の神経細胞新生を阻害すると抗うつ治療の臨床研究が行われているが，症例数や有効薬の効果が認められなくなると報告されたり ，性の報告はうつ病に対す る も の が 圧 倒 的 に 多抗うつ薬の慢性投与や，ヒトの電気けいれん療法

いに相当する電気けいれん刺激によって海馬の神経．一方，rTM S の抗うつ効果の作用機序については，ヒトの脳機能画像を中心とした検討と細胞新生が促進されることがげっ歯類

ともに，げっ歯類などの動物を用いた神経生物学

長類 で報告されている．

的な検討も多数報告されているが，いまだ解明されていないのが現状である．

や霊これらの報告からは，ヒトのうつ病の治療で用いるような連日の rTMS が海馬の神経細胞新生

著者所属：1）和歌山県立医科大学医学部神経精神医学教室，2）大阪大学大学院医学系研究科精神医学教室
本論文は，PCN 誌に掲載された最新の研究論文
意義と展望などにつき加筆したものである．

を編集委員会の依頼により，著者の 1人が日本語で書き改め，その精神医学のフロンティア：反復経頭蓋磁気刺激によるラット海馬における神経細胞新生の増加

1019を増加させ，その増加がうつ病治療の効果発現にィン後，抗 BrdU 抗体を一次抗体として反応後，関与する可能性が示唆されるが，げっ歯類を用い‑diaminobenzidine tetrahyABC 法 を 経 て 3,3ʼて連日の rTM S が海馬の神経細胞新生に及ぼすdrochloride（ DAB）を 用 い て 発 色 さ せ，効果を検討した報告はこれまでに 1編のみであり，hematoxylin で対比染色し，BrdU 陽性細胞数をその検討では有意な増加は認められなかった ．

カウントした．また，二重免疫組織染色では抗この否定的な結果には種々の要因が想定されるが，BrdU 抗 体，抗 neuron‑speciﬁc class Ⅲ β‑

ヒトのうつ病の治療はもとより，実験動物モデル

tubulin（TuJ 1）抗体を一次抗体として反応後，においても最適な rTM S の刺激条件が確立してbiotinylated donkey anti‑rat IgG と Cy3‑con-いない現状を考えると，用いられた rTM S の刺jugated donkeyanti‑mouse IgG，Cy2‑conjugat-

激条件が適切ではなかった可能性がその 1つに挙

ed streptavidin を使用し，蛍光顕微鏡にて観察げられる．そこで，本研究では，強制水泳試験にした．

よるラットに対する rTM S の抗うつ効果の検討
で Sachdev らが用いた刺激条件にできるだけ

3．統計学的解析

準じて rTM S を施行し，rTM S が海馬の神経細カラー 3CCD カメラを備えた顕微鏡（Eclipse

胞新生に及ぼす効果について予備的に検討した．

E800）にて画像を取り込み，一個体あたり 6切片ずつ（−2.8mm〜−4.5mm, relative to breg-．研究の方法および結果ma ）歯状回の顆粒細胞層（granule cell layer:1．rTM S と BrdU 投与GCL），下 顆 粒 細 胞 層（ subgranular zone :rTM S には M agstim 社製の M agstim SuperSGZ）における BrdU 陽性細胞数をカウントしRapid を 用 い た．16週 齢 の 雄 性 Sprague‑Daw-た．実 刺 激 群，対 照 群 で 海 馬 歯 状 回 の GCL，

leyラ ッ ト を rTM S 施 行 群（実 刺 激 群；n＝5）

SGZ の面積を NIH Image を用いて計測し，単と sham 刺 激 群（対 照 群；n＝5）に 分 け，直 径位面積あたりの BrdU 陽性細胞数を算出した．

70mm の 8の 字 コ イ ル を 用 い，刺 激 強 度 は次に，各個体あたり少なくとも 50以上の BrdU

rTM S 装置の最大出力の 70％，刺激 頻 度 は 25陽性細胞について，抗 TuJ 1抗体との二重染色Hz，刺激時 間 は 10秒 で，頭 部 に 1,000発 日，の割合を解析した．統計検定は Student の t 検定

14日間連日 rTM S を施行した．コイル面は頭部を用い，p＜0.05を有意とした．

に対して接線方向とし，ハンドルをラットの体部に平行となるようにした．sham 刺激ではコイル

4．結果面を頭部に対して垂直にし，他の全ての刺激条件

ほとんどの BrdU 陽性細胞は SGZ に認められは実刺激群と同一とした．両群ともに実験期間中た．実刺激群では対照群と比にけいれんや特段の見かけの行動上の変化は認め

GCL，SGZ における単位面積あたりの BrdU 陽

な か っ た．刺 激 期 間 中，bromodeoxyuridine

性細胞数の有意な増加を認めた（図 1，2）．

（BrdU）を rTM S 施行後に連日腹腔内投与し，最終刺激の 24時間後に灌流固定した．

し，海馬歯状回の抗 BrdU 抗体とニューロンのマーカーである
TuJ 1に対する抗体を用いた蛍光二重染色では，BrdU 陽性細胞の約 80％が TuJ 1陽性であった

2．免疫組織学的検討

が，2群間での差は認められなかった（実刺激群

最終刺激終了 24時間後，ラットを深麻酔下に81.3±2.5％，対照群 80.4±3.1％）．

4％パラフォルムアルデヒド液にて灌流固定を行い，後固定後，摘出脳を用いて海馬を含む冠状断で 5μm のパラフィン切片を作製した．脱パラフ．考察

本研究では，連日の rTMS がラットの海馬歯精神経誌（2012）114 巻 9 号

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HGCLA

B

図 1 対照群（A），rTMS 施行群（B）のラット海馬歯状回における BrdU 陽性細胞
Scale bar: 100μm. GCL, granule cell layer; H,hilus.

行研究に準じて設定した．すなわち，彼らと同じ規格の刺激装置と 8の字コイルを用い，コイル面を頭部に対して接線方向にあて，刺激パラメーター（刺激頻度は 25Hz，刺激強度 は rTMS
装置の最大出力 の 70％，刺 激 回 数 は 1,000発日）も彼らの報告に準じた．刺激頻度は，彼らが1，5，15，25Hz の 4条件で実験し，最も効果があると報告した 25Hz に設定した．ただし，刺激日数については，彼らの用いた 5日間ではなく，ヒトの臨床研究でも用いられる程度の 14日間と
図 2 歯状回における単位面積あたりのBrdU陽性細胞数連日の rTMS により BrdU 陽性細胞数が有意に増加した（対照群 63.1±5.1cells mm ，rTM S 施行群 102.3±6.4．
cells mm ， p＜0.05）

して連日 rTMS を施行した．

rTMS によるラットの海馬の神経細胞新生の検討の過去の報告は Czeh らによるもの 1編のみであるが，その報告では有意な増加は認められなかった ．本研究において，Czeh らの検討に比状回の神経細胞新生に及ぼす効果について検討し，べてより高い刺激頻度（25Hz 対 20Hz）で多数BrdU 陽性細胞の有意な増加を認めた．rTM S に回（14,000発 日対 5,400発 日）の刺激を行った

よる海馬の神経細胞新生を検討したこれまでの報ことが，海馬の神経細胞新生の促進に有効であっ告ではその増加は示されておらず，本研究は，た可能性が考えられる．

我々の知る限り rTM S による増加を示した初め

ラ ッ ト の 脳 に 対 す る rTMS で は，単 回 のTMS で生じる電流や電場の強度と分布にかかわての報告である．
や霊長類 においてる刺激条件，例えばげっ歯類の小さな脳に対する電気けいれん刺激や種々の抗うつ薬の慢性投与にコイルの大きさ，形状，刺激部位なども重要な検より海馬の神経細胞新生が促進されるというこれ討事項である ．Czeh らの検討では本研究と異までの報告と同様の結果を連日の rTM S を用いなり，電流や電場の強度や分布を理論的に推定して示した．本研究ではうつ病のモデル動物を用いたうえで刺激条件を設定し，ラット用の小さな円ておらず，行動実験も行っていないが，結果は海形コイルを用いて左前頭部を刺激している．今後，馬の神経細胞新生が連日の rTM S の抗うつ効果

本研究で用いた刺激条件で生じる電流や電場の強に関与している可能性を示唆するものである．

度や分布を理論的に推定し，それらがどのように本研究は，げっ歯類

本研究の刺激条件は，強制水泳試験によってrTM S の抗うつ効果を報告した Sachdev らの先海馬の神経細胞新生に影響したかを評価する必要がある．

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BrdU の投与回数について，先行研究の多くはるなどの問題点が予想された．Czeh らは刺激部実験全体で 1回あるいは数回程度投与し，約 1ヵ位や誘導電流の問題は，小型のコイルを用い，さ月後に海馬の神経細胞新生を検討しているのに対らに電流や電場の強度や分布を理論的に推定するして，本研究では 14日間連日 rTM S と BrdU 投ことでクリアしたと主張している．しかし，治療与を行い，最終投与の翌日に灌流固定しているたの作用機序に関連する，連日の rTMS の「慢性め，14日間の実験期間全体での増殖を評価して効 果」に は 神 経 回 路 を 介 し た 脳 全 体 の neuro-いることになるので，本研究の結果を先行研究とmodulation が関与すると想定されるので，局所比する際には注意が必要である．また，本研究の電気刺激をヒトの条件にできるだけ近似させる

では新生細胞の生存については検討していない．

ことは重要ではあるが，それを十分に行ってもラより正確に比，議論をするためには，本研究でットの脳に抗うつ効果に関連する効果や変化が得用いた rTM S の刺激条件と先行研究で用いられられる保障はないと判断し，結局，コイルが大きた BrdU の投与プロトコールを用いて検討する

く，また誘導電流の理論的な推定を行っていないことを含め，さらなる検討が必要である．

問題はあるものの，強制水泳試験で抗うつ効果を示した実績のある Sachdev らが用いた rTMS の．苦労・工夫したこと
種々のうつ病治療の効果発現に海馬の神経細胞刺激条件に準じた条件を本研究では用いることにした．

新生が共通して関与している可能性が先行研究か

ただし，本研究での刺激日数は Sachdev らのら示唆されているので，rTM S を用いて同様の5日に対し，ヒトで抗うつ効果を発揮するのに最検討を行った本研究のアイデア自体は特段画期的低限必要と考えられる 14日間とした（ヒトではなものではない．

週毎に 5日の施行と 2日の休みを繰り返すので，しかし，最適な rTM S の刺激条件に関して，本研究での日数はヒトの約 3週間分に相当する）．

ヒトの場合でも確定したものはないものの，刺激一方で，神経細胞新生が何日程度の rTMS で有部位（多くは左前頭前野），刺激頻度（10Hz 以意に増加するのかを推測できる過去のデータがな上），刺激強度，1日あたりの刺激数，日数などかったので，その日数の推定や survival の検討について，ある程度のコンセンサスが得られた条が困難となるが神経細胞新生の増加を捉える可能件が存在するのに対して，ラットの脳に対する性が少しでも上がることを優先して，BrdU の投

rTM S の検討のこれまでの報告は海馬の神経細与については rTMS の期間中連日施行するとい胞新生以外のものを含めても数少ないうえに，刺う先行研究と比べてやや変則的なプロトコールを激部位やコイルの大きさ・形状を含む刺激条件の用いた．

差異が大きかったために，これらを参考にして本研究で用いる刺激条件を設定する際に苦慮した．

お わ り に

このようにラットの脳に対する rTM S の報告

本研究は，14日間連日の rTMS によってラッが少ない理由の 1つとして，ヒトに比べて格段にトの海馬の神経細胞新生が増加することを示した．

脳や前頭葉が小さいことが挙げられる．小型のコ先行研究の結果と合わせて考えると，この結果はイルで高頻度刺激すると容易にコイルの温度が上海馬の神経細胞新生が rTMS の抗うつ効果に関昇するのでコイルを多数用意して何度も取り替え与している可能性を示唆するが，その可能性は推るという煩雑さに加えて，小さな脳のために正確測の域を出ないものであり，うつ病のモデル動物な局所刺激が難しい，ヒトと比べて相対的に広範や行動実験を用いての検討が，前述の電流や電場な脳領域で電流が誘導される，導電体である脳がの強度・分布の理論的推定，BrdU の投与方法の小さいと磁場強度が同じでも誘導電流が小さくな変更とともに今後の課題と考えられる．

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一方，rTM S による海馬の神経細胞新生の増2005

加が示されたので，この増加を客観的な指標とし6）Madsen, T.M., Treschow, A., Bengzon, J., etてラットでの最適な rTM S の刺激条件を求める

al.: Increased neurogenesis in a model of electroconvul-

ことができれば，ヒトのうつ病に対する rTM S
治療での最適な刺激条件を検討する際に，ヒトへのあてはめには難しい面もあるものの，ラットを用いた基礎的な知見が，臨床症状の改善とは全く異なった次元の判断の指標として寄与できる可能性が期待される．

sive therapy. Biol Psychiatry, 47; 1043‑1049, 2000
7）Malberg, J.E., Eisch, A.J., Nestler, E.J., et al.:Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus.J Neurosci,20; 9104‑
9110, 2000
8）Paxinos, G., Watson, C.: The Rat Brain in
Stereotaxic Coordinates. Academic Press, Sidney, 1986
9）Perera,T.D.,Coplan,J.D.,Lisanby,S.H.,et al.:

文献1）Czeh, B., Welt, T., Fischer, A.K., et al.:Chronic psychosocial stress and concomitant repetitive

Antidepressant‑induced neurogenesis in the hippocampus of adult nonhuman primates.J Neurosci,27; 4894‑
4901, 2007transcranial magnetic stimulation : eﬀects on stress10）Post, A., Keck, M.E.: Transcranial magnetichormone levels and adult hippocampal neurogenesis.

stimulation as a therapeutic tool in psychiatry: what

Biol Psychiatry, 52; 1057‑1065, 2002

do we know about the neurobiological mechanisms? J2）Gross,M.,Nakamura,L.,Pascual‑Leone,A.,etPsychiatr Res, 35; 193‑215, 2001

al.: Has repetitive transcranial magnetic stimulation11）Sachdev, P.S., McBride, R., Loo, C., et al.:（rTMS）treatment for depression improved?A system-Eﬀects of diﬀerent frequencies of transcranial magnetic

atic review and meta‑analysis comparing the recent vs.

stimulation（TMS）on the forced swim test model ofthe earlier rTMS studies. Acta Psychiatr Scand, 116;depression in rats. Biol Psychiatry, 51; 474‑479, 2002

165‑173, 20073）Keck,M.E.,Welt,T.,Post,A.,et al.: Neuroen-12）Sahay, A., Hen, R.: Adult hippocampal neurogenesis in depression.Nat Neurosci,10; 1110‑1115,2007

docrine and behavioral eﬀects of repetitive transcranial13）Santarelli, L., Saxe, M., Gross, C., et al.:magnetic stimulation in a psychopathological animal

Requirement of hippocampal neurogenesis for the be-model are suggestive of antidepressant‑like eﬀects.

havioral eﬀects of antidepressants. Science, 301; 805‑

Neuropsychopharmacology, 24; 337‑349, 2001

809, 20034）Loo, C.: TM S in the treatment of major de-14）Scott,B.W.,Wojtowicz,J.M.,Burnham,W.M.:

pressive disorder. The Oxford Handbook of Trans-Neurogenesis in the dentate gyrus of the rat following

cranial Stimulation.（ed. by Wassermann, E., Epstein,electroconvulsive shock seizures.Exp Neurol,165; 231‑C., et al.）. Oxford University Press, Oxford, p.633‑660,236, 200015）Ueyama, E., Ukai, S., Ogawa, A., et al.:20085）Loo, C.K., M itchell, P.B.: A review of theChronic repetitive transcranial magnetic stimulationeﬃcacy of transcranial magnetic stimulation（TM S）

increases hippocampal neurogenesis in rats. Psychiatry

treatment for depression, and current and future strat-

Clin Neurosci, 65; 77‑81, 2011

egies to optimize eﬃcacy.J Aﬀect Disord,88; 255‑267,