色素細胞幹細胞の制御による白斑症治療モデルの開発

岐阜大学大学院医学系研究科

國貞隆弘

Piebaldism is an autosomal dominant genetic pigmentary disorder, characterized by congenital white hair andpatches located on the forehead, anterior trunk, and extremities. Most piebald patients have a mutation of the Kit
gene, which encodes a tyrosine kinase receptor involved in pigment cell development. The white hair and patchesof such patients are already completely formed at birth and do not usually expand thereafter. This stability ofpigmented spots also applies to KitW and KitlSl mutant mice. However, 2 novel cases of piebaldism were reported in
2001, in which both mother and daughter having a novel Val620Ala mutation in their Kit gene showed progressive
depigmentation. To prepare an animal model of this mutation to explore undefined functions of KIT signaling for
maintaining pigmented melanocytes in the skin or more specifically the integrity of the melanocyte stem cell systemin the postnatal skin, we produced transgenic mice expressing Val620Ala Kit. These mice well mimicked the whitespotting pattern of patients; however, no change in this pattern was observed after birth, even after increasing thetransgene expression by various means. Here, we report the unexpectedly extremely stable maintenance of themelanocyte stem cell system under stringent conditions for KIT signaling.

１．緒のメカニズムで白斑を生じる分子として、先述の SLF や言ET3 EDNR3 MITF PAX3、などが知られている４，５）。

色素細胞は発生初期に神経管から離脱した多分化能をも

皮 膚 の 色 素 異 常 は 多 彩 な 臨 床 症 状 を 示 し、Theつ幹細胞である神経堤細胞に由来する。神経堤細胞はマウ

Pigmentary System ６） によると実に 141 種の病名が報告

スでは 9.5 日胚で移動を開始し、13.5 日までには体の様々されている。分類の大まかな基準は、先天的か後天的か、な部分へ移動し、その場所で色素細胞を含め、神経、内分色素過剰か色素過小か、表皮性か真皮性か、あるいは発生泌、結合組織、骨組織など様々な細胞・組織へと分化する。

段階で生じるか成長してから生じるかであり、臨床例とし色素細胞へと運命決定された細胞は色素細胞幹細胞（色素て最も多い白斑症（vitiligo）は自己抗体の形成などによる芽細胞）として表皮の近傍の真皮中を移動し、表皮に一斉

後天的な原因で色素細胞が失われ白斑が形成されると考えに移動後毛包の形成と共に一部はその中に進入する。毛包られている。例えば、mi vit というマウスの突然変異は、先で（ヒトでは毛包以外の表皮中にも）生涯色素細胞は維持天的な白斑（後天的なものと区別して piebaldism あるいされ、UV などの外部刺激に反応してその密度が増減するは Waardenburg 症候群として記載される）を持つ。mivit

こと、毛周期に同調して増殖・分化を繰り返すことから、では加齢と共に色素が減少することからヒトの vitiligo の幹細胞システムとして皮膚（ケラチノサイト）の再生と関モデルと考えられてきたが、原因遺伝子が Waardenburg１- ３）連しながら再生し続けると考えられる症候群の原因遺伝子と同じ転写調節因子 MITF であるこ。

例えば、White Spotting（W）マウスでは受容体型チロと、ヒト vitiligo に MITF 遺伝子の変異が見つかっていな

シンキナーゼ遺伝子 Kit の突然変異により、それを発現す

いこと、などから典型的な白斑症のモデルとは考えられてる色素細胞幹細胞は体内環境から十分なシグナル（ここでいない。いずれにしても、動物モデルを通して色素異常症はリガンドとして Kit に結合する SLF）を得られなくなり、の研究を進めることは、病態の分子的な本質を明らかにす移動能力が低下する。その結果、神経管から遠位にある腹る上で必要不可欠である。

部、額、臀部、四肢の先端を中心に色素細胞幹細胞が到達

我々は、Richard, 深井らにより 2001 年に報告されたヒせず、その部分は色素細胞の存在しない白斑になる。同様

ト piebaldism（まだら症）の臨床報告７） に注目した。その患者母娘は c-kit に変異を持ちまだら症と診断されたが、E st abl ish ment of a n i ma l models forpiebaldism by the regulation ofmelanocyte stem cells
Takahiro Kunisada
Depar t ment of T issue and OrganDevelopment, Gifu University Graduate
School of Medicine

娘には生後白斑の拡大が観察された。白斑形成は、表皮の色素細胞幹細胞の発生・維持ができず色素細胞が消失する、いわば幹細胞システムの破綻として統一的に扱うことができる。白斑形成という表現型を持つ毛色の突然変異体の解析により幹細胞の増殖・分化・自己複製を制御する因子（遺伝子）のほとんどが明らかにされている。そのような遺伝− 101 −コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

Tg-3

Tg-2

Tg-1

Tg-4

図１

子のひとつとしてマウスやヒトを含むいくつかの哺乳動物

ランスジェニックマウスを作成した（mt-kitV620ATg マウ

で受容体型チロシンキナーゼ c-kit の様々な変異が知られス）。メタロチオネインプロモーターは色素細胞を含む様々ている。c-kit 変異マウスを含む白斑を持つマウス変異体

な組織や細胞で発現を誘導するが、全く c-Kit を発現しなでは白斑パターンが生後に変化する現象は報告されていな

い W マウスですら必ずしも致死的でないことから、ドミナ

い。体表の一部に色素細胞が存在しない領域は、分子的なントネガティブに機能すると予想される Val620Ala 変異

原因が何であれ発生中の色素細胞の異常によって生じたもを広範囲の細胞に発現させても個体の生存に影響することのであり、いずれも生後には白斑のパターンは決まっておはないと考えた。これらの操作を含む実験の詳細は文献８）

り、成長に比例してそのサイズは拡大するがパターンは変に詳述した。

化しないとされている。

３．結

ところが、この論文で報告された c-kit 変異（Val620Ala）
では、一旦形成された娘の白斑領域が加齢に伴って拡大し３．１

果Tg マウスの表現型たことが報告されている。生後表皮の成長とは無関係に色7 個の独立した mt-kitV620ATg マウスが得られ、4 個体素細胞が減少するということは一端毛包に定着した色素細の白斑が遺伝することが確かめられ、下図１のように胞幹細胞が失われることを意味し、発生時に形成された白Tg-1,2,3,4 とした。この中から、比較的白斑の面積が少な斑部が安定して維持され、一端発生過程で形成された色素い Tg-1 と、白斑が最も大きい Tg-4 を株として維持した。

細胞の分布のパターンは生涯変わらないという従来のまだ白斑のサイズやパターンに個体差はあるものの、Tg-1 とら症に対する認識を覆すものである。この表現型が再現でTg-4 が外見で区別できないほどではなく、世代を重ねてきれば、受容体型チロシンキナーゼのシグナル異常によっも安定に維持された。トランスジーンの発現量を皮膚で比て生後に進行する白斑症（vitiligo）が生じることを証明

較すると Tg-4 の方が圧倒的に多く、ドミナントネガティ

できるだけでなく、表皮における色素細胞幹細胞の維持機

ブ c-kit 遺伝子の発現量と白斑の面積が比例していること構の解明に直接つながると考えた。になり、白斑形成がトランスジーンに起因することが示さ

本申請では報告されたまだら症と同一の点突然変異を導入した c-Kit 遺伝子をメタロチオネイン遺伝子の転写調節れた。つまり、この変異はヒトと同じくマウスにもまだら症を誘発することが確認された。

領域の下流に接続して色素細胞で強制発現させたトランスジェニックマウス（Tg マウス）を作成し、この大変希なmt-kitV620ATg マウスでの加齢に伴う白斑の変化

まだら症の表現型の再現を試みた８）。

２．実

３．２

これらの Tg マウスにおいて白斑の拡大が認められるか、験長期にわたって観察した。最も大きな白斑を持つ Tg-4 でヒトまだら症の c-kit Val620 Ala 変異はこの受容体の細も、生後の白斑の大きさや形状は、成長による表皮の拡胞内チロシンキナーゼ部位の数百アミノ酸にわたってヒ大以外は認められなかった（図２）。Tg-1 の小さな白斑

トとマウスでほぼ完全に保存されている領域で起こっておも、拡大も縮小もしなかった。多数の mt-kitV620ATg マウ

り、マウス c-kit 遺伝子に同様の変異を導入することで再スについて観察を行ったが、いずれも同様であった。従っ現可能と考えられた。ミスマッチ PCR プライマーを用いて、通常の飼育状態においては、c-kit のＶ６２０Ａ変異は、て Val620Ala 変異を導入したマウス c-kitcDNA を作成し、発生を反映した白斑形成はヒトの症例と同じく生じるもの

これをメタロチオネイン I 遺伝子の転写プロモーター領域の、生後の白斑の拡大は起こらないと考えられる。と接続した DNA コンストラクト作成し、これを用いてト− 102 −色素細胞幹細胞の制御による白斑症治療モデルの開発

Tg-1やや白斑が小さい（黒毛のストライプが太い）こと以外毛Tg-4

色のパターンは Tg-4 と変わらないが、実際に毛を剃って8d

みると表皮にメラノサイトが存在し、色素が沈着しているのがわかる。このマウスを剃毛後も飼育を続け再び剃毛したところ、表皮の白斑のパターンは変化していなかった。
このようなダブルトランスジェニックマウスを Tg-1 でも作製したが同様の結果であった。さらに、これらのダブル

5w

トランスジェニックマウスに ZnS04 を飲ませても、パターンが変化することはなかった。従って、ヒトと同様に毛包以外の表皮に色素細胞が常在する状態でも、mt-kitV620A

14w

によって生後に白斑が拡大することは無いことがわかった。

４．考察

以上、ヒト kitV620A 変異の生後の白斑の拡大を再現すべ
20w

く行った様々な試みは現在のところ全て失敗した。マウスの多くの piebaldism 変異体で一旦発生過程で生じた白斑の生後の拡大は報告されておらず、我々がそれらのマウス図２を飼育した経験でもそのようなことは観察されなかった。

３．３ トランスジーンの発現量の増加による白斑の変化

もちろん、ヒトでもこのような報告は一例のみである。従mt-kitV620A の発現を担うメタロチオネインプロモーターの別の遺伝的な要因、あるいは環境因子が付加することには重金属の添加により活性が増大する。実際に、Tg-1 やよって白斑の拡大が生じたと考えるのが妥当と思われる。って、ヒトでの症例報告では、mt-kitV620A に加えて何らかTg-4 においても ZnSO4 を飲用させることで数倍の転写亢

このように、ヒトの症例を再現する試みは成功しなかっ進が認められた。このようにして mt-kitV620A の発現を高めたが、本研究の過程で色素細胞の増殖・分化・維持に関した Tg マウスも、たとえ生後直ちに ZnSO4 の飲用を開始ていくつかの点が明らかになった。まず、色素細胞の発生し長期観察しても、生後の白斑の拡大は観察されなかった。

異常により生じた piebaldism の白斑の安定性である。発Tg-1 のホモ個体では、mt-kit V620A の発現量が 2 倍にな生過程での白斑のサイズあるいは形態には c-Kit シグナルると考えられ、実際その白斑は Tg-4 よりも大きくほとんが影響を及ぼすことは、今回作製した mt-kitV620ATg マウ

ど白色の固体も見られたが、そこにわずかに残った黒毛もスを見ても明らかであり、実際 SLFTg/+；mt-kitTg-1/+生涯消失することはなかった。

ダブルトランスジェニックには図４のように Tg-1 では決して観察されない腹部の白斑が極端に小さなものがしば３．４

ヒトに類似した色素細胞分布を示す SLF-Tg
マウスにおける mt-kitV620A トランスジーンの効果しば生じたが、c-Kit のリガンドである SLF の強制発現により、mt-kitV620A の活性が上昇したため、色素細胞がよりマウスでは、生後速やかに毛包以外の色素細胞が失われ野生型に近い分布を示すようになったと考えられる。ただるので、ヒトの色素細胞の動態を調べるモデルとしては限し、この場合ですら生後の白斑の変化は見られなかった。

界がある。ヒトでいう白斑の拡大とは、主に毛包以外の表マウスの場合、SLF の発現は生後においては毛包に限局皮に存在する色素細胞が消失をされるが、SLFTg では表皮全指すからである。この点を克服

SLFTg/+;mt-KIT Tg-4/+体に発現し続けるので、我々するため、我々が以前開発したは白斑の周囲の色素細胞が活性毛包以外の表皮にも生涯色素細化され、幹細胞を含めた色素細胞が維持されるヒト型の表皮を胞が存在しない白斑に進入する持つモデルマウス（hk14-SCFTg

ことは大変考えやすいと予想し

９）

V620A

Tg マ

たが、実際には半年後でも白斑ウスとを交配し、白斑の状態をのサイズや形状は変化しなかっ調べた。図３に示したように、た。もともと、c-Kit や ET3 なマ ウ ス ） と mt-kit

SLFTg/+;mt-KIT Tg-1/+

例 え ば SLFTg/+;Tg-4/+ ダ ブ

4w

どのシグナルの不足により生じ

5w

ルトランスジェニックマウスは

図３た piebaidism の 白 斑 が 生 後 も

図４− 103 −コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

変化しないのは十分予想されることであるが、いくらそれ作製には至らなかったが、たとえば ET3 など他のシグナを強制発現させたリガンドで活性化し、シグナルの不足分ルも同時に操作することで、様々な白斑症のマウスを作出を補っても（実際に発生過程ではほとんど腹部の白斑が消したい。

失するという著しい効果として現れているのだが）、生後の白斑のパターンは一切変化しない。シグナルの不足に対（引用文献）しても、過剰に対しても、一旦形成された胎児期の白斑の１）Hall, B.K.（1999）The Neural Crest In Development
and Evolution. New York: Springer.

パターンは強固に維持される。
神経堤由来の色素細胞は発生中皮膚の広範囲を移動し、

２）Le Douarin, N. M., and Kalcheim, C.（1999）The

それには c-Kit が必要であることが実験的に確実に示され

Neural Crest. Cambridge, UK: Cambridge Universityている。生後も、毛包のバルジに存在する色素細胞幹細胞

Press.

が毛周期に対応して毛球部へ移動することは確認されてお３）Nishimura E K, Jordan S A, Oshima H, Yoshida H,り 、今回確認されたことを言い換えると、生後の色素細Osawa M, Moriyama M, Jackson I J, Barrandon Y,

胞は個々の生存シグナルの増大や減少には反応せず、毛包Miyachi Y, Nishikawa S, : Dominant role of the nicheから毛包へ移動することはない、ということになる。生後

in melanocyte stem-cell fate determination. Nature 416,の色素細胞は、毛包でも表皮でもこれほど移動に対して抵854-860, 2002.

３）

抗することは、多くの脊椎動物が体表の配色を種や個体の４）Bennett DC, Lamoreux ML, : The color loci of mice -識別に使っていることを考えると進化的な合理性があると

a genetic century, Pigment Cell Res., 16, 333-344, 2003.

も考えられる。発生中の色素細胞と、生後のメラノサイト

５）Steingrimsson E, Copeland NG, Jenkins NA, : Mouseのどのような違いによってこのような移動性の差異がもた

Coat Color Mutations: From Fancy Mice to Functional

らされるかを明らかにすることは、piebaldism 以外の白Genomics, Dev. Dyn. 235, 2401-2411, 2006

斑症の発症機構にも参考になると思われる。色素細胞でな

６）The Pigmentary System, J.J. Nordlund, R.E. Boissy,

く、表皮の側に原因があることも考えられる。我々は十分

V.J. Hearing, R.A.King, and J-P Ortonne, eds（New

な検討をしていないが、UV 照射や発癌剤の投与で表皮がYork, NY: Oxford University Press）, pp. 475-487.

一気に黒化する現象の動態を詳しく調べることも必要かも

７）Richards KA, Fukai K, Oiso N, Paller AS, : A novelしれない。色素細胞の幹細胞が刺激に対して柔軟に反応しKIT mutation results in piebaldism with progressive

ないことが、白斑が自然治癒しない大きな原因と考えられdepigmentation. J Am Acad Dermatol 44: 288-292, 2001８）Tosaki H, Kunisada T, Motohashi T, Aoki H,るからである。
白斑症あるいは白髪などを含め、色素細胞の発生異常と

Yoshida H, Kitajima H, : Mice transgenic for KitV620A:

いう観点から症状の分子機構を調べ、治療あるいは予防を

recapitulation of piebaldism, but not progressive

行おうという試みは最近国内外で盛んである。ただ、実用

depigmentation, seen in humans with this mutation. J.

化という観点では、海外メーカーによるチロシナーゼ遺伝

Invest. Dermatol. 126, 1111-1118, 2006.

子に対するアンチセンス DNA を用いた美容液等新しいメ

９）Kunisada T, Yoshida H, Yamazaki H, Miyamoto,

ラニンコントロール法の実用化は国内外で活発であるが、A, Hemmi H, Nishimura E, Shultz LD, Nishikawa

色素細胞幹細胞の動態を制御する効果の高い製品は存在し

S-I, Hayashi S-I, :ない。その原因は、モデル動物を通した白斑あるいは白髪factor in the basal layer of epidermis promotesの発生機構の研究が不十分で色素細胞の消失に関する分子

survival, proliferation, differentiation and migration of機構の解明が不十分であることにある。本研究では、最終melanocyte precursors. Development 125, 2915-2923,

的に当初目指していた vitiligo タイプの白斑症のモデルの1988.

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Transgene expression of steel