酢酸による T 細胞活性化制御の分子機序解明

石黒名古屋大学大学院医学系研究科消化器疾患病態論寄附講座

緒和博准教授た NF–kappaB などの転写因子が特定の importin alpha言

酢酸は食酢の主成分であり、腸内細菌が産生する短鎖members を介して importin beta と結合することが知ら

1)脂肪酸の大部分を占めている 。また乳酸菌の一部（ビれているにもかかわらず、NFAT と importin beta の結フィズス菌など）は乳酸だけでなく酢酸も産生している

合様式についてはこれまで全く報告がない。本研究は

2)。これまで食酢や乳酸菌製品が健康に寄与することが酢酸・酢酸ナトリウムによる NFAT–importin beta 結合知られているが、酢酸・酢酸ナトリウムが免疫機能に与阻害の作用機序を分子レベルで解析し、NFAT–importin

える影響、特に T 細胞活性化に与える影響についてはbeta 結合様式の解明につなげることを目的として行った。

報告が全くなかった。また、酢酸・プロピオン酸・酪酸

これまで酪酸は染色体の構造を調節するヒストンのアナトリウム混合注腸が潰瘍性大腸炎の治療に有効とするセチル化を介して遺伝子の発現に影響を与えることが報告はあったものの、これら短鎖脂肪酸のうちのどの成知られている。そこで我々は、酢酸は NFAT–importin

分がどのように抗炎症作用を発揮しているかについてはbeta 結合を調節するアダプター分子のアセチル化を介不明であった3,4)。そこで我々が酢酸・酢酸ナトリウムして作用を発揮していると考え、酢酸によりアセチル化によるＴ細胞活性化への影響を検討したところ、酢酸・が誘導されるタンパクを検索し、酢酸によりアセチル化酢酸ナトリウムはＴ細胞活性化に極めて重要な転写因子が誘導されるタンパクの NFAT–importin beta 結合へのである NFAT の核内移行を特異的に抑制すること、その関与を検討した。

NFAT 核内移行抑制により T 細胞のサイトカイン産生が抑えられること、更に酢酸ナトリウムの投与が腸炎や皮実5)

膚炎の改善に有効であることがわかった 。

験方法

酢酸・酢酸ナトリウムともに NFAT に特異的な活性抑NFAT は５つのメンバーから構成される転写因子ファ制作用がある一方で酢酸ナトリウムは酢酸と比べ pH に

ミ リ ー で あ り、T 細 胞 に は NFAT1（NFATc2）、NFAT2対してほとんど影響を与えない。そのため、本研究の実（NFATc1）, NFAT4（NFATc3）が存在し、IL–2 などのサイ験には酢酸ナトリウムを使用した。実験材料・方法の詳

6)8)

トカイン発現に関与している 。NFAT はリン酸化され

細は既報の論文に記載した 。

た状態で細胞質に存在するが、T 細胞に刺激が与えられると活性化したカルシニューリンにより脱リン酸化され結

核内輸送体 importin beta と結合し核内へと輸送されて1. 酢酸ナトリウムは tubulin alpha のアセチル化を誘導

果いく。臨床で既に使用されているサイクロスポリンなどするの免疫調節剤はカルシニューリンの活性を阻害し NFAT

T 細胞由来 Jurkat 細胞を酢酸ナトリウムと培養したの脱リン酸化を妨げることで NFAT の核内移行を抑制

ところ、分子量約 55 kDa のタンパクが著明にアセチル7)する 。一方、酢酸・酢酸ナトリウムは NFAT の脱リン化された（図１）。これは内部コントロールに利用した酸化には全く影響を与えず脱リン酸化された NFAT とtubulin alpha と全く同じ大きさであり、tubulin alphaimportin beta との結合を阻害することで NFAT の核内は 40 番目のリシン残基がアセチル化されることが知5)移行を抑制することを我々は既に明らかにしている 。

ら れ て い る。 そ こ で ア セ チ ル 化 tubulin alpha に 対 す

しかし、酢酸・酢酸ナトリウムが NFAT–importin betaる抗体を用いて検討したところ、酢酸は濃度依存的に結合を阻害する分子機序については不明である。まtubulin alpha をアセチル化することを確認できた（図1石黒和博１）。なお酪酸はヒストンのアセチル化を誘導する一方討したところ、酢酸ナトリウムは HDAC6 の活性を濃度で tubulin alpha のアセチル化を誘導しなかった（図１）。

依存的に阻害することが分かった（図２B）。

マウスの脾臓から取り出した primary T cells でも酢酸による tubulin alpha のアセチル化を観察できた。

2. Tubulin alpha アセチル化と NFAT 核内移行抑制

こ れ ま で tubulin alpha は histone deacetylase 6

Jurkat 細胞において TSA 10 nM は酢酸 5mM と同様（HDAC6）により脱アセチル化され、HDAC6 を阻害するに tubulin alpha のアセチル化を誘導するが、それは培Trichostatin A（TSA）は tubulin alpha のアセチル化を誘

養１時間後までであり２時間後にはその作用は著しく減9)導することが知られている 。Jurkat 細胞でも TSA に弱する（図３A）。この現象を利用して tubulin alpha アセより tubulin alpha のアセチル化が誘導された（図２A）。

チル化と NFAT 核内移行抑制との関連を検討した結果、そこで酢酸ナトリウムが HDAC6 活性に与える影響を検NFAT 核内移行は tubulin alpha がアセチル化される条件下で抑制されることがわかった（図３B、C）。NFAT 依存0Acetate
1.25
2.55NaCl5Butyrate
5mM

レポーターアッセイでも検討したところ tubulin alphaがアセチル化される条件下で NFAT の活性化が抑制されることを確認できた（図３D）。なお、TSA も酢酸も NF-kDa
175kappaB の核内移行および活性化に影響を与えなかった（図３B、E）。以上から tubulin alpha アセチル化と NFAT核内移行抑制との関連が証明された。

80A58-

Ac.
5mM

1 μM

100

TSA

101nM

4630

anti-tubulin α (acetyl K40)

23
anti-tubulin α antibody

177B

anti-acetylated Lys antibody

100

HDAC6 activity (%)

58
46
anti-tubulin α antibody

anti-tubulin α (acetyl K40)
0Acetate 0

anti-histone H3 (acetyl K9)

図２

1.25

2.5510mM

酢酸ナトリウムならびに TSA による tubulin alpha のアセチル化

図１ 酢酸ナトリウムによる tubulin alpha のアセチル化
Jurkat 細胞を酢酸ナトリウム 0-5 mM 存在下で 30 分間培養した後、タンパクを抽出し Western blot analysis を行った。Lys or K,lysine。

（A）Jurkat 細胞を酢酸ナトリウムあるいは TSA とともに 30 分間培養した後、タンパクを抽出し Western blot analysis を行った。
（B）酢酸ナトリウム存在下で HDAC6 の酵素活性を評価した。
2

酢酸による T 細胞活性化制御の分子機序解明

tubulin alpha と結合することが分かった（図４B）。これ

3. NFAT, tubulin alpha, importin beta の相互作用
次 に 組 換 え タ ン パ ク を 用 い て NFAT, tubulin alpha,

らのことから NFAT と tubulin alpha はそれぞれ単独でimportin beta の 相 互 作 用 を 検 討 し た。 そ の 結 果、はなく NFAT–tubulin alpha 複合体となり importin beta

tubulin alpha は NFAT と結合する一方、importin betaに結合することが示唆された。

は tubulin alpha 存 在 下 に NFAT と 結 合 す る こ と が わ更 に 免 疫 沈 降 試 験 を 行 い 細 胞 内 の NFAT, tubulin

かった（図４A）。更に importin beta は NFAT 存在下にalpha, importin beta の 相 互 作 用 を 検 討 し た。 そ の 結

0.5h
Ac. TSA-1h
Ac. TSA --D2h
Ac. TSA

NFAT-dependent
luciferase activityAanti-tubulin α (acetyl K40)
anti-tubulin α antibody

B

PMA+iono.:-Nuclear
extract

0.5h Ac.
++TSA+

0anti-NFAT 1 antibody

PMA+iono.: -anti-p65 antibody+Ac.
+0.5h
TSA++Ac.
+2hTSA++0.5hAc. TSA++E
NFAT-dependent
luciferase activity

anti-Rb antibody
Lysateanti-tubulin α (acetyl K40)

Intensityof
NFAT150

25001PMA+iono.: -0PMA+iono.:-Nuclear
extract+2h Ac.
+TSA+

F

anti-NFAT 1 antibody
NF-κB-dependent
luciferase activityCanti-Rb antibody
Lysateanti-tubulin α (acetyl K40)

400

Intensityof
NFAT120PMA+iono.: -10

図３

Tubulin alpha アセチル化と NFAT 核内移行抑制との関連（A）Jurkat 細胞を酢酸ナトリウム 5 mM あるいは TSA 10 nM とともに 30 分間から２時間培養した後、タンパクを抽出し Western blot
analysis を行った。
（B、C）Jurkat 細胞を酢酸ナトリウム 5 mM あるいは TSA 10 nM とともに 30 分間（B）あるいは２時間（C）培養した後、PMA+ionomycin 刺激を加え、核分画を抽出し Western blot analysis を行った。 *、P < 0.05 (Student's t-test)。
（D、E）Jurkat 細胞を酢酸ナトリウム 5 mM あるいは TSA 10 nM とともに 30 分間（D）あるいは２時間（E）培養した後、PMA+ionomycin 刺激を加え、NFAT 依存レポーターアッセイを行った。
（F）Jurkat 細胞を酢酸ナトリウム 5 mM あるいは TSA 10 nM とともに 30 分間培養した後、PMA+ionomycin 刺激を加え、NF-κB 依存レポーターアッセイを行った。
3石

黒和博

果、tubulin alpha は NFAT と 細 胞 内 で 結 合 し て い る４列）。以上から酢酸は tubulin alpha のアセチル化をが tubulin beta は NFAT と 結 合 し て い な い こ と が わ誘導することで NFAT–tubulin alpha 複合体と importin

かった（図４C）。更に tubulin alpha–NFAT 結合は酢酸

beta との結合を阻害し NFAT の核内移行を抑制するとや PMA+ionomycin による細胞刺激により影響を受け考えられた。

なかった（図４D、第１列）。一方、importin beta は細次 に tubulin alpha が 結 合 す る NFAT の 領 域 を 同 定

胞刺激に伴い NFAT と結合し、この結合が酢酸によるするため図４E 上に示した NFAT 断片を発現するベク

tubulin alpha アセチル化により阻害された（図４D、第ターを細胞に導入して調べたところ、N 末端 1–571 はAGSTTubulin α： +Importin β： ++-E

GST-NFAT+++Input

Input

1-571 1-393

394-571

＊

Pull

40-

anti-tubulin β antibody

＊

Input
Importin β : ++Tubulin α : +NFAT: +-+++

17-

IP anti-tubulin α+++++++ anti-Flag antibody

LysateIPanti-Flaganti-importin β antibody

C

Lysate
IgG

D

Full

571

130kDaanti-tubulin α antibody

VectorLysate

PullB

394

NFAT

anti-tubulin α antibody

FIP

anti-NFAT

IgG

anti-NFAT

Cytosolic
PMA+iono.
- CsA Ac.

-Nuclear- PMA +iono.
- CsA Ac.

anti-tubulin α antibody

anti-tubulin α antibody

anti-tubulin β antibody

anti-tubulin β antibody
anti-Rb antibody

Acetate： ++PMA+iono.: +++IP
anti-NFAT
anti-tubulin αantibody

GIP

siRNA:

con.

tubulin αNo.1

anti-tubulin α (acetyl K40)

siRNA: control

LysatePMA+iono.:
NuclearextractIP
anti-importin β antibody

図４

No.2

-tubulin α-NFAT

Lysate-+tubulin αNo.1+No.2+-NFAT-RbNFAT, tubulin alpha, importin beta 間の相互作用（A）GST–NFAT, 6xHis-tubulin alpha, 6xHis–importin beta を混合し（Input）、GST–NFAT を回収した（Pull）。（B）GST–NFAT 存在下 / 非存在下で6xHis –Ztubulin alpha と 6xHis-importin beta を混合し（Input）、6xHis–tubulin alpha を抗 tubulin alpha 抗体による免疫沈降で回収した（ＩＰ）。
（C）
Jurkat 細胞の溶解液（Lysate）から NFAT を抗 NFAT 抗体による免疫沈降で回収した。（D）PMA+ionomycin で刺激した Jurkat 細胞の溶解液から NFAT を抗 NFAT 抗体による免疫沈降で回収した。（E）２９３Ｔ細胞に Flag-NFAT 発現ベクターを導入した後、Flag–NFAT を抗 Flag 抗体による免疫沈降で回収した。（F）Jurkat 細胞をサイクロスポリン（CsA）あるいは酢酸ナトリウム（Ac）存在下で PMA+ionomycin により刺激した後、細胞質分画・核分画を抽出した。（G）Jurkat 細胞の tubulin alpha を siRNA で knock–down させ、PMA+ionomycin で刺激した後、核分画を抽出した。
4

酢酸による T 細胞活性化制御の分子機序解明

tubulin alpha と 結合するものの N 末端 1–393 は 結 合

その低下に伴い NFAT の核内移行も抑制された（図４G）。

しない（図４E) ことから 394–571 断片に相当する Rel

以上から tubulin alpha は NFAT とともに T 細胞刺激後homology domain が tubulin alpha との結合に必須であに細胞質から核内へと移行していくことが確認できた。

ることが分かった。しかし 394–571 断片のみは tubulinalpha と 結 合 し な い（ 図 ４E） こ と か ら Rel homology

考

察domain だけでは十分ではなく regulatory domain を含酢酸の T 細胞に対する作用機序を分子レベルで検討

む N 末端領域も tubulin alpha との結合に重要であるこすることにより NFAT 核内移行の分子機序を明らかにとがわかった。この regulatory domain に importin betaすることができた。すなわち、酢酸は HDAC6 活性を阻との結合を調節するリン酸化 Ser/Thr 残基が存在するこ害することで tubulin alpha のアセチル化を誘導するが、とは興味深い。

この tubulin alpha こそがこれまで謎であった importin
beta との結合を補助する NFAT のアダプター分子であり、tubulin alpha のアセチル化はそのアダプター機能

4. Tubulin alpha と NFAT の核内移行
これまで tubulin alpha は細胞質に存在するとされてを阻害するため、酢酸は NFAT と importin beta との結きたが、tubulin alpha が NFAT と結合しているのであ合を阻害し NFAT の核内移行を抑制するのである（図５）。

れば tubulin alpha は T 細胞刺激に伴い NFAT とともに本研究の結果は “tubulin alpha アセチル化 ” が T 細胞に核内に移行するはずである。これを確認する実験を行っおける酢酸の影響を評価するための “ バイオマーカー ”

たところ tubulin alpha は tubulin beta とは異なり T 細として有用であることを示していると同時に NFAT 核内胞刺激後に核分画で検出される一方、NFAT 核内移行を移行抑制を介して T 細胞活性化を制御する “ 新しいター抑制するサイクロスポリン（CsA）や酢酸ナトリウムが存ゲット ” として有用であることも意味している。現在、在すると検出されなくなることが観察された（図４F）。

我々は本研究の成果を更に発展させ新たな抗炎症療法を

また siRNA により tubulin alpha の発現を低下させると、開発するため、tubulin alpha のアセチル化などを指標

図５

酢酸の作用機序と NFAT 核内移行の分子機序

核内輸送体 importin beta はカルシニューリンより転写因子 NFAT が脱リン酸化されると NFAT-tubulin alpha complex に結合し細胞質から核内へと輸送する。酢酸・酢酸ナトリウムは tubulin alpha のアセチル化を誘導することにより importin beta と NFAT-tubulin alpha complexの結合を阻害し NFAT の核内移行を抑制する。
5石黒和博に T 細胞の活性化を制御しうる化合物を見つけるスク

要リーニングを行っている。

1）酢酸は tubulin alpha のアセチル化を誘導する。

腸管、特に大腸には細菌が豊富に存在するが、健常で約2）Tubulin alpha は転写因子 NFAT と結合し、この複合は大腸に病的な炎症反応は観察されることはない。この体に核内輸送体 importin beta が結合する。

腸内細菌は発酵により酢酸を多量に産生しているが、そ

3）Tubulin alpha のアセチル化は NFAT–tubulin alpha 複の酢酸に T 細胞活性化を抑制する作用があることを考合体と importin beta の結合を阻害する。

えると、腸内細菌が産生する酢酸は腸管の炎症を制御する要因の一つであると推測できる。これに対して炎症性謝腸疾患（潰瘍性大腸炎とクローン病）では腸内細菌叢が辞

本研究に対して援助をしていただいた公益財団法人三変化し便中酢酸量が減少することが知られているが、腸島海雲記念財団に深く感謝いたします。

管内で酢酸量が低下することにより T 細胞活性化制御が不十分となり過剰な炎症反応につながっている可能性参がある。そのような病的状態は腸管内に酢酸ナトリウム

1) J.M. Wong et al.: J Clin Gastroenterol, 40, 235–243, 2006.

文献2) G.A. Preidis and J. Versalovic: Gastroenterology, 136,を補充することで解消されうるが、実際に臨床試験にお2015–2031, 2009.

いて酢酸ナトリウムを含む注腸による潰瘍性大腸炎の改善が報告されている

考

3) P. Vernia et al.: Aliment Pharmacol Ther , 9, 309–313,3,4)。我々は予備的臨床試験で酢酸

1995.

ナトリウム単独の注腸が難治性潰瘍性大腸炎や術後再発4) J. Patz et al.: Am J Gastroenterol , 91, 731–734, 1996.
5) K. Ishiguro et al.: Eur J Immunol , 37, 2309–2316, 2007.

クローン病を改善することを認めている（未発表）。今後

6) F. Macian: Nat Rev Immunol , 5, 472–484, 2005.
7) A. Kiani et al.: Immunity , 12, 359–372, 2000.

は腸内細菌が産生する酢酸の生理的意義を解明し、酢酸ナトリウムを用いた新たな抗炎症療法の開発に貢献して

8) K. Ishiguro et al.: J Immunol , 186, 2710–2713, 2011.

いきたい。

9) J.W. Hammond et al.: Curr Opin Cell Biol , 20, 71 –76,
2008.

6