化学物質の新規リスク評価のためのライブシングルセル解析手法の開発
大阪大学大学院基礎工学研究科

倉岡功

Risk assessment studies of chemical substances that induce DNA lesions are important, because DNA lesions in genomic
DNA result in cancer in humans. Many classes of DNA lesions induced by chemical agents are eliminated via DNA repair
nucleotide excision repair (NER) for the maintenance of genomic integrity. Ames test is one of the most commonly applied
tests in toxicology. In the test, NER-deficient mutant bacterial cells are used to detect the mutagenic capacity of chemicalsubstances. Unscheduled DNA synthesis test is also popular test for toxicology and measures DNA repair synthesis afterexcision of oligonucleotides containing DNA lesions during NER. And in human, individuals with NER-defective xeroderma
pigmentosum are cancer-prone. For toxicology research in human, therefore, it might be important to identify NERrepairable bulky DNA lesions induced by chemical substances. So far, simple and quick assays to detect such damaging
agents have not been developed using human living cells. Here, we report a simple, non-isotopic assay for determining DNAdamaging agents that induce NER-repairable DNA lesions by visualizing gene expression from treated fluorescent protein
vectors in a mammalian living cell system. This assay is based on a comparison of fluorescent protein expression in NERproficient and NER-deficient living cells. When we tested UV-irradiated fluorescent protein vectors, the fluorescent protein
was observed in NER-proficient living cells, but not in NER-deficient living cells. Similar results were obtained for vectors
treated with the anticancer drug, cisplain. By contrast, when treated with the DNA alkylating agent methyl methanesulfonate,
believed to cause no NER-repairable lesion, no difference in gene expression was observed in between NER-proficient andNER-deficient living cells. Using fluorescent protein expression and living test cells, our assay can specifically detect DNAdamaging agents that induce NER-repairable DNA lesions, and could be used to analyze chemicals with the potential tocause cancer.

1. 緒

おり、これらは分子生物学的観点からすると明らかに複雑言でまた遅い反応である。またこれらの方法論は 50 年以上化学物質のデータベースであるケミカルアブストラク

昔の生物学基盤により開発されている。

ト誌によれば、地球上に存在する化学物質は 1 億種をこえ、今回、申請課題の基になるバイオアッセイは、上記の化日常生活において 7 万以上の化学物質に囲まれ，さらに新学物質に係る試験よりさらに簡便でまた短期間にその安全規の化学物質が毎日のように登録されている。このような性を評価することができる。なぜならば、近年の分子生物無数とも思われる物質があるため，迅速に人に対しての健学から得られた知見を基に従来の試験法と異なった指標康影響を予測し，その影響の大きさの順位づけを行い，安（損傷に応答した転写反応）を用いているからである。我々全対策に結びつけるということは重要なことであると考えは、このバイオアッセイを従来の細胞株を用いて構築し、られる。しかしながら、人に影響を与える化学物質をすべ毒性に応答した転写反応およびその有用性を報告した 1 ‒ 4）。て網羅して、分析し評価することは困難を極め、さらに環今回さらにその応用として、生きたヒト細胞を用いて生き境中の化学物質は混合した状況で存在し、その影響はよりたままリアルタイムで、化学物質の安全性を評価できる方複雑かつ複合的に示される。

法を開発することを目標とした。

現在、化学物質の安全性評価の方法は、復帰突然変異試

当初、DNA 修復によってタンパク質の蓄積が観察でき験および染色体異常試験で基本解析されている。この 2 つる CSB タンパク質を標的として、予定の実験を開始した。の試験法は比較的簡便にまた短期間で化学物質の安全性をこのタンパク質は、化学物質などで生じた DNA 損傷を修評価することができる。しかしながら、それぞれ遺伝子組復するヌクレオチド除去修復機構に関するもので、特に転換え生物および細胞分裂の時間を必要とするし、またそれ写と共役することからその反応は非常に早いことが予測さぞれ突然変異誘発性および染色体異常誘発性を指標としてれた。また幾つかの論文によれば、確かに CSB およびそれに関連する修復遺伝子の細胞内局在はそれぞれ細胞核内の核小体に高頻度で存在することが報告されていた。そのA new method for detecting new biologicalrisk assessment of chemical substanceusing live cell analysis
Isao Kuraoka
Graduate School of Engineering Science,
Osaka University

ため我々はそれらのタンパク質と蛍光タンパク質を融合した発現ベクターを構築し、まずヒト細胞株である HeLa 細胞および HEK293 細胞に導入してその遺伝子発現を解析した。発現はウエスタンブロットにより確認し、タンパク質が確かに目的の大きさに観察できることが明らかになっ− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

た。また細胞内の局在を解析し、蛍光タンパク質としての神神経症状を引き起こす原因の一つとも考えられ、その損発現も確認することができた。しかしながら、その発現が傷を検出できることが示唆された。これによって、化学物安定せず、結果的に細胞においてこのタンパク質が分解さ質のリスク評価を求める新規の実験方法を構築できたと考れやすいということがわかった。加えて、これらのタンパえられる。

ク質発現安定発現株の構築を試みたが、これも細胞内での2. 方局在が安定しなかった。この原因として、融合タンパク質としては、予定した修復タンパク質は不安定であり、今回の我々の目的とした方法論では観察できないということが法

2. 1. 試験プラスミド、導入確認用のプラスミドおよびXPA 発現ベクターの構築わかった。

試験プラスミドとして、pEBMulti-Neo-tdTOMATO お以上の結果から、当初想定していた方法論ではリスク評よび導入確認用のプラスミドとして、pBluescript II KS（-）

価をすることは困難だと考え、新規の実験を行うことにし-EGFP をそれぞれ以下のように作製した。

た。この新規方法では、蛍光タンパク質発現ベクターを

2. 1. 1 pEBMulti-Neo-tdTOMATO

DNA 損傷剤（テスト試薬）と反応させることで、DNA 上に赤色発光タンパク質をコードした tdTOMATO cDNA損傷を生み出し、その損傷が修復されるかどうかを観察すを挿入するために、wtTDP43 tdTOMATOHA7）プラスミることで、損傷剤の危険性を評価する。また、この損傷をドを鋳型として PCR により両端に BamH I と Xho I の制限評価するために特にヌクレオチド除去修復機能を欠損した酵素サイトをもつ tdTOMATO cDNA を増幅した。この細胞（XPA 欠損細胞）、さらにこの修復機能を相補した細胞

PCR 産物を pEBMulti-Neo の BamH I および Xho I 制限酵（XPA 相補細胞）を作成し、その差異によって評価するこ

素部位に T4 DNA Ligase を用いて挿入した。ととした（Fig. 1）。これは化学物質を評価する最も多く用試験用のプラスミドには、紫外線、シスプラチンおよびいられているエームス法においては、DNA 修復特にヌクMMS により DNA 損傷が導入された。

レオチド除去修復を欠損した細菌を用いて、損傷を検出し2. 1. 2 pBluescript II KS（-）-EGFPやすくしている。そこでこの実験方法においても同様にヌ緑色発光タンパク質をコードしたEGFP cDNAを挿入す

クレオチド除去修復を欠損したヒト XPA 欠損細胞を用いるために、pEGFP-C1 プラスミドを鋳型として PCR によることとした 5）。この方法だと実際に生じたプラスミド上り両端に BssHII の制限酵素サイトをもつ EGFP cDNA をの DNA 損傷の修復を生きた細胞を蛍光顕微鏡で観察する増幅した。この PCR 産物を pBluescript II KS（-）の BssHIIことができるはずである。これらの作業仮説をもとに、以下制限酵素部位に T4 DNA Ligase を用いて挿入した。に示すように実験を行い、予測された通り一定のDNA 損傷

2. 1. 3 XPA 発現ベクターを測定することができた。さらに今回我々が構築した試験DNA 修復タンパク質をコードした XPA cDNA をサブ細胞株は XP 細胞であるため、基本的には NER で修復さクローニングし、PCR により両端に BamH I と Xho I の制れるはずの DNA 損傷を検出していることになった。XP 患限酵素サイトをもつ XPA cDNA を増幅した。この PCR 産者が高頻度発がんおよび精神神経症状を呈することから 6）、物を pEBMulti-Neo の BamH I および Xho I 制限酵素部位

この NER で修復される DNA 損傷は高頻度発がんおよび精に T4 DNA Ligase を用いて挿入した。また、全てのプラFig. 1 検出系の概要− 80 −

化学物質の新規リスク評価のためのライブシングルセル解析手法の開発

スミドベクターの塩基配列は、シークエンサーによって確や 6-4 pyrimidone photoproducts（（6 ‒ 4）光産物））が知ら認された。

れている 8）。これらの UV 損傷 DNA は隣接ピリミジン塩基間において光環化反応が起こることで生じる。生成の割

2. 2. 試験細胞の構築

合は CPD が 80 ～ 90 %、（6 ‒ 4）光産物が 10 ～ 20 % 程度で修復タンパク質XPAが欠損したXP-A患者の細胞（XP2OSあるが、（6 ‒ 4）光産物は構造の変化の大きさから CPD より細胞）に、今回作成した XPA を発現する pEBMulti-XPA ベも変異原性が高いことが知られている。そしてこれら 2 つクターを導入した。使用した pEBMulti-Neo ベクターには、の損傷は、いずれも NER により修復されることが分かっ

Neomycin 耐性遺伝子が組み込まれている。Neomycin 耐ている。よって、UV 損傷 DNA を用いることで、このア性遺伝子が組み込まれているベクターを細胞に導入し、そッセイが正しく機能するかを確かめた。また実際に DNAの細胞を抗生物質である G-418 Sulfate を含む培養液で増修復段階を明らかにするため、まず細胞内で確かに修復さ殖させることで、DNA が正しく導入された細胞のみを選れるか、また修復時間がどのように変化するかを検討する択することができる。ベクターを導入した XP2OS 細胞ため、UV 非照射のベクターおよび照射ベクターをそれぞを G- 418 Sulfate を含む培養液で培養し、ベクターが正しれ作製した試験細胞に導入した。その結果、UV 非照射のく導入され、生存した細胞のみを選択した。また、これベクターを導入した全ての細胞は導入後 24 h 後に RFP をらの樹立された細胞における XPA タンパク質の発現をウ産生し、蛍光が観察された（Fig. 2）。UV 照射されたベクエスタンブロッティングにより確認し、試験細胞であるターを導入した XP2OS / XPA 細胞も RFP 遺伝子を発現し、（XP2OS/ pEBMulti-XPA 細胞：XP2OS/XPA 細胞）を樹蛍 光 が 見 ら れ た。 し か し、XP2OS 細 胞 お よ び XP2OS/立した。さらにこの時、同様にして pEBMulti-Neo ベクタ

pEB 細胞では蛍光は観察されなかった。これは、UV によーのみを導入し、Neomycin 耐性で選択をしたコントロー

り生じた DNA 損傷が蛍光タンパク質ベクターにおける遺ル細胞（XP2OS / pEB 細胞）も樹立した。これらの試験細胞

伝子発現を妨害し、この損傷は、XPA タンパク質の存在（XP2OS 細胞、XP2OS/pEB 細胞、XP2OS/XPA 細胞）は、下では NER により修復され得ることを示唆した。

10% FCS（ウシ胎仔血清）を添加した DMEM 培地を用いしかしこの方法では、試験に用いる発現ベクターが６て、37 度５％二酸化炭素濃度を保った CO2 インキュベー時間までに導入されていない可能性も考えられる。また

ターにて培養された。

XP2OS 細胞および XP2OS / pEB 細胞には発現ベクターが加えて、それぞれの試験細胞に紫外線を照射し、その感導入されにくい可能性およびトランスフェクションによ受性を確認したところ、XPA を発現する細胞のみが紫外る細胞死の可能性も考えられる。そこで我々は、これらの線に抵抗性であった。このことは外来の XPA タンパク質ことを回避すべく、pEB-RFP ベクター同時に試験細胞にが細胞内で機能していることを示している。

Incubation Time (h)22. 3. 修復試験テスト（紫外線）
2 つの1.5 mL tube に① OPTI-MEM、pEBMulti-tdTOMATO、4624XP2OSpBS-GFP、②OPTI-MEM、損傷を与えたpEBMulti-tdTOMATO、pBS - GFP を 加 え た。OPTI-MEM と Lipofectamine® 2000

XP2OS/pEB

Reagent を混合したものを加え、室温でインキュベートした（5 min）
。前日に 12 well plate に撒いた XP2OS 細胞、

XP2OS/XPAの 1 well ずつに 125 µL ずつ加え、37 度５％二酸化炭素濃度を保った CO2 インキュベーターにて培養された（O/N）
。

UV

XP2OS/pEB 細胞、XP2OS/XPA 細胞（8.0 × 105 cells/mL）

24 h 後に細胞を蛍光顕微鏡で観察した。

XP2OS

また画像処理ソフト Image J により、蛍光強度を測定した。

3. 結

XP2OS/pEB

果

XP2OS
/XPA

本研究におけるアッセイを検証するために、UV によるDNA 損傷を検証した。
太陽光など、UVにより生じるDNA損傷として、隣接チミン同士が架橋した cyclobutane pyrimidine dimer（CPD）

repairFig. 2 UV 損傷を与えた pEB-RFP を導入した試験細胞の時間経過− 81 −コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

導入するモニターベクター（pBS-EGFP）を作製した。こUVれを試験するため、UV を照射して損傷を与えている pEB-Green

RFP ベクター、および UV を照射していない pEB-RFP ベクターと、損傷を与えていない pBS-GFP ベクターを同時に試験細胞に導入した。損傷を与えていない pEB-RFP とpBS-GFP を導入した 3 つの細胞は、全ての細胞においてGFP および RFP 遺伝子を発現し、蛍光が見られた。損傷

RedGreenRed

XP2OS

XP2OS/pEBを与えた pEB-RFP と pBS-GFP を導入した細胞について、
XPA タンパク質を産生している XP2OS/XPA 細胞においては、GFP と RFP 両方の蛍光が観察された（Fig. 3 & 4）。
これは、DNA の細胞中の核内への導入が正しく行われ、NER により修復が可能である DNA 損傷が除去されたと

XP2OS/XPA

Fig. 3 UV 損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光観
察

Relative ﬂuorescence [%]いうことを示唆している。一方で、XPA タンパク質が存在せず NER が欠損した細胞である XP2OS 細胞およびXP2OS/pEB 細胞においては、GFP 遺伝子のみ発現していた。これにより、この検出系が正しく NER による損傷を検出しているということがわかった。
続けて我々はシスプラチンにより生じる DNA 損傷が検出可能かを検討した。シスプラチンは広く利用されている抗がん剤であり、がん細胞におけるその細胞毒性活性は複製または転写を阻害するシスプラチン -DNA 付加物に起因する歪みによって媒介されると考えられている。最も多いシスプラチンによる DNA 損傷であるシスプ

120100806040200XP2OSXP2OS/pEB−UV

XP2OS/XPA+UV

Fig. 4 UV 損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光定量化

ラチン -DNA 付加物は、鎖内架橋（intrastrand crosslink）
で あ る 1,2 - intrastrand d（GpG）crosslink お よ び d（ApG）
crosslink であるが、これに加え、1,3-intrastrand d（GpNpG）crosslinkや鎖間架橋（interstrand crosslink）を少量生じる 9）。
NER は、これらの intrastrand crosslink を効果的に除去するが、interstrand crosslink は NER とは別の機構である相同組み換え修復で修復されると考えられている。
pEB-RFP ベクターをシスプラチンと処理し、G-25 カラ
ムに通して精製した後に試験細胞にトランスフェクトした。
高濃度（10 〜 100µM）のシスプラチン処理の細胞においては、全ての試験細胞で GFP の蛍光は観察されたが、RFPの蛍光は観察されなかった。これは、シスプラチンが遺Fig. 5 シスプラチン損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光観察

伝子発現を妨害するいくつかの DNA 損傷を生じ、それらが NER では修復されない interstrand crosslink を含むより複雑な DNA 損傷であり得ることを示唆している 10）。一方で、1 µM のシスプラチン処理をした細胞においては、XP2OS /XPA 細胞では RFP 遺伝子が発現したが、XP2OS細胞、XP2OS / pEB 細胞では発現しなかった（Fig. 5 & 6）。
よって、この濃度においては、RFP ベクターに NER で修復が可能な DNA 損傷を生成することが示唆された。
次に、NER とは異なる経路で修復されることが分かっている methyl methanesulfonate（MMS）で損傷を与えた。
MMS は、7- メチルグアニン（7-meG）
および 3- メチルアデニン（3-meA）のようなベクター DNA 中の DNA アルキル化

Fig. 6 シスプラチン損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光定量化− 82 −

化学物質の新規リスク評価のためのライブシングルセル解析手法の開発

塩基損傷、並びにAPサイトを誘導することができる 11）。DNA
修復酵素のアルキルアデニン DNA グリコシラーゼは、DNA 上の損傷塩基を認識し、アルキル塩基を除去して APサイトを生成する 12）。MMSにより誘発されるDNA損傷は、塩基除去修復（BER）の対象と考えられており、NER とは別の経路で修復されると考えている。よって、XPA が欠損しており NER が機能しない細胞であっても BER は機能すると考えられるため、損傷を受けた蛍光タンパク質によっても蛍光が観察されることが予想される。
pEB-RFP ベクターを MMS と処理し、G-25 カラムに通して精製した後に試験細胞にトランスフェクトした。すると、予想通りに全ての細胞において GFP と RFP 遺伝子のFig. 7 MMS 損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光観察発現が観察された（Fig. 7 & 8）
。これは、MMS により誘発される DNA 損傷は遺伝子発現に影響を及ぼさず、本研究におけるアッセイは BER により修復される DNA 損傷の検出には使用することができないことが示唆された。しかし、
1 mM の MMS では濃度が小さすぎて、損傷が適切に誘導されなかった可能性も否定することはできない。

4. 考

察

本研究では、DNA 損傷を与えた蛍光タンパク質を NERが欠損している XP-A 患者の細胞に導入し、損傷が修復されれば蛍光タンパク質遺伝子の発現を蛍光顕微鏡で検出することができるという原理を用いて、DNA 損傷の検出系

Fig. 8 MMS 損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光定量化を開発した。
UV 照射した pEB -RFP ベクターを細胞にトランスフェする DNA 損傷は、化学物質の細胞毒性作用によりほとんクションすると、UV 照射されていない pEB-RFP ベクタど検出されない。さらに、細菌細胞と哺乳類細胞の DNAーが全ての細胞において RFP を産生したのに対し、NER代謝には大きな差異があるため、哺乳類細胞中で分析する欠損細胞（XP2OS 細胞および pEB ベクターのみがトランことが求められる。

スフェクトされた XP2OS /pEB 細胞）では RFP は産生されまた、UDS 試験は、哺乳類培養細胞中の細胞周期の S 期ず、一方で NER 相補細胞（XP2OS/XPA 細胞）では RFP のの DNA 合成に進まない DNA に、放射性トリチウム標識蛍光を観察することができた。同様に、嵩高い DNA 損傷チミジン（3H - dT）を組み込むことに基づいており、取り込を誘発する DNA 損傷剤であるシスプラチンで処理すると、まれた 3H - dT は、X 線に感受性を示すオートラジオグラ

NER 相補細胞では濃度が小さい場合には蛍光タンパク質

フィーにより、ハロゲン銀粒子として検出されることによを産生するが、NER 欠損細胞では全く蛍光が観察されなり DNA 損傷を検出している 13）。UDS 試験は、古くから一かった。一方、DNA アルキル化塩基損傷を誘発する MMS

般的に用いられている in vivo における遺伝毒性試験であと共にインキュベートされたベクターを導入した試験細胞

り、XP 相補性診断試験としても使用されている。しかし、では、全ての細胞において蛍光タンパク質の蛍光を観察す

UDS 試験は複雑な過程を経る必要があり、さらに放射性ることができた。UV およびシスプラチンは NER で修復が同位体の使用を余儀なくされる。

可能な DNA 損傷を誘発するが、MMS は BER で修復され本研究における検出系では、これらの欠点を克服するこる DNA 損傷を誘発するので、本研究では NER によって修とができる。損傷をプラスミド自体に与えるため、細胞へ復された DNA 損傷を誘発する DNA 損傷剤を検出するこの影響はなく細胞毒性を考慮する必要性は少ない上に、細とができると結論づけた。

菌細胞ではなくヒトの生細胞を用いているため、よりヒト一般的に使用されている DNA 損傷剤のスクリーニングにとって有害である化学物質を見極めることができる。さ法であるエームス試験は、NER が欠損している突然変異らに、過程は蛍光タンパク質遺伝子発現ベクターに損傷を細菌細胞を用いて特定の化学物質が突然変異を誘発する可与え、細胞に導入するだけの簡単なものであるし、放射性能性を分析することができる。しかし、転写や複製を妨害同位体も用いる必要はない。

− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

さらに多くの試験試薬を用いて損傷と修復の関係を検討

MC, Satoh Y, et al., Analysis of a human DNA

する必要はあるものの、この検出系は、エームス法などのexcision repair gene involved in group A xeroderma

ように DNA 損傷を誘発するさらなる新しい DNA 損傷剤

pigmentosum and containing a zinc-finger domain,の発見、すなわち新規の化学物質の評価法に役立つことがNature 348. 73-76. 1990
6） Lehmann AR, McGibbon D, Stefanini M. Xeroderma

期待できる。

5. 総

pigmentosum, Orphanet J. Rare Dis. 6. 70. 2011

括7） Yang C, Tan W, Whittle C, Qiu L, Cao L, Akbarian

当初は、損傷を受けた細胞内のタンパク質の局在変化に

S, Xu Z. The C-terminal TDP-4 3 fragments have a

よって、生きた細胞で化学物質の安全性を評価する実験系

high aggregation propensity and harm neurons by aを確立することを目指した。しかしながら、局在変化では

dominant-negative mechanism. PLoS One 5. e15878. 2010

様々な細胞の状態（遺伝的背景の違いおよび損傷の生成頻8） Mori T. et al., Simultaneous establishment of度）により損傷による局在変化が観察されなかった。そこ

monoclonal antibodies specific for either cyclobutane

で従来の生化学的手法および遺伝学的手法の延長線上としpyrimidine dimer or（6 - 4）photoproduct from the sameて今回の検出法を考案した。この方法では、試験細胞を遺mouse immunized with ultraviolet-irradiated DNA,

伝学的に統一することで安定した細胞を確保し、また損傷

Photochem Photobiol, 54. 225-232.1991の生成頻度も外来遺伝子である発現プラスミドを用いるこ9） Moggs JG, Yarema KJ, Essigmann JM, Wood RD.とにより克服し、さらに発現プラスミドのモニターとしてAnalysis of incision sites produced by human cell

蛍光タンパク質を用いることで生きた細胞でリアルタイム

extracts and purified proteins during nucleotideに損傷のタイプおよび修復の効率を考察することができる

excision repair of a 1,3-intrastrand d（GpTpG）-cisplatin

実験系を確立することができた。細胞を様々な変異株を用

adduct. J Biol Chem. 271.7177-7186. 1996

いることで、また、発現プラスミドをさらに改変することによって応用研究が発展できることが期待できる

10）Wood RD. Mammalian nucleotide excision repair
proteins and interstrand crosslink repair. Environ Mol

14）。

Mutagen. 51. 520-526. 2010
（引用文献）

11）Karran P, Macpherson P, Ceccotti S, Dogliotti E,61） Hasegawa M, Iwai S, Kuraoka I. A non-isotopic assay

Griffin S, Bignami M. O -methylguanine residues elicit

uses bromouridine and RNA synthesis to detect DNA

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Chem. 268. 15878-15886. 19932） Morita Y, Iwai S, Kuraoka I. A method for detecting12）O'Brien PJ, Ellenberger T. Human alkyladenine

genetic toxicity using the RNA synthesis response toDNA glycosylase uses acid-base catalysis for selective

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functional assay for global genomic nucleotide excision4） Sonohara Y, Iwai S, Kuraoka I. An in vitro method

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for detecting genetic toxicity based on inhibition of14）Takatsuka R, Ito S, Iwai S, Kuraoka I. An assay toRNA synthesis by DNA lesions. Genes Environ. 1. 37:8.

detect DNA-damaging agents that induce nucleotide

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