アニオン性の多糖で被覆したキトサン微粒子へのタンパク質のカプセル化と機能評価
慶應義塾大学理工学部

佐 藤智 典In this study, chitosan particles were employed as a protein carrier. Glucose oxidase (GOD) was encapsulated in chitosan
particle coated with anionic polysaccharides such as hyaluronic acid and pectin. Encapsulation efficiency of GOD, size ofthe particles, and controlled release of GOD from the particles were investigated. Water-soluble chitosan was employed
to encapsulate proteins (BSA and GOD) at neutral pH condition. Protein-encapsulated chitosan particles were preparedby using cross-linker such as citric acid triacetate. Compared to other cross-linkers, citric acid was showed the higher
encapsulation efficiency for BSA (30-40%). However, the stability of ionic cross-linked chitosan particle was significantly
decreased by the addition of salt. Therefore, the chitosan particle was covalently cross-linked. Encapsulation efficiency wassignificantly increased (>80%), and the release of GOD from the covalently cross-linked chitosan particles was significantly
suppressed at neutral pH. Next, coating of the chitosan particles with anionic polysaccharides were carried out. Hyaluronic
acid-coated chitosan particles showed the aggregation. Pectin-coated chitosan particles showed high encapsulation efficiency
for GOD (60-90%), the particle size was submicron order. The aggregation of the particle coated with pectin was alsosuppressed. The release of GOD from the pectin-coated chitosan particles was significantly suppressed in the absence ofNaCl, and increased depending on the concentration of NaCl. The controlled release of proteins from chitosan particle wasachieved by using cross-linker and coating with anionic polysaccharide.

１緒することによって得られるカチオン性の多糖である。キ言

トサンは生体毒性が低く（マウスの経口 LD50 = 16 g/kg）、近年遺伝子組み換えタンパク質に代表されるバイオ医薬

生体適合性および生分解性に優れており、タンパク質キャ品の開発が進み、有効な治療法が存在しなかった各種疾病リアーの開発に適した長所を有している 。また、粘膜吸の治療薬として大きな期待が寄せられている。しかし、臨着性、抗菌・制菌性、免疫賦活作用など多様な生物活性を床応用にはまだまだ多くの課題が残されている。タンパク有する事から、タブレットやビーズ、マイクロスフェア、質の医薬品化に際しての主な問題点は、熱や酸、有機溶媒ナノパーティクルなど様々な剤形で、工業、農業、医薬ななどに不安定で、容易に変性・失活する、消化管や粘膜組ど様々な分野に応用されている。本研究者らはキトサンを織中のプロテアーゼによる分解・失活する、分子量が大き遺伝子のデリバリーとして利用してきたく生体への吸収効率が低い等である。例えば、タンパク質遺伝子と安定な複合体を形成し、遺伝子の分解酵素からのをカプセル化した粒子でも、塩存在下や酵素により速やか保護能力、細胞内において遺伝子発現活性に優れているこに放出や分解が起きる。体内への吸収効率が低く、期待通とを見出している。

りの治療効果が得られない。従来の低分子化合物ならば誘[1][2−7]。キトサンは

本研究の目的は、タンパク質製剤の設計・開発を行い、導体化によって、化合物の安定性・吸収性などを解決できタンパク質の安定性や特異性を改善し、その治療効果を高る事も多いが、タンパク質の誘導体化は容易ではない。そめる事である。キトサンを用いてプロテインキャリアーをのため、タンパク質の臨床応用には DDS による吸収や体設計するに当たって、以下の点に留意した。

内動態の制御が不可欠であり、「プロテインデリバリーシ①生体適合性・生分解性のあるマテリアルのみで微粒子をステム」の重要性が高まっている。

調製する。

本研究では、キトサン微粒子をタンパク質のキャリアーとして用いることにした。キトサンは、甲殻類や昆虫、微生物などの細胞壁など天然に豊富に存在するキチン（β-1,4- ポリ -N- アセチル -D- グルコサミン）を脱アセチル化
Encapsulation of proteins in chitosan
particles coated with anionic polysaccharides
and analyses of their functions②タンパク質が変性・失活しない緩和な条件でタンパク質をカプセル化する。
③タンパク質の保持能の高い微粒子を作製する。
本研究ではキトサンとタンパク質の複合体を作製し、さらにキトサン微粒子の安定性を向上させるために、ヒアルロン酸やペクチンのようなアニオン性多糖での被覆を行った。

Toshinori Sato
Department of Biosciences and Informatics,
Keio University

２

実験方法

水溶性キトサンは焼津水産化学㈱より入手した。ヒアルロン酸ナトリウムとペクチンは Wako から購入した。カ− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

プセル化するタンパク質であるグルコースオキシダーゼ− 40% 程度のカプセル化効率を持つ微粒子が調製された。

（GOD、Aspergillus niger）は ICN から購入した。

フマル酸やマレイン酸を架橋剤として用いた場合には、微タンパク質をカプセル化したキトサン粒子の作製プロセ粒子の形成は確認できなかった。よってクエン酸がキトサ

スは図１に示した。まず、BSA や GOD をカプセル化しン粒子の作製には有効であることが示された。またカプたキトサン粒子を作製した。キトサン溶液は 20 mM MES

セル化効率は、本研究では BSA や GOD を用いているが、buffer（pH6.0）に溶解した。架橋化剤として用いたトリタンパク質の種類により影響されることが示された。

ポリリン酸（TTP）やデキストラン硫酸（DS）およびク次に、調製したキトサン微粒子懸濁液の塩強度を変化さエン酸三ナトリウム（TC）は Milli-Q 水に溶解した。BSA、せた際の、懸濁液の濁度の変化を測定した。低分子であるグルコースオキシダーゼ（GOD）は Milli-Q 水に溶解した。

クエン酸は高分子であるデキストラン硫酸ナトリウムと比共有結合架橋を形成するには、縮合剤である EDC を 20較して、塩強度の変化に非常に脆弱であった。塩強度にmM MES Buffer（pH 5.8）に溶解して用いた。

依存して濁度が経時的に減少し、30mM NaCl でもわずかカプセル化効率は次のようして求めた。GOD をカプセ

1 分程で粒子が崩壊してしまう事が示された。一方、デキル化した被覆化キトサン微粒子懸濁液を、遠心分離機を用

ストラン硫酸の場合では、塩強度を変化させても濁度に大いて 10000 rpm, 20 min, 4 ℃の条件で遠心処理を行い、微きな変化は見られず、NaCl の濃度が 150mM でも微粒子粒子を沈殿させた。遠心後上清を回収し、上清中のタンパが崩壊しなかった。高分子－高分子間のコンプレックスは、ク質濃度をプロテインアッセイにより決定した。

ある位置で高分子同士の官能基が結合すると、近傍に存在カプセル化効率（%）＝（タンパク質仕込み濃度する官能基間で次々と結合が進行するため、安定性が高い−上清のタンパク質濃度）/（タンパク質仕込み濃度）×100と考えられる。

この微粒子懸濁液の NaCl 溶液、異なる pH 中での安定

次に、溶液の pH におけるキトサン微粒子懸濁液の濁性を評価した。被覆化キトサン粒子を塩溶液と混合した。

度を測定した。酸性の pH ではクエン酸の荷電率の低下、一定時間後、微粒子懸濁液を上記と同様の条件で遠心処理

pH6.5 以上ではキトサンの荷電率の低下に対応して濁度がを行い、微粒子を沈殿させた。遠心後上清を回収し、上清低下し、粒子が崩壊していた。つまり、官能基の荷電率のをプロテインアッセイした。

低下に対応して濁度が減少し、荷電率が濁度の変化（粒子３の膨張や崩壊）に密接に関わっている事が示唆された。こ実験結果の結果は、官能基の荷電率の低下に伴い、微粒子形成の駆キトサン微粒子の作製における、架橋化剤の違いによる動力である粒子内のイオン架橋点が減少するため微粒子が影響を検討した。トリポリリン酸を用いた場合、カプセル徐々に膨張し、イオン架橋点がある一定以下の数になると化効率が高いナノサイズの粒子を調製できる条件は見つか微粒子は完全に崩壊すると考察される。

らなかった。カプセル化効率は、10％前後であったが、粒そこで、より安定なキトサン粒子を得るために EDC に子径とゼータ電位はキトサン／トリポリリン酸比に依存しよる共有結合架橋の形成を行ったところ、塩存在下での微た変化が見られた。キトサンを増やすと粒子径は小さくな粒子の安定性が改善された。またタンパク質のカプセル化り、ゼータ電位は増加した。

効率は 80％かそれ以上となり、大幅に改善されることがデキストラン硫酸をクロスリンカーとした場合にはキトわかった。キトサンの架橋化によりタンパク質の放出が抑サン／デキストラン硫酸比が大きくなるにつれて粒子径お制されていることが示された。粒子サイズとしては、動よびカプセル化効率ともに大きくなり、ナノサイズの粒子的光散乱法および走査型電子顕微鏡での観察により 4 − 5

径と高いカプセル化効率を持つ微粒子が調製される条件は㎛程度であることが示された。
共有結合されたキトサン粒子からの内包された GOD の見つからなかった。
クエン酸を用いて調製したキトサン微粒子では、キトサ放出挙動を測定した。イオン架橋化キトサン微粒子では、ン／クエン酸の組成により、ナノサイズの粒径を有し、30pH 7.4 の緩衝液中において GOD が 10 分で 80% 以上放出

タンパク質

キトサン

架橋剤

4℃ , 200rpm, 24h

安定化剤としての高分子反応開始剤

4℃ , 200rpm, 24h

4℃ , 200rpm, 24h
被覆化キトサン粒子

図１

タンパク質をカプセル化した微粒子の作製方法の概略図− 28 −

アニオン性の多糖で被覆したキトサン微粒子へのタンパク質のカプセル化と機能評価されてしまった。一方、共有結合架橋化キトサン微粒子でも可能であった。アニオン性の多糖としてヒアルロン酸はは、GOD の放出が大幅に抑制され、数時間後でも 10％程粘性が高く安定な粒子を得ることができなかったが、ペク度であった（図２）。共有結合架橋により微粒子が膨張・チンを用いることで安定な粒子を得ることができた。この崩壊しなくなった事でタンパク質を粒子内に安定に保持でようなタンパク質をカプセル化した微粒子の作製を達成しきるようになり、放出が抑制されたと考えられる。

たが、用途によっては、溶液中での凝集の抑制や、塩溶液

次に、キトサン粒子をアニオン性の高分子により被覆を中での安定性を高める工夫を更に行なう必要性が示され行った。このような３元複合体の作製では、キトサンのアた。キトサン微粒子の安定性を向上と、タンパク質の徐放ミノ基とアニオン性高分子のカルボキシル基の比率 (N/C性が示されたことで、今後は細胞特異性を高めるための工比 ) によって調製される粒子の粒子径やカプセル化効率な夫、および細胞を活性化するタンパク質などをカプセル化どの物性が変化すると考えられる。そこで複数の N/C 比して、その機能を解析する予定である。

でキトサン粒子を被覆し、そのキャラクタリゼーションを行なった。ヒアルロン酸で被覆した粒子では凝集の度合い（引用文献）が高く正確な測定が出来なかったので、ペクチンでの測定

１）M. Morimoto et al, Trends. Glycosci. Glycotechnol., 14,を行なった。

205-222,（2002）

ペクチン被覆化キトサン粒子のカプセル化効率と粒子径２）T. Sato, T. Ishii, and Y. Okahata, Biomaterials, 22,の測定を行なった。カプセル化効率に関しては全体的に2075-2080（2001）

60 〜 90％の高い値を示していた。粒子径に関しては、N/

３）T. Ishii, Y. Okahata, T. Sato, Biochim. Biophys.

C 比の増加によりミクロンオーダーからナノオーダーへのActa,1514, 51-64（2001）

粒子サイズの減少が観察された。N/C 比が増加するにつ

４）M. Hashimoto, Z. Yang, Y. Koya, Non-viral Gene

れて粒子の凝集が抑制された。次に、ペクチン被覆キトサ

Therapy: Gene Design and Delivery, Springer, 63-74

ン粒子からの GOD の放出挙動における塩濃度の影響につ（2005）

いて検討した。その結果、塩濃度が高くなると GOD の放５）M. Hashimoto, M. Morimoto, H. Saimoto, Y.

出がみられた（図３）。

Shigemasa, T. Sato, Bioconjugate Chemistry, 17, 309-３

316（2006）

結言６）M. Hashimoto, M. Morimoto, H. Saimoto, Y.
Shigemasa, H. Yanagie, M. Eriguchi and T. Sato,

キトサン粒子中にタンパク質 GOD をカプセル化するこ

Biotechnology Letters, 28,815-821（2006）とができた。水溶性のキトサンを用いることで、タンパク

７）M. Hashimoto, Y. Koyama, and T. Sato, Chem Lett.

質の変性のない中性の pH でのカプセル化が可能であった。

37266-267（2008）

しかしながら、タンパク質とキトサンを混合するだけでは、溶液中でタンパク質を保持する事はできなかった。そこで、クエン酸を用いてキトサンをイオン架橋さらには共有結合架橋する事でタンパク質の保持効率を向上することができ20mM MES Buffer（pH6.0, 150mM Nacl）

た。さらに、その表面をアニオン性の多糖で被覆すること20mM MES Buffer（pH6.0, 10mM Nacl）
20mM MES Buffer（pH6.0）100

イオン架橋キトサン粒子

80

Cumulative Release（％）

Cumulative Release（％）

1006040200

共有結合架橋粒子
050

1001502008060402000

Incubation Time（ｍｉｎ）

図２ イオン架橋および共有結合架橋したキトサン粒子からの GOD の放出

246

Incubation Time（h）

図３ ペクチン被覆化キトサン微粒子からの GOD の放出の塩濃度依
存性− 29 −