【研究報告】（自然科学部門）

抗炎症性乳酸菌
YK-23 株菌体
表層タンパク質の抗炎症メカニズム解明に関する研究

金内

宮城大学食産業学部フードビジネス学科緒誠准教授

実験方法

言1.

ヒトの腸内には、数百種類以上、約 100 兆個に及ぶ細AK23 株の培養法
乳酸菌菌が生息し、これらの細菌の中には、炎症を誘発する

AK23 株 は、GYP 培

LPS（lipopolysaccharide）を含むグラム陰性細菌も存在

地（1％ Glucose、1％ Yeats extract、0.5％ Peptone、する。この LPS は、糖鎖部位から成るコア多糖と O-抗1％ Tween80 solution、0.5％ Salt solution; Tween80

原、脂質部位からなるリピド A から構成されており、

solution は 50 mg/mL 水 溶 液、Salt solution は 蒸 留 水1）

1 mL 中 に MgSO4・7H 2O 40 mg、MnSO4・4H 2O 2 mg、LPS の毒素活性の中心はリピド A である （Fig. 1）。
LPS の毒性消去物質として、乳由来のラクトフェリン

FeSO4・7H2O 2 mg、NaCl 2 mg） に て 30℃、24 時 間 培（LF）が知られる2）。LF は哺乳動物の乳に含まれ、牛乳養を行った。

では生乳で 0.1〜0.4 mg/mL 含まれているが、LF は、加熱殺菌により容易に失活する3）。さらに、日本を含むア2.

LPS消去タンパク質（LEP; LPS Elminating Protein）の分画

ジア地域の人々は乳糖不耐症の割合が高いため、乳由来
4）

菌体の分画方法は、口分田6）の方法を一部改変しての食品による大量摂取は困難である 。そこで乳由来に代わる LPS 消去効果物質が求められる。

行った。すなわち、培養後の菌体（0.3 g）は、10 mL の5）

リゾチーム（1 mg/mL）にて、37℃で 16 時間処理した。

これまでKondoら は、炎症物質消去乳酸菌
AK23 株を分離し、細胞壁に消去タンパク質これを遠心分離し、上清を細胞壁画分とした。この画分が局在することを報告した。しかし、AK23 株の LPS 消を凍結乾燥させ、10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）に再去に関するタンパク質の同定には至っていない。

溶解した。この画分を 300 kDa の遠心ろ過ディバイス

そこで、本研究では乳酸菌 AK23 株の LPS 消去タンパ（CD300C34、日本ポール株式会社）にて分画し、通過ク質の分離およびシークエンスを行い、同定を行うこと画分を得た。さらにこの通過画分を 100 kDa の遠心ろ過とした。また、LPS 消去時の LPS 構造中のリピド A 脂ディバイス（CD100C34、日本ポール株式会社）にて分肪酸と糖鎖部位の挙動についても検討した。

画し、LPS 消去タンパク画分を得た。分画方法のフローチャートは Fig. 2 に示した。

Fig. 1

リポ多糖の構造1

金内誠

留水を加え、全量 20 μL とした。各ウェルに 5 μL ずつ注入し、150 V、100 分、500 mA、80 W の条件で泳動を行った。
6.

LEP のホモロジー解析
Blue Native PAGE で 得 ら れ た 217 kDa の バ ン ド は、滅菌メスで切り出し、LC/MS/MS によるプロテオーム解析によってタンパク質同定した。分析は、株式会社日本プロテオミクス社に委託した。また、得られたペプチ
ド 断 片 の ア ミ ノ 酸 配 列 は、BLAST8）を 用 い て ホ モ ロ
ジー解析を行った。
7.

分散剤による LEP の LPS 消去への影響
LPS 消 去 タ ン パ ク 質 溶 液（150 μL） と 50 μL の LPS（O18、1.0 μg/mL） に LPS 分 散 剤（PYROSPERSE、 ロン ザ ジ ャ パ ン 株 式 会 社） を、1/200（v/v％） 添 加 し、15℃、24 時間反応させた。その後、混合液の LPS 量を測定した。対照は、LPS 消去タンパク質および LPS を含Y-23 strains の細胞の分画方法

Fig. 2

まない緩衝液を用いた。

各画分（150 μL）は、エンドトキシン溶液を加え、15℃で反応後、エンドトキシン消去活性を測定した。

8.
3.

LPS 量測定方法

AK23 株による各 O 抗原 LPS の消去
AK23 株 は、1.0（μg/mL） の 大 腸 菌 LPS（O18; LPS

LPS 量の測定は、リムルスカラー KY テストワコー

410、O111; LPS 420、Glycobiotech GmbH 社）、大腸菌（和光純薬工業）を用いた比色法により行った。すなわ

O26（120-05131、和光純薬工業）を含む GYP 培地にてち、LPS を含むサンプルをリムルスカラー試薬とマイク

30℃、24 時間培養した。培養後、1 M 炭酸ナトリウム溶ロプレートリーダーで測定した。

液にて pH 7.0 に調製し、LPS（エンドトキシン）量を測定した。

4.

LEP による LPS 消去活性測定法
9.

得られた LPS 消去タンパク質溶液（150 μL）は、50LPS 分解物の測定

μL の LPS（O18、1.0 μg/mL）へ添加し、15℃、24 時間

LPS から遊離した脂肪酸の測定は、エンドトキシンの反応させた。その後、混合液の LPS 量をリムルスカラー

試験法9）を一部改良して行った。すなわち、LEP によっKY テストワコー（和光純薬工業）にて測定した。LPSて作用させた LPS にクロロホルム–メタノール（2 : 1）

消去活性の 1 U は、1 時間に 1.0（μg/mL）の LPS を 1％2 mL を加え抽出した。得られた脂肪酸は、シリル化剤消去する能力もって示した。

（ビストリメチルシリルアセトアミド；和光純薬工業株式会社）50 μL を加えて 60℃で 20 分間反応させた。また、

5.

Blue-Native PAGE

水層の糖も 60℃で窒素ガスを吹き付け濃縮乾固し、シリ7）

Witting ら の Blue-Native PAGE 法によった。ゲルはル化剤にてシリル化した。脂肪酸と糖の測定は、GCMS-Native PAGE Novex、3–12％ Bis–Tris Protein Gels（ラQP2010（島津製作所）、カラムは、HP-5（Length: 30 m、イフテクノロジー社）を用いた。泳動緩衝液は Native

I.D.: 0.32 mm、Film: 0.25 μL）を使用し、キャリアガス

PAGE Running Buﬀer（20X） お よ び Native PAGEにはヘリウムガスを使用した。分析条件は Table 1 に示

Cathode Buﬀer Additive（20X）（ライフテクノロジーした。

社）を用いた。LEP 分画（10 μL）を 4×Sample Buﬀer（5 μL）、5％ G-250 Sample Buﬀer（1 μL）と混合し、蒸2抗炎症性乳酸菌 Pediococcus pentosaceus YK-23 株菌体表層タンパク質の抗炎症メカニズム解明に関する研究

結果および考察1.

で、LEP の断片のペプチドを解析した結果、56％の相同LPS 消去タンパク質（LEP）の単離性 で、DnaK/DnaJ chaperones の 一 部 の ATP-binding

ま ず、Fig. 3 に 従 い LPS 消 去 能 が 高 いsubunit of Clp protease と一致した。さらに、これらは、AK23 株の細胞を菌体外画分、細胞壁消化画DnaK の一部として HSP70 のシャペロンとして作用する分、細胞質画分、細胞膜画分の 4 つに分画した。細胞画ことが知られ10）、HSP70 は、熱ストレスだけでなく、非ス分の活性および精製工程の活性と収率は Table 2 に示しトレス環境下においても多く存在する11）。また、HSP70た。その結果、細胞質画分と培養上清画分は、LPS 量消は、LPS と特異的に結合する12）。このタンパク質の疎水去活性が見られなかった。一方、細胞壁画分は、LPS 消性残基に、LPS リピド A の疎水領域が結合していること去活性が最も高く、15.6（U/mL）であった。また、細が考えられた。

胞膜画分の LPS 消去活性は 3.0（U/mL）であった。次2.に、この細胞消化画分を、限外ろ過膜によって画分しLPS 消去タンパク質（LEP）の特性た。限外ろ過 300 kDa 未満の画分に強い活性が見られ、この LEP の LPS の O 抗原の違いによる LPS 消去の違12.2（U/mL）、比活性で、1.23（U/mg）まで上昇した。

いを検討するために大腸菌 O18、O26、O111 由来の LPS

さらに、分画分子量 100 kDa で分画の結果、100 kDa 以上の画分に強い活性が見られ、10.8（U/mL）、比活性で、9.87（U/mg）と純度の高い LEP が得られた。この時の収率は、比活性で 19 倍まで上昇することができた。
次に、これらタンパク質を BlueNativePAGE にて確認したところ、200 kDa のタンパク質のバンドと 150 kDaのタンパク質のバンドが検出された（Fig. 4）。これまで
Kondo ら5）は、150 kDa 以下には活性がないことを報告

Fig. 3した。そこで、200 kDa の LEP をアミノ酸シークエンス

AK23 株の細胞分画による LPS 消去活性後に、ホモロジー解析を行った（Table 3）。LC/MS/MS
Table 1
Injection temp
Evaporating temp
Injection mode
Control mode
Total ﬂow
Column ﬂow
Linear velocity
Purge ﬂow
Injection
Oven program【MS】
Ion source tempInterface temp
Measure mode

脂肪酸及び糖類の分析条件
170℃
280℃
Split lessPressure（99.8 kPa）
139.9 mL/min
2.69 mL/min
62.7 cm/s
3.0 mL/min
5 μL
170℃（5 min hold）→2.5℃/min→240℃（5 min hold）
260℃
260℃
SCAN（ / 50〜1000）

Table 2細胞壁消化画分
限外ろ過画分
300 kDa 未満
100 kDa 以上

Fig. 4

LEP（LPS 消去タンパク質）の Blue-Native PAGE

単離工程における LPS 消去タンパク質の収率消去活性（U）

タンパク質量（mg）

容量（mL）

比活性（U/mg）

精製倍率（回収率；％）

15.6

30.3

10.0

0.52

1（100）

12.2
10.8

9.9
1.1

5.0
1.0

1.23
9.87

2.38（39.1）
19.0（6.96）

1.0 μg/mL のエンドトキシンから 1 時間当たり 1％減少させる量を 1 U とした。
3金Table 3

内誠

LES のアミノ酸シークエンス

Accsetion No.; WP̲002833100.1, Honology; 56%

Fig. 5

AK23 株による抗原種のことなる大腸 LPS の消去率

Fig. 6 LPS 分散剤による LPS と LES の結合阻害による LPS消去への影響を用いて、LEP の LPS 消去率を検討し、結果を Fig. 5 に示した。その結果、24 時間中に LEP は、大腸菌 O18 由来 LPS 対して 72.2％の消去活性を示し、また、大腸菌
O26 由来 LPS 対して 69.3％の消去活性を示した。さらに、大腸菌 O111 由来 LPS に対しては、74.7％の LPS 消去能が見られた。このように O 抗原の違いによる消去率の差異は認められなかった。これは、本来毒素中心であるリピド A に作用するためではないかと推察された。
つぎに LPS の作用特性について検討するために、吸着および分解について検討した。LPS 吸着阻害剤による消Fig. 7

大腸菌 O18 由来 LPS からの遊離脂肪酸去への影響は Fig. 6 に示した。分散剤無添加のものの相対活性を 100％として示した。その結果、分散剤を添加脂肪酸と糖の遊離について検討した。結果は Fig. 7 に示し た 試 料 溶 液 の LPS 消 去 率 は 88％ と 無 添 加 と 比 べ 約した。LEP を作用させたところ、LPS からは、ヒドロキ10％低い傾向が見られた。本 LEP は、結合阻害剤では、シミリスチン酸は 89.6％、パルミチン酸は 19.5％、ステLPS 消去能は低下せず、分解などにより消去活性するとアリン酸は 69.3％と構成脂肪酸、特に構成脂肪酸率の高考えられた。

いミリスチン酸が遊離していた。

LPS は O 抗原とコア多糖からなる糖鎖部位と、リピドLPS に塩酸を加え、酸分解させた結果、グルコース、A から構成されている。そこで LEP による LPS からのガラクトース、ラムノース、リボース、グルコサミンが4抗炎症性乳酸菌 Pediococcus pentosaceus YK-23 株菌体表層タンパク質の抗炎症メカニズム解明に関する研究検出された（データ未提示）。これは Boman とMonner13）

吸着だけによる毒素消去でないことが示唆された。

や Morrison と Leive14）とは、構成する糖の種類が異なっ

4.

LPS の構成主成分であるミリスチン酸やグルコースた。次に LEP に LPS を作用させた結果、グルコースがを分解・遊離することで、その活性が阻害された可91％遊離した（データ未提示）。一方、グルコサミンや能性が考察された。LEP は、LPS リピド A 構成脂ペントースのリボースの遊離は確認できなかった。この肪酸やグルカン鎖を分解し、LPS 消去作用することように LEP は、グルカン鎖の加水分解活性を持ち、LPSが示唆された。

を 不 活 性 化 す るこ と が 考 え ら れ た。 一 般 に、 これら
謝LEP としての HSP は、ATP hydrolase に属する酵素で

辞15）ある 。また、一般に大腸菌型 LPS のリピド A は、糖鎖本研究を遂行にあたり、貴重な研究助成を賜りました

骨格にリン酸が結合し、さらに、ヒドロキシミリスチン

公益財団法人三島海雲記念財団に深く感謝いたします。

酸は、LPS 中で、アミド結合およびエステル結合した構造を有する16）。また、井口ら17）は、LPS の毒素活性には文

リピド A に結合するアミド・エステル両結合脂肪酸の

1） C. Galanos C., et al.:
, 148, 1–5, 1985.
2） B. J. Appelmelk, et al.:
, 62, 2628–2632,1994.
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5） A. Kondo, et al.:
, 81, 1457–1465, 2016.
6） 口分田晃：岡山医学会雑誌，96, 757–765, 1984.
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, 1, 418–428, 2006.
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Local Alignment Search Tool（http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast.cgi）.
9） 河西信彦：エンドトキシンの試験法（日本細菌学会教育委員会編），pp. 88–87, 菜根出版，1990.
10） M. P. Mayer ほか：蛋白質核酸酵素，47, 1189–1195, 2002.
11） 呂井利奈：歯基礎誌，40, 528–541, 1998.
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17） 井口毅裕ほか：日本細菌学雑誌，44, 805–812, 1989.

存在が不可欠であることを報告している。
よって、これらの分解によって活性が低下したと考えられた。今後は、本酵素のアミドやエステル、さらにリン酸への結合への分解活性についてさらに詳細に検討する予定である。
要
1.

約
AK23 株の LPS 消去物質は細胞壁成分から限外ろ過膜を用い、LPS 消去タンパク質（LEP; LPS Eliminating Protein）を分離した。

2.

LEP は、217 kDa の タ ン パ ク 質 で、DnaK/DnaJ
chaperones の 一 部 の ATP-binding subunit of Clpprotease と一致した。さらに、これは LPS 吸着性のある HSP（Heat Shock Protein）の一部でもあった。

3.

LEP は、大腸菌 O18、および O26、O111 由来の LPSに対しても高い消去能が見られた。また、LEP は、

5献