免疫不全マウス再構成皮膚における培養毛乳頭細胞による毛包形成誘導と関連因子の検討
聖マリアンナ医科大学

窪田泰夫

Living human skin equivalents, in which human keratinocytes are cultured on collagen matrix containing humandermal fibroblasts, have been successfully transplanted and maintained for a long time on deep connective tissue ofimmunodeficient mice. Here, we cultured human dermal papilla cells in the type I collagen gels and overlayed byprimary culture of human epidermal cells concomitant with a few melanocytes as a composite graft.
We exaimined effects of human dermal papilla cells derived from human hair follicle on the induction of hair follicle
after xenotransplantation of the composite grafts into immunodeficient mice. At three weeks after transplantation,
the epidermal cells generated human epidermis-like tissue. Histological examinations revealed that no epidermal
elongation or newly formed follicular-like structure were observed. Interestingly, a significant number of DOPA
positive melanocytes, which were initially concomitant in a primary epidermal cell culture, was found not onlyin the epidermal basal layer but also in the entire mid-dermis, while the transplantation of a composite grafts inimmunodeficient mice by using human fibroblasts instead of dermal papilla cells showed the presence of a small
number of melanocytes in the basal layer only.
These results indicates that human dermal papilla cells fascillitate the maintenance or migration of the melanocytes
in the xenotransplantation of composite grafts, a living human skin equivalents.
The present system by using the xenotransplantation of composite grafts in imunodeficient mice also seems to be
the good models for studying the cell-cell ( epithelial-mesenchymal) interaction.

今回われわれはヒト皮膚の in vivo 実験系とし

１ 緒 言て利用できる免疫不全マウスを用いた再構成皮膚免疫不全マウスに培養細胞を移植して作製するの線維芽細胞に代って培養ヒト毛乳頭細胞を用いヒト皮膚再構成システムは表皮細胞と真皮線維芽て同様の再構成皮膚を作製して毛包形成の誘導を細胞との相互作用の検討に有用である。さらに表検討した。また表皮細胞と線維芽細胞による再構

皮細胞と線維芽細胞以外にもさまざまな細胞種を成皮膚の中に直接的に毛乳頭組織を注入して、三組み合わせて移植することで任意の細胞の in vivo者の共存のもとでの毛包形成の誘導についても検に近い状況下での機能や各種細胞間の相互作用を討した。

解析することが可能な実験系と考えられている。

２ 実 験（材料と方法）

毛乳頭細胞は毛母の構成細胞の一つで毛幹形成の上で重要な役割を果たしていることが指摘され

２. １ SCID マウスの改良と供給

１）ている 。近年、細胞培養技術の進歩や細胞成長

本 研 究 で 使 用 し た SCID マ ウ ス の 多 く は因子の発見により毛乳頭細胞はヒト毛包からもBALB/cA を遺伝的背景にもつ系統である。この単離可能となり、長期の純培養も行なわれていBALB/cA− SCID マウスは高い繁殖性を有し、ビ２）る 。

ニールアイソレーターを用いて生産と供給を行な
The effects of human dermal papilla cellson the induction of hair follicle after
xenotransplantation of the composite
graft into immunodeficient mice.
Yasuo Kubota
St. Marianna University, School ofMedicine.Department of Dermatology

った。また定期的に微生物的汚染事故の発生を検討した。
２. ２ 細胞培養− 79 −a）ヒト表皮細胞
皮膚科手術材料よりフリーハンドルデルマトー

ムにて皮膚を薄く採取し、トリプシンないしデイスパーゼ処理により分散させた表皮細胞を低カルシウム無血清培地（KGM;Clonetic 社、カルシウム濃度 0.15 ｍＭ）にて培養を行なった。
b）ヒト線維芽細胞
皮膚科手術材料より得られた健常皮膚を型の如
く explant culture を行ない、皮膚切片から遊走する紡錘状細胞を 10％ FCS 添加 EagleMEM 培地（MEM;IBL, 免疫生物研究所）にて継代して使用した。
c）ヒト血管内皮細胞
臍帯静脈から 0.1％コラゲナーゼによる酵素潅
流法により単離した。培養液はＭ -199 培地に 20％ FCS、血管内皮増殖因子、ヘパリンを添加し、ファイブロネクチンをコートした培養皿で培養を行なった。形態学的にいわゆる敷石状を呈し、免疫染色により第８因子関連抗原陽性を確認した。
図１ ヒト毛包の構造（HE 染色）d）ヒト毛包毛乳頭細胞
毛根の下方は膨大し、毛球を形成し、その中にコーテイングした 35mm 培養皿に数個移して組は毛乳頭をいれている（図１）。この毛乳頭の毛器織培養した。基本培養液としては 20％ FCS 添加

官における生物学的意義は少なくない。すなわちの Medium199 を使用した。通常、48 時間程度の毛乳頭は毛包の発育や増殖を誘導し、毛組織の形あいだに単離した毛乳頭から辺縁に向かって紡錘成や維持において重要な役割が指摘されており，状の毛乳頭細胞が増殖、伸展していく所見が観察

男性ホルモン作用にも深い関係があることが判明された（図２）。培養液は三日に一度新しいものに３）している 。この毛乳頭を構成するヒト毛乳頭細替えた。この際に培養皿に付着の完全でない毛乳胞は未分化の間葉系細胞で互いに密着して塊状を頭を誤って除去しないようにする。数日後毛乳頭なして存在する。

細胞が confluent な状態になると型のごとく 0.25４）

ヒト毛包毛乳頭の単離と培養は Messenger ら％トリプシン− EDTA 溶液にて継代培養し、通常の方法に準じて行なった。まず正常人被髪頭部皮７〜８継代の培養が可能となっている。培養が７膚より毛包を採取し、実体顕微鏡下に 23G の注〜８代を越えると毛乳頭細胞の形態は大型化し、射針を用いて採取した毛包をその周囲を被う結合細胞は２極の紡錘状から多極化を呈してきた。毛組織性被膜から切開、反転し、毛乳頭を露出させ、乳頭細胞の生存期間はやや短く、線維芽細胞の継その基部から切断して毛乳頭を単離した。この過代培養可能数の１／２〜１／３程度に短い。

程で毛乳頭に決して暴力的に物理的刺激を加えてなお上述のいずれのヒト細胞も 0.25％トリプシ破損せしめないことが重要である。単離した毛乳ン− EDTA 溶液により継代した。なおヒト表皮細頭は予め１mg/mL のヒトファイブロネクチンで胞は初代培養を用い、その他の細胞種では３〜７− 80 −

免疫不全マウス再構成皮膚における培養毛乳頭細胞による毛包形成誘導と関連因子の検討継代を実験に供与した。

graft のコラーゲンゲル中に注入した。その後に
BALB/cA− nu, SCID マウスの皮下に移植して、３２. ３ Composite graft 法によるヒト再構成皮膚の作製週間ののち再構成皮膚の形成を観察して組織学的観察を行なった。

６培養線維芽細胞１×10 個を I 型コラーゲン液（新田ゼラチン社）の中に懸濁させて 12 皿培養シ

２. ６ 組織学的検討

ャーレでゲル化させる。続いてそのコラーゲンゲコラーゲンゲルの移植３週間後の開窓時に移植ルの上に別途培養調整しておいたヒト表皮細胞片の状態を確認して、肉眼的ならびに組織学的所６（初代）１×10 個を重層させ Composite graft を見を検討した。組織学的検討のために通常のホル作製した。数日後ゲルは収縮して培養皿辺縁からマリン固定・HE 染色のほか、フォンタナ・マッ剥がれてくるので、BALB/cA− nu, SCID マウスの皮下に移植し、生体接着剤を用いてマウス皮膚により保護した。３週間後にマウス皮膚を除去して開窓し、再構成皮膚の状態を観察した（図３）。
２. ４ ヒト血管内皮細胞およびヒト毛乳頭細胞を用いた SCID マウスでのヒト再構成皮膚の作製
血管内皮細胞および毛乳頭細胞をそれぞれ線維芽細胞の図２ 培養ヒト毛乳頭細胞（ 相差像）代りにコラーゲンゲル中に懸濁させ、同様にその上に表皮細胞を重層して Composite
graft を作製し、BALB/cA−
nu, SCID マウスの皮下に移植した。
２. ５ SCID マウスでのヒト再構成皮膚へのヒト毛乳頭組織の注入実験
線維芽細胞と表皮細胞による Composite graft を作製したのち、実体顕微鏡下にヒト毛包から単離した毛乳頭組織を直接的に Composite

図３ 線維芽細胞により作製した composite graft の nu/SCID マウスへの移植後に形成された再構成皮膚。マウス背部皮膚の開窓時の所見。

− 81 −

ソン染色および凍結切片標本を作製して DOPASCID マウスに改良を加えて nu 遺伝子を導入して反応を行なった。

BALB/cA− nu, SCID マウスを育成した。このマウスにはこれらの欠点はみられずレシピエント動２. ７ 単離ヒト毛包の凍結保存と男性ステロイ物として高い評価が得られるものと考えられた。

ドの作用

しかしながらこの BALB/cA− nu、SCID マウス

これまではヒト毛包の移植は頭皮皮膚の入手時は生産効率が他種と比較してやや低く、生産規模に限られてしまう欠点があったので、その実用拡大の点で若干の問題を残している。

性を高めるため単離したヒト毛包を凍結保存して BALB/cA− nu, SCID マウスの皮下に移植した。

３. ２ SCID マウスでのヒト再構成皮膚の作製

すなはち，同一ドナーから採取した単離毛包を線維芽細胞と表皮細胞からなる Composite graft

そのまま直ちに SCID マウスに移植する群と凍結は移植後３週目に開窓した時点では、組織上、数保存してから移植する群の２群に分けた。凍結保層の表皮細胞の層とコラーゲンゲル中に紡錘状の存方法は単離した毛包を DMSO 添加細胞凍結用線維芽細胞が散在する真皮が形成されており、い保護培地（cell stock media, 免疫生物研究所）に浸わゆるヒト皮膚の構造を呈していた。また使用し漬して凍結用チューブにいれてドライアイスにてた表皮細胞は初代培養であるため混入したメラノ凍結させて、液体窒素中に１週間以上おいて移植サイトが表皮基底層に分布しており、肉眼的にも実験を行なった。実験に際しては移植の直前に 37再構成された皮膚面にはわずかに黒褐色色素沈着℃の温湯にて急速に融解し麻酔下の BALB/cA −の所見が確認された。

nu, SCID マウスの背部皮膚に移植した。生体用接着剤および皮膚被覆剤にて固定保護して、経時的３. ３ ヒト血管内皮細胞およびヒト毛乳頭細胞に毛幹の伸長を観察した。そして、毛包採取後直を用いた SCID マウスでのヒト再構成皮膚の作ちに移植する群と凍結保存してから移植する群と製の間で毛包生着率を比較した。

血管内皮細胞を用いた移植片は移植後３週目にこの系によりヒト毛包を生体環境下に長期間維は開窓時に皮膚様の構造が形成されていなかっ持可能となるためヒトでは行ないにくかった実験

た。すなはち少量の細胞残骸物とコラーゲン基質に利用できると考えられた。例えばヒトへの男性のみがマウス皮下に残存しているにすぎなかっステロイドの投与は危険性があり容易ではない。

た。これは血管内皮細胞はコラーゲンゲル中におそこでこの移植毛包において男性ステロイドの作いて拘縮せず、ゲル組織を十分に支持することが用を検討した。すなはち毛包が生着して毛幹の伸できなかったものと思われた（data not shown）。

長が確認された例に関してエナント酸テストステ

一方、毛乳頭細胞により作製した Compositeロン（Enarmon depot）５mg を週一回皮下注射に

graft のマウス移植片では、開窓時に肉眼的にはて投与した。対照としては胡麻油を投与し、経時線維芽細胞による場合とほぼ同様の再構成皮膚の的に移植毛包の変化を観察した。

形成が確認された。しかし組織学的には毛乳頭細胞を使用した場合と線維芽細胞の場合ではメラノ

３ 結 果サイトの分布やメラニン顆粒の沈着の点で大きな

３. １ SCID マウスの改良差異が認められた。すなはちフォンタナ・マッソ

BALB/cA− SCID マウスは加齢に伴い、Leakyン染色や DOPA 反応を施行したところ、コラー現象が出現することと、胸腺腫が発生するこ

ゲン中に線維芽細胞を混じた場合ではメラニン顆とが欠点とされていた。しかしわれわれはこの粒や DOPA 陽性メラノサイトは表皮細胞層の最− 82 −

免疫不全マウス再構成皮膚における培養毛乳頭細胞による毛包形成誘導と関連因子の検討

下端のみに少数存在するのに対して、毛乳頭細胞著明に認められた（図４a、b、c、d）。

による再構成皮膚では表皮層のみならず真皮（コ３. ４ SCID マウスでのヒト再構成皮膚へのヒト毛乳頭組織の注入実験

ラーゲン層）へもメラニン顆粒やメラノサイトがacbd

図４ F= 線維芽細胞により作製した再構成皮膚組織 .D= 毛乳頭細胞により作製した再構成皮膚組織 . a；HE染色 ( 弱拡、×10）、b；HE 染色（強拡、×50）、c；フォンタナ・マッソン染色、d；DOPA 反応。毛乳頭細胞による再構成皮膚では真皮層にもメラノサイトやメラニン顆粒を多数認めた。また表皮層肥厚の程度も両者の間に差が見られた。

− 83 −

実体顕微鏡下にヒト毛包から単離した毛乳頭組織を直接的に線維芽細胞と表皮細胞を用いて作製

表１：ヒト単離毛包の nu/SCID マウスへの移植における凍結保存の影響。

ヒト単離毛包の移植成績した Composite graft のコラーゲンゲル中に注入実験
番号♯1
♯2
♯3
♯4♯5計		した。開窓後に組織学的に検討した結果、コラーゲンゲルの中に毛乳頭組織は残存していたが、その被覆表皮や周辺の線維芽細胞にはとくに変化を認めることはなかった（data not shown）。
３. ５ 単離ヒト毛包の凍結保存法の確立と男性ステロイドの移植凍結ヒト毛包への影響

凍 結正着本数／移植本数
0 ／ 203／611 ／ 1910 ／ 24
1 ／ 2325 ／ 92
（27.2％）

未 凍 結正着本数／移植本数
4 ／ 13
1／63 ／ 133 ／ 135 ／ 1316 ／ 58
（27.6％）

５例の健常頭皮から得られた毛包についてそも認められた点は毛包採取部位の差（頭頂部、側の BALB/cA-nu, SCID マウス皮膚への生着率は頭部）あるいは検体間の差を反映している可能性

凍結保存の有無によりなんらの影響も受けなかっもある。

た（表１）。さらにその生着した毛包の組織学的変４ 考 察

化も未凍結のものと比較して差異はなかった（図５）。このことは毛包のマウスへの移植実験が頭ある特定の異常を有する実験動物の作製はこれ部皮膚入手時にのみ制限されることがなく実用性までの研究材料や方法ではアプローチが困難であの向上が図られた。

った諸問題の解明に重要な糸口を与えてくれるこ

毛包が生着して毛幹の伸長が確認された例に関とがある。近年、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠如したしてエナント酸テストステロン（Enarmon depot）

SCID マウスを用いて正常のヒト皮膚由来細胞の５mg を週に一回の割合で合計６回投与した。対増殖や分化過程の解析が進んできている５、６、７）。

照群と比較して投与群５本の内２本において毛幹in vitro で培養された各種のヒト皮膚由来の細が脱落して移植した毛包にも退行変性を生じた胞を動物に移植することにより in vivo で増殖分（data not shown）。変化の認められなかった毛包化させることができれば、個々のヒト皮膚由来の細胞レベルでの研究が in vivoに一層近い状態で行なうことができる。SCID マウスへの培養細胞移植によるヒト皮膚再構成システムは各種の細胞の in vivo での働きを解析するのに有用な手段と考えられ、皮膚の悪性腫瘍や感染症などのヒト疾患の病態解明、あるいは上皮系と間葉系との相互作用の解明など多くの研究分野に利用できるものと考えられる。

図５ 凍結単離毛包の組織像。移植 3 カ月目（HE 染色）。未凍結毛包のそれとほぼ同様であった。

− 84 −

残念ながら、当初に目指していたヒト再構成皮膚内免疫不全マウス再構成皮膚における培養毛乳頭細胞による毛包形成誘導と関連因子の検討での培養毛乳頭細胞による毛包形成の誘導は成功

謝 辞

し得なかった。今後、このヒト皮膚再構成システ

本研究を行なうにあたりご援助をいただいた財

ムに毛乳頭細胞のほかに毛母の上皮細胞（外毛根団法人コスメトロジー研究振興財団に深謝いたし鞘細胞）の混合培養を行なったり、線維芽細胞増ます。

殖因子（FGF）や肝細胞増殖因子（HGF）などのなお、本研究の一部は平成 9 年 10 月松本市で毛髪成長に働くと考えられている各種成長因子の開催された日本皮膚科学会東部支部総会学術大添加などを試みる予定である。しかし毛乳頭細胞会、ワークショップにおいて発表した。

による再構成皮膚では表皮基底層ならびに真皮にまで及ぶメラノサイトの浸潤が認められた。生体

引用文献においては毛乳頭細胞はメラノサイトの豊富な毛

１）Jahoda CAB, Reynolds AJ: Dermal-epidermal

母の基部に存在している。前述の所見は毛母におinteractions-Follicle-derived cell populations in

ける両細胞の相互作用、とりわけ毛母における毛the study of hair-growth mechanisms. J Invest

乳頭細胞の毛母上皮内のメラノサイトの遊走や生Dermatol, 101:33S-38S,1993.

存、維持に対する重要な関与を示唆する興味深い

２）久志本常人、窪田泰夫、河陽子、ほか３名：ものと考えられた。さらにこの毛乳頭細胞からの酵素処理、細胞外マトリックスおよび細胞成長メラノサイトに対する因子（サイトカイン？、細因子が培養毛乳頭細胞に与える影響、日皮会誌、胞成長因子？）の同定を進める必要がある。最106 : 249-259、1996.

８）

近、Randall ら のグループは培養毛乳頭細胞か

３）板見 智：ヒト毛乳頭細胞と外毛根鞘細胞のら SCF（stem cell factor、幹細胞増殖因子）の産生・相互作用。組織培養工学、23：52-56、1997.

分泌を報告している。今回の実験においても毛乳４）Messenger AG. The culture of dermal papilla

頭細胞を用いた再構成皮膚に認められたメラノサ

cells from human hair follicles. Br J Dermatol,

イトの動態に関与する因子の一つとしてこの SCF

114:425-430,1986.

が考えられる。

５）McCune JM, Namikawa R, Kaneshima

BALB/cA− nu, SCID マウス皮膚への凍結ヒト

H., et al. The SCID-hu mouse; murine

毛包の移植生着は凍結保存によりなんらの影響もmodel for the analysis of human

受けなかった。さらに生着した毛包の組織学的変

hematolymphoid differentiation and function.

化も未凍結のものと比較して差異はなかった。こScience241:1632-1639,1988.のことは毛包のマウスへの移植実験が頭部皮膚入

６）野村大成：がん研究における SCID マウスの手時にのみ制限されることがなく遠隔地への輸重要性。Oncologia,26:321-328,1993.

送も確実に行なえるなど、実験システムとして

７）Christofidou-Solomidou M, Longley BJ,の実用性を高めたものと思われる。さらに今回、Whitaker-Menezes D, et al.Human skin/SCID

SCID マウスに移植された毛包が生着して毛幹のmouse chimeras as an in vivo model for human

伸長が確認されたヒト凍結毛包に対して男性ホルcutaneous mast cell hyperplasia. J Investモンの投与実験を行なったが，本実験系はヒトへ

Dermatol, 109:102-107,1997.の実験的投与が必ずしも容易ではないその他の薬

８）Hibberts NA, Messenger AG, Randall VA., Dermal剤のヒト毛包に対する直接的な効果をみることがpapilla cells derived from beard hair follicles secrete

可能なシステムでありその有用性が期待される。

more stem cell factor (SCF) in culture than scalp cells
or dermal fibroblasts. Biochem. Biophysis. Res.
Commun. 212:988-994, 1995.

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