糖脂質による増殖シグナル向上のメカニズムの解明

独立行政法人産業技術総合研究所

川 島

生物プロセス研究部門

永 子Sandhoff Disease is a progressive neurodegenerative disorder caused by mutations in the HEXB gene which encodes
the b-subunit of N-acetyl-b-hexosaminidase A and B, resulting in the accumulation of the ganglioside GM2. Previously,
we reported that astrocytes from Sandhoff Disease model mice (ASD) grew markedly more rapidly than those from wildtype mice (AWT). This was caused by c-Src and ERK activation due to accumulated GM2 in the lysosomes. These results
suggested that c-Src might be directly activated by accumulated GM2. To investigate this issue, here we analyzed i) interactions
between GM2 and intracellular c-Src by Western blotting of immunoprecipitation with anti-GM2 antibody; ii) localizationof accumulated GM2 and c-Src, by immunofluorescence; iii) length of the fatty acids of GM2 accumulated in lysosomes, by
MALDI-TOF MS. We observed that the accumulated GM2 interacted directly with c-Src and co-localized in the lysosome
membrane. Analysis of the GM2 ceramide moiety revealed no difference in the fatty acid lengths in AWT and ASD, indicatingthat densely-packed GM2 interactions with the cytosolic kinase c-Src, and glycosphingolipid (GSL) aggregation was sufficient
to result in transmission of signals for proliferation. These results indicate that excessive accumulated GSLs have direct signaltransduction activity, not only at the cell surface but also at the membrane of intracellular organelles such as lysosomes.

１．緒

ガングリオシドは c-Src を活性化する事も考えられる。我々言はこれまでに、ガングリオシドの細胞増殖調節に対する関酸性糖脂質であるガングリオシドは神経系に豊富に含ま連性、すなわち蓄積ガングリオシドによって増殖シグナルれており、シナプス形成や神経突起伸張に重要な役割を果が亢進する事、特にリソソームに過剰蓄積した GM2 が細1− 4）、細胞表層におけるコレステロールや胞内シグナルタンパク質である c-Src や ERK の活性化を引

GPI アンカータンパク質などと同様に、受容体などの糖タき起こす事を示してきた。しかし、GM2 による細胞内、ンパク質と共に細胞内外のシグナル伝達、接着、増殖、分しかもリソソームのルーメン側に位置する c-Src の活性化たしているが化などを調節しているマイクロドメイン

3, 5）を形成している。

機構の詳細は、未だ明らかではない。そこで今回は、GM2スフィンゴ糖脂質に関わる研究は、糖鎖の多様性と機能性と c-Src の 相 互 作 用 を 検 討 し た 結 果、 蓄 積 GM2 に よ るの解明に注力されてきたが、特に、シグナル伝達は糖脂質

c-Src の活性化機構が明らかとなった事から、以下に報告により調節されている事が明らかとされている。また、スする。

フィンゴ糖脂質の脂質分子、特に脂肪酸の生体膜における２．実マイクロドメインの構成、および機能の重要性も明らかに２．
１されてきた。

験細胞および培養

Src ファミリーキナーゼ（SFK）は、中枢神経系やヒトザンドホッフ病モデルマウスおよび野生型（C57BL/6）

癌細胞で活性が高く、悪性化・浸潤、また細胞接着・代謝・マウスより樹立したアストロサイト（ASD および AWT）血管新生の破壊などに関係している。特に c-Src を介したは、10 % 血清、100 mg/mL ペニシリン、50mg/mL ストレプ

ガングリオシドのシグナル伝達に関しては、GM3 や GM1

トマイシン、110 mg/mL ピルビン酸ナトリウムを含む DMEMにより Neuro2a の神経突起伸張が誘導される事などがすを用い、５% CO2 濃度で 37℃で培養した。

でに報告されているが、この現象は、細胞外ガングリオシドがシグナルドメインへ導入され、c-Src がリン酸化され２．２

細胞抽出液の調整る事で引き起こされるとされている。また、c-Src は抗リン酸化タンパク質を解析するために、培養した細胞はGM3 モノクローナル抗体によって共役沈降する事から、100 mM pervanadate 処理した後、１% Triton X-100 を含む 細 胞 溶 解 液 を 用 い て 細 胞 を 溶 解 さ せ た 後、4 ℃ で13,000 rpm で５分間遠心し、上清を細胞抽出液とした。

Enhanced Aggregation of Ganglioside
GM2 Transmit Proliferation Signals
Nagako Kawashima
National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology Bioproduction
Research Institute

２．３

免疫沈降
6≈ 10 個の細胞を、１% Triton X-100 を含む細胞溶解液で懸濁した後、可溶化させた。15,000 rpm で 5 分間遠心して、核を除去した上清を集めた。相当量のタンパク質上清を抗− 122 −糖脂質による増殖シグナル向上のメカニズムの解明GM2 抗 体 と 共 に イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後、ImmobilizedProtein L を加え、４℃で一晩インキュベートした。

２．７

糖脂質の分解、精製・メチル化

糖脂質の Folch 画分に、0.1N NaOH/ メタノールを加え40℃で 2 時間反応させた後、1N の酢酸で中和した。遊離２．
４ SDS-PAGE およびウエスタンブロット解析

脂肪酸は n- ヘキサンで除去した後に、残った画分は乾固細胞抽出液に SDS サンプルバッファーを加え、98℃でさせた。アルカリ分解した糖脂質は、0.1M KCl で再溶解

５ 分 イ ン キ ュ ベ ー ト し た。SDS-PAGE で 分 離 し た 後、した後、逆相カラム（C18 Sep-Pak）に供した。サンプルはPVDF 膜に転写し、３% BSA でブロッキングを行った。

メタノールおよびクロロホルム/メタノール（2 : 1）で溶出させ、その後、特異 1 次抗体および HRP 標識の抗 IgG 抗体を用い減圧乾燥させた後、NaOH/DMSO 懸濁液およびヨードメて検出を行った。バンドは、化学発光で検出した。

タンで再溶解させた。反応は冷 50% 氷酢酸および冷蒸留水を加えて反応を停止させた後、クロロホルムで抽出した

２．
５

免疫蛍光染色画分をメチル化糖脂質とし、MALDI-TOF MS で解析した。

GM2 と c-Src がリソソーム膜近傍に共局在しているかどうかを検討するために、抗 GM2 抗体、抗 c-Src 抗体、抗リ２．８

MALDI-TOF MS 解析

ン酸化 c-Src 抗体、抗 CD107a（Lamp-1）抗体を用いた蛍メチル化糖脂質は、Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer

光抗体染色を行った。アストロサイトにおける糖脂質と糖（Bruker Daltonics）を用いて、MALDI-TOF MSで解析した。

タンパク質を解析するために、細胞は４% パラホルムアルマトリックスは2,5-dihydroxybenzonic酸を含む溶液を用い、デヒドで固定した後、0.1 % Triton X-100 もしくは 90% メ質量を決定した。

タノールで膜透過処理した。10% normal ヤギ血清でブロ３．結ッキングした後、一次抗体を添加した。Alexa488/Alexa555が標識された二次抗体を反応させた後に共焦点レーザー顕微鏡を用いて検出した。

３．
１

果

GM2 との共沈物における c-Src の検出

c-Src/GM2 の相互作用を調べるために、野生型マウス由来のアストロサイト（AWT）およびザンドホッフ病モデ２．６ 糖脂質の抽出、分離および免疫薄層クロマトグ
ラフィー

ルマウス由来のアストロサイト（ASD）について免疫沈降

糖脂質は、イソプロピルアルコール / ヘキサン / 水を添いて免疫沈降を行った後、抗 c-Src 抗体を用いたウエスタ加して抽出した。超音波処理後、3,500 rpm で５分間遠心し、ンブロット法により沈降物を解析した。AWT および ASD得られた上層をガングリオシドを含む総脂質画分とした。の両者で c-Src と一致する約 60 kDa のタンパク質を検出しこの画分を乾固し、メタノール / クロロホルム / 水（4 : 2 : 1）

たが、AWT の細胞抽出液では、60 kDa 種は比較的少なく、を加えて 3,000 rpm で 5 分間遠心する事で Folch 画分を得た。

非特異性のマウス IgM の存在下ではシグナルは検出されこの Folch 画分を HPTLC プレートにスポットした後、クなかった（Fig. 1）。この結果から、ASD では GM2 が c-Src

ロロホルム / メタノール /0.2% CaCl2 溶媒（55:45 : 10）で展と強く結合している事が予想された。さらに抗 GM2 抗体開し、オルシノールで染色した。また免疫 TLC 解析には、の特異性を確認するために、免疫 TLC と抑制実験を行っ

TLC アルミシートや Silica gel 60 F254 を用い、TLC 解析とた。その結果、AWT および ASD の Folch 画分について、同条件でスポット・展開した後、抗 GM2 抗体（GMB28）抗 GM2 抗体を用いて検出したところ、GM2 のみ検出されおよび抗 GM3 抗体（GMR6）を用いて検出した。

た（Fig. 2）。さらに、抗 GM2 抗体で沈殿させた免疫沈降

Fig. 1 抗ガングリオシド抗体を用いた免疫沈降
左側：抗 GM2 抗体を用いた免疫沈降、中央：抗 GM3 抗体を用いた免疫沈降、右側：mu-IgM を用いた免疫沈降。
AWT：AWT 由来の細胞抽出液、ASD：ASD 由来の細胞抽出液、
mu-IgM：非特異的マウス IgM 抗体（ネガティブコントロール）。

Fig. 2 抗ガングリオシド抗体の特異性の検討
左 側：TLC の オ ル シ ノ ー ル 染 色、 中 央 お よ び 右 側： 免 疫
TLC,M：GM3、GM2 および GM1 の標準ガングリオシドを含有するマーカー実験を行った。実験は、抗 GM2 モノクローナル抗体を用− 123 −コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

物中にミセル化 GM2 添加すると、c-Src のバンドは、消失の量が含まれている事が分かった（Fig. 4B）。この結果よするという事が分かった（Fig. 3）。これらの結果は、使用り、ASD における c-Src は主に GM2 と相互作用している

した抗 GM2 抗体が免疫沈降物における GM2 を特異的に認事が示唆された。

識しているという事を示している。ASD の細胞表層において多く発現している GM3 についても抗 GM3 抗体を用い３．３

GM2 と c-Src の局在検討て、GM2 と同様の免疫沈降実験を行ったが、c-Src は GM2

免疫蛍光抗体染色によって、c-Src と GM2 の共局在を観に比べると非常に少ない量しか検出されなかった（Fig. 1）。

察した。細胞は８ウェルマイクロスライドに播種し、固定また、使用した抗 GM3 抗体に関しても GM3 のみを認識しした後に界面活性剤で膜透過処理を行った。各々の細胞は、ている事も確認できた（Fig. 2）。これらの結果は、GM2 に特異一次抗体、および FITC/Rhodamine 修飾 2 次抗体で染比べ GM3 は殆ど c-Src と相互作用していない事を意味する色した。ASD においては GM2 と c-Src の染色像を重ね合ものである。

わせた像はかなりオーバーラップしている事が示された事から（Fig. 5A）、GM2 は殆どが c-Src と共局在している事

３．
２

GM2 との共沈物における SFK の検出が示唆された。これまでに我々は、ASD においては GM2SFK（Fyn、Lyn、Yes）と GM2 の結合性を調べるために、は Lamp-1（CD107a/Lysosome marker）と共局在していTriton X-100 を含む緩衝液で溶解した各々の細胞抽出液をる事を示してきたが６）、今回は ASD における c-Src もまた用いて、抗 GM2 および抗 GM3 モノクローナル抗体を用いLamp-1 と共局在している事を確認した（Fig. 5B）。これらて免疫沈降を行った。免疫沈降とウエスタンブロッティンの結果は、ASD においては GM2 と同様に c-Src もまたリ

グはこれまで記載した様に行い、抗 Lyn、抗 Yes、抗 Fyn

ソソーム膜近傍に位置する事を示すものである。一方、抗体で検出を行った（Fig. 4A）。AWT および ASD におい

AWT でも c-Src シグナルが検出されるものの、染色シグて Fyn と Yes に相当するバンドは検出されたものの、バンナルの分布は ASD におけるそれとは全く異なる（Fig. 5B）。

ドの濃さは c-Src と比較すると非常に低かった。Lyn は検よって、通常状態では、c-Src はリソソームに局在するも出されなかった。細胞内の c-Src、Fyn、Lyn、Yes の量をのではない事を示している。

ウエスタンブロット法で解析したところ、これらは同程度

３．４

GM2 とリン酸化 c-Src の局在検討

c-Src およびリン酸化 c-Src の GM2 との共局在性を調べるために、ASD と AWT の免疫蛍光抗体染色を行ったが、タンパク質の脱リン酸化を防ぐために、過バナジウム処理を行った。さらに固定化と膜透過処理を行った後、細胞は、c-Src、リン酸化 c-Src および GM2 に対する一次抗体、続Fig. 3 抗ガングリオシド抗体の阻害実験
ミセル化 GM2 または GM3 を抗 GM2 抗体または抗 GM3 抗体を用いて沈澱させた免疫沈降物中に添加した。

いて FITC/Rhodamine 結合 2 次抗体で染色した。リン酸化c-Src のシグナルは AWT では微弱であり（Fig. 5 の c-Srcを比較）、全 c-Src のタンパク質量に対するリン酸化 c-Src

Fig. 4 SFK に関する検討
A : GM2 共役沈殿物における SFK の検討
B : AWT と ASD における SFK 発現タンパク質の検討− 124 −

糖脂質による増殖シグナル向上のメカニズムの解明の量は、AWT では低かった（Fig. 6）。さらに、AWT で脂肪酸構造は、大凡 C16 :0 〜 C20 :0 である事がわかった。

はリン酸化 c-Src と GM2 の染色像は重ならなかった一方で、この結果は、c-Src の挙動や活性化に影響を与えるのはASD ではリン酸化 c-Src と GM2 の染色像が重なった事か

GM2 の脂肪酸の鎖長ではなく、GM2 の過剰な蓄積であるら共局在している事が示唆された（Fig. 6）。

事を示唆するものである。

３．
５

４．考

糖脂質の TOF MS 解析察

これまで我々は、c-Src はリソソームに蓄積した GM2 と本研究で我々は、c-Src が GM2 と共役沈降する事から、相互作用する事を示してきた。さらに、これらの相互作用

c-Src が GM2 と相互作用する事を示したが。これはリソソ

では GM2 の脂質部位が関係しているのかを調べるために、ームに蓄積した GM2 が細胞内 c-Src と相互作用する事を示

TOF MS を用いて AWT および ASD における GM2 の分子唆するものである（Fig. 1 − 4）。また、c-Src と細胞質内量を調べた。AWT および ASD よりスフィンゴ糖脂質をGM2 の解析を行った結果、c-Src は、GM2 と同様、リソソFolch 画分として抽出した後に過メチル化し、TOF MS 解ームマーカー CD107a/Lamp-1 とも共局在している事がわ析を行った。過メチル化 GM2 に相当する分子量のピークかった。これは、ASD では c-Src がリソソームに蓄積したは、AWT と ASD 間で殆ど同じであり、同一の脂肪酸鎖GM2 と共局在している事を示すものである（Fig. 5）。さら長で構成されている事を示唆している（Fig. 7）。すなわちに、リン酸化 c-Src もまた CD107a/Lamp-1 と GM2 と共局
在 し て い る 事 も わ か っ た が（Fig. 6）、 こ れ ら は c-Src がGM2 と相互作用する事で活性化される事を示唆している。
また、過剰に蓄積した GM2 のセラミド部位の解析から、ASD における脂肪酸鎖長は極めて一般的である事も分かった。これは、糖脂質の脂肪酸鎖長とは関係なく、凝集した GM2 が細胞内 c-Src の挙動と活性化に極めて重要である
事を提案するものである（Fig. 7）。
Prinetti らは、ガングリオシドが細胞内 c-Src を活性化すると報告し７）、また岩渕らは、長鎖脂肪酸を持つスフィン
ゴ糖脂質のみが細胞内 SFK を活性化させる事ができると報告している８）。最近浜村らは、SFK の Yes の活性化には増 加 し た GD3 が 関 係 し て い る 事 を 報 告 し た。 我 々 は、
GM2 が細胞内 c-Src と相互作用する様に、過剰に蓄積したガングリオシドは細胞表層だけではなく、リソソームの様

Fig. 5 蛍光標識抗体を用いた各分子の局在検討
A：c-Src と GM2 の局在検討；（a-c）：AWT 細 胞（ 上 段 ）、（d-f）：
ASD 細胞（下段）、（a、d）抗 c-Src 抗体による染色、（e）：抗GM2 抗体による染色、（c、f）：重ね合わせ画像 .
B：c-Src と Lamp-1 の局在検討；（a-c）：AWT 細胞（上段）、（d-f）：ASD 細胞（下段）、（a、d）：抗 c-Src 抗体による染色、（b、e）：
抗 Lamp-1 抗体による染色、（c、f）：重ね合わせ画像 .

Fig. 6 リン酸化 c-Src と GM2 の局在検討（a-c）：AWT 細胞（上段）、（d-f）：ASD 細胞（下段）、（a、d）：
抗リン酸化 c-Src 抗体による染色、（b、e）：抗 GM2 抗体による染色、（c、f）：重ね合わせ画像− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Fig. 7

アストロサイト糖脂質の MS スペクトル

Fig. 8 リソソームの蓄積糖脂質からのシグナル伝達経路（ASD モデル）
このモデルは、本研究および Kawashima et al. J Neurochem（2009）の結果を基に作成した。細胞表層の GM3 は EGFR の様な成長因子受容体を不活性化し、さらに Akt を不活性化させる。これらの挙動は、細胞表層の GM3 により受容体（EGFR や FGFR）は不活性化を促され、一方でリソソームに蓄積したGM2 により活性化された c-Src は、増殖シグナル伝達系を刺激し、結果として細胞増殖能が亢進される。これらの現象は糖脂質、特にガングリオシドの細胞表層における増殖因子受容体のサプレッサーとして、さらに増殖と関わる細胞内シグナル伝達のアクティベーターとしても機能する事を示している。

なオルガネラにおける c-Src をも活性化させる事を示した。

ゴ糖脂質はリソソーム酵素により分解を受けることから、これは、スフィンゴ糖脂質が細胞表層からだけではなく、リソソームに過剰に蓄積する事はない。しかし、我々が用ある程度の糖脂質が蓄積しているオルガネラの細胞膜からいた GM2 ガングリオシドーシスモデルマウスから単離しもシグナルを伝達できる事を意味する。通常は、スフィンたアストロサイトは、分解酵素が欠損しているために− 126 −

糖脂質による増殖シグナル向上のメカニズムの解明

GM2 がリソソームに異常な密度で蓄積してしまう。以上（引用文献）の事から、ガングリオシドは蓄積の度合いにより細胞内の１）Takamiya, K., Yamamoto, A., Furukawa, K., et al. : Mice

c-Src のようなシグナル分子と相互作用し、これを活性化with disrupted GM2/GD2 synthase gene lack complex

させる事が出来る事を示している。

gangliosides but exhibit only subtle defects in their

また、AWT と ASD 間で GM2 の脂肪酸鎖長に差がない事が明らかとなったため、蓄積した GM2 から c-Src へのシ

nervous system, Proc Natl Acad Sci U S A 93, 1066210667. (1996)

グナルの伝達には脂肪酸鎖長は重要ではない事が示された。

２）Prinetti, A., Iwabuchi, K., and Hakomori, S. :この結果は、岩渕らの見出したラクトシルセラミドと Lyn

Glycosphingolipid-enriched signaling domain in mouseの相互作用に脂肪酸の長さが重要であるという報告と対照

neuroblastoma Neuro2acells. Mechanism of ganglioside-的な結果となった。この違いはおそらく、糖脂質が受容体

dependent neuritogenesis, J Biol Chem 274, 20916-として働くかどうかの違いと考えられる。ラクトシルセラ

20924. (1999)

ミドは好中球においてグルカンの受容体として働き、グル

３）Hakomori, S. : Structure and function of glycosphingolipids

カンと結合する事で Lyn を活性化する ８）。これに対し、and sphingolipids: recollections and future trends,

ASD では、リソソームに蓄積した GM2 により、c-Src はリ

Biochim Biophys Acta 1780, 325-346. (2008)

ガンドと結合する事なく恒常的に活性化されている。すな

４）Regina Todeschini, A., and Hakomori, S. : Functional

わち、受容体として機能する糖脂質により、細胞内リン酸

role of glycosphingolipids and ganglio sides in control化酵素の活性化は脂肪酸鎖長に依存する一方で、蓄積したof cell adhesion, motility, and growth, through糖脂質からのシグナル活性化では脂肪酸鎖長は無関係であ

glycosynaptic microdomains, Biochim Biophys Acta

る事を示している。今回我々が観察した ASD において、

1780, 421-433. (2008)

蓄積した GM2 による増殖シグナルの活性化は、Prinetti ら５）Ohkawa, Y., Miyazaki, S., Hamamura, K., et al. :の報告２）と似た機構であると考えられる。今回示した糖脂Ganglioside GD3 enhances adhesion signals and

質 GM2 と c-Src の相互作用はおそらく直接的なものと思わ

augments malignant properties of melanoma cells

れるが、テトラスパニンのようなアダプター分子が介在しby recruiting integrins to glyco lipid-enrichedている可能性も十分に考えられる。

microdomains, J Biol Chem 285, 27213-27223. (2010)

本研究により、ガングリオシドの蓄積により細胞増殖シ６）Kawashima, N., Tsuji, D., Okuda, T., et al. : Mechanism

グナルが活性化する仕組みが明らかとなった。この細胞増of abnormal growth in astrocytes derived from a

殖は、受容体を限定するものではなく、また糖脂質の蓄積

mouse model of GM2 gangliosidosis, J Neurochem 111,があれば細胞表層以外からも増殖シグナルが活性化する事

1031-1041. (2009)を示すものである。これは細胞種にも依存しない事を意味

７）
Prinetti, A., Marano, N., Prioni, S., et al. : Association of

するため、ガングリオシドのみによる細胞増殖能の活性化

Src-family protein tyrosine kinases with sphingolipidsが可能である事も示唆している。よって、ガングリオシド

in rat cerebellar granule cells differentiated in culture,により皮膚細胞の増殖活性化を亢進させる事が可能である

Glycoconj J 17, 223- 232. (2000)と考えられる。健康な皮膚を保持するためには、皮膚細胞

８）Iwabuchi, K., Prinetti, A., Sonnino, et al. : Involvementの増殖能亢進も重要な因子と考えられるため、今後この様of very long fatty acid-containing lactosylceramide inな知見を基に、応用研究に発展される事を期待する。

lactosylceramide-mediated superoxide generation andmigration in neutro phils, Glycoconj J 25, 357-374. (2008)− 127 −