４置換レゾルシノール誘導体のメラニン生成抑制効
九州大学農学研究院

清水邦

森林資源科学部門森林圏環境資源科学講座

義、安武政司、近藤隆 一 郎

The color of mammalian skin and hair is determined by a number of factors. The most important factor is the degreeand distribution of melanin pigmentation. Melanin synthesis inhibitory compounds are useful not only for the material
used in cosmetics as skin-whitening agents but also as a remedy for disturbances in pigmentation. Tyrosinase (phenoloxidase) is known to be a key enzyme for melanin biosynthesis in plants, microorganism and mammalian cells. Therefore,many tyrosinase inhibitors have been tested in cosmetics and pharmaceuticals as a way of preventing overproductionof melanin in epidermal layers. Also, various types of stimulation, including exposure to ultraviolet (UV) radiation,induce lipid peroxidation in the skin, which might in turn cause damage to epidermal cells, leading to postinflammatory
hyperpigmentation. Considering the importance of counteracting oxidative stress caused by UV to prevent harmful skindamage, it is important to design the multifunctional skin whitening agent with both antioxidant and anti-tyrosinase abilities.
A novel vitamin E derivative, (6"-hydroxy-2",5",7",8"-tetramethylchroman-2"-yl)methyl 3-(2',4'-dihydroxyphenyl)propionate(TM4R) which has chromanoxyl ring and 4-substituted resorcinol moieties, was synthesized and its inhibitory effect ontyrosinase, antioxidant ability and lightning effect of ultraviolet B (UVB)-induced hyperpigmentation were estimated. TM4R
showed potent inhibitory activity on tyrosinase, which is the rate-limiting enzyme in the melanogenesis. The scavenging
activities of TM4R on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and hydroxyl radicals were found to be nearly the same as
those of α-tocopherol. Furthermore, an efficient lightening effect was observed following topical application of TM4R toUVB-stimulated hyperpigmented dorsal skin of brownish guinea pigs. These results suggest that TM4R may be a candidate
for an efficient whitening agent, possibly by inhibiting tyrosinase activity and biological reactions caused by reactive oxygenspecies.

１．緒に、４位アルキル置換レゾルシノール類が強力なチロシナ

言ーゼ阻害効果を有することが知られている４, ５）ことから、紫外線から誘起される色素沈着メカニズムは、多岐に渡A. incisus より見出された阻害物質の活性発現には、４位っている。少なくとも、紫外線照射における活性酸素種の置換レゾルシノール構造が大きく関与していると予想し生成 、ケラチノサイトでの各種炎症性シグナル物質の産た。そこで、本研究ではチロシナーゼ阻害活性に関する上生、それに引き続くメラノサイトの活性化、メラニン生合記知見を基に、チロシナーゼ阻害活性とともに、美白剤と成酵素であるチロシナーゼなど一連の酵素活性の亢進、さして求められている主要な生理活性の一つである抗酸化活

らには，生成したメラニンのケラチノサイトへの受け渡し性を有する多機能性分子の創出及びその美白効果（茶色モなどが、色素沈着メカニズムに関与していると考えられる。

ルモット背部皮膚を用いた UVB- 誘導色素沈着抑制効果）

したがって、色素沈着を抑える物質（美白剤や色素沈着症について検討した。

１）治療薬）の開発には、上記メカニズムの数段階を抑制する

２．実多機能性美白剤のドラッグデザインが有効であろう。
筆者らは、これまでに未だ不明な点の多く残されている

２・１験 6）

チロシナーゼ活性測定法

チロシナーゼは、マッシュルーム由来チロシナーゼ [EC

熱帯産樹木心材成分に、美白剤原料を求め、パプアニューギニア産樹木であるクワ科の Artocarpus incisus（パンノキ）の心材抽出物が強力なチロシナーゼ阻害活性を有することを見出した２）。さらに、７種の活性成分を単離、同定したHO。これらの活性成分の構造的共通は、Fig. 1 のボック

２, ３）

ス部分で示した４位置換レゾルシノール構造である。さらThe inhibitory effects of 4-substituted
resorcinol derivatives on melaninbiosynthesis
Kuniyoshi Shimizu, Seiji Yasutake,＊Ryuichiro Kondo＊

Laboratory of Systematic Forest andForest Products Sciences, Faculty ofAgriculture, Kyushu UniversityOHOHOOHORRR=OH: (+)-dihydromorin IC50 =25µ�
M
R= H : (+)-norartocarpanone IC50 =1.76µ�
M

HOOH

OH

O

R=prenyl: artocarpes in: IC50 =13.5µ�
M
R=CHCHC H (C H 3) 2:isoartocarpes in: IC50 =21.1µ�
M

OH

HOR

HOO

HOHO

OH

O
OH

R =prenyl: 4-prenyloxyresve ratrol IC50 =0.66µ�M
M
R = geranyl: chlrophor in IC50 =0.26µ�OH

artocarbene IC50 =2.45µ�
M

Fig.1 The chemical structures and IC50 of active components from A.incisus.�
The boxed part:4-substituted resorcinol skeleton.(substrate:L-tyrosine)− 16 −

４ 置換レゾルシノール誘導体のメラニン生成抑制効1.14.18.1]（シグマ）を用い、前報に従い、それぞれ基質が示唆された。しかしながら、同樹木より単離された化合として L- チロシンを用いて、反物である artocarpin（16）は４位置換レゾルシノール構造

応により生じるドーパクロムの極大吸収波長である 475nmを B 環に有しているにも関らず、チロシナーゼ阻害活性の吸光度を測定し、活性を算出した。ポジティブコントロを示さなかった（Fig. 2）。したがって、４位置換レゾルールとしては、強力なチロシナーゼ阻害物質として知られシノール構造だけでなく、他の構造的特徴も活性発現に重ているコウジ酸８）を用いた。

要な役割を果たしていることが予想された。４位置換レゾ２）

もしくは DL-DOPA７）

ルシノール構造に起因したチロシナーゼ阻害活性をベース

２・２
既報９）

ヒドロキシラジカル捕捉活性測定とした多機能性分子を設計するためには、４位置換側鎖のに従い、ESR スピントラッピング法により算出構造に着目した、詳細な構造活性相関の知見が必要である。
まず、Fig.1 に示した化合物群がフラボノイド及びスチルした。

ベンに属することから、当該グループに属する 25 種の化合物

２・３

UV-B 誘導色素沈着抑制活性試験に対して、チロシナーゼ阻害活性を検討した（Table 1, Fig. 3）。
５種のスチルベン（21-25）で検討したところ４位置換

既報 10）に従い、茶色モルモット背部に、UV-B を照射後の色素沈着を色彩色度計にて評価した。

HO

３．結果及び考察

OHOMeO

Fig. １に示すように、A. incisus の心材抽出物から単離OHされたチロシナーゼ阻害活性物質の構造を比較することにより、チロシナーゼ阻害活性発現には、ボックスで囲んだ

Fig. 2 The chemical structure of artocarpin (16) isolated from A. incisus.
The boxed part: 4-substituted resorcinol skeleton

４位置換レゾルシノール構造が活性発現に重要であること
Table 1No. name(±)-flavanone(-)-pinocembrin(±)-naringenin(+)-aromadendrin(±)-fustin(±)-taxifolin(+)-dihydromyricetin(+)-dihydromorin(+)-norartocarpanone
flavonechrysin
apigeninkaempferol
quercetin
myricetinartocarpin
morin
artocarpesin
isoartocarpesin(-)-angolensin

2122
23
2425

pinosylvin
oxyresveratrol
4-prenyloxyresveratrol
chlorophorinartocarbenecaInhibitory activity of flavonoids and stilbenes on tyrosinase (substrate: L-tyrosine)
R3

1234567891011121314151617181920O

R5R6

R7

R2'

R3'

H
H
H
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
OH
H
OH
OH
OH
Pr
OH
H
H

H
OH
OH
OH
H
OH
OH
OH
OH
H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH

H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
CHCHCH(CH3)2H
Pr
CHCHCH(CH3)2H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
OH
OH
OH
OH
OCH3
OH
OH
OH

H
H
H
H
H
H
H
OH
OH
H
H
H
H
H
H
OH
OH
OH
OH

R3
OH
OH
OH
OH

R4H
H
Pr
Ger

R5OH
OH
OH
OH

R2'
H
OH
OH
OH

R4'
H
OH
OH
OH

R4'

H
H
HH
OH
OH
OH
H
H
H
H
H
H
OH
OH
H
H
H
H

H
H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH

R5'

(C2, C3)

H
H
H
H
H
H
OH
H
H
H
H
H
H
H
OH
H
H
H
H

IC50(µ�M)

2S, 2R2S
2S, 2R(2R, 3R)(2R, 3R),(2S, 3S)(2R, 3R),(2S, 3S)(2R, 3R)(2R, 3R)
2S>200>200>200
lag time decreasea
lag time decreasea
lag time decreasea
lag time decreasea
25
1.76>200>200>185
103
lag time decreasea
lag time decreasea>228>330
13.521.1>200>46
0.98
0.66
0.26
2.45

means promotion effect which could act as cofactor like diphenolcSee Fig. 3.

R3'R2'R7R6O

R5O
1-9R4'R5'R3Pr:

R3'R2'O

R7R6R5O
10-19

R4'HOH

R5'R3MeO

Me20

OGer:

Fig.3 The chemical structures of 1-24− 17 −R2'OH
R3R4R521-24

R4'

レゾルシノール構造を有する４種のスチルベン類（22-25）

また、一方、(-)-angolensin（20）（Fig. 3）も４位置換レに強力なチロシナーゼ阻害活性が観察されたが４位置換レゾルシノール構造を有するにも関らず、阻害活性を示さなゾルシノール構造を有さない pinosylvin（21）は、強力なかった。しかし、上述のような立体障害による活性の低減阻害活性を示さなかった。したがって、スチルベンに関し効果は、考えにくい。したがって、阻害活性低減要因を明ては、４位置換レゾルシノール構造が活性発現に極めて重らかにするために、４位置換レゾルシノール類の特に側鎖要であることが示唆された。に着目した構造活性相関検討を行った。 Table 2 に示すよ

続いて、20 種のフラボノイド（1-20）について検討しうに、４位置換基の構造によって、大きく活性が変動するた。その結果、B 環に４位置換レゾルシノール構造を有すことが判明した。特に、カルボニル基（26-30）を有する場合、る４種のフラボノイドのみ（8, 9, 18 及び 19）に高いチロ阻害活性が消失した。また、アゾ基（31, 33）を有する場シナーゼ阻害活性が観察された。しかしながら、16, 17 及合にも阻害活性が著しく減少した。カルボニル基及びアゾび 20 は B 環に４位置換レゾルシノール構造を有するにも基は、両置換基ともに、オルソ位の水酸基と水素結合を形関らず、高い阻害活性を示さなかった。これらの結果から成可能である。この分子内水素結合が存在することによっフラボノイド類に関しては、４位置換レゾルシノール構造て、活性発現に必須なレゾルシノール部分がチロシナーゼだけでなく、さらに他の構造的特徴が活性発現には、必要に強固に結合できず、阻害活性が著しく減弱したと考えらであることが示唆された。

れる。さらに、側鎖の極性のチロシナーゼ阻害活性に及４位置換レゾルシノール構造を有するフラバノン及びフぼす影響について検討した。Fig. 5 に示すように、側鎖にラボン型フラボノイドの場合には、３位に置換基を有する水酸基やカルボニル基などの極性基が存在すると活性が弱場合に、チロシナーゼ阻害活性が激減することが判明した

く、逆に疎水性が高いと強力な阻害活性を示すことが判明（９→８、18 及び 19 → 16 及び 17）。つまり、Fig. 4 に示した。これらの結果を Fig. 6 にまとめた。これらの知見をすように B 環に４位置換レゾルシノール構造を有したと基に、筆者らは、４位置換レゾルシノール構造に由来するしても、３位になんらかの側鎖置換基を有する場合には、強力なチロシナーゼ阻害活性を有し、かつ抗酸化活性を有その立体障害のために、４位置換レゾルシノール構造部分する化合物の設計を試みた。抗酸活性発現構造として αがチロシナーゼに結合できず阻害活性が低減したことが考えられる。

Table 2 Inhibitory activity of 4-substituted resorcinols on�tyrosinase (substrate: L-tyrosine)

HOHOO

HOHOOHR
HOO

HOR3OHOOHOH OHOOHOO

18: R=Pr, IC50 =13.5µ�
M
19: R=CHCHCH(CH3)2 , IC 50=21.1µ�M

9: IC50=1.76µ�M

HOOH

R28: IC50 =25µ�
M

Steric hindrance

Substituent (R)
CHO
COCH3COOH
CONHCH2CH2OH
COC6H5IC50 ( µM)>200>200>200>200>200

31N436

32H33NOHOOH ONo.
2627282930NN

227NN

HO34

R1

16: R 1=Pr, R2=CHCHCH(CH3 )2,R3 =OCH3 , IC50=25µ�
M
17: R 1=OH, R2 =H, R3=OH,IC 50>330µ�M

Fig.4 The effect of the introduction of C3 substituent of flavonoids wich have�
4-substituted resorcinol skeleton tyrosinase (substrate: L-tyrosine)

35363738394041OH
ClCH3CH2C6H5CH2(CH2)4CH3CH2(CH2)10CH3CH2CH3CH2CH2CH3ROH

OH− 18 −185S

58.0
13.0
12.0
2.80
1.98
1.63
1.100.91

４ 置換レゾルシノール誘導体のメラニン生成抑制効-tocopherol のラジカル捕捉活性発現部分構造であるクロOH

マノール環に着目し、（6"-hydroxy-2",5",7",8"-tetramethylOGlu
HOchroman- 2"-yl）methyl 3-（2',4'-dihydroxyphenyl）
propionate（TM4R）を分子設計・合成した（Fig. 7）。

IC50=8.85µ�
M

TM4R は、上記のチロシナーゼ阻害に関する構造活性相関検討により、コウジ酸以上の阻害活性が期待され、また、

OH

その抗酸化効果も α-tocopherol（ビタミン E）11）に匹敵OHHOするものと予想された。そこで、TM4R のチロシナーゼ阻害活性ならびに抗酸化活性を測定した。また、比較のたIC50=5.66µ�M

めに 2-carboxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol（Trolox），

OH

2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethyl chroman-6-ol（TM）
及び 3-（2',4'-dihydroxyphenyl）propionic acid（DPPacid）

HOを用いた（Fig. ８）。Table 3 に示すように、４位置換レゾルシノール構造を有する TM4R 及び DPPacid には高い

IC50=0.91µ�M

チロシナーゼ阻害活性が観察されたが、クロマノール環を有する Trolox 及び TM には、阻害活性は観察されなかっOHHOた。さらに、その阻害機構は、競争型であった（Fig.9）。
4 位置換レゾルシノール類によるチロシナーゼの阻害は競hydrophobicsubstituent

IC50=0.50µ�
M争型であることが報告されている５, ７）ことからも、TM4Rの強力なチロシナーゼ阻害活性には、4 位置換レゾルシノ

Fig. 5 The chemical structures and IC50 of 4-substituted resorcinols. �(substrate: L-tyrosine) Glu: glucose moiety.

HOOHO

HOO

N

Rール構造が強く関与していることが明らかとなった。
また、
DPPacid と比較して高い阻害活性が観察されたことから、

HN

R

OHO

The formation of intramolecular� HOhydrogen bond decrease activity.

OHHOO

R
R

Introduction of bulky substituent causes weaker activity.

Hydrophobic and less bulky substituents are preferred.�
Replacement of substituent with hygrogen atom�
dramatically decrease activity.
Fig.6 Summarized structure-activity relationship of compounds with 4-substituted resorcinol skeleton

HOO
Trolox

COOH

HOO

CH2OH

DPPacid
DMAP, DCC
benzene, 50°�

TMO

HOO

O
OH

AntioxidanthydrophobicTyrosinase
inhibition
TM4R

Fig. 7 Structure and synthesis of TM4R

− 19 −OH

HO
COOH
O
TroloxC H2O H
O
TM

HO

6"

4"

5"
10"
9"

7"
8"

O

3"
2"

1O

O

OH
32

TM4R

O

2'

1'
6'
5'

3'
4'

14
12
10
8642

OH-1.5

OH

0-0.5

0.5

1.5

2.5

1/[ DL-DOPA (mM)]

HO

Fig.9 Lineweaver-Burk plots of mushroom tyrosinase and DL-DOPA��in the absense or presence of TM4R�

Control,OHDPPacid

16I/V(∆O.D. at 475nm/min.)HO

1.88µM, 3.75µM

Fig.8 The chemical structures of Trolox, TM, TM4R and DPPacid�The boxed part with shadow: 4-substituted resorcinol skeleton�
The boxed part without shadow: chromanoxyl ring moiety

Table 3 Effects of Compounds on Mushroom Tryosinase

CompoundSubstrate
L- Tyrosine

DL -DOPA

IC50 (µM)

IC50 (µM)

Ki (µM) Type of inhibition

TM4R

0.325

232.74Competitive

DPPacid

3.0262

11.5

CompetitiveTM>423n.d.

n.d.

n.d.

Trolox>400n.d.

n.d.

n.d.

α
�-tocopherol

>232

n.d.

n.d.

n.d.

kojic acid

8.66

a11.8

arbutin

306

10400 0n.d.

a17aMixedan.d.

an.d.: Not determined. :Obtained from data of Ref. 7.

クロマン環の疎水性が活性増強にも寄与していることが示

外線による皮膚ダメージならびに脂質過酸化により引き起唆された。また、Table 4 に示すように、クロマノール環こされる炎症後の色素沈着も知られている。色素沈着の最を有する Trolox、TM 及び TM4R には、強力な抗酸化物

大の要因として紫外線照射後の酸化ストレスの関与が報告

質として知られる α-tocopherol と同等の抗酸化活性が観されている１）。したがって、強力なチロシナーゼ阻害活性察された。このように TM4R は、強力なチロシナーゼ阻ならびに抗酸化活性を有する多機能性分子である TM4R害活性ならびに抗酸化活性を有する多機能性分子であるこは、紫外線により惹起される色素沈着を効果的に抑制し、とが確認された。チロシナーゼはメラニン生合成の鍵酵素かつ皮膚の酸化ストレスダメージを防ぐ機能が期待されとして知られており、事実、コウジ酸のようなチロシナーた。そこで、UV-B により誘導される色素沈着に対するゼ阻害剤が、美白剤原料として知られている。一方で、紫TM4R の効果を検討した（Fig. 10）。TM4R は、市販の美− 20 −

４ 置換レゾルシノール誘導体のメラニン生成抑制効

Table 4 Antioxidant Activity of the Compounds
aCompoundHydroxyl radical (%)

DPPH [IC50(µM)]

b1.0 mM10 mM

TM4R91100

3.9TMn.d.

n.d.

3.2

Trolox

n.d.

n.d.

3.3α
�-tocopherol

7093

3.9DPPacid

n.d.

n.d.

No activity at 50 µM

n.d.: Not determined.
aHydroxyl radical scavenging activity was expressed as % inhibition concentration of hydroxyl
radicals generated by Fe (II) and H2O2 (Fenton reaction).
b
The IC50 values were caluculated f rom regression lines where the abscissa represented
the concentration of tested compound and the ordinate the average percent reduction ofDPPH radical from three separate tests.

65L* value(light←→dark)

4**321-50515days2535FIG.10 The degree of pigmentation (L* value) before and after daily topical applications(five times per week) of base solution [propylene glycol/ethanol (1/6)](control,○),TM4R (0.25M in base solution, ◆ ), kojic acid (0.25M in base solution, ■ ), or
arbutin [0.25M in base solution,▲). The applications were continued for 35 days.
Data are expressed as mean L values±SEM (n=8). L* valuse at day 0 are
49.9±2.7(control), 48.9±3.4 (TMR), 50.1±2.9 (kojic acid) and 49.9±2.8(arbutin). Student's t-test was used for the statistical analysis of the data. (*P<0.05, vs control)

白剤原料として知られるコウジ酸やアルブチンと比較し連のフラボノイド及びスチルベンを見出した。活性発現にて、顕著な色素沈着抑制効果を示した。この色素沈着抑制

は、分子内の４位置換レゾルシノール構造が関与している

効果メカニズムには、in vitro の結果を考慮すると、少なと考え、４位置換レゾルシノール類の構造活性相関を特に、くともチロシナーゼ阻害及び酸化ストレス抑制が関与してその側鎖置換基の構造に着目して行い、ある特定の構造的いると考えられる。

特徴（疎水性・分子内水素結合・立体障害）が阻害活性に４．総大きく影響を与えていることを見出した。さらにその知見括を基に、美白剤として求められている主要な生理活性の一A.incisus 樹木心材から強力なチロシナーゼ阻害物質とつである抗酸化能を分子に付与することを試みた。その結して、分子内に 4 位置換レゾルシノール構造を有する一果、抗酸化活性とチロシナーゼ阻害活性を有する多機能− 21 −

性新規ビタミン E 誘導体（TM4R:（6"-hydroxy-2",5",7",8"-4-substituted resorcinol moiety has both antioxidant andtetramethylchroman-2"-yl）methyl3-（2',4'-dihydroxyphenyl）

tyrosinase inhibitory properties. Lipids 36, 1321-1326,propionate）を合成し、動物実験において、顕著な UV-B

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