脂質を標的とした新しい皮膚遅延型アレルギー応答の機序解明と制御

京都大学ウイルス研究所

杉 田昌 彦The delayed-type hypersensitivity (DTH), or type IV allergy, is critical for many aspects of skin diseases, including
contact dermatitis. It has been established that DTH occurs in response to protein-based allergens, but our recent study
suggested that lipid components were able to elicit DTH responses in sensitized guinea pigs. Therefore, it is important todetermine how DTH to lipids may differ from DTH to proteins and whether it may also occur in primates. Here, we showthat a mycobacteria-derived glycolipid, glucose monomycolate (GMM), elicits DTH responses in bacillus Calmette-Guerin(BCG)-vaccinated guinea pigs. The GMM-elicited hypersensitivity was comparable with the classical DTH to purified
protein derivative (PPD) in that the skin reaction was associated with local infiltration by mononuclear cells with a peak
response at about 2 days. Nevertheless, the GMM-elicited DTH was dependent on CD1 function and highly skewed to
the TH1-type cytokine response. Furthermore, a similar response was observed also in BCG-vaccinated rhesus macaquemonkeys. Thus, these observations detect a novel pathway of DTH directed against lipid allergens.

１．緒

核菌細胞壁糖脂質であるグルコースモノ

言OHOH

ミコール酸（GMM）（右図）を皮内接種

MHC 分子がタンパク質断片であるペプチド抗原を結合すると、２日をピークとし、単核球の浸し T 細胞に抗原提示する現象は、近代免疫学が確立した中潤を主体としたアレルギー応答が観察さ心的パラダイムのひとつである。皮膚アレルギーをはじめ、れることを見いだした。このことは、ツ感染免疫やがん免疫、自己免疫病など多くの免疫病態が、ベルクリン反応に代表されるタンパク質このパラダイムに基づいて考察され、診断法や治療法が開を標的にした遅延型アレルギー応答拓されてきた。しかしながら、たとえばギランバレー症候（delayed-type hypersensitivity; DTH）

群では糖脂質に対する自己抗体が検出され、全身性エリテとは機序の異なる DTH が存在すること

マトーデスでは核酸に対する自己抗体が産生される。すなを示唆する。

わち、獲得免疫系が認識する抗原はタンパク質だけではな

そこで本研究において、GMM を標的いことを、これらの疾患は示唆している。実際、多様な脂とした新しいタイプの皮膚 DTH につい質抗原を T 細胞に提示する新しい抗原提示分子「グループて、モルモットおよびアカゲザルを用い１CD １分子（CD 1 a、CD 1 b、CD 1 c）」の存在が知られて詳細に検討することにより、タンパクているが、実験動物として有用なマウスやラットがこの免質を標的とした古典的 DTH との違いを疫システムを欠如することから、本領域の研究は立ち遅れ明らかにすることを目的とする。ている。皮膚においても表皮ランゲルハンス細胞は特異的

２．実にグループ１CD １分子を発現するが、その意義はほとん
1）

２.１

ど不明である 。
やアカゲザルを用いた脂質免疫の研究を進めてきた。モル

るいは M. bovis bacillus Calmette-Guerin

モットは、ヒトと類似したグループ 1 CD 1 システムを有し、 （BCG）より脂質の生成を行った。菌をまたヒトと同様の結核病態を示すことから、主として7 H 9 培地（ミドルブルック ADC、0 . 05 %BCG 接種モルモットをモデルとした解析研究を行っていTween- 80、５% グルコース添加）にて37℃で震盪培養し、ログフェーズの段階（OD 600 が 1 〜 1 . 5）で菌を回収したのち、常法により総脂質をクロロホルム／メタ
3）ノール（C/M）にて抽出した 。得られ
A novel pathway for the delayed-type
hypersensitivity directed against lipids
Masahiko Sugita
Institute for Virus Research, Kyoto University

た総脂質を C/M（２：１）１ml に溶解し、さらに 30 ml の氷冷アセトンを加え、氷中で 20 分静置した。遠心にて不溶画分を沈殿させ、ペレットを氷冷アセトンで− 89 −COOH

GMM の大量精製

Mycobacterium avium（serovar 4） ある 。後述のように、BCG ワクチン投与モルモットに、結O験

このような背景から、研究代表者の杉田は、モルモット

2）

OOH
OHOO

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

洗浄した後、1 ml の C/M に溶解した。これを C/M/ アセは下記の通りである。IFN-γ : GAC ATC TTG AGG AAT

トン / 酢酸（90：10：10：1）を展開溶媒とした薄層クロマ

TGG AAA G（sense），TTT GGA TCC TCT GGT CAT

トグラフィー（TLC）にて展開し、GMM に相当するスポCTT（antisense）；IL- 4：AGC TGA TCC GAT TCC

ットを掻き出して脂質を抽出した。夾雑物がなくなるまで

TGA AA（sense），GCT GGC TTC CTT CAC AGG AC

この操作を２〜３回繰り返した後、脂質を乾固し、メタノ（antisense）：IL- 10：TGC CTT CAG CAG AGT GAAール洗浄を行った。最終精製物をマススペクトロメトリー

GA（sense），GCA ACC CAG GTA ACC CTT AAAで解析し、GMM に対応したマススペクトラムが得られる（antisense）；eotaxin 1：GGG CTC ACT GGG CCA GAT

ことを確認した。

TC（sense），TCT CCA GTC GCT GAA GGG GT（antisense）；granulysin：TCG ACT GCA AGA TCT

２. ２

GMM リポソームの作製

GTC TGA G（sense），ACT TCA CCA TCC TAC ACA

クロロホルムに溶解した精製 GMM とホスファチジルコ

CAC G（antisense）；perforin：GAG TGC CGC TTC

リン、コレステロール、ステアリン酸付加オクタアルギニ

TAC AGT TAC CA（sense），CAG CCC GGA TGA

ンを混和し、減圧乾固することにより脂質フィルムを形成

AGT GGG TG（antisense）；GAPDH：GAA GCC CCAさせた。ここに滅菌水を加え、超音波処理を施すことによ

TCA CCA TCT TCC AGG（sense），GAG CCC CAG

りリポソーム形成を促進した。

CCT TCT CCG TG（antisense）。

２. ３

３．結モルモット免疫および皮内テスト

生後３週のメス Hartley モルモットを、SPF 環境で飼育

３.１

果モルモットの解析

し て 実 験 に 供 し た。 ２% グ ル コ ー ス 存 在 下 で 培 養 し た

BCG 投与を行ったモルモットに PPD を皮内接種すると、BCG 東京 172 株（5 × 10 cfu）をモルモット皮下に接種し、2 日をピークとした典型的な DTH 応答が観察されたこと、６週後に剃毛を施した大腿部において皮内テストを行った。

およびナイーブモルモットでは観察されなかったことから、５mg の GMM を含んだリポソームおよび相当量の空リポBCG の感作は成立したと判断した。BCG 非感作、感作を7ソームを 100 ml の PBS に溶解して接種するとともに、PPD問わず、空リポソーム接種のよる皮膚変化を認めなかった（0 . 5 mg）の接種を行った。抗原のチャレンジ後、経時的ことから、リポソーム自体により炎症惹起はないと判断しに皮膚硬結の長径を測定した。

た。一方、GMM リポソーム接種により、BCG 非感作モルモットに対しては皮膚応答を認めなかったが、感作モルモ

２. ４

リンパ節細胞の遺伝子発現解析

ットに対して 1 . 5 〜２日をピークとした遅延型応答を認め

BCG 接種モルモットの所属リンパ節より細胞を単離し、た。組織学的には、単核球の浸潤を主体とするものであっin vitro で GMM リ ポ ソ ー ム（1 mg/ml）あ る い は PPDた。したがって、１）応答の成立には、事前の感作が必要、（0 . 5 mg/ml）の刺激を行った。一部の実験においては、抗２）遅延型を示すこと、３）単核球の浸潤を顕著に認める

モルモット pan-CD 1 抗体である CD 1 F 2 / 6 B 5 を 10 mg/ml

こと、以上の３点から GMM によって誘起される応答はの濃度で加えた。18 時間後に細胞を回収し、全 RNA を抽DTH の基準を満たすものであり、DTH の標的抗原として出して、常法により RT-PCR を行った。

糖脂質が存在することが初めて明らかになった。

２. ５で刺激するとインターフェロン γ（IFN-γ）の顕著な遺伝子

一方、BCG 接種の所属リンパ節細胞を GMM リポソーム

アカゲザル免疫および皮内テスト
8アカゲザル一頭あたり、1 × 10 cfu の BCG を皮内接種

発現誘導を認めたが、このサイトカイン応答は抗 CD 1 抗した。また GMM リポソームの皮内接種には、50 mg を用体の存在下で完全に阻害された。したがって、GMM によいた。すべての動物実験は当該機関の承認を得て行った。

っ て 誘 起 さ れ る DTH は MHC を 拘 束 因 子 と す る 古 典 的DTH と異なり、CD 1 分子によって制御されていることが２. ６

リアルタイム PCR明らかとなった。また TH 1 サイトカイン（IFN-γ、TNF-α）リポソームを接種した皮膚を切り出し、破砕したのち、および TH 2 サイトカイン（IL- 5、IL- 10）の発現を検討し全 RNA の 抽 出 を 行 っ た。 逆 転 写 酵 素 反 応 に よ り 1 本 鎖

た と こ ろ、PPD 刺 激 で は 両 者 が 誘 導 さ れ た の に 対 し、DNA を合成し、それを鋳型としたリアルタイム PCR を行

GMM リポソーム刺激では TH 1 サイトカインのみが誘導うことにより、各遺伝子の mRNA 発現量を定量した。変され、TH 2 サイトカインは誘導されなかった。したがって、性処理（95℃、60 秒）ののち、変性（95℃、15 秒）、伸長（60GMM によって誘起される DTH は、極度に TH 1 型サイト℃、35 秒 ）の 2 ス テ ッ プ PCR（40 サ イ ク ル ）を 行 っ た

カイン産生にシフトした応答であることが分かった。

（Applied Biosystems 7500）。用いた各プライマーの配列− 90 −

脂質を標的とした新しい皮膚遅延型アレルギー応答の機序解明と制御

３. ２

アカゲザルの解析

スジェニックマウスが得られれば、GMM に対する皮膚２頭のアカゲザルに BCG の感作を行い、GMM リポソー

DTH がマウスにおいて再構築できる可能性が高い。

ム な ら び に 空 リ ポ ソ ー ム の 皮 内 接 種 を 行 っ た と こ ろ、５．総GMM リポソームにおいてのみ、皮膚の硬結を観察した。
組織学的には単核球の顕著な浸潤を伴うものであった。

括本研究により、霊長類における脂質特異的 DTH の存在皮膚組織より全 RNA を抽出し、それを鋳型としたリアが明らかとなった。治療に難渋し再発を繰り返す接触皮膚ルタイム PCR を行った結果、IFN-g の著明な発現亢進を認炎において、CD 1 分子を介した皮膚 DTH が関与しているめた。一方、TH 2 サイトカインである IL- 4 や IL- 10 の発現とすれば、抗 CD 1 抗体の局所投与などが治療効果を発揮は非接種組織と比較してむしろ低下していた。また、細胞するかもしれない。新たな DTH 応答の発見は、これまで

傷 害 性 T 細 胞 あ る い は NK 細 胞 因 子 で あ る perforin や未知であった皮膚病態の解明に結実し、皮膚医学の発展にgranulysin の発現上昇を認めた。

貢献するものと考えられる。

４．考察（引用文献）

本研究から、糖脂質を標的とした CD 1 依存的な皮膚

１）Pena-Cruz V, Ito S, Dascher CC, et al.: Epidermal

DTH 応答が実証された。旧来、たとえばウルシオールやLangerhans cells efficiently mediate CD 1 a-dependent

ダニ由来アカリジアルのような脂質成分が皮膚 DTH を誘

presentation of microbial lipid antigens to T cells. J.

起することが知られている が、ハプテンとしてタンパクInvest. Dermatol. 121 , 517 - 521 , 2003 .

4）

質を修飾することにより MHC 依存的 T 細胞応答が誘起さ

２）Otsuka A, Matsunaga I, Komori T, et al.: Trehaloseれると考えられる。この点、本研究で明らかとなったdimycolate elicits eosinopilic skin hypersensitivity in

DTH とは異質である。

mycobacteria-infected guinea pigs. J. Immunol. 181 ,8528 - 8533 , 2008 .

皮膚 DTH を担う CD 1 陽性抗原提示細胞は同定できていない。GMM の提示は主として CD 1 b 分子が担うと考えら

３）M a t s u n a g a I , N a k a T , T a l e k a r R S , e t a l . :れているが、アカゲザルにおいては CD 1 c 分子の関与が認

Mycolyltransferase-mediated glycolipid exchange in

められている 。表皮ランゲルハンス細胞は CD 1 a を高度

Mycobacteria. J. Biol. Chem. 283 , 28835 - 28841 , 2008 .に発現し、CD 1 c を中等度に発現するが、CD 1 b の発現を４）Sasai T, Hirano Y, Maeda S, et al.: Induction of

ほとんど欠如している。一方、真皮には少数ながら CD 1 ballergic contact dermatitis by astigmatid mite-derived

陽性樹状細胞が存在する 。また、一部のマクロファージ

monoterpene, alpha-acaridial. Biochem. Biophys. Res.

は本来 CD 1 分子を発現しないが、炎症刺激により CD 1 分

Commun. 375 , 336 - 340 , 2008 .

5）1）子の発現を獲得することから、活性化マクロファージの関

５）Morita D, Hattori Y, Nakamura T, et al.: Major T cell
response to a mycolyl glycolipid is mediated by CD 1 c

与も考えられる。

molecules in rhesus macaques. Infect. Immun. 81 , 311 -遺伝子操作が容易で免疫解析の手法も確立しているマウ

316 , 2013 .

スにおいては、グループ 1 CD １遺伝子が欠落しており、本研究で見られた皮膚 DTH は存在しない。しかし、研究

６）Kobayashi C, Shiina T, Tokioka A, et al.: GM-

代表者は最近、ヒト CD 1 A ゲノム遺伝子を導入したトラ

CSF-independent CD 1 a expression in epidermal

ンスジェニックマウスを樹立し、表皮ランゲルハンス細胞

Langerhans cells: evidence from human CD 1 A

での特異的な CD 1 a 発現を確認している 。同様の手法でgenome-transgenic mice. J. Invest. DErmatol. 132 , 241 -ヒト CD 1 b トランスジェニックマウスやサル CD 1 c トラン

244 , 2012 .

6）− 91 −