バイオシグナル分子を固定化した細胞成長促進ハイブリッド材料の合成
伊京都大学

工学部

藤嘉浩

Insulin or epidermal growth factor (EGF) was conjugated with synthetic polymers. One wascoupling with water-soluble polymer, poly(acrylic acid), another immobilized on water-insoluble
polymer, poly(acrylilc aicd)-grated polystyrene film or surface-hydrolyzed poly(methylmethacrylate) film. While conjugation with poly(acrylic acid) slightly altered the mitogenic
activity of the polypeptides, immobilization on films significantly enhanced the effect. Small
amounts of immobilized insulin and EGF (1 to 10% of the required amount of native insulin andEGF) were sufficient to stimulate growth of mouse fibrobalst STO cells and Chinese hamster
ovary cells overexpressing EGF receptors, respectively.

1緒

Cell commumcat10ns

呂

多細胞生物は、細胞間、コラ ー ゲンのような細胞間基質、及びホルモン・サイトカイン ・ 成長因子などのバイオシグナル分子の3つの様式で制御され、細胞社会（組織）を形成している(Fig. 1)。
このなか で、最後のバイオシグナル分子による制御だけが溶解状態で行われる1)。 はたして固体状態でもこの情報は伝達されうるのであろうか。
本研究では、 バイオシグナル分子としてイン乙△乙シュリンと上皮細胞成長因子(Epidermal growth

Extracellular Matricesfactor, EGF)を選び、これらを、種々の合成高Fig. 1分子とハイプリッド化し、その細胞成長促進活性を検討した。

2実験Hormones
Growtb Factors

細胞機能細胞間、 細胞間基質、 そして溶解状態のパイオシグナル分子とのコミュニケーションで制御される。

合成した。 インシュリン、ポリアクリル酸（分子インシュリン ・ ハイブリッド材料の合成量、15、000)、ポリスチレン、アクリル酸モノマ

Fig. 2に示すような二種類のハイプリッド体をーは、シグマ、シグマ、和光純薬、ナカライ・テ

2. 1

スクから各々購入した。
Design and Synthesis of Biomaterials
Hybridized with Biosignal Molecules
to Enhance Cell Growth

インシュリンとポリアクリル酸とのカップリン
グ反応は以下に示すように行った(Fig. 2a)。 まず、ポリアクリル酸の水溶液(200µg/ml)に水

Y oshihiro Ito

溶性カルボジイミド (lmg/ml)を加え、4℃でFaculty of Engmeenng,
Kyoto University

24時間反応させた。 過剰のカルボジイミドは限外濾過で除去した。 このように活性化したポリアク-45-hcctsg＂,‘dimnw,.
08
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4OOH

COOH

(lmg/ml) を含む種々の濃度のインシュリン水溶液中に 4℃で48時間浸せき し、 固定化を行った。
反応後、 インシュリンの放出がなくなるまで洗浄
1 2 s Iラベルした。 固定化量の定量、 洗浄 の確認は化インシュリンを用いて行った。

2. 2 EGF ハイブリッド材料の合成
Fig. 3に示すような二種類のハイプリット体を合成した。 EGF 、 ポリアクリル酪（分子量、 15 、 000)
ポリメチルメタクリレ ー トは、 東洋紡、 シ グマ、Fig. 3 EGFとポアルドリッチから各々眺入した。

rー行った (Fig.3a)。 ポリアクリル醗 (250µg/rnl)•-―

リアクリル酸のカップリン グは以下に示すように(5mg/mlを混合し、 室と水溶性カルボジイミド(ius -PAA)

温で30 分間反応させた。 限外速過で未反応のカルCOOH(ins-PSI)
Fig. 2化ポ リ ス チ レ ン 膜 を水 溶 性 カルボジイミド

贔◎やSculic
W .ms40c□eFs
W402ccor゜)AA（p＇曹・＇,＇•＇••＇ba/PSlで）洗浄した。 洗浄したボリアクリル酸 グラフト

本研究で合成したインシュリン複合体の合成スキ ー ム(a)ポリアクリル酸とインシュリンの結合、(b)ポリアクリル酸クラフト化ポリスチレン上へのインシュリンの固定化。

ポジイミドを除去した後、 EGF (300µg/rnl) と4 ℃で24 時間反応させた。 生成物は限外濾過で梢製した。

EGFの表面加水分解ポリメチルメタクリレ ー ト
膜へ固定化は以下に示すように行った (Fig.3b) 。
まず、 ポリメチルメタクリレ ー ト膜は、 トルエン
WSC

COOH

リル酸水溶液にインシュリン (2mg/ml) を加え、

�4 ℃でさらに 24 時間反応させた。 さらに活性化カ
ルボキシル基を除くためにグリシン ClOmg/ml)

PAA.

EGF

..

亨◎
EGF-PAAを加え、 4℃で6時間反応させた。 合成したハイプb

リッド体は限外池過により精製した。
インシュリンの膜への固定化は以下に示すように行った(Fig/2b) 。 まず、 ポリスチレン膜を室温、 0. 05Torrの減圧下で、NaOH

wsc4·c, 2h閉:Bh

己二’→�二→�→�二
50℃, 90 min

200wの電力でグロ ー 放電処理 を行った。 クロ ー 放電処理した膜を、 予めPMMA

精製し 、 水 溶 液 にし た ア ク リ ル 酸モ ノマ ー(20wt%) に浸せきし、 脱気し、 窒素置換して封Fig. 3管した。 これを60℃で2時間加熱することにより、
ク� ラフト重合を行った。 反応後、 モノマ ーの溶出がなくなるまで (pH 変化が観測されなくなるま-46-4EGF-PMMA

本研究で合成したEGF複合体の合成
スキ ー ム(a)ポリアクリル酸とEGFの結合、(b)表面加水分解ポリメチルメタ
クリレ ー トヘのEGFの固定化。

パイオシクナル分子を固定化した細胞成長促進ハイプリヅド材料の合成

且 nfgng<g8L.CI9(0 n9'henq[Eさ麿 u9E(からキャストして得た。膜は4MNaOH水溶液中に国50℃で90分間浸せきすることにより表面加水分解を行った。10wt%クェシ醸水溶液中で中和した後、pH変化がなくなるまで十分に洗浄し、固定化反応に供した。膜を水溶性カルポジイミド(5mg/ml)水溶液に4℃で2時間浸せきし、続いて種々の濃度のEGF水溶液中に4℃で48時間浸せきー

ベッコ変法イ ー グル最少必修培地あるいはHam
F-12培地で37℃、5 %炭酸ガス雰囲気下、90%湿

101520Retention time (min)

度のもとで培養された。 培養後、細胞内のDNA量F1g.S ポリアクリル酸と結合したEGF (b)のHPLC溶出パターン(a)生来のEGF 、 (b)未精製 、(c)精製ポリアクリル酸結合EGF。
矢印は標準に用いたタンパク質のビ ー ク位置を示す。

を1'、6 ー ジアミジノ ー 2 ー フェニルインド ールで染色し、蛍光法により定星した。

3士口
租

果

ハイプリッド材料の合成5゜を用い測定した。各々の細胞は、無血清のダルc

プリッド材料は、EGPレセプタ ー 過剰発現CHO細胞b

進活性は、 マウス繊維芽細胞STOを用い、EGPハイポリアクリル酸がカップリングした複合体のa細胞成長促進活性の測定

インシュリン・ハイプリッド材料の細胞成長促

3. 1ー

0且 ＜E O8N苔 8 日ぷ』

2. 3ー

EGFを用いて行った。

ーした。固定化後、非固定化EGFがなくなるまで洗I浄した。固定化羅、洗浄の確認は 2 5 Iラベル 化

HPLC測定の結果をFig. 4、5に示す。溶出パタ ー ン
から、インシュリンとEGF のハイプリッ・ド体の分a

約4分子のインシュリンが1分子のボリアクリル酸と、約1分子のEGFが1分子のポリアクリル酸と結合していることがわかった。

bEuga iea gueqJosqv子量は各々約4万と2万と見積もられた。

ハ イプリッド体の結合比が異なるのは、 仕込み比が異なるためと考えられる。
Fig. 6には仕込み量と、膜への固定化量の関係
510を示す。インシュリン、EGFともに仕込量の増加

15に伴い、固定化量も増加した。

Retention time (min)Fig. 4 ポリアクリル酸と結合したインシュリンのHPLC溶出パタ ーン(al生来のインシュリン、(b)ポリアクリル酸結合インシュリン。

3. 2

ハイブリッド体の細胞成長促進活性

修飾成長因子存在下での細胞成長を調べた結果

-47-

0.4

0.2

100200400300

3.5
3.0UO!
)
BlOdlOOU)

a0.6gP 日 IAq1,H ,p ;iNIleuuoz(du3lnsu!
8s U!Ip ;iq1ospB

5 p ;iNm qounm JO 1unow y0.82.01.51 .�

6005002.5。

10-1-2Insulin concentration (µg)

10

゜101102

Amount ofinsulin (µg/well)4100bb0604

一02pazi11
qoE E IJOJUOOEくs=aoatpu,VNO 」01unoE 83>nt3a08( Eof8u::l)03
z5101520゜゜25

EGF concentration in feed (µg/ml)
FI g. 6�

インシュリン(a)とEGF (b)の仕込み

Fig. 7濃度と固定化量の関係
インシュリンはポリアクリル酸グラフ
ト化ポリスチレン膜上に、 EGFは表面

50

100

150'500

1000

1500

2000

2500

EGF(nglwell)
ハイプリッド化インシュリン(a)とEGF(b)をFig. 7 に示す。 インシュリン ー ボリアクリル酸の細胞成長促進活性(a): 生来のインシュリン（▲) 、 ポリア
クリル酸結合インシュリン (0) 、固定化インシュリン（●） 。 (b) : 生来のEGF(●） 、ポリアクリル酸結合EGF (0) 、 固定化EGF(A)。 インシュリン存在下ではマウス繊維芽細胞STOをEGF存在下ではEGFレセプタ ー 過剰発現チャイニ ー ズ ・ ハムスタ ー 卵巣細胞を48時間培養し 、 それぞれ表面加水分解ポリハイプリッド体は生来のインシュリンより若干高

メチルメタクリレ ー ト膜、ポリアクリル酸い細胞成長促進活性を有した(Fig. 7a) 。

グラフト化ポリスチレン膜上での細胞数を1として相対1直として表した。

加水分解ポリメチルメタクリレ ー ト膜上に水溶性カルポジイミドをカップリング剤として固定化された。

そして固定化インシュリンは1/10から1/100の理活性を有するようになった(Fig. 7b)。EGFの考察4

漉度で生来のインシュリンあるいはそれ以上の生場合は、 ポリアクリル酸が結合することにより若インシュリン、EGFともに固定化により細胞成

干i舌性は低下したが、 固定化によりインシュリン長促進活性は飛躍的に増大した。 非常に低濃度での場合と同様の効果がみられた(Fig. 7b)。

高い成長促進活性を有するのは、 膜表面の局所濃度が高く、 細胞と有効に相互作用する濃度が高く-48-

パイオシグナル分子を固定化した細胞成長促進ハイプリヅド材料の合成なるためと考えられる。

リッド化は、 これまで非常に多くの研究がなされまた低濃度で有効なばかりでなく、 最大の促進効果も固定化バイオシグナル分子の方が高くなった。 これは、 固定化により、 レセプタ研究 はなかった。 本研究は、

ハ イオングナル分子のダウンをどのような形態の合成高分子とハイプリッド化ションが抑制されるためと考えられする かによって大きく活性が異なってくることをる 2) 。 この際、 インシュリン固定化より EGF 固定明確に示した。 本研究の知見は、 今後のハイプ化の方が細胞成長に対する効果が大き かったのリッド生体高分子の設計に有意義であろう。

ーレキュレーてきたが、 その作用機構や効果について統一的なー

は、 後者の細胞は EGF レセプターを過剰発現して引用文献おり、 EGFの影響を受けやすいためと考えられる。
インシュリンとポリアクリル酪のハイプリッド体の活性が生来のインシュリンより高くなったのは、 EGF 複合体の場合と異なり、 ポリアクリル酪1)伊藤嘉浩、：細胞増殖因子固定化材料による無血清細胞培養、 組織培養、
2) Ito Y, Zheng J,

19 520-524 1993

Imanishi Y, Yonezawa K,

1分子がインシュリンを複数分子有する多価リカ

Kasuga M, : Protein-free eel 1 culture on

ンドとなって、 レセプタ ー 凝集を促進して活性化

an artificial substrata with covalentlyを誘起しやすかったためと考えられる。

i mmobi 1 i zed i nsu 1 in, Proc. が'atI. Acad.

バイオシグナル分子と合成高分子とのハイプ-49-Sc1:, !IS/4 93 3598-3601 1996