寿命延長に伴う解糖系代謝経路への転換と分子機構の解析

寺田ヤス早稲田大学理工学術院・先進理工学部・化学・生命化学科

緒ヒコ

泰比古教授

制限で、平均寿命を 30 〜 50％程度、酵母からヒトに言

人の老化の仕組みを知ることは健康的な一生を送る上至るまで延長できることが明らかになっている。最近にで大切なことである。現在、老化機構には、プログラムなって、カロリー制限は Sirt1 遺伝子産物を酵素的に活説とエラー（傷害蓄積）説の二つの有力な説が知られて性化して、寿命の延長をもたらすことが明らかになって1)いる 。プログラム説とは、成長、老化などの人の一生きた。Sirt1 が活性化されるとフォークヘッド遺伝子のの老化が遺伝的にプログラムされて、遺伝子が生物種とFOXO1 が活性化され、ラジカルスカベンジャーの Mn-しての寿命を決定しているという考え方である。細胞はSOD（スーパーオキシド・ディスムターゼ）遺伝子等が分裂寿命を持ち、テロメア領域の DNA の短縮が分裂回転写活性化され酸化ストレスを減少させる機構が明らか数をカウントする分裂時計として機能している。テロメになった。一方、ES 細胞やがん細胞では解糖系代謝がアが短縮しテロメア領域の構造が維持できなくなると、亢進し、逆にミトコンドリアでの酸化的リン酸化経路はチェックポイント・システムが作動し、p53 と、これにほとんど利用されていない 。酸化的リン酸化経路を利

よって転写が活性化される p21 によって、CDK( サイク用できるようにがん細胞のエネルギー代謝経路を強制的リン依存性キナーゼ ) の活性化が抑制され、増殖因子をに変換させると、酸化ストレスが生じ細胞寿命が短縮化

加えても老化細胞は DNA 合成期 (S 期 ) へ進行することされ細胞死が誘発されることが報告されている。ミトコができなくなる。しかし、多くの生物種では、体細胞でンドリアの酸化的リン酸化経路は酸化ストレスの発生源もテロメア領域を伸長するテロメラーゼが活性化されてであることから、ES 細胞やがん細胞の不死化細胞では、おり、テロメア短縮がなく老化が起きることが知られて老化を促進する酸化ストレスを発生させないように解糖おり、テロメア短縮だけでは老化の仕組みを理解するこ系代謝経路へ転換させていることを示唆しているが、ことはできない。一方、エラー説とは、身体の構成成分にれらの分子機構は余りよくわかっていない。解糖系代謝劣化が起こりその蓄積が老化を誘導するという考え方で経路への転換や、細胞を酸化ストレス抵抗性にするメカある。劣化や傷害の最も大きな因子は活性酸素（reactive

ニズムを明らかにする目的で私たちは発現クローニング

oxygen species：ROS）である。活性酸素は呼吸の際にという手法を用いて本研究を遂行した。

3)

発生するので酸素消費量と寿命とは密接に関係しており、単位体重当たりの一日の酸素消費量が多い動物ほど寿命は短い。また、線虫やマウスを酸素濃度の高い条件で育てると寿命が短くなることもよく知られている。
以上の研究から、老化機構はプログラム説もエラー説もどちらも正しく、同じ人でも生活環境の違いで寿命が違ってくることから遺伝的素因と生活習慣から来る酸化ストレスの両方が老化に関係している。食習慣と老化の問題は、カロリー制限による寿命延長の研究から明らか
2)になってきた 。カロリー制限がマウスの寿命延長に関係していることを示す 80 年以上前の報告から今日に至るまでの研究で、平均的な摂取カロリーの 70％程度の

図１

1

Random peptide library の合成法

寺

結
１.

田泰比古

ダムペプチド・ライブラリー（RPL）を作製した。図２

果では、RPL をヘルパーベクターと 293T 細胞に導入し遺伝子ライブラリーの作製

a）ランダムペプチド・ライブラリー（RPL）の作製て lentivirus に変換した。このウイルスライブラリーを図１に示すように、18 個のランダムペプチドをコーMEF（マウス胎児細胞株）に感染させると、mRFP の融ドする 54 個の塩基を合成し、CSII–lentivirus ベクター合蛋白質としてランダムペプチドは安定的に保持されるの mRFP の下流の stuffer 領域に挿入し、エレクトロポようになる（図３）。一方、スクリーニングの疑陽性の問

8

題は、Adenovirus-Cre を感染させ lox–P 領域で挟まれた

レ ー シ ョ ン 法 に て 10 以 上 の complexity を 持 つ ラ ン

mRFP の融合蛋白質を除去し表現型の回復をチェックす
Lenti virus
randompeptide
Libraryることで解決できた（図４）。
pCMV-VSV-Gb）マウス ES 細胞由来 cDNA ライブラリーの作製
マウス ES 細胞は、フィーダー細胞である MEF から遺伝子導入

pCMV-ō 8.2

Adenovirus-Cre
293 Ｔ細胞培養上清
Lentivirusu
random-peptidelibrary

図２

DNAmRFP+
random peptide
融合蛋白質

図４

Lentivirus library への変換

Cre-lox システムによる疑陽性の確認

H c t 116, H T- 29, Panc - 1（ヒト腫瘍細胞）Low ROS level
Lentivirus random-peptide libraryinfection

High ROS level
Adenovirus-Cre infection
Low ROS level1）導入した遺伝子の回収と配列決定
2）Y2H による細胞内標的の決定
図３

エネルギー代謝を変換させる Pepitide をコードする遺伝子のスクリーニングと細胞内標的の同定
2Cre寿命延長に伴う解糖系代謝経路への転換と分子機構の解析

分離した後、細胞を集め、RNA を回収した。

たり、エネルギー代謝経路を解糖系に転換すると細胞Total RNA 50ng と primer I（12uM）をアニーリング寿命が大幅に延長されることが知られている。そこで、した後、primer II（12uM）を加え、逆転写酵素による伸MEF の寿命延長を誘導する活性を持つペプチドをスク

長反応を 42℃、90 分の条件で行った。

リーニングする目的で、10 個の細胞に RPL を感染させ、

primer I :CGGGGTACGATGAGACACCATTTTTTTTTTTTT

薬剤耐性マーカーのピューロマイシンを培養液に加えラTTTTTTTVN

ンダムペプチド遺伝子を発現した細胞を選択した。約 2primer II:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGGGGG

週間後、ほとんどの細胞では細胞老化が起き増殖を停止

7したが、68 個の細胞株が増殖を停止せずクローン化で次に、以下の primer III と IV を 12uM ずつ加え、上きた。

記の反応液から 2ul を 100ul の反応液に加え、95℃、さ ら に、Adenovirus-Cre を 感 染 さ せ、mRFP と ペ プ

15 秒、65℃ 30 秒、68℃、6 分の条件で 20 回のサイチドの融合遺伝子を欠落させると、19 株の細胞で細胞クルで PCR 反応を行った。

老化や細胞死が誘導された。これらの細胞からゲノム

primer III:CGGGGTACGATGAGACACCA

DNA を回収し、これを鋳型として PCR 法にて mRFP とprimer IV:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTペプチド領域の増幅を行った。さらに、回収した遺伝子を元のベクターに挿入し、MEF に導入したところ、19PCR 反応液を CHROMA SPIN 1000 にて精製後、エ個のうち、12 個に寿命延長の活性化が見られた。この

タノール沈殿を行い、in-Fusion smart 法（Clontech）に中から、最も活性の強い A-23 を導入した MEF では、て、PCR で増幅した cDNA をレトロウイルスベクター活性酸素の検出化合物である H2DCFDA を用いて細胞内である pMX に挿入した。エレクトロポレーション法にの活性酸素量を測定したところ、親株に比べて明らかに7て 10 以上の complexity を持つ cDNA ライブラリーを低下していた（図５）。このことから、A–23 ペプチドは、作製した。マウス ES 細胞由来 cDNA ライブラリーをウミトコンドリアの酸化的リン酸化経路を低下させエネル

イルス産生細胞である PLAT–E 細胞に遺伝子導入し、ウ

ギー代謝経路の転換を行っているか、あるいは、活性酸イルスライブラリーを作製した。このウイルスベクター

素のスカベンジャーである Mn–SOD やカタラーゼを活も lox–P サイトを予め挿入してあるため、Adenovirus–性化させ活性酸素量を低減させていることが示唆されCre を感染させ lox–P 領域で挟まれ cDNA 領域を除去した。

表現型の回復をチェックできるように設計した。

次に、これらのペプチドの細胞側の結合蛋白質を明らかにする目的で、この中から、A–23 クローン由来ペプ

2.

チドの結合蛋白質を酵母 two–hybrid 法にてスクリーニ

MEF の細胞寿命を延長する遺伝子スクリーニングa）RPL を用いたスクリーニング

ングしたところ、転写因子の p53 の C 末領域の四量体

MEF は極めて酸化ストレス感受性が強く、継代数形成ドメインに結合することが明らかになった。A–23

10–15 回で細胞寿命をむかえることが知られているが、ペプチドを発現した細胞では DNA 損傷に対して p21 遺培養条件を 20％酸素分圧から 1 〜 3％程度に低下させ伝子の発現が親株に比べ低下していたことから、A–23control

A-23

MEF

図5

ペプチド導入による活性酸素レベルの低下
3

寺田

泰比古

ペプチドは p53 の転写活性を抑制していることが示唆

3 〜 6 倍程度に亢進した。Sirt1 は、自分自身のプロモーされた。他のペプチド遺伝子に関しても同様の解析を行

ター活性をポジティブフィードバック経路で活性化する

い、細胞内標的蛋白質を同定している。

ことが知られているため、導入したプロモーターが上流のシグナルに応答していることが明らかになった。これb）マウス ES 細胞由来 cDNA ライブラリーを用いたらの細胞株は、Sirt1 経路の活性化を誘導する遺伝子やスクリーニング化合物などのスクリーニングに利用できることが確認でマウス ES 細胞由来 cDNA ライブラリーを同様に MEFきた。に感染させ、5 × 106 スケールのスクリーニングを行った。疑陽性株を Adenovirus–Cre を感染させ排除したと考察ころ、8 個の cDNA が MEF に対して寿命延長の活性をMEF の細胞寿命を延長する A-23 ペプチドは、酵母持つことが明らかになった。現在、これらの cDNA の塩

Two-hybrid 法にて細胞内の p53 に結合していること基配列決定を行っている。

が明らかになった。この結合領域は P53 の C 末端部位にある 4 量体形成に必須の領域であることから、A-23ペプチドは細胞内の p53 機能を抑制することによって3. Sirt1 遺伝子と Mn-SOD 遺伝子の発現を誘導する遺伝子スクリーニング法の確立

MEF 細胞の寿命を延長していることが示唆された。最Sirt1 遺伝子の転写を誘導する遺伝子や、また、Sirt1

近 に な っ て、P53 は SCO2（synthesis of cytochrome C経路を活性化し Mn–SOD 遺伝子の転写を亢進させる遺oxidase2）の転写制御を行っていることが報告されてい伝子をスクリーニングする目的で、これらの遺伝子のプる。ミトコンドリア内膜にある COX 複合体のサブユニッロモーター領域をヒト線維芽細胞の Tig3 のゲノムからトである。

増幅した。

COXII の銅と結合部位に SCO2 は必要で、SCO2 の機

SIRT1 promoter: -1593 〜 –1bp能が欠損するとミトコンドリアでの酸化的リン酸化経路

SIRT1(F):aattattaatACTTCAGGTGATCTGTCCGCが遮断される 。従って、p53 機能の低下が起きると、

SIRT1(R):aattgctagcCTTCCAACTGCCTCTCTGGC

エネルギー代謝経路は酸化的リン酸化経路から解糖経路4)へ転換が起きる。また、Sirt1 遺伝子の発現を p53 は負
Mn-SOD promoter：-3340 〜 +71bpに調節していることから、p53 機能の低下は Mn-SOD

Mn-SOD(F) primer: attaatGGATCCTTACAATGGAGATAGTの発現を亢進させ、活性酸素レベルが低下させる。以上

GGGGCCAGの結果から、A–23 ペプチドは p53 機能の低下を介して、Mn-SOD(R) primer tctagaGCTAGTGCTGGTGCTACCGCTG

エネルギー代謝経路の転換と Sirt1 の遺伝子発現の亢進ATGCCGCCを誘導することで細胞内の活性酸素レベルを低下させていることが示唆された。今後、単離した他の遺伝子解析

Sirt1 プロモーター遺伝子は、p–EGFPC1 ベクターのを進め解糖系へのエネルギー代謝経路の転換を誘導する

CMV 領域を除去し、この部位に Ase1–Nhe1 の制限酵メカニズムの解明を行っていく。さらに、Sirt1 プロモー素を用いて挿入した。また、Mn–SOD プロモーター遺ター遺伝子や Mn–SOD プロモーター遺伝子の活性化を伝子も同様に、p–EGFPC1 ベクター挿入した。これらの誘導する遺伝子や化合物のスクリーニング系も確立でき遺伝子を、HeLa 細胞と不死可した Tig3 細胞に導入し、たので、これらの細胞株を用いてスクリーニングをス

G418 にて薬剤選択を行い、発現株を単離した。HeLa

タートする。

細胞では、Sirt1 と Mn–SOD のプロモーター活性は恒常的に上昇しているために、レポーターである EGFP の要

約

蛍光強度は強いが、Tig3 細胞株では、HeLa 細胞に比べ活性酸素（reactive oxygen species：ROS）は、細胞障て 1/5 〜 1/10 レベルで、Sirt1 の経路がほとんど活性害の大きな因子として知られている。細胞の寿命を延長化されていないことが示唆された。そこで、Tig3 細胞させる最も効果的な方法は、細胞内の活性酸素量を低下の発現株に Sirt1 蛋白質をコードする遺伝子と、FOXO1させることである。実際に、不死可した細胞では、エネ遺伝子を導入したところ、いずれも EGFP の蛍光強度がルギー代謝経路を解糖系に転換することで、ミトコンド
4寿命延長に伴う解糖系代謝経路への転換と分子機構の解析

リアの酸化的リン酸化経路から発生する活性酸素量を抑る遺伝子や化合物の探索が可能になった。

制している。また、最近の研究から、カロリー制限による寿命延長は Sirt1 の活性化によってもたらされ、Sirt1

謝辞のターゲットの一つが Mn–SOD の転写活性化である

本研究は、公益財団法人三島海雲記念財団の研究資金ことも明らかになった。Sirt1 が活性化されると、Mn–によってなされたものである。本研究は、私たちの従来SOD の発現が亢進し、細胞内の活性酸素量は低下する。の研究とは異なる新しい取り組みであり、新しい研究の私たちは、細胞内の活性酸素量の低下をもたらす解糖系セットアップのために貴財団の研究費を役立てることがへのエネルギー代謝経路の転換や、Sirt1 経路の活性化でき、ここに感謝の意を表します。今後、Sirt1 経路を経路を明らかにする目的で、発現クローニングという手活性化させる物質を探索し、食と抗老化という新しい観法を用いて遺伝子スクリーニングを行ったところ、ラン点から研究を展開させていきたいと考えております。

ダムペプチド・ライブラリー (RPL) では 12 個、マウス
ES 細胞由来 cDNA ライブラリーでは、8 個の cDNA を文単離した。得られたペプチドの中には、p53 を抑制す

1) Neumann AA, Reddel RR.: Nat Rev Cancer . 2:879-84,

ることによってエネルギー代謝経路を解糖系に転換して

2002

献2) Bordone L, Guarente L.: Nat Rev Mol Cell Biol. :6:298-305,いると考えられるものが得られた。

2005

また、Sirt1 や Mn–SOD の発現を調節する遺伝子や化

3) Vander Heiden MG et.al.,: Science :324:1029-33, 2009

合物のスクリーニング系も確立し、今後、エネルギー代

4) Matoba S, et.al.,:Science . 312:1650-3, 200

謝経路の転換のみならず、Sirt1 経路の活性化に関与す5