〔大学院博士課程（後期）奨学金贈呈者〕

食餌性体内時計同調の作用機序に基づいた時間栄養学によるリズム障害の改善効果

田原優

早稲田大学大学院先進理工学研究科

緒

博士課程

その人口は近年増加しており社会問題にも発展しつつあ言

哺乳類の体内時計は視床下部にある視交叉上核（SCN）る。またそういった人は、癌や循環器系疾患、メタボリッにより支配を受けている。各組織には時計遺伝子群が発クシンドロームといった各種疾患へのリスクも高いとい現しており、それ自身が負の転写フィードバック機構をう臨床データが数多く報告されている 。このような症構成する事で、遺伝子発現に強固な日内変動・日内リズ状は時計遺伝子のミュータントでも見られムを作り出している。また時計遺伝子は様々な遺伝子のワーカーは体内時計が乱れている事が予想できる。しか発現を調節しており、マイクロアレイ解析によると全遺し時計の乱れというものがどういうものかはまだ理解が伝子の約 10％が日内変動をもっている事が分かってい進んでおらず、振幅の減弱、リズムの崩壊、位相のずれ

4)

5, 6)

、シフト1）などより具体的な状況を知る必要がある。そこで本研究

体内時計の調節（同調）には「外界の光」が一番効果

は、シフトワークモデルマウスの作製、そしてその時計的であり、光の情報は網膜、視神経を通り直接 SCN へ機能の評価、また免疫機能の評価を行った。また、シフ伝わる。それに対し、当研究室では「食餌」が光よりもトワークモデルマウスの時計を評価するにあたり、それ強い同調作用がある事を報告しており、食餌はインスリぞれの個体により時計の位相や乱れが異なる事が予想さン分泌を介して直接末梢時計に影響を与えている事が明れたので、１匹のマウスの時計を評価する測定系も新たる。

らかになった2, 3)。当研究室は食餌による時計同調、まに開発した。

たは時間を考慮した食餌方法などを「時間栄養学」という分野を立ち上げて研究しており、本研究では「リズム実障害に対していかなる食事方法が体内時計を介しての治験

方法

シフトワークモデルマウスの作製には、明暗サイクル療として役立つか」を、マウスを用いて検討した。

を一週間おきに８時間前進・後退させたものと、一日３リズム障害の中でもより身近なものとして、交代勤務時間おきに明暗サイクルが変わるものの２種類を用意し（シフトワーカー）による慢性的な時差ぼけが挙げられ、た。時計の評価には、インビボ・イメージングシステム

図１

インビボ・イメージングシステムを用いた発光リズム測定手順1

田原

優と時計遺伝子 Per2 にルシフェラーゼをノックインした結

PER2::LUC マウスを用いて、図１のような測定手順によ１. インビボ・イメージングシステムを用いた１個体のり腎臓・肝臓・顎下線の３部位の発光リズムを１日かけ果マウス体内時計測定法の確立て測定する系を立ち上げた。免疫機能の評価は B16 メ

４時間おきにマウスを麻酔し、ルシフェリンを皮下投

ラノーマ細胞を C57/BL6J マウスの皮下に移植し、移植与、その後８分で背中側、10 分でお腹側を撮影し通常癌の成長速度を測った。まだ、LPS（リボポリサッカラ飼育下のマウスで図２のような測定結果を得た。 Per2イド）の投与による死亡率も評価した。

遺伝子はどの組織でも発現しているので体全体が光ってZT11ZT19

ZT23

ZT3

ZT7

ZT11
各組織の発光リズム（n=3）
腎臓

腎臓
肝臓顎下腺

ZT11 ZT15ZT19ZT23

ZT3

ZT7

顎下腺
肝臓
図２PER2 :: LUC マウスによるインビボ時計評価（通常飼育マウス）

制限給餌（ZT14–ZT22）

腎臓

制限給餌の影響

肝臓顎下腺

ZT11 ZT15

ZT19

ZT23

ZT3

腎臓
肝臓顎下腺

自由摂食

ZT7

制限給餌（ZT2–ZT10）

ZT2–10ZT14–22

腎臓
肝臓10顎下腺

ZT11 ZT15 ZT19 ZT23
図３ZT31520

ピーク時刻［ZT］

ZT7

食餌時間の制限による発光リズムの位相変化（上：夜間の給餌、下：昼間の給餌）
225

食餌性体内時計同調の作用機序に基づいた時間栄養学によるリズム障害の改善効果

しまうはずだが、今回測定した部位は血流量も多いためマウスの明暗サイクルを反転させて２週間後に測定するか発光が強く、組織の特定ができたので評価の対象としと、ちゃんと反転した発光リズムが得られた。また、食て採用した。また、このマウスは元は C57BL/6J だった

餌時間の制限が末梢時計を変化させる事も分かっているが、黒い体毛が光を吸収してしまい発光を測る事ができので、昼間のみまたは夜間のみの食餌制限によりマウスなかったので、ICR と掛け合わせて白いマウスに置換し、の時計がその食餌時刻に同調しているかをこの測定系で発光を容易に測定できるようにした。それぞれの組織で確認した（図３）。また、この測定法はとても安定しておの発光リズムの位相（ピーク時刻）はコサイナー法により、誰が測定しても同じ結果を作り出す事ができた。

り検定した。結果、どの組織の位相も ZT19 付近（ZT はZT0 を明期開始時刻とする）であった。この位相は Per2

２. シフトワークモデルマウスの作製と、免疫機能評価のタンパク質量の日内変動と同様であった。ルシフェ

明暗サイクルを８時間シフトしたマウスの行動リズム

ラーゼによる発光は温度に依存すると言われているが、は、５日ほどかけて新しい位相に同調した。その明暗イメージング撮影中の体温を測定した結果、麻酔によりシフトを前進・後退３サイクル行った後、LPS（7.5mg/低下しさらに測定台が 37 度一定に保たれているために、kg,i.p.）を腹腔内投与した結果、通常飼育マウスと比べ昼夜の体温差はほぼ考慮しなくてもよい変動しかない事て死亡率が高くなった（図４）。また、メラノーマ細胞のが分かった。測定系の正当性をさらに証明するために、増殖も速く、シフトワークのモデルとして免疫機能の〈通常飼育群〉〈LPS(7.5mg/kg,i.p.) 投与後の生存曲線〉
120

生存率（％）

10080

cont60shift

40200012243648607284

経過時間（hr）〈シフトワーク群〉〈B16 メラノーマ cell の増殖〉
intactshift worker

3000

Tumor size ( mm2 )

2500
2000
1500
1000
500
0
day14

day19

day24経過時間（Day)

図４

シートワークモデルにおける免疫機能低下
3day29田原優低下を示した（図４）。一方、明暗を３時間おきに変化さ考察せたマウスは行動が暗期に集中する個体と、周期を約交代勤務、夜勤等のシフトワーカーにおける体内時計23.5 時間でフリーランさせる個体の２パターンが現れの乱れを明らかにするため、本研究では２種類のシフトた。前者は明暗サイクルに同調した行動を示したというワークモデルマウスを作製した。明暗サイクルの８時間

意味では時差ぼけしていないが、後者は同調できずに独前進・後退によるモデルはより人に近いモデルであり、自の周期で行動していることから、慢性的な時差ぼけ状そのマウスを用いて免疫機能の低下を見出す事ができ態であると予想できる（図５）。

た。今後、このモデルの時計機能を評価すると共に、今回実験が間に合わなかった食事による治療という課題に挑戦したいと考えている。それにあたり、食餌時間を暗３. シフトワークモデルマウスの時計の乱れ
上述のシフトワークモデルマウス（３時間明暗サイク期に固定する事で、明暗サイクルが８時間前進した際ル）を２ヵ月その環境で飼育した後、インビボ・イメーに、食餌時間も前進するので、より早く同調できると考ジングシステムで発光リズムを測定した。その結果、コえている。もう一方の３時間おきの明暗サイクルによるントロールと同じような綺麗な発光リズムがそれぞれのモデルは、行動リズムが明暗に同調できず、慢性的に時組織で確認できた（図５）。また振幅は腎臓において若干差ぼけ状態になっていると考えられ、時差ぼけの負荷を減弱していたが、他の組織ではコントロール群と変わら施すには良いモデルができただろう。また、このモデルなかった。この発光リズムは行動が暗期に同調した個体でさえしっかりとした発光リズムが見れた事は想定外でも、フリーランした個体も変わらなかった。

あり、今後の「乱れた時計」の認識を見直すべきデータと言えるだろう。

〈行動が明暗サイクルに同調した個体〉
腎臓
肝臓
顎下腺
LDLDLDLD 振幅（％）
80604020〈行動がフリーラン ( 時差ぼけ ) した個体〉

0腎臓

肝臓顎下腺

コントロールLDLDLDLD

図5

シフトワークモデル（3 時間明暗）の発光リズム
4食餌性体内時計同調の作用機序に基づいた時間栄養学によるリズム障害の改善効果

本研究において確立した１個体の末梢時計測定法は、また、マウスの末梢組織の体内時計を一個体で測定する

簡便かつ安定で、とても有用な手法であり、体内時計分系を世界で初めて確立した。この系を用いて、シフトワー野のさらなる発展に貢献できるものと考えている。また、

クモデルマウスの体内時計を測定した結果、腎臓で振幅今回の実験結果より、末梢時計は意外にも安定に正常なの低下が若干見られたが、他はほぼ正常に近い日内変動時計を刻んでいる事が分かった。しかし今回の条件におを示した。

ける中枢時計は全く評価できておらず、今後はさらに時計の乱れについて中枢時計と末梢時計の位相のずれにつ謝辞いて検討していきたいと考えている。というのは、時計本研究の遂行にあたり、公益財団法人三島海雲記念財の乱れの原因として「中枢時計と末梢時計の位相のずれ、団より学術奨励金のご支援を賜りました。心より感謝い情報伝達の遅れ」が体にとって不調をきたすのではないたしますと共に厚く御礼申し上げます。また、研究を遂かという考えもあるからである。今回シフトワークモデ行するにあたりご指導頃きました柴田教授に御礼を申し

ルマウスの末梢時計は正常に近く見えたが、実は中枢時上げます。

計との位相差がある可能性も十分に考えられるので、今後検討する必要がある。そして発光量の少ない脳を撮影

文対象にするにあたり、頭蓋骨の切除やカメラの感度、露1） Vollmers C, et al,: Proc Natl Acad Sci U S A , 106,21453–

光時間などを検討し、現在プロトコルの改良を行ってい21458, 2009.

献2） Tahara Y, et al,: J Biol Rhythms , 25,9–18,2010.
3） Tahara Y, et al,: J Biol Rhythms , 26,230–240,2011.

るところである。

4） Schernhammer ES, et al,: J.Natl Cancer Inst, 93, 1563–

要

約1568,2001.
5） Fu L, et al,: Cell , 111, 41-50,2002.
6） Kondratov RV, et al,: Genes Dev , 20, 1868–1873,2006.

明暗サイクルを変化させることによりシフトワーク・慢性時差ぼけのモデルマウスを作製し、その免疫機能の低下を LPS 投与、移植癌の増殖スピードで確認した。

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