T 細胞レセプタートランスジェニックマウスモデルを用いた食物アレルギーの機構解明

ハチ八ムラ

村東京大学大学院農学生命科学研究科食の安全研究センター

緒サト敏

シ志准教授

は T 細胞に生存分化シグナルを伝達する樹状細胞が重言食物に対して過剰あるいは異常な免疫応答が原因で要な役割を果たすと推測される。我々は OVA23–3 とは起こる食物アレルギーは、患者の大部分が乳幼児であ異なる TCR トランスジェニックマウス DO11.10 を用いり、乳幼児が特定の食物を摂取できないことから、栄養て、経口免疫寛容誘導における樹状細胞の役割について学的、精神的な問題、さらには保育、教育機関の給食に検討してきた。この DO11.10 マウスにおいては、食物おいて、切実な問題となっている。しかしながら、そのアレルギー症状を発症することなく経口免疫寛容が誘導発症機序はまだ不明な点が多く、また多くの患者が加齢とともに寛解するものの、その機序についても明らかとされる。DO11.10 において経口免疫寛容を誘導した場合は、パイエル板中の IL–10 産生性 CD11b+ 樹状細胞なっていない。当研究グループでは、T 細胞抗原レセプが誘導されることを既に明らかにしている 。一方で、ター（TCR）トランスジェニックマウス OVA23–3 を利用

OVA23–3 アレルギーマウス樹状細胞は、Th2 細胞の誘して、卵白飼料の摂取だけで誘発することができる、食導活性が高い、あるいは免疫抑制機能を有する制御性 T物アレルギーモデルマウスの開発に成功している。OVA細胞の誘導活性が低いなどの特徴があることが推測され23–3 は卵白アルブミン特異的 T 細胞抗原レセプター遺る。そこで、DO11.10 マウスにおける経口免疫寛容誘伝子を発現したトランスジェニックマウスで、体内の卵導時の樹状細胞をより詳細に解析し、OVA23–3 マウス

白アルブミン（OVA）特異的 T 細胞の頻度が極めて高く、における樹状細胞と比較を試みる。

OVA に対して過剰な T 細胞反応が誘発される。このマ2）制御性 T 細胞の解析

4)

ウスでは、卵白飼料を摂取させることにより血中の IgE
1)

アレルギーの発症には、免疫抑制機能を有する制御性

2)抗体価が上昇し 、さらに小腸炎が誘発される 。また、T 細胞の誘導不全、機能不全が関わる可能性がある。そ発症において、腸管免疫系における Th2 型応答（インターこで、本モデルにおいて、制御性 T 細胞の誘導、機能ロイキン（IL）–4 産生性 T 細胞による応答）が、重要なについて、制御性 T 細胞のマーカー分子 Foxp3 の発現要因と考えられる。本研究では、このモデルマウスを用に着目して解析する。

いて、食物アレルギーの発症機構を解明し、抗アレルギー機能を有する機能性食品開発のための有用な知見を得る

実ことを目的とする。

1. 実験動物

特にこれまで当研究グループにおいて成果を得られて験方法

BALB/c マウス、DO11.10 TCR トランスジェニック

きた以下の点に着目する。

マウス、RAG–/–DO11.10 TCR トランスジェニックマウ

1）樹状細胞の解析

スおよび、RAG–/–OVA 23-3TCR トランスジェニックマ

未感作 T 細胞に抗原提示を行い、Th1、Th2、制御ウスを用いた。DO11.10 TCR トランスジェニックマウ

性 T 細胞を誘導する主要な抗原提示細胞が樹状細胞でスおよび、OVA 23–3TCR トランスジェニックマウスは、ある。一方で、食物アレルギーの抑制機構として知ら卵白アルブミン（OVA）の 323–339 残基領域に相当するれているのが、腸管を介して取込まれる食品タンパクペプチド（OVA323–339）を I–A 拘束的に認識するが、質抗原に対してはたらく免疫抑制機構である「経口免遺伝子使用、構造の異なるαβTCR 遺伝子がそれぞれ導疫寛容」である。経口免疫寛容における免疫応答低下

入されており、RAG–/– マウスは T 細胞、B 細胞の遺伝d3)

は T 細胞依存性であることが知られているが 、これに子再編成に必要な遺伝子を欠損しており、内因性抗体・
1

八村

敏

志

また RAG–/–DO11.10 TCR トランスジェニックマウス

TCR が発現しない。

および、RAG–/–OVA 23-3TCR トランスジェニックマウ
ス由来樹状細胞の解析においては、PE 標識抗 CD11c 抗2. 抗原の経口投与体（HL3）および FITC 標識抗 B220 抗体（RA3–CB2）を用

DO11.10 TCR トランスジェニックマウスに経口免疫寛容を誘導するために、粗精製 OVA を 200 mg/ml のいて染色し、フローサイトメーターにて解析した。

濃度で溶解した水溶液を作製し、７日間自由摂取させた。また、Foxp3 の発現を検討する実験では、RAG–/–

6. CD4T 細胞中の細胞内 Foxp3 発現測定

OVA23–3 マウスおよび RAG–/–DO11.10 マウスに 20%回収した細胞の表面 CD4 分子を APC 標識抗 CD4 抗体（RM 4–5）で染色後、細胞内 Foxp3 の染色を PE anti-

卵白タンパク質飼料を 7 日間経口摂取させた。

mouse/rat Foxp3 Staining Set （eBioscience）付属のプロトコルに従って行った。

3. 脾臓、腸間膜リンパ節からの CD4T 細胞、樹状細胞の調製CD4T 細胞、樹状細胞の調製は MACS 法を用いて行っ

7. 樹状細胞との共培養により誘導される T 細胞のた。マウスより脾臓、腸間膜リンパ節を摘出し、それ細胞内 Foxp3 測定
RAG–/–DO11.10 TCR トランスジェニックマウス脾臓
由来の CD4+ T 細胞、および RAG–/–DO11.10 TCR トラ

ぞれをコラーゲナーゼ溶液で処理し、細胞懸濁液より
CD11c マイクロビーズまたは CD4 マイクロビーズ、および MACS 分離カラムを用い、CD4T 細胞を CD4+ 細胞

ンスジェニックマウスまたは、RAG–/–OVA 23–3 TCRとして、樹状細胞を CD11c+ 細胞として分離した。

トランスジェニックマウス腸間膜リンパ節由来樹状細胞を、0.1μM の OVA323–339 および 2 ng/ml TGF–βの存在下培養した。72 時間後、上記の方法により CD4 T

4. 経口免疫寛容状態における CD4T 細胞の細胞の Foxp3 発現をフローサイトメーターにて測定し抗原特異的応答の解析
CD4+ T 細胞とマイトマイシン C 処理した BALB/c 脾た。

臓細胞を 96 ウェル平底プレートに分注し、0–1μM のOVA323–339 ペ プ チ ド（ISQAVHAAHAEINEGR） の 存

結

在下 5 %FCS–RPMI 培地中で培養した。培養開始から

1. 経口免疫寛容状態における樹状細胞の解析

48 時間後に培養上清を回収し、培養上清中に含まれる果

まず、DO11.10 TCR トランスジェニックマウスを用

IL–2 量を ELISA 法により測定した。

いて経口免疫寛容誘導の確認を行った。本マウスに抗原（OVA）を経口投与した際に、全身性の免疫応答を司る脾臓および腸管免疫系の腸間膜リンパ節において、T 細胞

5. 樹状細胞の表面分子の測定
DO11.10TCR トランスジェニックマウス由来樹状細応答がどのように変化するかを IL–2 産生を指標に解析

胞を以下の抗体および２次試薬で染色し、フローサイトメーター（BDLSR）にて CD11c+ 細胞中の CD11b 発現と、した ( 図１)。その結果、抗原の経口投与により T 細胞各細胞表面分子発現との関係を解析した。

(pg/ml)・FITC 標識抗 CD11c 抗体（N418）

5000

・PE 標識抗 CD11b 抗体（M1/70）

4000

・ 次のビオチン標識抗体のうち一種と PE–Cy5 標識スト

IL-2 産生量SPL CD4
MLN CD4

3000

レプトアビジン

2000d

ビオチン標識抗 I–A 抗体（AMS–32.1）、

1000

ビオチン標識抗 CD80 抗体（16–10A1）、ビオチン標識抗 CD86 抗体（GL–1）、0

ビオチン標識抗標識抗 CD103 抗体（2E7）、ビオチン標識抗 PD–L1 抗体（M1H5）、

図１

ビオチン標識抗 PD–L2 抗体（TY25）

0246DO11.10 TCR トランスジェニックマウス脾臓（SPL）、
腸間膜リンパ節（MLN）における経口免疫寛容誘導

28 (day)

T 細胞レセプタートランスジェニックマウスモデルを用いた食物アレルギーの機構解明の IL–2 産生が低下し、経口免疫寛容が誘導されること発現する樹状細胞の割合が、抗原の経口投与とともに増が確認された。

加することが示された。そこで、免疫寛容誘導に関わる

次 に、 経 口 免 疫 寛 容 に お け る 樹 状 細 胞 の 変 化 を表面分子について、CD11b の発現とどのように相関しDO11.10 TCR– トランスジェニックマウスを用いて解析ているかを調べた。その結果、腸間膜リンパ節においては OVA の経口投与により、PD–L1+CD11b+ 樹状細胞 ,した。まず、未成熟な表現型を示す樹状細胞は免疫寛容を誘導することが知られているため、未成熟樹状細胞でPD–L2+CD11b+ 樹状細胞 , CD103+CD11b+ 樹状細胞の発現が低下している、MHC class II, CD80, CD86 の発現割合が増加することが示された（図２）。

強度を測定したが、これらの分子の発現は経口投与において変化は見られなかった（データ省略）。そこでさら以上の結果より、抗原の経口投与により腸間膜リンパ節において特定の CD11b+ 樹状細胞の細胞集団（サブに樹状細胞サブセットの分類に用いる代表的な表面分子セット）の割合が増加し、このサブセットが経口免疫寛を調べた結果、腸間膜リンパ節において CD11b 分子を容誘導に重要である可能性が示唆された。

図２

経口免疫寛容状態（卵白アルブミン投与）の DO11.10 TCR トランスジェニックマウス由来
腸間膜リンパ節樹状細胞における細胞表面分子発現
3

八村

敏

次 に、RAG–/–OVA23-3 マ ウ ス に お け る 樹 状 細 胞志

いてはほとんど誘導が認められなかった（図４）。の サ ブ セ ッ ト に つ い て 検 討 し、RAG–/–DO11.10 マ ウ

そこで、それぞれの樹状細胞によるＴ細胞の Foxp3スと 比 較 し た。 その結果、腸間膜リンパ節にお け る
CD11c+B220+ 細胞が著しく少ないことが明らかになっ誘導について細胞培養実験にて検討したところ、どちらた（図３）。

た。( 図５)。

2. 経口免疫寛容およびアレルギーモデルマウス

考の樹状細胞についても、誘導能力を有することが示され察における Foxp3 発現制御性 T 細胞の誘導

以上、本研究により、次 に 卵 白 飼 料 を 摂 取 し た RAG–/–DO11.10 マ ウ ス、RAG–/–OVA23-3 マウスぞれぞれにおける Foxp3 の発（1） 経 口 免 疫 寛 容 状 態 の 腸 間 膜 リ ン パ 節 に お い て、CD103+CD11b+ 樹状細胞、PD–L1+CD11b+ 樹状細胞、現について解析した。その結果、DO11.10 においては、CD4+T 細胞に強い発現が認められたが、OVA23–3 におらかとなった。また食物アレルギーモデルマウス OVA

PD–L2+CD11b+ 樹状細胞の割合が増加することが明23–3 において、樹状細胞の細胞集団に特徴があること(%)
18が示唆された。

CD11c+ 細胞中の B220 の発現（2）食物アレルギーモデルマウス OVA 23–3 においては、16抗原の摂取による腸間膜リンパ節における Foxp3 発現14誘導が不全であることが示された。一方で、細胞培養実12験においては、OVA 23–3 マウス樹状細胞の Foxp3 発10現誘導能に障害は認められなかった。

8以上の結果から、食物アレルギーの発症および抑制に6は腸管組織の樹状細胞が重要な役割を果たす可能性が示4された。また制御性 T 細胞の誘導の不全が関わること2が示唆された。ただし樹状細胞の関与の機序については、0さらなる検討が必要であると考えられた。
DO11.10

図３

樹状細胞、制御性 T 細胞の免疫抑制機能を増強する

OVA 23-3

食品素材を見出すことができれば、その摂取により食物RAG-/-DO11.10、RAG-/- OVA23-3 マウス腸間膜リンパ節における CD11c+ 細胞中の B220 の発現

アレルギーの予防、軽減が期待されると考えられる。このような素材は、抗アレルギー機能を有する機能性食品の創出につながると期待される。

Foxp3+T CD4T 細胞
(%)
10(%)

9188167146125104836422100DO11.10
図４共培養 CD4T 細胞における Foxp3 の発現

DO11.10

OVA 23-3

卵白飼料を投与した RAG-/-DO11.10、RAG-/- OVA23-3
マウス CD4 Ｔ細胞における Foxp3+ 発現

図５RAG-/-DO11.10、RAG-/- OVA23-3 マウス由来樹状細胞のFoxp3 誘導能4

OVA 23-3

T 細胞レセプタートランスジェニックマウスモデルを用いた食物アレルギーの機構解明

謝以上の結果から、食物アレルギーの発症および抑制に辞本研究を遂行するにあたり、研究助成を賜りました、は腸管組織の樹状細胞が重要な役割を果たす可能性が公益財団法人三島海雲記念財団に深謝申し上げます。

示された。また制御性 T 細胞の誘導の不全が関わることが示唆された。本モデルを用い、樹状細胞、制御性 T

要細胞の免疫抑制機能を増強する食品素材を見出すことが約

TCR トランスジェニックマウスモデルを用いた解析

できれば、その摂取により食物アレルギーの予防、軽減により、食物アレルギーの抑制機構である経口免疫寛容の誘導時に、腸間膜リンパ節において特定の CD11b+が期待されると考えられた。

樹状細胞の集団が増加することが明らかになった。また文

食物アレルギーモデルマウス OVA 23–3 において、樹

1) K. Shida et al: J. Allergy Clin. Immunol. 105, 788-795,状細胞の細胞集団に特徴があることが示唆された。さら2000.
2) H. Nakajima-Adachi et al.: J. Allergy Clin. Immunol. 117,に、OVA 23–3 マウスにおいては、腸間膜リンパ節にお献1125-1132, 2006,

ける Foxp3 発現誘導が不全であることが示された。一3) W. Ise et al.: J. Immunol. 175, 829-838, 2005.
4) A. Shiokawa et al.: Immunol. Lett. 125, 7-14, 2009.

方で、細胞培養実験においては、OVA 23–3 マウス樹状細胞の Foxp3 発現誘導能に障害は認められなかった。

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