iPS 細胞の造血幹細胞への分化能を応用した先天性皮膚疾患の治療

北海道大学病院皮膚科

藤田靖幸

Epidermolysis bullosa (EB) is a group of genodermatoses that cause blister formations from the congenital abnormalityof anchor proteins between the epidermis and the dermis. There have been several strategies for the treatment of EB, and sofar, cell therapies are the most promising approach because of the potential of systemic effects. We have proved that stem
cell therapies, including bone marrow transplantation, hematopoietic stem cell transplantation, can ameliorate the phenotypeand survival prognosis in the junctional EB model mice that lack type XVII collagen (Col17). In this study we explore more
efficient approaches of stem cell therapies for EB, including intramedullary transplantation, mesenchymal stromal/stem cellinfusion, application of induced pluripotent stem cells (iPSCs), and investigate factors in association with transdifferentiationfrom bone marrow-derived stem cells into keratinocytes.

１．緒的な治療効果を得るために，幹細胞移植の時期および方法

言の最適化検討，皮膚分化因子を併用した造血幹細胞移植，表皮水疱症は，皮膚の表皮 - 真皮境界部を構成する蛋白

骨髄内投与などのより効率の高い投与方法，および安全にに先天的な欠損ないし構造異常が生じることで同部位の脆施行しうる間葉系間質細胞療法や，iPS 細胞を応用した幹弱性を生じ，機械的刺激によって容易に水疱や潰瘍を形成細胞療法の有用性を検討する．本研究を遂行することによする疾患である．現時点で対症療法以外に確立した治療法

り，難治性疾患である表皮水疱症への新たな治療戦略を立は存在せず，特に重症型では感染症や脱水，二次的な悪性てる上で重要な知見が得られるものと考える．

腫瘍などを生じ，生後数年以内に死亡するものも存在する．

２．実

表皮水疱症などの重症遺伝性皮膚疾患において近年研究されている治療法としては，遺伝子治療，蛋白補充療法お験

2. 1. 分化誘導

よび細胞療法がある．このうち細胞療法は，正常遺伝子をES/iPS 細胞の分化誘導は Kitajima らのプロトコールに有する細胞を患者に投与して欠損蛋白の産生を促す治療法

準じて行った 3）．Lhx2 遺伝子を組み込んだレトロウィルである．全身性の効果が期待できること，生着により長期ス ベ ク タ ー を PLAT-E 細 胞 に transfection し， 培 養 後 に間の治療効果が望めること，造血幹細胞移植など現代の医上清を濃縮して Lhx2 レトロウィルス液を調製した．ES/療レベルで施行可能な治療法があり倫理的障壁が低いこと，

iPS 細胞を OP9 細胞と 10cm ディッシュ内で 5 日間共培養などの利点が考えられる．

し，mesodermal clusters を作製した時点で Lhx2 遺伝子

重症遺伝性皮膚疾患の治療開発に於いては，疾患モデルを形質導入させた．さらに 10 日間OP9 細胞と共培養を続け，マウスの利用が必須である．我々の研究室では近年，新血球系前駆細胞である c-kit+, sca-1+, lineage -population

規表皮水疱症モデルマウスとして，皮膚構成蛋白の 17（KSL 細胞）の出現をフローサイトメトリーにて確認した．

1）型コラーゲン（COL17）欠損マウスの作成に成功した ．
COL17 欠損マウスは従来の表皮水疱症モデルマウスと異2. 2. 細胞移植なり，成体まで生存する特徴を有しており，各種治療実験骨髄移植及び造血幹細胞移植として，ドナーとなる成体のモデルとして有用である．そして我々は，COL17 欠損

Col17 欠損マウスに 6Gy 放射線照射を行い骨髄機能を非破マウスにおいて実際に骨髄移植療法が予後改善および臨床壊的処置した後に，5×106 個の GFP+ トランスジェニック

症状の改善に寄与することを示した 2）．

マウス由来の骨髄由来細胞ないし 5×103 個の造血幹細胞

本研究は，上記表皮水疱症モデルマウスを用いて，効率を経尾静脈投与した．新生仔マウスに対しては 2.5Gy 放射線照射ののちに，5×106 個の骨髄由来細胞ないし 5×103

Treatment of congenital severe skindisorders with hematopoietic stem cells
obtained from induced pluripotent stemcells（iPSCs）
Yasuyuki Fujita
Department of Dermatology, Hokkaido
University Hospital

個の造血幹細胞を眼窩静脈叢を経由して静脈投与した．
MSC 療法として，成体 Col17 欠損マウス，COL17 レスキューマウス（マウス由来 Col17（以下 mCol17）を欠損す
るが、ヒト由来 COL17（以下 hCOL17）を発現することで表皮水疱症発症を回避したマウス 1））および Col17 欠損新生仔マウスの背部に，用手的な水疱形成ないし 4 mm パン− 105 −コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

チ皮膚メスを用いて全層皮膚欠損を作製した上で，GFP+ト6

む非血球細胞として GFP+CD45−細胞（ドナー由来）およランスジェニックマウス由来の MSC 1×10 個を経静脈投び GFP−CD45−細胞（レシピエント由来）を各々ソーティ

与，腹腔内投与ないし水疱/創傷周囲への局所投与を行った．

ングした．これら細胞から RNeasy Mini Kit（Qiagen）をES/iPS 細胞移植として，ドナーとなる成体 COL17 レス

用いて total RNA を抽出し，Ambion WT Expression Kit

キューマウスおよび Col17 欠損マウスに放射線照射を行っ（Applied Biosystems）を用いて cRNA を増幅・精製した．

た後に，1×104 個の Ly5.1 由来の造血系誘導済み ES/iPS

逆 転 写 反 応 に よ り cDNA を 合 成 し，GeneChip®Mouse細胞を，サポーター細胞として成体 Col17 欠損マウス由来

Gene 1.0 ST Array（Affymetrix）を用いてマイクロアレ5の全骨髄細胞 5×10 個とともに経静脈投与した．

イプローブとハイブリダイズさせた．GeneChip Scanner

2. 3. COL17 発現解析（AGCC）を使用してシグナル測定，データを取得し，3000 7G お よ び GeneChip Command Console®Software
骨髄移植・造血幹細胞移植においては，移植 4 週間後にGeneSpring GX にて解析を行った．

末梢血フローサイトメトリー解析にてドナー血球細胞の生３．結着を確認，背部皮膚に 4 mm パンチ皮膚メスを用いて全層皮膚欠損を作成し，3 週間後に上皮化した部位の皮膚を採取して検討に用いた．MSC 療法においては細胞療法後 3週間で皮膚を採取し，検討した．

果3. 1. 幹細胞移植の時期および方法の最適化検討
我々は，成体 Col17 欠損表皮水疱症マウスに対して骨髄由来細胞ないし造血幹細胞を経尾静脈移植し，臨床的な上記で得られた皮膚組織は①凍結切片作成後にマウス改善を見いだしている 2）．現実的には表皮水疱症患者は特Col17 モノクローナル抗体（1：2,500, KT4.2）による蛍光抗に重症例では成長前に死亡，ないし有棘細胞癌などの発体法③電子顕症により移植処置が困難になることが予想される．また，④表皮抽出物おCol17 欠損マウスは成体まで成長するものが自然経過では② total RNA 抽出および定性 RT-PCR

微鏡によるヘミデスモソーム構造観察

よびマウス Col17 モノクローナル抗体（KT4.2）を用いた全体の約 20 ％にとどまり，成長前に死亡する個体が多い．

Western blotting

そのためまず我々は，可能な限り生後早い段階での介入にを施行し，Col17 の発現を検討した．

よる治療可能性を検討した．生後 3 日以内の新生仔 Col17

2. 4. マイクロアレイ解析

欠損マウスに対して経眼窩静脈による骨髄移植を施行した

造血幹細胞移植を行いドナー細胞の生着を確認した

ところ，成体まで成長したマウスは 4/34 匹（11.8 ％）にとCol17 欠損マウスに対して 4 mm パンチ皮膚メスを用いてどまり，皮膚における Col17 発現も免疫染色・RT-PCR・全層皮膚欠損を作成し，3 週間経過して上皮化した皮膚組

Western blotting で確認できなかった（図 1A）．生存した織を採取した．ディスパーゼⅠ（エーディア）を用いて真Col17 欠損マウスの末梢血フローサイトメトリー解析で皮／表皮を分離し，さらに 0.25 % トリプシンで表皮細胞は，生着したドナー由来の GFP+ 血球細胞の割合は 12.8±2．

を分離させた後，FACS Aria を用いて表皮角化細胞を含2 % に過ぎなかった．また，臨床症状においても生後 28

図 1 Col17 欠損表皮水疱症マウス新生仔に対する造血幹細胞移植（A）Col17 欠損表皮水疱症マウス新生仔に対する造血幹細胞移植療法の治療成績（B, C）新生仔移植療法成功例．
生後 1 ヶ月の時点（B）では正常マウスとほぼ同様の臨床像であり，極めて良好な治療効果が得られたが，生後 2 ヶ月より急激にびらんの形成が強くなった（C）．

− 106 −iPS 細胞の造血幹細胞への分化能を応用した先天性皮膚疾患の治療日の時点ではほぼ正常と同様であったものの，その後 1 ヶ皮膚においても GFP 陽性細胞が観察されなかった（それぞ

月で急激に水疱びらんが多発するようになった（図 1B,C）．

れ n=5）．以上より本実験系においては，骨髄内投与は移この急激な臨床症状の変化の原因として，現病の表皮水疱植方法としてメリットが少なく，妥当性に乏しいことが判症の悪化や，GVHD の発症などが可能性として考えられた．

明した．

新生仔マウスに対する骨髄移植療法が困難であることが確認されたため，次に，GVHD の発症可能性が低く，容3. 2. 皮膚分化関連因子の検索

易に細胞数を得ることが可能である MSC の治療可能性を我々は過去に，骨髄由来細胞や MSC に発現するケモカ検討した．新生仔 Col17 欠損マウスに対して GFP トランインレセプターおよびケモカインによる相互作用が皮膚創

スジェニックマウス由来 MSC の腹腔内投与（n=11）および傷部への細胞動員を促進し，表皮角化細胞を含むドナー由水疱内への皮内投与（n=24）を行ったが，全例で生後 18 日

来皮膚構成細胞の出現を亢進させることを報告している．

以内に死亡し，未治療群との生存率に有意差を認めなかっ

そこでより直接的に，表皮水疱症マウスへの骨髄移植後にた（図 2）．

皮膚に出現するドナー由来およびレシピエント由来の表皮先天性皮膚疾患においては，白血病など血液悪性疾患細胞における遺伝子発現の差違を解析し，骨髄由来細胞のにおける造血幹細胞移植とは異なり，造血細胞を完全置表皮角化細胞への分化関連因子の検索を試みた．Col17 欠換する必要性が高くない．その一方で，Col17 欠損表皮水損マウスに骨髄移植を行い，生着後皮膚から GFP+CD45

疱症マウスへの骨髄移植実験において，造血系細胞の置換−細胞（ドナー由来表皮角化細胞）および GFP−CD45−細率（キメラ率）とドナー由来皮膚構成細胞の出現率との間に胞（レシピエント由来）を各々ソーティングし，マイクロアは正の相関が観察される（data not shown）．そのため，皮レイ解析で mRNA 発現の差違を網羅的に検討した．合計

膚障害をきたさない前処置でかつ，より生着率の高い移23446 プローブが解析可能であり，そのうち遺伝子発現に植手技が望ましい．また，MSC 移植系においては，尾静2.0 倍差以上を認めたプローブが 57 同定された．既知の脈投与では投与細胞の 80% が肺にトラップされるとされ，遺伝子でドナー由来角化細胞で発現が亢進しているものとMSC から皮膚構成細胞へ分化させるにあたり効率が相当して，Mmp13, Cxcl10, Cxcl9 などが検出された（図 3）．

低いことが推測される．これらの背景を勘案して，次に我々は，造血幹細胞・MSC を Col17 欠損表皮水疱症マウ

3. 3. ヒトMSCsの表皮水疱症治療への応用可能性の検討

スへ骨髄内投与する試みを行った．まず，成体 Col17 欠損

我々は過去にマウスにおいて，MSCs が皮膚構成細胞へ表皮水疱症マウスへ６Gy の放射線前処置の後，GFP+ 骨分化しうることを示し，MSCs の静脈投与によって表皮水髄細胞を骨髄内移植した．4 週間目における CD45+ 陽性疱症マウスにおいて欠損蛋白が発現しうることを示した．

細胞の生着キメラ率は 87.9±3.9%（n=5）であり，尾静脈

ヒト MSCs においてはチリのグループで，健常人の兄弟骨投与群の 72.1±5.5%（n=12）と比較して生着率に有意差を髄から採取・培養した MSCs を栄養障害型表皮水疱症患者認めた（p<0.05）．しかし，免疫染色による基底膜部 Col17の病変皮膚に局所注射することで，治療効果を有したといの発現割合に明らかな差を認めなかった．また，GFP 陽う報告があり，本邦でも MSC 局所投与の臨床試験が開始

性 MSC を成体 Col17 欠損表皮水疱症マウスおよび野生型されている．そこで，全身的作用に期待するという観点か

C57BL/6 へ骨髄内移植した群においては，移植 4 週間後

ら我々は，ヒト細胞が生着しうる免疫不全 NOG マウスにの時点でドナー GFP 由来の MSC は骨髄内に観察されず，おいて，ヒト MSC の静脈投与がヒト基底膜蛋白の産生を図 2 Col17 欠損新生仔マウスに対する間葉系間質細胞（MSC）
腹腔投与療法の治療成績− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

もたらすかを検討した．NOG マウス（n=4）に全層皮膚欠6ではこれらの蛋白発現は確認されなかった．COL7 をはじ損を作製し，直後に尾静脈よりヒト MSC 1×10 cells を投めとした他の皮膚基底膜蛋白の発現は，免疫染色・RT−与し，上皮化した皮膚を採取して検討したところ，免疫染PCR ともに確認できなかった．

色で MHC classⅠ 陽性細胞が真皮に散見され（図 4A），RT−PCR にても human GAPDH mRNA が検出された．4 匹

3. 4. ES/iPS 細胞による治療の検討

中 2 匹において human COL17，1 匹で human BPAG1 の次に我々は，ES および iPS 細胞の造血系細胞への分mRNA の発現がわずかに確認された（図 4B）が，免疫染色化誘導による造血幹細胞移植の治療可能性を検討した．

図 3 移植後角化細胞のマイクロアレイ解析
移植療法後の表皮水疱症マウス皮膚よりドナー由来（GFP+）/ レシピエント由来（GFP-）の角化細胞を抽出し，遺伝子発現解析を行った．合計 23446 プローブが解析可能であり，そのうち遺伝子発現に 2.0 倍差以上を認めたプローブが 57 同定された．

図 4 NOG マウスに対する MSC 療法の検討（A）ヒト MSC 投与後の NOG マウス皮膚の免疫組織学的検討．正常皮膚（右）ではCOL17 が基底膜部に線状に観察され，表皮角化細胞および線維芽細胞等の細胞膜にHLA classI が発現している．ヒト MSC 静脈投与後の NOG マウス皮膚では，真皮に散在性に HLA classI 陽性細胞が観察された．
（B） ヒ ト MSC 投 与 後 の NOG マ ウ ス 皮 膚 の RT-PCR 解 析．4 匹 中 2 匹 に human
COL17, 1 匹で human BPAG1 mRNA の発現が確認された．

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Ly5.1 由来の ES 細胞ないし iPS 細胞に Lhx2 遺伝子を導入

我々は，骨髄移植をはじめとした造血幹細胞移植療法が疾し，OP9 細胞と共培養することで血球系前駆細胞（KSL 細患モデルマウスにおいて治療法になり得るという知見を背胞）への分化を確認，さらに血球系細胞への分化を in vitro

景として，より有用な細胞療法の可能性を検討した．

で確認した（図 5A, B）．このようにして得られた細胞を成表皮水疱症に対する骨髄移植療法（造血幹細胞移植療

体 COL17 レスキューマウスに移植したところ，移植後 4法）は，移植された造血幹細胞，あるいは間葉系間質細週間後の時点での末梢血キメラ形成率は ES 細胞移植群で胞やそれらの細胞から分化した前駆細胞等が，何らかの6.32±2.53 %（n=5），iPS 細胞移植群で 12.2±5.26 %（n=10）

機序により皮膚構成細胞へと変化し，機能性を有する角であった．定性 RT-PCR において計 15 匹中，iPS 細胞由来化細胞として欠損蛋白を補充するという発想を基礎に置

造血幹細胞移植を行った 2 匹，ES 細胞由来造血幹細胞移

く．この角化細胞への変化においては，幹細胞ないし前植を行った 1 匹において mCol17 の発現が確認された（図駆細胞が自身の持つ可塑性を介して角化細胞へ分化する5C）．しかしながらこれらのマウス皮膚において，免疫染transdifferentiation という考え方と，幹細胞ないし前駆細色でmCol17 の基底膜への線状沈着は確認できなかった（図胞，あるいはマクロファージなどの成熟細胞が角化細胞と5D）．また，電子顕微鏡においてヘミデスモソームの成熟融合（fusion）することで，既存の角化細胞が欠損蛋白の産化も確認できなかった．

生能を獲得するという二つの機序が考えられる．我々が検４．考討した範囲では，疾患モデルマウスに性別の異なるドナー

察骨髄細胞を移植した実験系において FISH で角化細胞の X/表皮水疱症は生下時より全身皮膚に異常をきたし，感染Y 染色体を検討したところ，fusion した細胞は観察されな症や慢性貧血，悪性腫瘍など種々の合併症を併発して予後かった 2）．また，マウス PAM212 細胞をフィーダーとし不良となることも多い重症先天性皮膚疾患である．今回てヒト造血幹細胞を共培養したところ，皮膚基底細胞に特図 5 iPS/ES 細胞の血球系誘導（A）血球分化誘導後の FACS 解析．ES 細胞（左），iPS 細胞（右）ともに造血系前駆細胞（KSL）が同定された．
（B）
さらに OP9 細胞と共培養することで，Giemsa 染色で分葉核を有する好中球を含む成熟血球細胞が多数出現した．
（C）ES および iPS 細胞由来 KSL 細胞を COL17 レスキューマウスに移植したところ，一部のマウスにおいてmCol17 mRNA の発現が定性 RT-PCR にて確認された．
（D）同移植マウス皮膚を免疫染色したが，mCol17 の基底膜への沈着は確認されなかった．

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コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

異的に発現する K14 陽性細胞，すなわちヒト角化細胞へ，と比較して，移植において十分な末梢血キメラ形成を得ら

4）fusion を介さずに分化した ．同様の検討は，ヒト表皮水れていないことが挙げられる．血球誘導の効率的な方法の疱症患者へ造血幹細胞移植を行った例においても示されて検討や，移植細胞数の検討などをさらに重ねていく予定でいる．これらの知見からは少なくとも，造血幹細胞から角ある．

化細胞へ直接分化した経路が存在すると考えられるが，現iPS 細胞の重症先天性皮膚疾患への応用は，正常遺伝子

実的には fusion の経路を介して機能性角化細胞へ変化したを有する iPS 細胞を角化細胞へ分化，表皮シートを作製し細胞も少なからず含まれると考えられる．

それを植皮と同様に貼布する方法や，毛組織およびそれに今回我々は，より効率的な移植時期・方法を目指して新含まれる毛幹細胞・表皮幹細胞へ誘導して病変部皮膚へ移生仔疾患マウスへの骨髄移植・MSC 移植および骨髄内投入する方法などが考慮されるが，我々は重症先天性皮膚疾与による造血幹細胞移植を検討したが，いずれも通常の成患が全身皮膚を侵すという観点から，全身性の効果が少な体マウスへの conventional な骨髄移植療法と比較して優位

い治療回数で期待できる造血幹細胞移植の可能性を検討し性を見いださなかった．しかしながら，骨髄内投与においている．これら再生医療の分野においては，臨床応用に繋ては移植後 4 週の早期の時点で生着キメラ率が高く，臨床がる安全性・効率を備えた新規治療戦略を考慮し検討を継効果に有意差は無かったものの注目すべき知見であると考続する必要がある．

える．キメラ率の高い個体ほど骨髄細胞由来の皮膚構成細胞の出現割合は高くなる傾向が示唆されており，患者への（参考文献）

臨床応用という観点からは，小児例で施行されている骨髄

１） Nishie W, Sawamura D, Goto M, Ito K, Shibaki

内移植は通常の静脈投与による造血幹細胞移植と比較してA, McMillan JR, Sakai K, Nakamura H, Olasz E,

表皮水疱症の治療においても成績が向上する可能性が示唆

Yancey KB, Akiyama M, Shimizu H. Humanization ofされる．

autoantigen. Nat Med 13:378-383, 2007.

MSC を含む骨髄由来細胞の皮膚への遊走を促進し，皮２）Fujita Y, Abe R, Inokuma D, Sasaki M, Hoshina

膚構成細胞への分化を促進させる因子として，我々はケD, Natsuga K, Nishie W, McMillan JR, Nakamura

モカインの一種である CTACK/CCL27 や SLC/CCL21 のH, Shimizu T, Akiyama M, Sawamura D, Shimizu

可能性を示している 5, 6）．また，Tamai らは MSC の皮膚

H. Bone marrow transplantation restores epidermal

構成細胞への促進因子として HMGB-1 が重要な役割を果

basement membrane protein expression and rescues

たしていると報告している．我々はさらに critical な因子

epidermolysis bullosa model mice. Proc Natl Acad Sciの存在を検討するべく，in vivo において，マイクロアレU S A 107: 14345-14350, 2010.

イ法を用いて骨髄由来とドナー由来の角化細胞における３）Kitajima K, Minehata K, Sakimura K, Nakano T,遺伝子発現パターンを比較したところ，Mmp13, Cxcl10,

Hara T. In vitro generation of HSC-like cells from

Cxcl9 などが検出された．MMP13 は創傷皮膚において血murine ESCs/iPSCs by enforced expression of LIM-

管新生や角化細胞増殖に関わることが知られており，また

homeobox transcription factor Lhx2. Blood 1 1 7:3 7 4 8-CXCL9/10 は炎症性ケモカインとして生理的意義が検討さ

3758, 2011.

れつつある．表皮水疱症マウスや患者に置ける，これらの４）Fujita Y, Inokuma D, Abe R, Sasaki M, Nakamura因子の関与を今後検討することで，表皮水疱症に対する細H, Shimizu T, Shimizu H. Conversion from human

胞療法に新たな知見が加えられることが期待される．

haematopoietic stem cells to keratinocytes requires

また，造血幹細胞移植においては時に移植細胞数の低下

keratinocyte secretory factors. Clin Exp Dermatol
37:658-664, 2012.

による生着不全や，MHC mismatch による治療困難例が存在するが，iPS 細胞を応用した造血幹細胞移植はこれら

５）Inokuma D, Abe R, Fujita Y, Sasaki M, Shibaki A,の問題点を克服できる可能性がある．本研究ではその端緒

Nakamura H, McMillan JR, Shimizu T, Shimizu H.

として，Lhx2 遺伝子導入を併用した ES/iPS 細胞の血球系

CTACK/CCL2 7 accelerates skin regeneration via

分化誘導を行い，in vitro で造血系前駆細胞（KSL 細胞）おaccumulation of bone marrow derived-keratinocytes.

よび分化血球細胞を確認した．これらの細胞を COL17 レ

Stem Cells 24: 2810-2816, 2006.

スキューマウスに移植したところ，一部のマウスにおいて

６）Sasaki M, Abe R, Fujita Y, Ando S, Inokuma D,

mRNA レベルでの欠損皮膚基底膜蛋白の発現が確認されShimizu H. Mesenchymal stem cells are recruited

たものの，免疫染色や電子顕微鏡レベルでの回復は確認さ

into wounded skin and contribute to wound repair

れなかった．これはいくつかの理由が考えられるが，そのby transdifferentiation into multiple skin cell type. J

１つとして，conventional な骨髄 / 造血幹細胞移植モデル

Immunol. 180: 2581-2587, 2008.

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