乳酸菌による多発性硬化症治療への試み

中辻裕

大阪大学医学部神経内科緒司

講師

回投与し免疫することにより作成した。SJL/J マウスで言は proteolipid protein PLP（139–151） ペ プ チ ド と CFA

多発性硬化症（multiple sclerosis, MS）は中枢神経系の代表的炎症性脱髄疾患であり、若年期に発症した後、長を投与し作成した。

期に渡って再発・寛解を繰り返しながら増悪する難病で実験に使用した乳酸菌（Pediococcus acidilactici R037,ある。欧米で非常に多く世界的に若年成人の身体障害をLactobacillus delbruekii LAB4） は 培 養 後 遠 心 洗 浄 し、来す筆頭疾患である。
日本では従来希少疾患であったが、80℃にて 30 分間熱殺菌を行い、その後凍結乾燥を行い近年その患者数が特に日本において急増している。そこ使用まで 4℃にて保存した。乳酸菌の予防的効果を検証で急増の原因を究明し、適切な予防・治療法を講じるこするために、免疫 2 週間前から実験終了まで乳酸菌群とが急務である。MS の発症要因として遺伝要因と環境（R037, LAB4）には菌 4 mg/day を、コントロール群に要因が考えられるが、短期間で遺伝要因は不変であるこは PBS を投与し、EAE 重症度評価、脊髄の組織学的解析、とから、環境要因の変化が日本における MS 急増につな免疫学的解析を行った。

がっていると推定される。

ま た 治 療 的 効 果 を 検 証 す る た め に 乳 酸 菌 R037 をMS の 病 態 に 関 し て は、 主 に モ デ ル 動 物 で あ る 実

C57/BL6 マウスに免疫後 11 日目より投与を開始し、

験 的 自 己 免 疫 性 脳 脊 髄 炎（experimental autoimmune

EAE の重症度を評価した。

encephalomyelitis, EAE）を用いた研究により CD4 陽性
IL–17 産生 T 細胞（Th17 細胞）や制御性 T 細胞（Treg 細胞）

2. 組織学的解析1)が重要な役割を果たしていることが知られている 。一免疫後 22 日目に C57/BL6 マウスを 4%PFA で還流固方、近年腸管粘膜下層、腸管膜リンパ節における Th17定後、凍結切片を作製し、HE 染色にて脊髄への細胞浸細胞、Treg 細胞に腸内細菌叢が影響を及ぼし、腸内環潤の評価を行った。

境の変化に伴う免疫動態の変化が炎症性腸疾患のみならず膠原病をはじめとする様々な自己免疫性疾患に重要

3. サイトカイン測定2)な役割を果たしていることが示唆されている 。そこで

EAE 誘導後の全身の免疫動態を調べるため C57/BL6

我々は患者数増加の原因と推定される環境要因の変化のマウス免疫後 11 日目の所属リンパ節、脾臓より MNCs

中でも食習慣の変化が特に重要ではないかと考え、炎症(mononuclear cells） を 採 取 し MOG ペ プ チ ド で 72 時性腸疾患や食物アレルギーなどにおいて免疫動態に好影

間 再 刺 激 を 行 い 細 胞 上 清 の IL–10、IL–17、IFN–γ を響を与えることが示唆されている乳酸菌を用い、MS のELISA を用いて測定した。 また乳酸菌による腸管免疫モデル動物である EAE に対する効果と作用機序の解析の変化を明らかにするためナイーブマウスに乳酸菌をを行った。

2 週間経口投与し、腸管膜リンパ節、脾細胞を CD3/
CD28 抗 体 に て 72 時 間 刺 激 時 の 細 胞 上 清 中 IL–10、

方IL–17、IFN–γの産生を測定した。

法

1. EAE 作成と乳酸菌投与
EAE は C57/BL6 マウスでは myelin oligodendrocyte

4. FACS 解析

glycoprotein MOG（35–55）ペプチドと完全フロイント

C57/BL6 マウスに乳酸菌を 2 週間投与し、腸管膜リアジュバンド （CFA）を投与後、百日咳毒素を腹腔内に 2ンパ節、脾臓における Treg 細胞 （CD4 陽性 Foxp3 陽性
1中辻裕司T 細胞）、CD4 陽性 IL–10 産生 T 細胞の比率を FACS 解いて明らかな浸潤細胞の抑制が認められた（図 2）。これ

析を用いて調べた。

らのことより乳酸菌 R037 の予防的投与は中枢神経系への細胞浸潤を軽減し EAE の症状を軽減させることが示結された。

果

1. 乳酸菌 P. acidilactici R037 予防的投与の EAE に対する効果

2. 乳酸菌 R037 の抗原特異的なサイトカイン産生に免疫 2 週間前から実験終了まで C57/BL6 マウスに乳対する影響酸菌群として R037 もしくは LAB4 を、コントロール群

乳酸菌 R037 の抗原特異的なサイトカイン産生に対すとして PBS を投与したところ、乳酸菌群において EAEる影響を調べるために、C57/BL6 マウス免疫後 11 日のピーク時の症状の軽減を認めた（図 1A）。次に SJL/J目の鼠径リンパ節、脾細胞を採取し、MOG ペプチドでマウスにおいても同様の検討をおこなったが、やはり症再刺激を行い 72 時間後の細胞上清のサイトカインの状の軽減を認めた（図 1B）。EAE の症状軽減を組織学的測定を行った。R037 投与群において鼠径リンパ節でに検証するために脊髄への炎症細胞浸潤を HE 染色を用は IL–17 の有意な産生低下を認め、脾細胞では IL–17、いて細胞浸潤の評価を行ったが乳酸菌 R037 投与群におIFN–γ共に有意な産生低下を認めた。IL–10 に関しては

図１

P. acidilactici R037 の予防的経口投与は EAE を軽減する
A. C57/BL6 マウスでは R037 投与群において EAE のクリニカルスコアの有意な低下を認めた
B. SJL/J マウスにおいても R037 投与群においてピークスコアの軽減を認めた

図２

Pediococcus acidilactici R037 投与群において中枢への細胞浸潤は減少している
A. コントロール群

B. R037 群
2

乳酸菌による多発性硬化症治療への試み両群で有意な差は認めなかった。このことより乳酸菌

3. 乳酸菌 R037 の CD4 陽性 IL-10 産生細胞に対する影響

R037 の予防的投与は抗原特異的な炎症性サイトカイン

R037 の経口投与のみによる免疫動態への影響を調産生を抑制することが示唆された（図３）。

べ る た め に、 乳 酸 菌 R037 を 2 週 間 投 与 し た 時 点 で
C57/BL6 マウスから腸管膜リンパ節、脾細胞を調製し、CD3/CD28 抗体にて刺激を行い 72 時間後の細胞上清のサイトカイン測定を行った。IL–17、IFN–γの産生は 2群間で有意な差を認めなかったものの、IL–10 の産生は乳酸菌群において有意な上昇が認められた。
次に代表的な制御性 T 細胞である Foxp3 陽性 T 細胞の比率を調べたが腸管膜リンパ節、脾臓での比率では差を認めなかった。しかし CD4 陽性 IL–10 産生 T 細胞の比率を調べたところ腸管膜リンパ節、脾細胞において増加を認めていた（図４）。
4. 乳酸菌 R037 の治療的投与の EAE に対する効果
R037 の 治 療 的 投 与 に よ る 効 果 を 評 価 す る た め に
C57/BL6 マウスに対し発症直後である免疫 11 日目より
R037 を投与し、重症度を評価した。ピークスコアでは

図３

有意な差は認めなかったものの、area under the curve

乳酸菌 R037 の予防的投与は所属リンパ節（LN）、脾細胞（Spleen）(AUC) では投与後 2-7 日において乳酸菌群でコントローからの抗原特異的 IL–17, IFN–γ産生を低下させる

ル群に比べ有意な低下を認めた（図５）。

考察

本研究において乳酸菌 P. acidilactici R037 経口投与
が EAE の症状を予防的、治療的に軽減することが明らかになった。他の乳酸菌である Lactobacillus delbruekii
LAB4 株では効果は認められなかった。更に R037 の経図4R037 投与により腸管膜リンパ節（MLN）、脾細胞（Spleen）での図5

CD4 陽性 IL–10 産生細胞が増加する

R037 の治療的投与も EAE を軽症化させる
3中

辻裕

司

口投与の効果は異種の SJL/J マウスを、異なる抗原 PLP性硬化症と腸内環境には密接な関係があると考えられるペプチドで誘導した EAE に対しても確認できたことか

3,4)

らマウスの種によらず抗原非特異的と考えられる。てより効果的な菌株の探索や菌体成分などの検索を行う。今後詳細な分子メカニズムを検討することによっ

近年様々な自己免疫性疾患や多発性硬化症においてことにより、腸管免疫を利用した多発性硬化症に対するIL–17 の病態への関与を示唆する報告が数多く見られてより安全で安価な治療法を開発してゆきたいと考えていいる。今回の実験において、EAE 発症時における所属リる。

ンパ節、脾細胞の抗原特異的刺激による IL–17 産生はR037 投与群において低下していた。R037 投与により要約全身での炎症反応が抑制され、中枢神経系への細胞浸潤

乳 酸 菌 P. acidilactici R037 の 経 口 投 与 は CD4 陽 性の低下も認められた。またナイーブマウスへの乳酸菌経

Foxp3 陰性 IL–10 産生細胞を誘導し、抗原特異的な炎

口投与のみにより腸間膜リンパ節、脾細胞の MNCs の症性サイトカインの産生を抑制し EAE を抑制すること

CD3/CD28 抗体刺激による細胞上清中の IL–10 産生増が示唆された。乳酸菌を用いた腸管免疫の制御は多発性加が認められた。更に CD4 陽性細胞における IL–10 産硬化症の有効な治療法となりうることが示唆された。

生細胞比率の増加を認めていたが、CD4 陽性 Foxp3 陽性細胞の比率は乳酸菌群、コントロールの 2 群間では謝辞差がなかった。制御性 T 細胞としては CD4 陽性 Foxp3

最後に公益財団法人三島海雲記念財団よりご助成頂き陽性細胞や LAP (lactency-associated protein) 陽性細胞、ましたことにより、上記研究を推進することが可能とな

CD4 陽性 Foxp3 陰性であり IL–10 を産生する Tr–1 細りました。ここに厚く御礼申し上げます。なお、本研究報

胞が知られている。今回 Foxp3 陽性細胞や LAP 陽性細告書の内容は現在投稿準備中であることを申し添えます。

胞の比率は乳酸菌群、コントロール群において差を認めず IL–10 産生細胞のみに差を認めたことから CD4 陽性

参

Foxp3 陰性 IL–10 産生細胞が R037 経口投与により誘1) Bettelli E et.al, : Nat Immunol , 8, 345-350, 2007.

考文献2) Strober W et.al, : Immunity , 31, 377-388, 2009.

導され、炎症に抑制的に働いていると考えられる。

3) Yokote H et.al, : Am J Pathol 173: 1714-1723, 2008.

先行研究として抗生剤による腸内細菌の除去や

4) Ochoa-Reparaz J et al, : J Immunol 185: 4101-4108,

Bacteroides fragilis の菌体成分である Polysaccharide A

2010.

が EAE に効果的であったとの報告があり、EAE、多発4