皮膚組織において紫外線傷害を制御するユビキチン化システムの解析

北海道大学大学院医学研究科生化学講座

畠 山

鎮 次

Ataxia-telangiectasia (AT) is an autosomal recessive genetic disease characterized by immunological deficiencies,
neurological degeneration, developmental abnormalities and an increased risk of cancer. Cells isolated from AT patientsshow hypersensitivity to ionizing radiation, cell cycle abnormalities and aberrant cytoskeletal organization. The ataxiatelangiectasia group D (ATDC/TRIM29) gene was identified by its ability to suppress radiosensitivity of the cell line
AT5BIVA from the D group complementation group of the AT. Recently, we showed that TRIM29 suppresses apoptosis
induced by UV irradiation in HCT116 cell lines. In this study, we performed biochemical analysis of TRIM29 to clarify thefunction of TRIM29 under UV-irradiation or other DNA damages.

１．緒により、AT の異常による表現型を相補する遺伝子として

言

TRIM 29（ATDC）遺伝子が同定されている 1 , 2）。TRIM 29

紫外線（UV）は太陽から放射される電磁波であり、波長（ATDC）遺伝子は、染色体 11 q 23 に存在し、588 アミノ酸の長いものから、UVA、UVB 及び UVC の３種類に分けをコードしている 3）。TRIM 29（ATDC）タンパク質はジられる。日焼けで皮膚が赤くなり炎症を起こすのは UVB

ンクフィンガーモチーフを有し、tripartite motif（TRIM）であり、シミやソバカスの原因にもなる。さらに皮膚のタ ン パ ク 質 の 亜 系 の ひ と つ と し て も 報 告 さ れ て い る。

DNA を傷つけ、後に皮膚癌を生じさせるのも主に UVB とTRIM タンパク質群の多くは、RING ドメインを有してお考えられている。UVA は、波長が長いため、UVB より皮り、ユビキチンリガーゼ E 3 活性を示すことが推測される

膚の深部（皮膚真皮）まで到達するため、皮膚のシミやたが、TRIM 29 の構造的特徴としては、RING ドメインを欠るみの原因になると考えられている。紫外線を受けた皮膚損している。したがって、ATDC は酵素機能欠損型とし細胞の遺伝子（DNA）は通常 DNA 修復酵素系によって治て生理的にドミナントネガティブ的な機能をしている可能されるが、長年にわたり遺伝子を傷つけられることで修復性がある。最近においては、皮膚を含む扁平上皮細胞に特の際にミスを生じることがある。このようにして突然変異異的に発現し、かつ UV 照謝などで誘導される p 53 の活性が起きると、皮膚の扁平上皮細胞は老化を起こしたり、悪制御をつかさどるタンパク質として、ユビキチン化関連酵性細胞（癌細胞）へと変化してしまうことがある。

素 TRIM 29 が報告されている 4 , 5）。

毛細血管拡張性運動失調症（AT : Ataxia telangiectagia）

ユビキチンは 76 個のアミノ酸からなるタンパク質で、は協調運動不能、毛細血管拡張、感染症などを引き起こす

タンパク質の翻訳後修飾（ユビキチン化）に用いられ、タ遺伝性の免疫不全疾患であり、ATM（AT mutated）がそンパク質分解、DNA 修復、翻訳調節、シグナル伝達などの原因遺伝子である。AT は常染色体劣性遺伝性疾患で臨さまざまな生命現象に関わる。ユビキチン化はミスフォー

床的には進行性の小脳運動失調（ataxia）を起こすのみでルドタンパク質や不要になったタンパク質を細胞から除去なく、毛細血管拡張（telangiectagia）、精神遅滞、免疫不全、するためにも重要な役割を持っており、このシステムはタ

早老症状、発癌率の増加など幅広い症状を呈する。実際、ンパク質の品質管理と呼ばれている。

AT 患者由来の細胞は放射線高感受性や染色体不安定性を本申請において、皮膚細胞で TRIM 29 が DNA 傷害防御示すことが知られている。今日，癌治療の領域において、やタンパク質品質管理に関していかなる機能を有している

ATM タンパク質（リン酸化酵素）が細胞周期のチェックかを検証することを進めた。本研究成果により、ユビキチポイント制御に重要な役割をしていることが判明している。

ン化という新たな防御システムが皮膚の老化に関すること

さらに、AT 患者由来の細胞を使用した細胞遺伝学的実験が明らかとなれば、今までとは異なった角度から開発される薬剤や化粧品の発想につながることが期待できる。

２．実
Analysis of ubiquitin system regulating
UV-damage in skin
Shigetsugu Hatakeyama
Department of Biochemistry, Hokkaido
University Graduate School of Medicine

2 .1

験

TRIM 29 結合タンパク質の同定のための遺伝学的及び生化学的スクリーニング
皮 膚 扁 平 上 皮 細 胞 特 異 的 TRIM タ ン パ ク 質 で あ る
TRIM 29 に注目し、それの結合タンパク質の同定を試みた。

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コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

TRIM 29 結合タンパク質を同定するために、酵母ツーハイ

細胞生物学的実験を行った。

ブリッド法もしくはプルダウン法による結合タンパク質の３．結精製による質量分析解析を行った。
酵母ツーハイブリッド法：TRIM 29 の全長もしくは基質認

3 .1

果

TRIM 29 結合タンパク質の同定

識部位と考えられるＣ末端側の部分を bait として使用し、TRIM 29 の機能を解明するために、新たに TRIM 29 に各種の酵母内発現ライブラリーから、結合タンパク質の結合するタンパク質の同定を試みた。酵母ツーハイブリッ

cDNA の同定を試みた。

ドを使用したスクリーニングでは新たに注目すべき遺伝子プルダウンアッセイを用いた質量分析解析（図１）：結合の 同 定 に は で き な か っ た。 次 に 生 化 学 的 解 析 に よ りタンパク質同定のため、まずは FLAG タグ付き TRIM 29

TRIM 29 結合タンパク質の同定を試みた。まず、レトロウタンパク質を恒常的に発現した HeLa- S 3 細胞株を樹立

イ ル ス 発 現 ベ ク タ ー 系 を 使 用 し て、FLAG タ グ 付 き のした。安定発現細胞株樹立に際して、レトロウイルス発TRIM 29 の遺伝子が恒常的に発現する HeLa - S 3 細胞を樹現ベクター系を利用した。FLAG タグを使用した高度に立した。この細胞が樹立できたことで、安定的に TRIM 29調整された方法により、結合タンパク質を分離した。

が発現する状態が実現でき、HeLa - S 3 細胞は浮遊培養が可

SDS-PAGE によりタンパク質を分離し、バンドとして能なので大量培養が可能となった。次に TRIM 29 抗体を確認できるものはMALDI - TOF/TOF を使用してタンパ使って、細胞質及び核分画のどちらに発現しているかを調ク質を同定する。もしくは SDS-PAGE のバンドに関係べたところ、TRIM 29 のほとんどが核に発現していることなくゲルを数 10 に均等に切り出し、すべてを ESI- LC-が判明した（図２）。したがって、この安定発現細胞を大MS/MS により解析する。

量培養し、核分画のみを選択的に精製し、その溶解液に対して抗 FLAG 抗体を使用して FLAG-TRIM 29 及びその結2 . 2 扁平細胞株を使ったTRIM 29 に関する生化学的及び細胞生物学的解析

合タンパク質を網羅的に精製した（図１）。精製したタン

TRIM 29 による細胞機能に対する影響を調べるために、ると、結合タンパク質と思われる多数のバンドが検出されパク質を SDS-PAGE により分離し、銀染色を試みた。すた（図３）。質量分析により同定されたタンパク質を機能以下の実験を行った。
扁平上皮細胞株である HaCaT 細胞、PAM 細胞、HSC 2

的に分類すると、DNA 修復に関係するタンパク質複合体細胞、HSC 4 細胞及び CAS - 22 細胞等を使用した。特にの構成成分に分類されるものとクロマチンリモデリング

RNAi によってノックダウンさせた SiHa 細胞株を作製し、（染色体構造変化）の関与するタンパク質複合体の構成成

酵素 - 基質対応から推測される細胞機能に対して検討を試分に分類されるものであることが判明した（図４）。いく

みた。実際には、フローサイトメーターを使用し TRIM 29

つかの同定されたタンパク質に関しては、TRIM 29 と実際による細胞周期もしくは細胞死、及び細胞増殖等に関するに細胞内で結合してするかを確認した。

図１

TRIM29 結合タンパク質の同定のフローチャート

図２

細胞内分画による TRIM29 の発現部位の確認

図３− 144 −

精製された TRIM29 結合タンパク質の銀染色

皮膚組織において紫外線傷害を制御するユビキチン化システムの解析

図４

図５ TRIM29 遺伝子をノックダウンさせた
SiHa 細胞株の樹立。抗 TRIM29 抗体を使ったイムノブロット解析で発現を確認した。

同定された TRIM29 結合タンパク質の機能の可能性

3 . 2 扁平細胞株を使ったTRIM 29 に関する生化学的及び細胞生物学的解析
これまでの報告から、TRIM 29 は癌抑制遺伝子 p 53 依存性に機能することが示唆されている。そこで、扁平上皮細胞株の中で p 53 が野生型、かつ TRIM 29 が発現している細胞株として、SiHa 細胞株を細胞生物学的解析に利用した。まず、レトロウイルス発現系による shRNA を使用し、TRIM 29 遺伝子の発現をノックダウンさせた SiHa 細胞株を樹立した（図５）。この細胞株に対して、抗癌剤シスプラチン（CDDP）を作用させた際の細胞周期及び、アポトーシス細胞の比率を解析した。すると、対照細胞株と比較して、TRIM 29 ノックダウン細胞株では CDDP に対して、アポトーシスを起こす細胞数が増加していることが判明した（図６）。したがって、CDDP を含む DNA 傷害剤に対し

図６ TRIM29 ノックダウン SiHa 細胞株に CDDP を作用させた際の FACS 解析て、TRIM 29 は防御的な働きを有していることが示唆された。

最近、申請者らは TRIM 29 が p 53 のアセチル化酵素 Tip 60

４．考と結合することで、p 53 の機能を抑制することを示唆する

察結果を報告した 5）。これまでの内外の報告を総合的に考え皮膚細胞の老化の防御システムの研究を進める際に、ると、TRIM 29 は癌遺伝子的機能、すなわち外来刺激によDNA 傷害に対して異常を示す表現型をもつ疾患群をモデる細胞死（放射線感受性）を抑制する機能を有しているこルとして想定することは有効である。皮膚扁平上皮細胞株とが考えられる。紫外線等の刺激（傷害）に対して、一過に TRIM 29 は高発現しており、EGF 刺激により発現が減性に上皮細胞を防御する機構として TRIM 29 は重要な働

6）少することが知られている 。最近においては、Wnt シグきをしていると考えられるが、持続的に機能し続けると癌ナルにおける Dvl に TRIM 29 が作用することで、Wnt シグ化を誘導させることになる可能性もあるので、細胞自体のナルを活性化させることが報告されており、さらには膵臓傷害レベルに合わせた発現が重要になると思われる。また、

7）

癌と TRIM 29 との関係が示されている 。また、TRIM 29

EGF などの刺激に対して TRIM 29 は発現量変化を受ける

は癌抑制遺伝子産物 p 53 に結合しその機能を抑制することことが報告されているので、TRIM 29 の機能解析とともにで、癌遺伝子的振る舞いをすることが報告されている 4）。

TRIM 29 の発現変動のメカニズムを検討することも重要な

さらには、ヒストン脱アセチル化酵素 HDAC 9 の作用で課題と思われる。

8）

TRIM 29 の機能が制御されていることが報告されている 。

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コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

５．総

Rev Cancer, 11 , 792 - 804 , 2011 .

括４）Yuan Z, Villagra A, Peng L, Coppola D, Glozak M,

本 研 究 に よ り、DNA 障 害 を 起 こ す CDDP に 対 す る

Sotomayor EM, Chen J, Lane WS, Seto E.: The ATDC

TRIM 29 の機能が明らかとなった。さらに生化学的解析に(TRIM 29 ) protein binds p 53 and antagonizes p 53 -より、さまざまな DNA 修復関連遺伝子産物が TRIM 29 とmediated functions, Mol. Cell. Biol., 30 , 3004 - 3015 , 2010 .

相互作用することも判明した。CDDP と同様に、紫外線照５）Sho T, Tsukiyama T, Sato T, Kondo T, Cheng J,

射によっても DNA 障害が起きることが知られているので、

Saku T, Asaka M, Hatakeyama S: TRIM 29 negatively

皮膚上皮細胞にも高発現する TRIM 29 は皮膚で重要な働

regulates p53 via inhibition of Tip60, Biochim. Biophys.

きをしている可能性が高い。今後は DNA 修復におけるActa, 1813 , 1245 - 1253 , 2011 .

TRIM 29 のメカニズムを分子レベルで解明するために、今

６）Laderoute KR, Knapp AM, Green CJ, Sutherland

回同定した多くの結合タンパク質に関して詳細な生化学的RM, Kapp LN: Expression of the ATDC (ataxia

解析を進めることが重要となる。

telangiectasia group D-complementing) gene in A 431
human squamous carcinoma cells, Int. J. Cancer., 66 ,（引用文献）

772 - 778 , 1996 .

１）Kapp LN, Painter RB, Yu LC, van Loon N, Richard７）Wang L, Heidt DG, Lee CJ, Yang H, Logsdon CD,

CW 3 rd, James MR, Cox DR, Murnane JP: Cloning of aZhang L, Fearon ER, Ljungman M, Simeone DM:candidate gene for ataxia-telangiectasia group D, Am

Oncogenic function of ATDC in pancreatic cancer

J. Hum. Genet. 51 , 45 - 54 , 1992 .

through Wnt pathway activation and beta-catenin

２）Hosoi Y, Kapp LN: Expression of a candidate ataxia-stabilization, Cancer Cell, 15 , 207 - 219 , 2009 .

telangiectasia group D gene in cultured fibroblast cell８）Yuan Z, Peng L, Radhakrishnan R, Seto E: Histonelines and human tissues, Int. J. Radiat. Biol. 66 , 71 - 76 ,deacetylase 9 (HDAC 9 ) regulates the functions of the1994 .

ATDC (TRIM 29 ) protein. J. Biol. Chem., 285 , 39329 -３）Hatakeyama S: TRIM proteins and cancer, Nature39338 , 2010 .

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