放射線・紫外線適応応答マーカーを指標とした老化制御因子スクリーニング法の開発
東京都健康長寿医療センター研究所分子機構研究チーム

三浦ゆり

Organisms are exposed to various stresses such as oxidative stress and other environmental stresses, resulting in thediverse pathophysiological and pathological conditions with age. However, it is also known that low dose stress induces theadaptive response, which exerts protective effects against a subsequent higher dose. Radiation adaptive response has been
widely observed in various biological systems. The protective responses are expected to bring anti-aging effects in dermalcells. Thus, in order to find anti-aging factors involved in adaptive response, we try to explore the biomarkers of radiation
adaptive response in dermal cells, and lead to develop the protective agents against dermal aging. In the present study, we
examined radiation adaptive response in dermal fibroblast, and explored the low dose irradiation-responsive proteins using
proteomics on two-dimensional (2-D) PAGE. As a result, 0.1Gy pre-irradiation followed by 2-Gy challenging-irradiation
at 3-hr interval induced radiation adaptive response in dermal fibroblast. From proteomics analyses of protein profiles of
0.1Gy- or non-irradiated dermal fibroblast, some candidate proteins, which are responsible for radiation adaptive response,
were revealed.

1.

緒

特異的な現象について考慮する必要がある。それが、ホル言ミシスあるいは適応応答と呼ばれる現象である。
「ホルミ

老化には、遺伝的要因と環境的要因の両方が深く関与しシス（hormesis）」という言葉は、ギリシア語の「hormo（興ているが、環境的要因の中で最も重要なのは活性酸素・フ奮する）」が語源になっており、「大量では有害なさまざまリーラジカルによる酸化ストレスである。しかし、ひとくな毒物などが、少量ではかえって生理機能の刺激効果をもちに酸化ストレスと言っても、老化に実際に関与しているたらすこと」と定義されている。つまり、ストレスもそののは一度に多くの細胞を死に至らしめるような強い酸化ス強さがマイルドであれば、生体にとってプラスの効果をもトレスではなく、それほど強くはないが持続的な酸化ストたらすということである。放射線に関しては、低線量放射レスである。酸化ストレスの生体影響に関する研究は、活線照射により放射線適応応答が引き起こされることが知ら性酸素・フリーラジカルが様々な疾患や炎症などに深く関れている。放射線適応応答は、予め低線量放射線を照射す与することが明らかにされて以来、様々な研究者から注目ることにより高線量放射線に対する放射線抵抗性を獲得すを集めているが、現在のところ酸化障害あるいは細胞死をることであり、この防御応答は様々な生物で観察されてい引き起こすような強いストレス負荷の研究がほとんどであるり、老化や慢性疾患のモデルとなるような低レベルの持続因子など様々な酵素やタンパク質が知られている 。しか的なストレスに関してはほとんど明らかにされていないのし、多様な実験系において様々な指標を用いて研究されてが現状である。しかし、老化による細胞の機能低下とそのいるため、その分子機構は多様であり、それぞれの細胞、機構を明らかにするためには、低レベルの酸化ストレスにあるいはそれぞれの照射条件により関与する因子も様々で的を絞った研究が必要である。特に皮膚は、紫外線、環境あると考えられる。

1, 2）。放射線適応応答に関与する因子は、DNA 修復関連
3）

放射線、環境汚染物質など様々な刺激に直接曝される部位

皮膚は、環境放射線に直接曝される部位であるため、皮であり、皮膚老化の制御を目的とした研究をするためには、膚老化につながる酸化的傷害だけでなく、適応応答も引き放射線や紫外線の低線量照射による老化モデルの構築と、起こされていると考えられる。放射線適応応答を活性化すその解析が必要不可欠であると考えられる。

る因子は、酸化障害の蓄積を防御し老化を防止する因子で弱い（低レベルの）酸化ストレスによる生体への影響をあり、老化制御因子と考えられる。このため、皮膚老化を考えるときは、強い（高レベルの）酸化ストレスにはない遅らせて肌をみずみずしく保つためには、酸化ストレスを抑え込むことを目的とした抗酸化化粧品の開発だけでなく、細胞自身のもつこのようなストレス応答能を高め、防御機

Proteomic Research for Biomarker ofAdaptive Response to Ionizing andUltraviolet Radiation
Yuri Miura
Research Team for Functional Genomics,
Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology

構を活性化させることも重要であると考えられる。
そこで本研究では、皮膚線維芽細胞を用い、低線量放射線照射による細胞への影響をタンパク質レベルで解析し、細胞の自己防御応答である適応応答の活性化因子を探索することを目的とする。発現プロテオミクスを用いて、低線− 96 −

放射線・紫外線適応応答マーカーを指標とした老化制御因子スクリーニング法の開発

量放射線照射による細胞への影響を解析し、細胞の自己防出した。タンパク質二次元電気泳動とプロテオーム解析は、御応答である適応応答によって発現変動するタンパク質、以下のように行った（http://proteome.tmig.or.jp/2D/2DE_すなわち適応応答マーカーを探索する。今後、抗体等を用

method.html） 。

4）

いてこの適応応答マーカーを高感度かつ簡便に検出する系

あらかじめ膨潤させておいた等電点電気泳動用ストリッを構築し、適応応答マーカーを指標とした老化制御作用をプ ゲ ル（Immobiline DryStrip, pH4−7, 18cm: GE Healthcare）

持つ化合物のスクリーニングから、適応応答活性化というに抽出した核画分タンパク質をのせ、一次元目の等電点電新たなメカニズムによる皮膚老化防止剤の開発につなげる。

気泳動を行った（CoolPhoreStaar IPG-IEF Type P, Anatech）
。

2.
2. 1

実

ストリップゲルを還元化、アルキル化処理後、SDS-PAGE験を行った（CoolPhoreStar SDS-PAGE Dual-200, Anatech）。

培養細胞

泳動ゲルを蛍光染色し（SYPRO-Ruby）、ゲルスキャナー

細胞は、ヒト皮膚由来の線維芽細胞である TIG-118 を用を用いて泳動像を取り込み、ゲル間のディファレンシャルいた。培地は 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin を含むディスプレー解析を行った（PDQuest, Bio-Rad）。非照射

a-MEM を用い、37℃、5% CO2 / 95 % air 中で培養した。

細胞の泳動像と低線量照射細胞の泳動像のスポットをマッチングさせ、発現が変動するタンパクスポットを探索した。

2. 2X 線照射Ｘ線は、Ｘ線照射装置（MBR-1505R2：日立メディコ）

2. 5

タンパク質の同定を 用 い、 室 温 で 照 射 し た。 低 線 量 照 射 は、5.5 mm Al+発現の変動したスポットを、スポットカッターを用いて2.1 mm Cu のフィルターを用いて、管電流 2mA、管電圧切り出し、脱色処理後にトリプシン（Promega）とリシル100 kV、線量率 0.01Gy/min で行い、0.1Gy 照射した。また、エンドペプチダーゼ（和光純薬）により酵素消化を行った。

適応応答実験の場合の追加照射は、0.5mm Al + 0.1mm得られたペプチドをゲル片より抽出し、ターゲット上でマCu のフィルターを用いて、管電流 5mA、管電圧 150kV、トリクス（α -cyano-4-hydroxycinnamic acid）と混合した線量率 0.16Gy/min で行い、2Gy 照射した。照射しない細後、MALDI-TOF 質 量 分 析 計（AXIMA-CFR; Shimadzu

胞群（対照群）も照射群が照射している時間帯は室温に放Biotech）を用いて質量分析を行い、ペプチドマスフィン置した。

ガープリンティングを得た。Mscot 検索サイト（MatrixScience, London, UK, see http://www.matrixscience.com）

2. 3

放射線適応応答実験を利用して、スポットの同定を行った。

細胞は、Ｘ線を照射する 1 日前に細胞数を計測し、フラ3.

スコにプレートした。適応応答は、あらかじめ照射する低線量放射線照射の後、一定間隔後に高線量の追加照射を行

3. 1

結果

低線量放射線適応応答

い、追加照射による放射線障害があらかじめ低線量照射をまず、皮膚線維芽細胞において低線量放射線適応応答の行うことによって、軽減されるかどうかを調べるものであ起きる条件を検討した。生体が適応応答を起こすためには、る。そこで、あらかじめの低線量放射線と追加の高線量放あらかじめの照射と追加照射、さらにその間の間隔を決め射線を、それぞれ照射する群としない群に分け、全部で 4ることが重要である。そこで、あらかじめの照射（低線量群の細胞を用いて適応応答を評価した。即ち（低線量照射照射）については０から 1Gy まで、また追加照射（高線量有 - 追加照射有）、（低線量照射有 - 追加照射無）、（低線量照照射）については 1Gy から 5Gy まで検討し、適応応答がも射無 - 追加照射有）、（低線量照射無 - 追加照射無）である。

っとも顕著に現れる照射条件を求めた。また、あらかじめ細胞は、それぞれの条件で低線量照射と追加照射を行った照射と追加照射の間隔は、３時間と 24 時間について検討

後、37℃５%CO2 雰囲気下で２日間培養し、２日後の細胞した。その結果、あらかじめ照射を 0.1Gy で行い、2Gy の数増加を調べた。

追加照射を 3 時間後に照射することにより、追加照射による細胞増殖阻害が最も抑制され、皮膚線維芽細胞において2. 4二次元電気泳動適応応答がおきることが明らかになった（図１）。

細胞を低線量照射群と非照射群に分け、低線量照射群に0.1Gy 照射を行った。照射 3 時間後に照射群、非照射群と3. 2 二次元電気泳動による放射線適応応答因子の解析

も細胞を回収し、細胞分画キットを用いて核画分を分取しそこで次に、適応応答が発現する照射条件でＸ線を照射た。分取した核画分から、タンパク質抽出バッファー（8.5 Mし、プロテオミクス解析を用いて照射後の核タンパク質のurea, 0.2% SDS, ２% Triton-X100, ３% 2-mercaptoethanol,解析を行った。0.1Gy 照射 3 時間後に細胞を回収し、細胞２% Pharmalyte

分画キットにより核タンパク質を抽出した後、等電点電気3−10）を用いて、還元的にタンパク質を抽− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

図１ 皮膚線維芽細胞における適応応答
皮膚線維芽細胞である TIG-118 にあらかじめ 0.1Gy 照射し、3 時間後に 2Gy 照射して、2 日間培養後の細胞数を計測した。あらかじめ 0.1Gy 照射をした細胞としない細胞で、それぞれ 2Gy 照射による細胞増殖阻害を計算した。
あらかじめ低線量照射を行ったものの方が、2Gy 照射による細胞数の低下が少なく、増殖阻害が軽減されていることが示された。

図 2 皮膚線維芽細胞の核画分タンパク質の二次元電気泳動像（0.1Gy 照射 3 時間後）
TIG-118 に 0.1Gy 照射し、3 時間後に細胞を回収して細胞分画を行った。核画分を分取してタンパク質を抽出し、二次元電気泳動を行った。

泳動と SDS-PAGE を行った。図２に 0.1Gy 照射 3 時間後の核タンパク質の二次元電気泳動像を示す。低線量照射を行った細胞と行わない細胞について、得られた 2-D 画像をPDQuest（Bio-Rad）を用いて解析し、低線量照射により核内の発現が変動するタンパク質を探索した。その結果、
0.1Gy 照射によって増加するスポットを 18 スポット、減少するスポットを８スポット検出した。これらのタンパク質スポットについて MALDI-TOF/MS を用いたペプチドマスフィンガープリンティングにより同定を行い、放射線適応応答との関連性について検討している。

4. 考

察
図３

低刺激のストレスによって引き起こされる防御応答の一

放射線適応応答のメカニズムつである適応応答は、今まで様々な生物で観察されてきた。
ほ乳類細胞で初めて放射線適応応答を報告したのは 1984

二本鎖切断や膜構造の変化など）をセンサー分子が認識し，

年 Olivieri らである 。彼らがヒトのリンパ球における放次にシグナル伝達分子が活性化して情報を伝達した後，最射線適応応答を報告して以来、低線量放射線による適応応後に DNA 修復酵素やストレス防御因子などの防御能を持

答は様々な実験系で様々な指標を用いて行われてきた。

ったタンパク質が合成されると考えられる（図３） 。

1）

2）

我々の実験系でも、若齢ラットから初代培養したアストロあらかじめの低線量照射と高線量の追加照射の間の間隔サイトにおいて、細胞増殖阻害を指標とした放射線適応応に最適時間が存在するのは、この反応にかかる時間である答が起きることを報告している 。今回の皮膚由来線維芽と考えられるので、本実験系で適応応答が引き起こされる細胞を用いた実験により、比較的 PDL の若い皮膚線維芽

低線量照射後３時間後に細胞を回収し、この時核内におい細胞では、放射線適応応答が起きることが明らかになった。て発現変動するタンパク質をプロテオーム解析により調べ

そこで、放射線適応応答の分子機構について考察した。

た。これらのタンパク質は、放射線適応応答において防御まず、あらかじめの低線量照射による軽度の傷害（DNA因子の誘導に関与するタンパク質である可能性があると考5）− 98 −

放射線・紫外線適応応答マーカーを指標とした老化制御因子スクリーニング法の開発えられる。今後、これらのタンパク質とその適応応答におresponses, and aging. J Radiat Res（Tokyo）45:357-372;

ける役割を明らかにし、適応応答を活性化する因子の発見

2004.
３）Miura, Y., Endo, T.: Survival responses to oxidativeに繋げたい。

stress and aging. Geriatr. Gerontol. Int. 10 : S1-S10;
謝辞

2010.

本研究を遂行するにあたり、ご支援いただきました財団

４）Miura, Y., Kano, M., Abe, K., et al.: Age-dependent

法人コスメトロジー研究振興財団に心より御礼申し上げます。

variations of cell response to oxidative stress:
proteomic approach to protein expression and（参考文献）

phosphorylation. Electrophoresis 26 : 2786-2796; 2005.

１）Olivieri, G., Bodycote, J., Wolff, S.: Adaptive response

５）Miura, Y.: Proteomic approach for biomarker

of human lymphocytes to low concentrations ofdiscovery in radioadaptive responses –Age-dependentradioactive thymidine. Science 223 :594-597; 1984.

variations of cell response to low-dose radiation- Biol.

２）Miura, Y.: Oxidative stress, radiation-adaptive

Sci. Space 23 : 17-22; 2009.

− 99 −