紫外線防御因子メタロチオネインのヒノキチオールによる合成誘導とその意義
東北大学大学院

永薬学研究科沼章

Metallothionein has been known as one of photoprotection proteins. Effective inducers of metallothionein are needed for protection of skin from UVB-solar radiation. We have performed a search fornon-metallic substances which activate metallothionein gene expression. Hinokitiol, an extract of steam
distillation of the root or trunk of Japanese cypress, was found to activate the metallothionein promoter.
The results of our study for elucidation of the mechanism of induction of metallothionein synthesis byhinokitiol suggest that hinokitiol activates MTF-1, a transcriptional factor, through mobilization of zinc,an activator of MTF-1, from medium to cells.

１．緒

た、過酸化水素の刺激に応答する antioxidant responsive

言element（ARE）や IL-6 に応答する STAT3-binding site

メタロチオネイン（M T）は 1957 年にウマの腎臓中からの存在も報告されている。しかしながら、これまで知られカドミウム結合蛋白質として発見された分子量約 6000 の蛋ている非金属性の M T 誘導剤の M T 誘導能は亜鉛やカドミ白質で、構成アミノ酸の約 1/3 をシステインが占めていながウムといった重金属と比べると非常に低い。

ら S - S 結合を一つも持たず、かつ芳香族性アミノ酸を一つ

我々は、MT の示す紫外線防御作用に着目し、皮膚のも持たないという特徴的な構造を有している 。M T およびMT 合成を誘導する金属を検索したが一般的に金属化合物その類似蛋白質（銅 - ケラチン、フィトケラチンなど）は生は毒性が比較的高く。毒性の発現しない濃度範囲で効率良物界に広く存在し、ヒトやげっ歯類などのほ乳類をはじめとく MT 合成を誘導する金属は見出せなかった。そこで MTした脊椎動物、酵母、植物などの真核生物のみならず、ラ遺伝子プロモーターを活性化する非金属化合物を約 400

ン藻などの原核生物にもその存在が認められている。

種類の化合物中からスクリーニングしたところ、ヒノキチ１）

MT の性質として最もよく知られているのは重金属毒性オール（ヒノキチオール，別名 β-thujaplicin）が MT プロ軽減作用であり、MT はその SH 基を介して重金属と強固モーターを著しく活性化することを見いだすことに成功しに結合することによって毒性の発現を抑制する。また、フた。ヒノキチオールは、タイワンヒノキや青森ヒバの精油

リーラジカル消去作用や紫外線防御作用なども報告されてに含まれる結晶性酸性物質で、1936 年に野副らによっており、生体内において多機能な防御因子として働いている

天然物として初めて発見された炭素七員環芳香族化合物でと考えられている。

ある３, ４）。ヒノキチオールは殺菌・抗菌力に優れ５, ６）、メM T の合成は重金 属に加え、グルココルチコイド、パララニン生成抑制作用７, ８）などが認められているため、基礎コート、インターロイキン 6（I L -6）、紫外線照射２）などの化粧品や養毛剤等に広く用いられている。さらに、ある種様々な刺激によって誘導される。重金属やグルココルチコイの癌細胞を分化させたり、アポトーシスを引き起こしたりドによる M T の誘導は転写レベルで行われており、M T 遺することや、ヒノキチオールの基本骨格であるトロポロン伝子のプロモーター領域には重金属およびグルココルチコの誘導体が抗腫瘍活性を持つことなどが数多く報告されてイドによる転写促進に必須の cis - エレメントとしてそれぞいる。しかし、これまでヒノキチオールが蛋白質の誘導合れ metal response element（MRE）および glucocorticoid成に関与したり、特定の転写因子に作用したりするといっresponsive element（GRE）の存在が確認されている。また報告はほとんどなく、その MT プロモーター活性化機序

Induction of synthesis of metallothionein,a photoprotection protein, by hinokitiolに興味が持たれる。そこでヒノキチオールの MT プロモーター活性化機構の解明を試みた。

Akira Naganuma
Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
Tohoku University

２．実
２・１

細験

胞

マウス線維芽細胞株の Ltk −細胞、およびマウス MT-I
プロモーター（MT-I 遺伝子の転写開始点から 1400bp 上− 57 −流までの領域）の下流に lacZ 遺伝子を連結したプラスミすることおよび亜鉛処理による細胞内 MT 量の増加のピド 41）を Ltk −細胞に導入して得られた安定形質転換体ークが、ヒノキチオールの共存により低濃度側に移動するである L13-17 細胞を実験に用いた）。

ことが明らかになった。従って、これまでの検討により明らかになったヒノキチオールの MT プロモーター活性化

２・２メタロチオネインの定量作用およびヒノキチオールと亜鉛の併用によるピークの細胞の超音波破砕液を沸騰水浴中で５分間加熱して得た移動を伴う MT プロモーター活性化促進作用は実際の MT

上清を ammonium 7-fluorobenz-2-oxa-1,3-diazole-sulfonate

mRNA レベルの上昇や MT 蛋白質量の増加に反映するも（SBD-F）と反応させて MT の SH 基を SBD 蛍光標識した。のであることが明らかになった。

この反応液中の MT 濃度を蛍光検出高速液体クロマトグラ
フィ（HPLC）法９）により定量した。

またこのとき、解糖系の酵素である GAPDH の mRNAレベルがヒノキチオールの濃度依存的に上昇することが観察された。GAPDH は house keeping gene であり、生体

２・３

リポータージーンアッセイ

試料中の特定の蛋白質および mRNA を定量する際の内部種々の長さのマウス MT-I プロモーターの下流に lacZ標準として広く用いられているが、場合によってはそのレ遺伝子を連結したプラスミドと SV40 プロモーターの支ベルが変動することがいくつか報告されている。特に培養配下でルシフェラーゼを発現するプラスミドを同時に Ltk−細胞に導入した。レポーター活性は、細胞抽出液にX-gal を加えて反応させた後、マイクロプレートリーダーで 650nm の吸光度を測定して求めた。遺伝子の導入効率は細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定して求めた。

３．結果と考察マウス MT-I プロモーターの支配下で β- ガラクトシダーゼを発現する安定形質転換体である L13-17 細胞を用いてヒノキチオールの MT-I プロモーター活性化作用を検討したところ、80µM までのヒノキチオールによって濃度依存的に β- ガラクトシダーゼ活性が上昇し、それ以上高い濃度ではプラトーに達した（Fig. １）。一方、最も強力なMT 誘導剤の一つである亜鉛で処理した場合は、200µM付近でピークに達し最大の β- ガラクトシダーゼ活性を示したが（Fig. １）、ここに比較的低濃度のヒノキチオール（15, 25µM）を共存させることでそのピークが亜鉛の低濃度側に移動する現象が認められた（Fig. ２）。このとき、単独ではほとんど β- ガラクトシダーゼ活性が認められない 15µM のヒノキチオールと 40µM の亜鉛の共存により、200µM の亜鉛処理の場合と同等の強力な β- ガラクトシダーゼ活性が認められることから（Fig. ２）、ヒノキチオー
ルと亜鉛は非常に強力な相乗作用により MT プロモーターを活性化させると見ることもできる。しかし、ヒノキチオールは亜鉛処理によって得られる最大のプロモーター活性をさらに亢進させることはなかった（Fig. ２）。
次に、L13-17 細胞を用いた検討で見い出されたこれらの現象が実際の MT の合成誘導に反映するか否かを L1317 細胞の親株である Ltk −細胞を用いて検討した。その結果、MT mRNA レベルおよび細胞内 MT 量は共にヒノキチオールの濃度依存的に増加することが明らかになった。さらに、亜鉛（10-80µM）とヒノキチオール（15µM）を併用することによって MT mRNA レベルが劇的に上昇

Figure 1
Effects of hinokitiol or ZnCl2 on b-galactosidase
ac tivity and cell survival in L13-17 cells.
L13-17 cells (1x104 cells) were incubated for 24h in medium
containing various concentrations hinokitiol (HT) or ZnCl2.
Then β-galactosidease activity（■）and cell survaival（○）
were determined. Values are the means ± SD from 4 samples. The results were confirmed three separate experiments.

− 58 −紫外線防御因子メタロチオネインのヒノキチオールによる合成誘導とその意義

Firure 2Effects of ZnCl2 on β-galactosidase avtivity and cell survival in hinokitiol-treated L13-17 cells.
L13-17 cells (1X104 cells) were incubated for 24 h in medium containing various concentrations of hinokitiol (HT)with ZnCl2. Then β-galactosidase activity（■）and cell survaival（○）were determined. Values are the means ± SD
from 4 samples. The results were confirmed three separate experiments.

− 59 −

細胞を低酸素条件下で培養することや低酸素状態をミミッのエレメントである MRE の一つ、MREd が存在している。

クすると考えられている遷移金属のコバルトや鉄キレー

この MREd はマウス MT プロモーター上に存在する６つターの deferoxamine の存在下で培養することで GAPDHの MRE の中で、亜鉛で処理した場合最も高い転写活性化

mRNA レベルが上昇するという報告が多くある。一方で、能を示すエレメントである。また、この MREd が欠失しヒノキチオールはその分子内に β-diketone 構造を持ってている変異体（-135 − -1）にもわずかにヒノキチオールおりキレーターとして働くことが知られている。その金応答能があったが、MREd とその下流の MREc を欠失し属錯塩の形成能は Cu（II）> Ni > Pb > Zn の順であり、また変異体（-117 − -1）ではヒノキチオールに対する応答たヒノキチオールの母核である tropolone の場合も、一般が全く無かったため ､ MREc も弱いながらヒノキチオールの β-diketone の場合と同様に、Cu（II）> Ni > Co > Zn>応答エレメントとして働いていることが示唆された。

Pb > Cd > Fe（II）> Mn（II）>Mg > Ca の順である 10）。ヒ

さらに TATA box 領域から MREd までの MT プロモーノキチオールが赤色の鉄錯体である hinokitin から単離

ターを 3' 側から短くすると、最も転写開始点に近い MRE

精製されたことからもわかるように、ヒノキチオールはである MREa を欠失しただけで著しいプロモーター活性鉄ともキレートを形成する。そのためヒノキチオールがの減少が認められた。しかし、MREd と MREc を欠失さ

deferoxamine と同様の機構により GAPDH mRNA レベルせた場合と異なり、ヒノキチオールに対する応答の完全なを上昇させることも考えられる。最近、低酸素条件下で細消失は認められなかった。従って、MREa には MREd と胞を培養すると MTF-1/MRE 系を介して MT が誘導されMREc によるヒノキチオール応答を増強するはたらきがあるという報告 11）がなされているため、ヒノキチオールがると考えられる。

MT プロモーター活性化する機構の一つとして、ヒノキチまた以上のリポータージーンアッセイすべてに渡って、オールが低酸素状態をミミックし、その低酸素ストレスにヒノキチオール処理群と亜鉛処理群のリポーター活性はプより MT プロモーターが活性化されるという可能性も考えロモーターの欠失に対しほぼ同様の変動パターンを示しられる。しかし、どうして鉄キレーターが GAPDH を誘た。このことから、ヒノキチオールは最終的には亜鉛と同導させるのか、鉄キレーターが本当に低酸素状態をミミッ一の作用点、つまり MRE に作用して MT プロモーター活クしているのかといった点に関しては未だ明らかにされて性を上昇させる可能性が強く示唆された。ヒノキチオール

いない。と亜鉛の併用によっても、亜鉛によって得られる最大のプ一方、本研究によってヒノキチオールの共存により亜鉛ロモーター活性を越えるような活性が得られなかったことによる MT プロモーター活性化のピークが移動し、より低も、このようにヒノキチオールと亜鉛の作用点が同一であ濃度の亜鉛で最大のプロモーター活性が得られるようになると考えると説明できるものと思われる。

るという興味深い現象が起きることが明らかになった。そほ乳類の MT の誘導において亜鉛は特別の役割があるこでこの現象が亜鉛に特異的なものであるかどうかを調べと考えられている。MT プロモーター上に存在する MREるために、亜鉛以外の MT 誘導剤（DEX，カドミウム、銅、に結合する転写因子として MTF-1 が知られており、重金水銀、鉛およびビスマス）について検討したが、亜鉛の場

属による MT の誘導は主に MTF-1/MRE の系を介してい合に見られたようなピークの移動は認められなかった。従ると考えられている。リコンビナント MTF-1 を用いたって、ヒノキチオールによるピークの移動を伴う MT プロ無細胞系での実験では亜鉛、カドミウム、ニッケル、銀、モーター活性化促進作用は亜鉛との併用の場合に比較的特銅、コバルトといった遷移金属のうち亜鉛だけが MTF-1異的に認められる現象であることが示唆された。なおこれのコンセンサス MRE への結合を促進することが報告さらの MT 誘導剤のうち、ビスマスはヒノキチオールと併用れている 12）。つまり、亜鉛だけが MTF-1 に直接作用しすると非常に強く MT プロモーターを活性化させ、且つほて MTF-1 の MRE への結合活性を促進し、MT プロモーとんど細胞毒性を示さないことが明らかになった。そのたターを活性化するのであり、亜鉛以外の重金属は亜鉛のめ、ヒノキチオールとビスマスの併用は MT プロモーター

redistribution を介して間接的に MTF-1/MRE に作用するを活性化する理想的な方法であることが示唆された。

か、カドミウムのように MRE 以外の cis- エレメントにも次に、ヒノキチオールによる MT プロモーター活性化機構を明らかにするため、MT プロモーター上のヒノキチオ作用することで MT プロモーターを活性化すると考えられている。

ール応答領域の検索を行った。その結果、MT プロモータ

先の結果からヒノキチオールがこの亜鉛を介して間接的ーの -150bp から -135bp の領域にヒノキチオールの応答に MT プロモーターを活性化させる可能性が考えられた。

領域の一つが存在すると考えられた。この領域には亜鉛やそこで次に、ヒノキチオールによる MT プロモーター活性カドミウムなどの重金属に加え、過酸化水素や低酸素スト化における亜鉛の影響を検討した。細胞培養に使用した培レスといった重金属以外の刺激による MT の誘導にも必須

地には通常、約４µM の亜鉛が含まれており、この亜鉛は− 60 −

紫外線防御因子メタロチオネインのヒノキチオールによる合成誘導とその意義全て血清由来だと考えられる。そこで亜鉛を含まない無血５） Miyamoto, D. et al., :Thujapulicin-copper chelates

清培地において、ヒノキチオールの MT プロモーター活性inhibit replication of human influenza viruses, Antiviral化能について検討したところ、ヒノキチオールによる MT

Res., 39, 89-100, 1998.

プロモーターの活性化はほとんど認められなかった。さら６） Akiyama, H., Yamasaki, O., Kanzaki, H., et al. :Effectsに、この無血清培地に亜鉛を添加して通常の半分量に当たof zinc oxide on the attachment of Staphylococcus

る２µM の亜鉛を存在させた場合にはヒノキチオールによaureus strains, J. Dermatol. Sci., 17, 67-74, 1998.

る MT プロモーターの活性化が認められた。従って、ヒノ

７） Baba, T., et al. :Inhibitory effect of beta-thujapulicin

キチオールは細胞外の亜鉛に依存して MT プロモーターをon ultraviolet B-induced a poptosis in mouse

活性化させるものと考えられる。

keratinocytes. J. Invest. Dermatol., 110, 24-28, 1998.
８） S a k u m a , K . , O g a w a , M . , S u g i b a y a s h i , K . , e t４．まとめ

al.:Relationship between tyroshinase inhibitory action

本研究の結果、ヒノキチオールによる M T プロモーターのand oxidation-reduction potential of cosmetic whitening

活性化には亜鉛の動員を介した M T F-1 の M R E への結合

ingredients and phenol derivatives, Arch. Pharm. Res.,

活性の促進が関与していることが強く示唆された。これまで

22, 335-339, 1999.に報告されているヒノキチオールの多彩な生理作用の一部も

９） M i y a i r i , S . , S h i b a t a , S . , a n d N a g a n u m a , A . ,このような亜鉛の動員を介している可能性が考えられる。

:Determination of metallothionein by high-performanceliquid chromatography with fluorescence detection usung（文献）

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