膵β細胞のグルコース応答における性ホルモンシグナルに関する研究原田直

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科

緒樹助教

10% ウシ胎児血清、10 mM Hepes、1 mM ピルビン酸

言

2 型糖尿病は膵臓β細胞におけるインスリン分泌能とナトリウム、50μM メルカプトエタノールを含む RPMI

筋肉や肝臓、脂肪組織等の末梢組織におけるインスリン1640 培 地 を 用 い た。 尚、 ア ッ セ イ 時 に は charcoal–感受性のバランスの崩壊により発症する。日本人を含む

dextran（Sigma）処理ステロイド除去を行ったウシ胎児

東洋人においては元々インスリン分泌能が西洋人の約半血清を用いて作製した培地を使用した。

分ほどであるにもかかわらず、2 型糖尿病発症早期からグルコースに応答したインスリン分泌が低下すること、

2. Western blot 法

さらに病態の進行とともに膵β細胞量が減少することかリガンドを加えて 24 時間培養した細胞より抽出したら、インスリン感受性のみならず、膵β細胞の機能低下

粗タンパク質溶液は、Bradford 法によりタンパク質量も 2 型糖尿病の発症と深く関連すると考えられる。糖を定量後、SDS-PAGE に供し、ウエスタンブロットによ尿病の予防や治療を目的として、インスリン抵抗性にり解析した。ブロッキングには 6% のスキムミルクを含関する研究と膵β細胞機能に関する研究が行われている

む phosphate–buffered saline を用い、抗 AR 抗体（N20）が、後者に関する研究は、日本人を含む東洋人型の 2 型

あるいは抗 Cyclin D1 抗体（DSC– 6）と西洋ワサビペルオ

糖尿病予防や治療に関して大きく貢献する可能性を持つ。

キシダーゼ結合型 2 次抗体を用い、化学発光により検

近年、男性糖尿病患者において男性ホルモンであるテ出した。

1)

ストステロンレベルが低いことや 、ホルモン療法を行いテストステロンレベルが低下した前立腺がん患者にお3. 細胞増殖アッセイ

いて、糖尿病の発症リスクが上昇することが報告されて各種リガンドや阻害剤の存在下で細胞を 96 時間培養

2)

おり 、男性ホルモンと糖尿病の関係が注目されている。

した後に、アラマーブルー法を用いた励起波長：544

テストステロンは主に精巣で産生、分泌され、第二次性nm、蛍光波長：590 nm の蛍光を測定して細胞増殖を徴時に血中濃度がピークとなり、それ以後は加齢ととも評価した。また、DNA 量の測定は、蛍光色素 Hoechest4)に減少する 。テストステロンは、標的細胞において、33342 と、標準物質としてウシ胸腺由来デオキシリボ

そのまま直接、もしくは 5α–レダクターゼによってより核酸ナトリウムを用いて励起波長：355 nm、蛍光波長：活性の強い 5α–ジヒドロテストステロン（DHT）に変換

460 nm の蛍光度を測定した。

された後に、受容体型転写因子であるアンドロゲン受容体（AR）を介して生理作用を発揮する。膵β細胞におい4. siRNA の導入4)ても AR の発現が認められていることから 、テストス

siRNA の一過性トランスフェクションには Lipofectamin

テロンが膵β細胞に作用することが示唆されている。本

RNAiMAX Reagent（Invitrogen）を用い、control siRNA研究では、特に膵β細胞の増殖に及ぼすテストステロン（SIGMA）、もしくは AR siRNA（sense: 5’–GACUCAGCUGCの作用に関して検討を行った。

CCCAUCCAUCCA（dTdT）–3’）が、終濃度 20 nM になるように細胞に導入した。

実

験方法

1. 細胞培養5. 統計解析

INS –1 細胞及び INS –1 細胞に由来するサブクローンは統 計 解 析 に は JMP statistical software version 8.0.1
1

原

A.
INS-1

田直

樹

INS-1-derived cellsを用いて、データを ANOVA 法により解析し、post–hoc#3

分析には無処理群をコントロールとして Dunnett 法で#6#19行った。p < 0.05 をもって統計的有意とした。

AR

果ide

ラット膵β細胞株 INS–1 に AR の発現を見出し、さらalutamTestosteroDneHEAに AR の 発 現 量 が 異 な る INS–1 #3、INS–1 #6、INS–1BicNoB.

DHTne結#19 株を単離した（図 1A）。以後の実験には、AR の発現

INS-1 #6

量が高い INS1 #6 株を用いた。INS1 #6 株において ARの発現レベルに対するリガンドの影響を検討した結果、テストステロンと DHT では AR のタンパク質量が増加

図 1 INS-1 由来細胞株における AR の発現（A）INS-1 細胞から AR の発現レベルが異なる 3 種のサブクローン#3、#6、#19 を単離し、AR 発現レベルを Western blotting によりタンパク質レベルを比較した。（B）INS-1 #6 細胞に AR リガンドを加えて（DHT 10 nM、テストステロン 100 nM、DHEA 1000nM、bicalutamide 10 μM）24 時間培養後、AR タンパク質レベルについて検討した。

A.

し、副腎アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）と AR アンタゴニストである bicalutamide
では AR タンパク質量に変化は見られなかった（図 1B）。
INS1 #6 細胞の増殖に及ぼす男性ホルモンの影響について検討するため、テストステロンあるいは DHT 存
B.

AlamarBlue assay

Testosterone(nM)
DHT(nM)C.

AlamarBlue assay

Testosterone
DHEA
E2

D.

AlamarBlue assay

Testosterone
Bicalutamide

DNA contents

Testosterone
図２

INS-1 #6 細胞の増殖における性ホルモンの影響

INS-1 #6 細胞の増殖に及ぼす性ホルモンの影響を検討するために、細胞を性ホルモン存在下で 96 時間培養した。（A）テストステロン及びDHT 存在下で培養した細胞をアラマーブルー存在下でさらに 4 時間培養し、蛍光を測定した。（B、C）テストステロン 100 nM、DHEA 1000
nM、E2 100 nM、bicalutamide 10μM の存在下で培養後、アラマーブルー存在下でさらに 4 時間培養し、蛍光を測定した。（D）テストステロン 100 nM 存在下で培養後、ディッシュあたりの細胞 DNA 量を測定した。
2

膵β細胞のグルコース応答における性ホルモンシグナルに関する研究

在下で細胞を 96 時間培養後、アラマーブルーを用いINS–1 #6 細胞に AR siRNA または control siRNA をトラた増殖アッセイを行った。その結果、テストステロン

ンスフェクションし、AR siRNA により AR の発現が抑と DHT ともに 0.1 nM 以上の濃度で濃度依存的な細胞制されることを確認した（図 3A）。次に、siRNA 導入後、増殖促進作用が認められた（図 2A）。一方で、DHEA やテストステロン存在下で培養し、アラマーブルーを用い

女 性 ホ ル モ ン で あ る 17β– estradiol（E2） に は INS–1て増殖能を評価した。その結果、control siRNA を導入#6 細胞における有意な増殖促進効果は認められなかっした場合では、テストステロンにより増殖能の亢進が観た（図 2B） 。さらに、テストステロン（100 nM）による察されたが、AR siRNA を導入するとテストステロンにINS–1 #6 細胞の増殖促進作用は、AR アンタゴニストでよる増殖亢進作用が見られなかった（図 3B）。

ある bicalutamide（10 μM）により抑制された（図 2C）。

細胞周期の調節因子である Cyclin D1 の発現に及ぼすテストステロンによる増殖促進作用を裏付けるために、影響に関して検討した結果、INS1 #6 細胞においてテステストステロンで培養後の INS–1 #6 細胞を回収してトステロンは、Cyclin D1 の発現を上昇させた。一方で、

Hoechst 33342 を DNA にインターカレートさせ、蛍光AR アンタゴニストである bicalutamide はテストステロ強度を測定することにより DNA 量を測定した。その結ンによる Cyclin D1 の発現上昇を抑制した（図 4）。

果、テストステロン（100 nM）存在下で培養するとディッシュあたりの細胞 DNA 量が増加したことから、テスト考察

ステロンが細胞増殖を亢進させたことが裏付けられた

本研究では膵β細胞株である INS–1 #6 株を単離し、（図 2D）。さらに、テストステロンによる INS–1 #6 細胞細胞増殖に及ぼすテストステロンの影響について検討しの増殖能亢進に AR が関与するかどうかを調べた。まず、た。その結果、テストステロン及び DHT は細胞増殖を亢進させる作用を持つことが判明し、その作用は AR を

A.

siRNA

Control介して発揮することが判明した。細胞周期制御因子であARる Cyclin D1 は AR の標的遺伝子であり、β細胞においTestosteroneてもテストステロンによって発現が調節されることが判AR明した。
テストステロンは、雄ラットにおいてインスリンのB.

mRNA を増加させ、インスリンの含有量を増加させる

AlamarBlue assay

4)

ことや 、ストレプトゾトシンによる酸化ストレスから5)保護することが報告されている 。膵β細胞を用いた本研究により、テストステロンは膵β細胞に発現する ARを介して直接作用する機構を持つことが明らかとなった。一方で、副腎アンドロゲンである DHEA は、INS1
Testosterone
Bicalutamide

ARTestosterone
siRNA

図３Control

AR

Cyclin D1

INS-1 #6 細胞のテストステロンによる増殖促進におけるAR の関与（A）INS-1 #6 細胞に control あるいは AR siRNA を導入した細胞からタンパク質を抽出し、Western blotting にて AR レベルを解析

図４

INS-1 #6 細胞における Cyclin D1 の発現レベルした。（B）siRNA を導入した INS-1 #6 細胞をテストステロン（100INS-1 #6 細胞をテストステロン 100 nM と bicalutamide 10 μMnM）存在下で 96 時間培養後、アラマーブルー存在下でさらに 4存在下で 24 時間培養後タンパク質を抽出し、Western blotting に時間培養し、蛍光を測定した。て AR 及び Cyclin D1 タンパク質の発現を検討した。
3

原

田直

#6 細胞においては直接アゴニストとして機能していな

樹

えられる。

いことが示唆された。
膵β細胞は幹細胞からの分化よりも自身の細胞分裂に謝

6)

より細胞数の調節を行うことから 、テストストステロ

辞

本研究の遂行にあたりご支援を賜りました公益財団法ンによるβ細胞の増殖亢進は生理的に重要な意味を持人三島海雲記念財団に深く感謝申し上げます。

ち、加齢に伴うテストステロンレベルの減少がβ細胞量の減少に繋がり、糖尿病発症に寄与することが示唆され文た。

1) M.Fukui et al.: Endocr. J. , 54, 871–877, 2007.
2) N.L. Keating et al.: J. Clin. Oncol ., 24, 4448–4456, 2006.

要献等3) J.M. Kaufman JM and A. Vermeulen: Endocr. Rev. , 26,833–876, 2005.

約本研究では、膵β細胞株を用いて、男性ホルモンが4) S. Morimoto et al.: Endocrinology , 142, 1442 – 1447,

AR を介して細胞周期を調節し、細胞増殖亢進作用を持

2001.
5) S. Morimoto et al.: J. Endocrinol., 187, 217–224, 2005.
6) L.D. Horb and J.M. Slack: Int. J. Dev. Biol., 44, 791–796,

つこと明らかにした。この結果から、加齢等によるテストステロンレベルの低下が膵β細胞量の低下を引き起こ

2000.

し、東洋人型の 2 型糖尿病発症の一因となることが考4