ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析
富山大学和漢医薬学総合研究所

森田洋行

The bark and wood of Hesperethusa crenulata Roem., Naringi crenulate (Roxb.) Nicols., Limonia acidissima Linn.
belonging to Rutaceae, as well as Premna integrifolia Linn. (Verbenaceae) have been used to produce traditional cosmetics,
also known as “Thanaka” cream, for over 2000 years in Myanmar. Applying the paste to the skin of the face, arms, and legs
have been believed to make it smooth, clear, and cool, and also increases the production of collagen and elastin to prevent
wrinkles and skin aging, excessive facial oil, serious acne, pimples, blackheads, and whiteheads. Among the plants used
as “Thanaka”, the most popular ones among customers are the former three, whereas the last one is especially popular in
the Tanintharyi Region, in the southern part of Myanmar. However, P. integrifolia has not been investigated in a scientific,evidence-based manner. Hence, we evaluated in vitro melanin deposition regulatory, anti-inflammatory, antibacterial, andantifungal activities of the water, methanol, and chloroform extracts of P. integrifolia, and found that all extracts showed theabove mentioned activities. In particular, the chloroform extract showed the highest potency in the anti-melanin deposition
and anti-inflammatory activities, suggesting the cosmetic effectiveness of this plant. In order to further clarify the cosmeticeffectiveness of this plants from the chemical component point of view, we carried out the isolation of the compounds fromthe chloroform extract, and obtained 21 compounds including six new lignans. Interestingly, ten compounds exhibitedstrong or moderate anti-melanin deposition activities, providing new insight into the effectiveness of this plant as a cosmeticingredient. Additionally, five compounds showed weak melanogenesis enhancing activities. The present results also suggestthat the cosmetic anti-melanin deposition efficacy of the P. serratifolia wood should be discussed with consideration of themelanogenesis enhancing activities of the chemical constituents in this plant.

1. 緒かになった 2）。また、同時に、細胞毒性の極めて弱いこと

言が報告されるに至り、H. crenulatax の美肌化粧品素材とミャンマーでは、ミカン科植物 Hesperethusa crenulatax

しての有効性が間接的に示唆されている。産地は不明であRoem の枝木・樹皮・根のペーストが “タナカ” という名でるが、同植物に含まれるクマリン誘導体が抗菌活性や抗酸伝統的に天然美肌化粧品として用いられている。現地では、化作用を示すことも報告されている 3）。P. integrifolia に

この化粧品には、毛穴収縮作用と皮脂の過剰分泌阻害作用

ついては、アルカロイドやポリフェノールなどの単離が報による肌の保湿効果、抗酸化作用による肌荒れの軽減効

告されている 4 − 13）。しかし、化粧品素材として検証した果、さらには皮膚病予防の効果があると言われている。ま例は極めて少ない 4 , 10 - 12）。伝統的に使用されてきた天然資

た、日焼止めとして、肌の老化防止効果を目的に使用され源の中には、経験的に効果が認識されて長年用いられていている。一方、ミャンマー南部のベイやダウェイでは、クるものが数多くあり、その科学的検証により医薬品及び化

マ ツ ズ ラ 科 植 物 Premna integrifolia L.（ 異 名：Premna粧品の開発に繋がっているものが多々ある。また、同一のserratifolia）がタナカとして利用されている。この植物は、植物であったとしても、天然資源の化学成分は気候風土にインドでは美肌化粧品には利用していないが、解熱、解よって左右され、他の地域のものとは異なった効能を示す

毒、貧血改善、皮膚障害治療、健胃薬、抗炎症、肝障害改ことがあることから、ミャンマー産の P. integrifolia には、善、便秘、強心薬などの多岐に亘る症状に有効なアーユル

新たな美肌化粧品天然素材としての可能性が大いに期待

1）

ヴェーダ生薬の一つとして、頻繁に利用されている 。既される。本研究では、ミャンマー産の H. crenulatax と P.に、タイ産 H. crenulatax については、水や有機溶媒抽出

integrifolia の化粧品素材としての機能性を比較することで、液が強い抗炎症・抗酸化作用、比較的強いチロシナーゼ

P. integrifolia に新たな美肌化粧品素材としての科学的根阻害活性、及び、弱いながらも抗菌活性を示すことが明ら拠を与えることを目的とした。

2. 方
Verification of whitening ef fect ofMyanmar herb and analysis of whitening
component
Hiroyuki Morita
Institute of Natural Medicine, Universityof Toyama法2 . 1. 化合物抽出液の調整
ベイとヤンゴンで購入したミャンマー産のP. integrifolia
及び H. crenulatax の木部・樹皮・根を破砕機を用いて粉末化し、水、メタノール、クロロホルムに各々一晩浸すことで化合物の粗抽出液を調整した。

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ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析

2 . 2 . 抽出液の生物活性評価と単離した化合物のメラニン産生調節活性評価

25、50、100、及び 200 µM）を、Sigma 社から購入した

メラニン産生調節活性は、細井らの方法に準じ 14）、せ、37 ℃の条件下で、492 nm の吸光度を 3 分毎に 30 分間

100 µMの α-メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）と 0 . 25 µM

80 units/mL のマッシュルーム由来チロシナーゼに作用さ測定することでチロシナーゼ阻害活性を評価した。の 3 - イソブチル - 1 - メチルキサンチン（IBMX）にてメラ養液に抽出液を加え、1 N NaOH で細胞融解後に 360 nm

2 . 5 . 化合物 14 と 21 の cAMP 伝達経路阻害活性評価の吸光度を測定することにより、メラニン色素産生に及ぼ100 µM の α- メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）とニン色素の産生を誘導した B 16 -F 10 マウス黒色細胞の培す影響を評価した。メラニン産生調節活性には、アルブチ

0 . 25 µM の 3 - イソブチル - 1 - メチルキサンチン（IBMX）ンをコントロールとして用いた。単離した化合物のメラニにてメラニン色素の産生を誘導した B 16 -F 10 マウス黒ン産生調節活性評価についても同様に行った。抗炎症作用

色細胞の培養液に、100 µM の化合物 14 または 21 を加え、は、予め抽出液を作用させたマウスマクロファージ様細胞

37 ℃で 24 時間培養後、mRNA を抽出した。次いで、抽RAW 264 . 7 細胞にリポ多糖（LPS）で炎症を誘起した場合出した mRNA を鋳型として逆転写反応を行い、得られたと、LPS で炎症を誘起した RAW 264 . 7 細胞に抽出液を作

1 本鎖 DNA を鋳型として、色素細胞の分化増殖制御因子用させた場合の一酸化酸素産生抑制能を測定した

15）。抗（MITF）、チロシナーゼ（TYR）、チロシナーゼ関連タンパ

菌作用は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌、セレウス菌、ク質 1（TRP- 1）、チロシナーゼ関連タンパク質 2（TRP-大腸菌、及び肺炎桿菌、抗真菌作用はカンジダの培養液に2）遺伝子に特異的なプライマーを用いて各遺伝子を増幅抽出液を加え、これらの増殖阻害を測定することにより評し、その発現量を精査した。３リン酸デヒドロゲナーゼ

価した（GADPH）の mRNA の発現をコントロールとした。

16 , 17）。

3. 結

2 . 3 . 化合物の単離・構造決定
クロロホルム抽出液をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーに供して分画した後、さらに、カラムクロマトにおい果

3 . 1. P. integrifoliaと H. crenulatax 粗抽出液の生物活性評価
P. integrifolia と H. crenulatax の木部・樹皮・根に係る水、て分画操作を繰り返すことにより、化合物を単離・精製した。得られた化合物の化学構造は、NMR、HR-ESIMS 等

メタノール、及び、クロロホルム粗抽出液について、メラの各種スペクトル分析、化学変換、及び計算化学を用いてニン産生調節活性、抗炎症活性、抗菌活性、抗真菌活性を決定した。

測定した。その結果、いずれの粗抽出液においても、弱い抗炎症作用と抗菌活性が認められた。それらの中でも、ク2 . 4 . 化合物 14 と 21 のチロシナーゼ阻害活性評価

ロロホルム粗抽出液については抗炎症作用が最も強かっ

2 . 5 mM の L- 3、4 - ジ ヒ ド ロ キ シ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン

た。さらに、興味深いことに、P. integrifolia 木部のクロ（L-DOPA） と 化 合 物 14 ま た は 21（ 終 濃 度 6 . 25、2 . 5、ロホルム粗抽出液が、81 . 3 µg/mL の穏和なメラニン産生

Fig. 1 Anti-melanin deposition
activities of chloroform, water,and methanol extracts of theP. integrifolia wood against
α - MSH and IBMX-induced
melanogenesis and protein
contents in B16-F10 cell line.

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コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

抑制活性を示すことが明らかになった（Fig. 1）。これまで一方、この精製課程において、本クロロホルム粗抽出液にに、P. integrifolia の化粧品素材としての検証が行われては、単離した量が少なかったので化学構造を決定するまでいないが、本結果は P. integrifolia の化粧品としての効果には至らなかったものの、セサミン類縁体が含まれているを示唆するものである。

可能性が 1 H NMR による解析により示された。

3 . 2 . P. integrifolia 木部由来クロロホルム粗抽出液の化学成分の単離と化学構造決定の P. integrifolia 木部から新たに得たクロロホルム粗抽出

そこで、P. integrifolia の木部 3 kg から得たクロロホル

結果、上記の化合物に加え、10 種のリグナン premnan A

ム粗抽出液を各種クロマトグラフィーを用いて化合物の精（1 1；1 . 7 mg）、premnan B（1 2；1 . 6 mg）、tauntangyiol

製を繰り返し、10 種の精製化合物を得た 18）（Fig. 2）。こC（1 3；3 . 0 mg）、7 , 9 -dihydroxydolichanthin B（1 4；

れらについて、各種スペクトル分析を用いて化学構造を8 . 1 m g ）、 p r e m n a n C （ 1 5 ； 2 . 1 m g ）、（ 3 R 、 4 S ）決定した結果、2 種の新規テトラヒドロフラン型リグナン- 4 -（ 1 , 3 - b e n z o d i o x o l - 5 - y l c a r b o n y l ）- 3 - ［（ R ）taungtangyiols A（1；20 mg）と B（2；4 mg）、及び 8 種の- 1 -（1 , 3 -benzodioxol- 5 -yl）- 1 -hydroxymethyl］既知フロフラン型リグナン asarinin（3；10 mg）、sesamin（4；tetrahydro- 2 -furanone（1 6；1 . 6 mg）、（-）-aptosimon5 5 mg）、paulownin（5；2 0 mg）、4 α-hydroxysesamin（1 7；3 . 4 mg）、（-）-diasesamin-di-γ-lactone（1 8；

さらに、他の含有成分について検討するため、4 . 5 kg
液について、再度、化合物の単離 ･ 精製を進めた。その（6；5 0 mg）、4 α, 8 α-dihydroxysesamin（7；2 . 5 mg）、17 . 1 mg）、（+）-epi-sesaminone（19；4 . 0 mg）を、2 種のxanthoxyol（8；10 mg）、
1 α-hydroxy- 6 -epipinoresinol（9；既知トリテルペン oleanonic acid（20；4 . 2 mg）と（2 α, 3 α）15 mg）、1 α-hydroxypinoresinol（10；7 mg）であること-dihydroxyolean- 12 -en- 28 -oic acid（21；3 . 3 mg）とともが判明した。セサミンやその類縁体には、強い抗酸化作用に得ることができた 19 , 20）（Fig. 2）。新たに得たリグナンのや抗炎症作用、メラニン産生調節活性が報告されている。

うち、11 - 14 は新規リグナンであった。また、16 についFig. 2

Structures of isolated compounds from chloroform extracts of the P. integrifolia wood.

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ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析ては、合成品として既に報告されていたが、天然資源からの穏和なメラニン産生抑制活性を示すことが明らかになっ得られたのは今回が初めてである。一方、15 は、抽出液た（Table 1）。の HPLC 分析においては存在を検出できなかった。このこ次に、化合物 11 - 21 について、メラニン産生調節活性とから、5 は、抽出 ･ 精製課程において生じた人工物であを評価した結果、新規テトラヒドロフランリグナン 14 及ると推測される。

び既知トリテルペン 21 が各々 18 . 4 µM と 11 . 2 µM の IC 50
値で、B 16 -F 10 マウス黒色細胞に細胞毒性を示さずに

3 . 2 . P. integrifolia 木部から得た化合物のメラニン産生調節活性評価メラニン産生を抑制できることが判明した（Fig. 3）。また、既知トリテルペン 20 は、50 µM の濃度では B 16 -F 10

まず、単離した 1 - 10 について、メラニン産生調節活マウス黒色細胞に細胞毒性を示すものの、それ以下の濃度性を測定した 18）。その結果、既知フロフラン型リグナンにおいては、B 16 -F 10 マウス黒色細胞のメラニン産生を

4 - 8 が 10 µM 以下の IC 50 値で B 16 -F 10 マウス黒色細胞の17 . 7 µM の IC 50 値で抑制することが示された（Fig. 4）。

メラニン産生を強く抑制すること、及び、新規テトラヒド

一方、これらの化合物とは逆に、新規フェニルナフタレ

ロフラン型リグナン 1 と 2 が IC 50 値で 50 . 7 µM と 40 . 9 µM

ン型リグナン 11、新規フロフラン型リグナン 12、新規テトラヒドロフラン型リグナン 13 と 14、及び既知フロフラ
ン型リグナン 16 が、弱いながらもメラニン産生増強活性Table 1

Antimelanin deposition activities of 1-10.

CompoundIC50（µM)

CompoundIC50（µM)

12345αArbutina

50.7
40.9<10.0<10.0<10.0364.4

678910< 10< 10< 10> 100> 100を示すことが明らかになった（Fig. 3）19）。

3 . 3 . 化合物 14 と 21 のチロシナーゼ阻害活性評価
メラニン産生抑制活性を示した化合物のうち、新規テトラヒドロフランリグナン 14 と既知トリテルペン 21 について、チロシナーゼ阻害活性を評価した。しかし、いずれの化合物もチロシナーゼ阻害活性を示さなかった（Fig. 5）。

apositive control.

αFig. 3 Melanin deposition regulatory activities of 11-21 against α-MSH and IBMX-induced melanogenesis and protein
contents in B16-F10 cell line.

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コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Fig. 4 Anti-melanin deposition activity of 20 against α-MSH and IBMX-induced melanogenesis
and protein contents in B16-F10 cell line.

Fig. 5 Tyrosinase inhibitory activities of 14 and 21

Fig. 6 Effects of 14 and 21 on the expression of key
melanogenesis mRNAs.

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ミャンマー産ハーブの美白効果の検証と美白成分の解析

3 . 4 . 化合物 14 と 21 の cAMP 伝達経路制御機構の解析

P. integrifolia 以外にも、他のミカン科植物である Naringi

化合物 14 と 21 のメラニン産生抑制活性のより詳細な機で伝統的化粧品として利用されている。H. crenulatax は構の解明を目指し、メラニン合成経路の一つである cAMPミカン科に属すことから、これらの植物中にもクマリン誘伝達経路に及ぼす影響を、MITF、TYR、TRP- 1、及び導体が含まれ、化粧品としての効果を発揮している可能性

TRP- 2 の mRNA の発現量を精査することで評価した。そはあるが、これらの植物の化学成分と化粧品としての相関の結果、化合物 14 が TYR mRNA の発現を抑制すること関係についても興味が持たれるところである。

crenulate と Limonia acidissima の木部などもタナカの名により、メラニン産生抑制活性を示していることが示され

5. 総た。一方、化合物 21 は、その上流にある MITF mRNA の本研究においては、P. integrifolia が、H. crenulatax と発現に影響を及ぼすことにより、メラニン産生抑制活性をは異なった含有成分により、伝統的化粧品としての効果を制御していることが明らかになった（Fig. 6）。

4. 考括発揮している可能性が示された。しかし、本研究は、P.

察

integrifolia のメラニン産生調節活性について検討している本研究において、P. integrifolia 木部のクロロホルム粗が、抗酸化作用や抗炎症などの効果について詳細に検討す抽出液が、その樹皮や根の水及びメタノール抽出液よりもるには至っていない。今後、精製した化合物の抗炎症作用強い抗炎症作用を示すことに加え、穏和なメラニン産生抑や抗菌活性の評価を進めるとともに、P. integrifolia と H.

制活性をも示すことが明らかになった。ミャンマーでは、

crenulatax の各抽出液、及び単離・精製した化合物のジフ

伝統化粧品であるタナカは、その木部をペースト状にし、ェニルピクリルヒドラジルラジカル（DPPH）消去活性を指顔などに塗布するやり方で用いられている。ペーストとし標とした抗酸化作用や抗炎症作用などについて、他の化粧ての利用は、脂溶性化合物の効果も期待できる使用法であ品としての効果についても詳細に検討する必要がある。

る。本研究における結果は、P. integrifolia の化粧品としての効果を示唆するだけでなく、そのペーストとしての利謝

辞
計算科学を用いて化合物の絶対配置を決定するにあたり、用方法についても科学的根拠を与えたものと考える。
さらに、本研究においては、P. integrifolia 木部のクロご支援賜りました東京大学大学院薬学系研究科教授 阿部ロホルム粗抽出液から化合物の単離 ･ 精製を行うことによ郁朗先生及び大学院生 星野翔太郎氏に心より感謝申し上り、P. integrifolia に含まれるセサミンなどのリグナン類げます。

がそのメラニン産生抑制活性を示すことで、化粧品として本研究を助成対象課題として採択いただきました公益財の効果をもたらしている可能性が示された。しかし、本研団法人コスメトロジー研究振興財団に心から御礼申し上げ

究において、単離した化合物の中には、弱いながらもメラます。

ニン産生増強活性を示すものが見い出されている。クロロ
ホルム抽出液ではメラニン産生抑制活性が示されているこ（引用文献）とから、P. integrifolia の化粧品としての効果は示唆され

1） Mali P.Y. Premna integrifolia L.: A review of its

るが、そのメラニン産生抑制活性においては、本植物に含biodiversity, traditional uses and phytochemistry. Anci.
Scie. Life, 35, 4-11（2015）．

まれるメラニン産生抑制活性化合物と増強活性化合物の総和的効果によって、適度に化粧品としての効果を発揮し2） W a n g t h o n g S . , P a l a g a T . , R e n g p i p a t S . ,ているものと推定される。また、化合物 14 と 21 において、

Wanichwecharungruang S.P., Chanchaisak P.,

メラニン産生抑制の制御機構に違いが見られる。メラニン

Heinrich M. Biological activities and safety of

合成は、Wnt シグナル伝達経路によっても制御されるため、Thanaka （Hesperethusa crenulata） stem bark. J.

他のメラニン産生抑制活性を示した化合物についても含め、

Ethnopharmacol., 132, 466-472（2010）．

cAMP 伝達経路のみならず、Wnt シグナル経路について

3） Nayar M.N.S., Bhan M.K. Coumarins and otherも詳細に検討し、その総和的効果を解明していくことが必constituents of Hesperethusa crenulata. Phytochemistry,要である。

11, 3331‒3333（1972）．

一方、P. integrifolia の木部 H. crenulatax の主成分及び4） Rathore R.S., Prakash A., Singh P.P. Premna

化粧品としての活性本体については、クマリン誘導体の可integrifolia Linn, a preliminary study of anti-能性が指摘されており、成分の違いによる H. crenulatax

inflammatory and anti-arthritic activity. Rheumatism,と P. integrifolia の化粧品としての効果の違いに興味が持

12, 130‒134（1977）．

たれる。また、ミャンマーにおいては、H. crenulatax と5） Gopal R.H., Purushothaman K.K. Effect of plant− 73 −コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019Res., 45 1474 ‒ 1478（1985）．

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