ごあいさつ
この度コスメトロジー研究振興財団として、26 冊目の研究報告書を刊行いたしました。
設立以来 25 年以上にわたって、化粧品科学及び関連分野に貢献する研究テー
マに対し助成活動を滞りなく継続できたことは、多くの関係者の皆様のご理解ご協力によるものと、改めて感謝申し上げる次第でございます。
当財団の助成領域につきましては、医学、化学、薬学、生理学、心理学、文学、社会学など多岐にわたる分野の研究者のお力添えにより、コスメトロジーという分野が発展してきたといっても過言ではありません。助成させていただいた研究
テーマは、新素材設計、ライフサイエンス、化粧心理、文化論など多種多様であり、化粧品学の発展に有用な貢献ができたと考えております。また当財団の活動がその社会貢献の一助になっていることを幸いに思っております。
今回の報告書では、平成 27 ～ 28 年度に助成を受けられた方の中から 30 名の方の研究成果を掲載いたしました。
素材、物性に関する分野では、コラーゲンやペプチド素材に関するテーマと安
全性・安定性に優れた製剤化研究が顕著であったと思われます。
生体作用、安全性に関する分野では、皮膚のバリア機能、恒常性維持などにおける新たなメカニズムに関わる研究と皮膚の老化予防・治療に関する研究が中心であったと思われます。
精神、文化に関する分野の研究につきましては、香りの効果・メカニズムに関する研究や顔面の新しい評価法の研究など大変興味深い内容であったと考えています。
この研究報告書『COSMETOLOGY』誌がより幅広く活用されることを祈念します。
当財団は分野の枠や研究機関の属性などにとらわれることなく、化粧品学の発展のために、優れた研究に対して積極的に助成を行っていきたいと考えております。
今後とも、皆さまのますますのご協力とご支援をお願い申し上げます。

平成 30 年 7 月
公益財団法人 コスメトロジー研究振興財団
理事長

小林

保清

目

次

■ごあいさつ
■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・･ヘパリン導入コラーゲンからなる G/O エマルションの開発････････････････････････････････････････ 4
九州大学大学院工学研究院化学工学部門 井嶋 博之
・･微細藻類が生産するアスタキサンチンを水溶化するタンパク質の化粧品素材としての開発････････････ 8
東京農業大学生命科学部分子微生物学科・同大学応用生物科学部バイオサイエンス学科 川﨑 信治
・･リン脂質を主成分とする巨大分子集合体の構造発色性を利用した新規化粧品素材の開発･････････････ 12
崇東京都市大学工学部エネルギー化学科 黒岩・･特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用･････････････････････････････ 16
早稲田大学先進理工学部化学・生命化学科 小出 隆規
・･低刺激性生体接着材料の開発とその化粧品への応用･････････････････････････････････････････････ 22
新山手病院臨床医用工学研究室 小山 義之
・･アミノ酸系機能性界面制御剤による革新的な乳化技術の開発･････････････････････････････････････ 27
東京理科大学理工学部先端化学科 酒井 健一
・･化粧品・スキンケア製品に適したコメ糠タンパク質由来生理活性短鎖ペプチド素材の開発･･･････････ 32
新潟大学自然科学系（工学部機能材料工学科） 谷口 正之
・･Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価･･･････････････････････ 40
千葉大学大学院薬学研究院 東 顕二郎
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・･革新的なシミ予防・治療法の開発･･････････････････････････････････････････････････････････････ 48
名古屋大学大学院医学系研究科環境労働衛生学 飯田 真智子
・･ヒト iPS 細胞を利用して、表皮角化細胞の様々な刺激に対する反応性にフィラグリン
遺伝子の変異が与える影響について検討する･･･････････････････････････････････････････････････ 52
健
東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科皮膚科学分野 井川・･ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化
製剤の薬理効果への影響･････････････････････････････････････････････････････････････････････ 56
徳島大学大学院医歯薬学研究部 石田 竜弘・･フィラグリン遺伝子欠損ラットを用いたアレルギーマーチの解明･････････････････････････････････ 63
京都大学大学院医学研究科皮膚科学講座 大塚 篤司
・･メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 68
筑波大学医学医療系生理化学 大林 典彦
・･創薬のための毛囊を有する in vitro 人工皮膚モデルの開発････････････････････････････････････････ 75
健
岡山理科大学理学部臨床生命科学科 片岡・･化学物質の新規リスク評価のためのライブシングルセル解析手法の開発･･･････････････････････････ 79
功
大阪大学大学院基礎工学研究科 倉岡・･皮膚アレルギーを制御する ω3 由来脂肪酸メディエーターの産生・作用機構の解明･･･････････････････ 85
望
東京大学大学院薬学系研究科 河野・･皮膚ホメオスタシス制御に向けたアレルゲンセラピーの基盤研究とその応用･･･････････････････････ 89亮
金沢大学医薬保健研究域薬学系衛生化学研究室 鈴木・･皮膚加齢における基底膜蛋白の生理学的意義の解明･････････････････････････････････････････････ 94
健
北海道大学病院皮膚科 夏賀
・･生体皮膚「質感」「機能」二光子イメージングによる化粧品作用の評価システムの確立･･････････････ 98
智自治医科大学分子病態研究部 西村・･皮膚の恒常性維持における転写補助因子 MRTF-A/B の役割･････････････････････････････････････ 102
大阪大学大学院医学系研究科 林 謙一郎
・･細胞生存促進効果を有する糖内包化リポソームのアンチエージング化粧品への応用････････････････ 107
千里金蘭大学生活科学部食物栄養学科 日沼 州司
・･チロシナーゼと基質複合体結晶構造解析に基づいた反応機構の解明･･････････････････････････････ 113
大阪府立大学大学院生命環境科学研究科 藤枝 伸宇・･クエン酸による細胞機能の調節機構：美容および美白、老化における役割････････････････････････ 117
国立研究開発法人国立成育医療研究センター 宮戸 健二
・･アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果････････････････････････････････････ 122
京都大学大学院薬学研究科 山下 富義
Ⅲ．精神、文化に関する分野
・･顔面加齢の評価のための画像解析手法の開発：主観的感覚的評価から客観的定量的評価へ･･････････ 130
国際医療福祉大学三田病院放射線診断センター 奥田 逸子
・･肌の魅力に関する意識構造の年代間、性別間比較･･･････････････････････････････････････････････ 135
雄祐
関西学院大学理工学部 谿・･植物由来の香りが睡眠におよぼす影響の解明･･･････････････････････････････････････････････････ 141
東京大学大学院農学生命科学研究科 恒次 祐子
・･現代の子ども文化の中に見られる化粧の話題の分析と保護者と保育者の化粧に関する認識･･････････ 146
筑波大学医学医療系 徳田 克己、水野 智美
・･香りのなつかしさの神経メカニズム･･･････････････････････････････････････････････････････････ 153
福井大学医学部脳形態機能学分野 村田 航志・･新しい顔面 3 次元形状評価法の開発 ─相同モデル化による顔面形状の特徴を定量化する試み─････ 158
悦秀
九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病態学講座口腔顎顔面外科学分野 森■記念講演・第 28 回表彰・贈呈式記念講演「夢を形に：ナノテクノロジーで創る体内病院」･････････････････････････････････････････････････ 165
公益財団法人川崎市産業振興財団ナノ医療イノベーションセンター 片岡 一則■コスメトロジー研究雑感・･････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 177
■付

録

事業報告書

････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 201

2017 年度

研究助成を受けられた方々 ････････････････････････････････････････････････････････････ 203

役員一覧･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 206

●Ⅰ．素材、物性に関する分野
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
Ⅲ．精神、文化に関する分野●

ヘパリン導入コラーゲンからなる G/O エマルションの開発
九州大学大学院工学研究院化学工学部門

井嶋博之

Heparin-collagen conjugate using heparin having affinity for various growth factors was prepared. Furthermore, a gelin-oil (G/O) emulsion consists of this conjugate was developed. This G/O emulsion was able to immobilize various growth
factors including bFGF. In addition, this G/O showed good permeability to the skin. Furthermore, activation of the cultured
dermis model was suggested in the application test of bFGF-containing G/O. From the above, the effectiveness of the G/
O emulsion as a novel skin care technology having good skin permeability, stabilization of the active ingredient and its
sustained release property was expected.

１．緒

言

シワやたるみ、シミや黒ずみ、ニキビ、ニキビ跡、髪のダメージ・抜け毛などのトラブルは誰にでも起こる問題であり、精神衛生的観点からもこれら問題を解決することは重要である。近年、増殖因子が注目されており、上皮細胞増殖因子（EGF）や線維芽細胞増殖因子（FGF）などが配合された美容液が市販されている。しかしながら、増殖因子は不安定であり容易に失活するため、その安定性の向上が不可欠である。さらに、皮膚は優れたバリア性を有するた
め分子量数万の各種増殖因子の皮膚透過性は極めて低い。

Fig. 1 Image of activation of skin by G/O emulsion

これに対してタンパク質薬物を Solid-in-Oil 化することで疎水性表面の直径数百 nm の微粒子が作製でき、劇的な皮膚浸透性の向上が報告されている 1 - 2）。

ア技術を創出することを目的とした（Fig. 1）。

一方、ヘパリン導入コラーゲンは肝臓 3 - 8）、血管 5 - 6）, 9）、

２．方神経組織 10）に対する再生医療用基材としての有効性が実法

傍において自発的にゲル化し、高い生体親和性を示す。さ2 . 1. ヘパリン導入コラーゲンゲルへの増殖因子固定化と安定性評価らに本基材は EGF、FGF、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、

水溶性カルボジイミド塩酸塩（EDC）および N- ヒドロキ

肝細胞増殖因子（HGF）などの各種増殖因子と高い親和性

シスクシンイミド（NHS）を用いてコラーゲンゲルにヘパを有しており、自発的にそれら増殖因子を固体化保持できリンを導入した。作製したヘパリン導入コラーゲンゲルにる 4 - 10）。これにより、増殖因子の失活が阻害され、その細塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を固定化し、ELISA 法

証されてきた。本基材は生体内コラーゲンと同様に中性近、かつ徐放性がによりゲル内の bFGF 量を評価した。また、ヘパリン導入

ことにより、効果的な皮膚の活性化が期待

コラーゲンゲルに bFGF を固定化して 1 日間インキュベー

胞活性化効果を長期間良好に維持でき付与される

5 - 6）

9 - 10）

ションした後、ELISA 法によりゲル内の bFGF 量を評価される。
そこで本研究では、上記ヘパリン導入コラーゲンのナノした。

ゲルからなるエマルションを開発し、従来にないスキンケ

2 . 2 . G/Oエマルションの開発
ゼラチン溶液の水相と、ショ糖エルカ酸エステル（ER290）を溶解したシクロヘキサンの油相を混合し、超音波
Development of G/O emulsion consists ofheparin-collagen conjugate
Hiroyuki Ijima
Dept. of Chemical Engineering, Graduate
School, Kyushu University

ホモジナイザーを用いて乳化させた。ゲル化後油相を置換し、ミリスチン酸イソプロピル（IPM）に再分散させること
で G/O を調製した。G/O 調製時の界面活性剤濃度、水相と油相の体積比、ゼラチン濃度について最適化を行った後、−4−ヘパリン導入コラーゲンからなる G/O エマルションの開発

ヘパリン導入ゼラチン溶液を水相に用いた G/O 調製を試

3．結果と考察

みた。G/O の粒径分布は動的光散乱法（DLS）により測定し評価した。

3 . 1. ヘパリン導入コラーゲンゲルへの増殖因子固定化と安定性評価

2 . 3 . G/Oエマルションの皮膚浸透性評価

果、有意に多くの bFGF が固定化されていることが確認さた。また、G/O 内水相のゲル化を動的粘弾性測定によりヘパリン導入コラーゲンゲル内の bFGF 量を評価した結強化緑色蛍光タンパク質 EGFP を含むゼラチン溶液の水れた。その固定化効率は約 71 % であった。また、ヘパリ

相 1 mL と、IPM（ER- 290：50 mg/mL）の油相 2 mL を用

ン導入コラーゲンゲルに固定化した bFGF は、溶液中のいて EGFP 含有 G/O を調製した。拡散セルにマウスの背bFGF と比較してその活性を良好に維持していることが期

中皮膚を挟み、PBS を皮膚下面がさらされる程度まで加え待された（Fig. 2）。これは bFGF が分子構造の比較的安定た。EGFP 含有 G/O を皮膚上面に添加し、インキュベータ

なヘパリンに結合し、立体構造が安定化したためだと考えー内で 1 日間静置した。その後、皮膚断面の凍結切片を作られる。

製して蛍光観察を行った。

2 . 4 . 培養真皮モデルを用いた bFGF 固定化 G/O の有効性評価

3 . 2 . G/Oエマルションの開発
ナノゲル粒子を IPM に再分散させたところ、均一に分散させることができ、G/O の形成が示唆された。G/O 調

1 % コラーゲン溶液と 20 % FBS 添加 2 倍濃縮 DMEM製時の組成について最適化を行った結果、界面活性剤濃度

を 1：1 で混合した溶液にマウス線維芽細胞（L 929 細胞）を50 mg/mL、水相と油相の体積比 1：2、ゼラチン濃度 5 %5

懸濁し（6 . 7×10 cells/mL）、37 ℃下でゲル化させることの条件において、粒子径が小さい G/O が得られた。こので培養真皮モデルを作製した。この培養真皮モデル表面に条件下において、ヘパリン導入ゼラチン溶液を水相に用い

bFGF 固 定 化 G/O エ マ ル シ ョ ン を 塗 布 し 培 養 し た。

て G/O を調製したところ、平均粒径が 293 nm の G/O が得

Hoechst を用いた DNA を定量により、培養真皮モデル内られた（Fig. 3（A））。これより皮膚浸透可能なサイズの G/の細胞増殖を評価した。

O 作製が示唆された。また、IPM 中に分散した G/O エマ

Fig. 2 Immobilized bFGF in heparin-collagen conjugate gel
evaluated by ELISA; n = 3 . Bars represent S.D.

Fig. 3 Characteristics of G/O emulsion. (A) Size distribution of G/O emulsion evaluated with
DLS; n = 3 . (B) Phase-contrast microscopic observation of G/O emulsion. Bar indicates
1 µm.

−5−

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

ルションは安定であり、経時的粒径変化は観察されなかっ形成が示唆された。EGFP 含有 G/O の皮膚浸透試験の結果、た。さらに、G/O 粒子の動的粘弾性測定を行った結果、同EGFP の皮膚浸透が示唆された。さらに、bFGF 含有 G/O

様に作製した W/O エマルションと比較して硬いことが分の塗布試験において培養真皮モデル活性化が示唆された。

かった。これより、G/O 内水相のゲル化が期待された。

以上より、皮膚浸透性と有効成分の安定化および徐放性を有する新規スキンケア技術としての G/O エマルションの有3 . 3 . G/Oエマルションの皮膚浸透性評価

効性が期待された。

EGFP 含有 G/O の皮膚浸透試験を行った後、皮膚断面の蛍光観察を行った。EGFP の皮膚浸透性は見られなかった

謝

辞が、G/O 化することにより EGFP の皮膚内部への浸透が示

G/O エマルション作製および評価に尽力いただいた長された（Fig. 4）。また、G/O 調製時に EGFP の活性は失わ

尾征哉氏（九州大学）、山本惠美子氏（九州大学）に心よりおれておらず、皮膚浸透後も活性を維持していることが示さ

礼申し上げます。また、基材評価にご協力いただいた後藤れた。

雅宏教授（九州大学）、三浦佳子教授（九州大学）、小野文靖
准教授（九州大学）に感謝申し上げます。

3 . 4 . 培養真皮モデルを用いた bFGF 固定化 G/O の有効性評価
増殖因子不含培地と比較して bFGF 含有培地の増殖促進

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コスメトロジ
ー研究振興財団よりご援助いただきましたことに深く感謝
申し上げます。

効果は観察されなかった。これは bFGF の安定性の乏しさに起因するものである。また、bFGF 固定化 W/O エマル（引用文献）

ションにより培養初期において細胞増殖促進効果が見られ

1） Wakabayashi, R., Sakuragi, M., Kozaka, S., Tahara,

たものの、その効果は持続できなかった。一方、bFGF 固

Y., Kamiya, N., Goto, M.. Solid-in-Oil peptide

定化 G/O エマルションにおいては他の条件と比較して有nanocarriers for transcutaneous cancer vaccine

意な細胞増殖効果が確認され、少なくとも培養 7 日間そのdelivery against melanoma, Mol. Pharm., 1 5, 9 5 5-9 6 1,
2018.

効果が持続した。よって、G/O エマルションによる培養

2） Tahara, Y., Honda, S., Kamiya, N., Piao, H., Hirata, A.,

真皮モデルの活性化が期待された。

４．総

Hayakawa, E., Fujii, T., Goto, M., A solid-in-oil

括nanodispersion for transcutaneous protein delivery, J.
Control. Release, 131, 14-18, 2008.

ヘパリン導入コラーゲンゲルに増殖因子を固定化させる
ことで、増殖因子の活性維持が確認された。また、内水相

3） Ye, J., Shirakigawa, N., Ijima, H., Hybrid organoids

がヘパリン導入ゼラチンゲルである G/O（粒径約 293 nm）

consisting of extracellular matrix gel particles andFig. 4 In vitro evaluation on skin permeability of G/O emulsion using mouse skin. Bars indicate 200 µm.

−6−ヘパリン導入コラーゲンからなる G/O エマルションの開発

hepatocytes for transplantation, J. Biosci. Bioeng., 120,

growth factor/heparin-immobilized collagen system on

231-237, 2015.

albumin synthesis and spheroid formation by
hepatocytes, J. Biosci. Bioeng., 110, 208-216, 2010.

4） Nakamura, S., Kubo, T., Ijima, H., Heparin-conjugatedgelatin as a growth factor immobilization scaffold, J.

8） Ijima, H., Kubo, T., Hou, Y.-T., Primary rat
hepatocytes form spheroids on hepatocyte growth

Biosci. Bioeng., 115, 562-567, 2013.
5） Hou, Y.-T., Ijima, H., Shirakigawa, N., Takei, T.,

factor/heparin-immobilized collagen film and maintain

Kawakami, K., Development of growth factor-

high albumin production, Biochem., Eng. J., 4 6, 2 2 7-

immobilizable material for hepatocyte transplantation,

233, 2009.
9） Mizumachi, H., Ijima, H., Measuring stability ofBiochem. Eng. J., 69, 172-181, 2012.
6） Hou, Y.-T., Ijima, H., Takei, T., Kawakami, K., Growth

vascular endothelial growth factor using an

factor/heparin-immobilized collagen gel systemimmobilization technique, Adv. Biomed. Eng., 2, 1 3 0136, 2013.

enhances viability of transplanted hepatocytes andinduces angiogenesis, J. Biosci. Bioeng., 1 1 2, 2 6 5-2 7 2,10）Nagai, T., Ikegami, Y., Mizumachi, H., Shirakigawa,N., Ijima, H., Development of an in situ evaluation

2011.
7） Hou, Y.-T., Ijima, H., Matsumoto, S., Kubo, T., Takei,T., Sakai, S., Kawakami, K., Effect of a hepatocyte−7−

system for neural cells using ECM-modeled gel culture,
J. Biosci. Bioeng., 124 , 430 - 438 , 2017 .

微細藻類が生産するアスタキサンチンを水溶化する
タンパク質の化粧品素材としての開発
東京農業大学生命科学部分子微生物学科
東京農業大学応用生物科学部バイオサイエンス学科

川﨑信治

Under extreme environmental conditions such as desiccation and high salinity combined with high light irradiation, it
is difficult for higher plants to survive because light energy, in combination with oxygen, leads to the generation of reactive
oxygen species (ROS) under water stress conditions. However, microalgae are found to thrive under such conditions. A
microalga, strain Ki- 4 was previously isolated from asphalt in midsummer, and a novel water-soluble astaxanthin binding
protein, named AstaP, was identified from this microalga. This protein is heat-stable and possesses singlet oxygen-quenchingactivity in water. AstaP is thought to enable the microalga to survive under the extreme photooxidative stress conditions. Our
aim is to develop AstaP as a novel functional molecule, which can be produced at high yields, to enable lipid-soluble organic
astaxanthin to function in water. In this study, we have been working on developing a system to obtain large amounts of thehighly purified AstaP by engineering the cultivation systems of strain Ki- 4 . In addition, we are determining the possibilityof using AstaP as a cosmetic product to protect human cells from the toxic effects of sun light and ROS.

1. 緒あった。微細藻類 Ki-4 株はヘマトコッカス藻と同じ緑藻

言綱に属する微細藻類で、AstaP は本藻類が光酸化ストレス

植物は強光が付随する環境ストレス下では、活性酸素のを感知した際に細胞内で大量に生産される（図 2）。AstaP生成を伴う光酸化ストレスを発生し枯死にいたる。申請者
らは一般の植物が生存しえない砂漠環境などの極限環境から微細藻類の探索を行い、70株ほどの真核微細藻類を単離・保有している。これら極限環境から単離した藻類は、淡水性でありながら強い乾燥耐性や耐塩性を示し、強光照射下でかつ水分が 0 ％の環境でも数ヵ月間生存するなど強い環
境ストレス抵抗性を示すことから、シングルセルを強光毒性から防御するための優れた生命代謝系の存在が推定された。
強光下の真夏のアスファルトから単離した微細藻類 Ki-4
株は、強光が付随する環境ストレス（強光＋乾燥や塩スト

図 1 大学前の真夏のアスファルトから単離した
Ki-4 株の顕微鏡写真

レス）に遭遇すると細胞液を赤く変色して生存する（図 1）。
この赤色に着目して研究をすすめた結果、植物界で初めての発見となるアスタキサンチンを結合する水溶性タンパク質の精製に成功し、AstaP と命名した 1）（図 2）。アスタキ
サンチンはカロテノイドの中でも特に優れた抗酸化力をもつ脂溶性のカロテノイドであり、エビやカニの甲羅、フラミンゴの羽などに含まれる脂溶性のカロテノイドで、化粧品や機能性食品に広く利用されている。また植物界におけるアスタキサンチンは、真核の微細藻類ヘマトコッカス藻などが細胞内に油滴として蓄積することが知られるのみでDevelopment of a novel microa lga laqueous astaxanthin binding protein foruse in cosmetic products
Shinji Kawasaki
Tokyo University of Agriculture

図2
A. Ki-4 株を寒天培地上で培養し、強光 + 乾燥ストレスを付与した際の形態変化
B. Ki-4 株の液体による大量培養とストレス付与後の色彩変化
C. 精製後に純水に溶けたアスタキサンチン結合タンパク質（AstaP）−8−

微細藻類が生産するアスタキサンチンを水溶化するタンパク質の化粧品素材としての開発

はアスタキサンチンを純水に溶かす水溶化能力があり、その開発に着手した。

の水溶特性と 1 重項酸素消去活性は 100 ℃・1 時間の処理後も安定であった。そこで本研究では AstaP を脂溶性アス

2. 3. 細胞アッセイ系の確立

タキサンチンの効力を水溶液中で発揮し、かつ大量生産がAstaP は脂溶性のアスタキサンチンの効力を水溶液中で可能な新奇な機能性素材として認識し、化粧品分野での有発揮することが可能な抗酸化物質としてのユニークな機能

効的な利用法の可能性を探ることを目的とする。

性が期待される。そこで水溶液中での活性酸素消去能力の2. 実

評価、ならびに 1 重項酸素消去剤としての能力の評価と安験

定性に関する試験を行った。AstaP は新規な機能性素材で2. 1. 大量生産法の確立あることから、化粧品素材への応用は各種の安全性試験を

水溶性のアスタキサンチン結合タンパク質（AstaP）の商クリアする必要がある。その第一歩として、培養細胞を用

業利用には、まず本品の大量生産系の確立が前提条件とないた試験を実施した。細胞を用いた毒性試験はアスタキサる。そこで微細藻類の大量培養系の確立に着手した。まずンチンの抗酸化能力を評価した過去の論文を参考にして実は大量培養に向けた培地成分の確立を行った。培地には糖施した。専門家の指導の下で細胞培養系の立ち上げを行い、源など有機物を含まない無機塩類をベースとした安価な

その後にアスタキサンチンの機能性評価に関する論文を参

無機培地を採用し、完全な独立栄養（CO2 と光のみの供給考にして、マウス胎児由来の線維芽細胞である NIH3T3 細で生育）にて良好な生育を可能とする培地組成を検討した。

胞を用いて評価を行った。

次に光酸化ストレス付与に応じて発現する AstaP の最適な

3. 結誘導条件を決定するために、光強度や CO2 濃度、塩濃度、培養温度などの光酸化ストレス付与条件と、さらなる発現果

3. 1. AstaP の大量生産法の確立

量の向上を目指して鉄濃度の影響を調査した。また上記で培地成分に関する正確な情報を得るために、無菌環境下確立した培養条件を用いて、非閉鎖系での屋外培養槽によで Ki-4 藻の培養を行い、CO2 の濃度、ならびに光条件のる大量培養試験を実施した（図 3）。

検討を行った。その結果、培養開始後 4 日目で 3 × 106 個/ml（培地）の増殖を可能とする藻細胞培養系の確立に成2. 2. 大量精製法の確立功した。アスタキサンチン生産用に培養されている微細藻

AstaP の商業利用には、AstaP を容易に、かつ高純度に類ヘマトコッカス藻で報告されている細胞増殖速度は 105

精製する技術が必要となる。AstaP は細胞内で最も高い等

個 /ml のオーダーであることから 2，3）、細胞の数として評電点（pI=10.5）をもつことから、本性質を上手く利用する

価すると約 10 倍の増殖速度に相当する結果を得た。確立

ことにより他の細胞内タンパク質との容易な分別精製が可した大量培養系にて AstaP の生産効率の向上を試験した。

能になることが推定された。そこで前項 2. 1. で実施した

その結果、AstaP は光酸化ストレス下（強光＋塩ストレス

屋外大量培養法で生産した微細藻類から、AstaP の大量精や乾燥ストレス下）で速やかに遺伝子発現を開始し、スト製法の確立を試みた。まず安価でかつ容易な精製系の確立

レス開始後 2 日目には、細胞内で最も大量に蓄積するタンを目的として、イオン交換樹脂の検討と、効率的な精製法

パク質になることがプロテオーム解析の結果から判明した

図３
A. 非閉鎖系培養の様子
B. 本研究で最適化した培養法による Ki-4 株の生育。○：CO2 通気培養。●：Air 通気培養
C. 光酸化ストレスを付与後の藻体から抽出した水溶性画分−9−コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

（図 4）。そこで CO2 濃度や光の強度、さらには Fe イオン

3. 2. 抗酸化活性の評価法の確立の濃度を変化させ、AstaP 発現との相関性に関して解析を過去の研究において、AstaP は１重項酸素を水溶液中で行った。その結果、最適な通気 CO2 濃度の条件を決定し消去する活性に優れ、AstaP 0.2µM（アスタキサンチン換た（図 3）。またヘマトコッカス藻において Fe 添加による算）は標準化合物である NaN3（アジ化ナトリウム）1mM

アスタキサンチン合成量の上昇が報告されていたことからに相当する強い活性を示すことを報告した 1）。本活性は同様に添加したところ、AstaP 発現量の向上が観察された。

100 ℃で 1 時間のボイル後も失活しない耐熱性がある。現しかし Fe 未添加のものと比べて生産量が 1.2 倍程度高いの

在は精製した AstaP を用いて、1 重項酸素消去活性と共に、みであり、その後の生産プロセスにおける Fe の混入リス

様々な酸化基質に対する抗酸化活性について解析を行ってクもあることから、以後の実験は全て Fe 未添加条件で行いる。能力の比較に関しては可溶性の抗酸化剤であるアン

うこととした。次に、上述で開発した大量培養系を用いてトシアニンやフラボノイド類、ビタミン類、グルタチオンな生産した AstaP の効率的な精製法の開発を行った。AstaP

どの水溶性化合物を用いて、抗酸化活性や各種安定性（光、は高い等電点を有することから、陽イオン吸着カラムに使熱、放置）について比較した。その結果、興味深い結果が用するバッファー組成について検討した。その結果、他の得られたことから、現在は商業利用に向けた総合的な観点

タンパク質が吸着しない高アルカリのバッファーを使用しからの評価を継続し、論文化を目指してデータを精査してた場合でも陽イオン交換カラムに吸着することが判明したいる。

ため、カラム 1 本の使用のみで AstaP 溶出画分をほぼ完全

AstaP は新規な機能性素材であることから、細胞や生体に精製できる系の確率に成功した（図５）。現在は AstaP のへの影響は不明である。上記の解析において in vitro の系

質量より高分子領域に存在する微量の夾雑タンパク質を完で得られた AstaP の活性を応用的に評価するためにも、細全に除去するための溶出塩濃度のグラジェントの条件を検胞培養系の確立と、AstaP 共存下における細胞への影響を討している。また本精製は安価なイオン交換樹脂を用いた解析する必要がある。そこで細胞培養系の確立を行った。

場合でも可能であったことから、精製法の低コスト化と簡

過去にアスタキサンチンの細胞への機能性を評価した論便化に目途がついた。

文 4）を参考にして、ラット胎児由来の線維芽細胞（NIH3T3

図4A. AstaP 遺伝子の発現。光酸化ストレス付与から 2 時間後に発現誘導が観察された
B. AstaP タンパク質の発現。光酸化ストレス付与 48h 後（右）に大量発現が観察された

図5
A. AstaP タンパク質精製の様子
B. 精製タンパク質の SDS-PAGE。カラムクロマトグラフィー前（細胞粗抽出液、左）と後（右）。カラム 1 本で高純度の精製が可能となった− 10 −

微細藻類が生産するアスタキサンチンを水溶化するタンパク質の化粧品素材としての開発

細胞）の培養系の確立を行った。NIH3T3 細胞は理化学研

いた安全性評価を実施したい。また AstaP の機能性は、ア

究所のストック株を使用し、DMEM 培地に細胞を接種し、スタキサンチンの代表的な機能性である 1 重項酸素消去活5.0% CO2 インキュベータで数日間培養したところ、良好性の他にも、眼精疲労抑制や免疫賦活、脳梗塞など、新規に生育した。純水に溶けた濃縮 AstaP を添加して NIH3T3

な効果が続々と報告されている。これらの研究には全て脂細胞の生育への影響を観察したところ、これまでに終濃度

溶性のアスタキサンチンが用いられていることから、純水

15µM までの AstaP（OD484nm=1.5 に相当、濃いオレンに可溶な AstaP の利用性は未知の可能性を秘めている。今ジ色になる）を添加した条件下で細胞生育への負の影響は後は培養細胞の評価系を用いて、脂溶性のアスタキサンチ

観察されなかった。本研究で細胞培養系と添加実験に関すンがもつ機能性が水溶液中でも実現可能かどうかを解析し、る評価系を確立できたことから、今後は AstaP 共存下で細AstaP がもつ可能性を評価していきたい。

胞への紫外線照射の影響や活性酸素発生剤の影響などを観察し、細胞保護効果の有無を観察し、さらなる応用研究を謝

辞本研究の実施にご助成いただきました公益財団法人コス進める方針である。

4. 考

メトロジー研究振興財団に深謝いたします。

察

本研究では微細藻類由来の水溶性アスタキサンチン結合（引用文献）

タンパク質の化粧品素材への応用に関して研究を行った。

1） S. Kawasaki, K. Mizuguchi, M. Sato, T. Kono and H.

応用研究に着手する際に必要不可欠となる大量生産系の確

Shimizu. A novel astaxanthin binding photooxidative

立を目的として、屋外培養に向けたパイロットスタディを

stress inducible aqueous carotenoprotein from行った。開発した開放培養系での AstaP の生産量を総括

a eukaryotic microalga isolated from asphalt in

すると、パイロットスタディでは約 2 週間の期間でヒトのmidsummer. Plant Cell Physiol. 54, 1027-1040, 2013.

目で判別される充分なオレンジ色（OD485nm=0.5）の水溶

2） M. Harker, A.J. Tsavalos, and A.J. Young. Factors

液 50 ml を約 30 本得られる藻体が 10 L の培地から得られResponsible for Astaxanthin Formation in the

た。この生産量を基準としてスケール UP が容易な直径 3

Chlorophyte Haematococcus Pluvialis. Bioresourceｍの培養槽で行う場合は約 500 本（収率 50 ％として）、やTechnology 55, 207-214, 1996.

や中規模の直径 10 ｍの培養槽で行う場合は約 5,000 本（収3） I. Suh, H. Joo, C. Lee. A novel double-layered

率 30 ％として）の生産が可能と試算した。以上を総括する

photobioreactor for simultaneous Haematococcusと、供給面については商業化に必要な諸条件をクリアできpluvialis cell growth and astaxanthin accumulation. J.

る感触を得た。

Biotechnol. 125, 540-546, 2006.

一方、化粧品素材への利用には、機能性だけでなく安全

4） S. Hama, S. Uenishi, A. Yamada, T. Ohgita, H.

性を評価する必要がある。細胞への影響を評価したとこ

Tsuchiya, E. Yamashita, and K. Kogure. Scavenging ofろ、充分なオレンジ色の水溶液では、少なくとも NIH3T3

Hydroxyl Radicals in Aqueous Solution by Astaxanthin

細胞の増殖に負の影響を与えないことが判明した。今後は、

Encapsulated in Liposomes. Biol. Pharmaceu. Bull. 3 5,

様々な種類の動物細胞を用いてさらに高濃度の AstaP を用

2238-2242, 2012.

− 11 −

リン脂質を主成分とする巨大分子集合体の構造発色性を利用した新規化粧品素材の開発
東京都市大学工学部エネルギー化学科

黒岩崇

A novel structural color material was developed using millimeter-sized giant molecular aggregates formed inphosphatidylcholine (PC) /cholesterol (Chol) /stearic acid (SAc)/ water systems. A lipid mixture consisting of PC, Chol andSAc ( 5 : 5 : 1 in molar ratio) was dissolved in n-hexane and placed onto aqueous phases with various pH, then n-hexane
was removed by evaporation under ambient conditions in order to form giant molecular aggregates in the aqueous phase.
At low pH (< 8 ), film-like aggregates were obtained, while spherical aggregates were formed at high pH (> 8 ). Small/Wideangle X-ray scattering measurements revealed that the molecular aggregates exhibited the liquid crystalline polymorphism.
Spherical aggregates formed at high pH exhibited structural color depending on the salt concentration of their externalaqueous phase. The measurement results of reflection spectra of visible lights from the giant molecular aggregates indicatedthat their tunable colorization was attributed to change in the internal structure of the giant molecular aggregates. Abovefindings would contribute to develop biocompatible colorization materials for potential cosmetic application without any
dyes or pigments.

1. 緒

筆者らの研究グループでは、リン脂質、コレステロール

言に少量の添加剤を加えた混合脂質系において、従来着目さ自然界においては、昆虫の翅・表皮や鳥の羽を代表例とれてこなかったミリメートル以上の大きさをもつ巨大分子

して、特定の波長の光を吸収する色素によらない鮮やかな集合体の作製方法を開発し、さらにこの巨大分子集合体が色彩がみられる。これらは「構造色」と呼ばれる。構造色は、温度や外水相の組成といった環境要因によりその形態や外発色素材の表面にある数百 nm 程度の微細構造に照射され観・色彩を大きく変化させることを見出してきた 11）。こた光が回折、散乱、干渉などを起こし、特定の波長域の可れまでに、リン脂質 / コレステロール / 長鎖アルキルアミ。構造色は一般

ン / 水系において、塩濃度依存的に構造発色性を示す分子に美しい光沢を持ち、色素に比べて退色しにくい性質があ集合体の作製に成功している 12）。本研究では、この巨大るため、構造色を示す微細構造を人工的に作り上げること

分子集合体の生体適合性向上と化粧品分野への展開を目指

で新しい表示材料や色彩材料として利用する試みが展開さして、長鎖アルキルアミンに代わる添加成分として化粧品

れ 5）、その中でも、近年、分子集合体やゲルなどのソフト分野でも利用される長鎖脂肪酸に注目した。本稿では、リマテリアルをベースとする構造発色性材料が注目を集めて

ン脂質 / コレステロール / 長鎖脂肪酸 / 水系において色彩

視光線が強められることで観察される

いる

1-4）

6, 7）

。これらの研究では、シリカ微粒子、界面活性剤、を自在に制御可能な構造発色素材を開発することを目的と高分子ゲルなど、主として人工的に合成された化合物が基して、巨大分子集合体の形状および構造に及ぼす温度およ材として利用されている。一方で、自然界に広く分布するび pH の影響、発色性に及ぼす塩濃度の影響を中心に、巨生物体の構造色の構造的起源の解明が進む中

5, 8, 9）、天然物

大分子集合体の特性評価を行った結果について報告する。

由来の分子材料を利用して人為的環境下で構造発色性を発現させる試みはあまり進んでいない。一部のセルロース誘導体の水溶液が可視光の選択反射に基づく構造発色を示すことが古くから知られているが

2. 方

法

2. 1. リン脂質巨大分子集合体の作製
卵黄由来ホスファチジルコリン（PC）にはコートソーム

10）、化学修飾を伴わない、

天然物由来の生体分子そのものを利用して構造発色材料にNC-50（日油株式会社）を使用した。コレステロール（Chol）

利用することができれば、より高い生体適合性が求められ

および n- ヘキサンは和光純薬工業株式会社（現・富士フイる化粧品や食品などの新規分野への展開が期待できる。

ルム和光純薬株式会社）より購入し、ステアリン酸（SAc）
は東京化成株式会社より購入した。その他の試薬は和光純

Development of a novel cosmetic material
based on structural colorization of giant
molecular aggregates mainly consistingof phospholipids

薬工業株式会社より特級または分析グレードのものを購入

Takashi Kuroiwa
Department of Chemistry and Energy
Engineering, Faculty of Engineering,Tokyo City University

PC：Chol：SAc ＝ 5：5：1 のモル比でヘキサンに溶解（PCして使用した。いずれも購入後の精製は行わず、そのまま実験に用いた。
濃度 13mM）し、これを脂質溶液とした。この脂質溶液を
種々の pH の緩衝液（50mM）上に積層し、25 ℃以上で 24− 12 −

リン脂質を主成分とする巨大分子集合体の構造発色性を利用した新規化粧品素材の開発

時間静置してヘキサンを蒸発除去することで、球状または膜状の巨大分子集合体を作製した。このとき、脂質溶液と緩衝液の体積比は 1：2 とした。得られた巨大分子集合体
を外水相とともに超純水中に移し、水相の電導度を測定しながら外水相を超純水で希釈することで外水相の塩濃度を所定の値に調整した。

2. 2. 小角 /広角 X 線散乱（SAXS/WAXS）測定による巨大分子集合体の構造評価作製した巨大分子集合体に対し、高エネルギー加速器研
図 1 反射スペクトル測定装置の概略

究機構 PF BL-6A ステーションにて SAXS および WAXS
測 定 を 行 っ た。X 線 の 波 長 は 1.5Å と し た。 試 料 温 度 を
40 ℃から 5 ℃まで制御（冷却速度 2.5 ℃/min）しながら、
SAXS では 1 分おき、WAXS では 2 分おきに散乱パターンを撮影し、得られた 2 次元散乱データを使用して相構造を解析した。

2. 3. 巨大分子集合体の発色性の評価
巨大分子集合体の発色の様子は、主としてマクロズー
ムレンズ（TS93005、株式会社杉藤）およびカラー CCD カ
図 2 異なる pH で得られた巨大分子集合体の形状の違い

メラ（STC-TC202USB、センテック株式会社（現・オムロ
ンセンテック株式会社））より構成されるデジタルマイク
ロスコープシステムにより観察した。巨大分子集合体の可視反射スペクトルは図 1 に示す装置により測定した。円筒形のガラス製サンプル容器に外水相とともに巨大分子集合体を封入し、光ファイバーを介してハロゲンランプ光源（Megalight 100、株式会社モリテックス）からの光を試料に入射した。測定角θの位置に設置した光ファイバープ
ローブを接続したマルチチャンネル分光器（USB-650 Red
Tide、Ocean Optics, Inc.）を用い、種々の測定角における反射スペクトルを測定した。

3. 結

果

3. 1. PC/Chol/SAc/ 水系における巨大分子集合体の作製と構造評価

図 3 種々の pH および温度における巨大分子集合体の相構造（H：ヘキサゴナル相、C：キュービック相、L：ラメラ相、?：相構造の特定には至っていないが、秩序性の低いキュービック相と考えられるスポンジ相の発現が示唆される）

PC/Chol/SAc/ 水系において、水相の pH を種々変えて巨大分子集合体を作製した結果、pH が 8 より低い条件で子集合体においては、30 ℃～ 40 ℃付近でキュービック相は膜厚 1 mm 程度の透明・膜状分子集合体が、pH が 8 よが発現し、低温域でラメラ相が発現していることがわかっりも高い条件では直径 0.5 mm ～ 2 mm 程度の透明・球状

た。WAXS 測定の結果、いずれの条件においても分子集

分子集合体が得られた（図 2）。なお、SAc を添加していな合体を構成する脂質のアルキル鎖が低い秩序性を持って充い PC/Chol/ 水系（PC：Chol=5：5）では、水相の pH（4 〜填した液晶状態であることが示され、PC/Chol/SAc/ 水系

11）によらず膜状の分子集合体が得られ、球状分子集合体で得られる巨大分子集合体は温度および pH に依存して液の形成は認められなかった。SAXS 測定による巨大分子集晶多形を示すことが明らかとなった。

合体の構造評価13）を行った結果を図 3 に示す。低 pH 条件

で得られる膜状分子集合体においては、30 ℃～ 40 ℃付近

3. 2. 巨大分子集合体の構造色の発現と塩濃度依存性

でヘキサゴナル相が発現し、低温域でラメラ相が発現して塩濃度 50 mM、pH 10 のホウ酸緩衝液中で得られた透明・いることがわかった。一方、高 pH 条件で得られる球状分

球状の巨大分子集合体の外水相を超純水で希釈していくと、− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図 4 外水相の塩濃度を 0.51 mM に調整した巨大分子集合体の発色の様子

図 5 異なる外水相塩濃度に調整した巨大分子集合体の正面反射スペクトル（θ= 0 °）

巨大分子集合体は膨潤し発色性を示した。図 4に示すように、外水相の塩濃度を 0.51 mM に調整した場合、分子集合体が青色に発色している様子がわかる。図 5 には、異なる塩濃度における巨大分子集合体の正面反射スペクトル（θ = 0 °）を示す。いずれの塩濃度においても特定の波長域に明確な反射ピークが認められ、塩濃度によって反射波長が異なることが明らかとなった。本巨大分子集合体の構成成分（PC、Chol および SAc）はいずれも可視光の吸収を示

図6⒜ 外水相塩濃度 192 µM における最大反射波長の測定角依存性⒝ 種々の測定角において求められた周期長 d の値

さず無色の化合物であることから、この発色は巨大分子集合体内の特定の構造に起因する構造色であると考えられる。

3. 3. 反射スペクトルの角度依存性
塩濃度を 192 µM に調整した巨大分子集合体の反射スペ
クトルを様々な測定角θにおいて測定し、得られたスペクトルから求めた最大反射波長（λmax）を図 6 ⒜に示す。θ
が大きくなるにつれて最大反射波長は短波長側にシフトした。この結果から、散乱ベクトルの大きさ q0 =（4π /λmax）
necos（θ/2［nm） -1］を求め、
d=2π/q0 の関係より周期長d［nm］を算出した 4）。ここで、ne は試料の有効屈折率である。図6 ⒝ には、各測定角において求められた d 値を示す。各θ
における d 値はほぼ一定であり、これらを平均した平均周期長 dav は 226 nm であった。周期長 d が測定角によらず一定であること、および d の値が可視光線の波長の半分程度であることは、構造色の特徴の一つである

図 7 平均周期長 dav に対する外水相塩濃度の影響

4, 14）。種々の塩

濃度において同様の測定を行い、対応する dav の値を求めするものであり、外部環境により巨大分子集合体の構造発た結果を図 7 にまとめた。図 7 より、塩濃度が低くなるに

色特性を制御できる可能性を示すものである。今後、さらつれて dav の値が大きくなることが示され、塩濃度を低下に巨大分子集合体の発色および構造に関するデータを蓄積させることにより周期長 d が大きくなる傾向が認められた。

するとともに、内部構造の詳細な分析を行うことで、発色

この結果は、塩濃度により巨大分子集合体内部の周期構造メカニズムの詳細な解明と発色特性のより精緻な制御が可の大きさが変化することで異なる色彩を呈することを示唆

能になると期待される。

− 14 −

リン脂質を主成分とする巨大分子集合体の構造発色性を利用した新規化粧品素材の開発

謝

辞2880（2010）．

本研究を助成対象課題として採択いただきました公益財

5） J. Xu, Z. Guo: J. Colloid Interf. Sci., 406, 1-17（2013）．

団法人コスメトロジー研究振興財団に心より御礼申し上げ

6） X. Chen, H. Mayama, G. Matsuo, T. Torimoto, B.

ます。小角および広角 X 線散乱測定では、筑波大学生命環

Ohtani, K. Tsujii: J. Colloid Interf. Sci., 3 0 5, 3 0 8-3 1 4

境系教授 市川創作先生ならびに広島大学大学院生物圏科（2007）．

学研究科生物機能開発学専攻教授 上野聡先生のご支援と

7） N. Kumano, T. Seki, M. Ishii, H. Nakamura, Y.
Takeoka: Angew. Chem. Int. Ed., 50, 4012-4015（2011）．

ご助言を賜りました。ここに記して深謝いたします。研究を進めるにあたり、東京都市大学工学部エネルギー化学科

8） V. Saranathan, C. O. Osuji, S. G. Mochrie, H. Noh, S.

高分子・バイオ化学研究室（機能性バイオ分子グループ）のNarayanan, A. Sandy, E. R. Dufresne, R. O. Prum: Proc.

家才子翔平氏、大藤真琴氏には多大なご協力をいただきま

Natl. Acad. Sci. USA, 107, 11676-11681（2010）．
9） V. Saranathan, J. D. Forster, H. Noh, S. F. Liew, S. G.

した。ありがとうございました。

Mochrie, H. Cao, E. R. Dufresne, R. O. Prum: J. R. Soc.
（引用文献）

Interface, 9, 2563-2580（2012）．

1） S. Kinoshita, S. Yoshioka, Y. Fujii, N. Okamoto:10）R. S. Werbowyj, D. G. Gray: Macromolecules, 1 7,
1512-1520（1984）．

Photophysics of structural color in the Morpho

11）T. Kuroiwa, T. Saito, A. Kanazawa: Abstract of Asianbutterflies. Forma, 17, 103-121（2002）．
2） V. Sharma, M. Crne, J. O. Park, M. Srinivasarao:

International Symposium -Materials Chemistry-, The

Structural origin of circularly polarized iridescence in

9 2nd Annual Meeting of Chemical Society of Japan,
No. 2F4-36（2012）．

jeweled beetles. Science, 325, 449-451（2009）．
3） E. R. Dufresne, H. Noh, V. Saranathan, S. G. J. Mochrie,

12）黒岩崇，勝又ひかり，市川創作，金澤昭彦：日本膜学会第 35 年会講演要旨集，p. 117（2013）．

H. Cao, R. O. Prum: Self-assembly of amorphousbiophotonic nanostructures by phase separation. Soft

13）高分子学会編 :『新高分子実験学第 6 巻 高分子の構造⑵ 散乱実験と形態観察』，共立出版，pp. 229-233（1997）．

Matter, 5, 1792-1795（2009）．
4） H. Noh, S. F. Liew, V. Saranathan, S. G. J. Mochrie, R.

14）木下修一：『生物ナノフォトニクス―構造色入門―』，

O. Prum, E. R. Dufresne, H. Cao: Adv. Mater., 22, 2871-− 15 −

朝倉書店（2010）．

特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用
早稲田大学先進理工学部化学・生命化学科

小出隆規

Many collagen-binding peptides have been reported to date. However, most of them seem to be below a practical level.
Some do not possess enough affinity to detect collagen, and the others show little binding-specificity to collagen. We report
here novel collagen-binding peptides that hybridize to denatured portions of collagen. They are parallel dimers of collagenlike peptides both ends of which are tethered by covalent linkages. The peptides, named cyclic collagen-mimetic peptides(cCMPs), showed approximately two orders of magnitude higher collagen-binding affinity than single-chain counterparts
reported by Yu and co-workers. The collagen-detecting sensitivity of cCMPs was comparable to commercially available anticollagen polyclonal antibodies in western blotting, and fluorescent staining of cultured cells. No collagen type selectivity
was found, and the peptide recognized all types of collagen tested. In contrast, the peptides showed strong preference todenatured collagen. The results strongly support the common hybridizing mechanism targeting unfolding strands of collagen
triple helix. Molecular dynamic simulations of the hybridized products suggested that the cCMP-collagen hybrid has higher
stability than that of the corresponding hybrid with single-chain CMP. Some diseases such as osteoporosis and malignant
cancer are suggested to be accompanied by collagen denaturation and/or degradation. It is also suggested that inflammationand mechanical stress also induce collagen denaturation. We expect practical applications of cCMPs to detecting
conformational status of collagen in vivo.

１．緒言

コラーゲンは動物体内のいたるところに豊富に存在する
タンパク質である。コラーゲンに特異的に結合する分子は、生体内でのコラーゲンの検出や描出あるいは、薬物をコラーゲンリッチな組織に停留させるといった目的で有用であると期待されている。これまでに多くのコラーゲン結合ペプチドが様々なソースから探索されてきたが、実用に耐え

図 1 CMP の変性コラーゲン結合モデルa) 一本鎖、 b) 二本鎖および環状 CMP

る特異性あるいは親和性を有するものはほとんどなかった。
その中で、Yu（ユタ大学）らのグループは、Gly-Pro-Hyp（Hyp： 4 - ヒドロキシプロリン）の繰り返し構造を持つ、典型的なコラーゲンモデルペプチド（CMP）が、変性コラーモデルとして利用されてきたことからもわかるとおり、水ゲンに結合することを見出し、これを上記のような用途に溶液中で容易に自己集合して、三重らせんを形成してしま

利用しようとする研究を展開している。CMP はコラーゲう。そして、一旦三重らせんを形成した CMP は、コラーンの三重らせん構造がほどけた部位を認識し、ハイブリッ

ゲン結合能を失うという問題点がある。

ド三重らせんを形成することで結合すると考えられている

今回私たちはコラーゲン結合ペプチドとしての CMP の（図 1 a）。彼らはこの CMP を用いて、周辺でコラーゲンの能力を格段に向上させることを目的として、CMP を二本

分解が亢進していると考えられている悪性腫瘍を埋め込ん

平行に束ねた二本鎖 CMP を設計した。一本鎖の CMP は変1）だマウスの in vivo 蛍光イメージングに成功している 。ま

性コラーゲン中の二本のポリペプチド鎖と三重らせんを形た彼らは、マウスの尾の腱を引っ張ることによって腱のコ成する（1 + 2 hybrid）と考えられる。その一方で二本鎖ラーゲンが変性することを定性的に評価することに成功し

CMP は変性コラーゲンの一本のポリペプチド鎖と三重ら2）ている 。しかしながら、CMP は、古くからコラーゲン

せんを形成する（2 + 1 hybrid）と期待できる（図 1 b）
。私た
ちは三重らせん分子内部のペプチド間を共有結合で架橋させると三重らせん構造が安定化する 3 - 6） ことから、2 + 1

Molecular design, synthesis and applicationof the peptides that specifically recognize
collagenhybrid の方が 1 + 2 hybrid よりも安定であり、結果としてTakaki Koide
Department of Chemistry and Biochemistry,
School of Advanced Science and Engineering,
Waseda University

た。また、二本鎖 CMP のもう片方の末端も束ねた環状

二本鎖 CMP は一本鎖 CMP よりも高い結合能を持つと考え
CMP も同時に合成し、これらのコラーゲン結合能を評価した。

− 16 −

特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用

2. 方における吸光度を測定することでコラーゲン結合能を評価法した。

2 . 1. 環状 CMP の合成にチロシン残基を導入し、ペプチド溶液の濃度を吸光度か

2 . 3 . 環状 CMPを用いたコラーゲンの検出（westernblotting）

ら求められるようにした 7）。枝分かれ部分には Fmoc-Lys

コラーゲン検出能の比較においては、サンプルとしてⅠ（Fmoc）-OH を用い、ペプチドを二本に分岐させた。分岐型コラーゲンを用いた。Ⅰ-Ⅴ型コラーゲンの検出におい部分のスペーサーとして 6 - アミノヘキサン酸（Ahx）を導ては、300 ng のⅠ-Ⅴ型コラーゲンに対してタンパク質分入した。コラーゲン様配列としては三重らせんモデルして

子量マーカーを混合したものを用いた。これらサンプルを最も典型的な Pro-Hyp-Gly を採用し、トリペプチドの繰り8 % SDS-PAGE により分離したのち、ニトロセルロース

返し数が 4 回のものから 7 回のものまでを合成した。また、膜上に転写した。その後 5 % スキムミルク溶液を用いてブN 末端側に Cys（Acm）基を導入し、ジスルフィド結合をロッキングし、20 µg/mL のビオチン標識環状 CMP 7、一用いて環化できるようにした。N 末端はピリジンと無水酢

本鎖 CMP 溶液または抗コラーゲン抗体を添加し、室温で酸を用いてアセチル化した。ペプチド鎖は脱保護カクテル

1 時間放置した。環状 CMP 7 および一本鎖 CMP は使用直（TFA : H 2 O : m-cresol : thioanisole : ethanedithiol = 82 . 5

前に 95 ℃で 5 分間加熱した。続いて CMP を添加したもの: 5 : 5 : 5 : 2 . 5 , v/v）を用いて脱保護すると同時に樹脂からに対してはビオチン - ストレプトアビジン相互作用を用い切り離した。

て alkaline phosphatase（AP）を標識し、抗体を添加した

ペプチド鎖は Fmoc 固相法を用いて構築した。C 末端側

二本鎖ペプチドは 6 M グアニジン塩酸塩下においてヨウも の に 対 し て は goat anti-rabbit IgG（H+L）secondary

素で処理することによりジスルフィド結合を形成させるこ

antibody-AP conjugates を添加して 30 分間結合させた。

とで環化した。得られた粗ペプチドは、逆相高速液体クロ

続いて AP-conjugate substitute kit（BioRad）を用いてバマトグラフィーを用いて精製した。環状 CMP は検出のた

ンドを検出した。また、コラーゲンを転写したニトロセル

め、ビオチンまたはフルオレセインを標識した。

ロース膜は同時に、CBB 溶液を用いて染色した。

2 . 2 . enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）
によるコラーゲン結合能の評価

2 . 4 . コラーゲンの蛍光染色
マウス線維芽細胞（MEFs）は L- グルタミン酸、フェノー

コラーゲン溶液（AteloCell I-PC, 高研）を 10 mM 酢酸水

ルレッド含有 DMEM（low-glucose）に 2 % FBS、100 units/を用いて 10 µg/mL に希釈し、溶液を 95 ℃で 5 分間加熱処

mL ペニシリン - ストレプトマイシンおよび 200 µM L- アス

理を加えたもの（変性コラーゲン溶液）と、加えてないもの

コルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩を添加した培地（コラーゲン溶液）の二種類を用意した。96 -well plate にこ

で 3 日間培養したものを用いた。

れらの溶液を 50 µL ずつ添加し、2 日間放置することでそ

線維芽細胞が分泌したコラーゲンの検出に際し、コラー

れぞれをコートした。0 . 5 % スキムミルク溶液を用いてブゲンの変性を目的として 95 ℃に加熱した PBS を添加した。

ロッキング処理を施した後、5 µg/mL に調整したビオチン

細胞は 4 % パラホルムアルデヒドで 15 分間処理すること

標識環状 CMP 溶液を添加した。その際、CMP 溶液を使用で固定し、3 % BSA 溶液で 1 時間処理することでブロッキ直前に 95 ℃で 5 分間処理し 4 ℃で 1 分間冷却したものと、ングした。その後、蛍光標識した一本鎖 CMP、環状 CMP 7

加熱処理を施さないものの 2 種類を用いた。西洋わさびペを 95 ℃で 5 分間加熱し氷上で 1 分間冷却したもの、またルオキシダーゼを結合させたストレプトアビジンをさらには抗Ⅰ型コラーゲン抗体を添加し 1 時間室温で結合させた。

結合させたのち、ABTS と反応させて発色させ、405 nm

抗体を添加した細胞に関してはさらに、goat anti-rabbit

表1
名

称

一本鎖
二本鎖 CMP 4
二本鎖 CMP 5
二本鎖 CMP 6
二本鎖 CMP 7
環状 CMP 4
環状 CMP 5
環状 CMP 6
環状 CMP 7

合成した CMP の構造
構

造

Ac-（Pro-Hyp-Gly）n -Ahx-Tyr-Lys-NH 2
Ac-（Pro-Hyp-Gly）n -AhxAc-（Pro-Hyp-Gly）n -Ahx-Lys-Tyr-Lys- NH 2

Ac-Cys-Ahx-（Pro-Hyp-Gly）n -AhxAc-Cys-Ahx-（Pro-Hyp-Gly）n -Ahx-Lys-Tyr-Lys- NH 2

− 17 −

n
10
4
5
6
7
4
5
6
7

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

IgG（H+L）secondary antibody-FITC conjugates を 30 分

ラーゲンの三重らせん構造がほどけた部分に結合している間結合させた。細胞は共焦点顕微鏡で観察した。

ことを示唆している。さらに環状 CMP 7 と一本鎖は、コ

細胞内のコラーゲンの染色に際しては、細胞を固定した

ラーゲンに対して濃度依存的な結合を示した（図 2 c）。こ

後に 0 . 5 % Triton X- 100 で 5 分間透過処理を施し、上記のの結果から環状 CMP 7 のコラーゲンおよび変性コラーゲ

方法でブロッキング処理を施した。その後蛍光標識した環

ンに対する解離定数（KD）を算出したところ、変性コラー

状 CMP 7 お よ び 抗 コ ラ ー ゲ ン 抗 体（ ラ ビ ッ ト ） を anti-

ゲ ン に 対 し て 6 . 6×10 - 8 M、 コ ラ ー ゲ ン に 対 し て 1 . 1 ×

GM 130（Mouse）antibody（ゴルジ体マーカー）、または

10 - 7 M と求められた。また、一本鎖 CMP は最大結合量がanti-KDEL（Mouse）antibody（小胞体マーカー）存在下

環状 CMP 7 と同じだと仮定することで、変性コラーゲン

で上記の方法で添加し、1 時間結合させた。続いて細胞にに対して 9 . 5×10 - 6 M と算出されたが、コラーゲンに対しgoat anti-rabbit IgG（H+L）secondary antibody-FITCては求めることができなかった。これらの結果から環状

conjugates および goat anti-mouse IgG（H+L）secondary

CMP 7 は既報の一本鎖 CMP よりも 100 倍以上結合能が高®

antibody, Alexa Fluor 594 conjugates を添加し、30 分結いことが示された。
これらの CMP の 4 ℃における二次構造を円偏光二色性合させた。細胞は共焦点顕微鏡で観察した。

３．結（CD）スペクトル分析したところ、225 nm における正のコ

果ットン効果が観測された 8）。この結果から CMP は 4 ℃に

3 . 1. 環状 CMP 7 は変性コラーゲンに対して強い結合能を示す

おいて自己集合して三重らせん構造を形成していると考え

水溶液中 4 ℃で保存しておいたビオチン標識 CMP の I 型

ン結合能をもたないことが示唆された。よって以降の実験

コラーゲンに対する結合能を ELISA により評価したとこ

では CMP 溶液を使用直前に加熱してペプチド同士の自己ろ、これらはほとんどコラーゲンに結合しなかった（図集合を解消させてから使用した。

2 a）。そこで一本鎖 CMP に関する先行研究

1）

られ、図 2 a と合わせて考えると自己集合産物はコラーゲ

を参考に

ラーゲンに対する有意な結合が検出された（図 2 b）
。3 種

3 . 2 . 環状 CMP 7 は western blotting でコラーゲンを検出することができるの分子デザイン中では環状 CMP がもっとも結合能が高く、環状 CMP 7、一本鎖 CMP および市販の抗コラーゲン抗

CMP 内部の Pro-Hyp-Gly 繰り返し数が多いほど顕著な結体を用いて、Ⅰ型コラーゲンの検出感度をwestern blotting

合能を示した。また、これら CMP はコラーゲンよりも変で比較した（図 3 a）。結果環状 CMP 7 は一本鎖よりも高い性コラーゲンに強く結合した。この結果は CMP が変性コ

検出感度を示し、30 ng を泳動したコラーゲンの α 1 鎖とCMP 溶液を使用直前に加熱変性させたところ、CMP のコ

図 2 4℃における CMP のコラーゲン結合能評価（mean ± SD, n = 3）a）CMP 溶液非加熱、b）CMP 溶液を使用直前に 95℃で 5 分間加熱、c）環状
CMP7 と一本鎖の濃度依存的な結合− 18 −

特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用れた。これは推奨濃度（1 / 1000 倍希釈）の抗コラーゲン抗3 . 3 . 環状 CMP 7 は線維芽細胞が分泌したコラーゲ
ンを検出することができる

体よりも高い検出感度であり、1 / 200 濃度の抗コラーゲン

蛍光標識した環状 CMP 7 と一本鎖 CMP を用いて線維芽抗体に匹敵した。また、環状 CMP 7 は分子量マーカーと細胞が分泌したコラーゲンの検出を試みた。その際、分泌コラーゲンの混合溶液中からⅠ-Ⅴ型のコラーゲンを特異されたコラーゲンを熱変性させることを目的として、細胞的に検出した（図 3 b）
。この結果は環状 CMP 7 がコラーゲ

固定処理前に 95 ℃に加熱した PBS を添加したサンプルをン型間に共通するグリシンが三残基ごとに繰り返すアミノ用意した。結果として 30 µg/mL の環状 CMP 7 は、熱変性

酸配列を認識して結合していることを強く示唆している。

した場合のみコラーゲン線維を強く検出し、その検出感度

α 2 鎖をともに検出し、α 1 鎖に関しては 10 ng まで検出さは CMP 濃 度 依 存 的 で あ っ た（ 図 4 a）。 そ れ に 対 し て、

図３ 環状 CMP7 を用いたコラーゲンの検出
a）環状 CMP7、一本鎖、抗コラーゲン抗体の、コラーゲン検出感度の比較 ; b）環状 CMP7 を用いた I‒V 型コラーゲンの検出

図４

線維芽細胞が分泌したコラーゲンの検出（scale bar：50 µm）a）環状CMP 7、b）一本鎖CMP、c）抗コラーゲン抗体− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

30 µg/mL の一本鎖 CMP は同濃度環状 CMP 7 の 1 / 100 程

ロコラーゲンを認識していることを示している。また、プ度のシグナルしか観測されなかった（図 4 b）
。この結果はロコラーゲンが小胞体内部で三重らせんにフォールディン

in vitro で環状 CMP 7 は一本鎖 CMP よりも 100 倍程度変グされ、その後ゴルジ体に輸送されることを踏まえると10）、

性コラーゲンの検出能が高いことを示している。また、抗環状 CMP 7 は、抗体では検出することが難しい小胞体内

コラーゲン抗体は熱変性の有無に関わらずコラーゲン線維部の三重らせん中間体を特異的に検出したと考えられる。

を検出した（図 4 c）
。以上の結果から環状 CMP 7 は変性したコラーゲンを高感度で描出できることが示された。

3 . 4 . 環状 CMP 7 を用いて線維芽細胞の小胞体に存在するプロコラーゲンのフォールディング中間体を検3 . 5 . 環状 CMPとコラーゲンのハイブリッド三重ら
せんは、一本鎖 CMPとコラーゲンのそれらよりも安定である

環状 CMP が、一本鎖 CMP よりもなぜ高い変性コラーゲ

出することができる

ン結合能を示すのかを調べるために、Ac-（Pro-Hyp-Gly）7

フルオレセイン標識した環状 CMP 7 と抗コラーゲン抗- OH（一本鎖 CMP 7）と環状 CMP 7、二本鎖 CMP 7 または体を用いて、細胞固定処理および透過処理を施した線維芽

一本鎖 CMP 7 の複合三重らせんをモデル化した。そして細胞内部のプロコラーゲンの検出を試みた。図 5 a に示し

これらのモデルが三重らせんを形成している場合とほどけ

た よ う に、 環 状 CMP ７ で 検 出 し た 際 の シ グ ナ ル は 抗ている場合のエネルギー差（ΔGbind score）を、分子動力学

KDEL 抗体が検出した小胞体のシグナルと重なった。一方、 （MD）を用いて in silico で求めることで、それぞれの CMP
抗コラーゲン抗体で検出した際は抗 GM 130 抗体が検出しの結合エネルギーを評価した。結果として環状 CMP 7 のたゴルジ体のシグナルと重なった（図 5 b）
。この結果は、

ΔGbind scoreは3つのモデルの中で最も小さかった（ΔGbind（環

環状 CMP 7 が抗コラーゲン抗体と異なる特異性をもってプ

状 CMP 7）：- 147 . 43 kcal mol- 1 , ΔGbind（ 二 本 鎖 CMP 7）：

図5

線維芽細胞内部のプロコラーゲンの検出
a）環状 CMP7、b）抗コラーゲン抗体− 20 −

特異的に生体コラーゲンに結合するペプチドの分子設計・合成と応用- 138 . 90 kcal mol- 1 , ΔGbind（ 一 本 鎖 CMP 7）：- 128 . 6 kcal

謝

辞

mol ）
。これは環状 CMP が、当初の期待どおり、他の 2

本研究の遂行に協力いただいた瀧田講（早稲田大学）、藤

つの CMP よりも安定な三重らせんハイブリッドを形成す

井一徳（同）、増田亮（同）、門之園 哲哉（東京工業大学）のることを示唆している。

各氏に感謝する。また、本研究は公益財団法人コスメトロ

-1

４．総

ジー研究振興財団からの援助を得て実施された。

括

私たちは、コラーゲンに特徴的な Gly-Pro-Hyp 繰り返し配列を持つペプチドを二本平行に束ねて環化することで、（引用文献）
1） Y. Li, C. A. Foss, D. D. Summerfield, J. J. Doyle, C. M.

変性コラーゲンに対して特に高い結合能を持つ新規化合物

Torok, H. C. Dietz, M. G. Pomper, S. M. Yu, Proc. Natl.

を開発した。その結合能は ELISA と western blotting によAcad. Sci. USA, 109, 14767‒14772, 2012

り既報の一本鎖 CMP よりも 100 倍程度高いことが示され

2） J. L. Zitnay, Y. Li, Q. Zhao, B. H. San, B. Depalle, S. P.

た。このペプチドを用いて、western blotting ではⅠ- Ⅴ

Reese, M. J. Buehler, S. M. Yu, J. A. Weiss, Nature型までの全てのコラーゲンを検出できることから、環状

Communications, 8, 14913, 2017

CMP の認識配列はコラーゲンに共通の Gly-Xaa-Yaa の繰3） G. Melacini, Y. Feng, M. Goodman, J. Am. Chem. Soc.,
118, 10339‒10364, 1996

り返し配列であることが示唆された。環状 CMP は細胞が分泌したコラーゲンの蛍光染色にも利用できることが示さ

4） J. C. Horng, A. J. Hawk, Q. Zhao, E. S. Benedict, S. D.
Burke, R. T. Raines, Org. Lett., 8, 4735–4738, 2006

れ、抗コラーゲン抗体では評価することができなかったコ
ラーゲンの三重らせん変性の度合いを検出できる可能性が

5） I. C. Tanrikulu, R. T. Raines, J. Am. Chem. Soc., 136,
13490‒13493, 2014

示された。また、環状ペプチドは抗コラーゲン抗体では検出することが難しい小胞体内部のプロコラーゲンを検出す

6） N. B. Hentzen, L. E. J. Smeenk, J. Witek, S. Riniker,

ることができた。さらに MD 計算により、環状 CMP は他

H. Wennemers, J. Am. Chem. Soc., 139, 12815‒12820,の 2 種類の CMP よりも安定なコラーゲン複合体を形成す2017ることが示された。これらの結果から環状ペプチドは in

7） C. N. Pace, F. Vajdos, L. Fee, G. Grimsley, T. Gray,
Protein Sci., 4, 2411‒2423, 1995

vitro で変性コラーゲンを検出できる有用な化合物である
ことが示されたと考える。また、ペプチドの内部配列を最

8） C. G. Long, E. Braswell, D. Zhu, J. Apigo, J. Baum, B.
Brodsky, Biochemistry, 32, 11688‒11695, 1993

適化することでコラーゲンの型特異性などを付与できる可

9） A. Miki, S. Inada, T. Baba, K. Kihira, H. Fukada, M.

能性がある。
今回我々が開発した新規ペプチドは、生体中のコラーゲ

Oda, Biosci. Biotech. Biochem., 79, 1603-1607, 2015

ンの蛍光イメージングや薬物のターゲッティングに応用で10）S. Ito, K. Nagata, Sem. Cell Dev. Biol., 62 , 142 ‒ 151 ,きることが期待され、今後実験動物を用いた in vivo での検討を進めていく予定である。

− 21 −

2017

低刺激性生体接着材料の開発とその化粧品への応用
新山手病院 臨床医用工学研究室

小山義之

Skin-adhesive materials are expected to be applied to cosmetics such as nose packs or face masks. We have developed anovel biotissue-adhesive polymer complex consisting of poly(acrylic acid) (PAA) and poly(vinylpyrrolidone) (PVP). These
polymers are both highly safe synthetic polymers approved as food, drug, and cosmetic excipients. When these polymers
are directly mixed in a solution, they form a hydrophobic rigid complex, which does not adhere to tissues. Recently, we
succeeded in preparation of a biotissue-adhesive PAA/PVP complex by a solid/solution interface mixing method. When a
PAA film prepared on a plate was immersed in a PVP solution, it formed a highly swollen complex with PVP. The swollen
PAA/PVP complex gel was dried up to a transparent film, which could be swollen again in water to form a soft bio-adhesivehydrogel.
Those two polymers are linked through hydrogen-bonding to each other, and neutralizing of the carboxyl groups of
PAA molecule induces dissociation of the polymers. Thus, if the PAA/PVP complex film was put in a neutral buffer, it soon
swelled and then slowly re-dissolved into a clear solution. The swelling and re-dissolving behavior of the PAA/PVP complex
much depended on the molecular weight and crosslinking density of the polymers. The PAA/PVP mixing ratio affected thetissue-adhesion strength and mechanical strength of the water-swollen complexes. Complexes with higher content of PAA
showed higher adhesion strength, while those made of an equal unit mol of PAA and PVP exhibited the highest mechanicalstrength.
PAA/PVP complex adhered to wet skin, and after dried up, it could be peeled off without stimulation. It could remove alarge amount of blackheads from the skin, showing the high potential of the skin-adhesive complexes as low-stimulus facialor nose-masks.

1. 緒らも医薬品、食品、化粧品添加剤として認可され長く使用言されている安全性の高い水溶性高分子である。これらを用

生体接着性の高分子材料は、局所止血材、術後癒着の防いて生体接着性の高分子基材ができれば、有機溶媒などを止材などの医療機器だけでなく、美容パック、化粧クリー

用いることなく肌にやさしく接着するパッチ、マスキング、ムのカバーシート材など、化粧用材料としても幅広い応用

パック、カバーシートなどの材料が得られると期待される。

。皮膚や粘膜に接着性のある合成高分子

しかし、PAA と PVP は、通常の条件下で溶液中で混合材料として、ポリアクリル酸（PAA）が古くから知られてすると、すぐに水に不溶な疎水性複合体となり、生体接着

いる 3）。しかし、基材原料として PAA をそのままで使用性は失われてしまう。一方我々は、複合体の疎水化の機構するには、本ポリマーが水溶性であるためその利用は限定を検討し、固体／液体界面での混合によって生体接着性をされる。そこで PAA を橋掛けして水に不溶化したものが持った膨潤性 PAA/PVP 複合体を得る方法を開発した 5）。

各種開発され、粘膜接着性の薬物徐放担体などとしてその本研究では、固体／液体界面における PAA/PVP 複合体

DDS への応用が広く研究されてきた。しかし、化学的にの形成挙動、並びに得られる複合体の膨潤、生体接着機能

橋掛けしたゲルは成形性が悪く、また生分解性などに問題を詳しく調べ、このような接着性水和ゲルの化粧用品へのがあり、実用化はされていない。

応用について検討した。

が期待される1, 2）

そこで我々は、PAA とポリビニルピロリドン（PVP）からなる複合体ゲルに注目した。PAA が PVP と水に不溶な
水素結合錯体を形成することは古くから知られている 4）。

2. 方

法

2. 1. 生体接着性 PAA/PVP 複合体の調製

生体に直接接触する化粧品材料は生体適合性が良く、生体

様々な分子量の PAA をエタノールに溶解し、トレー、安全性が高いことが必須であるが、PAA と PVP は、どちまたは細胞培養プレートに入れ、乾燥させて PAA フィル
ムを得た。続いて様々な分子量の PVP の水溶液を加えて、Development of novel low-stimulus bioadhesive materials and their application tocosmetics
Yoshiyuki Koyama
Japan Anti-tuberculosis Association ShinYamanote Hospital Clinical MedicalEngineering Laboratory

PAA の膨潤挙動、および生成した PAA/PVP 複合体水和
ゲルの濁度の経時変化を調べた。膨潤後、水和ゲルを風乾して透明なフィルム状の PAA/PVP 複合体を調製した。また、膨潤したゲルを凍結乾燥することで、白色スポンジ状の複合体を調製した。

− 22 −

低刺激性生体接着材料の開発とその化粧品への応用

2. 2. PAA/PVP 複合体フィルムの膨潤挙動けた。一晩放置後そっと剥がし、クリーム、皮膚の状態を

2. 1. で得た各フィルムを pH 4.0 または pH 7.2 の緩衝液観察した。

に浸し、膨潤したゲルの重量の変化を測定した。また、ゲ

3. 結

ルの濁度を測定することで、複合体の白濁、沈殿、相分離

果3. 1. 生体接着性 PAA/PVP 複合体の調製の有無を調べた。

初めに PAA と PVP の各水溶液をそのまま混合してみた。

2. 3. PAA/PVP 複合体フィルムの接着強度

すると、両ポリマーは直ちに結合して白濁し、間もなく沈PAA/PVP 複合体フィルムを所定量の水で湿らせた魚肉
ソーセージに接着させ、上から垂直に引き上げ、剥離に要殿した。得られたのは水に溶解も膨潤もしない疎水性の沈殿であり、組織接着性も示さなかった。
一方、PAA 溶液を乾燥させ、フィルム状態にした後にする力を測定した。

PVP 水溶液を加えて固／液界面で両ポリマーを接触させ

2. 4. PAA/PVP 複合体スポンジのフェイス・パック
への応用たところ、PAA フィルムは徐々に膨潤しながら柔軟な水

PAA/PVP 複合体スポンジを少量の水で濡らした顔の表

PVP を用いた場合にはゲルは次第に白濁し、ゆっくりと面に接着させ、乾燥した後そっと剥がし、スポンジ表面お沈殿したが、高分子量（360,000）の PVP を加えて得られた

よび皮膚の状態を観察した。

ゲルは長時間安定で、24 時間以上経過しても沈殿、白濁

和ゲル状の複合体を形成した。比較的低分子量（40,000）のは見られなかった。

2. 5. PAA/PVP 複合体スポンジの化粧クリームカ
バーシートへの応用
目元に薬用化粧クリームを塗った後、周囲の皮膚を少量得られた水和ゲルは加熱乾燥させると透明なフィルムとなり、また、凍結乾燥すると白色の柔らかなスポンジ状となった（図 1）。

の水で濡らして上から PAA/PVP 複合体スポンジを貼り付

3. 2. PAA/PVP 複合体フィルムの膨潤・再溶解挙動
上で得られた乾燥フィルムやスポンジは、水を加えると再び高度に膨潤して水和ゲルを形成した。その緩衝溶液中での膨潤挙動は pH によって大きく変化した。複合体フィ
ルムを pH 7.2 の中性緩衝液に浸すと速やかに膨潤し始め、間もなく透明な柔らかい水和ゲルとなった。その後、ゆっくりと重量が減少し始め、10 時間後には完全に溶解して消失した。一方、pH 5 の弱酸性緩衝溶液中では、フィル
ムは膨潤したのち、そのまま溶解せずに水和ゲルのままで長時間安定に存在した（図 2）。

3. 3. PAA/PVP 複合体の接着強度
PAA/PVP 複合体のフィルムやスポンジを湿らせた鳥の図 1 固／液界面混合法による生体接着性 PAA/PVP 複合体の調製

皮や豚肉、魚肉ソーセージなどに貼付すると、水分を吸収

図 2 PAA/PVP 複合体フィルムの中性、および弱酸性水溶液中での膨潤・再溶解挙動− 23 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

して急速にゲル化しながら貼付部位に強固に接着した（図け、水の蒸発を遅くしたものについても同様にテストした。

3）。同様の接着は、ヒト表皮、口腔粘膜においても観察

防水テープを貼った複合体は翌朝もまだ水分を保持しておされた。

り、柔軟な水和ゲルの状態を保っていた。痒みなどの副作

PAA/PVP 複合体フィルム、またはスポンジを魚肉ソーセージに接着させ、剥離に要する力を測定したところ、そ用はなく、また長時間水和したゲルに接触し続けた皮膚にも発赤などの異常は観察されなかった。

の接着力は組織表面の濡れ具合に大きく依存し、適度な水

4. 考

分量のもとでは 70 ～ 100 g/cm2 の非常に高い接着力を示察した。

4. 1. 生体接着性 PAA/PVP 複合体

3. 4. PAA/PVP 複合体スポンジのフェイス・パック
への応用

しても組織接着性の複合体は得られない。PAA と PVP と少量の水で膨潤した PAA/PVP 複合体は、上述のように合の関与が報告されている 6）。溶液状態の高分子を混合す

非常に強固に皮膚などの生体組織に接着するが、乾燥後はると、両ポリマー分子が自由に動けるためにジッパー構造

端から持ち上げると、ほとんど刺激なく剥がすことができの結合体を形成し、さらに主鎖同士が強固に疎水結合して、た。そこで、鼻の周辺の皮膚を濡らした後、PAA/PVP 複

水に溶けない、膨潤もしない沈殿ができたものと思われる。

前述のように、PAA と PVP の各水溶液をそのまま混合の複合体形成はエントロピー変化がプラスであり、疎水結

合体スポンジを貼り付け、乾燥後に剥がしてスポンジ表面、および皮膚の状態を顕微鏡で観察した。

そこで、PAA 溶液を一旦乾燥させ、フィルム状の固体にしたのちに PVP 水溶液を加えることで、ポリマーの自剥離した PAA/PVP スポンジの表面には細かな毛や黒由なセグメント運動を抑制し、ジッパー状の主鎖の整列をずみが見られ、美容パックとしての高い効果が確認された

阻害しながら複合体ゲルを形成させることを試みた。する（図 4）。剥離時の皮膚への刺激は小さく、発赤などは全くと期待通り、フィルムは徐々に膨潤しながら柔軟な水和ゲ見られなかった。

ルを形成した。比較的高分子量の PVP から得られた水和
ゲルは、長時間放置しても沈殿・懸濁することなく透明な3. 5. PAA/PVP 複合体スポンジの化粧クリームカバ
ーシートへの応用
化粧クリームを塗った皮膚の周りを少量の水で濡らして、状態を安定に維持した。長い PVP の主鎖が深く絡み合うことで、ポリマー分子の再配列によるジッパーの構築を阻害したものと思われる。得られた水和ゲルは加熱乾燥させ

PAA/PVP 複合体スポンジで上からカバーしてそのまま就ると透明なフィルムとなり、また、凍結乾燥すると柔らか寝した。PAA/PVP 複合体スポンジは翌朝も貼った位置になスポンジが得られた。

留まっており、寝間着、枕、寝具へのクリームによる汚染

これらの固／液界面で得られた PAA/PVP 複合体フィは全くなかった。長時間接着していたにも関わらず、剥離

ルム、およびスポンジは、水を加えると再び高度に膨潤時の皮膚への刺激は小さかった。また接着部位の発赤など

して水和ゲルを形成した。そこでこれらの複合体の中性、は見られなかった。

および弱酸性緩衝水溶液中での挙動を詳しく調べてみた。

さらに、PAA/PVP スポンジの上に防水テープを貼り付

PAA/PVP フィルムを pH 7.2 の緩衝液に浸すと、フィルム

図 3 PAA/PVP 複合体の生体接着性− 24 −

図 4 PAA/PVP 複合体パックで取れた毛、黒ずみ低刺激性生体接着材料の開発とその化粧品への応用

は瞬時に吸水して膨潤し、水和ゲルを形成した。複合体は、チオフできることを意味する。口腔内や生体内に放置する

その後しばらく膨潤を続けたが、同時に表面からゆっくり

材料としての応用を考えるときに、非常に有用な性質であと溶解を始め、数時間後には完全に再溶解して消失した。

る。

PAA と PVP の高分子複合体は、PAA 側鎖のカルボキにより形成される。PAA/PVP 複合体を中性緩衝液に浸し

4. 2. 生体接着性 PAA/PVP 複合体の化粧品材料への応用

た直後は、吸収した液が少量であるため、カルボキシル基

膨潤性 PAA/PVP 複合体は、有機溶媒や油性の粘着材が持つ酸性によってゲルの内部は弱酸性に保たれ、PAAを使用せず、水だけで柔らかなゼリー状となって皮膚表面と PVP は結合した状態を維持している。その後、ゲルのにしっかりと接着する。またその素材は安全な合成高分子、周囲から浸入してくるイオンによってカルボキシル基はゆポリアクリル酸とポリビニルピロリドンである。これらのっくりと中和され、水素結合ができなくなり、しだいに高分子は、どちらもその皮膚へ刺激性、毒性がほとんどな

PAA と PVP との結合が解離していく。その結果、PAA/

いことが報告されている。さらに複合体の状態での安全性

PVP ゲルは中性緩衝液中ではゆっくりと解離して、元のを確認するため、培養繊維芽細胞に PAA/PVP 複合体を直

水溶性高分子にもどって溶解し、透明な溶液になったもの

接加えて、その細胞毒性を調べてみた。複合体添加三日後、

と思われる
（図 5）
。

生細胞の数を測定すると、何も加えていないコントロール

シル基が PVP 側鎖のピロリドニル基と水素結合すること

この機構を証明するために、PAA/PVP 複合体を pH 5と同じ数の細胞が生存しており、細胞毒性は全く観察されの弱酸性緩衝溶液に入れ、その挙動を観察した。すると、なかった。また、顕微鏡で観察すると、複合体の下にまで

予想通り酸性緩衝溶液中ではフィルムは一方的に膨潤し続びっしりと細胞が増殖している様子が見られ、本研究で得け、高度に膨潤した水和ゲルのままで長時間安定に存在しられた膨潤性 PAA/PVP 複合体は、安全な化粧用材料とした。弱酸性の条件下であるため、膨潤後もカルボキシル基て使用できることが確認された。

が中和されることなくピロリドニル基と水素結合し続けたためと考えられる。

また、皮膚接着性材料でもう一つ問題となるのは、剥離時の皮膚刺激である。本複合体は、少量の水で膨潤して皮溶液混合で得られた PAA/PVP 複合体は上述のように生膚に強固に接着するが、乾燥後に端から持ち上げるように体組織への接着性は示さない。組織接着性はカルボキシル

引くと、皮膚刺激がほとんどなく剥離することができた。

基の持つ生体成分との結合力による。PAA と PVP を通常

近年鼻パックなどの美容材料が広く使用されているが、剥の溶液混合した場合には、両ポリマーがジッパー状に整列

離時の皮膚へのダメージが懸念されている、特に、一定時し、カルボキシル基が PVP との水素結合でほとんど消費

間以上乾燥させると、堅くなって皮膚に無用な突っ張り感されているために、生体接着性はなくなったものと思われを与えたり、あるいは剥がすのがより困難になって皮膚をる。一方、固／液界面で作成された膨潤性 PAA/PVP 複合

傷めることがある。本複合体は、接着後、あるいは乾燥後、体では、両ポリマーが整列していないために非結合状態の長時間放置しても過度の接着を引き起こすことはなかった。

カルボキシル基が多く残り、生体組織への接着性を維持しそのため、皮膚に優しいパック材としての応用が期待されたと考えられる。

た。

乾燥した膨潤性 PAA/PVP 複合体を湿った鳥皮、豚肉

実際に、鼻の付近に添付して、乾燥した後剥離してみたなどの表面にあて、その接着力を調べた。その結果、接着

ところ、複合体の表面には多数の黒ずみが付着していた。

力は組織表面の濡れ具合に大きく依存し、適度な水分量の時間を気にしないで、より安全に使用できる、新しいパッ

もとでは 70 ～ 100 g/cm の非常に高い値を示した。また、

ク材料としての高い可能性が示唆された。

2

続いてこのような皮膚接着性複合体材料の、化粧クリー

水分が極端に多いと接着力は著しく低下した。すなわち多量の水を加えることで接着性をなくすことができる。これ

ムカバーシートへの応用について検討した。

は、接着が不要となった部位の生体接着性を任意にスイッ

近年、くすみや小じわなど、局所をケアするための薬用図 5 中性溶液中での PAA/PVP 複合体の解離− 25 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

化粧品が広く普及し、使用されている。一方、皮膚はヒト

化粧クリームに含まれる薬用成分が効率よく皮膚に作用の異物侵入に対する第一バリアーであり、薬物を効率よくするためには、クリームが乾燥するのを抑えることも必要

吸収させるのは容易ではない。しかし、過度の吸収促進剤である。そこで PAA/PVP 複合体スポンジの上から防水テの使用は、組織損傷の危険がある。薬用化粧成分の効果をープなどを貼り付けて水分の蒸発を抑えたところ、乾燥速

適切に引き出すには、適応部位に長時間接触させて、じっ度を容易に制御することができた。防水テープをそのままくりと吸収させることが必要であるが、化粧水やクリーム貼った場合には、12 時間経過後もスポンジは水分を保持などは比較的短時間で乾燥してしまい、薬用成分の皮膚へしており、柔軟な水和ゲルの状態を保っていた。一方、針の浸透は小さい。

で小さな穴を多数開けた防水テープを添付した場合には、薬物を含有する水溶液、オイル、ゲルなどを皮膚と一定以上接触させる方法として、上から接着性の保護シートを

スポンジはゆっくりと乾燥し、半日後には剥離が容易な状態となった。

貼ることが考えられる。クリームを塗った上から絆創膏の5. 総

ようなカバーで覆っておけば、接触時間、皮膚への浸透率

括は改善される。しかし、既存の皮膚接着性粘着シートは本研究で開発した高分子複合体は、傷口に直接貼っても一般に有機溶剤、界面活性剤を含むため、肌への刺激が大痛みがないほどの高い生体適合性、安全性を有しており、きく、皮膚のかぶれやかゆみの原因となり、返って肌荒れ水を加えるだけで柔らかなゲルを生成しながら皮膚にしっの原因となる。また、ニキビ跡や小さな傷がある場合には、

かりと接着する、安全で使用の容易な皮膚接着性材料であ

これらの成分が組織や神経を刺激し、炎症や痛みの原因とる。また、従来のパック材にように、一定時間以上乾燥さもなる。さらに剥離するときには、上皮の角質や皮脂などせると堅くなって皮膚に無用な突っ張り感を与えたり、あの成分をも取り去ってしまうため、肌を荒らす原因となる。

るいは剥がすのがより困難になって皮膚を傷めることがな

特に長時間接着させると、過度の接着力が生じて皮膚へのいため、就寝時などにも安心して使用することができる。

ダメージが大きくなるため、長時間のマスキングとしてのこのような取り扱いやすいカバーシートが容易に使用で使用は困難である。

きるようになれば、従来困難とされていたしみや小じわの有機溶媒、界面活性剤などの刺激物質を使わずに皮膚にしっかりと接着し、必要な時間経過後には刺激なく剥離で改善も可能となり、薬用化粧品の可能性を大きく向上させられると期待される。

きる被覆材があれば、薬用化粧品の効果を安全に大きく高めることが期待される。これらは同時に、クリームなどが謝

衣服や寝具によってこすり取られ、またこれらを汚染することも防止する。

辞本研究の遂行にあたり、公益財団法人コスメトロジー研

究振興財団によりご援助いただきましたことに深く感謝い

本研究で開発した PAA/PVP 複合体は、上述のように有たします。

機溶媒を使用せず、水だけで柔らかなゼリー状となって皮膚表面にしっかりと接着する。そして、乾燥後は、ほとん（引用文献）

ど皮膚刺激なく剥離ができる。長時間放置しても過度の接

1） Khanlari S. et al., Macromol. React. Eng., , 7, 573-587

着を引き起こすことはない。そのため、染み抜きクリーム（2013）などのマスク材としての応用が期待される。

2） Ryou M. et al., Techniques in Gastrointestinal

長時間安定に接着すること、皮膚への刺激がないことをEndoscopy, 8, 33-37（2006）

確認するため、就寝時に目元に化粧クリームを塗り、周囲

3） Smart J.D., Int. J. Pharmaceutics 73, 69-74（1991）

を水で軽く濡らし、PAA/PVP 複合体スポンジで上からカ4） Bimendina L. A. et al., Chem. zvestí , 3 0, 3 0 1-3 0 5

バーしてみた。PAA/PVP 複合体スポンジは翌朝までずれ（1976）ずに貼った位置に留まり、寝具などへのクリームによる汚5） Ito T. et al., MRS Communications, 5, 291-295（2015）

染を防止した。また、剥離時の皮膚への刺激は極めて小さ

6） Vasheghani F.B. et al ., Polymer Bulletin 55, 437-445

かった。

（2005）− 26 −

アミノ酸系機能性界面制御剤による革新的な乳化技術の開発
東京理科大学理工学部先端化学科

酒井健一

This report focuses on the preparation and stabilization mechanism of oil-in-water (O/W) type emulsions in thepresence of amphiphilic 1 : 1 stoichiometric complexes of acylglutamic acids (CnGlu) with tertiary alkylamines (CnDMA).
Relatively stable emulsions were obtained when C 16 Glu-C 16 DMA (or C 18 Glu-C 18 DMA), hexadecane, and water were
homogenized at 80 °C and then stored at room temperature. The gel–liquid crystal phase transition temperature (Tc) of
C 16 Glu-C 16 DMA and C 18 Glu-C 18 DMA dispersed in water was determined to be ca. 39 and 53 °C, respectively. This
indicates that the complexes form an adsorbed layer at the oil/water interface during the homogenization process above theTc, and then change into a gel during storage at room temperature. The gel phase formed at the oil/water interface prevents
the oil droplets from coalescing. In contrast, shorter chain analogues (C 10 Glu-C 10 DMA and C 12 Glu-C 12 DMA) did notyield stable emulsions since their adsorption layers were not able to prevent coalescence of the oil droplets (i.e., the Tc ofthese analogues was below the room temperature). The dispersion stability of these emulsion systems can also be controlled
by changing the aqueous pH.

1. 緒

ドロゲルを形成することも見出している 5，6）。本課題では、

言

この擬似二鎖型両親媒性物質が AIM として機能するため互いに混ざり合わない二つの相が接すると、そこには界の乳化条件を検討し、分散安定化機構の理解をめざした。

面が生じる。液体が関与する界面の性質は両親媒性物質

なお、以下で紹介する研究成果は、文献 7 で報告した 7）。

（界面活性剤）の存在により変化させることができる。通常、界面活性剤は分子溶解する溶液（連続）
相と界面吸着相とに分配されるため、界面状態の制御に直接関与できる分子数

2. 実
2. 1. 試験

薬はその添加量に比べて減少する。低炭素化社会あるいは持アシルグルタミン酸にアルキルアミンを複合化させた擬続成長可能な社会の実現という観点からすると、添加量に似二鎖型の両親媒性物質（以下、CnGlu-CnDMA と略して対する有効量の低減は大いなる課題である。すなわち、界表記する）は既報 5，6）のスキームに従い合成した。代表的面の性質を最大限有効に制御するためには、添加された両な化学構造を図 1 に示す。ここで、n はアルキル鎖長を表し、親媒性物質は二相の界面に独立した第三相として局在する

本研究では 10、12、14、16、ならびに 18 のものを調製した。

ことが望まれる。このような観点から筆者は、機能性界面

水相には、Barnstead NANO Pure DIamond UV システム

制御剤（Active Interfacial Modifier; AIM）と称する物質概により精製した超純水を用いた。油相には、ヘキサデカン

念を提唱している。AIM は共存する二相に親和性を有す（和光純薬工業）を用いた。pH 調整には、1 mol/L の塩酸（和

るが、いずれの相にも実質的に分子溶解することはないと

光純薬工業）と水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業）をいう点で、通常の “界面活性剤” とはその概念を区別してい

用いた。

1）

る 。
筆者の所属する研究室では近年、二鎖二親水基（ジェミ2. 2. 分析装置
示差走査熱量（DSC）測定には、Rigaku DSC8230 熱流束ニ）型のアミノ酸系両親媒性物質に関する研究も展開して2）いる。その中で、相挙動 、ひも状ミセルの形成

2，3）

、α

4）

ゲルの形成 などに関する成果を報告してきた。また、ア
シルグルタミン酸にアルキルアミンを複合化させた擬似
二鎖型の両親媒性物質は pH 感受的にひも状ミセルやハイ

Emulsification by Amino Acid-Type Active
Interfacial Modifier
Kenichi Sakai
Department of Pure and Applied Chemistry,
Faculty of Science and Technology,
Tokyo University of Science

図 1 CnGlu-CnDMA の代表的な化学構造（文献 7から許諾を得て転載）− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

型示差走査熱量計を用いた。アルミニウム製サンプルパン

これらの結果をふまえ、以下の乳化プロセスを検討した。

を試料容器として、α アルミナ粒子を標準物質としてそれ

乳化法①：複合体 0.5 wt%を超純水中に加え、常温（約 25 ℃）

ぞれ用いた。昇温速度は 1.0 ℃ /min、走査温度範囲は 10を維持しながら、プローブ型超音波ホモジナイザーによ‒ 60 ℃にそれぞれ設定した。

り撹拌した（3 分間）。ここで得られた複合体の水分散液
TM500にヘキサデカンを 20 wt% 加え、常温（約 25 ℃）を維持

粒子解析装置を用いた。エマルションサンプルの透明度が

動的光散乱（DLS）測定には、Anton-Paar Litesizer

しながら、プローブ型超音波ホモジナイザーにより再び十分ではなく、測定に支障をきたした場合には、適宜、超撹拌した（3 分間）。調製後の静置は常温（約 25 ℃）で行

純水で希釈後に測定した。

った。

凍結割断レプリカ法による透過型電子顕微鏡（FF-TEM）

乳化法②：複合体 0.5 wt% を超純水中に加え、80 ℃に加観察には、Hitachi H-7650 透過型電子顕微鏡を用いた。凍温しながら、プローブ型超音波ホモジナイザーにより撹

結試料の作成には Leica EM CPC 急速凍結試料作製装置、拌した（3 分間）。ここで得られた複合体の水分散液にヘ

凍結試料の割断とレプリカ膜作成のための蒸着操作にはキサデカンを 20 wt% 加え、80 ℃を維持しながら、プロ

Hitachi FR-7000A フリーズレプリカ作成装置をそれぞれーブ型超音波ホモジナイザーにより再び撹拌した（3 分使用した。電子顕微鏡観察は、印加電圧 120kV にて行った。

間）。調製後の静置は常温（約 25 ℃）で行った。
乳化法①と②で調製したエマルションサンプルの目視

3. 結果と考察

観察結果を図 3 に示す。乳化法① では、C10Glu-C10DMA

エマルションの調製方法を検討するにあたり、複合体水と C12Glu-C12DMA の系で急速なクリーミングが進行し分散液の熱挙動を評価した。これらのサンプルはまず、複た。また、C16Glu-C16DMA と C18Glu-C18DMA の系では合体と水をガラスバイアル中で混合し、80 ℃に加温、そバイアル上部に油相が分離し、バイアル底部に複合体と思の後、プローブ型超音波ホモジナイザー（Nissei US-300T,

われる沈殿物を確認した。つまり、乳化法①では分散安定

20 kHz）で 3 分間超音波撹拌することで得た。複合体水性に優れたエマルションを得ることはできなかった。一分散液（5 wt%）の DSC 測定結果を図 2 に示す。C10Glu-

方、乳化法②では、C10Glu-C10DMA と C12Glu-C12DMA

C10DMA は 10 ‒ 60 ℃の範囲でピークが検出されなかったの系でクリーミングが進行した一方、C16Glu-C16DMA と一 方、C12Glu-C12DMA は 約 13 ℃、C14Glu-C14DMA はC18Glu-C18DMA の系では分散安定性が著しく向上した。

約 24 ℃、C16Glu-C16DMA は 約 39 ℃、 そ し て C18Glu-

すなわち、C16Glu-C16DMA と C18Glu-C18DMA の系につC18DMA は約 53 ℃にそれぞれ吸熱ピークを観測した。小いては、乳化時の撹拌温度がエマルションの分散安定性を

角広角 X 線散乱（SWAXS）測定の結果、これらの吸熱ピー

決める主要な因子であることがわかった。これ以降の結果

クはゲル－液晶相転移に対応していることが示された。

はすべて、乳化法②で調製したサンプルに関するものであ

図 2 CnGlu-CnDMA 水分散液の DSC 測定結果
（文献 7 から許諾を得て転載）− 28 −

アミノ酸系機能性界面制御剤による革新的な乳化技術の開発

C12Glu-C12DMA で安定化を図られたエマルションは 1 週る。
油滴径の経時変化を評価するために、DLS 測定を行った。

間後に粒子径が増大したのに対し、C16Glu-C16DMA によ

結果を図 4 に示す。調製直後の時点で、すでに C12Glu-

り安定化されたエマルションはほぼ粒子径に変化は見られ

C12DMA を用いたエマルションの方が C16Glu-C16DMAなかった。すなわち、C16Glu-C16DMA を用いたエマルシを用いたエマルションよりも粒子径が有意に大きくなっ

ョンは油滴間の耐合一性に優れていることがわかった。

た。この粒子径の差がクリーミング速度の違いを引きお

油滴の表面状態を FF-TEM 観察により評価した。結果こしていると考えられる。また、経時変化に注目すると、を図 5 に示す。C16Glu-C16DMA で安定化された油滴の表

図 3 調製されたエマルションの目視観察結果（文献 7 から許諾を得て転載）

図 4 乳化法②で調製したエマルションの DLS 測定結果：(a) C12Glu-C12DMA，(b) C16Glu-C16DMA（文献７から許諾を得て転載）− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

妨げる役割を担っていると考えられる。一方、C12GluC12DMA（ゲル液晶相転移温度は約 13 ℃）によるエマルション系では、室温静置時でもアルキル鎖に運動性があり、界面膜が流動的であったため、優れた耐合一性を得られなかったと考えられる。同様な乳化安定化機構は、ホスホリ
ルコリン類似基を有する両性のジェミニ型両親媒性物質についても報告されている 8）。
液／液界面の性質を制御することで分散安定性に優れた
エマルションを調製するという界面科学の一分野に絞って現状の研究例を俯瞰すると、①コアとなる液滴の周囲をコロイド次元の固体微粒子で覆うことで、系の分散安定性を向上させるピッカリング乳化法 9）②リン脂質の二分子吸着膜で液滴を覆い、その分散安定化を図る三相乳化法 10）

図 5 油滴の FF-TEM 画像：(a) C12Glu-C12DMA,(b) C16Glu-C16DMA（文献７から許諾を得て転載）③液滴の周囲に液晶相を形成させることで分散安定性を向上させる液晶乳化法 11）

面には、大きなステップ状の構造を観察できた。また、そなどが知られている。また、緒言で述べたように、筆者はれを高倍率で観察すると、油滴の表面にストライプ状の構AIM と称する物質概念を提唱している。AIM により安定造が観察された。以上の観察結果から、C16Glu-C16DMA化を図られた場合も含めて、これら乳化系にはクリーミン

は油滴の表面でラメラ状の構造体を形成し、耐合一性に寄グや凝集による見かけ上の不安定化はおこっても、液滴間与していると考えられる。一方、C12Glu-C12DMA で安定の合一は阻害されるという共通現象が存在する。本系にお化された油滴の表面にも大きなステップ状の構造が観察さいても油／水界面に第三相としてゲル膜が存在し、これがれたが、ストライプ状の構造は確認できなかった。ゆえに、油滴間の耐合一性を高めているという点で、ここに列挙しC12Glu-C12DMA は油／水界面に吸着膜を形成しているが、た乳化系との共通性が認められる。

その秩序性は C16Glu-C16DMA 系よりも劣っていることが示唆された。

最後に、C16Glu-C16DMA を用いたエマルションについて、pH 感受性を検討した。乳化法②で得たエマルション

以上の結果から、C16Glu-C16DMA によるエマルショ

サンプルに pH 調整剤（塩酸もしくは水酸化ナトリウム水ンの安定化機構を考察する。DSC の測定結果に基づくと、溶液）を加え、1 分間手振り撹拌後に分散安定性を評価しC16Glu-C16DMA のゲル液晶相転移温度は約 39 ℃である。

た。1 時間経過後の目視観察結果を図 6 に示す。pH 6.2 と80 ℃での乳化撹拌時、C16Glu-C16DMA は水中でアルキ

pH 6.9 の系は比較的良好な分散性を維持していた。一方、ル鎖が融解し、運動性を有する状態となっており、ここにpH 5.2 の系では、バイアル上部に凝集体と油相の分離を確

ヘキサデカンが加わることで油／水界面に吸着膜が形成さ認した。また、pH 11.3 の系では、バイアル上部に油相がれる。その後、室温（約 25 ℃）まで放冷されることで、複分離した。すなわち、pH 5.2 と pH 11.3 の系は短時間のう合体のアルキル鎖が凍結し、ゲル化する。その結果、強ちに解乳化した。この解乳化がおきた理由について、そ

固な界面膜を形成し、この界面ゲル膜が油滴間の合一をれぞれ以下のように考察した。pH 5.2 のエマルションでは、

図 6 pH を変化させたエマルションサンプルの目視観察結果（文献 7 から許諾を得て転載）− 30 −

アミノ酸系機能性界面制御剤による革新的な乳化技術の開発

複合体を構成する C16Glu のカルボキシル基がプロトン化樹教授（東京理科大学理工学部先端化学科）をはじめとするされたことで、油滴間の静電反発が減少し、凝集したと考共同研究者の皆様に御礼申し上げます。

えられる。更に、油／水界面に吸着していた複合体自身も凝集することで脱着し、油滴間の合一が進行したと考えら（引用文献）れる。一方、pH 11.3 のエマルションでは、C16Glu の二ナ

1） Sakai, K., Ikeda, R., Sharma, S. C., Shrestha, R. G.,

トリウム塩と C16DMA に複合体が解離する。C16Glu 二ナ

Ohtani, N., Yoshioka, M., Sakai, H., Abe, M., Sakamoto,

トリウム塩は複合体に比べて親水性（水に対する溶解性）がK., Langmuir 26, 5349-5354, 2010.

高く、油／水界面から連続相（水相）へと移り、C16DMA

2） Shrestha, R. G., Nomura, K., Yamamoto, M.,

は非連続相であるヘキサデカンに溶解する。その結果、界

Yamawaki, Y., Tamura, Y., Sakai, K., Sakamoto, K.,

面膜の強度が低下し、合一が進行したと考えられる。以上

Sakai, H., Abe, M., Langmuir 28, 15472-15481, 2012.

のように、CnGlu-CnDMA の pH 感受性を利用することで、

3） Sakai, K., Nomura, K., Shrestha, R. G., Endo, T.,

これにより安定化を図られたエマルションの分散性も制御

Sakamoto, K., Sakai, H., Abe, M., J. Oleo Sci. 6 3, 2 4 9-できることを見出した。

255, 2014,.

4. 展

4） Sakai, K., Ohno, K., Nomura, K., Endo, T., Sakamoto,

望K., Sakai, H., Abe, M., Langmuir 30, 7654-7659, 2014.

系に存在する物質が、その求められる機能を過不足なく

5） Sakai, K., Nomura, K., Shrestha, R. G., Endo, T.,

最大限の効率で発揮している最も典型的かつスマートな複Sakamoto, K., Sakai, H., Abe, M., Langmuir 28, 17617-

合体は我々生命体である。一例をあげると、生体膜はリン

17622, 2012.

脂質をはじめとする両親媒性物質が自己集合したラメラ状

6） Sakai, K., Sawa, M., Nomura, K., Endo, T., Tsuchiya,

二分子膜であり、外界と生命組織体とを区別する重要な

K., Sakamoto, K., Abe, M., Sakai, H., Chem. Lett. 4 5,

界面科学的機能を担っている。この例に限った話ではなく、655-657, 2016.

省資源、省エネルギーといった現代社会で強く求められて

7） Tojinbara, T., Akamatsu, M., Sakai, K., Sakai, H.,
Langmuir 34, 268-272, 2018.

いる要求を、生命体は適切な機能性物質を効率的に利用することで解決している。AIM という物質概念に基づく研

8） Sakai, K., Fukushima, A., Misono, T., Endo, T.,

究は、生命体あるいは自然界がすでに確立しているこのよ

Sakamoto, K., Sakai, H., Abe, M., Chem. Lett. 44, 247249, 2015.

うな優れたシステムを一般生活環境の中に幅広く反映させることを目標としている。本研究では、CnGlu-CnDMA を

9） Pickering, S. U., J. Chem. Soc. Trans. 91, 2001-2021,
1907.

乳化剤の一例として取り上げてきたが、このコンセプトが新たな商品開発につながることを期待する。

10）Tajima, K., Imai, Y., Tsutsui, T., J. Oleo. Sci. 51, 285-謝11）Suzuki, T., Takei, H., Yamazaki, S., J. Colloid

296, 2002.
辞本研究をご支援いただきました公益財団法人コスメトロ
ジー研究振興財団に厚く御礼申し上げます。また、酒井秀− 31 −

Interface Sci. 129, 491-500, 1989.

化粧品・スキンケア製品に適したコメ糠タンパク質由来
生理活性短鎖ペプチド素材の開発
新潟大学自然科学系（工学部機能材料工学科）

谷口正之

In this study, to prepare the fraction containing multifunctional cationic peptides, we first hydrolyzed rice bran
protein (RBP) with pepsin. We separated the enzymatic hydrolysate of RBP into 20 fractions containing peptides withdifferent isoelectric point (pI) values by ampholyte-free isoelectric focusing (autofocusing). Subsequently, we examined
the antimicrobial activity of each fraction against four pathogens. In addition, we purified the cationic peptides fromfractions exhibiting antimicrobial activity by reversed-phase high-performance liquid chromatography and identified themby matrix-assisted laser/desorption ionization–time-of-flight mass spectroscopy. Of five cationic peptides identified, we
chemically synthesized three peptides with high pI values and evaluated their multiple functions, including antimicrobial,
lipopolysaccharide-neutralizing and angiogenic activities. Our results demonstrated that the three identified cationic peptides
exhibited multiple functions. Fractions containing cationic peptides obtained from RBP hydrolysate have the potential to be
used as functional ingredients in cosmetic and skin-care products.

1. 緒

物から美白効果があるチロシナーゼ阻害ペプチドを見出し言ている 11）。本研究では，コメ糠タンパク質の酵素加水分

近年，多くの生物が生産する抗菌ペプチドは，感染防御

解物から多彩な生理活性を兼ね備えたカチオン性ペプチド

ばかりでなく，炎症制御，創傷治癒，免疫応答の促進などのを調製することを目的として，⑴コメ糠タンパク質の酵素

生体を防御するための作用を兼ね備えていることが報告さ

加水分解物の調製，⑵ 等電点電気泳動によるカチオン性れており，食品ばかりでなく，化粧品，スキンケア製品，医ペプチド素材の調製，⑶ 逆相クロマトグラフィーと質量

1–3）分析計を用いた素材中のカチオン性ペプチドの同定，およまた，ヒトも生体を防御するために，多くのペプチドを生び ⑷ 同定した 3 種類のカチオン性ペプチドの複数の生理産している。例えば，唾液中の histatin は，抗炎症作用や活性（抗菌活性，LPS 中和活性，および血管新生促進活性）

薬品，医薬部外品の新しい素材として注目を集めている。

4）

抗菌作用を発揮する 。また，好中球などの細胞が産生すを検討した結果について報告する。

る LL-37 や β -defensin などのペプチドも，抗菌作用ばかり
でなく，免疫調節，抗炎症，創傷治癒，細胞増殖促進などの多くの生体防御機能を有しており，それらの多機能性に着目した医薬品開発が進められている

2. 方

法

2. 1. コメ糠タンパク質からのペプチドの調製とカチオ
ン性ペプチド画分の調製

5, 6）

。

最初にコメ糠タンパク質 RBP55（タンパク質含有量 55 ％，コメ糠中には，フィチン酸，イノシトール，トコトリエ
ノール，γ- オリザノール，フェルラ酸などの生理活性成分

築野食品工業株式会社）に超純水を加え，POLYTRONが含まれており，コメ糠はこれらの機能性成分を製造する

Homogenizer（KINRMATICA）を用いて溶液の均質化を原料として有効利用されている。しかし，コメ糠中のタン行い，透析によって，低分子不純物を除去した。その後，

パク質成分は有効に利用されていない。一方，コムギ，ダブタ胃粘膜由来ペプシンを用いて 5 時間，37 ℃にて加水

イズ，トウモロコシなどの穀類タンパク質の加水分解物，分解した。さらに，加水分解物を遠心分離し，得られた上およびそれらに含まれるペプチドには多彩な生理活性があ

澄液を再び透析することによって生成した低分子成分を除。そこで，筆者らは生理活性

き，出発材料を調製した。次に，出発材料を Bio -Rad 社のペプチドを生産するための原料として，コメ糠タンパク質

等電点電気泳動（Rotofor Cell System）を用いて，等電点に着目した。これまでにコメ糠タンパク質の酵素加水分解（isoelectric point, pI）の異なる 20 の画分に分離した。

ることが報告されている

7‒10）

Develpment of bioactive short peptides
derived from rice bran protein and theirapplication to cosmetic and skin-care
products

2. 2. ペプチド画分の抗菌活性の測定

Masayuki Taniguchi
Department of Materials Science andTechnology, Graduate School of Scienceand Technology, Niigata University

各画分のグラム陰性細菌である歯周病菌（Porphyromonas

等電点電気泳動によって分離した 20 の画分について，
ヒト病原微生物に対する抗菌活性を測定した。すなわち，
gingivalis）とアクネ菌（Propionibacterium acnes），グラ
ム陽性細菌であるう蝕菌（Streptococcus mutans），および− 32 −

化粧品・スキンケア製品に適したコメ糠タンパク質由来生理活性短鎖ペプチド素材の開発

日和見感染真菌（Candida albicans）に対する抗菌活性をTMた。96 ウェルプレートにコラーゲン様マトリゲルを用い

reagent（Promegaて人工基底膜を作製し，30 分間，37 ℃にてインキュベー

Japan KK）を用いて，生菌に由来する ATP の発光強度をションした。次に，HUVEC と各ペプチドまたはポジティ

測定することによって評価した。

ブコントロールとして創傷治癒作用を有するヒトのペプチ測定した。生菌数は，BacTiter-Glo

ドである LL-37 を含む培地 HuMedia-EG2 を，各ウェルに

2. 3. 活性画分からのカチオン性ペプチドの精製と同定添加した。CO2 インキュベーター中で 15 時間，37 ℃にて次に，抗菌活性が検出された画分から逆相クロマトグラを形成した，すなわち血管様に増殖した細胞を観察し，５フィーによってペプチドを精製した。必要に応じて粗精製

ウェルについて写真を撮った。その後，それぞれの画像

画分をもう一度，逆相クロマトグラフィーによって精製し，中の血管様の細胞の長さを，NIS-Elements BR Analysis

単一ピークを得た。各ピーク画分中のペプチドを MALDI-

software（株式会社ニコン）を用いて測定し，平均値を算TOF/MS（Bruker）によって解析し，ペプチドの分子量を出した。ペプチドを添加しないときの細胞の長さの平均値

求め，MS/MS 解析とデータベース検索によって，ペプチを100％として，各ペプチドの血管新生促進活性を評価した。

5 ％ CO2 雰囲気下で培養した後，顕微鏡を用いて管腔構造

ドを含むタンパク質とペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ

3. 結

決定した。

果

3. 1. ペプシン加水分解物の調製と等電点電気泳動によるペプチドの分画

2. 4. 同定したカチオン性ペプチドの抗菌活性の解析同定したペプチドの中から正味の正電荷が高く，pI が最適な酵素加水分解条件を検討するために，コメ糠タン

高いカチオン性ペプチドを選択した。それらのペプチドを

パク質（RBP55）をパパイン，トリプシン，ペプシン，ま医学生物学研究所㈱に委託して化学合成し，2. 2. の項に記

たはトリプシンとキモトリプシンの混合物を用いて，時載した方法に従って，4 種類のヒト病原微生物に対して抗間を変えて加水分解した。得られた加水分解物を等電点電菌活性を測定した。各ペプチドの抗菌活性は，ATP 発光

気泳動によって分離し，各画分の抗菌活性について検討し強度の結果から 50 ％増殖阻害濃度（IC50）
を算出し，比較した結果，ペプシンを用いて 5 時間加水分解したときに，高た。

い抗菌活性を有する画分を得ることができた。コメ糠タン
パク質をペプシンによって 5 時間加水分解したサンプルを，

2. 5. 同定したカチオン性ペプチドの LPS 中和活性の解析

等電点電気泳動によって分画した結果を図 1 に示す。pH

リポ多糖（Lipopolysaccharide, LPS）を特異的に検出する％程度であり，pI の違いによって，ペプチドを 20 の画分

カブトガニの血球抽出物から調製したLimulus amebocyteに分離することができた。また，画分 16 から 20 の pH は，が低い画分を除いて，各画分の回収率は，それぞれ 3 -5

lysate（LAL）
試薬を用いるリムルステストは，
LPS を検出・10 以上であり，これらの画分にカチオン性ペプチドが含定量することができる。本研究では，エンドトキシンとしまれていると考えられた。

て Escherichia coli O55:B5 由来の O 抗原を含む smooth 型に含まれる Factor C（セリンプロテアーゼ前駆体）と LPS

3. 2. 等電点電気泳動によって分離した各画分の抗菌活性の反応を起点としたカスケード反応により，最終的に LPS

ヒト病原微生物として，歯周病菌（P. gingivalis）とアクの濃度に応じて遊離した p-nitroaniline の 405nm におけるネ菌（P. acnes），う蝕菌（S. mutans），および日和見感染

吸光度を測定した。本研究では，予め各カチオン性ペプチ

真菌（C. albicans）を用いた。各画分の濃度を 3 mg/mL とドと LPS をインキュベーションした後に反応系に添加し，して抗菌活性を測定した結果を図 2 に示す。縦軸は，生コントロールと比べたときの吸光度の減少を測定し，LPS

菌数を表す ATP の発光強度から求めた生残率を示す。ペ中和活性を評価した。中和活性の強さは，リムルステスト

プチドを添加しないコントロール（図中の C）の発光強度を

LPS を使用した。リムルステストにおいては，LAL 試薬の反応を 50% 阻害する濃度，すなわち 50 ％有効濃度（EC50）

100 ％とした。いずれの病原微生物に対しても，pI が高いとして表した。

カチオン性の画分から高い抗菌活性が検出された。特に，画分 20 のサンプルは，4 種類の病原微生物に対して，い2. 6. 同定したカチオン性ペプチドの血管新生の解析ずれも高い抗菌活性を示すことがわかった。そこで，画分

ヒト臍帯静脈血管内皮細胞である（Human umbilicalvein endothelial cells, HUVECs）を用いて，次のようにし

18，19，および 20 からカチオン性ペプチドを精製し，同定することにした。

て，各ペプチドの血管新生（管腔形成）促進活性を測定し− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0

図 1 等電点電気泳動によるコメ糠タンパク質酵素加水分解物の分画

図 2 等電点電気泳動によって分離した各分画の病原微生物に対する抗菌活性
C：ペプチドを添加していないときの生残率（100 ％）

3. 3. カチオン性ペプチドの精製と同定

ク質とペプチドのアミノ酸配列を決定した。同定できた画分 18，19，および 20 から逆相クロマトグラフィーにペプチドの中で，同定の信頼性が高く，pI が高く，かつよって，それぞれペプチドを精製した。さらに，MALDI-

正味の電荷が正のペプチドを表１に示す。画分 18 から

TOF/MS によってペプチドの分子量を求め，MS/MS 解は 4 種類 , 画分 19 からは 1 種類のペプチドがそれぞれ同

析とデータベース検索によって，ペプチドを含むタンパ

定できたが，画分 20 からは，信頼性の高いペプチドを同− 34 −

化粧品・スキンケア製品に適したコメ糠タンパク質由来生理活性短鎖ペプチド素材の開発

表 1 コメ糠タンパク質酵素加水分解物から同定した短鎖カチオン性ペプチド

定することができなかった。例えば，SSFSKGVQRAAF
は，コ メ の globulin-like protein の 133 番 目 か ら 144 番 目の 12 残 基 の ア ミ ノ 酸 配 列 で あ り， こ の ペ プ チ ド の pI
は 12.0， 正 味 の 電 荷 は +２ で あ っ た。 ま た， ペ プ チ ド
SSFSKGVQRAAF は 画 分 18 と 19 か ら そ れ ぞ れ 同 定 され， ペ プ チ ド FSKGVQRAAF は SSFSKGVQRAAF の 部
分配列であることがわかった。そこで，3 種類のペプチド（LRRHASEGGHGPHW，EKLLGKQDKGVIIRA， お よ び
SSFSKGVQRAAF）を化学合成し，それらの生理活性を測定することにした。

3. 4. 同定したペプチドの抗菌活性同定した３種類のペプチドを化学合成し，それらの４種類のヒト病原微生物に対する抗菌活性を測定した結果，ペ
プチド LRRHASEGGHGPHW（略称 LRR）は C. albicansに 対 し て， ペ プ チ ド EKLLGKQDKGVIIRA（ 略 称 EKL）と ペプチド SSFSKGVQRAAF（略称 SSF）はそれぞれ P.
gingivalis に対して抗菌活性を示した。各ペプチドの抗菌活性の濃度依存性を図３に示す。これらのデータに基づいて，各ペプチドの IC50 を算出した結果，ペプチド LRR のC. albicans に対する IC50 の値は 289 µM，ペプチド EKL と
SSF の P. gingivalis に対する IC50 の値はそれぞれ 75.6 µMと 78.5 µM になった。

3. 5. 同定したペプチドの LPS 中和活性ペプチドの抗炎症活性の 1 つとして，LPS 中和活性を測定した。同定した 3 種類のペプチドは，図４に示すように，
LPS によって引き起こされるリムルステストの反応を濃度依存的に阻害した。したがって，これらのリムルステスト

図 3 同定した 3 種類のカチオン性ペプチドの抗菌活性の結果から，同定した 3 種類のペプチドは，LPS に結合し，中和活性を発揮することがわかった。

ることがわかった。

図 ４ の デ ー タ に 基 づ い て 計 算 し た 結 果， ペ プ チ ド
LRR，EKL，および SSF の EC50 の値は，それぞれ 1.07 µM，3. 6. 同定したペプチドの血管新生促進活性0.86 µM，および 1.41 µM となった。これらの EC50 の値は，ペプチドの創傷治癒活性の 1 つとして，HUVEC を用い

polymyxin B の値と比較して，10 倍程度であることから，て血管新生促進活性を測定した。血管新生促進活性を有す同定した 3 種類のペプチドは，比較的強く LPS を中和できるヒトの生体防御ペプチドとして知られている LL-37 をポ− 35 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

性を示すことがわかった。

4. 考

察

4. 1. 食品タンパク質酵素加水分解物から得られた生
理活性ペプチド
ミルク，卵，魚などの動物性タンパク質ばかりでなく，ダイズ，コムギ，コメ，ノリなど植物性タンパク質の酵素
加水分解物から生理活性があるペプチド画分やペプチドが得られている。特に，angiotensin I-converting enzyme

1.5（ACE）阻害 , dipeptidyl peptidase IV（DPP-IV）阻害，抗酸化，コレステロール低減などの生理活性があるペプチドに関して，多くの研究報告がある 7-10）。しかし，植物性タンパク質由来の多機能性ペプチドに関する報告は，抗酸化，抗炎症，癌細胞増殖阻害，コレステロール低下などの作用を兼ね備えたダイズタンパク質（アルブミン）由来の lunasin12），ACE 阻害と抗酸化の作用を兼ね備えたア
サ種子由来の５種類のペプチド（WYT，WVYY，SVYT，PSLPA，および IPAGV）13） などに限られており，また，
これらのペプチドはカチオン性ではない。さらに，コメ糠タンパク質由来の生理活性ペプチドとして，抗酸化活性を有するペプチド（VAGAEDAAK，AAVVQGQVEK，14）
GGHELSK，CQHHHDQWK など），癌細胞増殖阻害活性を有するペンタペプチド（EQRPR）15），DPP-IV 阻害活性を有するジペプチド（LP，IP）16）などが報告されているが，いずれも単独の生理活性を示すペプチドであり，多機能性ペプチドに関する研究報告はない。

4. 2. コメ糠タンパク質酵素加水分解物から得られたカチオン性ペプチドの多機能性
本研究では，粗精製のコメ糠タンパク質から生理活性が
図 4 同定した 3 種類のカチオン性ペプチドの LPS 中和活性ある低分子成分を除去し，さらにペプシンで加水分解した
後にもう一度，アミノ酸や低分子ペプチドを除去して，出発材料を調製した。両性担体を使用しない等電点電気泳

ジティブコントロールとして，同定した 3 種類のペプチド動によって，この出発材料を分画した結果，pI が高い画の血管新生促進活性を測定した結果を，図５に示す。同定

分 18，19，および 20 が得られた。重量を基準とした３つ

した 3 種類のペプチドは，LL-37 と同じように，血管新生の画分の回収率は，合計で 13 ％であった。これらの画分促進活性を発揮した。すなわち，細胞懸濁液に 1 µM またからカチオン性ペプチドを精製し，同定した結果，最終的は 10 µM の各ペプチドを添加した後，15 時間培養し，マに 3 種類のペプチドが得られた。３種類のペプチドは P.

トリゲル内で管腔（血管様）構造を有する HUVEC を，顕微

gingivalis または C. albicans のどちらかの病原微生物に対鏡を用いて 40 倍の倍率で観察し，その細胞の長さを計測

して抗菌活性を発揮したが（図 3），P. acnes や S. mutans

した。その結果，写真からもわかるように，ペプチド SSFに対して抗菌活性を示さなかった。したがって，画分 18，

は，LL-37 と同じ濃度（1 µM と 10 µM）において血管新生

19，および 20（特に画分 20）にはまだ同定されていない促進活性を示し，その作用は添加した濃度に依存していた。

抗菌ペプチドが存在していると考えられる。今後，これら一方，ペプチド LRR と EKL は 1 µM と 10 µM においてほのペプチドを精製し，同定する必要がある。また，同定しぼ同じ血管新生促進活性を示した。以上の結果から，同定た３種類のペプチドは，いずれも LPS 中和活性（図 4）と血した 3 種類のペプチドは，LL-37 と同じように，HUVEC

管新生促進活性（図 5）を発揮した。

の血管新生を促進する活性を有することから，創傷治癒活− 36 −

化粧品・スキンケア製品に適したコメ糠タンパク質由来生理活性短鎖ペプチド素材の開発

図 5 同定した 3 種類のカチオン性ペプチドと LL-37 の血管新生促進活性4. 3. カチオン性ペプチドの多機能性とそれらの作用

部分と相互作用する必要がある。したがって，多くの抗機構

菌ペプチドは，リジンやアルギニンを多く含み，かつ疎水ペプチドが抗菌活性を発揮するためには，負に荷電した性のアミノ酸を有している。すなわち，多くの抗菌ペプ

微生物の細胞膜（リン脂質）と静電的な相互作用によって結チドはカチオン性であり，かつ両親媒性である 17-19）。一方，合する必要がある。また，細胞膜内に入り込むか，細胞膜

LPS 中和活性を有する多くのペプチドは，LPS の lipid A

を通過して抗菌活性を発揮するためには，細胞膜の疎水性部分（毒性の本体）と相互作用することが知られている 20, 21）。

− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

この lipid A には負に荷電したリン酸基があり，また疎水

3） B. Mishra, S. Reiling, D. Zarena, G. Wang: Host性の脂肪酸の鎖がある。そのため，抗菌活性を発揮する多defense antimicrobial pepties as antibiotics: design

くのペプチドの場合と同じように，カチオン性であり，かand application strategies. Curr. Opin. Chem. Biol., 38:

つ疎水性アミノ酸を有するペプチドは，lipid A に結合し87‒96, 2017.

て LPS の毒性を中和すると考えられる。実際，同定した

4） L.T. Nguyen, E. F. Haney, H. J. Vogel: The expanding

3 種類のペプチド（LRR，EKL，および SSF）は，いずれもscope of antimicrobial peptide structures and their

リジンやアルギニンを有し（表 1），ロイシン，トリプトフ

modes of action. Trends Biotechnol., 29: 464‒472, 2011.

ァン，バリン，フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸も5） T. H. Nan, J.-K. Bang, B. Jacob, I.-S. Park, S. Y. Shin:含んでいることから，抗菌活性と LPS 中和活性を発揮しProkaryotic selectivity and LPS-neutralizing activity of

たと考えられる。ペプチドの血管新生促進作用に関しては，

short antimicrobial peptides designed from the human

その作用機構は完全には解明されていない。LL-37 の場合

antimicrobial peptide LL-37. Peptides, 35: 239‒247, 2012.

には，血管内皮細胞増殖因子（VEGF）のレセプターに作用

6） F. Semple, J. Dorin: β-Defensins: multifunctional

して，その後のシグナル伝達経路を活性化して，細胞の増modulators of infection, inflammation and more? J.

殖を促進していると考えられている

Innate Immun., 4: 337‒348, 2012.

22, 23）。本研究で同定したペプチドの血管新生促進の作用機構に関しては，現在，

7） T. A. Egorov, T. I. Odintsova, V. A. Pukhalsky, E.

VEGF のレセプターの阻害剤を用いて検討を進めている。

V. Grishin: Diversity of wheat anti-microbial peptides.

5. 総

Peptides, 26: 2064‒2073, 2005.

括8） B. P. Singh, S. Vij, S. Hati: Functional significance of
bioactive peptides derived from soybean. Peptides, 54:

カチオン性ペプチドの各生理作用の機構を解明するため

171‒179, 2014.

には，リジンやアルギニンをアラニンに置換した変異体，
または特定のアミノ酸をアルギニンやリジン，またはロイ

9） C. G. Rizzello, D. Tagliazucchi, E. Babini, G. S. Rutella,

シンやトリプトファンに置換した変異体を合成して，それD. L. T. Saa, A. Gianotti: Bioactive peptides from

らの各生理活性の変化を解析し，カチオン性アミノ酸と疎vegetable food matrices: Research trends and novel

水性アミノ酸の各生理活性への寄与を解明する必要がある。

biotechnologies for synthesis and recovery. J. Funct.
Foods, 27: 549‒569, 2016.

本研究において、コメ糠タンパク質加水分解物から抗菌，
LPS 中和，血管新生などの生理活性を有するペプチド混合

10）E. Maestri, M. Marmiroli, N. Marmiroli: Bioactive

物を調製することができた。今後、これらのペプチドが、

peptides in plant-derived foodstuffs. J. Proteomics, 147:

ニキビ予防、シワやタルミの防止、炎症の抑制、保湿など

140‒155, 2016.

を目的とした化粧品やスキンケア製品の素材として応用さ

11）A. Ochiai, S. Tanaka, T. Tanaka, M. Taniguchi: Rice

れることが期待される。また、ペプチド混合物から同定でbran protein as a potent source of anti-melanogenic

きたカチオン性ペプチドの生理活性とその作用機構を解明

peptides with tyrosinase inhibitory activity. J. Natural

して、コメ糠タンパク質由来ペプチドの有用性に関する科

Products, 79: 2545‒2551, 2016.
12）V. K. Lule, S. Garg, S. D. Pophaly, Hitesh, S. K. Tomar:

学的な根拠を実証する必要がある。

Poteintial health benefits of lunasin: a multifaceted soy（引用文献）

derived bioactive peptide. J. Food Sci., 80: R485‒R494,
2015.

1） R. J. S. de Castro, H. H. Sato: Biologically active
peptides: Process for their generation, purification and13）A. T. Girgih, R. He, S. Malomo, M. Offengenden, J.

identification and applications as national additives in

Wu, R. E. Aluko: Structure and functional characterization

the food and pharmaceutical industries. Food Res. Int.,of hemp seed（Cannabis sativa L.）protein-derived

74: 185‒198, 2015.

antioxidant and antihypertensive peptides. J. Funct.
Foods, 6: 384‒394, 2014.

2） N. B. da Cunha, N. B. Cobacho, J. F. C. Viana, L. A.
Lima, K. B. O. Sampaio, S. S. M. Dohms, A. C. R. Ferreira,14）L. Wattanasiritham, C. Theerakulkait, S. Wickramasekara,

C. la Fuente-Núñez, F. F. Costa, O. L. Franco, S. C. Dias:

C. S. Maier, J. F. Stevens: Isolation and identification of

The next generation of antimicrobial peptides（AMPs）

antioxidant peptides from enzymatically hydrolyzed

as molecular therapeutic tools for the treatment ofrice bran protein. Food Chem., 192: 156‒162, 2016.

diseases with social and economic impacts. Drug

15）A. Kannan, N. S. Hettiarachchy, L. O. Lay, R.
Liyanage: Human cancer cell proliferation inhibition

Discov. Today, 22: 234‒248, 2016.

− 38 −

化粧品・スキンケア製品に適したコメ糠タンパク質由来生理活性短鎖ペプチド素材の開発

by a pentapeptide isolated and characterized from ricelyase of rice on endotoxic activities of LPSs frombran. Peptides, 31: 1629‒1634, 2010.

Escherichia coli and periodontopathic Aggregatibactor
actinomycetemcomitans. Microb. Pathogen., 9 4, 2‒1 1,

16）T. Hatanaka, Y. Inoue, J. Arima, Y. Kumagai, H.

2016.

Usaki, K. Kawakami, M. Kimura, T. Mukaihara:
Production of dipeptidyl peptidase IV inhibitory21）M. Taniguchi, R. Toyada, T. Sato, A. Ochiai, E.

peptides from defatted rice bran. Food Chem., 1 3 4:

Saitoh, T. Kato, T. Tanaka: Effects of arginine- and

797‒802, 2012.

leucine-substitutions on anti-endotoxic activity and17）K. L. Brown, R. E. W. Hancock: Cationic host defense

mechanisms of action of a cationic and amphipathic（antimicrobial）peptides. Curr. Opin. Immunol., 8:

antimicrobial octadecapeptide from rice α-amylase. J.

24‒30, 2006.

Peptide Sci., 23: 252‒260, 2017.

18）L. T. Nguyen, E. F. Haney, H. J. Vogel: The expanding22）Y. Brudno, A. B. Ennet-Shepard, R. R. Che, M.

scope of antimicrobial peptide structures and their

Aizenberg, D. J. Mooney: Enhancing microvascularmodes of action. Trends Biotechnol., 29: 464‒472, 2011.

formation and vessel maturation through temporal19）M. Mihajlovic, T. Lazaridis: Charge distribution andcontrol over multiple pro-anginogenic and promaturation. Biomaterials, 34: 9201‒ 9209, 2013.

imperfect amphipathicity affect pore formation by
antimicrobial peptides. Biochim. Biophys. Acta, 1 8 1 8:23）H. Tomioka, H. Nakagami, A. Tenma, Y. Saito, T.
Kaga, T. Kanemori, N. Tamura, K. Tomono, Y. Kaneda,

1274‒1283, 2012.
20）S . T a k a y a m a , K . H a s h i m o t o , E . K o k u b u , M .

R. Morishita: New anti-microbial peptide SR-0 3 7 9

Taniguchi, K. Tajima, A. Ochiai, E.  Saitoh, A. Saito, K.

accelerates wound healing via the P1 3 kinase/Akf/

Ishihara, T. Kato: Inhibitory effects of a novel cationicmTOR pathway. Plos One, 9: e92597, 2014.

dodecapeptide［CL（14-25）］derived from cyanate− 39 −

Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価
千葉大学大学院薬学研究院

東顕二郎

We investigated the formation and stabilization mechanisms of drug/poloxamer 407 (P 407 ) nanosuspensions bysuspended-state NMR spectroscopy. Indomethacin (IMC) and piroxicam (PXC) used as models of poorly water-soluble
drugs are nonsteroidal anti-inflammatory drugs. For IMC, the three different polymorphs of γ-form, α-form and amorphous
form were used to evaluate the effect of initial crystal form of drug. P 407 , a tri-block copolymer composed of polyethylene
glycol (PEG) 101 -polypropyleneoxide (PPO) 56 -PEG 101 , was used as a stabilizer. Mean volume diameter in every suspension
prepared with wet-milling was 240 - 270 nm with unimodal size distribution. Cryogenic transmission electron microscopy
images of nanoparticles obtained using γ-form IMC indicated a rhombic-plate shape. In contrast, needle-like nanoparticles
were observed in the nanosuspensions of α-form and amorphous IMC. The nanoparticle obtained with PXC showed anirregular shape. Suspended-state cross polarization 13 C NMR measurements directly detected the molecular states of drugin nanosuspensions. IMC existed in its initial crystal form when γ-form and α-form IMC were used; amorphous IMC
transformed into crystalline α-form IMC. The PXC in the nanoparticle existed as the mixture of amorphous and crystalline
states. Suspended-state 13 C pulse saturation transfer NMR measurements revealed the molecular state of P 407 in thenanosuspensions. P407 could only adsorb to the surface of the IMC nanoparticles because IMC existed as crystals in the GM
suspension. Conversely, the larger numbers of P 407 were involved in the PXC nanoparticles where some of PXC existed as
amorphous state. The difference between the nanoparticle structures in the IMC and PXC systems could be a consequenceof the interaction strength of each drug with P 407 . The peaks of the PPO chains of P 407 in the spectra of GM suspensions
were split at lower and higher magnetic fields. The equilibrium of P 407 between micelle and nanoparticle was slower thanthe NMR time scale, which could stabilize the dispersion of the nanoparticles in water.

1. 緒ある。薬物粒子をナノ化することにより、薬物溶解速度の言

向上、薬物溶解度の上昇、消化管粘膜への付着性の増加が近年、スクリーニング技術の発展に伴い多数の医薬品・見込まれる。これにより、薬物経口吸収性改善が期待できる。

化粧品の新規候補薬物が見出されている。一方、それら候

懸濁液のナノ粒子内部あるいは固液界面の薬物と安定化剤

補薬物の 70 ％以上は難水溶性であり、その低い薬物吸収の状態を分子レベルで評価できれば、ナノ粒子製剤の処方

量のため薬効を最大限発揮できず、開発が断念されるケー設計及び品質評価・制御において有用な指針となる。しかスもある。今後も、薬物の分子量の増大・化学構造の複雑し、懸濁液は液相（溶解成分）と固相（ナノ粒子）の 2 相から化により溶解性が低い候補化合物は益々増えていくと予想なるため、固体試料と同様に評価するのは困難である。そされる。そのため、難水溶性薬物の溶解性改善技術の開発

こで、懸濁液を乾燥して試料を固化した後、固体試料の測は製剤研究における重要な課題の 1 つであり、これまでに、定法（粉末 X 線回折測定、熱分析、各種分光測定等）を適

結晶形の制御、塩や共結晶、シクロデキストリン包接化合用して評価がなされている。しかし、乾燥後において、ナ物及び非晶質固体分散体の調製などが広く適用されている。

ノ粒子内部あるいは固液界面にある薬物と安定化剤が懸濁

また 2000 年以降、薬物ナノ粒子化も溶解性改善手法とし状態の物性をそのまま保持しているかどうかは疑問であて注目されている 1）。薬物ナノ粒子は、その界面はポリマ

る。NMR は、分子を構成する原子 1 つ 1 つを区別して観ーや界面活性剤などの安定化剤で被覆されているが、その察する方法であり、他の測定法では得られにくい原子核レ

コア部分は主に薬物相から形成されている。薬物ナノ粒

ベルの情報を取得できる。また、NMR ではピークの線幅

子製剤のアプリケーションとして、筋肉内投与、静脈投与、や緩和時間測定などから、分子運動性に関する情報も得ら

経肺投与、経皮投与、経眼投与などがあるが、最も論文報れる。我々は固体 NMR で用いられているマジック角回転告が多くまた市販されている製品数が多いのは経口投与で（magic-angle spinning：MAS）及び双極子デカップリング（dipolar decoupling：DD）の 2 つの手法を応用して（Fig. 1）、
水に分散したナノ粒子中の薬物と安定化剤の分子状態を

Evaluation of molecular state of cosmetic
nanoparticles dispersed in water bysuspended-state NMR spectroscopy
Kenjirou Higashi
Graduate School of Pharmaceutical
Sciences, Chiba University

直接評価する試みを行っており、これを suspended-state
NMR と称している 2-4）。Suspended-state NMR では、試料の漏洩がないように工夫されたカプセル型容器に薬物ナノ懸濁液を封入し、これを固体 NMR の試料管にセットする。そして、外部磁場（B0）に対して 3cos2θ-1=0 を満たす

− 40 −

Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価

2. 方

MAS

Drug nanosuspension

法

2. 1. 薬物ナノ懸濁液の調製

zP407 を濃度 50 mg/mLとなるよう蒸留水に溶解させP407

B0

溶 液 を 得 た。 薬 物（γ 形 IMC、α 形 IMC、 非 晶 質 IMC、
PXC）を仕込み濃度 100 mg/mL で P407 溶液中に分散し、ボルテックスミキサーを用いて 3 分間混合し、物理的混合物（physical mixture：PM）懸濁液を得た。PM 懸濁液と直NMR signalyDD

径 5 mm のジルコニアボール 100 個を容量 50 mL のジルコ
ニ ア 製 粉 砕 ジ ャ ー（Verder Scientific Co. Ltd., Tokyo,
Japan） に 入 れ、 遊 星 型 ボ ー ル ミ ル（PM 100：Verderx

Scientific Co. Ltd., Tokyo, Japan）により回転速度 400 rpm

Capsule-type container
Solid-state NMR sample tube

Fig. 1 A schematic representation of suspended-state NMR

で粉砕を行うことにより、混合粉砕物（ground mixture
suspension：GM）懸濁液を調製した。

2. 2. 粒子径測定
θ＝ 54.7 °の角度（マジック角）で、試料管を数 kHz ～数十

MICROTRAC 9340-UPA（MicrotracBEL Corp., Japan）

kHz で高速回転させる MAS を適用する。さらに、NMR 信を用いて動的光散乱法により、ナノ粒子の体積平均径
（mean

1

号を取得する時に、 H 核の共鳴周波数の強い高周波数のvolume diameter; MV）を算出した。

ラジオ波を連続的に照射する DD を適用する。MAS と DDの併用により、固体試料のスペクトルの広幅化の原因と1

13なっている化学シフト異方項及び H- C 双極子相互作用

2. 3. 極低温透過型電子顕微鏡（Cryo-transmission
electron microscopy：Cryo-TEM）測定の両方を消去・軽減する。結果として、溶液 NMR では観

JEM-2100F（JEOL Co., Ltd., Japan）を用い、加速電圧察できない運動性の低い固体成分でも高分解能 13C NMR

120 kV で cryo-TEM 測定を行った。マイクログリッド膜

スペクトルの取得が可能となる。従って suspended-state

貼付グリッド（Cu200, Nisshin EM Co. Ltd., Japan）のフィ

NMR では、懸濁液中にある運動性の低いナノ粒子のコア

ルム被膜側を HDT-400（JEOL Co., Ltd., Japan）により 40にある薬物や固液界面にある安定化剤の NMR スペクトル

秒間親水化処理した後、各試料液 2 µL を吸着させた。過を、乾燥工程なしに直接得ることができる。

剰な溶液を濾紙で吸い取った後、液体窒素の自動供給に

本稿では、suspended-state NMR 法を用いて、湿式粉より温度を約 ‒170 ℃にコントロールした液体エタン内で砕により調製した 2 種類の薬物ナノ懸濁液について評価

急速凍結させ cryo-TEM 試料とした。Cryo-TEM 試料をした結果を報告する。難水溶性薬物のモデルとしてイン

Gatan 626 cryo-holder（Gatan, Inc., CA, USA）に液体窒素

ドメタシン（indomethacin：IMC、非ステロイド性抗炎症

中で装着し、‒170 ℃以下の温度を維持して TEM 測定を行薬）及びピロキシカム（piroxicam：PXC、非ステロイド性った。

抗炎症薬）を用いた。IMC には 7 つの結晶多形が報告されている 5）。ここでは、最安定形の γ 形 IMC に加えて準安定

2. 4. Suspended-state NMR 測定

形の α 形 IMC 及び非晶質 IMC を使用し、粉砕前の IMC 結

JNM-ECA 600（JEOL Resonance Co., Ltd., Japan： 外晶形が湿式粉砕より得られるナノ粒子の形態や IMC 分子

部磁場強度：14.01 T）を用い、suspended-state 13C NMR

状態に及ぼす影響を評価した。また、安定化剤として、ポ測定を行った。測定シークエンスは、MAS 5 kHz 条件下

リエチレンオキサイド（polyethyleneoxide：PEO）101 －ポ

において、交差分極（cross polarization：CP）及びパルス

リプロピレンオキサイド（polypropyleneoxide：PPO）
56 －飽和移動（pulse saturation transfer：PST）測定を行った。

PEO101 からなるトリブロックコポリマーであるポロキサ

また、spinning sideband を消去するため total suppression

マー 407（P407）を用いた。薬物と P407 を水に分散させてof spinning sideband 測定を合わせて用いた。Suspended-

湿式粉砕することで、薬物ナノ懸濁液を調製した。そして、

state NMR 測定では、MAS 下における試料の漏出を防ぐ

得られた薬物ナノ懸濁液中の薬物及び P407 の分子状態をため、特殊カプセル内に試料を封入した後、NMR サンプ

suspended-state NMR 測定により評価し、各薬物ナノ粒

ル管内に挿入した。MAS による高速スピニングの影響で、子の構造について考察した。

測定試料のサンプル管壁への偏析が認められた。しかし、この試料は再分散が可能であり、平均粒子径も MAS 回転− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018前とほぼ同等であった。このことから、MAS による試料の変化は起こらないと判断し、以降の解析を行った。

3. 結果・考察
3. 1. 粒子径及び形態評価
Fig. 2 左に各 GM 懸濁液の動的光散乱法による粒子径測定結果を示す。GM 懸濁液の MV は 240-270 nm であり、その粒子径分布は単峰性であった。この結果より、いずれの結晶形の IMC 及び PXC を用いた場合でも湿式粉砕により薬物ナノ懸濁液が形成されることが明らかとなった。一方、cryo-TEM 測定の結果（Fig. 2 右）、初期の薬物結晶形
及び薬物の種類に依存して得られる薬物ナノ粒子の形態は異なった。γ 形 IMC を用いて調製した GM 懸濁液では、菱形板状の形態が観察された。これに対して、α 形 IMC 及
び非晶質 IMC を用いて調製した GM 懸濁液では、針状のナノ粒子が認められた。各 IMC 粉末について走査型電子顕微鏡測定を行った結果、γ 形 IMC 結晶は菱形板状、α 形
IMC 結晶は針状の形態を呈した（data not shown）。この結果より、γ 形 IMC 及び α 形 IMC を用いて調製した場合、それぞれの初期結晶に特徴的な形態を保持したままナノ粒子化したのに対して、非晶質 IMC を用いた場合ではナノ粒子化に伴い形態が変化することが示された。さらに、
PXC を用いた系では IMC の系とは異なり、粒子の形態は不定形となり、またナノ粒子と水の固液界面に P407 に由来すると考えられる厚い表面層が認められた。
Fig. 2 (left) Particle size distribution patterns and (right) cryoTEM images of a GM suspensions prepared with (a) γ form
IMC, (b) α form IMC, (c) amorphous IMC and (d) PXC

3. 2. Suspended-state NMR 測定
3. 2. 1 CP 測定
Suspended-state NMR 測定により各 GM 懸濁液中の薬物と P407 の分子状態を評価した。Fig. 3 には各 GM 懸濁液の形態の相違が、ナノ粒子中の IMC 結晶形の違いに由来について、CP 法を用いて測定した NMR スペクトルを示す。

することを確認できた。PXC を用いた GM 懸濁液におい113

CP 法は双極子相互作用を介して H 核から C 核へ磁化をては、PXC ピークが先鋭化なピークと広幅なピークの重移動させる手法である。分子運動性の高い成分は双極子相ね合わせとして観察された。この先鋭なピークと広幅なピ互作用が平均化されるため CP スペクトルに反映されにくークはそれぞれ結晶と非晶質状態の PXC を反映しており、いのに対して、分子運動性の低い成分は CP スペクトルにGM 懸濁液においては PXC が結晶状態のみならず非晶質

強調されて観察される。すなわち、懸濁液では運動性の高状態で存在することが示された。湿式粉砕により調製したい溶解成分は CP スペクトルに反映されにくいのに対して、ナノ粒子中の薬物は通常結晶状態であることから、ナノ粒

運動性の低い粒子成分は強調して観察される 6）。γ 形 IMC

子中の PXC 非晶質化は興味深い事象と言える。

及び α 形 IMC を用いて調製した GM 懸濁液の IMC ピークは、

さらに、いずれの GM 懸濁液の CP スペクトルいずれにそれぞれ γ 形 IMC 及び α 形 IMC 結晶の化学シフト値と一致

おいても、P407 に由来するピークが 20 及び 70 ppm 付近した。一方、非晶質 IMC を用いて調製した GM 懸濁液のに認められた。CP 法は運動性の低い成分を強調して観察

IMC ピークは、α 形 IMC 結晶と同様であった。すなわち、する手法であることから、GM 懸濁液中には運動性の抑制

結晶性 IMC より調製した GM 懸濁液では粉砕過程で初期された P407 成分が存在することが明らかとなった。すな

結晶形を維持したまま IMC がナノ粒子化した一方、非晶

わち、この P407 ピークはナノ粒子と水の固液界面に吸着

質 IMC を用いた GM 懸濁液ではナノ化する過程で α 形 IMC

した成分あるいはナノ粒子に取り込まれた成分に由来するへと転移して結晶化したことが明らかとなった。また、本と考えられる。また、P407 のピーク強度は PXC を用いた結果より Fig. 2 の cryo-TEM 像で観察された IMC ナノ粒子

GM 懸濁液の方が、各結晶形の IMC を用いた GM 懸濁液よ− 42 −

Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価

13

Fig. 3 C CP/MAS NMR spectra of (a) γ-form IMC, (b) α-form IMC, (c) amorphous IMC, (d) GM suspension preparedwith γ form IMC, (e) GM suspension prepared with α form IMC, (f) GM suspension prepared with amorphous IMC,(g) PM suspension prepared with γ form IMC, (h) crystalline PXC, and (i) GM suspension prepared with PXCりも顕著に大きくなった。このことから、PXC を用いたに評価する目的で、PST 法による評価を行った。PST 法

GM 懸濁液では IMC を用いた GM 懸濁液と比較して、よりでは、運動性の高い成分（溶解成分）及び低い成分（ナノ粒

多くの P407 がナノ粒子成分として存在していると考察し子成分）の両方がスペクトル上に観察される。Fig. 4 に、γた。

形 IMC/P407 PM 懸濁液と各 GM 懸濁液のスペクトルを、

3. 2. 2 PST 測定

70 ppm 付近の PEO のメチレンピークに対してノーマラ

各 GM 懸濁液中に存在する P407 の分子状態をより詳細イズした結果を示す。PM 懸濁液のスペクトルでは、PEO− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 201813

Fig. 4
C PST/MAS NMR spectra of GM suspension prepared with γ form IMC(orange line), GM suspension prepared with α form IMC (blue line), GM suspension
prepared with amorphous IMC (red line), PM suspension prepared with γ form IMC(black line), and GM suspension prepared with PXC (green line). Solid and dottedarrows indicate the P407 forming polymeric micelles, and immobilized on the surfaceof nanoparticles, respectively.

鎖と PPO 鎖のメチレンピークは共に先鋭であった。PM分子ミセル間の吸着・脱着は NMR のタイムスケールより懸濁液においては P407 はほぼすべてが高分子ミセルとしも遅いことが示された 6）。溶液中における粒子への吸着はて存在しており、その速い等方性回転（相関時間 10 µs）の高分子と低分子の界面活性剤で大きく異なる。低分子界面

6）ため、先鋭なピークが観察されたと考えられた 。GM 懸活性剤では粒子界面とミセル間での吸着・脱着は極めて速濁液においては、PEO ピークの線幅と化学シフトは PM 懸い。一方、高分子界面活性剤では、多数あるモノマーが粒濁液のものとほぼ一致した。GM 懸濁液においては P407

子界面でそれぞれ相互作用するため、高分子鎖の部分的なは薬物ナノ粒子（200-300 nm）と高分子ミセル（10-20 nm）

吸着・脱着は起きるものの高分子鎖全体の吸着・脱着は抑の両方に存在する。薬物ナノ粒子と高分子ミセルでは、そ制される 8）。特に、粒子がナノサイズの場合には、高分子のサイズ及び拡散速度は大きく異なるにも関わらず、PEO

鎖の脱着は顕著に抑制される。よって、本 GM 懸濁液におピークの形状は同程度に先鋭であった。この理由として、

いても、P407 の疎水部である PPO 鎖のモノマーがそれぞ

ナノ粒子の PEO 鎖は主にナノ粒子と水の固液界面に存在れナノ粒子中で薬物と多数の疎水性相互作用を形成しておしており、水和層を形成しているため分子運動性が高く、り、この疎水性相互作用が協同的に働く。そのため、ナノ高分子ミセルの PEO 鎖と同様の分子状態にあることが考粒子に強く吸着した P407 の脱着は極めて抑制されている

えられる 7）。これに対して、74 ppm 付近の GM 懸濁液中と推察された。

の PPO のメチレンピークでは、低磁場側の高分子ミセル

Fig. 5 に suspended-state NMR より考察した IMC/P407に由来するピーク（実線矢印）に加えて、高磁場側にナノ粒

GM 懸濁液（Fig. 5a）及び PXC/P407 GM 懸濁液（Fig. 5b）の子成分である P407 に由来すると考えらえる肩ピーク（破線

模式図を示す。湿式粉砕により、γ 形 IMC を用いた GM 懸矢印）が観察された。PPO 鎖のピークが低磁場側と高磁場

濁液では γ 形 IMC ナノ結晶が、α 形 IMC 及び非晶質 IMC側に分裂して観察された結果より、P407 のナノ粒子と高を用いた GM 懸濁液では α 形 IMC ナノ結晶が形成された。

− 44 −

Suspended-state NMR 測定による水分散中の化粧品ナノ粒子の分子状態評価

Fig. 5 Schematic representations of (a) IMC/P407 and (b) PXC/P407 GM suspensions

各 IMC/P407 GM 懸濁液中においては、液相成分として方、MAS による遠心力の影響を考慮する必要があり、まP407 の高分子ミセル、固相成分として IMC ナノ結晶及びた NMR の感度の低さから測定に時間を要し、適用が薬物

その結晶界面に吸着した P407 が存在している。IMC ナ

濃度の高い薬物ナノ懸濁液のみに限られる。そのため、今ノ結晶界面に吸着した P407 は、疎水性の PPO 鎖の疎水

後の suspended-state NMR の汎用的な応用については更性相互作用により IMC 結晶に強く相互作用する一方、親なる発展が必須である。しかし、近年の NMR 技術の目覚

水性の PEO の水和層形成により IMC ナノ結晶の分散安定

ましい発展を背景に、将来的には薬物ナノ懸濁液の物性評化に寄与していると考えられる。PXC/P407 GM 懸濁液

価法として確立され、様々な薬物ナノ懸濁液の分子状態・でも、IMC/P407 GM 懸濁液と同様に、液相成分である

界面構造評価に用いることができると見込んでいる。そしP407 高分子ミセル及び固相成分である PXC ナノ粒子からて、効率的な高品質の薬物ナノ粒子製剤の処方設計及び精なる。そして、固相の P407 は主にナノ粒子界面近傍に存密な品質評価・管理に貢献するものと期待している。

在し、親水性の高い PEO 鎖を液相側に突き出し、また疎水性の高い PPO 鎖は粒子界面で固定された構造を形成する。IMC/P407 GM 懸濁液では IMC が結晶で存在するのみ（引用文献）
1） M. Malamatari, K. Taylor, S. Malamataris, D.

であるのに対して、PXC/P407 GM 懸濁液では PXC の結晶

Douroumis, K. Kachrimanis, Drug Discov. Today, 2 3,と非晶質が共存する。PXC の非晶質は非常に不安定であ534-547（2018）

り、室温でも速やかに結晶化する。したがって、水溶液中

2） J. Zhang, K. Higashi, W. Limwikrant, K. Moribe, K.
Yamamoto, Int. J. Pharm. 423, 571-576（2012）

で PXC 非晶質が単独で安定に存在するのは困難で、P407
が PXC 非晶質形成に寄与していると予想される。ナノ粒

3） Y. Kuroiwa, K. Higashi, K. Ueda, K. Yamamoto, K.
Moribe, Int. J. Pharm. 537, 30-39（2018）

子界面において、P407 の PPO 鎖が粒子内部を向いていることから、この PPO 鎖が PXC と相互作用を形成し、PXC

4） Y. Hasegawa, K. Higashi, K. Yamamoto, K. Moribe,
Mol. Pharm. 12, 1564-1572（2015）

非晶質を安定化していると考察した。IMC よりも PXC の
方が PPO 鎖との分子間相互作用が強い。そのため、より

5） K. Higashi, K. Ueda, K. Moribe, Adv. Drug Deliv.
Rev., 117, 71-85（2017）

多くの P407 がナノ粒子に取り込まれ、ナノ粒子中の一部

6） C. Mayer, Ann. R. NMR S. 55, 205-258（2015）の PXC が非晶質化したと推察した。

4. 総

7） K. Abe, K. Higashi, K. Watabe, K. Kobayashi, W.

括Limwikrant, K. Yamamoto, K. Moribe, Colloids Surf. A.
474, 63-70（2015）

Suspended-state NMR に よ り、 湿 式 粉 砕 に よ り 調 製
した IMC/P407 及び PXC/P407 ナノ懸濁液中の薬物の結

8） K. Sigfridsson, U. Skantze, P. Skantze, S. Johansson,

晶形やナノ粒子に吸着した P407 の分子状態を評価でき

I. Grant, B. Smedsrød, B. Fuglesteg, K. Elvevold, L.

た。Suspended-state NMR は、薬物ナノ懸濁液中の薬物

Lindfors, Int. J. Pharm. 518, 29-40（2017）と添加剤について原子レベルの詳細な情報が得られる。一− 45 −

革新的なシミ予防・治療法の開発
名古屋大学大学院医学系研究科環境労働衛生学

飯田

真智子

Hyperpigmentation (e.g., melasma, freckles, senile pigment freckles, and post-inflammatory pigmentation) is acommon skin disorder that progress with exposure to sunlight and is generally intractable. Hydroquinone, tranexamic acid,corticosteroids and kojic acid are well-established agents for treating hyperpigmentation. However, problems of limited
efficacy, recurrence and side effects such as hypopigmentation remain. Model mice would be important for the developmentof effective drugs. However, unlike human skin, the amount of melanin and the number of melanocytes are very limited in
the epidermis of wild-type haired mice and hairless mice. Therefore, model mice having pigmented skin would be a useful
tool for studying the mechanisms of hyperpigmentation and for developing effective drugs. Recently, an original mouse withpigmented skin was developed in our laboratory. In this study, we examined whether hyperpigmentation is induced by UVB
radiation in the skin from our original mouse.

1. 緒

色素沈着を再現することが可能になるのではないかと着想言した。もし、ヒト類似の色素沈着症が再現されれば、その一般的にシミと呼ばれる肝斑・雀卵斑・老人性色素斑・分子基盤に基づいた薬剤選別のための動物代替法開発への

炎症後色素沈着等は、難治性の色素沈着症
（疾患）
であると

発展も可能である。本研究では、まず、本モデルマウスが同時に、美容の観点から心理的負担も大きい 。治療法とヒト色素沈着症のモデルとしての有効性を検証する第一歩

しては、トラネキサム酸、ステロイド等の薬剤を組み合わとして、本モデルマウスに紫外線を照射し、色素沈着症がせる方法、あるいは、narrow-band UVB を用いた治療が高感度に再現可能かどうかを検討した。

1）

2）

一般的である 。一方、色素沈着等の副作用や再発の問題、
あるいは、長い治療期間を要する等の問題がある 1）。より画期的な予防・治療法の開発には、ヒトあるいはヒト類似

2. 方

法

2. 1. マウス
野生型 Hairless マウス（HL- マウス）5）、および、オリジナの疾患動物モデルを用いた色素沈着症の病態解明、および、
その科学的エビデンスに基づいた動物代替法による薬剤評

ルに開発した皮膚にメラニンを保有するオリジナルマウス

価システムの確立が重要である。

（Hairless mice with hyper-pigmented skin；HL-HPS マウ

野生型の有毛マウス皮膚では、メラノサイトおよびメス）の 5 -10 週齢の雄マウスを用いた。動物実験は、名古

ラニンは毛根内に存在し、表皮にはほとんど存在しない 。

屋大学動物実験委員会における厳正な審査を経て行った

一方、無毛のヘアレスマウスの表皮には、メラニン・メラ（承認番号：no. 29031）。

3）

ノサイトが分布する 4）。しかしながら、その量・数は僅かであり、肉眼的に皮膚メラニンの変化を観察・評価するこ2. 2. 皮膚色の測定とは難しい。従って、紫外線等による色素沈着の再現、機皮膚の黒さは、色彩色差計（CR-400；Konica Minolta,

序解明、予防・治療剤の評価を行うには感度が十分とは言Inc.）を用いて非侵襲的に測定した。皮膚の明るさの指標

えない。

である L* にて評価した 5）。L* 値が低いほど、皮膚が黒い

近年、当研究室において、肉眼的に皮膚メラニンを観ことを示し、L* 値が高いほど、肌が明るい（肌が白い）こ

察可能な無毛でかつ有色皮膚を持つマウス（Hairless miceとを示す。L* 値は、当該皮膚領域をランダムに 3 回測定し、with hyper-pigmented skin; HL-HPS マウス）が開発されその平均値を使用した。

た。この皮膚メラニン保有マウスを用いれば、より鋭敏に

2. 3. 組織学的解析
サンプリングした皮膚は、10% 中性緩衝ホルマリン（v/Development of model mice for skinhyperpigmentation
Machiko Iida
D ep a r t m e nt o f O c c up at i o n a l a nd
Environmental Health, Nagoya University
Graduate School of Medicinev）にて 4 ℃で一晩固定し、パラフィン包埋を行った。パ
ラフィン切片（4 µm）を作製し、ヘマトシキリン・エオ
ジン（HE）染色を行った。フォンタナ - マッソン（FM）染色は、同様に脱パラフィンを行った後、アンモニア銀液（40592；Muto Pure Chemicals Co., Ltd. ）に浸漬（暗所 1− 48 −

革新的なシミ予防・治療法の開発

晩）、その後、0.25% チオ硫酸ナトリウム水溶液（7772-98-7；

3. 2. 紫外線によるサンタンの誘導

Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）に浸漬した（室温 1

HL-HRP マウスにおいて、紫外線による色素沈着症が分）。マウントクイック（DM-01；Daido Sangyo Co. Ltd）

高感度に再現可能かどうかを検証するため、HL マウスおにて封入した後、フォンタナマッソン染色によって検出しよび HL-HRP マウスの右背部皮膚に UVB を単回照射した。

た表皮メラニン密度は、
画像解析ソフト WinROOF（Mitani

左背部皮膚は、UVB が照射されないようアルミ箔で覆っ

cooperation）により数値化した。WinROOF に取り込んだ

た。UVB 照射から 5 日後、HL マウスの UVB 照射部と非画像について、フォンタナマッソンで染色されたメラニン

照射部の皮膚色には肉眼的な変化はみられなかった（図顆粒だけが選択されるようカットオフ値（２値化）を設定し、

２）。一方、HL-HPS マウスの UVB 照射部では、非照射部

同じ試験内の評価はすべて同じカットオフ値にて評価した。

位と比べ、肉眼的にも皮膚の黒さの亢進（サンタン）
しているのが確認された（図２）。皮膚色を色彩色差計で測定し2. 4. 紫外線照射

た結果、HL マウスの皮膚では、非照射部の皮膚の L* 値と紫外線照射ランプは、FL20S.E-30/DMR；spectral irradiance，比べ、照射部の L* が有意（p < 0.01）に減少していた。次に、

2 9 0‒3 3 0 nm；peak wave, 3 0 5 nm；Toshiba Medical

UVB 照射後 5 日目の皮膚を採取し、パラフィン切片を作

Supply Co. Ltd.）を用いた 5）。麻酔下にて紫外線照射を行製し、フォンタナマッソン染色を行った。HL マウスでは、った。また紫外線照射領域以外の皮膚はアルミ箔で覆った。

UVB 照射部と非照射部でもメラニン産生の亢進はみられ

3. 結

なかったのに対し、HL-HPS マウスでは、非照射部と比べ、果照射部の基底層、有棘層、顆粒層、角化層において顕著な

3. 1. オリジナルモデルマウス（HL-HPS マウス）の皮
膚メラニン（WinROOF）によりメラニン密度を定量したところ、HL

HL-HPS マウスの皮膚色は、HL マウスの皮膚色と比べマウスでは、非照射部と比べ、照射部における有意なメラ

肉眼的に明らかに黒く（図１）、皮膚色を色彩色差計で測ニン密度の亢進はみられなかったが、HL-HPS マウスでは定した結果、HL-HPS マウスの L* 値の平均は 62.0、HL マ

非照射部と比べ、UVB 照射部において有意（p <0.01）なメ

ウスの L* の平均は 54.0 であった。また、両者は、統計学

ラニン密度の増加が確認された。

メラニン産生の亢進が観察された。また、画像解析ソフト

的に有意であった（p <0.01）。ヘマトキシリン・エオシン
染色では、HL マウスでは、ほとんど表皮メラニンが観察

3. 3. UVB 照射によるサンタンの回復されなかった。一方、HL-HPS マウスの表皮では、基底

HL-HPS マウスに生じたサンタンの経日変化を L* 値によ層・有棘層にメラニンが観察された。さらに、メラニンり評価した。UVB 照射部の L* 値は、UVB 照射から 5 日目を強調するために、フォンタナマッソン染色を行ったとこ

で非照射部と比べて有意に低くなり、UVB 照射から１週

ろ、HL- マウスにおいても表皮基底層におけるメラニン分

間後、L* 値は最も低値を示した（最も黒くなった）。その後、布が確認された。HL-HPS マウスの表皮では、さらに広範

皮膚の L* は緩やかに上昇し（明るさが回復し）、UVB 照射

囲（基底層、有棘層、顆粒層、角化層）に顕著なメラニンのから約１ヶ月で、UVB 非照射部の皮膚と同等の L* まで回分布が確認された。HL-HPS マウスでは、特に表皮細胞の復した。UVB 照後 5 日目から 40 日目までの HL-HSP マウ

apical 側に、メラニンキャップと呼ばれる形態をとってメスの皮膚の L* 値の変化は、非照射の L* 値と比べ統計学的

ラニンが分布することが確認された。WinROOF 画像解析に有意（p < 0.05）であった。一方、HL マウスでは、約１ヶソフトを用いて、フォンタナマッソン染色にて染色された
メラニン密度を解析したところ、HL-HPS マウスの表皮メ
ラニン密度は、HL- マウスのそれと比べ約 26 倍高く、また統計学的にも有意であった（p<0.01）。

図 1 オリジナルモデルマウスの皮膚メラニン
6 週齢の HL- マウス（HL）および HL-HPS マウス（HL-HPS）の背部皮膚の肉眼所見。

図 2 UVB 照射によるサンタンの発症
UVB 照射から 5 日後の HL- マウス（HL）および HL-HPS マウス（HL-HPS）の背部皮膚の肉眼所見。点線の左側は UVB 非照射
領域（UVB-）、右側は UVB 照射領域
（UVB+）。

− 49 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

月追跡しても顕著な皮膚色の変化は観察されず、有意な常、そのままでは回復が困難である 1）。また、その発症は、

L* 値の変化もみられなかった。

サンタンと比べると、紫外線等の曝露から比較的長い時間を経て発症する 10）。肝斑（シミ）等の色素異常症の病理学

3. 4. 遅延性色素沈着の出現的解析では、メラニン沈着は表皮層全体でみられるものの、

興味深いことに、UVB 単回照射から約 4 ヶ月後、HL-

特に表皮基底細胞において顕著であることが報告されていHPS マウスでは、一度は回復した色素沈着部において、再る 2）。HL-HPS マウスで観察された遅延性色素沈着も、最び色素沈着が発症した。一方、HL マウスの皮膚では、こ

初の UVB 照射から 16 週間後に発症した。また、自然回復のような遅延性の色素沈着はみられなかった。フォンタがみられず、メラニンの表皮基底細胞への顕著な蓄積が観

ナマッソン染色により、メラニンを検出したところ、HL-察された。以上の点において、HL-HPS マウスに発症した

HPS マウスの遅延性色素沈着領域では、基底層、有棘層、UVB 誘発性の遅延性色素沈着は、ヒトの肝斑等の色素沈

顆粒層、角化層にメラニンが観察され、主に基底層に顕著着症と類似している。

なメラニン沈着が確認された。また、WinROOF 画像解析

さらに、特筆すべきことは、本モデルマウスでは、僅かソフトを用いたメラニン密度の定量解析からも、HL-HPS

1 回の UVB 照射によって遅延性色素沈着を生じたことでマウスで誘導された遅延性色素沈着領域のメラニン密度ある。さらに、遅延性色素沈着を認めるまでに要した時間

は、HL マウスと比べ有意（p<0.01）に亢進していた。さらは、16 週であった。過去に、本研究においてコントローに、サンタンとは異なり、HL-HPS マウスの遅延性色素沈ルとして使用した HL- マウスに紫外線を 1 週間に 3 回、4着は、生涯消失することはなかった。

週間にわたって連続照射することにより、28 週後に遅延4. 考性の色素沈着が発症することが報告されている 11）。この察

HL- マウスを用いた研究では、野生型マウスで遅延性色素

表皮に顕著なメラニンを保有する HL-HPS マウスに紫外沈着の誘導している点で優れており、このマウスでもヒト

線を単回照射することで、一時的なメラニン産生亢進（サ類似の色素沈着が誘導されている 11）。一方、我々のモデンタン）、および、サンタン回復後に遅延性に発症する自ルマウスでは、遺伝子改変マウスを用いることで、1 回の然回復しない色素沈着症（シミ）を再現することに成功した。

紫外線照射によりヒトと類似した色素沈着を短期間で再現

一方、HL マウスでは、サンタンも遅延性色素沈着症も発できるため、より鋭敏な色素沈着のモデルマウスとして有症しなかった。

用である。

一般に、ヒトでは、紫外線に曝露されると数時間後か

5. 総

ら翌日にかけてサンバーン（日光皮膚炎）が生じ、その数括日後にサンタンと呼ばれるメラニン産生の亢進による皮当研究室にて開発された有色皮膚を持つオリジナルモデ

膚の黒化がみられる。紫外線によって産生されたメラニ

ルマウス（HL-HPS マウス）において、ヒト類似の紫外線誘ンは、表皮細胞核 apical 側に分布し、メラニンキャップ

発性サンタン、および、遅延性色素沈着が鋭敏に再現され（supranuclear melanin cap）と呼ばれる分布様式をとるこた。肝斑、日光黒子等の色素沈着（シミ）は、紫外線によっ6）とが知られる 。この supranuclear melanin cap は、核内て増悪することが知られる。色素沈着症は難治性疾患であDNA を紫外線から守るための防御システムと考えられてり、革新的な治療薬の開発が求められる。一方、美容的に

6, 7）。ヒト正常表皮のターンオーバーは、個人差や年も悩まれる患者さんも多い。化粧品の開発に実験動物を用

齢の違いはあるものの、28‒56 日で完結すると報告されていることは禁忌であり、今後、本モデルマウスに発症した

いる
いる

8, 9）

。紫外線によって一時的に産生されたメラニンも、

このターンオーバーに伴い、早くて概ね 1 ヶ月で角質と共色素沈着症の病態解明を進め、その分子基盤をもとにした鋭敏な動物代替法による薬剤選別法の開発が重要である。

に体外へ排出され、サンタンが回復すると考えられている。
本研究で用いたオリジナルモデルマウス、HL-HPS マウス

謝

辞でも、UVB 照射から 5 ‒10 日にかけて色素沈着が観察され、本研究を行うにあたり、多大なるご援助を賜りました公産生されたメラニンは supranuclear melanin cap の形態を

益財団法人コスメトロジー研究振興財団に深く感謝いたしとった。また、この色素沈着は紫外線照射から約 40 日をます。

かけて徐々に回復した。HL-HPS マウスに誘導された UVB照射による一時的な色素産生亢進（サンタン）
は、少なくと（引用文献）
1） Torok HM. A comprehensive review of the long-

も上記の点においてヒトと類似する。
一時的なメラニン産生の亢進（サンタン）は、自然回復

term and short-term treatment of melasma with a

可能であるのに対し、肝斑等の色素沈着症（シミ）は、通

triple combination cream. Am. J. Clin. Dermatol. 7,− 50 −

革新的なシミ予防・治療法の開発

Cell Mol. Life Sci. 66, 1493-1506, 2009.

223-230, 2006.
2） Sehgal VN, Verma P, Srivastava G, Aggarwal AK,7） Kobayashi N, Nakagawa A, Muramatsu T, Yamashina

Verma S. Melasma: treatment strategy. J. Cosmet.

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Laser Ther. 13, 265-279, 2011.

Mori T. Supranuclear melanin caps reduce ultraviolet
induced DNA photoproducts in human epidermis. J.

3） Yoshida H, Kunisada T, Grimm T, Nishimura EK,

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4） Yajima I, Kumasaka MY, Iida M, Oshino R, Tanihata

9） Weinstein GD, Van Scott EJ. Autoradiographic

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analysis of turnover times of normal and psoriaticmediated hyperpigmentation in skin via NF-kappa

epidermis. J. Invest. Dermatol. 45, 257-262, 1965.

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exposure-mediated DNA damage in young adults.

11）Naganuma M, Yagi E, Fukuda M. Delayed induction

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6） Park HY, Kosmadaki M, Yaar M, Gilchrest BA.
Cellular mechanisms regulating human melanogenesis.

− 51 −of pigmented spots on UVB-irradiated hairless mice. J
Dermatol Sci. 25, 29-35, 2001.

ヒト iPS 細胞を利用して、表皮角化細胞の様々な刺激に対する反応性にフィラグリン遺伝子の変異が与える影響について検討する
東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科皮膚科学分野

井川健

Previously, we have already successfully generated transgene-free and mutation-free human iPSCs (hiPSCs) fromhuman dermal fibroblasts by using the piggyBac transposon system. Moreover, we successfully differentiated these hiPSCs
into epidermal keratinocytes (iKCs; induced keratinocytes).
Incidentally, recent advances in the development of genome editing technologies based on programmable nucleases
such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator–like effector nucleases (TALENs) and the clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated nuclease Cas 9 (CRISPR/Cas 9 ) have substantially improved ourability to make precise changes in the genomes of human cells.
With our established systems of obtaining iKCs from hiPSCs and new technology of programmable nucleases, especially
CRISPR/Cas 9 system, we tried to clarify the precise effects of filaggrin gene (FLG) mutations in keratinocytes.
A guide RNA that targeted appropriate site of human FLG was designed by web-based tool and cloning into the
backbone vector of CRIPSR/Cas 9 (hFLG-CRISPR/Cas 9 ). We transfected hFLG-CRISPR/Cas 9 into hiPSCs and obtained
the several clones of hiPSCs which possessed random mutations in FLG. Then, original hiPSC and FLG-mutated hiPSCs
were differentiated into epidermal keratinocytes using our established protocols and we obtained the normal iKCs and FLGmutated iKCs. Under this condition, we can compare the phenotypes of normal and FLG-mutaed iKCs of the same genetic
background.
Thus, the results obtained from this system should be "true" meanings of FLG mutation in keratinocytes and should be
important information for the understanding of AD pathogenesis.

１．緒

業績によってノーベル賞を受賞して以降、このシステムを言利用した研究は驚くべきスピードで発展しており、また、

アトピー性皮膚炎は慢性に経過する炎症性皮膚疾患としそのシステムを臨床に応用しようとする試みは世界中で進てよく知られているが、難治であることもあり、常にその行している。そのような中で、我々も、リプログラミング

病態メカニズムの解明、治療法の開発の対象となっている

因子を、トランスポゾンベクターを利用して細胞に導入し、疾患である。近年、このアトピー性皮膚炎の少なくない

ヒト iPS 細胞を作製することに成功している 3）。また、そpopulation において、フィラグリン遺伝子の変異が見いだのヒト iPS 細胞を、表皮角化細胞に分化させ、さらには誘される（10 ％～ 30 ％）ことが報告されている。フィラグリ

導された表皮角化細胞を in vitro において重層化させ、再ンが皮膚のバリア機能を構成するタンパク質の一つである

構成表皮類似の構造を作ることも可能としている 3）。

ことから、この遺伝子の変異とアトピー性皮膚炎の発症に本研究では、我々が確立したヒト iPS 細胞作製から表皮は大きな意味合いがあるとされており、そのことについて

角化細胞誘導、再構成表皮類似構造の作製というシステム

1）

様々な研究がなされている 。しかしながら、その遺伝子と、遺伝子改変技術を組み合わせ、フィラグリン遺伝子変に異常があることと、個々の細胞（ここでは標的となる細異があることによる表皮角化細胞の機能に関して、様々な胞は表皮角化細胞である）のふるまいに異常がみられるの

外来性の刺激（炎症性刺激や感染症関連の刺激など）に対すかどうか、ということを、本当の意味で詳細に検討するこる反応性への影響という面から、詳細に検討することを目とについては、これまで検証できるシステムがなく、行わ的としている。

れていなかった。

2. 方

ところで、2006 年に京大の山中らによって、iPS 細胞の確立が報告 2） されて以降、また、2012 年に山中らがこの法

2 . 1. フィラグリン遺伝子変異の有無のみに違いのある一組のヒトiPS 細胞の作製
このためには、ヒト iPS 細胞において、ある程度の自在

Examination of 'true' meanings of filaggrin
mutation in keratinocytes for various
external stimuli
Ken Igawa
Department of Dermatology, Tokyo Medical
and Dental University

性をもって、遺伝子変異を導入するシステムの確立が必須である。ヒト ES 細胞 /iPS 細胞における遺伝子改変は、マウス ES 細胞 /iPS 細胞におけるそれに比して困難であるとされていたが、近年の技術の進歩により、人工ヌクレアー
ゼを利用することによって、比較的自在に行うことができ− 52 −

ヒト iPS 細胞を利用して、表皮角化細胞の様々な刺激に対する反応性にフィラグリン遺伝子の変異が与える影響について検討する

るようになっている（ゲ ノ ム 編 集 ）4）。本 研 究 に お い て は確立したもの）を利用して、3 次元培養皮膚モデル作製を

CRISPR/Cas 9 を利用して遺伝子改変を行った。

行った。カルチャーインサートにまず分化誘導された線維導入する変異は、本来は、実際のアトピー性皮膚炎患者

芽細胞を播種し、数日培養を行う。培養液を変更し、線維でみられるフィラグリン遺伝子変異をそのまま導入するべ芽細胞が重層し、真皮部分を形成するようにする。その後、

きであるが、システムの確立も同時並行で行う必要もあり、真皮部分の上部に iPS 細胞から誘導された表皮角化細胞をまた、黒白はっきりとした結果を得ることも考えて、まず播種し、さらに培養液を変更。数日培養後、表面を空気暴

はフィラグリン遺伝子をノックアウトすることを目的とし露し、角化細胞の重層と角化を促した。

た。フィラグリン遺伝子において、設定した標的配列を認

3. 結識するガイド配列を作製し、CRISPR/Cas 9 発現ベクターにクローニングする。このベクターをヒト iPS 細胞に導入
し、DNA の 2 重鎖切断後の non homologous end joining

3 . 1. フィラグリン遺伝子変異を有するヒトiPS 細胞の樹立（NHEJ）を利用したランダムな変異挿入がなされたヒト
iPS 細胞を採取してくる。

果

トランスポゾンシステムを利用して作成したヒト iPS 細胞において、CRISPR/Cas 9 のシステムを使うことによって、フィラグリン遺伝子にヘテロで欠失をもつものを数種

2 . 2 . 表皮角化細胞への分化プロトコールの確認類樹立した（図 1）。iPS 細胞の状態においては、形態的な

このようにしてフィラグリン遺伝子に変異を導入した

変化はみられない。

（ノックアウトした）ヒト iPS 細胞を、これまでに確立したプロトコールに従って表皮角化細胞に分化させる。さらに3 . 2 . 表皮角化細胞への分化プロトコールの確認

は、変異を導入していないオリジナルの iPS 細胞も表皮角

これまでに我々を含めて報告にある表皮角化細胞分化プ

化細胞へ分化させ、この二つの表皮角化細胞をもって互い

ロトコールに従って、ヒト iPS 細胞を分化させたところ、の差異を検討する。近年、表皮角化細胞への分化プロトコ

ことごとく失敗、という結果になった。そのため、ヒトールは我々も含めて確立されたと考えられていたが、もうiPS 細胞から表皮角化細胞を誘導するプロトコールについ一度そのプロトコールについて検討、確認を行うこととして再確認を行った。以前確立したプロトコールを改変してた。

（詳細は省く）検討したところ、図 2 に示すように、得られた細胞においては、表皮角化細胞の遺伝子発現が確認され

2 . 3 . ヒトiPS 細胞由来の線維芽細胞の誘導た。少なくとも表皮角化細胞の系に分化していることを確確立したヒト iPS 細胞から、線維芽細胞を誘導した。既認した。

に報告されている方法 5）を参照して作製した。

ただし、このプロトコールは、以前のプロトコールの半分の日程であり（2 週間程度）、それ以上の継続培養を続け

2 . 4 . ヒトiPS 細胞由来の線維芽細胞と表皮角化細胞を利用した 3 次元培養皮膚モデルの確立

ることが不可能であり、さらに、継代も不可能であった。

ヒト iPS 細胞由来の線維芽細胞と表皮角化細胞（以前に

図1

図2− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

3. 3.

我々が確立しているシステムとゲノム編集技術を利用した遺伝子変異挿入を組み合わせると、他の遺伝子背景は同

ヒト iPS 細胞から、すでに報告されている方法により線じで、標的の遺伝子、ここではフィラグリン遺伝子を選択

維芽細胞
（様細胞）
を誘導することができた（図 3）。

したが、その変異があるかどうかのみに違いのある、一組

3. 4.

の iPS 細胞を得ることができる。この一組の iPS 細胞をこ

以前に、すでにプロトコール（フル）
によって分化誘導し、れまでに確立した方法に従って表皮角化細胞へ分化させる

保存しておいた表皮角化細胞と、今回、誘導した線維芽細ことによって、はじめて、フィラグリン遺伝子の変異のみ胞（様細胞）を利用して、図 4 に示すような、真皮様構造のに違いがあり、他はすべて同じ、という表皮角化細胞を得上に、重層化した表皮様構造をもつ構造物を作製することることができる。
この一組の表皮角化細胞について、様々な外来性の刺激に成功した。

に対する反応性の違いを比較検討することによって、フィ４．考察／５．まとめ

ラグリン遺伝子の変異が表皮角化細胞のふるまいに与える影響を、本当の意味で詳細に検討することができることに本研究は、ヒト iPS 細胞を用いて、フィラグリン遺伝子なる。

に変異があることが、アトピー性皮膚炎にどのような意味

今回の研究では、表皮角化細胞の分化プロトコールの見合いをもつのか、ということを正確に評価する、というこ直し、ならびに、研究者の所属が変わったことによる影響とにつながることを期待して行ったものである。

図3

図4− 54 −

ヒト iPS 細胞を利用して、表皮角化細胞の様々な刺激に対する反応性にフィラグリン遺伝子の変異が与える影響について検討するもあって、フィラグリン遺伝子変異の有無による外部刺激（引用文献）

への反応の違いについてまでは検討することができなかっ

1） Irvine AD, McLean WH, Leung DY: Filaggrin

たが、それを検討するための前段階までは到達することがmutations associated with skin and allergic diseases. N

できたと考えている。

Engl J Med 2011;365:1315-1327.

表皮角化細胞のシングルセルの状態における、細胞のふ2） Takahashi K, Yamanaka S: Induction of pluripotent

るまいを検討するのみならず、今回の研究で成功したよう

stem cells from mouse embryonic and adult fibroblastに、より、正常の皮膚構造に近い状態（3 次元培養皮膚様cultures by defined factors. Cell 2006;126:663-676.

構造）において検討を行う用意ができたことは大きいと思3） Igawa K, Kokubu C, Yusa K, Horie K, Yoshimura Y,
Yamauchi K, Suemori H, Yokozeki H, Toyoda M,

われた。
ただし、先にも述べたように、表皮角化細胞への分化がKiyokawa N, Okita H, Miyagawa Y, Akutsu H,

うまく行われない状況がしばらく続いており、改変したプ

Umezawa A, Katayama I, Takeda J: Removal of

ロトコールで得られた表皮角化細胞（様細胞）
は、継代培養reprogramming transgenes improves the tissueが不可能であり、3 次元培養にもっていくことも不可能でreconstitution potential of keratinocytes generatedある。この部分においては、さらなる改変が必要であり、from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells

引き続き行う検討においては、しばらくの間は、シングル

Transl Med 2014;3:992-1001.
4） Kim H, Kim JS: A guide to genome engineering with

セルの状態においての検討、ということになる。
このように、本研究は、アトピー性皮膚炎においてフィprogrammable nucleases. Nat Rev Genet 2014;15:321-334.

ラグリン遺伝子の変異がもつ本当の意味に迫ることが可能

5） Itoh M, Umegaki-Arao N, Guo Z, Liu L, Higgins CA,となることにつながり、さらに、その遺伝子変異が表皮角

Christiano AM. Generation of 3D skin equivalents fully

化細胞において存在することの本来の意味を知ることがでreconstituted from human induced pluripotent stem

きると思われ、コスメトロジーにも大きな意義をもつ成果

cells（iPSCs）.PLoS One. 2013 Oct 11; 8 (10): e77673.

となったと考える。

− 55 −

ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化製剤の薬理効果への影響
徳島大学大学院医歯薬学研究部

石田竜弘

Polyethylene glycol (PEG) is considered as non-toxic and non-immunogenic material, and surface modification with
it can improve the immunogenicity and pharmacokinetics of nanocarriers. However, we recently reported that PEGylated
liposome loses their long circulating properties when they are administered twice in same animal with certain interval(accelerated blood clearance (ABC) phenomenon). We elucidated that anti-PEG IgM, secreted in response to the first doseof PEGylated liposome, is responsible for the rapid clearance of the second dose via initiation of complement activation. We
further elucidated that such anti-PEG IgM production is caused in nude mice (no T-cells), while it was not caused in SCID
mice (no B and T cells) and splenectomized mice (no spleen). These suggest that spleen B cells produce the anti-PEG IgM
in a T-cell independent manner. It appears that PEGylated liposome activates the immunity in spleen as T-cell independent
antigens do. In addition, we recently reported that nucleic acids such as siRNA and pDNA in SL further enhances anti-PEG
IgM production via tall like receptors (TLRs) (TLR 7 for siRNA, TLR 9 for pDNA) in their sequence dependent manner.
Our studies clearly demonstrate that any PEGylated formulations may display unexpected pharmacokinetic behavior upon
repeated injection if such formulation induce anti-PEG IgM production and, as a consequence, may show less therapeutic
efficacy or even cause undesirable side-effects. In this study, we paid an attention to PEG in the cosmetics and studied if the
PEG induces anti-PEG immunity after sequential addition for 60 days. The result clearly demonstrated that the cosmetic
containing PEG induces anti-PEG IgM, not anti-PEG IgG, and accordingly the cosmetic may be a major cause to induce preexisting anti-PEG IgM observed in sera of healthy volunteers.

1. 緒

よって 2 回目に投与した PEG 修飾リポソームが速やかに言

血中から排除されることを報告した 1）。

PEG（ポリエチレングリコール）はエチレングリコール

これらの抗体はあくまで、PEG を修飾した医薬品の投が重合した構造からなるポリマーであり、皮膚への刺激性

与によって誘導されたものと考えられていたが、最近のや毒性がほとんど認められないことから化粧品成分として臨床研究から、PEG 修飾医薬品による治療歴のない患者

広く使用されている。化粧品における PEG の用途としての一部が抗 PEG-IgM を保有していることを明らかとした。

は界面活性剤、クレンジング剤、乳化剤および保湿剤など

実際、東京大学医学部・女性外科・松本医師との共同研究があり、これらに含まれている PEG の一般的な分子量はにおいて、これらの患者に卵巣がんの特効薬である Doxil

200 ～ 10,000 程度である。また、分子量の調節や脂溶性（ドキソルビシン封入 PEG 修飾リポソーム）を投与した場基の導入により、さまざまな物性を持たせることができる

合、Doxil の血中濃度の急激な低下が観察され、通常得らため、数百種類以上の誘導体も使用されている。このようれる治療効果がほとんど得られないことも明らかとした。

に PEG には幅広い用途があるため、化粧品成分として汎これらの患者が抗 PEG 抗体を保有するに至った原因は用されており、我々も日常的に PEG に暴露されている。

明らかではない。前述のように、日常的に使用する化粧品

一方、PEG は医薬品においても重要な役割を果たしての中に PEG を含むものが多く存在するため、これらの化いる。PEG を修飾した医薬品は、有効成分がゆるやかに

粧品の日常的な使用により、PEG に対する抗体が誘導さ放出され、血中濃度が長時間保たれるという特徴を有するれたのではないかと考えた。PEG の皮膚透過性について、ため、血中で分解を受けやすい薬や、抗がん剤など毒性が分子量 4,000（PEG-75）以上の PEG は皮膚から吸収されな

発現しやすい薬においてよく用いられる。一方、我々は、

いが、それよりも小さい分子量の PEG は皮膚から最小限

PEG 修飾リポソームの投与によって PEG に対する抗体（抗に吸収されることが知られている 2）。また、傷害された皮PEG-IgM）の分泌が誘導されることを明らかにし、これに膚に対しては PEG の分子量に関係なく、透過性を示すことが明らかとなっている 3）。また、化粧品に含まれている
PEG の毒性について、Bárány らは PEG や PEG 誘導体はヒトの皮膚に対してはほとんど刺激を与えないが、経表皮水

Immunological response against PEG in
cosmetics
Tatsuhiro Ishida
Tokushima University, I nst itute of
Biomedical Sciences

分消失（TEWL）を増加させ、角質バリア機能を目に見えないレベルで傷害していることを報告しており 4）、透過した PEG が PEG に対する免疫反応を誘導していても何ら不思議ではない。

− 56 −

ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化製剤の薬理効果への影響

このような仮説を検証するため、PEG 含有化粧品をラ

ロリド、イソデシルグリセリルエーテル、ポリクオタニウ

ットに塗布した際の抗体産生評価ならびに化粧品によって

ム -10、ポリクオタニウム -52、ラウレス-4、ラウレス-16、誘導される抗 PEG 抗体による PEG 修飾医薬品の動態変化

ラウレス-23、ラウレス硫酸 Na、ビスセテアリルアモジメ

について検討を行った。

チコン、ステアロキシプロピルジメチルアミン、ジメチコン、

2. 方

水酸化 Na、安息香酸 Na、ベンジルアルコール、フェノ

法

キシエタノール、香料

2. 1. 実験動物
実験動物として HWY 雌性ラット（体重 150 ～ 250 g）を

2. 3. 上記化粧品の塗布

日本 SLC（静岡、日本）より購入して用いた。実験動物はガムテープを用いて腹部に 10 回程度テープストリッピ

SPF（specific pathogen free）環境下で生育させた。また、ングを行い、コットンに適量の PEG 含有化粧品を染み込全ての実験動物は徳島大学動物実験委員会によって承認をませ、腹部に塗布した。この操作を 1 日 1 回行った。

受けた上で行った。

2. 4. Anti-PEG antibodies の測定

2. 2. 塗布用化粧品

麻酔下で化粧品処置したラットから血液を採取し、血液を血清分離剤入りチューブ（栄研、東京、日本）に採取した。採取しPEG 含有化粧品として以下の 3 種類を用いた。
・化粧水：資生堂

AQUALABEL

モイスチャーローシ

た血液は 30 分間室温で放置した後、3000 rpm（KUBOTA2800）

ョン
（S）

で 20 分間遠心分離し、上清のみを回収した。血清は使用するま含有成分：水、DPG、エタノール、グリセリン、PEG-6、で－20℃で保存した。

PEG-32、PEG/PPG-14/7 ジメチルエーテル、エリスリト

ELISA 用 96 ウェルプレート（Costar®、Corning、NY、ール、アセチルヒアルロン酸 Na、ヒアルロン酸 Na、乳酸、

USA）
を用意し、
mPEG2000-DSPEを 50µL各ウェルに分注し、

塩化 Mg、PCA、アンズ果汁、塩化 Ca、水添レシチン、

室温で 1 晩インキュベーションした。Blocking Solution を

ポリクオタニウム -51、水溶性コラーゲン、PEG/ポリブ

350µL 分注し、1 時間インキュベーションした。インキュチレングリコール -44/15 メチルエーテル水添ダイマージ

ベーション後、Wash Solution を用いて 3 回洗浄した。血清

リノレイル、クエン酸 Na、EDTA-2Na、クエン酸、BG、をそれぞれを 100µL 分注し 1 時間インキュベーションした。

水酸化 Na、トコフェロール、PEG-30 ダイズステロール、Wash Solution を用いて 5 回洗浄後、Blocking Solution を用

水酸化 K、EDTA-3Na、フェノキシエタノール、香料

いて 5000 倍希釈した二次抗体を 100µL 分注し、1 時間イン

・日焼け止め：資生堂メン

UV プロテクター

キュベーションした。Wash Solution を用いて 5 回洗浄後、含有成分：水、シクロメチコン、BG、変性アルコール、メEnzyme Substrate を 100µL 分注し、5 〜 30 分インキュベ

トキシケイヒ酸オクチル、ジメチコン、ポリメチルシルセーションした。酵素反応を止めるために Stopping Solution

スキオキサン、PEG-9 ポリジメチルシロキシエチルジメチ

を 100µL 分注した。その後 Microplate reader（TECAN、

コン、ジステアルジモニウムヘクトライト、グリセリン、エMännedorf、Switzerland）
を用いて吸光度を測定した（λ=492

リスリトール、スクワラン、フルオロ（C9-15）アルコールリ

nm）。Goat anti-Rat IgM Antibody HRP Conjugated, Goat

ン酸、トリメチルシロキシケイ酸、PEG/PPG-14/7 ジメ

anti-Rat IgG-Fc Fragment Antibody HRP Conjugated を二チルエーテル、グルタミン酸 Na、メントール、ポリクオタ次抗体として使用した。

ニウム-51、ワイルドタイムエキス、チオタウリン、イソス
テアリン酸、（アクリル酸アルキル/ジメチコン）コポリマ

2. 5. Doxil の血中濃度測定

ー、ジステアリン酸 Al、水酸化 Al、PEG-150、EDTA-

ラット尾静脈よりDoxilを急速投与した。投与 5 日後に、血液3Na、DPG、BHT、フェノキシエタノール、香料、酸化亜を採取した。採取した血液は 30 分間室温で放置した後、20 分

鉛、酸化チタン間遠心分離し、上清のみを回収した。血清中のドキソルビシン

・シャンプー：花王

エッセンシャル リッチダメージケア シ

濃度は定法に従ってHPLCを用いて測定した。

ャンプー

3. 結

含有成分：水、ラウレス硫酸アンモニウム、エタノール、ラウレス-4 カルボン酸 Na、ラウリルヒドロキシスルタイン、果

3. 1. PEG 含有化粧品によるanti-PEG IgM 産生

ジステアリン酸グリコール、ラノリン脂肪酸、リンゴ酸、

まず、PEG 含有化粧品によってanti-PEG IgM が誘導されクエン酸、ヒマワリ種子油、ミリスチルアルコール、ス

るか検討を行った。PEG 成分が含まれている化粧水、日テアリルアルコール、PPG-7、PPG-3 カプリリルエーテル、

焼け止め、シャンプーのいずれかを 1 日 1 回ラットの腹部に塗コカミド MEA、グアーヒドロキシプロピルトリモニウムク

布し、塗布開始 16、37、60 日後に血清を採取した。採取− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

した血清中の anti-PEG IgM 量を ELISA により評価した。

3. 2. PEG含有化粧水誘導anti-PEG IgMの抗体力価

その結果、化粧水塗布ラットにおいて anti-PEG IgM 量

続いて、化粧水で誘導された anti-PEG IgM の抗体力価の増加が確認された。抗体量は塗布開始 37 日後にピークの評価を行った。Fig. 1 において最も anti-PEG IgM 量がとなったが、60 日後には抗体量が減少していることが明多かった化粧水塗布 37 日後 No.4 の血清を用い、この血清らかとなった。また、日焼け止めとシャンプーを塗布した

中の anti-PEG IgM が PL 投与によって誘導される anti-PEG

ラットにおいては anti-PEG IgM の誘導が確認されなかっ

IgM と比較してどの程度の抗体力価を持っているのか検討た。この理由の一つとして、日焼け止めとシャンプーは化を行った。

粧水に比べて皮膚透過性が低く、表皮樹状細胞であるラン

その結果、化粧水塗布によって誘導された anti-PEG IgM

ゲルハンス細胞にまで到達しなかったために、抗体産生がは、PL を 10-4 µmol phospholipids/kg 静脈内投与したとき生じなかった可能性が考えられる。また、IgG の誘導に関に誘導される anti-PEG IgM と同程度の抗体力価を持つこ

しても同様の検討を行った結果、PEG 含有化粧品によるとが確認された（Fig. 2）。

anti-PEG IgG の誘導は生じないことが確認された。

次に、この抗体力価が Doxil をどの程度クリアランスすFig. 1 Anti-PEG IgM and IgG production following putting PEG-including cosmetics on skin.
Face lotion（A, D）or sunscreen（B, E）or shampoo（C, F）including PEG was put on hairless rat’ s skin every day,respectively. Serum was collected on day 16, 37, 60 after putting. Anti-PEG IgM and IgG were determined using ELISA. Data
are presented as absorbance at 492 nm.

− 58 −

ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化製剤の薬理効果への影響るのかを検討するために、PEG 修飾リポソーム（10-2, 10-4,-6同程度の抗体力価を持つ PEG 修飾リポソーム（10-4 µmol

10 µmol phospholipids/kg）静脈内投与によって anti-PEG

phospholipids/kg）で誘導された anti-PEG IgM は、PEG 修

IgM が 誘 導 さ れ た ラ ッ ト に Doxil（0.7mg doxorubicin/

飾リポソームを投与していない無処置のラットと比較して、kg）を静脈内投与し、投与 4 時間後の Doxil の血中濃度をDoxil の血中濃度を投与 4 時間後に 50 ％程度低下させるこ

HPLC で測定した。

とが明らかとなった。

その結果、化粧水によって誘導された anti-PEG IgM とFig. 2 Titer of anti-PEG IgM induced by putting lotion.
Face lotion was putting on hairless rat’ s skin every day and serum was collected on day 37（●），
the serum which has highest titer among 4 sera was used as sample. PL was intravenously injected-6-4into hairless rat at a dose of 10 µmol phospholipids/kg（◇），10 µmol phospholipids/kg（□），or-2
10 µmol phospholipids/kg（△）
and serum was collected on day 5 after injection. Each value（PL pretreated）
represents the mean ± S.D.（n=3），Face lotion treated（n=1）．

Fig. 3 Blood retention of Doxil in PEGylated liposomes-pretreated rat.
-2-4
-6PEGylated liposomes（10 , 10 , 10 µmol phospholipids/kg）was intravenously injected into hairlessrat. Five days later, Doxil（0.7 mg doxorubicin/kg）was intravenously injected into the rat. Serum wascollected at 4 hr after injection. Serum concentration of Doxil was determined using HPLC. Each value
represents the mean ± S.D.（n=3）．The p-value indicates the statistcal difference between the control
rats and PL pretreated rats. *p ＜ 0.05, ***p ＜ 0.001.

− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

3. 3. PEG 含有化粧水誘導 anti-PEG IgM の特性評
価（親和性、補体）
Fig. 3 において、化粧水塗布によって得られた抗体力

PEG 含有化粧水を塗布し（Fig. 4）、これによって誘導された anti-PEG IgM の PEG 修飾リポソームへの結合性と補体活性化能の有無を評価した。

価と同程度の anti-PEG IgM を PEG 修飾リポソーム投与にこれまでの結果と同様に、化粧水の塗布によって anti-

よって誘導した場合、Doxil の血中からの速やかなクリア

PEG IgM の誘導が確認された（Fig. 4）。また血液中に anti-

ランスが確認された。しかし、化粧水塗布によって誘導

PEG IgM を分泌すると考えられる PEG 特異的細胞の存在された anti-PEG IgM と、PEG 修飾リポソーム投与によっも確認された。さらに PEG 修飾リポソームと競合 ELISAて誘導された anti-PEG IgM は性質が異なる可能性が考えを行った結果、化粧水で誘導された anti-PEG IgM は、られる。Doxil に対して ABC 現象が発現するには、anti-

PEG 修飾リポソームで誘導された anti-PEG IgM と同様に、

PEG IgM の Doxil に対する親和性や補体活性化能の有無がPEG 修飾リポソームに対しても結合性を示すことが確認重要となる。化粧水で誘導された anti-PEG IgM の性質をされた（Fig. 5）。このことから、化粧水で誘導された anti-

調べるため、これまでとは別に、へアレスラットに新たに

PEG IgM は PEG 修飾リポソームを認識する抗体であるこFig. 4 Anti-PEG IgM production following putting of PEG-including face lotion.
Face lotion including PEG was put on hairless rat’ s skin every day. Serumwas collected on day 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 after putting. Anti-PEG IgM was-2determined using ELISA. Serum from PL-pretreated rat（10 µmol phospholipids/kg）was used as a positive control. Data are presented as absorbance at 4 9 2
nm. Each value represents the mean ± S.D.（n=7）．The p-value indicates thestatistcal difference between the control rats and PL pretreated rats. *p ＜ 0.05,**p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001.

Fig. 5 Affinity of anti-PEG IgM induced by face lotion to PL.
Face lotion was putting on hairless ratʼs skin every day. Forty two days
later, serum was collected. Binding of anti-PEG IgM to PL was determined bycompetitive ELISA. The binding of anti-PEG IgM in 1 0 0-times diluted serum to
mPEG2000-DSPE on the plate were determined in the presence of competitor（PL-20.5µmol phospholipids/mL）．Serum from PEGylated liposome-pretreated rat（10µmol phospholipids/kg）was used as a positive control.

− 60 −

ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化製剤の薬理効果への影響とが明らかになった。続いて、anti-PEG IgM による補体ての血清において PEG 修飾リポソーム添加による溶血率

活性化が生じているか、
CH50キットを用いて検討を行った。

の減少は生じなかった。一方で、PEG 修飾リポソームを投本実験では血清中の補体量に比例して抗体依存的な補体

与したへアレスラット由来の血清に PEG 修飾リポソームの活性化が生じ、EA（感作ヒツジ赤血球）が溶血する。そを添加した場合は、溶血率の減少が生じた。このことから、のため、PL に血清中の anti-PEG IgM が結合して補体を化粧水で誘導された anti-PEG IgM による補体活性化は生活性化すると、血清中の補体量が減少するため EA の溶血じていないことが明らかとなった。補体活性化が生じなか量が減り、溶血率は低下すると考えられる。また、本実った原因として、①化粧水で誘導された anti-PEG IgM に験で用いた血清に、補体を消費することが知られている

補体活性化能がない、②化粧水誘導の anti-PEG IgM は補

zymosan を添加すると溶血率が低下したことから、いず体活性化能を持つが、抗体価が低いため古典経路を活性化れの血清も補体が含まれていることを確認している（Fig.

させるのに十分な抗体量が得られていなかった、の 2 点が6）。

考えられる。以前の検討においても、PEG 修飾リポソー

Fig. 6 より、化粧水を塗布したへアレスラット由来の全ムによって誘導された anti-PEG IgM が PEG 修飾タンパク

Fig. 6 Complement consumption following incubation of serum with PL.
Face lotion was put on hairless rat’ s skin every day. Forty two days later, serum
was collected. Complement consumption following incubation with either PL or-2zymosan was measured using CH5 0 kit. Serum from PL-pretreated rat (1 0 µmol
phospholipids/kg）was used as a positive control.

Fig. 7 Blood retention of Doxil in rat treated with face lotion.
Face lotion was put on hairless rat’s skin every day. Forty two days
later, Doxil（1.5 mg/kg）was intravenously injected into the hairlessrat. Serum was collected at 4 hr after injection. Serum concentrationof Doxil was determined using HPLC. Each value represents themean ± S.D.（n=7）．The p-value indicates the statistcal difference
between the control rats and face lotion pretreated rats. ***p ＜0.001.

− 61 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018に結合した後、補体活性化を生じさせないことを明らかに

Doxil を投与しても、血中濃度の低下は確認されなかった。

しており、化粧水によって誘導された anti-PEG IgM も同

本検討の結果より、PEG 含有化粧水によって anti-PEG
IgM が誘導されるが、補体活性化は生じないため、他の様の現象を引き起こしたと考えられる。

PEG 修飾製剤の体内動態変化を発現させる可能性は低い

3. 4. PEG 含有化粧水誘導 anti-PEG IgM が Doxilの血中滞留性に与える影響

ことが示唆された。そのため、Doxil のような血中濃度と次いで、化粧水で誘導された anti-PEG IgM によって能性は低いと考えられる。その一方で、PEG 化タンパク

Doxil のクリアラスが生じるか検討を行った。PEG 含有化製剤のような中和抗体の存在を考慮しなければならない薬粧水塗布 42 日後に Doxil を 1.5 mg doxorubicin/kg 静脈内剤に対してはその薬効を減弱させる可能性も考えられるた

投与し、その 4 時間後の Doxil 血中濃度を HPLC で測定した。

め、注意が必要である。

薬効が相関する薬剤に対しては治療効果に影響を及ぼす可その結果、Doxil 投与 4 時間後の血中濃度は化粧水塗布

5. 総

ラットと無処置ラットで大きな差はなく、Doxil のクリア

括

ランスは生じないことが確認された。Fig. 3 において PEG

本検討により、PEG を含有する化粧品によって実際に

修飾リポソームで誘導された anti-PEG IgM によって Doxil

抗 PEG-IgM が誘導されることが明らかとなった。今後、のクリアランスが生じたにも関わらず Fig. 7 において大き化粧品によって誘導された抗 PEG-IgM による PEG 修飾医

な血中濃度の低下が確認されなかった原因として、抗体

薬品の効果減弱が実際に引き起こされるかについて検討を力価が低いことや Fig. 6 において化粧水誘導の anti-PEG

行いたいと考えている。

IgM による補体活性化が生じなかったことが考えられる。

PEG 修飾医薬品は、血中濃度が長時間維持されるといその結果、マクロファージによる取り込みがみられず、血う利点を有しており、がんや肝炎などの疾患の治療薬とし中濃度の劇的な低下が生じなかったと考えられる。

て重要な位置を占めている。化粧品によって誘導された抗4. 考体がこれらの治療薬の効果を減弱してしまうことが証明さ察れた場合、これまで化粧品成分として安全と考えられてき本研究では、PEG 含有化粧品によって anti-PEG IgM のた PEG の使用が望ましくないと考えられる。

分泌が生じるか、さらに、この anti-PEG IgM によってDoxil の血中濃度に影響が生じるか検討を行った。本検討の結果から、皮膚に浸透しやすい化粧水によって anti-PEG（引用文献）
1） Abu Lila AS, Kiwada H, Ishida T, The accelerated

IgM の分泌が生じ、このピークは塗布開始 35 日前後とな

blood clearance（ABC）phenomenon: Clinical

ることが分かった。PEG 含有化粧水による anti-PEG IgMchallenge and approaches to manage. J. Control.

分泌量はラットの個体差が大きい結果となったが、最もRelease, 172, 38-47（2013）

anti-PEG IgM 分泌量の多かったラットの抗体価は PEG 修

2） Smyth Jr. HF, Some pharmacological properties

飾リポソームの 10-4 µmol phospholipids/kg 投与によってof polyethylene glycols of high molecular weight

誘導される anti-PEG IgM と同程度の抗体力価を持つこと（“carbowax” compounds）J. Ind. Hyg. Toxicol., 24, 281-が確認され、これは Doxil 投与 4 時間後の血中濃度を 50%

284（1942）

程度低下させる力価を保持していた。また、PEG 含有化

3） Herold DA, Rodeheaver GT, Bellamy WT, Fitton LA,

粧水誘導の anti-PEG IgM は PEG 修飾リポソームに対しBruns DE, Edlich RF, Toxicity of topical polyethyleneて高い親和性を持っていた。しかしながらこの anti-PEG

glycol. Toxicol. Appl. Pharmacol., 65, 329-335（1982）

IgM は、補体活性化能はなく、Doxil の動態変化を引き起

4） Bárány E1, Lindberg M, Lodén M., Unexpected skin

こす可能性は低いと考えられる。実際に PEG 含有化粧水

barrier influence from non-ionic emulsifiers. Int. J.

塗付によって anti-PEG IgM が誘導された状態のラットにPharmacol., 195, 189-195（2000）− 62 −

フィラグリン遺伝子欠損ラットを用いたアレルギーマーチの解明
京都大学大学院医学研究科皮膚科学講座

大塚篤司

Allergy March (atopic march) means a series of allergic diseases induced by one allergic disease. In recent years,
atopic dermatitis has attracted attention as a first step of allergy march. From the mouse model or human genetic analysis,
the mechanism of allergy march is gradually being elucidated. In allergy march, percutaneous sensitization is regarded asimportant for the induction of other allergic diseases, and among them, there is a high possibility that the mutation of thefilaggrin gene responsible for the skin barrier function is triggered. The application of zinc-finger nucleases (ZFNs) as agene-targeting technology has been successful in rats, which is faster and more efficient than embryonic stem cell-mediatedknockout technology. Herein, we report the generation and characterization of Flg knockout (Flg KO) rats. FLG KO rats
showed an increase in transepidermal water loss. we found that OVA-induced asthma exacerbated using atopic dermatitisinduced FLG KO rat compared to that of wild type rat. It is expected that new allergy march therapy development focusing
on filaggrin expression control will be developed in the future.

1. 緒

ルギー発症のリスクを高め、10 歳でオッズ比が 2.86、18

言

歳ではオッズ比が 4.25 にのぼる 7）。ピーナッツアレルギー

フィラグリンは皮膚バリア機能を担う重要なタンパクでのリスクがフィラグリン遺伝子の変異に依存するとの報告ある。アトピー性皮膚炎（AD）の約 20 ‒ 30% の患者にフィもある 8）。アレルギーマーチのメカニズムを説明する上でラグリン遺伝子の変異が認められるだけでなく、アトピー

抗原の交差性も指摘されている。ピーナッツのアレルゲン

性皮膚炎の患者のほぼ全てでフィラグリンタンパクの発現はスギ花粉などのエアロアレルゲンとの交差性を認める 9）。

が低下している。このことから、アトピー性皮膚炎発症とこのようにアトピー性皮膚炎、特にフィラグリン遺伝子のフィラグリンタンパクの関係は世界中で大きな注目を集め

変異とアレルギーマーチの関連を示唆する多くの傍証はあている。我々はこのフィラグリンの発現を亢進する新規化

るものの、そのメカニズムに関しての詳細は不明である。

合物を発見し、この化合物を投与したモデルマウスではア

そこで本研究申請課題では、申請者らが作成した新規モ

1）

トピー性皮膚炎が改善することを世界で初めて報告した 。

デル動物であるフィラグリン遺伝子欠損ラットを用いて、アトピー性皮膚炎、特にフィラグリン遺伝子の変異がア

フィラグリン遺伝子異常から始まる喘息発症のメカニズム

レルギーマーチの誘因に関与する可能性が海外で提唱されを解析し、アレルギーマーチ全貌の解明につなげることをている。エアロアレルゲンの経皮感作マウスでは全身の目的とする。

Th2 免疫応答が誘導され、アレルギー性鼻炎が誘導されやすくなるとの報告がある 2）。さらに、経皮感作によって誘導されたアトピー性皮膚炎モデルマウスでは、経気管支

2. 方

法

2. 1. フィラグリンラットの作成
近年、遺伝子ターゲッティング技術としてのジンクフ

3）によるアレルギー反応が誘導されやすくなる 。
ヒトでは、重症 AD 患者の 70% がその後喘息及びアレィンガーヌクレアーゼ（ZFN）が開発され、胚性幹細胞に

ルギー性鼻炎を併発する 4）。フィラグリン遺伝子変異を持よるノックアウト技術よりも速く効率的な遺伝子改変モ

つ AD 患者はフィラグリン遺伝子に変異を持たない AD 患

デルの作成が可能となっている 10）。ラットフィラグリン

者比べ喘息に罹患する可能性が高い 。また、フィラグリ遺伝子の第 2 エキソンを、従来の ZFN 試薬を用いて標的ン遺伝子に変異を持つ喘息患者ほど治療が難治するとの報化した。確認された ZFN mRNA を受精した F344 / Stm 卵

5）6）

告もある 。さらに、フィラグリン遺伝子変異は食物アレ母細胞にマイクロインジェクションした後、偽妊娠 Crlj：
WI 雌ラット（偽妊娠里親）の卵管に移した。8 匹の新生動
物をスクリーニングすると、4 匹（50 ％）が免疫組織化学的染色により確認されたように、FLG タンパク質発現の完

Mechanism of atopic march using filaggrin
knockout rat
Atsushi Otsuka
Department of Dermatology, Kyoto
University

全な喪失をもたらすフレームシフト突然変異である 7bp 〜
2622bp の欠失を含む突然変異を有していることが明らかとなった。

− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

2. 2. 喘息モデルの作成

炎反応を亢進することを報告している 11）。しかしながら、アトピー性皮膚炎モデルは、OVA アルブミンタンパク

Flaky tail マウスはフィラグリン遺伝子のみならず mattedを経皮的に感作し続ける OVA-ODT モデルが一般的に広遺伝子の変異を認めるため、フィラグリン遺伝子と皮膚のく用いられている。毛剃りしたマウスの背部に OVA タン

表現系の関連性は直接的に証明されていなかった。2012

パクを数日間貼付け密封し、それを 2 週間以上繰り返すこ

年 Kawasaki らによってフィラグリン遺伝子欠損マウスがとで、OVA 特異的 IgE がマウス内で上昇し、OVA タンパ

作製され、皮膚に特徴的な所見は認めないことが報告され

クを貼付けた部位には皮膚炎が誘導され、組織学的にはた 12）。我々はこのマウスと人のフィラグリン遺伝子変異に

アトピー性皮膚炎に近いことが知られている。そこでまよる表現系の違いが表皮の厚さによるものではないかと考ず、FLG KO ラットと野生型ラットを用いてアトピー性皮え、マウスに比べ表皮の厚いラットを用いてフィラグリン

膚炎モデルの構築を行う。皮膚における炎症の評価、全身遺伝子欠損動物を作成した。フィラグリン遺伝子欠損（FLG

性 Th2 反応の変化を観察する。続いてアトピー性皮膚炎KO）ラットを作成にあたり、Zink finger protein を用いモデルを誘導したラットを用いて、喘息モデルの評価を行た。ラットフィラグリン遺伝子の第 2 エキソンを、従来のう。密閉した箱内でラットを飼育し OVA タンパクを生食

ZFN 試薬を用いて標的化した。確認された ZFN mRNA をに溶解させネブライザーで噴霧させる。この惹起を２回ほ受精した F344/Stm 卵母細胞にマイクロインジェクション

ど行い、気道内浸潤細胞の評価、肺気道上皮の組織学的解した後、偽妊娠 Crlj：WI 雌ラット（偽妊娠里親）の卵管に析、また Th2 サイトカインの発現の変化を観察する。皮移した。8 匹の新生動物をスクリーニングすると、4 匹（50膚局所での炎症浸潤細胞とサイトカインの発現変化、また％）が免疫組織化学的染色により確認されたように、FLG

肺気道上皮でのそれら変化を比較し、アレルギーマーチのタンパク質発現の完全な喪失をもたらすフレームシフト突誘導に重要な標的物質の同定を試みる。

然変異である 7bp 〜 2622bp の欠失を含む突然変異を有し

3. 結ていることが明らかとなった。

果

このラットは、尾部に絞扼輪を伴い臨床所見を有する（図

3. 1. フィラグリン遺伝子変異（FLG KO）ラットの解析1 A）。遺伝子改変ラット（KO）では尾部に絞扼輪を認め背Flaky tail マ ウス と は、 フィラグ リン 遺 伝 子 に 変 異部の皮膚はダーモスコピーにて表皮が変化していることが（5303delA）を有するマウスであり、申請者が所属する研究わかった。また、ラットフィラグリン抗体を用いた免疫染室において Flaky tail マウスがダニ抗原を用いた接触皮膚

色では、KO ラットのフィラグリン発現が完全に消失して

図1
A．遺伝子改変ラット（KO）では尾部に絞扼輪を認め背部の皮膚はダーモ
スコピーにて表皮が変化していることがわかった。
B．ラットフィラグリン抗体を用いた免疫染色。WT：野生型、HT：ヘテロ遺伝子 KO、KO ホモ遺伝子 KO− 64 −

フィラグリン遺伝子欠損ラットを用いたアレルギーマーチの解明いることを確認した（図 1 B）
。このラットを用いて皮膚バ認された ZFN mRNA を受精した F344 / Stm 卵母細胞にマリア機能の基礎的な解析を行った。経皮水分喪失量と皮膚

イクロインジェクションした後、偽妊娠 Crlj：WI 雌ラッコンダクタンスは、FLG KO ラットで明らかに減弱していト（偽妊娠里親）の卵管に移した。8 匹の新生動物をスクリることが明らかとなった。また、共焦点ラマン分光装置をーニングすると、4 匹（50 ％）が免疫組織化学的染色により用いて角質層における天然保湿因子の含有量の評価を行っ確認されたように、FLG タンパク質発現の完全な喪失をたところ、水分保持量が FLG KO ラットで優位に減弱しもたらすフレームシフト突然変異である 7bp 〜 2622bp のていることを見出した。

欠失を含む突然変異を有していることが明らかとなった。
この FLG KO ラットでは、尾部に絞扼輪を認め背部の皮3. 2. フィラグリン遺伝子変異（FLG KO）ラットの解析

膚はダーモスコピーにて表皮が変化していることがわかっ

FLG KO ラットと野生型ラットを用いてアトピー性皮膚た。また、ラットフィラグリン抗体を用いた免疫染色では、炎モデルを構築した。続いてアトピー性皮膚炎モデルを

KO ラットのフィラグリン発現が完全に消失していること誘導したラットを用いて、喘息モデルの評価を行った。気を確認した。さらに、水分保持量が FLG KO ラットで優管支肺胞洗浄液中の総細胞数は、野生型ラットに比べて位に減弱していることを見出した。FLG KO ラットと野生FLG KO ラットで優位に上昇していた。さらに細胞分画を型ラットを用いてアトピー性皮膚炎モデルを構築した。続

比較したところ、好酸球が FLG KO ラットで優位に上昇

いてアトピー性皮膚炎モデルを誘導したラットを用いて、していることを見出した（図 2 A，B）。

喘息モデルの評価を行った。気管支肺胞洗浄液中の総細胞

4. 考

数は、野生型ラットに比べて FLG KO ラットで優位に上察昇していた。さらに細胞分画を比較したところ、好酸球が今回、我々は FLG KO ラットの作成に成功した。フィラ

FLG KO ラットで優位に上昇していることを見出した。以

グリン遺伝子欠損（FLG KO）ラットを作成にあたり、Zink

上より、FLG KO ラットでは、アトピー性皮膚炎誘導に伴

finger protein を用いた。ラットフィラグリン遺伝子の第い、喘息の増悪がみられることが明らかとなった。
ヒトの体全体を覆う皮膚は、面積が 1.6m2、重量は体重2 エキソンを、従来の ZFN 試薬を用いて標的化した。確図2− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018の 16% を占める人体最大の臓器である。皮膚は外界とのり、今後のコスメトロジーに大きな影響を与えるものと考接触がある臓器であるため生命を維持するための様々な機える。
我々は、本研究にて FLG KO ラットの作成に成功した。

能を有している。主な機能として、水分の喪失や透過を防ぐ、体温を調整する、微生物や物理化学的な刺激から生

我々はこれまで、FLG の発現をコントロールする化合物

体を守る、感覚器としての役割を果たす、などがある。皮の同定に成功し報告した 1）。具体的には、培養表皮細胞を

膚は外層から表皮、真皮、皮下組織の３層の構造を有する。

用いて約 1,200 種類の市販の化合物ライブラリーからフィ

表皮は角化細胞で構成され、外層から角層、顆粒層、有棘

ラグリンの発現を亢進する化合物のスクリーニングを行っ

層、基底層の４つに分類される。基底層にある基底細胞はた。この結果、JTC801 という化合物が培養表皮細胞のフ皮膚外層に向かい分裂しそれぞれの層を構成することとなィラグリン（プロフィラグリン）の発現を亢進させた。まる。最終的に核が脱落し角層になるまで約 45 日のターン

た、JTC801 は、ヒトの皮膚に近い構造を持つ 3 次元表皮

オーバー時間がかかるといわれている。

培養においても、フィラグリンの発現を亢進させた。ヒト

皮膚の最外層である角層では、細胞は脱核し死んだ角化

アトピー性皮膚炎患者ではフィラグリン遺伝子のヘテロ変細胞は落ち葉を敷き詰めたように重層化する。約 10 層か

異がほとんどである。そこでフィラグリン遺伝子にヘテらなる角層は表面から順に垢としてはがれ落ちる。フィラ

ロ変異を有するマウスに JTC801 を投与させたところ、フグリンはその角層の主要な構成成分の一つである。その働ィラグリンの発現が亢進した。また、JTC801 を投与した

きは強度や柔軟性、水分保持、皮膚の PH、生体内化合物

マウスでは経皮水分喪失量の低下が見られた。さらに、アへのバッファー作用など多岐にわたる。フィラグリン遺伝

トピー性皮膚炎モデルである NC/Nga マウスを用いた実子は角化細胞の他の最終分化に関連するタンパクと同様に

験では、JTC801 を内服させたマウス群でフィラグリンタ

クロモソーム 1q21 に存在する。フィラグリンはプロフィ

ンパクの発現が亢進し、アトピー性皮膚炎様の症状が改善

ラグリンとしてまず産生される。プロフィラグリンは分子された。以上より、皮膚でのフィラグリンの発現を上昇さ

量約 400KDa、10 ‒ 12 のフィラグリンリピート構造を有す

せ、バリア機能を亢進させることにより、アトピー性皮膚る。角化細胞の最終分化に伴いプロフィラグリンは脱リ炎の発症を抑制させる可能性があることが示唆された。しン酸化し、様々なプロテアーゼの作用により 37KDa のフ

かしながら、JTC801 を用いたヒトを対象とした臨床治験ィラグリンへと分解される。この脱リン酸化とプロテアを行うには安全性試験など多くの課題が残されている。まーゼによる分解はカルシウム濃度、セリンプロテアーゼ

た、マウスの皮膚はヒトとは違い、表皮が薄いことが知ら

CAP1/Prss8、そしてプロテアーゼ阻害剤（LEKTI）によっれている。そのため、新規化合物や薬剤のヒトでの有効性て制御されていることが報告されている 13 ‒16）。モノマーにが検討可能なモデル動物の開発が必要である。本研究で開なったフィラグリンはケラチンフィラメント同士を凝集さ発した、FLG KO ラットは、ヒトの皮膚に近いラットにてせる線維間凝集物質として働く。この間フィラグリンは角アトピー性皮膚炎のモデル動物を作成できたことに大きな層での強度や柔軟性に大きく貢献する。フィラグリンがな

意義がある。
今回、我々は世界初の FLG KO ラットの作成に成功した。

い状態では角層細胞ははがれやすく、経皮的な内と外との浸透性が上昇する。このことからフィラグリンがない状態

また、この KO ラットを用いたアトピー性皮膚炎モデルででは経皮水分喪失量（transepidermal water loss, TEWL）

は、喘息が増悪することが明らかとなった。今後、このモが上昇する 。角層の外層部ではフィラグリンは更に分解し、デル動物を用いてアレルギーマーチの解明のみならず、新アミノ酸、ウロカニン酸などの天然保湿因子（NMF）にな

規薬剤の検討が可能となるだろう。

17）る（図 1）。NMF は角層における水分保持量を担保し、PHを維持しバッファー効果を有する。このことで表皮細胞の（引用文献）

正常分化を促し、病原性細菌の集落形成を減少させる 18）。

1） Otsuka, A., et al. Possible new therapeutic strategy

本研究は、我々の研究室で作成した世界初の FLG KO

to regulate atopic dermatitis through upregulating

ラットを用いてアレルギーマーチメカニズムの解明を目指

filaggrin expression. J. Allergy Clin. Immunol. 1 3 3,
139-146 e131-110（2014）．

した。今後喘息モデルのみならず他のアレルギーモデルを適応することでアレルギー疾患に広くアプローチができる

2） Akei, H.S., et al. Epicutaneous aeroallergen exposure

ものと考える。アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギ

induces systemic TH2 immunity that predisposes toー疾患は今後更に増加することが予想される。現在解析しallergic nasal responses. J. Allergy Clin. Immunol. 118,ているフィラグリン遺伝子異常から始まるバリア機能の破62-69（2006）．

綻とアレルギーマーチの誘導メカニズムは、皮膚の健康が

3） Spergel, J.M., et al. Epicutaneous sensitization withアレルギーの予防という新しいコンセプトを提供可能であprotein antigen induces localized allergic dermatitis− 66 −

フィラグリン遺伝子欠損ラットを用いたアレルギーマーチの解明

using zinc-finger nucleases. PLoS One 5, e8870（2010）．

and hyperresponsiveness to methacholine after single
exposure to aerosolized antigen in mice. J. Clin. Invest.

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X-linked severe combined immunodeficiency（X-SCID）− 67 −

dermatitis. J. Invest. Dermatol. 126, 1200-1202（2006）．

メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析
筑波大学医学医療系生理化学

大林典彦

Rab 32 and Rab 38 (Rab 32 /Rab 38 ) have been proposed as regulating the trafficking of melanogenic enzymes, including
tyrosinase and tyrosinase-related protein 1 (Tyrp 1 ), to melanosomes in melanocytes. Rab 32 /Rab 38 are known to function
as switch molecules that cycle between a GDP-bound inactive form and a GTP-bound active form; the cycle is thought tobe regulated by an activating enzyme, guanine nucleotide exchange factor (GEF), and an inactivating enzyme, GTPaseactivating protein (GAP), which stimulates the GTPase activity of Rab 32 /Rab 38 . Although BLOC- 3 has already been
identified as a Rab 32 /Rab 38 -specific GEF that regulates the trafficking of tyrosinase and Tyrp 1 , physiological GAP for
Rab 32 /Rab 38 in melanocytes has never been identified, and it has remained unclear whether Rab 32 /Rab 38 are involvedin the trafficking of dopachrome tautomerase (Dct), another melanogenic enzyme, in melanocytes. In this study, weinvestigated RUTBC 1 , which was originally characterized as a Rab 9 -binding protein and GAP for Rab 32 and Rab 33 B in
vitro, and the results demonstrated that RUTBC 1 functions as a physiological GAP for Rab 32 /Rab 38 in the trafficking of
all three melanogenic enzymes in melanocytes. The results of this study also demonstrated the involvement of Rab 9 A in theregulation of the RUTBC 1 localization and in the trafficking of all three melanogenic enzymes. We discovered that either
excess activation or inactivation of Rab 32 /Rab 38 achieved by manipulating RUTBC 1 inhibits the trafficking of all threemelanogenic enzymes. These results collectively indicate that proper spatiotemporal regulation of Rab 32 /Rab 38 is essential
for the normal trafficking of all three melanogenic enzymes in melanocytes.

1. 緒

方で、色素細胞において実際に Rab32/Rab38 を不活性化

言する GAP（GTPase-activating factor）については謎に包メラニン合成酵素は色素細胞において生合成された後、まれており、Rab32/Rab38 の調節機構については十分に

トランスゴルジ網からエンドソームを経てメラノソームは理解されていなかった。そこで、本研究では in vitro でに輸送される。そして、輸送されたメラニン合成酵素のRab32 と Rab33B（Rab38 とは異なるアイソフォーム）に働きによりメラノソームでメラニンが産生・貯留される。

対して GAP 活性を有することが報告された Run and TBC

このメラニン合成酵素の輸送過程に異常をきたす疾患のdomain-containing 1 分子（RUTBC1、SGSM2 としても知1 つとして、白皮症を呈するヘルマンスキー・パドラッ

られる）に着目し 4）、色素細胞における RUTBC1 の機能をク症候群（HPS）が知られている。HPS 様の病態を呈する

解析し、メラニン合成酵素輸送における Rab32/Rab38 のモデル動物はいくつかが報告されているが、その中でも、制御機構を精緻に理解することを目的とした。

chocolate マウスや ruby ラットは Rab38 が責任遺伝子である 1）。Rab は低分子量 G タンパク質の 1 つで、GTP 結合型の活性化体と GDP 結合型の不活性化体をサイクルするこ

2. 方

法

2. 1. 試薬類とで、その機能を発揮する。Rab38 は一次構造が類似し

Rab32、Rab38、チロシナーゼ、Tyrp1、Dct に対する抗た Rab32 と冗長的にメラニン合成酵素のメラノソームへ体は、精製した各タンパク質あるいはペプチドをウサギの輸送を調節している 2）。近年、HPS の原因因子の 1 つでに免疫することにより得た。活性化型 Rab32 / Rab38 に特ある biogenesis of lysosome-related organelles complex-3

異的に結合する VPS9-ankyrin repeat protein（Varp）の（BLOC-3）と呼ばれる HPS1 と HPS4 分子から構成される単離は既に行っており、これを用いた 5）。ヒト RUTBC1

複合体が、Rab32 および Rab38（以下、Rab32/Rab38）のcDNA は、かずさ DNA 研究所（千葉、日本）より得た。マGEF（Guanine nucleotide exchange factor）として機能し、

ウス RUTBC1 に対する２種類の siRNA は、ニッポンジー

3）

Rab32/Rab38 を活性化することが報告されている 。一Functional analysis of a GAP for Rab 32 /Rab 38 that regulate melanogenic enzymes
trafficking in melanocytes
Norihiko Ohbayashi
Department of Physiological Chemistry,
Faculty of Medicine, University ofTsukuba

ン（富山、日本）より得た。

2. 2. 細胞蛍光免疫染色
マウス由来の色素細胞株 melan-a 細胞は、Dorothy C.
Bennett 教授から提供された。各種発現ベクターや siRNAは、Lipofectamine 2000（Invitrogen） を 用 い て melan-a細胞に導入した。染色された細胞を共焦点蛍光顕微鏡（FluoView 1000-D、オリンパス、東京、日本）により観察− 68 −

メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析した。共焦点顕微鏡で無作為に 20 細胞ずつ蛍光シグナル

在性 Rab32 / Rab38 の活性化レベルを評価した。

を取得し、MetaMorph ソフトウェア（Molecular Devices、

3. 結

Sunnyvale、CA）
で定量した。 ダネット検定またはスチューデント t 検定を用いて統計解析を行い、p 値 <0.05 を統果

3. 1. RUTBC1 はメラニン合成酵素の輸送に関わる

計学的に有意とみなした。

RUTBC1 の機能を解析するため、RUTBC1 を色素細胞に過剰発現させたところ、チロシナーゼ、Tyrp1、Dct すべて

2. 3. 共免疫沈降とプルダウンアッセイのメラニン合成酵素のメラノソームへの輸送が阻害され、それ

Lipofectamine-LTX Plus（Invitrogen） を 用 い て T7-

らの色素細胞における発現が大幅に低下した（図 2）。Rab32

GST-Varp または T7-GST 発現プラスミドを COS-7 細胞にとRab38 がともに不活性化したときに、これらメラニン合成導入した。可溶化バッファー（50mM HEPES-KOH pH7.2、酵素の輸送が阻害されることから 2）、RUTBC1 が色素細胞150mM NaCl、1mM MgCl2、1 ％ Triton X-100、 プ ロ テ

内で Rab32/Rab38 に対するGAPとして機能する可能性が示

アーゼ阻害剤（Roche））を用いて細胞を溶解し、細胞溶解

唆された。

物をグルタチオンセファロースビーズと共に 4 ℃で 2 時間
インキュベートした。ビーズを洗浄バッファー（50mM
HEPES-KOH pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.2 ％Triton X-100）
で 3 回洗浄し、
Varp ビーズを調製した。次に、
T7-RUTBC1 野生型（WT）/ R803A および FLAG-Rab32 /Rab38 を共発現した COS-7 細胞抽出物と Varp ビーズを反応させ、FLAG-Rab32 / Rab38 の活性化レベルを定量した。
T7-Varp 発現プラスミドをトランスフェクションした
COS-7 細胞抽出物を可溶化バッファーで溶解し、抗 T7 タ
グ抗体結合アガロースビーズと 4 ℃で 2 時間反応させた。
ビーズを洗浄バッファーで 3 回洗浄し、次いで RUTBC1
ノックダウン melan-a 細胞の可溶化物と共に 4 ℃で 2 時間
インキュベートした。そして、ビーズに結合した内在性
Rab32 / Rab38 タンパク質をイムノブロットで定量し、内図 １ 本 研 究 で 用 い た ヒ ト RUTBC1 お よ び そ の 変 異 体（RUTBC1-N、RUTBC1-C、および R803A 変異体）の模式図。
RUTBC1 は、Rab9 結合活性を有する N 末端 RUN ドメイン
（薄灰色のボックス）および、in vitro で Rab32 および Rab33Bに対して GAP 活性を示す C 末端 TBC ドメイン（暗灰色のボックス）
を有している。

図２ 色素細胞におけるメラニン合成酵素のメラノ
ソーム局在に対するRUTBC1 の過剰発現の影響。
上図は、
T7-RUTBC1、T7-RUTBC1（R803A）、
そしてコントロールとして T7-GFPを発現する色素細胞の画像を示す。Melan-a 細胞に T7 タグを付加した各タンパク質発現プラスミドをトラン
スフェクションし、チロシナーゼ、Tyrp1、Dctに対する抗体で染色した。 T7 タグタンパク質を発現する細胞は、破線で示されている。スケー
ルバー：20 µm。
下図は、上図で示されたチロシナーゼ / Tyrp1/ Dctシグナルを定量化したグラフである。バーは 20 細胞におけるシグナルの平均値を示している。

− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

3. 2. RUTBC1のTBCドメインはメラニン合成酵素の輸送に関わるが、TBCドメイン以外もメラニン合成酵

いて活性化型 Rab32/Rab38 をプルダウンした。その結果、
RUTBC1（R803A）変異体は Rab32/Rab38 を不活性化で素の輸送に必要である

きないのに対し、RUTBC1 分子は顕著に Rab32/Rab38 をメラニン合成酵素の輸送阻害が RUTBC1 における TBC

不活性化することを明らかにした（図４）。

ドメインの GAP 活性によるものかどうかを確認するため

一方、色素細胞から RUTBC1 をノックダウンし、そのに、N 末端側の RUN ドメインを欠いた RUTBC1-C および細胞可溶化液を用いて同様にして活性化型 Rab32 / Rab38

TBC ドメインの活性中心に点変異を導入した RUTBC1-Cを定量したところ、細胞内の Rab32 / Rab38 の発現量自体（R803A）を作製した（図 1）。RUTBC1-C の発現により、チは変化が認められないものの、活性化型 Rab32/Rab38 のロシナーゼ、Tyrp1、Dct すべてのメラニン合成酵素のメ

量がコントロールに比べて顕著に増加することを見出した

ラノソームへの輸送を阻害されたが、RUTBC1-C（R803A）（図５）。さらに細胞免疫染色により、RUTBC1 ノックダの発現ではほとんど影響が認められなかった（図 3）。これウン色素細胞では、メラノソーム上の Rab32/Rab38 シグ

らの結果から、RUTBC1-C によるメラニン合成酵素の阻ナルがより増強する結果を得た（図５）。これは RUTBC1

害は、RUTBC1 の基質となる Rab の強制的な不活性化に

ノックダウン色素細胞において Rab32/Rab38 が過剰に活よる可能性が高いと考えられた。しかしながら、予期せぬ性化され、メラノソーム膜に持続的に局在することを示唆ことに、全長の RUTBC1（R803A）変異体を過剰発現させしている。

ても、すべてのメラニン合成酵素のメラノソームへの輸送

3. 4. Rab32 とRab38 の過剰な活性化は、メラニン合成酵素の輸送を阻害するの阻害が観察されたことから（図 2）、TBC ドメインによるGAP 活性に依存しない、すなわち RUTBC1 の N 末端側のRab32/Rab38 はメラニン合成酵素輸送を促進すること作用によって仲介される何らかの分子メカニズムの存在がが知られており 2）、RUTBC1 ノックダウン色素細胞にお想定された。

いて Rab32/Rab38 が活性化したことから、RUTBC1 ノッ

3. 3. RUTBC1はRab32 とRab38 に対してGAP活性を有する

クダウン色素細胞ではメラニン合成酵素輸送が促進される

RUTBC1 による Rab の不活性化機構を明らかにするた色素細胞を用いてメラニン合成酵素の細胞内局在や発現量

め、Rab32/Rab38 を RUTBC1 あるいは RUTBC1（R803A）を評価したところ、メラニン合成酵素輸送が顕著に抑制さ変異体と共発現させ、その細胞抽出液より Varp 分子を用れるという全く相反する結果を得るに至った（図６）。

ものと予想した。しかしながら、RUTBC1 ノックダウン

図2− 70 −

図 3 RUTBC1 の C 末 端 TBC ド
メインの GAP 活性は、色素細胞におけるチロシナーゼ / Tyrp1 /Dct 輸送に関与する。
T7-GFP、T7-RUTBC1-C、 ま
た は T7-RUTBC1-C（R803A）を発現する色素細胞の画像を示す。Melan-a 細 胞 に T7 タ グ を付加した各タンパク質発現プラ
スミドをトランスフェクション
し、チロシナーゼ、Tyrp1、Dctに 対 す る 抗 体 で 染 色 し た。T7
タグタンパク質を発現する細胞は、破線で示されている。下図は、上図で示されたチロシナーゼ /Tyrp1 / Dct シグナルを定量化したグラフである。バーは、20 細胞シグナルの平均値を示している。

メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析

図 4 RUTBC1 は、細 胞 内 で Rab32 お よ び
Rab38 の両方を不活性化する。
T7-GFP、T7-RUTBC1 または T7-RUTBC1（R803A） と と も に FLAG-Rab32 あ る い は
FLAG-Rab38 を発現する COS-7 細胞を可溶化
し、Rab32/Rab38 エフェクターである Varpを結合したグルタチオンセファロースビーズ
を用いて活性化型 Rab32 および Rab38 をプ
ルダウンした。

図 5 RUTBC1 ノックダウンは、
Rab32 / Rab38 のメラノソーム発現を増加させる。
抗 Rab32 抗体（左上図）または
抗 Rab38 抗体（右上図）で染色され た RUTBC1 ノ ッ ク ダ ウ ン 色
素細胞の典型的な画像およびそれらに対応する明視野画像を示す。挿入図は、ボックス領域の拡大図を示す。メラノソームにおける Rab32 / Rab38 陽性シグ
ナルは、コントロール siRNA 処
理色素細胞においてメラノソー
ム（Mel、擬似赤色）と共局在しており、そのシグナルは RUTBC1
ノックダウン色素細胞において明らかに増加した。
（下図）T7GFP または T7-Varp と結合した
抗 T7 タグ抗体結合アガロースビ
ーズを、RUTBC1 ノックダウン
色素細胞の可溶化液とともにインキュベートした。免疫沈降した T7-GFP または T7-Varp および共免疫沈降した内在性 Rab32 /Rab38 が、示された抗体によるウェスタンブロットにより検出された。

− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

3. 5. Rab9Aはメラニン合成酵素の輸送に関与するはしばしばメラノソームにおいて共局在した（図 7）。単独

GAP 活性を欠損した全長 RUTBC1（R803A）変異体のの発現では RUTBC1 の大部分は細胞質全体に散らばった過剰発現の結果として、メラニン合成酵素の輸送が阻害ことから（図 7）、RUTBC1 のメラノソームにおける局在は、された分子基盤の解明を試みた。C 末端側の RUTBC1-C

Rab9A によって仲介されると考えられた。興味深いこと（R803A）変異体は阻害活性を示さなかったことから、に、Rab9A と RUTBC1 を共発現した色素細胞では、メラ

RUN ドメインを含む RUTBC1 の N 末端側領域が、メラニ

ニン合成酵素輸送が顕著に阻害されるのに対し、Rab9A

ン合成酵素の輸送に付加的な機能を果たしている可能性がと RUTBC1（R803A）変異体を共発現した色素細胞では、考えられた。興味深いことに、RUTBC1 は Rab9 エフェク

メラニン合成酵素の輸送に異常は認められなかった（図 7）。

ターとして同定されており （図 1）、RUTBC1 の N 末端

最後に、BLOC-3 のサブユニットである HPS4 もまた側領域は Rab9 結合に重要な役割を果たすことが報告されRab9 のエフェクター分子であることから 6）、Rab9A とている。色素細胞では、Rab9A アイソフォームのみを発RUTBC1 との機能関係を解析するため、HPS4 に焦点を現し、Rab9B アイソフォームを発現しないことから（デー当てて解析を行った。これまでの報告に一致するように、

タ未掲載）、RUTBC1 と共に Rab9A を色素細胞に発現さ

HPS4 と Rab9A の結合、および、RUTBC1 と Rab9A の結せた。その結果、Rab9A および RUTBC1（WT / R803A）

合を確認した（図８）。次いで、競合実験を行うことにより、

4）

図 6 色素細胞における RUTBC1 のノックダウン
は、3 つのメラニン合成酵素すべての発現を減少させる。
RUTBC1 ノックダウンは、Rab32 / Rab38 の発現を変化させることなく、色素細胞における3 つのメラニン合成酵素（チロシナーゼ、Tyrp1、Dct）全ての発現を強く抑制した。右図は 3 つのメラニン合成酵素それぞれに対する抗体を用いて染色された RUTBC1 ノックダウン色素細胞の画像を示す。破線は細胞膜を示す。

図 7 Rab9A はチロシナーゼのメラノソームへの適切な輸送に関与している。
T7-RUTBC1 ま た は T7-RUTBC1（R803A）と FLAG-Rab9A を共発現す
る色素細胞の画像を示す。抗 T7 抗体、
抗 FLAG 抗体、抗チロシナーゼ抗体を用いて細胞を染色し、対応する明視野（BF）画像を示す。赤色あるいは白色の
破 線 は、T7-RUTBC1（WT / R803A）
ま た は FLAG-Rab9A を 発 現 す る 細 胞を示す。挿入図は、ボックス領域の拡 大 図 を 示 す。T7-RUTBC1 + FLAGRab9A を発現する色素細胞ではチロ
シナーゼシグナルが減少したが、T7RUTBC1（R803A）+ FLAG-Rab9A を発現する色素細胞では減少しなかったことに留意されたい。

− 72 −

メラニン合成酵素を輸送する Rab32 および Rab38 の不活性化因子 GAP の色素細胞における機能解析

次に、RUTBC1 の過剰発現およびノックダウンによりメラニン合成酵素の輸送が阻害されたことから、メラニン
合成酵素輸送には Rab32/Rab38 の適切な活性化・不活性化のサイクル（すなわち GTP-GDP サイクル）が必要であると考えられた。
予期しなかった別の発見として、全長 RUTBC1 の GAP
活性変異体である RUTBC1（R803A）の過剰発現もまた、野生型 RUTBC1 の過剰発現と同じく、メラニン合成酵素
すべての輸送異常を引き起こしたことがあげられる。C 末
端の RUTBC1-C（R803A）変異体は全く効果がなかったことから、RUTBC1 の N 末端領域の重要性が示唆された。
RUTBC1 の N 末 端 領 域 は、Rab9 と 相 互 作 用 す る た
め、RUTBC1（R803A）変異体による阻害効果は、色素細胞における内在性 Rab9A を捕捉することにより、内在性
図8

RUTBC1 は HPS4 と競合して Rab9Aと結合する。
HA-HPS4 またはT7-RUTBC1 と共にFLAG-Rab9Aを発現した COS-7 細胞溶解液を、抗 FLAG タグ抗体結合アガロースビーズで免疫沈降させ、FLAG ビーズに結合したタンパク質を示された抗体を用いてイムノブロットした結果を示す。

Rab9A と内在性 RUTBC1 の相互作用を抑制した可能性が考えられる。RUTBC1（R803A）変異体を Rab9A と共に過剰発現した際には、メラニン合成酵素の輸送阻害は認められなかったという結果は、この可能性を裏づけていると考えられる。さらに本研究では、RUTBC1 が Rab9Aと BLOC-3 のサブユニットである HPS4 との相互作用を阻

RUTBC1 が HPS4 と Rab9A 間の結合を阻害することを見害することを示した。したがって、RUTBC1 過剰発現は、出した（図８）。これらの結果は、RUTBC1 が少なくともRab32/Rab38 の GAP 活性を促進することによる直接的な2 つの作用、すなわち① TBC ドメインを介する Rab32/

阻害、さらに、Rab9A と BLOC-3 の相互作用を阻害するこRab38 の 直 接 的 な 不 活 性 化 能、 ② Rab9A と BLOC-3 かとにより Rab32/Rab38 の活性化を間接的に阻害する、とら構成される複合体形成を阻害することによる間接的ないうモデルを提唱するに至った 7）。

Rab32/Rab38 の不活性化能を有していることを示してい

5. 総

る。

4. 考

括

本研究では、Rab9 結合タンパク質である RUTBC1 が察

Rab32/Rab38 を不活性化することにより色素細胞におけ

RUTBC1 は Rab32 および Rab33B に対して GAP 活性をる 3 つのメラニン合成酵素の輸送を抑制すること、また、有すること、そして in vitro では Rab38 に対して約 10 倍

RUTBC1 ノックダウンにより、メラニン合成酵素の輸送低い GAP 活性を有することが報告されていたが、その生が抑制されることを明らかにした。これらの発見により、理機能については不明であった。本研究では、RUTBC1

メラノソームへのメラニン合成酵素の輸送が正常に行われがメラニン合成酵素のメラノソームへの輸送に重要なるためには、Rab32/Rab38 の適切な GTP-GDP サイクルがRab32/Rab38 の生理学的な GAP であることを裏づけるい必要であることが示唆された。

くつかの研究成果を得ることができた。まず、RUTBC1-C

Rab32/Rab38 の活性化レベルを制御することは、メラ末端の TBC ドメインを色素細胞に発現させるとメラニ

ノソームの成熟（暗色化）の制御につながるため、Rab32/

ン合成酵素の輸送が阻害されるのに対し、その変異体

Rab38 の活性化制御は重要な創薬のターゲットと考える

RUTBC-1（R803A）を発現させても何ら影響が認められことができる。しかし、低分子量 G タンパク質には化合物なかった。第二に、RUTBC1 ノックダウン色素細胞では、が相互作用できるポケットが極めて少なく、低分子量 G タ

メラノソーム上の Rab32/Rab38 シグナルの増強が観察さ

ンパク質自身をターゲットとした新薬の開発は非常に困難れた。第三に、生化学的手法により RUTBC1 が活性化型であると考えられている。本研究成果をふまえ、Rab32/

Rab32 および活性化型 Rab38 の量を劇的に減少させ、一Rab38 と RUTBC1 の相互作用を阻害するような化合物の方で RUTBC1 ノックダウン色素細胞では活性化型 Rab32

開発は、メラニン合成酵素のメラノソームへの輸送を調節

および活性化型 Rab38 量の増加が観察された。これらのできる可能性が考えられる。本アプローチは、アルブチン

知見から、RUTBC1 が色素細胞における Rab32/Rab38 のをはじめとするメラニン合成酵素自身の活性化制御をター

機能的な GAP であると結論づけた。

ゲットとする既存のアプローチとは異なっている点に特色− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018があり、メラニン産生を多面的な角度から制御することは、

Raposo G, Seabra MC:  Rab38 and Rab32 control post-

今後のコスメトロジー研究の発展に不可欠であると考えら

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Biol. Cell, 20, 2900 ‒2908, 2009.

1427‒1440, 2016.

4） Wasmeier C, Romao M, Plowright L, Bennett DC,− 74 −

創薬のための毛嚢を有する in vitro 人工皮膚モデルの開発
岡山理科大学理学部臨床生命科学科

片岡健

The skin has a complex tissue architecture composed of a large variety of cell types of ectodermal and mesodermal
origins. Most of these cells are produced from corresponding progenitor/stem cells by tightly regulated mechanisms. In
our previous studies, we have demonstrated the utility of in vivo skin reconstitution assay. The characteristics of this assay
system we used are that the cells in a mixed suspension segregate from each other and actively form tissue architecture
through cell-cell and cell-environment interactions.
However, few studies have succeeded in generating a three-dimensional ( 3 D) tissue-like structure. During
embryogenesis, the cells accumulate and form complicated organ structure. Cellular interactions of epithelial, mesenchymal
and endothelial progenitors are very important steps of this early organogenesis.
In this study, we have generated a 3 D tissue-like structure in vitro using mouse skin epidermal and dermal cells mixed
with human umbilical vein endothelial cells and mesenchymal stem cells. These cells formed a 3 D spheroid within 72 hours
after inoculation on a Matrigel-coated dish. Epidermal keratinocytes were mainly located at the surface of the spheroids
and endothelial cells were positioned inside of the spheroids. Mixed cell spheroids formed hair follicles 3 weeks after
subcutaneous transplantation into the back skin of nude mice.

1. 緒ている浅い損傷であれば、バルジから供給される表皮幹細言胞や周囲の細胞の進展によって速やかに治癒に至る。しか皮膚は身体の表面を覆う最大の組織であり、微生物や抗し、皮下組織の脂肪組織や筋層まで損傷が達し付属器が残原などによる身体への侵入を防ぐための被覆・防御機能が存していない時、周囲の細胞による完全な治癒には非常に発達した組織の 1 つでもある。皮膚の構造は表面より表皮長い時間がかかる。その場合、患者の皮膚を採取して移植層、真皮層、脂肪や筋層などの皮下組織に分類される。さする自家植皮法が行われる。さらに広範囲な損傷においてらに付属器と呼ばれる毛嚢、汗腺、皮脂腺などを有するこは自家植皮に使用できる皮膚が不足するため、代わりに同とにより、体温調節や乾燥予防、排泄などの複合機能を発種・異種の培養皮膚シートを利用した治療が現在行われて揮する。これらの機能を維持するために、表皮に存在するいる 5）。この皮膚シートは表皮ケラチノサイトと真皮線維幹細胞が絶えず体細胞分裂を繰り返している。この幹細胞芽細胞により構成され、皮膚の被覆・防御機能は有していはバルジと呼ばれる皮脂腺の根元部分に存在し、上下方向る。しかし、毛嚢、汗腺、皮脂腺などの付属器を欠損してに分化することで皮膚表面と付属器の両方へ表皮細胞を供いる。このように創傷治癒した皮膚が付属器を欠損してい給していることが知られている。このバルジには毛嚢の幹ることは、皮膚の美容や体温調節など生理的に大きな問題

細胞と色素幹細胞も存在していることより、皮膚は幹細胞であり、付属器を有する正常により近い皮膚の供給が望ま

1）に富んだ組織でもある 。また容易に採取することもできれている。

るため、皮膚は組織細胞を用いた治療が最も進んだ組織でこれまでの研究において我々は、移植したマウスの表皮もある。初めてヒト表皮細胞の培養に成功したのは 1970細胞と真皮細胞に由来するほぼ完全な皮膚組織が形成され年代である 2, 3）。その後、重症熱傷患者から採取した表皮る in vivo 皮膚付属器形成モデルを開発した 6）。これは胎細胞を培養して表皮細胞シートを作製し、その患者へ移生 16 日目 ICR マウスより単細胞として回収した表皮細胞植したことが 1981 年に報告されている 。これが組織工と真皮細胞を 1.0 × 107 cells ずつヌードマウスの背側部に学の手法を用いた再生医療による世界初の治療症例であっシリコンチャンバーを用いて移植する方法である。この方た。通常、真皮に到達していない、または付属器が残存し法により移植 3 週間後には、ICR マウスに由来する毛嚢や4）

皮脂腺などの付属器を有したほぼ完全な皮膚組織が形成されていた。一方で、このような付属器を有する皮膚組織を
in vitro で作製することは非常に困難である。
In Vitro Artificial Skin Model with
Appendages for Drug Discovery
Ken Kataoka
Department of Life Sciences, Okayama
University of Science

近年、武部らは、iPS 細胞に由来する肝臓細胞を血管内皮細胞と間葉系幹細胞と共に培養しマウスへ移植すると、機能を有する肝臓組織を形成する肝臓の組織原基の作製に成功した 7）。これは複数種の細胞が 3 次元構造を形成しな− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

がら分化できる環境を保証することで、発生初期のプロセに混ぜ合わせた。

スを培養環境内で再現し組織を形成させる方法である。この方法を皮膚の組織原基へ応用した。また Chih-Chiang ら

2. 3. 免疫染色

は付属器の再生過程においてマクロファージが重要な役割
8）を果たすと報告した 。

混合培養 72 時間後の細胞塊を OCT コンパウンドで包埋し、液体窒素を用いて凍結ブロックを作製した。薄切以上より、我々は武部らの方法を参考に in vitro におけはクリオスタットを用いて 7 µm の厚さに調整し、蛍光免る組織原基形成実験を行い、混合培養に使用した各細胞の疫染色に用いた。一次抗体には抗体 Pan-Cytokeratin 抗局在を調べた。並びにマクロファージを加えて作製した組体（Sigma）、CD31 抗体（DAKO）を用い、二次抗体には抗織原基をマウスへ移植する皮膚組織形成実験を行い、付属

Anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 抗体と Anti-mouse IgG器を有する正常により近い皮膚組織の形成を目指し検討しAlexa Fluor 594 抗体を用いた。

た。

2. 方

2. 4. 細胞のラベリングとその観察法

混合培養に使用する細胞をあらかじめ蛍光色素でそれぞ2. 1. 細胞の調製れラベリングした。このラベリングには molecular probes

妊娠 16 日目 ICR マウス（日本クレア）胎仔より採取したキット（Life technologies）を利用した。混合培養に使用す

背部皮膚を、ディスパーゼ II 溶液に浸して４℃で 24 時間

る細胞をあらかじめ PKH67（真皮細胞）、PKH26（hMSC）、

処理し表皮層と真皮層に分離した後、トリプシン・EDTA

CLARET（HUVEC）でラベリングし混合培養した後、凍溶液処理（15 分）により単細胞とした。ヒト血管内皮細結ブロックを作製しクリオスタットを用いて 7 µm に薄切胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC）、

し蛍光観察した。

ヒ ト 間 葉 系 幹 細 胞（Human Mesenchymal Stem Cells：

3. 結hMSC）の初代培養細胞（クラボウ）を推奨されている培地を用いて培養し、3 次元培養用に調製した。マクロファー

果3. 1. in vitro 組織原基の形成

ジは ICR マウス（8 週齢メス、日本クレア）の腹腔へ 3.84 g/

我々が武部らの手法を参考にマウス胎児由来の表皮細胞、dL に調整したチオグリコレート培地 2 mL を投与し、72真皮細胞を hMSC、HUVEC と混合してマトリゲル上で培時間後に腹腔より回収した。

養したところ、散在していた細胞は徐々にまとまり始めた。
培養 24 時間後には播種した細胞はほぼまとまり、72 時間

2. 2. in vitro 組織原基形成実験

後には１つの球状な細胞塊を形成していた（図 1）。

あらかじめマトリゲルでコーティングした 24well プレー
トに表皮細胞、真皮細胞、HUVEC、hMSC を 2：2：3：1

3. 2. 形成された組織原基の免疫染色6の割合で総数 2.0 × 10 cells/well となるように播種し、表3 次元混合培養により形成された細胞塊において、構皮細胞用培地と血管内皮細胞用培地を等量混ぜ合わせた培成細胞であるマウス表皮細胞、マウス真皮細胞、HUVEC、地を用いて 3 次元混合培養を行った。マウスへ移植する実hMSC の配置を明らかにするために蛍光免疫染色を行った。

5

験にのみマクロファージを 2.5 × 10 cells/well となるよう細胞塊の蛍光免疫染色では細胞塊の表層にケラチン陽性の

図 1 形成された皮膚組織原基（培養 3 日目）− 76 −

A. 位相差顕微鏡像、B. H&E 染色像

創薬のための毛嚢を有する in vitro 人工皮膚モデルの開発

表皮細胞が局在しており、内部には CD31 陽性の血管内皮

3. 4. 組織原基の移植による組織形成実験細胞が存在していた（図 2）。

さらにこの細胞塊をヌードマウス皮下に移植したところ、数は少ないが移植部分に毛嚢形成が観察された（図 3）。さ3. 3. ラベリングした細胞の追跡

らにマクロファージを加えて作製した細胞塊をヌードマウ

播種する細胞をラベリングした後に 3 次元培養を行い、スの背側部へ皮下移植し、その 3 週間後に組織形成能を評

組織原基を形成した。形成された組織原基（細胞塊）を蛍光価するために移植部位の皮膚を採取して HE 染色を行った。

観察したところ、真皮細胞と HUVEC が共局在し、hMSC

興味深いことに、マクロファージが細胞塊中に存在していは細胞塊中に散在していた。

た方が移植細胞の定着率がよかった。これらの実験結果か

図 2 形成された皮膚組織原基の免疫染色像

緑：Pan-cytokeratin、赤：CD31

図3 皮膚組織原基移植3週後のヌードマウス皮膚組織（翻転して真皮側より観察している）
矢頭：形成された羽毛芽原基− 77 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

らこの細胞塊は培養内で作成された人工的な皮膚付属器原（引用文献）
1） Nishimura E. K. et al: Mechanisms of hair graying:

基と考えられた。

incomplete melanocyte stem cell maintenance in the

4. 考察とまとめ

niche. Science 307: 720-724, 2005

in vitro 組織原基形成実験において、細胞塊を構成して

2） Rheinwald JG and Green H: Serial cultivation of

いる 4 種の細胞の局在をほぼ明らかにした。細胞塊の表層

strains of human epidermal keratinocytes: the formationが表皮細胞、内部が血管内皮細胞により構成されている理of keratinizing colonies from single cells. Cell 6: 331-343,

由として、身体の表面を覆う役割に特化した表皮細胞の特1975性が大いに影響していると思われた。また真皮細胞と血管

3） Green H et al: Growth of cultured human epidermal

内皮細胞が局在していた理由として、真皮中には毛細血管

cells into multiple epithelia suitable for grafting. Natureが網状に張り巡らされており、生体環境の組織構造をその

science 76: 5665-5668, 1979
4） O’ Connor NE et al. The Lancet 317: 75-78, 1981

まま反映しているのではないかと想定された。
ヌードマウスに移植した細胞塊から形成された毛嚢が少5） 井家

益和 : 生物工学 92: 110-114, 2014

数であった原因として、生体細胞を培養系に移すことによ

6） Kataoka K et al: Participation of adult mouse boneって皮膚幹細胞の多分化能が失われたことが考えられる。

marrow cells in reconstitution on skin. Am J Pathol
163: 1227-1231, 2003

この問題を克服するためには、生体の微小環境に近い培養環境内で 3 次元混合培養し細胞の能力の低下を最小限に抑7） Takebe T et al: Vascularized and functional human

えた状態で移植するのが良いと考えられる。今後この原基

liver from a iPSC-derived organ bud transplant. Nature
499: 481-484, 2013のヌードマウスへの移植効率を改善する方法を開発したい。

8） Chih-Chiang C et al: Organ-level quorum sensing
directs regeneration in hair stem cell populations. Cell
161: 277-290, 2015

− 78 −

化学物質の新規リスク評価のためのライブシングルセル解析手法の開発
大阪大学大学院基礎工学研究科

倉岡功

Risk assessment studies of chemical substances that induce DNA lesions are important, because DNA lesions in genomic
DNA result in cancer in humans. Many classes of DNA lesions induced by chemical agents are eliminated via DNA repair
nucleotide excision repair (NER) for the maintenance of genomic integrity. Ames test is one of the most commonly applied
tests in toxicology. In the test, NER-deficient mutant bacterial cells are used to detect the mutagenic capacity of chemical
substances. Unscheduled DNA synthesis test is also popular test for toxicology and measures DNA repair synthesis after
excision of oligonucleotides containing DNA lesions during NER. And in human, individuals with NER-defective xeroderma
pigmentosum are cancer-prone. For toxicology research in human, therefore, it might be important to identify NERrepairable bulky DNA lesions induced by chemical substances. So far, simple and quick assays to detect such damaging
agents have not been developed using human living cells. Here, we report a simple, non-isotopic assay for determining DNA
damaging agents that induce NER-repairable DNA lesions by visualizing gene expression from treated fluorescent protein
vectors in a mammalian living cell system. This assay is based on a comparison of fluorescent protein expression in NERproficient and NER-deficient living cells. When we tested UV-irradiated fluorescent protein vectors, the fluorescent protein
was observed in NER-proficient living cells, but not in NER-deficient living cells. Similar results were obtained for vectors
treated with the anticancer drug, cisplain. By contrast, when treated with the DNA alkylating agent methyl methanesulfonate,
believed to cause no NER-repairable lesion, no difference in gene expression was observed in between NER-proficient andNER-deficient living cells. Using fluorescent protein expression and living test cells, our assay can specifically detect DNAdamaging agents that induce NER-repairable DNA lesions, and could be used to analyze chemicals with the potential tocause cancer.

1. 緒

おり、これらは分子生物学的観点からすると明らかに複雑

言でまた遅い反応である。またこれらの方法論は 50 年以上

化学物質のデータベースであるケミカルアブストラク

昔の生物学基盤により開発されている。

ト誌によれば、地球上に存在する化学物質は 1 億種をこえ、

今回、申請課題の基になるバイオアッセイは、上記の化

日常生活において 7 万以上の化学物質に囲まれ，さらに新学物質に係る試験よりさらに簡便でまた短期間にその安全規の化学物質が毎日のように登録されている。このような性を評価することができる。なぜならば、近年の分子生物

無数とも思われる物質があるため，迅速に人に対しての健学から得られた知見を基に従来の試験法と異なった指標

康影響を予測し，その影響の大きさの順位づけを行い，安（損傷に応答した転写反応）を用いているからである。我々

全対策に結びつけるということは重要なことであると考えは、このバイオアッセイを従来の細胞株を用いて構築し、られる。しかしながら、人に影響を与える化学物質をすべ

毒性に応答した転写反応およびその有用性を報告した 1 ‒ 4）。

て網羅して、分析し評価することは困難を極め、さらに環

今回さらにその応用として、生きたヒト細胞を用いて生き境中の化学物質は混合した状況で存在し、その影響はよりたままリアルタイムで、化学物質の安全性を評価できる方

複雑かつ複合的に示される。

法を開発することを目標とした。

現在、化学物質の安全性評価の方法は、復帰突然変異試

当初、DNA 修復によってタンパク質の蓄積が観察でき

験および染色体異常試験で基本解析されている。この 2 つる CSB タンパク質を標的として、予定の実験を開始した。

の試験法は比較的簡便にまた短期間で化学物質の安全性を

このタンパク質は、化学物質などで生じた DNA 損傷を修評価することができる。しかしながら、それぞれ遺伝子組

復するヌクレオチド除去修復機構に関するもので、特に転換え生物および細胞分裂の時間を必要とするし、またそれ写と共役することからその反応は非常に早いことが予測さ

ぞれ突然変異誘発性および染色体異常誘発性を指標としてれた。また幾つかの論文によれば、確かに CSB およびそれに関連する修復遺伝子の細胞内局在はそれぞれ細胞核内の核小体に高頻度で存在することが報告されていた。そのA new method for detecting new biologicalrisk assessment of chemical substanceusing live cell analysis
Isao Kuraoka
Graduate School of Engineering Science,
Osaka University

ため我々はそれらのタンパク質と蛍光タンパク質を融合した発現ベクターを構築し、まずヒト細胞株である HeLa 細胞および HEK293 細胞に導入してその遺伝子発現を解析した。発現はウエスタンブロットにより確認し、タンパク質が確かに目的の大きさに観察できることが明らかになっ− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

た。また細胞内の局在を解析し、蛍光タンパク質としての神神経症状を引き起こす原因の一つとも考えられ、その損発現も確認することができた。しかしながら、その発現が傷を検出できることが示唆された。これによって、化学物

安定せず、結果的に細胞においてこのタンパク質が分解さ

質のリスク評価を求める新規の実験方法を構築できたと考れやすいということがわかった。加えて、これらのタンパえられる。

ク質発現安定発現株の構築を試みたが、これも細胞内での2. 方局在が安定しなかった。この原因として、融合タンパク質としては、予定した修復タンパク質は不安定であり、今回の我々の目的とした方法論では観察できないということが法

2. 1. 試験プラスミド、導入確認用のプラスミドおよび
XPA 発現ベクターの構築わかった。

試験プラスミドとして、pEBMulti-Neo-tdTOMATO お以上の結果から、当初想定していた方法論ではリスク評

よび導入確認用のプラスミドとして、pBluescript II KS（-）

価をすることは困難だと考え、新規の実験を行うことにし-EGFP をそれぞれ以下のように作製した。

た。この新規方法では、蛍光タンパク質発現ベクターを

2. 1. 1 pEBMulti-Neo-tdTOMATO

DNA 損傷剤（テスト試薬）と反応させることで、DNA 上に

赤色発光タンパク質をコードした tdTOMATO cDNA損傷を生み出し、その損傷が修復されるかどうかを観察すを挿入するために、wtTDP43 tdTOMATOHA7）プラスミ

ることで、損傷剤の危険性を評価する。また、この損傷をドを鋳型として PCR により両端に BamH I と Xho I の制限評価するために特にヌクレオチド除去修復機能を欠損した

酵素サイトをもつ tdTOMATO cDNA を増幅した。この細胞（XPA 欠損細胞）、さらにこの修復機能を相補した細胞

PCR 産物を pEBMulti-Neo の BamH I および Xho I 制限酵（XPA 相補細胞）を作成し、その差異によって評価するこ

素部位に T4 DNA Ligase を用いて挿入した。

ととした（Fig. 1）。これは化学物質を評価する最も多く用

試験用のプラスミドには、紫外線、シスプラチンおよび

いられているエームス法においては、DNA 修復特にヌク

MMS により DNA 損傷が導入された。

レオチド除去修復を欠損した細菌を用いて、損傷を検出し2. 1. 2 pBluescript II KS
（-）
-EGFP

やすくしている。そこでこの実験方法においても同様にヌ

緑色発光タンパク質をコードしたEGFP cDNAを挿入す

クレオチド除去修復を欠損したヒト XPA 欠損細胞を用いるために、pEGFP-C1 プラスミドを鋳型として PCR によることとした 5）。この方法だと実際に生じたプラスミド上

り両端に BssHII の制限酵素サイトをもつ EGFP cDNA をの DNA 損傷の修復を生きた細胞を蛍光顕微鏡で観察する増幅した。この PCR 産物を pBluescript II KS（-）の BssHIIことができるはずである。これらの作業仮説をもとに、以下

制限酵素部位に T4 DNA Ligase を用いて挿入した。

に示すように実験を行い、予測された通り一定のDNA 損傷

2. 1. 3 XPA 発現ベクターを測定することができた。さらに今回我々が構築した試験DNA 修復タンパク質をコードした XPA cDNA をサブ細胞株は XP 細胞であるため、基本的には NER で修復さクローニングし、PCR により両端に BamH I と Xho I の制れるはずの DNA 損傷を検出していることになった。XP 患

限酵素サイトをもつ XPA cDNA を増幅した。この PCR 産者が高頻度発がんおよび精神神経症状を呈することから 6）、物を pEBMulti-Neo の BamH I および Xho I 制限酵素部位

この NER で修復される DNA 損傷は高頻度発がんおよび精に T4 DNA Ligase を用いて挿入した。また、全てのプラ

Fig. 1 検出系の概要− 80 −

化学物質の新規リスク評価のためのライブシングルセル解析手法の開発

スミドベクターの塩基配列は、シークエンサーによって確や 6-4 pyrimidone photoproducts（（6 ‒ 4）光産物）
）が知ら

認された。

れている 8）。これらの UV 損傷 DNA は隣接ピリミジン塩
基間において光環化反応が起こることで生じる。生成の割

2. 2. 試験細胞の構築

合は CPD が 80 ～ 90 %、（6 ‒ 4）光産物が 10 ～ 20 % 程度で修復タンパク質XPAが欠損したXP-A患者の細胞（XP2OSあるが、（6 ‒ 4）光産物は構造の変化の大きさから CPD より細胞）に、今回作成した XPA を発現する pEBMulti-XPA ベ

も変異原性が高いことが知られている。そしてこれら 2 つクターを導入した。使用した pEBMulti-Neo ベクターには、の損傷は、いずれも NER により修復されることが分かっ

Neomycin 耐性遺伝子が組み込まれている。Neomycin 耐ている。よって、UV 損傷 DNA を用いることで、このア性遺伝子が組み込まれているベクターを細胞に導入し、そッセイが正しく機能するかを確かめた。また実際に DNAの細胞を抗生物質である G-418 Sulfate を含む培養液で増修復段階を明らかにするため、まず細胞内で確かに修復さ殖させることで、DNA が正しく導入された細胞のみを選れるか、また修復時間がどのように変化するかを検討する

択することができる。ベクターを導入した XP2OS 細胞

ため、UV 非照射のベクターおよび照射ベクターをそれぞを G- 418 Sulfate を含む培養液で培養し、ベクターが正しれ作製した試験細胞に導入した。その結果、UV 非照射のく導入され、生存した細胞のみを選択した。また、これベクターを導入した全ての細胞は導入後 24 h 後に RFP をらの樹立された細胞における XPA タンパク質の発現をウ産生し、蛍光が観察された（Fig. 2）。UV 照射されたベク

エスタンブロッティングにより確認し、試験細胞である

ターを導入した XP2OS / XPA 細胞も RFP 遺伝子を発現し、（XP2OS/ pEBMulti-XPA 細胞：XP2OS/XPA 細胞）を樹

蛍 光 が 見 ら れ た。 し か し、XP2OS 細 胞 お よ び XP2OS/立した。さらにこの時、同様にして pEBMulti-Neo ベクタ

pEB 細胞では蛍光は観察されなかった。これは、UV によーのみを導入し、Neomycin 耐性で選択をしたコントロー

り生じた DNA 損傷が蛍光タンパク質ベクターにおける遺ル細胞（XP2OS / pEB 細胞）も樹立した。これらの試験細胞

伝子発現を妨害し、この損傷は、XPA タンパク質の存在（XP2OS 細胞、XP2OS/pEB 細胞、XP2OS/XPA 細胞）は、下では NER により修復され得ることを示唆した。

10% FCS（ウシ胎仔血清）を添加した DMEM 培地を用いしかしこの方法では、試験に用いる発現ベクターが６て、37 度５％二酸化炭素濃度を保った CO2 インキュベー

時間までに導入されていない可能性も考えられる。また

ターにて培養された。

XP2OS 細胞および XP2OS / pEB 細胞には発現ベクターが加えて、それぞれの試験細胞に紫外線を照射し、その感導入されにくい可能性およびトランスフェクションによ受性を確認したところ、XPA を発現する細胞のみが紫外る細胞死の可能性も考えられる。そこで我々は、これらの線に抵抗性であった。このことは外来の XPA タンパク質ことを回避すべく、pEB-RFP ベクター同時に試験細胞にが細胞内で機能していることを示している。

2. 3. 修復試験テスト（紫外線）
2 つの1.5 mL tube に① OPTI-MEM、pEBMulti-tdTOMATO、
pBS-GFP、②OPTI-MEM、損傷を与えたpEBMulti-tdTOMATO、
pBS - GFP を 加 え た。OPTI-MEM と Lipofectamine® 2000
Reagent を混合したものを加え、室温でインキュベート
した（5 min）。前日に 12 well plate に撒いた XP2OS 細胞、
XP2OS/pEB 細胞、XP2OS/XPA 細胞（8.0 × 105 cells/mL）の 1 well ずつに 125 µL ずつ加え、37 度５％二酸化炭素濃度を保った CO2 インキュベーターにて培養された（O/N）
。
24 h 後に細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
また画像処理ソフト Image J により、蛍光強度を測定し
た。

3. 結

果

本研究におけるアッセイを検証するために、UV による
DNA 損傷を検証した。
太陽光など、UVにより生じるDNA損傷として、隣接チミン同士が架橋した cyclobutane pyrimidine dimer（CPD）

Fig. 2 UV 損傷を与えた pEB-RFP を導入した試験細胞の時間
経過− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

導入するモニターベクター（pBS-EGFP）を作製した。これを試験するため、UV を照射して損傷を与えている pEBRFP ベクター、および UV を照射していない pEB-RFP ベ
クターと、損傷を与えていない pBS-GFP ベクターを同時に試験細胞に導入した。損傷を与えていない pEB-RFP と
pBS-GFP を導入した 3 つの細胞は、全ての細胞において
GFP および RFP 遺伝子を発現し、蛍光が見られた。損傷を与えた pEB-RFP と pBS-GFP を導入した細胞について、
XPA タンパク質を産生している XP2OS/XPA 細胞においては、GFP と RFP 両方の蛍光が観察された（Fig. 3 & 4）。
これは、DNA の細胞中の核内への導入が正しく行われ、NER により修復が可能である DNA 損傷が除去されたとFig. 3 UV 損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光観察いうことを示唆している。一方で、XPA タンパク質が存在せず NER が欠損した細胞である XP2OS 細胞およびXP2OS/pEB 細胞においては、GFP 遺伝子のみ発現していた。これにより、この検出系が正しく NER による損傷を検出しているということがわかった。
続けて我々はシスプラチンにより生じる DNA 損傷が検出可能かを検討した。シスプラチンは広く利用されている抗がん剤であり、がん細胞におけるその細胞毒性活
性は複製または転写を阻害するシスプラチン -DNA 付加物に起因する歪みによって媒介されると考えられている。最も多いシスプラチンによる DNA 損傷であるシスプ

Fig. 4 UV 損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光定量化

ラチン -DNA 付加物は、鎖内架橋（intrastrand crosslink）
で あ る 1,2 - intrastrand d（GpG）crosslink お よ び d（ApG）crosslink であるが、これに加え、
1,3-intrastrand d（GpNpG）
crosslinkや鎖間架橋（interstrand crosslink）を少量生じる 9）。
NER は、これらの intrastrand crosslink を効果的に除去す
るが、interstrand crosslink は NER とは別の機構である相同組み換え修復で修復されると考えられている。
pEB-RFP ベクターをシスプラチンと処理し、G-25 カラ
ムに通して精製した後に試験細胞にトランスフェクトした。
高濃度（10 〜 100µM）のシスプラチン処理の細胞においては、全ての試験細胞で GFP の蛍光は観察されたが、RFPの蛍光は観察されなかった。これは、シスプラチンが遺Fig. 5 シスプラチン損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光観察伝子発現を妨害するいくつかの DNA 損傷を生じ、それらが NER では修復されない interstrand crosslink を含むより複雑な DNA 損傷であり得ることを示唆している 10）。一方で、1 µM のシスプラチン処理をした細胞においては、
XP2OS /XPA 細胞では RFP 遺伝子が発現したが、XP2OS細胞、XP2OS / pEB 細胞では発現しなかった（Fig. 5 & 6）。
よって、この濃度においては、RFP ベクターに NER で修復が可能な DNA 損傷を生成することが示唆された。
次に、NER とは異なる経路で修復されることが分かっている methyl methanesulfonate（MMS）
で損傷を与えた。
MMS は、7- メチルグアニン（7-meG）
および 3- メチルアデ
ニン（3-meA）のようなベクター DNA 中の DNA アルキル化

Fig. 6 シスプラチン損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光定量化− 82 −

化学物質の新規リスク評価のためのライブシングルセル解析手法の開発

塩基損傷、並びにAPサイトを誘導することができる 11）。DNA
修復酵素のアルキルアデニン DNA グリコシラーゼは、DNA 上の損傷塩基を認識し、アルキル塩基を除去して AP
サイトを生成する 12）。MMSにより誘発されるDNA損傷は、
塩基除去修復（BER）の対象と考えられており、NER とは別の経路で修復されると考えている。よって、XPA が欠損しており NER が機能しない細胞であっても BER は機能すると考えられるため、損傷を受けた蛍光タンパク質によっても蛍光が観察されることが予想される。
pEB-RFP ベクターを MMS と処理し、G-25 カラムに通して精製した後に試験細胞にトランスフェクトした。する
と、予想通りに全ての細胞において GFP と RFP 遺伝子のFig. 7 MMS 損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光観察

発現が観察された（Fig. 7 & 8）
。これは、MMS により誘発される DNA 損傷は遺伝子発現に影響を及ぼさず、本研究におけるアッセイは BER により修復される DNA 損傷の検出には使用することができないことが示唆された。しかし、
1 mM の MMS では濃度が小さすぎて、損傷が適切に誘導されなかった可能性も否定することはできない。

4. 考

察

本研究では、DNA 損傷を与えた蛍光タンパク質を NERが欠損している XP-A 患者の細胞に導入し、損傷が修復されれば蛍光タンパク質遺伝子の発現を蛍光顕微鏡で検出することができるという原理を用いて、DNA 損傷の検出系

Fig. 8 MMS 損傷を与えたベクターを導入した試験細胞の蛍光定量化を開発した。
UV 照射した pEB -RFP ベクターを細胞にトランスフェ

する DNA 損傷は、化学物質の細胞毒性作用によりほとんクションすると、UV 照射されていない pEB-RFP ベクタ

ど検出されない。さらに、細菌細胞と哺乳類細胞の DNAーが全ての細胞において RFP を産生したのに対し、NER

代謝には大きな差異があるため、哺乳類細胞中で分析する欠損細胞（XP2OS 細胞および pEB ベクターのみがトランことが求められる。

スフェクトされた XP2OS /pEB 細胞）では RFP は産生されまた、UDS 試験は、哺乳類培養細胞中の細胞周期の S 期

ず、一方で NER 相補細胞（XP2OS/XPA 細胞）では RFP のの DNA 合成に進まない DNA に、放射性トリチウム標識

蛍光を観察することができた。同様に、嵩高い DNA 損傷

チミジン（3H - dT）を組み込むことに基づいており、取り込を誘発する DNA 損傷剤であるシスプラチンで処理すると、まれた 3H - dT は、X 線に感受性を示すオートラジオグラ

NER 相補細胞では濃度が小さい場合には蛍光タンパク質

フィーにより、ハロゲン銀粒子として検出されることによを産生するが、NER 欠損細胞では全く蛍光が観察されな

り DNA 損傷を検出している 13）。UDS 試験は、古くから一かった。一方、DNA アルキル化塩基損傷を誘発する MMS

般的に用いられている in vivo における遺伝毒性試験であと共にインキュベートされたベクターを導入した試験細胞

り、XP 相補性診断試験としても使用されている。しかし、では、全ての細胞において蛍光タンパク質の蛍光を観察す

UDS 試験は複雑な過程を経る必要があり、さらに放射性ることができた。UV およびシスプラチンは NER で修復が同位体の使用を余儀なくされる。

可能な DNA 損傷を誘発するが、MMS は BER で修復され本研究における検出系では、これらの欠点を克服するこる DNA 損傷を誘発するので、本研究では NER によって修とができる。損傷をプラスミド自体に与えるため、細胞へ復された DNA 損傷を誘発する DNA 損傷剤を検出するこの影響はなく細胞毒性を考慮する必要性は少ない上に、細とができると結論づけた。

菌細胞ではなくヒトの生細胞を用いているため、よりヒト

一般的に使用されている DNA 損傷剤のスクリーニング

にとって有害である化学物質を見極めることができる。さ法であるエームス試験は、NER が欠損している突然変異

らに、過程は蛍光タンパク質遺伝子発現ベクターに損傷を細菌細胞を用いて特定の化学物質が突然変異を誘発する可

与え、細胞に導入するだけの簡単なものであるし、放射性能性を分析することができる。しかし、転写や複製を妨害

同位体も用いる必要はない。

− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

さらに多くの試験試薬を用いて損傷と修復の関係を検討

MC, Satoh Y, et al., Analysis of a human DNA

する必要はあるものの、この検出系は、エームス法などのexcision repair gene involved in group A xeroderma

ように DNA 損傷を誘発するさらなる新しい DNA 損傷剤

pigmentosum and containing a zinc-finger domain,の発見、すなわち新規の化学物質の評価法に役立つことがNature 348. 73-76. 1990
6） Lehmann AR, McGibbon D, Stefanini M. Xeroderma

期待できる。

5. 総

pigmentosum, Orphanet J. Rare Dis. 6. 70. 2011

括7） Yang C, Tan W, Whittle C, Qiu L, Cao L, Akbarian

当初は、損傷を受けた細胞内のタンパク質の局在変化に

S, Xu Z. The C-terminal TDP-4 3 fragments have a

よって、生きた細胞で化学物質の安全性を評価する実験系

high aggregation propensity and harm neurons by aを確立することを目指した。しかしながら、局在変化では

dominant-negative mechanism. PLoS One 5. e15878. 2010

様々な細胞の状態（遺伝的背景の違いおよび損傷の生成頻

8） Mori T. et al., Simultaneous establishment of度）により損傷による局在変化が観察されなかった。そこ

monoclonal antibodies specific for either cyclobutane

で従来の生化学的手法および遺伝学的手法の延長線上としpyrimidine dimer or（6 - 4）photoproduct from the sameて今回の検出法を考案した。この方法では、試験細胞を遺

mouse immunized with ultraviolet-irradiated DNA,

伝学的に統一することで安定した細胞を確保し、また損傷

Photochem Photobiol, 54. 225-232.1991の生成頻度も外来遺伝子である発現プラスミドを用いるこ

9） Moggs JG, Yarema KJ, Essigmann JM, Wood RD.

とにより克服し、さらに発現プラスミドのモニターとして

Analysis of incision sites produced by human cell

蛍光タンパク質を用いることで生きた細胞でリアルタイム

extracts and purified proteins during nucleotideに損傷のタイプおよび修復の効率を考察することができる

excision repair of a 1,3-intrastrand d（GpTpG）-cisplatin

実験系を確立することができた。細胞を様々な変異株を用

adduct. J Biol Chem. 271.7177-7186. 1996

いることで、また、発現プラスミドをさらに改変することによって応用研究が発展できることが期待できる

10）Wood RD. Mammalian nucleotide excision repair
proteins and interstrand crosslink repair. Environ Mol

14）。

Mutagen. 51. 520-526. 2010
（引用文献）

11）Karran P, Macpherson P, Ceccotti S, Dogliotti E,
61） Hasegawa M, Iwai S, Kuraoka I. A non-isotopic assay

Griffin S, Bignami M. O -methylguanine residues elicit

uses bromouridine and RNA synthesis to detect DNA

DNA repair synthesis by human cell extracts. J Bioldamage responses. Mutat Res. 699. 62-66. 2010

Chem. 268. 15878-15886. 1993

2） Morita Y, Iwai S, Kuraoka I. A method for detecting12）O'Brien PJ, Ellenberger T. Human alkyladenine

genetic toxicity using the RNA synthesis response to

DNA glycosylase uses acid-base catalysis for selective

DNA damage. J Toxicol Sci. 36. 515-521. 2011

excision of damaged purines. Biochemistry. 42. 12418-

3） Kametani Y, Iwai S, Kuraoka I. An RNA synthesis
inhibition assay for detecting toxic substances using

29. 2003
13）Kelly CM, Latimer JJ. Unscheduled DNA synthesis: aclick chemistry. J Toxicol Sci. 39. 293-299. 2014

functional assay for global genomic nucleotide excision

4） Sonohara Y, Iwai S, Kuraoka I. An in vitro method

repair, Methods Mol. Biol. 291. 303-320. 2005

for detecting genetic toxicity based on inhibition of14）Takatsuka R, Ito S, Iwai S, Kuraoka I. An assay to

RNA synthesis by DNA lesions. Genes Environ. 1. 37:8.

detect DNA-damaging agents that induce nucleotide

doi: 10.1186/s41021-015-0014-8. eCollection 2015

excision- repairable DNA lesions in living human cells,5） Tanaka K, Miura N, Satokata I, Miyamoto I, Yoshida− 84 −

Mutat Res. 8201-8207. 2017

皮膚アレルギーを制御するω3 由来脂肪酸メディエーターの産生・作用機構の解明
東京大学大学院薬学系研究科

河野望

Allergic diseases such as atopic dermatitis and asthma are becoming very common in developed countries. Allergy is
associated with increased serum IgE levels and mast cell activation. Association of an antigen with IgE on the mast cellsurface causes cross-linking of the high-affinity IgE receptor (FcεRI), leading to exocytosis of granule-associated mediatorsand proteases (degranulation) as well as new synthesis of cytokines and lipid mediators. Therefore, uncovering molecularmechanisms that regulate mast cell activation could provide crucial insights into the pathophysiology of mast cell–associateddiseases. We recently found that omega- 3 fatty acid epoxides are produced in mast cells dependently of PAF-AH (II), an
oxidized phospholipid-selective phospholipase A 2 and are critical for proper IgE-mediated mast cell activation. In thisstudy, we demonstrated that PAF-AH (II) preferentially hydrolyzed omega- 3 epoxide–containing phospholipids in mastcell membrane to liberate omega- 3 epoxides. We also identified Cyp 4 a 12 a and Cyp 4 a 12 b as enzymes involved in theepoxidation of omega- 3 fatty acids in mast cells. We further reveled that the omega- 3 epoxides promoted IgE-mediatedactivation of mast cells by downregulating Srcin 1 , a Src-inhibitory protein that counteracts FcεRI signaling. Thus, theCyp 4 a 12 –PAF-AH (II)–omega- 3 epoxide–Srcin 1 axis presents new potential drug targets for allergic diseases.

1. 緒ているという、まったく予想外な現象を捉えた。すなわち、

言

PAF-AH（II）が単なる酸化リン脂質の消去酵素ではなく、アトピー性皮膚炎に代表されるアレルギー疾患は、先進諸国において罹患率が過去 20 年間で 2 ‒ 3 倍に急増してお新規の生理活性酸化脂肪酸の産生酵素であることが示唆された。

り、大きな社会問題となっている。マスト細胞はアレルギ

本研究では、マスト細胞機能を制御するエポキシω3 脂ー反応において中心的な役割を担う免疫細胞であり、免疫肪酸の産生機構、エポキシω3 脂肪酸の作用機構を解明す

グロブリン E（IgE）によって感作されたマスト細胞が抗原ることを目的とした。

刺激を受けると、脱顆粒を引き起こし、ヒスタミン、脂質

2. 方

メディエーター、サイトカインなどの炎症性物質を放出す

法る。これまでに、抗原刺激を受けたマスト細胞が脱顆粒に骨髄由来マスト細胞は、マウス骨髄細胞を IL3 存在下で至るまでの細胞内シグナル伝達経路は非常によく研究され培養することにより得た。骨髄由来マスト細胞の活性化ているものの、このマスト細胞活性化シグナルを調節する

は IgE と抗原（ジニトロフェニル化ヒト血清アルブミン）

因子については、未解明の部分が多い。

により刺激後、β ヘキソサミニダーゼの放出を常法に従い私は、これまでに生体膜リン脂質の酸化防御に関する研検出した。骨髄由来マスト細胞における Srcin1 の RNAi

。その中で、酸化リン脂質に選択的は Srcin1 に対する shRNA を発現するレトロウイルスをなホスホリパーゼである PAF-AH（II）のノックアウト（KO）感染させることによりおこなった。エポキシω3 脂肪酸おマウスを樹立し、PAF-AH（II）が酸化リン脂質を分解する

よびエポキシ脂肪酸を持つリン脂質の測定には UHPLC-

ことにより、過度な酸化ストレスによる組織障害に対す

QTRAP4500 を用いた。エポキシω3 脂肪酸含有リン脂質

る防御機構として機能することを示してきた。最近、この分解アッセイは、エポキシω3 脂肪酸含有リン脂質を含の KO マウスでは、皮膚アレルギー反応が減弱しているこむ培養マスト細胞膜画分にリコンビナント PAF-AH（II）をとを見いだし、さらに PAF-AH（II）はマスト細胞において作用させることによりおこなった。Cyp4a12a/b 二重欠損

EPA や DHA といったω3 脂肪酸がエポキシ化された酸化マウスは Cyp4a12a/b に対する sgRNA と Cas9 mRNA を

脂肪酸を選択的に産生し、マスト細胞活性化を正に制御し受精卵にインジェクションすることにより得た。

究に従事してきた1 ‒ 4）

3. 結
The mechanisms of production and actionof omega- 3 -derived fatty acid mediators
regulating skin allergy
Nozomu Kono
Graduate School of Pharmaceutical
Science, the University of Tokyo果

3. 1 エポキシω3脂肪酸含有リン脂質の測定系の確立
エポキシ脂肪酸を持つリン脂質の高感度な検出・定量系
を UHPLC- MS/MS を用いて構築した。その結果、マスト細胞からエポキシω3 脂肪酸を含有するリン脂質分子種を複数検出することに成功した（図 1）。またマスト細胞のリ− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図 1 マスト細胞におけるエポキシω3 脂肪酸含有リン脂質の検出（上）エポキシω3 脂肪酸含有リン脂質（1-palmitoyl-2-17, 18-EpETE PC）を検出する MRM チャ
ネルのイオンクロマトグラム。
（下）* でしめしたピークの MS/MS スペクトル。

ン脂質画分中のエポキシω3 脂肪酸を定量したところ、リン培養マスト細胞のマイクロアレイデータから、マスト細胞

脂質中に含まれる全ω3 脂肪酸の 1 % 程度がエポキシω3 脂に発現しておりω3 脂肪酸のエポキシ化に関わる可能性の肪酸であることが明らかとなった。

ある CYP を探索したところ、PAF- AH（II）の組織分布と非常に良く似た分布を示す Cyp4a12a、Cyp4a12b を見出した。

3. 2. PAF-AH（II）によるエポキシω3 脂肪酸含有リ

Cyp4a12a および Cyp4a12b をそれぞれ培養細胞に発現さン脂質の分解せたところ、添加したω3 脂肪酸からエポキシω3 脂肪酸

培養マスト細胞にエポキシω 3 脂肪酸を添加すると、すへの変換が顕著に増加した。Cyp4a12a、Cyp4a12b はアミ

みやかに膜画分に取り込まれ、エポキシω3 脂肪酸を含有

ノ 酸 レ ベ ル で 98% 以 上 の 相 同 性 を 示 し、 ゲ ノ ム 上 でするリン脂質が産生される。このようなエポキシω 3 脂肪酸を

100 kb 以内に近接して存在している。そこで、CRISPR /含有するリン脂質に富む脂質膜にリコンビナントPAF-AH（II）

Cas9 法により Cyp4a12a / b の二重欠損マウスを作成したを in vitro で作用させたところ、エポキシω3 脂肪酸を含有す

ところ、二重欠損マウス由来の培養マスト細胞ではエポキ

るリン脂質が減少し、遊離エポキシω3 脂肪酸の増加がみ

シω3 脂肪酸の産生の顕著な減少がみられた。

S234Cられた。一方、酵素活性を失った PAF-AH（II）

変異

リコンビナントではそのような活性はみられなかった（図 2）。

3. 4. エポキシω3 脂肪酸によるマスト細胞活性化促進の作用メカニズムの解明

3. 3. エポキシω3 脂肪酸を持つリン脂質の産生酵素の同定

シω3 脂肪酸を添加すると、IgE / 抗原刺激時の脱顆粒能がω3 脂肪酸のエポキシ化には複数のシトクローム P450回復する。この作用は IgE / 抗原刺激の直前の添加ではみ（CYP）が関わることが知られており、CYP2 と CYP4 ファ

られず、添加から 24 時間以上の時間が必要である。この

5）

ミリーの中には脂肪酸を基質とするものが多く存在する 。

ことから、エポキシω3 脂肪酸は遺伝子発現を介してマス

実際、培養マスト細胞に CYP 阻害剤を添加したところ、ト細胞機能を制御していることが示唆された。そこで、脂CYP4 選択的阻害剤 HET0016 を添加したときに、エポキ

肪酸をリガンドとする核内受容体であるペルオキシソーム

シω3 脂肪酸を持つリン脂質が顕著に減少した。そこで、増殖因子活性化受容体（peroxisome proliferator-activated

PAF - AH（II）KO マウス由来の培養マスト細胞にエポキ− 86 −

皮膚アレルギーを制御するω3 由来脂肪酸メディエーターの産生・作用機構の解明

図 2 PAF -AH（II）によるエポキシω3 脂肪酸含有リン脂質の分解（左）PAF - AH（II）による 17,18 - EpETE の産生。
（ 右 ）*PAF - AH（II） に よ る エ ポ キ シ ω 3 脂 肪 酸 含 有 リ ン 脂 質 の 分 解。
***p<0.001。

図 3 エポキシω3 脂肪酸と PPARγ アンタゴニスト
GW9662 で共通の遺伝子が発現現減少する。

receptor, PPAR）に着目し、PPAR の各種アゴニスト、ア

いて、まず Cyp4a12a/b によりω3 脂肪酸からエポキシω3

ンタゴニストの添加実験をおこなったところ、PAF -AH

脂肪酸が生成し、一旦膜リン脂質に取り込まれた後、PAF-（II）KO マウス由来のマスト細胞に PPAR γ のアンタゴニ

AH（II）により切り出され、生理活性を発揮していると考スト（GW9662）を添加したときに、脱顆粒能が野生型マウえられる。エポキシω3 脂肪酸がなぜ一旦膜リン脂質に取スと同程度まで回復した。次にエポキシω 3 脂肪酸およびり込まれるのかは不明であるが、エポキシω3 脂肪酸の安

GW9662 をそれぞれ処理した PAF-AH（II）KO マスト細胞

定性向上や代謝回転の重要性が関係しているかもしれない。

の遺伝子発現変化を DNA マイクロアレイにより比較した

リポキシゲナーゼの中には遊離脂肪酸のみならず、リン脂質

ところ、GW9662 で 1/4 以下に発現が低下した遺伝子群のに結合した脂肪酸も基質にするものも存在することから 7）、

ほとんどがエポキシω3 脂肪酸によっても 1/4 以下に発現

Cyp4a12a/b がリン脂質中のω3 脂肪酸を直接エポキシ化

低下していることがわかった（図３）。発現低下した遺伝子

している可能性もある。

の内、Srcin1（Src kinase signaling inhibitor 1）に着目した。

またエポキシω3 脂肪酸は、Srcin1 の遺伝子発現抑制を

Srcin1 は Src と Csk（carboxy-terminal src kinase）に結合介してマスト細胞の活性化を促進しているという、エポキ

する足場タンパク質であり、Csk は Srcin1 を介して Src とシω3 脂肪酸の作用機構の 1 つが明らかとなった。PPARγ

結合することにより、Src の C 末端のチロシンをリン酸化のアンタゴニスト GW9662 はエポキシω3 脂肪酸と同様の

6）

し、Src を不活化する 。Src ファミリーキナーゼである効果を示したが、エポキシω3 脂肪酸は PPAR γ レポータ

Lyn や Fyn はマスト細胞の IgE / 抗原刺激時の活性化に必ーアッセイにおいて、PPAR γ の活性化を抑制できなかっ須であること、Srcin1 は PAF-AH（II）KO マスト細胞で発た。したがって、エポキシω3 脂肪酸は PPAR γ の直接の現上昇しており、エポキシω3 脂肪酸によってそれが抑え

アンタゴニストとして働いているのではなく、別の標的分られたことから、Srcin1 がエポキシω3 脂肪酸の作用に関子があることが示唆された。核内受容体のなかには未だリ与する可能性が考えられた。そこで PAF-AH（II）KO マス

ガンドが不明なものが数多く存在しており 8）、それらの中ト細胞において Srcin1 を発現抑制したところ、KO マストにエポキシω3 脂肪酸をリガンドとするものがあるのかも細胞の活性化不全が WT レベルまで回復した（図 4）。

しれない。

4. 考

察

5. 総

括

エポキシω3 脂肪酸の産生において、PAF-AH（II）と本研究から、エポキシω3 脂肪酸の産生における PAF-

Cyp4a12a/b の重要性が明らかとなった。マスト細胞におAH2 の重要性が明らかとなり、エポキシω 3 脂肪酸が酸化− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図 4 Srcin1 はエポキシω3 脂肪酸のエフェクターである。
（右）Srcin1 の定量 PCR。（左）Srcin1 発現抑制による PAF-AH（II）KO マスト細胞活性化不全の回復。***p<0.001

Chem. 283（3）:1628-36, 2008.

リン脂質を介して産生されるという、従来のアラキドン酸
カスケードとは異なる脂肪酸メディエーターの産生経路の5） Arnold C, Konkel A, Fischer R, Schunck WH.

9）存在が示唆された 。本経路はマスト細胞を賦活化しておCytochrome P4 5 0-dependent metabolism of omega-6

り、本研究の成果は、皮膚アレルギーを制御する新たな方

and omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids.

法論の開発等へ貢献できると期待される。

Pharmacol Rep. 62（3）:536-47, 2010.
6） Cabodi S, del Pilar Camacho-Leal M, Di Stefano（引用文献）P, Defilippi P. Integrin signalling adaptors: not only
figurants in the cancer story. Nat Rev Cancer. 10（12）:1） Kono N, Arai H. Intracellular Platelet-Activating

858-70, 2010.

Factor Acetylhydrolase, Type II: A Unique Cellular
Phospholipase A2 That Hydrolyzes Oxidatively7） Ivanov I, Kuhn H, Heydeck D. Structural andfunctional biology of arachidonic acid 15-lipoxygenase-1

Modified Phospholipids. Enzymes. 38:43-54, 2015.
2） Kono N, Arai H. Intracellular transport of fat-soluble（ALOX15）．Gene. 573（1）:1-32, 2015.
8） Robinson-Rechavi M, Escriva Garcia H, Laudet V.

vitamins A and E. Traffic. 16（1）:19-34, 2015.

The nuclear receptor superfamily. J Cell Sci. 116（Pt 4）:3） Kono N, Ohto U, Hiramatsu T, Urabe M, Uchida Y,

585-6, 2003.

Satow Y, Arai H. Impaired α-TTP-PIPs interaction
underlies familial vitamin E deficiency. Science. 3 4 09） Shimanaka Y, Kono N, Taketomi Y, Arita M,（6136）:1106-10, 2013.

Okayama Y, Tanaka Y, Nishito Y, Mochizuki T,4） Kono N, Inoue T, Yoshida Y, Sato H, Matsusue T,

Kusuhara H, Adibekian A, Cravatt BF, Murakami M,

Itabe H, Niki E, Aoki J, Arai H. Protection against

Arai H. Omega-3 fatty acid epoxides are autocrineoxidative stress-induced hepatic injury by intracellular

mediators that control the magnitude of IgE-mediatedtype II platelet-activating factor acetylhydrolase bymast cell activation. Nat Med. 23（11）:1287-1297, 2017.

metabolism of oxidized phospholipids in vivo. J Biol

− 88 −

皮膚ホメオスタシス制御に向けた
アレルゲンセラピーの基盤研究とその応用
金沢大学医薬保健研究域 薬学系 衛生化学研究室

鈴木亮

Allergy is an inappropriate immune response to allergens. Allergy requires initial sensitization with a specific allergen.
The subsequent exposure to the same allergen result in patho(physio)logical responses mediated by immunoglobulin E (IgE)
and mast cells. We have investigated high-affinity receptor for IgE (FcεRI) signals that control mast cell activation, especially
focusing on the complexity of FcεRI activation and of the signaling network in response to different affinity of allergens.
What we found is that IgE and FcεRI activate a complex regulatory network by the affinity of allergens that governs thetype of allergic disease symptoms. In the mouse model, both high- and low-affinity allegens led to similar levels of immune
cells infiltrating the site of inflammation. However, the types of infiltrating cells differed depending on whether the allergens
used were high- or low-affinity. Whereas neutrophils were the dominant cell type infiltrating under a high-affinity antigen
challenge, monocyte/macrophages were more abundant with the low-affinity antigen challenge. The physiological relevanceof the differences in immune cell recruitment is still unclear. In this study, we explore the roles of different immune cell
recruitment on physiological relevance on allergic diseases. Thus, we develop novel theories for allergen affinity-dependent
immunotherapy for keeping skin homeostasis.

1. 緒

言

人類は太古から「美」を追求し、様々なコスメティックを研究・開発してきた。現代社会において化粧は、単に「美しくなる」という目的を超え、社会的・医学的に大きな役割を担うようになってきた。例えば「コスメティックセラ
ピー」という言葉に代表されるように、心理・健康面においても多大な影響を及ぼすことが、経験的そして科学的にも明らかになりつつある。
「化粧」には、その基本となる健康的な皮膚が不可欠であることは明らかである。ところが近年、住環境（乾燥、紫図 1 マスト細胞の活性化と分泌反応

外線など）
や生活環境
（食生活、
多種のコスメティックなど）の変化によって、我々の皮膚は様々なトラブルを抱えることが多くなってきている。そして、アトピー性皮膚炎、接促進されアレルギー反応が惹起される（図 1）。

触性アレルギーをはじめとするアレルギー性皮膚炎、花粉

我々は、アレルギー疾患モデル動物を用いた in vivo 解症が起因となる皮膚炎症症状など、皮膚の健康維持（ホメ析から、アレルゲン親和性が浸潤細胞の種類に大きな違い

オスタシス）に多大なダメージを与え大きな社会問題になを生じさせ、皮膚炎症反応を調節・制御していることを明っている。

らかにした。高親和性アレルゲンでは好中球が、一方、低これら多くのアレルギー疾患には、マスト細胞が重要

親和性アレルゲンでは単球・マクロファージが浸潤していな役割を担っている。マスト細胞は細胞膜上に IgE 受容体

ることを見いだした 1）。一般的に、好中球は、細菌・真菌（FcεRI）を発現し、アレルゲン特異的 IgE と結合している。

を異物として貪食・分解することで生体防御反応を担ってアレルゲンによって IgE 受容体が架橋・凝集することによいる。また、単球・マクロファージは死細胞や変性物質のって、マスト細胞が活性化される。その結果、分泌反応が補食・消化などクリーナーとしての役割を持つ。このことは、アレルゲン親和性選択的な浸潤細胞が、皮膚アレルギ
ー炎症の病態（終息、増悪）決定に多大な影響を及ぼしていNew insight on allergen immunotherapy
for keeping skin homeostasis
Ryo Suzuki
Institute of Medical, Pharmaceutical and
Health Sciences, Faculty of Pharmaceutical
Sciences, Kanazawa University

ることを強く示唆していた。しかしながら、これらの病態決定におけるマスト細胞と浸潤細胞の相互作用の生理機能は全く明らかになっていない。
そこで本研究では、アレルゲンによって誘導される浸潤細胞とマスト細胞の相互作用という視点から、アレルギー− 89 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

疾患の実体を明らかにし、皮膚ホメオスタシス制御機構を

2. 5. 走査型及び透過型電子顕微鏡による撮影

明らかにすることを試みた。

2. 方

電子顕微鏡による相互作用の解析には、マトリゲルをコートしたカバーガラス上で共存培養した細胞を用いた。

法

走査型電子顕微鏡のサンプルは 1% グルタルアルデヒド、

2. 1. 骨髄由来マスト細胞の分化と骨髄好中球の単離・精製方法〜 100 % エタノールで脱水処理した。透過型電子顕微鏡の骨髄由来マスト細胞（BMMC：bone marrow-derived mast

サンプルの場合には、2 % グルタルアルデヒド、2 % 四酸cell）は成体マウス（C57BL/6）の大腿骨から骨髄細胞を採取

化オスミウム、30 〜 100 % エタノールで処理後、エポキシ

0.5 % タンニン酸及び 1 % 四酸化オスミウムで処理後、70し、1 0% FBS、IL-3、SCF、MEM Non-Essential Amino

樹脂で包埋した。作製したサンプルは、走査型電子顕微鏡

Acids、Sodium Pyruvate、Penicillin、Streptomycin を 加（HITACHI, S-4300）及び透過型電子顕微鏡（花市電子顕微

えた RPMI Medium 1640 中で 37 ℃、5 ％ CO2 の条件下で鏡技術研究所 HITACHI, H-7600）により撮影した。

１ヶ月間培養し、マスト細胞に分化させた。骨髄好中球は

3. 結

マウス骨髄細胞を同様に採取し、赤血球溶血後 Percoll を用いた密度勾配遠心分画法により単離・精製した。

2. 2. フローサイトメータによるマーカー蛋白質の解析

果3. 1. マスト細胞と好中球のin vitro 共存培養システ
ムの確立
我々の研究から、アレルゲン親和性選択的な浸潤細胞がマウス骨髄細胞から分化及び単離・精製した骨髄由来マ

アレルギー疾患の病態を制御していることが明らかになっスト細胞と骨髄好中球の確認には、フローサイトメータをた 1）。特に、高親和性抗原の場合には好中球が有意にアレ用い、マーカー蛋白質の発現解析により行った。マスト細ルギー炎症部位に浸潤しマスト細胞と相互作用していた。

胞の確認には、マスト細胞のマーカー蛋白質である IgE 受

そこで、マスト細胞と浸潤細胞（好中球：高親和性抗原）と容体（FcεRI）を用い、IgE 受容体 α 鎖に対する特異的抗体の相互作用を追究するため、マウス骨髄由来マスト細胞とを用いて行った。また、好中球の解析には、マウス好中球

単離・精製マウス好中球を用いた in vitro 共存培養システのマーカー蛋白質である Ly6G に対する特異的抗体を用いムの確立を試みた。

た。これらマーカー蛋白質の定量的な発現解析にはフローサイトメータ（FACS Verse）
を用いた。

マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、骨髄由来マスト細胞への分化を行った。骨髄細胞は、SCF 及び IL - 3 の存在
下で１ヶ月間培養を行い、骨髄由来マスト細胞を得た。骨2. 3. In vitro 共存培養システムの確立

髄由来マスト細胞の分化レベルの確認には、マスト細胞

骨髄由来マスト細胞（1.0 × 106 cells）と骨髄好中球（6.0 ×

マーカー蛋白質である FcεRI を用い、α 鎖に対する特異的6抗体によるフローサイトメータ解析を行った。その結果、

10 cells）をマトリゲルコートのガラスボトムディッシュ
上で 24 時間共存培養し実験に用いた。共存培養した骨髄95% 以上の細胞でマスト細胞に分化していることが明ら由来マスト細胞を抗 DNP（Dinitrophenyl）-IgE 抗体で感かになった（図 2）。また、マウス骨髄好中球の単離・精製

作し、抗原（DNP - HSA）刺激に伴う両細胞の細胞間相互作には、マウス大腿骨の骨髄細胞について Percoll を用いた用を追究した。

密度勾配遠心分画法により行った。骨髄好中球の確認には、
マウス好中球マーカー蛋白質である Ly6G を用いた。フロ

2. 4. 細胞内カルシウムイオン動態と細胞骨格蛋白質の局在解析
骨髄由来マスト細胞と骨髄好中球の細胞内カルシウムイ

ーサイトメータで解析した結果、約 85% の細胞で Ly6G の発現が確認され、骨髄から好中球の単離・精製に成功したと考えられた（図 2）。

オン動態の解析には、カルシウム蛍光指示薬（Fluo4-AM）

先述した方法により得た骨髄由来マスト細胞と単離・精を用い、共焦点レーザ顕微鏡による画像解析により行った。

製した骨髄好中球を用いて、両細胞を用いた in vitro 共存

取得した蛍光強度の解析には Image J を用いた。細胞骨格

培養システムの確立を行った。マスト細胞と好中球を共存

蛋白質の局在解析には、好中球と共存培養させたマスト細培養すると、どちらの細胞も球形をしており、好中球は胞を抗原により特異的に活性化させたものを用いた。アクマスト細胞（直径：〜12 µm）と比較し、やや小さい（直径：チンの染色には FITC 標識ファロイジンを用い、チューブ〜 7 µm）ことがわかった。そこで、マスト細胞を特異的にリンの染色には Alexa Fluor 647 標識チューブリン抗体を抗原で活性化した際の両細胞間での相互作用について、細用いた。画像の取得には共焦点レーザ顕微鏡（Carl Zeiss）

胞形態及び動態を指標にイメージング解析を行った。マスを用い、相互作用の解析には Image J を用いた。

ト細胞を抗原で特異的に刺激すると、抗原によって活性化されたマスト細胞では、脱顆粒反応（ケミカルメディエー− 90 −

皮膚ホメオスタシス制御に向けたアレルゲンセラピーの基盤研究とその応用

図 2 フローサイトメータによる骨髄由来マスト細胞と骨髄好中球の確認（A）マスト細胞マーカー蛋白質FcεRIαの発現確認（B）マウス好中球マーカー蛋白質 Ly6G の発現確認

図 3 骨髄由来マスト細胞の抗原刺激応答に伴う骨髄好中球の動態
マスト細胞（MC）に好中球（N1‒ 6）が集積し相互作用している。

タの開口放出）が誘導され、それに伴う形質膜の波打現象

要な役割を担っている 4, 5）。一方、好中球の細胞膜上には（ラッフリング）が観察された。その後、丸い形態をしてい

遊走刺激因子を感知する各種受容体が存在し、受容体の活た好中球が、紡錘形に変化しマスト細胞の方向へ移動する性化にともなう様々なシグナル分子の活性化と細胞内カル様子が観察された。そして複数の好中球が、脱顆粒をしてシウムイオン動態の制御を行っていることが明らかになっいるマスト細胞と相互作用（接着）している様子が観察されている 6, 7）。ここでは、様々な細胞機能において重要な役

た（図３）
。

割を担う細胞内カルシウムイオンに着目し、両者の接着に伴う相互作用が、細胞間情報伝達においてどのような影響

3. 2. In vitro 共存培養システムを用いた細胞間情報伝達機構の解析を及ぼすのか追究した。その結果、好中球単独培養の場合には、抗原の刺激応答に伴う細胞内カルシウムイオン濃度

細胞内カルシウムイオン濃度は、様々な細胞機能の調節変化は観察されなかった。一方、マスト細胞と共存培養しに関与しており、細胞活性化状態を知る上で極めて重要なた場合においては、抗原でマスト細胞を特異的に刺激する指標になることが、これまでの多くの研究から明らかになと、はじめにマスト細胞でカルシウムイオン濃度の上昇が

っている

2, 3）

。特にマスト細胞においては、抗原依存的な観察された。その後、好中球がマスト細胞に向かって動き、細胞の活性化が小胞体からのカルシウムイオンの放出と細接着する様子が観察された。そしてマスト細胞と接着した胞外部からのカルシウムイオンの流入を引き起こすことに好中球において一過的に細胞内カルシウムイオン濃度が上よって脱顆粒反応が誘導され、各種メディエータ放出に重昇している様子が観察された（Data not shown）。このこ− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

好中球に細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が誘導されて3. 4. 電子顕微鏡を用いたマスト細胞と好中球の相互作用の追究いる可能性が示唆された。現時点では、これら相互作用に

抗原刺激応答に伴いマスト細胞と好中球が接着し、ダイ伴うカルシウムイオン動態変化の生理的役割については不ナミックに相互作用する様子が観察された。そこで、マス明であるが、現在慎重に検討中である。

ト細胞の好中球の接着形態や相互作用をより詳細に観察すとから、マスト細胞と好中球が相互作用
（接着）
した結果、

るために、走査型及び透過型電子顕微鏡を用いて追究した。

3. 3. 細胞間情報伝達を制御する分子基盤の解析

はじめに走査型電子顕微鏡を用いて両者の接着形態を観察

免疫細胞の細胞間相互作用において、様々な分子がそのしたところ、抗原刺激前は球形をしていた好中球が紡錘形

相互作用部位において特徴的な局在変化を行い、それら適に形態を変化させ、マスト細胞に密接に接着している様子

切な局在変化が起こることによって機能的な細胞間相互作が観察された（Data not shown）。また、透過型電子顕微

8，9）鏡を用い解析では、抗原刺激により活性化されたマスト細用と情報伝達が行われていることが明らかになっている。

そこで相互作用の足場として重要な細胞骨格に着目し、胞から分泌された顆粒内物質を好中球が貪食している様子

マスト細胞と好中球の相互作用にともなう細胞骨格蛋白質が観察された（Data not shown）。このことから、好中球の局在変化について追究した。ここでは、様々な細胞間相がマスト細胞から放出された炎症性メディエータを貪食し互作用において、接着部位で細胞骨格蛋白質の変化が明ら

アレルギー炎症応答を制御している可能性が示唆された。

かになっている F アクチンの集積やチューブリンの極性な4. 考

どについて、共焦点レーザ顕微鏡を用いた画像解析により察追究した。はじめに、チューブリンについて、相互作用

マスト細胞と好中球との相互作用を追究するための inに伴うチューブリンの極性変化を免疫染色法によって追vitro 共存培養システムの確立に成功した。確立したシス

究したところ、共存培養を行った細胞と共存培養していな

テムを用いた解析から、好中球はマスト細胞の活性化に伴い細胞では明確な極性変化は観察されなかった（Data not

い、遊走し接着することが明らかになった。また、両者のshown）。次に、アクチンについて相互作用に伴う F アク接着部位では細胞骨格をはじめとする様々な機能分子の集チンの局在変化を、ファロイジンを用いた F アクチンの特積が起こっていることが明らかになった。さらに細胞内カ異的染色法により追究した。その結果、マスト細胞と好中ルシウムイオン動態の解析から、両細胞間ではカルシウム球が相互作用（接着）している部分で、F アクチンが顕著に

イオン動態を制御する情報交換が起こっていることも明ら集積している様子が観察された（図４）。このような接着面

かにした。そして電子顕微鏡を用いた解析からは、好中球での F アクチンの集積は、接着していないマスト細胞や好がマスト細胞の分泌メディエータを貪食することによって

中球では観察されなかった。また、マスト細胞・好中球相アレルギー応答を制御している可能性が示唆された。

互作用に関与する分子の同定についても幾つか成功してお5. 総り、マスト細胞と好中球の相互作用には、細胞骨格をはじ括めとする様々な機能分子が関与している可能性が示唆され本研究で確立した in vitro 共存培養システムは、これた。現在は、個々の機能分子について相互作用における役まで明らかになっていなかった細胞間相互作用について、

割について検討を行っている途中である。

様々な分子基盤の研究を可能にし、相互作用が担う生理機能を明らかにする上で極めて有用な研究システムであった。
本研究で確立した in vitro 共存培養システムを用い、さらに分子・細胞レベルでの研究を行うとともに、それらの知見を基盤にした in vivo 研究へ展開することによって、相互作用が担う生理機能の一端が明らかになり、皮膚の健康維持に関する戦略的な治療方法の確立を行えるものと考えられる。また in vitro 共存培養システム確立に向けた条件
検討段階であるマスト細胞と単球・マクロファージの相互作用研究においても、in vitro 及び in vivo 研究を遂行することによって、これまで不明であった、アレルギー応答に

図 4 マスト細胞と好中球の相互作用部位におけるF アクチンの集積
マスト細胞（MC）と好中球（N）の相互作用の接着部位において F アクチンの集積が観察された（矢印）。

おける単球・マクロファージの新たな生理機能が明らかになることが予想される。これらの取り組みによって、新たな視点からアレルギー疾患の原因を究明するとともに、「コ
スメトロジー」における新たな展開をもたらせるものと考− 92 −

皮膚ホメオスタシス制御に向けたアレルゲンセラピーの基盤研究とその応用えられる。

degranulation in Fyn-deficient mouse bone marrowderived mast cells. J Leukoc Biol, 88, 863-875（2010）．

謝辞5） Ikeya M, Yamanoue K, Mochizuki Y, Konishi H,
Tadokoro S, Tanaka M, Suzuki R, Hirashima N. Orai-

本研究の遂行にあたり、公益財団法人コスメトロジー研
究振興財団よりご支援を頂きましたことを、心より感謝申

2 is localized on secretory granules and regulates

し上げます。

antigen-evoked Ca

2+

mobilization and exocytosis in

mast cells. Biochem Biophys Res Commun, 451, 62-67（引用文献）（2014）．

1） Suzuki R, Leach S, Liu W, Ralston E, Scheffel J,6） Putney JW, Steinckwich-Besancon N, Numaga-

Zhang W, Lowell CA, Rivera J. Molecular editing ofTomita T, Davis FM, Desai PN, D'Agostin DM, Wu

cellular responses by the high-affinity receptor for IgE.

S, Bird GS. The functions of store-operated calcium
channels. Biochim Biophys Acta, 1864, 900-906（2017）．

Science, 343, 1021-1025（2014）．
2） Rivera J, Fierro NA, Olivera A, Suzuki R. New

7） Jaconi ME, Rivest RW, Schlegel W, Wollheim CB,

insights on mast cell activation via the high affinity

Pittet D, Lew PD. Spontaneous and chemoattractant-

receptor for IgE. Adv Immunol, 98, 85-120（2008）．

induced oscillations of cytosolic free calcium in single

3） Suzuki R. The Emerging Picture of Mast Cell

adherent human neutrophils. J Biol Chem, 263, 1055710560（1988）．

Activation: The Complex Regulatory Network of HighAffinity Receptor for Immunoglobulin E Signaling. Biol

8） Hashimoto-Tane A, Saito T. Dynamic Regulation of
TCR-Microclusters and the Microsynapse for T Cell

Pharm Bull, 40, 1828-1832（2017）．

Activation. Front Immunol, 7, 255（2016）．

4） Suzuki R, Liu X, Olivera A, Aguiniga L, Yamashita
Y, Blank U, Ambudkar I, Rivera J. Loss of TRPC1mediated Ca

2+9） Dustin ML, Baldari CT. The Immune Synapse: Past,

influx contributes to impaired− 93 −

Present, and Future. Methods Mol Biol, 1584, 1-5（2017）．

皮膚加齢における基底膜蛋白の生理学的意義の解明
北海道大学病院皮膚科夏賀健

In skin, epidermal basement membrane zone (BMZ) is served as niche for epidermal stem cells and involves inregulating cell homeostasis. Type XVII collagen (COL 17 ) is a hemidesmosomal protein located at the epidermal BMZ.
COL 17 deficiency in mice and human exhibits early aged phenotype as gray hair and hair loss. In that context, COL 17
has been known to engage in maintaining melanocyte stem cells and hair follicle stem cells. However, the role of COL 17
in regulating stem cells in interfollicular epidermis has not been elucidated. Here we show that COL 17 distribution in
epidermal basal cells is altered with aging and this change also induces epidermal proliferation. Notably, overexpression ofhuman COL 17 in aged mice epidermis restores COL 17 distribution and epidermal quiescence. These findings demonstratethat COL17 is crucial for maintaining epidermal homeostasis. Our study implicates that faulty epidermal BMZ is involved in
uncontrolled cell proliferation, phenocopying aged skin and oncogenesis.

1. 緒

層数は加齢群で増加しており、増殖マーカーである PH3、

言

BrdU、PCNA いずれでも加齢群で陽性細胞数が増加して皮膚は全身を覆う人体最大の臓器であり、外表面に位置していることから老化の表現型を容易に捉えることができいた（図 1）。

化によって維持されている。表皮幹細胞は、表皮基底膜を3. 2. 加齢に伴って毛包間表皮の COL17 の分布は変化するニッチにしており 1）、加齢においても表皮基底膜の変化が若年群と加齢群の毛包間表皮における遺伝子発現を比較る。皮膚の上皮である表皮は、表皮幹細胞の自己複製と分生じると考えられている 。本研究の目的は、加齢に伴うしたところ、分化マーカーである Ppl、Evpl はやや加齢で表皮基底膜の変化を詳細に解析し、それに伴って生じる幹低下する傾向を認めた（図 2 上）。また、幹細胞マーカーで細胞の異常を解明することである。

ある Itga6 や Itgb1 は加齢で有意に低下していたが、同様

2）

2. 方

な幹細胞マーカーである Col17a1 は遺伝子発現に変化はな

法

かった（図 2 上）。一方、COL17 の分布は、若年群で表皮

6 週 齢（ 若 年 群 ） と 18 ～ 24 ヶ 月 齢（ 加 齢 群 ）野 生 型（C57BL/ 6）マウスを安楽死させ、掌蹠皮膚（毛包間表皮）をサンプリングし、凍結切片あるいはパラフィン固定切基底細胞を取り囲むように分布するのに対し、加齢群では
表皮真皮境界部に局在するようになった（図 2 下）。

RT-PCR、定量 PCR を行った。同様に、ヒト 17 型コラー

3. 3. COL17 の強制発現によって、加齢に伴う毛包間表皮の過増殖は消失する

ゲン（COL17）を表皮特異的（K14 プロモーター）に強制発現

COL17 の加齢における役割を明らかにするため、加3）させる K14-hCOL17 マウス 皮膚についても、組織学的解

齢した K14 -hCOL17 マウス毛包間表皮を解析したところ、析を行った。同マウスは、Kim Yancey 教授から供与された。

対照群と比較して K14-hCOL17 マウスでは表皮層数が減

BrdU 標 識 の た め、8.33 µg/g の BrdU（BD Pharmingen）

少し、各種の増殖マーカーの陽性細胞数も減少していた（図を安楽死の４時間前にマウスへ腹腔投与した。

3）。

片を用いて組織学的解析を行った。また、RNA 抽出から

3. 結

4. 考

果

3. 1. 加齢に伴って毛包間表皮は過増殖する

察

本研究により、加齢によって毛包間表皮は過増殖に至ること、

若年群と加齢群の毛包間表皮を比較したところ、表皮COL17 に代表される表皮基底膜領域蛋白の分布が変化すること、COL17 を表皮で強制発現させることによって加齢による過増殖の表現型が解除されることを明らかにした

Identification of physiological roles of
epidermal basement membrane zone
proteins on skin aging
Ken Natsuga
Department of Dermatology, Hokkaido
University Hospital（図 4）。毛包幹細胞では、タンパク分解酵素 ELANE の活性が上昇することによって、COL17 が加齢に伴って減少するとされるが 5）、毛包間表皮での ELANE の発現は確認できなかったため（data not shown）、毛包と毛包間表皮における COL17 の制御は異なるものと考えられた。本研究− 94 −

皮膚加齢における基底膜蛋白の生理学的意義の解明

図 1 加齢による毛包間表皮の増殖能の変化（文献 4 から改変）
BM: basement membrane, E-cad: E カドヘリン , PI: 核染色図 2 加齢毛包間表皮における遺伝子発現解析と COL17 の分布（文献 4 から改変）− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図 3 加齢した K14-COL17 マウス毛包間表皮の解析（文献 4 から改変）

図 4 毛包間表皮の加齢の模式図（文献 4 から改変）− 96 −

皮膚加齢における基底膜蛋白の生理学的意義の解明

Dermatol Symp Proc 14: 2-7, 2009と、毛包における COL17 の抗加齢効果を報告した先行研5）によって、COL17 が皮膚の老化を抑える重要な分子

3） Nishie W, Sawamura D, Goto M, Ito K, Shibaki

であることが解明された。今後は、COL17 の発現を調整

A, McMillan JR, Sakai K, Nakamura H, Olasz E,する抗加齢医学の進歩が望まれる。なお、本報告書に記載

Yancey KB, Akiyama M, Shimizu H: Humanization of究

4）autoantigen. Nat Med 13: 378-383, 2007

した実験結果を含む内容で、2017 年に論文発表した 。

4） Watanabe M, Natsuga K, Nishie W, Kobayashi Y,
謝辞Donati G, Suzuki S, Fujimura Y, Ujiie H, Shinkuma S,
Nakamura H, Murakami M, Ozaki M, Nagayama M,

本研究をサポートしてくださった公益財団法人コスメト

Watt FM, Shimizu H: Type XVII collagen coordinates

ロジー研究振興財団の関係者の皆様に深謝いたします。

proliferation in the interfollicular epidermis. Elife 6:（引用文献）

e26635, 2017

1） Watt FM, Fujiwara H: Cell-extracellular matrix

5） Matsumura H, Mohri Y, Binh NT, Morinaga H,

interactions in normal and diseased skin. Cold Spring

Fukuda M, Ito M, Kurata S, Hoeijmakers J, Nishimura

Harb Perspect Biol 3: a005124, 2011

EK: Hair follicle aging is driven by transepidermal2） Amano S: Possible involvement of basement
membrane damage in skin photoaging. J Investig− 97 −

elimination of stem cells via COL1 7A1 proteolysis.
Science 351: aad4395, 2016

生体皮膚「質感」「機能」二光子イメージングによる化粧品作用の評価システムの確立
自治医科大学分子病態研究部

西村智

We visualized skin-lesions in living mice by two photon microscope, and observed inflammatory responses after scratch
injuries. We also developed hand-held skin imaging device which can cover broad time-and-space scale. System can be
minimized to hand-held size, and weighs less than 300 g. This device can replace current pathological and radiographic
examination, and daily outpatient skin lesion observations. Skin barrier or immune functions can be recorded with outlooks
in real-time, after skin treatment or drug administrations.

1. 緒

微鏡を用いて皮膚観察を行った。マウスの広い皮膚を観察

言

対象とする際でも、三次元的な取得情報を増やしていく際

我々は非線型光学現象を用いたイメージングシステムにには、生物用の瞳の小さい顕微鏡レンズや光学系、現在のより、多様な疾患領域でのバイオイメージングを行ってい

サイズの素子を用いるとかならず一定の理論的限界が存る。基礎的には、血管イメージングでは生体スキャンの高在することが初期検討で明らかになった。生体の質感を十

速性を活かして、リアルタイムで広視野・高解像度でのイ分に表すことはしばしば困難であった。皮膚外観はミクロ

メージングを行っている。本研究ではまず生体皮膚に特化での質感と、マクロでの大きな形態情報、の両者が重要でして二光子顕微鏡をベースとしたイメージングデバイスのあり、二光子顕微鏡での視野の狭さは大きな限界であった。

作り込みを行った。元来、生体皮膚はイメージングの良い

従来の観察システムは、高解像度では 0.1 mm 視野であり、適応であり、皮膚疾患の治療から化粧品作用の検証まで広

サイズを広げていくと画質・解像度の劣化が著明であった。

く用いることができた。二光子顕微鏡では生体親和性が高

皮膚全体、マクロ・ミクロの統合的な外見解析のためにく、平均エネルギーの低い近赤外レーザーで局所的に光励

は、広視野・高解像度の光学的な両立が欠かせない。従起が可能であり、生体皮膚の良好な画像が我々のシステム

来の顕微鏡では、光路がわずか φ25 mm に固定されており、でも得られた。同時に、生体皮膚に傷害をくわえ、創傷治

なおかつ視野範囲と解像度にはトレードオフが存在してい癒の全過程をイメージングするなど、皮膚機能や外観の解た。ダーマトグラフィとして使用するためには視野範囲の析が行われた。

拡大が必須と考えられるため、その制約を外すことを検討

一方で、皮膚科外来診療での皮膚病変の観察・記録や、した。一眼レフカメラ、半導体用レンズ、あるいは、天体あるいは、美容分野での皮膚観察に焦点をあて、最小化し望遠鏡のようなサイズの光学系を考えると、マウスのマクた顕微鏡システムを開発した。本システムでは、手持ちサロ観察に必要な要件を達成することができる。そこで、
我々

イズで、完全オートフォーカス、完全オートシャッター、は、・広視野・低倍率・高 NA レンズによる顕微鏡ミクロイ

無限焦点可変、無限倍率可変を実現した。一見、荒唐無稽

メージングにみえる広スケールのイメージングを新規光学デザインに・低 F 値・高倍率・低収差マクロレンズによる体表スキより可能にしているため、独自性が高く今後の展開に期待ャンが持たれた。

を行った。

2. 二光子顕微鏡による生体皮膚観察について（方法・結果）三次元的な光線追跡再現まで視野にいれ生体皮膚質感のミクロ情報は主に二光子顕微鏡を用いてスキャンを行った。

まず、我々は、血管イメージングで実績のある二光子顕皮膚に最適化を行い、空間解像度 200 nm、30 fps でのリ
アルタイム４色イメージングを皮膚で達成した。
図 1・図 2 のように手指や腹部皮膚のイメージングを行い、体表面から皮膚角質全層、さらには、皮下結合組織・血管

Development of two photon microscopeand imaging systemfor evaluation of skinoutlooks and functions after treatment.
Satoshi Nishimura
Jichi Medical University

まで可視化が可能であった。画質は観察部位に大きく依存したが、皮膚前処置や皮膚表面のコーティング、液浸レンズの使用により改善が可能であった。
さらに図３のように固定処理を行えば、特定のタンパク− 98 −

生体皮膚「質感」「機能」二光子イメージングによる化粧品作用の評価システムの確立

図 1 マウスの足の指表面の二光子励起顕微鏡画像
CAG-eGFP マウスに Rhodamin-B デキストランを静脈注射後、麻酔下で顕微鏡ステージに乗せ、足指先皮膚の深部観察を行った（緑：表皮・機械受容器、赤：血流）。指先の皮膚は0.2 mm 程の厚い表皮に覆われており、その下には触覚受容器様の小体（被包神経終末）と思われる構造物が観察できた。

図 2 マウス腹部の皮膚の二光子励起顕微鏡画像
CAG-eGFP マウスに Rhodamin-B デキストランを静脈注射後、腹部を脱毛し、麻酔下で腹部皮膚の深部観察を行った。図１の指先の画像とは異なり、腹部では皮膚真皮のコラーゲン
線維網（白）が、第２高調波測定により詳細に観察できた。また、コラーゲン線維に密に包まれて点在する毛包受容器（緑）や血管の走行（赤）も詳細に観察できた。

図 3 皮膚の免疫染色画像
マウスの脚を脱毛処理した後、4 mm 角の皮膚を採取して凍結標本を作成した。免疫組織化
学により皮膚断面の構造を共焦点顕微鏡により観察した（青：核、緑：TRPV4 チャネル、赤：アクチン）。触覚受容体の１つである TRPV4 チャネルを染色したところ、表皮・毛包受容器
もふくむ皮膚構造だけでなくチャンネル分布もイメージングが可能であった。毛根部位は細胞骨格のアクチンフィラメントを多く発現しており、Rhodamin-pholloidine 色素により観察可能であった。

− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

質の分布をホールマウントでも切片でも高解像度での皮膚
表面での画像化が可能であった。
また、我々は皮膚の機械的傷害を加え実時間で、皮膚反3. 手持ちサイズシステムによる生体皮膚観察について（方法・結果）応を観察し、炎症性の細胞浸潤を画像としてリアルタイム

若年群と加齢群の毛包間表皮を比較したところ、表皮生にとらえている（図 4）。化粧品や美容処置、薬剤投与によ体皮膚観察では、現在ダーマトスコープが頻用されている。

る反応観察にも活用可能と思われた。

しかし、イメージングへのニーズは幅広く十分なソリュー

本システムはきわめて量子効率の高い高感度検出器・フションとはいえない。ユーザー（美容医、皮膚科医、化粧ェムト秒レーザーを用いており、可視化に伴う生体への影品メーカー）の声をまとめていくと、おそらく響は最小限である。マウスにおいて安全性を担保すれば、小さいものから大きなものまで撮影したい

ヒトにも理論的には用いることができる。しかし、解像度高解像度撮影を簡単に手持ちで行いたいを維持するためにはある程度のサンプル側への制約がある。

フォーカシングや位置だしから解放されたい

システムのサイズやコストからもヒトへの応用にはやや遠手ぶれはいやだ

いと考えられた。なおかつ、極端に広い視野での画像取得

調節ダイヤルをあつかいたくないは技術的に困難であり、体表面や皮膚病変全体の一度でのコストは最小限にスキャンは困難である。そこで、次項ではマクロ・ミクロの両極端での広いスケールを網羅しながらも、手持ちサイズで運用可能なシステム開発を目指した。

といったところと予測された。
ダーマトスコープを補完するためにズームタイプのシス
テムが考えられる。しかし、従来のズーム型の顕微鏡やマ

図 4 皮膚傷害後のリアルタイムイメージング
フレーム間隔は５分。実時間での細胞浸潤が二つの画像例からもよみとれる。より長期には、皮膚の線維化、創傷治癒、炎症反応のすべてを可視化可能とおもわれた。美容処置・化粧品や薬剤投与後のリアルタイムイメ
ージングとしても活用可能である。

− 100 −

生体皮膚「質感」「機能」二光子イメージングによる化粧品作用の評価システムの確立

クロズームレンズでは、ズーム両端（実質的な常用域）ではだけでなく、深部構造の情報まで得られており、顕微鏡結収差により解像度が低下し、像も明るくない。また、これ像の特性が生かされている。

らのカメラ部品は調節箇所が多く、不安定な皮膚を対象と

4. 考察および総括

するとハンドリングがきわめて困難である。そこで、我々はあらたな光路設計、結像設計をデザインし、マクロミク

生体二光子顕微鏡観察がごく低侵襲な赤外レーザーでも可能

ロを完全にオーバーラップした撮影を可能にした。リアルであることの実証が行われた。これは、美容処置・薬剤投与をタイムで高速で像モードを切り替え、フォーカス、ズーム、行った際の皮膚反応を実時間で観察できるということを意味し

像モード転換を一度に行っている。ユーザーの操作部をほている。ヒトにおいても、無染色でも同様のイメージングは理ぼフリーにしているが、解像度やシステム重量とのトレー論的には可能である。残るは、長期的な安全性評価だが、理論ドオフを避け、実効的提案とした。

的には自然光とかわらない範囲と予測できる。化粧品をほどこ最小化した顕微鏡システムでの超高解像度と超広視野のした際に、どのように皮膚のミクロな変化がおきるのか、アレ

両立例。生体観察をリアルタイムで行えるため、図５のよルギー反応はおきていないのか、といった評価が行われるため、

うに皮膚観察が可能になった。マクロミクロの網羅、全焦開発研究にも用いられる。同時に、皮膚科診療にも大きなメリ点位置での撮影・無限大ズームファクターの恩恵に簡単にットが予測される。悪性腫瘍の鑑別だけでなく、乾癬をはじめあずかれるようになっている。一本一本の毛根、毛包構造、とする皮膚の機能的診断にも本システムは有用と考えられた。

そこにある細胞輪郭まで無染色で可視化されている。表面

図 5 生体・ヒト皮膚観察のリアルタイムイメージング− 101 −

皮膚の恒常性維持における転写補助因子 MRTF-A/B の役割
大阪大学大学院・医学系研究科

林

謙一郎

Skin fibroblasts themselves are the cells that produce extracellular matrix (ECM), but their ability to produce ECM andmotility are low under the normal conditions. In contrast, when skin tissues are injured, they are changed to myofibroblasts.
Myofibroblasts exhibit an enhanced motility and accumulate at the injured area. There, they vigorously produce ECM
for wound healing. Such phenotypic modulation of skin fibroblasts is caused by the inflammatory response as follows.
Skin injury activates the secretion of inflammatory cytokines such as transforming growth factor-βs (TGF-βs) frominflammatory cells and the normal skin fibroblasts stimulated by these cytokines are converted into myofibroblasts.
However, this mechanism has not been fully characterized. In this study, I addressed this molecular event and found thatfactor X (anonymity because of unpublished results) plays a critical role in the myofibroblastic phenotypic modulation ofskin fibroblasts. Novel findings revealed by this study are as follows: 1 ) Myocardin related transcription factors A andB (MRTF-A/B) play a critical role in exhibition of myofibroblastic phenotype of skin fibroblasts, 2 ) In skin fibroblasts,
MRTF-A/B are usually localized in the nuclear but their functions remain inactivated because of low level expression offactor X, 3 ) The expression levels of myofibroblasts markers such as αSM-actin and collagens are up-regulated concomitantwith the increase in the expression of factor X in TGF-β-stimulated skin fibroblasts, 4 ) siRNA-mediated knockdown offactor X suppresses the TGF-β-induced up-regulation of these myofibroblastic markers, 5 ) Factor X binds to both of serum
response factor (SRF) and MRTF-A and activates the SRF/CArG-box mediated transcription.

1. 緒

αSM-actin 及びコラーゲンの発現増強は筋線維芽細胞マ

言ーカーとして知られている。これらの遺伝子の転写調節領

皮膚は表皮と真皮の 2 層構造になっており、外部からの域（プロモーターやそれと関連した領域［イントロン］）に刺激（紫外線、乾燥や温度変化）
から、内部の器官を守り、は CArG-box と呼ばれる転写因子、serum response factor

体温の調節や体内の水分・体液を保持するバリア機能を果（SRF）の結合サイト（シスエレメント）が存在し、SRF/

たしている。表皮層はケラチノサイトとそれが分化（角化）

CArG- box を介して正の転写制御を受ける 3）。この転写

し上層へ移行した細胞（角質化細胞）から構成されている。

制 御 に は SRF の 転 写 補 助 因 子 で あ る myocardin related

表皮構成細胞はケラチンを多量に含みバリア機能と体内のtranscription factors（MRTF-A 及び MRTF - B［MRTF-A/

水分が過剰に蒸散するのを防ぐ保湿機能を担っている。真B］）の活性化を必要とする。一般的には MRTF-A/ B は

皮層は細胞外マトリクス（ECM）（コラーゲン、エラスチン、

細胞内に局在し、Rho の活性化による細胞内での単量体

ヒアルロン酸）とこれらを産生する線維芽細胞から構成さG - actin 量の減少（アクチンダイナミクス）に伴い一過性に1）れ、皮膚の形状維持や弾力性を保つ機能を果たしている 。

核内移行する。核内で SRF は MRTF - A または MRTF-B

線維芽細胞は ECM 産生細胞であるが、炎症のない正常状と複合体を形成し CArG-box に結合することで SRF の転態ではこの活性は弱くかつ細胞運動能も低く保たれている。

写因子としての機能を活性化させる。我々の研究グループ

しかしながら、創傷による炎症反応が起こるとマクロファ

はこのアクチンダイナミクスに依存した MRTF- A /B の活ージなどの炎症細胞からサイトカイン（TGF-β など）が分泌性化（核内移行）の分子機構を解明した。この概略を以下にされる。これらの刺激を受けた線維芽細胞は ECM 産生能

記す。MRTF -A / B の核移行シグナル（NLS）は N 末に存在及び運動能の亢進した筋線維芽細胞に形質転換し創傷治癒する G - actin 結合ドメイン（RPEF motifs）の間隙に位置すを促す 。治癒が完了した後は TGF-β 受容体の発現低下にるため G - actin 量の多い状況下では G -actin と RPEL motifs

より筋線維芽細胞の形質発現は減衰し、正常線維芽細胞へとの結合が優先し、importin α / β1 と NLS との結合は拮抗戻る。

的に阻害される。このため、MRTF - A /B は細胞質に留ま2）る。一方、G - actin 量が減少した状況下では importin α /β1と NLS との結合が可能になり、核内移行する 4）。核内から核外への移行は Crm1 を介して行われる 5）。
The roles of MRTF-A/B in the homeostasisof skinKenʼichiro Hayashi
Graduate School of Medicine, Osaka
University

MRTF -A / B の 活 性 化 は SRF / CArG -box を 介 し た 転写を促進し、細胞骨格タンパク質及びコラーゲンなどのECM やその受容体タンパク質（integrin など）の発現を誘導する。その結果、細胞運動が亢進する。しかしながら、− 102 −

皮膚の恒常性維持における転写補助因子 MRTF-A/B の役割

コスメトロジーの観点から皮膚における MRTF -A / B の役の形質発現が抑制されていると考えた。この仮説に立脚す

割及びその制御機構に関する研究は限定的で十分な解析はると核内での MRTF-A/B 機能 on/off 機構の存在が示唆さなされていない。MRTF -A/B による細胞機能制御が皮膚れた。本研究では皮膚線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質の恒常性維持に関わり、傷害に応答した創傷治癒や老化転換における核内での MRTF - A / B の機能制御に焦点を当

または紫外線による皮膚機能低下と MRTF-A/B の制御がて解析を行った。

連携すると考えた。この可能性を探究し、コスメトロジー

2. 方に新たな研究視点を導入することを目指して本研究を開始した。本研究を立案した時点で初代培養正常皮膚線維芽細法

2. 1. 細胞培養

胞では他の培養細胞とは異なり Rho の活性化に依存せず

ヒト初代培養皮膚線維芽細胞（ATCC CRL-2072）を種々

MRTF - A/B は恒常的に核局在することを見いだしていた。

の ECM でコートした培養プレートに接種し DMEM-10%

炎症に伴う筋線維芽細胞の慢性的な活性化は線維化疾患

FCS で培養を行った。

（肝硬変、肺腎線維症や強皮症）
惹起の要因であると考えられている。筋線維芽細胞のオリジンとして正常線維芽細胞

2. 2. 遺伝子及びタンパク質発現解析の他、間質細胞、血中に存在する骨髄由来の幹細胞や上皮・細胞運動や ECM 産生の関わる遺伝子の発現を mRNA 及内皮細胞が知られている。上皮・内皮細胞から筋線維芽細びタンパク質レベルで解析した。解析方法として定量的胞への形質転換は上皮・内皮間葉転換という概念として研リアルタイム RT - PCR（RT - qPCR）法及びイムノブロッ

究が進められており、この場合も TGF- β を介したシグナ

ト法を用いた。指示された条件化で培養した皮膚線維芽ル伝達系の関与が明らかにされている。しかしながら、筋細胞から RNA を抽出・粗精製した後、cDNA 合成を行い、線維芽細胞への形質転換の分子機構の完全解明には至って

SYBR Green により増幅遺伝子を検出する RT - qPCR を行

いない
（図１）
。

った。イムノブロットの場合は 2 % SDS サンプルバッファ

前述したように、正常皮膚線維芽細胞では MRTF-A/B

ーで溶解させた細胞総抽出液を SDS- ポリアクリルアミドは恒常的に核局在するため、筋線維芽細胞への形質転換の電気泳動で含有されているタンパク質を分離後、ウェスタ

過程での MRTF-A/B の活性化は細胞内局在変化では説明

ンブロット法により PVDF メンブレンに転写し、目的とできない。これまでに得た知見から正常皮膚線維芽細胞でするタンパク質の抗体を用いてイムノブロットを行い解析は MRTF-A/B が恒常的に核局在するが、筋線維芽細胞様した。

図 1 筋線維芽細胞への形質転換経路の概略− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

2. 3. siRNAの導入因子である MRTF-A/B の発現を siRNA の導入によりノッsiRNA はシグマアルドリッチ社から購入した。siRNAの細胞への導入は Lipofectamine RNAiMAX を用いた。

クダウンさせた。この結果、α SM - actin 及びコラーゲンの発現は著明に低下し、細胞運動能も低下した（創傷治癒アッセイによる）（図 2）。

2. 4. プロモーターアッセイ

以上の結果から、通常の培養条件下では皮膚線維芽細胞

レポーターとして 3×CArG-luciferase3） を用いて SRF/

は筋線維芽細胞様の形質発現することが判明し、この形質

CArG- box を介した転写活性の定量的解析を行った。こ

発現は MRTF - A / B に依存することが明らかになった。培のレポーターと指示された発現 plasmids を培養細胞に導養条件が皮膚線維芽細胞の形質発現に及ぼす影響を検討す

入し、48 時間後に転写活性を計測した。導入効率の違いる目的で ECM コートしたプレートで培養を行い筋線維芽による luciferase 活性のばらつきを補正する目的で SV40細胞のマーカーの発現を検証した。ECM としてコラーゲ

プロモーターから転写される β -galactosidase 発現ユニッ

ンゲル、コラーゲンフィルム（希釈したコラーゲンを薄くコ

トがコードされた補正用 plasmid も共に導入した。SRF/

ーティング）及びマトリゲルを試した。いずれの ECM でコ

CArG- box を介した転写活性は β -galactosidase 活性で補ートしたプレート上で培養した皮膚線維芽細胞では著明な正した luciferase 活性に基づき比較した。

筋線維芽細胞マーカーの発現低下が認められた。筋線維芽細胞マーカーの発現低下は基質の硬さに影響されなかった

2. 5. 細胞運動能の解析（軟らかい基質：コラーゲンゲル及びマトリゲル；硬い基質：

二次元的な細胞運動は創傷治癒アッセイにより解析を行

コラーゲンフィルム）。これらの実験結果から接着した基質った。100 % コンフレントな培養細胞の培養プレートをスの硬さではなく ECM との接着が筋線維芽細胞様の形質発クラッチして一定サイズの帯状の創傷を作成し、細胞遊走現を抑制していることがわかった。一般的に MRTF-A/B

によってふさがる様子を観察した。細胞遊走を定量化するの機能発現は細胞内局在変化に依存しているため、上記のため、スクラッチ前と一定期間後の同視野を撮影し遊走面

結果は MRTF - A / B の細胞内局在変化に起因する可能性が積を計測した。

考えられた。このため、MRTF - A / B それぞれの抗体で免疫染色を行い、細胞内局在を検証した。この結果、皮膚線

2. 6. 細胞染色

維芽細胞では恒常的に MRTF - A は核に MRTF - B は核と種々の条件下で培養した皮膚線維芽細胞を 4 % パラホル

細胞質の両方に局在することが判明した。EMC の有無にムアルデヒドで固定し、指示された抗体で免疫染色を行っ関わらず、いずれの培養条件下でも MRTF-A/B の局在にた。Alexa Fluor 568 で標識された２次抗体を用いて標的は相違が認められなかった（図 3）。従って、MRTF -A/B

タンパク質を検出した。同時に Hoechst 33342 で核を染色の細胞内局在制御ではなく核内において MRTF-A/B の機した。

能を直接制御する機構の存在が示唆された。

2. 7. タンパク質－タンパク質相互作用

3. 2. 皮膚線維芽細胞の形質発現制御因子の探索と検証

In vitro 転写・タンパク質合成システム（Promega）を用いて調製したそれぞれの Tag 付きタンパク質溶液を混合

更なる検証のため、細胞運動や筋線維芽細胞への形質転し、指示された Tag 抗体を用いて免疫沈降を行った。共換に関連する遺伝子発現の ECM 依存性を RT - qPCR によ

沈降した分画に存在するタンパク質を SDS - ポリアクリル
アミド電気泳動で分離後、ウェスタンブロットを行い、指示された Tag 抗体を用いたイムノブロットによりタンパ
ク質 - タンパク質相互作用を解析した。

3. 結

果

3. 1. 培養条件に依存した皮膚線維芽細胞の形質発現
初代培養正常ヒト皮膚線維芽細胞（以降、皮膚線維芽細胞と省略する）を通常の培養条件下（コラーゲンなどのECM でコートしない培養プレート培養）で培養を行うと、
筋線維芽細胞のマーカーである αSM-actin 及びコラーゲ
ンの著明な発現が認められた。これらの遺伝子は SRF/
CArG-box を介した転写制御を受けるため、SRF 転写補助− 104 −

図 2 創傷治癒アッセイによる細胞運動能の比較
コ ン ト ロ ー ル (cntl) siRNA 導 入 し た 細 胞 の 移 動 領 域 を100% として表示 .

皮膚の恒常性維持における転写補助因子 MRTF-A/B の役割

図 3 MRTF -A の細胞内局在の比較（通常の培養プレート vs コ
ラーゲンフィルム）MRTF-B に関しても培養条件の相違による細胞内局在変化は認められない．

図 4 ECM が皮膚線維芽細胞の遺伝子発現に及ぼす影響
通常の培養プレート（ECM なし）で培養した場合を基準にした結果．
（↑：発現上昇、↓：発現減少、−：変化なし）

り比較した。この結果、細胞質と核の両方に局在するタンと結合して NFκB を介した炎症性遺伝子の発現を抑制する

パク質（未発表のため X 因子として表記）の発現が ECM 上役割を担っていることを明らかにしている 6）。皮膚線維芽で培養した場合に筋線維芽細胞のマーカーと同様に著明に細胞と血管内皮細胞の間で X 因子の発現を比較すると、血減少することを見いだした（図 4）。

管内皮細胞では X 因子の発現は極めて弱いことが判明しこの因子と筋線維芽細胞形質発現との相関を明らかにた。そこで、血管内皮細胞で 3×CArG - luciferase を用いする目的で TGF - β により誘導される遺伝子発現を解析したプロモーターアッセイを行ったところ、X 因子の発現た。通常の培養条件下で培養した皮膚線維芽細胞を TGF-β

plasmid を共発現させることで luciferase 活性の上昇が認で刺激すると、さらなる筋線維芽細胞マーカーの発現がめられた。この実験結果は前述した X 因子の機能を強く支増強される。予め、皮膚線維芽細胞に X 因子の siRNA を持するものである。

導入しておくと、この TGF- β に依存する筋線維芽細胞マ

X 因子の機能を検証する目的で in vitro でのタンパク質ーカーの発現増強が著明に抑制された。さらに、X 因子の- タンパク質相互作用を調べた。この結果、X 因子は SRF

siRNA を介したノックダウンは細胞運動能を大幅に減弱

及び MRTF-A と結合することが判明した。以上の結果かさせた。この結果から X 因子が筋線維芽細胞形質発現に重ら、X 因子は SRF/CArG-box を介した転写活性を促進さ要な役割を果たしていることが判明した。

せる機能を有することが判明した。

この X 因子の関わる現象の分子機構の解明を目指して

4. 考察・総括

解析を続けた。まず、転写レベルでの解析のためプロモ
ーターアッセイを行った。レポーターとしてベーサルプ

本研究で皮膚線維芽細胞の筋皮線維芽細胞への形質転ロモーターの上流に SRF のシスエレメントである CArG-

換には MRTF - A / B が重要な役割を担うことを明らかにし、box をタンデムに３個挿入した 3×CArG-luciferase を用いさらに細胞内局在変化以外の新たな MRTF- A / B の活性化た。皮膚線維芽細胞にこのレポーターと MRTF-A と X 因のメカニズムを見いだした。一般的な細胞では MRTF-A/子の発現 plasmids を導入すると著しい luciferase 活性の上B は細胞質に局在し、Rho の活性化した条件下でアクチン昇が認められたが、X 因子の発現 plasmid のみを導入した

ダイナミクス依存性に細胞質から核内に移行することで場合には活性上昇は起こらなかった。以上の結果から、X活性化される。しかしながら、皮膚線維芽細胞では恒常的因子の機能として MRTF-A を介した SRF/CArG - box にに MRTF - A / B は核局在するため、その活性化は細胞内のよる転写調節における正の制御が示唆された。最近の我々局在変化では説明できない。本研究での一連の解析によりの研究で、ヒト初代培養血管内皮細胞（以降、血管内皮細MRTF-A / B の活性化は皮膚線維芽細胞の筋皮線維芽細胞

胞と省略する）でも MRTF -A/B は恒常的に核に局在するへの形質転換に重要で、このプロセスに X 因子は決定的なが SRF /CArG - box を介した転写系を活性化せず、NFκB

機能を果たすことが判明した。

− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

正常皮膚線維芽細胞では MRTF -A/B は恒常的に核局在らに、X 因子の機能阻害はこれら線維化疾患の予防や治療

するが、ECM の過剰産生や細胞運動の亢進などの筋線維に応用できると思われ、新たな創薬ターゲットになる可能

芽細胞的な形質発現を発揮せず恒常性が維持される。わか性がある。このような視点から今後の研究を進めてゆきた

りやすく説明すると、創傷が癒えた後、その傷痕が少しい。

盛り上がった状態で治癒することが見られる。この盛り上がっているのが線維化した皮膚組織である。しかしなが（引用文献）

ら、傷害のない皮膚組織ではこのような状態にならず、正1） Wang Y, Viennet C, Robin S, Berthon JY, He L,

常な状態が維持される。つまり、正常皮膚線維芽細胞ではHumbert P. Precise role of dermal fibroblasts on

核局在する MRTF -A /B の機能が抑制されている。本研究melanocyte pigmentation. J. Dermatol. Sci. 88: 159-166.

ではこの抑制された MRTF-A/B 機能発現を活性化する因（2017）

子として X 因子を同定した。X 因子の発現は TGF - β に依2） Glim JE, van Egmond M, Niessen FB, Everts V,存性は発現上昇するが、ECM と接着した状況では発現がBeelen RH. Detrimental dermal wound healing: what

抑制される。従って、ECM を介したシグナル伝達系が X

can we learn from the oral mucosa? Wound Repair

因子の発現を抑制することが示唆されるが、この分子機構

Regen. 21: 648-60.（2013）の解明は今後の課題である。これまでの研究結果から、以3） Morita T, Mayanagi T, Sobue K. Dual roles of下のモデルが提唱できると考えている。正常皮膚組織のmyocardin-related transcription factors in epithelial

線維芽細胞は ECM 層に存在するため、X 因子の発現は抑mesenchymal transition via slug induction and actin

制されるため核内の MRTF -A/ B 機能は阻害された状態

remodeling. J. Cell Biol. 179: 1027‒1042.（2007）が維持され、過剰な ECM 産生や細胞運動能の亢進は抑え

4） Nakamura S, Hayashi K, Iwasaki K, Fujioka

られている。しかしながら、皮膚組織傷害による ECM 層

T, Egusa H. Yatani H, Sobue K. Importin α/β1の損傷により皮膚線維芽細胞は ECM から剥離し、さらにheterodimer-mediated nuclear import of myocardin

炎症細胞から分泌される TGF- β 刺激を受けることで X 因family members. J. Biol. Chem. 285: 37314-33723.（2010）

子の発現増強が誘起される。この結果、X 因子が SRF 及

5） Hayashi K, Morita T. Differences in the nuclear

び MRTF -A /B と結合し、MRTF-A/B 機能が活性化され、export mechanism between myocardin and myocardin-

皮膚線維芽細胞から筋線維芽細胞への形質転換が惹起されrelated transcription factors A. J. Biol. Chem. 2 8 8:る。このモデルは皮膚の恒常性維持に限定されたものでは5743-5755.（2013）

なく、筋線維芽細胞の寄与が示唆されている疾患（肝硬変、6） Hayashi K, Murai T, Oikawa H, Masuda T, Kimura

肺腎線維症、強皮症、網膜症などの線維化症やガン関連線

K, Muehlich S, Prywes R, Morita T. A novel inhibitory

維芽細胞［ガン組織の微小環境に局在する筋線維芽細胞］を

mechanism of MRTF-A/B on the ICAM-1 gene

介した扁平上皮ガンの浸潤・転移）の発症・進展にも関わり、expression in vascular endothelial cells. Sci. Rep. 5:

これらの疾患の病態解明にも適応できると考えている。さ10627.（2015）− 106 −

細胞生存促進効果を有する糖内包化リポソームのアンチエージング化粧品への応用
千里金蘭大学生活科学部食物栄養学科

日沼

州司

In this study, we examined the effect of maltose-encapsulated liposomes (ML) on cell survival of mouse fibroblast cellline L 929 sub-clone (L 929 -S) in culture with glucose-deficient media. Under our experimental conditions, almost all ofcells died within two days in culture without the addition of glucose, when cell viability was determined by trypan blue
dye exclusion test. Even in the presence of 50 µg/ml glucose or empty liposomes, almost all of cells died within a similar
range of time. Intriguingly, the combination of 50 µg/ml glucose and empty liposomes (G + L) prolonged the cell survival
one day or so, suggesting that low concentration of glucose and liposomes synergistically act on cells to promote thesurvival. However, ML promoted the cell survival evidently more than G + L. In assays using WST- 8 , ML showed greater
formazan formation in cells than the others including G + L. Therefore, the action mechanism of ML on the cell survival
was considered to differ from that of G + L. To elucidate the mechanism of ML for promoting the cell survival, we examinedby WST- 8 assays whether ML separated by a dialysis membrane (ML/cup) could influence on the cell survival. ML/cup
promoted the survival than maltose by the same treatment, suggesting that maltose consistently released from ML promoted
the cell survival. However, the cell survival-promoting activity of ML/cup was apparently less than that of ML administereddirectly to cells, suggesting that ML acted on cells by not only the sustained release of maltose but also direct incorporationof liposomes into cells. Consequently, our results suggest that saccharide-encapsulated liposomes would be applicable fordeveloping one of ingredients useful for cosmetics to activate skin cells whose metabolism lowered by such as aging.

1. 緒

取り込まれ、代謝されて ATP の産生などに働くことが知言られている。糖をリポソームに内包化して、細胞に投与

リポソームは、細胞膜や生体膜の構成成分であるリン脂

し、通常の糖の培地への添加と比較すれば、糖の投与形態

質を利用して人工的に作成するナノメーターサイズの粒子の違いによる細胞への影響の違いを明らかにすることがでである。リン脂質は、両親媒性分子のため、水中では親水きるのではないかと着想し、実験によりそれを確認するこ

基同士と疎水基同士がそれぞれ集合する性質があり、二重とにした。そこで本研究ではマルトースを内包化した直径。リポソームは内部に薬約 100 nm のリポソームを作製し、培養した L929-S 細胞

物やタンパク質などを内包化することができるため、ドラに加えた場合に、細胞の生存にどのような影響を及ぼすのッグデリバリーシステム（DDS）の搬送体として利用が期かを検討した。その結果、糖を枯渇した培地で培養すると、待されている。細胞膜は基本的にタンパク質や遺伝子は透

ML は、同等量の糖や空のリポソームを単独で加えた場合

過できないが、リポソームは細胞にエンドサイトーシスによりも細胞を長期に生存させることができることを見出し

よって取り込まれる性質を持つので、タンパク質や遺伝子た。老化によって糖の利用の効率は低下することが知られなどの目的とする物質をリポソームに内包化して細胞内にている 6）。本研究で作製した ML は、アンチエージング化

搬送することが可能である 3）。また物質を内包化したリポ

粧品の開発に利用できる可能があると考えられる。

膜構造を持つ粒子を形成する

1, 2）

ソームは徐々に分解されて、内容物を放出することから、目的物質の長期間の徐放の手段としても有用である。研究
代表者らは、リポソームの機能調節に食品成分の内包化が有用であることを見出している

2. 試料および実験方法
2. 1. リポソームの作製
リポソーム作製のための脂質としては、1, 2 - dipalmitoyl-

4, 5）

。

しかし、これまでリポソームについては、糖の細胞への

sn-glycero-3-phosphocholine（DPPC；NOF Co.）、1,2-dioleoyl

送達にリポソームを利用した報告はあまり見当たらない。グ-sn-glycero -3 -phosphocholine（DOPC；NOFCo.）、1, 2 - dioleoyl

ルコースはグルコーストランスポーターを介して細胞に-sn-glycero- 3 -phosphoethanolamine（DOPE；NOF Co.）を用いた。MLは次のように作製した。DOPC（6 mg）とApplication of saccharide-encapsulated
liposomes providing activities to promote
cell survival for anti-aging cosmetics
Shuji Hinuma
Senri Kinran University, Faculty of Human
Life Science, Department of Food andNutrition

DOPE（6 mg）の 計12 mgのDOPC/DOPEを4 mLの ク ロロホルムに溶解し、500 mLのナス型フラスコに入れて、エバポレーター（N 1000；EYELA）を使って有機溶媒を蒸発させて、5 ～ 10分フラスコを回転させながら脂質フィル
ムを形成させた。次にマルトース（和光）あるいはスクロース（2 g）を溶解したTAPSバッファー（4 mL）を加えて、− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

ボルテックス処理し、さらにスターラーで45℃、1時間撹

アンスロン試薬 1 mL に重層した。重層後、ボルテックス

拌した。空のリポソームを作製する場合は、リン酸緩衝液

により混和し、100 ℃、10 分処理した後、直ちに冷却した。

（PBS）を加えて、同様の処理をした。攪拌後、リポソー糖によるアンスロン試薬の発色は、分光光度計により 620

ム懸濁液をガラス試験管に入れて、超音波水槽（Ultrasonic

nm の吸光度を測定した。既知濃度の糖水溶液を標準検体

Cleaner VS- 100 III； ASONE）で28、45、100 Hzのサイクにして検量線を作成し、検体中の糖濃度を決定した。

ルで超音波処理を3時間行った。超音波処理後、100 nmのフィルターを装着したエクストルーダー（Avanti polar

2. 4. L929-S 細胞の培養

Lipids）による処理を行い、直径約100 nmのリポソームを

リポソームの影響を調べるための細胞としては、マ得た。その後、リポソーム懸濁液を透析膜チューブ（排除ウス線維芽細胞株の L929（JCB 細胞バンク）を当研究室

分子量1 , 000 , 000；Millipore）に入れてPBSで、4 ～ 5日間で長期培養し、糖飢餓に感受性が高くなった L929-S 細透析処理を行った。透析終了後、0 . 22 µm（Millipore）の胞を使用した。L929 - S 細胞は、グルタミンと HEPES 含フィルター処理をして滅菌し、実験に使用した。調整後

有 RPMI1640 培地（Gibco）に非働化した 10% ウシ胎児血のリポソームの粒子サイズとゼータ電位はZetasizer nano

清（FCS；Biowest）にペニシリンとストレプトマイシン

ZSP（Malvern）を使って測定した。

（Gibco）を加えた培地で、組織培養用フラスコ（Corning）
を使って継代したものを使用した。リポソーム添加実験の2. 2. リポソーム懸濁液の脂質の定量

ときは、0.25% Trypsin - EDTA（Gibco）を用いて L929-S 細作製した DOPC/DOPE リポソーム懸濁液の脂質量は、胞を剥離し、PBS（Wako）で 2 回遠心洗浄して、glucose-

sulfo-phospho - vanillin 法（7）で定量した。リポソーム懸濁

free RPMI1640 培地（Gibco）に非働化した 10% dialyzed

液からの脂質の抽出は、リポソーム懸濁液 75 µL をマイク

FCS（Gibco）とペニシリンとストレプトマイシンを加えた

ロチューブにとり、等量のクロロホルム 75 µL を加えて培地で、4 × 105 / mL に浮遊し、等量のリポソーム液（PBS

ボルテックスで 2 分攪拌した。攪拌後、遠心機（Hitachi）

で希釈）と 1：1 で混合した。必要な場合には、PBS に溶解

で 4,000 rpm、5 分遠心した。クロロホルム層をマイクロした糖を加えた。組織培養用マイクロプレート（Corning）

ピペットで別のマイクロチューブに移した。その後、得に加えて、炭酸ガス培養器で５％ CO2、37 ℃で培養した。

られたクロロホルム溶液を小型スピッツガラス試験管に半透膜で仕切った状態での ML の投与には、底面に半10 µL とり、遠心エバポレーター（CVE-200；EYELA）で透膜が張られた微量透析装置（EasyStep; Tomy）にリポ

40 ℃、10 分処理し、有機溶媒を除去した。標準検体としソーム懸濁液（100 µL）を加え、24 穴マイクロプレートてはエタノールに溶解した DOPC/DOPE 溶液を使用した。 （Corning）で培養した細胞の培養液（400 µL）に半透膜が接リポソームの脂質の定量は、次のように行った。試料にするように微量透析装置を設置して培養を行った。

200 µL の硫酸を加えて、ボルテックスで攪拌し、100 ℃
で 10 分処理後、冷水中で 5 分冷却した。1mL の Phospho -2. 5. トリパンブルー色素排除試験

vanillin reagent を加えて、ボルテックスで攪拌し、37 ℃

培養細胞の生存を確認するためにトリパンブルー色素排で 15 分処理した後、分光光度計（U5110；Hitachi）を使用

除試験を行った。培養液を除去し、細胞培養液量の 1/25

して波長 530 nm の吸光度を測定した。標準検体の検量線の 0.4 ％トリパンブルー溶液（Sigma - Aldrich）を加えたから検体中の脂質濃度を決定した。

後、倒立顕微鏡（CKX41；Olympus）で画像を CCD カメラ（Visualix - Pro2；Visualix）で撮影した。画像からトリパン

2. 3. リポソーム懸濁液の糖の定量

ブルーで染色されていない細胞の割合を、画像解析ソフト

リポソーム懸濁液の糖含量はアンスロン法により行った（画像内カウントツール４；Nihon system developer Co.）

（8）
。リポソーム懸濁液 50 µL をマイクロチューブに入れ、により解析し、細胞生存率として求めた。細胞数としては

クロロホルム 100 µL を加えてボルテックス処理した後、蒸1 画像当たり 100 個以上になるようにカウントした。

留水 300 µL を加え、さらにボルテックスで撹拌した。撹拌
後、遠心機（himac CT 13R；Hitachi）で 4 ℃、10,000 rpm、2. 6. フォルマザン生成試験

5 分間遠心し、水層を検体として使用した。リポソーム

細 胞 の 生 存 を 示 す 活 性 の 指 標 と し て、WST-8（Cellに内包されていない糖量は、リポソーム懸濁液を限外濾過

counting kit - 8；Dojindo）を利用したフォルマザン生成試

フィルター付チューブ（分子量 300,000 カット； Sartorius）

験を行った 4）。L929 -S 細胞を前述の培養条件で 96 穴マイで、4 ℃、4,000 rpm、30 分遠心し（2700；Kubota）、濾液のクロプレート（Corning）を使って、100 µL/well で培養した。

糖量から求めた。検体とアンスロン試薬との反応は、検体

24 穴マイクロプレートで培養する場合には 500 µL/well

250 µL を、小型スピッツガラス試験管に入れた冷却したで培養した。WST -8 による発色反応は、細胞培養液の− 108 −

細胞生存促進効果を有する糖内包化リポソームのアンチエージング化粧品への応用

450 nmの吸光度で、マイクロプレートリーダー（Maltiskan

3. 2. グルコース枯渇培地で培養した L929-S 細胞の生存に対するMLの影響

Ascent plate reader；Labsystems）
を使って測定した。

ML の細胞の生存への影響を調べる目的で、グルコー

1/10 量の WST- 8 液を加えて、4 時間培養後、発色反応を

3. 結

スを含有しない基礎培地で L929 - S 細胞を培養し、ML を果添加したときの影響を調べた。ML を添加すると培養 3 ～3. 1. 調製したリポソームの性状

4 日目でも細胞の生存率は 90 ％以上であった（図 3、ML）。

調製したリポソームについて性状解析した結果を表 1 に一方、何も添加しなかった場合には、3 ～ 4 日間の培養で、示した。空の DOPC/DOPE リポソームと ML のいずれも生存率は 10 ％以下に低下した（図 3、None）。興味深いこ約 100 nm のリポソームが得られた（図 1）。Z-potential はとに ML と同等量のマルトースを添加した場合（図 2、M）

マイナスの値を示したことから調製したリポソームはマイやグルコースを添加した場合（図 3、Ｇ）では、3 日目ではナスの電荷を持っていることがわかった。１回のリポソー

まだ生細胞はある程度認められたが、4 日目では生存率

ムの調製で、約 2.4 mL 程度の懸濁液を得ることができた。

は 10 ％以下に低下した。同じ培養条件で、L929-S 細胞

したがって、脂質の回収量は約 90 ％と推定された。一方、は、グルコース 1,000 µg/mL の添加では、1 週間以上、細リポソーム内包化のために投入したマルトースの回収率は胞の生存率の顕著な低下は認められなかった（未発表デー

約 50 ％と推定された。ML 懸濁液については、リポソータ）。したがって、低濃度（50 µg/mL）のマルトースやグルムに内包化されているマルトースの量は 90 ％以上と推定

コースでは L929 - S 細胞は 3 ～ 4 日でほぼ死滅することがされた。

わかった。ML と同等量の脂質量の空のリポソームを加え

本研究では、リポソームに内包化する糖として、グルコた場合には、顕著な細胞の生存促進効果は認められなかっースではなくマルトースを利用したが、グルコースは脂質た（図 3、L）。しかし低濃度のグルコースに空リポソーム

二重膜の透過性が高く、グルコースを内包化したリポソーを加えた場合（図３、G+L）には、糖や空リポソームを単独

ムの作製が困難であった。そのため糖内包リポソームを作で加えた場合と比較して、3 日目で明らかに生存を促進し製するための糖としてマルトースを使った。ML は 4 ℃でている傾向が認められた。L929 -S 細胞は、生存と増殖には安定であったが（未発表データ）、図 2 に示すように 37

十分量のグルコースが存在することが必須であるが、マル℃ではマルトースが経日的に徐々に放出されることがわか

トースでもグルコースよりも若干効率は低下するが、代替った。したがって ML は、細胞培養液中でマルトースの徐できることがわかっているので（未発表データ）、L929-S

放効果を発揮していることが示唆された。

細胞はマルトースを分解して、グルコースとして利用できると考えられる。低濃度のグルコースに空リポソームの組

表 1 調製したリポソームの性状
リポソーム

直径（nm）

Z-potential

脂質濃度（mg/mL）

マルトース濃度（µg/mL）

n

DOPC/DOPE

107.1 ± 11.6

-12.7 ± 7.4

4.6 ± 0.9

0

16

ML

99.9 ± 27.6

-16.7 ± 3.9

4.2 ± 1.8

450.4 ± 244.58

図 1 調製したリポソームの粒子径の分布
ML および空の DOPC/DOPE リポソームの粒子径を測定した結果の代表例を示した。

− 109 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図 2 ML からのマルトースの徐放ML（マルトースとして 1mg/mL）を PBS（1mL）に懸濁してエッペンドルフチューブに、37 ℃で処理後、リポソームの外に放出されたマルトース量を限外濾過処理により測定した。放出量（％）
は37℃処理する前のマルトース濃度を100％として求めた。

み合わせがそれぞれ単独で添加した場合に比較して、細胞の生存を延長する傾向が見られたことは、両者が L929 - S

図 3 グルコース枯渇培地で培養した L929-S 細胞に対する MLの生存促進作用
ML：マルトース（50µg/mL）含有リポソーム（106µg/mL）
添加；M+L：マルトース（50µg/mL）と空リポソーム（106µg/
mL）
添加；G+L：グルコース（50µg/mL）と空リポソーム（106µg/mL）
添加；M：マルトース（50µg/mL）
添加；G：グルコース（50µg/mL）
添加；L：空リポソーム（106µg/mL）
添加；None：無添加。
細胞の生存率はトリパンブルー試験により測定し、データは平均値と SD で示した
（n ＝ 3）。

細胞に対して生存延長に相乗的な働きをしていることが示唆された。しかし ML は糖と空リポソームの組み合わせよ
りもはるかに強い細胞生存促進作用を示した。これらの結果は、ML は空リポソームの組み合わせとは異なる作用機
序で L929-S 細胞の生存を延長させていることを示しているものと考えられた。

3. 3. グルコース枯渇培地で培養した L929-S 細胞のフォルマザン生成活性に対するMLの影響
WST - 8 は細胞内脱水素酵素により還元されて、フォルマザンを形成して発色することが知られているが、生細胞の指標として、一般的に使われている。そこでグルコース枯渇培地で培養した L929-S 細胞のフォルマザン生成活性に対する ML の影響の影響を調べた。複数回実験を行ったが、その結果の代表例を図 4 に示す。ML は培養 1 日目で

図 4 グルコース枯渇培地で培養した L929-S 細胞のフォルマザ
ン生成に対する ML の効果
ML、M+L、G+L、M、G、None の表記は図 3 と同じ。フォルマザン生成試験は WST-8 を用いて行った。データ（n ＝ 2）は培地のみの吸光度を測定値から引いた値の平均値を示した。誤差は平均値の 10 ％以内であった。

フォルマザン生成活性が最大に達し、培養 4 日目まで、徐々に活性は低下していったが、4 日目でもフォルマザン生成
活性が認められた（図 4、ML）。無添加（図 4、None）と空した細胞のフォルマザン生成活性に比較すると 1 ～ 4 日目

リポソームのみの添加（図 4、L）では、培養開始時点（培養ではるかに低かった。フォルマザン形成活性として見ると、

0 日目）でもほとんど検出されなかったことより、フォル

ML>M+L、G+L>M、G の強さの順になっていたが、これマザン生成は糖の代謝と密接に関連していることが示唆さ

らの結果は、トリパンブルー試験の結果とおおよそ一致しれた。低濃度（50 µg / mL）のマルトース（図 4、M）やグルていた。

コース（図 4、G）では培養 1 日目までは明確なフォルマザ
ン生成活性が認められたが、2 日目ではほとんど検出され3. 4. MLの作用機序の検討なくなった。低濃度の糖と空リポソームの組み合わせ（図ML の L929 -S 細胞に対する生存促進効果の作用機序を4、M+L、G+L）では、糖単独よりは 0 日目と 1 日目でよ明らかにする目的で、ML を培地中に直接投与した場合（図り強いフォルマザン生成活性を示したが、2 ～ 4 日目では

5、ML）と、半透膜で仕切られたカップに入れて投与した

ほとんどフォルマザン生成活性は認められなかった。し場合（図 4、ML / cup）の細胞のフォルマザン生成活性に与かし低濃度の糖と空リポソームの組み合わせは、ML 処理

える影響を比較検討した。この実験では、ML を投与した− 110 −

細胞生存促進効果を有する糖内包化リポソームのアンチエージング化粧品への応用

図 5 ML を半透膜で仕切って L929-S 細胞に投与したときの効果
ML、M、None の表記は図２、３と同じ。ML / cup は半透膜で仕切ったカップに入れて ML を投与、M/cup はマルトースを半透膜で仕切ったカップに入れて投与したことを示す。フォルマザン生成試験は WST -8 を用いて行った。データ（n = 2）は培地のみの吸光度を測定値から引いた値の平均値で示した。誤差は縦線で示した。

場合には、7 日後でも明確なフォルマザン生成活性が認め包化したリポソームも作製して、ML と同様の細胞生存延られた（図 5、ML）。半透膜で仕切られた ML を投与した

長試験を行ってみたが、スクロース内包リポソームにはグ場合（図 5、ML / cup）は、ML 粒子は半透膜を透過できな

ルコース欠乏培地で培養した L929 -S 細胞に対する細胞生

いので、ML は直接細胞に接触することはできないが、7存促進作用は全く認められなかった（未発表データ）。これ日後でもフォルマザン形成活性が検出された。この結果は、は L929 -S 細胞にはマルトースを分解してグルコースとし

半透膜を透過できるマルトースが ML から持続的に遊離し、て利用するためのグリコシダーゼが存在するが、スクロー

半透膜と透過して作用したマルトースが L929-S 細胞のフスを分解して利用するサッカラーゼが存在しないためではォルマザン形成活性の維持に働いていたことを示していないかと考えられた。どのような糖をリポソームに内包化るものと考えられた。しかし ML と比較すると ML/ cup のするとより細胞生存延長効果に有効かについては、さらにフォルマザン形成活性は半分から 1/4 程度であった。この検討する余地があると考えている。ML は、グルコース飢

ことは、ML はマルトースの徐放以外に直接細胞に接触し、餓条件下で培養した L929-S に対して、同等量のグルコー取り込まれることによって、細胞の生存延長効果を発揮しスやマルトースを添加した場合や、同等量の空のリポソーている部分もあることを示唆しているものと考えられた。

ムを添加したよりも強力な細胞生存延長効果を示した（図3、4）。興味深いことに、低濃度の糖や空リポソームをそ4. 考察および総括

れぞれ単独で加えた場合よりも、低濃度の糖と空リポソー

本研究では、L929 細胞株の sub-clone である L929 - S 株

ムを組み合わせて投与した場合の方が、単独よりも若干生を実験に使用した。L929 -S は糖飢餓に対する感受性が高存を促進する効果が認められた（図 3、4）。これらの結果は、

く、グルコース飢餓培養条件下では、約 2 日以内にほぼ死

空リポソームも糖の存在下で、細胞の生存に何らかの生存滅する性質を持つので、ML の細胞生存延長効果の判定が促進作用を有していることを示唆している。我々は、ML

やり易いので使用した。親株の L929 細胞は、グルコースに蛍光物質のカルセインを取り込ませたものを作製し、細飢餓条件下でも 1 週間近く生存が認められた（未発表デー

胞に投与すると、細胞に取り込まれることを確認しているタ）。リポソームに内包化する糖としてはマルトースを利（未発表データ）。したがって、細胞培養系に投与したリ用した（表 1）
。DOPC/DOPE リポソームに内包化するとポソームの少なくとも一部は、細胞内に取り込まれること

4 ℃では数週間安定だが、37 ℃ではマルトースが徐々に放によって、細胞生存の促進作用に関与しているものと考え出されることがわかった（図 2）。しかしグルコースを内包ている。リポソームは、リン脂質からできていているので、化した DOPC / DOPE リポソームは非常に不安定で 37 ℃処

それ自体が細胞の代謝によるエネルギー産生の原料となる理では、1 日以内にほとんどが放出されてしまった（未発とは考えにくいが、糖の存在下で細胞に取り込まれたリン

表データ）。グルコースは脂質二重層の膜を透過しやすい

脂質が代謝されて脂質代謝による脂肪酸の β 酸化の系路のので、内包化するための糖としては、グルコースよりもマ促進に働いている可能性が想像されるが、この点の検証に

ルトースの方が適当だと考えている。またスクロースを内

ついては今後の課題である。

− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

ML の細胞生存促進作用の機序を調べるためにリポソー（引用文献）

ムが透過できない半透膜で仕切った状態で細胞に投与した

１）Sessa G, Weissmann G. Phospholipid spherules

ところ、その状態でもある程度、細胞生存の延長効果を示（liposomes）as a model for biological membranes. J Lipid

した（図 5）。この結果は、ML からマルトースが徐放されRes. 1968 May;9（3）:310-8.

遊離した微量のマルトースが、細胞の長期的な生存維持に

２）Alipour E, Halverson D, McWhirter S, Walker GC.

働いている重要な機序の一つであることを強く示唆していPhospholipid bilayers: stability and encapsulation

る。この結果は、図 2 に示したように、ML が 37 ℃においof nanoparticles. Annu Rev Phys Chem. 2 0 1 7 Mayて（おそらくリポソームの分解や膜構造の不安定化により）

5;68:261-283. Deciphering the Functional Composition of

マルトースの徐放効果を示したという結果と一致していFusogenic Liposomes. Kolašinac R, Kleusch C, Braun T,

るように思われた。しかし半透膜で仕切られた ML のフォ

Merkel R, Csiszár A. Int J Mol Sci. 2018 Jan 24;19（2）．

ルマザン形成活性は、ML を直接細胞に投与した場合に比３）Amano C, Minematsu H, Fujita K, Iwashita S, Adachi

較して、明らかに低かった。この結果は ML が細胞に取りM, Igarashi K, Hinuma S. Nanoparticles containing

込まれることが、ML が十分な細胞生存促進効果を発揮す

curcumin useful for suppressing macrophages in vivo in

るためには重要であること示唆している。上述したような、

mice. PLoS One. 2015 Sep 11;10（9）J Clin Invest. 1986

リン脂質の取り込みによる糖の存在下での脂質代謝を介しJun;77（6）:2034-41.

たエネルギー産生系の亢進が ML の効果の発揮には必要な４）Fujita K, Hiramatsu Y, Minematsu H, Somiya M, Kurodaのではないかと考えている。これらの点の確認は今後さらS, Seno M, and Hinuma S. Release of siRNA from liposomesに検討が必要である。

induced by curcumin. Journal of Nanotechnology Volume
2016（2016），Article ID 7051523, 6 pages

本研究では、糖内包化リポソームの ML を調製し、糖欠乏培地で培養した繊維芽細胞に対して、強力な細胞生存促

５）Fink RI, Wallace P, Olefsky JM. Effects of aging

進効果を示すことを見出し、その機序についても一部解明

on glucose-mediated glucose disposal and glucose

することができた。糖内包化リポソームは老齢化に伴い代transport. J Clin Invest. 1986 Jun;77（6）:2034-41.

謝が低下した化粧品成分として利用できる可能性があるの

６）Frings CS, Fendley TW, Dunn RT, Qeen CA. Improved
determination of total serum lipids by the sulfo-phospho-

ではないかと期待している。

vanillin method. Clinical Chemistry vol. 18, No. 7, 1972
謝 辞７）Morris DL. Quantitative determination of carbohydrates

本研究にご協力、ご助言いただいた千里金蘭大学、藤田with Dreywood's Anthrone Reagent. Science. 1948 Mar

和代助教および大阪大学、黒田俊一教授に深謝いたします。

− 112 −

5;107（2775）:254-5.

チロシナーゼと基質複合体結晶構造解析に基づいた反応機構の解明
大阪府立大学大学院生命環境科学研究科

藤枝伸宇

Tyrosinase is a copper enzyme widely distributed in nature and has anti-ferromagnetically coupled binuclear copper ionsin the active site, where the dioxygen molecule can be reductively activated into [(µ-η 2 :η 2 -peroxide)dicopper(II)] species.
This active oxygen species play a central role in catalyzing the hydroxylation of phenols to catechols and the subsequentoxidation of catechols to o-quinones. However, the details of the binding mode of substrate tyrosine have been still a longstanding mystery to be resolved. We have reported the high-resolution crystal structures of recombinant pro-form tyrosinasefrom yellow mold. In the pro-form tyrosinase, the active site is covered by C-terminal shielding domain, which functions ascopper chaperone and can be proteolytically cleaved off to induce the catalytic activity. In this work, we have determined the
crystal structure of the active-form tyrosinase in order to compare the structures between the pro- and active-form tyrosinase.
First, the active-form tyrosinase was prepared by trypsin treatment of pro-form tyrosinase and purified by gel filtration
chromatography. The purified protein was crystallized by hanging-drop vapor diffusion method using the precipitant solution
containing polyethylene glycol. X-ray diffraction data was collected at Spring- 8 and determined the crystal structure of
the active-form tyrosinase. There was little difference in overall structures of pro- and active-form tyrosinase. We havesucceeded in determining the crystal structures of complex with inhibiters. Kojic acid was stacked on histidine coordinatedto copper ion. Based on the details of their binding modes, the reaction mechanism will be updated and discussed.

1. 緒

言

チロシナーゼはヒトからバクテリアまで幅広い生物が持
つ銅含有酵素であり、生体内でのメラニン色素の合成などに関与している。チロシナーゼは酸素を酸化剤として L-

Scheme1 Tyrosinase catalytic reaction

チロシンの水酸化反応を触媒し、生じた L- ドーパを酸化することでドーパキノンを生成する（Scheme 1）。ドーパ
キノンはその後、自己重合反応などを経てメラニンとなり、このような背景のもと、長年、チロシナーゼの酵素反応

細胞を紫外線から守る色素となる。チロシナーゼは活性中の機構について多くの研究が行われてきた。当研究室をは

心に２つの銅イオンを持ち、この銅イオンに酸素分子が結じめとし多くの研究者がモデル錯体や実際の酵素を用いた合した銅−活性酸素種オキシ体がチロシンなどフェノール

詳細な速度論的研究を行いチロシナーゼ水酸化反応の機構

類の水酸化反応を行い、続いて銅 2 価種のメット体がドーが提案されている。この機構によると基質フェノールがパなどカテコール類の酸化を行うと考えられている。そのフェノレートとして銅イオンに配位し、芳香族求電子置換

後、デオキシ体に酸素が結合し再びオキシ体が生成するこ反応によりフェノールの芳香族炭素と酸素の結合が形成さとで触媒サイクルが完了する。このようにチロシナーゼはれる。また近年、チロシナーゼの X 線結晶構造解析に成

芳香族炭素を位置選択的に直接水酸化することから、触媒功した例がいくつか報告されてきた。マッシュルーム由としての工業的利用が期待できる。一方で、生体内で皮膚来のチロシナーゼの活性中心では、２つの銅イオン（CuAの色素沈着や食品の褐変などの原因になることから、そのと CuB）がそれぞれ 3 つのヒスチジン残基に配位されてい阻害剤の開発も活発に行われている。そのためチロシナー

ることが知られている 1）。また別のグループからは活性中

ゼの反応機構を解明することは、触媒、医薬、食品など広心の金属を亜鉛に置換し、活性のない状態でのチロシナー

範疇な分野への貢献となる。特に、メラニン形成は肌のシ

ゼと基質の L- チロシンとの複合体結晶構造が報告されてミの直截的原因であり、コスメトロジーへの影響は大きい。

いる 2）。しかし、これらの結晶構造を重ね合わせてみるとCuA と ZnA でその位置が大きく異なっていることがわかり、活性のある銅イオンが結合した本来の基質結合状態でStructual Aproach to Molecular Mechanism
of Tyrosinase
Nobutaka Fujieda
Graduate School of Life and Environmental
Sciences, Osaka Prefecture University

あるかどうか明確ではない。併せて分解能も現状では詳細な相互作用が議論できるほど高くない。
一方で、当研究室では麹菌由来プロチロシナーゼの高分
解能構造解析に成功してきた 3）。プロチロシナーゼは今まで示したチロシナーゼとは異なり、銅結合触媒ドメインに− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

が近傍のシステイン残基と共有結合による架橋を形成しているが、今回このシステインをアラニンに変え架橋をなくした変異体を用いた。この変異体では活性の指標となる触媒回転数 kcat が一桁程度低下するが、活性種のオキシ体は野生型同様に生成し、他のチロシナーゼと比較しても十分高い活性を維持していることがわかっている。この変異体を用い、まずは野生型同様プロ型で精製を行った。その後
トリプシンを用いてプロテアーゼ処理を行い、ゲル濾過ク

Figure1 Tyrosinase activation

ロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーによって活性型変異体の精製を行った。これらクロマトグラフ

加え C 末端ドメインを持つチロシナーゼの前駆体型である

ィーの溶出グラフから単一の分子として活性型チロシナー

ことが明らかとなった（Figure1）。これら結果より、我々

ゼを精製できたことが確認された。精製した活性型変異体

はこの C 末端ドメインがチロシナーゼの活性中心を覆い隠の結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法によって行った。

すことで細胞毒となる酵素活性を抑えており、酵素反応が3. 結必要になると C 末端ドメインがプロテアーゼにより切断さ

果

れ活性を持つ活性型チロシナーゼとなることを提唱してきSPring-8 で X 線回折データを測定し、1.6 Å の分解能でた。本研究ではこのプロチロシナーゼからプロテアーゼ処

活性型変異体の結晶構造の決定に成功した。活性型では理によって活性型チロシナーゼを調製し、銅イオンが結合

C 末端ドメインが完全に取り除かれていることが確認でした活性型のチロシナーゼと基質との複合体結晶構造を詳き、さらには重ね合わせると全体構造はプロチロシナーゼ

細な議論が可能な高い分解能で決定し、チロシナーゼの反の銅結合触媒ドメインからほぼ変化しておらず、C 末端ド

応機構について議論することを目的とした。

メインの除去による構造変化はほぼ見られなかった。しか2. 方

し、活性中心を見てみると、銅イオンの位置に大きな変化

法が見られた。プロチロシナーゼでは CuA、CuB ともに 3

まずは常法に従い野生型プロチロシナーゼの大腸菌によつのヒスチジンが配位している構造であるのに対し、活性る発現とアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交型チロシナーゼでは CuA 側で 3 つのヒスチジンが配位し換クロマトグラフィーによる精製を行った。SDS -PAGE

た CuA1 に加えて、2 Å 離れた位置にヒスチジン 103 が外れ、で単一のバンドが見られ、プロチロシナーゼが精製できた

残りのヒスチジン２つと水分子１つが配位した CuA2 の状ことを確認した。次にプロチロシナーゼを活性型チロシナ態が見られた（Figure 2）。プロ型では C 末端ドメインにあーゼに変換するために、トリプシンによってプロテアーゼ

るフェニルアラニン 513 が活性中心に貫入しているが、活処理を行ったところ、活性型チロシナーゼは自身の持つチ性型ではフェニルアラニンが塞いでいた活性中心に水分子

ロシン残基を酸化し、その後重合によって褐変、沈殿してがアクセスできるようになり、銅に配位することでヒスチしまうことが明らかとなった。そこで野生型ではなく酵素

ジン 103 の配位が外れたと考えられる。CuA サイトの銅活性を下げた変異体を用いた。麹菌由来チロシナーゼは活イオン占有率は 20 % が CuA2、80 % が CuA1 の状態で存性中心の銅イオンに配位しているヒスチジンのうちの 1 つ

在し、CuA1 と CuA2 の間で平衡があることがわかる。

Figure2 Crystal structures of (A) pro-form and (B) active-form− 114 −

チロシナーゼと基質複合体結晶構造解析に基づいた反応機構の解明

次に基質 L- チロシンとの複合体結晶構造解析を試みた。

構造をもとに修正したチロシナーゼの反応機構は以下のよ

チロシンの濃度と浸漬時間を検討し、10 mM のチロシンうになる。活性種オキシ体のチロシナーゼに対し、チロシ溶液に 1 分間活性型チロシナーゼの結晶を浸けることでチンがこれらのアミノ酸残基との相互作用によって結合する。

ロシン複合体の結晶構造を 1.42 Å の分解能で得ることにそして CuA1 の状態から、ヒスチジン 103 が外れ CuA2 に成功した。活性中心にはチロシンに由来する電子密度がはシフトし、チロシンと結合した後、芳香族求電子置換反応

っきりと観測され、さらにチロシン溶液への浸漬時間をでチロシンの水酸化が進行する。その後カテコールの酸化10 分に延ばすと、チロシンのオルト位に水酸基に由来すに伴い、銅イオンは CuA2 から CuA1 の位置に戻り、生成る電子密度が観測され、結晶中で反応が進行することを明

物の解離を促進する。

らかにした。チロシンはヒスチジン 332 とのπ ‒ π相互作用、最後に活性種である酸素結合状態、オキシ体の構造につバリン 359 との CH‒ π相互作用、アスパラギンとセリンといて CuA1 と CuA2 で比較を検討した。活性型チロシナーの水素結合、そして CuA2 への配位結合によって活性中心

ゼではオキシ体は不安定で発生後数分で消滅するが、プロに結合していた。相互作用に関与するアミノ酸残基をアラ

チロシナーゼの状態では C 末端ドメインが酸素結合部位をニンに変えるとチロシンに対する親和性を示すミカエリス

覆い隠すためオキシ体を安定化することが当研究室の先定数 Km 値が上昇し、親和性が低下するという結果も間接

行研究によってわかっている。そこで、プロ型の変異体と、的にこれらのアミノ酸残基が基質結合に寄与していること

さらにヒスチジンを欠損させた二重変異体を用いた。二重を支持した（Figure 3）。

変異体はヒスチジンが 1 つ外れている CuA2 の状態を擬似

チロシンが配位することによって CuA2 の占有率は 20

的に生じさせるためにヒスチジン 103 をフェニルアラニン% から 30 % に増加した。さらに銅イオンを持たないアポにした変異体になる。調製後、UV - vis スペクトルからど体の結晶をチロシン溶液に浸漬したところ、銅イオンがあちらの変異体でもオキシ体の形成が確認できた。また共鳴

る場合と全く同じ場所にチロシンが結合している様子が観

ラマンスペクトルでも、サイドオン型で結合した銅酸素種

測され、チロシンは銅イオンへの配位結合がない状態で、に由来するピークが観測された。結晶構造では二重変異体

アミノ酸残基との相互作用のみによって活性中心に結合ででは銅が完全に CuA2 の位置にシフトし、酸素−酸素間のきることがわかった。これらの結果は、チロシンが銅イオ

距離は長く、銅−酸素間の距離は短く変化していた。これンに接近するという今までの定説とは逆に、銅イオンがチ

らは UV - vis スペクトルでバンドが短波長シフトしたこと、ロシンに対して接近する可能性を示唆しているものであ

ラマンスペクトルで Cu ‒ O 伸縮の値が大きくなったこととった。今回得られたチロシン複合体の結晶構造と以前報告一致する。CuA1 から CuA2 への遷移によって銅 ─ 酸素間されている亜鉛置換チロシナーゼ - チロシン複合体結晶構の結合が強まり、酸素 ─ 酸素間の結合は弱まることが示唆

造の重ね合わせを行ったところ、2 つの結晶ではチロシンされた。2 つのオキシ体を重ね合わせるとヒスチジンはほのフェノール部分はほぼ同じ位置にあり、チロシンの結合

ぼ重なっており、銅イオンが CuA1 から CuA2 に動くときした CuA2 と ZnA が同じ位置であることがわかった。こに、結合した酸素はただ引き上げられるだけでなく、片側れにより、上で述べた亜鉛イオンの位置が異なっていたのの酸素原子がチロシンのオルト位に近づくように向きが変は金属の違いによるものではなく、基質の結合によって起化することが示唆された。これらの結果から、CuA1 からこったものであることがわかった。ここまで得られた結晶

CuA2 への遷移は酸素をより活性化し反応に適した向きに変化させると予想される。

4. 考

察

このように本研究では麹菌由来チロシナーゼ変異体を用いて活性型チロシナーゼの結晶構造を高分解能で決定する
ことに成功した。また基質との複合体結晶構造を決定し、それらの結合様式を明らかにするとともに、触媒サイクル
において活性中心の銅イオンの一方が基質の結合に伴い、結合部位や配位構造を変化させ、反応を進行させるという興味深い現象を捉えることに成功した。つまり、銅と酸素が動くことで反応が進行していることが示唆された。従来、一般的に金属酵素においては、触媒に関与する金属は配位するアミノ酸残基に強固に保持されたまま機能すると考え
Figure3 Complex with tyrosine

られてきたが、近年、分析手法の発展により、反応の際に− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

金属の配位子や配位構造が大きく変化することを示す観測

はチロシナーゼの反応機構解明に貢献すると共に、金属酵結果が報告されている。アルコール脱水素酵素では基質の素における金属中心の柔軟な配位構造の重要性を示す一例

結合に伴って配位しているアミノ酸残基を変えながら反応となるものと言える。

を進行させていることが示唆され、古典的な反応機構と新しい反応機構で議論が起こっている最中である。本研究結（引用文献）

果は触媒サイクル中で柔軟に動く動的な金属中心という新

1） Ismaya WT, Rozeboom J, Weijn A, Mes JJ, Fusetti

規な機構を支持する証拠の一つになると考えられる。チロ

F, Rozeboom HJ, Wichers HJ, Dijkstra BW: Crystal

シナーゼのフェノール水酸化反応機構に関して、これまで

structure of Agaricus bisporus mushroom tyrosinase:チロシンが銅イオンに接近し、配位することで反応が進行

identity of the tetramer subunits and interaction with

すると考えられていた。しかしながら、複合体結晶構造か

tropolone, Biochemistry 50, 5477, 2011.

ら、第１段階としてアミノ酸残基によって形成されている

2） Goldfeder M, Kanteev M, Isaschar-Ovdat S, Adir

基質結合部位にチロシンが結合することが示唆された。さN, Fishman A: Determination of tyrosinase substrate-

らにこの結合したチロシンのフェノール性水酸基に対してbinding modes reveals mechanistic differences between

銅イオンが接近・配位し反応が進行することが考えられる。

type-3 copper proteinsNat. Commun. 5, 4505, 2014.

また、反応後、CuA が CuA2 から CuA1 に移動することで3） Fujieda N, Yabuta S, Ikeda T, Oyama T, Muraki N,

カテコールや o- キノンなどの配位性生産物の解離を促進

Kurisu G, Itoh S: Crystal structures of copper-depleted

していると推測される。このように、本研究で得られた結and copper-bound fungal pro-tyrosinase: insights into

果は活性中心の金属イオンが反応に伴い、大きく結合部位

endogenous cysteine-dependent copper incorporation,や配位構造を変化させるという過去に見られたことのない

J. Biol. Chem. 288, 22128, 2013.

現象を初めて直接的に観測したものである。これらの情報− 116 −

クエン酸による細胞機能の調節機構：美容および美白、老化における役割

クエン酸による細胞機能の調節機構：
美容および美白、老化における役割
国立研究開発法人国立成育医療研究センター

宮戸健二

Citric acid is a substance produced naturally in citrus fruits, such as grapefruits, oranges and lemons, and makes anaddition of sour taste to foods and drinks. Citrate synthase (CS) produces citric acid and initiates citric acid cycle (alsoknown as tricarboxylic acid cycle [TCA] and the Kreb’s cycle) that assumes respiratory activity in mitochondria of all
types of cells. In general, chemical properties of CS are beneficial for skin care and often contained in skin care products;
however, its cosmetic effect is still unproven scientifically. To address this issue, we studied a physiological role of citricacid by producing mice lacking a gene encoding extra-mitochondrial citrate synthase (hereafter, eCS). eCS proteins are
expressed in several types of cells such as neurons, sperm and hair sheath cells in mice. The eCS proteins are also producedin human cells; nonetheless, its biological role is unclear. From general knowledge about citric acid, we assumed that eCS
deficiency might reduce cellular activity, presumably causing metabolic problems. Expectedly, eCs-deficient mice exhibited
hypopigmented hairs due to the reduction of cellular activity of melanocyte stem cells, regardless of male or female.
Furthermore, the frequency of mating behavior of the male mice was low, and their sperm-fertilizing ability decreased agedependently, resulting in male subfertility. Moreover, graying hairs went age-dependently forward to white hairs in addition
to hair loss. Interestingly, the supplementation of cyclic AMP (cAMP) improved lower cellular activities in sperm andmelanocytes isolated from eCs-deficient mice under the in vitro condition, although the supplementation of citric acid was
unaffected. We discovered the role of eCS in pigmentation and reproduction. We further propose that enhancement of eCS
activity (or local application of cAMP) not only suppresses hair graying, but also improve male sexual dysfunction.

1. 緒

られる。

言

クエン酸は柑橘系果物の果汁の主成分だけでなく、補助クエン酸は、細胞内小器官であるミトコンドリアで働く

食品（サプリメント）としても販売されており、容易に体内

クエン酸回路（TCA 回路または Krebs 回路）を動かす 8 種に摂取することができる。さらに、クエン酸には様々な効

類の酸のうちの 1 つである。酵母からヒトまで、真核生物能があることが知られている。最も知られているのは疲労のあらゆる細胞がミトコンドリアをもっており、クエン酸

回復効果であり、クエン酸には筋肉における乳酸の濃度を合成から始まるクエン酸回路によって細胞のエネルギー低くする作用が知られている。また美容に関しても、皮膚源であるアデノシン三リン酸（ATP）が産生される。一方、の弾力性を高める作用が知られている。一方、クエン酸

細胞質にはクエン酸回路の前段階にあたる解糖系が存在し、摂取によって癌細胞が形成されにくくなるといった作用

クエン酸回路に比べて効率が悪いものの ATP を産生するが知られている。それ以外にも、骨粗鬆症の予防効果、高ことができる。

血圧の予防効果。通風や結石の改善効果などが知られてい多くの細胞では、好気的条件下ではクエン酸回路を使っる。しかしながら、実はクエン酸の効能については実際た ATP 産生が行われる。一方、癌細胞では好気的な環境に証明された例は少なく、科学的根拠が乏しいのが現状で下であっても解糖系を使って ATP が産生されることが知ある。例えば、クエン酸の作用として知られる「疲労回復」、

られており、Warburg 効果（ワールブルク効果、または好「筋肉や神経の疲労予防」について、科学的に検証を試みた

気的解糖）と呼ばれ 1，2）。癌細胞において Warburg 効果がものの証明に至らず、最近では否定的な見方もされている。

生じるメカニズムは未だに不明であるものの、解糖系からさらに、クエン酸を主成分とする医薬品がないことも、ク

クエン酸回路への切り替えにはクエン酸合成が必須である

エン酸の健康への効果が疑問視される一因となっている。

ことから、クエン酸合成酵素の何らかの機能異常または機能獲得が Warburg 効果を引き起こしている可能性が考え

ただし、クエン酸による細胞毒性は報告されておらず 3）、クエン酸が細胞の呼吸活性の制御に必須であるという事実については疑う余地がない。そのため、クエン酸を効率よく細胞に摂取する方法、または、細胞内におけるクエン酸

Regulation of cell function by citric acid:
Roles in beauty care, skin whitening andanti-aging
Kenji Miyado
National Research Institute for Child
Health and Development

合成酵素の活性を上昇させる方法（例えば、食材や飲料成分）が明らかになれば、クエン酸は「若さの持続」のカギを握る物質として再認識されるかもしれない。そこで本研究
では、クエン酸の健康や美容における効果を科学的に検証するとともに、クエン酸の摂取方法およびクエン酸合成酵− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

PVDF 膜を 1 次抗体（抗 eCS 抗体、抗 DCT 抗体、抗 β - アク素を活性化させる物質の同定についても検討した。

2. 方チン抗体）を含む 1% スキムミルク溶液中で室温 2 時間振法

盪させ、セイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼ（HRP）を

2. 1. 遺伝子改変マウスの作製結合させた 2 次抗体を含む 1% スキムミルク溶液中で室温

クエン酸合成酵素（citrate synthase、以下 CS）は、ミト

2 時間振盪させた。1%Tween 20 溶液によって洗浄した後、コンドリア内に存在する酵素であるが、一方ではミトコン

Enhanced ChemiLuminescence（ECL）Plus 検 出 試 薬 を

ドリア外の細胞質にも存在する。しかしながら、このこと用いて目的のタンパク質を検出した。

はあまり知られていない。我々は、ミトコンドリア外に3. 結存在する CS（extra-mitochondrial CS、以下 eCS）をコードする遺伝子を欠損させたマウス（eCs 遺伝子欠損マウス）を作製して解析を行った。eCs 遺伝子欠損マウスは米国の果

3. 1. eCs 遺伝子欠損マウスにおけるメラニン色素産生異常

Knockout Mouse Project（KOMP）Repository に 作 製 を

CS は、ミトコンドリア内に存在する酵素である一方、依頼した。作製されたヘテロ欠損マウスの交配によってホミトコンドリア外の細胞質にも存在するが、このことはあモ欠損マウスを作製した。マウスの飼育および関連するすまり知られていない 4）。CS はすべての細胞の呼吸系を司べての実験は国立成育医療研究センター研究所・動物実験

る酵素であるため、CS 変異マウスは発生初期の段階で致規則に基づいて行った（機関内承認番号 #2004-04）。

死になるはずである。そのため、Cs 欠損マウスを用いて成体におけるクエン酸の役割を解析することは困難である。

2. 2. 色素細胞（メラノサイト）の体外培養

ただし、マウスでは、CS 以外に、ミトコンドリア外 CS（eCS）

eCs 遺伝子欠損マウスの胎仔から皮膚を分離した後、コをコードするもう１つの遺伝子（eCs）が存在する。そこで、ラゲナーゼ処理によって組織片からメラノサイトを単離し常法に従って胚性幹細胞を用いて eCs 遺伝子欠損マウスをた後、培養シャーレに播種した。細胞が増殖するまで培養作製した。

し、カルシウム波の測定および免疫染色を行った。野生型

マウスの遺伝的背景を黒色系統の C57BL/ 6 にしたとこ

細胞のコントロールとして C57BL/6J マウスの胎仔からもろ、eCs 遺伝子欠損マウス（以下、KO マウス）は灰色を呈

メラノサイトを単離、培養した。

した（図 1A）。1990 年代までに毛色を決定する遺伝子はすべて同定されたはずであるが、eCS は色素形成を調節して

2. 3. 細胞内のカルシウム波の測定

いるタンパク質として働いている可能性が出てきた。そ培地中にカルシウム結合性の蛍光試薬（Oregon Green

こで、マウスの背中の 4 種類の毛のうち 2 種類（Awl とBAPTA - 1 AM）（Molecular Probes, Invitrogen, Eugene,

Zigzag）を比較したところ、KO マウスでは明らかに含有OR）を最終濃度 2 µM になるように添加し、細胞に取りされるメラニン色素の量が少なかった（図 1B）。そこで毛込ませた後、培地を交換して高感度 CCD カメラ（Andorを回収し、抽出液中に含まれるメラニン色素の量を吸光度

Technology, Belfast, UK）
を用いて経時的に観察を行った。

2. 4. 免疫染色
新生仔の皮膚から分離したメラノサイトを培養した後、2% ホルムアルデヒド溶液で固定し、1% スキムミルク溶液
でブロッキングした後、1 次抗体（抗 eCS 抗体、抗 c-kit 抗体、
抗 TRP2 抗体）を含む 1% スキムミルク溶液中で室温 2 時
間振盪させ、さらに蛍光物質（Alexa488 または Alexa564）と結合させた 2 次抗体を含む 1% スキムミルク溶液中で室温１時間振盪させた。ハンクス溶液で洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡（LSM510，Zeiss）を用いて蛍光像を撮影した。また、対比染色としてヘキスト 33324 によって染色体 DNA を染色した。

2. 5. ウエスタンブロット解析
皮膚組織の抽出物を SDS 電気泳動によって分離した後、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜にタンパク質を転写した。

図 1 eCs 欠損マウスにおけるメラニン色素形成異常および生殖能低下
A，色素形成異常．B，マウス体毛のメラニン色素沈着．C，毛から抽出したメラニン色 素 含 量の定 量化．D，小 脳での
eCs の発現（LacZ 染色）．E，精巣重量の低下．WT，野生型
マウス；KO，eCs 欠損マウス．

− 118 −

クエン酸による細胞機能の調節機構：美容および美白、老化における役割で測定したところ、有意な差が認められた（図 1C, D）。また、eCs 遺伝子を欠損させた領域には β - ガラクトシダー
ゼ（LacZ）遺伝子を挿入していたため、LacZ 染色によって
eCs 遺伝子の発現領域を調べたところ、小脳の特定の神経細胞層に eCS の発現が認められた（図 1D）。
一方、精巣にも発現が認められ、さらに精巣の重量がKO マウスでは有意に低下していることもわかった（図1E）。メラニン色素の量が低下した原因として、⑴ メラニン色素の合成量の低下、⑵ メラノサイトの細胞数の低下、が推測された。そこでこれらの点について検討を行ったと
ころ、メラノサイトの細胞数が KO マウスでは有意に低下していることが明らかになった（図 2A, B）。
続いて、eCS が関与するメラニン色素の産生過程を明らかにすることを試みた 5）。メラニン産生にはメラノサイト
刺激ホルモン（α - MSH）を介したシグナル伝達系によってチロシンがドーパミンに変換され、さらに、2 種類のメラ

図 2 eCs 欠損マウスにおけるメラノサイト数の低下
A，メラノサイト数の低下．B，メラノサイトの透過型電子顕微鏡画像．C，メラノサイトにおけるメラニン色素形成と eCS の役割の模式図．WT，野生型マウス；KO，eCs 欠損マウス．

ニン色素（フェオメラニンおよびユーメラニン）がチロシ
ナーゼ関連タンパク質（Tyrosinase-related protein-1，-2,
以下 TRP1, 2）よって生成される。そこでまずメラノサイ
トにおける eCS の発現の有無と、メラノサイトにおけるTRP1, 2 の発現量を比較した。
マウスの背側の皮膚から凍結切片を作製して抗 eCS 抗体で免疫染色したところ、eCS はメラノサイトが存在する
毛包の基部ではなく、毛幹に沿って存在する上皮細胞層に広く発現していることがわかった（図 3A, B）。この領域はバルジ領域に存在する幹細胞がメラノサイトへと分化する
過程で通過する領域である。さらに KO マウスの凍結切片について TRP1, 2 に対する抗体で免疫染色を行ったところ（図 3C）、TRP1 について KO マウスでは有意に発現が低下しており、TRP2 についても低下する傾向が認められた（図3D）。一方、KO マウスに対して飲用水に混ぜることで
α - MSH を投与したものの、KO マウスの毛に含まれるメ
ラニン色素の蓄積量を増やすことはできなかった（図 4A）。

図 3 eCS 発現部位およびメラニン色素生成への関与
A，eCS 発現組織．Red，eCS；blue，ヘキスト 33342．B，
ウエスタンブロット解析．C，メラノサイトにおける TRP1，2 の発現．D，メラノサイトにおける TRP1，2 の発現．WT，野生型マウス；KO，eCs 欠損マウス．

さらに、チロシンについても同様の方法で KO マウスに投与したものの、KO マウスの毛に含まれるメラニン色素の蓄積量には影響を与えなかった（図 4B）。
次に、図 2C の模式図でチロシナーゼの活性を制御する
サイクリック AMP（cAMP）によって KO マウスから単離したメラノサイトを処理したところ、メラニン色素の産生量が上昇することがわかった。すなわち、毛幹の上皮細胞層から分泌される cAMP が幹細胞からメラノサイトへの分化を制御していることが推測された。さらに、eCS はcAMP の毛幹の上皮細胞層における産生および分泌に重要な役割を果たしていることが考えられた。

3. 2. eCS による雄の生殖能力の制御
図 1 E に示したように eCS は雄の生殖能力にも関与して

図 4 eCs 欠損マウスのメラノサイトへの薬剤投与の効果
A，飲料水によるα-MSH 投与の効果．B，飲料水によるチロシン投与の効果．C，メラノサイトへの直接投与による cAMP の効果．WT，野生型マウス；KO，eCs 欠損マウス．

− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図 5 精子における eCS の役割
A，CS および eCS タンパク質のドメイン比較．B，CS およびeCS の組織での発現．C，精子での eCS の発現部位．D，先体反応前後での精子頭部における eCS の発現．E，マウス未受
精卵への Cs mRNA インジェクション後のカルシウムオシレーシ
ョン．F，マウス未受精卵の eCs mRNA インジェクション後のカ
ルシウムオシレーション．

図 6 精子における eCS の役割
A，ウエスタンブロット解析．PLCz1 の発現．B，クエン酸合
成活性（WT v.s. KO）．C，体外受精．D，交配による産仔数．E，カルシウムオシレーション（WT v.s. KO）．F，カルシウムオシレー
ション評価のパラメータ．G，波形の高さ．H，間隔．I，頻度．J，開始の時間．WT，野生型マウス；KO，eCs 欠損マウス．

いる可能性が考えられた。そこで、eCS タンパク質の発現を調べたところ、精子で発現していることがわかった（図わかった（図 6D）。さらに体外受精によって融合した KO

5A，B）。さらに野生型精子を抗 eCS 抗体によって免疫染精子による卵でのカルシウムオシレーションのパターンを色したところ、精子頭部に発現量が多いことがわかり、明調べたところ、開始が極めて遅くなることがわかった。図らかにミトコンドリアの局在とは異なっていた（図 5C）。

5F の結果と合わせて考えると、eCS は卵活性化因子としeCS が受精に関与する可能性が考えられたが、精子外膜はて融合直後から 40 分までのカルシウムオシレーションを卵との融合前に脱落するため、eCS が精子外膜の脱落後に誘導する因子であると推測された。すなわち、卵活性化に

精子頭部に存在するか否かによって関与するステップが異は 2 つの因子が関わっており、前半（開始）と後半（持続）でなってくる。そこで、精子外膜の脱落前後での eCS の局

役割を分担している可能性が考えられた。

在を調べたところ、eCS は精子外膜の脱落後でも精子頭部

4. 考に留まることがわかった（図 5D）。加えて、イモリでは CS察が受精後の細胞周期の再開（卵活性化）
を誘導することが報本研究では eCS が「メラノサイトによるメラニン色素の告されていることから 6）、CS および eCS をコードするメ

生成」および「男性の生殖機能」の両方に必須であることをッセンジャー RNA（mRNA）を野生型の未受精卵にマイ

初めて明らかにした（図 7A，B）。さらに、cAMP の塗布

クロインジェクションしたところ、どちらの mRNA でもによってメラノサイトのメラニン合成系が活性化されるこ

卵活性化に必要なカルシウム波（カルシウムオシレーショ

とも新しい発見である。本研究の成果は、脱色やカラーリン）を誘導することが明らかになった（図 5E，F）。同様に、

ングといった方法ではなく、cAMP と cAMP の競合阻害

メラノサイトにおいてもカルシウムオシレーションが起こ物質（アンタゴニスト）を用いて、メラノサイトにおけるメ

ること、さらに KO マウスのメラノサイトにおいては頻度

ラニン色素産生能を可逆的に制御する方法の開発につながが極めて少なくなることがわかった。

る。投与方法については現在検討中であり、近い将来には

一 般 的 に、 精 子 に よ る 卵 活 性 化 は ホ ス ホ リ パ ー ゼ
7）Czeta1（PLCz1）
によって誘導されることが知られている 。

皮膚への塗布によって簡便に物質をメラノサイトに導入することが可能になる。

そこで、KO マウスから採取した精子における PLCz1 の発

メラノサイトはメラニン色素を産生して真皮に紫外線が現を調べたところ、野生型精子と同程度の PLCz1 の発現

届かないようにすることで、炎症反応から肌を守ってくれが確認された（図 6A）。また、KO マウス由来精子では CS

る細胞である。日焼け止めスプレーには物理的・化学的に活性が低下していることがわかった（図 6B）。

肌を守るための紫外線保護成分が含まれているが、紫外線

次に KO 精子を用いて体外受精を行ったところ、有意差を吸収した際に生じる化学反応で、かえって肌にダメージは認められなかったものの、交配による産仔数は生後 6 ヶを与えてしまい、かぶれ、湿疹、吹き出物につながってし月（人間では 30 歳に相当）の雄ではほぼゼロになることがまう場合があり、シミやシワを防ぐために日焼け止めを塗− 120 −

クエン酸による細胞機能の調節機構：美容および美白、老化における役割

役割について科学的根拠が提示され、クエン酸合成酵素の新しい機能の解明につながると考えられる。この成果は、脱色や毛染めといった方法ではなく、ミトコンドリア外のクエン酸合成酵素の活性制御、または cAMP の投与によって体全体のメラニン色素の量をコントロールできることを示している。すなわち、白髪といった毛色の変化に対して、毛染めではなく、cAMP の塗布によって自然な黒色に戻すことができるかもしれない。皮膚の老化や、小脳の機
図 7 eCs のメラニン色素形成および生殖における役割
A，生殖および毛髪の周期性の模式図．B，細胞における CS
および eCS の役割分担．

能への eCS の関与についても今後検討する必要がある。
（引用文献）
1） Vander Heiden, M. G. & DeBerardinis, R. J.

布しているにも関わらず、別の症状で悩まされることにな

Understanding the Intersections between Metabolismってしまう。一方、cAMP の塗布でメラノサイトが活性化

and Cancer Biology. Cell 168（4），657-669（2017）．

され、メラニン色素が促進されれば、科学的にも根拠が明

2） Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C. & Thompson,
C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic

確であり、日焼け止めの代替法として有用である。
一方、eCS が男性の生殖機能に関与することは、イモリの研究から予想していたものの、精子でも CS が発現して

requirements of cell proliferation. Science 324（5930），
1029-33（2009）．

いるため、明確な結果が出ることは予想していなかった。

3） Fiume, M. M. et al. Safety Assessment of Citric Acid,

ところが、年齢依存的に（人間では 30 歳からに相当）、KO

Inorganic Citrate Salts, and Alkyl Citrate Esters as

マウスの産仔数が激減することから、男性の生殖機能におUsed in Cosmetics. Int J Toxicol 33（2 suppl），
16S-46S

ける eCS の関与は予想よりも大きいと考えられる。また、（2014）．

女性の生殖機能にも、年齢依存的に（やはり人間の 30 歳か4） Huang, Y. C. et al. Disruption of the peroxisomal

らに相当）、KO マウスの産仔数が激減するといった結果

citrate synthase CshA affects cell growth andも得られており、今後は男性・女性の両方向からの検討がmulticellular development in Dictyostelium discoideum.
Mol Microbiol 53（1），81-91（2004）．

必要である。
小脳における eCS の発現についてはまだ検討段階であ5） Steingrimsson, E., Copeland, N. G. & Jenkins, N. A.

る。小脳も「うつ病」「自律神経失調症」との関連があるこ

Melanocyte stem cell maintenance and hair graying.

とから今後検討する必要がある。一方、動物、植物、微生Cell 121（1），9-12（2005）．

物に存在するホルモンとして知られるメラトニンは、概日

6） Harada, Y., Kawazoe, M., Eto, Y., Ueno, S. &2+

リズムを司り、我々の睡眠を制御する物質であるが、メラ

Iwao, Y. The Ca

トニンの分泌とメラニン色素生成、さらには生殖機能に

physiologically polyspermic newt fertilization: its

は深い関係があることが報告されている。また、我々の研

signaling mechanism in egg cytoplasm and the species-

究からも生殖系に異常を生じるマウスにおいて、神経系にincrease by the sperm factor in

specificity. Dev Biol 351（2），266-276（2011）．

も異常を示すことを報告している 8，9）。神経系、色素形成、

7） Sanders, J. R. & Swann, K. Molecular triggers of egg

生殖系が何らかのメカニズムによってつながっている可能

activation at fertilization in mammals. Reproduction
152（2），R41-50（2016）．

性が考えられる。

5. 総

8） Miyado, K. et al. Requirement of CD9 on the egg

括plasma membrane for fertilization. Science 287（5451），

本研究から、ミトコンドリア以外に存在するクエン酸合321-324（2000）．

成酵素の重要性が明らかになった。クエン酸は、我々にと

9） Ishibashi, T. et al. Tetraspanin protein CD9 is a novelって容易に摂取できるものであるため、その生理作用につparanodal component regulating paranodal junctional

いては正確な知識が必要である。本研究から、クエン酸のformation. J Neurosci 24（1），96-102（2004）．

− 121 −

アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果
京都大学大学院薬学研究科

山下富義

Allergic contact dermatitis is a delayed hypersensitivity reaction triggered by contact with particular substances or
haptens. Molecular mechanisms of the inflammatory disorder are yet to be well established, but in recent years have beensuggested to involve activation of natural immunity via Toll-like receptors (TLRs) or Nod-like receptors (NLRs). We havepreviously developed a glycol-split heparin-sphingosine conjugate and found that it forms self-assembling nano-sized
micelles and exhibits an anti-inflammatory effect associated with down-regulation of TLR 4 signaling pathway. The present
study was initiated to apply self-assembling heparin derivatives to treatment and prevention of contact dermatitis disorders.
Firstly, we synthesized the derivatives of glycosaminoglycans (heparins, chondroitin sulfates, and hyaluronic acids),
and found that glycol-split low-molecular-weight heparin-stearylamine conjugate (gs-LHST) was the greatest inhibitory
effect against lipopolysaccharide-induced TNF-α production in primary cultured murine peritoneal macrophages. Then,
we prepared polyethylene glycol ointment containing nano-dispersed gs-LHST, and applied it to a dinitrofluorobenzene(DNFB)-sensitized mouse contact dermatitis model. DNFB-induced ear thickening was significantly suppressed when gsLHST-containing ointment was applied 2 hours prior to every DNFB sensitization. The anti-inflammatory effect of gsLHST-containing ointment was comparable to that of prednisolone-containing ointment. However, the effect of gs-LHSTcontaining ointment was not observed in the genetically TLR 4 -mutated strain C 3 H/HeJ, suggesting that blockade of TLR 4
signaling pathways by gs-LHST might be attributed to suppression of DNFB-induced ear thickening. Real-time polymerase
chain reaction (PCR) analyses indicated that gs-LHST-containing ointment can reduce elevated mRNA expression levels ofanti-inflammatory cytokines (TNF-α and IL- 1 β) and oxidative stress-responsive gene (HO- 1 ). These results suggested that
gs-LHST might be effective to inhibit cyclic inflammatory chain reactions involving TLR 4 and reactive oxygen species.

1. 緒

合させたヘパリン誘導体が、水溶液中でナノミセル粒子を言形成するとともに、LPS 活性化マクロファージからの炎症

接触性皮膚炎は種々の化学物質や金属などのハプテン

性サイトカインの産生を強力に阻害することを明らかにしにより引き起こされる遅延型のアレルギーである 。そた 9, 10）。さらに、本ヘパリンナノ粒子は、マクロファージの症状は丘疹や発赤など外見の変化を伴うため、患者のを LPS で刺激した後の IRAK- 1 のリン酸化や IκBα の分解

Quality of Life（QOL）を大きく損なうことも少なくない。

および NFκB の核内への移行を抑制したことから、TLR4

接触性皮膚炎が発症する詳細なメカニズムは依然不明で

シグナル伝達経路を抑制することが示唆されている 9）。

1）

あるが、その一部で Toll 様受容体（TLR）や Nod 様受容体

そこで、本研究では、ヘパリンナノ粒子の接触性皮膚炎（NLR）などを介した自然免疫の活性化と、それに伴う炎症治療への応用を最終的な目的として、次に示す実験を行っ。これまた。まず、種々のグリコサミノグリカンがヘパリンと同様

でに、TLR4 リガンドである LPS や熱ショックタンパク質に抗炎症作用を有する点に着目し 11, 12）、グリコサミノグリ

により接触性皮膚炎が増悪することや 5, 6）、接触性皮膚炎

カンに脂肪族アミンを縮合させた結合体を合成し、高い抗を引き起こす代表的な金属であるニッケルがヒトの TLR4

炎症効果を持ったグリコサミノグリカンナノ粒子を創製しを直接刺激することが報告されてきた 7）。また、TLR の刺た。次に、そのスクリーニングによって見出された低分子激で産生される TNF-α や IL -1β などの炎症性サイトカイ

量ヘパリン（以下、LHP）由来ナノ粒子の皮膚疾患への応用

反応の関与が近年の研究から示唆されている

1 ‒4）

ンが角化細胞の増殖や T 細胞の浸潤に関与することも示さを目的に軟膏剤を調製し、2, 4 - ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）誘発接触性皮膚炎モデルに対する治療効果を検討

8）

れている 。
我々はこれまでに、ヘパリンのウロン酸部位を開環したした。以下、これらの研究成果について報告する。

低抗凝固作用ヘパリンに D- エリスロスフィンゴシンを縮

2. 方

法

2. 1. グリコサミノグリカン－ステアリルアミン結合体の合成

Suppressive effect of self-assembling nanosized heparin on allergic dermatitis
Fumiyoshi Yamashita
Kyoto University, Graduate School of
Pharmaceutical Sciences

各種グリコサミノグリカン 1 g を 0.1 M 過ヨウ素酸ナト
リウム溶液 20 mL に溶解し 4 ºC で 72 時間反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムをグリセロールで分解、透析、凍結乾燥して得られた白色粉末を 0.2 M 水素化ホウ素ナト− 122 −

アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果

を蒸留水中で 2 日間透析した後凍結乾燥することで、各種

2. 5. 接触性皮膚炎モデルマウスにおける抗炎症作用の評価

グリコール開裂グリコサミノグリカンを得た。次に、こ重量比 4：1 の割合で混合したアセトン ‒ オリーブオイの 20 mg をホルムアミド 1.5 mL に溶解し、EDC 10mg でル混合液に、2, 4 - ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）をリウム溶液に溶解し、4 ºC で 72 時間反応させた。反応液活性化した後、ステアリルアミン 5 mg を添加し、25 ºC で0.5% の濃度で溶解した。6 週齢の BALB/c 系雌性マウス

24 時間反応させた。反応終了後、エタノール沈殿法によ（ 一 部 の 実 験 で は、C3H / HeJ、C3H / HeN マ ウ ス を 用 い

り生成物を回収し、蒸留水中で 2 日間透析することによりた）の腹部を除毛し、0 日目および翌日に 0.5% DNFB 溶液

精製し、凍結乾燥することによって、目的のグリコサミノ

25 µL を塗布した。5 日目から 3 日間に渡って 0.3%DNFB

グリカン－ステアリルアミン結合体を得た。

溶液 10 µL をマウスの右耳介に塗布することで再感作し炎症を惹起させた。コントロール群として、DNFB を含ま

2. 2. グリコサミノグリカンナノ粒子の物性測定ない溶液のみを塗布した。抗炎症実験では、0.3%DNFB

各種グリコサミノグリカン─ステアリルアミン結合体を溶液を耳介に適用する 2 時間前に、0.2 % もしくは 0.5%

0.01 mg / mL の濃度で蒸留水に溶解し、37 ºC で 5 分間、の gs - LHST を含有するポリエチレングリコール水性軟膏

42 KHz の超音波を照射することで微細化を行った。粒子10 mg を塗布した。ネガティブコントロールとしては薬物

径およびゼータ電位は Malvern 社製ゼーターサイザーナノを含有しない軟膏基剤、ポジティブコントロールとしては

ZS を用いて測定した。各種グリコサミノグリカン─ステア

0.5% プレドニゾロン軟膏を用いた。各軟膏の抗炎症作用

リルアミン結合体の臨界ミセル濃度は、ピレンを用いた蛍は、0.3 % DNFB 溶液を適用 24 時間後の耳介厚をデジタル

光プローブ法 13）により測定した。各種グリコサミノグリ

シックネスゲージにより測定するとともに、最終日（8日目）

カン ‒ ステアリルアミン結合体の水分散溶液を異なった濃に耳介を摘出し、各種炎症マーカー遺伝子の発現をリアル度で調製し、ピレン溶液と混和した。ピレンの最終濃度は

タイム PCR 法により測定することによって評価した。

7.5 × 10 -8 M であった。混合液は 12 時間静置して平衡化し、3. 結

励起波長 339 nm、発光波長 390 nm で蛍光測定を行った。

2. 3. LPS 刺激マウス腹腔マクロファージに対する抗炎症効果の評価果

3. 1. 各種グリコサミノグリカンナノ粒子の物性評価
未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸の 4 つのグリコサミノグリカンに対して、

5 週齢の ICR 系雌性マウスに 2.9% チオグリコレート培

過ヨウ素酸酸化によるグリコール開裂を行い、ステアリル

地を 1 mL 腹腔内投与し、4 日後に RPMI 1640 培地 5 mL を

アミンとの結合体を合成した（以下、それぞれを gs-HPST、用いて腹腔マクロファージを採取した。採取された腹腔マ

gs - LHST、gs - CSST、gs - HAST と称する）。各グリコサ

クロファージは 10 % ウシ胎児血清を含有する RPMI 1640

ミノグリカン誘導体を分散して得られるナノ粒子の粒子径培地に再懸濁した後、96 well マイクロプレートに 1.0 ×

は 100 〜 150 nm 程度、ゼータ電位は−20 〜−40 mV であり、105 cells /well で播種し、37 ºC、5% CO2 の条件で培養し臨界ミセル濃度も 0.014 - 0.018 mg/ mL と各誘導体間で大た。2 時間後に培地交換して非接着細胞を取り除いた。24

きな差は認められなかった。

時間後培地を OptiMEM に交換し、異なる濃度の各種グ
後、LPS を最終濃度 20 ng/mL で添加した。24 時間培養後、3. 2. LPS 刺激マウス腹腔マクロファージに対する抗炎症効果

上清中の TNF -α 量を murine TNF- α ELISA Kit を用いて

LPS 刺激時にマクロファージから産生される TNF- α 量定量した。細胞毒性の評価は WST-1 アッセイ法により評を ELISA 法により定量したところ、コンドロイチン硫酸価した。

を除いてグリコサミノグリカン存在下 TNF- α 産生がわず

リコサミノグリカン─ステアリルアミン結合体を添加した

かに減少した。グリコサミノグリカンをグリコール開裂す2. 4. グリコール開裂低分子量ヘパリン －ステアリル
アミン結合体含有水性軟膏の調製

ると TNF -α の産生抑制効果は完全に消失したが、ステア

グリコール開裂低分子量ヘパリン─ステアリルアミン結

ミノグリカンに比べて強力に TNF- α の産生を抑制できる合体（gs- LHST）は、前述の方法により合成した。水性軟ようになった。各グリコサミノグリカン ‒ ステアリルアミ

膏は、ポリエチレングリコール 4000、ポリエチレングリ

ン結合体の TNF- α 産生抑制効果に関して用量依存性を評

コール 400、および水を重量比 4：4：1 の割合で加熱混合

価し、IC50 値を算出したところ、gs-LHST で最も効果がした溶液に gs -LHST を添加し、ホモジナイザーで攪拌し高 く（0.010 mg/ mL）、 次 い で gs - HPST（0.018 mg/mL）、ながら徐々に冷却することによって調製した。

gs - CSST（0.033 mg / mL）、gs -HAST（0.113 mg/mL）のリルアミンと縮合させることによって、通常のグリコサ− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

Figu re 1 C o n c e ntratio n - d e p e n d e nt ef fe ct of glyc ol - s plit
glycosaminoglycan（G AG）-stearylamine conjugates on TN F- α
production from lipopolysaccharide（LPS）-stimulated mouse peritoneal
macrophages.

順となった（Figure 1）。

が、0.3% DNFB 溶液で再感作すると経日的にマウス耳介の肥厚が生じた。一方、0.3% DNFB 溶液で再感作する 2

3. 3. 各種 Toll 様受容体リガンド刺激によるサイトカ
イン産生に対する抑制効果

時間前に 0.2% gs-LHST 軟膏を耳介部に塗布したマウスにグリコサミノグリカン ‒ ステアリルアミン結合体の抗炎肥厚が有意に軽減された。軟膏中の gs-LHST 濃度を 0.5%症効果が LPS 特異的かどうか確認するために、TLR2 のリに増加させたところ、0.2% に比べやや増強傾向にあったが、ガンドである Pam2CSK4 と TLR3 のリガンドである Poly

有意な差は認められなかった（Figure 2）。

おいては、0.5% プレドニゾロン軟膏と同程度に、耳介の（I:C）を用いて、前項と同様の実験を行った。Pam2CSK4

8 日目にマウス耳介を摘出し、マウス耳介の組織学的評の刺激に対しては、LPS の場合とは異なり、いずれのグ価を行った。DNFB で感作することによって、表皮・真皮

リコサミノグリカン ‒ ステアリルアミン結合体も TNF-αの厚みが増し、細胞の浸潤が認められた。一方、0.2% gs-

産生抑制効果を示さなかった。一方、Poly（I:C）の刺激に

LHST 含有軟膏を前投与した群では、0.5% プレドニゾロン

対しては gs - HAST を除くすべてにおいて、LPS に比べ弱軟膏塗布群と同様、DNFB による組織学的異常が軽減されいものの TNF-α 産生が抑制される傾向にあった。ただし、ることが確認された（Figure 3）。

Poly（I : C）の添加により細胞毒性が認められたことから、

DNFB 誘 発 接 触 性 皮 膚 炎 モ デ ル に お け る gs-LHST の

この TNF -α 産生抑制は Poly（I:C）の細胞傷害性と関連する治療的効果が TLR4 を介するか否かを検討するために、可能性もあり、TLR3 経路に対する効果については結論でTLR4 遺伝子に変異のある C3H/HeJ マウスを用いて同様きなかった。

の検討を行った。その結果、C3H/HeJ マウスでも DNFB
感作による耳介肥厚は観察されたが、gs-LHST による抑3. 4. DNFB 誘発接触性皮膚炎モデルにおける耳介制作用は認められなかったのに対し。野生型の TLR4 が発肥厚抑制効果現している C3H/HeN マウスでは、BALB/c マウスの場合

先の検討において、低分子量ヘパリンの誘導体すなわと同様、0.5% gs-LHST 軟膏による耳介肥厚の抑制効果がち gs- LHST からなるナノ粒子ミセルが最も強力な抗炎症認められた（Figure 4）。

作用を示すことが明らかになった。そこで、gs-LHST をるマウス耳介肥厚に対する抑制効果を検討した（Figure 2）。

3. 5. DNFB 誘発接触性皮膚炎モデルでの炎症性遺伝子マーカー発現に対する影響

DNFB を含まないアセトン：オリーブ油（4：1）溶液で再炎症性サイトカインおよび酸化ストレスマーカー遺伝子の感作しても、マウスの耳介厚はほとんど変化しなかった発現に対する gs - LHST 含有軟膏塗布の影響について、リ含有する水性軟膏を調製し、DNFB 刺激により誘発され− 124 −

アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果

Figure 2 Inhibitory effect of glycol-split low molecular weight heparin conjugate (gsLHST)-containing ointment on 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB)-induced ear
thickening in BALB/c mice.

Figure 3 Histological assessment in a 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB)-induced mouse
contact dermatitis model.
At 24 h post the last DNFB stimulation (day 8), mouse pinnae were excised and fixed with
10 % formalin neutral buffer solution and embedded in paraffin. Paraffin-embedded pinnae
were sectioned at 5 µm and stained with hematoxylin and eosin. (A) Non-treatment, (B)
DNFB plus drug-free ointment base, (C) DNFB plus 0.5% prednisolone, and (D) DNFB plus
0.2% gs-LHST.

アルタイム PCR 法によって検討した。DNFB の感作によに対し、IL -12 の発現上昇に対しては影響が認められなかり上昇した炎症性サイトカイン TNF - α および IL- 1β の発った（Figure 5）。また、接触性皮膚炎において、ハプテン

現は gs- LHST 含有軟膏塗布によって有意に抑制されたの刺激によって産生される活性酸素種が炎症を進行させるこ− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

Figure 4 Inhibitory effect of glycol-split low molecular weight heparin conjugate（gs-LHST）-containting ointment on 2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB）-induced
ear thickening in C3H/HeN（left）and C3H/HeJ（right）mice.

Figure 5 Effect of glycol-split low molecular weight heparin conjugate（gs-LHST) on（A) TNF-α,（B）IL-1β, and（C）IL12 mRNA expression in a 2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB)-induced mouse contact dermatitis model.
Mouse pinnae were treated for three consecutive days with（upper）0.2% or 0.5% gs-LHST ointment,（lower）
0.2% gs-LHST or 0.5 % prednisolone ointment. The vehicle group was treated with the drug-free ointment base.
After 2 h mouse pinnae were stimulated with solution containing 0.3 % DNFB. At 24 h post the last stimulation with
DNFB, mRNA was extracted from pinnae and analyzed by real-time PCR. Each value represents the mean ±S.E.（n = 7-8）
. *P < 0.05. † P < 0.01.

とから 1, 4）、酸化ストレス応答性転写因子 Nrf -2 によって

LHST 含有軟膏塗布することによって軽微ではあるものの転写活性化されるヘム酸化酵素（HO -1）および NAD（P）

HO - 1 の mRNA 発現が有意に減少した。

H キノン還元酵素（NQO-1）の発現を測定したところ、gs-− 126 −

アレルギー性皮膚炎に対するナノ粒子化ヘパリンの抑制効果

4. 考ることが知られており 1, 4）、酸化ストレスにより熱ショッ

察

クタンパク質や酸化脂質などのダメージ関連分子パターン

我々の過去の検討では、グリコール開裂ヘパリンに D-（DAMPs）が産生され、DAMPs が TLR4 を刺激し再び活エリスロスフィンゴシンを結合させた誘導体で、LPS 刺激

性酸素種が産生するという炎症サイクルが提唱されていマクロファージにおける抗炎症反応の抑制効果が観察される 4, 18）。本研究においても DNFB 処理によって酸化ストレ

た

9，10）

。しかし、本研究において D - エリスロスフィンゴ

スマーカー遺伝子である HO-1 や NQO-1 の発現上昇が認

シンをステアリルアミンに変更しても有効であり、より安

められており、活性酸素種の産生が起こっていることは確

価にヘパリンナノ粒子による抗炎症効果が期待できること実である。gs - LHST 含有軟膏を投与した際には、NQO-1が示された。また、多くのグリコサミノグリカンが抗炎症では無効であったものの、代表的な酸化ストレス因子で作用をもつということから 14 ‒ 16）、本研究では各種グリコサ

ある HO - 1 の mRNA 発現は有意に抑制されており、gs-

ミノグリカンを用いて検討を行ったところ、脂肪族アミン

LHST による TLR4 シグナル経路の抑制が酸化ストレスをの修飾によるナノ粒子化による抗炎症効果の増大は、ヘパ介した炎症サイクルの活性化抑制に関与している可能性がリンに限らずコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸において示唆された。

も認められ、普遍性をもつことが明らかとなった。ただし、

5. 総抗炎症効果の強さはグリコサミノグリカンの種類によって括異なり、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸の本研究では、各種グリコサミノグリカン－ステアリルア

順であった。その原因の一つとして、グリコサミノグリカ

ミン結合体を合成し、グリコール開裂低分子量ヘパリン

ンの硫酸化度の違いが考えられる。ヘパリンは高度に硫酸－ステアリルアミン結合体 gs -LHST が LPS による炎症反化されたグリコサミノグリカンであり 2 糖繰り返し構造あ応の抑制に最も有効であることを明らかにした。さらに、たり平均 2 〜 3 分子硫酸化されている。これに対し、コンDNFB 誘発接触性皮膚炎モデルに対して、gs - LHST 含有

ドロイチン硫酸はヘパリンに比べて硫酸化度が低く 2 糖繰

水性軟膏を適用したところ、マウス耳介の肥厚および炎症

り返し構造あたり平均 0 〜 2 分子しか硫酸化されておらず、性サイトカインや酸化ストレスマーカー遺伝子の発現を有ヒアルロン酸では全く硫酸化されていない

14）

。グリコサ

意に抑制することを見出した。その効果には gs-LHST にミノグリカンの硫酸化度はタンパクとの相互作用に影響す

よる TLR4 シグナル経路の遮断が一部関与することが示唆ることが示されており、例えば TGF -1β に対する結合力はされた。これらの結果は、ハプテンによる接触性皮膚炎にグリコサミノグリカンの硫酸化度が上昇するにつれて増大対する治療や予防に有用な知見を提供するものと期待され

する

17）

。今回の検討でも、LPS 刺激に対する TNF -α 産生る。

抑制効果は、グリコサミノグリカンの硫酸化度とよく対応していた。また、我々の過去の研究では、ヘパリン骨格中（引用文献）の 6 位の硫酸基を脱硫酸化した際には抗炎症効果が減弱す

1） Kaplan, D. H., Igyártó, B. Z., Gaspari, A. A., Early

ることを明らかにしている 9）。6 位の硫酸基を持たないヒ

immune events in the induction of allergic contact

アルロン酸において TNF- α 産生抑制効果が著しく低かっ

dermatitis. Nat. Rev. Immunol., 12, 114-124（2012）．
2） Ptak, W., Bryniarski, K., Ptak, M., Majewska, M.,

たのは極めて合理的な結果である。
接触性皮膚炎の惹起相では、ハプテンによる再感作によGamian, A., Lobo, F. M., Szczepanik, M., Toll-like

り T 細胞や顆粒球の浸潤、角化細胞の増殖が起こり、ハ

receptor ligands reverse suppression of contact

8）

プテンが接触した部位で肥厚が生じる 。本研究では、グ

hypersensitivity reactions induced by epicutaneous

リコール開裂低分子量ヘパリン ‒ ステアリルアミン結合体

immunization with protein antigen. Int. Arch. Allergy

gs - LHST を含有するポリエチレングリコール水性軟膏を

Immunol., 139, 188-200（2006）．

投与すると、DNFB で誘発される接触性皮膚炎による肥3） Nakamura, N., Tamagawa-Mineoka, R., Ueta, M.,

厚が有意に抑制された。しかし、TLR4 遺伝子に変異のあKinoshita, S., Katoh, N., Toll-like receptor 3 increases

る C3H/HeJ マウスでは DNFB による耳介肥厚が起こるもallergic and irritant contact dermatitis. J. Invest.

のの、gs -LHST 含有軟膏の効果は観察されなかった。inDermatol., 135, 411-417（2015）．

vitro において gs - LHST の抗炎症反応抑制効果は LPS に特4） Martin, S., Esser, P., Weber, F., Jakob, T., Freudenberg,

異的であり、他の TLR アゴニストでは認められないこと

M., Schmidt, M., Goebeler, M., Mechanisms of chemical-

を併せて考えると、DNFB 誘発接触性皮膚炎に対する抗induced innate immunity in allergic contact dermatitis.

炎症効果は TLR4 を介していることが示唆される。一般に、Allergy, 66, 1152-1163（2011）．

ハプテンによる接触性皮膚炎において活性酸素種が発生す

5） Yusuf, N., Nasti, T. H., Huang, C. M., Huber, B.

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

S., Jaleel, T., Lin, H. Y., Xu, H., Elmets, C. A., Heat

12）Campo, G. M., Avenoso, A., Campo, S., Traina, P.,

shock proteins HSP2 7 and HSP7 0 are present in the

D’ Ascola, A., Calatroni, A., Glycosaminoglycans

skin and are important mediators of allergic contact

reduced inflammatory response by modulating toll-

hypersensitivity. J. Immunol., 182, 675-683（2009）．

like receptor-4 in LPS-stimulated chondrocytes. Arch.

6） Yokoi, S., Niizeki, H., Iida, H., Asada, H., Miyagawa, S.,

Biochem. Biophys., 491, 7-15（2009）．

Adjuvant effect of lipopolysaccharide on the induction13）Aguiar, J., Carpena, P., Molina-Bolıvar, J., Ruiz,of contact hypersensitivity to haptens in mice. J.

C. C., On the determination of the critical micelle

Dermatol. Sci., 53, 120-128（2009）．

concentration by the pyrene 1: 3 ratio method. J.

7） Schmidt, M., Raghavan, B., Müller, V., Vogl, T., Fejer,

Colloid Interface Sci., 258, 116-122（2003）．

G., Tchaptchet, S., Keck, S., Kalis, C., Nielsen, P. J.,

14）Page, C., Heparin and related drugs: Beyond

Galanos, C., Crucial role for human Toll-like receptor

anticoagulant activity. ISRN pharmacology, 2 0 1 3,910743，（2013）．

4 in the development of contact allergy to nickel. Nat.

15）Mazieres, B., Combe, B., Phan Van, A., Tondut, J.,

Immunol., 11, 814-819（2010）．
8） G r a b b e , S . , S c h w a r z , T . , I m m u n o r e g u l a t o r y

Grynfeltt, M., Chondroitin sulfate in osteoarthritis

mechanisms involved in elicitation of allergic contactof the knee: a prospective, double blind, placebo

hypersensitivity. Immunol. Today, 19, 37-44（1998）．

controlled multicenter clinical study. J. Rheumatol., 28,
173-181（2001）．

9） Babazada, H., Yamashita, F., Yanamoto, S., Hashida,M., Self-assembling lipid modified glycol-split heparin16）King, S. R., Hickerson, W. L., Proctor, K. G., Beneficial

nanoparticles suppress lipopolysaccharide-induced

actions of exogenous hyaluronic acid on wound healing.

inflammation through TLR4–NF-κB signaling. J.

Surgery, 109, 76-84（1991）．
17）Hintze, V., Miron, A., Moeller, S., Schnabelrauch, M.,

Controlled Release, 194, 332-340（2014）．
10）Babazada, H., Yamashita, F., Hashida, M., Suppression

Wiesmann, H., Worch, H., Scharnweber, D., Sulfatedof experimental arthritis with self-assembling glycol-

hyaluronan and chondroitin sulfate derivatives interact

split heparin nanoparticles via inhibition of TLR4–

differently with human transforming growth factor-β1

NF-κB signaling. J. Controlled Release, 1 9 4, 2 9 5-3 0 0（TGF -β1）．Acta Biomaterialia, 8, 2144-2152（2012）．

（2014）．

18）Lucas, K., Maes, M., Role of the Toll Like receptor11）Campo, G. M., Avenoso, A., Campo, S., D'Ascola, A.,（TLR）radical cycle in chronic inflammation: possible

Traina, P., Samà, D., Calatroni, A., Glycosaminoglycans

treatments targeting the TLR4 pathway. Mol.

modulate inflammation and apoptosis in LPS-treated

Neurobiol., 48, 190-204（2013）．

chondrocytes. J. Cell. Biochem., 106, 83-92（2009）．

− 128 −

顔面加齢の評価のための画像解析手法の開発：
主観的感覚的評価から客観的定量的評価へ
国際医療福祉大学三田病院放射線診断センター

奥田逸子

Facial aging is caused not only by age-related changes in the skin, but also by changes in muscles, subcutaneous soft
tissues, and adipose tissues. Gravitational effects also affect to the aging appearance. CT and MRI allow the depiction of thestate of those facial structures. We focused on the gravity and evaluated the gravitational effect to the facial appearance. Our
diagnostic imaging analysis based on the degree of sagging can be used as an objective evaluation of the state of the face andis useful to the elucidation of the mechanism for facial aging process. Furthermore, it will contribute to the development of
the facial anti-aging prostheses and the technical application to the police scientific criminal investigation.

１．緒

言

抗加齢
（アンチエイジング）
や美容への関心は、高齢化社
会になるにつれてますます高まっている。そのための美容施術の発展・発達は多くの精神的満足をもたらすと同時にその効果に対する期待値も高まっている。現在のところ顔
面加齢の評価は、容貌の衰え、皮膚のたるみ、あるいは、

図１

口角の下垂など、主に視覚的かつ主観的な評価などでしばしば行われている。顔面加齢に対する客観的な評価法は確立しておらず、抗加齢・美容医学のエビデンスは十分とはいえない状況である。
今日の高度に発展した多列CT装置であるMultidetectorrow CT（MDCT） な ら び に 高 磁 場 の 3 . 0 -T Magnetic

三次元CT画像 ：若年者と高齢者の容貌
左：20歳代、右：70歳代

CT画像データは多くの解剖学的情報を含んでおり、３次元画像を構築することで、若さや老いの容貌を立体的、かつ、リアルに描出することができる。右では目袋、ゴルゴライン、頬の下垂、鼻唇溝（ほうれい線）やマリオネットラインの深化な
どの加齢性変化が明瞭に描出されている。

resonance imaging（MRI）装置の普及と画像解析技術の進

２．対象および方法

歩によって、高精度で詳細な三次元画像を容易に作成することが可能となり、疾患の診断だけでなく、体表や体内の状態を立体的に確認することが可能となった

1 - 3）。我々は、

本研究は国際医療福祉大学三田病院の臨床試験審査委員
会（Institutional Review Board：IRB）にて承認を受け施行

これらの高度に進んだ画像診断法を抗加齢・美容医学と結した。顔面加齢の大きな要因の一つである重力による頬のびつけ、顔面加齢の客観的評価法の確立を試みた。CT・下垂に着目し、本研究をデザインした。

MRI の画像データは多くの解剖学的情報を含んでおり、3次元画像を構築することで、若さや老いの容貌を立体的、

2 . 1．対象

かつ、リアルに捉えることが可能である（図 1）。さらに、対象は 20 歳以上の成人である。以下の被検者は除外した。

断面表示することで、容貌と内部の解剖学的関係を描出す

ⅰ．顔面の表在性構造に影響を及ぼす外傷性変化がある

ることができる。そこで、重力荷重が中顔面に及ぼす影響被検者に着目し、たるみによる容貌変化の要因を画像解剖学的にⅱ．妊娠および妊娠の可能性がある被検者評価した。

ⅲ．閉所恐怖症を有する被検者選定基準に基づき、14 症例の被検者を登録した。その内訳は男性 6 名、女性 8 名で、平均年齢は 41 . 9 ± 7 . 1 歳であった。
Development of the imaging analysis
method for the facial aging: Establish of
the objective evaluation method
Itsuko Okuda, MD, PhD
Department of Diagnostic Radiology,
International University of Health andWelfare, Mita Hospital2 . 2．使用機器および撮像法
多列 CT 装置（Aquilion ONE または Aquillion 64 , キヤノ
ンメディカルシステムズ株式会社製 , 日本）を使用し、顔面を中心に撮像した。撮像条件は管電圧 120 kVp、管電流− 130 −

顔面加齢の評価のための画像解析手法の開発：主観的感覚的評価から客観的定量的評価へ

150 - 200 mA、撮像スライス厚 0 . 5 mm、関心領域（Field

するために、正面像および側面像の 3 次元画像を作成し、of view: FOV）
は 18 - 20 cm である。最初に仰臥位（体位 A）

頬の最も高い点を検出した。重力荷重による基準点の移動

にて顔面を撮像した。次に顔面に重力を荷重し、たるみを方向を観察し、基準点 A - 基準点 B の移動距離を計測した。

顕在化するように体位を変換（体位 B）し撮像した。得られ距離の計測は水平方向と垂直方向の計測も行った。さらに、た 画 像 デ ー タ は Digital Imaging and COmmunication in

基準点の移動距離と年齢との相関を評価した。

Medicine（DICOM）
規格にて画像保存した。

c．頬骨部脂肪体の厚み（Malar mount）の変化（図３）
基準 B のレベルの横断像を参照し、基準 B と同じレベル

２. 3．画像解析法の体位 A の横断像を選択し、基準 Aʼ とした。上顎骨前縁DICOM 画像を画像解析ソフトウェア（ZioCube, ザイオと皮膚表面の距離を Malar mount と定義し、基準 Aʼ と基ソフト株式会社 , 東京）がインストールされた専用パソコ

準 B の横断像にて Malar mount の厚みを計測した。厚みンに転送し、画像の解析を行った。3 次元画像を作成するの変化と年齢との相関を評価した。

とともに、以下の項目について解析した。合わせて、それ３．結らの結果と年齢との関係を分析した。

果

３-a. 重力荷重による容貌変化

a．重力荷重による容貌変化
重力荷重前の体位 A で撮像した 3 次元画像の容貌と重力体位 A と体位 B の 3 次元画像で認める容貌を比較した結荷重を行った体位 B で撮像した 3 次元画像の容貌を比較し、

果、MI 11 例、SI 3 例、NC 0 例、D 0 例であった。変化

見た目のエイジングレベルの変化を観察した。

の程度に個人差があったが、14 例の全例で容貌変化を認・顕著に増加（markedly increased：MI）

めた。重力荷重によって、見た目のエイジングレベルが上・軽度増加（slightly increased：SI）

昇していた。MI の平均年齢は 46 . 0 歳、SI の平均年齢は・変化なし（not changed：NC）

26 . 0 歳であった。すなわち、若年者は重力荷重を行って・減少（decreased：D）

も容貌変化は少ないが、年配者では重力の影響による容貌

b．頬骨部脂肪体の頂部（Malar top）の移動方向と移動距変化が顕著であった。

離（図 2）
体位 A において、頬が最も高い部位を Malar top とし基

３-b. Malar Top の移動方向と移動距離（図 4）

準 A を設定した。次に、体位 B における Malar top を基準重力荷重による Malar top の変化として、基準点 A に対B とし設定した。このとき、基準 A および B を正確に決定

し基準点 B は 14 例全例で内尾側に移動することが確認さ

図２

Malar topの移動方向と移動距離の計測法

顔面の正面像と側面像の３次元画像を作成し、頬の最も高い位置を検出し、基準点である
Malar topを決定した。重力荷重前の基準点Aと重力荷重後の基準点Bの距離を計測するとともに、水平方向と垂直方向を計測した。

− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図３

Malar mountの変化の計測法

重力荷重によって軟部の形状が変化しているが、顔面骨の形状が同じであることから同一レベルであることが分かる。基準Bと同一レベルの体位Aの横断像の頬頂部を基準A’ とした。
上顎骨前縁に接する補助線１を引き、それと平行な皮膚の接線を補助線2とした。補助線1と補助線2の間に垂線を引き、補助線1−補助線2の距離をMalar mountと定義した。基準A’と基準Bの横断像にてMalar mountの厚みを計測した。

図４

Malar Topの移動方向と移動距離

灰色枠内の左右は同一人物である。重力荷重によってたるみは増強し、見た目のエイジ
ングレベルが増加している。14例全例で基準点Aに対し基準点Bは内側下方に位置している。
移動距離の平均は24 . 3±4 . 79 mmである。

れた。Malar Top の移動距離の平均は 24 . 3 ± 4 . 79 mm で厚みの変化と年齢の相関は r= 0 . 72（P< 0 . 01）であった。

あった。内側に平均 13 . 3 ± 1 . 37 mm、尾側には平均 20 . 1

４．考± 5 . 55 mm と移動した。Malar top の移動距離と年齢の相関は r= 0 . 69（P< 0 . 01）
であった。

察

近年のコンピュータの進歩の恩恵を受け、画像診断装置
および画像解析装置は著しい発展を遂げた。CT は物質の３-c.

Malar mount の厚みの変化（図 5）

X 線吸収差を利用し、構造物を画像化する画像診断装置で体位 A および体位 B の横断像において、同一レベルのある 4 , 5）。1989 年にヘリカル CT が登壇して以来、CT はさ

Malar mount の厚みは、基準 Aʼ では平均 15 . 4 ± 2 . 27 mm、らに進化発展してきた6）。今日の診療現場ではMultidetector-

基準 B では平均 19 . 9 ± 3 . 22 mm であった。重力を荷重す

row CT（MDCT）が一般的に使用されている。MDCT はることで Malar mount の厚みは有意に増加した（P< 0 . 01）。

複数のＸ線検出器が配列されており、Ｘ線管球が体周囲を− 132 −

顔面加齢の評価のための画像解析手法の開発：主観的感覚的評価から客観的定量的評価へ

本研究では、最初に重力が加齢容貌を促進させるか否かを検証した。重力荷重した容貌と非荷重の容貌を比較すると、14 例全例で重力荷重を受けた容貌の見た目のエイジ
ングレベルは上昇していた。とくに、高齢者ほど加齢容貌が顕著に現れた。次に、この結果に基づき中顔面の形態変化を分析した。エイジングレベルを上昇させた形態的変化
として頬頂部の移動と厚みの変化が確認された。具体的には、頬頂部は平均 20 . 1±5 . 55 mm と下垂するだけでなく、内側に平均 13 . 3±1 . 37 mm と偏移していた。さらに、下垂 し た 頬 の 厚 み は 平 均 15 . 4±2 . 27 mm か ら 平 均 19 . 9 ±3 . 22 mm に増加しており、下垂した頬の厚みが明らかに増加することが確認された。これらの変化は年齢との関連性が高いとの結果を得た。
図５3 次元 CT 画像とともに横断画で顔面の皮下構造を観察

Malar mountの厚みの変化

すると、これらの中顔面の解剖学的要因として皮下脂肪織

重力荷重前の基準点A’のMalar mountの厚みの平均15 . 4±2 . 27 mmで あ る。 重 力 荷 重 後 のMalar
mountの厚みは14例全例で増加した。基準点Bは平均19 . 9±3 . 22 mmとMalar mountの厚みは統計学的に有意に増加した（P < 0 . 01）。

の形態変化が主として認められた。表面の皮膚形状や脂肪織内を走行する表情筋の位置も変動していたが、これらの変化は脂肪織の位置移動に伴う変化と考えられた。興味深
いことに、頬の内側に位置する鼻唇溝（ほうれい線）
はそれ自体に厚みの変化はなく、頬の下垂と厚みの増強が鼻唇溝の深化を強調していた。

１回転する間に複数の画像を一度で撮像できる。Ｘ線管球本研究において、重力荷重による疑似的な加齢性変化をは連続的に高速回転しており、短時間で広範囲を撮像する

顔面に誘発し、その変化を CT で評価した。症例数が少なことが可能である。そのため、MDCT は容積情報を有す

いにも関わらず、加齢とともに頬頂部は内尾側に下垂し、る薄く鮮明な画像を短時間で多量に収集でき、任意断面の下垂した頬厚が増加することが確認でき、それらが加齢容

画像や 3 次元画像の作成が可能になった。同時に、コンピ

貌をまねくことを実証したといえる。さらに、加齢容貌のュータの進歩によって画像解析装置の機能も向上し、3 次

解剖学的要因の一部を明らかにすることができた。今後、

元 CT 画像の作成が容易になった。画像解析装置を用いる

症例数の増加による知見の蓄積を図りたいと考える。

と、様々な表示条件の三次元画像を作成できる。Volume

５．まとめ

rendering とは容積画像データから三次元画像を作成する方法である（図 1）。さらに、CT 画像はコンピュータによ

今日の進歩した画像診断学的技術や評価法は加齢に関与る計算画像であることから、三次元画像を部分的に切り取する解剖学的構造物を可視化し、高い客観性を有する。顔ると、目的とする内部構造物が描出される。顔面の場合、

面加齢のメカニズムを解析するための有用な手段であり、1 回の検査で約 300 枚の画像データが収集でき、高精細で抗加齢・美容医学に対し科学的エビデンスの構築に貢献す

詳細な画像情報が大量に含まれている。加齢に関わる解剖る。さらに、本手法を普及させることで抗加齢化粧品や美学的情報を引き出すことで、加齢容貌およびその内部構造

容施術法の開発、加齢顔画像作成等の警察の鑑識捜査へのを評価可能である。しかし、現在の問題点は加齢の評価法

技術応用など、社会的にも貢献すると考えられる。本研究が標準化されておらず、客観的評価法が確立していないこによって得られた成果は関連領域の多くの研究者に積極的とである。

に広く発信していきたいと考える。

加齢による容貌変化は皮膚の老化に加え、皮下の加齢性変化も関与する 7）。皮下の解剖学的構造物には表情筋や筋

謝辞

膜、脂肪織、骨などがある 8）。これらの構造物の加齢性変本研究を行うにあたり、ご支援を賜りました公益財団法化が複合的に積載されることによって、年齢とともに容貌人コスメトロジー研究振興財団に深く御礼申し上げます。

変化が生じてくる。さらに、重力が加齢容貌に対して促進

本研究の継続がコスメトロジーの進歩と発展の一助になる

方向に働き、たるみが増強されるとされる 7）。今回、我々と幸いです。

は顔面に重力を荷重することで、疑似的に加齢性変化を促進させ、中顔面の容貌変化について客観的評価を試みた。

− 133 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

（引用文献）

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6） Kalender WA, Seissler W, Klotz E, Vock P. Spiralmultidetector row computed tomography to evaluate

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S, editor. Gray’s anatomy, 39th ed. Philadelphia: Elsevier
Churchill Livingstone; 2005.

− 134 −

肌の魅力に関する意識構造の年代間、性別間比較
関西学院大学理工学部

谿雄祐

The visually perceived shitsukan of the skin, such as translucency and glossiness, is important information in thehuman communication. The makeup is one of the methods that realize the ideal shitsukan. The way of makeup is different
according to ages. The hypotheses in this study were as follows; the age-related difference of the ideal shitsukan of theskin would underlie the difference of makeup, and the attractive skin that is wanted to get has different shitsukan from thegenerally attractive skin. To investigate these hypotheses, 3 experiments were executed. To execute these, the words that
express the condition and shitsukan of the skin were collected from the web sites of the cosmetic companies and the web sitethat the users freely write about their impression of the cosmetics. The frequently appeared words from both sources were
almost the same. This suggested that the gap between producer and customer was small. The evaluation of the subjective
importance of the shitsukan for the "ideal" attractive skin and "real" attractive skin showed that the age- and gender-relateddifference was not evident. The results of the paired comparison suggested that the visual shitsukan is more important than
the tactile shitsukan, and that the males regard whiteness as less important relative to the females. The results of the skin
image evaluation experiment showed that the important shitsukan was highly correlated the attractiveness of the skin, thatthe attractive skin showed some color deviation, and that the order of the attractiveness of the skin images used as the stimuli
almost the same for all ages and genders.

１．緒

肌が異なる可能性を考慮し、それぞれについて課題 1 で収言集した肌質感や状態の重要度について調査した（課題 2）。

反射、透過、吸収、散乱と言った肌の光学特性は、皮脂

課題 2 の結果から、年代と性別による顕著な違いは認めら

分泌量や血行など健康状態に影響され、肌の透明感やつやれなかったため、回答の類型によって評価者を群分けした。

感などの質感を左右する。視覚的に認識された肌の健康状

この群の間で重要度のばらつきが大きかった項目のうち、態は顔の魅力と相関する 1 , 2）など、対人関係や自己実現に

視覚的質感 2 語と触覚的質感 2 語について、新たな評価者

とって重要な要素であるため、我々は自他の区別なく肌のを対象に、評価者にとっての現実的に魅力的な肌における状態に注意を払い、肌の質感を維持、向上させるために日々重要度を一対比較実験により検討した（課題 3）。さらに、の手入れを行っている。一方、肌の質感に対する意識は年

課題 2 の回答者の一部を対象に、コンピュータグラフィッ

代によって異なることが知られている 3）。これらのことを

クス技術により作成した肌画像の魅力判断を行わせる実験鑑みると、評価者自身の年代によって魅力的だと感じる肌を実施した（課題 4）。

も異なる可能性がある。さらに、自らの肌を魅力的に装う

２．課題 1：肌質感関連語収集ための手段である化粧の嗜好も年代によって異なると考えられるだけでなく、化粧をする習慣の有無によっても肌の質感に関する意識構造が異なる可能性がある。

広く通用することが保証された肌質感を表現する語句を以後の課題で使用することを保証するために、学術研究で本研究では様々な年代の男女を対象に、魅力的だと感じる肌が有する質感に関する調査を行い、年代、性別ごとに使用された語句ではなく、化粧品会社と化粧品ユーザーが用いる言語表現から収集することとした。

肌質感や魅力に関する意識構造を明らかにすることを目的とした。まず、肌質感に関する言語表現を収集し（課題 1）、

2 . 1．方法

肌の魅力において広く重要視されている肌の質感や状態を大手化粧品会社 4 社のブランド紹介サイトにおけるベー明らかにした。次に、評価者自身がそうなりたいと願う「現スメイクに関するページと、一般ユーザーが書き込む化粧実的」に魅力的な肌と、抽象化された「理想的」な魅力的な品口コミサイトのうち化粧水、ベースメイク、チークに関するページを対象として、肌の質感と状態を表現する言語
表現の抽出を行った。口コミサイトからは、対象とした化粧品に関する 20 代、30 代、40 代、50 代、60 代ユーザー

The concept of the attractiveness of theskin
Yusuke Tani
Kwansei Gakuin University

による投稿について、年代ごとに収集時点で最新の 10 ページ分を収集対象とした。各 web ページの HTML データ
をプログラミングにより収集し、そこから当該部分を抽出した後、著者が内容を読み、文脈と対象が適切であること− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

年齢と性別を回答させた後、スクリーニングのために、肌を確認しながら言語表現を収集した。

に関する専門的知識を要する化粧品や美容関連業種への勤

2 . 2．結果と考察

務について回答させた。年齢と性別はモニター登録情報に化粧品会社のサイトからは延べ 65 語を、口コミサイト

含まれていたが、登録モニター本人の回答であることを担からは延べ 955 語を抽出した。次に、表記のゆれを調整し保するために回答させた。なお、調査会社から送られた案て同一内容と見なせるものをまとめた上で出現頻度の全語

内および調査サイトの冒頭には調査内容、守秘義務、報酬数に対する割合を求めた。この出現割合の上位 30 語を選に関する説明が記載されており、回答者はそれらに同意し抜した結果を表 1 に示す。

た上で回答を開始した。

口コミサイトからは一般ユーザーが用いる言語表現が中肌に関する専門的知識を有していないことが確認された

心的に収集され、化粧品会社のサイトから得られる専門家

回答者に対して、［1］現実的魅力肌と理想的魅力肌のどちが用いる言語表現とは様相が異なることが期待されたが、らか一方を想起させ、それが有する要素をできるだけ多く

上位 30 語のうち、口コミサイトからのみ収集された言語記述させた。どちらの魅力肌を想起させるかはランダムで表現は「明るさ」、「血色の良さ」、「毛穴の目立ち具合」、「てあったが、各カテゴリで半数ずつになるようにした。

かり」のみであり、残り 26 語は共通して収集された語であ

次に、課題 1 で収集した 30 語のそれぞれについて、［2］った。このことは、化粧品会社各社が一般ユーザーに訴求想起した魅力肌においてどの程度重要であると考えているする語句の選択を適切に行えていることを示唆するが、一かを「まったく重要ではない」、「重要ではない」、「どちら般ユーザー独自の表現や観点も残されている可能性も同時ともいえない」、「重要である」、「決定的に重要である」のに示していると考えられる。

5 段階評定させた。
最後に、［3］再度想起した魅力肌についてそれが有して

3．課題 2：肌質感重要度調査

いる特性についてできるだけ詳しく記述するよう求めた。

課題 2 では、課題 1 で得た 30 語が肌の魅力を評価する
上でどの程度重要だと考えられているのかを知ることを目

3 . 2．結果と考察的とした。その際、自分が手に入れたいと考える魅力的な質問［1］において重要だと考える項目が特にないと回答

肌と、自分が手に入れるかどうかは別にして魅力的だと感した回答者 131 名を分析から除外し、969 名分のデータをじられる肌における重要度を分けて調査した。本稿では以分析した。除外対象が最も多かったのは 40 代男性で全体後、前者を現実的魅力肌、後者を理想的魅力肌と呼ぶ。調の 1 / 4 近い 38 名であった。全年代を通じた除外率の平均

査はインターネット会社を介して集められた 20 代から 60

は男性が 18 . 9 ％、女性が 4 . 9 % であった。現実的魅力肌を代の一般成人男女を対象に web 上のアンケート形式で行

想 起 さ せ た 50 代 男 性 の 除 外 率 が 30 . 9 %、40 代 男 性 でった。

29 . 1 % となるなど、男性については理想的魅力肌に比べて現実的魅力肌に関する回答を要求された回答者で除外率

3 . 1．方法が高い傾向が認められた。一方、女性回答者についてはす

調査対象はインターネット調査会社にモニターとして登べての年代で想起した魅力肌によらず除外率が低かった録している 20 代から 60 代の成人男女で、無作為に選ばれ（図 1）。これらは、女性の肌に関する意識が男性よりも強て調査に関する案内を受け取り、調査サイトにアクセスしいことを示していると考えられる。

た方々であった。各カテゴリについて、回答を完了した順に 110 名、総数 1 , 100 名を回答者として報酬を支払った。
一般人の感覚における重要度を知ることを目的としたため、
表1

webサイトから収集した肌質感関連語

明るさ *
若々しさ
毛穴の目立ち具合 *
ハリ
滑らかさ
シミ
均一さ
潤い / 乾燥
やわらかさ
てかり *

小じわ
上品さ
血色の良さ *もちもち感
クマの目立ち具合
色味
華やかさ
透明感
自然さ、ナチュラル感
光沢感、輝き

肌荒れ
色っぽさ
強さ
くすみ
みずみずしさ
健康的
キメの整い
つや
色ムラ
すべすべ感

* 口コミサイト固有語− 136 −

図1

性別・年代別データ除外率

肌の魅力に関する意識構造の年代間、性別間比較

次に、質問
［2］
で得た肌質感関連語の重要度を、「まったの魅力に関して重要視する項目が異なることが示唆された。

く重要ではない」を 1 点、「重要ではない」を 2 点、「どちらそこで、分析対象とした 969 名の 30 項目に対する評価点ともいえない」を 3 点、「重要である」を 4 点、「決定的に重に対して階層クラスター分析を行い、20 クラスターに分要である」を 5 点として各群の平均を算出した。全群で 30

類した結果と実験群（想起させた魅力肌・年代・性別）の関

項目のほとんどが有意に 3 点を上回ったが、有意に 4 点を係を表 2 に示す。

超えた項目があったのは、
男性では現実的魅力肌・60代（「健表 2 から明らかなように、評定結果から回答者のカテゴ

康的」）と、理想的魅力肌・60 代（「若々しさ」、「健康的」）

リを推測することは困難である。すなわち、肌の魅力を判のみであった。一方、女性では現実的魅力肌・60 代にお断する際に重要視する肌質感は、想起する魅力肌、回答者

いて平均評定値が有意に 4 点を超えた項目がなかった以外の年代、性別によって明確に異なっているとは言えないこは、すべての群で 4 点以上の重要度評定値となった項目がとが明らかになった。
階層クラスター分析結果は、回答者を 3 クラスターに分確認できた（片側 t 検定、有意水準は 5 %）。
すべての評価項目について、想起した魅力肌の種類、回類することが適切であることを示していた。その群はすべ

答者の年代と性別の 3 要因混合計画の分散分析を行ったとての項目を重要と考える群、中程度に重要と考える群、どころ、魅力肌の種類の効果が有意となったのは「シミ」（単

ちらともいえないと考える群の 3 群であり、群内の男女差

純・単純主効果；20 代女性）、
「もちもち感」、「クマの目も明確ではなかった。そこで、評定結果を回答者ごとに標立ち具合」（単純主効果；20 代）
、
「くすみ」
、
「キメの整い」、

準得点化し、それに対して階層クラスター分析を行ったと「つや」の 5 項目であり、「クマの目立ち具合」を除いて理想

ころ、4 群（A 群、B 群、C 群、D 群）に分割することが適的魅力肌における重要度が現実的魅力肌における重要度よ

切との結果を得た。評価項目を横軸に取った重要度評定プ

り有意に高かった。すべての項目で何らかの主効果あるいロファイルを 4 群ごとに作成すると、プロファイルのピー

は交互作用が有意であり、回答者の年代と性別によって肌ク位置と振幅が異なることが確認できた（図 2）。このプロ

表2

評価結果に基づくクラスタリングと回答者群の比較

図2

評価者クラスターごとの重要度評定プロファイル− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

ファイルで大きく評価が異なる項目のうち、視覚的な肌質感である「シミ（しみがない）
」
、
「色味
（色白）
」
と触覚的な肌質感である「もちもち」、「すべすべ」
について、現実的魅力
肌における重要度を比較する実験を課題 3 として、新たな評価者を対象に実施した。これらの肌質感は回答者の自由
記述において高い頻度で出現したものでもあった。
また、2 つのクラスタリング結果を組み合わせて、全参加者を 12 クラスターに分類し、評価傾向の異なる 4 クラ
スター 620 名を対象として課題 4 を実施した。

４．課題 3：肌質感重要度比較実験
計画では、評価者の年代と性別、想起する魅力肌によって重要視される肌質感が異なる可能性が示されたことを受けて、特定の年代と性別の群について詳細は比較実験を行うこととしていた。しかし、調査結果はこの仮説を支持しなかったため、再度全年代の男女を対象として、重要度の高い肌質感のうち、視覚的な
「シミ」
と
「色白」
、触覚的な「もちもち」と「すべすべ」についてそれらの重要度を直接比較

図3

させる一対比較実験を行うこととした。

4 . 1．方

肌質感重要度一対比較結果

法

参加者はインターネット調査会社にモニターとして登録と、特に男性では重視されていなかった。これは適度に日している 20 代から 60 代の男女 1 , 000 名であった。彼らは焼けをしている方がたくましく健康的であり、男性にとっ調査会社によって無作為に抽出された候補者のうち、各年てはより好ましいからであると考えることができる。過度

代、性別で早期に回答を終了した 100 名ずつであった。実な色白はともすると病的な印象を与えることもあり、現実験は各参加者がそれぞれの環境で web ブラウザを使用し的魅力肌においては健康的であることが重要であることがて行った。調査会社から送られた案内および実験用ページ

示唆された。

には実験内容、守秘義務、報酬に関する説明が記載されて参加者のカテゴリごとに結果を見ると、男性はほぼ一貫おり、参加者はそれらに同意した上で実験を開始した。

して「シミがないこと」、「すべすべであること」、「もちも参加者の課題は、自身が手に入れたいと考える現実的魅ちであること」、「色白であること」の順となっていた。年

力肌を想起しながら、対提示される 2 つの肌質感のうち、代が高くなるほど色白であることの重要度が下がりすべす

想起した現実的魅力肌にとってより重要である方を回答す

べであることの重要度が高くなっていた。これは男性が一ることであった。比較させた肌質感は「シミがないこと」、

般的に、女性に比べて保湿や日焼け対策などの肌ケアをし「色白であること」、「もちもちであること」、「すべすべでないことと関連していると考えられる。色白については先あること」の 4 つであった。すべての組み合わせを一度ずに述べた通りである。一方、すべすべであることがより重つ比較させたため、質問数は 6 であった。参加者には所定要になる理由としては、日々のひげそりによるダメージのの報酬が後日支払われた。

蓄積と加齢に伴う皮脂分泌量の低下が原因であると考えられる。

4 . 2．結果と考察

年代による傾向の違いは女性でより顕著であった。20

比較対ごとに選択率を算出し、標準正規分布の累積分布

代では「色白であること」は触覚的な質感よりも重要であっ関数の逆関数の値へと変換し、平均値を取ることで各肌質

たが、年代が高くなるにつれて重要度が低くなった。それ

感の選好尺度値とした。参加者全体で見ると、「シミがなに伴って、若年代では重要度が低かった「すべすべである

いこと」が突出して高く、「すべすべであること」、「もちもこと」の重要度が高まり、高い年代では「もちもちであるこ

ちであること」と続き、「色白であること」が最も低かったと」よりも重要とされた。「色白であること」の重要度が低（図 3）。この結果は、視覚的な肌質感が触覚的な肌質感よ下することは、加齢に伴って素肌の明度が低下する傾向がり重要視される傾向を示していると考えられる。色白でああること 4）と関連していると考えられる。

ることは一般的には良いこととされているが、結果を見る− 138 −

肌の魅力に関する意識構造の年代間、性別間比較

図4

実験画面

ついて比較させた（図 4 右）ため、総試行数は 6 であった。

５．課題 4：肌画像評価実験

画像は皮膚の層構造と各層における透過率、反射率を色素

課題 2 において、30 項目の評定結果に基づいて評価者

量によって決定し、光の挙動をシミュレーションすることを類型化した結果は参加者の年代と性別と対応しないことで画像化するコンピュータグラフィックス技術 5）を用いてが示された。そこで、評価項目間の重要度に違いを持って作成した、右頬部の肌画像であった（図 4 左）。比較する肌

いてなおかつ多くの項目を重要だと見なしている評価者を

質感は、候補者のクラスターを判別する判別関数に含まれ対象に、肌の画像を見比べて 4 つの肌質感と魅力の優劣をた変数のうち、視覚的に判断可能なものであった。

回答させる一対比較実験を実施した。

5 . 1．方5 . 2．結果と考察

法

肌画像の選択率から選好尺度値を算出した。全参加者の実験参加者の候補者は、課題 2 の結果に基づいて、課題

結果から算出した選好尺度値は、画像 2 が最も魅力的であ2 の評価者から選抜した 620 名とした。その内訳は、30

り、次いで画像 1 が魅力的であることを示していた。魅力

項目の重要度が比較的均等に低いクラスターの 92 名（L タと肌質感の各項目の相関はいずれも高く、これらが密接なイプ）、30 項目のいくつかの重要度が低く、他は重要だと関係にあることが示唆された。
「みずみずしい」、「つやが考えているクラスターの 287 名（M 1 タイプ）、30 項目の半ある」、「若々しい」は「魅力的」と順位が完全に一致したが、分程度の項目について重要だと考えているクラスターの「色ムラがある」は順位が正反対とはならず、画像 2 は画像

151 名（M 2 タイプ）
、すべての項目を重要だと考えており、

1 よりも色ムラがあると評価されていた。このことから、

かついくつかの項目を非常に重視しているクラスターの魅力的な肌は部位によってある程度色が異なっていること

90 名（H タイプ）であった。

が明らかになった。参加者のカテゴリごとに見ても魅力の

実験への協力依頼に応じた 332 名が参加者となった（男順位に大きな変動は見られなかった（図 5）。この結果も年

性 168 名、女性 154 名）。実験は参加者各自が web サイト

代と性別によって魅力的だと感じる肌が持つ要素に大きなにアクセスする形で実施したため、観察環境については統

差はないことを示している。

制されていないが、十分な大きさで刺激画像を観察させる

６．総必要があったため、スマートフォンでの参加を禁止し、PC での参加を条件とした。

括

本研究では化粧品会社のサイトと一般ユーザーによる口

参加者は案内および web サイト先頭ページに記載されコミサイトの両方から肌質感を表現する語句を収集したが、た実験課題、秘密保持、報酬に関する説明を読み、理解し収集総数に占める割合の上位 30 語のうち 26 語は両方からた上で実験への参加に同意して課題を開始した。参加者に収集されたものであった。これは、専門家と一般人が用いは後日報酬が支払われた。

る言語表現の乖離が小さいことを示唆している。得られた課題は対提示された 2 枚の肌画像を見比べて、「みずみ語句が魅力的な肌にとってどれくらい重要であるかについ

ずしい」、「つやがある」、「色ムラがある」、「若々しい」、「魅て、年代と性別、想定した魅力肌による明確な差異は認め

力的」の各語により当てはまると感じた方を回答することられなかった。このことは年代や性別による魅力と関連のであった。画像は 4 種類あり、そのすべての組み合わせに強い肌質感の違いは個人差その他の要因と比べて大きいも− 139 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図5

肌画像の魅力のではないことを意味している。今後は魅力と関連の強い

Journal of the American Academy of Dematology, 57,

肌質感に対する評価が年代や性別によってどのように異な

977-984.（2007）．

るのかを、課題 4 のような画像に対する評価実験を通じて

3）征矢智美・野村美佳・林照次・長谷川敬 . 日本化粧品技術者会誌 , 38, 115-124.（2004）．

より詳細な検討を加えていくことが必要である。

4）菊地久美子・片桐千華・溝上陽子・矢口博久 . 日本色彩（引用文献）

学会誌 , 41, suppl.44-47.（2017）．

1）Jones, BC., Little, AC., Burt DM., Perrett, DI.

5）Iglesias-Guitian, JA., Aliaga, C., Jarabo, A., Gutierrez,
D. Computer Graphics Forum, 34, 44-55.（2015）．

Perception, 33, 569-576.（2004）．
2）Matts, PJ., Fink, B., Grammer, K., Burquest, M.

− 140 −

植物由来の香りが睡眠におよぼす影響の解明
東京大学大学院農学生命科学研究科

恒次

祐子

Effects of the odor of α-pinene, an odorous compound found in extracted oils of various plants including coniferous
trees, were investigated in terms of sleep quality. Lavender essential oil, which has been reported to have a positive influence
on sleep, was used for purposes of comparison. Eight male university students wore a wrist actigraph and heart rate monitor
for several nights while they slept inhaling the odor of α-pinene, lavender, or no odor (control). They also filled in the OSAMA sleep inventory and a sleep diary in the morning. Subjective odor intensity was significantly higher for α-pinene andlavender compared to that of the control. The average score for the factor IV of the OSA-MA sleep inventory (recovery fromfatigue) was higher, and sleep latency determined by actigraphy was shorter under the α-pinene condition compared to thecontrol. No significant difference was observed in heart rate and heart rate variability indices among three conditions. Since
there are several limitations in this study, such as a small sample size or less controlled sleep environment, further studies areneeded to precisely assess the effects of α-pinene on sleep quality.

1. 緒

られており，特にラベンダー精油で効果があるとした論文

言が多いことが報告されている。またこのレビューでは，吸厚生労働省の平成 27 年国民健康・栄養調査

1）

によると，

引の量や頻度の問題，さらにどのようににおいが睡眠質を20 代以上の男女で「睡眠時間が足りなかった」「睡眠全体改善するかというメカニズムが今後の研究課題として挙げの質に満足できなかった」という回答が全体で約 20 % あり，られている。

特に 20 代，30 代では 27 . 1 %，28 . 1 % と高かった。また「寝我々はこれまでに，においが人間に及ぼす影響を，人のつきにいつもより時間がかかった」「夜間，睡眠途中に目

生理的な反応を指標として明らかにする研究を行ってきた。

が覚めて困った」「起きようとする時刻よりも早く目が覚

例えば成人を対象とした研究により，植物に含まれるにおめ，それ以上眠れなかった」などの回答も一定数あり，睡い成分のうち「α -ピネン」という物質が血圧や心拍数を低下

眠の質に問題を抱える人が多いことがうかがわれる。これさせるなど，生体に鎮静的に作用することを明らかにしてまでに睡眠時間や不眠は死亡率やその他さまざまな疾患ときている 9）。α -ピネンは様々な植物に含まれる芳香性の化

2）

関係していることが報告されており ，睡眠の改善は重要学物質であり，近年は森林浴による免疫細胞活性化効果のな問題であるといえる。

一端を担っている可能性が示唆されている 10 - 11）。また我

睡眠改善を目的とした服薬を伴わない介入のひとつとしが国の人工林の主要樹種であり，木造住宅の主な材料であて，香りを用いた，いわゆるアロマテラピーが挙げられる。

るヒノキ，マツ，スギなどにも多く含まれており，いわゆ

オレンジ精油やラベンダー精油，ヒバ，ロースマリー，セる「木の家の香り」の主な成分でもある。最近内装を木質化

ージなど，様々な植物由来のにおいに気分改善効果がある

した居室において睡眠質が改善される可能性が報告されてことが報告されており

3 - 6），睡眠への効果が期待されてい7）

おり 12），α - ピネンのにおいによる睡眠への影響を解明する。韓国で出版された論文の系統的レビューでは ，13 報ることは興味深い課題であるとともに，身近な資源の活用の論文のメタ分析により，精油を用いたマッサージやにおにもつながるものと考えられる。

いの吸引が睡眠改善に有効であること，におい吸引がマッ

そこで本研究では若年成人男性を対象とし，睡眠効果にサージより効果的であること，においの種類としてはラベ関する既往報告の多いラベンダーと α- ピネンとの比較を行

ンダーおよびベルガモットが最も多く使われていることがうこととした。アロマテラピーの睡眠への影響について，

8）

報告されている。欧米の論文を中心としたレビュー にお従来の報告では実験室における終夜睡眠実験が多く，実環いても，多くの論文でにおい吸引による睡眠の効果が認め

境でのデータが不足している 8）との指摘をふまえ，研究対
象者の自宅における通常の睡眠ににおいを導入する方法を取ることとした。

2. 方
Effects of plant-derived odors on sleep
Yuko Tsunetsugu
Graduate School of Agricultural and Life
Sciences, The University of Tokyo法2 . 1. 実験方法
研究対象者は 20 代の男子大学生 8 名とした。事前に実験の目的や方法に関する説明を十分に行い，実験参加に関− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

する同意書に署名を得た。なお本研究は，国立研究開発法
人 森林研究・整備機構 森林総合研究所の倫理審査委員会の審査および承認を経て行われた。
研究対象者には自宅において通常通り睡眠をとるように指示した。4 名は第一夜ににおいのない状態で測定を行い，その後一夜ずつ α - ピネンまたはラベンダーのにおいを体験した。また 4 名については測定に慣れるように第一夜，
第二夜はにおいのない状態で測定を行い，第三夜以降に α ピネン，ラベンダー，および対照としてにおいのない状態での測定を 2 夜ずつ行った。対照を含むにおいの呈示順はFig. 1

研究対象者によりランダムとした。

試作したにおい発生シート

自宅で簡便ににおいを呈示する方法として，α- ピネンな
らびにラベンダー精油を含浸させたシール付きシートを試Ⅳ（疲労回復），因子Ⅴ（睡眠時間）をにおい別に算出した。

作した。活性炭，熱可塑性樹脂などを混合した担体に，市においの強度に関する主観評価については，無臭（0）～強販の α - ピネン（和光純薬工業㈱）またはラベンダー精油（東烈なにおい（5）の 6 段階での回答について，におい別に平香産業㈱）を含浸させ，不織布でカバーしたものであり，均値を求めた。

片面に両面テープが付いている（Fig. 1）。研究対象者にはまた活動量計にて得られたデータを用い，解析用ソフト

このシートを寝衣の右胸内側または外側の襟付近（においウェア（ActiLife 6，Actigraph 社）を用いて睡眠評価を行っが弱いと感じた場合）に貼り付けて就寝するように指示した。解析アルゴリズムとして，成人でより精度が高い 14）た。

との報告がある Cole–Kripke 式を用い，入眠潜時，総睡眠

睡眠評価は手首式活動量計（Actigraph 社 GT 3 X）
，睡眠時間，中途覚醒時間・回数，平均覚醒時間，総体動量，睡日誌，OSA 睡眠調査票 MA 版 13）にて行った。活動量計は眠効率を算出した。心拍 RR 間隔は Memcalc 法により周波

3 軸加速度計を搭載したものであり，重さ約 19 g であった。

数解析を行い，5 分ごとに低周波成分（LF：0.04 ～ 0.15Hz）

さらに，睡眠中の自律神経系活動を評価するために，小型および高周波成分（HF：0 . 15 ～ 0 . 4 Hz）を算出し，HF を心拍モニター（ユニオンツール社 WHS- 2）を用い心拍 RR

副交感神経系活動，LF/（LF+HF）を交感神経系活動の指間隔の測定を行った。あわせてにおいの強度に関する主観標とした。また睡眠深度との相関が報告されている HF/

評価を無臭（0）～強烈なにおい（5）の 6 段階で実施した。

（LF+HF）15） を求めた。心拍数は 5 分ごとの RR 間隔の平研究対象者には日中は通常通りに過ごし，就寝前に活動

均値の逆数として算出した。

量計および心拍モニターを装着するように，また起床後直質問紙および主観評価データは Friedman 検定を用い，

ちに OSA 睡眠調査票および睡眠日誌，においの強度に関においの種類による影響が有意であった場合，Wilcoxon

する主観評価質問紙に記入するように指示した。測定日のの符号付順位和検定（Bonferroni 補正）にてにおい間の差を

就床時刻，照明条件，直前の食事からの時間，その他室内検定した。その他の各指標についてはにおいの種類を要因

環境が普段と大きく変わらないように留意し，測定日にはとした一元配置分散分析を用いて検定を行った。解析は統

過度の飲酒，過度の運動を避けるように依頼した。

計ソフトウェア（SPSS 25，IBM 社）を用いて行い，有意水
準は 5 % とした。

2 . 2 . 試作したシートからのにおい物質放散

3. 結

睡眠時ににおいを発生させるために試作したシール付き
シートについて，小形チャンバー法（JIS A 1901）によりに

果

3 . 1. シートからのにおい物質放散

おい物質の放散速度を測定した。ラベンダー精油 60 µL をシートからの揮発性物質の放散は測定開始後 1 時間から含浸させたシートを 20 L のチャンバー内に 1 枚静置し，捕徐々に減少し，24 時間後以降はほとんど放散が認められ集管は TenaxTA を用いた。測定時間は 48 時間までとした。

なくなった（Fig. 2）。測定開始から 1 時間後の時点において濃度が高かったのは，上位からリナロール，リナリルア

2. 3. 解析ンスラニレートであると考えられた。これら 2 物質につい睡眠日誌および OSA 睡眠調査票 MA 版から自己申告にても，24 時間後以降はほとんど放散が認められなかった。

よる総睡眠時間を算出した。OSA 睡眠調査票 MA 版により得られた回答は所定の方法により集計し，因子Ⅰ（起床時眠気），因子Ⅱ（入眠と睡眠維持），因子Ⅲ（夢み），因子

3 . 2 . においの強度とOSA 睡眠調査票 MA 版
主観的なにおい強度はにおいの種類により有意に異なっ− 142 −

植物由来の香りが睡眠におよぼす影響の解明

Fig. 3 各におい条件における主観的におい強度
PN： α-ピネン， LV： ラベンダー，CT： 対照

Fig. 2 揮発性有機化合物濃度の変化
TVOC：総揮発性有機化合物（α-ピネン換算）
Linalool，Linalyl anthranilate：開始から1時間後の時点において濃度の高い上位2物質。ライブラリ検索による定性的な同定。
（α-ピネン換算）ており（p < 0 . 01），下位検定の結果，対照（においなし）に比較してラベンダー条件，α-ピネン条件ともににおい強度が有意に高かった（どちらも p< 0 . 01）。また，ラベンダー条
件とα-ピネン条件の間にも有意な差異が認められ（p< 0 . 05），
ラベンダーの方がにおい強度が高く評価されていた（Fig. 3）。
OSA 睡眠調査票 MA 版の各因子についてはにおいの種
類による影響は有意ではなかったが，因子Ⅳ（疲労回復）で有意傾向（p < 0 . 07）であり，下位検定により，α-ピネン条

Fig. 4 各におい条件における因子IV（疲労回復）の得点
PN：α-ピネン， LV：ラベンダー，CT：対照
平均値±標準偏差，N= 11（ラベンダー），12（α-ピネン，対照）

件で対照よりも疲労回復の点数が高い傾向（p< 0 . 06）が認められた（Fig. 4）。

3 . 3 . 睡眠指標
活動量計による睡眠評価については，すべての指標（入眠潜時，総睡眠時間，中途覚醒時間・回数，平均覚醒時間，
総体動量，睡眠効率）でにおいの主効果は有意とならず，睡眠質ににおいの影響は認められなかった。一元配置分散分析では有意ではなかったものの，入眠潜時は α- ピネン条件で 1 . 25 分，
対照では 3 . 83 分であり，下位検定（Bonferroni補正）により α- ピネン条件で有意に入眠潜時が短いという結果であった（p= 0 . 012）
（Fig. 5）
。また，有意ではないもFig. 5 各におい条件における入眠潜時
PN： α-ピネン， LV：ラベンダー，CT：対照
平均値±標準偏差，N= 11（ラベンダー），12（α-ピネン，対照）のの，α- ピネン条件では，中途覚醒時間および平均覚醒時間が短く，総体動量が少ない傾向にあった。その結果として睡眠効率（全就床時間中の睡眠時間の割合）
は α- ピネン条件で最も高かった（Fig. 6）。

3 . 4 . 心拍数および心拍変動性
心拍数，HF，LF/（LF+HF），HF/（LF+HF）のいずれの指標についてもにおいの種類の主効果は有意ではなかった。

Fig. 6 各におい条件における睡眠効率
PN：α-ピネン， LV：ラベンダー，CT：対照
平均値±標準偏差，N= 11（ラベンダー），12（α-ピネン，対照）− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

４．考たことで，様々な条件の統制が難しい面があった。既往研

察究により研究対象者の自宅において，ラベンダーのにおい

本研究では α -ピネンのにおいによる睡眠への影響を明ら

導入を週に 4 回，8 週間続けた際に睡眠に効果があったこかにするために，活動量計，心拍モニター，および質問紙とが報告されており 16），本研究においても，より長期間を用いた睡眠評価を試みた。比較対象としてこれまでに睡の測定を行うことで，妥当性の高い結果が得られる可能性

眠への効果が多く報告されているラベンダー精油を用い，は考えられる。しかしそのためには比較的生活が規則正しにおいのない対照条件とあわせて 3 条件を設定した。本研

く，ある程度の長期間に渡りあまり生活スタイルが変わら究用に試作したにおい発生シートを用いて，研究対象者のないグループを研究対象とする必要があることに注意が必

普段の睡眠環境に対してにおいを導入することを試みた。

要である。

においシートからのにおい物質放散測定では，測定開始

いくつかの課題がある一方で，本研究により α- ピネンの後 24 時間までにほとんどの揮発性成分が放散し，その後においが睡眠を改善する可能性が見出されたことは重要なは放散する成分は少なくなった。測定は規格に従いチャン成果であると考える。今後は，実験室などの統制された環

バーの換気回数を 0 . 5 回 / 時として行っており，実際の睡境下で睡眠ポリグラフなどを用いた終夜睡眠実験を行うな

眠実験の環境でシートが置かれる環境よりは換気量が多く，どの方法もあわせ，より詳細な検討を進めることが必要で放散速度が速かった可能性がある。本実験では 1 晩に 1 シある。

ートを用いるように指示しており，総就床時間は最も長いケースでも 10 時間半であったため，就床中のシートからのにおい放散量は十分であったと推測される。実際ににお謝

辞研究実施にあたって貴重な助言をいただいた国立研究開

い強度は対照よりもにおいのある 2 条件で有意に高かった。

発法人国立精神・神経医療研究センター 北村真吾室長，

加えて，ラベンダー条件で α- ピネン条件よりも有意に強度におい発生シートの試作にご協力をいただいた東香産業株

が高く，ラベンダーでは「楽に感じるにおい」と「強いにお式会社様，シートからの揮発性成分の放散測定について多い」の間，α- ピネンは「何のにおいか分かる弱いにおい」と大なご協力をいただいた国立研究開発法人 森林研究・整「楽に感じるにおい」の間であった。このにおい強度の差に備機構 森林総合研究所 宮本康太室長に厚く御礼申し上げ

より睡眠への影響にも差異があった可能性もあり，においます。

強度の調整は課題として残った。
本研究における α- ピネン条件では，対照よりも主観的な
疲労回復感が高く，入眠潜時が短くなる可能性が示唆された。また睡眠効率も 3 条件の中で高い傾向にあり，α- ピネ
ンが睡眠によい影響を与える可能性があるのではないかと推察される。一方，心拍モニターを用いた評価では，既報

15）（引用文献）
1） 厚生労働省，平成 27 年国民健康・栄養調査報告，
20172） 土井由利子，日本における睡眠障害の頻度と健康影響，
保健医療科学，61（1）: 3-10，2012

で OSA 睡眠調査票の各因子や睡眠ポリグラフ検査による

3） Lehrner J, Marwinski G, Lehr S, Johren P, Deecke L.,

睡眠ステージとの関係が報告されている各指標とも，におAmbient odors of orange and lavender reduce anxiety

いによる影響は認められなかった。本研究では研究対象者

and improve mood in a dental office. Physiology &が自分で自宅にて簡単に装着できることを重視し，小型のBehavior. 86（1-2）: 92-95. 2005.

ウェアラブル測定器を用いた。実験後のヒアリングによる

4） Itai T, Amayasu H, Kuribayashi M, Kawamura N,と，研究対象者にとってはストレスなく使用することがで

Okada M, Momose A, Tateyama T, Narumi K,

きる測定器であったといえそうであるが，得られた終夜のUematsu W, Kaneko S. Psychological effects of

心拍データにノイズが多く混入したり，睡眠中に測定器がaromatherapy on chronic hemodialysis patients.

外れるなどのケースもあった。より精度の高い測定を行う

Psychiatry Clin Neurosci. 54（4）: 393-7. 2000.
5） Diego MA, Jones NA, Field T, Hernandez-Reif M,

ことで，異なる結果が得られる可能性もある。
本研究において測定を試みたどの指標でも，従来睡眠へ

Schanberg S, Kuhn C, McAdam V, Galamaga R,の効果が多く報告されているラベンダーについて睡眠質にGalamaga M. Aromatherapy positively affects mood,

影響するとの結果は得られなかった。本研究は少人数でのEEG patterns of alertness and math computations. Int

検討に留まっていることや，におい導入の期間が短かった

J Neurosci. 96（3-4）: 217-24. 1998.

可能性，ラベンダーのにおい強度が高すぎた可能性など，

6） Johnson AJ. Cognitive facilitation following intentional

様々な原因が考えられるが，現時点では理由は不明である。

odor exposure. Sensors（Basel）．11（5）: 5469-88. 2011.

本研究は研究対象者の自宅という実環境での測定を目指し

7） Hwang Eunhee and Shin Sujin, The Effects of− 144 −

植物由来の香りが睡眠におよぼす影響の解明

Aromatherapy on Sleep Improvement: A Systematic屋 遼太，住宅の内装木質化が睡眠と日中の知的生産性

Literature Review and Meta-Analysis, The Journal ofに及ぼす影響，日本建築学会関東支部研究報告集，86 :Alternative and Complementary Medicine. 21（2）: 61-

225 - 228，201613）山本由華吏，田中秀樹，高瀬美紀，山崎勝男，阿住一

68, 2015
8） Lillehei Angela S. and Halcon Linda L., A Systematic雄，白川修一郎，中高年・高齢者を対象とした OSA 睡

Review of the Effect of Inhaled Essential Oils on Sleep,

眠調査票（MA 版）の開発と標準化，脳と精神の医学，10

The Journal of Alternative and Complementary（4）: 401 ‒ 409，1999

Medicine. 20（6）: 441-451, 201414）Quante M, Kaplan ER, Cailler M, Rueschman M,

9）（恒次他，2005）

Wang R, Weng J, Taveras EM, Redline S, Actigraphy-10）Li Q, Morimoto K, Nakadai A, Inagaki H, Katsumata

based sleep estimation in adolescents and adults: a

M, Shimizu T, Hirata Y, Hirata K, Suzuki H, Miyazaki

comparison with polysomnography using two scoring

Y, Kagawa T, Koyama Y, Ohira T, Takayama N,

algorithms. Nat Sci Sleep. 18 ; 10 : 13 - 20 , 2018 .

Krensky AM, Kawada T.，Forest bathing enhances

15）谷田恵子，OSA 睡眠調査票による睡眠感と睡眠中の

human natural killer activity and expression of anti-

心拍変動パワースペクトル指標との関連，日本看護技術

cancer proteins. Int J Immunopathol Pharmacol. 20（2

学会誌，9（3），19 - 26，2010 .
16）Keshavarz Afshar M, Behboodi Moghadam Z,

Suppl 2）:3 - 8 . 200711）Li Q, Nakadai A, Matsushima H, Miyazaki Y, Krensky

Taghizadeh Z, Bekhradi R, Montazeri A, Mokhtari P,

AM, Kawada T, Morimoto K. Phytoncides (wood essential

Lavender fragrance essential oil and the quality ofoils) induce human natural killer cell activity.

sleep in postpartum women，Iran Red Crescent Med

Immunopharmacol Immunotoxicol. 28（2）: 319 - 33 , 2006

J. 17（4）: e 25880 , 201512）西村 三香子，伊香賀 俊治，平田 潤一郎，小川 聡，土− 145 −

現代の子ども文化の中に見られる化粧の話題の分析と保護者と保育者の化粧に関する認識
筑波大学医学医療系

徳田

克 己、水 野智美

In this study, 2 researches are done. Firstly, the analysis for makeup toy in young children’s magazine and clarified
where makeup is position in the Japanese children’s culture. Secondly, we conducted a survey to parents with young children
and nursery teachers and asked about their awareness on makeup for children.
As a result, there are a lot of makeup in magazine and toys. It goes beyond pretend play and they can color eyeshadows,
cheeks, and lipsticks in coloring sheet and there are some that they can put makeup directly on their skin. Also, more than
70 % of the children in the magazine was wearing makeup.
The result of the survey to the parents and nursery teachers showed that most of the children put makeup on special
occasions such as performance and Shichigosan ceremony and many parents and nursery teachers had negative feelingtoward makeup such as “makeup is not good for children’s body and skin”.
It is not good to deny that children are interested in dressing up but it is not desirable that children’s cosmetics is in trend
and accept children to put on makeup from early age as culture.

１．緒る質問紙調査を行う。その中で、子どもはどのように化粧言をしているのかを明らかにするとともに、保護者や保育者

現代の幼児向け雑誌の中には、化粧に関する話題が多く取り上げられ、付録として子ども用のコスメが付いていることは珍しいことではない。また、玩具店には様々な種類の子ども用のコスメが販売されている。さらに、テレビや雑誌などで、化粧をした子どもが映し出される機会も増えの持っているいかなる特性が幼児の化粧に関する拒否感に関連しているのかを明確化する。

２．幼児向け雑誌および玩具におけるコスメの扱われ方てきた。このような状況により、幼児にとってコスメが身2 . 1.

幼児向け雑誌におけるコスメの扱われ方

近なものとなり、化粧への憧れが強くなってきている。雑

（1）分析対象と手続き

誌に掲載されている子どもモデルのような化粧をしたいと

2016 年 4 月～ 2017 年 3 月に発行された主に就学前の女言い出してきかなかったり、幼稚園や保育所に化粧をして児を対象としている 6 種類の雑誌、計 52 冊（5138 頁）、付

行きたがったりするという話題について幼児を持つ保護者

録数 55 個であった。雑誌名と冊数（頁数）は、女児の雑誌から頻繁に耳にする。一方で、幼児を持つ保護者や保育者として、ぷっちぐみ 12 冊（1318 頁）、ひめぐみ 3 冊（184 頁）、の中には、幼児期の子どもが化粧をすることにとまどいをキャラぱふぇ 7 冊（962 頁）、ピンク 6 冊（372 頁）、男女と感じたり、強い拒否感を抱いたりする者もいる。同じ幼稚も読む雑誌として、たのしい幼稚園 12 冊（1158 頁）、おと園に勤務する保育者間でも認識が異なり、ある保育者は子

もだち 12 冊（1144 頁）であった。分析対象アイテムは、顔どもが化粧をすることを容認するが、別の保育者は禁止すに関係するもの（チーク、口紅、ファンデーション、アイるという事態も生じている。

シャドー、つけまつげなど）に限定し、ヘア化粧、マニキ

そこで本研究では、大きく 2 つの調査を行った。1 番目

ュア、装飾品は除いた。

の調査として、幼児向けの雑誌やコスメ玩具の分析を行い、 （2）結果と考察
幼児がどのように化粧に触れているのか、日本の幼児文化

雑誌の内容を、キャラクター漫画、キャラクターぬり絵、の中に化粧がどのように位置づけられているのかを明らか

キャラクター製作、キャラクター紹介、まちがい探し、本にする。2 番目の調査として、幼児を持つ保護者と保育者

誌内容紹介、コスメ紹介、懸賞、コスメ広告、通販、映画を対象にして、幼児期の子どもの化粧に関する認識を尋ね

紹介、次号紹介、書籍紹介、他誌紹介、付録、綴込み付録、*** A na lysis of t he Topic of
Makeup in Modern Children’ s
Culture and Awareness of
the Parents and Nursery
Teachers
Katsumi Tokuda*, Tomomi
Mizuno**U n i v e r s i t y o f Ts u k u b a ,Faculty of Medicine− 146 −

綴込みシール、付録説明、その他の 19 項目に分
類し、コスメに関係するものが掲載されているページを計数した。
その結果、コスメに関する内容が掲載されていたのは 158 頁であり、全体の 3 . 1 ％であった。19
項目の中で最も多かったのは懸賞（39 頁）であった。賞品としてキャラクター玩具、キッズコスメ

現代の子ども文化の中に見られる化粧の話題の分析と保護者と保育者の化粧に関する認識

商品（子ども用のリップやチークなど、子どもが直接、肌ており、そこに色鉛筆を使って、まゆげ、チーク、口紅をに塗るもの）、化粧玩具（木製やプラスチック製のコスメの塗るというものであった（図 2）。頁内には化粧の見本が示形をした玩具であり、子どもの肌に直接には塗らないもの）

されていた。ただし、色鉛筆ではなく、付録の「メイクぬなどが当たるという内容であった。次に多かったのが、キりえコンパクト」を使ってぬり絵をさせるものもあった（図

ラリスというコスメキャラクター（しっぽが口紅の形をし3）。これらは大人が使用しているコンパクトやチップにている）やリカちゃんが登場するキャラクター漫画であっとてもよく似た玩具であり、この絵の具が子どもの顔など

た（35 頁）。また、リカちゃんの友だちの「化粧が上手なつに付着することが心配である（保護者への注意書きで保護

ばさちゃん」
がしばしば登場しており、口紅、アイシャドー、者の管理下で使用するように書かれている）。

フェイスペイントの方法などが載っていた（図 1）。つばさ

コスメに関連した付録は 3 個であった。１つは前述の「メ
イクぬりえコンパクト」であり、その他に「たからものボッちゃん人形の懸賞もあった。
化粧玩具の広告（16 頁）や紹介（7 頁）では、ラメ入りリックスリップペン（ケースの中の赤い口紅の形状の赤色水性

プなどの子どもが化粧をするためのキッズコスメ商品が取ペン）」、「ひかるおけしょうコンパクト（コンパクトの中に、り扱われていた。その頁には派手な化粧をしている子ども

鏡、パフ、チップ、押すと光る部分がある）」の 2 つがあっモデルが載っているものが多く、読者にとっては購買意欲た。リップペンは子どもが自分の唇に塗ってしまう危険性が増すことが推測された。

があると思われた（注意書きはある）。

幼児雑誌に特徴的であったのはキャラクターぬり絵であ

分析対象の 5 , 138 頁のうち、女児の写真が載っているのった（9 頁）。例えば、頁に大きくラプンツェルの顔が載っは 401 頁であった。そのうち、明らかに化粧をしていると

図1

リカちゃん人形を取り上げる中で、化粧の仕方を紹介している頁

図2

色鉛筆で化粧のぬり絵をする頁

図3

付録の「メイクぬりえコンパクト」を用いてぬり絵をする頁

図4

化粧をした女児の写真− 147 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

約 7 割の商品の対象年齢は 6 歳以上となっていた。し

判断された写真が載っているのは 283 頁（女児の写真のうかし、玩具店で観察していると、購入する子どもの年齢

ちの 70 . 1 ％）
であった
（図 4）
。

が対象年齢以下である（おそらく 3 ～ 5 歳）と思われるケ

2 . 2 . 幼児向け玩具におけるコスメの扱われ方

ースがほとんどであり、対象年齢を確認している保護者（1）分析対象と手続きはいなかった。

インターネットの大手通販サイト 2 社において「化粧＋また、約半数の商品に「保護者の監視のもとで遊ぶこおもちゃ」「コスメ＋おもちゃ」「メイク＋おもちゃ」「キと」「乳幼児の手の届かないところに保管すること」
といッズコスメ」を検索ワードとして検索された玩具に目を通う注意書きが書かれていたが、現実には保護者が監視しした上で、東京都内の大型玩具店 3 店舗、東京おもちゃシていないところで幼児が使用している可能性があると思ョー 2016 年、東京おもちゃショー 2017 年に行き、市場われる。
一部の商品には、化粧落としやリムーバーを用いなくでどのような幼児向けのコスメ玩具が販売されているのかを観察し、玩具の分析をした。

ても、水やせっけんで落ちること、子どもの肌に負担が（2）結果と考察

少ない成分を使っていることを明記していた。ただし、販売されている幼児向けのコスメ玩具は、1）
キッズコス

すべての商品に化学物質が含まれており、あくまでも大メ商品（実際に子どもが自分の肌や爪、髪に塗って遊ぶも人のコスメよりも皮膚への負担が軽いというだけに過ぎの）、2）木製あるいはプラスチック製で、見立てて遊ぶ化ないと言える。また、国産の商品はごく一部しかなく、

粧玩具、3）ぬり絵用紙や人形に塗って遊ぶ化粧玩具の 3 つ

ほとんどが中国や韓国で製造された輸入品であった。国に分類できた。

産であれば、薬事法によって感作性の強い色素などの使

1）キッズコスメ商品の中には、ディズニーのプリンセスシ用が禁止されているが、輸入品の場合にはそれらが含ま

リーズやバービーなどのキャラクターを使用したものがれている危険がないとは言えない。

目立った。これらのキャラクターを使用した商品は、色

2）木製あるいはプラスチック製の玩具の化粧玩具は、口紅、付きリップ（リップグロスを含む）、アイシャドー、ネイ

アイシャドー、チーク、化粧ブラシなどがポーチあるいル（ネイルストーン、ネイルシールを含む）、アクセサリはドレッサーとセットになっていた。実際に肌に色を付ー（ティアラ、指輪）などがセットあるいは単品で売らけることはできないが、精巧にできており、化粧をするれており、子どもがキャラクターになりきることができ気分を味わうことができる内容であった（図 7）。

るように作られていた（図 5、図 6）。

3）ぬり絵用紙や人形に塗って遊ぶ化粧玩具は、化粧パレッ

中身

図6
図5

キッズコスメ商品 2

キッズコスメ商品 1

図7

木製の
化粧道具

図8

− 148 −

ぬり絵用紙に塗って遊ぶ化粧玩具

現代の子ども文化の中に見られる化粧の話題の分析と保護者と保育者の化粧に関する認識

トに口紅、アイシャドー、チークの絵具とコスメチップ

かったことから、基本的には特別な日以外は、家の外にしやパフがセットされており、ぬり絵用紙や人形の顔にコていかない家庭がほとんどであると言える。

スメチップやパフを使って色を塗っていくようになって子どもが化粧をする頻度を尋ねたところ（表 4）、1 年に 1、

いた（図 8）。すべての玩具の注意書きに「肌や髪にしよ

2 日以下と答えた者が 6 割であり、1 か月に 1 回以上化粧うすることができない」と書かれていたが、幼児向け雑する子どもは 1 割に過ぎなかった。

誌の付録と同様に、子どもが肌に塗ってしまう危険があ

子どもが化粧をしたことによって生じた問題を尋ねたとると感じられた。なお、「玩具安全基準に適合した色素

ころ、「化粧品によって皮膚に異常が発生した」と答えた者

を用いている」
ことを明記する玩具が一部にあった。

が 2 ％（2 名）、「化粧が禁止されている場所（幼稚園や保３．幼児期の子どもの化粧に関する保護者、保育者の認識
3 . 1.

保護者に対する質問紙調査

育所など）に化粧をしていきたいと駄々をこねた」2 ％（2名）が挙げられたにすぎなかった。
③幼児の化粧に関する保護者の認識
幼児期の子どもが化粧をすることについて、どの程度、（1）目的幼児を持つ母親を対象に、幼児期の子どもが化粧をする

表1

ことについての認識、自分の子どもが化粧をした経験や状況、母親自身の化粧の経験などを明らかにする。

年齢

（2）方法
①調査対象者
埼玉県、茨城県、沖縄県で開催された幼児を持つ保護者を対象とした講演会（それぞれの県で 1 か所ずつ）に参加した母親 480 名を調査対象とし、282 名から回答を得た（回

子どもの人数

収率 59 ％）。そのうち、回答に不備のあるものを除き、女児の有無

228 名の回答を分析対象とした。

小学生以下の女児の有無②調査手続き

調査対象者の属性
20 代
30 代
40 代
無回答
1人
2人
3人
4 人以上
無回答
女児あり
女児なし
女児あり
女児なし

（N = 228）

3 ％ （ 8 名）
63 ％（ 144 名）
32 ％ （ 72 名）
2 ％ （ 4 名）
24 ％ （ 55 名）
52 ％（ 119 名）
14 ％ （ 32 名）
2 ％ （ 3 名）
8 ％ （ 19 名）
3 ％（ 143 名）
37 ％ （ 85 名）
61 ％（ 139 名）
39 ％ （ 89 名）

任意による無記名自記式質問紙調査を行った。調査時期
は、2016 年 1 月～ 3 月であった。

表2③倫理的配慮

子どもがはじめて化粧をした年齢
2歳
3歳
4歳
5歳
6歳
無回答

筑波大学医学医療系医の倫理委員会の承認を得て実施した（承認番号 1026）。
（3）結果①調査対象者の属性（n = 118）
7 ％ （ 8 名）
71 ％ （ 84 名）
2 ％ （ 2 名）
1 ％ （ 1 名）
2 ％ （ 2 名）
18 ％ （ 22 名）

調査対象者の属性を表 1 に示した。調査対象者の年齢は30 代と 40 代が 9 割以上を占めており、20 代はわずかで表3あった。また、子どもは 2 人以下が 7 割以上を占めた。また、女児のいる者は 63 ％であり、小学生以上の女児がいる者は 26 ％であった。
②わが子の化粧経験
小学生以下の女児を持つ者（n= 139）を対象に、子どもが幼児期に化粧をした経験があるかどうかを尋ねたところ、

子どもはどのような時に化粧をするのか（選択式）

発表会や七五三などの特別な日家の中での遊び
デパートへの買い物や外食などのお出かけ
幼稚園や保育園に行く時
その他（n =118）
87 ％（ 103 名）
19 ％ （ 23 名）
2 ％ （ 2 名）
2 ％ （ 2 名）
2 ％ （ 2 名）「ある」と答えた者は 85 ％（118 名）と、大半を占めた。子どもが化粧をしたことがある者に、子どもがはじめて化粧表4をしたのはいつかを尋ねたところ（表 2）、3 歳と答えた者
が 7 割以上であり、その他の年齢ではごくわずかであった。
子どもがどのような時に化粧をするかを尋ねたところ（表3）、「発表会や七五三などの特別な日」と答えた者が大半であったが、「家の中での遊び」と回答した者も約 2 割いた。
お出かけや幼稚園、保育所にしていく子どもは非常に少な− 149 −

子どもはどのくらいの頻度で化粧をするのか（選択式）
ほぼ毎日
1 週間に 3、4 日程度
1 週間に 1、2 日程度
1 か月に 1、2 日程度
半年に 1、2 日以下
1 年に 1、2 日以下
無回答（n = 118）（ 1 名）0
1 ％ （ 1 名）
8 ％ （ 9 名）
12 ％ （ 14 名）
60 ％ （ 71 名）
18 ％ （ 22 名）
1％

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

抵抗があるかについて、「非常に抵抗がある」から「全く抵表5

抗がない」までの 5 段階のリッカート尺度で尋ねた（得点が高い方が、抵抗が強いことを示す）。母親の年代（20 代、母親の年齢の違いによる抵抗感
M
3.40
3.75
3.60

20 代
30 代
40 代

30 代、40 代）によって抵抗感に違いがみられるかどうかについて、分散分析を用いて確認したところ（表 5）
、有意

SD
.548
.974
.999

（N = 228）
F値
0.75（ 2,178）

な差は認められなかった。また、子どもが化粧をする頻度（1 か月に 1 回以上化粧をするか、1 回未満か、化粧をしたことがないか）によって、化粧への抵抗感に違いがみられるかについて、分散分析を用いて確認したところ（表 6）、有意な差が認められた。多重比較を行ったところ、1 か月に 1 回未満の者と 1 か月に 1 回以上の者、化粧をしたことがない者と 1 か月に 1 回以上の者との間に、それぞれ有意な差が認められ、1 か月に 1 回以上の化粧を子どもがしている者は他の群と比べて抵抗感が低いこと、1 か月に 1 回

表6 子どもの化粧の頻度（1か月に1回以上化粧をしているか）による化粧に対する抵抗感（n =139）（小学生以下の女児がいる家庭のみ）
M
SD
F値
1か月に1回以上
1か月に1回未満
化粧経験なし

表7

ことがわかった。
常に賛成する」から「非常に反対する」までの 5 段階のリッカート尺度で尋ねた（得点が高い方が、賛成の程度が高いことを示す；表 7）。その結果、「化粧をして幼稚園や保育所に行ってはいけない」と認識する傾向が強い一方で、「特別な日に化粧をするのは問題ない」とも考える傾向がみられることから、幼児の化粧は、発表会や七五三などの特別な日だけにするものであり、幼稚園や保育所などの日常の生活ではすべきではないと考えていることが確認できた。
また、「子どもは化粧をしなくてもかわいいので化粧をする必要はない」と認識する傾向が強くあるために、「子ども化粧をして幼稚園や保育所に行ってはいけない

幼児の化粧に対する抵抗感に、調査対象者のどのような4.74 0.82

子どもは化粧をしなくてもかわいいので化粧をする必
4.64 0.78
要はない
特別な日（発表会や七五三など）に化粧をするのは問4.57 0.65
題ない
化粧品は子どもの皮膚や身体によくない

4.23 0.81

子どもの身体に安全な化粧品ならば子どもに使わせて2.74 1.10
もよい
化粧をすることによって子どもが自信を持つことができ
2.49 1.10
るならば化粧をしてもよい
子どもが喜ぶならば化粧をしてもよい

2.48 1.02

化粧後に丁寧に落としてあげれば子どもに化粧をする
2.22 1.04
ことに問題はない

表8どもが喜ぶならば化粧をしてもよい」「化粧後に丁寧に落いう意見には反対であった。

幼児が化粧することに関する保育者の認識（N = 228）
MSDの身体に安全な化粧品ならば子どもに使わせてもよい」「子としてあげれば子どもに化粧をすることに問題はない」と

12.21**（ 2,123）
3.82 0.95
1か月に1回未満＞1か月に1回以上化粧経験なし＞1か月に1回以上
4.11 0.69**p<0.01

未満の者は化粧をしたことがない者と抵抗感に違いがない
化粧に関する意見について、どの程度賛成をするかを「非2.50 0.85

幼児が化粧することに関する認識と抵抗感の関係（重回帰分析の結果）
β

化粧品は子どもの皮膚や身体によくない.470**

子どもが喜ぶならば化粧をしてもよい–.145*

認識が影響しているのかを明らかにしたいと考え、幼児が特別な日（発表会や七五三など）に化粧をするのは問題
–.600
ない

化粧をすることへの抵抗感を目的変数とし、表 7 に示した

化粧をして幼稚園や保育園に行ってはいけない

8 項目の認識を説明変数として、重回帰分析を行った（表8）。なお、重回帰分析を行うにあたっては、強制投入法を用いた。その結果、「化粧品は子どもの皮膚や身体によくない」という認識が化粧への抵抗感に影響を与えていることがわかった。

3. 2.

R2

保育者に対する質問紙調査–.035

子どもは化粧をしなくてもかわいいので化粧をする必要は–.147*ない
子どもの身体に安全な化粧品ならば子どもに使わせてもよ–.172*
い
化粧後に丁寧に落としてあげれば子どもに化粧をすること–.095に問題はない化粧をすることによって子どもが自信を持つことができるな.117
らば化粧をしてもよい
0.44****p<0.01、*p<0.05（1）目的
幼稚園、保育所、子ども園に勤務する保育者を対象に、幼児期の子どもの化粧に対する認識、自分が担当した子どもが化粧をした経験や状況、保育者自身の化粧の経験など①調査対象者
埼玉県、茨城県、沖縄県で開催された保育者を対象としを明らかにする。

た研修会（それぞれの県で 1 か所ずつ）に参加した女性保育（2）方法者 550 名を調査対象とし、378 名から回答を得た（回収率− 150 −

現代の子ども文化の中に見られる化粧の話題の分析と保護者と保育者の化粧に関する認識

69 ％）。そのうち、回答に不備のあるものを除き、357 名

表9の回答を分析対象とした。
②調査手続き年齢任意による無記名自記式質問紙調査を行った。調査時期
は、2016 年 1 月～ 3 月であった。
③倫理的配慮
筑波大学医学医療系医の倫理委員会の承認を得て実施し所属た（承認番号 1026）。
（ 3）結果①調査対象者の属性

保育歴調査対象者の属性を表 9 に示した。年齢は 20 代が最も多かった。また、所属は保育所（私立、公立）が多かった。

調査対象者の属性（N = 357）

20 代
44 ％（ 158 名）
30 代
20 ％ （ 71 名）
40 代
14 ％ （ 49 名）
50 代
19 ％ （ 66 名）
60 代以上2 ％ （ 9 名）
無回答
1 ％ （ 4 名）
公立幼稚園
9 ％ （ 31 名）
公立保育所
18 ％ （ 64 名）
公立こども園3 ％ （ 10 名）
私立幼稚園
14 ％ （ 52 名）
私立保育所
39 ％（ 140 名）
私立こども園10 ％ （ 36 名）
無回答
7 ％ （ 24 名）
12.12（± 11.39）
子どもあり
36 ％（ 129 名）（女児あり）（ 23 ％（ 93 名））
子どもなし
62 ％（ 222 名）
無回答（ 2 ％ （ 6 名））

子どもの有無子どもがいる者は 36 % のみであった。
②担当した子どもの化粧経験
これまでに担当したクラスの子どもが化粧をして登園した経験の有無を尋ねたところ、「化粧をしてきた子どもがいる」と答えた者は 13 %（48 名）であった。化粧をしてきた子ども（担当した子どもの中で化粧をしてきた子どもが複数いた場合には、最も化粧をする頻度が高い子ども）がどれぐらいの頻度で化粧をしてきたのかを尋ねたところ

表 10

担当した子どもの化粧の頻度
（選択式）

表 11

担当した子どもの化粧の内容（選択式）（n = 48）（化粧をして登園した子どもを担当した者のみ）
頻繁に化粧をしてきた
6 ％ （ 3 名）
時々化粧をしてきた
32 ％ （ 15 名）
1、2 回だけ化粧をしてきた
52 ％ （ 25 名）
その他
4 ％ （ 2 名）
無回答
6 ％ （ 3 名）

（表 10）、「頻繁に化粧をしてきた」と答えた者はわずかであり、数回程度にとどまっていた。化粧の内容を尋ねたと
ころ（表 11）、口紅（色付きリップを含む）
が最も多かった。
子どもがどのような時に化粧をしてきたのかを尋ねたと
ころ（表 12）、半数は「特に理由はわからない」と答えたが、「発表会などの園の行事の日」「子どもが自分用の化粧道具（n = 48）（化粧をして登園した子どもを担当した者のみ）
口紅（色付きリップを含む）
81 ％ （ 39 名）
チーク
29 ％ （ 14 名）
アイシャドー15 ％ （ 7 名）
その他
23 ％ （ 11 名）を買ってもらった後」の回答があった。
③幼児が化粧することに関する保育者の認識

表 12

幼児期の子どもが化粧をすることについて、どの程度、抵抗があるかについて、「非常に抵抗がある」から「全く抵抗がない」までの 5 段階のリッカート尺度で尋ねた。保育者の年代（20 代、30 代、40 代、50 代、60 代以上）によって抵抗感に違いが見られるかどうかについて、分散分析を担当した子どもはどのような時に化粧をしたか（選択式）（n = 48）（化粧をして登園した子どもを担当した者のみ）
発表会などの園の行事の日
23 ％ （ 11 名）
子どもが自分用の化粧道具を買ってもらっ
19 ％ （ 9 名）
た後
子どもが家族と外出した翌日
13 ％ （ 6 名）
特に理由はわからない
50 ％ （ 24 名）
その他
13 ％ （ 6 名）用いて確認したところ（表 13）、有意な差が認められた。
残差分析をした結果、40 代以上の保育者は、20 代の保育者と比べて抵抗感が有意に強いこと、50 代以上の保育者

表 13

は 30 代以上の保育者よりも抵抗感が有意に強いことを確認した。つまり、保育者の年齢が高いと抵抗感がより強く表れると言える。
化粧に関する意見について、どの程度賛成をするかを「非常に賛成する」から「非常に反対する」までの 5 段階のリッカート尺度で尋ねた（表 14）。その結果、「子どもは化粧をしなくてもかわいいので化粧をする必要はない」「化粧品
は子どもの皮膚や身体によくない」という認識が強く、「化保育者の年齢の違いによる化粧に対する抵抗感
M

SD

20 代

3.74 0.94

30 代

3.88 0.93

F値（N = 357）

50 代

15.12**（ 4,333）
4.32 0.89
40 代＝ 50 代＝ 60 代以上＞ 20 代
50 代＝ 60 代以上＞ 30 代
4.63 0.73

60 代以上4.88 0.35

40 代**p<0.01

粧をすることによって子どもが自信を持つことができるな
らば化粧をしてもよい」「化粧後に丁寧に落としてあげれ
ば子どもに化粧をすることに問題はない」という意見には− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

表 14

幼児が化粧することに関する保育者の認識

表 15（N=357）
MSD

子どもは化粧をしなくてもかわいいので化粧をする必4.74 0.62
要はない

化粧をして幼稚園や保育園に来てはいけない

4.39 1.06

化粧品は子どもの皮膚や身体によくない

4.39 0.84

特別な日（発表会や七五三など）に化粧をするのは問4.15 0.94
題ない
子どもの身体に安全な化粧品ならば子どもに使わせて2.47 1.14
もよい
子どもが喜ぶならば化粧をしてもよい

2.32 1.12

化粧をすることによって子どもが自信を持つことができ
2.23 1.06
るならば化粧をしてもよい
化粧後に丁寧に落としてあげれば子どもに化粧をする
2.09 1.02
ことに問題はない

幼児が化粧することに関する認識と抵抗感の関係（重回帰分析の結果）
β

化粧品は子どもの皮膚や身体によくない

0.35**

子どもが喜ぶならば化粧をしてもよい–0.24**

特別な日（発表会や七五三など）に化粧をするのは問
–0.01
題ない
化粧をして幼稚園や保育園に来てはいけない

0.15

子どもは化粧をしなくてもかわいいので化粧をする必要は0.01
ない
子どもの身体に安全な化粧品ならば子どもに使わせても–0.12*
よい
化粧後に丁寧に落としてあげれば子どもに化粧をすること–0.14*に問題はない化粧をすることによって子どもが自信を持つことができる
0.01ならば化粧をしてもよい

R2

0.46****p<0.01、*p<0.05

賛同しない傾向がみられた。

い存在になってきたと言える。

幼児が化粧することへの抵抗感には、保育者のどのよう

ただし、保護者および保育者の調査結果より、大半の子な認識が影響しているのかを明らかにしたいと考え、幼児

どもは、発表会や七五三などの特別な行事に限って化粧しが化粧をすることへの抵抗感を目的変数とし、表 14 に示ており、日常の遊びの中で化粧をしているケースは少数でした 8 項目の認識を説明変数として、重回帰分析を行ったあることが確認できた。このことは、保護者も保育者も「化（表 15）。なお、重回帰分析を行うにあたっては、強制投粧品は子どもの皮膚や身体によくない」と考え、幼児が化入法を用いた。その結果、母親と同様、「化粧品は子ども

粧をすることに否定的であったことが大いに関係しているの皮膚や身体によくない」という認識が化粧への抵抗感にと思われる。つまり、子どもが雑誌や玩具から影響を受け影響を与えていることがわかった。逆に、「子どもが喜ぶて化粧に憧れを抱いても、多くの家庭では、大人が日常にならば化粧をしてもよい」と考えることは、抵抗感を弱め取り入れることを制止しているのであろう。

ることに影響することを確認した。

４．総

子どもがおしゃれに関心を持つことを否定してはいけな
い。しかし、雑誌や玩具でキッズコスメの流行を作り、年括

齢が早い時期から子どもが化粧をすることを容認する文化本研究の結果より、幼児向け雑誌や玩具の中にコスメがを作ることは望ましいことではない。幼児期の子どもは母多く取り入れられており、化粧のまねをする遊びを超えて、親や保育者のまねをしたがり、化粧やファッションなどをぬり絵などで子どもが口紅やアイシャドー、チークの塗り

大人と同じようにやることで、大人の仲間入りをしたとい方を体験できるようになっていたり、直接、子どもが肌にう感覚を抱く。しかし、子どもには、キッズコスメをする

塗って遊ぶことができるようになったりできるようになっことで皮膚や身体に支障が生じる可能性があるとは考えにていた。また、雑誌に登場する子どもの 7 割以上が化粧をくく、大人と同じようにできるのであれば、当然ながらやしていた。このように、キッズコスメが子どもの日常に近りたいと考えてしまう。子どもが喜ぶからと言って、雑誌や玩具でキッズコスメ商品を開発し、進めていくことに警鐘を鳴らしていく必要性があると考える。

− 152 −

香りのなつかしさの神経メカニズム福井大学医学部脳形態機能学分野

村田航志

Olfaction is a unique sensory modality in that it can strongly bring memories back and induce physiological andpsychological responses. Odor sensation associated with old memories often accompanies comfortable feelings. However,neural mechanisms of such emotional responses are still unclear. We recently reported that odor-induced attractive behaviors
accompanies activation of the olfactory tubercle (OT) in mice. The anteromedial domain of the mouse OT was activatedby learned odor cues that induced approach behaviors. In addition, a larger number of dopamine receptor D 1 type neurons
were activated than D 2 type neurons. In this study, we addressed whether the D 1 type neurons in the anteromedial OT is
involved in attractive behaviors induced by odor cues associated with environment where mice spent infant period. We atfirst confirmed that mice acquired attractive behaviors to odors associated with bedding where they spent infant periods.
Activation of D 1 type neurons in the anteromedial OT was observed when mice showed approaching behavior to the odor
cue associated with the bedding. We confirmed that optogenetic activation of D 1 type neurons in the anteromedial OT
induced real-time place preference. These results raise a possibility that the D 1 type neurons in the anteromedial OT can be
activated by environmental odors which mice experienced in infants and plays a role in attractive behaviors.

１．緒

クスの手法で操作し、誘引行動が生じるかを検証した。

言

2．方法と結果母親が使っていた化粧品の香りには懐かしさや安心を感じるが、脳はいかにしてこの感覚をつくりだすのだろうか。
匂いに対する情動的な反応に関わる脳領域として近年注目

2 . 1. マウスにおける幼少期の養育環境臭の違いが成体期の匂い嗜好性に与える影響されているのが嗅結節である 1 , 2）。マウスを用いた我々の実験に使うマウス（C 57 BL/ 6 J 雄）はスギ・ヒノキ製チ

研究で、食べ物の在りかと関連づけた匂いに対する誘引行

ップの床敷で養育した群（スギ・ヒノキ群）と、ヒトが嗅い動には、嗅結節の前内側部のドーパミン受容体 D 1 陽性ニでも匂いのほとんどしない紙製チップの床敷（ペパークリ

3）

ューロンの活性化がともなうことがわかった 。また、マーン、日本 SLC）で養育した群（紙群）の 2 群を用意した。

ウス嗅結節内側部は異性の尿に対する誘引行動に関わるこスギ・ヒノキ群は生後 4 - 5 週齢まで母親マウスとスギ・とが報告されている 4）。嗅結節前内側部は匂いに対する広ヒノキ製おがくずを入れたケージで飼育し、4 - 5 週齢の時

義の誘引的な質感形成に関わるのではないかと予想された。

点で紙製チップを入れたケージに母親から離し、同腹の雄

本研究では母親に養育されたときに経験した匂いが成体同士で集団飼育した。紙群では妊娠期の母親マウスを紙製期に誘引的な行動を引き起こす神経メカニズムへの嗅結節

チップを入れたケージで飼育し出産、仔を養育させ、4 - 5の関与を明らかにするため、以下の実験を行った。

週齢の時点で紙製チップを入れたケージに母親から離し、

１．幼少期に経験した匂いに対する誘引的な行動が、ヒト同腹の雄同士で集団飼育した。マウスはそれぞれ 8 - 10 週

だけではなくマウスでも見られるかを調べた。具体的に齢まで飼育し、行動試験を行った（図 1 A）。

は養育環境の違い（スギ・ヒノキ製床敷または紙製床敷

行 動 試 験 は 事 前 の 実 験 環 境 へ の 慣 ら し（day 1：で）によるマウスのヒノキ精油への行動反応の違いを観

habituation）をした後に、テストを行った（day 2：test）（図1 B）。匂い嗜好性の測定試験では水とヒノキ精油、および察した。
２．ヒノキ精油に誘引行動を示すマウスで嗅結節の活性化

酢酸アミルをマウスに提示した。脱脂綿に各物質を 100 %濃度で 10 µL ずつを染み込ませ、ステンレス製のメッシュが生じるかを評価した。
３．活性化が見られた嗅結節神経回路をオプトジェネティ（18 - 8 ボール茶漉 4 . 5 cm、ビクトリー）に脱脂綿を包み、匂い源を用意した。匂い源は透明なケージ（W 175 × D 245
× H 125 cm, TP- 106 東洋理工）の右端中央に設置し、マウ

Neura l mechanisms of comfortablefeeling induced by odors bringing back ofmemories

スをケージに移した後に 3 分間自由行動させた。3 分間のKoshi Murata
Division of Brain Structure and Function,
Faculty of Medical Sciences, University ofFukui

鼻先を匂い源から 3 cm 以内に近づけてスニッフィングす

自由行動後は一度マウスの行動をビデオ録画し、マウスがる時間を実験者が目視で測定した（図 1 C）。day 1 の実験
環境の慣らしでは、同じ条件で水を提示し、10 分間の自− 153 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図 1 養育環境の匂いに対する誘引行動の獲得
A. 授乳期の養育環境が異なるマウスを 2 群用意した。片方はスギ・ヒノキ製床敷で飼育し、もう一方は紙製床敷で飼育した。B. 行動試験のスケジュール。C. マウスが匂い源に接近しスニッフィングする様子。D. スニッフィング時間の測定結果。

由行動を 2 回経験させた。
スギ・ヒノキ養育群が水よりも有意に長い時間ヒノキオ

2 . 2 . ヒノキ精油に誘引行動を示すマウスにおける嗅結節の活性化イルの匂いを嗅いだのに対し、紙養育群ではそのような有2 . 1 . と同様の手順でスギ・ヒノキ養育群のマウスに水意な増加は見られなかった（図 1 D）
。対照実験として提示

またはヒノキ精油を提示し、30 分後にペントバルビター

した酢酸アミルでは、どちらのマウス群も水に比べて時間

ルの腹腔内注射で麻酔し、4 % パラホルムアルデヒドで灌が短い傾向が見られた。これらの結果は、養育環境の匂い流固定した。取り出した脳を凍結し、20 mm 厚の嗅結節切に対して、成体期においてもその環境の匂いに対する誘引片を作製後、in situ hybridization 法により最初期遺伝子

行動を示すことを支持する。

c-fos の発現応答およびドーパミン受容体 D 1 の発現を観察− 154 −

香りのなつかしさの神経メカニズム

図 2 ヒノキオイルに誘引行動を示したマウスの嗅結節前内側部のc-fos 発現応答した（図 2）。養育時に嗅いだことのあるヒノキの匂いに対

嗅結節前内側部にアデノ随伴ウイルスベクターを用いてして誘引行動を示したマウスでは、嗅結節の前内側部 D 1

Cre 依存的にチャネルロドプシンを発現誘導した。同マウ

ニューロンの活性化がともなった。

スの嗅結節前内側部に光ファイバーを慢性留置し、青色レーザー光源と接続し、D 1 ニューロンの操作を行った。

2 . 3 . オプトジェネティクスによる嗅結節神経回路のマウスの誘引行動の観察にはリアルタイム場所嗜好試験

操作と場所嗜好性試験を用いた。この試験では暗いチャンバーと明るいチャンバ

2 . 2 . で神経細胞の活性化が見られた嗅結節前内側部のーを自由に行き来できる状況下で、マウスの嗅結節前内側

D 1 ニューロンが誘引的な行動に関わるかどうかを検証す

部 D 1 ニューロンを操作した。マウスは夜行性のため、通るためにオプトジェネティクス（optogenetics, 光遺伝学）

常は暗いチャンバーに長時間滞在する。明るい部屋に滞在を導入し、リアルタイム場所嗜好性試験によって誘引作用

している間、ニューロンを操作することで、通常は避ける

5）

明るいチャンバーの滞在時間が変化するかを検証した。ニの有無を調べた 。
オプトジェネティクスでは、神経細胞にチャネルロドプ

ューロンの操作をしない対照群としては、チャネルロドプ

シンという光感受性のイオンチャネルを発現誘導し、脳内シンを発現させずに光ファイバーを嗅結節前内側部に留置

留置した光ファイバーによって青色光を照射することで特した D 1 -Cre マウスを用いた（図 3）。

定の神経細胞群を操作することができる。嗅結節の神経細実験ではマウスを行動試験チャンバーに入れてから 20胞群の中でも D 1 ニューロンだけを操作するために、D 1

分間自由に探索をさせた。前半の 10 分間は光照射をせず、ニューロンが DNA 組換え酵素である Cre を発現する遺伝後半の 10 分間は明るいチャンバー滞在時に光照射をした。

子改変マウス（D 1 -Cre マウス）を用いた。D 1 -Cre マウスの前半では、チャネルロドプシンを発現させたマウスと対照− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

図3

嗅結節前内側部 D1 ニューロンの光操作による場所嗜好性の獲得− 156 −

香りのなつかしさの神経メカニズム

群マウスともに暗いチャンバーの滞在時間が明るいチャン

る誘引行動への嗅結節の必要性を検証したい。本研究の今

バーの滞在時間よりも長かった。後半では、チャネルロド

後の発展により、嗅覚が誘引的な意欲・情動を直接的に引プシン発現マウスでは明るいチャンバーの滞在時間が延びき起こす神経メカニズムが明らかになり、今後の化粧品香たのに対し、対照群マウスではそのような明るいチャンバ料の開発に役立つデータを提供できると期待される。

ーの滞在時間の延長は見られなかった。この結果から、嗅結節前内側部 D 1 ニューロンの神経活動は、マウスに対し

1）Yamaguchi M.（2017）Functional Sub-Circuits of theて誘引的に作用することがわかった。

３．考（引用文献）
Olfactory System Viewed from the Olfactory Bulb and察

the Olfactory Tubercle. Front Neuroanat. 2 0 1 7 Apr

スギ・ヒノキチップで養育されたマウスはヒノキオイル

11;11:33.

に誘引行動を示し、その誘引行動には嗅結節の活性化がと

2）Wesson DW, Wilson DA.（2011）Sniffing out theもなった。活性化が見られた嗅結節前内側部 D 1 ニューロ

contributions of the olfactory tubercle to the sense of

ンをオプトジェネティクスによって操作すると、マウスはsmell: hedonics, sensory integration, and more?

誘引行動を獲得した。嗅結節は、えさの匂いに対する誘引Neurosci Biobehav Rev. 2011 Jan;35（3）: 655-68.

行動だけではなく、幼少期に経験した匂いに対する誘引性3）Murata K, Kanno M, Ieki N, Mori K, Yamaguchi M.

など、より広義な香りの誘引性に関わる可能性が示唆され（2 0 1 5）Mapping of Learned Odor-Induced Motivated

た。母親から養育を受けた環境は動物にとって安全な環境

Behaviors in the Mouse Olfactory Tubercle. J Neurosci.

であり、嗅結節を介してその環境の匂いに対して誘引的な2015 Jul 22;35（29）:10581-99.
4）DiBenedictis BT, Olugbemi AO, Baum MJ, Cherry

情動を生じさせるのかもしれない。

４．総

JA.（2 0 1 5）DREADD-Induced Silencing of the Medial

括Olfactory Tubercle Disrupts the Preference of Female

様々な情動的要素をともなう香りの質感は、どのようにして脳でつくりだされるのかはよくわかっていなかった。

Mice for Opposite-Sex Chemosignals. eNeuro. 2015 Sep
22;2（5）.pii: ENEURO.0078‒15.2015.

最近の嗅覚生物学および神経科学的手法の発展により、よ

5）Zhang Z, Liu Q, Wen P, Zhang J, Rao X, Zhou Z, Zhang

うやく手がかりがつかめてきた。今回の研究期間でできな

H, He X, Li J, Zhou Z, Xu X, Zhang X, Luo R, Lv G, Li H,

かった実験として、1 つは養育環境の匂いを紙製チップに

Cao P, Wang L, Xu F. Activation of the dopaminergic

人為的につけ（例：酢酸アミル）、成体期でその匂いに対す

pathway from VTA to the medial olfactory tubercle

る誘引行動を評価する実験が挙げられる。もう 1 つは、嗅generates odor-preference and reward. Elife. 2 0 1 7 Dec

結節の機能の阻害実験で、幼少期の養育環境の匂いに対す

18;6. pii: e25423.

− 157 −

新しい顔面 3 次元形状評価法の開発
─相同モデル化による顔面形状の特徴を定量化する試み─
九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病態学講座口腔顎顔面外科学分野

森悦秀

Introduction: Recently, “homologous modeling” is frequently adopted as a new quantitative evaluation method of the faceon the study field of human morphometry. In this research, three dimensional ( 3 D) models of smile and straight faces fromsame persons were converted into homologous models and investigated to distinct smile and straight faces by the principal
component analysis (PCAs).
Materials and Methods: Twenty-two volunteers ( 19 males and 3 females, 22 smile and 22 straight faces) who had no
medical history cooperated with us for this research. The experimental protocol was approved by the ethics committee of
Kyushu University medical campus. Volunteers were photographed to create smile and blank looks by the VECTRA 3 D,and each data from them was converted into STL file and redundant regions, e.g. neck, hair and so on, was removed byan editorial software. Nine highly anatomic reproducible landmarks on the surfaces were plotted to trace changes in theexpressions. Each homologous model was manufactured to lay over those with a generic face, which was a standard model
depending on the 9 landmarks. Then, the PCAs was performed and its components that can distinguish between homologous
models of smile and straight faces were searched.
Results: From 1 st to 8 th components of PCA could estimate over 78 % in the all. The 2 nd and 6 th component showedsignificant differences between smile and straight faces. Both elements influenced homologous models in raising up or
drooping of eyelid and cheilion. But the 2 nd component seemed to influence in size of facial contour more.
Discussion: These findings showed that the 6 th component of PCA influenced most strongly between smile and straightfaces. It was suggested that the homologous models reconstructed by the single component of PCA would be useful toanalyze the movement of landmarks’ quantitatively.

１．緒

そこで、本研究では顔貌を相同モデル化し、主成分分析

言法を用いて“笑顔”と“真顔”の違いに関して検討を行った。

笑顔は人の印象に大きな影響を与えるため、“良い笑顔”

2. 方

は歯科治療の重要なゴールの一つである 1）。これまでの“良い笑顔” に関する研究では、正面からの写真等の材料を用

2 . 1. 対法

象

いて解剖学的特徴点の垂直的および水平的距離の変化を、

対象は、本研究の実施計画（九州大学医系地区臨床研究

2 次元的あるいは 3 次元的に計測されてきた 2）。しかしな

倫理委員会承認）を説明し、実施することに同意をした健がら、笑顔は表情筋等複数の構成要素が同時にかつ複雑に

康成人 22 名（男性 19 名、女性 3 名）とした。平均年齢は、変化しており、これを解析するための明確な評価方法は確

24.8歳（23-28歳）であった。
3D画像撮影解析装置（VECTRA

立されていない 3）。

H 1 , Canfield Scientific, Parsippany, NJ）を用いて、“笑顔”

筆者の研究室では、これまでに下顎前突患者の笑顔を主
4 , 5）と “真顔” の撮影を行った。撮影時は、頭部の固定は行わず、。これに2 つの表情は撮影者の指示のもと複数回の練習の後に撮影

よりこの解析法は、従来の解析法と比較してより詳細に顔し、1 組の “笑顔” と “真顔” の 3 次元データを得た。すべて

貌の変化を評価できることが示された。近年、人体の 3 次の撮影は、1 人の撮影者が行った。

成分分析し、性別による違いを報告してきた元的な計測方法の 1 つとして、対象物の 3 次元モデルを相同モデル化して主成分分析を行う方法が開発された 6 - 9）。

2. 2. 方法

この方法は、主成分分析の結果を視覚的に確認することが3 D 画像撮影解析装置で撮影した顔面データをもとに、でき、解析結果を直感的に捉えることができる非常に有用

3 次元再構築ソフトウェア（Mimics, Materialize, Leuven ,な方法である。

Belgium）を用いて 3 次元画像を作成し、STL データで保Development of new facial three dimensional
evaluation method  –Quantitative evaluationof facial morphology by homologous
modeling–
Yoshihide Mori
Section of Oral and Maxillofacial Surgery,
Division of Maxillofacial Diagnostic andSurgical Sciences, Faculty of Dental
Science, Kyushu University

存した。次に、これを相同モデル化支援ソフトウェア（HBM-Rugle, Medic Engineering Corporation, Kyoto）を用いて、画像のトリミングを行った。相同モデル化に必要な解剖学的ランドマークは、これまでの報告を参考に試行
錯誤し、最適と考えられた 9 点を定義した（Fig. 1 , Table 1）。
また、相同モデル化に必要なテンプレートデータは、3 次
元 CAD ソフトウェア（Geomagic Studio 9 , 3 D Systems,− 158 −

新しい顔面 3 次元形状評価法の開発－相同モデル化による顔面形状の特徴を定量化する試み－

Table 1Category

No. 1,4Medial canthus

End point of medial canthus

No. 2, 3

Lateral canthus

End point of lateral canthus

No. 5, 8

Cheilion

Lateral commissure

No. 6, 7

Crista philtri

Edge of upper lip at cupid bow

No. 9

Labiale inferius

Midpoint of the lower vermillion line

Table 2
Fig. 1

Definition of landmarks

Landmarks

Definitions

The result of principal component analysis

PCAs eigenvalue

Position of landmarks

Rock Hill, SC）を使用して顔のテンプレートモデルを生成した。顔面形状を構成する頂点数は 9 , 695 点であった。相同モデル化とは、テンプレートモデルを個別にスキャンさ

1st

6339.621.67

2nd5080.9

39.05

rd

3

3568.651.25

4th2430.459.55

52015.5

66.44

th

6

1762.172.47

7th1201.676.57

953.2878.83

th

れた顔面データの点群に自動的にフィットさせることであり、テンプレートモデルの頂点は最初に設定した解剖学的ランドマークと一致するように、フィッティングした。こ8の作業を相同モデル化ソフトウェア（HBM, Digital Human
Technology, Yokohama）および相同モデル化支援ソフト

cumulative
contribution ratio（％）

th

Table 3 The result of principal component analysis
between straight face and smile faceウェア（HBM-Rugle）を用いて各サンプルについて顔面データの相同モデル化を行った。

PCAs

22 名、44 個の顔面相同モデルのデータを相同モデル化

average of sigenvaluesmilestraight

P value

1st

26.04618.9540.06892nd

30.13614.864<0.0001*

3rd

26.13618.864顔” の差を JMP 5 . 1 . 2（SAS Institute, Cary, NC）を用いて、0.0620th

4

24.77220.2270.2453paired-t 検定あるいは Wilcoxon 順位和検定を用いて分析し5th

25.13619.8640.1771th

6

27.04617.9540.0195*7th

24.72720.2720.2549th

24.50020.5000.3072

ソフトウェア（HBM）を用い、形状を構成する頂点の XYZ
座標（9,695点）
を説明変数にして主成分分析し、“真顔”と“笑

た。

3. 結

果

8

主成分分析の結果、第 1 主成分の寄与率は 21 . 6 ％、第1 - 8 主成分までで累積寄与率は、78 ％を超えていた（Table
2）。“笑顔” と “真顔” の判別では、第 2 主成分および第 6 主り、様々なパラメーターの関与が予想される。研究の第一成分で有意差を認めた（Wilcoxon 順位和検定 , p< 0 . 05）

歩として客観的に判別できる形状を明確にすることが必要（Table 3）。第 2 主成分および第 6 主成分で顔面データをであるため、同一人物の表情変化すなわち “笑顔” と “真顔”

可視化したところ、第 2 主成分は、顔の大きさの成分を含を解析することが有用と考えた。

んでおり（Fig. 2）、“笑顔”と “真顔”の違いを主に表している

スマイルはコミュニケーションを円滑に行う上で大きなのは、第 6 主成分であると考えられた（Fig. 3）。第 6 主成影響を及ぼすといわれている。そのため、筆者のように顎分では、“笑顔” は、頬部が盛り上がり、鼻唇溝が深くなり、顔面領域の治療を行う歯科医師にとって、“良い笑顔” を獲

口角が挙上する違いがあることが明らかとなった（Fig. 3）。

得させることは治療のゴールを設定する上で重要な因子の一方、第 2 主成分は顔の大きさ（特に垂直方向）以外に口輪

1 つである。これまで “笑顔” に関する研究では、写真など

筋の動きを表しているように思われた（Fig. 2）。

を用いて 2 次元的に評価する方法や、模型や 3 次元画像を4. 考

用いて 3 次元的に評価する方法が用いられてきた。しかし

察ながら、3 次元的な評価であっても、解剖学的特徴点の距

本研究の目的である顔面形状の特徴を定量化するにあた

離や角度を計測して評価する方法が主流であり、複雑な形− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

-3SD

-2SD

-1SD

±0SD

+1SD

+2SD

+3SD

+2SD

+3SD

Fig. 2 Virtual shapes constructed by the 2nd component

-3SD

-2SD

-1SD

±0SD

+1SD

Fig. 3 Virtual shapes constructed by the 6 ｔｈ component

状を複合的かつ定量的に評価することは困難であった。近なく、同時に頬部の膨らみや、同時に鼻唇溝が深くなるこ

年、相同モデル化という概念が確立された。相同モデル化とが明らかとなった（Fig. 3）。すなわち、この手法を用いとは、人体形状データの統計処理を可能にするために、することにより、“真顔” から “笑顔” に変化する際の複合的なべての個人の人体形状を解剖学的に対応づけられた同一頂変化を定量的に評価することが可能であったと考えられる。

点数、同一位相幾何構造のポリゴンで表現することであり、一方、第 2 主成分が示す顔面の変化を観察すると、+ 3 SD

本技術は足、体型の計測やメガネフレーム作製などの産業

では “笑顔” のように見えるが、- 3 SD では口唇周囲が緊張

6 , 8 , 9）

。筆者は、これまでにし、“真顔” ではなく “緊張した顔” のように見える。± 0 SD

この方法を用いて “笑顔”時の口唇の変化に関して主成分分

が “真顔”に近いと判断し、顔面高の増大も見られたことか

析法を用いて検討し、口唇の動きは男女差があることを明ら第 6 主成分が “笑顔” と “真顔” を判断する成分と判断した

技術の分野で用いられている5）らかにした 。主成分分析法はデータ群の分散の大きな軸（Fig. 2 , 3）。

（主成分）
を順に見つけていく解析法であり、データの特徴

今回表示した顔面データ（Fig. 2 , 3）は被験者のデータすを解析するのに有用な方法である。しかし、筆者らが解析べてを用いて作成した平均顔であるが、それぞれ個々の顔を始めた時点ではではテンプレートデータの作成が難しく、面データの加工も可能であり、今後この手法を用いれば口唇等の限局的な変化を評価することはできるものの、顔個々にあった笑顔を予測することが可能となり、われわれ

貌すべてを評価することは困難であった。

歯科医師にとっては治療のゴールの設定の一助になると考その後相同モデル化の技術は進歩し、テンプレートをえられる。また、精神的なトラウマなどの理由により “いfree form deformation 法を用いて、対象の物体形状に対い笑顔” を作ることができなくなった患者などの治療に用応するように自動的に変形させる方法が開発され 、いることができるのではないかと考えている。本方法の用

Inoue らはこの方法を用いて、下顎骨の形状を詳細に評価

途はこれに止まらず、様々な顔面形状の解析に利用可能な

7）。この方法の利点は相同モデルをだけでなく、テクスチャーマッピングを用いて各頂点の色統計処理することによって、平均形状、分布の端に位置す情報を付与すれば化粧法の解析などにも応用できるのではる個別の仮想形状等も計算し合成することができることでと推測している。

する方法を確立した10）ある。このため、形状の違いを視覚的に捉えることが可能

5 . まとめで、評価結果を可視化できる。これにより、様々な変化が複雑に生じていても、少しずつ変化させて可視化すること

今回、われわれは顔面形状の特徴を定量化するために、により主成分が示すデータの傾向を総合的に判断できるこ“相同モデル化” を用いて主成分分析を行うことにより良好とができる。この方法を用いることにより、第 6 主成分がな結果を得た。

示す “笑顔”では、“真顔”と比較して口角が挙上するだけで− 160 −

新しい顔面 3 次元形状評価法の開発

謝

辞144-148, 2015.

稿を終えるに当たり、本研究に助成を頂いた公益財団法
研究計画の立案と実施に際し、ご支援いただいた九州大学大学院歯学研究院
外科学分野
口腔外科

口腔顎顔面病態学講座

口腔顎顔面

山田朋弘准教授ならびに九州大学病院

顔面

中野旬之講師に深謝致します。また、研究実施にご協力頂いた九州大学大学院歯学府
口腔顎顔面外科学分野

5） Mishima K, Shiraishi R, Kawai Y, Umeda H, Nakano
H, Ueyama Y. Characteristics of Posed Smiles for Class人コスメトロジー研究振興財団に感謝致します。

講座－相同モデル化による顔面形状の特徴を定量化する試み－

口腔顎顔面病態学

安田光祐学士に感謝致しま

3 Female Patients Before and After Osteotomy Using
Principal Component Analysis. J Craniofac Surg 27（7）: 1754-1758, 2016.
6） Mochimaru M, Kouchi M, and Dohi M. Analysis offoot forms using the FFD method and its application in
grading shoe lasts. Ergonomics 1999; 43: 1301-1313.
7） Kouchi M, Mochimaru M. Inter-individual variations

す。

in intra-individual shape change patterns. SAE Digital（引用文献）

Human Modeling for Design and Engineering

1） Shafiee R, Korn EL, Pearson H, et al. Evaluation ofConference 2006 ; 2006-01-2353.

facial attractiveness from end of treatment facial

8） Mochimaru M, Kouchi M. Statistics for 3D humanphotographs. Am J Orthod Dentofacial Orthop 1 3 3,

body forms. SAE Digital Human Modeling for Design
and Engineering Conference 2000; 2000-01-2149.

500-508, 2008.
2） Janson G, Branco NC, Fernandes TMF, et al.

9） Kouchi M, Mochimaru M. Simulation of the body

Influence of orthodontic treatment, middle position,

shape after weight change for health-care services. In:

buccal corridor and smile arc on smile attractiveness.

Duffy VG, ed. Advances in Applied Digital Human

Angle Orthod 81; 155-163, 2011.

Modeling. Indiana: CRC Press, 2010 : 217-222.

3） Schabel BJ, Franchi L, Baccetti T, McNamara JA Jr.

10）Inoue K, Nakano H, Sumida T, et al. A novel

Subjective vs objective evaluations of smile esthetic.

measurement method for the morphology of the

Am J Orthod Dentofacial Orthop 135; S72-S79, 2009.

mandibular ramus using homologous modeling.

4） Mishima K, Nakano A, Umeda H, Shiraishi R,

Dentmaxillofac Radiol 44（8）; doi: 10 . 1259 /dmfr. 20150062 ,Ueyama Y. Gender differences in posed smiles using
principal component analysis. J Craniofac Surg 43（1）:− 161 −

2015 .

●第 28 回表彰・贈呈式記念講演
●

片岡 一則

第 28 回表彰・贈呈式

記念講演（ステーションコンファレンス東京・平成 29 年 11 月 21 日）

夢を形に：ナノテクノロジーで創る体内病院
公益財団法人川崎市産業振興財団

片岡

ナノ医療イノベーションセンター長一則

かたおか・かずのり
1974年東京大学工学部合成化学科を卒業、79年同大学大学院工学系研究科、博士課程、工学博士を修了。同年から東京女子医科大学助手、講師、助教授を経て、1989年、東京理科大学基礎工学部助教授、94年同教授に就任。1998年、東京大学大学院工学系研究科マテリアル工学専攻教授に就任、2004年東京大学大学院医学系研究科付属疾病生命工学センター教授を兼務、昨年より現職の公益財団法人川崎市産業振興財団副理事長およびナノ医療イノベーションセンターセンター長ならびに東京大学名誉教授・政策ビジ
ョン研究センター特任教授に就任され、また、米国ノースカロライナ大学薬学部非常勤教授も務められ、この間、パリ大学、ミュンヘン大学、浙江大学などの客員教授や物質・材料研究機構、生体材料研究センターのディレクター等も務められました。
・専門分野：高分子材料工学分野、医用生体工学、ナノ医療技術分野
・その他：日本学術会議会員（第３部）、文部科学省各種科学技術関連委員、他多数参画

大変過分なご紹介をいただきまして、ありがとうござい

野では、聴診器、お医者さんや薬、病院、医療機器というました。きょうは、このコスメトロジー研究振興財団ののがそれぞれあったわけですが、だったら、これを一つに研究助成の表彰式ということで、助成を受けられた方々しちゃおうと、これがスマートナノマシンということにな

は、大変おめでとうございます。実は、私にとってもこのりまして、こういうものができると未来が変わるだろうと。

財団は特別な思い入れがございまして、第 2 回の平成 3 年

未来がどう変わるのかと言うと、病院が体内にできちゃうの 11 月にこちらがそうなんですけど、私自身がこの財団という、そういうお話なんです。体内病院のシステムの考の研究助成を頂きました。そのときのタイトルは『新しいえ方は、医療コンセプトは、現在はもちろん病気を治すと

DDS 剤形としての高分子ミセルの設計と機能開発』で、ちいうシックケアが中心で、皆さん病院に行くわけですけどょうど東京理科大にいたときなんですが、研究室を開いても、これはもう今、言われているように在宅にだんだんな

2 年ぐらいのところで、立ち上げに大変苦労していたときるだろう、さらには、ウエアラブルになるだろうと。もっに、この研究財団から貴重な助成金を頂きまして、研究をと先は何なんだろうというと、これは体内病院になるんじ

離陸させることができました。そういう点でも大変ありがゃないかと。つまり体内病院というのはどういうものかとたく思っていますし、その財団で講演をさせていただくというと、いわば検出機能があると。体内の隅々まで張り巡いうことで、私自身、きょうは大変に感激をしております。

らせた異常監視検知システムであり、また、診断と治療

それで、今日は若い方も多いので、タイトルが、少し前を行う、つまり体内で発生するあらゆる異常に対して対応向きと言うのですか、もちろん体内病院というのは今あるする能力、これが三位一体になって機能するという、そうわけではなくて、将来こういうものができたらいいなといいう仕組みが必要なんです。これは言ってみれば、体内のうことで、われわれが今、このナノ医療イノベーションセ

持つ生体防御システムという免疫システムがありますよね。

ンターという所で研究開発を行っている内容の一端を、ご要は免疫システムと非常に似てるわけなんですけども、免紹介させていただきたいと思います。これは建物ですが、

疫システムを人工的につくるというよりかは、そういうも多分、こんなものどこにあるか誰も知らないと思うのでのを補完供用する総合システムというものを体内病院といすが、これは羽田空港の多摩川のちょうど反対側が Kingうふうに考えようということです。

Sky Front と言うんですけども、これは昔、いすゞの自動

そうなると、その中核技術は何かと言うと、体内を自律車工場だったんですが、そこを再開発しまして、国立医薬的に循環して、いつも異常の検出と診断と治療をするウイ

品食品衛生研究所が用賀から移ってまいりました。それをルスサイズのスマートナノマシンという技術が必要になっ中核にして、今、医薬品、医療機器関係の研究所が周りをてくるだろうと。そういうものには、特定の細胞を撃つ、取り囲むようにして立ち上がってきております。

体内のバリアーを超える、負担をかけずに治す、老化、外ここで一体、何をやろうとしているのかということなん

敵から防ぐ、体内の微小環境を診ると、これができると社ですが、これは医療イノベーションセンターですからイノ会が変わると。こういった撃つ、超える、治す、防ぐ、診ベーションをやろうっていうわけなのですけども、実はわる、変えるという機能を搭載していく必要があるわけです。

れわれの身近にあるイノベーションで思い付くのは、カメこういう話をすると、私ぐらいの世代はすぐこういう映画

ラとか電話とかパソコンとかオーディオっていうのが昔はを思い出すんです、『ミクロの決死圏』という。これ、多バラバラにあったわけですが、今、ご存じのようにこれが分、若い方は知らないんじゃないかと思うんですが、私と一つになることによってスマートフォンができまして、わ

同じぐらいの世代のここにおられる方はご存知かと思うん

れわれのライフスタイルが大きく変わりました。医療の分ですが、ハリウッドの SF 映画でして、これは人間の体の中、− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

血管の中なんです。これ、お医者さんです。乗り物ごとうんでいくわけです。つまり標的細胞に選択的に結合する機

んと小さくして、送り込む。血管の中から病気を診断、治能とか、薬や造影剤を担持する機能とか、ここが大事なん

療するという奇想天外な映画なんです。私が見たのは、多ですけども、細胞の中、あるいは組織の中の環境に応答し分、高校生ぐらいかと思うんですけども、これを見て大変て構造が変化していく機能と、こういうものを作り込みま感激したことを覚えています。ですから、これはいってみす。では、どんな環境が変化するのかと。これは後でお話

れば、まさにインボディーホスピタルというわけです。こししますけど、例えば pH が変わる、あるいは酸化還元電

ういうものを創りたいということです。

位が変わる、あるいは ATP の濃度が変わる、そういうもそうは言っても、こんな奇想天外なことに研究費が出るのを検出して構造を変えていくということになります。

のかということなんですが、実は出てるんです。それはどこういうものを水中に置くと、これは自己組織化と言いこから出てるのかと言うと、文部科学省から出てまして、

ますけど、自然に自己会合して、ウイルスサイズの会合体、

文部科学省の中にセンター・オブ・イノベーションという高分子ミセルと言うんですけども、これがわれわれが作ろ仕組みがあります。これは 10 年プロジェクトなんですけ

うとしているナノマシンのプロトタイプです。これ、電子

ども、10 年後、あるいは 20 年後の社会を頭に描いて、そ顕微鏡写真なんですけども、これ 100 ナノメーター、だから、の社会を実現するために必要な要素技術を 10 年かけて開粒径が大体 50 ナノメーターです。これはちょうど C 型肝発していくというプロジェクトでありまして、われわれが炎ウイルスと同じぐらいのサイズになります。もちろんこ行っているのは、ここにある、ちょっと長いんですけど、「ス

れはウイルスではありません。完全な合成物でありますけ

マートライフケア社会への変革を先導するものづくりオー

ども、周りがポリエチレングリコールという親水性の高分

プンイノベーション拠点」、COINS というふうに呼んでい子で覆われていますから、これによって血中にこういうもますが。この COINS のプロジェクトが、現在、ナノ医療のを入れると、ウイルスなんかを注射すると、すぐ異物とイノベーションセンター iCONM で行われています。

して免疫に引っ掛かってしまうんですが、ポリエチレング

この COINS の目標は、この拠点の名前にもあるように、リコールでくるむことによって、そういった認識から免れ

スマートライフケア社会をつくろう。それ一体何なんだっる。言ってみれば、ステルス爆撃機のような機能を獲得すて言うと、要するにいつでも、どこでも、誰もがと、つまることができるわけです。

りごく少数の人だけじゃなくて、誰もがいつでも社会的負動画で、今のお話をもう一回お示しすると、こういうふ

荷の大きい疾患から解放されて、気づかないうちに健康に

うに水になじむ高分子と水になじまない高分子を作って、なるという、この夢みたいな社会をつくりたいなというの

例えばそこにこういった抗がん剤を結合します。これを今が目標なんです。こういうものを実現するには、気づかなのように水中に置くことによって、これが自動的に会合をいうちに健康になっちゃうわけですから、病院に行くことしていって、こういった高分子の会合体ができてくるわけ

自体が、もう気づいちゃっているわけです。だから、病院です。今日は、このお話はしませんが、こういった単純なに行かずに済むと言うと、必然的に体内病院ということに構造だけでなくて、中空粒子を作ったり、あるいはタバコなるわけです。

モザイクウイルスのようなものを作ったりとか、もちろん、そうは言っても、こんなものをどうやってつくるんだと言うと、これは大きさがウイルスサイズですから、当然の

そういうことがいろいろできますが、いずれにしても、この外側の殻が大変大事です。

ことながら歯車を組み合わせたり、材料を切ったりして作そうは言っても、どのぐらいステルスになるんだってい

るわけにはいかない。代わりにどうするのかと言うと、こうことです。最近は、顕微鏡の技術が大変進歩しまして、

れはモレキュラーエンジニアリングであろうと。つまり、こういうものを体に入れたときに何が起こるのかというこ

分子を組み上げてつくっていくということになるわけです。

とが、ちゃんと顕微鏡で見られるようになりました。これ

私のバックグラウンドは高分子化学ですから、高分子を使は今、マウスの耳の毛細血管の中を見てまして、血小板

うんですけども、ここにあるのは 1 本の高分子、長さは大という血栓形成に関与する小さな血球、1 から 4 ミクロン、

体 10 ナノメーター。ところが、高分子の分野にはいろん

これは緑の蛍光色素で標識しています。ナノ粒子は 100 ナな高分子があるんですが、これはブロックを連結した高分

ノメーター以下ですから、はるかにこれより小さいはずな子、ブロックポリマーと言いまして、ちょうどレンガブロんです。ところが、ポリエチレングリコールの殻がない状ックが並んだような形になっています。こちら側がポリエ態で血中に投与すると、血小板と大きさが同じになってる。

チレングリコールで親水性、こちらは体の中に入れて使い

つまり、これは一瞬のうちにダマができちゃうんです。ダますから、やたらなものは使えないので、例えばポリアミ

マができて、しかも黄色の部分が見えますから、これは血ノ酸、こういうものを使います。この 1 本の高分子の中に、中でペタペタと血小板にくっついているというわけです。

いわば位置選択的にいろんな機能を合成化学的につくり込ですから、こういうことが起きると、これはまずいわけ− 166 −

第 28 回表彰・贈呈式記念講演 「夢を形に：ナノテクノロジーで創る体内病院」

でありまして、例えば肺で塞栓を起こしたり、脳で梗塞をいったようなことなんです。ですから、ここでやりたいこ起こしたりするわけです。ところが、この同じものの表面と、つまり次世代の DDS によって標的治療を行うことなを、完全にポリエチレングリコールで覆うだけで状況は全んです。それによって内包薬物を幅広く選択して、手術と

く変わりまして、全くダマはなくなるんです。これによっ併用して、比較的早期の多数の患者さんに適用可能な技術て、要するにステルス性を獲得することができるようになをつくる。それによって、5 年生存率を上げていこうといりました。そうは言っても、ただ血中をぐるぐる回ってる

うわけです。

だけでは仕事はしませんので、目的の細胞を見つけて中にどんながんを対象にするかですが、これはもちろん部位

入っていって、細胞内の信号物質、例えば pH とか ATP とで言うと、胃がんや膵臓がんということになるんですが、か、そういうものを検出して、動的に構造が変化して、細治療が困難ながんという分類をすると、先ほどお話しした胞内で診断治療をするという。こういうことができること

転移がんです。がんによっては、薬が効かなくなってしまによって、ナノデバイス、さらにはナノマシンに進化してう薬剤耐性がんもあります。あるいは、もともと脳腫瘍のいくだろうというわけです。

ようなものは、薬が行きにくいし、最近ではがんの幹細胞

今日は、pH とか、あるいは光や超音波と組み合わせたという、治療抵抗性のがんがあるという問題が出てきていときのお話をしたいと思いますが、こういう体内病院へます。ですから、これをどうやって克服していくかという向けた研究を今やってるんですけども、この COINS では、ことなんです。

10 年後の世界と言いましたからビジョンが必要だという

先ほどお話しした、この高分子ミセルのようなものが、ことで、われわれがどんなビジョンを持ってるかと言うと、血中でぐるぐる回るのはともかくとして、どうしてがんにこういう技術がどんどん進むことによって、国民ががんの集まるのかということです。これに関して一番有力な方法

不安から解放され、アルツハイマー病は克服されると。年は、比較的、化学工学的な考えなんですけども、血管があ

齢を問わずスポーツが楽しめ、社会が医療コストの負担かると、低分子の抗がん剤だったらいろんな所から抜けてら解放されると。病気が国民の精神的身体的負担にならなってしまいますから、これでいろんな所にいって副作用がくなり、医療が日本の基幹産業になるという、多分、これ出るわけです。ところがウイルスサイズの粒子というのは、以上、楽観的なビジョンはないんじゃないかということで通常の血管の壁を通れませんから、通常の組織には入ってす。でも、もともと私、工学部なので、工学者というのはいかないわけです。こうやってぐるぐると回るんですけど

オプティミスティックでないとできないんです。

も、がんの部位は、後でもお示ししますが、血管の透過性

ただ、そうは言っても、このまんまだと、これは単なるが非常に上がっています。ですから、ウイルスサイズであ政治家の公約になっちゃいます。単なると言うと、怒られっても、がんの部位では比較的選択的に集積していくことちゃいますけども。これはサイエンスですから、ミッショができるという、こういった単純と言えば単純なんですが、ンがあるわけです。つまり、なんでがんが不安か。再発性

こういう方法論で集まっていくわけです。

があるからだろうと。それを抑えればいいだろうと。そのそうは言ってもこれマンガですから、本当に集まるのかためには、がん細胞だけに目的物を確実に到達させようと。

というわけです。これは、ちゃんと証明しなくちゃいけな

なんでアルツハイマーが克服できないのか。薬が要するにい。われわれは先ほど顕微鏡をお示ししましたが、この技

脳に入らないと。血液脳関門を突破する技術をつくろうと術を今、最大限に使っておりまして、これを使うと、これいう。実際には、この青に書いてある技術というのが実際は高速走査型の共焦点顕微鏡と言うんですが、実際にマウ行っている研究開発なんです。これがそれぞれ撃つ、超えスに移植したがんをそのまま直接見ることができます。どる、防ぐ、診る、治す、変えるに相当するんです。

のぐらいきれいに見えるのかって言うと、一例ですけど、がんのところからお話をしたいと思いますけど、皆さん

これは緑色蛍光タンパクです。GFP を発現しているがんもよくご存じのように、今、日本でがんで年間に亡くなる細胞を見てるんですけど、この緑の粒々の一個一個が、が人は 36 万人とか、それ以上です。だから、日本人の 3 人

ん細胞の核です。この黄色が毛細血管です。これが 1 ミリに 1 人が、がんで死んでいます。ですから、死亡率を下げですから、直径数ミリのがんを、このぐらいきれいに見る

るには数十万人規模に適用可能な治療法を開発しない限りことが可能になりました。

難しい。でも、いろんな方法があるではないかと。例えばこの技術を使って、がんの部位をまず静脈から蛍光ラベ手術もあります、放射線もある、重粒子線もある、最近はルした高分子ミセルを投与して、ずっとこのがんの所を観免疫療法が発達してきましたが、やはり限界があるんです。

察し続けます。そうすると、こういうふうになるんです。

例えば転移がんには、手術、放射線、重粒子線は使えない。

これはがんの中で、これを見ていくと、この赤い矢印を見あるいは免疫療法は、まだ適用可能ながんの種類が限られていただいてますが、ここでベントのような噴出がみられています。また、患者さんの内、約 2 割しか奏功しないとます。つまりここで、要するに血管が破裂というんですか、− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

ゆっくりと開いて、中のものが出ているということが分か

本当に体の中でこんなことが起きるのかっていうことです。

りました。これ、実際に動画で見るとこういうふうになりですから、それを証明しなくてはいけない。それで、先ほ

まして、この部位からナノマシン、ミセルが出てるんです。

どの生体内共焦点顕微鏡を使って観察を行いました。投与

面白いのは、右と左の画像でミセルの粒径がちょっと違う

した直後は、これは全身投与した後です、がんの中は最んです。30 と 70 ナノメーター。大した違いないじゃない

初真っ暗ですけども、やがて、この毛細血管の中が蛍光のかと思われるかもしれませんが、これは大変な違いがあり

色で緑になります。この黒い粒々は赤血球です。ですから、

まして、70 ナノメーターのミセルは血管から出ても、そ

安定なミセルが血中を回ってるんです。12 時間後、もっこで全部スタックして止まっちゃうんです。30 ナノメーと高倍率で見ます。どうなったかと言うと、まだ血管の中ターまで粒径を下げると、出た後でぱーっとがんの中に広は緑ですけども、がんの中は、がん細胞の膜は青で染めてがっていくということが分かりました。ですから、ここでいます。そうすると、一個一個のがん細胞が見えて、核が粒径というものが実は非常に重要であるということが分か

黒く抜けてるんですが、そのがん細胞の中が、実はこういったのです。

うふうに黄色とかオレンジ色になっています。これはつまこういうふうにして、がんの組織に入ったとして、そのり、先ほどお話ししたように、ミセルが壊れて薬が出てる

後は一体どうなるのか。これは当然、ウイルスサイズですということを示しているわけです。ですから、こういうふから、膜は通れないので、がん細胞の中には、細胞膜の一うにして、このナノスケールのトロイの木馬は、確かに一部にくるまれて入ります。この小胞は、エンドソームと言個一個のがん細胞の中にまで薬を送り届けることができる

うんですけども、いわば細胞の消化器官なんです。ですかということが分かりました。このシステムは、現在、アメら、この中で、人間の胃袋と同じように pH が下がります。

リカで臨床試験をやっていますが、実際、これは腫瘍の大実はわれわれのミセルは、pH が下がると薬が放出するよきさが普通の抗がん剤は耐性になっているから効かないん

うな仕掛けを持っていますので、核の近くに近づいた所で、ですけども、ミセル化することによって、かなりがんの増ちょうどトロイの木馬のように薬が出るということです。

殖を抑えることができるということが分かりました。

つまりマンガでもう一度お示ししますと、がんが耐性になですから、こういうふうに、がんと一口に言っても、集るというのはいろんなメカニズムがありまして、これだけまるだけでは駄目でして、このがんという組織の中にどんではありません。ただ、白金の抗がん剤なんかの場合によどん入っていく、つまり浸透していく機能というものが非く言われていることは、抗がん剤が細胞の中に入ってくる常に重要です。それが特に重要なのは、膵臓がんのようにと、それを解毒してしまうような物質が細胞の中でいっぱ治りにくいがんです。膵臓がんがなぜ治りにくいかと言い作られます。それが薬を解毒してしまうために、効かな

うと、もちろん一つは血管密度が低いんですけども、もうくなります。ところが、高分子ミセルは、細胞の中に、今一つは間質と言って、線維質が非常に多いんです。これが、お話ししたように膜に包まれてトロイの木馬のように入っ

その病理像ですけども、非常にヘテロです。この濃い青のていきます。細胞核の近くまで行って、pH が下がったと部分ががん細胞の集まったクラスターでして、赤が間質線ころでワーッと薬が出て、核に集積して耐性がんをやっつ維です。緑が血管で、血管は実は間質の中にしかありませけるという仕掛けができるわけです。

ん。ですから、血管から出ても、この間質の中をずっと通これは本当ですかということですね。これもちゃんと証っていかないと、がん細胞の集積の所まで行けません。実

明しなくてはいけませんので、先ほどのブロックポリマー

際、今使われているリポソームなんかは、全部この血管のの、ポリエチレングリコールの先端に緑の蛍光色素をつけ周りに集まっていて、そこから奥に入れないということがて、反対側に赤い蛍光色素を付けます。ミセルを作ると赤分かりました。

い蛍光色素はこのコアの中に入ってしまうので、完全に消しかし、先ほどのあの画像で見せたように、こういった

光してしまいます。つまり安定なミセルは緑色です。とこ自己組織化の粒子というのは、粒径コントロールができま

ろが、ひとたび、こういうふうに壊れると、赤い蛍光が出す。そこで、先ほどお話ししたように、30 ナノメーターてくるんです。本当にそうですかっていうので、これは培と 70 ナノメーターのミセルを作りまして、30 ナノメータ養しているがん細胞を顕微鏡で見ていきます。そうする

ーは緑でラベルし、70 は赤でラベルします。両方混ぜると、時間とともに、中が緑になります。つまり、安定なミと黄色ですから、血管の中は黄色なんですが、実はがんのセルが入っていきました。ところが、40 時間ぐらいたつと、

中は緑なんです。つまり何を意味してるかと言うと、30

この一個一個のがん細胞の中がぱーっとオレンジ色になる

ナノメーターのミセルだけが、確かに膵臓がんの中まで入んです。つまり、これで確かにミセルが壊れていったといっていけるということが分かりました。70 ナノメーター

うことが分かりました。

のミセルは、全部、血管の壁にへばりついています。

しかし、そうは言っても、これはシャーレの中ですから、

こういうものを使うと、例えば、これはより人の臨床に− 168 −

第 28 回表彰・贈呈式記念講演 「夢を形に：ナノテクノロジーで創る体内病院」

近いがんなんですけども、自然発生膵がんと言って、遺伝の表層にリガンドを付けるということです。

子改変を起こして、自然に膵臓がんができてしまうような

ここで選んだのは、環状 RGD ペプチドという小さなペモデルマウスです。そういうマウスであっても、このミセプチド分子なんです。なんでこれを選んだかって言うと、

ルを使うことによって、70 日間にわたって全例生存するとこういう構造なんですけど、これはがんの腫瘍血管によくいう結果を得ることができました。この膵臓がんは腹膜に発現するインテグリンというタンパク質があるんですけど転移して、こういうふうに腹水が出ちゃうんですけども、も、それに非常によく結合します。ですから、考え方としミセルの場合は全くそういうことが起こりませんし、それては、これを使うことによって腫瘍血管への結合性を高めから、腹水がなくなるだけでなくて、肝臓や消化管への転ようということです。高めるだけでなくて、実は驚くべき

移も非常に抑えられるということも明らかになりました。

ことに、どんどんがんの脳腫瘍の中に入っていけるという

このシスプラチンのミセルは、今、膵臓がんの患者さんことが分かりました。これがその画像なんですが、これもに適用して臨床試験が行われていますけども、標準治療に

生体内の顕微鏡で見ています。ここでは、環状の RGD を比べて生存期間が飛躍的に延びるといった結果というのも、付けたミセルを赤で標識して、コントロールを緑で標識し

今現在、得られてきています。

て、やはり混ぜてあるんです。これ脳腫瘍の中です。投あともう一つは、副作用がなくなるということも非常に与した直後は腫瘍の中は真っ暗ですけど、5 時間たつと赤重要でして、シスプラチンなんかの場合は、腎臓への毒性くなります。つまり、RGD ミセルだけがどんどん入ってが一番問題なんですが、もう一つ問題なのが耳が聞こえないくわけです。実は、この二つのミセルはサイズが全くくなっちゃうんです、内耳毒性という。実際、これはプラ同じです。物性は全く同じですから、隙間から入ってる

イエル反射って、大きな音を出すんです。きょう、音が出としたら、両方入らなければいけないですよね。ところが、ませんけど、下はシスプラチンを投与したモルモットで、RGD だけ付いたものが入るっていうことは何を意味して全く耳が聞こえないので、実際ぼーんと音を出しているん

るかと言うと、能動輸送が行われていると。つまり、このですけれども、全くどこ吹く風っていう感じなんです。とRGD が結合したミセルが内皮細胞のインテグリンに結合

ころが、上はミセルを投与したモルモットですから、音をして、能動的にがんの組織に輸送されているということがぼんと出しますと、こういうふうにびくっと、こうです。

分かりました。ですから、これを使えば、非常に治療が難

これだと、ちょっと何だか分からないので、ちゃんとしたしいといわれているグリオブラストーマ、脳腫瘍に対して聴力検査をすると、ミセル化することによって聴力損失はも治療ができるのではないかというわけです。

全くないということですから、こういった点も非常に大き実際、これはいろんな抗がん剤で試してうまくいくことが分かりましたけど、最近、期待されている核酸医薬にな利得であるというわけです。
現在、こういったわれわれが開発してきたものをベース

も、この方法論が使えるということが分かりました。これにしたミセルの内の幾つかは臨床試験に入っていまして、は名古屋大学と共同研究でやったんですけれども、長鎖非第 1 相、第 2 相、第 3 相といきます。第 1 相は安全性、第翻訳 RNA というのがあるんです。これをターゲットにす2 相は少数の患者さんで効果を見て、第 3 相で大規模な臨るアンチセンス核酸をこのミセルに搭載して、患者さん由床試験を行うんですけども、このパクリタキセル、シスプ

来の悪性脳腫瘍に対して、全身投与で確かに効くというこ

ラチン、ダハプラチン、エピルビシン、こういったようなとを確認しました。それはどういうことかと言うと、患者ものが今現在、日本とアジアと、それからアメリカ、最近さんの脳から脳腫瘍を摘出して、そこからがんの幹細胞をヨーロッパでも始まり国際的な臨床試験というものが行わ

取り出します。このがん細胞をマウスの脳に同所移植をいれています。

たしまして、そして、このナノマシンミセルの中に、ここのようにして幾つかのがんはここまできていますが、れ RGD が付いてるんですが、この長鎖非翻訳 RNA である

まだ難しいがんがあるんです。それが脳腫瘍です。脳腫瘍

TUG1 と言うんですけども、これを標的とするアンチセン

はなんで難しいかって言うと、先ほど、これ EPR 効果っ

ス核酸を搭載して全身投与を行ったわけです。

て言うんですけども、要するに血管の透過性が上がると言本当にこういう形で脳腫瘍に行くことをまず確認しましいましたけど、何のがんでも上がるわけではありません。

た。こちらがそうなんですけども、確かにこれがそうです。

上がらないがんもあります。その代表例が脳腫瘍でして、脳の中にどんどん入っていけるということが分かりました。

血液脳腫瘍関門と言って、要するに脳の血管は非常にバリ

どのぐらい効くかということで、効果を見たわけです。こアー性が高いので、がんになっても透過性が上がりません。

こではマウスを三つの群に分けています。一つはコントロですから、隙間からいくという方法論は全く効かないんでールです。これは全然関係ないアンチセンス核酸を入れてす。そうすると、全く別の方法が必要になるわけで、もっいます。二つ目は TUG1 に対するアンチセンス核酸を入れと能動的にいきたいということで次に考えたのが、ミセルています。3 番目は全く違う低分子の薬で、ガンマ・セク− 169 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

レターゼ・インヒビターという今、臨床試験が行われてい実際、どのぐらいきれいに見えるかと言うと、ここにある脳腫瘍に対する新しい抗がん剤です。これをコントロー

るのはがんです。造影剤がないと、ほとんど見えないんでルにして使って、検討をいたしました。これが脳腫瘍でしすけども、投与すると、これだけきれいに見えるようになて、この紫色の部分が脳腫瘍です。こんなに大きかったもるということが分かりました。実際、こういうふうにきれのが治療後、ここまで小さくなり、非常に劇的な効果があ

いにがんが造影されます。信号強度も圧倒的に既存の臨床ることが分かりました。実際見ると、これががんの大きさの MRI に比べて、はるかに高い信号強度が出るというこでして、これが何もしない場合、これがガンマ・セクレタとが分かりました。単に感度が上がるだけではなくて、小ーゼ・インヒビター、これがわれわれのミセルでして、圧さな転移まで見つけることができます。これが実は肝臓に倒的に効くということが分かりました。実際、本当にこの転移した小さな大腸がん、直径が 1 ミリから 2 ミリなんでTUG1 というものが、ちゃんとサイレンシングされている

すけども、白くぽーっと見えますよね。こういうふうに見かということで、これは遺伝子のノックアウトを見てるんることができました。

ですけども、確かにきちんとサイレンシングをされている

今、臨床に使われている造影剤がこちらなんですけどということが分かりましたので、この方法を使えば、核酸

も、これは陰性造影剤って言いまして、がんが黒く抜けま

医薬を脳の腫瘍に送り届けるということもできそうだなとす。そうすると、黒く抜ける陰性造影剤っていうのは、血いうことになってきたわけであります。

栓なんかができたり出血したりしても黒くなってしまうの他のほうはどうかということですが、いろいろあります

で、いわゆる疑陽性と区別がつかないんですけども、これが、この中で、例えば負担なく正確な予防診断技術というは完全な陽性造影剤ですから、非常にきれいに造影ができのを、どうやってこれで実現していくのかっていうことでるということが分かったわけであります。ですから、こうす。こういった診断技術としていろんなものがあるんです

いうふうに造影剤を使うことによって、より安全にかつ的が、皆さんがよくご存じなのは、MRI です。磁気共鳴イ

確に MRI だけでがんの診断というものが可能になりそう

メージング。これは今、非常に注目されています。というだなということが分かりました。

のは、これはもう既に国内で約 6000 台が稼働しています。

それでは、この入院不要、日帰り治療というのはどうな

それから、これは放射線照射が不要ですから完全無侵襲とんだろうということです。皆さんもよくご存じのように、いうことで非常に安全なんです。解像度は非常にいいんで

特に開腹手術なんか行うと、入院を 1 カ月しなくてはいけす。どんどん使えばいいだろうということなんですが、たない。そうなると、赤ん坊とか高齢の方には大変負担になだ弱点がありまして、感度が低いんです。ですから、必ずります。ですから、なるべく入院を避けたい。これは元気

PET/MRI と か CT/MRI と い う 形 で PET や CT と 組 み 合な人でも、入院してる間は結局、仕事ができなくなります

わせる必要がある。PET や CT は被ばくをしてしまいます。

から、お金も掛かるし、経済的負担も大きいわけです。そですから、もし MRI 単独でできれば、もっといいだろう

れに対して、われわれが将来こういう形になるといいなとというわけです。そのためには造影剤が必要であろうとい思っているのは、ナノマシンを全身投与して患部に集めた

うわけです。

後に、そこに光とか超音波とか中性子を当てることによっ

そういう訳で、私たちはこのミセル型、ナノマシン型造て、切らない手術をしてしまおうというわけです。こう影剤というものを最近、開発をいたしました。これがそういうふうにです。これは薬剤をそこで作っちゃったりとか、なんですけども、これは高分子ミセルの中に無機物が入っあるいは、きょうはお話ししませんけど、ホウ素、ボロンています。何が入っているのかと言うと、リン酸カルシウをここに集めて、中性子を当てて、中性子補足療法を行う

ムなんです。リン酸カルシウムとはなんですかって言うと、なんていうのも可能なんです。例えば、今、カプセル内視骨の成分です。ですから、全く無毒です。このリン酸カル

鏡っていうのがだんだん普及していますから、カプセル内

シウムの中に造影剤が入ってるんですけど、それは、マン

視鏡を飲むと、ナノマシンがカプセル内視鏡からの光刺激

ガンイオンなんです。必須金属でありますから、これも大によって患部で作動して薬を作ったりとか、あるいはナノ量に入れれば毒ですけども、少量であれば全く毒性がありマシンによる信号を内視鏡が検出して診断をするとか、そません。どういうアイデアかと言うと、この状態では実はういったようなことも将来はできるんじゃないかなと思っ

全く造影能がないんです。ところが、皆さんご存じのようて研究開発をみんなで進めているわけです。

に骨は酸で溶けるんです。ですから、がんの所は若干 pH

これは、まだもちろんできてないんですけども、きょうが低いんです。pH6.5 から 7 です。そういう状態でリン酸は、できたことをお話ししたいと思います。それは超音波

カルシウムが溶け始めます。するとマンガンイオンが出まとの併用なんです。皆さん、超音波診断ってよくご存じだす。このマンガンイオンがタンパク質に結合して、一気にと思います。広く使われています。ところが、超音波も集造影効果が出るんです。

束超音波と言いまして、要するにある 1 カ所にビームを絞− 170 −

第 28 回表彰・贈呈式記念講演 「夢を形に：ナノテクノロジーで創る体内病院」ってというか、超音波を集中させると非常に大きなエネル

分かりました。

ギーを出すことができます。実際、尿路結石とか腎結石と年齢を問わずスポーツを楽しむという夢のような状態がかを、これで破壊するという手術は既に行われているんでつくれるのかということです。やっぱりスポーツをするにすが、しかし、軟部組織に集束超音波を当てるとダメージ

は走ったり飛んだりしなくちゃいけないので、運動器官、が大きいので、なかなか難しい。そこでわれわれが考えた

特に関節ですよね。関節がやられちゃうと、スポーツなんのは、この集束超音波とナノマシンを組み合わせようとい

かできなくなってしまいます。関節の病気として一番問題

うことです。つまり、抗がん剤を搭載した高分子ミセルがなのが変形性関節症なんです。そうすると、これは変形性

既に臨床試験に入っていますので、これをまず患部に投与

関節症だから再生医療だと、細胞の移植かなと思われるとして、そこに集束超音波を当てるという、これ音響化学療思うんですが、われわれは細胞をなるべく使わないで再生法と言うんですけども、そういう方法を行いました。ここ医療をやりたいというふうに思っています。

で使ったのはエピルビシンという抗がん剤でして、これはどうするのかっていうと、一番考えつくのは遺伝子治療

超音波を当てるとラジカルが発生します。ですから、エピなんですけども、将来、遺伝子治療もできるとは思います

ルビシン自体が持っている抗がん効果と超音波を当てるこが、遺伝子治療っていうのはゲノムをいじりますから、例とによる活性ラジカルの効果のダブルパンチで、がんをや

えば発がんするんじゃないかとか、染色体にインテグレー

っつけちゃおうっていうんです。そうすると、こちらにあションしちゃうんじゃないかっていうことがよくいわれまるように薬剤の投与量を 6 分の 1 に下げて、集束超音波のす。実際、本当は可能性は少ないんですけど。それでも、強度を 15 分の 1 に下げても、十分に効くということが分

そういうことはゼロではないだろうと。もっと安全でなくかりました。つまり、より安全に治療ができるわけです。

てはいけないということで、われわれが着目したのは、実

実際にうまくいきそうだということで、これは実は完全

は DNA の遺伝情報からすぐタンパク質ができるわけではな医工連携状態でやってまして、興和、これは薬の会社ななくて、これがいったんメッセンジャー RNA に転写されんですけど、デンソーとか日立とかそういう会社が全部一ます。このメッセンジャー RNA の情報に従って、これが緒になって、研究開発を行っています。ですから、これは翻訳されて治療用のタンパク質ができますから、メッセン

医療機器と薬の合体したものなんです。まずは人に実際適ジャー RNA を使えばいいんじゃないか。治療用タンパク

用する前に、疾患愛玩犬、いわゆるペットのがんを治そうってもちろんあるんですが、残念ながら組織再生に関係すという、それを行いました。ここでは患犬って書いてある

るタンパク質っていうのは非常に不安定なんです。半減期のは、患者じゃないからです。これは実験動物という移植が非常に短い。例えば 5 分しかありません。ですから、そしたがんではありません。本当にがんになったワンちゃん

ういうものを外から入れるというのは非常に難しいんでです。これはミニチュアシュナウザーという種類のワンち

すが、メッセンジャー RNA は触媒みたいなものですから、ゃんで、軟骨肉腫ができて、歩けなくなっちゃっている。

標的細胞がいれば、そこに入っていってタンパク質を作るですから、例えばこういうワンちゃんに対して、今のようことができます。だから、ここに着目をしたんです。
こんなのがあるんだったら、なんで、今までみんなやっな治療を行いました。
左側が治療前でありまして、全く歩けないんです、こうてないんだということです。実は二つ問題がありまして、いうふうに。肉腫がお尻の所にできてしまっているためメッセンジャー RNA っていうのは体内ですぐに壊れちゃに、全く歩けない状態でした。こういうワンちゃんに対しう、加水分解されちゃう。もう一つは、免疫反応を誘導して、薬剤を、要するにミセルを投与して、1 日後に集束超ます。裸のメッセンジャー RNA を入れると、細胞の中の音波を当てました。1 週間後がこの右側の画像でありまし

トール・ライク・レセプターって言うんですけども、そうて、歩いている。歩くだけならともかく、走っちゃうといいうものにすぐ認識されて、激烈な免疫応答が起こります。

う劇的な回復を見せたわけです。この 1 例だけでなく、大だから、炎症反応が起きちゃうんです。この二つの理由で体十数例で、こういう効果が確認されまして、今年の 4 月

使えなかったんですが、われわれは最近、このメッセンジから女子医大、東京医大で実際にこのナノマシンと集束超ャー RNA を非常にきれいに、ナノマシン化することがで音波を組み合わせた、がんの音響化学治療の臨床試験が開きまして、そうすると、メッセンジャー RNA の分解が起始されました。これは世界で初めてでありまして、対象

こらなくなりますし、免疫反応も抑制されます。そうするのがんは膵臓がんです。今のところ順調に患者さんの状態と、これを使えば、例えばいろんなことができまして、こも非常に良好であるというふうに聞いています。ですから、

れは実際にマウスの脳で治療用のタンパクができてるってこういうふうにすることによって、一見、超音波と薬っていうのを見てるんですけども。それから、脊髄損傷にも、関係なさそうに見えますけども、実は組み合わせることにもちろん適用ができます。

よって非常に優れた効果を出すことができるということがさっきお話しした変形性関節症っていうのは、国内の推− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

計患者さんの数が 1,000 万人と言われています。寝たきり

定のタンパク質が多く発現します。何かと言うと、グルコの原因の約 10 パーセントです。ただし、どういうふうにーストランスポーターなんです。

進行していくかと言うと、最後は末期ってこんなになっち

つまり脳はグルコースが必要ですから、そのグルコース

ゃうんですけども、一番問題なのはこの辺りでして、今ちを脳内に取り込むトランスポーターが非常に多く発現してょうど初期の進行している所に適用する方法がないんです。

います。そこで、このミセルの表面にグルコースを結合し例えばヒアルロン酸なんか打ってますけど、気休めに近いました。それだけで入るんですか。入りません。どうすん状態です。末期になると、もちろん細胞移植しなきゃいけだ。これはちょっと工夫がありまして、血液の中のグルないんですけども、これまた大変です。そこで、われわれ

コース濃度をちょっとコントロールします。簡単に言うが目をつけたのはこの辺り、先制医療です。早期介入をしと、皆さん、糖尿病の検査ってありますね。グルコース負

ようと。そこにメッセンジャー RNA を使うわけです。そ荷試験。これは一晩ご飯を食べないで、お医者さんに行っれはどうするかって言うと、メッセンジャー RNA を搭載て、グルコースを打つわけです。それと全く同じことをやしたナノマシンを関節内に投与します。このメッセンジャ

ると、これ面白いんですけど、グルコーストランスポータ

ー RNA としては、軟骨誘導性転写因子と言いまして、要ーが一気にグルコースを脳の中に送り込む。要するにトラ

するに軟骨細胞に入ると、軟骨をどんどん作ってくれる。

ンスポーターのリサイクリングが起きるんです。それにつそれを作ることを、要するに刺激するタンパク質なんです。

られて、ミセルも一緒に脳の中に入っちゃうということがこれをコードしたメッセンジャー RNA を入れました。そ分かりました。これは実際に、このマウスの脳の中を見てうすると、コントロールの場合は、これ関節で、これはモいます。この緑の所は脳です。この黒い管が血管で、赤がデル動物なんです。もう関節が、がたがたになっちゃって

ナノマシンです。今まさに脳の中に、このナノマシンが侵るんです。ところが、治療用のメッセンジャー RNA を入入していってるというところを、リアルタイムで観測してれた場合は、非常にスムーズになってるということが分かいます。こういうことができるということが分かりました。

りました。つまり、こういう方法を使えば、変形性関節症

実際にどのぐらい入るのかって言うと、これ、ずっと奥のを本質的に治療することができるだろうというわけです。

深い所まで見てるんですけども、これは脳の表層です。赤非常に重要なことは、このメッセンジャー RNA を入れが血管です。この赤い粒々が高分子ミセルです。ですから、た高分子ミセル、ナノマシンは、凍結乾燥できます。つま血管の中にもありますけど、明らかに脳の実質までちゃん

りカップヌードルと同じなんです。だから、その辺に置いと入ってきてるということが分かりました。

といて、お湯を入れたら壊れますけども、生理食塩水を入これを踏まえて今、実際にわれわれがやってることは、れて注射すればいいんです。だから、町の整形外科のお医

このミセルの中に核酸医薬を搭載して、アルツハイマーに者さんの所でもこの治療はできますから、大きな細胞を培

関係する遺伝子をノックアウトするという実験をやってま養する施設であるとか、それを輸送するためのコストがかして、きょうはちょっとまだ論文になってないので、スラ

かりません。ですから、私たちは、これは将来、再生医療

イドは持ってきてませんけど、1 回の投与で BACE1 という、の大衆化って言ってるんですけども、再生医療を大衆化す

要するにアルツハイマーに関係する酵素の発現を 1 回だける上で、こういう方法論というのが非常に重要なんじゃなの投与で約 30 パーセント、サイレンシングできるといういかと思っています。ただし、何でもこれでできるわけじ

結果が現在得られています。そうなると、将来は非常に楽ゃないんです。ですから、細胞がいなくなったら駄目です。

天的なお話ですけど、これまでに薬物療法で病態そのもの

それは、もう細胞を入れなくちゃいけないですけども。だの進行を遅らせるだけだったんですけど、これがうまくいけど、より早い時期、まだ細胞がちゃんといるときに、こくと、本質的に到達困難であった薬剤を脳に送り届けるこ

ういう方法を行えば、歩けなくなりそうな人がまた再び運とができるだろうということが考えられます。

動ができるようになるだろうというのが、われわれが考え

さらに、もうちょっと先になりますと、脳の中で薬作っちゃおうということです。先ほどメッセンジャー RNA のている理想の状態ということになるわけです。
アルツハイマーです。これは一体どうするんだと、脳にお話をしました。実はメッセンジャー RNA からタンパク薬が行かないだろうというわけです。しかしながら、これ質ができます。抗体もできます。実際に、抗体のフラグも最近、行かせることができるようになりました。これはメントを脳の中で作らせるということにも成功していまどうするかと言うと、これが血液脳関門と言いまして、要す。ですから、われわれがやりたいことは、このメッセン

するに脳の血管の内皮細胞は非常にバリアー性が高いんでジャー RNA をミセルの中に搭載して、それを BBB を超えす。ですから、なかなか入りません。もちろん隙間から入て送り込んで、脳の中でメッセンジャー RNA を働かせてるのなんか、ほとんど不可能です。われわれが目をつけた

抗体薬を作る。そうすると、抗体を静脈注射して、わざわのは、しかし、そうは言っても、内皮細胞の表面にある特ざ BBB を超えなくても、脳の中で抗体ができちゃいます− 172 −

第 28 回表彰・贈呈式記念講演 「夢を形に：ナノテクノロジーで創る体内病院」

から、より効果的な治療ができるんじゃないかなというふ

こまでいけば、これはナノマシンと呼んでもいいんじゃな

うに思って、今、実際に研究開発を進めているわけです。

いかというわけで、これはまだできてませんが、こういうもっと先になると、どうなんだろうかと。この辺になっことがぜひ、いつになるんですかね、10 年後か、20 年後てくると SF になってくるんですけども、この COINS の研にはできるようになったらいいなというふうに思っていま

究チームにいっぱい若い人がいるんです。だから、若い人す。

たちに、僕はちょっとできないけど、君たちならできる

こういうお話をすると、こんなばかげたこと誰が考えんじゃないのって言って、やったらって言ってるのがこう

てんだっていうふうに言うかもしれませんが、実は最近、いう方法で、皆さんは小惑星探査機の「はやぶさ」って知Google が全く同じコンセプトを出してきまして、Googleってますよね。これはなんですごいかって言うと、小惑星の研究所で今現在、こういう研究がやられているっていうまで行くだけじゃなくて、そこで科学情報を採取して戻っお話ですので、Google が相手だとちょっと大変かなと思てくるっていうサンプリング機能があるんです。これ、私、

うんですけど、何とか日本発のこういった技術ができてく

非常に感動しまして、こういうものが体の中でできないか

るといいなというふうに思っています。

と。つまり、体内を自律巡回するナノマシンが疾患部位にそういうわけで、きょうのお話は、もちろんわれわれの行って、そこで診断して、治療をするだけじゃなくて、疾研究グループだけでは当然できないことでありまして、国患情報を採取してくる。

立がん研究センター、循環器病センター、それから東京大

きょうは、お話ししませんけど、実は COINS では体内学をはじめとする各大学医学部の附属病院、そういった所

埋め込み型の診断チップっていうのも研究してるんです。

の臨床の先生方との共同研究でございますので、まさに医どんどん小さくしていく。そうすると、このナノマシンが工連携なんですけども、この場を借りて、厚く御礼を申し体内に埋め込んだ診断チップに集合して、そこで分析が行上げたいと思います。どうもご清聴ありがとうございまし

われて、その診断情報が外部に ICT で発信されると。こた。

− 173 −

コスメトロジー研究雑感

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー研究雑感井嶋

私はこれまで、生物化学工学および機能性バイオマテリ
アルの融合による医用工学分野について研究を続けてきま博之

ジー研究振興財団ならびに本研究助成のことを知り、喜び勇んで申請させていただいた次第です。

した。特に、ハイブリッド型人工肝臓や移植用肝グラフト

当然ながら、私にとって新たな研究開発分野ということ

創出研究など、重篤な患者の救命に向けた実用的技術開発

で採択課題開始直後は研究の核となる基材開発などにおいについて 20 年以上にわたり強力な医工連携研究を遂行してトラブルが続出し大変苦労しましたが、研究期間およびています。同時にこれら研究開発の中で様々な新規知見の助成金の使い勝手が良く、何とか満足のいく成果を得るこ獲得や画期的な技術の創出があり、研究分野の新たな展開とができました。現在これら成果の発表に向けた準備を進を考えていました。

めており、さらに得られた成果の実用化に向けた発展的応

特に、開発技術の特性とより多くの方々のためになる研用研究に尽力するつもりです。

究へ展開したいという想いとのマッチングから、創傷治癒

コスメトロジー研究への参入と研究遂行の実現を可能に

ならびに皮膚の活性化に関する研究を計画・準備していましていただいたコスメトロジー研究振興財団に心から感謝した。ただし、恥ずかしながら当該分野に疎く、どうした

申し上げます。

（九州大学大学院工学研究院）

ものかと思案しておりましたところ、幸運にもコスメトロ

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
川﨑信治

近年、目に見えない微生物を発見する技術や難培養微生に安全性の観点からは、安全性が既知の化学成分で構成さ物を培養する技術が目覚ましく進歩し、人間の生活、健康、れる化粧品は魅力的と思います。一方、お肌には多種多様

病気に関連するあらゆる場面に微生物が善にも悪にも深くな生きた微生物が棲んでいることがわかってきました。共関与することがわかってきました。私は約 25 年前から微生か寄生かわかりませんが、お肌の世界にも微生物が善に生物を使用して研究をしてきたこともあり、微生物がもつも悪にも働いていることは、間違いないと思っています。

未知の能力には無限の可能性があると思っています。本研

未来の化粧品は、この目に見えない微生物たちとのお付究は１つの微生物との出会いからスタートしました。微生

き合いになりそうな予感がします。微生物の制御の観点か物の細胞も我々の細胞も同じ成分でできていますが、そのら化粧品開発に取り組んでいる方も多いと思いますが、ヒ

生命力の強さは計り知れません。得意・不得意は個々の微トの個性に応じて棲んでいる微生物も異なることから、そ生物で異なりますが、強光、乾燥、高塩、高温など、細胞の制御はとても難しいのではと想像します。アスタキサン

成分が不得意な環境下でも、微生物は細胞成分の変性を何

チン研究をきっかけに勉強を始めた化粧品分野ですが、微らかのシステムで防ぐことで平気で生き抜く力を秘めてい生物がもつ素晴らしい能力の可能性をさらに追求して、化ます。その秘密を発見できれば、ヒトの細胞にも応用でき

粧品産業に少しでも貢献できるよう精進したいと思います。

ると信じて研究をすすめています。

末筆になりましたが、本研究を進めるにあたり、コスメト

これまで私は化粧品業界とは無縁で、その中身は化学式の分野だと思っていました。化粧品の説明書きを見ると、ロジー研究振興財団から研究助成をいただきましたことを心から御礼申し上げます。

見慣れない化学物質がたくさん書いてあるからです。確か− 177 −

（東京農業大学生命科学部分子微生物学科）

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
黒岩崇2009 年に続き、全く異なる研究テーマで 2 回目の助成に化粧品分野に就職した卒業生が今では何人もいます。ふを賜りました。重ねてのご支援に心より御礼申し上げます。

だんの暮らしの中で、卒業生が関わった化粧品に出会える

前回採択いただいたのは、現勤務校に着任した 1 年目でしことを励みに、私自身も微力ながらコスメトロジーの発展た。研究室を立ち上げたばかりで、設備も十分でない中でに貢献できればとの思いで、今回の研究を進めてまいりまの研究助成は大変ありがたく、またテーマを採択いただけした。今回、再び採択いただけたことを契機に、（公財）
コたことに大いに勇気づけられたことを覚えております。前

スメトロジー研究振興財団にはもちろんのこと、共に頑張

回の「雑感」で、「工学部エネルギー化学科」にも化粧品に関ってくれた卒業生と、今まさに汗を流している現役学生にわる科学や技術に関心のある学生が一定数いることに驚かも深く感謝しつつ、今後とも教育に研究に精進してまいりされる、と書かせていただきました。あれから 8 年が過ぎ、たいとあらためて実感いたしました。
（東京都市大学工学部エネルギー化学科）研究室で卒業論文や修士論文を指導した学生のうち、実際

平成 28 年度

研究助成

コラーゲンは厚化粧
小出隆規

あれ？タイトルが間違っているぞ。
「コラーゲンで厚化れながらに決まっているといってよいと思います。

粧」が正しいのではないですか？と、ご自分のお母様や奥

さて、コラーゲンの場合はどうでしょうか？

実はコラ様（あるいはご自身…失礼）の顔を思い浮かべられた方、こーゲンのアミノ酸配列は、三重らせん構造を体温で保つにれは間違いではありません。

は不十分なのです。コラーゲンのポリペプチドは、細胞のアミノ酸が多数つながってできた紐（ポリペプチド）は、中で翻訳後修飾を受けることによってはじめて、安定な三一定のかたちに折り畳まれ立体構造をとることで機能をも重らせん構造を形成できるようになります。コラーゲンのったタンパク質になります。コラーゲンは三重らせん構造

修飾の大部分を占めるのはプロリンの水酸化です。またそを特徴とするタンパク質で、長い 3 本のポリペプチドが互の量は極めて多く、構成する全アミノ酸の10 ％以上に修飾

いにより合わされたかたちをとっています。私たちの体のが施されています。言い換えれば、コラーゲンは生まれな

中のタンパク質は、体温で立体構造がほどけてしまわないがらの姿では全くの役立たずで、大層な厚化粧をすること程度の熱安定性をもっています。そして、その熱安定性はで私たちの役に立つようになるのです。

タンパク質ごとに固有のアミノ酸配列によって規定されています。つまり、一般的にはタンパク質の熱安定性は生ま− 178 −

（早稲田大学先進理工学部化学・生命化学科）

コスメトロジー研究雑感

平成 27 年度

研究助成

皮膚接着性材料の化粧品材料への応用を検討して
小山

義之

私が生体接着性材料の研究を始めたのは、28 年ほど前、

一方、いろいろな方に皮膚への接着性などを試して頂い

粘膜接着性 DDS 材料に興味を持ったのがきっかけでした。

たところ、剥離時の刺激が小さい、という新たな長所をご

当時はポリアクリル酸が消化管などの粘膜に接着性を持つ

指摘頂きました。それでは、と思い立ち、検討を始めたのことが話題となり、その接着メカニズムや、薬物徐放担体が本研究で行った、美容パック、化粧クリームのカバーシなどへの応用が広く研究されていました。私は、ポリアクートへの応用です。

リル酸とポリビニルピロリドンを油性の材料で練り、徐放身近な人たちに、思い思いの方法で試みて頂き、現在ま性座薬の基材などを作っておりましたが、油なしでは接着でに高い評価を頂いており、化粧用途という新たな分野へ性の複合体が作れず、あまり大きな展開はできませんでしの興味が改めて高まりました。今後とも安全性を含めて詳た。ところが、数年前に私の研究室の伊藤智子研究員が、しい検討を続け、多くの方に喜んで頂けるような材料の開両ポリマーの混合法を工夫することにより、油なしでも生発に繋げたいと思っております。特に、皮膚の弱い方、天体に接着する複合体を調製する手法を見出しました。

然素材や刺激性物質などに過敏な方たちにも安心してご利得られた生体接着性複合体は乾燥させると透明なフィル
ムやスポンジ状になり、局所止血材や癒着防止材として用頂けるものが開発できれば、それは私たち材料開発者にとって大きな喜びとするところです。

様々な応用が可能となりました。特に、傷口を水和ゲルで最後になりましたが、本研究をご支援くださいました、

塞いで止血する効果は高く、歯科・口腔外科の用途では、公益財団法人コスメトロジー研究振興財団および関係者の抜歯後の止血を目的としたものが実用化され、現在医療機

皆様に心から御礼申し上げます。
（新山手病院臨床医用工学研究室）

器としての販売を開始しています。

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
酒井健一

阿部正彦先生（現・東京理科大学研究推進機構教授）から活性剤に関する研究を長く続けていますが、これの応用と引き継ぐかたちで、酒井秀樹先生（理工学部先端化学科教して、最近では潤滑油に関連した研究にも取り組んでいま授）と連名研究室を運営することになり、まもなく 4 年がす。潤滑油産業において、界面活性剤は油性剤（あるいは過ぎます。コスメトロジー研究振興財団からの研究助成は、油性向上剤）とも呼ばれています。分野が異なると使用す「酒井・酒井研究室」になってまもなくの時期に採択されまる専門用語が変わってしまい、当初は戸惑いもありました

したので、たいへん印象深く、またこの度のご支援によりが、「言葉が違うだけで考え方は同じ」ということに気がつ

本研究課題をおおいに推進することができました。関係すくと、逆に新鮮な気持ちで、この新しい分野を眺めることる皆様に厚く御礼申し上げます。

ができるようになりました。また、新しい分野で得た知識

さて、当研究室は 40 名超の学生をかかえる大所帯であを、何らかのかたちで「本業」に活かせないか、思いめぐらり、コロイド・界面化学を学術基盤として、基礎から応用

す時間も貴重なひとときになっています。コスメトロジー

まで幅広く研究を行っています。阿部先生時代からの研究

は、コロイド・界面化学と密接に関係しており、小生にとテーマを発展させつつ、社会的ニーズに適った新しいテーっては「本業」に近い実学分野です。今後も関連業界にお勤マへの挑戦も心がけています。社会的ニーズを知る最も的めの方との意見交換を通じて、社会からのニーズに適った

確な方法は、民間企業にお勤めの方からお話をうかがうこ

成果の発信に努めていきたいと思います。

とであり、こうしたことをきっかけに、共同研究に発展するケースもあります。一例をあげると、当研究室では界面− 179 −

（東京理科大学理工学部先端化学科）

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

平成 27 年度

研究助成

多機能性ペプチドの魅力
谷口正之

食品タンパク質由来の機能性ペプチドの研究を本格的に性、9 種類の病原微生物に対する抗菌活性、リポ多糖（LPS）

開始してから 8 年が過ぎました。チロシナーゼやプロテアで刺激したマクロファージによる一酸化窒素（炎症の指標ーゼなどの酵素の阻害ペプチドからスタートして、現在は、成分）産生の抑制作用、血管内皮細胞の血管新生促進作用

抗菌ペプチド、抗炎症ペプチド、創傷治癒ペプチドとそのや細胞遊走促進作用などを兼ね備えています。このペプチ

対象を拡大してきました。アミノ酸は 20 種類存在します

ドは、生体防御に関して多機能性を示すことがわかりましので、ジペプチドは 400 種類、トリペプチドは 8,000 種類、た。また、ペプチドの各活性や機能に対する構成するアミテトラペプチドは 16 万種類が存在する可能性があります。

ノ酸の寄与を解明するために、特定のアミノ酸を性質の異10 残基のアミノ酸から構成されるデカペプチドは、実になる別のアミノ酸に置換したペプチドを合成することがで10 兆 2,400 億種類が存在する可能性があります。この多きます。例えば、グリシンをアルギニンに置換したペプチ様性の魅力に取り憑かれてしまいました。

ドを合成した結果、LPS 中和活性が約 17 倍向上すること

現在は、10 から 20 残基程度のアミノ酸からなるペプチを見出しました。これは、ペプチドのもう一つの魅力です。

ドを主な研究対象にしておりますが、種類の多さだけでは

今後、食品タンパク質由来の多機能性ペプチドの研究をなく、１つのペプチドが複数の生理活性を示すことを発さらに展開して、皆さんの健康に役立つペプチド素材を開見しました。これは、ペプチドの第一の魅力です。例え発したいと考えております。将来、これらのペプチド素材

ば、米の酵素 α-amylase の部分配列である 18 残基のアミが化粧品、医薬品、食品などの多方面の分野で利用されるノ酸残基から構成されるペプチドは、プロテアーゼ阻害活ことを期待しています。（新潟大学工学部機能材料工学科）

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
東顕二郎

近年、化粧品に用いられる新規有効成分として、curcumin、

る こ と が 求 め ら れ る 化 粧 品 製 剤 に お い て、suspended-

CoQ10 、hesperetin、fullerene（C60）
等が挙げられます。こstate NMR はその品質管理・保証に役立つ有用な測定法にれらの新規成分はいずれも難水溶性であり、薬物ナノ粒子なると期待できます。

化技術は有効な化粧品を創製するために有用と期待されま

コスメトロジー研究振興財団から研究助成に採択された

す。事実、上記の物質の薬物ナノ懸濁液調製に関する研究こと、資金面でありがたかったことはもちろんですが、研報告は数多く存在するものの、その詳細な物性についての究内容や計画が認められたことが大変嬉しく、研究を進め

評価はほとんど行われていません。本研究で示したように、る上で高いモチベーションとなりました。そして頂いた助

suspended-state NMR 法を用いてこれら薬物ナノ懸濁液

成を基に、本研究を遂行し、得られた成果を様々な国内外の分子状態を明らかにすることができれば、これまでトラの学会や研究論文（Int. J. Pharm. 537, 30-39（2018））
としてイ＆エラーであった薬物ナノ粒子創生の効率化、最適化な発表することができました。この場を借りて改めて、コスど処方設計に有用な指針を示すことができます。具体的にメトロジー研究振興財団に感謝の意を示させて頂きます。

は、①薬物と安定化剤の相互作用を基にした、界面活性剤

今後は、本研究で得られた知見を基に更に研究を進めていの選択、②薬物の分子状態（結晶 or 非晶質）評価・制御にき、より高品質の化粧品・医薬品創製に向けて貢献していよる、薬物ナノ粒子からの薬物溶解速度のコントロール等

きたいと思います。

が考えられます。また、安全で質の高い製剤を安定供給す− 180 −

（千葉大学大学院薬学研究院）

コスメトロジー研究雑感

平成 27 年度

研究助成

メラニン機能の多様性
飯田真智子

皮膚・毛髪・眼のメラニン・メラノサイトは、皮膚色・考えられる。一方、メラニン（特にフェオメラニン）
は、正毛色・眼色を決定し、個体のアイデンティティ形成に関わ常範囲を超える強力な紫外線を吸収すると、フリーラジカ

る大変ユニークな生体分子である。外界と体内を隔てる皮ルを産生し、細胞障害をもたらす可能性が示唆されている。

膚は、紫外線、摩擦、有害化学物質などの物理的あるいはこのように、メラニンは、その環境により生体防御と細胞化学的刺激を日常的に受けており、これらの刺激は、皮膚障害の２つの局面を持つ。メラニン・メラノサイトは、内メラニン産生を亢進させる。メラニンは、紫外線などの有耳・脳・心臓にも分布し、聴覚・肥満・神経系・循環器系

害光の吸収、フリーラジカル除去、有害物質の吸着や排出の生理機能との関わりも報告されている。このようにメラする機能を持つ。皮膚メラニン産生の亢進は、美白を好む

ニン・メラノサイトは、生体の実に広範囲に分布し、その人々にとっては大きな悩みである。しかし、視点を変えれ機能も多岐にわたる点で興味深い。今後も、メラニン・メ

ば、メラニン産生は、それが正常な範囲であれば、様々なラノサイトの研究を通じて人々の美容と健康の向上に貢献

外的要因による皮膚のストレスレベルを示すバロメータ

していきたい。

（名古屋大学大学院医学系研究科）であり、生体防御システムの１つとして機能しているとも

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
井川健

この度は、コスメトロジー研究振興財団の研究助成にそのせいもあって、本来到達すべき結果までは出せなかっ

採択いただき、2 年間の研究をサポートいただいたことに、たことが悔いの一つではありますが、新しく異動した施設

厚く御礼を申し上げます。

においても、継続して研究を遂行していくことができる基

自分は、iPS 細胞や遺伝子改変技術を皮膚科の一般的な盤となる成果は出せたと考えております。コスメトロジー

疾患に応用していくことを一つのテーマとして研究を遂行に貢献する、という意味では、今回到達した結果を基盤としておりました。今回のテーマであります、表皮角化細胞して、これから行っていく研究の方こそが本来であろうか

におけるフィラグリン遺伝子変異の、本当の意味での役割、と思われますが、そこは、これからの自分の研究の発展にということに関しては、やはり自分のこだわりがありまし期待していただければと考えております。

て、なんとか成し遂げたいと考えておりましたので、まだ最後になりましたが、もう一度、この 2 年間のご支援を

道半ばではありますが、そこをサポートしていただいたこ賜りました、コスメトロジー研究振興財団に感謝を申し上とについては、ただ感謝しかありません。

げます。

この 2 年の間で、思いがけず自分の所属もかわりまして、− 181 −

（獨協医科大学皮膚科）

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
石田竜弘

ポリエチレングリコール（PEG）
は以前から汎用されてお体を有するということは、そういう運の悪い個人がいるとり、香粧品だけでなく医薬品や食品に添加剤として含まれいうことでよいのかもしれません。患者さんも、そのご家ており、私たちは生まれたときから PEG に暴露されてきて族も PEG に対する抗体を持っているから効果が得られないます。理論上、重合度が高い PEG（分子量が大きい）は、

かったという認識は皆無です（高い薬価は患者さんと国が皮膚も小腸も透過しませんし、透過するような分子量の小

支払い、多くの場合海外に流れます）。しかしながら、個さな PEG は腎臓の糸球体でろ過されて速やかに排泄され別化医療が推進され、遺伝子変異などを見極めての治療がるため、特に問題とされることはありませんでした。実際、行われている中で、それでよいのかと考えます。化粧品がこれまで PEG の摂取による健康被害などは報告されてい原因となっているかもしれない事象に対して注意喚起を行ません。一方、今回の検討でお示ししたように、化粧品中

うのは化粧品などの嗜好品の販売で利益を得ている業界との PEG によって抗体が生じる可能性があり、それが高価してはあるべき姿ではないでしょうか。本研究成果をインな PEG 修飾製剤を投与した患者さんにおいて、薬効の発

パクトの高い雑誌に掲載させ、問題提起をしたいと考えて現を妨げる可能性があることが示唆されました。この発見います。

もまた、副作用に直接繋がるものではなく、単に期待した薬効が得られない患者さんが出るかもしれない、というだ

研究助成をいただきました、公益財団法人コスメトロジ
ー研究振興財団には心より深謝いたします。

けですので、問題にはならないかもしれません。医薬品の（徳島大学大学院医歯薬学研究部）

治療効果には個人差があることは常識であり、抗 PEG 抗

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
大塚

私が行った研究は、新規フィラグリン遺伝子欠損ラットの作成とアレルギーマーチの解明です。

篤司

免疫染色では、KO ラットのフィラグリン発現が完全に消失していることを確認しました。さらに、水分保持量がフィラグリンは皮膚バリア機能を担う重要なタンパクで

FLG KO ラットで優位に減弱していることを見出しました。

す。アトピー性皮膚炎（AD）の約 20- 30% の患者にフィラ

FLG KO ラットと野生型ラットを用いてアトピー性皮膚炎

グリン遺伝子の変異が認められるだけでなく、アトピー性モデルを構築しました。続いてアトピー性皮膚炎モデルを皮膚炎の患者のほぼ全てでフィラグリンタンパクの発現が誘導したラットを用いて、喘息モデルの評価を行いました。

低下しています。このことから、アトピー性皮膚炎発症と気管支肺胞洗浄液中の総細胞数は、野生型ラットに比べてフィラグリンタンパクの関係は世界中で大きな注目を集め

FLG KO ラットで優位に上昇していました。さらに細胞分ています。アトピー性皮膚炎、特にフィラグリン遺伝子の画を比較したところ、好酸球が FLG KO ラットで優位に変異とアレルギーマーチの関連を示唆する多くの傍証はあ上昇していることを見出しました。以上より、FLG KO ラ

るもののそのメカニズムに関しての詳細は不明でした。

ットでは、アトピー性皮膚炎誘導に伴い、喘息の増悪がみ

今回、我々はフィラグリンノックアウト（FLG KO）ラッ

られることが明らかとなりました。

トの作成に成功しました。フィラグリン遺伝子欠損（FLG

今後、このモデル動物を用いてアレルギーマーチの解明

KO）ラットを作成にあたり、Zink finger protein を用いまのみならず、新規薬剤の検討が可能となると考えます。ました。この FLG KO ラットでは、尾部に絞扼輪を認め背た、フィラグリン遺伝子異常から始まるバリア機能の破綻

部の皮膚はダーモスコピーにて表皮が変化していることがとアレルギーマーチの誘導メカニズムは、皮膚の健康がア

わかりました。また、ラットフィラグリン抗体を用いたレルギーの予防という新しいコンセプトを提供可能であり、− 182 −

コスメトロジー研究雑感

今後のコスメトロジーに大きな影響を与えるものと考えます。

係者の皆様に深謝致します。

最後になりましたが、コスメトロジー研究振興財団の関（京都大学大学院医学研究科皮膚科学講座）

平成 27 年度

研究助成

小胞輸送とコスメトロジー
大林

典彦

真核細胞の細胞内では、タンパク質や脂質をはじめ様々成を賜りましたメラニンを生み出すメラニン合成酵素の輸な生体物質が小胞に包まれて、細胞内の複雑に張り巡らさ

送機構というように、徐々に色素細胞が統べる生命現象のれたネットワーク間を輸送されています。この小胞輸送の対象を広げていき、それらに関する包括的な小胞輸送シス

巧妙な仕組みに魅せられて、小胞輸送を調節する Rab やテムを理解しようと日々試みています。

Arf といった低分子量 G タンパク質の機能解明にこの 10

このたびの被助成研究の結果、Rab32/Rab38 の活性化

年間を費やしてきました。特に、色素細胞内に存在するメ制御は重要な創薬のターゲットと考えられることがわかり

ラノソームは、直径が 0.5µm ほどと他のオルガネラに比べました。本成果をふまえ、Rab32/Rab38 とその不活性化て大きく、さらにメラニンを蓄えているためハイコントラ因子である RUTBC1 の相互作用を阻害するような化合物

ストであり、光学顕微鏡下で極めて容易に観察が可能となの開発は、メラニン合成酵素の輸送制御、すなわちメラノっています。それ故に、メラノソームの細胞内運動は、オ

ソームの成熟制御へとつながるものと期待されます。本アルガネラダイナミクスを研究する上では、際立った輸送モ

プローチは、アルブチンをはじめとするメラニン合成酵素

デルと考えられています。メラノソーム研究をはじめた初

自身の活性化制御をターゲットとする既存のアプローチと期のころは、色素細胞内のアクチン線維や微小管といったは異なるもので、メラニン産生を多面的に制御する選択肢

細胞骨格上を成熟したメラノソームが運動する様に焦点をを提唱することは、コスメトロジー研究におけるアカデミ

当てて研究を行いました。その後、色素細胞が活性化されズムの役目の１つであろうと思います。

た後、その形態をダイナミックに変化させてメラニンを近（筑波大学医学医療系生理化学）

傍のケラチノサイトに受け渡していく機構や、このたび助

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
片岡

この度は、コスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択して頂き、関係する皆様に厚くお礼申し上げます。

健ト（2 次元）の形成が限界です。このような差が生じる原因を突き止めることができれば、組織形成の原理の解明、さ私は皮膚組織の発生過程などで３次元構造が形成される原理に興味があり、in vitro および in vivo の実験系を用いて研究を進めて参りました。in vivo ではバラバラにした細胞を移植することで付属器を有する皮膚組織（3 次元）がらには再生医療への応用も夢ではないと信じて日々研究をしております。
末尾になりましたが、コスメトロジー研究振興財団のますますのご発展を心より祈念申し上げます。

形成されるのに対して、in vitro では表皮・真皮細胞シー− 183 −

（岡山理科大学理学部臨床生命科学科）

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
倉岡

今回コスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択して功題だと言えます。

いただき、本研究を遂行できましたことをお礼申し上げま

それに対して現在の化学物質の安全性評価の方法は、比す。私は、DNA の損傷とその修復に関する研究を通して、

較的簡便にまた短期間で化学物質の安全性を評価すること

ヒトにおける突然変異誘発機構を調べています。どちらかができる復帰突然変異試験および染色体異常試験により解と言えば、細胞の中で生じている基本的な分子機構を解析

析されています。しかしながら、これらの手法は分子生物するというのが私のスタンスになりますが、この研究助成

学的観点からすると明らかに古くなっており、これらの方で支援していただくことによって、より応用研究に向かう

法論は 50 年以上昔の生物学基盤により開発されています。

足がかりを得たように感じています。それは私たちの環境

私の個人的な意見ではありますが、有用性の高い化学物中に存在する化学物質が私たちの思っている以上に私たち

質を安全に用いていくためには、化学物質の安全性評価法の DNA を傷つけていることがわかってきたからです。

はより開発されていく必要があるように思います。少なく

環境中の化学物質は、加速度的に増加しています。化学

とも化学物質が生まれ社会に広く使用されることが必要に物質のデータベースであるケミカルアブストラクト誌によなればなるほど、より確かな評価法の開発が重要になるでれば、その数は１億種を超えております。少なくとも日常

しょう。

生活においても７万以上の化学物質に囲まれています。少最後になりましたが、今回の助成により、私たちの結果

し考えると不思議な気にもなりますが、化学物質に関わらが原著論文として報告できたことを感謝したいと思います。

ない時がないとも言えます。さらにコスメトロジーにおいどうもありがとうございました。

て、化学物質とヒトとの関わりは避けることのできない問（大阪大学大学院基礎工学研究科）

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
河野 秀明
望
住吉

このたびは貴財団の研究助成に採択していただき、厚くなっていませんでした。

お礼申し上げます。今回の助成対象としていただきました

私は、10 年ほど前から「PAF-AH（II）によって酸化リンのは、アレルギーを引き起こすマスト細胞の活性化に関わ脂質から切り出された酸化脂肪酸が脂肪酸メディエーター

る脂肪酸メディエーターの研究についてです。

として働くのではないか」という仮説のもと、研究をおこ

脂肪酸は生体内脂質の基本的な構成要素であり、そのなってきました。最近ようやく PAF-AH（II）によって酸

ほとんどは生体膜リン脂質に結合した形で存在していま化リン脂質から切り出されたエポキシオメガ 3 脂肪酸がマす。脂肪酸には炭素数や二重結合数が異なる様々な脂肪酸

スト細胞の活性化に重要であることを見出すことができまが生体内に存在しますが、アラキドン酸という脂肪酸は酵した。そのような折に、本研究助成をいただけたことは大素的に酸化されて、エイコサノイドとよばれる一連のシグ

変励みになりましたし、この研究をさらに推進させる原動

ナル分子（脂肪酸メディエーター）へと変換され、特異的な力となりました。

受容体を介して多彩な生理活性を発揮します。一方、生体PAF-AH（II）の阻害剤はマウスのアレルギーモデルを抑膜リン脂質中の脂肪酸は酸化を受けやすく、酸化された脂制することも見出しており、本研究で見出したマスト細胞

肪酸をもつリン脂質「酸化リン脂質」が生成されます。この

活性化の調節機構を制御することで、アレルギーをコント

酸化リン脂質の酸化脂肪酸を切り出す活性をもつ酵素としロールする新たな方策を打ちだせる可能性があります。本

て PAF-AH（II）が知られていたのですが、本酵素が生体研究が、化粧品の安全性、機能性という面において少しで内でどのような機能を担っているのかはほとんど明らかにも貢献できれば幸いです。（東京大学大学院薬学系研究科）− 184 −

コスメトロジー研究雑感

平成 27 年度

研究助成

「アレルギー研究」と「コスメトロジー」
鈴木亮

この度は、貴財団からの研究助成を賜りまして誠に有り

え、「健康的に美しくなる」という役目が課されていると思難うございました。本研究助成を得て、研究が展開できまいます。一方で現代社会は、住環境（乾燥、紫外線など）やしたことを、この場をお借りして御礼申し上げます。

生活環境（食生活、多種のコスメティックなど）の急激な変

私はこれまで一貫してアレルギー研究に従事してまい化や、新たに開発された化粧品（新規機能成分など）により、りました。アレルギー疾患症状の一つとして、皮膚炎症

これまでと比較して皮膚は様々なトラブルを抱えやすくながあります。そして、「アレルギー研究」と「コスメトロジってきています。そのような意味において、様々な視点かー」は密接に繋がっていることを様々な場面で目にするこら「コスメトロジー」を研究する試みは豊かな社会の構築にとがあります。例えば、皮膚炎の患者さんは、外出を控え今後も益々重要な役割を担っていくと考えております。私

る傾向があります。また、その間化粧をすることを制限さは、「アレルギー研究」という視点から皮膚の健康維持を目れ、益々外出することに抵抗を持ち、それが原因で精神疾指した研究活動を行うことによって「コスメトロジー」に貢患を患ってしまうことすらあります。このように、現代社

献していきたいと考えております。

会における化粧品には、単に「美しくなる」という目的を超（金沢大学医薬保健研究域薬学系衛生化学研究室）

平成 27 年度

研究助成

加齢と掌蹠の皮膚夏賀

加齢なんて若い頃は全く興味がわかなかったのですが、健殖に至ることがわかったときにはとても驚きました。ヒト

自分の顔に
“しみ”
や
“しわ”
を発見したり、おでこが広くな皮膚を用いた多くの実験結果では、加齢によって表皮が菲ったりすると、研究の方向性もモチベーションもすっかり薄化すると報告されていますが、これは対象としている皮変わってしまって、老化とは何かみたいなことを考え出し

膚が露光部であり、紫外線による表皮細胞ならびに真皮たのが、助成を受けた研究課題のはじまりです。私のメンへの影響から表皮が菲薄化するものと考えられます。逆ターである北海道大学皮膚科の清水宏教授、西江渉准教授、に、マウスの掌蹠のように、紫外線曝露がなく、恒常的にそして弘前大学皮膚科に移られた澤村大輔教授らの作成

物理的刺激を受ける部位では、加齢によって表皮が過増殖した 17 型コラーゲンノックアウトマウス（Nishie W et al.,に至るようです。17 型コラーゲンを表皮特異的に発現さ

Nat Med 2007）は、3 ヶ月齢の段階で白髪と脱毛をきたすせたマウスでは、加齢しても表皮が過増殖とならないため、“早老化モデル”
であったことから、この研究では加齢表皮17 型コラーゲンは毛包間表皮にて抗加齢分子として作用と 17 型コラーゲンについて注目しました。とはいえ、全すると言えます。本研究の内容は、大学院生の渡邉美佳さ身のどの部分の皮膚を扱うかによって研究戦略も変わってんがコツコツとデータを重ねて 2017 年に論文発表しましきますが、私たちはマウスの毛周期に影響されない部分のた（Watanabe M, Natsuga K et al., Elife 2017）。予想外の表皮を扱うのが良いと考え、掌蹠の皮膚を対象として選び結果が、科学の進歩につながることを実感した研究でした。

ました。当初、加齢した掌蹠の表皮は薄くなるものと仮説（北海道大学病院皮膚科）

を立てていたものの、結果が仮説を覆し、加齢すると過増− 185 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
西村智

生物・医学研究におけるバイオイメージングでは「見てては広がりを作ることができると自負しています。朝昼逆いることは何を意味するのか？」という意識が希薄なこと

転、誰にも会わない、ラボにこもって文字通り機材と寝食が多く、画像を撮影して論文につかえて満足というタイプをともにして作っているイメージングデバイスですので、の研究が非常に多いと感じています。個人的には、「見た愛着の大きさは半端ではありません。必ずや、今回の提案

ことで何かを変えられない」研究スタイルに、ずっと違和

システムが多くの方の手にわたり、多くの方の Happy を感をもっていましたので、今回の提案では、生体の皮膚と演出できる、と信じたいと思います。ヒトは外観の助けをいう非常にわかりやすい部分で「観察により幸せや変革が借りながらアイデンティティを作り、コミュニケーション

もたらされるような」特化したイメージング研究を行いまをとっています。その多くには、体表面のテクスチャが関した。皮膚の生体観察、ときくと、研究テーマとしてニッ与していると思われます。リアルタイムで手に取りながらチだと指摘する生物学者がいるかもしれません。しかし、観察を行えれば、美容や薬剤塗布、スキンケアなど、多く皮膚というわかりやすい場所で、美容から皮膚科診療までの範囲で、体表面への適切な対処が可能になるでしょう。

すべてをカバーすることに結果的になり、研究テーマとし（自治医科大学分子病態研究部）

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成での研究成果のさらなる発展
林謙一郎

この度はコスメトロジー研究振興財団から研究助成を頂
き、深くお礼申し上げます。

条件下（ECM コーティングなし）ではこれらの発現が増強される。

Serum response factor（SRF）の 転 写 補 助 因 子である

一般的には MRTF-A は細胞質に局在し、血清刺激にmyocardin related transcription factors（MRTF-A及び MRTF

より核内移行し SRF 機能を活性化します。しかしながら、-B［MRTF-A/B］）は私の研究ターゲットの一つで、この皮膚線維芽細胞では MRTF-A は恒常的に核局在するため、転写補助因子の機能発 現制御の研究を長年行っています。

細胞内での局在変化では機能発現制御を説明できず、核内

MRTF-A/B の活性化は上皮・内皮細胞から筋線維芽細胞での MRTF-A 機能の on/off に関わる新たな制御機構の存への形質転換（上皮・内皮間葉転換）や筋線維芽細胞の機能

在が示唆されました。本研究でこの新たな制御機構の探究

発現（コラーゲン等の細胞外マトリクス［ECM］産生）に重を行い X 因子が MRTF-A の機能発現に重要であることを要な役割を演じていることが明らかにされ、多くの研究報明らかにすることができました。これまでの研究で、X 因告がなされています。しかしながら、皮膚線維芽細胞での子は皮膚組織の恒常性維持以外にもガン関連線維芽細胞をMRTF-A/B に関する研究はごく少数（4 〜 5 報）に留まって介した扁平上皮ガンの間質への浸潤や網膜色素上皮細胞のいるのが現状です。このような状況下で皮膚線維芽細胞で筋線維芽細胞への形質転換に関わることを明らかにしていの MRTF-A/B 絡みの研究を模索中に見いだしたのが以下ます。現在、これら一連の研究成果をまとめた論文を作成の知見です。これらが本研究の立案のきっかけになりまし

中のため匿名の X 因子とさせて頂きました。この論文が受た。

理されましたら、改めて研究報告書を提出させて頂きたく

１）正常皮膚線維芽細胞を MRTF-A 抗体を用いて免疫染存じます。

色したところ、恒常的に核局在することを見いだした。
２）正常皮膚線維芽細胞を ECM 上で培養した場合には筋

最後に、本研究遂行をサポートして頂きましたコスメト
ロジー研究振興財団に深く感謝いたします。

線維芽細胞マーカーの発現は抑制されるが、通常の培養− 186 −

（大阪大学大学院医学系研究科）

コスメトロジー研究雑感

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
日沼

州司

先ずは、本研究の実施にあたり、研究助成を賜りましたの研究に関しても、研究者間で研究資金の面でも大きな格

公益財団法人コスメトロジー研究振興財団に厚く御礼申し

差が生じるようになりました。また近年、総合的に見て日上げます。教育の傍ら、小規模な女子大で、十全とは言い本の研究の国際的な競争力も低下していることが、様々な難い研究環境ではありますが、研究を少しでも進めたいと面から指摘されるようになっています。資源の乏しい小さ

考えて仕事している小職にとっては、コスメトロジーの研な島国である我が国にとって、科学技術を発展させること

究助成が本研究を推進するうえで、大きな支えになりまは、日本が繁栄するための必須の要件であることは、多くした。若い頃に米国の研究所に留学し、当時の所長がノーの人の共通認識だと思いますが、残念ながら次第に研究環

ベル賞を受賞したデビット・バルチモアでしたが、彼が境は危機的な状況になってきています。そのような現状に

small science を提唱していて、感銘を受けました。small

おいて、コスメトロジー研究振興財団の研究助成は、公的

science というのは、生命科学は、小規模の数多くの研究資金がカバーできない small science の育成にも資するもの中から革新的なものが生まれるという考え方で、bigのだと理解しています。小職も一研究者として、微力ではscience とは逆の考え方になります。しかしそれから数十ありますが、コスメトロジーを含めた生命科学の進展に少年を経て、時流は結局、研究資金を特定の有望と思われる

しでも役立つように今後も精進したいと考えています。

対象に集中的につぎ込むという方向に進んでいき、我が国（千里金蘭大学生活科学部食物栄養学科）

平成 28 年度

研究助成

黒髪と白皙
藤枝

伸宇

人それぞれ感じ方に違いはあるものの、健やかな髪や肌

コスメトロジー研究振興財団と関係者の皆様には感謝の言

は健康のバロメーターであり、また、一生を通じてそうあ

葉もありません。本研究ではチロシナーゼのごくごく微細

りたいと思うものの一つと言えるだろう。大雑把に言えば、な空間における金属の挙動について研究させていただいた。

これらを司っている酵素、チロシナーゼは黒髪に対しては得られた結果にもとづいて、新たな領域にチャレンジし、味方であり、一方で白皙に対しては敵とみなすことができ

次の結果を残すことが最良の恩返しかと次の展開についてる。面白いもので人は相反するものを同時に手に入れたく日々思慮にふけっている。単純に考えれば阻害剤の設計になるようである。あるところでは抑制し、あるところではは確実に影響する結果が得られていることに加えて、チロ増幅させる、これらコントロールの根幹はその反応機構にシナーゼの活性を増幅させ、タンパク質線維を染色するな

隠されていると考えているわけであるが、なかなかこれがど、半人工毛の産出にも貢献できるかもしれない。本研究複雑である。見れば見るほどその神秘は奥へ奥へと隠れてはまだ、道半ばではあるが、今後重要な意味を持つ研究成いっているようにも見える。これはまさに基礎研究の醍醐果として期待している。最後に今後も貴財団とコスメトロ

味でもあり、終わりがないように見えるのは応用・展開を

ジー分野のさらなる発展を祈念し、私の雑感としたい。

考える上では大問題である。

（大阪府立大学大学院生命環境科学研究科）

今回、非常に基礎研究によったテーマに対して援助頂き、− 187 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

平成 27 年度

研究助成

感謝の気持ちを込めて
宮戸健二

研究費を頂いて感謝の気持ちでいっぱいである。研究費

細菌の共生」は根っこの部分でつながっている。そういっに採択されることが、私たち研究者の生命線であり、どん

た相互のつながりを見つけることが研究の醍醐味の一つでなに素晴らしいアイデアを持っていても研究費がなければある。クエン酸は、細胞内小器官であるミトコンドリアに実現することはできない。また研究費がなければ、有能なよって作られ、すべての細胞の呼吸に必要であるため、当若手研究者が、研究を続ける以前に生活することができな

然、細胞の代謝にも必要不可欠である。ただし、クエン酸

い。そういった諸々のことを含めて感謝の気持ちでいっぱの生合成系がミトコンドリア以外にも存在することは、ほいである。

とんど知られていない。私の研究はこのミトコンドリア以

今回の研究費助成で私は、果実に含まれる酸っぱい成分

外に存在するクエン酸合成酵素に着目した研究であり、「白（クエン酸）の働きを「美容」
や「若々しさ」の観点から研究を髪を予防し、黒髪・美髪をキープする」だけでなく、「生殖行った。結果として、クエン酸には白髪を防ぐ作用がある機能の維持」または「不妊」の予防にも発展する研究であり、ことを発見した。一方でこの研究は、出発点が不妊研究で詳細は省略したものの、「癌予防」への展開も考えられる。

あるという点が、他のコスメとロジー研究とは大きく異なクエン酸を摂取する方法、摂取するタイミング、最適な摂っている。しかしながら、私の研究経験から考えると、そ取量など検討課題は多々あるものの、クエン酸といった容れぞれの生命現象は思わぬところでつながっている場合

易に摂取できる物質にどのような可能性が秘められているがあり、例えば「生殖と免疫」、「生殖と神経系」、「生殖とのか、楽しみも多い。

（国立成育医療研究センター）

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
山下富義

外見の美しさを保ち精神的な内面の安寧をもたらす香粧

た。今回の研究のきっかけとなったナノ粒子化ヘパリンは、品には、装飾としての性格はもちろんのこと、自身の一部

DDS のための天然素材を探索する中で偶然見つけたものである皮膚そのものに対する悩みを解消し健康を与えるスです。薬物を含有させることなくそのままで抗炎症作用をキンケアシステムとしての性格も必要と考えています。皮

発現することを見出しました。天然多糖のヘパリンを出発

膚炎では身体症状として痒みがあり、見た目の変化を伴原料とすること、保湿や血行改善のためのヒルドイド（ヘうため、罹患者の QOL が著しく損なわれ、日常生活や社

パリン類似物質）が化粧品にも配合されることを考え合わ

会的活動に支障をきたしてしまうことも少なくありませせると、ナノ粒子化ヘパリンによる皮膚炎の抑制は香粧品ん。こうした苦しみから解放する、あるいは苦しみに至ら

分野の関心の高いテーマに違いないと確信しました。今回、ないように予防する機能を持った素材の開発は、香粧品化

コスメトロジー研究振興財団より助成をいただき、期待通学の分野の重要なテーマと思っていました。私自身、20りの成果を収められたことで、これまで何かしら “近くて数年前に薬物の経皮吸収に関するテーマで博士号の学位を遠い” と感じていた香粧品の研究分野に初めて貢献できた取得しました。医薬品も香粧品も皮膚に適用する化学物質

気がしています。研究機会を頂戴した貴財団に深く感謝しという意味では同じで、昔から香粧品分野に親近感を持っますとともに、今回の成果を糧にしながら新たな研究の開ていました。しかし、薬機法では医薬品／医薬部外品と化拓に邁進していきたいと思います。

粧品は明確に区別されますので、これまでに“香粧品”について研究する機会をもつことは残念ながらありませんでし− 188 −

（京都大学大学院薬学研究科）

コスメトロジー研究雑感

平成 27 年度

研究助成

たるみの内部構造について想う奥田

逸子

この度は大変お世話になりました。

頼っていたたるみの原因や予防を科学的な手法を用いて評

私は大学病院に勤務しており、日頃は病気の診断をして価できることが予想されました。そこで、私達は公益財おります。診療をしながら、老いや若さの本質を画像で見

団法人コスメトロジー研究振興財団の助成を得て、“顔面ることができたら面白いことだと考えておりました。ある加齢の評価のための画像解析手法の開発：主観的感覚的評

日、顔面の外傷や炎症を診断するため３次元 CT 画像を作

価から客観的定量的評価へ” について研究を行うこととし成した時、加齢現象を画像化できることに気が付いたことました。その結果、加齢とともに頬頂部は内下方に下垂し、がこの研究のきっかけでございます。最初は、数人の画像

下垂した頬厚が増加することが確認でき、それらが加齢容診断医や解剖学者などで加齢現象の内部画像について研究貌をまねくことを実証したといえます。さらに、加齢容貌しておりました。しかし、少ない人数で取り組むにはもっの解剖学的要因の一部を明らかにすることができたと考え

たいないことと思い始め、日本香粧品学会などで発表させております。

て頂き、多くの方々と意見交換をしてまいりました。そう

今日の進歩した画像診断学的技術や評価法は容貌のエイしているうちに、さらに多くの方々と交流できるように

ジングレベルや加齢に関与する皮下構造物を可視化し、高なり、この問題を扱う加齢画像研究会を 2012 年に立ち上い客観性を有するといえます。本研究によって得られた成げ、意見交換を続けてまいりました。この研究会において

果は、美容や化粧品開発などの関連領域の研究者に積極的は顔面のみならず、頭皮や乳房など広い範囲の研究が行わに広く発信していきたいと考えております。今後とも、公れ、発表してまいりました。

益財団法人コスメトロジー研究振興財団のご支援を賜りた

顔面のたるみ、とくに、頬のたるみが加齢容貌に大きな関わりがあることはよく知られていることです。しかしな

く宜しくお願い申し上げます。最後になりましたが、貴財団の益々の発展をお祈り申し上げます。

がら、頬のたるみの要因を客観的に評価した研究が少ない（国際医療福祉大学三田病院放射線診断センター）

ことが分かり、それを解明することは、これまで経験則に

平成 28 年度

研究助成

コスメトロジー雑感谿雄祐

私にとって、本研究助成は日本学術振興会の特別研究員はありましたがプログラミングを利用しました。産業界に以来の研究助成でした。自分自身の興味のみから発する研

おいてビッグデータの活用が常識化しつつあるようですが、究に取り組むのは、大学院生以来のことのように思われ、人工知能の飛躍的な発展を受けて、今後様々な研究分野にそれだけでも大変ありがたいものでした。その反面、チー

おいてもビッグデータを活用することが必須となることが

ムではなく個人で研究をすべて担当するのも久しぶりのこ予想される中、この機会を活用させていただきました。

とでした。その苦労と楽しさを再認識させていただいたことで、研究者として一段階進めたような気がします。

今回、初めてインターネット調査会社を利用した大規模なデータ収集を行いました。これまでは実験室で行う実験

本研究課題では、肌の質感と魅力の関係について検討すを行っていたため、その違いを体験できたことも大きな収るために、肌の質感を表現する語句を収集することから始穫でした。実験を実施する上で留意すべき点について、デめました。関連する研究で使用されている語句を用いるこータを見てから気づくこともありましたが、最低限見ようとが一般的のように思われますが、化粧品会社によるブラと考えていた内容はデータから見ることができたように思ンド紹介サイトと一般ユーザーが書き込む口コミサイトかっています。データの規模が大きいため、報告内容以外のら収集しました。権利や私の技術の問題もあり、小規模で分析もまだ可能であると考えていますので、それらから得− 189 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

られた知見は今後発表していきたいと思っております。
最後になりましたが、本研究で得られた知見が化粧品開発に携わっておられる方々にとって、少しでも参考になる

ものであれば幸いに思いつつ、このような機会をいただいたことの感謝を述べさせていただきます。ありがとうございました。

（関西学院大学理工学部）

平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感
恒次

祐子

この度はコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択

かなりの試行錯誤がありましたが，今後の研究継続に向けしていただき，誠にありがとうございました。わたしは植て自分なりに多くの知見を得ることができたと考えており

物，特に樹木のにおいが人間に与える影響を研究対象とします。スギやヒノキは長くわたしたちの住生活を支え，国ており，中でも日本の人工林の主要樹種であり，木造住宅

土保全の一端を担っている身近な樹木ですが，一般に我がの主な材料であるスギやヒノキのにおいを対象に研究を行

国では森林への関心はあまり高いとは言えず，特にスギにってきました。樹木には抽出成分と呼ばれるごく微量の化

いたっては最近花粉症の元凶として嫌われものになってい合物が含まれており，その組み合わせにより樹種に固有なます。コスメトロジーという新たな切り口からアプローチにおいが形成されます。このにおい成分は，例えば昆虫をすることで，身近な樹木の新たな価値を見出し，国内の森誘引したり忌避したり，菌類による腐朽を防ぐなど，樹木林利活用の活性化に貢献できる可能性があるかもしれませにとって様々な役割をしていることが知られています。こん。今回の研究を端緒に，今後も粘り強くにおいによる睡れまでの研究で，針葉樹に含まれる α- ピネンという化合物

眠や健康への影響解明に取り組みたいと思います。

のにおいへの短時間曝露が，成人で血圧や脈拍数を低下さ

本研究助成のように，広い分野を対象とし，研究者の自せ，副交感神経系活動を上昇させる可能性が示唆されてい由な発想を支援する寛容な研究助成は昨今では貴重なものました。より長期的な影響へ研究を広げたいと思い，睡眠となったようにも思います。重ねてご援助に感謝申し上げへの影響を調査したいと希望しておりましたが，今回の研るとともに，コスメトロジー研究振興財団のますますのご究助成をいただいたことで，新たに研究に着手することが発展をお祈りします。

でき，大変ありがたく存じております。

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

新たな研究分野に挑戦したこともあり，測定においては

平成 27 年度

研究助成

子どもと化粧
徳田

克己

女の子は、TV・雑誌の子役やモデル、母親や保育者の幼児雑誌の中に出てくる子どもモデルは男女ともきれい

化粧にあこがれ、遊びの中に化粧を取り入れながら成長しに化粧をしており、また「上手なリップのぬり方のページ」ていく。子ども学を専門にしている私たちは、女の子はいや「光るお化粧コンパクトの付録」などがあり、リップの形

つ頃から、またどのように化粧に興味を持っていくのか、をしたキャラクターが登場している。化粧玩具は高価なも母親や保育者の化粧の様子や化粧観が子どもにどのようにのが多く、大きなドレッサーの玩具まで売られている。さ

影響しているか、現代の幼児向け雑誌や化粧玩具では化粧らに実際に肌に塗るキッズコスメ商品も多数ある。これらがどのように扱われているかなどについて興味を持っていのことは、大きな驚きであった。

た。大変ありがたいことに、公益財団法人コスメトロジー

化粧人生は七五三で始まる。化粧好きな母親の子どもは研究振興財団から研究助成金をいただくことができ、これ幼少の頃から化粧に興味を持っていた。多くの子どもがらのことについてじっくりと調べることができた。

「おかあさんのようにきれいになりたい」と思ってリップを− 190 −

コスメトロジー研究雑感

いたずらして叱られていた。母親も保育者も多くは「子どをしてもいいよ」と言って、来るべき化粧解禁の日を待たもの化粧は肌に悪い」と言っている。子どものことを思っせている。でも子どもはそれほど長くは待てない。化粧は、てのことだ。しかし、子どもにとってみれば「私もきれい

酒やたばこのように解禁年齢が明確に区切られているわけになりたい。どうしてママは化粧をしていいのに私はダメではないので、年齢が長じるにつれて徐々に化粧デビューなの？」となる。だから幼児雑誌や化粧玩具では、リップの女の子が増えていく。そして大学のキャンパスは化粧美やチークの方法を子どもに教え、自分ではなく、人形など

人でにぎわうのである。

（筑波大学医学医療系）に化粧をさせる。母親は「もう少し大きくなったらお化粧平成 27 年度

研究助成

コスメトロジー雑感村田航志

この度はコスメトロジー研究振興財団の研究助成に採択

製チップを床敷とした場合で、成体期に木材精油への行動していただき、心より感謝申し上げます。御支援をいただ

反応に違いが生じることがわかりました。本研究ではさらいた時期がちょうど現在の研究室に着任した初年度でしたに誘引行動が生じる神経メカニズムにせまるため、嗅結節

ので、実験環境を立ち上げて研究を開始するにあたり大変という脳領域に着目し、誘引行動が生じるときの神経活動励みになりました。

と、神経活動を操作したときの行動変化を解析しました。

本研究では香りのなつかしさの神経メカニズムをテーマ

申請当初の研究計画どおりには研究が進まず、方針を変更に掲げ、幼少期に経験した匂いに対する心地よさがどのよした点もありましたが、嗅結節という脳領野と嗅覚で生じうな脳神経回路によって生じるかを明らかにしようとしてる行動反応の関係について少し理解を深めることができまいます。このテーマを着想したきっかけは、マウスの匂いした。マウス実験で得られた本研究の成果が、どこまでヒの好き嫌いを調べるために様々な香料を嗅がせて行動反トの香りの感じ方に当てはまるかはわからないところもあ応を観察していたことでした。観察を進めるなかで、マウ

ります。嗅覚の神経メカニズムは未解明な点が多いからこスが植物精油に対して強い誘引行動を示すこと、その誘引

そ、今後も研究を続け、香りで生じる様々な生理・心理作

行動が見られる個体と見られない個体がわかれることがあ用の仕組みを明らかにしたいと存じます。

りました。原因として立てた仮説が養育環境の違いであり、（福井大学医学部脳形態機能学分野）

本研究の結果から、木材のおがくずを床敷とした場合と紙

平成 27 年度

研究助成

顔の計測
森

悦秀

私が治療・研究対象としているのは口の先天異常である（ランドマーク）が少なく、大きさにも個体差があり、ラ

口唇口蓋裂、あるいは下顎前突、上顎前突、非対称など顎ンドマーク間の距離や角度の平均値にどれくらい意味があの先天的・後天的異常である顎変形症の患者さんです。
「（歯るのか疑問を感じていました。今回用いた相同モデル化技

科）
口腔外科」
を標榜していますので、口唇、鼻、顎など嫌術は産業技術総合研究所で開発されたものです。計測されでも目につく部分の外科治療が仕事です。このため、顔のた顔面形状は 3 次元空間に散布された点の集合（クラウド）

計測と評価を主に研究してきました。1980 年代中頃から、ですが、これらの点をつないで小さな三角形を作り、サー

三角測量の原理を応用したレンジファインダーを使って顔フェスモデルが出来上がります。計測対象物の平均的な形

面形状を 3 次元的に計測し、評価をしてきましたが、顔面状をもとにサーフェスモデルのテンプレートを作り、個々はなだらかな曲線で構成されており、再現性の高い特徴点の顔面形状のクラウドにフィットするようにテンプレート− 191 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

を変形させたのが相同化モデルです。もとのテンプレート

るかは、モデルの形状を変化させて人間が直感で見つけるは共通ですので、モデルを形作る点の数、三角形の面の必要があります。一方、個々のモデルにその変化を反映で数は共通で、すべての相同化モデルの点は 1 対 1 で対応しきるため、テーラーメイド医療には最適です。今回の研究ています。このため、多変量解析による統計処理が行えま

手法と結果はより詳細に検討する必要がありますが、新しす。今回用いた主成分分析法は大量の変数（説明変数）をよい形状計測法として有用と考えられます。

り少ない指標（合成変数）に要約しようとする統計手法です（九州大学大学院歯学研究院口腔顎顔面病態学講座口腔顎が、抽出された主成分が顔面のどのような特徴を表してい

顔面外科学分野）− 192 −

コスメトロジー研究雑感

平成 29 年度

国際交流

「ASMB Workshop 2017 on Basement Membranes」に参加して吉川

大和

この度、コスメトロジー研究振興財団の国際交流助成を

発表の機会を得ていました。このワークショップでは、要受け、2017 年 7 月12-14 日に米国テネシー州ナシュビルの旨集が作成されなかったので、どの発表もしっかりと聞く

バンダービルト大学で開催された基底膜に関するワークシことが求められるだけでなく、発表においても十分な背景

ョップ「ASMB Workshop 2017 on Basement Membranes」の説明が求められました。今回のワークショップの発表でに参加しました。

は、競い合う 2 つのグループによるラミニンのインテグリ

このワークショップは、バンダービルト大学の Dr. Roy

ン結合部位の構造についての発表が、その全容解明まであZent とワシントン大学の Dr. Jeffrey H Miner により企画ともう少しであり、とても印象的でした。さらに、モデルされ、会場および宿泊も大学の施設を使用し、研究者間の動物を使用した基底膜形成過程の視覚化が可能になり、基コミュニケーションを行いやすくするだけでなく、最新の底膜形成メカニズムへのアプローチが複数のグループによ知見を発表しやすいように要旨集を作成しないスタイルをりなされているのも印象的でした。また、基底膜は皮膚組取り入れて行われました。ワークショップでは、基底膜を織を支える必須な構造であることから、皮膚科領域の研究研究するための新しい技術、基底膜の物性、基底膜の生合者が多く参加していました。

成および安定性、基底膜と細胞のコミュニケーション、基

最後に、ご支援を賜ったコスメトロジー研究振興財団に

底膜分子の遺伝学、基底膜の分解、基底膜の機能に関連す改めて感謝を申し上げるとともに、今後も基底膜の研究とる疾患およびその治療法といった 8 つのセッションに分かいう面からコスメトロジーにも貢献してまいりたいと思いれて討論が行われました。70 名ほどの少人数ということます。

もあり、多くの参加者がポスターだけでなくオーラルでの− 193 −

（東京薬科大学薬学部病態生化学）

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

平成 29 年度

国際交流

第 10 回プロテオグリカン国際会議 参加報告
渡辺秀人

このたび、コスメトロジー研究振興財団・学術集会支援

未公表の研究内容でした。発生学や構造科学の内容は減り、助成を頂戴し、第 10 回プロテオグリカン国際会議に参加

疾患（特に炎症と癌）や医療応用に関する内容が目立ちましさせて頂きました。

た。数年前と比較すると大きく様変わりした感があります。

本国際会議は 1999 年夏に初回が日本にて開催され、以国際会議は旧知の仲の研究者と再会できるのが楽しみの降世界各地にて隔年で開催されています。今回は 2017 年

ひとつです。旧知の仲の研究者は皆さんお元気でそのバイ

9 月10 - 14 日（日- 木）の期間、ミラノからバスで約 1 時間

タリティに驚愕する一方で、自分を含めて「随分歳をとっのイタリア北部の観光地ヴァレーセにて Alberto Passi 博

たなあ」とも感じました。元気で活躍している姿を見るの士会長の下、開催されました。

は嬉しいことですが、一方で若手研究者の育成は当該研究

プロテオグリカンは、蛋白質とこれに共有結合するグリ分野でも大きな課題です。そのためには分野全体の底上げ

コサミノグリカンの複合体の総称です。グリコサミノグリが重要で、プロテオグリカンが病態制御を始めとして生体カンの代表としてはヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイ

内で多彩な機能を持ち疾患治療のみならず健康長寿にも役

チン硫酸、ヒアルロン酸がよく知られています。皮膚科領立つ分子群であることをアピールすることが必要だと思い

域、整形外科領域ではお馴染みの分子群といえます。これました。

らの分子群は細胞の増殖・分化・遊走等の挙動を制御した

本研究分野はまさに、「皮膚を清潔に保ち、美しく装う」

り、細胞外に存在して成長因子等の生理活性物質の機能をという化粧品学（コスメトロジー）の趣旨に沿う研究分野と制御したり、弾力性、可塑性等、器官・組織の物性を規定いえます。本研究分野の研究成果は化粧品学の発展に繋がする等、多彩な機能を生体内で発揮しています。

るものと期待しています。この度ご支援を賜りました貴財

さて発表に関してですが、事前に主催者側が「たとえ未団に重ねて御礼申し上げます。

完成であっても構わないので未発表データを発表する」というポリシーを強く打ち出していたこともあって、殆どは− 194 −

（愛知医科大学分子医科学研究所）

コスメトロジー研究雑感

平成 29 年度

国際交流

国際交流とコスメトロジーとの結びつきについて小山秀紀

今回の国際交流では，ドイツ，ヨーロッパ圏の産業現場ユーモアを交えながら語られた．講演後には，参加者と活をフィールドとして，応用人間工学の領域で作業－生理学

発な意見交換が行われ，若手研究者や技術者の育成の観点的手法の開発と応用について，先進的な研究を進めている，からも有意義であった．

Helmut Strasser 先生（ドイツ・ジーゲン大教授）を招聘し，高齢社会の中で，加齢影響に関わる調査研究と対策は，日本人間工学会第 26 回システム大会にて，「The “Art of

今後も重要な課題と思われる．今回の講演，国際交流では，Aging” from an Ergonomics Point of View – Wisdoms on

加齢影響の人間工学的知識だけではなく，人が豊かに生きAge」の講演をお願いした．大会には大学教員や院生，企るためのヒントを与える先人の知恵にも触れることができ

業の研究・開発者（化粧品メーカの参加者もあった）など約

た．人が年を重ねるとはどういうことなのか，美しさと60 名の参加があった．

はどういうことなのか，科学と芸術の相違と共通点，美の講演では，加齢による人間特性（筋力や組立能力，視覚・探究と製品応用の可能性について考えさせるものであった．

聴覚特性，神経・認知機能）の変化に関する基礎知識，そドイツと日本，先人と若手，異文化や世代を超えた国際交

れらを定量的に評価するための手法について説明された．

流による知識と知恵の伝授と共有は，将来的に，より美しまた，高齢者の経験の豊富さや，予測実行能力など，加齢

く豊かな人間生活の実現に寄与するのではないかと思われの肯定的な諸点についても説明され，年齢や経験に応じたる．

道具や環境の最適化の重要性について述べられた．さらに，著名な哲学者・芸術家・詩人の文献を引用し，先人の知恵

最後に，国際交流という貴重な経験の機会を与えていただきました，貴財団に感謝申し上げます．

と照らし合わせながら，年を重ねることの洞察について，− 195 −

（東北大学大学院医工学研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

平成 29 年度

学術集会支援第 39 回日本光医学・光生物学会開催報告
西田絵美

第 39 回日本光医学・光生物学会を森田明理会頭、松本った。

貴裕副会頭のもと、2017 年 7 月 21 日、7 月 22 日の 2 日間、学会は 2 つの会場の他、ハンズオンセミナー会場、展示

名古屋駅の KITTE3 階の JP タワー名古屋ホール＆カンフ

会場に分かれ開催された。1 日目は第 1 会場にて森田会頭

ァレンスにて開催した。今回の学会のテーマは、「最先端による開会の辞に始まり、2 名の奨励賞受賞者による講演、光の融合型研究と光の臨床の発展をめざして」で、あらた

平山秀樹先生、影山龍一郎先生による特別講演、臨床領域

な「光」に関する医学・生物学・化学・工学の分野の発展をから 2 名の先生のスポンサードセミナー、臨床と研究を結実感してもらうような工夫をした。振り返れば、1978 年

ぶ内容で 2 名の先生のランチョンセミナー、半導体につい

8 月 3・4 日に港湾会館（名古屋市港区）において光医学・ての 3 名の先生のシンポジウム、2 名の先生のスイーツセ

光生物研究会が開催された。主催者は名古屋市立大学医学

ミナー、一般講演 21 演題が行われた。また今回初めてハ部皮膚科の水野信行教授であり、当初就任 10 周年記念のンズオンセミナー会場にて、4 社の企業が機器を持ち込み、

1 回限りの研究会としての企画でしたが、50 演題を超え

その場で機器に触れ、実際の操作方法、特徴を含めた具体る研究会となり、成功裡に終わったことから、本学会の前的な説明を受けることができるブースを設置。また 2 日目

身「日本光医学・光生物学研究会」の第 1 回となった。「光も皮膚科の臨床について 2 名のモーニングセミナー、生体に関係する異分野の方々が集まって、お互いにそれぞれの光イメージングについて近藤科江先生、再生医療の応用に立場から他の分野の問題を批判・検討することは、独善的つき難波大輔先生より特別講演、光線療法と薬物療法につ概念をしりぞけ普遍的原理へと導き、また他の分野での研いて 2 名のランチョンセミナー、一般講演 14 演題を行い、究が自分の分野の新しいテーマの端緒ともなってくると考

最後には次期会頭中林孝和先生の閉会の辞をもって無事閉えるのであります」―と述べられ、光を共通項とした横断会となった。2 日間で、内容のみならず、120 名を超える的学会組織の必要性を強く感じておられた。29 年ぶりに人数の参加と非常に盛況な会となった。

名古屋市立大学医学部皮膚科が同学会を主催することとな− 196 −

（名古屋市立大学大学院医学研究科）

コスメトロジー研究雑感

平成 29 年度

学術集会支援日本動物実験代替法学会第 30 回大会への支援のお礼
小島

日本動物実験代替法学会第 30 回大会は、2017 年 11 月

肇─ Shujun Cheng（Guangdong Inspection & Quarantine

23 ～ 25 日に、大田区産業プラザ（東京・大田区蒲田）で開Technology Center, Guangzhou, China）ら催されました。お陰様で 711 名の方にご参加頂き、無事盛・An integrated testing strategy for in vitro skin

会のうちに終了いたしました。これも、コスメトロジー研

irritation and corrosive assessment using EpiSkinTM

究振興財団の支援により、中国人および韓国人の専門者をskin model

招聘し、ランチョンセミナーでの講演を開催できたことが─Junming Huang（Guangdong Province Center for

大きな反響を呼んだためと考えております。

Disease Control and Prevention, Guangzhou, China）
ら

11 月 25 日に開催されたランチョンセミナーでは、2 会

いずれの会場も各 150 席が満席の盛況ぶりであり、改め場で同時に開催され、A および B 会場で以下のような講演て中韓の行政や研究動向に参加者が興味を持っているこ

がなされました。

とを実感できました。中国人および韓国人の専門者とは、

A 会場

2016 年 11 月に佐賀県・唐津市で開催された第 1 回アジア

・Recent developments of toxicological alternative

動物実験代替法学会で協力関係を築き、2018 年 10 月に中methods in China

国・広州で開催される予定の第 2 回アジア動物実験代替法

─Xingfen Yang（School of Public Health, Southern

学会にて、その関係を深めつつあります。今後も、動物実

Medical University, Guangzhou, P.R.China）
ら

験の福祉や安全性試験法の開発を通して、益々日中韓の結・Current activities for the development and validationof alternative test methods in Korea

びつきが強くなっていくものと考えております。
繰り返しになりますが、これもコスメトロジー研究振興─Tae Cheon Jeong（College of Pharmacy, Yeungnam
University, Gyeongsan, Republic of Korea）
ら財団の皆様のご協力のお蔭です。改めまして、財団の支援に御礼申し上げます。今後とも、化粧品の安全性評価に動B 会場

物実験を用いない検討を行っていく “日本動物実験代替法

・An in vitro co-culture system to assess lipophilic学会” へのご支援をよろしく賜りますようお願い申し上げ

chemicals and petroleum chemicals for skinます。

sensitization− 197 −

（国立医薬品食品衛生研究所）

●
事業報告書
役

員
●

事業報告書

事業報告書（自平成 29 年 4 月 1 日

至平成 30 年 3 月 31 日）《研究助成関連》
2017

2017

5

8

公募開始

全国 601 の大学、病院、研究機関等へ公募要領及び推薦書を送付、関連学術雑誌 2 誌、当財団 HP 他 11 機関 HP に公募要領を掲載
7 10
公募締切り
応募総数123件
7/14 〜 8/25
各選考委員による個別審査
9
1
選考委員会
（第２分科会） 生体作用、安全性に関する分野の選考
9
5
選考委員会
（第１分科会） 素材、物性に関する分野の選考
9
8
選考委員会
（第３分科会） 精神、文化に関する分野の選考
9 29
本選考委員会
各分科会の結果を総合的に判断して研究助成35課題を選考
11 21
理事会
本選考委員会より答申、助成課題決定
第28回 表彰・贈呈式
研究助成対象35課題の代表者へ、助成金贈呈書を授与
記念講演
演題 ： 夢を形に：ナノテクノロジーで創る体内病院
講演者 ： 片岡 一則 先生
公益財団法人川崎市産業振興財団ナノ医療イノベーションセンター長
12 11
助成金交付
採択課題に対し研究助成金を交付 総額4,000万円
2 20
選考委員への承認（書面） 2018年度研究助成公募要領他《国際交流助成関連》
2017

4

14

審査

4
4
12

25
14
25

助成金交付
審査
助成金交付

国際交流（派遣）： 基底膜ワークショップ及びプロテオグリカン国際会議の審査
国際交流助成金の交付 50万円
国際交流（招聘）： 日本人間工学会第26回システム大会の審査
国際交流助成金の交付 50万円

《学術集会支援助成関連》
2017

7
7
9
9

6
10
11
25

審査
助成金交付
審査
助成金交付

学術集会支援 ： 第39回日本光医学・光生物学会の審査
学術集会支援助成金の交付 50万円
学術集会支援 ： 日本動物実験代替法学会第30回大会の審査
学術集会支援助成金の交付 50万円

平成28年度事業報告及び収支決算報告の承認
株主としての議決権行使の承認、報告事項
平成29年9月29日開催の選考委員会決定内容の承認
平成29年度収支予算書の一部変更の承認
平成29年度（第28回）研究助成者等の承認
平成30年度の事業計画及び予算案の承認、報告事項《理事会関連》
2017

5

23

第一回通常理事会

10
11

6
21

理事への承認（書面）
第二回通常理事会《評議員会関連》
2017

6
11

9
27

定時評議員会
平成28年度事業報告及び収支決算報告の承認、報告事項
評議員への報告（書面） 第二回通常理事会議決事項、表彰･贈呈式その他の報告− 201 −

コスメトロジー研究報告Vol.26, 2018

《その他》
1）報告書発行
中間報告書
研究業績 中間報告集 第26号
2017
5
1
9
1
完了報告書
コスメトロジー研究報告 Vol. 25（2017）、CD版を作成
2）行政届出関連
内閣府へ平成28年度事業報告書等の提出
2017
6 14
2018
1 15
内閣府へ平成30年度事業計画、収支予算書の提出
3）情報公開（当財団HP）
公募要領
2017年度「コスメトロジー研究」公募要領を掲載
2017
4
7
2018
6 30
事業報告及び収支決算
平成28年度事業報告書及び収支決算報告書を掲載
研究報告書「コスメトロジー研究報告 Vol. 25（2017）」を掲載
91
予算書一部修正
平成29年度予算書の一部修正
11 22
研究助成者及び課題名
2017年度（第28回）研究助成者名及び研究課題名を掲載
2017
3
1
事業計画及び収支予算
平成30年度事業計画及び収支予算書等を掲載− 202 −

事業報告書2017 年度助成を受けられた方々
１）第 27 回研究助成（35 名）
第 1 分野：素材、物性に関する分野（10 名）
氏

名

犬丸

啓

井上

所

属

職位

研究課題

広島大学大学院 工学研究科教授

紫外光照射下での酸化チタン粒子からの活性酸素の放出を完全に防止するナノ構造コーティングの開発

元基

明治薬科大学助教

シクロデキストリンを用いたサーファクタントフリーエマルショ
ンの安定化メカニズムの解明

内野智信

静岡県立大学
薬学部臨床薬剤学分野

講師

ナノ粒子の物性の違いが角層作用過程におけるナノ粒子と角層の相互作用に与える影響の検討－放射光X線を用いたアプローチ－

大貫義則

富山大学大学院
医学薬学研究部（薬学）客員教授

MRIと時間温度換算則を応用したエマルション化粧品の高精度乳化安定性予測岡本浩明

山口大学大学院 創成科学研究科

准教授

化粧くずれの低減を目的とした新規な非水素結合性有機ゲル化剤
の開発

紀和

利彦

岡山大学大学院 自然科学研究科

准教授

テラヘルツ波を用いた皮膚への化粧水浸透評価手法の開発

棚谷綾

お茶の水女子大学
基幹研究院自然科学系

准教授

皮膚疾患に有効な新規骨格を有するビタミン D 誘導体の創製

戸塚裕一

大阪薬科大学薬学部

教授

ケルセチン含有化粧品の最有効使用のための有機ナノコンポジッ
ト設計

平井

洋平

関西学院大学
理工学部生命医化学科教授

化粧品原料の次世代スクリーニング用細胞の創製：ES/iPS細胞の多重遺伝子加工山野喜

広島大学大学院
医歯薬保健学研究科生命薬科学

助教

モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン
産生抑制活性物質の創薬研究

職位

研究課題

第２分野：生体作用、安全性に関する分野（18 名）
氏

名

所

属

佐々木栄太

東京大学大学院
農学生命科学研究科
応用生命化学専攻

助教

細胞の損傷や老化により生成する脂質過酸化物のバイオイメージ
ング

清水

史郎

慶應義塾大学
理工学部応用化学科教授

メラニン生成関連タンパク質における新規糖修飾の解析と応用へ
の展開

下田

浩

弘前大学大学院 医学研究科

教授

革新的ハイブリッド型三次元ヒト皮膚モデルの開発

白土

明子

金沢大学
医薬保健研究域薬学系
生体防御応答学

准教授

ナノマテリアルによる細菌遺伝子発現の制御と感染調節

世戸孝樹

静岡県立大学薬学部 薬物動態学分野

講師

動物実験の3Rsに寄与する化学物質の光安全性評価法の戦略的開
発

徳村

雅弘

静岡県立大学
食品栄養科学部 環境生命学科

助教

化粧品成分の安全性評価のための製品性状を考慮した経皮曝露量推算スキームの構築 ─マニキュア用可塑剤の経皮曝露を考慮したリスクトレードオフ評価─

仲村英也

大阪府立大学大学院
工学研究科化学工学分野

准教授

ナノ粒子が細胞膜を透過する現象の理解：分子動力学計算および
平面脂質膜法による解析− 203 −

コスメトロジー研究報告Vol.26, 2018

氏

名

野口

範子

樋浦

所

属

職位

研究課題

同志社大学 生命医科学部教授

皮膚細胞を保護するタンパク質の分泌機構の解明と分泌促進因子の探索

仁

東北大学大学院 医学系研究科

助教

ヒト未分化胎盤幹（TS）細胞を用いた合成香料（HHCB）の安全性評価システムの開発

堀昌平

東京大学大学院 薬学系研究科教授

制御性T細胞による皮膚恒常性維持メカニズムの解明

水谷健一

神戸学院大学大学院
薬学研究科 幹細胞生物学研究室

特命教授

創傷治癒過程において、血管網の再構築が表皮幹細胞の分裂制御に果たす役割

村田

光麻

京都大学
医学研究科 皮膚科学講座

研修員

カルシウムイオンに着目した角層形成メカニズム・角化症の病態
解析

茂木精一郎

群馬大学大学院
医学系研究科皮膚科学

講師

皮膚の酸化ストレス障害に対する間葉系幹細胞の治療効果と制御
機構の解明

森山

博由

近畿大学 薬学総合研究所

准教授

皮膚老化予防に寄与する新規オートファジー制御機構の解明

保嶋智也

名古屋市立大学大学院
薬学研究科

助教

メラノソーム膜に局在するOCA4型アルビノ原因遺伝子MATPを標的としたメラニン合成阻害剤の開発

山上淳

慶應義塾大学 医学部医学科

山本圭

徳島大学大学院
社会産業理工学研究部
生物資源産業学域

准教授

プラズマローゲン型リゾリン脂質代謝系を基軸とした皮膚の恒常性と疾患調節の作用機序の解明

善本隆之

東京医科大学 医学総合研究所
免疫制御研究部門

教授

化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発

専任講師 表皮細胞間接着分子の発現増強条件と皮膚機能の総合的検討

第３分野：精神、文化に関する分野（７名）
氏

名

所

属

職位

研究課題

麻生

典

九州大学大学院 芸術工学研究院

助教

香りの文化と法的保護

有賀敦紀

広島大学大学院 総合科学研究科

准教授

化粧の濃さと社会的文脈の循環的相互作用に関する行動経済学的
アプローチ

小井川広志

関西大学 商学部教授

化粧品原料オイルとしてのパーム油の可能性と課題

大場健太郎

東北大学 加齢医学研究所
人間脳科学研究分野

助教

懐かしい香りを用いた回想法の効果検証および脳メカニズム解明

室長

眼瞼裂幅測定による耳鼻咽喉科心身症患者の客観的評価のこころ
み

五島

史行

独立行政法人国立病院機構
東京医療センター
臨床研究センター聴覚平衡覚障害研究部平衡覚障害研究室藤原寿理

福島県立医科大学
医学部システム神経科学講座

助教

化粧がもたらす社会的効用

横山由香里

日本福祉大学
社会福祉学部医療福祉専修

准教授

視覚障害者自らによる「化粧」が視覚障害者の Quality of Life に与える多面的な影響に関する研究− 204 −

─その神経基盤を探る

事業報告書２）国際交流助成（２件）
受入責任者

派遣・招聘者

愛知医科大学 分子医科学研究所
教授・所長
渡辺 秀人
東北大学大学院 医工学研究科
客員准教授
小山 秀紀

目

的

東京薬科大学吉川大和

基底膜ワークショップへ派遣（平成29年7月12日～ 14日、米国、バンダービルト大学）

愛知医科大学渡辺秀人

第10回プロテオグリカン国際会議へ派遣（平成29年9月9日～ 14日、イタリア、ヴァレーゼ）University of Siegen
Helmut Strasser

日本人間工学会システム大会への招聘
The Art of Aging 老化の美学（平成30年3月12日～ 13日、早稲田大学理工キャンパス）３）学術集会支援助成（２件）
実施責任者
西田

絵美

小島

肇

職

位

名古屋市立大学大学院
医学研究科

集会名
第39回日本光医学・光生物学会（平成29年7月21日～ 22日、JPタワー名古屋ホール＆カンファレンス）

国立医薬品食品衛生研究所 日本動物実験代替法学会第30回大会
安全性予測評価部（平成29年11月23日～ 25日、大田区産業プラザ）− 205 −

コスメトロジー研究報告Vol.26, 2018

役

員2018 年 7 月 1 日現在

理事長

小林

保清

株式会社コーセー

名誉会長

副理事長

小林

一俊

株式会社コーセー

代表取締役社長

専務理事

亀山

浩一

（常勤）

理

事

関根

茂

理

事

長野

哲雄

東京大学創薬機構

理

事

二木

鋭雄

東京大学

理

事

西川

武二

慶應義塾大学

理

事

野呂

影勇

早稲田大学

理

事

廣部

雅昭

東京大学

理

事

山㟢

幹夫

元新潟薬科大学

監

事

岩渕

信夫

公認会計士

監

事

村上

實

弁護士

評議員会長

内藤

昇

元株式会社コーセー

評議員

伊藤

正俊

評議員

齊藤

勲

元厚生省大臣官房審議官

評議員

仙名

保

慶應義塾大学

評議員

中村

陽子

評議員

西岡

清

評議員

花輪

隆昭

元昭和館

評議員

原田

敬之

東京女子医科大学

評議員

宮㟢

榮三

東京工業大学

日光ケミカルズ株式会社

東邦大学

取締役会長

客員教授

名誉教授
名誉教授
名誉教授
名誉教授
学長

常務取締役

名誉教授
名誉教授

元厚生省医薬安全局安全対策課安全対策企画官
東京医科歯科大学

名誉教授

館長
名誉教授

名誉教授

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コスメトロジー研究報告

Vol. 26／2018

非売品

2018年 9月 1日発行

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亀山 浩一
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