胆汁酸生合成のメカニズムに関する研究
東京工業大学理学部

藤本

善徳Cholic acid biosynthesis from cholesterol involves C-24/C-25 bond cleavage. A pre­cursor of the bond cleavage reaction is 3 a , 7 a , 12 a -trihydroxycoprostan-26-oic acid
(THCA) and this acid is converted into cholic acid by a mechanism similar to that of the/3 -oxidation of fatty acids. This research has focused on the stereochemical aspects ofthis C-C bond cleavage reaction and led to the following findings.
Evidence of the enzymatic formation of 24-oxo-THCA from△ 24 -THCA has beenobtained for the first time by the use of "C as a tracer. All of the four stereoisomers of3a, 7a, 12a, 24-tetrahydroxycoprostan-26-oic acid (TeHCA) were formed when
THCA was incubated with rat liver mitochondrial fraction. In contrast, (24R, 25R)­
THCA was formed when 700g supernatant fraction was used for incubation. The (25R)­
stereochemistry is noteworthy, since (3S)-hydroxy intermediate is known for /3-oxida­
tion of fatty acids. 27-Nor analogs of THCA and△ 24-THCA were also incubated withthe mitochondrial fraction to give a mixture of (24R)-and (24S)-24-nor-TeHCA.

1. 緒言的立場からその詳細について解明を試みることにした。
我々は先に ， この反応の中間体と考えられる

コ ー ル酸(1)に代表される胆汁酸類は肝朦においてコレステロ
ロールから生合成される。 コレステ

3 a,3a ,7a.

7 a,12 a, 24-tetrahydroxycoprostan-26-oic acid (TeHCA) (3)の24位， 25 位に関する4

ー ルがまず骨格における水酸化等の変化をうけ，12 a -trihydroxycoprostane となり，さらに側鎖末端の酸化をうけて3a, 7 a, 12 a trihydroxycoprostan -26-oic acid (THCA) (2)となり， これが'/3 ー 酸化タイプの反応で側鎖の ��,�喜 ご。、青ご

C-24と C-25 の間で切断をうけ，

コ ー ル酸が生ゞ合成されるとされている I) 。

TeHCA(3)ーゞ勾COCH’’ ’

24-oxo-THCA (5)HH，゜3)

COCH’’゜゜c

炉-THCA (4)植物ステロ ー ルのコレステロ ー ルヘの変換機構圧

0心-ミH

我々はステロイド代謝における炭素 炭素結合切断のメカニズムの研究（例えば， 毘虫における微生物による植物ステロ ー ルの側鎖切断の機構

ooHy一を解明してきた）の 一 環として， 本炭素ー炭素結cllolicacid (1)合切断を取り上げ， どのような立体化学的制御のFig. 1

もとに反応が進行しているのかを含めて有機化学

Studies on the biosynthesis of bile acid
Yoshinori Fujimoto-40-B iosynthetic pathway of chol ic acid
The COO H residue can be regarded as
COSCoA in the biological system.

胆it酸生合成のメカニズムに関する研究

2 I 3. 実験および結果
2/3. 1 . 13C標識TH CA(6)および△ 24_TH CA(7)の合成

従来の研究では胆it酸の生合成研究は放射性同H02cた。

Fig.2 Synthesis of'3C-labelled△ 2'-THCA andTHCA
Reagents:i, [P 届 PCH(''CHJ)CO2 Me] +Br ―(9), n-Buli; ii , H2 /10%Pd-C; iii, KOH­
MeOH

2/3.2. ラット肝無細胞酵素系における△ 24 _THCAの27-nor - 3a, 7a, 12a­l4位元素( C)を用いて行われてきた。今回新し いtr i -h yd rox ycop rostan -24-oneへ

13
アイデアとして初めて我々は安定同位元素( C)の変換

24-THCA を 合成し ，上で合成した13Cー 標識体（各1.0mg)をラット肝これ らを インキュベートすることにより ， 予想さ無細胞酵素系(10,000g上清 ， Tris緩衝液pH8.5.

れるTeHCAおよび24 オキソTHCAを含めてMg 2 +,で標識したTHCAおよび△ー32゜cHH択性の欠如は注目に値しよう。
この様な背景のもとに以下に示す実験を実施しごHご 向"f.

酸に変換されることを報告した 5) 。 この立体選HM8

Ho i-H⑧ドリアとインキュベートすると ， いずれ もコー ルA

次いで この4種の異性体をラット肝ミトコン

面―4学は訂正を要することが明らかとなった） ) 。

b

確定した（この結果以前に報告されていた立体化

ご三種の立体異性体の合成法を開発しその立体配置をAT P.

CoA, NAD を添加蛋白量10代謝物を1 C-NMRで分析するこ とに した。 ( cmg/叫）と37.5℃, 1時間インキュベートした。 エの導入部位は合成の簡便さを考慮して27位とする

タノ ー ルおよび10%NaOHを加え5時間還流した。

ことにした。[27 - 13CJ-THCA(6)および[27- 1 3CJ酢酸エチルで抽出し， 濃縮残i査をLH- 20(メタ3ヽー△ 2 1 -THCA(7)を目的化合物とし， Fig.2に示す方法で合成することができた。す なわち， アルデヒド(8)を原料とし 13 c標識イリド(9)と反応させ，不飽和エステルUO)を得た。これ を加水分解し(7)を得た。また， UO)を接触還元後 ， 加水分解し (6)を得た。
(7)の 13 C-NMRスペクトルはo 12.37および21.02に強いビ ー ク を示し ， △ ” に関してトランス体が95%シス体が5% の混合物であった。 (6)は o 17.55の混合物であった。 さらに ，ODSカラムによるHPLCのTHCAの25位立体異性体の溶出順序は30杓g.3

報告されているので， 本サンプルを同様な条件で分離し NMRにて27位が o 17.55に観察される異性体が25S体 ， 17.75のものが25R体とアサインできた。

-41-

25

20

15

10

1'C-NMR spectra(in part) of incubation
product
U pper:derived from [ 1'CJ一△"-THCA(7).
Lower:background from incubation
medium. Asterisked signals at 8 21.02,
12.37 and 8.16 are due to (Z) -and(E) - C27 carbons of (7), and a new carbon, re­spectively.

5および17.75に強いシグナルを示し 25位の R/S体ノ ー ルで溶出 ）を通した後， 1 3C-NMRを測定ししていた。

た。未反応の原料シグナルの他に ． 新たなシグナ

さらに ，ルが13c標識△24-THCAのインキュベー ションが（酵素的に酸化されて）エチルケトン体を与える

6)のかを ， 標識されていな いTeHCAを同様な条件c標識の化学的環境から ，でインキュベーションして調べたところ，いずれサンプルに観察された 。
この化学シフトと13TeHCAの4種の立体異性体の いずれ

このシグナルは 27-nor-3 a. 7 a. 12 a -trihy­の異性体からもエチルケトン体⑪を与えることがdroxy-coprostan-24-one仰の 26位の炭素に帰わかった。
THCAを基質としたインキュベ ー ションでは属されると考えた。事実合成した標品のC-26

エチルケトン体のC- 26のシグナルは観察されなは全く同じ化学シフトを示した。

かった。

さらに ， 先の濃縮残濱を p-TLCにて標品ケトンに相当する部分を分離しトリメチルシ

リルエ ー"'"
�喜ご ご向テル誘導体としGC-MSにより分析したところ ，2 / 3. 3. 24-0xo-3ct., 7ct., 12a-trihydroxy

保持時間が標品ケトンと同じ位置にピ ー クを示し，-copro stan-26-oic acidの化学的安そのマススペクトルは標品より1マス高くシフト定性g!

2), M゜cH

Et召"'"〗H

柘唸：/CDl,lllen

夏

上の実験結果は，△ 24-THCAが酵素反応(hy­dratase,oxidase)にて24-oxo-3 a, 7 a, 12a -trihydroxycoprostan-26 -oic acid(またはそのCoAエステル ）に変換された後に化学的に脱炭酸したと考えられるので，標記化合物の合成を試みた。
コ ール酸トリホルミルエステルU2)をイミダゾライドとして活性化しマロン酸の半エチルエステルのマグネシウム塩と反応させケトエステルU3)を得

Fig.4 Attempted synthesis of 24-oxo-THCA(5)た。これをKOH/MeOH で加水分解した。このトを示す。しかしながら ， この混合物を抽出に先00〇® ◎ 0,x'x’',＇xx,'x’↓''

12 3 4 5 6---

反応溶液は逆相TLCでケトカルボン酸のスポッ立ち中和するために， 2N-HC1または飽和NH4Clを加えてTLCを追いかけると，徐々に上記のスポットは消えて新たにエチルケトン体⑪に相当するスポットが現れてくることがわかった 6 > a@2/�.4. TeHCAの生成過程における立体化学

1 : After comletion of hydrolysis
2: After addition of 1 eq. of sat. aq. NH4 CI
3: After addition of excess sat. aq. N出Cl
4: authentic ethyl ketone {11)5: THCA (2)
6: cholic acid (1)Fig.5 Chemical stability of 24-oxo-THCA(5)TLC was performed by Merck RP18-F254
plate with MeOH-H,0(9:1) as a developing
solvent.

について
2/3.4.1. THCAのインキュベ ー ション
既に， THCAがラット肝の無細胞 系で cholicacidに変換されることは実験的に確かめられている。また，この無細胞酵素系で NAD非存在下
では ，TeHCAが微量生成することも報告がある。

今回 ， 4種の TeHCAの立体異性体のうちいずれ-42-

胆汁酸生合成のメカニズムに関する研究: (A) From (25S)·THCA

るという結果は他のグル ー プによっても報告されている a> a
THCAの25位の立体異性体のうちいずれが代謝されるのかに関しては， われわれの上記の結果は両異性体とも変換されることを示している。 最近 ． 同様な趣旨の報告がなされた。
'I(D) From (25R)-THCAi.

=. :;=[27- 13C]-THCAのインキュベーションでは25S体(o 17 .55)の方が25R体(017.75)より多く回収される。
2/3.4.2. (E)およ び(Z)―△ 24-THCAの'"'，インキュベ ー ション△ 24-THCAには(E)体および(Z)体がある。
このうちいずれがコー ル酸に変換されるかをラッ卜肝の無細胞酵素系で調べた。
NADを添加して(E)体をインキュベ ー トするとTeHCAの生成は認められず ， コー ル酸の生成が 確 認 さ れ た 。 しかしながら，CZ)体からはーTeHCA. コ ル酸の生成はともに認められな心(min)48

かった。 現在， 得られたTeHCAの立体化学につ32

心(min)48

いてTHCAを基質とした場合と同様な結果か否Fig.6 HPLC analysis of TeHCA(3) formed upon
incubation of (25S)-and(25R)-TH CA(2)(A) and(B):W1th mitochondrial fr.;(C)and(D) with 700g sup. Analysis was performedin the form of p-bromophenacyl ester,using an ODS column with MeOHー出0 sys­
tern as an eluting solvent.

か確認しているところである ” 。
2/ 3. 5. ハイブリッド基質， 27- nor-THCA
および△ 24-27-nor-T HCAの代謝物
脂肪酸のB酸化では ， 3Sの立体配置を有する
B ー ヒドロキシカルボン酸か中間体であることが知られている。今回 の24R. 25R体とはB 位の立が生成するのかを調べた。
まず， ラット肝のミトコンドリア分画を用いて体化学が Rであり脂肪酸の場合と逆である。 そNAD非存在下で(25R)ー および(25S)-THCA

こで， THCAの炭素を 一 つ取った， 27-nor­

をインキュベ ー トし生ずると考えられるTeHCA

THCAおよび△ 24 -27-nor-THCA(14およびー プロモフェナシルエステル誘導体として15)を 合成し ， これから生じる27-nor-TeHCAHPLCにてしらべたところ ， 4種のTeHCA異性U6)の立体化学を調べてみるのは脂肪酸のB酸化のをp体がいずれも確認された(Fi g.6)。 また ， このイ酵素系と胆it酸生合成系の酵素系の比較の点からンキュベーションで△ 24-THCAも生じている

大変興味深い。

ことが認められた 7 l。
次に，

まず ， これらがラット肝の無細胞酵素系（ミト700g上清を用いてNAD非存在下で同コンドリア画分， NAD添加）で基質となり得 る様な実験を行った。 Fig.6に示すとおり ， (24R.

か を 調 べ ， (14)は 7.7 %05)は17 .5%の収率でcholic25R)-TeHCAが主に生成することがわかった。

acidに変換されることを示した。 この 変換率はCrudeな無細胞酵素系で(24R, 25R)体が得られむしろ対応するTHCA等よりもよい値であった。

-43-

直�

二�"-�°'c�
Ho' 'oH
H

From 27-nor-THCA\(16)

(15)

(14)

HH CA(文邸/戸 OOH

Fromぷ'-27-nor-THC A’’’ ’

文6ooH． ．． ．
-THCA＇＇△△'"·THCA (4)匹Not metabolised

700g

supernatant 1,:戸忙H

�OOH�OOH
�’28

Fig.7’40 (min)戸'28IグH
� CA(�OOH=⇒

三24-oxo-T C (5)H A'40(mn)

�OOH

↓己' .

Charcterizedas this ketone (11)HPLC analysis of 27-nor-TeHCA(16)formed upon incubation of 27-nor-THCA(14) and△ "-27-nor-THCA(15) withmitochondrai I fr. Analysis was perfomedin the form of p-bromophenacyl ester, us­ing an ODS column with MeOH ー 出0 sys­
tern as an eluting solvent. Authentic(24S)-and(24R)-27-nor-TeHCA were eluted
at 29.0 and 36.4 min, respectively.

Fig.8 Summary of the Present Work*When mitochondrial fr. was employed,
four stereo isomers of TeHCA were formed.

27-nor THCAを， ラット肝無細胞酵素 系のミトコンドリア分画を用い NAD 非存在下にイン
キュベ ー トしたところ ， Fig.7に示すように24位の2つの異性体27-nor-TeHCAU6lが共に生成することがわかった。こ れはTHCAを基質とした気にすることなく実験を行うことができる以外に ，代謝物を分離することなく. 13C-NMR により生成物の構造を調べることができる。この利点を生かして， 今まで未報告の24-oxo-THCAが△ 四-THCAから生成することを間接的に示すこと場合 に見られる結果と同様である 9) 。
70 0g上清によるインキュベ ー ションは現在検ができた。
なお， 27-nor-3 a, 7 a, 12 a -trihydroxy-coprostan -24-oneについて， ウシガエルの胆討中である。

4. 考 察胆汁酸の生合成におけるB酸化類似の c-c 結合切断反応 に関して有機化学的立場から種々検討を加えた。
今 ま で に 行わ れていた放射性同位元素 14 c によるトレ ー サー実験でなく， 安定同位元素 l3 c によるトレ ー サ ー 実験を初めて胆汁酸の生合成の研究に導入した。通常の実験室で放射能による汚染をH

8H亜から単離の報告があるが 10 ', 24-oxo-THCAから2/3.3. に示したように化学的分解により生じたものと考えられる。
最近 ， このf3酸化様反応の酵素学的研究が進歩しつつあり ， 脂肪酸 分解系の酵素との比較の議論が可能になりつつある 1 b >。例えば ， bile acidCoA ligase(ミトコンドリアに存在）やbile acidoxidase(ペルオキシゾ ー ムに存在）はpalmitoyl-CoA ligaseや fatty acid oxidaseとは異なるものであるとか ， bifunctionalなbile acid hy --44-

胆汁酸生合成のメカニズムに関する研究

dratase/dehydrogenase (ペルオキシゾ ー ムにRes., 33, 455,0992); b) D. W. Russell and K.

存 在 ）はfattyacid peroxisomal /3 -oxidation
酵素と似通ったものであるとか，

D.R. Setchell, Biochemistry, 31, 4737(1992).

thiolase (ペル2) M. Morisaki, Y. Fujimoto and N. Ikekawa,

オキシゾ ー ムに存在）は脂肪酸thiolase と同一の'Metabolic Aspects of Lipid Nutrition in In­ものであるとか言われている。

sects,'eds, T. E. Mittler and R. H. Dadd,

我々は，基質 および代謝中間体の化学的構造にWestview Press, Colorado, 1983. p.17; N.

基づいて酵素の性質を比較を試みようとするもの

Ikekawa, M. Morisaki and Y. Fujimoto, Acc.

である。 ここに示した結果で， 注目すべきは知見

Chem.Res., in press.
3) Y. Fujimoto, C. -S. Chen, A. S. Gopalan andは：

C. J. Sih, J. Am. Chem. Soc., 104, 4720(1982);

1)ミトコンドリア分画および700g上清を用いたときの生成するTeHCAの立体化学が明らか

idem, J. Am. Chem. Soc., 104, 4721(1982).
4) T. Kinoshita, M. Miyata, S. M. Ismail, Y. Fu­に異なることである。
2) 700g上清を用い たときに生成するTeHCA

jimoto, K. Kakinuma, N. lkekawa and M.

ヒMorisaki, Chem. Pharm. Bull., 36, 1340988).

ドロキシ酸 (3S)と水酸 基の立体化学が反対で

5) Y. Fujimoto, T. Kinoshita, I. Oya, K. Kak­

は24R,25R体であり ，脂肪酸におけるf3ーあることであるcinuma, N. Ikekawa and M. Morisaki, Chem.

この事実はhydratase 酵 素の反応における 立

Pharm. Bull., 36, 142 (1988).

体的要因に， 胆it酸と脂肪酸 では差異があること

6) M. Yuri, M. Tokumoto, N. Hara, Y. Fujimo­
to, N. Kobayashi and M. morisaki, Chem.

を示すものである。
さらに知見を得るために， 胆Pharm. Bull., in press ; 由利正利 ， 徳元真理絵，

汁酸 と 脂 肪 酸 のハイプリッド基 質 27-nor­

原典行 ， 藤本善徳 ， 小林典子 ， 森崎益雄 ， 日本薬

この点について，THCAについて調べた結果，学会第113年会（大阪）発表。

やはりミトコンド

リア分画では(24R)―および(24S)の2つの24ー

7)小林典子 ， 宇都宮禎子 ， 平賀伴子 ， 森崎益雄 ， 大ヒドロキシ酸が生じることがわかった。
以上，

谷いずみ ， 藤本善徳 ， 日本薬学会第13年会（大阪）

ラット肝無細胞系において立体化学を考発表。
8) M. Une, I. Morigami, K. Kihira

慮し つつ基質と生成物の関係(Fig.8)を明らかに

and T.

Hoshita, J. Biochem., 96, 1103(1984)

してきたが， 今後は上に記した輿味ある発見の原因をより精製した酵素系を用いた実験系で解きあ

9) Y. Fujimoto, unpublished work.

かしていく必要がある。

10) Y. Noma, M. Une, K. Kihira, M. yasuda, T.
Kuramoto and H. Hoshita, J. Lipid. res., 21,

引用文献

339 (1980).

1)最近のReview: a), I. Bjorkhem, J. Lipid-45-