上皮型脂肪酸結合タンパク遺伝子欠損マウスにおける表皮水バリアー機能の変化
東北大学大学院

医学系研究科細胞生物学講座

大 和 田細胞組織学分野

祐 二

We have generated mutant mice for epidermal type fatty acid binding protein (E-FABP) by the gene targeting techniqueand examined in detail the phenotype. In spite of lack in the expression of E-FABP mRNA and its protein in the skin and othertissues of the mutant mice, the animals appeared normal in gross and histological examination. Northern blot analysis of other
FABPs revealed a distinct elevated gene expression of heart-type FABP (H-FABP) in the skin of the homozygous mice. In
analyses of the skin, differences were not observed in contents of major fatty acids, electron microscopic appearances as wellas inflammatory responses in ear skin between the mutant and wild type mice. Basal transepidermal water loss (TEWL) of
homozygous mice was lower as compared with that of the wild mice. When acetone was applied to the skin for disruption of thewater permeability barrier, the recovery in TEWL was delayed, despite maximum TEWL upon acetone treatment was similar
between the homozygous and wild type mice in terms of the size and time course. The molecular mechanism by which E-FABP
contributes to the water barrier function of the skin remains to be elucidated.

１

緒

TEWL の回復が野生型に比して遅延していた。皮膚の超微言

形態像、構成脂肪酸の測定結果、アラキドン酸に対する炎

表皮角層の細胞間脂質（脂肪酸・セラミド・コレステロ症反応には野生型と比して大きな差異を認めなかった。本ール）は、表皮の保湿（water barrier function: WBF）に研究結果から、E-FABP 分子の表皮 WBF への関与が示唆深く関与することが知られている。これらの細胞間脂質は、された。

表皮ケラチノで合成される層板小体（lamellar body）の２形で細胞間隙に分泌され、主に表皮顆粒層の表面に分布する脂質層を形成する１）２）３）。

２．１

脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein：FABP）は、

実験

E-FABP マウスの作成

Fig. １にマウス E-FABP 遺伝子の構造と、E-FABP 遺伝

これまでにげっ歯類で 11 種類のアイソフォームが同定され子ターゲッティングに用いたベクターおよび recombinationている。FABP は、脂肪酸、胆汁酸、レチノイドなどに結後の変異遺伝子の構造を示す。embryonic stem cell（ES合能を示す細胞内低分子タンパク（14-15kDa）であり、細cell）にターゲティングベクターを遺伝子導入後、陽性 ES

胞機能としては、脂肪酸の細胞内担体として脂肪酸の細胞クローンをサザンブロット法にてスクリーニングした。遺内取り込み、細胞内貯蔵、核の脂肪酸受容体への情報伝達

伝子組換え ES cell をマウス blast cyst に注入し、これを偽制御、さらにはセラミドやコレステロールなどの代謝制御

妊娠マウスの子宮に注入した。得られたオスキメラマウスに関与することが示唆されている４）５）。このうち上皮型をメス C57B6 マウスと交配し、得られたマウスの遺伝子型脂肪酸結合タンパク（epidermal-type FABP: E-FABP）は、を確認することによりヘテロ接合型マウスを得た。雌雄へ表皮のみならず脳、肺、消化管、眼球、胸腺などに広く発テロマウスの交配により得られたマウスを PCR 法およびサ現することがこれまでの我々の発現解析結果から明らかとザンブロット法により遺伝子型を確認した。本研究で使用なっている６）７）８）９）。今回の解析では、E-FABP の表皮した野生型および E-FABP ノックアウトマウスはこの雌雄における生理機能を明らかにするために、我々が樹立したへテロマウスの交配により得られたものである。

E-FABP 遺伝子欠損マウス（E-FABP マウス）の皮膚における表現型を種々の観点から検討を加えた。WBF の測定

２. ２ サザンブロット、ノザンブロット、ウェスタンブロット

からは、野生型に比べて著明な transepidermal water loss

野生型、ヘテロ接合型、ホモ接合型マウスの皮膚を採取（TEWL）の低下が観察された。また表皮アセトン処理後のし、genomic DNA、total RNA およびタンパクを従ってAltered water barrier function in epidermaltype fatty acid binding protein deficient
mice.

抽出し、それぞれ定法に従って解析した（Fig.1b）。使用したプローブおよび特異抗体の詳細は、発表論文の中で記載ずみである 10）。

Yuji Owada, MD.PhD
Division of Histology, Department of
Cell Biology,Graduate School of MedicalScience,Tohoku University

２. ３

形態学的解析

野生型および E-FABP マウスの背部皮膚を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、凍結切片およびパラフィン切− 66 −

上皮型脂肪酸結合タンパク遺伝子欠損マウスにおける表皮水バリアー機能の変化片を作成した。パラフィン切片は、定法に従って E-FABP

定はガスクロマトグラフィー（Hewlett-Packard Model 5890

特異抗体による免疫組織化学染色に付し光顕観察を行った。

gas chromatograph, Avondal, PA, USA）を用いて施行した。

凍結切片はエポン包埋後超薄切片を作成し、電子顕微鏡観察を施行した。

２. ６

２. ４た。マウス耳介皮膚にアラキドン酸溶液（１mg/10ul）をStandard inframation assay

生後 10 週齢の野生型および E-FABP マウスを使用し表皮 WBF の測定

ヘ テ ロ マ ウ ス の 交 配 に よ り 得 ら れ た メ ス 生 後 10 週
齢、野生型マウスおよび E-FABP ノックアウトマウスを塗布し、塗布１時間後に microruler（Mitsutoyo, Kasugai,Japan）を用いて耳介皮膚の厚さを測定した。

使用した。transepidermal water loss（TEWL）の測定は、

３evaporimeter（ServoMed, Stockholm, Sweden）を用いてマウス背部の剃毛した皮膚で施行した。表皮脂質バリアー除結果

野生型、ヘテロ型、E-FABP マウスの皮膚におけるサザン、去前後の WBF の相違を評価するために、アセトンを綿球

ノザン、ウェスタンブロットの結果を Fig.1b に示す。ヘテロ型でに浸して２分間皮膚に暴露し、暴露前と暴露後 30 分、２、４、は E-FABP ｍ RNA およびタンパクの発現は野生型に比べ12、36、48、96 時間後に測定を施行した。て 50％に減少していた。E-FABP マウス皮膚ではｍ RNA、タンパクの発現とも完全に消失していた（Fig. １）。

２. ５

E-FABP マウスは、肉眼的観察および皮膚を含めた各組脂肪酸成分測定

野生型および E-FABP マウスの背部皮膚をサンプリング

織に対する光顕的観察において明らかな発達異常を示さなし、クロロホルム・メタノール溶液にて脂質を抽出後、測かった。体重増加や生殖能にも大きな異常を認めなかった。

Fig. 1 (a) Intron/exon structure of murine E-FABP gene and representation of target construct. Homologies (bold lines) between targeting construct and genomic DNA, and the probe used for Southern blotting are indicated. (b) Southern blot of BamHI-digested
skin DNAs from each genotype mouse. Northern blot of total RNA (30ug) from skins probed with labeled mouse E-FABP cDNAor GAPDH (glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase) cDNA as a loading control. Western blot of skin lysates with anti-rat EFABP antibody. 10ug of protein from skins of each genotype mice were applied.

− 67 −

３. １ E-FABP マウスにおける表皮水バリアー機能の変化電子顕微鏡にて観察した。アセトン処理前の表皮顆粒層の電野生型および E-FABP マウスにおけるアセトン塗布

顕像は、野生型と比して E-FABP マウスとも大きな差異を前後の表皮水バリアー機能の時間的変化を Fig. ２に示す。

認めなかった。層板小体の構造、数、分泌像とも明らかな差

アセトン塗布以前では、E-FABP マウスの TEWL 値は野異は認めなかった。アセトン処理後の層板小体の分泌亢進生型に比して有意に低下していた。アセトン塗布後は、30も野生型との差異は認められなかった（data not shown）。

分、２、４、12、36、48 時間後の TEWL 値は有意な差異を認めないものの、36 時間後の TEWL 値は野生型ではほ３. ３脂肪酸成分分析ぼ前値に復しているのに対してノックアウトマウスでは回ガスクロマトグラフを用いた皮膚の脂肪酸測定結果を復の遅れが認められた。96 時間後には野生型、E-FABP

Table １に示す。各種脂肪酸の構成には野生型と E-FABP

マウスともほぼ塗布前の TEWL 値に復していた。

マウスの間に有意な差異を認めなかった。

３. ２ 超微形態像

３. ４

表皮ケラチノサイトの超微形態像をアセトン処理前後で炎症反応

脂肪酸およびその代謝産物であるエンコサノイドは、皮膚の炎症過程に深く関与することが示唆されている。E-FABP分子の炎症反応に対する関与を明らかにするために、野生型および E-FABP マウスの耳介におけるアラキドン酸誘発炎症反応の測定を施行した。耳介厚の測定結果は、野生型とE-FABP マウスの間に有意な差異を認めなかった（Table ２）。

３. ５ 心臓型 FABP（heart-type FABP: H-FABP）の発現増強
E-FABP マウスにおける他の FABP アイソフォームの代償的発現増強を評価するために、ノザンブロットを施行した。野生型では、E-FABP のみの発現が皮膚において認Fig. 2 Chronological changes of TEWL measured in the dorsal
skin of wild type and homozygous mice following acetone treatment. The time of acetone application is indicated by an arrow,the values at this point represent pretreatment levels. Closed
circles: homozygous mice, open squares: wild type mice. Statistical significance in a two-tailed Student's t test comparing

められた。
一方野生型では発現を示さない H-FABP 遺伝子は、ヘテロ型および E-FABP マウスの皮膚において発現増強を示すことが明らかとなった（Fig. ３）。

４

homozygous and wild type mice is indicated by *(P<0.05, n=6).
Table １

Table ２

考察

表皮の保湿や WBF については、角質細胞間の脂肪酸、Constituent fatty acid of mouse skin lipids

Tickness of the ear after arachidonic acid treatment
Fig. 3 Northern bolt analyses of E- and H-FABP in the skin of eachgenotype mouse. Note the increased expression of H-FABP in
the skin of heterozygous and homozygous mice of 0.7kb. As theinternal control, the expression of GAPDH mRNA is shown.

− 68 −

上皮型脂肪酸結合タンパク遺伝子欠損マウスにおける表皮水バリアー機能の変化

コレステロール、セラミドなどの脂質が重要な役割を担っ

proteins: their function and physiological significance.ていることは既に知られているものの、これらの代謝・輸Prog Lipid Res 35: 243- 282, 1996

送に関わる分子の生体レベルでの研究は、いまだ数少ない。

５）Coe NR, Bernlohr DA: Physiological properties andE-FABP はこれまでに、表皮 WBF 形成への関与のみなら

functions of intracellular fatty acid-binding proteins.
Biochim Biophys Acta 1391: 287-306, 1998

ず、乾癬をはじめとする炎症性疾患への関与も示唆されている 11）12）13）。E-FABP の細胞生物学的特性（種々の脂肪６）Owada Y, Yoshimoto T, Kondo H: Spatio-temporally

酸に対する結合能、脂肪酸の細胞内取り込み、脂肪酸を介

differential expression of genes for three members of

した情報伝達制御など）を考えると、我々が世界に先駆け

fatty acid binding proteins in developing and mature ratbrain. J Chem Neuroanat 12: 113-122, 1996て樹立した E-FABP ノックアウトマウスは、WBF 形成機
構の生体レベルでの解明のみならず、炎症や細胞の分裂・

７）Owada Y, Yoshimoto T, Kondo H: Increased expressionof the mRNA for brain- and skin-type but not heart-type

分化などの解明に大きな貢献をするものと思われる。
ノックアウトマウスではしばしば欠損蛋白の機能を、他fatty acid binding proteins following kainic acid systemicの構造類似蛋白がその機能を補完することが知られている。

administration in the hippocampal glia of adult rats. Mol

事実、既報の脂肪細胞型 FABP（A-FABP）ノックアウト

Brain Res 42: 156-160, 1996

マウスでは脂肪細胞において E-FABP の顕著な発現増強

８）Owada Y, Abdelwahab S, Suzuki R, Iwasa H, Sakagami。E-FABP ノックアウトマウスにおH, Spener F, Kondo H: Localization of epidermal-type

いても、皮膚、肝臓、腎臓などにおいて H-FABP の発現

fatty acid binding protein (E-FABP) in the alveolarが著明に増強していることが確認された（一部未発表デー

macrophages and some of the alveolar type II epithelialが観察されている

14）

cells in mouse lung. Histochem J 33: 453-457, 2002

タ）
。E-FABP と H-FABP は、FABP 分子ファミリーの中でも、蛋白構造や脂肪酸との結合能において高い類似性を

９）Owada Y, Suzuki R, Iwasa H, Spener F, Kondo H:有することが知られている 5）。E-FABP ノックアウトマウ

Localization of epidermal-type fatty acid binding protein

スは、発達期を通じて明らかな形態学的異常を示さなかっ(E-FABP) in the thymic epithelial cells of mice. Histochem
Cell Biol 117: 55-60, 2002

たが、この原因として H-FABP が E-FABP の機能を代償した可能性が示唆された。E-FABP の生体機能を解明する

10）Owada Y, Takano H, Yamanaka H, Kobayashi H,

ため、現在 E-H-FABP ダブルノックアウトマウスの表現

Sugitani Y, Tomioka Y, Suzuki I, Suzuki R, Terui T,

型解析を施行中である。

Mizugaki M, Tagami H, Noda T, Kondo H: Altered water

E-FABP ノックアウトマウスで観察された WBF の変化は、

barrier function in epidermal fatty acid binding protein

１）野生型に比べて basal TEWL が低値を示す。２）ア

deficient mice. J Invest Dermatol 118 : 430-435, 2002

セトン処理による表皮水分バリアーの破壊後に処理前値に11）Yamaguchi H, Yamamoto A, Watanabe R, Uchiyama

回復する時間が延長する。の２点である。これらの原因に

N, Fujii H, Ono T, Ito M: High transepidermal water loss

ついては、E-FABP ノックアウトマウス皮膚の脂肪酸含有

induces fatty acid synthesis and cutaneous fatty acid-率の測定結果や電子顕微鏡による超微形態観察からはそのbinding protein expression in rat skin. J Dermatol Sci 17:

原因を明らかにすることが出来なかった。詳細な脂質成分

205-213, 1998

解析（リン脂質、セラミド、コレステロールなど）あるい12）Masouye I, Saurat JH, Siegenthaler G: Epidermal fatty-

は初代培養ケラチノサイトを用いた脂肪酸の取り込み解析

acid-binding protein in psoriasis, basal and squamous cellなどを現在施行中である。

cartinomas: an immunohistochemical study. Dermatology
192: 208-213, 1996

（参考文献）

13）Siegenthaler G, Hotz R, Chatellard-Gruaz D, Didierjean
L, Hellman U, Saurat JH: Purification and characterization

１）Landmann L: The epidermal permeability barrier.

of the human epidermal fatty acid-binding protein:

Anat Embryol 178: 1-13, 1988

localization during epidermal cell differentiation in vivo２）Elias PM, Feingold KR: Lipid related barriers andand in vitro. Biochem J 302: 363-371, 1994

gradients in the epidermis. Endocrine, metabolic andimmunologic functions of keratinocytes. Ann NY Acad14）Hotamisligil GS, Johnson RS, Distel RJ, Ellis R,Papaioannou VE, Spiegelman BM: Uncoupling of obesity

Sci 548: 4-13, 1988
３）Feingold KR: The regulation and role of epidermal lipid

from insulin resistance through a targeted mutation inaP2, the adipocyte fatty acid binding protein. Science 274:

synthesis. Adv Lipid Res 24:57-82, 1991
４）Glatz JFC, van der Vusse GJ: Cellular fatty acid-binding− 69 −

1377-1379, 1996