生体適合性アパタイト粒子の結晶形態制御プロセスの確立とその応用
明治大学理工学部応用化学科

相 澤守

Hydroxyapatite（Ca10（PO4）（OH）
62 ; HAp）has been applied widely as a biomaterial for substituting human
hard tissues and as an adsorbent for chromatography.   The HAp crystal has two crystal planes with different
charges: positive on a-planes and negative on c-planes.   Thus, novel properties of the HAp may be producedby controlling the orientation of the crystal planes.   Controlled orientation may be achieved by modifying themorphology of HAp crystals.  For example, in order to increase the positive charge on the surface of the HApfibres, it is possible to grow hexagonal-shaped HAp fibres which are oriented along the c-axis so that the a(b)plane is wider than the c-plane.   It is expected that these apatite fibres have high specificity of adsorption toacidic proteins with negative charges.   One of the objectives of the present investigation was to establish thenovel process for the syntheses of the HAp crystals with well-controlled morphology.   We indicated the novel
syntheses process of plate-shaped HAp crystals using amorphous calcium phosphate (ACP) as a starting material.  
This process contains the control of growth direction of ACP to HAp by the absorption of amino acids, andthe accelerated crystal growth using an enzyme reaction of urea and urease.  In particular, in the case using a
glutamine acid as an amino acid, the plate-shaped HAp crystals were synthesized by hydrothermal treatment of
the HEPES buffer including the Ca2+ and PO43- ions, as well as urea and urease.の合成に成功している [2-4]。しかしながら、いまだ c 面を１．目的多く露出した板状アパタイトの合成には成功していない。

水酸アパタイト（Ca10（PO4）6（OH）
2；HAp）は生体硬組板状アパタイトの合成に関する報告には、結晶学的に板織を構成する無機成分と極めて近い化学組成をもち、これ状の形態をとりやすいリン酸水素カルシウムを前駆物質とを骨欠損部などにインプラントすると新生骨と直接結合すして、これを加水分解させて板状アパタイトを得る方法がるという優れた生体適合性を有する。このアパタイトは緻あるが、この手法で得られる板状アパタイトは多結晶体で密質や多孔質のセラミックスや顆粒などに加工されて整形あり壊れやすい。また、アルコール共存下での水熱法によ外科および口腔歯科領域において臨床応用されている。まり合成する方法も報告されているが、サブミクロンオーダた、アパタイトはタンパク質などの生理活性物質の吸着剤ーの微細なものしか得られない [5]。我々の知る限り、図１としても有用であり、吸着操作中にタンパク質の変性をほに示したような六角板状のアパタイト単結晶の合成に関すとんど起こさない吸着剤として知られている。

る報告はなく、もし本提案でこの板状アパタイトの合成にアパタイトは結晶学的には六方晶系に属する。そのモデル図を図１に記載する。このモデル図のように、アパタ成功すれば、世界で初めての合成例を示すことになると考えている。

[1]

イトには a 面と c 面という二つの結晶面がある 。一般的
2+に、a 面側は Ca が多く存在して正に帯電し、一方、c 面−3−

もし、この板状アパタイトの合成に成功すれば、上述したタンパク質吸着剤としての用途だけでなく、その形状をが存在するために負に帯電してい活用することによりコスメトロジー分野への応用が充分にる。この結晶面の電荷により、タンパク質が吸着すると考期待できる。例えば、板状粒子は表皮への接着性がよく（化えることができ、a 面には負電荷をもつ酸性タンパク質が、粧ののりがよい）、また屈折率を変化させるため、くすみc 面には塩基性タンパク質が特異的に吸着する。我々はこなどを薄く見せる効果が期待できる。さらに、もともと生れまでにアパタイトのタンパク質吸着の特異性を向上させ体適合性の高い物質を素材に用いているためにアレルギー側は主に OH と PO4るために、アパタイト結晶の形態制御法の確立を試み、a面を多く露出した構造をもつアパタイト単結晶ファイバー

繊維状アパタイト

Processing of biocompatible apatite
particles with well-controlled
morphology and its application

c面

Mamoru Aizawa

a面

Department of Applied chemistry,
Faculty of Science and Technology,
Meiji University− 16 −(-)

カルボキシル基を有するアミノ酸の吸着（グルタミン酸など）(+) (+) (+)(+) (+)(+) (-)(+)

図１

アミノ基を有するアミノ酸の吸着（リシンなど)(-) (-) (-) (-) (-) (-)(+)

板状アパタイト

アミノ酸共存下におけるHApの結晶成長（モデル）生体適合性アパタイト粒子の結晶形態制御プロセスの確立とその応用やアトピー性皮膚疾患をもつユーザーへの安心感も高いと

２．実験考えられる。

２．１ 非晶質リン酸カルシウムを出発物質とする板状アパタイトの合成とキャラクタリゼーション

そこで、本研究では、HAp の形態制御プロセスの確立を指向し、特に板状アパタイトの合成方法について２つのプロセスで検討した。具体的には、１）HAp と近い構

出発物質の非晶質リン酸カルシウム（ACP）は以下の造をもつ非晶質リン酸カルシウム（Amorphous calcium

よ う な 手 順 で 合 成 し た。 す な わ ち、0.75 mol･dm−3 Caphosphate; ACP）を出発物質とし、ACP とアミノ酸の官（NO3）2 水溶液（pH 10）50.0 ㎝3 に 0.25 mol･dm−3（NH4）能基とを相互作用させて、ACP から HAp への転化反応お2HPO4 水溶液（pH 10）87.7 ㎝3 を加え、氷冷下で 1 分間よびその結晶成長を制御することで HAp 粒子の形態制御撹拌した。生成した沈殿を固液分離した後、洗浄後、凍結を試みた。もうひとつのプロセスは、２）炭酸カルシウム乾燥して ACP 粉体を調製した。

（CaCO3）とオルトリン酸（H3PO4）との水溶液反応およ次に、合成した ACP 粉体を用いて板状アパタイトの合び尿素とウレアーゼとの酵素反応を併用し、板状のリン酸成を試みた。今回、適用したプロセスは、（i）ACP への水素カルシウム（dicalcium phosphate anhydrate: DCPA）

アミノ酸の吸着および（ii）HAp 合成バッファー中でのを経由して、その形態を維持したまま c 面を多く露出した

ACP からの HAp への転化および結晶成長からなる。そのHAp に転化させる合成方法である。

実験プロセスおよび実験条件をそれぞれ図２および表１にアミノ酸吸着用
バッファー

分散

アミノ酸の吸着(4 ℃, 1 day)

ACPスラリー
固形分 0.1%

ACP
HAp 結晶
精製水で洗浄後、アセトン置換により乾燥結晶成長
撹拌
1) 37℃, 7 days
2) 50℃, 7 days
3) 水熱処理 ; 120℃, 3 h

アミノ酸吸着用バッファー (pH 6.5)
・20 ｍmol・dm-3 HEPES
・アミノ酸
HAp合成用バッファー (pH 6.0)
・20.0 mmol・dm-3 HEPES
・6.58 mmol・dm-3 CaCl4・2.72 mmol・dm-3 NH4H2PO4・100 mmol・dm-3 尿素
・アミノ酸

図２
表１ACPスラリー
遠心分離したのち、上清を除く

HAp合成用バッファー
0.01 mass% ウレアーゼ（0.06 cm3 ）（HAp合成用バッファー10 cm3につき）
HEPES ;

2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piuperazinyl]ethanesulfonic acid]

ACPからのHAp合成プロセス

ACP へのアミノ酸の吸着および HAp の合成条件

ACPへのアミノ酸の吸着（20 mM HEPESバッファー使用）
添加アミノ酸 ** アミノ酸濃度mM

HApへの転化反応および結晶成長pH

吸着温度成分アミノ酸濃度
mM

合成条件

無添加
Glu
Lys

--50, 100, 200, 300
50, 100, 200, 300

6.5
6.5
6.5

4℃
4℃
4℃

*
*
*

50, 100
50, 100
50, 100

37 ℃, 7 day
37 ℃, 7 day
37 ℃, 7 day

無添加
Glu
Lys

--50, 100, 200 , 300
50, 100, 200 , 300

6.5
6.5
6.5

4℃
4℃
4℃

*
*
*

50 , 100
50 , 100
50 , 100

50 ℃, 7 day
50 ℃, 7 day
50 ℃, 7 day

無添加
Glu
Lys

--50, 100, 200 , 300
50, 100, 200 , 300

6.5
6.5
6.54℃
4℃
4℃

*
*
*50 , 100
50 , 100
50 , 100

120 ℃, 3 h120 ℃, 3 h120 ℃, 3 h*）20 mM HEPES + 6.58 mM CaCl2 + 2.72 mM NH4H2PO4 + 100 mM Urea（10 cm3）
，0.1％Urease（0.6 cm3）**）ここで、添加したアミノ酸はグルタミン酸ナトリウムおよびリシン塩酸塩の形で使用した。

− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006示す。ACP を所定濃度のアミノ酸を添加した HEPES バさせてアパタイトを合成した。なお、ウレアーゼは試料溶ッファーに分散させてスラリー（固形分 0.1 mass%）を調液中の尿素に対して 24h 以内に加水分解するように添加製し、４℃で１日静置した。アミノ酸は酸性アミノ酸としした。得られた粉体のキャラクタリゼーションは 2．1 節てグルタミン酸ナトリウム（Glu）、塩基性アミノ酸としと同様な方法で行なった。てリシン塩酸塩（Lys）を使用した。続いて、遠心分離によりアミノ酸を吸着させた ACP を固液分離し、それに所３．結果と考察定量の HAp 合成バッファー（アミノ酸 , Ca2+, PO43-, 尿素，間保持して HAp を合成した。また、水熱条件（120℃ , ３３．１ 非晶質リン酸カルシウムを出発物質とする板状アパタイトの合成とキャラクタリゼーションh）下でも同様に合成した。HAp 合成バッファー中の尿素

図３に HAp 合成の出発物質に用いた ACP の XRD 図をとウレアーゼは合成中に反応系の pH を増加させ、さらに示す。HAp の最大ピークである 31.7°近傍を中心としてウレアーゼを含む溶液）を加え、37℃および 50℃で７日2+3−バッファー中の Ca および PO4 が HAp 生成を促進させブロードな回折パターンが得られた。この粉体を TEM にる。

より観察したところ（図４）、粒径約 100 nm の微粒子の合成した ACP および HAp は粉末 X 線回折法（XRD）集合体であることが分かった。これらの粒子の制限視野および赤外吸収スペクトル法（FT − IR）により同定し、電子線回折（SAED）図形はハローパターンを示し、図３

それらの化学組成を高周波誘導結合プラズマ分析（ICP）の XRD の結果と併せてこれらの粒子が非晶質であることにより決定した。得られた粒子の形態は走査型電子顕微鏡が分かった。この粒子の化学組成を ICP 発光分析により（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）により観察した。

調べたところ、カルシウム含有量 33.46 mass% およびリン含有量 17.48 mass% であった。その Ca/P モル比は 1.48

２．２ 炭酸カルシウムとオルトリン酸との水溶液反応による板状アパタイトの合成とキャラクタリゼーション
本プロセスでは、炭酸カルシウム（CaCO3）とオルトリと計算され、約 1.5 と見積もりことができる。また、示差熱重量分析（DTA-TG）によりこの ACP 粉体の加熱変化を調べたところ、600℃までの加熱で加熱による重量減少は一定となり、その減少率は 14.6 mass％であった。

ン酸（H3PO4）との水溶液反応および尿素とウレアーゼとこれらの結果から、今回の実験で使用した ACP は Ca9の酵素反応を併用し、最初に板状リン酸水素カルシウムを（PO4）6・8. 8H2O と表記できる。伊藤らの報告によれば [6]、形成させ、その形態を維持したまま HAp に転化させて板非晶質リン酸カルシウム（ACP）の構造単位は組成式 Ca9状アパタイトの合成を試みた。

（PO4）6 で表せるクラスターであり、最近、ヒトの血漿の0.01, 0.05, 0.10 mol･dm−3 の炭酸カルシウムと沈殿剤で−3ある尿素を 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 mol･dm

無機イオン濃度と等しくした生体疑似体液（SBF）中でのを含むスラリー（1000

アパタイトの成長がこの ACP を成長単元とするクラスタ

3㎝ ）に、Ca/P 比が 1.67 となるようにオルトリン酸水溶液ー成長であることが明らかにされている。本研究で得られ（1000 ㎝3）を滴下した。1 時間攪拌後、硝酸を添加してている ACP もほぼ同様な化学組成であり、これを出発物pH を 3.00 に調整し、水溶液とした。その試料溶液にウレ質して用い、所定の Ca2+ イオンおよび PO43 − イオンを含アーゼを添加して 50℃で 24 時間加熱し、尿素を加水分解

む溶液中に懸濁し、結晶成長させることにより水酸アパタ
イトの結晶形態制御法の確立を試行した。
この ACP 粉体を出発原料として板状アパタイトの合成

図３

図４

ACPのXRDパターン− 18 −

ACPのTEM写真及びその電子線回折生体適合性アパタイト粒子の結晶形態制御プロセスの確立とその応用を行なった。まず、合成プロセスを確立するための予備的検討として、されるアミノ酸は同一のものである。
先に述べた ACP を用いて HAp の合成を試みたところ、

１）異なるバッファーを用いた HAp 合成

すべての実験条件において ACP は HAp に転化した。そ２）異なる pH 条件下での HAp 合成（pH 一定）の結晶性は合成温度が高くなるにつれて向上し、水熱条件

３）弱酸性からアルカリ性への pH のダイナミックな変化

下で最も結晶性の高い HAp が生成した。また、IR スペクを利用した合成

トルから、生成した HAp が炭酸イオンを含有しているこ

４）HAp 生成に必要な Ca および PO42+3−とが分かった。その炭酸イオンに帰属されるスペクトルのイオンの供給吸収は合成温度が低い方がより顕著であった。の４つの独立した実験を行なった。
こ れ ら の 知 見 を 総 括 す る と、 バ ッ フ ァ ー と し て は代表例として、アミノ酸として Glu を使用し、異なる温HEPES を 利 用 し、pH を ダ イ ナ ミ ッ ク に 変 化 さ せ な が度で合成した HAp の XRD パターンと SEM 写真を図５

ら Ca2+ および PO43 − イオンを供給することが ACP からに示す。XRD パターンでは、いずれも HAp に帰属されHAP への転化反応に有効であることが分かった。そこで、る回折線が見受けられるが、37℃および 50℃では結晶性

これらの知見をもとに次のプロセスを考案し、合成実験をが低く、120℃の水熱条件下では結晶性の比較的高い HAp行なった。

が得られた。特に、酸性アミノ酸である Glu を用いて合成

本合成プロセスは、（i）ACP へのアミノ酸の吸着およした場合には HAp の（002）面（２θ=25.8°）が比較的高び（ii）HAp 合成バッファー中での ACP からの HAp へい強度で検出された。SEM 観察では、得られた粉体は板の転化および結晶成長からなる。その実験プロセスおよび状粒子から構成されて、合成温度の増加とともにその粒径実験条件は既にそれぞれ図 2 および表 1 に示している。なも増大することが分かった。XRD の結果と併せて考える

お、（i）で吸着させたアミノ酸と（ii）の結晶成長で使用と、板状の平面が HAp の c 面に対応している可能性がある。

図５ HApの形態に及ぼす合成温度の影響*アミノ酸（Glu）共存下での合成：１）アミノ酸吸着バッファー：200 mM
２）HAp合成バッファー：50 mM− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

次に、50℃および水熱条件下で合成した HAp の粒子形態を図６に示す。これらの SEM 写真は表１の Bold で示

３．２ 炭酸カルシウムとオルトリン酸との水溶液反応による板状アパタイトの合成とキャラクタリゼーした実験条件に対応している。合成温度を 50℃とし、アション

ミノ酸無添加で合成した場合は粒状、酸性アミノ酸（Glu）

3．1 節のプロセスでアパタイトの板状化には成功したおよび塩基性アミノ酸（Lys）を添加して合成した場合はが、目的とするアパタイトの配向性（c 面が多く露出したいずれも板状結晶が生成した。カルボキシル基を多くもつ表面構造）という観点ではいまだ課題を残していた。そこ

Glu を添加した方がアミノ基を多くもつ Lys を添加した場

で、別のアプローチにより c 面が多く露出した板状アパタ合よりも板状粒子が生成しやすい傾向が認められた。

イトの合成を試みた。具体的には、１）炭酸カルシウムとこれらの結果より、アミノ酸共存下で ACP から HAp

オルトリン酸との水溶液反応および２）尿素とウレアーゼへの添加反応および結晶成長を行なうと板状粒子が生成すとの酵素反応を併用して板状アパタイトを合成するというることが見いだされた。また、結晶成長を水熱条件下で行試みである。

なうと 50℃の場合よりも結晶性の高いより大きな HAp 結

今回の報告では、炭酸カルシウムとオルトリン酸との水晶が得られることが分かった。逆に、37℃で合成した場合溶液反応に限定しているが、この出発原料の組み合わせはには 50℃や水熱条件に比べて微細な HAp 結晶が生成した。

他の種類のカルシウム原料とリン酸塩原料との組み合わせ

アミノ酸共存下での HAp 合成により板状粒子が生成しを実際に試した実験結果に基づいて決定したものである。

た理由として、HAp を構成する ACP クラスターは HAp

まず、炭酸カルシウムとオルトリン酸の各出発原料の濃と類似した構造をであり、その負に帯電した c 面とアミノ度および尿素濃度をパラメータとして変動させ、トータル酸のアミノ基が相互作用して c 面方向の結晶成長速度が遅24 種類の実験を行なった。Ca2+ および PO43 − の濃度をあくなるため、板状粒子が生成したものと考えられる。また、

げると pH が上昇しにくくなるためリン酸水素カルシウム

アミノ酸のカルボキシル基は溶液中の Ca2+ とキレート化（DCPD）が多く存在し、尿素濃度が高い場合にのみ HApして、ACP クラスターの a 面と相互作用しにくくなるたと リ ン 酸 八 カ ル シ ウ ム（Octacalcium phosphate: OCP）

め、a 面方向への特異的な結晶成長が起こらなかったものが生成した。
特 に、0.01 mol･dm−3 CaCO3 ，0.006 mol･dm−3 H3PO4と思われる。の場合、いずれの尿素濃度でも HAp と OCP との混合相となり、0.5 mol･dm−3 尿素のときは配向性が見られず、特に 1.0−2.0 mol･dm−3 尿素のとき c 面に相当する（002）（004），面の回折強度が特異的に高い HAp が生成した（図 7（a））。

図６

HApの形態に及ぼすアミノ酸添加の影響

図７ 酵素反応を利用して合成したHAp粉体のXRD図
出発物質：0.01mol・dm−3 CaCO3，0.006 mol・dm−3 CH3PO4
1.50 mol・dm−3（NH2）
2CO，HNO3によりpH３に調整（a）合成粉体（50℃，24 h）（b）（a）
を120℃，24 h水熱処理した粉体− 20 −

生体適合性アパタイト粒子の結晶形態制御プロセスの確立とその応用

図８ c 面を多く露出したHAp粉体のSEM写真
出発物質：0.01mol・dm−3 CaCO3，0.006 mol・dm−3 CH3PO4
1.50 mol・dm−3（NH2）
2CO，HNO3によりpH３に調整（a）合成粉体（50℃，24 h）（b）（a）
を120℃，24 h水熱処理した粉体

また、この粉体の粒子形態を図８（a）に記載したが、板処理することにより板状のアパタイトを合成できることが状の形態をしていることが観察された。この表面に多く露分かった。
また、１）炭酸カルシウムとオルトリン酸との水溶液反出している面が HAp の c 面に相当すると思われる。
この配向性の原因は出発原料の CaCO3 の緩衝能によ応および２）尿素とウレアーゼとの酵素反応を併用し、板り 尿 素 の 加 水 分 解 に よ る pH の 上 昇 が 緩 や か に 起 こ り、状アパタイトの合成を試みたところ、前述の方法よりも高DCPD から OCP そして HAp へと DCPD の形態を維持しい配向性を維持した板状アパタイトが生成することが分かたまま加水分解が進行したためと考えられる。

った。

さらに、この配向性の高い HAp と OCP との混合粉体

アパタイトは生体適合性が高く、しかも板状の粒子形態を 120℃ , 24 h で水熱処理した結果を図７（b）および図はコスメトロジー分野への応用が大いに期待できる。例え８（b）に示す。図７（a）の XRD 図から、水熱処理後にば、板状粒子は表皮への接着性がよいと考えられ、また屈OCP はすべて HAp に転化していること、および（002）

折率を変化させるため、くすみなどを薄く見せる効果が期面に対応する反射が比較的強く検出されていることが分か待できる。さらに、アパタイトはあらゆる素材のなかで最る。この結果は水熱処理後も目的とする c 面を多く露出しも生体適合性の高い物質のひとつであるため、アレルギーたアパタイトが合成できていることを示している。また、やアトピー性皮膚疾患をもつユーザーへの適用も可能であ

図 8（b）の SEM 写真からも板状の形態が水熱処理後でもろう。今後は産学連携も視野に入れながら、この新素材の維持されていることが確認できる。

コスメトロジー分野への応用を検討していきたい。

したがって、本プロセスは ACP を出発物質とする方法よりもアパタイトの配向性を制御可能な方法として有望で（引用文献）あり、今後、大量合成の方法を構築することにより従来の１）T. Kawasaki, J. Chromatogr., 544, 147（1991）．

アパタイトとは異なる新しい機能を持った「生体適合性粒２）M. Aizawa, A. E. Porter, S. M. Best and W. Bonfield,Biomaterials, 26, 3427–3433（2005）．

子」の創出が可能となると考えられる。

３）M. Aizawa, F. S. Howell, K. Itatani, Y. Yokogawa, K.
Nishizawa, M. Toriyama and T. Kameyama, J. Ceram.

４．総括Soc. Jpn., 108, 249–253（2000）．

アパタイトの形態制御プロセスの確立を指向して２つのプロセスにより板状アパタイトの合成を試みた。まず、

４）相澤守 , 木下真喜雄 , 山田耕二 , 板谷清司 , 岸岡昭 , 無機マテリアル , 5, 387–397（1998）．

ACP を出発物質として、アミノ酸の吸着による成長方向

５）F. Nagata, Y. Yokogawa, M. Toriyama, Y. Kawamoto,の制御と尿素とウレアーゼの酵素反応を利用した新規な板T. Suzuki and K. Nishizawa, J. Ceram. Soc. Jpn., 103,状アパタイトの合成プロセスを提案した。特に、アミノ酸としてグルタミン酸（Glu）を利用し、ACP に Glu を吸着させた後、それを尿素およびウレアーゼとともに Ca2+ お
よび PO4

3−

70–73（1995）．
６）伊藤敦夫 , 小沼一雄 , 立石哲也 , 日本結晶成長学会誌 ,25, A134（1998）．

を含む HEPES バッファーに懸濁させて、水熱− 21 −