栄養障害型表皮水疱症の原因遺伝子であるⅦ型コラーゲンの分泌メカニズムの解析
東京大学大学院薬学系研究科生理化学教室

齋 藤康 太Collagen is synthesized in the endoplasmic reticulum (ER) and secreted to the cell surface via secretory pathway.
Collagen is too big to fit into conventional secretory vesicles and the mechanism of collagen exit from the ER has not been
elucidated. We have recently identified cTAGE5, a protein localized at the ER exit site, and revealed that it is specificallyrequired for collagen export from the ER. Furthermore, cTAGE5 directly interacts with TANGO1, therefore, we suggest thatcTAGE5/TANGO1 complex form a collagen receptor complex within the ER.

１緒

一般に現在までに知られている積み荷受容体は、積み荷言と結合し、共に COPII 被覆小胞に取り込まれ出芽するこ小胞体（Endoplasmic Reticulum；ER）において合成さとで小胞体からの輸送を制御する。一方で、TANGO1 はれたタンパク質は、輸送小胞に積み込まれゴルジ体を経て出芽することなく、小胞体に留まったままで機能すること細胞内の様々な小器官へと運ばれる。この小胞輸送系に着から、TANGO1 は既存の積み荷受容体とは異なったメカ目した研究は、出芽酵母を用いた分泌阻害因子の網羅的なニズムで機能している可能性が考えられた。

スクリーニングにより数多くの変異体が単離されたことにコラーゲンはその形成する複合体が巨大であり（Ⅶ型コよって飛躍的に進展し、現在までに数多くの構成因子が明ラーゲンの場合は 400−500nm）、通常の COPII 被覆小胞（直らかとなっている。一方で高等真核生物の小胞輸送系は、径 60−90nm）には入りきらないと考えられている。しかし、出芽酵母に比べ分泌するタンパク質が多様であることを反その分泌の分子メカニズムは解明されていない。そこで、映して、更に多くの制御因子が存在することが考えられる。

申請者は TANGO1 の制御機構を理解することで、コラー

申請者は以前、ショウジョウバエ S2 細胞において分泌ゲン分子分泌の分子機構に迫ることができると考えた。

変異体を単離するため、dsRNA 法を用いた網羅的 RNAi

また、Ⅶ型コラーゲンは栄養障害型表皮水疱症（DEB）スクリーニングを行なった。その結果、出芽酵母では保存の原因遺伝子である。DEB は難治性疾患に登録されておされておらず、高等真核生物においてのみ存在する遺伝子り、未だに根本的治療法は確立されていない。Ⅶ型コラーとして TANGO1 を単離、同定した（Nature, 2006）。

ゲンが小胞体に蓄積し、分泌が阻害されることで、本疾患

TANGO1 は小胞体における COPII 被覆小胞出芽ドメイに罹患する患者の存在も知られていることから、本研究はンである ER exit site に特異的に局在し、小胞体内腔に配細胞生物学的知見のみならず、疾患生物学的貢献も期待さ向する SH3 ドメインでⅦ型コラーゲンと、細胞質中に配れる。

向するプロリンリッチ領域で COPII 被覆の複合体構成因２子の一部である Sec23/24 と結合することが明らかとなっ実験た。さらに、TANGO1 を発現抑制した細胞においては、TANGO1 と同様のドメイン構造を有するタンパク質をⅦ型コラーゲンが小胞体に蓄積し、その分泌が抑制されるデータベースから探索し、cTAGE5 を同定した。そこでことを見出した。また、この分泌阻害効果は、Ⅶ型コラー遺伝子のクローニング、抗体の作製を行ない、細胞内局在ゲンに特異的であり、その他の多くのタンパク質の分泌にをはじめ、細胞内動態の解析を行なった。

は 大 き な 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た。 以 上 の 結 果 か ら、さらに cTAGE5 の各種欠失変異体をリコンビナントタ

TANGO1 はⅦ型コラーゲンに対する積み荷受容体としてンパク質として大腸菌より精製し、生化学的解析を行なう機能する可能性が示唆された（Cell, 2009）。

ことで結合様式の同定をはかった。また、RNAi 法による発現抑制系を用いることにより、遺伝子の細胞内におけるThe mechanism of collagenⅦ secretion;
Understanding the etiology of dystrophic
epidermolysis bullosa（DEB）
Kota Saito
Department of Physiological Chemistry,
Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
University of Tokyo

機能同定を試みた。

2. 1

抗体の作製

抗原部位のペプチドおよび GST- fusion タンパク質を精製し、ウサギに免疫することにより作製した。作製した抗血清はそれぞれ、ペプチド及びタンパク質カラムによりア− 62 −

栄養障害型表皮水疱症の原因遺伝子であるⅦ型コラーゲンの分泌メカニズムの解析

フィニティー精製後、実験に用いた。

2. 2細胞培養及びトランスフェクション

HeLa 細胞を始め、各種培養細胞は DMEM, 10%FCS で37℃、5%CO2 で培養した。
トランスフェクションはLipofectamine2000（Invitrogen）を常法通りに用いた。また siRNA の導入には Lipofectamine RNAimax（invitrogen）を用いた。

2. 3結合因子の探索

HeLa 細胞を20 mM Tris-HCl（pH7.4）, 100mM NaCl, 1mM
EDTA, １%Triton X-100 及びプロテアーゼ阻害剤を含む溶液で可溶化し、65000 rpm 30 min 超遠心した。遠心後の上清にプロテイン A ビーズに結合させた抗体を添加し、免疫沈降した。その後、ビーズを TBS/0.1% Triton X-100 で洗浄後、サンプルバッファーを加えボイルし、SDS-PAGEにより分離した。

３
3. 1

結果

クローニング

データベース検索により、TANGO1 と同様のドメイン構造を有するタンパク質として cTAGE5 を単離した。この因子は、SH3 ドメインを有していないが、TANGO1 のC 末端側の配列と相同性を有し、コイルドコイルドメイン及びプロリンリッチ領域を有していた。

3. 2

図１ cTAGE5 と TANGO1 は結合する MBC : 22:2301
Protein A ビーズにそれぞれ 1.cTAGE5 抗体 2.HeLa lysate
3. cTAGE5 抗体 + HeLa lysate を添加し免疫沈降した局在の観察

cTAGE5 に対する抗体を作製し、内在性タンパク質の3. 4結合ドメインの同定局在を検討したところ、ER exit site のマーカーである

TANGO1 と cTAGE5 の結合ドメインを調べる目的で、

Sec31A と共局在した。また、ERGIC53 との局在を比較し各 種 欠 失 変 異 体 ど う し の 結 合 実 験 を 行 な っ た と こ ろ、た結果、一部で共に局在する様子が観察された。一方、

TANGO1 と cTAGE5 の 結 合 は、 細 胞 質 中 に 存 在 す る

COPI 被覆複合体の構成因子の一つである b-COP との共染

coiled-coil ドメインを介していることが示された。

色においては局在の一致は観察されなかった。以上の実験結果より、cTAGE5 は ER exit site に局在して機能してい3. 5る可能性が考えられた。

結合因子の同定

また cTAGE5 は TANGO1 と同様に、C 末端にプロリンリッチドメインを有している。TANGO1 はプロリンリッ

3. 3

cTAGE5 結合因子の探索

チドメインを介して Sec23/24 と結合することが認められ

次に、cTAGE5 に結合するタンパク質を探索する目的ていることから、cTAGE5 についても同様の検討を行っで、抗体を用いた免疫沈降画分中の共沈降物の有無を検討た。Yeast two hybrid 法を用いた解析の結果、cTAGE5した。

も同様に COPII 被覆複合体の構成因子である Sec23/24 とHeLa 細胞から抗体を用いて内在性タンパク質を免疫沈結合する事が明らかとなった。

降し、共沈降画分を銀染色法により検出した。その結果、cTAGE5 に相当する 110kDa のシグナルに加え約 250kDa

3. 6

コラーゲン分泌に対する影響のシグナルが銀染色により認められた。ウエスタンブロッ

最後に cTAGE5 の分泌に対する影響をノックダウン法

ト 法 に よ る 解 析 の 結 果、250kDa 付 近 の シ グ ナ ル はによって検討した。その結果、ノックダウンは多くのタンTANGO1 で あ る こ と が 判 明 し た。 よ っ て cTAGE5 にパク質の分泌には影響を与えないのに対し、TANGO1 とTANGO1 が特異的に結合することが明らかになった。

同様にⅦ型コラーゲンの分泌を顕著に阻害することが明らかとなった。

− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

図２ ノックダウン時のⅦ型コラーゲンの小胞体蓄積量ノックダウンにより、有意にⅦ型コラーゲンが小胞体に蓄積した。 MBC : 22 : 2301

図 3 TANGO1, 新規因子の協調によるⅦ型コラーゲン詰め込みモデル MBC : 22 : 2301

４

考察５

総括

以上のように、今回単離した新規因子 cTAGE5 は ER

本研究により、コラーゲン分子の積み荷受容体として新exit site に局在し、TANGO1 と特異的に結合することがたに TANGO1 と cTAGE5 が協調的に作用することが見出明らかとなった。さらに、cTAGE5 のノックダウンは、された。

TANGO1 のノックダウンと同様にⅦ型コラーゲンの分泌現在のコスメトロジーにおいては、コラーゲンは化粧品を 特 異 的 に 抑 制 し た。 以 上 の 結 果 か ら、 申 請 者 は、の構成要素として注目されている。本研究をさらに発展さ

cTAGE5 が TANGO1 と協調して小胞体からのⅦ型コラーせ、コラーゲン分子の分泌機構を明らかにすることができゲンの分泌を特異的に制御していると考える（図 3 参照）。

れば、コラーゲン分泌を制御することが可能になると考え

cTAGE5 は、小胞体内腔側にはほとんど配向しておらず、る。これにより、内在するコラーゲンの分泌を促進するよ

Ⅶ型コラーゲンとの結合は主に TANGO1 によって担われうな化粧品あるいは薬剤の作成に将来的に寄与できると考ていることが考えられる。つまり、cTAGE5 は TANGO1える。の補助因子あるいは制御因子として働く可能性が考えられ謝る。
今後、どのような分子メカニズムによって、TANGO1と cTAGE5 が協調的にⅦ型コラーゲンの分泌を担ってい辞本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりご援助賜りましたことを深く感謝申し上げます。

るのかを解明していくことが課題である。

− 64 −栄養障害型表皮水疱症の原因遺伝子であるⅦ型コラーゲンの分泌メカニズムの解析（発表論文、参考文献）

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Guizzunti, Yue Hu, Franz Wendler, Ramanuj(1Contributed equally).

DasGupta, Norbert Perrimon and Vivek Malhotra４）Shinya Takahashi, Kyoko Sakurai, Arisa Ebihara,(2006) Functional genomics reveals novel componentsHiroaki Kajiho, Kota Saito, Kenji Kontani, Hiroshi

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Nishina, and Toshiaki Katada (2011) RhoA activation

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２）Kota Saito, Mei Chen, Fred Bard, Shenghong Chen,Res. Apr;39(8):3446-57.

Huilin Zhou, David Woodley, Roman Polischuk, Randy
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cargo loading at Endoplasmic Reticulum exit sites. Cell,Erlmann, Kenji Kontani, Vivek Malhotra and Toshiaki

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Katada (2011) cTAGE5 mediates collagen secretion

３）Yoko Nagai1, Yoichi Asaoka1, Misako Namae,Kota Saito, Haruka Momose, Hiroshi Mitani, Makoto
Furutani-Seiki, Toshiaki Katada and Hiroshi− 65 −

through interaction with TANGO1 at endoplasmic
reticulum exit sites. Mol Biol Cell Jul 1;22(13):2301-8