X 線結晶構造解析に基づくチロシナーゼの成熟化および反応機構の解明
安田女子大学薬学部薬学科

的場康幸

Tyrosinase (Ty) and catechol oxidase (CO) are members of type-3 copper enzymes. While Ty catalyzes both phenolase
and catecholase reactions, CO catalyzes only the latter reaction. In the present study, Ty was found to catalyze thecatecholase reaction, but hardly the phenolase reaction in the presence of the metallochaperon called “caddie protein (Cad)”.
The ability of the substrates to dissociate the motif shielding the active-site pocket seems to contribute critically to thesubstrate specificity of Ty. In addition, a mutation at the N191 residue, which forms a hydrogen bond with a water molecule
near the active center, decreased the inherent ratio of phenolase versus catecholase activity. Unlike the wild-type complex,
reaction intermediates were not observed when the catalytic reaction toward the Y98 residue of Cad was progressed in
the crystalline state. The increased basicity of the water molecule may be necessary to inhibit the proton transfer from theconjugate acid to a hydroxide ion bridging the two copper ions. The deprotonation of the substrate hydroxyl by the bridging
hydroxide seems to be significant for the efficient catalytic cycle of the phenolase reaction.

１．緒の銅イオンが酸化されているものの、分子状酸素とは結合言していない構造を指す。Ty のフェノラーゼ活性はオキシ

メラニン色素生成に関わる酵素としてチロシナーゼ型酵素によって触媒されるが、カテコラーゼ活性はオキシ（Ty）が知られている。本酵素は、アミノ酸の一種である型でもメト型でも触媒される。オキシ型酵素がフェノラー

チロシンをメラニン前駆物質であるドーパキノンへと変換ゼ活性を触媒すると、デオキシ型に変換され、次の触媒サする反応を触媒する。この反応は皮膚や毛髪のメラニン色イクルに向かう。一方、オキシ型酵素がカテコラーゼ活性素合成に関わっており、皮膚で過剰にメラニンが生成するを触媒するとメト型に変換され、メト型酵素がカテコラーとシミやソバカスの原因となる。このため、Ty 活性を阻ゼ活性を触媒すると、デオキシ型に変換される。このため、害すれば、メラニン色素の生成を抑制できる。Ty は、そTy と CO の酵素学的違いとは、オキシ型酵素がフェノラの活性中心に 2 個の銅イオンを含むⅢ型銅結合酵素であーゼ活性を持つかどうかという点に集約できる。

り、ヒトから細菌に至るまで広く分布している。また、本研究対象としている放線菌由来 Ty は、特異的な銅輸送酵素の活性中心部位を含む約 250 アミノ酸からなる領域は、タンパク質（Cad）との複合体として産生される。この複合生物種を超えてアミノ酸配列上での相同性が認められる。

体に銅イオンを添加すると、Ty の活性中心に銅イオンがTy は、チロシンやチラミンをはじめとするフェノール基取り込まれ、Ty は活性型に変化する。その一方で、Cad質、および、ドーパやドーパミンをはじめとするカテコーは複合体から解離し、解離した Cad は重合して凝集体をル基質に作用し、両者をオルトキノンに変換する。それぞ形成する。Ty・Cad 複合体の結晶構造（図 1）においては、れの酵素活性をフェノラーゼおよびカテコラーゼ活性という。一方、Ty と同じⅢ型銅結合酵素であるカテコールオキシダーゼ（CO）は、フェノールを基質とすることができず、カテコラーゼ活性のみ有する。
Ⅲ型銅結合酵素の活性中心は、デオキシ型、オキシ型、メト型という 3 つの構造をとる。デオキシ型では活性中心にある 2 つの銅イオンが還元されており、分子状酸素と結合してオキシ型を生じる。メト型は、活性中心にある 2 つElucidation of maturation and catalytic
mechanisms of tyrosinase based on the
crystal structure
Yasuyuki Matoba
Faculty of Pharmacy, Yasuda WomenʼsUniversity− 147 −

図 1 Ty・Cad 複合体の結晶構造
Ty をオレンジで、Cad をシアンで示している。

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

Cad の Y 98 残基が、Ty の活性中心にフタをするように位置している 1）。筆者は、Cad の Y 98 残基が Ty の触媒作用により、ドーパキノンへと変換されることを発見した 2）。
また、Y 98 残基に対する酸化反応を時間分割 X 線結晶構造解析で観察することにより、触媒機構を予測することに成功した 3）。一方、海外グループの研究により、活性中心近傍に存在するシールドモチーフや水分子が Ty のフェノラーゼ活性に重要であると指摘されている 4）。
本研究では、放線菌由来 Ty を研究対象とし、その成熟化機構と反応機構を構造学的に明らかにすることを試みる。
得られた知見は、より高等な生物の持つ Ty においても共

図 2 Ty・Cad 複合体における Ty の活性中心の構造
Ty をオレンジで、Cad をシアンで示している。

通していることが予想され、ヒトの Ty を対象にした効果的な阻害剤開発に役立つと考えられる。

２．方法

3．結

本研究では、活性中心近傍に存在する水分子 Wat4 に着果目した（図 2）。放線菌 Ty において、この水分子は E 182 とCad と 結 合 し て い な い 野 生 型 Ty は 調 製 で き た が、N 191 残基の側鎖と水素結合している。各種Ⅲ型銅結合酵素

N 191 G 変異型 Ty は調製できなかった。そこで、Cad と複のアミノ酸配列を比較すると、放線菌 Ty の E 182 に対応す合体を形成している野生型もしくは N 191 G 変異型 Ty に、る残基はグルタミン酸であり、高度に保存されている。一方、

0 . 1 mM CuSO 4 と 1 mM NH 2 OH を添加し、30 ℃で 5 分間

N 191 に対応する残基は、Ty では保存されている場合が多放置することで、Ty を活性化した。その後、種々の濃度いが、CO ではグリシンになっている場合が多い。そこでの基質を加え、470 nm の吸光度の増加を経時的に測定した。

N191 残基をグリシンに置換した N 191G 変異体を作成した。

なお、フェノール基質としてチラミン、カテコール基質とこの変異体の酵素活性を調査するとともに、その X 線結晶してドーパミンを用いた。得られたカイネティクスパラメ構造解析を実施した。なお、本研究で使用した NH 2 OH は、ーターを表 1 に示す。

酵素に結合した銅イオンを還元する作用を持つため、分子野生型複合体および N 191 G 変異型複合体の結晶を作成

状酸素存在下で NH 2 OH を加えると、オキシ型酵素を生じし、1 mM CuSO 4 と 10 mM NH 2 OH を含む溶液中で 24 時させることができる。

間ソーキングした後に回折強度を測定し、その結晶構造を決定した。その結果、両複合体で Y 98 残基に対する反応が

表 1 Ty のカイネティクスパラメーター− 148 −

X 線結晶構造解析に基づくチロシナーゼの成熟化および反応機構の解明

図 3 Ty・Cad 複合体における Y98、CuA および CuB の電子密度（A）は野生型、（B）は N191G 変異型のものを示している。Ty をオレンジで、Cad をシアンで示している。

進行していることが観察された（図 3）。しかしながら、野と近づく。一方、デオキシ 2 型においては、CuA は元の位生型複合体では、Cu（II）結合型ドーパセミキノンを含む中置に戻る。ただし、触媒サイクルで酸素分子と結合する間体と、架橋部位に水酸化物イオンを持つデオキシ中間体

デオキシ型では 2 つの銅イオン間の架橋分子が水であるの（デオキシ 2 型）の存在が示唆されたが、N 191 G 変異型複合に対し、デオキシ 2 型では水酸化物イオンであり、CuA と体ではこれらの中間体が見いだされなかった。

CuB の間の距離が短くなる。

4．考

Ty のモデル錯体を利用した研究から、Ty のフェノラー察

ゼ活性は、基質のフェノール性水酸基が脱プロトン化してCad と結合していない野生型 Ty を用いたときと比べ、いるときに効率よく触媒されることが示されている 5）。今Cad が存在すると Ty のカテコラーゼ活性およびフェノラ回、フェノラーゼ活性が低い N 191 G 変異体では、Cu（II）ーゼ活性は減少した（表 1）。ただし、フェノラーゼ活性の結合型ドーパセミキノンとデオキシ 2 型中間体が見られな減少の方が顕著である。一方、ドーパミンを共存させると、かった。このことは、Ty のフェノラーゼ活性が効率よく

Cad 存在下における野生型 Ty のフェノラーゼ活性が増加回転するためには、架橋位置に水酸化物イオンが存在するした。Cad は Ty に銅を輸送するだけでなく、活性中心をデオキシ 2 型中間体の生成が必要であり、この中間体の水シールドする役割を持つと考えられる。すなわち、本実験酸化物イオンが、次のフェノール基質を脱プロトン化する

結果は、フェノールに比べカテコールの方が、活性中心近のではないかと示唆される。野生型 Ty において、Wat 4

傍にあるシールド部分を引きはがす能力が高いことを示唆

は E 182 と N 191 残基と相互作用し安定化されるとともに、している。またこのことは、Ty の成熟化の最終段階にお塩基性が高くなっている。また、フェノラーゼ活性の触媒いて、カテコール基質が基質結合ポケットに侵入し、シーサイクルで水素イオンが生じる。これらのことを合わせルド部分を取り除く作用を持つこと、および、シールド部て考えると、野生型では Wat 4 の部位で酵素反応中に生じ分の存在が酵素の見かけ上の基質特異性に影響を及ぼすこた水素イオンが保持され、架橋部位が水分子に変換されるとを示している。一方、N 191 G 変異型 Ty はカテコラーゼのを妨げていると推測される。一方、N 191 G 変異体では活性を有していたものの、ドーパミン添加の有無に関わらWat 4 の位置で水素イオンを保持できず、デオキシ 2 型がず、フェノラーゼ活性が極めて低かった。このことは、シ速やかに消失し、効率的な触媒サイクルを維持できないのールド部分だけでなく、活性中心近傍における水分子の安ではないかと考えられる。

定性・塩基性も、基質特異性に影響を及ぼしていることを

５．総示唆する。

括

筆者らが行った Cad の Y 98 残基に対する時間分割 X 線

本研究を通じて、カテコール化合物が Ty の成熟化を促

結晶構造解析 3）から、Ty のフェノラーゼ活性においては、進していること、および、活性中心近傍の水分子の安定性・オキシ型酵素による酸素添加反応後に Cu（II）結合型ドー塩基性により、Ty のフェノラーゼ活性が制御されているパセミキノンが生じる。その後、電子移動を伴って、デオことが明らかとなった 6）。これらの知見は美白用化粧品のキシ 2 型とドーパキノンへと変換されることが示唆された。

開発に役立つものと考えられる。

Cu（II）結合型ドーパセミキノンの生成時には、2 つの銅イオンのうち CuA が大きく位置を変え、基質の水酸基の方へ− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

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