脂質分子集合体の活性酸素種分解機能の解明による新規な抗酸化系の構築
山口大学工学部応用化学工学科

吉本誠

The structure and function of phospholipids are modified in the presence of reactive oxygen species（ROS）
such as hydrogen peroxide. An excess amount of the ROS is known to be decomposed enzymatically with catalase.
To our knowledge, little is known on the role of phospholipid molecules in decomposing the ROS in the absenceof the enzyme. In the present work, the decomposition of hydrogen peroxide at the initial concentration of 1.0 mM
was examined at pH 7.4 in the presence of the various molecular assemblies of phospholipids. Phospholipids usedwere various phosphatidylcholines（PC）which were different in the number of carbon atoms in the acyl chains n as
well as the degree of unsaturation. The saturated PCs（n < 10）forming monomers and micelles slightly enhanced
the decomposition of hydrogen peroxide. In marked contrast, the PCs forming liposomes（10 n）significantlyenhanced the decomposition reaction with neither lipid peroxidation nor change in the size of liposomes. Therefore,
the liposomes were suggested to undergo negligible physicochemical modifications in the presence of hydrogenperoxide. The steady-state fluorescence polarization of the probes incorporated in the liposome membranes wasmeasured to clarify an effect of hydrogen peroxide on the fluidity of liposome membranes. The fluidity of thelipid-water interface in the liposomes was decreased by the presence of hydrogen peroxide. On the other hand,practically no effect of hydrogen peroxide was seen on the fluidity of the hydrophobic region in the membrane.
These results obtained indicated that the liposome-mediated decomposition of hydrogen peroxide proceeded at thelipid-water interface of liposomes. In conclusion, it was revealed that the phospholipid bilayer membranes forming
liposomes functioned as a novel antioxidant system which effectively decomposed hydrogen peroxide.

１．緒

活性酸素による不飽和脂質分子の過酸化反応については豊言

富な知見が蓄積されている。一方、脂質分子が活性酸素の過酸化水素をはじめとする活性酸素種は、生体内におい安定性にどのように影響するのかについては不明な点が多て種々の機能を制御する因子として重要である１）。一方、

い。脂質の共存下における活性酸素の安定性を明らかにす

過剰に生成蓄積した活性酸素は、脂質膜の過酸化を引き起ることは、活性酸素に対する脂質膜の自己防御機能を解明

２）

こして疾病の原因となる 。生体内では過酸化水素は通常して脂質膜を利用した新規な抗酸化系を構築する観点からカタラーゼ等の酵素により効率よく分解除去されている。

重要であると考えられる。
本研究では、種々の疎水鎖長、不飽和度を有するホスフ

一方、脂質膜自体が活性酸素に対して発現すると考えられァチジルコリンを用いてリン脂質モノマー、ミセル溶液及る自己防御的な機能は殆ど知られていない。
著者らは、リポソーム内に封入されたグルコースオキシびリポソーム懸濁液を調製し、それらの脂質分子集合体がダーゼによるグルコース酸化反応を、酸素を連続的に供給モデル活性酸素である過酸化水素の分解反応に及ぼす影響する気泡塔バイオリアクターの条件下で行い、共存するリを検討した。また、脂質分子集合体の化学的安定性、粒子ポソーム内封入カタラーゼにより生成過酸化水素が効率よ

径及び膜流動性に及ぼす共存過酸化水素の影響を検討して、く分解されることを報告した

３-5）。この酸化反応過程にお脂質分子集合体と過酸化水素の相互作用機構を推定した。

いて、カタラーゼ分子のみならず、リポソームを構成する２．実

脂質二分子膜自体が過酸化水素の分解を促進していることが示唆された。脂質二分子膜は、タンパク質や水をはじめ

２．１

験

リン脂質とする種々の生体分子と静電・疎水性相互作用や水素結合

飽和リン脂質として、脂質親水部位（Choline）が同などにより複合体を形成して、脂質膜に結合した分子の構一であるが、疎水鎖を構成する炭素数が異なる種々の造に影響を及ぼすことが報告されている６，７）。これまでに、

diC nPC（diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine, n=4, 6, 7,8, 10, 12, 14） を 用 い た。 ま た、 不 飽 和 リ ン 脂 質 と し て、A novel antioxidant system based on lipid
assemblies-mediated decomposition ofreactive oxygen species
Makoto Yoshimoto
Depa r t ment of Appl ied Chem ist r yand Chemical Engineering, Faculty ofEngineering, Yamaguchi University

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（POPC）
を用いた。

２．２

脂質分子集合体の調製

ナス型フラスコ内で脂質を有機溶媒に溶解した後、有機溶媒を留去してフラスコ壁面に脂質薄膜を形成させた。凍− 18 −

脂質分子集合体の活性酸素種分解機能の解明による新規な抗酸化系の構築

結乾燥機を用いて８Pa 以下の減圧下（２h）で有機溶媒をand 0.1g/L 2,6-di-t-butyl-4-methylphenol（BHT） か ら な

ほぼ完全に留去した後、50 mM Tris-HCl/100 mM NaCl

る TBA 試薬 2 mL とを混合した。POPC-TBA 試薬混合液緩衝液（pH 7.4）で乾燥脂質膜を水和した。この操作によを密閉したガラス製容器に入れ、15 分間沸騰後、水冷した。

り炭素鎖長の短い脂質（n遠心分離（1000 g, 15 分）した後、532 nm の吸光度を測定

8）は、脂質濃度 10 mM において脂質モノマー溶液あるいは脂質ミセル溶液を形成した。

して過酸化脂質生成量の指標とした。

リポソームを形成した脂質懸濁液について、大きな多重層リポソームを形成させるために、−80℃で凍結及び 35℃で２．７

脂質膜流動性の評価融解する操作を 7 回繰り返した。さらに、エクストルーダー

脂質二分子膜の親水部位と疎水部位に配向する蛍光プロを 用 い て 平 均 細 孔 径 が 400nm、200nm、100 nm、80nm、ーブとして、Trimethylammoniumphenyl）-6-phenyl-1,3,5-50 nm、30nm のポリカーボネート膜を 11 回通過させて種々hexatriene iodide（TMA-DPH）と Diphenyl-1,3,5- hexatrieneの粒子径を有する一枚膜リポソームを調製した。脂質濃度（DPH）をそれぞれ用いた。脂質濃度 0.5 mM のリポソーは酵素法で測定し、調製した脂質分子集合体は−４℃で遮ムと 0.4 µM の DPH あるいは 2.0 µM の TMA-DPH を混合光保存した。

して 24 h 静置後、過酸化水素（10mM）を添加して５h 後の分極率 P を蛍光分光光度計で測定した。1/P 値をリポ

２．
３

リン脂質共存下における過酸化水素の分解ソーム膜流動性の指標とした。

脂質分子を溶解あるいは懸濁した Tris 緩衝液と過酸化3．

水素水溶液を混合して、脂質と過酸化水素の濃度がそれぞ
れ 1.0 − 40 mM と 1.0 mM の溶液 1.0 − 1.5 mL を調製した。

３．１

結

果

リポソームの過酸化水素分解機能

これをガラス製試験管に入れ、綿栓をして種々の温度に設

Fig. 1 に 25℃において脂質を含有しない Tris 緩衝液（pH定した恒温槽中に静置した。過酸化水素濃度の経時変化を7.4）及び平均直径 100 nm の POPC リポソームを種々の濃後述の酵素法により 120h 追跡した。

度で懸濁した Tris 緩衝液中の過酸化水素濃度の経時変化を示す。初期過酸化水素濃度は 1.0 mM である。脂質非共

２．
４

過酸化水素濃度の測定

存系では、過酸化水素は 120 h の間 90% 以上が分解せずに過酸化水素濃度は、西洋ワサビ由来の Peroxidase（HRP）安定に存在している。これより、過酸化水素分解の要因と触媒下の過酸化水素による o-dianisidine の酸化反応に基なり得る緩衝液中の不純物金属イオン及び試験管壁の影響

３）づき定量した 。反応溶液中の HRP、o-dianisidine 及びコは無視できることがわかる。一方、POPC リポソーム懸濁ール酸ナトリウムの濃度は、それぞれ５µM、3.3mM 及び系では、過酸化水素の分解反応が促進されている。リポソ

10 mM とした。ここで、コール酸ナトリウムは、リポソームの過酸化水素分解促進効果は、高脂質濃度条件下ほどームを溶解させ、リポソーム内水相の過酸化水素溶液を放顕著である。100µM Fe2+ イオン共存下において過酸化水出させるために添加した。25℃において、460 nm の吸光

素は 25 h で 90％以上が分解した（データ省略）。これは、本定量に影響を及ぼさなかった。

２．
５

脂質懸濁液の濁度測定

リポソーム粒子径及び粒子径分布の指標として、リポソームを懸濁した Tris 緩衝液の濁度を 600nm、25℃における吸光度（OD600）から評価した。初濃度 1.0 mM の過酸化水素と 120 h 共存させる前後のリポソーム懸濁液（[lipid]=10mM）の濁度を測定した。

２．
６

生成過酸化脂質量の評価

生成過酸化脂質の指標として、過酸化脂質の二次反応生成物を定量することができるチオバルビツール酸

Remmining hydrogen peroxide [%]度を測定して過酸化水素濃度を決定した。共存する脂質は、と 3.75 g/L TBA、150 g/L trichloroacetic acid, 0.25 M HCl60
10mM4025 oC
POPC liposome : 100nm

20025507540 mM

100125

Reaction time [h]本測定は、脂質過酸化を受ける可能性がある不飽和脂質
POPC について行った。POPC リポソーム懸濁液 0.5 mL[POPC]=1.0mM

800（4,6-dihydroxy-2-mercaptopyrimidine; TBA）法 8）を用いた。

Tris buffer (no lipid)

100Fig. １ 初濃度 1.0mM 過酸化水素の分解に及ぼす共存 POPC
リポソームの影響（25℃ , pH 7.4）

− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

Fe2+ イオンによりラジカル種が生成して過酸化水素の分解

３．３

種々の脂質分子集合体の過酸化水素分解機能反応が著しく促進されたためである。リポソーム共存によ

脂質分子の会合状態と脂質の炭素鎖の特性が共存する過る過酸化水素分解反応速度は Fe2+ 共存下の分解反応の場

酸化水素の分解反応に及ぼす影響を検討した。脂質濃度を合に比べて小さいことがわかった。

10 mM の一定として、脂質と初濃度 1.0 mM の過酸化水素を 120 h 共存させたときの残存過酸化水素濃度を Fig. ２

３．２ 過酸化水素共存下におけるリポソームの物理化学的特性の変化に示す。分解反応は pH7.4、 25℃の条件下で行った。脂30− 400nm の平均粒子径を有する POPC リポソームとル溶液（n= 7, 8）９）及びリポソーム懸濁液（n= 10, 12, 14,過酸化水素を 120 h 共存させた後にリポソーム懸濁液の濁POPC）を形成した。リポソームの平均粒子径は 100 nm度を測定して、過酸化水素共存前のそれぞれの濁度と比較とした。脂質によるリポソームの形成は濁度から判定した。

した。結果を Table 1 に示す。リポソーム懸濁液の濁度はFig. 2 において、脂質モノマーおよび脂質ミセル溶液中で過酸化水素の共存により僅かに増加しているものの、120は、脂質を添加していない Tris 緩衝液系よりも過酸化水

h 静置中に一部のリポソーム間において凝集体が形成する素の分解がやや促進されている。一方、リポソーム懸濁液

ことを考慮すると、過酸化水素はリポソーム懸濁液の濁度中では、脂質モノマー、ミセル溶液中に比べて過酸化水素に殆ど影響しないとみなすことができる。すなわち、リポの分解が著しく促進されている。これより、脂質が発現すソーム粒子径が共存過酸化水素の分解反応中に殆ど変化しる過酸化水素分解活性は脂質分子の集合状態に依存し、リないことがわかる。また、POPC リポソームと過酸化水素ポソームが最も高い活性をもつことがわかった。また、リを 120 h 共存させた後に過酸化脂質生成量を TBA 法で評

ポソームを形成する脂質の種類により、リポソームの過酸価したところ、POPC は過酸化されていなことがわかった。

化水素分解促進効果が異なることがわかる。diC14PC から以上の結果より、リポソームは過酸化水素共存下において形成されるリポソームは最も高い過酸化水素分解促進効果物理化学的な修飾を受けることなく過酸化水素の分解反応を示している。

質は、炭素鎖長 n により、モノマー溶液（n= 4, 6）、ミセを促進していると考えられる。
Table１
リポソーム平均直径[nm]リポソーム懸濁液濁度に及ぼす共存過酸化水素の影響
OD600（過酸化水素非共存下）

50
100
200
400

OD600（過酸化水素と120h 共存後）0.22 ± 0.06
0.39 ± 0.05
0.79 ± 0.08
2.13 ± 0.21

0.24 ± 0.07
0.54 ± 0.23
1.05 ± 0.25
2.13 ± 0.09

POPC25 oC

diC14PC

Liposomes(100 nm)

diC12PC
diC10PC
diC8PC

MicellesdiC7PC
diC6PCMonomers

diCC4PC
Tris buffer(no lipid)

020

4060

80

100Remaining hydrogen peroxide [%]Fig. ２ 1.0 mM 過酸化水素の分解に及ぼす種々の脂質分子の会合状態の影響（[lipid] =10 mM, 25℃ , pH 7.4)

− 20 −

脂質分子集合体の活性酸素種分解機能の解明による新規な抗酸化系の構築

３．４ リポソームの過酸化水素分解活性に及ぼす脂質膜相状態の影響なく、リポソームが触媒的に作用していることが示唆されFig. ３に diC14PC から形成される平均粒子径 100 nm のゼを触媒とすると速やかに分解されることから、リポソーリポソームを 15−35 ℃で初濃度 1.0 mM 過酸化水素と 120ムが発現する過酸化水素分解活性は微弱であり、低濃度のる。Fig. １で用いた 1.0 mM の過酸化水素は酵素カタラー

h 共存させたときの残存過酸化水素量を示す。diC14PC 膜過酸化水素に対する脂質膜の自己防御的な機能として捉えがゲル相から液晶相へ転移する温度 Tm は 23 ℃付近であることができる。脂質分子が過酸化水素の分解反応を効率る。リポソーム非共存系では、各温度において過酸化水素よく促進するのは、脂質分子がリポソームを形成するときは安定である。リポソーム共存系では、全ての温度においである（Fig. ２）。リポソームの脂質二分子膜は、数万からて過酸化水素の分解が促進されているが、15℃ではリポソ数十万の脂質分子が高密度かつ秩序的に集合して形成するームの共存効果がやや小さくなる傾向が認められる。これ安定な会合体であるのに対し、脂質ミセルはミセル間の脂より、液晶相の状態にあるリポソーム膜は共存過酸化水素質分子の組み換えが容易な不安定な会合体である。すなわの分解促進に有利であることが示唆される。

ち、脂質分子集合体内において分子の配向性と密度が高いことが過酸化水素分解活性の発現に寄与すると考えられる。

３．
５リポソームによる過酸化水素分解機構

また、Fig. ３の結果は、diC14PC から形成されるリポソー

リポソームと過酸化水素間の相互作用を効率よく検出す

ムがゲル状態に比べて液晶状態にある場合に高い過酸化水るために、種々のリポソーム（[lipid] = 0.5 mM）を初濃度素分解促進機能を示すことを示している。相転移温度が室10 mM の過酸化水素と５h 接触させ，H2O2/lipid モル比が温付近である diC14PC リポソームの過酸化水素分解機能に高い条件下で膜流動性を測定した。Fig. ４に異なる粒子径ついてはさらに詳細な検討が必要である。の POPC リポソームを用いたときに得られた結果を示す。

過酸化水素の共存による脂質膜親水部位の流動性の低下

いずれのリポソームでも疎水部位の流動性は親水部位に比（Fig. ４）より、過酸化水素分子がリン脂質親水部位と複べて高く、過酸化水素に殆ど影響を受けていない。一方、合体を形成して、脂質分子の回転運動を阻害しているもの

親水部位の流動性は、いずれの場合も過酸化水素の添加にと推測される。すなわち、過酸化水素の分解はリポソームより僅かに減少している。この結果は，過酸化水素分子が外膜 - 液本体及びリポソーム内膜 - リポソーム内水相の各脂質膜の親水部位（リポソーム膜表層）に結合して分解作界面で進行すると推定される。

用を受けることを示唆している。

４．考

リポソーム膜が発現する過酸化水素分解活性を最大限に高めることができれば、リポソームを安定な抗酸化素子と察して活用できると考えられる。例えば、リポソームとカタPOPC リポソームを過酸化水素と共存させた後に過酸化ラーゼを複合化した過酸化水素分解素子は、気泡塔バイオ脂質の生成およびリポソーム径の変化が認められなかった

リアクターの条件下において、酸化酵素反応で副生する過（Table １）。したがって、リポソームによる過酸化水素分酸化水素を効率よく安定に分解除去する機能を発現するこ解反応では、リポソーム自体が物理化学的に変化することとを明らかにしている５）。

Liquid-crystal state
Gel state80Tm= 24oC60[H2O2]initial = 1.0 mM
di14PC liposome

40[Lipid] = 10 mM
Reaction time : 120h20010203040Temperature [℃]Fig. ３ DMPC リポソームの過酸化水素分解機能に及ぼす温度の影響（■：脂質非共存下、□：脂質共存下、[lipid] =10 mM, pH 7.4）

Membrane fluidity, 1/P [−]Remaining H2O2 [%]100104(a) Hydrophobic
region3.58362.542(a) Hydrophilic
region305080100200400

Diameter of POPC liposomes [nm]2305080100200400

Diameter of POPC liposomes [nm]Fig. ４ POPC リポソームの（a）疎水部と （b）親水部の膜流動性の変化（過酸化水素添加前（■），添加後（□））− 21 −コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

（参考文献）

231-238（2005）１）Schallreuter, K. U., Elwary, S. M., Gibbons, N. C.,

５）Yoshimoto, M., Miyazaki, Y. Kudo, Y., Fukunaga, K.,

Rokos, H. and Wood, J. M., Activation/deactivation

Nakao, K. Glucose oxidation catalyzed by liposomalof acetylcholinesterase by H2O2: more evidence forglucose oxidase in the presence of catalase-containing
liposomes. Biotechnol. Prog., 22,（2006）

oxidative stress in vitiligo. Biochim. Biophys. Res.

６）P a l e o s , C . M . a n d T s i o u r v a s , D . , M o l e c u l a r

Commun., 315, 502-508（2004）

recognition and hydrogen-bonded amphiphiles. Top.

２）Emerit, J., Edeas, M. and Bricaire, F., Neurodegenerative

Curr. Chem., 227, 1-29（2003）

diseases and oxidative stress. Biomed. Pharmacotherapy,７）Kuboi, R., Yoshimoto, M., Walde, P. and Luisi,

58, 39-46（2004）
３）Yoshimoto, M., Miyazaki, Y., Sato, M., Fukunaga, K.,

P. L., Refolding of carbonic anhydrase assisted by

Kuboi, R. and Nakao, K., Mechanism for high stability

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
liposomes. Biotechnol. Prog., 13, 828（1997）of liposomal glucose oxidase to inhibitor hydrogen
peroxide produced in prolonged glucose oxidation.

８）Genot, C., Metro, B., Viau, M. and Bouchet, B.,
Characterisation and stability during storage of

Bioconjugate Chem., 15, 1055-1061（2004）

liposomes made of muscle phospholipids. Lebensm.-４）Yoshimoto, M., Wang, S., Fukunaga, K., Fournier, D.,

Wiss. u.-Technol., 32, 167-174（1999）

Walde, P., Kuboi, R. and Nakao, K. Novel immobilized
liposomal glucose oxidase system using the channel

９）Hauser. H., Short-chain phospholipids as detergents.

protein OmpF and catalase. Biotechnol. Bioeng., 90,− 22 −Biochim. Biophys. Acta, 1508, 164-181（2000）