PRESS RELEASE
2021年３⽉17⽇
報道関係者 各位
抑制性ニューロンだけに外来遺伝子を発現させる手法を開発－抑制性ニューロンが関与する精神神経疾患の研究を加速－
分野︓脳神経科学、キーワード︓抑制性ニューロン［*1］、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター［*2］、プロモーター［*3］、AAV-PHP.B［*4］、シャンデリア細胞［*5］群⾺⼤学未来先端研究機構（群⾺県前橋市）は、遺伝⼦治療⽤に利⽤されるアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを⽤いて、脳の抑制性ニューロンだけに外来遺伝⼦を発現させる⼿法を開発しました。
⾎液脳関⾨透過型AAVベクターをマウスの静脈から投与するだけで、全脳の抑制性ニューロン選択的に外来遺伝⼦を発現させることが可能となります。ニューロンの信号は次のニューロンを興奮させることで伝わり、ネットワーク（神経回路）が作られています。抑制性ニューロンは、ネットワークの興奮性信号伝達を抑制性に調節するニューロン群で、学習や記憶をはじめ、脳が正常に機能するのに重要な役割を果たします。最近の研究で、抑制性ニューロンの機能不全が統合失調症などの精神神経疾患の発症に関与していることが明らかになって来ました。今回の発明により、抑制性ニューロンが記憶や学習などの正常な脳機能に果たす役割や、統合失調症などの精神神経疾患の病態の解明、さらにそれらの疾患に対する遺伝⼦治療研究が加速することが期待されます。

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１． 研究成果のポイント
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抑制性ニューロンのみで遺伝⼦を発現させる事ができるGAD65プロモーターを開発した

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AAVベクターの静脈投与のみで全脳領域の抑制性ニューロンへ選択的な遺伝⼦発現が可能

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抑制性ニューロンが関与する精神疾患等の研究を加速させることが期待される

２．研究の成果
群⾺⼤学医学部医学科６年⽣の星野千秋、医学系研究科の今野歩講師、細井延武准教授、及び未来先端研究機構の平井宏和教授らの研究グループは、後脳領域を含む脳の全域で抑制性ニューロン選択的に遺伝⼦を発現させる⼿法を開発しました。脳はニューロンとグリア細胞からなります。ニューロンにも様々な種類がありますが、⼤きく興奮性ニューロンと抑制性ニューロンに分けることができます。興奮性ニューロンが作る神経回路に抑制性ニューロンが組み込まれ、ネットワークを制御することで、複雑な脳機能の実現が可能となります。脳神経研究の多くは、マウスを使って⾏われますが、近年、⽣後〜成熟後のマウスに遺伝⼦導⼊を⾏う際、AAVベクターがよく利⽤されます。
研究グループはこのAAVベクターに利⽤できる抑制性ニューロン特異的なGAD65プロモーターを新規に開発しました。GAD65は、抑制性ニューロンにおいて抑制性ニューロンの神経伝達物質であるGABAをグルタミン酸から合成する酵素です。GAD65の遺伝⼦は全ての細胞に存在しますが、抑制性ニューロンだけでGAD遺伝⼦が転写・翻訳されます。そこでGAD遺伝⼦の上流域から、抑制性ニューロンだけで発現を誘導する部分をスクリーニングし、「GAD65プロモーター」と命名しました。
これまでAAVベクターを⽤いて、抑制性ニューロン選択的に遺伝⼦を発現させる⼿段としては、Dlxエンハンサー（以下Dlx）が存在していましたが、前脳領域における抑制性ニューロンに対してのみ有効でした。GAD65プロモーターの発現特性を調べるために、⾎液脳関⾨透過型AAVベクター（AAV-PHP.B）を経静脈的に投与し、全脳領域での遺伝⼦発現パターンを解析したところ、G
AD65プロモーターは前脳のみならず、後脳を含む全脳領域において、遺伝⼦発現をもたらすことが明らかになりました（図１）。さらに、すべての抑制性ニューロンにtdTomato（⾚⾊蛍光たんぱく質）が発現しているVGAT-tdTomatoマウスを⽤いて、GAD65プロモーターの特異性を検討したところ、95%以上の⾼い特異性で抑制性ニューロン選択的な遺伝⼦発現が起きていることが明らかとなりました（図２︔次⾴）。

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また、⼤脳⽪質の抑制性ニューロンには様々なサブタイプが存在していることが知られていますが、G
AD65プロモーターを⽤いると、抑制性ニューロンの中のパルブアルブミン（PV）ニューロンへの発現割合が他のサブタイプより有意に⾼いことがわかりました。PVニューロンは数の多いバスケットニューロンと少ないシャンデリア細胞に分けることができますが、GAD65プロモーターはシャンデリア細胞でよく働き、外来遺伝⼦を強く発現することが明らかになりました（図３）。

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本研究成果は、2021年2⽉15⽇付の「Molecular Brain」の電⼦版に掲載されました。

タイトル︓
GABAergic neuron-specific whole-brain transduction by AAV-PHP.B incorporate
d with a new GAD65 promoter
著者︓Chiaki Hoshino†, Ayumu Konno†, Nobutake Hosoi, Ryosuke Kaneko, Ryo Muka
i, Junichi Nakai & Hirokazu Hirai＊ (†共筆頭著者︔＊責任著者)
掲載サイト︓
https://molecularbrain.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13041-021-0074
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なお、本研究は⼤阪⼤学⼤学院⽣命機能研究科、群⾺⼤学眼科学教室および東北⼤学⼤学院⻭学研究科⼝腔⽣理学分野との共同研究により実施されました。
また、本研究は⽇本学術振興会（JSPS）科学研究費補助⾦ 基盤研究（C）および⽇本医療研究開発機構（AMED）⾰新的技術による脳機能ネットワークの全容解明プロジェクトの助成を受け⾏われました。

3.

今後の展開
本研究成果により、マウス全脳域の抑制性ニューロンに対して、⾼い特異性で⽬的遺伝⼦を発現させることが可能になりました。また同研究グループは、このような細胞種特異的プロモーターと⼈⼯miRNAをAAVベクターに組み込むことにより、細胞種特異的な遺伝⼦ノックダウンが可能であることもつい最近報告しており（Yasui et al., 2020, Neuroscience）、今回報告したG
AD65プロモーターでも同様の⽅法が使えると考えられます。抑制性ニューロンの機能不全は統合失調症をはじめとした種々の精神疾患との関連が指摘されています。このような根本的な治療法のない疾患において、基礎的な研究を推進することは必要不可⽋です。今後、今回の⼿法を脳の疾患の基礎研究に応⽤し、新たな治療法の開発に結びつけて⾏きたいと考えています。
また、今回報告したGAD65プロモーターは遺伝⼦サイズが約2.5 kbとやや⼤きいという特徴があります。このためAAVベクターのパッケージング限界や、他に必要な発現カセット等を考慮すると、最⼤でも1.3 kb程度までの遺伝⼦の発現にしか利⽤できません。今後、本プロモーターの短鎖化を⾏う事により、さらに応⽤範囲を広げたいと考えています。

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【本件に関するお問合せ先】
群⾺⼤学⼤学院医学系研究科 教授
未来先端研究機構ウイルスベクター開発研究センター⻑

平井 宏和

群⾺⼤学⼤学院医学系研究科 講師 今野 歩
群⾺⼤学研究推進課未来先端研究⽀援係 TEL︓027-220-8116
E-MAIL︓kk-kensui4@jimu.gunma-u.ac.jp【⽤語説明】[*１]抑制性ニューロン︓ 脳の神経細胞には、⼤きく分けて神経細胞の活動を上げる興奮性ニューロンと、活動を下げる抑制性ニューロンが含まれています。興奮性ニューロンばかりが働くと過活動となり、てんかん等の状態が引き起こされることになるため、脳内では抑制性ニューロンが適切に働き脳の活動を制御しています。
[*２]アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター︓ウイルスを遺伝⼦のベクター（運び屋）として利⽤するウイルスベクターの１種です。ウイルスの⾼い感染能を利⽤して、⾼効率な遺伝⼦導⼊が可能です。AAVは元来病原性を持たないウイルスであるため、安全性が⾼いとされ、近年治療⽤遺伝⼦のベクターとしても利⽤されています。
[*３]プロモーター︓細胞内の遺伝⼦の発現はプロモーターによって制御されています。それぞれの細胞で必要な遺伝⼦が、それぞれの遺伝⼦のプロモーターの働きで発現されます。今回のGAD65プロモーターは抑制性ニューロンのみに発現しているGAD65のプロモーター領域を⼈⼯的に取り出し、GAD65プロモーターとして使⽤しています。
[*４]AAV-PHP.B︓近年開発されたマウスの⾎液脳関⾨を透過し、脳内に⾼効率に⼊り込むことができる特殊なAAVベクターです。マウスへの静脈投与により脳全域に遺伝⼦導⼊が可能であるため、脳神経科学研究のツールとして利⽤が拡⼤しています。
[*５]シャンデリア細胞︓⼤脳⽪質の抑制性ニューロンサブタイプであるパルブアルブミンニューロンの中で、さらに細かいサブグループに含まれる抑制性ニューロン。近年、統合失調症との関連が指摘され、注⽬が集まっています。

【研究者からのコメント】
本研究は医学部医学科⽣である星野千秋さんが主体となって実施しました。星野さんは⼊学したばかりの１年⽣の時から当研究室で熱⼼に研究を継続してきました。研究には困難がつきもので、途中で何度か研究テーマの変更を余儀なくされましたが、なんとか卒業前に出版に⾄りました。今回の論⽂は受理されるまで、２度の改訂を審査員から要求されましたが、星野さんにとって⼤変な時期と重なりました。１回⽬の改訂は卒業試験の時期に重なり、２回⽬の改訂作業で

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は医師国家試験の10⽇前にもかかわらず顕微鏡に向かっていました。昨今、基礎研究に興味をもつ学⽣が激減している中で、貴重な存在であり、将来が多いに期待されます。
群⾺⼤学ウイルスベクター開発研究センターでは、当研究室が主体となって運営しているAMED
⾰新脳ウイルスベクターコアを通じて、国内外の研究者にAAVベクターを配布しています。今回開発したGAD65プロモーターを搭載したAAVベクターも今後配布していく予定です。本プロモー
ターを⽤いた研究に興味がある⽅は、気軽にご相談いただければと思います。（今野）6