加齢に伴う皮膚脂質の変化に対するリピドーム解析

京都府立医科大学

守 田消化器内科

麻 由 子

Human skin is exposed to some environmental stress. Because phospholipid (PL) and cholesterol esters (CE) aremajor component of cellular membrane, it is expected that the lipid change is a cause of the morphological change of thehuman skin. To analyze the morphological change and the lipid change of the skin according to aging would be important.
In this study, to investigate the correlation of histology change and lipid change of skin, we analyzed lipid class, fatty acidcomposition using HaCaT cells.
The major component of lipid extracted from HaCaT cells was PL. The relative amount of CE was also high. The total
relative amount of saturated fatty acid and unsaturated fatty acid was the almost same, but it of poly unsaturated fatty acidwas low. Elaidic acid and/or oleic acid (18:1 ; carbon numbers : degree of unsaturation) would be the key component of skinlipid. The major molecular species of phosphatidyl choline (PC) were 32:1PC, 34:1PC, 34:2PC and 36:2PC. These molecules
contained more than one unsaturated fatty acid acyl chain. We will examine the structural analysis for triacylglycerol (TG)molecular species and PC molecular species and these oxidation products of skin tissue.

１緒２-２

言

脂質クラス分析

脂質クラス分析は TLC-FID 法に従った3, 4）。活性化させ皮膚は異物との接触や、紫外線、乾燥など、常にストレたクロマロッド（Chromarods S Ⅲ，三菱化学メディエンスを受けている組織である。皮膚脂質に関して脂質過酸化ス）に脂質サンプルを 1 mL スポットし、溶媒中で展開した。

物による皮膚炎の発症、コレステロール酸化物の発がん性脂質種の検出はイアトロスキャン（Iatroscan MK- 6 三菱などが報告されている 。脂質過酸化物は加齢による量的化学メディエンス）を用いた。各脂質クラス同定は、標準1）2）変動を示し 、リン脂質やコレステロールは生体膜の構成物質との保持時間の比較により行った。

成分であることから、脂質変化が皮膚の形態変化の一因で【TLC 条件】あることが予想される。皮膚では加齢に伴って表皮、真皮、・展開溶媒
ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸 =80：20：1（v/v/v）

脂肪層が薄くなり、弾力を損失するなど形態が変化する。
皮膚脂質を網羅的に解析し、脂質変動の全体像のプロファ【検出器条件】

イリングから加齢に伴う皮膚の形態変化および脂質変動を・水素流量解析することが重要であると考えられる。

・スキャンスピード

160 mL/min、空気流量 1500 mL/min
30sec/scan

本研究では質量分析法を用いて皮膚のリピドーム解析を行い、皮膚が受けるストレスに起因する皮膚の組織学的な２-３脂肪酸組成分析変化と脂質変動の相関関係を明らかにすることを目的とし、脂肪酸組成分析は GC-MS を用いて行った。抽出した脂皮膚細胞を用いてリピドーム解析へ向けた予備検討を行っ

質を三フッ化ホウ素・メタノール法 に従ってメチルエスた。

テル化し、ガスクロマトグラフィー・質量分析計（GC-2２ -１

実5）

17A-HP5000（Shimadzu））に供した。脂肪酸メチルエス

験テ ル の 同 定 は 標 準 試 薬（Supelco 37 Component FAME

脂質抽出Mix, SUPELCO）の保持時間との比較およびライブラリサ

クロロホルム‐メタノール混合溶液を用い、細胞から脂ーチによって行った。
【GC-MS 条件】

質を抽出した。

・カラム DB-23（Agilent Technologies）
・カラム温度

170℃ 1 分間→ 4℃ /min で 230℃まで昇温→ 230℃で 5 分間保持
Lipidomic analysis of skin lipid changingby aging
Mayuko Morita
Molecular Gastroenterology and Hepatology,
Kyoto Prefectural University of Medicine

・キャリアガス

ヘリウム（流速 1 mL/min）・スプリット比40：1

・気化室温度

270℃

・インターフェイス部温度− 28 −290℃

加齢に伴う皮膚脂質の変化に対するリピドーム解析

２-４質量分析脂質の割合が高かったが、リン脂質の中でも細胞膜の構成

質量分析法を用いて、脂質カラムの代わりにユニオンを成分である PC が主要成分であった。Positive mode で検出接続した、フローインジェクションを行った。

された主な PC 分子種、TG 分子種を図 2A、Table 3 に示

【測定条件】し た。 飽 和 脂 肪 酸 だ け で 構 成 さ れ た PC、TG 分 子 種 の・イオン化法

Intensity は弱く、多くが分子内に 1 個以上の不飽和脂肪酸

エレクトロスプレーイオン化法

・質量分析計 esquire HCT plus（BRUKER DALTONICS）を含む PC、TG 分子種であった。Negative mode で検出さ・溶媒

メタノール：水 =90：10（pH=7.0，1% ギ酸）

れた主な PC 分子種を Table 4 に示した。遊離脂肪酸（〜・流速20 mL/minm/z400）はほとんど検出されず、検出された主な脂質は・測定モード

３３-１

PC であった（図 2B、Table 4 ）。

Positive mode、Negative mode

結果4脂質クラス分析

考察

HaCaT 細胞を用いて皮膚脂質の解析を行った。細胞抽HaCaT 細胞から抽出した脂質の脂質クラスを Table１に出脂質の主な脂質成分はリン脂質であり、質量分析計によ示した。HaCaT 細胞抽出脂質ではリン脂質の割合が高く、る分析により、リン脂質の中でも特に PC を多く含んでい次いでステロール類、TG の割合が高かった。
多価不飽和脂肪酸３-２

脂肪酸組成分析

飽和脂肪酸10.93％

HaCaT 細胞抽出脂質の脂肪酸組成を Table２に示した。
主な脂肪酸は 16 : 0（ステアリン酸）、18 : 0（パルミチン酸）、43.29％

18 : 1（エライジン酸、オレイン酸）であった。エライジン

48.35％酸の割合はオレイン酸と同等であった。HaCaT 細胞抽出
脂質は、飽和脂肪酸と一価不飽和脂肪酸の割合がほぼ同じ一価不飽和脂肪酸であり、高度不飽和脂肪酸の割合は低い（図 1）。

３-３

図1脂質の網羅的解析

Table 2

HaCaT 細胞抽出脂質では、Table 1 に示したようにリン
Table 1CETG
FFA
Ch1+DG
PL

Table 3

C14：0
C16：0
C16：1
C16：1
C18：0
C18：1
C18：1
C18：2
C18：2
C20：4

HaCaT 細胞抽出脂質の脂質クラス①②③Ave.

11.20
8.52
6.40
6.21
67.67

12.15
5.73
3.83
5.85
72.44

16.19
10.34
6.02
7.49
57.94

13.17±2.65
8.20±2.32
5.42±1.39
6.52±0.86
66.1±7.38

HaCAT 細胞抽出脂質の主な PC、TG 分子種（Positive mode）

PC［M+H］m/z

Intensity

TG［M+NH4］m/zIntensity

30：1PC
32：1PC
32：2PC
34：0PC
34：1PC
34：2PC
34：3PC
36：1PC
36：2PC
36：4PC
38：2PC
38：3PC
38：4PC

706.5
732.5
730.5
762.5
760.5
758.5
756.5
788.5
786.5
782.5
814.5
812.5
810.5

95199842012709396161093622712184042656625178901346654464787252987496766754554554177046：0TG
48：0TG
48：1TG
48：2TG
50：1TG
50：2TG
52：1TG
52：2TG
52：3TG
54：2TG

796.5
824.6
822.6
820.5
850.6
848.6
878.6
876.6
874.6
904.6

313125316770385241327803
524523665469283877939291656301287452+

HaCaT 抽出脂質の脂肪酸組成− 29 −

HaCaT 細胞抽出脂質の脂肪酸組成①②③Ave.

4.28
32.47
2.97
9.25
11.30
19.50
14.91
2.14
3.13
3.85

3.15
26.82
3.14
9.49
11.94
19.19
16.25
4.12
2.97
6.03

3.04
26.11
2.87
10.03
10.77
18.62
18.83
2.48
3.69
4.39

13.49±0.69
28.47±3.49
2.99±0.14
9.59±0.40
11.34±0.59
19.10±0.45
16.66±1.99
2.91±1.06
3.26±0.38
4.75±1.13

Table 4 HaCAT 細胞抽出脂質の主な PC
分子種（Negative mode）+PC［M+HOO］

m/z

Intensity

30：1PC
32：0PC
32：1PC
32：2PC
34：0PC
34：1PC
34：2PC
36：1PC
36：2PC
38：2PC

750.5
778.5
776.5
774.5
806.4
804.5
802.5
832.4
830.5
858.5

18760
33925
58922
13071
15502
103839
54970
17334
66767
19594

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

図 2A

フローインジェクションによる測定結果（Positive mode）

図 2B

フローインジェクションによる測定結果（Negative mode）

過酸化物量の加齢変化ることが示された。脂肪酸組成の特徴として、飽和脂肪酸と一価不飽和脂肪酸の割合がほぼ同じであること、エライ

３）N . C . S h a n t h a : T h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y -ジン酸の割合が高いことが挙げられる。フローインジェク

flame ionization detection Iatroscan system. J.

ションによる網羅的測定において、ポジティブモード、ネ

Chromatography, 624, 21-35, 1992.

ガティブモードともに PC が顕著に検出され、それらは分４）Laurent Striby, Raymond Lafont, Madeleine

子内に 1 個以上の不飽和脂肪酸をアシル基にもつ PC 分子

Goutx: Improvement in the Iatroscan thin-layer

種であった。

chromatographic-flame ionization detection analysis

細胞膜の主要構成成分である PC の組成変化は、加齢にof marine lipids. Separation and quantitation of伴う皮膚組織の形態変化の指標になると考えられる。特にmonoacylglycerols and diacylglycerols in standards

一価不飽和脂肪酸を含む PC 分子種や TG 分子種、これらand natural samples. J. Chromatogr. A, 849, 371-380,に由来する化合物や酸化生成物が加齢に伴う皮膚脂質の指1999.
５）Shirai N, Suzuki H, Tokairin S, Ehara H, Wada S:

標になると考えられる。

Dietary and seasonal effects on the dorsal meat lipid（参考文献）

composition of Japanese (Silurus asotus) and Thai

１）Black HS, DR Douglas: Formation of carcinogen ofcatfish (Clarias macrocephalus and hybrid Clarias

natural orgin in the etiology of ultraviolet light-induced

macrocephalus and Clarias galipinus). Comp Biochem

carcinogenesis, Cancer Res, 33, 2094-2096, 1973.

Physiol A Mol Integr Physiol, 32, 609-619, 2002.

２）金子孝夫 , 田原正一 , 松尾光秀 : 老化に伴う皮膚脂質の− 30 −