脂質代謝異常を改善する新規機能性食品成分の探索法の確立

井上奈

東北大学大学院農学研究科

緒言実

近年、食生活の欧米化や生活スタイルの乱れに伴って、

験

方穂助教

法

細胞培養

肥満、高脂血症、糖尿病、高血圧などのいわゆるメタボ実験には脂質代謝解析を目的とした実験系でよく用リックシンドローム患者が増加している。メタボリック

いられる肝細胞であるラット由来肝細胞 McA–RH7777

シンドロームは脳や心臓の血管障害、動脈硬化症やガン3, 4）などのさらに重篤な疾病の発症を誘発し、日本のみなら的の細胞数になるまで 10% FBS 添加α–MEM（+Pen, Str,ず世界的にもその罹患率の増加が問題となっている。メL–Glu）で継代した。各実験を行う前に、FBS に含まれるタボリックシンドロームは脂質代謝異常を誘発すること脂質の影響を取り除くため、無血清α–MEM（+Pen, Str,から、現在、脂質代謝異常の予防・改善作用を有する食L–Glu）で前培養を行った後、各種分析に供した。

を選択した。McA–RH7777 細胞を 10cm dish で目品由来の機能性成分の探索が盛んに行われている。
食品由来機能性成分の効果を調べるために、まず実験 1

ELISA や培養細胞を用いた in vitro 実験によってスク細胞毒性評価リーニングが行われる。ついで、マウスやラットなどの添加するオロト酸が細胞増殖に与える影響を検討す実験動物を用いた in vivo 実験で機能性成分の有効性おるために、Cell Counting Kit（WST–8）を用いて、細胞毒よび安全性が検討され、有効性・安全性が確認されたの性評価を行った。96 well plate に 1 × 10 cells/well と

ち 、ヒトでの有効性試験および安全性試験に移行する、なるように細胞を播種し、48 時間培養を行った後、無というのが一般的である。

血清培地（Cont 群）あるいは各濃度（0µM 〜 1 mM）のオ4

しかしながら、実験に用いられる培養細胞および実験ロト酸を添加した無血清培地で 24 時間培養後、WST–8動物には多くの種が存在し、なおかつ同一種であっても溶液を各 well に添加し 4 時間の呈色反応を行い、マイ系統の違いにより、食品由来機能性成分に対する応答がクロプレートリーダーで 450nm の吸光度を測定した。

異なることは研究を行う上でよく経験することである。

Cont 群の吸光度を 100% とし、90% 以下の場合、「細また、実験の再現性を確保することも重要ではあるが、胞毒性がある」と判定して添加濃度から除外することと再現性を得ることは困難な場合も多い。

した。

そこで、本研究では、脂肪肝モデルとして長年用いられてきたオロト酸摂取ラットに焦点を当て、in vivo で14観察される脂肪肝および低脂血症モデルを in vitro で再脂質分泌量の評価

C–acetic acid からの新規脂質合成量および新規合成

in vivo で観察される現象を in vitro で再現するために現することを試みた。
オロト酸をラットが摂取した場合、著しい脂肪肝および低脂血症を呈するが1,2）、マウスでは、よりよい実験条件の確立が必要となる。そこで、予はこのような症状は誘発されない。ヒトにおいては肝機備試験として、まず細胞毒性が見られなかった全ての添能増強の目的でオロト酸が使われており、市販もされて加濃度での新規脂質合成量および新規合成脂質分泌量のいる。この脂肪肝および低脂血症の状態を細胞培養系で測定を行うこととした。
5再現することができれば、脂質代謝異常に対する食品成6 well plate に 5 × 10 cells/well となるように細胞分の影響を簡便かつ迅速に観察することができるようにを播種し、48 時間培養を行った。その後、無血清培地なると考え、その系の確立を目指した。

で 24 時間前培養を行い、脂質前駆体として
114C–acetic

井上奈

穂

acid を 0.5µCi/well となるように添加した無血清培地を播種し、48 時間培養を行った。その後、無血清培地（Cont 群）あるいはオロト酸添加した無血清培地で 24 時

で 24 時間前培養を行い、脂質前駆体として間培養し、細胞および培地を回収してした。回収した細acid を 0.5µCi/well となるように添加した無血清培地

胞および培地は Bligh & Dyer 法5）

14

C–oleicにより脂質抽出を行（Cont 群）あるいはオロト酸添加した無血清培地で 24 時

い、抽出脂質の 1/5 を液体シンチレーションカウンター

間あるいは 48 時間培養し、細胞および培地を回収した。

で測定し、総脂質量（dpm）を測定した。抽出脂質の残回収した細胞および培地は脂質抽出5）を行い、分析に6）り（4/5）全量は薄層クロマトグラフフィー分析に供し、供した 。

ヨウ素発色で各脂質画分の位置を同定した後、薄層をはぎ取って、液体シンチレーションカウンターで測定し、結6）各脂質画分の量（dpm）を測定した 。

果

細胞毒性評価の結果、オロト酸は 250 µM までは細胞毒性を示さなかった（図 1）。目視評価でも細胞の形態に異常は認められなかったことから、250 µM を上限と実験 2
実験 1（予備試験）で得られた結果から、脂質前駆体として用いた14して分析を行うこととした。

14

C–acetic acid だけでなく、 C–-oleic acidCont 群、オロト酸 0 〜 250 µM で14C–acetic acid かを用いて、脂質の取り込みについて評価を行うこととしらの新規脂質合成量および新規合成脂質分泌量の評価をた。また、対照群として DMSO を、オロト酸添加濃度行ったところ、オロト酸は脂質合成を増加して脂肪肝をは 50 µM、100 µM、250 µM と決定し、以下の試験を行っ誘発しているのではなく、脂質の取り込みを促進し、脂た。

質分泌を抑制することで、脂質を蓄積している可能性が示唆された（図 2 〜 4）。

14

C–acetic acid からの新規脂質合成量および新規合成得られた結果から、実験条件の検討を行い、対照群に脂質分泌量の評価
56 well plate に 5 × 10 cells/well となるように細胞Cell（dpm/dish）

を播種し、48 時間培養を行った。その後、無血清培地
で 24 時間前培養を行い、脂質前駆体として

14

C–aceticacid を 0.5µCi/well となるように添加した無血清培地（Cont 群）あるいはオロト酸添加した無血清培地で 24 時間あるいは 48 時間培養し、細胞および培地を回収した。
回収した細胞および培地は脂質抽出5）を行い、分析に6）供した 。
14

C–oleic acid からの脂質取り込みへの評価
5

6 well plate に 5 × 10 cells/well となるように細胞Medium（dpm/dish）

Cell viability（%）

図2
図1

14C-acetic acid からの新規脂質合成量および新規合成脂質分泌量

Cell Counting Kit を用いた細胞毒性評価
2

脂質代謝異常を改善する新規機能性食品成分の探索法の確立

Cell PL（dpm/dish）

Cell FC（dpm/dish）

Cell TG（dpm/dish）

Cell CE（dpm/dish）

図3

14

C-acetic acid からの各種脂質画分の新規合成量

Medium PL（dpm/dish）

Medium FC（dpm/dish）

Medium TG（dpm/dish）

Medium CE（dpm/dish）

図4

14

C-acetic acid からの各種脂質画分の新規分泌量
3

井上奈

穂

は DMSO 群を、オロト酸添加濃度は 50 µM、100 µM、合成は有意に増加した。一方、培地中への脂質分泌は250 µM と決定し、検討を続けた。

250 µM 添加で有意に低下した（図 5）。

14

まず、実験 1 と同様の方法で、 C–acetic acid からの

14
続いて、 C–oleic acid からの脂質取り込みへの評価

新規脂質合成量および新規合成脂質分泌量の評価を行っを行った。その結果、細胞への脂質取り込み量に 24 時た。その結果、24 時間培養では、オロト酸 100 µM お間培養においても 48 時間培養においても差は認められよび 250 µM 添加で培地中への脂質分泌が有意に低下ず、予備試験の結果から推測された脂質取り込み促進にした。しかしながら、250 µM 添加では細胞中の新規よる脂質蓄積の可能性についての結果を得ることはでき合成量の添加も観察された（図 5）。48 時間培養では、なかった（図 6）。
14C–acetic acid からの新規脂質合成量および新規合成

オロト酸 100 µM および 250 µM 添加で細胞中の脂質脂質分泌量の評価において、オロト酸 100 µM 添加条件下が in vivo で観察される現象を最も顕著に in vitro

図514C-acetic acid からの新規脂質合成量および新規合成脂質

図614C-oleic acid からの脂質取り込み分泌量

Cell（dpm/dish）

図724hrs まとめ

オロト酸 100 µM 添加条件下での 14C-oleic acid からの各種脂質画分の新規合成量

Medium（dpm/dish）

図8

オロト酸 100 µM 添加条件下での 14C-acetic acid からの各種脂質画分の新規分泌量4脂質代謝異常を改善する新規機能性食品成分の探索法の確立で再現できていたことから、対照群と 100 µM 添加群は行かなかった。今後、実験条件のさらなる検討を進めでの詳細な検討を行った。その結果、オロト酸添加は細て、普遍的条件の確立を目指したいと考えている。

胞内での遊離コレステロールおよびトリグリセリド画分において新規合成が有意に増加していた（図 7）。一方、

謝培地中への脂質の分泌は全ての画分で有意に抑制されて辞

本研究は三島海雲記念財団研究助成金の助成によっており、とくにトリグリセリド画分およびコレステロール行われた。

エステル画分で顕著であった（図 8）。

文要献1）Buang Y, et al, : Nutrition, 21, 867–873, 2005.

約2）Cha JY, et al, : Plant Hoods Hum Nutr, 56, 349– 356,

本研究より、ラットのオロト酸誘発脂肪肝は血中への2001.

脂質分泌阻害による肝臓への脂質蓄積が一因である可能

3）Dashti N, et al, :J Biol Chem, 282, 28597–28608, 2007.
4）Sundaram M, et al, :J Lipid Res, 51, 150–161, 2010.

性が示された。また、動物実験系で観察されるオロト酸添加による脂質蓄積の増加および脂質分泌の低下につい

5）Bligh EG, Dyer WJ : Can J Biochem Physiol, 37, 911–917,
1959.て、ある一定条件下での再現には成功したものの、動物

6）Inoue N, et al, : J Oleo Sci, 58, 171–175, 2009.

実験で観察されるような普遍的な実験条件の確立とまで

5