深海生物由来コラーゲンを活用した化粧品基材への応用研究

高知大学農学部

足立亨介

A partial length cDNA of the Type I procollagen a1 helical was determined using cDNA from muscle of deep see fish
Coryphaenoides yaquinae. The helical region was composed of Gly-X-Y repeats; the conserved triplets within the same
molecule in higher vertebrates. The number Ser residues in the helix were quite high compared to other vertebrates includingfish.
The amino acid composition of purified Type I collagen from Coryphaenoides acrolepis shows also high contents of Ser
residues among other fishes. These facts indicates that Ser is a key amino acid in Type I collagen in deep sea adaptation suchas high pressure, low temperature and etc.

緒が知られる 1）。コラーゲンが化粧品の材料として用いられ言る理由の一つとして、その「保水効果」が挙げられるが、コラーゲンは 40 年以上前から化粧品の配合材料として用いられているコスメ業界には非常になじみ深い成分であ

これはこの水分子を繊維中に封じ込めたハイドロゲルの効果を利用したものである 1）。

る 1）。本分子は、3 つのサブユニット遺伝子群がトリプル一方で我々は深海に生息する魚類であるシンカイヨロイへリックスを構成している。哺乳類、鳥類、爬虫類およびダラ Coryphaenoides yaquinae（生息水深約 6000m）および両生類では 2 本の a1 鎖と 1 本の a2 鎖が（a1）2 a2 の形でイバラヒゲ Coryphaenoides acrolepis（ 生息水深約 1000m）

1）存在しているが 、魚類ではこの 3 つが全て異なった鎖2）のコラーゲンの特質を生化学的に研究している。本種は深海中で 10−60MPa にも及ぶ圧力、および通年 1 −2 ℃程度（a1a2a3）である種が報告されている（図 1） 。
このⅠ型コラーゲンの各サブユニットの両端には、N 末の低水温に適応して生きているが、これらの環境を直接的端側には外側からシグナルペプチド、プロペプチドおよびに受けとめているのは表皮・真皮であり、その主要な構成テロペプチドが、同様に C 末端側にはプロペプチドおよび成分はコラーゲンである。このため深海動物のコラーゲンテロペプチドが存在するが、シグナルペプチドおよびプロはその環境に適応した構造・機能・物性を分子内で進化させペプチドはコラーゲンが成熟する過程で切断されることがていると考えられる。しかしながら、これまでにその構造分かっている。またテロペプチドの間は各サブユニットにと機能は解析された例がなく、詳細は未解明のままである。

おいて［Gly- X- Y］トリプレット構造をとっており、3 残上述のようにコラーゲンを化粧品基材に用いる場合はそ基ごとにグリシンが 338 回繰り返す一次構造をとることがの「保水効果」が鍵になるが、これまでに用いられている分かっている（図 1）1, 2）。このアミノ酸XおよびYには、各々素材としては哺乳類由来のもの、ティラピアなど浅海性のプロリンおよびヒドロキシプロリンが存在することが多く、魚類由来のものが中心である 1）。しかしながらこれらの素

これらはイミノ酸とも呼ばれ、コラーゲンの主要構成アミ材はコラーゲンの分子としての性質が似通っており劇的なノ酸であることが知られている（図 1）。イミノ酸はイミ効果の違いを見ていない。

ノ基とカルボキシル基を持ち、このうちヒドロキシプロリ

そこで本研究ではその生息環境から従来のコラーゲンとンのもつ OH 基がトリプルへリックスを安定化させているは全く異なる物性を有する可能性のある深海魚のⅠ型コラと一般には考えられている

1, 2）。このコラーゲン分子は1/4 ずつずれた形で規則正しく会合し（1/4 ずれ会合モデーゲンのまずは構造に着目し、その cDNA 配列からアミノ酸配列を類推することでその特性を検討する。

ル）、コラーゲン繊維を作り上げている。コラーゲン繊維

試料および方法はさらに重合することによりハイドロゲルを形成すること

シンカイヨロイダラ I 型コラーゲンα1 サブユニットのcDNA 断片配列の決定
試料となるシンカイヨロイダラ（学名：Coryphaenoides
The application of collagen from deep sea
animals to cosmetic vehicle
Kohsuke Adachi
Kochi Universityyaquinae、英名：Rattail fish）は、採取後、−80 ℃にて凍結保存した筋肉を用いた。TRIzol（Life Technologies）および NucleoSpin RNA（Takara）にて全 RNA の調製を行い、Rever Tra Ace（TOYOBO） に て 逆 転 写 し た 産 物 を Ex

−4−深海生物由来コラーゲンを活用した化粧品基材への応用研究Taq にて PCR で増幅した。PCR に用いたプライマーは 5pH が中性付近になるまで純水中で透析し、3 回ほど交換種類の硬骨魚種（タイセイヨウダラ、キンギョ、ゼブラフした。透析後、凍結乾燥機 FD-1（東京理科器械株式会社）ィッシュ、ティラピア、ヒラメ）、のⅠ型コラーゲンの各を用いて凍結乾燥したものを酸可溶性コラーゲン（Acid

塩基配列をマルチプルアラインメントし、保存性が高い部Soluble Collagen：ASC）とした。全ての操作は 5 ℃で行分をもとに、得られる断片が 50 − 100bp オーララップさった。

せるように設計した。増幅した PCR 断片を Mighty TAcloning Kit（TaKaRa）を用いてライゲーションし、サブク

精製コラーゲンのアミノ酸分析

ローニングし得られたプラスミドを、BigDye Terminator

凍結乾燥したコラーゲン試料 1 mg に蒸留水を 2 ml、濃v3.1 Cycle Sequencing Kit および ABI Prism 3100-Avant

塩酸を 2 ml 添加した後、ソノクリーナー 200D（株式会社Genetic Analyzer（Applied Biosystems）に供し、配列解カイジョー）中でソニケーションしながら、循環アスピレ析を行った。

ーター WJ-20（柴田科学株式会社）を用いて 10 分間吸引・脱気した。脱気後、ミニバキュームチューブをドライサー

イバラヒゲ I 型コラーゲンの精製

モユニット DTU-1C（タイテック株式会社）中で 110 ℃，試料となるイバラヒゲ（学名：Coryphaenoides acrolepis、24 時間インチュベートすることで試料を加水分解した。

英名：Pacific grenadier）は採取後、−50 ℃で保管したもの

放冷した後、試料をナス型フラスコに移し、ロータリーエを用いた。解凍後細切した皮から、コラーゲン以外のタンバポレーター（東京理化器機株式会社）を用いて試料を完パク質および脂質を除去するために 10 倍量の 0.1M NaOH全に乾燥させた。そこに、0.02M HCl を 3 ml 添加し、完全を添加し、並列スターラー SRS360YA（アドバンテックに溶解するまで攪拌した後、この溶液をマイクロシリンジ東洋株式会社）を用いて 1 日間攪拌後、日立冷却遠心機

で 1 ml とり、孔径 0.02 mm のディスポーザブルフィルター

himac CR 21E（株式会社日立製作所）を用いて 10,000×gユニット DISMIC-13cp（アドバンテック東洋濾紙株式会

で 10 分間遠心分離するアルカリ処理を 2 回繰り返した。

社）を用いてアミノ酸分析用ガラス瓶に濾過し、これをア

ここで沈殿に 10 倍量の純水を添加し、30 分間攪拌するこ

ミノ酸分析用試料としてアミノ酸分析に供した。とで沈殿を洗浄後、10,000×g で 10 分間遠心分離した。こ結の純粋による洗浄を上清の pH が中性付近になるまで繰り返した。洗浄後の沈殿に 10 倍量の 0.5M 酢酸を添加し、3日間攪拌後 10,000×g で 10 分間遠心分離し、上清を布で果シンカイヨロイダラ I 型コラー ゲンα1 サブユ ニット
cDNA 断片配列とそれより類推されるアミノ酸組成濾過した。この際得られた上清に終濃度 0.9M となるよう得られた 4 つの PCRcDNA 断片を連結することで塩基配NaCl を添加し、完璧に溶けるまで攪拌後、10,000×g で列 1935bp を決定し、582 残基のアミノ酸配列を推定した。

30 分間遠心分離を行った。その後デカントにより上清を同断片配列は、N 末端側のシグナルペプチド領域、テロペ除き、沈殿を 10ml の 0.5M 酢酸に完璧に溶解した。これをプチド領域および三重らせん構造の一部を具体的には透析用セルロースチューブ UC30-32-100（三光純薬株式会［Gly-X-Y］のトリプレット構造を 140 組含むことが判明社）に密封し、0.1M 酢酸中で 2 日間透析（2 回交換）後、した（図 1）。cDNA 配列から予想される同遺伝子のアミ3 つの異なるサブユニットが 3 重らせんを構成している。シグナルペプチド、N- プロペプチドおよび C- プロペプチドは、コラーゲンが成熟する過程で切断される領域。Gly-X-Y トリプレットの X お
よび Y の位置には各々 Pro およびHyp が多く見られる。
図１

魚類Ⅰ型コラーゲン構造の模式図−5−

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

ノ酸組成を同じく配列の明らかになっている他種生物の同ことが明らかになった。

領域と比較し、表 1 に示した。結果、同断片配列において考も他種生物と同じく、Gly がおおよそ 1/3 の割合を占める察結果が得られた。また Pro の含有量が他生物よりも低く、本研究ではシンカイヨロイダラのⅠ型コラーゲンの a1Ser の含有量が多い傾向があった。特に Ser の多さは顕著サブユニットの断片配列を決定し、それから得られるアミであり、同じ魚類であるゼブラフィッシュ同遺伝子との比ノ酸配列から同遺伝子中に Ser 残基が多く含まれているこ較では約 4.6 倍、ヒト同遺伝子の約 2.8 倍含まれていることを明らかにした。その逆に Pro は表 1 で比較した生物中とが分かった。

最も少ない値を示した（15.5 残基）。緒言で述べたように
本分子には Pro の水酸化された Hyp が含まれると予想されイバラヒゲ皮由来の I 型コラーゲンの精製とそのアミノ酸組成

るが、これは翻訳後修飾であるため、cDNA 配列のコドンからアミノ酸を推測する方法では Hyp の含量は分からなイバラヒゲの皮 4.8g（湿重量）から、上記の手法にてい。それ故ここでの Pro の量は実際タンパク質における59.5mg の酸可溶性コラーゲン（ASC）を精製することがPro と Hyp の合計と考えるべきである。尚、著者らはⅠ型出来た。表 2 に各試料から精製した ASC のアミノ酸組成

コラーゲンを構成する a2 および 3 鎖においても同様の解を示した。イバラヒゲⅠ型コラーゲンを構成するアミノ酸析を行っているが、結果が a1 鎖に追従するものであるこは Gly が全体の 1/3 を占め、Pro は 100 アミノ酸残基あたとを付記しておく。

り 7.5、Hyp は 4.8 残基、Ser は 7.3 残基含まれていること

一方で我々はシンカイヨロイダラよりやや浅い水深に生が明らかになった。これまでに精製タンパク質アミノ酸組息するイバラヒゲよりⅠ型コラーゲンを精製し、そのアミ3−5）と比べても深海魚であるイバラノ酸組成を検討した。その結果、実際のタンパク質を対象

ヒゲで Ser の含量が最も多く、Pro、Hyp 量は最も少ないとしても深海魚Ⅰ型コラーゲンは高い Ser 含量を持つこと

成の報告がある他魚種

表１ シンカイヨロイダラⅠ型コラーゲン α1 サブユニット cDNA 断片配列より類推されるアミノ酸組成−6−

表２ イバラヒゲ精製Ⅰ型コラーゲンのアミノ組成

深海生物由来コラーゲンを活用した化粧品基材への応用研究が明らかになった。また同実験では cDNA の解析と異なり、海性の魚類と比べて、Pro および Hyp のイミノ酸含量を減Hyp の量も実際に測定することが出来る。その結果、Proらし、Ser を増やす傾向にあることが明らかになった。今および Hyp 含量はともに他魚種に比して低いという結果

回、検討を行ったコラーゲンが、特有の物性や保湿効果をが得られた（表 3）。これもシンカイヨロイダラの遺伝子示すことが分かれば化粧品基材としての応用も大いに考え配列から予想される結果に一致する。

ることが出来る。しかしながら、深海魚のコラーゲンの研Pro はそれが水酸化された Hyp とともにはイミノ酸とも究でネックになるのが、その入手できる量である。バイオ呼ばれる。これらイミノ酸は側鎖がアミノ基と結合して環マスとしての深海生物は莫大なものがあるが、6000m も状になっている故、立体配置座に大きな制限を与える。この深海となるといまだ手軽なアクセス方法は確立されておの制限によってコラーゲンの三重らせんは安定化するともらず、試料としてのコラーゲンをグラム単位で調製するこいえるし、柔軟性を失うとも考えることが出来る。またとは、ティラピアや畜産物のコラーゲンに比べて大きな壁

Hyp 中の水酸基は（議論は分かれるようだが）それの作りになる。コラーゲンは構造が特殊なことや、翻訳後修飾がだす水素結合によって三重らせんを安定化させると考えら必要なこともあって組換えタンパク質の研究は他の分子にれている。今回の解析によって深海魚類であるシンカイヨ比べ立ち遅れている現状があるが、Pinkas 2011 らによっロイダラ・イバラヒゲⅠ型コラーゲンは陸上生物や他魚種て大腸菌で作出に成功した例もある。また近年は人工遺伝に比してより少量の Pro、Hyp を持ち、より多くの Ser 残子は以前よりも安価で作出できるようになってきた。今回基を有することが、明らかになった。上記の事実に照らし得た内容を基盤にして深海から得たコラーゲンの構造をミ合わせて考えると、イミノ酸の減少によって構成するアミミックした分子を組換えタンパク質にて作り出し、化粧品ノ酸の立体配置座の制限が減る一方で、Ser を増やすこと基材としての可能性を探ることも考えてみたい。

で水素結合による三重らせんの安定化を保持していると考（引用文献）えられる。
上記のことは深海魚 I 型コラーゲン分子の低水温・高水

１）コラーゲンの製造と応用展開 II：圧の深海環境への適応の結果と考えられる。低水温のみに

谷原正夫監修 , シーエムシー出版

対する魚類タンパク質の適応として酵素の活性中心付近で

２）海洋性コラーゲンを探る：の構造を少ないエネルギーで動かせるように柔軟化させて

３）Nagai T, Izumi M and Ishii M,: Fish scale collagen.

いるとの報告がある。また、高い水圧下への適応として分Preparation and partial characterization. International子が“柔軟化”するというのは一つの戦略であると考えら

Journal of Food Science and Technology, 39 , 239 – 244 ,れるが、深海魚ミオシンのロッド構造などではその構造を2004 .

コンパクトにして固くしていると考える例もある。

木村茂 ,五曜書房

４）Shahiri Tabarestani H, Maghsoudlou Y, Motamedzadeganこれらコラーゲン分子の構造の適応がいかに本分子の構A, Sadeghi Mahoonak AR, Rostamzad H,: Study on some造に影響しているのかを検討し、化粧品基材への応用をは

properties of acid-soluble collagens isolated from fish

かることが今後の課題である。

skin and bones of rainbow trout (Onchorhynchus

総mykiss). International Food Research Journal, 19 , 251 -括

257 , 2012 .

本研究において深海魚のⅠ型コラーゲンは陸上動物や浅５）Zhang Y, Liu W, Li G, Shi B, Miao Y, Wu X,: Isolationand partial characterization of pepsin-soluble collagenfrom the skin of grass carp (Ctenopharyngodon idella).

表３ イバラヒゲ精製Ⅰ型コラーゲンの Pro、Hyp、Ser 含量の他魚種との比較

Food Chemistry, 103 , 906 – 912 , 2007 .
６）Fields PA.; Review: Protein function at thermal
extremes: Balancing stability and flexibility. Comp.
Biochem. Physiol. A 129 , 417 - 431 , 2001 .
７）Morita T,: Comparative sequence analysis of myosin
heavy chain proteins from congeneric shallow- anddeep-living rattail fish (genus Coryphaenoides). The
Journal of Experimental Biology, 211 , 1362 - 1367 , 2008 .
８）Pinkas DM, Ding S, Raines RT, Barron AE,: Tunable,
post-translational hydroxylation of collagen Domains inEscherichia coli. ACS Chem Biol. 6 , 320 - 324 , 2011 .

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