皮膚の老化における染色体構造の変化と遺伝子修復機構に関する研究
理化学研究所花

岡文雄

Our previous experiments suggest that the length of the linker DNA which connects
nucleosomal core particles becomes to be heterogeneous by aging, both in vivo and invitro in human skin fibroblasts. In order to get some insight on the relation between
growth capacity and the regularity of nucleosome structure, we examined the structuralchange of lymphocyte chromatin upon growth stimulation with FHA. When chromatinof lymphocytes from peripheral blood was digested with the nuclease, unclear pattern ofelectrophoresis was observed. However, discrete ladders of nucleosomal DNA were de­tected in the case of lymphocytes stimulated with FHA for 48h and 96h. Their digestion
patterns were similar to those of lymphoma cell lines. These results indicate that theregularity of chromatin structure is closely related to the activity of cell proliferation.
As for the UV damage on the skin, we are investigating the mechanism of nucleotide
excision repair. We have purified to homogeneity a repair complex by in vitro comple­
mentation of the XP-C defect in a cell-free repair system containing UV-damaged SV
40 minichromosomes. The complex has a high affinity for ssDNA and consists of twotightly associated proteins of 125 and 58kd. Subsequent cDNA cloning revealed that the125kd subunit is a N-terminally extended version of previously reported XPCC geneproduct which is thought to represent the human homolog of the S. cerevisiae repair gene
RAD4. The 58kd species turned out to be a human homolog of yeast RAD23. The 58kd
species and yeast RAD23 share a ubiquitin-like N-terminus. The nature of the XP心defect implies that the complex exerts·a unique function in the genome overall repair
pathway which is important for prevention of skin cancer.

するバリヤ ー としても働いている。

1 . 緒

言

この皮膚は、 上皮組織としての表皮と、 結合組織としての真皮からなる。 表皮は、 その大部分をわれわれ人間の体全体を覆っている皮膚は体の占める表皮細胞と、 そこで作られて、 上述のバリ中で 番大きな器官であり、 個体の維持に重要なヤ ー としての機能を果す角質層（ケラチン層）、役割を果たしている。 すなわち、 外界からの情報

それに体表から日々剥離していく角質層を補うた

一一に敏感に反応し、 体内の環境を 定に維持するために、 常に細胞分裂を繰り返している表皮最深部

めの 一種のセンサ ー の役割を果たすと同時に、 外の基底細胞とから成り立っている。 真皮は膠原繊界からの物理的・化学的刺激に対して体内を保護維を中心とする繊維性結合組織で、 ほかに弾性繊

Studies on the Changes in Chromatin Structureduring P五g of Human Skin Fi­
broblasts and the Mechanism ofDNA Repair
Fumio Hanaoka
Riken Institute of Physical and,Chemical Research、維、血管、 神経、 平滑筋繊維などを含んでいる。
既にわれわれはヒトの皮膚繊維芽細咆が老化に伴って、 その細胞機能の中枢である染色体構造に変化をきたすことを観察している I) 。 本研究では、 その原因が細胞の増殖能と関係しているかどうかを、 ヒト末梢血リンパ球を用いて調べる。 同時に紫外線などによる遺伝子の損傷に対し、 皮膚-125-の細胞がどのような修復機構で対処しているかを種類のポリペプチドを含む画分が得 られた。 p

分子レベルで明らかにするための一つのアプロ ー125/p58複合体をグアニジンによる変性条件下、チとして、 われわれの確立した無細胞クロマチンゲル濾過HPLCによって分離し、 それぞれのポ修復系

2, 3 lの応用を試みる。

リペプチドをCNBrで分解した後、 逆相HPLCによって展開した。 p125については 一 ヶ所、 P

2. 実

験

58についてはニヶ所の部分アミノ酸配列を決定した。

2. 1

ヌクレオソーム構造の規則性の解析

細胞を界面活性剤を含む等張緩衝液中でホモジ

2. 4

クロコッカルヌクレア ー ゼを加え、 37℃で 一 定

XP-C群を相補する蛋白質のcDNAクロ ー ニング

ナイズすることにより核を調整した。 そこにマイ決定されたアミノ酸配列をもとに、 pl25につ時間保温した。 反応後、 DNAを抽出・精製しア

いては2組のオリゴヌクレオチド混合物を合成し、ガロ ー スゲル電気泳動法により分析した。

それらを用いた RT-PCRによってDNAプロ ープを作成した。 またp58については複数のオリゴ2.2ヌクレオチドを合成し、 プロー プとした。 以上の無細胞DNA修復系による修復能の検出

SV40のウイルス粒子を弱アルカリ処理するこプロ ー ブを用い、 HeLa細胞のcDNAライプラとによって得られるミニ染色体に紫外線を照射し、リー をスクリー ニングし、 ポジティブなクロ ー ンビリミジンニ量体を主とするDNA塩基損傷を導のなかでインサ ートの最も長いものについて塩基入した。 これを、 ATP およびCa- ⑫P〕 dCTP配列を決定した。

を含むデオキシヌクレオチド基質等の存在下、

3. 結果と考察種々の細胞粗抽出液と反応させた。 この時、 反応
液中には紫外線未照射のプラスミドpUC19を共存させ、 内部標準とした。 ヌクレオチド除去修復

3. 1

細胞増殖とヌクレオソ ー ム構造の規則性によって損傷が 修復されれば、 その部分に短い正常ヒト末梢血リンパ球、 T 細胞由来CEM細DNA合成が起こり、 放射標識されたヌクレオチ胞、 B細胞由来WILL II細胞についてクロマチドが取り込まれることになる。 この反応液からン構造を比較した。 CEM細胞、 WILL II細胞のDNAを抽出し、 制限酵素で直鎖状にした後、 ア両がん細胞ではヌクレオソ ー ムの単量体から 6、ガロ ー スゲル電気泳動でSV40DNAとpUC19を7量体までの明瞭な階段状の バ ンドが検出された。

分離し、 オー

トラジオグラフィーを行った。 ウイ

ルスDNAへの放射活性の取り込みを、

イメ ージ

一方、 正常リンパ球では3、 4量体までのヌクレ
オソ ー ムDNAは確認できるものの、 全体にバックグラウンドが上がり、 不均ーな分解様式を示しアナライザ ー によって定量化した。

た。 正常リンパ球をPHA存在下、 48時間、 96
XP-C群を相補する蛋白質の精製時間と培養したところ、 バ ンドの位置は変わらず、上記の無細胞系にXP-C群患者細胞の抽出液それぞれのビ ー クの高さが増した（図1)。 このを適用し、 :t�eLa細胞の核抽出液を出発材料としことは、 増殖能の低い細胞ではヌクレオソ ー ム:})てXP-C群の修復欠損を相補する因子を精製し規則性が低下し、 リンカ ー DNAの長さにバ ラつ

2. 3

た。 ホスホセルロ ー ス、 変性DNAセルロ ー ス、きが多くなるが、 細胞分裂を繰り返すと、 その間CMコスモゲルと Mono Qの4段階のカラムクロにヌクレオソ ー ム間の長さがそろってくることをマトグラフィ ー により、 分子量125Kと58Kの二示している。 したがって正常皮膚繊維芽細胞にお-126-

皮膚の老化における染色体構造の変化と遺伝子修復機構に関する研究

a性群の細胞抽出液いずれもが、修復正常なヒト293細胞抽出液に比べて低い活性しか示さなかっauuoqJ
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た。 また、異なる群のXP 細胞抽出液を適当な割合で混合すると相互の欠損が相補され， 修復合成活性の回復が見られた 3) 。 そこで遺伝子、蛋白質の両方とも解析の遅れていた XP-C 群について、相補因子の生化学的な同定を試みた。
阪1蓼汲党枯ぼ'l-1i叫町抽硲坊り炭怜油液を色発材朽こして、 4段階のカラムクロマトグラフィ ー により得た精製標品は、SDS ポリアクリルアミドゲル
電気泳動上、分子量125Kと58Kの二種類のポリbペプチドを含んでいた。 この二つのポリペプチドは、ゲル池過およびグリセロ ー ル密度勾配遠心において活性と挙動を共にしたことから、物理的な複合体を形成しているものと考えられる。 この因子は XP-C 群の細胞抽出液の修復欠f員を特異的に相補し、 C 群以外のXP 細胞抽出液による修復

c

I
I
I’ ’: ,合成には全く影響を与えなかった。 このことから、本因子が XP-C 群の原因因子である可能性が非常に高いと思われた。

＇3. 3

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我々の研究とは独立に、米国テキサス大学のグ

ヒト正常リンパ球の増殖とヌクレオソ ー ムの規ル ー プがcDNA発現ライプラリ ー を XP-C 群細1220 1070 905
図115 525 3ム5

XP-C 群相補蛋白質のcDNAクロ ー ニ

則性
無処理のヒト正常リンパ球(a) 、 同じくPHA処理、 48時間(b)および96時間(c)のサンプルについて、 「実験」の項で述ぺた方法によりヌクレオソ ー ムの規則性を解析した。

胞に導入することにより、 C群の修復欠損を相補する遺伝子 XPCC を単離した叫その塩基配列から予想される遺伝子産物は 823個のアミノ酸からなる惟定分子員93Kの蛋白質で、我々が生化いて観察された、老化細胞クロマチンのヌクレオ学的に同定した125K、58Kのどちらとも合致し

ソ ー ム配列の不規則性は、細胞の増殖能の低下になかった。 そこでXPCC 遺伝子産物と我々のpよって結果的に引き起こされたものと考えられる。

125/p58との関係を明らかにするために、cDNA

クロ ー ニングを行った。
3.2

無細胞系を用いた XP-C 群相補因子の精製

紫外線照射したSV40ミニ染色体を鋳型としてスクリー ニングの結果、pl25について長さ3.6kbのcDNAクロ ー ンが得られた。 その塩基配列を決定したところ、 XPCC 遺伝子の配列とほぼ用いる無細胞DNA修復系において、ヌクレオチ一致した。 しかしながらpl25のcDNAは、既にド除去修復機構に欠陥を有するヒト遺伝病、色素発表されている XPCC のcDNAよりもN末端が性乾皮症 (XP) の A から G までの七つの相補長く、我々が蛋白質レベルで決定したN末端の-127-アミノ酸配列がXPCCには含まれていなかった。

Hydrnpathy

pl25のORF はXPCCよりも 117個多い940個の; 1111

アミノ酸からなり、推定分子量は106Kと計算さ11l0一れた。

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100111公.JI.JOO—

XPCC遺伝子は出芽酵母のRAD4遺伝子と部図3分的な相同性を示すことが報告されているが、新たに同定されたN末端部分については既知の蛋m

心a.a.

IJ

p58の疎水性プロットとリン酸化可能部位
アミノ酸残甚数の下のバーはリン酸化可能部位を示す。

白質との相同性は特に見い出されなかった。推定
アミノ酸配列より、pl25は極めて親水性に富み、ていることが示唆された。

またカゼインキナ ー ゼII、 Cキナ ー ゼを初めとす本研究の結果、無細胞 DNA修復系を用いて精るプロテインキナ ー ゼによってリン酸化を受ける製されたXP-C群の修復欠損を相補する蛋白質可能性のある配列を非常に多く含むことが予想さが、遺伝学的に同定されたXPCC遺伝子産物とI一致することが分かった。このことは、我々の無れた（図2 )。

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500

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細胞系が細胞内のヌクレオチド除去修復反応を忠実に反映していることを改めて示 したものと言え900C,ai・る。さらに、XP-C群相補蛋白質のnativeな形髯�r���:り＼［叫図2を明らかにできたこと、 XPCCと新たな蛋白質との相互作用が見い出されたことは、無細胞系を利用することの有用性を証明した。今後、組み換

p125の疎水性プロットとリン酸化可能部位
アミノ酸残基数の下のバーはリン酸化可能部位を示す。

え蛋白質の大量発現、および抗体の作成によって、ヌクレオチド除去修復におけるpl25/p58の機能を明らかに していく予定である。特にXP-C群

一方、p58について2.9kbのcDNAクロ ンがの細胞は転写とカップルした修復に関しては正常得られた。その全塩基配列を決定したところ、アで、転写と無関係に起こる修復に欠陥があること

ミノ酸数409からな る推定分子量 43Kの未知の蛋が分かっている。その分子レベルでの解析に興味

ーー検索の結果、が持たれる。また上述の脱リン酸化の効果がどち

この蛋白質は出芽酵母の第V染色体上のSYGP2らのコンポ ー ネントによるものなのかを明らかに白質をコドしていた。ホモロジー

遺伝子のORF29と比較的高い相同性を示したが、できるはずである。さらに、この無細胞系を用いこれが実は DNA修復に関係 した遺伝子、RADることによって、他のXP相補因子を初めとする。 p58 も酵母のDNA修復因子を同定することが可能であろう。

23、であることが判明した

5)

RAD23も、N末端部分がユビキチンと似た配列をしており、その部分の機能に特に興味が持たれ文 献る。pl25同様、p58についてもカゼインキナ ー1)

ゼ rr 、およびCキナ

ー

ゼでリン酸化されうるアミIshimi, Y., Kojima, M., Takeuchi, F.,
Miyamoto, T., Yamada, M. and Hanaoka,ノ酸配列が数ケ所見い出された（図3)。 そこで

F., Exp. Cell Res., 169, 458-467 ·1.987).

精製 したXP-C群相補蛋白質 を、アガロ ー ス

2) Sugasawa, K., Masutani, C. and Hanaoka,

ビ ー ズに固定したアルカリ性ホスファタ ー ゼで処

F., J. 因ol. Chem., 268, 9098-9104 (1993).

理したところ、相補活性が失われた。このことか

3) Masutani, C., Sugasawa, K., Asahina, H.,ら、本蛋白質の活性がリン酸化による制御を受けTar jrn, K. and Hanaoka, F., J. Biol, Chem.,-128-

皮廣の老化における染色体構造の変化と遺伝子修復機構に関する研究

268, 9105-9109 (1993).

4) Legerski, R. and Peterson, C., Nature, 359, 70

5) Melnick, L. and Sherman, F., J. Mol. Biol.,-73 (1992).

-129-233, 372-388 (1993).