皮膚の天然保湿因子（NMF）の形成における転写因子MafB の役割

横浜市立大学生命医科学研究科

片 岡浩 介Natural Moisturizing Factor (NMF) in the skin epidermis is a complex mixture of water-soluble compounds such asamino acids. Filaggrin protein is one of the major components of NMF and is digested to amino acids through multi-stepprocessing and modifications. In this study, we focused on the transcriptional regulation of the filaggrin gene expression
during skin epidermal development. We identified an enhancer element upstream of the filaggrin gene and found thata transcription factor MafB activates it. Further elucidation of the mechanism of the filaggrin expression may help tounderstand how NMF are formed and maintained in skin epidermis.

１．緒

く不明である。

言

そこで本研究では、フィラグリンの転写制御やプロセシ

皮膚において水分保持の機能を担っているのは、主としング調節の分子機構を探ることによって、皮膚の水分保持て天然保湿因子（Natural Moisturizing Factor：NMF）と機能の調節機構の一端を明らかにすることを目的とする。

呼ばれる、いわゆる「うるおい成分」である。NMF は、

２．実

フィラグリンなどのタンパク質の分解生成物から複雑な過験

NMF の主たる成分であるフィラグリンタンパク質は、繰

２.１ MafB 欠損マウスの皮膚におけるフィラグリンタ
ンパク質の異常り返し構造を持った巨大なポリペプチド鎖（プロフィラグ

皮膚の角化細胞で発現する転写因子 MafB を欠損するマリン）として合成されたのちに、その繰り返し構造の単位

ウスの皮膚を組織学的に解析し、またフィラグリンに注目へと切り離され、さらにアミノ酸へと分解されて NMF をしてその発現レベルやプロセシングを調べた。

程 を 経 て 形 成 さ れ る こ と が 近 年 明 ら か に な っ て き た。

構成する。NMF は保湿だけでなく皮膚のバリア機能・恒常性維持にも必須であり、例えばフィラグリン遺伝子の変

２. ２

MafB 過剰発現マウスの作製と解析異によって皮外界からの異物・細菌の侵入の防禦能が低下

転写因子 MafB が皮膚の形成とフィラグリンタンパク質して、アトピー性皮膚炎の発症リスクが増大することもわの発現に及ぼす影響をさらに調べる目的で、MafB を過剰かっている 1）。

発現するマウスを作製し、その表現型を解析した。

フィラグリンタンパク質のプロセシングの過程には、各種の切断酵素（プロテアーゼ）が関与しており、さらに、

２. ３

MafB 欠損マウスにおける遺伝子発現解析

フィラグリンタンパク質のリン酸化やシトルリン化などの野生型および MafB 欠損マウス（胎生 18 . 5 日）の皮膚角修飾も必要とされるなど、複雑で精妙に制御されている。

化細胞より RNA を抽出し、フィラグリン遺伝子 mRNA のこれまでに、内外の精力的な研究によって、プロセシング発現レベルを、定量 PCR 法を用いて検討した。また、網に関わる酵素（プロテアーゼ）などが同定されて、少しず羅的に遺伝子発現の変化を調べる目的で、野生型およびつその過程の分子機構があきらかになりつつあるが 2）、まMafB 欠損マウス（胎生 18 . 5 日）の皮膚角化細胞から抽出だ全容の理解には至っていない。特に、フィラグリンの合した mRNA を用いて、マイクロアレイ解析を行った。

成過程（遺伝子発現）の制御機構については、普遍的な転る他には、あまりよく分かっていないのが現状であり、皮

２. ４ フィラグリン遺 伝 子座 周辺の in silico 解 析とECR の同定

膚を構成する角化細胞でのみ特異的に発現する仕組みは全フィラグリン遺伝子座周辺の in silico 解析を行い、発現写因子 Activator Protein 1（AP- 1）の関与 3）が知られてい調節に関わるエンハンサーとして機能する可能性が高い領域（Evolutionally conserved non-coding region; ECR）のRoles of transcription factor MafB in theformation of natural moisturizing factor（NMF）of skin epidermis
Kohsuke Kataoka
Graduate School of Medical Life Science
Yokohama City University

同定を試みた。

２. ５ フィラグリン遺伝子 ECRを介したMafB による転写の活性化− 90 −

同定された ECR を含む DNA 領域をヒト・ゲノム中から

皮膚の天然保湿因子（NMF）の形成における転写因子 MafB の役割クローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子を持つレポーター・

3.2

MafB 過剰発現マウスの作製と、その皮膚の解析プラスミドに組み込んで、このレポーター・プラスミドと転写因子 MafB が皮膚の形成とフィラグリンタンパク質

MafB 発現ベクターを培養細胞 BHK 21（ハムスター腎繊維の発現に及ぼす影響をさらに調べる目的で、MafB を過剰芽細胞由来）に共発現させ、ルシフェラーゼ活性を測定す発現するマウスを作製することにした。皮膚角化細胞の基ることによって、MafB が ECR 配列を介して転写を活性化底層で発現するケラチン 14 遺伝子のプロモーター支配下しうるかどうかを検討した。

で MafB を過剰発現するトランスジェニック・マウスを作３．結製し、３系統を得ることができた。そのうちの１系統（Tg 2）

果の８日齢の外観を示す（図１）。これらの過剰発現マウス

３.１ MafB 欠損マウスの皮膚におけるフィラグリンタンパク質の異常

では、皮膚の過剰な角化が観察され、組織学的な解析から私たちはこれまでに、bZip タイプの転写調節因子 MafBし、この表現型は週齢が上がり成体になると次第に消失し、が皮膚の角化細胞で発現していることを見出だしていた。

野生型マウスと違わない外観となった。その一方で、成体

MafB は、マクロファージ 4）や副甲状腺 5）などの組織・細においてはおよそ半分の頻度でパピローマの形成が見られ、胞の分化を司ることがこれまでに明らかにされていたので、それらのパピローマではフィラグリンタンパク質が過剰に角化細胞の分化にも深く関与している可能性が考えられた産生されていた。

も、角質層が過剰に生成されていることがわかった。ただこれらの MafB 欠損および過剰発現マウスの皮膚の解析ため、MafB 遺伝子を欠損するマウスの皮膚を解析するこから、MafB は皮膚の角化細胞の分化を正に制御することとにした。
組織学的な解析から、MafB 欠損マウスの皮膚では、角が示唆された。

質層の減少と層板顆粒の減少が見られたことから、フィラ抗フィラグリン抗体を用いた免疫組織染色により、実際に3 . 3 MafB 欠損マウスにおける遺伝子の発現レベルの解析

フィラグリンタンパク質の発現レベルと分布の異常が起き次に、フィラグリンタンパク質の発現低下が、転写調節ていることがわかった。そこで、マウス皮膚よりタンパクのレベルで生じているかどうかを調べるため、野生型およ質 を 抽 出 し、Western blot 法 に よ り 解 析 し た と こ ろ、び MafB 欠 損 マ ウ ス（ 胎 生 18 . 5 日 ）の 皮 膚 角 化 細 胞 よ り

MafB 欠損マウスの皮膚ではフィラグリンタンパク質の発RNA を抽出し、それぞれにおけるフィラグリン遺伝子現量とプロセシングが明らかに低下していることが判明しmRNA の発現レベルを、定量 PCR 法を用いて検討したとグリンタンパク質の量が低下している可能性が予想された。

た。このことは、MafB がフィラグリンから NMF を形成ころ、野生型マウスのおよそ５分の１にまで低下していたする複数のステップを制御する重要な役割を担っているこ（図２）。フィラグリン遺伝子以外のさまざまな皮膚の角化とを示唆している。

過程に関与する遺伝子について、インヴォルクリン、ロリクリンなどの構造タンパク質を中心に調べたが、これらの遺伝子の発現レベルに変化はなかった。

図１ MafB 過剰発現マウスの作製と解析
ケラチン 14 遺伝子プロモーター支配下で MafB を発現するトランスジェニック・マウスを作製した。得られた３系統のうちの１つ（Tg ２）の外観を野生型（WT）と比較した。

図２ MafB 欠損マウスの皮膚角化細胞における定量 PCR 解析
フィラグリン遺伝子の発現量を、コントロールとした gapdh
遺伝子の発現量によって補正し、野生型マウス（WT）における発現レベルを１とした場合の MafB 欠損マウス（KO）における発現量をグラフ化した。

− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

さらに網羅的に遺伝子発現の変化を調べる目的で、野生域（Evolutionally conserved non-coding region; ECR）の型および MafB 欠損マウス（胎生 18 . 5 日）の皮膚角化細胞同定を試みた。このような保存領域は、近傍の遺伝子（こから抽出した mRNA を用いて、マイクロアレイ解析を行の場合フィラグリン遺伝子）の発現調節に関わるエンハンった（図３）。用いたアレイにはフィラグリン遺伝子は含サーとして機能する可能性が高いからである。

まれていないが、フィラグリン以外にもレペチン（フィラ図４に示すように、フィラグリンタンパク質はこれまでグリンタンパク質と構造的に類似している）などの角化にに指摘されている通りに動物種間の相同性は低いため、エ関与する構造タンパク質をコードする遺伝子のいくつかのクソン領域での相同性はほとんど見られない。一方で、遺発現が MafB 欠損マウスでは低下していることがわかった。

伝子の 5’
上流領域には進化的な保存性の高い領域が３カ所また、意外なことに脂質代謝に関連する酵素などをコードほど見いだされた。このことは、フィラグリン遺伝子の発する遺伝子の発現が上昇していることも判明した。MafB

現調節機構が哺乳類の皮膚形成において重要な役割を担っは転写制御因子として脂質代謝系遺伝子の発現を負に制御ているため、進化を通じて保たれてきたことを示唆していする活性も併せ持つ可能性が考えられた。

る。私たちはこれらの保存領域を、プロモーター近傍側から ECR 1 〜 3 と命名した。

3 . 4 フィラグリン遺伝子座周辺のin silico 解析とECRの同定
次に、フィラグリン遺伝子の発現制御機構を解明する手

3 . 5 フィラグリン遺伝子 ECRを介したMafB による転写の活性化がかりを得るため、フィラグリン遺伝子座周辺の in silico

ECR 1、ECR 2、ECR 3 はそれぞれエンハンサー活性を担解析を行うことにより、進化的に保存度の高い非コード領っている可能性が高いので、これらの領域をヒト・ゲノム

図３ MafB 欠損マウスの皮膚角化細胞のマイクロアレイ解析
MafB 欠損マウス（KO）における mRNA の発現量を野生型マウス（WT）と比較し、Gene Ontology（GO）解析を行った。

図４ フィラグリン遺伝子上流領域の動物種（哺乳類）間での保存性の in silico 検索
ヒトのフィラグリン遺伝子座（exon1 〜 3）とその上流領域（約 13kb）を、マウス、ラット、ウシ、イヌの相同な領域と ECR ブラウザ（http://ecrbrowser.dcode.org/）を利用して比較した。保存性の高い領域を、転写開始点の近傍から順に ECR1 〜 3 とした。

− 92 −

皮膚の天然保湿因子（NMF）の形成における転写因子 MafB の役割中からクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子を持つレポ４．考ーター・プラスミドに組み込んだ。このレポーター・プラ

察

スミドと MafB 発現ベクターを培養細胞 BHK 21（ハムス以上の解析より、転写因子 MafB は、フィラグリン遺伝ター腎繊維芽細胞由来）に共発現させ、ルシフェラーゼ活子上流に同定した ECR 2 領域中の MARE - like - 1 配列に結性を測定することによって、MafB が ECR 配列を介して転合することによって、フィラグリン遺伝子の発現を活性化写を活性化しうるかどうかを検討した（図５）。ECR 1（フすることが推測される。MafB は、皮膚においては角化細ィ ラ グ リ ン 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 近 傍 ）の み で は、胞のうちの有棘細胞に特異的に発現しており、これはフィMafB による活性化はほとんど見られなかったが、ECR 1ラグリン遺伝子の発現が開始する領域であって、フィラグと 2 を連結すると、MafB による顕著な活性化が観察されリンと MafB の発現パターンは一致している。このこととた。ECR 1 と３の組み合わせではそのような活性化は見ら併せて、MafB 欠損マウスの皮膚ではフィラグリン遺伝子れなかった。したがって、MafB は ECR 2 を介してフィラの発現が顕著に低下していることからも、MafB がフィラグリン遺伝子の発現を促進すると考えられた。

グリン遺伝子の転写を直接活性化することが示唆される。

さらに、MafB が直接結合する DNA 配列を同定するた

MafB が生体内で直接フィラグリン遺伝子上流に結合するめ、MafB 結合配列に類似した DNA 配列を ECR 中から検かどうかを、今後クロマチン免疫沈降法などを用いて調べ

索 す る と、MafB が 結 合 す る 可 能 性 の あ り そ う な 配 列る必要がある。

（MARE 類似配列）が３つ見つかった。そこで、これらのまた、MafB がフィラグリン以外の遺伝子の発現も制御配列に塩基置換を導入したレポーター・プラスミドを作成しているかどうかを調べることも、今後検討すべき重要なし、同様にルシフェラーゼ・アッセイによって MafB によるポイントのひとつである。興味深いことに、マイクロアレ活性化を検討した。すると、３つの MARE 類似配列のうイ解析から、MafB は脂質代謝系の酵素をコードする遺伝ちの１つ（MARE - like - 1）を変異させた場合に MafB によ子群の発現を負に制御することが示唆された。脂質代謝は、る 活 性 化 が 低 下 し た。 し た が っ て、MafB は ECR 2 内 のフィラグリンをはじめとする NMF 成分とともに皮膚の保MARE - like - 1 配列に結合することによってフィラグリン

湿 や バ リ ア 機 能 に と っ て 重 要 で あ る こ と を 考 え る と、遺伝子を活性化すると考えられた。

NMF と脂質がバランスよく供給されるような仕組みが存在することが予見され、今後新しい研究分野となりうるだろう。
本研究では、フィラグリン遺伝子の発現に重要だと思われるエンハンサー領域として ECR 2 を同定したが、ECR 2内には MafB が結合する配列のみならず、皮膚の形成に重要な役割を担っていると考えられるいくつかの転写制御因子が結合しうる配列も見出だされた。組織特異的な遺伝子の発現は、いくつかの転写因子が組み合わさることによって協調的に活性化されることがしばしば見出だされるので、フィラグリンの発現制御においても、MafB がこれらの転写因子群と協調して機能している可能性が充分に考えられる。このようなエンハンサー解析から、NMF の形成や皮膚バリア機能の獲得を担う新規因子（特に転写制御因子）が特定される可能性が見えてきた。近年、フィラグリンの発現を遺伝子レベルで亢進させるような薬剤が発見され、アトピー性皮膚炎の治療薬として期待されていることからも 6）、フィラグリンを含めた皮膚 NMF 関連因子の転写制御機構の解明は今後ますます重要になると考えられる。

図５ MafB によるフィラグリン遺伝子 ECR の活性化
図中に示す ECR を含むルシフェラーゼ発現プラスミドを、MafB 発現プラスミドと共に培養細胞 BHK21 にトランスフェクションにより導入し、ルシフェラーゼ・アッセイを行った。
ECR1 のみを含むプラスミドを導入した場合のルシフェラーゼ活性を 1 とした相対値を示す。＊; p<0.01（引用文献）
１）Palmer CNA, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A,− 93 −

Zhao Y, Liao H, Lee SP, Goudie DR, Sandilands A,Campbell LE, Smith FJD, O’Regan GM, Watson
RM, Cecil JE, Bale SJ, Compton JG, DiGiovanna JJ,

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Fleckman P, Lewis-Jones S, Arseculeratne G, Sergeant

Hasegawa K, Zhang C, Yokomizo T, Esaki R, Kuroda

A, Munro CS, Houate BE, McElreavey K, Halkjaer

E, Yoh K, Kudo T, Nagata M, Greaves DR, Engel JD,LB, Bisgaard H, Mukhopadhyay S, and McLean WHI.

Yamamoto M, and Takahashi S. MafB is essential

Common loss-of-function variants of the epidermal

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2006 .
２）Matsui T, Miyamoto K, Kubo A, Kawasaki H,H, Hitoshi S, Ikenaka K, Hosoya T, Hotta Y, Takahashi

Ebihara T, Hata K, Tanahashi S, Ichinose S, ImotoS, and Kataoka K. MafB interacts with Gcm 2 andI, Inazawa J, Kudoh J, and Amagai M. SASPase

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3 . 320 - 333 . 2011 .
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Nakamizo S, Nakashima C, Nakajima S, Watanabe T,

protein 1 activity is involved in the regulation of

Miyachi Y, Narumiya S, and Kabashima K. Possible

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３）Jang４）Moriguchi T, Hamada M, Morito N, Terunuma T,− 94 −