細胞内小器官ペルオキシソ ー ム：エ ー テルリン脂質の生合成と酸素ラジカルスカベンジャ ー 機能及び欠損症
九州大学 理学部藤木幸夫

We have isolated peroxisome biogenesis mutants from Chinese hamster ovary (CHO) cells by the 9- (1'­pyrene) nonanol/ultraviolet (P90H/UV) method, using the wild-type CHO-Kl cells that had been stablytransfected with cDNA encoding peroxisome assembly factor-I (PAF-1). Nine P90H/UV-resistant cell clones,ZP104, ZP105, ZP106, ZP107, ZP108, ZP109, ZPllO, ZPlll, and ZP114, were isolated and examined for
intracellular location of catalase, a peroxisomal matrix enzyme, by immunofluorescence microscopy using
anti-catalase antibody. 111ese mutant cell clones showed cytosolic localization of catalase, apparently indicating
the defect of peroxisome biogenesis. Mutants lacking morphologically recognizable peroxisomes also showed
typical peroxisome assembly-defective phenotype such as severe loss of catalase latency and resistance to 12(1'-pyrene) dodecanoic acid (P12) /UV treatment. By transfection of cDNAs for PAF-1 and PAF-2 and cellfusion analysis between the CHO cell mutants including previously isolated Z24, Z65, and ZP92, six mutants,ZP105, ZP104 and ZP109, ZPllO and ZPlll, and ZP114 were found to belong to four novel complementationgroups, respectively. Complementation analysis with fibroblasts from patients with peroxisome biogenesis
disorders such as Zellweger syndrome revealed that ZP105 and ZP104/ZP109 were found to be in the same
complementatin as human groups II and III, respectively. Furthurmore, ZPllO/ZPlll and ZPl14 were notclassified to any of.ten human complementation groups, indicating that these two groups of mutants are inthe 11th and 12th complementation groups in mammals. Thus, the newly isolated CHO cell mutants defectivein peroxisome biogenesis would be very useful for not only isolating peroxisome biogenesis factors but alsodelineating pathogenic genes responsible for peroxisome biogenesis disorders.

緒ソ ー ム 病には、 副腎白質ジストロフィ ー (ALD)

言などの単 一 酵素欠損症 、 rhizomelic chondrodys­

ペルオキシソ ー ム (peroxisome) は 、 真核細胞
一plasia punctata などの複数酵素異常症およびペルに広く分布する 重の単位膜で囲まれた球状ないオキシソ ー ム欠損症がある。 そのうち最も重篤なし楕円形の直径 0.3 から 1µmの細胞内小器官（オものはZellweger症候群や新生児型 ALD などいわルガネラ）である。 その生理的機能は過酸化水素

ゆるペルオキシソ ー ム欠損症であり 、 平均寿命もの生成を伴う酸化反応（呼吸反応） の他 、 脂肪酸

1 年未満と非常に短く、の¢酸化 、 特に最近注目されている極長鎖脂肪酸

現在までに 10 の相補性群が報告されている 2) 、 3) 。

（炭素鎖C22 以上）の短鉗化 、 プラスマロ ー ゲンな

ペルオキシソ ー ムの形成機構については、 細胞質

どエ ー テルリン脂質の合成、 胆汁酸の生合成などの遊離型ポリソ ー ム で合成された構成タンパク質

多岐にわたる 1 ) 。

方 、 ペルオキシソ ー ム 機能のが翻訳後すでに細胞内に存在しているペルオキシ障害は遺伝性の致死的疾患をもたらすことが判明

ソ ー ム に移送された後、 成長、 分裂により増殖しし、 このオルガネラは生体機能に不可欠と考えらていくというモデルが現在受け入れられている 4)

一れるに至っている。 先天性代謝異常症ペルオキシ
Peroxisome : biogenesis of phospho­
lipids, oxygen radical scavenger, andperoxisome biogenesis disorders

また我々は、の共通常染色体劣性遺伝病として

0

一群のペルオキシソ ー ム タンパク質c 末端 3 アミノ酸配列 SerI Ala-Lys/Arg/

His-Ser-COOH (SKL モチ ー フ） がペルオキシ

ソ ー ム局在化シグナルであることも in vitro タン

Yukio Fujiki,

パク質輸送系、 遺伝子工学的手法を用いて見出し

Kyushu University Faculty of Scienceた 3) 、 5) 。 その他 、 ペルオキシソ ー ムの生合成機構やヒト欠損症病因解明を目的として、 我々はヒト-67-

ペルオキシソ ー ム欠損症患児由来細胞と同じ表胞ZP92に対しては、 最近、 相補活性を有するPAF

現型を示す3つの相補性群に属するペルオキシ- 2 cDNAのクロ ー ニングに成功して＼ヽる1111

0ソ ー ム欠損性CHO(Chinese Ha mster Ovary )細本研究では 、 以下の項目を研究目的とした。

胞株 、 Z24、 Z65 およびZP92を現在までに分離している い 、 7) (図1)。 その1つ ， Z65細胞に対しペ1 . 1）レオキシソーペルオキシソ ー ムの形成機構と病 因遺伝子の解明におけるCHO変異細胞の有効性が実ムの形成を回復させるcDNAを遺証されたことから、 さらにより多くの新しい伝学的相補活性を指標にしてクロ ー ニングし、 そ相補性群に属するペルオキシソ ー ム欠損性の遺伝子産物を Peroxisome Assembly Factor-1

CHO変異細胞の分離を試みる。

(PAF-1、 ペルオキシソーム形成因 子一1)と名

1. 2

新しく分離されたCHO変異細胞に対し 、付けた 。 ま た 、 この CHO変巽細胞と同じ相補CHO細胞間 およびヒトペルオキシソ ー ム欠損群（日本F群、 アメリカX群、 ヨ ー ロッパ5群）

症患者由来線維芽細胞との間で細胞融合法なの Zellweger 症候群の患児由来線維芽細胞に 対どにより相補性群を明らかにする。

8)

し、 PAF-1 cDNAはペルオキシソームの形成を1 . 3 CHO変異細胞の異常を正常化する相補相補 した。 つぎに、 この患者細胞由来のPAF-1遺伝子を単離するとともに、 正常細胞との比遺伝子を解析したところ、 119Arg (CGA) がstop

較によりペルオキシソ ー ムの機能とくにプラc odon (TGA)に点突然変異した いわゆるho­

スマロ ー ゲンの生合成とその機能に ついて追mozygous nonsense mutationのためペルオキシソ究 する。

ーム形成能を有しないことが判明した 9 )。 すなわ

2ち、 世界で初めてこの病態の原因遺伝子が解明さ実験れたことになる叫さらに両親は共に同じ部位に上記目的解明へ向けて、 以下の手法を用いた。

変異をも つheterozygous mutationであることも

2 . 1

新たなペルオキシソ ー ム欠損性CHO細明らかにし、 Zellweger症候群が劣性遺伝病であ胞株の分離： l::'. トの先天性ペルオキシソ ー ムることも分子レベルで証明した叫また 、 変異細欠損症には現在少なくとも約10種類の相補性

図1 CHO細胞野生株とペルオキシソ ー ム欠損性変異細胞の表現型
ペルオキシソ ー ムマトリック酵素 、 カタラ ー ゼは変異細胞ではサイトゾ ー ルに局在し 、 ペ ルオキシ ‘ノ ー ムが認められない。a, CHO-K1野生株； b, PAF-1安定表現型野生株； C, 変異細胞ZP104; d,ZP105; e,ZP109; f,ZP110;
g,ZP111; h,ZP114-68-細胞内小器官ペルオキシ ‘ノ ー ム：エ ー テルリン脂質の生合成と酸素ラジカルスカベンジャ ー 機能及び欠損症群が知られているので、 すでに分離しているびZP92と同様の表現型を示し、3つの相補性群CHO変異細胞に加えて、 多くム欠損性変巽細胞と推定された。の ペ ルオキシソ

ーペ ルオキシソ ーム欠損性変異細胞株を得る

ため、 先に有用性を示した 9- (1 1 - pyrene)

3 . 2

相補性群分類,,、 12)

nonanol (P90H) /UV法などいわゆる変異株

つぎに、 これらの新たに分離したCHO変展細選択法を用いて変異細胞株の分離を試みた。

胞および先に分離したZ24、 Z 65、 ZP92を含めた

但し、PAF- lcDNAのクロ ー ニングに用いた細胞間相補性群解析を相補遺伝子導入法および 細CHO変異細胞Z65と同じ相補性群に属する変胞融合法により検討した。 ZP92相補遺伝子であ異細胞の高頻度な分離を避けるため、 CHO細るPAF-2 cDNAのトランスフェクションでは胞（野生株）に予め ペ ルオキシソム形成因子ZP106に対してのみ ペ ルオキシソ ー ムの形成が観-1 (PAF- 1) cDNAを導入しておき変異原察されたことから、 ZP106はZP92と同じ相補性処理に供した。

群に属することが明らかになった。 またPAF-1ーーム欠損性CHO変異細胞

cDNAのトランスフェクッションではいずれの細の相補群解析：新たに分離された ペ ルオキシ胞もその巽常が相補されなかったことから、 Z 65

ソ ー ム欠損性CHO変異細胞株について、CHOと同一相補性群の変異細胞は期待通り分離されな変異細胞間にみなら ず、ペ ルオキシソ ー ム欠かったことになる。 一方、 細胞融合法による検討損症患者由来線維芽細胞との間ですべての組では、 ZP107 およびZP108はZ24との融合ではペみ合わせについて相補性群分類を行った。 そルオキシソ ー ム形成は認められず、 Z24と同じ相の方法としては 、 ポリエチレングリコ ー ルを補性群であることが明らかとなった。 ZP104 と用いた細胞融合法および現在すでにクロ ー ニ

ZP109 およびZPllOとZPlllはそれぞれ融合によングされているPAF-1、 PAF-2の cDNA導り相補できず同 一 相補性群であると判定した。

入トランスフェクション法を併用した。

ZP105およびZP11 4はいずれの細胞との融合によ2 . 2

ペルオキシソ3
3 . 1っても ペ ルオキシソ ー ムが形成されたことから、結果と考察ペルオキシソーそれらいずれの細胞とも嬰なる相補性群に属する

ム欠損性CHO変異細胞ことが判明した（表1)。

株の分離と生化学解析 11 、 12)

さらに患者由来細胞との融合試験から、 ZP105

P90H/UVr耐性細胞の中からペルオキシソ ー ムはヒト相補性群II群 （アメリカ）と、 ZP104 およのマトリクスタンパク質であるカタラ ー ゼに対す

びZP109 は川群とそれぞれ同じ相補性群に属する抗体を用いた蛍光抗体染色でペ ルオキシソ ー ムることも明らかになった。 ついで、 ZPllOとZPlllの有無を顕微鏡下で確認したところ、 明らかに ペおよび ZP1 14については、 先に報告されている

ムを欠損しカタラ ー ゼがサイトゾ ー

CHO およびヒトのいずれの相補性群にも属さなルに局在した9つの変異細胞、 ZP104、 ZP105、い、 哺乳動物細胞における第1 1 番目、 第12番目

ZP106、 ZP107、 ZP108、 ZP109 、 ZPUO、 ZPlllおの相補性群変異細胞であることも判明した。

ルオキシソ ー

よびZP1 1 4を得ることができた。 さらにこれらの変異細胞について、 細胞生化学的諸性質を検討し以上の結果から、 分離法の改良により新たな ペペ ルオキシソ ー ム¢—酸化系酵素のプルオキシソ ー ム欠損性CHO変異細胞が効率よくロセッシング異常や12- (1'-pyrene) dodecanoic得られることが実証されたことになり、 この系をacid (P12) /lN処理に対する高い感受性など生用いた さら に多くの ペ ルオキシソ ー ム欠損性

化学的にも先に分離した変異細胞Z24、 Z 6 5 およ

CHO変嬰細胞の分離が期待される。 ヒト相補性

たところ、-69 -ペルオキシソーム欠損症相補性群とCHO変異細胞および相補遺伝子

表1日本A

ヒ ト
アメリカ オランダ
VIII

相補性群臨床型

CHO変異細胞

相補遺伝子

ZP92

PAF-2

ZS, NALD, IRD

CVII
IV

DIX

E

I

2ZS, NALD, IRD

Z24

F

X

54ZS

265

PAF-1

(ZPl 05)

PTS1R

B

ZS, NALD3ZS
ZS

IIZS, NALD

IllZS

VI

IRD

(ZPl 04,ZP109)

ZS

G(ZPl 1O,ZPl 11)(ZPl 14)
ZS: Zellweger症候群 NALD: 新生児型副腎白質ジストロフィ ー IRD: 乳児型Refsum病群に属する2 種の変異細胞 ZP105 およびZP104/群と同じ相補性群に属すること、 ZPllOとZPlll

ZP109 を用いた病因解析や ZPllO /ZPlll 細胞並およびZP114はヒトを含む哺乳動物細胞におけびにZP114は2つの新しい哺乳動物細胞 相補性る新たな2つ（第11、 12番目）の相補性群 変異群に属するペルオキシソーム欠損性CHO変異細胞であることが証明されたことからこれらを相補する新たなペルオキシソーム形成因子の単離につながると考えられる。 さらにこれら動物細胞はプ細胞であることが明かとなった。 今後これらの変異細胞は相補遺伝子の単離など、ム形成 機構やプラズマロ

ベンジャ ー 機能の解明への有用性が期待される。

ラスマロ ー ゲンの合成とその機能などまだ不明な謝ペルオキシソ ー ムの生化学的研究にも有用であ

総辞本研究を行うにあたり、 御援助を項いた財団法

り、 今後これらの点についても追究したい。

4ペルオキシソ ーー ゲン等のラジカルスカ

人コスメトロジ ー研究振興財団に謝意を表します。

括

本研究では新たな相補性群に属するペルオキシ引用文献

ーム欠損性CHO変異細胞の分離を、 9 - (1'­1)藤木幸夫：ペルオキシソ ー ムの形成機構とpyrene) nonanol (P90H) /UV法を用いて試み

ペルオキシソ ー ム病 ． 生化学67:204- 223

た。 その結果、 多くのP90H/UVi耐性細胞からカ(1995).

ソタラ ー ゼ抗体染色検定法により9つ(ZP104 -2)藤木幸夫：ペルオキシソ ー ム病の遺伝子診

ZP114)の典型的なペルオキシソ ー ム欠損性変異

断「遺伝子診断ー その現状と展望J. 医学のあ細胞を同定、 分離した。 これらの変異細胞についゆみ174: 477 - 483 (1995).て、 既存の3種を含めCHO変異細胞間およびペ3) Fujiki, Y.: Peroxisomal topogenic signals andム欠損症患者由来線維芽細胞との細the etiology of peroxisome - deficient disease.

胞融合法等による相補性群解析の結果、 ZP105、In Membrane Protein Transport (Rothman, S.,ZP104とZP109はそれぞれヒト相補性群II群 、 UIed.) JAI Press, Greenwich, 1996, vol. 3, 213 -ルオキシソー-70-

細胞内小器官ペルオキシソ ー ム：エ ー テルリン脂質の生合成と酸素ラジカルスカベンジャ ー 機能及び欠損症

T., Shirayoshi, Y., Mori, T., and Fujiki, Y.: A hu­

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