2016 VOL.26

Review��
写真位置�
削 除し ないでください�

レーザー微細加工・表面改質技術を用いたレーザー微細加工・表面改質技術を用いたババイオチップデバイス開発に関する研究
イオチップデバイス開発に関する研究�
�花田
*
花田�修賢
修賢

Y. Hanada
１．はじめに応用に関しては,細胞が移動できる程度の大きさの微小流「個々の細胞には個性がある」という概念が生物・医用

体構造を CYTOP 基板表面に作製し,張り合わせを行うこ分野においてトレンドとなっており,マイクロメートルオとで, 3 次元バイオチップを作製した.その後,細胞を培地ーダーの微小な実験室を提供するバイオチップを用いたと共に流体構造に流し込むことで,流体構造壁面近傍にあ単一細胞分析・制御・観察法へのニーズが高まっている.

る細胞の詳細な顕微動態観察を試みた.

バイオチップの作製は,半導体技術を応用したフォトリソグラフィーが主流となっているが,細胞の種類やサイズ,分２．実験方法
図 1 に実験装置の概略図を示す.実験では,汎用レーザー析用途に合わせたバイオチップを日々作製する必要性がある研究現場では,ラピットプロトタイピング可能なレーに Nd:YAG レーザー(波長 532 nm, パルス幅 500 ps, 繰り返ザー加工技術が有効である.バイオチップ材料に関しては,し周波数 1 kHz)を使用した.レーザー光は ND フィルター

半導体 Si が当初用いられていたが,現在は顕微鏡下で細胞により出力を調節したあと対物レンズ(×20, NA:0.46)を介を様々な角度から観察しながら分析する必要があるためして CYTOP 基板表面に集光照射される.

ガラスやポリジメチルシロキサン(PDMS)などの透明材料が安価かつ整形し易いため広く用いられている 1).しかしながら,従来透明材料は培地(水)に比べ比較的屈折率が高く,細胞を観察する際には,バイオチップ材料との屈折率差によりバイオチップ内流体構造壁面や微細構造体近傍では,像がぼやける,影ができるなどの問題が発生する.よって,従来バイオチップでは,固体境界面近傍で運動する細胞や微生物の詳細な観察・分析は行われてこなかった.
上記を踏まえ,本研究では,水の屈折率にほぼ等しい低屈折率フッ素ポリマーCYTOP2)に着目し,汎用ナノ秒レーザーによる表面微細加工技術を確立することでバイオチッ

図 1 実験装置概略図

プを作製し,流体構造壁面などの固体境界面における鮮明な細胞の運動状態遷移を観察することを目的とした.フッCYTOP 基板を乗せる 2 軸ステージは,コンピュータ制御に素ポリマー全般に言えることであるが,CYTOP のマイクよりマイクロメートルオーダーの精度で駆動する.細胞のロメートルオーダー以下の微細加工は,ポリマーの高い透サイズに合わせた流体構造を作製する際には,図 2 に示す過性や化学的安定性などの優れた諸特性のため加工が困ように,x 方向にレーザー光を一定のピッチ間隔でずらし難とされており 3),現状では,シンクロトロン放射光 4)やイながら,所望するサイズまで多重走査した.

オンビーム 5), F2 レーザー6)を用いた表面微細加工技術に限られている.しかしながら,これら量子ビームを用いたフ�ッ素ポリマー加工技術は,装置の安定性やコスト面から産�業応用には至っていない.また,我々の研究室では,産業化

�が進みつつあるフェムト秒レーザーを用いた CYTOP 基板

�

7)

8)

内部への 3 次元中空構造 や光導波路 を作製することに

�

既に成功しているが,本研究では,産業応用への展開を図る

�ことを目的として汎用ナノ秒レーザーを使用したフッ素�

ポリマーCYTOP の表面微細加工技術の確立を試み,その�加工基本特性を検討した.加工技術確立後のバイオチップ

�* 弘前大学大学院理工学研究科

准教授- 183 -

図 2 流体構造作製の際のレーザー多重走査法

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CYTOP 基板表面をレーザーアブレーションすることでが確認できる.よって,実験では 195℃の熱処理を 30 分間行

レーザー照射領域周辺には,熱影響によるクラックやひびうことでアブレーション加工痕の形状を維持しつつ加工割れが発生する.また,レーザー照射領域底面もアブレーシ痕の粗度を改善した 9).

ョンによるデブリや冷却された溶融層による表面が粗い層が堆積することで荒れた状態になる.アブレーションによるレーザー照射領域の形状劣化は後に行うウェットエッチングにより表面粗さが改善され且つデブリも除去することが可能となる.よって,アブレーション後のウェットエッチングでは,レーザー照射領域を選択的にエッチングする溶媒を検討した.表 1 に検討を行った各種エッチング溶媒を示す.エッチング溶媒を選択する際には,ポリマーの溶解性を示す Hansen 溶解度パラメーターが一般的に用いられるが,フッ素ポリマーに関しては本パラメーターが使用できないことが知られており,エッチング溶媒の選択について不透明な部分が多い 3).そこで,表 1 に示す数種類のフッ素溶媒および溶媒の濃度を調整する希釈溶媒について検討することで,レーザー照射領域のみを選択的にエッチングできるか確かめた.
表 1 エッチング用各種フッ素溶媒

図 3 各種熱処理温度による CYTOP の流動性
CYTOP の表面微細加工技術を確立した後,表面加工された CYTOP 基板 2 枚を張り合わせることで 3 次元流体構
造を含む CYTOP バイオチップを作製し,水棲微生物であるミドリムシの流体構造壁面近傍における顕微動態観察を行った.

３．実験結果および考察
その結果,㈱旭硝子社から市販されているフッ素溶媒� ���� ����� のレーザーアブレーション加工�

AC-6000 をアセトン希釈することで,選択的エッチングを

図 4 に,異なるレーザーエネルギーで CYTOP 基板表面実現した.数あるフッ素溶媒の中から AC-6000 が高品質なにレーザー光を 1 回走査した際のアブレーション加工結

選択的エッチングを実現した理由については未だ不透明果を示す.図 4(a)はレーザー出力 30 mW,(b)は 14 mW であであるが,AC-6000 が他のフッ素溶媒に比べ高度にフッ素る.ステージ走査速度は 300 μm/s 一定とした.図 4 より,レ化していることが原因であると考えられる.

ーザー出力を適当に調節することで,熱影響によるクラッウェットエッチングにより,アブレーションによるデブリは除去できるが,レーザー照射領域には表面粗さが残る.

クやひび割れを最小限に抑えることが可能であることを確認した.

そこで,熱処理によるポリマーの流動性を利用することで,エッチングによる表面粗さの改善を試みた. 熱処理によ�るフッ素ポリマーの流動性は,フッ素原子が骨格構造を覆�

う化学構造により,他のポリマーに比べ低いことから,ガラ�

ス転移温度付近での熱処理による表面粗さ改善は困難を�要する.よって,実験では, CYTOP をガラス転移温度以上で�

短時間熱処理することで,表面粗さを改善し,且つアブレー�

ションにより形成された形状を維持することを試みた.図�

3 に,レーザー照射領域をエッチングした後,各温度で熱処�理した際のレーザー照射領域底面の顕微観察像を示す.

�CYTOP のガラス転移温度 108℃付近ではポリマーの流�

動性は確認できなかったが, 図 3 より 175℃の熱処理温度

�を約 9 分間行うことでポリマーが流動し始め,190℃の熱処

�理を行うことでレーザー照射領域底面が平坦化する様子

�- 184 -2016 VOL.26

�
�(c)

�

図 5 (a)アブレーション加工後,(b)エッチング後及び(c)熱処理後のレーザー顕微鏡像
図 4 アブレーション加工痕の透過顕微鏡像

レーザー出力(a)30mW 及び(b)14mW
エッチング後及び熱処理後の加工痕底面の透過顕微鏡及レーザー出力(a)30 mW 及び(b)14 mW

び原子間力顕微鏡像を図 6 に示す.図 6(a,b)より,熱処理後のレーザー照射領域は,ウェットエッチング後に比べ表面粗さが� ���� ����� 基板表面への流体構造作製�
バイオチップ作製では,数マイクロから数百マイクロメートル改善したことで透過性が向上した.また原子間力顕微鏡による程度の細胞サイズに合わせた流体構造を作製する必要があ

表面粗さ測定では,熱処理前後で RMS 値 50 ± 10 nm から 11る.図 2 で示したレーザー多重走査法により流体構造を作製し± 4 nm まで改善した.

た際の各工程(a)アブレーション(b)エッチング(c)熱処理におけ(a)る CYTOP 加工痕底面のレーザー顕微鏡像を図 5 に示す.図(b)5(a,b)より,ウェットエッチングによりレーザー照射領域のみが選択的にエッチングされ,加工痕底面に堆積したデブリが除去されることが確認できる.また,図 5(c)より,エッチングを行った
CYTOP を熱処理することで,加工痕底面やエッヂ部分の表面粗さが改善された.

(a)

図 6 (a)アブレーション加工後,(b)エッチング後及び(c)熱処理後のレーザー顕微鏡像
レーザー出力(a)30mW 及び(b)14mW
� ���� バイオチップ作製および細胞の動態遷移観察�

(b)

固体境界面における細胞や微生物の動態遷移観察を行うことは,細胞や微生物が有するセンサーなどの未知な機能の解明や癌研究における転移能制御などの観点から近年,研究が盛んに行われている.バイオチップを使用して細胞や微生物を固体境界面に近づけ運動の動態遷移を観察する場合,化学的および物理的な手法が多数存在するが,一般的な手法として,バイオチップ内の培地や試薬に流速を与え,流速による流体構造内圧力勾配により流体構造壁面に細胞を意図的に追いやる手法が簡便であり,細胞のソーティング応用に用いられている.また微生物の中には,自ら固体境界面に近づきユニークな運動をするものも存在す- 185 -

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る 7).しかしながら,流体構造壁面などの固体境界面近傍に察結果を示す.

おける細胞や微生物の顕微観察は,上記した光学的問題により困難であり,現状では,細胞の力学的な運動メカニズム流路壁面側をシミュレーションより解明する研究や蛍光観察による0s

動態分析が主なことから,固体境界面における「自然な状態の細胞や微生物」を顕微観察する研究は行われていなかった.よって,確立したナノ秒レーザーによる低屈折率ポリマーCYTOP の表面微細加工技術をもとに,細胞や微生物ミドリムシの流体構造壁面近傍における動態観察を目的とした
CYTOP 内部への 3 次元流体構造付きバイオチップを作製流路側した.図 7 に,作製したバイオチップの概略図を示す.

100 µm0.2 s0.3 s

図 7 バイオチップ概略図
図 8 CYTOP バイオチップ内の流体構造壁面顕微画像

作 製 し た バ イ オ チ ッ プ は ,2 つ の リ ザ ﾞ ー バ ー(800×800×150 µm)と CYTOP 表面から 200 µm 下に埋め込

図 8 より,CYTOP バイオチップを使用した場合には,流まれた中空流体構造(400×1200×50 µm)から成る.このよう体構造壁面近傍におけるミドリムシの鮮明なタイムラプなバイオチップを作製するには,2 枚の CYTOP 基板を用いス観察像を得ることができ,ミドリムシがどの箇所で流体て,ナノ秒レーザーによりリザーバーと流体構造をそれぞ構造壁面に衝突し,動態遷移するか確認できた.

れ作製し,最終的に熱処理により張り合わせることで 3 次元流体構造付きバイオチップが作製できる.なお,CYTOP

流路壁面側基板同士の張り合わせは, 150℃で 30 分間の熱処理を行う
ことで 2 枚の CYTOP 基板を張り合わせた.
バイオチップ作製後,細胞の流体構造壁面近傍における水棲微生物(ミドリムシ)の遊泳観察を行った.実験では,片方のリザーバーからミドリムシ及び培地(水)を同時に封入し,流体構造を培地で満たした後,流体構造壁面近傍を遊泳するミドリムシのタイムラプス観察を行った.図 8 にCYTOP バイオチップを使用した際の壁面近傍を泳ぐミドリムシの顕微観察結果を示す.また,比較のため,図 9 に従来ガラスバイオチップを使用した際の,ミドリムシの動態観- 186 -図 9 ガラスバイオチップ内の流体構造壁面顕微画像2016 VOL.26

参考文献

一方,図 9 に示す従来ガラスバイオチップを使用したミドリムシの動態観察では,流体構造壁面近傍で,観察像がぼ

1)観察ができなかった.

北森武彦: マイクロ・ナノ化学チップと医療・環境・バイオチップ, 技術教育出版, 東京, (2009) 4

やけ,影ができ,ミドリムシの壁面近傍における詳細な動態2)

http://www.agc.com/kagaku/shinsei/cytop/

3)

澤田英夫: フッ素樹脂の最新動向,シーエムシー出版,

4)

Y. Kato, K. Kanda, Y. Haruyama and S. Matsui: J.

5)

N. Fukutake, N. Miyoshi, Y. Takasawa, T. Urakawa, T.

４．結論

東京, (2013) 57

汎用ナノ秒レーザーを用いた低屈折率フッ素ポリマー

Electron Spectrosc. Relat. Phenom., 413 (2005) 144.

CYTOP の表面微細加工技術を確立し,本加工技術を用いたバイオチップ作製を行った.レーザー加工を用いたバイオチップ作製は,国内外の研究機関や大学により行われて

Gowa, K. Okamoto, A. Oshima, S. Tagawa and M.

おり,用途に合わせた機能を集積した様々なバイオチップ

Washio: Jpn. J. Appl. Phys., 49 (2010) 065201.

が開発されている.その中で,我々は,低屈折率フッ素ポリ

6)Sugioka,N.

ShimazawaandK.

Y. Hanada, T.Ogawa, K. Koike, and K. Sugioka: Lab

8)

Yasutaka Hanada, Koji Sugioka, Katsumi Midorikawa:

9)

Tatsuya Ogawa, Yasutaka Hanada: Appl. Phys. A, 122

Chip, 16 (2016) 2481.
Opt. Express, 18, 2 (2010) 446.

い,流体構造壁面におけるミドリムシの鮮明な顕微画像取得に成功した.我々が開発した CYTOP バイオチップは,従K.

7)元流体構造を含む CYTOP バイオチップを作製することで,固体境界面近傍におけるミドリムシの動態遷移観察を行

Obata,(2006) 251.

よびエッチング,熱処理により CYTOP の高品質な表面微細加工技術について検討した.また,張り合わせによる 3 次

K.

Midorikawa: Appl. Phys. A Mater. Sci. Process., 84

マーCYTOP に着目し,ナノ秒レーザーアブレーションお来バイオチップでは観察不可能な流体構造壁面などの固体境界面における細胞の動態観察に威力を発揮すると考えており,これまで行われてきた細胞の動態シミュレーシ
ョンや蛍光観察による細胞研究に新たな知見を与えると期待する.

謝� 辞�
本研究は，公益財団法人天田財団からの一般研究開発助成により実施した研究に基づいていることを付記するとともに，新たなレーザー加工法を確立することができ�更なる研究を進めることができました�ここに同財団に心より感謝の意を表します．

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(2016) 156.