乳酸菌がもつ抗酸化作用の分子基盤解明
筑波大学医学医療系

小林麻己人

Heat-treated cells of Lactococcus lactis strain H61 have been reported to exhibit anti-aging effects on human skin andbeing considered for application in cosmetics. However, the mechanism of the effects is not clear. I have been studying theantioxidant effects of various dietary phytochemicals using zebrafish as a model animal. In this study, I tried to evaluate
the antioxidant effect of Lactococcus lactis strain H61 by utilizing zebrafish. As a result, I found that strain H61 exerts its
antioxidant effect in zebrafish larvae, in which the relationship between biological effects and genetic mutations is easy toanalyze. Using this system, the antioxidant effect of strain H61 was shown to be not mediated by the Nrf2 pathway, whichis the master mechanism of cellular antioxidant response. Furthermore, we generated zebrafish mutants that disrupted key
genes in the mitochondrial biosynthesis pathway or the innate immune response pathway, paving the way to identify thisunknown mechanism.

１．緒

外の抗酸化経路を活性化する化粧品の開発が期待される。

言乳酸菌は腸内細菌叢を調整するプロバイオティクスとし65 歳以上の高齢者人口が 1 / 3 を占めるようになり、本て注目を集めてきたが、最近では菌体成分そのものがもつ邦はいよいよ超高齢化社会を迎えようとしている。その中バイオジェニックスとしての機能にも注目が集まっている。

で、抗酸化活性をもつ食品やサプリメントが生活習慣病の実際、乳酸菌成分入りの化粧品も市販され始めている。本予防に有効と注目され、中でも Nrf 2 経路というストレス研究課題で研究対象となっている乳酸菌 H 61 株もその一防御システムを活性化する食品成分の研究が国内外で進んつである 3）。乳酸菌成分の効果の一端は皮膚細胞に対するでいる 1 , 2）。ところが最近、Nrf 2 経路はがん増進にも働く抗酸化作用と考えられているが、その分子メカニズムに関ことが報告され、安全性が危惧されるようにもなってきた。

してはほとんどわかっていない。

また、Nrf 2 経路は年齢を重ねるにつれ、活性化力が減弱研究代表者は、Nrf 2 経路を介する抗酸化活性の研究をするという報告もされている。これらのことは、健常人、ゼブラフィッシュというモデル動物を用いて長年行って特に健常な高齢者にとって、Nrf 2 経路以外の抗酸化経路

きた 4 - 6）。この過程で、様々な食品成分が Nrf 2 を活性化を活性化する食品やサプリメントの摂取の方が望ましいこし、動物個体内で抗酸化活性を発揮させることを見出しとを示唆するが、そのような経路はまだ見つかっていない。てきた 7 - 9）。一方、農研機構の木元広実博士は乳酸菌研究

化粧品に関しても抗酸化成分を含有する商品のニーズがの第一人者で、多くの菌株を保持・解析すると同時に、機高まっており、実際、ビタミン C や E 等の抗酸化物質を含能性の高い菌株に関しては特許を取得し、動物試験・ヒト有する商品が多く市販されている。ただし、これらは酸化介入試験を行い、女性の肌健康への効用を実証した上で、ストレスを直接消去する抗酸化成分であり、安定性が低い

H 61 株含有ヨーグルトの商品化に導いている 10）。加えて上、量的に多く必要とされる。一方、Nrf 2 経路等を活性最近では、ヒト表皮角化細胞への直接添加で UV ダメージ化して、細胞内部の抗酸化物質や抗酸化タンパク質を誘導からの保護効果を示し、化粧品成分への応用の可能性も示

する間接型の抗酸化成分は、持続性が高く、少量でも効果している 11）。本課題研究では木元博士に乳酸菌 H 61 株をがあることが期待される。Nrf 2 経路の活性化が UV からご提供いただき、その抗酸化作用の実体同定を目的にゼブ肌を守ることは示されており、既に Nrf 2 経路を活性化すラフィッシュを用いた解析を試みた。

る植物成分を配合した化粧品も市販され始めている。ただ

２．方し、前述の通り、Nrf 2 経路にも問題があり、Nrf 2 経路以法2 . 1. ゼブラフィッシュに対する乳酸菌の抗酸化作用の解析
Elucidation of the molecular basis ofa nt iox id a nt ef fe ct s of l a ct ic ac id
bacteria
Makoto Kobayashi
Faculty of Medicine, University ofTsukuba

抗酸化作用の測定は遠藤らの方法 9）に従い、受精後 3 . 5日のゼブラフィッシュ稚魚 24 匹に対し、乳酸菌溶液を 12時間前処理後、洗浄し、新たに酸化ストレス剤として過酸化水素溶液を 48 時間処理し、12 時間ごとの生存率を計測した。ゼブラフィッシュ系統には野生型 AB 系統と Nrf 2− 127 −コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

系統 7）を用いた。乳酸菌は農研機構・り、致死率が 25 % 程度に下がった。この結果は、H 61 株

木元博士からご供与いただいた H 61 株と G 50 株の加熱処の前処理がゼブラフィッシュ体内の抗酸化力を高めること理菌体の凍結乾燥品を用いた。

を示唆する。一方、G 50 株ではこの効果が観察されなか変異型 nfe 2 l 2 afh 318ったことから、H 61 株特異的な作用であることが示された。

2 . 2 . CRISPR-Cas 9 によるゲノム編集った。標的配列に相補的な crRNA、Cas 9 との結合に必要

3 . 2 . Nrf 2 変異型ゼブラフィッシュ系統を用いた解析な tracrRNA、Cas 9 タンパク質の 3 者を 1 細胞期のゼブラ直接的抗酸化剤であるビタミン C や E ではこうした効果フィッシュ胚に注入した。注入胚を成魚まで育成し、PCRは観察されないことから、H 61 株の抗酸化作用はゼブラ及び DNA シークエンスを用いたジェノタイピングで目的フィッシュ体内の抗酸化経路を活性化する間接的作用と推の遺伝子破壊に成功した F 0 世代を選び出し、野生型成魚測された。細胞や動物の抗酸化力を間接的に高めるしくとの交配で F 1 世代を作出した。

みとして Nrf 2 経路が知られている。そこで H 61 株の抗酸CRISPR-Cas 9 によるゲノム編集は小谷らの方法 12）で行化作用が Nrf 2 経路の活性化を介するものかを Nrf 2 変異型

2 . 3 . 遺伝子発現解析系統（nfe 2 l 2 afh 318）で検証した（図 2）。nfe 2 l 2 afh 318

ホモ変乳酸菌等を処理したゼブラフィッシュ稚魚における遺伝子異型稚魚を用いて H 61 株の抗酸化作用を解析したところ、発現変動をqPCR 及び RNA-seqにより行った。いずれも乳Nrf 2 ホモ変異型稚魚においても H 61 株の前処理がコント酸菌等を処理した稚魚の抽出 total RNAを用いた。qPCRロールに比べて有意に生存率を向上させた。この結果は、は、total RNAを鋳型として合成した cDNAを用いて SYBR

H 61 株の抗酸化作用が Nrf 2 経路の活性化を介さないもの

Green 法で行った。RNA-seq はつくば i-Laboratory で実である可能性を示唆した。

施した。一次解 析データをもとに、野生型と Nrf 2 変異型稚魚の両方で無処理のコントロールよりも 1 . 5 倍以上の発現上昇が見られた遺伝子に着目した。これらをヒト遺伝子名に変換し、DAVID によるパスウェイ解析を行った。

3．結3 . 3 . H 61 株処理による遺伝子発現変動
H 61 株の抗酸化作用がどのような生体経路を介するかを調べるために、H 61 株処理により発現変動する遺伝子群を RNA-seq 法で探索した。浮かび上がった遺伝子群を果用いてパスウェイ解析を行ったところ、ミトコンドリアタ

3 . 1. ゼブラフィッシュに対する乳酸菌の抗酸化作用ンパク質をコードする遺伝子群の多くが発現亢進していた。

野生型 4 日稚魚に対し過酸化水素処理をしたところ、24検証のために、いくつかのミトコンドリアタンパク質遺伝時間後には 75 % 以上が致死となった（図 1）。この条件下で子に対して qPCR 解析を行ったところ、弱いながらも H 61

乳酸菌 H 61 株を 12 時間前処理すると有意に生存率が上が株により発現誘導される傾向があることがわかり（図 3）、

図 1 乳酸菌株の抗酸化作用
野生型 3.5日稚魚にH61株またはG50 株の125µg/ml 溶液を12 時間前処理した後、2.8mM 過酸化水素溶液を曝露させ 12時間ごとに生存率を測定した。* p < 0.05。

図 2 Nrf2 変異型稚魚に対する H61 株の抗酸化作用
nfe2l2afh318 ホモ変異型 3.5 日稚魚に H61 株を 12 時間前処理した後、2.2mM 過酸化水素溶液を曝露させ 12 時間ごとに生存率を測定した。* p < 0.05。

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ミトコンドリア生合成が亢進している可能性を示唆された。

製を CRISPR-Cas 9 を用いて試みた。その結果、Myd 88破壊系統の作製にも成功した。

3 . 4 . 遺伝子破壊ゼブラフィッシュ系統の作製

4．考H 61 株によるミトコンドリア生合成亢進が抗酸化作用察に関与する可能性が浮かび上がったので、ミトコンドリア本研究により、乳酸菌 H 61 株がゼブラフィッシュの抗生合成経路が異常な時に、H 61 株の抗酸化作用がどうな酸化作用を高めることを明らかにできた。このことは、よるかを検証することにした。そのために、まずミトコンドり高抗酸化力のある乳酸菌探索にゼブラフィッシュが有用

リア生合成に関わる転写因子 Sirt 1 及び PGC- 1 α の遺伝子であることを示すとともに、遺伝子破壊系統の活用により破壊ゼブラフィッシュを CRISPR-Cas 9 を用いて作製した。

作用メカニズムを遺伝学的に解明できる可能性が示唆されいずれもゲノム編集に成功したが、Sirt 1 破壊系統に関した。実際、Nrf 2 変異型系統を用いた解析の結果、H 61 株ては F 1 世代まで系統化できた。この sirt 1系統は 7 bpの抗酸化作用は Nrf 2 経路以外の生体経路を介すると推測の塩基欠失が導入されたフレームシフト変異系統であり、された。Nrf 2 経路とがん増進の関係が危惧されているたその産物は酵素活性ドメインを失うと予想される（図 4）。

め、H 61 株が Nrf 2 以外の経路を介して抗酸化作用を発揮

it 3263）

H 61 株には免疫賦活作用があることも知られており 、その作用は自然免疫応答機構を介すると予想されている。

することは、化粧品の開発応用を考える上で朗報となりうる。

H 61 株による抗酸化作用にも自然免疫応答が必要である

次に H 61 株の抗酸化作用を介する生体経路を明らかに可能性もあり、その検証のために自然免疫応答が減弱したするために、H 61 株処理により発現変動する遺伝子群をゼブラフィッシュを用いた解析を試みることにした。乳酸RNA-seq 解析で探索し、ミトコンドリア生合成が関与菌による自然免疫応答は Toll 様受容体 -Myd 88 経路を介する可能性を見いだした。その検証のために Sirt 1 及びするので、Myd 88 を破壊したゼブラフィッシュ系統の作

PGC- 1 α 遺伝子を破壊したゼブラフィッシュ系統を作製し

図 3 ミトコンドリア関連遺伝子の発現誘導
H61 株を 12 時間前処理した野生型 4 日稚魚を用いてmrps24、mrpl53、ndufs8b
遺伝子の発現解析を qPCR により行い、無処理稚魚を 1 とした時の相対発現量を解析した。* p < 0.05。

図 4 Sirt1 破壊系統の作製
it326
CRISPR-Cas9 により Sirt1 遺伝子領域に 7bp 欠損のフレームシフト変異を導入した（sirt1 ）。
生じるタンパク質は脱アセチル化ドメインを含む C 末 3/4 が欠失していると予想される。

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た。ただ、抗酸化作用の解析までには至らず、今後の課題

5） M. Kobayashi et al.: The antioxidant defense systemとして残った。一方、H 61 株が自然免疫応答遺伝子群をKeap1-Nrf2 comprises a multiple sensing mechanism

弱いながらも誘導することが RNA-seq 解析によりわかっ

for responding to a wide range of chemical compounds.

た。そこで自然免疫の関与を検証するために Myd 88 破壊

Mol. Cell. Biol. 29: 493-502（2009）．

系統も作製したが、こちらの解析も今後の課題である。今6） K. Mukaigasa et al.: Nrf2 activation attenuates

回の RNA-seq 解析ではミトコンドリア生合成以外の経路

genetic endoplasmic reticulum stress induced byは浮かび上がらなかった。技術的な問題である可能性もあa mutation in the phosphomannomutase 2 gene in

り、別手段としてマイクロアレイ解析も現在行っている。

zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115: 2758-2763

H 61 株の作用が遺伝子発現変動を伴わない可能性もあ（2018）．

る。その場合は遺伝子発現解析を基盤とした戦略では作用

7） K. Mukaigasa et al.: Genetic evidence of an evolutionarily

機構に迫ることができない。そこで現在、乳酸菌側からconserved role for Nrf2 in the protection against

迫る戦略も開始している。具体的には H 61 株を成分分離

oxidative stress. Mol. Cell. Biol. 32: 4455-4461（2012）．

し、どの成分に抗酸化作用があるか絞り込むアプローチと、

8） Y. Fuse et al.: Nrf2-dependent protection against

H 61 株の変異株を作製・解析し、どのような乳酸菌遺伝

acute sodium arsenite toxicity in zebrafish. Toxicol.

子が抗酸化作用に関与するかを探索するアプローチである。

Appl. Pharmacol. 305: 136-142（2016）．
9） Y. Endo et al.: Evaluation of antioxidant activity of

まだ開始したばかりで今後の結果が待たれる。

spice-derived phytochemicals using zebrafish. Int. J.

（引用文献）

Mol. Sci. 21: 1109（2020）．

1） M. Kobayashi & M. Yamamoto: Molecular mechanisms

10）H. Kimoto-Nira et al.: Effects of ingesting milk

activating the Nrf2-Keap1 pathway of antioxidant genefermented by Lactococcus lactis H 6 1 on skin healthregulation. Antioxid. Redox Signal. 7: 385-394（2005）．

in young women: a randomized double-blind study. J.

2） M. Kobayashi & M. Yamamoto: Nrf2-Keap1 regulation

Dairy Sci. 97 : 5898 - 5903（2014）．

of cellular defense mechanisms against electrophiles11）H. Kimoto-Nira et al.: Towards application of waterand reactive oxygen species. Adv. Enzyme. Reg. 4 6:

extract from heat-killed Lactococcus lactis H 6 1 as a113-140（2006）．

cosmetic ingredient. Lett. Appl. Microbiol. 68 : 530 - 5363） H. Kimoto-Nira: New lactic acid bacteria for skinhealth via oral intake of heat-killed or live cells. Anim.

（2019）．
12）H . K o t a n i e t a l . : E f f i c i e n t m u l t i p l e g e n o m emodifications induced by the crRNAs, tracrRNA andSci. J. 89: 835-842（2018）．
4） M. Kobayashi et al.: Identification of the interactive
interface and phylogenic conservation of the Nrf2-Cas 9 protein complex in zebrafish. PLoS One 1 0 :e 0128319（2015）．

Keap1 system. Genes Cells 7: 807-820（2002）．

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