紫外線誘発 DNA 損傷および修復酵素の細胞内分布状態の三次元的表示
奈良県立医科大学

ラジオアイソトープ実験施設

森俊雄

Two major DNA damage produced by 254-nm UV light are cyclobutane pyrimidine dimer（CPD）and（64）photoproduct（6-4PP）. Both photolesions are repaired in normal human cells by nucleotide excision repair（NER）. However, little is known about where CPDs are repaired or where 6-4PPs are repaired in relation tothe various sub-nuclear structures. The present study was performed to aim at three-dimensional demonstrationof UV-induced DNA damage and its repair in human cell nuclei. We first investigated the repair kinetics of CPD
and 6-4PP using an enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）with damage-specific monoclonal antibodies
in normal human and xeroderma pigmentosum complementation group C（XP-C）cells. We also examined thekinetics of repair DNA synthesis（unscheduled DNA synthesis, UDS）using a quantitative immunofluorescencemethod with anti-5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. We confirmed the normal repair in normal human cells
and the impaired repair in XP-C cells. Then, using laser scanning confocal microscopy, we succeeded in threedimensional visualization of the nuclear localization of CPDs, 6-4PPs and UDS in individual human cells. The
typical three-dimensional images of photolesions or UDS at various repair times reflected well the repair kinetics
obtained by ELISA or immunofluorescence. The important finding is that the punctate, not diffusely spread,
nuclear localization of unrepaired 6-4PPs was found at 2 h after irradiation. Similarly, the focal nuclear localizationof UDS was observed both during the first and the second 3h-repair periods. The present results suggest thatboth 6-4PPs and CPDs are non-randomly repaired from nuclei in normal human cells.

蛋白が順序よく関与する反応であることが明ら

１ 緒 言かとなってきた３、４）。こうした中、修復蛋白の太陽光に含まれる紫外線（特に、B 紫外線）は一つである XPG は細胞核内でドット状に分布し、細胞 DNA 中にシクロブタン型ダイマー（CPD）修復に伴い再分布することが報告された５）。このや（６−４）型ダイマー（６−４PP）といった DNA

結果は、試験管内修復実験に加えて、DNA 損傷損傷を誘起し、皮膚がんを発生させる 。ヒトにや修復酵素を実際の修復反応の場である細胞核おいては、これらの DNA 損傷はヌクレオチド除内で観察することの必要性と学問的おもしろさ去修復機構（NER）によって修復され、修復機構を示唆するものである。そこで本実験では、主要１）に欠陥を持つ常染色体劣性遺伝病、色素性乾皮症

な２種類の紫外線誘発 DNA 損傷の生成および修（XP）患者では太陽光被ばく部位の皮膚がん発生復について、我々が樹立した損傷特異モノクロー

頻度は著しく高くなる２）。近年、DNA 修復研究

ナル抗体を共焦点レーザー顕微鏡に応用するこは驚くべき速度で進展し、E を除いて７種類の相とにより個々の細胞レベルで三次元的に可視化補性群（A − G）からなる XP の原因遺伝子全てがすることを試みた。

クローニングされるに至った。また、精製修復蛋２ 実 験

白を用いることにより、修復反応を試験管内で再構築することが可能となり、NER は約 30 種類のThree-dimensional visualization ofultraviolet-induced DNA damage
and its repair in human cell nuclei
Toshio Mori, Ph.D.
Radioisotope Research Center
Nara Medical University

２. １ 細胞、お正常ヒト皮膚由来（MSU −１、MSU −２）
よび相補性群Ｃに属する XP 患者皮膚由来（XP１CTA）の線維芽細胞を実験に用いた。細胞はダルベッコ変法 MEM 培地に 10％の牛胎児血清を加えた培養液中で培養した。

− 116 −

紫外線誘発 DNA 損傷および修復酵素の細胞内分布状態の三次元的表示

２. ２ CPD および６−４PP の修復動態の解析

２. ５

紫外線照射後の細胞内修復 DNA 合成の三次元的可視化

細胞に紫外線（主として 254 nm）を照射した直後および各時間修復後に DNA を抽出し、損傷特

２. ４と同様の処理をした細胞において、共焦異モノクローナル抗体（CPD に対する TDM − 2点レーザー顕微鏡を用い、修復 DNA 合成および抗体、６−４PP に対する 64 M −２抗体）を利用し細胞核 DNA を示す FITC および PI の蛍光画像

た ELISA 法（酵素標識免疫法）により各サンプを作成し、0 . 2 um 間隔の約 25 枚の連続平面画像

ル DNA 中の損傷を定量した６）。

からなる三次元蛍光画像を構築した７）。

３ 結 果

２. ３ 紫外線照射後の修復過程における細胞内３. １ ヒト細胞における CPD および６−４PP のDNA 損傷の三次元的可視化

修復動態の定量

細胞に紫外線を照射した直後および各時間修復後に細胞を固定し、細胞 DNA を変性した後、図１に、30 J/m 2 の紫外線を照射された正常お損傷特異モノクローナル抗体、Biotin 標識２次

よび XP − C 細胞における CPD および６−４PP の抗体、さらに Streptavidin− FITC により DNA

修復動態の ELISA 法による定量の結果を示す。

損傷を蛍光染色した。同時に、細胞核 DNA を二つの正常細胞はほぼ同様の修復動態を示した。

propidium iodide（PI）で蛍光染色した。共焦点

つまり、６−４PP の 90％以上を３時間以内に修レーザー顕微鏡（InSIGHTplus − IQ、Meridian復し、また、CPD の 40％および 50％をそれぞれInstruments 社製）を用いて蛍光画像を作成し、照射後 10 および 24 時間に修復除去した。一方、各サンプル当たり 0 . 2 um 間隔の約 25 枚の連続平

XP − C 細胞は照射後 24 時間以内に両損傷をほと面画像を付属したソフトで立体化し三次元画像んど修復できなかった。

を構築した 。
７）２. ４

紫外線照射後の修復 DNA 合成（不定期DNA 合成）動態の解析
紫外線照射後、細胞を fluorodeoxyuridine および bromodeoxyuridine（BrdU）存在下で種々の時間修復培養した。細胞を固定し DNA を変性させた後、抗 BrdU モノクローナル抗体、Biotin 標識２次抗体、さらに Streptavidin − FITC により修復 DNA 合成部位を蛍光染色した。同時に、細胞核 DNA を PI で蛍光染色した。共焦点レーザー
顕微鏡を用いて、１サンプル当たり約 100 細胞について、単個細胞当たりの FITC および PI の蛍光量を定量し、修復 DNA 合成量を FITC/PI として計算した。なお、サンプル中に一部混入する
定期 DNA 合成細胞は極めて強力な FITC 蛍光を示し、修復 DNA 合成の計算から除外した。

図１ 30J/ m 2 の紫外線を照射された正常および XP− C 細胞における CPD および６−４PP の修復動態の ELISA 法による定− 117 −３. ２ 紫外線照射後の修復過程における細胞内

図３に、XP − C 細胞の各修復過程での６−４

DNA 損傷の三次元的可視化

PP および細胞核 DNA の三次元蛍光画像を示す。

図２に、30 J/m の紫外線照射直後および修復

MSU −２細胞の場合と同様に、未照射の細胞には過程の正常細胞（MSU −２）における６−４PP およ６−４PP の蛍光画像はほとんど見られないが（図び細胞核 DNA の三次元蛍光画像を示す。画像は３A）、照射直後には DNA 画像と重なり合う明細胞核の下側半分のみを表示しており、細胞核内るい蛍光画像が得られた（図３B）。しかしながら、部の観察を可能とした。また、損傷の画像を大６−４PP の明るい蛍光画像は照射後 6 時間修復さきく示し、対応する細胞核 DNA を右下に小さくせても何ら変化しなかった（図３C 〜 F）。

2表示した。未照射の細胞には６−４PP を示す蛍光

図４に、正常細胞（MSU −２）の各修復過程で画像はほとんど見られなかった（図２A）。しかの CPD および細胞核 DNA の三次元蛍光画像をし、照射直後には強い画像が得られた（図２B）。

示す。未照射の細胞には CPD の蛍光画像はほと損傷と DNA の三次元蛍光画像が重なり合うことんど見られないが（図４A）、照射直後には明るから、６−４PP が細胞核内一面に誘発されている

い蛍光画像が得られた（図４B）。照射６時間後でことがわかる。６−４PP の蛍光画像は照射後の修も、CPD の明るい蛍光画像に大きな変化が見ら復時間に依存して次第に弱まった（図２C 〜 F）。

れなかった。これは高々 20％しか修復されない興味あることに、修復２時間後に修復されずに残とする ELISA の結果（図１）とつじつまが合う。

った６−４PP の画像は細胞核内でドット状に見られた。

図２ 30 J/m 2 の紫外線照射直後および修復過程の正常細胞（MSU −２）における６−４PP および細胞核 DNA の三次元蛍光画像
画像は細胞核の下側半分のみを表示しており、細胞核内部の観察を可能とした。また、損傷の画像を大きく示し、対応する細胞核 DNA を右下に小さく表示した。A）未照射、B）照射直後、C）
１時間修復、D）２時間修復、E）３時間修復、F）６時間修復。

− 118 −

紫外線誘発 DNA 損傷および修復酵素の細胞内分布状態の三次元的表示

図３ 30J/m 2 の紫外線照射直後および修復過程の XP− C 細胞における６−４PP および細胞核 DNA の三次元蛍光画像
A）未照射、B）照射直後、C）１時間修復、D）２時間修復、E）３時間修復、F）６時間修復。

図４ 30J/m 2 の紫外線照射直後および修復過程の正常細胞（MSU−２）における CPD および細胞核DNA の三次元蛍光画像
A）未照射、B）照射直後、C）１時間修復、D）２時間修復、E）３時間修復、F）６時間修復。

− 119 −

３. ３

紫外線照射後の修復 DNA 合成（不定期量の結果を示す。二つの正常細胞はほぼ同様の修DNA 合成）動態の定量

復 DNA 合成動態を示した。照射後３時間までは

図５に、30 J/m の紫外線を照射後の正常およ極めて効率が良かったが、それ以降は効率が低下

び XP − C 細胞における修復 DNA 合成動態の定した。一方、XP − C 細胞は照射後９時間の間全2く修復 DNA 合成を示さなかった。
３. ４

紫外線照射後の細胞内修復 DNA 合成の三次元的可視化
図 6 に、30 J/m 2 の紫外線照射後の正常細胞（MSU −２）における修復 DNA 合成および細胞核DNA の三次元蛍光画像を示す。修復が始まっていない照射直後には修復 DNA 合成を示す蛍光画像が全く見られないが（図６A）、その後修復時間に依存して次第に画像は明るくなった（図６B〜 E）。修復３時間で、修復 DNA 合成蛍光画像が細胞核内でドット状を示すのが興味深い。
図５ 30J/m 2 の紫外線を照射後の正常および XP− C 細胞における修復 DNA 合成動態の定量
シンボルは図 1 と同様。

図７に、XP − C 細胞の修復 DNA 合成および細胞核 DNA の三次元蛍光画像を示す。照射後６時間まで、全く修復 DNA 合成が行われていないこ

図６ 30J/m 2 の紫外線照射後の正常細胞（MSU−２）における修復 DNA 合成および細胞核 DNA の三次元蛍光画像
画像は細胞核の下側半分のみを表示しており、細胞核内部の観察を可能とした。また、修復 DNA合成の画像を大きく示し、対応する細胞核 DNA を右下に小さく表示した。A）照射直後、B）１時
間修復、C）２時間修復、D）３時間修復、E）６時間修復。

− 120 −

紫外線誘発 DNA 損傷および修復酵素の細胞内分布状態の三次元的表示とがわかる。

４ 考 察

また、図８に、紫外線照射直後からの３時間、および 3 時間目から６時間目にかけての３時間に

254 nm 紫外線はヒト細胞 DNA 中に主に CPDおける正常細胞（MSU −２）の修復 DNA 合成おと６−４PP を誘起する。さらに、CPD と６−４PP

よび細胞核 DNA の三次元蛍光画像を示す。どちは共通して NER で修復され、損傷を含む約 30らの場合も修復 DNA 合成蛍光画像が細胞核内でヌクレオチドが DNA から修復除去された後、生ドット状を示した。

じたギャップは修復 DNA 合成によってうめられ

図７ 30J/m 2 の紫外線照射後の XP− C 細胞における修復 DNA 合成および細胞核 DNA の三次元蛍光画像
A）照射直後、B）１時間修復、C）２時間修復、D）３時間修復、E）６時間修復。

図８ 30J/m 2 の紫外線照射直後からの３時間、および３時間目から６時間目にかけての３時間における正常細胞（MSU−２）の修復 DNA 合成および細胞核 DNA の三次元蛍光画像
A）照射直後からの３時間の修復 DNA 合成、B）照射後３時間目から６時間目にかけての３時間の修復 DNA 合成。

− 121 −

る。それ故、図１と図５の結果を比較することで、いたします。また、本研究の遂行を可能にしたコ各々の損傷の生成割合などが計算できる。計算のスメトロジー研究振興財団研究助成に対し深く結果、６−４PP の CPD に対する生成割合は 0 . 34

感謝いたします。となった。また、照射後３時間までの修復 DNA
合成は、75％の６−４PP と 25％の CPD が関与す

引用文献

ること、さらに、３時間以降の修復 DNA 合成は、

１）Clingen PH, Arlett CF, Cole J et al.: Correlation of

ほぼ 100％ CPD が関与するすることが明らかと

UVC and UVB cytotoxicity with the induction

なった。

of specific photoproducts in T-lymphocytes

紫外線照射直後および修復過程のヒト細胞にand fibroblasts from normal human donors,

おいて、私達は世界で初めて CPD、６−４PP およPhotochem. Photobiol., 61 , 163 - 170 , 1995 .

び修復 DNA 合成の三次元的表示に成功した。得２）Cleaver JE, Kraemer KH: Xeroderma

られた蛍光画像は各損傷や修復 DNA 合成に極め

pigmentosum and Cockayne syndrome, In:て特異的であることが確認され、さらに、修復に

Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D

伴う画像変化は、ELISA 法や免疫染色法による（eds.）: The Metabolic and Molecular Bases

定量的結果を見事に反映することもわかった。こof Inherited Disease, McGraw-Hill, New York,

れらの結果は３次元蛍光画像が極めて信頼性の高いものであることを示している。この新技術の1995 , 4393 - 4419 .
３）Sancar A: Mechanisms of DNA excision

開発がもたらした最大の発見は、６−４PP の修復

repair, Science 266 , 1954 - 1956 , 1994 .

が細胞核内で均一ではないことを示唆したこと

４）Aboussekhra A, Biggerstaff M, Shivji MKKである（図２D）。この結果は、修復 DNA 合成さet al.: Mammalian DNA nucleotide excisionれる部位も細胞核内で均一ではないという図６D

repair reconstituted with purified protein

により支持された。さらに、６−４PP が主に関与

components, Cell, 80 , 859 - 868 , 1995 .

する照射後３時間の修復 DNA 合成も、CPD が５）Park MS, Knauf JA, Pendergrass SH et al.:

ほぼ全面的に関与する３時間目以降の修復 DNA

Ultraviolet- induced movement of thehuman

合成も共に細胞核内で不均一に起こることが明DNA repair protein, Xeroderma pigmentosum

らかとなった（図８）。以上の結果は、CPD も６type G, in thenucleus, Proc. Natl. Acad. Sci.

−４PP も共に細胞核内で不均一に修復されること

USA, 93 , 8368 - 8373 , 1996 .

を示すものとなった。

６）M o r i T , N a k a n e M , H a t t o r i T e t

DNA 損傷の修復過程の三次元表示に成功した

al.:Simultaneous establishment of monoclonal

ことから、続いて NER に関係する修復蛋白の画

antibodies specific for either cyclobutane

像作成を試みた。不幸なことには、損傷検出に用

pyrimidine dimer or（6 - 4）photoproduct from

いた細胞固定法は修復蛋白のエピトープを破壊

the same mouse immunized with ultraviolet-することが判明した。現在、修復蛋白の染色に成

irradiated DNA, Photochem. Photobiol., 54 ,功した新固定法を損傷検出に応用する実験を進225 - 232 , 1991 .

めている。

７）Nakagawa A, Kobayashi N, Muramatsu Tet al., : Three- dimensional visualization of

５ 謝 辞

ultraviolet-induced DNA damage and its repair

本研究は奈良県立医科大学皮膚科学研究室との共同研究であり、関係する諸先生に心より感謝− 122 −in human cell nuclei, J. Invest. Dermatol., 110 ,143 - 148 , 1998 .