脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物のIn vivo 評価系の構築
北里大学薬学部衛生化学

今 井浩 孝Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) is an important antioxidant enzyme that could directlyreduce phospholipid hydroperoxide in biomembrane induced by oxidative stress. In this study we found that disruptionof PHGPx by treatment of tamoxifen in skin of tamoxifen- inducible PHGPx KO mice could induce loss of hair follicle
morphogenesis without damage of skin tissue. And co-treatment of vitamin E with tamoxifen could suppress the delay of
hair follicle morphogenesis, indicating that generation of phospholipid hydroperoxide in skin might affect the hair follicle
formation in adult mice.

１．緒

我々は最近、全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損言マウス（図１）の作製に成功し、時間及び部位特異的にリン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダ

PHGPx を欠損させられるマウスを得た。このマウスを用ーゼ（PHGPx）は、酸化ストレスなどによる活性酸素によいて剃毛後、皮膚に直接タモキシフェンを塗布し、皮膚でり酸化された生体膜リン脂質の１次生成物であるリン脂質PHGPx の遺伝子を破壊した際、どの様なフェノタイプがヒドロペルオキシドをグルタチオン依存的に直接還元でき出るのかを検討したところ、外見上、皮膚細胞に異常はみ1）る主要な抗酸化酵素である 。申請者はこれまで PHGPxられなかったが、発毛に異常が見られることを見いだした。の個体及び細胞レベルでの機能の解析を一貫して行っておこのことは内在性に生じる脂質ヒドロペルオキシドが毛包り、全ノックアウトマウスが初期発生過程で致死となるこ細胞等に作用し、発毛を阻害していると考えられた。そこ

2）と 、精巣特異的及び網膜特異的 PHGPx 欠損マウスが不3 , 4）

で本研究では、この PHGPx 欠損による内在性に生じた脂、肝臓特異的 PHGPx 欠損マウス

質酸化による発毛阻害の詳細を明らかにすることを目的には肝細胞死をひきおこし出生直後死となること、ビタミン研究を行った。また脂質の酸化を抑えるビタミンＥがこの妊及び失明となること

5）Ｅの餌への投与により個体死がレスキューできること な発毛の阻害に対して効果を有するのかについて、In vivo

どを明らかにしてきた。また MEF 細胞でも PHGPx を欠で検証することにより、In vivo における脂質ヒドロペル損させると約３日後に細胞死が誘導され、その細胞死のメオキシドによる発毛阻害保護作用のある化合物のスクリー

カニズムはこれまで報告のある細胞死とは異なることを見ニング系の構築を目指した。

6）

出している 。この MEF 細胞死もビタミンＥの添加によ２．実り抑制される 7）。このように様々な細胞において PHGPxを欠損させると内在性にリン脂質ヒドロペルオキシドが蓄

2 .1

験

全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損マウスの交配と産出積し細胞死が誘導される。
皮膚は紫外線などにより最も脂質酸化が起きる組織のひ図１に示す様に、全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠

とつであるが、PHGPx の皮膚組織での発現部位やその機損マウス（Cre TG KO マウス；Cre+/− : TG+/− : PHGPx

能 に つ い て は ほ と ん ど 明 ら か に な っ て い な か っ た。

−/−）は、 申 請 者 が 作 成 し た 内 在 性 PHGPx 欠 損 マ ウ ス

PHGPx は活性中心に微量元素セレンを含むセレノシステ（PHGPx−/−）が胚発生致死となるところ 1）、LoxP 遺伝子インを有するが、ヒトの遺伝病でこのセレノシステインをで 挟 ん だ マ ウ ス PHGPx ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク TG 遺 伝 子

導入できなくなった患者では、PHGPx を含む 25 種類のセ（PHGPx-F-Lox）によりトランスジェニックレスキュー法によレン蛋白質の発現量が減少し、紫外線に対する感受性が増って作成したコントロールマウス（TG+/+, PHGPx −/−）3 , 7）

大することが報告されている 8）。と b アクチンプロモーターによって制御された CreER 遺伝 子 が ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク さ れ た マ ウ ス（Cre+/− ,Analysis of mechanism of inhibition of
hair growth by depletion of phospholipidhydroperoxide glutathione peroxidase inmice and rescue effects of vitamin E.
Hirotaka Imai
School of pharmaceutica l Sciences ,Kitasato University

PHGPx +/+）と PHGPx ヘテロマウス（PHGPx+/−）を交配して得られた W- Cre へテロマウス（Cre+/+, PHGPx+/−）を交配することで得られた。この交配で生まれてくる子供のジェノタイプは、CRE TG KO（Cre+/−: TG+/−: PHGPx−/−）、CRE TG ヘ テ ロ（Cre+/−: TG+/− : PHGPx+/−）の２種類である。CRE TG ヘテロマウスは内在性の PHGPx− 72 −

脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物の In vivo 評価系の構築によって毛を刈り取り、次にシェービングクリームとシェーバーを用いて皮膚を傷つけないように剃毛した。完全に剃ったのち、翌日完全に剃毛した皮膚に右２ヶ所左２ヶ所の計４ヶ所ずつ塗布した。塗布の回数の検討としては、３日連続（上）あるいは１日のみ（下）１回軟膏を塗布した。
毎日マウスを麻酔し、写真を撮影した。ビタミンＥの添加の条件としてはビタミンＥ（VE）500 µM（mol/w）＋５mg タモキシフェン /g 軟膏となるように調整し、タモキシフェンと同条件で塗布した。

2.4HE 染色、抗体組織染色、TUNEL 染色

タモキシフェンを塗布した初日を１日目とし、３日後、
図１ 全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損マウス（CRE/TG/KO）におけるタモキシフェン添加による PHGPx 欠損のしくみ

４日後と 14 日後にマウスを解剖し皮膚を凍結切片にし、各染色を行った。マウスを頸椎脱臼した後、脱血後、皮膚のみをはぎ取った。はぎ取った皮膚を、PBS に 30 分浸した の ち、PBS で よ く 洗 い 流 し、10 mL チ ュ ー ブ の 中 に4 %PFA を満たし、その中に切片を入れ 24 時間４℃で保存

ゲノム遺伝子を１本持つため、タモキシフェン投与によりした。翌日 15 % スクロース溶液に浸し、さらに翌日 15 %PHGPx は欠損されない。本実験では、CRE TG ヘテロマスクロース溶液に再度浸し、４℃で保存した。置換が終了

ウスをコントロールマウスとして用いた。

した切片を OTC コンパウンドに浸し、30 分程度なじませたのち、ドライアイスの上で凍結させた。この凍結させた

2.2

マウスのジェノタイプの判定

皮膚を 10 µm の厚さで切片とした。抗体染色は切片のスラ離乳時期（３〜４週齢）のマウスの尾 0 . 5 〜１cm を切断

イドガラスを室温で１～２時間風乾させた後、次の操作をし、1 . 5 mL チューブに入れ 50 mM NaOH 180 µl 加え、95行った。T-PBS（0 . 3 % TritonX- 100 /PBS）で３回洗浄を℃で 10 分間インキュベートした。その後、1 M Tris - HCl

行ったあと、ブロッキング液を加え室温で１時間反応させ（pH 8 . 0）を 20 µl 加え、12000 rpm、10 分間、室温で遠心した。 次 に 目 的 の １ 次 抗 体（PHGPx 6 F 10 500 倍 希 釈 9），た。上清をサンプル DNA とし KOD - FX DNA Polymerase

HNE：４倍希釈，AIF：100 倍希釈）を室温で 4 時間反応さ（TOYOBO）を用いて PCR を行った。Cre 遺伝子、内在性せた。次に T - PBS で洗浄し、２次抗体（FLUORESCWIN

PHGPx 遺 伝 子 の WT は WT 用 プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い

200 倍希釈 , Cy 3 200 倍希釈）をつけ、アルミホイルで遮光

1 . 4 kbp のバンドが増幅される。KO は KO 用プライマーセしながら室温で３時間反応させた。プレパラートはオールットを用い 1 . 6 kbp のバンドが増幅される。TG 遺伝子はインワンの蛍光顕微鏡にて撮影した。HE 染色、TUNEL内在性の PHGPx と内部配列は全く同じなので、3’側のマ染色は常法に従って行った。

ーカー配列を利用して TG 用プライマーセットを用いで増３．結幅し、1 . 7 kbp のバンドで判定した。Cre 遺伝子は Cre 用プライマーセットを用いて約 600 bp のバンドを増幅した。論果3 .1 PHGPx 欠損によって毛包が減少し発毛が遅延する

3）

文 を参照。

図 １ に 示 し た 様 に、 全 身 性 タ モ キ シ フ ェ ン 誘 導 型
PHGPx 欠損マウス（CRE/TG/KO）マウスでは、タモキシ2.3

タモキシフェンの調製と皮膚への塗布方法の検討

フェンをマウスに塗布あるいは投与するとタモキシフェン

タモキシフェン 10 mg を 99 . 5 % エタノール 10 mL に完全を取りこんだ細胞ではタモキシフェンがエストロジェン受に溶解し、軟膏 10 g と混ぜ合わせ作成した。タモキシフェ容体（ER 部分）に結合し、核移行シグナルが露出すること

ン 5 mg/g 軟膏を１回に 0 . 01 g 相当を塗布した。コーン油により、細胞質にあった CreER が核に移行し、PHGPx-F-の場合では直接タモキシフェンを１mg/ml となるように

Lox 遺伝子を破壊することにより、PHGPx 遺伝子が欠損溶かして 50 µ l 相当を塗布した。マウスはメスの全身性タする。コントロールマウス（CRE/TG/ ヘテロ）では内在モ キ シ フ ェ ン 誘 導 型 PHGPx 欠 損 マ ウ ス、Cre/TG/KO

性 PHGPx ゲノム遺伝子が１本残っているので PHGPx-F-（Cre+/− TG+/− PHGPx −/−）と コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス、Lox 遺伝子が破壊されても PHGPx は欠損しない。この２

CreTG ヘ テ ロ（Cre+/− TG+/− PHGPx+/−）を 用 意 し た。

つのマウスの背中の毛を剃毛した後、翌日に皮膚にタモキマウスにジエチルエーテルを用いて麻酔をかけ、バリカンシフェンを塗布することにより、どのようなフェノタイプ

− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014がみられるのかについて、毎日観察した。本実験では、図スではほぼ正常に戻った。一方、KO マウスではタモキシ２に示すようにタモキシフェンの塗布の方法および回数にフェンを塗布した場合、13 日目ぐらいまでは発毛が見らついても同時に検討した。背中の右側には軟膏に溶かしたれず、15、16 日後に皮下が黒くなり、以後 22 日以降でほタモキシフェンを塗布した。一方、左側にはコーン油に溶ぼ正常に戻った。タモキシフェンの塗布回数は３日連続塗かしたタモキシフェン（Tam）を塗布した。コーン油は液布と１日のみの塗布では特に違いがみられなかった。また体状であるため非常に塗布しにくいことがわかり、本実験

コーン油と軟膏入りのタモキシフェンでもどちらでも効果以降は軟膏に溶かしたタモキシフェンを用いることとした。

はみられたが、コーン油は液体であるために塗布時に表面図２に示す様に、６日目まではコントロールマウスもＫＯから流れるなどするために均一性、再現性には適していなマウスも剃毛した部分に変化はみられなかった（コントロ

いと考えられたため、以後は軟膏に溶かしたタモキシフェ

ールマウスの背中の一部はすでに発毛がはじまっているのンで塗布実験を行った。

でこの部分は除外している）。10 日目頃からコントロール

次にタモキシフェン塗布後、３日目と 14 日目の皮膚組

マウスの背中は皮下が黒くなり 13 日目ではすでに発毛の織の HE 染色像を比較した。図３に示すように、タモキシ回復状態が見られた。また 16 日後にはコントロールマウ

フェン塗布後３日目では、コントロールマウスと PHGPx

図２ Tam を塗布後の CRE/TG/ ヘテロ（コントロール）、CRE/TG/KO（PHGPx 欠損）マ
ウスの発毛への影響

図３

タモキシフェン塗布後の毛包形成の変化（HE 染色）− 74 −

脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物の In vivo 評価系の構築欠損マウスでは大きな違いは見られなかったが、14 日目

そこで、PHGPx 欠損により酸化脂質の蓄積がみられる

では、PHGPx 欠損マウスにおいて、コントロールマウスのかについて、酸化脂肪酸の分解物である４- ヒドロキシに比べ著しい毛包細胞の数の減少が見られることが明らか

ノネナール（4 -HNE）に対する抗体を用いて免役染色を行となった。このことから、皮膚へのタモキシフェンの塗布った。その結果、図５に示すようにタモキシフェン添加にによる PHGPx の発現低下は毛包形成に異常をひきおこし、より、コントロールマウスの皮膚に比べ、PHGPx 欠損マ発毛が遅れると考えられた。

ウスの皮膚組織における 4 -HNE の染色強度の増加が観察された。特に毛包において強いシグナルが観察された。こ3 . 2 PHGPx の減少により毛包での内在性脂質酸化が亢進するのことから PHGPx 欠損により内在性の脂質酸化反応が亢

次に抗 PHGPx 抗体を用いて皮膚の組織染色を行った。

PHGPx 欠損マウスにおいて細かいドット状の染色像の増図４に示すようにコントロールマウスの皮膚では毛包の部加が観察された。毛包組織部位にも観察されたが、コント位に PHGPx の比較的強い染色がみられたが、タモキシフロールマウスの毛包組織にもみられたため、この染色像のェン塗布４日後の PHGPx 欠損マウスでは毛包での PHGPx特異性については明らかとはならなかった。以上の結果かの発現がみられなくなっていた。PHGPx は生体膜脂質のら、毛包における PHGPx の欠損により生じるリン脂質の酸化により生成したリン脂質ヒドロペルオキシドを還元す酸化が毛包形成阻害のひとつの要因であると考えられた。

進 し て い る こ と が 示 さ れ た。 一 方、TUNEL 染 色 で はる。

図４

タモキシフェン塗布４日後の毛包での PHGPx の発現変化（抗体染色）図５ タモキシフェン塗布後４日後の毛包皮膚組織における抗 HNE 抗体染色および TUNEL 染色− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

3 . 3 ビタミンＥ添加は PHGPx 欠損による発毛の遅延を回復するが、活性化カスパーゼ抗体を用いた組織染色ではコントロそこで次に、脂質ヒドロペルオキシドの生成を抑制できた。このことからも毛包細胞においてもカスパーゼ非依存ると考えられるビタミンＥをタモキシフェンを塗布する際的な細胞死が起きていると考えられた。MEF 細胞ではドに軟膏に同時に混入し、PHGPx 欠損による発毛遅延を抑ット状の TUNEL 染色像が得られたが、毛包ではタモキシ制できるのかについて検討を行った。図６に示した様に、フェンを塗布しなくても染色像が観察されたことから非特ビタミンＥを加えたタモキシフェンでは投与回数に関わら異的な染色像をみている可能性が考えられた。この点につず、12 日目には皮下に発毛がみられ 16 日目には正常に戻いては今後の課題である。ビタミンＥ添加により PHGPx

り、図１のコントロールマウスと同様な時期に発毛がみら欠損による発毛の遅延を抑制できたことからも、この発毛れた。このことからビタミンＥはタモキシフェン添加によ遅延が脂質ヒドロペルオキシド依存的であることを強く示る PHGPx 欠損による内在性の脂質ヒドロペルオキシド由唆している。今回、LC - ESI - MS/MS による酸化脂質の解来の発毛阻害を抑制出来ることが明らかとなった。

析はできなかったが、毛包をマイクロダイジェスチョン法

ールマウスと PHGPx 欠損マウスでは違いが見られなかっ

本方法は、今後 In vivo における脂質ヒドロペルオキシにより抽出してどのような酸化脂質が蓄積しているかの解ド依存的な発毛阻害を抑制する化合物のスクリーニング系析を行うことが重要であろう。最近、ケラチノサイト特異として有効であると考えられた。

的 PHGPx 欠損マウス 10）が報告され、興味深いことに、出４．考

生後３週齢までは毛包形成が遅延するがその後は回復する察ことが報告された。本実験においては、胎児ではなく大人

本研究では、全身性タモキシフェン誘導型 PHGPx 欠損のマウスで起きる現象をみている。タモキシフェン塗布にマウスを用いて、酸化リン脂質の還元酵素である PHGPx

よる成体での PHGPx 欠損による毛包形成遅延がケラチノを欠損させることによりおきる発毛阻害のメカニズムにつサイトを介したものなのか、それとも直接的な毛包障害にい て 解 析 し た。 こ れ ま で に 我 々 は MEF 細 胞 を 用 い てよるものなのかは今後慎重に検討する必要があると考えら

PHGPx 欠損による細胞死のメカニズムについて詳細に検れる。しかしながら、我々のマウスではケラチノサイトを討してきた。PHGPx を MEF 細胞で欠損させると内在性の含む皮膚の細胞の大きなダメージはみられていない。なぜ

リン脂質ヒドロペルオキシドが 24 時間後に生成し、２日皮膚の細胞は PHGPx が欠損しても細胞死が誘導されない後から３日後にカスパーゼ非依存的な新規細胞死を誘導すのか、また毛包細胞が特に内在性で生じる脂質ヒドロペルることを見出している。本実験においてもタモキシフェンオキシドに弱いのかが解明できれば、新たな脱毛のメカニ塗布後４日目の皮膚組織において酸化脂質の生成をズムを明らかにできる可能性も秘めていると考えている。

4 -HNE 抗体を用いて検出できた。データは示していない

図６

ビタミンＥ添加による PHGPx 欠損マウスにおける発毛阻害の抑制効果− 76 −

脂質ヒドロペルオキシドによる発毛阻害のメカニズムの解析と保護化合物の In vivo 評価系の構築

５．総XV, 68 - 72 , 2012 .

括６）今井浩孝 , : 生体膜脂質酸化ホメオスタシスの破綻による新規細胞死と疾患 , オレオサイエンス , 11 , 15 - 23 ,本研究では成体の皮膚および毛包での内在性の脂質ヒド2011 .

ロペルオキシド生成が毛包形成に遅延を引き起こすこと、ビタミンＥは強い抑制効果を示すことを明らかにした。ま７）Imai H, : New strategy of functional analysis of

た本実験系は、In vivo における新たな治療薬のスクリー

PHGPx knockout mice model using transgenic rescue

ニング系にも利用できると考えられる。

method and Cre-loxP system., J. Clin. Biochem. Nutr.,
46 , 1 - 13 , 2010 .

謝辞８）S c h o e n m a k e r s E , A g o s t i n i M , M i t c h e l l C ,Schoenmakers N, Papp L, Rajanayagam O, Padidela

本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりR, Ceron-Gutierrez L, Doffinger R, Prevosto C,ご援助いただきましたことを深く感謝申し上げます。

Luan J, Montano S, Lu J, Castanet M, Clemons N,（引用文献）

Groeneveld M, Castets P, Karbaschi M, Aitken S,

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glutathione peroxidase 4 in mouse skin epithelial cells５）今井浩孝 , 松岡正城 , 中西広樹 , 田口良 , 石田規子 , 七impairs postnatal hair follicle morphogenesis that I

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出生直後死をレスキューする，ビタミンＥ研究の進歩 ,− 77 −