強力な抗酸化物質ヒドロキシチロソールの生産基盤開発
北海道大学大学院工学研究院

佐藤康治

Hydroxytyrosol (HT) obtained from olives is an antioxidant with multiple health benefits for human. Because of its low
content in olives, fermentative processes with engineered microorganisms have been developed as alternative sources. Wefor the first time succeeded in HT production from glucose with Escherichia coli engineered an artificial pathway employedtyrosine (Tyr) hydroxylase (TyrH), dihydroxyphenylalanine (DOPA) decarboxylase (DDC), and monoamine oxidase (MAO).
In the pathway, central metabolic Tyr is converted into HT as follows: (i) hydroxylation of Tyr by TyrH, (ii) decarboxylationof DOPA by DDC, (iii) oxidation of dopamine by MAO, and (iv) reduction of dihydroxyphenylacetaldehyde by endogenousalchohol dehydrogenase(s). However, the productivity was quite low. For high HT production, enhanced Tyr-supply in thecells is needed. Here, we established a Tyr-supplying pathway using a bacterial phenylalanine (Phe) hydroxylase together
with a cofactor-recycling system in E. coli and the titers of Tyr reached 2.9 g/L from Phe. Even though the strain was applied
to the HT production, the productivity was still low unexpectedly. We therefore need further improvements to accomplish
practical HT production.

１．緒言ヒドロキシチロソール（HT、図１）は、オリーブなどに含まれる強力な抗酸化物質で、その効果はビタミン C の10 倍ともいわれる。抗酸化作用のほか、抗炎症・抗菌作用、

図 1 オリーブにおける HT 生合成経路

メラニン産生や紫外線による DNA 損傷の抑制効果などが知られ、化粧品やスキンケア用品の有効成分として使用されている 1 , 2）。また、体の外側からだけでなく、美肌やアでなく、近年の世界的な環境意識の高まりから、石油に依ンチエイジング効果が期待されるサプリメントとして、内存する化学原料や有害な金属触媒の使用、さらには高温・側からのケアにも利用されている。さらに抗ウイルス活性

高圧条件下で合成するプロセスは敬遠され、新たな供給ルも知られており、最近は現在パンデミックを引き起こしてートが模索されている。このほかに、オリーブオイル製造

いる新型コロナウイルス感染症（COVID- 19）の感染予防効

時に発生する排水からの精製も検討されてはいるが、効率3）が低く、実用化には至っていない 4）。

果が注目されている 。
我々は HT を食事から摂取している。主な摂取源はバー

2015 年、持続可能な社会を実現するための世界目標（持ジンオリーブオイルであるが、含有量が低いため十分な健続可能な開発目標、SDGs）が決定された。その達成に向康効果が得られておらず、近年の健康志向の高まりもあり、け、経済活動と環境保全が両立した新しいプロセス開発が食品添加物やサプリメントとしての利用が拡大している。

要請され、従来の化学工業的製法とは異なり、省エネルギ

現在は、オリーブ果汁や葉エキスの濃縮物が使用されていー・低環境負荷で目的化合物を製造できるバイオテクノる。しかし、含有量の低さ、不純物の混在、個体・栽培エロジーは、その一端を担う重要な技術として注目されていリアによるバラつき、季節性などから、高純度での配合やる。特に微生物や酵素のもつ優れた物質変換能を活用した通年の安定供給に課題がある。また、HT はオレウロペイ

有用物質生産は、今後、ますます重要な技術になると期待ンの部分構造として生合成されるため（図１）、加水分解しされる。このような背景から、HT を生体触媒である酵素

2）遊離する必要があり、製造工程をより煩雑にする 。高純を用い合成する手法も報告されている 5 ‒ 7）。例えば、メラ度品も販売されているが、化学合成品で非常に高価なだけ

ニン色素合成に関与するチロシナーゼの利用がある 5）。本酵素は酸素を酸化剤としてタンパク質アミノ酸であるチロシン（Tyr）を水酸化し、ジヒドロキシフェニルアラニン

Development of production systems of apowerful antioxidant hydroxytyrosol
Yasuharu SatohDivision of Eng ineering, Hokka ido
University（DOPA）を生成する（図 2 上段）。キノコ由来チロシナーゼ
は Tyr と同じくフェノール構造をもつチロソールも水酸化できるため、HT 合成に利用された（図 2 下段）。しかし、本酵素はジオキシゲナーゼであり、水酸化反応に加えてキノン体への過剰な酸化反応も触媒するため、アスコルビン− 48 −

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図 2 チロシナーゼを利用した HT 合成
上段： Tyr 水酸化反応、下段： HT 合成反応

酸による還元プロセスが必要となる。このほかに、フラビ

ペインの加水分解によって生成される（図 1）。オレウロペン依存性ヒドロキシフェニル酢酸モノオキシゲナーゼやトインはチロソールを部分構造にもつリグストロシドの水酸ルエンモノオキシゲナーゼを用いたチロソールの HT への化によって生合成されると予想されているが 2）、関与する変換プロセスも報告されている

6 , 7）。これらの酵素合成法

はいずれも化学合成された原料を用いるため、持続可能な酵素は同定されておらず、新たな経路をデザインすることとした。
我々は Tyr を原料に脱炭酸とそれに続くアミノ基の酸開発目標 SDGs の達成の観点から改善が求められる。
そこで我々は、再生可能で安定供給が可能なバイオマス化、生成したアルデヒド基の還元反応を経てチロソールへを原料に、常温・常圧下で物質生産が可能な微生物による変換する植物および微生物由来酵素を用いた人工的な代謝発酵生産法の開発に着手した。これまでに HT 高生産菌の経路を設計し、合成生物学的アプローチで大腸菌へ実装す報告はなかったため、HT 生合成経路を実装した遺伝子組ることに成功していた 8）（図 3）。この成果に基づき、Tyr換え大腸菌による発酵生産について検討した。大腸菌はゲに代えて DOPA を出発化合物とすることで HT が合成可能ノム情報や遺伝子機能に関する知見などが充実し、さらにになると考え、検証した 9）（図 3）。チロソール合成で採用プラスミドベクターや遺伝子ライブラリーなどの遺伝子工した植物由来 Tyr 脱炭酸酵素（TDC）は DOPA の脱炭酸反学ツールが豊富、遺伝子導入や破壊が容易など、ほかの宿応も触媒するため HT 合成に利用できる。しかし、Tyr が主微生物よりも非常に扱いやすいという利点があり、物質存在する大腸菌内ではチロソールが副生される。後述のよ生産に広く用いられている。まずは、導入する HT 生合成

うに、Tyr は DOPA 合成の基質でもあり HT 収率の低下を経路を検討した。オリーブから得られる HT は、オレウロ招く。酵素は多種多様な化合物が混在する生体内で特定の

図 3 構築した HT およびチロソール生合成経路
BH4：テトラヒドロビオプテリン、MH4：テト
ラヒドロモナプテリン、HPAA：ヒドロキシフ
ェニルアセトアルデヒド、DOPA：ジヒドロキ
シフェニルアラニン、DHPAA：ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、HT：ヒドロキシチロソール、PheH：Phe 水 酸化酵 素、TyrH：
Tyr 水 酸 化 酵 素、TDC：Tyr 脱 炭 酸 酵 素、
MAO：モノアミン酸化酵素、ADH：アルコー
ル脱水素酵素、DDC：DOPA 特異的脱炭酸酵素− 49 −

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化合物と反応する高い基質特異性をもつため、動物由来のサンプル数は N= 3 とし、データは平均値 ± 標準偏差で記DOPA 特異的脱炭酸酵素（DDC）を用いることで、HT 選択載した。
HPLC 解析は、GL サイエンス社製 InertSustein C 18 カ的合成を達成した。
9）

続いて、大腸菌での DOPA 合成を検討した 。DOPA

ラム（15 cm × 2 . 1 mm ID, 3 µm）を連結した島津製作所社

合成活性をもつ酵素として前述のチロシナーゼがあるが、製 HPLC システムで行った。各培養液は 1 N 塩酸水溶液でDOPA は中間体であり、さらに酸化されたドパキノンを5 倍に希釈し、2 µL をインジェクションした。化合物は下還元する必要がある（図 2）。このほかに、動物が神経伝達記の条件で分離し、210 nm の吸収に基づき定量した。移物質ドパミンやアドレナリンの生合成に用いる Tyr 水酸

動相 A：0 . 1 %（v/v）ギ酸水溶液、移動相 B：0 . 1 %（v/v）
ギ化酵素（TyrH）も知られていた。しかし本酵素は動物に特酸含有メタノール、流速：0 . 2 mL/min、カラム温度：35 ℃、異的な補酵素であるテトラヒドロビオプテリン（BH 4）をグラジエント条件：5 %, 0 - 2 min、5 ‒ 30 %、2 ‒ 22 min。

要求するため、微生物による物質生産には利用されていな３．結果と考察かった。このような背景下、我々はマウス由来酵素を大腸するテトラヒドロモナプテリン（MH 4）が補酵素として機3 . 1. HT生産における律速反応の解明とTyr 供給の強化能することを明らかにした。MH 4 や BH 4 は反応の進行にグルコース（1 . 0 %［w/v］）からの HT 生産量は 12 mg/Lより酸化され消費される。ヒトは BH 4 再生系をもち、生（0 . 08 mM）と低く、また Tyr を 181 mg/L（ 1 mM）添加し体内での Tyr 水酸化反応の進行には、その両方が必須でた培地を用いた場合でも 29 mg/L（0 . 19 mM）と低かった 9）。

ある。そこで BH 4 再生関連酵素も大腸菌で共発現させた後者において Tyr の残存が確認されたことから、Tyr から結果、DOPA 合成反応が効果的に進行することがわかった。

DOPA への変換率の低さが原因と考えられた。本反応は最終的に、全ての遺伝子を導入した大腸菌でグルコースをTyrH が担うが、大腸菌内で反応を進行させるには補酵素原料に HT の発酵生産に成功した（図 3）。これは安価で再MH 4 の供給も欠かせず、TyrH と補酵素再生系の両方の生可能な糖（グルコースなど）を原料に、有害な化合物を使活性を評価する必要がある。

菌で異種宿主発現させ種々検討したところ、大腸菌に内在用せず、常温・常圧下で製造する持続可能なプロセスであ微生物の培養試験では、雑菌の混入を避けるため、試験る。しかし、現状の生産性は 12 mg/L（0 . 08 mM）と非常培地を蒸気滅菌や濾過滅菌し使用する。しかし、Tyr の水に低い。そこで本研究では、HT 生産性を改善し、実用生への溶解度は 453 mg/L（2 . 5 mM）と低いため、高濃度 Tyr産の可能性を検証した。

添加培地の調製に濾過滅菌は不適である。蒸気滅菌は、処２．方理中に Tyr がほかの培地成分と予期せぬ反応を引き起こす法ため適用できない。ヒトにとって Phe は必須アミノ酸であ2 . 1. プラスミド構築るが、Tyr は非必須アミノ酸である。これはヒトが Phe 水

ラット由来 PheH 遺伝子、ヒト由来 PCD および DHPR酸化酵素（PheH）をもち、Phe から Tyr を合成できるから遺伝子は、大腸菌のコドンに最適化した配列で遺伝子合である。本反応を担う PheH も TyrH と同じプテリン依存成し取得した。細菌由来 PheH 遺伝子は、当研究室の保存性芳香族アミノ酸水酸化酵素の一種である。Phe の水への株より調製したゲノム DNA を鋳型とした PCR で増幅した。

溶解度は 26 , 900 mg/L（163 mM）と Tyr のそれと比較して得られた DNA は該当の発現プラスミドへそれぞれクロー非常に高い。そこで、本酵素を用いた Phe から Tyr 変換経ニングし、各試験に使用した。

路を構築することで、高濃度での Tyr 供給が可能になるだ
けでなく、MH 4 再生系の効率評価も可能になると考え検2 . 2 . 生産試験証した。

生産試験には、M 9 Y 培地（0 . 1 %［w/v］酵母エキスを含MH 4 再生には、ヒト由来プテリン - 4 α- カルビノール

む M 9 最少培地。炭素源としてグルコースまたはグリセアミン脱水素酵素（PCD）とジヒドロプテリジン還元酵素ロールを 1 . 0 %（w/v）含む。
）に 5 g/L Phe および 20 mg/L（DHPR）を用いた。本遺伝子は PCD‒DHPR の順のオペロ

FeSO 4 を添加した培地を使用した。この試験培地 3 mL にンとなるように、中コピーベクターである pSTV 28 の lac

一晩培養した組換え大腸菌培養液を OD（濁度）が 0 . 15 とプロモーター下流にクローニングした（pSTV-BH 4 R、図なるように植菌し、30 ℃、200 rpm で培養した。タンパ4）。構築したプラスミドで大腸菌を形質転換し、タンパク質発現を誘導するため、培養開始から 3 時間経過後にク質発現を SDS‒PAGE 解析したが、明白なバンドは確認

イソプロピル -β- チオガラクトピラノシドを最終濃度ができなかった（図 5 A）
。そこで、各酵素に対する抗体を用0 . 5 mM となるように添加した。各時間に培養液をサンプ

いWestern blot解析した結果、図 5 BおよびCに示すように、リングし、菌体濃度は OD 測定、生産物は HPLC 解析した。

可溶性画分に両タンパク質の発現が確認できた。

− 50 −

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図 4 プラスミド pSTV-BH4R のマップ

図 6 プラスミド pQE1a-Rat のマップ

図 5 大腸菌での PCD および DHPR 発現の検証
A：SDS-PAGE 解析、B：抗 PCD 抗体を用いた Western blot 解析、C：抗 DHPR 抗体を用いた Western blot 解析、empty：pSTV28（コントロール）、BH4R：pSTV-BH4R、M：
分子量マーカー、W：菌体破砕物、S：W の可溶性画分、I：W の不溶性画分
Western blot 解析では、活性な酵素が存在する可溶性画分を分析。

次に、PheH との共発現を検討した。PheH は大腸菌で一部の微生物も PheH をもつ 10）。そこで、7 種の細菌かの発現が確認されているラット由来酵素の触媒ドメイン領

ら PheH 遺伝子を取得し、上記と同様の手法で評価した。

域を高コピーベクター pQE 1 a の強力な tac プロモーター

その結果、当研究室で単離した Gulbenkiania 属細菌由来下にクローニングした（図 6）。この際、宿主自身が産生しPheH（GsPheH、図 7）を発現した株で最も高い変換能が確た Tyr の混入を避けるため、Tyr 合成に必須な TyrA 遺伝認され、培養 72 時間で 5 , 236 ± 598 mg/L（28 . 9 ± 3 . 3 mM、子を破壊した大腸菌（Y 0 株）を用いた。その結果、Phe（分図 8）に達した。したがって、以降の検討には GsPheH を子量 165 . 19）を 5 , 000 mg/L（30 . 3 mM）添加した培地を用用いた。

い試験した結果、培養 48 時間で 79 . 7 ± 5 . 4 mg/L（0 . 44 ±2 つのプラスミドの使用は、2 種の抗生物質への耐性獲0 . 03 mM）の Tyr（分子量 181 . 19）生産が確認されたが、変得やプラスミド DNA 合成による負担（代謝負荷）の増加に換率は 1 . 6 ％と低かった。DHPR は MH 4 再生時に補酵素より、変換能が低下することが知られている。その影響をNAD（P）H を用いる。その供給には炭素源としてグルコ軽減するため、プラスミド pSTV-BH 4 R（図 4）中の lac プースよりもグリセロールの方が適していることが知られてロモーターと補酵素再生関連遺伝子（PCD と DHPR）を含おり、グルコースに代えてグリセロールを用い評価した。

む領域を PCR で増幅し、プラスミド pQE 1 a-Gs の NheI サ

その結果、Tyr 生産量は約 2 . 5 倍（197 ± 34 mg/L, 1 . 09 ±イトに挿入した（pQE 1 a-Gs-BH 4 R、図 9）。本プラスミ0 . 19 mM）に向上した。SDS-PAGE 解析で PheH の発現がドで形質転換した Y 0 株の Tyr 生産量は、培養 72 時間で確認できたにも関わらず、変換率は 3 . 6 ％と依然として低5 , 852 ± 471 mg/L（32 . 3 ± 2 . 6 mM）に達した（図 10）。こかったため、ほかの酵素の利用を検討した。の Tyr 生産量は添加した Phe を超過しているが、大腸菌− 51 −

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図 7 GsPheH 発現プラスミド pQE1a-Gs のマップ

図 9 プラスミド pQE1a-Gs-BH4R のマップ

図 8 pQE1a-Gs と pSTV-BH4R を導入した Y0 株の Tyr 生産試験■：Phe、□：Tyr、○：OD

図 10 pQE1a-Gs-BH4R を導入した Y0 株の Tyr 生産試験■：Phe、□：Tyr、○：OD

自身が産生した Phe が変換されたことが原因と考えられた。
また、先の 2 つのプラスミドを導入した株（図 8）と比較して、培養 24 時間時点の Tyr 生産量が大きく増加していた。
これはプラスミド数削減によって代謝負荷が軽減し、生産速度が向上したためと考えられた。さらに、Tyr 高生産が確認されたことから、補酵素再生系も効率的に機能することが分かった。
プラスミド pQE 1 a-Gs-BH 4 R は、以前の HT 生産研究で構築した TyrH 発現プラスミド pBbE 1 k- 39）（図 11）と同種の複製開始点（ori）をもつため、大腸菌内で同時に保持させることができない。また HT 生産には、さらに DDCとモノアミン酸化酵素（MAO）遺伝子の導入が必須であり、図 11 プラスミド pBbE1k-3 のマップ

多数のプラスミドの使用による宿主への代謝負荷の増大が懸念された。そこで、Tyr 生産に関与する PheH と補酵素再生遺伝子は大腸菌ゲノムへ組込むこととした。プラスミ要求性大腸菌（Y 0 株）の TyrA 遺伝子破壊領域へ導入した

ド pQE 1 a-Gs-BH 4 R から PheH、PCD と DHPR 遺伝子を（Gs 1 株）
。その培養 48 時間の Tyr 生産量を評価したとこ含む領域（Tyr 生産遺伝子カセット）を PCR で増幅し、Tyrろ、45 . 3 ± 1 . 8 mg/L（0 . 25 ± 0 . 01 mM）と非常に低かった− 52 −

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図 12 Tyr 生産遺伝子カセット組込み株とそれらに pQE1a-Gs ま
たは pSTV-BH4R を導入した株の Tyr 生産試験
Gs1 〜 Gs5：Tyr 生産遺伝子カセットを 1 〜 5 個組込んだ株

図 13 プラスミド pBbS1a-3 のマップ

（図 12）。ゲノム組込みでは、大腸菌内で遺伝子は 1 コピ

現するプラスミド pBbE 1 k- 39）（図 11）を用いた。その結果、ーであるのに対し、プラスミド pQE 1 a-Gs-BH 4 R は約 30

期待通り DOPA 生産（1 , 033 ± 12 mg/L；5 . 2 ± 0 . 06 mM）コピーになる。Tyr 生産量の低下は、遺伝子コピー数の減が確認された。

少が影響していると考えられたため、Tyr 生産遺伝子カグラムオーダーでの DOPA 供給が可能であったため、セットを大腸菌ゲノムの FeaB 遺伝子座へ追加で組込んだHT 生産を試みた。以前、我々が HT 生産時に使用したブ（Gs 2 株）。その結果、Tyr 生産量は約 2 . 8 倍に向上したが、タ由来 DDC 遺伝子と Micrococcus luteus 由来 MAO 遺伝子

依然として低かった（図 12）。そこで、大腸菌ゲノムに組をオペロンとして発現するプラスミド pBbS 1 a- 39）（図 13）込む遺伝子カセット数を 3、4、5 個とさらに増加させた株を上記の pBbE 1 k- 3 を含む Gs 5 株に導入し評価した。そ（Gs 3、Gs 4 および Gs 5 株）を構築し評価した結果、遺伝子の結果、予想に反し、HT だけでなく DOPA も検出されず、カセット数に比例した Tyr 生産量の増加が確認された（図約 30 mM の Phe が未反応のまま残存していた。このよう12）。しかし、プラスミド発現時（図 10）よりも大きく減少に反応が全く進行しなかった原因として、3 章 1 節で確認した。Phe の Tyr への変換反応は、Phe 水酸化と補酵素再された複数プラスミドの導入による宿主の代謝負荷の増大生という 2 種の反応が必要なため、どちらかが律速反応にが考えられた。

なっていると予想した。この検証のため、Tyr 生産遺伝子４．総カセットをゲノムに組込んだ株に、先に構築した GsPheH

括発現プラスミド pQE 1 a-Gs（図 7）または補酵素再生遺伝子

強力な抗酸化活性をもつ HT の化粧品原料としての利用発現プラスミド pSTV-BH 4 R（図 4）をそれぞれ導入し検価値は非常に高い。近年は COVID- 19 の感染予防効果も証した（図 12）。その結果、GsPheH 遺伝子の導入では Tyr注目されており、高純度品を安価に安定供給するルートが生産量は 978 ± 18 mg/L（5 . 4 ± 0 . 10 mM）であったのに対模索されている。我々は、その１つとして組換え大腸菌にし、BH 4 再 生 遺 伝 子 導 入 で は 2 , 862 ± 83 mg/L（15 . 8 ±よる発酵生産法を提案した 9）。本研究では、その生産性向0 . 46 mM）へと大きく向上した。よって、補酵素再生系が上を目指し、まずは基質となる Tyr 供給の強化に取組み、律速反応と判明した。このように Tyr 生産遺伝子カセット成功した。そこで、Tyr 供給を強化した大腸菌へ以前の研5 個をゲノムに組込んだ Gs 5 株は、補酵素再生遺伝子の導究で構築した HT 生産用プラスミドを導入したが、HT 生入により物質生産において十分な Tyr 供給が可能であった産を達成できなかった。この原因として、複数プラスミドことから、以降の検討に用いた。の導入による宿主の代謝負荷の増加が考えられた。今後は代謝負荷の軽減のため、HT 合成に必要な遺伝子全てを大3 . 2 . HT生産の検証

腸菌ゲノムへ組込む必要があると考えている。

高い Tyr 供給が可能になったため、次の反応ステップである DOPA 変換について検証した。上述のように補酵謝

辞素再生系の律速を回避するためには、その遺伝子の発現強本研究の遂行にあたり、御援助を賜りました公益財団法化が必要であったため、以前の研究で構築したマウス由来人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げま

TyrH 遺伝子と BH 4 再生関連遺伝子をオペロンとして発す。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

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