黄色ブドウ球菌における病原性遺伝子の多様化メカニズム：
同一種内多数ゲノム比較によるゲノム進化解析
東京大学新領域創成科学研究科および東京大学医科学研究所

小 林

一 三

Staphylococci are normal inhabitants on skin and mucous membrane of humans and can become pathogenic.
Especially, Staphylococcus aureus can cause severe inflammation in various tissues including skin whichsometimes results in serious disorder. In addition, this bacterium has developed resistance to practically all typesof antibiotics. Due to its clinical importance, whole genome sequences of multiple S. aureus strains have been
decoded. To date, complete genome was sequenced for more than ten strains and has become publicly available. In
their genome, several tandem clusters of paralogous genes, likely pathogenicity-related, have been found in genomic
islands. Intergenomic comparison with respect to these clusters revealed polymorphisms in them. In the case of lpl
gene cluster, encoding lipoprotein homologues, the variation was very extensive. Our multiple sequence alignment
revealed presence of a region highly conserved not only at the amino acid sequence level but also at the nucleotide
sequence level and regions to its 5’ and 3’ sides, which are more variable. The highly conser ved nucleotide
sequences are likely to have provided a site for homologous recombination generating the variation of this region.
Comparison of phylogenies of the 5’-variable region and the 3’-variable region revealed significant incongruence
within the same ORF. By contrast, pairs of 3’-variable region of an ORF and 5’-variable region of its downstream ORF
gave more congruent phyogenies with groups of conserved pairs, which suggested their linkage. An intergenic
region sandwiched by such a pair of variable regions seemed to have co-evolved with it. These lines of observations
supports our hypothesis that homologous recombination at the central conserved region have played a major rolein generating variations in this cluster. This model explains not only formation of various types of rearrangements
through multiple crossing-over events but also generation of a novel ORF with different sets of two variable regions.
The crossing-over events caused extensive shuffling of the two variable regions in one ORF, but maintained aconserved unit comprising 3’-variable region, intergenic region, and 5’-variable region spanning adjacent ORFs.
This characteristic mode of tandem paralogue diversification, maintaining 3’-part of a gene, intergenic region, and 5’part of its downstream gene as a unit of evolution, is unique among previously studied paralogue rearrangements, inwhich an ORF tended to have been considered as the unit of evolution.

１．緒の毒素遺伝子群、宿主細胞への接着や抗原抗体反応に関わ文る因子の遺伝子群、加水分解酵素の遺伝子群など、多様なブドウ球菌属細菌 Staphylococcus はヒトの皮膚や粘膜病原性因子が見出されてきた

１-７）。また、既に病原性に関に常在する細菌として重要である。この中で特に病原性わることが知られていた遺伝子に加えて、これらのホモロが問題となるのは黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus

グである病原性関連の候補遺伝子も見つかってきている。

で、ニキビや吹き出物等の傷口から皮膚に侵入し化膿性疾

こうした病原性遺伝子の多くは、「動く遺伝子単位」であ患を引き起こす。とびひ等の深刻な皮膚疾患の原因菌でもるファージやゲノミック・アイランド上に存在し、これらにあるほか、時に血管やリンパ管を介して感染が拡大すると乗って染色体に組み込まれていることが明らかになった 。

８）

更に重篤な疾患をも引き起こす。黄色ブドウ球菌はまた、

著者らはこれまでに、黄色ブドウ球菌のゲノム解読に参MRSA、VRSA 等、抗生物質が効かない系統の病院内感染・加し、抗生物質耐性やその他の病原性因子を乗せたゲノミ市中感染が社会的な問題ともなっている。

ック・アイランド上に、「動く遺伝子」の侵入・維持を制

１）

こうした臨床上の重要性から、黄色ブドウ球菌は本稿御する制限酵素の遺伝子が存在することに注目してきた 。

執筆時で 10 を超える菌株の全ゲノム配列が解読され、公また、やはりゲノミック・アイランド上でよく似た病原性

開 さ れ て い る（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes/）。

関連遺伝子が縦につながってクラスターを形成している、これらのゲノムには、抗生物質耐性に関わる遺伝子群、種々タンデム・パラログ・クラスターを複数株で比較し、その９）再編の分子機構を推定した 。
A mechanism to generate variation inpathogenicity-related tandem paraloguesof Staphylococcus aureus
Ichizo Kobayashi
Graduate School of Frontier Sciences,
University of Tokyo & Institute ofMedical Science, University of Tokyo

本研究では、黄色ブドウ球菌のゲノムが造り替えられ、多様な病原性が獲得されていく機構を解明すべく、以下の2 つの解析を行った。
（1）ゲノミック・アイランド上の制限酵素遺伝子の活性の有無を実験的に検討する。
（2）著者らの先行研究

９）で著しい再編が示唆された、ゲノミック・アイランド ν Sa α 上の病原性関連遺伝子 lpl のタンデム・− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

パラログ・クラスターについて、多数のゲノムで比較を行

identity を保っている central conserved region は相同組い、ゲノム再編の機構を明らかにすること。
（1）について換えを引き起こしてきたと考えられた。

は、ファージアッセイによって制限酵素活性を検討した（H.
Yuzawa & I. Kobayashi, unpublished）。本稿では（2）に３・２ついて、以下に詳細な結果を報告する。

２．解
２・１

可変領域の系統樹比較

仮 に ORF 中 央 の central conserved region を 介 し た
相同組換えが繰り返されてきたとすると、ある ORF の析5’-variable region と 3’-variable region は 交 叉 crossing-

配列抽出

over によってその組み合わせを変えてきたと考えられる。

NCBI ゲノム配列データベース（http://www. ncbi.nlm.

一方、ある ORF の 3’-variable region とその下流の ORFnih.gov/Genomes/）に 2007 年８月末の時点で登録されての 5’-variable region とでは、この過程において組み合わいた黄色ブドウ球菌９株のゲノム配列において、ゲノミッせが保存されてきたことが予想される。

ク・アイランド ν Sa α 上に存在するリポプロテイン様遺伝

そこで、二つの可変領域の塩基配列系統樹の比較を試

子 lpl のホモログを、BLASTP および TBLASTX（http://みた（Fig. 2）。１つの ORF を構成する 5’-variable region

www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）を用いた相同性検索によっと 3’-variable region のペアーで線を結んだ場合（Fig. 2て同定した。

（A））、系統樹間をつなぐ線は頻繁に交差し、予想通りこの組み合わせは進化の過程でシャッフルを起こしてきたこ

２・２

配列解析に使用したプログラムとが示唆された。一方で、ある ORF の 3’-variable region

マルチプルアラインメントの作成には ClustalW（http://とその下流の ORF の 5’-variable region というペアで線

www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/）を用いた。Similarity plot

を結んだ場合（Fig. 2（B））、系統樹間をつなぐ線はほと

は PLOTCON（http://emboss.sourceforge.net/）により作成した。系統樹は近隣接合法を用いて MEGA4.0（http://www.
megasoftware.net/）により作成した。

３．結果

３・１ lpl 遺伝子の構造９株（N315，Mu50, MW2, COL, MRSA252, MSSA476,NCTC8325, USA300, RF122）のゲノム配列から同定した
lpl 遺伝子全ホモログに対して、塩基配列およびアミノ酸配列を用いてマルチプルアラインメントを作成した。塩基配列レベルおよびアミノ酸配列レベルの similarity をプロットした結果を Fig. 1 に示す。なお、N315 株と Mu50株、MW2 株 と MSSA476 株 で は、 該 当 す る 遺 伝 子 お よび遺伝子間領域が完全に一致していており、本解析ではN315 株、MW2 株の配列のみを用いた。ORF の内部において、132 bp（44 a. a.）で gap を含まず、アミノ酸配列レベルでも塩基配列レベルでもよく保存された配列が見出され、この領域を central conserved region と定義した。
そして、この領域の 5’- 側および 3’- 側の可変領域をそれ
ぞ れ、5’-variable region、3’-variable region と 定 義 し た。
２つの可変領域は塩基長や配列組成に多様性が見られた。
リポプロテイン共通の，脂質修飾を受けるシステイン残基と、その N 末側のシグナルペプチドモチーフは、
5’-variableregion に含まれていた（Fig. 1）。
一般に、相同組換えは組換えを行う配列間に充分な長さと高い identity を要求する

10, 11）。この過程について詳細な解析が行われている近縁の枯草菌では、最小の長さは 70bp と報告されている12）。塩基配列レベルでも高い

Fig. 1 lpl 遺伝子の、構造（上）、塩基配列に基づく similarityplot（中）およびアミノ酸配列に基づく similarity plot（下）。
ORF 中央の保存領域を灰色で示す。（Tsuru & Kobayashi,unpublished）− 66 −

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Fig. 2 5’-variable region と 3’-variable region の系統樹比較。塩基配列を用いて近隣接合法により作成したそれぞれの系統樹を、一つの ORF の 5’側と 3’側という組み合わせ（A）、およびある ORF の 3’側とその下流の ORF の 5’側という組み合わせ（B）で比較したものを示す。（B）では、配列が保存されたペアー同士の分類が、それぞれ異なる破線のパターンで示されている。このペアーの分類に対応する、各系統樹での単系統群・側系統群の分類が、長方形で囲ってある。（Tsuru & Kobayashi, unpublished）

んどの場合、互いに平行な線でつながれるグループに分３・４ゲノム間比較とゲノム再編素過程の再構築類できることが見出された。加えて、この平行な線のグ二つの可変領域にたいする分類を各ゲノムの Map 上にループは、それぞれの可変領域の系統樹における internal表示したものを Fig. 3（A）に示す。ゲノム間を比較する

branch の短い単系統群ないしは側系統をつなぐように形と、遺伝子の順序は保存しておらず、またどの分類の配成されていた。これは、お互いに配列が保存されたペアの列セットを持つかがゲノムごとに異なっており、この領存在を示しており、やはり予想と一致する結果であった。

域が激しく再編成を起こしてきたことが示唆された。その中で、ORF を単位としてみると、１つの ORF の中で３・３遺伝子間領域の比較

は 5’-variable region と 3’-variable region と の 組 み 合 わ

Fig. 2（B）において保存されていることが示された、「あせがシャッフルされており、多様なホモログが存在している ORF の 3’-variable region とその下流の ORF の 5’-variableる。他方、「ある ORF の 3’-variable region とその下流のregion」という組み合わせのペアについて，それらの間にORF の 5’-variable region」という組み合わせの保存され挟まれた遺伝子間領域の配列を比較すると、遺伝子間領域たペアは、このような再編性を経た中でも維持されてきたでも配列が保存されていることが明らかとなった。従って，様子が見て取れる。

このタンデム・パラログ・クラスターでは，隣り合う２つPairwise のゲノム間比較において、次のような再編成のの ORF をまたいで、「3’-variable region、遺伝子間領域、素過程を見出すことが出来た。（1）挿入 / 欠失が USA300

5’-variable region」を一つの単位とする、保存された配列株（k-D-f-C-g-H-j-A-a-B1-）と COL 株（k-B1-）の間に見らのグループが存在することが示された。

れた。（2）転位が N315/Mu50 株（-D-f-G-k-）と MSSA252− 67 −

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Fig. 3 （A）各株における lpl タンデム・パラログ・クラスターの map。アルファベットで示した 5’-variableregion（ 小 文 字 ） お よ び 3’-variable region（ 大 文 字 ） に 対 す る 分 類 は、Fig. 2（B） で の 分 類 に 基 づ く。
USA300 株・COL 株間および COL 株・NCTC8325 株間の挿入 / 欠失について想定される欠失イベントについて、欠失領域を破線で、その境界領域を１から５の太線で示す。（B）USA300 株・COL 株間で想定される欠失イベントでの、境界領域のアラインメント。境界領域３は、境界領域 1 と境界領域２の間の組換えによって生じたことが示唆される。Central conserved region をアラインメントの上に表示した。（C）COL 株・
NCTC8325 株間で想定される欠失イベントでの、境界領域のアラインメント。（B）と同様。こちらでは、境界領域５が境界領域３と境界領域４の組換えによって生じたことが示唆される。
（Tsuru & Kobayashi, unpublished）

株（-G-k-D-f-）間で見られた。
（3）置換は RF122 株（-b-K-

このタンデムパラログクラスターで見られる多様性は、こd-B2-h-J-c-M-） と MW2/MSSA476 株（-b-B1-e-E-i-M-） のれらの再編素過程の繰り返しによって生成されてきたと考間で見られた。また、（4）USA300 株に存在する離れた二えられる。

つの A-a は遺伝子変換 gene conversion を示唆している。

− 68 −

USA300 株・COL 株 間 お よ び COL 株・NCTC8325 株

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間の挿入 / 欠失について想定される、欠失イベントの境まれるような構造が形成されたと考えられる。Central界のアラインメントを Fig. 3（B）,（C）に示す。ここでconserved region は相同組換えの足場となり、更なる再編は、３本の配列のうち中央の配列が上流で 1 番目の配列とを生じてきたのだろう。すなわち、交叉を通じ ORF 内で完全一致（３本目とは部分一致）していたものが、下流で２つの可変領域の組み合わせを交換し、ORF という遺伝は３番目の配列と完全一致（１本目とは部分一致）するよ

子発現の単位での多様性の創出に寄与してきた。この過程うになる、という変遷がみられる。組換え点と推定されるで、隣接する ORF をまたいで、「上流 ORF の 3’-variable

この領域は、central conserved region によく一致していregion、遺伝子間領域、下流 ORF の 5’-variable region」

た。この結果は、これらのイベントの分子機構が centralという単位は保存されてきたと考えられる（Fig. 4（A））
。
交叉の繰り返しはまた、Fig. 4（B）で示したように、conserved region での相同組換えであった可能性を支持している。次節のモデルで示すように、その他の再編素過程

Fig. 3（A）で観察されたような様々な再編の素過程を生も、同様に central conserved region での相同組換えといじうる。現在のゲノムのこの領域に見られる著しい多型のう分子機構によって生じてきたとして説明できる。

生成はこれらの再編素過程の積み重ねによって生じたと考えられる。

３・５ Central conserved region での相同組み換えによる再編・多様化モデル

４．考察

Fig. 4 に、今回の解析に基づくタンデムパラログ遺伝子今回のモデルにおいては ORF 内部の配列を介した相同の再編・多様化モデルを示す。配列レベルの多様性が生組み換えによって、２つの可変領域の交換による ORF レじる過程において、ORF 内部の central conserved region

ベルの多様性の創出と、ゲノム間のパラログ・クラスターが特異的に保存され、この部分が二つの可変領域に挟比較で見られる遺伝子順序やホモログ・セットの多様性のFig. 4 ORF 内部の保存配列を介した相同組換えによる多様化モデル。（A）相同組換えに伴う交叉によって、一つの ORF の 5’-variable region と 3’-variable region の組み合わせが交換されるが、ある ORF の 3’-variableregion と隣接する下流の ORF の 5’-variable region の組み合わせは保存される。（B）このような交叉の繰り返しによって様々な再編が生じうる。姉妹染色体間の不等交叉 [b] により、欠失（[a] から [c]）と重複（[a]から [d]）が生じる。さらに不等交叉 [e] が繰り返されると、遺伝子変換（[a] から [f]）が生じうる。染色体内の不等交叉 [g] は、環状 DNA[h] の切り出しと欠失（[a] から [i]）を生じる。環状 DNA が再挿入される [j] と、転位（[a] から [k]）が生じる。二通りの欠失（[a] から [c]、[a] から [i]）によって、置換 ([c] と [i]) が生じうる。

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コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

創出の両方を説明することができた。この多様性の基とな

４）Holden MT, Feil EJ, Lindsay JA, et al., :Completeる、（異なるグループの間で見られる）配列レベルの多様genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains:

性は、今回のモデルとは異なる進化的次元で形成されてきevidence for the rapid evolution of virulence and drug

たと考えられる。lpl 遺伝子ホモログを載せたゲノミック・

resistance, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 101, 9786-9791,
2004.

アイランド ν Sa α は、ブドウ球菌属細菌の中で黄色ブドウ球菌に種特異的に見られる。従って多様な配列を有するホ５）Gill SR, Fouts DE, Archer GL, et al., :Insights on

モログ・セットは ν Sa α が黄色ブドウ球菌の祖先型に挿入

evolution of virulence and resistance from the complete

される前に既に存在し、その後、本モデルの機構によってgenome analysis of an early methicillin-resistant

種内での多様性を更に蓄積してきたのかもしれない。

Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing
methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis strain,

多くの細菌では、様々な環境に応答して DNA レベルのJ. Bacteriol., 187, 2426-2438, 2005.

再編成を引き起こし、表現型を変化させて生存を計る、相13）６）Diep BA, Gill SR, Chang RF, et al., :Complete genome

宿主の免疫系の抗原となる分子の多様性を生み出す場合

sequence of USA300, an epidemic clone of community-は特に抗原変異 antigenic variation と呼ばれる

acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus,

変異 phase variation と呼ばれる過程が知られている。

13）。時にLancet, 367, 731-739, 2006.

それらは細菌の病原性にも関与する。これらの過程にパ14）。Lpl 遺伝子産７）Herron-Olson L, Fitzgerald JR, Musser JM, et

物がどのような生理学的な意義を担っているのか、相変異

al., :Molecular Correlates of Host Specialization inや抗原変異に関わる因子なのかについては不明である。しStaphylococcus aureus, PLoS ONE, 2, e1120, 2007.

ラログ群が関わる例が多く知られている

かし、もし他の細菌で見られるような抗原変異に関わるリ

８）Lindsay JA, Holden MT, :Staphylococcus aureus:

ポプロテインなのであれば、なぜこのような多様な配列をsuperbug, super genome?, Trends Microbiol., 12, 378-

持つ遺伝子がいくつも維持されているのか、なぜ central385, 2004.

conserved region が塩基配列レベルで非常に高い identity９）Tsuru T, Kawai M, Mizutani-Ui Y, et al., :Evolution

で保存されているのかを説明することができよう。今後のof paralogous genes: reconstruction of genome

実験的研究の進展が待たれる。

rearrangements through comparison of multiple「隣接する ORF をまたいだ配列を再編成の単位としてgenomes within Staphylococcus aureus, Mol. Biol. Evol.,23, 1269-1285, 2006.

遺伝子レベルの多様化を創出する」という本研究のモデル
は、ORF という単位に基づいていたこれまでのパラログ

10）Fujitani Y, Yamamoto K, Kobayashi I, :Dependence

研究・多重遺伝子族研究にない、新たな視点の導入である。

of frequency of homologous recombination on thehomology length, Genetics, 140, 797-809, 1995.

謝辞11）Fujitani Y, Kobayashi I, :Effect of DNA sequence

本研究に対して終始ご支援いただいたコスメトロジー財

divergence on homologous recombination as analyzed

団に感謝いたします。本報告書の中の進化解析は、東京大by a random-walk model, Genetics, 153, 1973-1988, 1999.

学大学院博士課程学生の鶴剛史君が中心になって進めまし12）Khasanov FK, Zvingila DJ, Zainullin AA, et al.,:Homologous recombination between plasmid andた。

chromosomal DNA in Bacillus subtilis requires（参考文献）

approximately 70 bp of homology, Mol. Gen. Genet.,
234, 494-497, 1992.

１）Kuroda M, Ohta T, Uchiyama I, et al., :Whole genome
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Genome, Cambridge University Press, New York, 2005,

２）Baba T, Takeuchi F, Kuroda M, et al., :Genome and277-322.

virulence determinants of high virulence community-14）Hughes D, Norstrom T, :Biological consequences

acquired MRSA, Lancet, 359, 1819-1827, 2002.
３）Ohta T, Hirakawa H, Morikawa K, et al., :Nucleotidefor bacteria of homologous recombination, Mullany

substitutions in Staphylococcus aureus strains, Mu50,

P (ed) :The Dynamic Bacterial Genome, Cambridge

Mu3, and N315, DNA Res., 11, 51-56, 2004.

University Press, New York, 2005, 351-384.

− 70 −