皮膚の健康・老化状態の非侵襲的解析法：
質量分析法を基盤としたケラチン上の化学修飾スクリーニング法の開発
東北大学大学院薬学研究科 臨床分析化学分野

大 江知 行、李宣 和、後 藤貴 章、宮 本浩 平

Purpose: Human skin is one of the major barriers of our body against environmental stimuli such as UV and chemicalexposures. Therefore, as the main constituent of the skin, keratins have recently been recognized as the major target proteins
to various chemical modifications. However, because of the difficulties associated with their insolubility and handling, there
have been lack of studies to identify the sites of chemical modification in keratins. Here, we introduce a combination ofnon-invasive sampling, simple clean-up, efficient digestion method, and MS analysis to screen keratin modifications. Thisapproach would provide significant information of the chemical modifications including oxidative modifications on keratinsthat could be useful as biomarkers of the skin damage.
Experimental: The analytical methodology to detect chemical modifications on skin keratins were optimized using tapestripping, filter-aided sample preparation, tryptic digestion, MALDI-TOF/MS etc. The tryptic keratins in human skin with/without H2O2 treatment were analyzed by MALDI-TOF/MS to confirm the oxidative modification sites.
Results and Discussion: We have developed the methodology to identify chemical modifications in human skinkeratins. Using the methodology, we have identified that Met259, 262,295, 469, located in the a-helical rod domain of K1, were themost susceptible sites to oxidation induced by H2O2 in vitro and in vivo.

１．緒
１−１

言

目的

表皮で作られるケラチンは、皮膚の最外側の角質層として 28 日程度のサイクルで剥離，脱落する疎水性蛋白質である（Fig. 1）１）。即ち、このものは、酸化や UV 照射に対する防護壁として常に外部からの刺激に直接晒されており、他の生体構成蛋白質とは極めて異なる環境にある。それ故、ケラチン上の状態変化を分別し情報源として活用することは、皮膚の健康・老化状態を知る上で極めて有用な方法論となると思われる。

Fig. 1 Section of epidermis (a) and Keratins (b)蛋白質上の微小な状態変化を明らかにする手段としては、その蛋白質上の化学修飾（酸化修飾以上の事を鑑み申請者は、化粧品の抗酸化・UV カットなど）を精査することが有効である。例えば、ケラチン上作用による皮膚の保護効果をも解析し得る非侵襲的かつ簡の化学修飾としては、活性酸素種２，３）、UV 照射４）によるカル便な皮膚状態評価法を開発するため、質量分析法を基盤とボニル化、更には脂質過酸化を介した脂質化修飾など、数したケラチン上の化学修飾、取り分け酸化修飾スクリーニ多くの可能性が考えられる。しかしながら、この様な微小ングの方法論を確立することを目的とする。

な変化を分別するには、抗体やプローブを用いたイメージングでは不充分であり、他の精緻な分析基盤が必要となる。
＊

Non-invasive analysis to monitor skinaging conditions: screening of chemical
modifications on keratin proteins by massspectrometry

１−２

皮膚状態評価法の現状：非侵襲的な皮膚状態評価法の試み
として、筑波大とカネボウのグループによる皮膚内コラーゲン構造の 3 次元画像化が報告されている５）。しかし、特殊な分析機器を必要とすること、データから皮膚状態＊

Tomoyuki Oe , Seon Hwa Lee, Takaaki
Goto, Kohei Miyamoto
Department of Bio-analytical Chemistry,
Graduate School of Pharmaceutica lSciences, Tohoku University

背景の質的変化の原因を直接フィードバック出来ないこと、などの制限もある。
化学修飾研究の現状：生体高分子上の化学修飾を情報源と− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

する dosimetry 研究は、化学物質の曝露・毒性評価など3494.6513）を用いて行った。蛋白質同定の peptide mass

で広く行われており、生体内のアルブミン、DNA の修fingerprinting（PMF）法 は、MS-Fit（ProteinProspector

飾体が広く用いられてきた。しかしながら、皮膚の健康・Version 5.2.1 Basic, UCSF Mass Spectrometry Facility）

老化状態を評価する研究例は皆無である。

を以下の検索条件で用いた：データベース , SwissProt.

研究対象としてのケラチン：ケラチンは、皮膚に多量に局

2008. 12. 16; 消化酵素，トリプシン ; maximum number of

在し、非侵襲的に採取可能である一方、疎水性で取り扱

missed cleavages, 2; constant modifications,

い困難な蛋白質である。更に生理活性が無い事も相まっ

carbamidomethyl（C），minimum matches, 4 ; sort type,て研究対象としての例も乏しかった。しかし最近、化学score sort; considered modifications, oxidation of M; min

工場労働者皮膚から、環境被曝としてのナフタレン修飾

precursor ion matches, 1; MOWSE On, 1; MOWSE P

ケラチンが示されるなど６）、ケラチンを用いた興味深い

factor, 0.4; masses, monoisotopic; mass tolerance, 0.2Da。

研究が報告され始めている。

検索にはシグナル / ノイズ比が 14.0 以上のピークを用いた。

２．実
２−１

サ ン プ ル 調 製 は、 試 料（0.5mL）及 び 150mMDHB 溶 液

験

（0.1%v/v リ ン 酸 を 含 む 50%v/v ア セ ト ニ ト リ ル 溶 液 ）試薬・基材類（0.5mL）をステンレス製 MALDI プレート上に順次滴下し、室温で乾燥させて用いた。

テープはアサヒバイオメッド社（東京）製の角質チェッカー用（25×25 mm）を用いた。超純水は大和薬品社（仙台）
過した物を、LC 用アセトニトリルは関東化学社（東京）製

２−３ ケラチンの皮膚からの採取、回収、精製、酵素消化（Fig. 2）を用いた。2, 5 - dihydroxybenzoic acid（DHB）は東京化成

表皮蛋白質の採取と回収：表皮上の脂質等を除くため、上社（東京）製、dithiothreitol（DTT）、iodeacetamide（IAA）、腕部皮膚を予めエタノールで清拭し、テープを張り３回mercaptoethanol、H2O2、sodium dodecyl sulfate（SDS）、押しつけ、一回目のテープは廃棄した。次いで２回目の重炭酸水素ナトリウム、塩酸、尿素、リン酸、リン酸二ナト

テープを同様に３回押しつけ、この物を分析に用いた。

製を、更に Millipore 社（Billerica,MA,USA）製 Milli-Q でろリウム（12 水 和物）、リン酸一ナトリウム（無水物）、NaClは

テ ー プ の 1/4（6.25×25mm）を 0.1%SDS/PBS 緩 衝 液

ナカライテスク社（京都）製、2-amino-2-hydroxymethyl-（50 mM sodium phosphate buffer、0.15 M NaCl、２mM

1, 3-propanediol（Tris）、2, 6-di-t-butyl-4-methylphenol

BHT、pH7.0、200 mL）中、handy pestle でそぎ落とし、（butylated hydroxytoluene; BHT）は和光純薬社（大阪）製、

11, 300 g、４℃、10 分間遠心し、その上清を 0.65mL の遠心チューブに移した。

トリプシンは Promega 社（Madison，WI，USA）製の物を用いた。ヒト angiotensin（Ang）
Ⅱは Calbiochem社（San Diego，

酵素消化と精製：常法に従い、20 mM DTT/RCM 緩衝液CA，USA）
製、ACTH（18 -39）はBachem社（Budendorf, Switzland）（8 mM 尿製、insuline chain B（酸化体）
は Sigma-Aldrich 社（St. Louis，2 mM BHT、pH 8.6）中 54℃、１時間の還元反応に付し、MO，USA）製を用いた。Amicon Ultra molecular cut off filter

110 mM iodeacetamide/RCM 緩 衝 液 中、 室 温、 暗 所 で（0.5mL，<30K）は Millipore 社（Billerica，MA, USA）
製を、45 分間アルキル化に付した。還元アルキル化後の試料

ZipTipC18 カートリッジは Waters 社（Bedford，MA,USA）は、molecular cut off filter（<30K）に 付 し、11,300g、素、50mM Tris、0.1M mercaptoethanol、製を用いた。また、ヒト表皮ケラチンは、実験者（K.M.）の上腕部より採取した。ホモジナイザーはフナコシ社（東京）製グラインダーに Scientist Specialities 社（Omaha，NE，USA）製を用い行った。

２−２

分析機器

MALDI-TOF/MS（Voyager-DE STR，AppliedBiosystems，Framingham，MA，USA）を以下の条
件 で 用 い た：mode: positive reflectron, mass range:
m/z500−5000; extraction delay time: 100 sec;
accelerating voltage: 20kV,: spectra:average of 100−
150 laser shots. カ リ ブ レ ー シ ョ ン は、Ang Ⅱ（m/z1046.5418）、Ang I（m/z 1296.6800）、ACTH（m/z2465.1989）、insuline chain B（oxidized）（m/zFig. 2− 74 −Sample preparation for non-invasive skin keratin analysis

皮膚の健康・老化状態の非侵襲的解析法：質量分析法を基盤としたケラチン上の化学修飾スクリーニング法の開発

４℃、12 分間遠心し、分析の妨害となる SDS 及び共存に示した。その結果、角質層蛋白質由来の 75 のペプチドする小蛋白質を濾液として除去した。フィルター上の残ピ ー ク の 内、61 ピ ー ク（K1：15；K2：11；K9：21；

渣を 100 mM 重炭酸アンモニア水溶液（100 mL、2 mM

K10：14．Total81%）がケラチンに帰属された。この事は、BHT を含む）に溶解し、トリプシン（0.75mg）存在下、極めて難溶性で取扱いの困難なケラチンを、テープストリ

37℃、オーバーナイトでインキュベートした。消化ペプッピング法による採取および FASP 法のみで、ほぼ選択的チドは、11, 300g、12 分間遠心し濾液として回収、フィに精製・回収可能である事が示された。

ルター上に残った溶液もフィルターユニットを逆さまにし 1,000g、3 分間遠心する事により回収した。消化ペプ

３−２

チド溶液は窒素気流下で乾固させ 0.1%TFA を含む５%酸化修飾位置の同定

次いで、３%H2O2 で 30 min 処理したヒト上腕部から試（v/v）アセトニトリル水溶液 50mL に再溶解した。

料を得、ケラチン酸化修飾を精査した。その結果、主要な脱塩操作：再溶解後の試料の脱塩精製は、予めアセトニト

酸化修飾ターゲットは K1 と K10 であり、とりわけ K1 の a-リ ル（10 mL×3）、 次 い で 0.1% TFA 水 溶 液（10mL×3）

ヘリックスドメイン上の Met259，262，296，469 が濃度依存的にで平衡化した ZipTipC18 カートリッジに数回通導する事酸化を受け、MALDI-TOF/MS により容易に分別可能でに よ り 保 持、0.1%TFA 水 溶 液（10 mL×3）で 洗 浄、あった（Fig. 4）。ちなみに、操作中の酸化は BHT 添加に0.1%TFA を含む 75%（v/v）アセトニトリル水溶液（10 mLより抑制された。また、修飾アミノ酸は、MS/MS 解析に×5）で溶出し、溶出液を窒素気流下で乾固させた。残より別途確認した。

渣は 50% アセトニトリル水溶液（40 mL）で再溶解後、そ３−３の一部（0.5 mL）を MALDI-TOF/MS 分析に付した。

反応時間と酸化修飾の関係

ついで、これらの Met 上の酸化修飾が、酸化ストレス２−４酸化実験を量的に反映するマーカーとなるか否かを判断する目的で、

in vitro での酸化実験：２−３で得られた 2 回目のテープの

上記 Met の酸化を、H2O2 との処理時間との関連でも精査

1/4（6.25×25 mm） を、1.8mL の H2O2 溶 液（0，2，5，した。その結果、いずれも酸化修飾の割合は、処置時間を10，40 mM）と 37℃、30 分間インキュベーションした。反応後、テープを水（1mL×2）で洗浄し、以下の操作は、２−３と同様に行い、試料とした。
in vivo での酸化実験：エタノールで清浄したヒト上腕部に、3%H2O2 溶
液 で 湿 潤 し た 脱 脂 綿（30 mm×30mm）を軽く押し当て、一定時間後、 水 に 浸 し た 脱 脂 綿（30mm×Fig. 3 MALDI-TOF/MS spectrum of human skin proteins after tryptic digestion30mm）で酸化部位を洗浄した。乾燥後、テープを張り３回押しつけ、その1/4（6.25×25mm）を試料とし、以下の操作は２−３と同様に行った。

３．結３−１

果ケラチンの回収実験

皮膚角質層蛋白質の非侵襲的採取には、表皮中薬物の抽出等に用いられるテープストリッピング法７）を、試料の精製にはプロテオミクスで多用されるfilter-aided sample preparation（FASP）法８）を検討した。最適条件を用いた時のトリプシン消化後のMALDI-TOF/MS スペクトルを Fig. 3− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

反映しており、酸化ストレスの指標となると考えられた（Fig. 5）。

４．考察

今回、皮膚の健康・老化状態の非侵襲的解析法開発を目的として、皮膚角質層ケラチンの採取を粘着テープによるテープストリッピング法、クリーンアップをmolecular cut off filter による FASP法 に よ り 行 い、 ト リ プ シ ン 消 化 とMALDI-TOF/MS の 利 用 に よ り、 ケ
ラチン上の化学修飾を簡便に分別出来
ら、シャンプー・リンス・ヘアトニック等のヘアケア製品る方法論の開発を試みた。
その結果、極めて疎水性で取扱い困難なケラチン上の化学修飾を簡便に評価する系を確立し、ケラチンが皮膚の健の評価、また未だ例は無いが裁判科学分野で規制薬物の長期使用履歴の評価にも応用できるものと思われる。
以上、本研究は非侵襲的かつ汎用機器で簡便に皮膚状態康・老化状態を知る情報源となり得る事、Met の酸化が酸を客観的に数値化、評価できるという独創的なものであり、化ストレスの指標となり得る事を確認した。
今 後、 他 の 生 理 的 酸 化 条 件（CuII/ ア ス コ ル ビ ン 酸、コスメトロジー分野の製品開発における効能評価・安全性

MnO2）、UV 照 射（254nm）、 脂 質 化 条 件（ 過 酸 化 脂 質

評価の迅速化、コストの低減、更には顧客サービスの向上

13-HPODE、分解物 4-hydroxy-2（E）-nonenal）でも検討し、等にも幅広く寄与するものと期待される。

これら修飾体の表皮での存在を確認する。また、ベースラ

６．謝

インレベルの酸化修飾を市販抗酸化クリームの継続的塗布

辞で減少し得るか否か、多変量解析により皮膚状態を定量的本研究は、平成 21 年度コスメトロジー研究振興財団のに解析出来るか否かも精査し、本コンセプトの妥当性を検研究助成を受けて行ったものである 9−13）。同助成会に心よ討する予定である。

り感謝致します。また、MALDI-TOF/MS 装置は本学医

５．総学研究科共通機器室の物であり、ここに感謝致します。

括『非侵襲的かつ汎用機器で簡便に皮膚状態を評価する方（引用文献）

法論』は、現在のところ国内外で見るべき物がない。それ

１）Plowman JE: The proteomics of keratin proteins. J.

故、プロテオミクスと dosimetry 研究の概念を取り入れた

Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.,

本研究は、通常の分析施設で常備している機器（MALDI-849, 181-189 (2007).

TOF-MS）でも対応可能であり、国内外に高いインパクト

２）Thiele JJ, Hsieh SN, Briviba K, Sies H: Proteinoxidation in human stratum corneum: susceptibility ofを与える物と期待される。
更に、本法は、皮膚の健康・老化状態、更には皮膚環境

keratins to oxidation in vitro and presence of a keratinのみならず、化粧品の抗酸化・UV カット効果をも非侵襲

oxidation gradient in vivo. J. Invest. Dermatol., 113,的に評価出来得るため、極めて有用な方法論と考えられる。

335-339 (1999).

また、角質層でのケラチンのサイクルが 28 日程度である

３）Hirao T, Takahashi M.: Carbonylation of cornified

ことを考える時、同一被験者をコントロールとした、よりenvelopes in the stratum corneum. FEBS Lett., 579,

具体的な効能評価を可能とするばかりか、真皮中コラーゲ

6870-6874 (2005).

ンを指標とした皮膚評価法とは全く異質の情報を得ること

４）Sander CS, Chang H, Salzmann S, Muller CS,
Ekanayake-Mudiyanselage S, Elsner P, Thiele JJ:も期待される。
一方ケラチンは、非侵襲的に採取可能であるばかりか、

Photoaging is associated with protein oxidation in

室温でも極めて安定な蛋白質である。それ故、被験者自身

human skin in vivo. J. Invest. Dermatol., 118, 618-625(2002).

による試料採取と郵送可能な安定性を考える時、化粧品会社が顧客のアフターサービスの一環としての試料分析も可

５）Sakai S, Yamanari M, Miyazawa A, Matsumoto M,
Nakagawa N, Sugawara T, Kawabata K, Yatagai T,能と考える。
更に、ケラチンは毛髪中にも多量に含まれていることか− 76 −Yasuno Y: In vivo three-dimensional birefringence皮膚の健康・老化状態の非侵襲的解析法：質量分析法を基盤としたケラチン上の化学修飾スクリーニング法の開発

17 日、仙台analysis shows collagen differences between young
and old photo-aged human skin. J. Invest. Dermatol.,10）宮本浩平、李 宣和、後藤貴章、大江知行：" 非侵襲的な表皮ケラチン分析法の開発と酸化修飾解析への応用 "．

128, 1641-1647 (2008).

みちのく分析科学シンポジウム 2011 、2011 年 7 月 23 日、

６）Kang-Sickel JC, Fox DD, Nam TG, Jayaraj K, BallLM, French JE, Klapper DG, Gold A, Nylander-French

米沢

LA: S-arylcysteine-keratin adducts as biomarkers of11）宮本浩平、李 宣和、後藤貴章、大江知行："Development

human dermal exposure to aromatic hydrocarbons.

of non-invasive proteomic analysis to monitor skinChem. Res. Toxicol., 21, 852-858 (2008).

conditions by mass spectrometry". 第 50 回日本薬学会

東北支部大会 、2011 年 10 月 29 日〜 30 日、仙台７）Chao YC, Nylander-French LA: Determination ofkeratin protein in a tape-stripped skin sample from jet12）Lee SH, Miyamoto K, Goto T, Oe T: "Non-invasive

fuel exposed skin. Ann. Occup. Hyg., 48, 65-73 (2004).

proteomic analysis of human skin keratins: screening８）Wiśniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, Mann M:of methionine oxidation in keratins by mass

Universal sample preparation method for proteome
analysis. Nat. Methods, 6, 359-362 (2009).

spectrometry". J. Proteomics, 75, 435-449 (2011).
13）Lee SH, Miyamoto K, Goto T, Oe T: "Non-invasive analysis
to evaluate skin conditions : screening of chemical（本助成金による業績）

modifications in human skin keratins by mass spectrometry"９）宮本浩平、李60th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied

宣和、後藤貴章、大江知行：" 非侵襲的サンプリングによる表皮ケラチン分析と酸化修飾解析への応用 "．日本分析化学会第 59 年会 、2010 年 9 月 15 〜

− 77 −

Topics, may 20-24, 2012, Vancouver, Canada.