CRISPR-Cas9 ゲノム編集技術を用いた紫外線防御剤となる多機能光回復酵素の開発
大阪大学大学院基礎工学研究科

山元淳平

Ultraviolet (UV) exposure of DNA causes formation of harmful DNA damage, such as cyclobutane pyrimidine dimers(CPDs) and pyrimidine( 6 – 4 )pyrimidone photoproducts ( 6 - 4 PPs), which block DNA replication and induce mutagenesis,
leading to carcinogenesis. Repair of these lesions is a vital pathway to maintain genetic integrity, and thus loss of the genes
responsible for DNA repair causes cell death or cancer. Among the DNA repair systems, photoreactivation is the simplestpathway, in which a sole photo-responsive enzyme, photolyase (PL), can repair UV-induced DNA lesion in a light-dependent
manner. Therefore, PLs are molecules applicable to the UV protectant under sunlight.
PLs are classified into two major classes, CPD photolyase and ( 6 – 4 ) photolyase, depending on their target substrates(CPD and 6 - 4 PP, respectively). If a hybrid type of PL that can recognize and repair both CPDs and 6 - 4 PPs is developed,
such a molecule excellently inhibits formation of UV-induced DNA damage and functions as a UV protectant. In this study,
I intended to develop the hybrid photolyase by combination of CRISPR-Cas 9 genome editing technology and directed
evolution of photolyase. Plasmids were designed to knock the modified PL genes in human cells via homology-independent
targeted integrity, with a promoter and antibiotic-resistant gene. After transfection of the plasmid with Cas 9 and gRNAproducing plasmids, however, antibiotics-resistant strains were not obtained, although the target genes were integrated into
the AAVS 1 site. Thus, the plasmid was used for functional screening of the hybrid PL in bacteria, the results of which are
shown in this report.

1.

緒酵素が存在する（図 1）。ヒト培養細胞に対して光回復酵素

言を導入する試みは 2000 年代前半からなされ始め、CPD 光

生体中の遺伝情報を含む DNA は紫外線の曝露により化回復酵素を HeLa 細胞へ導入することで、紫外線によって学構造の変化が誘起され、隣接するピリミジン塩基間にお誘起されるアポトーシスの減少 2）や、UVB 曝露に起因すいて光架橋反応が起こり、シクロブタン型ピリミジンダイる炎症作用の軽減 3）といった効果が報告されている。さらマー（CPD）や（6 - 4）光産物といった紫外線損傷 DNA が形に、CPD 光回復酵素を有するトランスジェニックマウスが成される。これら紫外線損傷 DNA の修復はヌクレオチド作成され、高い紫外線耐性を持つことが報告されている 4）。

除去修復機構（NER）が担っており、その修復経路の遺伝

また、より効率よくかつ簡便に CPD 光回復酵素の遺伝子的欠損は色素性乾皮症などの紫外線高感受性症状を伴う重を導入するため、mRNA として初代ケラチノサイトへの篤な疾病の原因であることが知られている。一方、大腸菌導入がなされ、医療応用への方向性が示された 5）。いずれからヒトを除く高等生物に広範に保存されている光回復との報告例も、CPD 光回復酵素のみを用いており、（6 - 4）光呼ばれる DNA 修復経路は、フラビンタンパク質のひとつ回復酵素を導入した報告例は見当たらない。単一の酵素でである光回復酵素が紫外線損傷の直接認識・修復を担って両方の損傷を修復することのできるハイブリッド型光回復

おり、紫外線損傷 DNA を単一の酵素で、かつ太陽光中の青色光を用いて修復することができるユニークな酵素である 1）。
ヒトは光回復酵素を有していないため、光回復酵素を外来からヒト細胞中へと導入、もしくは適切な条件で表皮塗布することで、上記疾患の遺伝子治療や紫外線防御効果が期待される。一方で、光回復酵素は高い基質選択性を有しており、CPD および（6 - 4）光産物のそれぞれの修復を担う

D eve l o p m e nt o f mu lt i - f u n c t i o n a lphotolyase as an ultraviolet protectant
using CRISPR-Cas 9 genome editing
Junpei Yamamoto
Graduate School of Engineering Science,Osaka University− 57 −

図1

光回復酵素についてコスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

酵素を調製できれば、前述の治療応用が可能になることがセイを用いた。制限酵素 XbaI によって線状化した pGE-期待される。過去に、（6 - 4）光回復酵素の一部のアミノ酸

XbaI-IPA と 2 . 2 . で調製した PCR 産物を In-fusion HD キ

を CPD 光回復酵素の相同アミノ酸へと置換することで、ットによって環状プラスミドとし、反応処理後の溶液を用（6 - 4）光回復酵素でありながら、CPD の修復が可能となる

いて SY 2 を形質転換し、薬剤を含む寒天培地プレート上6）ことを報告している 。しかし、この酵素は（6 - 4）光回復に撒いた。そのプレートに対し、0 . 2 J/m 2 の紫外光を照射酵素としての機能が喪失しており、ハイブリッド型として後、白色光を 30 分照射した。その後、暗所 37 ℃にて静置の遺伝子治療やコスメトロジーへの応用には十分ではない。

し、得られたコロニーについてコロニー PCR を行った。

本研究では、（6 - 4）光回復酵素を基本骨格とし、（6 - 4）PCR 産物の DNA 配列を解析し、変異導入された位置を調光産物修復能を保持したまま CPD 光回復能を持たせたハべた。

イブリッド型光回復酵素を、Error-prone PCR およびヒ

３．結ト線維芽細胞に対する CRISPR-Cas 9 ゲノム編集技術を組3. 1. 実験系のデザインみ合わせることで開発することを計画した。

２．方果CRISPR-Cas 9 による遺伝子導入には従来相同組換え法（HR）が用いられるが、非分裂細胞では HR の頻度が低いた

2. 1. プラスミド構築

め、非相同末端結合（NHEJ）を介したHomology-Independent

基本骨格となるプラスミドには pBluescript II SK（-）をTargeting Integration（HITI）法 8）による導入を計画した。

用い、XhoI/SacI サイトに諸々の PCR 産物を導入した。

そのために、図 2 に示すプラスミド DNA を設計・作成した。

PCR は PrimeSTAR MAX DNA polymerase も し く は

CRISPR-Cas 9 による遺伝子導入部位はヒトゲノム上のセ

PrimeSTAR GXL DNA poymerase（タカラバイオ）を用いーフハーバーである AAVS 1 とし、2 つの AAVS 1 認識配た。PCR増幅産物はアガロースゲル電気泳動によって分離・列でヒト PGK プロモーター・大腸菌 EM 7 プロモーター・精製した。PCR 増幅産物を用いたプラスミドの構築には、サブクローニング用制限酵素サイト（XbaI）・内部リボソIn-fusion HD キット（タカラバイオ）を用いた。構築したプー ム 進 入 部 位（IRES）・ ピ ュ ー ロ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子

ラスミドを用いて大腸菌 Stellar competent cells（Clontech）（PuroR）・ポリ A を挟んでいる。このプラスミドを pGE-を形質転換し、得られたプラスミドの DNA 配列はコロニ

XbaI-IPA と名付けた。プラスミドを AAVS 1 認識ガイドー PCR 産物のシーケンス解析により確認した。本研究でRNA および Cas 9 発現プラスミドとともにヒト細胞に導入構築した基本プラスミドを、pGE-XbaI-IPA と名付けた。

すれば、クローニングサイトにサブクローニングした任意目的配列を有する大腸菌コロニーを培養し、プラスミドをの遺伝子を AAVS 1 へ導入することができる。また、本系

NucleoBond Xtra Midi キットで精製した。

は大腸菌の合成プロモーターである EM 7 を保有している

pGE-XbaI-IPA の ク ロ ー ニ ン グ サ イ ト XbaI 部 位 に、Methanosarcina mazei 由来 CPD 光回復酵素（MmCPDII）もため、XbaI サイトに導入した遺伝子を大腸菌中でも発現することができる。

しくは Xenopus laevis 由来（6 - 4）光回復酵素（Xl 64）を導入したプラスミド pGE-MmCPD-IPA および pGE-Xl 64 -IPAは同様に作成した。

2. 2. Error-prone PCR
Xl 64 に対するランダム変異導入は既報 7）に従い Errorprone PCR により行った。100 µL の反応混合液（0 . 3 µM プ
ライマー , 10 ng pGE-Xl 64 -IPA, rTaq DNA polymerase,
1 0 mM Tris-HCl, 5 0 mM KCl, 1 . 5 mM MgCl 2 , 1 mM
MnCl 2 , 1 . 5 mM dATP, 1 . 5 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mMTTP）を調製し、変性（95 ℃ 30 s）・アニーリング（55 ℃30 s）・伸長（68 ℃ 2 min）のサイクルを 35 回行った。PCR産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製した。

2. 3. スクリーニング
DNA 修復活性の有無のスクリーニングには、DNA 修復能を失った大腸菌 SY 2 株を利用した UV サバイバルアッ− 58 −

図2設計したプラスミドと HITI によるゲノム導入

CRISPR-Cas9 ゲノム編集技術を用いた紫外線防御剤となる多機能光回復酵素の開発

3. 2. ヒト細胞を用いたプラスミドの機能確認能を有する MmCPDII を導入したプラスミドで形質転換を本システムの確認のため、制限酵素サイトに CPD 光回行った場合、生存率の大幅な向上が観測された。Xl 64 を復酵素および（6 - 4）光回復酵素の遺伝子を pGE-XbaI-IPA

含むプラスミドでは、光回復酵素を含まないものと比較すにサブクローニングしたプラスミド pGE-MmCPDII-IPA

ると小程度の生存率の向上が見られた（図 3）。これらのこおよび pGE-Xl 64 -IPA を調製し、NER が欠失した XP 2 OSとから、今回構築したプラスミドが SY 2 株の中で機能し細胞にこれらのプラスミド、AAVS 1 の gRNA 用プラスミていることがわかった。MmCPDIIとXl 64 の生存率の差は、

ド、および Cas 9 プラスミドとともに導入した。トランス生成する紫外線損傷の種類に対応していると考えられる。

フェクション７日後からピューロマイシンによる薬剤セレ

一般的に、紫外線照射によって生成する損傷としては、クションを行ったが、薬剤耐性を獲得した細胞は得られな

6 - 4 PP よりも CPD の方が多くなることが報告されており、かった。

6 - 4 PP 修復能しか持たない Xl 64 の導入では CPD の修復トランスフェクション後の細胞からゲノム DNA を抽出し、PCR をしたところゲノム中への遺伝子挿入は確認さはできないため、限定的な生存率の向上となったと考えられる。

れた。コントロールで用いた別の遺伝子導入プラスミドでは、ピューロマイシン耐性遺伝子は EF 1 α プロモーター下流に存在し、こちらは薬剤耐性が獲得された。このことか

3. 4. Error-prone PCRによる変異導入および機能スクリーニング

ら、XP 2 OS 細胞では PGK プロモーターの働きが弱く、薬これらの結果から、Xl 64 に対して変異導入を行い CPD剤耐性が充分に獲得されたなかったものと考えられる。し修復能が獲得された場合、生存率の大幅な向上が期待できたがって、ヒト細胞を用いたスクリーニングはできないとる。そこで、Xl 64 をテンプレートとし既報に従い Error-判断した。

prone PCR を行って変異導入を行った。XbaI サイトで線状化した pGE-XbaI-IPA に対して PCR 産物を In-fusion 法

3. 3. 大腸菌SY2によるサバイバルアッセイにて連結し、SY 2 大腸菌株を形質転換した。プレート上構築したプラスミドは大腸菌のプロモーターも含むため、に塗布した後、0 . 2 J/m 2 の紫外線を照射し、白色光 30 分

今回目的としたスクリーニングは大腸菌でも実施可能であ照射ののち、37 ℃でインキュベートしたところ、コロニる。そこで、各種 DNA 修復関連遺伝子を薬剤耐性遺伝子ーの形成が確認された。このうち、10 個のコロニーをピで置換した大腸菌株 SY 2 および今回構築したプラスミドックアップし、DNA 配列を解析した。結果を Table 1 にを用いてスクリーニングが実施可能であるかどうか検証し示す。

た。
この SY 2 株は内在性の組換え修復、光回復、およびヌクレオチド除去修復ができないため、紫外線照射によってTable 1

極めて容易に死滅する。ここに光回復酵素遺伝子を保有すEntry

変異導入塩基変異のタイプアミノ酸の変異

1T 483 A
A 1436 T
A 1510 G

Transversion
Transversion
Transition

なし（Gly 161 Gly）
Asn 479 Ile
Asn 504 Asp

2C 246 T
A 356 CT 1556 C

Transition
Transversion
Transition

なし（Phe 88 Phe）
Glu 119 Ala
Val 519 Ala

3C 734 T

Transition

Thr 245 Ile

4

A 428 GG 574 A
A 900 GT 1055 C

Transition
Transition
Transition
Transition

Asn 143 Ser
Val 192 Ile
なし（Ala 300 Ala）
Ile 352 Thr

5A 1093 G

Transition

Thr 365 Ala

6A 1041 G
T 1227 C

Transition
Transition

なし（Arg 347 Arg）
なし（Phe 409 Phe）

7

T 940 CA 1128 TA 1519 G

Transition
Transversion
Transition

Cys 314 Arg
なし（Gly 376 Gly）
Lys 507 Glu

8

リード失敗

9C 1089 T
T 1278 CTransition
Transition

なし（Phe 363 Phe）
なし（Asp 426 Asp）

10T 694 C
A 1128 GTransition
Transition

Cys 232 Arg
なし（Gly 376 Gly）

るプラスミドを導入することで、紫外線照射につづく白色光照射により、紫外線損傷 DNA を修復することが可能となり、生存率の向上が見られることが期待される。
まず、今回構築したプラスミド pGE-XbaI-IPA、pGEMmCPDII-IPA、および pGE-Xl 64 -IPA を用いて SY 2 株を形質転換し、その紫外線損傷 DNA の修復に伴う生存率の向上が見られるかどうか調べた。その結果、CPD 修復

図3

UV サバイバルアッセイの結果− 59 −

Error-prone PCR による Xl64 の変異導入パターン

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図４Error-prone PCR により変異導入された Xl64 のアミノ酸エントリー 4 においては、Xl 64 遺伝子配列 1545 塩基の回導入されたアミノ酸の変異は DNA 結合部位の周辺であうち、４箇所の変異が確認された一方で、他のエントリーり、損傷と直接相互作用するアミノ酸側鎖ではなかった。

においてはそれよりも少ない変異導入数であった。また、そのため、今後は変異導入を行う範囲を限定することで、変異導入によってアミノ酸変異が導入されない場合も多くより現実的な多機能酵素の開発につながると考える。

見られ、エントリー 6 や 9 では、アミノ酸配列としてはXl 64 野生型と同一であった。図４に、導入された変異の場所を示す。

（引用文献）
1） Yamamoto, J., Plaza, P., Brettel, K., Photochem.

４．考Photobiol. 93, 51- 66（2017）．

察2） Chigancas, V., Miyaji E. N., Muotri, A. R., Jacysyn, J.
F., Amarante-Mendes, G. P., Yasui, A., Menck, C. F. M.,

今回の変異導入では、主としてトランジション変異が起

Cancer Res. 60, 2458-2463（2000）．

こっており、アミノ酸の大幅な変化につながっていないことがわかった。より高度に変異導入することで、広範なラ

3） Stege, H., Roza, L., Vink, A. A., Grewe, M., Ruzicka,

イブラリ形成につながるため、別の手法による変異導入を

T., Grether-Beck, S., Krutmann, J., Proc. Natl. Acad.

試みる必要がある。また、今回のスクリーニングで得られSci. USA 97, 1790-1795（2000）．

た変異体のうち、エントリー 4 については DNA 結合部位

4） Schul, W., Jans, J., Rijksen, Y. M. A., Klemann, K. H.の近傍に 2 箇所の変異が導入されていることから、この配M., Eker, A. P. M., de Wit, J., Nikaido, O., Nakajima, S.,

列を有するタンパク質を遺伝子組換え体として得、タンパ

Yasui, A., Hoeijmakers, J. H. J., van der Horst, G. T. J.,
EMBO J. 21, 4719 - 4729（2002）．

ク質の機能解析に供する価値がある可能性がある。一方で、本スクリーニングでは、Xl 64 と機能的に変化がない場合

5） Boros, G., Miko, E., Muramatsu, H., Weissman, D.,においても生存コロニーとして得られたことから、スクリ

Emri, E., Rozsa, D., Nagy, G., Juhasz, A., Juhasz, I., vanーニング法として改善の余地があると考えられる。今回はder Horst, G., Horkay, I., Remenyik, E., Kariko, K., Emri,

In-fusion 反応産物を直接 SY 2 へと導入してスクリーニン

G., J. Photochem. Photobiol. B 129, 93 - 99（2013）．

グに供する方法を採用したが、一度、別の大腸菌に導入後

6） Yamada, D., Dokainish, H. M., Iwata, T., Yamamoto,にプラスミドを回収してから、SY 2 株にてスクリーニン

J., Ishikawa, T., Todo, T., Iwai, S., Getzoff, E. D., Kitao,A., Kandori, H., Biochemistry 55, 4173 - 4183（2016）．

グする方法も検討する必要がある。
以前の研究では、（6 - 4）光回復酵素の DNA 結合部位の内部で損傷部位と直接相互作用するアミノ酸を置換するこ
6）とで CPD 修復能を獲得できることを報告している 。今7） Cadwell, R. C., Joyce, G. F., Genome Res. 2, 2 8 - 3 3（1992）．
8） Suzuki, K. et al., Nature 540, 144 -149（2016）．

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