天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究
長崎国際大学薬学部薬品資源学研究室

宇都拓洋

Licorice (Glycyrrhiza spp.) is the most important ingredient for the Japanese Kampo medicine and the traditional
Chinese medicine, and has been reported to show various pharmaceutical functions. Liquiritin (LQ) and its aglycon
liquiritigenin (LQG) are major licorice flavonoids classified as a phloroglucinol. Our screening of components of licorice
extract revealed that LQ and LQG activate melanin synthesis in melanoma cells. In this study, we elucidated the molecularmechanism of melanin synthesis activated by LQ and LQG. In addition, we investigated the intracellular accumulationand target protein of LQ and LQG using anti-LQ/LQG monoclonal antibody (anti-LQ/LQG mAb). LQ and LQG activatedmelanin synthesis in mouse (B16-F1 and B16-4A5) and human (HMV-II) melanoma cell lines. LQ and LQG enhanced theexpression of tyrosinase (Tyr), TRP-1, and TRP-2. Molecular analysis suggests that LQ and LQG activate the p38 and PKA
signaling pathways leading to the MITF expression. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-LQ/LQG
mAb indicated that LQ and LQG cannot be detected in cellular lysate, and Western blotting using anti-LQ/LQG mAb as theprimary antibody demonstrated that LQ binds to an approximately 35-38 kDa protein. These results suggest that LQ andLQG enhance melanin synthesis via the activation of p38 and PKA signaling pathways by binding to an approximately 3538 kDa protein.

１．緒る他、健康食品にも利用されている。さらに最近は、甘草言エキスや甘草フラボノイドが配合されている化粧品、育毛

メラニンはメラノサイトより合成され、紫外線や活性酸剤、染毛剤などが多く市販され、甘草の持つ美容効果への素種の刺激から皮膚を保護する役割を持つとともに、メラ関心が高まっており、甘草エキス成分の機能解析や作用機ニン合成の減少が白髪や白斑の原因になることが知られ序に関する科学的エビデンスが求められている。ている 1, 2）。メラニンは、メラノサイト内のメラノソーム

我々は、これまでに約 30 種類の活性天然物に対するにおいて L- チロシンを出発物質として生合成されており、特異的モノクローナル抗体（mAb）の作製に成功しており、一連の合成反応は、チロシナーゼ（Tyr）、Tyrosinase-それらを用いたアッセイ系の開発を中心に研究を行ってき

related Protein-1（TRP-1） お よ び TRP-2 に よ り 調 節

た 7-10）。さらに、これら抗天然化合物特異的 mAb をツーされている 3）。またこれらメラニン合成因子の発現は、ルとして、高感度 ELISA やドットブロットによる生薬成

Microphthalmia-associated Transcription Factor（MITF）

分定量法の開発、免疫染色による植物組織中の活性成分局がプロモーター領域の M-box に結合することで誘導され、在分布解明、主有効成分のみをアフィニティーカラムで除MITF の活性化は複雑なシグナル伝達系により制御されて去し、主要成分除去エキスを用いた生薬成分の相乗効果解

いる4, 5）。これまでメラニン合成を抑制する天然化合物の明などの応用研究を展開してきた 11-12）。そこで本研究は、探索およびその作用機序解明に関する報告は数多いが、メ甘草エキス成分に対する特異的 mAb を作製し、細胞内でラニン合成を誘導する天然化合物に関する報告は少なく、の挙動や分子標的を解明し、甘草エキスのメラニン合成制メラニン合成を促進することで皮膚がんや白髪予防、白斑御機構に関する新たな知見を見出すことを目的とした。

治療などが期待されることから、これらの研究が望まれている。

甘草成分の解析は国内外で盛んに行われてきており、約500 種の成分がこれまでに同定されている。主要生理活性

甘草は全漢方処方の約 7 割に配合される重要な生薬で、成分はグリチルリチン（GC）であることが知られているが、抗炎症、抗アレルギー、抗潰瘍など多くの薬効が知られてフラボノイド類（甘草フラボノイド）をはじめとする GC 以6）

いる 。また甘草は、味噌や醤油などに甘味料と用いられ外の成分も、抗炎症、抗がん、抗菌作用など多彩な機能を持つことが報告されている 6, 13）。しかしながら、甘草エキス

Analysis of the mechanism of actionof constituents from licorice root using
monoclonal antibody against naturalcompounds
Takuhiro Uto
Department of Pharmacognosy, Facultyof Pharmaceutical Sciences, Nagasaki
International University

成分のメラニン合成への影響に関する報告はほとんどない。
本研究の初期実験として、甘草エキス成分のメラニン合成に与える影響をスクリーニングしたところ、代表的な甘草フラボノイドであるリクイリチン（LQ）とそのアグリコンであるリクイリチゲニン（LQG）（図 1）が、B16 メラノーマ細胞においてメラニン合成誘導活性を持つことを見出し− 77 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016Healthcare）にて行った。

2. 5. 抗 LQ/LQG-mAb の作製
LQ-MeOH 溶液に、NaIO4-H2O 溶液を滴下し、室温で30 分間撹拌した。この反応液に 50 mM Carbonate Buffer（pH 9.6）で溶解した Keyhole Limpet Hemocyanin（KLH）
図１を滴下し、室温で 6 時間撹拌した。反応生成物を精製水

LQ および LQG の化学構造に対して透析し、凍結乾燥後、LQ-KLH コンジュゲートた。そこで本研究は、はじめに LQ および LQG のメラニンを得た。また同様の手法で LQ-Human Serum Albumin

合成に関与する酵素群、さらにそれらを制御する転写因子（HSA）コンジュゲートも作製した。これらの免疫複合体やシグナル伝達分子への影響を解析し、さらに LQ および中の LQ の結合数を MALDI-TOF MS で確認後、マウスへLQG に対する mAb（抗 LQ/LQG-mAb）を作製することで、免疫感作し、抗体価が上昇した時点でマウスの脾臓細胞をLQ および LQG の細胞内挙動と分子標的の解析を行った。

単離した。得られた脾臓細胞とミエローマ細胞の細胞融合

２．実を行い、HAT セレクションによりハイブリドーマを選抜験

し mAb の作製を行った。

2. 1. 細胞培養
B16-F1 および HMV-II は ECACC、B16-4A5 は RIKEN

2. 6. 競合的 ELISAの確立

Cell Bank よ り 入 手 し た。B16-F1 お よ び B16-4A5 は50 mM Carbonate Buffer で溶解した LQ-HSA を 96-well

10% FBS 含 有 DMEM 培 地、HMV-II は 10 % FBS 含 有plate に 100 µL ず つ 分 注 し、 抗 原 を 固 相 化 し た。0.05%

RPMI1640 培地で培養した。

Tween-PBS（T-PBS）で洗浄後、300 µL の 5 % Skim MilkPBS）を加え、1 時間ブロッキングした。T-PBS で洗浄後、2. 2. メラニン産生量測定

LQ もしくはセルライセートを 50 µL を加え、さらに抗 LQ/4

細胞を 24-well plate に 1×10 cells/well で播種し、1 日

LQG-mAb 溶液を 50 µL を分注した。1 時間の競合反応後、培養後、LQもしくはLQG を添加した。3 日培養後、細胞をT-PBS で洗浄し、100 µL の Horseradish Peroxidase（HRP）

120 µL の 1N NaOH で溶解し、415 nm の吸光度をマイク-labeled Anti-mouse IgG（Fc specific）Solution を 加 えロプレートリーダーで測定し、メラニン産生量を測定した。

さらに 1 時間インキュベートした。洗浄後、100 µL の 2,2. 3. 細胞増殖抑制能測定を加え十分に発色したのち、405 nm における吸光度を測

2-Azino-di（3-ethylbenzthiazoline）Sulfonic Acid（ABTS）
細胞生存率は 3-（4, 5-Dimethylthiazol-2-yl）-2, 5-diphenyl定した。

-tetrazolium Bromide（MTT）法を用いた。B16-F1 細胞を96well plate に 0.2×10 4cells/well で 一 晩 培 養し、LQ もし2. 7. 交差反応性の算出

くは LQG を添加した。3 日間培養後、MTT（5 mg/mL）をLQ およびその類縁化合物に対する交差反応性を調べる

10 µLずつ各ウェルに添加し、さらに 4 時間培養した。沈殿ために、各種化合物を用いて競合的 ELISA を行った。各した MTT-formazanを 100 µL の 0.04N HCl–Isopropanolに種化合物の交差反応性は、サンプル非存在下での吸光度をて溶解し、マイクロプレートリーダーで吸光度（595 nm）を測100% とし、吸光度が 50% 阻害される濃度（IC50）で算出した。

定した。

2. 8. LQ および LQG の細胞内蓄積量測定

2. 4. Western Blotting

B16-F1 細胞（1×106cells）を10 cm プレートに播種し、一B16-F1 細 胞（3×105cells） を 6cm デ ィ ッ シ ュ に 播 種

晩培養後、経時的に LQ もしくは LQG で処理した。細胞し一晩培養し、LQ もしくは LQG で処理した。培養後、回 収 は PBS で 細 胞 を 十 分 洗 浄 し、Proteinase InhibitorsRIPA buffer で細胞溶解後、Protein Assay Dye Reagent

Cocktail を含む PBS で回収した。超音波破断機で細胞を粉Concentrate（Bio-Rad）にてタンパク量を定量した。SDS-

砕後、タンパク量を定量し、抗 LQ/LQG-mAb を用いた競PAGE は Laemmli 法を用い、等量のセルライセートタン

合的ELISAにてLQおよびLQGの細胞内蓄積量を測定した。

パクを Polyacrylamide Gel にて分離し、PVDF メンブラン

３．結に転写した。ブロッキング後、各種一次抗体中で 4 ℃下一晩処理し、HRP 結合二次抗体で１時間反応させた。検出果3. 1. LQ および LQG のメラニン合成誘導能

は ECL Prime（GE Healthcare）を用いて LAS-1000（GE− 78 −マ ウ ス メ ラ ノ ー マ 細 胞 B16-F1 細 胞 に お け る LQ ま天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究

た は LQG の メ ラ ニ ン 合 成 能 の 結 果 を 図 2A に 示 す。

ク質発現上昇に起因することが示唆された。

α-Melanocyte-Stimulating Hormone（α-MSH）はポジティブコントロールとして用いた。コントロール（未処理）と比較して LQ または LQG で処理した細胞ではメラニン合3. 3. LQまたは LQG の転写因子およびシグナル伝達因子への影響成が誘導されており、その効果は LQ より LQG が強かっ

MITF は活性化されると核内へ移行し、Tyr、TRP-1、た。また同様の結果が B16-4A5 細胞やヒトメラノーマ細TRP-2 遺伝子のプロモーター領域の M-Box に結合するこ胞 HMV-II においても確認された（data not shown）。さらとにより転写活性を高める14）。CREB は MITF 遺伝子の転写に、LQ および LQG の細胞毒性は認められなかったことか調節を担い、Akt、ERK、p38 により制御されている 14）。また、ら（図 2B）、LQ および LQG はメラニン合成促進能を有す

p38 と ERK は直接的に MITF を誘導することも報告されることが示唆された。ている 15）。そこで、LQ および LQG のこれら転写因子およびシグナル伝達因子への影響を調べた。LQ または LQG は

3. 2. LQまたは LQG のTyr、TRP-1および TRP-2のタンパク質発現への影響
in vitro チロシナーゼ活性解析の結果、LQ および LQG は、MITF タンパク質発現を誘導した（図 4A）。さらに図 4B に示すように、LQ または LQG 処理後 5 分より CREB、ERK、p38 のリン酸化が誘導され、時間経過とともにリン酸化が直接的にチロシナーゼ活性を誘導しなかった（図 3A）。そ消失した。一方、PI3K-Akt 経路は、α-MSH の刺激によ

こで、メラニン合成に関与する酵素群の発現を解析したとり逆に不活性化されメラニン産生を誘導することが知られ

こ ろ、LQ お よ び LQG は 共 に Tyr、TRP-1、TRP-2 の 発ているが 15）、LQ および LQG による Akt リン酸化の抑制能現を誘導した（図 3B）。この結果より、LQ および LQG のは強くなかった。

メラニン合成促進能は、Tyr、TRP-1、TRP-2 のタンパ

A

さらに LQ および LQG のメラニン合成への各シグナル

B

図２

A

B16-F1 細胞における LQ および LQG のメラニン合成誘導能（A）、細胞生存率への影響（B）＊p ＜ 0.01 vs control

B

図３

LQ および LQG の in vitro チロシナーゼ活性（A）、Tyr、TRP-1、TRP-2 発現への影響（B）− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

伝達系の関与を調べるために、PI3K 阻害剤（LY294002）、ハイブリドーマを樹立し mAb を調製した。精製した mAb

p38 阻害剤（SB203580）、MEK 阻害剤（U0126）、PKA 阻害のアイソタイプのタイピングを行った結果、サブクラス剤（H-89）による LQ または LQG 誘導性メラニン合成へ与は IgG 2 a で軽鎖が κ の mAb であることを確認した。次にえる影響を解析した。図 5 に示すように、LQ または LQG

抗 LQ/LQG-mAb を用いて競合的 ELISA の確立を行った。

誘導性メラニン合成は、SB203580 と H-89 で抑制されたプレートに固相化した LQ-HSA と遊離の LQ との競合によことから、LQ および LQG のメラニン合成には p38 およびるアッセイ系を検討した結果、0.39 〜 25 µg/mL（0.93 〜PKA が関与していることが示唆された。

59.75 µM）の濃度範囲内で吸光度との間に良好な直線関係が得られた（data not shown）16）。

3. 4. 抗 LQ/LQG-mAb の作製
さらなる LQ および LQG の作用機序解析を目的として
抗 LQ/LQG-mAb の作製を行った。今回我々は、LQ をハ

3. 5. 抗 LQ/LQG-mAb の交差反応性試験および構造活性相関プテンとし KLH をキャリアタンパク質とした免疫原（LQ-抗 LQ/LQG-mAb の特異性を調べるために、構造類似

KLH コンジュゲート）の調製を行った。LQ-KLH コンジ化合物および各種天然化合物に対する交差反応性を競合

ュゲートの調製は、LQ の糖部を NaIO4 で開環し、開環し的 ELISA により測定し、IC50 を算出した。その結果、本た糖部のアルデヒドを KLH のリジン残基とアルカリ条件mAb は、LQG（IC5 0 ＝ 3 3.0 9 µM）、Hesperetin（IC5 0 ＝下での縮合によりシッフベース形成することで作製した。

17. 83 µM）、Naringenin（IC50 ＝ 79.41µM）に対して交差

LQ-KLH コンジュゲートを免疫原としてマウスに免疫し、反応は示したものの、その他の Flavone 類および構造類似AB

図４

図５

LQ および LQG の MITF 発現（A）、CREB、Akt、ERK、p38 リン酸化（B）への影響

LQ および LQG 誘導性メラニン合成への各種阻害剤の影響
LY294002（LY）:10 µM、SB203580（SB）:10 µM、U0126（U）: 5 µM、H-89（H）: 2.5 µM− 80 −

天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究

化合物に対しては交差反応を示さなかった（表 1）。これら

的に LQ または LQG 処理した細胞から得られたセルライセの結果より、C-7 の hydroxyl 基と C-2 − C-3 間の単結合ート中には LQ または LQG はほとんど検出されなかったが本 mAb の認識に重要な役割を果たしていることが示唆（data not shown）。

された。本 mAb は LQG も良好に認識することから、LQGを用いて競合的 ELISA を行ったところ、1.56 〜 50 µg/mL

3. 7. LQ の結合タンパク質の検出（6.09 〜 195.12 µM）の濃度範囲内で吸光度との間に良好なLQ および LQG の標的分子同定を目的として、抗 LQ/直線関係が得られた。よって本 mAb は LQ と LQG に非常LQG-mAb を一次抗体とした Western Blotting を行った。に特異性が高い mAb であり、LQ および LQG の作用機序

抗 LQ/LQG-mAb は LQG よりも LQ に対する反応性が強い解析に有用なツールになりうる可能性が示唆された16）ことから、LQ 処理細胞由来のセルライセートの解析を行。

った。図 6 に示すように、コントロールおよび LQ 処理由3. 6. LQ および LQG の細胞内蓄積

来のセルライセートにおいて非特異的なバンドがいくつか

LQ または LQG 処理した B16-F1 細胞から調整したセルライセート中の LQ および LQG の蓄積量を、抗 LQ/LQG-

検出されるが、LQ 処理 5 分において 35-38kDa 付近に LQ結合タンパク質のバンド（◀）が検出された。

mAb を用いた競合的 ELISA で測定した。60 分以内で経時表１

抗 LQ/LQG-mAb の交差反応性

図６ 抗 LQ/LQG-mAb を用いた Western Blottingによる LQ 結合タンパク質の検出− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016

４．考および LQG 量を測定したが、LQ および LQG はほとんど察検出されなかった。この結果は、セルライセート中の LQ

本研究は、代表的な甘草フラボノイドである LQ とそのおよび LQG 量が ELISA の感度の 0.39 〜 25 µg/mL（0.93

アグリコンの LQG の持つメラニン合成誘導能に注目し研〜 59.75 µM）以下であるため検出できなかったと考えられ、究を行った。近年 LQ および LQG の生物活性に関する報告

LQ および LQG は細胞内には多く取り込まれずに細胞膜表は多くなっているが、メラニン合成に関する報告は皆無で面のレセプター等に関与していると考えている。さらにある。LQ および LQG は、マウスメラノーマ細胞（B16-F1、抗 LQ/LQG-mAb を一次抗体とした Western Blotting の結B16-4A5）およびヒトメラノーマ細胞（HMV-II）において果、LQ で 5 分処理した細胞由来のセルライセートにおいて、メラニン合成を促進し、その効果は LQ より LQG が強かっ35-38kDa 付近に LQ 結合タンパク質のバンドが検出された。また、LQ および LQG はチロシナーゼ酵素活性に直接た。これは p38、ERK、CREB がリン酸化された時間とも的に影響せず、Tyr、TRP-1、TRP-2 の発現を高めるこ

一致していることから、LQ 結合タンパク質のメラニン誘とでメラニン合成を促進していることが明らかになった。

導機構への関与が示唆される。

さらに転写因子・シグナル伝達系の解析や各種阻害剤にケミカルバイオロジー研究の発展により、天然化合物よる解析結果をまとめると、LQ と LQG は p38 及び PKAの標的分子の同定を試みる研究が活発になってきている活性化を引き起こし、CREB のリン酸化誘導を介する経が、天然由来の生理活性物質の多くは単一ではなく複数の路もしくは直接的に MITF の発現を誘導することで、Tyr、標的をもつことや、標的分子との結合様式やアフィニティ

TRP-1、TRP-2 の発現を高めてメラニン合成を促進してーの違いが多様であり解析が困難な点が多い。現在の標的いることが示唆された（図 7）。

分子解析法として、アフィニティークロマトグラフィー法

さらに我々は、LQ および LQG の細胞内での挙動・分布、や分子プローブ法が広く知られているが、これらの手法で標的分子の同定を目標として、特異的 mAb の作製を行っは限界があるため新しい手法が求められている。我々はた。本研究では、LQ-KLH コンジュゲートを免疫原とし抗天然物特異的 mAb をツールとして、生薬成分の細胞やてマウスに免疫することでハイブリドーマを樹立し、抗組織内の局在解明や標的分子同定に取り組んでいる。本

LQ/LQG-mAb の作製に成功した。本 mAb は、LQ と LQG

手法は生薬成分の構造を修飾する必要はなく、生細胞や組に加えて Hesperetin と Naringenin に対して交差反応は示織での解析が可能という利点がある。しかしながら、目的

すが、その他の Flavone 類及び構造類似化合物に対しては成分と標的分子の結合部位と、抗体のエピトープが近い交差反応を示さないことから、LQ および LQG の作用機序位置であれば抗体が結合できずに検出できない可能性が解析に有用なツールになりうる可能性が示唆された。抗ある。また、目的成分と標的分子間の結合様式が弱い場合

LQ/LQG-mAb を用いた競合的 ELISA を用いて、LQ およは、Immunocytochemistry（ICC）や Western Blotting でび LQG 処理した B16-F1 細胞由来セルライセート中の LQは検出できない恐れもある。本研究で用いた抗 LQ/LQGmAb は、Western Blotting では LQ 結合タンパク質を検出できたが、ICC では良好な検出ができなかった（data notshown）。今後、LQ 結合タンパク質を抗 LQ/LQG-mAb を用いた免疫沈降法により単離し、質量分析法により標的タンパク質を同定する予定である。またエピトープの異なるmAb による ICC や Western Blotting に加えて、アフィニティークロマトグラフィー法や分子プローブ法も行うことで、LQ および LQG の細胞内の挙動・局在や標的分子同定を確実なものとしたい。抗天然化合物特異的 mAb を用いた解析が、メラニン合成を制御する天然化合物の作用機構に関する新たな知見に繋がることを期待している。
（謝辞）

本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりご支援いただきましたことに深く感謝申し上げます。また、本研究の共同研究者である長崎国際大学薬学部の正山征洋教授、健康管理学部の藤井俊輔助手のご助言およびご協力
図７

LQ および LQG によるメラニン合成促進の分子機構に心より御礼申し上げます。

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天然物特異的モノクローナル抗体を用いた甘草エキス成分の作用機構に関する研究（引用文献）

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