新しい皮膚成分の分析手法としてのコレステロールセンサの開発

大阪府立大学先端科学イノベーションセンター

椎 木弘Control of the skin cholesterol level plays an important role for preventing the life-style related diseases
and goes a long way in skin health.   However, the conventional method is troublesome due to its sensitivity
and the necessity of using the enzyme reaction through many procedures.   Therefore, we focus on the simple
electrochemical measurement of cholesterol using the molecularly imprinted self-assembled monolayer (SAM).
A detection of the electroinactive cholesterol has been achieved by electrochemical method with a potassiumferrocyanide as a redox marker.  The change of the oxidation peak current (I) has shown a linear relationshipwith the concentration of cholesterol. The change of I related to the cavity concentration for the masstransport of redox marker on the molecularly imprinted SAM.  When the cholesterol-sensitive SAM recognizes
cholesterol, the I decreases due to the rejection of diffusion of the marker to the gold electrode surface.   Oncontrary, when the SAM extracts cholesterol, the marker diffuses to the electrode surface, and the I increases.  
The sensing properties of molecularly imprinted SAM, such as sensitivity, selectivity, and reproducibility, havebeen examined and it has been applied for simple and speedy electrochemical sensor development.

１．緒

テロール全体の約 11％を占めていることを報告し、加国言International Medical Innovations 社 と 米 国 ク リ ー ブ ラ

コレステロールは皮膚の保湿、老化防止に関する重要な

ンドクリニックの研究グループはコレステロール検査法成分として、また、細胞膜や細胞内の物質の移動を防ぐ生Cholesterol 1, 2, 3TM を開発した５）。この方法は検査パッド

体膜を構成する成分としても知られており、さらに胆汁酸、を手のひらに貼り付け、酵素反応による色の変化で皮膚の各種ホルモンの原料になるなど様々な役割を担っているな

コレステロール量を判断できるというもので非侵襲的な検ど、身体を維持していくために不可欠な化合物であるが、査が可能である。しかしながら、低感度なために定量的な過多摂取は動脈硬化や狭心症の危険因子である高脂血症の計測は困難で、一般母集団を対象とした CAD のリスクを発症に深く関わると言われている。食文化の相違か判定するスクリーニングテストとしては不適応であるとさら、高コレステロール血症を含む高脂血症は欧米人に多くれており、標準的な血液検査に取って代わる検査法ではな見られ、東洋人、とりわけ日本人には軽視されがちであっい。実際に皮膚と血中のコレステロールに相関が在るかたが、その人口は日本国内においても年々増大し、平成 2

否かという問題はいくつかの報告５−７）に結論を委ねるが、年には 700 万人であった患者は平成 12 年では 2000 万人をコレステロールを非侵襲的に計測するひとつの新しい試み超えるまでに増大している。さらに、他の生活習慣病や疾として、また、皮膚の健康状態を客観的に調べる一つの指患・疾病などとの合併症のリスクから計測による管理の必標として、分子鋳型８, ９） を刷り込んだ自己集合単分子膜要性が増しており、コレステロール濃度の適正レベルの維を利用した測定法の開発を行い、皮膚コレステロールの定持はゆとりある日常生活を送るための必要条件となってい量を行った。

１−４）

る。したがって、簡易なコレステロール計測法および機器の開発は、医療従事者だけでなく、家庭での健康の自己管

2．実理を望む多くの人々に切望されている。しかしながら、医療機関で行われる計測の全てが酵素法によるもので、採血（侵襲）を伴うため自宅での簡単な検査は困難である。

２．１

験

電極の作製と測定作用極（センサ部）に金電極（直径１㎜）、対極に白金

近年、米国 FDA は皮膚コレステロールが体内コレス線および参照極として Ag/AgCl［基準参照極 Ag/AgCl の標準水素電極（SHE）との電位差は 25℃で +0.199V］を

Development of novel analytical method
for skin cholesterol
Hiroshi Shiigi
Frontier Science Innovation Center,
Osaka Prefecture University使用した。以下、全ての電気化学計測により得られた値
は Ag/AgCl に対するもので、その表記は vs. Ag/AgClとする。金電極の表面を研磨および超音波洗浄した後、0.1M 硫酸水溶液中で−0.2 〜＋1.5V（vs. Ag/AgCl）、掃引速度 100mV/s で電位サイクルして洗浄した。この電極を 20mM コレステロールと 100µM ステアリルメルカプタ− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

ンを含む修飾エタノール溶液 50mL に 30min 浸けて金電分子鋳型がコレステロールを認識するとマーカーは電極表極上に自己集合単分子膜（self-assembled monolayer 以下面に接近することができないため（b）、その濃度に依存SAM と略）を形成した。SAM 電極をエタノール中に浸して酸化電流は減少する。
分子鋳型電極によるコレステロールの計測（マーカーのし 3 時間撹拌することで、鋳型分子であるコレステロールを洗い流して分子鋳型電極とした。SAM はチオール分子

酸化電流測定）は、5mM K4Fe（CN）6 を含む 50mM 過塩の−SH 部位が金に吸着することを利用したもので、下式

素酸カリウム電解液中、サイクリックボルタンメトリー[1] のような反応により形成されることが知られている 10）。 （CV）により行った。このとき、修飾電極からコレステロールを溶出させることで増加した酸化電流値を Io、鋳型電
R−SH ＋Au→

R−S−Au＋1/2 H2[1]

極がコレステロールを取り込んだ後の電流値を Ir と表すと、コレステロール認識による酸化電流変化は Io － Ir か

アルキルチオールを用いた場合、金電極上に吸着した隣ら求めることが可能で、これを ΔI と定義する。

り合うチオール分子のアルキル基がファンデルワールス力によって引き合うことで高密度にパッキングされる 11−13）。

２．２

血中コレステロールの定量

本研究ではチオール分子として長鎖アルキル基を有するス

血中の総コレステロール値は総合病院の臨床検査部によテアリルメルカプタン（C18H37SH）を使用し、コレステり、採血と測定を行った後に得られた。採血は食後２〜３ロールとの混合溶液に金電極を浸漬することで、金電極上時間（15 時〜 15 時半）に行った。4 人の被験者に対しては、に SAM を形成した。エタノール中で SAM 修飾電極を洗informed consent 後にすべての実験を行った。

浄すると、コレステロールだけが洗い流され、コレステロール分子の鋳型を有する SAM 膜が形成される。これを分２．３

皮膚コレステロールの抽出

子鋳型電極としてコレステロールの計測を行った。コレス

皮膚コレステロールの計測を行うために、プラスチック

テロールは非常に高い酸化電位を持つため、その電気化学カップ（内径 25㎜、容量 8mL）にエタノールを 1.0mL 入検出は広い電位窓を有するダイヤモンド電極を用いるなどれ、せっけんで手洗して 30 分後、手のひらにカップを接の必要がある触（60s）させコレステロールを抽出した。食後 2 〜 3 時。したがって、通常の電気化学系では電14）

気化学的に不活性な物質として取り扱われている。そこで、間に行った採血の一時間後（16 〜 16 時半）に、皮膚コレ本法では酸化還元活性化学種（[Fe（CN）6] ）をマーカーステロールの抽出操作を行った。

4−として用い、コレステロールの認識に伴う酸化電流の変化を読み取ることで間接的にコレステロールの定量を行った 15）。

２．４

従来法による皮膚コレステロールの定量

分子鋳型によるコレステロールの認識は以下により説明で酵素法では総コレステロール測定キット（コレステロー

きる（図１）。SAM 上に構築された分子鋳型が空の場合（a）、ル E- テストワコー，和光純薬工業）を使用した。反応溶マーカーは金電極表面に拡散し、酸化電流を生じる。一方、液に抽出液 20µL を加えて撹拌し、37℃で５分間静置した
後に 600nm の吸光度を測定した。
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による定量にはLC-10A システム（島津製作所）または 1100 Series（Agilent社）を使用した。カラムには Luna 5u C18（Phenomenex 社、150 ㎜ ×4.6 ㎜）を用い、カラム温度、流速、検出波長はそれぞれ 40℃、1.2mL/min、212nm で行った。また、溶離液としてアセトニトリル／ 2-プロパノールの混合溶液（1：1）を使用した。

３．結
３．１

果

電気化学応答

電気化学的に洗浄した後、裸の金電極では典型的なマーカーの CV 曲線が得られた（図２a）。しかし、SAM 電極
では酸化還元電流はほとんど見られない（b）。これは、電図１ 分子鋳型 SAM 電極のコレステロール認識機構の概念図、吐き出し（a）と取り込み（b）．

気化学的に不活性なステアリルメルカプタンとコレステロールにより、電極上に絶縁膜が形成されたため、電極表面− 84 −

新しい皮膚成分の分析手法としてのコレステロールセンサの開発にマーカーが接近できなくなったものと考えられる。分子縮され、分子鋳型に取り込まれると考えられる。このよう鋳型電極ではマーカーの酸化還元電流が曲線 a より小さいなコレステロールの認識過程が 30s で達成されるものと推値であるが再び現れた（c）。これは SAM 中のコレステロ測される。つまり、分子鋳型のコレステロールへの応答時ール分子が溶出した際、マーカーの拡散が可能な分子の形間として取り扱うことが出来る。以下、コレステロール溶の孔（分子鋳型）が形成されたことを意味する。分子鋳型液への電極の浸漬時間を 30s とした。鋳型電極のコレステ電極における酸化還元電流はコレステロール溶液に浸漬しロールの認識に伴う ΔI と濃度との関係を図 3 に示す。0た後に再び減少した（d）。このとき、酸化電流は浸漬時〜 1.0mM の濃度領域において直線的な変化が観察された。1.0mM 以上では ΔI はなだらかに増加間に依存して減少したが、約 30s 以上では変化は見られず、 （相関係数 0.9983）ほぼ一定になった。分子鋳型法は酵素反応とは異なり、分し、約 3mM で飽和に達した。標準的な酵素法による測定

子鋳型を構成するステアリルメルカプタンが目的分子（コの場合、求められた 600nm の吸光度をコレステロールのレステロール）と特異的に反応する部位を持たないが、両濃度に対してプロットすると（図４）、2.0 〜 10mM（70〜分子に大きな疎水基が存在する。このため、溶液中のコレ400 ㎎ dL− 1 に相当し、酵素法の実用測定領域 ) での相関

ステロール分子は疎水−疎水相互作用により電極近傍に濃係数は 0.9995（inset）であるが、1.0mM 以下では 0.8980にまで低下する。したがって、1.0mM 以下の低濃度領域（0.1〜 1.0mM）での定量は分子鋳型法（精度５% 以内、感度1.67µA/mM）が適すると考えられる。

2μA

３．２

分子鋳型の選択性

皮膚に存在する物質のほか、コレステロールと類似した構造を有する化合物について測定を行った。各物質の分子体積、相対感度（コレステロール（ΔI）を 1 とした時の相対値）を表 1 に示した。ステロイド骨格を持ち、コレステロールと似た構造を持つ胆汁酸では、分子体積の最も小さいデヒドロコール酸の相対感度は 0.52、最も大きなタウ−0.200.2E/V0.40.6

ロコール酸においては 0.24 となり、分子体積の増加に伴0.8って相対感度は減少した。デヒドロコール酸、デオキシコvs. Ag│AgCl

図２ サイクリックボルタンモグラム，裸の金（a），SAM 修飾電極（b），分子鋳型 SAM 電極（c）と 3mM コレステロー
ル溶液に浸漬後（d）．5mM K4Fe（CN）
6 を酸化還元マーカー，50mM KClO4 をバックグランド電解質として含む溶液中．I 0:
マーカーの酸化電流値，Ir : コレステロールを認識した後の酸化電流値．電流応答 Δ( I ) は次式により算出される．ΔI＝ I0 − Ir. （Shiigi et al.）ール酸、コール酸は、コレステロールよりも小さい分子であるが、カルボニル基（親水基）を持つため疎水雰囲気の鋳型に取り込まれにくいものと考えられる。しかしながら、これらの胆汁酸は 0.52 〜 0.24 とコレステロールの認識に0.032Absorbance / a.u.

R＝0.9983

Δl / μA

1.51R＝0.8980

0.020.60.40.010.2

R＝0.9995

0.500000.2

0.40.6

0.8

1Concentration of cholesterol / mM
図３

ΔI のコレステロール濃度依存性 .（Shiigi et al.）00.20.40.6040.8812161Concentration of cholesterol / mM
図４ 酵素反応溶液の 600nm での吸収ピーク強度のコレステ
ロール濃度依存性．挿入図は 16mM までの広い範囲での濃度依存性．
（Shiigi et al.）− 85 −コスメトロジー研究報告 Vol.14, 2006

おいて無視できない相対感度を示す。また、コレステロー

３．３

ルエステルでは体積の最も小さなコレステロールアセテー

皮膚コレステロールの測定

皮膚からのコレステロール抽出液を用いて、酵素法、トで 0.49、最も大きなリノール酸コレステロールにおいてHPLC 法と分子鋳型法のそれぞれの方法によりコレステロは 0.37 となり、分子体積が増加するにつれて相対感度にールの定量を行った。抽出液中のコレステロール濃度は抽減少が見られた。エステル型は胆汁酸と比べ、疎水性の強出時間に依存したが 60s 以上では変化が見られないことかい化合物であるが、3 位の置換基（R―）の存在により分子ら、抽出時間は 60s とした。酵素法および HPLC 法では体積がコレステロール（HO―）より大きくなり、鋳型に取抽出液そのままでは吸光計の感度が得られないため、加熱・り込まれにくいものと考えられる。このような選択特性の減圧により 5 倍に濃縮した。それぞれの方法から得られた相違から、分子鋳型がコレステロールとのわずかな構造の値は等しいものとなった。以上のことから、分子鋳型法は違い（R―＝ CH3OCO―，C7H15OCO―，C17H31OCO―）を酵素法や HPLC 法と比較して同等の認識能を持つだけで認識していることが示唆された。また、コレステロールはなく、５倍以上の感度を有するため、皮膚コレステロール光や熱によって酸化されるため、皮膚コレステロールは酸の計測に適していることがわかった。また、コレステロー化コレステロールとして存在する場合がある。それらに対ルの非侵襲計測の観点から、血中の総コレステロール値とする相対感度はケトコレステロールで 0.97、コレステロー

分子鋳型法により得られた皮膚コレステロールの値を比較

ルエポキシドで 0.88 であり、コレステロールと同程度のした。４人の被験者はいずれも 20 代男性（22 〜 29 歳）で、選択特性を示した。一方、コレステロールの前駆体、皮膚血中総コレステロール濃度が最も高い被験者（220mg/dL）に多く存在する物質として知られるスクワレン 16）はステでは皮膚コレステロールは 0.37mM、血中濃度が低い人

ロイド骨格の環が開いた構造をしており、疎水性が強くコ（159mg/dL）では 0.17mM となり、血中総コレステロー

レステロールと類似しているが相対感度は 0.39 と比較的ルと皮膚コレステロールの間に相関が見られた（相関係数小さい。皮膚に広く分布しているトリオレインやオレイン0.9886）。同一抽出液を加熱・減圧により 5 倍に濃縮した後、酸などの脂肪酸については 0.20 以下の低い値を示した。

酵素法および HPLC 法により計測した結果と良く一致した。

− 86 −

新しい皮膚成分の分析手法としてのコレステロールセンサの開発

エタノールで抽出した後に、同一箇所から再び抽出した能であることから、皮膚コレステロールの測定に適してい場合、４時間の間隔を保つことで皮膚コレステロール値にることがわかった。しかしながら、皮膚に存在する汚れや回復が見られた。室内外における大気環境の変化が皮膚に皮脂などさまざまな妨害物質の存在のため、更なるセンシ与える影響を考えると、コレステロールは少なくとも 4 時

ング特性の向上や皮膚からの抽出法の最適化の必要がある。

間で分泌され、保湿の役割を果たすと考えられる。さらに、実際には個人差や生活習慣だけでなく、抽出法により大き抽出操作における溶媒の与える影響としてメタノール、ヘく左右されるため、本方法を多くの被験者に対して実施し、キサン、プロパノール、アセトニトリルなどを用いて実験臨床データを取得することが必要である。

を行った。各条件はエタノールの場合と同じで、溶媒の化学的性質、皮膚に与える影響を調べた。アセトニトリル、 （参考文献）
ヘキサンでは、コレステロールの抽出量に関して増加の傾向にあったが、いわゆる手荒れが認められ、２〜３日間元１）山中 學 , 村地 孝 , 林 康之 , 臨床検査 MOOK, No.4, 血清脂質 , 金原出版 , 1（1980）．に戻ることは無かった。メタノール、プロパノールの場合、

２）岡 芳知 , 倉林正彦 , 福内靖男 , 山田信博 , Molecular

手荒れは見られなかったが、コレステロール抽出量は減少

Medicine, 38, 92, 生活習慣病 分子メカニズムと治療 , 中した。

山書店（2002）．
３）P. M Ridker, J. Genest, P. Libby, Heart disease: a４．考

textbook of cardiovascular medicine, 6 th ed., W. B.

察Saunders, 1010 Philadelphia (2001).

実際の計測を考えると、総コレステロールの正常値に個４）H. Bouissou, J. De Graeve, C. Legendre, M. L. Solera,

人差はあるが通常 130 〜 230 ㎎ /dL と言われており、3.4

E. Wulfert, J. C. Thiers, Biomed Pharmacother, 36, 159〜 5.9mM に相当する。皮膚に存在するコレステロールは(1982).

0.37 〜 0.65mM であり、従来法による定量は抽出液の濃縮

５）R. Zawdiwski, D. L. Sprecher, M. J. Evelegh, P.

工程を要したが、我々が開発した分子鋳型法では 1.0mM

Orsewood, C. Carte, M. Patterson, Clin. Chem., 7, 1302以下の濃度領域においても十分な感度（1.67µA/mM）が(2001).

得られ、皮膚コレステロールの定量が可能になった。さら６）J. Mancini, S. Chan, J. Frohlich, L. Kuramoto, M.に、血中濃度との良好な相関が得られたことから、総コレ

Schulzer, D. Abbott, Am. J. Cardiol., 89, 1313 (2002).

ステロール値の測定の可能性も示唆された。しかしながら、

７）L. Edouard, F. Doucet, J. C. Buxtorf, J. L. Beaumont,

妨害が予測される角層、皮脂、表皮、真皮などに存在する

Clin. Physiol. Biochem., 3, 323 (1985).

種々の物質に対しては、十分な選択性が得られたものと、

８）H. Shiigi, K. Okamura, D. Kijima, A. Hironaka, B.

今後、抽出法や前処理などによる解決法が必要な物質が存

Deore, U. Sree, T. Nagaoka, Electrochemical and Solid-

在した。例えば胆汁酸は、分子鋳型の選択特性に大きな影響を与える値を示したが、生体中では腸で再吸収されて肝State Letters, 6, H1 (2003).
９）H. Okuno, T. Kitano, H. Yakabe, B. Deore, H. Shiigi, T.

臓に戻るといった閉鎖的な循環を行っており、その低い血Nagaoka, Anal. Chem., 74, 4184 (2002).

中濃度（1 〜 8µM）のために皮膚での存在は計測に関し

10）桑畑 進 , Electrochemistry, 67, 90(1999).てほとんど影響しない濃度であることが予測される。また、

11）P. E. Laibinis, G. M. Whitesides, D. L. Allara, Yu.-T. Tao,スクワレンや脂肪酸などの疎水性が強い物質の、同じく疎A. N. Parikh, R. G. Nuzzo, J. Am. Chem. Soc., 113, 7152

水性の強い分子鋳型膜への非特異吸着が、コレステロール(1991).

計測に与える影響はほとんど見られなかった。エステル型

12）M. C. Porter, T. B. Bright, D. L. Allara, C. E. D. Chidsey,

では、分子鋳型がコレステロールとのわずかな構造の違い

J. Am. Chem. Soc., 109, 3559 (1987).

を認識していることが示唆されたが、選択特性に与える影

13）原 正彦 , 表面科学 , 21, 724 (2000)．

響は大きく、今後の検討課題である。

14）A. Kotani, F. Kusu, Arch. Dermatol. Res., 294, 172(2002).

５．総

15）S. A. Piletsky, E. V. Piletskaya, T. A. Sergeyeva, T. L.

括

Panasyuk, A. V. El’ skaya, Sensors and Actuators B, 60,

本研究により開発した分子鋳型によるコレステロール計
測法は従来の酵素法よりも工程が少なく、取り扱いが容易であることに加え、低濃度領域（＜ 1.0mM）の測定が可216 (1999).
16）見城 勝，大倉さゆり，任田美穂 , 金子智佳子，太田尚子，J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn., 34, 365 (2000).

− 87 −