ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析
東京都健康長寿医療センター研究所

今江理恵子

Phosphatidylinositol (PI) is a versatile lipid that not only serves as a structural component of cellular membranes, butalso plays important roles in signal transduction through distinct phosphorylated derivatives of the inositol head group. PI
contains stearic acid (18 : 0 ) as the predominant fatty acid at the sn- 1 position. This fatty acid composition is formed throughfatty acid remodeling by sequential deacylation and reacylation. We previously identified acyltransferases responsible for theincorporation of stearic acid into the sn- 1 position of PI in C. elegans (acl- 8 , acl- 9 and acl- 10 ) and mice (lycat). However,the biological significance of the enrichment of stearic acid at the sn- 1 position of PI is largely unknown. In this study, weanalyzed the phenotypes of acl- 8 acl- 9 acl- 10 triple mutants in C. elegans and found that the epithelial morphology wasdisrupted. The mutants showed defects in the amount and localization of actin filaments at the apical junction of epithelialcells. In addition, PI (4 , 5) P 2 was significantly accumulated at the apical junction of epithelial cells. Furthermore, ourgenetic screen identified the ether lipid biosynthetic pathway genes acl- 7 /DHAPAT and ads- 1 /AGPS as suppressor genes ofacl- 10 mutants. We found that acl- 7 mutation rescued both the reduced amount of stearic acid at the sn- 1 position of PI andthe defects at the apical junction of epithelial cells in acl- 8 acl- 9 acl- 10 triple mutants. Taken together, these results indicate
the important role of stearic acid in the sn- 1 position of PI in the epithelial cell integrity through proper actin filamentorganization.

1. 緒

リン酸導入に関わる酵素として、ホスホリパーゼ A 1（ipla-言1）、脂肪酸転移酵素（acl-8, 9, 10）を世界に先駆けて同定し、皮膚の恒常性は、表皮幹細胞から表皮角化細胞が分裂、線虫表皮幹細胞の非対称分裂において PI の sn- 1 位の脂肪分化して剥がれ落ちる “ターンオーバー” の繰り返しや、バ酸組成が重要な役割を果たすことを明らかにしている 2）。

リア構造の形成等によって維持される。一方、加齢によっさらに、acl- 8 , 9 , 10 の哺乳動物相同分子である LYCATて表皮幹細胞数が減少することや、表皮のターンオーバーについても、マウスにおいて PI の sn- 1 位の脂肪酸組成をが遅くなることが知られている。また、バリア構造の破綻規定していることを明らかにした 3）。しかし、PI の sn- 1

はアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患を引き起こす。角質バリ位の脂肪酸組成がどのようにして上皮細胞の恒常性に寄与

アにおいては、セラミドに代表される細胞外脂質が重要なしているか、その分子メカニズムについては未だほとんど働きを担っていることが知られている。脂質は生体膜の重明らかになっていない。本研究では、PI の特徴的な脂肪要な構成成分でもあり、膜タンパク質機能の調節因子とし酸組成が上皮細胞の恒常性において果たす役割を分子レベて、あるいはシグナル分子として、細胞機能に必須の役割ルで解明することを目的とした。

を果たす。しかし、皮膚の恒常性において生体膜脂質がど

2. 方のような役割を果たすのかについては、あまり明らかにな

法

2 . 1 . アクチンフィラメントの観察っていない。
私は、生体膜リン脂質の一つであるホスファチジルイノ

young adult 期の線虫を回収後、ホルムアルデヒド、アシトール（PI）の特徴的な脂肪酸組成を規定する酵素群のセトンにて固定後、Alexa Flior 546 -phalloidin で染色した。

同定及び機能解析を行ってきた

1 - 3）。PI は、グリセロール

観察は共焦点顕微鏡ライカ TCS SP 8 を使用した。

骨格の sn- 1 位にステアリン酸（18：0）、sn- 2 位にアラキドン酸（20：4）を持つ分子種が圧倒的に多い。これまでに、モデル生物である線虫を用いて、PI の sn- 1 位へのステア

2 . 2 . xhIs 3503 [dpy- 7 p::PLCδ 1 -PH::GFP] の作成

MoSCI 法にて、線虫ゲノム（IV 番染色体の特定の部位）にシングルコピーで外来遺伝子（上皮細胞特異的 dpy- 7promoter の下流に PLCδ 1 -PH::GFP をつないだ DNA 配列）
The roles of the characteristic fatty acidcomposition of phosphatidylinositol in the
homeostasis of skin
Rieko Imae
Tokyo Metropolitan Geriatric Hospitaland Institute of Gerontologyを挿入した株を作成した。

2 . 3 . サプレッサー遺伝子の同定
線虫（Bristol N 2 株）の近縁種である Hawaiian 株を用いた Snip-SNPs 法を用いて、原因遺伝子の染色体、ゲノム− 84 −

ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析領域を絞り込んだ。該当するゲノム領域に存在する遺伝子

る adherence junction にアクチンフィラメントが局在してについて、feeding RNAi 法にて発現抑制し、原因遺伝子いることが知られている。そこで、細胞間接着部位のアクと考えられる遺伝子についてサンガー法にてシークエンス

チンフィラメントを観察した。野生株では細胞間接着部位解析し、原因変異の同定を行った。にアクチンフィラメントが一様に存在しており、詳細に観察すると細かいドットが連なったように配置している（図2 . 4 . 脂質解析

1 B）。一方、acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では、細胞間接着部

線 虫 を 回 収 後、 超 音 波 処 理 に よ り 破 砕、Brigh and位におけるアクチンフィラメントが大きな不定形のドット

Dyer 法にて脂質を抽出した。個々のリン脂質脂肪酸量の状に局在し、細胞間接着部位に一様には存在しないこと

定量については、TLC にて各リン脂質を分離後、メチルが分かった（図 1 B）。また、細胞間接着部位におけるアクエステル化して GC-MS にて解析した。また、リン脂質脂チンフィラメントの量を解析したところ、acl- 8 , 9 , 10 三肪酸分子種の測定には LC-MS を用いた。

重変異体では顕著に増加していることが分かった（図 1 C）。

3. 結

アクチンフィラメントの大きなドットは、seam cell の分果断が生じている部分と完全ではないが一致したことから、

3 . 1. acl- 8 ,9,10 三重変異体は上皮細胞のapicaljunction 部位のアクチンフィラメントの量や局在に異常を示す

アクチンフィラメントの制御が異常になったことにより、細胞間接着部位に異常な張力が生じ、上皮細胞の形態に異常が生じた可能性が考えられる。

線虫を用いて、上皮細胞における PI の sn- 1 位の脂肪酸期から成虫期になる段階で、上皮細胞の一種である seam

3 . 2 . acl- 8 , 9, 10 三 重 変 異 体 は 上 皮 細 胞 のapical junction 部位の PI（4 , 5）P 2 の量が顕著に増加する

cell が互いに融合し、細長い多核の細胞になる。seam cell

PI は、極性頭部のイノシトール環がリン酸化されるこは、隣接する大きな上皮細胞である hypodermal cell ととで様々な phosphoinositide に変換され、シグナル伝達やadherence junction を形成しており、アピカルジャンクシ小胞輸送等、細胞内の様々な現象に関与する。PI の sn- 1

ョン複合体の構成分子である AJM- 1 ::GFP を発現する株位の脂肪酸組成が変動すると、phosphoinositide の産生や（syIs 78）を用いて観察すると、AJM- 1 ::GFP は２本の平行分解、あるいは phosphoinositide の局在等に影響が生じるなラインとして観察される（図 1 A）。一方、acl- 8 , 9 , 10可能性が考えられる。一方、アクチン調節タンパク質には、三重変異体では、seam cell が途切れてギャップが生じる

phosphoinositide の一つである PI（4 , 5）P 2 によって活性様子や、小さく分断されている様子が観察された（図 1 A）。

制御を受けるものが多い。そこで、acl- 8 , 9 , 10 三重変異

acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では seam cell 同士の融合の過程

体の上皮細胞で、PI（4 , 5）P 2 の量や局在に異常がないには異常が見られなかったことから、seam cell が融合しか解析した。PI（4 , 5）P 2 に結合する PLCδ 1 の PH ドメ

た後、何らかの原因で細胞の形態が維持できなくなり、分インに GFP を結合したプローブ（PLCδ 1 -PH::GFP）を上皮断が生じたものと考えられる。

細胞で発現させた株（xhIs 3503）を作成し、acl- 8 , 9 , 10組成の役割を明らかにするため、acl- 8 , 9 , 10 三重変異体
を用いて上皮細胞の形態を観察した。野生株では、幼虫細胞の形態維持には、アクチンフィラメントの裏打ち構三重変異体バックグラウンドと比較して観察した。同時造が重要である。上皮細胞においては、細胞接着に関わにアクチンフィラメントの染色も行い、PLCδ 1 -PH::GFP

図1

acl-8, 9, 10 三重変異体は上皮細胞の apical junction におけるアクチンフィラメントの量や局在に異常を示す− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019の局在との関連を調べた。xhIs 3503 では、アクチンフを観察し、成虫期において途切れのない系統を選別した。

ィ ラ メ ン ト が 存 在 す る apical junction 部 位 に 弱 く PLC

44000 haploid genome をスクリーニングし、サプレッサ

δ 1 -PH::GFP が局在する様子が観察された（図 2 A）
。一方、

ー変異体として 2 系統を単離した。うち 2 系統（原因遺伝acl- 8 , 9 , 10；xhIs 3503 では apical junction 部位に PLC

子変異：xh 25 及び xh 26）（図 3 A, B）について、バックク

δ 1 -PH::GFP がドット状に集積する様子が観察された（図ロスを 2 回行った後、近縁種との SNPs を利用した原因遺2 B, C）。興味深いことに、この PLCδ 1 -PH::GFP のドット伝子のマッピングを行った。その結果、xh 25 についてはとアクチンフィラメントのドットの位置は、完全ではない

acl- 8 , 9 , 10 と同じ AGPAT acyltransferase family に属が一致していた。以上の結果から、acl- 8 , 9 , 10 三重変異する acl- 7 における exon/intron 境界での G → A の置換で体では、apical junction 部位において PI（4 , 5）P 2 が過剰あり、exon/intron 構造が乱れ、フレームシフトが起こり、に集積しており、それによってアクチン調節タンパク質がpremature stop となる変異であった（図 3 C）
。xh 26 につ活性化され、アクチンフィラメントが過剰に動員された可いては、ads- 1 の exon 中での C → T の置換であり、進化能性が考えられる。

的に保存されたPがLに置換するP281Lの変異であった（図3 D）。acl- 7 , ads- 1 の RNAi でも acl- 10 変異体の表現型

3 . 3 . acl-10 変異体のサプレッサー遺伝子として、エーテル型リン脂質合成酵素 acl-7 と ads-1 を同定の抑圧が観察されたことから、acl- 7（xh 25），ads- 1（xh 26）
は loss /reduction of function となる変異であると考えら

PI の sn- 1 位の脂肪酸組成の上皮細胞における役割の分れる。acl- 7 と ads- 1 は、エーテル型リン脂質を合成する子メカニズムをさらに探る目的で、acl- 8 , 9 , 10 と遺伝初発段階の酵素である（エーテル型リン脂質とは、sn- 1 位学的に相互作用する分子のスクリーニングを行うことにの脂肪酸の結合様式が通常のリン脂質のようにエステル結した。acl- 8 , 9 , 10 のうち、acl- 10 は上皮細胞にメイン合ではなくエーテル結合であるものを指す）。このことかに発現しており、acl- 10 変異体は単独でも AJM- 1 ::GFP

ら、acl- 10 変異体の表現型はエーテル型リン脂質合成とのパターンに異常を示す（図 1 A）
。そこで、遺伝学的操何らかの関わりがあることが示唆された。

作を簡便にするため、acl- 10 変異体を用いてサプレッサ然変異剤（EMS）を処理し、表現型が回復する個体を単離

3 . 4 . acl-7,8 ,9,10 四重変異体では PI の脂肪酸組成、apical junction 部位の異常が共に回復するして原因遺伝子をマッピングする、という方法で行った。

サプレッサー遺伝子を用いてさらに解析を進めるため、

acl- 10 変異体は、低張液に浸すと体が破裂しやすいとい

acl- 7 の deletion mutant を作成した（tm 3252）（図 4 A）。

う特徴があり、スクリーニングにはこの表現型を利用しtm 3252 は acyltransferase motif の下流に欠失部位があるた。変異剤処理した acl- 10 変異体の F 2 世代から、1 st スが、フレームシフトを起こして premature stop となるこ

クリーニングとして水に浸しても生存している個体を単とが予想されるため、ACL- 7 の局在部位であるペルオキー遺伝子のスクリーニングを行った。acl- 10 変異体に突nd離し、2 スクリーニングとして AJM- 1 ::GFP のパターン

シソームに局在できず、null になると考えられる。実際、

図 2 acl-8, 9, 10 三重変異体では上皮細胞の apical junction における PI（4, 5）P2 の量が顕著に増加する− 86 −

ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析

図 3 acl-8, 9, 10 三重変異体のサプレッサー遺伝子として、エーテル型リン脂質合成酵素 acl-7 とads-1 を単離

図4

acl-7, 8, 9, 10 四重変異体では ajm-1::GFP のパターン及び PI の脂肪酸組成が回復している− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019acl- 7（tm 3252）ではエーテル型リン脂質の一つであるアの比率が野生株と同程度まで戻っていることが分かった

ルケニル型 PE の量が検出限界以下であったことから、機（図 4 E）
。以上の結果から、サプレッサー変異体では PI の能喪失型変異体であることが確認された。acl- 7（tm 3252）

脂肪酸組成が野生株と同様に戻ったことにより、表現型がと acl- 8 , 9 , 10 ; syIs 78 を交配して作成した acl- 7 , 8 , 9 ,回復したと考えられた。近年、線虫のエーテル型リン脂質

10 ; syIs 78 についても、AJM- 1 ::gfp のパターンの異常は合成の変異体を単離し、解析した報告 4）において、脂肪酸顕著に回復していることが確認できた（図 4 B, C）。acl- 7合成の促進、SCD（Stearoyl-CoA desaturase）（fat- 5 , 6 ,（tm 3252）による表現型の抑圧が、脂質組成が戻ったこと

7）の発現低下により、脂質全体で 18 : 0 / 18 : 1 ratio が増によるのかどうかを判別するため、acl- 7 , 8 , 9 , 10 四重加していることが報告されている。実際、PE についても変異体の脂質解析を行った。まず、GC-MS を用いてリンGC-MS で脂肪酸の量を定量したところ、acl- 7（tm 3252）脂質の脂肪酸組成を解析した。その結果、PI の脂肪酸組

では 18 : 0 の量が劇的に増え、18 : 1 n- 7 の量が減少して成において、acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では 18 : 0 の量がいた。PI においても acl- 7（tm 3252）における 18 : 0 / 18 :減少し、18 : 1 n- 7 の量が増えているが、acl- 7 , 8 , 9 , 101 n- 7 ratio の増加傾向が見られており（図 4 D）、これによ四重変異体では、18 : 0 の量が野生株と同程度まで増加って acl- 7 , 8 , 9 , 10 四重変異体における PI の脂肪酸組成し、18 : 1 n- 7 の量も野生株と同程度まで減少しているこがレスキューしたものと考えられた。さらに、acl- 7 , 8 ,とが分かった（図 4 D）。さらに、LC-MS を用いて PI の脂9 , 10 四重変異体では、上皮細胞接着部位におけるアクチ肪酸分子種を解析した。野生株では 18 : 0 / 20 : 5 が major

ンフィラメントの集積や、PI（4 , 5）P 2 の集積について

で 18 : 1 / 20 : 5 が minor ピークとして存在するのに対し、もレスキューしているかを検証した。その結果、これら

acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では 18 : 1 / 20 : 5 が major ピーの表現型についてもレスキューする傾向が見られた（図 5）。

クとなり、18 : 0 / 20 : 5 はマイナーピークとして存在する。

この結果から、上皮細胞接着部位におけるアクチンフィラ

一方、acl- 7 , 8 , 9 , 10 四重変異体ではこの二つの分子種

メント及び PI（4 , 5）P 2 の量の制御は、PI の sn- 1 位の脂

図 5 acl-8, 9, 10 四重変異体では上皮細胞の apical junction におけるアクチンフィラメントの量、PIP2 の蓄積が回復する− 88 −

ホスファチジルイノシトールの特徴的脂肪酸組成の皮膚恒常性における役割の解析

肪酸組成が重要な役割を果たしていることが強く支持され酸組成変化が原因となっている場合も存在すると考えられた。

るが、本研究により異常発症の分子メカニズムの一端が明4. 考らかになった。この結果は、皮膚恒常性破綻の予防法や治察療法の開発に貢献できるものと考えられる。

本研究から、acl- 8 , 9 , 10 三重変異体では上皮細胞間接着部位において PI（4 , 5）P 2 が過剰に蓄積していること、 （引用文献）
また、その蓄積部位に高頻度でアクチンフィラメントが集

1） Lee HC, Inoue T, Imae R, Kono N, Shirae S, Matsuda

積していることが明らかになった。このアクチンフィラメ

S, Gengyo-Ando K, Mitani S, Arai H. Caenorhabditis

ントの過剰な集積が引き起こす収縮力によって、上皮細胞

elegans mboa-7, a member of the MBOAT family, is

形態に異常を来した可能性が考えられる。PI（4 , 5）P 2 は、

required for selective incorporation of polyunsaturated

アクチンフィラメントの重要な制御因子である Rho ファミ

fatty acids into phosphatidylinositol. Mol Biol Cell. 19（3）:1174-84, 2008.

リー低分子量 G タンパク質（RHO- 1 , RAC- 1 , CDC- 42 等）を正に制御することから、過剰に蓄積した PI（4 , 5）P 22） I m a e R , I n o u e T , K i m u r a M , K a n a m o r i T ,はこれらの分子の活性化を介してアクチンフィラメントのTomioka NH, Kage-Nakadai E, Mitani S, Arai H.

集積を引き起こした可能性が考えられる。その他にも、PI

Intracellular phospholipase A1 and acyltransferase,（4 , 5）P 2 の effector で、アクチンフィラメントの重合をwhich are involved in Caenorhabditis elegans stem

制御する分子は多数存在するので、そうした分子の活性化

cell divisions, determine the sn-1 fatty acyl chain ofを介している可能性も考えられる。

phosphatidylinositol. Mol Biol Cell. 21（18）: 3114-24,2010.

生細胞において観察されるPI（4 , 5）P 2 シグナリングは非常に早い応答であり、高度にコンパートメント化されてい3） Imae R, Inoue T, Nakasaki Y, Uchida Y, Ohbaる。PI の sn- 1 位の 18：0 が 18：1 に置換されると、上皮Y, Kono N, Nakanishi H, Sasaki T, Mitani S, Arai

細胞間接着部位において PI（4 , 5）P 2 のドット状の集積

H. LYCAT, a homologue of C. elegans acl-8, acl-9,が観察されたことから、PI の脂肪酸組成は局所における適and acl-1 0, determines the fatty acid composition of切な PI（4 , 5）P 2 の制御に重要であると考えられる。すphosphatidylinositol in mice. J Lipid Res. 53（3）: 335-

なわち、PIのsn-1 位の脂肪酸組成が異常であると、PI（4, 5）

47, 2012.

P 2 の産生酵素あるいは分解酵素の基質認識に異常が生じ、

4） Shi X, Tarazona P, Brock TJ, Browse J, Feussner

異所性に PI（4 , 5）P 2 の産生が起きる、あるいは PI（4 ,I, Watts JL. A Caenorhabditis elegans model for ether

5）P 2 の分解が妨げられる可能性がある。また、脂肪酸

lipid biosynthesis and function. J Lipid Res. 5 7（2）:組成が異常な PI（4 , 5）P 2 は、生体膜における局在化（コ265-75, 2016.

ンパートメント化）に異常を来し、mis-localizasion が起き

5） Huang LS, Mathew B, Li H, Zhao Y, Ma SF, Nothてしまうことも考えられる。一方、AJM- 1 ::GFP や他のアI, Reddy SP, Harijith A, Usatyuk PV, Berdyshev EV,

ピカルジャンクション構成分子（E-Cadherin/HMR- 1 やKaminski N, Zhou T, Zhang W, Zhang Y, Rehman

α-catenin/HMP- 1）はアピカル側に正常に局在していたこ

J, Kotha SR, Gurney TO, Parinandi NL, Lussier YA,とから、上皮細胞の極性そのものには大きな異常はないと

Garcia JG, Natarajan V. The mitochondrial cardiolipin

思われる。

remodeling enzyme lysocardiolipin acyltransferase isa novel target in pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit

近年、ヒトやマウスにおいて、acl- 8 , 9 , 10 の相同分子Care Med. 189（11）: 1402-15, 2014.

である LYCAT が肺線維症や喘息に関わることが報告されている 5 , 6）。acl- 8 , 9 , 10 三重変異体で上皮細胞の細胞間

6） Huang YT, Liang L, Moffatt MF, Cookson WO, Lin X.

接着部位の異常が見られたこと、細胞間接着は上皮バリア

iGWAS: Integrative Genome-Wide Association Studies

機能の形成に重要な役割を担うことから、マウス肺におof Genetic and Genomic Data for Disease Susceptibility

いても、PI の sn- 1 位の脂肪酸組成が異常になると、細胞Using Mediation Analysis. Genet Epidemiol. 3 9（5）:間接着に異常を来し、肺胞上皮や気道上皮バリア機能が破347-56, 2015.

綻した結果、肺線維症や喘息が引き起こされる可能性が考7） Ulmann L, Mimouni V, Roux S, Porsolt R, Poisson

えられる。ヒト皮膚バリア機能においても同様に、PI のJP. Brain and hippocampus fatty acid composition insn- 1 位の脂肪酸組成は重要な役割を担っている可能性がphospholipid classes of aged-relativecognitive deficit

高い。また、加齢による PI の脂肪酸組成変化の報告もあrats. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 6 4（3）:7）

る 。このように、皮膚の疾患や美容において、PI の脂肪− 89 −

189-95, 2001.