新規な生体親和性化粧品素材ホスファチジル−パンテノールの抗炎症作用と分子機構の解明
北海道大学大学院水産科学研究院

細川雅史

Phosphatidyl-panthenol (P-panthenol) is a novel phospholipid prepared by phospholipase D-mediatedtransphosphatidylation. In this study, we found that P-panthenol suppressed mRNA expression of pro-inflammatory
factors such as IL-6, IL-1b, TNF-a, COX-2 and iNOS in LPS-stimulated macrophages like RAW264.7 cells. In addition,P-panthenol also down-regulated mRNA expression of pro-inflammatory cytokines in TNF-a stimulated humankeratinocytes, HaCaT cells. The suppressive effects by P-panthenol were stronger than those of free panthenol andphosphatidylcholine used as substrate for P-panthenol synthesis. Inhibition of phosphorylation of p38, ERK and JNK in
MAPK cascade is suggested to be the mechanism of anti-inflammatory effects by P-panthenol.

１．緒したマクロファージによる炎症性因子の過剰産生に対する言抑制機能である。従来の遊離型 panthenol との効果の比較

近年、化粧品には美しく見せることを目的とした従来までの基礎化粧品機能に加え、美しい素肌を維持する美白効を行うとともに、分子機構の解明をはかり、新規化粧品素材としての有効性を明らかにすることを目的とした。

1）果やアンチエイジング機能が期待されている 。それに伴２．実って、安全性の高い新たなスキンケア化粧品素材の探索や開発が進められている。本研究では、そのような機能性素験

2. 1．細胞培養材として panthenol（ビタミン B5 アルコール）の新規リンマウス由来マクロファージ様細胞 RAW264.7 は大日本脂質誘導体に注目した。Panthenol は、皮膚組織に対する住友製薬より購入し、10% FBS 含有 RPMI1640 培地を用

抗炎症作用など優れた機能性2−4）が知られているが、水溶いて、37 ℃、5% CO2 存在下で培養を行った。ヒト角化細性であることから化粧品素材として利用するには、界面活胞 HaCaT は CLS（Cell Lines Service, ドイツ）から購入し、性剤を用いて脂質中に乳化させ生体親和性を高める必要が10% FBS 含有 DMEM 培地を用いて、37 ℃、5% CO2 存ある。そのような問題を解決し、スキンケアやヘアケアへ在下で培養を行った。の 幅 広 い 利 用 が 期 待 で き る 新 素 材 と し て phosphatidylpanthenol（P-panthenol 図 1）の合成を検討してきた。

2. 2．炎症因子の mRNA 発現量の測定

P-panthenol は、生体膜の主要な構成脂質であるリン脂質

RAW264.7 細胞 5×104 cells を RPMI1640 培地 1 ml を用を基本骨格とすることから、生体適合性に優れているばかいて 24-wellプレートに播種し、24 h前培養した。その後、りでなく両親媒性が付与されるため、水中においてリポソ

P-panthenolまたは遊離型panthenol、大豆phosphatidylcholineーム形成能をもつ。筆者らは、これまでにホスホリパーゼ（SoyPC）をそれぞれ所定の濃度となるように添加し、24hD を用いたホスファチジル基転移反応により、テルペンア培養した。なお、試料はエタノール溶液として培地に添加

ルコールやフェノール化合物のリン脂質誘導化法

5, 6）を開した。エタノールの終濃度は、培地に対して 0.1 % とし、発しており、その反応系を応用し、反応条件を検討するこ

細胞毒性が見られないことを確認した。次いで、0.1 mg/mlとで高収率での P-panthenol の合成が可能となった。となるようにリポポリサッカライド（LPS）を添加して炎症

そこで本研究では、P-panthenol の新規化粧品素材としての優れたスキンケア機能を明らかにするため、美白効果刺激し、6 h の培養後に RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて total RNA を抽出した。

やアンチエイジング効果と密接に関わる抗炎症作用 に着HaCaT 細胞 5×104 cells を DMEM 培地 1 ml を用いて 24-目した。具体的には、皮膚組織を構成する角化細胞や浸潤well プレートに播種し、24 h 前培養した。その後、上記と7）同様に試料添加し 48 h 培養した。更に 0.1mg/ml の TNF-aを添加して 24 h の培養後に total RNA を抽出した。
抽出した total RNA からcDNA を合成した。炎症因子のAnti-inf lammatory effect of a novel
phospholipid, phosphatidyl-panthenol
Masashi Hosokawa
Faculty of Fisheries Sciences, Hokkaido
UniversitymRNA 発現量の測定は、定量 PCR 法により行った。なお、
反 応 試 薬 は FastStart Universal Probe Mster（ROX）（Roche） を 使 用 し、TaqMan®Gene Expression Assay（Applied Biosystems Japan Ltd.）を用いて、所望の遺伝子− 111 −コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図1

ホスファチジル - パンテノール（P-panthenol）の合成反応

３．結発現を測定した。

果

3. 1．P-panthenol の活性化マクロファージに対する炎症因子産生抑制効果

2. 3．炎症性サイトカイン分泌量の測定
RAW264.7 細胞を 2. 2. と同様に培養した後、0.1 mg/ml

新規リン脂質として合成した P-panthenol の抗炎症作用をの LPS を添加して炎症刺激し、更に 24 h の培養後に培地評価するため、マクロファージ様 RAW264.7 細胞に対するを回収した。IL-6 および IL-1b の分泌量の測定は、mouse炎症因子の産生抑制能を調べた。最初に、P-panthenol の細IL-6 ELISA Kit お よ び IL-1b ELISA Kit（ い ず れ も胞毒性を WST-1 法で調べた結果、終濃度 100 mM においてThermo Scientific）を使用し、添付されたプロトコールに細胞生残率への影響は見られず、毒性の低い脂質であるこ従って行った。HaCaT 細胞も 2. 2. と同様に培養した後、とを確認した。

0.1 mg/ml の TNF- a を添加して 24 h の培養後に培地を回RAW264.7 細胞培養液に P-panthenol を添加して 24h 培

収 し た。IL- 6 分 泌 量 の 測 定 は、human IL-6 ELISA Kit

養後、LPS を用いて炎症を誘発した結果、炎症性サイトカ（Thermo Scientific）を使用して行った。

イ ン で あ る IL-1b、TNF-a お よ び 炎 症 関 連 酵 素 で あ るiNOSおよびCOX-2のmRNA発現量がコントロール群（LPS

2. 4．Western Blotting 法（+））と比較して有意に低下した（図 2）。P-panthenol は、
5RAW264.7 細胞および HaCaT 細胞 5×10 cells を培地 5IL-6 の mRNA 発現も抑制したが、同濃度では panthenol にml を用いて 6-well プレートに播種し、24h 前培養した。

よる抑制効果は認められず、また SoyPC による抑制効果

次いで、2. 2. と同様に P-panthenol を添加して RAW264.7と 比 較 し て も 強 い 抑 制 傾 向 で あ っ た（ 図 3）
。 更 に、細胞は 24 h 培養した後、0.1mg/ml の LPS を添加して炎症

P-panthenol は、 終 濃 度 25 － 50 mM 以 上 で IL-6 お よ び

刺激を行い、45 min の培養後に細胞を回収した。HaCaT

IL-1bのタンパク質産生量を抑制することが示された（図 4）。

は 48h 培養した後、0.1 mg/ml の TNF-a を添加して 15 min

P-panthenol はビタミン B5 のリン脂質誘導体であるが、培養後に細胞を回収した。その後、細胞タンパク質溶液をビタミン B1 のチアミンやビタミン B6 のピリドキシンにつ調製し、SDS-PAGE によるタンパク質分離を行った。電いても PLD を用いてリン脂質誘導体を調製し、活性化マ気泳動したポリアクリルアミドゲルから PVDF メンブラ

クロファージにおける炎症因子の産生抑制能を比較した。

ンにトランスファーした後、一次抗体および二次抗体を用

その結果、終濃度 50mM 処理においてホスファチジル - チ

いて抗原抗体反応を行い、各タンパク質の発現量は、発光アミンには、弱いながらも IL-6 のｍ RNA 発現を抑制した

検 出 試 薬 は ECL（GE Healthcare） ま た は ImmunoStarが、 ホ ス フ ァ チ ジ ル - ピ リ ド キ シ ン に は 認 め ら れ ず、（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）を用いて検出を行

P-panthenol の高い抗炎症効果が確認された。

った。タンパク質の発光シグナルの検出は ATTO Cold
CCD Camera System（アトー株式会社）を用いて行った。

2. 5．統計学的処理

3. 2．P-panthenol の皮膚細胞における炎症因子の産生抑制効果
皮膚組織では、刺激や損傷等によりマクロファージが浸得られた数値は各群で平均値及び標準偏差として示した。

潤し、皮膚表皮細胞と相互作用することによって炎症が進

統計処理は、Dunnett または Tukey の検定を用いて行い、行する。その際、マクロファージから放出される TNF-a有意水準は P < 0.05、および P<0.01 とした。などの炎症性サイトカインがメディエーターとして重要な− 112 −新規な生体親和性化粧品素材ホスファチジル - パンテノールの抗炎症作用と分子機構の解明

（μM）

（μM）
図 2 P-panthenol の活性化マクロファージに対する炎症因子遺伝子の発現抑制** P < 0.01 vs. LPS（+）

図 3 P-panthenol の活性化マクロファージに対する IL-6 mRNA 発現抑制** P < 0.01, * P < 0.01 vs TNF-α（+）††P < 0.01, † P < 0.05 vs Panthenol

図 4 P-panthenol の活性化マクロファージにおける IL-6 および IL-1β の産生抑制** P < 0.01 vs.LPS（+）− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

役割を担っている。そこで、炎症性サイトカインによる皮め前処理することによって、それら炎症性サイトカインの膚表皮細胞の活性化に対する P-panthenol の抑制効果を明mRNA 発現量の有意な低下が認められた（図 6）。以上の結らかにするため、ヒト角化細胞 HaCaT を TNF-a で刺激し、果は、P-panthenol が皮膚表皮細胞とマクロファージ間のその炎症因子産生に及ぼす影響を評価した。

相互作用を効果的に制御して、炎症の誘導や進展を抑制す

TNF-a 処理により HaCaT では IL-6 の産生が上昇したが、ることを示唆している。

P-panthenol はそのｍ RNA 発現誘導（図 5）およびタンパク質産生を有意に抑制した。一方、合成反応の基質として用3. 3．P-panthenolによる炎症因子遺伝子の発現抑制機構

いた遊離型の panthenol や SoyPC には終濃度 50 mM 処理にP-panthenol がマクロファージ様 RAW264.7 細胞およびおいては抑制効果が全く認められなかった。よって、

HaCaT 角化細胞のいずれに対しても炎症因子の産生抑制

TNF-a に よ る HaCaT の 炎 症 誘 導 に 対 す る 抑 制 に は、効果を示したことから、それらの制御機構に関わる情報伝

P-panthenol の構造が重要であることが推察される。

達経路として MAPK 経路への影響を調べた。図 7 に示す

このような角化細胞に対する P-panthenol の炎症因子産ように、P-panthenol は LPS で刺激した RAW264.7 細胞で生抑制効果は、TNF-a による刺激のみならず認められた。

見られる p38 および ERK のリン酸化を抑制していること

すなわち、RAW264.7 細胞を LPS 処理によって炎症刺激が示された。また、HaCaT 細胞に対しては、p38 に加えすることにより得られた培地を用いて HaCaT 細胞を培養

JNK のリン酸化を抑制し、それらの因子の活性化を制御したところ、IL-6 や TNF-a の mRNA 発現量が増加した。

していることがわかった（図 8）。

これに対し、HaCaT 細胞を P-panthenol を用いてあらかじ

図 5 P-panthenol のヒト皮膚細胞に対する IL-6 mRNA 発現抑制** P < 0.01 vs TNF-a (+)††
P < 0.01, † P < 0.05 vs Panthenol##P < 0.01, # P < 0.05 vs PC（同濃度間の比較）（μM）
図６ ヒト皮膚細胞のマクロファージ培養液による活性化と P-panthenol による抑制効果** P < 0.01 vs MΦ medium− 114 −

新規な生体親和性化粧品素材ホスファチジル - パンテノールの抗炎症作用と分子機構の解明

図 7 P-panthenol のマクロファージ様 RAW264.7 細胞における MAPK 制御**P < 0.01, *P < 0.05 vs LPS（+）

図 8 P-panthenol のヒト皮膚細胞 HaCat における MAPK 制御**P < 0.01, *P < 0.05 vs LPS（+）− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

４．考

（引用文献）察１）正木

近年、男女を問わず化粧品素材の機能性として「スキン仁編 ,: 機能性化粧品素材の開発 IV, シーエムシー出版 , 2006.

ケア」が注目されている。スキンケア機能の一つとして皮２）Ebner F, Heller A, Rippke F, Tausch I, : Topical膚老化や皮膚炎に対する抗炎症効果があり、炎症を予防し

use of dexpanthenol in skin disorders, Am. J. Clin.

たり、鎮静化することで健康で美しい肌の維持が期待され

Dermatol. 3, 427-433, 2002.

る。本研究では、新規化粧品素材を開発する目的で、これ３）Wiederholt T, Heise R, Skazik C, Marquardt Y,

ま で に 利 用 が な さ れ て い る panthenol に 着 目 し た。

Joussen S, Erdmann K, Schröder H, Merk HF, Baron

Panthenol は生体内においてビタミン B5 である panthenic

JM,: Calcium pantothenate modulates gene expression

acid に変換されるプロビタミンである。クリームやシャン

in proliferating human dermal fibroblasts, Exp.

プー、育毛剤等に広く利用されており、安全性も高い物質

Dermatol., 18, 969-978, 2009.といえる。しかし、panthenol は水溶性であるため、組織

４）Bissett DL,: Common cosmeceuticals, Clin Dermatol.,
27, 435-445, 2009.

での滞留性が乏しいことや皮脂バリアを透過しにくいことがあり、応用面での制限が課題である。本研究では、その

５）Yamamoto Y, Hosokawa M, Kurihara H, , Miyashita

ような panthenol をリン脂質誘導化することで生体適合性

K,: Preparation of phosphatidylated terpenes via

や両親媒性を付与し、利用用途を広げるばかりでなく、そphospholipase D-mediated transphosphatidylation, J.の抗炎症作用が増強することを期待した。

Am. Oil Chem. Soc., 85, 313-320, 2008.

生体内の炎症反応では、組織構成細胞に加え、マクロフ

６）Yamamoto Y, Kurihara H, Miyashita K, Hosokawa

ァージが重要な役割をになう。合成した P-panthenol は、

M,: Synthesis of novel phospholipids that bind

マクロファージ様 RAW264.7 細胞に対し、LPS によってphenylalkanols and hydroquinone via phospholipase

誘導される炎症因子の mRNA 過剰発現を効果的に抑制しD-catalyzed transphosphatidylation, New Biotechnol.,た。その効果は、従来の遊離型 panthenol よりも強く、リ

28, 1-6, 2011.

ン脂質誘導体の優れた機能性を確認した。これらの発現制

７）平尾哲二 ,: 角層サイトカインに着目した皮膚刺激緩和

御機能は、炎症因子の産生に関わる p38 や ERK のリン酸アプローチ , 正木

化抑制を機序として、複数の経路を制御することによる効

シーエムシー出版 , 2006, 72-79 頁 .

果的な作用であることが示唆された。P38 や ERK などの
8, 9）

MAPK カスケードの下流には、NF- k B

10）や AP-1 といっ

仁編 ,: 機能性化粧品素材の開発 IV,８）Pasparakis M, : Role of NF-κB in epithelial biology,Immunol. Rev., 246, 346-358, 2012.

た転写因子が存在し、炎症因子の mRNA 発現を制御する

９）Tsuruta D,: NF-kappaB links keratinocytes andことから、それらへの影響についても検討することが期待

lymphocytes in the pathogenesis of psoriasis, Recent

される。また、P-panthenol はマクロファージが産生する

Pat. Inflamm. Allergy Drug Discov., 3, 40-48, 2009.

TNF-a によって刺激した角化細胞 HaCaT に対しても、p3810）Zenz R, Eferl R, Scheinecker C, Redlich K, Smolen

や JNK のリン酸化抑制を介して炎症性サイトカインの産J, Schonthaler HB, Kenner L, Tschachler E, Wagner

生を抑制したことから、皮膚の炎症時にみられる細胞間相EF, : Activator protein 1 (Fos/Jun) functions in

互作用に対しても制御効果を示すものと推察する。

inflammatory bone and skin disease, Arthritis Res.

今後、より詳細な作用機構の解明や効果的な利用形態にTher., 10, 201, 2008.

関して更なる研究を重ねたいと考える。

謝

辞本研究にご助成いただきました公益財団法人コスメトロ
ジー研究振興財団に深謝いたします。

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