チロシナーゼと基質複合体結晶構造解析に基づいた反応機構の解明
大阪府立大学大学院生命環境科学研究科

藤枝伸宇

Tyrosinase is a copper enzyme widely distributed in nature and has anti-ferromagnetically coupled binuclear copper ionsin the active site, where the dioxygen molecule can be reductively activated into [(µ-η 2 :η 2 -peroxide)dicopper(II)] species.
This active oxygen species play a central role in catalyzing the hydroxylation of phenols to catechols and the subsequentoxidation of catechols to o-quinones. However, the details of the binding mode of substrate tyrosine have been still a longstanding mystery to be resolved. We have reported the high-resolution crystal structures of recombinant pro-form tyrosinasefrom yellow mold. In the pro-form tyrosinase, the active site is covered by C-terminal shielding domain, which functions ascopper chaperone and can be proteolytically cleaved off to induce the catalytic activity. In this work, we have determined thecrystal structure of the active-form tyrosinase in order to compare the structures between the pro- and active-form tyrosinase.
First, the active-form tyrosinase was prepared by trypsin treatment of pro-form tyrosinase and purified by gel filtration
chromatography. The purified protein was crystallized by hanging-drop vapor diffusion method using the precipitant solution
containing polyethylene glycol. X-ray diffraction data was collected at Spring- 8 and determined the crystal structure of
the active-form tyrosinase. There was little difference in overall structures of pro- and active-form tyrosinase. We havesucceeded in determining the crystal structures of complex with inhibiters. Kojic acid was stacked on histidine coordinatedto copper ion. Based on the details of their binding modes, the reaction mechanism will be updated and discussed.

1. 緒言

チロシナーゼはヒトからバクテリアまで幅広い生物が持つ銅含有酵素であり、生体内でのメラニン色素の合成などに関与している。チロシナーゼは酸素を酸化剤として L-Scheme1 Tyrosinase catalytic reaction

チロシンの水酸化反応を触媒し、生じた L- ドーパを酸化することでドーパキノンを生成する（Scheme 1）。ドーパキノンはその後、自己重合反応などを経てメラニンとなり、このような背景のもと、長年、チロシナーゼの酵素反応細胞を紫外線から守る色素となる。チロシナーゼは活性中の機構について多くの研究が行われてきた。当研究室をは心に２つの銅イオンを持ち、この銅イオンに酸素分子が結じめとし多くの研究者がモデル錯体や実際の酵素を用いた合した銅−活性酸素種オキシ体がチロシンなどフェノール詳細な速度論的研究を行いチロシナーゼ水酸化反応の機構類の水酸化反応を行い、続いて銅 2 価種のメット体がドーが提案されている。この機構によると基質フェノールがパなどカテコール類の酸化を行うと考えられている。そのフェノレートとして銅イオンに配位し、芳香族求電子置換後、デオキシ体に酸素が結合し再びオキシ体が生成するこ反応によりフェノールの芳香族炭素と酸素の結合が形成さとで触媒サイクルが完了する。このようにチロシナーゼはれる。また近年、チロシナーゼの X 線結晶構造解析に成芳香族炭素を位置選択的に直接水酸化することから、触媒功した例がいくつか報告されてきた。マッシュルーム由としての工業的利用が期待できる。一方で、生体内で皮膚来のチロシナーゼの活性中心では、２つの銅イオン（CuAの色素沈着や食品の褐変などの原因になることから、そのと CuB）がそれぞれ 3 つのヒスチジン残基に配位されてい阻害剤の開発も活発に行われている。そのためチロシナーることが知られている 1）。また別のグループからは活性中

ゼの反応機構を解明することは、触媒、医薬、食品など広心の金属を亜鉛に置換し、活性のない状態でのチロシナー範疇な分野への貢献となる。特に、メラニン形成は肌のシゼと基質の L- チロシンとの複合体結晶構造が報告されてミの直截的原因であり、コスメトロジーへの影響は大きい。

いる 2）。しかし、これらの結晶構造を重ね合わせてみるとCuA と ZnA でその位置が大きく異なっていることがわかり、活性のある銅イオンが結合した本来の基質結合状態でStructual Aproach to Molecular Mechanismof Tyrosinase
Nobutaka Fujieda
Graduate School of Life and EnvironmentalSciences, Osaka Prefecture University

あるかどうか明確ではない。併せて分解能も現状では詳細な相互作用が議論できるほど高くない。
一方で、当研究室では麹菌由来プロチロシナーゼの高分解能構造解析に成功してきた 3）。プロチロシナーゼは今まで示したチロシナーゼとは異なり、銅結合触媒ドメインに− 113 −コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

が近傍のシステイン残基と共有結合による架橋を形成しているが、今回このシステインをアラニンに変え架橋をなくした変異体を用いた。この変異体では活性の指標となる触媒回転数 kcat が一桁程度低下するが、活性種のオキシ体は野生型同様に生成し、他のチロシナーゼと比較しても十分高い活性を維持していることがわかっている。この変異体を用い、まずは野生型同様プロ型で精製を行った。その後
トリプシンを用いてプロテアーゼ処理を行い、ゲル濾過ク

Figure1 Tyrosinase activation

ロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーによって活性型変異体の精製を行った。これらクロマトグラフ

加え C 末端ドメインを持つチロシナーゼの前駆体型であるィーの溶出グラフから単一の分子として活性型チロシナーことが明らかとなった（Figure1）。これら結果より、我々ゼを精製できたことが確認された。精製した活性型変異体

はこの C 末端ドメインがチロシナーゼの活性中心を覆い隠の結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法によって行った。

すことで細胞毒となる酵素活性を抑えており、酵素反応が3. 結必要になると C 末端ドメインがプロテアーゼにより切断さ果れ活性を持つ活性型チロシナーゼとなることを提唱してきSPring-8 で X 線回折データを測定し、1.6 Å の分解能でた。本研究ではこのプロチロシナーゼからプロテアーゼ処活性型変異体の結晶構造の決定に成功した。活性型では理によって活性型チロシナーゼを調製し、銅イオンが結合C 末端ドメインが完全に取り除かれていることが確認でした活性型のチロシナーゼと基質との複合体結晶構造を詳き、さらには重ね合わせると全体構造はプロチロシナーゼ

細な議論が可能な高い分解能で決定し、チロシナーゼの反の銅結合触媒ドメインからほぼ変化しておらず、C 末端ド応機構について議論することを目的とした。

メインの除去による構造変化はほぼ見られなかった。しか2. 方し、活性中心を見てみると、銅イオンの位置に大きな変化法が見られた。プロチロシナーゼでは CuA、CuB ともに 3

まずは常法に従い野生型プロチロシナーゼの大腸菌によつのヒスチジンが配位している構造であるのに対し、活性る発現とアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交型チロシナーゼでは CuA 側で 3 つのヒスチジンが配位し換クロマトグラフィーによる精製を行った。SDS -PAGE

た CuA1 に加えて、2 Å 離れた位置にヒスチジン 103 が外れ、で単一のバンドが見られ、プロチロシナーゼが精製できた

残りのヒスチジン２つと水分子１つが配位した CuA2 の状ことを確認した。次にプロチロシナーゼを活性型チロシナ態が見られた（Figure 2）。プロ型では C 末端ドメインにあーゼに変換するために、トリプシンによってプロテアーゼるフェニルアラニン 513 が活性中心に貫入しているが、活処理を行ったところ、活性型チロシナーゼは自身の持つチ性型ではフェニルアラニンが塞いでいた活性中心に水分子ロシン残基を酸化し、その後重合によって褐変、沈殿してがアクセスできるようになり、銅に配位することでヒスチしまうことが明らかとなった。そこで野生型ではなく酵素ジン 103 の配位が外れたと考えられる。CuA サイトの銅活性を下げた変異体を用いた。麹菌由来チロシナーゼは活イオン占有率は 20 % が CuA2、80 % が CuA1 の状態で存性中心の銅イオンに配位しているヒスチジンのうちの 1 つ在し、CuA1 と CuA2 の間で平衡があることがわかる。

AB
CuA2

CuA

CuB

CuA1

H103

CuB

H103
Figure2 Crystal structures of (A) pro-form and (B) active-form− 114 −

チロシナーゼと基質複合体結晶構造解析に基づいた反応機構の解明

次に基質 L- チロシンとの複合体結晶構造解析を試みた。

構造をもとに修正したチロシナーゼの反応機構は以下のよ

チロシンの濃度と浸漬時間を検討し、10 mM のチロシンうになる。活性種オキシ体のチロシナーゼに対し、チロシ溶液に 1 分間活性型チロシナーゼの結晶を浸けることでチンがこれらのアミノ酸残基との相互作用によって結合する。

ロシン複合体の結晶構造を 1.42 Å の分解能で得ることにそして CuA1 の状態から、ヒスチジン 103 が外れ CuA2 に成功した。活性中心にはチロシンに由来する電子密度がはシフトし、チロシンと結合した後、芳香族求電子置換反応っきりと観測され、さらにチロシン溶液への浸漬時間をでチロシンの水酸化が進行する。その後カテコールの酸化10 分に延ばすと、チロシンのオルト位に水酸基に由来すに伴い、銅イオンは CuA2 から CuA1 の位置に戻り、生成る電子密度が観測され、結晶中で反応が進行することを明物の解離を促進する。

らかにした。チロシンはヒスチジン 332 とのπ ‒ π相互作用、最後に活性種である酸素結合状態、オキシ体の構造につバリン 359 との CH‒ π相互作用、アスパラギンとセリンといて CuA1 と CuA2 で比較を検討した。活性型チロシナーの水素結合、そして CuA2 への配位結合によって活性中心

ゼではオキシ体は不安定で発生後数分で消滅するが、プロに結合していた。相互作用に関与するアミノ酸残基をアラチロシナーゼの状態では C 末端ドメインが酸素結合部位をニンに変えるとチロシンに対する親和性を示すミカエリス

覆い隠すためオキシ体を安定化することが当研究室の先定数 Km 値が上昇し、親和性が低下するという結果も間接行研究によってわかっている。そこで、プロ型の変異体と、的にこれらのアミノ酸残基が基質結合に寄与していることさらにヒスチジンを欠損させた二重変異体を用いた。二重を支持した（Figure 3）。

変異体はヒスチジンが 1 つ外れている CuA2 の状態を擬似チロシンが配位することによって CuA2 の占有率は 20的に生じさせるためにヒスチジン 103 をフェニルアラニン% から 30 % に増加した。さらに銅イオンを持たないアポにした変異体になる。調製後、UV - vis スペクトルからど体の結晶をチロシン溶液に浸漬したところ、銅イオンがあちらの変異体でもオキシ体の形成が確認できた。また共鳴る場合と全く同じ場所にチロシンが結合している様子が観ラマンスペクトルでも、サイドオン型で結合した銅酸素種測され、チロシンは銅イオンへの配位結合がない状態で、に由来するピークが観測された。結晶構造では二重変異体アミノ酸残基との相互作用のみによって活性中心に結合ででは銅が完全に CuA2 の位置にシフトし、酸素−酸素間のきることがわかった。これらの結果は、チロシンが銅イオ距離は長く、銅−酸素間の距離は短く変化していた。これンに接近するという今までの定説とは逆に、銅イオンがチらは UV - vis スペクトルでバンドが短波長シフトしたこと、ロシンに対して接近する可能性を示唆しているものであラマンスペクトルで Cu ‒ O 伸縮の値が大きくなったこととった。今回得られたチロシン複合体の結晶構造と以前報告一致する。CuA1 から CuA2 への遷移によって銅 ─ 酸素間されている亜鉛置換チロシナーゼ - チロシン複合体結晶構の結合が強まり、酸素 ─ 酸素間の結合は弱まることが示唆

造の重ね合わせを行ったところ、2 つの結晶ではチロシンされた。2 つのオキシ体を重ね合わせるとヒスチジンはほのフェノール部分はほぼ同じ位置にあり、チロシンの結合ぼ重なっており、銅イオンが CuA1 から CuA2 に動くときした CuA2 と ZnA が同じ位置であることがわかった。こに、結合した酸素はただ引き上げられるだけでなく、片側れにより、上で述べた亜鉛イオンの位置が異なっていたのの酸素原子がチロシンのオルト位に近づくように向きが変は金属の違いによるものではなく、基質の結合によって起化することが示唆された。これらの結果から、CuA1 からこったものであることがわかった。ここまで得られた結晶

CuA2 への遷移は酸素をより活性化し反応に適した向きに変化させると予想される。

4. 考

察

このように本研究では麹菌由来チロシナーゼ変異体を用Tyrosine

いて活性型チロシナーゼの結晶構造を高分解能で決定することに成功した。また基質との複合体結晶構造を決定し、それらの結合様式を明らかにするとともに、触媒サイクル

CuA2において活性中心の銅イオンの一方が基質の結合に伴い、結合部位や配位構造を変化させ、反応を進行させるという興味深い現象を捉えることに成功した。つまり、銅と酸素が動くことで反応が進行していることが示唆された。従来、一般的に金属酵素においては、触媒に関与する金属は配位するアミノ酸残基に強固に保持されたまま機能すると考え

Figure3 Complex with tyrosine

られてきたが、近年、分析手法の発展により、反応の際に− 115 −コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

金属の配位子や配位構造が大きく変化することを示す観測

はチロシナーゼの反応機構解明に貢献すると共に、金属酵結果が報告されている。アルコール脱水素酵素では基質の素における金属中心の柔軟な配位構造の重要性を示す一例

結合に伴って配位しているアミノ酸残基を変えながら反応となるものと言える。

を進行させていることが示唆され、古典的な反応機構と新しい反応機構で議論が起こっている最中である。本研究結（引用文献）

果は触媒サイクル中で柔軟に動く動的な金属中心という新

1） Ismaya WT, Rozeboom J, Weijn A, Mes JJ, Fusetti

規な機構を支持する証拠の一つになると考えられる。チロ

F, Rozeboom HJ, Wichers HJ, Dijkstra BW: Crystal

シナーゼのフェノール水酸化反応機構に関して、これまで

structure of Agaricus bisporus mushroom tyrosinase:チロシンが銅イオンに接近し、配位することで反応が進行

identity of the tetramer subunits and interaction with

すると考えられていた。しかしながら、複合体結晶構造か

tropolone, Biochemistry 50, 5477, 2011.

ら、第１段階としてアミノ酸残基によって形成されている

2） Goldfeder M, Kanteev M, Isaschar-Ovdat S, Adir

基質結合部位にチロシンが結合することが示唆された。さN, Fishman A: Determination of tyrosinase substrate-

らにこの結合したチロシンのフェノール性水酸基に対してbinding modes reveals mechanistic differences between

銅イオンが接近・配位し反応が進行することが考えられる。

type-3 copper proteinsNat. Commun. 5, 4505, 2014.

また、反応後、CuA が CuA2 から CuA1 に移動することで3） Fujieda N, Yabuta S, Ikeda T, Oyama T, Muraki N,

カテコールや o- キノンなどの配位性生産物の解離を促進

Kurisu G, Itoh S: Crystal structures of copper-depleted

していると推測される。このように、本研究で得られた結and copper-bound fungal pro-tyrosinase: insights into

果は活性中心の金属イオンが反応に伴い、大きく結合部位

endogenous cysteine-dependent copper incorporation,や配位構造を変化させるという過去に見られたことのない

J. Biol. Chem. 288, 22128, 2013.

現象を初めて直接的に観測したものである。これらの情報− 116 −