ヒアルロン酸水溶液におけるナノコットン効果の研究
独立行政法人理化学研究所

丑環境ソフトマテリアル研究ユニット田公規The function of aqueous hyaluronan (HA) solution is investigated focusing on the transport phenomena
occurring inside the media which is a model matrix involved in extracellular matrices (ECM). With measurementsof diffusion coefficient using three kinds of spectroscopy, the distance dependence of the diffusion coefficient (DDDC)
was observed for small molecules and globular proteins. In short diffusion (< 10 nm), the diffusing molecules
are not interfered with by the mesh structure of HA and the diffusion coefficient was the same in the aqueous
solutions without HA. On the other hand, for long diffusion (> 100 nm), the diffusion coefficient was significantlydependent on the HA concentration showing that the magnitude of diffusion coefficients was decreased due to theinteraction with the polymer chain. The curve of DDDC was successfully obtained by the present experimentindicating that the anomalous diffusion occurs in the 10-100 nm area of diffusion distance. The HA matrix,
which is an important member of ECM, acts as if an cotton ball holding moisture the string mesh of which isin nanometer scale. We named this function as “Nano-Cotton” . HA nano-cotton acts not only as a fine matrix
holding a large amount of water but also as a media controlling the transport phenomena inside ECM in terms ofanomalous diffusion which affects on various dynamics of cell activities such as cell adhesion, tumor migration andinvasion and others.

１． 緒

ロセスである細胞接着（C ell Ad hesion）は、接着分子 8）と言いわれることの多い膜貫通タンパクによって引き起こされる。

細胞外マトリックス（Extracellular Matrix: ECM） と接着分子には、細胞間の接着を行う連結器となるもの（カドは、動物において細胞と細胞の間を占める、非細胞部分をヘリン 2,9）が例）の他に、外部の ECM に対する親和基を有し、総称する名である。従来細胞に比べてその役割が軽視されE C M に接着する働きを持つものがある。コラーゲン類に親てきたが、体積比で言えば、細胞と同等の割合を占めると和力を持つインテグリン 2,10）がその代表であるが、H A に対言われ、広い意味で骨や皮膚の大部分、毛髪なども ECMして親和力を持つ C D442,11）もあり、どちらもよく似た働きの範疇に入ると考えてよい。ECM は、大きく分けて、コをすると考えられている。すなわち細胞は、E C M を足場に

2）

ラーゲンなどのタンパク質 、ヒアルロン酸（Hyaluronicするとともに、外部の E C M の存在を情報として細胞内部Acid, Hyaluronan:HA）2 − 6）やコンドロイチン類などの糖に与え、代謝を調節する働きをするのである。

1）類から構成されているが、従来、不活性で、ちょうど細胞HA は Fig. １に示すようにグルクロン酸と N- アセチルと細胞の間の詰め物のように、ただ体の形を作るだけのもグルコサミンの２糖を単位とする単純な糖鎖高分子で、ほのと考えられてきた。しかし、最近の研究で、ECM と細とんどすべての脊椎、無脊椎動物が持っている多糖類であ胞は絶えず情報のやりとりをし、細胞自身の代謝を変えたる。眼球の硝子体の中に存在するものや、関節液、関節軟り、細胞内の生体作用を制御したりする要因となっている骨に存在するものが著名であるが、ほぼ全身に分布し、活発に代謝されている。最近ではガン細胞の増殖や転移など

7）ことが判明してきた 。
ECM は通常細胞自らが合成し、時に応じて自ら分解し、にも HA や CD4411）が関わっていると言われている。

その結果、細胞の周りの環境を能動的に整えるなかだちを従来市販されている試薬としての HA は鶏冠や臍帯からする。環境が変わることによって細胞は形を変えたり、代抽出したものが多く、分子量が小さいうえに共存するタン謝調節を変化させたりするので、細胞の外の環境に関するパク質などが除かれていないことが欠点であった。しかし、情報が再び細胞内部の動的な作用を変化させることになる。

最近では遺伝子工学によって微生物に合成させたものが工たとえば、発生、再生、分化、臓器形成などで、重要なプ
Investigation of “Nano-Cotton” effect inaqueous hyaluronan solution
Kiminori Ushida
Eco- Soft Materials Research Unit, Riken

Fig. 1−2−

The structure of Hyaluronanヒアルロン酸水溶液におけるナノコットン効果の研究

業化され、純度も高く分子量の大きなものが医薬品（関節リウマチの治療薬）として実用化されている 12）。一方、
HA の潤い成分としての効果が注目されるに至り、化粧品材料として必要欠くべからざるものになっている。HA の消費量が増大するに従って、マヨネーズ生産の廃棄物であった卵白から HA を抽出する工場も生産を開始している。
我々は、ECM 中の情報伝達の担い手としての HA 水溶液に注目し、大量に保持された水の中で、物質がどのように移動するかを調べてきた。HA をわずか１wt％しか含まない水溶液でも、Fig. ２に示すように、HA の分子量によっては数万 cP（マヨネーズ程度）の粘性係数を示すが、このような高粘度の媒体の中でも 99％含まれる水の中を様々な分子が移動することができる。HA の高分子鎖はナノメータスケールの糸として絡み合い、緩い網目状の空間を形成し、同時に大量の水を保持していることになる。この状
況をナノメータスケールの綿という意味で「ナノコットン」

Fig.2 Shear viscosity of HA aqueous solution (1 wt%) withvarious molecular weight (unpublished result). The viscosity
is lowered significantly because the linear polymer chainsare aligned in parallel. We consider that the cylindrical ion
atmosphere make the friction between two polymer chains.と呼ぶことにした。本研究では、HA 水溶液に保持された水分＝ナノコットンの中で物質がどのように移動するかをを用いた。HA が存在しないときの D obs（D0）については明らかにし、そこに見られる「異常拡散現象（Anomalous

後述の NMR や FCS の結果と一致している。蛍光、吸収スDiffusion）13）」についての知見を得ることを目的とした。

ペクトルなどを調べても、これらの分子について、ポリア

２. 実
２．
１

ニオンである HA との特異的な相互作用は見られなかった。

験試料 14-17)

２．
３ パルス磁場勾配 NMR 法による拡散係数測定 15）

HA は電気化学工業から提供を受けた、分子量公称 30

パルス磁場勾配（Pulsed Field Gradient: PFG−）NMR 法は最近万、100 万、200 万の粉末試料を用いた。HEPES バッフ

盛んに用いられるようになった測定方法である。NMR では

ァに NaCl を用いてイオン強度を調整した水溶液に、各種磁場勾配（FG）をかけて、適当な読みとりパルスを用い溶質を加えた溶液を試料に用い、測定は室温で行った。

ることによって空間分解能を与えることが可能で、医療用
MRI はこの原理に基づいている。FG をパルス化し、２回２．
２光化学反応を用いた拡散係数の測定14-16）に分け、その間隔を変化させながら信号の減衰を観測する

拡散律速である光化学２分子反応
A* + B →（dark products）と、特定の位置から移動して消えてしまった分子の数が見（1）積もれ、Dobs を求めることができる。γ, G, δ, ∆ をそれぞれを用いて拡散係数を決定した。励起状態の蛍光あるいはリン光の消光反応で求めた２次反応速度定数 k（2）から拡散磁気モーメント、FG の大きさ、FG パルス幅、FG パルス
間隔とすると律速を仮定して
k（2）=4π（DA+DB）（rA+rB）

ln（I（G）/I（0））= − γ G δ Dobs（∆ − δ/3） （3）2（2）2 2となる。本測定は緩和時間が長く、D の大きい水分子ではを用いて拡散係数 DA, DB を個々の分子の Dobs として求める。

測定が容易で精度も高いが、今回は光化学反応で測定した

ここで rA、rB は反応２分子の半径を示す。この手法を我々

Ru（bpy）32+ や cytc が測定対象であったので、誘導エコーは Photochemical Bimolecular Reaction（PCBR）と呼んでいる。

法を用いたパルスシークエンスをプログラムし、できるだ発光の消光反応速度は、堀場製作所製の NAES102 を用け緩和時間の長い信号を探して用いた。

い、単一光子法による寿命測定を用いて決定した。水溶液を用いた実験であり、かつ励起状態の寿命が十分に長い必要があるので、光励起分子として Ru（bpy）32+ を用いたが、２．４ 蛍光相関分光（FCS）法を用いた拡散係数測定 16-17）−3−消光剤には、Fe（CN）
6 、Co（acac）
3、Co（edta）、メチ

蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy）18）

ルビオロゲン（MV2+）、シトクローム c（cytc）を用いた。

は、倒立型共焦点顕微鏡を用いたとき、レーザー光照射領域観察された蛍光減衰は単一指数関数で、Stern-Volmer プと（対物レンズとピンホールに依存する）受光側の効率によロットで問題なく２次反応速度定数が定まった。って決まる微小体積内（Confocal Volume Element: CVE）に存

r A , r B にはそれぞれのイオン半径（球形に近似）の文献値

在する、数の少ない蛍光物質からの蛍光強度が揺らぐことを−3−利用した測定方法で、必ずしも単分子の条件を必要としない。CW レーザーで繰り返し励起された蛍光物質が Brown
運動で CVE を出入りすることによって蛍光が揺らぐが、D の大小に応じて揺らぎの速さが決まるので、その揺らぎの時間相関関数（TCF）を解析することによって、D を定量的に見積もることができる。
本測定では試料をウェル型チャンバーに入れて、市販のFCS 装置（Zeiss ConfoCor）もしくは自作の装置（Olympus
IX71 ベース）を用いて測定した。

３．結３．
１

果PCBR 法の結果

Fig.3 に PCBR 法で測定した、様々な分子の拡散係数（Dobs）が HA の添加によってどのように相対的に変化するかをプロットした図を示す。D obs は、HA の添加によりわずかに変化する。正の電荷を持った消光剤（MV2+、cytc）
では、HA の濃度が増えるに従って D obs が増大するように見え、負の電荷を持った消光剤（Fe（CN）63-、Co（edta）-）では減少する。しかし中性の消光剤 Co（acac）3 では

Fig.3 Relative dependence of Dobs on C HA using variousquenchers observed by PCBR method. Slight dependenceof Dobs on CHA is apparently observed for charged molecules
while almost no dependence was observed for a neutralquencher, Co(acac)3. Since the ionic strength was inducedby the existence of HA polymers, no intrinsic dependence onCHA is expected for the charged molecules (see text).

その変化は見られない。NaCl を添加した実験でも同様の変化が見られることから、我々は、この系で HA の添加によりイオン強度が増大して、k（2）そのものが、DebyeSmoluchowski の関係にしたがって変化したものと考えた。
したがって、このそれぞれの拡散係数は HA を添加してもHA を含まないときの拡散係数 D0 と等しいと結論できた。
蛍光消光で測定した Dobs は、指数関数減衰が大きく崩れない範囲で、励起状態寿命 τ により制限された}}

N2exp( – τt ) 1 ∑ x i(τ)–x i(o) dt
1NDobs(τ)=∞
6 t exp( – tτ )dt
0∞

0（3）

〈x 2〉exponent(τ)=6τで 近 似 的 に 表 さ れ る。 平 均 ２ 乗 変 位（Mean SquareDisplacement : MSD）の平方根を単純に拡散距離 L と考Fig. 4 Reduction of observable diffusion coefficient on HA
addition measured by PFG-NMR. The fitting curves wereobtained from eq. 5.

えると、この寿命を L に変換するのに

L=〈x 2〉exponent = 6Dobs(τ)τ

（4）の式を用いるのが適当である。蛍光寿命は 300-400ns であった。に従う。この式はゲル中の球状タンパク質の拡散について古くから用いられてきているが、その濃度における網目の大きさ ξ と、拡散する粒子の大きさ b が３．
２

PFG-NMR 法の結果

ξ =(b/a)C–0.5

HA

NMR で求めた D obs を HA 添加量に対してプロットすると PCBR 法と全く異なった結果が得られた。Fig. 4 にこによって結びつけられる。Fig. ４は定量的にもこの式に従うと考えている。

2+れを示す。測定した分子は、その大きさの順に水、MV 、2+（6）

この測定法では磁場勾配パルスの間隔 ∆（10-100 ms）がRu（bpy）3 、cytc であるが、直径の大きな分子ほど HAサンプリング時間と考えられる。いったん求められた D obsの添加により相対的に Dobs が低下する。

は等方的であると考えられるので、（4）式と同じく L は

Dobs の濃度依存性は Ogston18）の式

Dobs/D0 =exp(–aC0.5HA)（5）

L= 6Dobs ∆と書けると考えればよい。

−4−（7）

ヒアルロン酸水溶液におけるナノコットン効果の研究

３．
３

４．考FCS 法の結果

Fig. 5 に cytc を Alexa488 でラベルして Dobs を測定した

４．１

察

拡散係数の距離依存性 16,19,20)

結果を示す。色素のみの場合も比較のために示す。FCS

３．１−３．３の結果を Table 1 にまとめる。の場合も Fig. 4 の PFG-NMR における cytc とほぼ同じ結PCBR、PFG-NMR、FCS という３つの手法で HA 水溶果が得られ、式（5）に従った。ただし、この場合１wt%液中の cytc の D obs が測定できた。それぞれの測定法で求におけるメッシュサイズは 7 nm で PFG-NMR よりもわずめた拡散係数の数値、また HA の添加時の挙動は全く異なかに小さい。これは、拡散する分子が感じる網目がわずかっていた。これはいかなる理由によるものであるか。（4）、に小さいことを示唆しており、拡散時間と同等の時間領域（7）、（10）式で求めた数値を Table １に示したが、こので網目構造そのものが動的に揺らいでいることを示してい３つの測定方法は全く異なる L に対応した D obs を与えてると考えている。

いる。

本 測 定 方 法 に お い て は、CVE に よ っ て 空 間 が 規

１ wt% における cytc の Dobs を L に対してプロットした定され、空間サンプリングが先に決まることが特徴である。
しかし、通常用いられる CVE の高さ z と半径 w を用いた
TCF に対するフィッティング式

G(τ)=1+ 1N}}}

11+ ττ

D

11+ zτ 2( w) τ12} +ƒ exp(– ττ )（8）FD（最後の項は蛍光寿命による補正）は実は２次元視野における粒子の平均滞在時間 τ D をパラメータにしており、それから拡散係数 Dobs をDobs =w2/4τ

D（9）によって導出している。本測定方法では、先に拡散時間を
τD と考え、L は等方的に

L= 6Dobs τD（10）と算出した。フィッティングに頼っている以上、むしろサンプリング時間を先に決めていることになる。

Fig. 5 Reduction of observable diffusion coefficient on HA addition measured by FCS. The fitting curve was obtained from eq. 5Table 1 Summary of the observation time and the diffusion distance observed for various molecules by three independent techniques, PCBR2162, PFG-NMR2162, and FCS. ?obs and L
were calculated from the results in the absence of HA.

−5−

ものが Fig. 6 である。
我々はこのプロットを DDDC（DistanceDependence of Diffusion Coefficient）と呼んでいる。L が小さい極限では D obs は D 0 に外挿すべきであろう。PCBR における Dobs も D0 と変わらないが、FCS、PFG-NMR の Dobs
は約 30％小さく、HA 濃度に対して式（9）に従うことから、網目構造に妨害を受けたと考えられる挙動をとる。
先般の式（6）における ξ の値や、他の研究者による ESR やFRAP の測定から、１wt% HA の網目の大きさは約 5-10nm であると考えられるので、そのすぐ上の 10-100 nm で急激に拡散係数が変化するというのは妥当であると思われる。
結局この系では、大きく分けて網目内で終わるような短距離拡散（L<10 nm）と、数個から数 10 個以上の編み目を経て遅くなる長距離拡散（L>100 nm）という２つのモードが観測され、そのそれぞれでほぼ D が定数（すなわち <x2> が時間の１次に比例する）をとる「Normal Diffusion（素直な拡散）」になっている。
Fig. 6 の DDDC プロットは、だらだらとした傾斜状の関数でなく階段状になること、すなわち２つのモードの変換が 10-100 nm という比較的狭い領域で起こることは注目すべきである。これは HA の作る網目の大きさがかなり揃っていて、ばらつきが少ないことを示している。この 10-100

Fig.6 A plot of distance dependence of diffusion coefficients(DDDC) plot of Dobs at CHA = 1.5 wt% against the averaged diffusion distance L on logarithmic scale. Since theDobs obtained from PCBR experiment is increased by 28% by the ionic strength of the HA chain, D0 was used as
the intrinsic value assuming that Dobs without the effect ofionic atmosphere is almost equal to D0 (see text). Furthermore, the curve should be extrapolated to D0 at L = 0. The
profile should be a step function with a sudden drop at 10100 nm. The numbers indicated beside each point are τobs
values corresponding to each experiment.

nm という数字には、ナノバイオロジーに関わる生物的な意
味があると思われるが、このことについては次項で述べる。
Fig.6 では、D obs が急激に変化する領域が存在する。これはこの領域で少なくとも、MSD が時間に比例しない「異常拡散（Anomalous Diffusion）」を起こすことを示している。
異常拡散現象は、様々な系ですでに議論されている。例えば、ガラス系では、ガラス転移点の前後に異常拡散が起きることが知られており、コロイド系、ゲル、さらには細胞の内部でも起こることが知られている。著しい異常拡散現象が起きる場合、時間相関関数そのものがひずむことが予想されるが、今回の系の FCS 測定では（8）式からのずれは全く観測されなかった。このことは、拡散距離（MSD）の増加に従って、拡散係数の変化が比較的ゆっくり進行し、時間相関関数のひずみからは観測できない異常拡散現象が存在すると言うことを示している。

４．２ 異常拡散現象と ECM の果たす役割（ナノコットンの中の移動現象）

Fig.7 A drawing of the network structure in extracellularmatrices (ECM) consist of a blend of proteins (Collagens),hyaluronan (HA) and other proteoglycans (PG) .

近年、生体内の拡散現象が通常の拡散とは異なる異常拡散に属するという報告が相次いでいる。実際細胞質や、ECM は全て複雑系であり、均一な媒体ではない。従って、質と、HA などの糖類の柔らかい網目状物質が共存してい拡散現象は必ずその空間構造に依存し、時間によって変化る。コラーゲンは電子顕微鏡で見えるので、研究が進んでする拡散係数（MSD の時間微分）を示す。このことについるが、柔らかい糖鎖は実態がつかめていない。しかし我々

いて ECM を例にして考察する。Fig.7 は典型的な軟骨組の研究結果は１wt％程度の糖鎖の作る網目構造でも十分織の ECM を模式的に示したものである。通常の ECM でに拡散に影響を与え、異常拡散を引き起こしていることをはコラーゲン類のようなタンパク質に属する堅い網目状物示している。ナノコットンはまさにこの異常拡散を生じさ−6−ヒアルロン酸水溶液におけるナノコットン効果の研究せる空間なのである。
Fig. ８に ECM に接触した細胞表面を模式図として示す。
細胞膜には様々な酵素、アクセプターやチャネルが存在している。これらは、細胞表面に様々な物質を分泌したり、外部からの物質と反応したり、細胞膜を通して、物質や粒子を出し入れすることもあるだろう。この細胞表面が HAの作る ECM、すなわち異常拡散の起こる空間と接触している場合と、していない場合ではどのような違いがあるかを考察する。
細胞膜表面から分泌される物質は、ECM 空間内に濃度勾配を作る。この濃度勾配によって、例えば他の細胞への情報伝達や代謝が進行することになる。異常拡散は、この濃度勾配に影響を与えるのは明らかで、細胞表面の反応や、情報伝達の収率に大きな影響を与えるだろう。その一方で、Fig. 8 A drawing of the material transports around the cellsurface (Plasma Membrane ). NLM stands for Non-LivingMatrials.

10nmより近距離の拡散はほとんど水と変わらず、しかも網目

medical applications of hyaluronan and its derivatives.

より小さなタンパク質なども容易に回転するので、配向してアLondon: Portland Press 1998.

クセプターなどと容易に反応することができるだろう。
ECM

５） L. Lap k, Jr., L. Lap k, S. De Smedt, ほか２名の作る空間は、不均一な反応場における位置による反応性や反:Hyaluronan: preparation, structure, proper ties,応収率に微妙な変化を与える。こういった小さな変化でも、and applications. Chem. Rev. 98, 2663-2683, 1998.

細胞は敏感に感じ取り、代謝活動を調整すると考えて良い。

６） D. Evered, and J. Whelan, editors. :The biology ofHA の作る網目状 ECM ＝ナノコットンの作る効果は、単hyaluronan. Chichester, UK: John Wiley & Sons, 1989.に水分を保持する保湿成分にとどまらず、代謝物質の７） 秋山

徹，宮園 浩平

移動現象を微妙に調整する役割を果たし、細胞がそれ羊土社を「心地よい」と感じるような環境を提供することに

８） 宮坂 昌之ある。HA マトリックス中の移動現象の基本的メカニズ
ムを積極的に利用することにより、癌の細胞レベルの治療、

潤社

５．謝

2003.
監修．：新版

着システム10） 林正男

共立出版

秀2001

著 .: 新細胞接着分子の世界

11） 清水元治

辞接着分子ハンドブック

2000.

９） 関口清俊，鈴木信太郎編．
：多細胞体の構築と細胞接

ドラッグデリバリ、発生の調節、再生医療への展開など、新たな応用への指針を与えることができると考えている。

編．：シグナル伝達研究 2003

羊土社

編：癌転移の分子医学、羊土社

2001.

1996.

12） 三好照三，田中稔一，高橋泰文．
：ヒアルロン酸の医本研究はコスメトロジー財団の援助により行われた。同薬品への応用

Bio Industry, 11, 632-642, 1994.

財団の援助に感謝する。また本研究の主要な部分は、益13） J.-P. Boucharud and A. Georges, :Anomalous

田晶子、山下宏一、越野広雪、Thomas Kluge（以上理研）、Diffusion in Disordered Media : Statistical Mechanisms,

西村吾朗、金城政孝、田村守（北大電子研）との共同研究

Models and Physical Applications. Phys. Rep. 195, 127-である。また、HA については、三好照三、北川広進（電293, 1990.

気化学工業㈱）高橋泰文（㈱中外製薬）らのご協力の下提

14） T. Kluge, A. Masuda, K. Yamashita, ほ か １ 名供を受けたものである。これらの方々にも謝意を表する。

. :Effects of charge and structure of hyaluronic acid on theluminescence quenching in aqueous solution. Photochem.

（参考文献）

Photobiol. 68:771-775, 1997.
th１） B. Alberts, et al. : Molecular Biology of The Cell 415） T. Kluge, A. Masuda, K. Yamashita, ほか１名 .

ed. 1092-1112, New York : Garland Science 2001.

:Concentration and molecular weight dependence of２） 宮坂昌之、矢原一郎
リー細胞接着羊土社

編:Bio Science 用語ライブラ

the quenching of Ru(bpy)32+ by ferricyanide in aqueous

1996

solutions of synthetic hyaluronan., Macromolecules３） G. Abatangelo, and P. H. Weigel, editors. : Newfrontiers in medical sciences: Redefining hyaluronan.

33:375-381, 2000.
16） A. Masuda, K. Ushida, H. Koshino, ほか２名 . :NovelAmsterdam, The Netherlands: Elsevier.

distance dependence of diffusion constants in hyaluronan

４） T.C. Laurent, editor. : The chemistry, biology and−7−

aqueous solution resulting from its characteristic nano-correlation spectroscopy: Theory and applications.

microstructure. J. Am. Chem. Soc. 123:11468-11471,

Berlin: Springer 2001.

2001.
17） A. Masuda, K. Ushida, G. Nishimura, ほか 5 名 .

19） 丑田公規，益田晶子．
：実験で観測される拡散係数に見る時空間相関と生体系の物質輸送:Experimental evidence of distance-dependent diffusion
coefficients of a globular protein observed in polymer

59, 4, 216-220, 2004.

aqueous solution forming a network structure on20） 丑田公規、益田晶子

日本物理学会誌: ヒアルロン酸水溶液中の物質

nanometer scale., J. Chem. Phys., 121, 10787-10793,

移動と細胞外マトリックスとしての働き2004

1, 10-17, 2004.

18） R. Rigler and E. S. Elson, editors. :Fluorescence−8−

光化学35,