有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用
岡山理科大学大学院理学研究科臨床生命科学専攻

中村元直G-protein coupled receptors (GPCRs) are pivotal targets in medical and pharmaceutical research fields because a wide
variety of disease-related processes are critically controlled by the signal transduction mediated by these receptors.  Type 2
better taste receptors (TAS2Rs) comprise a large family of GPCRs with 25 distinct isoforms encoded in the human genome.  
Recent studies have shown that TAS2Rs are not only expressed in the taste buds of the tongue, but also in the skin.  In thepresent study, we showed the functional expression of all human TAS2Rs in the human keratinocytes.  Interestingly, theseTAS2R proteins are not localized on the plasma membrane, mainly detected in the cytoplasmic regions in the immune-fluorescent staining experiments of the keratinocytes.  The expressions of TAS2Rs in these cells were enhanced by the stimulation with bitter compounds, such as denatonium, diphenhydramine and saccharine.  Furthermore, the stimulation of bitter
compounds further increased the expression of three ABC-transporters, ABC-B1, ABC-C1 and ABC-G2, which are involving in the multidrug-resistance of various cancer cells.  These results raise the possibility that the activation of TAS2Rs by
the bitter compounds enhances the exclusion of these substances from the keratinocytes through the ABC-transporters.  Theanalyses of the signaling pathway evoked by the TAS2Rs revealed the coupling of these receptors with Gαi and/or Gα12/13,
followed by the activation of NF-κB.  Together, these results suggest that the keratinocytes possess TAS2Rs in the cytoplasmic organelles, and recognize the infiltrated substances, including bitter compounds, resulting in the activation of theABC-transporters, such as ABC-B1, ABC-C1 and ABC-G2, to exclude the substances.

1．緒に塗布することで排除機構を作動させ、蓄積有害物の排除言を促進することで皮膚炎悪化を回避させることができるか

ヒトは自然界で生きる限り様々な有害物に触れる。生命をも脅かすこうした異物は 2 つに分類される。1 つはウイもしれない。こうした奇抜な発想を実現化するために基盤的な知見を積み上げるのが本課題の目的である。

ルスや細菌などの病原微生物であり、もう 1 つは有害化合２．方物である（図 1）。ヒトは前者に対しては免疫防御システムで対抗する。しかし後者に対しては、苦味感覚による拒絶法

2. 1. 苦味受容体の皮膚組織、細胞株での発現解析

反応こそあるものの、皮膚などに侵入した有害物を感知し、ヒトケラチノサイト（−/＋分化）、および、ヒト表皮角排出する機構については十分解明されていない。我々は、化細胞株である HaCaT 細胞での 25 種類の苦味受容体遺伝苦味受容体が有害物排除に深く関わると予測している。即子の発現確認は、これら細胞より RNA を調製して cDNA

ち、皮膚に発現する苦味受容体は、細胞内に侵入した有害を合成後、これを鋳型とした RT-PCR 法で行った。なお、物をリガンドとして感受して活性化され、排除機構発動シ

ヒトケラチノサイトの分化誘導は、1 mM 塩化カルシウム

グナルを惹起することで有害物を細胞外に排出するという添加下での３日間培養で行った。

仮説である（図 2）。ところで、ヒト苦味受容体遺伝子には多様性があり、個々人で若干の配列差異が存在する。この2. 2. ヒト皮膚組織での苦味受容体タンパクの発現解配列多様性は異物排除能の個人差に直結する。ある苦味受析

容体が皮膚細胞内に侵入した炎症原因物質を感受できない

ヒト皮膚組織切片を用いた苦味受容体タンパク（25 種類

配列の場合、当該物質を細胞外に排除できず、蓄積してしのうち、TAS 2 R 14 と TAS 2 R 38 を解析）の発現解析は、まうことで皮膚に悪影響を及ぼすであろう。これが有害物市販の抗 TAS 2 R 14 抗体と抗 TAS 2 R 38 抗体を用いて行侵入に起因する皮膚炎の個人差と考える。こうした人のたった。本解析は、東京大学医学部皮膚科の住田隼一医師にめには無害な苦味受容体賦活剤を創製し、これを炎症部位依頼し、実施して頂いた。解析に用いたヒト皮膚組織切片は、健常人から作製した組織とアトピー性皮膚炎患者から作製したものの２種類を用いた。

Functional expression of the bitter taste
receptors in human keratinocytes
Motonao Nakamura
Department of Life Science, Faculty ofScience, Okayama University of Science

2. 3. 苦味受容体の細胞内局在解析
φ 35 mm のディッシュ（glass bottom）で培養した HaCaT細胞を固定化し、透過処理後、一次抗体反応（抗 TAS 2 R 14抗体と抗 calnexin 抗体、抗 transferrin receptor 抗体、抗− 157 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図１

ヒトが持つ２つの生体防御システム

図２

生命を脅かす異物は2つに分類される。1つはウイルスや細菌等の病原微生物であり、もう1つは有害化合物である。ヒトは前者に対しては免疫防御システムで対抗する。しかし後者に対しては、皮膚などに侵入した有害物を感知し、排出する機構については十分解明されていない。我々は、苦味受容体が有害物排除に深く関わると予想している。

Golgin- 97 抗体、抗 EEA 1 抗体、抗 CD 71 抗体、或いは、皮膚細胞への有害物の侵入（作業仮説）

皮膚は様々な危険物質に曝される。大きい物質や親水性物質は角質層や脂質二重膜によって細胞内侵入を阻止できるが、疎水性低分子は細胞内に侵入する。苦味受容体の局在部位はどこか（ 感 受）、リガンド（苦味物質）結合後、どのような情報伝達を発信するのか（発動）、受容体の活性化が有害物排除のトリガーとなるのか（排出）、本研究ではこの3つの課題に取り組む。

15 時間刺激した。

抗 COX IV 抗体の組合せ）を行った。その後、二次抗体反応（AF- 546 標識抗ラビット IgG 抗体［TAS 2 R 14 抗体用］

2. 6. NF-κBの活性化の評価と AF- 488 標識抗マウス IgG 抗体［オルガネラマーカー抗1 mM 塩化カルシウム添加下での３日間培養で分化誘導体用］）
を行い、PBS で洗浄後、共焦点蛍光顕微鏡を用いてしたヒトケラチノサイトを 1 mM デナトニウムで 15 時間

苦味受容体とオルガネラマーカーの細胞内局在観察を行っ

刺激後、Hypotonic 緩衝液で細胞を破砕し、遠心分離によた。

り核画分を単離した（上清は細胞質画分として解析に供した）。その後、この核画分を核タンパク質抽出緩衝液に懸2. 4. 分化ヒトケラチノサイトを苦味物質で刺激した際の苦味受容体遺伝子の発現上昇

濁することで核タンパク質を抽出し、核タンパク質画分とヒトケラチノサイトの分化誘導は、1 mM 塩化カルシウ

は NF-κB の構成サブユニットのうち、p 65 に着目して解ム添加下での 3 日間培養で行った。分化ヒトケラチノサイ

析を行った。即ち、細胞質タンパク質画分と核タンパク質ト、および、線維芽細胞を 1 mM デナトニウムで 15 時間画分に存在する total p 65 比較と核内リン酸化 p 65 の量を刺激後、これら細胞より RNA を調製して cDNA を合成し、Western blotting での検出バンドの濃さで比較した。

して解析に供した。本実験では古典的経路に着目し、検出苦味受容体や ABC トランスポーター（ABC-B 1、ABC-C 1、３．結および、ABC-G 2）の発現変動（mRNA 量）を定量 PCR 法で果行った。苦味受容体の解析は 25 種類の苦味受容体のうちヒトは G タンパク質共役型受容体（GPCR）に属する 25

TAS 2 R 14 と TAS 2 R 38 について実施し、β- アクチンを種類の苦味受容体遺伝子を持つ。本研究ではまず、苦味受コントロールとして評価した。

容体に関する以下の３つの知見を得ることを目指した。
（i）
この受容体群は皮膚細胞に発現する、（ii）この受容体は形

2. 5. ルシフェラーゼレポーター系を活用した苦味受容体情報伝達解析
HEK 293 T 細胞に TAS 2 R 38 と 5 種類いずれかの GPCR

質膜ではなく細胞内に局在する、（iii）皮膚細胞を苦味物質で刺激すると異物排出に関わる ABC トランスポーターの発現が増強する。

シグナル応答性レポーター（CRE、SRE、AP- 1、NFAT、或いは、SRF エレメントのいずれかを連結した深海エビル

3. 1. 苦味受容体群のヒトケラチノサイト における発シフェラーゼ［NanoLuc］）を導入し、TAS 2 R 38 リガンド現解析（フェニルチオカルバミド ; PTC、或いは、6 -n- プロピル

ヒトケラチノサイトにおける 25 種類の苦味受容体遺伝チオウラシル ; PROP）で刺激した際のルシフェラーゼ活性子の発現を RT-PCR にて解析した結果、1 mM 塩化カルシの上昇を評価した。リガンド刺激はいずれも 1 mM 濃度で、ウムでの分化誘導によって角化系細胞に分化後、いずれの− 158 −有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用受容体も明らかな発現上昇が認められた（図 3）。なお、このうち、TAS 2 R 14 と TAS 2 R 38 を解析）の局在解析は、の 発 現 上 昇 は 定 量 PCR で も 確 認 し て い る（data not

市販の抗 TAS 2 R 14 抗体と抗 TAS 2 R 38 抗体を用いて行shown）。また、同様の 25 種類の苦味受容体遺伝子発現はった。本解析は、東京大学医学部皮膚科の住田隼一医師にヒト表皮角化細胞株である HaCaT 細胞においても RT-依頼し、実施して頂いた。解析に用いたヒト皮膚組織切片

PCR 法で確認している（data not shown）。

は、健常人から作製した組織とアトピー性皮膚炎患者から作製したものの２種類を用いた。解析の結果、両受容体と3. 2. ヒト皮膚組織での苦味受容体タンパクの発現解析
ヒト皮膚組織切片を用いた苦味受容体タンパク（25 種類

図３

も表皮付近に高い発現が認められたが、健常人とアトピー性皮膚炎患者との間に特筆すべき差異は認められなかった（図 4）。

ヒトケラチノサイトでの25種類の苦味受容体遺伝子の発現解析

ヒトケラチノサイト由来のcDNAを鋳型とした発現解析の結果を示す。ケラチノサイトは1mM 塩化カルシウム添加有無によって未分化（−）
、分化（＋）の２つの状態のものを用いた。
これら細胞からRNAを調製し、このRNAから合成したcDNAを用いてRT-PCRを行った。いずれの細胞株からも25種類全ての苦味受容体の発現が認められた。

図４

ヒト皮膚組織におけるTAS 2 R 14、および、TAS 2 R 38タンパクの発現

ヒト皮膚組織におけるTAS 2 R 14、および、TAS 2 R 38タンパクの免疫染色実験の結果を示す。解析に使用したヒト皮膚組織切片は全て東京大学医学部にて倫理委員会の承認のもと、調整されたものである。Aは健常人から調整した皮膚組織、Bはアトピー性皮膚炎患者から調整した皮膚組織である（東京大学医学部皮膚科の住田隼一医師との共同研究）。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

3. 3. 皮膚系細胞株における苦味受容体の細胞内局在解析

3. 4. ヒトケラチノサイト を苦味物質で刺激した際の苦味受容体の発現増強

共焦点顕微鏡を用い、HaCaT 細胞での当該受容体の細前述の分化ヒトケラチノサイトと線維芽細胞のそれぞれ胞内局在を免疫染色で調べた結果、抗 TAS 2 R 14（図 5）、を 1 mM のデナトニウムで 15 時間刺激し、苦味受容体遺抗 TAS 2 R 38（data not shown）のいずれの抗体を用いた解伝子発現量の変化を定量 PCR 法で調べた。図 6 に示すよ析でも受容体の局在は形質膜ではなく、細胞内を示唆する

うに、両受容体とも分化ヒトケラチノサイトでは苦味物質ものであった。先行研究で皮膚組織における苦味受容体発刺激で発現の上昇が認められたが、線維芽細胞では認めら

現の報告はあるものの、細胞内局在への言及については全れなかった。なお、同様の苦味物質刺激（1 mM のデナト1）

くない 。なお、小胞体（calnexin）、ゴルジ体（Golgin- 97）、ニウム、1 mM サッカリン、0 . 1 mM キニーネ塩酸塩など）

リサイクリングエンドソーム（transferrin receptor）、初期による苦味受容体自身の発現増強は HaCaT 細胞においてエンドソーム（EEA 1）、リソソーム（LAMP- 1）、ミトコンも認めている（data not shown）。

ドリア（COX IV）などの局在マーカーを用い、共局在性を検討したが、何のマーカーに対しても有意な共局在性を示すものはなかった。なお、同様の細胞内局在はヒトケラチノサイト でも確認している（data not shown）。

図５

3. 5. ヒトケラチノサイトを苦味物質で刺激した際のABCトランスポーターの発現増強
前述の分化ヒトケラチノサイトを１mM デナトニウムで

HaCaT細胞における苦味受容体の細胞内局在解析

HaCaT細胞に発現しているTAS 2 R 14と6つのオルガネラ（Endoplasmic reticulum、Golgi body、Recyclingendosome、Early endosome、Lysosome、Mitochondria）特異的タンパクを市販抗体で染色し、共焦点顕微鏡で共局在性を評価した。緑；抗オルガネラタンパク抗体で反応後、Alexa Fluor（AF）488標識抗マウスIgG 抗体 で 蛍 光 染 色した。 赤；抗TAS 2 R 14抗 体 で反 応 後、AF 546標 識 抗ウサギIgG抗 体 で 蛍 光 染 色した 図。
Merge； TAS 2 R 14と各オルガネラマーカーの局在を重ね合わせた図。Phase contrast；明視野で細胞を観察した図。

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有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用

図６ ヒトケラチノサイトをデナトニウムで刺激した際の苦味受容体の発現上昇
分化ヒトケラチノサイトと線維芽細胞を1mMデナトニウムで15時間刺激した際の苦味受容体遺伝子（TAS 2 R 14、TAS 2 R 38）の発現上昇を定量PCRで調べた。β-アクチン遺伝子の発現量をコントロールとした。

15 時間刺激した細胞より RNA を調製し、cDNA 合成後、

図７ 苦味物質刺激による異物排出ABCトランスポーターの発現増強
分化ヒトケラチノサイト を1mMデナトニウムで刺激した際のABC-B 1、ABC-C 1、 お よ び、ABC-G 2の 発 現 上 昇 を 定 量PCRで調べた。β-アクチン遺伝子の発現量をコントロールとした。

3. 7. NF-κBの活性化評価

定量 PCR 法により ABC トランスポーターの遺伝子発現変先行研究より、ABC-B 1 の発現に NFκ-B の活性化が深動を解析した。なお、本実験では、ABC トランスポータ

く関与し、抗がん剤耐性回避の標的分子として注目されてーの中でも抗がん剤排出への関与が報告されている３つのいる 3 - 6）。そこで、前述の分化ヒトケラチノサイトを１mMトランスポーター、ABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 に着デナトニウム、１mM PTC、１mM サッカリン、１mM サ目し、これらの発現量変化を解析した。その結果、苦味物

リシン、或いは、0 . 1 mM キニーネ塩酸塩で 15 時間刺激し、質刺激に伴い、ABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 いずれのp 65 の 核 移 行 量 や 核 移 行 p 65 の リ ン 酸 化 度 合 い か ら遺伝子も発現が有意に上昇することが示唆された（図 7）。

NFκ-B の活性化を評価した。その結果、これら苦味物質

なお、同様の苦味物質刺激（1 mM のデナトニウム、1 mMの刺激で NFκ-B が有意に活性化されていることが示唆さ

サ ッ カ リ ン、0 . 1 mM キ ニ ー ネ 塩 酸 塩 な ど ）に よ るれた（図 9）。なお、同様の苦味物質刺激（1 mM のデナトニ

ABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 の発現増強は HaCaT 細胞

ウム、1 mM サッカリン、0 . 1 mM キニーネ塩酸塩など）ににおいても認めている（data not shown）。

よる NFκ-B の活性化は HaCaT 細胞においても認めている（data not shown）。

3. 6. 苦味受容体から発信される情報伝達４．考

苦味受容体群は GPCR ファミリーに属する。この受容体

察群から発信される情報が何の G タンパク質を介したものか

冒頭で述べたように、本研究では苦味受容体に関するを知るために、以下の実験を行った。HEK 293 T 細胞に以下の３つの知見の確保を目指した。（i）この受容体群はTAS 2 R 38 と 5 種類いずれかの GPCR 応答性レポーター

皮膚細胞に発現する、（ii）この受容体は形質膜ではなく細（CRE、SRE、AP- 1、NFAT、或いは、SRF エレメントを胞内に局在する、（iii）皮膚細胞を苦味物質で刺激すると異連結した深海エビルシフェラーゼ）を導入し、TAS 2 R 38

物排出に関わる ABC トランスポーターの発現が増強する。のリガンドとして認知されているフェニルチオカルバミド（i）に関しては、ケラチノサイトや表皮角化細胞株での 25（PTC）、或いは、6 -n- プロピルチオウラシル（PROP）で 15種類全ての苦味受容体遺伝子の発現のみならず、ヒト皮膚時間刺激した際のルシフェラーゼ活性の上昇を評価した 2）。

組織での苦味受容体タンパクの確認などから、外界に最もその結果、どちらの刺激も SRE および SRF エレメントを接する表皮組織に苦味受容体が発現していることを示唆で活性化する結果が認められた（図 8）。我々はこの実験によきた。
（ii）興味深いことに、これら苦味受容体は形質膜でって苦味受容体に共役している G タンパク質に関しては、はなく細胞内に局在するが、本研究期間ではその局在部位Gα i 型と Gα 12 / 13 型の関与を予想した。

を明確にすることはできなかった。細胞破砕後の分画で当該受容体は膜画分に検出されることからいずれかのオルガ− 161 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図８

GPCRシグナル応答性レポーターを活用した苦味受容体情報伝達経路の解析

HEK 293 TにTAS 2 R 38と5種類いずれかのGPCRシグナル応答レポーター（CRE、SRE、AP-1、NFAT、或いは、SRFエレメントを連結した深海エビルシフェラーゼ）を導入し（左）、TAS 2 R 38リガンド（PTC或いは、PROP）で刺激した際のルシフェラーゼ活性の上昇を評価した。どちらの刺激もSREおよびSRFエレメントの活性化が認められた（右）。

質で刺激を受けたケラチノサイトや表皮角化細胞株では異物排出のためのタンパク質が増加 / 作動することが予想できる。我々はまず ABC トランスポーターに着目し、その中 で も 異 物 排 出 能 の 報 告 が あ る ABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 に関して解析を行った７）。なお、ヒト結腸腺癌
細 胞 株 で あ る Caco 2 細 胞 で の 苦 味 受 容 体 を 介 し た
ABC-B 1 の発現上昇や 8）、皮膚組織での ABC-B 1 の発現については先行研究で既に報告されている 9）。本研究において、我々は分化ケラチノサイトの苦味物質刺激に伴いABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 の発現が増加すること見出した。実際に細胞自体がこうしたタンパク質の発現増加
図９ 分化ヒトケラチノサイトにおける苦味物質刺激後のNFκ
-Bの活性化
分化ヒトケラチノサイトを1mM PTC、1mMデナトニウム、1mM サッカリン、1mM サリシン、或いは、0 .1 mM キニーネ塩酸塩で刺激した際のNFκ-Bの活性化。p 65；NFκ-Bのp 65サブユニット、phos-p 65；NFκ-Bのp 65サブユニットのリン酸化体で異物排出能を高めているか否かを今後行う予定である。
例えば、蛍光ローダミンを細胞に取込ませ、苦味受容体刺激で排泄能が高まるか否かを調べる計画である 10）。
本研究から、創薬に関して我々は以下の提案をする。苦
味受容体遺伝子には配列多様性があり、これは異物排除能の個人差に直結する。皮膚炎原因物質を感受できない配列を持つ場合、当該物質を排除できず、蓄積によって皮膚炎

ネラ膜に局在するものと推察する。小胞体なのか？ゴルジが発症するであろう。こうした人のために、無害な苦味受体なのか？或いは、それ以外なのか？解明が今後の大きな容体賦活剤を創製し、これを炎症部位に塗布することで排課題である。（iii）図 2 に示す作業仮説からすれば、苦味物除機構を作動させ、蓄積有害物の排除を促進することで皮− 162 −有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用

膚炎悪化を回避させる考えである（図 10）。苦味受容体を創薬標的として捉えた点では前例のない研究である。
GPCR は形質膜から情報発信すると考えられてきたが、本研究はこうした概念も覆す。細胞内 GPCR 情報伝達という新たな研究領域を提唱できる可能性も秘めている。生体防御の観点からも、こうした防御機構の提唱はこれまで全くなかった。本研究は新規創薬への挑戦でもある。

５．謝辞

ヒト皮膚組織切片を用いた苦味受容体の発現解析にご協力頂いた東京大学医学部皮膚科の住田隼一医師に感謝いたします。本研究の遂行にあたり、助成をしてくださった公

図10

苦味受容体を標的とした創薬アイデア

25種類の苦味受容体の中で配列個人差のない受容体を標的とし、これを活性化する無害な賦活剤を創製すれば、皮膚細胞内へ蓄積した有害物質を細胞外に排出させることができる。

益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝いたします。助成金により遂行された本研究成果は、国内外の学会や国際学術雑誌に発表することで社会に還元し、貢target therapy of AKT and NKκ-B signaling pathway

献することをお約束します。

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