環境応答型スマート材料としてのケラチンゲルの創出

信州大学繊維学部

藤 井敏 弘Human hair is mainly composed of cysteine-rich proteins such as keratin and keratin-associated proteins (KAPs). Whena keratin solution was incubated with 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), the zero-length
cross linker between amino and carboxyl groups, the solution changed to opaque white/light beige color gel in appearance.
The gel was formed according to the EDC and protein concentrations. Electrophoresis showed that the cross-linked proteins
were free of KAPs and composed of keratin only. Thus, the gel was named “keratin gel”. The keratin gel could both retain
various proteins and release some of them. Ovalbumin (MW=45 kDa; pI=5.2) incorporated into EDC/keratin gel wascontinuously released for 24 h. This time-release was suppressed when the incorporated gel was treated with oxidative
treatment such as H2O2, while the release was slightly increased after reductive treatment of the gel. The keratin gels will beavailable for the controlled-release of macromolecules corresponding to oxidation-reduction environment.

１．緒スキャホールド機能を有していることが報告されている

言6 , 7）。

これらのことは、毛髪タンパク質は生体適合性に優れたバ

光、温度、pH などの変化に反応する環境応答型ゲルは、イオマテリアルであることを示唆している。

次世代の高機能性マテリアルとして注目されている。医学

再生医療を含めた自然科学の最近の最大トピックスとしから工学までの広い分野で利用が想定されており、生体親て、人工多機能性幹細胞（iPS）の樹立とその応用があげら和性や環境低負荷性が求められている。

れる。これは「自分由来の細胞で、自分を治療する技術」

私たちは 2002 年から“セルフリサイクル”の概念を提であるため、移植医療に代わる再生医療として注目され多唱して、これを実証する研究・開発を進めている。これか額の予算が投入されている。これは、新しい産業創出にもら生まれてくる製品を“セルフリサイクル製品”と名付け、繋がるため、国民の期待は高い。一方では、「国民医療費」「動物や他者の生体組織・材料を使わず、本人由来の生体物は 40 兆円におよぶと報道されており、毎年 1 兆円もの増加

1 , 2）。となっている。この要因としては高齢化が進んだことに加この生体物質として毛髪組織に注目した。この理由として、

えて、CT、MRI、内視鏡などの診断や治療に使用してい血液と比べて、毛髪は採取する負担が小さく、大量に入手る「高度医療技術」が挙げられてきている。iPS 細胞からが可能で、フィルム、ゲルなどへと加工する技術を開発す作られるセルシートや組織などが治療に利用できるようにれば、安全・安心なマテリアルとなるものと考えている。

なれば移植医療にとっては福音となるが、さらなる高額な硬ケラチンを抗原としてマウスに投与して免疫原性を調べ医療費を国民に負担させることになる。このため、今後、たところ、マウス体毛ケラチンはヒト毛髪および爪ケラチ

低コストで品質の高い医療用の材料と診断・治療技術を社ンと比べて、100 〜 200 倍も免疫応答性が低いことを報告会が求めてくることを確信している。

質を原料として、本人が使用するための品」と定義した

3）

している 。またヒト毛髪タンパク質フィルムはプロテア

私たちは、ケラチンを原材料としたフィルムへの加工技ーゼにより分解を受けることや、ヒト毛髪および爪タンパ術は開発しているが、ゲルへの加工技術は未だ確立していク質とそれらのフィルムはラット腹腔由来の肥満細胞を刺ない。本研究では、簡便な技術を組み合わせて、スマート激しないことを私たちは見出している材料でかつ生体適合性にも優れたケラチンゲルを開発する

4 , 5）。また、羊毛およびヒト由来の硬ケラチンフィルムやスポンジは細胞培養ことを目的とする。の足場として期待されており、線維芽細胞などとの接着性、2．実生存、増殖などにおいて問題がなく、コラーゲンに匹敵する

2 .1

験

毛髪タンパク質溶液の調製とケラチンゲルの作製

化学処理が施されていないボランティアから提供された頭髪を用いた。毛髪を信大法溶液（５M 尿素 , 2 . 6 M チオ
Creation of the keratin gel : an environmental
response type smart material
Toshihiro Fujii
Faculty of Textile Science and Technology,
Shinshu University

尿素 , ５% 2 -メルカプトエタノール , 25 mM Tris-HCl, pH8 . 5）に浸し、50℃で３日間抽出を行った。ろ過と遠心操8）

作により毛髪残渣を取り除き、タンパク質溶液を得た 。
この溶液は蒸留水に透析後、不溶物を遠心で取り除き使用− 32 −

環境応答型スマート材料としてのケラチンゲルの創出した。タンパク質濃度は牛血清アルブミンを標準として

3．結9）

Bradford 法で測定した 。
ゲル形成は小試験管中の毛髪タンパク質溶液にゼロ距離

3 .1

果

EDC 濃度がゲルの形成に与える影響

化 学 架 橋 剤（EDC；1 - ethyl- 3（3- -dimethylaminopropyl）

EDC による架橋は近距離のアミノ基とカルボキシル基carbodiimide hydrochloride）を加えてインキュベートし、の間にペプチド結合を作り、副産物は尿素で未反応 EDC一定時間後に倒立試験により確認した。ゲルの還元処理はとともに水洗により除去ができる。このため生体適合性のチオグリコール酸、酸化処理は過酸化水素を用いた。

保持が期待できる。EDC はタンパク質間の相互作用を調べるために多用されている。ケラチンと同類の筋肉に含ま2.2

電気泳動れている中間径フィラメントであるデスミンがカルポニン

倒立試験の 1 / 10 のスケールでタンパク質と試薬を加えて反応させ、可溶化成分を Tricine/SDS- ポリアクリルアなどの細胞骨格タンパク質と EDC により架橋することを
11）報告している 。

ミドゲルの電気泳動（トリシン /SDS - PAGE）によって分

可 溶 化 し た 毛 髪 タ ン パ ク 質 溶 液（10 mg/ml）に 0 −析した。泳動後のゲルは、0 . 1％ クマシーブリリアントブ

100 mM まで EDC 濃度を変えて加えた。37℃、30 分間イ

ルー R - 250、10 % 酢酸、40 % エタノールで２時間染色後、ンキュベーション後に小試験管を倒立させたところ、0 −10％酢酸溶液で脱色処理を行った 。

５mM EDC においてはタンパク質溶液の操作直後に落下10）することが観察されたが、20 mM 以上の EDC 濃度では試2.3

遊離（放出）試験

験管の底にゲル状の凝集体が形成され、これらは倒立してゲルへの高分子量成分の保持と遊離は、６種のタンパクも落下せずに底部に保持されていた（Fig. 1 A）。中間の 7質のブレンドを毛髪タンパク質に混ぜ、100 mM EDC を加− 10 mM EDC においては試験管の底から壁に半固体の物えてゲル化した。ゲル化されなかったものを 0 . 5 ×PBS に質が残存していることから、倒立試験に耐えられるまでのより洗浄後、0 . 5 ×PBS を加え 37℃下で遊離してくるタンゲルとなっていないことが示された。これらの結果、毛髪パク質量と成分を Bradford 法と電気泳動で分析した。

タンパク質は EDC により架橋が生じゲル凝集体が形成すFig. 1

ケラチンゲル形成における EDC の影響− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

ることが示された。また半透明なタンパク質溶液は、ゲルpH が６の時のみにゲルが形成していた。ケラチンの等電化により不透明で白色〜淡ベージュ色を呈していた。

点は type Ⅰが 4 . 8 − 6、type Ⅱが 5 . 9 − 7 . 8 であることから、上記した条件を 1 / 10 のスケールでおこない、可溶化タンパク質をトリシン /SDS - PAGE で分析した（Fig. 1 B）。

等電点に近い条件下では凝集性が高まりゲル化しやすいことが考えられる。

毛髪タンパク質溶液は高分子量成分（> 90 kDa）
、ケラチン（40 − 65 kDa）
、 ケ ラ チ ン 結 合 タ ン パ ク 質（KAPs; 6 −3.3

タンパク質のケラチンゲルへの保持と放出

20 kDa）から構成されていた。１mM EDC の添加によりケラチンゲルへのタンパク質の保持と放出性を調べるた

ケラチンバンドが減少し、スタッキングゲルの上部が強くめ、phosphorylase b（97 kDa），bovine serum albumin

染色されることから、超高分子量成分が形成されたことが（66 kDa），ovalbumin（45 kDa），carbonic anhydrase示された。EDC 濃度が 10 mM 以上となると、ケラチン、（30 kDa），trypsin inhibitor（20 kDa），
（14 kDa）
α-lactalbumin

高分子量成分、超高分子量成分のバンドは見かけ上ほぼ完からなるタンパク質カクテル（LMW - ST）を用いた。

全に消失していた。このことは、架橋がさらに進み、スタケラチンゲルの形成は外部タンパク質の添加により抑制ッキングゲルにすら入らないぐらいまでの高分子となってされるため、ここでは毛髪タンパク質の 1 / 10 濃度のタンいることが示唆された。一方、低分子量タンパク質のパク質カクテルと 100 mM EDC を加え、37℃、60 分間放KAPs は 100 mM EDC の添加条件下でも残存していること置してゲルを作製した。形成したゲルは簡単に洗浄した後、から、ほとんど架橋されないことが示された。この結果、

37℃、0 . 5 ×PBS 溶液にインキュベーションして 24 時間まEDC 誘導の毛髪タンパク質ゲルはケラチンを主成分としでの放出試験を行った（Fig. 2 A）
。２時間ぐらいまでは放ているため、ケラチンゲルと呼ぶことにした。

出タンパク質は見られないが、３時間後から経時的な放出が検出できた。24 時間後においては、加えたタンパク質

3.2

EDC 依存性ゲル形成の諸性質の約 30 % が外液中に回収された。一方、カクテルを加えEDC/ ケラチンゲルの形成はタンパク質濃度に依存しててないケラチンゲルからの放出はほとんど見られなかった。

いた。これは毛髪タンパク質溶液のロットあるいは保存期

次に、外液に放出されたタンパク質の成分を電気泳動で間により変動した。ここでは、５mM EDC 添加時におけ調べたところ、bovine serum albumin, ovalbumin, carbonic

るケラチンゲル形成について、処理時間、温度、pH の影
響を倒立法で調べた（Table 1）。処理温度が 37℃において、60 分以上のインキュベーションでゲル形成が見られた。
このため、60 分間の処理時間で温度変化を調べたところ、35℃以下ではゲル形成は見られないが、40 − 50℃ではゲル形成が観察された。50℃においては、30 分以内でもゲルが生じていた。反応溶液の pH の影響を調べたところ、

Table 1

各種条件がケラチンゲル形成に与える影響

Fig. 2− 34 −

ケラチンゲルからのタンパク質の放出環境応答型スマート材料としてのケラチンゲルの創出

anhydrase は有意に、trypsin inhibitor は僅かに検出がでTable 2

封入タンパク質の性質と放出性き た。 一 方、phosphorylase b と α-lactalbumin は 24 時 間後の外液中にも検出できなかったことから、有意に放出がなされないことが明らかとなった（Fig. 2 B）。
タンパク質カクテルを構成している６種類のタンパク質の分子量、等電点、システイン含量を Table 2 に示す。このカクテル自体とカクテルに毛髪タンパク質溶液を加えた条件で EDC 処理したところ、trypsin inhibitor は見かけ上減少するが、他のタンパク質のバンドには影響を与えないため化学的に結合は生じていないことが示された。これらの結果は、ケラチンゲルからのタンパク質の放出は分子量13）だけに依存しているのではないことが明らかとなった。ま軸に整列してコルテックス部位を作り上げている 。しかた、平均的な電荷状態をあらわす等電点においては、放出しながら、ケラチンと KAPs 間の EDC- 複合体は形成されされない a-lactalbumin がケラチンの等電点に近いことかなかった（Fig. 1 ）。

ら関連することが推測できるが、例数を増やす必要がある。

私たちは、ヒト毛髪から効率の高いタンパク質の抽出方法（信大法）と、この溶液に含まれているケラチンの自己3.4

還元− 酸化処理が放出反応へ与える影響集合を誘発させてフィルム形成をする技術を独自に開発し毛髪ケラチン分子の特徴として、システインを多く含んてきている

8 , 14）。このフィルムは淡ベージュ色を帯びた不でおり、これから作られる− SS −結合は髪の毛がもつし透明なフィルムであるが、チオグリコール酸などの還元剤なやかさと硬さを作り出す基本と考えられている。還元剤の処理により、半透明なフィルムに変化する。半透明フィ存在下で抽出された毛髪タンパク質はシステインの状態でルムは臭素酸などによる酸化剤で処理すると、元の不透明あると考えられる。そこで、ケラチンゲルをパーマ施術でなフィルムに戻る。還元−酸化状態に伴い、フィルムの微多用されている還元剤のチオグリコール酸と酸化剤の過酸細構造もダイナミックに変化が生じていることを見出して化水素を用いて処理した後、放出試験を行った。これらのいる。不透明−半透明−不透明の変化は数回繰り返すこと

処理は、肉視レベルにおいて影響を与えなかった。100 mMが可能である。つまり、還元、酸化といった環境状態におチオグリコール酸で処理をしたケラチンゲルは未処理ゲル

いてケラチンフィルムおよびその素材であるケラチンは環と比べて、放出量の増加が見られるのに対して、過酸化水境応答性をもつタンパク質であることが示された

15 , 16）。

素で処理したケラチンゲルは放出量の顕著な減少が見られ毛髪ケラチンは約９% ものシステインを含み、ジスルフた。還元と酸化処理がゲルに与える違いは、保水量においィド結合により高強度を示し、階層的な構造体と合わせて、ても見ることができた。

毛髪のしなやかな物性を生み出している。一方、KAPs の４．考

システイン含量は 20 % 以上もあり、両者間のジスルフィ察ド結合を利用すれば、新しいタイプのゲルの作製が可能で毛髪の主成分のケラチンは細胞骨格タンパク質の中間径あると思われる。EDC −ケラチンゲルを還元剤および酸フィラメントに分類されており、デスミン、ビメンチンな化剤で処理すると、ゲル内に封入したタンパク質の放出量

どと同じく、ケラチン単量体は自己集合し、直径 10 nm のが変化するため、ケラチンネットワークの網目密度が変化

枝分かれがないフィラメントとなる。私たちは、平滑筋のすることが示された（Fig. 3 ）。このことは、ケラチンゲル

デスミンがカルポニンと EDC により架橋されることを以が EDC により架橋されてゲル形成した場合においても、前に報告している 。ケラチンを含む中間径フィラメント

酸化および還元状態で性能が変化する環境応答型のスマーの分子間相互作用の解明に化学架橋剤は有効なツールであト材料であることが示された。さらに、①化学架橋剤を使ることを示している。EDC はコラーゲンを高分子化する用しない条件下でのゲルの形成 . ②ケラチン単独ではなく、のにも使用されており、この方法で作製したコラーゲンゲ

KAPs を含んだケラチンゲルの形成 . ③網目構造を変化さ

ルの生体適合性は高いことが知られている

せ、強度などの物性や分子ふるい効果が調整できるゲルの11）12）。本研究において、毛髪ケラチンは EDC により架橋されてゲル化する形成 . の可能性が示された。

ことが明らかとなった。毛髪組織の構築は、ケラチンフィ

美容師や理容師は他人の髪と長時間接触するにも関わらラメントからなるミクロフィブリルがマトリックスと呼ばず、これが原因とする職業病の発生は知られていない。頭れる KAPs を介して長軸に整列し、マクロフィブリルを形

髪は１日 150 − 300 mg 合成され、その質量の 70 − 80 % は成する。このマクロフィブリルは、細胞膜複合体により長タンパク質である。毛髪同様に再生される血液やリンパ液− 35 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

Fig. 3

酸化 / 還元がタンパク質放出に与える影響

は、生体に不可欠で多様な生体成分と多様な細胞を含んでof scaffolds from human hair proteins for tissue-

いる長所をもつ。しかしながら、血液やリンパ液を原料とengineering applications, Biomed Mater 3 , 1 - 12 , 2008 .

した場合と比べ、毛髪は安全面、保存面、採取負担などに

８）Nakamura, A, Arimoto, M, Takeuchi, K, Fujii, T, :A

おいて優れている。特に、本人由来の毛髪組織を使用してrapid extraction procedure of human hair proteins and化粧品・医用材料などに適用できるようになれば、私たち

identification of phosphorylated species, Biol. Pharm.
Bull., 25 , 569 - 572 , 2002 .

にとっては安全・安心な生体資源となる。

９）Bradford, MM, :A rapid and sensitive method for謝辞

the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.

本研究にご助成頂きました公益財団法人コスメトロジー

Biochem., 72 : 248 - 254 , 1976 .

研究振興財団に深謝申し上げます。また、本研究の遂行にあたり、共同研究者の伊藤弓子さんに厚く御礼申し上げま10）Schagger, H, von Jagow, G, :Tricine-sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for theす。

separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.
（参考文献）

Anal. Biochem., 166 : 368 - 379 , 1987 .

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intermediate filaments by calponin and its bindingsite on the desmin molecule. J. Biochem., 127 , 457 - 465 ,２）藤井敏弘 , 小林俊一 , ：セルフ - リサイクルに向けたヒ2000 .

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