ロドデンドロールによる細胞死へのフェロトーシスの関与の可能性
山形大学大学院医学系研究科

小林翔

Rhododendrol is metabolized to rhododendrol quinone by tyrosinase in melanocytes. Reactive oxygen species, such ashydroxyl radical and singlet oxygen, are produced and cause oxidative damage in melanocytes. Recent study has revealed
that ferroptosis, a non-apoptotic, iron-dependent cell death, appears to be involved in pathogenesis of a variety of diseases. It
is likely that rhododendrol-induced leukomelanodermia is also caused by ferroptosis by means of lipid peroxidation products
produced during rhododendrol oxidation in melanocytes. Singlet oxygen also induces feroptosis, and, on the contrary, radicalscavenger edaravone effectively suppresses feroptosis caused by cysteine deprivation. Singlet oxygen is commonly produced
via photon-mediated energy transfer reaction and also tyrosinase-catalyzed rododendrol metabolism, so that it is likely thatferroptosis is induced by resulted singlet oxygen in melanocytes upon UVB irradiation.
Here we first established a rat monoclonal antibody (FerAb) against Hepa 1-6 cells that had been cultivated in cystine-deprived media. Binding of the resulting antibody increased during advancing ferroptosis which was caused, not only
by cystine deprivation but also treatment with xCT inhibitor erastin or GPX4 inhibitor RSL3, although apoptotic cell death
induced by a staurosporine treatment had no effect on the binding. Thus, FerAb appears to be the useful tool to detect ferroptosis. When we examined effects of rhododendrol on human melanocyte MNT1 cells, it damaged the cells only at highdose. However, precise analyses of the cells by means of FACS indicated that only less-differentiated cells containing low
levels of melanin appeared to die by the rhododendrol treatment. This is similar to the in vivo situation, and hence this cellculture system using the MNT1 cells may be ideal model system for rhododendrol-induced melanocyte death.

1．緒

制遺伝子のp 53 が活性化して酸化型システイン（シスチン）

言の取込みに働く xCT の遺伝子発現を抑制して細胞死をも白樺などの植物由来のフェノール化合物であるロドデンたらす。またロドデンドロールによる白斑は日光を浴びてドロールはメラノサイトに作用し、メラニン合成におけるいる皮膚に顕著なことから、紫外線による増強効果が指摘

律速酵素・チロシナーゼにより代謝されてロドキノンとなされている 6 , 7）が、紫外線の照射によりロドデンドロールる。ロドキノンはチロシナーゼ酵素を阻害することで美白代謝物から実際に一重項酸素が生成することが確認されて効果を発揮するが、過剰に作用するとグルタチオン含有量いる 8）。これまで我々は、フェロトーシス抑制に果たすを低下させ、細胞死を誘導して白斑の原因となる。この時

xCT の役割について、培養細胞ならびに遺伝子欠損マウの細胞死はアポトーシスによると報告されているが、本病スを用いて研究してきた 9 - 11）。またドナー化合物を用いて、態では炎症細胞の関与が示されている 1）ことから、アポト一重項酸素が肝癌由来の Hepa 1 - 6 細胞にフェロトーシスーシス以外の細胞死の関与も考えられる。

を誘導することを確認しており 12）、本化合物を用いるこ

ロドデンドロールによる細胞障害過程では活性酸素が生2）成し、グルタチオンが低下する ため、抗酸化能の減弱がとで、ロドデンドロールによる白斑形成に一重項酸素が関与することを検証することができると考える。

細胞死に関わる可能性がある。一方、その過程でオートフ

これまでのところロドデンドロールによるメラノサイト

ァジーが活性化される 3）など、2012 年にはじめて報告さの障害作用とフェロトーシスとの関連についての報告はなれた鉄依存性細胞死・フェロトーシスに酷似している。フいが、ロドデンドロールがオートファジーを活性化し、活4）ェロトーシス誘導には次の２つの経路が知られている 。

性酸素・ラジカルが細胞死に関わることから、図 1 に示す

1）システイン供給不足もしくはグルタチオン低下により、ようにフェロトーシスが関与する可能性が高いと考えていグルタチオンペルオキシダーゼ 4（GPX 4）が正常に機能せる。本研究では、in vivo におけるフェロトーシス細胞の5）ず、増加した脂質過酸化物が細胞死をもたらす 。2）癌抑検出を可能にするモノクローナル抗体を作製し、さらにヒト由来の MNT 1 メラノサイトを用いて、ロドデンドロー
ルによる細胞死へのフェロトーシスの関与と、その抑制剤

Potential involvement of ferroptosis incell death by rhododendrol

による細胞保護作用を調べた。

２．方Sho Kobayashi
D epa r t ment of Bio chem ist r y a nd
Molecular Biology, Graduate School ofMedical Science, Yamagata University法

2. 1. フェロトーシス認識抗体の作製
マウス肝癌由来の Hepa 1 - 6 細胞をシスチン（酸化型シ− 115 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図１ ロドデンドロール（RD）によるメラノサイト細胞死がフェロトーシスによる可能性を示す模式図。一重項酸素, 1 O 2 ; ヒドロキシルラジカル, HO·

ステイン二量体）欠乏培地で培養してフェロトーシスを誘導し、それを抗原としてラットに免疫した。単離したリンパ球とマウスミエローマ細胞・SP 2 を細胞融合し、得られたハイブリドーマの培養上清の中からフェロトーシス細胞を特異的に認識する抗体を免疫細胞染色により選抜し、ラットモノクローナル抗体・FerAb を得た。

2. 2. ロドデンドロールの細胞生存への影響
ヒト由来の MNT 1 メラノサイトを培養し、ロドデンド

図２ 抗フェロトーシス抗体の特異性の検討。免疫細胞染色による抗フェロトーシス抗体（FerAb）と抗HNE抗体（HNE Ab）との比較。
（A）Fer-1はフェロトーシス抑制剤ferrostatin-1を示す。
HNEおよびアクロレイン（ACR）修飾ウシ血清アルブミン（BSA）を用いたドットブロット解析の検討結果（B）。

ロール添加後の生細胞数を CellTiter-Blue® Cell Viability
Assay kit（Promega）による測定やトリパンブルー色素排除試験法による細胞数計測を行い、ロドデンドロールが細ポリン処理によりアポトーシスを誘導した細胞には全く反胞生存に与える影響を調べた。

応しなかった。代表的な脂質過酸化物である 4 - ヒドロキ
シ - 2 - ノネナール（HNE）を認識する抗体（HNE Ab）もフ

2. 3. 細胞内活性酸素と脂質過酸化物の定量

ェロトーシス細胞に結合したが、生細胞とも強く結合する活性酸素種（H 2 DCF-DA と DHR 123）と脂質過酸化物（C 11 -BODIPY581 / 591）を認識する蛍光プローブを使用し、FerAb は HNE 修飾 BSA との反応性を示した（図 2 B）が、ウエスタンブロット解析では正常細胞とフェロトーシス細フローサイトメーターを用いて解析した。

３．結ため、特異性については FerAb の方が優れていた（図 2 A）。

胞の間で反応性に違いを認めず、タンパク質自体ではなく果HNE 類似の構造を認識していると考えられた。細胞内に3. 1. フェロトーシス認識抗体の作製

おける FerAb 結合部位を共焦点レーザ顕微鏡により調べ

フェロトーシス研究のほとんどは培養細胞を用いて行わたところ、生細胞では細胞膜の仮足様構造に結合し、フェれてきたが適切なマーカーがないため、その判定が難しい

ロトーシス細胞では細胞内全体に不均一に結合し、またミことが問題点として挙げられる。そこで生体内でフェロトトコンドリアなどの細胞小器官にも部分的な結合を認めた。

ーシスを検出することを目的として、フェロトーシス細胞を認識するラットモノクローナル抗体を作製した 13）。768

3. 2. ロドデンドロールのMNT1メラノサイトに対する作用

クローンから最終的に 1 つのクローンを選別し、FerAbと命名した。本抗体は、シスチン欠乏培地での細胞培養、ヒト由来の MNT 1 メラノサイトをロドデンドロール処ならびにシスチン細胞内取込みの阻害剤・erastin や脂質理し、生細胞数を測定することで、ロドデンドロールが細過酸化を抑制する GPX 4 の阻害剤・RSL 3 で処理してフェ胞生存に与える影響を調べた。その結果、ロドデンドローロトーシスを誘導した細胞と強く反応したが、スタウロス

ルの濃度依存性に細胞死を認めたが、予想に反して高濃度− 116 −

ロドデンドロールによる細胞死へのフェロトーシスの関与の可能性を必要とした（図 3 A）
。そこで、約半数が細胞死を起こす

り活性酸素種に対して耐性であるため、ロドデンドロール7 mM の濃度を用いて、シスチンを含む通常培地と、含ま処理に対しても耐性となっており、分化度の低い細胞が選ないシスチン欠乏培地で細胞死について検討した。まず、択的に死滅したと考えられる。この小さな細胞に限定する

通常培地で培養した細胞に、広くフェロトーシスを誘導すと、ロドデンドロールによる致死効果が大きいことが分かる erastin を投与したところ部分的に細胞死が認められ、る。ロドデンドロールを塗布した皮膚では、メラニンを有その程度はロドデンドロールの存在によって増強されたするメラノサイトはすぐに減少することはなく、時間を経（図 3 B）。次にシスチン欠乏培地で培養したところ、同様た後に白斑が生じることから、未分化な細胞が選択的に死に部分的な細胞死を認めた。ロドデンドロールが存在する滅していると考えられ、本知見とも一致する。したがって、と 7 割程度まで細胞死が増強された。フェロトーシス抑制

ロドデンドロールによる MNT 1 メラノサイトの傷害は、剤の効果について調べたところ、脂質過酸化を抑える生体内のメラノサイトの傷害機構を調べるモデル細胞系とferrostatin- 1、鉄のキレート剤である DFO、およびラジして有用と考えられる。今後、この未分化な細胞に焦点をカル消去剤の Edaravone はいずれも細胞死を抑制する傾当てて解析することで、フェロトーシスの関与を明確にし、向を示したが、その効果はわずかであった。

その予防や治療に応用できる可能性がある。

次に細胞内に活性酸素種が生じ、脂質過酸化が起こってxCT の阻害やシステインの欠乏によって誘導されるフいるかどうかについて調べた。活性酸素の検出プローブとェロトーシスには、ミトコンドリアの関与が報告されていして H 2 DCF-DA を用いて、FACS 解析を行ったところ、る。我々は電子伝達複合体 III から生成するスーパーオキ

ロドデンドロール処理しない細胞では、蛍光強度の低い小シドを特異的に抑制する阻害剤を用いて、この複合体由来さなピークと、強い大きなピークに分かれ、ロドデンドロのスーパーオキシドが関与することを明らかにしている 15）。

ール処理により蛍光強度の小さなピークが選択的に消失しロドデンドロールによるメラノサイトの細胞死についても、た（図 4）。同様の傾向が DHR 123 を用いた場合にも認めら同様に電子伝達複合体 III が関与するかどうか検討を予定

581 / 591している。紫外線による白斑形成については一重項酸素のれた。しかし、過酸化脂質を検出する C 11 -BODIPY

関与が考えられている 8）ため、ドナー化合物を用いて紫外によってはこのような違いを認めなかった。

４．考線曝露時の一重項酸素の関与についても検討を行う予定で察ある。

ロドデンドロールによる白斑は日本国内で問題となった

５．総ことから、関連する研究のほとんどは国内で行われている。

括

フェロトーシスについては、その引き金となるのは鉄イオ

本研究により、フェロトーシス細胞を特異的に検出するン依存性に生じる活性酸素・ラジカルと考えられており、ラットモノクローナル抗体・FerAb の作製に成功した。

シスチン欠乏によるフェロトーシスは、ラジカル消去剤でMNT 1 メラノサイトはロドデンドロールによる白斑形成14）あるエダラボン（商標名：ラジカット）により抑制される。のモデル系として有用であり、本細胞を用いることで、ロ今回作製した FerAb は、ヒト子宮頸癌由来の Hela 細胞や、ドデンドロールによる皮膚の白斑へのフェロトーシスの関

種々の刺激でフェロトーシスを誘導した Hepa 1 - 6 にも結与とその機構を解明することができると考える。

合したことから、動物種や刺激を問わずフェロトーシスを起こした細胞を共通に認識すると考えられる。FerAb は（引用文献）

フェロトーシス細胞を特異的に検出できるため、フェロト

1） Tanemura A, Yang L, Yang F, Nagata Y, Wataya-ーシスの機構や各種の病態への関与を解明する研究に有用

Kaneda M, Fukai K, Tsuruta D, Ohe R, Yamakawa M,と考えられる。

Suzuki T, Katayama I. An immune pathological andMNT 1 メラノサイトに対するロドデンドロールの作用

ultrastructural skin analysis for rhododenol-inducedについては、細胞死の誘導に高濃度を必要とすることから、

leukoderma patients. J. Dermatol. Sci., 77, 185 -188（2015）

一見したところでは細胞毒性は低いように思われる。しか2） Ito S, Wakamatsu K. Biochemical Mechanism of

しながら、蛍光強度の低い細胞と高い細胞は、これまでのRhododendrol-Induced Leukoderma. Int. J. Mol. Sci.,

知見から、次のような違いに基づくと考えられる。すなわ（2018）
19, 552（16 page）

ち、MNT 1 メラノサイトには分裂を終えて大きくなりメ

3） Yang L, Yang F, Wataya-Kaneda M, Tanemura A,ラニンを合成している分化の進んだ細胞と、分裂したばかTsuruta D, Katayama I. 4（ 4-hydroroxyphenyl）

りで小さく蛍光強度の低いメラニンの少ない細胞が存在す-2-butanol（rhododendrol）activates the autophagy-

る。分化度の低い細胞は内在性の蛍光物質、すなわちメラ

lysosome pathway in melanocytes: insights into theニンが少ないと考えられる。メラニンには抗酸化活性があ

mechanisms of rhododendrol-induced leukoderma. J.

− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図３ ロドデンドロール（RD）によるメラノサイト（MNT 1）細胞死の誘導。ロドデンドロール濃度依存性（A）と7 mM RDとフェロトーシスの誘導剤ならびに抑制剤の併用効果（B）。平均±標準偏差（n= 3）を示す。

図４ ロドデンドロール（RD）の作用のFACS解析。DCFおよびC 11-BODIPY 581/ 591を用いたヒストグラム（A）と7mM RD処理前後の細胞の分布の比較（B）。A図の赤矢印で示すピークと、B図の矢印内の細胞集団は一致する。

− 118 −

ロドデンドロールによる細胞死へのフェロトーシスの関与の可能性

glutamate transporter: implications for immune

Dermatol. Sci., 77, 182-185（2015）
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