【研究報告】（自然科学部門）

抗肥満作用を示すコーヒー薬効成分の同定とその作用機序の解明

多胡慶應義塾大学薬学部衛生化学講座
緒言めぐみ准教授

アラビカ種）を用いて、通常の飲用時の濃度であるコー肥満が、生活習慣病のリスクファクターとなること

ヒー豆粉 8 g を熱湯 140 mL でフィルタードリップしたが明らかとなり、肥満の予防や改善が現代医療におけるコーヒー豆抽出液を 100％（v/v）として実験に用いた。

重要な課題として注目されている。肥満は、脂肪細胞のフィルター滅菌を行った後、分注し、使用前まで−20℃分化の亢進に起因するため、肥満の予防・改善には、脂に保存した。

肪細胞の分化過程を抑制することが重要である。
2.

コーヒーは世界中で愛飲されている飲料であり、多脂肪細胞の分化に及ぼすコーヒー豆抽出液の影響の検討

くの疫学調査により、習慣的なコーヒーの飲用者では、3T3-L1 細胞に、コーヒー豆抽出液（5％（v/v））およ肥満の割合が低く、生活習慣病の発症リスクが減少する
1）

ことが示されている 。したがって、コーヒーには抗肥び MDI（IBMX, dexamethasone, insulin）を添加し 6 日満作用があることが示唆されているが、その薬効にはま間培養後、Oil red O 染色を行い、脂肪滴を染色した。

だ多くの不明な点が残されている。

エタノールで色素を抽出後、吸光度（OD490）を測定し、これまでに私達は、コーヒー豆抽出液には、肥満の脂肪滴の蓄積量を定量化した。

要因である脂肪細胞の分化を抑制する活性があることを見出している2）。コーヒー豆抽出液を添加したマウス脂3.

転 写 因 子 C/EBPs、PPARγ の 発 現 誘 導 に 及 ぼ す
コーヒー豆抽出液の影響の検討

肪前駆細胞 3T3-L1 では、分化誘導剤（dexamethasone,IBMX, insulin）による脂肪滴の蓄積が顕著に阻害され3T3-L1 細胞に、コーヒー豆抽出液（5％（v/v））およびることを観察している。しかしながら、現在まで、コーMDIを添加し2日間培養後、RNAを抽出した。RT-qPCR

ヒーが抗肥満作用を示す分子機構は不明であり、脂肪細により、C/EBPδ、C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα mRNA胞の分化抑制活性を有するコーヒー含有成分は同定されの発現量を測定した。また、コーヒー豆抽出液およびていない。

MDI を添加した 3T3-L1 細胞から溶解液を調製し、イム

3T3-L1 細胞の脂肪細胞への分化過程には、Insulin シ

ノブロット法により、C/EBPδ、C/EBPβ、PPARγ、C/グナル経路を介した転写因子カスケード（C/EBPδ, C/EBPα の発現を検討した。

3）

EBPβ, PPARγ, C/EBPα）の発現誘導が重要である 。
4.

よ っ て、 本 研 究 で は、 転 写 因 子 の 発 現 誘 導 お よ びインスリンシグナル経路に対する影響の検討

Insulin のシグナル伝達経路に及ぼすコーヒー豆抽出液

3T3-L1 細胞に、コーヒー豆抽出液（5％（v/v））およの影響を検討することにより、コーヒー豆抽出液によるび MDI を添加し、細胞溶解液を調製した。イムノブロッ

脂肪細胞分化抑制の作用機序を明らかにすることをめざ

ト 法 に よ り、IRβ、IRS1、IRS2 の 発 現 量 お よ び MEK、した。また、有機溶媒により分離したコーヒー豆抽出液

ERK1/2、Akt の 活 性 化 を 検 討 し た。MEK、ERK1/2、画分を用いて、脂肪細胞分化を抑制するコーヒー含有成

Akt の発現量に対するリン酸化量を Image J により定量分の探索を行った。

化し、グラフ化した。また、IRβ、IRS1、IRS2 mRNAの発現量を RT-qPCR により検討した。

実験方法
1.

コーヒー豆抽出液の調製
コーヒー生豆および焙煎コーヒー豆（コロンビア産、1多図1

胡めぐみ

コーヒー豆抽出液による脂肪細胞分化抑制（a）コーヒー豆抽出液の添加期間。（b）脂肪滴の蓄積量。

図2

コーヒー豆抽出液による PPARγ および C/EBPα の発現抑制（a）C/EBPs、PPARγ mRNA の発現（b）C/EBPs、PPARγ タンパク質の発現。

結1.

果oil red O 染色により、脂肪滴の蓄積量を測定した。そコーヒー豆抽出液による脂肪細胞分化の抑制の結果、分化誘導後の 2 日間に、コーヒー豆抽出液を添

コーヒー豆抽液による脂肪細胞分化の抑制機構を解加した条件である c、d、h において、脂肪細胞の分化が析するために、図 1（a）で示すように、3T3-L1 細胞に顕著に抑制された（図 1）。したがって、MDI による分コーヒー豆抽出液（5％（v/v））を添加する時期を変え化過程の初期において、コーヒー豆抽出液は脂肪細胞のて、分化誘導剤 MDI 存在下、6 日間培養した。その後、分化を抑制することが明らかになった。
2

抗肥満作用を示すコーヒー薬効成分の同定とその作用機序の解明

図32.

コーヒー豆抽出液による C/EBPβ リン酸化の抑制コーヒー豆抽出液による C/EBPαおよび PPARγの発現抑制
次 に、 脂 肪 細 胞 の 分 化 に 重 要 な 転 写 因 子 C/EBPδ、C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα の発現誘導に及ぼすコーヒー豆抽出液（5％（v/v））の影響を検討した。コーヒー豆抽出液は、MDI による C/EBPδ mRNA や C/EBPβ mRNA

図4の発現誘導には影響を及ぼさなかったが、PPARγ mRNA、C/EBPα mRNA の発現誘導を有意に抑制した（図 （2 a））。

コーヒー豆抽出液による MEK、ERK1/2、Akt 活性化の抑制（a）IRβ の リ ン 酸 化。（b）MEK、Akt、ERK1、ERK2 のリン酸化。

また、イムノブロット法により、これらの転写因子のタンパク質発現を検討した結果、コーヒー豆抽出液は、MDI による C/EBPδ や C/EBPβ の発現誘導には影響をに及ぼす影響を検討した。Insulin はチロシンキナーゼ共及ぼさなかったが、PPARγ や C/EBPα 発現誘導を抑制

役型受容体である insulin 受容体（IRβ）と結合し、細胞した（図 2（b））。

内シグナル伝達経路を活性化する。まず、IRβ のリン酸化に及ぼすコーヒー豆抽出液の影響を検討した。MDI3.

コーヒー豆抽出液による C/EBPβの活性抑制により IRβ のリン酸化が誘導されたが、コーヒー豆抽出

PPARγ や C/EBPα は、C/EBPβ の代表的な標的遺伝液は IRβ のリン酸化に影響を及ぼさなかった（図 （4 a））。

子である 3, 4）。コーヒー豆抽出液が、MDI による PPARγ

一方、コーヒー豆抽出液は、MDI による MEK-ERK1/2

mRNA、C/EBPα mRNA の発現誘導を抑制したことか

および Akt のリン酸化を抑制した（図 4（b））。したがっら、コーヒー豆抽出液が C/EBPβ の活性化を抑制する可て、コーヒー豆抽出液は、IRβ の下流で、Insulin のシグ能性が示唆された。C/EBPβ の活性は、Insulin 刺激によナル伝達経路を抑制することが示唆された。

るタンパク質キナーゼ ERK によるリン酸化による制御されることが知られている4）。そこで、抗リン酸化 C/5.

コーヒー豆抽出液によるIRS1タンパク質の発現抑制

EBPβ 抗体を用いたイムノブロット法により、C/EBPβ

コーヒー豆抽出液が insulin シグナル伝達経路を抑制すのリン酸化に及ぼすコーヒー豆抽出液の影響を検討した。

る機構を明らかにするために、IRβ の基質である IRS1 おコーヒー豆抽出液を添加した 3T3-L1 細胞では、MDI によび IRS2 の発現に及ぼすコーヒー豆抽出液の影響を検よる C/EBPβ の発現誘導は観察されたが、C/EBPβ のリ討した。コーヒー豆抽出液は、IRβ の発現量には影響をン酸化が抑制されていた（図 3）。よって、コーヒー豆及ぼさなかったが、IRS1 の発現量を低下することを見出抽出液は、C/EBPβ の活性化を抑制することが明らかにした。一方、コーヒー豆抽出液は、IRS2 の発現量を増なった。

加した（図 5（a））。続いて、IRβ mRNA、IRS1 mRNA、IRS2 mRNA の発現に及ぼすコーヒー豆抽出液の影響を4.

コーヒー豆抽出液による insulin シグナル伝達経路検討した。コーヒー豆抽出液はIRβ mRNAやIRS1 mRNAの抑制の発現には影響を及ぼさなかったが、IRS2 mRNA の発

次に、コーヒー豆抽出液が insulin のシグナル伝達経路現を有意に増加させた（図 （5 b））。以上の結果より、コー3

多図5

胡めぐみ

コーヒー豆抽出液による IRS1 タンパク質の発現抑制（a）IRβ、IRS1、IRS2 の発現。（b）IRβ、IRS1、IRS2 mRNA の発現。

考ヒー豆抽出液は、IRS1 の発現をタンパク質レベルで抑制察することが明らかになった。さらに、タンパク質合成阻

コーヒーの飲用効果は、世界中で精力的に研究されて害剤シクロヘキシミド（CHX）を用いて、IRS1 の分解いるが、疫学調査が中心であり、コーヒー成分の薬効にに及ぼすコーヒー豆抽出液の影響を検討した結果、コー着目した研究は十分に行われていない。本研究で、私達

ヒー豆抽出液は IRS1 の分解を促進することを観察しては、初めてコーヒー豆抽出液が IRS1 の分解を誘導するこいる。とにより、脂肪細胞の分化を抑制する分子機構を明らかにした（図 6）。分化誘導剤 MDI のうち、dexamethasone

6.

IRS1 の発現低下および脂肪細胞分化の抑制を示す

は C/EBPδ mRNA の 発 現 を 誘 導 し、IBMX は C/EBPβ

コーヒー豆含有成分の同定

mRNA の発現を誘導することが知られている 3, 4）。図 2 にコーヒー豆抽出液が IRS1 の分解を誘導することによ示すように、コーヒー豆抽出液は、MDI による C/EBPδ

り、脂肪細胞の分化を抑制することが明らかになった。

mRNA や C/EBPβ mRNA の発現誘導を抑制しなかった

これまでに、コーヒー生豆抽出液は、IRS1 の発現や MDIことから、dexamethasone や IBMX の作用には影響を及による脂肪細胞の分化に影響を及ぼさないことを観察しぼさないことが示唆された。これまでに得られた結果にており、IRS1 の分解誘導や脂肪細胞の分化抑制を示す

より、コーヒー豆抽出液を添加した 3T3-L1 細胞では、コーヒー含有成分は焙煎によって生じる成分であると考アダプター分子である IRS1 タンパク質の分解が促進さえられた。そこで、有機溶媒（ヘキサン、酢酸エチル、れることにより、insulin のシグナル伝達経路が特異的にブタノール）を用いて、焙煎コーヒー豆抽出液を分離後、阻害され、脂肪細胞の分化を抑制すると考えられた。

各画分の脂肪細胞分化や IRS1 の発現に対する抑制効果

コーヒー豆抽出液による IRS1 の分解は、proteasome 阻を検討した。その結果、酢酸エチル画分が、IRS1 の分

害剤 MG1323 により解除されたことから、コーヒー豆抽解を促し、脂肪細胞分化を抑制することを見出した。

出液は、プロテアソームを介した IRS1 の分解を抑制し4抗肥満作用を示すコーヒー薬効成分の同定とその作用機序の解明

図6

コーヒー豆抽出液による IRS1 タンパク質の発現低下を介した脂肪細胞分化抑制機構な治療薬やサプリメントの開発の一助となることが期待ている可能性が示唆された。

され、今後の創薬研究において貢献できると期待される。

IRS1、IRS2 のユビキチン依存的分解経路が報告されており、IRS1、IRS2 に共通した E3 ユビキチンリガーゼとして、SOCS1/3 が同定されている6）。また、Cullin-RING

要

約
疫学調査により抗肥満作用があると報告されている

E3 が IRS1 に特異的なユビキチンリガーゼであることが7）

報告されている 。コーヒー豆抽出液を添加した 3T3-L1

コーヒーの飲用効果を分子レベルで理解することをめざ細胞では IRS1 の分解のみが亢進されたことから、コーし、コーヒー豆抽出液による脂肪細胞分化の抑制機構を

ヒー豆抽出液は、SOCS1/3 ではなく、Cullin-RING E3 の解析した。本研究により、コーヒー豆抽出液は、insulin活性を制御する可能性が高く、今後、検討する必要があのシグナル分子 IRS1 の分解を促進することにより、脂る。

肪細胞の分化を抑制することを明らかにした。コーヒー

今回の研究で、コーヒー豆抽出液の IRS1 の分解誘導や豆抽出液は、IRS1 の分解を誘導し、insulin 刺激依存性脂肪細胞分化抑制を示す活性は、焙煎により生成されての ERK 活性化および ERK による C/EBPβ の活性化を抑いることが明らかになった。また、既知のコーヒー豆含制することが明らかになった。また、IRS1 の分解誘導有成分であるカフェインやクロロゲン酸には、脂肪細胞や脂肪細胞の分化抑制を示すコーヒー含有成分は、焙煎分化を抑制する活性は検出されておらず、抗肥満効果をにより生じることが明らかになった。

示すコーヒー成分は、焙煎によって生成する未知の成分謝である可能性が高い。現在までに、コーヒー豆抽出液の辞酢酸エチル画分が、IRS1 の分解を促し、脂肪細胞分化を本研究を遂行するにあたり、助成を賜りました公益抑制することを見出しており、今後は抗肥満効果を示す財団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

成分の完全精製をめざす。抗肥満作用を示すコーヒー豆抽出液の活性成分を同定することは、肥満に対する有効
5

多文胡めぐみ

献1） R. M. van Dam, et al.:
, 360, 1477–1478, 2002.
2） R. Aoyagi, et al.:
, 37, 1820–1825, 2014.
3） Z. Cao, et al.:
, 5, 1538–1552, 1991.
4） R. J. Christy, et al.:, 3, 1323–1335, 1989.
5） T. Berg, et al.:
, 334,638–645, 2005.
6） L. Rui, et al.:
, 277, 42394–42398, 2002.
7） X. Xu, et al.:, 30, 403–414, 2008.

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