糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

大阪大学大学院

谷

口

医学系研究科直之The biological roles of asparagine-linked oligosaccharides（N-glycans）on glycoproteins are thought to beplayed through the interaction of terminal glycan structures and their receptors. The diversity and avidity ofthe terminal structures are, however, regulated by the core structure of N-glycans. In vertebrates, six different
N-acetylglucosaminyltransferases（GnT-I through GnT-VI）are involved in initiating the synthesis of highly branchedN-glycan core structure. Among them, we have purified and cloned four GnTs（GnT-III, IV, V, VI）for the first time.
GnT-VI catalyzes the transfer of N-acetylglucosamine（GlcNAc）to position 4 of the Manα1,6 arm of the core structureof N-glycan, forming the most highly branched pentaantennary glycans with a bisecting GlcNAc. The human GnT-VIhomolog（hGnT-VIh）gene was originally identified in the region commonly deleted in pancreatic cancer, but its functionis unknown. hGnT-VIh shows no GnT-VI activity, although its primary structure is very similar to that of chicken GnTVI（galGnT-VI）（50％ identity）. In order to elucidate the biological role of chicken GnT-VI and human GnT-VIh, thegalGnT-VI and hGnT-VIh genes were introduced into a mouse melanoma cell line B16F1. Melanin production wasenhanced in hGnT-VIh gene-introduced cells, accompanied by increased tyrosinase activity. In contrast, it was reducedin galGnT-VI transfectants, accompanied by a decrease of tyrosinase activity level. To investigate the molecular mechanismof these phenomena, tyrosinase mRNA levels in the cells were examined. The mRNA level in hGnT-VIh transfectants waselevated, while that in galGnT-VI transfectants was reduced compared to control cells. To study alterations in carbohydrate
chains induced by the expression of hGnT-VIh and galGnT-VI genes, oligosaccharides on cell-surface were examined by
flowcytometry using DSA and L-PHA lectins, which recognize poly N-acetyllactosamin and β1,6GlcNAc branch, respectively.
The reactivity against DSA and L-PHA was increased in hGnT-VIh-transfectants but decreased in galGnT-VI-transfectants.
Taken together, it is suggested that the expression of the hGnT-VIh and galGnT-VI genes regulates melanin production via
the regulation of tyrosinase expression accompanied by alterations in carbohydrate chain structures.

１．緒

cDNA クローニングを行ってきた１、５〜７）。GnT- Ⅰ〜Ⅴは言

ヒトに存在し、ヒト遺伝子が同定されているが ６、８〜 12）、

タンパク質に付加された糖鎖は、様々なタンパク質の機

GnT- Ⅵは魚類や鳥類では見つかっているが、哺乳動物で能を調節することにより、細胞の分化と増殖を制御するこはまだ見つかっていない４、７）。トリ GnT- Ⅵの cDNA クとが知られている。糖タンパク質糖鎖には、アスパラギン

ローニングにより、従来 GnT- Ⅳの相同遺伝子として知ら

結合型（N 型）糖鎖とムチン型（O 型）糖鎖があり、Nれていたヒト GnT- Ⅳホモローグ（hGnT-IVh）13）が、実型糖鎖をもつものが多い。N 型糖鎖は、タンパク質のアスは GnT- Ⅳよりも GnT- Ⅵにより相同性が高いことがわか

パラギン（Asn）残基に結合しており、N- アセチルグルり７）、以降 hGnT- Ⅵ h と改名した。hGnT- Ⅵ h は、GnT-

コサミン（GlcNAc）とマンノース（Man）より成る特徴

Ⅵおよび GnT- Ⅳとアミノ酸配列でそれぞれ 50％および的な分岐コア構造を有する（Fig. 1）。この糖鎖付加により27 ％ 一 致 し て い る が、hGnT- Ⅵ h に は GnT- Ⅵ 活 性 もタンパク質が機能分子として成熟するようになる。糖鎖は、GnT- Ⅳ活性もみられなかった７）。

単糖が非還元末端側に一つずつ付加して伸長するが、このGnT- Ⅳあるいは GnT- Ⅴで合成される高分岐糖鎖構造

反応は糖転移酵素で触媒される。N 型糖鎖のコア分岐構造
は６つの N- アセチルグルコサミン転移酵素（GnT- Ⅰ〜Ⅵ）
によって合成される（Fig. 1）。
われわれはこれまで、GnT- Ⅲ、- Ⅳ、- Ⅴ、- Ⅵについて精製を行い １〜４）、精製酵素のアミノ酸配列に基づいてRegulation of Melanin Production by
Glycosyltransferases.
Naoyuki Taniguchi
Department of Biochemistry, Osaka
University Medical School

Fig. 1. Structure of the pentaantennary N-linked core oligosaccharide containing the bisecting GlcNAc residue.
Location at which the GlcNAc transferases (GnT-I through VI) are
involved in the branch formation.

− 30 −

糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

は、癌細胞の転移 14）や受精 15）、受容体機能 16）、免疫反応 17）など に 関係している。GnT- Ⅵ は、GnT- Ⅴ の産物である β1,

２. ３ ニワトリ GnT- Ⅵ（galGnT- Ⅵ）遺伝子導入
メラノーマ細胞の作成

6GlcNAc 分岐構造を認識して４）、さらに β1, 4 結合で GlcNAc

pSV-GnT- Ⅵ７）から galGnT- Ⅵの ORF を、pcDNA3.1 にを転移してより複雑な分岐構造を形成する（Fig. 1）。糖鎖が挿入し、pcDNA-galGnT-VI を作製した。トランスフェクシ

高分岐化すると、多価性が付与されて糖鎖受容体との親和性

ョン、スクリーニング、クローン化の方法は hGnT- Ⅵ h とが非常に高まることから 18）、GnT- Ⅵの導入によりさまざま

同様である。

な生物作用が生じることが予想された。また、hGnT- Ⅵ h
に関しては、試験管内で糖転移酵素活性はみられていないが、

２. ４

ノーザンブロッティング

各細胞から total RNA を Trisol を用いて抽出した。得

未知の糖鎖修飾反応を触媒する可能性が考えられた。
メラニン細胞のメラニン産生のキー酵素であるチロシナ

られた total RNA 10µg をホルムアルデヒド変性ゲルで電気ーゼは、チロシン加水分解活性とドーパ酸化活性を同時に泳動し、陽性荷電ナイロンメンブレン（Roche）にブロッ

もつが、その活性には N 型糖鎖が必須であることが知ら

ティングした。galGnT- Ⅵ遺伝子の mRNA レベルの発現をれている 19 〜 21）。また、α-MSH 等による cAMP 産生刺激

見る場合には、GnT- Ⅵ遺伝子の後半部分の配列を元にしてによってメラノーマ細胞のメラニン産生が増加する際、さ作ったジゴキシン標識 RNA プローブを、チロシナーゼ遺22）。

伝子の mRNA レベルでの発現をみる場合には、チロシナ

このように、メラニン細胞におけるメラニン産生には Nーゼ遺伝子の配列全長を元に作成したジゴキシン標識 DNA型糖鎖が深く関わっていることがわかっているが、実際どプローブをハイブリダイズさせ、アルカリフォスファターのような糖鎖構造が関与しているのか、また、どのようなゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（Roche）にて検出した。

まざまなタンパク質の N 型糖鎖の合成が促進される

糖転移酵素が関与しているのかは不明である。われわれは、最近、GnT- Ⅲ遺伝子をマウスメラノーマ細胞 B16 細

２. ５

RT-PCR胞に発現させると、チロシナーゼの糖鎖構造が変化すると

total RNA 1µg を用いて、random primer と逆転写酵素 Su-

ともに、その活性が上昇して、メラニン産生が増大するこ

perscript Ⅱによって逆転写反応（RT）を行った。PCR は、変とを見出した23）。そこで他の糖転移酵素の影響を調べるた性を 94℃で 30 秒、アニーリングを 55℃で 30 秒、伸長反応をめに、トリ GnT- Ⅵと hGnT- Ⅵ h の cDNA をマウスメラ

72 ℃ で 1 分 間 の 条 件 で、hGnT- Ⅵ h 遺 伝 子 の 場 合 は、

ノーマ細胞 B16F1 に導入してその効果を調べた。

Gn4H5S：5'-AACGTTCTACAGTGTCATTC-3' と GnT4H5A：

２．実
２. １

5'-GGATGCAATGACTTTCTTGA-3' を用いて 28 サイクル、験

チロシナーゼ遺伝子の場合は、TYRinB F：5'-GAGTATAATAGCCATCAGGT-3'、と TYRinB R：5'-CTTGGGACATT-

材料

哺乳動物用発現ベクター pcDNA3.1/Zeo（+）は、Invitro-

GTTCCATTC-3' を用いて 29 サイクル、コントロールの β- ア

gen 社より購入した。ビオチンで標識された Datura stra-

クチン遺伝子の場合は、βactinF：5'-TTACCAACTGGGAC-

monium agglutinin（DSA）、leucoagglutinating Phaseolus

GACATG-3' と reverse primer βactinR：5'-AGGAGCCAGAG-

vulgaris agglutinin（L-PHA）は、EY laboratories 社より購

CAGTAATCT-3' を用いて 21 サイクル増幅させた。

入 し た。RNA 抽 出 試 薬 Trizol、Superscript Ⅱ、LipofectAmine は GIBCOBRL 社より購入した。抗生物質 Zeo-

２. ６

チロシナーゼ活性測定、タンパク定

cell は InvivoGen 社より購入した。BCA プロテインアッセ

チロシナーゼの活性測定は、細胞溶解液 50µL に 1 mM

イキットは Pierce 社より購入した。マウスメラノーマ細胞の β-L-dehydroxyphenylalanin（L-DOPA）を 950µL ずつ

B16F1 は、10％牛胎児血清を加えたダルベッコ改変イーグ

加えて、37℃で 30 分間反応させた後、475 nm で DOPA-

ル基礎培地を用いて、5％ CO2 下、37℃で培養を行った。

chrome の吸光度を測定した 20）。タンパク質定は牛血清アルブミンを標準として用いて、BCA プロテインアッセイ

２. ２ ヒト GnT- Ⅵホモローグ（hGnT- Ⅵ h）遺伝
子導入メラノーマ細胞の作成
pSV-hGnT- Ⅵ h13）から hGnT- Ⅵ h の open reading frame

キットによって行った。

２. ７

フローサイトメトリー（ORF）を pcDNA3.1 ベクターに挿入し、pcDNA-hGnT- Ⅵ

各細胞を 0.25％ EDTA を含むリン酸緩衝生理食塩水

h を作製した。B16F1 細胞に、LipofectAmin を用いてメー（PBS）で剥がし、20µg/mL のビオチン化レクチンと氷上カーのマニュアルに従い、pcDNA-hGnT- Ⅵ h をトランス

で 30 分間反応させた後、PBS で洗い、さらに FITC 標識

フェクトし、100µg/mL の zeocell を添加してスクリーニン

ア ビ ジ ン を 氷 上 で 30 分 間 反 応 さ せ、PBS で 洗 っ た 後、グし、限界希釈法により細胞をクローン化した。

FACScan（Beckton Dickinson 社製）にて解析した。

− 31 −

３．結チロシナーゼ活性変化のメカニズムを明らかにするため

果に、まず、mRNA レベルの発現をノーザンブロッティング

ニワトリ GnT- Ⅵ遺伝子 galGnT- Ⅵをマウスメラノーマで解析した。hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞ではチロシナーゼ

細胞 B16F1 にトランスフェクトして、zeocell 耐性株を得た。

の転写物が検出されたが、親株、Moc トランスフェクタン

これらの Zeocell 耐性株における導入 GnT- Ⅵ遺伝子の発現

ト、galGnT-VI 遺伝子導入細胞では検出されなかった（Fig.

を、ノーザンブロッティングで解析したところ、転写物が5）。次に、親株、Moc トランスフェクタント、galGnT- Ⅵ

確かに発現していた（data not shown）。

遺伝子導入細胞におけるチロシナーゼ mRNA の発現をよ同様に、ヒト GnT- Ⅵホモローグ遺伝子 hGnT- Ⅵ h につり高感度の RT-PCR で解析したところ、galGnT- Ⅵ遺伝子

いても B16F1 細胞にトランスフェクトして Zeocell 耐性株

導入細胞では、親株、Moc トランスフェクタントと比べてを得た。hGnT-VIh 遺伝子の発現は、転写物量が非常に少発現が低下していた。
チロシナーゼは糖タンパク質であり、糖鎖の付加が酵素活

くノーザンブロッティングでは検出できなかったが、RT-性の発現に必要であることが報告されている 19 〜 21） ので、

PCR で転写物を確認した（data not shown）。
galGnT- Ⅵおよび hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入メラノーマ細hGnT- Ⅵ h 遺伝子あるいは galGnT- Ⅵ遺伝子の強制発現に胞は、親株や Mock トランスフェクトと比べて、特に目立よりチロシナーゼの糖鎖が改変されて酵素活性を変化させる

った増殖速度の変化はみられなかった（data not shown）が、可能性が考えられた。そこで、まず、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導

galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞は、対照細胞より白くなり、反入細胞および galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞における GnT- Ⅵ活

対に hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞は黒くなった（Fig. 2）。光学顕微鏡で観察すると、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞は、細胞間あるいは細胞 - 基質間の接着が増強したためと思われるが突起を出して伸展した細胞形態をとるとともに、メラ
ニン色素を多量に含有している細胞が多数みられた（Fig.
3）
。一方、galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞は明らかな形態学的な差異はみられなかった。
次にメラニン産生のキー酵素であるチロシナーゼの発現を調べた。hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞のチロシナーゼ活性は、対照細胞と比べて約２倍高く、一方 galGnT- Ⅵ遺伝子
導入細胞は約４分の１に低下していた（Fig. 4）。この結果から、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入メラノーマ細胞および galGnT- Ⅵ遺伝子導入メラノーマ細胞におけるメラニン産生の変化は、チロシナーゼ活性で制御されていると思われた。
Fig. 3. Microscopic observation of parent B16F1 cells,
mock transfectants, galGnT-VI transfectants, and hGnT-VIhtransfectants.

Fig. 2. Comparison of cell-pellet color between parent
B16F1 cells, mock transfectants, galGnT-VI transfectants,
and hGnT-VIh transfectants.

Fig. 4. Tyrosinase activity levels in parent B16F1 cells,
mock transfectants, galGnT-VI transfectants, and hGnT-VIhtransfectants.

− 32 −

糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

Fig. 5. Tyrosinase mRNA levels in parent B16F1 cells,
mock transfectants, galGnT-VI transfectants, and hGnT-VIhtransfectants.
Tyrosinase mRNA expression levels were examined by
Northern blotting (panel a) and RT-PCR (panel b).

性を測定したが、親株同様いずれも活性が検出されなかった（data not shown）。何らかの阻害物質の混入による活性

Fig. 6. Reactivities of cell surface glycoproteins to DSA and
L-PHA lectins.
Mock transfectants, galGnT-VI transfectants, and hGnT-VI
transfectants were examined by flow cytometry analysis using DSA (panel a) and L-PHA (panel b) lectins.

抑制も考えられたので、次に、細胞内における糖鎖変化を

我々は N- アセチルグルコサミン転移酵素 GnT- Ⅲ（図１参レ ク チ ン を 用 い て 調 べ た。 直 接 に GnT- Ⅵ 産 物 で あ る照）遺伝子をマウスメラノーマ B16 細胞に導入するとチロ

GlcNAcβ1-4（GlcNAcβ1-6）Manα 構造を認識するレクチ

シナーゼ活性の上昇に伴いメラニン産生が増加することをンは知られていないので、GnT-V 産物である β1,6GlcNAc

見出した 23）。本研究では、galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞では

ブラ ンチ 構造 を認識するとされる DSA レクチン 24） とチロシナーゼ活性の低下に伴ってメラニン産生が抑制され、

L-PHA レクチン 25）を用いて、フローサイトメトリーで細一方、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞では逆にチロシナーゼ活

胞表面の糖鎖構造との反応性について調べた。DSA に対す性の上昇に伴いメラニン産生が亢進することを見い出した。

る反応性は、対照として用いた mock トランスフェクタン

Gn- Ⅵは N 型糖鎖の分岐形成に与り、また、hGnT- Ⅵ h もトと比べて、hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞では増加し、gal-

未知ではあるが糖転移酵素である可能性が高いので、これGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞では不変あるいは若干低下したらの遺伝子導入は、チロシナーゼを含む糖タンパク質糖鎖（Fig. 6a）
。L-PHA の反応性も DSA レクチンの反応性と一の構造を改変し、活性に影響を及ぼすことが予想された。

部異なるものの、mock トランスフェクタントと比べて、

しかし両者のトランスフェクタントにおいて、導入した遺hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入細胞では増加し、galGnT- Ⅵ遺伝子

伝子が発現していることを mRNA レベルでは確認できる導入細胞では不変あるいは若干低下した（Fig. 6b）。したがものの、GnT- Ⅵの活性は検出できなかった。何か試験管内って、hGnT- Ⅵ h 遺伝子と galGnT- Ⅵ遺伝子の導入は細における GnT- Ⅵ活性を阻害する細胞内物質が混入したの胞表面の N 型糖鎖の構造を変化させ得ることがわかった。

かもしれない。糖転移酵素は、発現量が非常に少なく試験

４．考管内で活性が検出されなくても、実際に細胞内では糖鎖の察生合成を行う場合があるので、導入遺伝子が細胞内で糖転

チロシナーゼの活性を規定する因子は複数あり、糖鎖も移酵素として働いているかもしれない。

その一因と考えられる 19、20）。実際、チロシナーゼについ一方、ポリ N- アセチルラクトサミンと β1,6GlcNAc 分岐ている N 型糖鎖は分子シャペロンとの結合に関わり、酵部を認識する植物レクチン DSA と L-PHA を用いたフロー

素活性の発現に必要であることが証明されている

21）

。以前、

サイトメトリーにより細胞表面の糖鎖構造の変化を調べた− 33 −

ところ、galGnT- Ⅵ遺伝子導入細胞と hGnT- Ⅵ h 遺伝子[GlcNAc to Man]-β1,4-N-acetylglucosaminyltransferase VI

導入細胞における細胞表面の糖鎖変化は逆に動いた。このfrom hen oviduct. J. Biol. Chem. 275 : 32598-32602, 2000

レクチンとの反応性が、導入遺伝子産物の直接的な糖転移

５） Minowa MT, Oguri S, Yoshida A, Hara T, Iwamatsu

酵素活性に基づくものであるか、それとも他の糖転移酵素

A, Ikenaga H, Takeuchi M: cDNA cloning and expres-

群の撹乱に基づくものであるかは不明である。いずれにしsion of bovine UDP-N-acetylglucosamine : β1,3-D-

ろチロシナーゼの糖鎖自体も変化している可能性も高い。

mannoside α1,4-N-acetylglucosaminyltransferase IV. J.
Biol. Chem. 273：11556-11562,1998

チロシナーゼの活性変化とチロシナーゼの mRNA の発現が相関していたことから、本研究で観察された galGnT-６） Saito H, Nishikawa A, Gu J, Ihara Y, Soejima H,

Ⅵあるいは hGnT- Ⅵ h 遺伝子導入によるメラニン産生量

Wada Y, Sekiya C, Niikawa N, Taniguchi N: cDNAの変化は、一つにはチロシナーゼ遺伝子の発現が変化した

cloning and chromosomal mapping of human N-acetyl-ためと思われる。この原因としては、galGnT- Ⅵと hGnT-

glucosaminyltrans-ferase V. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 198 : 318-327, 1994

Ⅵ h の mRNA が直接チロシナーゼ遺伝子の転写あるいは
チロシナーゼ mRNA の安定性に干渉した可能性が考えら

７） Sakamoto Y, Taguchi T, Honke K, Korekane H,れる。別の可能性としては、細胞表面の糖鎖変化が、チロ

Watanabe H, Tano Y, Dohmae N, Takio K, Horii A,

シナーゼ遺伝子の発現に影響を及ぼしたか、あるいは別のTaniguchi N: Molecular cloning and expression of

分子を介してチロシナーゼ mRNA の安定性を調節していcDNA encoding chicken UDP- N -acetyl-D-glucosamine

ることが考えられる。

（GlcNAc）: GlcNAc β 1-6（GlcNAc β 1-2）-Man_1-R[GlcNAc to Man] β 1,4N -acetylglucosaminyltransferase

以上をまとめると、トリ GnT- Ⅵ遺伝子およびヒト GnT-VI, J. Biol. Chem. 275 : 36029-36034, 2000

Ⅵ h 遺伝子のマウスメラノーマ細胞における発現は、チロ
シナーゼの発現変化を介して、メラニン産生を制御するこ

８） Kumar R, Yang J, Eddy RL, Byers MG. Show TB,
Stanley P: Cloning and expression of the murine geneとが明らかとなった。

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本研究を遂行するにあたりご支援いただきましたコスメ

９） Tan J, D'Agostaro AF, Bendiak B, Reck F, Sarkar

トロジー研究振興財団に深謝いたします。

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UDP-GlcNAc:GlcNAc β1-6（GlcNAc β1-2）Manα1-R13） Furukawa T, Youssef EM, Yatsuoka T, Yokoyama− 34 −

糖転移酵素の関与するメラニン産生制御の解析

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− 35 −