タイトジャンクション動的平衡を制御する低分子化合物の探索

名古屋大学大学院創薬科学研究科構造分子薬理学分野

廣 明

秀 一

The cellular maintenance of tight junctions (TJs) is considered as dynamic remodeling processes of equilibrium between
internalization / degradation and generation of claudin-based TJ strands. While the mechanism of biogenesis of TJs driven by
ZO-1 and its paralogs were well understood, the molecular mechanism behind TJs' turnover remains unknown. Recently, theE3 ubiquitin ligase ligand of Numb-protein X1 (LNX1p80) was identified as a responsible factor that binds to claudin-1 andpromotes its endocytosis. Since the first PDZ domain of ZO-1 is indispensable for claudin interaction in the TJ biogenesis,
a competition between ZO-1 and LNX1p80 against claudin is assumed. We analyzed in vitro binding activity of the several
claudin-derived peptides and the other peptides derived from the TJ-related proteins. We found that some of the claudinderived peptide could bind LNX1-PDZ2, whereas none of claudins bind LNX1-PDZ3. Notably, all of these claudin-derived
peptides bound ZO1-PDZ1. CAST and JAM-4 are the strong binders to LNX1-PDZ2 domain, which also did not bind ZO1PDZ1. For further clarifying the molecular recognition mechanisms underlying the claudin competition among LNX1 andZO-1 PDZ domains, we started the structurl studies. We also succeeded in determining the NMR structure of mouse ZO1PDZ1 domain, which was further subjected to a virtual screening study for identifying ZO1-PDZ1 inhibitors. We succeededin crystallizing the LNX1-PDZ2 in a certain condition, and the structural determination at 1.5Å resolution was mostly
completed. This high-resolution structure of LNX1-PDZ1 is also planned to be subjected to a virtual screening study. These
structural informations of TJ-related PDZ domains will provide the molecular basis towards discovery and development of
TJ-regulating (promoting and inhibiting) small molecular weight compounds.

1．緒TJ の形成には、この裏打ちタンパク質群の特定の PDZ ド言

メインと CLD の相互作用が、必須であることが知られて細胞接着装置は、組織や臓器の形成に必須の構造体であいる（図１a）。TJ は腸管や血液脳関門などの上皮細胞にり、その異常はがんや他の多くの疾患の原因になっている。

存在し、細胞極性を維持すると同時に、水分子やイオンの細胞接着装置は、まず直接細胞間の接着に関与する膜タン透過を調節するバリア機能を持つ 1）。皮膚においては、水

パク質である接着分子の細胞質側に、その分子の機能を制分子の透過を制御するバリアとして、保湿・保水などコス御する足場タンパク質、それを安定化するための細胞骨格、

メトロジー研究の観点からも注目される。例えば、TJ のならびに接着分子によって制御されているシグナル伝達因主成分の一つ claudin-1 を欠損したマウスが、全身の乾燥

子など、数多くのタンパク質から構成されている。これらにともなう脱水症状により生後すぐに死んでしまうことかの多数のタンパク質が巨大な分子複合体を形成して、生体

ら、TJ は皮膚バリア機能における保水・保湿に極めて重膜に存在する膜ドメイン構造とともに、最終的に細胞間接要な役割を果たすと考えられてきた 1）。

着を完成させているのである。接着装置は、特に上皮細胞

これまで、TJ の制御は、ZO -1 による形成促進のメカニで発達しており、頭頂部のタイトジャンクション（TJ）と、ズムのみが知られており 2, 3）、一方、その分解経路ないしそれより内側に位置するアドヘレンスジャンクション

ダウンレギュレーション過程についてはほとんど研究がな（AJ）により構成されている。

されていなかった。しかし 2008 年に、筆者らの共同研究

このうち TJ は、４回膜貫通構造をもつ接着分子クロー者である神戸大学医学研究科の古瀬教授らのグループが、

ディン（CLD）およびオクルーディンと、CLD の裏打ちタ

CLD のエンドサイトーシスを促進する因子としてマルチ

ンパク質 ZO- 1/ZO- 2 と呼ばれるマルチドメイン蛋白質か

PDZ ドメイン蛋白質である LNX1p80 を発見・同定した 4）。

らなる。具体的には、CLD の C 末端に存在する PDZ 結合

LNX1（Ligand of Numb X1）は、もともとは神経前駆細モチーフと、ZO-1/ZO -2 が持つ PDZ ドメインが結合する。

胞の維持と胎生期の神経発生に必須の因子 Numb の相互作用因子として同定されたユビキチン化酵素 E3 であり、A search for low-molecular weight ligandsthat regulate a dynamic equillibrium oftight-junction.
Hidekazu Hiroaki
Division of Structural Molecular Pharmacology,
Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
Nagoya University

Numb との結合モチーフ NPXY の下流に、4 つの PDZ ドメ
イン、N 末端に RING ドメインを持つ（図１b）。古瀬らは、
この LNX1 の PDZ ドメインが CLD の C 末端に結合することで CLD をユビキチン化し、そのエンドサイトーシスの促進と細胞表面からの TJ 構造の消失を誘導することを見出した。興味深いことに、ZO -1/ZO - 2 と LNX1 は、いず− 66 −

タイトジャンクション動的平衡を制御する低分子化合物の探索れもその PDZ ドメインによって TJ を構成する鍵分子であの１番目の PDZ ドメイン（ZO1-PDZ1）の立体構造決定をるクローディンの C 末端を認識して結合するため、お互い行った。一連の研究結果から得られる知見、とくに原子レに競合関係にある。言いかえれば、CLD との相互作用にベルでの立体構造情報は、インシリコ創薬の手法などと組おいて両タンパク質の PDZ ドメインが拮抗し、TJ の形成

合わせることで、LNX1 に特異的な薬剤を設計・探索すると消失の動的平衡を達成していると考えられる（図１c）。

ことを可能にするであろう。

筆者らは、皮膚バリア機能を強化する低分子化合物を、

2．実

構造生物学に基づいた創薬手法を援用して探索することを2・1

目的として、研究を開始した。その際に、特に CLD と験

GST 融合 LNX1 のドメイン発現系構築と精製

LNX1 の相互作用を特異的に阻害する低分子化合物を開発

本研究の最終的なゴールの一つは LNX1 の PDZ ドメイすることができれば、前述の動的平衡が TJ 形成側に偏り、ンの立体構造決定であるが、構造解析には大量の精製した

結果的に TJ が担う皮膚のバリア機能を強化できるのでは

タンパク質試料が必要である。従って、研究に先立ち、効ないかと考えた。すでに皮膚バリア機能を強化することを率のよい大腸菌組換えタンパク質発現系の構築と精製法の目的とした化粧品成分として、タイトジャンクション形成確立は必須である。

促進剤の報告がある一方で、TJ の形成過程における細胞

ヒト（h）・マウス（m）LNX1 のドメイン領域（表 1）の質内タンパク質を標的とした、タイトジャンクション形成

遺伝子を pGEX - 6P3 -PRESAT ベクターに挿入した発現用促進剤の報告はまだない。しかし、通常、タンパク質─タ

プラスミドを作製した 5）。このプラスミドを大腸菌 BL21

ンパク質相互作用（protein-protein interaction, PPI）を創（DE3）に 導 入 し た。 そ の 大 腸 菌 を LB 培 地 で 培 養 し、薬標的とする場合には、低分子化合物によりその相互作用

IPTG によって発現誘導することで目的タンパク質を大量を強化することは原理的に難しい一方で、PDZ ドメインのような相互作用ポケットの形状が明らかなドメインに対

表１

しては、PPI 阻害剤の開発は不可能ではない。ここで問題

LNX1になるのは、LNX1 に 4 つある PDZ ドメインのどのドメイ
mouse

ンが CLD との結合に寄与しているか不明であるということである。そこで、筆者らは、構造生物学的手法と分子間相互作用解析により各 PDZ ドメインの特徴付けを行うことを目指した。まず、LNX1 の PDZ ドメインの結晶解析をhuman

行った。分子間相互作用解析では、LNX1 の PDZ2 ドメイ
ンと CLD の一部に相互作用を検出し、一方 PDZ3 はいず
れとも相互作用しなかった。更に、JAM- 4/CAST が LNX1
- PDZ2 に CLD よりも強く結合することが明らかになった。
それと並行して、CLD 結合においてそれと拮抗する ZO-1

domain 領域
アミノ酸残基数110
258 ー 367PDZ1
87381 ー 467PDZ287
505 ー 591PDZ3
106621 ー 726
PDZ4
125
16 ー 140RING
110
254 ー 363PDZ1
87377 ー 463PDZ287
504 ー 590
PDZ3106621 ー 726
PDZ4

本研究において構築された LNX1p80 の各領域の発現系。数字は、発現系を構築した領域の N 末端とC 末端の残基番号を示す。右欄は、各発現系のアミノ酸残基数である。

a）ZO-1 のドメイン構成図b）LNX1p80 のドメイン構成図c）TJ 形成と分解の動的平衡による制御機構の模式図
図１− 67 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

発 現 さ せ た。 集 菌 後、 超 音 波 に よ り 大 腸 菌 を 破 砕 し、い た。 ま ず、 構 造 解 析 ソ フ ト CCP4 の 中 の プ ロ グ ラ ム

DEAE - sepharose カラム、Glutathione-sepharose カラムを

Molrep7）を用い位相を決定した。モデルには Protein Data順に用いて融合タンパク質を精製した。さらに PreScission

Bank に登録されている hLNX2-PDZ2（PDB ID：2VWR）

Protease によりカラム上で GST 部分を切断し、ゲル濾過を用いた。モデルとの兼ね合いで、mLNX1PDZ2 の 87 個

カラムに通した。精製後、限外濾過によるタンパク質の濃のアミノ酸のうち N 末端側 2 残基はカットした。また Unit

縮を行った。これを透析し結晶化用サンプルとした。相互cell 内に 1 分子というシンプルな構造であった。この構造

作用解析には GST 融合タンパク質を用いた。条件を精査

を CCP4 中のプログラム Refmac5 8）によって精密化した。

したがヒト・マウスいずれの由来の LNX1 においても 1 番

構造の確認には、プログラム Coot を用いた。精密化を 20目の PDZ ドメインと 4 番目の PDZ ドメインについては、

サイクルかけた後、Coot による構造の確認・修正をした。

溶解度の高い、かつアグリゲーションしにくい良質なタン

Coot で出力された電子密度図は非常に精巧であり、マッ

パク質試料を得ることができなかった。従って、今後の研プのとおりに座標を合わせるようにした。この作業を 5 セ

究は２番目と３番目の PDZ ドメインに限って続行するこット程度行った後、Coot の Find water を用い、水を assignととした。

した。ただし、非常に高分解能データであることを考慮し、
1σ のレベルで電子密度が球状であるもの以外の場所に

2・2

LNX1-PDZ2 と相互作用するペプチドの作成

assign された水はすべて削除した。R factor、Free R の値

本研究では LNX1-PDZ2 に相互作用するパートナーに注が 20% 程度から落ちなくなったところで、構造解析ソフト

目し、その C 末端 10 アミノ酸をチオレドキシン（Trx）融Phenix 中にある Phenix.refine を用い、simulated anniling

6）合ペプチドとして発現系を構築ののち、発現・精製した 。

を行った。最後に multi conformer（alternative conformer）

精製には DEAE - sepharose カラム、Ni キレート sepharoseのアミノ酸、および対称軸上に存在する水を 0.5 の占有率

カラムを順に用い、imidazol を含むバッファーで溶出した。

で assign した。この構造を Refmac 5 で 20 サイクル精密化

溶出したタンパク質を透析し、以降の実験に用いた。用意したモデルを最終的なマウス LNX1-PDZ2 の構造とした。

したペプチドの配列を表２に示す。

立体構造は、現在、PDB 登録準備中である。

2・3

2・4

X 線結晶解析

LNX1-PDZ2とペプチドの相互作用解析

24 mg/mL まで濃縮したマウス LNX1-PDZ2 の試料を、Trx 融合ペプチドを Co2+ レジンに固定し、そこへ 5nmol

リガンドフリー状態で、結晶化を試みた。大規模スクリー

GST あるいは GST 融合 LNX1- PDZ2 を添加した。4℃で 1

ニングには大阪大学蛋白質研究所 Phoenix を使用し、約時 間 半 攪 拌 し バ ッ フ ァ ー で 3 回 wash し た 後、500mM

870 条件の探索を行った。結晶化は、4℃で蒸気拡散法

imidazol を含むバッファーで溶出した。差を明瞭にするた（sitting drop 法）で行った。晶出した結晶がタンパク質のめ 銀 染 色 を 行 っ た。 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 セ ン サ ー結晶であることを確認する為に、神戸大学研究基盤センタ（BIACORE®3000）をもちいた相互作用解析においては、ーにおいて X 線照射実験を行った。更に有望な結晶につい10mM CH3COONa 水 溶 液（pH5.0）で 希 釈 し た 20mg/mLては、flash cooling 法により凍結し、大阪大学鈴木准教授

Trx 融合ペプチドをセンサーチップ CM3 に固定した。そに 共 同 研 究 を 依 頼 し て、 つ く ば の 高 輝 度 放 射 高 施 設

こへ HBS-EP バッファーに溶解した 0, 10, 25, 50, 100 mg/（Photon Factory, PF）で構造決定用のデータセットを取

mL の 濃 度 の LNX1-PDZ を ア ナ ラ イ ト と し て 測 定 し た。

得した（表３）。

CLD と相互作用することが明らかな mZO1 -PDZ1 を、陽マウス LNX1-PDZ2 の結晶構造決定には分子置換法を用性の標準試料として測定し、結果を比較した。
表３

表２
施設名

本研究において構築された claudin ならびにタイトジャンクション
関連蛋白質の C 末端ペプチドの配列。添え字の m/h はそれぞれ
マウス・ヒト由来であることを示す。CAST ではヒトとマウスでこの領域のアミノ酸が完全一致している。すべてのペプチドはチオ
レドキシン融合タンパク質発現系として構築された。

神戸大学
高エネルギー加速器研究機構
研究基盤センタ—
放射光科学研究施設
装置名
RIGAKU R-AXIS Ⅳ ++PFAR-NW12A
波 長
1.0Å
1.0Å
露光時間
10 分
2秒
回転角度
0, 90°
+1°
撮影枚数
2枚
360 枚
カメラ距離
150mm
100mm
In house 回折装置（神戸大学）ならびにつくば高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設（PF）におけるマウス LNX1PDZ2 の結晶回折実験の諸条件− 68 −

タイトジャンクション動的平衡を制御する低分子化合物の探索

2・5
13

ZO1-PDZ1 の NMR 立体構造解析

化条件で再現性のよい結晶が得られたことになる。

15

C/ N で二重標識したマウス ZO-1 の一番目の PDZ ドメ

それを踏まえて、更に高分解能の反射を与える結晶を得

イン（mZO1-PDZ1）について、NMR を用いて立体構造決るために、前述の条件の組成を出発点に、１% もしくは定を行った。
0.7mM のタンパク質を 20mM MES 緩衝液（pH

0.1 M 刻みに沈殿剤および塩濃度を変化させて、最適条件5.8）に 溶 解 し、 シ ゲ ミ サ ン プ ル 管 に 封 入 し て、 一 連 のを探索した。ただし条件 B6 に用いるカコジル酸は毒物で2D-NMR、3D-NMR の測定を行った。測定は、大阪大学蛋

あり、試薬の入手ならびにハンドリングが煩雑であったた

白質研究所 Bruker DRX-600 ならびに神戸大学医学研究科

め、pH が同じ条件として 0.1M Bis -Tris（pH 6.5）で代用設置の Bruker Avance-III 測定装置を使用した。データ解した。緩衝液成分を替えたにも拘わらず、結晶は 4℃、

9）

10）

析は NMRPipe 、Sparkyをそれぞれ用い、構造計算に

3．結
3・1

over night の静置で再現よく析出した（図 2A）。一方、結晶の大きさは PEG の量に大きく依存することがわかった。

は CYANA ver2.1 11）ならびに CNS1.2 12）を用いた。

すなわち、PEG が最適結晶化領域よりも 1 % でも多いと結果

晶の大きさは半分以下になる。これらの観察により、pH

mLNX1-PDZ2 の結晶構造解析

6.5 の近傍が最適 pH なのかもしれないと考えられる。

mLNX1-PDZ2 の結晶構造解析は、後述する結晶化キッ

次にこれらの結晶がタンパク質の結晶であることを確認

トを用いて、Sitting drop 法（リザーバ 80mL, drop1+1 mL）

する為に、神戸大学研究基盤センターにおいて X 線照射実により行った。その際、マウス LNX1-PDZ2 は溶解度が極験を行った。Structure Screen で析出した 3 条件では、中めて高い試料であったため、低い母液からは再現よく結晶心に程近い点で回折点が得られ、タンパク質の結晶であるが得られなかった。そこで、濃度を濃縮限界と考えられる

ことが確認できた。図 2B は B6 の回折像を示している。こ

24mg/mL まであげ、さらに結晶化温度を 4℃として条件の B6 条件の回折像はそれぞれの回折点が独立して存在おの 探 索 を 行 っ た。 そ の 結 果、 結 晶 化 キ ッ ト Structure

り、極めて良好であった。そこで、これらの結晶を flash

Screen（Molecular Dimensions 社）中の 3 条件（A7, B6, D1）、

cooling 法により凍結し、PF でシンクロトロン光により回および Index（Hampton research 社）F11、Crystal Screen

折実験を行い、立体構造決定と精密化に用いた。

Cryo（Hampton research 社）C4 で結晶の析出が認められた。

図 3 A にはマウス LNX1-PDZ2 の精密化途中での電子密結晶が得られた条件のうち、Structure Screen A7 は、度図に側鎖モデルを当てはめている途中経過の図を、図以前に 2.8 Å 分解能の結晶が得られたものの、これまで再

3 B には得られた PDZ ドメインの立体構造のリボン図を示

現が取れていなかった条件と全く同じ組成であった。そのしている。図中の右側のへリックスのすぐ左側が、ペプチため、再度得られた結晶は、以前に得られた結晶の再現でド結合部位のポケットである。このPDZドメインは、CLD1あると考えられる。一方、結晶が得られた条件であるなど一部の（後述のように全てではない）クローディン C 末Structure Screen B6 と Crytal Screen Cryo C4 は、供給元

端ペプチドに結合することができる。ここで、CLD1 を含む、が異なるもののバッファー組成が同じであった。従って、ほぼすべてのクローディンの C 末端は、ZO1-PDZ1 と優先

母液濃度を濃くコントロールすることで、いくつかの結晶的に結合可能であることから、同じ PDZ ドメインであって

図２(A）mLNX1-PDZ2 の結晶の写真、(B) 結晶回折像の拡大図。
数字は分解能を示す。

− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

3・3 LNX1 に優先的に結合する CLD 以外の基質の決定

も、基質ペプチドの分子認識の様式はかなり異なることが予想される。この予想は、リガンドフリー状態でのポケッ

更に、TJ に存在するタンパク質には、CLD のほかにも、

ト形状の差異からも、ある程度裏付けられた。

その C 末端が LNX1 の PDZ ドメインと相互作用すると報告されているタンパク質が多数存在する。これらの中から、3・2 試験管内タンパク質相互作用実験による LNX1の CLD 結合ドメインの決定

CLD よりも強く LNX1 と結合し、CLD と拮抗することの試験管内タンパク質結合実験（pull-down 実験、data not

ドの構造をもとに、CLD と LNX1 の相互作用を特異的に

shown）ならびに BIACORE を用いた相互作用実験から、阻害する低分子化合物を設計することにつながる。そこで、PDZ2 と PDZ3 の 二 つ の PDZ ド メ イ ン の う ち、 ど ち ら がCLD を含む９種の LNX1 結合タンパク質由来ペプチドとCLD に結合するかの判定を行った。表４には、種々のペLNX1 の PDZ ドメインとの溶液中での会合を精査した。そプチドと PDZ ドメインとの解離定数 KD の結果を示した。

の結果、JAM ファミリーのひとつである JAM4 の C 末端

できるタンパク質を探索することができれば、そのペプチ

その結果、mLNX1-PDZ2 は一部の CLD と相互作用するペプチドが、mLNX1-PDZ2 と強く相互作用することがわ

が一方全く相互作用をしない CLD もあることが明らかにかった。また mLNX1-PDZ2 は hCAST とも相互作用するなった。通常、PDZ ドメインの多くはペプチドの C 末端 4とわかった。これは前述の pull down assay の結果と一致

アミノ酸を必要十分条件として認識するが、CLD ではこした。

の 4 残基はどれも配列がよく似ている。従って、mLNX1PDZ2 には通常の PDZ ドメインとは異なる分子認識機構が3・4 mZO1-PDZ1 のリガンドフリー体の溶液構造決定

内在している可能性が示唆された。これに対し mLNX1-NMR を用いて、mZO1-PDZ1（95 アミノ酸残基）由来の

PDZ3 は実験したどの CLD とも相互作用せず、同じ LNX1

主鎖ならびに側鎖のほぼすべての水素、窒素、炭素の内の PDZ 間でも結合に差が見られた。

NMR シグナルを帰属することができた。帰属した結果は、

図３(A) マウス LNX1-PDZ2 の精密化途中の電子密度図。
(B) マウス LNX1-PDZ2 の立体構造のリボン表示。
表４

表面プラズモンセンサー解析による解離定数 KD の比較。
n.d.) 実験を行ったが結合が弱く検出できなかったもの。
ハイフン）実験を行っていないもの。

− 70 −

タイトジャンクション動的平衡を制御する低分子化合物の探索

国 際 デ ー タ ベ ー ス で あ る BioMagResBank に 登 録 し たするために、現在、哺乳動物での培養細胞系で発現する（deposition code 11424）。この結果は、Biomolecular NMR

LNX1 全長のプラスミドをもとに、それぞれの PDZ ドメイ

13）

ンをドメインごと欠失した変異体を作成した。この変異体

Assignment 誌に報告した 。
得られた化学シフト情報をもとに、更に NOE 情報によプラスミドを培養細胞に導入して、４つあるPDZドメインのるプロトン間距離を解析して、立体構造の決定に成功した。

うちの PDZ2 を破壊した場合にのみ TJ のエンドサイトー

決定した立体構造座標は、国際データベース Protein Data

シスと分解が起きないことを確認する、という細胞生物学

Bank に登録した（PDB code ; 2RRM）。収束した 20 個の的実験を、神戸大学医学研究科古瀬教授と共同で進めてい立体構造の重ね合わせ構造を図 4A に、既に報告されている。また、CLD1 の C 末端ペプチドと 15N 標識した mLNX1-

る ZO1 - PDZ1 の結晶構造（PDB : 2H3M）との比較を図 4B

PDZ2 を用いて、滴定実験を行った結果、LNX1 はかなりに、示す。既知の結晶構造との最大の構造の差異は、ペプ

広いインタフェースを用いて CLD1 を認識しているという

チドリガンド（=CLD）結合ポケットの入口付近に存在す

予備実験結果も既に得ている。そこで、これらの結果がまる b2/b3 loop の向きである。なお、結晶中では、このルーとまり次第、マウス LNX1-PDZ2 の立体構造ならびにペプ

プ部分に硫酸イオンが結合していることが知られている。

チドとの相互作用の結果を査読付き専門誌に発表する予定

我々が決定した立体構造では、このループ部分に比較的大である。

きな構造揺らぎがあることが明らかになった。

４．考

それらを踏まえた上で、mLNX1-PDZ2 のフリーの立体構造を利用したインシリコスクリーニングと、それにより

察探索された低分子化合物が mLNX1-PDZ2 に結合するかど

本研究の最終目的は、TJ を分解する因子である LNX1

うかの検証実験が、次に解決すべき課題である。筆者がについて、それを分子標的とみなして、それに特異的な阻2011 年に神戸大から名古屋大に異動した関係で、特にイ害剤を開発し、コスメトロジー分野研究に展開することでンシリコスクリーニング関連の研究環境の再始動に手間取ある。今回得られた結果からは、LNX1 の二番目の PDZ ドってしまい、現時点で mLNX1-PDZ2 のバーチャルスクリ

メインが、CLD との相互作用の一端を担うことが示され、ーニングは開始していない。また、インシリコスクリーニ

LNX1-PDZ2 を標的とした「立体構造に基づいた」創薬アングの結果を実験的に検証するためには、NMR を利用しプローチの妥当性は検証できた。しかし、LNX1 の PDZ1た滴定実験を予定しているが、その結果を解釈するためにドメイン、PDZ4 ドメインが、CLD との相互作用の責任ドも、mLNX1-PDZ2 の NMR 解析を進め、シグナルの全帰

メインではないという確証を得るまでにはいたっていない属を行う予定である。これまでに ZO1-PDZ1 に関してイン（preliminary には CLD とは結合しないという結果を得て

シリコスクリーニング実験を行った結果では、20 個程度

はいる）。これは、タンパク質試料としての性質が悪く、の化合物からでも数個の結合化合物が得られている。従っ大腸菌発現系で大量の可溶性のタンパク質試料を調製するて、インシリコスクリーニングの精度そのものについては、ことが困難だったからである。そこで、この問題点を解決

既存の技術（市販ドッキングソフトの精度など）が十分実

図４(A)mZO1-PDZ1 の NMR 溶液構造、10 個の解の重ね合せ図。(B) 今回著者らが決定した NMR 構造（濃色）と既知の結晶構造（淡色, PDB:2H3M）の比較。太く表示された loop 部分の構造が大きく変化している。

− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

用可能なレベルに達していると考えられる。今後の研究のadherens junctions during epithelial cell polarization., J

進展が期待できる。

Cell Biol, 176, 779-786, 2007.

一方、本研究で得られた結果であるところの、JAM4 の

４）Takahashi S, Iwamoto N, Sasaki H, Ohashi M, Oda Y,

C 末端ペプチドが、mLNX1-PDZ2 に対して、CLD のいず

Tsukita S, Furuse M: The E3 ubiquitin ligase LNX1p80

れのペプチドよりも強く結合するという発見の持つ意義は

promotes the removal of claudins from tight junctions

大きい。すなわち、例えば細胞膜透過ペプチド（CPP）のin MDCK cells., J Cell Sci, 122, 985-994, 2009.

ような方法論を援用して、JAM4 ペプチドを細胞内に送り

５）Goda N, Tenno T, Takasu H, Hiroaki H, Shirakawa

込むことによって、LNX1 の TJ 分解機能が阻害できる可M: The PRESAT-vector: asymmetric T-vector for能性が示された。これは、今後、検証するに値する有力な

high-throughput screening of soluble protein domains

仮説である。その一方で、細胞接着分子である JAM4 につ

for structural proteomics.,Protein Sci., 13, 652-658, 2004.

いては、これまで、TJ 近傍に共局在することは知られて

６）Tenno T, Goda N, Tateishi Y, Tochio H, Mishima M,

いたが、TJ 形成においてどのような役割を果たしている

Hayashi H, Shirakawa M, Hiroaki H: High-throughput

か な ど の 報 告 は ほ と ん ど な か っ た。 ま た、 生 理 的 に、

construction method for expression vector of peptides

JAM4 が LNX1 によってエンドサイトーシスされるのかど

for NMR study suited for isotopic labeling.,Protein Eng.

うかについては、未だ明らかではない。今回の筆者らの知Des. Sel., 17, 305-314, 2004.

見は、JAM4 が TJ 近傍において TJ 抑制因子である LNX1７）Vagin AA, Teplyakov A: MOLREP: an automatedと優先的に結合することによって、間接的に CLD のユビ

program for molecular replacement., J. Appl. Crys, 30,

キチン化を抑え、TJ の安定化に寄与しているのではない

1022 -1025, 1997.

か、という新しいモデルを示唆している。更に、LNX1 に８）Vagin, AA, Steiner, RS, Lebedev, AA, Potterton,

はスプライシングバリアントとして RING ドメインのない

L, McNicholas, S, Long, F and Murshudov, GN:

E3 活性を欠失した LNX1p70 というイソフォームが存在しREFMAC5 dictionary: organisation of prior chemicalているが、その分子は、細胞接着装置の足場タンパク質とknowledge and guidelines for its use., Acta Cryst. D,
60, 2284 - 2295, 2004.

して機能する可能性が高い。本助成金によって行われた研究が端緒となり、コスメトロジー研究における新規作用メ９）Delaglio F, Grzesiek S, Vuister GW, Zhu G, Pfeifer

カニズムにおける皮膚保湿助剤が開発できるとともに、細J, Bax A: NMRPipe: a multidimensional spectral

胞接着装置研究に新たな光をあてる一助となれば幸いであprocessing system based on UNIX pipes., J. Biomol.

る。

NMR, 6, 277-293, 1995.

最後に、本研究を遂行するにあたり、ご支援いただきま

10）Goddard TD, Kneller DG: Sparky 3,University ofCalifornia, San Francisco.

した財団法人コスメトロジー研究振興財団に心より感謝い11）Guntert P: Automated NMR protein structure

たします。

calculation, Prog. Nuc. Magn. Reson. Spect., 43, 105-125,（引用文献）

2003.

１）Furuse M, Hata M, Furuse K, Yoshida Y, Haratake12）Brunger AT , Adams PD , Clore GM , DeLano

A, Sugitani Y, Noda T, Kubo A, Tsukita S: Claudin-

WL , Gros P , Grosse RWK , Jiang JS , Kuszewski J ,based tight junctions are crucial for the mammalian

Nilges M , Pannu NS , Read RJ , Rice LM , Simonson

epidermal barrier: a lesson from claudin-1-deficient

T , WarrenGL: Crystallography & NMR system: A

mice., J Cell Biol, 156, 1099-111, 2002.

new software suite for macromolecular structure
determination., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 54,２）Itoh M, Furuse M, Morita K, Kubota K, Saitou M,

905-921, 1998.

Tsukita S: Direct binding of three tight junctionassociated MAGUKs, ZO-1, ZO-2, and ZO-3, with the13）Umetsu Y, Taniguchi R, Satomura R, Goda N,
1

13

15

COOH termini of claudins., J Cell Biol, 147, 1351-1363,

Ikegami T, Furuse M, Hiroaki H*: H,

1999.

resonance assignment of the first PDZ domain of３）Ikenouchi J, Umeda K, Tsukita S, Furuse M, Tsukita
S: Requirement of ZO-1 for the formation of belt-like− 72 −C, andmouse ZO-1, Biomol. NMR Assign, 5, 207-210, 2011.

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