【研究報告】（自然科学部門）

味蕾細胞種特異的な化学感覚刺激応答の定量的可視化法の開発

加塩麻紀子

京都府立医科大学細胞生理研究部門
緒助教

実験方法

言

ENaCα発現細胞に蛍光 Ca2＋バイオセンサー GCaMP3 を食べ物の味は栄養素・毒素の知覚を通じて生存に、さ発現する遺伝子改変マウスの作出

らに食の愉楽を通じて生活の質にも重要な役割を果たす。現代の食品開発において、我々が食品の「味」を如ENaCα プロモータ制御下で Cre リコンビナーゼを発何に受容し識別するかを科学的に理解することは、味覚現するトランスジェニック（Tg）マウス（α-1）として感じる食品の「味」を自在にコントロールするたマウス） と、Cre リコンビナーゼ活性によりGCaMP3めの重要課題の 1 つである。現在までに T1Rs・T2Rs をを発現する Ai38 マウス2）の交配により、ENaCα 発現細胞はじめとする味細胞に発現する味受容体遺伝子が同定さ特異的に GCaMP3 を発現するマウス（れ、さらに 5 基本味（甘・苦・塩・酸・旨味）が味蕾でマウス）の作出を行った。

α-それぞれ異なる細胞種により受容されるといった末梢味マウスの味蕾における GCaMP3 発現覚の分子・細胞基盤の理解が飛躍的に向上してきた。しα

かし、受容体不明の味覚受容機構（例えばグルコースポ細胞種の確認

リマー Polycose® の甘味）・味認識のチューニングを担マウス（5 週齢以上）を麻酔下で灌α-

う味細胞内の味覚情報処理機構・味細胞間の複数味覚の流固定後、茸状乳頭および有郭乳頭を含む舌上皮組織を統合機構についての解明が遅滞しており、現在の末梢味採取し、薄切切片を作製した。得られた組織切片の免疫覚研究の重要課題である。本研究では、これらの課題に組 織 染 色 に よ り、GCaMP3 発 現 細 胞 種 を 検 討 し た。

取組むための新しい技術的基盤の開発と、これによる塩GCaMP3 の発現は抗 GFP 抗体、II 型味細胞の同定は抗味の受容・処理・統合機構の体系的解析を提案する。

PLCβ2 抗体、III 型味細胞の同定は抗 AADC 抗体用いる

Na は細胞外液の主要陽イオンとして体液量調節に必ことで、各味細胞種における GCaMP3 発現を検討した。

＋須の物質である。Na 摂取量制御のため、塩味受容機構＋の解明は特に先進国で深刻な高血圧の予防など社会的希マウスの茸状乳頭味蕾におけるGCaMP3αシグナルのライブセルイメージング求がある。実際、我が国で高血圧患者は 4,000 万人と推定され、脳心血管障害に深く関与しており、食塩過剰摂マウス（6〜10 週齢）の舌組織から、α-取 が 高 血 圧 の 誘 因 で あ る こ と は よ く 知 ら れ て い る。

茸状乳頭を含む舌上皮を酵素処理により単離し、共焦点

ENaCα の KO マウス解析により ENaC が塩味受容に必須

レーザー顕微鏡観察下に酸味刺激（50 mM クエン酸）であることがわかったが1）、ENaC 発現味細胞の塩味情を行い、GCaMP3 の蛍光輝度変化を記録した。

報処理機構は全く不明のままである。
本研究は、蛍光 Ca2＋バイオセンサー GCaMP3 を用い結果た味細胞の細胞種特異的味刺激応答記録法の確立と、そENaCα発現味細胞に蛍光 Ca2＋バイオセンサー GCaMP3をの応用による塩味受容・処理・統合機構の体系的解析を発現する遺伝子改変マウスの作出目的とした。

マウス1）と、α配し、交配にはマウス2）（図 1）を交マウスの作出を行った（図 2）。

αα-マ ウ ス（ヘ テ ロ 接 合 体） とマウス（ホモ接合体）を用いた。

マウスについては、ホモ接合体の外見上の目立った異常はなく、生1

加

図1

麻紀子

GCaMP3 レポーターマウス（

図2図3塩）の Rosa26 遺伝子座マウス作出の概要

αマウスの茸状乳頭（FuP）および有郭乳頭（CvP）における GCaMP3 の発現

αPLCβ2（II 型味細胞マーカー）、AADC（III 型味細胞マーカー）と GCaMP3 の共局在を示す。

よび外見上の目立った異常を認めなかった。

殖機能も正常であったため、ホモ接合体としてコロニーを維持できることがわかった。上記交配によって生まれた仔のジェノタイピングによってウスの選別を行った。

α-α-

マ

マウスは発達お2味蕾細胞種特異的な化学感覚刺激応答の定量的可視化法の開発

図4

α

マウス茸状乳頭味蕾における酸刺激（50 mM クエン酸）に対する［Ca2＋］i 応答（A）クエン酸処置前（Before）、処置時（Citric acid）および washout 後（After）の茸状乳頭味細胞における GCaMP3 蛍光輝度変化を示す。（B）（A）に示した味細胞（cell 1〜3）それぞれの蛍光輝度の Baseline（F0）からの変化率（ΔF/F0）。

考

マウス味蕾における GCaMP3 発現細α胞種の確認

察
得られた

マウスの味蕾において酸α-2＋

図 3 に示すように、茸状乳頭・有郭乳頭とも AADC

味刺激に対する味細胞の［Ca ］i 応答が確認でき、本シ発現細胞のほとんどに GCaMP3 の発現が確認された。

ステムは味刺激応答記録に適用可能であることが確認で

一方 PLCβ2 発現細胞については、有郭乳頭の PLCβ2 発きた。さらに、茸状乳頭の II 型細胞の約半数、III 型細現細胞には GCaMP3 発現がほとんど認められないが、胞のほぼ全て、および非 II/III 型細胞の少数で GCaMP3

茸状乳頭の PLCβ2 発現細胞のおよそ半数が GCaMP3 を発現が確認され、これらの細胞群にアミロイド感受性塩発現していた。さらに茸状乳頭および有郭乳頭において味受容に関わる味細胞が含まれると考えられた。今後は

AADC・PLCβ2 非発現細胞への GCaMP3 の発現もわずこれらの細胞群に注目した塩味応答記録を行うことで、かに確認された。アミロライド感受性塩味受容は茸状乳塩味情報処理機構の解明に迫れるものと期待する。さら頭を介すると考えられていることから、茸状乳頭の II 型には、全味細胞あるいは味細胞種特異的に GCaMP3 を細胞の約半数、III 型細胞のほぼ全て、および非 II/III 型発現させることで塩味以外の味質の応答記録へと本シス細胞の少数がアミロライド感受性塩味受容細胞の候補とテムの応用範囲を拡大し、種々の味覚研究が可能となる考えられた。と期待する。塩味刺激に対する［Ca2＋］i 応答記録には、酸味応答と比較して高い感度での測定系が求められると2＋マウスの茸状乳頭味蕾における［Ca ］iα予測され、GCaMP3 で感度不十分である場合には現在応答記録最高感度を誇る GCaMP6f を GCaMP3 に替わって使用することでより高感度な記録ができると考え、現在システ

図 3 で示した通り、GCaMP3 は酸味受容細胞でもあるムのアップデートを進行中である。

III 型細胞にも発現することから、まずは電位依存性2＋Caチャネルを発現しカルシウム応答が大きいと予想要された III 型細胞の酸味応答記録を塩味刺激に先んじて約行い、測定系の稼働性を確認した。図 4 に示すように、塩味受容に必須の分子である ENaCα を発現する味細酸味刺激であるクエン酸の処置に応答して GCaMP3 発胞に、選択的に蛍光 Ca2＋バイオセンサー GCaMP3 を発現細胞中の一部で、蛍光輝度が 50〜100％一過性に増大現する遺伝子改変マウスを作出した。得られたマウスの2＋する［Ca ］i 応答を観察した。この結果から、GCaMP3

味蕾を用いた免疫組織学解析により各味細胞種への2＋は味細胞［Ca ］i 応答記録に適用可能であることが確認

GCaMP3 発現を検討した結果、茸状乳頭の II 型細胞のできた。一方で、酸味刺激の後に GCaMP3 の蛍光輝度約半数、III 型細胞のほぼ全て、および非 II/III 型細胞のは基線以下に減少したが、これは酸味刺激に伴う細胞内少数に GCaMP3 が発言しており、これら細胞群にアミの酸性化によって GCaMP3 の蛍光が褪色したことに起ロイド感受性塩味受容に関わる味細胞が含まれると考え因すると考えられ、酸味に対する［Ca2＋］i 応答記録へのられた。さらにGCaMP3 適用上の注意すべき点と考えられた。

単離した味蕾を用いて、酸味刺激による［Ca2＋］i 応答を3α-

マウス茸状乳頭から

加塩麻紀子記録することに成功した。本システムを適用することいただいたものであり、本研究は京都府立医科大学細胞で、今後さらに塩味情報受容機構の解析が可能となると生理学の樽野陽幸講師、孫紅昕博士、丸中良典教授と共期待される。

同で行ったもので、この場を借りて皆様に感謝申し上げます。

謝辞
文

援助いただきました公益財団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様に、深く感謝致します。

献1） J. Chandrashekar, et al.:2） H. A. Zariwala, et al.:α-

マウスは Columbia 大学 Charles Zuker 教授より供与

4, 464, 297–301, 2010.
, 32, 3131–3141, 2012.