接触皮膚炎への p38 mitogen-activated protein kinase の関与機構の解明
千葉大学大学院

粕医学研究院分子生体制御学

谷善俊To elucidate the role of p38 mitogen-activated protein kinase (p38) in the pathogenesis of inflammation, a mouse contact
hypersensitivity (CHS) model induced by 2,4-dinitro-1-fluorobenzene (DNFB) was used. Ear swelling was induced bychallenge with DNFB, accompanied by infiltration of mononuclear cells, neutrophils and eosinophils, and a marked increase
in mRNA levels of cytokines such as interleukin (IL)-2, interferon (IFN)-γ, IL-4, IL-5, IL-1β, IL-18 and tumor necrosis
factor (TNF)-α in the challenged ear skin. Both ear swelling and the number of infiltrated cells in DNFB-challenged
ear skin were significantly inhibited by treatment with SB202190, a p38 inhibitor. Furthermore, the DNFB-induced
expression of all cytokines except IL-4 was significantly inhibited by treatment with SB202190. Ribonuclease protection
assay revealed that the mRNA levels of chemokines such as IP-10 and MCP-1 in ear skin were markedly increased at 24h after challenge with DNFB. The induction of these chemokines was significantly inhibited by treatment with SB202190.
In p38α +/- mice, both ear swelling and infiltration of cells induced by DNFB were reduced compared with those in wildtype mice. However, induction of cytokines by DNFB was also observed in p38α +/- mice, although the induction of IFN-γ,
IL-5 and IL-18 was typically reduced compared with that in wild-type mice. Challenge with DNFB slightly induced IP-10
and MCP-1 mRNA in p38α +/- mice, with weaker signals than those in SB202190-treated wild-type mice. These results
suggest that p38 plays a key role in CHS and is an important target for the treatment of CHS.

１．緒

そこで我々は、2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB）による

言

マウス接触皮膚炎（Contact Hypersensitivity：CHS）モデ

Mitogen-activated protein kinase（MAPK）ファミリー

ルを用い、p38 阻害剤の効果を検討するとともに p38α ノッは、細胞外からの刺激を核内の転写機構制御にまで変換・クアウトマウス（ヘテロ接合体；ホモ接合体は胎生致死３））の伝達するリン酸化酵素群であり、細胞の増殖、分化、形質DN F B による接触皮膚炎誘導に対する応答を検討し、p38転換、生存、アポトーシス等の様々な生物現象において中心の接触皮膚炎への関与機構を分子レベルで解明し、p38 阻的役割を演ずる重要な酵素である。哺乳類における MAPKs

害剤の適用法を含めた新たな治療法の開発を目的とした。

は Extracellular signal-regulated kinase(ERK)、c-Jun２．実N-terminal kinase（JNK）、p38 MAPK（p38）の３つに分2.1類することができる。

験実験動物

p38 は特にサイトカイン、U V 等の細胞外ストレスにより活C57BL/6J 雄マウスを p38α 遺伝子ヘテロ接合体雌マウスと性化されるとともに、サイトカインの産生にも積極的に関与しかけ合わせ、p38α 遺伝子ヘテロ接合体マウス（p38α +/-）とている 。したがって、炎症を伴う病態伸展に密接に関与す野生型マウス（Wt: p38α +/+）を得た。F6 世代以降の雌マウると考えられ、p38 をターゲットとしたサイトカイン抑制が炎スを実験に用いた。Genoty ping に用いた３種の PCR プライ症性疾患治療の良好な st rateg y になることを示唆している。

マーと条件は以下の通り：A, 5’-CCCTATACTCCCTCTCTG

一方、p38 阻害剤の適用は場合によっては一部のサイトカイン

TGTAACTTTTG-3’; B, 5’-CCCAAACCCCAGAAAGAAATGAの産生をむしろ上げるという報告もあり、p38 をターゲットとTG-3’; and C, 5’-TTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCすることに異論を唱える説も登場している 。これらの議論がTG-3’ : 94（30 秒），55（30 秒），72（1 分）で 35 サイクあるにもかかわらず、現時点では、炎症性病態伸展への p38

ル／ 800-bp および 450-bp の PCR 産物をそれぞれ変異おの関与様式を個体レベルで証明した研究はほとんど存在しなよび野生型アリールとして認識した。

１）

２）

いとともに、炎症性皮膚疾患に関連した研究報告は存在し2.2ない。
E s s e n t i a l R o l e o f p38 M i t o g e n activated Protein Kinase in Contact
Hypersensitivity.
Yoshitoshi Kasuya

接触皮膚炎モデル

0.5％ DNFB（in acetone/olive oil（A/O）soln.）100μl をマ
ウス・8 週令雌の背部に塗布（感作）し、５日後、20μl の同液を耳介部に塗布した（惹起）。耳介腫脹と組織変化を経時的に計測・観察した。対照実験として、同様に感作した

Department of Biochemistry andMolecular Pharmacology, Graduate Schoolof Medicine, Chiba University

マウス耳介部に DNFB を含まない A/O soln. を 20μl 塗布した。p38 阻害剤：SB202190 は、惹起 30 分前に 10 -5 Mを 25μl 塗布した。

− 71 −

2.3

形態学的検討耳介部のパラフィン包埋切片（３μm）を作製しヘマト
キシリンーエオジン（HE）染色後、高倍率下で組織浸潤

Table 1 : Printer sequence, annealing temperature (A. temp),
number of cycles (Cycle#) and size of PCR product used for detection of each cytokine.

炎症細胞を確認した。

2.4

局所サイトカイン mRNA 発現量の検討

耳介部より total RNA を調製し、各２μg の total RNA をRT-PCR に供し、各種サイトカインの発現量を確認した。
各サイトカインの検出用プライマー、アニーリング温度、サイクル数は Table １に記載した。

2.5

RNase protection assay による局所ケモカイン

発現量の検討マ ウ ス LT N、R A N T ES、eot a xin、macrophageinflammatory protein（MIP）-1α、1β&2、IFN-γ inducible
protein（IP）-10、monocyte chemoattractant protein（MCP）-1、TCA-3 とハウスキーピングジーンである L32（ribosomalR NA）および GA PDH に対するマルチプローブテンプレー
ト（mCK-5/BD PharMingen）を用いた RNase protection
assay に、耳介部より調製した total RNA 各 10μg を供した。

2.6

リンパ球の皮下移植実験

感作した Wt および p38α+/- マウスの所属リンパ節よりリンパ球をそれぞれ調製し、2×105 cells in 20μl PBS の懸濁液を未感作の Wt マウス耳介部の表皮下にインジェクションし、そこに 2020μl の 0.5％ DNFB（in A/O soln.）または A/O soln. を塗布して 24 時間後の耳介腫脹を観察した。
対照実験として、細胞を含まない in 20μl PBS を、未感作の Wt マウス耳介部の表皮下にインジェクションし、20μlの 0.5％ DNFB（in A/O soln.）を塗布した。

３．結3.1果DNFB による CHS に対する p38 阻害剤の効果

DNFB は経時的に耳介腫脹を誘導した。p38 阻害剤である SB202190 の投与はこの耳介腫脹を有意に抑制した（Fig. 1）。また、その組織所見から、SB202190 の投与は、DNFB による炎症細胞の組織内浸潤と表皮細胞間浮腫を抑制した（Fig. 2）。惹起 24 時間後の浸潤細胞の構成は、リンパ球を主体とした単核球細胞が主であるが、好中球および好酸球も確認され、これら細胞の浸潤数も SB202190の投与により抑制された（Fig. 3）。

3.2 局所サイトカイン発現量に対する p38 阻害剤の効果

TNF-α）の DNFB による発現誘導を有意に抑制した（Fig. 4）。

惹起前にはほとんど検出されない耳介部のサイトカイン mRNA レベルが、DNFB による惹起によって時間依存3.3p38α+/- を用いた CHS の検討的に一律誘導された。また、SB202190 の投与は I L -4 を除Wt に比して p38α +/- では、DNFB による惹起 24 時間

くサイトカイン（IL-2、IFN-γ、IL-5、IL-1b、IL-18 および後の耳介腫脹、単核球細胞等の組織内浸潤が有意に抑えら− 72 −

接触皮膚炎への p38 mitogen-activated protein kinase の関与機構の解明れていた。また、耳介部のサイトカイン mRNA レ
ベルの DNFB による誘導は、IFN-γ、IL-5 およびIL-18 は p38α +/- では抑えられているものの、他のサイトカインは Wt とほぼ同等であった（Fig. 5）。

3.4

局所ケモカイン発現量の検討

DNFB に よ る 惹 起 24 時 間 後 の 耳 介 部 の ケ モ カ イ ン

MIP-1β、MIP-1α および MIP-2 mRNA がほとんど認めらmRNA 発現誘導と SB202190 投与の効果、および p38αれず、DNFB による惹起によって誘導される IP-10 およ+/- でのケモカインの挙動を検討した。Wt においてはコび MCP-1 mRNA の発現も微弱であった（Fig. 6）。

ントロールレベルでは、MIP-1β および MIP-1α mRNAの微弱な発現と MIP-2 mRNA の強い発現が認められる

3.5

p38α +/- の CHS 抵抗性機構の検討が、DNFB による惹起によって付加的に IP-10 およびp38α +/- の CHS 抵抗性獲得は感作段階か否かを、移植

MCP-1 mRNA の強い発現誘導が確認された。この典型的実験により検討した。未感作 Wt 耳介部への DNFB 塗布

な IP-10 および MCP-1 の発現誘導が SB202190 投与には CHS を誘導しないが、感作した Wt および p38α +/- かよって有意に抑えられた。一方 p38α +/- では、Wt およら調製したリンパ球の未感作 Wt 耳介部への移植は、いずび SB202190 投与群のコントロールレベルで認められたれの場合も DNFB 塗布によって CHS を誘導した。また、− 73 −

リンパ球の耳介部への移植後、DNFB-free A/O soln. の塗布では CHS は誘導されなかった（Fig. 7）。

４．考察

本研究から、p38 が CHS の発症に密接に関与することが示唆され、p38 阻害剤が、経皮的投与という簡便な投与法で CHS に治療効果を発揮する可能性が示された。

p38 アイソフォームの関与様式
p38 の関与様式としては、少なくとも局所におけるサイトカイン—ケモカインネットワークの産生制御を介して CH S の成立に寄与していると考えられた。p38 には、α、β、γ、δ の４つのアイソフォームの存在が知られている。このうち、様々な種類の細胞に広汎に存在するのは α および β であり、p38阻害剤が効果を発揮する対象も α および β である。したがって、本研究で示された、p38 阻害剤の CH S の病態進展に対する抑制効果および p38α +/- では CHS 発症が抑えられることを考慮すると、p38 の４つのアイソフォームのうち、少なくとも α が中心的な役割を演じていることが考えられた。

− 74 −

接触皮膚炎への p38 mitogen-activated protein kinase の関与機構の解明

p38 の時間的・空間的関与機構にある。p38 阻害剤は、高濃度用いると異なるタイプのCHS の発症には、感作段階、惹起段階の２つのステッMAPK である JNK も阻害する 5）。JNK は p38 と共有するプを経るが、少なくとも p38 阻害剤を用いた実験では、す上流のキナーゼ（MAPK Kinase Kinase）を有しており、でに感作したマウスに DNFB による惹起直前に p38 阻害p38 が活性化する細胞環境下では往々にして JNK も並行剤を投与しているため、惹起段階での p38 の関与が明らして活性化する。本研究の CHS モデルにおいても、p38かである。そこで、p38α +/- において「はたして正常にとほぼ同じ時間経過で JNK は活性化していた。しかしな感作が成されるか」をリンパ球の移植実験により検討した。

がら、本研究で用いた p38 阻害剤の投与法・投与量では、感作した p38α +/- の所属リンパ節から調製したリンパ球p38 を特異的に阻害し JNK の活性には何ら影響しないこの未感作（naive）Wt への移植によって、移植耳介部位へとを確認している（未発表データ）。JNK が CHS にどのの DNFB の塗布で耳介部腫脹を誘導できた。この事実は、ように関与しているかは今のところ不明であるが、治療応

p38α +/- においても正常に感作されうることを示してい用を考慮する上で p38 阻害剤の JNK への影響を無視するる。したがって、CHS における p38 の関与の時間的特性ことはできない。次に、本研究において p38 阻害剤は惹としては、感作段階よりもむしろ惹起段階にあると結論起段階の直前に投与したが、惹起後の p38 阻害剤投与にできる。次に、p38 の空間的関与機構については、DNFBよる効果の検討が、実用性を考える上で重要となる。また、による惹起 24 時間後の組織に浸潤した CD4 陽性細胞をステロイド剤の繰り返し投与で確認されるような病変増悪回収・純化し、RT-PCR により Th1 サイトカインである効果が、はたして p38 阻害剤では成立しないか否かも今

IL-2 と IFN-γ、Th2 サイトカインである IL-4 と IL-5 の後の課題として検討が必要となる。

発現を確認することで検討を加えた。p38 阻害剤を投与した Wt における浸潤 CD4 陽性細胞のサイトカイン産生能

参考文献

は、p38 阻害剤未投与の Wt のそれと同等であった。一方、

１） Rin cón, M ., E n slen , H ., R a ingeaud , J., et a l. :p38α +/- における浸潤 CD4 陽性細胞のサイトカイン産生Interferon-γ expression by Th1 effector T cells mediated

能は IFN-γ および IL-5 で低下が見られた（データは示さby the p38 MAP kinase signaling pathway. EMBO J., 17,2817-2829, 1998.

ず：本研究結果の報告論文 4）参照）。p38α +/- における浸潤 CD4 陽性細胞の IFN-γ および IL-5 の産生低下は、

２） van den Blink, B., Juffermans, N.P., ten Hove, et al. :CHS 病変部におけるサイトカイン低下のプロファイルと

p38 Mitogen-activated protein kinase inhibition increases

相関していたことから、p38α +/- では、細胞内の p38 のcytokine release by macrophages in vitro and during
infection in vivo. J. Immunol., 166, 582-587, 2001.

内活量の低下が一部のサイトカインおよびケモカインの産生抑制に直接的に寄与している可能性が考えられた。一方、

３） Tamura, K., Sudo, T., Senftleben, et al. : Requirement

p38 阻害剤による局所サイトカイン—ケモカインネットワ

for p38α in erythropoietin expression: a role for stressークの産生制御は、浸潤細胞自体の p38 の内活量に影響

kinases in erythropoiesis. Cell, 102, 221-231, 2000.

することなく、少なくとも浸潤炎症細胞数の抑制を介して４） Takanami-Ohnishi, Y., Amano, S., Kimura, S., et al. :寄与することが示唆された。しかし、p38 阻害剤投与によEssential role of p38 mitogen-activated protein kinase in

る CHS 病変部におけるサイトカイン低下はかなり顕著で

contact hypersensitivity. J. Biol. Chem., 277, 37896-37903,
2002.

あったことから、p38 阻害剤は表皮構成細胞でのサイトカ

５） Le-Niculescu, H., Bonfoco, E., Kasuya, Y., et al. :イン産生を付加的に抑えることも考えられた。

Withdrawal of survival factors results in activation of

p38 阻害剤の治療応用の今後の課題

the JNK pathway in neuronal cells leading to Fas ligand

p38 阻害剤の治療応用上の１つの問題点は、その特異性

induction and cell death. Mol. Cell. Biol., 19, 751-763,
1999.

− 75 −