ストレスが惹起する消化管バリア機能の破綻に対する、フラボノイド類の防御作用鈴木卓

広島大学大学院生物圏科学研究科

緒弥

講師

改善する機能が強く期待される。本研究は、精神的スト

言

現代社会では、「ストレス社会」という言葉が示すよレスが誘導する消化管バリア機能の破たん、それに続くうに、多くの人が様々なストレスに曝されながら生活を消化管の炎症に対する、フラボノイドの軽減作用とその送っている。適度なストレスは、医学的には問題になら分子機序を探ることを目的とし、以下の研究を実施した。

ないが、慢性的あるいは過度のストレスは、身体的、精（1）消化管 TJ バリア機能活性作用を有するポリフェノー神的不調を引き起こす。なかでも消化管は、ストレス感ルのスクリーニング受性の高い組織であり、ストレスが関与する疾患として、（2）精神的ストレスモデル動物における消化管の TJ バリ潰瘍、腸過敏性症候群、炎症性腸疾患など多数知られてア機能の破たん、炎症を軽減するフラボノイドの探索いる。近年、これらの精神的ストレスに起因する消化器（3） ストレスが誘導する炎症性サイトカインによる TJ バ系疾患の発症メカニズムとして、消化管バリア機能の破リア機能低下に対するポリフェノールの改善作用の探索たんが提案されている。我々の消化管は、管腔内の異物（腸内細菌由来のエンドトキシン、食事由来抗原など）を実験方法

体内に侵入させないバリア機能を有しているが、脳が精

1.

消化管 TJ バリア機能活性作用を有する

神的ストレスを感じたとき、主に視床下部－下垂体－副ポリフェノールのスクリーニング

腎軸を介し、バリア機能を破たんさせ、それによる管腔ヒト消化管上皮 Caco-2 細胞を用いて、消化管 TJ バ

内異物の侵入が消化管や各種臓器の炎症、免疫システムリア機能亢進活性を有するポリフェノール類（フラボノ1)の攪乱を引き起こすと考えられている 。

イド類を含む）を探索した。方法として、トランズウェ

消化管バリア機能とは、複数のバリア因子によって統ルシステムに培養した Caco–2 細胞の粘膜側に各種のポ合されるシステムの総称であり、なかでも上皮細胞間のリフェノール類（100 μM）を添加し、48 時間までの TJ物質の通過を制御するタイトジャンクション（TJ）は最バリア機能を評価した。ポリフェノール類として、アピ2)も重要な因子の１つである 。TJ は、膜貫通型タンパ

ゲニン、クルクミン、ミリセチン、ヘスペレチン、ケルク質のオクルディンやクローディン、そして ZO タンパセチン、モリンを用いた。TJ バリア機能の評価として、ク質などの細胞内裏打ちタンパク質によって構成される経上皮電気抵抗値（TER）を測定した。TJ バリア機能が複合タンパク質群である。精神的ストレスによる TJ バ強化されると、TER は上昇し、逆に TJ バリア機能が低リア機能破たんの分子機序は完全には解明されていない

下すると、TER が低下する。

ものの、ストレス負荷によって上昇するサイトカインが、TJ 分子の発現や局在を攪乱することが報告されている。

2.

これらの知見を基盤に、我々は食品成分による消化管フラボノイドによる TJ バリア機能活性作用の分子メカニズムの探索

バリア機能保護作用を通した、疾病の予防・改善に注目

ヒト消化管上皮 Caco–2 細胞を用いて、ポリフェノーしている。これまでに、いくつかの食品因子（短鎖脂肪ル類による TJ バリア機能活性作用の分子メカニズムを酸、フラボノイドなど）に TJ 機能調節作用を見出して探索した。方法として、トランズウェルシステムに培3,4)。なかでもフラボノイド類は、上皮細胞内シグ養した Caco–2 細胞の粘膜側に各種のポリフェノールナル系を修飾して TJ バリア機能を高めることが証明さ類（100 μM を添加し、48 時間後に細胞抽出液から細れ、消化管バリア機能の破たんとそれに係る疾病を予防・胞骨格画分を調製した。イムノブロット法により、各きた1

鈴木卓

弥

種 の TJ タ ン パ ク 質（ZO–1、ZO–2、JAM–1、Occludin、最終日に、ラットに３時間の拘束ストレスを負荷し、直Claudin–1/3/4）の細胞骨格結合量を定量した。

ちに解剖を実施した。小腸と大腸を用いた腸管反転サック法により、消化管バリア機能を評価した（FITC– デキ

ストレスが引き起こす消化管バリア機能低下とストラン透過速度を指標として）。消化管炎症の指標と消化管炎症におよぼすポリフェノール摂取の影響して、小腸と大腸の Myeloperoxidase（MPO）活性を解1 および 2 において、ケルセチン、ヘスペレチン、ク析した。また小腸組織の Tumor necrosis factor （TNF）–

ルクミンに消化管 TJ タンパク質調節作用が認められた

αの mRNA 発現量をリアルタイム RT–PCR 法にて解析ため、拘束ストレスラットを用いて、消化管バリア機能した。

3.

低下と消化管炎症に対するケルセチン、ヘスペレチン、クルクミンによる改善作用を探索した。Wistar 系、雄性、4.

炎症性サイトカインによる TJ バリア機能低下に７週齢のラット（日本 SLC 株式会社）を AIN-93G 準拠の対するポリフェノールの影響基本飼料で１週間予備飼育した後、次の５群すなわち、3 において、ストレス負荷が小腸組織の TNF–α発現対照群（ストレスなし / 基本食群）、ストレス / 基本食群、量を誘導し、ケルセチンとヘスペレチンがストレス誘導

ストレス / ケルセチン食群、ストレス / ヘスペレチン群、型の消化管バリア機能低下を軽減したため、消化管上ストレス / クルクミン群に群分けした。その後、それぞ皮 Caco–2 細胞において、炎症性サイトカイン（TNF–αれの試験食で５日間飼育した。ポリフェノール添加量はと IFN–γ）による TJ バリア機能低下に対する、ケルセ0.3% とし、飼料および水は自由摂取とした。試験期間

チンとヘスペレチンの改善作用を探索した。ただし、クルクミンは大腸透過性を高めたため、本試験には含めなかった。方法として、Caco–2 細胞の粘膜側へケルセチンとヘスペレチン（～ 100 μM）を、漿膜側へ TNF–αと IFN–γ（10 ng/mL）を添加後、48 時間後の TJ バリア機能（TER）を評価した。また、イムノブロット法によりTJ タンパク質の発現量を解析した。

結1.
図１ 消化管上皮 Caco-2 細胞における経上皮電気抵抗値（TER）Caco-2 細胞に各種ポリフェノールを作用させ、6 時間後の TER を測定した。平均値±標準誤差（*P<0.05）。

図２

果消化管 TJ バリア機能活性作用を有するフラボノイドのスクリーニング

図１に、Caco–2 細胞にアピゲニン、クルクミン、ミ消化管上皮 Caco-2 細胞における TJ タンパク質の細胞骨格結合量

Caco-2 細胞に各種ポリフェノールを作用させ、6 時間後の TJ タンパク質の細胞骨格結合量をイムノブロット法により解析した。平均値±標準誤差（*P<0.05）。
2

ストレスが惹起する消化管バリア機能の破綻に対する、フラボノイド類の防御作用

リセチン、ヘスペレチン、ケルセチン、モリンを作用さリア機能調節（活性化を含む）の分子メカニズムを解明せたときの、経上皮電気抵抗値（TER）の変化（６時間後）するため、各種 TJ タンパク質の細胞骨格結合量を解析を示した。各種ポリフェノールは、それぞれ TER に異した（図２）。TER を増加させたケルセチンは、ZO–2、なる影響を与えたが、ケルセチン、クルクミン、ヘスペ

Occludin、Claudin–1、ヘスペレチンは、ZO–1、ZO–2、レチンを作用させたとき、それら TER は対照群よりもOccludin、Claudin–4、 ク ル ク ミ ン は、ZO–2 の 細 胞 骨高値を示し、TJ バリア機能の強化が確認された。一方格結合量を増加させた。一方で、TER を低下させたアピで、アピゲニンを作用させた Caco–2 細胞では、TER がゲニンは、Claudin–1 の細胞骨格結合量を増加させ、TER対照群よりも低値を示し、TJ バリア機能の低下が確認を変動させなかったミリセチンとモリンは、TJ タンパクされた。ミリセチンとモリンを作用させた Caco–2 細胞質の細胞骨格結合量にも顕著な影響を与えなかった。の TER は、対照群と大きな差は認められなかった。
3.
2.

ストレスが引き起こす消化管バリア機能低下とフラボノイドによる TJ バリア機能活性作用の消化管炎症におよぼすポリフェノール摂取の影響

分子メカニズムの探索

ラットの体重、摂食量には群間差は認められなかっポリフェノール類（フラボノイドを含む）による TJ バた（データ省略）。反転サック法による消化管バリア機能の評価において、ストレス負荷は大腸のバリア機能には影響しなかったが、小腸の FITC- デキストラン透過性を上昇させ、バリア機能の低下を誘導した（図３）。このとき、ヘスペレチン、ケルセチン、クルクミンを摂取したラットでは、ストレスが引き起こした透過性の上昇が抑制された。しかしながら、クルクミンの摂取は、大腸の透過性を上昇させた。小腸組織の TNF–αmRNA 発現量は、ストレスにより上昇したが、ヘスペレチン、ケルセチン、クルクミンの摂取により部分的に回復した（図４）。小腸と大腸組織の MPO 活性には群間差は認められなかった（データ省略）。

Colon

図３

ストレス負荷ラットにおける小腸、大腸の

図４

FITC- デキストラン透過性

ストレス負荷ラットにおける小腸の Tumor Necrosis Factor(TNF)-αmRNA 発現量

ラットに５日間ポリフェノールを含む、あるいは含まない食餌をラットに５日間ポリフェノールを含む、あるいは含まない食餌を摂取させた後、３時間の拘束ストレスを負荷した。腸管反転サッ摂取させた後、３時間の拘束ストレスを負荷した。リアルタイム

ク法にて、消化管透過性を評価した。平均値±標準誤差（異なるアRT-PCR 法により、TNF-αの遺伝子発現量を解析した。平均値±

ルファベット：P<0.05）。

標準誤差（異なるアルファベット：P<0.05）。
3

鈴

4.

木卓

弥

らず、ケルセチンは Claudin–4 の発現を誘導した。

ストレスが誘導する炎症性サイトカインによるTJ バリア機能低下に対するポリフェノールの考改善作用の探索

察

Caco–2 細胞において、TNF–αと IFN–γ刺激時にケストレスが引き起こす消化管バリア機能の低下は、過ルセチンを作用させたときの TER（48 時間後）を図５に敏性腸症候群、炎症性腸疾患など、多くの消化器系疾患

示 し た。TNF–α と IFN–γ は、Caco–2 細 胞 の TER を 低の発症や憎悪に関与していることが提案されている。本下させ、TJ バリア機能の低下を誘導した。ケルセチン

研究は、ポリフェノール類が持つ消化管バリア機能調節はサイトカインによる TER 低下を濃度依存的に回復し作用に着目し、まず培養細胞を用いたバリア機能活性化たが、ヘスペレチンには回復作用は認められなかった作用のスクリーニングを実施し、活性の高いポリフェ（データ省略）。さらに、TNF–αと IFN–γは TJ タンパクノールとして、ケルセチン、ヘスペレチン、クルクミン

質 Occludin の発現量の低下を引き起こしたが、ケルセを選抜した。続いて、ストレス負荷ラットにおいて、消チンを作用させた Caco–2 細胞では、Occludin の減少が化管バリア機能改善作用を探索したところ、ケルセチン回復した。さらに、炎症性サイトカインの刺激にかかわとヘスペレチンに改善作用が確認された。さらに、培養図５

炎症性サイトカインによる消化管バリア機能低下に対するケルセチンの改善作用

消化管上皮 Caco-2 細胞の粘膜側にケルセチンを、漿膜側に TNF-αと INF-γを作用させ、48 時間後の TJ バリア機能（経上皮電気抵抗値：TER）と TJ タンパク質発現量（Occludin と Claudin-4）を解析した。平均値±標準誤差（異なるアルファベット：P<0.05）。
4

ストレスが惹起する消化管バリア機能の破綻に対する、フラボノイド類の防御作用細胞において炎症性サイトカインが引き起こす消化管バが示された。

リア機能破綻に対するヘスペレチンとケルセチンの作用

また、Caco–2 細胞において、ケルセチンは TNF–αにを探索したところ、ケルセチンに改善作用が観察された。

よる TJ バリア機能低下を改善し、これがケルセチンに

また、TNF–αと IFN–γによる Caco–2 細胞の TJ バリアよるバリア機能保護作用のメカニズムの１つであること

機能の低下を軽減したのはケルセチンのみであったが、が提案された。一方で、ヘスペレチンは TNF–αによる

これらの結果は、ケルセチンとヘスペレチンが消化管バTJ バリア機能低下を軽減せず、バリア機能保護作用にリア機能の低下や攪乱によって引き起こされる各種疾病おいてケルセチンとは異なる作用を持つことが示されを予防・軽減する可能性を示唆するものである。

た。

ヒト消化管上皮 Caco–2 細胞を用いた試験において、

本研究は、様々なポリフェノール類に消化管バリア機様々なポリフェノール類が TJ バリア機能を修飾（調節）能を調節する機能があることを明らかにした。その作用することが示唆された。なかでもケルセチン、ヘスペレは、ポリフェノールの種類によって特徴的なものであり、チン、クルクミンは、TJ バリア機能を顕著に強化するバリア機能強化作用を示すヘスペレチンとケルセチン作用が認められ、消化管バリア機能の低下によって引きは、ストレス負荷ラットにおいて消化管バリア機能の低起こされる疾病に対する予防・軽減作用が期待できるこ下を軽減する作用も確認された。ケルセチンとヘスペレとが提案された。TJ 透過性は、複数の TJ タンパク質のチンには、ストレスが引き起こす消化管バリア機能の低機能・局在によって総合的に決定される。この TJ タン

下に関連する疾患を予防・軽減する機能性食品成分へのパク質複合体はアクチン細胞骨格に結合して機能するこ応用が期待できると提案されるが、その作用メカニズムとが知られ、過去の報告によれば、その細胞骨格結合量の詳細の解明にはさらなる研究が必要である。また、他が TJ バリア機能・透過性を強く反映する（図 5）。ケルのポリフェノール類についても、消化管バリア機能調節

セチンは、ZO–2、Occludin、Claudin–1、ヘスペレチン作用を通した有益な効果が期待できると考えられる。

は、ZO–1、ZO–2、Occludin、Claudin–4、クルクミンは、ZO–2 の細胞骨格結合量を増加させ、これら TJ タンパ

要約

ク質の局在変化がバリア機能強化の要因であることが示

消化管は、管腔内の異物を体内に侵入させないバリアされた。膜貫通型タンパク質の Occludin と Claudin は、機能を持ち、そのバリア機能の低下は様々な疾患につなTJ バリア（透過性）を決定する重要な分子の１つであり、がることが知られている。このバリア機能の最も重要な裏打ちタンパク質である ZO–1、ZO–2 は、TJ 複合体を因子の１つが、タイトジャンクション（TJ）構造が知らアクチン細胞骨格に安定的に結合させたり、適切に局在れ、TJ は上皮細胞間の物質の通過を制御する役割を持させるのに重要な役割を持つことが知られている。一方

つ。本研究は、消化管上皮細胞とストレス負荷ラット

で、アピゲニンは TER を減少させて、TJ バリア機能をを用いて、ポリフェノール類（フラボノイドを含む）の低下させたが、Claudin–1 の細胞骨格結合量を高めた。

もつ消化管 TJ バリア機能強化・保護作用を探索し、そこれは、やや矛盾的な結果を示すものであり、アピゲニの機能を基盤としたバリア機能保護食品の開発を目指しンの作用についてはさらなる試験による解明が必要であた。最初に、ヒト消化管上皮 Caco–2 細胞に様々なポリると考えられた。

フェノールを作用させ、TJ バリア機能への影響を解析

Caco–2 細胞におけるスクリーニング試験の結果から、した。使用したポリフェノールは、TJ バリア機能へ各々TJ バリア機能活性化作用を示したケルセチン、ヘスペ特徴的な作用を示した。ケルセチン、ヘスペレチン、クレチン、クルクミンを選抜し、ストレス負荷ラットにおルクミンは、TJ バリア機能を強化し、一方でアピゲニいて、疾病改善作用を確認しところ、ケルセチンとヘスンは TJ バリア機能を弱めた。続いて、ストレス負荷ラッペレチンがストレス誘導型の小腸バリア機能低下を部分トを用いて、ケルセチン、ヘスペレチン、クルクミンに的に改善し、これらが動物個体においても消化管 TJ バよる消化管バリア機能の保護作用を探索した。ストレス

リア機能を保護・強化することが示された。同時に、ケは、小腸透過性と炎症性サイトカイン Tumor necrosis

ルセチンとヘスペレチンは、炎症性サイトカインである

factor（TNF）–α遺伝子発現の上昇を誘導した。３種のポTNF–αの発現量を低下させ、ストレスによるバリア機リフェノール摂取は、これらの異常を部分的に回復し、能低下によって引き超される消化管炎症も抑制すること

消化管バリア機能保護作用と炎症軽減作用を示した。ま5

鈴木卓

弥

た Caco–2 細胞において、ケルセチンは TNF–αによる念財団による研究助成を賜りました。同財団関係者の皆TJ バリア機能低下を回復した。これら結果は、ケルセ様に深く感謝の意を表します。

チンやヘスペレチンがストレスによる消化管バリア機能の低下に関連する疾患を予防・軽減する機能性食品成分

引への応用が期待できること、他のポリフェノール類につ1) Turner, J. R. Nat Rev Immunol 9, 799-809 , 2009

用文

献2) Gonzalez-Mariscal, L. et al. Prog Biophys Mol Biol 81,

いても、消化管バリア機能調節作用を通した有益な効果

1-44, 2003が期待できることを提案するものである。

3) Suzuki, T. et al. Br J Nutr 100, 297-305, 2008
4) Suzuki, T., and Hara, H. J Nutr 139, 965-974, 2009

謝辞5) Rao, R. K. et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol
279, G332-340, 2000

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人三島海雲記6