【研究報告】（自然科学部門）

STH クロマト PAS を利用した、加工食品における農作物の品種判定検査

門田有

岡山大学大学院環境生命科学研究科緒希助教ると安定して遺伝する4）。そのため、品種特異的な挿入

言
農作物の品種判定は、食の安心・安全に関わる重要な部位は、品種を特定するうえで有効なマーカーとなる。

検査である。近年、食品偽装や不正表示などが頻繁に新

このマーカーはレトロトランスポゾンの挿入の有無で判聞やニュース等でも取り上げられ、消費者の食品安全に定するため明確な判定が可能であり、アズキ、イチゴ、対する関心は非常に高まっている。そのため、野菜や果サツマイモ、コムギ等さまざまな作物種で開発が進めら物などの農作物、あるいは食品に含まれる原料品種を正れている 2, 3, 5 7）。実際にこれまでの研究において、アズ確に判定できる技術の開発が必要とされている。一方キの「しゅまり」と「きたのおとめ」という品種を対象で、日本には品質の高い農作物品種が多く、高級品としに開発されたマーカーを用いることで、品種がブレンドて海外へ輸出されている。しかしながら、品種の盗用やされた加工餡からでも原料のアズキ品種を正確に判定可

偽装表示など日本のブランド力が悪用される事態が発生能なことが報告されている2）。また、近年はより簡便なしている。農作物の品種は育成者権によって保護されて検査を実現するため、C-PAS（Chromatographic Printed

おり、第三者による無許可での栽培や販売は禁止されて

Array Strip）法という新しい DNA シグナル検出法も注–1）

いる 。このような諸外国での無断使用や品種の盗用を目されている。この手法は、専用の器具や設備を必要と防止するため、税関、あるいは農作物や食品の製造・運せず、マッチ棒サイズのクロマト紙でシグナルを検出す搬現場等で、正確かつ簡便に判定できる品種判定法の開る。シグナル検出も短時間（15 分間）で終わるため、発が求められている。

実用性が極めて高いと考えられる。著者らはこの手法を利用し、イチゴ単体サンプルについては極めて簡便に品

しかし、いまだに実用的な技術は開発されていない。

種を特定できることを示している8）。

さまざまな問題点が指摘されており、例えば、野菜や果物の見た目や香りなどの特徴では明確に区別ができな

そこで本研究では、レトロトランスポゾンマーカー

い、ジュースやジャム、小麦粉など一度加工されてしまを 利 用 し、 さ ら に C-PAS 法 や LAMP（Loop-mediated

うと、そこに含まれる原料品種を特定できない、などがIsothermal Ampliﬁcation）法等も組み合わせることで、あげられる。また、SSR（Simple Sequence Repeat）や複数品種がブレンドされた加工品からでも、簡便かつ正CAPS（Cleaved Ampliﬁed Polymorphic Sequence）な確に原料品種を特定可能な技術の開発を試みる。これにど既存の DNA 判定法では、複数のマーカー情報を組みより、実用化に向けた加工食品からの品種判定を試験的合わせることで判定していたため、操作が煩雑になり、に実証する。

いくつかの品種がブレンドされると正確な判定ができな
実験方法

い。さらに DNA を検出するうえで専用の高額機器や設備も必要である。よってこれらの問題点を克服した、簡供試材料はアズキ品種の「きたのおとめ」と「しゅま便かつ正確に品種を判定可能な技術の開発が望まれる。

り」とする。本研究では、これら品種が含まれる加工餡最近の研究結果から、レトロトランスポゾンというゲか ら 二 種 類 の 方 法 に よ り DNA を 抽 出 し た。 一 つ はノム中に存在する複製配列を利用することで複数の品種

GenCheck DNA Extraction Reagent kit（株式会社ファがブレンドされた加工品からでも原料品種を正確に特定スマック）を用いた方法である。まずは餡 10 mg に対しできることが示されている 2, 3）。レトロトランスポゾンて GenCheck® DNA Extraction Reagent buﬀer を 100 μLとはゲノム中に散在する複製配列であり、一度挿入され加え、ボルテックスでよく攪拌した。100℃で 10 分間加1門田有温した後、氷中で 1 分間静置し冷却した。15,000 g で遠希

表1心分離した後、上澄みを回収し、分析用試料とした。もう一つは水抽出法である。こちらは、餡 300 mg に対して滅菌水を 300 μL 加え、ボルテックスで良く攪拌した
後 5 分間静置した。再度ボルテックスで攪拌した後、同様に 5 分間静置した。13,000 rpm で 2 分間遠心分離した
後、上澄みを回収し、分析用試料とした。DNA の濃度測定には Nano drop 2000（Thermo Fisher Scientiﬁc）をGenCheck で抽出した「きたのおとめ」の DNA 濃度と希釈後濃度
番号濃度（ng/μL）

備考

1294.4
79.4

希釈無し

345660.0
40.0
20.0
5.0

希釈用いた。
これら DNA サンプルを用い、LAMP 法により DNAの増幅反応を行った。LAMP 法とは栄研化学が独自に開発した DNA 増幅法であり、これを用いれば一定温度の反応で効率的に DNA を増幅させることが可能である（http://loopamp.eiken.co.jp/lamp/index.html）。DNA 抽出液 2 μL に Isothermal Master Mix（増幅用酵素等含む）を 5 μL、プライマー mixture を 3（あるいは6）μL 混合し、ヒートブロックを用いた 65℃の等温反応によってDNA を増幅した。DNA 増幅産物は 1.5％アガロースゲルによる電気泳動で確認した。また、C-PAS による検出法では、DNA 増幅産物にクロマト紙を 1 秒浸した後、色素と展開液を混合した反応液 20 μL に 15 分間浸し、室温にてクロマト展開を行った。なお、プライマー配列は各品種特異的な DNA 配列を基にすでに設計済みのものを用いた（データ非公開）。
結果
本研究では二種類の DNA 抽出方法を用い、各手法について 2 回ずつ抽出作業を行った。回収された DNA 濃
度は GenCheck を用いた場合「きたのおとめ」が 79.4 および 94.4 ng/μL、「しゅまり」が 145.8 および 62.8 ng/μL、

図1

水 抽 出 を 用 い た 場 合「き た の お と め」 が 58.6 お よ び
85.0 ng/μL、「し ゅ ま り」 が 293.0 お よ び 43.5 ng/μL であった。いずれの方法においても簡易に十分量の DNAを抽出することができた。これら DNA を対象に LAMP

GenCheck により抽出した「きたのおとめ」のシグナル検出。（A）アガロース電気泳動の結果。（B）C-PAS による検出の結果。M は 100 bp ladder、1〜6 は表 1 に対応する。C-PAS の赤矢印は目的のシグナルが確認されていることを示す。

法による DNA 増幅を行った後、C-PAS 法によるシグナいた場合にシグナルが確認された（図 1B）。また「しゅル検出を行った。

まり」についても同様に LAMP 反応とシグナル検出をまずは「きたのおとめ」について GenCheck で抽出し行ったが、増幅は確認されなかった。「しゅまり」検出

た DNA をさまざまな濃度に希釈し、LAMP 反応を行っ用のプライマーは「きたのおとめ」検出用のプライマーた（表 1）。LAMP で増幅した産物を 1.5％アガロース電と比較し、増幅効率が低いことが示唆されたため、プラ気泳動で確認したところ、希釈した DNA 溶液を用いたイマー量を 2 倍にする、あるいは LAMP の反応時間を場合に増幅が確認された（図 1A）。これら増幅産物を用1.5 倍 長 く す る な ど の 条 件 検 討 を 行 っ た。 そ の 結 果、い C-PAS 法によるシグナル検出を行ったところ、アガ「しゅまり」の場合はプライマー mixture を 2 倍量の 6 μL

ロース電気泳動の結果と同様、希釈した DNA 溶液を用加えれば、安定してシグナルを検出できることが示され
2

STH クロマト PAS を利用した、加工食品における農作物の品種判定検査

表2図2

表3

GenCheck で抽出した「しゅまり」の DNA 濃度と希釈後濃度
番号濃度（ng/μL）

備考

162.8

希釈無し

23440.0
20.0
5.0

希釈

GenCheck により抽出した「しゅまり」のシグナル検出。
（A）アガロース電気泳動の結果。（B）C-PAS による検出の結果。M は 100 bp ladder、1〜4 は表 2 に対応する。
C-PAS の赤矢印は目的のシグナルが確認されていることを示す。なお、条件 1 では使用するプライマー量を 2 倍にし、条件 2 では反応時間を 1.5 倍にした。条件 1 の方がシグナルが検出されやすい傾向にあった。

図3

水抽出法で得られた DNA の希釈後濃度

番号

品種濃度（ng/μL）

K1
K2K3K4

きたのおとめ60.040.0
20.0
5.0

S1S2S3S4

しゅまり

60.043.520.05.0

水抽出で得られた DNA のシグナル検出。（A）アガロース電気泳動の結果。（B）C-PAS による検出の結果。M は
100 bp ladder、K1〜K4 お よ び S1〜S4 は 表 3 に 対 応 する。C-PAS の赤矢印は目的のシグナルが確認されていることを示す。

た（表 2、図 2A、B）。また、「きたのおとめ」、「しゅまり」のいずれも DNA の濃度を 5〜60 ng/μL に調整すれ「きたのおとめ」と「しゅまり」の DNA サンプルを 1 : 1

ば、水抽出法で得られた DNA サンプルでも十分な増幅の比で混合し、LAMP 反応を行った。その際、「しゅま反応が見られ、大体の場合シグナルを検出することがでり」の方が増えにくいため、「しゅまり」のプライマーきた（表 3、図 3A、B）。ただし「しゅまり」では最小を 2 倍量とした。アガロース電気泳動での増幅は確認さ量の 5 ng/μL ではシグナルが見えず、DNA 量が少なすれたが、C-PAS 法による検出では「しゅまり」のシグぎると増幅が起こりにくいと考えられた。

ナルが得られなかった（表 4、図 4A、B）。「きたのおと単独サンプルでのシグナル検出に成功したため、続いめ」については明瞭なシグナルが確認されたことからて混合サンプルでも C-PAS 法によるシグナル検出が可（図 4B）、「きたのおとめ」のみ増幅したと考えられた。

能かを検証した。GenCheck および水抽出で得られた

そこで「しゅまり」のプライマー量を 3 倍量に調整し、
3

門

表4田有

希

混合サンプルの濃度

番号

抽出法

濃度（ng/μL）

G1G2G3GenCheck

40205DW1DW2DW3

水抽出40205図5

条件検討後の混合サンプルのシグナル検出。（A）アガロース電気泳動の結果。（B）C-PAS による検出の結果。
M は 100 bp ladder、A1 と A2 は混合サンプルであり、それぞれ 20 ng/μL、5 ng/μL に調整した。C-PAS の赤矢印
は目的のシグナルが確認されていることを示す（上側がしゅまり、下側がきたのおとめに該当）。

た。その結果、単独サンプルと混合サンプルいずれの場合でも明瞭なシグナルの検出に成功した。従来の PCRによる DNA 増幅反応では、複数の温度条件下で反応を起こす必要があるため、専用の機器が必要である。一方
LAMP 法の場合は一定温度の反応でよいため、簡易なヒートブロックやウォーターバス（あるいはお湯）でDNA 増幅が可能である。また電気泳動によるシグナル検出では、ゲル作成、電気泳動、染色等必要であり、準備 か ら 検 出 ま で 2 時 間 程 度 は か か る。 そ れ に 対 し て
C-PAS 法はクロマト紙を反応液に 15 分間程度浸すだけで終わるため、操作も簡便で、大幅に時間も短縮でき
図4る。つまり、LAMP 法と C-PAS 法を導入すれば、高額混合サンプルのシグナル検出。（A）アガロース電気泳動の 結 果。（B）C-PAS に よ る 検 出 の 結 果。M は 100 bp
ladder、G1〜G3 お よ び DW1〜DW3 は 表 4 に 対 応 す る。
C-PAS の赤矢印は目的のシグナルが確認されていることを示す。

な実験機器や設備も不要で、極めて短時間に検査を行うことができる。また、本研究では GenCheck および水抽出の二種類の方法で DNA を抽出したが、どちらの方法で も 簡 易 に 十 分 量 の DNA を 抽 出 で き た。 た だ し、LAMP 反応を行った。その結果「しゅまり」でも増幅

C-PAS 法で明瞭なシグナルを検出するには DNA 濃度やが確認され、両品種について明瞭なシグナルを確認するプライマー量等を調整しなければならず、用いるサンプことに成功した（図 5A、B）。

ルやプライマーによってはいくつかの条件検討が必要であることが示唆された。以上のことから、適切な条件を考察設定すれば、本手法は現場検査に対応し得る極めて実用的な手法であると考えられた。

本研究ではアズキ品種の「きたのおとめ」と「しゅまり」を対象に LAMP 法による DNA 増幅、C-PAS 法によるシグナル検出を行い、試験的な品種判定検査を行っ
4

STH クロマト PAS を利用した、加工食品における農作物の品種判定検査

要約ば、ジャムやジュースなどに含まれる果物品種や、小麦

本研究では、加工食品から簡便かつ正確に原料品種を粉に含まれるコムギ品種等）に適用可能である。今後は特定する技術の開発を目的とし、加工餡を対象にその検より詳細な実験条件の検討や他の食品での試験を行い、証実験を行った。その結果、LAMP 法と C-PAS 法を用実用的な技術の開発を目指す。

いることで、高額な機器や設備も不要で、短時間にアズ謝

キ品種を正確に特定できることが示された。従来の手法

辞本研究を遂行するにあたり、研究助成を賜りました公と比較した本手法の利点を以下に示す。
1.

PCR による DNA 増幅では複数の温度条件下で反応益財団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様に心させる必要があり、サーマルサイクラー等専用の機より感謝申し上げます。また、株式会社ファスマック事器が必要である。一方 LAMP 法では、一定の温度条業開発部の高崎一人副部長にはプライマー配列の設計や件下（65℃）の反応で DNA 増幅が可能であり、簡実験条件の検討に関するアドバイスのご提供など、非常易なヒートブロック、ウォーターバス（お湯）等でにお世話になりました。この場をお借りし、厚く御礼申よい。

し上げます。

2. 従来の電気泳動によるシグナル検出では、アガロー
文スゲルの作成、電気泳動、染色などの操作が必要であり、トータルで 2 時間程度はかかる。加えて UV

献1） 種苗法（総務省法令データ提供システム：http://law.
e-gov.go.jp/htmldata/H10/H10HO083.html）
2） 中川藍ほか：DNA 多型，17, 85–91, 2009．
3） 田原誠ほか：DNA 多型，15, 122–125, 2007．
4） A. Kumar, J. L. Bennetzen:, 33, 479–532, 1999.
5） 秋竹広翔ほか：DNA 多型，21, 64–72, 2013．
6） 門田有希ほか：DNA 多型，21, 47–54, 2013．
7） 門田有希ほか：DNA 多型，22, 60–65, 2014．
8） Y. Monden, et al.:., 185, 57–62, 2014.

トランスイルミネーター等専用の機器が必要である。一方 C-PAS 法によるシグナル検出では、操作も簡便で 15 分間の反応で終わる。またマッチ棒サイズのクロマト紙があれば検査が可能で、場所も選ばない。
今回は加工餡から試験的に原料アズキ品種を特定したが、本手法はその他のさまざまな食品や農作物種（例え5