HLA検査のエッセンス
Vol.1 HLA基礎
第2部 HLA検査試薬
株式会社ベリタス
2024/4/25

HLAタイピング検査（HLA抗原検査）

なぜHLAタイピングを行うのか• HLAタイピングとはHLA遺伝子を解析してHLAアレルを決定すること• 移植は自分以外の組織が体内に入ってくる‒ 体内で異物と認識されないためには、できるだけ自分に近い組織を選択することが重要‒ HLAアレルを移植前に確認し、できるだけHLAが一致している臓器を選択することが生着率の向上につながる

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

3タイピング検査手法の比較
手法
タイピングトレー
SSP法
RSSO法（LABScan/Luminex）
SBT法（サンガーシークエンス）
NGS（次世代シークエンス）

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

利点課題

コスト安
短時間
大量検体処理解像度（中～高）
高解像度

低解像度
大量検体に不向き
Luminexが必要
みなし判定
コスト、時間、装置（シークエンサー）

全配列のタイピング

操作の煩雑さ4タイピングトレー Dr. Paul I. Terasaki

1 uLの血清でLymphocyte cytotoxinをテストする方法を開発
Terasakiプレートは一般的な用語として利用されるようになる
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

5タイピングトレー• テラサキHLAトレー‒ 体外診断用医薬品として承認取得‒ 昭和58年(1983年)6月24日～平成18(2006年)年7月26日

HLA抗原の複雑性が明らかになるにつれ精度が不十分になった
遺伝子タイピングが必要となり、使用されなくなった歴史がある
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

6

SSP(Sequence Specific Primer)法
DNA抽出

PCR

電気泳動

解析

• 製品名：マイクロSSP• 短時間でのアウトプット• 高額な装置が不要• 低解像度• 大量検体には不向き

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

7

SSP法の商品の一例• 多くの試薬が2桁用キット

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

8SSPの手技のポイント• DNA濃度は100 ng/μLが最適• D-Mixを室温に戻した際の色はピンク、黄色は使用不可• ポリメラーゼはAmpliTaqを使用、ボルテックス不可• PCRトレイのウェルの底にプライマーがあるため、D-Mixは壁面から加える• ゲルにサンプルを加える際はできるだけ速やかに、チップは深く入れすぎない
気泡が入ったらチップを取り換える

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

チップは深く入れす
ぎない

9

解析方法
ワークシート• すべてのマイクロSSP製品でロットごとに提供（pdf）• One Lambdaより公開• 血清型ファイルの更新によりアップデート（年2回）

マイクロSSP JPN早見表• JPNのみ• ベリタスにて作成、提供（pdf）• JSHI推定アレル表の更新によりアップデート（年1回）

HLA Fusion (ソフトウェア)• すべてのマイクロSSP製品で使用可能• ロット、血清型ファイルの更新によりカタログファイルがアップデート• Fusion4.6.1では、JPNキットで発生していた解析結果が保存できない問題は解消しました
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

10

解析の流れ
JPN以外の場合：
HLA Fusionで結果を確認（必要に応じてワークシートを併用）

JPNの場合：
早見表で結果を予想した後にHLA Fusionで結果を確認

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

11

RSSO(Reverse Sequence Specific Oligonucleotide)法
DNA抽出

PCR

ハイブリ＆洗浄• 製品名：LABType• 中～高解像度（キットに依存）• 大量検体にも対応• アウトプットまで数時間
1• LABScanで測定

2

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

解析

3SA PE

21

測定

SA PE

312

RSSO法の商品• LABTypeシリーズ‒ SSO,CWD,XRの3種類‒ DQ/DPはα鎖も同時にタイピングが可能

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

13

LABType SSO/CWD/XRの違い
製品群

測定機器

解像度

LABType SSO

LABScanシステム/LABScan3Dシステム

2桁

LABType CWD

LABScan3Dシステムのみ

4桁

LABType XR

LABScan3Dシステムのみ

4桁Locus

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

プローブ数
SSO

CWD

XR

A

83

204

954

B

1192101080

C64187

1180

DRB1

79140

416

DQB168-

-

DQA1

34-

-

DPB1

225-

-

DPA129-14

LABTypeの手技のポイント• DNA濃度は20 ng/μLが最適• D-Mixを室温に戻した際の色はピンク、黄色は使用不可• ポリメラーゼはAmpliTaqを使用、ボルテックス不可• DNA変性の際は液色の変化を確認‒ 濃いピンク→中和後に透明• ビーズ試薬はボルテックス後にピペッティングで混合• 温度のメリハリをしっかり‒ ビーズを加える際は氷上で速やかに行う‒ ハイブリ終了後は速やかに氷上で冷やす• LABScanでの測定時はテンプレートファイルのロットを確認
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15

RSSO法の測定装置（LABScan/医療機器）名称

ビーズ数
100色（10×10）

試薬
SSOのみ

LABScanシステム（届出番号：13B3X10148000010）

500色（10×10×5）
SSO,CWD,XR
全て使用可能LABScan
3Dシステム（届出番号：13B3X10148000020）

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

16

LABType解析• 検査成立基準を必ず確認すること• コントロールサンプル‒ 陽性コントロールが正確にタイピングされている‒ 陰性コントロールで蛍光値の高いビーズがないこと• False反応がないことや、カットオフ付近のビーズ反応は注意が必要‒ ビーズのカットオフを変更する際はビーズに結合しているプローブを必ず確認

検査成立基準の確認
陰性コントロール検体の確認

カットオフ付近のビーズ反応の確認
陽性/陰性の境目にFalse反応がないことを確認
False反応のビーズは水色で表示される

陰性コントロールはRawDataが高いビーズがないことの確認

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17SBT(Sequencing Based Typing)法
DNA抽出

PCR

シークエンス反応

シークエンス

解析• 製品名：SeCore（シーコア）• 高解像度• サンガーシークエンサーで測定• 大量検体の際は手間がかかる• 結果が出るまでに1-2日かかる

専用解析ソフト：uTYPE
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NGS(Next Generation Sequencing)法
DNA抽出

PCR

ライブラリー
作成

シークエンス

解析• 製品名：AllType NGS / AllType FASTplex NGS‒ 11ローカスを1度に解析• 高解像度（完全タイピング）• 次世代シークエンサーで測定• 結果が出るまでに時間がかかる（2-2.5日）

専用解析ソフト： TypeStream Visual
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

19

NGSの手技・解析のポイント• DNA濃度は25 ng/µLが最適• できるだけ長鎖のDNAを使用する‒ HLA遺伝子のほぼ全長を増幅するため‒ ボルテックスによる混合、長期の冷蔵保存、凍結融解の繰り返しは推奨しない• 精製に使用する磁性ビーズの量が操作ステップにより異なるため注意• 酵素による反応時間と温度は正確に‒ 速やかに試薬を添加して、速やかにサーマルサイクラーに入れる• 解析は専用解析ソフト(TSV)を使用、バージョンは3.0または3.1• IMGTは3.54(October 2023)が最新ファイル‒ SSP、LABTypeとバージョンが異なるため注意• カタログファイルは試薬ロット・シーケンス機器によって異なるため注意‒ AllType：ALL-11LX_015_00‒ AllType FASTplex：ALL-FAST11LFX_004_00（Illumina）
ALL-FAST11LX_004_00（IonS5）

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20

HLA分子とタイピング領域

Exon 3

Exon 4

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

Exon 2

Exon 2

Exon 2

Exon 3

Exon 321

HLAタイピング領域（Class I）
SBT法

RSSO法

NGS法

移植・輸血検査学 第1刷（2004）より転載
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

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HLAタイピング領域（Class II）

NGS法

RSSO法

SBT法

移植・輸血検査学 第1刷（2004）より転載
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

23

解像度の違い
検査手法
SSP法（SSPJPN)

Allele 1

Allele 2

XX1:=:24:02/24:02L/24:02Q/24:03/24:04/24:05/24:06/24:07/24:08/24:09N/24:10/24:11N/24:13/24:15/24:17/2
4:18/24:20/24:21/24:22/24:23/24:25/24:26/24:27/24:28/24:29/24:30/24:31/24:32/24:33/24:34/24:35/24:36N/2
4:37/24:38/24:39/24:40N/24:41/24:42/24:43/24:45N/24:46/24:47/24:48N/24:49/24:50/24:53/24:54/24:55/24:5
6/24:58/24:59/24:60N/24:61/24:62/24:63/24:66/24:67/24:68/24:69/24:70/24:72/24:73/24:74/24:75/24:76/24:7
8/24:79/24:80/24:82/24:83N/24:84N/24:85/24:86N/24:87/24:88/24:89/24:90N/24:91/24:95/24:96/24:97/24:98/
24:99/24:100/24:101/24:102/24:103/24:104/24:106/24:107/24:108/24:109/24:110/24:111/24:112/24:113/24:1
14/24:115/24:116/24:117/24:118/24:119/24:121/24:122/24:123/24:124/24:125/24:126/24:127/24:128/24:129/
24:130/24:131/24:132N/24:133/24:134/24:135/24:136/24:137/24:139/24:140/24:141/24:142/24:143/24:144/24:145/24:146/24:147/24:148/24:149/24:150/24:151/24:152/24:153/24:154/24:155N/24:156/24:157/24:158N/24:
159/24:160/24:161/24:162/24:163N/24:164/24:165/24:166/24:167/24:168/24:169/24:170/24:171/24:172/24:17
3/24:174/24:175/24:176/24:177/24:178/24:179/24:180/24:181/24:182/24:183N/24:184/24:185N/24:186/24:187/24:189/24:190/24:192/24:193/24:194/24:195/24:196/24:197/24:198/24:199/24:200/24:201/24:202/24:203/24:
204/24:205/24:206/24:207/24:208/24:209/24:210/24:212/24:213/24:214/24:215/24:216/24:217/24:218/24:219/24:220/24:221/24:223/24:224/24:225/24:226/24:227/24:229/24:230/24:231/24:232N/24:234/24:235/24:236/2
4:237/24:238/24:239/24:240N/24:241/24:242/24:243/24:244/24:245/24:246/24:247/24:248/24:249/24:250/24:
251/24:252N/24:253/24:254/24:255/24:256/24:257/24:258/24:259/24:260/24:261/24:262/24:263/24:264/24:26
5/24:266/24:267/24:268/24:269/24:270/24:271/24:272/24:273/24:274/24:275/24:276/24:277/24:278N/24:279/
24:280/24:281/24:282/24:283/24:284/24:285/24:286/24:287/24:288/24:289/24:290/24:292/24:293/24:294Q

XX2:=:33:01/33:03/33:03Q/33:04/33:05/33:06/33:07/33:0
8/33:09/33:10/33:11/33:12/33:14/33:15/33:16/33:17/33:
18/33:19/33:20/33:22/33:23/33:25/33:26/33:27/33:28/33:29/33:30/33:31/33:32/33:33/33:34/33:35/33:36/33:37/3
3:39/33:40/33:41/33:42/33:43/33:44/33:45/33:46/33:47/
33:49/33:50/33:52/33:54/33:55/33:56/33:57/33:58/33:59/33:60/33:62/33:63/33:64/33:65/33:66/33:67/33:68/33:7
0/33:71/33:72/33:73N/33:74N/33:75/33:76/33:77/33:78/3
3:79/33:80N/33:81/33:82/33:83/33:84/33:85/33:87/33:88/33:89/33:90/33:91/33:93/33:94/33:95

XX1:=:24:02/24:02Q/24:21/24:27/24:40N/24:48N/24:49/24:69/24:70/24:74/24:76/24:78/24:79/24:80/24:83N/24:86N/24:93/24:101/24:105/24:110/24:111/24:114/24:116/24:117/24:118/24:120/24:1
22/24:123/24:126/24:127/24:128/24:132N/24:135/24:137/24:140/24:141/24:142/24:144/24:147/24:150/24:152/24:153/24:154/24:155N/24:157/24:158N/24:159/24:161/24:163N/24:165/24:166/24:16
9/24:170/24:171/24:172/24:173/24:175/24:176/24:178/24:179/24:180/24:181/24:183N/24:185N/24:186/24:187/24:192/24:193/24:195/24:196/24:198/24:202/24:205/24:206/24:209/24:212/24:216/2
4:217/24:221/24:222N/24:223/24:224/24:225/24:231/24:232N/24:233/24:234/24:235/24:236/24:23
7/24:238/24:242/24:243/24:244/24:245/24:247/24:249/24:250/24:251/24:253/24:254/24:257/24:2
58/24:261/24:263/24:264/24:265/24:266/24:267/24:268/24:269/24:270/24:271/24:272/24:275/24:276/24:279/24:280/24:283/24:284/24:286/24:287/24:292/24:295/24:297/24:303N/24:305/24:306/2
4:311/24:312N

AJAFR:=:33:03/33:03Q/33:06/33:15/33:25/33:31/33:40/33:44/33:74N/33:77/33:78/33:7
9/33:80N/33:81/33:82/33:84/33:85/33:95

検査の目的に応じて試薬の選択を

SSO法(LABTypeSSO)SSO法(LABType XR)

XX1:=:24:02/24:292/24:295/24:303N/24:306/24:3
GNHZ:=:03/95
11NGS

24:02:01:01

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

33:03:01:01
24

抗HLA抗体検査

25

なぜ抗体検査を行うのか• 移植前‒ 患者の体内にドナーに対する抗体が存在することが移植後の生着に影響を及ぼす• 移植後‒ DSA(Donor Specific Antibody)の存在は生着率の低下につながる‒ 定期的に抗体検査を行いDSA発現の有無をモニタリングすることが重要移植前後で抗体の有無を検査することが患者様の予後の改善につながる

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

26

DSAとは• Donor Specific Antibodyの略• DSAの存在は臓器生着に影響している• LABScreen Single Antigen試薬により算出されるnMFIの値(normalized Mean Fluorescence Intensity：One Lambda）をもとにDSAの有無を議論されることが主流

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

27

保険収載内容 (2024/4時点)• 臓器移植
実施時期

検査内容

点数

移植前

抗HLA抗体検査

4000点

移植後スクリーニング検査（抗体の有無を見る）

1000点

抗体特異性同定検査（スクリーニング検査で陽性の場合のみ、陽性のアレルを同定する）

4850点• 造血幹細胞移植‒ 移植前に抗HLA抗体検査を実施した場合に4000点• 全ての検査において、検査方法・試薬の指定はない
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

28

抗HLA抗体検査の歴史• より大量検体へ• より高感度へ• より高精度へ

LAT（ELISA）

FlowPRA（フローサイトメーター）

LABScreen（Luminexビーズ）

LCT（細胞障害性試験）
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29

LCT（リンパ球細胞障害試験）
生細胞死細胞• 最も生体内の反応に近い• 生細胞が必要になるため、実臨床において検査ができないこともある

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

30

FlowPRA• フローサイトメーターを用いて抗HLA抗体の有無を判断• 試薬の種類‒ FlowPRA Screening‒ FlowPRA Single Antigen
ラテックスビーズ

陰性
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

陽性31

FlowPRA解析

検体血清のネガティブピークがはっきりと分かる場合、NC 血清で設定したM1をそのまま用いるのではなく、M2を再設定して%PRA を求める

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

32

LABScreen試薬名目的

LABScreen Mixed

スクリーニング

LABScreen PRA

スクリーニング
ある程度の特異性、%PRAの算出

LABScreen Single Antigen 抗体特異性の同定
DSA(Donor Specific Antibody)の検出
nMFI値の算出
・LABScreen Single
Antigen Supplement
・LABScreen Single
Antigen ExPlex(LABScan3D専用)

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

ルミネックス
ビーズ

抗体の同定
DSA(Donor Specific Antibody)の検出
nMFI値の算出
日本人に特有なHLA抗原を多く含む

33

Mixed, PRA, Single Antigenの違い
スクリーニング試薬

特異性同定試薬

Mixed

PRA

Single Antigen

17種ビーズClass I :56種ビーズ

Class I :97種ビーズ

Class II :35種ビーズ
B13Class II :95種ビーズ

A11

B62

A2

Class I : 3パネル/1beads

1パネル/１beads

Class II : 5パネル/1beads細胞株からの抽出抗原

1抗原/1beads

組換え体からの精製抗原*1パネル＝1人分のハプロタイプ
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

34

LABScreenの測定装置（LABScan/医療機器）
名称

ビーズ数

試薬

100色（10×10）

ExPlexは使用不可

500色（10×10×5）

全て使用可能LABScanシステム（届出番号：13B3X10148000010）

LABScan
3Dシステム（届出番号：13B3X10148000020）

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

35

LABScreenの手技のポイント• 検体の前処理として凍結融解と遠心は必ず行う‒ 非特異反応を減らすために、できるだけきれいな検体を使用する• 検体は血清を推奨• ビーズ試薬はボルテックス後にピペッティングで混合• Wash Bufferの希釈は用時調整

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

36

LABScreen 検体の前処理• NCビーズ‒ NBG RatioやnMFIの値の算出に使用されるため、できるだけ低くすることが大切‒ 抗HLA抗体以外の物質の影響で高くなる• PCビーズ‒ 低い場合は、本来存在する抗HLA抗体がビーズに結合していない可能性(偽陰性)がある‒ 補体活性が高いことやIgMが含まれることが原因で低くなる
方法（赤字は実施を推奨）

目的

結果に与える影響

凍結融解、Adsorb Out、FBS、
超高速遠心

非特異タンパクを取り除く

NCビーズの値を下げる

EDTA

補体活性型抗体の影響を取り除く

PCビーズの値を上げる

DTT

IgMの影響を取り除く

PCビーズの値を上げる

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

37

LABScreen解析• One LambdaのNC血清を使用• 検査成立基準の確認••••

MinBead Cnt : 50以上
NC : 1500以下
PC : 500以上
PC/NC Ratio : 2以上• Single Antigen ExPlex使用時はカタログファイルをHLA Fuison内で結合してからデータをインポート• Single AntigenのDP及びDQのビーズには2種類のHLA抗原が結合しているため、α鎖とβ鎖のどちらに反応しているのかを判断することが必要• 患者とドナーのタイピング結果も活用しDSAが産生され始めていることを見逃さない• 必要に応じてエピトープ解析を活用する

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

38

検査精度向上のために

HLA Fusion -解析ファイル• 最新ファイルを使用• ベリタスのホームページよりダウンロード可能‒ https://www.veritastk.co.jp/hla/soft_file.html• HLA Fusionのバージョンの違いによる解析結果の違いはない‒ 最新のバージョンはFusion4.6.1• 日本人フィルタはインポート後に解析に使用するための設定を行う‒ 設定方法は次のページを参照
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

40

HLA Fusion -日本人フィルタの設定
LABType

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

MicroSSP

41

HLA Fusion -フィルタの変更方法• 解析画面で検体ごとにフィルタを変更ができる• 日本人以外の検体はCWDフィルタの使用を推奨
日本人フィルタ使用

Set Configボタンをクリック

フィルタを選択CWDフィルタ使用

CWDフィルタの表示
青：Common
ピンク：Well Document

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

42タイピング検査結果• DRとDQの連鎖、ハプロタイプを確認• 日本組織適合性学会の報告ルールに準じて報告する場合は下記を参照‒ http://jshi.umin.ac.jp/standarization/file/JSHI-hyoki-2017-2.pdf‒ 例)Ambiguityは頻度の高い順に記載、組み合わせも加味して記載、ヌルの場合は「N」の表記を忘れない（HLA検査に必要なHLAの基礎知識 中島様講演会資料抜粋）
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43

ハプロタイプの確認(日本人の場合)• HLA研究所様のホームページ
https://hla.or.jp/med/haplo_tools/• 造血幹細胞移植情報サービス
https://www.bs.jrc.or.jp/bmdc/donorregistrant/m2_03_00_statistics.html

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

44

抗体検査の考え方• 抗HLA抗体はHLA抗原の特異的な構造（＝アミノ酸配列）に対して産生される• HLA抗原に特異的に結合するのではなく、HLA抗原が有するエプレットに特異的に結合する
エプレット 1
エプレット 3

HLA抗原細胞エプレット 2
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

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CREG（Cross Reactive Group）
Aローカス

実際に見つかった抗血清の特異性
A1+A36
A1+A36+A80+
A2A3+A24
A3+A11
A30+A31
A31+A33
A2+A24
A2+A68+A69
A2+B57+B58
B62+B75
B62+B57
B35+51+B53
B51+B52
B38+B39+B67
B44+B45
B7+B27B7+B60+B48
B60+B61+B13B54+B55
B55+B56 etc.

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

A36

A1A3A11A80

A30A31A29A26A43

A23A2A69

A66

A68

A34A33A25

A32A74

B50

B45

B41

B61

B49

B44

B13

B60

A24

整理
統合Bローカス
B46

B57

B58

B76

B62

B63

B72

B75

B77

B47
B37

B71

B78

B64
B35

B53

B51

B52

B18

B59

B65
B39

B27

B8
B67

B48
B81

B7

B73

B42

B82

B55
B56

B54

B38

* Nakajima F. MHC Vol.13, No2: 200646

CREGvsEplet

交差反応性グループ
抗体特異性に基づく抗原の分類で、抗原をグループ化して類似性を図式化したもの
抗体の反応性に基づく分類
旧来からの経験則
実際の反応説明のつかない反応もある

抗原決定基
抗原のアミノ酸配列に基づく抗体認識部位の分類で、アミノ酸の位置と種類で示す抗原の設計図に基づく分類
HLA遺伝子解析で明確化
反応の予測予測どおりに反応しない場合もある

Aローカス
A36A1A3A11A80A30A43A23A2A69A66A68A34A33A25A32

α1-domain

Position

11123333333444455566666777777788889
37917940123456134824623567034678901230

9999000000111111123344444444555
2579256789012345671823456789012

Consensus

HYFSREADTQFVRFAQRRIQGQERNVHTDVDLGTLRGASIMYDSDGRFLRGYHQDKRMITKRKWEAAHV

HLA-A*01:01
HLA-A*02:01
HLA-A*11:01
HLA-A*24:02
HLA-A*26:01
HLA-A*30:01
HLA-A*31:01
HLA-A*33:03----------------K--------M---AN------D---------------------G--K---H----------Y-----------------------Q----------D--S------------------E-GK----EN-RIALR--Y------------------RN------AN------D--S-S---------------R-----Q------------T-----------------R------I-----------T------------------RN----I-----------------------------------------

A31

A29
A26

HLA allele

A24

A74

* Nakajima F. MHC Vol.13, No2: 2006（一部改変）

56R

73I

抗原抗体反応は1:1の反応ではなく、1つの抗体は複数の抗原と反応する
HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

47

動画の紹介• 今日から始めるHLAシリーズ‒ Vol.2 HLA抗体検査入門‒ Vol.3 マイクロSSP入門‒ Vol.4 LABType入門
https://www.veritastk.co.jp/sciencelibrary/learning/hla-video-compilation.html

HLA検査のエッセンス Vol.1 第2部

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ご清聴ありがとうございました
ご質問はございますでしょうか