金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究

東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター

伊藤大知

Peritoneal metastasis is frequently found at a late stage of stomach and ovarian cancer. Recently intraperitoneal
administration of anticancer drugs such as paclitaxel and cisplatin (CDDP) is expected because relatively high concentrationof the drugs can be administered to disseminated cancer cells. i.p. of paclitaxel is now clinically used as an advanced medical
treatment in Japan. However, the clearance of CDDP is much faster than that of paclitaxel, thus new approach to deliver
CDDP to peritoneal nodules are expected. It is well known that high concentration of hyaluronan exists in peritoneum, thus
hyaluronan (HA) -based drug carrier for CDDP is potentially biocompatible in peritoneum. In addition, the affinitiy between
HA and CD44, which is highly expressed in cancer cells, can be utilized to delivery CDDP to cancer cells selectively.
Therefore, we have developed nanogel composed of iminodiacetic acid-modified HA (HA-IDA) and CDDP. In the present
research, we investigate the targeting effect of the nanogel in vitro using human disseminated stomach cancer cell line,
MKN45P, and human mesothelium cell line, Met-5A. Moreover, we made stomach cancer cell spheroids of MKN74 using
PDMS-bottom plate, then clarified the efficient penetration of the nanogel compared to HA-IDA without CDDP. HA has
excellent water-retention ability, so is utilized widely in cosmetic industry nowdays. The knowledge from the present
research will contribute not only to medical applications but also cosmetic applications.

１．緒言

ヒアルロン酸（HA）は、N －アセチルグルコサミンとグルコン酸が交互に結合した多糖類であり、腹腔液に高濃度で含まれ消化器等の腹腔臓器同士の摩擦を低減する潤滑油的な働きをしていることが知られている。
腹腔内で起こる様々な疾患の中でも、がんの腹膜播種は生命に直結する予後の非常に悪い転移がんである（図１）。
原発胃がんや卵巣がんが臓器漿膜を超えて浸潤し、腹腔内に飛散したがん細胞は腹腔中を拡散し、腹腔内の様々な場所に転移巣である播種巣を形成する。
期待される治療法の一つが抗がん剤を播種巣近傍に高濃度の抗がん剤を投与可能な腹腔投与であり、タキソールの腹腔投与は先進医療として認められている。一方で、セカンドラインとして期待されるシスプラチン（CDDP）は、

図１

腹膜播種（a）とヒアルロン酸（b）

腹腔からのクリアランスが速く、インフュージョンポンプを使った持続投与が試みられているが、効果は十分とは言発に成功した（図 2）。難治固形がんでは、DDS 製剤の組い難く、新たな投与法が期待されている。

織浸透性も重要である。そこで本研究では、HA-IDA ／このため我々は、腹腔液に含まれる HA の生体適合性に着目し、HA をドラッグキャリアとした CDDP 送達システ

CDDP ナノゲルあるいは HA-IDA の抗がん特性や播種巣浸透性の検討を行った。

ムの研究を行ってきた。とりわけ CDDP を二座配位する

２．実

イミノ二酢酸を修飾したヒアルロン酸 HA-IDA の合成を行い、HA-IDA と CDDP から成る新たなナノゲル製剤の開験

2. 1. HA-IDA 及び HA-MAの合成
HA 0.5 g（Mw=100kDa） を 100mL の 純 水 に 溶 解 し、Development of new hyaluronan derivatives
modified with metal-ion ligands and theirtissue penetration
Taichi Ito
Center for Disease Biology and IntegrativeMedicine
School of Medicine, The University ofTokyoEDCI 0.78 g（DMSO3mL ／純水 3 mL 混合液に溶解）を添加し、４時間攪拌を行った。さらにイミノ二酢酸（IDA）
1.2 g と NaOH（1N）10 mL をそれぞれ添加し、一晩撹拌した。
さ ら に 透 析（Spectra/Por MWCO=6000 ～ 8000Da） 膜を用いて純水で透析し、凍結乾燥を行った。重水中にてNMR 測定を行い、修飾率を決定した。

−8−

金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究

図２

HA-IDA/CDDP ナノゲルのコンセプト

IDA の代わりにマロン酸（MA）を用いて、同様のス樹立されたもので、高度な転移性を持つ細胞株である。まキームでマロン酸修飾ヒアルロン酸 HA-MA を合成した。

た、腹腔の腹膜・臓器漿膜を覆っている中皮細胞の株化細IDA が CDDP と錯体配位すると 8 員環を形成する一方で、胞である Met-5A（ATCC；CRL-9444）を用いた。
ま ず MKN45P に 対 し て、HA-IDA 及 び CMC-IDA を

MA は 6 員環を形成する。このため MA の方が IDA よりも投与し、その取り込みを共焦点顕微鏡によって観察しキレート形成定数が高いことが予想される。
またHAの代わりにカルボキシメチルセルロース（CMC）た。さらに HA-IDA/CDDP ナノゲルを調製し、同様に共を用い、CMC-IDA を作製した。CMC は HA と非常に似た焦点顕微鏡によって観察した。さらに HA-IDA/CDDP ナ

物性を示す一方で、ヒト細胞上の膜レセプターとは相互作

ノ ゲ ル、HA-MA/CDDP ナ ノ ゲ ル、HA/CDDP ナ ノ ゲ ル、用しない bio-inert な物質であることが知られている。このCMC-IDA/CDDP ナノゲルを作製し、0.1mg/mL の濃度でため物性は類似しつつ、生物学的が異なる HA の対照物質

MKN45P に添加 4 時間後、FACS 測定によって取り込みとして用いられる。

量を比較した。
さらにMKN45PまたはMet-5Aを 24 穴プレートで培養し、引き続き、HA-IDA（または HA, CMC, CMC-IDA）0.20 g
を 15mL 純水に溶解し、EtOH を HA が凝集しないように

ナノゲルを投与後、1 日後に MTT assay によって殺がん

微 量 ず つ 滴 下 し た。 さ ら に 2-chloro-1-methylpyridinium

細胞効果を検証した。

iodide 66 mg を添加した後、Triethylamine 70µL 滴下し、FTSC 4.0 mgを添加して、110℃で 24 時間還流した。最後に、

2. 4. スフィロイド培養とナノゲルの浸透実験

純水／ NaCl 水溶液で透析の後に、凍結乾燥を行って、蛍光測定により修飾率を決定した。

共同研究者である東京大学生産技術研究所・酒井教授の指導の下、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ハニカムマイクロウエルシートを既報に従い、ソフトリソグラフィー
1）

2. 2. ナノゲル調製法によって作製した 。良く洗浄したシリコンウエハ上にHA-IDA 5mg/mL 溶液（母液 A）と CDDP 15mg/mL（母フォトレジスト（SU-8；MicroChem, Newton, MA）をス液 B）溶液をマイクロチューブ内で混合し、ヒートブロッ

ピンコーティングにより塗布し、フォトマスクを用いて露ク 95 ℃で加熱した。これを 20 分間氷上で冷却し、純水で光後、現像液で処理し、CF3 イオンを利用した反応性イ透析した後凍結乾燥する事によりナノゲルを作製した。原

オンエッチング（装置：SAMCO, Model RIE-10NR）を行

子吸光によって CDDP 含有量を決定し、ナノゲル PBS 溶った後に剥離して、モールドを作製した。PDMS と触媒液の粒子径を DLS（動的光散乱）によって測定した。

（Silpot 184, Dow Corning, Tokyo, Japan）を 9：1 で混合+してモールドに流し込み、75 ℃で 2 時間加熱後に剥離して、

2. 3. ナノゲルのがん細胞標的性の検証

酸素プラズマで 10 秒間処理後、親水化コーティングのた胃がん腹膜播種細胞株である MKN45P は、共同研究者

めに MPC ポリマー（Lipidure-CR1701, Nichiyu）のエタノの東京大学附属病院腫瘍外科・北山准教授によって作製さール溶液に浸漬して、PDMS ハニカムシートを得た。ハニれたものを用いた。MKN45 をヌードマウスに腹腔投与し、カムシートを、24 穴プレートと同様のフレームの底にセ回収された腹水から培養、再投与を繰り返すことによってットし、酸素透過性 24 穴プレートを作製した（図 3）。

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３．結果

3. 1. ナノゲルのキャラクタリゼーション
HA-IDA の IDA 部位のメチレン基、HA のアセチル基のプロトン積分値の比から、修飾率を決定した（図 4 左）。
IDA 修飾率は 40% 程度まで向上可能であり、本研究ではHA-IDA（IDA 修飾率 35%）と HA-MA（MA 修飾率 36%）を用いた。
HA-IDA、HA-MA、及び対照物質としての未修飾の HAを CDDP と混合し、加熱してナノゲルを得た。未修飾 HAもグルクロン酸のカルボキシル基とキレートすることによってナノゲル化する。DLS 測定によって、PBS 中では HAが 70 mm 程度に対して、ナノゲル化することによって 10〜 20 mm まで粒子径が変化した。またキレート配位子の種類によって粒子径が異なることが示され、ナノゲルサイズが HA-MA ＞ HA-IDA ＞ HA となった。CDDP の水への溶解度はそれほど大きくないため、錯体形成定数が高い MA
図３ 作製した PDMS ハニカム培養プレート（上）と胃がん細胞株：MKN74 を用いて作製したスフィロイド得られた培養プレートは底面素材に PDMS を用いていの CDDP 配位数が一番多く、より疎水化して最も小さいサイズを取ったものと考えられる。

3. 2. ナノゲルのがん細胞標的性るために、通常のポリスチレンディッシュの 80 倍の酸素

CD44 は HA の 6 糖分を認識すると言われている。このを供給することが可能で、生理活性が高く、細胞密度が高ため HA の CD44 結合能は、化学修飾によって即座に失わいスフィロイドを作製することが可能である。

れるものではないが、HA 主鎖への化学修飾率が増加する

本研究では PDMS ハニカム培養プレートを用いて、胃−62に従って、親和性は低下していくことが知られている。さ

がん細胞株である MKN74 を 5×10 cells/cm で播種し、らに HA を介した CD44 のラフト化促進、あるいは低分5 日間培養することによって、直径 200 mm 程度のスフィ

子 HA や可溶性 CD44 との競合によるラフト構造の消滅が、ロイドを得た。さらに蛍光標識を行った HA-IDA/CDDP細胞の活性化や静止期への移行と、密接に関連しているとナ ノ ゲ ル、 及 び CMC-IDA/CDDP ナ ノ ゲ ル を 0.1mg/mL言われている。また細胞種により活性化と静止化は刺激の濃度で添加し、10 時間後に共焦点顕微鏡観察によってに対して逆転するケースも報告されている。このため HA-ナノゲルの浸透速度を評価した。

IDA やナノゲルが確かにがん細胞に取り込まれることを図 4 HA-IDA の 1H NMR（左図）と CDDP と混合・加熱・透析を行って作製した各ナノゲルの動的光散乱により測定した粒子径（右図）− 10 −

金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究

CDDP と錯形成をさせて複合化させても、効率的にエンド示すことが重要である。
HA-IDA と CMC-IDA の取り込み共焦点顕微鏡写真を図サイトーシスされることを示した。

5 に示す。CMC-IDA と比較して、HA-IDA が活発に播種

さらに FACS によって各種ナノゲルの取り込み量を図 7細胞株に取り込まれていることが観察される。さらに HA-に示す。PBS 中 4 時間後の時点で各ナノゲルは CDDP をIDA/CDDP ナノゲルの取り込み過程を共焦点顕微鏡で観十分に担持している（data not shown）。まず CD44 発現察した結果を図 6 に示す。CDDP と錯体配位しナノゲル化量が高かった播種細胞株 MKN45P で取り込み量が多い一しても、高いエンドサイトーシス効率を示した。すなわ方で、中皮細胞株 Met-5A では取り込み量が少ない。またち、本研究においては HA に IDA 修飾を施しても、さらにCMC-IDA/CDDP ナノゲルの取り込み量が一番少ない。
一方で興味深いことに、リガンドポリマーとして HA を用いた時より、化学修飾を施した HA-MA、HA-IDA を用いたナノゲルの取り込み効率が高くなった。
この点については、ナノゲルの構造とエンドサイトーシスの機構の関係をより詳細に調べていく必要がある。
以上の結果を踏まえ、MKN45P と Met5A に対してナノゲルを添加し、MTTassay を行った結果を図 8 に示す。CMCIDA/CDDP ナノゲルは若干毒性が低下するものの、CDDP とほぼ同様の用量作用曲線を描く。これに対して HA-IDA/
CDDP ナ ノ ゲ ル と HA-MA/CDDP ナ ノゲルは、播種細胞に対しては遊離 CDDPと同程度かそれ以上の殺細胞効果を発現するのに対し、中皮細胞に対しては非常に低い毒性を示し、がん細胞選択性を発現して著しく副作用を低減できる可能性

図5

図6が示唆された。

HA-IDA 及び CMC-IDA の MKN45P 取り込み効率

ナノゲルの MKN45P 取り込み過程の共焦点顕微鏡観察− 11 −

図7

各ナノゲルの MKN45P 取り込み量の比較コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図8

各ナノゲルの腹膜播種細胞株 MKN45P（左）と中皮細胞株 Met-5A（右）への MTT assay の結果

図9MKN74 スフィロイド浸透性：HA-IDA（上）及び HA-IDA/CDDP ナノゲル（下）３．３．胃がん細胞スフィロイドへのナノゲル浸透性度を制御することは決定的に重要である。本研究では、プ

例え in vitro で高い効果を示しても、最終的に in vivo でレート培養を用いた通常の in vitro 実験と動物モデルを用高い効果を示さなければ意義ある研究とは言えない。腹膜いた in vivo 実験をブリッジするものとして、スフィロイ播種に対する抗がん剤の腹腔投与で期待することは、腹腔ドを用いたナノゲルの浸透性評価を試みた。

から播種巣への抗がん剤の直接的な浸透による送達である。

実験結果を図 9 に示す。まず HA-IDA のみをスフィロイ全身循環に移行してから血流を介して播種巣に抗がん剤がド外部から添加した所、10 時間後でもスフィロイド内部送達されるならば、静脈投与と同等の効果しか得られない。

までポリマーが拡散していない。一方で、CDDP とキレー

このために、外部境界から播種巣内部へのナノゲル浸透速

トさせ HA-IDA/CDDP ナノゲル化することによってスフ− 12 −

金属イオン配位子修飾ヒアルロン酸の開発と組織浸透性に関する研究ィロイド中心部までナノゲルが拡散するとともに、プレー二酢酸は EDTA を丁度半分にしたと考えられる分子であト実験の結果とも良く一致してエンドサイトーシス効率り、潜在的に生体適合性が高い分子であると考えられる。

も非常に高いことが観察された。これは HA-IDA の CDDP

実際合成した HA-IDA そのものは、繰り返し実験を行っの配位の有無により、サイズや脂溶性が劇的に変化するた

た結果 in vitro と in vivo での毒性は非常に低いことが明らめであると考えられる。

かになった。合成スキームと化学構造の単純さから、将来４．考臨床で十分に利用可能な材料となりうる。一方でこのポリ察

マーとシスプラチン（CDDP）から作製したナノゲルの機

ヒアルロン酸に二座配位子であるイミノ二酢酸（IDA）

能は、本研究で明らかにしたように、腹膜播種の腹腔投与やマロン酸（MA）を修飾したヒアルロン酸誘導体を開発

DDS を実現する上で様々な利点を持っていることが明らし、CDDP とのキレート形成により自発的に組みあがるナかになった。今後は他のがん種への適用検討も有益である

ノゲルの開発を行って、IDA と MA という異なったリガと考える。

ンドを用いることにより、ナノゲルのサイズ等が異なるこ

さらに本研究とコスメトロジー分野への貢献を総括すとを明らかにした。さらにナノゲルはがん細胞に効率的にる。一般に HA の組織浸透性は非常に低く、分子量 1kDa

取り込まれ、遊離 CDDP と同等かそれ以上の抗がん特性以下の HA の角質透過性などが報告されているが、本研究を発揮するのに対して、中皮細胞に対する毒性を劇的に低で用いている 100kDa の HA が組織を浸透していくことは減できることを初めて明らかにした。

ない。しかしイオンとキレートすることによって、組織のさらに一歩踏み込み、高酸素透過性培養プレートを用い間質中を高速拡散することが示唆された。近年、ヒアルロて胃がん細胞スフィロイドを作製することに成功し、スフン酸は保水性を高める化粧品材料として需要が増加していィロイド中でナノゲルの拡散性が劇的に向上することも見る。HA をイオンや疎水性物質と複合化して、分子量が高出した。現在 in vitro の結果に基づき、動物実験の検討を

い HA の回転半径を抑え、ナノサイズ化することにより組開始している。

織浸透性を制御する、と考えれば、本研究は DDS の分野

ヒアルロン酸の CD44 との結合、エンドサイトーシス、分解、細胞内情報伝達は、まだまだ不明な点が多く生理学に止まらず、広く化粧品の R&D にも応用可能な知見であると考えられる。

的な研究が精力的に行われている。ナノゲルが効率的に６．謝エンドサイトーシスされる機構については、ヒアルロン

辞酸分解酵素、エンドサイトーシス阻害剤やオリゴ HA、抗本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりCD44 等を用いた更なる研究の深化が必要である。またナご援助を賜りましたことを感謝申し上げます。ヒアルロンノゲルが間質中を拡散する機構についても、FCS 等を用酸をご供与頂いたキッコーマンケミファに感謝致します。

いたより詳細な研究が期待される。

またスフィロイド作製プレートの作製をご指導頂いた東京

５．総大学生産技術研究所・酒井康行教授、腹膜播種細胞株をご括供与頂いた東京大学医学部付属病院・北山丈二准教授に感本研究では、ヒアルロン酸（HA）にイミノ二酢酸（IDA）謝致します。最後に、本研究の実験を行ったバイオエンジ等を修飾した非常に単純な化学合成で作製した HA 誘導体

ニアリング専攻修士課程 2 年平本翔大君、JSPS博士研究員・（HA-IDA）を用いた研究である。EDTA 等はかなりの高太田誠一博士に感謝致します。

濃度を静脈投与しても安全なことがわかっている。イミノ− 13 −