【研究報告】（自然科学部門）

ウイルス感染から家畜を守る機能性飼料添加剤の開発

中

村美紀子

（現 富士レビオ株式会社研究員）

山口大学大学研究推進機構産学公連携センター

緒言

学術研究員

細胞が用いられている。しかし鶏卵培養法では、生産開ウイルスは、過去から将来にわたり永続する人類最大

始 6 か月前からニワトリを育成し有精卵を準備する必要の脅威であるといわれている。免疫不全を引き起こすがあるため、緊急の生産には対応できないうえ、鶏卵でHIV や致死性の高いエボラウイルス、感染力が高く世のウイルスの継代・馴化の過程で抗原性が変化しワクチ界中に患者が蔓延することが起こるインフルエンザ等、ン効果が低くなる可能性が指摘されている。また、ウイ

我々の世界は様々なウイルスの脅威にさらされている。

ルス感染初代・株化動物細胞の場合は、病原体に依存ししかしこれは家畜にとっても同様であり、世界のあらゆた製造法や品質管理を確立しなければならず、こちらる場所でウイルスに感染した家畜の処理が大規模に行わも、継代・馴化の過程で抗原性が変化しワクチン効果がれ、社会問題となっている。特に家畜におけるウイルス低くなる可能性が指摘されている。一方、微生物による伝播を止めることは難しく、感染地一帯の全家畜処理で遺伝子組換えワクチン生産は、抗原変異がなく流行株に感染を止めるしか方法がない。

マッチしたワクチン生産が可能なうえ、滅菌処理された

日本において鳥インフルエンザが発生すると、鶏舎消密閉環境化で厳密に管理・製造が可能である。そのた

毒、鶏、鶏糞、飼料の処理、卵の回収、従業員等への対め、ワクチン製造には微生物による遺伝子組換えワクチ

人対策、地下水汚染対策、移動制限などによる食流通シン生産が最も有効と考えられる。

ステムの混乱と、経済を含め甚大な被害がもたらされ微生物である酵母に B 型肝炎ウイルスの外殻タンパクる。しかも、感染ルートを特定できないので、鳥インフ質を遺伝子組換えにより生産させた遺伝子組換え B 型肝ルエンザ発生の予防策は試行錯誤が現状である。例え炎ワクチンが 1988 年から日本で開発され販売されていば、従業員などが野鳥との接触を避けること、野鳥や野る。我が国における遺伝子組換え技術の画期的な成果でネズミの侵入を防げる鶏舎を整備すること、発生国からあるが、微生物による遺伝子組換えワクチンは B 型肝炎の鶏肉等の輸入禁止、発生国からの帰国者の靴の洗浄徹

ウイルスに限られており、インフルエンザなど、他のワ底等、感染ルートを予測してウイルスを持ち込まない対クチンにはいまだ応用されていない。

処方法に今の予防方法は終始している。そのため、家畜

酵母は、パンやお酒、酵母エキスとして食品添加物にをウイルス感染から守る積極的な予防策を開発すること使用されているだけでなく、整腸剤として家畜の飼料添が重要である。

加物としても使用されており、酵母を食することに対しヒトにおいては、ワクチンの予防接種が感染予防としての安全性はすでに確保されている。もし、ワクチン効て行われる。予防接種とは、弱毒化や不活化したウイル果のあるウイルスタンパク質を含有する酵母を作製する

スやウイルスのタンパク質の一部をあらかじめ健常者にことができれば、その酵母を飼料に混ぜることで、飼料接種し、そのウイルスに対する抗体をつくらせることでを食した家畜は、体内でウイルスに対する免疫をつけるある。これにより、事前に抗体が準備されたヒトは本物ことができ、ウイルス感染から家畜を守ることが期待でのウイルスが感染した時にいち早く抗体が産生され、ウきる（図 1）。そこで本研究では、栄養価が高くワクチイルスに対応できるので症状が軽いか、現れない。ここン効果も期待できるウイルスタンパク質高含有酵母の開で接種する弱毒化あるいは不活化したウイルスやウイル発を目指した。

スタンパク質の一部のことをワクチンと呼び、そのワクチンの生産の多くは鶏卵やウイルス感染初代・株化動物
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村美紀子

HEK293 細胞での HBsL 発現

4.

HEK293 細胞に PCR で作製した GFP-HBsL 遺伝子コンストラクトをトランスフェクションし、24 時間後にGFP-HBsL の発現を蛍光顕微鏡で観察した。また、48時間後に PBS で 2 回リンスし、細胞に直接 SDS sample
buﬀer を加え、細胞抽出液を調整した。GFP-HBsL の発
現を western blotting により確認した。1 次抗体にモノクローナル抗 GFP 抗体（Santa Cruz）、2 次抗体に HRP
標 識 抗 マ ウ ス IgG 抗 体（Jackson ImmunoResearchLab）、シグナル検出に、ImmunoStar Zeta（Wako）を図1用いた。

ワクチンとなるウイルスタンパク質を高生産する酵母を開発して、その酵母を家畜飼料に添加し、日常的に家畜動物に食べさせることで、ウイルス感染から家畜動物を守る。

結果
B 型肝炎ウイルス外殻タンパク質は酵母内で分解さ

1.

れる．
実験方法
1.

組換えワクチン作製のために、B 型肝炎ウイルスの外実験材料殻タンパク質である HBsL を用いた。B 型肝炎ウイルスの外殻タンパク質は、酵母で大量発現でき、それにより酵 母 は、 パ ン や お 酒 に も 使 わ れ る（ワクチンが生産できることが知られている4）。そこでま）、および、耐熱性酵母である（）を用いた。

ず、酵母で高発現が知られている過剰発現

ヒト胎児腎細胞 HEK293 細胞は山口大学遺伝子実験施設

用プロモータを用いて酵母で発現させたが、SDS-PAGEから入手した。プライマーは、北海道システムサイエンにより発現が検出できなかった。発現が検出できない理スまたはユーロフィンジェノミクスより購入した。導入由を調べるため、次に、緑色に光る蛍光タンパク質

用 遺 伝 子 は、KOD plus（Toyobo）、KOD FX Neo

GFP を遺伝子工学的に融合させ（GFP:HBsL）、発現さ（Toyobo）、GXL（Takara）のいずれかのポリメラーゼせた。GFP により、HBsL 発現を蛍光顕微鏡下で観察がを用いて、各社の推奨プロトコールに準じて PCR を行可能になる。その結果、GFP と HBsL を融合させて発現い用意した。

させると、誘導 4 時間後では GFP:HBsL の緑色が観察されたが、24 時間後は緑色が薄い、または観察されない

2.

形質転換およびトランスフェクション結果であった。このことから、GFP:HBsL を発現するでの形質転換には、PEG-リチウム形質転1）換 法 を 用 い た。

が、発現 24 時間後には分解がされてしまうことがわ

で の 形 質 転 換 に は、かった（図 2, GFP:HBsL）。4 時間後の GFP:HBsL は、核Abdel-Banat らが報告した方法2）を用いた。HEK293 細周辺と細胞膜周辺に局在が観察されたことから、小胞体胞へのトランスフェクションには、以前我々が報告したにいったん局在して、その後分解されることが示唆され方法3）を用いた。

た。
次に、HBsL のどの領域が存在すると分解されるのか

3.

ガラクトース誘導実験を調べるために、HBsL の C 末側を削除した GFP:HBsL

酵母を YPD 培地で一晩培養し、その培養液に最終濃ΔC を作製したところ、これは分解されなかった（図 2,度 2％になるように 10％ガラクトース溶液を添加し誘導

GFP:HBsLΔC）。このことから、C 末側の配列があるとを開始した。0、4、6、24、48 時間目と経時的にサンプ

HBsL は分解されることが明らかになった。HBsL の C

リングを行い、GFP-HBsL および RFP-HBsL の発現を末側には疎水性リッチのペプチド配列が 4 か所（TM1,それぞれ蛍光顕微鏡（Axio Imager, Zeiss）で観察した。

TM2, TM3, TM4）存在し、これらが膜貫通領域となると予想されている。図 2 に示したように GFP:HBsL はいったん小胞体に局在してから分解されることから、膜2ウイルス感染から家畜を守る機能性飼料添加剤の開発

図2

B 型肝炎ウイルス外殻タンパク質 HBsL の酵母における発現発現誘導後、4 時間では GFP のみと HBsL を融合した GFP:HBsL もどちらも緑色の発現が観察できる。4 時間後の GFP:HBsL では緑色が核周辺から細胞膜周辺に局在（拡大写真）したので、小胞体に移行していると予想できた。しかし、24 時間後には緑色が消失した。
HBsL の C 末を削除した GFP:HBsLΔC および TM1 領域を除いた GFP:HBsLΔCΔTM1 では 24 時間後も緑色の発現が観察されるので、分解が起こらなかったことがわかった。HBsL の C 末側の疎水性領域に分解を引き起こす配列があると予想される。

図3

ヒト培養細胞 HEK293 での HBsL 発現（A）GFP-HBsL 遺伝子を HEK293 にトランスフェクションして、24 時間後の写真である。細胞内に GFP:HBsL 粒子が現れた。（B）その細胞で GFP 抗体によるウェスタンブロッティング法で検出すると GFP:HBsL は分解されていないことがわかった。

貫通領域が分解と関わっているのではないかと考えられた（図 3A）。さらに、この粒子状のタンパク質が分解さた。そこで、GFP:HBsLΔC に TM1 を除いてその C 末側れていないかどうかを調べるために、タンパク質を抽出を 与 え た と こ ろ、 こ れ は 分 解 さ れ な か っ た（図 2,

し、GFP 抗体によるウェスタンブロッティングを行っ

GFP:HBsLΔCΔTM1）。 こ の こ と か ら、 疎 水 性 領 域 がた結果、タンパク質のバンドは予想される 63 kDa に現

HBsL の分解に関わっていることがわかった。

れ、全く分解されていないことがわかった（図 3B）。以
上の結果より、GFP タンパク質を融合したことによる

2.

ヒト培養細胞における HBsL の挙動

アーチファクトではなく、HBsL はヒト培養細胞では分HBV ウイルスワクチンが酵母により商用生産されて解されないが、酵母宿主においては分解されることがわいるにもかかわらず、我々の実験系では HBsL が分解さかった。このことから、酵母に B 型肝炎ウイルスの外殻れることから、この結果が GFP タンパク質を融合したタンパク質を遺伝子組換えにより生産させる遺伝子組換ことによるアーチファクトではないかと考えた。そこ

え B 型肝炎ワクチンが商品化されているものの、現状ので、同じ構造の融合遺伝子をヒト培養細胞 HEK293 に発生産方法では、問題があることが理解できた。ここに、現させて観察した。その結果、ヒト培養細胞 HEK293 で酵母による遺伝子組換えワクチン製造が、他のウイルスは安定に発現する GFP-HBsL 粒子が細胞内に観察されワクチン製造に応用されていない理由があるのかもしれ
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図4

酵母
発現

村美紀子

における GFP:HBsL の発現誘導後 6 時間では GFP:HBsL が観察されるが、24 時間後には 消 失 し て お り、 別 種 の 酵 母においてもGFP:HBsL は分解されることがわかった（左，GFP:HBsL）。この HBsL の C 末に人工ペプチドを付加したところ安定な粒子を形成するものが現れた（右，GFP:HBsL:peptide2）。

図5ないと考えられる。
3.

における HBsL の高生産（A）において HBsL を赤色蛍光タンパク質に融合（RFP:HBsL）させてマルチコピーで発現させたところ、24 時間後でも安定な発現が可能となった。（B）発現させて 24 時間後には、赤色を可視光で観察できるぐらいに大量に RFP:HBsLを発現させることができた。

酵母で安定に発現する HBsL の作製
図 2 より、HBsL の C 末側は分解されやすい性質を有のみである。そこで再度、していることがわかったので、その性質を無効にするよで安定

うに HBsL を改変できれば安定に発現できるのではないに発現させる方法を考えることにした。我々は、分解速かと考え、次に、様々な配列を C 末に付加する方法で改度を上回る高発現が可能になれば安定に発現できるので変を行い、酵母で安定に発現する HBsL 改変体を探すこはないかと考え、高い過剰発現ができるマルチコピープとにした。この時、遺伝子改変を容易に行うことができラスミドと一気に発現させる誘導性プロモータを組み合る酵母わせることで安定に発現できないか検討した。その結を用いた。様々な改変体を調べ、ある短いペプチド配列を付加すると GFP:HBsL が安定に発果、HBsL に変異等を与えなくても現するものが現れた（図 4）。この粒子は、2 日後になっに発現できることがわかった（図 5）。今回は GFP ではても分解されない大きな粒子となっており、これでなく RFP を用いたことで、赤色を指標に発現量を観察

HBsL を安定に発現させることができると考えられた。

できるようにした。図 5B のように可視光下でも赤色がそこで、同じ構造の HBsL 改変体を、実際にワクチン生誘導されるほどの高発現ができたことから、かなり大量産に使われているの HBsL が生産できるようになったことを示している。に発現させたところ、予

このように、想に反して安定に発現しなかった。この理由はまだわ

で安定において HBsL の発現が可かっていないが、宿主により、タンパク質の安定性が異能となったので、現在、E 型肝炎ウイルス、インフルエなることが考えられる。

ンザウイルス、風疹、日本脳炎などの他のウイルスの外殻タンパク質を酵母で発現させているところである。い4.

酵母

で安定に発現するずれも安定な粒子の生産に成功しており、今後はこれら

HBsLの精製方法を開発する予定である。

現 在、 ワ ク チ ン 生 産 宿 主 と な っ て い る の は
4ウイルス感染から家畜を守る機能性飼料添加剤の開発

考察るウイルス感染症予防において重要な成果となったと考家畜における経口投与ワクチンとして、鶏脳脊髄炎ウえている。今後は発現された HBsL の定量化と、酵母をイルス、鶏コクシジウム感染症、牛大腸菌ワクチン、豚簡単に破砕し、細胞内の粒子として生産されたウイルス

マイコプラズマ肺炎、狂犬病ワクチンなど、すでに様々外殻タンパク質粒子を外で出した状態で飼料に混ぜる方な開発が行われている。しかし、ほとんどが生ワクチン法が必要であり、引き続き開発する予定である。

（弱毒化病原体）であり、安全性への問題を残す。また、要

これらの弱毒ウイルスの実際の投与量は、タンパク質に約換算するとピコグラム以下の量であり、大量のウイルス酵母においてワクチンとなるウイルス外殻タンパク質がワクチンとして必要なわけではない。したがって、あを効率よく生産する方法を開発した。このワクチン含有る程度の酵母量でもワクチン効果が発揮されることが期

酵母を飼料として家畜等へ与えることで、低コストでの待できる。さらに、家畜飼料としてももともと酵母にはウイルス感染症対策が可能となる。

価値がある。特に良い腸内細菌叢を保つために、枯草謝菌、乳酸菌、酵母などを混合させた生菌剤が飼料に添加

辞
公益財団法人三島海雲記念財団より本研究へのご支援されており、すでに酵母が飼料添加剤として利用されてを賜りましたことを深く感謝いたします。本研究を通しいる歴史がある。
一方、タンパク質製剤であるバイオ医薬品において、て海外発表に挑戦することができ、情報交換を行うと共2006 年に欧米で上市されている 107 品目のうち 21％が酵に有益なコメントを頂戴することができました。また、母で作られており、タンパク質生産用宿主としての実績

本研究を遂行するにあたり、山口大学大学院医学系研究も多い。また日本で使用されている B 型肝炎ワクチンは科（工）の赤田倫治先生には多大なご協力とご助言を賜酵母にウイルスタンパク質を生産させたものであり、ワりました。自身の今後の研究姿勢・指針も授かることがクチン用生産宿主としての実績もある。遺伝子組換え技でき、心より感謝申し上げます。また、ゲノム生命機能術、タンク培養などの大量培養技術も確立されている。

工学研究室の皆様にもご助力頂きましたことを感謝いた

その酵母細胞でワクチンタンパク質を生産させ、そのまします。

ま飼料に混合することは、現実味を帯びた方法である。
文

その飼料を食べた家畜にワクチン接種と同じ効果があるかどうかは今後調べなければならない課題であるが、少献

1） R. H. Schiestl, R. D. Geitz:, 16, 339–346,
1989.
2） B. M. Abdel-Banat, et al.:, 27, 29–39, 2010.
3） M. Nakamura, et al.:
, 57, 767–780, 2015.
4） K. Shiosaki, et al.:
, 106, 143–149, 1991.

なくとも酵母細胞内に安定にワクチンタンパク質を生産できるという本研究の結果や、経口で接種するワクチンが家畜に応用されていることから、かなり可能性の高い方法であると考えられる。本研究の成果は、家畜におけ5