リン酸カルシウムナノ粒子によるサイトカインの経皮送達システム
国立研究開発法人産業技術総合研究所ナノ材料研究部門

中村真紀

Transdermal delivery system of cytokines by calcium phosphate (CaP) nanoparticles would be useful in the cosmetic
and medical fields. In this study, we aimed to fabricate CaP nanoparticles containing a clinically approved cytokine, basic
fibroblast growth factor (FGF-2). First, we used cytochrome C as a model basic protein, which has similar characteristics(isoelectric point and molecular weight) to FGF-2. Negatively charged heparin was co-immobilized within CaP nanoparticles
as a dispersant. The CaP nanoparticles immobilizing both cytochrome C and heparin were fabricated from a reaction solution
containing calcium ions, phosphate ions, carbonate ions, heparin, and cytochrome C. The immobilization efficiencies ofcytochrome C in the CaP nanoparticles with heparin were about three times higher than those in the CaP nanoparticles
without heparin, indicating that heparin improved immobilization efficiencies of cytochrome C within CaP nanoparticles.
This might be due to the interaction between negatively charged heparin and basic protein, cytochrome C. The role ofheparin as a dispersant was also confirmed: the cytochrome C–CaP nanoparticles with heparin were dispersed in water,whereas those without heparin did not. Next, we fabricated CaP nanoparticles immobilizing both FGF-2 and heparin in thesame manner. The resulting nanoparticles slowly released FGF-2 in a culture medium for at least two days. These results
indicate the potential of the resulting nanoparticles as cosmetic and medical materials, which are capable of releasing FGF-2.

１．緒

ノ粒子の DDS 応用の可能性について検討してきた 1 , 2）。

言本研究では、サイトカインを真皮層まで送りこむことの皮膚内へ有効成分を浸透させる経皮薬物送達システム

できる経皮 DDS 構築に向けて、リン酸カルシウムとサイ（DDS）は、低侵襲であることから、美容ならびに医療のトカインの複合ナノ粒子の合成を試みた。著者らのリン酸分野で注目されている。線維芽細胞増殖因子（FGF）等のカルシウムナノ粒子合成技術を発展させ、粒子構造や表面サイトカイン（細胞から分泌され、細胞間の情報伝達等に特性を制御することで、DDS に適した分散性ナノ粒子の関与するタンパク質）は、細胞増殖促進作用等を有するこ設計を目指した。サイトカインとしては、褥瘡（床ずれ）・とから、化粧品や医薬品の成分としても有用である。しか皮膚潰瘍治療剤等として臨床応用されている FGF- 2 を選し、親水性のサイトカインの場合、細胞が密に並び強固な択した。また、粒子の分散性向上を期待して、負電荷を有バリア機能を持つ皮膚表面の疎水性の角層を透過するのはし、血液凝固阻止剤として臨床応用されているヘパリンの容易ではない。皮膚を透過することのできるナノ粒子等の共担持を試みた 3）。まず、FGF- 2 のモデルタンパク質とキャリア（運搬体）にサイトカインを複合化できれば、サイしてシトクロム c（FGF- 2 と類似した等電点・分子量を有トカインを真皮層まで送りこむことができると期待される。

し、安価で取り扱いや分析が容易）を用いた予備的な条件

リン酸カルシウムは、歯や骨の主要無機成分であり、フ検討を行い、続いて FGF- 2 を用いた検討を行った。さらに、ァンデーション等のコスメトロジー素材としても使用され得られたナノ粒子からの FGF- 2 放出挙動について、予備ている。優れた生体親和性と生体吸収性（例外もあり）を示的な評価を行った。

し、汎用的な無機塩と水のみで合成できることから、安価２．方で安全性に優れる DDS 用のキャリアとして注目されてい法する DDS について研究を進め、様々な機能性物質（DNA、2 . 1. シトクロム c 担持リン酸カルシウムナノ粒子の合成

磁性酸化鉄ナノ粒子、銀ナノ粒子等）を複合化したリン酸塩化カルシウム溶液（500 mM）、リン酸水素二カリウム

カルシウムナノ粒子の液相合成技術を開発し、得られたナ溶液（500 mM）、生理食塩水（0 . 9 w/v%）は、無菌性・エンる。著者らはこれまで、リン酸カルシウムをキャリアとドトキシンフリーといった安全性の担保されている医療用注射液を用いた。炭酸ナトリウム、ヘパリンナトリウムTransdermal delivery system of cytokines
by calcium phosphate nanoparticles

は一般用試薬を用い、それぞれ、超純水、生理食塩水に溶

Maki Nakamura

パリンナトリウム溶液：5 mg/mL）。まず、塩化カルシウ

Nanomaterials Research Institute, National
Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology (AIST)解させた溶液を用いた（炭酸ナトリウム溶液：500 mM、ヘム溶液、ヘパリンナトリウム溶液、生理食塩水を混合した
A 液（カルシウムイオン濃度：80 mM、ヘパリン濃度：0、− 68 −リン酸カルシウムナノ粒子によるサイトカインの経皮送達システム

1 . 0、2 . 0、2 . 5、3 . 0 mg/mL）、ならびに、リン酸二カリウ料を得た。振とう時間は 0 時間あるいは 24 時間とした。

ム溶液、炭酸ナトリウム溶液、生理食塩水を混合した B 液

振とう時間 0 時間では、ヘパリンの有無にかかわらず、（リン酸イオン濃度：80 mM、炭酸イオン濃度：80 mM）を一次粒子径 50 nm 程度の球形に近い形状のナノ粒子が得ら調製した。また、シトクロム c を生理食塩水に溶解させたれた（図 1 上）。EDX スペクトルでは、いずれの試料にも溶液を C 液とした（シトクロム c 濃度：2 mg/mL）。15 mL

カルシウム（Ca）、リン（P）、酸素（O）の大きなピークが検チ ュ ー ブ に、B 液 1 mL、C 液 1 mL、A 液 2 mL の 順 に 加出され、ヘパリンを添加して得られた試料では、ヘパリえ、1 分間ボルテックスで撹拌した後、振とう機（25 ℃、ン特有の元素である硫黄（S）の小さなピークも検出された150 rpm）で 0、1、3、6、24、48、75 時間反応させた。振（図 2）。これにより、ヘパリンがこれらの粒子中に担持さとう後（振とう時間 0 時間では振とうせずに撹拌後すぐ）、れたことを確認できた。炭素（C）の小さなピークの一部は、遠心操作により析出物を回収した。また、遠心後の上澄み担持されたヘパリンやシトクロム c に由来するものと考えを希釈し（上澄み希釈液）、シトクロム c の担持量算出に用られる。シトクロム c 担持率は、ヘパリンを添加して得らいた（詳細は 2 . 3 .）。

れた試料で 37 %、添加せずに得られた試料で 13 % と、ヘパリン添加により大きく増加した（図 3）。負電荷を有する2 . 2 . FGF- 2 担持リン酸カルシウムナノ粒子の合成

ヘパリンと、塩基性タンパク質であるシトクロム c の静電A 液ならびに B 液は、2 . 1 . と同様に調製した。FGF- 2的相互作用により、シトクロム c がヘパリンと共に粒子にを遺伝子組み換えしたトラフェルミン製剤（褥瘡・皮膚潰瘍治療剤）を生理食塩水に溶解させた溶液を C 液とした
（FGF- 2 濃度：0、10、20、50、100 µg/mL）。反応の際にタンパク質低吸着性の 15 mL チューブを用いた以外は、2 . 1 .と同様の手順で反応を行い、析出物を回収した。

2 . 3 . 構造・組成評価得られた試料をシリコン基板上で乾燥させ、走査電子顕微鏡（SEM）観察ならびにエネルギー分散型 X 線分光法（EDX）による元素分析を行った。SEM 観察においては、試料に金蒸着を行った。シトクロム c 担持粒子では、紫外可視分光光度計により上澄み希釈液の吸光度（409 nm）を測定し、検量線を用いて上澄みに含まれるシトクロム c 量を算出、反応液中のシトクロム c 量（2 mg）との差分を担持量として算出した。担持率は、（粒子に担持されたシトク

図 1 得られた試料の SEM 像ロム c 量）／（反応液中のシトクロム c 量：2 mg）× 100（%）
として算出した。また、得られた試料を超純水に懸濁させ、粒子径分布およびゼータ電位を、動的光散乱法（DLS）および電気泳動光散乱法（ELS）により調べた。

2 . 4 . FGF- 2 の放出挙動評価
2 . 2 . で得られた試料を細胞培養用の培地に懸濁し、懸濁後すぐ（0 時間）ならびに 37 ℃で 24、48 時間静置後に培 地 中 に 放 出 さ れ た FGF- 2 の 濃 度 を ELISA（EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay）で測定した。

３．結果

3 . 1. シトクロム c 担持リン酸カルシウムナノ粒子3. 1. 1. ヘパリンの有無の影響
ヘパリンの有無がシトクロム c の担持率や粒子分散性に与える影響を検討するため、A 液のヘパリン濃度を 2 . 5mg/mL（Hep（+））あるいは 0 mg/mL（Hep（−））として試

図 2 得られた試料の EDX スペクトル（シリコン（Si）は基板由来）− 69 −

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図 3 得られた試料のシトクロム c 担持率
図 4 ヘパリン濃度を変化させて得られた試料の SEM 像
表 1 得られた試料の平均粒子径およびゼータ電位担持されやすい状態となり、より多くのシトクロム c が担持されたと考えられた。DLS 測定によると、ヘパリンを添加して得られた試料の平均粒子径は 140 nm 程度であったが、添加せずに得られた試料は水中で沈降しやすく、信頼できる粒子径は得られなかった（表 1）。また、ヘパリンを添加して得られた試料のゼータ電位は ‒ 15 mV であり、図 5 ヘパリン濃度を変化させて得られた試料のシトクロム c 担持率添加せずに得られた試料の + 6 mV よりも絶対値が大きくなった（表 1）。ヘパリンを添加して得られた試料では、粒た試料の + 6 mV よりも絶対値が大きくなった（表 1）。振と子間の静電的反発が粒子の分散性に寄与したと考えられた。

う時間 0 時間で得られた試料と同様、ヘパリンを添加して振とう時間 24 時間では、ヘパリンの有無にかかわらず得られた試料では、粒子間の静電的反発が粒子の分散性に不定形の粒子が得られた（図 1 下）
。EDX スペクトルでは、寄与したと考えられた。

振とう時間 0 時間と同様に、カルシウム（Ca）、リン（P）、以上より、ヘパリンは、シトクロム c の担持率向上なら酸素（O）の大きなピークが検出され、ヘパリンを添加しびに生成粒子の分散性向上に大きく寄与することが示されて得られた試料では硫黄（S）の小さなピークも検出された

た。

（図 2）。ヘパリンを添加して得られた試料における S/Ca

3. 1. 2. ヘパリン濃度の影響

元素比（EDX ピークにより算出）は、振とう時間 0 時間（S/ヘパリンの濃度がシトクロム c の担持率や粒子分散性Ca= 0 . 068）よりも振とう時間 24 時間（S/Ca= 0 . 116）で大に与える影響を検討するため、A 液のヘパリン濃度を 1 . 0、きくなり、より多くのヘパリンが担持されたと考えられた。

2 . 0、2 . 5、3 . 0 mg/mL（Hep 1 . 0、2 . 0、2 . 5、3 . 0）と 変 化

シトクロム c 担持率は、ヘパリンを添加して得られた試料させて試料を得た。振とう時間は 0 時間とした。

で 76 %、添加せずに得られた試料で 23 % と、ヘパリン添SEM 観察によると、ヘパリン濃度にかかわらず、一次加により大きく増加し、さらに振とう時間 0 時間よりも増粒子径 50 nm 程度の球形に近い形状のナノ粒子が得られた加した（図 3）。DLS 測定によると、ヘパリンを添加して得（図 4）。シトクロム c 担持率は、ヘパリン濃度が増加するられた試料の平均粒子径は 160 nm 程度であったが、添加につれてわずかに増加した（図 5）。DLS 測定によると、得せずに得られた試料は水中で沈降しやすく、信頼できる粒られた試料の平均粒子径は 130 ～ 180 nm 程度、ゼータ電子径は得られなかった（表 1）。ヘパリンを添加して得られ位は - 17 ～ - 16 mV 程度であり（表 2）、ヘパリン濃度によた試料のゼータ電位は − 2 2 mV であり、添加せずに得られり大きな違いは見られなかった。

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表 2 ヘパリン濃度を変化させて得られた試料の平均粒子径およびゼータ電位以上より、今回変化させたヘパリン濃度の範囲内では、ヘパリン濃度はシトクロム c の担持率や粒子分散性に大きな影響を与えないことが示された。
3. 1. 3. 振とう時間の影響

図 6 振とう時間を変化させて得られた試料の SEM 像

振とう時間がシトクロム c の担持率に与える影響を検討するため、振とう時間を 0、1、3、6、24、48、75 時間と変化させて試料を得た。A 液のヘパリン濃度は 2 . 5 mg/mL とした。
振とう時間 1、3、6 時間で得られた試料の SEM 観察によると、振とう時間 0 時間（図 1 左上）と同様、一次粒子径50 nm 程度の球形に近い形状のナノ粒子が得られた（図 6）。
すなわち、振とう時間 6 時間から 24 時間（図 1 左下）にかけて不定形に形状が変化すると考えられた。この形状変化の理由の 1 つとして、長時間の反応によるリン酸カルシウムの結晶構造の変化が推測されることから、今後結晶構造解析を行う予定である。なお、シトクロム c 担持率は、0時間から 24 時間では振とう時間が増加するにつれて増加したが、24 時間以降はほぼ同じであった（図 7）。
以上より、振とう時間が 24 時間あれば、シトクロム cを充分に担持できることが示された。

図 7 振とう時間を変化させて得られた試料のシトクロム c 担持率
表 3 FGF-2 濃度を変化させて得られた試料の平均粒子径およびゼータ電位

3 . 2 . FGF- 2 担持リン酸カルシウムナノ粒子
3. 2. 1. FGF-2濃度の影響
3 . 1 . のシトクロム c に代えて、FGF- 2 の担持を試みた。
その際、C 液の FGF- 2 濃度を 0、10、20、50、100 µg/mLと変化させて試料を得た。A 液のヘパリン濃度は 2 . 5 mg/mL、振とう時間は 0 時間あるいは 24 時間とした。
FGF- 2 濃度 100 µg/mL で得られた試料では、振とう時間にかかわらず、水中で沈降しやすく、DLS 測定において信頼できる粒子径は得られなかった。FGF- 2 濃度 0 ～50 µg/mL で得られた試料では、振とう時間 0 時間で平均粒子径 140 ～ 220 nm 程度、振とう時間 24 時間で平均粒子径 150 ～ 240 nm 程度となった（表 3）。ゼータ電位は、振る添加物（エデト酸ナトリウム水和物等）の影響が考えられ

とう時間 0 時間で - 18 ～− 15 mV 程度、振とう時間 24 時る。添加物を含まない FGF- 2 を用いた検討は今後の課題

間で - 24 ～− 17 mV 程度となり、FGF- 2 濃度の低い方がとしたい。

ゼータ電位の絶対値が大きくなる傾向にあった。

3. 2. 2. FGF-2の放出挙動

FGF- 2 濃度 100 µg/mL で得られた試料が沈降しやすか

C 液中の FGF- 2 濃度 10、20、50 µg/mL で得られた試料った理由として、FGF- 2 原料として用いた製剤に含まれについて、培地中での FGF- 2 放出挙動を評価した。振と− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

う時間 0 時間で得られた試料では、粒子を懸濁させた直後の培地中に、14 ng/mL（C 液中 FGF- 2 濃度 = 10 µg/mL）から 70 ng/mL（C 液中 FGF- 2 濃度 = 50 µg/mL）の FGF- 2 が検出された。しかし、いずれの試料でも、24、48 時間後にはほとんど FGF- 2 が検出されなくなった（図 8 左）。これは、培地中に放出された FGF- 2 が構造変化を起こしたことによると考えられる（培地中で FGF- 2 が構造変化し、ELISA で検出される濃度が急減することが知られている）。
従って、振とう時間 0 時間で得られた試料では、FGF- 2が粒子より速やかに放出されたものの、持続的な FGF- 2放出はなかったと考えられた。一方、振とう時間 24 時間

図 8 FGF-2 濃度を変化させて得られた試料の FGF-2 放出挙動で得られた試料では、24、48 時間後であっても FGF- 2 が放出初期と同程度の濃度で検出されたことから（図 8 右）、FGF- 2 の放出が、24、48 時間後でも継続していたと考え謝辞られた。後者の試料では、長時間の反応によって、表面だ

本研究は、公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財

けでなく内部にも FGF- 2 の担持されたリン酸カルシウム団の助成を受けて行われたものである。研究の実施に当たナノ粒子が生成したと推定される。っては、産業技術総合研究所の大矢根綾子博士、分領和歌

以上より、振とう時間によって FGF- 2 の放出挙動が大きく変化すること、ならびに、振とう時間 24 時間で得ら子氏、黒岩輝代子氏、荒木裕子氏をはじめ、関係各位にご指導・ご協力を頂いた。

れた試料では FGF- 2 を少なくとも 48 時間にわたって徐放（引用文献）できることが示された。

４．総1） 中村 真紀 , 大矢根 綾子 ,「機能性リン酸カルシウムナ括ノ粒子の液相合成とバイオメディカル応用」, セラミッ
クス , 55, 189‒192（2020）．

著者らのリン酸カルシウムナノ粒子合成技術をもとに、塩基性タンパク質であるシトクロム c（FGF- 2 のモデルタ

2） 中村 真紀 , 大矢根 綾子 ,「遺伝子や造影剤を細胞へ送ンパク質として条件検討に使用）
ならびに FGF- 2 を担持し達するリン酸カルシウムナノ粒子の簡便・迅速な作製技術の開発」，NEW GLASS, 36, 22‒24（2021）．

た分散性リン酸カルシウムナノ粒子を合成した。ヘパリンの共担持が、タンパク質の担持率向上（本研究ではシトク

3） M. Nakamura, A. Oyane, K. Kuroiwa, Y. Shimizu,

ロム c でのみ確認）や粒子分散性向上に大きく寄与するこA. Pyatenko, M. Misawa, T. Numano, H. Kosuge,とが明らかとなった。得られたナノ粒子は、FGF- 2 を持“Facile one-pot fabrication of calcium phosphate-続的に放出できることから、美容や医療の分野への応用がbased composite nanoparticles as delivery and MRI期待される。今後の課題としては、皮膚の透過に適したナ

contrast agents for macrophages” , Colloids Surf. B

ノ粒子構造の最適化等が挙げられる。

Biointerfaces, 162, 135‒145（2018）．

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