メラニン生成関連タンパク質における新規糖修飾の解析と応用への展開
慶應義塾大学理工学部応用化学科

清水史郎

Premelanosome protein (PMEL) is a functional protein as a scaffold for melanin synthesis and pigmentation inmelanosome. PMEL forms non-toxic amyloid fibrils through aggregation of its fragments. In the previous studies, PMEL
has several N-glycosylation and O-glycosylation sites and those are significant for membrane trafficking or fibril formation.
C-mannosylation is a unique type of protein glycosylation, which the alpha-D-mannopyranose is attached to the firsttryptophan residue in the consensus sequence, Trp-Xaa-Xaa-Trp/Cys (Xaa represents any amino acid). PMEL has one
predicted C-mannosylation consensus sequence, Trp 153 -Lys-Thr-Trp, in the N-terminal region (NTR) and Trp 153 isprobably C-mannosylated; however, the presence of C-mannosylation in PMEL has not been reported. In this study, we
first demonstrated by mass spectrometry that PMEL is C-mannosylated at predicted Trp 153 , and also C-mannosylated
at Trp 104 and Trp 156 , which belong to Trp 104 -Val-Asn-Asn and Trp 156 -Gly-Gln-Tyr, respectively. In addition, weidentified that C-mannosylation at Trp 104 can occur near N-glycosylation at Asn 106 . Furthermore, we evaluated the role ofC-mannosylation in PMEL on its function of fibril formation, using C-mannosylation-defective mutant (W 104 F, W 153 F/W 156 F) PMEL transiently overexpressed HeLa cells. Compared with control and W 104 F, W 153 F/W 156 F especiallydiminished fibrils. Taken together, PMEL is C-mannosylated at Trp 104 , Trp 153 and Trp 156 , and we suggest that theC-mannosylation of PMEL regulates amyloid fibril formation and/or pigmentation in melanosome.

１．緒る 2）。実際に約 30 の例のうち、半分以上が TSR 領域で言C-mannosylation されている。そして、TSR 領域内でのヒトゲノムプロジェクトの成果をもとに、ゲノムだけでC-mannosylation 責任酵素として線虫ではdpy-19 が 3）、哺なく転写産物やタンパク質の情報も網羅的に理解すること

乳類では DPY 19 L 1 や DPY 19 L 3 などが報告されている 4 , 5）。

ができるようになってきた。これらの情報は時に様々な疾

一方、TSR 領域以外での C-mannosylation の報告も我々病との関連を明らかにし、治療法ならびに診断法の新規開の研究成果を含めて数例知られている。現在までに TSR発と改良が進められてきた。そして、今後も生命分野の情領域以外で起こる C-mannosylation の責任酵素が DPY 19

報は AI などとの結びつきでさらに発展することが期待さファミリーによるものであるか否かは不明であるが、よりれている。

多くの基質例を提示することで C-mannosylation に対する

また、生命現象の解明に貢献したのはゲノム情報だけで新たな知見が提示できるものと思われる。

はなく、質量分析機器の技術革新によるところが少なくなメラノソーム内においてメラニン色素沈着の足場としい。例えば、これまでは解析に膨大な時間を要した生体内て重要な役割を担う PMEL タンパク質は、糖鎖修飾をの代謝産物をスピーディーに解析し病態を理解することが受ける糖タンパク質である。PMEL はメラノサイトやメできるようになったり、報告例がない生体内の有機物（核ラノーマ特異的に発現しており、その組織特異性からメ酸やタンパク質の翻訳後修飾など）の発見につながったりラノーマ検出のための腫瘍抗原でもある。また、PMELと、その恩恵は計り知れない。

はプロテアーゼによる切断を経てアミロイド繊維を形成

タンパク質翻訳後修飾の 1 つである C-mannosylation
1）し、それが色素沈着の足場として機能する。そのため、は 1994 年にヒト尿中の RNase 2 より見出された 。これ

PMEL の繊維形成機構を解明することは、メラニン産生までに基質タンパク質は約 30 知られており、分泌、細胞とアミロイド形成の両方の点で重要である。PMEL は N

内局在、フォールディングに関与していることが分かっ末端に疎水性アミノ酸を多く含むシグナルペプチドを持ている。基質の多くはトロンボスポンジンタイプ I リピー

つ分泌型タンパク質である。PMEL はメラノソームに輸ト（TSR）領域を持ち、その領域内で複数箇所修飾を受け送されたのち、数回の切断を経てメラニン色素沈着のための繊維が形成される。PMEL における糖鎖修飾は、N 型糖鎖修飾（N-glycosylation）、O 型糖鎖修飾（O-glycosylation）

Novel glycosylation of melanin-related
protein and its application
Siro Simizu

ともに存在し、それぞれの役割も解析されているが、C-mannosylation の有無や役割は未解明のままである。

Department of Applied Chemistry,
Faculty of Science and Technology,
Keio University− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

２．方

時に C-mannosylation 責任酵素の可能性がある遺伝子も導法入することで酵素の同定を試みた。C-mannosylation の有２．１．PMEL 過 剰 発 現 細 胞 の 樹 立 とリコ ン ビ ナ
ントタンパク質の 精 製 およ び 質 量 分 析 法 に よる
C-mannosylation の確認

無は上述と同様に質量分析法で評価した。

３．結果

全長のヒト PMEL タンパク質は膜貫通領域があり、過剰

３．
１．PMELタンパク質におけるC-mannosylation

発現させた際に精製するのが困難であると考えられたので、

図 1 にヒト PMEL タンパク質の概略を示す。PMEL は N

C-mannosylationされる可能性が高いPMELのN-terminal

末端側からシグナルペプチド（SP）、N-terminal regionregion（PMEL-NTR）をクローニングし、その N 末端に検（NTR）、Polycystic kidney disease domain（PKD）、リピ出用の Myc 配列と精製用の His 6 配列を導入した発現ベクート領域（RPT）、kringle-like domain（KLD）、そして膜貫ターを作製した。発現ベクターを CHO-K 1 細胞に遺伝子通領域（TM）があり、細胞が分化する過程で RPT と KLD導入し、選択培地で培養することで、PMEL-NTR を安定の間でプロテアーゼによる切断を受ける。切断された断片的に過剰発現する細胞株を取得した。樹立した細胞からアはそれぞれ N 末端側が Mα、C 末端側が Mβ と呼ばれる。

フィニティー精製によりリコンビナントの PMEL-NTR をMα は細胞外領域に存在し、その中に 153 番目のトリプト大量に得ることに成功したため、得られた PMEL-NTR がファンを含んだ C-mannosylation を受ける可能性があるコ

C-mannosylation されているか否かを質量分析法で確認しンセンサス配列がある。

た。

図 1 の 210 番目のアミノ酸までをクローニングし、さらに検出用の Myc タグと精製用の His 6 タグ配列を導入した

２．２．PMEL に お ける C-mannosylation が そ の機能に及ぼす影響ベクターを作製した。配列が正しいことを確認後、ハムス

ヒト子宮頸がん細胞の HeLa 細胞は PMEL を発現してよるセレクションを経て安定的に過剰発現している細胞株

いないが、PMEL を発現させると本来の機能発現に必要（CHO-K 1 -HM-PMEL-NTR）を樹立した。また並行して、な切断を受けることが知られている。そこで野生型およ全長の PMEL をクローニングし、発現用ベクターを作製

び C-mannosylation されるトリプトファンをフェニルアした。

ター由来である CHO-K 1 細胞に遺伝子導入し、G 418 にラニンに置換した変異型 PMEL を HeLa 細胞に遺伝子導入

PMEL の 153 番目のトリプトファンが C-mannosylationし、野生型が切断を受ける条件で変異型が切断されるか否さ れ て い る か を 確 認 す る た め、CHO-K 1 -HM-PMEL-かを評価した。また、ヒトメラノーマ細胞の SK-MEL- 28

NTR 細 胞 よ り リ コ ン ビ ナ ン ト PMEL-NTR を 粗 精 製 し細胞は PMEL を発現しているが、メラノソーム成熟過程た。そして得られたタンパク質の質量分析を行うことでのステージⅡからステージⅢへの移行ができないことがC-mannosylation を検出した。その結果、予想されてい知られている。よって、SK-MEL- 28 細胞の内在性 PMELた 153 番目のトリプトファンだけでなく、104 番目およびをノックアウトし、その後、野生型または変異型の PMEL

156 番目のトリプトファンも C-mannosylation されているを再発現させることでメラノソームの成熟に PMEL のことが示唆された。

C-mannosylation が関与しているか否かを評価した。

２．３．PMEL に お ける C-mannosylation 責 任 酵
素の探索

３．２．PMELタンパク質におけるC-mannosylationの役割

３．
１．の 結 果 を 受 け て、PMEL タ ン パ ク 質 に お け る

C-mannosylation 責任酵素が存在しないことが報告され

C-mannosylation の役割を解析するために、2 つの実験をていたハエ由来の S 2 細胞に PMEL-NTR を発現させ、同行った。1 つは HeLa 細胞に野生型または変異型の PMEL

図1

ヒトPMELタンパク質の概略− 84 −

メラニン生成関連タンパク質における新規糖修飾の解析と応用への展開を発現させてその差を比較する実験であり、もう 1 つはメのトリプトファンを 2 か所ともフェニルアラニンに置換しラノーマ細胞の PMEL をノックアウトし、野生型またはた 2 WF を遺伝子導入すると、断片化された PMEL の量が変異型を再発現させる実験である。３．
２．の実験は全て全減少していた。このことから PMEL タンパク質における特長の PMEL を使用した。に 153 番目および 156 番目の C-mannosylation が、PMELHeLa 細胞を用いた実験結果を図 2 に示す。前述したようが切断されるのに重要である可能性が示唆された。に HeLa 細胞には PMEL は発現していないため、空ベクタ

2 つ目の実験である、メラノーマ由来 SK-MEL- 28 細胞ーを導入した neo のレーンには PMEL は検出できない。まにおける PMEL のノックアウト実験は、現在までにノッた野生型（wt）を発現させた場合は、全長を検出できる E- 7クアウト細胞を樹立し、その後に wt、WF、または 2 WF抗体で 100 kDa 付近にバンドが確認でき、さらに HMB 45を再導入した細胞を樹立中である。なお、ノックアウト細抗体で Mα および細かく切断された PMEL を認識すること

胞における電子顕微鏡像から、これまでの報告通り、II 型ができた。同条件で 104 番目のトリプトファンをフェニルのメラノソームが検出できなくなっていることは確認した

アラニンに置換した WF を遺伝子導入した際は wt を導入し（図 3）。

た時との差があまりなかった。一方、153 番目と 156 番目

図2

図3

HeLa細胞を用いたPMELタンパク質におけるC-mannosylationの役割の解析

SK-MEL-28細胞におけるステージIIのメラノソーム電子顕微鏡像の例− 85 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

３．３．PMEL に お ける C-mannosylation 責 任 酵素の探索されていないものである可能性が高いことが分かった。

これまでに我々は新たな C-mannosylation 責任酵素ととが知られている S 2 細胞に PMEL を遺伝子導入するだ

して DPY 19 L 3 を報告しているが、その際にハエ由来のけで、（DPY 19 ファミリータンパク質を導入しなくても）S 2 細胞を使用したノックイン実験を行っている。つまC-mannosylation された。本研究で、責任酵素の同定まり、S 2 細胞には C-mannosylation 責任酵素が欠損しておでには至らなかったが、新規 C-mannosylation 責任酵素り、基質とともに酵素を導入すると、基質タンパク質がの存在が示唆された。

すなわち、C-mannosylation 責任酵素が欠損しているこC-mannosylation されていた。そのことを利用し、PMELの C-mannosylation 責任酵素も同様に探索することとし謝辞た。具体的には、S 2 細胞に PMEL だけ、または同時に責

質量分析は理化学研究所・環境資源科学研究センター・任酵素の候補である DPY 19 L 1 ～ L 4 のそれぞれを導入し、生命分子解析ユニットの堂前直先生、鈴木健裕先生との共PMEL における C-mannosylation の有無を質量分析により同研究によるものです。また、電子顕微鏡像は東京医科歯確認した。その結果、予想に反し PMEL だけを導入した科大学・難治疾患研究所の清水重臣先生、荒川聡子先生とS 2 細胞由来のリコンビナント PMEL が C-mannosylationの共同研究の成果です。

されていた。また、DPY 19 ファミリーを共発現してもそ

本研究成果により、日本糖質学会より第 20 回日本糖質の C-mannosylation の程度が変化しなかった。このことか

学会ポスター賞（第 36 回日本糖質学会）を研究室に所属しら、PMEL における C-mannosylation 責任酵素は、これまていた大学院生である小松 良亮が「メラノソーム関連タンでに知られている DPY 19 ファミリータンパク質ではない、パク質 PMEL における C-mannosylation の解析」と題し受新規なものである可能性が示唆された。

賞している。

４．考また、本研究を遂行するにあたり公益財団法人コーセー察

コスメトロジー研究財団よりご助成いただきましたことに本研究では、メラニン生成関連タンパク質である PMEL感謝申し上げます。

における C-mannosylation の役割を解析した。その結果、（引用文献）

大変興味深い研究成果を得ることに成功した。
Ⅰ）PMEL は C-mannosylation されることを世界で初めて

1） Hofsteenge J, Müller DR, de Beer T, Löffler A,明らかにすることができた。また、予想された 153 番目

Richter WJ, Vliegenthart JF. New type of linkage

だけではなく、104 番目と 156 番目のトリプトファンも

between a carbohydrate and a protein: C-glycosylation

C-mannosylation されていた。さらに、104 番目と 156

of a specific tryptophan residue in human RNase Us.

番目の C-mannosylation は、我々のこれまでの研究からBiochemistry 33, 13524-30（1994）．

も提唱されているコンセンサス配列以外で起こったこと

2） Niwa Y, Simizu S. C-mannosylation; previous studies

から、C-mannosylation のコンセンサス配列に関する有and future research perspectives. Trends Glycosci.

益な情報を提供することができた。

Glycotechnol. 30, E231-8（2018）．

Ⅱ）PMEL の C-mannosylation は繊維形成の前段階である

3） Buettner FF, Ashikov A, Tiemann B, Lehle L, Bakker

プロテアーゼによる切断に関与している可能性が示唆さ

H. C. elegans DPY-1 9 is a C-mannosyltransferase

れた。以前の報告で、アラニン・スキャンにより PMEL

glycosylating thrombospondin repeats. Mol. Cell 50, 295-

中の重要なトリプトファンをスクリーニングしている報302（2013）．

告があり、153 番目と 156 番目のトリプトファンを他の

4） Niwa Y, Suzuki T, Dohmae N, Simizu S. Identification

アミノ酸に置換すると PMEL としての機能が著しく低

of DPY19L3 as the C-mannosyltransferase of R-spondin1

下することは分かっていた。しかし、本研究成果により、

in human cells. Mol. Biol. Cell 27, 744-56（2016）．

その原因が C-mannosylation である可能性を示唆するこ

5） Shcherbakova A, Tiemann B, Buettner FF, Bakkerとができた。詳細は PMEL ノックアウト細胞に様々な

H. Distinct C-mannosylation of netrin receptor

変異型 PMEL を再発現させることで明らかになると考thrombospondin type 1 repeats by mammalian DPY19L1

えられる。

and DPY19L3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, 2574-9

Ⅲ）PMEL の C-mannosylation 責任酵素はこれまでに同定（2017）．

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