表皮細胞に対する機械的刺激の作用
東京大学医学部付属病院

小 宮 根真

皮膚科

弓Human skin is exposed to outer environment, which always suffers from outer stimuli. Mechanical stimulus
is one of such stimuli, which could be the most frequent stimulus affecting skin, however, the effect of mechanicalstimulus on human skin has not been adequately investigated. In order to clarify the effects of mechanical stimuli on
human epidermis, we employed the equipment that utilized in the investigation of cardiac muscles, and stimulated
keratinocytes by stretching cells. Mechanical stretch induced BrdU incorporation, which was inhibited by inhibitors
for EGF receptor, MEK1/2, PI3K, and calcium channel. Mechanical stretch induced ERK phosphorylation, which
was also inhibited by inhibitors for EGF receptor phophorylation, MEK1/2 and PI3K. Mechanical stretch induced
phosphorylation of Akt, which is known to inhibit cellular apoptosis, and it was also dependent on MEK1/2, PI3K,and EGF receptor. DNA microarray experiment revealed a set of genes regulated by mechanical stretch. Theseresults indicate that mechanical stretch causes activation of signaling molecules, resulting in regulation of a varietyof gene expression, some of which induce proliferative and anti-apoptotic phenotype in keratinocytes.

１．緒

phosphotyrosine（PY-20）, anti mouse IgG HRP

言conjugate, anti rabbit IgG HRP conjugate は Santa Cruz

表皮は、人を構成する組織の一番外側にあって、常に外（Santa Cruz, USA）から、anti phospho-EGFR antibody的環境の影響を受けている。外的環境因子として、熱、光、は Calbiochem（San Diego, CA）から購入した。試薬につ化学物質などがあるが、機械的刺激も重要な外的刺激因子

い て は MEK inhibitor U0126 は Promega（Madison,である。機械的刺激が実際に皮膚にどのように作用していUSA）より、PI-3 kinase inhibitor wortmannin、EGFRるかを考えると、たとえば強度の外力は皮膚の外傷の原因

kinase inhibitor AG1478 と negative control SB202474 はとなり、また軽度の外力は皮膚の掻破、マッサージ、スクCalbiochem より購入した。

ラブ洗顔などの際に皮膚に加えられると考えられる。さらに、ティッシュエクスパンダーによる皮膚の伸展、急激な

２）表皮角化細胞の培養

肥満や妊娠による皮膚の伸展といった現象も皮膚に加わる

正常ヒト新生児表皮角化細胞（NHK）のプライマリー

機械的刺激である。このように、機械的刺激は、日常的にカルチャーは岩城硝子より購入し、KBM（keratinocyte

皮膚に影響を及ぼしていると考えられるが、機械的刺激がbasal medium）にハイドロコーチゾン、インスリン、甲表皮に与える影響については、ほとんど研究が行われてい状腺ホルモン、ウシ下垂体抽出物（BPE）と EGF を加えない。我々は、本研究において、機械的刺激が表皮細胞にた KGM（keratinocyte growth medium、keratinocyte-

どのような影響を与えるのかを、Vitro の実験系を構築し、SFM、GIBCO）で培養した。表皮細胞が 70 − 80％コンフ検討した。さらに、機械的刺激の遺伝子発現への作用を、ルエントになったところで、トリプシン処理し、底面積比DNA アレイを用いて網羅的に検討した。

２．実

１：４で、継代培養した。３−４回継代したものを実験に用いた。

験HaCaT 細 胞 は Deutsches Kresforschungszentrum,
Fusenig 教授より許可を得、昭和大学黒木登志夫先生より

１）抗体と試薬
抗体に関しては anti phospho-ERK1/2, anti phospho-供与されたものを、10％ウシ血清（FBS）を加えた MEM

Akt（Ser 473）, anti Akt は Cell Signaling（Beverly,（modified Eagle's medium）で培養し、70 − 80％コンフルUSA） か ら、anti PCNA, anti ERK2, anti EGFR, anti

エントになったところで、トリプシン処理し、底面積比１：

The effects of mechanical stretch onkeratinocytes
Mayumi Komine
Department of Dermatology, University ofTokyo

10 で、継代培養した。
これらの細胞はすべて、37℃、５％ CO2 下のインキュベーター内で培養した。

３）シリコン製培養皿上での細胞培養
伸縮可能なシリコン製の培養皿（内空部分４× ２× １cm、底面積８㎠、太陽興業社製）をオートクレーブした後、− 14 −

表皮細胞に対する機械的刺激の作用

その底面をタイプⅠコラーゲン（Sigma）にてコーティン

EGFR 抗体とともに４℃ 16 時間インキュベートして上記グし（0.02mg/ 個）、その後 NHK ないし HaCaT を１×と同様に再度ウェスタンブロットを行った。

105 cells/ ㎠の密度にて播種し、37℃、５％ CO2 下にて培養した。シリコンを伸展させるためにはステンレス製のチ６）DNA アレイャンバー（東和科学、東京）にシリコン培養皿を装着して表皮細胞を４時間、16 時間、24 時間、48 時間ストレッ引き伸ばして固定する、という方法で +10, +20, +30％のチ後、ストレッチしない表皮細胞と同時に、キアゲン社の長軸方向の伸展を持続的に可能とした。伸展前と +20％伸RNA 抽出キットにて RNA を抽出し、Affymetrix 社の展後の状態とを（図１）に示した。

DNA マイクロアレイチップを用いて、ストレッチの有無による遺伝子発現の差異を検討した。

４）BrdU アッセイ

３．結正常ヒト表皮細胞および HaCaT 細胞を 20％伸展刺激を加え 24 時間培養した。最後の３時間を 100mM の BrdU で果１）表皮細胞に伸展刺激を加えることにより、BrdUパルスし、スクレーパーを用いて細胞を PBS に回収した取り込みが促進する。

ものを 96 ウェルプレートに播種して遠心した。乾いた 96

表皮細胞を 20％、24 時間伸展することにより、BrdU

ウ ェ ル プ レ ー ト の BrdU 取 り 込 み を Cell Proliferation

取り込みは、正常ヒト表皮細胞で 2.2±0.4 倍、HaCaT 細ELISA, with a BrdU colorimetric system（Roche,胞で 2.0±0.5 倍に上昇し、これは統計学的に有意であった

Mannheim, Germany）を用いて測定した。

（p<0.05）。また、この BrdU 取り込みの上昇は、MEK1/2阻害剤である U0126（10µM）、PI3Kinase 阻害剤であるWortmannin(1µM)、EGF 受容体阻害剤である AG1478(200５）ウェスタンブロット法
NHK および HaCaT 細胞からの蛋白抽出およびウェスタンブロットは、以下のように行った。リン酸化 ERK、リンｎ M)、 カ ル シ ウ ム チ ャ ネ ル 阻 害 剤 で あ る Gadoliniun（150µM）にて抑制された（図２）。

酸化 EGF、リン酸化 Akt の検出には、Lysis buffer として以上の結果は、伸展刺激は表皮細胞の増殖能を上昇させ、

RIPA buffer（20mM Tris（pH 7.5）, 150mM NaCl, 1mM

そ の 伸 展 刺 激 に よ る BrdU 取 り 込 み の 増 加 は、ERK、

EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5mM sodium

PI3K、EGF 受容体、カルシウムチャネルに依存している

pyrophosphate, 1mM b-glycerophosphate, 1mM sodium

ことを示している。

orthovanadate, 1mM PMSF, 1mg/ml leupeptin）を用いた。
抽出した蛋白はサンプルバッファー [50mM Tris（ph7.4）/0.14％ sodium dodecyl sulfate（SDS）/ １２）表皮細胞に伸展刺激を加えることにより、ERK％がリン酸化する。

b-mercaptoethanol（vol/vol）] 中 で 煮 沸 し、12.5 ％ SDS

表皮細胞に伸展刺激を加え、１分後、２分後、５分後、polyacrylamide gel を 用 い て 電 気 泳 動 し た。PVDF 膜

15 分後、30 分後、60 分後に細胞を回収し、ウェスタンブ（Immobilon-P）に転写した後、膜はブロッキングバッファ

ロット法にてリン酸化 ERK を検出したところ、伸展刺激

ー [ ５％ BSA in 25mM Tris/0.02％ KCl/0.8％ NaCl（pH7.4）

により２分後より ERK のリン酸化が認められ、５分後、] で４℃２−８時間インキュベーションし、抗ヒトケラチン

15 分後にピークとなり、30 分後、60 分後と次第に減少しモノクローナル抗体、あるいは抗リン酸化 ERK、抗リン酸ていくのが確認された。このメンブレンを再度抗 ERK 抗化 Akt、抗リン酸化 EGFR と４℃ 16 時間インキュベーシ体にてブロットしなおし、ERK の蛋白レベルの変化を検ョンした。膜は洗浄後、二次抗体と１時間反応させ、化学討したところ、図に示すように ERK の蛋白レベルはほぼ蛍光抗体法にて発色させた。PVDF 膜はストリッピングバ
ッファーにてストリッピング後、抗 ERK、抗 AKT、抗図１

図２− 15 −一定であった（図３）。

下流にあると考えられる Akt のリン酸化を検討した。伸展刺激により５分後、15 分後、30 分後に Akt のリン酸化

３） 伸 展 刺 激 に よ る ERK リ ン 酸 化 は U0126、が確認された（図６）。

Wortmannin により阻害される。
表皮細胞に伸展刺激を加える１時間前に、MEK1/2 阻

６）伸展刺激による AKT リン酸化は、MEK1/2 依存害 剤 で あ る U0126、 お よ び PI3K 阻 害 剤 で あ る的である。

Wortmannin を加え、伸展後、前述のように細胞を回収し、伸展刺激による Akt リン酸化に MEK1/2 が関与するかウェスタンブロット法にて ERK のリン酸化を検出したと否かを検討するため、MEK1/2 阻害剤である U0126 を伸こ ろ、 伸 展 刺 激 に よ る ERK の リ ン 酸 化 は U0126、展刺激 1 時間前より加えたところ、伸展刺激による Akt

Wortmannin によって阻害された。一方、陽性コントロー

リン酸化は U0126 により抑制された。すなわち、伸展刺ルとして用いた EGF 刺激による ERK リン酸化は、U0126

激による Akt リン酸化は MEK1/2 依存的であると考えらにより抑制されたが、Wortmannin によっては抑制されなれる（図７）。

かった（図４）。すなわち、伸展刺激による ERK リン酸化は、MEK1/2 および PI3K の下流にあると考えられる。

４）伸展刺激による ERK リン酸化は、Gadolinium お
よび AG1478 により阻害される。
伸展刺激１時間前よりカルシウムチャネル阻害剤である
Gadolinium あるいは EGF 受容体チロシンキナーゼ阻害剤である AG1478 を加え、伸展後、前述の如く細胞を回収し、ウェスタンブロット法にて ERK のリン酸化を検出した。
伸展刺激による ERK リン酸化は、Gadolinium あるいはAG1478 により濃度依存的に抑制された（図５a,b）。EGFによる ERK リン酸化は Gadolinium では抑制されなかったが、AG1478 によって抑制された。したがって、伸展刺激による ERK リン酸化は EGF 受容体およびカルシウム

図５

チャネルの下流にあると考えられる。

５）伸展刺激は AKT をリン酸化する。
伸展刺激による BrdU の取り込みに PI3K が関与していることから、細胞のアポトーシス抑制的に働き、PI3K の図６

図３

図４

図７− 16 −表皮細胞に対する機械的刺激の作用

７）伸展刺激による AKT リン酸化は、PI3K 依存的でてどのような遺伝子の発現が調節されているのかを広範囲ある。に検討するため、Affymetrix 社の DNA チップを用いて、PI3K が、伸展刺激による Akt リン酸化の上流にあるか12000 個の遺伝子について、伸展刺激による発現調節の有否かを検討するため、PI3K 阻害剤である Wortmannin を無を検討した。ここではその一部を示す（図 10）。基底細加 え、 伸 展 刺 激 に よ る Akt リ ン 酸 化 を 見 た と こ ろ、胞に発現の認められるラミニン５の３つの構成分子

Wortmwnnin により、伸展刺激による Akt リン酸化が抑（laminin alpha 3、beta 3、gamma 2）、Bullous pemphigoid

制された。すなわち、伸展刺激による Akt リン酸化は

antigen 1、Integrin alpha 6 の発現が伸展刺激により誘導さPI3K の下流にあると考えられる（図８）。

れ、 分 化 し た 表 皮 細 胞 に 発 現 の 認 め ら れ る Filaggrin、Loricrin、Keratin 1、Keratin 9 の発現は抑制されていた。

８）伸展刺激による Akt リン酸化は、EGF 受容体のこのうち、ラミニンの３つの構成分子についてウェスタン下流にある。

ブロットにて蛋白レベルでの発現を検討したところ、図 11

伸展刺激による Akt リン酸化に、EGF 受容体が関与していに示すように、alpha 3、beta3 の発現は伸展刺激により誘るか否かを検討するため、EGF 受容体リン酸化阻害剤である

導されたが、gamma 2 の発現にはあまり変化が認められなAG1478 を加えたところ、伸展刺激による Akt リン酸化は抑かった。

制された。したがって、伸展刺激による Akt リン酸化は EGF受容体の活性化に依存していると考えられる（図９）。

９）DNA マイクロアレイよる伸展刺激の遺伝子発現に対する作用
DNA マイクロアレイ法は、同時に多数の遺伝子発現調節を検討するのに大変優れた方法である。伸展刺激によっ

図 10a

図８
図 10b

図９

図 11− 17 −

４．考制されることを示している。β １インテグリンおよび察

EGF 受容体はともに細胞膜上にあり、ともに伸展刺激に皮膚は体表を多い、外界からの機械的刺激を最も直接にかかわることから、これらが細胞膜上でなんらかの相互作受ける可能性が高い臓器であるが、皮膚に対する機械的刺用を引き起こしている可能性が考えられる。伸展刺激がど激についての検討は、現在のところあまり行われていない。のようにしてこれらの分子を刺激するのか、あるいは β

今回我々は、皮膚、特に表皮細胞に対して、伸展という機１インテグリンと EGF 受容体がどのように相互作用を起械的刺激が加えられたときに、どのような変化が引き起ここすのかは不明であり、今後の検討課題である。また、されるかを解明するために、実験を行った。今回は、伸展DNA マイクロアレイにより、多数の遺伝子発現が機械的可能なシリコンチャンバーに表皮細胞を播種して伸展刺激刺激により影響を受けることが明らかとなり、その一部とを加えた。この方法は、小室らの報告１） に準じたものでして、細胞外マトリックス産生、増殖促進、分化抑制など、ある。このような伸展刺激が実際にどのような場面で皮膚より基底層の細胞に近い形質を誘導することがわかった。に与えられるのかは一考を要するが、おそらく掻破によっ

今後は表皮細胞の構築を正常に維持する上での機械的刺激て、表皮に伸展刺激が加わると考えられる。ティシューエの意義を検討していきたいと考えている。

クスパンダーで皮膚を伸展させる場合や、表皮内腫瘍の増殖に伴い、表皮細胞が伸展される場合にも、やはり同様な（参考文献）伸展刺激が加わるものと考えられる。さらに、洗顔の際に１） K o m u r o I , K a t o h Y , K a i d a T , S h i b a z a k i Y ,皮膚を強くこすったり、フェイシャルブラシによる皮膚のKurabayashi M, Hoh E, Takaku F, Yazaki Y,

刺激の際にも、同様な伸展刺激が表皮に加わる可能性があ:Mechanical loading stimulates cell hypertrophy andる。

specific gene expression in cultured rat cardiac
myocytes. Possible role of protein kinase C activation,

伸展刺激により、まず表皮細胞に増殖シグナルが生じる

J Biol Chem, 266, 1265-1268, 1991.

ことは、ティシューエクスパンダーによって皮膚が伸展拡大することや、表皮内腫瘍の周辺部皮膚に増殖性変化を伴

２） Iwasaki H, Eguchi S, Ueno H, Marumo F, Hirata Y,

うことをよく説明できる。その際に、EGF 受容体の活性:Mechanical stretch stimulates growth of vascular化を介していることは、血管平滑筋細胞２） や、血管内皮

smooth muscle cells via epidermal growth factor

細胞

receptor, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 278,３）など、他の細胞における機械的刺激の受容とパラ

H521-H529, 2000.

レルな結果である。今回、伸展刺激により Br ｄ U の取り込みが亢進し、さらにアポトーシス抑制的にはたらく Akt

３） Tseng H, Peterson TE, Berk BC, :Fluid shear stressが活性化したことは、これらの事実を裏付けるものと考え

stimulates mitogen-activated protein kinase inられる。我々の実験により、伸展刺激による ERK のリン

endothelial cells, Circ Res, 77, 869-878, 1995.

酸 化 お よ び Akt の リ ン 酸 化 の 双 方 が、EGF 受 容 体、

４） Kippenberger S, Bernd A, Loitsch S, Guschel M,

MEK1/2、PI3K の下流にあることが明らかとなった。こMuller J, Bereiter-Hahn J, Kaufmann R, : Signaling of

れは、今回ポジティブコントロールとして用いた EGF に

mechanical stretch in human keratinocytes via MAP

よる ERK のリン酸化が MEK1/2 下流にあるが、PI3K のkinases. J Invest Dermatol, 114, 408-412, 2000.

下流にはないことを考えると、伸展刺激による EGF 受容

５） Yano S, Komine M, Fujimoto M, Okochi H, Tamaki

体の活性化が、EGF による EGF 受容体の活性化とは異な

K, :Mechanical stretching in vitro regulates signalったアウトカムを生じることを示しており、興味深い。ドtransduction pathways and cellular proliferation in

イツのグループ

human epidermal keratinocytes.

４）は、同様の伸展刺激システムを用いて表皮細胞に伸展刺激を加えることにより、ERK がリン酸化し、そのリン酸化は β１インテグリン中和抗体により抑− 18 −

122, 783-90, 2004.

J Invest Dermatol,