表皮ケラチノサイトの角化プロセスにおけるPLD/mTORシグナリングの関与

財団法人岐阜県研究開発財団岐阜県国際バイオ研究所

大口 健司
Calcium has been known to be a major factor for triggering the differentiation of keratinocytes. In the current study,
the involvement of mammalian target of rapamycin (mTOR) in the regulation of calcium-induced diffrentiation wasexamined using normal human epidermal keratinocytes (NHEK). Treatment of NHEK with calcium was found to cause
marked decreases in p70 ribosomal S6 kinasae (p70S6K) phosphorylation level. The activity of mTOR is essential forphosphorylation of p70S6K and the treatment of NHEK with rapamycin, a potent inhibitor of mTOR effectively potentiatedcalcium-induced differentiation. Moreover, treatment of NHEK with rapamycin caused marked decreases in protein level ofcyclin D1, a cell cycle regulator. These results indicate that mTOR would be involved in the calcium-induced differentiation
by modulating the expression of cyclin D1 in NHEK.

１．緒

グナリングの機能が注目されている。

言

これまでに我々は、種々の細胞機能制御における PLD/細胞は外来刺激を受けると固有の情報変換酵素が活性mTOR シグナリングの関与について検証してきた。メラ化され、様々なシグナル伝達系を介して細胞機能が発揮

ニン細胞がもつメラニン生合成機能（メラノジェネシス）される。情報変換の引き金として、ホスホリパーゼに代における PLD の関わりについて、マウス B16 メラノーマ表される脂質変換酵素の役割が重要であり、膜脂質の大細胞系を用いて解析した結果、PLD アイソザイムのひと部分を占めるホスファチジルコリンは、ホスホリパーゼ Dつである PLD1 の発現量および酵素活性がメラニン生成量（PLD）により分解されホスファチジン酸（PA）に変換さと逆相関の関係にあることを突き止め、PLD1 はメラノジれる。PA 自身、あるいはその変換体であるリゾ PA やジェネシスのネガティブレギュレーターとして作働することアシルグリセロールは、種々のシグナル伝達分子の活性制を見出した 。さらに、PLD1 の作用メカニズムについて御に関わる重要なセカンドメッセンジャーとして機能する。

解析を行った結果、PLD1 は mTOR を介してチロシナーゼ

最近、mTOR（mammalian target of rapamycin）と呼ば（メラニン生合成過程の律速酵素）の発現を mRNA レベルれるタンパク質が、PLD の産生する PA によって直接的にから抑制することを明らかにした 。

１）３）４）活性化されることが報告された 。mTOR は、マクロラメラノジェネシスのみならず、PLD1 が真皮線維芽細胞イド系有機化合物ラパマイシン（rapamycin）の細胞内標のもつコラーゲン産生機能の制御分子としても作用するこ的分子として同定されたセリン・スレオニンキナーゼであとを見出している 。ヒト真皮線維芽細胞の PLD1 遺伝子り、ターゲット分子の p70S6K（p70 S6 kinase）ならびにをノックダウンすると、mTOR 活性の低下に伴い細胞外4E-BP1（eIF4E-binding proteinへのコラーゲン分泌が抑制されることが明らかとなった。

1）を介して種々の細胞機

５）能制御、特に細胞の分裂や成長（サイズ）における調節因PLD1 ノックダウンによるコラーゲン産生の減弱は、細胞２）子として重要な役割を果たしている 。mTOR は、ある内のプロコラーゲン発現量の低下と相関しており、PLD1種のアミノ酸や PI3K/Akt 経路によって活性が調節されるが mTOR を介してコラーゲン合成を促進的に制御するとことが知られていたが、PA が mTOR の FRB ドメインにいう新知見を得ている 。このように、PLD/mTOR シグ結合することによっても活性化されることが明らかにされナリングは、各々の皮膚細胞がもつ重要機能の制御に関与ている 。この作用は PA 以外のリン脂質ではみられないすることが明らかになってきた。

１）５）

ことから、mTOR の活性化はリン脂質の中でも PA 特有の一方、皮膚の主要細胞であるケラチノサイト ( 表皮角化作用であり、新しいシグナル経路としての PLD/mTOR シ細胞 ) は、活発に増殖と分化を繰り返すユニークな特色をもつ。細胞分裂は基底層でのみ行われ、分裂によって生じた新しい細胞は上層へ移動しながら幾つかのステージを経

Involvement of PLD/mTOR signaling
in differentiation of human epidermal
keratinocytesて分化し、最終的に apoptotic な角質細胞となる。すなわ
ちケラチノサイトの分化は、増殖→分化→終末分化（角化）という一連のプロセスをみることができる。ケラチノサイ

Kenji Ohguchi

トの分化を制御するシグナル伝達系に PLD が関与する可Gifu International Institute of Biotechnology

能性は、Bollag らにより報告されているが− 81 −

6, 7）

、その意義

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

や分子機構は十分に明らかにされていない。また、ケラチの発現増加がみられた（Fig. １）。

ノサイト分化シグナリングにおける mTOR の関与につい

次に、カルシウムによる分化誘導後の mTOR 活性のては知られていないのが現状である。そこで、ケラチノサ変動について、mTOR の代表的なターゲット分子である

イトの分化制御における PLD/mTOR の関わりについて解p70S6K のリン酸化レベルを指標に調べた。リン酸化タン

析することを目的とし、本研究ではカルシウムによる角化パク質に特異的な抗体（２種類）を用いたウエスタンブロ誘導における mTOR の関与について検証した。

ット法により、分化誘導後のリン酸化 p70S6K の経時変化

２．実を解析した。Fig. ２に示すように、２種類の抗体により検験出した p70S6K のリン酸化レベルは、分化誘導直後から低細胞は、正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK、クラボウ）下が見られた。両者の変化には若干のタイムラグがあり、を用いた。ケラチノサイト分化の制御機構に mTOR が関Thr389 の 脱 リ ン 酸 化 は 分 化 誘 導 ５ 分 後 か ら、Thr421/

わっているか否かについては、mTOR の直下に位置するSer424 の脱リン酸化は分化誘導 10 分後から起こることがターゲット分子である p70S6K のリン酸化状態を指標に、分かった。また、両者の脱リン酸化状態は一過性であるが、カルシウムスイッチ（1.5mM カルシウム添加）による分Thr389 においては 60 分後には定常レベルに戻るのに対し、化誘導系にて検証した。P70S6K のリン酸化は、Phospho-Thr421/Ser424 はリン酸化レベルの低い状態が 24 時間後p70S6K（Thr389）Antibody おまで続いた。

よび Phospho-p70S6K

Extracellular signal-regulated kinase（ERK）もカルシ（Thr421/Ser424）Antibody（Cell signaling）を 用 い た ウウムによる分化誘導に伴いリン酸化レベルが低下することエスタンブロット法により検出した。

が報告されている。Fig. ３に示すように、p70S6K（Thr389）

３．結果および考察とほぼ同様の挙動を示したが、脱リン酸化の回復時間や程3. 1. カルシウムによるケラチノサイト分 化 誘 導とp70S6K のリン酸化レベルの変化度に相違がみられたことから、mTOR 経路との連係（相互のクロストーク作動機構）解析が今後の課題である。

細胞外カルシウムは、ケラチノサイトの分化調節に重要に向かって高くなるカルシウムの濃度勾配が存在し、角化3. 2. カルシウムによるケラチノサイト分化誘導に対するmTOR 阻害の影響調節因子の重要因子と考えられている。NHEK の細胞外ケラチノサイト分化の制御機構における mTOR の関与

カルシウム濃度を上昇させると、角化が誘導され分化マーとその意義を明確にするために、カルシウムによる分化誘カーとして知られている involcurin（エンベロープ蛋白質）

導に対するラパマイシン（mTOR の選択的阻害剤）の影響な役割を演じている。実際に、表皮では基底細胞から上層

Fig.1 Induction of differentiation marker
by calcium in normal human epidermal
keratinocytes.

Fig.2 Changes in phosphorylation levels of p70S6K during calciuminduced differentiation in normal human epidermal keratinocytes.

Fig.3 Changes in phosphorylation levels of ERK1/2 during calciuminduced differentiation in normal human epidermal keratinocytes.

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表皮ケラチノサイトの角化プロセスにおける PLD/mTOR シグナリングの関与を検証した。ラパマイシンの添加により involcurin の発現（抗アポトーシス）や細胞成長（サイズ）の制御などに関与に変化はみられなかったが、ラパマイシン存在下にて高カすることが報告されているが、細胞分化への関わりはあま

ルシウム処理した細胞では、involcurin 発現が増強しており知られていない。本研究では、mTOR 経路を中心としり、mTOR を阻害することで分化誘導がより促進されるたシグナリングの視点からケラチノサイト特有の分化プことが示された（Fig. ４）。すなわち、mTOR はカルシウロセスである角化の制御機構について解析した。その結ムによる分化誘導シグナリングにおいてネガティブレギュ果、分化誘導後の cyclin D1 のダウンレギュレーションにレーターとして作動している可能性が示唆された。

mTOR が関わっている可能性が示唆された。分化誘導初期にみられる p70S6K の脱リン酸化機構については不明で

3. 3. カルシウムによるケラチノサイト分化誘導に伴う
cyclin D1 発現レベルの変化あるが、mTOR 活性の阻害（上流シグナルの遮断）あるい

Cyclin D1 は、細胞周期の G1 期から S 期への進行因子でターゼ）の活性化が考えられることから、mTOR に対するあることから、その発現量を減少させることで、増殖からsiRNA を用いた検証などから明らかにしていきたい。ケ分化へのスイッチ切り替えに寄与する重要な因子として知ラチノサイトの分化異常は、種々の角化異常症のみならずられている。NHEK におけるカルシウム分化誘導に伴う皮膚の自然老化現象としても頻繁に観察される。これらのcyclin D1 発現の変化を調べたところ、p70S6K の脱リン酸発症に、これらのシグナリング異常が関与する可能性もあ化がみられた直後から、顕著なダウンレギュレーションがり、今後の検討課題としたい。

は p70S6K をターゲットとする脱リン酸化酵素（ホスファみられた（Fig. ５）。
謝

3. 4. Cyclin D1 の ダウンレギュレーションに おける
mTOR の関与

辞本研究にご助成頂きました財団法人コスメトロジー研究振興財団に心よりお礼申し上げます。

ケラチノサイト分化誘導に伴う cyclin D1 のダウンレギュレーション機構における mTOR の関与を調べるために、 （引用文献）
cyclin D1 のタンパク質発現に対するラパマイシンの影響

１）Fang Y, Vilella-Bach M, Bachmann R. et al.

を検証した。その結果、ラパマイシンの添加により cyclin

Phosphatidic acid-mediated mitogenic activation of

D1 の発現が減少した（Fig. ６）。すなわち、カルシウムにmTOR signaling. Science, 294, 1942-1945 (2001)

よる分化誘導シグナリングにおける mTOR のネガティブ２）Fingar DC, Blenis J. Target of rapamycin (TOR): an

レギュレーターとしての機能は、cyclin D1 発現の調節に

integrator of nutrient and growth factor signals and起因する可能性が示唆された。

coordinator of cell growth and cell cycle progression.

４．総Oncogene, 23, 3151-3171 (2004)

括３）Ohguchi K, Banno Y, Akao Y. et al. Involvement

PLD/mTOR シグナリングは、新しい細胞内シグナル伝達経路として注目されている。これまでに、サバイバルof phospholipase D1 in melanogenesis of mouse B16
melanoma cells. J Biol Chem, 279, 3408-3412 (2004)

Fig. 4 Effects of rapamycin on calcium-induced differentiation in normal
human epidermal keratinocytes.

Fig. 5 Changes in expression of cyclin D1 during calciuminduced differentiation in normal human epidermal
keratinocytes.

− 83 −

Fig. 6 Effects of rapamycin on cyclin
D1 expression in normal humanepidermal keratinocytes.

コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

４）Ohguchi K, Banno Y, Nakagawa Y. et al. The

and -2 phosphorylation (activation) are required fornegative regulation of melanogenesis by phospholipasemaximal phorbol ester-induced transglutaminase

D1 through mTOR/p70 S6 kinase 1 signaling in mouseactivity, a marker of keratinocyte differentiation. J

B16 melanoma cells. J Cell Physiol, 205, 444-451 (2005)

Pharmacol Exp Ther, 312, 1223-1231 (2005)５）Ohguchi K, Banno Y, Akao Y. et al. Involvement７）Bollag WB, Xie D, Zheng X. et al. A potential roleof phospholipase D1 in collagen type I production

for the phospholipase D2-aquaporin-3 signaling moduleof human dermal fibroblasts. Biochem Biophys Resin early keratinocyte differentiation: production of aCommun, 348, 398-402 (2006)phosphatidylglycerol signaling lipid. J Invest Dermatol,６）Bollag WB, Zhong X, Dodd ME. et al. Phospholipase
D signaling and extracellular signal-regulated kinase-1− 84 −

127, 2823-2831 (2007)