GABA による摂食行動調節機構

ヒ檜ノイ

井

金沢大学医薬保健研究域薬学系

緒栄一准教授における GABA シグナリング分子発現の可能性について

言

現代の先進社会においては、エネルギーの過剰摂取とは、ほとんど解析されていないのが現状である。そこで運動不足が常態化しており、肥満やメタボリックシンド

本研究では、この脂肪細胞に注目し、GABA シグナリン

ローム患者およびその予備軍は、近年世界的に急増してグ機構の存在と、脂肪細胞におけるその機能についてのいる。これに深く関与しているのが脂肪細胞である。脂検討を行った。

肪細胞は脂肪組織に主に存在し、摂取したエネルギーを中性脂肪として細胞内に蓄積して必要に応じて全身に再実験方法

供給するエネルギー代謝のための器官であるが、近年、異なる期間培養したマウス由来前駆脂肪細胞株 3T3–

この脂肪細胞が生理状況に応じて様々な内分泌因子（アL1 細胞およびマウス内臓脂肪組織から total RNA を回ディポサイトカイン）を産生、分泌し、糖・脂質代謝、収し、GABA シグナル関連分子の発現について RT–PCR動脈壁の恒常性維持に重要な役割を果たしていることが法 を 用 い て 解 析 し た。 ま た、GABAB 受 容 体 ア ゴ ニ ス

明らかになった。肥満、脂肪蓄積によるアディポサイト

トおよびアンタゴニストを 3T3–L1 細胞に持続的に曝カインの産生異常が、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、露し、細胞成熟への影響を細胞内に蓄積した中性脂肪

1)動脈硬化症を引き起こすことも報告されている 。

を染色する Oil red O 染色を用いて評価した。さらに、

一方、γ– アミノ酪酸（GABA） は、哺乳動物の中枢神GABAB R1 サブユニット欠損マウスを用いて、野生型お経に高濃度存在する抑制性神経伝達物質として知られ、よび欠損マウス由来の初代培養脂肪細胞を培養し、RT–中枢の GABA シナプスでは抑制性情報伝達を担う。すPCR 法により脂肪細胞特異的遺伝子の発現について検なわち、中枢の GABA は主に Glutamate から Glutamic討を行った。また、野生型および欠損マウスから摘出しacid decarboxylase（GAD）により合成され、神経終末のた内臓脂肪組織について、体重当たりの組織重量の比較、シナプス小胞に蓄えられる。小胞に蓄えられた GABA は、

RT-PCR 法による脂肪細胞特異的遺伝子の発現の検討を刺激に応じて前シナプスからシナプス間隙に放出された行った。GABAB R1 サブユニット欠損マウスを用いて後、後シナプス膜状に存在する GABA 受容体を介して抑ELISA 法による血中 leptin 濃度の測定、食糧摂取量の比制性シナプス後電位を発生する。シナプス間隙に放出さ較も行った。

れた GABA は、やがて神経細胞やグリア細胞に存在するGABA トランスポーターにより細胞内に取り込まれ、そ結の作用を終える。中枢神経において、GABA の抑制作用

1. GABA シグナル分子の発現解析

果が毒物や薬物により傷害されると、神経の異常興奮や痙脂肪細胞における各種 GABA シグナル関連分子の発現攣症状が引き起こされる。さらに、GAD 活性阻害などを解析するために、各日数培養した 3T3–L1 細胞およびにより中枢で GABA 濃度が低下する状況下では、興奮性雄性マウス精巣周囲の内臓脂肪組織について、GABAA、2)の上昇と痙攣症状が誘発される 。近年我々は末梢組織

GABAB、GABAC 受容体の各サブユニット、GABA 合成である骨組織（骨芽細胞）や軟骨組織（軟骨細胞）において、酵素である GAD および GABA トランスポーター（GAT）

GABA によるシグナル伝達機構の存在を見出し、これらを特異的に認識するプライマーを用いて RT-PCR を行っ細胞の分化および成熟を調節する可能性について報告した。3T3–L1 細胞に関してはいずれの培養日数のおいててきた3),4)。しかしながら、起源を同じくする脂肪細胞

も GABAA 受容体のサブユニットの mRNA 発現は認めら1

檜井栄

一れなかった。脂肪組織に関しても同様の結果を得た。同かった（図 1）。脂肪組織においても同様の結果を得た。

じくイオノトロピック型である GABAC 受容体について

GAD および GAT についても同様の検討を行ったところ、同様の解析を行ったところ、培養 8 日目の 3T3–L1 細それらの mRNA 発現は 3T3–L1 細胞および脂肪組織の胞においてρ1、ρ2 サブユニットの mRNA 発現は確認両方で確認されなかった。

されたが、ρ3 サブユニットに関してはいずれの培養日数においてもその発現は確認されなかった。脂肪組織に

2. GABAB 受容体機能解析

おいては、ρ1、ρ2、ρ3 の発現が確認された。メタボ

3T3–L1 細胞および脂肪組織において発現の確認さトロピック型 GABAB 受容体についても RT–PCR を行っれた GABABR1 サブユニットが形成する GABAB 受容体

た結果、GABABR1 サブユニットの mRNA 発現はいずれへの刺激が、脂肪細胞の分化に与える影響を検討した。の培養日数の 3T3–L1 細胞においても観察されたのに対3T3–L1 細胞を 8 日間および 16 日間持続的に、GABABし、GABAB R2 サブユニットの mRNA 発現は観察されな受容体アゴニストである Baclofen およびアンタゴニス

GABAB receptors

A. Primers used for GABAB receptors

B. RT-PCR for GABAB receptors

図１ Expression of metabopic GABAB receptor subunits in 3T3-L1 and fat tissue(A) Primers used for GABAB receptor subunits. (B) RT-PCR for GABAB receptor subunits.

Lipid droplet accumulation

図２

Lipid droplet accumulation

3T3-L1 cells were cultured for 8 to 16 days, in either the presence or absence of theGABAB R agonist baclofen and the antagonist saclofen, followed by Oil red O staining.
2

GABA による摂食行動調節機構

トの Saclofen に曝露し、細胞内中性脂肪蓄積量を Oil養した MEF 細胞から mRNA を抽出し、脂肪細胞特異的red O 染色を用いてその染色性を評価した。その結果、遺伝子の発現を解析した。その結果、脂肪細胞分化過Baclofen お よ び Saclofen に よ る Oil red O 染 色 性 に 著程に重要な転写因子である PPARγと C/EBPαにおいて名な変化は認められなかった（図 2）。続いて、GABABは有意な変化は認められなかったが、アディポサイト

R2 サブユニットが存在せず GABAB R1 サブユニットがカインのひとつである leptin が、野生型マウスに比べ単独で発現している脂肪細胞において、GABAB 受容体

GABAB R1 欠損マウスで有意に低下していた。さらに生の機能的発現を確認するために、GABAB 受容体の代表

後 4 週目のマウス内臓脂肪組織においても、GABAB R1的な機能の一つである cAMP 応答性について検討した。

欠損マウスで leptin の mRNA 発現の有意な減少が確認

3T3–L1 細胞を播種後 20 ― 24 時間目に、レポーターされ（図 3）、血中 leptin 濃度も GABAB R1 欠損マウスにとして転写制御因子 CREB の結合配列である CRE 配列
ELISA for leptinをもつプラスミドを細胞に導入させてから、Baclofen

4 ― 8 weeks mice

お よ び ア ン タ ゴ ニ ス ト の CPG46381 を 24 時 間 曝 露し、Forskolin により上昇させた CRE 転写活性の変動をLuciferase assay により測定した。その結果、Baclofenおよび CPG46381 はともに CRE の転写活性に有意な影響を与えなかった。
3.

GABABR1 欠損マウスの表現系解析
野生型マウスと GABAB R1 欠損マウスからそれぞれ

mouse embryonicfibroblast（MEF）を調製し、白色脂肪細胞へと分化誘導を行った。そして、各培養日数にお図４

いて Oil Red O 染色を行ったが、両者の脂肪細胞分化程

Plasma leptin level

Plasma was collected from blood of wild-type and GABAB-null

度には有意な変化は認められなかった。次に、各日数培

mice, followed by measurement of plasma leptin level using ELISA.

mRNA expression on fat tissue

Gene/GAPDH（% of contorol ）4 weeks mice

図３

Expression of adipocyte specific genes in mouse visceral fat tissue

Total RNA was extracted from mouse visceral fat tissue, followed by RT-PCR or real-time PCR using specific primers.
3檜井栄

一

おいて有意に低下していた（図 4）。一方で、食糧摂取量

要は GABAB R1 欠損マウスで増加していた。さらに体重お1. 脂肪細胞には GABAB 受容体を形成する 2 つのサブユよび内臓脂肪重量は GABAB R1 欠損マウスで減少していニットのうち GABAB R1 サブユニットのみが単独で発現ることが確認された。

しているが、この GABAB R1 サブユニットは G タンパ

約ク質共役型の受容体としての機能は有していない。

考2. 脂 肪 細 胞 に 発 現 す る GABAB R1 サ ブ ユ ニ ッ ト は、察

本研究結果より、脂肪組織の中心的な存在である脂肪leptin の発現制御に関与している。

細胞に発現する GABAB R1 サブユニットは、G タンパク3. GABAB R1 サブユニット欠損マウスでは、血中 leptin質共役型受容体として機能するのではなく、摂食行動や濃度が低下し、それにともなって食糧摂取量が増加する。

エネルギー代謝に重要な leptin の発現調節に関与する

4. GABAB R1 サブユニット欠損マウスにおいて、内臓脂重要な因子である可能性が示された。また、GABAB R1肪組織は減少している。

サブユニット欠損マウスでは内臓脂肪組織特異的な重量の減少が認められたが、leptin 低下との因果関係の有無

謝およびそのメカニズムは今後明らかにしなければならな

辞本研究を遂行するにあたり、公益財団法人三島海雲記

い重要な課題であり、大変興味深いものでもある。

念財団による研究助成を賜りましたことを深く感謝申し

現代社会において、肥満患者の急激な増加は一つの社上げます。

会的問題となっており、近い将来、自分自身にも襲い掛また、研究遂行に多大なるご支援やご助言を頂きまし

かりうる問題である。本研究は、肥満研究における新たた金沢大学医薬保健研究域薬学系・薬物学研究室の米田な視点から展開されたものである。今後の展開によって幸雄博士に深く御礼申し上げます。

は、脂肪組織だけでなく他の組織における GABAB R1 サ
ブユニットの重要な機能の解明に結びつく可能性も秘め参ている。今後のさらなる解析が、肥満やメタボリックシ

1) E.D. Rosen and B.M. Spiegelman: Nature, 444, 847-853,

ンドロームのような生活習慣病の予防や治療に新たな展

2006.

考文献

2) I. Mody, et al.: Trend Neurosci . 17, 517-525, 1994.

望をもたらすことを期待したい。

3) S. Fujimori, et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun . 293,1445-1452, 2002.
4) S. Fujimori, et al.: Eur. J. Pharmacol . 550, 24-32, 2006.

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