味覚コーディング機構解明とその応用に向けた酸味情報伝達神経回路の可視化に関する研究

石丸

東京大学大学院農学生命科学研究科

緒喜朗

特任助教

れ、甘・旨・苦・酸・塩の 5 基本味が別々の味細胞で

言

味刺激は、舌前部に散在する茸状乳頭、後部の有郭乳受容されることが示された

1,2)。一方、味細胞と味神経頭、後部側面の葉状乳頭や口蓋などに存在する味蕾とい間の連絡については、各々の基本味が異なる味神経にう組織で受容される。舌後部の味蕾には舌咽神経（第 IX

よって伝えられるか否かという味覚コーディング機構の脳神経）、舌前部と口蓋にはそれぞれ顔面神経（第 VII 脳問題をはじめ、未解明の点が多い。

神経）の分枝である鼓索神経と大錐体神経が投射し、さ味神経とさらに高次の神経細胞における味覚コーディらに高次の延髄孤束核（NST）へ味覚情報を伝達している。

ング機構の解明を目的として、基本味ごとの味情報伝

マウスでは舌咽神経の細胞体は迷走神経節状神経節・舌達神経回路の可視化が試みられている。現在までに甘咽神経下神経節（NPG）、顔面神経の細胞体は顔面神経膝味と旨味受容体に共通のサブユニット T1R3 と苦味受容1)神経節（GG）に存在する 。

体 T2R5 の遺伝子発現制御領域それぞれの制御下に、経近年、末梢の味蕾における味覚受容機構について解シナプストレーサー分子コムギ胚芽レクチン（WGA）を明が進み、電子顕微鏡観察に基づいて I ～ IV 型に分類発現させたトランスジェニックマウス（それぞれ T1R3–される味細胞のうち、甘・旨・苦味はそれぞれ一部の II

WGA、T2R5–WGA マウス）が作出され、T1R3–WGA マ型細胞、酸味はシナプス構造を持つ III 型細胞で受容さウスでは NST、T2R5–WGA マウスでは NPG と GG まで

図1

PKD1L3-WGA マウス味蕾における WGA mRNA の発現解析（A–E） WGA mRNA の発現を有郭乳頭（CvP）（A)、葉状乳頭（FoP）（B, E)、茸状乳頭（Fup）（C)、口蓋（Palate）（D) を用いて調べた。
WGA mRNA は PKD1L3 と同様に、有郭乳頭と葉状乳頭で発現し、茸状乳頭と口蓋では発現しなかった。
（F–K） 有郭乳頭における WGA と PKD1L3（F–H）、WGA と TRPM5（I–K）の二重 ISH を行ったところ、WGA 陽性細胞は PKD1L3 発現細胞と一致し（F–H）、TRPM5 発現細胞とは排他的であった（I–K）。スケールバー＝ 50μm
（K.Yamamoto,et.al. : J. Neurochem. in press より転載）
1

石WGA タンパク質の輸送が観察された丸喜3,4)朗。本研究では、や III 型細胞マーカー分子の発現細胞を比較した。二重

甘味、旨味と苦味に次いで、酸味受容細胞からの神経回in situ ハイブリダイゼーション法から、WGA の mRNA路を可視化することを目的とした。

は PKD1L3 と同じ細胞で発現し、II 型細胞マーカー分子 TRPM5 とは排他的に発現することが分かった（図 1）。

結また、二重免疫染色を行ったところ、WGA タンパク質

果1. PKD1L3-WGA マウスの作出のシグナルは、III 型細胞マーカー分子 AADC 陽性細胞では検出されたが、II 型細胞マーカー分子 PLC-β 2 陽

酸味を伝達する味神経を可視化するために、酸味受容細胞特異的な WGA 発現を試みた。酸味受容体候補分子性細胞では検出されなかった（図 2）。

PKD1L3/PKD2L1 は、酸味を受容する III 型細胞特異的以上より、舌後部からの酸味情報伝達神経回路の可視5)に発現する 。そこで、PKD1L3 遺伝子の 5’ 上流約 10化に使用できるマウスの作出に成功し、PKD1L3 遺伝子kb を遺伝子発現制御領域と推定して WGA 発現プロモーの 5’ 上流約 10 kb が強い活性と高い特異性を持つプロターとして用い、その下流に WGA を連結させた Tg ベモーター領域として機能することも明らかとなった。まクターを作製し、マウス胚に導入した。その結果、3 系

た、III 型細胞から II 型細胞への WGA タンパク質の輸統の Tg マウスを確立し、2 系統で強い WGA の mRNA送が起こらないことが示された。

発現が確認できた。
3. 感覚性脳神経節における WGA 陽性細胞の分布と2. 味蕾における WGA の mRNA とタンパク質の分布

発現相関解析

PKD1L3–WGA マ ウ ス で は、WGA の mRNA と タ ン

味神経の細胞体が存在する GG と NPG において、輸パク質はいずれも、有郭・葉状乳頭の一部の味細胞に送された WGA タンパク質を抗 WGA 抗体を用いた免疫発現し、茸状乳頭や口蓋の味蕾では発現しないという染色法によって検出したところ、片側の NPG 全体で約6,7)

PKD1L3 と同様の発現様式を示した（図 1、図 2） 。次に、300 細胞（約 5%）、片側の GG 全体で約 10 細胞（約 1%）

WGA が発現する細胞種を特定するため、WGA と II 型が WGA 陽性であった（図 3）。WGA 陽性細胞数の顕著

図 2 PKD1L3-WGA マウス味蕾における WGA タンパク質の発現解析（A–D） WGA タンパク質の発現を有郭乳頭（CvP）（A）、葉状乳頭（FoP）（B, E）、茸状乳頭（Fup）（C）、口蓋（Palate）（D）を用いて調べた。WGAタンパク質は、有郭乳頭と葉状乳頭で発現し、茸状乳頭と口蓋では発現しなかった。
（E–J） 有郭乳頭における WGA と AADC（E–G）、WGA と PLG-β2（H–J）の二重免疫染色を行ったところ、WGA 陽性細胞は AADC 発現細胞と一致し（E–G）、PLG-β 2 発現細胞とは排他的であった（H–J）。スケールバー＝ 50μm（K.Yamamoto,et.al. : J. Neurochem. in press より転載）
2味覚コーディング機構解明とその応用に向けた酸味情報伝達神経回路の可視化に関する研究な違いは、舌咽神経は有郭乳頭と葉状乳頭に投射し、鼓NST については、舌咽神経は吻側領域（rNST）に投射
9)

索神経は主に茸状乳頭に投射することに起因すると考えすることられる。また、これまでラットで電気生理学的に証明さ味神経が投射することれていた鼓索神経の葉状乳頭への投射

8)を、初めて解や、rNST 冠状断面の中心背側（RC 領域）に10)が示されている。PKD1L3–

WGA マウスではこの RC 領域において、WGA タンパク剖学的に示すことができた。

質の強いシグナルが検出されたが、NST の吻側末端部WGA 陽性細胞が多く観察された NPG では、舌咽神経

では WGA が検出されなかった（図 4）。また、咽頭から束の周囲に多くの WGA 陽性細胞が集まっていた（図 3）。の迷走神経が投射する rNST 内の尾側領域においては、NPG には迷走神経と舌咽神経の細胞体が集合し、解剖WGA シグナルは観察されなかった（図 4）。さらに高次学的に分離できないとされているが、舌咽神経に含まれの PbN については、明確な WGA シグナルは検出できる酸味情報伝達神経の細胞体が局在することから、NPGなかった（データは示さない）。の中でも舌咽神経と迷走神経の細胞体は、存在する位置

さらに、脳の尾側において、NST や PbN などの味覚が大きく分かれている可能性が示唆された。また、二重伝達神経回路以外の WGA シグナルの位置を検証したと免疫染色法を用いて WGA 陽性細胞の遺伝子発現解析をころ、網様体（RF）や三叉神経運動核（V）、顔面神経核（VII）、行ったところ、WGA 陽性細胞は味神経での発現が示唆被蓋核（DTN）、舌下神経核（XII）でシグナルが見られたされている P2X2 と P2X3 を発現するが、体性感覚神経（データは示さない）。これらの位置で WGA mRNA は検で発現する TRPV1 を発現していなかった（図 3）。

出されなかったことから、輸送された WGA タンパク質が検出されたと考えられる。

4. 脳神経核における WGA 陽性細胞の分布
末梢味細胞と連絡する味神経は延髄孤束核（NST）に投考射し、さらに高次の結合腕傍核（PbN）へと味情報が伝察
本 研 究 で は、PKD1L3 陽 性 細 胞 に 経 シ ナ プ ス ト1)達されることが知られている 。そこで、脳切片を用いレーサー WGA を発現するトランスジェニックマウスて免疫染色法を行い、NPG や GG からこれらの神経核へ（PKD1L3–WGA マウス）を作出し、舌後方の III 型細胞

WGA が輸送されているかを検証した。

を基点とした神経回路の可視化に成功した。

図 3 感覚性脳神経節における WGA タンパク質の検出（A–F） NPG、 GG における抗 WGA 抗体を用いた免疫染色（A, D）。それぞれの拡大写真を B、E に示す。NPG では舌咽神経束の周囲に WGA陽性細胞が多く観察された（A, B）。GG でも WGA シグナルが観察された（D, E）。NPG、GG における WGA プローブを用いた ISH（C, F）。 WGAの mRNA 発現は見られなかった。
（G–I） NPG における WGA と P2X2、P2X3、TRPV1 との二重免疫染色、P2X2、P2X3 は舌咽神経束の周囲にも発現しており、WGA シグナルを内包した（G, H）。TRPV1 と WGA シグナルは排他的であった（I)。スケールバー＝ 50μm
（K.Yamamoto,et.al. : J. Neurochem. in press より転載）
3石丸喜

まず、PKD1L3 遺伝子の開始コドン 5’ 上流約 10 kb

朗にも示すことができた。

を用いて、有郭乳頭と葉状乳頭の PKD1L3 発現細胞特さらに高次の NST においては、強い WGA シグナル異的に WGA が発現することが示された。このことから、が観察された。まず、前後軸方向については、NST 吻

本研究で使用した領域が舌の PKD1L3 発現細胞におけ側の 800μm の範囲で、シグナルが検出された（図 4）。

る外来遺伝子発現に利用可能であるといえる。

NST における味神経の投射領域は、吻束側から鼓索神

次に、PKD1L3–WGA マウスの感覚性脳神経節にお経、大錐体神経、舌咽神経の順にそれぞれが重複するいて、味細胞から輸送された WGA タンパク質を検出ように並んでいる 。冠状断面では、rNST は吻側中央し、NPG で は WGA 陽 性 細 胞 が 舌 咽 神 経 束 の 周 囲 に（RC）と吻側外側（RL）、内側（M）、腹側（V）領域に分けら多く集まっていることが示され（図 3）、舌咽神経の細れ、RC 領域に味神経が投射する胞体が NPG の中で局在する可能性が示唆された。ま検出されたのは、NST の吻側 3 分の 1 ほどの RC 領域で、た、PKD1L3–WGA マウスの NPG の WGA 陽性細胞は、舌咽神経が投射する領域と一致し、鼓索神経が投射する

TRPV1 を発現しなかった（図 3）。TRPV1 は体性感覚神

NST の吻側末端部では WGA が検出されなかった（図 4）。

経に発現する分子で、熱やカプサイシン、さらに酸に応一方、咽頭由来の迷走神経が投射する rNST 内の尾側領9)11,12)

10)。本研究で WGA が。味覚としての酸味は TRPV1 を介して受容域では、PKD1L3–WGA マウスでは WGA シグナルが検される体性感覚の酸とは、少なくとも末梢の神経節にお出されず（図 4）、PKD1L3 が咽頭には発現しないことがいては別の経路で伝達されていることが示された。さら示唆された。

答するに、GG でも WGA 陽性細胞が検出された（図 3）。GG に

また、NST からの投射を受ける PbN では、WGA シグ

は舌の前方 3 分の 2 の味覚を支配する鼓索神経の細胞ナルが検出できなかった。WGA タンパク質は近接した体が存在する。葉状乳頭への味刺激によって鼓索神経の細胞間を受動的に輸送されるため、その量は細胞間の応答が見られるという結果から、電気生理学的に示唆さ移動を経るにしたがって次第に減少する。本研究におれていた鼓索神経の葉状乳頭への投射

8)

いては、マウスの嗅神経回路や小脳遠心性回路、T1R3–を、解剖学的

図４

NST における WGA 陽性細胞の分布（A–F） NST 連続切片の抗 WGA 抗体を用いた免疫染色。WGA のシグナルは NST の吻側 800μm の範囲（C–E）で観察された。
スケールバー＝ 500μm（G） マウス NST 横断面の模式図。A–F の切片の位置を直線で示す。（H, I） 黒線（A, D）の拡大図をそれぞれ H、I に示す。
（K.Yamamoto,et.al. : J. Neurochem. in press より転載）
4

味覚コーディング機構解明とその応用に向けた酸味情報伝達神経回路の可視化に関する研究

WGA マウスの結果

3,13)と同様に、味神経回路が 2 段階の酸味情報伝達神経回路を可視化することに成功した。
今 後、 本 研 究 で 作 出 し た PKD1L3–WGA マ ウ ス と、先の NST まで可視化された。
PKD1L3-WGA マ ウ ス の 脳 で は、 味 細 胞 か ら 大 脳 味T1R3–WGA や T2R5–WGA マウス、さらにそれぞれを覚野への味覚伝達神経回路以外の神経核においても、交配したマウス間で、各神経節や神経核での WGA 陽性

WGA シグナルが検出された（データは示さない）。網様細胞数を比較することによって、味覚コーディング機構体や三叉神経運動核、舌下神経運動核、顔面神経運動核解明に繋げたいと考えている。の WGA タンパク質の由来として、PbN で WGA シグナルが検出されないことと、T1R3–WGA マウスでも網様謝体やこれらの運動核でシグナルが検出されたことから、

辞本研究を実施するに当たりご支援を頂きました公益財

1 次味神経である舌咽神経や鼓索神経から直接網様体や団法人三島海雲記念財団に厚く御礼を申し上げます。

運動核へと WGA が輸送された可能性を考えている。味覚の延髄反射経路については rNST を起点にして検証さ参れたものが多く、1 次味神経から網様体や運動核への投

1) D. A. Yarmolinsky, et al,: Cell , 139, 234-244, 2009.

文献

2) Y. Ishimaru: Odontology, 97, 1-7, 2009.

射について検証したものは少ない。TG からは運動核へ直接投射することが報告されており

考3) M. Ohmoto, et al,: Mol. Cell. Neurosci ., 38, 505-517,14,15)、NPG や GG でも2008.

運動核へ直接投射する経路がある可能性が考えられる。

4) M. Ohmoto, et al,: Biochem. Biophys. Res. Commun ., 400,734-738, 2010.

要5) S. Kataoka et al,: Chem . Senses , 33, 243-254, 2008.

約6) A. L. Huang et al,: Nature , 442, 934-938, 2006.
7) Y. Ishimaru, et al,: Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103, 12569-

本研究は、味覚コーディング機構解明の端緒として、
酸味受容細胞と連絡する神経を特異的に可視化し、酸味12574, 2006.

伝達神経回路に関する知見を得ることを目的とした。酸8) T. Yamamoto and Y. Kawamura: Brain Res ., 94, 447-463,

味受容体候補分子であり、有郭・葉状乳頭に発現する

1975.
9) R. B. Hamilton and R. Norgren: J. Comp. Neurol ., 222,

PKD1L3 の推定エンハンサー / プロモーター領域を用い

560-577, 1984.て、PKD1L3 陽性細胞特異的に経シナプストレーサー分

10) M. C. Whitehead: J. Comp. Neurol ., 276, 547-572, 1988.

子 WGA（コムギ胚芽レクチン）を発現する遺伝子導入マ11) M. J. Caterina, et al,: Nature , 389, 816-824, 1997.

ウスを作出した。末梢神経節や神経核において、WGA

12) M. Tominaga, et al,: Neuron , 21, 531-543, 1998.
13) Y. Yoshihara, et al,: Neuron , 22, 33-41, 1999.

シグナルの分布を詳細に解析したところ、有郭・葉状乳

14) D. Menetrey and A. I. Basbaum: J. Comp. Neurol. , 255,

頭に投射する舌咽神経の細胞体が集まる迷走神経下神経

439-450, 1987.

節 / 舌咽神経節状神経節（NPG）と二次味神経の細胞体

15) C. F. Marfurt and D. M. Rajchert: J .Comp. Neurol ., 303,が存在する延髄孤束核（NST）で、強いシグナルが検出さ489-511, 1991.

れた。つまり、味細胞から NST 味覚領域まで、舌後部5