酵母を利用した組み換えヒト型セラミド生産系の開発

広島大学大学院生物圏科学研究科

船戸耕一

Yeast has been widely and successfully used to produce polypeptides, enzymes, vitamins, and lipid components
of high commercial interest. Here we describe progress using the yeast Saccharomyces cerevisiae as an industrialorganism for production of human-type ceramides. The yeast cells do not synthesize sphingolipids desaturated
at the ∆4-position of the dihydrosphingosine, which are found in many eukaryotic organisms including humans.
Instead, they produce sphingolipids hydroxylated at the C-4 position. Therefore in order to 'humanize' ceramide
biosynthesis in the yeast, it is necessar y to eliminate endogenous yeast ceramide biosynthetic pathway andintroduce a heterologous DES1 gene encoding a sphingolipid ∆4-desaturase. Indeed, the resultant yeast strain wascapable of synthesizing ∆4-desatulated sphingolipids. Furthermore, we observed that the engineered yeast canproduce a human-type ceramide, ceramide NS. Since ceramides play a critical role in maintaining the permeability
barrier function of the skin, the yeast-derived human-type ceramide could be used for clinical applications toimprove the impaired barrier function seen in several skin diseases including atopic dermatitis.

１．緒より、ヒトの皮膚に対して最も安全で高い効果が期待され言るヒト型セラミドを効率的に生産するシステムを開発する

皮膚の最外層には、水分を保持する保湿機能と外部刺激ことを目的とした。

から肌を保護するバリア機能を司る角質層という組織が存

２．実在する。角質層は角質細胞と天然保湿因子、そして細胞間験

約半分を占めるセラミドが、それらの機能に極めて重要な２.１ hDES1（ヒト由来の DES1）遺伝子発現ベクターと破壊株の作製役割を担っている。例えば、アトピー性皮膚炎や老人性乾ヒト cDNA ライブラリーを鋳型として PCR を行い、得皮症に共通する特徴は保湿能の著しい低下であるが、そのられた PCR 産物の制限酵素サイトを利用して酵母用遺伝主因は脂質代謝酵素異常によるセラミド量の減少であるこ子発現ベクターにクローニングした。またタンパク質の発とが知られている。またセラミドはバリア機能の増強・美現チェック用として、N 末端に HA および GFP が融合し白作用やメラニンの生成を抑制する作用があることも示唆た hDES1 遺伝子発現ベクターも作製した。酵母破壊株のされている。セラミドは外部から補給することが可能な物

作製は PCR を用いた遺伝子置換法を用いた。YDp プラス質である。そのため近年では、乾燥敏感肌を伴う皮膚疾患ミドを鋳型として PCR を行い、標的遺伝子の上流−選択に対する治療薬あるいは化粧品・美容健康食品の素材としマーカー遺伝子−下流が連結した PCR 産物を得た。形質て大変注目されている。実際、化粧品に関しては、セラミ転換を行い、栄養要求性培地で形質転換体を選抜し標的遺ドを配合した多くの製品がすでに市販されている。セラミ伝子の破壊株を得た。

脂質から構成されているが、その中でも特に細胞間脂質のドの原料としては、これまで牛などの動物由来のものが使われていたが、感染症の問題が指摘され、現在では米、小麦、大豆や芋などの植物性セラミドが主流である。しかし、

２ . ２ 放 射 能 標 識 [3H] myo-inositol お よ び [3H]
sphingosine を用いたイノシトール含有スフィンゴ

植物性セラミドはヒトのセラミドと構造が異なる上に生産脂質の解析性が低いことから、それらを克服することが可能な新しい

野 生 株、 各 遺 伝 子 破 壊 株 を SD 培 地 で 25 ℃、 一 晩 振生産技術の開発が強く望まれている。本研究では、酵母の盪培養した後、イノシトールを含まない SD あるいは含セラミドの合成および代謝システムを巧く制御することに有 SD 懸 濁 液 0.5 ㎖（ 菌 体 重 量 50 ㎎ ） を 調 製 し た。 ラ
ベル時の温度で 10 min 間プレインキュベーションした

Genetic engineering for synthesis ofhuman ceramides in yeast

後、[3H] myo-inositol（15µℓ，15µCi）（図 2A）または [3H]

Kouichi  Funatomyo-inositol）あるいは 37℃で 3 時間（[3H] sphingosine）

Graduate School of Biosphere Science,Hiroshima Universitysphingosine（8µℓ，4µCi）（図 2B）加え、30℃で２時間（[3H]インキュベーションした。10mM の非標識 PHS は、最終濃度が 100µM になるように、プレインキュベーションの前に加えた）（図 2A）。250mM の NaF と 250mM の NaN3−7−コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

を 20µℓ加え、反応を停止させた後、氷冷した滅菌水で 3℃で 90min 間反応させた後、0.6N 酢酸溶液で中和させた。

度洗浄し、菌体を 66µℓの滅菌水に懸濁させた。懸濁液にブタノール抽出により塩を除去し、得られたブタノール層グラスビーズを加え、激しく攪拌することにより菌体を破を窒素ガスにより濃縮乾燥させた。脂質を 20µℓのクロロ砕した。これにクロロホルム、メタノール、懸濁液の比がホルム−メタノール−水（10：10：3）に溶解させ、薄層10：10：3 になるようにクロロホルム、メタノールを加え、クロマトグラフィー（TLC）プレートに全量をスポットし、脂質を抽出した。抽出液の遠心分離を行い、得られた上清

クロロホルム−メタノール− 4.2N NH4OH（9：7：2）でを回収した後、窒素ガスを吹き付けて濃縮乾燥させた。試展開した１）。展開後、放射能標識スフィンゴ脂質をバイオ料を 100µℓのクロロホルム - メタノール−水（10：10：3）

イメージアナライザー（BAS）で解析した。に溶解し、0.6N NaOH メタノール溶液を 20µℓ加え、30

図１

酵母のスフィンゴ脂質生合成経路（

図２）とヒト型セラミドの産生経路（出芽酵母におけるヒト型スフィンゴ脂質の合成活性能力−8−）酵母を利用した組み換えヒト型セラミド生産系の開発

２. ３hDES1 タンパク質の発現解析

２. ５

野生株、N 末端に HA が融合した hDES1（HA-hDES1）

放射能標識 [3H] DHS を用いたセラミドの解析

sur2 遺伝子破壊株および hDES1 遺伝子発現ベクターを遺伝子発現ベクターを形質転換した sur2 破壊株を SD 培

形質転換した株を SD 培地で 25℃、一晩振盪培養した後、地で 25℃、一晩振盪培養した後、ミクロソーム画分を調SD 懸濁液 5 ㎖（0.5OD600units, 0.1 OD600/ ㎖）を調製した。

２）

製した 。ミクロソーム画分を遠心（100,000g×60 min）し、[3H] DHS を 10µℓ（10µCi）加え、25℃で 24 時間培養した。

可溶性画分（S）と膜画分（P）を分離した。SDS-PAGE 後、250mM の NaF と 250mM の NaN3 を 200µℓ加え、反応をニトロセルロース膜に転写し、マウス抗 HA モノクロー

停止させた後、氷冷した滅菌水で 3 度洗浄し、菌体を 66µナル抗体を用いてウエスタン解析した（図３）。

ℓの滅菌水に懸濁させた。上述したように、菌体を破砕、脂質を抽出・濃縮乾燥した後、NaOH 処理、ブタノール抽出、２. ４ ニンヒドリン試薬を用いたスフィンゴイド塩基の解析

脂質の濃縮乾燥を行った。脂質を 20µℓのクロロホルム−メタノール−水（10：10：3）またはクロロホルム−メタ

sur2 遺伝子破壊株および hDES1 遺伝子発現ベクターをノール（10：10）に溶解させ、あらかじめ borate（70mM形質転換した株を SD 培地で 25℃、一晩振盪培養した後、Na2B4O7. 10H20 メタノール溶液）で 30 min 間処理し乾燥SD 懸濁液 0.5 ㎖（菌体重量 50 ㎎）を調製した。30℃で２させた TLC プレートに全量をスポットし、クロロホルム時間インキュベーションした後、氷冷した滅菌水で 3 度洗−メタノール（9：1）で展開した４）。展開後、放射能標識浄し、菌体を 66µℓの滅菌水に懸濁させた。上述したようセラミドを BAS で解析した（図 5A，5B）。に、菌体を破砕、脂質を抽出・濃縮乾燥した後、200µℓの3．結果と考察

メタノール− 5N HCl（9：2）混合液を加え、80℃で 1 時間インキュベーションした。再度、濃縮乾燥させた後、ブジヒドロスフィンゴシン（DHS）生合成以降の反応はタノール抽出、脂質の濃縮乾燥を行った。脂質を 20µℓの高等動物細胞と酵母の間で大きく異なる。宿主として用いクロロホルム−メタノール−水（10：10：3）に溶解させ、る出芽酵母にはスフィンゴイド ∆4 - デサチュラーゼ遺伝

TLC プレートに全量をスポットし、クロロホルム - メタ

子 DES1 が存在しないことから、スフィンゴシンを骨格

３）ノール− 2.5N NH4OH（40：10：1）で展開した 。TLCにもつヒト型セラミドは合成されない（図１）3, 5 −6）。そ

プレートにニンヒドリン試薬（0.2％ニンヒドリンエタノの代わり sur2 遺伝子がコードする酵素によって DHS のール溶液）を噴霧、100℃で数分間加熱し、スフィンゴイC- 4 位が水酸化されフィトスフィンゴシン（PHS）が合成

ド塩基を解析した（図 4）。スタンダードとして、50nmolsされる。次いでそれらのスフィンゴイド塩基 DHS と PHS（10mM の 5µℓ）の精製品（S, DHS, PHS）を用いた。

は、それぞれジヒドロセラミドとフィトセラミドに変換さ

図３

出芽酵母における hDES1 タンパク質の発現

図４ hDES1 遺伝子導入によるスフィンゴシン骨格をもつスフィンゴ脂質の産生−9−コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007れる。そのためヒト型セラミドを酵母で合成させるためにそこで、放射能標識 [3H] スフィンゴシンを用いて、外因性は、酵母特有の PHS とフィトセラミドの両方が合成されスフィンゴシンがイノシトール含有スフィンゴ脂質に変換ないように細工をし、DES1 遺伝子を酵母に導入する必要されるかどうか解析を行った。sur2 破壊株に [3H] スフィがあると考えられる。もし酵母のセラミド合成酵素がスフンゴシンを加えると、スフィンゴシン由来の 2 つの特異的ィンゴシンあるいは DES1 タンパク質がジヒドロセラミドな脂質が検出された（図 2B）。比較的穏やかな NaOH 処を基質として認識することができるならば、スフィンゴシ理後に検出されることから、この 2 つの脂質はアミド結合ンを骨格にもつヒト型セラミドが酵母で合成されるはずでを有するスフィンゴ脂質であり、それらの移動度からそれある。本研究では、酵母の SUR2 遺伝子を破壊した株をぞれ IPC-AS と MIPC-AS（A: モノヒドロキシ脂肪酸鎖 ,S:ベースにし、ヒト由来の DES1（hDES1）遺伝子を導入スフィンゴシン骨格）であると推定された。一方、野生株することによってヒト型セラミドが産生されるかどうかにではそれらの脂質はほとんど検出されない。これは、おそついて解析を行った。

らく野生株で作られる PHS あるいはフィトセラミドとの競合が原因であると考えられる。これらの結果は、細胞内３.１ 外因性基質によるヒト型スフィンゴ脂質の合成活性
SUR2 遺伝子がコードする酵素 C4- ヒドロキシラーゼは、でスフィンゴシンが合成されれば、スフィンゴシン骨格をもつヒト型セラミドが sur2 破壊株で合成される可能性をDHS またはジヒドロセラミドの C-4 位に水酸基を導入す示している。また SUR2 遺伝子の破壊がヒト型セラミドる触媒活性をもつ。従って、その遺伝子破壊株は、C-4 位の合成のための必須な条件であることも示唆している。

が水酸化された PHS 骨格をもつイノシトール含有スフィ酵母には、C4- ヒドロキシラーゼ SUR2 タンパク質以ンゴ脂質、イノシトールリン酸セラミド（IPC-NP，IPC-

外に、スフィンゴ脂質の脂肪酸の α 位に特異的に作用す

AP，IPC-BP； N: 脂肪酸鎖，A: モノヒドロキシ脂肪酸鎖，る α- ヒドロキシラーゼの存在が知られている。この酵

B : ジヒドロキシ脂肪酸鎖，P: フィトスフィンゴシン骨格）

素をコードする遺伝子は SCS7 であり、この遺伝子の破と マ ン ノ シ ル -IPC（MIPC-NP，MIPC-AP） を 合 成 す る

壊株はスフィンゴ脂質の脂肪酸の α 位に水酸基を導入すことができない（図 2A）。この sur2 破壊株に細胞外からることができない（図１）。上述したように、sur2 破壊株

PHS を供給させると、PHS 骨格をもつ IPC-AP と MIPC-

では PHS を骨格にもつスフィンゴ脂質は合成されないが、AP が合成される。このことは、内因性のスフィンゴイド

SCS7 タンパク質の作用により 2 種類の異なった脂肪酸鎖塩基と同様に、細胞内に取り込まれた外因性スフィンゴイ（N: 脂肪酸鎖、A: モノヒドロキシ脂肪酸鎖）を有するセラ

ド塩基もセラミドの合成を経てイノシトール含有スフィンミド（Cer-NSa, Cer-ASa）とイノシトール含有スフィンゴゴ脂質へ変換されることを示している。

脂質（IPC-NSa, IPC-ASa, MIPC-NSa, MIPC-ASa）が合成

ヒト型スフィンゴイド塩基（スフィンゴシン）をセラミされる（図 2A）。酵母でヒト型セラミドを効率的に生産ドに変換させる能力が酵母にあるかどうかは不明である。

させるためには、またその後の抽出と精製を容易にさせる

図５ hDES1 遺伝子導入によるセラミド NS の産生と YDC1 破壊及び ISC1 過剰発現の影響− 10 −

酵母を利用した組み換えヒト型セラミド生産系の開発には、基質となるセラミドの種類が少ないほうがより効果したコントロール株では検出されない。また sur2 と scs7的であると考えられる。そこで、モノヒドロキシ脂肪酸鎖の両方の遺伝子を破壊させた株に hDES1 遺伝子を導入しからなるスフィンゴ脂質（Cer-ASa, IPC-ASa, MIPC-ASa）たときにのみ観察され、sur2 単独破壊株においては認めが合成されない sur2 scs2 二重破壊株（図 2A）においてられなかった。更に放射能標識 [3H] sphingosine でラベルも、上記と同様の実験を行った。その結果、sur2 単独破した sur2 scs7 二重破壊株において検出されたセラミド分壊でみられたスフィンゴ脂質と移動度の異なる 2 つのスフ子と同じ移動度を示すこと、この脂質の合成がセラミド合ィンゴ脂質が観察された（図 2B）。SCS7 タンパク質の機成阻害剤である australifungin により阻害されたことから能とその移動度から推察するに、この 2 つの脂質はそれぞ（data not shown）、Cer-NS であると考えられる。これは、れ IPC-NS と MIPC-NS であると考えられる。以上の結果

hDES1 遺伝子を形質転換した sur2 scs7 二重破壊株で産生は、sur2 破壊株と同様に、細胞内でスフィンゴシンが合されたセラミドの主なものが Cer-NSa と Cer-NS であると成されれば、スフィンゴシン骨格をもつヒト型セラミドがいう LC-MS/MS の解析結果とも一致している（data notsur2 scs2 破壊株で合成される可能性を示している。

shown）。
そこで、この評価系を用いて、アルカリジヒドロセラミ

３. ２

hDES1 タンパク質の発現解析

ダーゼをコードする YDC1 遺伝子（図 1 参照）の破壊お

hDES1 タンパク質が酵母の細胞内で発現されるかどう

よびイノシトールホスフォスフィンゴ脂質ホスフォリパー

かついて調べるため、N 末端に HA が融合した hDES1 遺ゼ C をコードする ISC1 遺伝子（図１参照）の過剰発現の伝子発現ベクターを sur2 破壊株に形質転換し、可溶性画影響について解析を行った。その結果、sur2 scs7 二重破分と膜画分を調製した後、それらの画分をウエスタン解析

壊株の Cer-NSa を 100％とした場合、二重破壊の Cer-NSした。その結果、HA 融合 hDES1 タンパク質の殆どは膜は 30%、sur2 scs7 ydc1 三重破壊株で 64%、ISC1 を高発画分に存在し、酵母内で hDES1 タンパク質が膜タンパク現させた sur2 scs7 ydc1 三重破壊株で 309% と順次増加質として発現していることが確認できた（図３）。また蛍した（図 5B）。以上の結果は、hDES1 遺伝子を sur2 scs7

光顕微鏡により GFP 融合 hDES1 タンパク質の発現も確二重破壊株に導入することによって、ヒト型セラミドであ認できた（data not shown）。

る Cer-NS が産生されること、および Cer-NS を酵母で効率的に産生させるには YDC1 との三重破壊と ISC1 の高３. ３ hDES1 遺伝子導入によるヒト型スフィンゴ脂質の産生発現が有効であることを示唆している。

４．総

sur2 破壊株と sur2 scs7 破壊株に hDES1 遺伝子を導入括することによって、スフィンゴシン骨格をもつスフィンゴ

本研究では、まず hDES1 遺伝子を sur2 破壊株および脂質が合成されるかどうかについて解析を行った。形質転

sur2 scs7 二重破壊株に形質転換させるとスフィンゴシン換した株から脂質を抽出、塩酸で処理（スフィンゴ脂質の骨格を有するスフィンゴ脂質が合成されることが示された。

アミド結合を分解）した後、得られた全スフィンゴイド塩

また hDES1 遺伝子を sur2 scs7 二重破壊株に形質転換さ基をニンヒドリン試薬で分析した。その結果、hDES1 遺せることによりヒト型セラミドである Cer-NS が産生され伝子を形質転換した両方の株からスフィンゴシンが検出さること、Cer-NS をより効率的に産生させるには YDC1 とれた（図 4）。コントロールベクターを形質転換した sur2の三重破壊と ISC1 の高発現が有効であることが示唆され破壊株では、スフィンゴシンは検出されない。これらの結た。以上の結果より、出芽酵母を用いてヒト型セラミド

果は、hDES1 を導入した sur2 破壊株および sur2 scs7 破を産生する基盤的システムが構築できたといえる 7）。今後、壊株において、スフィンゴシン骨格をもつスフィンゴ脂質

この Cer-NS 合成システムをより効果的なシステムに最適が合成されていることを示しており、ヒト型セラミドが産化することにより、実用化可能なシステムの開発が期待さ生されている可能性を強く示唆している。

れる。

次に実際に、ヒト型セラミドが産生されているかどうかについて解析を行った。TLC を用いたセラミド分子種の謝

辞分離の方法についてはこれまでいくつか報告がある。そ本研究に対してご支援を頂いた財団法人コスメトロジーのなかで Cer-NSa と Cer-NS を分離することが可能な方法研究振興財団に深く感謝致します。また本研究の遂行にごを用いて、ヒト型セラミドの産生評価を行った。その結尽力頂いた広島大学大学院生物圏科学研究科とサントリー

果、hDES1 遺伝子を形質転換した sur2 scs7 破壊株にお株式会社先進コア技術研究所の共同研究者の皆様に厚く御いて、Cer-NSa とはあきらかに移動度の異なる脂質が検出礼申し上げます。

された（図 5A）。この脂質は、ベクターのみを形質転換− 11 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

（参考文献）

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