森林生物資源からの育毛活性成分の探索
九州大学大学院

近農学研究院森林資源科学部門

藤隆 一 郎The investigation of bioactive natural products has, in recent years, assumed a greater sense of urgency in responseto the expanding human population and its subsequent demands for food, cosmetics, good health, and increasing areasof land on which to live. It has so far been known a lot of hair regrowth promoters of that the efficacies are mainly thestimulation of blood circulation and the vasodilatation. Recently the basic researches for hair growth and hair follicle
cycle have been rapidly improved by the progress of cell culture technique and genetic engineering. In general thefollowing factors have been mentioned as probable causes on hair loss: the hormonal effect of androgen, the inactivationof hair matrix cells, the reduction of blood circulation around hair follicle and so on. The purpose of this investigation isto identify extracts or components form plants having proliferating effects on mouse hair epithelial cells.
The proliferation activity of 49 samples prepared from extract of heartwood was examined. The extracts from
Cercidiphyllum japonicum showed proliferation activity on hair epithelial cells by [3H] thymidine uptake assy. Structureactivity investigation suggested that catechol structure is important for expressing ability of proliferation activity on
hair epithelial cells.

１．緒

言

２．実

樹木は化学的にはセルロース、ヘミセルロース、リグニ

２. １ン及び抽出成分に分類できる。特に、抽出成分は樹種により質的、量的に多種多様であり、これまでに様々な生理活性物質が報告されており毛根由来上皮系細胞の培養

毛根由来上皮系細胞の単離および培養は Tanigaki ４）らの方法を一部改良して行った。

、これらから有用な機能を備４日齢マウスより背部皮膚片を採取した。皮膚片を幅１、２）えた物質が見つかる可能性は高いと考えられる。

験２〜３mm 程度の短冊状にし、その皮膚片を 500 unit/mL

また育毛剤の需要は年々高まってきている。従来、育毛ディスパーゼ入り５％ FBS － DMEM に移し、４℃で 17 . 5剤のターゲットは中高年の男性であったが、近年の社会的時間静置した。この際に抗生物質（GIBCO、Antibiotic-

環境の変化に伴い若年層や女性にまでその需要が拡大してantimycotic）を１％ v/v となるように添加した。

いる。以前の育毛剤は頭皮の環境整備や栄養補給、経験的ディスパーゼ処理した皮膚片を、ピンセットを用いてな民間薬が主であった。しかし近年、毛の成長や脱毛症に表皮を剥離除去し、真皮を 0 . 25％コラゲナーゼ入り５％関する基礎的研究の進展により見いだされた知見に基づくFBS － DMEM に移した。これを 37℃で１時間インキュベ

新しい観点からの育毛活性成分の開発が試みられるようにートした。インキュベート後、真皮の固まりが見えなくなっている 。本研究で着目した毛根由来上皮系細胞は最なるまでピペッティングを行い、1000 rpm で 5 分遠心し、終的に毛に分化する細胞であり、同細胞の増殖促進活性を真皮繊維芽細胞および毛根組織を得た。

３）有する物質は育毛剤原料の候補となり得る。

遠心後、ペレットに PBS（－）を加え、十分に懸濁させそこで本研究では豊富な生理活性成分を有している樹木

た後、真皮繊維芽細胞を取り除くために 400 rpm で１分遠抽出物からの育毛活性成分の探索として、毛根由来上皮系心処理し、上清を吸引除去した。この操作を４回繰り返し細胞増殖促進物質を見出すことを目的とした。

た。さらに真皮繊維芽細胞を取り除くために 70 µm のフィルターを通し、フィルター上に残ったものをバックウオッシュし、これを毛根組織とした。
得られた毛根組織を遠心処理で集め、0 . 25％トリプシン

Investigation on active compounds ofhair growth from forest bioresources
Ryuichiro Kondo
Laboratory of Systematic Forest andForest Products Sciences, Faculty ofAgriculture, Kyushu University/ 0 . 1％ EDTA 溶液を加え、５分間ピペッティンした。FBSをトリプシンと同量加え、さらに PBS（－）を 10 倍量加えた。
この細胞懸濁液をシリコンメッシュで濾過し、シリコンメッシュを通過してきたものを毛根由来上皮系細胞とした。
得られた毛根由来上皮系細胞を遠心後、上清を吸引除去し、５％ FBS － DMEM に懸濁した。血球計算盤にて細胞数を計測し、所定濃度となるように５％ FBS － DMEM（0 . 5− 21 −％抗生物質を含む）にて細胞を希釈した。type １collagen３．結でコートした 24 well plate（FALCON）に５× 105 cells/well の細胞密度で播種した。播種した細胞は 37℃、５％３. １

果毛根由来上皮系細胞増殖促進活性評価系の確立

CO 2 条件下で 17 時間培養した。
17 時間培養後、5 %FBS-DMEM を吸引除去し、PBS細胞増殖促進活性評価系の確立の際にポジティブコント（－）で洗浄後、培地を MCDB 153（SIGMA）（insulin：５ロールとして毛根由来上皮系細胞増殖促進効果ならびにµg/mL、hydrocortisone: 1 . 4 µM、EGF: 5 ng/mL、BPE：

発毛効果が報告されている minoxidil（70 ppm）を用いた。

50 µg を含む）に交換し、培養を続けた。培養は 37℃、５

よって minoxidil と control の間に顕著な [ 3 H]thymidine％ CO 2 条件下で行った。なお MCDB 153 に培地交換した取り込み量の差が観察される系の構築を目的とした。

日を培養初日と定義した。

培養 2 日目以降の [ 3 H]thymidine 取り込み量を経時的に測定した結果培養４日目に control と minoxidil 添加

２. ２

毛根由来上皮系細胞増殖促進活性評価法

系に差が観察された（Fig. １）。この結果から control と所定期間培養した毛根由来上皮系細胞に [ 3 H] thymidine

minoxidil 添加系に差が観察されるのは培養４日目前後で溶液（8 KBq/well）（statistic ability、1 . 81 TBq/mmol）あることが判明した。また control の取り込み量は経時的（Amersham）を添加し一定時間取り込ませた。その後、に減少していくのに対し、minoxidil 添加系では培養 4 日

各 well を冷 PBS（４℃）で２回洗浄、冷 10％トリクロロ目以降から取り込み量が減少している。Control は分化酢酸で１回洗浄した。さらに冷 10％トリクロロ酢酸を加し、その結果、増殖能が失われ取り込み量が減少している

え、４℃で 30 〜 60 分静置した。トリクロロ酢酸を除去後、と考えられる。一方 minoxidil は毛根由来上皮系細胞の分1 N の NaOH を添加し１時間以上 37℃で静置した。その後、化を遅延、増殖期間を延長するために培養４日目から [ 3 H]数回ピペッティングし液体シンチレーションカウンターにthymidine 取り込み量に差がでていると考えられる。て放射活性を測定した。

よって minoxidil と同様の効果を持つ物質の探索を行うことを目的に、スクリーニングでは培養初日にサンプルを２. ３

サンプル調製およびスクリーニング添加し、培養４日目に [ 3 H]thymidine を添加しその取り込

国産樹木（主に落葉広葉樹）は九州大学演習林よりサンプリングした。直径が 20 cm 以上の幹もしくは枝を伐採

み量を測定することで各サンプルの毛根由来上皮系細胞増殖促進効果を評価することとした。

し、心材部と樹皮に分けた。心材部、樹皮それぞれを木粉（# 80 pass）にし、室温でメタノールに浸して１日静置を３. ２

３回繰り返すことによりメタノール抽出物を得た。

樹木抽出物のスクリーニング

49 種の樹木抽出物をスクリーニングした結果、アカマ

タイ産樹木は葉部、茎部、花部に分けそれぞれをアセトン抽出した。

ツ心材メタノール抽出物、カツラ心材メタノール抽出物、ニセアカシア樹皮メタノール抽出物、Albizia myriophylla

調製した抽出物を毛根由来上皮系細胞培養初日に添加（1/ 1000 v/v、エタノール溶液）した。４日間培養後、葉部アセトン抽出物に minoxidil と同等の細胞増殖促進活性が観察された（Fig. ２）。

[ H]thymidine を添加し細胞増殖促進活性を評価した。な

最も再現性よく、また入手が容易であるカツラ材部メタお溶媒のみを加えたものを control とし、control を 100％

ノール抽出物について培養 2 日目以降の [ 3 H]thymidine 取3として各サンプルの細胞増殖促進活性を評価した。

２. ４

1500

カツラ（Cercidiphyllum japonicum）に含ま**れる成分の探索
カツラ材部メタノール抽出物 2474 mg を n －ヘキサン、エーテル可溶部、酢酸エチル可溶部、水層残渣を得た。各

1000

DPM

エーテル、酢酸エチルで逐次分配し、n －ヘキサン可溶部、control
minoxidil

500

可溶部の重量を測定し、分配比を算出した後、各可溶部の細胞増殖促進活性について試験した。さらにエーテル可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン→0酢酸エチル→メタノール）により８つに分画した。各画分に含まれる成分を逆相分取 HPLC により単離し、NMR、MS、旋光度により同定した。

234
培養日数（日）

5Fig.1 ［3H］thymidine取り込み量の経時変化
mean±SD，n=3，*p<0.05 to control− 22 −

6森林生物資源からの育毛活性成分の探索

り込み量を経時的に測定した結果、カツラ材部メタノール

quercetin、（2 R, 3 R）－（+）－ ampeloptin、myricetin、gallic

抽出物にも minoxidil と同様に毛根由来上皮系細胞の増殖

acid に有意な活性が観察された（Fig. ６）。これら活性を期間の延長効果が観察された（Fig. ３）。このことからカ示した化合物のどのような構造が活性発現に寄与している

ツラ材部メタノール抽出物に minoxidil と同様の効果を有の検討するために、共通構造に着目した構造－活性相関をする物質が含まれると考えられる。

行った。

３. ３

３. ４ フラボノイドおよび関連化合物の細胞増殖促進

カツラ材部メタノール抽出物に含まれる成分の探索

活性カツラ材部メタノール抽出物に着目し、これに含まれる細胞増殖試験に供した化合物の一部を Fig. ７に、試験成分の探索を行った。有機溶媒分配後の各可溶部の細胞試結果を Fig. ８に示す。フラボノイド化合物では flavone、験結果（Fig. ４）を示す。細胞試験の結果より、エーテ（±）－ 4 ' － hydroxyflavanon、（±）－ naringenin、apigenin

ル可溶部に１ppm、0 . 1 ppm 両濃度において高い毛根由来に活性が観察されなかった。B 環の水酸基パターンに注上皮系細胞増殖促進活性が観察された。そこでエーテル可目するとカテコール構造を有するもの（luteolin、（±）－

溶部に含まれる成分の探索を行った。その結果（2 R, 3 R）

eriodictyol、（+）－ catechin、（－）－ epicatchin、（－）－－（+）－ aromadendrin、kaempherol、sexangularetin、epigallocatechin（EGC））に活性が観察された。またフラ（2 R, 3 R）－（+）－ taxifolin、quercetin、（2 R, 3 R）－（+）

ボノイド以外の化合物でもカテコール構造を有している－ ampeloptin、myricetin、gallic acid を同定した（Fig. ５）。
1 ppm
0.1ppmkaempherol、sexangularetin 以外の単離・同定した化合物を細胞試験に供したところ（2 R, 3 R）－（+）
－ taxifolin、ヘキサン可溶部

1 ppm
0.1ppm
エーテル可溶部**

酢酸エチル可溶部**

アカマツ心材MeOH抽出物*

カツラ心材MeOH抽出物

*

水層残渣

*

ニセアカシア樹皮MeOH抽出物

050100150200

Relative cell growth（%）*

Albizia myriophylla
050100150Fig.4 カツラ材部メタノール抽出物各可溶部の細胞増殖促進活性
mean±SD，n=3，*p<0.05

200

Relative cell growth（%）
Fig.2 樹木抽出物の毛根由来上皮系細胞増殖促進活性評価系を用いたスクリーニング結果
mean±SD，n=3，*p<0.0510μM
1μM(+)-aromadendrin*(+)-ampeloptin

2500

*

2000

*

1500
DPM

*

myricetin**

controlminoxidil：70ppm
カツラ：心材，1ppm*(+)-taxifolin

quercetin

*

1000

*

gallic acid
500002345
培養日数（日）650100150200250

Relative cell growth（%）

7Fig.3 カツラ材部メタノール抽出物添加系の［3H］thymidine取り込み量の経時変化。
mean±SD，n=3，*p<0.05 to control

Fig.6 カツラ材部メタノール抽出物エーテル可溶部より単離した化合物の細胞増殖促進活性
mean±SD，n=3，*p<0.05− 23 −

R1
R3

R1OH

HOOH

O

HO

R2

C

O

R2

OH
OH

HOO

O

OH

kaempferol (R1: H, R2 : H, R3 : H)
quercetin (R1: OH, R2 : H, R3 : H)
myricetin (R1: OH, R2 : OH, R3 : H)
sexangularetin (R1: H, R2 : H, R3 : CH3)OHHOOH

OHO(2R, 3R)-(+)-aromadendrin (R1: H, R2 : H)
(2R, 3R)-(+)-taxifolin (R1: OH, R2 : H)
(2R, 3R)-(+)-ampeloptin (R1: OH, R2 : OH)gallic acidFig.5 カツラMeOH抽出物エーテル可溶部より単離・同定された化合物
R3

R3R2
R1

R2O

R1OH

O

OH
O

HO

R1

R1O

(±)-4' -hydroxyflavanon (R1: H, R2 : OH, R3 : H)(±)-naringenin (R1: OH, R2 : OH, R3 : H)(±)-eriodictyol (R1: OH, R2 : OH, R3 : OH)

O

ROH

OH
(+)-catechin

OHOHOH

CH3OH

HOcatechol (R : H)
4-methylcatechol (R : CH3)
caffeic acid (R : -CH=CHCOOH)
L-DOPA (R : -CH2CH (NH2) COOH)(R)-(-)-epinephrine (R: -CH (OH) CH2NHCH3)

OHOH
resorcinolOH

flavone (R1, R2, R3 : H)
apigenin (R1: OH, R2 : OH, R3 : H)luteolin (R1: OH, R2 : OH, R3 : OH)OH
3-methylcatechol

Fig.7

OOH
OH
(-)-epicatechin

フラボノイドおよび関連化合物*(-)-EGC
10μM
1μM

flavone

10μM
1μM

resorcinol(±)-4'-hydroxyflavanone

catechol**(±)-naringenin
4-methylcatechol**

apigenin
3-methylcatechol
luteolin*(±)-eriodictyol(+)-catechin(-)-epicatechin*
050100*caffeic acid**(-)-epinephrine*

L-DOPA150200

Relative cell growth（%）***
0100200300

Relative cell growth（%）

Fig.8 フラボノイドおよび関連化合物の細胞増殖促進活性
mean±SD，n=3，*p<0.05 to control− 24 −**400

森林生物資源からの育毛活性成分の探索

もの（catechol、4 － methylcatechol、3 － methylcatechol、

唆された。

caffeic acid、L － DOPA、（－）－ epinephrine）に活性が観

今後は今回見出された活性化合物の活性発現機構の解明察された。カツラより単離された活性化合物も分子内にカを行うとともに活性化合物をリードとした新規育毛剤の開テコール構造を有している。これらの結果から活性発現に発が期待される。

はカテコール骨格の存在が重要であることが示唆された。

４．考（引用文献）

察１）C . P o l o t t i , R . K o n d o , K . S h i n m i z u e t a l : A n

今 回、 毛 根 由 来 上 皮 系 細 胞 の 培 養 系 お よ び [ H]examination of the anti fungal components in thethymidine 取り込み法を用いた細胞増殖促進活性評価系

heartwood extracts of Pterocarpus indicus. Mokuzaiを構築した。また minoxidil が毛根由来上皮系細胞の増gakkaishi, 41 , 593 - 597 ( 1995 )

3

殖期間を延長していることが示され、樹木抽出物より

２）K. Shimizu, R. Kondo, K. Sakai: The inhibitoryminoxidil と同様の効果を有する物質を探索した結果、カcomponents from Artocarpus incisus on melanin

ツラ材部メタノール抽出物を選抜した。カツラ材部メタノ

Biosynthesis. Planta Medica, 64 , 408 - 412 ( 1998 )ール抽出物は毛根由来上皮系細胞に対し、minoxidil と同３）Takahashi T, Kamiya T, Yokoo Y: Proanthocyanidinsfrom grape seeds promote proliferation of mouse hair様に同細胞の増殖期間の延長が観察された。

follicle cells in vitro and convert hair cycle in vivo.

カツラ材部メタノール抽出物の活性成分として gallic

Acta Derm-venereol, 78 , 428 - 432 ( 1998 )acid、taxifolin、quercetin、myricetin、ampeloptin などのポリフェノール類を同定した。これらの化合物をもとに

４）Tanigaki N, Ando H, Ito M, Hashimoto A, Kitano Y.

構造 - 活性相関を検索したところ、分子内にカテコール構Electron microscopic study of cultured cells from the造を有するポリフェノール類に活性が観察された。このこ

murine hair tissues: cell growth and differentiation.とから毛根由来上皮系細胞増殖促進活性の発現には分子内Arch Dermatol Res 282 , 402 - 407 ( 1990 )にカテコール構造を有していることが重要であることが示− 25 −