ごあいさつ
コーセーコスメトロジー研究財団の 29 冊目の研究報告書をお届けします。
本財団は、1990 年に株式会社コーセーの創業者小林孝三郎により設立され、昨年は創立 30 周年を迎えることができました。この間、
本財団がコスメトロジー（化粧品科学）の発展をめざして研究助成活動を滞りなく継続できましたことは、多くの関係者の皆様のご理解とご協力によるものと、心より感謝申し上げる次第
でございます。
化粧品科学は、医学、生命科学、化学、心理学、社会学など幅広い学問領域を基盤に成り立っており、これら様々な専門分野の研究者が集って化粧品分野の研究に参画することで、今日のコスメトロジーが体系づけられてきたといえます。
本財団が助成した研究テーマも、化粧品の新素材や物性評価など工学的なテーマから、健康な皮膚を保つための皮膚科学や安全性の研究、さらには化粧心理や化粧文化といった化粧行為を研究対象にしたものなど多岐にわたります。これら
研究助成の成果を通して、これまで本財団がコスメトロジーの発展に微力ながら貢献できましたことは、私どもの大きな喜びとするところでございます。
今回の報告書は、2018 年度から 2019 年度に助成を受けられた研究者 39 名の研究報告を掲載しております。また「コスメトロジー研究助成を受けて」と題して、研究助成を受けられた先生方の所感を収載しています。
皆様には、この研究報告書 COSMETOLOGY 誌をご高覧いただきまして、コ
スメトロジーの更なる発展に向けてご活用いただければ幸いです。
引き続き、本財団は、独創的な研究テーマを積極的に助成してまいる所存でございます。今後とも、皆様からますますのご協力とご支援を賜りますようお願い申し上げます。

2021 年 9 月
公益財団法人 コーセーコススメトロジー研究財団
理事長

小林

保清

目

次

■ごあいさつ
■研究報告
Ⅰ．素材、物性に関する分野
・･天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基盤開発と機能解明･･････････････････ 4
名城大学理工学部 景山 伯春・･機能性化粧品として期待できる皮膚ガス応答性発色素材の研究開発････････････････････････････････ 8亮
島根大学大学院自然科学研究科 笹井・･乳酸菌オリゴ DNA による上皮細胞の炎症制御と経皮核酸素材への展開････････････････････････････ 13
信州大学農学部 下里 剛士
・･ β -アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製･････････････････････････････････････････････････ 18
芝浦工業大学システム理工学部生命科学科 須原 義智・･超分子架橋を施した高保水性コラーゲン微粒子の創製･･･････････････････････････････････････････ 25
東京医科歯科大学生体材料工学研究所 田村 篤志
・･高分子ベシクル積層膜の秩序構造とダイナミクス･･･････････････････････････････････････････････ 31
大分大学理工学部 檜垣 勇次
・･強紫外光が照射された部位選択的な治療を可能とする分子システムの開発･････････････････････････ 36
大阪薬科大学 平野 智也
・･化粧品原料微粒子の液中での分散・凝集状態評価技術の開発･････････････････････････････････････ 40
隆昌
法政大学生命科学部 森・･エマルション重合過程におけるミクロ生体高分子ゲルの粘弾性測定法の開発･･･････････････････････ 46
東京大学大学院総合文化研究科先進科学研究機構 柳澤 実穂
・･モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究･･･････ 49
喜
広島大学大学院医系科学研究科薬学分野 山野・･CRISPR-Cas9 ゲノム編集技術を用いた紫外線防御剤となる多機能光回復酵素の開発････････････････ 57
大阪大学大学院基礎工学研究科 山元 淳平
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
・･In vitro/in silico 試験による皮膚感作性の毒性学的懸念の閾値（TTC）コンセプトの確立････････････ 62
国立医薬品食品衛生研究所安全性予測評価部 足利 太可雄・･シリカナノ不織布を用いた汎用皮膚三次元モデルの開発･････････････････････････････････････････ 67
横浜国立大学大学院工学研究院 飯島 一智・･黄色ブドウ球菌免疫かく乱タンパク質を介したアトピー性疾患発症・増悪機構の解明･･･････････････ 71
名古屋市立大学大学院薬学研究科医療機能薬学専攻衛生化学分野 伊藤 佐生智・･転写因子 SOX2 による皮膚虚血再灌流障害（急性期褥瘡）における制御機構の解明
および新規治療法の開発･････････････････････････････････････････････････････････････････････ 77
群馬大学大学院医学系研究科皮膚科学 内山 明彦
・･皮膚で発現する化学物質受容体が体の温度適応に与える影響･････････････････････････････････････ 81
甲南大学大学院自然科学研究科 / 統合ニューロバイオロジー研究所 太田 茜、高垣 菜式− II −

・･脂肪酸の構造ダイバーシティを活用する生理活性物質創製･･･････････････････････････････････････ 86
東京大学大学院薬学系研究科 大和田 智彦
・･EGF が皮膚炎に与える影響とメカニズム･･･････････････････････････････････････････････････････ 89
熊本大学大学院生命科学研究部免疫学講座 押海 裕之
・･アトピー患者に対する化粧品の皮膚刺激性・保護作用を評価する新規皮膚炎モデルの開発･･･････････ 93
修
広島大学原爆放射線医科学研究所 神沼・･メラニン色素合成の解明に向けて〜チロシナーゼ関連タンパク質の金属要求性に関する基盤研究〜･･･ 97
京都大学大学院生命科学研究科 神戸 大朋・･神経ペプチドシグナルを介したアレルギー発症メカニズムの解明と皮膚炎軽減効果････････････････ 102
北海道大学遺伝子病制御研究所 北村 秀光
・･アシル CoA 合成酵素 ACSVL4 による皮膚バリア形成機構･･･････････････････････････････････････ 109
北海道大学大学院薬学研究院 木原 章雄
・･ロドデンドロールによる細胞死へのフェロトーシスの関与の可能性･･････････････････････････････ 115
翔
山形大学大学院医学系研究科 小林・･食薬用植物からの育毛活性物質の探索･････････････････････････････････････････････････････････ 120
筑波大学生命環境系 繁森 英幸
・･アトピー性皮膚炎発症者に高度に定着する黄色ブドウ球菌と健常者皮膚細菌の菌種間干渉の解析･ ････････ 125
静岡県立大学食品栄養科学部 島村 裕子
・･アトピー性皮膚炎における新規オートファジーの関与とそれを応用した治療法開発････････････････ 131
東京医科歯科大学難治疾患研究所 清水 重臣
・･皮膚付属器官を有する三次元再生皮膚器官系の開発････････････････････････････････････････････ 135
真
国立研究開発法人理化学研究所 生命機能科学研究センター 武尾・･常在菌フローラ育成を目指す肌表面微小環境応答性ポリアミノ酸の開発･･････････････････････････ 141
東京工業大学科学技術創成研究院化学生命科学研究所 武元 宏泰
・･ヒト嗅覚受容体センサーによる匂いのデジタル化を応用した香水設計手法の確立･･････････････････ 145
大阪大学産業科学研究所 立松 健司
・･高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明･･････ 150
城西大学薬学部 徳留 嘉寛
・･有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用･･････････････････ 157
岡山理科大学大学院理学研究科臨床生命科学専攻 中村 元直・･ヒト iPS 細胞に由来する若齢および加齢様の性質を示す積層および立体皮膚オルガノイドの作製･････ 164
関西医科大学大学院医学研究科医科学専攻
イノベーション再生医学 iPS・幹細胞再生医学講座 服部 文幸
・･アレルギー性化合物を感知する自然免疫受容体の同定とそれを利用した感作抗原性評価系の樹立････ 167
博満
鹿児島大学大学院医歯学総合研究科 原・･ヒト皮膚に発現する薬物トランスポーター遺伝子多型・発現解析と経皮吸収への影響･･････････････ 170
豪
九州大学大学院薬学研究院薬物動態学分野 廣田・･創傷治癒に関わる細胞挙動に対するソフトマテリアルによるメカノストレスの影響評価････････････ 175
英樹
大阪府立大学大学院理学系研究科 森・･ミトコンドリアを標的とするナノカプセル型機能性化粧品の開発････････････････････････････････ 181
北海道大学大学院薬学研究院 山田 勇磨− III −

Ⅲ．精神、文化に関する分野
・･ウグイス糞の諸特性と細菌叢の解析とその利用･････････････････････････････････････････････････ 188
筑波大学生命環境系 青柳 秀紀
・･香りが認知能力に与える影響･････････････････････････････････････････････････････････････････ 191
名古屋大学大学院理学研究科 上田（石原）奈津実、福枡 直人、布施 尚城、木下 専
・･桜の香りによる脳に及ぼす影響の機能生理学的解析････････････････････････････････････････････ 195
星薬科大学運動科学教室 竹ノ谷 文子■コスメトロジー研究助成を受けて・･････････････････････････････････････････････････････････････････ 205
■付

録

事業報告書

････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 227

2020 年度

研究助成を受けられた方々 ････････････････････････････････････････････････････････････ 229

役員一覧･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 232− IV −

●
Ⅰ．素材、物性に関する分野
Ⅱ．生体作用、安全性に関する分野
Ⅲ．精神、文化に関する分野●

天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基盤開発と機能解明
名城大学理工学部

景山

伯春

Mycosporine-like amino acids (MAAs) are a group of water-soluble, low-molecular-weight secondary metabolites
known as a natural biological sunscreen. Since it has been suggested that MAAs possessed multiple bioactivities forhealth and beauty, a universal production process of MAAs from biomass is an important subject. Here, we developed
a broadly applicable and cost-effective method for the purification of MAAs from cyanobacterial cells. Because of theirphotoautotrophic property, the cyanobacteria, which are photosynthetic microorganisms, are of interest as a natural sourceof useful compound production. The purification method presented here was designed and developed by using a halotolerantcyanobacterium Halothece sp. PCC7418, which could produce a rare MAA, mycosporine-2-glycince (M2G). A threestep separation process using low pressure liquid chromatography yielded high-purity M2G. Moreover, the most common
MAAs, shinorine (SHI) and porphyra-334 (P334) could also be successfully purified from commercialized sunscreen reagent
Helioguard®365 by utilizing this method. The experimental parameters obtained in this study might allow for a scale-upof the MAA production process for future commercialisation. From the viewpoint of application as skin care ingredient,antioxidative activities of purified MAAs were evaluated by the 2,2ʼ-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) assay. Inhibitory activities of these MAAs toward tyrosinase, which is known to be an enzyme involved in melaninbiosynthesis, was also investigated.

１．緒活性 3）、酸化ストレスによる細胞死の抑制 3）、コラゲナー

言

ゼ活性阻害 4 , 5）や蛋白質の糖化抑制 5）といった活性を示す

シアノバクテリアは光合成によって光エネルギーと二酸
化炭素を様々な有機化合物に変換することができる。そことが報告されている。図 1 に M 2 G、SHI および P 334 の分子構造を示す。

の光合成能、増殖力および遺伝子操作の容易さから、シ

将来的に、さらなる MAA の機能評価を行う際には、高アノバクテリアは有用物質の工業生産への応用が期待さ

純度の標品が必須である。これまでに、シアノバクテリアれている。本研究で着目するマイコスポリン様アミノ酸

細胞に存在する MAA について、汎用性の高い抽出手法お（Mycosporine-like amino acid, MAA）は水溶性の二次代よび同定方法の提案があった 6）が、広範囲のシアノバクテ

謝産物であり、シアノバクテリア、海洋性紅藻、サンゴやリア種に適用可能な単離精製手法については報告されてい陸棲地衣類などの多様な生物において合成されることがなかった。そこで、本研究では株種に関わらずシアノバク

1）

知られている 。これまでに 30 種を超える MAA が報告

テリアから効率よく高純度で MAA を獲得するためのプロされており、これらの吸収極大は紫外線（UV）領域である

セス開発を目指した。その結果、コストメリットの高い低圧268 〜 362 nm の範囲に存在する 1）。この特性を利用して、クロマトグラフィーを適用し、耐塩性シアノバクテリアか

MAA は UV-A 吸収製剤 Helioguard 365 などとして既に製ら M 2 G を高純度で獲得する手法を確立した。この手法は、品化されている。Helioguard 365 にはリポソーム化されHelioguard 365 に含まれるリポソーム化された SHI およびた紅藻由来の shinorine（SHI）および porphyra- 334（P 334）

P 334 の単離精製にも適用可能だった。また、精製 MAAが含まれている。シアノバクテリアにおける MAA の生理を用いて皮膚のアンチエイジングに関わる生理活性である的な役割はまだ完全には明らかにされていないが、UV 防抗酸化活性およびチロシナーゼ阻害活性の評価を行った。

2）

御や細胞内の浸透圧調節を担うと考えられている 。さら

２．方に、近年になって MAA の様々な生物学的活性が報告されている。例えば、耐塩性シアノバクテリアから単離した

法

2 . 1. MAAの抽出

mycosporine- 2 -glycine（M 2 G）は、フリーラジカル消去

耐塩性シアノバクテリア Halothece sp. PCC 7418 の培養液から細胞を回収し、適量のメタノールを加えた後に超Mycosporine-like amino acids as natural
sk i n ca re i ng red ient s : P roduct ion
development and investigation of biological
functions
Hakuto Kageyama
Faculty of Science and Technology, Meijo
University

音波処理を施すことで細胞を破砕した。遠心分離によって得られた上清をメタノール抽出液とした。メタノール抽
出液を減圧遠心乾燥した後、乾燥物に純水を加えて溶解した。遠心分離によって不溶性物質を除いた後に得られた上清に対してクロロホルムを若干量加えた。懸濁後、遠心分離によって得られた上層（水層）を回収した。クロロホルム−4−天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基盤開発と機能解明

中に色素が溶解するため、この操作を行うことで水層の色れる画分を回収した後に凍結乾燥したサンプルを最終精製

は濃緑色から無色に近くなる。続いて、限外ろ過によって物とした。

3 , 000 Da 以上の溶解物を除き、これを低圧クロマトグラ

2 . 3 . 精製 MAAの同定

フィーに供する M 2 G の抽出液とした。
SHI および P 334 については、Helioguard 365 より抽出精製した MAA は、吸収スペクトル解析および高速液体

した。Helioguard 365 はエイチ・ホルスタイン社より提クロマトグラフィー（HPLC）解析によって標準物質と比較し供いただいたサンプルを用いた。まず、Helioguard 365

た。HPLC 分析においては、ShimPack FC-ODS column

を減圧遠心濃縮し、適量の純水と混合した。遠心分離によ（3 µm; 15 0 ×4 . 6 mm）をメインカラムとし、ガードカラムとって不溶性物質を除いた後に得られた上清に対して、上清して ShimPack FC-ODS column（3 µm; 3 0×4 . 6 mm）をと等量程度のクロロホルムを加えた。懸濁後、遠心分離に接続した。カラムを 3 5 ℃に保ち、移動相として 1 % 酢酸水

よって得られた上層（水層）
を低圧クロマトグラフィーに供

溶 液を用いて流 速 0 . 4 mL/minで分 離した。検出波 長はする SHI および P 334 の混合抽出液とした。

33 0 nmとした。また、LC/MS 解析によって各 MAAの分子量を測定すると共に、AVANCE III HD による核磁 気

2 . 2 . MAAの分離共鳴（NMR）解析によって MAA の分子構造を確認した。

２. 2. 1. 溶離液として1%酢酸水溶液を用いた逆相クロマ

2 . 4 . 精製 MAAの抗酸化活性測定

トグラフィー
Cosmosil 40 C 18 -PREP（ナカライテスク社製）をポリカ

2 , 2 ʼ-azino-bis（3 -ethylbenzothiazoline- 6 -sulfonicーボネート製の空カラム（18×300 mm）に充填したカラム

acid）（ABTS）法を利用した。ABTS をペルオキソ二硫酸を用いた。溶離液として 1 % 酢酸水溶液を使用して、流速カリウムと反応させて、ABTS ラジカルカチオンを調製し、3 . 0 mL/min で MAA 抽出液を分画した。各画分の吸光度

これを MAA 試料と反応させた。MAA の抗酸化力によっ（330 nm）を分析し、MAA が含まれる画分を回収した後にて消失した ABTS ラジカルカチオン量を吸光度（413 nm）

凍結乾燥した。

により定量し、陽性対照として用いた Trolox の抗酸化力

２．２．２.

と比較した。

溶離液として 0.1 M 酢酸アンモニウム水溶液を用いた逆相クロマトグラフィー
2 . 2 . 1 . において凍結乾燥した試料を適量の 0 . 1 M 酢酸

２. 5 . 精製 MAAのチロシナーゼ阻害活性測定

アンモニウム水溶液に溶解し、2 . 2 . 1 . と同様のカラムを

メラニン生合成における中間体物質の L-DOPA を基用いて分離した。溶離液として 1 % 酢酸水溶液を使用して、質として用い、マッシュルーム由来のチロシナーゼの触流速 3 . 0 mL/min で対象の MAA を分画した。各画分の吸媒作用によって酸化された DOPA キノンを経て生成した

光度（330 nm）を分析し、MAA が含まれる画分を回収した

DOPA クローム量を吸光度（492 nm）により定量した。陽後に凍結乾燥した。

性対照としてコウジ酸を使用し、MAA のチロシナーゼ阻

２. ２. 3.

害活性を評価した。

ゲルろ過クロマトグラフィー

2 . 2 . 2 . において凍結乾燥した試料を適量の純水に溶

３．結

解し、ゲルろ過クロマトグラフィーに供した。Sephadex
G- 10（GE ヘルスケア社製）をポリカーボネート製の空カラ

果３. 1. M 2 G の単離ム（14 × 500 mm）に充填したカラムを用いた。溶離液とし本研究で確立した手法を用いることで、湿重量 1 . 0 gて純水を使用して、流速 2 . 0 mL/min で MAA 抽出液を分の Halothece sp. PCC 7418 細胞あたり 87〜140 µg の精製画した。各画分の吸光度（330 nm）を分析し、MAA が含ま

M 2 G が得られた。HPLC 分析における M 2 G のピーク面積

図 1 本研究において用いた MAA の分子構造
M2G、SHI および P334 の分子構造を示す。

−5−

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

は 99 . 8 % 以上となった（図 2）。また、1 H および 13 C NMR
スペクトル解析によっても精製 M 2 G が高純度であることが示された。
3. 1. 1. M2Gの各抽出処理
まずメタノール抽出液の吸収スペクトルを確認したところ、330 nm 付近に M 2 G と推定される吸収極大が検出された（図 3 A）。また、クロロフィルやカロテノイドなどの光合成色素類の吸収極大が 400 〜 700 nm の範囲に検出された（図 3 A）。次に、抽出物を乾燥させて純水に溶解させた後に得られた上清では 400 nm 以上の吸光が著しく低下しており、色素類化合物の大半が除去されていることが分かった（図 3 B）。さらにクロロホルムを添加した後に得られ

図 2 最終 M2G 精製産物の HPLC クロマトグラム
M2G のピーク強度を 1.0 とした相対値を用いたクロマトグラムを示す。

た上層（図 3 C）では、400 nm 以上の波長の吸収はほとんど検出されなくなった。一方、限外ろ過処理をした試料では、処理前と比較して吸収スペクトルに顕著な違いは見出せなかった（図 3 D）。
3. 1. 2. 低圧液体クロマトグラフィーによるM2Gの精製
1 % 酢酸水溶液を用いた逆相モードによる一段階目の精製処理では、260 nm 付近の大きな吸収極大が残存した（図3 E）。その吸収波長から、核酸系の不純物が混入していると推定された。その後、溶離液として 0 . 1 M 酢酸アンモ
ニウム水溶液を用いた逆相モードによって処理することで、これらの不純物と M 2 G を分離することができた（図 3 F）。
最後にゲルろ過クロマトグラフィーによって溶解液を純水に置換して最終産物を得た（図 3 G）。

3 . 2 . SHI および P 334 の単離本研究で確立した手法を用いることで、上述した M 2 Gと同レベルの純度で SHI および P 334 を精製することができた。1 . 0 mL の Helioguard 365 からそれぞれ 110 µg（SHI）および 160 µg（P 334）を取得することができた。

3 . 3 . 精製 MAAの抗酸化活性
本研究で精製した MAA を用いて ABTS ラジカルカチ
オンの消去能を調査したところ、IC 50 値はそれぞれ 40 µM（M 2 G）、94 µM（SHI）お よ び 133 µM（P 334）と 求 め ら れた。一方で、陽性対照である Trolox の IC 50 値は 10 µM だった。これらの結果から、本研究で確立した手法で精製した MAA が抗酸化活性を保持しているが明らかになった。

3 . 4 . 精製 MAAのチロシナーゼ阻害活性
精製 MAA を用いてチロシナーゼ活性への阻害効果を調査したところ、最終濃度 6 . 4 mM（M 2 G）
、8 . 4 mM（SHI）
および 7 . 5 mM（P 334）で各 MAA をアッセイ系に添加しても阻害活性は検出できなかった。一方で、陽性対照のコウジ酸は 60 µM でチロシナーゼ活性を 50 % 以下まで低下させた。これらの結果から、今回の調査に用いた MAA はチ

図 3 M2G の各抽出および精製ステップにおける試料の吸収ス
ペクトル
各パネルはそれぞれ A: メタノール抽出液、B: メタノール抽出液の乾燥物を水に溶解した後の上清、C: クロロホルム処理後の上清、D: 限外ろ過後の試料、E: 一段階目の逆相分離後の試料、F: 二
段階目の逆相分離後の試料、G: ゲルろ過分離後の試料を示す。
スペクトルは、220 〜 800nm の範囲で最も吸光度の大きい値
を 1.0 とした相対値で示してある。

−6−

天然スキンケア原料としてのマイコスポリン様アミノ酸：生産基盤開発と機能解明

Commun. 14, 1-6. 2019.

ロシナーゼ阻害活性を有しないことが示唆された。

４．考4） Waditee-Sirisattha, R.; Honda, M.; Hibino, T.;察

Kageyama, H. Potential inhibitory effects of plant and

本研究で提案した精製手法は、MAA の抽出液を二段階

cyanobacteria-derived natural products on advancedの逆相クロマトグラフィーに供すものである。逆相クロマ

glycation end-product formation. In A Closer Look

トグラフィーはその分離特性、理論段数および再現性の高at Glycation: A Potential Hotspot for Age-Related

さから広く物質の分取精製に用いられている。しかしな

Complication and Diseases ; ansari, N.A., Ed.; Nova

がら、分取カラムおよび分取 HPLC システムはスケールがScience publishers, Inc.: Hauppauge, NY, USA, 2 0 2 1;

大きくなる程に高価となるため、より低コストの手法が望pp. 201-224.

ましい。本研究においては、コストメリットの大きい粒子
径 40 µm の汎用型オクタデシルシリル担体をポリカーボネ

謝

辞ート製カラムに充填し、低圧システムによって分離操作を

本研究を遂行するにあたり、公益財団法人コーセーコス行うこととした。酸性溶離液（1 % 酢酸水溶液）および中性

メトロジー研究財団（旧公益財団法人コスメトロジー研究

溶離液（0 . 1 M 酢酸アンモニウム水溶液）を用いた二段階の振興財団）よりご助成いただきましたことに心より感謝申

分離処理により、不純物を効率よく除去することができたし上げます。

（図 3）。同一のカラムを用いた二段階の処理は、低コスト化に貢献できると考えられる。逆相分離に続いて行うゲル（引用文献）

ろ過クロマトグラフィーにおいては溶離液として純水を用

1） Wada, N.; Sakamoto, T.; Matsugo, S. Mycosporine-

いており、凍結乾燥した最終産物には溶離液に由来する化

like amino acids and their derivatives as natural

合物は含まれない。それ故に、本手法によって精製した

antioxidants. Antioxidant 4, 603-646. 2015.

MAA は多様な評価試験に適用可能である。

2） Kageyama, H.; Waditee-Sirisattha, R. Mycosporine-

本研究では精製した M 2 G、SHI および P 334 を用いて抗like amino acids as multifunctional secondary

酸化活性を ABTS 法によって評価し、テストした MAA 全

metabolites in cyanobacteria: From biochemical toてが活性を示すことを明らかにした。一方で、メラニン生

application aspects. Stud. Nat. Prod. Chem. 5 9, 1 5 3-合成に関与する酵素であるチロシナーゼに対する阻害活性194. 2018.

は検出されなかった。しかしながら、皮膚の弾力性やハリ

3） Cheewinthamrongrod, V.; Kageyama, H.; Palaga,を保つコラーゲンを分解するコラゲナーゼの阻害活性を有T.; Takabe, T.; Waditee-Sirisattha, R. DNA damage

することが既に分かっているなど 4 , 5）、スキンアンチエイ

protecting and free radical scavenging properties

ジング剤応用への MAA の期待は大きい。今後も、関連すof mycosporine-2-glycine from the Dead Sea

る物性の評価を行い、ネガティブな結果を含めて知見を積

cyanobacterium in A375 human melanoma cell lines. J.

み上げることが重要である。

Photochem. Photobiol. B 164, 289 - 295. 2016.
4） Hartmann, A.; Gostner, J.; Fuchs, J.E.; Chaita, E.;

本研究助成により得られた成果

Aligiannis, N.; Skaltsounis, L.; Ganzera, M. Inhibition

1） Ngoennet, S.; Nishikawa, Y.; Hibino, T.; Waditee-of collagenase by mycosporine-like amino acids frommarine sources. Planta Med. 81, 813 - 820. 2015.

Sirisattha, R.; Kageyama, H. A method for isolation andcharacterization of mycosporine-like amino acids from5） Tarasuntisk, S.; Patipong, T.; Hibino, Y.; WaditeeSirisattha, R.; Kageyama, H. Inhibitory effects of

cyanobacteria. Methods and Protoc. 1, 46. 2018.
2） Kageyama, H.; Waditee-Sirisattha, R. Antioxidative,

mycosporine-2-glycineisolated from a halotolerantanti-inflammatory, and anti-aging properties of

cyanobacteriaumon protein glycation and collagenase

mycosporine-like amino acids: Molecular and cellular

activity. Lett. Appl. Microbiol. 67, 314 - 320. 2018.

mechanisms in the protection of skin-aging. Mar Drugs

6） V o l k m a n n , M . ; G o r b u s h i n a , A . A . A b r o a d l yapplicable method for extraction and characterization

17, 222. 2019.
3） Patipong, T.; Hibino, T.; Waditee-Sirisattha, R.;of mycosporines and mycosporine-like amino acids

Kageyama, H. induction of antioxidative activity andof terrestrial, marine and freshwater origin. FEMS

antioxidant molecules in the halotolerant cyanobacterium

Microbiol. Lett. 255, 286 - 295. 2006.

Halothece sp. PCC7418 by temperature shift. Nat Prod−7−

機能性化粧品として期待できる皮膚ガス応答性発色素材の研究開発
島根大学大学院自然科学研究科

笹井亮

In this research, I investigated the molecular detectable ability of the hybrid films of dyes with ion-exchangeable layered
inorganic compounds. It was found that the protonation reaction of cationic porphyrin derivatives rapidly proceeded in theinterlayer space of layered α-zirconium phosphate modified with decylamine, even when the concentration of proton isrelatively low. In the case of the hybrid film of anionic pyrene with layered double hydroxide (LDH), the photoluminescenceintensity ratio of between monomer and excimer species of pyrene linearly depended on the toluene concentration inethanol solution. I show for the first time that the LDH sheet film with fluorescein dyes and 1 -butanesulfonate could
quantitatively detect ammonia in an aqueous solution by its photoluminescence intensity. These results are indicted that film
materials which can detect specific molecules dissolved in solution can be prepared by hybridizing suitable dyes with ionexchangeable layered inorganic compounds. Moreover, the present materials will be applicable for molecular detection of
specific molecules in skin-gas and sweat.

１．緒

組みの一つとして，LDH シートの検知材料化も行った．

言

２．方イオン交換性を有する無機層状化合物が構造中に有する

法

ができる
（共存）
だけでなく，同一空間でそれぞれの分子が２．
１. αZrPをホストとした複合透明膜の創製と検知
能評価

お互いに邪魔することなく本来の特性を発揮できる（共栄）

既報 13）に従って，第一稀元素化学工業㈱より提供され空間となる．著者はこれまでにこのような複数の機能分子

た αZrP 粉末を Tetramethylammonium hydroxide 水溶液が共存共栄できる系（複数機能共存共栄系）
を，イオン交換に分散することにより調製した αZrP ナノシート水懸濁液性無機層状化合物として粘土鉱物の一種であるスメクタイ

を減圧ろ過することにより得られるゲル状のろ取物をガラ

トや層状複水酸化物（LDH），層状チタン酸を用い，そのス基板上に転写すること（ろ過膜転写法）により αZrP 透明

層間に界面活性剤などで創製できる分子吸着場と，吸着分膜を作製した．この αZrP 透明膜を butylamine（BA）と α,子の酸化分解のための光触媒部位や特定の分子吸着の可否

β, γ, δ-tetrakis（-methylpyridinium- 4 -yl）porphyrinを示す環境応答性部位とを共存共生させた系を実現してき（TMPyP）との混合水溶液に浸漬することで，複合透明膜

層空間は，性質の異なる様々な分子を複数種取り込むことた

1 - 16）．特に吸着場と環境応答性部位の複合機能共存共栄（αZrP/BA/TMPyP 透明膜）を作製した．得られた αZrP/

系では，これまでに相対湿度，高湿度下でのアンモニウム，

BA/TMPyP 透明膜の評価は，XRD，紫外可視吸収スペク

二酸化窒素，芳香族化合物などを発光強度変化により簡易

トルおよび発光スペクトル測定により行った．この αZrP/

4 - 7 , 9 - 11 , 13 - 16）．

BA/TMPyP 透明膜中の TMPyP のピロール基のプロトン

このように特定分子の検知が可能な材料は，吸着場や環境化挙動について評価することで，水溶液中のプロトン濃度

応答性部位の組み合わせにより，本研究が最終目標とする検知能を明らかにした．TMPyP のプロトン化は，濃度の皮膚ガス中に含まれる各種分子を吸着・濃縮・検知できる

異なる塩酸（［HCl］= 0 ~ 0 . 01 mol/L）に αZrP/BA/TMPyP 透

材料となりうることが期待できる．そこで本研究では，イ

明膜を浸漬した後に，αZrP/BA/TMPyP 透明膜の紫外可オン交換性層状無機化合物として層状 α リン酸ジルコニウ

視吸収スペクトルを透過法により測定することにより評価

ム（αZrP）および層状複水酸化物（LDH）を用い，その層間した．

定量検知できる材料の創製に成功しているに両親媒性分子と色素を複合化した透明膜の創製と，その分子検知能について評価した．さらに材料化に向けた取り

２. ２. LDHをホストとした複合透明膜の創製と検知
能評価
既報 14）に従って，協和化学工業㈱製の炭酸イオン型

Research and Development of Promising
Skin-Gas Responsive Coloring Materials as
Functional Cosmetics
Ryo Sasai
Graduate School of Natural Science andTechnology, Shimane University

LDH を原料として，NaCl を含む酢酸緩衝溶液を用いた脱炭酸イオン化およびプロピオン酸イオンとの陰イオン交換反応により得られるプロピオン酸イオン型 LDH を水に分散することにより調製した LDH ナノシート水分散液を用いてろ過膜転写法により LDH 透明膜を作製した．この−8−

機能性化粧品として期待できる皮膚ガス応答性発色素材の研究開発

LDH 透明膜を 1 -pyrenesulfonic acid（Py）の EtOH 溶液に

３．結果・考察

浸漬することで，複合透明膜（LDH/Py 透明膜）を作製した．
得られた LDH/Py 透明膜の評価は，XRD，紫外可視吸収
スペクトル測定および発光スペクトル測定により行った．

3. 1. αZrPをホストとした複合透明膜の創製と検知
13）
能評価

この LDH/Py 透明膜をトルエン濃度の異なる EtOH 溶液中

本研究で作製した αZrP/BA/TMPyP 透明膜を酸性水溶に浸漬した場合の発光スペクトル変化を精査することで，液に浸漬すると，図１のように膜の色調が変化することがこの LDH/Py 透明膜のトルエン検知能を評価した．

明らかとなった．これは図 2 に示すような TMPyP の構造中に存在するピロール部位のプロトン化反応が進行したこ

２．３. LDHシートへの両親媒性分子と色素の複合化と水中アンモニア検知能評価とを示すものである．様々なプロトン濃度の水溶液に浸漬㈱日本触媒より提供された LDH が保持・固定化されたは図 3 に示すようなスペクトル変化を示す．BA で修飾さ膜材料である LDH シートを出発物質として次の方法によれた αZrP 層間に取り込まれていても TMPyP のプロトンり色素複合材料の作製を行った．既報 9）で報告した LDH

化反応は，水溶液中と同様に進行した．紫外可視吸収スペ

粉末へのブタンスルホン酸（C 4 S）とフルオレセイン色素

クトルの成分解析を詳細に行った結果，TMPyP のプロト

（AFD）の複合化手法を参考にして，まず LDH シートを窒ン化反応の pKa 値が水溶液中の値（0 . 80 と 2 . 06）とは異な素気流下で酢酸− EtOH 溶液に浸漬することで酢酸イオン

り，αZrP/BA/TMPyP 透明膜中では 2 . 4 と 2 . 6 という値

型 LDH シートを作製した．この酢酸イオン型 LDH シート

を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た． こ の よ う に αZrP/BA/

を所定量の C 4 S（LDH の陰イオン交換容量（AEC）に対し

TMPyP 透明膜中では TMPyP のプロトン化反応が低プロて 300 %）および AFD（AEC に対して 0 . 025 %）を溶解しトン濃度で効率よく進行するようになることが明らかになた 混 合 水 溶 液 に， 窒 素 気 流 下 で 浸 漬 す る こ と で LDH/

っ た． 酸 性 水 溶 液 浸 漬 後 の αZrP/BA/TMPyP 透 明 膜 の

AFD/C 4 S シートを作製した．得られた LDH/AFD/C 4 S

XRD 測定の結果，プロトン化反応の進行に伴い，層間距シートの評価は，XRD，FT-IR（ART 法），拡散反射スペ離の低下が観測された．この結果は，BA が層間から脱離

クトルおよび発光スペクトル測定により行った．このしたことを示唆する．また，この αZrP/BA/TMPyP 透明

LDH/AFD/C 4 S シートの検知能評価は，濃度の異なるア膜の酸性水溶液への浸漬により生成したプロトン化

ンモニア水に浸漬した後の LDH/AFD/C 4 S シートの拡散

TMPyP の脱プロトン化反応は，塩基性水溶液に浸漬して反射スペクトルおよび発光スペクトルの変化により評価しも進行しなかった．これは層間に BA が存在しないため，た．

層間に固定化されたプロトンが脱離されないためと考えらした場合の紫外可視吸収スペクトル測定の結果，典型的に

図1

αZrP/BA/TMPyP 透明膜の酸性水溶液浸漬前後の色調

図2

水溶液中における TMPyP のプロトン化反応−9−コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図 4 LDH/Py 透明膜の外観，紫外線照射下での発光状態，
発光スペクトルおよび LDH 上での Py 分子の存在状態のモデル図

図 3 αZrP/BA/TMPyP 透明膜の異なるプロトン濃度での紫外可視吸収スペクトル

図 5 異なるトルエン 含 有量の EtOH 溶 液に浸 漬した場 合のLDH/Py 透明膜の発光スペクトル．励起光波長：365 nm

図6

EtOH 中のトルエン含有量に対する Ie/Im 値依存性

れる．
このことからこの αZrP/BA/TMPyP 透明膜は，発汗を図 5 に示す．約 370 nm に観測される Py モノマー由来のなどにより発生する皮膚上の体液の酸性度の微小な変化の発光強度に対して約 450 nm に観測される Py エキシマー由検知に利用できる可能性を秘めたものであると考えられる．

来の発光強度が，トルエン濃度の増加に伴い減少することが明らかとなった．この現象は，LDH/Py 透明膜が溶媒中

３. ２. LDHをホストとした複合透明膜の創製と検知
14）のトルエンを Py エキシマー由来の発光強度の変化により能評価検知できる材料であることを示唆するものである．また，

図 4 に作製した LDH/Py 透明膜の外観，紫外線照射下でPy モノマー由来の発光強度（Im）に対する Py エキシマー由の発光状態，発光スペクトルおよび LDH 上での Py 分子の来の発光強度（Ie）の比（Ie/Im）は，EtOH 中のトルエン含有存在状態のモデル図を示す．図４の通り LDH/Py 透明膜は，量の増加とともに直線的に減少した（図 6）．これは強度比

透明かつ Py 由来の発光を示した．また，観測された発光により EtOH 中トルエン含有量を定量評価できることを示のほとんどは，モデル図に示すような分子間相互作用をし唆するものである．このような発光強度比変化は，LDH/

た Py 分子由来のエキシマー発光であることがわかった．

Py 透明膜中に存在するエキシマー発光種がトルエン分子

このような発光特性を有する LDH/Py 透明膜を異なるトの吸着によりモノマー発光種に変換されることによると考

ルエン濃度の EtOH 溶液に浸漬した場合の発光スペクトルえられる．この発光種の変換には，LDH/Py 透明膜中の− 10 −

機能性化粧品として期待できる皮膚ガス応答性発色素材の研究開発

Py 分子周辺の親水性と疎水性のバランスが大きく影響し対数に対しておおよそ比例した．特にアンモニア濃度がていると考えられる．今後，水溶液中や気相中でのトルエ

10 ppm 以下では比較的良好な直線性を示していることかン検知能に関する研究が必要であるが，今回の結果は，ら，この LDH/AFD/C 4 S シートは，水に溶存したアンモLDH/Py 透明膜がシックハウス症候群や芳香族中毒の検知

ニアを，特に低濃度において発光強度により定量的に検知に有用な材料であろう．

できる材料として利用できる可能性をもつことが明らかである．図 9 に LDH/AFD/C 4 S シートを様々な濃度のアン

３. 3. LDHシートへの両親媒性分子と色素の複合化
16）と水中アンモニア検知能評価

モニア水に浸漬した場合に得られる拡散反射スペクトルをピークでの光吸収強度で規格化したスペクトルを示す．こすべてのイオン交換性層状無機化合物と色素の複合体ののスペクトルから，460 nm 付近に観測される吸収の強度

透明膜が必ずしも作製できるとは限らない．そこで透明でがアンモニア濃度の増加に伴い減少していることがわかっはないがイオン交換性層状無機化合物の一種である LDH

た．この 460 nm 付近の吸収は，AFD がモノアニオン体（図を担持・固定化したシートである LDH シート（㈱日本触媒10）として存在する場合に観測される吸収帯であることかより提供）を用いた LDH/AFD/C 4 S シートの作製を試み

ら，アンモニアが存在しない場合に LDH/AFD/C 4 S シー

た．得られた LDH/AFD/C 4 S シートは，図 7 に示すようト中に存在している AFD のモノアニオン体が，アンモニに AFD 由来の黄色を示すとともに，ブラックランプ下でア濃度の上昇に伴い上昇する pH の影響を受け，モノアニ

AFD 由来の発光を示した．この結果は，既報で示したオン体よりも高輝度発光を示すジアニオン体へと変化した

LDH/AFD/C 4 S 粉末を相対湿度 40 % 以上の環境に置いたためと考えられる．人が緊張状態に置かれるなど，身体的・場合と同じであることから，出発原料を LDH シートとし精神的ストレス（疲労）にさらされると皮膚ガス中のアンモた場合でも LDH/AFD/C 4 S 粉末試料と同等の性能を示す

ニア濃度が増加するとの報告もある点を考慮すると，ここLDH/AFD/C 4 S シートが得られたことを示唆するものでで得られた LDH/AFD/C 4 S シートのアンモニア検知能をある．この得られた LDH/AFD/C 4 S シートを濃度の異な

さらに高感度化することで，この LDH/AFD/C 4 S シート

るアンモニア水に浸漬した場合に得られる 470 nm で励起して得られる発光スペクトルを図８⒜に示す．図８⒜ に示
すように水中のアンモニア濃度の増加とともに，発光強度も増加することが明らかとなった．この結果は，このLDH/AFD/C 4 S シートが水中のアンモニアの存在を発光増強により検知できるだけでなく，その濃度を定量的に検知できる可能性を示唆するものである．定量性を確かめるために，図８⒝ に発光ピークでの発光強度のアンモニア
濃度依存性を示す．このアンモニア濃度依存性から，このLDH/AFD/C 4 S シートの発光強度は，アンモニア濃度の

図 7 LDH/AFD/C 4 S シートの外観（左）とブラックランプ下での発光外観（右）図 8 (a)LDH/AFD/C 4 S シートを異なるアンモニア濃度の水溶液に浸漬した際に得られる発光スペクトル．励起光
波長：470 nm．(b) ピーク波長での発光強度のアンモニア濃度依存性− 11 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図 10

AFD のモノアニオン体とジアニオン体の分子構造

氏より，LDH シートを㈱日本触媒の山下毅氏，小川賢氏，高澤康行氏よりご提供いただきました．LDH/AFD/C 4 S
シートの作製に関しては，堀江化工㈱の吉原一紗氏にご尽力いただきました．この場をお借りして深謝いたします．
図 9 LDH/AFD/C4S シートを異なるアンモニア濃度の水溶液に浸漬した際に得られる拡散反射スペクトル．縦軸は，ピークでの吸収強度で規格化した値（引用文献）
1） R. Sasai, D. Sugiyama, S. Takahashi, Z. Tong, T.
Shichi, H. Itoh, K. Takagi, J. Photochem. Photobiol. A
155, 223-229（2003）．

がアンモニアを指標とした疲労やストレス検知素材として利用可能であろう．機能性化粧品としての利用を考えた場

2） R. Sasai, Y. Hotta, H. Itoh, J. Ceram. Soc. Jpn. 1 1 6,
205-211（2008）．

合には，この LDH/AFD/C 4 S シートに高いアンモニア吸

3） R. Sasai, T. Itoh, W. Ohmori, H. Itoh, M. Kusunoki, J.

着除去能の付与が課題の一つとして挙げられよう．

４．総Phys. Chem. C 113, 415-421.

括4） R. Sasai, IOP Conf. Series: Materials Science and

本研究では，大気中や水中に存在する特定の分子に対しEngineering 18, 082003（6 pages）（2011）．

て色調や発光特性の変化を示す材料として，イオン交換性

5） 笹井亮 , 森田理夫 , 粘土科学 49, 1-5（2011）．

層状無機化合物をホストとして色素と複合化した材料の創6） 笹井亮 , ゼオライト 28, 2-9（2011）．

製とその評価を行った．特に将来のデバイス化を見据え，

7） R. Sasai, N. Iyi, H. Kusumoto, Bull. Chem. Soc. Jpn.
84, 562-568（2011）．

“膜” 材料に注目した研究を展開した．その結果，今回用いた層状 αりん酸ジルコニウムや層状複水酸化物が，このよ

8） R. Sasai, R. Watanabe, T. Yamada, Appl. Clay Sci.
93-94, 72-77（2014）．

うな材料のホスト材料として非常に有用であることを明らかにできた．特にこのような層状化合物の場合には，その

9） R. Sasai, M. Morita, Sensors Actuators B 238, 702-705

層間に選択的検知を実現できる“場” の作り込みや，色調や（2016）．

発光変化の起源となる色素を層間にどのような状態で担持

10）Y. Date, Y. Matsui, Y. Kagawa, E. Hino, T. Fujii, M.

するかが重要であることが明らかとなった．すなわち，層Suzaki, K. Aoki, R. Sasai, Bull. Chem. Soc. Jpn. 90, 148-間の特性を十分に制御することができ，そこに応答性を付与することができれば，様々な分子に対して特異的な応答

153（2017）．
11）T. Fujimura, T. Shimada, R. Sasai, S. Takagi,
Langmuir 34 , 3572 - 3577（2018）．

を示す材料を，自在に作ることができる可能性を示せたものと考える．今回の結果に基づき，今後さらに 2 次元ナノ12）Y. Aoyama, T. Fujimura, R. Sasai, Chem. Lett. 4 8 ,空間の特性制御を進め，そこに応答性をもつ色素を効果的に配置することにより，特定の分子を選択的に検知可能な

40 - 42（2019）．
13）T. Fujimura, Y. Aoyama, R. Sasai, Tectrahedron 58 ,材料のラインナップを増やしていく予定である．ラインナ
ップの拡充により，化粧品分野さらにメディケア分野に利150912（4 pages）（2019）．
14）T. Fujimura, Y. Akagashi, Y. Aoyama, R. Sasai, Int.

用可能な皮膚ガス検知材料へと今後深化させていく予定で

J. Photoenergy 8870930（7 pages）（2020）．
15）笹井亮 , C & I Commun. 45 , 34 - 37（2020）．

ある．

16）笹井亮 , 藤村卓也 , 伊達勇介 , セラミックス 55 , 859 謝辞862（2020）．

本研究で用いたイオン交換性層状無機化合物のうち，層17）R. Sasai, S. Yamamoto, A. Naito, T. Fujimura,

状 αりん酸ジルコニウムは第一稀元素化学工業㈱の中島靖− 12 −

Nanomaterials in submitted（2021）．

乳酸菌オリゴDNAによる上皮細胞の炎症制御と経皮核酸素材への展開
信州大学農学部下里剛士

Research into the action of probiotics against infectious and inflammatory diseases and allergies has recently attracted
considerable attention in both the medical and food sciences. My research group has identified immunomodulatory DNA
sequences from immunoregulatory probiotics (immunobiotics) and confirmed that several synthetic oligodeoxynucleotides(ODNs) derived from these sequences maintain the immunomodulatory properties. To develop ODNs that retain functionality
after oral administration, my research group attempted to produce acid-resistant ODN particles by encapsulating ODNs incarbonate apatite particles (ODNcaps) using a cell transfection method with carbonate apatite particles. These edible ODNs
retained their immunomodulatory activity when taken up by intestinal mucosal cells. We have also developed ODN particles
for transdermal absorption. The ability to produce particles containing immunomodulatory ODNs opens the possibility ofusing ODN particles in studies involving mouse disease models. If the therapeutic efficacy of ODN particles can be achieved
without parenteral injection, the cost, complexity and inconvenience of immunomodulatory therapy could be dramaticallyreduced. In addition, this approach may lead to the development of novel immunobiotic foods and cosmetics that willcontribute to the prevention or suppression of many types of infectious, allergic, inflammatory, and autoimmune diseases.

1．緒

癒効果（マウス試験）1）、ⅱコラーゲンタンパク質 + オリゴ

言DNA の混合液の創傷治癒効果（サル試験）2）、ⅲアセトン +細菌由来のゲノム DNA が免疫増強作用を有するというオリゴ DNA の混合液の抗腫瘍作用 3）。いずれの報告も、発見（Nature, 374 , 546 - 549 , 1995）以降、多彩な免疫機能

大容量のオリゴ DNA を傷口や炎症部位に直接塗布する手を有するオリゴ DNA（ODN，DNA 短鎖）が次々と見出さ法が採用されており、オリゴ DNA の簡便かつ経済的な経れている。とくに、感染症・ガン・アレルギー・炎症性疾

皮ルートはいまだ確立されていない。筆者は、オリゴ DNA患の予防や治療を目的とした機能性核酸分子として研究がの経皮ルートの構築を目指し、コスメトロジーの概念を組進められてきた。オリゴ DNA を用いた臨床試験も進んでみ合わせたスキンケア素材の開発研究を行った。

おり、「核酸医薬」
領域で実現に向けた段階に突入した。これまでに ODN を用いて、様々な動物試験が行われ、その投与方法としては、腹腔内投与（i.p.）、皮下投与（s.c.）、鼻

2. 方

法

2. 1. ODNODNの合成はIntegrated DNA Technologies, Inc（Coralville,

腔に滴下（i.n.）などの手法が一般的で、尾静脈からの投与（i.v.）例もある。またオリゴ DNA の投与量としては、マウ

IA, USA）社に合成を外注委託した。

ス 1 匹あたり 100 - 500 µg といった報告が多い。すなわち、・GpC-ODN1612 , 5 '-G*C*T*A*G*A*G*C*T*T*A*G*G*C*T- 3 ' 4）

注射器を用いて、直接血管内部や組織内に注入する方法が・CpG-ODN 1555 , 5'- G*C*T*A*G*A*C*G*T*T*A*G*C*G*T -3' 5）採用されている。筆者は、注射に頼らない─食べる乳酸菌

・CpG-ODNMsST, 5 '-C*A*G*G*A*C*G*T*T*G*T*A*T*C*A*C*DNA ─を掲げ、2015 年、胃液に溶けず腸まで届く DNA

T*G*A*A- 3’ 6）

ナノカプセルの開発に成功した。本成果により、オリゴ

以上の Phosphorothioate bond（PS）-ODN、Phosphodiester

DNA を有効成分とする機能性食品や家畜飼料・ペットフbond（PO）-ODN をそれぞれ合成した。なお、* は PS bondードなどの開発に向けた展開が可能となった。残された投を示している。

与ルートは経皮ルートであるが、オリゴ DNA を経皮ルー
トから動物試験を実施した例は、以下 3 例に限定される。

2. 2. ODN-炭酸アパタイト微粒子の合成
ODN- 炭酸アパタイト微粒子の合成は、Wang らの方法

ⅰコラーゲンタンパク質 + オリゴ DNA の混合液の創傷治を 参 考 に 一 部 改 変 し て 作 製 し た 7）。 す な わ ち、ODN を
1 mg/mL となるよう滅菌 PBS で希釈し、ODN 溶液とした。
Regulation of Inflammation in Epithelial
Cells by Lactobacillus Oligodeoxynucleotides
and Development to Novel Transdermal
Oligodeoxynucleotide Materials

次に、塩化カルシウム二水和物 CaCl 2・2 H 2 O（ナカライテ

Takeshi Shimosato

1 M CaCl 2 とした。さらに、滅菌済み 200 mL ビーカーにFaculty of Agriculture, Shinshu University

DMEM（Invitrogen, CA, USA）を 26 mL ×チューブ 4 本分

スク , Kyoto, Japan）を 7 . 35 g 電子天秤で秤量し、50 mL チ
ューブに取り、ミリ Q 水で final 50 mL にメスアップして− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021に当たる約 100 mL（+α）を取った。50 mL チューブ 4 本にJapan）に よ り 解 析 し た。 画 像 は、（Fluoview software

DMEM を 26 mL ずつピペッターで正確に分注した。事前

Olympus）を用いて分析した。

にウォーターバスを 37 ℃に設定し温めておき、DMEM
26 mL に ODN 溶 液 150 µL（ODN 量 150 µg）を 加 え た。

2. 5. 走査型電子顕微鏡による粒子形態観察

ODN+DMEM と 1 M CaCl 2 を 37 ℃、5 min ウ ォ ー タ ー バ

ODN 微粒子懸濁液をナノパーコレータ試料載台（JEOL,

スで温めた後、ODN 含有 DMEM に 1 M CaCl 2 を 4 mL 加

Tokyo, Japan）に 35µL添加した。
10mLシリンジ（TERUMO

えた。37 ℃、5 min ウォーターバスで温めた後、3 , 000 g ×

Corporation, Tokyo, Japan）を用いて液体を吸い、試料を20 min 遠心分離し、アスピレーターで上清を丁寧に除去

よく定着させたのち、12 -well plate（Nippon Genetics）にした。2 mL の滅菌済み PBS で懸濁し、2 mL チューブ（ア500 µL ずつ分注した 2 . 5 % グルタルアルデヒド（TAAB

ズ ワ ン 株 式 会 社 , Osaka, Japan）に 回 収 し た。8 , 000 g ×

Laboratories Equipment, Ltd, Berks, UK）に 1 hr 十分に浸5 min 遠心分離し、ピペッターで上清を丁寧に除去した上すことで固定した。以降液体試薬による静置および洗浄はで、−30 ℃冷凍庫に一晩静置した。翌日、フリーズドラ

12 -well plate に 500 µL ずつ試薬を分注し行った。完全にイヤー DC 401（ヤマト科学株式会社）を用いて凍結乾燥し脱 水 す る た め、100 % エ タ ノ ー ル に て 30 min 静 置 し、た。作製した ODN 微粒子は−80 ℃にて保存した。特性解100 % エタノールを交換して静置する工程を 2 回行った。

析として、1 wt % リン酸カルシウム水分散液を調製し、1脱水完了後、t- ブチルアルコール（Nacalai Tesque）に浸し分間の超音波照射の後、粒径を測定した（FPAR- 1000，大52 ℃、30 min で 2 回静置し、−80 ℃で保管した。フリー

塚電子株式会社，Osaka，Japan）。

ズドライヤ DC 401（Yamato Scientific）で凍結乾燥したの
ちオスミウムコーター Neoc-AN（Meiwafosis CO., Ltd., Tokyo,

2. 3. マウス細胞を用いた免疫機能解析

Japan）を用いてオスミウムコーティングを行い、卓上走

C 57 BL/ 6 マウスを、頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓細胞および腹腔マクロファージを回収した。細胞は、遠心

査型電子顕微鏡 JCM- 7000 F（JEOL, Tokyo, Japan）により観察した。

分離（2 , 000 rpm, 20 ℃ , 5 min）し、10 mL の RPMI- 1640 培

３．結地（Sigma Co., St. Louis, MO, USA）に 10 % fetal calf serum

果（FCS ; Sigma），
100 U/mL penicillin, 100mg/mL streptomycin,

本研究は、感染症、アレルギーなどの予防や治療に有効

2 5 mM HEPES, 1 . 0 mM sodium pyruvate, nonessential

な ODN 化粧品、医薬品の創製へと繋げる基盤研究として、

amino acids, 0 . 0035 % 2 -mercaptoethanol を加えたコンプリ

ODN 微粒子を作成する技術の開発研究を実施した。

ート培地に懸濁した。細胞懸濁液はセルストレイナー（日本 BD, Tokyo, Japan）、メッシュサイズ 40 µm に通すこと

3. 1. ODN-炭酸アパタイト微粒子の特性解析

で凝集細胞を除去した。上記コンプリート培地にて 2 回洗

核酸成分の細胞へのトランスフェクションには、主にカ

浄後、細胞を回収し、カウンテス自動セルカウンター

チオン性脂質などが採用されている。近年では、新たに金（Invitrogen）を用いてトリパンブルー染色法により生細胞

ナノ粒子、カーボンナノチューブ、生分解性ポリケタルナ

数をカウントした。細胞を 12 well plate（Thermo Fisher

ノ粒子と核酸成分との結合・包接技術が開発され、哺乳類

6

Scientific, IL, USA）に 2 × 10 cells/well で 播 き、37 ℃、細胞への新たな遺伝子導入技術として開発が進められてい

5 %CO 2 条件下で 3 hr 培養した。その後、GpC-ODN 微粒子、る。とくに（a）分解酵素による消化から核酸を保護する（b）

CpG-ODN 微 粒 子 で 刺 激 し、6 hr 後 の 細 胞 を 回 収 し た。

核酸の生体内における滞留時間を延ばす（c）核酸のエンド®

Total RNA と Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa Bio，

サイトーシスによる取り込み効率を向上させる（d）標的細Kusatsu, Japan）を用い、逆転写反応により cDNA を合成し胞に核酸を安定的に届ける（e）長い時間をかけて核酸をゆた。cDNA を鋳型としてマウスプライマーを用いて、リア

っくりと運搬体の外へと放出する（f）核酸量を抑えること

ルタイム PCR 法により発現解析を行った。

による低コスト化など、優れた運搬媒体が検討されている。
本研究では、Wang らの開発した炭酸アパタイト粒子を用

2. 4. 共焦点レーザー走査顕微鏡による6FAM-ODN
微粒子の取り込み解析

いた微粒子作成技術を改良し、その特性解析を行った。

腹腔マクロファージをPBS, 6FAM-ODN微粒子（500µg/ンに吸着させ、ナノサイズにまで成長させたものである。

mL, containing 5 µg/mL ODN）を用いて 37 ℃、1 h 処理しその粒子は直径 100 nm- 150 µm のナノ - マイクロサイズ

た。そして腹腔マクロファージに 4 %PFA を添加し室温でであることが示された（図 1）。

ODN- 炭酸アパタイト微粒子は、ODN をカルシウムイオ

15 min 固定した。6 FAM-ODN 微粒子の取り込みを共焦点レーザー走査顕微鏡（FV 1000 D-IX 81 , Olympus，Tokyo，− 14 −

乳酸菌オリゴ DNA による上皮細胞の炎症制御と経皮核酸素材への展開

図 1 ODN- 炭酸アパタイト微粒子（A）の特性解析．リン酸カルシウ
ム水分散液を調製し、1 分間の超音波照射（B）を行い、粒径を解析し
た（C）

図3

図 2 腹腔マクロファージ細胞における 6FAM-ODN お
よ び 6FAM-ODN カ プ セ ル の 取 り 込 み 解 析（Bar ＝
5µm）
無処理細胞
（A）
，ODN 微粒子処理細胞（B）

ODN 微粒子で処理したマウス脾臓細胞における Il 4，Il 6，Il 1β，Tnfa mRNA の発現解析

3. 4. ODN微粒子を塗布したマウス耳介における影響

3. 2. ODN微粒子の取り込み解析
マウス腹腔マクロファージ細胞を調製し、6 FAM-ODN

これまでに乳業用乳酸菌 Streptococcus thermophilus ゲ

微粒子を用いて取り込み解析を in vitro で行った。SP 細胞

ノム配列中より同定した CpG-ODN が、マウスの脾臓細胞を PBS および 6 FAM-ODN 微粒子で処理し、蛍光標識を培養系において IFNγ および IL- 33 を強く誘導することを追 跡 し た。 コ ン ト ロ ー ル に お い て、16 . 01 %，9 . 83 %，発見している 8 , 9）。4 週間にわたる連続投与試験を実施し16 . 88 % であった蛍光値に対し、6 FAM-ODN 微粒子におた後、マウスより耳介を採取し、耳介組織切片（パラフィ

ける値は 66 . 64 %，69 . 64 %，64 . 36 % を示した。共焦点レン切片）を作成した。HE 染色により、濃い紫色で染色さーザー顕微鏡による解析の結果からも、6 FAM-ODN 微粒

れている箇所が表皮（Epidermis）である。光学顕微鏡下に子を取り込む腹腔マクロファージ細胞が観察された（図 2）。

おいて、各群より表皮の厚さを 5 ポイント測定した。Ctrl

生体防御システムの最前線に分布するマクロファージおよ群および GpC-ODN 微粒子群と比較して、CpG-ODN 微粒

び樹状細胞は、抗原を取り込み後、抗原提示して免疫応答子群において有意に高い数値となり、皮膚の肥厚が細胞組を誘導することが知られている。すなわち、腹腔マクロフ

織レベルで観察された（図 4）。

ァージにおける ODN 微粒子の取り込みは、能動的に行わ

3. 5. 高機能ODN微粒子および乳化剤の開発れている可能性が示唆された。

高 機 能 微 粒 子 作 成 装 置（ フ ァ ル マ バ レ ー セ ン タ ー，3. 3. ODN微粒子の免疫特性解析

Shizuoka，Japan）を用いた微粒子作成技術の提供を受け、C 57 BL/ 6 雄マウスから脾臓細胞を調製し、コントロー

球状粒子のオリゴ DNA 微粒子の試作を行った。コーティ

ル（Ctrl）として PBS、GpC-ODN 微粒子、CpG-ODN 微粒

ング基剤として、アルギン酸ナトリウムを採用し、水溶性子で 6 時間培養後、リアルタイム PCR 法を用いて、IL- 4，のアルギン酸ナトリウムとオリゴ DNA を高機能微粒子作

IL- 6、IL- 1 β と炎症性サイトカインである TNF-α を測定成装置により均一に射出後、ドライヤーにより粒子化し、した。GpC-ODN 微粒子と比較して、CpG-ODN 微粒子で中間体［アルギン酸ナトリウム -ODN］を得た。さらに［アは Il 1 β、Il 6、Tnfa の発現増加が見られた。一方で、Il 4

ルギン酸ナトリウム -ODN を塩化カルシウム溶液に投入については強力に抑制された（図 3）。

し、水に不溶で球体を呈する粒子体を得ることに成功した− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図4

図5

図6

マウス耳病理組織切片の観察 Bar ＝ 200 µm

球状を示す ODN 微粒子の走査型電子顕微鏡画像（Bar ＝ 5 µm）

ODN 微粒子噴霧用スプレー（試作品）（A），ODN ヒアルロン酸ナトリウム乳化液（B, C）（図 5）。

４．考

また、噴霧型 ODN 微粒子の作成を目指し、ODN 粒子体

察の調製液をエアゾール缶に充塡した試作品を作製した。さO D N や m i R N A（ m i c r o R N A ）、 s i R N A（ s m a l l

らに微粒子の乳化、分散、破砕技術を駆使して、経皮投与

interfering RNA）、さらには plasmid DNA（pDNA）など、を目的とした ODN の粒径均一化に取り組んだ。1 % ヒア

核酸成分の細胞へのトランスフェクションには、カチオン

ルロン酸ナトリウムに混合した ODN に対して乳化処理（ナ性リポソームなどの脂質分子が長年利用されてきた。しかノヴェイタ-電動式C-ES，
三重ナノテク生産技術センター）

しながら、脂質性のトランスフェクション試薬は非常に高を繰り返すことで、均一に分散した乳化 ODN 微粒子の開価であることから、近年では、ポリケタル粒子、金ナノ粒発に成功した（図 6）。

子、カーボンナノチューブ（CNT）や四塩化ケイ素ナノ粒
子と核酸成分との結合・包接技術が開発され、哺乳類細胞− 16 −

乳酸菌オリゴ DNA による上皮細胞の炎症制御と経皮核酸素材への展開

への新たな遺伝子導入技術として期待されている。これら（引用文献）

すべて in vitro 細胞培養系レベルでの transfection を想定

1） T. Sato, M. Yamamoto, T. Shimosato, D. M. Klinman,

したデリバリーシステムであるが、最近では、siRNA や

Accelerated wound healing mediated by activation of

CpG ODN の in vivo デリバリーシステムが検討されている。

Toll-like receptor 9. Wound Repair Regen 18, 586-593

Titta らは、界面活性ポリオール（Pluronic F- 127）とプロ（2010）．

ピ レ ン ス ル フ ィ ド よ り 合 成 し た ナ ノ 粒 子（NPs）と CpG

2） M. Yamamoto, T. Sato, J. Beren, D. Verthelyi,

ODN の複合体（NP-CpG）を用いて、メモリー型細胞傷害

D. M. Klinman, The acceleration of wound

性 T 細胞（メモリー CD 8 T 細胞）の再活性化を強力に誘導

healing in primates by the local administration of

することを発見した。また、マウスフットパッドへの皮下

immunostimulatory CpG oligonucleotides. Biomaterials

投与（intradermal injection, i.d.）によって、ガン細胞の移

32, 4238-4242（2011）．

+

植に対してマウスの生存率を高め、抗ガン作用を示すこと

3） H. Ikeuchi, T. Kinjo, D. M. Klinman, Effect of。Fanらは、カーボンナノチューブ（CNT）

suppressive oligodeoxynucleotides on the developmentとCpG ODNの複合体（CNT-CpG）の皮内投与（subcutaneousof inflammation-induced papillomas. Cancer Prev Res

injection, s.c.）、頭蓋内投与（intracranial, i.c.）が、同じく（Phila）4, 752-757（2011）．

を明らかにした10）。その他、プロ

4） S. Klaschik, I. Gursel, D. M. Klinman, CpG-mediated

タミン -CpG ODN、脂質性リン酸カルシウム -pDNA など

changes in gene expression in murine spleen cells

様々な核酸キャリアーが提案されている。しかしながら、

identified by microarray analysis. Mol Immunol 4 4,核酸分子は安定性に乏しく、腸管粘膜への経口送達は、い1095-1104（2007）．

抗ガン作用を示すことを報告している

11）

まだ課題とされているが、筆者は、これまでに胃酸耐性を

5） T. Sato, T. Shimosato, A. Ueda, Y. Ishigatsubo,

有する ODN ナノカプセル（ODNcap）の開発に成功した 7）。

D. M. Klinman, Intrapulmonary Delivery of CpG

本成果を踏まえ、本研究で作成した改良型 ODN 微粒子は、Microparticles Eliminates Lung Tumors. Mol Cancer

これまで様々な核酸分子キャリアーが提案されている中で、Ther 14, 2198-2205（2015）．

大幅なコストカットを達成した。一方で、包摂率が約 70

6） S. Nigar et al., Synergistic oligodeoxynucleotide% であることから、さらなる包摂効率の改善が望まれる。

strongly promotes CpG-induced interleukin-6
production. BMC Immunol 18, 44（2017）．

現在、上皮細胞培養系を用いて、粒子化、乳化 ODN 微粒子による抗炎症効果について検証を進めている。今後は、

7） Y. Wang et al., Inhibitory/suppressive oligodeoxynucleotide

ヌードマウスを用いた塗布試験も計画しており、経皮的に

nanocapsules as simple oral delivery devices for

浸透した ODNA の皮内における分布状況について経時的

preventing atopic dermatitis in mice. Mol Ther 2 3,に解析を行う予定である。ODN の経皮投与は、前人未到

297-309（2015）．

の投与ルートである。併行して実施した ODN 微粒子の粒

8） T. Shimosato et al., CpG oligodeoxynucleotides

度分布の狭小化により、気管支関連リンパ組織（BALT）や

induce strong up-regulation of interleukin 33 via Toll-

腸管関連リンパ組織（GALT）への送達性と取り込み効率のlike receptor 9. Biochem Biophys Res Commun 3 9 4,向上が期待された。経気道投与法の構築にあたっては、

81-86（2010）．

ODN 微粒子体調整液を充填したエアゾール缶の試作を行

9） T. Shimosato et al., Identification of a potent

い、最適なデバイス構築に向けた研究開発を開始しており、

immunostimulatory oligodeoxynucleotide from

将来的には呼吸器アレルギー疾患や呼吸器悪性疾患、さらStreptococcus thermophilus lacZ. Anim Sci J 80, 597-には呼吸器感染症に対する吸入核酸医薬の研究開発につな

604（2009）．

がる成果と考える。また核酸医薬の耐胃酸性の問題は、炭1 0）A. de Titta et al., Nanoparticle conjugation of CpG

酸アパタイトを基材とすることで克服されたことから、

enhances adjuvancy for cellular immunity and memory

ODN 炭酸アパタイト粒子体を作成し、ファルマバレーセ

recall at low dose. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 19902-

ンターとの協働による高機能微粒子作成装置を用いること

19907（2013）．

で、狭い粒度分布が再現され、経口摂取後の GALT への

11）H. Fan et al., Intracerebral CpG immunotherapy with

送達・取り込み向上が期待された。このように、ODN 微

carbon nanotubes abrogates growth of subcutaneous

粒子体の特性を明らかにし、経口、経気道に加えて、経皮

melanomas in mice. Clin Cancer Res 1 8 , 5 6 2 8 - 5 6 3 8

ルート開発に向けた道筋を見出した。以上本研究は、抗炎（2012）.

症作用の知られた ODN を有効性成分とする、スキンケア
化粧品等の開発に向けた取り組みとして位置づけられる。

− 17 −

β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製
芝浦工業大学システム理工学部生命科学科

須原義智

We synthesized a collagen-mimetic peptide for the purpose of increasing of biological and physical stability. Collagenis one of the most important proteins in mammalian body that maintains structural integrity of the organs and tissues. It
has been used for a biomaterial such as regenerative medicine because of excellent biological compatibility. The consensus
sequence of a general collagen model peptide is known as (X-Y-Gly)n (for X and Y, it corresponds to proline (Pro) or
hydroxyproline (Hyp)), however, it is unstable to hydrolytic enzymes. Most collagen used as biomaterials derived fromanimals, which can be supplied inexpensively and in large quantities. But many problems such as immune reactions andcontamination of pathogens are existed. In order to increase the stability to hydrolytic enzyme and its thermodynamic
stability and overcome those problems, we synthesized a collagen mimetic by converting one of the basic sequence ProHyp-Gly into β-amino acid. In short, our mimetic contains one of β-proline (βPro), β-hydroxyproline (βHyp) and β-alanine(βAla), which is substituted from one of Pro, Hyp, and Gly in the consensus sequence.
The synthetic strategy was following. First, three amino acid residues of the basic sequence Pro-Hyp-Gly containing
β-amino acid such as Pro-βHyp-Gly, βPro-Hyp-Gly and Pro-Hyp-βAla were respectively synthesized, and then they wererepeatedly elongated to 30 amino acids residues such as (Pro-Hyp-Gly) 10 , (Pro-βHyp–Gly) 10 , (βPro-Hyp-Gly) 10 , and (ProHyp-βAla) 10 by a solid-phase synthesis method. The resulting collagen mimetics were investigated the helical formation andstabilities for application to biomaterials. Furthermore, we also studied an anti-skin cancer activity of those tripeptide residue
to apply for a biologically active agent.

1.

緒ある L- ヒドロキシプロリンの類縁体を合成して組み込む

言

ことが試みられているが未だ有効な手法は見つかっていな

コラーゲンは腱、軟骨、骨の有機間質、眼の角膜のようい。

な結合組織や皮膚に見られる重要なタンパク質であり、人そこで我々は α -アミノ酸を、コラーゲンの元々の性質

工臓器をはじめとした再生医療へ応用するための材料としを保持しながら安定に存在できる人工コラーゲンの創製をて注目されている。コラーゲンを構成するトリペプチド目指した。体内の加水分解酵素に安定なペプチド化合物と（Collagene Tripeptide: CTP）は、X-Y-Gly を基本配列として、β -アミノ酸から構成される β -ペプチドが知られてしてもっている（X および Y は通常 Pro か Hyp が相当する）

いる。β- ペプチドは天然の α -ペプチドに最も近く、特有（図 1 A）。この CTP が多数繋がることで螺旋構造をもつポの堅いコンフォメーションをもっている。我々は、コラゲ

リペプチド鎖を形成する。さらに、その左巻きのポリペプ

ナーゼをはじめとする各種の加水分解酵素に耐性をもつ安チド鎖が寄り集まって右巻きの３本鎖ヘリックス構造をと定な人工コラーゲンの創製を目的として、コラーゲンを構ることで、線維組織や骨格の構造維持に必要な性質を示す

成する α -アミノ酸を β-アミノ酸に変換した化合物の創製ことが知られており、化学的にも興味深い物質である。しを行った（図 1 B）。

かしながら、天然のコラーゲンは α-アミノ酸から形成されているため、コラゲナーゼをはじめとした体内の加水分

２．方法となっている。これまでにコラーゲン三重鎖ヘリックスの2. 1. コラーゲンペプチドに組み込むためのβ-アミノ酸の選択構造や化学的安定化をはかるための類縁体研究が本研究では、コラーゲンを構成する Pro -Hyp-Gly のそ

Holmgren らや Goodman らを中心に世界中で行われていれぞれの α -アミノ酸を、β -アミノ酸に変換した人工コラ

解酵素に対する安定性の問題などが実用化への大きな障壁る

1 , 2）。それらは主にコラーゲンを構成する α- アミノ酸でーゲンを構築して天然のコラーゲンとの比較を行うことにした。これら β-アミノ酸の中でグリシン（Gly）を β -アミノ

Synthesis of artificial collagen-mimetic
peptide derived from β-amino acids酸に変換したものは、市販の β-アラニン（β Ala) が相当する。一方、β -ヒドロキシプロリン（β Hyp）や β -プロリン

Yoshitomo Suhara（β Pro）は、カルボン酸が環に沿って移動した 1 とカルボ

D epa r t ment of B io s cience a nd
E ng i ne er i ng , C o l leg e of Sy st em sEngineering and Science, Shibaura
Institute of Technology

ン酸側へ一炭素増炭した 2 の 2 種類が考えられる（図 2）。
本研究では合成の簡便さから、2 の形式をとった β -アミノ酸を合成して、Pro -Hyp- Gly に組み込んだ β-ペプチド化− 18 −

β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製

図1

コラーゲンの構造とβ-ヒドロキシプロリンを含む人工コラーゲンの創成

図2

α-アミノ酸からβ-アミノ酸へ変換した化合物

図3

人工コラーゲン（30 mer）の合成方法

合物を創製することにした。本研究では合成の簡便さから、

30 mer を得る。
（4）得られたペプチド鎖から三重鎖ヘリッ

2 の形式をとった β- アミノ酸を合成する。

クスを形成させる。以上で得られたコラーゲンペプチドの物理化学的性質を調べ、天然型と β- アミノ酸を組み込ん

2. 2. コラーゲンペプチド鎖の合成方法

だペプチドの違いを検討した。

目的とするコラーゲンペプチド鎖の合成は図 3 に示す方法で行う。まず（1）上記で示した β- アミノ酸を合成する。

2. 3. 扁平上皮がんにおけるCTPの生物活性解析

次に（2）Pro、Hyp、Gly もしくはそれらの β - アミノ酸を

CTP は経口投与や皮膚塗布によって紫外線誘発性の皮液相法により順次カップリングして、N 末端を Fmoc で保膚障害が改善されたことが報告されている 3）。しかし、護 し た CTP 残 基（Fmoc•Pro-Hyp-Gly-OH、Fmoc•β Pro-CTP の作用メカニズムや紫外線が発症要因とされる皮膚

Hyp-Gly-OH、Fmoc•Pro-β Hyp-Gly-OH、Fmoc•Pro-

がんの治療法は未だ報告されていない。現在の皮膚がんの

Hyp-β Ala-OH）を得る。
（3）無保護の C 末端を樹脂に固定

治療法は副作用を起こすものが殆どであるため、低抗原性、化し、自動ペプチド合成装置により上記の CTP とのカッ

低アレルゲン性である CTP と皮膚がんの関連を解明する

プリングを９回繰り返した後、樹脂からの切り離しと保護ことができれば、低リスクの治療法開発への寄与が期待で基の脱保護を同時に行い、HPLC で精製して目的とする

きる 4）。そこで、本研究で合成した CTP に関して生理活− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

性物質への応用を検討する一助として、扁平上皮がん培養

ルボン酸 11 とし、最後にアミノ基を Fmoc 基で保護するこ細胞株を用いて扁平上皮がんにおける CTP の生物活性評とで、90 % 収率で目的とする 4 を得ることができた（図 5）。

価を行った。

３．結

3. 2. CTPの合成

果

上記のようにして合成した β - アミノ酸をビルディング

3. 1. ビルディングブロックとなるβ-アミノ酸（βPro、
βHyp）の合成

ブロックとして、液相法により N 末端を Fmoc で保護した

コラーゲンペプチドを合成するためのビルディングブロ

OH、Fmoc•Pro-β Hyp-Gly-OH、Fmoc•Pro-Hyp-β Ala-

CTP 残基（Fmoc•Pro-Hyp-Gly-OH、Fmoc•βPro-Hyp-Gly-

ックとなる β Hyp 誘導体 3 は、図 4 に示すようなスキーム

OH）の合成を行った。

で合成した。まず、Z-O-tert-butyl-L-hydroxyproline（5）3 . 2 . 1. βPro を組み込 んだ CTP（Fmoc•βPro-HypGly-OH）
（12）
の合成

を出発原料として、ジアゾメタン存在下でクロロギ酸エチ
ルを反応させ、アゾ化合物 6 を 80 % 収率で得た。次にトβPro を組み込んだ CTP 誘導体は、以下のように合成しリフルオロ酢酸銀、トリエチルアミンによって転位反応にた。最初に、上記で合成した β Pro（11）のアミノ基を Z 基より、60 % 収率で一炭素増炭したカルボン酸 7 に変換した。

で保護した 15 を 90 % 収率で得た。ペプチドカップリング

最後にアミノ基の保護基を Z 基から Fmoc 基に付け替える試薬である COMU を用いて、15 のカルボン酸残基と Hyp

ことで目的とする 3 を得ることができた（図 4）。

（tBu-Hyp-Me）のアミノ基の間でカップリングさせ、74 %次に N 末端を Fmoc 基で保護した β Pro 誘導体 4 は、図 5の収率で二量体 16 とした。さらに 16 のメチルエステルをに示すスキームで合成した。すなわち、（S）-pyrrolidin-

加水分解してカルボン酸 17 にした後、同様に Gly のアミ

2 -ylmethanol（8）を出発原料として、そのヒドロキシ基にノ基とカップリングさせて高収率で三量体 18 を得た。最p-toluene sulfonyl 基を導入して 9 とした後、KCN により後に N 末端と C 末端の Z 基と Bn 基を脱保護して、N 末端

高収率でシアノ基に変換した 10 とした。その後、濃塩酸のみを Fmoc 基で保護することで、目的とする CTP（Fmoc•と酢酸の混合溶液によって、シアノ基を酸加水分解してカ

βPro-Hyp-Gly-OH）（12）を得ることに成功した（図 6）。

図4βHyp 誘導体の合成

図5

βPro 誘導体の合成− 20 −

β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製

3. 2. 2.

βHyp を組み込んだ CTP（Fmoc•Pro-βHyp-

後にベンジル基と Z 基の脱保護と N 末端の Fmoc 化を行い、Gly-OH）（13）の合成

目 的 と す る CTP（Fmoc•Pro-βHyp-Gly-OH）（13）を 得 る

β Hyp を組み込んだ CTP 誘導体 13 の合成は、以下のよことができた（図 7）。

うな方法で行った。上記で合成した 6 をメチルエステル体

3. 2. 3.

βAla を組み込んだ CTP（Fmoc •Pro-Hyp-β

19 に変換した後、接触水素化により、アミノ基のみを無Ala-OH）（14）の合成

保護とした 20 を高収率で得た。この 20 のアミノ基を Z 基

β Ala を組み込んだ CTP 誘導体 14 の合成は、以下のよで保護した Pro（ZPro）のカルボン酸とカップリングさせ、うな方法で行った。まず、ZPro（24）を出発原料とし、こ60 % の収率で二量体 21 とし、さらにアルカリ加水分解にれに Hyp をカップリングさせ、二量体 25 を得た。次に C

よりカルボン酸体 22 とした。22 に C 末端をベンジル基で末端のメチルエステルをアルカリ加水分解してカルボン酸保護した Gly をカップリングさせ三量体 23 を得た後、最体 26 とし、引き続き βAla ベンジルエステルとカップリン

図6

βPro を組み込んだ CTP（Fmoc◦βPro-Hyp-Gly-OH）
（12）
の合成

図7

βPro を組み込んだ CTP（Fmoc◦Pro -βHyp - Gly-OH）
（13）
の合成

− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

グすることで三量体 27 とした。最後に接触水素化により

3. 5. 計算化学により推定した立体構造

ベンジル基と Z 基の脱保護を行い、N 末端の Fmoc 化を行

3 . 5 . 1.

うことで目的とする CTP（Fmoc•Pro-Hyp-β Ala-OH）（14）を得ることができた（図 8）。

CPTの立体構造

このように合成したコラーゲン類縁体のうち、それらを構成する CTP である Pro-Hyp-Gly と Pro-β Hyp-Gly の構
造を、計算化学によって解析した。本研究では、合成した

3. 3. 固相合成による30merの合成

30 mer の Gly-Hyp-Pro の繰り返し構造であるトリペプチ

上記で得られた CTP 13 は、上記の 2 . 2 . に示した方法

ドについて最安定化構造を求めた。このとき、C- 末端とに従って 30 mer を合成した。それぞれレジンに固定し、N- 末端はメチル基で置換し、計算方法は BLYP/DNP//

固相合成法により 9 回繰り返してカップリングした後、レMMFFs（COSMO in Water）で行った。その結果、天然のジンから切り離して、最後に HPLC 精製することで（Pro-

コラーゲンは Gly-Hyp-Pro で一回転し、Gly から Pro まで

β Hyp-Gly）10 を得ることができた。

の距離は 6 . 509 オームストロングであったのに対し、Hypを β -アミノ酸に置換した Pro-βHyp-Gly では 6 . 970 オーム

3. 4. 合成した（Pro-β Hyp-Gly）10の熱安定性

ストロングであった。この結果より、β- アミノ酸を組み合 成 し た コ ラ ー ゲ ン ペ プ チ ド の 30 mer で あ る（Pro-込むことによって、ヘリックス構造の一回転あたりの距離

β Hyp-Gly）10 について、天然型の（Pro-Hyp-Gly）10 と比較はわずかに変化するものの、構造自体は天然のヘリックス

した。CD スペクトルにより熱安定性を調べたところ、構造に類似していると予想できた（図 9）。

（Pro-Hyp-Gly）10 は 58 ℃でヘリックス構造が壊れたもの

10 および10
3 . 5 . 2 . （Pro-Hyp-Gly）（Pro-Hyp-βAla）の、興味深いことに β- アミノ酸を組み込んだ（Pro-β Hyp-の立体構造

Gly）10 では 80 ℃以上でもヘリックス構造を維持していた。

コラーゲンペプチドの 30 mer について、計算化学の手

このことからも今回我々が合成した人工コラーゲンは熱安

法 に よ り（Pro-Hyp-Gly）10 と β -ア ミ ノ 酸 を 組 み 込 ん だ

定性が非常に高いことが示された。

図8

βAla を組み込んだ CTP（Fmoc◦Pro - Hyp -βAla-OH）
（14）
の合成

Pro-Hyp-Gly

Pro-βHyp（2）-Gly

図 9 計算化学による CTP の推定構造
計算方法：BLYP/DNP//MMFFs（COSMO in Water）− 22 −

β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製（Pro-Hyp-β Ala）10 を比較した（図 10）。その結果、二つのがん細胞においても同様に、CTP および CTP 誘導体の高ペプチドは類似した立体構造を有していることが明らかと濃度曝露による細胞生存率の有意な減少を確認したが、コなった。また、β -アミノ酸を組み込んだペプチドのほうがラーゲンコートの有無による細胞生存率の変化はみられな

安定に存在できることも示唆された。

かった。以上の細胞生存率測定では、CTP の違いによる細胞生存率の違いは観察されなかった。

3. 6. CTPの生物活性評価

CTP および CTP 誘導体による細胞生存率減少のメカニ

次に、合成した CTP（Gly-Hyp-Pro）とその誘導体（Gly-

ズムを解明するために、ウエスタンブロットを行った。細

β Hyp-Pro）を様々な濃度でヒト扁平上皮がん細胞（A 431）

胞周期制御に関与するタンパク質の一つである p 21 の検に添加して、その細胞生存率を調べることでがん細胞増殖

出を行ったところ、CTP および CTP 誘導体曝露による抑制効果を評価した。さらにウエスタンブロット法により、

p 21 の発現量の変化は観察されなかった。

タンパク質の発現量解析を行い、がん細胞に対する CTP

４．考および CTP 誘導体の作用メカニズムの探索を行った。

察

その結果、それぞれを 10 µM および 100 µM の添加濃度

これまでにコラーゲンを模倣した化合物の研究が世界中では、がん細胞の生存率に有意な変化はみられなかった。

で行われているが、その多くは Hyp を別の化合物に置きそこで、CTP および CTP 誘導体を高濃度の 1000 µM で曝換えたものである。それに対し本研究では、CTP（Gly-

露したところ、図 11 に示すように有意な生存率の減少がHyp-Pro）を基にして、構成するアミノ酸を β - アミノ酸に確認された。コラーゲンコート上で培養したヒト扁平上皮

変換したコラーゲンペプチドを創製したため、計算化学に

length：80.36 Å，potentioan energy：432.0 kJ/mol

length：75.16 Å，potentioan energy：232.1kJ/mol
図 10

図 11

計算化学による 30mer の立体構造

CTP および CTP 誘導体 1000 µM 曝露時の細胞生存率− 23 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

よる構造解析の結果からも、天然に近い性質をもっている

したがって、今後もさらに詳細に研究を続けることにより、と考えられる。さらに、得られたペプチドは熱安定性の高再生医療やコスメトロジーの分野への新規の機能性材料へい強固なヘリックス構造をもっていることが明らかとなっ応用可能な人工コラーゲンを創出することは、十分可能でた。このコラーゲンペプチドの加水分解酵素に対する安定あると考えられる。

性はまだ調べていないが、もしも天然のコラーゲンに比べて著しく高い安定性を有していれば、新しい機能性材料と謝

辞本研究の遂行にあたり、御援助を賜りました公益財団法

して生物化学分野に応用できる可能性がある。
また、創薬科学分野への応用の可能性についても検討した結果、今回は予備的な実験ではあるが、CTP および人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げます。

CTP 誘導体はヒト扁平上皮がん細胞に高濃度で曝露する
ことで細胞増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。

（引用文献）

CTP および CTP 誘導体による細胞生存率減少のメカニズ

1） Holmgren SK, Bretscher LE, Taylor KM, Raines RT.

ムとして、細胞周期やアポトーシスへの関与が考えられる。

A hyperstable collagen mimic. Chem. Biol. 1999, 6, 63-

CTP により細胞生存率が減少したのに対し、細胞周期制70.

御タンパク質の一つである p 21 は CTP による影響がみら

2） Goodman M, Bhumralkar M, Jefferson EA, Kwak J,

れなかったため、今後他の細胞周期に関わるシグナルや、Locardi E. Collagen mimetics. Biopolymers, 1 9 9 8, 4 7,

アポトーシス誘導タンパク質においても同様の実験が必要

127-142.

である。

3） Pyun HB et al. Effects of Collagen Tripeptide

５．総Supplement on Photoaging and Epidermal Skin Barrier

括in UVB-exposed Hairless Mice. Prev Nutr Food Sci.
2012 Dec; 17（4 ）:245-53.

β-アミノ酸を組み込んだ人工コラーゲンは、天然のコラーゲンと類似した立体構造をもち、さらに天然に比べて熱4） Hakuta A et al. Anti-inflammatory effect of collagen

安定性が非常に高いことを見出した。またそれを構成する

tripeptide in atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2 0 1 7

CTP は、生理活性物質に応用できる可能性も示された。

Dec; 88（3）:357-364− 24 −

超分子架橋を施した高保水性コラーゲン微粒子の創製
東京医科歯科大学生体材料工学研究所

田村篤志

In order to fabricate collagen microparticles with high water content and chemical stability, the collagen microparticles
cross-linked with carboxylmethylated α-cyclodextrin (α-CD)-threaded polyrotaxanes (CMPRs) were prepared. First, thecross-linking of collagen hydrogels with CMPRs were tested. CMPR-cross-linked collagen hydrogels showed higher
mechanical and swelling properties than those of EDC/NHS-cross-linked and carboxymethyl cellulose (CMC)-crosslinked collagen hydrogels. These results suggest that the mobility of cross-linking points in CMPR-cross-linked collagenhydrogels contributed to improving mechanical and swelling properties. Additionally, the chemical compositions of CMPR
greatly affected mechanical and swelling properties of CMPR-cross-linked collagen hydrogels, and CMPR comprisinghigh molecular weight axle polymer and high α-CD threading ratio was suitable for improving the functions of collagenhydrogels. Moreover, CMPR-cross-linked collagen hydrogels showed high adhesiveness of mouse fibroblasts comparedwith EDC/NHS-cross-linked and CMC-cross-linked collagen hydrogels, presumably due to the high elasticity of CMPRcross-linked collagen hydrogels. Finally, CMPR-cross-linked collagen microparticles with 3 . 38 ± 1 . 42 μm in diameter
were successfully prepared. These cross-linked collagen microparticles showed excellent chemical stability. Altogether withthese results, the cross-linking of collagen with CMPR is an effective method to modulate the mechanical properties andcytocompatibility, and CMPR-cross-linked collagen microparticles would be applied as a cosmetic ingredient.

1.

緒従するようなしなやかさは失われ、硬くて脆い構造になる。

言

また、架橋方法や条件によっては細胞毒性が生じるといっ

真皮などの生体組織を構成するコラーゲンは、医療、食た問題も指摘されている 3）。

品、美容製品など様々な分野で利用されている生体由来高このような従来の化学架橋ヒドロゲルの力学特性を改善分子である。コラーゲンはヒドロゲルなどへの成型加工もすることを目的に、当研究室ではこれまでに鎖状高分子が容易であり、組織適合性や保水性（保湿性）に優れることか多数の環状糖類 α -シクロデキストリン（α-CD）空洞部に貫。

通した超分子ポリロタキサンによるゼラチンの架橋を検討

このような目的で用いるコラーゲンは角質層に留まり、肌した 4 , 5）。ポリロタキサン中の α-CD は軸高分子上を自由

表面の保湿剤として機能すると考えられる 2）。また、コラーに移動するといった特徴があり、α-CD 同士を架橋するこ

ゲンのヒドロゲルは医療分野では再生医療や癒着防止膜なとで、可動性の架橋構造を有するヒドロゲルが得られる 6）。

どの外科的な利用まで幅広く研究されている。コラーゲン

本ゲルは架橋点が滑車のように軸高分子を移動するため、ゲルは単体で使用される場合も多いが、医療目的では力学

伸張しても滑車様の運動により高分子の切断が回避され、

1）

的な強度を増大させる目的で化学架橋が検討されている 。

破壊エネルギーの蓄積を防ぐといった特徴がある 6 , 7）。実

これまでに検討されている代表的なコラーゲンの架橋法と際に、ポリロタキサンを用いてゼラチンを架橋した結果、して、グルタルアルデヒドや縮合剤によるコラーゲン分子

破断強度が増大するとともに低応力高歪な力学特性を示す

鎖同士の架橋、ポリエチレングリコールなど親水性ポリマ

ことを見出している 1）。そこで本研究では、ポリロタキサーを用いた架橋が挙げられる 1）。これらの架橋により破断

ンによるコラーゲンの化学架橋を行い力学特性、細胞接着

強度の増大は達成されるが、コラーゲン本来が有している性を明らかにするとともに、美容分野への応用に向けたポ

J 字型の応力−歪み特性（低歪み時には応力が小さく、J 字

リロタキサン架橋コラーゲンマイクロ粒子の調製を検討しのように応力が増加）は喪失し、プラスチックのような Sた。

ら美容製品分野では美肌成分として利用されている

1 , 2）字型応力−歪み特性（低歪み字に応力が大きく、S 字を描
いて応力が増加）を示す。すなわち、生体組織の動きに追Design of collagen microparticles byintroducing supra molecula r cross linkers
Atsushi Tamura
I nstitute of Biomateria ls a nd
Bioengineering, Tokyo Medical and
Dental University

２．方法

2. 1. カルボキシメチル化ポリロタキサンの合成
環状分子として α-CD（塩水港精糖社製）、軸高分子として 平 均 分 子 量 10 , 000、35 , 000 の カ ル ボ キ シ 末 端 PEG（Sigma-Aldrich 社製）、封鎖基として 1 - アダマンチルア
ミン（富士フイルム和光純薬社製）を用いたポリロタキサン
は既報に従い合成した 8）。次に、ポリロタキサンを 1 . 5 M
水酸化カリウム水溶液に溶解させ、2 - ブロモ酢酸（東京化− 25 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

成社製）を添加し、室温で 24 時間反応させた。反応終了後、

2. 4. 架橋コラーゲンゲル微粒子の調製と評価

分画分子量 35 , 000 の透析膜を用いて、純水に対して透析

Span- 20 を溶解させた流動パラフィン溶液に、中和しを行うことで精製し、凍結乾燥により粉末状のカルボキシたコラーゲン溶液を添加し、ホモジナイザーによって乳化

メ チ ル 化 ポ リ ロ タ キ サ ン（CMPR）を 得 た。CMPR 中 のさせた。その後、上記と同様に、CMPR、EDC、NHS を

1

α-CD 貫通数、及びカルボキシメチル基修飾数は H NMR

溶解した水溶液を滴下し、24 時間攪拌した。反応修了後、（Avance III 400 , Bruker Biospin）
測定により決定した。

2 - プロパノールを用いて 3 回洗浄し、精製を行った。位
相差顕微鏡により観察し、粒径を計測した。

2. 2. コラーゲンゲルの化学架橋と力学特性の評価

３．結

アテロコラーゲン粉末（高研社製）に 1 mM 塩酸を加え、氷冷下で溶解させた。次に、水酸化ナトリウム水溶液でコ

果

3. 1. ポリロタキサン架橋コラーゲンゲルの調製

ラーゲン溶液を中和し、テフロン性の鋳型に加え、37 ℃

本研究では、軸高分子分子量、及び α-CD 貫通数の異なで 24 時間静置することでコラーゲンゲルを調製した。次る 4 種類の CMPR を調製した。1 H NMR 測定より求めたに、CMPR をエタノール－純水の混合溶媒（エタノール：

各 CMPR の軸高分子分子量、α-CD 貫通数、ならびにカル

純水＝ 3：7）に溶解し、縮合剤として 1 - エチル - 3 -（3 - ジ

ボキシメチル基修飾数を Table 1 に示す（ポリロタキサン

メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC、東中の α-CD はエチレングリコール 2 ユニットを包接するた

京化成社製）、及び N- ヒドロキシコハク酸イミド（NHS、め、軸高分子の重合度より α-CD 貫通率を計算）。架橋コ

東京化成社製）を CMPR 中のカルボキシ基：EDC：NHS =ラーゲンゲル微粒子作成の条件検討に先立ち、コラーゲン

1 : 10 : 10 のモル比となるように加え、15 分攪拌した。そゲルを用いて CMPR による架橋の検討と物性評価を行っの後、コラーゲンゲルを CMPR 溶液に浸漬し、室温で 24た。コラーゲンは分子中にリシンに由来する一級アミノ基

時間静置し、化学架橋を行った。反応終了後、コラーゲンを有しているため、カルボキシ基を有する化合物と縮合反ゲルはリン酸緩衝溶液（PBS）に浸漬し、未反応の CMPR、応により結合が可能である。そこで、あらかじめ調製した及び縮合剤を除去した。本操作を計 3 回繰り返すことで精コラーゲンゲルを CMPR 溶液に浸漬することで架橋反応製し、架橋コラーゲンゲルを得た。比較対象として、可動を行った（Fig. 1）。反応後、各架橋コラーゲンゲル中に残性の架橋構造を有していないカルボキシメチルセルロース

存するアミノ基を定量した結果、いずれの架橋コラーゲン（CMC、数平均分子量 139 , 000、東京化成社製）で架橋しゲルにおいても残存アミノ基は 20 % 以下であり、アミノ

たコラーゲンゲル、及び EDC/NHS のみで化学架橋を行っ基の大部分が架橋されたことを確認した。

たコラーゲンゲルを調製した。

次に、各架橋コラーゲンゲルの力学特性を引張強度より

コラーゲンゲルの力学特性は引張強度測定、及び動的粘評価した（Fig. 2）。NHS/EDC で架橋したコラーゲンゲル

弾性測定によって評価した。引張強度はダンベル型に成形や CMC 架橋ゲコラーゲンゲルでは、歪みに対して応力がしたゲルを作成し、RE 2 - 33005 B（山電社製）により測定

ほぼ直線的に増加する傾向が認められた。どちらの架橋コした。動的粘弾性は Rheosol-G 3000（UBM 社製）により測

ラーゲンゲルも歪みがおよそ 10 % 程度で破断し、破断時定した。

において 2 MPa 以下の応力を示した。一方、CMPR 架橋
ゲルでは、J 字型の応力－歪み曲線を示した。これは、伸2. 3. 架橋コラーゲンゲルへの細胞接着性評価

長時に架橋点となるポリロタキサン部位が異動することに

24 ウェルプレート内に上記と同様に架橋コラーゲンゲ

起因すると考えられる。また、破断時の歪みも 1 . 5 ～ 2 倍ルを作成し、マウス線維芽細胞株である BALB/ 3 T 3 細胞程度増大するとともに、破断強度も大幅に向上した。特に、

32を 2 × 10 cells/cm の密度で播種した。所定時間経過後、軸高分子が短く、α-CD 貫通率の低い CMPR（CMPR- 17 %-位相差顕微鏡により細胞を観察し、細胞接着数を計測した。

10 k）ほど低応力高歪みであった。また、軸高分子が長く、Table 1CMPR の化学組成

Sample code

Mn of PEG axle

Number of threading α-CDs onto PRX（threading ratio）

Number of CME groups on PRX（per α-CD）

Mn

CMPR- 17 %- 10 k

10 , 000

19 . 5（17 %）52 . 4（2 . 68）

32 , 300

CMPR- 37 %- 10 k

10 , 000

41 . 9（37 %）122（2 . 92）

58 , 300

CMPR- 20 %- 35 k

35 , 000

82 . 3（20 %）275（3 . 34）

132 , 000

CMPR- 37 %- 35 k

35 , 000

147（37 %）495（3 . 35）

208 , 000

− 26 −

超分子架橋を施した高保水性コラーゲン微粒子の創製

Fig. 1

Fig. 2カルボキシメチル化ポリロタキサン（CMPR）
によるコラーゲンの化学架橋

各架橋コラーゲンゲルの応力－歪み曲線

Fig. 3

各架橋コラーゲンゲルの PBS 中での膨潤特性度が最も高い値を示した。また、各架橋コラーゲンゲルの3. 2. ポリロタキサン架橋コラーゲンゲルへの細胞接
着性

動的粘弾性測定を行った結果、破断強度の値と相関して、次に、各架橋コラーゲンゲルの生体親和性を明らかにす

貯蔵弾性率が上昇した。以上の結果より、CMPR によるるために細胞接着性を評価した。細胞として、マウス線維

化学架橋によりコラーゲンゲルの力学特性を大きく改善で芽細胞である BALB/ 3 T 3 細胞を使用した。細胞播種直後きるとともに、CMPR の化学組成によって力学特性が変から 24 時間後までは徐々に接着、伸展する細胞数が増加

化することを明らかにした。

する様子がどのゲルでも観察された（Fig. 4）。しかしながα-CD 貫通率の低い CMPR（CMPR- 37 %- 35 k）では破断強

各架橋コラーゲンゲルの膨潤特性を明らかにするために、ら、72 時間後にはポリロタキサン架橋コラーゲンゲル上

乾燥状態のゲルを PBS に浸漬後の重量変化を調べた（Fig.

で伸展した細胞数が顕著に増加している様子が観察された。

3）。その結果、NHS/EDC で架橋したコラーゲンゲルや

実際に、細胞接着数を計測した結果、分子量 35 , 000 の

CMC 架橋コラーゲンゲルと比較して、CMPR 架橋コラー

PEG を軸高分子として用いた CMPR 架橋コラーゲンゲル

ゲンゲルでは膨潤度が大きく増大する様子が観察された。

上で細胞数が有意に増加していることが確認された（Fig.

特に、軸高分子の分子量が大きい CMPR- 20 %- 35 k、及び5）。また、接着細胞の形態とアスペクト比を計測した結果、

CMPR- 37 %- 35 k で架橋したコラーゲンゲルにおいて大き2 時間後では CMPR- 37 %- 35 k で架橋したコラーゲンゲ

な膨潤度を示した。

ルにおいて細胞接着面積の増大が確認され、早期に細胞が− 27 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Fig. 4

各架橋コラーゲンゲル上に播種した BALB/3T3 細胞の位相差顕微鏡像

Fig. 5

各架橋コラーゲンゲル上における BALB/3T3 細胞の接着数

伸展していることが示唆された。しかしながら、24～ 72を踏襲し、CMPR 架橋コラーゲンゲル微粒子の調製を行

時間後の細胞では、各架橋コラーゲンゲル間で接着面積やった。コラーゲン水溶液と流動パラフィンを混合し乳化後、アスペクト比に有意な差は認められなかった。以上の結果

ただちに CMPR 溶液を加えることで架橋反応を行った。

を総合して考えると、力学特性、膨潤度、細胞親和性に優

最終的には、Fig. 6 に示すような球状の粒子が得られた。

れるコラーゲンゲルを調製するためには軸高分子が長く、粒子の平均直径は 3 . 38 ± 1 . 42 μm であった。粒径のヒスト

α-CD 貫通率の高い CMPR が好適であり、微粒子調製の実

グラムは単峰性であったものの、変動係数は 0 . 42 と大き験では CMPR- 37 %- 35 k を使用することとした。

く、粒系分布は比較的大きいことが明らかになった。本CMPR 架橋コラーゲンゲル微粒子を PBS 中に分散させ、3. 3. コラーゲンマイクロ粒子の調製

37 ℃で浸透しても 1 週間以上は同様の粒子形状を保持しこれまでに報告されているコラーゲン微粒子の作成方法ていた。一方で未架橋コラーゲンゲル微粒子は 1 週間後に− 28 −

超分子架橋を施した高保水性コラーゲン微粒子の創製

Fig. 6CMPR 架橋コラーゲンゲル微粒子の位相差顕微鏡像と、粒径のヒストグラム（n=529）は消失していたことより、CMPR による架橋が施されて率の上昇が確認されており、このような力学的特性の違い

いることが確認された。以上の結果より、化学的に安定なによって細胞の早期進展や増殖性に変化が表れたと考えら

CMPR 架橋コラーゲンゲル微粒子が調製されたと言える。

れる 9）。

４．考

また、CMPR- 37 ％ - 35 k で架橋したコラーゲン微粒子

察では、同様に調製したコラーゲン微粒子（10 ～ 20 μm）より

本研究では、コラーゲンゲルの新たな架橋方法として分も粒径が小さいものが得られた 10 , 11）。コラーゲン微粒子

子可動性を有するポリロタキサンによる架橋を検討した。

の粒径は界面活性剤の濃度や攪拌速度によって変化する。

グルタルアルデヒドなどの従来の化学架橋では、コラーゲ

架橋剤として添加した CMPR は親水性であり、ただちにンゲルの力学特性や化学的安定性が改善されるが、応力－水層に分配されると考えられるが、親水性の高分子である

歪み特性が天然のものから大きく変化してしまう点や、細ため界面活性剤として機能し、粒径が小さくなったと考え

胞接着性が低下することが課題であった。
本研究では、種々られる。しかしながら、軸高分子の分子量や、あらかじめの化学組成の CMPR を用いてあらかじめ調製したコラー

油層に溶解した界面活性剤の濃度を詳細に検討することにゲンゲルの架橋を行った。予備的な検討としてコラーゲン

よって、コラーゲン微粒子の粒径は制御できると考えられ溶液中で CMPR と反応後、ゲル化を行ったが、ゲル化しる。

ないサンプルがあったことや、力学特性の改善が見られな

５．総かった。これは、CMPR の添加によりコラーゲンの分子括間相互作用によるゲル化が阻害されたと考えられる。一方、本研究では、分子可動性を有するポリロタキサンによるあらかじめ調製したコラーゲンゲルの架橋ではゲル化の条

コラーゲンゲルの架橋を検討するとともに、架橋コラーゲ

件は変化しないが、ゲル内部まで均一に架橋できるかが課

ン微粒子の調製を行った。適切な化学組成の CMPR を用題である。実際に得られた架橋コラーゲンゲルではほとん

いてコラーゲンゲルを架橋することで、力学特性、膨潤度、どのアミノ基が反応していたことより、内部まで十分架橋

ならびに細胞接着性に優れる架橋コラーゲンゲルが得られされていると考えられる。

ることを明らかにした。また、本手法を利用してコラーゲ

CMPR で架橋したコラーゲンゲルでは力学的な強度やン微粒子の調製に成功した。CMPR 架橋コラーゲン微粒

膨潤度などの物性が、EDC/NHS 架橋コラーゲンゲルや分子は、化学的安定性、細胞親和性、膨潤度に優れることか

子可動性のない CMC 架橋コラーゲンゲルと比較して大幅ら化粧品成分として有用であると考えられ、今後の応用展に向上していた。特に、軸高分子が長く、α-CD 貫通率の開が期待される材料である。

高い CMPR では膨潤度や力学特性に優れることを明らかにした。これは、高分子量の軸高分子を用いることで化学

謝

辞架橋の架橋点間距離が延長されたためであると予想される。

本研究の遂行にあたり、多大なるご支援を頂きました公

また、CMPR- 37 ％ - 35 k で架橋したコラーゲンゲルは細益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より感謝

胞 の 進 展 や 増 殖 に も 優 れ る こ と が 明 ら か に な っ た。

申し上げます。

CMPR- 37 ％ - 35 k で架橋したコラーゲンゲルでは、弾性− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

（引用文献）

applications of mechanically interlocked polymers. Nat.
Rev. Mater. in press（2021）DOI : 10.1038/s41578-021-

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J. Mater. Sci. Mater. Med. 21 , 1891 - 1898（2010）．

高分子ベシクル積層膜の秩序構造とダイナミクス
大分大学理工学部

檜垣勇次

Polymer micelles are valid for the bio-compatible smart molecular system in the field of nanomedicine. Double
zwitterionic diblock copolymers composed of a poly(carboxybetaine methacrylate) (PCB) chain and a poly(sulfobetaine
methacrylate) (PSB) chain (PCB-b-PSB) were synthesized by radical addition fragmentation chain transfer polymerization.
Well-defined diblock copolymers with narrow molecular weight distribution were systematically produced. The
hydrodynamic radius of gyration of the particles produced by the PCB-b-PSB aggregation was determined by dynamic
light scattering measurement. The PCB-b-PSB diblock copolymers with high molecular weight PSB block produced
uniform micellar aggregates with narrow size distribution in the salt-free aqueous solution. Because the sulfobetaines show
electrostatic and/or dipolar cohesive interactions to produce sulfobetaine couples in salt-free water, the PSB chains yield
insoluble core with network structure to produce micellar aggregates. The micellar structure depends on the concentrationof co-existing zwitterions. The PCB-b-PSB micellar aggregates transformed in the presence of sulfobetaine compounds,
whereas the other zwitterions including glycine and taurine hardly induced the transformation of the aggregates. The
zwitterion-specific structure modulation is rationalized by the complementary interaction of the zwitterions depending on
the charged groups, charge density balance, and geometric form. The micellar structure transform efficiency also depends
on the charge spacer length (CSL) of the sulfobetine compounds. The dissociation of PCB-b-PSB chains from the micellar
aggregates was preferentially induced through the interactions with sulfobetaines with long CSL. The electrostatic anddipolar interactions are encouraged in the long CSL sulfobetaines because the dipole moment and charge density areaugmented by separating the charges.

1.

緒子の集合体であるため低分子量両親媒性分子である界面活

言

性剤や脂質と比較して，会合体の構造安定性が高く，分子両親媒性分子の媒質中における会合により形成されるミセル状分子集合体や中空球状分子集合体であるベシクルは，量の制御や分子鎖の部分的な修飾によって，会合体の形態と環境応答性の設計が容易である（Fig. 1）2 , 3）。

薬物や美容有効成分の輸送や徐放，微小反応場など，物質

正電荷と負電荷が炭化水素鎖で連結された双性イオンを科学分野や医療分野における実用化の可能性から多大な注

側鎖に有する双性イオン高分子は，電荷と水との強い相互目を集めている。ベシクル内部に薬剤を直接内包した薬物作用により極めて親水性が高く，実効電荷が中性であるた

内包ベシクル，ベシクルに酵素を内包した生体内反応性ベめ生体高分子を含む荷電粒子との相互作用が弱く，非特異

シクル，腫瘍への集積を促進するターゲッティング機能を的吸着が抑制されるため，生体適合性高分子として注目さ付与したベシクルキャリアなど，数多くの機能性ベシクル

れている 4 , 5）。双性イオン高分子は，双性イオン構造，分が提案されている。しかしながら，脂質分子で構成された

子量，高分子濃度に応じて多様な自己集合特性を示す。ポベシクルは，構造安定性が低い上に，膜透過性が高く，選リカルボキシベタイン（PCB）は水中で高度に水和して溶解

択的物質輸送に課題がある。さらに，細胞膜では内葉と外する。一方，ポリスルホベタイン（PSB）は水中でスルホベ葉を構成する脂質の組成が非対称であるため膜貫通タンパ
ク質の配向が制御されており選択的物質輸送が実現されるのに対し，脂質分子の自己集合により形成される人工ベシ
クルは対称構造であるため，膜構成物質の配向制御や，内層と外層の独立した膜機能の制御に課題がある 1）。一方，非対称多成分高分子鎖であるブロック共重合体の集積により構築される高分子ミセル／ベシクルは，高分子量鎖状分

Ordered Structure and Dynamics ofPolymer Vesicle Multi-Layered Films
Yuji Higaki
Faculty of Science and Technology, Oita
University

Fig. 1 Schematic representations of aggregate geometry
depending on the volume fraction of block copolymer
components.

− 31 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

タイン基同士の相互作用により凝集する。スルホベタイン

重溶媒には 200 mM NaCl 重水溶液を用いた。GPC 測定は，凝集体はイオンにより相互作用が遮蔽されるため，電解質

島津製作所製高速液体クロマトグラフィーシステムを用い，水溶液中では分子鎖が解離する 6）。したがって，双性イオ

TSKgel G 5000 PWXL と TSKgel G 3000 PWXL を連結したン高分子を適切に分子設計することで，ブロック共重合体

カラムを用いて，溶離液を 200 mM NaCl 水溶液とし，流の固体表面への集積とナノメートルスケールの秩序構造形

速 0 . 6 mL/min，カラムオーブン温度 40 ℃で測定した。ポ成の制御が実現され，隔離された層に局在化した内包分子

リエチレンオキシド標準試料でキャリブレーションした。

が計画的に徐放される積層ラメラ膜が構築されると着想しそこで本研究では，PCB と PSB で構成される双性イオ

2. 2. PCB-b-PSB水溶液中における会合体構造の解析

ン高分子ブロック共重合体（PCB-b-PSB）が固体表面で形

動的光散乱（DLS）測定は，Zetasizer Nano ZS（Malvern）

成する高分子構造体の秩序構造とそのダイナミクスの解明

にて，He-Ne レーザー（波長 633 nm）を用い，測定温度 25を目的とした。PCB-b-PSB の合成，PCB-b-PSB が水溶液℃，測定角度 173 ˚ で行った。溶液の PCB-b-PSB 濃度は中で形成する高分子会合体の構造と環境応答性形態変化の

1 . 0 mg/mL とし，孔径 0 . 20 μm の親水化 PTFE フィルタ解明まで研究が進捗したので，研究成果を報告する。

ー（Advantec, HP 020 AN）で濾過して測定に供した。散乱

た。

２．方

光強度の自己相関関数から計測した緩和時間より算出した法

剛体球の拡散係数より，Stokes - Einstein 式に基づき流体

2. 1. PCB-b-PSB双性イオン高分子ブロック共重合体の合成

力学的半径（Rh）を求めた。

３．結果・考察

可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合により，PCB 高
Macro-CTA より PSB 鎖を RAFT 重合によって鎖延長す3. 1. PCB-b-PSB双性イオン高分子ブロック共重合体の合成ることで PCB-b-PSB を合成した（Fig. 2）7）。反応溶液を透合 成 し た PCB Macro-CTA と PCB-b-PSB の GPC 測 定

析精製した後，溶液をメタノールに滴下し，沈殿物を遠心により計測した数平均分子量（Mn, GPC）と分子量分布（Mw/

分離により回収した。

Mn, GPC），1 H-NMR 測定により計測した PSB 鎖の重合度に分 子 連 鎖 移 動 剤（PCB Macro-CTA）を 合 成 し た。PCB

合成したブロック共重合体の PCB/PSB 組成は 1 H-NMR

基づき算出した数平均分子量（Mn, NMR），PCB 鎖と PSB 鎖

測定，数平均分子量（Mn）と分子量分布（Mw/Mn）は GPC 測の重合度から算出したブロック共重合体の重合度比を1定により計測した。 H-NMR 測定は，AVANCE-III 400

Table 1 に示す。PCB Macro-CTA の分子量分布は十分に（Bruker Co., Ltd.）を用い，室温，400 MHz で測定した。

狭く，高度に分子量制御された高分子鎖が得られた。PCB

Fig. 2

Table 1aPreparation of the PCB Macro-CTA and PCB-b-PSB diblock copolymers

Characteristics of the PCB Macro-CTA and PCB-b-PSB diblock copolymers

SampleMn, GPCa

Mw/Mn, GPCa

Mn, NMRb

PCB/PSBNMRb

PCB 43 Macro-CTA

9 , 500

1 . 11--

PCB 43 -b-PSB 40

21 , 100

1 . 11

21 , 200

1 / 0 . 93

PCB 43 -b-PSB 100

32 , 100

1 . 1038 , 800

1 / 2 . 33

PCB 43 -b-PSB 166

55 , 800

1 . 0858 , 200

1 / 3 . 86

The data were determined by GPC measurements, b The data were determined by the
integration of 1 H-NMR signals assigned to methyl protons of quaternary ammonium cations.

− 32 −

高分子ベシクル積層膜の秩序構造とダイナミクス

一 方，PSB 組 成 比 の 低 い PCB 43 -b-PSB 100 と PCB 43 -b-

Macro-CTA を RAFT 重合で鎖延長して PSB 鎖の分子量を制御することで PCB/PSB 組成比の異なる PCB-b-PSB

PSB 40 は，会合体由来のシグナルと単分子鎖由来のシグナ

ブロック共重合体を系統的に合成した。PCB-b-PSB のルがそれぞれ観測された（Fig. 3 ⒝ , ⒞）。PSB の重合度が1

H-NMR スペクトルには，PCB の四級アンモニウムカチ

低下すると，分子鎖間で相互作用するスルホベタイン基のオンメチル基（3 . 35 ppm）と PSB の四級アンモニウムカチ

数が減少するため，会合駆動力が低下する。したがって，

オンメチル基（3 . 24 ppm）に帰属されるシグナルがそれぞ

孤立分子鎖に相当する Rh ≒ 4 nm の散乱体が発生している

れ観測され，それらの積分比より PSB 鎖の重合度を算出と 推 測 す る。 ま た，PCB と PSB の 重 合 度 が 同 等 で あ る

してPCB-b-PSBの数平均分子量を算出した（Mn, NMR）
。Mn, GPCPCB 43 -b-PSB 40 では，ブロック共重合体の分子量が小さと Mn, NMR がよく対応しており，GPC 測定で計測された分

いにもかかわらず，会合体の Rh が大きくなった。PCB 鎖

子量，分子量分布は十分に正確であると考えられる。

と PSB 鎖の体積比が均等になるとブロック共重合体凝集
体の界面曲率が低下して二分子膜状の会合体を形成する。

3. 2. PCB-b-PSB水溶液中における会合体構造の解析【分子構造依存性】

すなわち，ミセル状会合体からベシクル状会合体への構造

PCB 43 -b-PSB 166 は純水中で Rh= 40 . 5 nm の粒径分布のPSB 鎖の界面曲率が低下したために会合数が増大している

狭い均質な会合体を形成した（Fig. 3 ⒜）。ブロック共重合と解釈することもできる。ただし，Rh が小さいほど散乱体を構成する PCB 鎖と PSB 鎖は共に親水性であるが，光強度が弱いため，大部分の分子鎖は孤立鎖として存在しPSB は水中で側鎖のスルホベタイン基同士が静電的相互作ている。

転移を起こしていると考えられる。あるいは，PCB 鎖と用，あるいは双極子相互作用により凝集する。したがって，

PCB 43 -b-PSB 166，PCB 43 -b-PSB 100 は純水中でミセル状

PCB-b-PSB は PSB 鎖が凝集したコアを形成し，PCB 鎖が会合体を形成していたが，塩濃度の増加に伴い，分子鎖が水和膨潤したシェルを形成することにより，コアシェル型

会合体から脱離した（Fig. 4 ⒜ , ⒝）。PSB 側鎖のスルホベ

球状会合体を形成していると考えられる。透過型電子顕微

タイン基間相互作用が水溶液中のイオンにより阻害される

鏡による相補的な解析が必要であるが，ブロック共重合体ためであると考えられる。一方，PCB 43 -b-PSB 40 は会合が形成する高分子ベシクルは，Rh> 100 nm となることが形態の変化がみられなかった（Fig. 4 ⒞）。二分子膜状会合多いため，計測されている会合体はミセル状会合体である体は球状会合体と比較して分子鎖の狭雑によるエントロピと解釈している。

ー損失が小さいことに加え，PSB 分子鎖の分子量が低いた
めイオンによる会合阻害の影響が低かったと考えられる。

Fig. 3

Rh distributions of ⒜ PCB43-b-PSB166, ⒝ PCB43-b-PSB100, ⒞ PCB43-b-PSB40 aggregates in salt-free water.

Fig. 4 R h distributions of ⒜ PCB 43-b-PSB166, ⒝ PCB 43-b-PSB100, ⒞ PCB 43-b-PSB 40 aggregates in salt-free water（blue），
10 mM NaCl aq.（green），and 100 mM NaCl aq.（red）．

− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

3. 3. PCB-b-PSB水溶液中における会合体構造の解析【双性イオン選択的相互作用】

PSB 166 が形成する Rh= 40 . 5 nm の均質会合体の形態は，共双性イオン高分子 PCB-b-PSB は，スルホベタイン基が存するスルホベタイン（SB 4）の濃度増大に応じて不安定化，

選択的に会合することでミセル状会合体を形成する。すな

粗大化し，孤立鎖に解離した（Fig. 6）。PSB 側鎖のスルホ

わち，スルホベタイン，カルボキシベタインは双性イオン

ベタイン基と溶液中に存在する SB 4 が相互作用するため，選択的に会合し分子構造体を形成している。したがって，

スルホベタイン側鎖間の凝集が解離することで PCB-b-

この分子組織体は共存する双性イオンの構造に応じて構造

PSB の会合が阻害されたと考える（Fig. 7）。また，電荷間変化が誘導されると考えられる。

スペーサー炭素数 6 のスルホベタインが最も効果的に会合験に用いた双性イオンの構造を Fig. 5 に示す。PCB 43 -b-

純水中で最も均質な会合体を形成する PCB 43 -b-PSB 166を阻害した（Fig. 8）。電荷間距離が離れているため双極子について双性イオン特異的な会合形態変化を研究した。実モーメントが大きく，分子形態の自由度が高いことに加え，Fig. 5 Chemical structure of zwitterions employed in thisstudy.

Fig. 6 R h distributions of PCB 43-b-PSB166 in ⒜ salt-freewater（blue），⒝ 10 mM SB4 aq.（green），⒞ 100 mM SB4aq.（purple），and ⒟ 1000 mM SB4 aq.（red）．

Fig. 7 Schematic representation of PCB-b-PSB aggregate form variation through the association and dissociation ofzwitterions depending on the co-existing zwitterion species and the concentration.

Fig. 8 R h distributions of PCB 43-b-PSB166 in ⒜ salt-free water（blue），⒝ 100mM
SB2 aq.（green），⒞ 100 mM SB4 aq.（purple），and ⒟ 100 mM SB6 aq.（red）．

− 34 −

高分子ベシクル積層膜の秩序構造とダイナミクス

正電荷と負電荷が干渉しないため電荷密度が高く，電荷間（引用文献）の相互作用が強く働くためであると考える。一方，グリシ

1） Peyret, A.; Zhao, H.; Lecommandoux, S., Preparation

ン水溶液とタウリン水溶液では会合体の形態変化は誘導さ

and Properties of Asymmetric Synthetic Membranes

れなかった。グリシンとタウリンはスルホベタインと同じ

Based on Lipid and Polymer Self-Assembly. Langmuir
2018, 34, 3376-3385.

く双性イオンであるが，電荷部位の構造，電荷間距離，電荷密度についてスルホベタインとの対称性が低く，スルホ

2） Blanazs, A.; Armes, S. P.; Ryan, A. J., Self-Assembled

ベタイン基の会合が阻害されないためであると考える。すBlock Copolymer Aggregates: From Micelles to

なわち，PCB-b-PSB 会合体の形態は共存する双性イオン

Vesicles and their Biological Applications. Macromol.
Rapid Commun. 2009, 30, 267-277.

との双性イオン特異的な相互作用により大きく変化するこ

3） Cabral, H.; Miyata, K.; Osada, K.; Kataoka, K., Blockとが示された。

４．総

Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications.

括Chem. Rev. 2018, 118, 6844-6892.

合成した PCB-b-PSB 双性イオン高分子ブロック共重合

4） Shao, Q.; Jiang, S., Molecular Understanding and体は，ブロック共重合体の分子量と PCB/PSB 組成比に応Design of Zwitterionic Materials. Adv. Mater. 2014, 27,

じて水溶液中で多様な形態の会合体を形成することが明ら

15-26.

かとなった。両双性イオン高分子ブロック共重合体は，双5） Paschke, S.; Lienkamp, K., Polyzwitterions: From

性イオン高分子鎖における水溶性の非対称性と環境応答性

Surface Properties and Bioactivity Profiles toを利用した新たな会合性高分子群として位置づけられる。

Biomedical Applications. ACS Appl. Polym. Mater.
2020, 2, 129-151.

本研究の目的である固体表面に集積したブロック共重合体
会合体の秩序構造とそのダイナミクスの解明のため，固体

6） Shao, Q.; Mi, L.; Han, X.; Bai, T.; Liu, S.; Li, Y.; Jiang,

表面に吸着したブロック共重合体が形成する構造を中性子

S., Differences in Cationic and Anionic Charge Densities

8）

反射率測定 ，相互作用ポテンシャルを反射干渉顕微鏡

Dictate Zwitterionic Associations and Stimuli Responses.

9）J. Phys. Chem. B 2014, 118, 6956-6962.

により計測する実験をそれぞれ実施する予定である。今年
度は，感染症拡大による移動制限のため当初計画していた

7） Lim, J.; Matsuoka, H.; Yusa, S.; Saruwatari, Y.,

中性子反射率測定による吸着膜の構造解析，および反射干Temperature-Responsive Behavior of Double

渉顕微鏡実験を実施することができなかった。

Hydrophilic Carboxy-Sulfobetaine Block Copolymers
and Their Self -Assemblies in Water. Langmuir 2019,謝辞35, 1571-1582.

本研究の遂行にあたり，多大なるご支援を賜りました公

8） Higaki, Y.; Kobayashi, M.; Takahara, A., Hydration

益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より感謝State Variation of Polyzwitterion Brushes through

申し上げます。

Interplay with Ions. Langmuir 2020, 36, 9015-9024.

また，本研究は当研究室の清水 茜 氏の尽力によるもの

9） Higaki, Y.; Fröhlich, B.; Yamamoto, A.; Murakami, R.;

で あ り， 動 的 光 散 乱 測 定 装 置 を 用 い た 研 究 に あ た り

Kaneko, M.; Takahara, A.; Tanaka, M., Ion-Specific

一二三 恵美 教授（大分大学全学研究推進機構）にご協力いModulation of Interfacial Interaction Potentials

ただきました。この場をお借りいたしまして厚く御礼申し

between Solid Substrates and Cell-Sized Particles

上げます。

Mediated via Zwitterionic, Super-Hydrophilic Poly
（sulfobetaine）Brushes. J. Phys. Chem. B 2 0 1 7, 1 2 1,
1396-1404.

− 35 −

強紫外光が照射された部位選択的な治療を可能とする
分子システムの開発
大阪薬科大学平野智也

Methods utilizing the irradiation of light are powerful tools for various fields of scientific research, as well as in industry
and in medical application, because they enable non-invasive and spatio-temporal control. In those methods, the molecules,
whose functions such as emission of light and cleavage of covalent bonds have been utilized. Coumarin has been utilized
as a core structure of those photofunctional molecules, such as fluorescent sensors and photoremovable protecting groups.
Here, we have developed photoremovable protecting groups that could function under a specific condition, that is, a specificrange of pH or the presence of hydrogen peroxide, respectively, derived from coumarin-based fluorescent sensors. Thosegroups could potentially be utilized in photo-releasing a drug selectively around diseased tissues.

1.

緒

言

光は植物における生合成だけでなく、ヒトにおいても活性型ビタミン D の生合成などの生理機能において必須であ

２．特定の pH 領域で機能する光分解性保護基の開発
2. 1. 方法る。その一方で、過剰な光、特に紫外線の照射は活性酸素

特定の環境選択的な光分解性保護基としてまず、特定の種の産生を引きおこし、皮膚への障害、シミなどだけでな

pH 領域で機能する光分解性保護基の開発を行った。生体く、がんなどの疾患の要因にもなる。そのため、有害な量内における pH は、エンドソーム、リソソーム、ミトコンの紫外光を防ぐ、もしくは障害を予防、治癒する機能を持ドリアなどの細胞内小器官ごとに異なるだけでなく、がん

つ分子は有用となる。一方、光分解性保護基とは、特定の組織近傍においては弱酸性になるなど、細胞、組織の状態

波長の光照射により共有結合の切断がおこる分子団である。

に応じても変化する。そのため、特定の pH 選択的に機能

光分解性保護基を cAMP、グルタミン酸などの生理活性分する光分解性保護基は、生理機能解析および、図 1 に示す子に導入した分子は Caged 化合物と呼ばれる。Caged 化合

分子システムの構築に有用となる。

物は任意の部位、タイミングでの光照射によって、生理活

図 2 に示す Bhc は、光分解性保護基として汎用されてい性分子を生成させることを可能とするため、様々な生物学る分子団である。我々はこれまで、Bhc の母核であるクマ研究において用いられてきた。本研究では、こうした光分

リン骨格を持つ、様々な蛍光センサーを開発してきた 1）。

解性保護基の光分解反応を制御することにより、弱酸性やその結果、pH の変化に伴い、蛍光強度が OFF-ON-OFF

活性酸素種存在下などの特定の環境選択的に機能する光分と変化する蛍光センサー 1 などを開発した 2 , 3）。pH の変化

解性保護基の開発を行った。開発した光分解性保護基を、に伴い、蛍光強度が OFF-ON と変化する蛍光センサーは生理活性、治療効果がある分子と組み合わせた Caged 化

これまで数多く開発され、様々な生理機能解析に応用され合物は、疾患組織選択的に活性分子を光放出する分子シスてきた。その一方で、OFF-ON 型のセンサーは、例えば

テムとなる（図 1）。例えば、強紫外光によって活性酸素がpH 6 以下の環境を検出することはできるものの、pH がさ生成している部位選択的に機能する光分解性保護基は、光らに低下した環境とを識別することができない。一方、1による障害がおきている部位選択的な治療、保護を可能となどの OFF-ON-OFF 型の変化を示し、特定の pH 領域をする分子システムになりえる。

検出する蛍光センサーはこうした問題を解決した有用なセンサーとなりえる。我々は、センサーの機能を光分解性保護基に付与することができれば、特定の pH 領域で機能する光分解性保護基になりえると考えた。具体的には図 2 に示すように、センサー 1 と Bhc の構造要素を組み合わせたDevelopment of molecular system forthe treatment of the area irradiated bystrong ultraviolet light
Tomoya Hirano

化合物群 2 をデザインした。これらの化合物を合成し、pH を変化させた際の光分解反応効率を HPLC により解析した。

Osaka University of Pharmaceutical
Sciences− 36 −

強紫外光が照射された部位選択的な治療を可能とする分子システムの開発

図１

図2

本研究で開発を目指す分子システムの概要

特定の pH 領域選択的に機能する光分解性保護基のデザイン

2. 2. 結果と考察が進行すると考えられる。また、モノアニオン型が存在す

合成した 2 の機能を解析した結果、いくつかの化合物にる pH は、二つの水酸基の pKa を変化させるハロゲン原子

お い て、pH が 増 大 す る の に 伴 い、 光 分 解 反 応 効 率 がによって調整される。すなわち、2 a では pH 9、2 e では

OFF-ON-OFF と変化することが明らかとなった 。例えpH 6 と、光分解反応がおこる pH が変化したと考えられる。

ば、2 a は pH 3、pH 6 で は 光 分 解 反 応 が お こ ら な い が、開発した光分解性保護基の中でも 2 e は、pH 6 というがん

pH 9 では反応が進行し、pH 12 では進行しない（図 3）。さ組織近傍で見られる環境で光分解反応がおこるため、がん

らに光分解反応がおこる pH は、導入したハロゲン原子の選択的に治療薬を光放出する分子システムに応用できると数、位置に応じて変化することも明らかとなった。すなわ

考えられる。

4）

ち、2 つの塩素原子と 1 個の臭素原子を有する 2 e では、
pH 3 では光分解反応がおこらないが、pH 6 では進行し、pH 9 ではおこらなかった。図 2 に示すように蛍光センサ
ー 1 の蛍光強度変化は、二つの水酸基の脱プロトン化によ３．活性酸素種存在下で機能する光分解性保護基の開発
3. 1. 方法

る制御される。すなわち、7 位の水酸基が脱プロトン化さ活性酸素種は、生体に対して障害を与える因子としてだ

れたモノアニオン型で強い蛍光を持つが、6 位に導入したけでなく、生体内でのシグナル伝達分子として機能するな

フェノール性水酸基も脱プロトン化され、ジアニオン型とど多様な作用を持つ。そのため、活性酸素種存在下で機能なると蛍光を失う。化合物群 2 においても同様の脱プロト

する光分解性保護基は、生理作用解析のみならず、図 1 にン化がおこり、モノアニオン型となったときに光分解反応示したような、活性酸素が関与する疾患の治療、保護に有− 37 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図3

図4

化合物 2 の機能解析

過酸化水素存在下で機能する光分解性保護基のデザイン

用な分子システムに用いることができる。我々は、活性酸

その機能を解析した。

素種の中でも過酸化水素に着目し、2 節で述べた研究と同様の戦略、すなわち蛍光センサーと Bhc の構造要素を組み

3. 2. 結果と考察合わせることによって、過酸化水素存在下で機能する光分

種々の活性酸素存在下における、化合物 4 の光分解反応

解性保護基の開発を行った。これまでに報告されている過効率を解析した結果を図 5 に示す。検討した活性酸素種の酸化水素を検出する蛍光センサーにおいては、ボロン酸ピ

中で、過酸化水素存在下において、水酸基への構造変化とナコールエステルが過酸化水素により水酸基へと変換され光分解反応によって生成する化合物 6 が、最も高収率で得る反応が利用されている。我々は本反応をクマリン骨格にられた。選択性において改善の余地があるものの、化合物

応用することにより、過酸化水素を検出する蛍光センサー

4 は過酸化水素存在下で機能する光分解性保護基になりえ3 を開発していた（図 4）。そこで、この蛍光センサーと光ることが明らかとなった。

分解性保護基の構造要素を組み合わせた化合物 4 を合成し、− 38 −

強紫外光が照射された部位選択的な治療を可能とする分子システムの開発

図5

４．総

化合物 4 の機能解析

versatile scaffolds for fluorescent sensors. New J Chem

括

39: 8389-8396, 2015

本研究により我々は、蛍光センサーの構造とクマリン骨2） Shiraishi T, Saito T, Kagechika H, Hirano T:

格を基に、特定の pH 領域または過酸化水素存在下で機能

Development of a novel fluorescent sensor to detect aする光分解性保護基の開発に成功した。蛍光センサーの開specific range of pH. Tetrahedron Lett 55: 6784-6786,

発は現在、世界中で爆発的に進行しており、多種、多様の2014

センサーが報告されている。本研究の戦略にこうしたセン

3） Hirano T, Noji Y, Shiraishi T, Ishigami-Yuasa M,

サーを用いることによって、個々の疾患特有の環境選択的

Kagechika H: Development of an ‘OFF-ON-OFF’に機能する光分解性保護基の開発は可能になると考えられfluorescent pH sensor suitable for the study ofる。こうした研究成果は、光を利用した治療、予防を行う

intracellular pH. Tetrahedron 72: 4925-4930, 2016
4） Kato D, Shiraishi T, Kagechika H, Hirano T:

ための新たな分子システム開発の基盤となる。

6-Arylcoumarin as a Scaffold of Photofunctional（引用文献）

Molecules with OFF-ON-OFF Type Regulation. J Org

1） Shiraishi T, Kagechika H, Hirano T: 6-Arylcoumarins:− 39 −

Chem 86: 2264-2270, 2021

化粧品原料微粒子の液中での分散・凝集状態評価技術の開発
法政大学生命科学部

森隆昌

It is important to characterize and control the particles dispersion state in slurries in order to obtain the productswith desirable properties. Thus, the particles dispersion state in various aqueous slurries were investigated by using thehydrostatic pressure measurement and the osmotic pressure measurement. The particles dispersion state in slurries werechanged by adding a dispersant or controlling the slurry pH value. For the hydrostatic pressure measurement, the particle
dispersion state of not only spherical particles but also irregular shaped particles such as platy ZrO 2 , could be successfully
evaluated. It was shown that the packing fraction of green body had a good connection not to the apparent viscosity and the
median diameter of particle size distribution, but to the settling time determined by hydrostatic pressure measurement. For
the osmotic pressure measurement, it was demonstrated that the amount of coarse particle that simulated the aggregates in
the nano particle slurry could be estimated from the osmotic pressure change. It was also found that the nano composite withrelatively homogeneous microstructure could be obtained from the well-dispersed nano particles slurry which displayed
relatively large osmotic pressure.

1.

緒は、我々の独自技術である沈降静水圧測定法 1）
（すでに商

言

品化し、現在㈱JHGSよりHYSTAPという商品名で販売中）

化粧品製造分野において、原料粒子の液中での分散・凝を、ナノ粒子の分散状態評価では、やはり我々の独自技術

集状態は、製品の性能を決定づける重要な因子であり、製である浸透圧測定法 2）（特許第 5723735 号）を用いて、それ品の更なる高性能化のためには、これまで以上に高度に制ぞれを化粧品原料微粒子（不規則形状粒子及びナノ粒子）に御しなければならない。例えば、光学特性に優れる板状粒

適した形に最適化し、評価技術・装置を確立する。スラリ

子や、一次粒子径が 100 nm 以下のいわゆるナノ粒子が用ーの様々な「圧力」に注目することで、既存の評価方法よりいられているが、これらは粒子が分散している状態で使用も的確に分散状態が評価できることを示す。

されることではじめて優れた特性を発揮することができる。

２．方

液中での粒子の分散状態を高度に制御するためには、まず、液中での粒子の分散状態を的確に評価できなければならな法

2. 1. 不規則形状粒子スラリーの沈降静水圧測定

い。さらに、最終製品がスラリーではなく、スラリーを成

試料粉体は長さ 1 µm に対して 0 . 3 µm 程度の厚みを持つ

形して製品を得る場合においては、スラリーの充填性を合

六角板状の酸化亜鉛（堺化学工業株式会社、XZ- 1000）をわせて評価できることが求められる。最適な分散剤や表面用いた。粒子の等電点は pH 9 . 8、粒子密度は 5 . 6 g・cm- 3

修飾剤の決定、添加量の決定などはいずれも的確な粒子分である。

散状態・充填性の評価がなければ、本当の意味で最適条件を決定できたことにならないからである。

まず ZnO が粒子体積濃度 20 vol% となるように ZnO、分散剤（ポリカルボン酸アンモニウム、以下 PCA と略記）、

そこで本研究では、化粧品原料微粒子の液中での分散・イオン交換水を混合し、1 h ボールミル処理した。PCA 添

凝集状態を的確に評価できる技術及びそれを実現する装置

加量は 0 . 48，0 . 50，0 . 55，0 . 60，0 . 70 mg・g- 1 ZnO とした。

を開発する。化粧品原料微粒子の中でも特に評価が難しい、

その後スラリーを分離回収し、5 min 真空脱泡を行ったも⑴ 不規則形状粒子のを試験用スラリーとした。

⑵ ナノ粒子試験用スラリーは、沈降静水圧測定、見かけ粘度測定、の液中での分散・凝集状態を的確に評価できる技術及び装粒子径分布測定（レーザー回折散乱法、X 線透過型）で評価

置の開発を目指す。まず不規則形状粒子の分散状態評価でした。沈降静水圧測定は図 1 に示すように、粒子の沈降に伴う静水圧減少速度を測定するもので、静水圧の減少速度の大小から粒子の分散状態が評価できる。粘度測定はコー

Development of evaluation technique ofparticles dispersion and aggregation
state in liquid for cosmetic powders
Takamasa Mori
Faculty of Bioscience a nd Applied
Chemistry, Hosei University

ンプレート型レオメーターで見かけ粘度を測定した。粒子
径分布測定ではスラリーを希釈し、異なる原理の評価装置
でそれぞれ粒子径分布を測定した。さらに調製した試験用スラリーを石膏板上に置いた樹脂製の型に流し込み成形し、成形体充填率をアルキメデス法で求めた。

− 40 −

化粧品原料微粒子の液中での分散・凝集状態評価技術の開発

図１

沈降静水圧測定の原理

2. 2. ナノ粒子スラリーの浸透圧測定
ZrO 2 ナノ粒子スラリー（ZR- 30 BFN、日産化学工業、粒子径 15 nm）に凝集体に見立てた ZrO 2 粗大粒子（SPZ、第一稀元素化学工業、粒子径 1 . 5 ~ 2 . 5 µm）を添加後、スラリー中の総 ZrO 2 濃度が 7 vol% になるまでイオン交換水で添加し、超音波バスで 10 分間分散処理した。粗大粒子の割合はナノ粒子スラリー中に含まれる ZrO 2 粒子に対し、質量割合で 99：1 〜 50：50 とした。

図2

図 2 に浸透圧測定装置の概要を示す。スラリーと分散媒

ナノ粒子スラリーの浸透圧測定装置概要

を 隔 て る 半 透 膜 と し て、 限 外 濾 過 膜（PLHK 04710、Merck、分画分子量 100000）を用いた。まずはじめに、分を 80 ℃でさらに 12 h 静置した。

散媒室にスラリーと同じ pH の NaOH 水溶液を注入し、バ作製したナノコンポジットの粒子配列微構造を、走査型

ルブを閉め、密閉した。その後、スラリー室にスラリーを

電子顕微鏡（SU 8020、日立ハイテクノロジーズ）を用いて注入し、分散媒室に接続した圧力センサーで浸透圧を 15観察した。

時間測定した。さらに、スラリー中粒子の粒子径分布を動３．結果及び考察

的光散乱式粒径分布測定装置（堀場製作所、LB- 550）を用

3. 1. 不規則形状粒子スラリーの沈降静水圧測定結果

いて測定した。
またナノ粒子スラリーの浸透圧測定結果の有効性を検証

図 3 に PCA 添加量に対する成形体充填率を示す。PCAするために、ナノコンポジットの微構造と浸透圧の関係をの添加量が増加するとともに PCA 吸着量が増加し、PCA調査した。SiO 2 ナノ粒子スラリー（ST- 40、日産化学工業、の立体障害及び静電反発力が大きくなったため、PCA 添

15 vol%、粒子径 10 - 15 nm、pH 10 . 1）に HCl、NaOH を添加量とともに成形体充填率が向上したと考えられる。

加することで pH 調整を行い、分散・凝集状態を変化させた。

図 4 に見かけ粘度と成形体充填率の関係を示す。従来、調製したスラリーの浸透圧を測定するとともに、以下の手

見かけ粘度は粒子分散の指標とされており、粒子が分散す順でナノコンポジットを作製した。アクリレート系ラテッ

るほど見かけ粘度は低下し、成形体充填率は向上すると言クススラリー（LX 857 X 2、日本ゼオン、粒子径 200 nm）

われてきたが、この粒子に関してはそのような関係は見らの pH をナノ粒子スラリーと同一に調整した後、アクリレ

れない。成形プロセスはスラリーの濃縮・乾燥過程であるート系ラテックススラリーに SiO 2 ナノ粒子スラリーを 5ため、粒子濃度一定条件で評価する見かけ粘度では結果がwt% の割合で添加し、400 rpm 撹拌下で 10 min 混合した。

一致しないと考えられる。

混合したスラリーをテフロン製シャーレに膜厚 500 µm に

図 5、6 に粒子径分布測定結果から得られたメジアン径なる量だけ滴下し、室温で 24 h 乾燥させた。得られた膜と成形体充填率の関係を示す。粒子が凝集しているスラリ− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図3

PCA 添加量に対する成形体充填率の変化

図5

メジアン径（レーザー回折）と成形体充填率

図4

スラリーの見かけ粘度と成形体充填率の関係

図6

メジアン径
（X 線透過）と成形体充填率ーほどメジアン径は大きくなるため、メジアン径が小さいいが現れたと考えられる。さらに、レーザー回折散乱式のスラリーの方が成形体充填率は大きくなると考えられる。

粒子径分布測定装置の場合（図 5）は、粒子形状が不規則な図を見ると概ね粒子径が大きくなると成形体充填率が低下場合は測定結果の再現性に影響が出るため、今回のようなしていると見ることはできるが、精度はそれほど高いとは不規則形状粒子の場合は特に評価が難しいと考えられる。

言えない。これは濃厚系スラリーの場合、既存の粒子径分

図 7 に沈降静水圧測定の結果得られた沈降終了時間と成布測定装置で粒子径分布を測定するためには相当に希釈し形体充填率の関係を示す。同一原料の場合、粒子が分散しなければならないことに原因があると考えられる。希釈操ているほど沈降終了までの時間は長くなる。さらに沈降試作によって凝集体がほぐれること、希釈後は粒子間距離が験では、粒子濃度が見かけ上増加していく濃縮過程である

広がるため粒子の衝突頻度が低下し凝集しにくいことから、ため、濃縮過程における粒子分散の違いを評価することが全体的にメジアン径は小さくなる方にシフトすることが懸でき、これはすなわちスラリーの充填性を評価しているこ

念され、その結果、希釈前のスラリーでは粒子分散状態にとに相当する。図からわかるように沈降終了までの時間が差があっても、粒子径分布にその差が現れない場合がある

長い充填性の良いスラリーほど成形体充填率が大きくなっと考えられる。特にレーザー回折では X 線透過に比べさらていることがわかり、沈降静水圧測定が最も成形体充填率に希釈を必要とするため希釈による分散の影響が大きく、を的確に予測できることが示された。スラリー原料から成メジアン径がほぼ等しいスラリーでも成形体充填率には違

形により製品を得るプロセスでは、これまでのような粒子− 42 −

化粧品原料微粒子の液中での分散・凝集状態評価技術の開発

図7

図9

静水圧が Pmin に達する時間と成形体充填率の関係

図8

粗大粒子割合が浸透圧に及ぼす影響

CS 式による浸透圧に及ぼす粒子体積分率の影響の推算

図 10 粗大粒子割合が DLS で測定したメジアン径に及ぼす影響

分散性の評価のみを行ってスラリー最適条件を決定するの

図 9 に Carnahan-Starling の式の粒子体積分率が浸透圧ではなく、スラリーの充填性（濃縮過程における粒子分散に及ぼす影響を示したが、粒子濃度が高い領域では、わず状態の変化）を評価した上で最適条件を決定することが良かな粒子濃度の差で浸透圧が大きく変化することが見て取いことが示唆された。

れる。今回のスラリーはいずれも粒子体積濃度が同じではあるが、浸透圧には明確な違いが見られた。これはスラリ

3. 2. ナノ粒子スラリーの浸透圧測定

ーに含まれている粗大粒子は沈降速度が大きく、測定中に

図 8 に粗大粒子割合別の浸透圧測定結果を示す。これよ

底部に堆積していることから、浸透圧の発現には寄与してり、粗大粒子の割合が増加するとともに浸透圧測定値が減いないことが原因であると考えられる。よって、沈降・堆少した。

積する粗大粒子の割合が大きいほど浸透圧は低くなったと

粒子分散系の浸透圧は完全にモデル化されてはいないが、浸透圧に及ぼす粒子濃度の影響は、例えば以下のCarnahan3）Starling の式 に表されるように、粒子濃度の影響を大き考えられる。したがって、スラリーの浸透圧測定によって、スラリー中に含まれる少量の粗大粒子・凝集粒子を検出できることが示唆された。
図 10 には動的光散乱により測定した粒子径分布のメジく受ける。

アン径を示す。全体的に粒子径分布は原料の粒子径よりも、粗大粒子の粒子径に強く影響を受けていることがわかる。

− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図 11

DLS で測定したメジアン径と浸透圧の関係

図 13

図 12

ナノコンポジットの外観

ナノコンポジットの微構造観察結果したがって、動的光散乱でもスラリー中の粗大粒子割合のSiO 2 とアクリレート系ラテックスの混合スラリーによ違い、すなわち、凝集の程度の違いを評価できるものと考って作製されたナノ複合材料膜の写真を図 12 に示す。種々えられるが、粒子径が極端に大きい粒子があるとそれに隠のスラリー評価により、原料となるナノ粒子スラリーの分れて、大部分の粒子径が小さい粒子の情報が得られないこ

散状態は条件によって異なることが明らかになった一方で、とが懸念される。今後、粒子分散系の浸透圧のモデルにつ作製されたナノコンポジットの外観には大きな違いは見らいて検討し、粒子径分布を求めることで、ナノ粒子から粗れなかった。

大粒子までを含んだ全体の粒子径分布の推定ができるようにすることが重要であると考える。

pH の異なる SiO 2 スラリーを用いて作製されたナノコン
ポジットの粒子配列微構造 SEM 像を図 13 に示す。SEM

pH の異なる SiO 2 スラリーの浸透圧と DLS によって測定

画像中の黒い円がラテックス粒子で、色の薄い箇所がそこされたメジアン径の関係を図 11 に示す。浸透圧が高いほに充填されたナノ粒子である。浸透圧測定値が最も高い、

ど DLS で測定されたメジアン径は小さいことから 2 つのすなわち最も粒子が分散している pH 10 の条件において、評価には良い相関があった。

最も均質に粒子が配列している様子が確認された。

− 44 −

化粧品原料微粒子の液中での分散・凝集状態評価技術の開発

５．総括

スラリー中の粒子分散状態、特に評価が難しい不規則形状粒子とナノ粒子の分散状態評価について検討した。不規則形状粒子のスラリーにおいては、球形もしくはそれに近い粒子と同様に沈降静水圧を測定し、その減少速度から粒子の分散状態並びに濃縮に伴う粒子分散状態の変化（充填性）を評価することができた。ナノ粒子スラリーについて
は、スラリーの浸透圧測定から粒子分散状態を評価することができた。今後は、これらの粒子を利用した製品特性とスラリー中の粒子分散状態、充填性との関係を明らかにしていくことで、実プロセスにおけるスラリー評価の有用性を実証していく。
図 14

ゼータ電位の pH 依存性（引用文献）
1） T. Mori, K. Kuno, M. Ito, J. Tsubaki, T. Sakurai,“Slurry Characterization by Hydrostatic Pressure
Measurement ‒Analysis Based on Apparent Weight

ナノコンポジット作製に用いたラテックス粒子及び SiO 2粒子のゼータ電位を図 14 に示す。この結果から本実験でFlux Ratio‒” Adv. Powder Technol., 1 7（3）, 3 1 9-3 3 2

用いた 2 種の粒子は全ての実験条件において負に帯電して（2006）

いることがわかった。このことから、本実験の条件におい

2） T. Mori, H. Nagashima, Y. Ito, Y. Era, J. Tsubaki,ては異種粒子間の凝集の影響は小さく、ナノ粒子の分散・Agglomeration of Fine Particles in Water Upon

凝集状態がナノ複合材料の粒子配列微構造に影響を及ぼし

Application of DC Electric Field, Miner. Eng., 133, 119-たと考えられる。

126（2019）− 45 −

エマルション重合過程におけるミクロ生体高分子ゲルの粘弾性測定法の開発
東京大学大学院総合文化研究科先進科学研究機構

柳澤

実穂

Although biopolymer microgels are used in a variety of applications, their viscoelastic properties have been difficult todetermine due to their difficulty in analysis. In this study, the surface viscoelasticity of gelatin microgels prepared in lipid
droplets were investigated using cyclic micropipette aspiration. It was found that the gelatin gel gelled inside the small
droplets with a radius of about 50 μm or less covered with a lipid membrane was about 10 times harder than the bulk gel.
By changing the aspiration pressure cyclically, we also evaluated their storage modulus E’ (reflecting elasticity) and loss
modulus E’’ (reflecting viscosity). Then, the microgels have a smaller E’’/E’ ratio than the corresponding bulk gels, meaning
the microgels have a distinct nanostructure from bulk gels. Nanostructure analysis showed that small microgels contained
more beta sheets in their structures than bulk gels. Our findings indicate that the confinement of gelling polymers in lipid
membranes contributes to the variation in viscoelasticity of protein-based microgels through changes in secondary structure.

1.

緒

約 50 µm 以下のミクロゲルは、従来のバルクゲルよりも約

言10 倍ゲル弾性が高くなること、従来知られてきたナノ構

コラーゲンから得られるタンパク質由来のゼラチンや海造であるヘリックス構造だけでなく、ベーターシート構造

藻から得られる多糖類由来のアガロースなど、多くの生体も多く含まれることを見出した 1）。これらのサイズ依存性

高分子ゲルはその優れた生体親和性や生分解性により、化から、エマルション重合によりゼラチン・ゲルにベーター

粧品や医薬品、食品などの材料として活用されている。特シートが形成され、それが新たな架橋点となることでゲルに油中液滴（エマルション）中でのゲル化（エマルション重弾性が上昇したと考えられる。しかし、なぜエマルション

合法）により得られる 1 ミリメートル以下の小さなミクロ

重合がゼラチン・ミクロゲルのナノ構造変化とゲル弾性上

ゲルは、その大きな表面積・体積比により、周囲の環境変昇を招いたのかは不明である。そこで本申請研究では、こ化にすばやく応答し、例えば体積変化に応じてゲル中に内の問いに対し（i）膜界面効果として考えられる膜の電気的包した薬物を放出する医薬用カプセルなど、高度な機能性

特性や界面に働くラプラス圧とヤング率の相関関係を解析

材料として注目されている。こうしたミクロゲルの基本的すること、（ii）そしてナノ構造をより強く反映する粘弾性

機能は、そのナノ構造と粘弾性特性に依存しているが、ミを１つのミクロゲルに対して測定する手法を開発し、そのクロゲル分散液としての解析が進む一方、実際に機能を担解析からナノ構造変化の要因へ迫ることを目的とした。

うミクロゲル単体に対しては未解明な点が多い。

２．方

エマルション重合により形成されるミクロゲルは、重合時に常にゲル化高分子が膜界面と接しており、界面物性が法

2. 1. エマルション界面の影響評価

ミクロゲルの構造や物性へ影響することが予想される。生

エマルション重合過程における膜界面効果として、膜物

体高分子ゲルでは、ゲル構造がタンパク質の 2 次構造であ性特性と膜によるミクロ空間閉じ込めに伴うラプラス圧、るヘリックス構造やベーターシート構造であることから、膜との直接的接着による影響をそれぞれ個別に評価するた

膜界面の電荷などを含む物性がそれら 2 次構造転移を変化

め、膜物性と油水界面に生じる界面張力が異なる 2 種のリさせる可能性が高い。実際に筆者らは、生体高分子ゲルとン脂質：1 , 2 -dioleoyl-sn-glycero- 3 -phosphocholine（DOPC）、

してゼラチンを用い、リン脂質からなるエマルション中で

1 , 2 -Dioleoyl-sn-glycero- 3 -phosphoethanolamine

ゲル化させて得られるミクロゲルに対し、表面弾性（ヤン（DOPE）、界面活性剤：Span 80 を用いてゼラチン・ミク

グ率）の測定とナノ構造解析を行った。その結果、半径がロゲルを作製した。膜表面電荷は基本的に全て負に帯電しており、その大きさは DOPC < DOPE < Span 80 の順でViscoelastic analysis of biopolymer
m icrogel prepa red f rom emu lsion
polymerization
Miho Yanagisawa
Komaba Institute for Science, Graduate
S chool of A r ts a nd S ciences , The
University of Tokyo

あることが知られている。また、界面張力の大きさは、DOPC < Span 80 < DOPE << 活性剤無しの順で大きくなる。ゼラチン・ミクロゲルは、これらのリン脂質や界面活性剤を溶解したミネラルオイルと高温（約 60 ℃）のゼラチ
ン溶液を攪拌してエマルション化し、その後ゲル化温度（30 ℃）以下に冷却することで作製した。さらに、ゲル化− 46 −

エマルション重合過程におけるミクロ生体高分子ゲルの粘弾性測定法の開発

しない高分子であるポリエチレングリコール（PEG）とゼラチンからなる 2 成分混合溶液を、均一相状態でエマルショ
ン化し、部分濡れ型の相分離パターン形成後にゲル化させることで、膜接触有りと膜接触無しの異なる 2 面を持つヤ
ヌス型のミクロゲルを作製できる 2）。これより、ゲル化時に同じ DOPC 膜で覆われたミクロ空間へ閉じ込められているが、膜接着している部分と膜接着していない部分を有するミクロゲルが形成できる。このそれぞれの部分に対してヤング率とナノ構造を解析すれば、膜への直接的接触と膜によるミクロ空間閉じ込めのどちらが弾性率上昇やナノ構造転移へ影響をもたらしているのかを導くことができる。

2. 2. ベーターシートの蛍光可視化
ミクロゲル中に形成されたベーターシート構造を可視化

図 1 ミクロゲルの周期的吸引による表面粘弾性測定（上）と、吸引に伴うキャピラリー内への変形長さ L と吸引圧 P の時
間変化（下）を示す模式図するため、ベーターシートに富むアミロイド構造の蛍光観察に使用される Thioflavin T（ThT）
をゲル化前のゼラチン溶液に添加し、温度をゲル化温度以下に冷却した後での蛍光強度変化を、共焦点レーザー顕微鏡（FV 1200 , オリンパス）
にて観察した 1）。

2. 3. ミクロゲル表面の粘弾性測定
ミクロゲルの表面弾性（ヤング率）
は、ゲル表面をガラス
キャピラリーにより微小吸引し、吸引圧 P と吸引長さ L の比例関係から求めた 1）。本研究ではさらに、ゲル化過程で膜に接していた部分と接していなかった部分の異なる２面

図 2 球形ミクロゲルを覆う膜の負帯電度とゲル表面のヤング率の相関関係を備えたミクロゲルに対し、局所的なヤング率を測定することで、膜への直接的接触がヤング率へ及ぼす影響を導く 3）。
さらに、キャピラリーの吸引圧 P をサインカーブのように周期的に変化させることで粘弾性を評価するシステムを構築した（図 1）4）。吸引圧力と変形長さの時間変化に対して、その振幅と、圧力と変形の間の遅延に該当する位相差 δ を用いて、貯蔵弾性率 E’、損失弾性率 E’’ を求めることで粘弾性を評価する。これにより、ミクロゲルの弾性が支配的であったとしても、微小変形に伴うミクロゲル表面の粘弾

図 3 非球形のゼラチン・ミクロゲルにおける局所的なヤング率（Ave. ± SE.）
。凸面（脂質膜接触有り）と凹面（脂質膜接触無し）
でのヤング率の違い。N はゲル数。

性を評価できるようになる。
（DOPC < DOPE < Span 80 の順）、ヤング率が大きくな

３．結果と考察ることが分かった（図 2）。負に帯電する界面活性剤をゲル⒤ 膜界面の効果

化する生体高分子に添加すると、ヘリックス形成が阻害さはじめに、異なる脂質や界面活性剤を用いて半径が 50れることが報告されており 5）、我々の実験においても、負µm 以下の球形のゼラチン・ミクロゲルを作製し、その表帯電した膜がヘリックス形成を阻害し、逆にベーターシー

面のヤング率と膜物性の相関関係を調べた。エマルション

ト形成を促進したためにヤング率が上昇した起源と考えら重合過程では、膜界面に働く張力の大きさに比例するラプれる。

ラス圧による影響を受ける。そこで、膜界面張力値の異な

つぎに、直接的な膜接触が表面ゲル弾性へ与える影響をる 4 つの系（DOPC < Span 80 < DOPE << 活性剤無し）に導くため、膜接触有りと無しのそれぞれの面に対して弾性

対して、ヤング率を比較したところ、系統的な違いは見ら測定を行った（図 3）。その結果、接触有りの面が接触無しれなかった。次にエマルションを覆う膜の電気物性との相の面よりも高弾性となったものの、バルクゲルの弾性（5関関係を調べた。その結果、帯電の度合が増すにつれてkPa）と比べると共に遥かに高弾性であった 3）。このことは、− 47 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

膜接触がゲル弾性を高めるが、ミクロ閉じ込めによりその効果が内部まで到達すると解釈できる 2）。さらに、この相分離したミクロゲルに対して ThT を添加したところ、ゲル化に伴いミクロゲルの中央まで蛍光強度が均一に上昇した（図 4）。この結果は、膜の負電荷により形成が誘起されるベーターシート構造が、膜近傍だけでなく、ミクロゲルの内部まで生じることを意味している。
図4

相分離ミクロゲルの ThT 蛍光画像

ⅱ ミクロゲルの粘弾性特性
次に、キャピラリー吸引の圧力を周期的に変化させることで、弾性を反映する貯蔵弾性率 E ’ と粘性を反映する損失弾性率E ’’の相関を調べた。バルクゲルでは、
粘弾性比E ’’
/E’ はゼラチン濃度によらず、また低周波数領域（ f < 0 . 1
Hz）で は ほ ぼ 一 定 と な る（ 図 5）
。 そ こ で、 周 波 数 を f =0 . 01 Hz に固定して、ミクロゲルとバルクゲルに対して、粘弾性比率を測定し比較した（図 6）。その結果、ミクロゲ
ルの方が小さな E ’’ /E’ 値をもつことが分かった 6）。この値の違いは、ゼラチン濃度では説明できないことから、ミクロゲルがバルクゲルとは異なるナノ構造を持つことを支持

図 5 バルクサイズのゼラチン・ゲルにおける粘弾性比（E’’/E’）と周波数 f の関係する。ミクロゲルでは、トリプルヘリックスだけでなく、多量のベーターシートも形成されていることから、従来の未反応なランダムコイル部位がベーターシートへ転移する
ことで粘性が低下し、E ’’/E’値が減少したと考えられる。

５．総括

本申請研究では、エマルション重合によりナノ構造とヤング率が上昇するゼラチン・ミクロゲルに対し、その理由
を膜物性と膜接着、ラプラス圧による膜界面効果の評価と、ゲル表面の粘弾性測定から迫ることを目的とした。その結果、膜の負帯電と膜によるミクロ閉じ込めがゲル弾性上昇

図 6 周波数 f = 0.01Hz の 5.0 wt% ゼラチンのバルクゲルとミクロゲルに対する粘弾性比（E ’’/E ’）の比較を生むこと、ランダムコイルがベーターシートへ転移することで従来のバルクゲルとは異なる粘弾性比を持つことが

2） M. Yanagisawa, S. Nigorikawa, T. Sakaue, K.

明らかとなった。この知見は、ゼラチン・ゲルに限定されFujiwara, M. Tokita, PNAS, 111, 15894-15899（2014）

ず、他の生体高分子ゲルに対しても成り立つことが期待さ

3） Sakai, N. Hiro-oka, S. Sasaki, S. Kidoaki, M.

れる。また、本研究により構築したキャピラリー吸引によYanagisawa, Nihon Reoroji Gakk., 47, 55-59,（2019）．

る粘弾性評価は、その他のミクロ材料の力学評価として役

4） 特願 2020-15270, 柳澤実穂 , 酒井淳 ,「粘弾性測定方法

立っており

7 , 8）および粘弾性測定装置」、今後は同様のサイズを持つ生細胞などの力学的評価にも応用可能であることを実証していきたい。

5） R. Wustneck, E. Buder, R. Wetzel, H. Hermel,
Cholloid Polym. Sci., 267, 429-433（1989）．

謝辞6） A. Sakai, A. Sakai, Y. Murayama, M. Yanagisawa,
Langmuir, 36: 5186-5191（2020）．

本研究にご支援をいただきました公益財団法人コーセー

7） Y. Kurashina, M. Tsuchiya, A. Sakai, T. Maeda, Y.

コスメトロジー研究財団に深くお礼申し上げます。

Jung Heo, F. Rossi, N. Choi, M. Yanagisawa, H. Onoe,（引用文献）

Appl. Mater. Today, 21, 100937（2021）．

1） A. Sakai, Y. Murayama, K. Fujiwara, T. Fujisawa, S.

8） S. Hayasaki, M. Shimizu, Y. Katsurada, A. Sakai, M.

Sasaki, S. Kidoaki, and Miho Yanagisawa, ACS Cent.

Yanagisawa, Y. Atomi, T. Watanabe, J. Fiber Sci.

Sci., 4, 477-483（2019）．

Technol., 76: 288-295（2020）．

− 48 −

モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究
広島大学大学院医系科学研究科薬学分野

山野喜In Europe, animal testing on cosmetics has been banned without exception since 2013, and globally, animal testingtends to be avoided. The international trend of conducting animal experiments based on the concept of the 3Rs (Reduction,
Replacement, Refinement) is becoming more and more established, and when conducting animal experiments, it is required
to use animal species with as little or no sensation as possible. Meanwhile, in the process of searching for new cosmetic raw
material candidates, it is desirable to discover more effective and safer ones at an early stage.
In this study, we used zebrafish, a well-known vertebrate model organism, to search for new cosmetic materials fromnatural resources and to verify the usefulness of zebrafish as a method for evaluating new cosmetic material candidates. Zebrafish from the embryonic stage to just after hatching were used to screen for natural resource samples that inhibit melaninpigment production in zebrafish, and a total of five compounds were isolated from two microbial culture extracts. Of these,
compounds S2 and F1 effectively inhibited melanin pigment production in zebrafish without any obvious toxicity. For the
purpose of comparison, a search study was performed from plant extracts that show tyrosinase inhibitory activity in vitro but
not melanin pigment inhibitory activity in zebrafish. As a result, 20 compounds were isolated, three of which were new compounds. None of the obtained compounds showed melanin pigment inhibitory activity in zebrafish, and some of them showedhatching inhibitory activity. These results suggest that the search for melanin production inhibitors using zebrafish is a usefulapproach for early evaluation of the efficacy and potential toxicity of candidate materials for cosmetics to the living body.

1．緒としてのゼブラフィッシュを用いた研究開発手法の有用性

言の検証を行った。

EU では 2013 年から化粧品開発における動物実験が全ゼブラフィッシュは体長 4 ~ 5 cm 程度のインド原産の小面禁止となり、世界的にも同様に動物実験は忌避されるよ型熱帯魚で、コイ科コイ目に属し、金魚やコイに近い種でうになってきている。毒性試験や研究開発において必要なある（Fig. 1）。丈夫で飼育、繁殖が容易であり、一つの水動物実験に関しても “動物実験の 3 R（Reduction（削減）、槽で多数飼育ができ、多産で、卵が透明であることからそReplacement（置き換え）、Refinement（苦痛の軽減）” の考の発生過程を顕微鏡で観察できるなどといった、実験動物

えに則って行うという国際的な流れがあり、できる限り合として用いる上で重要な多くの利点を有しており、脊椎動

理的かつ生体に対する苦痛の少ない実験手法を選択し、可物のモデル生物として長く用いられてきた歴史がある。当能な限り意識や感覚の少ない低位の動物種を使用すること

初は発生生物学と分子遺伝学の分野において用いられていが求められている。そのため、ヒトに近い動物であるから

たが 1 , 2）、その後哺乳類との生理学的類似性の高さが確認というだけの理由で安易にラット等を用いて毒性や効能のされ 3 , 4）、その利便性が認められたことで様々な分野で用評価を行うことは避けるべき状況となっている。

いられるようになり、現在では創薬や毒性研究にも利用さ

しかし、化粧品や医薬品の開発過程において、製品に用れている 5 , 6）。

いる可能性のある化合物がもつ生体への潜在的な毒性や効

メラニン色素産生抑制活性の評価のためのモデル生物と能をできる限り早い段階で評価することは、安全で高品質して、ゼブラフィッシュは多くの利点を有している。まず、な化粧品や医薬品を作り出す上で重要であり、何かしらのゼブラフィッシュを用いた実験は、メラニン合成に関わる方法でそれらを行う必要がある。

酵素の阻害活性試験や細胞培養などの in vitro 系とは異な

そこで本研究では、脊椎動物モデルであるゼブラフィッ

り、生体全体を用いた in vivo 評価系であることから、複シュを用い、天然資源由来のメラニン色素産生抑制物質の雑な生体内環境においても被験物質が実際に期待した効果

探索を行うことを通して哺乳類を用いた動物実験の代替法
Drug discovery research for a safe
melanin production inhibitor using
zebrafish as a vertebrate model
Yoshi Yamano
Department of Pharmacognosy, Graduate
School of Biomedical and Health Sciences,
Hiroshima University− 49 −

Fig. 1

ゼブラフィッシュコスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

用いて室温抽出し活性評価用の抽出物を得た。微生物は液体培地（Seed broth）で 2 週間静置培養後、ポテト培地に移しさらに 2 週間静置培養したものを、acetone にて抽出し、得られた粗抽出物をさらに水と 2 -butanone を用いて分配
し、2 -butanone 層を活性評価用抽出物とした。すべてのFig. 2

受精後72時間におけるゼブラフィッシュのメラニン産生を示すかどうかという本質に関わる点を評価することがで抽出物は DMSO によって濃度調整しスクリーニングに用いた。

2. 2. チロシナーゼ阻害活性試験法

きる。ゼブラフィッシュの卵は受精後 24 時間で器官形成

酵素は Mushroom tyrosinase（Sigma）を用いた。96 wellが見られ、48 時間で尾部におけるメラニン産生（黒い斑点

プレートの各 wellに、濃度調整した被験サンプル溶液 10 μLとの形成）が見られるようになる（Fig. 2）。卵は 96 well プレ

0 . 25 mg/mLに調整したL-tyrosine 入りK-phosphate bufferートの各 well にピペットで複数個ずつ入れることができ、 （0 . 05 M, pH 6 . 8）を 40 μL ず つ 加 え、475 nm に お け る
その飼育水に被験物質を添加しておくだけで、比較的短い

backgroundの吸光度を測定した。続いて 100 units/mLに調時間（2 ~ 3 日）でメラニン産生抑制活性を顕微鏡で確認す

製 し た mushroom tyrosinase 溶 液（K-phosphate buffer）

ることができる。また、ゼブラフィッシュは卵から発生初を 50 μL ず つ 加 え て、25 ℃ で 10 分 間 反 応 さ せ た の ち、期を通して 7 日間までは、飼育水に含まれる物質を主に皮475 nm における吸光度を測定し、この値から background膚から吸収するため、その吸収様式がヒトの皮膚吸収のモの吸光度を引いた値を基に、酵素反応阻害率を算出した。

7 , 8）

デルに近いといわれている。

各サンプルの試験は少なくとも 3 回行い、その平均値と標

一方、ゼブラフィッシュの発生過程において、被験物質

準偏差値を示した。half maximal inhibitory concentration

が正常な器官形成プロセスを阻害するような作用を有して

value（IC 50 値）は阻害率 50 % を跨ぐ 2 点のサンプル濃度といると、孵化阻害や生育遅延、奇形の発生などを誘発する阻害率の値から 2 点直線法を用いて算出した。

ことから、ゼブラフィッシュは被験物質の有害性を確認する手段としても用いられている。そのため、ゼブラフィッ

2. 3. ゼブラフィッシュメラニン産生抑制活性試験法

シュを用いてメラニン色素の産生抑制活性を評価すること

ゼブラフィッシュは 14 hours/ 10 hours の明暗サイクル

で、同時に被験物質の潜在的な毒性も評価することが可能

下、水温 26 ℃で飼育した。採卵日の前日に雄と雌を同じであり、被験物質の生体への効能と安全性を一度に評価で水槽にいれておき、次の日に水槽の底から受精卵を採取しきる優れた手法であると考えられる。

た。 滅 菌 蒸 留 水 で 受 精 卵 を よ く 洗 浄 し た の ち Embryo

本研究では、微生物や植物などの天然資源からメラニン

medium 中に分散させた。続いて 96 well プレートの各ウ

色素合成阻害活性をもつ化合物を探索することで、ゼブラェルに被験サンプル溶液を 1 μL 添加しておき、そこに受フィッシュを評価系に用いた探索手段の有用性の検証を行

精卵 3 個と 99 μL の Embryo medium を分注した。72 hourった。研究手順としては、まず当研究室が保有する植物・

後に顕微鏡観察およびメラニン色素の吸光度測定によりメ

微生物培養抽出物ライブラリーを用いて、メラニン色素生

ラニン産生抑制活性を評価した。メラニン色素の定量には合成を担う酵素であるチロシナーゼの阻害活性を in vitro

被験サンプルに晒したゼブラフィッシュを 10 匹用い、において評価し、続いてその阻害活性を示したサンプルか

PBS で洗浄後、1 % Triton X- 100 を含む PBS 中でホモジ

らゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性を示すサンプ

ナイズした。遠心分離により上清を取り除いたのち、100ルを選別し（微生物 BLS- 1 - 3 - 3 , BLS- 1 - 4 - 4）
、その活性μL の 1 N NaOH/ 10 % DMSO を加え、よく攪拌後、80 ℃を指標に化合物を探索した。また、対照実験として、チロ

で 2 hour おくことでメラニンを溶解させた。続いて遠心

シナーゼ阻害活性は見られたがゼブラフィッシュのメラニ

分離後上清をとり、405 nm の吸光度を測定し Control の吸ン産生抑制活性は見られなかったハウチワノキ材部から、光度の値との比較からメラニン色素産生抑制活性を算出しそのチロシナーゼ阻害活性を指標に化合物を探索し、それた。各化合物の試験は少なくとも 3 回行い、その平均値とぞれの天然資源から得られる化合物の構造と活性の関係を

標準偏差値を示した。IC 50 値は阻害率 50 % を跨ぐ 2 点のサ比較した。

ンプル濃度と阻害率の値から 2 点直線法を用いて算出した。

２．方法

2. 4. 微生物の簡易同定

2. 1. 植物および微生物の活性評価用抽出物の調整

スクリーニングの結果メラニン産生抑制活性を示した微植物は主に沖縄県で採集したものを用い、methanol を生物を、16 S rRNA 配列をもとに簡易同定した。まず各微− 50 −

モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究

生物株を MH broth 中で増殖させたのち、CTAB 法を用い害活性試験を行った。研究室に保有するおよそ 1000 サンて genome DNA を単離した。続いてその genome DNA を

プルをスクリーニングし、そのうち 23 サンプルが 100 μg/

テ ン プ レ ー ト に 27 F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）

mL の濃度で 50 % 以上のチロシナーゼ阻害活性を示した

および 1492 R（GGYTACCTTGTTACGACTT）プライマ（Fig. 3）。

ーを用いて 16 S rRNA 領域を PCR で増幅し、精製後、サ続いてこの 23 サンプルを用いて、ゼブラフィッシュにンガー法により塩基配列を解析した。得られた塩基配列を対するメラニン産生抑制活性試験を行った結果、8 サンプ

GenBank のデータベースで Blast 検索することにより、微ル が 100 μg/mL の濃度で明確な抑制活性を示し、そのう生物を同定した。

ち 特 に 再 現 性 に 優 れ て い た 2 サ ン プ ル（BSL 1 - 3 - 2 ,2. 5. 抽出物からの化合物の精製・構造解析

対照実験として、ゼブラフィッシュに対するメラニン産生

1 - 4 - 4 株）を本研究の探索源に決定した（Fig. 4 b, c）。また、
ゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性もしくはチロ抑制活性は見られなかったが（Fig. 4 d）チロシナーゼ阻害

シナーゼ阻害活性が確認された抽出物をヘキサン、酢酸エ

活性を示したサンプルである沖縄産植物ハウチワノキ材部

チル、ブタノール、水の各種溶媒を用いて分配した後、シから、チロシナーゼ阻害活性化合物を探索し、ゼブラフィ

リカゲルカラムクロマトグラフィー、ODS カラムクロマ

ッシュメラニン産生抑制活性をもつ抽出物から単離される

トグラフィー、HPLC を用いて順次精製を行った。単離し化合物との機能と構造の比較を行った。

た化合物の構造は、MS、NMR、IR などの各種物理化学

3. 2. BSL1-3-2株の同定と単離した化合物

データを解析することにより決定した。

３．結同定：BSL 1 - 3 - 2 株は広島県広島市の宇品海岸で採取し果た海水から分離培養した細菌である。微生物種の同定のため

3. 1. 探索サンプル決定のためのスクリーニングに本細菌の 16 S rRNA 領域の塩基配列を解析し、GenBank

当研究室が保有する微生物および植物の抽出物ライブラに登録されている微生物 16 S rRNA からBlast 検索を行ったとリーを用いて、一次スクリーニングとしてチロシナーゼ阻ころ、Staphylococcus sp. strain H 62 の 16 S rRNAと100 %Fig. 3 チロシナーゼ阻害活性スクリーニングの結果（100μg/mL，赤線：50％以上の阻害活性を示したサンプル）

Fig. 4 メラニン産生抑制活性スクリーニングの結果（100μg/mL） a：Control，b：BSL1- 3 - 2，c：BSL1- 4 - 4，
d：ハウチワノキ材部− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021の相同率を示したことから、本菌種をStaphylococcus sp. であacid（F 3 . 3 . 0 mg）、monomethyl succinate（F 4 . 9 . 0 mg）をると推定した。

単離同定した（Fig. 6）。

培養：本株を SMS 寒天培地上で培養し得られたコロニーを液体培地 Seed broth 500 mL に植菌し 2 週間培養後、3. 4. 沖縄産植物ハウチワノキから単離した化合物固体培地であるポテト培地 5 kg に移し 2 週間培養した。

2004 年に沖縄県中頭郡にて採取した植物ハウチワノキ

化合物の精製：菌体抽出物を分配し、各画分のうちゼブ（学名 Dodonaea viscosa）の材部 900 g の抽出物 58 . 9 g から

ラフィッシュのメラニン色素産生抑制活性が最も強かった化合物の探索を行った。その結果、3 個の新規ジテルペン化

酢酸エチル層 5 . 7 g から化合物の精製を行った。その結果、合物（D 1 . 4 . 4 mg, D 2 . 138 mg, D 3 . 7 . 5 mg）（Fig. 7）と、173 つの化合物 maltol（S 1 . 7 . 0 mg）、5 -hydroxymaltol（S 2 .

個の既知化合物として 4 つのジテルペン labd- 13（E）-en- 8 ,21 . 3 mg）、monomethyl succinate（S 3 . 14 . 5 mg）を単離同

15-diol（D4. 12.3mg）10, 11）、
ent-15, 16-epoxy-9αH-labda- 13

定した（Fig. 5）。

（D 16 . 27 . 5 mg）、14 -diene- 3 α, 8 β-diol（D 5 . 970 mg）12）、
hutriwaic acid（D 6 . 26 . 9 mg）13 , 14）、6 -hydroxyhardwickjic

3. 3. BSL1-4-4株の同定と単離した化合物

acid（D 7 . 4 . 1 mg）15）、4 つのフラボ ノ イ ド viscosine（D 8 .

同定：BSL 1 - 4 - 4 株は B 1 - 3 - 2 株と同様に広島県広島

5 3 . 3 mg）1 6）、7 , 4 ′-trihydroxy- 3 ′- （4 -hydroxy- 3 -市の宇品海岸で採取した海水から分離培養した細菌である。

methylbutyl-5′-（trimethylbut-2-enyl）-3, 6-dimethoxyflavone

同様に 16 S rRNA 領域の塩基配列を解析し、GenBank に（D9. 48.4mg）10, 17）、alizarin（D10. 31.8mg）17, 18）、dodovisone

お い て blast 検 索 し た と こ ろ、Francisella uliginis strain

19）
20）
C（D11. 6.0mg）、3 つのクマリンscopoletin（D 12 . 25 . 0 mg）、

TX 07 - 7310 の 16 S rRNA と 99 % の相同率を示したこと

isofraxidin（D13. 4.3mg）21, 22） 、fraxetin（D 14 . 15 . 6 mg）23）、から、本種を Francisella uliginis もしくはその近縁種であ

1 つのリグナン（+）-pinoresinol（D 15 . 8 . 0 mg）24）、そして他ると推定した。培養・精製方法も BSL- 1 - 3 - 2 と同様の手の 5 つの化合物 protocatechuic acid（D 16 . 27 . 5 mg）25）（、E）

順で行い、ゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性の最も強か-cinnamic acid（D 1 7 . 1 9 . 6 mg（D 1 8 と の mixture）2 6）、った酢酸エチル層 4 . 8 g から、4 つの化合物 5 -hydroxymaltol

methyl hydrogen azelate（D 18 . 19 . 6 mg（D 17とのmixture）（F 1 . 2 5 . 6 mg）、4 -［formyl- 5 - （methoxymethyl）

2 7）

9）

- 1 H-pyrrol- 1 -yl］butanoic acid（F 2 . 0 . 7 mg） 、succinic

Fig. 5、β-hydroxylpropiovanillone（D 1 9 . 1 1 . 1 mg）2 8）、

4 -hydroxyacetophenone（D 20 . 2 . 7 mg）29）であった（Fig. 8）。

BSL 1 - 3 - 2株から単離された化合物

Fig. 7

Fig. 6

BSL 1 - 4 - 4株から単離された化合物

ハウチワノキ材部から単離された新規化合物− 52 −

モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究

なお、D 17とD 18 はmixtureの状態で得られたため、活性試より得られた計 25 種の化合物に対してチロシナーゼの阻

験の対象からは外した。

害活性を評価した（Fig. 9）。ポジティブコントロールには
Arbutin を用いた。それぞれ 1 mg/mL および 100 μg/mL

3. 5. 単離化合物のチロシナーゼ阻害活性の化合物濃度でのチロシナーゼ阻害活性を評価した結果、BSL 1 - 3 - 2 株、BSL 1 - 4 - 4 株およびハウチワノキ材部

S 2 および F 1 が最も強い活性を示した。S 2 および F 1 のFig. 8

ハウチワノキ材部から単離された化合物

Fig. 8

ハウチワノキ材部から単離された化合物− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Fig. 10 メラニン色素産生抑制活性試験の結果

a：Control，b：S 2（100μg/mL），c：Kojic acid（2 mg/mL）

IC 50 値はそれぞれ 2 . 76 ± 0 . 32 , 3 . 24 ± 0 . 22 μg/mL であった。
またハウチワノキ由来の化合物としては D 12 , D 13 , D 19
が比較的強い活性を示した。

3. 6. 単離化合物のゼブラフィッシュメラニン産生抑制
活性Fig. 11化合物F 2添加により発生した奇形

チロシナーゼ阻害活性と同様に本研究で得られた計 25
種の化合物を用いてゼブラフィッシュメラニン産生抑制活性を評価した。化合物濃度は 100 μg/mL とし、十分な孵

1 - 4 - 4 から計 7 個の化合物を単離し、そのうち S 2、F 1

化率（80 % 以上）を示し明確なメラニン産生抑制活性が見が強いゼブラフィッシュメラニン産生抑制活性を示した。

られた化合物に関しては、ホモジネートの吸光度からその一方、比較のために探索を行った植物ハウチワノキ材部か阻害率も算出した。

ら 20 個の化合物を同定したが、いずれの化合物もゼブラ活性試験の結果、5 -hydroxymaltol（S 2 および F 1）がゼフィッシュのメラニン産生抑制活性を示さなかった。さらブラフィッシュに対し毒性を示さず、メラニン産生抑制活に F 2 , D 2 , D 4 , D 5 , D 8 ~D 13 , D 19 は ゼブラフィッシュ性を示し、溶媒のみを添加したゼブラフィッシュに比べそのふ化阻害や奇形発生といった毒性を示した。

れぞれ 46 . 8 ± 10 . 2 % と 38 . 2 ± 8 . 4 % メラニン色素の産生をスクリーニングの段階でゼブラフィッシュのメラニン産抑制した（Fig. 10）。ポジティブコントロールとして用い

生抑制活性を示したサンプル（微生物株 BSL 1 - 3 - 2 , 1 - 4 -た Kojic acid は 2 mg/mL の濃度で 66 . 2 ± 5 . 5 % の産生抑制

4）からは期待通り in vivo でもメラニン産生抑制活性を示

活性を示した。

す S 2、F 1 が得られた。このことから、本活性試験法は混その他の結果としては、S 1 が阻害率 12 . 0 % と弱い活性合物および単一化合物のいずれの状態においても in vivoを示し、S 1 , S 2 , F 1 以外の化合物では明確なメラニン産で作用するサンプルを評価できることが示された。活性化

生抑制活性が見られなかった。一方、F 2 , D 2 , D 4 , D 5 ,合物である S 2 および F 1 はいずれも 5 -hydroxymaltol で

D 8 ~D 13 , D 19 はゼブラフィッシュに対して 100 μg/mL のあり、本化合物はチロシナーゼ阻害剤としてすでに化粧品

濃度で強いふ化阻害活性を示し、全てゼブラフィッシュのに用いられているコウジ酸と同じ分子量であり、分子サイ

孵化を 90 % 以上阻害した。また F 2 を添加したゼブラフィ

ズや官能基の位置も似ていることから、類似した細胞内浸ッシュの中で、孵化に成功した個体には、奇形が見られた

透性とチロシナーゼ阻害機構を有すると推定される。ゼブ（Fig. 11）。

ラフィッシュを評価系に用いた探索の結果、実際に市販品４．考に用いられている化合物と似た化合物が得られたことも、

察

本評価系が有効性の高いサンプルを選別するのに適してい

本研究ではゼブラフィッシュをメラニン産生抑制活性のることを示唆している。5 -hydroxymaltol は TA 100 に対機能評価系として用いることで、サンプルの安全性と有効する変異原性を示すことが報告されているという懸念事項

性を正確かつ迅速に評価することができるかどうかを検証があるが 30）、この変異原性は同論文中でコーヒー、紅茶、した。具体的には in vitro でメラニン合成酵素の阻害活性

アルコール飲料や現在医薬部外品の美白剤として承認されを示すサンプルをスクリーニングし、そこからさらにin vivoているコウジ酸も同様に示すことが記されていることから、でゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性を示すものを

特 別 な 注 意 を 要 す る も の で は な い と 推 定 さ れ る。5 -スクリーニングし、両方の試験において活性を示したサンhydroxymaltol はその構造からだけでも、コウジ酸と同様

プルからその活性化合物の探索を行った。また比較のためにチロシナーゼ阻害活性をもつことが容易に推定されるが、に in vivo でメラニン産生抑制活性は見られなかったが、意外なことに筆者が調べた範囲ではそのチロシナーゼ阻害

in vitro では活性を示したサンプルからもその活性化合物

活性に言及した文献が見当たらないことから、本研究で初の 探 索 を 行 っ た。 そ の 結 果、 微 生 物 株 BSL 1 - 3 - 2 とめてそのメラニン産生抑制効果が示された可能性がある。

− 54 −

モデル脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いた安全なメラニン産生抑制活性物質の創薬研究

BSL 1 - 4 - 4 から単離された F 2 はゼブラフィッシュに対ができる。化粧品はその効能の強さと同時に高い安全性がするふ化阻害および奇形の発生を引き起こすという結果が求められるものであることから、ゼブラフィッシュを用い示された。このような毒性はエキスの段階では見られなかた新規素材開発や毒性評価はそれらの目的に沿ったモデル

っ た が、F 2 の 単 離 量 は 0 . 7 mg と 活 性 化 合 物 で あ る 5 -になるのではないかと期待している。

hydroxymaltol の 25 . 6 mg と比べ微量にしか含まれていな
かったことから、エキスの段階ではその毒性はマスクされ（引用文献）ていたと考えられる。このことからゼブラフィッシュを用

1） Driever, W.; Solnica-Krezel, L.; Schier, A. F.;

いた評価系は、混合物としてのサンプルの有効性を総合的

Neuhauss, S. C. F.; Malicki, J.; Stemple, D. L.; Stainier,に評価できる一方で、各構成化合物の潜在的危険性の評価

D. Y. R.; Zwartkruis, F.; Abdelilah, S.; Rangini, Z.; Belak,にも用いることができることが示唆された。これまでに報J.; Boggs, C. A genetic screen for mutations affecting

告されている F 2 に関する論文

9 , 31 , 32）

embryogenesis in zebrafish. Development, 1 2 3, 3 7-4 6

からは、F 2 はいくつかの細胞に対しての影響が見られているが強い細胞毒性を（1996）

示すという表記は見当たらないことから、in vitro での細2） Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell, 87, 969977（1996）

胞毒性では評価できなかった F 2 の生体に対する毒性をゼ
ブラフィッシュを用いることで初めて確認できた可能性が

3） Kimmel, C. B. Genetics and early development ofzebrafish. Trends. Genet., 5, 283-288（1989）

ある。
対照実験として行った、チロシナーゼ阻害活性を示し、

4） Fishman, M. C. Zebrafish genetics : the enigma of

ゼブラフィッシュのメラニン産生抑制活性を示さなかった

arrival. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9 6, 1 0 5 5 4-1 0 5 5 6

ハウチワノキ材部抽出エキスから得られた化合物は、単離（1999）

後もゼブラフィッシュメラニン抑制活性を示さなかった。

5） den Hertog, J. Chemical genetics : drug screens inzebrafish. Biosci. Rep., 25, 289-297（2005）

一方、D 12 , D 13 , D 19 は in vitro においてチロシナーゼ阻
害活性を示したが、in vivo においては卵のふ化阻害を引

6） Pichler, F. B.; Laurenson, S.; Williams, L. C.; Dodd, A.;
Copp, B. R.; Love, D. R. Chemical discovery and global

き起こした。

gene expression analysis in zebrafish. Nat. Biotechnol.,in vitro における酵素阻害活性試験は迅速に結果が得ら

21, 879-883（2003）

れる優れた試験法であるが、細胞内浸透性が低い化合物や生体への毒性が強い化合物、非特異的に多くの酵素を阻害

7） Langheinrich, U. Zebrafish:a new model on theする化合物など実用上問題がある化合物を判別することがpharmaceutical catwalk. BioEssays, 25, 904-912（2003）

できないというデメリットもあり、今回得られた化合物で8） Cha, S.-H.; Ko, S. -C.; Kim, D.; Jeon, Y. -J. Screening ofはそれらの判別されなかった特徴が毒性という形で現れた

marine algae for potential tyrosinase inhibitor : Those

可能性がある。

inhibitors reduced tyrosinase activity and melanin
synthesis in zebrafish. The Journal of dermatology, 38,

本研究結果から、ゼブラフィッシュを用いるメラニン色

354-363（2011）

素産生抑制活性試験法は、生体に対して毒性が低くかつ生体内でメラニン産生抑制活性を示す原料を開発の初期段階

9） Chin, Y. -W.; Lim, S. W.; Kim, S.-H.; Shin, D. -Y.; Suh,
Y. -G.; Kim, Y. -B.; Kim, Y. C.; Kim, J. Hepatoprotectiveから効果的に選別できる可能性が示された。

５．総

pyrrole derivatives of Lycium chinense fruits. Bioorg.

括Med. Chem. Lett., 13, 79-81（2003）

ゼブラフィッシュのタンパク質は、ヒトのオルソログと10）Feliciano, A. S.; Medarde, M.; Lopez, J. L.; Miguel delの同一性は 70 ％以下であるが、基質結合領域（多くの場合、

Corral, J. M.; Puebla, P.; Barrero, A. F. Terpenoids from

薬物結合標的）などの機能ドメインでの保存性はかなり高leaves of Juniperus thurifera. Phytochemistry, 27, 2241-

く、100 ％の類似性に近づいており、これが多くの薬剤が2248（1988）

ゼブラフィッシュとヒトで同等の効果を示すというこれま

11）Zdero, C.; Bohlmann, F.: Niemeyer H.M. Seco -で報告されてきた実験結果の科学的根拠となっている 7）。

Labdanes and other constituents from Ophryosporus

ゼブラフィッシュを用いた評価系では、本研究でも示されfloribundus. Phytochemistry, 29, 3247-3253（1990）

たように、その成分の有効性だけでなく、短期・長期毒性

12）Mata, R.; Contreras, J. L.; Crisanto, D.; Pereda-に関しても同時に評価できるという利点があり、胚発生、Miranda, R.; Castañeda, P.; Del Rio, F. Chemical studies

メラニン色素産生、稚魚の生死、血流、内臓機能、行動量

on Mexican plants used in traditional medicine, XVIII.

など、化合物が生体に与える影響を包括的に評価すること

New secondary metabolites from Dodonaea viscosa J.

− 55 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

24）Moon, S. -S.; Rahman, A. A.; Kim, J. -Y.; Kee, S. -H.

Nat. Prod., 54, 913-917（1991）
13）Huang, Z.; Jiang, M. -Y.; Zhou, Z. -Y.; Xu, D. Two

Hanultarin, a cytotoxic lignan as an inhibitor of actin

new clerodane diterpenes from Dodonaea viscosa.

cytoskeleton polymerization from the seeds ofZeitschrift fuer Naturforschung, B: A Journal of Chemical

Trichosanthes kirilowii. Bioorg. Med. Chem., 16, 72647269（2008）

Sciences, 65, 83-86（2010）14）Jefferies, P. R.; Payne T.G. Diterpenes of the25）Zhang, H. L.; Nagatsu, A.; Okuyama, H.; Mizukami,

cascarillin group from Dodonaea species. Tetrahedron

H.; Sakakibara, J. Sesquiterpene glycosides from cotton

Lett., 48, 4777-4782（1967）

oil cake. Phytochemistry, 48, 665-668（1998）

15）Zdero, C.; Bohlmann F.; Mungai G.M. Clerodanes,

26）Chaloner, P. A. Geminal and vicinal carbon-1 3-

seco-clerodanes, geranyl geraniol derivatives andcarbon-13 coupling constants in carboxylic acid derivatives.

unusual sesquiterpenes from Conyza hypoleuca.

J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1028-1032（1980）
27）Khlebnikova, T. B.; Pai, Z. P.; Fedoseeva, L. A.;

Phytochemistry, 30, 575-581（1991）16）van Heerden, F. R.; Viljoen, A. M.; van Wyk, B.-E.

Mattsat, Y. V. Catalytic oxidation of fatty acids. II.

The major flavonoid of Dodonaea angustifolia. Fitoterapia,

Epoxidation and oxidative cleavage of unsaturated

71, 602-604（2000）

fatty acid esters containing additional functional

17）Zhang, L. B.; Ji, J.; Lei, C.; Wang, H. Y.; Zhao, Q. S.;

groups. React. Kinet. Catal. Lett., 98, 9-17（2009）

Hou, A. J. Isoprenylated Flavonoid and Adipogenesis-28）Achenbach, H.; Stocker, M.; Constenla M. A.

Promoting Constituents of Dodonaea viscosa. J. Nat.

Constituents of tropical medicinal plants. Part 3 1.

Prod., 75, 699-706（2012）

Flavonoid and other constituents of Bauhinia manca.
Phytochemistry, 27, 1835-1841（1988）18）Muhammad, A.; Anis, I.; Khan, A.; Marasini, B. P.;
Biologically active29）Zander, W.; Mohr, K. I.; Gerth, K.; Jansen, R.; Muller,

C-alkylated flavonoids from Dodonaea viscosa. Arch.

R. p-Hydroxyacetophenone amides from Cystobacter

Choudhary, M. I.; Shah, M. R.

ferrugineus, strain Cb G35. J. Nat. Prod., 74, 1358-1363

Pharm. Res., 35, 431-436（2012）19）Gao, Y.; Fang, Y.-D.; Hai, P.; Wang, F.; Liu, J. K.

（2011）

Isoprenylated flavonoids and clerodane diterpenoids30）Kosuge, T.; Tsuji, K.; Nukaya, H.; Terada, A.; Ochiai,

from Dodonaea viscosa. Nat. Prod. Bioprospect., 3, 250-

M.; Wakabayashi, K.; Nagao, M.; Sugimura, T. Isolation

255（2013）

and Identification of 5-Hydroxymaltol, a Mutagenic
Substance in Glucose Pyrolysate. Agricultural and20）Vasconcelos, J. M. J.; Silva, A. M. S.; Cavaleiro, J. A. S.

Biological Chemistry, 47, 881-883（1983）

Chromones and flavanones from Artemisia campestris
subsp. maritima, Phytochemistry, 49, 1421-1424（1998）

31）Le, T. P. L.; Lee, J. W.; Kim, J. G.; Han, J. S.; Kwon, H.;21）Tsukamoto, H.; Hisada, S.; Nishibe, S. Coumarins

Lee, D.; Lee, M. K.; Hwang, B. Y. Tetrahydroprotoberberinefrom bark of Fraxinus japonica and F. mandshurica

N- O x ides f rom Chel idon iu m M ajus a nd Thei r

var. japonica. Chem. Pharm. Bull., 33, 4069-4073（1985）

Inhibitory Effects on NO Production in RAW 2 6 4.7
Cells. Phytochemistry Letters, 41, 38-42（2021）

22）Hu, H. -B.; Zheng, X. -D.; Jian, Y. -F.; Liu, J. -X.; Zhu,
J. -H. Constituents of the root of Anemone tomentosa.

32）Xiong, J.; Huang, Y.; Wu, X. -Y.; Liu, X. -H.; Fan, H.;
Wang, W.; Zhao, Y.; Yang, G. -X.; Zhang, H. -Y.; Hu, J.

Arch. Pharm. Res., 34, 1097-1105（2011）23）Yasuda, T.; Fukui, M.; Nakazawa, T.; Hoshikawa, A.;-F. Chemical Constituents from the Fermented Mycelia

Ohsawa, K. Metabolic Fate of Fraxin Administeredof the Medicinal Fungus Xylaria Nigripes. Helv. Chim.

Orally to Rats. J. Nat. Prod., 69, 755-757（2006）

Acta., 99, 83-89（2016）− 56 −

CRISPR-Cas9 ゲノム編集技術を用いた紫外線防御剤となる
多機能光回復酵素の開発
大阪大学大学院基礎工学研究科

山元淳平

Ultraviolet (UV) exposure of DNA causes formation of harmful DNA damage, such as cyclobutane pyrimidine dimers(CPDs) and pyrimidine( 6 – 4 )pyrimidone photoproducts ( 6 - 4 PPs), which block DNA replication and induce mutagenesis,
leading to carcinogenesis. Repair of these lesions is a vital pathway to maintain genetic integrity, and thus loss of the genes
responsible for DNA repair causes cell death or cancer. Among the DNA repair systems, photoreactivation is the simplest
pathway, in which a sole photo-responsive enzyme, photolyase (PL), can repair UV-induced DNA lesion in a light-dependent
manner. Therefore, PLs are molecules applicable to the UV protectant under sunlight.
PLs are classified into two major classes, CPD photolyase and ( 6 – 4 ) photolyase, depending on their target substrates(CPD and 6 - 4 PP, respectively). If a hybrid type of PL that can recognize and repair both CPDs and 6 - 4 PPs is developed,
such a molecule excellently inhibits formation of UV-induced DNA damage and functions as a UV protectant. In this study,
I intended to develop the hybrid photolyase by combination of CRISPR-Cas 9 genome editing technology and directed
evolution of photolyase. Plasmids were designed to knock the modified PL genes in human cells via homology-independent
targeted integrity, with a promoter and antibiotic-resistant gene. After transfection of the plasmid with Cas 9 and gRNAproducing plasmids, however, antibiotics-resistant strains were not obtained, although the target genes were integrated into
the AAVS 1 site. Thus, the plasmid was used for functional screening of the hybrid PL in bacteria, the results of which are
shown in this report.

1.

緒酵素が存在する（図 1）。ヒト培養細胞に対して光回復酵素

言を導入する試みは 2000 年代前半からなされ始め、CPD 光

生体中の遺伝情報を含む DNA は紫外線の曝露により化回復酵素を HeLa 細胞へ導入することで、紫外線によって学構造の変化が誘起され、隣接するピリミジン塩基間にお誘起されるアポトーシスの減少 2）や、UVB 曝露に起因す

いて光架橋反応が起こり、シクロブタン型ピリミジンダイ

る炎症作用の軽減 3）といった効果が報告されている。さらマー（CPD）や（6 - 4）光産物といった紫外線損傷 DNA が形に、CPD 光回復酵素を有するトランスジェニックマウスが成される。これら紫外線損傷 DNA の修復はヌクレオチド作成され、高い紫外線耐性を持つことが報告されている 4）。

除去修復機構（NER）が担っており、その修復経路の遺伝

また、より効率よくかつ簡便に CPD 光回復酵素の遺伝子的欠損は色素性乾皮症などの紫外線高感受性症状を伴う重を導入するため、mRNA として初代ケラチノサイトへの篤な疾病の原因であることが知られている。一方、大腸菌導入がなされ、医療応用への方向性が示された 5）。いずれからヒトを除く高等生物に広範に保存されている光回復との報告例も、CPD 光回復酵素のみを用いており、（6 - 4）光呼ばれる DNA 修復経路は、フラビンタンパク質のひとつ

回復酵素を導入した報告例は見当たらない。単一の酵素でである光回復酵素が紫外線損傷の直接認識・修復を担って両方の損傷を修復することのできるハイブリッド型光回復

おり、紫外線損傷 DNA を単一の酵素で、かつ太陽光中の青色光を用いて修復することができるユニークな酵素である 1）。
ヒトは光回復酵素を有していないため、光回復酵素を外来からヒト細胞中へと導入、もしくは適切な条件で表皮塗布することで、上記疾患の遺伝子治療や紫外線防御効果が期待される。一方で、光回復酵素は高い基質選択性を有しており、CPD および（6 - 4）光産物のそれぞれの修復を担う

D eve l o p m e nt o f mu lt i - f u n c t i o n a lphotolyase as an ultraviolet protectant
using CRISPR-Cas 9 genome editing
Junpei Yamamoto
Graduate School of Engineering Science,
Osaka University− 57 −

図1

光回復酵素についてコスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

酵素を調製できれば、前述の治療応用が可能になることがセイを用いた。制限酵素 XbaI によって線状化した pGE-

期待される。過去に、（6 - 4）光回復酵素の一部のアミノ酸

XbaI-IPA と 2 . 2 . で調製した PCR 産物を In-fusion HD キ

を CPD 光回復酵素の相同アミノ酸へと置換することで、ットによって環状プラスミドとし、反応処理後の溶液を用（6 - 4）光回復酵素でありながら、CPD の修復が可能となる

いて SY 2 を形質転換し、薬剤を含む寒天培地プレート上6）ことを報告している 。しかし、この酵素は（6 - 4）光回復に撒いた。そのプレートに対し、0 . 2 J/m 2 の紫外光を照射酵素としての機能が喪失しており、ハイブリッド型として後、白色光を 30 分照射した。その後、暗所 37 ℃にて静置の遺伝子治療やコスメトロジーへの応用には十分ではない。

し、得られたコロニーについてコロニー PCR を行った。

本研究では、（6 - 4）光回復酵素を基本骨格とし、（6 - 4）

PCR 産物の DNA 配列を解析し、変異導入された位置を調光産物修復能を保持したまま CPD 光回復能を持たせたハべた。

イブリッド型光回復酵素を、Error-prone PCR およびヒ

３．結ト線維芽細胞に対する CRISPR-Cas 9 ゲノム編集技術を組

3. 1. 実験系のデザイン

み合わせることで開発することを計画した。

２．方果

CRISPR-Cas 9 による遺伝子導入には従来相同組換え法（HR）が用いられるが、非分裂細胞では HR の頻度が低いた

2. 1. プラスミド構築

め、非相同末端結合（NHEJ）を介したHomology-Independent

基本骨格となるプラスミドには pBluescript II SK（-）を

Targeting Integration（HITI）法 8）による導入を計画した。

用い、XhoI/SacI サイトに諸々の PCR 産物を導入した。

そのために、図 2 に示すプラスミド DNA を設計・作成した。

PCR は PrimeSTAR MAX DNA polymerase も し く は

CRISPR-Cas 9 による遺伝子導入部位はヒトゲノム上のセ

PrimeSTAR GXL DNA poymerase（タカラバイオ）を用い

ーフハーバーである AAVS 1 とし、2 つの AAVS 1 認識配

た。PCR増幅産物はアガロースゲル電気泳動によって分離・列でヒト PGK プロモーター・大腸菌 EM 7 プロモーター・精製した。PCR 増幅産物を用いたプラスミドの構築には、

サブクローニング用制限酵素サイト（XbaI）・内部リボソ

In-fusion HD キット（タカラバイオ）を用いた。構築したプー ム 進 入 部 位（IRES）・ ピ ュ ー ロ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子

ラスミドを用いて大腸菌 Stellar competent cells（Clontech）（PuroR）・ポリ A を挟んでいる。このプラスミドを pGE-を形質転換し、得られたプラスミドの DNA 配列はコロニ

XbaI-IPA と名付けた。プラスミドを AAVS 1 認識ガイド

ー PCR 産物のシーケンス解析により確認した。本研究でRNA および Cas 9 発現プラスミドとともにヒト細胞に導入構築した基本プラスミドを、pGE-XbaI-IPA と名付けた。

すれば、クローニングサイトにサブクローニングした任意目的配列を有する大腸菌コロニーを培養し、プラスミドをの遺伝子を AAVS 1 へ導入することができる。また、本系

NucleoBond Xtra Midi キットで精製した。

は大腸菌の合成プロモーターである EM 7 を保有している

pGE-XbaI-IPA の ク ロ ー ニ ン グ サ イ ト XbaI 部 位 に、Methanosarcina mazei 由来 CPD 光回復酵素（MmCPDII）もため、XbaI サイトに導入した遺伝子を大腸菌中でも発現することができる。

しくは Xenopus laevis 由来（6 - 4）光回復酵素（Xl 64）を導入
したプラスミド pGE-MmCPD-IPA および pGE-Xl 64 -IPA
は同様に作成した。

2. 2. Error-prone PCR
Xl 64 に対するランダム変異導入は既報 7）に従い Errorprone PCR により行った。100 µL の反応混合液（0 . 3 µM プ
ライマー , 10 ng pGE-Xl 64 -IPA, rTaq DNA polymerase,
1 0 mM Tris-HCl, 5 0 mM KCl, 1 . 5 mM MgCl 2 , 1 mM
MnCl 2 , 1 . 5 mM dATP, 1 . 5 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM
TTP）を調製し、変性（95 ℃ 30 s）
・アニーリング（55 ℃
30 s）・伸長（68 ℃ 2 min）のサイクルを 35 回行った。PCR
産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製した。

2. 3. スクリーニング
DNA 修復活性の有無のスクリーニングには、DNA 修復
能を失った大腸菌 SY 2 株を利用した UV サバイバルアッ− 58 −

図2

設計したプラスミドと HITI によるゲノム導入

CRISPR-Cas9 ゲノム編集技術を用いた紫外線防御剤となる多機能光回復酵素の開発

3. 2. ヒト細胞を用いたプラスミドの機能確認能を有する MmCPDII を導入したプラスミドで形質転換を本システムの確認のため、制限酵素サイトに CPD 光回行った場合、生存率の大幅な向上が観測された。Xl 64 を

復酵素および（6 - 4）光回復酵素の遺伝子を pGE-XbaI-IPA

含むプラスミドでは、光回復酵素を含まないものと比較すにサブクローニングしたプラスミド pGE-MmCPDII-IPA

ると小程度の生存率の向上が見られた（図 3）。これらのこおよび pGE-Xl 64 -IPA を調製し、NER が欠失した XP 2 OSとから、今回構築したプラスミドが SY 2 株の中で機能し細胞にこれらのプラスミド、AAVS 1 の gRNA 用プラスミていることがわかった。MmCPDIIとXl 64 の生存率の差は、

ド、および Cas 9 プラスミドとともに導入した。トランス

生成する紫外線損傷の種類に対応していると考えられる。

フェクション７日後からピューロマイシンによる薬剤セレ

一般的に、紫外線照射によって生成する損傷としては、クションを行ったが、薬剤耐性を獲得した細胞は得られな

6 - 4 PP よりも CPD の方が多くなることが報告されており、かった。

6 - 4 PP 修復能しか持たない Xl 64 の導入では CPD の修復

トランスフェクション後の細胞からゲノム DNA を抽出し、PCR をしたところゲノム中への遺伝子挿入は確認さはできないため、限定的な生存率の向上となったと考えられる。

れた。コントロールで用いた別の遺伝子導入プラスミドでは、ピューロマイシン耐性遺伝子は EF 1 α プロモーター下流に存在し、こちらは薬剤耐性が獲得された。このことか

3. 4. Error-prone PCRによる変異導入および機能スクリーニングら、XP 2 OS 細胞では PGK プロモーターの働きが弱く、薬これらの結果から、Xl 64 に対して変異導入を行い CPD

剤耐性が充分に獲得されたなかったものと考えられる。し修復能が獲得された場合、生存率の大幅な向上が期待できたがって、ヒト細胞を用いたスクリーニングはできないとる。そこで、Xl 64 をテンプレートとし既報に従い Error-

判断した。

prone PCR を行って変異導入を行った。XbaI サイトで線状化した pGE-XbaI-IPA に対して PCR 産物を In-fusion 法

3. 3. 大腸菌SY2によるサバイバルアッセイ

にて連結し、SY 2 大腸菌株を形質転換した。プレート上構築したプラスミドは大腸菌のプロモーターも含むため、に塗布した後、0 . 2 J/m 2 の紫外線を照射し、白色光 30 分

今回目的としたスクリーニングは大腸菌でも実施可能であ照射ののち、37 ℃でインキュベートしたところ、コロニる。そこで、各種 DNA 修復関連遺伝子を薬剤耐性遺伝子ーの形成が確認された。このうち、10 個のコロニーをピで置換した大腸菌株 SY 2 および今回構築したプラスミド

ックアップし、DNA 配列を解析した。結果を Table 1 にを用いてスクリーニングが実施可能であるかどうか検証し示す。

た。
この SY 2 株は内在性の組換え修復、光回復、およびヌクレオチド除去修復ができないため、紫外線照射によってTable 1

極めて容易に死滅する。ここに光回復酵素遺伝子を保有す

Entry

変異導入塩基変異のタイプアミノ酸の変異1

T 483 AA 1436 T
A 1510 G

Transversion
Transversion
Transition

なし（Gly 161 Gly）
Asn 479 Ile
Asn 504 Asp

2

C 246 TA 356 CT 1556 C

Transition
Transversion
Transition

なし（Phe 88 Phe）
Glu 119 Ala
Val 519 Ala

3

C 734 T

Transition

Thr 245 Ile

4

A 428 GG 574 A
A 900 GT 1055 C

Transition
Transition
Transition
Transition

Asn 143 Ser
Val 192 Ile
なし（Ala 300 Ala）
Ile 352 Thr

5

A 1093 GTransition

Thr 365 Ala

6

A 1041 G
T 1227 C

Transition
Transition

なし（Arg 347 Arg）
なし（Phe 409 Phe）

7

T 940 CA 1128 T
A 1519 G

Transition
Transversion
Transition

Cys 314 Arg
なし（Gly 376 Gly）
Lys 507 Glu

8

リード失敗

9

C 1089 T
T 1278 C

Transition
Transition

なし（Phe 363 Phe）
なし（Asp 426 Asp）

10

T 694 CA 1128 G

Transition
Transition

Cys 232 Arg
なし（Gly 376 Gly）

るプラスミドを導入することで、紫外線照射につづく白色
光照射により、紫外線損傷 DNA を修復することが可能となり、生存率の向上が見られることが期待される。
まず、今回構築したプラスミド pGE-XbaI-IPA、pGEMmCPDII-IPA、および pGE-Xl 64 -IPA を用いて SY 2 株
を形質転換し、その紫外線損傷 DNA の修復に伴う生存率の向上が見られるかどうか調べた。その結果、CPD 修復

図3

UV サバイバルアッセイの結果− 59 −

Error-prone PCR による Xl64 の変異導入パターン

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図４

Error-prone PCR により変異導入された Xl64 のアミノ酸エントリー 4 においては、Xl 64 遺伝子配列 1545 塩基の回導入されたアミノ酸の変異は DNA 結合部位の周辺であうち、４箇所の変異が確認された一方で、他のエントリー

り、損傷と直接相互作用するアミノ酸側鎖ではなかった。

においてはそれよりも少ない変異導入数であった。また、そのため、今後は変異導入を行う範囲を限定することで、変異導入によってアミノ酸変異が導入されない場合も多く

より現実的な多機能酵素の開発につながると考える。

見られ、エントリー 6 や 9 では、アミノ酸配列としてはXl 64 野生型と同一であった。図４に、導入された変異の場所を示す。

（引用文献）
1） Yamamoto, J., Plaza, P., Brettel, K., Photochem.

４．考

Photobiol. 93, 51- 66（2017）．

察2） Chigancas, V., Miyaji E. N., Muotri, A. R., Jacysyn, J.
F., Amarante-Mendes, G. P., Yasui, A., Menck, C. F. M.,

今回の変異導入では、主としてトランジション変異が起

Cancer Res. 60, 2458-2463（2000）．

こっており、アミノ酸の大幅な変化につながっていないことがわかった。より高度に変異導入することで、広範なラ

3） Stege, H., Roza, L., Vink, A. A., Grewe, M., Ruzicka,

イブラリ形成につながるため、別の手法による変異導入を

T., Grether-Beck, S., Krutmann, J., Proc. Natl. Acad.

試みる必要がある。また、今回のスクリーニングで得られSci. USA 97, 1790-1795（2000）．

た変異体のうち、エントリー 4 については DNA 結合部位

4） Schul, W., Jans, J., Rijksen, Y. M. A., Klemann, K. H.

の近傍に 2 箇所の変異が導入されていることから、この配M., Eker, A. P. M., de Wit, J., Nikaido, O., Nakajima, S.,

列を有するタンパク質を遺伝子組換え体として得、タンパ

Yasui, A., Hoeijmakers, J. H. J., van der Horst, G. T. J.,
EMBO J. 21, 4719 - 4729（2002）．

ク質の機能解析に供する価値がある可能性がある。一方で、本スクリーニングでは、Xl 64 と機能的に変化がない場合

5） Boros, G., Miko, E., Muramatsu, H., Weissman, D.,においても生存コロニーとして得られたことから、スクリ

Emri, E., Rozsa, D., Nagy, G., Juhasz, A., Juhasz, I., vanーニング法として改善の余地があると考えられる。今回はder Horst, G., Horkay, I., Remenyik, E., Kariko, K., Emri,

In-fusion 反応産物を直接 SY 2 へと導入してスクリーニン

G., J. Photochem. Photobiol. B 129, 93 - 99（2013）．

グに供する方法を採用したが、一度、別の大腸菌に導入後

6） Yamada, D., Dokainish, H. M., Iwata, T., Yamamoto,にプラスミドを回収してから、SY 2 株にてスクリーニン

J., Ishikawa, T., Todo, T., Iwai, S., Getzoff, E. D., Kitao,A., Kandori, H., Biochemistry 55, 4173 - 4183（2016）．

グする方法も検討する必要がある。
以前の研究では、（6 - 4）光回復酵素の DNA 結合部位の内部で損傷部位と直接相互作用するアミノ酸を置換するこ6）とで CPD 修復能を獲得できることを報告している 。今7） Cadwell, R. C., Joyce, G. F., Genome Res. 2, 2 8 - 3 3（1992）．
8） Suzuki, K. et al., Nature 540, 144 -149（2016）．

− 60 −

In vitro/in silico 試験による皮膚感作性の毒性学的懸念の閾値（TTC）コンセプトの確立
国立医薬品食品衛生研究所安全性予測評価部

足利

太可雄

Recently, several in vitro skin sensitization tests have been listed in the OECD guidelines. The threshold of toxicologicalconcern (TTC) is a threshold value for human exposure that does not show any obvious adverse effects at the lower doses
for all chemicals. In this study, we aimed to develop a quantitative prediction model using in vitro/in silico dataset and establish a TTC concept for skin sensitization.
The EC3 value, which is the endpoint of the LLNA, was used as the objective variable, and data on 120 substances wereextracted from the dataset published by Cosmetics Europe. In vitro tests (DPRA, KeratinoSensTM and h-CLAT) data andphysico-chemical properties were used as the explanatory variables. A quantitative prediction model for EC3 was developed
using support vector regression (SVR), which is a machine learning approach. Predicted EC3 values were used to establish a
no expected sensitization induction level (NESIL), and acceptable exposure level (AEL) for each chemical was calculated by
dividing NESIL by sensitization assessment factor (SAF). Then by fitting gamma distribution of the AELs using a negativelog (10) scale, 95 and 99 percentile probability were calculated as the Dermal Sensitization Threshold (DST) value. Finally,
conversion of the DST to the threshold concentration of a women’s face cream was done as an example of the application ofthis concept.
This prediction model was validated by 3-hold cross validation, and the accuracy of prediction of potency class in fivecategories was 45.8%. Assuming 20% of all chemicals to be skin sensitizers, the DST (μg/cm2) for women's face cream wascalculated as 0.129 (99 percentile) and 3.99 (95 percentile), respectively. Furthermore, the threshold concentration of thistype of products was calculated as 0.008 % (for DST 99 percentile) and 0.26% (for DST 95percentile). This TTC concept
will be useful for the safety evaluation of, for example, impurities in cosmetic ingredients as a non-animal approach.

1.

緒証の厳格化など化粧品開発をとりまく最近の状況において、

言

皮膚感作性における TTC 手法は、原料中の不純物や天然

毒性学的懸念の閾値（TTC：Threshold of Toxicological

物中の微量成分などヒト曝露量が非常に低いと考えられる

Concern）とは、あらゆる化学物質についてそれ以下の曝物質に関する、毒性試験を伴わない包括的安全性評価法と露量では明らかな有害影響が現れないとするヒト曝露の閾

して強く期待されている。

値として設定される値であり、その手法は過去の毒性試験

最近 in vitro 皮膚感作性試験が相次いで OECD ガイドラ

データの統計学的解析により発展してきたものである。

インに収載され、in silico 試験法も含めた試験法の組み合

TTC 手法は毒性未知の化学物質について毒性試験を行わ

わせについても OECD ガイダンスが公開された 5）。また日

ずにリスクを評価するアプローチであり、対象物質の化学

欧の化粧品工業会は重要課題として in vitro/in silico 試験

構造の情報とヒト曝露量に関する情報のみが必要とされる法による皮膚感作性のリスク評価に取り組んでいる 6 , 7）。

ため、毒性学的情報は極めて限られているが曝露量が通常

さらに最近、日本化粧品工業連合会による日本人女性の化極めて低い化学物質群を包括的に評価するために有用であ粧品使用量の調査 8）があった。

ると考えられている。TTC 手法はこれまで主に経口曝露

こうした状況から、最近国際的主要化粧品メーカーでもの全身毒性について検討されており、香料 1）や医薬品の不皮膚感作性の TTC コンセプトの実用化が検討されている。

純物 2）など一部では公的規制においても受け入れられていそこで本研究では、従来用いられてきた in vivo 試験デーる。一方、経皮曝露による主要な毒性である皮膚感作性にタの代わりに将来増加が見込まれる in vitro/in silico 試験

ついても、Safford により TTC コンセプト（DST：Dermal

データによる皮膚感作性の TTC コンセプトの確立を目指

Sensitization Threshold）が提案されて以来研究が進んでし、検討を行った。

いる

3 , 4）。動物実験の廃止、原料調達の多様化、安全性保E s t a b l i s h m e nt o f a t h r e s h o l d o f
toxicological concern（TTC）concept forskin sensitization by in vitro/in silico
approaches
Takao Ashikaga
National Institute of Health Sciences,
Division of Risk Assessment

２．方法

2. 1. データセットの確立
マウス皮膚感作性試験 LLNA のエンドポイントである
EC 3（%）を精度よく予測可能なモデルを構築するために、
Cosmetics Europe により公表された、in vivo/in vitro データセット 7）のうち全ての試験データが揃っている 120 化
合物のデータを用いた。予測モデル作成のため、そのうち− 62 −

In vitro/in silico 試験による皮膚感作性の毒性学的懸念の閾値（TTC）コンセプトの確立

90 化合物を training set、30 化合物を test set としてランケアやシャンプーなど）および使用状況（髭剃り後など）かダムに分割して使用した。目的変数は同一化学物質で複数ら設定した感作評価係数（SAF：Sensitization Assessmentの in vivo データがある場合、LLNA EC 3（µmol/cm²）の中Factor）9）で除することで許容曝露濃度（AEL：Acceptable

央値とした。説明変数は、in vitro 試験の DPRA, h-CLAT,

Exposure Level）を算出し、最終的に各化学物質の AEL を

TM

KeratinoSens

それぞれにおいて、Lys および Cys を含む

常用対数に変換した値について、ヒストグラムを作成した。

ペ プ チ ド 減 少 率（%）
、CV 75（µM）お よ び MIT（µM）、

市販の統計解析ソフトである JMP を用い、最尤法によりEC 1 . 5（µM）および IC 50（µM）を用いた。さらに説明変数

このヒストグラムをガンマ分布にフィッティングした。ことして、主に皮膚透過性に関わる被験物質の物理化学定数のようにして得られた AEL の予測モデルと、in vivo 試験（Molecular weight, LogP, LogS, Boiling point, Melting

結果から得られた従来モデルを 2 種のパラメーター（形状point）を用いた。データの欠損値処理として、LLNA 陰性

母数と尺度母数）を指標に比較した。Negative Log（10）物質の EC 3 の中央値を 150 %（後に µmol/cm² に単位変換）、

AEL の 99 パーセンタイルと 95 パーセンタイルの値から、

DPRA ペプチド減少率が 0 のものを 0 . 001 %、h-CLAT 陰DST（99 percentile）と DST（95 percentile）値を算出した。

性物質の MIT 値を 10 , 000 µg/mLとした。さらに LLNA お

さらに、代表的な化粧品の製品タイプである女性用フェー

よび in vitro 試験データについては、
常用対数変換を行った。

スクリームを例として、本モデルと従来の動物実験によるDST 値の比較を行った。最後に日本化粧品工業連合会の2. 2. 機械学習による強度（EC3値）予測モデルの開発

本 人 女 性 に お け る フ ェ ー ス ク リ ー ム の 曝 露 量（CEL：

説明変数から目的変数を予測するために非線形の機械学

Consumer Exposure Level）を算出し、CEL=DST 値とし習モデルである Support Vector Regression（SVR）を選択

調査結果による製品タイプ別の使用量と曝露面積 8）から日た場合の製品中の配合濃度閾値を計算した。

した。データセットとして準備した 120 化合物について

３．結

3 -fold cross validation による性能評価を行った。モデル

果

2の評価指標としては R（決定係数）と RMSE（平均平方二乗作成した EC 3 値予測モデルの予測値と実測値の散布図誤差）を用いた。RMSE は値が小さいほど予測値と実測値を図 1 に示す。training set と test set の R 2 値の平均は、2の誤差が小さいことを示す。また、R は予測モデルが適それぞれ 0 . 584 , 0 . 585 であり、RMSE 値はそれぞれ 0 . 545 ,

切にデータを表現できるかを示し 1 に近づくほど良いモデ

0 . 653 であった。各 cross validation の R 2 と RMSE を表 1

ルといえる。RMSE と R 2 の計算式は下記に記した。

2. 3. 皮膚感作性DST値の設定得られた予測EC3（%）
値を単位面積当たりの曝露量（µg/cm 2）に変換後、既知の関係式 3）からヒトにおける無感作誘
導 濃 度（NESIL：No Expected Sensitization Induction
Level）を算出した。さらに、個人間変動、製剤系（スキン表1

図1

EC 3 （µmol/cm 2）の予測値と実測値の対応

3 - fold cross validationにおけるR 2とRMSE− 63 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021に示す。またカテゴリー分類（Extreme, Strong, Moderate,

さらに女性用フェースクリームの使用量（0 . 84 g/day、日

Weak, Non-Sensitization）における予測値と実測値の一致

本人女性 90 percentile）と曝露面積（551 cm 2、日本人女性率は 45 . 8 % であった。120 化学物質中、予測値と実測値の頭 部 面 積 の 半 分 ）か ら、CEL を 算 出 す る と、1 . 52（mg/カテゴリーが 1 区分以内のずれに収まったのは 114 化学物

cm 2 /day）であった。そこで CEL=DST として、化学物質質であり、全体の 90 % 以上であった。予測値と実測値のの女性用フェースクリームの配合濃度閾値を算出すると、カテゴリーごとの対応を表 2 に示す。

DST（99 percentile）において 0 . 008 %、DST（95 percentile）

次に得られた EC 3 値予測モデルにより、LLNA 陽性 90において 0 . 262 % とそれぞれ算出された。

物質について EC 3 予測値を算出し、各種数値変換後、最４．考終的に Negative Log（10）AEL を算出した。なお、女性用察フ ェ ー ス ク リ ー ム の SAF は International Fragrance

今回開発に用いた in vivo の LLNA データは、Cosmetics

Association（IFRA）の基準に従って 100 とした 。図 2 に、Europe に よ り 公 表 さ れ、 現 在 開 発 中 で あ る OECD

Negative Log（10）AEL のヒストグラムおよびガンマ分布

Defined Approach による皮膚感作性試験テストガイドラにフィッティングした結果を示す。得られたガンマ分布のインでも使用されている信頼性の高いものである。予測モ

形状母数と尺度母数はそれぞれ 1 . 98、0 . 73 であった。

デル開発において目的変数の質は大変重要であるため、現9）

全化学物質の 20 % が皮膚感作性陽性と仮定し、今回得ら れ た ガ ン マ 分 布 か ら、 女 性 用 フ ェ ー ス ク リ ー ム の時点で最も信頼性の高いと考えられるデータセットを使用した。

Negative Log（10）AEL の各パーセンタイルを算出した。

開発した SVM による EC 3 値予測モデルは、R 2 が 0 . 585

99 パーセンタイルと 95 パーセンタイルの値は、それぞれであり、カテゴリー分類の一致率も 45 . 8 % であったため、

0 . 901 , −0 . 601 であった。これらの値を AEL に変換し、予測可能であると判断された。また、各 R 2 と RMSE につそれぞれを DST 値とすると、DST（99 percentile）= 0 . 126

いて training set と test set は大きな差がなく、汎化性能に

22（µg/cm ）、DST（95 percentile）= 3 . 99（µg/cm ）であった。

問題ないと考えられた。EC 3 値予測モデルの予測性が良好と判断し、LLNA における陽性物質について予測 EC 3

表2

予測値と実測値のカテゴリーごとの対応（%）値を NESIL に変換後 AEL を算出し、常用対数に変換
して Negative Log（10）AEL を算出し、ヒストグラムを作成したところ、ガンマ分布にフィッテイング可能と考えられた。ガンマ分布の 2 種のパラメーターである形状母数と尺度母数はそれぞれ、1 . 98、0 . 73 であり、LLNA の実測値から求めたガンマ分布の形状母数と尺度母数はそれぞれ、
2 . 57、0 . 57 であったことから、今回開発した EC 3 値予測モデルによる予測値の強度分布は実測値のそれと類似していることが示された。
今回得られた DST（99 percentile）= 0 . 126、DST（95percentile）=3.99 は、従来報告されたLLNAによるDST（99

ガンマ分布

予測と実測のカテゴリーが一致した物質:
55 substances（45 . 8 %）
予測と実測のカテゴリーが1区分ずれた物質:
59 substances（49 .1%）
予測と実測のカテゴリーが2区分ずれた物質:
5 substances（4 .1%）
予測と実測のカテゴリーが3区分ずれた物質:
1 substances（4 .1%）

図2 Negative Log（10）スケールにおける皮膚感作性物
質のAELの分布− 64 −

In vitro/in silico 試験による皮膚感作性の毒性学的懸念の閾値（TTC）コンセプトの確立

percentile）= 0 . 06、DST（95 percentile）= 1 . 63）と比較して査による 90 パーセンタイルの値を用いた。製品使用量や約 2 倍であった。また皮膚感作の AOP（Adverse Outcome

曝露面積は化粧習慣や人種により違いがあると考えられる

Pathway）において重要な Key Event であるタンパク質とため、同様の調査結果がある欧州の SCCS ガイダンス 12）なの結合の観点から High Potency Category（HPC）に分類さども参照し、設定条件による違いを確認すべきと考える。

れる皮膚感作性物質の DST（95 percentile）= 1 . 5 とする報本研究では、機械学習である SVR を用いて強度予測モ

告もある 10）。今回用いた 90 品の LLNA 陽性物質には、デルを作成した。これまでも機械学習による皮膚感作性のEC 3（%）の予測値が extreme に分類される 0 . 1 未満のもの

強度予測モデルはいくつか開発されており 13 - 15）、最近ア

がなく、そのことが強度分布に影響を与えた可能性が考えメ リ カ 環 境 保 護 庁（EPA）に お い て、Artificial Neuralられた。今後強度が extreme に分類される皮膚感作性物質

Network 16）による皮膚感作性強度予測モデルによるイソチをデータセットに追加するべきと考える。

アゾリノン系防腐剤のリスク評価が行われたことは注目に

今回試算した DST 値は、Cosmetics Europe により公表値する。今後こうした機械学習による皮膚感作性の強度予された 120 化合物のデータを用いたこと、作成した EC 3測モデルによる原料の配合許容濃度予測の実用化が期待さ予測モデルにより求めた Negative Log（10）AEL がガンマれている。

分布をとること、全化学物質の 20 % が皮膚感作性陽性で５．総あること、CEL=DST としたことなど様々な前提条件に基括づいており、今後それらの妥当性に関して検証が必要であ化粧品開発における動物実験が困難になる中、皮膚感作る。さらに、今回 acceptable risk の probability は 99 パー

性の TTC コンセプト（DST）の実用化が急務となっている。

センタイルと 95 パーセンタイルを採用したが、どの値を本コンセプトが確立されれば、閾値未満の曝露量の範囲で用いるべきかについても議論が必要である。

安全性試験を行わずに、被験物質（例えば化粧品原料）の原

また、TTC コンセプトは実務上様々な利点がある一方
で、以下に示すデメリットも知られている

11）

料情報と配合濃度のみで安全性評価が可能になることが期待できるためである。具体的な活用の例として、動物実験。

・化学物質の複合曝露の影響を考慮していない。

以外では特に評価が困難とされる、化粧品原料中の不純物

・データセットの量と質の限界

や天然物中の微量成分の安全性評価に効率的で有用な手法

・TTC は確率に基づくものであり、すべての化学物質かとなることが挙げられる。皮膚感作性の TTC コンセプトを確立するためには、多様な感作性陽性物質からなる信頼

ら守るものではない。
・適用範囲が限られており、タンパク質などトレーニング

性の高いデータセットが鍵となるが、LLNA など in vivo

セットに入っていない不適格要件の明確化が必要のデータセットの拡充が期待できない現状を考えると、in

さらに、本 DST 値を用いる場合に注意すべき点として、

vitro 試験のデータセットの拡充に期待したい。

ヒトにおける無感作誘導濃度（NESIL）を用いていること

今回機械学習の手法である SVR の採用により、予測精から明らかなように、あくまでも感作未成立状態における度および頑健性の良好な強度予測モデルの開発が可能とな閾値であることが挙げられる。したがってすでに感作が成った。本モデルにより非動物実験結果による定量的リスク

立している個体の場合、今回求めた DST 値よりかなり少評価（QRA）が可能になり、製品中の配合許容濃度の算出

ない曝露量で皮膚炎が誘発する可能性がある。

などへの応用が期待できる。

以上の課題などから、皮膚感作性における TTC コンセ

いずれにしても化粧品開発における動物実験が困難にな

プトは、アイデアとして提唱されているものの、未だ行政りつつある現在、曝露量が極めて少ない場合に限られるも的規制の受け入れには至っておらず、今後上記の点も含めのの、in vitro 試験さえも不要となる皮膚感作性の TTC コて幅広い議論が必要になると思われる。それらを踏まえたンセプトの確立はニーズが高いと考えられ、本研究がその上で、今回得られた DST 値は、適切な適用範囲のもとで、きっかけとなれば幸いである。

皮膚感作性試験を伴わない包括的安全性評価の基準になる
謝可能性があると考えられた。

辞

今回設定した DST 値を用いて、製剤（女性用フェースク

本研究は、名古屋市立大学大学院薬学研究科 医薬品安リーム）中の化学物質の配合濃度閾値を算出した。経皮適全性評価学分野および国立医薬品食品衛生研究所 安全性用する製剤は、サンスクリーンなど全身に使用するもの、

予測評価部第四室との共同研究により行われたものであり、シャンプーなど洗い流すものなど様々であり、今回例とし関係者の皆様に深く感謝いたします。

て挙げた女性用フェースクリーム以外の製品タイプについまた本研究の遂行にご支援をいただきました公益財団法ても、配合濃度閾値を算出してその妥当性を議論する必要

人コーセーコスメトロジー研究財団に篤く御礼申し上げまがある。また、製品使用量は、日本化粧品工業連合会の調す。

− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

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isothiazolinones-support-passman− 66 −

シリカナノ不織布を用いた汎用皮膚三次元モデルの開発
横浜国立大学大学院工学研究院

飯島一智

In this study, epidermal and epidermal-dermal skin models were constructed using silica nano-nonwoven fabrics. To
construct the epidermal skin model, epidermal keratinocyte line, HaCaT cells, or primary normal human epidermal keratinocytes (NHEK) were seeded onto silica nano-nonwoven fabrics placed in cell culture inserts and cultured at the air-liquidinterface for two weeks in keratinocyte differentiation medium. In order to construct the epidermal-dermal skin model, fibroblast cell line, NIH3T3 cells, or primary normal human dermal fibroblasts (NHDF) were seeded and cultured for five days insilica nano-nonwoven fabrics prior to seeding of keratinocytes. Constructed models were evaluated by microscopic observation after hematoxylin and eosin staining, trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurement and quantification ofvarious epidermal/dermal-related gene expressions using real-time PCR. The thickness of epidermis of the models constructed with silica nano-nonwoven fabrics was thicker than that constructed in cell culture inserts. The expression of genes suchas hTGM1 and hLOR in epidermal models constructed on silica nano-nonwoven fabrics were much higher than those of cell
culture inserts. This means that silica nano-nonwoven fabrics may mimic the basal lamina structure and increase the functions of keratinocytes. In the construction of epidermal-dermal skin models, similar positive effect of silica nano-nonwoven
fabrics were observed. Finally, the prepared three-dimensional epidermal and epidermal-dermal skin models were evaluatedby a method similar to the OECD TG skin corrosiveness test. The three-dimensional skin models met the evaluation criteriaof the skin corrosiveness test. These results suggested the usefulness of the silica nano-nonwoven fabrics-based three-dimensional skin models.

1.

緒

動し三次元に分布することができ、十分な機械的強度によ言り長期的な細胞培養に伴う収縮を防ぐこともできる。さらEU 圏内における化粧品製品および原料の動物実験の完に高い物質拡散性を有し、三次元培養において問題となる

全禁止を受け、我が国の化粧品メーカー各社も動物実験廃内部への栄養、酸素、増殖因子などの十分な供給が可能と止を表明しており、その代替法の開発が進められている。

なる。また、近年、シリカナノ不織布中で培養することで、皮膚刺激性試験としては、OECD テストガイドラインに収

線維芽細胞のコラーゲン産生能が顕著に増加することを見載されている代替法としてコラーゲンマトリックスを用い出した 4）。

た人工皮膚三次元モデル 1）などが用いられているが、非常本研究では、シリカナノ不織布を細胞足場として用い、に高価である。今後、発展途上国を含めた世界中で実験動表皮層のみ、あるいは、真皮層と表皮層からなる人工皮膚物を用いない皮膚刺激性試験法を普及させるためには、よ

三次元モデルを作製した。作製した人工皮膚三次元モデル

り安価で取り扱いの簡便な三次元皮膚モデルの開発が必要については、従来法である表皮モデルやコラーゲンを用いと考えられる。

た真皮 - 表皮モデルと比較し、シリカナノ不織布が表皮角

我々はシリカナノ不織布を用いた細胞の三次元培養法の開発に取り組んできた化細胞や線維芽細胞に与える影響について解析を行った。

2 - 4）。ゾル - ゲルプロセスを介して２．方電界紡糸により作製されるシリカナノ不織布は高い生体適合性を示すとともに、シリカのもつ高い熱安定性のためオ

法

2. 1. 細胞剥離方法の検討

ートクレーブにより滅菌することができる。さらに、シリ皮膚モデルの作製にあたり、まず真皮層を構成する線維

カナノ不織布は、細胞外マトリックス（ECM）を形態的に芽細胞の剥離方法の検討を行った。通常のトリプシン

模倣することで細胞の高機能化に寄与する。高い空孔率を-EDTA を用いた剥離と感温性培養プレートを用いた剥離有し、細胞は多くの交互連結した孔を通じて不織布中を移について、それぞれの手法で剥離した細胞を播種した際のシリカナノ不織布への侵入能を評価した。両者に有意な差は認めなかったため、以降の実験ではより安価なトリプシ

Development of a versat ile t hree dimensional skin modelusing silica nano-nonwoven fabrics

ン -EDTA を用いた細胞剥離手法を採用することとした。

2. 2. 表皮のみからなる三次元皮膚モデルの作製
表皮のみからなる三次元皮膚モデルは、セルカルチャー

Kazutoshi Iijima
Yokohama National University

インサート内にセットしたシリカナノ不織布上にヒト表皮− 67 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

角化細胞株 HaCaT または正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）

測定により評価した。遺伝子発現解析では、各種表皮関連を播種し、市販の角化培地で 14 日間気 - 液界面培養し角遺伝子および真皮関連遺伝子の発現をリアルタイム PCR化させることで作製した（シリカ表皮モデル）。対照として、により定量した。リアルタイム PCR は hGAPDH およびセルカルチャーインサートに直接 HaCaT または NHEK を

mGAPDH をコントロールとし、ΔΔCt 法により定量化した。

播種し、シリカ表皮モデル同様に角化培地で 14 日間の気

さらに、OECD TG 皮膚腐食性試験 5）に準ずる手法により、- 液界面培養により角化させた（インサート表皮モデル）。

作製した各種三次元皮膚モデルを用いた皮膚腐食性試験を

播種細胞数は用いるセルカルチャーインサートのサイズに行った。具体的には、陽性対照の 8 N KOH および 14 . 4 %よるが、例えば 12 ウェルセルカルチャーインサートを用

HCl 処 理 後 の 生 存 率 を 3 -（4 , 5 -Dimethyl- 2 -thiazolyl）

いる場合には、播種細胞数は 2 . 5 × 105 cells とした。

- 2 , 5 -diphenyltetrazolium Bromide（MTT）アッセイにより定量化し、陰性対照の水に対する相対値で表した。

2. 3. 表皮と真皮からなる三次元皮膚モデルの作製

３．結

表皮と真皮からなるモデルは、マウス胎児線維芽細胞株

果

カ ナ ノ 不 織 布 へ 播 種 し 5 日 間 培 養 し た 後、 上 部 か ら

3. 1. 不死化細胞株を用いた三次元皮膚モデルの作製と評価

HaCaT または NHEK を播種し表皮モデルと同様に角化さ

Fig. 1 に不死化細胞株を用いた皮膚モデルの組織像を示せることで作製した（シリカ真皮・表皮モデル）。対照は、す。シリカ表皮モデルにおいて表皮角化細胞はシリカナノ

NIH 3 T 3 または NHDF を含むコラーゲンゲルを作製し、不織布中には侵入せず、その表面において角化が起こって培養することなくその上部に HaCaT または NHEK を播種いることがわかった。シリカ表皮モデル（Fig. 1 b）の表皮し角化させて作製した（コラーゲン真皮・表皮モデル）。播

層の厚みはインサート表皮モデル（Fig. 1 a）と比較してよ

種細胞数は用いるセルカルチャーインサートのサイズにより大きく、扁平重層構造が観察された。一方、シリカ真皮・るが、例えば 12 ウェルセルカルチャーインサートを用い表皮モデル（Fig. 1 c）の表皮層の厚みはコラーゲン真皮・NIH 3 T 3 または正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）をシリ

5る場合には、播種細胞数は線維芽細胞が 5 ×10 cells、表表皮モデル（Fig. 1 d）と同程度であった。

5

不死化細胞株を用いた三次元皮膚モデルの構築では、表皮角化細胞が 2 . 5 × 10 cells とした。

皮層を構成する表皮角化細胞 HaCaT がヒト由来、真皮層

2. 4. 作製した各種三次元皮膚モデルの評価を構成する線維芽細胞 NIH 3 T 3 がマウス由来の細胞株で作製した各種三次元皮膚モデルについては、形態、バリあるため、表皮層と真皮層の遺伝子発現を区別して評価す

ア機能および遺伝子発現に基づいて評価を行った。形態観ることができる。遺伝子発現解析の結果の概要を Fig. 2 に察のための試料はパラフィン包埋ブロックをミクロトーム

まとめた。シリカ表皮モデルでは、インサート表皮モデル

により薄切後、ヘマトキシリン - エオジン（HE）染色を行と比較して hTGM 1 , hLOR, hIVL, hFLG, hZNF 750 の有うことで作製した。バリア機能は経上皮電気抵抗（TEER）

意な発現上昇がみられた。さらに NIH 3 T 3 細胞を播種したシリカ真皮・表皮モデルでは、コラーゲン真皮・表皮モ
デルと比較して、hTGM 1 , hTGM 2 , mCol 4 の発現が有意に高かった。

Fig. 1 Hematoxylin and eosin staining of skin model
constructed with immortalized cell lines− 68 −

Fig. 2 Summary of gene expression in skin models
constructed with immortalized cell linesシリカナノ不織布を用いた汎用皮膚三次元モデルの開発

3. 2. 初代培養細胞株を用いた皮膚モデルの作製
次に、より生体に近い初代ヒト細胞を用いて各種皮膚モデルを作製した。各種モデルについて MTT アッセイにより細胞活性を評価した。結果、シリカ表皮モデルはインサート表皮モデルよりも、シリカ真皮・表皮モデルはコラー
ゲン真皮・表皮モデルよりも高い活性を示した。
遺伝子発現解析の結果の概要を Fig. 3 にまとめた。シリ
カ表皮モデルではインサート表皮モデルと比較して
hTGM 2 の発現上昇がみられた。また、シリカ真皮・表皮
モ デ ル で は、 シ リ カ 表 皮 モ デ ル と 比 較 し て hTGM 1 ,Fig. 3 Summary of gene expression in skin models
constructed with human primary cells

hTGM2, hZNF750 が高発現であった。さらにシリカ真皮・表皮モデルは、コラーゲン真皮・表皮モデルと比較して
hTGM 2 , hCOL 1 , hCOL 3 , hCOL 4 の発現が上昇した。

3. 3. 皮膚モデルとしての利用可能性の評価
作製した各種三次元皮膚モデルについて、OECD TG 皮
膚腐食性試験 5）に準ずる手法により評価を行った。シリカ
表皮モデルにおいて皮膚腐食性の評価基準である、陽性対
照物質添加後 3 min における生存率 50 ％以下、または添加後 60 min における生存率 15 ％以下のいずれかを満たしていた（Fig. 4）。

４．考察

シリカナノ不織布を細胞足場として用い、不死化細胞株
または初代培養細胞より表皮のみからなる皮膚三次元モデ
ル（シリカ表皮モデル）
および、真皮と表皮からなる皮膚三Fig. 4 MTT assay of primary cell skin models conductedaccording to protocol of skin corrosion test次元モデル
（シリカ真皮・表皮モデル）を作製した。
シリカ表皮モデルは扁平重層構造を有しており、表皮層に、過去の我々の報告 4）と同様にシリカナノ不織布中におの厚みは、セルカルチャーインサート内で作製される従来

ける三次元培養が線維芽細胞の機能を高めたと考えられる。

の表皮モデルと比較して 2 倍程度の厚みを有していた。イ

次に、より生体に近い初代ヒト細胞を用いて各種皮膚モ

ンサート表皮モデルと比較してシリカ表皮モデルにおいてデルを作製した。MTT アッセイにおいてシリカ表皮モデ

発現が亢進していた遺伝子群について詳細に調べると、

ルはインサート表皮モデルよりも、シリカ真皮・表皮モデ

hTGM 1 および hLOR は角化マーカーであり、hIVL およ

ルはコラーゲン真皮・表皮モデルよりも高い活性を示した。

び hFLG はバリア機能に関連するタンパク質をコードし、シリカナノ不織布を用いて作製した両方の三次元皮膚モデ

hZNF 750 はマーカー細胞増殖・接着マーカーである。こルでは細胞数が多く、播種後の増殖能が高い可能性が示唆

れより表皮層の厚みの増加は、表皮角化細胞の高機能化（表された。

皮の角化、バリア機能上昇や細胞増殖の促進）によるもの

遺伝子発現解析の結果、シリカ表皮モデルではインサーと推測された。シリカナノ不織布の剛性の高い繊維構造がト表皮モデルと比較して hTGM 2 の有意な発現上昇が確

形態的に基底膜構造を模倣することで、その上部に播種さ認された。TGM 2 は表皮の基底層付近の細胞において高れた表皮角化細胞の機能が亢進された可能性が考えられる。

発現することが知られている。さらにシリカ真皮・表皮モ

一方、シリカ真皮・表皮モデルの表皮層の厚みはコラー

デルでは、コラーゲンモデルと比較して hTGM 2 , hCOL 1 ,ゲン真皮・表皮モデルと同程度であったが、表皮角化細胞

hCOL 3 , hCOL 4 の発現が有意に上昇した。これらの結果の角化に関わる hTGM 1、表皮の基底層付近の細胞においは、初代培養細胞を用いた場合にも、不死化細胞の結果同て高発現する hTGM 2 および真皮の基底膜付近の細胞にお様に表皮細胞の高機能化がもたらされることを表している。

いて高発現する mCol 4 の発現が有意に高かった。シリカ

興味深いことに、シリカ真皮・表皮モデルではシリカ表皮

表皮モデルと同様にシリカナノ不織布の剛性の高い繊維構モデルと比較して hTGM 1 , hTGM 2 , hZNF 750 の有意な造が基底膜を模倣することで表皮の角化を促進するととも発現上昇が確認され、線維芽細胞との共培養による影響が− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

不死化細胞株を用いた時と比較してより顕著にみられた。

く、安価で安定的に供給可能である。今後、皮膚腐食性試

これはおそらく、初代培養細胞においては線維芽細胞が分験における被験物質の種類を拡大して検証を行うことで、泌し表皮角化細胞に影響を与える因子の分泌量が多い、あシリカナノ不織布を用いた新規皮膚モデルの有効性を明ら

るいは表皮角化細胞のこれらの因子への感受性が高い、たかにする予定である。

めと考えられる。
最後に、作製した各種三次元皮膚モデルについて、
5）（引用文献）

OECD TG 皮膚腐食性試験 に準ずる手法により評価を行

1） OECD TG439

った。作製した各種三次元皮膚モデルは、皮膚腐食性試験

2） Iijima K, Ishikawa S, Sasaki K, Hashizume M,
Kawabe M, Otsuka H, Osteogenic differentiation ofの評価基準を満たしていた。
三次元皮膚モデルのバリア機能を評価するために実施しbone marrow-derived mesenchymal stem cells in

た TEER 測定では、シリカナノ不織布とセルカルチャー

electrospun silica nonwoven fabrics, ACS Omega, 3,
10180-10187（2018）．

インサートとの間に生じる空隙の影響のため、極端に低い値を示し、正確な評価を行うことができなかった。今後、

3） Ishikawa S, Iijima K, Sasaki K, Hashizume M,

作製した三次元皮膚モデルを固定するなどの対策を講じた

Kawabe M, Otsuka H, Cartilage differentiation of bone

うえで、物質透過性とともに評価を行う予定である。

marrow-derived mesenchymal stem cells in three-５．総

dimensional silica nonwoven fabrics, Appl. Sci., 8, 1398

括（2018）．

シリカナノ不織布を細胞足場として用い、表皮層のみ、

4） Ishikawa S, Iijima K, Matsukuma D, Iijima M, Osawa

または真皮層と表皮層からなる皮膚三次元モデルの作製に

S, Otsuka H, Silica-based nonwoven fiber fabricated by

成功した。シリカナノ不織布は表皮角化細胞や線維芽細胞

electrospinning to promote fibroblast functions, Bull.

の機能を高め、優れた皮膚三次元モデルの構築を可能にす

Chem. Soc. Jpn., 93, 477-481（2020）．

ることが示された。さらに、化学合成されるシリカナノ不5） OECD TG431

織布は動物由来のコラーゲンのような供給リスクなどもな− 70 −

黄色ブドウ球菌免疫かく乱タンパク質を介したアトピー性疾患発症・増悪機構の解明
名古屋市立大学大学院薬学研究科医療機能薬学専攻 衛生化学分野

伊藤

佐生智

Staphylococcus aureus (S. aureus) colonizes approximately 30% of the population asymptomatically but causes various diseases such as food poisoning, suppurative disease, sepsis, or systemic infections. S. aureus is associated with atopic
dermatitis (AD); it frequently colonizes in the skin of atopic dermatitis. S. aureus is notorious for producing a series of
exotoxins and immune disturbing proteins, however none of the staphylococcal exotoxins except with δ-toxin and phenol
soluble modulins had been reported to activate mast cells and basophils, critical immune cells involved in the developmentof Th2 cell-mediated allergic inflammation such as atopic dermatitis. In this study, we aimed to identify staphylococcal exotoxins that activate mast cells and basophils. We found that α-hemolysin, a principal small β-barrel pore-forming toxin, did
not activate mast cells individually, but it augmented the degranulation induced by other stimuli. We showed that among 14
members of staphylococcal superantigen-like protein, SSL12 induced the degranulation and cytokine production of mast cellin an IgE-independent manner, and SSL12 evoked local inflammation in vivo. We also showed that SSL12 induced the production of IL-4 in bone marrow derived basophils and freshly isolated murine basophils in bone marrow cells. These results
propose the novel immune regulatory activity of α-hemolysin and SSL12 by activating mast cells and basophils that contributes to the development of allergic inflammation disorders such as atopic dermatitis.

1.

緒胞の脱顆粒を引き起こすことが示され 1 , 2），これらのペプ

言

チド性毒素がアトピー性皮膚炎増悪因子の一つであるとい

アトピー性皮膚炎は皮膚の炎症を伴う疾患であり，そのう考えが受け入れられている．しかしながら他の黄色ブド炎症においてはマスト細胞が中心的な役割を果たしている．

ウ球菌毒素もアトピー性皮膚炎の発症増悪に関与している

また血液中の存在割合は少ないが多量の IL- 4 を産生する可能性は依然残されている．本研究ではマスト細胞と好塩

好塩基球もアトピー性皮膚炎の病態形成に関与している．

基球を活性化する黄色ブドウ球菌毒素を探索し，その生理

一方，黄色ブドウ球菌は一部の健常人においても検出され機能を解析することで，黄色ブドウ球菌とアトピー性皮膚る常在菌であるが，食中毒，化膿性疾患や敗血症の起因菌炎の毒素を介した関係を明らかにすることを目指した．

でもある．黄色ブドウ球菌はアトピー性皮膚炎患部で高頻２．方度に検出されることが知られており，本菌とアトピー性皮膚炎との関連が指摘されている．黄色ブドウ球菌は溶血毒

法

2. 1. 組換え黄色ブドウ球菌毒素の調製

素ヘモリジンや白血球崩壊毒素ロイコシジン，MHC と

黄色ブドウ球菌毒素，免疫かく乱タンパク質は大腸菌を

TCR を非特異的に架橋して T 細胞の非特異的活性化を引用いた組換えタンパク質として調整した．黄色ブドウ球菌

き起こすスーパー抗原，スーパー抗原活性も示す腸管毒素

ATCC 27733 株のゲノムより Primestar GxL（Takara）をエンテロトキシンなど多彩な外毒素を産生する．さらに本用いて増幅後，発現プラスミド pCold-II（Takara）にクロ菌は IgG の Fc 部に結合し，抗体の機能を阻害する Protein

ー ニ ン グ し た 後， エ ン ド ド キ シ ン の 産 生 能 を 欠 い た

A をはじめとする，多彩な免疫かく乱タンパク質を産生す

ClearColi（Lucigen）に形質転換した．続いて IPTG 及びコる．以前より黄色ブドウ球菌由来タンパク質がアトピー性ールドショックにより組換え毒素を N 末端 6 xHis 融合タン

皮膚炎の発症・増悪に関与している可能性が指摘されていパク質として発現誘導した．大腸菌を回収し，超音波処理

たが，マスト細胞や好塩基球を活性化する毒素は見出されにより破砕後，Ni セファロース 6 FF（GE healthcare）を用ていなかった．最近黄色ブドウ球菌のペプチド性溶血毒素

いて精製し，PBS に対して透析して調製した．

である δ 毒素や PSM（phenol soluble modulin）がマスト細2. 2. 好塩基球・マスト細胞の調製
マスト細胞は BALB/c マウス骨髄細胞を 10 ％ FBS，ペInvolvement of staphylococcal immunedistubing proteins in atopic dermatitis

ニシリン，ストレプトマイシン , 2 - メルカプトエタノール

Saotomo Itoh及びマウス IL- 3 を添加した RPMI 1640 培地で存在下 4 週

Department of Molecular and Cellular
Health Science, Graduate School of
Pharmaceutical Science, Nagoya City
University

間培養することにより調製した．好塩基球はマウス骨髄細胞を上述の条件で 2 週間培養したのち，c-Kit 陽性細胞をビオチン化抗 c-Kit 抗体（BioLegend）とストレプトアビジ− 71 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

ンを共有結合した磁気ビーズ（IMAG Streptavidin Particles

は検証されていなかった．そこで Hla のマスト細胞の活性

Plus DM，BD Bioscience）を用いて除去することにより調化に対する影響を解析した．先行研究と同様に，Hla は製した．調整したマスト細胞，好塩基球の確認は c‒Kit 及

30 µg/mL 以下の濃度でマスト細胞を傷害せず，脱顆粒もび FcεRI の発現をフローサイトメーター（FACD Verse，

誘導しなかった．一方でマスト細胞を IgE- 抗原複合体，

BD Bioscience）
で解析することにより行った．

イオノフォアで処理した際に誘導される脱顆粒は Hla 存在
下で 2 倍程度に増強された（図 1 AB）．この脱顆粒増強作

2. 3. マスト細胞，好塩基球細胞機能に対する組換え
毒素の影響

用は Hla の濃度依存的であり，10 µg/mL 以上の Hla の存在
下で増強作用が観察された（図 1 C）
．また Hla による脱顆

組換え毒素のマスト細胞の脱顆粒誘導活性及び細胞傷害

粒増強作用はカリウムイオンとナトリウムイオンの濃度を活性は各々顆粒酵素 β‒ ヘキソサミニダーゼ（βHex），細胞

細胞内の濃度に一致させた緩衝液中では観察されなかった

質酵素乳酸脱水素酵素（LDH）の放出により評価した．タ（図 1 D）．膜孔形成能を欠いた二つの Hla の変異体｛Hla5イロード液に懸濁したマスト細胞（1 × 10 /well）を毒素存（H 35 L）
；溶血不全変異体，Hla（PSGS）；膜孔の本体であ在下で 37 ℃，30 分インキュベート後，遠心して上清を回る β-ステムに相当する領域を PSGS の 4 アミノ酸に置換し収した．上清中の βHex の酵素活性を p- ニトロフェニル ‒た変異体｝では脱顆粒増強能が認められなかった（図 1 E）．

N‒ アセチル ‒β‒D‒ グルコピラノシド（富士フィルム）を基

以上より Hla は単独ではマスト細胞の脱顆粒を惹起しない質として測定することで脱顆粒誘導活性を評価し，LDHが，他の刺激によるマスト細胞の脱顆粒を増強すること，の酵素活性を Cytotoxicity LDH Assay Kit‒WST（同仁化この脱顆粒増強作用には Hla による膜孔形成が必要である学）を用いて測定することで細胞傷害活性を評価した．好ことが示された．

塩基球およびマスト細胞のサイトカイン mRNA の発現はし，3 時間後に細胞を回収し，RNA を抽出した．全 RNA

3. 2. Staphylococcal superantigen-like 12によるマスト細胞の活性化作用を Primescript RTMastermix（Takara）を用いて逆転写し

黄色ブドウ球菌のStaphylococcal superantigen-like（SSL）

た の ち，Thermal cycler Dice Real-Time System 及 びファミリーはスーパー抗原と類似の立体構造をとりながら，

SYBR Green Premix Ex Taq Kit（Takara）を用いて個々

スーパー抗原活性を示さない 14 種からなる分泌毒素であのサイトカイン mRNA 発現量を測定した．サイトカイン

る．私たち及び海外のグループにより，SSL ファミリーは定量的 RT-PCR により評価した．106 の細胞を毒素で処理

6

タンパク質は ELISA により測定した．10 の細胞を毒素で種々の免疫関連分子を標的とし，その機能を阻害すること処理し，24 時間後に培養上清を回収し，上清中のサイト

で免疫回避に働く免疫かく乱タンパク質であることが示さ

カ イ ン 量 を eBioscience ELISA Ready-SET Go（Thermo

れている 3）．しかしながら SSL ファミリーのマスト細胞に

fisher）
を用いて定量した．

対する作用は解析されていなかった．そこで SSL ファミリーがマスト細胞を活性化するか否かを検討した．14 種の2. 4. 組換え毒素による局所炎症誘導作用

SSL のうち，SSL 1 から SSL 11 及び SSL 13 はマスト細胞毒素による局所炎症惹起作用はエバンスブルー漏出試験の脱顆粒を誘導しなかったが，SSL 12 はマスト細胞の脱により評価した．BALB/c マウスに 1 % エバンスブルー溶

顆粒を惹起し，SSL 14 も SSL 12 に比べ 1 / 20 程度である

液を尾静脈より投与し，耳介に組換え毒素を皮内投与した．

が脱顆粒を誘導した（図 2 AB）．SSL 12 によるマスト細胞

30 分後，血管からのエバンスブルーの漏出を観察した．

の脱顆粒の誘導は濃度依存的であり，1 . 1 µg/mL 以上の写真撮影後，耳介をホルムアルデヒドで抽出し，620 nm

SSL 12 によって有意に脱顆粒が誘導された（図 2 C）
．先にの吸収を測定することでエバンスブルー漏出量を評価した．

報告されている δ 毒素はマスト細胞に対し βHex と同時に

３．結

LDH の漏出を引き起こしたが，SSL 12 は 30 µg/mL まで

果の 濃 度 に お い て LDH の 漏 出 を 引 き 起 こ さ な か っ た（ 図3. 1. 溶血毒素αヘモリジンによるマスト細胞の応答増
強作用mRNA の発現とタンパク質分泌を誘導した（図 2 E~H）．

α ヘモリジン（Hla）は黄色ブドウ球菌の産生する代表的さらにあらかじめエバンスブルーを静脈投与したマウスのな溶血毒素であり，標的細胞表面でホモ 7 量体からなる膜

耳介に 10 µg の SSL 12 を投与したところ，エバンスブルー

孔を形成し，標的細胞を傷害する．Hla はマスト細胞の活の血管外への漏出が認められた（図 3）．以上より SSL 12 は性化を惹起しないことがすでに報告されているが 2），免疫

直接マスト細胞を活性化し，局所炎症を惹起することが示

複合体など他の刺激によるマスト細胞活性化に対する影響

された．

2 D）
． ま た SSL 12 は マ ス ト 細 胞 の IL- 6 及 び IL- 13 の− 72 −

黄色ブドウ球菌免疫かく乱タンパク質を介したアトピー性疾患発症・増悪機構の解明

図1

Hlaによるマスト細胞の脱顆粒増強作用− 73 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図2

SSL 12によるマスト細胞の活性化− 74 −

黄色ブドウ球菌免疫かく乱タンパク質を介したアトピー性疾患発症・増悪機構の解明られた（図 4 B）
．この IL- 3 処理骨髄細胞から c-Kit 陽性細胞を除去して好塩基球を調製し（図 4 C），SSL 10，SSL 12，
SSL 14 による IL- 4 産生を評価したところ，SSL 12 のみが好塩基球からの IL- 4 産生を誘導した（図 4 D）．また熱処理した SSL 12 では IL- 4 誘導能は認められなかった（図4 D）．SSL 12 による好塩基球からの IL- 4 産生は濃度依存的であり，0 . 1 µg/mL 以上の SSL 12 によって有意な IL- 4
産生が認められた（図 4 E）．SSL 12 による IL- 4 産生はマウスより単離した直後の骨髄細胞においても認められた．
以上より SSL 12 は好塩基球からの IL- 4 産生を誘導することが示された．

４．考図3

察本研究により Hla は単独ではマスト細胞の傷害も活性化

SSL 12の局所炎症誘導作用を引き起こさないが，他の刺激による脱顆粒を増強するこ

3. 3. SSL12による好塩基球からのIL-4産生の誘導とが示された．変異型 Hla を用いた解析により，Hla によ好塩基球の存在比率は血液中顆粒球の 1 ％以下であるが，るマスト細胞の脱顆粒増強作用には Hla による膜孔形成を刺激に応答して大量の IL- 4 を産生することが知られてい必要とする．また細胞外のカリウム，ナトリウム組成を変る．好塩基球は IL- 4 産生を介して Th 2 型免疫反応を制御

更した条件での解析より Hla による脱顆粒の増強には，することからアトピー性皮膚炎への関与も示されている．

Hla の形成した膜孔を介してのカチオンの流出入が必要でそこで SSL ファミリーが好塩基球を活性化するか否かを検ある．マスト細胞が免疫複合体によって脱顆粒を誘導され討した．骨髄細胞を 14 日間 IL- 3 存在下で培養することで，る際にはカリウムチャネル KCa 3 . 1 を介して細胞内のカリFcεRI（+）c-Kit（-）の好塩基球のフェノタイプを示す細胞

ウムが流出し，その後のカルシウムイオンの流出と脱顆粒に分化する（図 4 A）．この IL- 3 処理骨髄細胞を用いて SSLを促進することが知られている 4）．マスト細胞に結合し，ファミリーの IL- 4 誘導活性を検討した．SSL 12 で処理し膜孔形成した Hla はイオンの通り道として機能し，カリウ

た IL- 3 処理骨髄細胞から IL- 4 の産生が認められ，SSL 10，

ムの流出を促進することで脱顆粒を促進していると考えら

SSL 14 も SSL 12 と比して量は少ないが IL- 4 の誘導が認め

れる．

図4

SSL 12による好塩基球からのIL- 4産生− 75 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

14 種存在する SSL ファミリーは構造的に類似性のない

し活性化作用を示すことを明らかにできた．また SSL 12

種々の免疫関連分子を標的とし，免疫かく乱作用を示すこが好塩基球を刺激して IL- 4 産生を誘導するという知見は，とが知られている．本研究により SSL の一つ SSL 12 がマ

黄色ブドウ球菌が毒素を介して免疫応答を Th 2 優位に導スト細胞の脱顆粒とサイトカイン産生を誘導することが示

き，免疫アレルギー疾患の発症増悪に関わる可能性を示すされた．マスト細胞を直接活性化する黄色ブドウ球菌毒素ものである．今回見出した黄色ブドウ球菌毒素によるマスと し て は ペ プ チ ド 性 溶 血 毒 素 δ 毒 素 と Phenol soluble

ト細胞と好塩基球の活性化作用により，アトピー性皮膚炎

modulin が報告されている．δ 毒素はマスト細胞に対し，と疾患患部での黄色ブドウ球菌の常在の関係を説明できる

脱顆粒と同時に膜傷害を引き起こすが，SSL 12 は膜傷害可能性がある．本研究の成果は，アトピー性皮膚炎をはじを引き起こさずに脱顆粒を誘導することから，SSL 12 は δめとする免疫アレルギー性疾患の予防法，治療法の開発に毒素とは異なったメカニズムでマスト細胞を活性化してい寄与し，アレルギー患者の肉体・精神・社会的な健康の獲得・ると考えられる．本研究で行った in vitro の実験は IgE 及維持に貢献すると考えている．なお本報告書に記載した結び抗原が存在しない条件下で行われている．したがって果を含む内容で 2019，2020 年に論文発表を行った 5 - 7）．

SSL 12 によるマスト細胞の活性化は IgE 非依存的経路による．私たちは SSL 12 がマスト細胞の表面に結合すること， （引用文献）
SSL 12 によるマスト細胞からのサイトカイン産生はチロ

1） Nakamura Y, Oscherwitz J, Cease KB, Chan SM,

シンキナーゼの阻害薬等で抑えられることを見出しており，

Munoz-Planillo R, Hasegawa M, et al. Staphylococcus

SSL 12 は何らかの受容体を介してマスト細胞を活性化しdelta-toxin induces allergic skin disease by activatingていると考えられる．

mast cells. Nature. 2013; 503（7476）: 397-401.

本研究により SSL 12 が好塩基球からの IL- 4 産生を誘導

2） Hodille E, Cuerq C, Badiou C, Bienvenu F, Steghens

することも示された．好塩基球の IL- 4 産生を誘導する因JP, Cartier R, et al. Delta Hemolysin and Phenol-

子としては IgE- 抗原複合体，IL- 3 などのサイトカイン，

Soluble Modulins, but Not Alpha Hemolysin or Panton-

寄生虫由来のプロテアーゼや細菌細胞壁成分などが知られValentine Leukocidin, Induce Mast Cell Activation.

ている．本研究で見出した SSL 12 は細菌の外毒素としてFrontiers in cellular and infection microbiology. 2 0 1 6;は初めての IL- 4 誘導因子である． IL- 3 処理骨髄細胞を

6: 180.

用いた解析では SSL 12 だけでなく SSL 10，SSL 14 も少な

3） 伊藤佐生智 . 黄色ブドウ球菌の産生する免疫かく乱毒

いながら IL- 4 を誘導したが，一方で調製した好塩基球に素ファミリー staphylococcal superantigen-like proteins.

お い て は SSL 12 の み が IL- 4 を 誘 導 し た． し た が っ て

生化学 . 2017; 89（6）: 861-5.

IL- 3 処理骨髄細胞における SSL 10，SSL 14 による IL- 4 産

4） Shumilina E, Lam RS, Wolbing F, Matzner N,

生は好塩基球の調製過程で除去された c-Kit 陽性細胞によZemtsova IM, Sobiesiak M, et al. Blunted IgE-mediated

るものであると考えられる．SSL 14 はマスト細胞においactivation of mast cells in mice lacking the Ca -て SSL 12 の 1 / 20 程度であるが脱顆粒を誘導したこと，

activated K channel KCa3.1. J Immunol. 2008; 180（12）:SSL 10 は IgG，プロトロンビンとホスファチジルセリンに

8040-7.

2++

結合することが報告されている．SSL 10 と SSL 14 は好塩

5） Nishiyama S, Urabe A, Morikawa A, Kobayashi M,

基球以外の細胞に対し，SSL 12 とは異なった細胞に対しOnozaki K, Itoh S, et al. Staphylococcal superantigen-て IL- 4 産生を誘導すると考えられる．SSL 12 は in vitro

like 1 2 induces the production of interleukin 4 inで調製した好塩基球だけでなく，好塩基球をわずか（0 . 5％）murine basophils. Biochem Biophys Res Commun.

に含む，単離した直後の骨髄からも IL- 4 産生を誘導した．

2020; 532（2）: 200-4.

したがって SSL 12 は in vivo においても IL- 4 産生を誘導し

6） Hayashi K, Itoh S, Morikawa A, Onozaki K, Taki S,

うると考えられる．SSL 12 による好塩基球からの in vitro

Tsuji T, et al. Staphylococcal alpha-hemolysin does not

での IL- 4 産生の解析は IgE 及び抗原が存在しない条件下

induce cell damage in murine mast cells but itで行われている．したがって SSL 12 は IgE 非依存的に好augments the degranulation induced by FcepsilonRI

塩基球を活性化すると考えられる．

cross-linking and ionomycin. Biochem Biophys Res

５．総

Commun. 2019; 508（1）: 263-9.

括7） Kobayashi M, Kitano T, Nishiyama S, Sanjo H, Onozaki

本研究により，すでに報告されている δ 毒素や Phenol

K, Taki S, et al. Staphylococcal superantigen-like 1 2

soluble modulin だけでなく，黄色ブドウ球菌毒素 Hla とactivates murine bone marrow derived mast cells.

SSL 12 が炎症のエフェクター細胞であるマスト細胞に対Biochem Biophys Res Commun. 2019; 511（2）: 350-5.

− 76 −

転写因子 SOX2 による皮膚虚血再灌流障害（急性期褥瘡）における制御機構の解明および新規治療法の開発
群馬大学大学院医学系研究科皮膚科学

内山明彦

Cutaneous ischemia-reperfusion (I/R) injury is engaged with the early pathogenesis of cutaneous pressure ulcers (PUs).
Our previous work identified that the induction of genes that were consistently upregulated in the oral mucosa, especiallytranscription factor SOX2, accelerate wound healing in skin. The aim of this study was to investigate the effect of SOX2 on
the formation of PUs after cutaneous I/R injury and determine the molecular and cellular mechanisms. We found that induction of SOX2 in the keratinocytes significantly suppress the formation of PUs. The induction of SOX2 in the keratinocytes
suppressed the numbers of infiltrating inflammatory cells (MPO+ neutrophils, CD68+ macrophages) in the skin area after I/R
injury. In SOX2 expressing ice, the number of CD31+ endothelial cells was significantly increased, and hypoxic area was significantly decreased when compared with control mice. In SOX2/OKD-48 (Keap1-dependent oxidative stress detector, No
48-luciferate) mice, Nrf2 antioxidant response pathway was significantly enhanced with respect to control OKD-48 mice. In
vitro, SOX2 expressing keratinocytes significantly decreased the numbers of apoptotic cells under H2O2 stimulation. These
results suggest that the induction of SOX2 in the keratinocytes might protect against the development of PUs after cutaneous
I/R injury by enhancement of anti-oxidative response, resulted in suppression of apoptosis, protection of vascular damages
and inhibition of infiltration of inflammatory cells.

1.

緒

癒能を有する口腔粘膜表皮に発現する転写因子 SOX 2 を言同定した 2）。また表皮細胞に発現させた SOX 2 は創傷部位

褥瘡は自立体動が困難な高齢者や知覚神経や動機能障害

における血管新生やヒアルロン酸の産生の亢進、EGFR シを呈する様々な疾患に関連して発症する皮膚疾患である。

グナルを活性化させることで皮膚創傷治癒を促進させるこ

超高齢化社会である本邦において、褥瘡発症のリスクは今とも明らかにした 3）。しかし、転写因子 SOX 2 における皮後さらに高まることが予想される。褥瘡は急性期（紅斑・膚虚血再灌流障害（急性期褥瘡）及び酸化ストレスの制御機紫斑期）を経て慢性期（潰瘍形成期）に到る。潰瘍形成後は構については未だ明らかとなっていない。そこで本研究で様々な外用治療が行われているが、難治や再発を繰り返す

は、これまでに解明されていない転写因子 SOX 2 による症例が多く、医療界ならびに社会的問題となっている。し皮膚虚血再灌流障害に関する制御機構及び治療効果の有無

かし、潰瘍形成前の急性期褥瘡（紅斑・紫斑期）
において、を明らかにすることを目的とした。

その後の潰瘍形成を防ぐ有効な治療は未だ確立されていな

２．方い。そのため、患者の QOL の向上や治療期間・医療費の削減のためにも、急性期褥瘡に対する新たな治療法の開発

法

2. 1. 皮膚虚血再灌流モデルが期待されている。我々はこれまでに急性期褥瘡（皮膚虚2 枚の磁石（1180 G）を用いて背部の皮膚を両方向から血再灌流障害）の病態において酸化ストレスや血管障害が12 時間圧迫（虚血）させた後に磁石を外した（再灌流）。連

重要であり、それらを抑制することでその後の潰瘍形成を

日虚血再灌流部位の写真撮影を行い潰瘍部の面積を予防できることを見出した 1）。

ImageJ software を用いて計測した。

口腔粘膜では皮膚と比べて創傷が早期にかつ瘢痕形成を残さずに治癒することが知られている。我々はこの知見を2. 2. マウス

もとに口腔粘膜上皮と皮膚表皮細胞の遺伝子発現の違いにタモキシフェン投与下に表皮細胞特異的に SOX 2 を発よる創傷治癒制御機構の違いについて検討を行った。その現するマウス（K 14 CreERTM/LSL-SOX 2）4）
（SOX 2 マウ

結果、創傷治癒皮膚の表皮細胞には発現せず、高い創傷治ス）を用いてコントロール群（DMSO：100 μL）とタモキシ
フェン群（DMSO：タモキシフェン 1 . 5 mg/ 100 μL）を 5 日
間連日で腹腔内投与し、1 週間後から実験を行った（図 1）。

The role of transcription factor SOX 2
in the regulation of cutaneous I / R
injuryAkihiko Uchiyama

また酸化ストレス可視化マウス（OKD- 48）5）と SOX 2 マウ
スを掛け合わせて SOX 2 /OKD- 48 マウスを作成し、皮膚
虚血再灌流後における酸化ストレスに関して評価した。

Department of Dermatology, Gunma
University Graduate School of Medicine− 77 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図1

SOX 2マウスを用いた皮膚虚血再灌流モデル
図2

図3

虚血再灌流部位の潰瘍面積の比較

炎症細胞浸潤の評価

2. 3. マウス初代表皮細胞培養

皮膚虚血再灌流障害により生じる潰瘍形成に対する影響を

SOX 2 マウスの出生後 0 ～ 2 日目の表皮シートから初代評価した。コントロール群と比較してタモキシフェン投与

表皮培養細胞を作成した 。過酸化酸素 0 . 5 mM 刺激下に群では潰瘍形成が虚血再灌流後 1 日目から 8 日目まで有意おけるアポトーシス細胞数について TUNEL 染色を用いてに抑制された（図 2）。

6）比較、検討した。

3. 2. 皮膚虚血再灌流後に生じる炎症細胞浸潤の検討
2. 4. 酸化ストレス可視化

SOX 2 マウスを用いて、表皮細胞に発現させた SOX 2 のSOX 2 /OKD- 48 マウスを用いて皮膚虚血再灌流後の皮皮膚虚血再灌流障害により生じる炎症細胞浸潤について免膚組織を採取しルシフェリン溶液（0 . 3 mg/mL）
で処理した疫染色にて検討を行った。タモキシフェン投与群において後に IVIS（PerkinElmer）
で輝度を測定した。

浸潤する好中球（MPO 陽性）の数は 1 日目、3 日目に、ま３．結たマクロ―ファージ（CD 68 陽性）の数は 1 日目においてコ

果ントロール群と比較して有意に低下した（図 3）。

3. 1. 皮膚虚血再灌流後に生じる潰瘍形成の検討
SOX 2 マウスを用いて、表皮細胞に発現させた SOX 2 の− 78 −

転写因子 SOX2 による皮膚虚血再灌流障害（急性期褥瘡）における制御機構の解明および新規治療法の開発

図4

血管量と低酸素領域の評価

図5

3. 3. 皮膚虚血再灌流後の低酸素領域、血管傷害の検討

酸化ストレス応答の検討

４．考察

次に SOX 2 マウスにおけるコントロール群、タモキシ

表皮細胞特異的 SOX 2 発現マウスを用いた皮膚虚血再フェン投与群で皮膚虚血再灌流部での低酸素領域、血管傷

灌流障害（褥瘡モデル）の検討により、通常 SOX 2 を発現

害について免疫染色法で検討を行った。タモキシフェン投しない皮膚表皮細胞に SOX 2 を発現させることで皮膚虚

与群では血管内皮細胞（CD 31 陽性）の割合がコントロール

血再灌流後に生じる潰瘍形成が抑制されることが明らかと群と比較して有意に増加していた。さらに低酸素領域なった。SOX 2 が潰瘍形成を抑制する要因として、虚血再（α-pimonidazole 抗体陽性）についても同様に検討を行った

灌流障害後に生じる酸化ストレスに対する Nrf 2 -Keap 1

ところ、タモキシフェン投与群ではコントロール群と比較

系の活性化が関与している可能性が示唆された。その結果、して低酸素領域が有意に低下した（図 4）。

表皮細胞のアポトーシスを抑制し、炎症性サイトカイン産生の低下などによる血管傷害の軽減、低酸素領域の低下及3. 4. SOX2による酸化ストレス応答に対する検討

び炎症細胞浸潤の減少が生じた可能性が考えられた。今後

SOX 2 /OKD- 48 マウスを用いて皮膚虚血再灌流後におは転写因子 SOX 2 による皮膚虚血再灌流障害の制御機構

ける酸化ストレス防御機構（Nrf 2 -Keap 1 系）について検討に お い て、SOX 2 が タ ー ゲ ッ ト と す る 遺 伝 子 の 同 定 やを行った。タモキシフェン投与群ではコントロール群と比SOX 2 による酸化ストレス応答に関する制御機構に関して較して皮膚虚血再灌流後の皮膚部位において Nrf 2 -Keap 1

詳細な検討を行う。SOX 2 と同等の効果が得られる薬剤のの活性化が上昇する傾向がみられた（図 5）。さらに SOX 2

同定によって褥瘡発症予防につながる革新的な新規治療薬

マウス由来初代表皮細胞培養の実験系において過酸化水素が期待できる。急性期褥瘡において、その後に生じる潰瘍（H 2 O 2）により生じるアポトーシス細胞について TUNEL

形成を抑制することができれば患者の疼痛の軽減や潰瘍治

染色によって検討を行った。タモキシフェン投与群ではコ

癒後の瘢痕形成を防ぐことができる。その結果医療費や人ントロール群と比較して酸化ストレスにより生じるアポト

件費、労働量の軽減につながることが予想され、高齢化社

ーシス細胞数が有意に抑制した（図 6）。

会への高い貢献が期待できる。

− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図6

酸化ストレスとアポトーシス細胞の検討（引用文献）

EGFR/MEK/ERK signaling mediated by EGFR

1） Sekiguchi A et al. Botulinum toxin B suppresses theligands. J Invest Dermatol. 139, 1809-1820（2019）．

pressure ulcer formation in cutaneous ischemia-4） Yun, L. et al. Evidence that SOX2 overexpression isreperfusion injury mouse model: Possible regulation of

oncogenic in the lung. PLoS One. 5, e11022（2010）．

oxidative and endoplasmic reticulum stress. J Dermatol5） Oikawa D. et al. A transgenic mouse model formonitoring oxidative stress. Sci Rep. 2, 229（2012）．

Sci. 90, 144-153（2018）．
2） Iglesias-Bartolome R. et al. Transcriptional signature

6） Lichti Ulrike. et al. Isolation and short-term culture

primes human oral mucosa for rapid wound healing.

of primary keratinocytes, hair follicle populations and

Sci Transl Med. 10, eaap8798（2018）．

dermal cells from newborn mice and keratinocytes

3） Uchiyama A. et al. SOX2 epidermal overexpression

from adult mice for in vitro analysis and for grafting topromotes cutaneous wound healing via activation of

immunodeficient mice. Nat Protoc. 3, 799-810（2008）．

− 80 −

皮膚で発現する化学物質受容体が体の温度適応に与える影響
甲南大学大学院自然科学研究科／統合ニューロバイオロジー研究所

太田

茜、高 垣

菜式

Animals senses temperature information for acclimation and habituation to dynamically changing environmental temperature conditions. However, their molecular and cellular machinery has not been well known. In this analysis, nematode
Caenorhabditis elegans was utilized to study molecular and cellular machinery of temperature tolerance. Through the analysis, chemical receptor expressing in cuticle was involved in temperature acclimation of the body.

1．緒

せたり、細胞膜の組成を不飽和脂肪酸に置き換えることで言

低温耐性を獲得していると考えられている。このように、温度は生体に影響を与える重要な環境情報であり、体温低温への適応や耐性に関して、最終的な脂質や糖の蓄積にの 1 ℃の変化が生体の状況に大きな影響を与える。これまよる不凍化が知られている一方で、このような不凍化を引でに環境温度に対する生体調節について、主に生化学的なき起こすまでの温度情報の受容や温度情報伝達に関しては、視点から解析が行われてきたが、その分子機構については、未知の点が多く残されている。その理由として、膨大な細未知の点が多く残されている。そのような背景において、胞によって構成される生物種では、それらの細胞からなる

従来の神経系に加えて表皮や皮下組織における温度の受容

細胞間ネットワークと温度適応との相関性を解明するためやその制御が、個体の温度に対する適応や耐性に重要であのタイムスケールが大きくなるためである。そのような背る可能性が考えられている。そこで、本研究では、全細胞景をふまえて、本研究においては、シンプルなモデル動物

数が約 1000 個と非常に少ない線虫 Caenorhabditis elegans

C. elegans を利用して、温度適応を司る新規分子の同定をを解析系として、表皮で発現している受容体が個体の温度目指した。

耐性に関わるかどうかを、分子遺伝学的に検証した。特に、

C. elegans は土壌自活性の体長が約 1 mm の非寄生性のヒトにおいて神経系や表皮で発現している機械刺激受容体

線虫であり、その体は 959 個の体細胞で構成されている。

が実際に温度を受容して、個体の温度耐性を制御している

ゲノム DNA は、モデル動物の中でも小さく、約 100 Mb

かを調べ、その変異体における体内の脂肪酸比率を測定しである。C. elegans の全遺伝子の約 36 % は、ヒトにも相同たため、その現状を記載する。

遺伝子が存在し、ヒトと対応付けした解析が行われている。

我々ヒトを含む動物が生息している地球上では、その地

C. elegans のライフサイクルは 25 ℃で約 2 . 5 日、15 ℃で域や昼夜によって劇的に温度が変化する。例えば、砂漠地

約 7 日とモデル動物の中では短く、精子と卵を一個体中に区では日中の温度差が約 50 ℃を超えることもあり、一年持つ雌雄同体であるため、系統維持が非常に容易であり、の最低と最高の気温差を見ると日本でも約 40 ℃近い温度

約 0 . 1 % の頻度で雄が出現するため、それを利用した交配の変化幅の中で生活をしている。このような生物の機構とを行うことで遺伝学を用いることができる。

して、高温適応や低温適応が存在する。そのなかでも低温

C. elegans の温度に対する応答としては、温度走性や高適応については、植物から動物まで幅広く研究が行われて温耐性が 40 年以上前から解析されているが 1）、近年、低いる。生物が示す低温への適応としては、普段生息してい温耐性や低温馴化と呼ばれる現象が報告され、その分子組

る温度よりも低い温度で生息すると、より低温にさらされ織機構が少しずつ見つかってきている 2）。例えば、25 ℃でてもダメージが少ない現象である。このような現象は、植飼育した個体は 2 ℃に置かれると死滅してしまうのに対し物や昆虫でも観察され、それらにおいては、細胞内において、15 ℃で飼育した個体は 2 ℃でも生存することができるて凍結しにくいトレハロースなどの糖やアミノ酸を集積さ（図 1）3）。さらに、25 ℃で飼育された個体をわずか 3 時間
から 5 時間だけ 15 ℃に置くことで、2 ℃に置かれた際に生＊Effects of skin- expressed chemical
receptors on body temperat u reacclimation＊

Akane Ohta, Natsune Takagaki

Graduate school of Natural Science /Institute for Integrative Neurobiology,
Konan University

存できるようになる 2 , 4）。この現象は低温馴化と呼ばれている。低温耐性と低温馴化の分子機構が最近、少しずつ見つかってきている。低温耐性において、環境温度は頭部に存在する ASJ と ADL と呼ばれる 2 対の感覚ニューロンで受容され、ASJ からインスリンやステロイドホルモンが分泌され、それらが腸の受容体で受け取られる（図 2）2 , 5）。

− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図1

C. elegansの低温耐性

15℃で飼育したC. elegansは2℃で48時間の低温にも耐えられるが、25℃で飼育したC. elegansは低温に耐えられず、死滅する。
25℃飼育個体を3時間以上15℃に静置することで、2℃で48時間の低温でも生存できるようになる。

図2

既知の低温耐性の分子組織ネットワーク

頭部に存在するASJ感覚ニューロンが温度を受容すると、ASJからインスリンが分泌され、腸や神経系がインスリンを受容し、低温耐性が制御されている。

腸においてインスリン受容体情報伝達を介して、フォーク利用して、温度受容に関わる新規の分子の同定を目指した。

ヘッド型の転写因子である DAF- 16 が遺伝子発現を誘導

その中で、皮下組織で発現している GPCR 型の受容体が温し、体内の脂質合成系の遺伝子などを発現する（図 2）2）。

度適応に関与していることが見つかった、また、ヒトの機

また、腸からステロイドホルモンが分泌され、それが精子

械刺激の受容に関わる DEG/ENaC 型のメカノ受容体が温に働きかけ、さらに、精子が頭部の ASJ 温度受容ニュー度に応答することが見つかり、そのホモログを欠損したシロンをフィードバック制御する 6）。低温馴化に関しては、

ンプルなモデル動物 C. elegans では、低温耐性の異常が観ADL 温度受容ニューロンで受容される温度情報が、ADL察され、体内の脂肪酸構成比が変化していることが示唆さと局所神経回路を構築している酸素受容ニューロンからのれたため報告する 9）。

酸素濃度の情報と統合され、環境の酸素濃度依存的な低温

２．実

馴化の制御が行われる 7）。ADL における温度情報伝達には TRP チャネルと KQT 型カリウムチャネルが関与してい験

低温耐性テストる。これらの ASJとADL 温度受容ニューロンを介した温度15 ℃で飼育された C. elegans の 2 〜 4 個体を新しい培地

情報伝達は、低温耐性や馴化を負に制御する経路である 8）、に乗せ（P 0）
、解析目的となる飼育温度で一晩飼育し産卵

一方で、低温耐性を正に制御する分子経路はほとんど未知させる。その後に P 0 個体を取り除き、卵（F 1）を各飼育温であった。本研究では、C. elegans の低温耐性の実験系を度で飼育する。F 1 が成虫に成長した後に、飼育培地を氷− 82 −

皮膚で発現する化学物質受容体が体の温度適応に与える影響

上に 20 分間置き、タッパーに入れ、2 ℃のメディカルキャビネットで 48 時間静置し、低温刺激温度を与える。その後、キャビネットからタッパーを取り出し、15 ℃で一晩置き、生存率を顕微鏡下で測定する 3）。1 回の解析につき、3 枚の飼育培地を用意し、1 系統につき少なくとも 9 枚分の解析を行った。

in vivo カルシウムイメージング
2 %（v/w）アガロースパッドに線虫系統を 1 〜数匹置き、医療用接着剤で固定し、M 9 バッファーに浸して丸型カバーガラスをかぶせた。サンプルを倒立顕微鏡に装備されている ITO ガラスプレートタイプの温度制御装置の上に置いた。W-Viewoptical system を用いて蛍光を観察し、蛍光画像は EM-CCD カメラで撮影した。画像の蛍光強度はMetaMorph により解析した。細胞内のカルシウム濃度の相 対 変 化 は イ エ ロ ー カ メ レ オ ン（yelow cameleon 3.60
（YC3.60））のacceptor/donor（YFP/CFP）もしくはGCaMP 8

図3xdh- 1変異体の低温耐性

成虫期における、xdh-1変異体の低温耐性解析（アッセイ数
エラーバー : SEM。**p < 0 . 01（Tukey-Kramer）。
xdh-1変異体はが低温耐性異常を示した。

9）。

と tag-RFP（pKOB 006 gcy - 5 p::tag -RFP 10））の acceptor/
donor（GFP/RFP）蛍光の比で計算した。温度変化刺激は、
温度制御装置を用いて与え、約 5 分間ニューロンの細胞体2+

わずか 2 対の介在ニューロンにおいて XDH- 1 が低温耐性

内の Ca 濃度の変化を測定した。

３．結

特異的な回復実験を行った結果、AIN と AVJ と呼ばれるを制御していることが見つかった。AIN と AVJ は介在ニ果ューロンであるため、それらが温度を受容している可能性

1 皮膚で発現する化学物質受容体分子が低温耐性に関与もあるが、一般的にはそれらの介在ニューロンの上流に温

低温耐性に関わる新規の分子を同定するために、温度受た。そこで、AIN と AVJ 介在ニューロンの上流に位置す

容ニューロンと味覚ニューロンを用いた 1 細胞トランスク

る感覚ニューロンを神経回路データベースから調べたとこ

リプトーム解析を行った。その結果、温度受容ニューロン

ろ、ASG 感覚ニューロンなどのメカノレセプターが発現でのみ強く発現している化学受容体様分子の遺伝子が見つしている感覚ニューロンが複数存在していた。そこで、メかってきた。その遺伝子の発現を GFP などを用いて解析

カノレセプターに焦点を当て、メカノレセプターの変異体したところ、上皮細胞において発現が観察された。さらに、を 用 い て 低 温 耐 性 の 異 常 の 有 無 を 調 べ た と こ ろ、

ノックアウト変異体を作成して、その低温耐性を調べたとDegenerin/Epithelial Sodium Channel（DEG/ENaC）タイ

ころ、低温耐性の低下が観察された。この結果から、上皮プのメカノレセプター DEG- 1 の変異体において、低温耐細胞で発現している化学受容体様分子が、個体の温度適応性の低下異常が見られた。DEG- 1 は AIN 介在ニューロン

関与している可能性が考えられた。

の上流に位置する ASG 感覚ニューロンで発現しているた度を感知する感覚ニューロンが存在する可能性が考えられ

め、Ca 2 + イメージング法を用いて ASG の温度に対する応2 接触刺激を受容する受容体が低温耐性に関与

答性を測定した 11 , 12）。野生株の ASG は温度に対して大き低温耐性を正に制御する分子はこれまでにほとんど同定な応答を示した。それに対して、deg -1 変異体ではその反されていなかったため、順遺伝学的解析から低温耐性が低

応が低下していた。以上の結果から、DEG- 1 は温度受容下している変異体を単離した。その変異体の原因遺伝子を情報伝達に関与していることが示唆された。実際に、次世代 DNA シークエンサーなどを駆使して同定した結果、DEG- 1 が温度を受容するのかを調べるために温度を受容

低温耐性を制御する新規遺伝子 xdh- 1 を同定した。このしない細胞に DEG- 1 を発現させて、温度に応答するよう遺伝子の産物は、ヒトのプリン体代謝経路において、ヒポになるかをカルシウムイメージング法で測定したところ、キサンチンからキサンチン、キサンチンから尿酸への酸化

温度に応答するようになった。そこで、DEG- 1 の温度感を触媒する酵素であるキサンチンデヒドロゲナーゼ

受性を直接的に調べるために、Xenopus oocyte に DEG- 1（XDH）のホモログであった。xdh- 1 変異体において、特を発現させて、電気生理解析を行ったところ、温度に対す定の細胞のみで野生型の xdh- 1 遺伝子を発現させる細胞る反応が見られた。さらに、ヒトの DEG/ENaC タイプの− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図4

成虫期の野生株と成虫期のxdh- 1変異体の脂肪酸組成比率測定

左図は、成虫期の野生型および成虫期のxdh-1変異体の個々の脂肪酸種の比率を示す。右図は、飽和脂肪酸（SFA）、
モノ不飽和脂肪酸（MUFA）、およびポリ不飽和脂肪酸（PUFA）。左右の図共に、各アッセイでN= 3。エラーバーはSEMを示す。 文献9）より引用一部改変。

メカノレセプターである MDEG を Xenopus oocytes に発によるかについては、今後の細胞特異的な回復実験などで現させ、温度変化を与えたところ、温度に対する反応が見明らかになると考えられる。さらに、順遺伝学的解析からられた。つまり DEG- 1 だけでなく、ヒトの DEG/ENaC

得られたヒトの触角刺激受容に関わるメカノ受容体のホモタイプのメカノレセプターである MDEG も機械刺激だけ

ログが低温耐性に関与しており、ヒトの MDEG も温度受9）容に関わっていた。これはヒトを含む動物でメカノレセプ

ではなく温度も受容していることがわかった 。

ター DEG/ENaC が個体の温度耐性を制御している初めて

3 低温適応時の脂質構成率の変化

ケースである 9）。今後は、これらの分子が関わる温度受容

DEG/ENaC タイプのメカノレセプター DEG- 1 の変異についての生理学的解析がより必要になると考えられる。

体において、体内の脂肪酸構成率の変化が起きているかをMS 解析などで調べた。多くの生物において、体を構成す（引用文献）

る飽和および不飽和脂肪酸の比率は環境温度によって変化

1） A. Ohta, A. Kuhara, Molecular mechanism forするため、野生株と deg- 1 変異体の脂肪酸の脂質割合を

trimeric G protein-coupled thermosensation and測定した。その結果、SFA（飽和脂肪酸）、MUFA（単不飽synaptic regulation in the temperature response circuit

和脂肪酸）そして PUFA（多価不飽和脂肪酸）のいずれにおof Caenorhabditis elegans. Neuroscience research 7 6,いても野生株と deg- 1 変異体において差が存在した。さ

119-124（2013）．

らに、個々の脂肪酸種に関しもそれらの構成比率を比較し

2） A. Ohta, T. Ujisawa, S. Sonoda, A. Kuhara, Light andたところ、deg- 1 変異体においても 20 : 4 n- 3 の増加が存

pheromone-sensing neurons regulates cold habituation

9）

在した 。つまり、DEG- 1 の異常により、体内の膜脂質

through insulin signalling in Caenorhabditis elegans.
Nature communications 5, 4412（2014）．

の構成が変化し、低温耐性に影響を与えている可能性が考

3） T. Ujisawa, A. Ohta, O. M., S. S., A. Kuhara, Cold

えられる。

４．考

tolerance assay for studying cultivation-temperature-察

dependent cold habituation in C. elegans. Protocol
Exchange,（2014）．

温度シフトにおいての GPCR をコードする複数の遺伝子の発現量が変化していた。そのなかでも、皮膚で発現する

4） M. Okahata et al., Natural variations of cold tolerance

GPCR をコードする変異体について低温耐性を測定したと

and temperature acclimation in Caenorhabditis elegans.
J Comp Physiol B 186, 985-998（2016）．

ころ、低温耐性や馴化の異常が観察されたことから、この受容体の低温耐性への関与が示唆された。この GPCR 遺伝

5） T. Ujisawa et al., Endoribonuclease ENDU-2子は、皮膚に加えて幾つかの神経細胞などでも発現していregulates multiple traits including cold tolerance via

たため、今回見つかった低温耐性の異常がどの細胞の異常

cell autonomous and nonautonomous controls in− 84 −

皮膚で発現する化学物質受容体が体の温度適応に与える影響

elegans. PloS one 11, e0165518（2016）．

Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America,9） N. Takagaki et al., Mechanoreceptor-mediated（2018）．

circuit regulates cold tolerance in Caenorhabditis

6） S. Sonoda, A. Ohta, A. Maruo, T. Ujisawa, A. Kuhara,

elegans. bioRxiv 5,（2019）．

Sperm Affects Head Sensory Neuron in Temperature10）K. Kobayashi et al., Single-Cell Memory Regulates aTolerance of Caenorhabditis elegans. Cell reports 1 6,

Neural Circuit for Sensory Behavior. Cell Rep 1 4,

56-65（2016）．

11-21（2016）．

7） M. Okahata, A. D. Wei, A. Ohta, A. Kuhara, Cold

11）A. Kuhara, N. Ohnishi, T. Shimowada, I. Mori, Neuralacclimation via the KQT-2 potassium channel iscoding in a single sensory neuron controlling opposite

modulated by oxygen in Caenorhabditis elegans. Sci

seeking behaviours in Caenorhabditis elegans. Nat

Adv 5, eaav3631（2019）．

Commun 2, 355（2011）．

8） T. Ujisawa, A. Ohta, M. Uda-Yagi, A. Kuhara,

12）T. Ujisawa, A. Ohta, A. Kuhara, Long-term calcium

Diverse Regulation of Temperature Sensation byimaging of ASJ sensoryneuron controlling cold

Trimeric G-Protein Signaling in Caenorhabditis

tolerance in C. elegans. Protocol Exchange,（2014）．

− 85 −

脂肪酸の構造ダイバーシティを活用する生理活性物質創製
東京大学大学院薬学系研究科

大和田

智彦

There are scattered reports that fatty acids have different effects on ω-3 and ω-6; supplements of DHA and EPA, whichare ω-3 fatty acids, are available, but not so often for ARA, which is an ω-6 fatty acid. Fatty acids have a high degree ofstructural diversity in terms of the total number of carbons, the number of double bonds, the position of the double bonds,
and the geometric isomerism of the carbon-carbon double bonds, since they usually contain Z-olefines also E-olefines. The
structural diversity of fatty acids not only refers to the diversity of molecular formulae due to geometric isomerism anddifferences in the number of carbons, but also refers to the fact that there are many conformations of a single fatty acidbased on bond rotations. There should be present endogenous ligands that are fatty acids themselves or have fatty acids as
substructures, and there are corresponding receptor proteins. It is certain that fatty acids are involved in a part of the signaltransduction mechanism in vivo. We studied herein rational design and synthesis of molecules with fixed conformations
based on the structure of fatty acids, which will lead to the creation of substances with bioactive functions such as cosmetology and pharmaceutical supplements.

1．緒

言

脂肪酸は、カルボキシル基とメチル基を持つ炭素鎖長の異なる分子である。多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、2 つ以
上の二重結合を含む脂肪酸分子のグループで、ω- 3（炭素数 3）と ω - 6（炭素数 6）PUFA の 2 つの主要なグループに分かれ、これらのグループのメンバーは生物活性脂質メディエーターの多くのレパートリーの前駆体である。ω - 3

図１

脂肪酸の役割は、中性脂肪を減らし、血圧を下げ、動脈のDiversity of Conformations of DHA

プラークの蓄積を遅らせると報告されている。ω- 6 脂肪酸の役割は、血糖値のコントロールと血圧の低下作用が報告

脂肪酸を部分構造として持つ内因性リガンドが存在し、対されているが詳細な機構は不明である。脂肪酸は ω- 3 と応する受容体タンパク質が存在している。脂肪酸が生体内

ω - 6 で作用が異なるという報告が散見される。ω- 3 脂肪シグナル伝達機構の一端に関与しているのは確実である。

酸である DHA や EPA のサプリメントは販売されているが、脂肪酸の構造を利用し立体配座を固定した分子を合理的に

ω- 6 脂肪酸である ARA は違う。脂肪酸は全長の炭素数、設計合成すれば、コスメトロジーをはじめ医薬品的サプリ

二重結合の数、二重結合の位置、通常は Z 体であるが E 体

メントなど生理活性機能を有する物質創製につながるはずを含むため炭素 - 炭素二重結合の幾何異性の区別など高いである。

構造ダイバーシティを有している。脂肪酸の構造ダイバー

２．方

シティとはこのような幾 何 異 性や炭 素 数の違いによる分 子

法式 のダイバーシティを意 味 するだけではなく、1 種類の脂溶媒や膜中、受容体結合サイト内などの様々な周辺環境

肪酸（たとえば DHA：ドコサヘキサエン酸）についても、結で脂肪酸（DHA）の長時間ＭＤやレプリカ交換、メタダイ

合回転に基づく多数の立体配座が存在することを指している

ナミックス計算を実施する。構造探索の網羅性が重要であ

1 , 2）（図 1）

り、複数の計算理論を実施・比較する。構造を類似性で分。

サプリメントだけではなく、脂肪酸そのもの、あるいは類し、各小分類から複数の代表構造を選択する。特にDHA について研究し、方法論の妥当性を検討する。
溶液中の脂肪酸の立体配座は加速型分子動力学法の一種

Creation of Bioactive Substances by
Utilizing Structural Diversity of Fatty
Acids
Tomohiko Ohwada
Graduate School of Pharmaceutical
Sciences, The University of Tokyo

replica exchange with solute tempering（REST）法にて網羅的に発生させた 3 , 4）。相似行列（similarity matrix）を、Schrödinger 社 製 の Canvas に よ っ て 生 成 さ れ る 3 Dpharmacophore fingerprint と Tanimoto 類似度（Tanimoto
similarity metric）から作成した。クラスタリングは各脂肪− 86 −

脂肪酸の構造ダイバーシティを活用する生理活性物質創製酸について収集したすべての立体配座について行い、重要

ミュレーションの利用した。 DHA を含む柔軟な PUFA のな立体配座を抽出するのに用いた。クラスター数は 30 以

全立体配座空間を収集するために，加速分子動力学シミュ

下になるようにして、Kelly’s 基準値とクラスター間のレーションの一つである REST 法を用いて , 多数の立体配

distance を考慮してクラスターを merge した。

置を生成した。REST は、レプリカ交換法による分子動力３．結学シミュレーションの一種で、対象となる分子を選択的に果加熱する一方で、周囲の環境は低温のままにしておく方法

脂肪酸サロゲートのデザインである。対象分子を選択的に加熱することで、立体配座間

DHA サロゲートは cis-炭素 ─ 炭素二重結合をベンゼンの変換が促進され、少ないレプリカ数でもアクセス可能な環で置き換えることによってデザインした。炭素数を同じ立体配座を保存することができる。本研究では，カルボン

ように揃えるようにした（例を Fig. 3 に示した）5）。

酸イオンが生物学的環境で一般的に観察されることから，
PUFA のイオン化形態を最小化して使用した。ピコ秒ごと

PUFAの立体配座空間の収集に立体配座を抽出することで、1000 個のユニークな立体

PUFA の立体配置空間の収集において加速分子動力学シ

配座が収集された。立体配座の性質をよりよく理解するた
めに、クラスタリングを行い、DHA の立体配座の傾向を調べた。結果的にこの手法で効率的に立体配置が得られることが分かった。

立体配座のクラスタリング法
立体配座を分類するための最適な条件を確立するために、いくつかの典型的なクラスタリング手法をテストした。

重み付けセントロイド連結法
DHA がとる主要な立体配座を出力すると考えられたため、最初に重み付けセントロイド結合を選択した。クラス
図２ DHAサロゲートの例

図3

ター数を Kelly’s Penalty 10 の最小値に設定したところ、DHAの立体配座の分類（主成分解析の場合）− 87 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

加重セントロイド結合では、全体の 70 - 90 % をカバーする

ため、分子サイズの異なる分子では、立体配座の類似性が高度に変形した過密なクラスターが得られ、結合法の信頼高いにもかかわらず、互いに離れた座標を与えてしまう。

性が低いことに気付いた。例えば、水中の DHA コンフォ

この点は、PUFA 立体配座とそのサロゲート立体配座を比ーマーの場合、1000 個の立体配座を加重セントロイド結較する際に問題となる。したがって、立体配座を 3 次元空合法で 20 個のクラスターにクラスタリングすると、871間にプロットするためには、別の記述子が必要となり現在個の立体配座が同じクラスターに入る。しかし、この主要検討を継続している。

なクラスターに含まれる立体配座は、高い類似性を持って４．考いるわけではない。クラスター分散は、メンバー数が 10
以下のマイナークラスターに比べて著しく大きい。そのため、より適切な結合方法を模索する必要がある。

察

多価不飽和脂肪酸の立体配座を水中または n- オクタノール中で、それぞれ REST 法で網羅的に発生させたところ、
この 2 つの極性の異なる溶媒中での立体配座の和で、全立

記述子の選択体配座空間をカバーできることが分かった。このことは、PUFA の単純で柔軟な構造をさらに特徴づけるために、

タンパク質に結合する際、脂肪酸の立体配座は、多数の

我々は現在利用可能な分子記述子のリストを測定した。一

DHA の溶液立体配座から選択される可能性を示唆してい般に、分子指紋や分子記述子は、QSAR/SAR 解析、仮想る。

分子スクリーニング、標的分子のランク付け、薬物のADME 予測などの創薬プロセスで使用される。 そのため、 （引用文献）
ほとんどの分子指紋や記述子は、2 次元的な構造の違いを

1） H o r r o c k s L A , Y e o Y K ; H e a l t h b e n e f i t s o f

説明するものとなっている。つまり、トポロジー的に異なdocosahexaenoic Acid（DHA）．Pharmacol. Res., 4 0,

る分子を区別することしかできない。我々の研究では、立211, 1999.

体配座を区別したいだけなので、限られた数の指紋や記述

2） Dyall SC; Interplay between N-3 and n-6 long-chain

子を評価することができる。実際、3 D ファーマコフォア

polyunsaturated fatty acids and the endocannabinoid

指紋は、使用できる唯一の指紋でありながら、前節で述べsystem in brain protection and repair, Lipids, 52, 885,

た階層型クラスタリングに有効であることが分かった。一2017.

方で、いくつかの 3 次元記述子は、立体配座の特性評価に

3） Liu P, Kim B, Friesner RA, Berne BJ; Replica

おいて、ユニークな視点を与えた。FOSA と FISA は我々

exchange with solute tempering: a method forが重要な記述子として選択した 2 つの記述子で、それぞれ

sampling biological systems in explicit water. Proc.

全溶媒到達表面積（SASA）の疎水性成分と親水性成分を表

Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102, 13749, 2005.

している。表面積は立体配座のフォールディングに大きく

4） Wang L, Friesner RA, Berne BJ; Replica exchange

依存し、フォールディングの度合いが高いほど SASA は低with solute scaling: a more efficient version of replica

くなる。私たちは、これらの 3 つの記述子を、末端炭素距

exchange with solute tempering（REST2）．J. Phys.

離とともに、3 D プロットの座標として用いることで、最Chem. B, 115, 9431, 2011.

小限のデータで立体配座を表現することを考えた。DHA

5） Jung S, Inoue A, Nakamura S, Kishi T, Uwamizu A,の 1000 個の立体配座をプロットし、色でクラスターを区

Sayama M, Ikubo M, Otani Y, Kano K, Makide K, Aoki

別している。図 3 に示すように、この 3 つの記述子、末端J, Ohwada T; Conformational constraint of the gycerol

炭素距離と疎水性（FOSA）と親水性（FISA）がうまくクラ

moiety of lysophosphatidylserine, an emerging

スターを区別している。

lysophospholipid mediator, affords compounds with

しかし、研究を進めるとこの記述子のセットには致命的な問題があることが判明した。表面積は大きさに依存する− 88 −

receptor subtype selectivity, J. Med. Chem. 5 9, 3 7 5 0,
2016.

EGF が皮膚炎に与える影響とメカニズム
熊本大学大学院生命科学研究部免疫学講座

押海裕之

Epidermal growth factor (EGF) has been used as a component of many cosmetics. EGF has been believed to promote
the turnover of the skin and has an anti-aging ability. Recently, we found that EGF regulates the expression of pro-inflammatory cytokine expression in a DDX60 RNA helicase-dependent manner. Pro-inflammatory cytokines are well known to increase vessels permeability leading to swelling, redness and pain. Our data imply that EGF can suppresses the inflammationin the skin. In this study, we further assessed the role of EGF on the inflammatory immune responses, and found that EGF
suppressed delayed type hypersensitivity in mice. However, EGF did not reduce the phagocytosis ability of macrophages
required for excluding waste product in the skin. Recently, severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-2 (SARSCoV-2) causes coronavirus disease-2019 (COVID-19). SARS-CoV-2 infects host through mucosal epithelial cells, and thus
it is unclear whether EGF within the cosmetics affect the immune response against SARS-CoV-2. Therefore, we investigatedthe effect of EGF on the antiviral activities of epithelial cells. Interestingly, EGF in the culture medium suppressed vesicularstomatitis virus (VSV)-induced cytopathic effect (CPE) on epithelial cells, although EGF attenuated the IL-6 expression
from VSV-infected cells. EGF-promoted antiviral activities were also observed when cells were infected with seasonal
influenza A virus. EGF attenuated the CPE of cells infected with influenza A virus, and reduced IL-6 expression levels. Interestingly, moderate reduction of SARS-CoV-2 replication was observed when EGF existed in cell culture medium. Thesefindings elucidated novel useful aspects of EGF within the cosmetics.

1．緒ら、EGF の免疫応答に与える影響を新たに明らかとする

言

ことは EGF を化粧品の成分として加えることの効果や、上皮成長因子（EGF: Epidermal Growth Factor）は、様々

その安全性を考える上でも重要である。

な化粧品に配合され、美容液、スキンケアクリーム、パッEGF と免疫応答の関連として、特に EGF がサイトカイ

ク、化粧水、ファンデーションなどの成分として加えられ、ン受容体の下流で働く STAT 3 のリン酸化が EGF 受容体

加齢に伴う肌のターンオーバーの遅れの解消やコラーゲンの活性化により促進することは古くから報告されている 1）。

の生成を促進するなどの効能が期待されている。一方で、STAT 3 は IL- 6、IL- 8、IL- 35 などによっても活性化し、EGF はその受容体である EGFR は非小細胞肺癌を含め多転写因子として様々な免疫応答を誘導する。一方で、EGF

くの悪性腫瘍で発現が高いため、EGF を過剰に存在するによる免疫制御のメカニズムについては不明な点も多く存ことが発がんなどに与える影響についての指摘などがあり、在する。我々の研究室ではこれまで自然免疫応答の研究を

EGF を安易に化粧品の成分として使用することの安全性続けてきており、その中で DDX 60 と呼ばれるヘリカーゼについては懸念もある。しかし、現状として、アンチエイ

が炎症性サイトカインの産生に重要な役割を果たすことをジングなどを謳い EGF が配合された化粧品は現在でも数発見した 2）。興味深いことにこの DDX 60 について、EGF

多く販売されている。

が DDX 60 分子のチロシンリン酸化を誘導することで炎症

免疫と肌の透明感やハリなどは密接に関連し合うことがを抑えることを明らかとした 3）。これは EGF が DDX 60 分

近年明らかとなりつつあり、特に、老廃物の除去には強い子の機能を介して炎症を抑える役割を果たすことを示唆す

貪食能を有する皮膚のマクロファージが重要な役割を果た

るが、これらが皮膚炎などの炎症に与える影響については

すことや、マクロファージなどから産生される過剰な炎症

十分に解明されていない。

性サイトカインは局所の炎症を誘導し赤みなどの原因とな一方で 2020 年に始まった新型コロナウイルス感染症

ることが知られている。EGF は上皮細胞の成長に影響を（COVID- 19 : coronavirus disease- 2019）のパンデミック

与えるのみならず、免疫応答などにも影響を与えることか

によりウイルス感染症の問題がある。EGF は化粧水などにも配合されており、新型コロナウイルス（SARS-CoV- 2）が感染する目や鼻や口などの粘膜にも触れる機会が多い。

Effect of EGF on hypersensitivity in theskin and its underlying mechanism
Hiroyuki Oshiumi
Department of Immunology, Faculty ofLife Sciences, Kumamoto University

そのため、化粧品に配合された EGF が免疫に影響を与えることで感染に抵抗性や感受性を与える可能性もあり、その検証も喫緊の課題となる。
本研究では「自然免疫」という視点から特に DDX 60 ヘリ
カーゼと細胞外小胞の機能に焦点をあて、EGF がこれら

− 89 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021の分子を介して肌のターンオーバーや健康に与える影響を

264 . 7 細胞に対して DDX 60 遺伝子をノックアウトするた解明し、EGF 配合化粧品の新たな効能と機能を解明する

めに CRISPR-Cas 9 の実験系でそれぞれエクソン 11 を除ことを目的として研究を進めた。

去しノックアウト細胞株を作成した。DDX 60 遺伝子がノ２．方ッ ク ア ウ ト さ れ た こ と に つ い て は 定 量 PCR 法 に よ り法mRNA の発現量で確認した。

2. 1. 接触性過敏反応

野生型と DDX 60 ノックアウト細胞株に対して、その培

マウス近郊系として C 57 BL/ 6 系統の野生型マウスと養液に EGF を添加し、それぞれの貪食能を蛍光ラベルしDDX 60 遺伝子をノックアウトしたマウスを実験に使用したビーズの取り込み量で FACS により評価した。その結果、た。動物実験にあたっては熊本大学の動物実験委員会の承EGF 添加により濃度依存的に野生型のマクロファージ細認を得た実験計画書に基づいて実験を実施した。接触性過胞株の貪食能の増加が観察された。一方で、DDX 60 をノ

敏反応の実験系として DNFB（dinitrofluorobenzen）の反復

ックアウトしてもマクロファージの貪食能は低下しなかっ塗布を実施した。炎症誘導後には EGF を添加し、炎症のた。これらのことは EGF が制御する DDX 60 の機能はマ増悪を組織切片の観察とサイトカイン産生を指標に評価しクロファージの貪食能には関与しないことが示唆された。

た。

3. 2. EGFが過剰な炎症を抑制するメカニズム

2. 2. フローサイトメトリー

DDX 60 分子は通常ウイルス由来の RNA を認識して活マクロファージに与える影響としてTHP-1 やRAW 264 . 7

性化するが正常の細胞株にはウイルスは存在しない。しか細胞を用いて、CRISRP-Cas 9 の系を用いて DDX 60 のノ

し DDX 60 の欠損細胞では定常時での炎症性サイトカイン

ックアウト細胞を作成した。貪食に与える影響として蛍光の産生も減少することが明らかとなったため、DDX 60 のラベルしたビーズの取り込みをフローサイトメトリーによ

内在性のリガンドを探索した。細胞質内のウイルス認識受

り解析を行った。フローサイトメトリーでは FACS キャリ

容体である RIG-I と MDA 5 は通常は内在性の LINE- 1 やバーを用いて実験を実施した。

Alu などのレトロエレメントを認識しないが、RIG-I や
MDA 5 のアミノ酸変異によりこれらのレトロエレメント

2. 3. サイトカイン量の測定を認識することが知られている。MDA 5 の G 495 R 変異は

ヒト上皮細胞株である HEK 293 細胞や HeLa 細胞株はそ

AGS の患者で発見されヒトの Alu 配列を過って認識する

れぞれ 10 % の牛胎児血清（FCS）を含む D-MEM（low Glc）

よ う に な る こ と が 知 ら れ て い る。 我 々 は こ の MDA 5 -と Eagleʼs MEM を用いて培養した。EGF についてはそれG 495 R 変異を野生型と DDX 60 の KO 細胞に発現させ I 型

ぞれヒト組換え EGF を用い実験を実施した。炎症性サイ

インターフェロンと IL- 6 などの炎症性サイトカインの産

トカインの測定においては、細胞から RNA を抽出し逆転

生量を比較したところ、MDA 5 -G 495 R 変異による IL- 6

写後に定量 PCR 法により定量した。また、細胞上清中のの産生は DDX 60 のノックアウトにより減弱することを発サイトカイン量については ELISA 法を用いて実施した。

見した。これらは、内在性のレトロエレメントが DDX 60
を介して炎症性サイトカインを誘導すること、また、EGF

2. 4. ウイルスがこれを抑制することで過剰な炎症を制御できることを示

牛水疱性口内炎ウイルス（VSV）は Vero 細胞を用いて増唆する。

殖させた。ウイルスの力価は Vero 細胞を用いたプラークさせた。力価は MDCK 細胞を用いてプラーク法により決3. 3. EGFが過敏反応に与える影響（マウス動物モデル）

定した。SARS-CoV- 2 は国立感染症研究所より分与いた

マウスの接触型過敏反応の動物モデル実験において野生法を用いた。インフルエンザウイルスは鶏卵を用いて増殖

4）

だいた COVID- 19 患者由来のウイルス株を用いた 。ウ型と DDX 60 ノックアウトマウスで比較した。DNFB をマ

イルスの増殖およびプラーク法による力価測定はウスの耳に反復塗布し、接触過敏反応による腫れの程度をVeorE 6 /TMPRSS 2 細胞を用いて実施した。新型コロナ測定したところ、DDX 60 ノックアウトマウスでは腫れがウイルスのウイルス量については TCID 50 法により測定

野生型マウスと比較し緩和されることが示唆された。一方した。

で、この過敏反応に関与する因子としてリンパ節や脾臓の３．結T 細胞数などを測定したが、野生型と DDX 60 ノックアウ

果トマウスでは有意な差が見られず、そのメカニズムの解明

3. 1. EGFがマクロファージ貪食能に与える影響については今後の課題である。

マクロファージ様の細胞株である THP- 1 細胞と RAW− 90 −

EGF が皮膚炎に与える影響とメカニズム

3. 4. EGFによる抗ウイルス作用たのに対し、逆にIL-6 の産生を抑制することが示された（図

DDX 60 分子はウイルス感染時のサイトカイン産生に関2）。これは EGF がサイトカイン産生を抑え炎症を抑制し与しており、EGF が DDX 60 依存的なサイトカイン産生をながらも VSV に対して抗ウイルス作用を示すことを示唆抑制することから、ウイルス感染時の免疫応答におけるする。
次に季節性インフルエンザウイルスに対する影響につい

EGF の役割について検討した。
VSV は実験室で古くから用いられているウイルスであて調べた。EGF を培養上清に加えることで、ウイルスのりヒト上皮細胞を含め様々な細胞に感染する。我々は増殖については抑制する傾向が観察された（図 3）。一方でEGF 存在下で培養した HeLa 細胞へ VSV を感染させ、36

ウイルス感染後のサイトカイン産生に与える影響について

時間後に細胞をホルマリンで固定した後にクリスタルバイ

調べたところ、I 型インターフェロン産生が EGF により増オレットで染色し生細胞を観察することで VSV の細胞傷加したのに対し IL- 6 を含む炎症生サイトカイン産生は逆害活性（CPE: Cytopathic effect）について調べた。実験のに低下することが明らかとなった（図 3）。

結果、ウイルスによる細胞傷害活性が EGF によって濃度2020 年 に COVID- 19 パ ン デ ミ ッ ク の 原 因 と な っ た

依存的に抑制されることが明らかとなった（図１）。一方で、

SARS-CoV- 2 に対する影響について次に調べた。国立感EGF は VSV 感染時の I 型インタフェロン産生を増加させ染症研究所より分与された、COVID- 19 患者より単離さ

図1

VSVによる細胞傷害活性におけるEGFの効果

HeLa細胞を図に示す濃度のEGFを含む培養液で培養し、VSVをMOI＝0 , 1, 4で感染させた。感染後36時間の時点で細胞をホルマリンで固定したのちにクリスタル
バイオレットを用いて生細胞を染色した。EGFの転化により細胞傷害が抑制されることが示唆された。

図3

図2 VSVによるIL- 6産生誘導におけるEGFの役割
HeLa細胞をVSVでMOI＝1の条 件で感染させ、感染後24時間の時点での細胞上清中のIL- 6のタンパク量についてELISAにより測定した。培養液中のEGFによりIL- 6の産生量が減少した。

インフルエンザウイルス感染に対するEGFの効果

細胞培養液に10 ng/mLのEGFを添加することでインフルエンザウイルスによる細胞傷害が抑制されることが示唆された（図左）。一方で、このときの培養上清中のウイルス量を比較するとEGF存在下ではウイルス量が低下していた。

− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

れた SARS-CoV- 2 株について、EGF の有無によるウイル

た場合には、これらが目などの上皮細胞に触れ、免疫応答

ス量の違いについて ACE 2 を過剰発現させた HEK 293 細に影響を与える可能性が考えられた。本研究では EGF が胞を用いて調べた。SARS-CoV- 2 感染 2 日後の細胞上清上皮細胞の抗ウイルス作用に与える影響についても調べた。

のウイルス量について TCID 50 法により測定したところ

EGF は DDX 60 の機能を抑制しサイトカイン産生を抑制す

EGF 存在下ではウイルス量がやや減少する傾向が観察さることから、DDX 60 依存的な抗ウイルス作用を抑制するれた。

ことが懸念されたが、実験の結果は反対に EGF が上皮細４．考胞の抗ウイルス作用を強めることを発見した。ウイルス実察験で古くから用いられている VSV に対しては EGF が上皮

EGF は上皮の成長を促し肌のターンオーバーなどを促細胞のウイルスによる細胞傷害活性を抑制することが示さ

進することから一時期は多くの化粧品に配合され使用されれ、季節性インフルエンザについてはその増殖を抑制するており、アンチエイジングを謳う数多くの商品にも配合さことが示唆された。一方で COVID- 19 のパンデミックとれていた経緯がある。一方で、悪性腫瘍で EGF の受容体なる SARS-CoV- 2 に対する影響では、ウイルスの増殖をが過剰発現するなど健康への影響についても懸念が指摘さやや抑制する傾向が見られた。これらの結果、EGF はれることがある。

DDX 60 依存的なサイトカイン産生を抑制するものの上皮

EGF と免疫との関連についてはこれまで十分に解明さ細胞の抗ウイルス活性は抑制せず、むしろ活性化することれてこなかった。創傷治癒の過程で初期の傷口では外来かが示唆された。これらは EGF を配合する化粧品などが新らの病原体などの異物が免疫応答により排除される。その型コロナウイルス感染に対しては特に悪影響がないことを際には高い貪食能を示す好中球に加えてマクロファージな示唆する。

どの細胞も重要な役割を果たす。その過程ではオプソニン

５．総化された異物の貪食に加えて、炎症を誘導する IL- 1 β、括IL- 6、TNF-α などの炎症生サイトカインが産生される。

EGF の効果については肌のターンオーバーを促進しア

一方で異物が除去され上皮細胞の増殖とともに創傷治癒がンチエイジング効果があると謳われる一方で、悪性腫瘍の完了する段階では EGF が重要な働きをする。この EGF が増殖促進など負の側面があることも懸念されている。本研

上皮の成長を促す以前の免疫応答にどのような影響を与え

究では EGF の効果として肌に影響を与える炎症を抑制す

るのかについては十分な役割が解明されてこなかった。こる効果があることを示した。さらに、近年問題となっていのような状況の中で我々は以前に EGF が DDX 60 分子のる新型コロナウイルス感染に対する免疫応答にも悪影響を

リン酸化を誘導し、それにより炎症生サイトカインの産生

示さないことが示唆された。これらは化粧品に EGF を配が抑制され、炎症の抑制につながることを発見した。

合することの効果や効能についての根拠を提示するもので本研究では EGF の DDX 60 分子を介した免疫制御機構
について調べたところ、1）EGF はマクロファージの貪食あり、化粧品の安全性や機能についての理解と安心につながると期待される。

を促すが、DDX 60 分子は関与しないこと、2）EGF は内在性レトロエレメントによる DDX 60 依存的な炎症性サイト（引用文献）

カイン産生を抑制すること、3）EGF は過敏反応の抑制に

1） Zhong, Z., Wen, Z. & Darnell, J.E., Jr. Stat3: a STAT

弱 い な が ら 寄 与 す る こ と、 な ど が 明 ら か と な っ た。

family member activated by tyrosine phosphorylation

DDX 60 が制御する TNF-α や IL- 6 などの炎症性サイトカ

in response to epidermal growth factor and

インは毛細血管の内皮細胞の透過性を亢進し、炎症を誘導

interleukin-6. Science 264, 95-98（1994）．

することが知られている。これらのことから、EGF はマ

2） Miyashita, M., Oshiumi, H., Matsumoto, M. & Seya,

クロファージの貪食能の亢進による老廃物の除去を促し上T. DDX60, a DEXD/H box helicase, is a novel antiviral

皮の成長を促進する効果があることに加え、赤み、かゆみ、

factor promoting RIG-I-like receptor-mediated

腫れなどの原因となる炎症を抑制する働きがあることが示

signaling. Mol Cell Biol 31, 3802-3819（2011）
．

唆された。

3） Oshiumi, H. et al. DDX6 0 Is Involved in RIG-I-

2020 年に入り SARS-CoV- 2 による COVID- 19 のパン

Dependent and Independent Antiviral Responses, andデミックが世界的な問題となっている。SARS-CoV- 2 は

Its Function Is Attenuated by Virus-Induced EGFR

粘膜上皮細胞に感染すると考えられており、上気道と下気Activation. Cell Rep 11, 1193-1207（2015）．

道より感染する。一方で、他の粘膜上皮から感染するウイ

4） Matsuyama, S. et al. Enhanced isolation of SARS-

ルスと同様に目などの粘膜からも感染すると考えられていCoV-2 by TMPRSS2-expressing cells. Proc Natl Acadる。そのため、化粧水やパックなどに EGF が含まれてい

Sci USA 117, 7001-7003（2020）．

− 92 −

アトピー患者に対する化粧品の皮膚刺激性・保護作用を評価する
新規皮膚炎モデルの開発
広島大学原爆放射線医科学研究所

神沼修

Stimulating activity for skin, including that of patients with atopic dermatitis, is one of the most important issues for thedevelopment of cosmetics. I have recently proven that antigen-specific T cells have potential to induce allergic inflammation in various tissues including skin, without assistance of IgE/mast cell-dependent pathway. Here, I aimed to establish a
new mouse model of skin inflammation that enable to evaluate the stimulating and protective effects of cosmetics on atopic
patients’ skin. Hairless mice in which antigen-specific T cell receptor (TCR) is expressed on all peripheral T cells is generated by mating BALB/c-background Hr mice with cloned mice that we recently established from mite-specific T cells.
Th1 and Th2 cells were differentiated from splenic CD4+ T cells of ovalbumin (OVA)-specific TCR-transgenic mice by invitro stimulation culture. BALB/c mice were adoptively transferred with the antigen-specific Th1 and Th2 cells, then theback skin was challenged with topical application of OVA solution. In addition to the inflammatory features observed in thehistological specimens, accumulation of eosinophils and antigen-specific Th2 cells, evaluated by the elevation of eosinophil
peroxidase activity and by flow cytometry, respectively, in the skin was induced by antigen challenge, despite the absenceof antigen-specific IgE. Neither antigen-specific Th1 nor naive CD4+ T cells induced eosinophil accumulation, although Th1
cells by themselves migrated into the skin. The accumulation of eosinophils and Th2 cells in the skin was suppressed by administration of dexamethasone and FK506, indicating an essential role for Th2 cells in the eosinophil recruitment. Based on
the rapid development of atopic dermatitis-like pathological features and its responsiveness to therapeutic drugs prescribed,
the usefulness of our skin inflammation model for the evaluation of stimulating and protective effects of cosmetics on theskin of atopic patients was indicated.

1．緒るだけで、皮膚炎を含めたあらゆるアレルギー疾患病態が言発症することを明らかにしてきた 1）。さらに最近、抗原特腐食性を含めた皮膚刺激性は、化粧品を開発する上で最異的 T 細胞由来のクローンマウス樹立に世界で初めて成功

も重要な検討項目とされ、さまざまな実験系が実用化されし、そのマウスを用いれば、わずか 3 日という短期間でアている。一方、皮膚のバリア機能が低下したアトピー等のレルギー病態を誘発できることを見いだした 2）。

皮膚炎患者に対する皮膚刺激性の問題も大きいが、現在そそこで本研究は、この新たに樹立した抗原特異的 T 細胞

れを的確に評価できる実験系はない。このことから、多く

クローンマウスを活用し、化粧品のアトピー患者皮膚に対の化粧品において、アトピー患者等への使用は回避せざるする刺激性や、場合によってはその逆となる保護作用の有を得ない状況となっている。

無ならびに程度を的確に評価できる、迅速かつ安定的に発アトピー患者の皮膚に対する化粧品の影響評価が困難な症する皮膚炎モデルの開発を目指した。その成果を元に、要因として、迅速かつ安定的に発症し、さまざまな化合物

健常人だけでなく、化粧品の必要性をより強く感じているの影響評価に資する皮膚炎モデルが樹立されていないこと

アトピー患者達でも安心して利用できる、安全な化粧品のが挙げられる。アトピー性皮膚炎を模した自然発症および開発を後押しするため、本モデルを用いた評価系の普及に

抗原誘発動物モデルは多いが、いずれも発症に長期間を要努めてゆきたい。

する上、個体間のバラツキが大きいため、本来影響がない

２．方ことを前提に開発される化粧品類の微細な影響を解析する

法

一方、申請者は独自に開発したマウスモデルを用い、ア

2. 1. 抗原特異的TCRを発現するヘアレスマウスの作
出

トピー性皮膚炎発症に重要と考えられてきた IgE ／マスト

クローンマウスのバックグラウンド系統である BALB/c細胞系が活性化されなくても、抗原特異的 T 細胞が存在す

由来のヘアレスマウスである Hr と、申請者が独自に開発のに適しているモデルはない。

し、現在維持している８種類の T 細胞クローンマウスのうDevelopment of a new skin inflammation
model useful for the eva luation of
stimulating and protective effects ofcosmetics on the skin of atopic patients
Osamu Kaminuma
Research Institute of Radiation Biology
and Medicine, Hiroshima University

ち 1）、ダニ抗原（Der f）特異的な２種類の T 細胞クローン
マウス（Df# 1 , Df# 2）を交配した。尾ゲノムを抽出してPCR を行うことにより、産仔の遺伝子型判定を行った。

2. 2. T細胞依存性皮膚炎病態の解析− 93 −T 細胞クローンマウスおよび卵白アルブミン（OVA）特コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

異的 T 細胞受容体（TCR）遺伝子を導入したトランスジェ

前に皮下投与した。

ニックマウスの脾細胞より、磁気細胞分離システムを用い

３．結てCD4＋ T細胞を分離した。それをそれぞれ特異抗原および

果

X 線照射した BALB/c マウス脾臓細胞と共培養することに

Hr マウスと Df# 1 および Df# 2 マウスを交配し、遺伝子より、OVA 特異的 T 細胞を in vitro で樹立した。その際、型判定を行うことにより、ダニ抗原特異的 TCR およびヘTh 1 および Th 2 細胞を分化誘導するために、それぞれアレス遺伝子の双方をヘテロに持つ雌雄マウスが確保でき

IL-12 ＋抗 IL-4 抗体および IL-4 ＋抗 IFN-γ 抗体を培養開た。

始時に添加して 7 - 10 日間培養した。樹立した抗原特異的

また、そのヘアレスクローンマウスの樹立を待つ間、T

T 細胞を回収し、5（and 6）-carboxyfluorescein diacetate

細胞依存性皮膚炎病態の解析を進めた。In vitro で樹立しsuccinimidyl ester（CFSE）で染色した後、BALB/c マウス

た抗原特異的 Th 1 および Th 2 細胞を BALB/c マウスに移に尾静脈より移入した。その 24 間後、除毛した背部皮膚入し、その皮膚に抗原チャレンジすると、皮膚組織の肥厚

または耳介に抗原溶液を投与した。陰性コントロールとしおよび炎症細胞浸潤を伴う皮膚炎病態を惹起できた（図 1）。

て、分化誘導前のナイーブ CD 4＋ T 細胞移入マウス群およナイーブ CD 4＋ T 細胞を移入したコントロール群では、明び非特異的抗原であるウシ血清アルブミン（BSA）投与群

らかな炎症応答はみられなかった。皮膚における好酸球浸を設定した。抗原チャレンジに伴う皮膚炎病態の発症を、潤に伴う EPO 活性の変化を解析した結果、Th 2 細胞を移

病理組織学的変化を指標として評価した。また皮膚組織へ入した場合には好酸球が多く浸潤するが、Th 1 細胞移入の 好 酸 球 浸 潤 を、 組 織 ホ モ ジ ネ ー ト 中 の eosinophil

マウスでは著しい好酸球浸潤はみられなかった（図 2 A）。

peroxidase（EPO）
活性を測定することにより評価した。組

一方、移入した T 細胞は、Th 1 および Th 2 細胞移入マウ

織に浸潤した抗原特異的 T 細胞は、フローサイトメーター

スの両者で、抗原チャレンジに伴い皮膚局所への有意な浸で CFSE 陽性細胞を計数することにより解析した。

潤がみられた（図 2 B）。
Th 2 細胞移入モデルにデキサメサゾン（Dex）およびタク

2. 3. T細胞依存性皮膚炎モデルに対する薬剤の効果

ロリムス（FK）を投与したところ、いずれも抗原誘発皮膚2 . 2 . で樹立した皮膚炎モデルに対する各種薬剤の効果

好酸球および抗原特異的 T 細胞浸潤を有意に抑制した（図を検討した。ステロイド薬である dexamethasone および3）。アトピー性皮膚炎に対するステロイド薬および免疫免疫抑制薬であるタクロリムス（FK 506）を phosphate-

抑制薬の効果が、Th 2 細胞移入モデルで再現できた。

buffered saline（PBS）に懸濁し、抗原チャレンジの 30 分

図１ T細胞移入マウスにおける抗原誘発皮膚炎反応
In vitroで樹立したOVA特異的ナイーブCD 4＋ T、Th1およびTh 2細胞を移入したマウスの背部皮膚にOVAチャレンジした。チャレンジ96時間後に皮膚組織を採取し、H&E
染色を行って弱拡大（上段）および強拡大（下段）で鏡検した。スケール；50μm。矢印；
好酸球。

− 94 −

アトピー患者に対する化粧品の皮膚刺激性・保護作用を評価する新規皮膚炎モデルの開発

図２

T細胞移入マウスにおける抗原誘発皮膚細胞浸潤反応

OVAおよびBSAチャレンジ24時間後における、皮膚組織のEPO
活性（A）および抗原特異的T細胞浸潤（B）解析した。

図3

Th 2細胞移入マウスにおける抗原誘発皮膚炎に対する治療薬の作用

Th 2移入マウスにデキサメサゾン（Dex）およびタクロリムス（FK）を1および10 mg/kg皮下投与し、OVAおよびBSAチャレンジして、皮膚組織のEPO活性（A）および抗原特異的T細胞浸潤（B）解析した。

４．考

モノクローナル抗体が気管支喘息を対象に、また IL- 4 お察

よび IL- 13 の受容体に対する抗体がアトピー性皮膚炎に対

これまで、アトピー性皮膚炎を模した動物モデルとして、
NC/Tnd（Nga）マウスの他 3）、OVA 他抗原の反復投与に
4）

5）

6）

する治療薬として上市されたことによって、臨床的にも実
証された。

7）

等

本研究でも、T 細胞移入マウスにおいて、IgE ／マストの遺伝子導入マウス等が報告されている。しかし、いずれ細胞系の関与がなくても明らかな皮膚炎症状がみられたこも発症に長時間を要する上、症状の不均一性や誘発工程のとは意義深い。その迅速かつ安定的に発症する性状に加え、煩雑性等が問題となり、アトピー患者に対する化粧品を含

明確な発症メカニズムならびに治療薬応答性の面からも、めた化学物質の安全性を評価するための標準的な試験系と化粧品の皮膚刺激性・保護作用を評価する標準的試験系とすることは難しい。

しての高い有用性が示唆された。

よる惹起モデル 、CASP 1、IL- 18および IL- 33

一方、本研究課題を実施する上で、アトピー性皮膚炎に５．総おける発症機構の理解も重要となる。これまでは、多くの括患者で血中 IgE の上昇が観察され、その IgE が抗原を介し短期間に安定して皮膚炎症状が惹起できるアトピー性皮て架橋されることにより、掻痒等を誘発する主物質である

膚炎モデルが樹立できた。ヘアレスクローンマウスを確立

ヒスタミンがマスト細胞から放出されるため、IgE ／マス

できれば、より簡便に多くの化合物による影響をスクリー

ト細胞系がその病態形成にも重要であると考えられてきた。

ニング的に評価できるようになることから、アトピー患者

しかし申請者はそのパラダイムに逆行し、各種アレルギー

皮膚に対して影響がないものだけでなく、それに対する保疾患発症における共通の責任細胞として、T 細胞が重要な

護・治癒作用を有する物質を見いだせる可能性がある。す1）

役割を担うことを示してきた 。その成果は最近、代表的

なわち、これまでアトピー患者皮膚に対する悪影響を懸念

な T 細胞サイトカインの IL- 5 およびその受容体に対するして試験することも忌避されていた、多くの化粧品材料を− 95 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

ライブラリーとした探索研究を実施することにより、コスdermatitis-like skin lesions in mice. Clin Exp Allergy

メトロジー発の新たな皮膚炎治療薬開発に結びつくことも

37: 151-161, 2007.
5） Asahi K, Mizutani H, Tanaka M et al: Intradermal

期待される。

transfer of caspase-1（CASP1）DNA into mouse（引用文献）

dissects: role of CASP1 in interleukin-1beta associatedskin inflammation and apoptotic cell death. J Dermatol

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contributes to the spontaneous development of atopic

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+

Proc Natl Acad Sci U S A 99: 11340-11345, 2002.

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4） Wang G, Savinko T, Wolff H et al: Repeated epicutaneous
exposures to ovalbumin progressively induce atopic− 96 −

2194. e2183, 2019.

メラニン色素合成の解明に向けて〜チロシナーゼ関連タンパク質の金属要求性に関する基盤研究〜
京都大学大学院生命科学研究科

神戸

大朋

Melanin biosynthesis requires tyrosinase protein family consisting of tyrosinase (TYR), tyrosinase-related protein 1(TYRP1), and tyrosinase-related protein 2 (TYRP 2). These three proteins show high sequence identify. TYR has oxidase
activity, and possesses two copper ions coordinated at the active center. The Golgi-resident copper transporter ATP7A playsa pivotal role in the coordination of TYR with copper. In contrast, the coordination metals for TYRP1 and TYRP2 have notyet been clarified, although it was suggested that they have a homologous structure to TYR, and thus copper ions would becoordinated at their active site. The crystal structure of TYRP1 was recently reported, which showed that TYRP1 has homologous structure to TYR, as expected. However, it was a surprising result that the coordinated metals at the active center are
not copper ions but zinc ions. Currently, information about the metals coordinated at the active center of TYRP1 and TYRP2
is complicated. In this study, we tried to address this unappreciated issue using the gene disruption/re-expression evaluation
strategy. We first confirmed that TYR activation requires ATP7A using the cells deficient in ATP7A gene. We then showedthat two Zn transporter (ZNT) complexes, specifically ZNT5-ZNT6 heterodimers and ZNT7 homodimers, which locate to
the compartments of the early secretory pathway, play essential roles for TYRP1 expression. Moreover, we showed that thecells deficient in both ZNT5 and ZNT7 genes changed the color from black to brown in cell pellets, indicating that both ZNTcomplexes contribute to melanin synthesis. These results provide novel insights into the molecular mechanism underlying
the melanin biosynthesis and TYRP1 expression.

1．緒

ヒト体内のタンパク質の中で亜鉛含有タンパク質は言

10 % 程度、また、銅含有タンパク質は多くても 0 . 5 % 程度

メラニン色素は、メラニン細胞においてメラノソーム中と予想されている 10 , 11）。細胞内におけるこれらのタンパ

で、チロシンから数段階の酵素反応を経て合成される 1 , 2）。

ク質の生合成や活性発現には、亜鉛や銅が正しく配位されこのメラニン合成に関わる酵素として、チロシナーゼ

る必要があるため、亜鉛や銅の運搬を担うトランスポータ（TYR）、チロシナーゼ関連タンパク質 1（TYRP 1）、チロ

ーは厳密に制御されている 12 , 13）。上述の通り、TYR の活

シナーゼ関連タンパク質 2（TYRP 2）の３つが存在する 3 , 4）。

性中心に配位する銅は ATP 7 A により供給されるが 5）、本TYR は、活性中心に銅イオンを配位するタイプ３銅タン

研究では、TYRP 1・2 に亜鉛を供給する亜鉛トランスポ

パク質であり、そのモノフェノールモノオキシゲナーゼ活ーターが存在すると仮定して解析を実施した。尚、我々の性の発現には、活性中心への銅の配位が不可欠となる。ま

これまでの解析から、亜鉛要求性のエクト型酵素は、亜鉛

た、この銅の配位にはトランスゴルジネットワークに局在

トランスポーター複合体である ZNT 5 -ZNT 6 ヘテロ二量する銅トランスポーター ATP7A（メンケスタンパク質）が必体と ZNT 7 ホモ二量体が機能することが明らかとなって5）須の役割を果たす 。そのため、ATP 7 A の変異マウスはいるため 14 , 15）、これを指標とし、補因子の観点からメラ

いずれも斑模様やうすい色を特徴とする被毛を呈する 6 , 7）。

ニン色素生合成の一端を解明することを試みた。

一方、TYRP 1 と TYRP 2 に関しては、TYR と高い相同性

２．方を有すること、さらに相同の活性部位を持つと予想される

法

。このよう

2. 1. 細胞培養、トランスフェクション、亜鉛・銅トラン
スポーター欠損株の作成な状況下、最近 TYRP 1 の結晶構造解析から、TYRP 1 はヒトメラノーマ細胞である SK-MEL- 2（JCRB 細胞バン

TYR と相同な活性中心を持つものの、配位している金属ク）の培養には 10 % FCS を添加した RPMI 1640（和光純薬ことから、以前よりタイプ 3 銅酵素に分類されており、これまで十分な解析が実施されてこなかった

2 , 3）

は銅ではなく、亜鉛であることが報告された

8 , 9）

工業株式会社）を用いて、5 % CO 2、37 ℃の条件下で 10 cm。

dish にて培養、および継代維持を行った。一方、別のヒト
メラノーマ細胞である HMV- Ⅱ（理研 BRC）には RPMI 1640
Studies on the mechanism how melaninbiosynthesis is regulated by metals
Taiho Kambe
Graduate School of Biostudies, Kyoto
University

ではなく、Ham’ s F- 12 buffer（和光純薬工業株式会社）を用いた。亜鉛トランスポーター ZNT 5 および ZNT 7、銅ト ラ ン ス ポ ー タ ー ATP 7 A 欠 損 株 を 樹 立 す る た め に、
pX 330 -B/B ベクターにそれぞれの遺伝子の gRNA を接続
したプラスミドを作成した。この作成したプラスミドをブ− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

ラ ス ト サ イ ジ ン S 耐 性 遺 伝 子 発 現 ベ ク タ ー と 共 に SK-（3 7 5 mM Tris-HCl（pH 6 . 8）、3 0 % Glycerol、6 % SDS、

MEL- 2 細胞および HMV-II 細胞に Lipofectamine 2000 を

0 . 1 % BPB）を 8 µL 加え、37 ℃で 20 分間インキュベートし使用して導入し、薬剤耐性株を指標にそれぞれのトランス

た。Novex WedgeWell 4 - 1 2 % Tris-Glycine Gels

ポーター欠損株（ZNT 5 ZNT 7 二重欠損株と ATP 7 A 単独

（Invitrogen）を用い、10 mA、４℃の条件で 3 時間程度、欠損株）を樹立した。また、TYR、TYRP 1、TYRP 2 および、電気泳動を行った。バッファーの置換とゲルの平衡化のた

トランスポーターの発現ベクターの導入にもLipofectamine

め、泳動後のゲルを 50 mM phosphate buffer（pH 6 . 0）で2000 を使用した。

室 温 に て 3 時 間 振 と う し た。 平 衡 化 し た ゲ ル は color
formation buffer（1 0 mM phosphate buffer（pH 6 . 8）、1 . 5

2. 2. Western blotting

mM L-DOPA、4 mM MBTH）中において 37 ℃で 1 時間反膜 タ ン パ ク 質 20 µg を 2×SDS sample buffer（375 mM
Tris-HCl（pH 6 . 8）, 3 0 % Glycerol, 6 % SDS, 0 . 5 M DTT,応させた。TYR による L-DOPA 酸化産物である DOPA
chrome のバンドの生成を褐色の色素として確認した。

0 . 1 % BPB）に溶解し、37 ℃で 15 分間反応させサンプル溶３．結液とした。8 % SDS-polyacrylamide gel を用いて電気泳動を行った後、0 . 45 µm PVDF 膜（Immoblion-P）に transfer

果

3. 1. TYR活性はATP7Aによって制御されるした。以下に示した一次抗体にて 4 ℃で一晩抗体反応を行

TYRP 1 の解析を実施するにあたり比較対象となる TYRい、PBS-T で 10 分間の洗浄を 3 回行った後、二次抗体をの銅依存性に関する解析を実施した。CRISPR/Cas 9 を使用

反 応 さ せ た。ImmoblionTM Western Chemiluminescent

して ATP 7 A を欠損させた SK-MEL- 2 細胞株を樹立した。

HRP Substrate（Millipore）を用いて化学発光させ、ImageTYR、TYRP 1、TYRP 2 を一過的に発現させたところ、Quant LAS 500（GE Healthcare Life Science）にて検出しATP 7 A 欠損株および親株のどちらにおいてもメラノソー

た。一次抗体には、anti-TYRP 1（1 : 3000 ; Sigma）、anti-

ムと思われる小胞への局在が観察された（図１A）。一方、

Rab 2 7 a（1 : 1 0 0 0 ; Cell Signaling technology）、anti-Halo

ザイモグラフィーにおいては、ATP 7 A 欠損株におけるMonoclonal Antibody（1 : 1 0 0 0 ; Promega）、anti-ATP 7 A

TYR 活性を検出することができなかった（図 1 B）。これら（1 : 3000）を使用した。二次抗体には、GE Healthcare 社のの結果から、ATP 7 A 欠損株においては、TYR はアポ型

HRP 標識抗 IgG 抗体（1 : 3000）を使用した。

酵 素 と し て 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ た。 一 方、
TYRP 1 および TYRP 2 の発現は、野生株と ATP 7 A 欠損

2. 3. 免疫蛍光染色

株において差違はみとめられず、両者の発現に ATP 7 A はカバーガラス上で 2 日間培養した SK-MEL- 2 細胞を必要でないことが明らかとなった（Fig. 1 A）。

PBS で洗浄した後、中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業
株 式 会 社 ）に て 固 定 し た。PBS で 3 回 の 洗 浄 後、0 . 1 %3. 2. ZNT5ZNT7二重欠損株ではTYRP1は安定にTriton（Nacalai Tesque）によって透過処理を 15 分間行っ発現できないた後、6 % BSA/PBS 溶液（アルブミン , ウシ血清由来 , フ

次に、SK-MEL- 2 細胞において、亜鉛トランスポータ

ラクション V, pH 7 . 0（和光純薬工業株式会社））でブロッキー ZNT 5 と ZNT 7 を共に欠損させた ZNT 5 ZNT 7 二重欠

ングした後、2 % BSA/PBS 溶液に一次抗体を希釈して 4

損 株 を 樹 立 し た。 本 二 重 欠 損 株 に TYR、TYRP 1、℃で一晩抗体反応を行った。PBS で 10 分間の洗浄を 3 回

TYRP 2 を一過的に発現させて Immunoblot 解析を実施し行った後、同様に二次抗体、三次抗体それぞれを室温で 1たところ、TYR と TYRP 2 は野生株と同様に欠損株にお時 間 反 応 さ せ た 後、SlowFade Antifade kit（Molecular

いても発現が確認された。一方、TYRP 1 の発現は、欠損

Probes）を用いてカバーガラスに封入した。蛍光観察には株においてみとめることができなかった。TYR、TYRP 1、

蛍光顕微鏡 FSX 100（Olympus）
を使用した。一次抗体には、

TYRP 2 の発現や局在への ZNT 5 と ZNT 7 の影響をさらに

anti-TYR［T 311］
（1 : 1000 ; Santa Cruz Biotechnology）、

詳細に解析するため、TYR、TYRP 1、TYRP 2 を野生株

anti-TYRP 1（1 : 1000 ; Sigma）、
anti-TYRP 2［C- 9］（1 : 1000 ;と ZNT 5 ZNT 7 二重欠損株に一過的に発現させ、免疫蛍Santa Cruz Biochemistry）を用いた。二次抗体、三次抗体

光染色によるタンパク質発現と局在解析を行った。TYRには Molecular Probes の Alexa 標識抗 IgG 抗体を使用しと TYRP 2 はメラノソームと思われる小胞への発現が確認た。 核 の 染 色 に は 4 , 6 -diamino- 2 -phenylindole（DAPI）されたが、TYRP 1 は、野生株で観察された発現が欠損株（1 : 1000 ; Abcam）
を用いた。

に お い て は 消 失 し て い た（ 図 2）
。 し た が っ て、ZNT 5 ZNT 6 ヘ テ ロ 二 量 体 と ZNT 7 ホ モ 二 量 体 の 発 現 が、

2. 4. ザイモグラフィー

TYRP 1 の安定発現に不可欠であることが示唆された。

調整した膜タンパク質 50 µg に 6 × SDS buffer: DTT（-）− 98 −

メラニン色素合成の解明に向けて〜チロシナーゼ関連タンパク質の金属要求性に関する基盤研究〜

A

B

図１

ATP 7 A欠損SK-MEL- 2細胞に発現させたTYR、TYRP 1、TYRP 2の免疫染色の結果

A. ATP 7A欠損株と野生株において、TYR、TYRP 1、TYRP 2の発現に顕著な変化はみとめられない。
B. ATP 7A欠損株においてはTYRの酵素活性は消失する。TYRの活性はザイモグラフィーによって検出した。

図2

ZNT 5 ZNT 7二重欠損SK-MEL- 2細胞に発現させたTYR、TYRP 1、TYRP 2の免疫染色の結果

ZNT 5 ZNT 7二重欠損株においては、野生株で検出されたTYRP 1の発現が完全に消失する。一方、TYRとTYRP 2の発現には変化はみとめられない。

3. ３. TYRP1の発現にはZNT5-ZNT6ヘテロ二量体およびZNT7ホモ二量体が輸送した亜鉛が不可欠である

させた場合には TYRP 1 の発現はみとめられなかった（図TYRP 1 の発現が ZNT 5 と ZNT 7 の輸送する亜鉛に依存活性が必要であることが明らかとなった。また、ZNT 7 おしているのか明らかにするため、亜鉛輸送活性を失った

よび亜鉛輸送活性を持たない ZNT 7 変異体を用いても同様

ZNT 5 変 異 体 を 用 い た 解 析 を 試 み た。ZNT 5 の 属 す るの結果が得られた（結果省略）。

3）。 以 上 の 結 果 よ り、TYRP 1 の 発 現 に は、ZNT 5 とZNT 6 が結合した ZNT 5 -ZNT 6 ヘテロ二量体の亜鉛輸送

ZNT ファミリーには膜貫通領域内に高度に保存された 2。この HD-HD モ

3. 4. HMV-II 細胞のZNT5ZNT7二重欠損株ではメラニン生成が障害される

チーフ内のアミノ酸残基をアラニン（A）に置換した変異体

ZNT 5 -ZNT 6 ヘ テ ロ 二 量 体 と ZNT 7 ホ モ 二 量 体（ 両ZNT 5 H 451 A と ZNT 5 D 599 A は、ZNT 6 と正常にヘテロ二量体

ZNT 複合体）が TYRP 1 の発現に影響を与えたことから、を形成できるが亜鉛結合能を失うため、どちらも亜鉛輸送

両 ZNT 複合体のメラニン色素生合成に与える影響を解析

活性をもたない変異体となる 16）。野生株と ZNT 5 ZNT 7

した。SK-MEL- 2 細胞は、メラニン生合成ができないメ

二重欠損株に TYRP 1 と共に、ZNT 5、ZNT 5 H 451 A または

ラノーマ細胞であったため、本解析では、黒色を呈するヒZNT 5 D 599 A を一過的に発現させたところ、野生株においてトメラノーマである HMV-II 細胞を使用した。HMV-II 細は、いずれの ZNT 5 においても TYRP 1 は発現した。これ

胞の ZNT 5 ZNT 7 二重欠損株と野生株のメラニン色素量に対し、欠損株においては ZNT 5 を発現させた場合のみを比較したところ、欠損株の黒色が肉眼で観察できるほど

TYRP 1 が検出され、ZNT 5 H 451 A または ZNT 5 D 599 A を発現減少していた（図 4）。このことより、両 ZNT 複合体が輸つのヒスチジン残基（H）と２つのアスパラギン酸残基（D）からなる HD-HD モチーフが存在する

13）− 99 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図3 TYRP 1の発現にはZNT複合体が輸送した亜鉛が不可欠である
ZNT 5 ZNT 7二重欠損株において消失したTYRP 1の発
現が、ZNT 5の再発現で回復する。

図4 ZNT 5 ZNT 7二重欠損株ではメラニン生成が障害される野生株およびZNT 5 ZNT 7二重欠損株の細胞ペレットの写真。

送した亜鉛がメラニン色素生成に重要な役割を果たしていても用いられるタンパク質である。ATP 7 A 欠損細胞にることが示唆された。

TYR を発現させると、TYR の活性は消失するが、TYR タ
ンパク質はメラノソームと予想される細胞内小胞に局在し４．考察とまとめた。今後、この局在がメラノソームであるのかメラノソー

これまで、TYR と TYRP 1 および TYRP 2 の補因子の観

ム特異的タンパク質との比較により検討する予定である。

点からの成熟化過程についてはほとんど明らかにされていまた、このアポ型の TYR が正しくメラノソームに輸送さなかったが、本研究では、その分子メカニズムの一端を解れる事実は、亜鉛が配位しないと速やかに分解されると考明 し た。SK-MEL- 2 を 用 い た ATP 7 A お よ び ZNT 5 -えられる TYRP 1 の結果と対比すると非常に興味深い。

ZNT 6 ヘテロ二量体と ZNT 7 ホモ二量体（両 ZNT 複合体）

以前の論文で、TYRP 2 の活性が亜鉛に依存していると欠損株による解析の比較、さらに亜鉛輸送活性を持たない報告されていたため 17）、本解析は当初、ZNT 5 ZNT 7 二

ZNT 5 変異体である ZNT 5 H 451 A と ZNT 5 D 599 A を用いた解重欠損株における TYRP 2 の発現に関して解析を進めてい析などから、TYRP 1 は両 ZNT 複合体によって輸送された。しかしながら、TYRP 2 の発現に関しては、欠損株にた亜鉛によって制御されることを示している。これまで、

おいて全く変化がみとめられなかった。したがって、上述

TYRP 1 は TYR と同じタイプ 3 銅タンパク質であると考の報告が間違いだった可能性もある。しかしながら、このえられてきたが、本結果は、TYRP 1 の結晶構造で亜鉛が報告を引き続き支持する場合、TYRP 2 への亜鉛供給は、配位していることを報告した論文の内容に呼応する結果と両 ZNT 複合体以外の亜鉛トランスポーターが担っている

考えている

8 , 9）と考えられる。細胞外や細胞小器官で機能する亜鉛酵素の。

本 解 析 で は、 主 に SK-MEL- 2 細 胞 を 用 い て TYR、

多くは、両 ZNT 複合体によって亜鉛が輸送されると思わTYRP 1、TYRP 2 の 発 現 解 析 を 実 施 し た。Western

れるため、本結果は非常に興味深い例となり、メラノソー

Blotting において TYRP 1 が特異的に検出されなかった。

ム局在型の亜鉛トランスポーターが存在する可能性も浮上

ZNT 5 ZNT 7 二重欠損株において過剰発現させた TYRP 1する。

でさえ安定に存在できない事実は、細胞内で両 ZNT 複合

これまで、本研究のように金属の中でも特に亜鉛に焦点体が存在しない場合、TYRP 1 の分解が極めて迅速に行わを当て、メラニン生合成との関わりに着眼した研究は、ほれることを示唆する。TYR、TYRP 1、TYRP 2 導入細胞

ぼ皆無であった。メラニン生合成は、TYR 酵素群の補酵か ら 調 整 し た RNA を 鋳 型 に し た RT-PCR 解 析 で は、素となる金属の観点からも複雑な活性発現制御機構が存在

TYRP 1 も TYR と TYRP 2 と同様に発現していることが確することが想定される。本研究の解析を進展させ、メラニ

認できており（結果省略）、この結果も本仮説を支持する。

ン色素生合成の分子機序の解明に繋げたいと考えている。

今後は、この素早い TYRP 1 の分解機構に関しても解析をその成果は、美白効果を持つ化粧品などの開発に幅広く応進めていく予定である。

用されることが期待される。

TYR、TYRP 1、TYRP 2 はメラノソームマーカーとし− 100 −

メラニン色素合成の解明に向けて（引用文献）〜チロシナーゼ関連タンパク質の金属要求性に関する基盤研究〜

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2）− 101 −

神経ペプチドシグナルを介したアレルギー発症メカニズムの解明と皮膚炎軽減効果
北海道大学遺伝子病制御研究所

北村秀光

Not a few people are suffering from allergic skin diseases such as atopic dermatitis and psoriasis. With the developmentof medicine, patients with skin diseases are relieved by the treatment with anti-inflammatory or steroidal drugs. However, there are some patients having not only side effects such as drug allergies and anaphylaxis but also refractory patients.
Therefore, it is important to elucidate the onset and aggravation mechanisms of skin diseases from a new perspective. In theprevious studies, we revealed that a neurokinin A receptor, NK2R-mediated neuropeptide signals, activated in a STAT1-dependent manner, augmented antigen presentation ability of dendritic cells and induced allergen-specific T cell immune responses.
In this study, we investigated the involvement of STAT1-mediated neuropeptide signals in the onset and clinical condition of skin diseases by using a psoriasis mouse model. We established a psoriasis model by the treated with imiquimod(IMQ) to the skin and found that body weight loss scale formation and thickness of skin in STAT1-deficient mice were significantly reduced compared to wild-type mice. Ly6C-expressing myeloid cells were transiently induced in the IMQ-treatedwild-type mice were significantly lower in the STAT1-deficient mice. Furthermore, we confirmed that IL-17A and NK2R
gene expression levels were down-regulated in the spleen cells of IMQ-treated STAT1-deficient mice compared to that ofwild type mice. These data suggested that STAT1 activation were closely related to the pathogenesis of in the IMQ-induced
psoriasis model mice.
Base on the present findings, we speculate that STAT1-mediated neuropeptide signaling cascade and the related molecules may be promising drug targets to improve skin diseases such as psoriasis.

1．緒

ド抵抗性重篤化喘息マウスモデルを構築し、これに NK 2 R

言拮抗阻害薬を投与することで、病態の発症、重篤化が軽減

アトピー性皮膚炎などの免疫・アレルギー性皮膚疾患にされるデータを得た 2 , 3）。これらの発見は、IFN-STAT 1

苦しむ方が増えている。近代医学の発展により、効果の高の活性化による NK 2 R の発現誘導を介した神経ペプチド

い抗炎症薬、抗アレルギー薬、またはステロイド薬が開発

シグナルが、過剰な免疫応答により誘導される慢性炎症にされ、数多くの患者さんを救済している。しかしながら、密接に関与することを示唆する。

薬剤アレルギー・アナフィラキシーなど副作用の発生や完乾癬は、角化細胞の分化不全と過剰増殖を特徴とする慢全に寛解できない患者さんも存在することから、これまで性皮膚疾患で、患者の割合は世界人口の約 2 ～ 3 ％であるの視点とは異なる皮膚疾患の発症、重篤化メカニズムの解と推定されている。一般的に、乾癬の症状として、皮膚表明と副作用の少ない安全な治療法の開発は重要であると考面が隆起する肥厚、そこに境界明瞭な赤い発疹である紅斑える。

が生じ、その表面に乾燥した銀白色の角質が付着する鱗屑

これまでの先行研究で、痛みやストレス、あるいは侵襲が認められる 4 , 5）。これまで、乾癬の治療には紫外線療法などの刺激により神経系から放出される神経ペプチドタキ

や CD 4 陽性 T 細胞やマクロファージの活性化を抑制する

キ ニ ン 類 の 一 つ、 ニ ュ ー ロ キ ニ ン A の 受 容 体 で あ る

シクロスポリン製剤のような免疫抑制剤や、乾癬に関与す

NK 2 R がⅠ型インターフェロン（IFN-α/β）あるいは II 型イるサイトカインに作用する抗TNF-α、IL-12、IL-23、IL- 17

ンターフェロン（IFN-γ）の刺激により、STAT 1 依存的に抗体などの生物学的製剤などが使用されており、症状の軽免疫細胞の一つである樹状細胞に発現誘導され、炎症・免減や早期治療による効果は認められている。しかしながら、疫応答の重篤化に関与すること、さらに NK 2 R に対する

現在まで乾癬の根治には至っておらず、強い免疫抑制作用

拮抗阻害薬がアレルゲン特異的 T 細胞の誘導と活性化を有による副作用や治療の長期化が問題となっている 6 - 8）。

意に抑制することを見出した 1）。また IFN- γ 誘発ステロイ

イミキモドは、イミダゾキノリン系の低分子化合物で、
樹 状 細 胞 や マ ク ロ フ ァ ー ジ が 発 現 す る toll 様 受 容 体

Elucidation of the onset mechanism of
a llerg y mediated by neuropept ide
signals and the relieving effect ondermatitis
Hidemitsu Kitamura
I nst it ute for G enet ic Med ici ne ,Hokkaido University（TLR 7）のアゴニストで、インターフェロン制御因子による IFN-α/β の産生が起こる。またマウスの皮膚に対して
イミキモドの塗布により、乾癬様の病態が誘発されることが報告されている 9）。イミキモドによって誘発された皮膚炎症では、紅斑、角化細胞の過剰増殖による表皮肥厚や分化不全による鱗屑が観察され、ヒトにおける乾癬の症状と− 102 −

神経ペプチドシグナルを介したアレルギー発症メカニズムの解明と皮膚炎軽減効果

非常によく似ていることが知られている 10 - 12）。

から 4 の範囲（0、なし 1、軽度 2、中程度 3、重症 4、極そこで本研究では、皮膚炎症性疾患の改善・寛解を目指し、イミキモド誘発乾癬マウスモデルを作出し、その病態

めて重症）で採点した。総合スコアは上記 3 つの項目の合計（0 ～ 12）で表した。

の 発 症 と 重 篤 化 お よ び 炎 症・ 免 疫 細 胞 に お け る IFNSTAT 1 依存的な神経ペプチド受容体 NK 2 R の発現増強を介した神経ペプチドシグナルの活性化制御メカニズムの解2. 3. 皮膚の組織学的解析
イミキモドクリームを 2 日、あるいは 7 日間塗布した後、明を行うとともに、皮膚疾患の発症・重篤化との関連を検

マウス背部の皮膚を採取し、サンプルを 4 ％パラホルムア

討した。

ルデヒドで固定した後、HE 染色標本を作成し、光学顕微

２．方鏡による組織学的な観察を行った。

法

2. 1. イミキモド誘発乾癬モデルの作出
野生型 C 57 BL/ 6 マウスあるいは同系の STAT 1 欠損マ
ウスを使用し、はじめに背部の剃毛を行った 2 日後、自然

2. 4. イミキモド誘発乾癬モデルにおける免疫担当細胞の解析
イミキモドクリームを 2 日、あるいは 7 日間塗布した後、免疫系の活性化に重要な Toll 様受容体 TLR 7 / 8 のアゴニ

マウスより脾臓細胞を回収し、フローサイトメトリーにて

ストで、IFN-α/β を産生誘導する作用効果のあるイミキモ

各種免疫担当の解析を行った。また、各種炎症性サイトカ

ドを含む市販クリーム（BESELNA CREAM 5 % , 持田製

インやケモカインの遺伝子発現レベルを定量 PCR 法によ薬株式会社 , Tokyo, Japan）をマウスの皮膚に塗布した。

り評価した。

コントロールとして市販のワセリンを使用した。塗布を開始した日を Day 0 とし、Day 6 までの 7 日間、連続塗布し、その翌日まで、マウスの体重の変化を計測するとともに、皮膚の炎症の程度を解析、評価した（図 1）。

2. 5. 統計解析
有意差検定は、Student の t 検定を用いて行い、有意水
準は P< 0 . 05 とした。

３．結

2. 2. 乾癬様皮膚炎症の重症度スコア

果

いて背部皮膚の炎症状態を評価した。スコアは炎症面積を3. 1. イミキモド誘発乾癬モデルマウスにおける病態の発症とNK2Rの発現考慮せず評価を行った。紅斑、鱗屑および皮膚の厚さは 0

皮膚炎症性疾患領域における新たな制御メカニズムの解

重症度指数（PASI：Psoriasis Area Severity Index）を用明を目指し、イミキモド誘発乾癬マウスモデルを作出し、病態の発症における神経ペプチドシグナルの関与について検討した。イミキモド誘発乾癬モデルマウスの体重を計測したところ、イミキモド塗布後、1 から 2 日において、一過性に体重が減少することを見出した（図 2 A）。さらに 7日後、皮膚の外観より、肥厚と鱗屑の症状が認められると
図1

イミキモド誘発乾癬モデルの構築と解析・評価

図2

ともに、皮膚の組織学的観察から、表皮および真皮の肥厚、イミキモド誘発乾癬モデルマウスの体重変化および皮膚の外観とHE染色像− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

血管の造成および炎症・免疫細胞の浸潤を確認した（図以上の結果から、イミキモド誘発乾癬モデルマウスにおける病態の発症過程において NK 2 R を介した神経ペプチ

2 A）。
そこで、イミキモド塗布 2 日後に、マウスから脾臓を回ドシグナルの関与の可能性が示唆された。

収し、フローサイトメトリーによる、各種免疫担当細胞を解析した結果、Ly 6 C を中程度発現し、Ly 6 G を発現しない単球系の細胞および Ly 6 C と Ly 6 G を共発現する顆粒球
系の細胞の割合が増加することを見出した（図 3）。

3. 2. イミキモド誘発乾癬モデルマウスの病態発症におけるSTAT1の関与
次に、STAT 1 欠損マウスを使用し、イミキモド誘発乾

さらにイミキモド塗布 2 日後、マウス脾臓細胞において、

癬モデルの病態発症における STAT 1 の活性化とシグナル

各種サイトカインおよび神経ペプチド関連遺伝子の発現を伝達の関係について検討した。イミキモド塗布 1− 5 日後解析した結果、炎症性サイトカイン IL- 6 および神経ペプにおいて、野生型マウスの体重減少の割合が STAT 1 欠損

チドタキキニン類の一つニューロキニン A の受容体 NK 2 R

マウスでは有意に減弱するとともに（図 5 A）、皮膚の外観の発現レベルが有意に増加することを確認した（図 4）。

から肥厚や鱗屑の症状が野生型マウスに比べ、STAT 1 欠

図3

図4

図5

イミキモド誘発乾癬モデルマウス脾臓細胞のLy 6 C/Ly 6 G陽性細胞の解析

イミキモド誘発乾癬モデルマウス脾臓細胞のサイトカインおよびNK 2 R遺伝子発現の解析

イミキモド誘発乾癬モデルマウスの体重変化および皮膚の外観におけるSTAT 1の効果

− 104 −

神経ペプチドシグナルを介したアレルギー発症メカニズムの解明と皮膚炎軽減効果

した。野生型マウス脾臓細胞において、イミキモド塗布 2

損マウスにおいて、軽減されることを認めた（図 5 B）。
さらに、PASI を用いてイミキモド誘発乾癬モデルの病日後一過性に誘導される Ly 6 C を中程度発現し、Ly 6 G を態に対する STAT 1 の関与を検討した。イミキモドの塗布発現しない単球系の細胞の割合が、STAT 1 欠損マウスににより野生型マウスにて生じた皮膚の肥厚・鱗屑および総お い て 有 意 に 減 少 す る こ と を 認 め た（ 図 8 A）。 一 方、合のスコア増加が、STAT 1 欠損マウスにおいては、特にLy 6 C と Ly 6 G を共発現する顆粒球系の細胞の割合は、イ

6 日から 7 日後、有意に抑制されることが明らかになった

ミキモド塗布 2 日後および 7 日後のいずれにおいても、野

（図 6）
。

生型マウスに比べ STAT 1 欠損マウスにおいて増加するこさらに皮膚の組織学的観察から、野生型マウスに比べ、STAT 1 欠損マウスにおける真皮の肥厚が著しく減弱するとを確認した（図 8 A および 8 B）。
イミキモド塗布 2 日後、野生型および STAT 1 欠損マウ
スの脾臓細胞において、各種サイトカインおよび NK 2 R

ことを確認した（図 7）。
以上のデータから、イミキモド誘発乾癬マウスモデルに遺伝子の発現レベルを解析した。その結果、STAT 1 欠損

おける病態の発症と重篤化において STAT 1 の活性化とそマウス脾臓細胞において、IL- 17 A 遺伝子の発現レベルがのシグナル伝達機構が重要であることが示唆された。

有意に減弱するとともに、NK 2 R 遺伝子の発現レベルが減少する傾向にあることを確認した（図 9）。

3. 3. イミキモド誘発乾癬モデルマウスの炎症反応・免
疫応答におけるSTAT1およびNK2Rの関与

炎症反応と免疫応答において、STAT 1 は IL- 17 の産生誘

STAT 1 欠損マウスを使用したイミキモド誘発乾癬モデ

導と NK 2 R を介した神経ペプチドシグナルの制御に関与

ルにおける炎症・免疫担当細胞の誘導および活性化を検討

図6

図7

以上のデータから、イミキモド誘発乾癬モデルマウスのする可能性が示唆された。

イミキモド誘発乾癬モデルマウスの病態におけるSTAT 1の効果

イミキモド誘発乾癬モデルマウスの皮膚組織におけるSTAT 1の効果

− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図8

イミキモド誘発乾癬モデルマウス脾臓細胞のLy 6 C/Ly 6 G細胞におけるSTAT 1の効果

図9 イミキモド誘発乾癬モデルマウス脾臓細胞のサイトカインおよびNK 2 R遺伝子発現におけるSTAT 1の効果

４．考を中程度発現し、Ly 6 G を発現しない単球系の細胞の割合

察がするとともに、IL- 17 産生レベルの低下、および乾癬の乾癬は紅斑、丘疹、鱗屑、異常な角化を特徴とする難治

発症、病態の重篤化が軽減することを見出した。また我々

性の慢性皮膚疾患であり、これまで、効果の高い抗炎症薬、

は STAT 1 が欠損した条件では、IFN-α/β あるいは IFN-γ

副作用の少ないステロイド薬に加えて、TNF-α や IL- 23、刺激による樹状細胞の活性化や抗原特異的 T 細胞の応答性

6 - 8）。最近、が著しく減弱することも確認している（未投稿データ）。一

乾癬患者において、STAT 1 およびその下流標的、関連分

般に乾癬の病態発症および重篤化の過程で、CD 4 陽性 T

IL- 17 を標的とする治療薬も開発されている子の発現レベルと病態との関連が報告され13 , 14）、またヒ細胞から Th 1、Th 17 への分化が誘導され、Th 1 から IFN-γ、ト遺伝子発現プロファイルの解析においても、乾癬の病態

Th 17 から IL- 17、IL- 22 が産生されることが知られ、特と STAT 1 との関連が示されている 15）。

に Th 17 と病態に関する報告が多くなされている 16）。

本研究のイミキモド誘発乾癬マウスモデルにおいて、

本研究成果および先行研究による知見から、イミキモド

STAT 1 が欠損した条件では、一過性に誘導される Ly 6 C

誘発乾癬モデルにおいて、IFN-STAT 1 の活性化とそれ− 106 −

神経ペプチドシグナルを介したアレルギー発症メカニズムの解明と皮膚炎軽減効果

図10 イミキモド誘 発 乾 癬モデルマウスの 病 態発 症および 重 篤化におけるSTAT 1−
NK 2 R関与モデルに引き続く炎症反応・免疫応答の過程で発現誘導される

５．総IL- 17 と NK 2 R を介した神経ペプチドシグナルが、皮膚疾患の発症および重篤化において関与することが考えられた（図 10）。

括

本研究により、イミキモド誘発乾癬モデルにおいて
STAT 1 依存的な炎症・免疫応答の惹起と神経ペプチド受

これまで我々の研究グループは、ヒト単球由来樹状細胞

容体 NK ２R の発現増強、およびそれらの病態の発症およについて IFN-α/β で刺激することによりニューロキニン A

び重篤化への関与が示された。今後、STAT 1 依存的な神受容体 NK 2 R が発現誘導されるとともに、NK 2 R に対す経ペプチドシグナルの制御は、新たな皮膚疾患の予防、改る拮抗阻害薬がヒト樹状細胞に作用し、シラカバ花粉抗原

善法あるいは治療戦略の一つとして期待できる。

特異的 T 細胞応答を有意に抑制することを見出した 1）。またマウス樹状細胞においても IFN-γ の刺激で STAT 1 依存
的に NK 2 R が発現誘導されるとともに、IFN-γ 誘発ステ

謝辞本研究における乾癬モデルの構築および評価法について、

ロイド抵抗性重篤化喘息モデルマウスに対して NK 2 R 拮

信州大学農学部の田中沙智先生にご指導頂きました。また

抗阻害薬を投与することで、病態の発症、重篤化が軽減さ病態や免疫担当細胞の解析について、当教室大学院生の沈

2 , 3）。また他の研究グループからも、輝棟君に協力頂きました。最後に、本研究のご援助受け賜in vitro 細胞培養評価系およびイミキモド誘発乾癬モデル、りました公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団にあるいはヒト臨床検体を使用した臨床研究において、深く感謝申し上げます。

れるデータを得ている

JAK-STAT 1 シグナル伝達経路の活性化とその阻害による病態の減弱効果が報告されている 17 - 22）。従って、今後、 （引用文献）
乾癬モデルの炎症・免疫担当細胞について詳細な解析を引

1） Ohtake J, Kaneumi S, Tanino M, Kishikawa T, Terada

き続き行い、IFN-STAT 1 依存的な NK 2 R の発現制御メ

S, Sumida K, Masuko K, Ohno Y, Kita T, Iwabuchi S,

カニズムを解明するとともに、NK 2 R を介した神経ペプ

Shinohara T, Tanino Y, Takemura T, Tanaka S,

チドシグナルによる病態の発症、重篤化への関与を検証す

Kobayashi H, Kitamura H. Neuropeptide signaling

ることで、皮膚炎症領域における新たな予防・改善法や治through neurokinin-1 and neurokinin-2 receptors

療ターゲットの同定と創薬に繋ぐ科学的エビデンスが得ら

augments antigen presentation by human dendritic cells.

れると考えられる。

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− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

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− 108 −

アシル CoA 合成酵素 ACSVL4 による皮膚バリア形成機構
北海道大学大学院薬学研究院

木原章雄

Acylceramides are lipids that play an essential role in the formation of the permeability barrier in the skin, and the impairment of their synthesis causes the skin disorder ichthyosis. However, the acyl-CoA synthase (ACS) that converts ω-hydroxy fatty acid to ω-hydroxy acyl-CoA in the acylceramide synthesis pathway still remained unidentified. In the present
study, we examined the possibility that ACSVL4 (ACS very long-chain, member 4), which is the causative gene for ichthyosis prematurity syndrome, is the unidentified ACS involved in acylceramide production. Acsvl4 knockout (KO) mice exhibited neonatal lethality and severe skin barrier defect phenotype. Histological analyses showed hyperkeratosis and abnormal
lipid lamellar formation in Acsvl4 KO mouse epidermis. The amount of acylceramides in Acsvl4 KO mice was reduced toabout 10% of that in wild-type mice. In addition to the role as an ACS, ACSVL4 has been implicated in a fatty acid transporter, and reduced fatty acid uptake has been assumed to be a cause of the ichthyosis pathogenesis. However, the amountof fatty acids and triglycerides were not decreased in the epidermis of Acsvl4 KO mice. In vitro experiments revealed thatACSVL4 indeed exhibits ACS activity toward ω-hydroxy fatty acids. From these results, we conclude that the skin symptomof ichthyosis prematurity syndrome is not caused by decreased fatty acid uptake, but by impaired acylceramide synthesis.
Our findings contribute to the elucidation of the molecular mechanism of skin barrier formation and the pathogenesis of hereditary ichthyosis.

1．緒

化した特殊なセラミドクラス，アシルセラミド（オメガ -O-言

アシルセラミド）が存在する。アシルセラミドはセラミド

皮膚は強力な透過性バリアを有し，外界からの病原体やの脂肪酸部分（炭素数（C）30 ‒ 36）のオメガ位にリノール酸

アレルゲン，化学物質などの異物の透過を阻止することで，が結合した３本鎖構造をもつ（図 1）。アシルセラミドの特感染症やアレルギーの防止に重要な働きを担っている。ま

殊な構造は脂質ラメラを形成し，維持するために重要であた，この皮膚の透過性バリアは体内からの水分の損失も防る。アシルセラミドは皮膚バリア形成に必須であり，アシ

いでおり，この機能は陸上動物の生命維持に必須である。

ルセラミド産生に関わる遺伝子の変異はヒトでは魚鱗癬の皮膚の透過性バリアは極めて強力なため，通常皮膚からの中でも重症なタイプの魚鱗癬（常染色体潜性先天性魚鱗癬）

感染はほとんど起きない。しかし，火傷により皮膚バリアを引き起こし，マウスでは皮膚バリア異常によって新生致が損なわれると感染症のリスクは大幅に上昇する。また，死を引き起こす 1 , 2）。また，ヒトのアトピー性皮膚炎患者

先天的に皮膚バリア異常を示す疾患として乾燥，肥厚，鱗ではアシルセラミド量の減少が観察されている 3）。

屑を主徴とする魚鱗癬がある。アトピー性皮膚炎患者ではアシルセラミドの皮膚バリアにおける重要性にも関わら皮膚バリア機能が低下して，アレルゲンが侵入しやすくな

ず，アシルセラミド産生の分子機構が解明され始めたのはっている。

最近のことである。アシルセラミド中の C 30 - 36 脂肪酸の脂質の高い疎水性は物質の透過を阻むことから，脂質は伸長には脂肪酸伸長酵素 ELOVL 1 および ELOVL 4，アミ

透過性バリアの形成に適している。実際，表皮の最外層（角ド結合形成にはセラミド合成酵素 CERS 3，脂肪酸オメガ質層）には脂質の多層構造体（脂質ラメラ）が存在し，皮膚水酸化にはシトクローム P 450 の 1 つである CYP 4 F 22，

バリア形成において中心的な役割を果たしている。脂質ラ

リノール酸とのエステル結合形成にはトランスアシラーゼ

メラは主にセラミド，脂肪酸，コレステロールで構成され

PNPLA 1 が関わっている 2 , 4 - 6）。表皮は四層で構成されてている。セラミドは生体膜脂質スフィンゴ脂質の疎水骨格

おり，内側から基底層，有棘層，顆粒層，角質層である。

であり，長鎖塩基と脂肪酸の２本の疎水鎖から構成される。

ケラチノサイトは基底層で増殖後，分化しながら外側に向表皮にはこの通常のセラミドに加え，皮膚バリア形成に特Skin barrier formation by the acyl-CoA
synthetase ACSVL 4
Akio Kihara
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Hokkaido University− 109 −

図1

アシルセラミドの構造

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

けて移動する。有棘層から顆粒層にかけてアシルセラミド

２．方は産生される。アシルセラミドはグルコースの付加を受け，アシルグルコシルセラミドへ変換後，層板顆粒内に蓄えら法

2. 1. マウスの作製と飼育れる。アシルグルコシルセラミドはその後顆粒層と角質層

本実験では C 57 BL/ 6 J マウスおよび CRISPR/Cas 9 シの境界部で細胞外へ放出され，グルコースが除去されて再ステムを用いて作成した Acsvl 4 KO マウスを使用した。

度アシルセラミドとなり，脂質ラメラの構成成分となる。

マウスの飼育は，室温 23 ± 1 ℃，湿度 50 ± 5 ％，明／暗 12

我々は上述のアシルセラミドの C 30 ‒ 36 脂肪酸のオメガ

時間サイクルに維持された飼育室において，摂餌は自由に位を水酸化する脂肪酸オメガ水酸化酵素遺伝子CYP4F22

摂取できる条件下で行った。

5）を同定した 。CYP 4 F 22 は先天性魚鱗癬の原因遺伝子であり，CYP 4 F 22 遺伝子変異をもつ患者ではアシルセラ

2. 2. 皮膚透過性バリアアッセイ

ミド量が大きく減少していた。また，我々は in vitro にお経 皮 水 分 蒸 散 量（TEWL）は 経 皮 水 分 蒸 散 量 測 定 器

ける解析から CYP 4 F 22 の基質が脂肪酸であることを見出

VAPO SCAN（Asch Japan）を用いて胎生 18 . 5 日（E 18 . 5）

した。脂肪酸はアシル CoA の状態で脂肪酸伸長酵素によのマウスの背中に密着させることで測定した。トルイジンって伸長される。そのため，脂肪酸伸長酵素によって産生

ブルー染色は E 18 . 5 マウスをメタノールに 5 分間浸し，された超長鎖アシル CoA が CYP 4 F 22 の基質になるために

PBS で洗浄後，0 . 1 % トルイジンブルー PBS 溶液に 4 ℃では，一旦 CoA が加水分解される必要がある。一方，脂肪2 時間浸すことで行った。

酸と長鎖塩基間のアミド結合を形成するセラミド合成酵素の基質はアシル CoA であるため，CYP 4 F 22 によって産

2. 3. 形態学的解析生されたオメガヒドロキシ超長鎖脂肪酸は再度 CoA 体へ

E 18 . 5 マウスから採取した皮膚を 3 . 7 % ホルムアルデヒ

変換される必要がある。しかし，この反応に関与するアシドで固定し，アルコールで脱水後，パラフィンに包埋した。

ル CoA 合成酵素
（ACS）
は未だ不明なままである。

マイクロトームで厚さ 4 µm のホルマリン固定パラフィン包

アシルセラミドの皮膚バリア機能における重要性を考えると，アシルセラミド産生経路上の未同定 ACS 遺伝子の埋切片を作成し，Tissye-Tek DRS 2000（Sakura Torrance）
を用いてヘマトキシン／エオジン（H/E）染色を行った。

変異は先天性魚鱗癬を引き起こすと予想される。哺乳類には 26 種 の ACS が 存 在 す る。 そ の 中 で ACSVL 4（ 別 名FATP 4，SLC 27 A 4）は症候性魚鱗癬である魚鱗癬未熟児

2. 4. プラスミド
N 末端に 3×FLAG タグを融合したタンパク質を発現さ

7）症候群の原因遺伝子である 。魚鱗癬未熟児症候群は魚鱗

せ る 哺 乳 類 発 現 用 ベ ク タ ー pCE-puro 3×FLAG- 1 の癬症状に加えて早産および新生児の呼吸停止を特徴とし，

Bam HI‒Not I 切 断 部 位 へ ACSVL 4 遺 伝 子 を 導 入 し，Acsvl 4 KO マウスは無気肺および皮膚バリア異常を伴っpCE-puro 3× FLAG-ACSVL 4 を作製した。

8）て新生致死となる 。我々はこのヒトとマウスにおける症状／表現型から，ACSVL 4 こそがアシルセラミド産生経

2. 5. 脂質解析

路上で働く未同定 ACS 遺伝子であると考えた。これまで，

脂質の解析は液体クロマトグラフィー（LC）連結タンデ

ACSVL 4 遺伝子変異が魚鱗癬未熟児症候群の魚鱗癬症状

ム質量分析（MS/MS）によって行った。LC には逆相カラムを引き起こすメカニズムは不明であった。ACSVL 4 がア

（AQUITY UPLC CSH C 18 column：粒径 1 . 7 µm，内径シルセラミド合成へ関与することは考えられたことがなく，

2 . 1 mm，長さ 100 mm；Waters）を用いた。カラム温度はAcsvl 4 KO マウスの表皮において通常のセラミドクラス

55 ℃に設定し，イオン化はエレクトロスプレーイオン化の短鎖化は観察されているものの，アシルセラミドの測定法を用い，三連四重極型質量分析計（Xevo TQ-S；Waters）

はなされていない。これまではむしろ，ACSVL 4 の別名を用いて検出した。各脂質分子種は，多重反応モニタリン

である FATP 4（Fatty acid transporter 4）の名前が示す通グ（MRM）モードで分子種ごとに特異的な親イオン（Q 1），

り，ACSVL 4 が脂肪酸の取り込みに関与し，その異常が娘イオン（Q 3）の質量電荷比，コリジョンエネルギーを設魚鱗癬未熟児症候群の症状を引き起こすという説が有力で定し，ポジティブイオンモードで検出した。データの解析あった。

には MassLynx software（Waters）を使用し，定量は内部

本研究では，ACSVL 4 変異による魚鱗癬未熟児症候群

標準との割合を計算して行った。

の皮膚症状発症の原因がこれまで提唱されてきた脂肪酸のトランスポート活性低下なのか，我々が新たに提唱したア
シルセラミド産生不全によるものかを明らかにするために
Acsvl 4 KO マウスの解析を行った。

2. 6. In vitroアシルCoA合成アッセイ
HEK 293 T 細胞に pCE-puro 3×FLAG- 1（ベクター）または pCE-puro 3 × FLAG-ACSVL 4 をトランスフェクシ− 110 −

アシル CoA 合成酵素 ACSVL4 による皮膚バリア形成機構

ョンして 24 時間後，膜画分を回収した。酵素反応は膜画大きく減少しており，野生型マウスの 9 . 1 %であった。一方，分（20 µg）に基質である脂肪酸（1 µM リグノセリン酸，

一価不飽和タイプではアシルセラミドの時とは異なって

1 µM ネルボン酸，または 30 - ヒドロキシトリアコンタン

KO マウス中での減少が小さく，合計量は野生型マウスの酸）と 0.5mM CoAを加えて，インキュベート（37℃ , 1 時間）

46 % であった。以上のことから，ACSVL 4 がアシルセラすることで行った。生成されたアシル CoA は LC-MSMS

ミド合成に関与することが明らかとなった。

で解析した。

３．結果

3. 1. Acsvl4 KOマウスにおける皮膚バリア機能と表皮形態の異常3. 3. Acsvl4遺伝子欠損は表皮への脂肪酸の取り込みを低下させない
脂肪酸の組成を LC-MS/MS によって解析したところ，
Acsvl 4 KO マウスでは C 24 以下の鎖長の殆どの脂肪酸のAcsvl 4 KO マウスは，野生型（WT）マウスに比べて皮膚量が WT マウスに比べて増加していた（図 5 A）
。一方，にしわが少なく張っており，新生致死であった。E 18 . 5 日

C 26 以上の飽和脂肪酸の量は差が見られず，一価不飽和に帝王切開により得られたマウスの生存率を経時的に調べ

脂肪酸では増加していた。脂肪酸総量では Acsvl 4 KO マ

たところ，KO マウスは摘出後 2 時間以内に全て死亡した。

ウスでは WT マウスに比べて約 2 . 1 倍増加していた。これ

親元から離してミルクが飲めないこの条件では WT マウス

まで，ACSVL 4 の脂肪酸トランスポーターとしての機能は摘出後 22 時間まで生存していた。このように，Acsvl 4が想定されてきたが，Acsvl 4 KO マウスでの脂肪酸量のKO マウスは出生後極めて短時間で死亡することが明らか

増加はこの可能性を否定した。アシルセラミドの構成要素となった。帝王切開によって得られた E 18 . 5 の KO マウス

であるリノール酸（C 18 : 2）は，哺乳類の生体内では合成では WT に比べて体重が軽く，体内から体外への皮膚透過性

きない必須脂肪酸であるため，表皮の細胞は外部から取りバリア機能の指標である TEWL は WT マウスの 4 . 4 倍高込む必要がある。リノール酸の量に関しても Acsvl 4 KO

い値を示した（図 2 A）
。次にトルイジンブルー染色により

マウス表皮中で増加していた。

体外から体内への皮膚透過性バリア機能を調べたところ，

アシルセラミド中のリノール酸はトリグリセリドに由来

WT マウスでは色素の浸透は見られなかったのに対し，

し，トランスアシラーゼ PNPLA 1 がトリグリセリド中のKO マウスでは強い色素の浸透が見られた（図 2 B）
。これ

リノール酸をオメガ水酸化セラミドに転移する 6）。Acsvl 4

らの結果から，Acsvl 4 KO マウスでは皮膚バリア機能がKO マウスの表皮におけるリノール酸含有トリグリセリド

低下していることが確認された。

量を調べた結果，いずれの分子種も WT マウスよりも増加

次に Acsvl 4 KO マウスの表皮の形態学的な変化を調べしていた（図 5 B）。これらの結果は Acsvl 4 KO マウスにおるため，H/E 染色を行った。WT マウスの角質層では，脂ける皮膚バリア形成不全とアシルセラミド量の減少がリノ質ラメラの存在を示す角質細胞間の間隙が観察され，10ール酸の取り込み異常に起因するのではないことを示して層未満の角質層が存在していた（図 3）。一方，KO マウス

いる。

では角質層の数の増加が観察され，角質細胞間の間隙は不明瞭であった。このことは，過角化と脂質ラメラ形成不全を示していた。また，KO マウスでは有棘層が顕著に肥厚していた。

3. 4. ACSVL4はオメガ水酸化脂肪酸に対してACS
活性を示す
ACSVL 4 はアシルセラミド合成経路上でオメガ水酸化
脂肪酸をオメガ水酸化アシル CoA へ変換させる ACS であ3. 2. Acsvl4 KOマウス表皮におけるアシルセラミド
量の低下
Acsvl 4 のアシルセラミド産生への関与を調べるために，ると考えられる。これまで，ACSVL 4 は長鎖から極長鎖の非水酸化脂肪酸に対して活性を示すことは報告されているが，アシルセラミドに使用されるオメガ水酸化超長鎖脂

マウス表皮中のアシルセラミド量を LC-MS/MS によって肪酸に活性があるかは調べられていない。そこで，本実験解析した。Acsvl 4 KO マウスではすべてのアシルセラミ

ではヒト ACSVL 4 のオメガ水酸化 C 30 脂肪酸に対するド分子種が WT マウスに比べて減少しており，総量では約

ACS 活性を，ACSVL 4 を過剰発現させた HEK 293 T 細胞

9 . 8 % にまで低下していた（図 4 A）
。飽和と一価不飽和のの膜画分を用いた in vitro の実験によって調べた。その結アシルセラミドは共に同程度減少していた（飽和，7 . 4 %；果，コントロールに比べ，ACSVL 4 過剰発現によってオ

一価不飽和，11 %）。次にアシルグルコシルセラミドを測

メガ水酸化 C 30 : 0 脂肪酸に対する ACS 活性は 9 . 8 倍増加

定したところ，Acsvl 4 KO マウス中の総アシルグルコシ

した（図 6）。また，ACSVL 4 過剰発現により，C 24 : 0 脂肪

ルセラミド量は野生型マウスの約 37 % であった（図 4 B）。

酸への ACS 活性は 6 . 6 倍，C 24 : 1 脂肪酸への ACS 活性は

特に飽和タイプではアシルセラミドと同様に KO マウスで

3 . 6 倍増加した。これらの結果から ACSVL 4 は，アシル− 111 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図2

Acsvl 4 KOマウスにおける皮膚バリア異常

A. TEWLの測定（n = 4 ; Studentʼs t - test; **P< 0 . 01）。
B. トルイジンブルー染色。

図3

Acsvl 4 KOマウスにおける過角化と脂質ラメラ形成不全

図4

セラミド組成A. アシルセラミド量，B. アシルグルコシルセラミド量（n = 3 ; Studentʼs t -test;*P< 0 . 05 , **P< 0 . 01）。

− 112 −

アシル CoA 合成酵素 ACSVL4 による皮膚バリア形成機構

図5 脂肪酸とトリグリセリド量
A. 脂肪酸量，B. トリグリセリド量（挿入は総量; n = 3 ; Studentʼs t-test; *P< 0 . 05 ,**P< 0 . 01）。

図6

アシルCoA合成酵素活性

セラミド合成に必要なオメガ水酸化アシル CoA の合成活

エステラーゼによる C 30 ‒C 36 脂肪酸への変換，脂肪酸オ性を示すことが明らかになった。また，ACSVL 4 は非水

メガ水酸化酵素 CYP 4 F 22 によるオメガ水酸化脂肪酸への酸化／オメガ水酸化に関わらず，長鎖から超長鎖に至るま変換，ACS によるオメガ水酸化アシル CoA への変換ステッでの幅広い脂肪酸に対して活性を示すことも示された。

プが含まれる。これらのうち，チオエステラーゼと ACS は

４．考

未同定であった。本研究ではアシルセラミド合成に関わる

察ACS として ACSVL 4 を同定した。

アシルセラミドは皮膚透過性バリア形成に必須な脂質分

Acsvl 4 KO マウスは 15 年以上前に作成され，激しい皮子であり，その産生異常はヒトにおいては魚鱗癬，マウス

膚バリア異常を示すことが報告されたが，その原因は不明

においては新生致死を引き起こす。しかし，アシルセラミ

なままであった 8）。これまでは ACSVL 4 /FATP 4 の脂肪ドの産生に関わる遺伝子の全ては明らかになっていない。

酸トランスポーター活性の低下が皮膚バリア異常の原因でアシルセラミド産生経路には C 30 ‒C 36 アシル CoA がチオあるという説が有力であった。近年，多くのアシルセラミ− 113 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

ド関連遺伝子の同定が同定され，その KO マウスが作成さ

3） Ishikawa J, Narita H, Kondo N, Hotta M, Takagi Y,れた。それらの KO マウスで観察された激しい皮膚バリア

Masukawa Y, Kitahara T, Takema Y, Koyano S,

異常は，Acsvl 4 KO マウスで見られるものと極めて類似

Yamazaki S, Hatamochi A. Changes in the ceramide

していた。そこで我々は Acsvl 4 KO マウス／魚鱗癬未熟

profile of atopic dermatitis patients. J. Invest. Dermatol.,児症候群で見られる魚鱗癬症状はアシルセラミド合成低下．
130, 2511-2514（2010）に起因すると考え，実際本研究においてこのことを実証し

4） Sassa T, Ohno Y, Suzuki S, Nomura T, Nishioka C,

た。Acsvl 4 KO マウスの表皮ではリノール酸を含む多く

Kashiwagi T, Hirayama T, Akiyama M, Taguchi R,の脂肪酸およびリノール酸含有トリグリセリドの量は低下

Shimizu H, Itohara S, Kihara A. Impaired epidermal

しておらず，むしろ増加していた。これらの結果から

permeability barrier in mice lacking Elovl1, the geneAcsvl 4 遺伝子欠損による脂肪酸の取り込み低下が皮膚バ

responsible for very-long-chain fatty acid production.

リア異常を引き起こされるという説は否定された。

Mol. Cell. Biol., 33, 2787-2796（2013）．

５．総

5） Ohno Y, Nakamichi S, Ohkuni A, Kamiyama N, Naoe

括

A, Tsujimura H, Yokose U, Sugiura K, Ishikawa J,

本研究によって，アシルセラミド産生経路のうちのミッAkiyama M, Kihara A. Essential role of the

シングリンクの１つを解明した。また，魚鱗癬未熟児症候

cytochrome P4 5 0 CYP4F2 2 in the production of

群の原因がこれまで想定されていた脂肪酸の取り込み低下

acylceramide, the key lipid for skin permeability

ではなく，アシルセラミド産生不全であることが明らかと

barrier formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1 1 2,なった。我々の発見は魚鱗癬未熟児症候群の皮膚症状発症

7707-7712（2015）．

の機構を解明しただけではなく，皮膚バリア形成の分子機

6） Ohno Y, Kamiyama N, Nakamichi S, Kihara A.
PNPLA1 is a transacylase essential for the generation

構の解明に寄与した。

of the skin barrier lipid ω-O-acylceramide. Nat.
（本研究助成により得られた成果）

Commun., 8, 14610（2017）．

・Yamamoto H, Hattori M, Chamulitrat W, Ohno Y,7） Klar J, Schweiger M, Zimmerman R, Zechner R, Li

Kihara A. Skin permeability barrier formation by the

H, Törma H, Vahlquist A, Bouadjar B, Dahl N, Fischer

ichthyosis-causative gene FATP4 through formation

J. Mutations in the fatty acid transport protein 4 geneof the barrier lipid ω-O-acylceramide. Proc. Natl.

cause the ichthyosis prematurity syndrome. Am. J.

Acad. Sci. U. S. A., 117, 2914‒2922（2020）．

Hum. Genet., 85, 248-253（2009）．
8） Herrmann T, van der Hoeven F, Gröne HJ, Stewart（引用文献）

AF, Langbein L, Kaiser I, Liebisch G, Gosch I,

1） Akiyama M, Shimizu H. An update on molecular

Buchkremer F, Drobnik W, Schmitz G, Stremmel W.

aspects of the non-syndromic ichthyoses. Exp.

Mice with targeted disruption of the fatty acid transport

Dermatol., 17, 373-382（2008）．

protein 4（Fatp4, Slc2 7a4）gene show features of lethal

2） Kihara A. Synthesis and degradation pathways,
functions, and pathology of ceramides and epidermal

restrictive dermopathy. J. Cell Biol., 1 6 1, 1 1 0 5-1 1 1 5（2003）．

acylceramides. Prog. Lipid Res., 63, 50-69（2016）．

− 114 −

ロドデンドロールによる細胞死へのフェロトーシスの関与の可能性
山形大学大学院医学系研究科

小林翔

Rhododendrol is metabolized to rhododendrol quinone by tyrosinase in melanocytes. Reactive oxygen species, such ashydroxyl radical and singlet oxygen, are produced and cause oxidative damage in melanocytes. Recent study has revealed
that ferroptosis, a non-apoptotic, iron-dependent cell death, appears to be involved in pathogenesis of a variety of diseases. It
is likely that rhododendrol-induced leukomelanodermia is also caused by ferroptosis by means of lipid peroxidation products
produced during rhododendrol oxidation in melanocytes. Singlet oxygen also induces feroptosis, and, on the contrary, radical
scavenger edaravone effectively suppresses feroptosis caused by cysteine deprivation. Singlet oxygen is commonly produced
via photon-mediated energy transfer reaction and also tyrosinase-catalyzed rododendrol metabolism, so that it is likely thatferroptosis is induced by resulted singlet oxygen in melanocytes upon UVB irradiation.
Here we first established a rat monoclonal antibody (FerAb) against Hepa 1-6 cells that had been cultivated in cystine-deprived media. Binding of the resulting antibody increased during advancing ferroptosis which was caused, not only
by cystine deprivation but also treatment with xCT inhibitor erastin or GPX4 inhibitor RSL3, although apoptotic cell death
induced by a staurosporine treatment had no effect on the binding. Thus, FerAb appears to be the useful tool to detect ferroptosis. When we examined effects of rhododendrol on human melanocyte MNT1 cells, it damaged the cells only at highdose. However, precise analyses of the cells by means of FACS indicated that only less-differentiated cells containing low
levels of melanin appeared to die by the rhododendrol treatment. This is similar to the in vivo situation, and hence this cell
culture system using the MNT1 cells may be ideal model system for rhododendrol-induced melanocyte death.

1．緒

制遺伝子のp 53 が活性化して酸化型システイン（シスチン）

言の取込みに働く xCT の遺伝子発現を抑制して細胞死をも白樺などの植物由来のフェノール化合物であるロドデン

たらす。またロドデンドロールによる白斑は日光を浴びてドロールはメラノサイトに作用し、メラニン合成におけるいる皮膚に顕著なことから、紫外線による増強効果が指摘

律速酵素・チロシナーゼにより代謝されてロドキノンとなされている 6 , 7）が、紫外線の照射によりロドデンドロール

る。ロドキノンはチロシナーゼ酵素を阻害することで美白

代謝物から実際に一重項酸素が生成することが確認されて効果を発揮するが、過剰に作用するとグルタチオン含有量いる 8）。これまで我々は、フェロトーシス抑制に果たすを低下させ、細胞死を誘導して白斑の原因となる。この時

xCT の役割について、培養細胞ならびに遺伝子欠損マウの細胞死はアポトーシスによると報告されているが、本病スを用いて研究してきた 9 - 11）。またドナー化合物を用いて、態では炎症細胞の関与が示されている 1）ことから、アポト

一重項酸素が肝癌由来の Hepa 1 - 6 細胞にフェロトーシス

ーシス以外の細胞死の関与も考えられる。

を誘導することを確認しており 12）、本化合物を用いるこ

ロドデンドロールによる細胞障害過程では活性酸素が生
2）成し、グルタチオンが低下する ため、抗酸化能の減弱がとで、ロドデンドロールによる白斑形成に一重項酸素が関与することを検証することができると考える。

細胞死に関わる可能性がある。一方、その過程でオートフ

これまでのところロドデンドロールによるメラノサイト

ァジーが活性化される 3）など、2012 年にはじめて報告さの障害作用とフェロトーシスとの関連についての報告はなれた鉄依存性細胞死・フェロトーシスに酷似している。フいが、ロドデンドロールがオートファジーを活性化し、活4）ェロトーシス誘導には次の２つの経路が知られている 。

性酸素・ラジカルが細胞死に関わることから、図 1 に示す

1）システイン供給不足もしくはグルタチオン低下により、ようにフェロトーシスが関与する可能性が高いと考えていグルタチオンペルオキシダーゼ 4（GPX 4）が正常に機能せる。本研究では、in vivo におけるフェロトーシス細胞の5）ず、増加した脂質過酸化物が細胞死をもたらす 。2）癌抑検出を可能にするモノクローナル抗体を作製し、さらにヒト由来の MNT 1 メラノサイトを用いて、ロドデンドロー
ルによる細胞死へのフェロトーシスの関与と、その抑制剤

Potential involvement of ferroptosis incell death by rhododendrol

による細胞保護作用を調べた。

２．方Sho Kobayashi
D epa r t ment of Bio chem ist r y a nd
Molecular Biology, Graduate School of
Medical Science, Yamagata University法

2. 1. フェロトーシス認識抗体の作製
マウス肝癌由来の Hepa 1 - 6 細胞をシスチン（酸化型シ− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図１ ロドデンドロール（RD）によるメラノサイト細胞死がフェロ
トーシスによる可能性を示す模式図。一重項酸素, 1 O 2 ; ヒドロ
キシルラジカル, HO·

ステイン二量体）欠乏培地で培養してフェロトーシスを誘導し、それを抗原としてラットに免疫した。単離したリン
パ球とマウスミエローマ細胞・SP 2 を細胞融合し、得られたハイブリドーマの培養上清の中からフェロトーシス細胞を特異的に認識する抗体を免疫細胞染色により選抜し、
ラットモノクローナル抗体・FerAb を得た。

2. 2. ロドデンドロールの細胞生存への影響
ヒト由来の MNT 1 メラノサイトを培養し、ロドデンド

図２ 抗フェロトーシス抗体の特異性の検討。免疫細胞染色による抗フェロトーシス抗体（FerAb）と抗HNE抗体（HNE Ab）との比較。
（A）Fer-1はフェロトーシス抑制剤ferrostatin-1を示す。
HNEおよびアクロレイン（ACR）修飾ウシ血清アルブミン（BSA）を用いたドットブロット解析の検討結果（B）。

ロール添加後の生細胞数を CellTiter-Blue® Cell Viability
Assay kit（Promega）による測定やトリパンブルー色素排除試験法による細胞数計測を行い、ロドデンドロールが細ポリン処理によりアポトーシスを誘導した細胞には全く反胞生存に与える影響を調べた。

応しなかった。代表的な脂質過酸化物である 4 - ヒドロキ
シ - 2 - ノネナール（HNE）を認識する抗体（HNE Ab）もフ

2. 3. 細胞内活性酸素と脂質過酸化物の定量

ェロトーシス細胞に結合したが、生細胞とも強く結合する

活性酸素種（H 2 DCF-DA と DHR 123）と脂質過酸化物（C 11 -BODIPY

581 / 591

）を認識する蛍光プローブを使用し、FerAb は HNE 修飾 BSA との反応性を示した（図 2 B）が、ウエスタンブロット解析では正常細胞とフェロトーシス細フローサイトメーターを用いて解析した。

３．結ため、特異性については FerAb の方が優れていた（図 2 A）。

胞の間で反応性に違いを認めず、タンパク質自体ではなく果

HNE 類似の構造を認識していると考えられた。細胞内に3. 1. フェロトーシス認識抗体の作製

おける FerAb 結合部位を共焦点レーザ顕微鏡により調べ

フェロトーシス研究のほとんどは培養細胞を用いて行わたところ、生細胞では細胞膜の仮足様構造に結合し、フェれてきたが適切なマーカーがないため、その判定が難しい

ロトーシス細胞では細胞内全体に不均一に結合し、またミことが問題点として挙げられる。そこで生体内でフェロト

トコンドリアなどの細胞小器官にも部分的な結合を認めた。

ーシスを検出することを目的として、フェロトーシス細胞を認識するラットモノクローナル抗体を作製した 13）。768

3. 2. ロドデンドロールのMNT1メラノサイトに対する作用

クローンから最終的に 1 つのクローンを選別し、FerAbと命名した。本抗体は、シスチン欠乏培地での細胞培養、

ヒト由来の MNT 1 メラノサイトをロドデンドロール処ならびにシスチン細胞内取込みの阻害剤・erastin や脂質

理し、生細胞数を測定することで、ロドデンドロールが細過酸化を抑制する GPX 4 の阻害剤・RSL 3 で処理してフェ胞生存に与える影響を調べた。その結果、ロドデンドロー

ロトーシスを誘導した細胞と強く反応したが、スタウロス

ルの濃度依存性に細胞死を認めたが、予想に反して高濃度− 116 −

ロドデンドロールによる細胞死へのフェロトーシスの関与の可能性を必要とした（図 3 A）
。そこで、約半数が細胞死を起こす

り活性酸素種に対して耐性であるため、ロドデンドロール

7 mM の濃度を用いて、シスチンを含む通常培地と、含ま処理に対しても耐性となっており、分化度の低い細胞が選ないシスチン欠乏培地で細胞死について検討した。まず、択的に死滅したと考えられる。この小さな細胞に限定する

通常培地で培養した細胞に、広くフェロトーシスを誘導すと、ロドデンドロールによる致死効果が大きいことが分かる erastin を投与したところ部分的に細胞死が認められ、る。ロドデンドロールを塗布した皮膚では、メラニンを有その程度はロドデンドロールの存在によって増強されたするメラノサイトはすぐに減少することはなく、時間を経（図 3 B）。次にシスチン欠乏培地で培養したところ、同様た後に白斑が生じることから、未分化な細胞が選択的に死に部分的な細胞死を認めた。ロドデンドロールが存在する

滅していると考えられ、本知見とも一致する。したがって、と 7 割程度まで細胞死が増強された。フェロトーシス抑制

ロドデンドロールによる MNT 1 メラノサイトの傷害は、剤の効果について調べたところ、脂質過酸化を抑える

生体内のメラノサイトの傷害機構を調べるモデル細胞系とferrostatin- 1、鉄のキレート剤である DFO、およびラジして有用と考えられる。今後、この未分化な細胞に焦点をカル消去剤の Edaravone はいずれも細胞死を抑制する傾当てて解析することで、フェロトーシスの関与を明確にし、向を示したが、その効果はわずかであった。

その予防や治療に応用できる可能性がある。

次に細胞内に活性酸素種が生じ、脂質過酸化が起こって

xCT の阻害やシステインの欠乏によって誘導されるフいるかどうかについて調べた。活性酸素の検出プローブとェロトーシスには、ミトコンドリアの関与が報告されていして H 2 DCF-DA を用いて、FACS 解析を行ったところ、る。我々は電子伝達複合体 III から生成するスーパーオキ

ロドデンドロール処理しない細胞では、蛍光強度の低い小シドを特異的に抑制する阻害剤を用いて、この複合体由来

さなピークと、強い大きなピークに分かれ、ロドデンドロのスーパーオキシドが関与することを明らかにしている 15）。

ール処理により蛍光強度の小さなピークが選択的に消失しロドデンドロールによるメラノサイトの細胞死についても、た（図 4）。同様の傾向が DHR 123 を用いた場合にも認めら同様に電子伝達複合体 III が関与するかどうか検討を予定

581 / 591している。紫外線による白斑形成については一重項酸素のれた。しかし、過酸化脂質を検出する C 11 -BODIPY

関与が考えられている 8）ため、ドナー化合物を用いて紫外によってはこのような違いを認めなかった。

４．考線曝露時の一重項酸素の関与についても検討を行う予定で察ある。

ロドデンドロールによる白斑は日本国内で問題となった

５．総ことから、関連する研究のほとんどは国内で行われている。

括

フェロトーシスについては、その引き金となるのは鉄イオ

本研究により、フェロトーシス細胞を特異的に検出する

ン依存性に生じる活性酸素・ラジカルと考えられており、ラットモノクローナル抗体・FerAb の作製に成功した。

シスチン欠乏によるフェロトーシスは、ラジカル消去剤でMNT 1 メラノサイトはロドデンドロールによる白斑形成

14）あるエダラボン（商標名：ラジカット）により抑制される。

のモデル系として有用であり、本細胞を用いることで、ロ今回作製した FerAb は、ヒト子宮頸癌由来の Hela 細胞や、ドデンドロールによる皮膚の白斑へのフェロトーシスの関

種々の刺激でフェロトーシスを誘導した Hepa 1 - 6 にも結与とその機構を解明することができると考える。

合したことから、動物種や刺激を問わずフェロトーシスを起こした細胞を共通に認識すると考えられる。FerAb は（引用文献）

フェロトーシス細胞を特異的に検出できるため、フェロト

1） Tanemura A, Yang L, Yang F, Nagata Y, Wataya-

ーシスの機構や各種の病態への関与を解明する研究に有用

Kaneda M, Fukai K, Tsuruta D, Ohe R, Yamakawa M,と考えられる。

Suzuki T, Katayama I. An immune pathological and

MNT 1 メラノサイトに対するロドデンドロールの作用

ultrastructural skin analysis for rhododenol-inducedについては、細胞死の誘導に高濃度を必要とすることから、

leukoderma patients. J. Dermatol. Sci., 77, 185 -188（2015）

一見したところでは細胞毒性は低いように思われる。しか2） Ito S, Wakamatsu K. Biochemical Mechanism of

しながら、蛍光強度の低い細胞と高い細胞は、これまでのRhododendrol-Induced Leukoderma. Int. J. Mol. Sci.,

知見から、次のような違いに基づくと考えられる。すなわ（2018）
19, 552（16 page）

ち、MNT 1 メラノサイトには分裂を終えて大きくなりメ

3） Yang L, Yang F, Wataya-Kaneda M, Tanemura A,

ラニンを合成している分化の進んだ細胞と、分裂したばか

Tsuruta D, Katayama I. 4（ 4-hydroroxyphenyl）

りで小さく蛍光強度の低いメラニンの少ない細胞が存在す-2-butanol（rhododendrol）activates the autophagy-

る。分化度の低い細胞は内在性の蛍光物質、すなわちメラ

lysosome pathway in melanocytes: insights into the

ニンが少ないと考えられる。メラニンには抗酸化活性があ

mechanisms of rhododendrol-induced leukoderma. J.

− 117 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図３ ロドデンドロール（RD）によるメラノサイト（MNT 1）細胞死の誘導。ロドデンドロール濃度依存性（A）と7 mM RDとフェロトーシスの誘導剤ならびに抑制剤の併用効果（B）。平均±標準偏差（n= 3）を示す。

図４ ロドデンドロール（RD）の作用のFACS解析。DCFおよびC 11-BODIPY 581/ 591を用いたヒストグラム（A）と7mM RD処理前後の細胞の分布の比較（B）。A図の赤矢印で示すピークと、B図の矢印内の細胞集団は一致する。

− 118 −

ロドデンドロールによる細胞死へのフェロトーシスの関与の可能性

glutamate transporter: implications for immune

Dermatol. Sci., 77, 182-185（2015）
4） Fujii J, Homma T, Kobayashi S. Ferroptosis causedby cysteine insufficiency and oxidative insult. Free

function. J. Biol. Chem., 290, 8778-8788（2015）10）Kang ES, Lee J, Homma T, Kurahashi T, Kobayashi
S, Nabeshima A, Yamada S, Seo HG, Miyata S, Sato H,

Radic. Res., 23, 1-12（2019）5） Friedmann Angeli JP, Schneider M, Proneth B,

Fujii J. xCT deficiency aggravates acetaminophen-

Tyurina YY, Tyurin VA, Hammond VJ, Herbach N,

induced hepatotoxicity under inhibition of the

Aichler M, Walch A, Eggenhofer E, Basavarajappa D,

transsulfuration pathway. Free Radic. Res., 5 1, 8 0 - 9 0

Rådmark O, Kobayashi S, Bornkamm GW, Wanke R,（2017）

Forster H, Yefremova O, Heinrichmeyer M,11）Kobayashi S, Hamashima S, Homma T, Sato M,

Hanschmann EM, Geissler EK, Stockwell BR,

Kusumi R, Bannai S, Fujii J, Sato H. Cystine/glutamate

O´Donnell VB, Schick JA, Conrad M. Inactivation oftransporter, system x c-, is involved in nitric oxide

the ferroptosis regulator Gpx4 triggers acute renal

production in mouse peritoneal macrophages. Nitricfailure in mice. Nat. Cell. Biol., 16, 1180-1191（2014）

Oxide. 78, 32-40（2018）6） Ito S, Wakamatsu K. A convenient screening method

12）Homma T, Kobayashi S, Fujii J. Induction of

to differentiate phenolic skin whitening tyrosinase

ferroptosis by singlet oxygen generated from

inhibitors from leukoderma-inducing phenols. J.

naphthalene endoperoxide. Biochem. Biophys. Res.

Dermatol. Sci, 80, 18-24（2015）

Commun., 518 519-525（2019）7） Goto N, Tsujimoto M, Nagai H, Masaki T, Ito S,

1 3）Kobayashi S, Harada Y, Homma T, Yokoyama C,

Wakamatsu K, Nishigori C. 4（ 4-Hydroxyphenyl）

Fujii J. Characterization of a rat monoclonal antibody-2-butanol （rhododendrol）-induced melanocyte

raised against ferroptotic cells. J. Immunol. Methods.,

cytotoxicity is enhanced by UVB exposure through（2021）
489, 112912（9 page）

generation of oxidative stress. Exp. Dermatol., 27, 754762（2018）14）Homma T, Kobayashi S, Sato H, Fujii J. Earavone, afree radical scavenger, protects against ferroptotic cell8） Miyaji A, Gabe Y, Kohno M, Baba T. Generation ofdeath in vitro. Exp. Cell Res., 3 8 4, 1 1 1 5 9 2（9 page）

hydroxyl radicals and singlet oxygen during oxidation（2019）of rhododendrol and rhododendrol-catechol. J. Clin.

15）Homma T, Kobayashi S, Sato H, Fujii J. Superoxide

Biochem. Nutr., 60, 86-92（2017）

produced by mitochondrial complex III plays a pivotal

9） Kobayashi S, Sato M, Kasakoshi T, Tsutsui T,

role in the execution of ferroptosis induced by cysteine

Sugimoto M, Osaki M, Okada F, Igarashi K, Hiratake J,

starvation. Arch. Biochem. Biophys., 7 0 0, 1 0 8 7 7 5（9Homma T, Conrad M, Fujii J, Soga T, Bannai S, Sato

page）（2021）

H. Cystathionine is a novel substrate of cystine/− 119 −

食薬用植物からの育毛活性物質の探索
筑波大学生命環境系

繁森英幸

Hepatocyte growth factor (HGF) has mitogenic, motogenic, and morphogenic activities in epithelial cells. Induction of
HGF production may be involved in organ regeneration, wound healing and embryogenesis. HGF is also known to act onhuman and animal hair follicles to promote hair growth. In this study, the effects of naturally occurring compounds, whichwere isolated from edible and medicinal plants, on HGF production in Neonatal Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDF)
were investigated. Clovamide, one of the caffeic acid derivatives significantly induced HGF production dose-dependent
manner. To know the important substructure for HGF production activity, we next investigated the effect of the partial structure of these caffeic acid derivatives. From the results, clovamide showed strong activity on the promotion of HGF production. It was suggested that the caffeoyl moiety of caffeic acid derivatives such as clovamide and its related compounds isessential for accelerated production of HGF. The compound which has the caffeoyl moiety may be useful for the treatmentof some intractable organ diseases in addition to hair growth activity.

1．緒

材から新たな HGF 産生促進活性物質を探索するとともに、

言

CQA 類、PHEG 類や Daphnane 型ジテルペン化合物と併肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor, HGF）は、せて、それらの化合物の機能を解明することを目的とする。

当初肝細胞に対する最も強力な増殖促進因子として同定さ２．方れていたが、腎尿細管や気管支上皮、ケラチノサイトなど
様々な上皮系細胞に対しても増殖促進因子として機能する
1）

ことが知られている 。また最近では、血管内皮細胞、軟法

2. 1. 天然由来化合物のHGF産生促進活性２．
１．
１．活性試験用化合物

骨細胞、造血幹細胞などの間葉系細胞の増殖を促進させる

当研究室で食薬用植物や微生物から単離した化合物 6 - 10）：ことも明らかにされている。さらに、HGF はヒトおよびActeoside、Arctigenin、Antimycin A 3 a、Palmaenone A、動物の毛包に働き、発毛・育毛を促進することも知られてPalmaerin A、Daphnodorin C、Clovamide、Piceatannol お

2）いる 。成長期毛包の毛乳頭細胞からは、HGF、インスリ

よび Scirpusin B

ン様増殖因子 - 1、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、

２．
１．２．細胞培養

退行期にはトランスフォーミング増殖因子 -β などの因子

正常ヒト皮膚線維芽細胞（Normal human dermal fibroblastsが産生され、これらが毛母細胞などに作用することで、ヘ：NHDF）（Kurabo Co.）を、10 % FBS を加えたダルベッコ

3）

アサイクルが制御されていると考えられている 。また、

改変イーグル培地（DMEM）（Sigma-Aldrich Co.）を用いて、毛髪の成長期移行シグナルであるシグナル伝達兼転写活性37 ℃、5 % CO 2 加湿雰囲気中で培養し、各実験に使用した。

化因子 3（STAT 3）は、HGF により活性化されることが知

２．
１．
３．NHDF 細胞への化合物投与

られている。当研究グループでは、これまでに寄生植物のフラスコで培養した NHDF 細胞をトリプシン処理し、アメリカネナシカズラやヤセウツボから単離したカフェオ

96 well plate に 5 . 0 × 104 cells/mL になるように 100 µL ず

イルキナ酸（CQA）類ならびにフェニルエタノイド配糖体

つ播種して、コンフルエントになるまで培養し、化合物を（PHEG）類などのカフェ酸誘導体に、正常ヒト皮膚線維芽0 . 5 % FBS DMEM で希釈し、培地交換の要領で 96 well

細胞に対する顕著な HGF 産生促進活性があることを見出

plate に 100 µL/well で添加し 96 h 培養した。

した 4）。また一方で、ジンチョウゲから単離した Daphnane

２．
１．
４．サンドイッチ酵素結合免疫吸着検査法（Enzyme-型ジテルペン化合物にも顕著な HGF 産生促進活性を見出5）している 。そこで本研究では、食薬用植物を含む天然素

linked immuno-sorbent assay： ELISA）
ELISA用の 96well plate（Nunc）に抗ヒトHGF抗体（R&D
Systems）を播種し、4 ℃で一晩インキュベートした。各
well を 0 . 05 % Tween 20 in PBS（TBS/T）で洗浄し、ブロS ea rch for ha ir g rowt h-promot ing
compounds from edible and medicinal
plants
Hideyuki Shigemori
Faculty of Life and Environmental
Sciences, University of Tsukuba

ッキング剤（5 % Tween 20、5 % Sucrose 含有 PBS で溶解した 1 % BSA）を添加し 1 h 静置した。これ以降の実験操
作は室温で行った。溶液の除去ならびに TBS/T 洗浄を行い、上記の細胞上清を添加した。同時に、標準曲線用に
human HGF standard（R&D Systems）を 0～50 ng human− 120 −

食薬用植物からの育毛活性物質の探索

図1

HGFが関与する生理作用

HGF/mL の範囲で添加した。2 h 静置した後、溶液の除去に、0 . 2 mL クロロホルムを添加し室温で 3 min 静置した後、ならびに TBS/T 洗浄を行い、ビオチン化抗 HGF 二次抗体

遠心（12000 rpm、15 min、4 ℃）し、水層（上層）を新しい（R ＆ D Systems）を添加し 2 h 静置した。溶液の除去およチューブに移した。0 . 5 mL イソプロパノールを添加してび TBS/T 洗浄を行い、ストレプトアビジン標識ホースラ

室温で 5 - 10 min 静置した。遠心（12000 rpm、10 min、4 ℃）

ディッシュ・ペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase:

した後、上清を除去して 70 % エタノール（1 mL）を添加し、HRP）（R&D Systems）を添加した。インキュベート（30さらに遠心（7500 rpm、5 min、4 ℃）した後、上清を除去

min）後、溶液の除去ならびに TBS/T 洗浄を行い、酵素基して風乾し、水で希釈して total RNA 溶液を調製した。

質 2 , 2 '-Azinobis（3 -ethyl- 2 , 3 -dihydrobenzothiazole- 6 -一方で、氷上で試薬と RNA 溶液を混ぜ、65 ℃で 5 min

sulfonic acid）（ABTS）
溶液を添加してアルミホイルで遮光（RNA 変性）、37 ℃で 5 min（ゲノム DNA 除去）、37 ℃でし 30 min 静置した。最後に反応停止剤として 2 M 硫酸を

15 min、50 ℃で 5 min、98 ℃で 5 min（逆転写活性および添加した後、410 nm で吸光度を測定した。得られた値よ

酵素失活反応）の条件で反応終了後にサンプルを回収した

り検量線を作成し、1 well あたりの HGF 産生量を求めた。

（cDNA）。この cDNA サンプルと試薬およびプライマーを

２．
１．
５．BCAタンパク質定量法

混ぜ PCR 用の 96 well plate に播き、フィルムをして定量

ELISA アッセイに用いる上清を取り除いた後の 96 wellplate を TBS/T で 軽 く 洗 浄 し、0 . 5 % Triton X- 100 含 有的逆転写 PCR（RT-qPCR）を行った。
２．
１．７．HGF 産生経路に関わる酵素に対する阻害剤を用

PBS を添加して 20 min ほどシェイカーで振盪し細胞層をいた HGF 産生促進活性回収した。新たな 96 well plate に回収した細胞サンプルま阻 害 剤：KT 5720（ プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ A ：PKA）、

たは BSA standard と Working solution を添加し、562 nm

PD 98059（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ／細胞で吸光度を測定した。得られた値より検量線を作成し、サ外シグナル調節キナーゼ：MAPK/ERK）、SB 203580（p 38

ンプル内のタンパク質量すなわちプレートに生着していた分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ：p 38 MAP）、細胞数を求めた。

SP 600125（c-Jun N-terminal kinase：JNK）、Wortmannin

上記の 2 つのアッセイ結果より、単位タンパク質量あた（ホスファチジルイノシトール 3 - キナーゼ：PI 3 K）およびりの HGF 産生量（pg/µg protein）を算出し、各化合物によBisindolylmaleimide 1（プロテインキナーゼ C ：PKC）
2 . 1 . 1 . における活性試験用化合物中で最も顕著な HGF

る HGF 産生促進活性を調べた。
２．
１．６．HGF 産生に関与するmRNAの発現量測定

産生促進活性が認められた Clovamide を用いて上記の阻害

NHDF を 6 cm dish に播種しコンフルエントになってか剤を添加して NHDF 細胞からの HGF 産生量を 2 . 1 . 4 . サ

ら化合物を添加した。化合物処理後、培地を除去して PBS

ンドイッチ ELISA 法と 2 . 1 . 5 . BCA タンパク質定量法とで洗浄後、RNA 抽出用試薬 ISOGEN 1 mL/well を添加し、同様の方法を用いて測定した。

かき取ってチューブに回収して 5 min 室温静置した。これ− 121 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

３．結

HGF 産生促進活性を調べた。その結果、Acteoside および果

Clovamide に顕著な HGF 産生促進活性が認められた（図３．
１．
１．天然由来化合物によるHGF 産生促進活性２）。Acteoside の HGF 産生促進活性についてはすでに当

HGF 産生促進活性が知られている血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor: PDGF）をポジティブコ

研究室で報告していることから、これ以降の実験では、Clovamide（図 3）を用いて検証することとした。

ントロールとして、9 種類の天然由来化合物（Acteoside、

そこで、Clovamide の濃度（0 . 5、1、5 および 10 µM）をArctigenin、Antimycin A 3 a、Palmaenone A、Palmaerin A、

変えて経時変化（48 h および 96 h）を調べたところ、濃度依

Daphnodorin C、Clovamide、Piceatannol および Scirpusin B）

存的ならびに時間依存的に HGF 産生促進活性が増強したについて、各 5 µM を用いてサンドイッチ ELISA 法により

（図４）。

図2

天然由来化合物のHGF産生促進活性

図3

図4

Clovamideの構造式

Clovamideの濃度および時間依存的なHGF産生促進活性− 122 −

食薬用植物からの育毛活性物質の探索

３．
１．２．HGF 産生に関与するmRNAの発現量測定

KT 5720 を添加した際に HGF 産生量が減少することが観

RT-qPCR を用いて Clovamide の添加（5 および 20 µM）
による HGF mRNA 発現量を調べた結果、6 h 処理では有測された（図６）。したがって、HGF 産生には PKA 経路の関与が重要であることが示唆された。

意差は見られなかったが、48 h 処理において Clovamide

４．考（20 µM）
では有意差が見られた
（図 5）
。
３．
１．
３． Clovamide によるHGF 産生促進経路の解明

察

9 種類の天然由来化合物を用いてサンドイッチ ELISA

HGF 産生経路に関わると想定した酵素の阻害剤（KT 5720、法により HGF 産生促進活性を調べた結果、Acteoside およPD 98059、SB 203580、SP 600125、Wortmannin お よ び

び Clovamide に顕著な HGF 産生促進活性が認められたこ

Bisindolylmaleimide 1）を用いて、Clovamide との共処理にとから、先行研究で活性が認められた CQA 類や PHEG 類

よ る HGF 産 生 量 を 調 べ た 結 果、PKA 阻 害 剤 で あ るなどのカフェ酸誘導体と同様にカフェ酸構造に含まれるカ

図5

図6

Clovamide処理によるHGF mRNA発現量

酵素阻害剤を用いた Clovamide によるHGF 産生量の変化− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

テコール構造が活性発現に重要であることを明らかにした。 （引用文献）
そこで本研究では、Clovamide を用いて HGF 産生促進活

1） Matsumoto K, Nakamura T. Hepatocyte growth

性についてさらなる機構解明を行った。Clovamide の濃度

factor: Renotropic role and potential therapeutics forを変えて経時変化を調べたところ、濃度依存的ならびに時

renal diseases. Kidney Int. 59: 2023-2038, 2001.

間 依 存 的 に HGF 産 生 促 進 活 性 が 増 強 し た こ と か ら、

2） Lee Y-R, Yamazaki M, Mitsui S, Tsuboi R, Ogawa H.

Clovamide に顕著な HGF 産生促進活性を有していること

Hepatocyte growth factor（HGF）activator expressedを確認した。また、RT-qPCR を用いて Clovamide の添加

in hair follicles is involved in in vitro HGF-dependent

による HGF mRNA 発現量を調べた結果、時間依存的に発hair follicle elongation. J Dermatol Sci 25: 156-163, 2001.

現量が増加してることから、遺伝子発現レベルでも HGF

3） Philpott MP, Sanders DA, Kealey T. Effects of insulin産生が促進されていることを明らかにした。さらに、酵素and insulin-like growth factors on cultured human hair阻害剤を用いた実験において、Clovamide による HGF 産

follicles: IGF-I at physiologic concentrations is an

生促進活性発現機構には PKA 経路が重要であることを明important regulator of hair follicle growth in vitro. J

らかにした。

Invest Dermatol. 102: 857-861, 1994.
4） Kurisu M, Nakasone R, Miyamae Y, Matsuura D,

５．まとめ

Kanatani H, Yano S, Shigemori H. Induction of

HGF は健康状態の時はあまり産生されておらず、病気

hepatocyte growth factor production in human dermalになった時に血中の HGF 量が増加する。実際に、肝炎のfibroblasts by caffeic acid derivatives. Biol Pharm Bull

患者では数倍から 10 数倍にも上昇することから、HGF は

36: 2018-2021, 2013.

組織や臓器に傷害が加わることで産生されることが知られ

5） Nakasone R, Kurisu M, Onodera M, Miyamae Y,ている。一方で、加齢とともに HGF 産生能力は低下し、Matsuura D, Kanatani H, Yano S, Shigemori H.

このことが高齢化に伴う生活習慣病が発症しやすくなる原

Promoting effects on hepatocyte growth factor

因とも言われている。さらに、HGF は育毛・発毛作用がproduction of daphnane diterpenoids from Daphne

あり、頭髪の再生も行うため、加齢に伴う HGF 産生量のodora. Heterocycles 87: 1087-1092, 2013.

低下が脱毛や薄毛の原因ともなっている。すでに筋萎縮性6） Kurisu M, Miyamae Y, Murakami K, Han J, Isoda H,

側索硬化症（ALS）や脊椎損傷などに対しての HGF 投与にIrie H, Shigemori H. Inhibition of amyloid β aggregation

よる臨床試験が行われているが、脱毛や薄毛の治療の場合

by acteoside, a phenylethanoid glycoside. Biosci Biotech

はそこまでの療法は適していないと思われる。そこで、Biochem. 77: 1329-1332, 2013.

HGF 産生を促進する化合物を食品やサプリメントまたは

75）Higashinakasu

K, YamadaK, Shigemori H,

化粧品として摂取することで体内の HGF 産生を向上させ

Hasegawa K. Isolation and identification of potent

ることが有効な方法と考えられる。すでに、先行研究におstimulatory allelopathic substances exuded from

いて顕著な HGF 産生促進活性が認められた CQA 類ならび

germinating burdock（Arctium lappa）seeds. Heterocyclesに PHEG 類は、サツマイモ、ゴボウ、プロポリス、コーヒ

65: 1431-1437, 2005.

ーならびにオリーブなどの食用植物に含まれている。また、

8） Matsumoto T, Hosoya T, Tomoda H, Shiro M, Shigemori

今回活性が認められた Clovamide もカカオ豆やコーヒー豆

H. Palmaenones A and B, two new antimicrobialに含まれている成分でもあることから、ココア、チョコレ

chlorinated cyclopentenones from discomycete Lachnum

ートおよびコーヒーにも含まれている。したがって、これpalmae. Chem Pharm Bull 59 : 1559-1561, 2011.

らを日常的に摂取することによって加齢に伴って減少した

9） Tanabe Y, Matsumoto T, Hosoya T, Sato H, Shigemori

HGF の産生を促進することで、脱毛や薄毛を予防する育H. Palmaerins A-D, new chlorinated and brominated毛剤の開発につながるものと思われる。このような化合物

dihydroisocoumarins with antimicrobial and plant growthは皮膚への安全性はもちろんのこと、生体内に投与してもregulating activities from discomycete Lachnum palmae.

健康に対する害はほとんどないことが示唆される。したがHeterocycles 87: 1481-1491, 2013.

って、これらの化合物を配合したサプリメントや化粧品の10）Tsunoda T, Takase M, Shigemori H. Structure-activity

安全性は高く、このような天然由来化合物を配合した育毛

relationship of clovamide and its related compounds for剤の開発に貢献するものと考えられる。

the inhibition of amyloid β aggregation. Bioorg Med
Chem 26: 3202-3209, 2018.

− 124 −

アトピー性皮膚炎発症者に高度に定着する黄色ブドウ球菌と健常者皮膚細菌の菌種間干渉の解析
静岡県立大学食品栄養科学部

島村裕子

Staphylococcus aureus has been reported to overgrow in the skin of patients with atopic dermatitis. It has been reported
that some bacteria in normal human skin have the ability to suppress the growth of S. aureus and contribute to the barrier
function of the skin. However, the effect of Corynebacterium spp., which has a high occupancy in the human skin flora, on
the growth and expression of virulence factors of S. aureus are unclear. In this study, the effects of Corynebacterium spp. on
the growth and expression of virulence factors of S. aureus were examined. Furthermore, the inhibitory effect of cell freeculture medium (CFCM) of Corynebacterium spp. on S. aureus-induced inflammation was evaluated.
CFCM of Corynebacterium isolates ⑥-3 (Cory ⑥-3) significantly suppressed the growth of S. aureus in the early stageof culture and the expression of virulence factors RNAIII, hla and spa. When S. aureus MVs were added to RBL-2H3 cells,
the release rate of β-hexosaminidase was significantly increased. On the other hand, CFCM of Cory ⑥-3 significantly reduced the release of β-hexosaminidase induced by S. aureus MVs. S. aureus MVs enhanced the expression of normal humanepidermal keratinocytes (NHEK) inflammation-inducing genes, and Cory ⑥-3 CFCM significantly suppressed the expression of these genes. Our studies are the first to demonstrate the effect of Corynebacterium isolates on the inflammatory responses induced by S. aureus MVs in cultured keratinocytes.

1．緒

殖および病原因子の発現の抑制効果について解析した。また、

言

RBL- 2 H 3 細胞のβ-hexosaminidase 放出率を測定することで、アトピー性皮膚炎（AD）患者の皮膚では、常在菌の種類

S. aureus 由来分子を含むMVs および Corynebacterium 属菌が著しく減り、その過半数を黄色ブドウ球菌（Staplylococcusの培 養 液から菌 体を除 去した cell free condition medium

aureus）が占める異常な状態が起きていることが報告され（CFCM）が、I 型アレルギー反応である脱顆粒に及ぼす影響

1）ている 。また、S. aureus が産生するメンブランベシクを調べた。さらに、マイクロアレイ解析を用いて、表皮角ル（membrane vesicle; MVs）は、20～ 400 nm の球状構造

化 細 胞（NHEK）の 免 疫 関 連 遺 伝 子 の 発 現 に 対 す る S.

2 , 3）。一方、

aureus MVs および CFCM の影響を網羅的に解析した。将正常なヒトの皮膚細菌叢は、多様性に富んでいることから、

来的には、正常皮膚細菌叢由来の菌体外成分を利用した皮膚細菌叢の正常なバランスを維持することが AD の予防、

AD に対する新規スキンケア方法の開発を目指す。

体であり、AD を悪化させることが知られている悪化防止につながると考えられる。これまでに、AD のモ

２．方デルマウスでは、S. aureus と Corynebacterium bovis が皮膚細菌叢の多くを占めていることが報告されている 4）。一方、

法

2. 1. AD発症者の皮膚細菌叢

我々は、成人皮膚常在細菌叢から分離したCorynebacterium

20 代の AD 発症者 8 名（男性 2 名および女性 6 名）と、属菌の中に、S. aureus の増殖を抑制するものが存在する

20 代の皮膚炎症状のない健常者 9 名（男 2 名、女 7 名）のことを見出している。しかし、Corynebacterium 属菌によ

前額より皮膚細菌叢を採取した。Biostic® Bacteremia DNA

る S. aureus の増殖抑制メカニズムについては明らかにな

Isolation Kit（MO BIO）を用いて DNA を抽出し、PCR にっていない。

よる 16 S rRNA 遺伝子の増幅を行った。その後、アガロ

そこで、本研究では、AD 発症者の皮膚細菌叢について、ースゲルからのライブラリを調製し、The Ion PGM Hi-Q

16 S メタゲノム解析を用いて調査し、皮膚細菌叢の動態

View Sequencing Kit（Life Technologies）を 用 い て、Ion

および各細菌群の病態への関与を解析した。次いで、AD

PGM® sequencer（Life Technologies）で塩基配列を決定し発症者から得られた S. aureus と、健常者の皮膚から分離た。得られた塩基配列は、QIIME を用いて解析した。なお、した Corynebacterium 属菌を共培養して、S. aureus の増

本研究は、本学研究倫理審査委員会の承認（承認番号 29 21）を得て実施した。

Interference between Staphylococcus
aureus showing skin colonization in
atopic dermatitis patients and healthyskin bacteria
Yuko Shimamura
School of Food and Nutritional Sciences,
University of Shizuoka

2. 2. S. aureusの増殖および病原因子発現に及ぼす
Corynebacterium分離株の影響得られた皮膚細菌叢より、S. aureusおよびCorynebacterium
属菌を分離した。Corynebacterium属菌よりCFCMを調製し、AD 発症者から分離した S. aureus の増殖および病原因子− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021の発現に与える影響を調べた。病原因子は、S. aureus の熱した。加熱後、三フッ化ホウ素メタノール錯体メタノー

agr 制御系によって発現が調節されている RNAIII、hla（αル溶液 2 mL を加え、再びドライブロックバスを用いて毒素）、および spa（protein A）
遺伝子を標的とした。

100 ℃で 7 分間加熱した。冷却後、ジクロロメタン 2 mLを加え、30 秒間攪拌抽出を行った後、3 分間超音波で混和

2. 3. S. aureus由来MVsの調製した。混和後、飽和食塩水 5 mL を加えて、軽く振とうし、AD 発症者から分離した S. aureus ① - 1 を BHI 培地に接1 , 500 rpm、10 分間で遠心分離した。ジクロロメタン層（下

種 し、37 ℃、110 rpm で 一 晩 振 と う 培 養 し た。 菌 液 を層）を褐色バイアル瓶に採取し、GC-FID 測定用試料とした。

3 , 000 g、15 分間で遠心分離後、菌体ペレットを除去した。

３．結

上清を 0 . 2 µm フィルターでろ過後、限外ろ過して、100 kDaで濃縮し、さらに、超遠心機を用いて 150 , 000 g、3 時間、果

3. 1. AD発症者の皮膚細菌叢

4 ℃で超遠心分離し、上清を除去した。PBS 50 µL で MVs

16 S メタゲノム解析の結果を、Fig. 1 に示した。被験者を懸濁し、タンパク質量を測定後、使用時まで−20 ℃でより採取した前額（Fig. 1（A））と右頬（Fig. 1（B））の皮膚細保存した。

菌叢では、多くのサンプルで Propionibacterium 属菌が大部分を占めていた。S. aureus を含む Staphylococcus 属菌は、

2. 4. RBL-2H3を用いた脱顆粒試験

被験者ごとに占有率が大きく異なった。Corynebacterium

24 well plate に、RBL- 2 H 3 細 胞 を 2 . 0 × 10 5 cells/ 400µL/well となるように播種し、24 時間培養した。培地を除属菌は、被験者ごとに占有率が大きく異なっていたが、17
名中 15 名の皮膚に存在が確認された。

去 し、 細 胞 を PBS 500 µL/well で 2 回 洗 浄 し た 後、
releasing mixture 160µL/well + S. aureus由来MVs（0 . 05 µg/µL protein）20 µL/well、または、releasing mixture 160 µL/
well + S. aureus 由来 MVs（0 . 1 µg/µL protein）10 µL/well+ CFCM（0、0 . 03、0 . 04、0 . 05、0 . 07、0 . 1、0 . 2、0 . 4 お

3. 2. S. aureusの増殖および病原因子発現に及ぼす
Corynebacterium分離株の影響
Corynebacterium 属菌の CFCM（Cory ① - 4、Cory ⑤ - 1、Cory ⑥ - 3、Cory ⑦ - 4、Cory 6 - 2、Cory 6 - 5 および Cory

よび 1 . 0 mg/µL）10 µL/well を添加し、37 ℃で 10 分間イ

18 - 4）を添加して培養を行ったところ、S. aureus の増殖

ンキュベートした。さらに、A 23187 を終濃度 5 µM となは有意に抑制された（Fig. 2）。これら 7 つの菌株は、rpoB

るように 20 µL/well ずつ添加し、37 ℃で 30 分間インキュ遺伝子に基づいて作成した Corynebacterium 分離株の系統ベートした後、10 分間氷冷して反応を停止した。培養上樹において、同様のクラスターに含まれていた。また、熱清 50 µL を 96 well plate に移し、5 mM substrate solution

処理した Corynebacterium 分離株 CFCM を S. aureus に添を 50 µL/well ずつ添加し、37 ℃で 30 分間インキュベート

加した場合においても、同様の結果が得られた。

した。Stop buffer を 200 µL/well ずつ添加し、マイクロプ

そ こ で、S. aureus の 増 殖 を 最 も 抑 制 し た Cory ⑥ - 3

レートリーダーにて 405 nm における吸光度を測定した。

CFCM を添加して、S. aureus の病原因子発現に及ぼす影響について調べた。その結果、Cory ⑥ - 3 CFCM は、S.

2. 5. 正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）の炎症惹起に対するCFCMの抑制作用

aureus の病原因子である RNAIII、hla および spa の遺伝子
発現量を有意に抑制した（Fig. 3）。

S. aureus MVs（3 . 5 µg/µL protein）および CFCM（5 µg/µL）を添加して培養した NHEK から total RNA を抽出した。

3. 3. RBL-2H3を用いた脱顆粒試験

Agilent RNA 6000 Nano Kit（Agilent Technologies, Inc.,

A 23187 を添加し、calcium ionophores 刺激により細胞

cat.# 5067-1151）
およびAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent

内の Ca 2 + を増大させた RBL- 2 H 3 細胞の脱顆粒に対するTechnologies, Inc.）を用いて Total RNA の品質を確認した。

Corynebacterium 属菌の CFCM および S. aureus MVs の影

NHEK か ら 回 収 し た Total RNA を 用 い て、GeneChip ™

響を検討した。その結果、9 株の Corynebacterium 属菌のScanner 30007 G（Thermo Fisher）
による DNA マイクロア

CFCM の添加により β-hexosaminidase の放出率が有意にレイ（ClariomTM S Assay, human）
解析を行った。

減少した（Fig. 4（A））。また、S. aureus MVs（Fig. 4（B））
の添加により β-hexosaminidase の放出率が有意に増加し

2. 6. CFCM中の脂肪酸のGC分析

た（Fig. 4（C））。 さ ら に、S. aureus MVs と Cory ⑥ - 3

約 200 mgのCFCMの凍結乾燥物または標品として 29 . 85

CFCM を同時に添加したところ、S. aureus MVs と PBS を

mg の tuberculostearic acid（ 終 濃 度 100 ppm）に、0 . 5 M

添加した場合と比較して、β-hexosaminidase の放出率がNaOH-CH 3 OH 溶液 1 . 5 mL と、ラウリン酸（内部標準物質）

有意に減少した（Fig. 4（C））。そこで、S. aureus MVs に

2 mg を加え、100 ℃のドライブロックバスにて、9 分間加

よる RBL- 2 H 3 細胞の脱顆粒を最も抑制する Cory ⑥ - 3− 126 −

アトピー性皮膚炎発症者に高度に定着する黄色ブドウ球菌と健常者皮膚細菌の菌種間干渉の解析

Fig. 1: The skin microbiome composition of patients with atopic dermatitis（AD）and healthy
subjects at the genus level.
（A）The skin microbiome composition of human forehead.（ B）The skin microbiome
composition of human cheek. AD: patients with atopic dermatitis, Healthy: healthy subjects.

Fig. 2

Effect of Corynebacterium CFCM on the growth of S. aureus.

The cell concentration was measured by the optional density at 600 nm（OD 600）
． Error bars
represent SE. Distilled water（DW）was used as a negative control. * represents p ＜ 0 . 01
compared to the DW.

Fig. 3

Effect of Corynebacterium CFCM on virulence gene expression.

S. aureus were cultured for 5 h with CFCM isolated from Corynebacterium spp. Gene expression of
RNAIII（A）, hla（B）and spa（C）mRNA was determined by real-time RT-PCR. Distilled water（DW）was
used as a negative control. Error bars represent SE. * represents p < 0 . 05 compared to the DW, * * p <0 . 01 compared to the DW.

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Fig. 4 Inhibitory effect of Corynebacterium CFCM on ㌼-hexosaminidase release from RBL- 2 H 3cells.
（A）Inhibitory effect of Corynebacterium CFCM on ㌼-hexosaminidase release from A23187-stimulated
RBL- 2 H 3 cells.（B）Transmission electron microscopic analysis of S. aureus membrane vesicles
（MVs）
（
．C）
Inhibitory effect of Cory ⑥-3 CFCM on ㌼-hexosaminidase release from S. aureus MVs.
（D）Concentration dependence of Corynebacterium CFCM on inhibition of ㌼-hexosaminidase releasefrom S. aureus MVs. *represents p < 0 . 01 compared to the control. † p < 0 . 01 ; unpaired, twotailed student' *s t-test.

CFCM の 濃 度 を 検 討 し た。S. aureus MVs と 共 に、0、供し、有意な変動が認められる免疫応答系シグナル経路を

0 . 03、0 . 04、0 . 05、0 . 07、0 . 1、0 . 2、0 . 4 お よ び 1 . 0 mg/

探 索 し た と こ ろ、TNF signaling pathway お よ びµL の Cory ⑥ - 3 CFCM 凍結乾燥物の PBS 溶解液を RBL-

Cytokine-cytokine receptor interaction が抽出された。S.

2 H 3 細胞に添加し、ϐ-hexosaminidase の放出率を測定しaureus MVs 添加群、S. aureus MVs + Cory ⑥ - 3 CFCMた。その結果、S. aureus MVs と 0 . 2 mg/µL の Cory ⑥ - 3

添加群および Cory ⑥ - 3 CFCM 添加群の pathway 解析結

CFCM 凍結乾燥物の PBS 溶解液を RBL- 2 H 3 細胞に添加

果におけるシグナル経路に含まれる遺伝子の ratio（=fold-した際に、ϐ-hexosaminidase の放出率が最も減少した（Fig.

change）を Table 1 に 示 し た。CXCL 1、BCL 3、IL 1 B、

4（D））
。一方、1 . 0 mg/µL の PBS 溶解液を RBL- 2 H 3 細TNFAIP 3、IL 22 RA 1、TNFSF 10 および CD 40 遺伝子の胞に添加したところ、ϐ-hexosaminidase の放出率が増加し発現は、S. aureus MVs 添加群で増加し、NFκBIA（NFκB

た（Fig. 4（D）
）ことから、CFCM の脱顆粒抑制には、最適

Inhibitor Alpha）遺伝子を除き、S. aureus MVs + Cory ⑥

な濃度が存在すると考えられた。

- 3 CFCM 添加群で減少した（Table 1）。

3. 4. 正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）の炎症惹起に対するCFCMの抑制作用

3. 5. CFCM中の脂肪酸のGC分析
15 菌株の Corynebacterium 分離株 CFCM 中に含まれる

S. aureus MVs および Cory ⑥ - 3 CFCM が NHEK の免脂肪酸を GC-FID によって分析したところ、全てのサンプ

疫関連遺伝子に対して与える影響を網羅的に解析するため、

ルにおいて、標準物質溶液（ジクロロメタン）と内部標準物

マイクロアレイ解析を行った。各群のサンプルデータにお質（ラウリン酸メチル）以外に、3 つのピークが検出された

いて、ratio（= fold-change）> 1 . 7 および ratio < − 0 . 6 で発

（Fig. 5（A））。Tuberculostearic acid の保持時間は 44 . 7 分

現が変動した遺伝子を抽出し、DAVID の pathway 解析にであったが、サンプル由来の検出ピーク中に同一の保持時− 128 −

アトピー性皮膚炎発症者に高度に定着する黄色ブドウ球菌と健常者皮膚細菌の菌種間干渉の解析

Table 1

Summary of differential gene expression in normal human epidermal keratinocytes.

Gene Accession

EntrezGene
ID

Gene Symbol

S. aureus MVs

S. aureus MVs+ CFCM

CFCM

NM_ 001511

2919

CXCL 1

2 . 812 . 62

1 . 57

NM_ 021258

58985

IL 22 RA 1

2 . 28

1 . 81

1 . 50

NM_ 005178

602

BCL 3

1 . 91

1 . 401 . 14

NM_ 000576

3553

IL 1 B

1 . 88

1 . 63

1 . 40

NM_ 001270507

7128

TNFAIP 3

1 . 74

1 . 51

0 . 97

NM_ 020529

4792

NFKBIA

1 . 71

1 . 881 . 16

NM_ 001250

958

CD 40

1 . 71

1 . 66

1 . 45

Fig. 5 : GC analysis of fatty acids in CFCM from Corynebacterium isolate.
（A）GC-FID chromatogram of fatty acid from Corynebacterium CFCM（Cory ⑥- 3）．
（a）A peakat retention time（RT）35 . 0 min.（b）RT 41.1 min.（c）RT 43 . 9 min.（B）Comparison of relative
abundances of fatty acid from Corynebacterium CFCM of the peak at RT 35 . 0 min,（C）RT
41.1 min, and（D）RT 43 . 9 min. Relative abundances were calculated from peak areas in gas
chromatograms（n = 2）．

間のものは存在しなかったことから、Corynebacterium 分

４．考離株 CFCM 中に含まれる脂肪酸の中には、tuberculostearicacid は存在しないことが示唆された。

察

S. aureus は、AD 発症者の皮膚で異常増殖することが報得られた 3 つのピークの脂肪酸について、凍結乾燥物の告されており 1）、菌体自体やその産生物が AD を悪化させ

質量と内部標準物質のクロマトグラムによって面積値の補ることが示唆されている 2 , 3）。これまでに、一部の正常ヒ正を行い、BHI +α 培地中に含まれる脂肪酸量を 1 として、ト皮膚常在細菌は、S. aureus の増殖抑制能を有し、皮膚Corynebacterium 分離株 CFCM 中に含まれる脂肪酸量を相のバリア機能に寄与することが報告されているが、ヒト皮対比較した。各種 Corynebacterium 分離株 CFCM 中に含膚細菌叢における占有率が高い Corynebacterium 属菌 5）がまれる脂肪酸量を相対比較したところ、菌種による差は認

S. aureus に与える影響については明らかになっていない。

められなかった（Fig. 5（B）-（D））
。

そこで、本研究では、Corynebacterium 属菌が S. aureusの増殖および病原因子の発現に与える影響、さらに S.

− 129 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Corynebacterium 属菌の菌体外成分を明らかにすることにaureus 誘導性 AD に対する作用について調べた。
Corynebacterium 分離株由来 CFCM を S. aureus に添加して培養したところ、Corynebacterium 分離株⑥ - 3（Coryより、S. aureus 誘導性 AD に対する正常ヒト皮膚常在細菌を利用した新規スキンケア方法の開発が望まれる。

⑥ - 3）の CFCM において、S. aureus の培養初期段階における増殖および病原因子である RNAIII、その下流遺伝子である hla および spa の発現を有意に抑制した。RNAIII 遺6）（引用文献）
1） Kong, H., Oh, J., Deming, C., Conlan, S., Grice, E.,

伝子は、agr 制御系遺伝子群の発現を調節している こと

Beatson, M., Nomicos, E., Polley, E., Komarow, H.,

から、Cory ⑥ - 3 の菌体外成分が quorum sensing 機構を

Murray, P., Turner, M., Segre, J.: Temporal shifts in

阻 害 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た。 ま た、calcium

the skin microbiome associated with disease flares andionophores で前処理した RBL- 2 H 3 細胞に S. aureus MVs

treatment in children with disease flares and treatmentを添加したところ、β-hexosaminidase の放出率が有意に

in children with atopic dermatitis. Genome Res., 2 2:増加し、脱顆粒を誘導した。一方、Cory ⑥ - 3 の CFCM は、

850-859（2012）．

S. aureus MVs が誘導した β-hexosaminidase の放出を有2） Wang, X. , Thompson, C., Weidenmaier, C., Lee J.:

意に減少させ、脱顆粒反応を抑制した。マイクロアレイ解

Release of Staphylococcus aureus extracellular vesicles

析の結果、S. aureus MVs は、NHEK の炎症誘導関連遺伝

and their application as a vaccine platform. Nature子の発現を亢進させ、Cory ⑥ - 3 CFCM は、これら遺伝子

Commun., 9: 1-13（2018）．

の発現を有意に抑制した。これらの結果より、S. aureus

3） Gurung, M., Moon, D., Choi, C., Lee, J., Bae, Y., Kim,

MVs は、NHEK の炎症誘導に関連する遺伝子を増大させ、J., Lee, Y., Seol, S., Cho, D., Kim, S., Lee, J.:

そ れ に 対 し て、Cory ⑥ - 3 の 菌 体 外 成 分 は、S. aureus

Staphylococcus aureus produces membrane-derived

MVs 自体に作用することで、炎症反応の増悪を抑制して

vesicles that induce host cell death. PLoS ONE, 6: 1-8いる可能性が示唆された。15 菌株の Corynebacterium 分（2011）．

離株 CFCM 中に含まれる脂肪酸を GC-FID によって分析

4） Kobayashi, T., Glatz, M., Amagai, A., Nagao, K.:したところ、菌種による差は見られなかったことから、S.

Dysbiosis and Staphylococcus aureus colonization

aureus の増殖および病原因子の発現抑制には、脂肪酸以drives inflammation in atopic dermatitis. Immunity, 42:外の物質が関与している可能性が考えられた。

756-766（2015）．

５．総

5） Grice, E., Segre, J.: The skin microbiome. Nat. Rev.

括

Microbiol., 9: 244-253（2011）．

本研究の成果より、ヒト皮膚常在細菌であるCorynebacterium

6） Vuong, C., Saenz, L., Götz, F., Otto, M.: Impact of the

属菌の菌体外成分は、S. aureus の増殖および病原因子の発agr quorum-sensing system on adherence to

現を抑制することを明らかにした。さらに、Corynebacterium

polystyrene in Staphylococcus aureus. Infect. Dis., 182:

属菌の菌体外成分は、S. aureus MVs による脱顆粒および

1688-1693（2000）．

AD 様皮膚病変の誘発を抑制することが示唆された。今後、− 130 −

アトピー性皮膚炎における新規オートファジーの関与とそれを応用した治療法開発
東京医科歯科大学難治疾患研究所

清水重臣

We aimed to elucidate the role of autophagy in skin development. There are two types of autophagy, namely canonicalautophagy and alternative autophagy, and we generated various skin-specific autophagy gene-knockout mice. Althoughsimple knockout mice of canonical autophagy and alternative autophagy did not show any remarkable abnormalities, double-knockout (Beclin1-knockout) mice died within a day after birth owing to impairment of epidermal barrier. Furthermore,
we found that Beclin 1 deficiency causes mislocalization of integrins, abnormal cell detachment of basal cells and their immature differentiation, and abnormal skin development.
We also screened a low–molecular weight compound library to identify chemicals with alternative autophagy-inducing
activities and successfully identified candidate compounds. By the application of these compounds to atopic dermatitis model mice, we obtained TMD-AD129 compound which exhibited strong anti-dermatitis activity. At present, we are optimizing
this compound for development as drugs.

1．緒

言

ヒトの皮膚には 200 種以上の菌が共生しているが、皮膚には、角質層などによる「物理的バリア」、表皮角化細胞から分泌される抗菌ペプチドによる「自然免疫バリア」、細胞内に侵入した細菌を殺菌するオートファジー機構「ゼノファジー」の３種のデフェンス機構が備わっており、微生物による侵入を阻止し恒常性を保っている。しかし、宿主側の変調や微生物叢のプロファイルに変化が生じると、恒常性が破綻し（dysbiosis）、アトピー性皮膚炎などの疾患発症へとつながっていく。
オートファジー（自食現象）とは、細胞内の自己構成成分（例えば、不要なタンパク質や傷害を受けたオルガネラなど）を分解する細胞機能であり、細胞内浄化作用を有す

図1 全ての細胞は、Atg 5依存的オートファジーと新規オートフ
ァジーの２つの機能を有している。両者は、①膜の由来、②実
行分子、③分解基質を異にしている。

るため、その変調は様々な疾患や病態の原因となる。皮膚細胞においても、オートファジー機構は存在しており、紫き上がる。オートファゴソームが形成されると、その後に外線を浴びたときなどにオートファジーが活性化されるこ

リソソームが直接融合し、リソソームの消化酵素によってとが知られている。皮膚細胞を含めて、全ての細胞は 2 種

その内容物が消化される。リソソームには、カテプシンな類のオートファジー機構を有している。即ち、Atg 5 分子

どのタンパク質分解酵素、酸性リパーゼ、DNA 分解酵素に依存して小胞体膜に由来する通常型オートファジーとなど様々な種類の消化酵素が含まれているため、内容物はAtg 5 分子を利用せずゴルジ体膜に由来する新規オートフ

ほぼ完全に消化されることとなる。２種類のオートファジァジーである

1 , 2）（図 1）。両者ともに、初期段階では、隔ーは、これらのオートファジー形態に関しては、ほとんど離膜と呼ばれる小さな２重膜構造物が形成される。この隔差異が認められない。一方、２つのオートファジーは、⑴離膜は伸長すると共に湾曲し、細胞質やオルガネラを囲い誘導する刺激の種類、⑵オートファジー膜の由来、⑶実行込み、最終的には両端が融合したオートファゴソームがで分子の種類、⑷分解する基質の種類が異なっており、細胞内では、全く異なる役割を果たしている 3 - 5）。
前述のごとく、アトピー性皮膚炎の発症には、宿主側のThe role of alternative autophagy inatopic dermatitis and its therapeutic
use
Shigeomi Shimizu
Tokyo Medical and Dental University,
Medical Research Institute

変調が大きく関わっているため、オートファジーの変調はその原因のひとつとなりうる。そこで、本研究では、まず皮膚においてオートファジーがどのような役割を果たしているかを明らかにした。次に、新規オートファジーを活性化できる化合物を探索して、アトピー性皮膚炎の治療への− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021応用を目指した。

２．方

３．結

法

果

課題 1：皮膚におけるオートファジーの役割を明らかにする

2. 1. 皮膚におけるオートファジーの役割を明らかにする

スを複数種類作成した 6）。

方法 1：

１：通常型オートファジー欠損マウス：Atg 5 flox マウス、

上記課題のために、皮膚特異的オートファジー欠損マウ

オートファジー分子を欠損したマウスを複数作製し、Atg7 floxマウス、Atg14 floxマウスを、それぞれ keratin 5

neonate ならびに adult mice においてその表現系を観察し（K 5）- cre マウスと交配して、皮膚特異的通常型オートた。皮膚に異常が見られた場合には、皮膚からの水分蒸散

ファジー欠損マウスを作製した。しかしながら、皮膚に量（TWEL）を TWEL 測定器を用いて計測した。また、皮明らかな異常を認めるマウスはなかった。

膚 の 組 織 を 採 取 し、 免 疫 組 織 染 色 な ら び に western

２：新規オートファジー欠損マウス：Wipi 3 flox マウスを

blotting による解析を行った。基底細胞の分裂方向の測定

K 5 -cre マウスと交配して、皮膚特異的新規オートファには、survivin 染色法を用いた。

ジー欠損マウスを作製した。しかしながら、皮膚の顕著な異常は認められなかった。

2. 2. アトピー性皮膚炎に有効な新規オートファジー誘
導天然物／化合物を開発する
方法 2：

３：両オートファジー欠損マウス：両方のオートファジーに共通して機能する Beclin 1 の flox マウスと K 5 -cre マ
ウスと交配して、皮膚特異的両オートファジー欠損マウ

約 20000 種類の低分子化合物と約 5000 種類の天然物かスを作製したところ、当該マウスはすべて生後 1 日以内

ら、新規オートファジー誘導化合物／天然物をハイスルーに死亡した。また、死因は皮膚のバリア形成機構の不全

プットアッセイにより同定した。

による多量の水分蒸散量が原因であると思われた（図 2）。

ダニ抗原塗布による皮膚炎を作製し、各化合物を塗布

さらに、皮膚の詳細な解析を行ったところ、K 5 の発現（n= 5、1 日おき、200 µL 患部に塗布 / 匹）し、8 日後に皮量が多い一方、K 10 や Filaggrin の発現量が低く、基底層

膚炎の程度をスコア化した。

からの皮膚細胞分化に異常があることが判明した（図３）。

図２：皮膚特異的Beclin1欠損マウスは、皮膚のバリア形成機構の不全によって、水分蒸散量が多く、生後1日以内に死亡した。

図3 皮膚特異的Beclin1欠損マウスは、K 5の発現量が多く、一方、K10の発現量やFilaggrinの発現量が低く、基底層からの皮膚細胞の分化に異常があることが判明した。

− 132 −

アトピー性皮膚炎における新規オートファジーの関与とそれを応用した治療法開発

このため、基底層細胞の分裂方向を、Survivin 染色に償しながら、基底細胞の細胞分化を正常に保っているこて観察したところ、正常よりも垂直方向の分裂が多く、と、これにより、正常な皮膚が形成されることが明らか

細胞が十分に分化しないまま基底層から上層に上がってとなった。

いるものと思われた（図 4）。また、この原因が細胞接着に機能するインテグリンの局在異常に起因する可能性が

課題２：約 20000 種類の低分子化合物と約 5000 種類の天考えられた。即ち、本来細胞膜に存在して細胞外マトリ然物を新規オートファジーモニター細胞に投与し、ハイックスと結合するインテグリンが細胞内にとどまってい

スループットスクリーニングにて、約 110 種類の新規オたため、これが原因であると思われた（図 5）。

ートファジー誘導化合物／天然物を見いだした（図 6）。

以上より、皮膚において、２つのオートファジーは代ビオスタ AD 誘発 NC/Nga マウス皮膚炎モデルを作製

図4 Survivin染色により、基底層細胞の分裂方向を解析したところ、皮膚特異的Beclin1欠損マウスでは、
水平方向より垂直方向の分裂が多く、未分化のまま上層に上がっていることが示された。

図5

皮膚特異的Beclin 1欠損マウスでは、インテグリンの局在が異常であった。

図６

ハイスループットを用いた新規オートファジーの計測

新規オートファジーモニター細胞に化合物ライブラリーを投与して、その後の、新規オートファジー誘導をCell Imagerで定量測定する。

− 133 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

未分化細胞が分化されないまま脱接着して上層に上がり（図 4）、皮膚の形成不全が起こる（図 1）ものと考えられた。新規オートファジーの機能不全
は通常型オートファジーによって代用されうるので、両者のオートファジーを欠損させたときにのみ皮膚形成異常が出現するものと考えられる。
このように、オートファジーは皮膚形成に関わっているために、皮膚炎等の病態においても何らかの関与があるものと思われた。実際に、アトピ
ー性皮膚炎の皮膚に新規オートファジー誘導化合物を塗布することによって、劇的な皮膚症状の改善ならびに脾臓重量の改善が認められている。今後、インテグリンの局在を含めて、新規オートフ
ァジー誘導化合物の作用メカニズムを明らかにすることが重要である。

５．総括

本研究により、２つのオートファジーは代償しながら、正常な皮膚形成に機能していることが明らかとなった。また、新規オートファジーの誘導

図７ TMD-AD 129を隔日に塗布したマウスは皮膚炎が改善した。

により、アトピー性皮膚炎の改善が期待できることが明らかとなった。
し、各化合物（200 µL）を隔日に塗布し、8 日目に皮膚の性状をスコア化した。その結果、化合物 TMD-AD 129を塗布したマウスにおいて、皮膚炎の顕著な改善を認めた（図 7）。また、このマウスにおいては、脾臓の重量も謝

辞本研究の遂行にご支援いただきました公益財団法人コー
セーコスメトロジー研究財団に篤く御礼申し上げます。

0 . 1032 ± 0 . 032 g（対照は 0 . 142 ± 0 . 024 g）と腫大が顕（引用文献）

著に抑えられていた。
これらの結果より、新規オートファジー誘導化合物の1）Nishida, Y.; Arakawa, S.; Fujitani, K.; Yamaguchi, H.;

塗布により、アトピー性皮膚炎が改善することが示されMizuta, T.; Kanaseki, T.; Komatsu, K.; Otsu, K.;

た。

Tsujimoto, Y.; Shimizu, S. Nature 2009, 461, 654-658.

４．考2）Honda, S.; Arakawa, S.; Nishida, Y.; Yamaguchi, H.;察Ishii, E.; Shimizu, S. Nature Commun. 2014, 5, 4004.

本研究によって、皮膚形成を正常に行うために、２つの

3） Yamaguchi, H.; Arakawa, S.; Kanaseki, T.;

オートファジーが代償的に機能していること、その主な機

Miyatsuka,T.; Fujitani,Y.; Watada,H.; Tsujimoto,Y.;

序が、インテグリンの細胞膜への局在制御によることが明Shimizu, S. EMBO J. 2016, 35, 1991-2007.

らかとなった。新規オートファジーは、ゴルジ体から細胞4）Torii, S.; Yamaguchi, H.; Nakanishi, A.; Arakawa, S.;

外あるいは細胞膜にタンパク質を輸送する際に、その量のHonda, S.; Moriwaki, K.; Nakano, H.; Shimizu, S. Nature

調節を行っている。即ち、過剰な分子が輸送されようとす

Commun. 2020, 11, 17544.

るときに、新規オートファジーが活性化されて、これらを

5） Yamaguchi, H.; Honda, S.; Torii, S.; Shimizu, K.;

分解するのである。皮膚においては、インテグリンが新規

Arakawa, Katoh, K.; Miyake, K.; Miyake, N.; Fujikake,

オートファジーの分解基質となっているため、新規オート

N.; Sakurai, H.; Arakawa, S.; Shimizu, S. Nature

ファジーが破綻すると、インテグリンが細胞内に異常に蓄Commun. 2020, 11, 5311.

積する（図 5）。すると、新たなインテグリンが合成されず

6）Noguchi, S.; Honda, S.; Saitoh, T.; Matsumura, H.;に細胞膜上のインテグリン量が減少し、細胞接着性が低下

Nishimura, E.; Akira,S,; Shimizu, S. Commun. Biol.

するものと考えられる。さらに、細胞接着性が低下すると、

2019, 2, 37.

− 134 −

皮膚付属器官を有する三次元再生皮膚器官系の開発
国立研究開発法人理化学研究所 生命機能科学研究センター

武尾真

The skin plays essential roles in temperature control, barrier, bacteriostatic action, buffering action, and excretory action.
Three - dimensional (3D) human skin equivalents (HSEs) are widely used for researches in the field of cosmetology andskin care biology as alternative model for animal experiments. However, the conventional HSE has quite simple structure
consists of epithelium and dermis, and can partially mimics the physiological function of natural skin due to the lack of skinappendages such as hair follicles, sebaceous glands, and sweat glands.
In this study, we aimed to develop a three-dimensional regenerated skin organ system with the same tissue structure andfunction as the natural skin. To this end, 1) we developed a novel HSE that maintains the normal ECM and cellular alignment observed in the natural skin in accordance with tension by reproducing tensional homeostasis. 2) We established a technology to regenerate mature hair follicles in vitro and succeeded in constructing a skin organ system (Bioskin) in vitro byincorporating the mature hair follicles into functional three-dimensional human skin. This Bioskin was able to maintain hairshaft growth, demonstrating usefulness of the Bioskin as an in vitro evaluation model that have similar function as a natural
skin organ system. Our study will provide the basic technology and novel skin model not only for cosmetology but also forclinical field.

1．緒

言

皮膚は表皮層、真皮層、皮下脂肪層の三層から成り、さらに毛包や汗腺、皮脂腺などの皮膚付属器が複雑に三次元
配置された
「器官系」
であり、温度調節機能、バリア機能、静菌・緩衝作用、排泄作用などを有し生体の恒常性の維持において重要な役割を担っている。このため、スキンケア
やコスメトロジーにおける研究開発においては、安全性は当然のことながら、機能性の評価が重要となってくる。現
在欧州を中心に研究開発における動物実験の縮小を求める
社会的需要が世界的に普及しつつあり、動物実験代替法として三次元培養ヒト皮膚モデルが広く用いられている。しかしながら、従来のヒト皮膚モデルは上皮と真皮という非常に単純な構造であり、正常ヒト皮膚に存在する毛包・皮

図1

皮膚付属器を有する三次元再生皮膚器官系の構築

脂腺・汗腺などの皮膚付属器や皮下組織が存在せず、構造的、機能的に不十分なモデルである（図 1）。一方、より生

歯や毛髪、分泌腺が発生し、生体器官と同じように機能す体に近い条件での安全性、有効性の試験のために国外からることを実証した 2 - 5）。また、iPS 細胞から作製した胚様輸入したヒト生体皮膚もしくは死体皮膚が使用されている

体から毛包や皮脂腺を含む皮膚器官系を再生する技術を世が、個体差に起因するロット間差や皮膚の絶対量の不足な界に先駆けて開発した 6）。そこで本研究課題ではこれらのどの問題がある。これまでに本研究グループは、三次元的技術を応用し、人工皮膚に生体外で発生させた毛包や皮脂な細胞操作技術である「器官原基法」を開発し、幅広い器官

腺を組み込み、生体の皮膚と同等の構造と選択透過性や径1）再生の研究に道を拓いた 。この再生した器官原基を歯や毛穴透過性などの機能を有する三次元再生皮膚器官系（バ

毛髪、分泌腺を失った部位に移植することにより、完全なイオスキン）を構築することを目的とした。本研究の成果としての天然皮膚と同等の構造と機能を持つ次世代三次元
人工皮膚モデルは、動物実験代替法としてより生体に近い

Development of regenerative skin organsystem with skin appendages
Makoto Takeo
R I K E N C enter for Biosystems
Dynamics Research

状態での安全性試験を行うことを可能とするだけではなく、
これまでの人工皮膚モデルでは不可能であった機能性、有効性の評価も可能とし、コスメトロジーの発展に大きく寄与すると期待できる。

− 135 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

２．方

インサートから外し、さらに 3 日間気相培養した。Bell 型

法

モデル；コラーゲン溶液に NHDF を混合し固化させた後

2. 1. 実験動物

7 日間浮遊培養し収縮させた。その後上層に NHEK を播

C57BL/6Nマウスは、日本SLC株式会社より購入した。

種し 4 日間浸漬培養後、7 日間気相培養を行った。（図 2）

また、この研究は理化学研究所神戸支部施設内動物管理使
用委員会によって承認されたプロトコールに従って実施した。

2. 4. 再構成原基の作製および生体外培養
E 18 胎児皮膚由来上皮細胞および間葉細胞、もしくは、

2. 2. 細胞培養

成体マウスヒゲ由来バルジ領域上皮細胞および初代培養毛

ヒト表皮角化細胞（NHEK ; Kurabo, Osaka, Japan）、ヒ

乳頭細胞を用いて「器官原基法」により再構成原基を作製しト皮膚線維芽細胞（NHDF ; Kurabo）は 37 ℃、5 % CO 2 環

た。これらをカルチャーインサート上に置き、専用培地に

境下でそれぞれの専用培地（Humedia-KG 2 , 10 % FBS, 1 %て培養を行った（図 3）。

Penstrep, 10 ng/mL bFGF 含有 DMEM）を用いて培養を行

２. 5. 組織学的解析

い、皮膚モデルの作製に供した。

作製した人工皮膚を 4 % パラホルムアルデヒド溶液で固2. 3. 人工皮膚モデルの作製

定し、パラフィンまたはティシュー ･ テック O. C. T. コン

THS モデル；コラーゲン溶液（KOKEN, Tokyo, Japan）

パウンド（Sakura Finetek Japan Co., Ltd., Tokyo, Japan）に異なる濃度の NHDF をそれぞれ混合し、カルチャーイに包埋した。パラフィン組織切片（10 µm 厚）を作製後、

ン サ ー ト（Corning, NY, USA）に 積 層 し 固 化 さ せ た

HE 染 色 を 行 い、Axio Scan.Z 1（Carl Zeiss, Oberkochen,（Dermal equivalent, DE）。 こ れ を Snapwell イ ン サ ー ト

Germany）にて撮影した。また、パラフィン組織切片（10µm（Corning）に挟み込み、上層に NHEK を播種した。4 日間厚）または凍結組織切片（10 µm 厚または 50 µm 厚）を作製

浸漬培養後、7 日間気相培養を行った。TRS モデル；THS

後、免疫染色を行い、LSM 780 共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）

モデルと同様に細胞を播種し、気相培養 4 日目に Snapwellにて撮影した。

図2

皮膚モデル作製方法の概略図

図3

再構成原基作製方法の概略図− 136 −

皮膚付属器官を有する三次元再生皮膚器官系の開発

2. 6. バリア機能測定

様に組織全体が収縮しており、張力均衡は喪失している。

表皮バリア機能は OECD テストガイドラインに従ってそこで、コラーゲンゲル中に線維芽細胞を播種した後、す評価した。各濃度の SDS 溶液を人工皮膚表面に 1 時間塗

ぐに Snapwell インサートに人工真皮を固定することによ

布し、24 時間培養後の細胞生存率を MTT アッセイによりり、横方向の牽引力バランスを再現する張力恒常性皮膚モ

評 価 し た。TEER 測 定 は、EndOhm（World Precision

デル（Tensional Homeostasis Skin model ; THS モデル）を

Instruments, Sarasota, FL, USA）を用いて行った。TEWL測構築した。この THS モデルは、培養中に容器から切り離定は、VAPO SCAN system（ASAHI BIOMED, Kanagawa,

されると天然皮膚同様に収縮する（Tension Release Skin

Japan）
を用いて行った。

model ; TRS モデル）ことから、張力均衡の再現が示された（図 4 A）。線維芽細胞の三次元的な形態とコラーゲン線

2. 7. 遺伝子発現解析

維を比較すると、天然皮膚や TRS モデルは張力方向に配RNeasy Plus Mini kit（QIAGEN, Venlo, Netherlands）を用

向性をもって引張された形態をとるのに対し、Bell 型モデ

い て 人 工 皮 膚 か ら RNA を 抽 出 し、SuperScript VILO

ルや TRS モデルではその配向性を失っていた（図 4 A）
。さ

（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を用いて cDNA をらに、THS モデルでは、表皮細胞層が分化し、気層培養合成した。Real-time PCR は、Applied Biosystems Quant

か ら 7 日 目 に は、 ケ ラ チ ン 5（KRT 5）、 ケ ラ チ ン 10

Studio 12 K Flex（Thermo Fisher Scientific）を用いて行っ（KRT 10）、フィラグリン（FLG）、クローディン 1（CLDN 1）

た。

などのケラチノサイト分化マーカーの局在が表皮層で観察

３．結され、天然皮膚と同様に基底層、有棘層、顆粒層、角質層

果の細胞層に組織化されていることが確認された（図 4 B）。

3. 1. 張力均衡型人工皮膚の構築および構造評価
はじめに、バイオスキンの土台となる機能的人工皮膚の3. 2. 張力均衡型人工皮膚の皮膚機能評価構築を行った。皮膚は圧迫や引張といった外的な力だけで次に、THS モデルと TRS モデル、Bell 型モデルの皮膚なく、組織内部で細胞同士がコラーゲン線維を介して引っ機能を比較評価した。化学物質の安全性評価項目の一つで張り合うことで生じる内的な力も存在し、これらの張力がある SDS 塗布による皮膚一時刺激性評価では表皮バリア

均衡した状態にある。この張力の均衡は機械的ストレス信機能については、THS モデルは従来モデルと同レベルの号を介して皮膚器官の恒常性を維持する上で重要な役割を細胞生存率、TEWL 値、TEER 値を示した（図 5 A-D）
。ま

果たしている 。従来の Bell 型モデルは、コラーゲンゲル

た、フルオレセインを使用した局所投与試験では、PBS 塗

中に線維芽細胞を播種した後に浮遊培養し、線維芽細胞の布群と比較すると SDS 塗布群ではフルオレセインの表皮収縮力による人工真皮の収縮がコラーゲン線維の再編成を層への劇的な拡散が見られた（図 5 E, F）。これらの結果か促すとされてきた。しかし、従来のこの工程は切除皮膚同

ら、THS モデルは既存の人工皮膚モデルと同様のバリア

7）

図4

張力均衡型人工皮膚の構造

A. 各人工皮膚モデルの実体像およびHE染色像、Scale bars, 1mm（実体像）or 50 µm（HE染色像）
B. 天然ヒト皮膚およびTHSモデルの免疫染色像、Scale bars, 50 µm− 137 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

剤の塗布によっても確認された（図 6 C）
。以上の結果から、機能試験に使用することができることが示された。
次に真皮機能として、線維症や老化に伴うしわ、たるみの形成に重要な役割を果たす細胞外基質関連タンパク質のTHS モデルは既存の人工皮膚と比較し、より生体に近い機能性を有することが示された 8）。

遺伝子発現と線維形成を評価した。その結果、THS モデ
ルではコラーゲン・エラスチン線維形成機能の向上が確認

3. 3. 毛包の生体外培養方法の構築された（図 6 A）。更に、老化に伴う真皮細胞外基質の減少

皮膚器官系の生体外での再構築に向けて、生体外培養にに対して効果的とされるレチノイン酸誘導体（ATRA）をおいて成熟毛包を再生する技術の確立を行った。初めに、各人工皮膚に添加したところ、THS モデルにおいて顕著

マウス胎児皮膚由来細胞を用いて「器官原基法」により再生

なコラーゲンおよびヒアルロン酸合成遺伝子の発現促進と毛包原基を作製し、生体外で発生させる培養条件の検討をコラーゲン線維の形成促進が確認された（図 6 B）
。この薬行った。その結果、毛包発生時に作用するサイトカインシ物に対する応答性は、内服・血中投与を想定した培地へのグナルの制御下で培養することにより、再生毛包原基の初薬物添加だけでなく、外用剤塗布を想定したローション製

期発生誘導から成長期 VI 期の毛包にまで成熟させること

図5

THSモデルの皮膚バリア機能の解析

A-D. SDSを用いた皮膚刺激性試験 A. 実体像およびHE染色像、Scale bars, 1 mm（実体像）or 50 µm（HE染色像）
B. 細胞生存率 C. TEWL分析 D. TEER分析 E. F. フルオレセインを用いた局所投与アッセイ 垂直断面の共焦点画像（E）、
2 . 5 D強度プロット（F）Scale bars, 50 µm− 138 −

皮膚付属器官を有する三次元再生皮膚器官系の開発

図6 THSモデルの真皮機能の解析
A. 真皮ECM関連タンパク質のReal-time PCR解析 B. C. 人工皮膚モデルのATRAに対する反応性試験、IAM ; the intravenous administration model、TAM ; the topical application modelに世界に先駆けて成功した。さらに、これまでに生体外増た。また、胎児性および成体組織幹細胞を用いて生体外で幅に成功している毛包間葉性幹細胞である毛乳頭細胞と毛毛包を発生させることに世界で初めて成功し、この毛包を包上皮性幹細胞を用いて作製した成体マウスヒゲ由来再生

人工皮膚へ組み込むことによって長期的な毛幹形成が認め

毛包原基の初期発生も同様に誘導可能であり、間葉系幹細られ、バイオスキンの概念が実証された。

胞を毛包周囲に配置することにより、成長期 VI 期まで成近年、化粧品・ヘルスケア業界では科学的根拠に基づく製品開発への期待と関心が高まっている。しかしながら動熟することが明らかとなった。
次に、３. 1 . で作製した機能性三次元人工皮膚に成体マ

物実験の規制や動物実験代替法が十分でなく、機能評価可ウス由来成熟再生毛包を組み込んだところ、再生毛の上皮

能な人工皮膚の開発に期待が寄せられている。しかし、こ組織と人工皮膚の表皮組織が接続し、毛幹が伸長し、健全れまで組織再生によって構築された皮膚は正常ヒト皮膚にな毛包組織が維持されていたことから、成体由来体性幹細存在する毛包・皮脂腺・汗腺などの皮膚付属器や皮下組織胞を用いた生体外人工皮膚器官系（バイオスキン）構築に向が存在せず、不完全な皮膚構造であり、十分な高度化がなけた概念が実証された。

されていないという現状にある。本研究課題における成果

４．考により、これまで克服できなかった組織からの器官再生、察

さらに皮膚付属器である毛包を有する三次元人工皮膚器官

本研究において、三次元人工皮膚に張力を付加すること系の再生が達成可能であることが示された。また、本研究により、天然皮膚に近い組織構造と生体反応を示すことがにおいて得られた既存の人工皮膚に様々な付属器官や細胞

明らかとなり、組織および器官の機械的刺激が組織・器官を組み込むための技術と知見は、樹状細胞や活性型肥満細構造と機能発現に重要な役割を果たしていることが示され

胞、抗原特異的リンパ球などの組み込みを可能とし、皮膚− 139 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

炎やアクネ菌感染モデル、非アレルギー性皮膚炎モデル、and their niches. Nature Commun. 3, 784（2012）

アレルギー性皮膚炎モデルなど、研究のニーズに応じた

4） Hirayama M, Ogawa M, Oshima M, Sekine Y, Ishida

様々な評価系へとカスタマイズできる可能性を示しており、

K, Yamashita K, Ikeda K, Shimmura S, Kawakita T,

コスメトロジーのみならず医薬品分野を含む多くの研究分

Tsubota K, Tsuji T. Functional lacrimal gland

野の進歩・発展において、多大なる貢献が可能であると期

regeneration by transplantation of a bioengineered待される。今後は、皮膚器官系としての機能評価および生organ germ. Nature Commun. 4, 2497（2013）

体外評価モデルとしての機能評価を行い社会実装を目指す。

5） Ogawa M, Oshima M, Imamura A, Sekine Y, Ishida
K, Yamashita K, Nakajima K, Hirayama M, Tachikawa

謝辞T, Tsuji T. Functional salivary gland regeneration by

本研究を遂行するにあたりご支援を頂きました公益財団
法人コーセーコスメトロジー研究財団に感謝いたします。

transplantation of a bioengineered organ germ. Nature
Commun. 4, 2498（2013）
6） Takagi R, Ishimaru J, Sugawara A, Toyoshima K,（引用文献）

Ishida K, Ogawa M, Sakakibara K, Asakawa K,

1） Nakao K, Morita R, Saji Y, Ishida K, Tomita Y,

Kashiwakura A, Oshima M, Minamide R, Sato A,

Ogawa M, Saitoh M, Tomooka Y, Tsuji T. The

Yoshitake T, Takeda A, Egusa H, Tsuji T.

development of a bioengineered organ germ method.

Bioengineering a 3D integumentary organ system

Nature Methods 4, 227-230（2007）

from iPS cells using an in vivo transplantation model.

2） Ikeda E, Morita R, Nakao K, Ishida K, Nakamura T,

Sci. Adv. 2, e1500887（2016）

Takano-Yamamoto T, Ogawa M, MizunoM, Kasugai S,7） Hsu CK, Lin HH, Harn HIC, Hughes MW, Tang MJ,

Tsuji T. Fully functional bioengineered toothYang CC. Mechanical forces in skin disorders. J.

replacement as an organ replacement therapy. Proc.

Dermatol. Sci. 90, 232-240（2018）

Natl. Acad. Sci. USA 106, 13475-80（2009）8）Kimura S, Tsuchiya A, Ogawa M, Ono M, Suda N,3） Toyoshima K, Asakawa K, Ishibashi N, Toki H,

Sekimoto K, Takeo M, Tsuji T. Tissue-scale tensional

Ogawa M, Hasegawa T, Irie T, Tachikawa T, Sato A,

homeostasis in skin regulates structure andTakeda A, Tsuji T. Fully functional hair follicle

physiological function. Commun. Biol. 3, 637（2020）

regeneration through the rearrangement of stem cells− 140 −

常在菌フローラ育成を目指す
肌表面微小環境応答性ポリアミノ酸の開発
東京工業大学科学技術創成研究院化学生命科学研究所

武元

宏泰

Skin flora plays an essential role in skin health conditions. Conventional cosmetic strategies can deliver nutrients tothe flora, which often facilitates the growth of not only beneficial bacteria but also bad bacteria. In the present study, a new
methodology that delivers the nutrients to beneficial bacteria for the selective growth was developed. In design, glucose
as a nutrient was conjugated with poly (amino acid) side chains via boronic ester. Thus, the developed system can release
glucose in response to weakly acidic pH, which is suitable for the growth of beneficial bacteria. In fact, incubation of thedeveloped polymer system at pH 5 facilitated the release of glucose payload relative to the incubation at pH 8. Ultimately, when
Staphylococcus epidermidis was selected as a beneficial bacterium, the growth was selectively accelerated in the presenceof the developed polymer at pH 5, relative to the conditions at pH 8 which is suitable for the growth of bad bacteria. The
obtained results suggest that the developed polymer system potentially achieves the selective growth of beneficial bacteria
for good skin health conditions.

1．緒

言

表皮常在菌は肌表面の環境構築を司るため、その健全な育成は肌の保湿や肌荒れ防止へと直結する。実際に、荒れた肌表面での善玉菌の比率を大きくすることで、肌の保湿能力や肌荒れを改善できる 1）。これに関し、表皮常在菌は肌表面に均一に分布するわけではなく、種々の外的要因（pH や栄養物質量等）に応じて異なる集団を形成するため、善玉菌と悪玉菌の数や比率（肌常在菌フローラ）は微小領域ごとに異なると考えられる。そこで本研究では、肌表面の環境の差異に応じて最適な作用を発現する機能性分子（ア
図1

ミノ酸ベース）の開発を通じて、肌常在菌フローラの局所

皮膚付属器を有する三次元再生皮膚器官系の構築制御を通じた理想的な育成を目指す。具体的には、機能として「善玉菌環境選択的な栄養補充」が組み込まれた分子に設計することで、悪玉菌が多く存在する領域では pH 上

を開発する
（図 1）
。

昇に伴ってオリゴ糖放出が阻害される。このような方針の

肌常在菌フローラの育成には適した pH 環境と栄養補充

もとに、「善玉菌選択的な栄養補充」を可能とする高分子のが有用だと考えられる。既存の方法論で pH 調整は可能な開発を着想した。PEG を開始剤とした NCA 重合法によりものの、栄養補充においては多くがオリゴ糖を用いるため

ポリアミノ酸誘導体を作成し、側鎖改変によりオリゴ糖を善玉菌（代表的には Staphylococcus epidermidis）だけでな導入する。オリゴ糖の導入には酸性条件選択的に開裂するく悪玉菌（代表的には Staphylococcus aureus）への栄養供給

ボロン酸エステル構造を採用した。ボロン酸はジオール構が懸念される。そこで本研究では、細菌に取り込まれづら造と可逆的なエステル形成を行うが、ボロン酸エステルはい高分子にオリゴ糖が担持された構造体を着想した。ポリpH 7 以下にて速やかに加水分解し、ジオール誘導体が放エチレングリコール（PEG）を有する高分子は PEG の排除出される 3）。これに関し、常在菌の育成に有用なオリゴ糖

体積効果のために細胞に取り込まれづらい 2）。さらに、善の多くはジオール構造を含む。そのため、善玉菌育成に適玉菌が好む弱酸性 pH においてオリゴ糖が徐放されるようした pH 約 5 でオリゴ糖の放出の加速が期待される。本研究では、善玉菌の生育に適した pH 環境では栄養を補充し、The development of poly(amino acid)that recognizes microenvironment ofskin for healthy growth of skin flora

善玉菌選択的な育成を促すことで、肌表面の理想的な常在菌フローラを構築するための手法を提案する。

２．方Hiroyasu Takemoto
Laboratory for Chemistry and Life
Science, Institute of Innovative Research,
Tokyo Institute of Technology

法

2. 1. ポリアミノ酸誘導体の合成
反応手法は図 2 に従った。MeO-PEG -NH（分子量10 , 000）
2− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図２高分子の合成スキームと Lys（TFA）-NCA とを DMSO 中で混合した。反応溶液

2. 4. 高分子に基づく善玉菌の増殖促進試験

は室温にて 3 日間撹拌し、ジエチルエーテルに対して再沈

PEG -P（Lys-FPBA 49）100 に対してグルコースを 49 倍量殿を行った。得られた PEG-P（Lys-TFA）はメタノール／

混合し、Staphylococcus epidermidis を培地にて培養する

5 M NaOH aq.（4 / 1、v/v）に再溶解し、室温にて一晩撹拌際に添加した。この際、培地の pH を 5 . 0 あるいは 8 . 0 とした。0 . 01 M HCl での透析、純水での透析の後に凍結乾した。定期的に培地中の Staphylococcus epidermidis 量を燥を行い、PEG-PLys を白色粉末として得た。

600 nm の濁度にて測定した。

PEG-PLys へのボロン酸の導入は脱水縮合反応にて実施

３．結した。PEG-PLys と FPBA、DMTMM を MeOH と 50 mM
炭酸バッファーの混合溶液（1 / 1、v/v、pH 8 . 5）に溶解し、果

3. 1. ポリアミノ酸誘導体の合成

一晩撹拌した。反応溶液は 0 . 01 M HCl、純水にて透析しPEG-PLys を 1 H NMR 解析すると、その PLys 鎖由来のた後に凍結乾燥を行うことで、PEG-P［Lys（FPBA）］を白

プロトン強度から Lys 重合度は 40 のものと 100 のものの色粉末として得た。

2 種類の合成に成功した。続けて、PEG-P［Lys（FPBA）］とした後に 1 H NMR 解析すると、FPBA 由来のプロトン

2. 2. 善玉菌を育成するための糖のスクリーニング

強度より、PLys 鎖への導入率はそれぞれ 50 % であった。

Staphylococcus epidermidis を培地にて培養する際、50

これ以上 FPBA 導入率を上げると水溶性が著しく低下す

mM のグルコース、グルコサミン、スクロース、ラクトー

るため、本研究ではこの導入率を採用した。結果として、

スを添加し、Staphylococcus epidermidis の増殖を観察しPEG-P［Lys（FPBA）49 ］100 と PEG-P［Lys（FPBA）20 ］40 とのた。Staphylococcus epidermidis の培養液中の量は 600 nm

2 種類のポリアミノ酸誘導体の合成に成功した。

での濁度にて測定した。

3. 2. 善玉菌を育成するための糖のスクリーニング

2. 3. グルコース放出のpH応答性

善玉菌を増殖するのに適した糖成分を選別するために、

PEG -P（Lys-FPBA 20）40 に対して 20 倍量のグルコース

グルコース、グルコサミン、スクルース、ラクトースを添を混合し、50 mM の酢酸バッファー（pH 5 . 0）あるいはト加した際の Staphylococcus epidermidis の増殖を評価した

リスバッファー（pH 8 . 0）
に対して透析した。定期的に外液（図 3）。ここでは、Staphylococcus epidermidis の量を濁度を採取し、外液に含まれるグルコース量をグルコース定量にて測定している。糖の添加なしの系に比較して、グルコキット（BioVision）
にて測定した。

ースを添加した系では顕著に Staphylococcus epidermidis の− 142 −

常在菌フローラ育成を目指す肌表面微小環境応答性ポリアミノ酸の開発

図３

糖を添加した際のStaphylococcus epidermidisの増殖

図４ 開発したポリアミノ酸誘導体からのグルコース放出とpH応
答性増殖が促進されたことが示された。一方で、ラクトースやスクロースでは目立った増殖の促進はみられず、なおかつ
グルコサミンでは増殖の低下が確認された。このため、本研究ではポリアミノ酸誘導体に結合させる糖分子として、グルコースを選出した。

3. 3. グルコース放出のpH応答性
Staphylococcus epidermidis の増殖に適した糖としてグルコースを選定した。そこで、合成したポリアミノ酸誘導体とグルコースとを混合し、会合体調製をした後に、pH 5
および pH 8 でのグルコース放出能を評価した（図 4）。pH 8で処理した系においては、5 時間後に 25 % 程度のグルコース放出が観察されたのに対し、pH 5 で処理した系においては 33 % 程度のグルコース放出が観察された。このことから、開発した系において、善玉菌育成環境に適した pHにおいて、グルコース放出の加速が確認された。

図５ 開発したポリアミノ酸誘導体を用いた善玉菌増殖とpH応
答性

3. 4. 高分子に基づく善玉菌の増殖促進試験
善玉菌育成環境下において、開発したポリアミノ酸誘導

４．考

体がグルコースの放出を加速させることが確認されていた。

察

次に、実際に Staphylococcus epidermidis を培養する際、本研究では、善玉菌環境選択的に栄養物質を放出し、そ開発したポリアミノ酸誘導体を添加して増殖速度を評価しの育成を促進する高分子材料の開発を行った（図 1）。善玉

た。ここでは、培養する際の pH も 5 と 8 に設定した（図 5）。

菌は弱酸性環境が育成に適するため、弱酸性 pH に依存しpH 8 においては、開発したポリアミノ酸誘導体の添加にて栄養物質（糖）を放出する分子設計が必要となる。これに関わらず、2 時間後に増殖をみせたものの、それ以降は目関し、本研究ではボロン酸エステル結合に着目した。ボロ

立った増殖を誘導しなかった。一方で、pH 5 においては、

ン酸は糖の有するジオール結合とボロン酸エステル結合をpH 8 の系に比較して培養液中の Staphylococcus epidermidis

容易に形成するが、それは pH 7 以下の弱酸性環境下にての増殖が顕著であり、その増殖はポリアミノ酸誘導体の添開裂が促進される。一方で、悪玉菌環境である弱塩基性

加によってさらに加速された。特に、8 時間後では相対的

pH では糖分子の放出が抑制されるため、悪玉菌の増殖へな Staphylococcus epidermidis の数は 6 % ほど増大していは寄与しないことが期待される。高分子の合成から糖分子た。

の選定、糖分子の放出挙動の評価、善玉菌の一つである− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Staphylococcus epidermidis を用いた増殖評価等を介して、実現する可能性が示された。一方で、pH 5 において PEG-P

善玉菌フローラの育成における一つの方法論を提唱する。

［Lys（FPBA）］とグルコースとの会合体を添加していない糖分子を担持する高分子としては、ポリエチレングリコ系と比較すると、Staphylococcus epidermidis の増殖促進ール（PEG）とポリアミノ酸のブロック共重合体を選択した。

は 8 時間後で 6 % 程度であり、改善の余地が残されている。

ポリエチレングリコールは化粧品に汎用されるバイオマテ

これに関し、PEG-P［Lys（FPBA）］とグルコースとの会合

リアルであり 2）、そしてポリアミノ酸は生分解性・生体適

体の添加量や、会合体からのグルコース放出能等を最適化

4）

合性に優れる 。なかでも、ポリリシン（PLys）のようにする必要があると言える。

側鎖に反応性官能基を有するポリアミノ酸は種々の化学構

肌フローラの状況は個人によって千差万別であり、それ造を導入可能である。まず、PEG を開始剤として PEG-に応じて育成を促進するべき菌の種類・量も異なると予想

PLys を合成した。得られた PEG-PLys に対して脱水縮合される 5）。本研究では善玉菌としてStaphylococcus epidermidis

反応を介して FPBA（ボロン酸）を導入した（図 2）。FPBAを選定し、担持する糖分子としてグルコースを選択した。

は疎水性を有するが、PLys 側鎖への導入率を約 50 % に調しかしながら、本研究にて開発されたシステムでは、今回節することで、良好な水溶性を有する PEG-P［Lys（FPBA）］

スクリーニングしなかった他の糖も担持することができる。

の取得に成功した。

そのため、種々の糖分子を同時に担持し、個別の菌の育成得られた PEG-P［Lys（FPBA）］を用いて糖分子の担持体を作成する前に、善玉菌の育成を促進するための糖分子のに最適化した分子設計も可能であり、今後の展開として期待される。

選定を行った。図 3 に示すように、糖分子を処置していない群に比較してグルコースを添加した群では明らかな

謝

辞Staphylococcus epidermidis の増殖促進が観察された。そ本研究は、公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財のため、本研究ではグルコースを PEG-P［Lys（FPBA）］へ

団の 2019 年度の研究助成を受けて行ったものである。同と担持させることにした。グルコース分子とボロン酸との財団に心より感謝する。

反応性は広く知られており、すでにグルコースセンサー等への展開が行われている。そのため、FPBA とグルコースとの速やかなエステル形成反応かつ pH 依存的な脱離が期待される。

（引用文献）
1） Y. Nodake, et al., Pilot study on novel skin caremethod by augmentation with Staphylococcus

PEG-P［Lys（FPBA）］とグルコースとの会合体は、pH 8

epidermidis, an autologous skin microbe –A blindedに比較して pH 5 においてグルコース放出能が促進された

randomized clinical trial. J. Dermatol. Sci., 79, 119-126（図 4）。透析開始後 5 時間において、pH 5 では約 30 % 多（2015）．

くのグルコースが pH 8 の系に比較して放出されており、

2） K. Knop, et al., Poly（ethylene glycol）in Drug Delivery:

弱酸性 pH でのグルコース放出の促進が確認された。これ

Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angew.

に関し、放出は数十分〜数時間をかけて徐々に進行したとChem. Int. Ed., 49, 6288-6308（2010）．

推察される。実際に使用する際、数秒の時間単位でのグル

3） G. Springsteen, et al., A detailed examination of

コース放出は扱いづらいと予想されるが、比較的緩やかなboronic acid-diol complexation. Tetrahedron, 58, 5291-

グルコース放出は容易なハンドリングへ繋がると期待される。

5300（2002）．
4） K . M i y a t a , e t a l . , R a t i o n a l d e s i g n o f s m a r t

最後に、開発したPEG-P［Lys（FPBA）］とグルコースとの会

supramolecular assemblies for gene delivery: chemical

合体を用いて、善玉菌であるStaphylococcus epidermidis のchallenges in the creation of artificial viruses, Chem.

増殖を評価した。本研究の仮説通り、pH 5 にてPEG-P［LysSoc. Rev., 41, 2562-2574（2012）．

（FPBA）］とグルコースとの会合体を添加した群において最も

5） T. Iwase, et al., Staphylococcus epidermidis Esp

Staphylococcus epidermidis の増殖が促進された。このこ

inhibits Staphylococcus aureus biofilm formation andとから、弱酸性条件下でグルコース放出を促進させる高分

nasal colonization, Nature., 465, 346-349（2010）．

子を添加することで、善玉菌環境選択的なフローラ育成を− 144 −

ヒト嗅覚受容体センサーによる匂いのデジタル化を応用した
香水設計手法の確立
大阪大学産業科学研究所

立松健司

Smell sensory testing is very important in the development of a wide range of odor-related products such as cosmetics,
foods, and air fresheners. However, the accuracy of the sensory test is limited to human ability, and both of reproducibility
and throughput are low. In addition, it was difficult to share odor information across time and space. Since a perfumer needs
to memorize many odors, the training period is at least 5 years, usually 10 years, which is very costly to grow. On the other
hand, chemical odor sensors and gas chromatography are detection methods based on the structure of compounds, and it
is impossible to directly link these measurement data with the sensory test results. Our group created an olfactory receptor
sensor using cultured cells expressing all 388 subtypes of human olfactory receptors, and which was able to quantify all theodors that humans can perceive. In this study, the odor of commercially available perfume was measured and quantified by
the olfactory receptor, and the odor of perfume was quantified. In the future, this technology will be able to transform fragrance blending that relies on experiences and intuitions into evidence-based blending.

1．緒

きないような分子を匂い分子と区別して解析対象から除外

言することが不可能である。そのため従前の香り解析装置は、

近年の生活水準向上に伴い、香り関連製品は、アロマやたとえばコーヒーの香調といったようなごく限られた範囲

香粧品、芳香剤や消臭剤、食品香料などだけではなく匂い内での応用にとどまり、ヒト嗅覚の主観と結びつけること

環境関連製品を含めて大きな市場を形成している。様々なが困難であった。一方で視覚については、ヒトの赤・緑・青・製品の香り付けにおいて、適切な香調を作り出す際には、白の光を検出する 4 種類の光受容タンパク質の応答強度とこれまで官能試験が中心的な役割を果たしてきた。官能試

その位置情報に由来する情報から構成されており、視覚情験においては、「ウッディー」
や「スモーキー」
といった匂い報をヒトの光受容タンパク質と関連するわずかな数値

質を言語化して、これらの匂いの特徴を持つ“基準臭” を調（RGB ＋明度＋座標）で表現可能であり、すでに視覚は時合により設定し、各基準臭と検査対象物を嗅ぎ比べて、多空間を超えた情報伝達に成功している。映像に関係する産くの場合 6 段階の匂い強度で匂い質を評価、記録している。

業の規模は、香り関係の産業に比して巨大である。嗅覚にこのような言語表現を介在させた記録は検査者のそのときおける匂い分子の識別は、嗅覚受容体の立体構造に依存しの体調や個人差による影響を排除できず、正確な嗅覚情報ており、匂い分子をヒトの嗅覚と同様に検出するためにはの数値化、記録は困難であり、時間、空間を超えた香りの

ヒトの嗅覚受容体を用いることが最も正確である。そこで、伝達は不可能であった。また、多種多様な匂いを嗅ぎ分け

いくつかの研究グループでは、ヒトの嗅覚受容体そのものて適切な言語表現に置き換えることができる熟練した調香をセンサー素子として、匂いを数値化することを目指して師の育成には、10 年以上の教育期間がかかり、それにとおり、先行している米国デューク大学の松波らを含む多く

もなうコストも問題となる。以上のような官能試験の問題のグループは、嗅神経の細胞内シグナル伝達経路（図 1）を点を解決するために、機器分析により客観データとして香培養細胞において模倣している 1）。

りを記録することを目指して、多数の電気センサー素子を哺乳動物の嗅神経細胞は、それぞれ 1 種類の嗅覚受容体

アレイ化したもの（例：島津製作所、におい識別装置 FF-を発現している。嗅覚受容体は 7 回膜貫通型の G タンパク2020）やガスクロマトグラフィー（例：アルファ・モス、

質共役型受容体（G protein coupled receptor, GPCR）であフラッシュ GC ノーズ Heracles NEO）を用いたものが開り、嗅覚受容体サブタイプの総数は、ヒトで 388 種 2）と報発、市販されている。しかしながら、これらは化合物の構

告されている。嗅神経において嗅覚受容体が匂い分子によ造に基づく検出方法であり、原理的にヒトが嗅ぐことがでり刺激されると嗅覚受容体に特異的な Gαolf がアデニル酸シ
ク ラ ー ゼ を 活 性 化 し、 細 胞 内 の cAMP 濃 度 が 上 昇 し、Establishment of perfume design method
applying odor digitization by humanolfactory receptor sensor
Kenji Tatematsu
Department of Biomolecular Science andReaction, The Institute of Scientific andIndustrial Research (ISIR), Osaka University

CNG チャネル（cyclic nucleotide gated channel）が開き、細胞外カルシウムイオンが流入するという多段階のシグナ
ル増幅を経て最終的には活動電位を発生する。また嗅神経内のカルシウム応答以外のシグナル伝達経路では、PKA（Protein kinase A）は cAMP と結合して活性化され、転写因子 CREB（cAMP response element-binding protein）の− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図１

嗅神経の細胞内シグナル伝達経路

リン酸化を触媒し、CREB による転写が活性化されている。

レポーター遺伝子アッセイにおける弱点を解消するために、松波らをはじめとして多くの研究グループは、CREB 結合

私たちはまず嗅神経細胞内の匂いシグナル伝達経路を模倣

配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポーター

した培養細胞を作製した。この嗅神経模倣細胞は、ルシフ

を用いて、ヒト嗅覚受容体約 400 種類すべてを網羅した匂ェラーゼレポーター遺伝子アッセイに用いられているのとい分子に対する嗅覚受容体レパートリーの解析を行ってい同様の細胞にさらに CNG を発現させたものである。このる 。しかしながらルシフェラーゼレポーター遺伝子アッ細胞の培地に匂い分子を添加し、匂い分子が嗅神経模倣細セイは、レポーター遺伝子の転写と翻訳の時間が必要であ胞の発現する嗅覚受容体に結合したときは、嗅神経と同様るために様々な問題をともなう。まず、官能において重要に細胞外のカルシウムイオンが流入して細胞内カルシウムな嗅覚受容体応答の経時変化の情報は得られず匂いに対す

イオン濃度が上昇する。細胞内カルシウムイオン濃度は、る嗅覚受容体の応答強度のみの情報しか得られない上に、細胞に事前導入したカルシウムイオン蛍光指示薬で定量で後述するネガティブフィードバックによる匂いへの馴化もきるため、脳に伝わる嗅神経の情報と同義の匂い情報をリ検出できないことが弱点である。極性が小さい匂い分子種

アルタイムに蛍光輝度として検出できる。また、この細胞は多く、これらの匂い分子はレポーター遺伝子の発現を待は嗅神経と同様にカルモジュリン（Calmodulin）、ホスホ

つ間に細胞培養液から蒸散してしまう問題もある。またチ

ジエステラーゼ（Phosphodiesterase, PDE）、カルモジュリ

オールのような反応性の高い匂い分子は、数時間の培養時

ンキナーゼ II（Calmodulin kinase II, CaMK II）、カルシウ

間でも化学反応により異なる分子種へと転換されて、反応

ムイオン排出システムを持ち、嗅神経と同様に匂い分子に前と異なる嗅覚受容体が応答してしまうこともある。極性

対する応答後のネガティブフィードバックが観察される。

が小さく分子量も小さな匂い分子は、細胞膜透過性が高い

私たちの研究グループでは、この細胞に 388 種のヒト嗅覚

ために嗅覚受容体以外の細胞内シグナル伝達経路に干渉す

受容体全サブタイプを発現させて、各受容体サブタイプ発ることも考えられる。このルシフェラーゼレポーター遺伝

現細胞を 20 × 20 区画のグリッドに整列化したヒト嗅覚受子アッセイは、ウェルプレートで実施されており、各ウェ

容体発現細胞アレイを開発し 3）、ヒト嗅覚受容体センサー

ルへの細胞播種とウェルごとに異なる嗅覚受容体サブタイと命名した（図 2）。

1）プの発現プラスミドを導入する手順が必要とされるためにヒト嗅覚受容体センサーは、嗅神経細胞と同様に匂い分測定の準備が非常に煩雑であった。これらルシフェラーゼ

子添加直後から細胞が応答し、なおかつ応答の開始から収− 146 −

ヒト嗅覚受容体センサーによる匂いのデジタル化を応用した香水設計手法の確立

図２

嗅覚受容体センサーと取得されたデータ

図3

嗅覚受容体センサーによる香水の測定結果

束までは数分間であるため、ルシフェラーゼレポーター遺いて調製し、前記のスライドガラスのグリッド区画ごとに伝子アッセイに比べると匂い分子の細胞内への浸透により1 種類の嗅覚受容体発現プラスミドからなるリポプレック

惹き起こされる偽陽性や偽陰性、匂い分子の蒸発や変性のスを印刷した。このスライドガラスに嗅神経模倣細胞を播影響は低減されており、なおかつヒト嗅覚受容体レパート

種し 10 %（v/v）ウシ胎児血清を含む Dulbeccoʼs Modified

リーをハイスループットに解析することを可能としている。

Eagle Medium で培養し、スライドガラス上のリポプレッ

また、匂い応答の時間軸の情報が得られるため、匂いの刺

クスをエンドサイトーシスにより細胞へ導入し、ヒト嗅覚

激性や余韻といった官能との関連付けにおいて重要なデー受容体を細胞に発現させてヒト嗅覚受容体センサーとした。

タが得られることも期待されている。ヒト嗅覚受容体センサーのこれらの特性により、これまでにない切り口で匂い2. 2. ヒト嗅覚受容体センサーによる香水の測定。

関連製品・サービスを提供できる。そこで本研究では市販

リ ン ゲ ル 液［140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 ,香水の匂いをヒト嗅覚受容体センサーにより測定して、香1 mM MgCl 2 , 50 mM HEPES（pH 7 . 2），1 mM ピルビン酸

水に応答する嗅覚受容体を明らかにし、香水の調香に資す

ナトリウム］でスライドガラス上の細胞を洗浄した後、細ることを目指した。

胞内のカルシウムイオン濃度の変動を測定するためにカル

２．方シウムイオンの蛍光指示薬 Calbryte 520（AAT Bioquest）

法

を溶解したリンゲル液でスライドガラスを 30 分間インキュ

2. 1. ヒト嗅覚受容体センサーの作製

ベーションした。その後リンゲル液を 3 分間、50 分の 1

スライドガラス上に 20 × 20 区画のグリッドを疎水性イに希釈した香水ポールスミス エクストリーム メン オード

ン ク で 形 成 し た。 次 に Lipofectamine（Thermo Fisher

トワレを 2 分間、リンゲル液を 5 分間スライドガラスに灌Scientific）とヒト嗅覚受容体発現プラスミドからなるリポ

流し、灌流中のヒト嗅覚受容体センサーの蛍光を蛍光顕微

プレックスをヒト嗅覚受容体の全サブタイプ 388 種類につ鏡により 1 . 5 秒間隔で撮影した。

− 147 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

３．結では、同じ嗅覚受容体を持つ複数の嗅神経の嗅覚受容体応

果

答の情報は、糸球体により束ねられてから大脳に伝達され香水溶液灌流前の蛍光強度を 100 %（F 0）としたときの灌るが、私たちのヒト嗅覚受容体センサーは、一つ一つの嗅流時の最大蛍光強度時の蛍光強度（F）の変化率（ΔF/F 0）を神経模倣細胞の応答を画像として記録はしているが、各細疑似カラーで示す（図 3 A）
。香水に応答した嗅覚受容体の胞の応答を束ねるような数値化は行っていない。今後、画

サ ブ タ イ プ は、OR 2 W 1、OR 1 A 1、OR 5 P 3 で あ っ た。

像処理を工夫することにより、画像の中でノイズに埋もれ

図 3 B に応答した嗅覚受容体の蛍光強度変化率をグラフでているかもしれない多数の嗅神経模倣細胞の応答を検出す示した。応答したすべての嗅覚受容体において、香水灌流ることが課題として考えられる。

直後から蛍光輝度の上昇がみられた。また、OR 2 W 1 と香水は、速度の異なる多数の香料から構成されており、OR 5 P 3 は香水を除いた後 4 分以内に香水添加前の蛍光強その香調は蒸発開始から時間の短い順にトップノート、ミ度に復帰したのに対して、OR 1 A 1 は香水を除いた後も 5

ドルノート、ラストノートと呼称される。香水は、時間の分間以上経過しても香水添加前の蛍光強度に復帰せず、嗅経過にともない様々な香調を楽しめるように匂い分子種ご

覚受容体ごとに細胞内のカルシウムイオン濃度の経時変化とに異なる蒸発速度を考慮に入れて様々な匂い分子を組みが異なる結果となった。

合わせて設計されている。今回の本香水の測定では、香水

４．考に含まれる全ての匂い分子を同時に測定しているが、香水察の分留を行うことによりトップノート、ミドルノート、ラOR 2 W 1 と OR 1 A 1 は、1- へプタノン、1 -オクタンチオ

ストノートを分けて測定することが可能となるであろう。

ール、β -シトロネロールなど、幅広い官能基を持つ匂い

また分留により香水のアルコール濃度を下げることにより、分子に応答し 、匂い分子としては比較的長い炭素鎖の部

より希釈率の低い高濃度な香水をヒト嗅覚受容体センサー

分で匂い分子を認識しているかもしれない。両嗅覚受容体で測定できるかもしれない。

4）

共に今回測定した香水（以下、本香水）に含まれるリナロー
ルやシトロネロールに応答した可能性は高い。OR 5 P 3 は、

現在、嗅覚受容体の細胞内シグナル伝達経路に介入して、ネガティブフィードバック経路を抑制することにより、匂クマリンに応答することが報告されており 、本香水にもい分子に対する感度を上昇することを試みている。これまクマリンが含まれているためこれを検出した可能性が高い。

でのところ PDE 阻害剤の IBMX や CaMK II 阻害剤 KN- 62

また OR 5 P 3 は、1 - オクタノールのような長い炭素鎖を持を 用 い る こ と に よ り（ 図 1）
、 ヒ ト の 嗅 覚 検 知 閾 値 が、つ匂い分子を応答し、嗅覚受容体をその応答する匂い分子

78 ppt であるところ 7）、ヒト嗅覚受容体センサーで 4 L 空の構造をもとにしてクラスタリングすると OR 5 P 3 は、気中の濃度 10 ppt のイソ吉草酸に対する嗅覚受容体応答のOR 2 W 1 や OR 1 A 1 と相関が高いことが示されており 5）、検出に成功している 8）。香水の測定にもこれら阻害剤を用

これらの嗅覚受容体は共通の匂い分子に応答している可能いることにより、より多くの嗅覚受容体応答を検出できる性がある。

はずである。

4）

今回の測定では、３種類の嗅覚受容体の応答が検出され５．総たが、本香水の成分表示では 12 種以上の純品香料が含ま括れていることが示されており、香調の複雑さからもこの香

嗅覚受容体センサーによる香水の測定により、香水設計

水を嗅いだときのヒトの嗅覚では、より多くの嗅覚受容体（調香）のリバースエンジニアリングや測定データに基づくが応答していると思われる。本来応答すべき嗅覚受容体の理論的な香水調香の可能性を示すことができた。

応答を今回検出できなかった原因としては、まず香水の成分が挙げられる。本香水を 50 分の 1 に希釈してから測定（引用文献）

しているものの嗅覚受容体への香水主成分であるアルコー

1） Mainland J. D., Li Y. R., Zhou T., Liu W. L. L.,ルの干渉は否定できない。また、本香水に含まれるゲラニ

Matsunami H. Human olfactory receptor responses to

オールは、それ自体が匂いを持つが同時に CNG 阻害能も

odorants. Sci. Data, 2, 150002, 20156）あわせ持つことが報告されており 、ヒト嗅覚受容体セン2） Niimura Y., Nei M. Evolution of olfactory receptor

サーの感度を下げて、その結果として応答の検出に成功で

genes in the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci.

きた嗅覚受容体の種類が減少した可能性がある。他の原因

U.S.A, 100, 12235-40, 2003

としては細胞の構造や神経回路の有無の違いが挙げられる。
嗅神経には複数の線毛があり、ここに多数の嗅覚受容体分3） 黒田俊一

匂いの定量方法、それに用いる細胞及びその細胞の製造方法。特願 2019-536790

子が局在しているが、嗅神経模倣細胞は線毛を持たないた

4） Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H.,

めに表面積は嗅覚受容体に比べて小さい。嗅覚の神経回路

Mainland, J. D. Odor Coding by a Mammalian Receptor− 148 −

ヒト嗅覚受容体センサーによる匂いのデジタル化を応用した香水設計手法の確立

Gen. Physiol. 133, 583-601, 2008

Repertoire. Sci. Signal. 2, ra9-ra9, 20095） Audouze K., Tromelin A., Le Bon A. M., Belloir C.,
Petersen R. K., Kristiansen K., Brunak S., Taboureau O.

7） 永田好男

三転比較式臭袋法による臭気物質の閾値測定結果。日本環境センター所報 17, 77-89, 1990

Identification of odorant-receptor interactions by global

8） Lian Y., Tatematsu K., Sakai H., Sato S., Kuroda S.

mapping of the human odorome. PLoS One. e9 3 0 3 7.

Improving the sensitivity of odor molecule detection in2014

olfactory receptor-expressing cells. 日 本 農 芸 化 学 会

6） Takeuchi H., Ishida H., Hikichi S., Kurahashi. T.

2021 年度大会

Mechanism of olfactory masking in the sensory cilia. J.

− 149 −

高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明
城西大学薬学部

徳留

嘉寛

Skin administration is a simple method of therapeutic and cosmetic application. However, the protective barrier provided by the skin makes it challenging to achieve delivery of high molecular weight compounds. Efforts to improve the penetration of hyaluronic acid (HA) have yielded nanoparticulate polyion complexes of HA with poly-L-lysine (HANP), which
act as vehicles for delivering HA deeper into the skin. However, the mechanism for this effect and the response of HANP to
the skin environment have not been explored. In this study, the penetration of HANP in skin is compared with that of HA,
and differences in the pathways are identified. In addition, the properties of the particles in a simulated skin environment areassessed and HANP are found to show morphological changes in response to ions. These findings are expected to pave theway for future transdermal delivery of other high molecular weight ionic compounds such as proteins.

1．緒

製剤は調製の段階で凍結乾燥を行う必要があり、薬物の変言性が懸念される。

皮膚を介する物質の皮膚透過は、投与の簡便さや中断の本研究では調製が容易であり、有機溶媒や界面活性剤を容易さ、肝初回通過効果の回避が可能であるといった点か使用せずにナノ粒子を形成できる Polyion complex（PIC）

ら注目されている。しかし、皮膚の最外層に存在する角層技術に着目した。PIC は反対に帯電した高分子電解質間のは、物質の透過に対してバリア機能を有しており、経皮吸

強い静電的相互作用により、互いの電荷を打ち消し合って

収における最大の障壁となっている。一般的に受動拡散で形成される集合体であり 9 , 10）、生体適合性の高い試薬を用

皮膚を透過できる物質は分子量が 500 Da 以下で、比較的いることで安全性の高いナノ粒子の調製が可能であると考

脂溶性の高い化合物とされている

1 , 2）。難皮膚浸透性化合物の浸透を向上させるために経皮吸収促進技術が多くの研えられている。また、水に溶解した化合物を加工せずに用いるため、温度による変性等を考慮する必要がない。

究者により盛んに研究されている。経皮吸収促進技術は物PIC を用いた以前の研究で我々は、アニオン性化合物に理的促進法と化学的促進法に大別される。物理的促進法と

HA を用いて Hyaluronic acid nano particle（HANP）を調

3）

4）

等

製することで、HA の皮膚浸透性が向上したことを報告しの技術が高分子化合物の皮膚浸透性を向上させるための研ている 11）。HA は分子量が約数百万の水溶性高分子である究として報告されている。しかし、これらにはわずかに皮ため、一般的には受動拡散での皮膚内への浸透は困難であ膚を損傷させる、あるいは特別な機械を用いるため利便性ると考えられていた。皮膚の水分・弾力性維持に重要なはに欠けるといった問題点がある。一方、化学的促進法としたらきを担っている HA の皮膚浸透性を向上させた HANP

しては、マイクロニードル 、イオントフォレーシス

5）

6）て、良く知られているエタノール やℓ-メントール 等がは、シワやたるみの改善といった皮膚機能改善効果が期待報告されている。しかしこれらは、比較的低分子化合物のされる。しかし、HANP が皮膚をどのような経路を介し応用に限られ、高分子化合物には効果が高くない。その他、て通過しているのか、粒子の形態を保ったまま皮膚に浸透

最近は溶媒としてイオン液体を用いる手法 7）等も報告されしているのかといった具体的な浸透のメカニズムはいまだている。特に高分子化合物の皮膚浸透性の向上は多くの研解明されていない。

究者にとって大きな課題である。九州大学の後藤先生らの本研究課題では、アニオン性化合物に HA、カチオン性グループでは、非侵襲的に化合物を皮膚内に浸透させるた化 合 物 に Poly-L-lysine hydrochloride（PLL）を 用 い てめ、水溶性薬物をナノコーティングし油状基材中に分散さ

HANP を調製し、この粒子を用いて高分子水溶性ナノ粒

8）

せる Oil-in-solid 製剤 が研究されている。しかし、S/O

子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メ
カニズムの解明を目的に検討を行った。

The skin penetration mechanism of highmolecular weight compounds based ont he s k i n p e net r at io n b eh av ior of
hyaluronic acid nanoparticles
Yoshihiro Tokudome, Ph.D.
Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Josai University

２．方法

2. 1. 実験材料
ヒアルロン酸ナトリウム（FCH- 120 , M.W. 1 , 200 kDa,
純度：99 . 9 %）はキッコーマンバイオケミファ（東京、日本）を用いた。ポリリジン（PLL）、アセトアルデヒド、シクロ− 150 −

高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明

ヘキシルイソシアニド、コレステロール、パルミチン酸、を HPLC で定量した。

コレステロール硫酸はシグマ製（St. Louis, MO, USA）のも

上清中の HA は、YMC-Pack Diol- 300 カラム（300 × 8 . 0のを使った。5 -アミノフルオレセイン、ケラチンは東京

mm, S- 5 µm, 30 nm）を用いたHPLCによって確認した。移動化成工業（東京、日本）から購入した。ジパルミトイルフォ

相は 10 mM 酢酸アンモニウム：メタノール＝8：2、流速は 1 mL/

スファチジルコリンは日本精化（兵庫、日本）から供与されminに設定した。注入量は 50 µLとし、210 nmの波長で紫外たものを用いた。その他溶媒は、富士フィルム和光純薬工

線検出を行った。

業（大阪、日本）
から購入した。その他の試薬は特級グレー
ド以上のものを精製せずに用いた。

2. 6. HAのケラチンへの吸着性の評価

2. 2. 蛍光標識ヒアルロン酸の調製

1 mL 添加し、24 時間撹拌した。0 . 45 µm のフィルタでケ

ケラチンパウダーに HA 水溶液、または HANP 水溶液をFluorescence-labeled HA（FL-HA）は、アルデヒド、アミン、イソシアニド、カルボン酸の 4 成分縮合反応で調製

ラチンパウダーを濾過し、（リン脂質リポソーム）と同様の条件でろ液中の HA を定量した。

した 12）。調製した HL-HA 中に未反応の 5 -FL の混入を除た。FL-HA 溶液を凍結乾燥し、FL-HA 粉末とした。

2. 7. 角層細胞間脂質リポソーム（SCLL）への吸着性の評価

2. 3. ヒアルロン酸ナノ粒子の調製

ル（25 %）、パルミチン酸（25 %）、コレステロール硫酸（10 %）

くためにセルロースチューブを用いて 24 時間透析を行っクロロホルムに溶解したセラミド（40 %）、コレステロー
1 mM の FL-HA 水溶液と 0 . 1 mM の PLL 水溶液を FL-を混合し、溶媒を減圧留去して薄膜を作製した。精製水でHA：PLL ＝ 1：2 となるように混合し、室温で 15 分間撹

水和後、超遠心機により、289 , 000 ×g、4 ℃の条件で 15 分

拌することで FL-HANP を得た。また、0 . 1 mM の HA 水

間遠心分離した。得られた沈殿に精製水を 1 mL 加えて再溶液と 0 . 1 mM の PLL 水溶液を HA：PLL ＝ 1：1 となるよ

分散したものを SCLL とした。SCLL 分散液と HA 水溶液

うに混合して HANP を得た。

または HANP 水溶液が 1：19 の比率になるように混合し、

2. 4. In vitro 皮膚浸透性試験

分離し、上清の HA を HPLC で定量した。

24 時間撹拌した。289 , 000 ×g、4 ℃の条件で 15 分間遠心
動物の取り扱いは城西大学動物実験管理委員会により承ウスは、株式会社星野試験動物飼育所（茨城、日本）から購

2. 8. 全反射型フーリエ変換赤外分光法による角層細胞間脂質の流動性の評価

入した。マウスから採取した全層皮膚と、採取後にテープ

ヘ ア レ ス マ ウ ス の 全 層 皮 膚 を 採 取 し、 精 製 水、0 . 05

ストリッピングによって角層を除去した角層除去皮膚を使

mM HA 水溶液、0 . 05 mM PLL 水溶液、HANP 水溶液、認された方法に従って実施した。6 週齢の雄性ヘアレスマ

2用した。縦型フランツ拡散セル（有効透過面積：1 . 77 cm ）FL-HANP 水溶液に 1、6、24 時間浸漬させ、FTIR で測定に表皮側を上にして皮膚を装着した。レシーバ側を 5 mLを行った（測定条件；積算回数：40、分解能：0 . 9 cm- 1、の精製水で満たし、ドナー側に FL-HA 水溶液または FL-

測定温度：32 ℃）。

HANP 水溶液を 1 mL 適用した。セルの温度は 32 ℃に保ち、
24 時間皮膚浸透性試験を行った。24 時間後に、角層除去

2. 9. HANPの形態観察

皮膚と全層皮膚からそれぞれ凍結切片を作製し、蛍光顕微

HANP の形態を 2 % リンタングステン酸溶液によるネガ

鏡で皮膚中の蛍光を観察した。さらに全層皮膚からは角層

ティブ染色を用いて、透過型電子顕微鏡（Transmissionを剥離し、顕微鏡で角層の表面を観察した。

Electron Microscope：TEM）（JEM- 1 4 0 0 Plus、JEOL Ltd.、
東京、日本）で観察した。また、PBS を最終濃度が 150 mM

2. 5. リン脂質リポソームへの吸着性の評価となるように添加した HANP の形態を TEM により観察しDipalmitoyl phosphatidylcholine（DPPC）をクロロホルた。

ムに溶解し、溶媒を留去することで薄膜を作製した。精製
水で水和後、凍結融解後、超遠心機により、289 , 000 ×g、4 ℃の条件で 15 分間遠心分離した。得られた沈殿に精製

2. 10. 統計分析
全てのデータは少なくとも 3 回の独立した結果からの平水を 1 mL 加えて再分散させたものをリン脂質リポソーム

均±標準偏差（SD）とした。Student’s t-test、Dunnett’sとした。リン脂質リポソームと HA 水溶液または HANP 水

test で統計処理を行った。

溶液が 1：19 の比率になるように混合し、24 時間撹拌した。
289 , 000 ×g、4 ˚C の条件で 15 分間遠心分離し、上清の HA− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

３．結性を調査した。FL-HA 適用群では皮膚表面に FL-HA 由

果

来の蛍光が観察された。FL-HANP 適用群では非粒子の3. 1. ヒアルロン酸ナノ粒子の調製

HA よりも皮膚深部への FL-HA の浸透が観察された。こFL-HA と PLL から FL-HANP を、HA と PLL から HANPを調製した。FL-HANP は粒子径が 242 . 5 ± 22 . 7 nm、PDIの結果より、HA を粒子化することによる皮膚への浸透性の向上が示された（Fig. 1 a, b, c and d）。

が 0 . 58 ± 0 . 10、ゼータ電位が−49 . 8 ± 3 . 9 mV のナノ粒子

また、全層皮膚に FL-HA 水溶液または FL-HANP 水溶であった。HANP は粒子径が 92 . 2 ± 7 . 8 nm、PDI が 0 . 20液を適用し、皮膚浸透性試験を行ったところ、FL-HANP± 0 . 03、ゼータ電位が−29 . 5 ± 2 . 6 mV のナノ粒子であっ

適用群で角層に強い蛍光が確認された。しかし、角層以下

た（Table 1）。

への FL-HA の浸透は見られなかった（Fig. 1 e, f, g and h）。
皮膚表面から角層を剥離し、表面を観察したところ、

3. 2. In vitro皮膚浸透性試験

FL-HA 適用群では角質細胞に、FL-HANP 適用群では角角層除去皮膚を用いて FL-HA、FL-HANP の皮膚浸透
Table 1
SampleFL-HANP
HANP

Fig. 1層細胞間脂質に FL-HA 由来の蛍光が観察された（Fig. 2）。

Physical properties of HANP and FL-HANP

Particle diameter（nm）
242.5 ± 22.7
92.2 ± 7.8

PDI0.58 ± 0.10
0.20 ± 0.03

Zeta potential（mV）− 49.8 ± 3.9− 29.5 ± 2.6

Cross-sectional fluorescence image of hairless mouse skin.

（a）Stripped skin, fluorescence image, HA application,（b）Stripped skin, bright field image, HA application,（c）Stripped skin, fluorescence image, HANP application,（d）Stripped skin, bright field image, HANP application,（e）Full thickness skin, fluorescence image, HA application,（f）Full thickness skin, bright field image, HA application,（g）Full thickness skin, fluorescence image, HANP application,（h）Full thickness skin, bright field image, HANP
application. Scale bars indicate 50 µm.

Fig. 2 Skin surface fluorescence image of hairless mouse.
（a）Fluorescence image, HA application.（b）Fluorescence
image, HANP application. Scale bars indicate 50 µm.

− 152 −

高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明

これらの結果より、HA は細胞内経路、HANP は細胞間経

は HA よりも有意に高い吸着率を示した（Fig. 3 a）
。したが路を通って皮膚に浸透している可能性が示された。HA をって、HANP は生体膜と強く相互作用する可能性がある

ナノ粒子化することで、透過経路が変化する可能性が示さことが想定された。
次に角質細胞の主成分であるケラチンを用いて HA と角れた。

質細胞の相互作用を調査した。HA は HANP よりも有意に

3. 3. HANPの皮膚構成物の吸着性（in vitroでの検討）

高い吸着率を示した（Fig. 3 b）。したがって、HA は HANP

角層除去皮膚を用いた皮膚浸透性試験の結果より、FL-

最後に SCLL との吸着を確認した。HANP は HA よりも

HANP 適用群で FL-HA の皮膚深部までの浸透が確認され有意に高い吸着率を示した（Fig. 3 c）。したがって、HANP

た。HA をナノ粒子化することで生体膜との相互作用が変は角層細胞間脂質と強く相互作用する可能性があることが化する可能性がある。ここでは、生体膜のモデルとしてリ想定された。

と比較して角質細胞と強く相互作用する可能性がある。

ン脂質リポソームとの吸着を、角質細胞のモデルとしてケ
ラチンとの吸着を、また、角層細胞間脂質のモデルとして、

3. 4. ATR-FTIRを用いた検討
2850 cm- 1 付近に現れる CH 2 対称伸縮振動、2920 cm- 1

角層細胞間脂質から構成したリポソーム（SCLL）との吸着を確認した。

付近に現れる CH 2 逆対称伸縮振動由来のピークが高波数

生体膜の代替としてリン脂質リポソームを用いることで、
HANP と生体膜の間で起こる相互作用を推察した。HANP側へシフトすることで脂質の流動性が上昇することが知られているが、全ての群において、ピークの高波数側への有Fig. 3 Adsorption of HANP and HA on（a）phospholipid liposomes,（b）keratin, or（c）SC lipid
liposomes. Values represent the mean and standard deviation（SD）of three independent results.
Statistical processing was performed using Student’ s t-test. *p < 0 . 05 ; **p < 0 . 01; *** p < 0 . 001.
Table 2 Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy(ATR-FTIR) measurements of CH symmetric (a) and asymmetric (b)stretching vibrations in the stratum corneum after 1, 6 , and 24 h.
（a）

（b）

ControlDistilled water
HA
PLL
HANP
FL-HANP1h
2850.1 ± 0.1
2850.0 ± 0.0
2849.8 ± 0.2
2849.8 ± 0.0
2849.9 ± 0.1
2850.1 ± 0.26h2849.9 ± 0.1
2849.8 ± 0.0
2850.1 ± 0.1
2849.8 ± 0.1
2849.9 ± 0.1
2849.8 ± 0.1

24 h2849.9 ± 0.2
2849.8 ± 0.2
2849.9 ± 0.1
2849.8 ± 0.0
2849.8 ± 0.0
2849.9 ± 0.1

ControlDistilled water
HA
PLL
HANP
FL-HANP1h2917.6 ± 0.3
2917.4 ± 0.2
2917.3 ± 0.2
2917.3 ± 0.2
2917.3 ± 0.2
2917.8 ± 0.3

6h2917.6 ± 0.1
2917.4 ± 0.1
2918.0 ± 0.3
2917.5 ± 0.0
2917.5 ± 0.4
2917.6 ± 0.2

24 h2917.3 ± 0.2
2917.6 ± 0.4
2917.7 ± 0.2
2917.6 ± 0.1
2917.8 ± 0.6
2918.0 ± 0.1

Samples: Control (stratum corneum only), Distilled water (vehicle), HA(hyaluronic acid), PLL (poly L-lysine), HANP (hyaluronic acid nanoparticle),
FL-HANP (fluorescently labeled HANP). Values represent the mean andstandard deviation (SD) of three independent results.

− 153 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

イオン存在下では形態の変化が観察された（Fig. 4 c, d）。

意なシフトは見られなかった（Table 2）。

物性値も大きく変化した（Fig. 5）。

3. 5. TEMによるHANPの形態観察

４．考

皮膚に適用された HANP は、ナノ粒子の形態を保った

察

まま皮膚に浸透しているのか、結合がほどけて HA として本研究課題では、ヒアルロン酸ナノ粒子を用いて高分子

皮膚に浸透しているのかを調査するため、HANP に PBS

水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物を 添 加 し た。PBS の 最 終 濃 度 が 150 mM と な る よ う にの皮膚浸透メカニズムの解明を目的に検討を行った。

HANP に添加することで、皮膚に接触した後の HANP の形態を推測した。

1 mM の FL-HA と 0 . 1 mM の PLL を 1：2 の比率で混合して調製した FL-HANP をヘアレスマウスの角層除去皮膚

HANP は粒子径 200 nm ほどの球形の粒子であり（Fig.

に適用し、24 時間皮膚浸透性試験を行った。FL-HA 適用

4）、時間が経過しても変化しなかった（Fig. 4 a, b）。共存

群と比較し、FL-HANP 適用群で皮膚深部への FL-HA のFig. 4 Observation of HANP morphology by transmission electron
microscopy（TEM）（a）HANP and distilled water,（b）HANP and PBS（final concentration:
15 0 mM），（c）HANP and distilled water（enlarged view），（d）HANPand PBS（final concentration: 15 0 mM）（enlarged view）．Scale bar
indicates 200 nm.

Fig. 5 Particle diameter, PDI, and zeta potential of HANP and HANP on addition of PBS（final
concentration of 150 mM）．
（a）Particle diameter,（b）PDI,（c）zeta potential. Values represent the mean and standard deviation（SD）
of three independent results.

− 154 −

高分子水溶性ナノ粒子の皮膚浸透挙動を題材とした高分子化合物の皮膚浸透メカニズムの解明

浸透が確認された。この結果から、一般的に皮膚への浸透動由来のピークとされる。これらのピークの高波数側へのが困難であるとされている水溶性高分子化合物の HA をナ

シフトは、トランス配座からゴーシュ配座への立体配座のノ粒子化することで、皮膚への浸透性が改善されることが変化を表しており、ゴーシュ配座が増加することで脂質の示唆された。

充填効率が低下する。つまり、赤外吸収の波数は脂質の流次いで、角層を除去した皮膚への HA または HANP の浸動性上昇に伴い高波数側にシフトする。Control 群と比較

透メカニズムを解明することとした。角層除去皮膚の表面

して HANP、HANP の構成成分である HA、PLL 等の全サは、生細胞の細胞膜であると考えられるため、リン脂質リ

ンプルで、ピークの高波数側への有意なシフトは確認されポソームを用いた疑似的な生細胞膜への吸着性を調査した。

なかった（Table 2）。すなわち、角層流動性に大きな変化

HA 群と比較して、HANP 群でリン脂質リポソームへの吸はなかったことから、HANP は脂質の流動性を乱して皮着性が有意に高かった（Fig. 3 a）
。この結果は角層除去皮膚に浸透している可能性は低く、従来の浸透促進技術より膚を用いた皮膚浸透性試験により得られた切片画像と似たも皮膚バリア機能に対し大きな影響を与えないと考えられ傾向を示しており、非粒子の HA よりも HANP の皮膚浸透る。

性が高いことを支持する結果となった。このことから、

最後に、皮膚に適用した後の HANP は、粒子化したま

HANP は生体膜へのより強い相互作用によって皮膚浸透

ま皮膚に浸透しているのか、もしくは結合が崩壊して HA性が高まると考えられる。

と PLL 単体として浸透しているのかを調査するために、

皮膚浸透性試験後の全層皮膚から角層を剥離し、皮膚表

HANP に PBS を加えることで生体に接触したときと同条面から蛍光顕微鏡で観察すると、FL-HA 適用群では角質件（PBS 150 mM）を想定し、物性値を測定した。PBS を加細胞に、FL-HANP 適用群では角層細胞間脂質に蛍光が確えることで粒子径と PDI は増大、ゼータ電位の絶対値は減認された（Fig. 2）。このことから、HA と HANP では角層

少した（Fig. 5）。また、TEM 画像においても、PBS を加を通過する経路が異なる可能性を考え、角質細胞および角えることで HANP の形態が変化した（Fig. 4）ことから、層細胞間脂質に対して、それぞれがどのような相互作用を

HANP は共存イオンの影響によって崩壊した可能性があしているのかを調査することとした。まず、角質細胞の主る。この現象はイオンによって PIC の静電相互作用が乱れ成分であるケラチンへの吸着性から、HA または HANP とることが原因で誘発されると考えられるため、HANP を

角質細胞の相互作用を調査したところ、HA 群でケラチン皮膚に適用した際に、皮膚中のイオンと反応して同様の現への吸着性が有意に高かった（Fig. 3 b）
。また、角層細胞象が起こると推測した。このことから、皮膚浸透後に間脂質と組成が類似している SCLL への吸着性から、HA

HANP は崩壊し、皮膚中で HA 単体として水分・弾力性維または HANP と角層細胞間脂質の相互作用を調査したと持の機能を果たすことが期待できる。HANP としての生ころ、HANP 群で有意に SCLL への吸着性が高かった（Fig.

体に対する安全性はいまだ不明であるため、粒子としての3 c）。これらの結果は、Fig. 2（角層表面の顕微鏡画像）の形態を保ったまま皮膚に浸透するよりも、皮膚中で崩壊し画像を支持する傾向を示していた。水溶性高分子であるて非粒子の HA となることで安全性が高まると考えられる。

HA は角質細胞への吸着性が高いため皮膚深部まで浸透せ

しかし、HANP は角層に接触した際に皮膚表面で崩壊す

ずに表面で留まり、HANP は小さな粒子を形成している

るのか、角層に浸透した後に皮膚中で崩壊するのかは定か

ほか、細胞間脂質への吸着性が高いことで細胞間脂質を介ではない。前述のように HANP の崩壊にはイオンが大きして皮膚に浸透することが示唆された。角質細胞を介するく影響すると考えられることから、よりイオン強度の高い

細胞内経路は少なくとも細胞膜を 2 回透過する必要がある。

ところで崩壊する可能性が高い。これらのことから、

また、細胞間脂質の表面積を考慮すると細胞間経路を介す

HANP は皮膚適用直後に崩壊するのではなく、皮膚に浸る浸透の方が有利である。そのため、ナノ粒子化をするこ

透する過程で徐々に崩壊することが予想されるが、引き続とによって、より浸透が有利な経路を介して水溶性高分子き調査が必要である。また、PLL の挙動についてもいまだ化合物を皮膚に浸透させることができる可能性が示された。

不明な点があるため、HANP として皮膚に適用した後のまた、リン脂質リポソームへの吸着性の結果から、HANP

PLL の局在を引き続き調査する必要がある。

は角層を通過した後に、生細胞膜に対して高い吸着性を示

以上の本研究課題結果から、水溶性高分子をナノ粒子化

すことが考えられる。よって、PIC 技術によるナノ粒子は、することで皮膚浸透経路が異なることで高分子の皮膚浸透

非粒子の化合物と比較して、角層を通過した後により皮膚性を向上させた可能性があることがわかった。

深部まで浸透する可能性が示された（Fig. 3 a）。
HANP 適用後の角層の流動性を ATR-FTIR で調査した。 （引用文献）
角層に特異的に検出される 2850 cm- 1、2920 cm- 1 付近のピ

1） Bos J.D., Meinardi M.M., The 500 Dalton rule for the

ークは、それぞれ CH 2 対称伸縮振動、CH 2 逆対称伸縮振skin penetration of chemical compounds and drugs,− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

7） Zakrewsky M., Lovejoy K.S,, Kern T.L., Miller T.E.,

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− 156 −

有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用
岡山理科大学大学院理学研究科臨床生命科学専攻

中村元直

G-protein coupled receptors (GPCRs) are pivotal targets in medical and pharmaceutical research fields because a wide
variety of disease-related processes are critically controlled by the signal transduction mediated by these receptors.  Type 2
better taste receptors (TAS2Rs) comprise a large family of GPCRs with 25 distinct isoforms encoded in the human genome.  
Recent studies have shown that TAS2Rs are not only expressed in the taste buds of the tongue, but also in the skin.  In thepresent study, we showed the functional expression of all human TAS2Rs in the human keratinocytes.  Interestingly, theseTAS2R proteins are not localized on the plasma membrane, mainly detected in the cytoplasmic regions in the immune-fluorescent staining experiments of the keratinocytes.  The expressions of TAS2Rs in these cells were enhanced by the stimulation with bitter compounds, such as denatonium, diphenhydramine and saccharine.  Furthermore, the stimulation of bitter
compounds further increased the expression of three ABC-transporters, ABC-B1, ABC-C1 and ABC-G2, which are involving in the multidrug-resistance of various cancer cells.  These results raise the possibility that the activation of TAS2Rs by
the bitter compounds enhances the exclusion of these substances from the keratinocytes through the ABC-transporters.  Theanalyses of the signaling pathway evoked by the TAS2Rs revealed the coupling of these receptors with Gαi and/or Gα12/13,
followed by the activation of NF-κB.  Together, these results suggest that the keratinocytes possess TAS2Rs in the cytoplasmic organelles, and recognize the infiltrated substances, including bitter compounds, resulting in the activation of the
ABC-transporters, such as ABC-B1, ABC-C1 and ABC-G2, to exclude the substances.

1．緒に塗布することで排除機構を作動させ、蓄積有害物の排除

言を促進することで皮膚炎悪化を回避させることができるか

ヒトは自然界で生きる限り様々な有害物に触れる。生命をも脅かすこうした異物は 2 つに分類される。1 つはウイもしれない。こうした奇抜な発想を実現化するために基盤的な知見を積み上げるのが本課題の目的である。

ルスや細菌などの病原微生物であり、もう 1 つは有害化合２．方物である（図 1）。ヒトは前者に対しては免疫防御システムで対抗する。しかし後者に対しては、苦味感覚による拒絶法

2. 1. 苦味受容体の皮膚組織、細胞株での発現解析

反応こそあるものの、皮膚などに侵入した有害物を感知し、ヒトケラチノサイト（−/＋分化）、および、ヒト表皮角排出する機構については十分解明されていない。我々は、化細胞株である HaCaT 細胞での 25 種類の苦味受容体遺伝

苦味受容体が有害物排除に深く関わると予測している。即子の発現確認は、これら細胞より RNA を調製して cDNA

ち、皮膚に発現する苦味受容体は、細胞内に侵入した有害を合成後、これを鋳型とした RT-PCR 法で行った。なお、物をリガンドとして感受して活性化され、排除機構発動シ

ヒトケラチノサイトの分化誘導は、1 mM 塩化カルシウム

グナルを惹起することで有害物を細胞外に排出するという添加下での３日間培養で行った。

仮説である（図 2）。ところで、ヒト苦味受容体遺伝子には多様性があり、個々人で若干の配列差異が存在する。この2. 2. ヒト皮膚組織での苦味受容体タンパクの発現解

配列多様性は異物排除能の個人差に直結する。ある苦味受析

容体が皮膚細胞内に侵入した炎症原因物質を感受できない

ヒト皮膚組織切片を用いた苦味受容体タンパク（25 種類

配列の場合、当該物質を細胞外に排除できず、蓄積してしのうち、TAS 2 R 14 と TAS 2 R 38 を解析）の発現解析は、まうことで皮膚に悪影響を及ぼすであろう。これが有害物

市販の抗 TAS 2 R 14 抗体と抗 TAS 2 R 38 抗体を用いて行侵入に起因する皮膚炎の個人差と考える。こうした人のたった。本解析は、東京大学医学部皮膚科の住田隼一医師にめには無害な苦味受容体賦活剤を創製し、これを炎症部位依頼し、実施して頂いた。解析に用いたヒト皮膚組織切片
は、健常人から作製した組織とアトピー性皮膚炎患者から作製したものの２種類を用いた。

Functional expression of the bitter taste
receptors in human keratinocytes
Motonao Nakamura
Department of Life Science, Faculty of
Science, Okayama University of Science

2. 3. 苦味受容体の細胞内局在解析
φ 35 mm のディッシュ（glass bottom）で培養した HaCaT
細胞を固定化し、透過処理後、一次抗体反応（抗 TAS 2 R 14抗体と抗 calnexin 抗体、抗 transferrin receptor 抗体、抗− 157 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図１

ヒトが持つ２つの生体防御システム

図２

生命を脅かす異物は2つに分類される。1つはウイルスや細菌等の病原微生物であり、もう1つは有害化合物である。ヒトは前者に対しては免疫防御システムで対抗する。しかし後者に対しては、皮膚などに侵入した有害物を感知し、排出する機構については十分解明されていない。我々は、苦味受容体が有害物排除に深く関わると予想している。

Golgin- 97 抗体、抗 EEA 1 抗体、抗 CD 71 抗体、或いは、皮膚細胞への有害物の侵入（作業仮説）

皮膚は様々な危険物質に曝される。大きい物質や親水性物質
は角質層や脂質二重膜によって細胞内侵入を阻止できるが、疎水性低分子は細胞内に侵入する。苦味受容体の局在部位はどこか（ 感 受）、リガンド（苦味物質）結合後、どのような情報伝達を発信するのか（発動）、受容体の活性化が有害物排除のトリガーとなるのか（排出）、本研究ではこの3つの課題に取り組む。

15 時間刺激した。

抗 COX IV 抗体の組合せ）を行った。その後、二次抗体反応（AF- 546 標識抗ラビット IgG 抗体［TAS 2 R 14 抗体用］

2. 6. NF-κBの活性化の評価と AF- 488 標識抗マウス IgG 抗体［オルガネラマーカー抗1 mM 塩化カルシウム添加下での３日間培養で分化誘導

体用］）
を行い、PBS で洗浄後、共焦点蛍光顕微鏡を用いてしたヒトケラチノサイトを 1 mM デナトニウムで 15 時間

苦味受容体とオルガネラマーカーの細胞内局在観察を行っ

刺激後、Hypotonic 緩衝液で細胞を破砕し、遠心分離によた。

り核画分を単離した（上清は細胞質画分として解析に供した）。その後、この核画分を核タンパク質抽出緩衝液に懸2. 4. 分化ヒトケラチノサイトを苦味物質で刺激した際の苦味受容体遺伝子の発現上昇

濁することで核タンパク質を抽出し、核タンパク質画分とヒトケラチノサイトの分化誘導は、1 mM 塩化カルシウ

は NF-κB の構成サブユニットのうち、p 65 に着目して解ム添加下での 3 日間培養で行った。分化ヒトケラチノサイ

析を行った。即ち、細胞質タンパク質画分と核タンパク質

ト、および、線維芽細胞を 1 mM デナトニウムで 15 時間

画分に存在する total p 65 比較と核内リン酸化 p 65 の量を刺激後、これら細胞より RNA を調製して cDNA を合成し、Western blotting での検出バンドの濃さで比較した。

して解析に供した。本実験では古典的経路に着目し、検出

苦味受容体や ABC トランスポーター（ABC-B 1、ABC-C 1、

３．結および、ABC-G 2）の発現変動（mRNA 量）を定量 PCR 法で果行った。苦味受容体の解析は 25 種類の苦味受容体のうちヒトは G タンパク質共役型受容体（GPCR）に属する 25

TAS 2 R 14 と TAS 2 R 38 について実施し、β- アクチンを種類の苦味受容体遺伝子を持つ。本研究ではまず、苦味受

コントロールとして評価した。

容体に関する以下の３つの知見を得ることを目指した。
（i）
この受容体群は皮膚細胞に発現する、（ii）この受容体は形

2. 5. ルシフェラーゼレポーター系を活用した苦味受容体情報伝達解析
HEK 293 T 細胞に TAS 2 R 38 と 5 種類いずれかの GPCR

質膜ではなく細胞内に局在する、（iii）皮膚細胞を苦味物質で刺激すると異物排出に関わる ABC トランスポーターの発現が増強する。

シグナル応答性レポーター（CRE、SRE、AP- 1、NFAT、或いは、SRF エレメントのいずれかを連結した深海エビル

3. 1. 苦味受容体群のヒトケラチノサイト における発シフェラーゼ［NanoLuc］）を導入し、TAS 2 R 38 リガンド

現解析

（フェニルチオカルバミド ; PTC、或いは、6 -n- プロピル

ヒトケラチノサイトにおける 25 種類の苦味受容体遺伝

チオウラシル ; PROP）で刺激した際のルシフェラーゼ活性子の発現を RT-PCR にて解析した結果、1 mM 塩化カルシの上昇を評価した。リガンド刺激はいずれも 1 mM 濃度で、ウムでの分化誘導によって角化系細胞に分化後、いずれの− 158 −

有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用

受容体も明らかな発現上昇が認められた（図 3）。なお、このうち、TAS 2 R 14 と TAS 2 R 38 を解析）の局在解析は、の 発 現 上 昇 は 定 量 PCR で も 確 認 し て い る（data not

市販の抗 TAS 2 R 14 抗体と抗 TAS 2 R 38 抗体を用いて行

shown）。また、同様の 25 種類の苦味受容体遺伝子発現はった。本解析は、東京大学医学部皮膚科の住田隼一医師に

ヒト表皮角化細胞株である HaCaT 細胞においても RT-依頼し、実施して頂いた。解析に用いたヒト皮膚組織切片

PCR 法で確認している（data not shown）。

は、健常人から作製した組織とアトピー性皮膚炎患者から作製したものの２種類を用いた。解析の結果、両受容体と3. 2. ヒト皮膚組織での苦味受容体タンパクの発現解析
ヒト皮膚組織切片を用いた苦味受容体タンパク（25 種類

図３

も表皮付近に高い発現が認められたが、健常人とアトピー性皮膚炎患者との間に特筆すべき差異は認められなかった（図 4）。

ヒトケラチノサイトでの25種類の苦味受容体遺伝子の発現解析

ヒトケラチノサイト由来のcDNAを鋳型とした発現解析の結果を示す。ケラチノサイトは1mM 塩化カルシウム添加有無によって未分化（−）
、分化（＋）の２つの状態のものを用いた。
これら細胞からRNAを調製し、このRNAから合成したcDNAを用いてRT-PCRを行った。いずれの細胞株からも25種類全ての苦味受容体の発現が認められた。

図４

ヒト皮膚組織におけるTAS 2 R 14、および、TAS 2 R 38タンパクの発現

ヒト皮膚組織におけるTAS 2 R 14、および、TAS 2 R 38タンパクの免疫染色実験の結果を示す。解析に使用したヒト皮膚組織切片は全て東京大学医学部にて倫理委員会の承認のもと、調整されたものである。Aは健常人から調整した皮膚組織、Bはアトピー性皮膚炎患者から調整した皮膚組織である（東京大学医学部皮膚科の住田隼一医師との共同研究）。

− 159 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

3. 3. 皮膚系細胞株における苦味受容体の細胞内局在解析

3. 4. ヒトケラチノサイト を苦味物質で刺激した際の苦味受容体の発現増強

共焦点顕微鏡を用い、HaCaT 細胞での当該受容体の細前述の分化ヒトケラチノサイトと線維芽細胞のそれぞれ胞内局在を免疫染色で調べた結果、抗 TAS 2 R 14（図 5）、を 1 mM のデナトニウムで 15 時間刺激し、苦味受容体遺抗 TAS 2 R 38（data not shown）のいずれの抗体を用いた解伝子発現量の変化を定量 PCR 法で調べた。図 6 に示すよ

析でも受容体の局在は形質膜ではなく、細胞内を示唆する

うに、両受容体とも分化ヒトケラチノサイトでは苦味物質ものであった。先行研究で皮膚組織における苦味受容体発刺激で発現の上昇が認められたが、線維芽細胞では認めら

現の報告はあるものの、細胞内局在への言及については全れなかった。なお、同様の苦味物質刺激（1 mM のデナト

1）

くない 。なお、小胞体（calnexin）、ゴルジ体（Golgin- 97）、

ニウム、1 mM サッカリン、0 . 1 mM キニーネ塩酸塩など）

リサイクリングエンドソーム（transferrin receptor）、初期

による苦味受容体自身の発現増強は HaCaT 細胞においてエンドソーム（EEA 1）、リソソーム（LAMP- 1）、ミトコン

も認めている（data not shown）。

ドリア（COX IV）などの局在マーカーを用い、共局在性を検討したが、何のマーカーに対しても有意な共局在性を示
すものはなかった。なお、同様の細胞内局在はヒトケラチ
ノサイト でも確認している（data not shown）。

図５

3. 5. ヒトケラチノサイトを苦味物質で刺激した際のABCトランスポーターの発現増強
前述の分化ヒトケラチノサイトを１mM デナトニウムで

HaCaT細胞における苦味受容体の細胞内局在解析

HaCaT細胞に発現しているTAS 2 R 14と6つのオルガネラ（Endoplasmic reticulum、Golgi body、Recycling
endosome、Early endosome、Lysosome、Mitochondria）特異的タンパクを市販抗体で染色し、共焦点顕微鏡で共局在性を評価した。緑；抗オルガネラタンパク抗体で反応後、Alexa Fluor（AF）488標識抗マウスIgG 抗体 で 蛍 光 染 色した。 赤；抗TAS 2 R 14抗 体 で反 応 後、AF 546標 識 抗ウサギIgG抗 体 で 蛍 光 染 色した 図。
Merge； TAS 2 R 14と各オルガネラマーカーの局在を重ね合わせた図。Phase contrast；明視野で細胞を観察した図。

− 160 −

有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用

図６ ヒトケラチノサイトをデナトニウムで刺激した際の苦味受容体の発現上昇分化ヒトケラチノサイトと線維芽細胞を1mMデナトニウムで15時間刺激した際の苦味受容体遺伝子（TAS 2 R 14、TAS 2 R 38）の発現上昇を定量PCRで調べた。β-アクチン遺伝子の発現量をコントロールとした。

15 時間刺激した細胞より RNA を調製し、cDNA 合成後、

図７ 苦味物質刺激による異物排出ABCトランスポーターの発現増強
分化ヒトケラチノサイト を1mMデナトニウムで刺激した際のABC-B 1、ABC-C 1、 お よ び、ABC-G 2の 発 現 上 昇 を 定 量
PCRで調べた。β-アクチン遺伝子の発現量をコントロールとした。

3. 7. NF-κBの活性化評価

定量 PCR 法により ABC トランスポーターの遺伝子発現変先行研究より、ABC-B 1 の発現に NFκ-B の活性化が深動を解析した。なお、本実験では、ABC トランスポータ

く関与し、抗がん剤耐性回避の標的分子として注目されてーの中でも抗がん剤排出への関与が報告されている３つのいる 3 - 6）。そこで、前述の分化ヒトケラチノサイトを１mM

トランスポーター、ABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 に着

デナトニウム、１mM PTC、１mM サッカリン、１mM サ

目し、これらの発現量変化を解析した。その結果、苦味物

リシン、或いは、0 . 1 mM キニーネ塩酸塩で 15 時間刺激し、質刺激に伴い、ABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 いずれの

p 65 の 核 移 行 量 や 核 移 行 p 65 の リ ン 酸 化 度 合 い か ら

遺伝子も発現が有意に上昇することが示唆された（図 7）。

NFκ-B の活性化を評価した。その結果、これら苦味物質

なお、同様の苦味物質刺激（1 mM のデナトニウム、1 mMの刺激で NFκ-B が有意に活性化されていることが示唆さ

サ ッ カ リ ン、0 . 1 mM キ ニ ー ネ 塩 酸 塩 な ど ）に よ るれた（図 9）。なお、同様の苦味物質刺激（1 mM のデナトニ

ABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 の発現増強は HaCaT 細胞

ウム、1 mM サッカリン、0 . 1 mM キニーネ塩酸塩など）ににおいても認めている（data not shown）。

よる NFκ-B の活性化は HaCaT 細胞においても認めている（data not shown）。

3. 6. 苦味受容体から発信される情報伝達４．考

苦味受容体群は GPCR ファミリーに属する。この受容体

察群から発信される情報が何の G タンパク質を介したものか

冒頭で述べたように、本研究では苦味受容体に関するを知るために、以下の実験を行った。HEK 293 T 細胞に

以下の３つの知見の確保を目指した。（i）この受容体群はTAS 2 R 38 と 5 種類いずれかの GPCR 応答性レポーター

皮膚細胞に発現する、（ii）この受容体は形質膜ではなく細（CRE、SRE、AP- 1、NFAT、或いは、SRF エレメントを胞内に局在する、（iii）皮膚細胞を苦味物質で刺激すると異連結した深海エビルシフェラーゼ）を導入し、TAS 2 R 38

物排出に関わる ABC トランスポーターの発現が増強する。

のリガンドとして認知されているフェニルチオカルバミド（i）に関しては、ケラチノサイトや表皮角化細胞株での 25（PTC）、或いは、6 -n- プロピルチオウラシル（PROP）で 15

種類全ての苦味受容体遺伝子の発現のみならず、ヒト皮膚時間刺激した際のルシフェラーゼ活性の上昇を評価した 2）。

組織での苦味受容体タンパクの確認などから、外界に最もその結果、どちらの刺激も SRE および SRF エレメントを接する表皮組織に苦味受容体が発現していることを示唆で活性化する結果が認められた（図 8）。我々はこの実験によきた。
（ii）興味深いことに、これら苦味受容体は形質膜でって苦味受容体に共役している G タンパク質に関しては、はなく細胞内に局在するが、本研究期間ではその局在部位

Gα i 型と Gα 12 / 13 型の関与を予想した。

を明確にすることはできなかった。細胞破砕後の分画で当該受容体は膜画分に検出されることからいずれかのオルガ− 161 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図８

GPCRシグナル応答性レポーターを活用した苦味受容体情報伝達経路の解析

HEK 293 TにTAS 2 R 38と5種類いずれかのGPCRシグナル応答レポーター（CRE、SRE、AP-1、NFAT、或いは、SRFエレメントを連結した深海エビルシフェラーゼ）を導入し（左）、TAS 2 R 38リガンド（PTC或いは、PROP）で刺激した際のルシフェラーゼ活性の上昇を評価した。どちらの刺激もSREおよびSRFエレメントの活性化が認められた（右）。

質で刺激を受けたケラチノサイトや表皮角化細胞株では異物排出のためのタンパク質が増加 / 作動することが予想できる。我々はまず ABC トランスポーターに着目し、その中 で も 異 物 排 出 能 の 報 告 が あ る ABC-B 1、ABC-C 1、
ABC-G 2 に関して解析を行った７）。なお、ヒト結腸腺癌
細 胞 株 で あ る Caco 2 細 胞 で の 苦 味 受 容 体 を 介 し た
ABC-B 1 の発現上昇や 8）、皮膚組織での ABC-B 1 の発現については先行研究で既に報告されている 9）。本研究において、我々は分化ケラチノサイトの苦味物質刺激に伴い
ABC-B 1、ABC-C 1、ABC-G 2 の発現が増加すること見出した。実際に細胞自体がこうしたタンパク質の発現増加
図９ 分化ヒトケラチノサイトにおける苦味物質刺激後のNFκ
-Bの活性化
分化ヒトケラチノサイトを1mM PTC、1mMデナトニウム、1mM サッカリン、1mM サリシン、或いは、0 .1 mM キニーネ塩
酸塩で刺激した際のNFκ-Bの活性化。p 65；NFκ-Bのp 65サブ
ユニット、phos-p 65；NFκ-Bのp 65サブユニットのリン酸化体

で異物排出能を高めているか否かを今後行う予定である。
例えば、蛍光ローダミンを細胞に取込ませ、苦味受容体刺激で排泄能が高まるか否かを調べる計画である 10）。
本研究から、創薬に関して我々は以下の提案をする。苦
味受容体遺伝子には配列多様性があり、これは異物排除能の個人差に直結する。皮膚炎原因物質を感受できない配列を持つ場合、当該物質を排除できず、蓄積によって皮膚炎

ネラ膜に局在するものと推察する。小胞体なのか？ゴルジが発症するであろう。こうした人のために、無害な苦味受体なのか？或いは、それ以外なのか？解明が今後の大きな容体賦活剤を創製し、これを炎症部位に塗布することで排課題である。（iii）図 2 に示す作業仮説からすれば、苦味物除機構を作動させ、蓄積有害物の排除を促進することで皮− 162 −

有害物侵入を最前線で防ぐ新規な皮膚細胞機構の発見と皮膚保護剤創製への応用

膚炎悪化を回避させる考えである（図 10）。苦味受容体を創薬標的として捉えた点では前例のない研究である。
GPCR は形質膜から情報発信すると考えられてきたが、本研究はこうした概念も覆す。細胞内 GPCR 情報伝達という新たな研究領域を提唱できる可能性も秘めている。生体防御の観点からも、こうした防御機構の提唱はこれまで全くなかった。本研究は新規創薬への挑戦でもある。

５．謝辞

ヒト皮膚組織切片を用いた苦味受容体の発現解析にご協力頂いた東京大学医学部皮膚科の住田隼一医師に感謝いたします。本研究の遂行にあたり、助成をしてくださった公

図10

苦味受容体を標的とした創薬アイデア

25種類の苦味受容体の中で配列個人差のない受容体を標的とし、これを活性化する無害な賦活剤を創製すれば、皮膚細胞内へ蓄積した有害物質を細胞外に排出させることができる。

益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝いたします。助成金により遂行された本研究成果は、国内外の学会や国際学術雑誌に発表することで社会に還元し、貢target therapy of AKT and NKκ-B signaling pathway

献することをお約束します。

and multi-drug resistance by specific cell penetrating
inhibitor peptides in HL- 60 cells. Asian Pac. J. Cancer（引用文献）

Prev., 15, 4353-4358, 2014

1） Wolfle U., Elsholz FA, Kersten A, Haarhaus B,

6） Wu W, Yang J-J, Wang Y-L, Wang H, Tao M, Wang

Muller WE, Schempp CM: Expression and functional

L, Gu J-J, Cai Y, Shi Y, Yao D-F: Reversal of multidrug

activity of the bitter taste receptors TAS2R1 andresistance of hepatocellular carcinoma cells by

TAS2R3 8 in human keratinocytes. Skin Pharmacol.

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2） Meyerhof W, Batram C, Kuhn C, Brockhoff A,7） Robey RW, Pluchino KM, Hall MD, Fojo A, Bates SE,

Chudoba E, Bufe B, Appendino G, Behrens M: The

Gottesman MM: Revisiting the role of ABC

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3） Kuo MT, Liu Z, Wei Y, Lin-Lee Y, Tatebe S, Mills

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receptor signaling induces ABCB1 though a

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20024） Sun J, Yeung CA, Co NN, Tsang TY, Yau E, Luo K,

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Wu P, Wa JCY, Fung K-P, Kwok T-T, Liu F: Clitocine

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− 163 −

ヒト iPS 細胞に由来する若齢および加齢様の性質を示す積層および立体皮膚オルガノイドの作製
関西医科大学大学院医学研究科医科学専攻 イノベーション再生医学 iPS・幹細胞再生医学講座

服部文幸

It goes without saying that healthy skin is the most important foundation of cosmetics. Easily evaluate the benefits of
new ingredients such as protective ingredients from external stimuli such as ultraviolet rays and dryness, and ingredients
supplied from the dermis to the epidermis in order to maintain a higher degree of skin health against aging. That is important. On the contrary, it is also important to predict the negative effects on skin health by applying or drinking these newingredients in order to prevent the occurrence of side reactions. Traditionally, these evaluations have been performed exclusively with animals. However, physiological difference between spiecies that have hindered accurate screening has not been
overcome, yet. Furthermore, in recent years, the spirit of animal protection and the development of laws and regulations
have rapidly become widespread, and there is a social demand for the complete abolition of animal experiments, especiallyin the field of cosmetics. Under such circumstances, human iPS cells have few ethical problems in establishment and can be
widely used in industry. Human iPS cells are theoretically infinitely self-renewable and can differentiate into any somaticcell, so the merit of utilizing them in the field of cosmetology is immeasurable. Therefore, we created a three-dimensional
skin model using human iPS cells derived from a Japanese Werner Syndrome patient. Furthermore, we introduced a p16INK4A reporter that is activated in senescent cells into the above cell line to develop a system that can observe aging in realtime. Using this system, we also found that the aging of them was accelerated by exposure to Doxorubicin.

1．緒らに老化細胞で活性化される p 16 INK 4 A レポーターを遺言伝子導入し、リアルタイムに老化を観察できるシステムを

健やかな皮膚は、コスメトロジーにおいて最も重要な基盤であることは言うまでもない。加齢に抗して皮膚の健康構築した。さらにこの老化が Doxorubicin の暴露により加速されることを見出した。

状態をより高度に維持するために、紫外線や乾燥など外部

２．方刺激からの防御成分や、真皮から表皮への供給成分など、新規成分の有益性を簡便に評価することは重要である。また、逆にこれら新規成分の塗布や飲用により、皮膚健康に与える負の影響を予見することも、副反応の発現を未然に法

2. 1. 細胞日本人、健常人および Werner 患者由来 iPS 細胞は、共に理研細胞バンクから入手した。

防ぐために重要である。従来、これらの評価は、専ら動物を用いて実施されてきた。しかしながら、従来の動物を用いた試験には根本的な種差の壁があり、正確なスクリーニ
ングが妨げられてきた。さらに、昨今では動物愛護精神と法令の整備が急速に普及し、特にコスメトロジー分野では、
動物実験を完全に廃止することが社会的に求められている。
このような状況にあって、ヒト iPS 細胞は、樹立における倫理的問題も少なく、産業界で広く活用できる。ヒトiPS細胞は、理論的に無限に自己複製可能であり、またどの体細胞へも分化できる点で、コスメトロジー分野で利活用す

2. 2. 細胞分化
ヒト iPS 細胞の未分化維持培養方法は、文献 1 に基づき一部改良を加えた。
ヒト iPS 細胞の線維芽細胞分化は、文献 2 および文献 3の方法に基づき実施した。
ヒト iPS 細胞のケラチノサイト分化は、文献 4 の方法に基づいて行った。
立体皮膚モデルの作製方法は、文献 2 の方法を一部改良して実施した。

るメリットは計り知れない。
そこで、我々は、日本人の早老症（Werner Syndrome）由来のヒト iPS 細胞を用いて立体皮膚モデルを作製した。さPreparation of laminated and threedimensional skin organoids derived fromhuman iPS cells showing young and agelike properties
Fumiyuki Hattori
Department of Innovative Regenerative
Medicine Kansai Medical University
Graduate School of Medicine

2. 3. p16INK4Aレポーター株の作製
老化指標として p 16 INK 4 A の発現をリアルタイムで観察するために、レポーターを作製し、ヒト iPS 細胞に対し恒常的遺伝子導入を行い、遺伝子導入株を作製した。レポーターは、p 16 INK 4 A プロモーター領域をクローニング
し、この支配下に EGFP を配した。さらにこの遺伝子発現ユニットを PiggyBac プラスミドへと薬剤耐性遺伝子の恒常的発現ユニットとタンデムに挿入した。ウェルナー症候群患者由来 iPS 細胞に対して上記のレポータープラスミド− 164 −

ヒト iPS 細胞に由来する若齢および加齢様の性質を示す積層および立体皮膚オルガノイドの作製をリポフェクション法により遺伝子導入した。恒常的遺伝化誘導したケラチノサイトを真皮上に播種したところ、迅子導入株の選別を薬剤耐性により実施し、数株のクローン

速に接着、平面状に広がった。これらにより構築された立を得た。

体皮膚モデルは、構築後２ヶ月以上安定して維持できた（図
1）。

2. 4. 人工的老化誘導の実施

健常人および Werner syndrome 患者由来 iPS 細胞から人工的な老化を発生させるために、ゲノムの二重鎖切断を発生させる抗がん剤 : Doxorubicin を低濃度 20 , 30 , 50

線維芽細胞およびケラチノサイトを分化誘導することに成功した。

nM で 5 日間暴露し、その後増殖促進培地において 1 週間培養を行ってから、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。

３．結

3. 2. 老化レポーターiPS細胞株の作製
次に、皮膚細胞の老化度をリアルタイムに検出し、選別

果可能とするために、老化レポーターを有するヒト iPS 細胞

3. 1. 積層皮膚モデルの構築

株の樹立を行った。プラスミド遺伝子の構造は図 2 A のと

コラーゲンなどの細胞外マトリックスの混合物に対し、おりであり、ウェルナー症候群患者由来 iPS 細胞への遺伝

分散したヒト iPS 細胞由来線維芽細胞を懸濁した後、半透子導入株（図 2 B）は、正常な増殖能と多分化能を維持して膜培養カップ上に播種を行った後にゲル化処理を行った。

いた。未分化状態では蛍光レポーターを発現することはな

これにより、細胞外マトリックス真皮の構造を模した。培かった。

養直後は、ゲル中に均一に分散して存在した線維芽細胞は、１週間の後には、線維芽細胞どうしが相互作用した編み目

3. 3. ウェルナー症候群患者由来分化細胞の自然老化状の構造を呈した。さらに、緑色蛍光タンパク質を恒常的

ウェルナー症候群由来 iPS 細胞から自然分化した細胞をに発現させる遺伝子組み換えを行ったヒト iPS 細胞から分5 回継代したところ、増殖性が低下し細胞体が大きくなる

線維芽細胞

ケラチノサイト
図1

積層皮膚モデルトランスウェル上において、下層にヒトiPS細胞由来の線維芽細胞を、上層にヒトiPS細胞由来のケラチノサイトを培養した。ケラチノサイトにはGFPを恒常的に発現させた。

図2

p 16 INK 4 Aレポータープラスミドと導入したウェルナー症候群患者iPS細胞（A）レポータープラスミドの構造を示した。
（B）遺伝子導入したウェルナー症候群患者由来iPS細胞とその緑色蛍光（老化していな
い細胞ではGFPを発現していない）。

− 165 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

（A）

（B）

図３

ウェルナー症候群患者由来iPS細胞から分化した細胞の老化

ウェルナー症候群由来iPS細胞から分化した細胞を継代し得られた老化形質細胞。

図4

ウェルナー症候群患者由来iPS細胞から分化した細胞の人工的老化促進

肥大を呈する状態に至った。この細胞のレポーター GFPに 老 化 の 状 態 を リ ア ル タ イ ム で 観 察 で き る よ う に、発現状態を確認したところ、図 3 B のように蛍光性を示し

p 16 INK 4 A のプロモーター配列を用いた「老化レポーター

た。同時に、この細胞を老化依存的 βgal 染色に供したと

iPS 株」を作製した。この株を線維芽細胞に分化誘導した

ころ、陽性を示した（図 3 A）。

直後においては、老化レポーターの発現は見られなかったが、分化後の継代を重ねることでレポーターの発現が誘導

3. 4. ウェルナー症候群患者由来線維芽細胞の人工的された。さらに DNA の二重鎖切断を引き起こす抗がん剤

老化促進

Doxorubicin を低濃度で長期間処理したところ、細胞の増続いて、p 16 INK 4 A レポータープラスミドを導入した

殖性は完全に失われ、細胞質の肥大を呈する、いわゆる老ウェルナー症候群患者由来 iPS 細胞から、線維芽細胞を分化細胞様の形質を示した。この細胞においては、極めて強化誘導した。この細胞は継代を 3 回経た状態では、蛍光性

い老化レポーターの発現が観察された。このことから、ウを示さなかった。この細胞に抗がん剤であり二本鎖 DNA

ェルナー症候群由来 iPS 細胞と、p 16 INK 4 A レポーター

切断を惹起する Doxorubicin を 5 日間添加し、その後増殖の組み合わせにより、比較的短期間に老化の形質を呈する

可能な培地に交換して７日間培養を行った。Doxorubicin

細胞を生きたまま入手可能であること、さらに Doxorubicin処理を行った細胞では、増殖が完全に停止し、細胞体が大への暴露により、老化形質細胞の出現を加速できることがきくなる、いわゆる老化細胞の様態を示した。この時にレ示唆された。今後、老化レポーターを有するウェルナー症

ポーター GFP の発現を観察したところ、図 4 に示すように、候群患者および正常人由来の iPS 細胞から積層皮膚モデル

Doxorubicin に暴露された細胞にだけ強い蛍光シグナルをを作成し、様々な抗老化候補物質の探索や効能確認に応用

検出した。

してゆく。

４．考察と今後（引用文献）

ウェルナー症候群患者由来 iPS 細胞から分化誘導した線

1） Sci Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594.

維芽細胞およびケラチノサイトから成る積層皮膚モデルを

2） PLoS One. 2013 Oct 11; 8（10）: e77673.

構築した。この時、ケラチノサイトの生存期間が単体で培

3） Stem Cell Res. 2011 Jan; 6（1）: 83-9.

養している時よりも著明に延長されたことは興味深い。次4） PLoS One. 2015 Aug 26; 10（8）: e0136713.

− 166 −

アレルギー性化合物を感知する自然免疫受容体の同定とそれを利用した感作抗原性評価系の樹立
鹿児島大学大学院医歯学総合研究科

原博満

A variety of small reactive organic compounds, called haptens, induce allergic contact dermatitis (ACD), which is
caused by T cells reactive to haptens. In the previous study, we identified that IL-1 secretion through immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-Syk-CARD9 signal activation is essential for dendritic cells to prime hapten-reactive
T cells during the sensitization of contact hypersensitivity (CHS), an experimental model of ACD in mice. This finding
implicates the presence of ITAM-coupled innate immune receptors that sense haptens. In this study, we sought to identify
ITAM-coupled receptors expressed on myeloid cells that are responsible for CHS sensitization. We have identified two candidate receptors, IgSFR2 and IgSFR6, by screening for hapten-binding capacity using receptor-Ig fusion proteins and for
ITAM-NFAT signal-activating capacity using receptor-expressing NFAT-GFP reporter cells. To evaluate the requirement ofIgSFR2 and IgSFR6 for the induction of CHS, we performed TNCB-induced CHS using mice deficient for either IgSFR2 or
IgSFR6, or both. However, deficiencies of these receptors did not affect the induction and severity of CHS as compared towild-type mice. These results suggested that innate immune activation through IgSFR2 and IgSFR6 is not sufficient for CHS
sensitization and other relevant ITAM-coupled receptors might exist and cooperatively act for hapten recognition and CHS
sensitization together with IgSFR2 and IgSFR6.

1．緒るためには、抗原を提示する樹状細胞（DC）が Toll 様受容

言体（TLR）などのパターン認識受容体（PRRs）を介して病原

接触皮膚炎は職業現場において最も頻発する皮膚疾患で体成分（PAMPs）
や内因性危険因子（DAMPs）を認識し、活ある。中でも、アレルギー性接触皮膚炎（Allergic contact

性化（成熟）すること必要である。これは TLR による微生dermatitis: ACD）は日用品、医薬品や化粧品に含まれる物成分の認識を例に考えると理解しやすいが、構造的、化

様々な化合物が T 細胞を感作することによって引き起こさ

学的に多種多様なハプテンがどのような自然免疫受容体をれる疾患であり、社会的にも大きな問題となっている。接介して DC を活性化、成熟させるのかについては明らかで

触アレルゲンとなる感作性化合物（ハプテン）
は宿主の蛋白はなかった。

質と結合することで抗原性を獲得するが、これまで 3000

DC やマクロファージなどの自然免疫細胞が発現する C

種類近くの化合物がハプテンとして報告されている。化粧型レクチン受容体（CLR）やIgスーパーファミリー受容体（Trem、品や医薬品の開発過程で、配合成分の化合物の感作性を適CD 300 ファミリーなど）の一部は、Immunoreceptor tyrosine-

切に評価することが必要となるが、現状では動物を用いた

based activation motifs（ITAM）を介して細胞内シグナルアレルギー性試験が主流である。その煩雑性や、環境や個を活性化する ITAM 共役型受容体である 1）。骨髄系細胞の体差から生じるデータの不安定性もさることながら、近年

ITAM の下流では Syk キナーゼの活性化が誘導され、さらでは動物愛護の倫理的観点から、その使用が量的にも質的に CARD 9 シグナル経路が活性化することでサイトカインにも制限されている。従って、これに替わる信頼度の高いなどの遺伝子発現が誘導される。近年、これらの ITAM

in vitro 評価系が求められている。特に、EU を中心に拡大

共役型受容体が様々な PAMPs や DAMPs を認識して様々なしつつある「動物実験をして開発した製品の販売禁止」の世疾患の病態形成に関わることが明らかになってきている。

界的動向への対応は、我が国の産業界に迫られている喫緊

我々は、ハプテンが DC の ITAM-Syk-CARD 9 シグナルをの課題でもある。

活性化し、これによって DC から分泌された IL- 1 が T 細胞

免疫学の一般的理論として、ナイーブ T 細胞が抗原によ受容体の副刺激となって働くことで、ハプテン反応性の Tってプライミングされ、エフェクター T 細胞へと分化す細胞がプライミングされることを見出した 2）。この結果は、ハプテンを感知して DC を活性化する未知の ITAM 共役型

Identification of innate immune receptors
that sense allergic compounds for thedevelopment of novel assay systems toevaluate allergenicity
Hiromitsu Hara
Kagoshima University Graduate Schoolof Medical and Dental Sciences

受容体の存在を示唆するものであった（図 1）。そこで本研究では、アレルギー性化合物を感知する ITAM 共役受容体の同定を試み、その受容体の ACD 発症における役割を明らかにすることを目指した。ACD 発症に関わる受容体が同定された場合、その反応性を指標として化合物のアレ
ルゲン性を評価する in vitro システムの開発が期待される。

− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図1 アレルギー性化合物は、ITAM-Sykシグナルを介してNLRP 3インフ
ラマゾームとCARD 9経路を活性化し、T細胞のプライミングに必須なIL-1を樹状細胞から分泌させる

図３ IgSFR 2とIgSFR 6はハプテンを認識
ITAM-NFATシグナルを活性化する

図2 TNCBに結合性を示すITAM共役受容体（受容体名は通し番号であり、分子名ではない）

２．方2. 3. ハプテン誘導性contact hypersensitivity

法

2. 1. ITAM共役受容体-Igライブラリーを用いたハプ（CHS）試験

ハプテン結合性を示した候補 ITAM 共役受容体をそれ

テン結合試験

ぞ れ、 あ る い は 両 方 欠 損 す る マ ウ ス（IgSFR 2 -KO、

ハプテンに結合する ITAM 共役受容体の探索を行うた

IgSFR 6 -KO、IgSFR 2 / 6 -DKO）を 用 い て、ACD の マ ウ

め、これまで報告されている 22 種類の骨髄系 ITAM 共役

スモデルであるハプテン誘導性 contact hypersensitivity

受 容 体（CLR、Ig ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー 受 容 体（TREM,（CHS）試験を実施した。CHS 試験は、ハプテン TNCB をLMIR など）の細胞外ドメインと human IgG 1 -Fc 領域とのマウスの腹部に塗布して感作させ、5 日後に耳に TNCB を融合蛋白（ITAMR-Ig 蛋白）を作製した。このライブラリチャレンジして、48 時間後の耳介の肥厚を測定した。

ーを用い、ELISA システムを用いて数種類のハプテン

３．結（TNCB、DNCB、Oxazolone、FITC）との結合性を調べた。

2. 2. NFAT-GFPレポーター細胞株を用いたハプテン
反応性試験

果

3. 1. ハプテンを認識するITAM共役受容体の同定
ITAM 共役受容体 -Ig ライブラリーを用いたハプテンとの結合スクリーニングの結果、異なるハプテンに対して結

ハプテン結合性を示した候補 ITAM 共役受容体とその合性を示し（図 2）、さらに ITAM-NFAT シグナルを活性会合 ITAM アダプター分子を安定発現した NFAT-GFP リ化する（図 3）受容体として、IgSFR 2、IgSFR 6 の二つを同ポーター T 細胞株（43 . 1）を作成し、これらの細胞のハプ定した。これらはいずれも Ig スーパーファミリーに属し、テン反応性を、GFP 発現量あるいは上清中の IL- 2 産生量

DAP 12 に会合して活性化シグナルを伝達することが報告を指標として評価した。

されている。これらの候補受容体がハプテンと結合するこ− 168 −

アレルギー性化合物を感知する自然免疫受容体の同定とそれを利用した感作抗原性評価系の樹立とで ITAM シグナルを活性化できるかを調べるため、各受容体と DAP 12 を安定発現する 43 - 1 細胞を作成し、これをハプテンで刺激して NFAT 活性化（GFP 発現）あるい
は IL- 2 産生を解析した。その結果、IgR 2 および IgR 6 の両方とも NFAT 活性化や IL- 2 産生を誘導できることがわかった。さらに、これら二つの受容体の反応性は試験した
ハプテン毎に異なることから、それぞれが異なる化学構造を認識していることが推測された。

3. 2. 候補受容体のCHS発症における役割の検討
IgSFR 2 および IgSFR 6 の ACD 発症における役割を調べるため、これら受容体の遺伝子欠損マウス（IgSFR 2 KO、IgSFR 6 -KO）を用いて TNCB 誘導性の CHS 試験を実施した。また、コントロールマウスとして野生型マウス

図4 IgSFR 2とIgSFR 6のダブル欠損マウスでもCHS発症に影響しないと DAP 12 欠損マウスを用いた。過去の報告で我々は、
DAP 12 欠損マウスが CHS を発症しないことを報告している 2）。実験の結果、DAP 12 欠損マウスでは TNCB チャレン受容体以外の複数の未知のハプテン受容体が存在し、それジ後の耳介の腫脹がほとんど生じないのに対し、IgSFR 2らが協調してハプテンの認識と自然免疫の活性化に関わっおよび IgSFR 6 欠損マウスは、野生型マウスと同等の腫脹ている可能性が考えられた。

が観察された。この結果から、IgSFR 2 あるいは IgSFR 6

５．総の単独の欠損は CHS 発症に影響しないことがわかった。

括

In vitro の結合試験において、IgSFR 2 および IgSFR 6 の本研究は、感作性化合物を認識する宿主受容体を用いた

両方とも TNCB に結合性を示したことから、これらの受容化合物の in vitro 感作性評価試験系の樹立を目指して立案

体が協調的に TNCB の認識に関わっていると考え、両方した。しかし、ハプテン結合性の受容体の同定には至ったの受容体を欠損するマウス（IgSFR 2 / 6 -KO）を作成してものの、これらの受容体のアレルギー性接触皮膚炎感作に

CHS 試験を実施した。しかしながら、IgSFR 2 / 6 -KO でおける重要性を見いだすことができず、その結果、目標とも野生型マウスと同等の CHS の誘導が観察された（図 4）。

する評価試験系の樹立には至らなかった。ITAM-Syk-

４．考CARD 9 経路の活性化を利用した評価試験法として、受容察体を同定し、それを利用するものではなく、何らかの形で本研究において、ハプテン化合物に結合する ITAM 共

この細胞内シグナル経路を検出、定量するシステムを考案

役型受容体のスクリーニングによって二つの候補受容体する方が現実的であるのかもしれない。今後もハプテン受（IgSFR 2、IgSFR 6）を同定した。これらの受容体はそれぞ

容体の同定を続けるとともに、有用な新しい感作性試験法

れ TREM ファミリーと CD 300 ファミリーに属する受容体の創出を模索していきたいと思う。

であり、DAP 12 に会合して細胞内シグナルを伝達することが過去に報告されており、レポーター細胞を用いた試験に お い て、 実 際 に ど ち ら の 受 容 体 も DAP 12 を 介 し て（引用文献）
1） Hara H and Saito T: CARD9 vs. CARMA1 in innate

ITAM 下流のシグナルを活性化することを確認した。我々

and adaptive immunity. Trends in immunol. 2009, 30

は過去の報告で、CHS の感作には樹状細胞が発現する（5）: 234-242.

DAP 12 シグナルが必要であることを見出していたことか

2） Yasukawa S, Miyazaki Y, Yoshii C, Nakaya M, Ozaki

2）

ら 、今回同定した２つの受容体がハプテン化合物を感知

N, Toda S, Kuroda E, Ishibashi K-I, Yasuda T,

する有力な受容体候補であると判断し、それぞれの受容体

Natsuaki Y, Mi-ichi F, Iizasa EI, Nakahara T, Yamazakiの欠損マウスを用いた CHS 試験を実施してその病理的重M, Kabashima K, Iwakura Y, Takai T, Saito T,

要性の評価を行った。しかしながら、いずれの受容体を単Kurosaki T, Malissen B, Ohno N, Furue M, Yoshida H,

独で欠損するマウスあるいは両方欠損するマウスにおいてand Hara H: An ITAM-Syk-CARD9 signaling axis

も、TNCB 誘導性の CHS 反応は野生型と遜色がないもの

triggers contact hypersensitivity by stimulating IL-1であった。この結果から、IgSFR 2 と IgSFR 6 がハプテン

production in dendritic cells. Nat Commun. 2 0 1 4, 5:の認識と CHS 感作に全く必要でないか、あるいはこれら

3755.

− 169 −

ヒト皮膚に発現する薬物トランスポーター遺伝子多型・発現解析と経皮吸収への影響
九州大学大学院薬学研究院薬物動態学分野

廣田豪

Membrane transporters have broad specificity and facilitate the uptake and efflux of their substrates across plasma membranes. Two major superfamilies, the ATP-Binding Cassette (ABC) and Solute Carrier (SLC) families, strongly influence theabsorption, distribution, and excretion of drugs. Although the skin penetration of xenobiotics was previously attributed topassive diffusion, increasing evidence indicates that transporters have a function in the biochemical barrier of skin epithelial
cells beneath the stratum corneum. The identification of drug transporters expressed in human skin and inter-individual differences in gene expression are important for understanding the role of drug transporters in human skin. Twenty-two ABC
and 15 SLC transporters were expressed at detectable levels in human skin, and ABCC3, SLC22A3, SLCO3A1, SLC16A7,
ABCA2, ABCC1, and SLCO2B1 were strongly expressed in skin. The expression of ABCC3 (MRP3) and SLC22A3(OCT3) mRNAs showed large inter-individual variabilities. None of the SNPs tested (−1767G>A, −1328G>A, −1213C>G,−897delC, −260T>A, and −211C>T) in the promoter region of the ABCC3 gene showed a significant change in ABCC3mRNA levels. ABCC3 expression levels negatively correlated with the methylation status of the CpG island (CGI) locatedapproximately 10 kbp upstream of ABCC3 (Rs: −0.323, P < 0.05). As a result of systematic screening in the 5’-flanking
region of SLC22A3, fourteen SNPs were identified; of these variants, 4 were novel. Of the 14 SNPs the variant, −1603G>A
suppressed transcriptional activity in reporter assays and was associated with lower expression levels of SLC22A3 in skinsamples obtained from Caucasian female origin. In humans, the concentration of squalene in samples taken from the back atbaseline was significantly lower in homozygotes for −1603A/A than in homozygotes for −1603G/G. These results suggestthat the genetic mutation contributes to the variation in the expression and activity of the drug transporter in human skin.

1．緒

制御機構は、ゲノム中で CpG ジヌクレオチドの出現頻度

言が高い CpG islands と呼ばれる領域内のシトシンがメチル

薬物トランスポーターは薬物の生体への取り込み及び生化を受ける DNA メチル化であり 5）、特に癌等の疾患にお体からの排泄を担う膜タンパク質の総称で、薬物吸収を司ける遺伝子発現の変動とエピジェネティック修飾との関連

る小腸、薬物排泄を担う肝臓及び腎臓、薬物の膜透過を制研究については多数報告されている 6）。

限する血液脳関門等、広範な組織に発現している。薬物ト

皮膚は、成人で表面積 1 . 4～1 . 7 m 2、総重量 3 . 2 ～ 4 . 8

ランスポーターは薬物の吸収、分布及び排泄の支配要因に

kg にも及び、人体で最大の臓器である肝臓よりも大きいなることが明らかになっている 1）。実際、近年では臨床上組織と言える。皮膚は皮膚表面から角質層を有する表皮、重要な薬物間相互作用の原因についても、一部又は全てを真皮及び皮下組織から成り、経皮水分蒸散量の制御や微生薬物トランスポーターにより説明できることが報告されて物及び化学物質侵入の防御といった両方向性バリアとしている 2）。また、薬物トランスポーターの発現量・活性の個機能している。皮膚は薬物の投与部位の一つでもあり、初人差が薬物の体内動態に影響する事例も数多くの研究で報回通過効果を回避できること、投与及び投与中止が簡便で3）

告されており 、その個人差要因を解明する研究も個別化あること、非侵襲的な投与が可能であること、頻回投与す医療を実現する上で重要となる。

ることなく血中薬物濃度を維持できる可能性があること等、

遺伝子発現の個人差に影響する要因としては一塩基多型

他の投与経路にはない利点が数多くある。しかし、元来皮（SNPs）が広く知られており、薬物の体内動態及び薬物応

膚は外部環境から生体を保護する役割を担っており、消化答を担う数多くの遺伝子についても、SNPs が個人差の原管等からの吸収に比べると皮膚からの薬物の吸収は極めて因となることが報告されている 1 , 3 , 4）。また、近年では遺少なく、吸収速度や効果発現に要する時間も遅い。また、伝子の塩基配列の変異を伴わない遺伝子発現制御機構であ長らくの間、薬物の皮膚透過は受動拡散によるものと考える「エピジェネティクス」も注目されている。その代表的なられてきたため、これまでの経皮吸収に関する研究では、

Analysis of genetic polymorphisms andexpression of drug transporter genes in
hu m a n s k i n a nd t hei r e f fe c t s o ntransdermal absorption
Takeshi Hirota
Department of Clinical Pharmacokinetics,
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Kyushu University

物理的バリアである角質層の克服に主眼が置かれ、薬物をいかに効率よく透過させ、標的部位に運ぶかという製剤的な技術開発が中心であった。そうした中、近年、皮膚にも薬物トランスポーターが発現し、皮膚において生化学的バリアとして機能することを示す研究が報告されるようになった。正常ヒト角化細胞を用いた研究では、MRP ファミリー及び OATP ファミリートランスポーターが構成的に− 170 −

ヒト皮膚に発現する薬物トランスポーター遺伝子多型・発現解析と経皮吸収への影響

発現することが報告されている 7 , 8）。本研究では、ヒト皮メチル化シトシン及び非メチル化シトシン由来のバンド強膚組織における薬物トランスポーターの発現プロファイル、度に基づき、以下に示す相対メチル化頻度を算出した。

発現量及び個人差に関する情報を整理するとともに、個人

非メチル化シトシン由来バンド強度

差要因並びに皮膚における機能解明を試みた。

２．方

相対メチル化頻度 = メチル化シトシン由来バンド強度 /法

2. 4. 臨床試験によるヒト皮脂量及び皮脂成分に対す
るトランスポーターの遺伝子多型の影響

2. 1. ヒト皮膚組織
ヒト皮膚組織は、白人の女性由来であり、部位は腹部又本試験は、九州大学病院臨床研究倫理審査委員会の審査、は胸部からなる 48 例である。本研究は、九州大学ヒトゲ

承認を得て実施した。同意の得られた 20 歳以上 60 歳未満

ノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会による審査を経て、の健康成人男性 91 名より全血 2 mL を採取した。血液か承認を得たものである。

ら genome DNA を抽出し、ダイレクトシークエンス法により SLC 22 A 3 遺伝子の - 1603 G>A の遺伝子診断を実施

2. 2. 遺伝子多型解析した。診断結果に基づき、- 1603 G ホモ型及び - 1603 A ホ

ヒト皮膚組織で最も高発現であり個人差も大きかった分

モ型それぞれ 10 及び 6 名を選択した。額及び背部に正中子種について、5’ 上流域の遺伝子多型解析を実施した。対線を挟んで左右対称に 3 × 3 cm の皮脂評価部位を 2 カ所設

象は皮膚組織検体 48 例とした。ヒト皮膚組織約 20 ～ 30

定し、一方を皮脂量、もう一方を皮脂成分評価用とした。

mg より genome DNA の抽出及び精製を行った。変異の有３．結

無をスクリーニングした後、ダイレクトシークエンス法に果

3. 1. ヒト皮膚組織に発現する薬物トランスポーターの探索より遺伝子型を決定した。

2. 3. DNAメチル化解析

白人女性皮膚組織由来 cDNA のプール試料（n= 20）を用

トランスポーター遺伝子周辺の CpG island 内のシトシ

い、ABC ファミリートランスポーター 26 種（ABCA 1 ~ 10、ン に つ い て、Combined Bisulfite Restriction Analysis

12、ABCB 1、ABCC 1 ~ 6、8、10 ~ 12、ABCG 1、2、5、8）（COBRA）法によりメチル化頻度を解析した。転写開始点

及び SLC ファミリートランスポーター 25 種（SLC 15 A 1、2、を起点に前後 20 , 000 bp の領域に存在する CpG island を、

SLC 16 A 1、3、7、8、SLC 22 A 1 ~ 8、10、11、SLC 46 A 1、CpG island searcher（http://cpgislands.usc.edu/）を用いて

SLC 4 7 A 1、2、SLCO 1 A 2、1 B 1、1 B 3、2 B 1、3 A 1、検索した。調製したbisulfite変換genome DNAを鋳型とし、

4 A 1）の発現をリアルタイムPCR法により探索した（Table

各 CpG island 領域を増幅した。得られた PCR 産物に対し1）。ヒト皮膚には、ABC ファミリー 8 種（ABCA 1、2、5、7、て制限酵素処理を用い、アガロースゲル電気泳動を行い、ABCC 1、3、5、ABCG 1）及 び SLC フ ァ ミ リ ー 8 種

Table 1

ABC and SLC transporter expression in human skin

Gene

Ct MeanGene

Ct MeanGene

Ct MeanGene

Ct Mean

ABCA 1ABCA 2ABCA 3ABCA 4ABCA 5ABCA 6ABCA 7ABCA 8ABCA 9ABCA 10ABCA 12ABCB 1
ABCC 128 . 929 . 131 . 1> 35
29 . 032 . 330 . 731 . 232 . 131 . 231 . 832 . 129 . 3

ABCC 2
ABCC 3
ABCC 4ABCC 5ABCC 6
ABCC 8ABCC 10ABCC 11ABCC 12ABCG 1
ABCG 2
ABCG 5ABCG 833 . 427 . 032 . 228 . 432 . 2> 35
33 . 233 . 6> 35
29 . 932 . 934 . 4> 35

SLC 15 A 1
SLC 15 A 2
SLC 16 A 1
SLC 16 A 3
SLC 16 A 7
SLC 16 A 8
SLC 22 A 1
SLC 22 A 2
SLC 22 A 3
SLC 22 A 4
SLC 22 A 5
SLC 22 A 6
SLC 22 A 7

30 . 632 . 529 . 733 . 330 . 0> 35
32 . 9> 35
28 . 633 . 030 . 2> 35> 35

SLC 22 A 8
SLC 22 A 10
SLC 22 A 11
SLC 46 A 1
SLC 47 A 1
SLC 47 A 2
SLCO 1 A 2
SLCO 1 B 1
SLCO 1 B 3
SLCO 2 B 1
SLCO 3 A 1
SLCO 4 A 1

> 35
> 35
> 35
32 . 529 . 230 . 4
> 35
> 35
> 35
30 . 128 . 933 . 7For easy comparison（1 st screening）, mean cycle threshold（Ct）values of each transporter were calculated. Sixteenth ofthe pooled cDNA was used as template for real-time PCR. Pooled cDNA was prepared by mixing identical volume ofcDNA（n= 20）． The Ct values of > 35 , in the range 31 to 35 and < 31 were interpreted as absence of gene expression,presense of gene expression but being below the limit of quantitation and presence of gene expression being at thequantitative level, respectively.

− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Table 2 Absolute expression levels of ABC and SLC transporter mRNAs in human skinshowing the lowest and highest values, means and standard deviations
Gene

Minimuma)

Maximuma)

Meana)

SDa)

Fold Changeb)

ABCA 1ABCA 2ABCA 5ABCA 7ABCB 1
ABCC 1
ABCC 3
ABCC 5ABCG 1
ABCG 2
SLC 15 A 1
SLC 16 A 1
SLC 16 A 7
SLC 22 A 3
SLC 22 A 5
SLC 47 A 2
SLCO 2 B 1
SLCO 3 A 1

2 . 052 . 690 . 837
0 . 546
0 . 664
3 . 155 . 11
1 . 231 . 110 . 0370
BD
1 . 482 . 652 . 96
0 . 894
0 . 2212 . 388 . 767 . 7310 . 86 . 323 . 664 . 4312 . 147 . 7
6 . 96
6 . 27
0 . 635
15 . 34 . 9217 . 526 . 97 . 8020 . 8
11 . 730 . 84 . 81
6 . 462 . 791 . 83
1 . 995 . 4220 . 13 . 572 . 52
0 . 338
4 . 002 . 97
6 . 957 . 84
3 . 082 . 455 . 3517 . 91 . 672 . 12
1 . 290 . 830 . 91
1 . 9912 . 6
1 . 731 . 190 . 182
4 . 44
1 . 064 . 265 . 491 . 654 . 71
2 . 41
7.2

3.8
4.0
7.6
6.7
6.7
3.8
9.3
5.6
5.7
17 . 140 . 8
3.3
6.6
9.1
8.7
93 . 94.9
3.5a）× 10 - 3 mol/mol GAPDHb）Maximum/Minimum ratio
BD: Below detection（SLC 1 5 A 1、1 6 A 1、1 6 A 7、2 2 A 3、2 2 A 5、4 7 A 2、

ABCC 3 /MRP 3 が 20 . 0 % を 占 め、 次 い で SLCO 3 A 1 /SLCO 2 B 1、3 A 1）が中～高発現していた（Ct < 31）。また、

OATP 3 A 1、SLC 22 A 3 /OCT 3 が そ れ ぞ れ 17 . 8 及 び

ABC ファミリー 14 種（ABCA 3、6、8 ~ 10、12、ABCB 1、

7 . 8 % で続き、上位 3 分子種で約 50 % を占めた。発現量がABCC 2、4、6、10、11、ABCG 2、ABCG 5）及 び SLC フ

多かった上位 3 分子種について、例数を追加して Pfaffl 法

ァ ミ リ ー 7 種（SLC 15 A 2、16 A 3、22 A 1、22 A 4、46 A 1、により発現量の個人差をさらに検討した。ヒト皮膚では

47 A 1、SLCO 4 A 1）は低発現であり（31 ≤ Ct ≤ 35）、それSLC 22 A 3 /OCT 3 の発現量の個人差が最も大きく、変動以外のトランスポーター（ABC ファミリー 4 種及び SLC フ

係数（%CV）は 61 . 8 % を示した。次いで、ABCC 3 /MRP 3ァミリー 10 種）については発現を確認できなかった（35 <の個人差が大きく（%CV：58 . 0）、SLCO 3 A 1 /OATP 3 A 1

Ct）。

は上位 3 分子種の中で最も個人差が小さかった（%CV：
40 . 0）。

3. 2. ヒト皮膚組織に発現する薬物トランスポーター
mRNAの定量

3. 3. ヒト皮膚組織におけるABCC3/MRP3発現に対するDNAメチル化の影響

前項で中～高発現に分類された 16 分子種、並びにマウス皮膚で輸送活性が報告されている ABCB 1 /MDR 1 及びABCC 3 /MRP 3 発現に対する 5’ 上流域の遺伝子多型のABCG 2 /BCRP について、個体別の cDNA（n= 18）を用い解析を行ったが、影響を認めなかった。このため次いでて絶対検量線法により発現量を定量した（Table 2）。そのDNA メ チ ル 化 の 影 響 を 検 討 し た。CpG island searcher

結果、ヒト皮膚では ABCC 3 /MRP 3 の発現量が最も多く、 （http://cpgislands.usc.edu/）を用い、CpG island を探索し20 . 1 ± 12 . 6（× 10 - 3 mol/mol GAPDH）を示した。次いで、た結果（%CG：50 % 以上、ObsCpG/ExpCpG：0 . 60 以上、

SLCO 3 A 1 /OATP 3 A 1、SLC 22 A 3 /OCT 3、SLC 16 A 7 /Length：200 bp 以 上、Gap between adjacent islands：

MCT 2、ABCA 2 /ABC 2 及び ABCC 1 /MRP 1 で高い発現100 bp 以上）、10 カ所の CpG island を同定した（Table 3）。

が認められ、それぞれ 17 . 9 ± 7 . 2、7 . 84 ± 5 . 49、6 . 95 ±であった。これらの結果に基づき、ヒト皮膚組織に構成的

3. 4. ヒト皮膚組織におけるABCC3/MRP3発現量とDNAメチル化頻度の相関解析に発現する薬物トランスポーター総量に対する個々の相対DNA メチル化頻度と ABCC 3 /MRP 3 mRNA 発現量と

的発現量比
（平均値）
を算出したところ、最も高発現であるの相関解析を行った。その結果、‒ 19895 位（CpG island

4.26、6.46 ± 2.12 及び 5.42 ± 1.99（×10-3 mol/mol GAPDH）− 172 −

ヒト皮膚に発現する薬物トランスポーター遺伝子多型・発現解析と経皮吸収への影響

Table 3 Location of CpG islands within 20 kbp up- and down-stream of the TSS
in the ABCC 3 gene
No.

Start

End

%GC

Obs/Exp

Length（bp）

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

– 20090– 16357– 15643– 13873– 13448– 9874
– 680
– 429
9717
19852

– 19881– 16153– 15423– 13600– 13221– 9674
– 532
502
10205
20429

53 . 356 . 650 . 760 . 6
57 . 557 . 767 . 170 . 754 . 453 . 60 . 6030.6
0 . 608
0 . 604
0 . 6030.6
0 . 602
0 . 732
0 . 611
0 . 657

210
205
221
274
228
201
149
931
489
578

No. 1）で は CG site の メ チ ル 化 頻 度 と ABCC 3 /MRP 3‒ 1603 G>A との関連について検討を加えた。同意の得らmRNA 発現量に正の相関を認めた（P < 0 . 05）。同様に、れた健康成人男性（20 歳代、86 名）より採取した全血から– 9718 位（CpG island No. 6）で は 負 の 相 関（P < 0 . 05）、

genome DNA を 抽 出 し、SLC 22 A 3 遺 伝 子 5’ 上 流 域– 13222 位（CpG island No. 5）では正の相関傾向（P < 0 . 10）‒ 1603 G>A の遺伝子検査を実施した。解析の結果、野生を 認 め た。 以 上 よ り、 ヒ ト 皮 膚 組 織 に お け る ABCC 3 /ホモ型、ヘテロ型及び変異ホモ型はそれぞれ 55、25 及びMRP 3 mRNA 発現制御に、これら CpG islands 内の DNA6 名で、アレル頻度は 21.5%であった。被験者 16 名（‒1603Gメチル化が関与する可能性が示された。

ホモ型：10 名、‒ 1603 A ホモ型 6 名）について、額及び背部の皮脂量を測定した。測定の結果、皮脂量は背部に比べ3. 5. ヒト皮膚組織におけるSLC22A3/OCT3発現に対する5’上流域の遺伝子多型の影響
白人女性皮膚（n= 48）より抽出した genome DNA を用い、額で多く、また、定常皮脂量の方が回復皮脂量より多い傾向であった。遺伝子型と皮脂量との関係について、背部の定常皮脂量では遺伝子型による差がある傾向であった。

SLC 22 A 3 遺伝子の 5’ 上流域約 2 kbp に存在する遺伝子多４．考察と総括型を網羅的に解析した。その結果、14 種の SNPs を同定し、そ の う ち ‒ 1672 C>T、‒ 632 insGCCCT、‒ 626 ～ ‒ 622 del「ヒト皮膚組織に発現する薬物トランスポーターの定量

GCCCT、‒ 295 G>A の 4 種は未報告の変異であった。また、とその個人差要因の解析」と題し、薬物の皮内動態及び皮アレル頻度が 50 % 以上と高頻度で存在する変異が 5 種、内応答性に関与しうる薬物トランスポーターの発現探索及10 ～ 30 % と比較的高頻度の変異が 3 種存在した。

び定量と、その個人差要因並びに機能解明に関する研究を展開した。薬物動態に重要とされる分子種を中心に、ヒト

3. 6. ヒト皮膚におけるSLC22A3/OCT3発現量と5’上流域の遺伝子多型の関係

皮膚組織における発現プロファイルを検討し、定量可能と判断した分子種についてその絶対発現量を評価した。合わ

同定した SNPs がヒト皮膚における SLC 22 A 3 /OCT 3

せて、最も高発現であった ABCC 3 /MRP 3 については、

mRNA 発 現 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た。 そ の 結 果、発現の個人差要因の一部を解明した。比較的多数例の皮膚‒ 1603 G>A では変異による有意な発現量の低下を認めた組織を用いて取得できたこれらの知見は、皮膚での毒性・が（P= 0 . 008）
、残りの遺伝子多型では有意な影響は認めな

薬効発現の個人差を考察する上で重要であり、皮膚におけかった。

る薬物トランスポーターの生理機能等の類推にも役立つと考えている。また、ヒト皮膚における SLC 22 A 3 /OCT 3 発

3. 7. ヒト皮脂量及び皮脂成分に対するSLC22A3遺伝子5’上流域–1603G>Aの影響

現の局在及び個人差要因を検討し、臨床研究にて皮脂量及これまでの検討の結果、ヒト皮膚における発現量の個人

SLC 22 A 1 /OCT 1 及 び SLC 22 A 3 /OCT 2 の paralog で あ差に 5’ 上流域の SNP（‒ 1603 G>A）が寄与する可能性が示

る SCL 22 A 3 /OCT 3 が皮膚で比較的高発現であり、皮膚された。SLC 22 A 3 /OCT 3 はテストステロン及びプロゲにおける局在及び個人差要因を解明できたことは、臨床上ステロンの輸送に関わるトランスポーターであり、両ホル

意義のある知見に繋がる可能性があると考えている。本研

モンは皮脂分泌の促進に関与すると考えられていることか

究では「ヒト皮膚と薬物トランスポーター」について、基礎

ら、皮脂に着目しその個人差と SLC 22 A 3 遺伝子 5’ 上流域

的知見の収集から臨床研究の遂行に至るまで多岐にわたる

び皮脂成分に対する SLC 22 A 3 /OCT 3 の影響を評価した。

− 173 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021検討を実施できた。皮膚は薬物の投与部位としてますます

3） Maeda K and Sugiyama Y.: Impact of genetic

多くの注目を集めているが、薬物の皮内動態及び制御に関

polymorphisms of transporters on the pharmacokinetic,

する研究はまだ始まったばかりである。齧歯動物皮膚及びpharmacodynamic and toxicological properties of

ヒト皮膚由来細胞では、薬物トランスポーターが薬物輸送

anionic drugs. Drug Metab Pharmacokinet. 23, 223-35に寄与することが報告されていることから、ヒト皮膚（臨（2008）．

床）における薬物トランスポーターの寄与について明らか

4） I e i r i I , H i g u c h i S , S u g i y a m a Y . G e n e t i cとしていくことが今後の課題のひとつと考える。また、各polymorphisms of uptake（OATP1B1, 1B3）and efflux

薬物トランスポーターの基質群の特性から、皮膚の恒常性（MRP2, BCRP）transporters: implications for inter-

維持に薬物トランスポーターが重要な役割を果たしている

individual differences in the pharmacokinetics and

ことを類推でき、薬物輸送のみでなく、皮膚の機能維持及pharmacodynamics of statins and other clinically

び疾患発症との関連研究を展開していくことも重要と言え

relevant drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5,る。本研究における成果がそうした研究の駆動力となり、

703-29（2009）．
5） Jones PA, Takai D. The role of DNA methylation in

皮膚科学研究が推進されることを期待する。

mammalian epigenetics. Science. 293, 1068-70（2001）．
謝辞6） Das PM, Singal R. DNA methylation and cancer. J

本研究の遂行にあたり、助成してくださいましたコーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝いたします。この場

Clin Oncol. 22, 4632-42（2004）．
7） Baron JM, Höller D, Schiffer R, Frankenberg S, Neis
M, Merk HF, Jugert FK. Expression of multiple

を借りて、厚く御礼申し上げます。

cytochrome p4 5 0 enzymes and multidrug resistance（引用文献）

associated transport proteins in human skin1） Cascorbi I. Role of pharmacogenetics of ATP-binding

keratinocytes. J Invest Dermatol. 116, 541-8（2001）．

cassette transporters in the pharmacokinetics of drugs.

8） Schiffer R, Neis M, Höller D, Rodríguez F, Geier A,
Gartung C, Lammert F, Dreuw A, Zwadlo-Klarwasser

Pharmacol Ther. 112, 457-73（2006）．
2） Schneck DW, Birmingham BK, Zalikowski JA,

G, Merk H, Jugert F, Baron JM. Active influx transport

Mitchell PD, Wang Y, Martin PD, Lasseter KC, Brown

is mediated by members of the organic anion

CD, Windass AS and Raza A. The effect of gemfibrozil

transporting polypeptide family in human epidermal

on the pharmacokinetics of rosuvastatin. Clin

keratinocytes. J Invest Dermatol. 120, 285-91（2003）．

Pharmacol Ther. 75, 455-63（2004）．

− 174 −

創傷治癒に関わる細胞挙動に対するソフトマテリアルによるメカノストレスの影響評価
大阪府立大学大学院理学系研究科

森英樹

We evaluated the migration ability of fibroblasts and vascular endothelial cells by scratch assay. To evaluate the cell
migration ability, cell images were acquired over time as the cells were cultured after cell detachment by scratch treatment.
Since both cells filled the detached area by proliferation and migration within 48 hours, the migration rate and direction ofeach cell was determined by image analysis and calculation based on the temporal images of the cells during 48 hours ofculture. Compared to fibroblasts, vascular endothelial cells tended to migrate more perpendicular to the boundary with thedetached area. In addition, the migration rate of vascular endothelial cells was slower than that of fibroblasts. By analyzing
the migration characteristics of individual cells, we were able to find differences in the migration characteristics of different
cell types, which cannot be determined by the conventional method of measuring the total area covered by cells. To investigate the effect of covering with a soft hydrogel as a wound dressing on cell migration, a scratch assay was performed on
vascular endothelial cells covered with gelatin-alginate gel after cell detachment. The gel-covered vascular endothelial cells
lost their polarity in the direction of migration, and their migration rate became slower. Covering with a soft gelatin-alginate
gel seemed to have the effect of delaying the migration of cells to re-cover the wound.

1．緒に細胞の移動能がどのように変化するかを調べることを目

言

的とした。

創傷治癒には、皮膚を構成する線維芽細胞やケラチノサ

２．方

イトだけでなく、血管を構成する血管内皮細胞など多くの細胞が関わる。外傷の治療に用いられる創傷被覆材には繊法

2. 1. 細胞の培養

維や軟らかいハイドロゲルなどが用いられるが、その材質

実験にはマウス線維芽細胞の株化細胞である SNL とマ

や硬さ
（粘弾性）
はそれらの細胞の移動や形態を含めた様々

ウス血管内皮細胞の株化細胞である b.End 3 と UV ♀ 2 をな挙動に影響を与えると考えられる。近年、物理的刺激の用いた。細胞は 10 % FBS および抗生物質を含む DMEM

1 つとして細胞の足場の硬さに対する細胞の応答メカニズ

培地を用い、ポリスチレン製培養皿上に播種し、炭酸ガス

ムが明らかになってきているが、細胞種によってその応答

インキュベータ内で 37 ℃、5 ％ CO 2 条件下で培養した。

性は異なる 1 - 3）。複数種類の細胞からなる生体組織の再生を促すために用いられる生体材料の選定には、それぞれの2. 2. スクラッチアッセイ

細胞の材料の硬さに対する応答性も考慮する必要がある。

細胞を 3 cm 培養皿上で 80 ％コンフルエントの状態にな

近年の情報科学技術の進歩に伴い、研究に利用できる性能

るまで培養し、滅菌済ピペットチップの先で接着した細胞をもったカメラやコンピュータを比較的安価に入手できるの上を１回引掻くことで、幅約 700 µm の直線状の傷をつようになり、比較的情報量の大きい経時的な培養細胞の画けるように細胞を剥がした（図 1）。更に、その細胞を引き像データを簡便に保存、解析できるようになった。培養細続き 2 日間培養する様子を、炭酸ガスインキュベータ内に胞の経時的な画像は個々の細胞の移動や形態などに関する非常に多くの情報を含んでいると考えられる。そこで本研
究では、インビトロ創傷治癒アッセイ法として利用されているスクラッチアッセイを用いて、線維芽細胞と血管内皮細胞の運動能の違いを調べるとともに、創傷被覆材などに利用されるアルギン酸カルシウムゲルで細胞を被覆した時

Evaluation of the effect of mechanostressby soft materials on cellular behaviors
related to wound healing
図1

Hideki Mori
Graduate School of Science, Osaka
Prefecture University− 175 −細胞の剥離方法（A）細胞の剥離方向と（B）剥離した細胞の画像（scale bar= 100μm）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

設置した細胞顕微観察装置 CytoWatcher（ アトー社製）を用いて、20 分間或いは 30 分間隔で経時的に撮影した。

2. 3. 細胞の画像解析
経時的に得られた細胞画像をもとに、画像解析プログラ
ム ImageJ を用いて各画像における各細胞の座標を求めた。
連続的に細胞を撮影することができた計 110～130 個の細胞の座標データから各細胞の 6 時間毎の移動方向と移動距離を求めた。図 2 には細胞の移動方向 θ と移動距離 l を図−1示した。細胞の移動速度 v = l ×（t 1 − t 0）とした。

2. 4. ゼラチン-アルギン酸カルシウム混合ゲルの作製
アルギン酸ナトリウムが１％、ゼラチンが 8 ％になるよ

図2

うに蒸留水に溶解し、ゼラチン - アルギン酸ナトリウム混画像解析による細胞移動の距離と移動方向の表し方

合液を作製した。ゼラチン - アルギン酸ナトリウム混合液
をアルミ製円筒形金型に入れ、18 ℃ 24 時間、10 ℃ 2 時間、
4 ℃ 24 時間の順に冷却し、直径 15 mm、高さ 5 mm の円筒形ゲルを作製した。更にこのゲルを 0 . 5 M 塩化カルシウ
ム溶液に 24 時間浸漬した後にオートクレーブ処理を施し、HEPES 緩衝液に 3 日間浸漬したものを実験に用いた。ス
クラッチアッセイを実施する直前に、観察する細胞の上からゼラチン - アルギン酸カルシウム混合ゲル（ハイドロゲ
ル）を被せた
（図 3）
。

３．結

果

細胞の移動特性を知るためにスクラッチ処理によって細胞を剥離した部分は、いずれの細胞でも増殖と移動によっ

図3て剥離後 48 時間程度で細胞が剥離部を埋めた。剥離部を細胞へのハイドロゲルの被せ方

埋めるまでの 48 時間における細胞の移動特性を評価する
ために、12 時間毎の細胞の移動方向と移動速度の分布を解析し、図４および図 5 に示した。線維芽細胞 SNL は、

34 μm/h で各培養期間の中で最も高かった（図 5 B）。

スクラッチ処理後 12 時間ではスクラッチ方向に対して垂ヤング率 50 kPa 程度の弾性をもつハイドロゲルである

直な方向（0±22 . 5 °）へ向かう細胞が全体の約 8 割を占めてゼラチン - アルギン酸カルシウム混合ゲルを細胞に被せたいたが、12 ～ 24 時間では全体の 4 割程度であり、48 時間時の血管内皮細胞 UV ♀ 2 の移動方向と移動速度に関して、以降では移動方向の極性がほとんど見られなくなった（図

移動速度が最も高くなるスクラッチ処理後 12 時間におけ4 A）。SNL の細胞移動速度は、スクラッチ処理後 24 時間

る値をもとに解析した。ゲルを被せていない対照条件ではまでは約 9 割の細胞が 130 μm/h より低い移動速度で、様々

UV ♀ 2 の移動方向は垂直方向（θ ＝ 0±22 . 5 °）に明らかなな速度の細胞が見られた。細胞移動速度の平均値はスクラ

極性が見られたが、ゲルを被せて培養した条件では細胞のッチ処理後 12 ～ 24 時間で 74 μm/h と最も高く、24 時間

移動方向は 360 °を 24 分割したすべての方向にわたってお以降では徐々に低下した（図 4 B）。

り、移動方向に大きな偏りが見られなかった（図 6）。細胞

一方、血管内皮細胞 b.End 3 では、スクラッチ処理後 24の移動速度もゲルを被せて培養した条件の平均値は 20 μm/

時間までスクラッチ方向に対して垂直に進む細胞は全体のh で、対照条件の平均値 39 μm/h に比べ低下した（図 7）。

7 割以上を占め、24 ～ 36 時間でも半数の細胞が垂直方向

また、対照条件では細胞移動速度 v= 10 - 20 μm/h が最頻値へ移動しており、SNL に比べて移動方向に極性が見られであるのに対し、ゲルを被せて培養した条件では細胞移動た（図 5 A）
。移動速度に関しては大部分の細胞が 80 μm/h

速度 v = 0 - 10 μm/h が最頻値であった。軟らかいゼラチン -よりも低い速度で移動しており、SNL よりも低かった。ス

アルギン酸カルシウム混合ゲルを被せることによって、被クラッチ処理後 12 ～ 24 時間における移動速度の平均値がせられた血管内皮細胞の移動特性に変化が生じた。

− 176 −

創傷治癒に関わる細胞挙動に対するソフトマテリアルによるメカノストレスの影響評価

AB

図4 スクラッチアッセイにおける線維芽細胞の移動特性
線維芽細胞SNLの（A）移動方向と（B）移動速度のヒストグラム− 177 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

AB

図5 スクラッチアッセイにおける血管内皮細胞の移動特性
血管内細胞b.End 3の（A）移動方向と（B）移動速度のヒストグラム− 178 −

創傷治癒に関わる細胞挙動に対するソフトマテリアルによるメカノストレスの影響評価

図6 ハイドロゲル被覆培養時の血管内皮細胞UV♀2の移動方向の分布

４．考察

スクラッチアッセイは in vitro で簡便に細胞の移動を評
価できる創傷治癒アッセイ法として、皮膚の再生に関わる
細胞挙動の研究や塗布薬として効果が期待される低分子化合物の評価など多くの研究に用いられている 4 - 6）。しかし、これらのスクラッチアッセイの評価方法の多くは、スクラ
ッチあるいは専用の型によって細胞培養容器中に細胞剥離部を作製し、その剥離部が細胞によって再び覆われる様子を観察し、細胞の再被覆面積の経時変化を定量するものである 7）。細胞剥離部の再被覆面積の計測は、創傷治癒に対する薬効を簡便に判断できる利用しやすい指標であるが、その細胞による再被覆のメカニズムを知るためには個々の細胞の挙動を注意深く観察し、適切なパラメーターで評価する必要がある。本研究では、細胞の移動方向と移動速度の 2 つのパラメーターに絞って評価した。線維芽細胞由来の SNL と血管内皮細胞由来の b.End 3 では移動方向と移動
速度のどちらの特性も異なっていた。細胞剥離部を細胞が再被覆する面積および速度を議論する上で、細胞移動速度

図7 ハイドロゲル被覆培養時の血管内皮細胞UV♀2の移動速度の分布だけでなく、細胞の移動方向の極性についても考慮する必５．総要がありそうである。最近、細胞集団運動の方向性が細胞間におけるセリン／トレオニンキナーゼである ERK の活8）

括スクラッチアッセイによって得られた細胞の経時的な画

性伝搬によって決まることが報告された 。血管内皮細胞像をもとに、個々の細胞の 2 種類の移動特性（移動方向、由来の UV ♀ 2 はゼラチン - アルギン酸カルシウム混合ゲ

移動速度）を評価した。線維芽細胞と血管内皮細胞の間でルを被せたことによって移動の方向性の極性が見られなく細胞種による移動特性の違いを見つけた。また、ゼラチンなったことはゲルの粘弾性が ERK 活性伝搬に何らかの影- アルギン酸カルシウム混合ゲルを血管内皮細胞の上に被響を及ぼしているかもしれない。今後、これらの因果関係

せて培養すると、細胞の移動方向に偏りが見られなくなり、について細胞種やパラメーターを増やし、更に研究を進め

移動速度を低下させることを見つけた。本研究で用いた 2る必要がある。

つの移動特性は創傷治癒に関する細胞挙動評価パラメータ− 179 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

ーとして、創傷被覆材を評価する指標になることが期待で

analysis of cell migration in vitro, Nature Protocols, 2,

きる。

329-333（2007）．
5）A. Grada, M. Otero-Vinas, F. Prieto-Castrillo, Z. Obagi,（引用文献）

V. Falanga, Research techniques made simple: Analysis

1） S. Dupont, L. Morsut, M. Aragona, E. Enzo, S. Giulitti,
M. Cordenonsi, F. Zanconato, J. Le Digabel, M. Forcato,of collective cell migration using the wound healing
assay, J. Invest. Dermatol., 137, e11-e16（2017）．

S. Bicciato, N. Elvassore, S. Piccolo, Role of YAP/TAZ

6） P. Sarkhail, L. Navidpour, M. Rahimifard, N. M.

in mechanotransduction, Nature, 474, 179-185（2011）．

Hosseini, E. Souri, Bioassay-guided fractionation and2） H. Mori, A. Takahashi, A. Horimoto, M. Hara,

identification of wound healing active compound from

Migration of glial cells differentiated from neurosphere-

Pistacia vera L. hull extract, J. Ethnopharmacol. 2 4 8,

forming neural stem/progenitor cells depended on the112335（2020）．

stiffness of the chemically cross-linked collagen gel7） F. Cappiello, B. Casciaro, M. L. Mangoni, A novel invitro wound healing assay to evaluate cell migration, J.

substrate, Neurosci. Lett., 555, 1-6（2013）．
3） P. A. Janmey, D. A. Fletcher, C. A. Reinhart-King,
Stiffness Sensing by Cells, Physiol. Rev., 100, 695 -724

Vis. Exp., 133, e56825（2018）．
8） K. Aoki, Y. Kondo, H. Naoki, T. Hiratsuka, R.Í E. Itoh,（2020）．

M. Matsuda, Propagating wave of ERK activation4）C. -C. Liang, A. Y. Park, J. -L. Guan, In vitro scratchorients collective cell migration, Dev. Cell, 43, 305-317

assay: a convenient and inexpensive method for（2017）．

− 180 −

ミトコンドリアを標的とするナノカプセル型機能性化粧品の開発
北海道大学大学院薬学研究院

山田勇磨

Mitochondria, which have a variety of functions, are attracting the interest of scientists, since they are organelles thatcan contribute to the realization of innovative disease treatments, the maintenance of beauty and health, and development in
the life sciences. To date, data related to commercially available cosmetic products that deliver functional molecules to mitochondria to exert cosmetic effects have not been reported. The aim of this study is to develop a nanocapsule-type functional
cosmetic product that targets mitochondria. To accomplish this, we propose to use a nanocapsule (MITO-Porter) to deliver
molecules to mitochondria in human skin cells. The proposal includes "Construction of drug-encapsulated nanocapsules","Verification of cellular uptake and mitochondrial delivery of the nanocapusule" and " Functional evaluation of mitochondria”.

1．緒価 ）」 の 順 に 研 究 を 進 め た。 本 報 告 書 で は、 特 に、「1 .

言CoQ 10 -MITO-Porter の構築」および「2 . 培養細胞を用いた多彩な機能を有するミトコンドリアは、革新的疾患治療

細胞内動態観察」について詳細を報告する。

の実現、美容・健康の維持、ライフサイエンスの発展に寄

２．方与するオルガネラとして注目されている。本オルガネラは、法

抗酸化効果およびアンチエージング効果に深く関連する、

2. 1. CoQ10 -MITO-Porterの調製

活性酸素シグナル調節、エネルギー（ATP）産生を担うた

２．
１．
１.

め、化粧品のターゲットとしても注目される。現在までに

マイクロ流体デバイスを利用したナノカプセル調

製の検討

市販されている化粧品において、細胞内部のオルガネラに本研究では、ATP 酸性の補酵素であり抗酸化能を有す

機能性分子を送達・作用させ、美容効果を発揮させた商品

る CoQ 10 を MITO-Porter 1）に内封した CoQ 10 -MITO-Porterの報告例は皆無である。

の調製を行った。MITO-Porter は北海道大学・大学院薬本研究では、皮膚細胞のミトコンドリアに作用して細胞学研究院・薬剤分子設計学研究室（以下、当研究室と略す）の ATP 産生能・代謝能を亢進させるアンチエージング効で開発したミトコンドリア標的型ナノカプセルであり、ミ果の獲得、ミトコンドリアで産生される余剰活性酸素を除トコンドリア膜融合を有する脂質二重膜小胞（リポソーム）

去し抗酸化能の獲得を可能とする『ミトコンドリアを標的からなる（Fig. 1）。MITO-Porterを用いた戦略では、ミトとするナノカプセル型機能性化粧品』の開発を目指す。ミコンドリア膜との膜融合を介して内封分子を放出させるため、トコンドリアの分子送達に関しては、ミトコンドリア標的

送達分子の種類やサイズによらない送達が可能となる 2 - 4）。

型ナノカプセル・MITO-Porter 1 - 3）を基盤カプセルとし、当研究室では、CoQ 10 -MITO-Porter の構築を種々の調

ヒト由来皮膚細胞のミトコンドリア内部に機能性分子を送製法を用いて検討を進めていた。単純水和法、逆相蒸発法、達する戦略を試みる。送達分子候補としては、ATP 酸性

エタノール希釈法を用いた検討において、エタノール希釈の補酵素であり抗酸化能を有するコエンザイム Q 10（CoQ 10）

法（以下、従来法）を用いた際に、CoQ 10 の搭載率が高いなどを用いる。

CoQ 10 -MITO-Porterを構築できることを報告していた 5）。

本申請研究では、「薬剤封入ナノカプセルの構築（1 .
CoQ 10 -MITO-Porter の構築）」、
「細胞導入、ミトコンド
リアへの分子送達の検証（2 . 培養細胞を用いた細胞内動態観察）」、および「機能評価（3 . ミトコンドリアの機能評

Development of na nocapsu le -t y pefunctiona l cosmetics for ta rgeting
mitochondria
Yuma Yamada
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Hokkaido University

Fig. 1− 181 −

Mitochondrial delivery using a MITO-Porter systemコスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

一方で、CoQ 10 の難水溶性により、リポソーム調製の効率終工程として、iLiNP で調製した CoQ 10 -MITO-Porter 溶を低下させ、粒子径が不均一であり、1 回の調製に得られ液は、透析（2 時間、4 ℃）を行い含有するエタノールを除る収量が微量であることなどが問題であった。

去した。粒子物性の測定方法については次項に記載する。

本申請研究では、実用化を見据え、均一性の高いナノ粒

２．１．２.

CoQ10 -MITO-Porter の物性評価および 保存

子を無菌的に大量調製が可能なマイクロ流体デバイスを利

安定性の検証用した粒子調製を試みた。具体的には、共同研究者である

前項に記載の方法で、CoQ 10 を含有した CoQ 10 -MITO-

北海道大学・大学院工学研究院・渡慶次学教授、真栄城正Porter を調製し、粒子径、PdI（均一性の指標であり、値寿助教が開発したマイクロ流体デバイス（invasive lipidが小さい方が均一性が高い）、ゼータ電位（表面電位）を測

nanoparticle production（iLiNP）device）を用いて、エタ

定し、構築した粒子物性の最適化を図った。粒子径およびノール希釈法の原理を利用した CoQ 10 -MITO-Porter の構

PdI は動的光散乱法を、ゼータ電位は電気泳動法を利用し6）築を検討した 。エタノール希釈法では、脂質のエタノーた原理に基づき、Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments

ル溶液に水系緩衝液を加え脂質の溶解度を下げることで脂Ltd., Malvern, WR, UK）
を用いて測定した。

質の自己集合化を促し脂質を粒子化する。iLiNP によってまた、調製した粒子の安定性を評価するために、4 ℃お脂質懸濁液（CoQ 10 を含む）と緩衝液を急速に混合・攪拌す

よび 25 ℃、遮光下にて 14 日間保管し、経時的に物性を評ることで均一な粒子調製、連続調製を可能とする（Fig. 2）。

価した。

iLiNP を用いた脂質粒子調製では、①脂質相の組成、②水相の種類、③総流速、④流速比（水相 / 脂質相の流速の2. 2. 培養細胞を用いた細胞内動態観察

比率 =EtOH 希釈濃度に相当）を変化させることにより多彩

マ イ ク ロ 流 体 デ バ イ ス で を 用 い て 調 製 し た CoQ 10 -な粒子設計が可能となる。①脂質相の組成には、MITO-

MITO-Porter［µ］および従来法で調製した CoQ 10 -MITO-

Porter を 構 成 す る ナ ノ カ プ セ ル 材 料［1 , 2 -Dioleoyl-sn-

Porter［ED］の細胞内動態を観察した。ヒト由来皮膚細胞

glycero- 3 -phosphoethanolamine（DOPE）/ sphingomyelinを含む培養細胞で検討を行ったが、特許出願準備中のため、（SM）/ 1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxy polyethylene

ここではヒト子宮頸がん由来細胞（HeLa 細胞）を用いた研

glycol 2 0 0 0 （DMG-PEG 2 0 0 0）/ Stearylated R 8

究成果を紹介する。

（STR-R 8）］および CoQ 10 を含有するエタノール懸濁液を

２．２．
１.

細胞取り込み能評価準備した。②水相には、
phosphate buffered saline（PBS）（‒）

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］および従来法で調製した CoQ 10 -およびHEPES glucose を用いて検討を進めた。③総流速はMITO-Porter［ED］の細胞導入能を評価するために、蛍光標

500 µL/min に固定し、④流速比は、EtOH 希釈濃度が 10 %、識（DOPE-N-（7 -nitro- 2 - 1 , 3 -benzoxadiazole- 4 -yl）

20 %、30 %、40 ％となるように設定して検討を進めた。最（NBD-DOPE）を脂質量の 0 . 5 mol% 含有）を施した。粒子をFig. 2 Schematic image showing the preparation of the CoQ 10 -MITO-Porter by ethanol
dilution（A）and by using microfluidic device named iLiNP device（B）．

− 182 −

ミトコンドリアを標的とするナノカプセル型機能性化粧品の開発

HeLa 細胞に添加し、１時間インキュベーションした（37 ℃ , 5 %を評価するために、ミトコンドリア酸素消費量（OCR）を

CO 2）。細胞に取り込まれた粒子の蛍光量をフローサイトメ

Agilent Seahorse XFp extracellular flux analyzer

リー（FACS）（Gallious; Beckman Coulter Inc., Pasadena, MA,（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いてUSA）を用いて平均蛍光強度を測定し、細胞取り込み能を評価した。ミトコンドリア機能の指標として基礎呼吸能評価した。

（mitochondrial basal respiration）お よ び 最 大 呼 吸 能

２．
２．２.

細胞内局在観察（Maximal respiration）を計測した。本評価の詳細な方法

上記に従い調製した蛍光標識粒子（緑色）を HeLa 細胞添は既報を参考にして頂きたい 7）。

加し、インキュベーションした（37 ℃ , 5 % CO 2）。赤色の３．結果・考察ミトコンドリア染色試薬 Mito Tracker Deep Red（Thermo
Fisher Scientific）でミトコンドリアを染色した後、粒子添

3. 1. CoQ10 -MITO-Porterの調製

加より 3 時間後の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡

３．
１．
１

マイクロ流体デバイスを利用したナノカプセル調（CLSM）を用いて観察した。緑色の粒子が赤色に染色した製の検討

ミトコンドリアに局在した場合には、黄色のシグナルとし

iLiNP を用いた CoQ 10 -MITO-Porter［µ］の調製において、て観察される。また、画像解析を行い、下記の式 1 に従い、①脂質相の組成、②水相の種類、③総流速、④流速比（水ミトコンドリア占有率を算出した。

相 / 脂質相の流速の比率 = EtOH 希釈濃度に相当）の条件をミ
トコンドリア占有率（%）
１細胞中の黄色領域（共局在）
の面積平均
×100
＝
１細胞中の赤色領域（染色したミ
トコンドリア）の面積平均検討した。Fig. 3 に検討結果を示す 6）。本検討では、①脂質 相 に は MITO-Porter を 構 成 す る ナ ノ カ プ セ ル 材 料…式１

2. 3. ミトコンドリアの機能評価［DOPE/SM/DMG-PEG/STR-R 8］および CoQ 10 を含有す
るエタノール懸濁液を充填し、③総流速は 500 µL/min に固定して検討を進めた。

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］添加時のミトコンドリア機能④流速比は、エタノール希釈濃度が 10 %、20 %、30 %、Fig. 3 Effect of ethanol dilution concentration on the physicochemical properties of the CoQ 10 -MITO-Porter［μ］. Particle size and PDI of the CoQ 10 -MITO-Porter［μ］prepared in PBS（-）（A）and HEPES glucose（B）
are shown.

− 183 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Fig. 4 Comparison of physicochemical properties between the CoQ 10 -MITO-Porter［ED］and the CoQ 10 MITO-Porter［μ］． The particle size（A）, dispersibility（B）and ζ-potential（C）are shown.

40 ％となるように検討を進めた。②水相の種類を PBS（-）とした際の粒子形成後の物性評価結果を Fig. 3 A（a）に、HEPES glucose とした際の結果を Fig. 3 B（a）に提示する。
エタノール希釈濃度の低下に依存して粒子径が小さくなった。水相に PBS（-）を用いた群では、エタノール希釈濃度
が 20 ～ 30 % の時、PdI は約 0 . 12 と単分散であったが、エタノール希釈濃度 10 % では他の希釈濃度よりも多分散であった（Fig. 3 A（a））
。一方、水相に HEPES glucose を用いた場合には、PBS（-）群と比較して PdI 値が大きく単分散性は低かった（Fig. 3 B（a））
。
最終工程として、iLiNPで調製したCoQ 10 -MITO-Porter 溶液を透析した際の粒子物性を（Fig. 3 A（b）
）および（Fig. 3 B（b））に示す。粒子径は両溶媒とも小さくなる傾向を認めた

Fig. 5．
Evaluation of the stability of CoQ 10 -MITO-Porter［μ］

が、PdI については増加が認められた。特に HEPES glucoseを用いた際には、PdI の増加が顕著であった。ここまでの検討より、②水相の種類をPBS（-）
、④流速比を 20％に設定しCoQ 10 -MITO-Porter［µ］を調製することとした。

保存温度であることを確認した（Fig. 5）。
調製量も従来技術では µL オーダーであったが、iLiNPを用いた方法では実験室でも L オーダーでの大量調製が見込める。調製時間も大容量になるほど iLiNP を用いた調製

３．１．２

CoQ10 -MITO-Porter の物性評価および 保 存法の方が、短時間で調製ができる。従って、iLiNP を用い安定性の検証た CoQ 10 -MITO-Porter［µ］調製は微小化・均一・大量調従来技術を用いて調製した CoQ 10 -MITO-Porter［ED］

製を可能にする技術として期待できる。

と比較し、iLiNPを用いた調製したCoQ 10 -MITO-Porter［µ］は、粒子径が小さく（Fig. 4 A）
、PdI も小さい傾向にあっ

3. 2. 培養細胞を用いた細胞内動態観察

た（Fig. 4 B）。特に透析後は、均一な精度の高い粒子が調３．２．
１

細胞取り込み能評価製できた 6）。iLiNP を用いることにより粒子径は約 50 nm

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］（粒子径 48 nm）および従来法と従来技術より 1 / 2 倍小さな粒子となった（Fig. 4 A）。ゼ

で調製した CoQ 10 -MITO-Porter［ED］（粒子径 96 nm）のータ電位においても約 + 20 mV であり（Fig. 4 C）
、ほぼ一定

細胞導入能を評価した 6）。その結果、50nm 程度の CoQ 10 -

して正電荷ペプチドである Octaarginine（R 8）を修飾でき

MITO-Porter［µ］の細胞取り込みを評価した結果、従来型たと考えられる。

MITO-Porter（100 nm 程度）と比較して有意に高い細胞取調製した CoQ 10 -MITO-Porter［µ］の安定性を評価する

り込みを確認した（Fig. 6）。

ために、4 ℃および 25 ℃、遮光下にて 14 日間の安定性試

３．
２．
２ 細胞内局在観察験を行った 6）。その結果、25 ℃においては経時的に粒子径CoQ 10 -MITO-Porter［µ］の細胞内局在を観察した 6）。そが増大した。一方、
4 ℃では粒子径が約 50 nm 付近を維持し、の結果、従来法（CoQ 10 -MITO-Porter［ED］）と比較して細安定な CoQ 10 -MITO-Porter［µ］の保存には 4 ℃が適切な胞内に多くの緑蛍光シグナルが観察され、細胞への導入効− 184 −

ミトコンドリアを標的とするナノカプセル型機能性化粧品の開発率が優れていることを確認した（Fig. 7 A（a）,（c））。さらに、

3. 3. ミトコンドリアの機能評価

緑色の CoQ 10 -MITO-Porter［µ］と赤色に染色したミトコ

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］をヒト由来皮膚細胞に添加し、ンドリアとの共局在を示す黄色シグナルが観察され（Fig.

その後にミトコンドリア機能の指標としてミトコンドリア

7 A（b）,（d））
、CoQ 10 -MITO-Porter［µ］がミトコンドリア

基礎呼吸能およびミトコンドリア最大呼吸能を計測した。

に集積することを確認した。

特許出願準備中のため、詳細は開示できないが、構成を最顕微鏡で取得した画像を解析し、粒子のミトコンドリア

適化した CoQ 10 -MITO-Porter［µ］を用いた際には、CoQ

占 有 率 を 算 出 し た 結 果 を Fig. 7 B に 示 す。 そ の 結 果、単独投与では観察されなかったミトコンドリア機能の向上

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］は、CoQ 10 -MITO-Porter［ED］とが確認されている。

比べて優位に高いミトコンドリア占有率を示した。

４．総

過去の報告で、理論計算および実験データより、効率的な細胞取り込みに最適な粒子径は 40～60 nm との報告がある。従って、iLiNP で調製した約 50 nm の CoQ 10 -MITOPorter［µ］、効率よく細胞に取り込まれ、ミトコンドリア
へ集積量も向上したと推察される。

括

本報告書では、以下の内容を報告した。
（1）マイクロ流路デバイスを利用して微小なCoQ 10 -MITOPorter［µ］を調製することに成功した。
（2）CoQ 10 -MITO-Porter［µ］が高効率に細胞に取り込まれミトコンドリアへ集積することを確認した。
（3）CoQ 10 -MITO-Porter［µ］が細胞のミトコンドリア機能を向上させることを確認した。
市販されている化粧品には、抗酸化効果やアンチエージ
ング効果を宣伝している商品があるが、機能性分子が作用部位である皮膚細胞膜や細胞内部に導入されていることは示されていない。美容効果が得られることは確認されていると思われるが、その能力を最大限には発揮できていないと思われる。さらに、細胞内部のオルガネラに機能性分子を送達・作用させ、美容効果を発揮させた商品の報告例は皆無である。そのため、抗酸化効果およびアンチエージン

Fig. 6 Cellular uptake of the CoQ 10 -MITO-Porter by
HeLa cells.

グ効果に深く関連するミトコンドリアに機能性分子を導入

Fig. 7 Intracellular trafficking of the CoQ 10 -MITO-Porter. Intracellular observation of the CoQ 10 -MITO-Porter using CLSM（A）．
Based on such images, mitochondrial occupancy rate（B）was estimated.

− 185 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

する本研究で開発するナノカプセル型機能性化粧品は、化（引用文献）
1） Y. Yamada et al., Biochimica et biophysica acta, 1778,

粧品分野に新たな市場を創生すると確信している。
現在は、「皮膚組織を用いたナノカプセルの皮膚細胞ミトコンドリアへの分子送達の検証」
を進めており、3 D 細胞培養法を用いた新しい評価法を確立中である。今後は、本研究をさらに発展させ、ミトコンドリアを標的とするナノ423-432（2008）．
2） Y. Yamada, H. Harashima, Adv Drug Deliv Rev, 6 0,1439-1462（2008）．
3） Y. Yamada et al., Adv Drug Deliv Rev, 154-155, 187209（2020）．

カプセル型機能性化粧品の基盤技術の確立を目指す。

4） Y. Yamada et al., J Control Release, 3 2 7, 5 3 3-5 4 5謝辞（2020）．

ここで紹介した研究成果は北海道大学・大学院薬学研究
院・薬剤分子設計学研究室【Team Mitochondria】に所属す

5） Y. Yamada et al., Biological & Pharmaceutical
Bulletin, 40, 2183-2190（2017）．

る学生諸氏の日々の努力の賜物であり、学生各位に心より

6） M. Hibino et al., J Pharm Sci, 108, 2668-2676（2019）．

感謝する。また、本研究を遂行するにあたり、公益財団法

7） Y. Yamada et al., Mitochondrion, 55, 134-144（2020）．

人コーセーコスメトロジー研究財団のご支援を頂きました
ことに深く御礼申し上げます。

− 186 −

ウグイス糞の諸特性と細菌叢の解析とその利用
筑波大学生命環境系

青柳秀紀

Fecal matter of Horornis diphone has been used as a cosmetic (facial cleanser and skin stain remover, etc.) for the last
1,000 years until recently. Due to the enforcement of the Law for the Protection and Management of Birds and Animals, it
has become difficult to obtain fecal matter and to manufacture the cosmetic products utilizing this component. The mechanism of the cosmetic effects of feces of H. diphone has been little investigated, and one of the main components of the feces(the intestinal microflora) is still unknown. In this study, I attempted to analyze the properties of feces as well as the intestinal bacterial flora present in the feces of H. diphone. Elemental analysis of the fecal matter showed that the nitrogen content
of the feces was higher than that of their feed. This suggests that the feed is digested and degraded as it passes through thedigestive tract of the warbler and that the feces may contain proteins such as enzymes. In addition, the fecal matter exhibited
weak activity of protease and trypsin, and also possessed antioxidant activity. Next-generation sequencing was used to analyze the intestinal bacterial community structure in the fecal matter of H. diphone. Analysis at the genus level, Lactococcus,
Macrococcus, and Weissella were detected as abundant bacteria.

1．緒

きれば、現在は入手困難なウグイスの糞に代わる、より優言れた新規化粧品（素材）を開発できるのではないかと考えた。

ウグイス（Horornis diphone）は日本全域に分布し、その
糞は化粧品
（洗顔料）
や肌のシミ抜きとして古くは平安時代

さらに私は、ウグイス糞に含まれる微生物（腸内細菌）が化粧品機能に関与しているのではないかとも考えた。

（1 , 000 年以上前）より用いられ、海外にも輸出販売されて以上の背景を基盤に本研究では、ウグイスの糞が化粧品きた。1980 年、鳥獣保護管理法によりウグイスの捕獲や的効能を示す機構の解明とその利用を最終目的に、今回は飼育は禁止され、糞の入手が困難となった。その後、ウグその基礎として、ウグイス糞の諸特性と糞の主要な要素でイスの代わりにソウシチョウ（Leiothrix lutea）、メジロ

ある細菌叢（ウグイス腸内細菌由来）の解析と培養化を試み（Zosterops japonicus）の糞を使用して類似の化粧品の製造た。

販売がなされてきたが、2002 年の鳥獣保護管理法により

２．方

捕獲や飼育は禁止され、糞の入手が困難となり、製造がで

法

2. 1. ウグイスの糞の成分元素分析と諸活性の測定

きなくなった。
ウグイス糞が化粧品として使用されてきたことはよく知

任意の量のウグイスの糞をオートクレーブ滅菌後、凍結られているが、“なぜ、ウグイスの糞が優れた化粧品機能

乾燥した試料の C、H、N元素量を、2400 II CHN Elementalを示すのか？” については学術的に解明されておらず未知

Analyzer（Perkin-Elmer）
を用いて定量した。

な部分が多い。一つの説として、ウグイスは昆虫食である

ウグイスの糞のプロテアーゼ活性の測定は、1 %（w/v）

ため、腸内で強いタンパク質分解酵素が分泌されており、カゼイン溶液に種々の濃度に希釈した糞の試料液を加えて消化管が短いため、消化酵素（プロテアーゼ）が糞に含まれ、混和後、37 ℃、30 min 反応させた。5 %（w/v）トリクロロ

それがヒトの肌に作用していることが言われている。さら酢酸（500 µL）を加えて反応を停止させた後、遠心分離を行に、ウグイスの糞の主な要素である細菌叢（腸内由来）につい、 そ の 上 清 の 吸 光 度（A 280）を 測 定 し た。1 min あ た り

いても未解明である。

A 280 を 1 上昇させる反応液全体のプロテアーゼ量を 1 U と

このような現状を踏まえ、私はウグイスの糞に興味を持定義した。

ち、これまで未解明であったウグイスの糞が化粧品機能をウグイスの糞のトリプシン活性の測定は、96 ウェルプ

示す仕組みを解明し、その知見を活用・模倣することがでレートに、100 mM Tris･HCl（pH 8 . 0）+ 0 . 1 % Tween 20 を
60 µL、種々の濃度に希釈した試料液を 30 µL、100 µM MCA（ 蛍 光 基 質：Boc-Gln-Ala-Arg MCA［Peptide Institute］）

Characteristics and bacterial flora ofHorornis diphone fecal and its utilization
Hideki Aoyagi
Faculty of Life and Environmental
Sciences, University of Tsukuba

溶液を 90 µL 添加し、37 ℃、30 min 反応後、遊離したAMC（7 -Amino- 4 -methylcoumarin）の 蛍 光 強 度（ 励 起 波 長
355 nm、測定波長 460 nm）を測定した。活性は 1 nmol の
AMC が 1 分間に遊離する量を 1 mL あたりに換算し、1 mUと定義した（1 mU = 1 nmol AMC/min/mL）。

− 188 −

ウグイス糞の諸特性と細菌叢の解析とその利用

ウグイスの糞の抗酸化活性は DPPH ラジカル消去活性に得られた。一方、ウグイスの餌のプロテアーゼ活性やトリ
プシン活性を測定した結果、いずれの活性も検出されなか基づき測定した。

った。この結果は、ウグイスの餌が消化管内を通過する間

2. 2. 次世代シークエンサー（MiSeq）によるウグイスの糞の細菌群集構造解析に、プロテアーゼやトリプシンが糞に含まれることを示唆

ウグイスの糞試料をQuickGene DNA tissue kit S（Kurabo）

される消化酵素由来なのか？、糞に含まれる腸内細菌由来を用いて調製後、Quick Gene-Mini 80（Kurabo）で DNA をなのか？、について解析中である）。今回、得られたウグ抽出した。16 S rRNA 遺伝子の V 4 領域を増幅するため、イスの糞のプロテアーゼやトリプシンの活性は高くはなく、している（現在、プロテアーゼやトリプシンが腸内で分泌

1 st_PCR_ 515 F プライマーと 1 st_PCR_ 806 R プライマー、

これまで、ウグイスの糞が化粧品的効能を示す一つの説とExTaq HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用いて１段して、ウグイスの消化酵素（プロテアーゼ）が糞に含まれて階目の PCR 反応をおこなった。PCR 産物を AMpure XP

いることが言われてきたが、その真偽については引き続きビーズ（Beckman Coulter）で精製し、20 µL で溶出した。

検証する必要がある。

さらに、溶出液 2 µL を鋳型とし、MiSeq での解析に必要

ウグイスの糞の DPPH ラジカル消去活性に基づく抗酸化な共通配列とサンプル識別をおこなうための MID 配列でデ活性を測定した結果、ウグイス糞の懸濁液の抗酸化活性はザインされたプライマーを用いて、20 µL の反応系で 2 段

125 〜 500 µg/mL で容量依存的に増加したが、アスコル

階目の PCR を行った。PCR 産物を再び、AMpure XP ビ

ビン酸の IC 50 値（DPPH を 50 % 消去できる濃度）と比較しーズ（Beckman Coulter）で精製し、20 µL で溶出し MiSeq

た場合、その活性は 1 / 60 程度の低いものであった（ウグでペアエンドシーケンシングした。MiSeq から得られたリイスの餌には抗酸化活性はほとんど検出されなかった）。

ードデータは以下の①〜③の基準に基づき、sickle ver

次世代シーケンサーを用いてウグイスの糞に含まれる細1 . 33 を用いてフィルタリングをおこなった。①両鎖の読菌群集構造を属レベルで解析した結果、14 試料から計 74

み始めがプライマーと完全一致する配列であること、②プ属が検出された（図 1）。優占属は、Lactococcus（22 . 43 %）、ライマー領域、および低精度配列のトリムをおこない両鎖

Macrococcus（14.73%）、
Weissella（14.39%）、Leuconostocaceae

とも規定以上の長さを保っていること、③両鎖が結合でき科の同定されなかった属（14 . 19 %）であった。しかしながら、試ること。Fastx toolkit ver 0 . 0 . 13 . 2 を用いて低品質の塩基料によってその存在比は大きく異なった（Lactococcusで 2 . 3 〜

対 を 除 去 し た。 ト リ ミ ン グ し た リ ー ド は FLASH ver

60 . 8 %、Macrococcus で 2 . 9 〜 41 . 3 %、Weissella で 0 . 2 〜

1 . 2 . 10 を用いてペアエンド結合した。キメラ配列チェッ

50 . 4 %、Leuconostocaceae 科の同定されなかった属で 0 . 2

クには USEARCH ver 8 . 0 . 1623 _i 86 linux 64 を用いた。微〜 29 . 0 %）。ウグイスの糞に含まれる細菌叢は腸内由来の生物群集構造は QIIME ver 1 . 9 . 0 を用いて分析した。配列細菌であることが考えられる。これまで国内外を通じて野は相同性 97 % を基準とし、操作的分類単位（Operational

鳥の腸内細菌（叢）に関する研究は少なく 1 - 3）、ウグイスに

Taxonomic Unit=OTU）にクラスタリングし、Greengenes

ついては初めての報告である。

database に基づいて分類学上の決定をおこなった。

また、種々の寒天平板培地を用いてウグイスの糞に含まれる細菌の単離培養を試みたところ、ウグイス糞に存在す

３．結果および考察る全微生物の 0 . 5 % 程度の種類しか単離培養できなかった。

成分元素分析の結果を表 1 に示した。C（炭素）は約 0 . 78

また、ウグイスの糞の試料からプロテアーゼ産生細菌を対倍、H（水素）は約 0 . 77 倍に減少していた。一方、N（窒素）

象に、単離培養を試みた結果、16 種類の細菌の単離培養は約 1 . 35 倍に増加していた。窒素はタンパク質や酵素のに成功したが、いずれも次世代シーケンサーを用いた細菌

構成元素である。今回の結果から、消化管を通る間に糞に群集構造解析において存在比が非常に低い細菌のみであっ窒素源であるタンパク質や酵素などが含まれた可能性が考た。
以上の結果から、ウグイス糞中には未培養微生物が多くえられた。
ウグイスの糞のプロテアーゼ活性とトリプシン活性を測存在していることが示唆され、今後、これらの未培養微生定した結果、それぞれ約 11 . 8 U/mg、1 . 75 U/mg の活性が物の培養化が求められる。現在、ウグイス糞からの細菌の

表1
試料
餌
糞

ウグイスの餌と糞の元素分析
C
44.72
35.00

含量（w/w ％）
H
7.10
5.48

N
4.90
6.60

培養効率の向上や、毒素除去能、メラニン生成抑制能、皮膚炎症抑制能、バイオサーファクタント生産能、金属ナノ粒子の生成能などの機能を有する新規細菌の培養化、取得についても検討中である。

− 189 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図１

次世代シーケンサー（MiSeq）を用いたウグイスの糞に含まれる属レベルでの細菌群集構造の解析．

４．総（引用文献）

括1） Waite, D. W., Taylor, M. W. Characterizing the avian

ウグイスの糞は洗顔料やシミ抜きとして古来より国内外

gut microbiota: membership, driving influences, andで商業利用されてきたが、これまで学術的検討が乏しく、

potential function. Frontiers in Microbiology, 5, 2 2 3

その諸特性や糞の主要な要素である細菌叢（ウグイス腸内（2014）．

細菌由来）は未解明であった。本研究において、これまで

2） Ushida, K., Segawa, T., Tsuchida, S., Murata, K. Cecal

未解明であったウグイス糞の諸特性や腸内細菌群集構造を

bacterial communities in wild Japanese rock

はじめて解析し、その一端を明らかにした。今後、本研究ptarmigans and captive Svalbard rock ptarmigans.

成果を基盤に研究を推進することで、ウグイス糞が化粧品

The Journal of Veterinary Medical Science, 78, 251-257

機能を示す仕組みの解明や有用な新規微生物の取得が期待（2016）．

できる。さらに、得られた知見を模倣したり、取得した有

3） Wang, W., Zheng, S., Sharshov, K., Cao, J., Sun, H.,

用微生物を活用することで、現在は入手困難なウグイスのYang, F., Wang, X., Li, L. Distinctive gut microbial

糞に代わる、より優れた新規化粧品（素材）の開発が期待でcommunity structure in both the wild and farmed

きる。

Swan goose（Anser cygnoides）．Journal of Basic
Microbiology, 56, 1299 -1307（2016）．

− 190 −

香りが認知能力に与える影響
名古屋大学大学院理学研究科

上田（石原）奈津実、福枡 直人、布施 尚城、木下 専
Japan faces the super-aged society on which the increasing number of patients with dementia is becoming a fast social
problem. It reported that individuals diagnosed with mild cognitive impairment show deficits in pattern separation and thedecline of the hippocampal function due to aging induces the disability to separate similar patterns. However, the molecularbasis is still unclear. The molecular basis about simple memory formation such as fear memory formation, is well understood
now. On the other hand, in addition to intrinsic factors, external factors such as aroma and exercise etc., are intricately involved in memory retention decline. Therefore, there is not enough information to stop the progression of forgetfulness withage.
We have been studying the physiological significance of the neural network formation, rearrangement and maintenanceof the septin cytoskeleton consisting of the nucleotide binding protein family SEPT1-14 (Ageta-Ishihara et al., Nature Commun 2013, 2015, Neurochem Int 2018, Neurosci Res 2020). In the course of this study, we found that Septin-deficient miceretain memory of spatial context for 2h, but not for 24h in the spatial pattern separation paradigm (unpublished).
In this study, we developed a new behavioral paradigm to examine the influence of external factor on memory retention,
evaluated this new pattern separation paradigm in Septin-deficient mice and assessed effects of aroma (Vanilla Musk) on
cognitive ability. Our new behavioral paradigm sheds light on providing new lifestyle modification (using aroma) as the scientific basis for prevention of "forgetfulness" in elderly people.

1．緒

死変異体の単離から細胞周期に異常がみられる変異体とし言て発見された 6）。分裂細胞においては収縮環、鞭毛や繊毛

我が国において急速に高齢化が進展する中、健康寿命ののリングの構成成分であり、多数の分子を集積し相互作用

延伸や要介護人口の減少は重要な課題である。認知機能にさせる足場として、また、細胞の微小領域における分子の焦点をあてると、認知症の中核症状は進行性の学習・記憶

局在や非対称性を保証する拡散障壁としての役割が報告さの障害であり、日常生活に支障をきたすこともある。初期

れている 7 - 8）。興味深いことに、セプチンは最終分化したの段階では記憶障害の程度は軽いため、この時点で進行を神経系の細胞で最も高発現することから 9）、細胞質分裂を抑制することが望まれるが、頭部 MRI 画像などで異常を超えたセプチン系の未知の生体機能を探索する必要性が示発見できるのは中後期となってしまう。近年、認知症患者

唆されている。我々はこの問題にアプローチする過程で、と診断される数年前の時点でも視空間認知障害として空間

セプチン細胞骨格欠損マウスの行動レベルでの異常を精査

弁別（既知と未知の場所を区別できない）などの高次機能がした結果、セプチン細胞骨格欠損マウスは正常な空間定位低下することが報告され 1）、遺伝的要因の解明が注目され能力をもつ一方で、異なる形状の空間の弁別試験においてている。一方で、空間弁別に影響を与える環境的要因につ記憶保持で低成績を示すことを見出した（投稿準備中）。しいては、運動で促進される神経新生は空間弁別能力を向上

かしながら、既存の空間弁別試験では新奇と既知の空間へさせ

2 - 3）、カフェイン摂取がこのパターン分離の成績を高の暴露の待機時間が 2 時間から 24 時間で設定されており、めることも示されている 4）。興味深いことに、レモンやロ

数日以上にわたる環境的要因の影響を評価することができーズマリーなどのアロマの刺激は物忘れや認知症を防ぐ可ない。そこで本研究では、香りが空間弁別能力に与える影能性があると期待されているが、空間弁別に与える影響は響を評価し、遺伝的要因により低下した能力を向上しうる

全く評価されていない。我々は、重合性ヌクレオチド結合

ことを確認する目的で、空間弁別試験に環境的要因を暴露

蛋白質セプチン細胞骨格に着目し、神経系での生理機能のできる実験系を構築し、この実験系において遺伝的要因に5）解明を行っている 。セプチンは出芽酵母の温度感受性致

より記憶保持低下マウスが従来法と同様の成績低下を示すかを検証した。続いて、構築した実験系にアロマの香りを＊組み合わせ、行動解析を実施した。

２．方Effects of scent on cognitive ability＊

法

Natsumi Ageta-Ishihara, Naoto Fukumasu,
Naoki Fuse, Makoto Kinoshita

2. 1. 実験動物

Division of Biological Science, Nagoya
University Graduate School of Science系統）の雄を日本 SLC から購入して用いた。セプチン細胞

実験には野生型マウス（C 57 BL/ 6 N または C 57 BL/ 6 J− 191 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

骨格欠損マウスを用いた行動試験においては、Septin+/- マ-/-

ウス同士の交配により、雄の Septin 欠損群（Septin ）と同+/+

前半の 3 分間の探索行動量を 1 試行目の前半の 3 分間の探索行動量でそれぞれ割り、100 を掛け、パーセンテージで）を作製し、毛並みやひげ表したものを用いて既知もしくは新奇の探索行動量としての状態を記録し、健康状態を確認したうえで実験に使用し比較を行った。アロマ（Vanilla Musk）はケージの端にプラた。明暗サイクルを 12 時間（8：00 ─ 20：00 が明期）としスチック容器を設置し、1 滴（約 10 ml 程度）をたらし 1 日

た部屋で飼育を行い、行動実験は 9：00 から 19：00 の間

目の試行の後に暴露を開始し、試験当日まで継続した。

性、同生育環境対照群（Septinに行った。行動解析装置内は、装置中央が 100 lux になるよう調光した。実験の 30 分前にはマウスを行動解析装置

2. 5. データ解析と統計処理付近の待機場所に入れて実験環境に慣らした。各マウスのマウス行動データの取得及び解析には、ビデオ・トラッ

試行終了後、次亜塩素酸水もしくは 70 % エタノールを用

キング・システム（Ethovision）もしくは Image J（NIH）をいて殺菌消毒し、匂いによる影響を最小限にした。

用いた。統計解析はソフトウェア Prism を利用した。グラ

全ての動物実験は名古屋大学の動物実験委員会の許可を受け、動物実験ガイドラインに従い行った。

フは平均値と標準誤差で示した。統計解析によって求められた p 値が 0 . 05 未満であることをもって有意であると判断した。

2. 3. 空間弁別試験

３．結6 ─ 18 週齢の同生育環境の野生型雄マウスに対し、外部からの視覚刺激を可能な限り排除するため、試験開始 3 ─
4 日前にケージ周囲に白色のケージカバーを装着した。試果

3. 1. 環境的要因（香りの効果）を評価しうる空間弁別試験の確立

験前日は、マウスに不定形（四角と丸の性質をもつ）の箱を空間弁別評価のために汎用的なパラダイムは 1 試行目に

10 分間自由に探索させることで、新奇空間探索行動量に立方体または円筒の容器にマウスを入れ、探索行動量（移

群間有意差がないことを確認したうえで、実験者による接動距離）を測定し、24 時間後に新奇もしくは既知の容器に

触・拘束によるストレス負荷（ハンドリング）を 5 分間、7

マウス入れ行動量を測定することで、新奇もしくは既知空

日間連続で与えて実験環境に馴化させた。1 日目から 4 日間の認識を評価している（図 1 A, B）。今回は、揮発性成分

目は、マウスの尾をつかんだ状態を維持し、マウスの背側の行動解析に与える影響を評価するため、同一個体においを撫でることで実験者によるマウス個体への接触に馴化さて、新奇と既知の測定をし、環境的要因として揮発性成分せた。この時、噛まれても強引に引き離すことはせず、マの暴露の有無により既知と新奇の認識率の変化を評価する

ウスに不快感をもたせないよう留意した。5 日目から 7 日

必要がある。そこで、新たに環境的要因を評価できる空間

目は、マウスが跳ねないようであれば尾を放して自由に手弁別試験の構築を行った。様々な条件を検討した結果、マのひらの上を歩かせつつ体を触った。マウスの尾を放したウスが実験操作に慣れすぎると、活動性が自然に増加する状態でマウスが実験者の手のひらから降りようとせず、尾傾向がみられることがわかったため、実験期間を 9 日間にが下がった状態かつ触れても恐怖を感じない（すくみ反応

設定した（図 1 C）。試行 2 ─ 8 は既知空間への暴露を継続しを示さない）状態を、マウスが実験者に馴化した状態と見た。試行 3 ─ 8 に関しては、実験系の再現を繰り返してもなした。形状のみが異なる新奇空間、1 辺 30 cm の立方体

有意差がなく、この間に揮発性成分への暴露の有無を組みまたは直径 34 cm, 高さ 30 cm の円筒を探索させ、移動距合わせて実験を行い、試行 3 ─ 8 での行動変化をモニター

離を 6 分間計測した後、ホームケージに戻し、24 時間のしながら、9 試行目の成績を評価できることがわかった（図

遅延時間後に異なる空間での移動距離を 3 分間計測した。

1 D）。8 試行目の前半の 3 分間の探索行動量を 1 試行目の遅延時間前後の移動距離の比を算出した。

前 半 の 3 分 間 の 探 索 行 動 量 で 割 っ た 値（ 既 知：30 . 19 ±4 . 77 % n= 7）は 9 試行目の前半の 3 分間の探索行動量を 1

2. 4. 環境的要因を評価しうる空間弁別試験

試行目の前半の 3 分間の探索行動量で割った値（新奇：46.65

6 - 18 週齢の同生育環境の野生型もしくはセプチン細胞
骨格欠損雄マウスに対し、容器（白い四角箱、縦 × 横 × 高± 4.42% n=7）と比べ優位に低下しており（p=0.0263）、新奇と既知空間の認識可能な実験系が構築できた。

さ : 17 . 5 × 16 . 5 × 30 cm）と、同素材、同色、同面積である施した。1 試行目に円筒の容器にマウスを 5 分間入れ、探3. 2. 環境的要因（香りの効果）を評価しうる空間弁別
試験における遺伝的要因の影響

索行動量（移動距離）を測定した。これを 8 日間連続で行っ

遺伝的要因により空間弁別の記憶保持が低下したセプチ

た。9 日目に 1 試行目とは異なる（新奇）容器に 3 分間入れ、

ン細胞骨格欠損マウスを用いて、新たに構築した実験系を

探索行動量（移動距離）を測定した。8 もしくは 9 試行目の用いて行動試験を実施した。その結果、野生型マウスは既容器（白い円筒形、直径 × 高さ : 17 × 27 cm）を用い試験を実− 192 −

香りが認知能力に与える影響

図１

既存の空間弁別試験と環境的要因（香りの効果）を評価しうる空間弁別試験

Ａ）既存の空間弁別試験 Ｂ）既知空間と新奇空間における移動距離の比を評価しうる新たな空間弁別試験 Ｄ）移動距離の推移

Ｃ）環境的要因

図２ 新たな実験系におけるセプチン細胞骨格欠損マウスの空間弁別試験における訂正性の再現Ａ）移動距離の推移

Ｂ）移動距離の比

知空間（ 8 日目）より新奇空間（9 日目）で有意に高い移動距離を示した（68 ± 6 . 4 vs. 85 ± 4 . 4 ％ , p= 0 . 010 , n= 10）が、セプチン細胞骨格欠損は両空間で同等の移動距離を示した（68 ± 7 . 3 vs. 66 ± 8 . 8 %, p= 0 . 86 , n= 11）。

3. 3. 空間弁別試験における香りの効果
野生型マウスを用いて、新たに構築した実験系を用いてVanilla Musk の香りの有無で行動試験を実施した。その結果、香り暴露群では記憶の保持に異常が認められた（80± 7 . 4 vs. 85 ± 5 . 5 %, p= 0 . 64 , n= 7 , 8）
。一方で、対照群
では有意差は認められないものの、新奇と既知空間を判別
し て い る 傾 向 が 認 め ら れ た（77 ± 7 . 8 vs. 95 ± 6 . 9 %,p= 0 . 11 , n= 7）。

− 193 −

図3

香り暴露が空間弁別試験に与える影響コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

４．考

（引用文献）

察

1） Stark SM, Yassa MA, Lacy JW, Stark CE. A task to

本研究の遂行により、揮発性成分を含む外的要因（環境assess behavioral pattern separation（BPS）in humans:

的要因）の行動解析に与える影響を評価しうる空間弁別試

Data from healthy aging and mild cognitive impairment,

験系の構築に成功した。さらに、遺伝的要因により従来広

Neuropsychologia, 51（12）: 2442-2449（2013）

く用いられている空間弁別試験において低成績を示すこと

2） Clelland CD, Choi M, Romberg C, Clemenson GD Jr,を見出しているセプチン細胞骨格欠損マウスにおいても、

Fragniere A, Tyers P, Jessberger S, Saksida LM,

外的要因を評価系に組み込んだ試験でも同様に、空間弁別

Barker RA, Gage FH, Bussey TJ. A functional role forの記憶保持の機能低下が認められることを見出した。今回

adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern

使用したアロマの香りでは認知機能の向上は認められなか

separation, Science, 325（5937）: 210 - 213（2009）

ったが、今後はさらにこの系を用いて、様々な香りや揮発3） Sahay A, Scobie KN, Hill AS, O'Carroll CM, Kheirbek

性成分を暴露し、認知機能を向上させる物質を同定するこMA, Burghardt NS, Fenton AA, Dranovsky A, Hen R.

とを目指す。最終的には、空間弁別の記憶保持障害マウス

Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient（セプチン細胞骨格欠損マウス）に空間弁別試験の向上を引

to improve pattern separation, Nature, 472（7344）: 466

き起こす匂い物質を暴露し、試験結果が向上するかを評価- 470（2011）

することで、揮発性低分子化合物を含むフラグレンスなど

4） Borota D, Murray E, Keceli G, Chang A, Watabe JM,

日常に取り入れやすい形での香りを用いて認知症に対する

Ly M, Toscano JP, Yassa MA. Post-study caffeine

処方介入の提案を目指す。

administration enhances memory consolidation in

認知機能の向上に効果が見出された揮発性低分子化合物

humans, Nat Neurosci., 17（2）: 201-203（2014）に関しては、この成分を含む形の製品開発を進めることで5） Ageta-Ishihara N, Kinoshita M. Developmental and日常に取り入れやすい形での香りの提供につながる。さらpostdevelopmental roles of septins in the brain,に、補完代替医療としての臨床メディカルアロマテラピー

Neurosci Res., S0168 - 0102（20）: 30440 - 30445（2020）

も徐々に普及してきており、医療機関や介護施設で取り入

6） H a r t w e l l L H . M a c r o m o l e c u l e s y n t h e s i s i n

れるところが出てきている。メディカルアロマセラピーは

temperature-sensitive mutants of yeast, J Bacteriol., 93

科学的根拠が不足していることなどが原因で、積極的に取（5）: 1662 - 1670（1967）

り入れている医療現場はまだ少ないが、本研究を通じて香

7） Sharma S, Quintana A, Findlay GM, Mettlen M,

りの認知に与える影響に対して科学的根拠を示すことがで

Baust B, Jain M, Nilsson R, Rao A, Hogan PG. An

きれば、空間弁別記憶保持向上を指標に同定した香り成分

siRNA screen for NFAT activation identifies septinsを含む芳香浴をより多くの医療現場で取り入れていただく

as coordinators of store-operated Caことが可能となる。この基礎研究成果が
「医療」
や
「健康」と

2+

entry, Nature,499（7457）: 238 - 242（2013）

いった産業展開につながる成果の蓄積の一助となり、コス

8） Koch S, Acebron SP, Herbst J, Hatiboglu G, Niehrs

メや関連商品が健康寿命にも影響を与える製品として波及

C. Post-transcriptional Wnt Signaling Governs

することを期待する。

Epididymal Sperm Maturation, Cell, 1 6 3（5）: 1 2 2 51236（2015）

謝辞9） Kinoshita A, Noda M, Kinoshita M. Differential

本研究を遂行するにあたり、ご援助を賜りました公益財
団法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上

localization of septins in the mouse brain, J Comp
Neurol., 428（2）: 223 - 239（2000）

げます。また研究の遂行にあたり木下専教授（名古屋大学
理学研究科）に温かいご指導をいただきました。この場をお借りいたしまして厚く御礼申し上げます。

− 194 −

桜の香りによる脳に及ぼす影響の機能生理学的解析
星薬科大学運動科学教室

竹ノ谷

文子

We have focused on a low-temperature vacuum extraction method that can extract aroma components derived from natural products, extracting them with cell extracts (CE) from various plants, and performing functional evaluation so far, in order to utilize the pharmacological effects of various plants widely and effectively. Here, we used a technique of cold vacuum
extraction to extract cell extracts (SCEs) from pupal flowers in order to exploit the potency and scent of pupal preferred by
Japanese people. We discovered that its main component was benzaldehyde (BzA). We also found increased cerebral bloodflow in the brain upon human exposure to SCE. In addition, the scent of SCE was reported an anti-stress effect and even an
effect of hypereuphoria by promoting oxytocin secretion. In addition, we confirmed the physiological action of a single component of BzA, the main component of SCE. Consequently, BzA exposure to humans showed a marked increase in cerebral
blood flow medial to the frontal lobe of the cerebral cortex. BzA exposure also measured the amount of various hormones
secreted in saliva. These results confirmed a significant decrease in cortisol levels and a significant increase in secretory IgA
and oxytocin. These data suggest that BzA, a major component of SCE, activates brain function, enhances immune function
and provides euphoria. Moreover, the stress lowering effect of the patient was observed as a result of the aroma bathing of
SCE in patients of the clinical field. In addition, there were no adverse events in the aroma bath verification of SCEs. These
results suggest that SCE can be used in cosmetics and medical care, and are expected to be a material that can be applied tothe healthcare of people.

1．緒

法を用い、さくらの花びらから香り成分のさくらセルエキ

言ストラクト（以下：SCE）を抽出し、その成分分析および抗日本古来より親しまれている「さくら」には、咳止め、解酸化能を検討した。次に、SCE を人に嗅がせ、脳機能へ熱、解毒効果、および神経鎮静作用など、様々な薬理的効の影響やストレスホルモンをはじめとした種々のホルモン

果１, 2）があることが報告されている。その他、抗炎症効果 3）、や免疫賦活作用をしらべ、さくらの香りが持つヒトへの生

4）

老化促進の因子である糖化の抗糖化作用 などの皮膚老化
5）

理・薬理作用の詳細を明らかにした。さらに SCE の主成防止作用 をもつことからも、さくらを利用した美容や化分であるベンズアルデヒド（以下：BzA）の単一成分がどの粧品が製造されている。しかし、天然のさくらは開花期間

ような生理作用をもつかを NIRS および唾液中の各種ホルは短く、花びらも大変繊細であること、また、香り成分も

モン分泌量から検討した。

微量であることから、素材となるさくらの芳香成分の抽出

近年、香りを用いたアロマセラピーは医療分野において、は容易ではない。これまで、香り成分の抽出法は、水蒸気

リラクセーション効果や、さらには病気の治療や症状の緩和

蒸留法が代表的であるが、その他、圧搾法、溶剤抽出法、などに利用され、その有効性を示す報告も多く見られる7）。

さらには超臨界流体法などの手法が知られているが、通常そこで我々は、体動困難な患者を対象に SCE の暴露によの芳香成分を抽出する水蒸気蒸留法などでは、さくらの有る抗ストレス作用を検討した。このような日本独自のさく

効成分を得ることは非常に難しいのが現状である。

らの香りのもつ有効成分や、その生理作用が明らかになれ

そこで近年我々は、5 ℃前後の低温により、植物水分が自然に移行し、植物由来成分の含有率が高いセルエキスト

ば、新たな化粧品開発や商品の高負荷価値につながることが期待される。

ラクト（CE）が抽出できる低温真空抽出法に注目し、特に２. 方 法

この抽出法は芳香成分などを得る際は大変有効であることを報告してきた 6）。そこで我々は、超微量成分や熱に弱い成分でも、自然に近い原料を抽出できるこの低温真空抽出

2. 1. 低温真空抽出法による五泉さくらのセルエキスト
ラクトの抽出
新潟県五泉市の八重桜（Prunas lannesiana）の花びらを採取し、低温真空抽出法を用い、さくら花びらの細胞水でFunctional physiological analysis of theeffect of the scent of cherry blossoms on
the brain
Fumiko Takenoya
Hoshi University School of Pharmacy andPharmaceutical Sciences

ある SCE と乾燥粉末を抽出物とした。

2. 2. SCEの成分分析
成分分析は GCMS-QP 2010 SE GC/MS 分析機（株式会社島津製作所 , 京都）を用い、解析を行った。化合物の同− 195 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

定は、標品の GC/MS スペクトルの保持時間（RT）と化合

安定するであろうと思われる 14 〜 16 時に測定を行った。

物の沸点、および MS のデータベースを用いた。化合物の対象群は SCE を、コントロール群は水をそれぞれ 30 mL

推定は NIST 11 データベースを利用し、装置の化合物推定

ずつディフューザーで暴露し、対象者の病室にて 30 分間

8）の芳香浴を行った。唾液は暴露前、暴露 15 分後、暴露終プログラムで各ピークの化合物を推定した 。

了時の 3 回を採取し、2 . 4 . と同様な方法にて唾液中コルチ

2. 3. SCEおよびSCE単一成分の香り暴露による脳血流量の測定ゾール値を測定した。

３．結

被験者を環境に適応させた後、測定は非侵襲的に脳神経活動を測定する Near-infrared spectroscopy：NIRS（近赤果3. 1. GC/MS解析によるSCEの成分分析の結果

外光脳機能イメージング装置 , OEG- 16 , 島津製作所）を用

SCE の成分は主に３つが検出され、約 90 ％が BzA であいた。NIRS は近赤外光を用いて生体内のヘモグロビン

り、残りの10％はベンジルアルコールとクマリンであるこ（Hb）酸素代謝変化を測定することで、脳神経活動量の指とが明らかとなった。また、検出できなかった超微量成分

標となる脳血流量を測定することが可能である 9 , 10）。被験の存在のあることも明らかになった。

者は座位なり、頭部フォルダーおよび測定プローブを装着
または BzA を 1 滴（約 0 . 01 mL）滴下し、鼻孔から 5 cm 先

3. 2. ヒトのSCEとBzA暴露による前頭葉の脳血流量の測定に近づけて香りを暴露した。大脳皮質前頭前野近傍部およ

被験者に SCE および BzA を暴露し、NIRS にて前頭葉のび大脳皮質側頭葉近傍部の脳血流量を測定部位とした。測脳血流量を測定し、その結果を図 1 に示した。1 から 16定方法として香り暴露前に 30 秒間の安静後、120 秒間ののすべてのチャンネル領域において、SCE 暴露群よりもSCE またはベンズアルデヒドを暴露し、暴露終了後に 30

BzA 暴露群の値が高かった（図 1 -A, B）。前頭葉外側領域

秒間安静を取り、脳血流量の変化を測定した。NIRS の測の 3 および 16 チャンネルで有意な血流量の増加（P< 0 . 05）

定結果は BrainSuite/View（ビー・アール・システムズ株が見られ（図 1 -C）、特に前頭葉内側領域の 9 チャンネルに後、閉眼・安静の状態を維持させ、ムエットの先端に SCE

式会社）を用いて解析した。

2. 4. SCEおよびSCE単一成分（BzA）の香り暴露による唾液中各種ホルモン量の測定
SCE 暴露による唾液中のホルモンはコルチゾール、アミラーゼ、デヒドロエピアンドロステロン（以下：DHEA）、オ
キシトシン、および分泌型 IgA は Enzyme-Linked Immuno
Sorbent Assay（ELISA 法）を用いた。アミラーゼは唾液
中の α-Amylase 活性を基質との反応により比色定量により測定したが、その他コルチゾール、DHEA、オキシトシ
ン、および分泌型 IgA はマイクロプレートに目的タンパク質に対する抗体を固相化し、目的物質の酵素標識抗原を同一マイクロプレート内で同時に反応させ、反応後にマイクロプレートに残る酵素活性を検出する競合法 ELISA によって測定した。。なお、ヒトでの本実験は、星薬科大学倫理審査委員会の承認を得て行われた（承認番号：28 ‒ 005）。

2. 5. 臨床現場のSCE 暴露による抗ストレス作用
急性期医療施設に入院中の、意識清明ではあるが病態や治療（がん患者、脊髄損傷患者、骨折患者、うつ病患者）などが起因によって体動が困難な患者（20 〜 70 歳代）を対象
した。対象患者の同意を取得し、SCE の香りを好まない
場合は、患者に不快を与える可能性があることを考慮し、対象者から除外した。また嗅覚に障害のない者を対象とした。コルチゾールの日内変動などを考慮し、比較的身体が− 196 −

図1

SCEおよびBzAの香り暴露による前頭葉の脳血流量

桜の香りによる脳に及ぼす影響の機能生理学的解析

おいて有意な血流量の増加（P< 0 . 05）が確認された（図なかった（図 3 -C）。

1 -C）。これらの実験結果から、前頭葉の脳血流増加は、

さらに、SCE および BzA 暴露による液性免疫に影響をSCE 暴露群よりも BzA 暴露群の方が高くより内側領域で与えるか否かを検討するため、免疫に関与する分泌型 IgA顕著であることが分かった。

ホルモン量の変化を測定した。その結果、分泌型 IgA はSCE 暴露群では変化はみられなかった。しかし、BzA 暴

3. 3. ヒトのSCEとBzA暴露による側頭葉の脳血流量の測定

露群では暴露終了 30 分後に有意な増加（P< 0 . 05）がみられ

3 . 2 . の実験と同様に、SCE および BzA を暴露し、側頭さらに、SCE および BzA の香り暴露によるオキシトシ

葉についての脳血流量を比較検討した。その結果、両暴露

ン分泌量を測定した結果、SCE 暴露では、暴露前と比較し、群とも、ほとんどの領域で脳血流の数値はややマイナスの暴露終了直後と暴露終了 30 分後で有意な増加（P< 0 . 05）が値を示した（図 2）。また、左右の側頭葉とも両暴露群の脳見られた（図 4 -B）。さらに BzA 暴露においても暴露終了

た（図 4 -A）。

血流量に有意な差異はみられなかった（図 2 -A, B）。この実験結果から、側頭葉の SCE 暴露と BzA 暴露は両者ともやや低下することは明らかとなった。

3. 4. ヒトにおけるSCEおよびBzA暴露による唾液中各種ストレスホルモン量の測定
SCE および BzA の香りがヒトにどのような生理的影響を及ぼすかをしらべるため、SCE の香り暴露による唾液
中の様々なホルモン分泌を、暴露前、暴露 30 分後、および暴露終了 30 分後で比較した。その結果、ストレスホル
モンである α アミラーゼは、SCE 暴露 30 分後に有意な低下（P< 0 . 01）がみられ（図 3 -A）、一方の BzA 暴露群では増加傾向がみられたものの有意な差はみられなかった（図3 -A）。さらにコルチゾールは SCE 暴露群では低下傾向がみられたが有意な差はみられず、BzA 暴露群では暴露終了 30 分後に有意な低下（P ＜ 0 . 05）がみられた（図 3 -B）。
また DHEA は SCE 暴露群では暴露終了 30 分後に有意な増加（P< 0 . 05）がみられたが、BzA 暴露群では変化は見られ
図2

図3

SCEおよびBzAの香り暴露による側頭葉の脳血流量

SCEおよびBzAの香り暴露によるストレス関連のホルモン量の変化− 197 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

30 分後で有意な増加（P< 0 . 05）がみられた（図 4 -B）。

４．考察

3. 5. 体動困難な患者におけるSCE 暴露による抗ストレス作用の検討

材の成分が担保されているか否かはその効果を大きく左右

我々は植物のもつ芳香成分や薬理的作用を発揮させる素体動困難者の SCE の香り暴露前のコルチゾール値は、する。そこで我々は、その抽出法の違いにおける様々な効0.18012±0.1196µg/dL,香り暴露中は 0.15460±0 . 09412 µg/

果の違いを検討した結果、様々な抽出法のうち、特に低温

dL, そ し て 30 分 間 の 香 り 暴 露 終 了 時 に は 0 . 14150 ±

真空抽出から得られた SE は自然由来に近く、高い機能評. 07381 µg/dL と暴露前よりも暴露中、または暴露後にコ価をもつことを報告してきた 11 , 12）。これまで、植物からルチゾール値が低下した（図 5）。

抽出され芳香療法に使用される精油や CE はラベンダーやそれぞれ各個人の SCE 暴露前後のコルチゾール値をみ

ローズ系などといった西洋的な植物から抽出される芳香成ると暴露前よりも暴露中にコルチゾール値の低下がみられ分が主であり、日本古来のさくらの香りによる脳機能や生た者は 10 人中 5 名（50 %）であり、また暴露前よりも暴露

理作用を解析した研究はほとんどみられない。そこで今回

30 分後にコルチゾール値が低下した者は、10 人中 8 名の研究では、さくらに注目し、超微量成分や熱に弱い成分（80 %）であった。一方、対象患者 11 名のうち、1 名が、でも自然に近い原料を抽出できる低温真空抽出法からSCESCE の香りが苦手という理由から途中中断した事例があを抽出した 13）。

った。しかし、SCE の香り暴露での気分不快や体調の変化など有害事象を認めた事例はなかった。

図4

SCE を成分分析した結果、芳香成分は約 9 割を BzA が占めていた。この BzA は、抗炎症作⽤ 14）、抗菌作用 15）なSCEおよびBzAの香り暴露による免疫および愛情関連ホルモン量の変化

図5

体動困難な患者のSCEの香り暴露によるコルチゾール値の変化− 198 −

桜の香りによる脳に及ぼす影響の機能生理学的解析

どの薬理作用も報告されているが、芳⾹族アルデヒドに分

心身のヘルスケアに応用できることが期待できる。実際、類される有機化合物の一つに属し、特異な臭いを有するも認知症患者を対象とし、日中はローズマリーカンファーやのが多く、アーモンドや杏仁などの⾹り成分でもあること

レモン精の香りで活性化を狙い、夜は沈静化を目的としベがしられている。しかし、さくらの香りや BzA の香り暴

ンダーやスイートオレンジの香りを用いて、心身のオンと露によるヒトへの生理作用についての報告はほとんどみら

オフを図り、認知症を改善した事例 25）などがある。今回我々れない。また、これまで NIRS を用いた様々な香りによるが用いた SCE のさくらの香りは脳血流に変化を与えるこ

脳血流を観察した報告は多数みられるが、さくらの香り暴とからも、心身に変化を与える香りとして十分に活用でき

露による脳機能を評価した報告はみられない。NIRS は酸ることが期待される。

素化ヘモグロビン濃度と脱酸素化ヘモグロビン濃度の変化

一方、今回我々は、SCE 暴露後、各種ホルモン分泌量量を記録しているが酸素化ヘモグロビンの変化が局所脳血を報告してきた。α アミラーゼは特に負荷的ストレス反応

流の変化と高い相関を示している。また神経が活動するたは早く、さらに精神的ストレスにおいて増加がみられるホ

めには酸素と栄養が必要なため ､ その両者を供給する局所

ルモンである。今回、SCE 暴露により α アミラーゼ分泌量

脳血流増加は、その部位の神経活動の増加を示すことが報は、暴露 30 分後で有意な増加がみられ、BzA の単独暴露で告されている16）は、α アミラーゼ分泌量に変化はみられなかった。これは、。

今回我々は、NIRS を用いて SCE および BzA 単独の香り

SCE のベンズアルデヒド以外の芳香成分が α アミラーゼ分暴露による前頭葉と側頭葉の血流量を測定した。その結果、泌量に関与した可能性が推測されるが、詳細は不明である。

前頭葉では SCE および BzA の両者の香り暴露で、脳血流また、ストレスマーカーであるコルチゾールは SCE 暴露量の増加がみられ、その作用は BzA 単一暴露群の方が有群では有意差はないものの経時的な低下傾向を示し、BzA意に高かった。しかし、側頭葉では、両暴露群ともに前頭暴露では、暴露終了 30 分後において顕著な減少を示した葉に比べ、脳血流量は低下傾向を示し、さらに左右の側頭ことから、BzA が抗ストレス作用に大きく貢献している

葉とも両暴露群の部位による差はみられなかった（図 2）。

ことが示唆された。

この結果から、さくらの香りは、特に前頭葉内側領域を活さらに DHEA はストレス評価の一つであり、ストレス性化させることが明らかとなり、その作用は BzA が担っに対抗する「抗ストレスホルモン」として知られ、一方ではている可能性が示唆された 17）。

中枢系や免疫系においてコルチゾールとは反作用をもちコ

これまで、アロマセラピーでの用途の高いラベンダー精

ルチゾールのバランスを取ることが知られている。今回、油の香り暴露による脳血流量を NIRS から解析した報告は

SCE 暴露では DHEA 量は暴露前と比較し、有意な増加が多数みられるものの必ずしも一致した結果ではない。しかみられたが、BzA 暴露では変化はみられなかった。これ

し、ラベンダー精油暴露による生理作用は沈静化を示す報らの結果から、DHEA の抗ストレスに関する作用は BzA

告が多くみられる

18）。今回、我々の行ったさくらの香り暴

露による脳血流は前頭葉で活性化がみられ、側頭葉では沈以外の芳香成分の関与が考えられるが、その実態の解明は今後の課題である。

静化の傾向を示した。このような結果から、今後の研究課

さらに我々は、免疫関連で口腔などの粘液にあり免疫機題として PET などを用いたより詳細な脳機能の解析の必能に重要な役割をもつ分泌型 IgA のホルモン分泌量につい要性のあることが考えられる。

て調べたが、唾液中の分泌型 IgA は、不快情動の生体影響

近年我々は、レモングラスの香り暴露により、大脳皮質を解析する指標として知られている。SCE 暴露は暴露前前頭葉内側領域の脳血流量の増加を観察した 19 , 20）。また、と比較して変化はみられないものの、BzA 暴露では暴露

レモン、ユーカリさらにローズマリー精油を健常人に暴露

終了 30 分後で有意な増加（P< 0 . 05）がみられた（図 4 - 1）。

することにより、大脳皮質の脳血流量の増加を観察報告しこれらの結果から、さくらの香りの免疫亢進作用には BzAている。一方、前頭葉の脳血流量を低下させ鎮静化傾向をの貢献が高いことが予想された。これまでの研究で香りと示す精油の種類には、ローズやオレンジ
であるひのき21）

また、和の香り22）などが報告されている。また近年我々は、免疫に関した報告はいくつかみられるが、レモンおよびラベンダーの香り暴露は免疫亢進作用がみられること 26）、

動物用の核磁気共鳴機能画像法（fMRI）を用い、ラット脳さらにベルガモット精油の口腔内免疫能亢進が報告されてにおける脳血流量の変化をしらべた結果、ジンジャーまたいる 27）。しかし、好みまたは心地よい香りが免疫能を促

はティートリー精油暴露では、前脳内側部や視床下部外側進させている可能性も示唆されている 28）こともあり、香部での脳血流量増加を確認し、神経内分泌系の摂食調節作

りと免疫についてはより詳細な研究を行っていく必要があ

用の関与を示唆する可能性を報告している 23 , 24）。

ると思われる。

このように香りの種類により脳の活動や活性部位が異な

一方、オキシトシンは視床下部で産生される下垂体後葉ることを考えると、香りを上手く利用することによって、分泌ホルモンで子宮収縮や母乳の射乳を引き起こすことが− 199 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

知られているホルモンであるが、抗鎮痛作用、抗不安作用 29）

BzA が重要な役割を持つ可能性が示唆された。今後、さなどの薬理的作用を有すことが知られている。また、オキ

くらの薬理的作用とさくらの香りのもつ生理的作用を活か

シトシンはコミュニケーションにおける信頼関係、共感感

すとともに、ヘルスケアーとコスメの融合によって、単な情、さらには愛情をもたらす効果をもつなどの幸せホルモる美容や健康維持のみならず医療分野においても人々の心ンとしても知られている

30）。今回の実験では、オキシト

身の健康に役立つことを願っている。

シンは SCE 暴露により、暴露 30 分後および暴露終了 30
分後ともに有意な増加（P< 0 . 05）がみられた。さらに BzA（引用文献）の単独暴露においても、暴露終了 30 分後で有意な増加

1） 東京農業大学出版会 : 東京農業大学短期大学部生活科学（P< 0 . 05）がみられた。これらの結果から、さくらの香り研究所編，桜さくらサクラ 100 の素顔 , 2000.（さくらのの多幸感についても BzA の関与が示唆された。

木の皮、咳などの薬理作用）P133

さらに我々は今回の研究で、香りがもつ抗ストレス作用や薬理的作用を医療現場で導入するため、移動困難な患者

2） 鈴木洋 著 : 漢方のくすりの事典 第 2 版 生ぐすり・ハー
ブ・民間薬 . P44 2016.

を対象に SCE の芳香浴の効果を検討した。今回、12 名患

3） Zhang YQ et al.: The anti-inflammatory effect of

者が検証に参加したが、SCE の香りが好まない理由から

cherry blossom extract（Prunus yedoensis）used in

途中、参加中止者が 1 名あった。SCE 香りを使用した芳香

smoothing skincare product. Int J Cosmet Sci 3 6（6）:浴では、8 割以上の対象者が芳香浴前と比較し、唾液コル

527-530. 2014.

チゾールの低下が確認され、医療現場での体動困難な患者

4） Alikhani Z et al.: Advanced glycation end productsに対して、ストレス緩和作用がみられたことが明らかとな

enhance expression of pro-apoptotic genes andった。また今回の検証では、さくらの香りを利用した芳香

stimulate fibroblast apoptosis through cytoplasmic and浴での有害事象がみられた者はいなかったことから、患者

mitochondrial pathways. J. Biol. Chem. 280, 12087-12095.

への心身の負担や侵襲性がないことが明らかとなり、SCE

2005.

を利用した芳香浴の安全性が示されたと思われる。しかし、

5） Wang Yet al.: Protective skin aging effects of cherry

合成の芳香成分を利用したさくらの香りの芳香浴は、必ずblossom extract（Prunus yedoensis）on oxidative stress

しも安全性が担保されないことからも、芳香浴を行う際のand apoptosis in UVB-irradiated HaCaT cells.

精油や CE の選択には十分な注意が必要であり、特に医療

Cytotechnology 71（2）: 475-487. 2019.

現場では有効成分を確認することは勿論のこと、天然物由来の香りを使用した芳香浴を推奨すべきと考える。

6） 塩田浩二、伊藤歌奈子：低温真空抽出による細胞水（セ
ルエキストラクト）の有用性（特集 芳香蒸留水を再評価

今回のような医療現場での芳香浴の効果や安全性の検証する，フレグランスジャーナル社 . 23（3），57-60, 2014.

は重要であり、様々な角度からのエビデンスの構築が必要

7） 今西二郎： 1 章アロマセラピー序論 . 補完・代替医療であると考える。今後、我々は被験者数を増やして、詳細メディカル・アロマセラピー . 2-4. 金芳堂 .（2006）

な検証を行っていく予定である。しかし、今回の検証でも

8） Robert S et al.: Characterization of lavender essential

香りを利用した医療現場の導入が期待される十分な結果がoils by using Gas Chromatography-Mass Spectrometry

得られたと思われる。

with correlation of linear retention indices andさらに近年我々は、ヒト腫瘍細胞に対するさくらの葉由

comparison with comprehensive two dimensional Gas

来の CE 添加による細胞増殖抑制効果を報告し、さくらのChromatography, Journal of Chromatography A 970 : 225-

もつ新しい薬理作用を報告している

234. 2002.

31）。このような、さくらの多様な薬理・生理作用に加え、今回の研究により、

9） Hoshi Y et a.,: Interpretation of near-infrared

SCE の香りによる脳血流促進、抗ストレス、免疫亢進作

spectroscopy signals a study with a newly developed用が明らかになった。今後、SCE の香りはコスメへの応

perfused rat brain model. J. Applied Physiology 9 0:

用は勿論のこと、ヘルスケア商品などの医療分野において1657-1662, 2001.
10）福田正人：精神疾患の診断・治療のための臨床検査とも幅広い用途が期待される。

５. 総

しての NIRS 測定 , MEDIX, 39: 4-10, 2003.

括11）佐藤和恵ほか：低温真空抽出法によるラベンダー精油

今回の研究により、SCE の主成分である BzA の単独暴の成分検討 ,日本アロマセラピー学会誌 13（1），24-30, 2014.

露は、前頭葉の脳血流量の増加、抗ストレス作用、免疫亢12）塩田清二 著：〈香り〉はなぜ脳に効くのか，NHK 出版

進作用さらには多幸感作用などの生理作用をもつことが確認された。さらに、さくらの花の香りには、主成分である

新書 2012.
13）竹ノ谷文子ほか : さくらの花びらセルエクストラクト− 200 −

桜の香りによる脳に及ぼす影響の機能生理学的解析の生理機能解析〜五泉さくらの抗酸化能と生理作用〜日

本アロアセラピー学会誌 18（1），14-21, 2019leaf oil. J Physiol Anthropol 22: 34: 44, 2015.
23）近藤高史ほか：精油のにおいと脳活動変化、日本アロ

14）Kim KN et al.,: 5-Bromo-2-hydroxy-4-methyl-

マセラピー学会誌 3（1）23-28, 2004.

benzaldehyde inhibited LPS-induced production of pro-24）Kondoh Tet al.: Central Olfactory Pathway ininflammatory mediators through the inactivation of

Response to Olfactory Stimulation in Rats Detected by

ERK, p38, and NF-κB pathways in RAW 264.7 macrophages.

Magnetic Resonance Imaging, Chem. Senses 30: 172‒173,

Chem Biol Interact 25（258）: 108-114, 2016.

2005.

15）Ramos-Nino ME et al.,: QSARs for the effect of25）Jimbo D et al.: Effect of aromatherapy on patients

benzaldehydes on foodborne bacteria and the role ofwith Alzheimer's disease. Psychogeriatorics 9: 173-179,

sulfhydryl groups as targets of their antibacterial

2010.

activity. J Appl Microbiol 84（2）: 207-212, 1998.
16）上田

26）Kiecolt-Glaser JK, et al.: Olfactory influences on

孝：意識障害に対するアロマテラピー香りが脳に及ぼす影響─三次元的局所脳血流量の変化から─，
BRAIN NURSING, 16, 1398-1403, 2000．

mood and autonomic, endocrine, and immune function.
Psychoneuroendocrinology 33: 328-39, 2008.
27）枝 伸彦ほか：エッセンシャルオイルによる香り刺激17）竹ノ谷文子ほか：さくら花びらの主成分であるベンズ
アルデヒドの生理作用─さくら花びらの主成分の機能解析─日本アロアセラピー学会誌 19（1）, 1-9, 2020.

が口腔内免疫能に及ぼす影響についての生理心理学的研
究 , アロマテラピー学雑誌 20: 28-37, 2019.
28）Watanuki S, Kim YK. : Physiological responses18）大久典子 ほか：香り刺激による心拍変動と脳神経細胞の酸素代謝 , 自律神経 41（4）, 2004.

induced by pleasant stimuli. J Physiol Anthropol Appl
Human Sci 24: 135-138, 2005.

19）塩田清二、匂いによるアルツハイマー型認知症の治療研究とその展開, AROMA RESEARCH 15: 103-107, 2014.

29）Okimoto, N et al.: RGS2 mediates the anxilolytic
effect of oxytocin. Brain Res 1453: 26-33, 2012.

20）塩田清二、竹ノ谷文子：香りによるアルツハイマー型30）Uvnas-Moberg K et al.: Oxytocin, a mediator of anti-

認知症の予防・治療法について 食品加工技術 37: 41-46,

stress, well-being, social interaction, growth and2017.

healing med sychosom. Med Psychother 5 （1 1）: 5 7-8 0,21）Igarashi M et al. : Effects of olfactory stimulation
with perilla essential oil on prefrontal cortex activity. J

2005.
31）Shibato J et al.,: Towards identification of bioactive
compounds in cold vacuum extracted double cherry

Altern Complement Med 20 : 545-549, 2014.
22）Ikei H, et al., : Physiological effect of olfactorystimulation by Hinoki cypress（Chamaecyparis obtusa）

blossom（Gosen-Sakura）leaves. Plant Signal Behav 14（10）: e1644594, 2019.

− 201 −

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
景山

伯春

このたびはコーセーコスメトロジー研究財団の研究助成能力など、MAA が興味深い活性を有することが徐々に明に採択していただき誠にありがとうございました。今回採らかになってきました。このような背景で、従前からの基択いただいた課題は、シアノバクテリアが生合成する二次礎生物学的な研究を継続すると共に、MAA を用いてアン

代謝物質マイコスポリン様アミノ酸（MAA）の単離精製プ

チスキンエイジングに関わるやや応用的なテーマもやって

ロセス開発と物性評価です。私はもともと（現在も）シアノ

みようという気になってきました。その上で、本助成で行バクテリアに備わる普遍的な分子機構に興味をもっており、った精製プロセス開発は、一見地味ですが、純度の高い

MAA を取り扱うきっかけとなったのもシアノバクテリア

MAA の物性評価用標品を取得するという大変重要な研究の塩ストレス応答機構の研究でした。はじめは、耐塩性シ基盤となりました。このような研究計画を採択いただける

アノバクテリア細胞内に蓄積した MAA の浸透圧調節能にことは我々研究者にとって大変ありがたいものです。本研

着目して研究を進めていました。その時には、MAA が水究をご支援いただいたことに改めて厚く御礼申し上げるとによく溶け、紫外線を吸収し、抗酸化活性をもつことが分共に、コーセーコスメトロジー研究財団のますますのご発

かっていました。さらに研究を進めていくと、酸化ストレ展をお祈り申し上げます。 （名城大学理工学部化学教室）

スによる DNA 損傷の緩和作用や蛋白質の糖化を抑制する

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて笹井亮

この度、「機能性化粧品として期待できる皮膚ガス応答が立ち始めたころであったことも相まって、健康状態を示

性発色素材の研究開発」という課題を採択していただき、す化粧品（機能性化粧品）に有用な材料になるのではないか

誠にありがとうございました。私はこれまで今回の研究課と考え、申請をし、採択いただき、研究をはじめ、現在に題でも取り上げたように、粘土のようなイオン交換性層状至ります。報告書に示した通りいくつかの系で可能性のあ

無機化合物の層間に色素を複合化することにより得られるる検知素材の創製にたどりつけつつあると思っているとこ

光機能性材料の創製を行ってきました。その中で、層間にろですが、まだまだ皮膚ガス中の分子の検知には至ってい取り込まれた色素の分光学的特性が、材料の周辺環境や分ません。今後、今回の研究助成をきっかけとして、最終的子吸着により劇的に変化する現象を明らかにしてきました。

には皮膚ガス中に含まれ、健康状態につながる分子を高感

特に、私の材料が高湿度下での分子検知に有用であること

度かつ選択的に検知し、色素の色調や発光状態の変化によがわかり、どのような分野に利用可能かをいろいろと調査・り “視える化” できる材料の創製を実現していきたいと考え検討していた折に、貴研究助成の存在を知り、化粧品へのています。最後になりましたが、化粧品という身近な分野

適用の可能性を考える機会を得ることができました。そうに私の材料が使える可能性を見出す機会をいただいた、貴した調査活動の中で、皮膚ガス中の成分の精査により、健研究財団の事務局を含む関係の方々ならびに審査をいただ

康状態を非侵襲的に診断できる可能性が研究されているこ

いた先生方に深謝いたします。

とを知りました。ちょうど私の開発した材料の膜化に目途− 205 −

（島根大学大学院自然科学研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
下里剛士

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

経皮ルートの確立を目指した、挑戦的な課題提案となって金を賜り、財団関係者の皆さまをはじめとして、大変お忙います。現在、上皮細胞培養系を用いて、粒子化、乳化オ

しい中ご審査頂きました審査員の先生方に心より御礼申し

リゴ DNA による炎症制御作用について検証を進めていま上げます。農学分野からの研究提案にも関わらず、助成採す。具体的な成果として、ヒアルロン酸ナトリウムとオリ択の判断を頂きましたことに対して、研究主宰者として重ゴ DNA を混合し、乳化処理を施した素材の開発に成功しねて御礼申し上げます。私が軸を置く、研究分野の性質上、たことから、ヌードマウスを用いた塗布試験も計画してお食品や家畜の飼料など経口的なルートに特化した新たな素り、経皮的に浸透したオリゴ DNA の皮内における分布状

材開発を行ってまいりました。乳酸菌やビフィズス菌など況について経時的に解析を行う予定があります。以上本研の有用微生物のゲノム DNA の経口ルートの開発に成功し、究は、抗炎症作用の知られたオリゴ DNA を有効性成分と機能性食品・飼料素材としての利活用を目指してまいりまする、スキンケアクリームやローション等の開発基盤の構した。その中で、所属大学の工学部の先生よりお声がけが築を目指した取り組みとして位置づけられます。今回、貴あり、幕張メッセにて開催された COSME Tech 2018 化財団より助成頂いたことを励みに、経皮ルートの開発研究

粧品開発展に出展させて頂きました。そちらで、筆者が成を一層加速させていく所存です。末筆ながら、コーセーコ

功したオリゴ DNA の経口ルートの開発事例についてプレスメトロジー研究財団のますますのご発展を、心よりご祈ゼンを行ったところ、数名の来場者より経皮ルートに対す

念申し上げます。

（信州大学農学部）

る要望と期待が多く寄せられました。本研究では、未開の2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて須原義智

この度はコスメトロジー研究助成に採択を頂き誠に有難Gly）10 を合成することでした。これは固相合成という手法

うございました。私の研究室では創薬化学分野の研究を中で CTP（Pro-βHyp-Gly）を９回繰り返して合成するのです

心に行っており、新規化合物を化学合成して薬のタネになが、非天然のアミノ酸を組み込んでいるため、通常の天然

りうる化合物を探索しています。今回採択を頂いたのは、のアミノ酸の場合とは異なり、ペプチド鎖の伸長の過程でβ-アミノ酸をコラーゲンの基本配列に組み込んだ化合物をできた立体構造次第では途中で伸長ができない可能性があ創製する研究です。コラーゲンはプロリン、ヒドロキシプロ

りました。また、CTP を繋げるためのユニットとなる

リン、グリシンからなるトリペプチド（Collagene Triprptide :Fmoc･Pro-βHyp-Gly の純度を 99% 以上に上げないと十分CTP）を基本構造として、それが多数繋がることで螺旋構に反応が進行しないことがわかりました。

造を持つ 1 本のポリペプチド鎖となります。その 3 本が寄今回採択して頂きましたテーマを含め、普段は学生と一り集まって右巻きの 3 本鎖ヘリックス構造をとることで、緒に試行錯誤を繰り返し、切磋琢磨しながら研究を進めて線維組織や骨格の構造維持に必要な性質を示すことがわかおります。それまでにうまくいかなかった化学合成を克服っています。私たちはこのコラーゲンの物理化学的な性質し、苦労して最終化合物を得たときは何事にも替えられなや、CTP の生理活性物質としての可能性に興味を持ち、い喜びがあります。このような貴重な機会を与えてくださ研究を進めております。

いましたコーセーコスメトロジー研究財団に心より御礼申

今回の研究で最も難しかったのが、β-アミノ酸を組み込し上げます。（芝浦工業大学システム理工学部生命科学科）

んだ CTP を 10 個繋げたコラーゲンペプチド（Pro-βHyp-− 206 −

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて田村

篤志

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

は、ポリロタキサンの生体材料としての利用を検討しておに採択して頂き、財団ならびに関係者の方々に深く感謝申りますが、これまでの知見や材料設計の手法を美容製品へし上げます。今回採択頂いた研究課題は美容製品の成分との応用を目指した研究で行うことは初めてであり、新たにして耳にする機会の多いコラーゲンに関する研究です。こ

学ぶことの多い研究となりました。結果としては、ポリロ

れまでの自身の研究は、合成高分子や超分子構造ポリマー

タキサンの架橋に関するこれまでの知見と矛盾しない結果に関する研究が中心であり、天然由来高分子の研究を行っが得られましたが、コラーゲンでも超分子架橋の効果が得た経験がほとんどなかったため、自身にとっては挑戦的なられたことは興味深い成果だと考えています。コラーゲン

課題でした。具体的には、我々のグループで研究を行っては美容製品だけではなく医療材料としても用いられておりきた超分子材料ポリロタキサンによるコラーゲンの機能化ますので、美容製品から着想した本テーマは、医療材料とを目的とした研究ですが、新鮮な気持ちで新たなテーマにしての応用も期待できると考えております。また、この度取り組むことができました。

頂いた研究の機会は、これまでの自身の研究とは視点が異コラーゲンを超分子で架橋するという研究は、突拍子のなる研究であり、柔軟な発想で研究に取り組むことの重要ない研究だと思われる方もいると思いますが、ポリロタキ

性を再認識しました。今後も研究を継続し、コスメトロジ

サンの分子可動性を利用した材料設計は注目を集めており、ー分野の発展に寄与する材料が創出できればと考えており様々な分野で研究が進められています。私の所属研究室でます。

（東京医科歯科大学生体材料工学研究所）

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて檜垣勇次

コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成に採択いた

アや化粧品等のコスメトロジーに関連する製品への応用、だきましたことに、心より感謝いたします。この度拝受いさらには物質輸送の制御による新たな医用分子システムとたしました研究費を活用して、環境応答性会合特性を示す

しての応用も見込んでいます。研究助成申請書では、会合

新規両親水性ブロック共重合体の創成と会合体形態変化発性高分子鎖の界面集積と秩序構造形成を制御し、形成され現機構についての研究を遂行することができました。おかるナノ積層構造多層膜のダイナミクスの計測までを視野にげさまで、双性イオン高分子で構成される非対称高分子鎖入れた研究計画でしたが、COVID-19 感染拡大による移動が、双性イオン選択的相互作用により水溶液中で分子鎖の制限のため当初計画していた実験が遅延してしまったこと構造に応じてミセル状会合体を形成し、特定の双性イオン

が大変心残りです。

との特異的相互作用によって会合形態変化が誘導される現私事ではございますが、2018 年 7 月に九州大学から本象を見出しました。疎水性相互作用により水溶液中で構造学に異動し、わずかなスペースと実験台しかない状況で、安定性の高い会合体を形成する両親媒性ブロック共重合体

2019 年 4月に配属された学部生４名と共に研究室を立ち上が会合性高分子として一般的ですが、本研究で対象としたげました。実験環境を整えるための資金がなければ研究を異種親水性高分子で構成される両親水性ブロック共重合体

始めることすらままならない不安定な状況で、研究を支援

は分子鎖と水の相互作用に応じて会合体形成が誘導されるしていただきましたことに心より厚く御礼申し上げます。

新たな自己組織化高分子群として、高分子化学分野、コロ末筆ながら、コーセーコスメトロジー研究財団と関係者各

イド・界面化学分野における新境地となると考えています。

位に重ねて御礼申し上げるとともに、貴財団のますますのまた、この新たな自己組織化高分子群の研究は、スキンケ

ご発展を心よりお祈り申し上げます。（大分大学理工学部）− 207 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて平野智也

この度は、コスメトロジー研究財団の研究助成に採択し性保護基の開発です。この光分解性保護基を、抗酸化剤、ていただき、ありがとうございました。2019 年 4 月より疾患に対する治療薬などの生理活性をもつ分子を結合させ現職に異動し、研究室を新たに主宰することになるタイミ

る。保護基が結合した状態では生理活性を失っていますが、ングでこのような助成をいただけて、本当に助かりました。

強い紫外光が照射され、さらに活性酸素種も生成した部位

重ねて、御礼申し上げます。

では、光分解反応が進行して抗酸化剤などが生成し、保護、

私はこれまで、ケミカルバイオロジー、創薬化学の分野

治療効果が発揮される分子システムになるのでは、と考えの研究を行い、蛍光物質、光分解性保護基などの光によりました。今になって思えばチャレンジングな研究でしたし、機能する分子を開発してきました。お恥ずかしながら、コ

率直に申し上げて、研究は道半ばと言わざるを得ません。

スメトロジーという言葉の意味もよく知りませんでした。

しかしながら、こうした萌芽的な研究にも可能性を見出し

そんな折、貴財団の研究助成の応募書類を読んだとき、光ていただいたことは、本当にうれしかったです。研究助成というキーワードによって、私の研究はコスメトロジーの期間が終わっても、私のコスメトロジーの研究は続きます。

分野と繋がるのでは？と考えました。その結果、考案し、今後は、より実用的な分子の開発と応用を目指していきま

提案した研究は、光によって発生する活性酸素種が存在すす。どうもありがとうございました。

（大阪薬科大学）るときに、同じ光によって共有結合の切断が起こる光分解

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて森

この度は我々の研究に助成頂きありがとうございました。

隆昌やナノ粒子のスラリーの評価を継続していくことで、我々

我々の研究は液中の粒子分散状態の評価技術を作るというの技術を「実プロセス」で利用頂けるようになることを目指

やや地味な印象を受ける（と思われる）ものです。しかしします。今回の助成研究以外にも、液中での粒子分散に関

我々は液中の粒子分散状態の制御こそが化粧品のみならず、する独自の評価技術やスラリー調製技術を開発しています

全スラリー技術の基盤となるものとの信念のもとに研究をが、これらはいずれも実際の産業現場の課題に向き合い、しております。一見すると目立たない、しかし、重要な技

その中にある学術的な問題を明確化したことによって生ま術であるという所をご理解頂けたのではないかと思うと大れたものです。スラリー評価の研究を継続していると、と変うれしく思います。

もすると「評価できるものをとりあえず評価してみよう」と今回の助成研究の中では、不規則形状粒子やナノ粒子のいう姿勢に陥りやすくなると感じております。しかし、そ分散という、分散評価の中でもやや困難を伴うスラリーにれでは、実プロセスの課題を解決することはできないでしチャレンジしました。おかげさまで、これまで独自に開発

ょう、完全な自己満足です。今回の助成研究のように、評してきた分散評価技術（沈降静水圧測定法、浸透圧測定法）

価すべきものを評価する、そして評価する方法がなければで不規則形状粒子やナノ粒子の分散についても上手く評価

新たに作るという姿勢で「現場に役立つ基礎研究」を発展できるのではないかという結果を得ることができました。

させていきたいと思っています。 （法政大学生命科学部）

今回得られた成果をもとに、今後も様々な不規則形状粒子− 208 −

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて柳澤

実穂

この度は、コスメトロジー研究財団の研究助成事業に採ゲルが、従来のバルク系で形成されるミクロゲルとは異な択していただき、誠にありがとうございました。採択時は、

る粘弾性特性を持つことを明らかにしました。またその要

東京農工大学大学院工学研究院に在籍しておりましたが、因として、マイクロメートルサイズのエマルションを覆う

申請研究が始まる 2019 年 1 月より東京大学大学院総合文

膜物性が、ゲルのナノ構造を変化させることを導きました。

化研究科へ移籍したため、今回の 2 年間にわたる助成は非本研究により得られた知識は、上記のタンパク質由来のゼ

常に有難く、お蔭様で無事に研究室を立ち上げることがでラチンだけでなく、アガロースなど他の生体高分子ゲルにきました。今回採択していただきました研究内容は、化粧対しても成り立つことを見出しており、今後の生体高分子・品学においても馴染みの深い生体高分子ミクロゲルの力学

ミクロゲルからなる化粧品製造において役立つことが期待特性やナノ構造に関するものです。ミクロゲルの分散溶液されます。さらに、今回確立したミクロゲルの粘弾性評価

に対する理解が進展する一方、機能を担う 1 つのミクロゲ法は、従来のレオロジー測定では不可能であったマイクロルに対する評価法は、その小ささゆえに限られていました。

メートルサイズのミクロ力学評価を実現する系として役立

これに対して我々は、ミクロゲルサイズ以下の細さを持つ

つはずです。今後も、こうしたソフトマター物理や高分子

長いガラスキャピラリーを用いて、ゲル表面を周期的に吸物理の視点から、コスメトロジー研究へ貢献したいと考え引変形させて粘弾性を評価する手法を確立し、例えばエマております。
（東京大学大学院総合文化研究科先進科学研究機構）

ルション重合（乳化法）
により形成されるゼラチン・ミクロ

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて山元

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

淳平

信しています。

に採択して頂きまして、心より感謝申し上げます。これま本研究では、CRISPR-Cas9 ゲノム編集と機能スクリー

で、光回復酵素と呼ばれる DNA 修復酵素の基礎的な点にニングを掛け合わせることで、新たな酵素機能の発現を目注目して研究を進めてきた中、もっと応用研究へと展開で指しました。これまで CRISPR-Cas9 を用いた研究についきるのではないか、と提案してくださった境慎司教授（大ては着手したことがなく、大阪大学高等共創研究院の鈴木

阪大学大学院基礎工学研究科）の言を受けて、コスメトロ

啓一郎教授とともに本課題を進める中で、私が持っているジーへの応用を真面目に考え始めたのが、この研究のきっ技術を鈴木教授の技術と組み合わせることで、本課題のほかけでした。調べてみますと、過去には光回復酵素の医療

かに新たな研究を始めることができました。貴財団助成が応用が真面目に考えられており、現在の技術を使えばコスきっかけとなり、停滞していた状況の好転へとつながって

メトロジーへの応用に供することが可能であろうと思い立おり、感謝の一念しかありません。助成期間は終了いたし

ち、最終目標を高々と掲げて申請書を書いた次第です。残ましたが、本課題はまだ道半ばですので、今後も引き続き念ながら、研究期間内に最終目標に到達することはできな

コスメトロジー研究への貢献ができるよう一層精進してまかったですが、これまでとは大幅に異なる研究方針や実験いります。末筆ながら、本課題の選考・支援に携わって頂手法に取り組むことができ、現在では本課題を通して得た

いた関係各位に重ねて感謝を申し上げるとともに、コーセ

知見・技術を改良してスピード感のある研究ができていまーコスメトロジー研究財団のますますのご発展をお祈り申す。また、本研究を通して多面的な考え方を身につけるこし上げます。

とができ、その後の研究費申請にも良い影響を与えたと確− 209 −

（大阪大学大学院基礎工学研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

2018 年度

研究助成

新しい時代の化粧品の安全性評価の確立を目指して足利

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成に採択していただき、厚く御礼申し上げます。

太可雄

安全性の確保であり、説明責任を含めてこれができないメーカーは、お客様に化粧品を提供する資格はないと思いま

本研究のきっかけは、私が株式会社資生堂から国立医薬す。一方で動物実験は困難となり、国際的な規制動向の把品食品衛生研究所に職場を移し、動物実験が困難な状況に握、膨大な原料の切り替え対応、新規原料の開発など現場

おいてコスメトロジーの発展にために何をすべきかを改めの苦労は尽きません。

て自らに問いかけたことです。幸いこれまで私は、特に動こうした状況を踏まえ、私は本研究を通して、共同研究

物を用いない皮膚感作性評価について実務を行うとともに、者に恵まれたことに加え、国内の様々な現場の研究者と率様々な研究機関との共同研究や業界活動を経験しており、直な意見交換をしてまいりました。スタートしたばかりの化粧品の安全性評価を担当している現場が実際に何を必要

本研究が社会実装されるためには、国際的にも様々な立場としているかを肌感覚で知っているつもりです。そこで、からの専門家との交流を通じた発展が必要になるため、今新しい時代の化粧品の安全性評価法として、動物実験に依後は本研究成果を積極的に国際的に発信していきたいと思存しない皮膚感作性のリスク評価（強度予測）と毒性学的懸います。道のりは遠く、非才な私には荷が大きすぎると思念の閾値の開発という大きな目標を設定しました。

いますが、今後も皆様とともに、新しい時代の化粧品の安

化粧品の安全性評価の現場では、対象とする原料の情報は限られており、しっかりとした評価のためには様々な分

全性評価の確立を目指して一歩ずつでも進んでまいりたいと思っています。

析試験や安全性試験を検討することになります。言うまで（国立医薬品食品衛生研究所安全性予測評価部）

もないことですが、化粧品開発において最も重要なことは2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて飯島一智2018 年 4 月に現所属に異動し研究室を立ち上げた際、は香粧品とは無縁の暮らしを送ってきましたが、会議や講最初に採択いただいた研究課題が本研究助成でした。私は義、ゼミなどがオンラインで行われるようになったことでそれまで細胞足場材料の研究を主に再生医療を志向して行自身の加齢を実感するとともに見た目を意識するようになってきましたが、独立を機に安全性評価に関する研究を立り、白髪染めやスキンケアを始めました。外出自粛で鬱々ち上げようと「シリカナノ不織布を用いた汎用皮膚三次元とする中で、少し若返ったように感じられる自分の顔を見

モデルの開発」を提案いたしました。現在、安全性評価にると元気が湧いてくる感覚がありました。コーセーコスメ

関する研究は当研究室の主要なテーマのひとつになりましトロジー研究財団が医学・生物学、化学分野にとどまらず、た。

精神、文化に関する研究分野のご支援もされていることを研究期間の後半約 1 年間は COVID-19 の影響を大きく受思い出し、その意義を再認識いたしました。

けました。大学への入構が約 2 ヶ月間禁止され、解除後も最後になりましたが、研究をご支援いただきましたコー

学生の滞在時間の制限や試薬・消耗品の納入遅れなど、研セーコスメトロジー研究財団および関係者の皆様に心より究の遂行が難しい時期が続きました。

御礼申し上げます。

一方で新たな発見もありました。これまで消費者として− 210 −

（横浜国立大学大学院工学研究院）

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて伊藤

佐生智

コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成に採択いたの研究がなされている Hla のような既知毒素でも新しい視

だき、2 年間の研究をサポートしていただいたことに厚く点から解析することで新機能を見出せる、未だ研究の余地お礼申し上げます。私は細菌毒素に興味があり、黄色ブドがあるのだと考えさせられました。また SSL12 の研究は、

ウ球菌毒素の新たな機能、特に免疫かく乱作用の発見を目

これまで毒素による免疫抑制作用に着目していた自分にと指して研究を進めております。これまでは生化学的な手法って、毒素の免疫活性化作用という、逆の生理作用の発見により黄色ブドウ球菌毒素の新規標的分子の探索を行ってであり、新たな研究のフィールドが開けたように感じましおりましたが、数年前からこの手法での標的分子の探索にた。振り返ってみると、私にとってコスメトロジー研究助

限界を感じていました。本助成を受けて新たにマスト細胞成を受けたことは、毒素研究の突破口であり転換点であっと好塩基球を用いた実験系を導入いたしました。これらのたように思います。今後は毒素の作用機序の解明、毒素の細胞の免疫応答に影響を及ぼす毒素を探索した結果、溶血アレルの生理活性の比較など見出した毒素による免疫細胞

毒素 α ヘモリジン（Hla）がマスト細胞の活性化を増強するの活性化機構の解明を進めることでコスメトロジー研究にこと、機能未知であった Staphylococcal superantigen-like

貢献したいと思います。

（SSL）12 がマスト細胞と好塩基球を活性化することを見出（名古屋市立大学大学院薬学研究科衛生化学分野）

すことができました。Hla の研究を通じて、古くから多く2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
内山明彦

この度はコーセーコスメトロジー研究財団の研究助成にました。大学院生と一緒に取り組んでいますが当初は期待採択していただき誠にありがとうございました。私は皮膚していた実験結果が出ない日々が続いていたため、頑張っ

科領域における common disease である褥瘡に関する研究て実験に取り組む院生へ非常に申し訳ない思いを抱いていを行っています。現在も有効な治療方法が確立されていなました。その後、SOX2 は虚血再灌流障害に対する酸化ス

い急性期の褥瘡（紅斑や紫斑のみの状態）に対して、潰瘍化

トレス応答作用を増強し、組織へのダメージを軽減するこの抑制や潰瘍の早期治癒につながる革新的な治療アプローとを示すことができました。本研究成果を基礎として、老チについてこれまでに様々な検討を行ってきました。私は化などの酸化ストレスが関連する皮膚疾患に対する SOX2

現在 NIH での留学にテーマにしていた転写因子 SOX2 のやそのターゲットを用いた新たな治療開発につながること

皮膚疾患への治療応用の可能性に関して日々様々な検討をを期待しています。

行っています。本研究では転写因子 SOX2 による急性期褥瘡における制御機能についてマウスモデルを用いて検討し− 211 −

（群馬大学大学院医学系研究科皮膚科学）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

2019 年度

研究助成

皮膚で発現する化学物質受容体が体の温度適応に与える影響
太田 秀明
茜
住吉

このたびは貴財団の第 30 回研究助成に採択い頂きましの結果が一部得られ、従来、ヒトにおいて接触刺激などをて、深く感謝申し上げます。研究のターニングポイントと受容するメカノレセプターとして知られていた分子が、温なっておりましたため、貴重な機会となりました。本助成

度を受容することを見つけました。さらにその C. elegans

研究のテーマは、皮膚で発現する化学物質受容体が体の低ホモログの変異体において、低温耐性が異常であり、体内温耐性に与える影響を線虫をつかい解析するものです。貴の脂肪酸比率が変化ししていることが見つかりました

財団に研究進展の背中を押して頂いたと同時に、期待に応（Takagaki, et al., 2020）。また、皮下組織で発現している

えられるよう結果を出すために精進したいと思いました。

GPCR も低温耐性に関与していました。

本研究では、C. elegans とよばれる体長 1 mm ほどの線

今後は以上の結果をもとに、より応用に近い研究も進め

虫をつかって、動物がどうやって周りの環境温度を受容していきたいと考えています。シンプルな動物の胚スループ

温度に適応するのかを解明する目的で行っています。具体

ットな応答解析系をつかっても、動物の温度応答機構の全的には、C. elegans の温度に対する応答である低温耐性に貌を解き明かすには時間がかかりますが、全力で取り組み着目し、ヒトを含む動物の温度受容機構や、温度環境に馴たいと思います。これからも、本助成を受けられる多くのれる仕組みを解き明かそうと進めています。これまでの研研究者の皆様のご活躍と貴財団のさらなる御発展をお祈り

究から、温度の感覚や記憶に関わる幾つかの遺伝子が見つ申し上げます。

かりまして、それらは人間にも存在していました。

（甲南大学大学院自然科学研究科／統合ニューロバイオロ

本研究助成では、皮膚で発現する化学物質受容体が体のジー研究所）

温度適応に与える影響を解析しました。その中で、予想外2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
大和田

智彦

不飽和脂肪酸、例えば DHA はサプリメントとして販売ていないことを見せつけられました。一見無駄なように見され、通販でもよくみられる化合物で、その作用の多彩さ

える研究にも投資し、ある幅広さが科学・技術には不可欠がよく知られています。この数年サプリメントから医薬品な様です。また、このコロナ禍で、何よりも身体的・精神シードができるかも知れないとの発想から研究を行ってい的な面からの健康が重要であることを痛感致しました。コ

ますが、新しいことを学びながらの展開でなかなか思うよ

スメトロジーにも既にセルフメディケーションの発想が組

うにいきません。このコーセーコスメトロジー研究財団のみ込まれていると思いますが、コロナ禍を経験している今、研究助成の成果も完成版とは大変かけ離れたものです。一

日頃からのセルフメディケーションが今後ますます重要に方でこの研究助成を受けている間に未曾有のコロナウイルなると思います。コーセーコスメトロジー研究財団のますス感染拡大が起こり、学生の感染防止やその中での研究室

ますの貢献を祈って止みません。この度は公益財団法人コの運営、講義のオンライン化への対応で手探り状態が続き、ーセーコスメトロジー研究財団の研究助成を受けることが記憶が残らないくらい次から次へ考えることが出て来て大でき心より感謝申しあげます。

変だったというのが正直な所です。今回のパンデミックが、日本のハードだけではなくソフトも時代の変化に対応でき− 212 −

（東京大学大学院薬学系研究科）

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
押海裕之

免疫応答は病原性を有する異物に対しての生体防御機構

私たちの研究室では以前から自然免疫の研究を進め、そとしてヒトの身体に備わったシステムである。一方で、この研究の中で上皮成長因子（EGF : Epidermal Growth Factor）の免疫系の異常が花粉症などを引き起こし本来無害である

がDDX60 と呼ばれる分子のリン酸化を介して炎症性サイ

異物に対しても過剰に反応することがヒトにとって悪い影

トカインの産生を制御することを明らかとした。EGF は肌響を及ぼす。そのため化粧品に含まれる成分に対しても免のターンオーバーを誘導しアンチエイジングを謳う数多く

疫応答が生じた場合には皮膚や肌に大きな影響を与える。

の化粧品に配合されている。炎症性サイトカインは毛細血

それが重大な社会問題として発展した例として「茶のしず

管の透過性を亢進することで赤発や腫脹を伴った炎症の原

く石鹸」によるアレルギー誘発問題が有名である。この石因となることから EGF がこれらの肌の炎症に与える影響

鹸に含まれていた小麦加水分解物はもともと身体に害悪のを調べることが重要と考えられた。今回、コスメトロジー

ないものであり、多くの人にとっても健康や美容の面から研究助成を受けて EGF と免疫との関連について新たにも何の影響もなかったことに対して、一部の人にはアレル

EGF が炎症を抑えることを明らかとして、さらに、炎症ギーを誘導し大きな問題を引き起こした。またこれ以外にを抑えながらも上皮の抗ウイルス作用は阻害しないことをも硫酸ニッケルや塩化コバルトなどを含めた様々な化粧品

明らかにすることができた。これらの発見は EGF を化粧品の成分がアレルゲンとして問題となるケースも稀に存在すに含ませることの効果や安全性を考えるための重要な基礎る。そのことから化粧品の成分が免疫に与える影響は重要

データになると期待される。

な問題となる。

（熊本大学大学院生命科学研究部免疫学講座）

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
神沼修

本研究を遂行するにあたり、大変貴重な研究助成を賜りローンマウスを利用して、そのようなアトピー患者皮膚にました公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に深対する化粧品の影響を、スクリーニングレベルで簡便に検謝申し上げます。

討できるマウスモデルの作製に挑みました。一部計画通り

100 万人単位で死者の出るパンデミックとなった新型コに進まないところもありましたが、それでもアトピー性皮

ロナウイルス感染症に対し、漸くワクチン・治療薬が供給

膚炎様病態を、迅速かつ安定して発症するモデルの樹立にされるようになってきました。そのような多くの人命を救成功し、ステロイド薬やタクロリムス等、既存のアトピー

いうる医薬品においても、連日副作用の問題が報道される性皮膚炎治療薬の有効性も確認することができました。

につれ、コスメトロジー領域における安全性の問題は、よ今後このモデルを、アトピー患者皮膚に対する化粧品安り厳格に議論されるべきものではないかと実感します。

全性評価系のスタンダードとなるよう、さらに熟成してゆ

勿論これまで、化粧品を開発する上で最も重要な検討項

く計画です。またその利活用を促すことにより、より良い目とされる皮膚刺激性を含め、その安全性を評価するさま

化粧品の提供を通じて人々を笑顔にする、元来コスメトロ

ざまな実験系が実用化されています。その一方、皮膚のバジーが持つ意義を高めることに、微力ながら貢献してゆき

リア機能が低下したアトピー等の皮膚炎患者に対する化粧たいと考えています。

品の利用はより慎重になるべきですが、私は、そのような最後になりましたが、今回のご支援を賜りましたことに皮膚炎患者に対する皮膚刺激性を的確に評価できる実験系

改めて御礼申し上げますと共に、貴財団の益々のご発展をが充実していないことに気づきました。

心より祈念致しております。

そこで今回、自身が開発した抗原特異的 T 細胞由来のク− 213 −

（広島大学原爆放射線医科学研究所）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

2018 年度

研究助成

チロシナーゼと金属
神戸

大朋

私は長年にわたり亜鉛を研究対象としてきたのですが、ため、生命活動においてこの制御は極めて重要なこととな

留学先で銅酵素であるチロシナーゼの研究をかじったことります。これらのことを考えますと、本研究の目的はメラがあります。帰国後 10 年を過ぎ、偶然目にした論文で、チ

ニン色素合成の理解を深めることではありますが、これにロシナーゼには他に２つの相同分子が存在しており留まらず、生命金属の細胞内動態と生理作用の統合的な理（TYRP1・TYRP2）、チロシナーゼとの相同性の高さから解にまで貢献できるのではないかと期待しています。

それらの金属配位が銅であると思われていたところ、亜鉛

チロシナーゼは、美白との関連からもこれまで多くの研の可能性が出てきたという混沌とした状況にあることを知究が実施されており、コウジ酸などは、作用点がチロシナりました。銅と亜鉛といった拮抗する 2 つの微量金属が協ーゼであることが明らかにされています。コウジ酸と同じ調して機能する連続的な酵素反応を解析した例は、現在ま効果は、チロシナーゼに配位した銅を除去する銅キレート

でのところ報告されておらず、私は、チロシナーゼこそ、剤でも実現可能であることも分かっています。本研究成果

この謎を解明するのに相応しい酵素ではないかとの考えにによって、TYRP1 や TYRP2 を阻害する成分が同定でき至り、本研究助成にご採択いただいたことをきっかけに、

れば、チロシナーゼを阻害する成分を組み合わせることで、研究に着手しました。

好みに合わせた色を作り出すこれまでにないオーダーメー細胞で発現するタンパク質の 30% には金属が配位してド化粧品の創成といった新たな価値を持つ化粧品開発に結おり、正しい金属が的確なタイミングで配位することは、びつくのではないかと、日々夢を膨らませて研究を進めてタンパク質がその機能を発揮することに不可欠です。そのいます。

（京都大学大学院生命科学研究科）

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて北村

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成に採択していただき、誠にありがとうございました。

秀光

特異的 T 細胞応答を惹起し、慢性炎症やアレルギー疾患に関わることを発見しました。

私は、現在、健康維持にとって重要な神経系と免疫系の本研究では、イミキモド誘発乾癬モデルマウスを作出し、クロストークについての研究を展開し、特に神経ペプチド

IFN-STAT1-NK2R 信号伝達経路による乾癬の病態発症

受容体を介した神経ペプチドシグナルによる免疫機能の調と重篤化への関与を示唆するデータを得ました。本研究成

節効果および免疫関連疾患の予防法の確立を目指して研究果をもとに、引き続き、IFN-STAT1 依存的な NK2R の発を進めています。その中で、痛みやストレスにより産生さ現誘導を介した神経ペプチドシグナルの制御による皮膚炎

れるタキキニン類の一つニューロキニン A による免疫調の改善効果について明らかすることで、将来、皮膚炎に苦節作用に関する研究を行い、これまで IFN-γ 誘発ステロイ

しんでいる患者さんたちに少しでもお役に立つ情報、知見

ド抵抗性重篤化喘息モデルの病態の発症と重篤化、またシを発信したいと考えています。

ラカバ花粉抗原に対するヒト免疫応答において、ニューロ

最後に、本研究を遂行するにあたり、共同研究を行ってキニン A の受容体である NK2R を介した神経ペプチドシグ

いる先生方や研究室の学生さんに深く感謝するともに、ごナルによる制御メカニズムについて検討しました。その結支援いただいたコーセーコスメトロジー研究財団および関果、抗原提示細胞の一つである樹状細胞において IFN-

係者の皆様に心より御礼申し上げます。

STAT1 依 存 的 に NK2R が 発 現 誘 導 さ れ る と と も に、
NK2R を介した神経ペプチドシグナルが過剰なアレルゲン− 214 −

（北海道大学遺伝子病制御研究所）

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2018 年度

研究助成

セラミドとコスメトロジー
木原章雄

この度は研究助成を賜り、ありがとうございます。今回骨格をなすため、全ての組織、細胞に存在します。しかし、採択していただいた研究課題はアシルセラミドと呼ばれる

一般的な組織におけるセラミドはスフィンゴ脂質生合成経

皮膚透過性バリア形成に必須な脂質の産生の分子機構に関路の中間体という側面が大きく、量的にはそれほど多くあするものです。近年、セラミドは多くの化粧品に配合されりません。一方、表皮角質層においてセラミドは脂質多層るようになり、「セラミド＝皮膚機能の改善」というイメー

構造体（脂質ラメラ）の主要な構成成分として重要であり、ジが一般の人にも広く認められるようになってきましたが、他の組織に比べて数十倍量存在しています。このようにセセラミドと一口に言っても多様なクラスと分子種が存在しラミドが多くかつ多様な分子種が存在しているというのはます。この多様なセラミドクラスの中でもアシルセラミド

表皮の大きな特徴の１つです。私はセラミド研究会というは皮膚バリア機能に最も重要です。私たちはこれまでアシセラミドに関する学術集会の副会長を務めています。このルセラミド産生に関わる多くの遺伝子を同定してきました

研究会は 14 年前に発足し、アカデミアと民間（特に化粧品、が、本研究課題の対象である ACSVL4 はその最後の遺伝

食品メーカー）の研究者が参加して年に一度情報交換を行子になります。私は基礎の脂質生化学者として長年セラミっています。もし、セラミドに興味のある方がおられまし

ド研究に従事してきましたが、必ずしも皮膚あるいはアシ

たら、是非一度ご参加ください。末筆ながら、コーセーコ

ルセラミドに限らず様々な組織における多様なセラミドのスメトロジー研究財団の今後ますますのご発展を祈念いた

重要性、産生の分子機構に関する研究を行ってきました。

します。

（北海道大学大学院薬学研究院）

セラミドはスフィンゴ脂質という生体膜の脂質成分の疎水2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて小林翔

この度は、コスメトロジー研究助成に採択頂きまして誠

ロドデンドロールによる白斑形成にフェロトーシスが関与にありがとうございました。今後の研究の発展の基盤となするのではないかと仮説を立て、本研究に取り組んできまる成果を得ることができ、コーセーコスメトロジー研究財した。しかし、フェロトーシスを直接判断する方法が無か

団および関係者の皆様には心より感謝いたします。

ったため、生体での病態への関与についての解析が不十分

これまで私は生体内の酸化ストレスに対する抗酸化防御でした。本研究の成果の一つとしてフェロトーシス細胞を機構について遺伝子改変動物およびそれら動物由来の培養

特異的に認識するラットモノクローナル抗体の樹立に成功

細胞を用いて研究を行ってきました。特に、細胞の主要な致しました。今後、この抗体を用いて、ロドデンドロール

抗酸化物質であるグルタチオン（GSH）の代謝とその合成による白斑などの皮膚疾患と共に、酸化ストレスが発症にに必要不可欠なシステインの供給経路について一貫して続関わる癌や神経変性疾患などの病理標本に使用し、病態とけています。近年、GSH の枯渇は過酸化脂質の蓄積が特

フェロトーシスとの関係の解明のため詳細な解析を続けて徴的な鉄イオン依存的細胞死・フェロトーシスを誘導する

いく所存です。

ことが明らかになり、GSH 代謝の観点からフェロトーシ

本研究を進める中でご協力を賜りました多くの共同研究

スを制御する分子機構の解明を目指した基礎研究を進めて者の先生方や学生には深く感謝すると共に、研究成果を社います。最近、私達は一重項酸素がフェロトーシスを誘導

会に還元できるように邁進していきたいと思います。

することを確認しており、紫外線の照射によりロドデンド
ロール代謝物から実際に一重項酸素が生成されることから、− 215 −

（山形大学大学院医学系研究科）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
繁森

英幸

高齢化が進むにつれて、老化に関わる薄毛や脱毛に悩むする天然由来化合物の探索を行いました。その結果、カフ方は年々増加しています。重篤な病気ではありませんが、ェ酸誘導体の 1 つであるクロバミドという化合物に、顕著

精神的なことを考慮するとその対策は重要であると思われな HGF 産生促進活性を見出しました。クロバミドはカカます。これまでに多くの育毛剤が開発されてきており、一オ豆やコーヒー豆に含まれる成分でもあることから、ココ定の効果は現れていると思いますが、一方においては副作

ア、チョコレートおよびコーヒーにも含まれており、これ用なども問題になっているのが現状です。そこで、より安らを日常的に摂取することによって加齢に伴って減少した

全で安心な育毛剤の開発においては、副作用の少ない薬剤

HGF の産生を促進することで、薄毛や脱毛を予防するこ

ひいては日常的においても摂取することのできる化合物をとができるものと期待されます。さらには、HGF 産生を促用いることが適切だと思われます。そこで本研究では、肝進することによってアルツハイマー型認知症や筋萎縮性側細胞増殖因子（HGF）に着目して、その HGF 産生を促進す

索硬化症（ALS）などの難治性神経変性疾患にも効果を有する化合物を育毛剤へと応用することを目的としました。

ることが見出されており、クロバミドはこのような疾病の

HGF は細胞増殖、血管新生、細胞死抑制および形態形成予防への応用にも期待されます。最後になりましたが、本などの活性を有していますが、育毛・発毛作用もあり、頭研究助成に採択していただいたコーセーコスメトロジー研

髪の再生にも関わることが知られています。本研究では、

究財団ならびに関係者の皆様に心より感謝申し上げます。

ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）を用いて HGF 産生促進を有（筑波大学生命環境系）

2018 年度

研究助成

新たな観点からの黄色ブドウ球菌の研究
島村裕子

この度は、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助成

主任教官の増田修一教授のサポートもあり、黄色ブドウ球を賜り、2 年間の研究をサポートしていただきましたこと

菌の放出する膜小胞と皮膚常在菌の代謝物との関連性の解に、心よりお礼を申し上げます。

明を目指すテーマへと発展させることができました。ヒト

私は、これまで、食品衛生学的観点から、食中毒起因菌

皮膚上に常在する細菌の代謝物が黄色ブドウ球菌を正常なである黄色ブドウ球菌を研究してきました。3 年前のある数に戻す、またはその病原性を抑制することにより、宿主日、アトピー性皮膚炎患者の皮膚では、常在菌の種類が著防御に関与していることを明らかにすることができれば、しく減り、その過半数を黄色ブドウ球菌が占めるという論

アトピー性皮膚炎の治療につながるだけでなく、高齢者や文を読んだ学生が「アトピー性皮膚炎に関与する皮膚常在皮膚炎症状のない健常者においても、日常のスキンケア法菌」として黄色ブドウ球菌を研究してみたいと熱い希望をとしての活用が期待できると考えています。今後は、本研

ぶつけてきてくれました。それをきっかけに、初めて、「学究で得られた成果をもとに、正常ヒト皮膚常在細菌の菌体生と一緒」に研究費の申請書を作成しました。研究助成に外成分を明らかにすることにより、黄色ブドウ球菌が誘導採択された時は、資金面でのサポートをいただけることにするアトピー性皮膚炎に対するスキンケア方法の確立に向加え、研究内容が認められたことが大変嬉しく、研究の原

けて、研究を進めていきたいと思います。

動力となりました。新たな研究分野に挑戦したこともあり、思うようにいかないこともありましたが、学生の頑張りや− 216 −

（静岡県立大学食品栄養科学部）

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて清水

重臣

このたびは、コーセーコスメトロジー研究財団の研究助

胞の最も本質的な機能であると考えられます。新規オート

成によりご支援いただき、まことに有難うございました。

ファジーを入り口に、さらに深く解析を進めることにより、

私は、「新規オートファジー」という新たな細胞内タンパク

バリア機能の新たな側面がわかるのではないかと期待して質分解機構を発見し、その生体での機能解析と疾患との関おります。

連性を研究しております。体を構成するすべての細胞が有また、本研究では、新規オートファジーを活性化して皮する機能ですので、皮膚においてももちろん機能しており膚のバリア機能を向上させる化合物の同定にも成功しまします。様々な臓器の細胞において新規オートファジーの役た。本化合物の開発を進めることにより、アトピー性皮膚割を解析することにより、臓器ごとにその役割が異なって炎に限らず、シミ取りや美白などの肌の美容に対しても、いることを見出しておりますが、興味深いことに、いずれ科学的な根拠に基づいた効果が得られるのではないかと期の臓器の細胞においても、新規オートファジーはその本質待しております。このように、今回ご支援いただいた研究的な機能に密接に絡んでおります。今回の皮膚に関する研を今後もさらに発展させていきたいと考えております。

究においては、バリア機能の一翼を担っていることが明ら（東京医科歯科大学難治疾患研究所）

かになりましたが、これは即ち、バリア機能こそが皮膚細2019 年度

研究助成

天然の人工皮膚を目指して
武尾真

この度は貴財団の研究助成に採択していただき、誠にあ法を確立し、この毛包を人工皮膚へと組み込むことによっりがとうございます。関係者の皆様には厚くお礼を申し上て、毛の生えた人工皮膚を開発することもできました。毛げます。

包は様々な物質の体表面から皮膚内への浸透の経路となり、現在、日本の人口の約 2 人に 1 人は何らかのアレルギー

また毛包の皮脂腺から分泌される皮脂は皮膚のバリア機能疾患にり患していると言われており、また昨今の新型コロを高めることが知られています。これらのことから、今回ナウイルス対策で手洗いや手の消毒の機会が増えたことに開発した毛の生えた人工皮膚は従来の皮膚代替物に比べ、より、肌のアレルギー反応や肌荒れが問題となっています。

より天然の皮膚に近い状態での安全性・機能性試験の実施

私自身も肌が弱く、特定の洗顔料以外では顔が荒れ、ガビが可能であると期待されます。

ガビになってしまいます。このため、化粧品の安全性や、今回の研究において得られた、人工皮膚に様々な皮膚付

副反応について、さらに注意を払う必要が求められていま

属器や細胞を組み込むための技術と知見は、組み込む細胞

す。化粧品開発において、動物実験の代替法として人工皮種を変えることにより研究のニーズに応じた様々な評価系

膚が使われていますが、より生体皮膚の反応に即した安全へとカスタマイズできる可能性を示しています。また、人性・機能性試験が必要とされます。

工皮膚をさらに高度化することによって「天然の（皮膚と同今回助成金を受け、張力という機械的な刺激を付加する

等の）人工皮膚」を作り上げることにより、コスメトロジー

ことにより、これまでの皮膚代替物と比較して、より天然

のみならず再生医療分野を含む多くの研究分野の進歩・進の皮膚に近い生理活性を示す三次元人工皮膚を開発するこ展に貢献していきたいと考えています。

とに成功いたしました。また、生体外での毛包の再構築方（国立研究開発法人理化学研究所生命機能科学研究センター）− 217 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて
武元

宏泰

自身の専門分野が高分子化学及びそのバイオマテリアル

現在、医療の世界では個人の状態（時には遺伝子情報）にへの展開であり、その技術に立脚して肌フローラ育成とい応じたテーラーメード型の治療への展開が叫ばれつつある。

う研究を着想した。医療応用を目指す研究には経験がある

同様に、化粧品においても個人の状況に応じて最適な成分

ため、生体適合性や毒性等へ配慮しながらの材料設計を行組成が存在するはずである。これに関し、本研究ではそのった。しかしながら、医療応用においては体内にて機能を一環として肌フローラにおける善玉菌を選択的に育成する

発揮する分子設計が求められるのに対し、肌フローラ育成

手法の開発に取り組んだ。開発された手法においては、弱ということで体外での機能発現が重要である。そのため、

酸性 pH に依存して栄養物質を放出するように分子が設計

外気との接触等にも耐えられるようなタフな材料設計を行されている。そのため、悪玉菌優勢な弱塩基性環境では栄うように苦心した。

養物質の放出が抑制されるが、善玉菌優勢な弱酸性 pH で提案した課題の遂行においては分子の設計や合成、分子は栄養物質の放出及び菌の増殖の促進が誘導される。肌表の機能の物理化学的評価や菌類を用いての生物学的評価が面のミクロな環境での pH 変化を認識できるように設計す

含まれており、包括的な内容となっていた。頂戴した研究ることで、その時々の肌の状態に適した機能発現が可能と資金の自由度が高いため、それらの一連の研究遂行へのハなる。開発された分子設計は種々の栄養物質にも適用でき

ードルは低く、有り難かった。コロナ禍で研究時間等が厳る。今回は Staphylococcus epidermidis に着目して研究をしく制限されたものの、全体を通してのフィージビリティ

遂行したが、将来的には様々な表皮常在菌に適応した素材の確認までこぎつけたのは、先述の研究資金の使いやすさ

開発へと取り組んでいきたい。

によるものが大きいと考えている。

（東京工業大学科学技術創成研究院化学生命科学研究所）

2019 年度

研究助成

コーセーコスメトロジー研究財団研究助成事業の可能性
立松健司

このたびは、コスメトロジー研究助成によりご支援賜り

財団様もこのような交流の場を設けて頂ければ、コスメト

まして、誠に感謝申し上げます。今回の受賞者表彰式に際

ロジー分野のさらなる発展つながるのではと感じています。

して開催頂いた立食パーティーで、受賞された多数の研究

また、株式会社コーセー様の研究所研究員の方への共同研

者、株式会社コーセー様の研究者と話が弾みました。他財

究提案の場としても機能するかもしれません。今後のコー団の例を挙げて恐縮ですが、助成金研究の終了後も毎年受セーコスメトロジー研究財団様の活動として御一考頂けれ賞式典への参加が可能で、サロンとして研究者交流の場とば幸いです。

なっている例もございます。コーセーコスメトロジー研究− 218 −

（大阪大学産業科学研究所）

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて徳留

嘉寛

この度はコスメトロジー研究助成に採択を頂きまして関

ときてなかったのが正直なところですが、そういう意味で係の皆様に感謝申し上げます。化粧品に関わる基礎的、応は化粧品に関わる研究に大学院生時代にはすでに触れてお用的な研究に対する研究助成はあまり多くなく、様々な公り、そこにまた立ち戻っているという不思議な感覚があり的な競争的研究費の中では珍しいなかで、大変ありがたくます。研究は視野を広く、そして境界はないことを実感で思っています。私は研究活動として、化粧品科学を中心にきる研究室でした。

行っていますので、自分の研究を化粧品研究そのものとし化粧品に関わる研究は、基礎研究も応用研究もありますて申請し、採択して頂けたことに関し本当にありがたく思が、その一部は商品化にも将来的にはつながるものもあるっています。

と思います。良い化粧品は、人々の気分を明るくし、人々話が少し変わりますが、私は大学院生時代に、静岡県立の生活を良くすることが考えられます。さらに景気も良く大学で奥 直人先生（現帝京大学薬学部長）の研究室でリポすることも考えられます。そのような分野の研究助成をしソームを用いた研究を行っておりました。当時は、固形がてくださるコーセーコスメトロジー研究財団様には本当にんや転移がんを治すことを目指したリポソーム研究を行っ感謝を申し上げますとともに私自身もより一層、この研究ておりましたが、その横の実験台ではある企業の方がリポ分野に関わり、さらにより良い成果を出せるように精一杯

ソームを化粧品に応用することを試みていました（その時努力したいと思います。繰り返しになりますが、この度は点では、モイスチャーリポソームの基礎的研究はすでに終コスメトロジー研究助成を頂きまして感謝申し上げます。

わっていたようですが）。その時には化粧品の研究にピン（城西大学薬学部）

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて中村

元直

この度のコーセーコスメトロジー研究財団研究助成への採出機構の作動シグナルを惹起することで細胞障害を回避させ

択には心より御礼申し上げます。私は 19 年間、民間製薬企る、まさに妄想とも言える作業仮説です。“独創性は、最初業で創薬に従事し、2006 年に東京大学大学院医学系研究は少数派、多くの人から共感を得たら独創性は薄れる” とは科に准教授として着任してからは本格的に Gタンパク質共役

思いつつも、こうした私の妄想的研究課題をご理解いただき、型受容体（GPCR）研究をスタートさせました。ただ、私の助成に採択していただいたことを本当に嬉しく思っております。

GPCR 研究は 1991 年の血小板活性化因子受容体遺伝子

私が考えている仮説が実証できれば新奇な生体防御機構ののクローニングにさかのぼります。以来約 30 年、GPCR の提唱のみならず、皮膚の保護剤開発にも発展する夢のある

創薬標的としての魅力に取り憑かれて研究を続けてまいりましテーマだと確信しております。こんな話を研究室で学生としてた。民間企業の研究員時代はテーマの制約等で挑戦的なおりますと、妄想の輪が広がり、学生の目が輝いてくるのが課題にはなかなかチャレンジできませんでしたが、その反動

わかります。研究には夢があります。若い研究者達と一緒にか、アカデミックな世界に移ってからは誰もやらないこと、誰も夢を育てることにも財団の助成を活用させていただいておりま

思いつかないこと、即ち、『 独創性 』をキーワードに様々なす。妄想とは言いつつ、自身の提案には責任を持ち、着実

GPCRを対象とした研究を節操なく続けてまいりました。そんに証拠を積み上げて実証に向けて努力を続けております。後な中でも本採択課題は奇抜な類いのテーマと言えます。①苦に振り返った時、今回の助成が研究成功へのスタートであっ味を感受する受容体が皮膚細胞に存在する、②しかも形質たと言えるよう、精いっぱい研究に精進していく所存です。

膜ではなく細胞内オルガネラ膜に局在する、③その意義は、今後の財団のますますのご発展を祈念いたします。

細胞内に侵入した有害物質の結合で活性化され、有害物排− 219 −

（岡山理科大学大学院理学研究科臨床生命科学専攻）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

2018 年度

研究助成

高齢社会に美と健康をもたらす研究を志して
服部文幸

2002 年より、ヒト iPS 細胞を用いた心臓再生医療一筋にアが出現し、女学生および女性研究者（20 代～ 60 代）らと研究活動を行ってきましたが、2018 年に現職に就いて以来、の議論が、次の目標や夢を生みつつ、大変に熱く盛り上がより広い分野への iPS 細胞の応用を模索してまいりました。

っていることです。この経験から、アピアランスに対する中でも、かねてより興味を持っていた皮膚やその付属器官

ウォンツの計り知れない大きさを実感できました。今後も、へのアプローチを展開する最初の一歩を貴財団に助けて頂

医療・医薬品分野からコスメトロジー分野への応用は加速きました。この場をお借りして、貴財団に関わられておらする一方であろうと予想されます。我々のように医療的なれる方々に心から御礼を申し上げます。今回、「ヒト老化

視点からコスメトロジーを考えてゆくことが益々重要であ

皮膚モデル」という切り口で採択を頂き、報告書に記述致ると同時に、コスメトロジー分野のマーケティングや研究しましたように、ある程度の達成を得たものと考えており開発部門と我々医療研究者の緊密な交流の必要性を思わずます。今後この研究を発展させ、実用価値をさらに高めてにはおられません。最後とはなりますが、コーセーコスメ

ゆきたいと考えております。特筆させて頂きたいのは、こ

トロジー研究財団の益々のご発展を祈念いたしております。

の研究をさせて頂いている過程で、様々な気付きやアイデ（関西医科大学大学院医学研究科医科学専攻）

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて原

博満

今回、コスメトロジーの研究助成を受けましたことに深もぜひ、萌芽的、挑戦的な基礎研究課題に引き続き数多くく感謝をしております。結果的には、私の研究者としてののご支援をしていただいて、近年、目に見えて衰退の道を見通しの甘さから、しっかりとした結論にまで至ることがたどっている日本の基礎科学力の再興にお力添えをいただ

できませんでした。しかし、自分としては大変挑戦的な研ければ大変嬉しく思います。貴財団の崇高な理念を称え、究課題に取り組ませていただくことができました。この研感謝し、今後のますますの発展をお祈りしております。

究期間は、私の研究人生の新鮮かつ貴重な経験として今後（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科）の成長の糧になるであろうと強く感じております。今後と2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて廣田

豪

この度はコスメトロジー研究助成を賜りまして心より感生体を保護する役割を担っており、消化管等からの吸収に謝申し上げます。助成頂いた研究内容は、ヒト皮膚におけ比べると皮膚からの薬物の吸収は極めて少なく、吸収速度

る薬物トランスポーター発現の個人差要因の解明です。皮や効果発現に要する時間も遅いことが知られております。

膚は薬物の重要な投与部位の一つでもあり、投与や投与中

また、薬物の皮膚透過は受動拡散によるものと考えられて止が簡便であることことから、他の薬物投与経路にはないきたため、これまでの経皮吸収に関する研究では、物理的利点が数多くあります。しかし、元来皮膚は外部環境からバリアである角質層の克服に主眼が置かれ、薬物をいかに− 220 −

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて効率よく透過させ、標的部位に運ぶかという製剤的な技術

ーの応用展開です。近年、薬物治療においては、個別最適開発が中心でありました。今回の研究により、皮膚には重化による効率的・経済的な医療が進められております。薬

要な薬物トランスポーターが存在しその発現量には幅広い物治療と同様に、皮膚におけるトランスポーターの発現量個人差があることが明らかとなりました。また、トランスに応じて、個人個人に合った最適な化粧品の選択が今後のポーター発現量と皮脂量との関係も示唆されました。この

本研究の展開により期待できると考えております。今後も、ことは、経皮投与に基づく薬物治療の最適化に大きく寄与

コスメトロジー研究を推進することで、本学問分野のさらすることが期待されます。

なる発展に貢献していきたいと思います。最後になりまし今回明らかとなったメカニズムは薬物治療の最適化のみ
ならず、皮膚美容においても重要な知見となると考えられたが、コーセーコスメトロジー研究財団のますますの発展をお祈り申し上げます。
（九州大学大学院 薬学研究院 薬物動態学分野）ます。すなわち、皮膚におけるトランスポーター発現の個人差を考慮した新たなテーラーメードによるコスメトロジ

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて森

英樹

この度はコーセーコスメトロジー研究財団の研究助成にているのか非常に複雑だと考えられ、興味が湧くところで採択していただき、誠にありがとうございました。私は細す。最近の研究では細胞膜上にあるチャネルタンパク質、胞が接着するための生体材料とそれに対する細胞の応答性細胞 - 基質間接着タンパク質、それと繋がっている細胞骨の違いについて研究しております。その研究の中で、タン格、核内裏打ちタンパク質など機械的刺激に応答する、いパク質や多糖類などの天然高分子で作製したハイドロゲル

わゆるメカノセンサーと考えられる様々な機構が発見されを用いて細胞を培養しようとすると、想定していたほど細ています。生体組織を維持するために細胞レベルで様々な胞が接着しなかったり、接着しても細胞が進展しなかった

メカノセンサーが巧みに働いているということでしょう。

りすることがあります。特に同じゲル上で複数の細胞を共これらのメカノセンサーと合わせて細胞培養組織の形成過培養しようとするとそのような問題がよく生じます。その程が説明できるように今後も更に研究を進めたいと考えて原因の一つとして、ハイドロゲルのような非常に軟らかいおります。また、このような研究がコスメトロジー研究の

足場材料上で移動できるか否かといった細胞の特性が細胞一助となればと思います。

の種類によって異なることが挙げられます。実際の生体内最後になりましたが、本研究をご支援いただきましたコ

における組織形成の過程で、周辺にある複数の細胞や細胞ーセーコスメトロジー研究財団と関係者の皆様に改めて感から作られた細胞外基質の粘弾性から生じる力学的刺激が、謝申し上げると共に、ますますのご発展をお祈り申し上げ

組織を構成するそれぞれの細胞の挙動にどのようの影響します。

（大阪府立大学大学院理学系研究科）

2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて山田勇磨

この度は、「ミトコンドリアを標的とするナノカプセル

では、特に医薬品開発を目標とした研究テーマに注力して型機能性化粧品の開発」に研究助成をしていただき、心よ

まいりました。ミトコンドリアは、抗酸化効果およびアン

り御礼申し上げます。私はこれまでに、ミトコンドリア標

チエージング効果に深く関連する、活性酸素シグナル調節、的型脂質二重膜小胞（リポソーム）、MITO-Porter の開発

エネルギー産生を担うため、化粧品のターゲットとしても研究を進めてまいりました。MITO-Porter に関する研究注目されております。そのため、ミトコンドリアを標的と− 221 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

した機能性化粧品に関する研究を幾度となく計画いたしま

胞内部さらにはミトコンドリアに機能性素材を送達するた

したが、残念ながら研究を進める機会を得ることはできまめ、新しいコンセプトのナノカプセル化粧品を世界に先駆せんでした。この度の助成によって、はじめて「MITO-

けて提供する革新的技術になりうると期待しております。

Porter を活用した美容研究」に挑戦する機会を与えて頂き現段階では、皮膚細胞のミトコンドリアに機能分子を送達し、ミトコンドリア機能を変化させるところまで研究をました。
リポソームなどのナノカプセルが配合された化粧品は既進めることができました。これから、さらなる検討が必要に販売されておりますが、化粧品成分として、ナノカプセになると思いますが、今後も研究を継続し、微力ながらコ

ル、ビタミン類などの化粧品素材、添加剤などを単に混合

スメトロジー分野の発展に寄与していきたいと考えておりした緩衝液としている商品が大半を占めていように思ってます。

おりました。そのため、真に化粧品素材をナノカプセルに末筆ながら、本研究にご支援頂いたことに重ねて感謝申

含有した化粧品の開発は、目的の効果を発揮するための重し上げるとともに、コーセーコスメトロジー研究財団の今要な課題であると考えました。また、本研究で開発を進め後のますますの発展をお祈り申し上げます。
（北海道大学大学院薬学研究院）

たナノカプセルは、皮膚組織上に留まるだけではなく、細2019 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて青柳秀紀

このたびは、公益財団法人コーセーコスメトロジー研究す。“無形の力（財産）” の一つに異分野の多様性に富んだユ財団の研究助成に採択していただきまして誠にありがとう

ニークな “人脈” があげられています。コーセーコスメトロ

ございます。ウグイスの糞は化粧品素材（洗顔料や肌のシジー研究財団は 30 年以上の歴史があり、そこで形成されミ抜きなど）として、古くは平安時代から近年まで利用さた研究者集団は非常に多様性に富んでいます（「創立 30 周

れてきました（鳥獣保護管理法により、現在はウグイスの年記念誌 コスメトロジー研究 30 年のあゆみ」を拝見いた

糞の入手が困難となり、製品の製造ができない状況にありしますと、医学、歯学、医療学、看護学、生活科学、薬学、ます）。長年にわたり広く使用されてきたウグイスの糞で工学、理学、農学、教育学、人文学、芸術、観光学など、すが、これまで学術的研究はほとんどなく、化粧品的効能

非常に幅広い）。今後、このユニークな “無形の力（財産）”を示す機構や糞の主な要素である細菌叢（腸内由来）など、の発展、活用、展開、社会への還元、が重要になると思い

大部分が未解明な状況にありました。この現状を踏まえ、ます。たとえば、コスメトロジー分野（あるいはその他の本研究では、ウグイスの糞が化粧品的効能を示す機構の解分野）の大きな課題（テーマ）に対して、貴財団のユニーク

明とその利用を最終目的に、今回はその基礎として、ウグな “人脈” を活用し、みんなで知恵を出し合い、協力し、取イス糞の諸特性と糞の主要な要素である細菌叢（ウグイス

り組むような取り組みや、“人脈” を交流、発展させる機会

腸内細菌由来）の解析と培養化を試みました。本研究助成を作るのも面白いと思います（新たなイノベーションや価により今後の研究の基盤となる基礎的研究成果が得られ、値観を創成できる）。

現在も研究を推進中です。

最後に貴財団の今後のますますのご発展を祈念申し上げ

近年、人生 100 年時代が謳われ、100 年時代を豊かに生ます。

き抜く力として “無形の力（財産）” の重要性が叫ばれていま− 222 −

（筑波大学生命環境系）

2020 年度

コスメトロジー研究助成を受けて2018 年度

研究助成

コスメトロジー研究助成を受けて上田（石原） 奈津実

私は分子神経科学の研究に学位取得時から携わっており、マウスを用いて環境的要因の影響を評価可能な実験系を構

コスメトロジーの分野の研究者ではございませんが、今回、築することに成功いたしました。私のように分野外の研究

環境的要因（香り）と遺伝的要因の関与が示唆されている記者が自身の持つ研究成果をコスメトロジーに波及させる一

憶保持能力について研究する機会をいただきました。もと助として、今後の採択課題に関しましては、必要に応じてもと、遺伝的要因により記憶保持能力が低下したマウスを

貴社との共同研究などを通じ、匂い物質など提供可能な研

見出し
（未発表）
、このマウスを使って環境的要因の影響を究素材を使用させていただく機会をご提示いただければ、探索することで、社会問題となっている認知症の治療につ分野外の研究者が持つ研究成果をコスメトロジーで生かす

ながる提案ができないかと考えたことが、研究テーマ提案

きっかけ作りを提供して下さる助成金としても機能するののきっかけです。本助成金は萌芽的な研究提案も受け付けではと感じました。最後になりましたが、社会問題となって下さったため、分野外の研究者で挑戦的な研究テーマにている健康寿命の向上に対して貢献可能な研究を展開する

なりますが、応募してみました。実際に研究を進めると、第一歩を提供して下さった、公益財団法人コーセーコスメ

匂い物質の選定の際に購入可能な材料という点で選択肢がトロジー研究財団の関係者の皆様に感謝申し上げます。こ限られてしまい、記憶保持を向上させる匂いの同定には至のきっかけをさらに飛躍させ、将来的には基礎研究成果がりませんでした。一方で、十分な助成をいただいたことで、医療や健康といった産業展開につながる成果の蓄積の一助

記憶保持能力の評価系に匂い物質の暴露を組み合わせた実となるよう精進してまいります。

験系の構築と、遺伝的要因により記憶保持能力が低下した（名古屋大学大学院理学研究科）

2018 年度

研究助成

コスメトロジーの受賞を受けて
竹ノ谷

文子

私の研究助成を採択頂きまして、コーセーコスメトロジ

特にさくらの香り暴露によるホルモン分泌や脳機能解析をー研究財団の30年という節目であります今年度に、このよ行うには、既存の研究費だけでは到底研究を遂行することうな研究成果を報告させて頂きますことに感謝申し上げま

大変難しいことであります。しかし、今回の助成金によりす。

まして、その検証をヒトまで進めることができ、さらに測私の研究は、日本独自の花として愛されております、さ定のパラメーターを増やすことが可能になりました。このくらの香りの持つ有効成分を化粧品などの関連製品開発にようなことは研究室の活性化にも繋がってきました。さら繋げるのは勿論のこと、ヘルスケアへの応用に活かすため、には臨床現場での香りの導入を目指すための第一歩として、動物実験を基本として、ヒトでの検証実験を目指してきま

体動困難な患者様での検証も行うことができました。今後、した。薬理的作用を持つ植物の芳香成分などの抽出は水蒸

この研究を契機として、香りを美容やヘルスケアのみなら

気蒸留法で行われることが殆どでありますが、私どものグず、医療分野にも活用または応用していけるような、新しループでは、天然物由来の成分を抽出できる低温真空抽出

いコスメトロジーの創生を目指して研究を行えればと考え、法にこだわりを持ち、その有効性を評価してきました。今

更に研究を進めていく所存でございます。このような考え

回、私どもは、この抽出法により、繊細なさくらの花びらに至りましたのも、ひとえに、コーセーコスメトロジー研からセルエキストラクトを抽出し、その香りが脳に与える究財団のサポートによるものと深く感謝申し上げます。

影響やその生理作用の解析にチェレンジしてまいりました。

− 223 −

（星薬科大学運動科学教室）

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

● 学術集会支援助成（1 件）2020 年度

学術集会支援助成

第１回レドックス R&D 戦略委員会公開シンポジウムを終えて伊藤

この度はコーセーコスメトロジー研究財団より学術集会

健健康であることの関係を爼上に載せて議論しました。

支援助成をいただき、第１回レドックス R&D 戦略委員会

新しい生活様式の元年とも言える令和 2 年度、本シンポシンポジウムを開催しました。貴財団と選考にあたっていジウムも全ての講演をオンラインで実施しました。その結ただいた先生方、関係者の皆様に厚く御礼申し上げます。

果、学界と企業を合わせて 129 名の方に参加いただくこと

レドックス R&D 戦略委員会はレドックス制御に関連しができました。当委員会は学会を主体とする学術集会とはた健康科学（創薬、機能性食品、化粧品など）の推進とその一線を画し、企業会員が運営にも携わっているという特色

産業応用の促進を目的として令和 2 年 8 月 8 日に設立されがあります。本シンポジウムでもその特色が活かされ、画た産学官連携委員会です。記念すべき第 1 回の本シンポジ

面越しからも産学一体の熱気が伝わる盛会になったことをウムでは、テーマを「レドックスホメオスタシスと認知症・大変ありがたく思っております。

生活習慣病」とし、サテライトシンポジウム「超硫黄分子がいつまでも健康で美しく長生きしたいという要望は、誰加速するレドックスバイオロジーのパラダイムシフト」をもがもっている人間らしさなのかもしれません。このよう含め基調講演 1 件と 18 件のレドックスに関わる最先端のな要望に当委員会はいかに応えるのか、そのような問いか

研究発表を 2 日間にわたり行いました。

けに当委員会が目指すべき方向が示された気がいたします。

酸化ストレスは、ヒトを含む生物の老化や疾患に関与し末筆となりましたが、今後とも当委員会の活動がコーセ「コスメトロジー」の分子基盤の１つです。本シンポジウム

ーコスメトロジー研究財団の目指す美と健康への一助とな

では、DNA やタンパク質への酸化・親電子性物質修飾のることを願いつつ、貴財団の益々のご発展を心よりお祈り

化学的基盤から個体レベルでの生体防御応答や生活習慣病

申し上げます。

に至るまで、様々な角度からレドックスホメオスタシスと− 224 −

（弘前大学大学院医学研究科）

●
事業報告書
役

員
●

事業報告書

事業報告書（自 2020 年 4 月 1 日

至 2021 年 3 月 31 日）《研究助成関連》［コスメトロジー研究助成］
2020
5
7
公募開始
7
9

10
5

全国 649 の大学、病院、研究機関等へ公募要領を送付し、関連学術雑誌 3 誌及び 12 関連機関 HP と当財団 HP に公募要領を掲載
公募締切り
応募総数110件、各分科会毎に選考委員による個別審査（7/18 ～ 8/28）
選考委員会分科会（書面） 書類審査による予備選考と本選考委員会決議を選考委員長へ一任する旨の承認
第二回選考委員会
選考委員長出席の下、研究助成候補33課題を選考
第二回臨時理事会（書面） 選考委員会から候補課題を答申、助成採択課題の決定
創立30周年記念式典
研究助成採択33課題の代表者に対し、助成金贈呈書を授与
助成金交付
研究助成金を交付 総額5,500万円
選考委員への報告（書面） 2021年度研究助成公募要領他

9 29
10
9
11 25
12 10
2021
2
5
［大学講座研究助成］
2020
1 10
公募開始
3
3

12
30

5

25

6 22
11 25
12 10
［国際交流助成］2020 10
9［学術集会助成］2020 109

全国 601 の大学と附属研究機関へ公募要領の送付及び関連学術雑誌 1
誌と当財団 HP に公募要領を掲載
公募締切り
応募総数48件
創立30周年記念実行委員 予備選考通過課題20件の決定後、選考委員全員による個別審査（4/1
会（書面）～ 5/10）
第一回選考委員会（書面） 採択候補者3名を内定、選考委員長裁定により最終採択候補者3名の決定
第一回臨時理事会（書面） 選考委員会から最終採択候補者を答申、助成採択者決定
創立30周年記念式典
研究助成採択3課題の代表研究者に対し、助成金贈呈書を授与
助成金交付
研究助成金を交付 総額8,000万円
第二回臨時理事会（書面） 選考委員会で承認を得た1件について採択決定
第二回臨時理事会（書面） 選考委員会で承認を得た3件について採択決定《表彰事業》
2020

3

30

6
11

22
25

創立30周年記念実行委員 1990年から2017年までのコスメトロジー研究助成採択者を対象に論文会（書面）実績を調査し、被引用件数が優れた候補者の中から表彰候補者3名を選出
第一回臨時理事会（書面）「創立30周年記念コーセーコスメトロジー奨励賞」表彰者を決定
創立30周年記念式典
表彰者3名に対し、表彰状と副賞300万円を贈呈《創立30周年記念式典》
2020

11

25

出席者は財団理事会メンバーと当年度の表彰・贈呈対象者に限定し、「創立30周年記念コーセー
コスメトロジー奨励賞」の表彰式、助成金贈呈式及び受賞者記念写真撮影のみ実施− 227 −

コスメトロジー研究報告Vol. 29, 2021

《理事会関連》
2020

5

22

6

22

10
11

9
25

第一回通常理事会（書面） 2019年度事業報告及び収支決算報告（含監査報告）を承認する件
任期満了に伴う選考委員の選任に関する件
任期満了に伴う理事候補者の選出に関する件
補欠監事候補者の選出に関する件「選考委員会規則」の一部改定に関する件
株主としての議決権行使について
第一回臨時理事会（書面） 代表理事及び業務執行理事の互選に関する件
事務局長の選任に関する件
常勤役員の報酬に関する件
2020年度大学講座研究助成採択者を承認する件「30周年記念コーセーコスメトロジー奨励賞」表彰者を承認する件
第二回臨時理事会（書面） 2020年度コスメトロジー研究助成者等を承認する件
第二回通常理事会
2020年度収支予算書の一部変更を承認する件
2021年度事業計画及び予算案を承認する件
理事長、副理事長及び専務理事の職務執行状況の報告《評議員会関連》
2020

6

12

6
11

26
30

2019年度事業報告及び収支決算報告（含監査報告）を承認する件
任期満了に伴う理事の選任に関する件
監事の選任に関する件
評議員への報告（書面） 第一回臨時理事会について
評議員への報告（書面） 第二回通常理事会議事、報告事項について
定時評議員会（書面）《その他》
1）報告書発行
2020
5
1
9
1
2021
3
1

中間報告書
完了報告書
創立30周年記念誌

2）行政届出関連
2020
6 17
6 24
7
7
9
9
2021
2
8

内閣府
法務局
内閣府
内閣府
内閣府

研究業績中間報告集 第29号
コスメトロジー研究報告 Vol. 28（2019）、CD版を作成「コスメトロジー 30年のあゆみ」

令和元年度事業報告書等の提出
変更登記申請（役員の変更）
変更の届出（役員の変更）
公益法人行政担当室による立入検査
令和3年度事業計画書等の提出

3）情報公開（当財団HP等）
2019 122
2020年度 大学講座研究助成公募要領の掲載
2020
1 10
2020年度 大学講座研究助成公募開始
3
2
2020年度 事業計画等の掲載
3 12
2020年度 大学講座研究助成公募終了
4
6
2020年度 コスメトロジー研究助成公募要領の掲載
57
2020年度 コスメトロジー研究助成公募開始
6 30
事業報告、新役員等の掲載
7 10
2020年度 コスメトロジー研究助成公募終了
91
コスメトロジー研究報告Vol. 28の発行及び掲載
11 27
2020年度 表彰および研究助成者受賞者等の掲載
2021
2 19
2021年度 事業計画等の掲載− 228 −

事業報告書2020年度助成を受けられた方々（1）コスメトロジー研究助成（33名）
第 1 分野：素材、物性に関する分野（9 名）
氏

名

所

属

職位

研究課題

池田

将

岐阜大学工学部化学生命工学科教授

刺激応答性DNAナノ構造体の構築

伊村くらら

お茶の水女子大学基幹研究院
自然科学系

講師

ソフトな界面分子膜を足場とした機能性ゲル薄膜構築手法の開発

宇田亮子

奈良工業高等専門学校

教授

紫外線応答型リポソームの膜融合性を用いた送達システムの開発

岡村陽介

東海大学工学部応用化学科教授

装着感のない皮膚貼付型ナノ透明薄膜の創製と芳香・消臭能の精
密制御

唐澤

悟

昭和薬科大学薬学部

教授

多くの水分子を保持した機能性親水コロイドの開発

北山雄己哉

大阪府立大学大学院工学研究科

助教

天然物由来高分子を利用した新規サンスクリーンカプセルの創出

通阪

栄一

山口大学大学院創成科学研究科

准教授

多孔性高分子粒子を用いた自発的乳化技術の開発

長井紀章

近畿大学薬学部医療薬学科准教授

毛根への薬物直接送達を可能とするナノ結晶ハイドロゲルの開発

湊遥香

信州大学繊維学部

博士
研究員

開閉制御可能なナノシャッター構造を有する高分子微粒子担体の開発

第２分野：生体作用、安全性に関する分野（16 名）
氏

職位

研究課題

岐阜薬科大学薬学部

教授

皮膚細胞間バリアの破壊に関わる光センサーの解明と予防薬の開
発

大田 昌樹

東北大学大学院環境科学研究科准教授

ヒトの視覚と嗅覚を制御する新しい抽出分離素材の開発

大森深雪

愛媛大学大学院医学系研究科
感染防御学講座

講師

皮膚-免疫増幅サイクルの遮断によるアレルギー性皮膚炎の病態
制御

北浦

次郎

順天堂大学大学院医学研究科
アトピー疾患研究センター

先任准教授

皮膚の偽アレルギーを誘導する分子のスクリーニング法確立

小暮健太朗

徳島大学大学院医歯薬学研究部（薬学域）衛生薬学分野

教授

イオン導入時の微弱電流による皮膚への安全性の厳密な検証と美容効果の検討小林麻己人

筑波大学医学医療系

講師

乳酸菌がもつ抗酸化作用の分子基盤解明

五十里

名

所
彰

属

櫻井

文教

大阪大学大学院薬学研究科

准教授

病原体由来および自己由来二本鎖RNAがインターフェロン非依存的にコラーゲン産生を抑制する機構の解明

志馬寛明

名古屋市立大学大学院医学研究科
免疫学分野

講師

紫外線で誘導される制御性T細胞が創傷治癒を促進するメカニズ
ムの解明

下田

将之

慶應義塾大学医学部病理学教室

准教授

皮膚老化・美容に関わる生体内ヒアルロン酸代謝機構の解明

高杉征樹

大阪市立大学大学院医学研究科
分子生態医学講座

助教

ヒアルロン酸とデスモソームタンパクとの新規結合が皮膚機能に及ぼす影響の解明

田中知明

千葉大学大学院医学研究院
分子病態解析学

教授

脂肪細胞移植治療応用に資する脂肪細胞多様性の単一細胞解析とエピジェネティクス制御を介した脂肪細胞機能調整法の開発− 229 −

コスメトロジー研究報告Vol. 29, 2021

氏

名

所

属

職位

研究課題

津田

雅貴

広島大学大学院
統合生命科学研究科（テニュアトラック）

助教

新規変異評価システムを用いた長波長の紫外線（UVA）による突然変異誘発機構の解明

南雲陽子

筑波大学生命環境系

助教

天然由来物質によるclaudin-1を介した高分子送達の科学的基盤
研究

林

良太

新潟大学医歯学総合病院皮膚科

助教

日本人における接触皮膚炎とバリア機能に関与する遺伝子変異の解析および3Dスキンモデルを用いた接触皮膚炎の最適な治療法
の探索

原口

省吾

昭和大学医学部生化学講座

講師

加齢に伴い皮膚で産生量が減少する新規皮膚ステロイドホルモン
の機能解明

日浅

未来

岡山大学薬学部

テニュア
コラーゲン合成に必須なビタミンC輸送メカニズムの解明
助教

第３分野：精神、文化に関する分野（8 名）
氏

名

石川

正昭

兵庫県立尼崎総合医療センター

医長

他覚的定量評価を伴った嗅覚検査の開発

伊藤文人

高知工科大学
フューチャー・デザイン研究所

講師

リアルワールドパラダイムと脳機能イメージングによる顔印象認
知の神経基盤の検討

鎌田泰彰

国際医療福祉大学保健医療学部
視機能療法学科

助教

瞳孔振動と心拍変動解析を用いた香りが自律神経に及ぼす影響田中明

福島大学共生システム理工学類

教授

顔の動画像解析による脈波の多点抽出と皮下の血行動態の評価法
の開発

新美

亮輔

新潟大学人文学部准教授

顔魅力の知覚に服および行動の知覚が与える影響の検討

松原

恵理

国立研究開発法人森林研究・整備機構森林総合研究所

主任
研究員

木の香りによる作業効率への影響解析

若林一道

大阪大学歯学部附属病院

助教

分光イメージング装置を用いた天然歯のグラデーションの数理解析

国立病院機構東京医療センター
臨床研究センター聴覚障害研究室室長

顔面神経麻痺に対する重症度診断AIソフトを用いたより効果的なメイクアップ法の開発

職位

研究課題

和佐野
浩一郎

所

属

職位

研究課題

（2）大学講座研究助成（３名）
氏

名

天谷

雅行

慶應義塾大学医学部皮膚科

教授

表皮角層形成機序の解明と角層機能制御によるアレルギー疾患予
防法の開発

椛島

健治

京都大学大学院医学研究科
皮膚科学

教授

アトピー性皮膚炎の発症機序の時空間的理解とアレルギー克服を目指した研究帝京大学戦略的イノベーション
研究センター（SIRC）、
大阪大学大学院生命機能研究科

教授

上皮バリアの分子細胞生物学的研究を基盤とした皮膚疾患の病態解明と治療予防法の開拓

月田早智子

所

属

（3）国際交流助成（１件）
実施責任者
東海大学工学部医用生体工学科
衛藤 憲人

招聘目的
第29回日本人間工学会システム大会（2021年3月から2022年3月へ延期）− 230 −

Dr. Menozzi Jackli, ETH Zurichの招聘

事業報告書（4）学術集会助成（３件）
実施責任者

招聘目的

大阪大学微生物病研究所
原 英二

国際細胞老化研究会（ICSA）2020年度学術会議（2020年11月から2021年6月へ延期）

北海道大学大学院薬学研究院
脇本 敏幸

第23回天然薬物の開発と応用シンポジウム（2020年10月から2021年10月へ延期）

弘前大学大学院医学研究科附属
高度先進医学研究センター
伊東 健

レドックスR&D戦略委員会第一回学術集会（2021年3月4日～ 5日オンライン開催）「創立 30 周年記念コーセーコスメトロジー奨励賞」を受けられた方々
氏

名

所

属

職位

阿部

正彦

東京理科大学研究推進機構総合研究院

教授

石原

一彦

東京大学大学院工学系研究科マテリアル工学専攻

教授

片岡

一則

（公財）川崎市産業振興財団ナノ医療イノベーションセンター

センター長− 231 −

コスメトロジー研究報告Vol. 29, 2021

役

員
2021 年 7 月現在

理事長

小林

保清

株式会社コーセー 名誉会長

副理事長

小林

一俊

株式会社コーセー 代表取締役社長

専務理事

亀山

浩一

（常勤）

理

事

岩橋

槇夫

北里大学 名誉教授

理

事

関根

茂

理

事

長野

哲雄

東京大学 名誉教授

理

事

二木

鋭雄

東京大学 名誉教授

理

事

西川

武二

慶應義塾大学 名誉教授

理

事

野呂

影勇

早稲田大学 名誉教授

理

事

宮地

良樹

京都大学 名誉教授・静岡社会健康医学大学院大学 学長

監

事

小林

久美

公認会計士

監

事

村上

實

弁護士

評議員会長

内藤

昇

元 株式会社コーセー 常務取締役

評議員

伊藤

正俊

東邦大学 名誉教授

評議員

奥

直人

静岡県立大学 名誉教授・帝京大学薬学部 教授

評議員

齊藤

勲

評議員

齋藤

美穂

評議員

仙名

保

評議員

中村

陽子

評議員

西岡

清

評議員

宮㟢

榮三

日光ケミカルズ株式会社 代表取締役名誉会長

元 厚生省大臣官房審議官
早稲田大学 名誉教授・常任理事
慶應義塾大学 名誉教授
元 厚生省医薬安全局安全対策課安全対策企画官
東京医科歯科大学 名誉教授・兵庫医科大学 常務理事
東京工業大学 名誉教授

− 232 −

＊本財団についてのお問い合わせは下記にお願いいたします。

公益財団法人 コーセーコスメトロジー研究財団〒 103— 0028

東京都中央区八重洲一丁目 5 番 17 号
八重洲香川ビルディング 4 階
電話 03（6860）2190

コスメトロジー研究報告

Vol. 29／2021

非売品

2021年 9月 1日発行

編集責任者
発
行
制

作

印

刷

亀山 浩一
公益財団法人 コーセーコスメトロジー研究財団〒103−0028 東京都中央区八重洲一丁目５番 17 号
電話 03（6860）2190
エイエム企画〒362−0034 埼玉県上尾市愛宕一丁目２番７号
電話 048（778）7943
株式会社サンセー

表紙デザイン監修：株式会社コーセーⒸ2021

商品デザイン部デザイン室不許複製

禁無断転載