渦のねじれ流によるコラーゲンナノファイバーの形成制御と形態変換
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神戸大学大学院理学研究科 、滋賀医科大学医学部 、内蒙古医科大学薬学院

津田3

明彦

Natural nanofibers attract much attentions in the field of nanocosmetics. In this study, we have studied formation
controls and structural transformations of the bionanofibers such as collagen and amyloid fibrils by torsional flows of vortex.
Linear dichroism (LD) spectroscopy allowed spectroscopic visualization of the flow-induced alignment of the nanofibers inthe solution. Although collagen showed poor LD response, insulin amyloid fibril provided strong LD response upon stirringof the solutions. We found that insulin molecules self-assemble to form a nanofiber that enables flow-induced alignment in
the vortex flows, but form fibrous aggregates that show no alignment without stirring of the solution. The results obtained inthis study suggest the importance of fluid flows in the process of protein fibrillations.

1. 緒

本研究課題において我々は、「コラーゲンナノコスメ」への言展開を目標に、メカニカル撹拌によって生じる渦のねじれ植物のパルプから抽出されるセルロースナノファイバーは、高い粘性と大きなチキソトロピーインデックスを有し流を用いることによるコラーゲンナノファイバーの形成制御と形態変換を企てた。ているため、流動性のないゲル状であってもスプレー噴霧

我々の研究グループでは、これまでに生体高分子を模倣でき、タレ止めに応用できる。肌の上でしっかり定着するした様々な超分子ナノファイバーを創製し、分子化学的な化粧下地や、振って液状にしたものを顔に吹きかけ固まる

視点からそれらの構造解析と機能開拓を行ってきた。それ美容パックなどへの応用が可能である。さらに水中での乳らの超分子ナノファイバーは溶液の流れに沿って配向し、化・分散安定効果に優れるため、各種オイルの乳化安定化

直線二色性（LD）を誘起する 1 - 5）。一方向にねじれた構造をや、金属箔、金属酸化物など高比重の粒子の沈降防止、分持つナノファイバーは、撹拌によって生じる渦の流れに沿散安定化など、リキッドファンデーションや日焼け止めなってねじれ配向して、ファイバーと渦のねじれ方向が一致どへの応用が期待されている。化粧品にナノファイバーがする時、より効率的に配向することができる。またその時、配合された「ナノコスメ」
関連商品が社会で広がりを見せよ形成するナノファイバーのサイズも大きくなる。そのよううとしている。

な現象を見出し、我々は、動物体内に大量に存在するバイナノコスメにおいて植物性ナノファイバーに期待と関心オ線維として知られているコラーゲンと、渦の流れの不斉が集まる一方で、コラーゲンなど動物性線維への関心が薄流体力学的相互作用に着目した。体内におけるコラーゲンれつつある。コラーゲンは、美容や健康を目的としたサプ線維の形成や分解には、血液、リンパ液、および組織液なリメントやドリンク、様々なコスメアイテムに配合され、どの体液の流れ（体内流）が深く関わっている。したがって、現在も数多くの商品が存在する。しかし、分子化学的な視コラーゲンによる体内流刺激のメカノセンシングと体組織点から、コラーゲン線維からミクロフィブリル（ナノファによる体内流統制のメカノバイオロジー機構の研究が、コイバー）を取り出し、その構造や形態をナノレベルで修飾・ラーゲンナノコスメにおける全く新たな技術と概念を生み制御して、機能を引き出している例は数少ない。これまで出す可能性を秘めている。に商品化されているコラーゲン配合化粧品の多くは、その我々は、上記の目標を掲げてコラーゲンナノファイバー効用として肌の保水効果をうたっている。しかし、コラーの開発を行った。コラーゲン水溶液の加熱による変性コラゲンナノファイバーには、上記セルロースナノファイバーーゲン（ゼラチン）の形成過程、および、その溶液の冷却にと同様の機能に加え、その高い柔軟性や伸縮性、人体とのよる変性コラーゲンの再凝集過程において、溶液の撹拌をより高い親和性などを活かした様々な新機能が期待される。

行うことにより渦の流れを生み出し、その流れとの流体力

Formation control and morphology
conversion of collagen nanofibers bytorsional flows of vortex

学的相互作用による変性コラーゲンの凝集形態の制御を企てた。本研究期間において我々は、流体力学的な相互作用によってコラーゲンが渦の流れに沿って配向することを見Akihiko Tsuda

出したが、コラーゲンナノファイバーの構築までには至ら

Graduate School of Science, Kobe University1/
Department of Chemistry, Shiga University ofMedical Science 2 /School of PharmaceuticalSciences, Inner Mongolia Medical University 3なかった。しかし一方で、タンパク質のインスリンを用いることによって当該目標を達成することができた。

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インスリンは熱変性によってアミロイド線維を形成する

渦のねじれ流によるコラーゲンナノファイバーの形成制御と形態変換ことが知られている。アミロイド線維は、タンパク質のミ化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 0 . 2 mL を 添 加 し、0 . 14 mM の イスフォールディングにより形成されるタンパク質の集合体

ンスリン濃度 , 3 mL, pH 3 ,［NaCl］= 0 . 28 mM のサンプであり、アルツハイマー病やパーキンソン病などの疾病にルを調製した。また、加熱・撹拌の測定は温度：75 ℃，関わる物質として高い関心を集めている。アミロイド線維撹拌子の回転速度：1400 rpm の条件下で行った。の形成プロセスは、モノマーから部分的に構造変化した中3. 結間体を経て核を形成し、さらには集合化による線維化が起果きる経路が最も支持されている（図 1）6 , 7）。我々は、渦の①無撹拌条件下、10 ℃あるいは 20 ℃でコラーゲン水溶液流れによるマクロな流体力学的相互作用がミクロなアミロの LD スペクトルを測定しても、LD シグナルを観察すイド線維の核形成に寄与し、その線維の形態を大きく変化ることはできなかった。しかし、撹拌条件下においてさせることを見出した。

測定を行ったところ、コラーゲンの吸収帯に相当する2. 方

200 nm 付近に誘起 LD を確認することができた。撹拌

法の ON‒OFF に応じて、LD スペクトルも即座に変化した。

加熱・撹拌条件下におけるコラーゲンやインスリンの温度を一旦 75 ℃まで上昇させて、再度 20 ℃にまで冷却線維化に伴う配向現象を観測するために、それらの水溶し、LD を測定したところ、撹拌条件下において誘起 LD液中での加熱・撹拌前後の紫外 - 可視光吸収スペクトルと強度の著しい減少が確認された。一方、ゼラチン水溶液

LD スペクトルを測定した。インスリンの配向挙動は LDを用いて同様の実験を行っても、撹拌による誘起 LD をスペクトルを用いて測定することができる。LD の強度は確認することはできなかった。

LD=A｜ − A⊥ で表される。A｜ は縦方向の直線偏光の吸収②加熱撹拌条件下におけるインスリンの線維化に伴う配向強度、A⊥は横方向の直線偏光の吸収強度を示す。LD の測現象を観測するために、水溶液中におけるヒトインスリ

定には φ 8×11 mm の円柱状のネック部分がある 10×10 ×ンの加熱・撹拌の前後における紫外 - 可視吸収スペクト40 mm の光学セル（1 mm の厚さの石英ガラス製）を使用しルと LD スペクトルを測定した（図 2）。276 nm と 283 nmた。撹拌子はテフロン製の φ 3 × 8 mm を使用した。に極大吸収波長が得られ、LD スペクトルでは吸収スペ①コラーゲンと液体の流れによる流体力学的相互作用を期クトルに対応した負の誘起 LD が得られた。次に撹拌が待し、左右の撹拌によって生じる不斉な渦の流れにおけ線維の配向挙動にどのように寄与しているのか調べるた

るコラーゲン分子（三重鎖および一重鎖）のねじれ配向挙めに、加熱撹拌により生成したアミロイド線維に対し8）て撹拌状態を切り替えながら LD 強度の経時変化を測定

動をフロー誘起 LD スペクトル法で調査し 、コラーゲンと渦の流れの流体力学的相互作用およびキラルセンシング機構を明らかにした。石英セルに 0 . 05 mg/mL のコラーゲンもしくはゼラチン水溶液を 3 mL 加え、φ 2 ×5 mm のスターラーバーで溶液を 1300 rpm の回転速度で撹拌し、LD スペクトルを測定した。
②インスリン 0 . 4 µmol（2 . 5 mg）を 25 mM 塩酸 0 . 2 mL に溶かし、超純水 2 . 6 mL に希釈した。その後、14 mM 塩

図1

アミロイド線維形成プロセスの概略図

図 2 加熱・撹拌によるインスリン水溶液の LD スペクトルおよび紫外 - 可視吸光スペクトルの変化 . 加熱・撹拌前（---），加熱・撹拌後（—）．

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コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

図 3 撹拌のスイッチングによる波長固定（276 nm）LD スペクト
ルの変化

図 4 加熱開始から 10 分間（---）および 15 分間（—）の撹拌、加熱開始後 75-90 分（---）に撹拌を行った際に得られた経時変化
LD プロファイルした（図 3）。無撹拌状態では LD 不活性だったが、撹拌解離したゼラチン状態では配向現象を与えないこともわかった。

状態では負の LD シグナルが現れ、左右の撹拌で異なった強度の LD が現れた。次に撹拌が線維形成のどの過程②インスリン水溶液に加熱・撹拌を行うと、線維化を生じ、に作用しているのかを明らかにするためにインスリン水形成した線維が渦の流れに応答して配向することが明ら

溶液の加熱初期に一定時間だけ撹拌を ON にし、その後かとなった。撹拌を行わずに加熱するだけでもインスリOFF にして、LD 強度の経時変化スペクトルを測定したンの集合化が生じるが、撹拌を行うことで線維形態のア（図 4）。成長の初期に撹拌を行うと溶液の流れに配向すミロイド線維への成長が促進された。また興味深いことる線維が形成していることが明らかになった。に、撹拌による渦の流れの物理刺激が核形成過程におい4. 考て関与しているという可能性が得られた。

察①上記の結果より、三重鎖構造を持つコラーゲンは、比較

上記の研究結果は、タンパク質の線維化プロセスにおけ的剛直で硬い構造を持つため、溶液の流れに沿って配向る溶液の流れの重要性を示している。今後、変性コラーゲすることができ、誘起 LD を与えたと考えられる。一方、ンの再凝集過程を溶液の流れで制御することによる変性コゼラチンは、コラーゲンの三重鎖がほどけた構造を持ち、ラーゲンの凝集形態の制御をさらに検討したい。

剛直性が低く柔らかい構造のため、溶液の流れに沿って配向することができなかったと考えられる。実際にそれ（引用文献）

を支持する結果として、三重鎖構造を持つコラーゲンを

1） Tsuda A, Alam M A, Harada T, Yamaguchi T, Ishii

加熱すると、三重鎖が解離してゼラチンと同じ状態とな

N, Aida T. Spectroscopic visualization of dynamic

り、誘起 LD の強度が弱まることが確認できている。

vortex flows using a dye-containing nanofiber. Angew.
Chem. Int. Ed. 46: 8198-8202.（2007）②上記の結果より、撹拌によってアミロイド線維の成長が線維の伸長方向に促進され、線維が渦の流れに沿って

2） Ando Y, Sugihara T, Kimura K, Tsuda A. A self-配向しているものと考えられる。また、図 3 の結果から、assembled helical anthracene nanofibre whose P- andアミロイド線維の高次のねじれ構造が渦の流れの方向に

M-isomers show unequal linear dichroism in a vortex.

対して非等価な流体力学的相互作用を生じているのでは

Chem. Commun. 47: 11748-11750.（2011）ないかと考えられる。
図 4 において、成長の初期（〜 17 分）3） TsujimotoY, Ie M, Ando Y, Yamamoto T, Tsuda A.に撹拌を行うと溶液の流れに配向する線維が形成していSpectroscopic visualization of right- and left-handed

ることがわかる。加熱撹拌によって生じる溶液の流れと

helical alignments of DNA in chiral vortex flows. Bull.

インスリンの流体力学的相互作用が線維状に成長する核Chem. Soc. Jpn. 84: 1031-1038.（2011）
4） Yamamoto T, Tsuda A. Vortex-induced alignment

形成段階に関与していると考えられる。

5. 総of a water soluble supramolecular nanofiber composed

括of an amphiphilic dendrimer. Molecules 18: 7071-7080.

①本研究から、三重鎖構造を持つコラーゲンが溶液の流れに沿って配向することが明らかになった。一方、それが（2013）5） Tsuda A. Hydrodynamic helical orientations of− 38 −

渦のねじれ流によるコラーゲンナノファイバーの形成制御と形態変換

nanofibers in a vortex. Symmetry 6: 383‒395.（2014）
6） Ahmad A, Uversky V N, Hong D, Fink A L. Early
events in the fibrillation of monomeric insulin. J. Biol.

with insulin mutants. Biochemistry 4 0: 8 3 9 7-8 4 0 9.
（2001）
8） Adachi R, Yamaguchi K, Yagi H, Sakurai K, Naiki

Chem. 280: 42669-42675.（2005）

H, Goto Y. Flow-induced alignment of amyloid7） Nielsen L, Frokjaer S, Brange J, Uversky V N, Fink
A L. Probing the mechanism of insulin fibril formation− 39 −

protofilaments revealed by linear dichroism. J. Biol.
Chem. 282: 8978-8983.（2007）