リン脂質ベシクル上にリポアミノ酸が形成するナノチャンネルとその薬物放出能の検討
金沢大学大学院自然科学研究科

太田明雄

Incorporation behavior of N-amino acid-type surfactant into phospholipid vesicle membrane has been studied.
It was known that leakage of the vesicle-entrapped probe took place slowly at a very low concentration in the sulfateor sulfonate-type surfactant systems, on the other hand it occurred rapidly at the concentration just below theCMC in the amino acid-type surfactant systems. These results suggest that the amino acid-type surfactants adsorb
cooperatively on the vesicle surface, and as a result, the surfactant molecules organize to make a kind of channel
which is large enough for the entrapped molecules to pass through easily. In this study, the effect of amino acidresidue on the incorporation into the vesicle membrane was investigated from the both view points of morphology
and interaction. Furthermore the control of the release of entrapped-molecules from vesicles by temperature or pH
was examined.

１．緒

度 CMC よりも低濃度）；２）（その臨界濃度以上で）ベシ

言

クル二分子膜構造を破壊することなしに内包物を放出させこれまでアシル化アミノ酸に代表されるアミノ酸系界面る；３）内包物の放出速度が大きい；ということである。

活性剤は肌に優しくマイルドな界面活性剤として認知され、これらの事実より、アシルアミノ酸界面活性剤（リポアミまたその特性を生かした商品も数多く開発されている。まノ酸）はベシクル２分子膜上に協同的に吸着し、内包物のたアミノ酸の種類を選ぶことにより、官能基を系統的に変通り道（チャンネル）を形成しているのではないかと推測化させることができるため、親水部位のサイズや極性、電した。そこで本申請研究では、ａ）リポアミノ酸のリン脂荷といったものが界面活性剤の物理化学的性質に及ぼす影

質ベシクルへの作用様式とその形態観察、ｂ）そのアミノ響を検討する上でも、都合の良い対象である。更にグリシ酸側鎖の影響を系統的に検討した。さらにこの作用を利用

ンを除くアミノ酸は光学活性体であり、分子不斉といったして、温度や pH による内包薬物の放出制御を試みた。

観点からも非常に興味深い対象である。実際アシルアミノ

２．実酸塩を扱った研究について、総説として既に多くが紹介さ験れいている 1）− 7）。しかしながら、生体に対して“マイルリン脂質として L-α- ジパルミトイルホスファチジルコ

ドである”とは物理化学的にどのようなことなのか、そのリン（DPPC）を選んだ。ベシクルは Bangham 法にて作メカニズムは詳細には明らかにされていない。そこで我々成した後、ポリカーボネートメンブランを用いたエクスト

はこれまで蓄積してきたアミノ酸系界面活性剤の研究手法

ルージョン法にて、約 100 nm 径を有する均一のユニラメや成果を生かし、上記のメカニズムを脂質膜（リン脂質ベラベシクルとして調製した。内包薬物のモデルとして 5（6）シクル）とアシルアミノ酸界面活性剤（リポアミノ酸）と- カルボキシフルオレセイン（CF）を利用し、濃度消光すの相互作用という観点から明らかにすることを目的としるような濃度（0.1M）にて封入した。CF を封入したベシて実験を進めているが、その中で硫酸エステル系やスルクル分散液は 100nm にサイジングした後、封入できなかホン酸系界面活性剤と、アミノ酸系界面活性剤ではベシクった CF をゲルろ過にて除去した。薬物放出実験の場合で８）ルに対する作用が全く異なる事が明らかとなった 。前者

は、DPPC 濃度は 0.05mM に調製し、界面活性剤を添加しの界面活性剤と比較してアミノ酸系界面活性剤のベシクルた後の CF 蛍光強度の回復度より漏出率を見積もった。アへの作用としての主な特徴は、１）ベシクルへの作用に対

シルアミノ酸界面活性剤として N- ドデカノイル - グリシ

し協同性を有し、ある臨界濃度が存在する（臨界ミセル濃ン（C12-Gly）、-L- アラニン（C12-Ala）、L- ロイシン（C12Leu）、- Ｌ - フェニルアラニン（C12-Phe）およびドデカノ

Investigation on nano-channels madefrom lipo -amino acid surfactants on
phospholipids vesicles
Akio Ohta
Graduate School of Natural Science andTechnology, Kanazawa University

イル -L- セリン（C12-Ser）、-L- アスパラギン（C12-Asn）、-L- グルタミン酸（C12-Glu）の各ナトリウム塩を使用した。
こ れ ら の 界 面 活 性 剤 の 構 造 式 を Schem1 に、 ま た TrisHCl 0.1M（pH ＝ 7.4）緩衝液中における CMC を Table 1にそれぞれ示した。アシルアミノ酸のベシクルへの作用
様式は恒温滴定型カロリメトリー（ITC）と 300kV Cryo-− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

TEM による形態観察を位相差法により非染色の条件下とがわかる。比較としてドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で行った。Cryo-TEM による形態観察では DPPC 濃度はの系を示した。SDS 系では低濃度からすでに漏れが生じ、2mM で固定し、アシルアミノ酸濃度を変化させて実験を

CMC に近づくにつれ徐々に漏れ率が上昇するものの、２行った。また各サンプル調製には、Tris-HCl 0.1M（pH ＝時間後でもそれほど大きな漏れを引き起こしていないこと

7.4）緩衝液を溶媒として使用した。内包薬物の放出制御がわかる。両者を比較するとそのアシルアミノ酸界面活性の実験では、他に pH ＝ 6.0 と 8.2 の緩衝液も溶媒として剤の作用における協同性が顕著であることがよくわかる。

使用した。これらは Tris-HCl 0.1M（pH ＝ 7.4）緩衝液に、次にアミノ酸の違いについて検討することにする。まず疎それぞれ HCl、NaOH 水溶液を適量加えることで調製した。

水性アミノ酸で比較すると側鎖が嵩高い Leu, Phe ではその漏れ速度が非常に高く、側鎖の小さな Gly と Ala 系で３．結果と考察はその速度が低いことがわかる。特に Phe 系では CMC のFig.１に界面活性剤の添加直後と２時間後の CF 漏出率20％程度の低濃度の溶液においてさえ、ベシクル添加後二を、各 CMC で換算した界面活性剤濃度（C * ＝ C /CMC）時間以内に内包物を完全に放出させている。一方親水性アに対してプロットしたものである。なお漏出率 L は各点ミノ酸である Ser、Asn、Glu 系はそれぞれ異なる挙動をにおける蛍光強度 I、界面活性剤添加以前の蛍光強度 Ibg、示した。側鎖に水酸基を有する Ser 系は添加直後の漏れ率ならびに TritonX-100 を添加することで完全にベシクルをは低いものの Leu, Phe 系に似たような挙動を示した。こ

崩壊させた後の蛍光強度 Itriton から以下の式により計算しれに対しアミド基を有する Asn 系は Gly、Ala 系の挙動にている。

似ているが、漏れ率は他の系と比べて小さかった。なお後L（％）＝

I − Ibg
Itriton×r − Ibg

者の系では、CMC 以降の高い濃度領域で漏出率が再度減× 100

少している。この原因については未解明であるが、現時点

なお r は TritonX-100 を添加することによる希釈率を表では界面活性剤ミセルと DPPC ベシクルとの複合体が形しており、今回のケースでは 1.1 とした。いずれのアシル成されたためではないかと考えている。側鎖にカルボキシアミノ酸界面活性剤の場合でも、かなり低い濃度ではベル基を有する Glu 系も同様に、CMC 後に漏れ率の低下をシクルの漏れを殆ど引き起こさないものの、CMC よりも示したが、この系に関しては CF は C12-Glu ミセルに可溶低いある濃度に達すると急激に漏出率が上昇しているこ化されると顕著に消光されることがわかっており、この蛍O

O
N
H

COOONa

C12-GlyN
H
C12-AlaO

ON
H

C12-LeuN
H

C12-Ser

COONa

O

N
H

C12-PheOH

O

C12-Glu

COONa

COONa
O
NH2O

COONa
C12-Asn

NH

COONa

COOH
NH

COONa

Scheme 1 使用したアシルアミノ酸界面活性剤の分子構造

Table 1 各界面活性剤の臨界ミセル濃度（25℃ in 0.1M tris-HCl pH = 7.4）

CMC /mM

SDS

C12-Gly

C12-Ala

C12-Leu

1.1

3.0

3.00.60

C12-PheC12-Ser

C12-Asn

C12-Glu

0.35

4.14.814.0− 30 −

リン脂質ベシクル上にリポアミノ酸が形成するナノチャンネルとその薬物放出能の検討

光の消光により見かけの漏れ率が減少したものと思われる。

活性剤の微分エンタルピーの結果を Fig. ２に、それぞれ次に DPPC ベシクル懸濁液と界面活性剤水溶液との微Fig. １と同様に CMC で換算された濃度に対して示した。

分希釈熱測定を行った。なお DPPC 濃度は蛍光実験の際DPPC ベシクルが存在しない場合の微分エンタルピーはに使用した量と同じ濃度になるように適量をセルに添加

CMC 近傍で急激に変化し、CMC 前後のエンタルピーのし、各界面活性剤の CMC の 20 倍の濃厚水溶液を滴下した。

差を取ることで、ミセル形成エンタルピーを得ることがでDPPC ベシクル存在下、非存在下での各系における界面きる ９）。その結果より SDS 系、C12-Phe 系ではミセル形

Fig.1 SDS および各アシルアミノ酸界面活性剤系におけるベシクル内包物の放出挙動。（○）添加直後、（●）添加２時間後(a) SDS, (b) C12-Gly, (c)C12-Ala, (d) C12-Leu, (e) C12-Phe, (f) C12-Ser, (g) C12-Asn, (h) C12-Glu

Fig.2 SDS および各アシルアミノ酸界面活性剤系における界面活性剤の微分エンタルピー （○）界面活性剤のみ、（●）DPPC
ベシクル共存下(a) SDS, (b) C12-Gly, (c) C12-Leu, (d) C12-Phe.

− 31 −

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成は発熱的であり、C12-Gly と C12-Leu 系では逆に吸熱的の値は DPPC 分子がベシクル状態からミセル内に移行すであることがわかる。一方 DPPC ベシクルが存在した場合、る際のエンタルピー変化に相当するが、このことは DPPC

このミセル崩壊のプロセスに伴う熱の出入りに加え、ベシの可溶化に伴うエンタルピー変化は界面活性剤の種類にあクルへの界面活性剤の作用に伴うエンタルピー変化が加わまり依存しないことを示している。実際に得られた回帰曲ることになる。SDS 系では比較的低濃度から DPPC が存線から DPPC 濃度がゼロの極限値を算出したところ、そ在しない場合の希釈熱のカーブからずれ始め、CMC の 50

れぞれ 36 〜 42 kJ mol −1 付近の値を示した。なお DPPC％程度の濃度において最大値に達し、その後単調に減少しベシクルは 42 ℃付近でゲル状態から流動性の大きな液晶た。C12-Gly と C12-Leu 系では CMC の 50％程度の濃度ま状態への転移を示すことが知られているが 10）、その相転ではほぼ一定の値であったが、最初の矢印の点で急激に上移の潜熱が約 36 kJ mol −1 である 11）。可溶化に伴うエンタ昇し、CMC の 80％程度の濃度において極大値をとりそのルピー変化とほぼ同等であることから、界面活性剤ミセル

後ＣＭＣに達した後 DPPC が存在しない場合の希釈熱の中での DPPC の状態は液晶状態に似通っているといえる。

カーブと同様の挙動を示した。これらの結果は上述した各

しかしながら DPPC 濃度が上昇するにつれ、各界面活性界面活性剤におけるベシクル膜への作用様式を強く支持し剤系における微分エンタルピーの差が拡大している。詳している。つまり SDS 系では低濃度領域から単調に作用しく見てみると、SDS 系では比較的その減少度が小さいのているのに対し、C12-Gly と C12-Leu 系では最初の矢印のに対し、アシルアミノ酸界面活性剤系ではそのエンタルピ点まではベシクル膜に対してエンタルピー的には殆ど影響ー値がより急激に減少した。これはミセル中での混和性のを与えていないものの、ある濃度に達すると協同的に作用違いを反映しているものと思われる。つまり DPPC はアしていることになる。また界面活性剤が作用した際の大きシルアミノ酸界面活性剤ミセル中よりも、SDS ミセル中な吸熱は、主に DPPC ベシクル膜のパッキング状態の緩でより界面活性剤と混和しているものと思われる。この結和を反映したものと思われる。その後は添加された分子は果はこれまで考察してきた DPPC ベシクル内での界面活膜上のドメイン形成に消費され、界面活性剤モノマー濃度性剤の混和性の違いと共通している。

が CMC に到達するとミセルが形成され、DPPC 分子はミこれらの結果をもとに、C12-Gly、C12-Leu と C12-Phe

セル内に可溶化されていくものと思われる。一方 C12-Phe系に対して、幾つかの濃度において、cryo-TEM によるベ系では、非常に希薄な濃度においては DPPC が存在しなシクルの形態観察を行った。結果はそれぞれ Fig. ４に示い場合の希釈熱のカーブから負の方向にずれており、低濃した。Fig．4a は C12-Gly（C*＝ 0.6）における像であるが、度における吸着が発熱的であることを示している。その後

漏れ挙動や熱測定の結果からは既にベシクルに対して作用他のアシルアミノ酸型界面活性剤と同様に CMC の 50％し、内包薬物を漏れさせているにもかかわらず、ほぼもと程度の濃度付近から急激に上昇し、CMC 付近で極値をとの粒径を保ったユニラメラベシクル像を得ることができた。

った後減少した。C12-Phe 系での極大のエンタルピーは他一方同じ濃度（C* ＝ 0.6）における C12-Leu 系（Fig．
4d）
、の界面活性剤に比べ非常に大きな値を示した。この結果は

C12-Phe 系（Fig．4f）では、C12-Gly 系と同様に急激な漏先の内包物の漏れ挙動の結果と対応しているように思われれの発生や大きな正のエンタルピー変化を起すという点でる。すなわち C12-Phe はベシクルに対して非常に強く作は似通った挙動であるにも関わらず、その形態が異なって用する結果、内包物の素早い漏れを引き起こしたのではないた。C12-Leu 系ではほとんどのベシクルはカプセル形をいかと考えられる。

保っていたが、その輪郭は円形ではなく多角形であった。

次に各界面活性剤ミセルの DPPC 分子の可溶化能を検更に写真にあるような一部にはシートに転移したものが観討するために、先の実験とは逆の滴定測定を行った。具

察できた。なおそのシートへ転移したものの存在比は１％

体的にはセル内の各 CMC の４倍濃度のミセル溶液中に以下であった。C12-Phe 系ではその違いが著しく、球状ベDPPC ベシクル懸濁液を滴定し、その際に発生する熱を測シクルは全く観察されず、全てのベシクルがシートへと転定した。結果を DPPC の微分エンタルピーを DPPC の濃移していた。C12-Leu、C12-Phe 系で見られた内包物の急度に対して Fig.３に示した。各界面活性剤系ともに比較的激な漏れは、ベシクルの形態をカプセル状からシートへと大きな正の値を示し、DPPC 濃度の上昇とともに減少する転移させることに起因しているものと思われる。またベシような挙動を示した。なおグラフ内に示した実線は、回クルの輪郭が多角形に近いような形が得られたことは、界帰曲線に分数関数（f（CDPPC）＝ P1 ＋ P2/（P3 ＋ CDPPC）：

面活性剤がベシクルに均一に作用しているのではなく局所P1，P2，P3 は可変パラメータ）を用いてフィッティング的に作用していることを裏付けているように思われる 12）。

したものであるが、実験結果をうまく再現できている。まつまり部分的に吸着した結果、DPPC リッチドメインと界た DPPC 濃度が無限希釈に近づくにつれ、各系の値は同面活性剤が吸着した部分との間に、ある種の界面が形成さじような値に収束していくように見える。この無限希釈でれたためではないかと考えている。次に、C12-Leu、C12-− 32 −

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Phe 系において漏れが起こり始める濃度（C*＝ 0.1）にお態転移を引き起こすことで、漏出効率が高くなる C12-Leu

ける画像を検討してみる（Figs. 4c, 4e）。この濃度においと C12-Phe 系に対して、温度と pH の変化による内包物のてはどちらの系ともにシート構造は殆ど確認できなかった放出挙動を検討した。またこれらの界面活性剤は CMC がが、やはりベシクルの輪郭は多角形であった。これらのこ低く、他の系に比べ添加量を抑えることができることも利とから C12-Leu、C12-Phe 系の場合では、ベシクルへの局点として挙げられる。なお内包物には同様に CF を用いた。

所的な作用は低濃度から既に起こっており、濃度が上昇す

まず両系ともにおいて CMC の４％、ならびに 40％の濃度るにつれ過度なドメイン形成が、カプセルを崩壊させシーでの結果を Fig. 5 に示した。この結果より、温度を上げるトへと転移させていることが予想される。最後に Fig. 4b

ことで内包物が放出されやすくなることがわかった。これの C12-Gly（C*＝ 4）における像について触れてみる。画は界面活性剤の作用によるベシクル形態の転移が温度の上像にあるように一部には疎水性アミノ酸系で見られた多角昇により促進されたためだと思われる。特に CMC の４％形状の輪郭が得られたものの、観察できたベシクルは全てでは、25℃以下の温度においては全く漏れを生じさせていカプセル状であった。漏れ挙動の結果において C12-Gly 系

ないが、35℃まで温度を上昇させることで内包物を速やかを含む幾つかの系では、CMC 後に漏れ率が減少するといに漏出させることができることがわかった。なお C12-Leu、

う特異な挙動を示しているが、TEM 画像からは形態の変C12-Phe 両系とも CMC の 40％濃度においても、DPPC の化など特に変わった様子は見られなかった。

二分子膜の相転移温度は 35℃以上であることを確認して以上の結果より、界面活性剤の作用によりベシクルの形いる。同様に Fig. ６に示したように、pH については低下

Fig.3 各界面活性剤ミセル水溶液中における DPPC の微分エンタル
ピー

Fig.4 各界面活性剤系におけるベシ
クルの形態(a) C12-Gly, C* = 0.6, (b) C12Gly, C* = 4, (c) C12-Leu, C* =0.2, (d) C12-Leu, C* = 0.6, (e)C12-Phe, C* = 0.1, (f) C12-Phe,C* = 0.6 ( 各 bar = 100nm)− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

させることで内包物が放出されやすくなることが分かった。

C12-Leu、C12-Phe 系では、速やかな放出能を有すること特に pH を７から６へと僅かに下げることで劇的な変化をがわかった。TEM 観察により、これらの系におけるベしており、両系とも CMC の 10％程度の濃度においては、シクル膜への作用が局所的であり、かつその性質のため内包物の放出のオン・オフをほぼ完全に制御することが可

CMC 以下においてベシクル形態の転移を引き起こすこと能である。これらの界面活性剤の見かけの pKa は７前後がわかった。このベシクル形態の転移が内包物の速やかなであることから、界面活性剤のカルボキシル基の解離を抑放出をもたらすことが予想される。更に添加する界面活性えることで、ベシクルへの吸着量が飛躍的に向上し、その剤にこの C12-Leu や C12-Phe を用いることで、僅かな pH結果内包物の放出を招いたのではないかと考えられる。

や温度の調節により、鋭敏にベシクル内包物の放出を制御４．結できることがわかった。

言

アシルアミノ酸界面活性剤を用いたベシクル膜内包謝

辞物の放出作用を系統的に検討した。これらの界面活性剤

本研究を遂行するにあたり㈶コスメトロジー研究振興は SDS と比較すると、その作用が協同的であることが特財団の支援をいただきました。ベシクルの熱測定は、北陸徴としてあげられる。特に側鎖に嵩高い疎水基を有する

先端科学技術大学院大学教授(a)10015℃
25℃
35℃

80

L/%

100100(c)808060606060

4040404020202020000100
200
300
0100200300
0100200300
0t / sect / sect / sec
Fig.5 C12-Phe および C12-Leu 希薄溶液系におけるベシクル内包物放出挙動の温度依存性(a) C12-Phe, C* = 0.04, (b) C12-Phe, C* = 0.4, (c) C12-Leu, C* = 0.04, (d) C12-Leu, C* = 0.4.
0(a)10080100pH = 6pH = 7
pH = 8L/%

6040200(b)100(c)

80808060606040404020202040− 34 −

100200t / sec

300(d)

10000080
12004080
120040801200t / sect / sect / sec
Fig.6 C12-Phe および C12-Leu 希薄溶液系におけるベシクル内包物放出挙動の pH 依存性(a) C12-Phe, C* = 0.1, (b) C12-Phe, C* = 0.4, (c) C12-Leu, C* = 0.2, (d) C12-Leu, C* = 0.4.

0(d)100800L/%(b)

由井伸彦氏の協力により行4080t / sec120

リン脂質ベシクル上にリポアミノ酸が形成するナノチャンネルとその薬物放出能の検討いました。また TEM 観察は、分子科学研究所「ナノ支援」

７）宮岸重好，表面，35，85 (1997).

プログラムの援助を受け、生理学研究所教授

８）Yasuhara K. Ohta A.

永山國昭氏

Asakura Y.

Kodama T.

ならびに R.Danev 博士に多大なご協力をいただきました。

Asakawa T. Miyagishi S., Colloid Polymer Science 283, 8,

この場を借りて深謝いたします。

p.987-993 (2005).
９）Ohta A., Murakami R., Takiue T., Ikeda N., Aratono（関連文献）

M., J. Phys Chem. B 104(35), p8592-8597 (2000).

１） 吉 田 良 之 助， 竹 原 将 博， 有 機 合 成 化 学 協 会 誌，33，ックス II (4) 生体膜のダイナミクス，共立出版 (2000).

671 (1975).
２）吉田良之助，竹原将博，渋江昭夫，薄羽恭謙，油化学，
26，747 (1977).
３）竹原将博，表面，22，459 (1984).

10）八田一郎，村田昌之：シリーズ・ニューバイオフィジ
11）Fa N., Ronkart S., Schank A., Deleu M., GaigneauxA., Goormaghtigh E., Mingeot-Leclercq M. -P., Chem.
Phys. Lipids 144, p108-116 (2006).

４）竹原将博，表面，22，512 (1984).

12）Ickenstein L.M., Arfividsson M.C., Needham D.,

５）竹原将博，油化学，34，964 (1985).

Mayer L.D., Edward K., Biochim. Biophys. Acta 1614,

６）坂本一民，油化学，44，256 (1995).

p1335-138 (2003).

− 35 −