【研究報告】（自然科学部門）

7-ケトコレステロールの白血球–血管内皮相互作用の検討

谷東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科血管代謝探索講座
緒真 理 子

特任准教授

実験方法

言

1.

動脈硬化の形成には、血管壁におけるコレステロール層流下での血管内皮細胞に対する単球接着実験

エステルの蓄積と、骨髄由来細胞群による炎症過程といゼラチンコートしたカバースリップにヒト臍帯静脈内う二つの現象が関与している。この動脈硬化症における皮細胞（human umbilical vein endothelial cell; HUVEC）

炎症過程とは、まず好中球、単球、リンパ球等の白血球を播種し、50 μM 7-ketocholesterol あるいは cholesterolが血管内皮細胞に接着・内皮下に遊走し、単球から分を 24 時間前刺激した後、0.1 ng/mL TNFα を 4 時間刺激化したマクロファージが、酸化 LDL を取り込み、泡沫し、37℃に保温された位相差顕微鏡上の ﬂow chamber に細胞となって集簇する過程であると考えられてきた。

セットした。ヒト骨髄単球性白血病細胞株（THP-1）細よって、血管炎症の初期病変として、白血球–血管内皮胞溶液を、ﬂow chamber にシリンジポンプを用いて流速細胞の相互作用は重要と考えられる。血管内皮細胞に43.2 mL/h（1.0 dyne/cm2）で流し、HUVEC と THP-1 細

発現する細胞接着分子には主に、ICAM-1（intercellular胞の接着の様子をビデオカメラで撮影した8）。1 視野あadhesion molecule-1）、VCAM-1（vascular-cell adhesionたり 10 秒、各コンディション 14 視野を録画し、1、2、molecule-1）、E-selectin があり、これらが白血球のイン13、14 番目を除いた 10 視野を計測に用いた。撮影したテグリンや糖鎖と結合することにより、単球やマクロ動画は PC に取り込んで画像化し、THP-1 細胞の rolling1）

ファージの内皮下への浸潤につながっていく 。と adhesion の数を計測した。

動脈硬化症の危険因子として、加齢や生活習慣等の因2.

子が考えられている。生活習慣の中でも食生活、特に脂接着分子および炎症シグナルのタンパク発現の変化

質に注目すると、コレステロールの摂取が血中の酸化コ

Cholesterol も し く は 7 - ketocholesterol 24 時 間 刺

レステロールの上昇につながるという報告がある2）。

激・TNFα4 時 間 刺 激（接 着 分 子）、 あ る い は chol/7-7-ketocholesterol（7K）は、コレステロールが酸化変性

ketocholesterol 1 時 間 刺 激・TNFα15 分 刺 激（シ グ ナ

して生じる酸化コレステロールの一つである。食事中にル 伝 達 分 子） を し た HUVEC か ら lysate を 回 収 し た。

含まれているコレステロールが熱や光によって変性した

Reducing buﬀer（E-selectin は、Non-reducing buﬀer）をものが外因性に摂取されるほか、体内ではコレステロー用いて変性させた後、SDS-PAGE で分離し、E-selectin、ルやコレステロール脂肪酸エステルが活性酸素によってICAM-1、VCAM-1 のタンパク質発現量、p-JNK（c-jun

酸化されて生じる3）。7-ketocholesterol はアテローム性動N-terminal kinase）、p-p65 の活性化、NFkB の不活性化

4）

脈硬化プラークに存在し 、また血中の 7-ketocholesterolタンパクである IκBα のタンパク質発現量を調べた。ローの濃度が高い人は冠動脈疾患を発症しやすいという報告

ディングコントロールには、β-actin を用いた。

5）もある 。7-ketocholesterol は、で高い炎症誘発性や細胞毒性をもつことが報告されているが 6, 7）、

3.

接着分子および炎症シグナルの mRNA 発現の変化
Cholesterol も し く は 7-ketocholesterol 24 時 間 刺 激、血管内皮細胞にどのような影響を及ぼすかについて詳し

TNFα2 時 間 刺 激 を し た HUVEC か ら RNA を 抽 出 し、くは解明されていない。
本 研 究 で は、 酸 化 コ レ ス テ ロ ー ル の 一 つ で あ る

Prime script RT を用いて cDNA を作製した。さらに、

7-ketocholesterol の血管炎症惹起作用について、白血球

KAPA SYBR qPCR kit を用いて反応させ、mRNA 量をの血管内皮細胞接着に及ぼす影響と、その分子メカニズ測定した。ターゲット遺伝子は、E-selectin、Interleukin-8

ムを検討した。

（IL-8）、Monocyte Chemoattractant Protein-1（MCP-1）、1

谷真 理 子次に、白血球–血管内皮細胞の相互作用に細胞接着

Toll-like receptor 2（TLR2）、Toll-like receptor 4（TLR4）分子の発現が関与しているか、ウェスタンブロット法でとし、コントロールは 18S rRNA とした。

細胞接着分子のタンパク発現量を検討した。その結果、Immunoﬂuorescence による NFkB の核移行

4.

7-ketocholesterol 添加で、TNFα 単独刺激や cholesterol

HUVEC に cholesterol もしくは 7-ketocholesterol 24 時

添加に比べて E-selectin の発現量が特に増加しているこ

間刺激、TNFα20 分刺激を行った後、1％パラホルムアとが確認された（Fig. 2A）。E-selectin は mRNA レベル

ルデヒドで固定し、一次抗体として rabbit anti-p65、二でも増加しており、ウェスタンブロット法で得られた結次抗体として goat anti-rabbit-FITC を用いて免疫蛍光果と一致していた（Fig. 2B）。
さらに、血管内皮細胞傷害により生じる現象として、染色を行った。さらに DAPI を用いて核を染色し、細胞細胞接着分子の発現亢進の他に、炎症性サイトカインや内での p65 の局在を調べた。

ケモカインの産生増加が挙げられる9）。そこで、RT-PCR
結果法によりケモカインの mRNA 量を測定したところ、イン

Flow assay により、7-ketocholesterol 添加で白血球–ターロイキン-8（IL-8）の mRNA 量が 7-ketocholesterol

血管内皮細胞の相互作用にどのような影響が及ぼされる添加で有意に増加していた。また、7-ketocholesterol がかを検討したところ、TNFα 単独刺激・cholesterol 添加

細胞内に取り込まれる受容体を同定するために、TLR2、と比較して THP-1 細胞のローリング数が有意に増加しTLR4 の mRNA 量も測定したが、TLR2 の発現量は変化て い た。 接 着 現 象 に つ い て は、7-ketocholesterol 添 加

せず、TLR4 は、7-ketocholesterol 添加で TNFα 単独刺で、TNFα 単独刺激と比べて有意に増加していたが、激や cholesterol 添加に比べて増加するものの、TNFα 刺cholesterol 添加と比べると増加傾向は見られるものの有激なしに比して変化は認められなかった（Fig. 2B）。

意差は見られなかった。また、ローリング数と接着数の接着分子やケモカインの発現上昇に至る細胞内シグナ合計数の比較においても、7-ketocholesterol 添加によりル伝達経路について検討したところ、7-ketocholesterolcholesterol 添加に比べて有意に増加していた（Fig. 1A,添加により、p-p65 の発現上昇と IκBα の分解が見られB）。

（Fig. 3A）、さらに免疫蛍光染色では p65 が核に移行しFig. 1 7-ketocholesterol の白血球–血管内皮細胞相互作用への影響。Cholesterol/7-ketocholesterol 24 時間刺激、TNFα4 時間刺激をした HUVEC を用いて、ﬂow assay を行った。3 回実験を行い、同じ傾向の結果が得られたので、代表的な 1 回の結果を示す。
（A）撮影した動画の一部を切り取った静止画。
（B）各コンディションにおける、撮影した 10 視野でのローリングと接着の合計数を表している。***: ＜0.001, **: ＜0.01, n.s.: not statistically signiﬁcant2

7- ケトコレステロールの白血球 – 血管内皮相互作用の検討

Fig. 2 （A）Cholesterol/7-ketocholesterol 24 時間刺激、TNFα4 時間刺激をした後 E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 の発現量の変化を示す。β-actin は同一メンブレン上でリプローブした結果である。3 回実験を行い、代表的な 1 回の結果を示している。（B）
Cholesterol/7-ketocholesterol 24 時間刺激、TNFα2 時間刺激をした後の mRNA 量の変化を示す。E-selectin は TNFα（＋）
を 1 としたときの相対値、IL-8, MCP-1, TLR2, TLR4 については、TNFα（−）を 1 としたときの相対値を示している（ ＝3）。
**: ＜0.01, *: ＜0.05, n.s.: not statistically signiﬁcantFig. 3 （A）Cholesterol/7-ketocholesterol 1 時間刺激、TNFα15 分刺激をした後の p-p65, IκBα, p-JNK の発現量の変化を示す。p65,
β-actin, JNK はそれぞれ同一メンブレン上でリプローブした結果である。3 回実験を行い、代表的な 1 回の結果を示している。
（B）Cholesterol/7-ketocholesterol 24 時間刺激、TNFα20 分刺激をした HUVEC における、NF-κB p65 の局在を示す。緑がp65、赤が DAPI で染色した核の位置を表しており、二つが重なった部分は黄色で表されている。3 回実験を行い、代表的な視野の写真を示している。
3

谷

真 理 子ていることが確認された（Fig. 3B）。p-JNK のタンパクの発現が増加することが示唆された。

発現量は、7-ketocholesterol 添加で、TNFα 単独刺激や要cholesterol 添加に比して変化は見られなかった（Fig. 3A）。

約
コレステロールが酸化変性した酸化コレステロールは考察

加工食品に多く含まれ、動脈硬化の発症・進展に関与す

本研究の結果より、7-ketocholesterol 添加によって白る危険因子として注目されているが、その詳しいメカニ血球–血管内皮細胞の相互作用が亢進することがわかっズムはわかっていない。本研究では、酸化コレステロー

た（Fig. 1）。酸化コレステロールを多く含む食品を摂取ルの一つである 7-ketocholesterol の血管炎症惹起作用にしたり、生体内でコレステロールが酸化されたりして、ついて、白血球の血管内皮細胞接着に及ぼす影響と、そ血中で 7-ketocholesterol が増加する状況では、TNFα 等の分子メカニズムを検討した。
ヒ ト 臍 帯 静 脈 内 皮 細 胞（HUVEC） に、TNFα との炎症刺激が入ると、白血球の血管内皮細胞への接着が亢進する可能性が考えられる。

7-ketocholesterol あるいは対照としてのコレステロール

H U V E C に お い て は 、E - s e l e c t i n の 発 現 が（cholesterol）を添加し、24 時間培養後、ヒト骨髄単球

7 - ketocholesterol 添 加 で 増 加 し て い た（Fig. 2A）。

性白血病細胞株（THP-1）を用いて、定常流下におけE-selectin の発現増加は、Flow assay においてローリンる生理的細胞接着実験を行った。その結果、HUVEC とグが有意に増加していたという結果と一致する。さらTHP-1 細胞の相互作用は、7-ketocholesterol 添加によっに、HUVEC に お け る ケ モ カ イ ン の mRNA 発 現 量 は、てローリングが有意に増加し（ ＜0.01）、ローリングとIL-8 で有意に増加していた（Fig. 2B）。IL-8 は、好中球に接着の合計数も、7-ketocholesterol 添加よって有意に増対する走化因子と考えられていたが、それだけでなく、加した（18.9±0.35 cells/CPF; ＜0.01）。また、同様の条ローリングしている単球が血管内皮との強固な接着に移件下における HUVEC での細胞接着分子のタンパク発現

10）行するのにも重要な役割を果たすという報告がある 。

（ICAM-1、VCAM-1、E-selectin）は、7-ketocholesterol

MCP-1 は、単球の炎症組織への recruitment に関わって添加によって増加し、IL-8 の mRNA 量も増加していた。

9）いると言われている が、今回は 7-ketocholesterol 添加

さらに、7-ketocholesterol 添加の細胞接着分子発現誘導による有意な産生増加は見られなかった。の機序を検討したところ、7-ketocholesterol 添加においHuang et al. は、 ヒ ト 網 膜 色 素 上 皮 細 胞 で、て NF-kB の不活性化因子である Iκ-Bα のタンパク量は7-ketocholesterol による炎症刺激は TLR4 を介すること低下しており、また免疫蛍光染色法で p65 の核移行が確11）を報告している 。そこで、7-ketocholesterol 刺激をし認されたことから、炎症性転写因子である NF-κB が関た HUVEC における TLR2、TLR4 の mRNA 量を調べた与していることが示唆された。

が、TLR2 は 変 化 せ ず、TLR4 は 7-ketocholesterol 添 加

以上より、今回の研究によって 7-ketocholesterol が、で TNFα 単独刺激や cholesterol 添加に比べて増加する血管炎症を介して動脈硬化の進展リスクを高める可能性

ものの、TNFα 刺激なしとは変わらないという結果にを示された。

なった（Fig. 2B）。
謝

血管内皮細胞において、細胞接着分子の発現上昇に至辞る細胞内シグナル伝達経路としては、NF-κB を介した経本研究を実施するにあたり助成を頂きました公益財団

路が報告されている12）。そこで、NF-κB の活性化を検討

法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様に厚く御礼したところ、7-ketocholesterol 刺激で IκBα の分解亢進を申し上げます。と、p65 の核移行の増加が見られた（Fig. 3）。p65 のリ
文

ン 酸 化 亢 進 も わ ず か に 認 め ら れ、7-ketocholesterol に
よって NF-κB 経路が活性化していることが考えられた。

献1） R. Ross:
2） H. N. Hodis, et al.:
1991.
3） G. Poli, et al.:4） M. Ohtsuka, et al.:262, 2006.
5） T. Hitsumoto, et al.:

また、今回 NF-κB 同様に細胞接着分子発現に関与することが知られている p-JNK の発現の増加は見られなかった。したがって、7-ketocholesterol は、NF-κB をはじめ、炎症シグナル経路の活性化することによって E-selectin
4, 340, 115–126, 1999.
, 89, 2–3, 117–126,, 1（1）,125–130, 2013.
, 13（5）, 256–, 16（4）,363–7- ケトコレステロールの白血球 – 血管内皮相互作用の検討

370, 2009.
6） A. Vejux, et al.:
7） J. Amaral, et al.:8） M. Yoshida, et al.:（7）,1165–1171, 2001.
9） S. S. William, et al.:

2002.
10） S. Apostolakis, et al.:
2009.
11） J. D. Huang, et al.:12） C. Tucker, et al.:

, 41（7）,2008.
, 8（2）,e56099. 2013.
, 21, 160（1）, 91–102,5, 84（3）, 353–360,, 18, 9（7）:e100985, 2014.
, 9, 899–908, 1995.