アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析
広島大学大学院医系科学研究科

松浪勝義

Propionibacterium acnes is a Gram-positive anaerobic rod-shaped bacteria found on the skin and in the intestinal tract. It
is widely known as the causative agent of acne vulgaris, but has recently attracted attention for its involvement in pustulosis,prostatitis, hyperostosis, synovitis, sarcoidosis (granuloma), and implant-related infections. Therefore, it is an important
issue to clarify what mechanisms influence pathogenesis. In this study, we investigated the cytotoxicity of culture extracts
obtained under various culture conditions together with Staphylococcus aureus against human skin-derived fibroblast cellline KMST-6. The results showed that the cytotoxicity of the culture extracts varied depending on the culture medium.
For example, S. aureus was active in LB and MH media, but not in GAM and BHI media, which suggests that the cultureconditions, including the culture medium, are important in the study of metabolites. As no significant differences wereobserved in TLC and LC-MS analyses, it is possible that the compounds that are primarily responsible for the activity aretrace amount that is difficult to isolate and purify, or that the difference in activity is not dependent on a specific compoundbut on the overall activity of various compounds such as lipids that have weak activity. However, as observed in the coculture in LB medium, the activity was stronger in the co-culture than in the monoculture, this observation may provide aninteresting feature for future research on the interaction of these indigenous skin bacteria.

１．緒

養条件の変更や他の微生物との共培養法などで休眠遺伝子

言の活性化 4）を行うなど詳細に代謝産物を検討することが必

ヒトの皮膚表面には皮膚常在菌と呼ばれる細菌や酵母要である。

が存在し均衡状態を保っている。皮膚常在菌は肌を弱酸以上の観点から、美容などのコスメトロジー領域におい性に保ち、病原菌の侵入に対しバリア機能の役割を果て重要な疾患であるニキビに注目し、その原因菌であるアたす一方、バランスが崩れ、ある種の菌が多量に増殖すクネ桿菌（P. acnes）や黄色ブドウ球菌（S. aureus）についてると種々の皮膚炎症を引き起こす。代表的な皮膚常在種々の条件で培養（単独および共培養）を行い、皮膚細胞に菌 は 表 皮 ブ ド ウ 球 菌（Staphylococcus epidermidis）、 ア対する細胞毒性を評価することとした。

ク ネ 桿 菌（Propionibacterium acnes）、黄色ブドウ球菌

２．方（Staphylococcus aureus）である 1 , 2）。表皮ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌の増殖を防ぐ抗菌ペプチドや皮膚のバリア機法2 . 1. 微生物株および培養について能を高めるグリセロールを産生することが知られている。一使用菌株アクネ菌 Propionibacterium acnes（GTC 00154、方、黄色ブドウ球菌は皮膚炎や創傷部位の化膿を引き起こ

嫌気性グラム陽性桿菌）は岐阜大学の微生物コレクションし、アクネ菌はニキビの誘発に関係が深い。しかし、代謝から分与いただいた。アクネ菌（P. acnes）は嫌気性細菌の産物としてはこれまでに histamine, tryptamine, propionic

ため角型ジャー・ケンキシステム（三菱ガス化学 , A- 41）acidなどの短鎖脂肪酸などが報告されているが2 , 3）、いずれあるいはパウチ袋（三菱ガス化学 , A- 94）に入れ、アネロ

も HPLC によるあらかじめ想定した標品との比較によるもパック・ケンキ（三菱ガス化学 , 脱酸素剤 A- 04）による嫌ので化学的研究は十分ではない。一方、放線菌などのゲノ気培養を行った。黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus

ム配列研究の結果、単一の培養条件では一部の２次代謝産（JCM 20624、理研微生物材料開発室（RIKEN BRC））は生遺伝子しか活性化しておらず眠っている遺伝子（cryptic

好気性のため前培養は通常の好気条件下（35 ℃, 150 rpm）genes）から本来さらに多様な２次代謝産物を産生する能で培養を行った。共培養の場合は、それぞれの菌株を上力があることが報告されている。そのため、培地などの培記条件にて前培養後に混合し、嫌気培養条件で培養した。
使用培地は、嫌気性細菌用培地（GAM：Gifu AnaerobicMedium）や一般的な細菌類の培養に用いられる Luria-Chem ica l a na lysis of seconda r ymetabolites of Propionibacterium acnes
Katsuyoshi Matsunami
D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o g n o s y,Graduate School of Biomedical andHealth Sciences, Hiroshima University

Bertani Broth Medium（LB）培地、Mueller Hinton Broth（MH）培地、Brain Heart Infusion（BHI）培地をベースに人工皮脂としてヒト皮脂の代わりに入手しやすい馬油（井藤漢方製薬 , 純馬油）を 0 . 5 w/v% 添加し培養した。LB 培地
を用いたアクネ菌と黄色ブドウ球菌の共培養については 1− 78 −

アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析

週間にわたって毎日一部を回収、抽出、乾固して被験物質とし、以下に示す方法でヒト皮膚由来線維芽細胞 KMST 62 . 3 . ヒト皮膚由来線維芽細胞株に対する細胞毒性評
価に対する細胞毒性を MTT 法により評価した。

抽出物添加条件での培養および吸光度測定には平底 96well

抽出は培養液と等量の酢酸エチルを加え、十分に攪拌、

plate（Nunc microwell 167008 , Thermo Fisher Scientific）

静置の後、上層を酢酸エチル可溶画分として回収した。まを使用した。
ヒト皮膚由来線維芽細胞株 KMST- 6（RCB1955、た、エマルジョンを形成した培養物についてはスクリュー

Riken BRC 細 胞 材 料 開 発 室 ）は 培 地 と し て Dulbeccoʼs

キャップ付き試験管に入れ、遠心操作（2000 rpm）によりModified Eagleʼs Medium（DMEM、D 5796、SIGMA）に十分に分離させた上で上層を回収し、減圧下で溶媒を除去

非 働 化 済 み 牛 胎 児 血 清 10 %、Amphotericin B（SIGMAすることで抽出物を得た。

A 9528）、Kanamycin sulfate（WAKO 119 - 00703）をそれまた、大量培養については、1 L の三角フラスコ２本にぞれ、5 . 6 µg/mL、100 µg/mL になるよう加えたものを使それぞれ 500 mL の培地を調製し、オートクレーブにより用した。5 % CO 2、37 ℃、湿度 95 % の条件下で培養を行い、滅菌した培地を用いて行った。まず、平板培養から得たコ

0 . 05 % Trypsin-EDTA 溶液により細胞をはがし、得られロニーを、試験管培地（2 mL）に摂取し前培養（増殖に差がた細胞懸濁液を継代およびアッセイに使用した。培養抽あるため S. aureus は好気下で 1 日、P. acnes は嫌気下で出物は DMSO に溶解し、培地を加えることで終濃度 500、5 日、35 ℃）を行った。そのうち 1 mL を 100 mL フラスコ

200、100 µg/mL の濃度に調整した。各 well には 5 × 103（培地 20 mL）に接種し同様の条件で中間培養を行い、最後個の細胞を播種し、化合物を添加後 72 hr 培養を行った。にこの中間培養物 10 mL を摂取することで、上記 1 L のフ終濃度 1 % の DMSO 溶液のみで培養した well を比較対象

ラスコを用いて大量培養を行った。抽出は等量の酢酸エチとして、抽出物の有無による細胞増殖率の変化を吸光度測ルを加え、分液ロートでよく攪拌、混合したのち、静置し、定により評価した。具体的には、72 hr の培養の後、上清必要に応じて遠心操作（2000 rpm）により上層を酢酸エチを吸引除去し、MTT（0 . 5 mg/mL）を含む培地を 100 µL 加ル可溶画分として回収した。さらに、エバポレーターで濃え、さらに 1 . 5 hr 培養を行った。その後培地を吸引し、生縮を行い、残存した水分をオイルポンプで除去することで成した MTT formazan を DMSO 100 µL を加えることで溶抽出物を得た。

解し、マイクロプレートリーダーにより 540 nm の吸光度を測定した。また、細胞の形態変化を調べるため、通常の2 . 2 . HPLC 分析および分離精製について明視野観察に加えて、細胞の染色像として MTT を添加・少量培養抽出物はメタノールに溶解あるいは懸濁し、培養したものについても写真撮影を行った。

Sep-pack C 18 カートリッジ（Waters）に通液したものをサンプルとした。HPLC の使用カラムは Inertsil ODS- 3

増殖抑制率は下記の式を用いて算出し、細胞毒性を評価した。

（6 . 5 mm × 250 mm、GL サイエンス）で分離を行った。得

増殖抑制率（%）

られた化合物の同定は Bruker Avance III 500 核磁気共鳴=［1 ‒（Asample ‒Ablank）/（Acontrol‒Ablank）
］
× 100

装置
（Bruker）（共鳴周波数 1 H NMR : 500 MHz、13 C NMR

Asample：サンプルを添加して培養した場合の吸光度: 125 MHz）を使用し、溶媒中の D シグナルを internal lock

Ablank ：Plate や培地に由来する吸光度signal とした。ケミカルシフト値の表示は調製に用いた重Acontrol：DMSO を添加して培養した場合の吸光度水素化溶媒の残存軽水素シグナルの δ 値（ppm）で補正した。

３．結

また、ハイブリッド型質量分析システム LTQ Orbitrap
X（Thermo Fisher Scientific）を使用し質量分析を行った。

果

3 . 1. KMST- 6 に対する増殖阻害活性の経時変化

また、活性の見られた抽出物との代謝物の差異を見るため

まず、一般的な細菌用培地である LB 培地を用い、P.

LC-ESI-MS による分析を行った。使用カラムは上記と同acnes と S. aureus の共培養条件下で、培養日数による活様に Inertsil ODS- 3（6 . 5 mm × 250 mm、GL サイエンス）

性の変化について検討を行った。前培養で十分増殖したを用い、移動相 A（0 . 1 % ギ酸 -H 2 O）
、移動相 B（0 . 1 % ギそれぞれの培養液を混合し（Day 1）、35 ℃の嫌気培養下で酸 - アセトニトリル）、
流速 0 . 5 mL/min、0 - 10 min（A : 90 %,Day 7 まで培養を継続した。培養期間中、一日ごとに培養

B : 1 0 %）、1 0 - 1 2 0 min（A : 9 0 %, B : 1 0 % か

ら A : 0 %,液の一部を回収し、酢酸エチルを加えて混合し、静置してB : 100 %、グラジエント溶出）、イオン化 : ESI、positive

得られた上層を酢酸エチル可溶画分として回収した。減モ ー ド、Spray voltage : 5 kV、Sheath gas flow rate : 60、圧下で有機溶媒を留去し、得られた培養粗抽出物のヒト

Aux gas flow rate: 20 で分析を行った。

KMST- 6 細胞に対する細胞増殖抑制率を MTT 法により求めた（図 1）。その結果、培養開始の初期（Day 1 - 2）にはそれほど活性は見られないが、培養 4 日目あたりで十分な− 79 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

インにデンプンを加えた Mueller-Hinton broth（MH 培地）、嫌気性細菌用培地の Gifu Anaerobic Medium（GAM 培地）など組成が大きく異なるものを用い、単独培養および共培養を行い、KMST- 6 に対する細胞毒性評価を行った（図 2）。
それぞれの菌株の至適条件を考慮し、P. acnes 単独（PA）
および P. acnes と S. aureus の混合培養（PA+SA）は嫌気培養、S. aureus（SA）は前培養のみ好気下で行った。培養は上述の結果をもとに７日間、35 ℃で行った。
LB 培地では図 1 同様に共培養で活性が見られ、500 µg/
図 1 ヒト皮膚由来線維芽細胞 KMST-6 に対する増殖阻害活性P. acnes と S. aureus との共培養代謝産物の経時変化（35℃、嫌気培養）。抽出物濃度：500µg/mL, LB（Luria-Bertani）培地

mL の濃度で阻害率 46 . 5 ± 7 . 6 % の増殖阻害活性を示したが、S. aureus 単独でも 34 . 8 ± 3 . 3 % の活性が見られることから主に S. aureus に由来する代謝産物であると考えられ た（ 図 2、3）。 一 方、MH 培 地 で は S. aureus で 95 . 0 ±0 . 01 % の阻害活性が見られたが、200 µg/mL では活性は活性が見られるようになり、その後はほとんど活性の変見られなかった。一方、共培養条件（PA+SA）では活性化はなかったことから、培養は 4 - 7 日で行えば十分に活が見られなかったことから、S. aureus 単独による条件が性が見いだされることが示された。そこで、今後の実験重要であると考えられた。逆に、嫌気培養用培地である

では 7 日間の培養期間で活性を評価することとした。一方、

GAM 培地では P. acnes 単独培養のみ活性が見いだされた

500 µg/mL の濃度では活性が見られたが、200 µg/mL 以（抑制率 82 . 1 ± 11 . 9 %）。共培養では細胞毒性を示さなか下では活性は見いだされなかったことから、それほど強いったことから S. aureus の共存により P. acnes による２次毒性ではなく、さらに、培地の変更や単独培養についても代謝に変化が起こったか、S. aureus による毒性成分の代併せて検討を行うこととした。

謝が起こった可能性がある。この GAM 培地での P. acnes
単独培養では 200 µg/mL で 17 . 3 ± 1 . 0 % の細胞毒性が示さ

3 . 2 . 種々の培地条件における単独および共培養による活性の変化

れたが 100 µg/mL では毒性は見られなかった（図 2）。また、培養条件の違いにより代謝産物が変化することが知られも細胞形態の変化は見られ、同様の形態変化は GAM（SA,増殖率には影響しなかったが、BHI 培地（SA, PA+SA）でていることから 、LB 培地に加え、動物脳と心臓組織由PA+SA）, LB（PA, SA, PA+SA）, MH（PA, PA+SA）の場

来の Brain Heart Infusion broth（BHI 培地）や牛肉、カゼ合でも観察されたことから、何らかの影響を及ぼしている

5）

図 2 各種培地における単独培養および共培養代謝産物の KMST-6 に対する増殖阻害活性PA : P. acnes, SA : S. aureus, PA+SA : 混 合 培 養 , LB : Luria-Bertani medium, MH :Mueller–Hinton medium, BHI : Brain Heart Infusion medium, GAM : Gifu AnaerobicMedium, 35℃ , 抽出物濃度 : 500µg/mL, n=3− 80 −アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析

図 3 各種培地における単独培養および共培養代謝産物の KMST-6 に対する影響
PA : P. acnes, SA : S. aureus, PA+SA : 混 合 培 養 , LB : Luria-Bertani medium, MH : Mueller‒Hintonmedium, BHI : Brain Heart Infusion medium, GAM : Gifu Anaerobic Medium, 35 ℃ , 抽 出 物 濃 度：500µg/mL, DMSO : 通常の明視野観察像と MTT 発色後 , X2 : PA+SA に見られる形態変化（通常明視野 ,X ２倍に拡大 , 同様の形態変化は BHI 培地（SA, PA+SA）, GAM（SA, PA+SA）, LB（PA, SA, PA+SA）,MH（PA, PA+SA）にも観察される。

ことが示唆された（図 3）。以上の結果から、最も強い細胞る HPLC クロマトグラムの比較により、活性に関わる成分毒性の見られた MH 培地による S. aureus の単独培養、おが見い出せないか検討することとした。培養抽出物をメタよび GAM 培地による P. acnes の単独培養に注目し、代謝ノールに溶解あるいは懸濁し、Sep-pack C 18 カートリッ物について検討を行うこととした。

ジに通液することでメタノール溶出液を得た。0 . 1 % のギ酸存在下、10 % アセトニトリルから 100 % アセトニトリル

3 . 3 . 培養抽出物に含まれる代謝産物の解析まで溶出強度を変化させてグラジエント溶出を行った。ク

次に細胞毒性の見られた MH 培地による S. aureus 培養

ロマトグラムは LC-ESI-MS による TIC（Total Ion Count）抽出物（MH-SA）、および GAM 培地による P. acnes 培養

でプロットしクロマトグラムプロファイルを比較したも抽出物（GAM-PA）について含有化学成分の化学的解析をのを図 4 に示す。溶出時間 43 . 6、46 . 9、100 . 5、115 . 6 min行うこととした。まず、MH 培地による S. aureus の大量などの主要な成分は毒性の見られた GAM-PA および毒性培養の後、得られた抽出物についてシリカゲル TLC 分析の見られなかった GAM-SA で共通に存在することから細（CHCl 3 : MeOH= 20 : 1 および 7 : 1 で展開後、0 . 5 % 硫酸／胞毒性に関与するとは考えにくい。その他、マイナー成分加熱発色）を行い、確認されたスポットについて高分解についても顕著な差異を見出すことは難しく、前処理条件

能 TLC（HPTLC）を用いて薄層分取を行った。次に得らや分析条件を検討する余地はあるものの、毒性に関係する13れた成分について H および C NMR、MS の測定を行い成分は検出されない程度の微量であることが示唆され、同化合物の同定を試みたところジグリセリドの混合物であ定は困難であると予想される結果となった（図 4）。なお、ると推定された。さらに HPLC などで分離を試みる必要

MH 培地を用いた S. aureus の毒性成分についても同様にがあるが、培地の添加物として馬油を用いていることか

LC-MS 分析を行ったが、差異を見出すことは困難であった。

1

ら、S. aureus に由来するものかについても含めて今後詳４．考細に検討する必要がある。一方、上述の 3 . 2 . の結果（図 2）

察から、MH 培地による P. acnes 培養抽出物（MH-PA）、おPropionibacterium acnes（ゲノム解析によりCutibacterium

よび、GAM 培地による S. aureus 培養抽出物（GAM-SA）

acnesに変更 6））はグラム陽性嫌気性桿菌で、皮膚や腸管なに毒性が見られなかったことから、グラジエント溶出によどに存在するヒトの常在菌の一つである。ニキビ（尋常性− 81 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022図 4 S. aureus（GAM-SA）および P. acnes（GAM-PA）
培養代謝産物の LC-ESI-MS クロマトグラム
GAM 培地 , 嫌気培養 , 35℃ , 10% アセトニトリルから 100% アセトニトリルでグラジエント溶出。縦軸は Total ion count の相対値を示す。横軸は溶出時間。

痤瘡）の原因菌として広く知られるが、近年、前立腺がんよび量の差に起因する可能性がある。実際、細胞毒性が見の原因にもなる前立腺炎、滑膜炎、膿疱症、骨化過剰症、られた濃度は 500 µg/mL と比較的高い濃度であり、また、骨炎症候群、サルコイドーシス（肉芽腫）、坐骨神経痛、イTLC 分析および LC-MS 分析で目立った差異が見られなか

7）

ンプラント関連感染症に関与するとして注目されている 。

ったことから、活性を中心的に担う成分は単離・精製が難そのため、どのような機構が発症に影響するかを明らかしい微量成分であるか、または、特定成分に依るのではなにすることは重要な課題となっている。本研究では、同じく、弱い活性をもつ脂質などの種々の成分の活性が総合的く皮膚常在菌の一つである黄色ブドウ球菌 Staphylococcusに差異となって現れた可能性がある。今後のより網羅的な

aureus と合わせて種々の培養条件で得られる培養抽出物

メタボローム解析手法などにより詳細が明らかになることについてヒト皮膚由来線維芽細胞株 KMST- 6 に対する細を期待する。

胞傷害、LC-ESI-MS による含有代謝物の基礎的解析を行

５. 総った。

括

その結果、種々の培地にて培養産物を得たところ、培地皮膚の表面にはアクネ菌や黄色ブドウ球菌が常在し、皮によって細胞毒性が変化することが示された。例えば、S.

脂などを代謝することで様々な代謝物を産生している。ヒaureus については LB や MH 培地では活性が見られるもの

ト皮膚由来細胞に対する細胞毒性は、これらの微生物の皮の、GAM や BHI 培地では活性が見られなかった。一方、膚に対する炎症などに関係すると考えられ、活性化合物をP. acnes については GAM 培地で活性が見られたものの、明らかにすることは皮膚科学、コスメトロジー研究にとっ他の 3 種の培地では活性が見られなかったことから代謝産て重要であり、創薬標的の発見も期待できると期待される。

物の研究にあたっては培地を含めた培養条件の検討が重要

今回の結果から、抗生物質産生菌に見られるような特定物であることを示している。しかし、GAM 培地の組成には質の産生は見られないか、あるいは微量なため活性本体をLB 培地にも含まれるペプトン類や BHI や MH 培地に含ま明らかにすることが困難な可能性が示唆された。しかし、れるような動物組織由来の抽出物も含まれるなど炭素源やLB 培地での共培養で見られたように単独培養よりも共培窒素源は他の培地と類似しているともとれる。大きな違い

養の方が活性が強く見られた結果も得ており、これら皮膚としてはシステインやチオグリコール酸などの還元性の成常在菌の相互作用について今後の研究に興味がもたれる結分が含まれることから、嫌気的環境が細胞毒性成分の生成果となった。には重要である可能性がある。今回は活性本体の同定には至らなかったが、過去の論文ではグリセロリン脂質やホス（引用文献）

ファチジルイノシトールが、また、同属の P. propionicum

1） Alexandra P, Peter L, Propionibacterium acnes:

からは糖脂質が報告されている 。これら脂質類は一般の

infection beyond the skin, Expert Rev Anti Infect8）

細菌にも見られる膜成分であるが、培養動物細胞の細胞膜

Ther, 9（12）:1149-56,（2011）．doi: 10.1586/eri.11.137.に影響することから細胞毒性成分として同定されることも

2） Allaker RP, Greenman J, Osborne RH, The production

多い。そのため、今回の研究で見出された培養条件の違い

of inflammatory compounds by Propionibacterium acnesによる細胞毒性活性の発現の差異は含有脂質成分の種類おand other skin organisms, Br J Dermatol, 117: 175-183− 82 −

アクネ桿菌（Propionibacterium acnes）などの皮膚常在菌代謝産物の解析（1987）．doi.org/10.1111/j.1365-2133.1987.tb04114.x

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3） Tax G, Urbán E, Palotás Z, Puskás R, Kónya Z, Bíró

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