ラミニン - 5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化
京都大学大学院医学研究科皮膚生命科学講座

宇谷厚志

Laminin α3 chain, a functional key subunit of laminin-5, contains a large globular module (G module) at its
C-terminus, which consists of a tandem repeat of five homologous LG modules (LG1~5). Here, we show that arecombinant α3LG4 and synthetic peptides containing syndecan binding motif within LG4 (A3G756) induced
keratinocytes motility and a MMP-9 expression in keratinocytes. The A3G756-induced cell motility was inhibitedby an MMP-9 inhibitor and a neutralizing antibody of MMP-9, indicating the cell motility was dependent on anMMP-9 activity. In addition, the A3G756-induced cell migration was also abolished by the presence of p38MAPKinhibitor, but not by Erk MAPK inhibitor. Neutralizing antibody to integrin α5 as well as β1 could inhibit A3G756induced cell migration. These data showed that syndecan binding with laminin-5 α3LG4 module induced
keratinocyte migration, which was mediated by a set of molecules such as MMP-9, p38MAPK, and integrin α5β1. These results suggest that the interaction between laminin and syndecan may have a significant role inreepithelialization at wound healing.

１緒

能があまりに明確であるために、かえってマトリックス成言分が細胞を活性化するという面に、関心が低かったと言え

表皮真皮基底膜に接して存在する表皮細胞の「皮膚基底る。それだけに、「基底膜分子が表皮を活性化する」とい細胞層」には、表皮細胞、メラノサイトなどが属する。こうコンセプトは、これから注目を集める分野に成りうるとれらの細胞は、基底膜の細胞外マトリックスに直接結合し考える。ており、マトリックスからシグナルを受け、分化、増殖、２アポトーシス等生物学的活動を調節している。基底膜は表皮幹細胞のいわゆる「ニッチェ」を提供していると考えられる。一般に接着細胞は、その足場を「受容体」で認識し、実験Materials and methods
1 Cell culture

本来の機能を発揮する。皮膚基底膜には、４型コラーゲン、Human primary keratinocytes were purchased

パーレカンをはじめとするプロテオグリカン、ラミニンなfrom Clonetics and maintained in keratinocyte-SFM

どが存在する。これらが、複雑に相互結合し、細胞へのシsupplemented with EGF and bovine pituitary extracts

グナルを調節していると考えられる。その中で、ラミニン（Invitrogen Life Technologies）． Keratinocytes were-5 は、特に皮膚科で精力的に研究されている分子の１つでused at the 2nd 〜 5th passage in the experiments.

ある。角化細胞に対して、ラミニン- 5 は、細胞接着、遊走、分化、アポトーシス等の機能を有し、また癌細胞の転移を2制御する機能もあるなど皮膚科医にとって興味深い分子である。

Recombinant Proteins and Synthetic Peptide
Recombinant α3 LG4-5, LG4 and LG5 modules wereexpressed as a chimera with human IgG Fc portion at

私は、ラミニン -5 の生物学的活性を研究してきており、

the C-terminus and purified as previously described with1, 2）

a minor modification1, 2）. Briefly, recombinant proteins

本研究では、ラミニン - 5 由来細胞接着活性中心を含む合were expressed in 293 T cells by Ca-P transfection

成ペプチドの表皮細胞遊走活性化をマトリックスメタロプ

kit（Invitrogen Life Technologies）．After 24h, cells

ロテイナーゼ産生、MAPK，インテグリンに焦点を当ててwere incubated with CHO medium（Invitrogen解析する。皮膚基底膜は、単なる「構成成分」としての機Life Technologies）for another 2 days, followed by

近年、ヘパリン依存性細胞接着活性中心を同定した。

purification with protein A-Sepharose（AmershamKeratinocyte migration activated bysynthetic peptide containing syndecanbinding site within laminin- 5 α 3LG 4domainPharmacia Biotech）．

3Atsushi Utani
Associate professor, Department ofdermatology, Kyoto University Graduate
School of Medicine

Reagents
An anti-human MMP-9 monoclonal antibody（6-6B）

and a MMPs inhibitor（MMP-9/MMP-13 Inhibitor I,444252）were purchased from Calbiochem.

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ラミニン -5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化

FITC-conjugated anti fibronectin antibody（#4470-2504）

5RT-PCR Analysis of MMP-9was from Biogenesis. MAPKs inhibitors, SB203580

After 24 h stimulation of recombinant proteins orand PD98059, were from Calbiochem. The MMPs andsynthetic peptides, total RNA was prepared from cells byMAPKs inhibitor were dissolved in dimithyl sulfoxide

RNAeasy kit（Qiagen GmbH）． cDNA was synthesized（DMSO）．Heparin was from SEIKAGAKU KOGYO andfrom RNA（2.0 μg）with an oligo（dT）primer in a total

cycloheximide from Sigma Chemical Co. The protein

volume of 21 μl by SuperScriptTM First-Strand Synthesis

concentration is calculated by the BCA Protein Assay

System for RT-PCR（Invitrogen Life Technologies）．
cDNAKit（Pierce）．Purity of proteins was determined by（1 μl for MMP-9 or 0.1 μl for GAPDH）was subjected

reducing 10% SDS-PAGE and Coomassie Blue staining.

to PCR for amplification. In preliminary experiments,

The following function-blocking monoclonal antibodies

we determined the optimal number of cycles within（mAbs）against integrin subunits were used: P1E6

the linearity of reactions for each PCR product. Theagainst integrin α2; P1B5 against integrin α3; P1D6cycle number for MMP-9 was 30 cycles and GAPDHagainst integrin α5; GoH3 against integrin α6. All ofwas 25 cycles. The primers for PCR are: The primers

them were obtained from chemicon, Temecula, CA. Ratfor PCR are: human MMP-9（1715-2129nt, GenbankTM

mAb13 against integrin β1 was a kind gift from Dr. K.

J05070），forward 5'-AAGCTGGACTCGGTCTTTGAG

M. Yamada（National Institute of Dental and Craniofacial

and backward 5'-ACTGCAGGATGTCATAGGTC;

Research, National Institutes of Health, Bethesda, USA）．

human GAPDH (292-885 nt, GenbankTM J04038),
forward 5'-CCCATCACCATCTTCCAG and backward

43）

Colloidal Gold Phagokinetic Assay

5'-CCTGCTTCACCACCTTCT. Using these primers,

Cell migration induced by synthetic peptides was

PCR was performed by the Expand High Fidelity PCR

examined by a phagokinetic track assay, as previouslySystem（Roche Diagnostics）at 94℃ for 4 min followed

described by Albrecht-Buehler. Briefly, cover slips（10by individual cycles at 94℃ for 30 s, 58℃ for 30 s, 72℃ formm in diameter）were dipped in 1 % freshly prepared

1 min with an extension step of 7 min at 72℃ at the end

bovine serum albumin（BSA）in distilled water andof the last cycle. The products were separated on 1.5%

then in 100% ethanol and were quickly dried with aagarose gel. The bands were visualized with ethidium

hair dryer. They were placed into 24-well tissue culture

bromide staining.

plates. The BSA-coated cover slip was covered with
0.3 ml of Gold salt solution（0.01% of formaldehyde was

6Gelatin Zymography

mixed in the solution（10% of 14.5mM HAuCl4, 58% ofKeratinocytes（1.2×10 4 cells in 96-well dishes）wereH2O and 32% of 36.5mM Na2CO3）with boiling.) and leftseeded and incubated for 24h. Cells were starved

undisturbed for 1-2 h to let the gold salt particles settle.

for 24h and treated in 50 μl of fresh medium withFollowing PBS wash, the cover slips were kept at 4 ℃

reagents. Conditioned media were recovered, andin dMEM. Plates were rinsed once with PBS before use.

lyophilized. The lyophilized samples were dissolved in

Approximately 3,000 cells were plated onto the wells andnonreducing sample buffer（6 % glycerol, 1% SDS, andallowed to adhere the cover slips for 30~60 minutes, the0.004 % bromophenol blue），and incubated in 37℃ water

peptide was added to medium to induce migration. Thebath for 10 min. Samples were loaded on a 10% SDS-cells were incubated for 12~24 h, washed and fixed inpolyacrylamide gel containing 1 mg/ml gelatin（BioRad

10% formaldehyde in PBS for 10 min. Three randomlyCo.Ltd.）．The gel was run in Tris/glycine buffer for 2h

selected and non-overlapping fields（x40）analyzed underand then incubated in 2.5 % Triton X-100 solution for 15dark field optics and photographed with a CCD camera

min twice to remove SDS. To detect gelatinase activity,（Model VB7010, KEYENCE）and by a NIH Image 1.60

the gel was incubated in reaction buffer containing 50program. The migration was detected as an area without

M Tris-HCl（pH 7.4），0.2M NaCl, 5 mM CaCl2 and 1

golf particle. The migration index（MI）represented themM ZnCl2 overnight at 37 ℃ . The gelatinolytic activity

ratio of the area consumed by cell migration tracks to awas visualized by staining with 0.1%（w/v）Coomassiewhole area of the field.

Brilliant Blue R-250, 10%（v/v）glacial acetic acid, and30%（v/v）methanol and destaining with 10%（v/v）
acetic acid and 30%（v/v）methanol. Protease activity− 51 −

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was detected as translucent area in a Coomassie blue-

taken by Carl Zeiss LSM510 Confocal microscopy.

stained gel. The scanned results of gels were calculated

３by NIH image 1.60. The values except time course
analysis were depicted as the ratio of the conditioned
media only as a control.

結果・考察

３・１ ラミニン - ５α３鎖の LG4 ドメインは、角化細胞遊走を刺激する。
以前、ラミニン α3 鎖 LG4 に細胞接着活性があること 1）、7Immunostaing

また同部位が MMP-1 分泌を促すこと２）を証明した。本研

HaCat cells（immortalized keratinocytes）seeded on

究において、その活性部位が細胞遊走を刺激するかどうか

poly-D-lysine coated cover glass were fixed with 4%を判定した。はじめにレコンビナント蛋白で LG45 ドメイ

paraormaldehyde/PBS and followed by incubation withンをつくり、培養角化細胞に投与し、その遊走刺激活性をFITC-conjugated anti fibronectin antibody（Biogenesis）

金コロイド法で判定した（Fig. 1A, B）。細胞が動いた部

at 1：200 for 1 h at room temperature. Photograph was

分の金コロイドを貪食するという性質を利用した方法であFigure1 ラミニン α3LG4 はケラチノサイトの遊走を刺激する
A: Keratinocyte migration stimulated by recombinant laminin α3LG4-5 module. Keratinocytes were incubated on gold particle
coated cover slips without (a) or with (b) 10 µg/ml of the rec-LG4-5 module. After 24 hour stimulation, cells were fixed andrepresentative fields were photographed at x 40 under dark field optics.
B: Quantitation of the Phagokinetic track was calculated by measuring the MIs, using NIH Image 1.60. The data presented aremean +/- S. D. of three independent experiments. *, p<0.05.
C: Dose-dependent manner of cell migration activity stimulated by recombinant LG4 modules. Keratinocytes were stimulated
for 24 h. Quantitation of the Phagokinetic track was calculated as above.

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ラミニン -5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化る。この結果 LG4 は、濃度依存性に遊走刺激活性を持つ5 アミノ酸残基ほど C 末にのばした 19mer の合成ペプチことが明らかになった（Fig. 1C）。

ド A3G756 を新たに作成し、活性を証明した（Fig. 2B）。
これらの実験は α3 鎖 LG4 ドメインのシンデカン結合部位

３・２

活性部位マッピング

は、遊走刺激活性を有するということを示している。

LG4 ドメイン（約 200 アミノ酸残基）のうちの活性部

一般に細胞遊走を引き起こす機構は実に数多くの分子が位のマッピングをおこなった（Fig. 2A）。LG4 ドメインを関与している。そのなかでも、細胞外マトリックスと直接カヴァーする 21 個の合成ペプチド 1）を用いて、遊走刺関係している分子として、受容体のインテグリンと細胞周激活性を金コロイド法で計測した。シンデカン結合部位と辺成分を分解することで遊走を引き起こす MMP（マトリして同定した部分（75aR）のみに活性が同定できた。こックスメタロプロテイナーゼ）に注目した。まず MMP かの活性はヘパリン共存により阻害されるので、この活性はら解析を始めた。以前 A3G756 が角化細胞の MMP-1 の産シンデカン依存性であると考えた。水溶性を増すために、生増加を引き起こすことを報告していたため 2）、遊走刺激Figure 2 合成ペプチドを用いた活性部位マッピング
A: Cell migration was stimulated by the synthetic peptides (192 µg/ml) for 12 hour. The
active peptide, A3G75aR- promoting migration was inhibited by heparin (30 µg/ml)(column 75aR-Hep).
B: Keratinocytes were treated with 30 µg/ml of the scrambled peptide (S4) (a) or theA3G756 (b) for 12 hours on colloidal gold coated cover slips, and photographed at x40.

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も逆に活性は減弱した。時間の検討では、ペプチド添加後と代表的 MMP の１つである MMP-9 に注目した。

12 時間でプラトーに達した（Fig. 4AB）。この A3G756 は３・３

A3G756 による MMP-9 産生刺激実験（Fig. 2）より MMP-9 の産生増加を引き起こすので、まず MMP- ２，-9 のタンパク量を、ゼラチンザイモグ化学阻害剤（MMP-9/MMP-13 chemical inhibitor 444252）ラフィーを行った（Fig. 3A）。レコンビナント蛋白（rec-ならびに MMP-9 中和抗体を共存させ、金コロイド法実LG4）、および合成ペプチド（A3G756）で、明らかに濃度験を行った。A3G756 ペプチドによる遊走刺激は中和抗依存性に MMP-9 のみの増加を引き起こした。その増加は、体、MMP-9/-13 に対する阻害剤の共存で完全に阻害できmRNA の増加によるものであり、ヘパリン依存性である

た（Fig. 4C）。この事実は、A3G756 ペプチドは、シンデと共に denovo な蛋白合成を必要とすることが、RT-PCRカンに結合後、遊走を引き起こす機構には、MMP-9 の活にて判明した（Fig. ３B）。

性が必須であることを示している。

３・４ A3G756 ペプチドによる細胞遊走刺激およびその MMP-9 依存性

３・５p38MAPK の関与

この A3G756 は、シンデカンに結合後 p38MAPK をリ

A3G756 ペプチドによる細胞遊走刺激をペプチドによるン酸化することにより細胞内へシグナルを伝達することを遊走刺激活性を金コロイド法で計測した。濃度依存性に遊報告した 2）。そこで、この細胞遊走への MAPK の関与を走を刺激した。ただし 30μg/ ㎖をこえて濃度をこくして検討した（Fig. 4D）。P38MAPK と MEK の阻害剤共存下

Figure 3 ラミニン α3LG4 and A3G756 による MMP-9 の発現増加 .
A: MMP-9 activity induced by the recombinant LG4 modules (left) or the A3G756 (right). Keratinocytes
were incubated for 24 h. MMP-9 in the conditioned medium was analyzed by zymography (Upper). Lower,
pooled results of zymography analysis. S4, scrambled peptide.
B: The A3G756-mediated MMP-9 induction through an increase of mRNA. Keratinocytes were incubatedwith 30 µg /ml of the A3G756 or the S4 peptide in the presence of cycloheximide (CHX) or heparin (Hep).
RT-PCR was performed as described in M&M.

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ラミニン -5α3LG4 由来シンデカン結合ペプチドによる表皮細胞遊走活性化

Figure 4 A3G756 による遊走刺激は MMP-9 と p38MAPK に依存している .
A: Dose-dependent cell migration. keratinocytes were incubated with various amounts of A3G756 for 12 h.
B: Time course of cell migration. Keratinocytes were incubated with 30µg/ml A3G756 (+) or S4 (-) for indicated periods. Data
presented are mean +/- S.D. of three non-overlapped fields from each cover slip.
C: Keratinocytes on gold particle-coated cover slips were incubated with the S4 or the A3G756 peptide (30µg/ml) for 12 h in
the presence of an MMP-9 neutralizing antibody (Ab) (20µg/ml), an MMP-9/-13 chemical inhibitor 444252 (inhibitor), 2mM,or a mouse IgG as a control antibody (IgG) (20µg/ml).
D: Keratinocytes were incubated with 30µg/ml A3G756 in the presence of PD98053 (20µM) or SB203580 (30µM) for 12 h.
The value of the sample incubated with A3G756 was taken as 100%. Data are mean +/- S. D. of three independent
experiments.

Figure 5 A3G756 による遊走はインテグリン α5β1を介している。
A: Keratinocytes were incubated with A3G756 in the presence of functional blocking antibodies. Mouse IgG for control (IgG),
integrin α2 (P1E6), integrin α3 (P1B5), integrin α5 (P1D6), and integrin α6 (GoH3), and integrin β1 (rat IgG2 antibodymAb13). Data presented are mean +/- S.D. of three non-overlapped fields from each cover slip.
B: Fibronectin staining using HaCat cell with Carl Zeiss LSM510 Confocal microscopy. Original magnification, X100.

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で遊走刺激活性測定を金コロイド法で試みた。P38MAPKれる。そこに MMP-9 が何らかのマトリックス蛋白もしく阻害剤を添加した場合に遊走は著しく低下した。このこは細胞表面分子などをプロセスする経路も加わって、遊走とより、A3G756 の遊走刺激活性には P38MAPK が関与が可能になると考えられる。
以上により A3G756 は、19 アミノ酸と短く合成が容易していると示された。RT-PCR の結果から、P38MAPK はMMP-9 の mRNA の増加を阻害することが判明した 。こであり、皮膚へ直接作用させる際にも、工夫しやすいと考の結果から p38MAPK は、MMP-9 転写レベルの抑制によえられる。In vitro の実験である程度分子機構が明らかにり遊走活性を阻害する可能性を示している。

されたと考え、in vivo の動物実験による潰瘍治癒促進効

4）

果の検討を計画している。

３・６integrin α5β1 の関与

これらの実験よりラミニン- 5α3 鎖 LG4 は、シンデカン（文献）に結合することにより細胞遊走を刺激しその際に増加する

１）Utani A, Nomizu M, Matsuura H, et al. A unique

MMP-9 が細胞遊走に必須であることが判明した。そこで、

sequence of the laminin alpha3 G domain binds

細胞遊走の際に必須といわれているインテグリンについて

to heparin and promotes cell adhesion throughその関与を検討した（Fig. 5A）。インテグリン中和抗体をsyndecan-2 and -4. J Biol Chem 276: 28779-28788, 2001

共存下で遊走刺激活性測定を金コロイド法で試みた。結果

２）Utani A, Momota Y, Endo H, et al. Laminin alpha3

は、インテグリン α5β1 の関与が最も考えられた。抗 α5 中LG4 module induces matrix metalloproteinase1

和抗体単独で 100％阻害できないので、他の α 鎖の関与も(MMP1) through MAPK signaling. J Biol Chem 278:

少ないながら存在すると考えられる。抗 β1 抗体では完全34483-34490, 2003に抑制できたので、β 鎖に関しては β1 のみであると考え

３）Albrecht-Buehler G. The Phagokinetic Tracks of 3T3
Cells. Cell 1977, 11 (2), 395-404

られる。
培養ケラチノサイトはファイブロネクチンを培養細胞の４）Momota Y, Suzuki N, Kasuya Y, Kobayashi T,まわりに分泌沈着させている（Fig. 5B）。インテグリン αMizoguchi M, Yokoyama F, Nomizu M, Shinkai H,

5β1 のリガンドは、ファイブロネクチンである事実より、

Iwasaki T, Utani A. Laminin ?3 LG4 module induces

A3G756 による遊走活性には細胞自身が分泌しガラス面にkeratinocyte migration: involvement of matrix

沈着させるファイブロネクチンの存在が必要であり、イン

metalloproteinase-9. J Recept Signal Transduct Res.

テグリン α5β1 を介してのシグナルが必須であると考えら

25:1-17, 2005

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