【研究報告】（自然科学部門）

腸管上皮クローディンバリアに着目した
食物アレルギーリスク評価系の開発

渡利彰

大阪大学大学院薬学研究科生体機能分子化学分野
緒言浩

助教

してマウスやラットを用いた毒性試験や繁殖試験、催奇輸入食品の増加、遺伝子組換え食品の開発、機能性食形性試験などが行われているに過ぎず、食品添加物の安品の需要拡大など国民の食環境は大きく変化し、天然物全性確保に繋がるレギュラトリーサイエンスの科学的知のみならず人工合成した食品を摂取する機会が急増しつ見は著しく不足しているのが現状である。とりわけ、食つある。この腸管粘膜を取り巻く環境の多様化・激変に物アレルギー誘因性は一部の食品添加物に関してのみ直伴い食物アレルギーが増加傾向にあり、小児および成人接的な免疫活性化能が知られているだけで、腸管免疫組の約 10％が食物アレルギーに罹患しており、アトピー織パイエル板（PP）上皮細胞バリアの分子基盤に着目性皮膚炎・喘息の誘因になることも示されている。食物した解析はいまだ皆無である。

アレルギーの罹患期間は 2〜20 年間の長期に亘ること、腸管粘膜は生体内外を隔てるバリアとして機能し、腸社会生活に支障を来すことから、食物アレルギーリスク

管粘膜免疫組織 PP が細菌・微生物等の生体内侵入に対評価法の確立は急務となっている。また、国際的な流通する防御網を構築している。PP は一層の上皮細胞層に網の発達により、食の安全性確保は全世界の課題である

覆われており、上皮細胞層の細胞間隙は密着結合（TJ）

ことは言うまでもないが、食料の約 6 割を輸入に頼り地によってシールされ、通常食物未消化物が非特異的に産地消が困難な本邦の食糧供給体制を踏まえると、ほぼPP 内に侵入することはない。一方、食品および食品を全ての食品に使用されている食品添加物の安全性確保は加工する際に用いられる添加物により TJ シール機能が我が国において最重要課題と言える。しかしながら、食破綻すれば、食物アレルギーの誘因となりうる（図 1）。

品添加物の安全性試験に関しては一部の既存添加物に関

しかしながら、いまだ TJ シール機能に着目した食物ア

図1

腸管上皮腸管上皮バリアと食物アレルギーの関連性1渡利彰

レルギーリスク評価系の構築は皆無である。

浩

かけた。その後、発光量を Tristar LB 941（ベルトール

PP を覆う腸粘膜上皮細胞層に存在する TJ において、ド）により測定した。

中心的な役割を担っているのが膜タンパク質 claudin（CLDN）である。CLDN は分子量〜23 kDa の 4 回膜貫結通蛋白質であり、現在までに 27 種類の分子種が見出さ

1.

1）

果
CLDN-2 プロモーター領域のクローニングれている 。さらに CLDN の発現およびバリア機能にはCLDN-2 レポーター遺伝子を作成するため、UCSC プ

組 織 特 異 性 が 知 ら れ て お り、 腸 管 上 皮 バ リ ア で はログラムを利用し、CLDN-2 の発現調節領域を決定しCLDN-1, -4, -5 がバリアを強める作用、CLDN-2 がバリた。本プログラムにより CLDN-2 ゲノム領域周辺においアを弱める作用を有している。つまり、腸管上皮細胞にて進化的に保存された領域を調べた結果、CLDN-2 のおいて CLDN-1, -4, -5 の発現低下、もしくは CLDN-2 のmRNA をコードしている領域で高い保存領域を確認し発現上昇が引き起こされると腸管バリア機能が破綻し、た以外に、CLDN-2 転写開始点の周辺約 1000 bp におい

腸管内から非特異的に物質が流入することで食物アレルて保存領域を確認した。続いて、CLDN-2 プロモーターギーが惹起されると考えられる。これらの腸管上皮バリ領域における転写因子の結合モチーフを調べた結果、

ア制御機構に着目し、筆者はすでに CLDN-4 バリア制御

AP-1 や E-box モチーフが存在することが認められた。

2）活性解析系を確立しており 、バリア制御活性を有する

そ こ で、Caco-2 細 胞 か ら 細 胞 DNA を 精 製 し、 こ の食品添加物の同定に成功している。本研究では、腸管でDNA を鋳型として PCR により CLDN-2 プロモーター領の炎症により発現上昇が認められる CLDN-2（バリアを域を増幅した。レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ弱める作用を有する）に着目し、CLDN-2 バリア制御活遺伝子を用い、上流に増幅したCLDN-2プロモーター領域性を示す食品添加物の迅速かつ簡便なスクリーニングシを挿入することで CLDN-2レポーター遺伝子を作製した。

ステムを構築することで、腸管上皮 CLDN バリアを指CLDN-2 レポーター遺伝子を安定的に発現した細胞を標にした食物アレルギーリスク評価系の構築を目指した。

作製するため、ヒト結腸腺癌細胞株 HT29 にレポーター遺伝子を導入し、薬剤選択を行うことで CLDN-2 レポー

実験方法
1.

ター遺伝子を発現させた細胞を 21 クローン単離した。

CLDN-2 の転写調節領域の決定中でも比較的ルシフェラーゼ活性の高い細胞株を選択し、以下の実験に用いた。

CLDN-2 の転写調節領域を決定するため UCSC ゲノムブラウザを利用した。CLDN-2 のゲノム領域周辺で進化

2.

的に保存されている領域として、CLDN-2 転写開始点を含Snail を用いた CLDN-2 レポーター遺伝子の検討
CLDN の発現は、様々なシグナル伝達因子や転写因子

む約1000 bpの領域をCLDN-2プロモーター領域とした。

により制御を受けていることが知られている。中でも2.

CLDN-2 レポーター遺伝子発現ベクターの作製

Snail は CLDN の発現抑制因子として多くの報告が存在

CLDN-2 プロモーター領域下にルシフェラーゼ遺伝子する3）。Snail は上皮間葉転換（EMT）を誘導する主要を搭載した CLDN-2 レポーター遺伝子ベクターとしてな転写因子として働くことから、EMT を誘導する際、pGLCLDN2p を作製した。ヒト腸管上皮細胞株である上皮細胞特有の様々な細胞接着因子の発現を調節するこ

Caco-2 細 胞 か ら 細 胞 DNA を 精 製 し、PCR 法 に よ りとが知られている。Snail が発現調節する細胞接着因子

CLDN-2 プロモーター領域をクローニングした。作製しの 中 に は CLDN フ ァ ミ リ ー も 含 ま れ、Snail は CLDNたベクターは制限酵素解析とシークエンス解析を行うこファミリーの転写調節領域に結合することで発現抑制にとで pGLCLDN2p を得た。

関 わ る こ と が 報 告 さ れ て い る3）。 そ こ で、CLDN-2 レポーター遺伝子が Snail により誘導される CLDN-2 の発

3.

ルシフェラーゼアッセイ

現 抑 制 作 用 を モ ニ タ ー で き る か を 検 討 し た。 ま ず、HT29 細胞を 96 well プレートに播種し、CO2 インキュSnail が誘導する CLDN-2 の発現変化を HT29 細胞においベータにおいて培養した。翌日、培養液を除去し、PBSて 検 証 し た。HT29 細 胞 に Snail 遺 伝 子 を 発 現 さ せ、100 μL で 2 回 wash した後、ピッカジーン LT 2.0（東洋CLDN-2 の発現をリアルタイム PCR により検討した。

インキ）を 100 μL/well 加え、30 分間室温にて shaker に

その結果、snail 発現量依存的な CLDN-2 発現の低下が2腸管上皮クローディンバリアに着目した食物アレルギーリスク評価系の開発確認された（図 2A）。続いて、Snail が誘導する CLDN-2

最 初 に、TNF-α が 誘 導 す る CLDN-2 の 発 現 変 化 をの発現低下を CLDN-2 レポーター遺伝子がモニターできHT29 細胞において確認した。HT29 細胞に様々な濃度るかを検討した。HT29/CLDN2p 細胞に snail 遺伝子をの TNF-α を添加し、CLDN-2 の発現量をリアルタイム導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した結果、Snail 発

PCR により検討した。その結果、TNF-α の濃度依存的現量依存的なルシフェラーゼ活性の低下が確認されたに CLDN-2 の 発 現 が 上 昇 す る こ と が 確 認 さ れ た（図（図 2B）。 以 上 の 結 果 か ら、 作 製 し た CLDN-2 レ ポ ー3A）。次に、TNF-α が誘導する CLDN-2 の発現上昇をター遺伝子は Snail が誘導する CLDN-2 の発現低下と相関

CLDN-2 レポーター遺伝子がモニターできるかを調べしたレポーター活性を有していることが明らかとなった。

た。HT29/CLDN2p に TNF-α を添加した後、ルシフェラーゼ活性を測定した結果、TNF-α の添加量依存的にTNF-αを用いた CLDN-2 レポーター遺伝子の検討

ルシフェラーゼ活性が上昇することが確認された（図-α は食物アレルギー
Tumor Necrosis Factor（TNF）

3B）。以上の結果から、作製した CLDN-2 レポーター遺発症時に上昇する炎症性サイトカインの 1 つであり、伝子は TNF-α により誘導される生理的な CLDN-2 の発3.

4）

CLDN-2 の発現上昇を誘導することが知られている 。

現変化と相関したレポーター活性を有していることが明

そこで、TNF-α のような生理的な刺激による CLDN-2らかとなった。
以上の結果より、作製した CLDN-2 レポーター遺伝子の発現変化を、作製した CLDN-2 レポーター遺伝子がモは、snail や TNF-α による CLDN-2 の発現調節と相関しニターできるかを検証した。

図2

Snail 遺伝子発現による CLDN-2 レポーターシステムの評価

A. Snail 発現量依存的に CLDN-2 発現が低下した。CLDN-2 遺伝子発現はリアルタイム PCR により評価した。B. Snail 発現量依存的に
CLDN-2 レポーター活性が低下した。

図3

TNF-α による CLDN-2 レポーターシステムの評価

A. TNF-α 添加量依存的に CLDN-2 発現が上昇した。CLDN-2 遺伝子発現はリアルタイム PCR により評価した。B. TNF-α 添加量依存
的に CLDN-2 レポーター活性が上昇した。
3渡利彰

浩

たレポーター活性を示したことから、CLDN-2 のレポー物の腸管上皮バリアへの影響を包括的な CLDN バリアター遺伝子として妥当であると判断した。

活性を指標に評価する系を構築しようとするものであるが、本評価系は、食品添加物による食物アレルギー誘因

CLDN-2 発現制御因子のスクリーニング

4.

性評価系としての側面のみならず、遺伝子組換え食品成樹 立 し た HT29/CLDN2p 細 胞 が よ り 広 範 な CLDN-2分、有害微生物、カビ毒素、残留農薬、残留性金属・有発現制御因子による CLDN-2 発現変動をモニターできる機化合物（食品製造工程で使用する機器成分等）など食

か ど う か を 確 か め る た め、2430 種 の 化 合 物 ラ イ ブ ラ

品中に含まれる可能性のあるあらゆる物質による腸管上リーから CLDN-2 発現変動を誘導する化合物のスクリー

皮バリアへの影響を検知できる評価系となりうる発展性ニングを試みた。その結果、複数の CLDN-2 発現制御化を秘めている。したがって、本研究において開発を試み合物の同定に成功した。

た食物アレルギーリスク評価系は次世代の食品の安全性を確保するためのリスク管理・評価に向けたレギュラト

考察

リーサイエンス確立に資するものと考えられる。

本研究では CLDN-2 バリアに影響を及ぼす可能性のあ要る食品添加物の迅速かつ簡便なスクリーニングシステム

約を構築することを目指し、CLDN-2 発現モニター細胞の本研究は、腸管での炎症により発現上昇が認められる樹立を試みた。進化的に保存された CLDN-2 プロモー

CLDN-2 に着目し、CLDN-2 バリア制御活性を示す食品ター領域をクローニングし、本領域における CLDN-2 発添加物の迅速かつ簡便なスクリーニングシステムとして

現 モ ニ タ リ ン グ 能 を CLDN-2 発 現 低 下 活 性 を 有 す る

CLDN-2 レポーターシステムを構築し、本システムによsnail および CLDN-2 発現亢進作用を有する TNF-α を利りこれまで CLDN-2 発現制御能が未知であった因子を同用して検証した。その結果、両者による CLDN-2 発現制定することに成功した。本システムを利用することで、御活性と相関したレポーター活性を示すことが明らかと

CLDN-2 の発現変動を誘発する可能性のある食品添加物なったことから、確立した CLDN-2 レポーターシステムの同定が可能であると考えられる。

により CLDN-2 発現がモニター可能であると判断した。
謝

続いて、より広範に CLDN-2 発現に影響を及ぼす因子の辞
本研究を遂行するにあたりご支援を賜りました公益財

モニタリングに対応可能かを検討するため、2430 種の団法人三島海雲記念財団に深謝いたします。

化合物ライブラリーを利用し、CLDN-2 発現に影響を及ぼす化合物のスクリーニングを行った結果、新規の文

CLDN-2 発現制御化合物の同定に成功することができた。この結果は、本 CLDN-2 発現レポーターシステムが献

1） A. Tamura, S. Tsukita:, 36, 177–185, 2014.
2） A. Watari et al.:
, 426（4）,454–460, 2012.
3） F. Carrozzino, et al.:
, 289（4）,C1002–C1014, 2005.
4） Y. Amoozadeh et al.:
, 309（1）,C38–C50, 2015.

CLDN-2 発現に影響を及ぼす未知の因子が同定可能であることを示している。したがって、本システムを利用することで、CLDN-2 の発現変動を誘発する可能性のある食品添加物の同定が可能であると考えられる。
本研究は、現在の食品において必要不可欠な食品添加4