不飽和脂肪酸とその過酸化生成物の皮膚角質層への作用に開する研究大阪薬科大学森

本一

洋Effects of unsaturated straight-chain fatty acid and its oxidized products on skin stratum
corneum were examined using rat skin permeation of drugs in in vitro and FT-IR method. We
investigated that the effects of pretreatments of high purity oleic acid and its oxidation productson the permeations of indomethacin, as relatively lipophilic compound and 6-carboxyfluorescein(6-CF),as hydrophilic compound through rat skins. The skin permeations of indomethacin and6-CF were very low (duffusivity;2.3 x 10-6 and 0.19 x 10 -6cm'/h, respectively). Permeations ofindomethacin and 6-CF were significantly increased by prepreatment with oleic acid or its firstand second oxidation products.
The frequency of the asymmetric CH bond stretching a bsorbance (2919cm-I ) on FT-IR spectraof stratum corneum was shifted to higher wavenumber (7.5cm-I) by the treatment of high purity
oleic acid. Therefore, the perturbation increase of lipid domain in stratum corneum by oleic. acid
The degree of shift was decreased by first and second oxidized products of oleic acid. On the otherhand, the frequency of the a-helix NH deformation of amidell (1548cm-1) on FT-IR spectra ofstratum corneum was shifted to higher wavenumber·(2cm-1) by the treatment of high purity oleicacid. The shift significantly increased by first oxidized product with highest peroxide value(85.7meq/kg). Therefore, keratin cell in stratum corneum should be affected by first oxidized
product with high peroxide value.

緒の吸収促進剤が見出されているが、 それらの吸収言促進剤の実用化には皮屑刺激性、安全性などが問
経皮吸収型製剤は薬物の全身治療を目的とした題となる 2 〉 。 オレイン酸などの不飽和脂肪酸類は新しい投与剤形として期待されている。 しかし、高い薬物の皮盾透過促進効果を示すことが知られ皮盾の最表面に存在する角質層はケラチン、紬維ているが、 これらは生体由来物質であることより状たん白、 さらにはセラミトや中性脂質より成り実用化が期待されている(Fig. 1)、 体内からの水の蒸発や外部からの物質以上）のオレイン酸が開発されているが、 一般的｀3)。 最近、 高純度(99%の侵入に対し強いハ リア ー として機能している。に市販オレイン酸は酸化物を含み、 また酸化されしたがって、 この角質層は皮府表面からの薬物のやすい欠点を有している。 したがって、 これらの。 現在、 薬物の皮府吸収促

酸化生成物の皮附への影響を調べることは重要で進に関する様々な研究が進められており、 数種類ある。 本研究では、 高純度オレイン酸、 酸化生成

吸収バリアーとなる

1)

段階の異なる酸化物を含むオレイン酸による薬物の皮膚透過促進効果および皮膚角質層（ケラチノ
Effects of Unsaturated Fatty Acid and its Oxidized
Products to Skin Stratum Corneum

サイトおよび脂質層）への影響について検討した。

Kazuhiro Morimoto

ステロイド系消炎剤であるインドメタシンおよびOsaka Universityof Pharmaceutical Sciences

皮膚透過の検討には脂溶性モデル薬物として非水溶性モデル薬物として6ー カルボキシフルオレセイン(6-CF)を用いた。 皮膚角質層への影響はフーリエ変換赤外分光法(FT-IR)により解析した。

-91-

KERATIN IS EDCELLCeramide
Route of Drug Permeation through Human Stratum Corneum

Fig. 12方1>

cycloheptan-2-one)は Nelson 社のものを使用した。

法

モデル薬物としては、 インドメタシンと 6-CF
2-1

は Sigma 社のものを使用 した。 吸収促進剤溶液

材料および試料の調整はプロピレングリコ ー ル (PG) またはプロビレン

吸収促進剤としては、 高純度オレイン酸 (E0-99酸化生成物を含むオレイン酸 (Table 1)

グ リコ ー ル (PG)/ エタノ ー ル (EtOH) (l/2) 混は日本油脂（株）のものを、 Azone (1-dodecylaza

液に溶解させ調製した。 製剤は水に溶解させた; 99. 9%) 、

Table 1

Peroxide values and carbonyl values of oleic acids of various grades

High Purified Olelc Acid
E0-99 (99.9%) a)
E0-90 (90%) a)
Low Grade Olelc Acid
LL(60%) a)

peroxide value(meg/kgl

゜

carbonyl value (meq/kg)
total
saturated 11nsaturated
0.3

゜

0.3

0.1

0.8

0.1

0.9

1.7

6.9

0.9

..7.8-92-534534．．
．．．．
385928242336

Oxidized Olelc AcidFirst Oxidized b)
SO-L
48.7
5.4
20.0
SO-H
5.4
27.4
12. 1
30.5
47.5
PO-L
1.8
85.7
3.7
PO-H
64.7
Second Oxidized c)
0.6
SO-LRO
23.5
0.4
SO-HR
46.9
1.5
al.P urity of olelc acid(mol%)b ) O;! bubbling(1 oo ° C) treated high purity olelc acld(E0-99)c ) Heat(200 ° c treated first oxidized olelc acid)イ淋包和脂肋峻とその過酸化生成物の皮Jill'角質脳への作用に関する研究

3Carbopol 1342 (1%w/w) にPG (12%w/w)および

結果および考察EtOH(24%w/w)を加えて製したゲル基剤 中に薬物( 0 .5mg/g)を溶解させ、 アンモニア水を加え3-1 皮膚透過性pH7.
0とすることにより調製した。

高純度オレイン酸(E0-99)と強制酸化物を含むオレイン酸のインドメタシンと6-CFの皮膚透過に

2 -2

In Vitro皮膚透過実験及ぼす影響について検討した。

除毛したWist ar系雄性ラット（体重200-250g)

Fig. 2 には高純度オレイン酸 (E0-99)と強制1次の腹部摘出皮府表面を 吸収促進剤溶液で 前処理酸化したオレイン酸(SO-L, SO-H, PO-L, PO-H)に(1時間）し、 その前処理液を 皮盾表面から取り除よる インドメタシンと6-CFの皮膚透過促進効果をいた後、薬物の皮盾 透過実験に 用いた。透過実験示した。インドメタシンの皮膚透過におけるこれ4)。インらの促進効果は、 E0-99< SO-H<PO-L く SO-L くドメタシンはHPLC 法、 6 CFは蛍光光度法 により定PO-Hの順に高いことが認められたが、 E0-99と量した。

強制1次酸化したオレイン酸の透過促進効果の間にはFranz型拡散セル(37℃)を用いたには有意差は認められなかった。6-CFの皮屑透過2-3におけるこれらの促進効果は、PO-L く E0-99<PO­

FT-IRによる皮膚角質層の解析

白色ウサギ（体重約2kg) の耳から剥離した

H<SO - H<SO-Lの順に高いことが認められた。

皮膚角質層を用いた。吸収促進剤溶液で表面を処E0-99と強制1次酸化したオレイン酸の透過促進理(2時間）した 皮膚角質層を FT- IR (P arkin

効果の間には有意差は認められなかったが、酸化Elmer,1720X)を用い測定しFT-IRスペクトルを得過程の中間体であるSO-Lの6-CFへの吸収促進効果た。
光源にはHe: Neレー ザ ー (0.633µm)を使用の高いことが示された。

し、出力は400m Wとし、 分解能2cm―I、 積算回数100回、 室温で測定した。
5306-carb oxyfl u orescel nlndomethacln

48Fig.2゜2゜゜

2103OE 』ad880 P % ) UO IICD―O ! maE [ad(ilBO P % ) LI

2010642010864Time (h)Time (h)Effects of pretreatments of oleic acids·(0.2%) containing first oxidation
products on the permeations of indomethacin and 6-carboxyfluorescein throughrat skins.
0 Control, High Purity Oleic Acid (● E0-99)
First Oxidized Oleic Acid (D SO-L, ● SO-H, △ PO-L, ▲ PO-H)
Each point represents the mean 土S .E. of 4 experiments.
-93-5306-ca rboxyfl u oresce Inlndomethacln

432』

108゜2゜゜Fig. 3asop%)uoneaE ad(adeaEJ―aSOP%)UOI(201064
20·10
864Time (h)Time (h)Effects of pretreatments of oleic acids (0.2%) containing first oxidation
products on the permeations of indomethacin and 6-carboxyfluorescein throughrat skins.
0 Control, High Purity Oleic Acid (● E0-99)
First Oxidized Oleic Acid (口SO-L, ● SO-H, △ PO-L, ▲ PO-H)
Each point represents the mean 士S.E. of 4 experiments.

Fig.3には高純度オレイン酸(E0-99)と強制2次を用い 、 細 胞 間 隙 脂 質 C H 2逆 対 称 伸 縮 振 動

酸化したオレイン酸(SO-LRはSO-Lを2次酸化した(2919cm I付近）由来の波数のシフトにより評価しもの、SO-HRはSO-Hを2次酸化したもの） によるイた 5) 。赤外吸収の波数は脂質流動性の上昇に伴いントメタシン と6-CFの皮膚透過促進効果を示した。

高波数側にシフトすることが報告されている。まインドメタシンの皮府透過におけるこれらの促進

た、皮府角質層のたん白変成はa-helixのペプチ

効果ば、 SO-HR< E0-99< SO-H< SO-LくSO-LR のlト 結合のN-H deformation (1548cm 付近）由来の順に高いことが認められたが、E0-99と強制2次酸波数のシフトから評価した。 ウサギの耳の皮膚角化したオレイン酸の透過促進効果の間には有意差

質層のFT-IRスペクトルをFig. 4に示した。

――‘―Iは認められなかった。6-CFの皮膚透過におけるこ細胞間隙隙脂質C比逆対称伸縮振動(2919 cm

れらの促進効果は、 SO-HR< E0-99< SO-H< SO­

付 近 ） 由 来 の 赤 外 吸 収 は 、 高 純 度 オ レ イ ン酸

LR< SO-Lの順に高いことが認められた。 E0-99(E0-99)の処理によりコントロ ー ル(PG処理）にと強制2 次 酸化したオレイン酸 の透過促進効果

比べ高波数側に約7. 5cm 1、ンフトした。たん白―の 間には有意差は認められなかったが、 強制2の a-h e lixのペプチド結合のN-H deformation

次酸化物の6-CFへの透過促進効果は減少した。

(1548cm I 付近）由来の赤外吸収も高純度オレイン―酸(E0-99)の処理によりコントロ ー ル(PG処理）
3-2

FT-IRによる皮懇角質層の解析に比べ高波数側に約2 cm―lシフトした。 オレイ

皮岡角質層の細胞間隙脂質流動性 と細胞実質のン酸並びにAzoneで処理した皮門角質層の脂質CH2

たん白の立体構造に及ぼす高純度オレイン 酸

逆対称伸縮振動 、並びにたん白のa-helixのペプ(E0-99)、強制酸化したオレイン酸 、Azoneの影孵

チド結合のN-H deformation(l548cm l付近）由を検討した。皮膚角質層の細胞間隙脂質流動性は、

来の赤外吸収の波数をTable 2に示した。

―

角質層のFT-IR スペクトル からGolde n らの方法

-94-

c-c二重結合を有するオレイン酸の2次酸化物でィ�fi糾和脂肋俄とその過醸化生成物の皮I青角質Jfliへの作用に関する研究、N-H deformation

CH2 asymmetric stretching

A11sua UJ

一hl!
SU.I
IUIAl!S U a lua)b)

....

....

，．．．

，．ヽ.

""

1600
1800
1400
1200
Frequency(cm- 1)

1000

800

Frequency(cm·1)

2800

3200

Fig.4

2400

2000，．．．

a)b)Frequency(cm·1 )

600

400

FT-IR spectra of stratum corneum of rabbit ear skins over the―Irange 400-3200cma) treatment with 0.2%b)high purity oleic acid (E0-99)

treatment with solvent(PG)

ある不飽和カルボニルに着目しその角質層細胞間来の赤外吸収はコントロ ー ル(PG処理）に比べ高波隙脂質流動性に与える影響を評価した。 Fig. 5 に数側にシフト（約 7. 5cm示すように高純度オレイン酸の処理により細胞間オレイン酸の不飽和カルポニル価の増大に伴い低隙隙脂質 CH2 逆対称伸縮振動 (2919cm

Table 2―lof N-H deformation of amideIIfrom proteins and CH,

from lipids of stratum corneum of rabbit ear skins
N-H deformatlon(Protelns)
Frequency(Sh 1ft I n\'.I)
1546.00%0.12(0.00%0.12) b)
Control (PG)
High Purity Olelc Acid
E0-99(0.2%)
1548.10ェ0.10(2.10±0.10)8)First Oxidized Olelc Acid
1547.40±0.27(1.40±0.27)8)
so・L(0.2%)
SO-H (0.2%)
1547.95五0.03(1.95,,0.03)8)

PO-L(0.2%)
1547.55±0.71(1.55±0.71)8)
PO·H(0.2%)
1550. 04ェ0.89(4.04±0,59)B)b)
Second Oxidized Olelc Acid
1548.35x0.22(2.35,,0,22)8)
SO-LR(0.2%)
AZONE (0.2%)) した。

この効果は、下し、 その値が12meq/kg と 2 次酸化の進んだ SO-H付近）由Effects of treatments with oleic acids and Azone on FT-IR

SO-HR(0.2%)―l1547.85±0.12(1.85土0.12)8)
1553.83,,0.23(7.83±0.23)a)b ))asymmetric stretching

CH2asymmet.r lc (Llplds)
Freq uency(Shlftlnq)
2918.00x0.40(0.00ェ0.40)b )292 5.SOct0.33(7.50ェ0.3 3)3)
2923.33±1.20(5.33±1.20)8)
2921.GB_ct0.61(3.68辺.61)a) b)
29.25.45,e0.92(7.45±0.92)3)
2924.54ct1 .30(6.54ェ1.30)3)

2926.95±0.15(8.95x0.15)a) b)

2924.45,eQ,66(6.45±0.66)3)
2923.83,e0,69(5.83±0.69)3)

Shlftlng=frequency shifting from control(treatment with PG)a)Slg nlflcant In comparison with c o ntrol (p<0.05)b )Slgnlflcant In c omparison with high purity olelc acid ( E0-99 ;0.2%) (p<0.05)
Each point represents the mean ±S .E.of 4experiments .

-95-―1frequency(cm――108642E ov )(L,uenbe 』L::,4S ..{6u1 !

0•2゜

515

10

Unsaturated Carbonyl Value(meq/kg)

Relationship between unsaturated carbonyl value of ole1c
acids and CH, asymmetric stretching frequency(IR) ofstratum corneum of rabbit ear skins
0 Control(PG), High Purity Oleic Acid(● E0-99)
First Oxidized Oleic Acid('[コ SO-L, • SO-H, △ PO-L, ▲ PO-H)
Each point represents the mean 士S. E. of 4 experiments.

Fig.5

では高純度オレイン酸に比べ有意に低波数側にシ吸収の波数のシフトとオレイン酸の過酸化物価の―フ（約4cm l )した。

関係を示した。 たん白のa-helixのペプチド結合―のN-H deformation (1548cm I付近）由来の赤外吸

一方、Fig. 6にたん白のa-helixのペプチド結―合のN-H deformation (1548cm l付近）由来の赤外収も高純度オレイン酸(E0-99)の処理によりコ

一5▲
—32

゜

Fig.6T•4(L •E OV )uenbeJ::1,S .<:6C IU!IIー゜

2040

60

80

100

Peroxide Value (meq/kg)

Relationship between peroxide value of oleic acids and shiftingof N-H deformation frequency(IR) of stratum corneum ofrabbit ear skins
0 Control(PG), High Purity Oleic Acid(● E0-99)
First Oxidized Oleic Acid(口SO-L, ■ SO-H, △ PO-L, ▲ PO-H)
Each point represents the mean 士S.E. of 4 experiments.

-96-ィ＜胞和脂肪酸とその過酸化生成物の皮Ii! 角質層への作用に関する研究―l

ントロ ー ル(PG処理）に比べ高波数側に約2cmレイン酸(1次、2次）によるインドメタシン並びシフトした。 高純度オレイン酸と過酸化物価が約にCFに対する経皮吸収促進効果には有意な差は認50meq/kgまでのものとたん白のa-hel ixのペめられなかった。 これは強制酸化物は酸化過程でプチド結合のN-H deforma tion(1548cm-1付近）

オレイン酸とその酸化物を共存するために、薬物由来の赤外吸収のシフトの間には有意な差は認めの経皮吸収促進効果には直接的に影態しなかった

られなかった が、 過酸化物価が80meq/kgと酸と考えられる。

化が進んだオレイン酸(PO-H)では有意に高波数側ヘシフト（約4cm-1)した。

参考文献

以上、FT-IR スベクトルの解析から高純度オレイl)B. W. Barry,

ン酸で処理をした場合、インドメタシンの主な透(1987)

過経路と考えられる細胞間隙脂質の流動性が上昇}. Controlled. Relea,se.,

6 85-972)橋EEi充、岡本浩一、経皮吸収の改善、瀬崎仁編することが認められ、その流動性の上昇効果はオ“医薬品の開発

レイン酸の2次酸化物である不飽和カルボニルの”第13巻、87-133頁、広） 11書店

(1987)増加に伴い減少させることが示唆された。 オレイ3)M. L. Fran coeur, G. M. Golden, R. 0. Potts, Pham.

ン酸と比較して、鎖長の短い不飽和カルボニルがRes., 7 621-627(1990)

細胞間隙脂質構造を乱すと考えられる。 一方、高4)K. M or imo to,

A. Na g a y a su, S. Fu k a n oki,

純度オレイン酸の処理により CFの主な透過経路と

K. Morisaka, S. H. Hyon, Y. Ikada, Drug. Dev.

考えられる角質層実質細胞のたん白の構造変化がInd. ?harm., 16 13 -29(1990)

FT-IR スペクトルの解析から認められ、 1 次酸化し5)G. M. Golden , J.E. Mckie, R. 0. Potts, }. Pham.

たオレイン酸はさらにその変化を増加することがSci., 76 25-28(1987)

認められた。 高純度オレイン酸と強制酸化したオ-97-