ミルクタンパク質からなる無機有機ハイブリッドナノスフェアの創製

慶應義塾大学大学院理工学研究科

藤 本

基礎理工学専攻生物化学専修

啓 二Nanoparticles composed of biopolymers have received much attention as a useful material applicable to a varietyof industrial fields. We focused on casein proteins, which are associated and assembled into an organic and inorganic
supra-structure. We could prepare nanoparticles of beta-casein coupled with polyethylene glycol (PEG) by changing pH,
2+temperature, and Ca concentration. Since the obtained nanoparticles were soluble at body temperature, we tried to produce
calcium phosphate as a cross-linker in a nanoparticle. The obtained particles had a diameter of approximately 100 nm at pH
7.4 and kept stable over a wide range of temperature. Phosphorous could be detected inside the nanoparticle with XPS andEDX measurements. It was also found that nanoparticles were disrupted by lowering pH from pH 7.4 to 4.0.

１．緒

オンを添加して、カゼイン内に含まれるカルシウムイオン

言と反応させることで粒子内にリン酸カルシウムを析出させ

バイオポリマーは生体適合性に優れたものが多く、そのた。得られたナノ粒子はリン酸カルシウムが架橋点としていくつかは温度、pH など生体内環境によって構造を変化働き、PEG 鎖が分散安定性を付与することになる（ナノスさせることができる。牛乳中にはバイオポリマーであるタフェア）。最後に、作製した粒子に DDS キャリアに向けたンパク質が約 3 . 2％含まれており、近年これらを食品以外モデル薬物の封入と放出の最適化を行った。の分野における素材として利用することが注目されている。

２．実

多種類の牛乳タンパク質の中で主要なものにカゼインがあ験る。牛乳タンパクであるカゼインは牛乳中で 100nm スケ

まず、修飾を施していない bカゼインの基礎的性質であールのミセルを形成しており、このミセルには主に a カゼる会合挙動を詳しく研究した。すなわち、b カゼイン水溶液

イン、b カゼインが含まれている。本研究では、ミセルをの透過率および散乱強度測定により、pH、温度応答性お形成するカゼインのうち、b カゼインに着目した。b カゼ

よび Ca 濃度による b カゼインの会合力の変化を観察した。

インは生体適合性、生分解性に加え、アミノ基を数多く持

これらを踏まえて、分散安定性の付与とナノ粒子化の制つため、化学修飾が容易に行えるという利点がある。さら御を目的として、urea により鎖状にした bカゼインの NH2に b カゼインは pH や温度、Ca 濃度によって特徴的な会基に polyethylene glycol（PEG）を化学修飾させることに合挙動を示すバイオポリマーである。化学修飾により会合よって試みた。PEG 修飾後に urea を取り除き、温度と pH挙動を制御することで、生体適合性に優れた DDS キャリを変化させることにより PEG - b カゼイン粒子を作製した。

アとなるナノ粒子を作製することができる。本研究では、続いて、生体内の pH 条件においても粒子形状を維持さ抗がん剤のターゲティングを目指し、正常血管では漏出しせるため、Ca を添加することで PEG-Ca b カゼイン粒子にくい化合物が腫瘍血管では漏出しやすく腫瘍部位に滞留を作製した。

2+2+2+しやすいといった EPR 効果の利用を狙い、100nm スケールの粒子の作製を目指した。

2+

さらに Na2HPO4 および KH2PO4 を加えることでリン酸カルシウムとbカゼインの複合化を試み、有機無機ハイブリッ

図１にデザインコンセプトを示す。はじめに bカゼインドナノ粒子（Calcium phosphate-PEG-bcasein nanoparticle, ナを尿素を用いてランダムコイル状態に変化させて、アミノスフェア）を作製した。複合化の際にキレート剤を用いるノ基を介して PEG 鎖を化学修飾する。次に、カルシウム

ことにより、PEG-Ca bカゼイン水溶液に存在するCa を除イオン存在下で urea を透析によって除去することにより、去し、Na2HPO4 およびKH2PO4 との沈殿物を生じさせないよ

100nm スケールの粒子を形成させた。その後、リン酸イうにした。

2+

2+

また、作製したナノスフェアに対し、組成分析、形態観察、二次構造の分析、表面電荷測定、および内部環境評価
Preparation of inorganic-organic hybrid
nanoparticles by chemical modificationof milk protein, casein
Keiji FujimotoGraduate School of Science and technology,Keio Universityによるキャラクタリゼーションを行った。なお、この際リン酸カルシウムと複合化させない粒子（PEC 粒子）を作製し、ナノスフェアの挙動を比較した。その後、リン酸カルシウムの低 pH にて溶解するといった性質を考慮し pH 応答性を検討した。

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図１

カゼインから作る無機有機ハオブリッドナノスフェア

図２

カルシウムイオンによるβカゼインの会合挙動の変化

生体内環境を考慮した外部環境の変化に対するナノス

よって二次構造が崩れ、変性したまま疎水性結合して、よフェアの変化を観察として、この場合には pH の変化により巨大な凝集体を形成すると考えられる。これより、b カるナノスフェアの崩壊性について粒子サイズの変化を測

ゼインをナノ粒子として使用するためには、まず水中での定することにより検討を行った。さらに、モデル薬物と安定性を上げるような改質を施す必要がある。
2+して正電荷を帯びた 6-methoxy-N-ethylquindinium iodide

b カゼインは、4℃では 400mM の Ca が存在しても沈（MEQ）を用いて、透析法によりナノスフェアへの取り込殿しないが、37℃では 8 〜 15mM の Ca で沈殿する。こみ挙動を MEQ の蛍光強度変化から検討した。次に、MEQのように Ca を加えると凝集しやすくなることが知られの放出実験を行うために、凍結乾燥させたナノスフェアている。よって本研究では、加えた Ca の量と温度によに対し、MEQ 溶液を 4℃にて 3 日間浸透させた。未封入のる b カゼインの会合挙動の関係を求めた。pH7.4 の条件下

MEQ を限外ろ過にて除去した後に、CAPAC 粒子から放で 1000 ppm の b カゼイン溶液に Ca を添加して検討を行出された MEQ 濃度の経時変化を蛍光光度計で測定した。

った。図２に示すように b カゼインのみの溶液では温度2+2+2+2+2+による透過率の変化は見られないが、Ca の存在下では

３．結果および考察

温度を上げるにつれ透過率が下降した。2.0 mM では 40℃、2+b カゼインは pH を等電点（pI=4.6）へ近づけることで凝6.0 mM では 30℃、10.0 mM では 20℃と、Ca 濃度を上げ集体となって沈殿した。また、温度を上昇させることによていくと、より低い温度で透過率の急激な下降が見られる

り、b カゼインの散乱強度が上がり、b カゼインの会合がようになった。この結果より Ca 濃度を上げていくこと進んでいくことが示唆された。b カゼインは温度の上昇にで、b カゼインを低温で会合させることができると考えら

2+−7−コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

図３

粒子サイズ制御のためのカゼインの PEG 修飾れる。しかし得られた b カゼインの形態は凝集した不定形

100 nm ほどのナノスフェアが分散して存在していることであり、サイズと形状を制御することはできなかった。

がわかった（図４）。図５に EDX により領域の構成元素をタンパク質はジスルフィド結合の還元切断と尿素の添加定性分析した結果を示す。粒子が存在しない部位では検出による水素結合の阻害によりアンフォールディングされ、されなかったリンとカルシウムのピークが CAPEC 粒子に三次元の立体から二次元の鎖状になる。そして一旦アンフは検出された。これにより、ナノスフェア内にはリン酸カォールディングしても還元剤と尿素を取り除くと自発的にルシウムの結晶が含まれていることが示唆された。

天然構造が回復する。b カゼインにはシステイン残基が含以上のように、ナノスフェアの温度変化や乾燥した状態まれていないため、ジスルフィド結合は存在しない。そのにおける安定性が示された。しかし、この粒子を DDS キため、尿素のみによって、フォールディングの制御が可能

ャリアとして応用するためにはキャリアが形状を維持したであると考えられる。5000 ppm の b カゼインに尿素を加まま薬剤を目的部位まで運ぶことに加え、目的部位で保持え、b カゼインの水素結合を切断した。尿素を加えることしていた薬剤を放出することが求められる。ナノスフェアで沈殿が生じていた b カゼインが徐々に透明になっていき、の室温における pH 応答性を調べたところ、この粒子は生尿素濃度 2.0M では透過率がほぼ 100 % となった。尿素を体内 pH では粒子の形状を維持しているが、低 pH にする添加して粒径が顕著に減少した b カゼインから尿素を抜くと即座に粒子が崩壊することがわかった。この現象を利用と、再び b カゼインの粒径である 25nm 付近の大きさに戻することによって、pH 変化による粒子の溶解によって薬った。

剤を放出させることができると考えられる。バイオポリマ

そこで、b カゼインに安定性を付与するため両親媒性でーのような大きな物質は、エンドサイトーシス経路によりある PEG 修飾（図３）を行ったところ、環境応答性が PEG細胞内に取り込まれることが予想される。エンドソーム内の導入率によって変化することを見出した。PEG 導入率は低 pH に保たれていることから、低 pH で崩壊するといの高い b カゼインは pH および温度応答性を失い、会合がうナノスフェアの性質は、DDS キャリアに内包された薬起こらなくなった。一方、低い PEG 導入率では応答性は剤を細胞内で放出できるという点から有利である。

維持されており、会合が起こりやすい高温、低 pH 条件にそこで、モデル薬物として蛍光物質を用いて透析法において直径 100 nm スケールの粒子が生成することを見出よりナノスフェア内に封入することを試みたところ、正した。b カゼインのみから作製した粒子はすぐに凝集して電荷を持つ MEQ という蛍光分子の場合に封入が観察さしまったが、この PEG - b カゼイン粒子は分散状態を維持れた。おそらく、負電荷に帯電したナノスフェアとの静していた。しかし、pH を生体内条件にすると、この粒子電相互作用により吸着および吸収されたものと考えられは溶解してしまった。

る。次に MEQ の pH 7.4 および pH 4.0 での放出実験を行っ

2+

そこで、この条件（pH7.4）において Ca を添加したとた。外部溶液に放出された MEQ 濃度の経時変化を図６にころ、粒子の形成が観察された。PEG - b カゼインは高 pH示す。pH7.4 では、徐々に MEQ が放出されているのに対し、では負電荷を帯びているため溶解状態であるが、Ca を添pH4.0 では放出が一気に進んでいることがわかった。これ加することによって会合が促進されて粒子が形成されたとは、pH を 4.0 まで低下させることによりナノスフェアが崩考えられる。この PEG-Ca b カゼイン粒子はシャープな壊し、内部に MEQ を保持することができなくなったため温度応答性を示し、高温においては会合するが、室温に戻だと考えられる。実際に pH 4.0 において粒子が完全に崩壊すことにより即座に粒子の形状を維持できなくなった。

するには約 2 日間かかったことから、50 hr ほどで放出が平2+2+

次に、室温でも粒子形状を維持する粒子の作製を目指し、衡に達したのは妥当な結果であると考えられる。

リン酸カルシウムと b カゼインの複合化を行った。TEM

以上の結果から、無機有機ハイブリッドナノスフェアをによる乾燥状態の観察を行った結果、pH 7.4 において直径用いて pH の低下による薬物放出のスイッチングを行うこ−8−

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図４

ハイブリッドナノフェアの透過型電子顕微鏡

図６

図５

EDXによるナノスフェアの元素分析

pH によるナノスフェアからの薬物放出の変化とができた。今後、粒子外部への薬物の吸着を抑制し、内ができた。このナノスフェアは pH 変化によって崩壊する部への封入効率を向上させる工夫が必要だと考えている。

性質を持ち、pH 応答性 DDS キャリアとして有望な素材で４．総あることがわかった。

括バイオポリマーである b カゼインを化学的に改質した

謝

本研究は修士学生堀真帆君の貢献によるものが大であっ後、無機物と複合化することによって、生体適合性に優れ、100 nm スケールの無機有機ナノスフェアを作製すること辞た。ここに謝意を示す。

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