核内受容体 PPARを介して皮膚の美容効果を発揮する化粧品素材の探索
大阪大学大学院薬学研究科生命情報解析学分野

橘敬 祐

The permeability barrier is required for terrestrial life and it is localized at the outermost layer of the epidermis, thestratum corneum, where extracellular lipid membranes inhibit water movement. The stratum corneum is the end product of
keratinocyte differentiation and comprises a layer of cross-linked proteins and lipids. Epidermal homeostasis and the barrier
function integrity depend on the tight coordination of keratinocyte proliferation, differentiation, and programmed death.
Peroxisome proliferator-activated receptor a (PPARa) is a ligand-activated transcription factor belonging to the nuclear
hormone receptor superfamily. PPARa is mainly expressed in the liver, and is also present in the epidermis. PPARa binds toperoxisome proliferator responsive element (PPRE) and activates several target genes, which leads to fatty acid catabolism.
PPARa ligands have been used to treat dyslipidemia by reducing plasma triglycerides and increasing high-density
lipoprotein cholesterol. On the other hand, various cell culture and in vivo approaches suggest that PPARa contributes tofetal skin development, epidermal barrier maturation, and sebocyte activity. Thus, PPARa represents a research target forunderstanding and improving the recovery of skin barrier function.
Previously, we established a tightly tetracycline-regulated human hepatoblastoma cell line that can be induced to express
human PPARa (HepG2-tet-off-hPPARa). We subsequently engineered reporter cell line expressing the luciferase gene thatcan be used to quantify the PPARa activity by modulators using HepG2-tet-off-hPPARa.
In this study, we evaluated extracts of approximately 200 natural products and found an extract that enhanced reporter
gene activity. Furthermore, this extract up-regulated the expression of adipose differentiation-related protein (ADRP),
which is a known PPARa target gene. These findings suggest that the extract is a candidate agent for improving epidermal
permeability barrier function.

1．緒

誘導、脂質産生の促進、バリア機能の向上、皮膚炎症の抑言制などに関わっており、その機能に注目が集まっている 5）。

ヒトの表皮は、基底膜に接する表皮ケラチノサイトが分これらのことから、皮膚の PPARa の活性を調節できる化裂、分化、成熟することにより形成される。表皮には、水合物（PPARa モジュレーター）は、皮膚疾患の改善、美容分の蒸散を防ぐバリア機能が備わっている。バリア機能にの用途に貢献できる可能性が期待でき、機能性化粧品の素は細胞間脂質が大きな役割を果たしており、この機能が損材として有望と考えられる。

なわれると肌が乾燥状態になり、荒れ肌になる。一方、バ

我々はこれまでに、ヒト PPARa の機能を解析するためリア機能が正常に保たれていると、皮膚は適度に水分を保に、テトラサイクリン誘導システムを用いた PPARa の発持することができ、きめが整った美しい肌を維持できる。

現量を制御できるヒト細胞株を樹立した。樹立した細胞株

すなわち、バリア機能を改善する物質は、優れた化粧品のを用いてトランスクリプトーム解析を行った結果、本細胞素材になり得る

1, 2）株においてもヒト PPARa が脂肪酸代謝や脂質の代謝に深。

核内受容体ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体aく関わることが明らかになった 6−9）。さらに、樹立した細（PPARa）は、PPRE とよばれる認識配列に結合し、リガ胞株にレポーター遺伝子を組み込むことで、全長のヒトンドや翻訳後修飾により活性化されることで標的遺伝子群

PPARa の発現量を制御でき、かつ、PPARa の転写活性化3）の 発 現 を 調 節 し、 機 能 を 発 揮 す る 転 写 因 子 で あ る 。

能を生体内に近い環境で簡便・迅速に測定できる、セルベ

PPARa は 肝 臓 で 脂 肪 酸 の 代 謝 や 善 玉 コ レ ス テ ロ ー ルースの PPARa モジュレータースクリーニングシステムを（HDL）の産生を促し代謝を改善することから、PPARa の構築した。

4）

リガンドは高脂血症治療薬として用いられている 。また、

本研究課題では、構築したスクリーニングシステムを用

PPARa は表皮にも発現しており、ケラチノサイトの分化いて、約 200 種類の天然物抽出エキスの中から、PPARaの機能を制御し、皮膚疾患やバリア機能改善等の美容効果を発揮し得る素材の探索を行った。

Screening of natural products to findcosmetic agents that modulate PPAR
function
Keisuke Tachibana
Graduate School of Pharmaceutica lSciences, Osaka University

２．実験

２・１ PPARα モジュレータースクリーニング細胞を用いた活性測定試験−2−

PPARa モジュレータースクリーニング細胞は、DMEM

核内受容体 PPAR を介して皮膚の美容効果を発揮する化粧品素材の探索（10%charcoal/dextran treated FBS、100IU/mL penicillin、

２・２

100mg/mL streptomycin、2 mg/mL tetracycline、300 mg/mL G418、0.5 mg/mL puromycin、2 mg/mL blasticidin）

天然物からの活性成分の探索

スクリーニング検体として、植物を中心とする約 200 種類の天然物抽出エキスを用いた。

中で培養した。PPARa の発現誘導は、トリプシン処理後天然物抽出エキスの分画精製は、常法に従い以下のよう回収した細胞を 1×PBS（−）で３回洗浄し、tetracyclineに 行 っ た。 ま ず、 天 然 物 を MeOH で 抽 出 し、 得 ら れ たを除去することにより行った。Tetracycline 除去後、96 穴

MeOH エキスを EtOAc と水で分配した。水層は n-BuOH

マイクロプレートに、各ウェルあたり 150 mL の DMEM

を 用 い、n-BuOH 可 溶 部 と 水 可 溶 部 に 分 配 し た。 一 方、（10% charcoal/dextran treated FBS、100 IU/mL

EtOAc 可溶部は、n-hexane と 90%MeOH で分配した。さら4penicillin、100 mg/mL streptomycin）培地中に 2.5×10 個に、n-hexane-CHCl3 系、CHCl3-MeOH 系、または、CHCl3-になるように細胞を播種し、24 時間培養した。培地を除EtOAc 系の溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラ

去後、各種天然物抽出エキスを 3、10、30mg/mL になるよフィーによって精製し、それぞれの画分を得た。これら画

う に 調 製 し た DMEM（10% charcoal/dextran treated

分 の う ち 活 性 の 見 ら れ た 画 分 に つ い て は、 さ ら に、FBS、100 IU/mL penicillin、100mg/mL streptomycin）を

MeOH-CHCl3 の溶媒系で ODS カラムを用いた HPLC によ150 mL 添加し、48 時間培養した。培地を除去後、70 mL のり分画した（Fig. 2）。

細胞溶解液（25 mM Tris-phosphate（pH7.8）、2mM DTT、2mM trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetraaceticacid（CDTA）、10%glycerol、1%Triton X-100）を加えて室温下 15 分以上撹拌し、細胞を溶解した。20mL の細胞溶
解液に、50 mL の発光基質液（20mM Tricine-NaOH（pH7.8）、2.67mM MgSO4、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、270mM
Coenzyme A、530mM ATP、470mM luciferin）を添加して、ルミネッセンスプレートリーダーを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。なお、PPARa を発現させていないコントロールとして、培地に終濃度 2 mg/mL の tetracycline を添加して培養した細胞を用い、同様の処理を行い活性を測定した（Fig. 1）。

Fig. 1

Fig. 2

Screening system of PPARα modulators.

Extraction-fractionation scheme of the natural product 40.

−3−コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

２・３

定量 RT-PCR

３・２

天然物 40 番からの活性成分の探索

培養細胞からの total RNA の抽出は、QuickGene RNA

PPARa の転写活性の上昇が認められた７種類の抽出液

cultured cell kit S を用いてキットに添付のプロトコールの中から、3 mg/mL の濃度でも活性が認められたサンプルに従い行った。SuperScriptTM III First-Strand Synthesis

40 番を選択し、本抽出液に含まれる活性成分のさらなるSystem for RT-PCR を用いて、キットに添付のプロトコ探索研究を行った。
まず、サンプル 40 番の MeOH 抽出エキスを EtOAc と水ールに従い、抽出した total RNA から cDNA を合成した。
合 成 し た cDNA を 鋳 型 と し て、QuantiTectTMSYBR®

れら MeOH 抽出エキス、EtOAc 可溶部、n-BuOH 可溶部、Green PCR Kit を用いて定量的 real-time PCR を行った。

３．結３・１で分配した。さらに、水層を n-BuOH と水で分配した。こ
水可溶部の４つの抽出画分を用いてスクリーニングを行っ果た。その結果、EtOAc 可溶部および n-BuOH 可溶部にお天然物抽出エキスのスクリーニング

い て 濃 度 依 存 的 な 活 性 化 効 果 が 認 め ら れ た。 こ の 時、

PPARa の活性を調節する天然物抽出エキスのスクリー
ニングには、我々が開発した PPARa モジュレータースク

EtOAc 可溶部では、10mg/mL 以上の濃度において、他の画分よりも強い活性化効果が認められた（Fig. 4）。

リーニング細胞を用いた。本スクリーニング細胞は、テト

そこで、EtOAc 可溶部をさらに n-hexane と 90 % MeOH

ラサイクリン誘導システムを応用した PPARa の発現を制で分配した。まず、MeOH 可溶部を CHCl3-MeOH 系溶媒御できるヒト肝癌由来細胞株 HepG2-tet-off-hPPARa 細胞を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精を用いて樹立した 6, 7）。すなわち本細胞株は、培地中に製し、Me-1 〜 5 の５つの画分を得た。これら画分を用い

tetracycline が 存 在 す る と PPARa は 発 現 せ ず（Tet+）、てスクリーニングを行った結果、Me-1 画分に活性が認めtetracycline を除去することで発現量が上昇する（Tet−）。

られた（Fig. 5A）。そこで、Me-1 画分をさらに n-hexane-

さ ら に、 こ の 細 胞 の ゲ ノ ム に は、PPARa の 応 答 配 列

CHCl3 系の溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフ

PPRE を含むプロモーターの下流にルシフェラーゼをコーィーで精製し、Me-1.1 〜 1.5 の 5 つの画分を得た。これら

ドする遺伝子が組み込まれている。従って、ルシフェラー画分を用いて活性を評価した結果、Me-1.1、1.2、1.3 の画ゼ活性を指標にすることで、各種サンプルの PPARa に対分に活性化効果が認められた（Fig. 5B）。興味深いことに、する活性化効果を評価することができる。このように、本Me-1.2 画分は 3mg/mL の低い濃度で最も高い活性化効果

スクリーニング細胞株は、全長のヒト PPARa の発現量をが得られた。そこで、Me-1.2 画分を選択し、CHCl3-EtOAc制御可能であり、またレポーター遺伝子もゲノム上に組み系の溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで込まれていることから、生体内に近い条件で活性の評価を精製し、Me-1.2.1 〜 1.2.5 の 5 つの画分を得た。これら画分行える優れたスクリーニング細胞株である。

を用いて活性を評価した結果、Me-1.2.2 〜 1.2.4 の画分に転上記スクリーニング細胞株を用いて、約 200 種類の天然写活性の上昇が認められた（Fig. 5C）。そこで、Me-1.2 画物抽出液のスクリーニングを行った。スクリーニングの手分と同様に 3 mg/mL の濃度で活性の認められた Me-1.2.3 画順を以下に示す（Fig. 1）。まず、リガンドスクリーニング

分を選択し、MeOH-CHCl3 系の溶媒系で ODS カラムを用細胞を 96 穴マイクロプレートに播種し、tetracycline を除いた HPLC により精製した。得られた画分 Me-1.2.3.1 およ

去した培地で培養することで PPARa の発現を誘導した

び Me-1.2.3.2 を用いて活性を評価した結果、Me-1.2.3.1 画分（Tet −）。24 時間培養後、各種天然物抽出液を 3 mg/mL まに転写活性化効果が認められた（Fig. 5D）。

たは 30mg/mL になるように添加した。添加 48 時間後にル

一方、n-hexane 可溶部は n-hexane-CHCl3 系の溶媒を用シフェラーゼアッセイを行い、ルシフェラーゼ活性を指標いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、に各種抽出液による PPARa の転写活性化効果を評価した。

Hex-1 〜 4 の 4 つの画分を得た。これら画分を用いてスクな お、 コ ン ト ロ ー ル と し て tetracycline を 除 去 せ ず に、リーニングを行った結果、Hex-3 画分に活性が認められた

PPARa を発現させていない条件でもアッセイを行った（Fig. 6A）。そこで、Hex-3 画分をさらに n-hexane-CHCl3（Tet+）。

系の溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにその結果、Fig. 3に示すようにtetracyclineを除去し PPARaよって精製し、Hex-3.1 〜 3.4 の 4 つの画分を得た。これらを発現させた時に、既知の PPARa リガンドであるフェノ画分を用いて活性を評価した結果、Hex-3.2 画分にフェノフィブリン酸（終濃度 50mM）よりも高い活性化効果を示フィブリン酸と同程度の活性化効果が認められた（Fig.

した抽出液が 7 種類得られた（サンプル 10、16、40、42、6B）。Hex-3.2 画分をさらに n-hexane-CHCl3 系の溶媒を用

61、241、264 番の抽出液）。特に、サンプル 40 番の抽出液

いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、では、3 mg/mL の濃度でもフェノフィブリン酸と同程度のHex-3.2.1 〜 3.2.5 の 5 つの画分を得た。これら画分を用いて活性が認められた。

活性を評価した結果、Hex-3.2.4 画分と Hex-3.2.5 画分に活−4−核内受容体 PPAR を介して皮膚の美容効果を発揮する化粧品素材の探索

Fig.3 Screening of the MeOH extracts of the natural products for PPARα modulators.

−5−

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Fig.3 –continued.

−6−核内受容体 PPAR を介して皮膚の美容効果を発揮する化粧品素材の探索

Fig. 4 Screening of the natural product 40 extracts for PPARα modulators.

Fig. 5 Screening of the MeOH layer of the natural product 40 for PPARα modulators.

−7−

コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

Fig. 5 –continued.

Fig. 6 Screening of the n-hexane layer of the natural product 40 for PPARα modulators.

−8−核内受容体 PPAR を介して皮膚の美容効果を発揮する化粧品素材の探索

Fig. 6 –continued.

Fig. 7 Me-1.2.3.1 fraction up-regulated the expression of ADRP.

−9−コスメトロジー研究報告 Vol.20, 2012

性化効果が認められた（Fig. 6C）。まず、Hex-3.2.4 画分を、PPARa の生理機能を明らかにすると共に、PPARa を活性

n-hexane-CHCl3-EtOAc 系の溶媒を用いてシリカゲルカラ化する成分が皮膚の恒常性や機能を改善し美容を促進する

ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て 精 製 し、Hex-3.2.4.1 〜という、新たな化粧品素材開発へのアプローチを提唱する3.2.4.3 画分を得た。これら画分を用いて活性を評価した結ことで、コスメトロジーの発展に寄与したい。

果、Hex-3.2.4.2 画分に活性化効果が認められた（Fig. 6D）。

５．謝

一方、Hex-3.2.5 画分は、CHCl3-EtOAc 系の溶媒を用いて辞

シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、本研究を遂行するに当たり、御支援頂きました公益財団

Hex-3.2.5.1 〜 3.2.5.4 画分を得た。これら画分を用いて活性法人コスメトロジー研究振興財団に厚く御礼申し上げます。

を評価した結果、弱いながらも Hex-3.2.5.1 画分に活性化効果が認められた（Fig. 6E）。興味深いことに、これら画分（引用文献）

を薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて解析した結果、

１）Feingold KR, : Thematic review series: skin lipids.

これら画分にはそのスポットのパターンより Me-1.2.3.1 画

The role of epidermal lipids in cutaneous permeability

分に含まれる成分と同じものが含まれていることが明らか

barrier homeostasis., J Lipid Res, 48, 2531-2546, 2007.になった。

２）Rawlings AV & Harding CR, : Moisturization and skinbarrier function., Dermatol Ther, 17 Suppl 1, 43-48, 2004.

３・３

活性成分を用いた遺伝子発現解析

３）Tachibana K, Yamasaki D, Ishimoto K, et al., : The
role of PPARs in cancer., PPAR Research, Volume

スクリーニングの結果、サンプル 40 番から精製した Me-2008, Article ID 102737, 2008.

1.2.3.1 画分に含まれる成分が、本スクリーニング系で活性を示す成分として考えられた。そこで、本成分を用いて、

４）Evans RM, Barish GD & Wang YX, : PPARs and the

PPARa の標的遺伝子の発現が誘導されるか否かを調べた。

complex journey to obesity., Nat Med, 10, 355-361, 2004.

PPARa の発現が確認されているヒト肝癌由来 Huh-7 細胞

５）Michalik L, & Wahli W, : Peroxisome proliferator-8）

activated receptors (PPARs) in skin health, repair andを 、Me-1.2.3.1 画分で処理し、48 時間後に total RNA を回収した。回収したtotal RNA から cDNA を合成し、PPARa

disease., Biochim Biophys Acta, 1771, 991-998, 2007.の 標 的 遺 伝 子 で あ る 脂 肪 滴 形 成 に 関 わ る adipose６）Tachibana K, Kobayashi Y, Tanaka T, et al., :differentiation-related protein（ADRP）遺伝子 6）の発現を

Gene expression profiling of potential peroxisome

解 析 し た。 そ の 結 果、Me-1.2.3.1 画 分 の 添 加 に よ っ て

proliferator-activated receptor (PPAR) target genes in

ADRP の発現量が、約 1.5 倍程度に上昇した（Fig. 7）。

human hepatoblastoma cell lines inducibly expressing

４．考

different PPAR isoforms., Nuclear Receptor, 3, 3, 2005.

察７）T a c h i b a n a K , : A p p l i c a t i o n o f t h e H u m a n

我々が構築したスクリーニング系を用いて、PPARa のHepatoblastoma Cell Lines Inducibly Expressing

転写活性化能を促進する成分の探索を行った。今回、約Peroxisome Proliferator-activated Receptors (PPARs).,

200 種類の天然物抽出エキスを評価した結果、７種類の天Yakugaku Zasshi, 127, 1223-1229, 2007.

然物抽出エキスに PPARa を活性化する成分が含まれてい８）Tachibana K, Anzai N, Ueda C, et al., : Regulation

る可能性が示唆された。このうち、サンプル 40 番の抽出of the human PDZK1 expression by peroxisome

エキスをさらに分画した結果、PPARa を活性化する成分

proliferator-activated receptor alpha., FEBS Letters,

を、Me-1.2.3.1 画分にまで絞り込むことに成功した。今後、

582, 3884-3888, 2008.

この画分に含まれる成分を同定すると共に、どのようなメ

９）Tachibana K, Takeuchi K, Inada H, et al., : Regulation

カニズムで PPARa の活性を制御するのかを、アンタゴニ

of the human SLC25A20 expression by peroxisome

ストなどの薬剤を用いてさらに詳細に解析する必要がある。

proliferator-activated receptor alpha in human

一 方、Me-1.2.3.1 画 分 は PPARa の 標 的 遺 伝 子 で あ る

hepatoblastoma cells., Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 389, 501-505, 2009.

ADRP の発現量を増加させた。これまでに、表皮ケラチノ
サイトにおける ADRP の発現量の上昇に伴う脂質の増加

10）Corsini E, Viviani B, Zancanella O, et al., : Induction

が、SDS などの刺激による細胞膜の損傷の修復に関わってof adipose differentiation related protein and neutral

10）いることが報告されている 。従って、Me-1.2.3.1 画分にlipid droplet accumulation in keratinocytes by skin

含まれる成分も、皮膚のバリア機能向上による肌荒れ防止、

irritants., The Journal of investigative dermatology,改善作用を有している可能性が考えられる。

121, 337-344, 2003.

今後本研究課題で得た知見をもとに、皮膚における− 10 −