【研究報告】（自然科学部門）

胎児期ビタミン A-レチノール代謝系の機能維持と先天性脊柱側弯症の発症予防

下川哲

高崎健康福祉大学
緒言

仙椎移行部において昭教授

遺伝子群の発現が有意に低下していることなどを発見した1）。

脊柱側弯症（Congenital Scoliosis）は、脊椎が生理的弯曲を越えて弯曲する異常である。この側弯症は、先天

本研究の目的は、DNA microarrayを用いてIS rat 椎骨性・特発性・症候性の三つに分類されている。特発性側における網羅的な遺伝子解析を行い、側弯症の発症に関わ弯症は一部原因遺伝子の探索が始まっているが、先天性ると考えられているビタミンA-レチノール代謝系について側弯症はいまだ原因および原因遺伝子の検索さえも行わ解析し側弯症の発症過程をより深く理解することにある。

れておらず、手術以外に根本的な治療法がない。先天性側弯症は、生まれつきの形態異常を来した椎体（楔状実験方法

椎、蝶形椎、半椎など）を有するが故に成長と共に側弯1.

実験動物を来す疾患である。高度の側弯では胸郭が著しく変形

先天性脊椎後側弯症のモデルラットであるIS rat は京し、そのために肺の機能が低下する。その結果、肺や心都大学大学院医学研究科附属動物実験施設から供与され臓に重篤な合併症を引き起こす（図 1）。脊椎の形態異た。野生型ラット（WT）としてウィスター（Wistar）

常以外に他の身体的異常を認めないことが多く、疼痛なratsを日本 SLC Inc.（静岡）から購入した。すべてのラッ

どの自覚症状に乏しいため、姿勢異常を起こすまで気づ

トは温度・湿度、照明、餌、水の管理された施設で生育かれないことが多い。もし早期に診断が可能になれば、された。同型遺伝子同士の雌雄による交配により繁殖さ早期の外科的治療により姿勢異常の増悪を予防できる可せ、仔が誕生した日をP0とした。本研究のすべての動物能性がある。我々は先天性脊柱側弯症の発症メカニズム

実験は高崎健康福祉大学動物実験倫理委員会および群馬を明らかにする目的で、先天性に腰椎の後側弯症を持つ大学医学部動物実験倫理委員会の承認を受けて実施した。

モデル動物である Ishibashi（IS）rat の形態学的および2.

遺伝子的解析を行ってきた。これまでに IS rat はヒトの遺伝子発現量のプロファイルの作成

先天性脊柱側弯と極めて類似した形態を示すことや、胎DNA microarray を用いて IS で奇形が集中する椎骨局生期から 1 次骨化中心の癒合や変形がみられること、腰所における網羅的な遺伝子解析を試みた。生後 4 日齢（P4）の IS rat の奇形が集中する第 3 から第 5 腰椎の脊椎試料から常法により mRNA を抽出し cDNA を合成後、緑色蛍光色素である Cy3 で、Wistar ラット同部位由来の cDNA を赤色蛍光色素である Cy5 で標識した。標識化したcDNAをラット全遺伝子型 DNA チップ（3D-gene、東レ社製）とハイブリダイゼーションさせた。蛍光値をスキャナーによって読み取り正規化した後、発現量として算出することでラット脊柱側弯症における遺伝子発現プロファイルを作製した。

図1

共同研究者の執刀による腰椎に半椎（hemivertebra）を認めた手術例。
1

下川哲

先 天 性 脊 柱 側 弯 症 発 症 に お け る ビ タ ミ ン A-レチ

3.

昭い て 顕 著 な 発 現 低 下 が み ら れ た。 こ の う ち、ノール代謝系の関与,,,の遺伝子発現を Real-time PCR で確認したところ WT に比べて IS ラットではすべて有意発現変動遺伝子群が情報伝達系のどのパスウェイに多に減少していた（ ＜0.01、図 3）。

く含まれていたかを調べる「パスウェイ解析」を行った。
ビタミン A-レチノール代謝系の発現にとって重要な遺さらに、WT および IS ラットの血中レチノール濃度伝子を選択し、Real-time PCRにより遺伝子発現、Westernを HPLC に よ り 測 定 し た。IS の 血 中 レ チ ノ ー ル 濃 度

blotting によりタンパク質発現、High performance liquid（193±0.014 ng/mL） は WT（125±0.005 ng/mL） に 比chromatography（HPLC）によりラット血中のレチノー較して有意に高いことがわかった（ ＜0.01、図 4）。

ル濃度を測定した。
考結果察本研究結果は、神経成長因子受容体およびビタミンDNA microarray を用いた IS で奇形が集中する椎骨局

A-レチノール代謝系遺伝子群の発現低下は、先天性脊所における網羅的な遺伝子解析において、およそ 2 万個柱側弯症の原因の一つか少なくても発症に影響を与えるの遺伝子のうち野生型 Wistar ラットの当該部位と比較ことを強く示唆している。これまでの研究では、骨折のして発現が 8 倍以上上昇したものは 90 遺伝子であった。
逆に発現が 0.125（1/8）倍以下に低下したものは 106 遺伝子存在した（図 2）。興味深いことにこのうち神経成長因子受容体であるTropomyosin receptor kinase（Trk）
遺伝子群は 0.1 倍程度の顕著な発現低下を認め、Realtime RT-PCR による mRNA 発現、抗 Trk 抗体を使ったWestern blotting や免疫染色によるタンパク質の発現においても有意な発現低下を確認した2）。
次に、発現変動遺伝子群が情報伝達系のどのパスウェイに多く含まれているかを調べる「パスウェイ解析」を行ったところ、発現低下遺伝子が最も多く含まれるのはビタミン A-レチノール代謝系に関するパスウェイで図2あった。この代謝系は 39 遺伝子で構成され、このうちmicroarray にて検出した 33 遺伝子中 9 遺伝子で IS にお

図3

DNA microarray の結果のプロット。横軸は Cy5 で標識した WT 由来の遺伝子。縦軸は Cy3 で標識した IS 由来の遺伝子。

,,,の遺伝子発現。数値は平均±標準誤差で表示した。標本数はそれぞれ ＝7。平均値の差の検定はStudentʼs -test で検定した。** ＜0.01。
2胎児期ビタミン A- レチノール代謝系の機能維持と先天性脊柱側弯症の発症予防する異常である。現在、外科的治療以外に根本的な治療法のないこの疾患にとって、病因遺伝子の同定と発症メカニズムの解明は側弯症に対する早期の診断と遺伝子治療への第一歩である。本研究において我々は先天性脊柱後弯症モデルラット（IS ラット）において奇形が集中する椎骨局所における網羅的遺伝子解析から、神経成長因子受容体（,,）およびビタミン A-レチノール代謝系の遺伝子群の発現が有意に低下していることを見出した。さらに IS ラットの血中レチノール濃度は野生型（Wistar）ラットに比べて有意に上昇していた。これらの結果により、この疾患の原因の一つは腰椎骨における図 4 野生型（WT）と IS ラットの血清レチノール濃度。数値は平均±標準誤差で表示した。標本数はそれぞれ ＝16。平
均値の差の検定は Welchʼs -test で検定した。** ＜0.01。
3）ビタミン A-レチノールの代謝／利用障害である可能性が強く示唆された。今後、ビタミン A-レチノール代謝のリ系の最終リガンドの投与による側弯の改善と本症のヒトガンドである NT-3 が骨形成を促進するとの報告があるにおける病態メカニズムについて解析する予定である。

修復過程での発現がみられる ことや、

4）が 、骨形成異常における神経成長因子受容体の関与についてその詳細は明らかでない。IS では、

謝の発現低辞下による神経成長因子の機能不全から骨芽細胞が十分に本研究の遂行にあたり学術研究奨励金を賜りました公機能せず、不良な形態を示す可能性などが考えられる。

益財団法人三島海雲記念財団に衷心より御礼申し上げま

一方、レチノイン酸はホメオティック遺伝子の転写活性す。先天性脊椎後側弯症のモデルラットである IS rat は5）を制御することが知られている 。IS ではレチノール代

京都大学大学院医学研究科附属動物実験施設から供与さ謝に関する遺伝子群の発現低下によりレチノイン酸が正れました。また、本研究は飯塚伯氏と角田大介氏（群馬

常に代謝されずホメオティック遺伝子の発現が抑制され大学大学院医学系研究科整形外科学分野）ならびに鯉淵て椎骨の正常な発生過程が障害されている可能性があ典之氏（群馬大学大学院医学系研究科応用生理学分野）る。また IS の血中レチノール濃度が上昇していたこととの共同研究で成されたものです。

から、腰椎骨におけるビタミン A-レチノールの利用障

文

害やレチノール自体の過剰による代謝異常が体節形成機

1） T. Seki, et al.:., 312, 193–199, 2008.
2） D. Tsunoda, et al.:
, 412, 11–18, 2016.
3） K. Asaumi, et al.:
, 26, 625–633, 2000.
4） T. Nakanishi, et al.:,203, 1268–1274, 1994.
5） T. Suzuki, et al.:
, 41, 143–152, 1999.

構を破綻させ側弯を発症させていると考えられる。
要献約

先天性脊柱側弯症は、脊椎が生理的弯曲を越えて弯曲3