酸化ストレスにより生体膜に生成する酸化型リン脂質の代謝機構の解明
中北里大学

薬学部

川靖

一Phosholipids hydroperoxide glutathione peroxidase（PHGPx）is the unique antioxidant which is able toreduce the phospholipid hydroperoxides produced in biomembrane. PHGPx is preferentially localized in
mitochondria as compared with another type of glutathione peroxidase such as classical GPx（cGPx）. ThecDNA for PHGPx included two site for initiation of translation. One deduced product was 20 kDa PHGPx（non-mitochondrial type）and another was 23 kDa PHGPx（mitochondria type）which possessed a signal
peptide for the targetting to mitochondria. Cells that overexpressed the 23 kDa PHGPx were more resistancethan control cells to the oxidative damage of mitochondria caused by the treatment with KCN, while theprotective effect for the mitochondria damage were not observed in the 20 kDa PHGPx-overexpressed cells.
The 23 kDa PHGPx could prevent cell death due to the damage of mitochondria with oxidative stress andwould be a key antioxidant enzyme to protect a damage of the skin which is exposed to oxidative damage.

リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペ

１ 緒 言

ルオキシダーゼ（PHGPx）はリン脂質やコレステ皮膚は生体の最外層にあり、さまざまな物質にロールヒドロペルオキシドなど生体膜中に生ずよる化学的、物理的な障害の最前線にある。特にる脂質ヒドロペルオキシドを消去できる細胞内

紫外線などによる最大の標的となるのは高度不の唯一の抗酸化酵素であり、広く組織、細胞に存飽和脂肪酸をもつリン脂質であり、過酸化反応の在している２、３）。我々は生体膜に生ずる酸化型

結果生ずる過酸化脂質は皮膚の炎症、老化を引きリン脂質であるリン脂質ヒドロペルオキシドの起こす原因物質として注目を集めている。過酸化代謝機構を考える上で、PHGPx はカギとなる酵

脂質研究の歴史は古いが、生体膜中に生ずる脂質素であると考え、本研究では細胞の老化と深く係の過酸化物の消去に係わる防御機構を検討した

わるミトコンドリアにおける本酵素の生理的な報告は少ない。リン脂質が過酸化されることより役割について検討を行った。

生ずる一次生成物はリン脂質ヒドロペルオキシ２ 実 験ドであり、この生成を抑制することは生体膜の酸化的な障害の防御につながる。特に、細胞内の活２. １ PHGPx の細胞内分布の測定

性酸素の主要な産生の場であるミトコンドリア

ヒト血管内皮系ガン細胞株 ECV 304 細胞、ラでの過酸化脂質の蓄積は細胞の老化、さらには細ット好塩基球系細胞 RBL 2 H 3 細胞の PHGPx を胞の死に至ることから、ミトコンドリア内の防御放射性セレンで標識した後、オルガネラに分画し因子の役割を明らかにすることは重要と考えられた。遠心分離により、核、ミトコンドリア、ミク１）ロソーム、細胞質に分画した。可溶化したミクロている 。
The emzymatic regulationof production of oxidative
phospholipids in biomembrane
suffered with oxidative stressYasuhito Nakagawa
Faculty of pharmaceutical
Sciences Kitasato University

ソーム、ミトコンドリア画分および細胞質画分を抗 PHGPx モノクローナル抗体で免疫沈降を行い、得られた試料について SDS − PAGE を行った。ゲルを乾燥後、イメージングアナライザーにより放射活性のあるスポットを検出した。

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２. ２ in vitro 翻 訳 系 に よ る リ コ ン ビ ナ ン ト
PHGPx の作成

開始コドンを含む細胞質型 PHGPx をコードしている pRPHGPx 2 を哺乳動物の発現ベクターをベPHGPxcDNA を用いて、T 7 RNA polymerase35

クターに組み込み、エレクトロポレーション法ににより調製した mRNA に［ S］メチオニン、ウより RBL − 2 H 3 細胞へ遺伝子導入した。またコサギ網状赤血球ライゼ−トを加え、リコンビナンントロール細胞として、PHGPx インサートを含ト蛋白質の作成を行った。

まない発現ベクター SR − α と pSV 2 -neo を導入した細胞も同時に作成した。遺伝子導入した細胞２. ３ PHGPx のミトコンドリアへの輸送をゲネチシンにより耐性株を選択し、高発現細胞

２. ３. １ in vitro でのミトコンドリアへの輸送のスクリーニングを行った。

ラット肝臓ミトコンドリアにリコンビナント

３ 結 果

PHGPx を添加し、反応を開始させた。一定時間に２, ４−ジニトロフェノールを添加して反応を停

３. １ PHGPx の細胞内分布止させた後、遠心し、ミトコンドリアと上清に分ヒト血管内皮細胞株である ECV 304 細胞に離した。ミトコンドリアは Proteinase K により

つ い て 細 胞 を 放 射 性 セ レ ン で ４ 日 間 標 識 し、ミトコンドリア表面に結合したリコンビナント

PHGPx の放射活性の細胞内分布について調べた。

PHGPx を消化した。遠心により得られたミトコ対象として、GPx として一般的によく知られてンドリアを可溶化して SDS − PAGE を行った。泳いる cytosolic GPx（cGPx）についても、同様に調動後、イメージアナライザーにより放射活性を測べ、比較検討した。Fig. １に示すように ECV 304定し、定量した。
２. ３. ２ Green Fluorescent Protein（GFP）
融合タンパク質の細胞内分布の測定
PHGPx の第１開始コドンから第２開始コドンを含むアミノ酸配列の１番から 32 番までをコードする遺伝子、および第２開始コドンからのアミノ酸 28 番から 70 番までをコードする遺伝
子を GFP 遺伝子にライゲイションしたキメラcDNA（L − GFP、S − GFP）を構築した。第１開始コドンを含まない S − GFP、第１開始コドンを含む L-GFP をエレクトロポレーションを用いて、RBL − 2 H 3 細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞をカバーガラスに細胞を付着させ、ホルムアルデヒドに 20 分間浸し、細胞を固定した。カバーガラスを洗浄後、GFP の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。
２. ４ ミトコンドリア型、細胞質型 PHGPx 高発現細胞株の樹立
第１開始コドンを含むミトコンドリア型
PHGPx をコードしている pRPHGPx 4 と、第２Fig. １ Subcellular localizations of PHGPx andcGPx in the ECV304 cells.
ECV304 cells were metabolically labeled with 75Se
(0.14 mCi/mL) for 4 days. The 75Se-labeled cells werefractionated by differential centrifugation into nuclear
fraction, mitochondrial fraction, microsomal fraction andcytosolic fraction. Distribution of PHGPx and cGPx
was determined by immunoprecipitation analysis withanti-PHGPx and anti-cGPx. Relative radioactivities
of PHGPx and cGPx were calculated from scanningdensitometry by a Bio-Imaging Analyzer.

− 68 −酸化ストレスにより生体膜に生成する酸化型リン脂質の代謝機構の解明

細胞では、cGPx の総発現量の 86 % が細胞質画ンを有する cDNA からは 197 アミノ酸からなる分に存在していた。PHGPx は核画分に 13％、ミ分子量約 23 kDa の PHGPx（L − form）が、第２トコンドリア画分に 34％、ミクロソーム画分に開始コドンからは 170 アミノ酸からなる分子量18％、細胞質画分に 33％の割合で存在しており、。
約 20 kDa の PHGPx（S − form）が翻訳された４）いずれのオルガネラにおいても発現が見られた

第１開始コドンと第２開始コドンの間のリーダが、ミトコンドリア画分と細胞質画分に多く分ー配列がオルガネラへの輸送シグナルとなって布していた。ラット好塩基球系細胞である RBL −いる蛋白質が存在することから、PHGPx のこの2 H 3 細胞においても ECV 304 細胞と同様に cGPx

リーダー配列がミトコンドリアへの輸送シグナは主に細胞質に存在しており、PHGPx はミトコルであるか否かについて検討した。

ンドリア画分に多く存在していた。
ミトコンドリア画分および細胞質画分におけ３. ３ PHGPx のミトコンドリアへの輸送機構

る PHGPx と cGPx の存在量比について見ると、放射性メチオニンで標識されたリコンビナン

細胞質画分では cGPx 量は PHGPx の約 3 . 5 倍でト PHGPx をミトコンドリアとともに反応させ、あるのに対して、ミトコンドリア画分では cGPx

ミトコンドリア内へ輸送された PHGPx 量を SDS-

は PHGPx の約 1 / 3 であり、ミトコンドリアにおPAGE で調べた（Fig. ３）。反応 30 分後においていて PHGPx の存在比が高いことが明らかになっも、リーダー配列を持たない 20 kDa の S-form のた。このことは細胞質に存在する主なＧＰｘのアPHGPx は輸送されず、ミトコンドリア内に放射イソザイムは cGPx であり、ミトコンドリアでは性 PHGPx は検出されなかった。一方、リーダーPHGPx であることを示している。

配列を持つ 23 kDa の L − form と反応したミトコ
ンドリア内では輸送された PHGPx が検出された。

３. ２ 分子量の異なる２種の PHGPx の発現

ミトコンドリア内に輸送された L − form の分子ラット脳 cDNA ライブラリーより PHGPx の量は 20 kDa に変化していることが明かとなった。

cDNA をクローニングを行った結果、PHGPx にミトコンドリア内に輸送された 20 kDa PHGPx は３）は翻訳開始点が２つ存在していた（Fig. ２） 。

リーダー配列を認識するポリクローナル抗体（抗それぞれの開始コドンを有する cDNA を鋳型とP −１抗体）で沈降されないことから、ミトコンドして in vitro の蛋白質合成系を用いて、リコンビリア内に輸送された 23 kDa L − form のリーダー

ナント PHGPx の合成を行った。第１開始コド配列はプロセシングにより切断され、20 kDa のFig. ２ The structure of cDNA for rat PHGPx.

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Fig. ３ Import of mitochondria type PHGPx into mitochondria
The cytosol type and the mitochondria type of [35S] PHGPx, synthesized in thein vitro translation system (A), was incubated with rat liver mitochondria at 25℃
for 30 min (B). After import, the mitochondria were treated with proteinase K for
30 min at 0 ℃ (C). After the incubation, the mitochondria were further incubatedwith proteinase K, reisolated and analyzed by 12.5% SDS-PAGE, with subsequent autoradiography and quantitative analysis with the Bio-imaging analyzer.

PHGPx に変化したものと考えられた。これらのミトコンドリアへ選択的に輸送されることを示

結果より、リーダー配列を有する 23 kDa L − form

している。以上のことから、第１開始コドンからの PHGPx がミトコンドリア内へ輸送されること翻訳される 23 kDa PHGPx がミトコンドリアに輸が明かとなった。

送されるミトコンドリア型 PHGPx であり、第２L − form のリーダー配列が細胞内でミトコンド

開始コドンから翻訳されている 20 kDaPHGPx がリアへの標的化シグナル（ターゲティングシグナ

ミトコンドリア以外に存在する細胞質型 PHGPxル）として機能するのかについて細胞レベルで明であることが明かになった。

かにするため、シグナルペプチド− GFP の融合タンパク質を細胞内に発現させることにより検討

３. ４ ミトコンドリアの選択的な酸化的障害にした。リーダー配列を含む 32 アミノ酸をコード

対する PHGPx の役割する配列をクラゲ蛍光蛋白質である GFP の N 末PHGPx のミトコンドリアにおける役割を明か側に融合させた L − GFP、第２開始コドン以降のにするために、ミトコンドリア型 PHGPx を高42 アミノ酸をコードする配列を同様に融合させ発現した M 15 細胞、細胞質型 PHGPx を高発現た S-GFP の２種類の発現ベクターを RBL − 2 H 3

した L ９細胞を作成し、ミトコンドリアの酸化細胞に導入し、発現した GFP 融合タンパク質の的障害に対する応答を調べた（Fig. ４）。電子伝細胞内分布を蛍光顕微鏡で調べた。その結果、S達系複合体 IV の阻害剤であるシアン化カリウム− GFP を発現させた細胞は細胞全体に蛍光が見ら（KCN）で各細胞を処理し、生存率を調べた。コ

れ、S − GFP は主に細胞質に分布していることがントロール細胞株の S １、細胞質型 PHGPx 高発示された。L − GFP は S − GFP の細胞内分布とは現細胞株の L ９細胞では KCN 処理後、２時間後明かに異なり、蛍光の分布はミトコンドリア特異に強い細胞障害が見られ、処理後４時間での生存的蛍光色素であるローダミン 123（Rh 123）の蛍率は 35％であった。しかし、ミトコンドリア型光パターンと良く一致した。このことはリーダーPHGPx を高発現した細胞株である M 15 細胞で配列を融合させた GFP タンパク質（L − GFP）はは同時間の処理においても 69％の生存率を示し、− 70 −

酸化ストレスにより生体膜に生成する酸化型リン脂質の代謝機構の解明たしていると考えられている。絶えず酸化的ストレスの環境下にある表皮細胞のミトコンドリア機能を維持するために、PHGPx は主要な役割を果たしているものと推測される。ミトコンド
リア抗酸化酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の発現はストレスに応じて変動することから、SOD に連動して活性酸素を消去する PHGPx の発現も変動するものと考えられるが、PHGPx の発現制御に関しては細胞質型、ミトコンドリア型の転写調節を含めほとんど明らかにされていない。生体膜の酸化型リン脂質の産生調節機構を明らかにするためには PHGPx の発現調節機構の解明はこれからの検討されるべき課題である。
こうした問題を明らかにすることにより、Fig. ４ Effects of KCN on the cell viability of thePHGPx overexpressed cells.
Mitochondrial type PHGPx overexpressed
cells (closed squares, M15), cytosolic type
PHGPx overexpressed cells (closed triangles,L9) and control cells transfected with the emptyvector (closed circles, S1) were plated in 0.5x105
cells/well in 5%FCS/DMEM. After 24h, theseclones were exposed for the indicated time with25mM KCN. After the treatment of KCN, cell
viabiliy was examined with the release of lactate
dehydrogenase (LDH). Viability is expressed asa percentage, relative to the total LDH in thecells that were lysed with 0.2%Tween20. Data
are expressed as the means of triplicate results.

ミトコンドリアの酸化的障害が介在するさまざまな疾病の発症、老化、アポトーシスなどの細胞死の機構の解明につながるものと期待される。
引用文献
１）Quillet MA, Jaffrezou JP, Mansat V, et al. :Implication of mitochondrial hydrogen peroxide
generation in ceramide-induced apoptosis, J.
Biol. Chem., 272 , 21388 - 21395 , 1997 .
２）Roveri A, Maiorino M, Ursini F, : Enzymaticand immunological measurements ofsoluble and membrane-bound phospholipidhydroperoxide glutathione peroxidase, Method

処理後 6 時間においても 56％の生存率を保っておin Enzymology, 233 , 202 - 212 , 1994 .

り、S １、L ９細胞と比較して約２倍の耐性を獲得

３）Imai H, Sumi D, Hanamoto A, et al. :していた。これらの結果より、ミトコンドリアのMolecular cloning and functional expression

酸化的な障害に対し、細胞質型 PHGPx は関与する

of a cDNA for rat phospholipid hydroperoxide

ことはないが、ミトコンドリア型 PHGPx は防御因

glutathione peroxidase : 3 '-untranslated子として機能していることが明かとなった。

region of the gene is necessary for functionalexpression, J. Biochem., 118 , 1061 - 1067 , 1995 .

４ 考 察４）Arai M, Imai H, Sumi D, et al. : Import into

活性酸素の主要な産生の場であるミトコンド

mitochondria of phospholipid hydroperoxide

リアに存在する抗酸化酵素はミトコンドリアのglutathione peroxidase requires a leader

酸化的な障害に起因する老化、アポトーシスなど

sequence, Biochem. Biophys. Res. Commun.,の細胞死を抑制する上で極めて重要な役割を果

227 , 433 - 439 , 1996 .

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