シルクプロテイン−ポリフェノールコンジュゲートの合成と機能評価

大阪大学大学院工学研究科応用化学専攻

宇山浩

The biological and pharmacological effects of polyphenols have been demonstrated in numerous human, animaland in vitro studies. The present report describes synthesis and bio-related properties of polyphenol conjugateson poly(amino acid)s such as silk protein and poly(ε-lysine). In this study, chlorogenic acid, caffeic acid, and green
tea catechin were used as polyphenol for the conjugation. At first, silk protein was chemically modified with thepolyphenols by using dehydrating coupling agent, but the introduced ratio of the polyphenols was very low. Next, anenzymatic conjugation of the polyphenols on poly(ε--lysine) has been examined. The conjugates were successfullysynthesized by the oxidation of the polyphenols using Myceliophthora laccase as catalyst in the presence ofpoly(ε-lysine). The antioxidant activity of the resulting conjugates was evaluated in terms of superoxide anion
scavenging activity. The conjugates greatly scavenged superoxide anions in a concentration dependent manner on
the polyphenol unit level, compared to the monomeric polyphenol. These data imply that the enzymatic conjugation
enormously improved the antioxidant property of the polyphenols. Additionally, the conjugates showed goodinhibitory effects toward disease-related enzymes, xanthine oxidase, collagenase, and hyaluronidase.

１． 緒

ール類の酵素的酸化を伴うカップリング、の二種類の方法

言を検討した。
②に関し、ポリ（ε-リジン）−クロロゲン酸コンジュゲ

緑茶をはじめとする食品に含まれるポリフェノール類は、優れた抗酸化性、抗ガン活性、抗菌性、抗炎症性、抗ウィートの合成を詳しく述べる。大気中、ポリ（ε-リジン）（0.64 g, ５ルス性などの種々の生理活性を有することが知られており、

mmol monomer unit）を蒸留水 20 ㎖に溶解させ、pH を 7動脈硬化などの成人病やガン発生を予防する機能性食品基に調整した。ここに２㎖のメタノールに溶解させたクロロ材として注目されている。一方、天然にはプロアントシアゲン酸（0.089g, 0.25mmol）を混合した。ラッカーゼ溶液

ニジンに代表されるポリフェノールオリゴマーが知られて（5μℓ, 5units）を添加することで反応を開始し、24 時間

おり、低分子ポリフェノール類とは異なる特異的な生理活

後、６N HCl 数滴を加え、10% メタノールを含む蒸留水性を示す。動脈硬化抑制作用、胃潰瘍抑制作用、大腸ガン中で透析することにより精製した（cut-off MW=500）。得

抑制作用、糖尿病合併症抑制作用などが見出されている。
一方、我々は低分子量ポリフェノール類を人工的に高分られた溶液を凍結乾燥し、0.38g のコンジュゲートを得た。
1H-NMR（DMSO-d6）: δ/ppm ＝ 1.0-2.0（br. CH2CH2CH2

子量化することで、ポリフェノールの機能向上・新機能発of PL），2.4-2.9（CH2），3.0-3.2（brε-CH2），3.2-3.6（br.

現を検討してきた 1 −８）。本研究ではシルクプロテインをCHOH），3.6-3.9（α-CH2），7.5-8.6（br. CH=CH，Ar-H），8.7-9.1（br.

始めとするタンパク質（ポリアミノ酸）へポリフェノールAr-OH）。ポリ（ε-リジン）−カフェ酸コンジュゲート、を導入し、その機能の増幅を調べた。

ポリ（ε-リジン）−緑茶カテキンコンジュゲートは同様に２．実合成した。

験３．結

ポリフェノール類としてはクロロゲン酸（ChA）、カフ果

ェ酸（CA）といったカルボン酸含有のポリフェノールと本研究の前半ではポリフェノールとしてクロロゲン酸と緑茶抽出カテキン（GTC）を用いた。幹ポリマーへのコカフェ酸を用いた。これらはコーヒーの独特の褐色、香り、ンジュゲート化は幹ポリマー側鎖のアミノ基を利用し、①味のもとになるものであり、抗酸化性、抗炎症性、抗アレ

ポリフェノールのカルボン酸間の脱水縮合、②ポリフェノルギー性などの様々な生理活性が知られている。コーヒーは 13 世紀半ば頃からアラビアを中心とするイスラム教のSynthesis of Silk Protein-Polyphenol
Conjugates and Evaluation of TheirProperties
Hiroshi Uyama
Depa rtment of Applied Chemist ry,
Graduate School of Engineering, OsakaUniversity

国々で愛飲され薬としても用いられたと言われており、後に欧州に伝わり現在では緑茶と並び世界中で広く飲用されている。近年ではコーヒーに肝臓がん予防効果があることなども報告されている。
最初にモデル反応として、合成ポリアミンの一種である分岐状ポリエチレンイミン（分子量 2 万）とカフェ酸の反−2−シルクプロテイン−ポリフェノールコンジュゲートの合成と機能評価応を検討した。水中でのペプチド結合形成に一般的に用いクロロゲン酸コンジュゲート（PL-ChA）の UV-vis スペられる縮合剤 1- エチル -3-（3- ジメチルアミノプロピル）

クトルを測定したところ、250 〜 450nm にポリリジンがカルボジイミド塩酸塩と縮合助剤 N- ヒドロキシスクシン

ほとんど吸収を示さないのに対し、コンジュゲート化によイミドを用いることで、カフェ酸が効率的に導入された（ポりクロロゲン酸に由来する吸収が見られた。カフェ酸におリエチレンイミンのアミノ基当たり数％の導入）。

いても同様の結果が得られた。ポリ（ε- リジン）へのクロスーパーオキシドアニオンは通常の好気性代謝などによロゲン酸とカフェ酸の導入率を元素分析により求めたとこって、生体内で常に生成している。そのひとつにキサンチ

ろ、7.4%（PL-ChA）と 8.1%（ポリ（ε-リジン）−カフェ酸ンがキサンチンオキシダーゼによって尿酸に変わる反応がコンジュゲート（PL-CA））であった。
得られたコンジュゲートの SOD 様活性を調べた（Fig. 1）。

ある。この過程で酸素が電子受容体として働くことで同時にスーパーオキシドアニオン（SOD）が発生する。そこで、クロロゲン酸、カフェ酸のいずれにおいてもポリペプチ

このキサンチン／キサンチンオキシダーゼ系を用いてスードへのコンジュゲート化により SOD 様活性が大きく向上

パーオキシドアニオンを発生させ、化学発光法で検出するした。また、コンジュゲート化ポリフェノールの DPPH

ことにより生成物のスーパーオキシドアニオン消去能、す（1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）ラジカルに対する消去能

なわち SOD 様活性を調べたその結果、カフェ酸に比較しを測定した。DPPH は天然には存在しないが、比較的安定てコンジュゲート化による機能の向上が見られなかった。

なラジカルであり評価が簡便なことから、抗酸化性の指標

次にシルクプロテインを用いて同様の反応を行ったが、カとしてよく用いられる。Table 1 に IC50 値として抗酸化性フェ酸の導入率が 1％以下であったため、酵素法によるポ機能を示す。これより、DPPH 消去能がコンジュゲート化リフェノール類のコンジュゲート化に切り替えて、狙いとにより低下することが明らかとなった。

するコンジュゲートの合成を試みた。

キサンチンオキシダーゼによりキサンチンから尿酸が生

クロロゲン酸とカフェ酸といったカルボン酸基含有ポリじる反応は、プリン体と呼ばれる共通構造を持つ物質が分フェノールを用いる酵素的コンジュゲート化を検討した。

解される最後の過程である。プリン体は体内の代謝によっ

幹ポリマーとしては、抗菌・静菌作用を有する食品基材て生成したり、またビールや動物性食品に含まれることでであるポリ（ε- リジン）を用いた。Myceliophthora 由来のも知られており、最終産物である尿酸が関節に蓄積するこ

ラッカーゼを触媒に用い、ポリフェノールをポリ（ε- リジとにより痛風などの症状を引き起こす。よってキサンチンン）（PL）にコンジュゲートさせた。ポリ（ε- リジン）−オキシダーゼの阻害物質はスーパーオキシドアニオンの生(a)100SOD-like activity (%)

SOD-like activity (%)

100806040200050100(b)80604020015005

Concentration (µM)

0100150
Concentration (µM)■:ChA, ●:PL- ChA■:ChA, ●:PL- ChA

Fig.1 SOD-like activity of PL-polyphenol conjugates: (a) chlorogenic acid; (b) caffeic acid.

Table1 Antioxidant property and enzyme inhibition activity of PL-polyphenol conjugates

ProductIC50 (μM)
DPPH scavenging

Collagenase inhibition

Hyaluronidase inhibition

Chlorogenic acid
PL-ChA18.4>30145>150

145
157

Caffeic acid
PL-CA17.3>30145
150

145
230−3−コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

成を抑制するとともに、尿酸の生成を阻害することによるに阻害活性が見られたが、その活性はモノマーと同程度あ痛風治療薬としても有用であると考えられる。Fig. 2 に本るいはそれ以下に留まった。

コンジュゲートのキサンチンオキシダーゼ阻害能を示した。

ヒアルロニダーゼは人間の肌や眼球、鶏のとさかに含まクロロゲン酸、カフェ酸のコンジュゲートは濃度に応じたれる保湿成分であるヒアルロン酸を分解する酵素である。

キサンチンオキシダーゼ阻害を示し、モノマーと同程度で真皮中に存在する酵素ヒアルロニダーゼは活性化して、かあるの阻害活性を示した。

ゆみ・ひりつき・毛細血管の拡張による赤み、むくみなど

マトリックスメタロプロテイナーゼは Zn を活性中心にの炎症を引き起こす。またヒアルロニダーゼは炎症時の血持つ酵素群であり、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロ管透過性を増加させることにより、アトピー性皮膚炎、アメリシンなどからなる。これらは細胞外マトリックスのタレルギー性鼻炎やじんましんなどの I 型アレルギー症状にンパク質を分解、再構築する酵素で、その恒常性を保つのも深く関わっており、抗炎症剤、抗アレルギー剤としてヒに重要な役割を果たしているが、その発現や活性のバランアルロニダーゼ阻害剤の開発が求められている。本研究でスが崩れると様々な病態が発症する。そのため近年、がん得られたコンジュゲートのヒアルロニダーゼ阻害能についや炎症、関節炎などに対し、マトリックスメタロプロテイて評価を行った（Table １）。その結果、コラゲナーゼ阻ナーゼをターゲットとした薬剤の開発に注目が集まってい害と同様に顕著な活性の増幅は見出されなかった。

る。同様に、微生物（Clostridium histolyticum）由来の次に緑茶抽出ポリフェノール（緑茶カテキン）のポリ（εコラゲナーゼについても多くの研究が行われている。この- リジン）へのコンジュゲートを試みた。緑茶に含まれる

微生物コラゲナーゼは基底膜の主成分であるⅣ型コラーゲ

カテキン類は最も豊富に存在しよく研究されている植物ポンを分解する酵素である。コラーゲンは骨、軟骨、皮膚、リフェノールの 1 つである。茶の木は Camellia sinensis

血管などに多く含まれ、体内の全タンパク質の 30% を占というツバキ科に属する植物で、その乾燥葉重量中に 10める。コラーゲンの衰えにより動脈硬化、関節痛、肌あれ、〜 15% のカテキン類が含まれる。中国や日本では古くか

シミ・しわなどの症状が現れる。よって、これらの症状をら健康によいとされ、嗜好品としてだけでなく様々な疾患予防するためのコラゲナーゼ阻害剤の研究が盛んに行われに対する民間療法として緑茶が飲用されてきたが、その薬ており、ポリフェノール類もそのひとつである。そこで本効の多くがこのカテキン類によるものであると考えられる。

研究で得られたコンジュゲートのコラゲナーゼ阻害能につ緑茶カテキンの主成分の構造を Fig. 3 に示す。本研究ではいて評価を行った（Table１）。その結果、コンジュゲート緑茶カテキンとして三井農林製ポリフェノン 70S を用いた。

100(a)

80

Inhibition activity (%)

Inhibition activity (%)

10060402000100200300
Concentration (µM)(b)

806040200-200■:ChA, ●:PL- ChA
Fig. 2HOOHOOHOHOOHOHOHOOHOHOHOHOOHOHepicatechin■:ChA, ●:PL- ChA

XO inhibition activity of PL-polyphenol conjugates: (a) chlorogenic acid; (b) caffeic acid.
OHHO

100
200
300
Concentration (µM)

OH

OH

OH

epigallocatechin gallate
Fig. 3OOHOHOOH

OOH
OHepigallocatechin

Structure of typical catechin derivatives in green tea

−4−O

HOOH

OH

epicatechin gallateシルクプロテイン−ポリフェノールコンジュゲートの合成と機能評価

コンジュゲートの合成はカフェ酸、クロロゲン酸の場合については、緑茶カテキン、ポリ（ε- リジン）−緑茶カと同様にラッカーゼ触媒を用いて行った。得られたポリ（εテキンコンジュゲートともに低濃度で効果的に消去された。

- リジン）−緑茶カテキンコンジュゲート（PL-GTC）に

DPPH についてはコンジュゲート化により緑茶カテキンよおける緑茶カテキンの導入率は 3.4mol% であった。

り抗酸化性が低下したが、ABTS に対しては抗酸化性が抗酸化性評価の尺度として、上述の DPPH 消去能とSOD 様活性以外に、安定カチオンラジカル（2,2’ -Azino-bis向上した。SOD 様活性については、コンジュゲート化による著しい向上が見られた。

（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS）に対するポリ（ε-リジン）−緑茶カテキンコンジュゲートの酵素消去能を測定した。評価結果を Table2 に示す。比較とし阻害活性について調べたところ、キサンチンオキシダーゼ、て工業的に用いられている抗酸化剤である BHT や Trolox

コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼのいずれに対しても、コンの抗酸化性を示した。DPPH ラジカル、ABTS ラジカル

ジュゲート化により阻害活性が大幅に向上した（Fig.４）。

Table２ Antioxidant activity of PL-GTC conjugate
Radical scavenging activity（IC50 ( μM））

ProductDPPH

ABTS

Superoxide anion

Green tea catechin
PL-GTC conjugate

7.2
16.9

5.2
4.4

55.8
4.6

BHT
Trolox−24.8−−>>200
155100(a)Inhibition activity (%)

Inhibition activity (%)

10080
60
402000100200
Concentration (µM)■:GTC, ●:PL- GTC

Inhibition activity (%)

10080
6040200300(b)050100Concentration (µM)■:GTC, ●:PL- GTC(c)8060402000100200
Concentration (µM)

300■:GTC, ●:PL- GTC
Fig. 4

Enzyme inhibition activity of GTC and PL-GTC conjugate for: (a) xanthine oxidase;(b) collagenase; and (c) hyaluronidase−5−150コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

これらの結果から、緑茶カテキンの機能向上にポリペプチカフェ酸、緑茶といったポリフェノール類に拡張できるこドへのコンジュゲート化が有効であることがわかった。ことが明らかとなり、得られたポリフェノール含有コンジュの結果はカフェ酸、クロロゲン酸のコンジュゲート化と異ゲートには機能材料としての応用が期待される。

なり、緑茶カテキンに特有の現象である。

４．考（参考文献）

察１）M. Kurisawa, J. E. Chung, Y. J. Kim, H. Uyama, and

本研究ではカフェ酸、クロロゲン酸、緑茶カテキンとい

S. Kobayashi, Amplification of Antioxidant Activity andったポリフェノール類のタンパク質へのコンジュゲート化

Xanthine Oxidase Inhibition of Catechin by Enzymaticを試みた。ポリフェノールのカルボン酸基を利用したコン

Polymerization, Biomacromolecules, 4, 469-471 (2003).

ジュゲートではモデル系で反応の進行を確認できたが、ア２）M. Kurisawa, J. E. Chung, H. Uyama, and S.

ミノ基（リジン残基）の少ないシルクプロテインでは、十Kobayashi, Enzymatic Synthesis and Antioxidant

分な反応の進行を達成できなかった。また、シルクプロテ

Properties of Poly(rutin), Biomacromolecules, 4,

インは可溶型サンプルの分子量が高くなく（数千程度）、1394-1399 (2003).

そのことが収率と導入率の低下につながっていると思われ

３）M. Kurisawa, J. E. Chung, H. Uyama, and S.
Kobayashi, Oxidative Coupling of Epigallocatechinる。
一方、酵素法については、モデルポリマーであるポリ（ε-リGallate Amplifies Antioxidant Activity and Inhibits

ジン）に対するポリフェノールの導入法が確立できた。ラXanthine Oxidase Activity, Chem. Commun., 294-295

ッカーゼの添加により空気酸素を用いた酸化が利用できる(2004).

ために、コンジュゲート体合成の操作は極めて簡便である。

４）Y. J. Kim, J. E. Chung, M. Kurisawa, H. Uyama, and

また、抗酸化性や酵素阻害活性が見出されたことから、実S. Kobayashi, New Tyrosinase Inhibitors, (+)-Catechin-用的香粧品基材としての可能性が示された。

Aldehyde Polycondensates, Biomacromolecules, 5,474-479 (2004).

活性酸素やフリーラジカルによる酸化傷害は種々の疾病や発がん、老化と密接に関わっている。酸化ストレスは、

５）Y. J. Kim, J. E. Chung, M. Kurisawa, H. Uyama,

細胞の DNA、細胞膜上のリン酸脂質、蛋白、糖質を傷害

and S. Kobayashi, Superoxide Anion Scavenging and

し、老化や血管傷害、脳障害、がんなどを進行させる。こXanthine Oxidase Inhibition of (+)-Catechin-Aldehyde

うした酸化ストレスから体を防御して体を錆びつくのを防Polycondensates. Amplification of Antioxidant Property

止するために、優れた抗酸化作用を有する食品や医薬品がof (+)-Catechin by Polycondensation with Aldehydes,必要とされる。現在、緑茶カテキンをはじめとするポリフ

Biomacromolecules, 5, 547-552 (2004).

ェノール類は飲料やサプリメントなどの健康食品として用６）Y. J. Kim, H. Uyama, and S. Kobayashi, Inhibition

いられているが、さらに機能を高めることにより疾患を治Effects of (+)-Catechin-Aldehyde Polycondensates

療する製剤などへの積極的な利用が期待される。その観点

on Proteinases Causing Proteolytic Degradation ofから本研究で開発したポリ（ε- リジン）には機能性食品、Extracellular Matrix, Biochem. Biophy. Res. Commun.,

予防薬への用途が想定される。

320, 256-261 (2004).
７）N. Ihara, S. Schmitz, M. Kurisawa, J. E. Chung, H.

５．まとめ

Uyama, and S. Kobayashi, Amplification of Inhibitory

本研究では、主に酵素を触媒に用いたクロロゲン酸、カActivity of Catechin against Disease-Related Enzymes

フェ酸、緑茶カテキンのポリ（ε- リジン）へのコンジュ

by Conjugation on Poly(ε-lysine), Biomacromolecules, 5,ゲート体の合成と機能評価を行った。コンジュゲート化に

1633-1636 (2004).

よりスーパーオキシドアニオン消去能が著しく向上し、キ８）N. Ihara, M. Kurisawa, J. E. Chung, H. Uyama, andサンチンオキシダーゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ

S. Kobayashi, Enzymatic Synthesis of a Catechinといった疾患関連酵素に対する阻害能が見出された。これ

Conjugate of Polyhedral Oligomeric Silsesquioxane andらの結果から、我々が先に見出したポリフェノール類の高Evaluation of Antioxidant Property, Appl. Microbiol.

分子量化による生理活性の増幅という手法をクロロゲン酸、Biotechnol., 66, 430-433 (2005).

−6−