逆ミセルの微細構造を利用した生理活性物質内包型ナノカプセルの創製
九州大学大学院

小工学研究院化学工学部門

野努

Reversed micelles and water-in-oil microemulsions can disperse nano-size water droplets in a polar solvents. The nanowater droplets stably solubilize biomolecules such as proteins, peptides and DNA, and the size is controllable by adjustingwater contents. On the other hand, the sol-gel method is a low temperature process widely used to produce opticallytransparent, microporous glasses by the polycondensation of liquid phase alkoxide precursors. Reversed micellar solution
facilitates forming nano-size glasses in the hydrophilic core containing bioactive molecules. The hydrophilic nano sphereis favorable for solubilizing biomolecules and for hydrolysis of the alkoxide precursors. To create a novel nano carrier forbioactive materials, therefore, my strategy is based on the sol-gel encapsulation of the nano-size water droplets solubilizing
biomolecules. Transmission electron microscope (TEM) observation shows that nano particles can be produced by theAOT and NP-5 reversed micellar droplets. The monodispersed particles with 10 - 20 nm diameter were obtained. However,in fact, almost all the immobilized protein preparations we obtained are a micro-size aggregate of the nano particles. Inaddition, the protein encapsulation profiles indicate that proteins solubilized in reversed micelles are completely incorpolated
into them with the growth of silica particles. The efficiency of protein encapsulation into the nano silica particles depends
on the water droplet pH, Wo value (= [water]/[surfactant]), and the composition of alkoxide precursors. It seems thatthese factors affected not only the surface condition of cytochrome c but also the sol-gel processing. The encapsulated
cytochrome c and subutilisin Carlsberg in nano silica particles retain their catalytic activities. Subtilisin Carlsberg entrappedin nano silica particles shows 40-fold greater transesterification activity than any other immobilized subtilisin Carlsberg.
Protein encapsulation in silica gel prevents from denaturing protein by organic solvent. Molecular isolation of proteins in
nano silica particles enhances the effective enzyme quantity and the surface area to contact with bulk substrate solution.
These effects facilitate the high performance of subtilisin Carlsberg entrapped in nano silica particles for transesterification
reaction in organic media. Hereafter we will develop new nanocapsules including biomolecules with high dispersibility
and good reactivity.

１． 緒

ドラッグキャリアとして、またナノカプセル表層へのター

言

ゲティング機能の付与することにより、目的細胞への特異生命活動を司る酵素や核酸はナノレベルの機能性分子で的な遺伝子導入やサイトカイン放出が期待できる２）。

あり、医療、美容、触媒など今後更に広い範囲で利用されこのようなナノキャリアを創製するために、筆者は有機ている。そのため、これらの極めて特異的な機能を様々な溶媒中で特殊な界面活性剤が自己組織化によって形成する媒体へ安定かつ高効率に適応させるための手法は、今後重逆ミセルのナノオーダーの微小水滴核に着目し、この微小要な技術になると期待される。近年、「ナノテクノロジー」

水滴核にバイオ分子を可溶化した後に外部からマトリクスと呼ばれる分野が世界的規模で注目されるようになってい形成因子となるシリカ前駆体を投入し、高効率でバイオ分るが１）、本研究もナノスケールのバイオ分子を効率よく使子を包括したナノカプセル調製法を提案している。既往のいこなすためのデザインという面で、広義のナノテクノロ研究において、逆ミセル内で金属アルコキシドなどのゾルジーと言えるであろう。

−ゲル反応を行うことによって、金属触媒を担持するシリ従来の生理活性物質包括担体は小さいものでもマイクロカ微粒子３､ ４） や半導体への応用を目指した金属酸化物のスケール（10 - ６m オーダー）の担体であり、回収・再利用性

ナノ微粒子調製５､ ６）あるいは単なるナノシリカ微粒子調製に長けてはいるものの極めて高価なバイオ分子を効率よく７〜 10）利用することには十分でなく、生体への適応範囲も限定さ

ル−ゲル反応は穏和な条件で生体物質を包括固定化できるれてしまう。これに対して、ナノカプセルはそのサイズか手法として知られている 11､12）。それ故、生体分子の可溶ら角質層間隙へも浸透できるほどであり、安定に包括した化能力に優れた逆ミセルの微小液滴 13）をゾル−ゲル反応のツールとして利用されている。また一方、低温ゾでカプセル化することによって、極めて効率的な生体分子
Development of nano particles
encapsulating bioactive molecules by using
microstructure of revesed micelles
Tsutomu Ono
Department of Chemical Engineering,
Faculty of Engineering, Kyushu University

包括法となることが期待される。
本研究では、逆ミセルに可溶化したタンパク質分子がいかにして効率よくナノカプセルに包括されるかを、AOT 逆ミセルの微小液滴におけるシトクロム c の包括挙動について検討した。また包括されたタンパク質（酵素）の触媒特性に関しては、NP-5 逆ミセルを用いて調製したナノシリ－2－

逆ミセルの微細構造を利用した生理活性物質内包型ナノカプセルの創製

カ包括 subtilisin Carlsberg を用いて Wo 値の影響や他のトクロム c の酵素活性を測定した。

固定化酵素との比較を行った。

２． 実

２−５．包括 subtilisin Carlsberg の酵素活性測定

験エステル交換反応実験は、0.2M 酢酸ビニルと 0.02M ベ

２−１．試薬ンジルアルコールを含むシクロヘキサン溶液中へ調製し包括実験のモデルタンパク質として Horse hea r t cyto-

たナノカプセル包括 subtilisin Carlsberg 標品を分散させ、chrome c（分子量 12,384，Sigma 社製）、ナノ微粒子包括固定化

反応温度 35℃で往復振盪器で振盪させながら行った。所

酵素の実験のモデル酵素として Bacillus licheniformis 由

定反応時間後の試料中の生成物濃度をガスクロマトグラフ

来の subtilisin Carlsberg を精製等をせずそのまま用いィー（Shimadzu GC-14B）によって測定して初期反応速た。シリカゲル前駆体としては、東京化成工業社製のテト度および反応率を求めた。

ラメトキシシラン（TMOS）、メチルトリメトキシシラン（MTrMOS）、ジメチルジメトキシシラン（DMDMOS）、２−４．透過型電子顕微鏡（TEM）による観察

アミノプロピルトリメトキシシラン（APTrMOS）を用いゾルゲル反応を開始して 24 時間後の溶液サンプルをマた。また、逆ミセル構成因子である界面活性剤には、ジイクログリッド上の垂らし、十分乾燥させた後に、日本電-2- エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム（AOT）と子製透過型電子顕微鏡（JEM-200CX，加速電圧 200kV）非イオン性界面活性剤であるポリエチレングリコールモノを用いて観察を行った。

-4- ノニルフェニルエーテル（NP-5）を用いた。酵素活

３． 結性測定用の基質には、東京化成工業社製の（2,2'-Azinodi（2-Ethyl Benzthiazoline Sulfonic Acid））Diammonium Salt

果３−１．シトクロムｃのナノカプセル中への包括（ABTS）、酢酸ビニル、ベンジルアルコールを用いた。

シトクロム c を溶解させた逆ミセル内相の pH を 4, 8,12 としたときのシトクロム c の包括挙動を Figure 1 に示

２−２．タンパク質含有ナノ微粒子の調製した。また、それぞれの pH で調製されたシトクロム c 含タンパク質に Tris-HCl 緩衝液と 250mM AOT/ イソオ

有シリカ微粒子の TEM 写真を Figure 2 に示した。

クタン溶液あるいは NP-5/ シクロヘキサン溶液を添加し、Fig.1 より、pH が高くなるほどシトクロム c の包括が早所定の Wo（=[H2O]/[Surfactant]）値となるタンパク質含くなることが明らかである。また、調製時の pH が高くな有逆ミセル溶液を調製した。シトクロム c の最終的な溶るにつれて、得られたシリカ微粒子の粒径も大きくなるこ

液濃度は 0.2 ㎎ / ㎖になるように、subtilisin Carlsberg はとが TEM 観察の結果明らかとなった。（Figure 2）。上記10 ㎎ / ㎖となるように設定した。これらの逆ミセル溶液

pH 領域では、シトクロム c の電荷状態も大きく変化してへ 150mM となるようにシリカ前駆体を溶解させ、恒温往微細空間を形成する界面活性剤である AOT との相互作用復振盪器（25℃）で所定の反応時間インキュベーションすにも大きな影響を与えると考えられる。しかしながら、いることによってゾル - ゲル反応を進行させてシリカ微粒子の成長を促した。所定時間後、3,500rpm, 10min の遠心分離によって調製されたシリカ微粒子を沈殿物から回収した。
シトクロム c の包括率は、このときの上澄み液のシトクロムc 濃度とシリカ前駆体投入前の逆ミセル溶液中のシトクロム c濃度と比較して算出した。シトクロム c 濃度の測定は、分光光度計（Shimadzu UV-2500PC）により 408 nm の吸光度より求めた。遠心分離によって回収されたナノシリカ微粒
子包括 subtilisin Carlsberg は、24 時間凍結乾燥させ、得られた標品を各種水分活 a W= 0.44 を有する飽和 KCO3 溶液で 24 時間水和処理して反応実験に用いた。

２−３．包括シトクロム c の酵素活性測定
遠心分離によって回収したナノカプセル包括シトクロムc は、24 時間凍結乾燥させ、得られた標品を所定濃度のABTS 水溶液へ再分散させて、過酸化水素添加後における ABTS の吸光度の時間変化から、ナノカプセル包括シFigure 1. Effect of pH on the cytochrome c encapsulation in
nano-silica particles prepared by AOT reversed micelles.

−3−Figure 2. TEM images of nano silica particles prepared byAOT reversed micelles: (A) pH 4, (B) pH 8, (C) pH12.

Figure 3. Effect of Wo value, the molar ratio of water to surfactant in reversed micellar solution, on the cytochromec encapsulation in nano-silica particles prepared by AOT
reversed micelles.

ずれの pH においてもほぼ 100% のシトクロム c がシリカ微粒子内に包括されており、シトクロム c 非存在下でもほ逆ミセル液滴を利用して、subtilisin Carlsberg を包括しぼ同様の粒子成長過程を示すことから、各 pH におけるシたナノシリカ微粒子を調製した。NP-5 逆ミセルによってトクロム c の包括挙動は、主にシリカゲル微粒子の成長速調製されたナノシリカ微粒子は、AOT 逆ミセルで調製さ度によって支配されていると考えられる。

れたナノシリカ微粒子に比べて単分散性が高く、本実験でFigure 3 にはシトクロム c の包括率に及ぼす Wo 値の影

は平均粒径が約 13 nm の単分散シリカ微粒子が調製でき響を示した。溶液中の界面活性剤濃度に対する水分子濃度る条件で subtilisin Carlsberg を包括した。酢酸ビニルととして定義される Wo 値は、逆ミセル溶液の特徴を示す数ベンジルアルコールのエステル交換反応において、同量の値としてしばしば用いられる。界面活性剤濃度一定な逆ミsubtilisin Carsberg を用いて調製したその他の固定化酵素

セル溶液中で水分量が増加すると（すなわち、Wo 値が増に比べて、ナノシリカ包括 subtilisin Carlsberg では約 40加すると）、逆ミセルは各分子集合体の数を増やすのでは倍ほど初期反応速度が高いことが明らかとなった（Figureなく、分子集合体が抱える微小水滴核の径を増加させるこ4）。また Fig.4 の挿入図より、通常の酵素反応と同様の反とになる。既往の実験事実より、Wo 値と逆ミセル半径に応挙動を示し、24 時間で約 80％近くの生成物を与えてい14）は一次の相関があることが知られている 。本実験結果では、ることも明らかである。
粉末酵素よりも凍結乾燥処理で有機溶媒中での酵素活性Wo 値が小さい場合に、すなわち逆ミセルのサイズが小さい場を大きく向上することができるという報告 15, 16）もあるが、ナ合に、より迅速にシトクロム c の包括が達成されている。
また、無機シリカ前駆体である TMOS と有機シリカ前駆ノシリカ包括酵素はそれよりも非常に高い酵素活性を示すこ

体 で あ る MTrMOS や DMDMOS あ る い は 表 面 電 荷 をとができた。また、セライトのような無機担体に吸着させたカチオン性に変えるアミノ基含有シリカ前駆体である

場合よりも高い酵素活性を示し、さらに酵素なしで調製した

APTrMOS を混合して調製したハイブリッドナノシリカ

ナノシリカ微粒子にその後酵素を吸着させたナノシリカ微粒カプセルに関する検討も行ったが、シトクロム c 包括挙動

子吸着 subtilisin Carlsberg よりも大幅に高い初期反応速にはほとんど影響を与えなかった。さらに、包括されたシ度を得たことから、ナノシリカ微粒子内へ包括することによトクロム c は、ナノカプセル内の包括後もペルオキシダーって有機溶媒による失活を抑制されていることが酵素活性ゼ様の酵素活性を十分に維持していることが、ABTS をの大幅な向上に影響していると考えられる。さらに、N P-5用いた実験より明らかとなった。

逆ミセル溶液中における均一反 応系よりもナノシリカ包 括
subtilisin Carlsberg の不均一反応系の方が触媒活性の点で３−２．ナノカプセル包括 subtilisin Carlsberg の触媒特性非イオン性界面活性剤である NP-5 によって形成された勝っているところは、酵素分子への基質のアクセシビリティーが原因になっていると思われる。逆ミセルの液滴中へ可溶−4−逆ミセルの微細構造を利用した生理活性物質内包型ナノカプセルの創製

Figure 5. TEM images of the aggregate of nano silica particles prepared by NP-5 reversed micelles.
Figure 4. Transesterification activity of sublitilin Carlsberg immobilized by various method. Modes of immobilization of sublitisin Carlsberg: a, without immobilization (powder enzyme);b, lyophilized from aqueous buffer; c, solubilized into reversed
micelles; d, attached onto Celite 545; e, attached onto nanosilica particles; f, encapsulated in nano silica particles. Inset,
the time course of the product concentration from transesterification by subtilisin Carlsberg encapsulated in nano silica
particles are shown. Initial concentration of vinyl acetate andbenzyl alcohol are 0.2 M and 0.02 M, respectively.

化した subtilisin Carlsberg は、周囲を水と界面活性剤層で覆われているために求核種であるベンジルアルコールの接近が強く抑制された結果、エステル交換活性はナノシリカ包括subtilisin Carlsberg よりも低くなったと推察される。上記のように有機溶媒による失活抑制は、ナノシリカ包括 subtilisin
Carlsberg が高い酵素活性を示す大きな要因のひとつと考えられるが、ナノシリカ微粒子に酵素を包括することでさらにもうひとつの大きな効果が得られていることも示唆されている。
Fig u re 5 は遠心分離によって回収された凝集物を T EM で観察したものであり、多数のナノシリカ微粒子が連結して多孔Figure 6. Effect of water content, Wo, on the transesterification activity of sublitilin Carlsberg encapsulated in nanosilica particles.

性の凝集物となっていることがわかる。この結果から、ナノシリカ包括酵素は、膨大な表面積を獲得することで埋没によ

解とその加水分解によって生じるシラノール基間の重縮合反る酵素の無効化を防ぎ、酵素へのアクセシビリティーも向上

応によって三次元シリカマトリックスが形成され、そのうち、させたことも今回の活性向上の大きな要因であると考えるこ重縮合反応はアルカリ性において促進されることが知られてとができる。

いる。従って、今回得られた実験結果より、シトクロム c のFigure 6 ではナノシリカ包括 subtilisin Carlsberg のエス

包括挙動はシリカゲルの形成と密接に関係していることが示

テル交換活性に与える微粒子調製時の Wo 値の影響を示し唆された。逆ミセル液滴内の pH が高くなるにつれて、ゾルた結果である。その結果、Wo<5 においては極めて低いエス−ゲル反応の進行が促進され、それによってシリカ粒子の成テル交換活性を示した。これに対して、Wo>5 で調製された長が進むとともに、逆ミセルの液滴交換時におけるシリカ粒

ナノシリカ包括 subtilisin Carlsberg はほぼ一定の触媒活性子の合一も盛んになることが Fig. 2 より明らかである。シリを示している。

カ微粒子どうしの合一によって、溶液中に均一に分散できる

４．考

ナノシリカ微粒子としては存在が難しくなるが、タンパク質を察包括したシリカ微粒子凝集体（Fig. 5）はナノシリカ微粒子の一般に、ゾル−ゲル反応はケイ素アルコキシドの加水分性質を残しているため、固定化された酵素による反応実験の−5−

際にはその固定化状態が大きく反映された結果となった（Fig.

上を達成できれば、均一系でありながら生体分子とは異な4）。ナノシリカ包括酵素は、粉末酵素や凍結乾燥処理酵素る表面特性を有した生体分子溶液を調製できる。固定化担と同様に有機溶媒中で不均一系を呈している。しかしながら、体に生分解性や徐放性のような機能を付与することによっ粉末酵素や凍結乾燥処理酵素が多数の酵素分子の凝集体でて、サイトカイン徐放特性を有した培地などの開発が可能あり埋没してるがゆえ有効に酵素機能を発揮できない酵素のとなる。

割合は極めて多いと考えられるが、ナノシリカ包括酵素のなお本実験結果から、生体物質の包括挙動はする逆ミセ

場合は各逆ミセル液滴中に酵素分子を分散して固定化されルの性質だけでなく、シリカゲル形成および成長挙動と深ており、得られた凝集体は多孔性の極めて大きな表面積をく関連していることが示唆されており、効率的な生体物質有した固定化酵素となっている点で、ナノスケールで包括の包括方法に関してはさらなる詳細な検討が必要であろして効果が明瞭に現れている。

う。

また、逆ミセルの形状に大きく影響を与える水分量（Wo

生理活性物質内包型ナノカプセルは、そのサイズから皮値）は、包括挙動においては顕著な違いを示したが、包膚中の細胞層に対して効率よく浸透することが可能であ括された subtilisin Carlsberg の酵素活性にはそれほど大り、そこで内包する生理活性物質の効果を発揮させることきな影響を与えることはなかった。ただし、Fig. 3 およびが期待できる１）。それゆえ、本技術を利用して高機能性皮Fig. 5 の結果からみると、Wo=5 付近で包括挙動、酵素活膚浸透キャリアの開発や生体内の患部へとドラッグターゲ性ともに良好な結果が得られている。一般に、ゾル−ゲルティングを行うナノキャリアの開発へと研究を展開したい反応が油水界面近傍で開始すると考えられており、タンパと考えている。

ク質周辺においてゾル−ゲル反応が進行することが可能な
逆ミセル径の小さな Wo =5 の系で最も効率的に包括が行（参考文献）

われているためだと推察されるが、現在のところその詳細

１） 川合知二 監修：図解 ナノテクノロジーのすべて，工については不明である。

業調査会

これより低水分量の逆ミセル液滴中でゾル−ゲル反応を

２） Lawrence MJ, Rees GD : Microemulsion-based media

行った場合には、シリカ微粒子の成長は小さく、凝集体をas novel drug derivery systems, Adv. Drug Derivery

形成するには不十分であったと考えられる。Wo<5 の逆ミRev., 45, 89-121, 2000.

セルにおいては、液滴中の水分子はほとんどが界面活性剤

３） Blum J, Avnir D, Schumann H : Sol-gel encapsulatedによる相互作用によって束縛されており、通常の水分子とtransition-metal catalysts, 1999, 32-38, 1999.

異なる性質を有していると言われており、ゾル−ゲル反応４） K i s h i d a M , H a n a o k a T , K i m W Y , N a g a t a H ,の進行にも何らかの影響を及ぼしていると考えられる。

Wakabayashi K : Size control of rhodium particles

５．総of silica supported catalysts using water-in-oil

括microemulsion, Appl. Surf. Sci., 121/122, 347-350,
1997.

本年度の研究成果より、逆ミセルのナノスケールの微細構造を利用することによって、生体分子であるタンパク質

５） Kawai T, Usui Y, Kon-no K : Synthesis and growth

をナノシリカ微粒子内に包括することが可能であることがmechanism of GeO2 particles in AOT reversed micelles,明らかとなった。さらにナノシリカカプセル内に包括されColloids Surf. A, 149, 39-47, 1999.

たタンパク質は本来の触媒機能を保持しており、ゾル−ゲ

６） Pileni MP, Tanori J, Filankembo A : Biomimetic

ル反応を経て安定にシリカ微粒子内に包括固定化されるこ

strategies for the control of size, shape and self-とが明らかとなった。しかしながら、実際に得られている

organization of nanoparticles, 123/124, 561-573, 1997.

タンパク質固定化シリカゲルは、これらのナノカプセルの

７） Arriagada FJ, Osseo-Asare K : Phase and dispersion凝集物であり、溶液中に均一に分散できるほどの細かなサ

stability effects in the synthesis of silica nanoparticles

イズではないことも同時に明らかとなった（Fig. 5）。たin a non-ionic reverse microemulsion, Colloids Surf., 69,

だ、多孔性の固定化酵素としては極めて有効であることが105-115, 1992.

subtilisin Carlsberg の触媒特性から示された。今後はナノ

８） Arriagada FJ, Osseo-Asare K : Synthesis of nanosize

カプセル形成後の各粒子間の凝集を巧みに制御することがsilica in Aerosol OT reverse microemulsions, J. Colloid

必要であり、目的に応じてナノカプセルのモルフォロジー

Interf. Sci., 170, 8-17, 1995

を設計することも極めて重要であることが示唆されたこと

９） Osseo-Asare K, Arriagada FJ : Growth kinetics ofとなる。生理活性物質内包型ナノシリカカプセルの表面化

nanosize silica in a nonionic water-in-oil microemulsion:

学修飾によって凝集力の抑制を行い、溶液への分散性の向A reverse micellar pseudophase reaction model, J.

−6−

逆ミセルの微細構造を利用した生理活性物質内包型ナノカプセルの創製

13） Ono T, Kawakami K, Goto M, Furusaki S : Catalytic

Colloind Interf. Sci., 218, 68-76, 1999
10） Arriagada FJ, Osseo-Asare K : Synthesis of nanosize

oxidation of o-phenylenediamine by cytochrome csilica in a nonionic water-in-oil microemulsion: Effects

encapsulated in reversed micelles, J. Mol. Catal. B., 11,of the water/surfactant molar ratio and ammonia

955-959, 2001.

concentration, J. Colloid Interf. Sci., 211, 210-220,

14） Pileni MP, Zemb T, Petit C : Solubilization by
reverse micelles: Solute localization and structure

1999.
11） F u r u k a w a S , O n o T , I j i m a H , K a w a k a m i K :perturbation, Chem. Phys. Lett., 118, 414-420, 1985.

Enhancement of activity of sol-gel immobilized lipase in15） Klibanov AM : Enzymatic catalysis in anhydrous

organic media by pretreatment with substrate analogues,organic solvents, Trends Biochem. Sci., 14, 141-144,J. Mol. Catal. B., 15, 65-70, 2001.

1989.

12） Edmiston PL, Wambolt CL, Smith MK, Saavedra16） Ke T, Klibanov AM : On Enzymatic activity in organic

SS : Spectroscopic Characterization of albumin andsolvents as a function of enzyme history, Biotechnol.

myoglobin entrapped in bulk sol-gel glasses, J. Colloid

Bioeng., 57, 746-750, 1998.

Interf. Sci., 395-406, 1994.

−7−