オリゴアルギニン固定化高分子と生体膜との相互作用の科学的検証

摂南大学薬学部薬剤学研究室

佐久間信 至We have been investigating cell-penetrating peptide-linked polymers as a new class of penetration enhancers. Cellpenetrating peptides are cationic oligopeptides such as oligoarginine and penetratin and they are internalized into cells via
macropinocytosis. We designed a novel polymer: poly (N-vinylacetamide-co-acrylic acid) (PNVA-co-AA) modified witholigoarginine, with the expectation that the polymers would enable poorly membrane-permeable molecules physically
mixed with them to effectively penetrate cell membranes without their concomitant cellular uptake. Here, we evaluated theperformance of D-octaarginine-linked PNVA-co-AA on cell membranes. When cultured Caco-2 cells were incubated with
5(6)-carboxyfluorescein (CF), about 0.1% of applied CF was internalized into the cells during a 30-min experiment. This
poor membrane permeability was dramatically enhanced by the D-octaarginine-linked polymers. A similar enhancement
was observed when anionic CF was substituted with cationic atenolol and nonionic FITC-dextran. None of the individualcomponents had any influence on CF uptake, demonstrating that only D-octaarginine anchored chemically to the polymericplatform enhanced the membrane permeation of CF. The polymer-enhanced CF uptake was consistently high evenwhen the incubation time was extended to 120 min. Confocal laser scanning microphotographs of cells incubated with
D-octaarginine-linked polymers bearing rhodamine red demonstrated that the cell outline was stained with red fluorescence.
The polymer-enhanced CF uptake was significantly suppressed by 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride, which is an inhibitorof macropinocytosis. Results indicated that D-octaarginine-linked polymers remained on the cell membrane and poorly
membrane-permeable molecules were continuously internalized into cells mainly via macropinocytosis repeated for theindividual peptidyl branches in the polymer backbone without the concomitant cellular uptake of the polymers.

１．緒

このような中、現状を打破する可能性を秘めた DDS キ

言

ャリアとして、HIV ウイルスの感染機構の研究中に見出さ1）れた細胞膜を容易に透過するタンパク質をベースに開発さ経口、経鼻などの非侵襲的ルートを介して生体に投与されれた膜透過ペプチドが精力的に研究されている 6）。膜透過た薬物は、膜透過過程を経て全身循環血へ移行し、作用部ペプチドは塩基性アミノ酸を多く含む 10 残基程度のカチ位へ運ばれた後、治療効果を発揮する。しかし、生体膜はオン性オリゴペプチドであり、代表的なものとしてオリゴ不必要な分子の侵入を防ぐ障壁であり、生体にとって異物アルギニン、ペネトラチンなどが知られている。これらのである薬物の膜透過性は概して低い。

ペプチドは、主にマクロピノサイトーシスにより細胞内に薬物は、さまざまな経路を介して生体に投与される 。

膜透過促進は、コントロールドリリース、ターゲティン

取り込まれる 7）。マクロピノサイトーシスとは、細胞が本グと並ぶ DDS 研究の主課題である 2）。低膜透過性分子の来備えている貪食作用の 1 つであり、負電荷の細胞膜表面細胞膜透過性を改善して細胞内へ効率的にデリバリーするとの静電的相互作用により膜表面に濃縮された正電荷の分DDS 的手法は、脂溶性の改善やトランスポーターによる子が細胞内に取り込まれる現象をいう（Fig. 1）。
膜透過ペプチドを用いた細胞膜透過促進手法に関して、認識などを利用したプロドラッグ、吸収促進剤などを用いて共存する低膜透過性分子の膜透過性を改善する物理混合

低膜透過性分子を膜透過ペプチドに化学結合させたプロド物に大別される 3−4）。現状、実質的な選択肢は前者であり、ラッグが広く研究されている 8）。この手法の場合、細胞膜

後者については、膜透過促進剤としてカプリン酸ナトリウを透過しない核酸も細胞内にデリバリーできることが報告

ムを処方したアンピシリン及びセフチゾキシムの坐剤が上されている。一方、細胞内でプロドラッグからペアレント市されているのみである 5）。一方、前者についても、技術ドラッグが放出されなければ薬効は発現せず、この点が本の普遍性を欠く限定的なものであり、膜透過促進技術の開手法の解決すべき課題となっている。負電荷の低膜透過性発は困難を極めている。

分子と正電荷の膜透過ペプチドを静電的に相互作用させた物理混合物も研究されている 9）。調製方法は簡便であるが、Performance of oligoarginine-linked
polymers physically mixed with poorly
membrane-permeable molecules on cell
membranes

膜透過促進作用を獲得するためには静電的相互作用が不可Shinji Sakuma
Department of Pharmaceutics, Facultyof Pharmaceutical Sciences, Setsunan
University

胞内に取り込まれた時点で膜透過促進作用が消滅するため、欠であり、負電荷の低膜透過性分子に限定された手法である。さらに、膜透過ペプチドが低膜透過性分子とともに細同分子の持続的な取り込みが期待できない。膜透過ペプチ
ドを表面に固定化した微粒子に低膜透過性分子を内包させ− 81 −コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013たキャリアも研究されている 10）。ウイルスベクターに代わる。低膜透過性分子を同高分子と混合して生体膜上に適用る安全な遺伝子デリバリーキャリアとして期待されている

すると、ペプチド鎖の近くに存在する低膜透過性分子は偶が、導入効率の向上が解決すべき課題となっている。

発的に細胞内に取り込まれる。オリゴアルギニン固定化高

このような現況下、我々は、オリゴアルギニンなどを側分子に対するマクロピノサイトーシスは他点で同時に起こ鎖に化学結合させたカチオン性オリゴペプチド固定化高分るため、同高分子自体は細胞内に取り込まれず、膜透過促子を設計・合成し、『低膜透過性分子と混合して生体膜上進作用は持続する。比較的少量の促進剤の添加で、安全かに適用するだけで、膜上に留まる同高分子により繰り返しつ効率的に薬物の膜透過を促進するアイディアである。本誘導されるマクロピノサイトーシスを介して、共存する低項では、現状で最も強い膜透過促進作用が確認されている膜透過性分子のみの膜透過が促進される』ユニークな機

D- オクタアルギニン固定化高分子と生体膜との相互作用構に基づく膜透過促進剤として同高分子の開発を進めていの検証を通して、同高分子の膜透過促進機能を定量化する

る11−13）。具体的には、N-vinylacetamide（NVA）と acrylicacid（AA）のランダム共重合体で、生体適合性の優れるとともに、同高分子の膜透過促進機構の解明を試みた結果を報告する。

poly（N-vinylacetamide-co-acrylic acid）（PNVA-co-AA）

２．実をプラットフォームとして用いたオリゴアルギニン固定化高分子（Fig. 2）を合成し、研究を進めている。既に我々は、

２.１

験D- オクタアルギニン固定化高分子の合成

マウスを用いた in vivo 経鼻吸収実験及び in vitro 細胞取りPNVA-co-AA へ の D- オ ク タ ア ル ギ ニ ン の 固 定 化

込み実験を通して、オリゴアルギニン固定化高分子がイン方 法 を Fig. 4 に 示 す。PNVA-co-AA の 脱 塩 後、N, N'-スリンの経鼻吸収を促進して血糖降下作用を増強すること、

dicyclohexylcarbodiimide（DCC）を 用 い て PNVA-co-AA同高分子が FITC- デキストランの Caco- 2 細胞内への取りのカルボキシル基を活性化し、N-hydroxysuccinimide と込みを促進することを証明している 11）。また、粘膜投与型

反 応 さ せ、PNVA-co-AA N-hydroxysuccinimide ester とワクチンの抗原キャリアとしてのオリゴアルギニン固定化した。次に、N-oxysuccinimide 基と置換することによって、高分子の可能性を検証し、同高分子とタンパク抗原をマウPNVA-co-AA のカルボキシル基に D- オクタアルギニンのス鼻腔内に複数回投与することにより、抗原特異的な血清アミノ基を結合させた。また、共焦点レーザー顕微鏡を用中の IgG に加え、鼻腔内の分泌型 IgA も誘導されることをいた実験に用いるため、D- オクタアルギニン固定化高分13）子に蛍光色素のローダミンレッドを導入した高分子も合成明らかにしている 。
オリゴアルギニン固定化高分子のオリゴアルギニン鎖は、Fig. 3 に示す機構（作業仮説）に基づき、細胞が本来備えした。本研究で用いられた D- オクタアルギニン固定化高分子の物性を Table 1 にまとめる。ている貪食作用の 1 つのマクロピノサイトーシスを誘導す

Fig. 1

Schematic representation of macropinocytosis.

Fig. 2 Chemical structure of oligoarginine-linked poly（N-vinylacetamide-co-acrylic acid）（PNVA-co-AA）．

− 82 −

オリゴアルギニン固定化高分子と生体膜との相互作用の科学的検証

Fig. 3 Schematic representation of the cellular uptake of poorly membrane-permeable molecules
physically mixed with oligoarginine-linked polymers.

Fig. 4
Table 1Synthesis of D-octaarginine-linked PNVA-co-AA.

Characterization of D-octaarginine-linked PNVA-co-AA used in this study.

− 83 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

２. ２

In vitro 細胞実験

２. ２. １

３．結果と考察Caco- 2 細胞の培養及び細胞懸濁液の調製

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（D-MEN）溶液にfetal bovine serum（FBS）を 10 %、antibiotic-antimycotic

３.１ D- オクタアルギニン固定化高分子の膜透過促進
機能の定量化

mixture（penicillin-streptomycin）を 0 . 5 %、non-essential

CF は分子内にカルボキシル基を持つ分子量 376 . 3 の蛍

amino acids を 1 % となるように加え、培養液を調製した。

光物質である。高水溶性であることから膜透過性は極めて

Caco- 2 細 胞 を 6 × 104 cells/mL の 濃 度 で flask に 播 種

低く、主に細胞間隙を透過して細胞内にわずかに取り込し、37℃、95 % O 2 / 5 % CO 2 の条件下で培養した。0 . 25 %

まれる程度である。まず、D- オクタアルギニン非存在下、trypsin-EDTA を用いて細胞を flask から剥離させた後、1CF 濃度を変えて、Caco- 2 細胞と CF を 30 分間インキュベ

× 106 cells/ 0 . 30 mL の濃度で培養液に懸濁させた。遠心分ートした後に細胞内に取り込まれた CF の量を求めた。そ離後、沈殿した細胞を PBS 210 mL 中に懸濁させた。の結果、CF 濃度に関係なく、添加した CF の約 0 . 1 % が細胞内に取り込まれることが確認された（データ省略）。本２. ２. ２

In vitro 細胞内取り込み実験

実験では Caco- 2 細胞を浮遊状態で用いており、細胞間隙低膜透過性のモデル化合物として、アニオン性の 5（6）ルートは関与しないことから、ごくわずかの CF が受動拡-carboxyfluorescein（CF）、カチオン性の atenolol 及びノ散により細胞内に取り込まれたと考えられた。D- オクタ

ニ オ ン 性 の 分 子 量 4000 の FITC-dextran（FD- 4）を 用 いアルギニン固定化高分子の添加により細胞内に取り込まれた。PBS を 溶 媒 と し て 用 い て、CF 水 溶 液（0 . 1−5 mM）、る CF 量が増加することが予想されることから、細胞懸濁

atenolol 水溶液（2 . 5 mM）、FD- 4 水溶液（2 mM）、膜透過促

液中の CF 濃度を低濃度の 0 . 01 mM に固定し、以後の実験進剤（D- オクタアルギニン固定化高分子あるいはその構成を行った。

成分、0 . 1 − 2 mg/mL）を含む水溶液、阻害剤（5 （- N-ethyl-Zaro らは、オリゴアルギニンの細胞内取り込みに要す

N-isopropyl）amiloride（EIPA、1 mM）、chlorpromazine（CPZ、る時間は 15 分以下であることを報告している 14）。高分子

1 mM）あるいは methyl-b-cyclodextrin（MbCD、20 mM））に固定化されたオリゴアルギニンは細胞内に取り込まれなを含む水溶液を別々に調製した。２. ２. １の細胞懸濁液

いと我々は考えていることから、インキュベーション時間

210 mL にモデル化合物水溶液、膜透過促進剤水溶液、阻害を 30 分に固定し、CF の細胞内取り込みに及ぼす D- オクタ剤水溶液を 30 mL ずつ添加した（コントロール実験で一部アルギニン固定化高分子の濃度の影響を検討した。その結の水溶液を添加しないときは、代わりに PBS を同量添加）。

果、Fig. 5 に示すように、濃度依存的に膜透過促進作用は37℃、95 % O 2 / 5 % CO 2 の条件下で 30 − 120 分間インキュ明らかに強くなった。細胞懸濁液中の D- オクタアルギニベートした後、遠心分離により細胞を分取した。PBS で数ン固定化高分子の濃度が 0 . 2 mg/mL になるように調製し回洗浄することにより細胞内に取り込まれていないフリーたときの CF の細胞内取り込み量は、同高分子未添加時ののモデル化合物を除いた後、細胞を PBS 200 mL に分散さ20 倍以上であった。一方、D- オクタアルギニン固定化高せた。細胞を破砕し、モデル化合物を抽出した後、その濃分子の濃度を 0 . 01 mg/mL まで低下させると、CF の細胞度を HPLC により求め、細胞内に取り込まれたモデル化合内取り込み促進効果は消失した。以上の結果から、D- オ物の割合（細胞内に取り込まれたモデル化合物の量 / 細胞クタアルギニン固定化高分子の濃度を 0 . 2 mg/mL に固定にアプライしたモデル化合物の量）を算出した。

し、実験を継続した。
インキュベーション時間を 30 分とし、D- オクタアルギ

２. ２. ３ D- オクタアルギニン固定化高分子と細胞との相互作用

ニン固定化高分子の構成成分である D- オクタアルギニン、PNVA-co-AA、両者の物理混合物による CF の細胞内取りローダミンレッドを導入した D- オクタアルギニン固定込み促進効果を検討した。結果を Fig. 6 に示す。膜透過化高分子を PBS に溶解させ、2 mg/mL とした。２. ２. １促進剤を添加せずに CF を Caco- 2 細胞と 30 分間インキュの 細 胞 懸 濁 液 210 mL に 蛍 光 性 高 分 子 水 溶 液 30 mL 及 び

ベートしたとき、アプライした CF の約 0 . 1 % が細胞内にPBS 60 mL を添加した。37℃、95 % O 2 / 5 % CO 2 の条件下で取り込まれた。D- オクタアルギニン固定化高分子の添加

30 分間インキュベートした後、遠心分離により細胞を分により、CF の細胞内取り込みは再現性よく促進され、30取した。PBS で数回洗浄することにより細胞に付着してい分間にアプライした CF の約 2 . 0 % が取り込まれた。一方、ないフリーの蛍光性高分子を除いた後、細胞を PBS 200 mL

D- オクタアルギニン固定化高分子の構成成分を同濃度でに分散させた。PBS を 10 v/v% ホルムアルデヒド水溶液に添加した場合、いずれの条件においても CF の細胞内取り置換し、細胞を固定化した後、共焦点レーザー顕微鏡で細込みはまったく促進されなかった。以上の結果から、高分胞を観察した。

子に固定化された D- オクタアルギニンのみが膜透過促進− 84 −

オリゴアルギニン固定化高分子と生体膜との相互作用の科学的検証

次に、アニオン性の CF、カチオン性の atenolol 及びノ３. ２ D- オクタアルギニン固定化高分子の膜透過促進機構の解明

ニオン性の FD- 4 を用いて、D- オクタアルギニン固定化高我々の期待に反して D- オクタアルギニン固定化高分子分子の膜透過促進作用に及ぼす低膜透過性分子の電荷の影が細胞内に取り込まれるのであれば、同高分子が低膜透過響を検討した。後二者は正に帯電した D- オクタアルギニ性化合物とともに細胞内に取り込まれた時点で膜透過促進ン固定化高分子と静電的に相互作用しないと考えられる。

作用が終結し、継続的な取り込みが観察されないと考えら

Table 2 に示すように、低膜透過性分子の電荷に関わらず、れる。そこで、インキュベーション時間を 120 分まで延長

D- オクタアルギニン固定化高分子は共存する低膜透過性し、細胞内に取り込まれる CF の量の経時変化を観察した。

分子の膜透過を促進することが確認された。このことから、

仮に、30 分間に D- オクタアルギニン固定化高分子のほと低膜透過性分子と D- オクタアルギニン固定化高分子とのんどが細胞内に取り込まれるならば、それ以降の CF の細間の静電的相互作用は、本システムにおいて必要条件でな胞内取り込みの増加量は、同高分子の非存在下同様、受動いことが示された。

拡散のみに依存する。Fig. 7 から明らかなように、D- オク

Fig. 5 Cellular uptake of CF in the absence（ □ ）andpresence of D-octaarginine-linked PNVA-co-AA（ ■ ）atdifferent concentrations. Caco-2 cells were incubated withCF（0.01 mM）and the polymer（0.01− 0.2 mg/mL）in PBS
at 37℃ for 30 min. After incubation, CF that had associatedwith cells was assayed by HPLC. Data are expressed as
the percentage of the amount of CF taken up into the cells
to that added to the medium（mean ± s.d., n = 3）．

Fig. 6 Cellular uptake of CF in the absence（ □ ）andpresence of D-octaarginine-linked PNVA-co-AA（■）and
its individual components（ □ : D-octaarginine, : PNVAco-AA, □ : a physical mixture of D-octaarginine and PNVAco-AA). Caco-2 cells were incubated with CF (0.01mM)
and each substance (0.2 mg/mL) in PBS at 37 ℃ for 30
min. When the physical mixture was used, the respective
concentrations of D-octaarginine and PNVA-co-AA were
adjusted to 0.2 mg/mL. After incubation, CF that had
associated with cells was assayed by HPLC. Data areexpressed as the percentage of the amount of CF taken up
into the cells to that added to the medium（mean ± s.d., n= 3）．
□効果を示すことが明らかとなった。

Table 2 Effect of charges on the penetration enhancement of poorly membrane-permeable molecules in the absence
and presence of D-octaarginine-linked PNVA-co-AA.

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コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

タアルギニン固定化高分子存在下、CF は継続的に細胞内に取り込まれ、減弱する傾向は観察されなかった。この結果は、D- オクタアルギニン固定化高分子が細胞外で機能し続けていることを示唆しており、低膜透過性分子と混合して生体膜上に適用するだけで、それ自体は細胞内に取り込まれずに共存する同分子のみの膜透過を促進する D- オ
クタアルギニン固定化高分子の機能を支持するものと判断された。
引き続いて、ローダミンレッドで蛍光ラベルした D- オ
クタアルギニン固定化高分子とインキュベートした後のCaco- 2 細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、Fig. 8 に示すように、ローダミンレッドに由来する赤色蛍光は、細胞の輪郭に沿うように観察された。このデータのみでは、D- オクタアルギニン固定化高分子の細胞内取り込みがまったく起こっていないと断言できないが、大部分の D- オクタアルギニン固定化高分子は細胞膜上に滞留していると考えられた。
我々は、オリゴアルギニン固定化高分子の存在下における低膜透過性分子の膜透過促進機構として、「① 1 本の高Fig. 7 Cellular uptake of CF in the absence（ □ ）andpresence（ ■ ）of D-octaarginine-linked PNVA-co-AA. The
incubation time was set at 30, 60, or 120 min. Caco-2cells were incubated with CF（0.01mM）and the polymer（0.2 mg/mL）in PBS at 37 ℃ . After incubation, CF that
had associated with cells was assayed by HPLC. Data areexpressed as the percentage of the amount of CF taken up into
the cells to that added to the medium（mean ± s.d., n = 3）．

Fig. 8 Consecutive images of a Caco-2 cell captured with a confocal laser scanning microscope equippedwith a helium-neon laser（543nm）（red bar: 10µm）．Caco-2 cells were incubated with D-octaargininelinked PNVA-co-AA bearing rhodamine red in PBS at 37℃ for 30 min, and were fixed with formaldehyde
after the removal of free fluorescent polymer. The laser was used with a primary dichroic beam-splitter.
Emissions above 560 nm were detected to observe the cellular distribution of D-octaarginine-linked PNVAco-AA bearing rhodamine red. Optical sections were gathered at 1-µm intervals perpendicular to the z-axis.
The dimensions of the image displayed on the monitor were set as 512 × 512 pixels.

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オリゴアルギニン固定化高分子と生体膜との相互作用の科学的検証

Fig. 9 Effect of inhibitors on the cellular uptake of CF in the presence of D-octaarginine-linked PNVA-co-AA.
Caco-2 cells were incubated with CF（0.01 mM）and the polymer（0.2 mg/mL）in the absence（□）andpresence（■）of each inhibitor（EIPA: 0.1 mM, CPZ: 0.1 mM, MbCD: 2 mM）in PBS at 37℃ for 30 min.
After incubation, CF that had associated with cells was assayed by HPLC. Data are expressed as thepercentage of the amount of CF taken up into the cells to that added to the medium（mean ± s.d., n = 3）．

分子鎖に固定化された多数のオリゴアルギニンに対するラフト介在性エンドサイトーシスが関与していることを示

マクロピノサイトーシスが多点で同時に進行する。②マしているのかもしれない。

クロピノサイトーシス間の競合が起こるため、細胞は高分４．総子を取り込むことができないものの、オリゴアルギニン鎖括近くに存在する低膜透過性分子のみが偶発的に細胞内に取カチオン性オリゴペプチド固定化高分子は、「それ自体り込まれる。③細胞膜上に留まるオリゴアルギニン固定

は細胞内に取り込まれることなく、細胞が本来備えている化高分子によりマクロピノサイトーシスが繰り返し誘導

貪食作用の 1 つのマクロピノサイトーシスを繰り返し誘導され、低膜透過性分子の細胞内取り込みが著しく促進されし、共存する低膜透過性分子のみの細胞膜透過を飛躍的にる。
」を提唱している。EIPA は、マクロピノソームを形促進すること」を期待して設計された新規の膜透過促進剤++成するための Na /H 逆輸送を阻害することによりマクロである。同高分子の膜透過促進剤としての可能性を見出す

ピノサイトーシスを阻害する。Fig. 9 に示すように、D- オ

ことに成功した我々は、現在、D- オクタアルギニン固定

クタアルギニン固定化高分子による CF の細胞内取り込み化高分子をシーズとして、カチオン性オリゴペプチド固定は、EIPA により有意に抑制された。このことから、マク化高分子の実用化を目指したトランスレーショナルリサー

ロピノサイトーシスは、D- オクタアルギニン固定化高分チを強力に推進している。単に混合して生体膜上に適用す子存在下の低膜透過性分子の膜透過促進に明らかに関与しるだけで共存する低膜透過性分子を効率的に細胞内にデリていると判断された。さらに、代表的なエンドサイトーシバリーするだけでなく、優れた安全性及び薬物を限定しなスであるクラスリン介在性エンドサイトーシス及び脂質ラい優れた汎用性の観点からも、カチオン性オリゴペプチド

フト介在性エンドサイトーシスが D- オクタアルギニン固固定化高分子を用いた細胞膜透過促進手法は、ライフサイ定化高分子の膜透過促進機構に関与している可能性についエンス分野で広く受け入れられることが期待される。て、それぞれの阻害剤である CPZ 及び MbCD を用いて検討した。いずれも統計学的な有意差はなかったが、MbCD（引用文献）

存在下における CF の細胞内取り込み量は約 20 % 減少して

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２）橋田充：DDS とは何か─ DDS の方法論─，橋田充監

シスの存在の可能性を提唱している 15）。前述の結果は、D-修，高倉喜信編集：図解で学ぶ DDS，じほう，2010 年 8

オクタアルギニン固定化高分子の膜透過促進機構にも脂質月 15 日，pp. 6 - 10．

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コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013

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