【研究報告】（自然科学部門）

乳製品のフードディフェンスを目指した
ビッグデータ化モレキュラー解析の構築

井之上立命館大学薬学部
緒言

浩

一准教授

質を分析（ターゲット分析）するのではなく、本研究は、加工食品（特に乳製品など）は常に安定かつ、持続的ビッグデータの統計的モレキュラーパターンにより、加生産および販売がなければならない。しかし、近年の工食品・製品別の変化を未然に判断できる解析法を検討

ニュースでは、加工食品の汚染や劣化による事例が後をする。

絶たない。現在、素材・調理などが複雑な乳製品において、予期せぬ汚染や劣化の検査には、フードディフェン

実験方法ス（食品防御）の新たな概念が求められる。そのため、

1.

NMR による基礎的な検討

従来のターゲット分析に加え、複雑な未知成分を踏まえ粉ミルク試料を電子天秤にて 1.0 g 量りとり、本試料た測定技術とデータ処理の構築が今後のフードディフェをプラスチック製チューブに移して、メスピペットで精ンスでは必須と考えられる。従来までの乳製品に関する製水 10 mL を取り、それに加えたものを標準試料とし汚染などのモニタリング対象は、ダイオキシンなどの塩た。

1–3）。

調 製 し た 試 料 を さ ら に、 前 処 理 と し て 遠 心 分 離

しかしながら、2008 年に生じたメラミン混入粉ミルク（14,000 g, 10 min, 4℃）、 限 外 ろ 過（14,000 g, 10 min,では、予想不可能な食品汚染（混入事例）が世界中を震4℃）、前処理なしの 3 つの条件で処理をしたものを試料撼させ、中国で 5 万人以上の乳幼児（3 才以下）の被害として NMR で測定しスペクトルの確認を行った。

素系化合物、細菌およびマイコトキシン類であったが生じた。現在、私たちの食生活分野では、多彩化され未知汚染物質（メタミドホス）混入試料の調製は、同た乳製品と裏腹に全く想定外の汚染などが発生すること

様試料を電子天秤にて 0.1 g 量りとり、本試料をプラスがあり、既存の技術や概念では到底解析できないレベル

チック製チューブに移して、メスピペットで精製水に達している。そこで、予想不可能な乳製品の劣化や汚1 mL を取り、それに加えたものを標準試料とした。そ染状況の情報に対して、新たなオミクス解析（ノンターの後、1,000 ppm の農薬をプラスチック製のチューブに4）ゲット分析）を考案する 。本研究目的を達成するためそれぞれ 10 μL、100 μL 取り遠心エバポレーターで乾固には、非選択的理化学分析技術を用いて、食材の膨大かし、そこに、それぞれ、試料を電子天秤にて 0.1 g 量り

つ複雑なモレキュラーデータを取得し、詳細な解析のたとり、メスピペットで精製水 1 mL を取り、それに加えめの統計手法を統合的にシステム化することが第一段階たものを 10 ppm 農薬混入試料、100 ppm 農薬混入試料である。このシステムは、乳製品の種別判断、特徴別精と し た。 ま た、20,000 ppm の 農 薬 を そ れ ぞ れ 50 μL、査などへ応用可能と判断しており、十分に利用できる。

100 μL 取り遠心エバポレーターで乾固し、そこに、そそこで、本システムを基盤として、我々は、様々な食品

れ ぞ れ、 試 料 を 電 子 天 秤 に て 0.1 g 量 り と り、 メ ス ピのビッグデータ取得を目指して、多彩な分離技術や前処

ペ ッ ト で 精 製 水 1 mL を 取 り、 そ れ に 加 え た も の を理の追加検討を実施する。具体的には、粉ミルクの網羅1,000 ppm 農薬混入試料、2,000 ppm 農薬混入試料とし的成分検知を目的として、非選択的検出法（核磁気共鳴た。本研究では、有機リン系殺虫剤のメタミドホスを用法（NMR）および液体クロマトグラフィー／質量分析いた。以上の試料を遠心分離（14,000 g, 10 min, 4℃）に法（LC-MS））で検出された情報をデジタル化（ビッグて処理した。得られた上澄み溶液を測定サンプルとしデータ化）
・多変量統計処理による情報蓄積・解析法のた。上澄み液 540 μL と重水素 60 μL を混和し、NMR 管構築を試みる。つまり、従来までの試験法である対象物に移し NMR にて測定を行った。
1井之上

浩

一

未知劣化試験の評価については、試料を電子天秤にてスチック製チューブに移して、メスピペットで精製水1.0 g 量りとり、本試料をプラスチック製チューブに移10 mL を取り、それに加えた。その後、本試液を限外ろして、メスピペットで精製水 10 mL を取り、それに加え過（14,000 g, 10 min, 4℃）にて処理した。得られた採取たものを標準試料とした。対象試料を電子天秤にて液 200 μL と ア セ ト ニ ト リ ル 200 μL を 混 和 し、 フ ィ ル

1.0 g 量りとり、本試料を密封の可能なプラスチック製ターろ過を行い、測定試料とした。

チューブに移して、メスピペットで精製水 10 mL を取

また、未知汚染試料調製については、NMR 同様の操り、それに加えたものを、それぞれ冷凍（−80℃）、冷作を実施した。LC-MS の測定条件は表 2 に示す。

蔵（10℃）、インキュベート（38℃）の各条件で 1 日間保存した。測定直前に新たに標準試料を調製し、計 4 試

結料を遠心分離（14,000 g, 10 min, 4℃）にて処理した。得1.

られた上澄み液 540 μL と重水素 60 μL を混和し、NMR果NMR による前処理などの基礎的な検討
本実験は、NMR 測定を用いて最適な迅速かつ簡便な管に移し NMR にて測定を行った。

前処理条件の検討を行った。粉ミルク 1.0 g に精製水

NMR の測定条件は表 1 に示す。

1 mL を加えた試料に対して、前処理をしないもの、遠心分離（14,000 g, 10 min, 4℃）にて処理したもの、限外

2.

LC-MS による基礎的な検討

ろ過（14,000 g, 10 min, 4℃）にて処理したものの 3 条件でのサンプルを NMR で測定を行い、得られたスペクト各粉ミルクを電子天秤にて 1.0 g 量り、本試料をプラルで比較検討を行った。図 1 に得られた各スペクトルを
表1NMR
NMR 解析ソフト
多変量解析ソフト
Temperature
Pulse programTime domain size
Pulse angle
Acquisition time
Relaxation delay
Frequency of ch.1
Receiver gain
Dummy scan
Scan
Spinning

NMR の測定条件示した。［1］が前処理をしないもの、［2］が遠心分離にて処理したもの、［3］が限外ろ過にて処理したもののス

Bruker 社製 AVANCE Ⅲ HD
Top Spin（Bruker BioSpin 社）
Amix（Bruker BioSpin 社）
300 K
noesygppr1d65536
90°
3.98 s4.00 s4.70 ppm
20342560 Hz
表2ペクトルを示している。前処理なしで測定したサンプルに比較して、遠心分離、限外ろ過したサンプルは強度や形状が良いスペクトルが得られた。また、遠心分離と限外ろ過の処理したサンプルのスペクトルに大差がみられないことから、本実験では、より簡便な前処理操作として、遠心分離による粉ミルクサンプルの前処理を採用することとした。
次に、粉ミルクに未知物質（農薬）が人為的に添加された場合、NMR 測定により評価できるかの基礎的な検LC-MS 測定条件

UPLCTOF-MS
解析ソフト: Waters ACQUITYTM Ultra Performance LC: Waters LCT PremierTM XE: MarkerLynx XS, SIMCA

ColumnTSKgel ODS-100Z（2.0×150 mm, 3 μm）（東ソー株式会社）逆相系カラム
TSKgel Amide-80（2.0×150 mm, 2 μm）（東ソー株式会社）HILIC モード: 40℃: 0.2 mL/min: A: 0.1% ギ酸水溶液、B: 0.1% ギ酸アセトニトリル溶液: 10 μL
TSKgel ODS-100Z: B＝2-2-98-98-2-2%（0-5-30-40-40.1–50 min）
TSKgel Amide-80: B＝95-95-10-10-95-95%（0-5-30-40-40.1–50 min）

Column Temperature
Flow Rate
Mobile Phase
Injection volume
Gradient
Ion mode
Capillary voltage
Desolvation temperature
Source temperature
Cone gas ﬂow
Desolvation gas ﬂow
MS Range: Electrospray positive（W mode）: 10 V: 350℃: 120℃: 50 L/h: 650 L/h
: / 100–1000

2乳製品のフードディフェンスを目指したビッグデータ化モレキュラー解析の構築

図2

NMR による PCA プロット（粉ミルク中未知物質（メタミドホス）の汚染評価）●●

図1Blank
10 ppm 混入サンプル●●

100 ppm 混入サンプル
2,000 ppm 混入サンプル

NMR 測定による粉ミルクの前処理検討（1H-NMR スペクトル）[1] 前処理なし[2] 遠心分離法[3] 限外ろ過膜法

討を実施した。添加した農薬はメタミドホスである。添加濃度は 10 ppm, 100 ppm, 2,000 ppm で評価を行った。
各サンプル調製、前処理を行い、NMR 測定で得られた結果を多変量解析（PCA）で評価した。PCA での結果

図3を図 2 に示した。それぞれ、黒のプロットが農薬の添加

NMR による PCA プロット（粉ミルクの劣化評価）●●

されていない粉ミルク、青のプロットが 10 ppm になるように添加した粉ミルク、緑のプロットが 100 ppm にな

標準サンプル−80℃保存サンプル● 10℃保存サンプル● 38℃保存サンプル

るように添加した粉ミルク、赤のプロットが 2,000 ppm（10℃）条件下で保存したサンプル、青のプロットがイになるように添加した粉ミルクを示している。

ンキュベート（38℃）条件下で保存したサンプルを示し

PCA の結果、100 ppm 以下の農薬濃度では濃度依存ている。この結果から、各条件下で保存したサンプルご的な変化をみることができなかった。2,000 ppm 程度のとに分けることができ、その中でも特に温度をかけて保濃度（測定時サンプルに絶対値で 1 mg 程度）の混入が存したサンプルは PC1 において分かれ、識別することあれば第一主成分において明らかな識別が可能であっが可能であった。

た。
2.

次に、粉ミルクを劣化させることによる含有成分変化

LC-MS による未知物質混入および劣化評価への応用が本手法で評価できるか検討を行った。NMR にて、粉ミルク試料（標準試料、各条件下の冷凍（−80℃）、冷

粉ミルクは多くの成分（添加物、乳成分、脂質など）蔵（10℃）、インキュベート（38℃）で 1 日間保存したを含有しており、その成分分離分析を行うため、逆相系試料の計 4 試料）を分析したデータにおいて、PCA をカラムおよび HILIC モードを検討した。本実験は移動行った。PCA の結果を図 3 に示した。赤のプロットがコ相に 0.1％ギ酸水溶液および 0.1％ギ酸アセトニトリル溶

ントロールの標準試料、緑のプロットが冷凍（−80℃）液を用い、検出にはエレクトロスプレーイオン化ポジ

条 件 下 で 保 存 し た サ ン プ ル、 黒 の プ ロ ッ ト が 冷 蔵

ティブ（ESI-ポジティブ）モードを利用した。ESI-ポジ3

井之上

表3

浩

一

LC-MS によって検出されたピーク検出数

HILIC（amide 80）

Sample 1

Sample 2

Sample 3

ティブモード（N

検出数

12341333
1399
1397
1206

12341398
14961390
1200

12341153
124711401031

ODS（ODS-100Z）

平均1333.81371.01142.8

合計SD

検出数

平均SD

平均検出数

90.51140113911461153

1144.56.52478.3

123.8

598584569575

581.5

12.6

1952.588.41104111211311120

1116.8

11.52259.6

100–1000）で測定を行い、保持時間として 0.5 分から 40 分で検出化合物数を得た。表 3 に検出化合物数を示した。逆相系カラムで約 1,040 化合物、HLIC モードで約 1,300 化合物が検出された。そして、両モードでの測定を合算させることで、約 2,230 化合物を得ることができた。よって、本手法にはより多くの成分を検出するために、逆相モードと HILIC モードを合算させる手法を採用することとした。
次に、粉ミルクに未知物質（メラミン）が人為的に添加された場合、本手法が有用であるか検討を行った。
LC-MS にて、2 種の粉ミルク試料（標準試料、100 ppm メラミン混入試料）計 4 サンプルを HLIC モード（TSKgelAmide-80）、逆相系カラム（TSKgel ODS-100Z）の両図4分離モードで分析した。それぞれのメラミン混入試料において未知物質として混入したメラミンのピーク（

LC-MS による PCA プロット（粉ミルクの未知汚染（メラミン）の評価）■■■■

127.03）を抽出し、HLIC モード（TSKgel Amide-80）、逆相系カラム（TSKgel ODS-100Z）の両分離モードでSample 1
Sample 1
Sample 2
Sample 2

標準サンプル
100 ppm メラミン混入サンプル
標準サンプル
100 ppm メラミン混入サンプル

未知物質と設定した汚染の原因であるメラミンを検出することができた。測定し得られたデータにおいて、統計ODS-100Z）の両分離モードで分析した。それぞれの未的な解析である PCA を行った（図 4）。赤色および緑の知物質（農薬）混入試料において未知物質として混入しプロットがそれぞれの標準試料として、青および黄色がた各農薬のピークを抽出し検出を確認した。分析した未知汚染物質（メラミン混入）である。PCA においてデータにおいて、統計的な解析である PCA を行った

粉ミルクの種類別だけでなく基準試料と汚染試料が明ら（図 5）。青色のプロットが標準試料、赤色のプロットがかに判別可能であった。

エトフェンプロックス、水色のプロットがメタミドホ

次に、粉ミルクに未知物質（農薬類）が人為的に添加

ス、緑のプロットがアセタミプリド、黄色のプロットがされた場合、本手法が有用であるか検討を行った。添加マラチオンの混入試料として示している。PCA におい

した農薬はエトフェンプロックス、アセタミプリド、メて基準試料と各農薬の汚染試料が明らかに判別可能でタミドホス、マラチオンの 4 種である。LC-MS にて、粉あった。

ミルク試料（標準試料、10 ppm 農薬混入試料）を HLIC
モ ー ド（TSKgel Amide-80）、 逆 相 系 カ ラ ム（TSKgel4乳製品のフードディフェンスを目指したビッグデータ化モレキュラー解析の構築

め、網羅的な解析が可能であった。しかし、微量にしか混入せずにサンプル中の成分比に大きな変化がみられない場合にはそれらを検出、PCA による識別を行うことは困難であったが、高濃度の異物混入や成分比の大きな変化がみられる場合にはそれらを検出し PCA による識別を行うことが可能であった。
LC-MS では、さらなる感度評価ができるため、2 種類の分離手法を採用して様々な未知汚染物質へ応用を試みた。未知物質の汚染評価試験では、未知物質としてメラミン、農薬、重金属が混入された場合を想定して評価を行った。未知物質の汚染評価試験では未知物質としてメラミンや農薬を粉ミルク中に混入した場合、混入した化
図5合物を LC-MS で測定し検出されることで、他の試料とLC-MS による PCA プロット（粉ミルクの未知汚染（農薬類）の評価）
■
■
■
■
■

異なるピークが得られ、PCA において判別が可能であった。

標準サンプル
10 ppm アセタミプリド混入サンプル
10 ppm エトフェンプロックス混入サンプル
10 ppm マラチオン混入サンプル
10 ppm メタミドホス混入サンプル

要約
本研究では、乳製品のフードディフェンスを目指したビッグデータ化モレキュラー解析の構築を目指した。乳考察

製品には、代表的な粉ミルクを採用し、理化学的分析技

まず初めに、NMR 測定による粉ミルクの質的評価お術 に は、NMR お よ び LC-MS を 用 い た。 本 実 験 か ら、よび前処理の基礎的検討を実施した。NMR の測定で

NMR では感度面に問題があり、消費者への危害が懸念

は、前処理に粉ミルク試料を溶解し、遠心分離するだけされる食品汚染レベルを直接的に評価することは難しいでその上澄みをサンプルとして測定が可能であった。と考えられた。一方で、LC-MS では、数 ppm レベルによって、本実験では NMR 測定の前処理に遠心分離の操おいても検出することが可能であり、問題と考えていた作を採用することとした。未知物質混入試験では、農薬極性に関する測定範囲も 2 つの分離モードを利用するこを添加し、NMR 測定後、PCA により評価を行った。そとで達成できた。そのため、メラミンや農薬類のようにの結果、100 ppm 以下の低濃度の添加では濃度依存的な外部から意図的に混入される恐れを未然に検知できた。

変化を確認することができなかった。2,000 ppm 以上

今後は、さらに重金属や微生物などの想定外の汚染評価（測 定 試 料 中 に 絶 対 量 で 1 mg 程 度） の 混 入 が あ れ ばへ応用することを検討する必要がある。

PCA において明らかな識別を行うことが可能であった。
謝

劣化試験では、水に溶解させた粉ミルクをインキュベー

辞ト（38℃）、冷蔵（10℃）、冷凍（−80℃）の条件下で 1

本研究を遂行するにあたり、研究助成を賜りました公

日保存し、コントロールと比較し評価を行った。その結益財団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様に深果、各条件下で保存したサンプルごとに分けることがでく感謝申し上げます。

き、その中でも特に温度をかけて保存したサンプルは
文

PC1 において分かれ、識別することが可能であった。劣化による粉ミルク製品中の成分の変化を PCA において

献

1） R. Malisch, et al.:2） J. N. Selvaraj, et al.:
440–452, 2015.
3） R. M. Kent, et al.:4） K. Inoue, et al:
2013.

評価することが可能であったと考えられる。本実験により NMR 測定による評価は、簡便な前処理による測定が可能であり、すべての含有成分を分析対象とできるた

5, 492, 2–10, 2014.
, 32,, 7, 1217–1244, 2015.
, 61, 1228–1234,