【研究報告】（自然科学部門）

付着性乳酸菌の IgA 産生を誘導する細胞壁成分の構造解析と接着関連分子の機能評価

山崎思

関西大学化学生命工学部
緒言

乃助教を増強する菌体成分の同定と表層構造の改変による免疫刺激の制御の可能性を検討した。

「食」は我々にとって毎日欠くことのできない栄養源であるが、最近では、健康意識の高まりから「食」の機能性が注目されている。中でも、発酵食品などに含まれ方る乳酸菌は、我々の健康に有益な生体調節作用を示すこ

1.

法
乳酸菌の培養の 前 培 養 と し て、 フ ロ ー ズ ン スとから、プロバイオティクス菌として幅広い世代に利用トックを解凍し、適当量を 5 mL の MRS 培地（BD 社製）されている。
乳酸菌が示す生体調節作用のひとつに免疫賦活作用がに植菌した後、アネロパック（三菱ガス化学社製）を使ある。食餌成分が直接作用する腸管が、単なる消化吸収用して、37℃で 20 時間、嫌気条件下で静置培養した。のための器官ではなく、全身の 60％の免疫細胞が集ま本培養として、MRS 培地に前培養液を 1％（v/v）植菌る最大の免疫器官であることから、「食」による免疫系した後、37℃で 20 時間、静置培養した。の制御が期待されている。この腸管に発達した粘膜免疫2.

系（腸管免疫系）において特徴的な分泌型 IgA 抗体は、パイエル板細胞の培養粘膜上で病原体に結合することで、病原体の侵入およびマウスは BALB/c（8〜10 週齢、雌性）を使用した。マ感染防御にはたらく。したがって、腸管 IgA 産生を誘導ウスを安楽死させた後、腸管からパイエル板を採取し、するプロバイオティクス菌の摂取は病原体の感染予防のコラゲナーゼ処理によりパイエル板細胞を単離した。培

観点から効果的であり、すでに IgA 産生を増強する乳酸養用培地として、10％ウシ胎児血清、100 U/mL のペニ1–3）。しシリン、100 μg/mL ストレプトマイシンおよび 55 μM のかし、これらの IgA 産生増強作用は、特定の菌株に限定2-メルカプトエタノールを含む RPMI 培地を用いた。96されており、免疫刺激となる菌体成分の同定や菌株間の穴プレートに 1.0×105 cells/well となるようにパイエル系統的解析などは十分に進んでいない。

板細胞を播種し、死菌体あるいは菌体成分を添加した菌株やビフィズス菌株は数多く報告されている

一方、乳酸菌やビフィズス菌の生体調節作用は、生菌後、37℃、5％ CO2 存在下で 4 日間培養した。培養上清でのみ認められる作用と死菌であっても認められる作用中の IgA 濃度は ELISA 法により測定した。とがある。免疫賦活作用は、菌体表層と免疫細胞表層との相互作用により発現することが多いため、死菌であっ結果および考察ても得られることが多い。品質管理の観点からは、死菌

1.

は生菌よりも安定性において優れており、培養条件によ乳酸菌が示す IgA 産生増強作用
パイエル板細胞におけるの IgA 産生増強作用

り菌体の表層構造を制御することができれば、期待するを図 1 に示す。70％（v/v）エタノールで殺菌後、減圧乾効果を付与した菌体の供給が可能となる。著者らは、こ燥した菌体は、濃度依存的に IgA 産生を増強した（図れまでに死菌体で IgA 産生を増強する乳酸菌株のスク1A）。また、オートクレーブ殺菌を行った菌体においてリーニングを行い、に強い IgA 産生も、エタノール殺菌菌体と同程度の IgA 産生の増強を確増強作用を見出している。本研究では、菌体の表層構造認した。一方、エタノール殺菌した菌体を超音波処理にの制御による IgA 産生増強作用の向上を目指し、その基より破砕すると、処理時間が長くなるに伴い、IgA 産生礎的研究として、増強作用が低下した（図 1B）。これらの結果より、本菌をモデル菌株とした IgA 産生1山崎思乃

株のエタノールおよび熱に安定な細胞壁成分に IgA 産生増強作用があり、その作用の発現には菌体の構造そのものが重要であることが示唆された。
2.

IgA 産生増強作用に関与する TLR の特定Toll 様受容体（toll-like receptor; TLR）は樹状細胞やマクロファージなどの細胞表面に存在し、特定の病原体の分子パターンを認識する受容体である。これまでに、
グラム陽性菌のペプチドグリカン4）、リポテイコ酸5）、および表層タンパク質6）などが TLR2 の、グラム陰性菌のリポ多糖（LPS）が TLR4 のリガンドとなることが報告されている。

が作用する TLR から IgA 産生誘導作用を示す菌体成分を推定するために、パイエル板細胞に抗 TLR2 抗体または抗 TLR4 抗体（Biolegend 社製）を添加し、エタノール殺菌菌体と培養したところ、抗TLR2 抗体の添加により IgA 産生増強作用が抑制されたが、抗 TLR4 抗体による影響は見られなかった（図 2）。
が TLR2 を介して IgA 産生を増強することから細胞壁の構成成分に着目し、菌体の構造を維持したま
図1

パイエル板細胞におけるま、タンパク質、脂質、および核酸を順次除去し、IgAの IgA 産生増強作用産生を増強する細胞壁成分を特定することとした。

パイエル板細胞に A：エタノール殺菌した菌体、B：超音波破砕し、遠心分離により上清を除去した菌体を添加し、4 日間培養したときの IgA 産生量。
N: negative control, P: positive control（Pam3CSK4 1 μg/mL）,* ＜0.05

3.

IgA 産生増強作用を示す菌体成分の特定菌体を 0.3％ SDS 溶液で煮沸処理後、0.02％ アクチ

ナーゼ E による除タンパク質、メタノールおよびクロロホルムによる脱脂、0.01％ DNase および RNase による

図2の IgA 産生増強作用に関与する TLRパイエル板細胞にエタノール殺菌した菌体（10 μg/well）および A：抗 TLR2 抗体（TLR2 Ab; 5 μg/mL）またはアイソタイプ抗体（IgG1; 5 μg/mL）, B：抗 TLR4 抗体（TLR4 Ab; 10 μg/mL）またはアイソタイプ抗体（IgG2a; 10 μg/mL）を添加し、4 日間培養したと
きの IgA 産生量。
* ＜0.052

付着性乳酸菌の IgA 産生を誘導する細胞壁成分の構造解析と接着関連分子の機能評価

図3

IgA 産生増強作用を示す細胞壁成分の特定

SDS 溶液での煮沸処理、アクチナーゼによる除タンパク質、メタノールおよびクロロホルムによる脱脂、核酸分解酵素による除核酸を行い、各成分を除去した画分（10 μg/mL）をパイエル板細胞に添加し、4 日間培養したときの IgA 産生量。
N: negative control, P: positive control（Pam3CSK4 1 μg/mL）,* ＜0.05

除核酸を順次行い、各細胞壁成分を除去した画分の IgAの設計が、乳酸菌の高機能化に有効であることを示唆す産生の増強能を測定した。その結果、クロロホルムによるものである。一方、本菌株は高い凝集性を示すことかる脱脂処理により IgA 産生増強作用が低下し、逆にクロら、腸管付着性に関わる接着分子の機能解析にも着手し

ロ ホ ル ム 抽 出 物 に は IgA 産 生 増 強 作 用 が 認 め ら れ たている。乳酸菌の表層構造を解析し、設計することで腸（図 3）。また、菌体を細胞壁分解酵素であるリゾチーム

管免疫系の制御が可能となれば、免疫機能が十分でないおよびムタノリシンで処理すると、ある酵素濃度域にお小児や高齢者の QOL の向上にも貢献できると期待されいて IgA 産生が増強することがわかった。また、抗リポる。

テイコ酸抗体で菌体表層のリポテイコ酸を蛍光標識し、謝フローサイトメトリー法により表層への露出の程度を調辞

べたところ、酵素の濃度依存的に表面に露出するリポテ本研究を遂行するにあたり、助成を賜りました公益財

イコ酸密度の増大が確認された。これらの結果から、団法人三島海雲記念財団に厚く御礼申し上げます。まの細胞壁のリポテイコ酸などの脂質成分が TLR2

た、細胞培養に関するご支援および免疫学的見地からのに結合して IgA 産生を増強していると考えられた。現ご助言をいただきました国立研究開発法人 医薬基盤・在、脂質成分の同定と機能解析を進めている。

健康・栄養研究所 ワクチンマテリアルプロジェクト
プロジェクトリーダー

要約

國澤純博士に深く感謝申し上げます。

乳酸菌は、食品成分として経口摂取が容易で習慣化し文やすく、腸管免疫系を介した「食」による免疫調節に大きく寄与するものである。本研究では、をモデ

献1） A. Sato, et al.:
, 171, 3684–3690, 2003.
2） Y. Kotani, et al.:
, 9, e91857, 2014.
3） F. Sakai, et al.:
, 9, e105370, 2014.
4） H. Y. Lin, et al.:., 226, 1573–1582, 2011.
5） B. F. Sels, et al.:, 11, 161, 2012.
6） S. R. Konstantinov, et al.:.
105, 19474–19479, 2008.

ル菌株とし、IgA 産生増強作用を細胞壁の脂質に見出すとともに、その活性成分を酵素処理により菌体表層に露出させると IgA 産生が増強することを明らかにした。これは、免疫賦活作用のメカニズムに基づく菌体表層構造

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