炎症性皮膚疾患におけるアクアポリン９の機能解明

京都大学大学院医学研究科次世代免疫制御を目指す創薬医学融合拠点

竹馬真理子

Aquaporins (AQPs, AQP0-12) are membrane water/glycerol channel proteins that participate in various cellular functions
in many cell types. AQP9 is expressed in several immune cells including neutrophils; however, its role in cutaneous immune
response remains unknown. Here we show the involvement of AQP9 in skin allergic inflammation using AQP9 knockout(AQP9-/-) mice and the contact hypersensitivity (CHS) model.
First, AQP9-/- mice showed impairment of CHS responses to hapten (DNFB) compared with wild-type (WT) mice.
Adoptive transfer of AQP9-/- LNs cells into the ears of WT recipients resulted in impaired CHS response, indicating thedefect of sensitization in AQP9-/-. IL-17 production was decreased in AQP9-/- compared with WT LNs cells.
WT mice showed high neutrophil accumulation in LNs at 18 h after DNFB application, but it was abrogated in AQP9-/mice. In accordance, we found the attenuation of AQP9-/- neutrophil migration to LNs after DNFB application. Furthermore,the neutrophil migration in response to CCR7 ligands was suppressed in AQP9-/- using chemotaxis chambers.
Finally, we found that the administration of neutralizing antibody during the sensitization phase suppressed IL17 production from LNs cells as well as CHS response in WT mice, suggesting the implication of neutrophils for IL-17
production during the development of CHS.
These data suggest that AQP9-expressing neutrophils play an important role in the sensitization phase of CHS throughtheir migration function.

１．緒た表皮細胞や、皮膚に浸潤する多くの免疫細胞（好中球、言肥満細胞、T 細胞など）に発現していることが示唆されて水は生命現象にとって必須の物質であり、体内ではみかいるが、その機能はほとんど明らかにされていない。また

け以上にダイナミックな水輸送が行なわれている。この水AQP9 欠損マウスが既に樹立されているが、皮膚の詳細な輸送を支える膜蛋白として発見されたアクアポリン

機能解析は未だ実施されておらず、皮膚外観や組織には顕（AQP）は、現在までに、AQP0 から AQP12 までの 13 の著な異常がないと言及されている 5）。

遺伝子が報告されている。1992 年に AQP1 が発見されて我々は、免疫細胞に発現する AQP9 が、接触皮膚炎、ア以降、AQP の研究は、腎臓、腸管など水の吸収が盛んなトピー性皮膚炎あるいは乾癬のような免疫異常を伴う炎症臓器を中心に進められてきた。この進展により、近年では、性皮膚疾患の発症に関与している可能性を検討した。

AQP が、水やその他の物質輸送を介して、さらに高次のAQP9 欠損マウスを用い、接触皮膚炎モデル 6）における野生命現象を制御することがわかってきている。

生型マウスとの表現型を比較することで、AQP9 の機能解

我々は皮膚における AQP に着目し、皮膚の構成細胞に明を本研究の目的とした。

発現する AQP 分子の機能を明らかにしてきた。これまで

２．実に、AQP3 欠損マウスおよび AQP3 ノックダウン細胞を主な研究材料に用い、表皮細胞に発現する AQP3 が、細胞

験

2. 1. 接触皮膚炎モデル

遊走および細胞増殖を調節し、創傷治癒、腫瘍形成あるいAQP9 遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス（AQP9-/-, C57BL/6 genetic

はアトピー性皮膚炎発症に関与していることを明らかにしbackground）は、Rojek 博士（Aarhus University、デンマてきた

1, 2, 3）

。また、T 細胞に発現する AQP3 が、ケモタクーク）から入手し、京都大学動物施設内にて、Hetero 同士シスを調節することで、接触皮膚炎発症に関与することを交配により繁殖し実験に供した。AQP9-/- および野生型

報告している 4）。

（WT）マウスは、2, 4-dinitrofluorobenzene（DNFB）を腹部

一方 AQP9 は、今までの報告や予備検討から、分化しに塗布し感作した。塗布 5 日後にDNFBを耳介に塗布し（チャレンジ）、24 時間後の耳介浮腫をmicrometer（Mitsutoyo）により測定した。

Role of Aquaporin- 9 in inflammatory
skin disease
Mariko Chikuma
Center for Innovation in Immunoregulative
Technology and Therapeutics, Kyoto
University Graduate School of Medicine

感作の成立を調べるため、DNFB 塗布 5 日後に、皮膚所属 リ ン パ 節 を 摘 出 し、2, 4-dinitrobenzene sulfonic acid（DNBS）とともに 3 日間培養し、細胞増殖能（3H サイミジン取り込み）と、培養上清のサイトカイン量（INF-gamma,IL-17A）を測定した（ELISA kit, e-bioscience）。さらに、− 88 −

炎症性皮膚疾患におけるアクアポリン９の機能解明

DNFB 感作５日後のリンパ節の細胞、およびチャレンジ

好中球での AQP9 免疫染色では、AQP9 が細胞膜と細胞質

24 時間後のリンパ節ならびに皮膚中の細胞を調製し、に局在していることが示された（図 1, right）。
ハプテン（DNFB）誘発による接触皮膚炎反応を、WT お

flow cytometry FACS Fortessa system（Becton Dickinson）

よび AQP9-/- マウスを用い検討した。AQP9-/- マウス皮膚でにより解析した。

は、発症程度を表す耳介浮腫（厚さ）が、WT マウスと比較

2. 2. Adoptive Transfer Experiments

して有意に抑制されていた（図 2, left）。HE組織染色像から、-/-DNFB 感作 5 日後に、AQP9 および WT マウスの所属

AQP9-/- マウス皮膚では、WT で認められる免疫細胞の浸リンパ節から細胞を調製し、耳介へ皮下投与した。その直潤と表皮肥厚が抑制されていることが示された（図 2, right）。

後、耳介に DNFB を塗布した。翌日の耳介浮腫を測定した。

接触皮膚炎反応惹起時（チャレンジから 24 時間後）に採取した皮膚を用い、FACS 解析あるいは組織解析により、

2. 3. Chemotaxis Assay

皮膚内に浸潤している T 細胞（CD4+, CD8+）、樹状細胞

AQP9-/- および WT マウスの Bone Marrow 細胞から、（MHCII+ CD11C+）、肥満細胞（Toluidine blue 染色）、おPercoll 分画により好中球を調製した。Transwell Chamber

よび好中球（Giemsa 染色）の細胞数を測定した。AQP9-/- 皮（5 µm pore size, Corning Costar）の上部に好中球をアプラ

膚では、CD4+ および CD8+ T 細胞、ならびに好中球の浸潤イし、下部のケモアトラクタント（CCL19, CCL21, fMLP）が WT 皮膚と比較して有意に低下していることが示されたへ遊走した細胞数を、FACS により解析した。

（図 3）。

３．結AQP9-/- マウスで接触皮膚炎の感作が成立しているかを果検討した。DNFB 塗布 5 日後のリンパ節由来細胞を採取し、C57BL6 の WT マウスから好中球（Neutrophil）、肥満細++ナイーブマウス（WT, AQP9-/- マウス）の耳介皮内に移入し胞（BMMC）、T 細胞（CD4 , CD8 細胞）、樹状細胞（BMDC）、た（adoptive transfer）。直後に DNFB を塗布し、1 日後におよびマクロファージ（BMM）を採取し、AQP9 遺伝子発耳介浮腫を測定したところ、AQP9-/- 細胞は WT 細胞と比現量をリアルタイム PCR により測定した。AQP9 は、好較して、有意に耳介浮腫を減少させた（図 4）。この結果は、中球および肥満細胞で高い発現が確認された（図 1, left）。

AQP9-/- マウスでは接触皮膚炎反応の感作過程の成立が抑図１ C57BL6 マウス由来細胞における AQP9 発現（left；リアルタイム PCR による定量、right；好中球での AQP9 免疫染色）

図２ WT および AQP9-/- マウスにおける接触皮膚炎反応（left；接触皮膚炎反応による耳介浮腫、right；HE 組織染色）− 89 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

図３

図4

図5

接触皮膚炎反応惹起時の皮膚内の細胞数（CD4+、CD8+ T 細胞、好中球）

所属リンパ節由来細胞の Adoptive transfer による接触皮膚炎反応

DNFB 塗布 5 日後のリンパ節由来細胞の細胞増殖能（left）、IFN-gamma 産生量（middle）、IL-17 産生量（right）制されていることを示している。

作不成立の主な原因と考えた。

-/-

AQP9 マウスで確認された接触皮膚炎反応の感作不成

種々の検討から、AQP9-/- マウスにおいて観察される接立の原因を探るため、DNFB 塗布 5 日後のリンパ節由来細触皮膚炎抑制には、好中球が関与していることを見出した。

胞を採取し、DNBS と共に培養し、詳細を解析した。細胞WT マウスでは、DNFB 塗布によりリンパ節内の好中球

内 へ の サ イ ミ ジ ン 取 り 込 み、 お よ び 細 胞 か ら の IFN-数が顕著に増加し、塗布 18 時間後に細胞数がピークにな-/-

gamma 産生量は WT と AQP9 マウス細胞で差はなかった。

ることを見出した（data not shown）。この時、AQP9-/- マ

一方、IL-17 産生は、AQP9-/- 細胞で顕著な減少が認められウスでは、好中球の増加が顕著に抑制されていた（図 6,-/-た（図 5）。なお、リンパ節内の細胞分布は、WT と AQP9left）。好中球の中和抗体（anti-mouse Ly6G mAb）を投与

マウス細胞で有意な差はなかった（data not shown）。リンし、好中球を除去した WT マウスでは、DNFB 塗布によるパ節内の細胞、特に CD8+ T 細胞からの IL-17 産生が、接接触皮膚炎反応が抑制された（図 6, middle）。またこれら

7, 8）。従のマウス由来のリンパ節細胞では、IL-17 産生が顕著に低って、AQP9 細胞で IL-17 産生低下していることが、感下していた（図 6, right）。さらに、AQP9-/- マウスに、WT触皮膚炎反応に必須であることが報告されている-/-− 90 −

炎症性皮膚疾患におけるアクアポリン９の機能解明

図 6 好中球の接触皮膚炎への関与
リンパ節の好中球数（left）、好中球除去による接触皮膚炎の抑制（middle）
および IL17 産生量低下（right）

図7

好中球のケモタクシス（left）、F-actin 染色（right）

マウス由来の好中球を移入することで、接触皮膚炎抑制と走を調節していることが認められた。AQP9-/- マウスでは、IL-17 産生低下が回復した（data not shown）。以上の結果DNFB 塗布により誘発される好中球のリンパ節への浸潤が-/-は、AQP9 マウスでの接触皮膚炎低下は、好中球に原因低下することで、その後に起こる T 細胞の活性化、特にがあることを示唆している。

IL-17 産生の抑制が原因となり感作が成立せず、耳介浮腫

DNFB 塗布後に、AQP9-/- マウスにおいて、リンパ節に局在する好中球数の増加が抑制された要因として、好中球を指標とする接触皮膚炎反応が惹起されなかったと考えられた。のリンパ節への浸潤 / ホーミングが AQP9 欠損により低下

今後も、接触皮膚炎における好中球の役割を詳細に探索したことが予想された。好中球のリンパ節への浸潤には、するとともに、好中球に発現する AQP9 の機能を明らか

CCR7-CCL19/21 の関与が報告されている 9）。そこで、好にしていく予定である。

中球の CCL19/21 に対する細胞遊走能を、Transwell を用いて検討した。AQP9-/- 好中球では、CCL19 および CCL21（引用文献）への細胞遊走が顕著に低下していた（図 7, left）。また、

１）Hara-Chikuma M & Verkman AS (2008) Aquaporin-3-/-

AQP9 好中球では、CCL19/CCL21 刺激で誘発される細facilitates epidermal cell migration and proliferation

胞の方向性（F-actin 染色）が低下していた（図 7, right）。好during wound healing. J Mol Med (Berl) 86(2): 221-231.

中球に発現する AQP9 が、ケモカイン誘発性の細胞遊走２）Hara-Chikuma M & Verkman AS (2008) Preventionof skin tumorigenesis and impairment of epidermal cellを調節していることが示された。

４．考

proliferation by targeted aquaporin-3 gene disruption.

察Molecular and cellular biology 28 (1): 326-332.

AQP9 は、皮膚の免疫反応を担う好中球で高い発現が確

３）Nakahigashi K, et al. (2011) Upregulation of aquaporin-3

認され、また接触皮膚炎反応に必須であることが示された。

is involved in keratinocyte proliferation and epidermal

好中球に発現する AQP9 が、ケモカイン誘発性の細胞遊hyperplasia. The Journal of investigative dermatology− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol.23, 2015

allergic contact dermatitis. The Journal of investigative

131 (4): 865-873.

dermatology 133 (2): 303-315.

４）Hara-Chikuma M, et al. (2012) Chemokine-dependent T
cell migration requires aquaporin-3-mediated hydrogen７）Nakae S, et al. (2002) Antigen-specific T cell sensitization

peroxide uptake. The Journal of experimental medicineis impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression

209 (10): 1743-1752.

of allergic cellular and humoral responses. Immunity
17 (3): 375-387.

５）Rojek AM, et al. (2007) Defective glycerol metabolism+in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of８）He D, et al. (2 0 0 6) CD8 IL-1 7-producing T cells are

the National Academy of Sciences of the United States

important in effector functions for the elicitation ofof America 104 (9): 3609-3614.

contact hypersensitivity responses. J Immunol 177 (10):６）Honda T, Egawa G, Grabbe S, & Kabashima K6852-6858.

(2013) Update of immune events in the murine contact９）Beauvillain C, et al. (2011) CCR7 is involved in the migration

hypersensitivity model: toward the understanding ofof neutrophils to lymph nodes. Blood 117 (4): 1196-1204.

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