化粧品による光老化の抗酸化的制御に関する細胞生物学的及び生化学的研究
群馬大学医学部

宮地良樹

Photoaging i's a term that denotes the gross and microscopic cutaneous changes induced bychronic sun exposure, which is quite different from intrinsic chronological aging both
qualitatively and quantatively. Among the various insults brought by ultraviolet (UV) irradiation,
reactive oxygen species (ROS) and lipid peroxides are one of the most reasonable candidates forexplaining actinic injuries in photoaging.
In the present study, using an experimental animal model of photoaging, we investigated thetime dependent antioxidant enzyme changes as well as dermal glycosaminoglycan levels by_disaccharide analysis. We have found that SOD activity was increased by repeated UVBirradiation, but catalase was not, indicating that the skin SOD and catalase activities are notcoordinately regulated by a long-term UV irradiation and that the SOD activity, which has beenreported to decrease after acute actinic·injury, is induced by chronic photo-oxidative stress.
We have also demonstrated that the total amount of main disaccharide units increased by
UV irradiation confirming the previous histochemical findings.
Another important progress made during the present investigation was the development of
the three-dimensional culture system supplemented with L-ascorbic acid 2-phosphate using
dermal fibroblasts from photoaged murine skin. This method should provide a promisingtechnique to evaluate the capacity for regulating the photoaging process by cosmetics in the nearfuture.

緒

医療費か使われてる疾患である 1 - 3) 。 しかし、光言

老化は予防あるいは制御可能な老化現象であり、高齢化社会を迎えて、加齢による皮府老徴に対一般の人々の啓蒙が重要であるが、現在のところする関心も高まり、また皮膚悪性腫瘍患者、とり被服やサンスクリ ー ンなどによる物理化学的な光わけ日光角化症、基底細胞上皮腫、有棘細胞癌な防御のみ可能である。 この光老化の本質的な制御との患者数が明らかに増加している。 これらの疾手段が開発されれば医療経済の面からみても福音患に共通していることは、長期にわたる紫外線曝と考えられる。
そこで、今回の研究では、 ヘアレスマウスを用露による蓄積性の光線皮膚傷害が、 高齢期に露光部皮rii 病変としてあらわれる点である。 すなわ

いた光老化モデル を作成し、得た試料を皮府抗ち、紫外線生物学の研究対象として克服されるべ酸化能、皮阿ムコ多糖の側面から検討するとともき課題と考えられる。 日光露出部にみられる皮府に、次のステップとして光老化モデルマウス由来

老徴は光老化として通常の非露光部皮府の老化と線維芽細胞の三次元培養系を確立・検証することは、質的にも量的にも明確に区別される加齢現象

で、将来、培養下での紫外線照射および各種酸素で、整容的な観点からも、光発癌とともに莫大なストレスによる抗酸化能、過酸化脂質レベルの変Cell biological and biochemical studies on

折、 コ ラ ー ゲン架橋結合の解明をめざすことにし動 4) 真皮ムコ多糖の組成および量的変化の二糖分

anti-oxidative regulation of photo­

た。 さらにこれらの変化が化粧品として投与可能

aging by cosmetics

な抗酸化剤の外用というドラッグデリバリ ー によYoshiki Miyach1

りとのように修飾され、 それが究極的に光老化制

Gunma University

御に貢献しうるか否かを明らかにしたいと考えている応 7)
0-67-2

実3)ムコ多糖二糖分析

験9)

まず、租ムコ多糖を精製のうえ、 コ ンドロイチ

I)光老化モデルマウスの作成

ナ ーゼ ー8)

ABC消化したのち、PMPラベルし、HPLCにて、 ヒアルロン酸、 コ ンドロイチン硫酸、デルマ

譴齢の雌性ヘアレスマウス (HOS: Hr-1)を購入し、週3回、マウス背面剃毛皮附に、 1 回あたりUVB(290-320nrn)を40rnJ/crn八UVA(320-400nrn)

タン硫酸を構成する△Di-HA (HA)、△ Di-6S (CS)△ Di-4S (CS)、 △ Di-4S (DS)を測定した。

を30 J/crn吋つそれぞれ照射した。 1 群を12匹と14)皮府抗酸化能測定 0)

し、最高36週間照射した。

SOD活性は、チトクロ ー ム法にて、 カタラ ーゼ活性は、紫外部吸収法によりそれぞれ測定した。

2)皮府試料の準備
UVA、UVB照射群、非照射コントロー ル群の三群115)線維芽細胞の三次元培養

それぞれ より12、24、36週後に4匹ずつのマウスから皮阿片を採取し、実験まで 80℃にて保存した。 凍結試料は、 フリ ー ザ ー ミルにて粉砕し所定の実験に供した。

)

マウス線維芽細胞に先立ち、 ヒト線維芽細胞を—10%FCS添加DMEM に0. lmMのリン酸化アスコルビン酸 (Ase• 2-p) を加えて、 co 臼ンキュベ ー ターで培養した。 細胞を収穫したのちムコ多糖分析

圃●□に供した。
ADl-4S(CS)
ADl-4S(DS)ADI-HA

6 weeks

12 weeks
1UVA10。

。
Control

155

名苓シ A』
p 3ElーOEu

105lq竺giA』
p :1
ElOEu

15UVB

Control

24 weeks
P<0.01〇ーUVB

10。

。
UVA

1555Control

UVB

36 weeksg
ヱ8p
A A』
p iElーOEu

1品la
A A』
p :IElOEu

15UVA

Control

UVAFig. 1 The total amount of skin main disaccharide units in UVA-,UVB-irradiated and unirradiated control mice at 6th.12th,24th and 36th week.

-68-UVB

化粧品による光老化の抗陪化的制御に関する細胞生物学的及び生化学的研究△ Di-4S(DS)
8Control··•··UVA

6-uve

••

•
•ふ→嶋ii­

．
．
．
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I．
nと．．
ー嶋

＝6-aMピp6w11owu
-．
一
▲
．
．
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6――

812゜゜

36weeks

24

�
66゜。

22OEu
p6El
iMAl
6!
lj
J—

一△ DI-HA

122鼻36weeks△ Di-4S(CS)86
鼻owu
p6w11aMAl
461
12 ,． ... I-· ．一—．

6゜゜, 2236weeks

Fig. 2 The sequential changes of skin main disaccharide units,
hyaluronic acid-derived△ Di-HA (HA) ,dermatan sulfate
derived △ Di-4S (DS) and chondroitin-sulfate derived△ Di-4S (CS), in UVA-,UVB-irradiated and unirradiatedcontrol mice.
鼻士口係

3

UVA、 UVB照射群 とも 有意な増加を示した(P<果0. 0 l)。 二糖レベルの分析では、 すべて増加傾向を示すものの、UVA照射36週の △ Di-HA (HA)をI) 光老化モデルマウスの皮店ムコ多糖分析

コ ントロールヘアレスマウスでは、 △ Di-HA除いて統計的な有意差はみられなかった(Fig. 2)。

(HA)と △ Di-4S (DS)がほぼ全ムコ多糖の95%二釉組成をみると、照射36週でUVB、UVA、 コントを占め、その全体量はFig. lに示すように、照射ロ ー ル群の順に、△ Di-HA (HA)の減少、△ Di-4S

12週からUVA照射群で増加しはじめ、24週では、(DS)の増加傾向が認められた(Fig. 3) 。

-69-ISi•

D△ D1-4S(CS)△ 01-45(05)△ oi-HA

12 weeks

Control

Control

UVA

UVA

UVB

UVB
020

一6 weeks4060801002024 weeks
Control

UVA

UVA

UVB

UVB
2040606080

36 weeks

Control

04080

100％

゜20406080

100％

100％

Fig. 3 The compositional change of skin main disaccharide units
in UVA-, UVB-irradiatcd and unirradiated co11trol mice at
6th, 12th, 24th and 36th week.
..... ·UVA-• UVB155゜>弓 BO OS UPISml�,0ー(uia10Jd 6E二·-contr

122436Weeks

Fig. 4 The effect of UVA or UVB irradiation on SOD activity ,nhairless mice skin. Results are expressed as mean士SEM(n = 4) . *p<O. OS;analyzed by two factor ANOVA followedby Fisher's protected LSD test.

2)皮屈抗酸化能の変化

迦後に上昇したSOD活性は、 24週までにほほコ

UVB照射群では 一 様に有意な(P<0.05) SOD

ントロ ー ルレペルに復した(Fig. 4)。 カタラ ー活性の上昇がみられたが、 UVA照射群では、12ゼ活性は、 全経過を統計処理するとコントロ ー ル-70-

化粧品による光老化の抗俄化的制御に関する細胞生物学的及び生化学的研究

群およひUVB照射群に比して、 有意な低下かみ細胞外マトリックスも産生し、あたかも真皮の様られた(Fig. 5)。

相を呈す る よ う に なった 。 単層培 養に比し 、

ニニ

505
11V�U!>
IS＞一1:>e.l!
E /U!
Wtn)Al(u,a10d』620•

DNA量にして約5倍となり、ムコ多糖の二糖分折でもFig, 7に示すように、 Asc•2-p添加群の方がより正常ヒト真皮のムコ多糖に類似するようになcontrolった。
● △Di-6sロ△Di-4s(CS)● △Di-4s(DS)四 △Di-Os□ △Di-HA％
10080

゜601224Weeks

3640203)線維芽細胞の三次元培養

Fig. 7 The composit1onal change of maind1saccharide units in the medium andthe eel I layer supplemented with orwithout L-ascorbic acid 2-phosphate.
The eel I layer supplemented with Ase
2-p beeame eloser to that of thedermis mainly due to the inerease of△ Di-4S (DS)゜

Fig. 5 The effect of UVA or UVB irradiation
on Catalase activity in hairless miceskin. Results are·expressed asmean士SEM (n = 4) . *p<O. 05, "n<O. 01;
analyzed by two factor ANOVA
followed by Fisher's protected
LSD test.

Dermis(n =7)

Asp·2- pを添加することにより、20日間の培養で、 Fig. 6に示すように、線維芽細胞は重層し、Cell layer
Cell layer
with Ase 2-p without Ase 2-p(n =3)(n :4)

4考案

今回の研究から判明したことを列挙すると以下のようになる。
1) 光老化モテルマウスの皮腐変化は、ヒト光老化を反映したものであり、光老化研究に供することが可能であること。

2)

Fig. 6 Microscopic finding of the eel I layer
supplemented with L-ascorbic acid2-phosphate. Multi layered fibroblasts
supplemented with L-ascorbic acid2-phosphate are surrounded by a denseextracellular matrix.

長期紫外線反復照射による皮屑抗酸化能の変化は、SODとカタラ ー ゼとでは挙動が異なること、
急性紫外線照射では減少するSOD活性も、 慢性反復照射ではむしろ誘導されること、UVAとUVB と-71-5では、異なる変化を示すこと。
3)

総括

真皮ムコ多糖の二糖分折では、従来の組織化学的変化をほぼ反映した変化を量的に把握できた

光老化モデルマウス皮膚を用いて、長期反復紫こと、これらの変化は UVA、UVBにより差異があり、外線による皮膚抗酸化能、ム コ多糖組成、 コラ ーしかも照射回数に依存して変化していくこと l 2)0ゲン架橋形成などに対する影響を検討した。 同時

Ase ・ 2-pを添加したヒト線維芽細胞培養系でに、線維芽細胞三次元培養系を確立することによ4)ーは線維芽細胞は重層し、コラゲンやムコ多糖をり、将来の抗酸化剤投与による光老化制御実験系産生すること、ムコ多糖の組成は、真皮に類似しとしての応用、化粧品による光老化の抗酸化的制ていること、などの諸点である。 さらに、現在判御を展望した。

明しつつある事実として、ヒト日光露出部皮膚の文

ム コ多糖分折においても、光老化モデルマウスとl

献、さらに、ヒト

1. Yoshiki Miyachi, "Photoaging from an

線維芽細胞の三次元培養系において コラー ゲン産

oxidative standpoint", J Dermatol. Sci., 9 79

同様の所見が得られつつあり

3)

ー

生を電顕的に確認し、 また コラ-86 (1995)

ゲン架橋結合に”

2. 宮地良樹、 “老化の趾床 一 皮膚 、活性酸素•フついても生化学的に解析する技術を確立した（いリ ー ラジカル、5 181-186 (1994)

ずれも発表準備中）。

3. 宮地良樹、 “紫外線防御、NMシンポジウム

これらのデー タに基づき、今後の検討課題とし””

1) 光老化モデルマウス由来線維芽細胞の三次元

4. 宮地良樹、 “皮膚老化と過酸化脂質 、Geガatric

培養の確立。

Medicine.,32 1069-1072 (1994)

同培養系を用いて、in vitroにおける紫外線

2)

5. 宮地良樹、 “活性酸素病態学(3) ー 皮盾科領域

照射を含む新たな酸素ストレスに対し、線維芽細における抗酸化剤の臨床応用

胞の抗酸化能、過酸化脂質量がどのように変動す

56 503-513 (1994)”

西日本皮膚科

6. 宮地良樹、“皮膚抗酸化療法とフリ ー ラジカル＂

るかの検証。
同じく、 コラ ー ゲン架橋結合やムコ多糖組成

3)

光と皮膚 日経メディカル311 155-158 0994)ては以下のような実験が求められよう。

Mebio.,11 (4) 72-77 0994) -がどのような挙動を示し、それが光老徴をどあよ7. 宮地良樹、 “抗酸化剤による皮膚疾患の治療うに説明しうるかの検討。

”

日皮会誌、104 1608-1609 (1994)”

最終的に、cosm eticsとして外用可能な抗8. 宮地良樹、“紫外線儀害モデル 、細胞工学別冊

酸化物質（現在実用化しているB —カロテンやビタ

活性酸素実験プロト コー ル、 谷口直之監修

ミンEなどとの比較も含めて）をin vitr吋支与し、秀澗社283-287 (1994)

4)

上記の変化をいかに制御しうるかの検索などであ9. Tadayoshi Higuchi, Kazunori Ohnishi,る。

H i r o aki H a ya shi, O s a m u Ishikawa,

これらの検討により、長期紫外線照射による変Yoshiki Miyachi "Cha n g es in skin

一 部でも抗酸化物質投与により制御可能であdisaccharide compon ents correlate with

化のることが判明すれば化粧品に配合することにより、

t h e sev erity of sclerotic skin in

光防御よりもさらに積極的な抗光老化戦略手段と

systemic sclerosis" , Acta. Dem叫ol. Venereal.,

しての有用性が明らかになり、臨床応用が可能と

74 179-182 (1994)なるものと期待される。

10 K a t s u yuki Okada, Yu m i ko Non aka,Kazunori Ohnishi, Osamu Ishikawa, Yoshiki-72-化粧品による光老化の抗帷化的制御に関する細胞生物学的及び生化学的研究

Miyachi, UTime-dependent effect of chronic

Miya chi, "Disac charide ana 1 ysis of theUV irradiation on superoxide dismutase

skin glycosaminoglycans in chronicallyand cata lase activity in hairless miceultraviolet-irradiated hairless mouse,"]. Dermatolぷ，in press
13 Yumiko Takahashi, Kat suyuki Okada,skin" , J Den湿ol.ぷ，8 183-186 0994)
11 Osamu Ishikawa, Yoko Kojima, Yoshiki
Miyachi, UDisaccharide analysis of dermal

Kazunori Ohnishi, Osamu Ishikawa,

fibroblast derived glycosaminoglycans

Yasushi Igarashi, Yoshiki Miuachi,in the three dimensional culture",]Dem皿ol. Sci., 8 203-207 (1994)"Disaccharide analysis of human skinglycosaminoglycans in sun-ex posed andsun-protected skin of the aged people"

12 Yumiko T akahashi, Kat suyuki Okada,
Kazunori Ohnishi,Osamu Ishikawa, Yoshiki]. Derrnatol. Sci., in press-73-