増殖因子による毛包休止期制御機構の解明
国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 放射線医学総合研究所 組織再生治療研究プログラム

中山文明

The expression of several Fibroblast growth factors (FGFs) is synchronized with the hair cycle in the skin and some
FGFs play a key role in regulation of the hair cycle. In particular, the expression of FGF 18 peaks in the telogen phase, andmaintains the telogen phase to determine its duration. Although the expression of FGF 13 also peaks in the telogen phase,the role of FGF 13 in the hair cycle remains unknown. This study investigated the involvement of recombinant FGF 13 inthe duration of the telogen phase and produced Fgf 13 hemizygous knock-out mice using CRSPR-Cas 9 system to examine
the physiological effects of FGF 13 . Recombinant FGF 13 was administered intraperitoneally to three-week-old female
C 57 BL/ 6 mice harboring uniform telogen phase hair follicles three times a week and the duration of the telogen phase
was determined by assessing the dynamics of skin color changes in a previously shaven telogen skin. FGF 13 significantly
prolonged the telogen phase to delay the transition into the anagen phase. In addition, FGF 13 pretreatment of eight-weekold mice harboring uniform telogen phase hair follicles suppressed the proliferation of hair follicle cells to delay the processof anagen phase induced by depilation. In contrast, Fgf 13 gene knock-out using CRISPR-Cas 9 system failed to produce
homozygous Fgf 13 knock-out mice, but produced only heterozygous knock-out mice. However, heterozygous Fgf 13 knockout mice did not significantly show the prolongation of the telogen phase. These results indicate that recombinant FGF 13
prolongs the telogen phase, suggesting that FGF 13 plays an essential role in maintaining the telogen phase. Assessing thefetuses from the edited embryo suggested that constitutive Fgf 13 knock-out mice might be embryonic lethal. Therefore,conditional keratinocyte-specific Fgf 13 knock-out mice must be generated to examine the physiological mechanism of thehair cycle regulation by FGF 13 .

1. 緒言

毛周期は、休止期、成長期、退行期の 3 つの時期からなり、種々の線維芽細胞増殖因子（FGF）の発現変動と連動
し 1）、FGF に制御されていることが明らかになってきた（図図 1 毛周期と FGF。各毛周期で 発 現 が増 加する FGFを示した。多くの FGF が毛周 期 を 前 に 進 め る が、FGF18 は抑 制 的に働き休止期を維持する。

1）。特に、FGF 18 は毛包幹細胞が存在するバルジ領域で発現し 2）、休止期で発現が増加し、成長期で低下すること
で 1）、休止期を維持していることが明らかになった 3）。一方、
FGF 13 も FGF 18 と同様に休止期で発現が多く、成長期で発現が低下している 4）。しかも、Ｘ連鎖性先天性多毛症では毛包において FGF 13 遺伝子の発現が著しく低下し、この FGF 13 発現低下が多毛症の原因と考えられていること
5）

胞内 FGF” とよばれ、細胞外での作用は全く知られていなから 、FGF 13 も毛周期制御に関係し、FGF 18 と同様にかった。ところが、我々は、この FGF 11 サブファミリー休止期の維持に重要な役割を担っていると推定される。しの FGF が細胞外から細胞内に容易に移行できることを見かしながら、FGF 13 の毛周期に対する機能は未だ証明さ出した 6）。この発見は、何らかの機序で FGF 13 が細胞外れていない（図 1）。に放出されれば、FGF 13 も FGF 18 と同様に細胞に作用でFGF 13 を含む FGF 11 サブファミリーの FGF は、他のきることを意味し、FGF 13 のシグナル分子としての可能FGF と異なり FGF 受容体と反応できない。しかも、その性を飛躍的に広げることになった。そして、組み換え体分泌機序も不明なことから、FGF 11 サブファミリーは “細FGF 13 を生体に投与することで、FGF の毛包周期への役割を探索できる可能性を示した。
FGF 13 の生体での役割を知るために、その遺伝子のノThe Regulation of Hair Cycle Resting
Phase by Growth Factors

ックアウトマウスを調べることは非常に有用である。しかFumiaki Nakayama

しながら、FGF 13 は、脳神経系で発現が多いことが知ら

Regenerative Therapy Research Program,
National Institute of Radiological Sciences,
National Institute for Quantum andRadiological Science and Technology

れているが、そのノックアウトマウスの表現型の報告がない 7）。すなわち、FGF 13 遺伝子の全身性ノックアウトマウスが誕生し、長く生存できるか未だ不明である。

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コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

以上、他の FGF と同様に、FGF 13 も毛周期制御に関与を購入して使用した。マウスの毛包は、出生後しばらく毛している可能性が考えられた。そこで、本研究では、組周期が同調しており、3 週齢の C 57 BL/ 6 では休止期に揃み換え体 FGF 13 を利用して、FGF 13 の毛周期への関与をっている。この 3 週齢のマウスを項部から背部 1 / 3 にか検討した。近年、CRISPR‒Cas 9 システムにより、ノックけて電動バリカン（Pet club ER 803 , Panasonic）で剃毛し、アウトマウスの作成が迅速、簡便化されてきたことから、項部の皮膚の色調の変化を観察することにより、毛周期のCRISPR‒Cas 9 システムにて FGF 13 ノックアウトマウス変化を判定した。すなわち、休止期では皮膚がピンク色だ作成も試みた。

が、成長期に移行するに従って毛包のメラニンが増加し、2. 実皮膚は青色に変化することで判定した。マウス 1 匹あたり

験10 µg の FGF 13 を 0 . 5 mL の 5 ％マウス serum 含有生理食2 . 1. 組み換え体 FGF13 タンパク質の作成

塩水に希釈して、マウス腹腔内に投与した。コントロール

ヒト FGF 13 には種々の splicing variant が存在するが、マウスには、0 . 5 mL の 5 ％マウス serum 含有生理食塩水

本研究では transcript variant 3（NM_ 001139501）配列ののみ投与した。FGF 13 は剃毛後 2 日目から週 3 回、計 8FGF 13 を用いた。この遺伝子配列を Gateway pDEST 17回投与し、皮膚の写真撮影も週に 3 回麻酔下で実施した（図Vector に 組 み 込 み、pET 発 現 シ ス テ ム に よ り、 大 腸 菌2 A）。

（BL 21（DE 3）pLysS）
内で His タグ付き FGF 13 蛋白質を大量に産生させ、Ni Sepharose カラムで精製した 6）。さらに、
PBS で透析した後、‒ 80 度に分注保存し、用時解凍して使用した。

2 . 3 . FGF13 投与による成長期誘導後の細胞分裂の検出
日本クレアから 8 週齢のメス C57BL/ 6 NJcl を購入して使用した。8 週齢の C57 BL/ 6 は生後 2 サイクル目の休止期に

2 . 2 . FGF13 投与中のマウス毛周期の測定毛包が揃っている。この 8 週齢のマウスの背部を抜毛するマウスは、日本クレアから 3 週齢のメス C 57 BL/ 6 NJclと、休止期の毛包は成長期へと誘導させる。抜毛 24 時間前

図 2 FGF13 投与による毛包休止期の延長。3 週齢マウスの背部を剃毛し、週 3 回 FGF13 を投与しながら、項部の毛周期を皮膚色で判定した。

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増殖因子による毛包休止期制御機構の解明に 100µgの FGF13 を腹腔投与し、抜毛後 24 時間と 72 時間

剃毛した皮膚の色調はすべてピンク色だった。生理食塩水に皮膚を採取した。採取 2 時間前にも BrdU ラベリング液をを投与したコントロール群は 5 日目で軽度青色を呈し、成腹腔に注射して、分裂中の細胞核をBrdU でラベルした。パ

長期の開始が示された（図 2 B）。さらに、9 日目では約半ラフィン包埋切片を抗BrdU 抗体で免疫組織化学染色し、分数のマウス項部が青色になり、16 日目で全頭が成長期と裂中の細胞を検出した（図 3A）。

なった（図 2 C）。一方、10 µg の FGF 13 を週 3 回腹腔投与した群では、7 日目でもピンク色を保ち、依然として毛包2 . 4 . CRISPR–Cas 9 システムによるFGF13 KOマウスの作成
Alt­-R® CRISPR‒Cas9 System を用いたゲノム編集によ休止期が持続し、9 日目でも 80 % のマウスが休止期を維持した（図 2 C）。よって、FGF 13 投与群では、2 〜 4 日の休止期の延長が認められた。

りFgf 13 遺伝子のノックアウト（KO）マウスの作成を試みた。
マウスは C57BL/6NJcl を用い、gRNA は Fgf13 の variant

3 . 2 . 組み替え体 FGF13 による成長期誘導の阻害

1 ～ 4 の共通部分を壊すように設計した。そして、Cas 98 週齢の C 57 BL/ 6 の毛包も休止期に揃っており、抜毛Nuclease と gRNA Complex の複合体をマウス受精卵にエレすることで一斉に毛包を成長期に誘導できる。そこで、抜クトロポレーションにて導入し、培養後 2 細胞期の受精卵

毛後 72 時間で毛包角化細胞への BrdU の取り込みを観察を偽妊娠マウスの卵管へ移植した。19 日後分娩により新生すると、BrdU 陽性細胞が著明に検出できることから、角仔を得た。

化細胞は分裂を始め、毛包は成長期に入ったことが示され

3. 結た（図 3 B）。一方、抜毛の 24 時間前に FGF 13 を腹腔注射果しておくと、BrdU 陽性細胞が極めて少ないことから、細3 . 1. 組み替え体 FGF13 によるマウス毛包休止期の延長
3 週齢の C 57 BL/ 6 では、毛包は休止期に揃っており、胞分裂が抑制されていることがわかった。さらに、毛包の形態変化からも成長期の開始がコントロールに比べて遅延していることが明らかになった（図 3 B）。

図 3 FGF13 投与による成長期誘導の阻害。8 週齢マウスに FGF13 投与後、抜毛による成長期誘導を行い、BrdU の取り込みにより細胞分裂を判定した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.27, 20193 . 3 . CRISPR–Cas 9 システムによるFGF13 遺伝子ノックアウト

FGF 13 が FGF 18 同様に休止期の維持に大きな役割をはた

CRISPR‒Cas 9 システムによって FGF 13 遺伝子の全身FGF 13 の毛包周期における生理的な役割を調べるため性ノックアウトを試みた。1 匹の妊娠マウスから 7 匹の仔に FGF 13 のノックアウトマウスは有用である。しかしなマウスが得られたが、FGF 13 遺伝子がホモでノックアウがら、FGF 13 遺伝子の全身性ノックアウトマウスについトされた個体は得られず、ヘテロでノックアウトされたて情報がなく、出生できるか不明であった。そこで、本研

雌が 1 匹だけ得られた。一方、別の 2 匹の妊娠マウスを出究では、CRISPR‒Cas 9 システムにより FGF 13 の全身性産予定日前日に帝王切開したが、着床痕は 20 個以上認めノックアウトマウス作成を試みた。その結果、残念ながらられたものの、胎仔は計 8 匹しか存在しなかった。しかも、FGF 13 遺伝子のホモ欠損マウスを得ることができず、ヘゲノム解析の結果これらの胎児の FGF 13 遺伝子はすべてテロノックアウトの雌マウスが得られただけだった。雌の野生型で、ヘテロノックアウトマウスも得られなかった。

ヘテロノックアウトマウスで毛包周期を観察したが、野生雌のヘテロノックアウトマウスと野生型マウスとの交配型マウスと有意な違いを認めなかった。毛包で FGF 13 のにより、数匹のメスのヘテロノックアウトマウスが得られ発現が低下しているヒトのＸ連鎖性先天性多毛症では、男た。FGF 13 遺伝子座は X 染色体上にあるため、オスのノ性患者でほぼ全身に強く多毛症の症状が出現しているのにックアウトマウスが得られれば、FGF 13 の発現が完全に対して、変異のある遺伝子座が１つしかない女性キャリア欠損しているはずだが、オスのノックアウトマウスは生ま

では、ごくわずかに体幹に多毛傾向を示すのみである 5）。よれてこなかった。これらのヘテロノックアウトマウスの背って、FGF 13 遺伝子の雌のヘテロノックアウトマウスに部を剃毛して皮膚色を観察し、休止期の長さを測定した。

何らかの毛の異状を見出すのは困難で、毛包においてさ

生後から 3 周期ほどの観察では、毛包休止期の長さについらなる FGF 13 減少もしくは発現欠損が毛の表現型の異状てヘテロノックアウトマウスと野生型マウスとの間に有意を検出するために必要と考えられた。一方、FGF 13 遺伝な違いは認められなかった。

子座は X 染色体上にあるため、オスのノックアウトマウ4. 考していることを示唆している。

スが得られれば FGF 13 発現のないマウスとなるが、雌の察ヘテロノックアウトマウスとの交配を繰り返しても、オマウス毛包は、3 週齢から休止期が 1 週間続き、その後スのノックアウトマウスは全く得られなかった。生後の成長期が始まる。休止期では毛包は短縮し、毛幹の先端も食殺の可能性も考慮し、出産直前の帝王切開も実施した毛包から分離して容易に抜ける状態となっている。この時、が、FGF 13 遺伝子ホモノックアウトの胎仔を認めなかっ毛をバリカンで剃ると、皮膚にはほとんど毛幹が残らないた。胎盤着床痕の数に比べて、胎仔数が少ないことからも、ため、皮膚色はピンク色となる。一方、成長期が始まると、FGF 13 遺伝子の破壊は胚性致死になる可能性が高いと考

毛包が下へ伸長するとともに、毛包先端から黒い毛幹が伸えられた。よって、FGF 13 の毛包周期における生理的なびてくるため、剃毛後の皮膚は青色調を呈する。したがっ役割を調べるためには、皮膚角化細胞だけ FGF 13 を欠損て、実験開始から 1 週間、すなわちマウスが 4 週齢になると、させるコンディショナルノックアウトマウスの作成が必要

無処置のコントロールマウスでは、皮膚色がピンク色かと結論づけられた。

ら青色に変化する（図 3）。ところが、組み替え体 FGF 13

5. 総を腹腔投与した群では、1 週間たってもピンク色のままで、約 2 ~ 4 日ほど成長期への移行が遅延した（図 3）。すなわち、

括組み替え体 FGF 13 を用いたマウス実験により、FGF 13

FGF 13 の投与が明らかに毛包休止期の期間を延長した。

が毛包角化細胞の分裂を抑制し、毛包休止期を延長させる休止期に抜毛することで、毛包は成長期に誘導されることが明らかになり、FGF 13 が毛包休止期の維持に重要ことが知られている。そのメカニズムは、毛幹に FGF 18な役割を果たしていることが示唆された。今回、FGF 13などを分泌する細胞が接しているが、抜毛により毛幹との全身性ノックアウトマウス作成を試み、ヘテロノックアともにこの細胞が除かれ、毛包の FGF 18 の濃度が低下すウトマウスを得られたが毛周期の異状を認めなかった。まることで、成長期に移行すると考えられている。抜毛後た、FGF 13 全身性ノックアウトマウスは胚性致死になるには FGF 13 の発現も低下することから 1）、FGF 13 につ可能性が高いことも示した。今後、皮膚角化細胞特異的にいても同様の作用が推定されたため、組み替え体 FGF 13

FGF 13 を欠損させたコンディショナルノックアウトマウを抜毛前にマウス個体に投与してみた。驚くべきことスを作成することで、FGF 13 による生理的な毛周期制御に、FGF 13 の投与により毛包の成長期への誘導は阻害さ機構の解明につなげていく予定である。

れた。すなわち、FGF 13 の事前投与が抜毛により失われた休止期維持の機構を補ったことを意味している。これは、− 130 −

増殖因子による毛包休止期制御機構の解明（引用文献）

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