果実におけるビタミン C 生合成調節機構の解明

石川島根大学生物資源科学部緒孝博准教授2)
実から ､ 植物においても D –Man/L –Gal 経路以外の別言

我々ヒトはアスコルビン酸を生合成できないため、日経路の存在についても議論の最中である｡ 事実、これ常的に食事からビタミンＣを摂取しなければならない｡

までにイチゴ果実から単離されたアルドース / ケトース

果実を筆頭に植物はビタミンＣを豊富に含んでおり、還元酵素が D –GalUA を基質にすること、同酵素遺伝子我々にとって最大の供給源となっていることは周知の事

を過剰発現したシロイヌナズナでは葉中のアスコルビ実であるが､ 植物がどのようにアスコルビン酸の合成をン酸量が野生株の 3 倍程度まで増加することなどから､調節し､ なぜ多量に含んでいるのかについてはほとんど植物でも組織特異的に D –GalUA 経路が機能している可明らかになっていないのが現状である。

能性が示唆されている ｡ しかしながら､ 植物では D –3)

植物のアスコルビン酸生合成に関しては､ これまでGalUA より生成した L – ガラクトン酸から､ アスコルビにさまざまな代謝経路が提唱されてきた（図 1）。最近にン酸の最終前駆体となる L – ガラクトノ –1,4– ラクトンなってようやくモデル植物シロイヌナズナを用いた研究

ヘの変換を触媒するアルドノラクトナーゼが未同定であから、D – マンノース（D –Man）と L – ガラクトース（L –Gal）ることなどから､ D –GalUA 経路の存在について未だ明の誘導体を代謝中間体とする D –Man/L –Gal 経路がその確な結論には至っていない。

1)

主要経路であることが分子遺伝学的に証明された ｡ 一

これまで植物のアスコルビン酸生合成に関する研究は､方、緑藻では D – ガラクツロン酸（D –GalUA）を代謝中間シロイヌナズナを中心に進められており、アスコルビン酸体とする経路がアスコルビン酸生合成に機能している事を最も豊富に含む果実に関する知見は非常に限られてい図１

植物におけるアスコルビン酸生合成経路の概要
1

石川孝

博るのが現状である｡ 果実をアスコルビン酸供給源としておいて 25 度で 100 μmol ｍ−2ｓ−1 の光条件の下 16 時考えた時､ その生合成や調節機構の解明は学術的な側面

間明 ･8 時間暗条件下で栽培した｡ アスコルビン酸の定のみならず､ ビタミンを高含有した有用品種の開発や育量にはビピリジル法を用いた。

種など応用研究にとっても重要であるといえる。そこで遺伝子発現解析は、real–time RT PCR 法を用い、果今回、未解明の果実におけるアスコルビン酸生合成調節

実組織 ( 約 200 mg) から定法にしたがって RNA 抽出し機構の解明を目的に､ モデル果実として分子遺伝学的た後、得られた total RNA (2μg) に対し Prime Script RT

ツールとして有用なトマトの矯性品種 Micro–Tom に着Master Mix (Takara) を用いて cDNA を合成した。 Real-目し､ 果実成熟に伴うアスコルビン酸レベルおよび生合time PCR は SYBR Premix EX Taq Ⅱ (Takara) を用いて､成関連酵素遺伝子発現レベルの変動、ソース葉からシン

Thermal Cycler Dice Real Time System で行った。ノーク果実へのアスコルビン酸転流の影響などについて検討

マライザーにはトマト elongation factor 1α (EF1α) 遺を行った。

伝子を用いた。
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トレーサー実験は、1.0 μCi の L –[6– C] アスコルビン酸をトマト葉から吸収させた後、100 μmol ｍ−2ｓ−1

実験材料および方法
トマト ( Solanium lycopersicum L. cv.'Micro–Tom' ) は､の連続光条件下 24 時間後に植物体を回収 ･ 乾燥後、果市販の土を用いてポットに植え、グロースチャンバーに実を含む各組織へのアスコルビン酸の分布を BAS- Ⅲ

図２

トマト果実の各成熟段階におけるアスコルビン酸量 (A) および D-Man/L-Gal 経路構成酵素遺伝子の発現レベル (B)IMG；immature green, MG；mature green, BR；breaker, YL；yellow, OR；orange, RD；mature red, PMM；phosphomannose mutase, VTC1；
GDP-D-Man pyrophosphorylase, GME；GDP-D-Man-3',5'-epimerase, VTC2；GDP-L-Gal phosphorylase, VTC4；L-Gal l-P phosphatase, GDH；
L-Galactose dehydrogenase, GalLDH；L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase2

果実におけるビタミン C 生合成調節機構の解明（Fuji Film）を用いたオートラジオグラフィーにより評価とが認められた（図２B）。その他の遺伝子についても､した。

アスコルビン酸レベルが最大となる RD の段階ではいず

D –GalUA 還元酵素およびアルドノラクトナーゼ活性れも発現レベルが最も低下していることが示された。以は、それぞれ文献 2）および 4）の方法にしたがって測定

上の結果から、果実のアスコルビン酸レベルと D -Man/した。

L -Gal 経路との関連は低いことが示唆された。

結果および考察

２. 葉から果実へのアスコルビン酸転流の可能性
Franceschi と Tarlyn は､ シロイヌナズナとアルファ

１. トマト果実成熟過程におけるアスコルビン酸量とD -Man/L -Gal 経路構成酵素遺伝子発現レベルとの関連

ルファ（ Medicago sativa ）を用いた研究から、アスコル

トマト果実を immature green（IMG）から red（RD）でビン酸はソース器官の葉からシンク器官の花および果実の各成熟段階に分け､ アスコルビン酸量を測定したとこや根端に転流して蓄積することを報告している 。そころ､ IMG から RD にしたがって湿重量あたりで約２倍に､で､ 前項の結果を受け、トマト果実の成熟に伴うアスコ果実当たりでは約８倍に増加した（図 2A)。この時､ 植物

ルビン酸レベルの増加には、葉からの転流が影響していアスコルビン酸生合成の主要経路である D –Man/L –Galるのではないかと考え､ L –[6– C] アスコルビン酸によ経路構成酵素遺伝子の発現レベルを real–time PCR によるトレーサー実験を行った｡ その結果､ 果実においてはり検討したところ､ ホソホマンノースムターゼ（PMM）

当初の予想に反し RD の成熟果実ではなく､ 成熟初期のや GDP–Man エ ピ メ ラ ー ゼ（GME）、GDP–L –Gal ホ ス ホ

IMG 果実において強いシグナルが観察されたことから､リラーゼ（VTC2）､ L –Gal 脱水素酵素（GDH）ではアスコ転流は果実成熟の初期段階におけるアスコルビン酸量のルビン酸レベルの低い IMG の段階ですでに発現レベル制御に関連していることが強く示唆された（図３）。まは最大であり、その後 RD まで成熟に伴って低下するこた､ アスコルビン酸はトマトにおいても､ シロイヌナズ

5)14

図３ L-[6-14C] アスコルビン酸によるトレーサー実験(A) トマト植物体の実体写真 .
14(B) L-[6- C] アスコルビン酸投与 24 時間後の植物体全体のオートラジオグラフィー．
(C) 果実の実体写真．
14(D) L-[6- C] アスコルビン酸投与 24 時間後の果実のオートラジオグラフィー．
1, immature green; 2-5, mature green; 6-9, mature red.
3

石

図４

川

孝

博

各種アスコルビン酸生合成前駆体が果実アスコルビン酸量に及ぼす影響

IMG ; immature green, RD ; mature red, D-GalUA ; D-galacturonate, L-GulL ; L-gulono-1,4-lactone, L-Gal ; L-galactose

ナとアルファルファの場合と同様､ 葉から葉といったと良い相関性を示した｡ 一方､ RD 果実の場合､ IMG 同ソース器官同士には転流しないこと､ 果実以外にも根端様 L -Gal 処理により有意なアスコルビン酸の増加が認や花にも転流することが認められた（図３）。

められたが､ IMG の場合とは異なり、L –Gal よりも D –GalUA で処理した場合に高いアスコルビン酸増加率を示

３.

成熟果実では D -GalUA 経路がアスコルビン酸した。したがって、IMG 果実では D –Man/L –Gal 経路以生合成に機能している

外に D –GalUA 経路の機能が示唆された。

前項までの実験から、成熟果実におけるアスコルビ

もし IMG 果実において D –GalUA 経路が機能しているン酸の蓄積には D –Man/L –Gal 経路および転流による影のであれば､ 同経路を構成する D –GalUA 還元酵素およ響は低いことが示唆された｡ そこで､ 次に D –Man/L –び植物では未同定のアルドノラクトナーゼの各酵素が機Gal 経路以外の別経路の関与について検討した。はじめ

能しているはずである。そこで､ この点を明らかにするに IMG と RD の果実について各種アスコルビン酸生合

ため IMG および RD 果実から調整した無細胞抽出液を成前駆体の影響について調べた｡ 前駆体は､ D –Man/L –用いて両酵素活性を評価した｡ また D –Man/L –Gal 経路

Gal 経 路、D –GalUA 経 路､ D – グ ル ク ロ ン 酸（D –GlcUA）

からも経路の最終段階を触媒する L –Gal 脱水素酵素およ経路からそれぞれ L –Gal､ D –GalUA､ L – グロノ -1,4- ラ

び L – ガラクトノ –1,4– ラクトン脱水素酵素活性についクトン（L –GulL）を５ｍＭ濃度で加え､ 24 時間処理後にても評価した｡ その結果､ D –GalUA 還元酵素とアルドノアスコルビン酸量を測定した｡ その結果､ IMG の果実ラクトナーゼ活性はともに果実の膜画分においてのみ検ではコントロールに較べ､ L –Gal を与えた場合のみアス出可能であり、特にアルドノラクトナーゼ活性は IMGコルビン酸量の増加が認められたが､ 他の前駆体ではと RD で比較した場合約２倍に増加していることが示さ有意差は認められなかった（図４）。この結果は 1 項でれた（表 1）。アルドノラクトナーゼは植物で未同定の酵示した D –Man/L –Gal 経路構成酵素遺伝子の発現レベル素であり、活性の検出は今回が初めての報告となる ｡

表１6)

IMG および RD 果実におけるアスコルビン酸生合成関連酵素活性の比較

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果実におけるビタミン C 生合成調節機構の解明

一方､ L –Gal 脱水素酵素活性は RD では IMG と較べてアルドノラクトナーゼの同定を中心に D –GalUA 経路の76％に減少しており、図２Ｂで示した L –Gal 脱水素酵

解析を進めることで､ 果実におけるアスコルビン酸生合素遺伝子の発現レベルの低下と相関していることが確認成調節の詳細解明が期待される。

された。
以上の結果から RD 果実においては､ D –Man/L –Gal謝辞

経路以外にも D –GalUA 経路が機能しており、この経路

本研究は､ 公益財団法人三島海雲記念財団の平成 22が活性化されることで高いアスコルビン酸レベルを維持年度「学術研究奨励金」により行われたものです｡ 助成6)していただいた財団関係者の方々に深く感謝申し上げましていることが推測された 。

す。

要

約

トマト Micro-Tom の果実成熟段階とアスコルビン酸

文献1) J.Dowdle,et al.: Plant J , 52,673-689,2007.

量の関係について解析を行った｡ 果実中のアスコルビ

2) T.Ishikawa,et al.: J. Biol.Chem .,283,31133-31141, 2008

ン酸量は成熟初期段階の IMG から後期の RD にかけて

3) F.Agius,et al.: Nat.Biotech ,21, 177-181, 2003.
4) T.Ishikawa,et al.: Biosci. Biotech.Biochem .,70,2720-2726,増加した｡ この時､ IMG においては D –Man/L –Gal 経路と葉からの転流がアスコルビン酸量の制御に関連して2006.

いること､ RD におけるアスコルビン酸量の増加には D –5) VR.Franceschi and NM. Tarlyn,: Plant Physiol ,130,649656,2002.

GalUA 経路の活性化が重要であることが示唆された｡ 本

6) A.A.Badejo,et al.: J. Exp. Bot ., in press, 2011.

研究では､ 植物で未解明の D –GalUA 経路が成熟段階特異的に機能している可能性を初めて示めしており、今後､

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