均一径リポソームと細胞の融合のためのマイクロ流路デバイスの作成

東京大学生産技術研究所

竹 内昌 治This report describes a method for preparation of monodisperse giant liposomes from patterned lipid films using
electroformation. The lipid films were patterned successfully on an indium tin oxide (ITO) electrode by a Parylene lift-offprocess. We found that the coefficient of variation (CV) of diameters of liposomes improved from 34 % to 7.6 % by using
the patterned lipid films for liposome formation.
Giant liposomes (10 - 100 μm in diameter) are cell-sized spherical lipid membranes and can enclose bio-functionalmaterials (e.g DNA, proteins); they can be used as an artificial cell or biological reactor. In our previous work, we havesucceeded in enclosing different types of nano/micro materials in giant liposomes efficiently using microfluidic channels
with electroformation method. In order to control the volume of materials enclosed in the liposomes, it is important toprepare uniform-sized liposomes. The size is also an important factor determining the success for cell-liposome fusions.
Micro-contact printing of lipids using PDMS stamp to achieve size control of liposomes was reported. However, in general,
PDMS tends to swell when in contact with organic solvents. Here, we have used a Parylene sheet instead of PDMS for
preparing lipid patterns in order to avoid such a swelling problem. Also, the Parylene sheet has advantages that it can bepatterned by standard photolithography and peeled off from the substrate easily.
Two indium tin oxide (ITO) glasses were used as electrodes and separated by a silicone spacer chamber filled withdegassed water. The lipid films were patterned on the bottom ITO glass using a Parylene sheet. When AC signal (10 Hz, 0.5- 2.5 Vpp) was applied to the top and bottom ITO electrodes, the giant liposomes were formed from the patterned lipid films.
Fluorescent images of the lipids with squares of 20 μm showed clear edges of the patterned lipids on the ITO glass. Patterned
lipids of 50 x 50 μm2 square swelled and became round after applying electric field.
The size of the liposomes became lager as the size of patterned lipid films increased. When the liposomes were produced
without the patterned lipid films, the size of the liposomes were widely distributed (CV = 34 %). In contrast, our preliminary
experiment shows that the CV became narrow to 7.6 % when the patterned lipid films were used. These results imply
that this method — electroformation of giant liposomes from lipid patterns — is useful to produce uniform-sized giant
liposomes.
Finally we fabricate a device that combines microfluidic and electrical manipulation of cells or artificial vesicles in orderto perform well controlled electrofusion. The actual device allows immobilizing cells or vesicles by suction onto an array ofmicroholes and aligning different vesicles over the holes by dielectrophoresis.

１．緒ムを作成することが要求されている．本研究の目的は，直言径の揃ったリポソームを効率的に作成し，リポソームと細近年，消費者のニーズは，高度化・複雑化し，多機能性を持った化粧品を求められるようになっている．近い将来胞と融合させることができる集約化されたマイクロ流路デバイスを実現することである．には，細胞に直接作用する多機能性化粧品に対する要求が本研究では，均一径リポソームを作成するために，筆者今後ますます拡大すると思われる．細胞内に，物質を高効らの得意とするマイクロ流体デバイスを利用することに注率・低侵襲な方法で導入するために，物質を含んだリポソ目した．マイクロ流体デバイスを利用することによって，ームを細胞に融合させる方法がある．リポソームとは，リ少量の試料で，実験に必要なさまざまな条件を変化させる

ン脂質を主体に形成される二重膜の水溶液を包含した球形ことができる．さらに，顕微鏡下で観察・操作を可能とすの小胞である．細胞膜と同様の構造を持っているため，細るデバイスと集積化できる．具体的には以下のような機能胞との適合性があるマイクロカプセルとして使うことがでをもつマイクロ流体デバイスを実現する．

きる．物質を均一な量を大量に細胞内に導入するためには，

１）均一直径リポソームの作成機能：マイクロ流路内でマ体積の揃った（直径の揃った）マイクロサイズのリポソー

イクロエレクトロフォーメイション法を利用することによって，均一径のリポソームを効率よく生産する．
２）リポソームの操作機能（位置制御，融合）：流路内に，

Fabrication of microfluidic devices
for the production of monodisperse
liposomes and the fusion of cells
Shoji Takeuchi
Institute of Industrial Science, The
University of Tokyo− 40 −

マイクロ電極アレイを置くことで，リポソームの位置を制御する．また細胞とリポソームに電圧をかけることにより，融合させることができるような機能を付加する．
リポソームの中でも近年，直径 10 から 100 ミクロンと大均一径リポソームと細胞の融合のためのマイクロ流路デバイスの作成

きい“ジャイアント”リポソームの応用が注目されている ．

1）の微細穴あきシートを用いて，リン脂質膜のパターンニンその大きさから，直接顕微鏡下で観察できることが一番のグする方法を試みた．一般的に PDMS は，有機溶媒中で利点であり ，細胞と同様の大きさであることから人工細膨潤してしまうという問題があるが，パリレンでは，起こ胞のモデルとして用いることができる ．さらに，リポソらない．また，パリレン樹脂は，ガラス基板に蒸着し，一ーム内には，薬剤や DNA を包み込むことができ，マイク

般的なフォトリソグラフィーの方法を用いて，簡単にマイロサイズの容器として用いることもできる ．

クロサイズのパターニング作製することができる．さらに，

2）

3）

4）

ジャイアントリポソームの生成法に，リン脂質膜で覆われた基板に電圧を印加することによって，膜を剥離させ，蒸着したパリレンは，容易に基板から剥がすことができる
7）という利点がある ．

単層の脂質二重膜で構成させるエレクトロフォーメーショ

以降，パリレンパターンシートを用いてリン脂質膜をパン法がある ．他の方法に比べて，単一膜構造を得られやターンニングし、エレクトロフォーメーション法を用いる

すい特徴があるが，水和法 など他の方法と同様に，作製ことにより，均一径のジャイアントリポソームを基板上にされたジャイアントリポソームの径には，ばらつきがあ

アレイ状に作製する方法について検討した結果を報告する．

1）

5）

る．リポソーム内に薬品や DNA を閉じ込め , 人工細胞やマ

２．実

イクロカプセルとして用いるためには，リポソームの粒径

験

は，知っておかなければならない重要なパラメーターであ

図１（a）に実験に使用したデバイスの実験系と，図１（b）

り，均一な大きさのリポソームを作製することで，リポソに断面からみたプロセス図を示す．厚さ 0.5 mm のシリコーム内に決まった用量の試薬を注入することが可能になる．

ーンスペーサーの上下に電極（ITO ガラス，大きさ：30×

ここでは，本プロジェクトでは，まず，均一な直径のリポ40 mm, 厚さ 0.55 mm, 10Ω/sq, 新得硝子）を配置し，内部ソームの作製に必要な検討を開始した．続いて，リポソーにリン脂質の薄膜のパターンを作製する．

ムや細胞の位置や固定操作が可能なデバイスを実現する．
これまでに，均一なリポソームを作製する方法として，パリレン樹脂を用いた脂質膜のパターニング方法とは，
図１（b）に示すように，（i）パリレン樹脂をガラスプレー

Taylor ら は，PDMS（polydimethylsiloxane）で で き た ス

トに蒸着し，O2 プラズマによりパターン化された穴あきタンプを利用し，リン脂質フィルムをパターニングする技シートを作る．その上から（ii）リン脂質と有機溶媒を混術とエレクトロフォーメーション法を利用する方法を試みぜた溶液を流し込み，１時間ほど乾燥させる．すると ITOている ．ここでは，PDMS のスタンプを使用する代わりガラスプレートが露出している穴の部分にリン脂質膜がに，マイクロ加工技術を利用して作製されたパリレン樹脂

でき，（iii）パリレンを剥がすとリン脂質膜のパターンが6）

図１（a）均一径リポソームを作製するためのマイクロデバイスの概略図．（b）パリレン
シートによるリン脂質のパターンニング法のプロセス図．（c）その基板を利用したマイクロチャネル内でのエレクトロフォーメーション法．

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コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010

できる．有機溶媒を完全に蒸発させるため，真空中で２時３．結果と考察間以上乾燥させる．その後，図１（c）のように，リポソーム形成のため，シリコーンチャンバー内に水溶液（Milli-Q

穴あきパリレンシート上に , リン脂質溶液を流し込み乾system; Millipore，pH=6.0）を導入し，電圧を印加するこ燥させる際に，シートが ITO ガラス基板から剥がれてしとで，チャンバー内で，均一径のジャイアントリポソームまうことはなく，シートは，ピンセットを使い基板の端かの作製を試みた．

ら持ち上げると簡単に剥がすことができた．図２（a）に，リン脂質は，ホスファチジルコリン（EPC）とホスファパリレンシートを剥がす前と後の蛍光写真をそれぞれ示す．

チジン酸（EPA）（Sigma-Ladrich）をクロロホルムとメタシートを剥がす前には，基板の全体が蛍光でひかり，リンノール，または，ホスファチジルコリン（EPC）をメタ脂質が全体に付着しているのがわかる．図２（b）に示す

ノールのみで溶かしたものを使用した．また，蛍光観察ように，シートを剥がすと，リン脂質膜パターンが ITOを行うことができるように，リン脂質を，蛍光色素 DiI基板上に作製されていることがわかる．正方形のパターン（1,1’-dihexadecyl - 3, 3, 3’, 3’- tetramethylindocarbocyanie

サイズは，20 μm×20 μmで，パターン間隔は 30 μm である．

perchlorate, ex/em: 549/564 nm）で染色した．

図２（c）にそれぞれのパターンの蛍光強度を示す．これよパターンされたリン脂質膜やリポソームの観察は，倒り，パターンのエッジの境界がはっきり確認できる．以上

立顕微鏡（IX-70, Olympus）を用いて，蛍光観察または微の結果より，マイクロ加工を用いて作製された微細穴のパ分干渉観察し，CCD カメラ（ExwaveHAD, Sony，またはリレンシートを用いて，リン脂質を ITO ガラスの基板上

C2741-79, Hamamatsu）を用いて撮影，ビデオで録画した．にパターンすることできた．

特に静止画像は，イメージプロセスソフト AquaCosmos作製されたリン脂質膜からエレクトロフォーメーション（Hamamatsu）を用いて撮影した．ジャイアントリポソー法によりジャイアントリポソームを作製することを試みた．

ムの直径は，Image-Box software（Library Co.）を使用し周波数 10 Hz，電圧 0.5 V の交流電場（正弦波）を印加するて計測した．とリン脂質膜が振動している様子を確認することができた．
その後，電圧を 1.5 V まで次第に上げていく．それに伴い脂質膜の振動も増幅した．電場を印加してから，５min 以
内にリポソームが形成されており，図３に示すように電場による振動によりリポソーム同士が融合したり，小さなリポソームがジャイアントリポソームへと成長する様子を確認することができた．
図４に，大きさ 10 μm×10 μm の正方形のリン脂質膜に

図３ リン脂質膜に電圧 AC field（1.5V, 10Hz）印加した後のリポソー
ムの（a）融合前，（b）融合中，（c）融合後の微分干渉像．

図２ （a）パリレンパターンを剥がす前の蛍光写真，（b）リン脂質膜（正方形 20μm×20μm）をパターンした蛍光写真．（c）断面 A-B の蛍光強度．

図４ 脂質パターン 10μm×10μm を用いて，エレクトロフォーメーション法により作製されたリポソームアレイの微分干渉像．

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均一径リポソームと細胞の融合のためのマイクロ流路デバイスの作成

電圧を印加してから 20min 後の結果を示す．作製されたジ泳動などの現象を利用して、リポソームを動かした。このャイアントリポソームは，その径が一番大きくなる位置でとき、多チャンネル信号発生装置によって、マイクロ電極観察し，本微分干渉像は，基板の底辺から７μm 高さで撮間に正確に選択的な電圧を印加することにより、位置決め影されたものである．それぞれのリン脂質膜パターン上に，を効率的に実行した。図６は、パターンした電極のある流１つのジャイアントリポソームが形成されたが，２つ以上路にリポソームを導入し、写真の A-A’ に電圧を印加するのジャイアントリポソームが脂質パターン上に形成されてことにより、リポソームの位置を移動させた実験の写真でいたものもあった．ジャイアントリポソームは，アレイ状ある。に作製され，基板上に固定されていた．ジャイアントリポ

また，移動制御させたリポソームを基板上へ整然と配置

ソームが基板上にアレイ状に固定されていることで，例えする方法として、図７のようなデバイスを開発した。このば，ジャイアントリポソームに一種類の膜タンパク質を再デバイスはマイクロ小孔が基板上に形成されており，その構築する場合には，膜タンパク質の機構解析を効率的に行上下に流路が設置してある．上側流路にリポソームを導入うことができるスクリーニングデバイスに応用することがし、下側流路を吸引すると、陰圧がかかり、上のリポソーできると考える．固定されているリポソームを基板から浮ムが、マイクロ小孔を塞ぐようにして固定化される。この遊させ，回収するには，例えば，高電圧を印加し外的な力ようにして、小孔の位置の設計どおりに、リポソームをアを加えるなど，検討が必要である．

レイ化させることが可能である。写真Ｅは、本研究で製作

図４のジャイアントリポソームの直径を測り，直径分布したリポソーム固定用の基盤である。これを用いて、多くを図 5 に示す．比較として，リン脂質パターンを使用しなのリポソームや細胞を２列に配置することに成功した。

かった場合の結果も図５に示す．パターンを用いた場合のリポソーム径の変動係数（CV：Coefficient of Variation）
値は，脂質パターンを用いなかった場合に作製されたリポソームの CV 値 34 ％から 7.6 ％に減少した．これより，均一径ジャイアントリポソームを作製するためには，リン脂質のパターンを使用することが有用であることが確認できた．
最後に，実際にマイクロ流体デバイス内で作成されたリポソームを操作可能な機能を実現した。具体的には、リポソームの位置制御、２種のリポソームの融合が可能なマイクロ電極アレイを組み込んだ。位置制御に関しては、誘電図５ エレクトロフォーメーション法により作製されたリポソームの数 vs. 直径．パターンしたリン脂質を使用しない場合 と 使 用 し た 場 合． パ タ ー ン サ イ ズ：10μm×10μm． 変動係数 CV：標準偏差値を平均値で割り％表示した値．

図６：電極アレイによるリポソームの位置制御

図７ リポソームや細胞の固定用基板．リポソームを固定し細胞を導入することで，リポソームと細胞の融合を試みる。かの写真は細胞を固定している顕微鏡映像．

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コスメトロジー研究報告 Vol.18, 2010４．総２）M. I. Angelova and D. S. Dimitrov:「Liposome括Electroformation.」, Faraday Discuss. Chem. Soc., 81, pp.
303-311 and 345 (1986).

本研究では，マイクロ加工技術を用いて作製されたパリ
レンシートにより，リン脂質膜をパターニングすることが３）Y. Yoshikawa, T. Kanbe, and K. Yoshikawa:できた．また，パターンされたリン脂質と，エレクトロフ「Daunomycin Triggers Membrane Blebbling andォーメーション法により，より直径分散の小さいジャイア

Breakage of Giant DNA Encapsulated in a Cell-Sized

ントリポソームを基板上にアレイ状に作製することができ

Liposome.」, Chemical Physics Letters, 366, pp. 305-310

た．さらに，マイクロ加工技術を利用してリポソームや細(2002)胞の移動や固定が可能なデバイスを実現した．これらの研

４）G. Tresset and S. Takeuchi:「Utilization of Cell-Sized

究を通じて，均一直径のリポソームを得て，細胞等と融合

Lipid Containers for Nanostructure and Macromolecule

させるためには，微細加工技術やマイクロ流体技術が有効

Handling in Microfabriation Devices.」, AnalyticalChemistry, 77, pp. 2795-2801, (2005).

であることが示された．

５）J. P. Reeves and R. M. Dowben:「Formation and謝辞

Properties of Thin-Walled Phospholipid Vesicles.」, J Cell
Physiol, 73, pp. 49-60 (1969)

本研究を遂行するに当たり，ご支援いただきました㈶コ
スメトロジー研究振興財団および共同研究者に深く感謝い６）P. Taylor, C. Xu, P. D. Fletcher and V. N. Paunov:「ANovel Technique for Preparation of Monodisperse Giant

たします．

Liposomes.」, Chem Commun, 14, pp. 1732-3 (2003)（文献）７）K. Atsuta, H. Noji, and S. Takeuchi:「Micro Patterning１）P. L. Luisi and P. Walde:「Why Giant Vesicles? Giantof Active Proteins with Perforated PDMS Sheets (PDMSSieve) . 」, Lab on a Chip, 4, pp. 333-336, (2004)

Vesicles.」, John Wiley & Sons, LTD. pp. 3-9 (2000)− 44 −