In vitro/in silico 試験による皮膚感作性の毒性学的懸念の閾値（TTC）コンセプトの確立
国立医薬品食品衛生研究所安全性予測評価部

足利太可雄

Recently, several in vitro skin sensitization tests have been listed in the OECD guidelines. The threshold of toxicologicalconcern (TTC) is a threshold value for human exposure that does not show any obvious adverse effects at the lower doses
for all chemicals. In this study, we aimed to develop a quantitative prediction model using in vitro/in silico dataset and establish a TTC concept for skin sensitization.
The EC3 value, which is the endpoint of the LLNA, was used as the objective variable, and data on 120 substances wereextracted from the dataset published by Cosmetics Europe. In vitro tests (DPRA, KeratinoSensTM and h-CLAT) data andphysico-chemical properties were used as the explanatory variables. A quantitative prediction model for EC3 was developed
using support vector regression (SVR), which is a machine learning approach. Predicted EC3 values were used to establish a
no expected sensitization induction level (NESIL), and acceptable exposure level (AEL) for each chemical was calculated by
dividing NESIL by sensitization assessment factor (SAF). Then by fitting gamma distribution of the AELs using a negativelog (10) scale, 95 and 99 percentile probability were calculated as the Dermal Sensitization Threshold (DST) value. Finally,
conversion of the DST to the threshold concentration of a women’s face cream was done as an example of the application ofthis concept.
This prediction model was validated by 3-hold cross validation, and the accuracy of prediction of potency class in fivecategories was 45.8%. Assuming 20% of all chemicals to be skin sensitizers, the DST (μg/cm2) for women's face cream wascalculated as 0.129 (99 percentile) and 3.99 (95 percentile), respectively. Furthermore, the threshold concentration of thistype of products was calculated as 0.008 % (for DST 99 percentile) and 0.26% (for DST 95percentile). This TTC concept
will be useful for the safety evaluation of, for example, impurities in cosmetic ingredients as a non-animal approach.

1.

緒証の厳格化など化粧品開発をとりまく最近の状況において、

言

皮膚感作性における TTC 手法は、原料中の不純物や天然毒性学的懸念の閾値（TTC：Threshold of Toxicological

物中の微量成分などヒト曝露量が非常に低いと考えられるConcern）とは、あらゆる化学物質についてそれ以下の曝物質に関する、毒性試験を伴わない包括的安全性評価法と露量では明らかな有害影響が現れないとするヒト曝露の閾して強く期待されている。

値として設定される値であり、その手法は過去の毒性試験

最近 in vitro 皮膚感作性試験が相次いで OECD ガイドラデータの統計学的解析により発展してきたものである。

インに収載され、in silico 試験法も含めた試験法の組み合

TTC 手法は毒性未知の化学物質について毒性試験を行わわせについても OECD ガイダンスが公開された 5）。また日ずにリスクを評価するアプローチであり、対象物質の化学欧の化粧品工業会は重要課題として in vitro/in silico 試験

構造の情報とヒト曝露量に関する情報のみが必要とされる法による皮膚感作性のリスク評価に取り組んでいる 6 , 7）。

ため、毒性学的情報は極めて限られているが曝露量が通常さらに最近、日本化粧品工業連合会による日本人女性の化極めて低い化学物質群を包括的に評価するために有用であ粧品使用量の調査 8）があった。

ると考えられている。TTC 手法はこれまで主に経口曝露

こうした状況から、最近国際的主要化粧品メーカーでもの全身毒性について検討されており、香料 1）や医薬品の不皮膚感作性の TTC コンセプトの実用化が検討されている。

純物 2）など一部では公的規制においても受け入れられていそこで本研究では、従来用いられてきた in vivo 試験デーる。一方、経皮曝露による主要な毒性である皮膚感作性にタの代わりに将来増加が見込まれる in vitro/in silico 試験

ついても、Safford により TTC コンセプト（DST：Dermalデータによる皮膚感作性の TTC コンセプトの確立を目指Sensitization Threshold）が提案されて以来研究が進んでし、検討を行った。

いる3 , 4）

。動物実験の廃止、原料調達の多様化、安全性保E s t a b l i s h m e nt o f a t h r e s h o l d o f
toxicological concern（TTC）concept forskin sensitization by in vitro/in silico
approaches
Takao Ashikaga
National Institute of Health Sciences,
Division of Risk Assessment

２．方法

2. 1. データセットの確立
マウス皮膚感作性試験 LLNA のエンドポイントであるEC 3（%）を精度よく予測可能なモデルを構築するために、
Cosmetics Europe により公表された、in vivo/in vitro データセット 7）のうち全ての試験データが揃っている 120 化合物のデータを用いた。予測モデル作成のため、そのうち− 62 −

In vitro/in silico 試験による皮膚感作性の毒性学的懸念の閾値（TTC）コンセプトの確立

90 化合物を training set、30 化合物を test set としてランケアやシャンプーなど）および使用状況（髭剃り後など）かダムに分割して使用した。目的変数は同一化学物質で複数ら設定した感作評価係数（SAF：Sensitization Assessmentの in vivo データがある場合、LLNA EC 3（µmol/cm²）の中Factor）9）で除することで許容曝露濃度（AEL：Acceptable央値とした。説明変数は、in vitro 試験の DPRA, h-CLAT,Exposure Level）を算出し、最終的に各化学物質の AEL をTM

KeratinoSensそれぞれにおいて、Lys および Cys を含む常用対数に変換した値について、ヒストグラムを作成した。

ペ プ チ ド 減 少 率（%）
、CV 75（µM）お よ び MIT（µM）、市販の統計解析ソフトである JMP を用い、最尤法によりEC 1 . 5（µM）および IC 50（µM）を用いた。さらに説明変数

このヒストグラムをガンマ分布にフィッティングした。ことして、主に皮膚透過性に関わる被験物質の物理化学定数のようにして得られた AEL の予測モデルと、in vivo 試験（Molecular weight, LogP, LogS, Boiling point, Melting

結果から得られた従来モデルを 2 種のパラメーター（形状point）を用いた。データの欠損値処理として、LLNA 陰性母数と尺度母数）を指標に比較した。Negative Log（10）物質の EC 3 の中央値を 150 %（後に µmol/cm² に単位変換）、AEL の 99 パーセンタイルと 95 パーセンタイルの値から、DPRA ペプチド減少率が 0 のものを 0 . 001 %、h-CLAT 陰DST（99 percentile）と DST（95 percentile）値を算出した。

性物質の MIT 値を 10 , 000 µg/mLとした。さらに LLNA お

さらに、代表的な化粧品の製品タイプである女性用フェー

よび in vitro 試験データについては、常用対数変換を行った。

スクリームを例として、本モデルと従来の動物実験によるDST 値の比較を行った。最後に日本化粧品工業連合会の2. 2. 機械学習による強度（EC3値）予測モデルの開発

本 人 女 性 に お け る フ ェ ー ス ク リ ー ム の 曝 露 量（CEL：説明変数から目的変数を予測するために非線形の機械学Consumer Exposure Level）を算出し、CEL=DST 値とし習モデルである Support Vector Regression（SVR）を選択

調査結果による製品タイプ別の使用量と曝露面積 8）から日た場合の製品中の配合濃度閾値を計算した。

した。データセットとして準備した 120 化合物について

３．結

3 -fold cross validation による性能評価を行った。モデル

果2の評価指標としては R（決定係数）と RMSE（平均平方二乗作成した EC 3 値予測モデルの予測値と実測値の散布図誤差）を用いた。RMSE は値が小さいほど予測値と実測値を図 1 に示す。training set と test set の R 2 値の平均は、2の誤差が小さいことを示す。また、R は予測モデルが適それぞれ 0 . 584 , 0 . 585 であり、RMSE 値はそれぞれ 0 . 545 ,切にデータを表現できるかを示し 1 に近づくほど良いモデ0 . 653 であった。各 cross validation の R 2 と RMSE を表 1ルといえる。RMSE と R 2 の計算式は下記に記した。

2. 3. 皮膚感作性DST値の設定得られた予測EC3（%）
値を単位面積当たりの曝露量（µg/cm 2）に変換後、既知の関係式 3）からヒトにおける無感作誘導 濃 度（NESIL：No Expected Sensitization InductionLevel）を算出した。さらに、個人間変動、製剤系（スキン表1

図1EC 3 （µmol/cm 2）の予測値と実測値の対応

3 - fold cross validationにおけるR 2とRMSE− 63 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021に示す。またカテゴリー分類（Extreme, Strong, Moderate,

さらに女性用フェースクリームの使用量（0 . 84 g/day、日Weak, Non-Sensitization）における予測値と実測値の一致

本人女性 90 percentile）と曝露面積（551 cm 2、日本人女性率は 45 . 8 % であった。120 化学物質中、予測値と実測値の頭 部 面 積 の 半 分 ）か ら、CEL を 算 出 す る と、1 . 52（mg/カテゴリーが 1 区分以内のずれに収まったのは 114 化学物cm 2 /day）であった。そこで CEL=DST として、化学物質質であり、全体の 90 % 以上であった。予測値と実測値のの女性用フェースクリームの配合濃度閾値を算出すると、カテゴリーごとの対応を表 2 に示す。

DST（99 percentile）において 0 . 008 %、DST（95 percentile）

次に得られた EC 3 値予測モデルにより、LLNA 陽性 90において 0 . 262 % とそれぞれ算出された。

物質について EC 3 予測値を算出し、各種数値変換後、最４．考終的に Negative Log（10）AEL を算出した。なお、女性用

察フ ェ ー ス ク リ ー ム の SAF は International Fragrance

今回開発に用いた in vivo の LLNA データは、CosmeticsAssociation（IFRA）の基準に従って 100 とした 。図 2 に、Europe に よ り 公 表 さ れ、 現 在 開 発 中 で あ る OECD

Negative Log（10）AEL のヒストグラムおよびガンマ分布

Defined Approach による皮膚感作性試験テストガイドラにフィッティングした結果を示す。得られたガンマ分布のインでも使用されている信頼性の高いものである。予測モ

形状母数と尺度母数はそれぞれ 1 . 98、0 . 73 であった。

デル開発において目的変数の質は大変重要であるため、現9）

全化学物質の 20 % が皮膚感作性陽性と仮定し、今回得ら れ た ガ ン マ 分 布 か ら、 女 性 用 フ ェ ー ス ク リ ー ム の時点で最も信頼性の高いと考えられるデータセットを使用した。

Negative Log（10）AEL の各パーセンタイルを算出した。

開発した SVM による EC 3 値予測モデルは、R 2 が 0 . 585

99 パーセンタイルと 95 パーセンタイルの値は、それぞれであり、カテゴリー分類の一致率も 45 . 8 % であったため、0 . 901 , −0 . 601 であった。これらの値を AEL に変換し、予測可能であると判断された。また、各 R 2 と RMSE につそれぞれを DST 値とすると、DST（99 percentile）= 0 . 126

いて training set と test set は大きな差がなく、汎化性能に22（µg/cm ）、DST（95 percentile）= 3 . 99（µg/cm ）であった。

問題ないと考えられた。EC 3 値予測モデルの予測性が良好と判断し、LLNA における陽性物質について予測 EC 3

表2予測値と実測値のカテゴリーごとの対応（%）値を NESIL に変換後 AEL を算出し、常用対数に変換して Negative Log（10）AEL を算出し、ヒストグラムを作成したところ、ガンマ分布にフィッテイング可能と考えられた。ガンマ分布の 2 種のパラメーターである形状母数と尺度母数はそれぞれ、1 . 98、0 . 73 であり、LLNA の実測値から求めたガンマ分布の形状母数と尺度母数はそれぞれ、2 . 57、0 . 57 であったことから、今回開発した EC 3 値予測モデルによる予測値の強度分布は実測値のそれと類似していることが示された。
今回得られた DST（99 percentile）= 0 . 126、DST（95percentile）=3.99 は、従来報告されたLLNAによるDST（99ガンマ分布

予測と実測のカテゴリーが一致した物質:
55 substances（45 . 8 %）
予測と実測のカテゴリーが1区分ずれた物質:
59 substances（49 .1%）
予測と実測のカテゴリーが2区分ずれた物質:
5 substances（4 .1%）
予測と実測のカテゴリーが3区分ずれた物質:
1 substances（4 .1%）

図2 Negative Log（10）スケールにおける皮膚感作性物
質のAELの分布− 64 −

In vitro/in silico 試験による皮膚感作性の毒性学的懸念の閾値（TTC）コンセプトの確立percentile）= 0 . 06、DST（95 percentile）= 1 . 63）と比較して査による 90 パーセンタイルの値を用いた。製品使用量や約 2 倍であった。また皮膚感作の AOP（Adverse Outcome

曝露面積は化粧習慣や人種により違いがあると考えられるPathway）において重要な Key Event であるタンパク質とため、同様の調査結果がある欧州の SCCS ガイダンス 12）なの結合の観点から High Potency Category（HPC）に分類さども参照し、設定条件による違いを確認すべきと考える。

れる皮膚感作性物質の DST（95 percentile）= 1 . 5 とする報本研究では、機械学習である SVR を用いて強度予測モ

告もある 10）。今回用いた 90 品の LLNA 陽性物質には、デルを作成した。これまでも機械学習による皮膚感作性のEC 3（%）の予測値が extreme に分類される 0 . 1 未満のもの

強度予測モデルはいくつか開発されており 13 - 15）、最近アがなく、そのことが強度分布に影響を与えた可能性が考えメ リ カ 環 境 保 護 庁（EPA）に お い て、Artificial Neuralられた。今後強度が extreme に分類される皮膚感作性物質

Network 16）による皮膚感作性強度予測モデルによるイソチをデータセットに追加するべきと考える。

アゾリノン系防腐剤のリスク評価が行われたことは注目に

今回試算した DST 値は、Cosmetics Europe により公表値する。今後こうした機械学習による皮膚感作性の強度予された 120 化合物のデータを用いたこと、作成した EC 3測モデルによる原料の配合許容濃度予測の実用化が期待さ予測モデルにより求めた Negative Log（10）AEL がガンマれている。

分布をとること、全化学物質の 20 % が皮膚感作性陽性で５．総あること、CEL=DST としたことなど様々な前提条件に基括づいており、今後それらの妥当性に関して検証が必要であ化粧品開発における動物実験が困難になる中、皮膚感作る。さらに、今回 acceptable risk の probability は 99 パー性の TTC コンセプト（DST）の実用化が急務となっている。

センタイルと 95 パーセンタイルを採用したが、どの値を本コンセプトが確立されれば、閾値未満の曝露量の範囲で用いるべきかについても議論が必要である。

安全性試験を行わずに、被験物質（例えば化粧品原料）の原

また、TTC コンセプトは実務上様々な利点がある一方で、以下に示すデメリットも知られている

11）

料情報と配合濃度のみで安全性評価が可能になることが期待できるためである。具体的な活用の例として、動物実験。

・化学物質の複合曝露の影響を考慮していない。

以外では特に評価が困難とされる、化粧品原料中の不純物・データセットの量と質の限界や天然物中の微量成分の安全性評価に効率的で有用な手法

・TTC は確率に基づくものであり、すべての化学物質かとなることが挙げられる。皮膚感作性の TTC コンセプトを確立するためには、多様な感作性陽性物質からなる信頼ら守るものではない。
・適用範囲が限られており、タンパク質などトレーニング性の高いデータセットが鍵となるが、LLNA など in vivoセットに入っていない不適格要件の明確化が必要のデータセットの拡充が期待できない現状を考えると、in

さらに、本 DST 値を用いる場合に注意すべき点として、vitro 試験のデータセットの拡充に期待したい。

ヒトにおける無感作誘導濃度（NESIL）を用いていること

今回機械学習の手法である SVR の採用により、予測精から明らかなように、あくまでも感作未成立状態における度および頑健性の良好な強度予測モデルの開発が可能とな閾値であることが挙げられる。したがってすでに感作が成った。本モデルにより非動物実験結果による定量的リスク立している個体の場合、今回求めた DST 値よりかなり少評価（QRA）が可能になり、製品中の配合許容濃度の算出ない曝露量で皮膚炎が誘発する可能性がある。などへの応用が期待できる。

以上の課題などから、皮膚感作性における TTC コンセ

いずれにしても化粧品開発における動物実験が困難にな

プトは、アイデアとして提唱されているものの、未だ行政りつつある現在、曝露量が極めて少ない場合に限られるも的規制の受け入れには至っておらず、今後上記の点も含めのの、in vitro 試験さえも不要となる皮膚感作性の TTC コて幅広い議論が必要になると思われる。それらを踏まえたンセプトの確立はニーズが高いと考えられ、本研究がその上で、今回得られた DST 値は、適切な適用範囲のもとで、きっかけとなれば幸いである。

皮膚感作性試験を伴わない包括的安全性評価の基準になる謝可能性があると考えられた。

辞

今回設定した DST 値を用いて、製剤（女性用フェースク

本研究は、名古屋市立大学大学院薬学研究科 医薬品安リーム）中の化学物質の配合濃度閾値を算出した。経皮適全性評価学分野および国立医薬品食品衛生研究所 安全性用する製剤は、サンスクリーンなど全身に使用するもの、予測評価部第四室との共同研究により行われたものであり、シャンプーなど洗い流すものなど様々であり、今回例とし関係者の皆様に深く感謝いたします。て挙げた女性用フェースクリーム以外の製品タイプについまた本研究の遂行にご支援をいただきました公益財団法ても、配合濃度閾値を算出してその妥当性を議論する必要

人コーセーコスメトロジー研究財団に篤く御礼申し上げまがある。また、製品使用量は、日本化粧品工業連合会の調す。

− 65 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

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