【研究報告】（自然科学部門）

ビフィズス菌由来母乳オリゴ糖分解酵素の合成酵素への転換による母乳オリゴ糖の合成

山田

東京大学大学院農学生命科学研究科（現緒言

日本学術振興会

千早特任研究員

特別研究員 PD）

り、最初に報告された Glycoside hydrolase family 20 にオリゴ糖は腸内の『善玉菌』を増やすことで腸内環境属する LnbB（由来）は、–1 サを改善するプレバイオティクスとして注目を浴びていブサイトの GlcNAc のアセチル基が求核攻撃をするといる。特に母乳中に含まれる種々のオリゴ糖（母乳オリゴう基質補助型のグリコシダーゼである4）。基質補助型の糖）は出生後間もない乳幼児の腸内にビフィズス菌を増LnbB を合成酵素として用いるためには高価なオキサゾ殖・定着させるために機能していることがわかってきリン基質が必要となる。最近報告されたもう一つのた。母乳オリゴ糖は 3 個以上の単糖が結合して複雑な構LnbX（造をした 240 種類以上の糖化合物からなる混合物であはアノマー保持型のグリコシダーゼである5）。保持型グる。そのうち 4 種類が 50％を占め、代表的なオリゴ糖とリコシダーゼは合成酵素への改変例が多いことから、本して知られている。母乳オリゴ糖の主要な構成ユニット

研究では保持型のラクト- -ビオシダーゼ（LnbX）を変はラクト- -ビオース I（LNB; Gal-β1,3-GlcNAc）であり、異型合成酵素（グライコシンターゼ）へと機能改変させ北岡らのグループにより LNB の合成が GNB/LNB ホス

ることで母乳オリゴ糖を高回収率で合成することを目的ホリラーゼ（GLNBP）を用いて安価で大量生産可能にとした。このような変異型合成酵素を用いた方法は糖転1）

subsp.

由 来）

なった 。これを基に母乳オリゴ糖の合成法開発への道移活性を利用した方法に比べ高い回収率となることが期が開かれた。

待される。

オリゴ糖を合成する方法は上述したホスホリラーゼを

我々は LnbX の触媒ドメインの立体構造を LNB との用いる方法以外に糖質加水分解酵素を合成酵素へと改変複合体の状態で決定している（投稿論文準備中）。–1 サ

し、合成基質と組み合わせることで糖を合成するものがブサイトの GlcNAc アノマー炭素付近に酸性アミノ酸残2）ある 。本研究では、母乳オリゴ糖を加水分解する酵素基がいくつか存在しており、C1 から最も近い位置にのひとつであるラクト- -ビオシダーゼを改変し、ラクD418 があり、D411 はグリコシド結合の酸素原子からト- -テトラオースを合成することを目的とした。ラク

3 Åの位置にあったことから、D418 が求核触媒残基、ト--ビオシダーゼは母乳オリゴ糖から LNB を切り出D411 が酸/塩基触媒残基であると思われた。しかし、す活性を持ち（図 1）、ビフィズス菌が LNB を取り込み

D411 は GlcNAc（−1）の C1 から 3 Å 離れており、その資化するために重要な酵素として知られている3）。これ間に水分子が存在していたことから水を介してプロトンまでに 2 種類のラクト- -ビオシダーゼが報告されておを受け渡す Grotthuss 機構であることが示された（図 2、

図1

ラクト- -ビオシダーゼの母乳オリゴ糖加水分解反応
1

山

図2

図3
表1

田

千

活性中心のアミノ酸残基（求核触媒残基 D418，酸／塩基触媒 D411）

保持型加水分解酵素であるラクト- -ビオシダーゼ（LnbX）の反応機構

実験方法

活性中心のアミノ酸残基の変異体活性

WT
D411N
D411A
D418N
D418A
D411N/D418N
D411A/D418A
D418G
D418S

早Speciﬁc activity（mU/mg）

Relative activity
（％）

1,250
1.9
2.5
4.9
2.0
5.70.20.70.3

1000.150.20
0.400.160.460.01
0.06
0.02

LnbX の WT プラスミドを鋳型とし、求核触媒残基であるアスパラギン酸（D418）に各種のプライマーを用いて PCR を行い変異体プラスミドの作製を行った。変異体プラスミドを専用シャペロン LnbY と共に大腸菌発現株に形質転換後、共発現させ、Ni-NTA（Qiagen）を用いて精製した。変異体酵素の加水分解活性は 0.33 mM
NP-LNB 基質を用いて測定した。フッ化 LNB 合成には、Gal-1P お よ び フ ッ 化 GlcNAc を 基 質 と し、GNB/LNB ホスホリラーゼ（GLNBP）を 1–2 mg/mL 添加してpH 7 にて 37℃で数時間反応させた。フッ化 GlcNAc は石図 3）。これらのアミノ酸残基の変異体を作製し精製し川県立大学の本多裕司准教授より提供していただいた。

た酵素の加水分解活性を測定した結果、野生型酵素

シリカゲル TLC プレートに反応溶液を 1 μL スポットし、（WT）の比活性値よりも 100 分の 1 以上活性が低下して展開溶媒 90％（v/v）アセトニトリルにて展開し、ジフェいたことから、D418 と D411 が活性に重要なアミノ酸残ニルアミンで発色させることで TLC によるフッ化 LNB基であることが示唆された（表 1）。の検出を行った。LNT 合成には、その反応溶液に基質となるラクトースと各種変異体酵素を添加して 25℃で 242

ビフィズス菌由来母乳オリゴ糖分解酵素の合成酵素への転換による母乳オリゴ糖の合成

図4合成酵素へと機能改変させたグライコシンターゼを用いたラクト- -テトラオース合成反応
a. フッ化 LNB の合成，b. フッ化 LNB から LNT の合成

時間反応させた後、展開溶媒（酢酸：水：ブタノール＝ス ペ ー ス が 生 ま れ る た め で あ る と 考 え ら れ て い る。

1 : 1 : 2）にて展開し、フッ化 LNB 合成のときと同様に発LnbX の二つの触媒残基のうち、求核触媒残基のアスパ色させ、LNT が生成されているかどうかを確認した。

ラギン酸（D418）に部位特異的変異を導入してアラニン、グリシン、セリンに置換し、グライコシンターゼの結果および考察作成を試みた。LnbX の変異体 D418A、D418G、D418S

1. ガラクトース 1 リン酸とフッ化 GlcNAc からの GNB/の加水分解活性を測定したところ、WT に対し 100 分のLNB ホスホリラーゼによるフッ化 LNB の合成1 以下にまで活性が抑えられていた（表 1）。生成した
LNT の加水分解活性が抑えられていることから、高い

ま ず、LNT の 合 成 に 必 要 と な る 原 料 で あ る フ ッ 化回収率が見込めるのではないかと予想された。

LNB の合成を試みた。α フッ化 GlcNAc と Gal-1P を基質とし、通常 LNB を合成する際に用いる GNB/LNB ホス

次に、酵素–反応中間体アナログをミミックした αホリラーゼ（GLNBP）の野生型酵素（WT）または変フッ化 LNB をドナー基質とし、ラクトースをアクセプ異体を作用させた（図4a）。TLC 分析の結果、LNB より少ター基質として組み合わせ、LnbX グライコシンターゼ

し上の位置にスポットがみられた（図 5a, No. 5）。これの糖転移反応を触媒させることで LNT の合成を試みたはフッ化 LNB のスポットと推測され、フッ化 LNB が生（図 4b）。その結果、D418A/G/S の 3 つの変異体をそれ成した可能性が示された。このような通常の糖合成に用ぞれ作用させた反応液中において、D418S のみフッ化いる WT 酵素を使って、フッ化糖を合成する方法は大村

LNB の消失および LNT と同じ位置にスポットが検出さらによって報告されている6）。

れた（図 5b, No. 9）。しかし、フッ化 LNB 合成の反応溶液をそのまま次の反応に使用しているため、LNT と推2.

LnbX グライコシンターゼの作成と，フッ化 LNB と測れるスポットは残存 Gal-1P である可能性も残されてラクトースからの LNT の合成いる。TLC 分析だけでは LNT かどうか判断できなかったため、今後、HPLC を用いて化合物の同定を行い反応保持型酵素では、一般的に、求核触媒残基（アスパラ産物が LNT かどうかを調べる。

ギン酸またはグルタミン酸）を側鎖が小さいアミノ酸（アラニン、グリシン、セリン）に変異することにより、今回、グライコシンターゼとして用いた変異体酵素は高いグライコシンターゼ活性が得られることが報告され3 種類であり、それ以外のアミノ酸残基に置換した変異ている。これは、求核触媒残基の能力を失わせることに体が LNT 合成に適している可能性も考えられるため他より加水分解活性が抑えられつつ、フッ化糖が結合するの変異体の作製も試みる予定である。
3山田千早図 5 TLC 分析
a. フッ化 LNB の合成 b. ラクト- -テトラオースの合成

要約
ビフィズス菌法人三島海雲記念財団および関係者の方々に心より感謝申し上げます。また、本研究は東京大学大学院農学生命

subsp.

由来のラクト- -ビオシダーゼを合成酵素へと改変し、科学研究科 伏信進矢教授、国立研究開発法人農業・食合成基質と組み合わせることで、母乳オリゴ糖の基本骨品産業技術総合研究機構食品研究部門 北岡本光博士、格となるラクト- -テトラオース（LNT）を合成するこ

京都大学大学院生命科学研究科 片山高嶺教授、石川県とを目的として実験を遂行した。合成したフッ化 LNB

立大学 本多裕司准教授らの協力を受けてなされたものとラクトースを組み合わせて、求核触媒残基の Asp418です。この場をお借りして感謝致します。

をアラニンやグリシン、セリンに置換した LnbX の変異
文

体をグライコシンターゼとして作用させた。セリンに置換した変異体を作用させた条件において、LNT と同じ

1） M. Nishimoto, M. Kitaoka:.,
71, 2101–2104, 2007.
2） L. F. Mackenzie, et al.:, 120, 5583–5584, 1998.
3） J. Wada, et al.:
, 74, 3996–4004,
2008
4） T. Ito, et al.:
, 288, 11795–11806, 2013.
5） H. Sakurama, et al.:
, 288, 25194–25206, 2013.
6） T. Ohnuma, et al.:
, 444, 437–443, 2012.

位置にスポットが検出された。今後、生成された化合物の同定を行う予定である。
謝献

辞本研究の遂行に当たり、助成金を賜りました公益財団4