アトピー性皮膚炎発症者に高度に定着する黄色ブドウ球菌と健常者皮膚細菌の菌種間干渉の解析
静岡県立大学食品栄養科学部

島村裕子

Staphylococcus aureus has been reported to overgrow in the skin of patients with atopic dermatitis. It has been reported
that some bacteria in normal human skin have the ability to suppress the growth of S. aureus and contribute to the barrier
function of the skin. However, the effect of Corynebacterium spp., which has a high occupancy in the human skin flora, on
the growth and expression of virulence factors of S. aureus are unclear. In this study, the effects of Corynebacterium spp. onthe growth and expression of virulence factors of S. aureus were examined. Furthermore, the inhibitory effect of cell freeculture medium (CFCM) of Corynebacterium spp. on S. aureus-induced inflammation was evaluated.
CFCM of Corynebacterium isolates ⑥-3 (Cory ⑥-3) significantly suppressed the growth of S. aureus in the early stageof culture and the expression of virulence factors RNAIII, hla and spa. When S. aureus MVs were added to RBL-2H3 cells,
the release rate of β-hexosaminidase was significantly increased. On the other hand, CFCM of Cory ⑥-3 significantly reduced the release of β-hexosaminidase induced by S. aureus MVs. S. aureus MVs enhanced the expression of normal humanepidermal keratinocytes (NHEK) inflammation-inducing genes, and Cory ⑥-3 CFCM significantly suppressed the expression of these genes. Our studies are the first to demonstrate the effect of Corynebacterium isolates on the inflammatory responses induced by S. aureus MVs in cultured keratinocytes.

1．緒

殖および病原因子の発現の抑制効果について解析した。また、

言RBL- 2 H 3 細胞のβ-hexosaminidase 放出率を測定することで、アトピー性皮膚炎（AD）患者の皮膚では、常在菌の種類S. aureus 由来分子を含むMVs および Corynebacterium 属菌が著しく減り、その過半数を黄色ブドウ球菌（Staplylococcusの培 養 液から菌 体を除 去した cell free condition mediumaureus）が占める異常な状態が起きていることが報告され（CFCM）が、I 型アレルギー反応である脱顆粒に及ぼす影響

1）ている 。また、S. aureus が産生するメンブランベシクを調べた。さらに、マイクロアレイ解析を用いて、表皮角ル（membrane vesicle; MVs）は、20～ 400 nm の球状構造化 細 胞（NHEK）の 免 疫 関 連 遺 伝 子 の 発 現 に 対 す る S.

2 , 3）。一方、

aureus MVs および CFCM の影響を網羅的に解析した。将正常なヒトの皮膚細菌叢は、多様性に富んでいることから、来的には、正常皮膚細菌叢由来の菌体外成分を利用した皮膚細菌叢の正常なバランスを維持することが AD の予防、AD に対する新規スキンケア方法の開発を目指す。

体であり、AD を悪化させることが知られている悪化防止につながると考えられる。これまでに、AD のモ

２．方デルマウスでは、S. aureus と Corynebacterium bovis が皮膚細菌叢の多くを占めていることが報告されている 4）。一方、

法

2. 1. AD発症者の皮膚細菌叢

我々は、成人皮膚常在細菌叢から分離したCorynebacterium

20 代の AD 発症者 8 名（男性 2 名および女性 6 名）と、属菌の中に、S. aureus の増殖を抑制するものが存在する20 代の皮膚炎症状のない健常者 9 名（男 2 名、女 7 名）のことを見出している。しかし、Corynebacterium 属菌によ前額より皮膚細菌叢を採取した。Biostic® Bacteremia DNA

る S. aureus の増殖抑制メカニズムについては明らかにな

Isolation Kit（MO BIO）を用いて DNA を抽出し、PCR にっていない。

よる 16 S rRNA 遺伝子の増幅を行った。その後、アガロ

そこで、本研究では、AD 発症者の皮膚細菌叢について、ースゲルからのライブラリを調製し、The Ion PGM Hi-Q

16 S メタゲノム解析を用いて調査し、皮膚細菌叢の動態

View Sequencing Kit（Life Technologies）を 用 い て、Ionおよび各細菌群の病態への関与を解析した。次いで、ADPGM® sequencer（Life Technologies）で塩基配列を決定し発症者から得られた S. aureus と、健常者の皮膚から分離た。得られた塩基配列は、QIIME を用いて解析した。なお、した Corynebacterium 属菌を共培養して、S. aureus の増

本研究は、本学研究倫理審査委員会の承認（承認番号 29 21）を得て実施した。

Interference between Staphylococcus
aureus showing skin colonization inatopic dermatitis patients and healthyskin bacteria
Yuko Shimamura
School of Food and Nutritional Sciences,
University of Shizuoka

2. 2. S. aureusの増殖および病原因子発現に及ぼす
Corynebacterium分離株の影響得られた皮膚細菌叢より、S. aureusおよびCorynebacterium属菌を分離した。Corynebacterium属菌よりCFCMを調製し、AD 発症者から分離した S. aureus の増殖および病原因子− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021の発現に与える影響を調べた。病原因子は、S. aureus の熱した。加熱後、三フッ化ホウ素メタノール錯体メタノー

agr 制御系によって発現が調節されている RNAIII、hla（αル溶液 2 mL を加え、再びドライブロックバスを用いて毒素）、および spa（protein A）遺伝子を標的とした。

100 ℃で 7 分間加熱した。冷却後、ジクロロメタン 2 mLを加え、30 秒間攪拌抽出を行った後、3 分間超音波で混和

2. 3. S. aureus由来MVsの調製した。混和後、飽和食塩水 5 mL を加えて、軽く振とうし、AD 発症者から分離した S. aureus ① - 1 を BHI 培地に接1 , 500 rpm、10 分間で遠心分離した。ジクロロメタン層（下種 し、37 ℃、110 rpm で 一 晩 振 と う 培 養 し た。 菌 液 を層）を褐色バイアル瓶に採取し、GC-FID 測定用試料とした。

3 , 000 g、15 分間で遠心分離後、菌体ペレットを除去した。

３．結上清を 0 . 2 µm フィルターでろ過後、限外ろ過して、100 kDaで濃縮し、さらに、超遠心機を用いて 150 , 000 g、3 時間、果3. 1. AD発症者の皮膚細菌叢

4 ℃で超遠心分離し、上清を除去した。PBS 50 µL で MVs

16 S メタゲノム解析の結果を、Fig. 1 に示した。被験者を懸濁し、タンパク質量を測定後、使用時まで−20 ℃でより採取した前額（Fig. 1（A））と右頬（Fig. 1（B））の皮膚細保存した。

菌叢では、多くのサンプルで Propionibacterium 属菌が大部分を占めていた。S. aureus を含む Staphylococcus 属菌は、

2. 4. RBL-2H3を用いた脱顆粒試験

被験者ごとに占有率が大きく異なった。Corynebacterium

24 well plate に、RBL- 2 H 3 細 胞 を 2 . 0 × 10 5 cells/ 400µL/well となるように播種し、24 時間培養した。培地を除属菌は、被験者ごとに占有率が大きく異なっていたが、17名中 15 名の皮膚に存在が確認された。

去 し、 細 胞 を PBS 500 µL/well で 2 回 洗 浄 し た 後、
releasing mixture 160µL/well + S. aureus由来MVs（0 . 05 µg/µL protein）20 µL/well、または、releasing mixture 160 µL/well + S. aureus 由来 MVs（0 . 1 µg/µL protein）10 µL/well+ CFCM（0、0 . 03、0 . 04、0 . 05、0 . 07、0 . 1、0 . 2、0 . 4 お

3. 2. S. aureusの増殖および病原因子発現に及ぼす
Corynebacterium分離株の影響
Corynebacterium 属菌の CFCM（Cory ① - 4、Cory ⑤ - 1、Cory ⑥ - 3、Cory ⑦ - 4、Cory 6 - 2、Cory 6 - 5 および Cory

よび 1 . 0 mg/µL）10 µL/well を添加し、37 ℃で 10 分間イ18 - 4）を添加して培養を行ったところ、S. aureus の増殖ンキュベートした。さらに、A 23187 を終濃度 5 µM となは有意に抑制された（Fig. 2）。これら 7 つの菌株は、rpoBるように 20 µL/well ずつ添加し、37 ℃で 30 分間インキュ遺伝子に基づいて作成した Corynebacterium 分離株の系統ベートした後、10 分間氷冷して反応を停止した。培養上樹において、同様のクラスターに含まれていた。また、熱清 50 µL を 96 well plate に移し、5 mM substrate solution処理した Corynebacterium 分離株 CFCM を S. aureus に添を 50 µL/well ずつ添加し、37 ℃で 30 分間インキュベート加した場合においても、同様の結果が得られた。

した。Stop buffer を 200 µL/well ずつ添加し、マイクロプ

そ こ で、S. aureus の 増 殖 を 最 も 抑 制 し た Cory ⑥ - 3レートリーダーにて 405 nm における吸光度を測定した。

CFCM を添加して、S. aureus の病原因子発現に及ぼす影響について調べた。その結果、Cory ⑥ - 3 CFCM は、S.

2. 5. 正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）の炎症惹起に対するCFCMの抑制作用

aureus の病原因子である RNAIII、hla および spa の遺伝子発現量を有意に抑制した（Fig. 3）。

S. aureus MVs（3 . 5 µg/µL protein）および CFCM（5 µg/µL）を添加して培養した NHEK から total RNA を抽出した。

3. 3. RBL-2H3を用いた脱顆粒試験

Agilent RNA 6000 Nano Kit（Agilent Technologies, Inc.,

A 23187 を添加し、calcium ionophores 刺激により細胞

cat.# 5067-1151）
およびAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent内の Ca 2 + を増大させた RBL- 2 H 3 細胞の脱顆粒に対するTechnologies, Inc.）を用いて Total RNA の品質を確認した。

Corynebacterium 属菌の CFCM および S. aureus MVs の影

NHEK か ら 回 収 し た Total RNA を 用 い て、GeneChip ™

響を検討した。その結果、9 株の Corynebacterium 属菌のScanner 30007 G（Thermo Fisher）
による DNA マイクロア

CFCM の添加により β-hexosaminidase の放出率が有意にレイ（ClariomTM S Assay, human）
解析を行った。

減少した（Fig. 4（A））。また、S. aureus MVs（Fig. 4（B））の添加により β-hexosaminidase の放出率が有意に増加し

2. 6. CFCM中の脂肪酸のGC分析

た（Fig. 4（C））。 さ ら に、S. aureus MVs と Cory ⑥ - 3

約 200 mgのCFCMの凍結乾燥物または標品として 29 . 85

CFCM を同時に添加したところ、S. aureus MVs と PBS をmg の tuberculostearic acid（ 終 濃 度 100 ppm）に、0 . 5 M添加した場合と比較して、β-hexosaminidase の放出率がNaOH-CH 3 OH 溶液 1 . 5 mL と、ラウリン酸（内部標準物質）有意に減少した（Fig. 4（C））。そこで、S. aureus MVs に2 mg を加え、100 ℃のドライブロックバスにて、9 分間加よる RBL- 2 H 3 細胞の脱顆粒を最も抑制する Cory ⑥ - 3− 126 −アトピー性皮膚炎発症者に高度に定着する黄色ブドウ球菌と健常者皮膚細菌の菌種間干渉の解析

Fig. 1: The skin microbiome composition of patients with atopic dermatitis（AD）and healthy
subjects at the genus level.
（A）The skin microbiome composition of human forehead.（ B）The skin microbiome
composition of human cheek. AD: patients with atopic dermatitis, Healthy: healthy subjects.

Fig. 2

Effect of Corynebacterium CFCM on the growth of S. aureus.

The cell concentration was measured by the optional density at 600 nm（OD 600）
． Error bars
represent SE. Distilled water（DW）was used as a negative control. * represents p ＜ 0 . 01
compared to the DW.

Fig. 3

Effect of Corynebacterium CFCM on virulence gene expression.

S. aureus were cultured for 5 h with CFCM isolated from Corynebacterium spp. Gene expression ofRNAIII（A）, hla（B）and spa（C）mRNA was determined by real-time RT-PCR. Distilled water（DW）wasused as a negative control. Error bars represent SE. * represents p < 0 . 05 compared to the DW, * * p <0 . 01 compared to the DW.

− 127 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Fig. 4 Inhibitory effect of Corynebacterium CFCM on ㌼-hexosaminidase release from RBL- 2 H 3cells.
（A）Inhibitory effect of Corynebacterium CFCM on ㌼-hexosaminidase release from A23187-stimulated
RBL- 2 H 3 cells.（B）Transmission electron microscopic analysis of S. aureus membrane vesicles
（MVs）
（．C）
Inhibitory effect of Cory ⑥-3 CFCM on ㌼-hexosaminidase release from S. aureus MVs.
（D）Concentration dependence of Corynebacterium CFCM on inhibition of ㌼-hexosaminidase releasefrom S. aureus MVs. *represents p < 0 . 01 compared to the control. † p < 0 . 01 ; unpaired, twotailed student' *s t-test.

CFCM の 濃 度 を 検 討 し た。S. aureus MVs と 共 に、0、供し、有意な変動が認められる免疫応答系シグナル経路を

0 . 03、0 . 04、0 . 05、0 . 07、0 . 1、0 . 2、0 . 4 お よ び 1 . 0 mg/

探 索 し た と こ ろ、TNF signaling pathway お よ びµL の Cory ⑥ - 3 CFCM 凍結乾燥物の PBS 溶解液を RBL-

Cytokine-cytokine receptor interaction が抽出された。S.

2 H 3 細胞に添加し、ϐ-hexosaminidase の放出率を測定しaureus MVs 添加群、S. aureus MVs + Cory ⑥ - 3 CFCMた。その結果、S. aureus MVs と 0 . 2 mg/µL の Cory ⑥ - 3添加群および Cory ⑥ - 3 CFCM 添加群の pathway 解析結

CFCM 凍結乾燥物の PBS 溶解液を RBL- 2 H 3 細胞に添加

果におけるシグナル経路に含まれる遺伝子の ratio（=fold-した際に、ϐ-hexosaminidase の放出率が最も減少した（Fig.

change）を Table 1 に 示 し た。CXCL 1、BCL 3、IL 1 B、4（D））
。一方、1 . 0 mg/µL の PBS 溶解液を RBL- 2 H 3 細TNFAIP 3、IL 22 RA 1、TNFSF 10 および CD 40 遺伝子の胞に添加したところ、ϐ-hexosaminidase の放出率が増加し発現は、S. aureus MVs 添加群で増加し、NFκBIA（NFκBた（Fig. 4（D））ことから、CFCM の脱顆粒抑制には、最適Inhibitor Alpha）遺伝子を除き、S. aureus MVs + Cory ⑥な濃度が存在すると考えられた。

- 3 CFCM 添加群で減少した（Table 1）。

3. 4. 正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）の炎症惹起に対するCFCMの抑制作用

3. 5. CFCM中の脂肪酸のGC分析
15 菌株の Corynebacterium 分離株 CFCM 中に含まれる

S. aureus MVs および Cory ⑥ - 3 CFCM が NHEK の免脂肪酸を GC-FID によって分析したところ、全てのサンプ疫関連遺伝子に対して与える影響を網羅的に解析するため、

ルにおいて、標準物質溶液（ジクロロメタン）と内部標準物マイクロアレイ解析を行った。各群のサンプルデータにお質（ラウリン酸メチル）以外に、3 つのピークが検出された

いて、ratio（= fold-change）> 1 . 7 および ratio < − 0 . 6 で発（Fig. 5（A））。Tuberculostearic acid の保持時間は 44 . 7 分

現が変動した遺伝子を抽出し、DAVID の pathway 解析にであったが、サンプル由来の検出ピーク中に同一の保持時− 128 −

アトピー性皮膚炎発症者に高度に定着する黄色ブドウ球菌と健常者皮膚細菌の菌種間干渉の解析

Table 1

Summary of differential gene expression in normal human epidermal keratinocytes.

Gene Accession

EntrezGene
ID

Gene Symbol

S. aureus MVs

S. aureus MVs+ CFCM

CFCM

NM_ 001511

2919

CXCL 1

2 . 812 . 62

1 . 57

NM_ 021258

58985

IL 22 RA 1

2 . 28

1 . 81

1 . 50

NM_ 005178

602

BCL 3

1 . 91

1 . 401 . 14

NM_ 000576

3553

IL 1 B

1 . 88

1 . 63

1 . 40

NM_ 001270507

7128

TNFAIP 3

1 . 74

1 . 51

0 . 97

NM_ 020529

4792

NFKBIA1 . 71

1 . 881 . 16

NM_ 001250

958

CD 40

1 . 71

1 . 66

1 . 45

Fig. 5 : GC analysis of fatty acids in CFCM from Corynebacterium isolate.
（A）GC-FID chromatogram of fatty acid from Corynebacterium CFCM（Cory ⑥- 3）．
（a）A peakat retention time（RT）35 . 0 min.（b）RT 41.1 min.（c）RT 43 . 9 min.（B）Comparison of relativeabundances of fatty acid from Corynebacterium CFCM of the peak at RT 35 . 0 min,（C）RT
41.1 min, and（D）RT 43 . 9 min. Relative abundances were calculated from peak areas in gas
chromatograms（n = 2）．

間のものは存在しなかったことから、Corynebacterium 分

４．考離株 CFCM 中に含まれる脂肪酸の中には、tuberculostearicacid は存在しないことが示唆された。

察

S. aureus は、AD 発症者の皮膚で異常増殖することが報得られた 3 つのピークの脂肪酸について、凍結乾燥物の告されており 1）、菌体自体やその産生物が AD を悪化させ質量と内部標準物質のクロマトグラムによって面積値の補ることが示唆されている 2 , 3）。これまでに、一部の正常ヒ正を行い、BHI +α 培地中に含まれる脂肪酸量を 1 として、ト皮膚常在細菌は、S. aureus の増殖抑制能を有し、皮膚Corynebacterium 分離株 CFCM 中に含まれる脂肪酸量を相のバリア機能に寄与することが報告されているが、ヒト皮対比較した。各種 Corynebacterium 分離株 CFCM 中に含膚細菌叢における占有率が高い Corynebacterium 属菌 5）がまれる脂肪酸量を相対比較したところ、菌種による差は認

S. aureus に与える影響については明らかになっていない。

められなかった（Fig. 5（B）-（D））
。

そこで、本研究では、Corynebacterium 属菌が S. aureusの増殖および病原因子の発現に与える影響、さらに S.

− 129 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Corynebacterium 属菌の菌体外成分を明らかにすることにaureus 誘導性 AD に対する作用について調べた。
Corynebacterium 分離株由来 CFCM を S. aureus に添加して培養したところ、Corynebacterium 分離株⑥ - 3（Coryより、S. aureus 誘導性 AD に対する正常ヒト皮膚常在細菌を利用した新規スキンケア方法の開発が望まれる。

⑥ - 3）の CFCM において、S. aureus の培養初期段階における増殖および病原因子である RNAIII、その下流遺伝子である hla および spa の発現を有意に抑制した。RNAIII 遺6）（引用文献）
1） Kong, H., Oh, J., Deming, C., Conlan, S., Grice, E.,

伝子は、agr 制御系遺伝子群の発現を調節している こと

Beatson, M., Nomicos, E., Polley, E., Komarow, H.,

から、Cory ⑥ - 3 の菌体外成分が quorum sensing 機構を

Murray, P., Turner, M., Segre, J.: Temporal shifts in

阻 害 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た。 ま た、calcium

the skin microbiome associated with disease flares andionophores で前処理した RBL- 2 H 3 細胞に S. aureus MVs

treatment in children with disease flares and treatmentを添加したところ、β-hexosaminidase の放出率が有意に

in children with atopic dermatitis. Genome Res., 2 2:増加し、脱顆粒を誘導した。一方、Cory ⑥ - 3 の CFCM は、850-859（2012）．

S. aureus MVs が誘導した β-hexosaminidase の放出を有2） Wang, X. , Thompson, C., Weidenmaier, C., Lee J.:

意に減少させ、脱顆粒反応を抑制した。マイクロアレイ解

Release of Staphylococcus aureus extracellular vesicles

析の結果、S. aureus MVs は、NHEK の炎症誘導関連遺伝

and their application as a vaccine platform. Nature子の発現を亢進させ、Cory ⑥ - 3 CFCM は、これら遺伝子

Commun., 9: 1-13（2018）．の発現を有意に抑制した。これらの結果より、S. aureus

3） Gurung, M., Moon, D., Choi, C., Lee, J., Bae, Y., Kim,

MVs は、NHEK の炎症誘導に関連する遺伝子を増大させ、J., Lee, Y., Seol, S., Cho, D., Kim, S., Lee, J.:

そ れ に 対 し て、Cory ⑥ - 3 の 菌 体 外 成 分 は、S. aureus

Staphylococcus aureus produces membrane-derived

MVs 自体に作用することで、炎症反応の増悪を抑制してvesicles that induce host cell death. PLoS ONE, 6: 1-8いる可能性が示唆された。15 菌株の Corynebacterium 分（2011）．

離株 CFCM 中に含まれる脂肪酸を GC-FID によって分析

4） Kobayashi, T., Glatz, M., Amagai, A., Nagao, K.:したところ、菌種による差は見られなかったことから、S.

Dysbiosis and Staphylococcus aureus colonization

aureus の増殖および病原因子の発現抑制には、脂肪酸以drives inflammation in atopic dermatitis. Immunity, 42:外の物質が関与している可能性が考えられた。

756-766（2015）．

５．総5） Grice, E., Segre, J.: The skin microbiome. Nat. Rev.

括Microbiol., 9: 244-253（2011）．

本研究の成果より、ヒト皮膚常在細菌であるCorynebacterium

6） Vuong, C., Saenz, L., Götz, F., Otto, M.: Impact of the属菌の菌体外成分は、S. aureus の増殖および病原因子の発agr quorum-sensing system on adherence to現を抑制することを明らかにした。さらに、Corynebacterium

polystyrene in Staphylococcus aureus. Infect. Dis., 182:属菌の菌体外成分は、S. aureus MVs による脱顆粒および1688-1693（2000）．

AD 様皮膚病変の誘発を抑制することが示唆された。今後、− 130 −