サンスクリ ー ンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究
浜松医科大学古川福実

UVB is well known to induce anti-ENA antibody binding on the surface of humancultured keratinocytes. In SLE-prone MRL/lpr mice, UVB irradiation accelerates theonset of skin lesions and augments the cytotoxicity of cultured cells. Based on our previ­
ous reports, we examined the preventive effects of sun screen on DVB-induced changes
in uitro and in uiuo.
Normal human cultured keratinocytes were purchased from Clonetics (EPI­PACK, San Diego). MRL/1 mice were maintained in our laboratory. As the sun screen,di- (p-methoxycinnamoyloxy) -mono- (2'-ethylhexanolyloxyl) propane was dis­solved in acetone for in uitro test and in the base cream for the in uiuo test.
In uitro MTT assay revealed the 1- 2 % sun screen solution in acetone blocked com­pletely the DVB-induced cytotoxicity of EP!-P ACK cells, mouse keratinocytes andmouse fibroblasts in culture. Anti-ENA antibody binding to cultured human ker­
atinocytes was markedly suppressed by sun screen. Long-term exposue to 500mJ le而
UVB light accelerated the development of skin lesions in MRL/1 mice painted with basecream. In contrast, 2 or 4 % sun screen painting blocked the early onset of skin lesions.
These results suggested the usefulness of sun screen in the prevention of photocyto­
toxicity in human and murine lupus dermatoses.

1. 緒 言未だ充分に解明されているとは言い難い面があるのも事実である。
紫外線の細胞障害性や易感受性の研究において近年、 日光特に紫外線による皮膚障害が、 有棘は従来、 地表に到達しない短波長紫外線 (UVC、細胞癌や基底細胞癌などの悪性新生物、加齢およ部の自己免疫疾患の発症あるいは修飾因子と波長 280nm 以下）を用いた研究が主であった。

して注目されている。 主たる原因は皮膚を構成す

しかし、 実際の日常生活においては、 UVB やる表皮細胞や線維芽細胞の中波長紫外線 (UVB、UVA C 長波長紫外線、波長 280-320nm) に対する細胞障害性や易感受胞障害性や易感受性が問題となる。 この点につい性にある。 このような紫外線による皮膚障害を防ては、 国内外の研究成果は十分ではなく、 易感受止する目的で多種のサンスクリ性の検索方法については確立した方法さえもない

一び一ーン剤が用いられ

波長 320nm 以上）の細サンスクリ ーのが現状である。 そこで、 我々は今回下記の点を、ン剤の組織障害性に対する防御作用については、主に免疫学ならびに生物学的手法により明らかに定の効果をあげている。 しかし、Immunological Effects of Sun Screen on Hu­
man and Murine Keratinocytes
Irradiated with UltraViolet B
LightFukumi Furukawa

するために研究を行った。
1) UVB 照射に対する培養細胞の易感受性の検討
2)

サンスクリ ー ン剤の紫外線（特にUVB) による細胞毒性防御能は均 ーであるか否か。 すHamamatsu University
School of Medicine

なわち、 各個人別の培養表皮細胞を得ることにより、 その均 一 性の有無を検討する。

-91-3)サンスクリ ーン剤の自己免疫疾患とくにエリレ ー トを用いた発色法によるMTT法あるいは蛍テマト ー デスにおける光線過敏性（易感受光顕微鏡を用いたAO/EB法を用いた。詳細は、性）への 有効性が指摘されている。紫外線にコスメトロジ ー 研究振興財団研究業績中間報告集

対する易感受性に対するサンスクリ ーン剤の第2号p63-79, 1993に記載ずみである。
Pam、 HSCあるいはMRL/1マウスの線維芽有 用性の解析を行う。

細胞に対するUVB 50mJ/c面の単照射において、2. 実験と結果2%SB(プラスチック皿に SB溶解液を入れ、 皿越しに照射。 照射線量は、 溶解液を入れた皿越し

2. 1に培養細胞面での測定値。）は、 完全に細胞障害細胞毒性への効果

培養細胞株として、 マウス由来のPam212、性を阻止した（表 1)。 HSCや線維芽細胞では、

HSC-1 C人由来皮膚squamous cell carcino­ma)を用いた（京都大学医学部皮膚科井階幸

線量依存性の傾向が伺えた。

一先生より分与）。 また、 成人あるいはマウスの表

表1

Percent inhibition of UVB-induced cyto­
toxicity by sunguard B

皮あるいは真皮線維芽細胞の培養を行った。
ヒト表皮培養細胞は、 新生児包皮より 得た皮店組織を0.25%トリプシンで4℃ 20時間処理した後、 表皮と真皮を剥離した。 表皮細胞浮遊液は、
MCDB153培地を基本とするKGM培地で無血清の条件下で型のごとく(37℃、 5% C02イン
キュベ ー タ ー 内） 行った。 真皮組織はコラゲナ ー
ゼ処理で線維芽細胞浮遊液を得た後、 10%F CSを含んだM199培地で培養した。 また、 正常人や光線過敏性を示す代表的疾患であるル ー プスエリ

Concen1ra1ion of Sunguard 8Cell0.5%

1.0%

2.0%

Pam 2120%0%100%100%

HSCー1060士11100

100MRL/1 fibroblasts

043士749土21100

Results are expressed as the mean (士1SD) ofthree experiments.
l) Sunguard B was dissolved in acetone.
2) A single 50mJ/crr1 UVB light irradiation wasperformed.

テマト ー デス(LE)の患者の表皮細胞培養は、ヒト培挫表皮細胞へのUVB照射による細胞障

我々が開発した人工表皮水疱作製器 I . 2 >と培養害性は、 包皮由来あるいは成人由来においても線方法 3) を用いて 行った。

量依存性に認められた。 図lは、 正常人(Con­trol)と光線過敏性を有するLEの培養表皮細胞

マウスの表皮細胞と真皮線維芽細胞の培養も、基本的には上記の方法によった4)を用いた結果を示している。 正常人はLE患者に。

サンスクリ ーン剤として、 di-(p-methoxycin -比して高い細胞障害性を示し、 新生児包皮のnamoy loxy)-mono-(2'-ethy lhexanoy loxy)

値 8) より高値を示した。 また、 培養細胞の条件

propane(サンガ ー ドB、 以下SB)を用いた。

が安定すれば、 個人差（細胞障害性）は新生児包実験によっては、 SBのコントロ ールとして base

皮の場合とほぼ同様であった。 そして、 2%SB

cream (oil 13 %, moisture 7 %, UV ab­によって、 UVBによる包皮あるいは成人培養表

sorbent 8 %, P-25 3 %, water 69 %)を用いた。

皮細胞の障害性は 阻止された。

線源として、 Toshiba FL-20SE30サンラン

自己免疫マウスのMRL/1では、 我々はすでに同ラン プは 305nmの波長にビ ー ク

コントロ ー ルのMRL/nマウスに比べてUVBにを有し、 UVR -305/365による測定で 15 cmの距対する細胞障害性が高いことを報告した 4) 。 今離で 2.4mW /c面の energy outputを示す。

回の実験においては、 例えば培養表皮細胞の場合、プを用いた。

細胞毒性の検定には既報 4) のごとく、 96穴プ-92-

著明な抑制効果があることがMTT法を用いて明サンスクリ ー ンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究

30

らかとなったが、抑制の程度には、両マウス間に゜ー25有意な差は見られなかった。図 2 は、第 2 代培養
表皮細胞にUVB200mJ/c面を照射したときの細（凌2匿璽100 mJ/cm2
仁50 mJ/cm2
仁コ 0 mJ/cm2胞毒性の結果を示している。

501

A1 9 XO +O +f.Q

2. 2 自己免疫現象に対する効果
2.2.1
MRL/1マウスの場合
MRL/1マウスは代表的な自己免疫マウスで、4-5ヶ月齢にみられる皮疹はヒトLEの皮疹モデ
ルである 5) 。このマウスを用いて、図3の実験計

5画に沿って照射を二日ごとに総計28回行った。
我々の従来の研究結果 6) よりUVB 500mJ/c而
LE(6 cases)

図1Control(10 cases)

Cytotox1city of Cultured Keratinocytes toUVB

2) 2% SB、3) base cream、4)無処置の4つを設定した。肉眼的所見において、1)2)群

亡コ： non-treatedで著明な皮疹誘発抑制効果が見られるものの、他の免疫学的所見において差が見られないのは既報のごとくであった。そこで今回の実験では、表皮内の免疫担当細胞であるランゲルハンス細胞の動I n25 I20（図3のC)照射群で有意な肉眼的所見が得られることが判明していたので、今回の照射量を500mJ/c面と設定した。処置群として1) 4%SB、T

霊： sun screen

態を検索してみた。その結果、表 2 に示すように

SBはランゲルハンス細胞の減少を抑制すること

啄、一一J 15•→一，»

MRL/Mp-lpr/lpr(MRL/1)
MAL/Mp—+/+(MRL/n)

1.5-mo-oldI
0 O O UV irradiation A:Control
B:100mJ/cm2.80 1
ぢ、 0uve(c:soo

D:10005MRL/1(newborn)

MRL/n(newborn)

UVB; 200mJ/cm 2
図2

E:1 J/cm2
F:1028 times every two day s
Examination : Light microscopy (skin & kidney)
Ultrastructural microscopy
Skin lupus band test
Anti-DNA antibodies(lg G)
Proteinuria
図3 In vivo UV light irradiation
UVA<Effects of sun screen on UVB-induced cy­
totoxicity of cultured keratinocytes-93-表21a·-Langerhans cells in the epidermis of
MR L/1 mice irradiated with UVBて、 この現象は、 UVBに対する表皮細胞の易感
受性のマ ー カ ー として用いられ得る。 この減少にNumber/mm

対してSBがはたして、 抑制的に働くか否かを検4% Sunguard B

3 7. 5士7.1

討した。

2% Sunguard 834.7士3.9

Base cream

31.7土5 .2

TreatmentNon

23.9士5.2

Non-iradiated33.7土5.9

新生児包皮より得た第2継代目の培養表皮細胞を用いた。 抗体として用いたSS-A/Ro, SS-Bl
La, RNP, Sm 抗原に特異的な抗血清は、 SLE患者の血清をスクリ ー ニングすることにより得た。
特異性 の 検 索 は、 double immunodiffusion,control

c ounter immunoelectrophoresis お よびim­Results were expressed as the mean (士1SD) of
5 examined mice.

munoblott ing 法で行った。 他に、自己免疫マウが判明した 。 しかし、 この ような傾向はbase

DNA抗体を用い、 コ ントロ ー ルとして正常人血cream群でも見られたことからSB特異的と言え清(NHS)や無活性培養液を用いた。 測定方法るか否か問題点として残っている。

は、 Lab-Tek chamber slideあるいは60mm 培

2. 2. 2ス由来のモノクロ ー ナル抗dsDNA抗体と抗ss­

抗ENA抗体結合誘導能

養 用ディシュに細胞を培養し、 70-80% コ ンフ-UVB易感受性モデルとしてールエンシ ー に達した時、 サンスクリ ー ン処置を

UVB照射によって、 正常人培養表皮細胞表面にENA (extractable nuclear antigens)が発行った後50mJ/c記のUVB照射し、 さ らに24時間後に免疫組織学的に検索に供した。

7現されることを従来 より認めてきた - 9 l。 光線過敏性を示すL.E. 患者の表皮細胞では、 コ ント

一ロ ー ルに比べて高い発現性を示す（図4)。 従っ
60”のごとく、 Lab-Tek chamber slide 用には、 acet one で、 flow cytometry 用には、 2%検討した。 二次抗体としては、 FIT C 抗ヒトIgGを用いた。 表3に示すとおり、 FACS解析にて明40 30 20

saqoJ
dJOl'lu1
pu1
q%

らかな抑制効果が認められた。 また、 通常の蛍光抗体法においても同様の結果を得た。
表3

Effects of sun screen on UVB induced bind­ing of antibody probes on the surface ofcultured keratinocytes by flow cytometry
Antibody specificilles

10Control(10 cases)（--- ） cytotoxic,ty baseline
Antibodies binding to cultured ker­
atinocytes irradiated with UVB (100mJ/cnl)-94-% positive cells
ControlSun screen

SS-A/Ro

235士6953土1.2

SS-B/La

20.7土6.6

37土3.6

U,RNP

24.6土87

4 1士5114.2土97

54土4.9<1%<I%

SmNHS•

LE(6 cases)

図4報

パラホルムアルデヒドで後固定した細胞を用いて匿璽anti-SS-A
巨anti-RNP
anti-ssDNA
亡NHS50抗ENA抗体の培養表皮細胞への結合は、 既Resu Its represent the mean (士1SD) of at least
three experiments. Cells were irradiated with asingle UVB dose of 50mJ/cnl.
*N HS;normal human serumサンスクリーンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究

3. 考察文献l)古川福実他：京大式人工表皮水疱作製器の紹介
I . 基本設計とその試作。皮紀要84: 5-9, 1989

培養表皮細胞を用いて紫外線、特にUVB照射2)古） If福実他：京大式人工表皮水疱作製器の紹介による細胞障害性や易感受性を検討した。 特に、II. 水疱表皮の組織学的検討。皮紀要84: 11-14,

UVB照射によって本来細胞内あるいは核内にあ1989

るU,RNPやSS-A/Ro抗原が細胞表面に移動

3) Furukawa F et al : Serum-free serial culture

する現象は、UVBに対する細胞の易感受性を検of adult human keratinocytes from suct10n­出する方法として有用なものではないかと推察さ

blister roof epidermis. J Invest Dermatol 89 :れた。

460-463, 1989

そして、本研究は、このようなin vitro系にお4) Furukawa F et al : Susceptible cytotoxicity to

いてサンスクリ ー ン剤がUVB照射による表皮細ultraviolet B light in fibroblasts and ker­

胞障害性あるいは易感受性に対してもまた皮膚をatinocytes cultured from autoimmune-prone

場とする自己免疫的現象に対しても抑制的あるいMRL/Mp-lpr/lpr mice. Clin lmmunol Im­
munopathol 52: 460-472, 1989

は予防的に働くことを示している。 また、 MRL
マウスを用いた実験より本剤の予防的あるいは治5) Furukawa F et al: Dermatopathological stud­

療的有用性が明らかとなった。 今後は、in vitro

ies on skin lesions of MRL mice. Arch Der­のUVBに対する易感受性の検索方法が、真に細matol Res 276: 186-194, 1984

胞表面であるか否か、あるいはin vitroのサンス

6) Horiguchi Y, Furukawa F et al : Effects of ul­

クリ ー ン剤の溶解性の問題等が解決されなければtraviolet light irradiation on the skin of MRL/

ならない。 前者においては、すでにconfocal蛍

1 mice. Arch Dermatol Res 279: 478-483, 1987

光顕微鏡によって、細胞表面の局在を確認したと

7) Furukawa F et al : Estradiol enhances bind­ころである。 このような問題点が、明らかになれ

mg to cultured human keratinocytes of anti­

ば、サンスクリ ー ン剤のさらに詳細な分子的作用

bodies specific for SS-A/Ro and SS-B/La. J機序をも知ることができるようになろう。

Immunol 141: 1480-1488, 1988
8) Furukawa F et al : Binding of antibodies to謝 辞

the extractable nuclear antigens SS-A/Ro

本研究に対するコスメトロジ ー 財団の援助に感and SS- B/La is induced on the surface of謝します。 また、本研究は、京都大学医学部皮膚human keratinocytes by ultraviolet light

科今村貞夫教授をはじめ、同大学の多くの先生方C UVL). J Invest Dermatol 94: 77-85, 1991のご協力により可能となったことを付記します。

9) Furukawa F et al : Relationship between heatshock protein induction and the binding of an­tibodies to the ENA on cultured human ker­
atinocytes. J Invest Dermatol 101 : 191-195,1993-95-