ごあいさつ
当財団発足以来， 早くも4年の歳月が流れました。
この間， 化粧品を取り巻く諸環境は大きく様変わりしています。 化粧品が担う社会的及び文化的側面の解明が進み， また同時に皮膚科学領域の知見が急速に蓄積されつつあります。 一方化粧品産業界においては商品の高機能化， 国際化のうねりの中で， 世界的な規模で， 戦略建て直しが模索されています。
このような状況の下， 化粧品の今ある姿を明らかにし， 今後あるべき姿を指し示す コ スメトロジ ー （化粧品学）の構築を目指す当財団の着実な事業活動は， 多くの人々の賛同を得ることができて， 順調に推移して参りました。
なかんずく， 既成の学問領域にこだわらず， 境界領域の研究課題を広く公募しての研究助成活動は， そのユニ ー クさ， 選考の適切さなどで，関係各界の注目を集めており，コ スメトロジ ー の進展に寄与するところ大であるとの評価を得ております。
さて， この度， 昨年に引き続き， 上記助成研究課題に関する平成6年
度報告をまとめ， 皆様にお届け致します。 参考にして頂ければ幸いです。
私どもは， 皆様方にご理解をいただきながら，

コ スメトロジ ー の更なる発展を願い， 諸活動を強力に推進していく所存であります。 今までにも増して， 当財団の活動を温かく見守って下さいますようお願い申し上げます。
平成6年8月財団法人 コスメトロジ ー 研究振興財団
理事長

小林

孝三郎

—一目

．

次

ごあいさつ

■ 研究報告I. 素材， 物性に関する分野

・・・・・・...…………………………

2

明治
国立衛生試験所 武田"…...
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・• 新ししヽDDS剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発

10

東京理科大学片岡
則・..………….........
…………
開発• 化粧品素材としての利用が可能な乳酸菌の新規育種技術の18

早稲田大学理工学部 桐村光太郎
ーー ルモノブチルエ ー
リ
ナ
エチレング
コ
水ーノ
テルからなるン•
3 成分 2 相系の相挙動に関する熱力学的考察 .. • ·.... ·.. • ·.... ·.. · ·.. ·....·..·.. ·.. ·.. ·.. ·.. ·.. ·23• 各種界面活性物質によるマクロおよびマイクロエマルションの調製並びに物性に関する物理化学的研究 .. · ·.... ·.. ·.. ·.. ·.. · ·.. ·.. ·.... • ·.... ·.. ·.. • ·.. ·.. ·..

29• 新製剤i去及び新素材を用しヽた化粧品の品質確保に関する研究

一

九州大学理学部

東京理科大学理工学部
Il. 生体作用， 安全性に関する分野• 太田母斑に対するQスイッチ・ルビーレーザ ー の治療効果

誠

荒殿

阿部

正彦

・.........................................

帝京大学医学部

渡辺晋

一• 細胞内脂質輸送機構の解析

一細胞内ビタミンE特異的輸送タンノぐク質の構造と意義一…………………………...
東京大学薬学部

新井

44

50

洋由

・皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生 ・・・・・・・・.............................................................

57

東京薬科大学 森陽..........................................

66. ;{ッチテスト結果のコ

ンビュ ー タ ー 処理システム開発研究

名古屋大学医学部附属病院分院
・皮隣過敏症に対するマスト細胞の役割

律子.............................................

72

大阪大学医学部 北村 幸彦
・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・·................................................

77

ーマスト細胞欠損動物を用しヽた検定法の開発—
・チロジナーゼ抑制因子の精製と応用

早川

北里研究所メディカルセンタ ー 病院

亀山孝

一

郎

．接触光過敏症のマウスモデルを用いた化粧品による光アレルギーのスクリーニングおよびサンスクリーンの効果の評価 .......................................
浜松医科大学 滝川雅浩

82

・・・・・・・..................................................

・人工皮膚を用しヽた皮膚の形成機構に関する研究
・サンスクリー

68

広島大学理学部 吉里 勝利
性御ンの紫外線 表皮障害に対する防 作用の免疫生物学的研究 •••…………….. • 91

浜松医科大学 古川
福実..
......................
............
............
96
検討—
Sensorを用しヽ
Skin
た
Direct・皮溝と加齢の関係ー
慶應義塾大学医学部 本間 聡起• 開放型セルを用しヽたレーザー光音響法による経皮吸収測定 ・・・・・・......••.••..••......•....•..••.••.•103
東京大学工学部 澤田嗣郎••.
…
…... 107………
……………
• 神経ペプチドによる皮膚炎症反応の成立機序とその特異的制御
・皮膚の機能と脂質代謝に関する基礎的研究

千葉大学医学部 岩本 逸夫
・・・ ・·•.•..•....•.•••••.•.•..•..••..••..••••.••...•.•.•• •·•·•..• 115
新届大学医学部

小野輝夫

・転移因子を用いたアントシアニン色素生合成遺伝子とそ の発現調節因子遺伝子の解析 •••..• •·•..•·•··•·..••··• · • ·• · ·.. •·••·• · •••.·• · •..··•• • · •..· ••• •· ·119
東京理科大学基礎工学部
・皮膚の老化における染色体構造の変化と遺伝子修復機構に関する研究
理化学研究所
● 記念講演平成5年度記念講演

酸素分子の二重性格性につしヽて

● 付

録

花岡

文雄

......................................................131
東京大学薬学部● コスメトロジ ー 研究雑感

飯田滋………………………125

廣部雅昭....................................... ·..·...........................................·141：：�=成刃;���·· : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :�;

平成5年度事業報告............................................................................................. 151

． ．

研究報告

I

素材、物性に関する分野

II

生体作用、 安全性に関する分野

I . 索材，物性に関する分野

新製剤法及び新素材を用いた化粧品の品質確保に関する研究
国立衛生試験所

武田

国立衛生試験所

東京都立衛生研究所

愛知県衛生研究所

木嶋敬二

鈴木助治

河村典久

明

治
神奈川県衛生研究所

堀田佳哉•岸美智子

埼玉県衛生研究所

石野正蔵

Functional cosmetics make the best use of recent technical advancement in such field
as formulating technology, new materials and biotechnology.
We want establish routine analysis for quality and prossmg control.
In this study, a method has been developed for the simpie and rapid analysis of an ionic preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters, sodium dehydroacetic acidand sodium sorbic acid in cosmetic products by high performance liquid chromatogra. pro ducts are foundation contain nylon fme powder, titaphy (HPLC) . These cosmetic
mum dioxide fine power as a new materials, rinse in shampoo by new formulating tech­
nology and eye liner.
The present method consists of two steps ; firstry extraction and cleaning up andsecondly, quantification by HPLC.
HPLC conditions ; Column, ODS silica gel column Mobile phase, ① 0.002 M
cetyltrimethylammonium chloride/0.05M NaH,PO, • MeOH ·CHぶN (50 : 35 : 15)(pH 5.2with H,PO,)② MeOH·H,0 (60 : 40)
The present method was applicable to the determination of anionic preservates mcommercial products without interference of other cosmetic ingredients.

1. 緒

クノロジーやファインケミストリ ーによる新素材

言の開発研究、更にこれらをとり入れた新製剤技術
これまで化粧品は製品の安定性、使用性、製造の開発によって行われているものである。 これら技術および品質管理などが中心であった時代、低の新素材を含有又は新製剤技術によって製造され感作性原料など安全性が重要視された時代を経てた化粧品中の添加成分の分析法および添加成分と現在は技術革新と平行して高令化社会を迎えるに基剤との相互作用を考慮した現象を追求し、目的あたり、老化制御に対する期待など化粧品の有用性の問題がクローズアップされてきた。

に合った分析法を確立し、化粧品の品質確保に寄いわゆる機能性化粧品といわれるものは、生物本研究においてはこれら化粧品のうち、新原料学、物理学、薬学、心理学など多くの学問分野がとして微粒子酸化チタン、微粒子ナイロンバウ
ダー等、新製剤としてリンスインシャンプ ー、上関与したライフサイエンスを基盤としてバイオテ

与することを目的として実験を行った。

記の新原料を含有するファンデー ションそして安Studies on quality control of cosmetics usmg
new types of formulating tech­
nology and materials.

全性への配慮が必要な眉目化粧品類であるアイラ
イナーを対象として製品中に含有されるアニオン

Akiharu Takeda

型防腐剤の分析法の確立を高速液体クロマトグラ

National Institute of Hygienic
Sciences-2-

フィ ー (HPLC)を用いて行った。

新製剤法及び新素材を用いた化粧品の品質確保に関する研究

3. 実験方法および結果

2. 試薬、 試料および装置
2. 1

3. 1

試薬、 試料ファンデ ー ション中のメチルパラベンの定量

ソルビン酸カリウム(SOA-K)は市販試薬
ー級、デヒドロ酢酸 ナトリウム(DHA-Na)

3. 1 . 1

メチルパラベン標準溶液

は市販試薬99%以上、塩化ステアリルトリメチ

メチルパラベン 100.0mgを精秤し、メタノ ー ルルアンモニウムは「粧原基」品、ヤシ油脂肪酸メにとりヽし 100..0叫とし、これをメタノ ー ルで希釈

チルタウリンナトリウムは「粧外規」品を各々用し、10、20、30

い た 。 シリカゲル は Kieselgel-60 (メ ル ク社

なお抽出方法の検討には 50、100、200ppmの溶°、 40ppmの溶液を調製した。

製）を105 、2 時間活性化し、シリカゲルデシ液を用いた。

ケータ中に保存したものを用いた。 その他の試薬

3. 1 .2

は、すべて市販特級品を用いた。

試料A-1、A-2を各々0.5gを精秤し、これに抽出方法の検討

実験に 用いた試料はアセトニトリル、エタノ ー ルまたはテトラヒドロ(A)ファンデ ー ション

フランを加えて 10.0叫とし超音波浴で 5分間分散微粒子ナイロンパウダー 配合ファンデ ー

した後、遠心分離( 3500rpm、10分間）し上層ション(A-1)および微粒子酸化チタン配をメンブランフィルタ ー C 0.45 11 m)で池過し、合パウダーファンデーション(A-2)でいHPLC に注入した。 さらに上記の操作を2回繰り

ずれもメチルパラベンを0.3%含有するもの

返し、同様に HPLC に注入した。 抽出回数及び(B)リンスインシャンプ ー
ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、溶媒の違いによる抽出率を算出し、Table 1.に示した。

塩化ステアリルトリメチルアンモニウムを主Table 1 より各溶媒による抽出率は良好でほぼ基剤としたもので安息香酸ナトリウム 0.5%

同じ傾向であった。しかしアセトニトリルに比べ含有するものてエタノ ー ル、THFは遠心分離できれいな上澄(C)アイライナ ー液が得られず混濁が強く、アセトニトリルの場合

ポリメタクリル酸配合乳化型液状アイライはほとんど混濁せず優れていた。 従って抽出には

ナ ー C C-1)及びペンシル型固形アイライ

アセトニトリルを用いた。更に超音波処埋の時間、ナ

ーC C-2)で前者はメチルパラベン 0.05％、後者はプロビルパラベンを0.1%含有す

試料の 加温時間等を検討したが処理時間を5分にすれば加温の必要がない ことがわかった。

るものを各々用いた。
2.2

装

Table 1.

抽出溶媒の違いによる抽出率

置

抽出it,(%)''

高速液体クロマトグラフは 一般に市販されている装置を、検出器、デ

ー

試料

沼 媒

試料口(g)

A·I

7しi:iリII
I9)→l
TIIF

Q,501
0,506
0.503

92 1
90:1
101.0

7Hこトリl
I9J-II
TIIF

0.501
0:501
0.502

100.0
'98 2
101.7

タ処理装置も汎用されているものを使用した。また HPLC 用カラムは市
A-2

販パックドカラムを用い、オクタデシル化した平均粒子径5µm、内径4.0-4.6mm、長さ 125250 mmのものを使用した。

·

2

3

計

6. I
57
53

1.2
0.7
01

99.7
IO�. I
106 7

1.2
6.4
5,3

0.8
09
0.7

105 0
105.5
107 7

1) メチルバラベン配合呈 (0.3%) に対する各画分より．得た定星値の割合--::- 3 -

3. 1 . 3 試験溶液の調製
試料A-1、 A-2各々 0.5gを50叫の遠心管にとり、 アセトニトリル 10叫を加え、 超音波浴中

ピ ー ク面積(X 1000)
y21000(47邸3x 2.3079) R"2 2 1.000
2000
十で5分間分散させる。 これを遠心分離(3000rpm、10分間）後上澄液を50叫のメスフラスコにとりさらにこの操作を2回繰り返してアセトニトリル
層をメスフラスコに分取し、 アセトニトリルを加1000

えて全量を50.0叫としたメンプランフィルタ ー
3. 1 .4。。

(0.45µm)で濾過し、 HPLCに注入した。
ファンデ ー ション中のメチルパラベ
ンのHPLCクロマトグラム
Fig.Iに示すHPLCの条件で試料A-1、 A-2

20

30

40

50

濃度(ppm)

メチルパラベンの検量線

89

回収率の検討2.lA-1、 A-2の試料について 3.1.3に従い試
験溶液を調製し、 HPLCにより定量した結果をTable 2に示した。 n ==5の平均回収率からC · V％も小さく良好な結果が得られた。

|

HPLCの測定条件
カラム； TSK gel ODS 80叫(4.6mm i.d.
X 150mm)
移動相； 0.002M 塩化セチルトリメチルアン
モニウム /0.05M NaH,PO, •MeOH · CH,CN (50:35:15)(PH5.2 リン酸）°
カラム温度； 40
流 速； 1.0叫 /min
UV検出器； 254nm
注入覇； 10µR,
検量線の作成平均回収率(%)

CV(%)

3. 2 リンスインシャンプ ー 中のアニオン性防腐剤の定量
3. 2. 1

アニオン性防腐剤標準溶液

安息香酸ナトリウム(BA-Na)、 SOA-K、
DHA-Na、 パ ラベン類C PH BAE)

Cメチル、

エチル、 プロビル、 プチルエステル）各100.0mg
を各々メタノ ー ルに溶解し、 これを更に適宜メタノ ールで希釈し標準溶液とする。
3. 2. 2

3.1.1で得られたメチルパラベン標準溶液C10、回収!f, (%)

5
4
．0
．
0

A-2

試科嚢Cal

5
1
．6
．
5
9
9

A-I

3
．7
．
6
6
9 9
～
～
3
．7
．
5
9 5
9

試料

9 1
0
0
5
5
．
．
0
～ 0
～
3
500。
5
0 0

〗‘
旦

Table2 試料 A-1、 A-2の回収率(n = 5)

試料 A-1、 A-2 および標準溶液中のメチルパ
ラベンのHPLCクロマトグラム

3. 1 . 5

和g.2
3. 1 . 6

r

m

p

p

Fig.1

蕊

マトグラムを示した。

ヽ
8
0
ヽ
0
6
l
老l
s

丁
—
�
い巨

中のメチル パラベンの分離を行った。 各々のクロ10

リンスインシャンプ ー 中へのアニオ
ン性防腐剤の添加

20、 30、 4 0 ppm)をFig.Iの条件で操作し、 得BA-Na、 SOA-KおよびDHA-Naの50.0

られたビ ー ク面積とメチル パラベンの注入量からmg/叫の水溶液を調製し、 各々 2.0叫をとり、 こ

検量線を作成した。 その結果をFig.2に示した。

れにリンスインシャンプ ー を加えて、 合計重量を20.0gとし、 よくかき混ぜたものを試料BA-Na、-4-

新製剤法及び新素材を用いた化粧品の品質確保に関する研究

試料SOA-K、 および試料DHA-Naとする。

3.2.4

またPHBAEは各エステルそれぞれ50. 0rng/叫の3.2.1で得られた各 アニオン性防腐剤標準溶液

メタノ ー ル溶液を調製し、 0.1叫ずつ同一容器にはSOA-K、DHA-Naの農度20、50、100µg

とり、メタノー

検量線の作成ルを揮散させた後リンスインシャ／叫、BA-Na、PHBAE、10、20、40µg/叫

ンプ ー を加え、合計重量10. 0gとし、よくかき混で得られたピ ー ク面積と アニオン性界面活性剤のぜたものを試料(PHBAE-1)、各エステル溶液

注入量から検量線を作成した。 原点を通る直線関0.2叫ずつ取り同様に調製した試料(PHBAE-係が成立した。 HPLC の測定条件はFig.1と 同

2)および各エステル溶液 0.5叫ずつ取り同様にじであるがカラムにはSuperspher 100 (RP -調製した試料(PHBAE-3)を調製した。

18Ce))(4mmi.d.X 125mm)を用いた。

3.2.3 試験溶液の調製
3.2.3. 1

メタノ

ー

3.2.5

ル抽出法

回収率の測定リンスインシャンプ ー にアニオン性防腐剤を添

各試料約 0.5gを精密にはかり、5叫のメタノ ー

加した試料BA-Na、 SOA-K及びDHA-Na

ル及び無水硫酸ナトリウム5gをかきまぜ、さらを3.2.3.2 シリカゲルカラム法で処理した。 溶離ール20叫を加え、40℃で20分間加温す

液A中にはBA-Na、 SOA-K、DHA-Naはる。 これを氷冷した後、遠心分離C3000rpm、検出されず、溶離液B より各々BA-Na、SOAにメタノ

10分間）し、 上澄み液を と る。 残 留物にメタ-K、DHA-Naを検出した。 その時の回収率をノ ー ル20叫を加え同様の抽出 を行う。 上澄み液

Table 3に示した。 試料PHBAEl-3からは溶を合わせエバポレ ータ ー C40℃以下）で濃縮し、離液A中にはPHBAEを検出したが、溶離液Bー ルで正確に20叫とし試験溶液とする。

中からはPHBAEは検出されなかった。 これら

シリカゲルカラム法 1)の回収率をTable4に示した。 PHBAE-3は若メタノ

3.2.3. 2

3.2.3.1と同様に操作し上澄み液を合わせ以下

Table3 試作リンスインシャンプーヘの BA-Na,
SOA-K, DHA-Naの添加回収結果

つぎのように操作する。 エバポレ ー タ ー (40℃以下）で濃縮し更にメタノ ー ルを完全に留去する。
これを約3gのシリカゲルにまぶしてよく分散させる。 別に予めシリカゲル3gをヘキサン ・ 酢酸
エチルC97:3)を用いて充填したカラムに、減添加�(%)

含条(i)

回収率（％）

変動係数

BA-No

0.51

1.05

103.9

02

SOA-K

0 50

0 50

94. 2

3.5

DIIA-Na

0.52

0.52

91 4

40

圧しながら積層させた。 さらにこの混液を用いてフラスコ中に残留したシリカゲルをカラム中に洗Table 4 試 作 リ ン ス イ ン シ ャン プ ー ヘ の PHBAE（メチル、 エチル、 プロピル及びブチ
ルエステル）の添加回収結果い込む。 ついでカラムにヘキサン ・ 酢酸エチル(97:3)を流し、はじめの溶出液60叫を除く、
つぎにヘキサン ・ 酢酸エチル( 80:20)で溶出し、-―-メチルエステルエチルエステル
プロビルエステル
プチルエステル1•1m,1r, 2メチルエステルエチルエステル
プロビルエステル
プチルエステル留出液60叫を分取し、これを溶出液Aとした。
さらに、カラムにメタノ ー ルを流し、溶出液60合叫を分取し、 これを溶出液B とする。 A及びBの溶出液を各々エバポレー

約1叫まで濃縮し、メタノ

ー

タ

ー

(40℃以下）で合

ルで正確に20叫とし試験溶液A、B とし、適宜希釈してその20µP,

仝

-5-

I5
I8
06
2. 5

計

I 9
06
2.1
0. 4

計

エチルエステル
プロビルエステル
プチルエステルをHPLCに注入した。

—

変動係数

1'118,\E 3

!t

II

14
I 3
I I

干低い値を示したが概ね良好な結果が得られた。

と酸類が同時に分析されるので以下の検討を行っ

溶離液B中のBA-Na 、SOA-K、DH A-Naた。
3 . 2. 7のクロマトグラムをFig.3に示した。
また 、2.1(B) 中のBA-Naの 定量を行った
ところ0.54%であり、その他のアニオン性防腐剤は検出されなかった。

安息香酸ナトリウムとパラベン共存
製品におけるHPLCによる分離

検出波長 254nmではBA-Naとプロビルパラ
ベン などは近い保持時間を示すが 235nmの検出
ではBA-Naの濃度 40µg/叫の時に各パラベン 4

( I
)

3 寸8

µg/叫及び 8µg/叫の濃度で共存していてもほー

とんど検出されなかった。BA-Naとパラベン(Nは HPLCでは移動相の条件により分離が可能であり、試験溶液中の濃度を適当に選ぶことにより、

C"')

―
―

29

シリカゲルカラムを用いる分離を行わず定量が可能であった。
3.3 アイライナー 中のメチルパラベン及びプロ

92 ·2

ビルパラベンの定量
3.3. 1標準溶液の調製

3.2.1アニオン性防腐剤標準溶液に準じてパラベン類の標準溶液を調製した。
3. 3. 2 試験溶液の調製『ー'.·'.•...,:,
r·.._

固型アイライナ ー の場合は試料約O.lgを精秤
し、アセトンを加えて、20分間超音波処理をす

Fig.3

試作リンスインシャンプー中のBA-Na, SOA-K, DHA-NaのHPLCクロマトグラム(1) DHA-Na(2) SOふK (3) BA-Na
HPLCの測定条件
カラム： Superspher 100 (RP-18 (e))(4mm i.d. X 125 mm)
注入量； 20 11 R,
その他はFig.lと同じし、メタノ ー ルを加えて、40 水浴中で 10分間

市販リンスインシャンプ ー の分析

タノ ー ルを加えて、10叫とした後、上澄み液を

3. 2. 6

市販リンスインシャンプ のうち安息香酸塩含ー

有の表示 のある2品目（製品A 、B) について
3.2.3.1メタノ ー ル抽出法で処理しHPLCにより分離し、235nmで検出を行い、BA-Naをピる。更にアセトンを加えて10叫とした後、上澄み液を 0.5 /.Lillのフィルタ ーを用いて濾過し、試験溶液とした。
液状アイライナ ー の場合は試料約0.2gを精秤°加温した後、20分間超音波処理をした。更にメ
0.5 /.Lillのフィルタ ー を用いて隠過し、試験溶液とした。
3.3.3 検量線の作成

ー

3.2.1で 調製したPHBAE 標準溶液(0-40

ク面積値による絶対検量線法によって定量を行っppm) を用いて検量線 を作成した。6種類のたところBA-Naとして0.4 8%及び0.53%の安PHBAEは各々完全に分離した。この場合 カラ

息香酸塩が検出された。この場合 、製品Aには

ムにWakosil ODS 5C18 (4.6mmid X 250mm)、

パラベンの記載があり確認したところ、イソプチ

移動相はメタノ ー ル• 水C 60:40)、検出波長はルパラベンであった。3.2.3.1のメタノ ー ル抽出

254nmを用いた。この条件により各々の検量線法は簡便で再現性のある方法であるがパラベン類

は いずれも原点を通る直線が得られた。

-6-

新製剤法及び新素材を用いた化粧品の品質確保に関する研究

3.3.4 抽出方法の検討
3. 3.4. 1について検討し、そ の測定値を比較した結果を固形アイライナー

Table 6に示した。それぞれの 抽出率は、 メタ

固形アイライナ ー 中の パラベンの分析についてノ ー ルを用いた際の分析値を100と換算した場合は報告がみられない。そこでまず、試料から超音Table 6各種抽出溶媒による液状アイライナ ー 中のメ
チルパラベンの分析

波を用いて分散させることにより、 パラベンを最ム及びn ー ヘキサンの各溶媒約8叫を加えて、 20
分間超音波処理することにより、それぞれ抽出し、その測定値を比較した結果をTable 5に示した。

aJ抽出率は， 溶媒としてメタノ ー ルを用いた際の分祈値を100と換算した場合の数値

Table5各種抽出溶媒による固形アイライナ ー 中のn­
プロピルパラベンの分析
媒溶の数値で表した。試料は風乾しやすく、溶媒への抽出率,)
325305 c:,c:,599907ー

32530500

50%エクノ ー ル
メタノ ー ルエタノ ー ル
アセトン
酢酸エチル
クロロホルムかヘキサン

599907oooolo．．．．．．
000
coo

分析値(%'w/•;)

co
l
ll

50%エタノ ー ル
メクノ ー ルエタノ ー ルアセトン
酢駿エチル
クロロホルムn — ヘキサン

800 80660
8
9099

ル、

メタノ ー ル、アセトン、酢酸エチル、クロロホル

抽 出 率ヽ ）分折値(%, w/w)`
L
88786605555555
0000000．．．．．．．
0000000

試料C-2 O.lgを精秤し、水、50%エタノ

如
I合

ー

媒

も効率よく抽出する溶媒について検討した。

°

溶解 を容易にするため、まず 40 の水浴中で 10
分間加温することとした。抽出溶媒に水を用いた
場合には、 88%と十分な抽出率が得られなかった。また、n ー ヘキサンではパラベンは抽出されなかった。 更に50%エタノ ー ル、メタノ ー ル、
エタノ ー ル、アセトン、酢酸エチル及びクロロホa)抽出率は， 溶媒としてアセトンを用いた際の分析値を100と換算した場合の数値

ルムでは、ほとんど同率で高率に パラベンが抽出

各々の抽出率は、アセトンを用いた際の分析値をされた。そこでバラベン以外の成分が溶解しにく

100と換算した場合の数値で表した。極性の高いく、 上澄み液を施過する際容易なメタノ ー ルを抽水及び50%エタノ ー ルでは、十分に分散がされ出溶媒として用いた。

にくく抽出率もそれぞれ53%及び9 2%であった。

3. 3. 5

メタノー ル及び酢酸エチルでは、試試料C-1、C-2のアイライナ ー の分析結果を料の分散はされたが、抽出率はそれぞれ95%、

Table 7 に示したが、固形アイライナ ー にはプロ

9 3%及び 75%であった。また酢酸エチルは、ク

ピル パラベンが 0.100%、液状アイライナ ー にはロマトグラム上でn ー プロピルパラベンとほぽ同

0.058%含有されていた。

ー

ル、エタノ

ー保持時間に溶媒ピー クを認めるため、適当でな

回収率の測定Table? 試料C-1、C-2パラベン含量

かった。更に極性の低い溶媒であるクロロホルム

21
――
cc

及びn ー ヘキサンにより パ ラベンは抽出されなかった。しかし、アセトンでは試料はよく分散さ

パラペン含歪(%)

変勅係数（％）

O. LOO
0 .058

0 .11
l. 84

れ、分析値が最も高い値を示した。
3.3.4.2

液状アイライナ ー

3.3.6

市販アイライナ ー （固形）を 3.3.2 試験溶液 の

液状アイライナ ー 中のパラベンの分析について
は斉藤ら

2)

市販アイライナ ー の分析の報告を参考にして行った。すなわ

調製に準じて処理し、分析した結果をTable 8にー示した。各々n ー プロピル パラベンが 0 064%及と同様に、 超音波処理による パラベンの抽出溶媒

び 0.075%含有されており、他の パラベン類は含

ち、試料C-1を 0.2g精秤し、固形アイライナ-7-まれてい な かった。 市販アイライナー （固形）A、

また 、 微粒子ナイロンパウダー 3% 含有の頬紅

B社のク ロマトグラムをFig.4に示した。
TableB市販の固形アイライ ナ ー 中のn ー プロピルパ
ラベン含量に0.3% の割合 でメチルパラベンを含有した モデ
ル試料を3.1.3 試験溶液の調製法またはアセトニ
トリルの代わりにメタノ ー ルを用いる方法で試験

変動係数（％）

溶液を調製し 、 Fig.1に準じて 測定を行った。 た

17
6
9
．
0．
0

45
D
6
7
00
．
0．
0

33

社社
AB

パラベン含堂（％）

もTHFを用いて 調製する必要がある。

だし移動相は0.002M臭化ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウム/0.05M NaH2P04· MeOH ·CH 3 CN (50:35:15) Cリン酸でpH5.2に調製）

C92 .cS S 2 "Eを用いた。 その結果 、 回収率はアセトニトリル(83%)を用いる より メタノ ー ル(94%)を用いる方が良い回収率が得られた。
こ れら のこと 及び3.1 の実験 結果から 、 抽出溶
媒にアセトニトリルまたはメタノ ー ルのいずれか製品によって使い 分け、 超音波処理を行うことによって微粒子酸化チタンや微粒子ナイロンパウ
ダーに配合さ れている パラベンの吸着現象は分析上特に考慮する必要はないことがわかった。

4.2

リンスインシャンプ ー 中のアニオン性防腐
剤の定量

A社

B社

(!)

(1)

成分（カチオン、非界面活性剤及びシリコン類な£€ 6 . 0 Iど）の組合せでできている。 安息香酸ナトリウム

リンスインシャンプ ーはシャンプ ー 成分（アニオン、 両性、非イオン界面活性剤など）と リンスの定量においては単に無水硫酸ナトリウムを加え
メタノ ー ル抽出によっても良好な 結果が得られる
ことがわかった。 更にHPLC の測定条件に関し

Fig.4 市販固形アイライナ ー のHPLCクロマトグラム
HPLCの測定条件は本文中に記載(1) n ー プロビルパラベンては移動相に0.002M臭化ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウム/0.05M NaH2P04· MeOH ·CH心N (50:35:15)、 検出波長235nmでも測定が可能である。 またサリチル酸ナトリウムに関し

4. 考察とまとめては移動相に0.002M臭化ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウム/0.05M NaHz P04· MeOH ·

ファンデ

ー

ション中のメチルパラベンのCH 3 CN (20:35:15) (リン酸でpH5.2に調製）THFを 抽出溶媒に用いると HPLC のビ ー クはた。 リンスインシャンプ ー の場合はシリカゲルカ

若干ブロー ド化してピ ー ク高さが低くな る （エタラム法で分析が可能であるが検出波長235nm をの20%減）のでこ の場合標準溶液用いると BA-Naと PHBAEが共存していても

4. 1

定量

ノ

ー ルの場合を用いると保持時間約7分で測定する ことができ-8-

新製剤法及び新素材を用いた化粧品の品質確保に関する研究

試験溶液中の農度を適当に選ぶことによりシリカ

ノ ー ルで 一定量とする。 これを HPLC に注入しゲルカラム法を用いずメタノ ー ル抽出法でよいこ

試料C-1、C-2の回収率を測定したところC-1とがわかった。

については100.0%C-2については90.4%の回収率が得られた。 しかしながらアイライナ ー の製

4.3アイライナー

中のメチルおよびプロビルパ

ラベン
アイメ

ー

品は種類も多く、前述の様に製品中に含有する成分も多岐に渡っている。 そのため妨害成分の検出

クアップの中でアイライナ

は眼の粘などには十分注意し、分散、分離が困難な場合に膜の近くに使用するので安全性の点で注意が必要である。 また顔料の使用を初め処方も複雑である

は分析を行うにあたって液を分配法 2 , 3) 、カラム抽出法2. 4 >など を応用した前処理操作などがので分析上困難なタイプの 一つでもある。 3.3.2

必要と考えられる。

の試験溶液の調製で固形アイライナ

ー

ー

はアセトン

で、液状アイライナ ー はメタノ ー ルを抽出溶媒に

文 献

用いる以外に試料に無水Na2S04およびメタノ ールを加え、 スパ ー テルでよくすりつぶし、振とう

1)日本薬学会編 衛生試験法注解" P .890 、 金原出°機で10分間振とうし、 更に 40 の水i谷中で10分版、 東京、 1990
2)斉藤恵美子ら、 衛 生試 験所報告、 106 、 97

間加温する。 ついで10分間超音波処理を行う。
更に遠心分離(3000rpm、10分間）を行う。 残
滑をメタノ

ー

ルで上記と同様に再抽出し、メタU

C 1988)3)鎌田国広ら、 東京都衛研年報、 32、 99 (1981)
4)三上栄一ら、 衛生化学、 32、 34 C 1986)°

ノ ー ル層を合わせ40 以下で減圧濃縮し、メタ-9-新しい DDS 剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発
東京理科大学生命科学研究所

片

岡

一

則

Supramolecular structures, such as lipoproteins and viruses, occur in vivo as natu­
ral carner systems. In mimicking such vehicles, we have been studying micelle-form­
ing polymeric drugs as a novel type of drug carrier. Polymeric micelles based on AB
block copolymers of polyethylene oxide ( PEO ) and poly-b-benzyl-L-aspartate(PBLA) were prepared. Such polymeric micelles are expected to physically incorpo­
rate drugs. AB block copolymers were synthesized using amino-terminated PEO to ini­
tiate the polymerizaいon of /3一 benzyI-L-aspartate-N-carboxyanhydride ( BLA­
NCA) . The composition and molecular weights of the block copolymers were estab­lished by 1 H-NMR. Micellar solutions of PEO-PBLA block copolymer were character­ized by dynamic light scattering. Fluorescence probe techniques were used to study thepolymeric micelles. From changes in the fluorescent intensity and shifts in the excita­tion spectrum of pyrene upon micellization, critical micelle concentrations (CMC) of
PEO-PBLA block copolymers were obtained. The vibrational structure of monomer
pyrene fluorescence was altered in PEO-PBLA micellar solutions consistent with low
polarity within the PBLA core. In PEO-PBLA micellar solutions, 1,3- (1,1'­
dipyrenyl)-propane intramolecular eximer emission, relative to monomer emission
was very small ; this indicated very low mobility of PBLA segments within the micellar
core. Further evidence for the limited motion of PBLA segments in the micellar core wasobtained by'H NMR. This limited motion of the PBLA segments in the micellar core isin contrast to low molecular weight surfactants which commonly show a higher degreeof motion within their cores. The ability of PEO-PBLA micelles to solubilize hydropho­
bic molecules was studies by UV and fluorescence spectroscopy using pyrene. Enhanced
solubility of pyrene was determined with increasing concentrations of PEO-PBLA.
Then, potential of entrapping Adriamycin ( ADR) within micelles based on PEO­PBLA block copolymers was investigated. The loading process involved bringing ADR
and PEO-PBLA into an aqueous milieu from N,N-dimethylformamide (DMF )through a simple dialysis procedure. Evidence for the physical entrapment of ADR with­in the micelles was derived from fluorescence spectroscopy, where considerable quench­
ing of fluorescence was observed for ADR associated with the micelles. In addition,quenching experiments, using a water-soluble quencher (iodide (「））, showed that―the fluorescence of ADR, present in micellar solutions, was largely uneffected by I ,whereas the fluorescence of free ADR was readily quenched. As a result of the entrap­
ment of ADR within the polymeric micelles, the drug slightly binds serum albumin as
evidenced by gel permeation chromatography (GPC). In contrast, free ADR readilybinds serum albumin in aqueous solutions. The finding suggests that ADR is stably en­
trapped within PEO-PBLA micelles. The ADR imbued within the micelles is expected
to display markedly dissimilar pharmacokinetics relative to free ADR.

Design of Polymeric Micelles for Novel Carn 一
ers in Drug Delivery Systems
Kazunori Kataoka

1. 緒

言

近年、経皮あるいは経粘膜的に、 薬物等の生理Research Institure for
Biosciences
Science University of Tokyo

活性物質を体内に制御されたモ ー ドで供給する薬物送達システム(DDS)の研究が国内外で大きな注目を集めている

-10-

I)

。 このようなシステムは、

新しい DDS 剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発

体内で作用する薬物のみならず、皮膚角質層などの体表部位に作用する生理活性物質や香料成分の制御放出の実現を通じてコスメトロジ 一 分野においても大きな貢献をなすことが期待される。 薬物等を制御されたモ ー ドで供給するためには、薬物を安定に保持し、また、必要に応じて制御放出される機能を有する担体システムの設計が重要な課

micelle formation

題である。 本研究では、親水性連鎖と疎水性連鎖

ゎ紐、紐とからなるプロック共重合体が、水溶液中で疎水

N\J

咋わ

性連鎖を内核、親水性連鎖を外殻とする安定な多chemically bound drug

分子会合体（高分子ミセル）を形成することに着F ig.1

目し、その内核を薬物のミクロ ・ リザ ー バ ー としDrug loading of polymeric miceIlesて利用する新規薬物担体システムの構築を行った。

2. 実 験

このような高分子ミセルには、 〔1〕難溶性物質の包接化による溶解性向上、 〔2〕凍結乾燥状態
あるいは溶液状態での優れた安定性、 〔3〕内核PEO-PBLAプロックコポリマ ー はFig.2にからの薬物制御放出、 〔4〕外殻表面への生体組示すように、 B ー ベンジル ー L ー アスパルテ ー トー

織親和性分子あるい は剌激応答分子（インテリN ー カルボン酸無水物(BLA-BCA)を片末端ジェント化）の連結、等の様々な利点が期待され、に一級アミノ基を有するポリエチレンオキサイド

DDS用の新剤型 として高い 有用性が見込ま れを開始剤として、重合 することによって合成しる2- 4) 0

た 5) 。 この際、PEOとPELAの分子量を種々変本研究の目的を達成せしめるためのプロック共

えたプロックコポリマ ー を合成した。 これを水溶

f�0J

液中に溶解し、PEO-PBLAミセルを得た。

重合体としては、 〔 1 〕ミセルの外殻を形成する

親水性のセグメントとミセルの内核としてミクロ環境を形成するセグメントの 2 種類の役割分担の明確なセグメントを有すること、 〔 2〕薬物等をrn『心十導入可能な官能基を有すること、 〔3〕良好な生

匹

.J(,

―.

.ll.LtJdK:i1.f.EfU.JJ.L;1

体適合性を有すること、という3つ の特色を備え
Fig.2

たポリエチレンオキシド／ポリアミノ酸プロック
共重合体に着目した。 第1年度においては疎水性『心rn

Synthesis of micelle- forming AB block
copolymers based on PEO and poly(amino acids)

プロックとしてポリ(/3 ー ベンジル ー L ー アスパ
PEO-PBLAミセルの特性解析については、

ルテ ー ト）(PBLA)を選び、種々連鎖長を変えたPEO-PBLAプロックコポリマ

ー

を合成し、

蛍光プロ ー プ法により行い、蛍光プロ ー プとしてそのミセル形成能と疎水性モデル薬物（ビレン）ビレン(Py)を使用したの取り込み能(Fig.I参照）を評価した。 また、

クコポリマ

第 2年度においては、実際の薬物として疎水性制ー

6)。 水溶液中のプロッの濃度変化に伴うPyモノマ ー の光

強度変化、および励起スペクトルシフトより、分

ガン剤アドリアマイシン(ADR)の導入を行い、

子 量 の異なる各PEO-PBLAプロックコポリ

高分子ミセル型ドラッグとしての有用性について

マ ー につきCMC を測定した。 その際、Pyモノ検討した。

マ ー の蛍光スペクトルの第 ービー ク、第三ピ ー ク-11-比CI /III)より、ミセル内のミクロ極性を調べ

次に、ピレンの蛍光挙動からこれらブロック共た。また、ミセル内核 PBLAセグメントの運動

重合体ミセルの臨界ミセル濃度(CMC)を評価

性について、蛍光プロ ー ブとして1、3 ー ビス(1した。異なる濃度のプロック共重合体共存下におービレニル）プロパンCP3CP )を使用して検討

けるピレンの蛍光スペクトルならびに励起スペク

した。すなわち、 P3CP のエキサイマ ービー

トルをそれぞれFig.3 とFig.4に示す。ブロックク、

モノマ ー ビー ク強度比Cle/Im)より、 PEO­

Em= 390 nm

PBLAミセルのミセル内核のミクロ粘性を解析し、 ミセル内 PBLAセグメントの運動性を評価

PEO-PilLA (mg/ml)
1.
0.5
2.

3.

した。さらに、 PEO-PBLAミセルヘの疎水性
マ ー 形成、および Pyモノマ ー の蛍光スペクトルのI/皿比変化の導入量依存より導入を確認し、種々の導入法について検討を行った。
ミセル中へのADR導入は以下のように行った。
ADR塩酸塩を DMF下に少量のトリエチルアミンを入れて溶解し、さらにそこに PEO-PBLA

4. 10
5. 50
6. 1007. 5008. 1000(
snun ,i
.1
u.1
l!
q.1
u)AJ!
SUaJ
U!

プロ ー プの可溶化については、 PyのエキサイI

5

プロックコポリマ ー を溶かした。一晩暗所で撹拌の後、溶液をO.lM酢酸バッファ ー (pH5.5)に対して透析し、引き続いて蒸留水で透析を行い、ミセルを得た。 ミセル中に捕捉されたADRの量は485nmの吸光度より算定した。

3. 結果と考察

300
Fig.3

340
320
wavelength (nm)360

Excitation spectra of pyrene in PEO­PBLA aqueous solutions.
Sample is 5-10. The Concentration of
pyrene is 6.0xe-1 M.

共重合体の濃度上昇に伴って赤色シフトが認めら
3. 1

ブロック共重合体ミセルの調製とモデル薬れる。特に、ピレンの(O、 0)バンドに由来す

物（ピレン）の導入

る334nmのビー クがミセルに取り込まれること

PEO-PBLAブロックコポリマ ー は、 PEOとによって339nmにシフトしていることがわかる。

PBLA鎖の分子量を種々変えたものについて合この励起スペクトルにおける334nmとのビー ク成を行った。 PBLA中のBLAユニット数が20比からCMCを見積ることが可能である ” 。また、以下で PEOセグメントの分子量が5000以上の試

ビレンの蛍光強度は周囲の極性に依存するため、料は水溶性を示した。また、いずれの試料も水溶蛍光強度変化からもCMCを決定することができ

液中でミセルを形成することが動的光散乱測定よる 8) 。Fig.5 には、蛍光強度及び339nmと334

り明らかとなった。平均粒径は約20nm程度であnmの強度変化比をブロック共重合体濃度に対しる。重量平均分布より少量の二次凝集体と考えらてプロットした結果を示す。図より、約5-lOmg/れる粒子が平均粒径100nm程度に観察された。

1の範囲で蛍光強度あるいはビー ク強度比が急激

一方、5-10について静的光散乱よりミセル分子に変化しており、CMCがこの濃度領域にあるこ6

量を算定すると、2. 8 X 10 と求められた。これより、会合数はおよそ400となる。但し、この値とが明らかである。
また、ビレンの蛍光スペクトルにおいて、その振動微細構造はピレンの置かれている局所極性にには、二次凝集体の寄与も含まれている。

-12-

新しい DDS 剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発

1.9

PEO-PBLA (mg/ml)
1.
0.5

●口

S

10

so

6. 1007. 5008. 1000

1.5
1.
4_- - --

園じ

�
；

6．
1

(S}!U n iC.1e .1}!q .
rn ) A l!SU ;}lU !

5.

IIII
I

3.

4.

1

7
1．

2.

1.8

・
。▲

Ex== 339 nm

..

'�
4

Fig.6

.

� ..
'

-]
-3
-2
log (coucentration)

.

�!!四l
Ire出lllC
lolrrcnc
hcnzyl alcohol
chloruforn,
ethyl acetate
dioxnnc
water

皿
0.58
I.OS
1.24
1.25
1.37
I.SO
1.87

'

0

I/ill vibrational band ratio of pyrene as afunction of logarithm PEO-PBLA con­centration. The concentration is ex­pressed in units of mg/mR.

／皿比は水溶液中のビレン（約1.87)と同程度の高い値を示すが、 CMCを境にその値は小さく

420
400
wavelength (nm)

380

360

なり約1.45程度の値となる。 これは、 プロック

440

共重合体のミセル形成に伴ってビレンがミセル内核に取り込まれたものと考えられる。 アスパラギ
ン酸ユニットの保護基であるベンジルアルコ ー ル

Fluorescence spectra of pyrene in PEO­PBLA aqueous solutions.
Sample is 5-10. The concentration of
pyrene is 6.0xe-1 M.

中では、 ピレンのI/皿比は1.24であり、 ミセ

9敏感であることが知られている(Ham効果） )。

PBLA骨格のアミド構造の寄与や内核と外殻界

Fig.4

ル中の値の方がやや大きい。 このことについては、面に位置するビレンの寄与等が考えられる。 以上

そこでバンドI ((0、 O)バンド）とバンド皿CC o 、 2)バンド）の比(I /Ill比）を取り、 プの結果より、 プロック共重合体ミセル内核に疎水

ロック共重合体濃度に対してプロットした結果を性物質を非共有結合的に導入することが可能であり、 さらに低いCMC値からは、 この ミセル形態

Fig.6に示す。 CMC以下の領域においては、

●

．

▲

．

ロ•

-1
log (concentration)

゜

Fig.5

-3

っ＿

log (concentration)

0 .0
_4

ロ亀

-1

口●

-2

。

-3

ロ

5
0

c

i�

▲

0
1

▲

4

口 ●

0
0
0
4
gug S;JJO llU (C lO )

。

5
1

0
0
0
8
0
0
0
6

(n c ) h 1!SU ,l)U !

2000(P C E [6£ £ ) O !JIU A l!SU .J
lU !

．
．

0
0
0
0
ー

"'

2.0

The total fluorescent intensity of monomer emission and the intensity ratio (339/334) from theexcitation spectra of pyrene versus logarithm PEO-PBLA.
-13一

が熱力学的に極めて安定であることが示された。
Ex= 333 nm
3.2

ミセル内核の粘性評価

薬物を安定に内核に保持するためには、内核が局所の粘性が高ければ薬物の局所拡散が妨げられ、外部へのリリー スが抑制されるからである。そこ
゜で、ミセル内核の局所粘性をヒ レンダイマ ー (P3CP)(Fig.7参照）のエキサイマ

ー

発光強度か

ら見積もることとした。P3CPは粘性の低い環境
下では分子内回転が容易な為、顕著なエキサイ

三
5さs
）
u
9
一
(
二l
w．
,
A
11
旦u
(

固体状態であることが望ましい。すなわち、内核,(b)。このエキサイマー

発光強度はミクロ枯性

。

る

IO)

FIuorescence spectra of 1,3- ( 1, 1'ー
dipyrenyl) propane in PEO-PBLA andSOS micellar solutions. Samples are 1220 at a concentration of0.10 mg/m2 and
SOS at a concentration of 3.0 mg/m 2 .
The concentration of 1 3 (1 1dipyrenyl) propane is 2 .0xe-7M.

Structure of 1,3- (1,1'-dipyrenyl )propane (P3CP)

マ ー 発光を480nm付近に示すことが知られてい

]「 60

Fig.7

n
n

Fig.8

500
450
wavelength (nm)

。

..o�

360

加温処理、超音波処理効果により、水中でのビレンの溶解度(6.0xe-1M)の500倍を溶解可能でーあることが示された。この疎水性薬物モデルとし

発光強度Cle)とモノマ ー 発光強度(Im)の比てのピレンの導入測定から、導入法を工夫するこの上昇とともに低下することから、エキサイマ

・。

(le/Im)よりP3CP周囲のミクロ粘性を評価

3.0e-4することができる11) 。Fig.8 に例を示したが、

heatsonication

4

e―
0

するビークがミセル形成後は極端に小さくまたプ゜れているものと考えられる。このことは、別途、

・
。

4

1

―
e0
．

U
JI\
U;J
;J

に内核に保持された物質の動きも大幅に束縛さ
1H-NMRにおいてフェニル環のプロトンに由来．

)なった。すなわち、プロック共重合体ミセル内核
では、高分子鎖の運動性がかなり低く、そのため(Zれず、le/Im値も極 め て低 い ことが明らか と．
2

中ではP3CPエキサイマ 一 発光はほとんど認めら゜

SDSミセルに比して、プロック共重合体ミセル．

゜

O.Oe+O+

ロー ドになることからも支持された。

1020

PEO-PBLA (mg/ml)

次にピレンのミセル内への導入を促進する目的
で、通常の撹拌での導入の他に加温処理、超音波
処 理 の 効 果を調べた 。Fig.9より 、 導 入量は
PEO-PBLAの濃度に依存することが示され、

-14-

Fig.9

The solubilization of pyrene in PEO­PBLA micellar solutions. The loading ofpyrene was faci Iitated by heating at 80℃,
sonication. Pyrene has a solubility inwater of 6.0xe -7 M.

新しい DDS 剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発とにより、 疎水性物質の導入量をかなり増加することが可能であり、 PEO-PBLA プロックコポ
リマー の薬物担体としての有用性が期待された。
3.3 ブロック共重合体ミセル中へのアドリアマ
5 q,osqc(ne)83イシン(AOR)の導入と安定性の評価
ビレンでの結果をふまえ、 実際の薬物として
ADRの取り込みを行った。導入法は、 実験の項に詳述したように有機溶媒(DM下）から緩衝液への透析平衡法である。 ミセル中に取り込まれないフリ ー のADRは限外口過により除去した。
この方法により、 ミセル重量に対して10%の割5合でADRを導入可能であることがミセルの吸光度測定より明らかとなった。また、動的光散乱よりADR内包ミセルの直径は約35nmと求められた。この値は、 ADRを内包しない場合に比して若干大きめの値となっている。ADR内包ミセル

10

15

elution volume (ml)Fig.10 Stability of PEO-PBLA micelles after
incubation with albumin (10 mg/mU in
PBS、0.1, pH7.4) , onalyzed by gel per­meation chromatograms (GPC) . The
concentration of ADR is 10 mg/mU.

は凍結乾燥保存が可能であり、 再溶解後もミセル
次にミセル内に保存されたADRの安定性をゲ
ルロ過クロマトグラフィー逗

u1aou8 SOJOnIJ
Sua1
)Al!
q.ra
1
m11
<.
旦 un ,（

直径に変化のないことが確認された。
(GPC) により評価し た 。 結果をFig.10に示す。Fig.10は、 PBS中に保存したミセルのGPC であるが、 排除限界に単分散のミセルビー クが認められる。この試料をlOmg/叫濃度のアルプミン溶液中に共存させた時の時間経過を あわせてFig.10に示す。 5時

ー・・ (t= 0)

PF,;Q-Pl;lしA/AO�

•二·: ;:: 闘闊h}
二 二 i に閤間経過後もミセルピ ー クの強度に変化は認められず、 その安定性が確認された。なお、 ウサギ血清を用いて評価した場合にも同様の結果が得られている。また、 ミセル内包ADRについては内部遮蔽効果による著しい消光が認められた。時間経過
とともにわずかな蛍光強度の増加が観察されたが、

500

550

600

650

700

wavelength (nm)Fig.11 Fluorescence emission spectra of ADR
and PEO-PBLA/ADR micelles in PBS
buffer (0.10M, pH7.4). The concentra­tion of ADR is 10 mg/mg.

その程度 は極めて小さく、 内 核 に 保 持 され たADRは、 少なくともPBS中ではほとんど外部に放出されないことが判明した(Fig.11)。

ような疎水的ミクロ環境には浸透しにくいはずである。したがって、 ADRがミセル内核に確かに

さらに蛍光の消光剤であるヨウ素イオンによる保持されていればヨウ素イオンにより消光しにく

ADR蛍光の消光度合を調べることからADRのいことになる。 その評価は(1) 式に示すStern

ミセル内存在状態を評価した。 ョウ素イオンは負-Volmer の式で行われる。

荷電を有しかつ水和しているため、 ミセル内核の-15-

Fo/F=l+Ksv [r-]ここで Fと Fo は、核に疎水性薬物を内包可能であることが明らかと(1)―

I 存在下あるいは非存在下でのADR蛍光強度、 Ksvは消光定数でありこの

値 が 大 き い程、 消光されやす い こ ととなる。

'
ダ

定であることが示された。 このプロック共重合体

ミセルは凍結乾燥状態での保存も可能であり製剤8上の利点も大きい。 内核に保持し得る薬物としては、 アドリアマイシン以外に消炎剤インドメタシ

゜

6

J oJ

゜

ンも適用可能であることも予備的に確認している。

4

内包薬物の選択が広く、 優れた安定性を有する本

n~

゜
゜

2

プロック共重合体ミセルは、 薬物や香料等のキャリア ー として、 薬学ならびに化粧品分野において0.2

広範な応用が今後期待できるものと考えられる。
0.4
l- (M]

0.6

0.8

文 献

F ig.12 Stern-Volmer plots for ADR 1ncorpo­
rated into PEO-PBLA micelles in PBS
buffer (0.1M, pH7.4) . The concentra­
tionofADR is5mg/mD.
比してミセル内包ADRではKsvの値が極めて小さいことがわかる。 Ksvは正確には、 消光速度定数(kq)と蛍光寿命（てo)の積であらわされる。

外部に拡散することなく安定に存在できることがマイシンはI - ! こよる消光を受けず化学的にも 安

ADR : Ksv = 17.310と異なり固体状態であるため、 保持された薬物は特徴である。 事実、 ミセルに保持されたアドリア

Fig.12に結果を示すように、 フリ ー のADRに12なった。 ミセル内核は、 通常の界面活性剤ミセルてoはフリ ー ADRと比べてミセル内包

ADRでは同程度かあるいはむしろ小さい値を示すことが別途、 蛍光寿命の測定から明らかとなっている。 したがって、 ミセル内包ADRで観測された小さいKsv値は、 消光速度定数kqが小さいことに由来するためと結論される。 すなわち、

1) Advances in Drug Delivery Systems, Vol. 5,
Eds. J.M. Anderson, S. W. Kim, J. Kopecek,
Elsevier, Amsterdam, 1993

2) K. Kataoka, G. S. Kwon, M. Yokoyama, T.

Okano, Y. Sakurai, J. Controlled Release廷

119 C 1993)

3) M. Yokoyama, T. Okano, Y. Sakurai, H.
Ekimoto, C. Shibazaki, K. Kataoka, Cancer

Res. 廷3229 C 1991)

4) G. s·. Kwon, M. Yokoyama, T. Okano, Y.

Sakurai, K. Kataoka, Pharm. Res. 1Q_,_ 970
C 1993)5) M. Yokoyama, S. Inoue, K. Kataoka, N. Yui,

ADRはミセル内核に安定に保持される結果、ーI との衝突頻度が下がり、 消光されにくいものと考えられる。 この結果は、 ミセル内包ADRが化学的に安定であることとも一 致するものである。

T. Okano, Y. Sakurai, Makromol. Chem. 追L
2041 C 1989)

6) K. Kalyansundaram, J. Thomas, J. Amer
Chem. Soc. 盤2039 C 1990)

7) C. Zhao, M. Winnik, G. Riess, M. D. Crouch­

4. 総 括er, Langmuir§_, 514 C 1990)

以上の結果より、 PEO-PBLAプロック共重

合体は水溶液系でミセルを形成し、 また、 その内-16-8) R. C.Mast, L. V. Haynes, J. Colloid Interface
Sci. 臨3 5 (1975)

9 ) A. Nakajima, Bull. Chem. Soc., Jpn. 丑3272

新しいDDS剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発(1971)

11) H. Dangreau, M. Joniau, M. Cuyper, I.

10) K. A. Zachariasse, W. Vaz, C. Sotomayor, W.
Kunhnle, Biochem. Biophys. Acta, 臨323

Hanssens, Biochemistry, 紅 ， 3594 C 1982)
12) P. Bahadur, N. V. Sastry, T. K. Rao, Col­loids and Surfaces幽343 C 1988)(1982)-17-

化粧品素材としての利用が可能な乳酸菌の新規育種技術の開発
早稲田大学理工学部

桐村光太郎・宇佐美昭次

A gene relating to /3 -glucoside utilization of Enterococcus Jaecalis subsp. liquefa­
ciens IFO 12968 was cloned and expressed in Escherichia coli JM 109. In a 3.4 kb-genefragment, two open reading frames (ORFl, 1.47 kb ; ORF2, 0.98 kb) were sequenced.
Although functions of these genes were not correctly determined through the homology
research on the genes and proteins. However, since the ORF2 protein showed homologies
to the lac repressor, it seems likely that these genes code proteins relating to /3 ― gluco­side transport.

1. 緒

戸

り皮膚の感染症を防ぐことが発見されたことをきっ かけとして、 約30年前より これを化粧品素

乳酸菌とは糖類をエネルギ ー 源として乳酸を主材として利用することが始められた。 実際に乳酸要な代謝産物とする発酵を行う細菌の総称である。

菌培養液を化粧品に添加すると皮膚の保湿作用や乳酸菌と人類との関わりは古くからあり、人類の抗酸化作用が向上するため、有用な化粧品素材と歴史の歩みとともに、種々の有用な乳酸菌が選択、考えられる。 今後は乳酸菌の代謝産物の化粧品素育種され、多様な発酵食品が開発された。 バ タ ー 、材としての新規機能の調査と、乳酸菌自体を添加

チ ー ズ、発酵乳、 ワイン、潰物等がこれらの代表した化粧品の開発が予想される。 しかし、実用性例である。 こうした発酵食品は特有な風味によるを考えた場合には、解決しなければならない問題

おいしさ、乳酸菌の作用による保存性と消化性のも多く、このためには乳酸菌を遺伝的に改良する向上が特徴である。 さらに、食品製造関連のみなための育種技術を確立し、乳酸菌の新規な機能をらず、最近では乳酸菌の有する他の有用機能も明開発する必要がある。

らかにされ始めた。 その顕著な例としては腸内乳

本研究は、化粧品素材としての利用に適した乳酸菌の 機能があげられ、人間の小腸下部に主に検酸菌に関する、遺伝子工学を利用した育種技術を出される腸内乳酸菌は乳酸を生成することで多種開発することを目的としている。 本研究により化の雑菌の繁殖を抑えることが判明している。 また、

粧品素材としての利用に適した多機能性乳酸菌の乳酸菌には免疫賦活作用など多彩な生体調節機構

育種が可能であると考えている。

が見いだされており、人間の健康維持• 増進に寄

2. 実験方法

与する有用な微生物としての認識が高まっている。
一方、乳酸菌の培養液がやけどの回復を早めた
Development of New Breeding Systems for Lac­
tic Acid Bacteria Available as
I Cosmetic Materials

2. 1

使用菌株

供試菌として、 セロビオ ー ス発酵性を有する
E. faecalis subsp. liquefaciens IF012968 を用いた。 また遺伝子クロー ニングの際の宿主菌とし

Kohtaro Kinmuraては、大腸菌 Escherichia coli JM 109 を用いた。

-18-

化粧品素材としての利用が可能な乳酸菌の新規育種技術の開発

2.2

培養方法

2.5

E. faecalisの液内培養には、ペプトン、酵母
エキス、グルコー

塩基配列の決定ベクタ ー 中の挿入断片の縮小化は、制限酵素にスを主成分とするPYG培地をよる消化およびライゲ ーション反応を繰り返し行

用い37℃にて静置培養を行った。 E.coliの培養

うことにより行った。 また、 exonuclease illぉには、 バ クトトリプトン、酵母 エキス、NaClよ

よびmung bean nucleaseの反応を取り入れた

り成 るLB培地を用い、必要に応じて形質転換前

D eletionキットも利用した。得られたディレ ー

培養用に M9培地（最小培地）、本培養に2 YT培

ションプラスミドの塩基配列の決定は、Sanger

地(LBより富栄養な もの） を使用しいずれも37の方法に従い、蛍光オ ー トマチックシ ー ケンサ ー℃にて培養した。 また、 E. Coliの形質転換体のを利用して行った。 また、必要に応じて既知の塩選択および培養のときには、上記の培地にアンピ

基配列から DNAシンセサイザ ー によって合成しシリンを終濃度でlOOµg/叫になるように培地にたプライマ ー を用いてPCRを行いPCR産物を添加した。

塩基配列決定の際に用いた。

2. 3

2. 6

DNAの調製

in vivoにおける遺伝子発現

各オ ー

E. faecalisを培養後集菌し、 bufferに懸濁した後、リゾチ ー ムおよびSDSを加えて溶菌させ、プンリ ーディングフレ ー ムをPCRにより増幅さ せ 、 発現ベ ク タ ー で あ る pUC18 、proteinase K 処理、 RNase A処理、フェノ ー ル

pBluescript II、 pK K223-3に連結し、組換え

・クロロホルム抽出、 エタノ ー ル沈殿を行い、全プラスミドを構築した。この組み換えプラスミド

DNAを精製した。

を用いて E. coli JM109に形質転換し、形質転換

E. coliからの組換えプラスミドおよびシャロ

体をlacおよびtacプロモ ータ ー の誘導剤であるミドの抽出は、アルカリSDS法に従って行った。

isopropy1-1-thio-(3-o-- galactopyranoside

また必要に応じてQI AGENプラスミド精製キッ(IPTG)とアンビシリンを添加した培地で培養

トも使用した。

した。 約2 4時間培養後、集菌・洗菌し、 TME
ースゲル電気泳bufferに懸濁し、超音波処理により細胞を破砕

動後、エチジウムプロマイド染色し、 UVライトした。遠心分離した上清をSDS-PAGE により照射により行った。

分離し、クマジ ー ブル ー染色でタンパク質の検出

DNAの分子量測定は、アガロを行った。同様の系で、 IPTGを添加しない場合
2. 4の結果と比較することにより目的タンパク質の同大腸菌の形質転換定を行った。

E. coliの形質転換はHanahanの方法に従って行った。この際、形質転換体の選択には、 5-

3. 実験結果および考察

bromo-4-chloro-3-indolyl- /3 n-glucopy­ーranoside (X-glu)を利用した。X-gluはf3-glucosidaseにより分解されると青く呈色する。

3. 1 セロビオ ー ス資化性遺伝子を含むプラスミ

そこ でX-gluを含む培地で青色に呈色したコロ

ドpEFG3の塩基配列の決定

ニ ー を採取し、解析を行った。 また、シャロミド

E. faecalisより全DNAを抽出し、 制限酵素

ベクター を用いた場合は、ファ ー ジベクタ ー の場

Eco Rlにて 消化後、 E. coli JM109 を宿主 、合 と 同 様in vitro packagingキットを用いて

pUC18をベクタ ー としてショットガンクロ ーニ

行った。

ングを行った。X-gluを含有する選択培地上で青色を呈するコロニ ー が6個得られたが、得られ-19-

たクロ ー ンの保持するDNA断片は、 サザンハイ

2 は18bpしか離れておらず非常に近接していた。

プリダイゼ ションおよび制限酵素分析により、ORF2の終止コドンの直後には、 安定なステム・

pEFGl、 pEFG2 、 pEFG3の3種に大別できる

ル ー プ構造の形成可能な配列が見出され、 ORF2ことが判明した。 この中で、 pEFG3を保持するの終止コドンで転写は終結するものと考えられた。

スを唯 の炭素源として生

なお、 ORFlは完全長ではなく上流部分が欠けー

大腸菌は、 セロビオー一ていることが示唆された。

育可能であった。 そこで pEFG3について塩基配列を含めた詳細な解析を行うことにした。
pEFG3を縮小化したプラスミドを数種作成し、3.2

pEFG3の上流域のクロ ー ニング

それら のLB培地上でのX-gluの発色を(3 ―E.faecalisの全DNAを抽出した後Kpn Iで

gluc osidase活性と し て 、 FIG.l に示し た 。

完全消化後、 コスミドベクタ ー の 一 種である
Charomid9-36をベクタ ー 、 宿主はE.coli JM

Fragment�-G lu c .a 非 l ad se
a c l 1 v 11 yslze(kb)

lac P→+

109を用いてE.faecalisのゲノムDNA2-16Kb

pEFG3.0,I

3.4＋

pEFG36225＋

断片を 含む組み換え体を約 5000 個取得した。

oEF03

f1

54

H,H �N�↑ う

pEFG3l\J21

pEFG:\6.4

pEFG3 の EcoR I - Kpn I 断 片約 2.4Kb をプ

＋

17
I

1 kb

ロー プとしてコロニ ー ハイプリダイゼ ー ションをI

行ったところハイプリダイズするクロ ー ンを3個

FIG.1. Del etion analysis of tile insert of pEF G3.
Restriction endonucleases : A, Accl ; B,
BamHI; E,EcoRI; H,Hindlll; K,Kpnl;
X,Xbal.

取得した。 その組み換えシャロミドを抽出し、Kpn Iで消化後、 電気泳動し、 サザンハイプリ
ダイゼ ー ションを行った結果をFIG.3に示した。

FIG.lより当該遺伝子を約2.1kbの領域に限定した。 このDNA断片の塩基配列の決定を行うため(A)に、 pBluescript IIをベクタ ー としてサプクロー

123456123456

ニングを 行いFIG .2に示すようなseque n c ing(B)stra t egyで塩基配列を決定した。 その結果951
bpと978bpの2 つのオ ー プンリ ー ディングフ
レ ー ム（以下ORFl、 ORF2と略）が存在して6.6--—
4_4-2.3- -いることが判明した。 しかもこのORFlとORF

三
��

----

El

『↑

2.0-

＜

1↑ � �1 1
I

1 kb

I

X-glu poslth•e region

FI G.2. Sequencing strategy for the X - glu pos巾veregion of pEFG3The arrows denote the direction and extent
of sequence determination. The open read­ing frames are shown as OR Fl and ORF2.
Restr1ct1on endonucleases : A, Accl ; B,
BamHI; EcoRI; H,Hind Ill; K,Kpnl; X、
Xbal.

-20-

FIG .3 . Southern hybridization analysis.
(A) Lane 1,6, A DNA digested with Hind
Ill . Lane 2, recombinant charomid (1) di 一
gested with Kpn I . Lane 3, recombinantcharomid (2)digested with Kpnl. Lane 4,
recombinant charomid (3) digested with
Kpnl. Lane 5, £. faeca/is chromosomal
DNA d1gested withKpnl .
(B) Hybridization analysis of the South­
ern transfer of the DNA s from gel (A) ,using labelled 2 .4kb EcoRI-Kpnl frag­ment of pE FG3 as a probe.

化粧品素材としての利用が可能な乳酸菌の新規育種技術の開発

この約6.7KbのKpn l断片を pBluescriptIIKS＋にサブクロ ー ニングし、 FIG.4に示すようなディレ ー ションプラスミドを得て塩基配列を決定産物が、 E.coliの(3-glucosideの利用に深く関わっていることが判明した。 さらに遺伝子発現とした。 これにより完全長のORFlは1470bpから成るオ ー プンリ ーディングフレー ムであることが判明した。 ORFlの上流にはプロモ ー タ ーやSD
配列と推測できる領域が存在していた。 決定した塩基配列のうち2.7Kbを FIG.5 (次頁）に示した。

pEFG3U/R"
pEFG3U/Ro,-KA
pEFG3U/Ro,-EA
pEFG3U/R,.·KS
pEFG3U/R,.·ES

lacP­
K

E A

S

K

,,,.
,.,

f,ogmeot
�·)

f

H

r

T 1

3.1

E

0.7

2.7

け
I

0.35

S

I

,.,

pEFG3U·KS

3.6

pEFG3U·KA

ヽ.0

coside資化能を与えている理由についての詳細は不明である。 しかし、 以上の結果は、 E. Jae ­calis由来のORF産物が直接的に、 または他の糖取り込み制御機構の抑制によって、 E.coliのcryptic (3 -glucoside-PTSを活性化したことを強く示唆している。
[

4.

ー

F IG.4. Deletion plasmids of pEFG3U and pEFG3
U/Rev. The arrow indicates the directionof lac promoter in pBluescript II. Restric­tion endonuclease used are as follows: A,
Apal; E,EcoRI; K,Kpnl; S,Spel.

士口系

pEFG3U

遺伝子産物同定のためにin vivo での遺伝子発現状況を調べた 結果、 FIG.6に示すように約36
KDaのタンパクが発現していることが判明した。
これはORF2の塩基配列より推定した分子量と一致していた。 ORFl、 ORF2ともに(3-glu­
cosidase遺伝子をコ ー ドしている可能性は極めて低いにも関わらず、 E. coli JM109に(3-glu­

E. faecalis由来の/3 ― glucoside資化性遺伝子の塩基配列を決定したところ、 約3.4Kbの領域

_．
_

l
-

97 .4(kDa)
66.2

疇

二 [』
[
[ ．｝

戸年号 ·{，ー

45.0

一

]

高い相同性を示し、 ORF2はlac リプレッサータ
ンパク質と高い相同性を示した。
さらに各々のORF産物の機能を調べるために、塩基配列のデ ー タをもとにORFlのみを含む領域、 ORF2のみを含む領域、 ORFlとORF2双方を含む領域をPCRにより増幅し、 ベクタ ー
pUC18、 pBluescript II、 pKK223-3にクロ ーニングした。 ORF2のみを含む領域と、 ORFlとORF2双方を含む領域をクロ ー ニングしたものは、 IPTGの存在下X-gluを分解して青色を呈するクロ ー ンが得られた。 これより特にORF2

6

-

·日
一
＿

9
.
＂-1.
1-1

ともに他生物起源の(3― glucosidaseとの相同性は低かった。 むしろORFlは sucrose-6-phos­
phate hydrolaseやsucrose a -glucosidaseと

5 [

4

3

2

3.3各オ ー プンリ ー ディングフレ ー ムの機能についての検討ORFl、 ORF2それぞれについてアミノ酸レ
ベルでの相同性を調べたところ、 ORFl、ORF2

31.0

21.5
FIG.6. SOS-PAGE of the crude extract from E.
coli transformants harboring ORF2 gene.
Lanes 1,6, molecular weight markers
Lanes 2 、 5, transformants with IPTG (in­ducer) Lane 3, transformants without
IPTG Lane4,E. coli JM109 harboring pUC
18

-21-

10
20
30
10
50
60
●AACOGTT ATCRTRARTRRRTGTRARTT RT●● IAT TATTTTGATT TRARTRGAT T TR TAT
70
60
90
100
110
120
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-35
-10
130
110
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160
170
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1070
10●0
TCRAGCCTTTRATO CGCCAGRT GOT COTO CACTTGCOO↑CAGTTGGATTGGOTTGCCAGA
Q AF H RP O O A RLAUSUIOL
PE
1090
1100
1110
1120
1130
1110
AATCACTTACCCAROTGRTOTGOROGOTTGOOCARATGGCTTRAOTCTOOTTAAAOARCTI TYPSOUEO UAH OLS
L
U<EL
IISO
1160
1170 I
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1190
1200
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ML AQ
1210
1220
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1260
R reCGCC RC TACT; rA TCAAR TGGCTGCCATTT『TTRTC『ACTGC『TCTTTTGAAT『ROA
SA T T L
S H O C HFL
ST ASFELE

F JG .5.

1390
1100
1110
1120
1130
1110
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R OOPF R E<Y G T
IREI <IRKH

2050
2060
2070
20●0
2090
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O

AFLAP

2100

GI
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USS
QH

2110
2120
2130
2110
2150
2160
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2170
21●0
2190
2200
2210
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1 1T O AHH T O APSOY RLR OYK
2230
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2700
RTTCTTAAT『CCTCATTTOCCTATTTTCCCT『AATTCCARAGC RCAOROATTAAATAATA

Nucleotide sequence of the genes from E. faecalis
Putative initiation codons

codon

rows

(ATG)

、 which control {3-glucoside utilization in E.coli.

are at bp140 and 1631.

In the downstream of the termination(•)、 the putative transcriptional terminator at bp2610 to 2639 is indicated by inverted ar­、 which represent the proposed stem of the stem-loop structure.

の中に2つのオ ー プンリ ー ディングフレ ー ム

関与するタンパク質である可能性が高い。 これら

約 l .5Kb ; ORF2 : 約 l.OKb) が存在の遺伝子を E. coli 内で発現させた場合、 (3 -(ORFl:

していることが判明した。 ORFl 、 ORF2 は両者とも /3 -glucosidase をコードする遺伝子ではなく、むしろ E.coli の /3 - glucoside 輸送機構に-22-

glucoside輸送が可能になり、 (3 -glucoside 資化能を獲得していることが示唆された。

水 ー ノナン ー エチレングリコ ー ルモノブチルエ ー テルからなる
3 成分 2 相系の相挙動に関する熱力学的考察
九州大学理学部

荒誠殿

The phase behavior of a ternary two-phase system composed of water, nonane, andethylene glycol monobutyl ether (C4El) was investigated thermodynamically. The
compositions of the water and nonane phases were measured precisely as a function of
the total concentration of C4El and temperature under atmospheric pressure by gas liq­
uid chromatography. A new kind of criterion of ideality for the two-phase equilibrium
was proposed and examined by using the composition data obtained. The composition
region of ideal dilute solution behavior was determined for the two phases as a functionof temperature. It was suggested that the formation of the aggregate of C4El in the wa­
ter phase is enhanced at lower temperatures and that in the nonane phase at higher tem­
peratures, respectively. Furthermore the entropy and enthalpy of transfer of ether
molecules from the water to the nonane phase were evaluated not by calorimetry but by
applying the thermodynamics to the composition data. The transfer was found to ac­
company the positive entropy and be endothermic.

この方法では求められない。 これらの点 から考え

1. 緒 言て、平衡組成を求める実験手法を確立し、その結果を解析する熱力学式を導出することは重要なこ

マイクロエマルション I - 3 l 、多 重臨界点 4. 5) 、
6
油相と水相間における活性剤相の濡れの挙動 -8あるいは関連した種々の事柄

9)を理解するためとであり、ゆらぎと相図の理論を結果に応用する
ことにより会合体の構造に関する情報をも得られII)る可能性がある。

に、水、油、および非イオン性界面活性剤を含む

この研究では水、 ノナンおよびC4Elからなる多成分系の相挙動に関して多くの研究が報告され3成分系を選び、 各相の組成をガスクロマトグラている。 相の平衡組成とそれらの熱力学的解析は

フ法 12) を用いて温度の関数として正確に求めた。

構成成分の移行に伴う 熱力学量を与え、 さらにさらに理想性、会合体形成、移行の熱力学量を検

我々が以前に報告したように2相間の界面形成に討する熱力学関係式を導出し適用した。

関する、より深い理解をもたらす

10)。 3成分系

2. 実 験

についての相境界は光学的方法などによって決定されてきたが、与えられた条件下での平衡組成はThermodynamic Consideration on Phase Be­
havior of the Ternary Two­
Phase System of Water, Nonane,
and Ethylene Glycol Monobutyl
Ether
Makoto Aratono
The Faculty of Science
Kyushu University

2. 1

試

料

水はアルカリ性過マンガン酸カリウム溶液から3回蒸留したもの、 ノナンとC4Elは市販特級試薬を蒸留したものを用いた。 ガスクロマトグラフ
により純度は、それぞれ 99.9% 以上であると判
断された。

-23 一

定

4

2.2 測

ガスクロマトグラフ(HITACHI263-70)に3より平衡組成は決定された：水とノナンの等重量混合物に所定量のC4Elを加えた混合物を1時間程度激しく混合した後、1-30時間をかけて完全に相分離させた。 この後、各相の小量をガスクロ

��

i; 2

マトグラフに導入しビ ー ク面積をクロマトグラフ
積分計(HITACHI D-2500)により求め、検量線により組成に換算した。組成決定の実験誤差
5はモル分率で水、ノナンおよびC4Elに対してそれぞれ 6 X 10-3 、1 X 10-4 、3 X 10-4 であった。

3. 1

温度一 定下での2相の組成

20

25

10梵

Fig .2

3. 結果と考察

15

10

Mole fraction of C4E 1 in the water phasevs mole fraction of C4E 1 in the nonane
phase curves at constant temperatures(1) T = 293.15K、(2) 295.65, (3) 298.15, (4)300.65, (5) 303.15, (6) 305.65.

水相とノナン相をそれぞれ上つき添え字Wと以下においてはこの全濃度における水相でのモル0で、水、ノナン、C4Elの各成分をそれぞれ下分率を X3w., 、油相でのそれを xl·I で表す。温度つき添え字1、2および3で示す。平衡組成は温の上昇によりノナン相でのC4Elの濃度は増大し、度とC4Elの全モル分率 ．℃3の関数として測定され水相でのそれは減少する。これは油ー非イオン性

た。図1では平衡組成がx叶こ対してプロットされ、界面活性剤2成分系の上部臨界溶解現象および水°

図2ではx翌vs xa プロットの形で示されている。

ー非イオン性界面活性剤2成分系の下部臨界溶解

なお図2中の黒丸は第3相が出現する点であり、現象が3成分系の相挙動に大きく影響を及ぽしていることを示している I 3) 0
図lbで見られるノナンの溶解度の急激な増加
は、この濃度がノナンが存在しない場合の水相中
での会 合体形 成の濃度に近いこ とか ら 12. 14. 15) 、

0
1』xNOL•娑 NO

0
2

(a)

水相中での会合体形成に関係していると思われる。
したがって、ノナン相においても水が検出され始／＇める濃度付近 で会合体形成が始まっていると思わ(b)れる。会合体形成に関して、次のことを指摘しておく：第1に、低い温度におけるほぼ 一 定の X3oと高い温度におけるほぼ一 定の X3w は、水相とノ
6

x3

ー

3 2

゜

Fig .1

ナン相において会合体が形成されている1つの証

Mole fraction of component vs total mole
fraction of C4E 1 curves at constant tem­
peratures : (a) 1n the water phase, (b) in
the nonane phase; (l)T = 293.15K, (2)295.65 、 (3) 298.15, (4) 300.65, (5) 303.15, (6)305.65.

-24-

拠である16) 。第2に2つの比 X1° lxs0 と xtlxs w
が温度にほとんど依存しないことは、水とノナンの相互溶解度の上昇が、水とノナンの2成分系の相互溶解度の上昇ではなく、C4El会合体の存在により主に引き起こされていることを示している。
ところで得られた結果を熱力学的な見地から検水ーノナンーエチレングリコールモノプチルエーテルからなる3成分2相系の相挙動に関する熱力学的考察

討してみる。 溶液の性質は会合体形成により変化

0.25

/

0
2

的性質が役立つこと

5
0

o

程式

0
1

す。 3成分2相系の平衡条件を表す3つの連立方'___,--／

oの理想希薄溶液の一種の基準となりうることを示

51は良く知られているが、各相の組成関係も 2 相系o1 '3 ::J/0 UO!
P EJ/a1
ow

点を吟味するのに溶液の束ーo

し理想溶液の挙動からはずれてくるだろう。 この―碍s,dT +碍V,dp +Jl,?dx 10 +µ,�dx 30-µぶdx 竺— µ,fdxt = 0, r =1,2,3，戸二二＝＝＝＝二＝：：

(1)

290

を解くとノナン相における組成の関係は
Fig.3(ax,0厄xf)r,P = - (xtµ1�+xt/,喝+ xt/,t3�)!

（平硲 +x翌心 +xt1心），r = 1,2

(2)

295

T/K

300

305

Mole fraction of C4E1 vs temperature

CU rves : (1) X {'", (2) X t·', (3) X f'", (4) X f• t,で与えられる。 ここで△ �, = y,°-y 叉 y = s,v(3)

よび X3 0 . t の値とともに図 3 に温度の関数として

は成分rの水相からノナン相への移行の熱力学量示されている。 温度の上昇により X30 , nの値は減であり、またµij =砒/axj

少し、 X30 , t の値は増加している。 これは油に富(4)

む相では、高い温度において会合体形成が促進さである。 ノナン相が理想希薄溶液であれば式 2 のれ、したがってC4Elの溶解度が増加することを

ca砂I碕） T,p = - x,oげ(1 - Xr°) - X『(1 - X刃J/

上昇により xt·" の値は僅かに増加し、 X3w , t の

右辺はモル分率だけの項で

゜

汽 1-x3°)-x; (1 -ぶ）lX3o[x示唆する。 一方、 水に富む相においては、温度の(5)値は減少している；すなわち高い温度で会合体形と書かれる。 式5の両辺は別々に実験から求めら成は減少し、したがって溶解度も低下する。 さられるのでノナン相が理想希薄溶液であるかどうかを吟味するのに利用できる。 水相に対する式5のに低い 2 つの温度では水相およびノナン相の両相で会合体が存在していることが分かる。

類似式を利用して水相の理想性も検討できる。 これまで2相系の理想挙動の基準として、傾き1を

3.2

0

相プリズム

持つlnx aw vs lnx a 直線が利用されてきたが、こ3成分系の相挙動の温度依存性を示すために、のことは式5の代わりに式1から得られる簡単な

異なる温度でのギブズ三角形を重ね合わせた相プ

関係

リズムを組立て図4に示してある。 ここで三相領(aぶ/ax3°)r,P = xtは3°(6)を利用することと等価である。 しかしながら実験域も中心の三角形で示されている。 温度の上昇に伴い中間相の組成は時計まわりに、 2 相の平衡組

結果に式6を適用しても、独立に2相の理想性は成を結ぶ平衡連結線は反時計まわりに回転してい吟味できない。 この点において式5は式6よりもることが分かる。 このことはC4Elの親水性が温有用であることを指摘しておく。

度の上昇により低下していることを示している。

式5の左辺(LHS)は X1°VS xs° 曲線から、 右2 成分系の上部および下部臨界溶解温度近傍での辺(RHS)は図laから計算された。 LHSの値

溶液挙動から考えて、C4El分子は水相においては、以後xt·"と記すモル分率においてRHSのは水和を通してどちらかと言えばエネルギー 的に、値からずれ始めた。 水相に対する式5の類似式に

またノナン相においてはどちらかと言えばエント

より X3 . n も決定された。 これらの値は X3 . t お

ロビ ー 的に安定な状態にあると言えるだろう。

w

w

-25-

で与えられる。

したがって、移行のエントロビーやエンタル

ピーが熱測定によってのみならず、2相の組成を
温度の関数として測定することによっても得られることに注意すべきである。理想希薄溶液の挙動が観測される領域では式7は

5△姑＝ー(RT/.ぶ）(axt伶T)P.X3o(9)のように簡単な式となる。△ �S3 の値は、式9を図5に示された X3 vs T曲線に適用して得られた。
w

4

3

12

．

11

� �
さ 2

10

\5

2

忍

゜

water
Fig.4

0.4

X2

0.6

0.8

I

295

300

305

TJK

F ig.5

1
nonane

(a)

04 0
O

乏 •s';;11
r
>I
ou,,
1

Phase prism constructed at different
temperatures: ( 1) T = 293. 15K 、 (2) 295.65,(3) 298.15, (4) 300.65, (5) 303.15, (6) 305.65.

Mole fraction of C4E 1 in the water phasevs temperature curves at constant mole
fraction of C4E 1 in the nonane phase: ( 1)10 2xr = 0.5, (2)1, (3)2、(4)3, (5)4, (6) 5, (7) 6,(8) 7, (9) 8, (10)9, (11) 10, (12) 1 1, (13) 12, (14) 14, (15)xi"'vs T.

12 ⑱
O
O

3.3

0.2

290

1

移行の熱力学量式1からC4El分子の移行のエントロビーが次式で与えられる：

心3 ={咄(ax10国）四，：＋咄(ax『JaT)が，:]E]＜

ここで石fは式lに現われているモル分率のうちの1つである。対応するエンタルピーは△跳 =T△糾

-� 20

っシ

(7)

(8)

-26-

(b)

40

゜゜

Fig.6

2

一［杓図（可taT)Pふ，，a+!心(ax戸T)p•.ja

ち

3

X 0,n

10 梵

Entropy and enthalpy of transfer of C4E 1
molecules from the water to the nonane
phase at 298.15K : (a) entropy, (b) en­
thalpy.

水 ー ノナン ー エチレングリコ ー ルモノプチルエ ー テルからなる3成分2相系の相挙動に関する熱力学的考察

図6に△w国の値と対応する△釘加の値が298.15

Haase, D.Langmuir 1985, 1, 281-288.

El分子の水相からノナン相への移行は、 エント

Phys.Chem.1986, 90, 671-677.

lb) Kahlweit, M. ; Strey, R. ; Firman, P. J

Kにおいてx翌に対してプロットされている。 C4

ロピ(c ) Kahlweit, M. ; Strey, R. ; Aratono, M. ;ー の増大を伴い吸熱的であることが分かる。

Jen, J.; Schubert, K.V. J.Chem.Phys.1991,

このことは、 ノナン相よりも水相において分子間の引力的な相互作用が分子の運動と配向を束縛していることを示している。 さらにこのことは、 上に述べたC4El分子は水相においては水和を通し

95, 2842-2853.

7) Chen, L.-J.; Jeng, J.; Robert, M.; Shukla,
K.P. Phys. Rev.A. 1990, 42, 4716-4723.

的に、 またノナン

8) Aratono, M. ; Kahlweit, M. J. Chem. Phys.

安定な状態にあるということを強く支持している。

9) Degiorgio, V. ; Corti, M. ; Physics of Am­

界面における吸着挙動が、 界面張力の測定結果とsions ; North-Holland Physics Publishmg :てどちらかと言えばエネルギ

ー

相においてはどちらかと言えばエントロビ ー 的に1991, 95, 8578-8583.

phiphiles: Micelles, Vecicles and Microemul­

我々の次の論文では、 C4El分子の水／ノナン

その熱力学的解析およびこの論文で得られた結果をもとにして議論される予定である。

Amsterdam ; 1985, and references cited in.

10) (a)Aratono, M. ; Motomura, K. Bull. Chem.
Soc. Jpn. 1985, 58, 3205-3209.

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(b)Kahlweit, M.; Strey, R. ; Haase, D.; Ku­

Motomura, K. Colloid Polym. Sci. 1990, 268,

Borkovec, M.; Eicke, H.-F.; Busse, G.; Eg­

11) Teubner, M. J. Chem. Phys. 1992, 96, 3811-

L. ; Soderman, 0. ; Stilbs, P. ; Winkler, J. ,12) (a)Kilpatrick, P.K.; Gorman, C.A.; DaVIs,

meda, H. ; Schmeling, T. ; Faulhsaber, B. ,gerrs, F.; Funck, T.; Richmann, H.; Magid,

Dittrich, A. ; Jahn, W. J. Colloid Interface877-882.

3813.

H. T.; Scriven, L. E.; Miller, W. G. J. Phys.
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E. ; Miller, W. G.J. Colloid Interface Sc1.

(d)

Kahlweit, M. ; Strey, R. ; Busse, G. J. Phys.

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chem. 1990, 94, 3881-3894.

13) Kahlweit, M. ; Lessner, E. ; Strey, R. J.

135-149.

14) Quirion, F. ; Magid, L. J. ; Drifford, M.

237-243.

15) Elizalde, F.; Gracia, J.; Costas, M. J. Phys.

1336. (bl Widom, B. Langmuir 1987, 3, 12-17.

16) Harusawa, F. ; Saito, T. ; Nakajima, H. ;2) Shinoda, K. ; Lindman, B. Langmuir 1987, 3,
3) Kunieda, H. J. Colloid Interface Sci.1989, 133,4) (a) Widom, B. J. Chem. Phys. 1975, 62, 13325 ) Lovellette, M. J. Phys. Chem. 1981, 85, 12661270.

6 ) (a) Kahlweit, M. ; Strey, R. ; Firman, P. ;Phys. Chem.1983, 87, 5032-5040.

Langmuir 1990, 6, 244-249.
Chem.1988, 92, 3565-3568.

Fukushima, S. J. Colloid Interface Sci. 1980,
74, 435-440.

17) Manabe, M.; Koda, M.; Shirahama, K. Bull.
-27-

Chem. Soc. Jpn. 1975, 48, 3553-3556.

18) Prigogine, I. ; Defay, R.; Chemical Thermo­

K. Motomura, J. Phys. Chem. 1993, 97,

5141-5143.

dynamics ; Everett, D. H., Trans. ; Long­

2) Thermodynamic consideration on phase19) Sassen, C. L. ; Filemon, L. M. ; de Loos, T.

tem of water, nonane, and ethylene gly­

mans: London, 1954; p393.

W. ; de Swaan Arons, J. J. Phys. Chem.

1989, 93, 6511-6516.

20) Aratono, M. ; Nagoya, F. ; Takiue, T. ; Ike­da, N.; Motomura, K. to be published.

behavior of the ternary two-phase sys­

col monobutyl ether

M. Aratono, F. Nagoya, T, Takiue, andN. Ikeda, J. Phys. Chem. 1993, 97 ,
13820-13823.

3) Thermodynamic study on adsorption of

研究成果
1) Thermodynamic study on phase transi­tion at the water/undecyl alcohol inter­face

M. Aratono, T. Takiue, N. Ikeda, A.

Nakamura, and-28-

the ternary two-phase system of water­
nonane-ethylene glycol monobutyl ether

M. Aratono, F. Nagoya, T. Takiue, andN. Ikeda, J. Colloid Interface Sci. 1994,

m press.

各種界面活性物質によるマクロおよびマイクロエマルションの調製並びに物性に関する物理化学的研究
東京理科大学理工学部

阿

部

正

彦

Properties of the o/w type microemulsion with dimyristoylphosphatidylcholine,
properties of the microemulsion with anionic/cationic mixed surfactants, phase behav­
ior of amphoteric surfactant multi-phase microemulsion, binding constants ofinorganic electrolytes and aggregation numbers of the o/w type microemulsion with anamphoteric surfactant, and molecular interactions between lipid and some steroids in amonolayer and in a bilayer (w/o/w type macroemulsion) were investigated from thepoint of colloid and surface chemistry. The properties of microemulsion were dependent
extensively on both salinity and pH values. The middle-phase microemulsion with mix­tures of anionic/cationic surfactants was independent of both temperature and salinity.
The formation of the DMLL microemulsion was strongly depend both on pH and on
salinity. The DMLL microemulsion near the isoelectric point was found to have some at­
tractive features compared with other surfactants such as sulfonates and/or nonionics.
The adsorption density of DMLL molecules on the surfaces of o/w type microemulsions
increased as the pH approached that of the isoelectric region ; then the surfactant num­
ber on the surface of unit microemulsion was able to be obtained if we specified the di­ameter of the microemulsion. The interaction between hydrophobic groups of DPPC andsteroids in both the monolayer and the bilayer membranes (w/o/w type macroemul­sion) was found to increase with decreases in the number of side chains and double
bonds in the steroid molecules involved.

しかし、 マクロエマルションは熱力学的非平衡系

1 . 天然界面活性物質による0/W型マイクロエマルションの物性 1 )であるため静置安定性が悪く、 やがては相分離を起こす系である。
“マイクロ

1. 1緒 言一”

一方、 熱力学的平衡系である

エマルションは、 “マクロ”エマルションのように水と油をかなり高い比率で含んだ般に、 水と油との界面張力は大きい （約50

系でありながら、粒子径が非常に小さく(10-mN/m)ため混じり合わないが、 界面活性剤な100nm程度）、 外観は透明で（勿論、 透明でない

どの両親媒性物質を添加すると、 その界面張力はものもある）、 しかも安定な 一液相であることか大幅に低下して相互溶解 し、 “マクロ”エマル

ションとして分散させることが可能である

2)0

Physicochemical Studies on Preparation andProperties of Microemulsions
with Various Surface Active
AgentsMasahiko Abe
Faculty of Science and Technol­ogy Science University of Tokyo

ら高付加価値を有する系としてかなり多くの研究がなされている 3 -6} 0
エマルションが、 食品、 化粧品あるいは医薬品等の分野において利用される場合、 その可溶化能、生体適合性、 生体内分解性等を考慮し、 使用する界面活性剤の選択に十分注意を払わなければならない。 生体膜構成成分であるホスファチジルコリ
ンは、 ドラッグキャリア ー を目的とした二分子膜（リポソ ー ム） 7, 8} や脂肪乳剤（リピッドマイク-29-ロスフェア ）9, 10) などの研究に用いら れており、定装置(Zetasizer III、 MALVERN社製）を用

また工業的には、 化粧品あるいは食品用乳化製品

いて、 フリンジモ ー ドのレ ー ザドップラ ー 電気泳等に広く利用されている安全性の高い天然の界面動法により行った。

活性物質である。 し かし、 このホスファチジル コリンを用いた研究の多くは、 “マクロ" エマルションに関するものであり、 “マイクロ" エマル1 . 3 結果および考察
1 . 3. 1

マイクロエマルションの生成： 一般。 そこで本研に、 ジミリストイルホスファチジルコリンなどの究では、 ジミリストイルホスファチジルコリン

レシチンは疎水性ならびに疎油性が強く、 また水ションに関するものは少ない

11 1
.

2)

(DMPC)を 用いた0/W型マイクロエマル

に対する溶解度が極めて小さく(cmcは25℃で、ションを調製し、 その物性に及ぼす飽和炭化水素

10 7 -10 10 mol/dm3 程度 13 l)水にも油にもの炭化水素鎖長、塩濃度、 pH等の影響を、粒子溶けにくい物質であることから、 マイクロエマル――

ションを生成するためにはコ ー サー ファクタント

ー径ならびにゼ タ電位の測定により検討した。

の添加が不可欠である。 そこで、 コー サー ファク
1 .2

実

1 .2. 1

験

タントとして、 両親媒性物質であるプロパノ ー ル

マイクロエマルションの鯛製：所定を加えたところ、0/W(Oil-in-Water)型マ

濃 度 の塩 水 と DMPC (L- a -Dimyris­

イクロエマルションの生成が確認された。 図1に、

t oyl phosphatidylcholine : DMPC)との混合

DMPCを用いたマイクロエマルション生成に及液に、所定量のアル コー ルおよび飽和炭化水素をぼすプロパノ ー ルおよびテトラデカンの添加濃度

添加し て十分に振とうした後、 30℃の恒温 槽にの影響を示す。

静置することにより、0/W型マイクロエマル
ションを調製した。
1 . 2.224

相状態の判定および粘度の測定：相状態の観察は、 1.2.1項で調製した試料をテフロ
ンライナ ー キャップ付きネジロ試験管に封入し、O+Wm

試験管ミキサ ー により充分振とうした後、 30℃（土0.1℃)の恒温水槽中で静置して行った。 相状態の判定は、 分離相の有無、溶解状態や流動性の確認、 並びに偏光顕微鏡を用いて行った。 また、粘度の測定にはウベロー デ粘度計を用い、 30℃
恒温下で測定を行った。
1 .2. 3 粒子径の測定：マイクロエマルショ
ンの粒子径 の測定は、 光 散乱測定装置(4700
Submicron particle analyzer、 MALVERN
社製）を用いて動的光散乱法により行った。 光源

0

0.2

0.4

0.6

0. 8

1.0

1.2

l.4

Concentration of n-tetradecane I wt%
Fig.1 Phase diagram of DMPC/n-tetradecane/1-propanol/water microem u ls ion systems
at 30℃ and pH=5. The concentration of
DMPC is 0.5 wt%

としてアルゴンレ ー ザ(COHERENT社製：最大出力5W、 波長488nm)を用い、 30土0.1℃

度(wt%)を表わし、 横軸は系全体に対する飽

恒温水槽中において測定した。
1 .2.4ゼー

タ電位およびpHの測定：マイクロエマルションの(-電位測定は、 〖ここで、たて軸は水相に対するプロパノ ー ル 濃

ー

電位測

-30-

和炭化水素 濃度(wt%)を表わす。 また、 図中の●印は飽和炭化水素の可溶化限界領域（二相分各種界面活性物質によるマクロおよびマイクロエマルションの調製並びに物性に関する物理化学的研究

離領域）、 〇印は液晶相から一液相0/W型マイク

化水素の添加量が低い領域では、 DMPCの炭化

ロエマルションに変化する領域を示す。この二つ水素鎖同士の疎水基間相互作用により運動が束縛の曲線の交点における飽和炭化水素の添加量が、された、 いわゆる層 状のラメラ構造を形成してい0/W型マイクロエマルション中に可溶化できるるため粘性は大きくなる。しかし、 飽和炭化水素

油の最大可溶化量に相当し、 テトラデカンの場合の添加量の増加に伴い、 このラメラ構造の疎水部

0.82wt%であることが分かった。

分に油分子が入り込み層間隔が徐々に広がり、 炭

1 . 3. 2

マイクロエマルションに及ぼす飽和

化水素鎖同士の相互作用が弱まる。その結果、 あ

炭化水素の影響：飽和炭化水素の添加農度を図lる濃度（図2では0.4 wt%)以上の油を添加したの破線A Cプロパノ

ール濃度が14.5wt%

一定のときに油／水界面が曲率を持つようになり、 球状場合）に沿って増加させると、 溶液は半透明で粘のマイクロエマルションヘ構造変化したものと考桐な状態から、 透明で流動性に富んだ状態へと変えられる。

化した。この飽和炭化水素の添加量の低い領域で

1 . 3. 3 マイクロエマルションに及ぼすコ ー

得られる粘稲な溶液を、 偏光板を用いて直行ニコ

サ ー ファクタントの影響：マイクロエマルション

ル下で観察したところ光学的に異方性を示し、 まの粒子径に及ぽすプロパノ ー ルの添加濃度の影響

た偏光顕微鏡によりラメラ(lamellar)液晶特を図3に示す。図3から明らかなように、 プロパ

有の組織像が観察された。そこで、 この溶液の粘ノ ー ル濃度の増加に伴いマイクロエマルションの性に及ぼす飽和炭化水素の添加濃度の影響につい粒子径は減少した。一般に、 プロパノ ー ルなどのて図2に示す。図2から明らかなように、 溶液のアルコ ー ルは、 界面活性剤分子と共に油／水界面

粘性は飽和炭化水素濃度の増加に伴い徐々に減少に配向して界面張力を低下させる働きのあることし、 油の農度が0.4wt%以上でほぼ一一定となった。

が知られている。例えば、 非イオン系界面活性剤

421

般に、 分散溶液の粘性はその構成分子間の相互作用に依存すると考えられる。すなわち、 飽和炭

0
•�2.
>姜一

4
3

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8
3

mu

2.5

b

1.5
O

0.1

30
1
4.0

0.2 0.3 0.4 0.5

0.6 0.7
Concentration of n-tetradecane / wt%
Fig.2 Effect of the concentration of n-tetrade­cane on viscosity for DMP C/1-propanol/
water systems at 30℃ and pH=5. The con­centrations of DM PC and 1-propanol are
0.5 wt% and 14.5 wt%, respectively

15.0

1 0
6.

17.0

Concentration of co-surfactant I wt%
Fig.3 Effect of the concentration of cosurfactant
on particle size for DMP C/n-tetradecane/water microemulsion systems at 30℃ and
pH=5. The concentrations of DMPC and n-tetradecane are both 0.5wt %

-31-

I
0•

8

の添加と同様にDMPCマイクロエマルション系＼ー。

れらの結果から、 NaClの添加は、プロパノ ー ル\

増加に伴い粒子径は減少することが分かった。 こ

6ずれのプロパノ ー ル濃度においても添加塩濃度の゜゜4を検討するため粒子径の測定を行ったところ、い[度の増加に伴い減少した。 さらに、塩濃度の影響

2

ぼす添加塩の影響：油の最大可溶化量は NaCl濃g

マイクロエマルションの相挙動に及UO;J

1 . 3. 4A0ンの粒子径は減少したものと考えられる。

卜の界面張力が低下したため、マイクロエマルショ

゜

液滴粒子の大きさの減少をもたらすと述べていることから、プロパノ ー ルの添加により油／水界面

80

UJO Ucng §m 'Harkins 16'は、油／水の界面張力の低下は分散

Q
.
-

また、

2
1

らl.80mN/m に 低下す る 14. l 5)。

言パノ ー ルを加えると、界面張力は6.67mN/mか6
1;
こ a uc:>
ク
l
ゞ ー

―

水ーベンゼン系に、 1 X 10 5 mol/dm3 の1ー プロ

0
2

CC1sPOE30 ; 1 X 10-3mol/dmりを添加した

10pH

F ig.4 The maximum concentration of n-tetrade­cane for the microemulsion formation in
DMPC/1-propanol/brine microemu lsion
systems at 30℃ • The concentrations of
DMPC and 1-propanol are 1.0wt % and14.0wt % , respectivelyの親水性を高める働きがあるものと考えられる。
a

aー
ジメチルー

N" ー ラマイクロエマルション表面におけるDMPCの極

ウロイルリジン（合成両性界面活性剤）マイクロ性基の挙動を詳細に検討するため、pH変化によこの様な傾向は、 N 、 N

r- 電位を測

エマルション系 l 7 l にも認められることから、両る0/W型マイクロエマルションの性界面活性剤の等電領域における特異的な現象で定した。 この際、DMPCおよびプロパノ ー ルのあると考えられる。 両性界面活性剤では、塩添加

濃度は一定とし、 さらにイオン強度を一定とするによる現象としてKrafft点の低下が知られていため、 NaClを5 X 10 3mol/d町添加した。 こるが 18) 、このことも系の親水性が増加したことのを意味しており、本研究における粒子径、あるいの表面電荷密度(az)を、図5に示す。 図5か一―

r- 電位の値から求めたマイクロエマルション

は最大可溶化量が減少する要因の つであると考ら明らかなように、DMPCによる0/W型マイ

えられる。

クロエマルションの表面電荷密度は、pHの増加

1 . 3. 5

マイクロエマルションの相挙動に及ーに伴い正の値から負の値へと変化し、pH3.2付

タ電位：飽和炭化水素の最近でゼロとなった。 これは、DMPCが親水韮内

大可溶化量に及ぼすpHの影響を図4に示す。 図にトリメチルアンモニウム基とリン酸基を持つこ

4から明らかなように、マイクロエマルション中とから、酸性側ではトリメチルアンモニウム基のに取り込まれる油の最大可溶化量は、pH7付近

正電荷が、また、アルカリ性側ではリン酸基の負から急激に減少した。 これは、pH7以上のアル電荷の寄与が強くなるためであると考えられる。

ぼすpHの影響とゼカリ性側では、pHの増加に伴い系全体の親油性

次に、0/W型マイクロエマルション粒子径にが減少する傾向にあることを示唆している。 この及ぼすpHの影響について検討した（医6)。 図6

ような現象は、マイクロエマルションの表面に配から明らかなように、粒子径はpH3�7の等電点向したDMPCの親水基のイオン性がpHに依存

領域で極大を示した。 この領域では、表面電荷密することに起因するものと考えられる。 そこで、度の絶対値が特に低い（図5)ことから、他の-32-

各種界面活性物質によるマクロおよびマイクロエマルションの調製並びに物性に関する物理化学的研究

062

゜’ ’ l

-2

30

'c;

Surface charge density of DMPC/ n­t e t r a d e c a n e /1 - p r o p a n o l / b r i n e
microemulsion systems at 5 x 10-'M of
NaCl aqueous solution as a function of
pH at 30℃ . The concentrations of OMPC and 1-propanol are 1.0wt % and 14.0
wt%, respectively

Fig.6

8

pH

゜

6

20

10

2

8

6

4

2

Fig.5

゜

4

-3

0
4

Q,J

e.o -1
....

0
5

<l)

゜

゜

.::'

mu-gN
!
S�P!
PCJ

�

10

pH

Effect of pH on particle size for DMPC/n-tetradecane/ 1-propanol/brinemi­croemulsion systems at 30℃. The con­centrations of DMPC and 1-propanolare 1.0wt% and 14.0wt%、respectively

オン界面活性剤であるアルキル硫酸ナトリウムとカチオン界面活性剤である塩化アルキルトリメチ

pH領域に比ベマイクロエマルション表面に配向した親水基同士の反発（イオンーイルアンモニウムを用いて、 それらの混合界面活性オン相互作剤／油／アルコ ー ル／水系の多相マイクロエマル用）が弱まり、 相対的に疎水性が強まるため、粒ションを調製し、 油／水界面における親水性相互

子径が大きくなったものと考えられる。

作用と親油性相互作用のバランス並びにそれらの強度からマイクロエマルションの生成を考察する

2. アニオン／カチオン界面活性剤混合系
1

マイクロエマルションの物性 9)とともに、 ミドル相マイクロエマルションの可溶
化パラメ ー タ ー 、 流体力学的粒子径、 界面張力について検討した。

2. 1

緒 言

一般に、 二種類以上の界面活性剤を混合した場

2.2

合、 その組み合わせにより界面活性剤単独系では

実

2. 2. 1

験
界面活性剤：アニオン界面活性剤は認められない優れた機能や複合効果の現れること

日本サ ー ファクタント（樹から提供されたアルキルが知られている 20 lが、 アニオン界面活性剤とカ

硫酸ナトリウム（炭化水素鎖長が10,12,14,16)

チオン界面活性剤を混合すると沈殿物が生成したをエタノ ー ル再結晶、 エ ー テル抽出した後、 試料り、 界面活性が失われることが多い。 しかし、混に供した。 また、 カチオン界面活性剤は塩化アル合方法によっては優れた特性を発揮することが可

キルトリメチルアンモニウム（炭化水素鎖長が2能となる I) 。 そこで本研究では、 典型的なアニ

10,12,14,16)を用いた。 これは、 東京化成（株）製-33-

特級品を数回アセトンで再結晶した後、 試料に供なように、 両者の混合モル比が1 : 1付近で 形成した錯体のクラフト点は100℃以上になることがした。
2.2.2実験方法：マイクロエマルションの分かる。 このことから、 SDSと DTACの混合モ

調製は、 1.2.1 項に準じた。 多相マイクロエマル

ル比が等モルに近づくほど、 水への溶解性は著しションの各相中のアニオン界面活性剤はエチルバく低下するものと考えられる。

イオレット抽出分光法により定量し、 カチオン界

2. 3.2 マイクロエマルションの生成：イオ

面活性剤はオレンジII抽出法により定量した。 流

ン 性界面活性剤は親水基がイオン解離するため、体力学的粒子径の測定は1.2.3項に準じた。 界面

親水性と親油性のバランスはかなり親水性側に張力の測定は、 スビニングドロップ界面張力計

偏っ てい る 。 こ の た め 、 SDS 単 独あるいは(Texas大学製）を用いて行った。

DTAC単独の界面活性剤を用いてマイクロエ マ
ルションを調製したところ、 添加したアルコ ー ル

2.3 結果および考察の炭化水素鎖長(CCN)が4以上、 すなわち比一般に、 アニオン界面

較的親油性の強いアルコ ー ルを用いたときにマイ活性剤とカチオン界面活性剤を混合した場合、 反

クロエマルションは相変化を示し、 ミドル相マイ2.3. 1

錯休の生成；

対の電荷を持つ親水部同士が結合して錯体を生成

クロエマルションを生成した。 このマイクロエマする。 そこでまず、 アルキル鎖長が12のSDSとルション相は、 アルコ ー ル濃度の増加に伴い下相DTACの混合モル比と混合の際生成する錯体の(0/W型）から過剰の油相と水相を伴うミドル

溶解温度（クラフト点）との関係を検討した（図相を経て、 上相(W/0型）へと連続的に変化し7)。 SDSのクラフト点は15℃、 DTACのクラた。

フト点は0℃以下である

22)が、 図7から明らか

一方、 SDS水溶液に DTAC水溶液を混合した

場合、 不溶性の白色結晶（錯体）が析出したが、この系にアルコ ー ルを添加したところ錯体は溶解120.0した。 そこで 、 各種アルコ ー ルを添加してSDS/DTAC界面活性剤混合系マイクロエマルション

100.0＾ 80.0の調製を試みたところ、 CCNが3以下の アルu

コ ー ルを用いた場合のみ、 ミドル相マイクロエマ
ルションの生成が確認で きた。 また、 プロパノ ー゜

ル添加に伴う界面活性剤混合系の多相マイクロエo.. 60.0

豆

マ ル シ ョ ン の 相 挙 動 は 、 SDS 単独あるい は¢:;DTAC単独系の相挙動とは異なり、 プロパノ ー40.0

ル濃度増加に伴い上相マイクロエマルション、 ミ

�o

ドル相マイクロエマルション、 下相マイクロエマ

20.0 I― 、 '゜゜

ルションヘと変化した。 すなわち、 SDSあるいは DTAC単独系の場合、 界面活性剤自身の親水
0.2

l.0

性が強くそれぞれ水中でミセルを形成し易いため、Molar fraction of SDS
Fig.? Relationship between Krafft Point and Mo­
lar Fraction of SOS for Mixed Aqueous So­
lution of SOS and OT AC

系全体の親水性と親油性のバランスをつり合わせ

0.4

0.6

0.8

るには親油性の強いアルコ ー ル( CCN�4)の添加が必要となる。 一方、 SDSと DTACを混合した際に生成する錯体は疎水性が強いことから、-34-

各種界面活性物質によるマクロおよびマイクロエマルションの調製並びに物性に関する物理化学的研究

ミドル相マイクロエマルションを生成するためには親水性の強いアルコー

性界面活性剤と考えることができるので、SDS/ル(CCN;;;; 3)の添加

DTAC混合界面活性 剤によ るマイクロエマル

が必要となったものと考えられる。 ただし、界面

ションの相挙動（ミドル相マイクロエマルション

活性剤単独系の場 合、添加されたア ルコ ー ルはの最適プロパノ ー ル濃度と可溶化パラメ ー タ ー ）コ ー サ ー ファクタントとしての機能を発揮する が、に及ぼす温度の影響を検討した（図9)。 図9からー

明ら か なように、最適プロパノ ール濃度や 可溶化

ルはコ ー サ ー ファクタントとしてでは なくコ ー ソ

パラメ ー タ ー は温度に依存せず一定となった。 まルベントとして作用 し、不溶性の界面活性剤錯体

た、メタノ ールやエタノ ールを用いて同様な実験

界面活性剤混合系の場合には添加されたアルコ

2.3.3 塩濃度の影響：種々の混合モル比において生成するミドル相マイクロエマルションの
流体力学的粒子径CHo )に及ぼす塩濃度の影響を図8に示す。 SDS ならびに DTAC単独系（ペ

uo�
1
1
:u
1
ud:
m 0:)w nw pdo

100

SDS:DTAC() 0 :10(I J: 7
O l: 1• 7: Jo lO: 0

80

0
4

(
Eu
)OH

0
6

2

゜゜

--·•―: ．

→―←0--0-

8.0

ニ---

ェ

1.0

．

ンタノ ール濃度4wt%)の場合、高塩濃度領域に

10.0

．

IJO
$ 6) 1om �
d0Jd,の溶解度を増加さ せるものと思われる。

0.5

．

6.0·一

JO

40

50

60

70

80

6.0
4.0
5.0
3.0
Salinity(%)
Fig.8 Relationship between Hydrodynamic D1 ーameter (Ho) of Middle Phase Mi­
croemulsion and Salinity for Various Mix­
ing Ratio of SDS and OT AC/n-Decane/1Propanol/Brine Systems an 30℃

Fig.9 Effect of Temperature on Optimum Con­
centration of 1-Propanol and Solubiliz6 ーtion Parameter (a) of Middle Phase Mi­
croemulsion for SOS/OT AC/n-Decane/1Propanol/Brine Systems

おいてのみ、ミドル相マイクロエマルション が生を行ったところ、 同じ傾向を示した。

1.0

2.0

°

Temperature ( C)成し、 そのH叫ま塩濃度に大きく依存した。 一 方、

これらのことか ら、生成したマ イクロエマル

SDSとDTACを等モル混合 した場合、ミドル相

ションの相挙動は、界面活性剤、飽和炭化水素、

マイクロエマルションは低い塩濃度領域においてアルコ ールの 炭化水素鎖長に依存することが分かも生成し、 そのHoは塩濃度にほとんど依存し なり、特に界面活性剤混合系によるマイクロエマル

いことが分かった。 これは、 SDSとDTAC間のションは塩濃度や温度に影響を受けにくい特異な

静電的相互作用により親水部に存在する 電荷の中系であることが分かった。

和が起こるため、塩の添加に伴うイオン強度の変化に影響を受け な かったものと考えられる。
2.3.4

温度の影響： SDSとDTACを混合すると電荷の中和が起こるため、一種の非イオン

-35-

1.0

多相マイクロエマルションに関する研究は、 ア
ニオン界面活性剤や非イオン界面活性剤について

4
．
0

言

6
．
0

緒

U OflJU.IJ ajOJ-IJ

3.1

0
0
。

3. 両性界面活性剤を用いたマイクロエマ
17)
ルションの物性

O.l

数 多く行われているが、 両性界面活性剤について
4はほとんどない。 そこで本研究では、 アミノ酸から誘導され、 生体や環境に対する安全性 の高いア

JO

12

14

マルションを調製し、 その生成条件に及ぼすpH、pH
F 1g .10 Effect of pH on mole fraction of each typeof DM LL at 25℃

塩濃度、 温度の影響を検討した。

3.3.2

ミノ酸系両性界面活性剤を用いて多相マイクロエ

DMLLの溶解温度：塩濃度が変化しても溶解温度は等電点領域に近づくほど増加した。 また、中性 領域において塩濃度の増加に伴い

3.2 実 験3.2.1

界面活性剤：アミノ酸系界面活性剤

a

a

e

であるN 、 N ージメチルーN ーラウロイルリ

溶解温度は減少することが分かった。
3.3.4

DMLLマイクロエマルションに及ジン(DMLL)は、 味の素闊中央研究所から提ぼすpHの影響：コ ー サ ー ファクタント濃度増加

供されたものをそのまま用いた。

に伴う 相挙動はWinsor型の相変化 23) を示した。

3. 2. 2 実験方法： DMLLの酸解離指数 はそれぞれ電位差滴定により求めた I 7 >。 多相マイ

図11に、 塩濃度が0.3%の時の各マイクロエマル
ションを生成するコ ー サ ー ファクタント濃度領域

クロエマルション の調製 および物性測定 は1.2項とpHの関係を示す。 図11から明らかなように、に準じた。

DMLLの酸解離定数および等電型）をとるので、 それらの酸解離定数を求めたと電点pH i = 6.0 となった。 そこで、 各pHにおけ
LLのモル分率を求めたところ、 図10に示す関係

モル分率 がほぼ 1となる等電領域 はpH5-7の範囲に存在することが分かった。

-36-

4

6

8

pH7以上の領域においてアニオン型／双イオン型混合系となることが分かった。 また、 両性型の2下の領域においてカチオン型／双イオン型混合系、Lower ph11se。

が得られた。 DMLL単独水溶液の場合、 pH5以uる双イオン型、 カチオン型、 アニオン型のDM­

01

ころ、 pKa1 =2.2、 pK.2 = 9.8となり、 また、 等

Upper ph心51異なる構造（カチオン型、 双イオン型、 アニオン;
)UO
I JO UO!le.llU;}

点： DMLLは水溶液のpHに依存して3種類の

0
2

果

^
,

3.3.1

(
OUl?
lU;}

3.3結

25

10

pH
Fig.11 The range of cosurfactant concentrations
which lead to multiphase microemulsion
formation for solutions containing 0.3%
NaC I, as a function of pH (at 25℃)．

各種界面活性物質によるマクロおよびマイクロエマルションの調製並びに物性に関する物理化学的研究

Winsor型の相変化は広いpH範囲で起こり、 ミ

サ ー ファクタント濃度が大きい系ほど親水性相互ドル相マイクロエマルションを生成するためのペ作用は大きくなる。 さらに、可溶化パラメ ー タ ー

ンタノ

は、最適コ ー サ ー ファクタント濃度におけるミドー

ルの必要量は酸性側あるいはアルカリ性側の方が等電点領域よりも大きかった。 図12に、塩濃度が0.3%の時の最適コール相マイクロエマルションヘの水と油の相互可溶示す。 可溶化パラメ ー タ ー は等電点領域に近づくに従い減少したが、pH3およびpH8において極

うときほど、この可溶化パラメ ー タ ー は大きくなる24 . 2 5 >。 したがって、最適コ ー サ ー ファクタン

小を示すことが分かった。 それらのpHではまた

卜濃度および可溶化パラメ ー タ ー が極小を示したになるものと考えられる。 また、pH変化により
最適コ ー サ ー ファクタント濃度が変化したのは、

）
5
2

ー
｀
．
、

¢ /1

，

）
8

）

ー，

るものと考えられる。特に、pH3およびpH8においてDMLLの双極子ーイ オン間の相互作用により膜に凝集力が働き、DMLL分子が油／水界叩

20． l ___

22

ー�，�唸

24

•
••
,- •

g
/

」313日g ed uonezm qn1os

面（マイクロエマルションの表面）に密に配向するため、系の親油性相互作用が増加（親水性相互
,
1
8

l6

上4

'2

゜

pH3およびpH8において親水性相互作用が極小

DMLLの 3種類の型のモル分率の変化に起因す(11.1)

181-16

唸ー

化能力を示す指標として用いられるが、親水性相
互作用と親油性相互作用が共に大きな値でつり合

ぃ△

ファクタント濃度における可溶化パラメ ー タ ー とpHの関係を

26

サ

ー

作用が減少）したものと考えられる。
10

pH
Fig.12 pH-dependence of optimum concentra­tion of cosurfactant at 25℃ (NaCl 0.3%).

4. 両性界面活性剤を用いた 0/W 型マイ

界面張力は極大値 を示したが、マイ クロエマル

4. 1

クロエマルションの会合数と結合定

数 2 6)緒呂

ションの粒子径は極小値を示した。 また、いずれ

前節で、DMLLによる多相マイクロエマルのpHにおいても、マイクロエマルションの生成

ションの相挙動を検討したところ、マイクロエマ

領域に及ぼす温度の影響は小さく、酸性側におけルションの生成条件は親水基からのプロトンの解

る最適コ ー サ ー ファクタントは温度の上昇に伴い離、または親水基へ対イオンの結合に影響される

増加したが、アルカリ性側では減少し、等電点領ことが示唆された。 すなわち、この親水基の解離域付近においては温度にほとんど影響しなかった。

によって油／水界面における親水性相互作用が変化すると考えられることから、マイクロエマル

3.4

考

ションの生成並びに相挙動を解釈するには、親水察
一

紙面の関係で詳細は省略するが、イオン強度

基の荷電状態の検討が不可欠である。 そこで本研

定におけるDMLLマイクロエマルションのpH

究では、下相マイクロエマルションの移動度の測依存性も、前述したWinsorのR理論できる。 最適コ

ー

サ

ー

23)

で解釈

定を行い、pHによるマイクロエマルション表面

ファクタント濃度においての荷電状態の変化についてDLVO理論を用いて親水性相互作用と親油性相互作用のバランスはつ検討した。

り合い、 Rは1となる。 したがって、最適コ ー-37-

4.2 実 験
実験方法：モビリティ ー の測定は、4.2. 1ゼー

タサイザ ー 皿を用い、フリンジモ ー ドのレ ー

ザ ー ドップラ ー 電気泳動法により行った。 その他

＾s

c::
、-

の測定については、前述した通りである。

i.

4. 3

ell
•"0
—

結

果

図13に、 下相マイクロエマルションの ゼータ電位とpHの関係を示す。 なお、 ゼ ー タ電位はモ
ビリティ ー の値からHenryの式27 lにより求めた。

20

pHの増加に伴いゼ ー タ電位は正の値から負の値

....

•

7.5%
o : 8.0%
o : 8.5%
●

も

:

-10
0

40

20

。

pH

8

10

Fig.14 Hydrodynamic diameter of the lower
phase (0/W type) microemulsion as afunction of pH at various concentrationsof cosurfactant (25℃, NaCI0.3%).

゜

-5

60

〇

Cosurfactant

R

6

5

. ...

l

80

4

ヽ
日

臼

7.5%
: 8.0%
O: 8.5%()l＾ > 10 ト々つ．

Cosurfactant

っ

15 t-

•一

10 0
1

表面電荷密度を算出できる 2 8 l。 得られた表面電
荷密度とpHの関係を図15に示す。 いずれのコ ー
サ ー ファクタント濃度においても表面電荷密度はpHの増加に伴い正の値から負の値へと変化し、

pH

8

6

た。 このことから、 DMLL分子が電気的に中性

4

Fig.13 t; -potential of the lower phase (0/W
type) microemulsion as a function of
pH at various concentrations of cosurfac­
tant (25℃, NaCl 0.3%) .

2

10

pH3.9 に お い てゼ ロ となることが分か った。
DMLLの等電点はpH6であるので、 pH6においてDMLLに由来する正味の電荷はゼロとなるものと考えられるが、 表面電荷密度は負の値を示しとなる等電点領域においても、 マイクロエマル
ション表面には溶媒中のアニオンが吸着しているものと考えられる。 等電点領域において、 特に電へと変化した。 また、 いずれのコ ー サ ー ファクタ

解質として加えたNaCl濃度が高いことから、 マント濃度においてもゼ ー タ電位はpH3.9でゼロ

イクロエマルションの表面には塩素イオンの方がとなった。 図14に、 下相マイクロエマルション

ナトリウムイオンよりも優先的に吸着しているもの粒子径とpHの関係を示す。 ゼ ー タ電位を表面のと考えられる。 また、 コ ー サ ー ファクタント濃ー

電位に等しいと仮定すると、 ゼ タ電位および粒度の増加に伴い下相マイクロエマルションの粒子

子径の値により0/W型マイクロエマルションの径は増加した。 これは、 コ ー サ ー ファクタント濃-38-

各種界面活性物質によるマクロおよびマイクロエマルションの調製並びに物性に関する物理化学的研究

度が変化する。 すなわち、 ccoo-J の吸着点にはプロトンとナトリウムイオンが競争的に結合し、一方、 [ N (CHs入］の吸着点には、まずプロ

Cosurfactant● : 7.5%
o : 8.0%
o : 8.5%105トンが結合した後、正に帯電した親水基[HNを考える。

イオンの結合によるヘルムホルツ自由エネル
ギ ー 変化は、静電的な正味の仕事、イオンの吸着（結合） による仕事および配置エントロビ ー の寄ー

与を考える式を出発として、 [COO ］へのプロトンとナトリウムイオンの単位面積当たりの最大吸着数、 [HN3-5+(CHs入］にのみ塩素イオンが結合するモデル

，

J」ns
翌
3 eク 3 g e

゜At,m 3 C,OIX) }!SUJp
(

15

+

(CHり』へのプロトンと塩素イオンの単位面積当たりの最大吸着数、各イオンのマイクロエマルション表面における電気化学

8

6

4

0

2

-10

ポテンシャルエネルギ ー 、 DMLL の吸着密度、10pH

酸解離定数を考慮すると、最終的に次式が得られる（詳細は参考論文26)参照）。
― H

KNa-Kc1= (1/C) [ (1/ (1+10 p /
― H
―p a
a
10 k2)_ (l/ (l+lO-pK2/ 1Q p )]Fig .15 Surface charge density of the lower phase(0/W type) microemulsion as a func­tion of pH at various concentrations ofcosurfactant (25 ℃, NaCl 0.3%).

―I=-0.20 CM )ここで、C=CNa =CcI=O.lOMとした。 また、度の増加に伴い疎水性が増加するため、1 粒子当pH6付近において DMLL に由来する正味の電荷たりに可溶化される油の量が増加するものと考えはゼロとなることから、次式が得られる。

られる。 さらに、粒子径はpH3およびpH8におKNaexp

いて極大を示したが、これは前節で述べたように、(-et;/kT)-Kctexp(et;/kT)= (a leC ) ( 1/ N)

DMLL 分子間の凝集力によ り親水性相互作用が減少し、親油性相互作用が増加するためと考えら

これらの式を用いてナトリウムイオン、塩素イオれる。

ンの結合定数、 DMLL の吸着密度 (N) を求めたところ、次の関係が得られた。

4.4

考

察

O<KNaく0.91

0/W 型 DMLL マイクロエマルションの表面

0.2Q<Kc I <1.11

電荷密度は、 DMLL 分子の吸着密度やプロトン、

Kci-KNa =0.20

ナトリウムイオン、塩素イオンの DMLL の親水

N>0.79基への結合に依存する。 まず、対イオンがすべてとれた構造を有するアニオン型の DMLL が均一

吸着密度N を0.8とし、図14 の粒子径を基にしてに吸着するようなマイクロエマルションを考える。

マイクロエマルション単位当たりの DMLL 分子

さらに、その DMLL の親水基にプロトン、ナトの会合数は約4000 であることが分かった。

リウムイオン、塩素イオンが結合して表面電荷密-39-5. W/0/W 型マクロエマルション（リポソ ー ム）中におけるリン脂質とステロ
29イドの相互作用 )グルコー スのリポソ ー ムからの放出の経時変化か
ら検討した。
5.3結果と考察

5. 1

緒 言

5.3. 1気／液界面における混合単分子膜の一般に、 W/0/W型マクロエマルション（リポ挙動：脂質二分子膜の横方向の分子間相互作用は、ーム）の安定性を向上させるために、 リン脂質

気／液界面に形成する単分子膜のそれと類似した／ コレステロ ー ル／荷電物質の3成分系で調製さ傾向を持つので、 まずリン脂質とステロイド類のソれているものが多い

30>。 リポソー

ムをドラッグキャリヤ ー として応用するため r;; は、 リポソ ー ム

モル比を7 : 3 (動物細胞の細胞膜 と 同一 の組
2成）3 l にした場合の7[ ー A曲線を図16に、 またの膜としての安定性および安全性の向上、 また、100

徐放などの処方の融通性を高めることが不可欠でな種々のステロイドおよび半合成されたステロイ
ドを用いて、 単分子膜を生体膜の最小単位と考え、リン脂質／ステロイド混合単分子膜の物性並びにリポソ ー ムの安定性に及ぼすステロイドのセグメ
ントおよび側鎖構造の影響を検討した。
5 .2

実

験

5.2. 1

試

0
gn1
go
旦 g38

る。 そこで本研究では、 自然界に存在する代表的）各種ステロイドの影響を検討することは重要であ（苓あるため、 界面化学および物理化学的観点からのDPPC:steroid:DCP=7:3:l

80
60
40
20
10

20

30

40

50

60

70

Incubation time (hours)

料：リン脂質として日本油脂（樹から提供されたL-a ー ジパルミトイルホスファ
チジルコリン（純度99.6%以上）を、 荷電物質

Fig.16 Time dependence of glucose leakage(DPPC: steroid: DCP = 7: 3: 1) : �.
without steroid; e, 4,22-stigmastadien-3-one; ● ， stigmasterol; 0, /3 ー s1tos­
terol ; f), /3 -cholestanol ; 0, choles­
terol.

として市販品のリン酸水素ジヘキシルを、 ステロ

その組成比を5 : 5 (動物の赤血球と同 一 の組

イドとしてコレステロ ー ル、成）3 3 ) を図17に示す。 図から明らかなように、

f3

ー コレスタノ ール、/3 ー シトステロ ー ル、 スチグマステロ ー ル、 4,22リン脂質とステロイドとからなる混合単分子膜はースチグマスタジエン ー ー

3 オンを用いた。 内水相ステロイドの種類に依存せず凝縮膜を形成した。

マ ー カ ー 物質としてグルコー スを、 緩衝塩溶液と図には示していないが、 混合単分子膜の圧縮弾性して調製したリン酸緩衝化生理食塩水を、 蛍光プ

率は同 一 親水基（水酸基）をもつ4種類のステロ

ロ ー プとしてピレンを用いた。

イドの場合ほとんど同じであったが、 親水基が異

5.2.2

実験方法

なるスタジエンを用いた場合はかなり異なった。

気／液界面におけるリン脂質とステロイドの混本研究で得られた見かけの1 分子当たりの分子占

合単分子膜の表面膜圧の測定は、 協和界面科学（樹有面積および圧縮弾性率などから、 気／液界面に製の表面膜圧計を用いて、 Wilhelmy法によりおけるステロイドの配向状態をモデル化すると図行った。 リポソ ー ムの調製はSzokaらの方法 31

18となった。 スタジエンを用いた混合単分子膜

に従って逆相蒸発法(REV)により行った。 膜の場合(5 : 5)、 明確な二段階の崩壊を示したこ

透過性の測定は、 リポソーム内水相に保持された-40-とから、 混合単分子膜中で相分離 3 4) しているも各種界面活性物質によるマクロおよびマイクロエマルションの調製並びに物性に関する物理化学的研究

（
苓）
品gsn
g
1
0g

100.____

造の違いによるリン脂質とステロイドの疎水基間相互作用が大きいステロイドほど低下した。 一方、_ -- _ _80

ステロイド環部の構造が異なる場合は、前述した傾向とは異なることが分かった。 また、 リン脂質に対するコレステロール のモル比が5 : 5のとき、

60
40

゜゜

膜は最も安定になると言われているが、 ステロイ

20

ドの種類によりそのモル比は異なることが分かっ

た。
10

20

30

40

50

Incubation time (hours)

60

70

Fig.17 Time dependence of glucose leakage(DPPC: steroid: DCP = 5: 5: 1) : --.
without steroid ; ● ， stigmasterol ; (),/3 -sitosterol; 0, /3 -cholestanol; 0,cholesterol.

5. 3. 3脂質二分子膜中の微視的流動性および極性：リン脂質とステロイドの疎水基間相互作
用が弱いものほど膜がルーズとなるために流動性が増加し、 膜透過性も増加すること等が分かった。

謝 辞
当財団からの研究助成のお蔭で、参考文献に記載し てあるNo.l、 No.17、 No.19、 No.26、

No.29を研究成果とすることができました。 ここに、 感謝の意表します。

参考文献
1)阿部正彦、 矢島勲 、 荻野圭三、 椿信之 、 中野善

air phasewater phase�-s1tosにrolcholesterol
4,22-stigmastad.icncsb邸lllStcrol
玲nc
�-cholestanol

郎、 色材協会誌、 65, 212 (1992).

2 )荻野圭三 ， 太田基巳 ， 油化学， 23 , 28 (1974).

3) J. H. Schulman, D. P. Riley,J. Colloid Inter­Fig.18 Model of orientation of steroids at air/water interface.

face Sci.,3,833 (1948).

4)国枝博信 ， 篠田耕三 ， 日本化学会誌 ， 11 , 2001のと考えられる。 これらのことから、 混合単分子(1972).

膜中におけるリン脂質とステロイドの疎水基間の5) M. Nakamae, M. Abe, K. Ogino, J. Colloid

なく、 かつ、 側鎖の枝分かれが少ないほど大きくなり、 スチグマスタジエン< (3-シトステロール

6) B. H. Robinson, Chem. Britain, 26, 342

相互作用（凝集力）は、 ステロイドの二重結合がInterface Sci., 135, 449 (1990).
(1990).

くコレステロール< (3-コレステロールの順にな

7)菊池

ることが分かった。

寛 ， 井上圭三 ， 油化学， 34. 784 C 1985).

8)北野博己 ． 表面. 25. 231 (1987).

脂質二分子膜の膜透過性：グルコー

9 ) A. Wretlind, J. Parenteral Enteral Nutri., 5,より低下し、 膜が安定になることが分かった。 ま10) F. Ishii, I. Sasaki, H. Ogata, J. Pharm.

5. 3. 2ス放出率（膜透過性）は各種ステロイドの添加にた、 膜透過性はステロイドの種類に依存し、 コレ
ステロー ル< (3-コレスタノー ル< (3-シトステ
ロールくスチグマスタジエンの順となり、 側鎖構

230 (1981).

Pharmacol., 42,513 (1990).

11)金子晃久 ， 篠田耕三 ， 油化学, 37 , 740 (1988).

12) D. Capitani, A. L. Segre, R. Sparapani,-41-

Langmuir,7,250 (1991).

13)野島庄七， 砂本順三 ， 井上圭三 ，

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p.9. 南江堂C 1988).

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167 (1988).

15)阿部正彦 ， 西野 宏 ， 荻野圭三 ， 燃料協会誌 ， 67 ,856 C 1988).

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26) M. Abe, A. Kuwahara, K. Yoshihara, K.

Ogino,M. J. Kim, T. Kondo, H. Ohshima, J.
Phys. Chem., 98, 2991 (1994) .

16) W. D. Harkins, F. E. Brown, J. Am. Chem.

27) D. Henry, Proc. Roy. Soc. London, A133, 10617) M. Abe, A. Kuwahara, K. Ogino, H. Ohshi­28) H. Ohshima,T. W. Healy,L. R. White,J. Col­

Soc., 41,499 (1919).

ma, T. Kondo, M. J. Kim, J. Surface Sci.

Technol.,8,155 C 1992).

18)辻井 薫 ， 油化学 ， 29 . 662 C 1980).

(1931)

loid Interface Sci.,90,17 (1982).

29) H. Yamauchi, Y. Takao, M. Abe, K. Ogmo,
Langmuir,9,300 (1993).

19)阿部正彦、 矢島 勲、荻野圭三、 石油学会誌 ， 36,30) M. Nishijima, M. Nojima, Farumashia, 22,20) K. Ogino, M. Abe, "Mixed Surfactant Sys­

31 ) F. Szoka, D. Papahadjopoulos, Proc. Natl.

326 C 1993).

tems",Marcel Dekker,New York (1992).

21)鈴木洋 ，＂“界面と界面活性物質 ， 産業図書 ， p.

119 (1990).

22)関根正巳 他、料ー＂“ハンドプック ー 化粧品・製剤原改訂版 ， 日光ケミカルズ ， p.299 C 1977).

23) P. A. Winsor,Chem. Rev.,68,1 (1968).

-42-1329 (1988).

Acad. Sci. USA,75,4194 (1978).

32)井上圭三 ， ファルマシア, 22,1329 (1988).

33)今泉勝巳 ． 油化学 ， 40, 869 (1991).

34 ) M. Nakagaki, T. Handa, Bull. Chem. Soc.
Jpn.,49,880 (1976).

II. 生体作用， 安全性に関する分野

太田母斑に対するQスイッチ・ルビ ー レ ー ザ ー の治療効果
帝京大学医学部

渡辺晋Previous treatments for nevus of Ota have either been ineffective or have caused
scarring. In this study, selective photothermolysis was employed for the treatment of
this serious cosmetic problem.
A Q-switched ruby laser was used to deliver 6 J/cm2 pulses at a wavelength of 694
nm and with a pulse duration of 30 ns. A total of 114 patients with nevus of Ota weretreated, with treatment intervals ranging from 3 to 4 months. The clinical efficacy oflaser treatment was evaluated by comparative photographic analysis. Five treatment re­sponse levels were defined based on the percentage of pigment lightening compared withthe original color : "excellent" for 70 % or more lightening, "good" for 40 % to 69 % ,"fair" for 10 % to 39 % , " unchanged" for 9 % or less, and "worsened" for darkening.
The efficacy rate C i.e., the percentage of patients in whom the treatment responses
were good or excellent) was 13 % C 3/23) in patients treated once, 72 % C 18/25) inthose treated twice, 97 % C 30/31) in those treated three times, and 100 % C 35/35) inthose treated four or more times. No hypertrophic or atrophic scarring was observed inany of the patients. However, transient postinflammatory hyperpigmentation of 2
months'duration was noted in a few patients
Selective photothermolysis using the Q-switched ruby laser appears to be a safe andeffecitve method for lightening or eliminating nevus of Ota.

1 . 緒

言

しも有効とはいえず、 強く圧抵し過ぎると癒痕がみられるなどといった欠点があった。

太田母斑は顔面、 特に三叉神経の

一

枝あるいは

一方、 明確な理論と実験の裏付けがないまま二枝領域に生ずる青色から灰褐色の色素異常症で、

レ ー ザ ー が太田母斑の治療に使用されたことがあ東洋人に多くみられ、 我が国では0.6%の頻度 でるが、 治療効果が乏しいうえに癒痕等の副作用が！）。 太田母斑は生命的に多く認められ、 レ ー ザ ー 療法 はむしろ有害である問題となる疾患ではないが、 本症が顔面に生ずるとの考えが主流を占めるようになった。 しかし近ことから美容的には深刻な問題である。 治療とし

年、 selective photothermolysis (SP)というては植皮、皮膚削剥術、 ドライアイス圧抵術など

レ ー ザ ー 療法の治療指針が提唱され 2) 、 この条が行なわれていたが、 外科療法の場合手術創を残件を満たしたレ ー ザ ー ならば、 搬痕を残すことなみられるとされている

すこと、 ドライアイス圧抵術では、 病変の部位にく、 色素性皮膚病変のi台療が可能であることが示

よってはある程度効果が認められるものの、必ずされた。 具体的には、 i )ターゲットに特異的に

Efficacy of the Q-Switched Ruby Laser in theTreatment of Nevus of Ota.
Shinichi Watanabe

吸収される光を、 ii)タ ー ゲットを破壊するのに充分な照射エネルギ ー で照射し、 かつiii)レ ー
ザ ー 照射を目的とするタ ー ゲットの熱の拡散時間以内に終了しな け れ ばならない

School of Medicine
Teikyo University

レ

ー

ザ

ー

療法 はこのレ

ー

ザ

ー

3)

。 かつてのの照射時間に注意が払われず、 連続照射のレ ー ザ ー を使用していたため、 ケロイド等の副作用が認められた わけである-44-

太田母斑に対するQスイッチ・ルビーレーザーの治療効果

（図1)。

2.4

そこで今回我々は、 SPの条件を満たすパルス

それぞれレ ー ザ ー 照射前に臨床写真をとり、 そ効果判定

照射のレ ー ザ ー (pulsed laser)を使用し、太の臨床写真を元に、 治療前後の改善度を判定した。

田母斑患者の治療を行い、その有用性を検討した。
従来のレーザー燎法Selective Photothermolysis
（連ザ続照
射）
ー光線
レー
レ--ザ ー 光線

効果判定はレ ー ザ ー 照射後3から4か月後の次回
レ ー ザ ー 照射時の直前に行った。
2.5

判定基準

効果判定は、著効、有効、 やや有効、 不変、悪化の5段階で判定したが、 効果判定の基準は治療前の病変部皮腐色を100%として、不変は10%未
満の改善、 やや有効は40%未満、 有効は70%未
満、 著効はそれ以上の改善のみられたもので、悪化とは色素増強のみられたものとした。
図1

従来のレ ー ザー療法（連続照射）とselective
photothermolysis (パルス照射）の違い

2.6

病理検査

約半数の症例で、レ ー ザ ー 照射前の病変部皮膚2. 実あるいはレ ー ザ ー 照射部位の皮膚生検を行い、 病

験

理学的検索を行った。
使用レ

ー

ザ

使用したレ

ー

ザ ー は東芝製の臨床研究用Q­

2. 1

ー

3. 結

果

switched ruby laserで、 この機械は波長6 94.3
nm、照射時間30nsのレ ー ザ ー 光を照射する。

3. 1

治療経過

照射直後に照射野に 一 致し、 皮膚が白くなる
2.2

immediate whiteningが認められたが、 この現対象患者

対象患者は当科を受診した太田母斑患者で、そ象は15分ほどで消失した。さらに照射後1�2 分の内訳は、 男25名、 女89名の計114名で、年齢して照射野からその辺縁にかけて蒜麻疹様の紅斑

は8歳から63歳までであった。人種はすべて黄色が生じたが、 翌日には腫れはかなり軽減した。し人種であり、国籍は1名が韓国人で、他はすべて

かし眼瞼周囲などでは腫れが著しく、数日間腫脹

日本人であった。

が続くことがあった。また血管の脆い老人の皮膚では、特に眼のまわりに皮下出血をきたしたが、

2.3

レ

ー

ザ

ー

皮下出血は、 約十日ほどで消褪した。症例により、

照射

レ ー ザー照射は無麻酔あるいはリドカインク
リ ー ムによる表面麻酔後に行い、照射直後、部分的に点状の梨爛がみられたり、あ眼の周囲を照射

るいは照射翌日に小水疱がみられた症例もあった

する場合はプラスチック製の光を通さないコンタ

が、 大部分の症例は明瞭な梨襴や小水疱のみられ

クトレンズを装着し、 眼をレ ー ザー 光から保護しないまま経過し、数日するとレ ー ザ ー 照射野に褐た。レ ー ザ ー の照射間隔は3から4か月で、 使用

色の痴皮• 落屑が付着するようになった。 その痴

したレ

ー

ザ

ー のエネルギ ー

密度は6 J/c面であった。

皮・落屑は1週間から10日ほどすると剥がれ落ちた が 、 痴皮 • 落屑が 剥 が れると 、 epidermal
pigmentationの強い症例では褐色の色調は軽減-45-

し、むしろ青みが目立つようになった。しかし大部分の症例では、 落屑が剥がれても色調の変化はほとんど認められなかった。また一部の症例で照射部位に一致して炎症後の色素沈着が認められたが、 その色素沈着も1-2か月で消褪した。色調
はレ ー ザ ー 照射後徐々に薄くなり、 通常2回目のレ ー ザ ー照射後には患者自身が色調の薄くなったのに気付くようになることが多かった。
3.2

治療成績

1回レ ー ザ ー 照射をうけた患者23名中、 7名が不変、 13名がやや有効、 3名が有効であったが、2回レ ー ザ ー 照射をうけた患者25名中、 7名がやや有効、 16名が有効、 2名が著効、 3回レ ー ザ ー
照射をうけた患者31名中、 1名がやや有効、 26
名が有効、 4名が著効、 4回レ ー ザ ー照射をうけた患者17名中、 2名が有効、 15名が著効、 そして 5回以上レ ー ザ ー照射をうけた患者18名はすべ

ぷ、一

図3

治療前（上図）とレ ー ザ ー 照射5回後（下図）図4

治療前（上図）とレ ー ザ ー 照射5回後（下図）の太田母斑患者臨床像て著効を示した（図2-4)。有効以上を有効率との太田母斑患者臨床像して計算すると、 1回照射で 13%、 2回照射で 72

図2

治療前（上図）とレ ー ザ ー 照射4回後（下図）の太田母斑患者臨床像-46-

太田母斑に対するQスイッチ・ルビーレーザーの治療効果％、 3回照射で97%、4回照射で100%となり、7)。 しかし、真皮内メラノゾー ム以外の細胞や徐々にではあるが4回以上照射すると100%の有

その周りの膠原線維には全く変性像は認められな効率を示した（図5)。 なお、数例の患者で治療かった（図8)。

後 一過性の色素沈着がみられたが、癒痕などの副作用は一 例も見られなかった。 ただし、皮膚削剥術、 ドライアイス圧抵術を行っている症例では、搬痕の程度に応じ、改善度が劣っていた。
3.3
レ

ー

病理組織検査ザ ー 照射前の病変部皮膚では真皮の浅層か

ら深層にかけて、細長い胞体を有し、褐色の色素を有する真皮内メラノサイトが散在して認められた（図6)。 レ ー ザ ー 照射直後には、表皮真皮境
界部の所々に小水疱が認められ、また表皮基底細図6

レーザー照射前の真皮内メラノサイト。 成熟したメラノゾーム（矢印）が多数認められるn

図7

レーザー照射直後の真皮内メラノサイト（＊）。
破壊されたメラノゾーム（矢印）が多数認められる。

図8

レーザー照射直後の真皮内メラノサイト（＊）。
メラノゾ ームを含有していない線維芽細胞（矢印）などには変性像は全く認められない。

胞を中心に細胞内の空胞が認められた。 真皮内メ
ラノサイトは破裂し、細胞膜は不明瞭となり、その胞体内あるいはその辺縁に中心が白く抜けたメ
ラノゾームやポップコ ー ン状に破裂したメラノ
ゾ ー ムが散在している像が多数認められた（図（免唆呉ミ翠‘‘'';>!f1如"(f'図5

治療前（上図）とレーザー照射5回後（下図）の太田母斑患者臨床像。 矢印は当院来院前に受けた縫縮手術のあと。

-47-

ため瞬間的に燃え尽きてしまう。 そのため、色調

4. 考

察

の改善が照射後すぐにみられるものと考えられた。
ところで太田母斑のレ ー ザ ー 治療の際に、観察すでに、太田母斑患者に対するQ-switched

期間と照射回数のうちどちらが色調の改善によりruby laserの有効性を検討した報告4. 5 lかある

重要な役割を担っているのかはいまのところ不明

が、これらの報告は対象患者が少なく、照射回数である。 しかし、たった2回しかレ ー ザ ー 照射をおよび観察期間もまちまちであったため、太田母

受けていない患者でも、2回目の照射後半年から斑患者に対するQ-switched ruby laserの有効

一年後の間にもさらに色調の改善がみられたので、率がはっきりしなかった。 しかし、今回我々は多照射回数よりは時間の経過が必要で、時間が経た

数の太田母斑患者を比較的長期間にわたって観察

ないと色の改善は認められないものと考えられた。

し、治療効果と観察期間あるいは照射回数との間

さらに、太田母斑ではレ ー ザ ー 照射後に破壊されに密接な関係があることが判明した。 つまり太田たメラノゾ ー ムのすべてがリンパ節に移動すると

母斑はレ

ー

ー

ザ 照射後すぐに色調が薄くなるわけは限らないので、一部はそこに残存することとなではなく、徐々に色調が薄くなり、その改善にはり、追加照射が必要となる。 しかし、照射間隔を時間がかかること、 そして有る程度の照射回数がどの程度とったら最も少ない照射回数で最大の治必要なこと、そしてこれらの条件をみたせば100

療効果が上がるかはいまのところ不明である。

％改善がみられることが明らかにされた。 さらにレーー

ザ 照射直後の病変部皮膚の電顕観察を行ったところ、真皮内メラノゾー

一方、 扁平母斑や肝斑などのbasalpigmen­
tationではQ-switched ruby laserを照射する

ムの破壊がみられると、照射直後に照射部位の表皮だけがきれいに剥ものの、その辺縁の膠原線維には全く変化がみら離され、靡欄面となるが、太田母斑では 一部の症れなかった。 このことから、Q-switched ruby

例で点状の歴爛が認められるのみで、 immedi­

laserが搬痕を残すことなく、色素病変のみを選

ate whiteningが照射直後の主な皮膚反応である。

択的に破壊することが確かめられた。

従って、Q-switched ruby laserを照射すると一方、入れ墨患者では、同じQ-switched ru ­太 田 母 斑 な ど の dermal melanosis と basal

by laserを照射しても、照射後 一 週間ほどで痴

pigmentationとの鑑別が容易である。 また血管

皮• 落屑がとれると、その時点で色調の著明な改の脆弱な老人皮膚では、特に眼瞼周囲で、レ ー

6)。 このように太田母斑と入れザ ー 照射直後に皮下出血が認められたが、basal

墨では、病変か真皮にあるという点で共通していpigmentationが原因である色素病変ではこの皮るのにもかかわらず、 治療態度が異なるのは、下出血は認められなかった。 Q-switched ruby

善が認められるター

ゲットが太田母斑ではメラニンで、多くの入

laserのprimary targetはメラノゾ ー ムである

れ墨の場合は炭素であるためと思われる。 つまり、ので、メラノゾ ー ム含有細胞から離れた血管壁にメラニンは熱に強いため真皮内メラノサイトが破は、直接的な影響はないと考えられている。 しか壊されても、破壊されたメラノゾ

し、 highpeak powerを有するパルスレ ー ザ ー

ー

ムはそこに残存し、炎症反応によって引き起こされた組織球に

では生体にphotoacou stic effectを引き起こすこ貪食され、リンパ節などに運ばれて初めて色調のとが知られていて ” 、この場合primary target

改善がみられるわけである。 これに対し多くの入から比較的離れた部位にも衝撃波が伝わる。 従っ

れ墨は、炭素が組織球に貪食されて生じたものでて、Q-switched ruby laser照射直後にみられあるので、レ ー ザ ー 照射により、炭素を貪食した

た皮下出血は、このレ ー ザ ー 照射による衝撃波に細胞が破壊されるのと同時に炭素自身も熱に弱いより生じたものと考えられた。

-48-

太田母斑に対するQスイッチ・ルビ ー レ ー ザ ー の治療効果

いずれにしろ、 今迄有効な治療法のなかった太tive studies of femtosecond to microsecond

田母斑に対し、 有用な治療法が開発されたことはlaser pulses on selective pigmented cell injuryーm skin. Photochem Photobiol 1991 ; 53 : 757-

画期的なことであり、 今後さらにより有効なレザー療法を発展させるために、 最適のエネルギ

62.

ー

密度や、 レ ー ザ ー の照射間隔などを明らかにし、

4) Goldberg DJ, Nychay SG. Q-switched ruby

さらに将来に生ずるかもしれない副作用の発現を

laser treatment of nevus of Ota. J Dermatol

注意深く観察する必要があると思われる。

Surg Oncol 1992 ; 18 : 817-21.
5) Geronemus RG. Q-switched ruby laser ther­

文 献

apy of nevus of Ota. Arch Dermatol 1992; 128 :1) Hidano A, Kajima H, Ikeda S, Mizutani,

1618-22.

Miyasato H, Nimura M. Natural history of6) Taylor CR, Gange RW, Dover JS, Flotte TJ,

nevu�of Ota. Arch Dermatol 1967 ; 95: 187-95.

Gonzalez E, Michaud N, Anderson RR.

2) Anderson RR, Parrish JA. Selective pho­

Treatment of Ttattoos by Q-switched rubylaser. Arch Dermatol 1990 ; 126 : 893-9.

tothermolysis : Precise microsurgery by se­lective absorption of pulsed radiation. Science

7) Watanabe S,

1983 ; 220 : 524-7

Flotte TJ, McAuliffe DJ,

Jacques SL. Putative photoacoustic damage

3) Watanabe S, Anderson RR, Brorson S,m skin induced by pulsed ArF excimer laser.

Dalickas G, Fujimoto JG, Flotte TJ. Compara

J Invest Dermatol 1988; 90: 761-6.

-49-細胞内脂質輸送機構の解析

一細胞内ビタミンE特異的輸送タンパク質の構造と意義 一
東京大学薬学部

新 井 洋

由a -Tocopherol, the most biologically acitve form of vitamin E, is a lipid-soluble an­tioxidant, which can inhibit the peroxidation of membrane lipids. a -Tocopherol is
widely distributed throughout the mammalian tissues, where it is found in the mem­branes of intracellular organelles. The mechanism by which a -tocopherol is trans­
ported to intracellular organelles has not yet been clarified. a -Tocopherol transfer pro­tein which facilitate the transfer of this vitamin between membranes was detected in rat
liver cytosol by us and others. We have recently succeeded in purification of a -toco­pherol transfer protein and showed that the protein has Mr. of about 30 kDa and is com­posed of two charge isomers. Furthermore, we have isolated the cDNA encoding a -to­copherol transfer protein and deduced the primary amino acid sequence. The protein is
unique and is not identical to any other proteins ever reported. Both Western and North­ern blot analyses revealed that a -tocopherol transfer protein is expressed exclusively inthe liver in rats. Surprizingly, a -tocopherol transfer protein has been found to exhibit astructural homology with the cellular retinal binding protein present only in retinal ep­
itherial cells and with SEC 14 protein that bind to and transfer specifically phos­
phatidylinositol and phosphatidylcholine. These three proteins may form a new familyof lipid binding/or transfer proteins.

方、生体という不均 ーな場においては、いかにし

1. 緒

言

て必要な時に、必要な場に、そして必要な量を正しく供給するかということは非常に重要な問題で活性酸素やフリ ー ラジカルにより生ずるいわゆ一ある。

る酸素毒性に対して、生体は 連の防御システム

ビタミンEのように水に溶けない物質の輸送に(別名トコフェロ ー

は、生体は複雑な機構でこれに対処している。 まを備えている。 ビタミンE

ル）は脂溶性のラジカル捕捉型抗酸化物として生ず、小腸から吸収されたビタミンEは、小腸で合体内で最も重要なものであり、生体膜における脂成されるリポタンパク質の1つであるキロミクロ

質の連鎖的過酸化反応を抑えることにより、生体ンとともに、リンパ管を経て血管中へと輸送され膜の酸化傷害を防いでいる。 ビタミンEの抗酸化る。 さらに、各臓器への輸送にも血漿リポタンパ

物としての化学的特性や、様々な病態との関係等

ク質が利用されている。 しかし、ビタミンEのリ

一

ポタンパク質への結合は物理化学的性質によるもについてはかなり詳細に解析されてきている。

Mechanism of intracelluler lipid transport- Structure and function of"
a -tocopherol transfer prot(i1n -のであり、特別の結合因子が存在しているわけではない。 従って、その輸送もリポタンパク質代謝にそったいわば受動的な輸送といえる。
一方、細胞内においては、ビタミンEは主に細Hiroyuki Arai

胞内小器官の膜脂質二重層に存在しており、細胞

Faculty of Pharmaceutical
Sciences
The University of Tokyoの外から供給されたビタミンEは、何らかの方法
で各小器官に輸送されているはずである。 しかし-50-

細胞内脂質輸送機構の解析

これまで、ビタミンEの細胞内輸送機構に関してた。そこで、この因子の性状を解析した結果、熱は殆ど知見がなかった。このような背景のもとに、に対して不安定であること、トリプシン消化に

我々は細胞内のビタミンEの輸送機構というもの

よって失活すること、などからタンパク質であるに興味をもち研究を開始した。最近我々は、ビタと予測された。さらに、可溶性画分をゲル濾過力

ミンEの細胞内輸送に関すると考えられるユニ ー

ラ↓にかけて、この因子の分子量を調べたところ、
ベ
知万の位置に活性が溶出された。

クな細胞内タンパク質の単離、一次構造の解明に成功した。その結果、ビタミンEの体内動態を制ビタミンEには、図2に示すようにクロマン環

御する新たな機構が見えてきた。ここでは、こののメチル基の数や位置の違いによって、a、 B 、

新規細胞内ビタミンE特異的輸送タンパク質につ7ヽ8といった同族体が存在する。

いて最近の知見を紹介する。
CH 3

2. a' ー トコフェロ ー ル輸送タンパク質の同定と(2-メチルー 2-(4', 8', 12'—トリメチルトリデシル） ー 6 ー クロマノール）

Toe

我々は、動物の臆器の可溶性画分中にビタミン

a-

/3-

Eの膜間輸送を促進する因子があるのではないか

7ーo-と考え、検索を行 った ll 。方法は、ビタミンEの一 つであるa ー トコフェロ ー ルの放射標識体を
肝朦より調製した比較的重い(10,000 X g遠心で沈殿する）膜画分をアクセプタ

ーに用い、リポー

ムから膜画分へのa トコフェロ

ー

ルの移行

ト コ ー ル

分子式5. 7. 8—トリメチル—

C,.H.,O,430 715, 8 ー ジメチル—

c,.1-1.,0,416. 69

7. 8 ー ジメチル—c,● H.,O,416 698-メチル—

c,,11.,0,402. 66

図2

組み込んだリポソ ー ムをドナ ー に、また、ラット

ソ

CH,

トコール

精製

ー

CH,

- 1 -よ CH,

分子量ビタミン E同族体の構造

そこで見いだされたタンパク質がこれらの同族体の中でどれをよく認識するか調べてみた。リポ
ソ ー ムに放射標識したa ー トコフェロ ー ルととも率を測定することにより輸送活性を測定した。図に、過剰量の無標識類似体を加え、競合実験に

1に示すように、何も試料を加えなくてもある程

よってその特異性を調べた。その結果、表1に示度の速度でa ー トコフェロ ー ルはリポ ‘ノ ー ムからすように、無標識のa ー トコフェロ ー ルを過剰に膜画分への経時的な移行がみられたが、ここに、加えると、a ー トコフェロ ー ル標識体のみかけ上

ラット肝臓から調製した可溶性画分を加えると、の移行は顕著に低下したが、クロマン環のメチル移行速度の有意な増加が観察された。従って、こ基の数が1つ少ないだけの7 ー トコフェロ ー ルをの可溶性画分には、a ー トコフェロ ー ルの膜間輸

加えても競合率は低いということが分かった。ま

送を促進する何らかの因子が存在すると考えられた、フェノ ー ル性水酸基をプロックしたa ー トコ'°I A

r'' ,、

a

●

図1

____.

_

rcytosol

1s

ノンでは殆ど競合阻害は見られなかった。従って、
このタンパク質は、ビタミンE同族体のなかでも

20

t

�

20
,o
Time (min),oフェロ ー ル酢酸や、酸化体のa ー トコフェリルキ

30

a ー トコフェロ ー ルを特異的に認識し輸送するこ'"jloとが判明し、我々はa ー トコフェロ ー ル輸送タン
Protein (mg)1,0

パク質(aTTP)と名付けた。その後長い間、2.0

ラット肝可溶性画分によるa ー トコフェロ ー ルの膜間輸送促進このタンパク質の実体は不明のままであったが、最近、このタンパク質の完全精製に成功した 2) 。
aTTPは以下の各操作で精製した。ラット肝

-51-

表1

ビタミンE輸送タンパク質の茎質特異性

Competitor

kDa['•CJ a - Toe.Transfer(%/30min)
I

II

None

16.1

14.6

a -Tocopherol

0.0

0.0

こ亨

30.0-

CH.,

5.8

5.3

応

14.4-

CH3

a -Tocopherol acetate 13.0

12.9

16.2

13.2

芯こいー
Tocopherol quinone

図3

D-Origin—一-frontビ タ ミ ン E 輸 送 タ ン パ ク 質 のSOS-PAGEパターン
レ ー ンA,D: 分子量マ ー カ ー
レ ー ンB
: 等電点5.1アイソフォ ー ム
レ ー ンC : 等電点5.0アイソフォ ー ム

,,CH3

亨

O
CH3

C

20.1- -

HO ,,
CH,

B

94.067 、 043.0- -CH.,

y -Tocopherol＾―- ― 一一CH,

3. a TTP の性質

OH

1) 基質特異性
朦のホモジェネ ー トから10, 000 X g遠心上清を集精製した aTTP を用いた場合も、 a ー トコフェ

め、 pH 4.5の酸処理を行い、 その上清を硫安分

ロ ー ルに対して強い選択性を示した。 また、 2つ

画後、 ゲル濾過（セファデックスG-75)、 イオのアイソフォ ー ムの間で基質特異性には差はみらン交換(DEAEセファロ ー ス）、 ヒドロキシアパれなかった。 現在のところ、 これら2つのアイソ

タイト、 クロマトフォ ー カシング、 ブル ー セファ

フォ ー ムの機能的違いは明らかになっていない。

ロ ー スの各クロマトグラフィ ー で完全精製品を得一ることができた。 a TTP は、 クロマトフォ ー カ

シャトル機構によって膜間輸送を促進することがシングの段階で、 等電点5. 1および5. 0の2つの判明し、 aTTPl 分子当り 1 分子の a ー トコフェ

ビ ー クに分かれた。 最終精製品はどちらのアイソ

ロ ー ルが結合することが、 精製タンパク質を用いフォた実験から明らかになった。

ームも約1000倍の精製倍率であり、 ラット

方、 aTTP は、 a ー トコフェロ ー ルを結合して、肝臓可溶画分の全 タンパク質のうち2つ合わせて
約 0.2%を占める比較的豊富なタンパク質である

2)局在性

ことが分かった。 精製品のSDS-PAGEパタ ー

まず、 精製タンパク質を用いて各種モノクロ ーンでは、 どちらのアイソフォ ー ムも分子量30,500

ナル抗体を作製した。 それらの中には、 等電点のの単ーバンドを示し（図3)、 また、 ゲル應過カ

異なる 2 つのアイソマ ー を共に認識する抗体、 おラムによる活性の溶出位置から算出される分子量

よび一方のアイソマ ー のみを認識する抗体が得らも約3万であったことから、 このタンパク質はモれた。 このことは2種類のアイソマ ー が免疫化学

ノマ ー で活性を示すことが明らかになった。

的に似ているが、 異なる部分も存在することを示
している。

-52-

細胞内脂質輸送機構の解析

次に、両アイソマ ー を認識する抗体を用いて、
aTTP の臓器 分布を調べたところ、興味深いことに、ラット各臓器の中で本タンパク質は肝臓にしか存在しないことがわかった。 しかし、様々 な
肝癌細胞株を調べてみたところ、いずれにもa
TTP は発現していなかった 3) 。 また、ラット肝朦実質細胞の初代培養系を用いて aTTP の発現を調べると、培養開始後 24時間内に実質細胞から 速やかに消失していった。 以上のように、aTTP は、「肝朦特異的に発現しているタンパク質」であり、しかも「分化特異的に発現するタンパク質」であることが明らかになった。

-70

-�o

-50

-60

-JO

-20

GCGGCGTT紅TCCCATGACCCGCCGGCCAGCTTCCGGGMACCMAGTCTTTGGGTTCCG
10

→ 10

20

JO

<O

GGGGGGCCGGCCバGGCAGAGA TGCGGCCGGGGCCAGTGGTTGGAAMCAGCTC心CG心
M
50

A

E

60

M

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V

V

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O

90

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E

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CAGCCCGACCACTCGCCCCTGGTCCAGCCGGGCCTGGCCGMCTGAGGCGCCGGGCGCAG
O

P

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H

110

S

P

L

120

V

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P

G

130

L

A

E

140

L

R

R

150

R

A

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160

GAGGAGGCCGTCCCAGAGACCCCGCAGCCGCTCACAGACGCTTTCTTGTTGCGATTCCTG
E

E

G

V

1 70

P

E

T

180

P

O

P

L

190

T

O

A

200

r

L

L

210

R

r

L

220

CGTGCCCGGGATTTCGACCTGGACCTGGCCTGGCGCTTMTGMMACTATTACMATGG
R

A

R

O

230

r

O

L

2,0

O

L

A

W

250

R

L

H

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K

N

Y

270

Y

K

W

280

CGAGCAG.'ぶGTCCAGMCTMGTGCAGATCTACACCCTAGMGT紅CCTTGGACTTCTG
�. �
290

E

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E

L

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L

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H

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L

330

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L

L

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MGGCTGGCT ACCATGGAGTTCTGAGGTCC応GGATCCGACTGGCAGTAGAGTTCTCATT
�

A

G

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L

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L

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T

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I

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V

O

E

V

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R

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G

510

V

K

A

520

AT ATTTGACCTGG入AGGCTGGCAGATTTCTCATGCTTTTCMATTACCCCATCTGTAGCC

4. a TTP遺伝子のクロ ー ニング

I
r
o
L
E
G
W
O
I
s
-s:ici一—----,.-r--....
��·--

H

A

r

a

560

I

T

p

S

V

A

580

570

MG入AG紅TGCTGCTGTAGTTACAGATTCCTTTCCATTGMAGTTCGTGGGATCCATTTG
K

K

I

A

590

A

V

V

600

T

O

S

610

r

e

L

K

620

V

R

G

630

I

H

L

640

ATMATGAGCCGGTCATTTTCCATGCTGTCTTTTCCATGA TTMAC CA TTTCTGACTGM

aTTP 特異的抗体を用いて、ラット肝朦 cD­
NAライプラリ ー から遺伝子クロ ー ニングを行っ
た結果
クロ

4)

、全長2194bpの a TTP をコー ンが得られた。

ードする

そこから推定されるタンパ

ク質は、278個のアミノ酸をコ ー ドし（図4)、これから算出される分子量は31,845となり、精製
一

タンパク質のものとよく 致していた。 また、a

I

N

E

P

650

V

t

r

660

H

A

V

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r

S

M

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K
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P

L
T
' r 100""-E 'MGATTM芯GTCGGATTCATCTGCATGGGMCMTTATAMTCMGCCTACTTCAGCAC
K

I

K

G

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R

!

H

720

L

H

G

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N

N

Y

K

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S

S

L

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L

O

H

760

TTCCCAGACATTCTTCCTCTGG心TATGGTGGTMCGAGTCCTCCATGGAGGATATTTGT
r

?

O

I

770

L

P

L

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E

Y

G

G

790

N

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S

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D

I

C

•20

CAGG応TGGACAMTTTTATMTGMGTCTGAAGATTATCTCAGCAGCATTTCTGAGACC
O

E

W

830

T

N

r

●● O

I

M
850

K

S

E

D

860

Y

L

S

S

I

870

S

E

T

880

ATCCいTGAGMGTTGTTTCCTGTGMTGACTTCATCTMMTTCMGGATGGGATTCTA
1

a ·

890

900

910

920

930

940

TCTGGTTACTAAACTCMGACCい.ACCTTCTAMCGMTTGATCCTTATCTGATCTTTM

TTP はこれまでに報告されているどのタンパク

図4

ビタミンE輸送タンパク質質とも異なり、新規のタンパク質であることが分かった。 全体的にそれほど疎水性は高くなく、疎た結果、等電点5.0のアイソマ ー をコ ー ドするこ

水性基質と結合するようなドメインは一次構造かとが明らかになった。 我々は、このクロ ー ン以外

らは推定できなかった。 しかし、 C末端側に疎水に 5つの別のクロ ー ンを単離したが、いずれも同性アミノ酸が比較的多く存在していたことから、

じアイソマ ー をコ ー ドするクロ ー ンしか得られな

C末端側部分に韮質（の特に疎水部）結合部位がかった。 肝臓内において、2つのアイソマ ー はタ

存在している可能性が示唆された。 また3'非翻訳

ンパク質的にはほぼ同量発現している。 従って、領域は約1300bp と 比 較 的長 く 、 そ の な か に

2つのアイソマ ー は同じ遺伝子にコ ー ドされておmRNAの半減期を短くするシグナルといわれてり、翻訳後の修飾の違いによって生じた可能性もいるAUUUA配列が4箇所存在していた。 本タ考えられる。 しかし、現在2つのアイソマ ー の構

ンパク質は肝初代培養系において速やかに消失し造的相違はまだ明確ではなく、また機能的役割分たことを述べたが、このmRNAの特徴を反応し担も含めて今後解決されなければならない問題でているかもしれない。

ある。

得られた遺伝子が2つの等電点の異なるアイソ
マ ー のどちらをコ ー ドするか、モノクロ ー ナル抗体を用いて発現したタンパク質との反応性で調べ

-53-

6.

5. 既知のタンパク質との相同性得られたラットaTTPのアミノ酸配列と既知
ーのタンパク質とのホモロジ を検索した結果、興味深いホモロジーa TTP の生理的役割

当初、我々は、ビタミンEのような脂溶性分子を細胞内で各小器官に運ぶためには、何らかの輸があることが見いだされた。 1

送担体が必要であろうという考えのもとに、a­つは眼の網膜に存在し、11 ー シス ー レチナ ー ルをトコフェロ ー ルの輸送タンパク質の検索を始めた。

特異的に結合するタンパク質(CRALBP, eel­

最初に用いた材料がラットの肝朦可溶性画分でlular retinaldehyde binding protein)であり、あったため、すぐにそのようなタンパク質を同定

もう1つは、酵母のSEC14タンパク質である。

することができ、こうしたタンパク質は恐らくす

CRALBPは1988年にクロ ー ニングされたが、べてのビタミンEを必要とする臓器に存在するとー思われた。 しかしながら、その後aTTPの性状

他のレチノイド結合タンパク質、例えばレチノ

ル結合タンパク質やレチノイン酸結合タンパク質が解析されるに従い、aTTPは肝臓にのみ特異などとは全くホモロジ ー がない。 このタンパク質的に発現していることが明らかになってきた。

は、眼の網膜上皮細胞内に存在し、視細胞にレチ

従って、我々が同定、精製したaTTPは、a ー ト

ナ ー ルを供給する役割を持つと考えられている。

コフェロ ー ルの細胞内輸送を普遍的に担うタンパ

一方、SEC14は、酵母の分泌変異株の1つからク質ではなく、むしろ、肝臓特有の機能を担うタ得られた遺伝子であり、その機能は、分泌過程のンパク質であることが予想されてきた。 そこで、中で特にゴルジ体の関与する過程において必須でこれまでのビタミンの体内動態に関する知見をもあることがわかっている。 また、このタンパク質とに、aTTPの性状から予想されるaTTPの生は、 リン脂質の中でホスファチジルイノシト ー

理的役割を推察してみたい。

ルとホスファチジルコリンの膜間での交換輸送を行既に述べたように、 自然界のビタミンEにはメ

う活性を有することが知られている。 しかし、こチル基の数や位置の違いによって、a、 /3 、7 ヽの活性と分泌過程における機能との関連は現在の

8 ー トコフェロ ー ルなどの同族体が存在する。 一

ところ明確ではない。 これらのタンパク質の間で般に食物の中にはa ー トコフェロ ー ルよりもy-の ホモロジ ー を調べると、aTTPと CRALBP

トコフェロ ー ルのほうが多い。 例えば、ダイズ油の間では約54%、aTTPとSEC14の間で約40では7体はa体の約6倍多く含まれる。 生体はこ％であった。

れらのトコフェロ ー ルを食餌として摂取している

以上のように、aTTPは、 2つの全く異なる脂が、 ヒトやラットなど哺乳動物の生体内にはa­

質、すなわちレチナ ー ルとホスファチジルイノシ

トコフェロ ー ルのほうが多く存在する。 例えば、

ト ー ル（およびコリン）を輸送するタンパク質と健常人血しょう中のa ートコフェロ ー ル濃度は7相同性が高いことが判明し、これらが脂質輸送ター トコフェロ ー ルに比較して5-2 0倍高い。

ンパク質としての新しいフ ァミリ ー を形成していて、哺乳動物にはこれらトコフェロ ー ル同族体をる可能性が考えられる。 これらのタンパク質は、識別してa ー トコフェロ ー ルを選択的に摂取する輸送する甚質は異なっていても機能的類似性があ機構が存在するはずである。 また、実験的にa-るかもしれず、それについては後に議論する。

トコフェロ ー ルの投与量を増加させると、脂肪酸従っの吸収などとは異なり、体内へのa ー トコフェ
ロー ルの摂取率が低下することから摂取機構には飽和過程があることが示唆されていた。 しかし、

-54-

- --

'

細胞内脂質輸送機構の解析

高等動物がいかにしてトコフェロ ー ル同族体を識ル同族体の識別は、小腸における吸収段階にある

別し、一定量を摂取しているかについてはこれまのでなく、肝臓内にあることが提唱されたのであでまったく不明のままであった。

る。我々が精製し たaTTPは、同族体のなかで最近、米国のKaydenおよびカナダのIngold

a ー トコフェロ ー ルを選択的に認識し、しかも生の共同研究によって、吸収されたビタミンEの体体内において肝臓にのみ存在する。これらの結果

5)は、 ビタミンE同族体の肝臓での識別にこの輸送

彼らの実験によると、まずa ー トコフェロ ー ルとタンパク質が関与していることを強く示唆していr ー トコフェロ ー ルは、小腸での吸収段階ではいる。そこでこのような仮説に甚づいて、aTTP

ずれも同程度の効率で吸収され、キロミクロンにの肝細胞内での役割を考察してみた。

内動態が詳細に解析され、一つの説が出された

結合しリンパ管へ放出されることがわかった（図キロミクロンレムナントは、肝朦内に取り込ま5)。キロミクロンは血液中で代謝を受け、 一 部

れた後ライソソ ー ムで分解され、結合していたaのトコフェロ ー ルは各末梢組織に受け渡されるが、

ー

ピタミンE

、;

および7 ー トコフェロ ー ルが遊離される。これ

らのトコフェロ ー ルはライソソ ー ム膜を通過して-Toe

細胞質側に放出されるが、これらのうちa体だけ

王が細胞質に存在する特異的輸送タンパク質に結合する。はじめに述べたように、aー トコフェロ ールはVLDLに選択的に取り込まれて血液中に再リポ蛋白賃放出されると考えられるので、aTTPは結合したa ー トコフェロ ー ルをVLDLが合成されるオ
ルガネラまで輸送する機能を持つと考えられる。
VLDLは小胞体膜で合成されゴルジ装置を経て分泌されてお り、aTTPはこれらのオルガネラのどこかを認識し、a ー トコフェロ ー ルを効率良

図5

くVLDLに運ぶ機能を担っているものと考えら

ビタミンEの体内動態れる。aTTPをクロ ー ニングした結果、このタ
残りはキロミクロン粒子とともに 旦肝臓に取りンパク質が、酵母のSEC14とホモロジ ー がある

込まれる。肝朦に取り込まれたトコフェロ ー ルは、ことを前に述べた。SEC14 は分泌過程に必須の次に肝臓で合成されるリポタンパク質である高密タンパク質であり、電顕による観察の結果、細胞

一度リボタンパク質(VLDL)に結合して再び血質のみならず一部はゴルジ体膜にも結合している

液中に放出される。興味深いことに、肝臓に取りことが示されている。もし、aTTPも同様の性

ー トコフェ

質を有しているならば、ゴルジ体においてa ー ト

ロ ー ルのみがVLDLに結合して再び血液中に放コフェロ ー ルを分泌過程にあるVLDLに受け渡出されるが、7 ールはVLDLにはしているかもしれない。現在我々は、このような

ほとんど結合していなかった。VLDLは血液中仮説に基づき解析を続けている。一方、7 ー トコ

で最終的にはLDLまで代謝されるが、これらのフェロ ー ルは、本輸送タンパク質に結合できず、リポタンパク質を介して各組織にa ー トコフェ

効率良く再循環されないために体内農度が低下す込まれたトコフェロロールのうち、aトコフェロ

ーー ルが供給される。こうして生体内にはa ー ト

コフェロ

ー

るものと考えられる。

ルが選択的に蓄積していくものと考え

血液中を循環するリポタンパク質は、絶えず肝た。言い換えれば、生体内におけるトコフェロ ー

臓に取り込まれて代謝されている。例えばヒト-55-

血漿リポタンパク質の主要成分であるLDLの約者ではaTTPが欠損していると考えるとうまく2/3量は肝臓に取り込まれて代謝されている。 肝説明できる。 現在我々はラットのcDNAをもと

臓は再び新たなリポタンパク質(VLDL)を合にヒト肝朦にも非常によく似たタンパク質がある

成して再び血液中に分泌する。従って、血漿リポことを確認し、そのcDNAを単離している。 近タンパク質に結合したaー トコフェロ ールも、血液中を循環している間に一旦は肝朦内に取り込ま

い将来、これらの遺伝子を材料にビタミンE欠乏症の原因の1つが明らかになるかも知れない。

れなければならない。 ここでaTTPに結合した
トコフェロ ー ルだけがVLDLと共に再循環され参考文献

るならば、肝朦内のaTTPが体内を循環するa­I) Mowri, H., Nakagawa, Y., Inoue, K. and No­

ー ル量を規定している可能性が考えら

jima, S. : Enhancement of the transfer of a -トコフェロ

れる。 はじめにaー トコフェロ ールの摂取量には飽和性があることを述べたが、その分子機構の実

tocopherol between liposomes and mitochon­dria by rat-liver protein (s) .

体がこのaTTPであるのかも知れない。 現在、Eur. J. Biochem., 117, 537-542 (1981)

aTTPの発現にどの様な調節機構があるのか全

2) Sato, Y., Hagiwara, K., Arai, H. and Inoue,

く不明であるが、aTTP発現の調節により生体

K. : Purification and characterization of a -内ビタミンE量を制御する機構も考えられ、今後

tocopherol transfer protein from rat liver.
FEBS Jett., 288, 41-45 (1991)の興味深い問題である。
ところで、古くからビタミンE欠乏症という先

3) Mowri, H., Nojima, S. and Inoue, K,: Lack of

天性疾患が知られていた。 このような患者では、

protein-mediated a -tocopherol transfer be­

筋肉、神経に異常か発生し、反射消失、運動失調、

tween membranes in the cytoplasm of ascites

感覚異常、筋力低下等の症状が現れる。 欠乏症の

hepatomas.

原因の1つは、リポタンパク質の構成成分の 一つ

Lipids, 23, 459-464 (1988)

であるアポBが合成できないために血液中のリポ

4) Sato, Y., Arai, H., Miyata, A., Tokita, S.,

タンパク質が欠損し、ビタミンEを血液中で輸送

Yamamoto, K., Tanabe, T. and Inoue, K.

できないことによる。 またこれとは別に、リポタ

Primary structure of a -tocopherol transfer

ンパク質合成は正常であるにも関わらず、原因不protein from rat liver : Homology with cellu­

明のビタミンE欠乏症があることが知られていた。

Jar retinaldehyde binding protein.

最近この患者におけるトコフェロ ー ルの体内動態

J. Biol. Chem., 268, 17705-17710 (1993)が解析され、その結果、小腸ではビタミンEを正5) Kayden, H. J. and Traber, M.G. : Absorp­

常人と同じように吸収できるが、その後a トコ

tion, lipoprotein transport, and regulation of

ー

フェロ

ー

ルも7

ー トコフェロ ールと同様にすばや

く排泄してしまうために欠乏症に陥るということが明らかにされた。従って、このような先天性患-56-

plasma concentrations of vitamin E in hu­
mans.
J. Lipid Res., 34, 343-358 C 1993)

皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生
陽森

東京薬科大学The involvement of tumor cell-fibroblast interaction in matrix metalloprotemases(MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) production was exam med. Co-cultures of human skin fibroblasts with human MCF-7 cells of epithelial ori­
gin showed increased MMP and TIMP production when compared to cultures of the in­dividual cells. The effect was dependent on the cellular ratio between human skin fibro­
blasts and MCF-7 cells. The stimulatory factors can be detectd in the conditioned medi­um from MCF-7 cell cultures. The addition of membrane fractions prepared from MCF-7 cells to the fibroblast cultures also stimulated MMP and TIMP production. However,kinds of increased MMPs were different from kinds of MMPs induced by soluble factors
released from tumor cells.
These results demonstrated that MCF-7 cells have two forms of stimulatory factor
MMP stimulatory factors that is present at outer surface of MCF-7 cells and MCF-7
cells derived factors that stimulate MMP production of fibroblasts.

MMPsはその基質特異性の違いから 3つのグ

1. 緒

言

ル ー プに大別される。 第1グル ー プは、 間質の主要構成成分であるI型コラ ーゲンを基質とする組皮膚病変や皮膚障害においてサイトカインの関

織性コラゲナ ー ゼ(MMP-1)に代表されるも与が報告されているがサイトカインと組織破壊にのである 第2グル ー プは、 基底膜の構成成分で関連する酵素との関係は必ずしも明確ではない。

あるIV型コラ ーゲンを分解しうるMMPであり、著者は皮膚線維芽細胞と表皮細胞など種々の細これには72kDa.IV型コラゲナ ー ゼ(MMP-2)胞間の相互作用によって皮膚線維芽細胞の産生すおよび92kDa.IV型コラゲナ ー ゼ(MMP-9)のる細胞外マトリックス分解酵素の変動を調べてい2種類が知られている。 これら酵素は変性コラ ー

るうち、 皮膚線維芽細胞とガン細胞の相互作用にゲンであるゼラチンに対しても強い分解活性を示

興味ある現象を見いだした。 そこで、 細胞外マトすことからゼラチナ ー ゼとも呼ばれている。 第3リックスの分解に関与する酵素の中で 特にマトのグル ー プは、 ストロムライシン(MMP-3)

リックスメタロプロテア

ー ゼ(MMPs)に着目に代表されるもので前者の中間的な基質特異性を有し、 プロテオグリカン、 ラミニンやフィプロネ

した。
Production of matrix degrading enzymes byskin fibroblast-tumor cell inter­actionYo MonTokyo College of Pharmacy

クチ ン な ど も 分 解 す る 。 また MMP-3はproMMP-1やproMMP-9の活性化にも関与して い る こ とか知 られ て い る 。 一方、 これ ら
MMPs産生細胞から共に産生され1: 1のモル比でMMPsを不活化する組織性メタロプロテア ー ゼ
インヒビタ ー (TIMP)が知られている。 従って今日では局所におけるMMPsとTIMPの量的-57-

バランスの崩れが細胞外マトリックスの分解を誘起すると考えられて いる。

究所竹沢俊明博士よりそれ ぞれ提供を受けた。
正常ヒト乳腺上皮細胞はクラボウよりMamma­

以上のことから著者は、 正常ヒト乳腺上皮細胞
および乳ガン細胞株MCF-7 、 および BT-20細

ry Pack Kitを購入し使用した。 細胞は5% CO2-95% air気相下、 37℃で75c面flaskを用いて培胞を使用し、 正常ヒト 線維芽細胞 との細胞間相互作用の面からMMPおよびTIMP産生に ついて検討を加え た。

養 し、 細胞が confluentになった時点で随時継代した。 その際、 培養液は線維芽細胞 、 MCF-7細胞およびBT-20細胞 については10% ( v/v)

2. 実験材料および実験方法

FBS/MEM を 、 正 常 ヒ ト 乳 腺 上 皮 細 胞 はMammary Pack Kitに付属していたMEGMを使用した。 なお全ての実験において 線維芽細胞は

2. 1 培養器具および試薬
細胞培養プラスチック器具はCorning製；
Eagle's minimum essential medium
C MEM) はGland Island Biochemical Co.
2+2+
製； Ca and Mg free phosphate-bufferedsaline (PBS (-))は日水製薬製； fetal bovime

継代数12-22のものを、 正常ヒト乳腺上皮細胞は継代数9-10の ものを使用した。
混合培養は線維芽細胞がconfluentになった時
点で乳腺上皮細胞 、 MCF-7細胞あるいはBT20細胞を混合 し、 10% ( v/v) FBS/MEMで 24
h培養 した後、 0.2% ( w/v) LAH/MEMで洗

serum (FBS)はM. A. Bio-products製；
alkaline phosphatase-conjugated goat anti
- (rabbit IgG) IgG, alkaline phosphatase­conjugated donkey anti- (sheep Ig·G) IgG, 5

浄、 同培養液に交換した。 また MCF-7細胞培
養上清、 MCF-7細胞膜画分に よる線維芽細胞の処理は、 線維芽細胞がconfluentになった時点で-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, Ni­
tro Blue TetrazoliumはSigma製； Sephadex
G-75は Pharmacia 製； gelatinはDIFCO
Laboratories Co. 製； human recombinant

中で実施した。 それぞれの培養上清は培養処理
48h後に回収し、 ー20℃で凍結保存し試料とした。

Transforming Growth Factor (TGF) aはGIBCO BRL 製 ； polyclonal goat anti
- (human TGF a) IgG は R&D Systems
Inc. 製； human platelet TGF /3 1はキング醸

造製をそれぞれ購入し使用した。 なおSheep an­ti- ( human proMMP-1, MMP-3 お よび
TIMP)および Rabbit anti- (human proMMP-2)抗体はKansas大学医学部Hideaki Na­
gase教授より提供を受けた。
その他の 試薬は全 て特級試薬を使用した。
2.2 細胞培養および処理方法
ヒト乳ガン細胞株MCF-7細胞およびBT-20
細胞は防衛医科大学校小佐野博史博士より 、 正常ヒト皮膚線維芽細胞はグレ ー ス株式会社中央研-58-

0.2% (w/v) LAH/MEMで洗浄後、 同培養液

2. 3 MCF-7 細胞培養上清の調製
MCF-7細胞を75c面flaskで培養し、 conflu­
entになった時点で 0.2% (w/v) LAH/MEM
で洗浄 し、 同培養液に交換した。 48h後に培養上清を回収 、 4℃、 l,OOOrpmで 5min遠心分離し、さらに上清を45 /.Lillのシリンジフィルタ ーに て細胞を完全に除去した。 回収した上清はフィルト
ロン OM-5 membrane (岩城硝子社製）を用いて限外ろ過をし、 100倍に濃縮したものをー20℃
で凍結保存し試料とした。
2.4 MCF-7細胞膜画分の調製
Biswasらの方法 ll に従って調製 し、 試料とした。

皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酪素の産生

2. 5 MM P-3およびゼラチナーゼの活性測定
培養液中の潜在型 MMP-3およびゼラチナ ー
ゼの活性化は培養液に 2mM APMA(50mM製）を用いて200mAでlh転写させた。転写後た
だちにニトロセルロ ー ス膜をドライミル ク 溶液(10%(w/v) fatty-free dry milk/lOmM

Tris-HCl/0.9 % (w/v ) NaCl/0.02 % ( w/v) NaN 3(pH 7.5)) に浸しlOminのblock­in gを行い、 ついで蒸留水およびTBS buffer(50mM Tris-HCl/200mM NaCl (pH 7.5))'l'ris-HCl/150mM NaCl/lOmM CaCh ( pH

7 .5)に溶解）を等量添加し、 ゼラチナ ー ゼ 活性は5min 、またMMP-3 活性は30min 37℃でそれぞれインキュベーションして実施した。 MMP

にて 数回洗浄した。洗浄 後1% ( w/v) BSA/

-3の活性測定は［旧］カ ルボキシメチル 化ト ランスフェリンを基質 2) とし、 10 µ1の基質溶液(3mgトランスフェリン /ml 、 240,000dpm/mgト
ランスフェリン）に活性化した酵素液 10 µ1を加え37℃で一 定時間反応させた後、氷冷した 3.3%(w/v)トリクロル酢酸(TCA) を200µ1 加え、8,000 X gで5min遠心分離し得られた上清100µ1の放射活性を液体シンチレー ションカウンタ ーにて測定した。 ゼラチナ ー ゼ 活性 測定はCowston
and Barrettの方法 3) で調製した[ 14c Jアセチ
ル 化 Type Iコラーゲンを60℃ 、 20minインキュ
ベーションしゼラチン化 させたものを基質とした。
200µ1の基質溶液(4mgゼラチン /ml 、 3,000
dpm/mgゼラチン）に活性化した酵素液100µ1を加え 37℃ で一 定 時 間 反 応 させ た後、60 % Cw/v) TCAを100µ1 加え、8,000 X gで5min遠心分離し得られた上清100µ1の放射活性を液体シン
チレ ー ションカウンタ ーにて測定した。 なお酵素

活性 1 unitは上記条件下でlminに1 µgのゼラチンを分解 する酵素量とした。
2. 6

Western blotting法

細胞培養上清に終濃度3.3%になるよう TCAを加え、 8,000 X gで5min遠心分離し、 得られた沈殿にLaemmliの方法 4) に従って 調整した
sample solutionを加え、 7.5%から13% Cw/v)アクリルアミド ゲル を用い て SDSー ポリアク

リルアミ ド ゲル電気泳動(SDS-PAGE) を行った後、 ゲルをtransfer buffer(20mM Tris/
150mM glycine/20% C v/v) methanol/0.1%(w/v) SDS)に浸したニトロセルロ ース膜 に密着させ、セミドライ型転写装置（マリソル社

PBS (-)で希釈した1次抗体溶液に4℃で12h以上浸した。 1次抗体結合 後、 blockingおよび洗浄を同様に行い1% (w/v) BSA/PBS(-)
で希釈した
アル カリフォスファタ ー ゼを結合した
2 次抗体溶液に室温でlh浸した。 その後TBS
bufferで数回洗浄し、 基質溶液(0.4mM Nitro
Blue
Tetrazolium/0.4mM 5-bromo-4chloro-3-indolyl phosphateをlOOmM Tris­

HCl/lOOmM NaCl/5mM MgCb (pH 8.0)に溶解）に浸し適当な時間発色させた。 発色後、 蒸
留水およびTBS bufferですばやく洗浄しstop
solution ( 20mM Tris-HCl/5mM EDTA

(pH8.0))に適当な時間浸した後、 ろ紙にて脱水し乾燥した。
2. 7 Gelatin zymography
ゼラチン(1.2mg/叫）を含む7.5% (w/v)ア

クリルアミドゲル を用いて非還元条件下で、Laemmliの方法 4) に従い SDS-PAGEを行った後、 ゲル 中からSDSを除去するため2.5%(vIv) Triton X-100を含むbuffer(50mM Tris
-HCl/5mM CaClり1µ, M ZnClz/0.02% (w/v)
NaN3 (pH 7.5)) でlh洗浄 後、 37℃で適当な時間Triton X-100を含まない 上記buffer中でインキュベーションした。 その後ゲル を染色液
(0.1 %(w/v) Coomassie Brilliant Blue/50% ( v/v ) methanol/20 % C v/v ) aceticacid) 中、 静かに浸とうしながらlOmin 染色し、その 後 30 %( v/v ) methanol/1 % ( v/v )formic acidにて脱色処理を行った。

-59-

』一

正常乳腺上皮細胞あるいは乳ガン細胞株(MCF-7およびBT-20細胞）と正常線
維芽細胞との混合培養におけるMMPsお仁proMMP-1

UOJ
I
gnpoJd
a>l
eau

3. 1

:

r・

]
A

3. 実験結果

よびTIMP産生の検討
正常乳腺上皮細胞あるいは2種の乳ガン細胞株(MCF-7およびBT-20細胞）と 正常 線維芽細
生をウエス タンプ ロ ット法 により検討した。
Fig.lに示したように 線維芽細胞単独のみでも

凡二
]
c
［

proMMP-1 [A]、 proMMP-3 [ B] および
TIMP [CJ産生を認めた
Clane1)が、 MCF-20細胞Clane 4)との混合培養ではTIMP産
生はMCF汀細胞との混合培養時とほぼ同様であるが（それぞれ1.56倍および1.6倍） proMMP-1およびproMMP-3産生には顕著な変化は認められなかった。 また正常乳腺上皮細胞、 MCF-7細胞およびBT-20細胞それぞれ単独 (lanes
5-7)てはこれらの産生はいずれも認められなかった。
次に、 proMMP-2産生についてもウエスタン
プロット法およびゼラチンザイモグラフィ ー により検討した(Fig.2)。 正常乳腺上皮細胞と線維芽細胞との混合培養Clane 2)では、 線維芽細
胞単独Clane 1)と比べ変化を認めなかった。
しかしMCF-7細胞 (lane3)、 あるいはBT-20
細胞 (lane 4)と線維芽細胞との混合培養では

Fig.1← TIMP

7
6

1

がら、 正常乳腺上皮細胞Clane 2)あるいはBTuon:
rnpoJda11ne1a�-7細胞と混合培養することにより、 それぞれ10倍、 4.2倍、 1.8倍増加したClane3)。 しかしなこ

胞との混合培養におけるMMPおよびTIMP産仁proMMP・3[B]

Production of MMPs and TIMP by hu­
man skin fibroblasts cocultured withnormal or neoplastic breast cells. Con­
fluent fibroblasts at the 18th passage
were coculturedwith normal or neoplas­
tic breast cells in 10 % (w/v) FBS/
MEM for 24h, and then the medium waschanged to 0.2 % (w/v) LAH/MEM
and incubated further for 48h. The har­vested medium was performed to west­
em blot with antibodies against
proMMP-1 〔幻 、proMMP-3 〔B〕'吋
Tl叩〔CJ as described in the methods.
Lane 1, human skin fibroblast(HSF) ; lane 2、coculture of HSF andnormal human mammary epithelial
cells ( HMEC) ; lane 3, coculture of
HSF and MCF-7 cel Is ; lane 4, cocultureof HSF and BT-20cells; lane 5, HMEC;
lane 6、 MCF-7 cells and lane 7, BT-20
cel Is.

proMMP-2産生はそれぞれ 2.94倍および3.15倍の増加が認められた。 また正常乳腺上皮細胞、

3. 2 MCF-7細胞と正常線維芽細胞との混合培

MCF-7 細 胞 、 BT-20 細 胞 そ れ ぞ れ 単 独養によるMMPsおよびTIMP産生におよ(lanes 5-7)では、 proMMP-2産生はいずれ

ぼすMCF-7細胞数の影響も認められなかった(Fig.1-2)。

MCF-7細胞と線維芽細胞とのi昆合培養におけるMMPsおよびTIMP産生におよばすMCF-7細胞の細胞数の影響を検討した。 Fig.3に示され-60-

皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生

1
l
←l ,

6

7

5

1

uononpoJ
d
a>ne1
a1:1

ニ

たように、線維芽細胞のみClane 1)と比較し、MCF-7細胞の細胞数を段階的に増やしながら混合培養する(lanes 2-6)と、 MCF-7細胞の細胞数の増加に従ってproMMP-1 [ A J、
proMMP-3 [ B]およびTIMP [ CJ産生の増加が認められ、線維芽細胞とMCF-7細胞の細胞数比が2: 1Clane 6)のときは増加率がそれ
ぞれ 3.7倍、 2.4倍および1.3倍であった。 しかしながらMCF-7細胞のみClane 7)では、 これ

Fig.2

Production of proMMP-2 by HSF cocul­
tured with normal or neoplastic breast
cells . The conditioned medium in Fig.1
was performed to gelatin zymography orwestern blot with antibody against
proMMP-2 as described in the methods.
Lane 1、 HSF; lane 2, coculture of HSF
and HMEC ; lane 3, coculture of HSF
and MCF-7 cells ; lane 4, coculture of
HSF and BT-20 cells; lane 5, HMEC;
lane 6, MCF-7 cells and lane 7 , BT-20
cells.

らの産生はいずれも認められなかった(Fig.3-4)。
次に、 proMMP-2産生についても同様検討した。 Fig.4 に示したように、 混合培養におけるMCF-7細胞数 が増えるに従ってproMMP-2産生は増加し(lanes 2-6)
、線維芽細胞とMCF7細胞の細胞数比が2: 1Clane 6)のとき4.3倍まで増加した。 しかし MCF- 7細胞のみ(lane7)では、 proMMP-2 産生は全く認められな[BJ.,,g 3"'"o 1>ua:C.

Production of MMPs and TIMP in cocul—
ture of HSF and MCF-7 cells. Confluent
HSFs at the 17th passage were cocul­
tured with various cell number of MCF7 cells in 1 0% (w/v) FBS/MEM for 24h,and then the medium was changed to 0.2% (w/v) LAH/MEM and incubated for
48h. The harvested medium was per­formed to western blot with antibodies
against proMMP-1 (A〕 ， 訂oMMP-3(B〕 , or Tl叩〔C〕 as described in
the methods. Lane 1, HSF ; lanes 2-6,
HSF cocultured with MCF-7 cells (ra­tios of ce!I number of HSF: MCF-7; 32:. , respective1, 1 6 : 1, 8 : 1 4 : 1 and 2・1ly) and lane 7, MCF-7 cells.

Fig.4

7

7

5

6

6

5

4

4

3

Fig.3

2 3

1

C 5. 1
.. 1
uo11
unpo,
d
3>eau

．
．

<1)�

5 3 1
d
rnpoJ
uon:
aAl
eau

＝コ2,-

□

3 2 1
uononpoJ
d
a>eau

かった。

Production of proMMP-2 in coculture of
HSF and MCF-7 cells. The conditioned
medium in Fig. 3 was performed togelatin zymography or western blot with
antibody against pr凶MP-2 as de­scribed in the methods. Lane 1 、 HSF;
lanes 2-6, HSF cocultured with MCF-7
cells (ratios of cell number of HSF :MCF-7; 32: 1 , 16: 1, 8: 1、4: 1 and 2 : 1,
respectively) and lane 7, MCF-7 cells.

3.3 線維芽細胞のMMPsおよびTIMP産生におよぼすMCF-7細胞の培養上清の影響
Fig.5に示したようにMCF-7細胞培養上清中-61-

冒璽暑旦璽こ [BJ[A]

proMMP-3

TIMP

Clane 3)にはproMMP-1 [A]、 proMMP-

Fig.6

TIMP

2

UO!I
Oll
PO」d
8>-ea8

Effect of MCF-7 conditioned medium(MCF-7-CM) on the production of
MMPs and TIMP by HSF. Confluent
HSFs at the 18th passage were treatedwith MCF-7-CM in 0.2% (w/v) LAH/
MEM for 48h, and then the harvested
medium was performed to gelatin zy­
mography or western blot with. antibod­
ies against proM叩-1 〔A〕 ， 釘oMMP-2 (B〕，proMMP崎〔C〕 , or TIMP〔D) as described in the methods. Lane
1, untreated HSF ; lane 2,HSF treatedwith MCF-7-CM and lane 3, MCF-7CM.

2 1

[CJ

2

POJd
Oll
UO!I
a>l
-eau

2 1

:ig.5

雪雪誓誓履←

proMMP・2

2 1

21．
． 3uo,
p npoJd
A
． 1
．
g
•
1
•
=
1:l
proMMP-3[CJ｀口 f[J口!= [BJ｀

proMMP-1

proMMP・1

Effect of plasma membrane of MCF-7
cells on the production of MMPs and
TIMP by HSF. A high-speed membrane(100,000 x g) fraction was preparedfrom sonicated MCF-7 cells as de—scribed in the methods. Confluent HSFs
at the 19th passage were treated withmembrane fraction of MCF-7 cells in 0.2% (w/v) LAH/MEM for 48h, and thenthe harvested medium was performed
to gelatin zymography or western blot
with antibodies against proMMP-1〔A) , proM血-2 〔B〕 ， 町oMMP-3〔 C 〕 、 or TIMP 〔 D〕、Lane 1, un廿ea←
ed HSF; lane 2, HSF treated with mem­brane fraction of MCF-7 cells and lane
3, membrane fraction of MCF-7 cells.

2 [BJ、 proMMP-3 [ C]およびTIMP [DJのいずれも検出されなかったが、 この培養上清をも検出されなかったが、 このMCF-7細胞の細胞

線維芽細胞に添加し培養する(lane 2 )と、 混

膜 画 分 を 線 維芽細 胞 に添 加 することに より合培養したときと同様proMMP-1、 proMMP

proMMP-1、proMMP-3およびTIMP産生が-2 、 proMMP-3およびTIMP産生の顕著な増促進したClane 2)。 しかしながらproMMP-2産加が認められた。

生には変化が認められなかった([B]lane2)。

3.4 線維芽細胞のMMPsおよびTIMP産生に

3. 5 線維芽細胞のゼラチナ ー ゼ活性におよぼすMCF-7細胞培養上清の影響およぼすMCF-7細胞膜の影響
MCF-7細胞の細胞膜画分を線維芽細胞に添加

これまでMCF-7細胞培養上清 により線維芽細したときのMMPsお よ びTIMP産生を検討し胞のMMPs産生が促進することが明らかとなった (Fig.6) 。 MCF-7 細胞膜画分Clane 3)

たが、 同時にこれらの阻害活性を有するTIMPにはproMMP-1 [ A]、 proMMP-2 [ B]、

産生も促進することが示された。 そこで実際の活proMMP-3 [ C]およびTIMP [ D]いずれ

性発現におよぼす影響について検討した。 Fig.7-62-

皮膚線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生に示したようにMCF-7細胞培養上清にはゼラチ

Table 1. Effect of MCF-7-CM on the growth of
HSF in growth phase.

ナ ー ゼ活性はほとんどないが、MCF-7細胞培養
上清を線維芽細胞に添加することにより、ゼラチ-

Cell number (x 10 4 celh/well)

ナ ー ゼ活性は、3-5倍に有意に増加した。

5

Control

3.81 • 0.17

5.85 • 0.44

HCF-7-CH(100%)

4.90 • 0.66 ••6.50 • 0.43 •01

一方、正常乳腺上皮細胞との混合培養ではMMP

5

0

>i
l
>l
k
ue aseu11e1a,i

HSFs at the 19th paeeage (3 x 104 cells/veil) vere Incubated In
12 mu! tlvellplate !or 2 h, and then medium vas changed to MEM o r
SX(v/v) FBS/MEM containing condonsad MCF-7-CM corr●● ponding t o!OOX(v/v) original CM. A!ter 48 h cultiv&tion, cell number o ! HSF
vas counted. The d●ta are expres,ed as the mean values • SD o! 6
wells. • and ••, significantly di!!erent from cont:ol (p<0.05 •nd
p<0.01, respectively).

5
1．

(E /SlJ
Un)

0
2．

＊＊

Serum concentration (X, v/v)
0Treatment

産生はほとんど影響がなかった。 また正常乳腺上皮細胞や乳ガン細胞株自体にはこれらのMMP産生能は認められなかった。 このことから混合培養

HSF+MCF-7 CM

Fig.7

によるMMP産生の増加は正常乳腺上皮細胞ではEffect of MCF-たCM on the gelat1naseactivity produced by HSF. Confluent
HSFs at the 12th passage were treatedwith MCF-7-CM (12.5% . 25% , 50% ,and100%,respectively) in 0.2% (w/v) LAH/MEM for 48h. The harvested
medium was performed to assay for
gelatinase activity as described in themethods. Results are presented as themean士SD of 3 wells. • and ● •, signifi­
cantry different from untreated HSF (p<0.05 and p<0.01, respectively) .

見られず、乳ガン細胞株にのみ認められるが、細胞株によっても異なることも明らかとなった。 さらにMCF-7細胞と線維芽細胞の混合培養の細胞数比を変化させたところ、MCF-7細胞の細胞数に依存してMMPs産生が増加した。 混合培養において免疫蛍光法によりproMMP-1、 -2およびー3の産生細胞を検討したところ、proMMP1およびー3の増加は線維芽細胞の産生能の促進の3.6 線維芽細胞の増殖におよぼすMCF-7細胞結果であることが明らかとなった。

（未発表デ ータ）

培養上清の影響
線維芽細胞の増殖におよぼすMCF-7細胞培養

この線維芽細胞 5 - 6 lの MMPs産生を促進させ

上清の影響を検討した。 Table.lに示したようにる因子としてMCF-7細胞から産生される液性因

MCF-7細胞培養上清は線維芽細胞の増殖を無血子によるものと、MCF-7細胞と線維芽細胞が接清および5%血清存在下ともに有意に増加させた。

着することによる場合 ” が考えられる。

察

4. 考

MCF-7細胞の培養上清を線維芽細胞に添加したところ、混合培養の時と同様proMMP-1、
proMMP-2、proMMP-3およびTIMP産生が今回、正常乳腺上皮細胞と2種の乳ガン細胞株促進したのに対し、MCF-7細胞の細胞膜画分添を用い 正 常 線 維 芽 細 胞 と の 混 合 培 養 に よ る

加ではproMMP-1、proMMP-3およびTIMP

MMPs産生を検討した。 MCF-7細胞との混合産生は促進するもののproMMP-2産生には変化培 養 で は proMMP-1 、 proMMP-2 お よ びが認められなかった。 従ってMCF-7細胞の産生

proMMP-3産生が著しく増加した。 BT-20細するMMP産生促進因子は細胞膜と液性因子とで胞においてはproMMP-2産生は増加したが他の異なることが示唆された。

MMP産生ではあまり変化が認められなかった。

一方、MMPsは、通常はこれらの産生細胞が-63-

同時に産生すると理解されている。組織性メタロ

生促進作用の結果と併せて、線維芽細胞のMMP

プロテア ー ゼインヒビタ ー (TIMP)と1:1のモ

産生を促進させる因子は増殖因子を含めて複数存

ル比で複合体を形成することにより不活化される。

在することが示唆された。

proMMP-2 お よ び proMMP-3 は そ れぞれ

以上、乳ガン細胞株MCF-7細胞と正常線維芽TIMP-2とTIMP-1と特異的に結合し活性化を細胞との細胞間相互作用について検討した。in

阻害する。従って局所でのMMPsとTIMPとのvivoでのMCF-7細胞の転移能を検討した報告

量的バランスがMMP活性発現に重要であるとさはあるがその詳細な機構についてはほとんど明られている。

かではないが、本実験からMCF-7細胞は自らはSchultzら

8)

は、rTIMP-1は腹腔内投与によりマウスB16メラノ ー マの肺転移を抑制すること、
Kohkhaら

9)

全くMMPsを産生しないがMCF-7細胞が産生する液性因子あるいは 接着することにより線維芽は、TIMP-1のアンチセンスcD­細胞はMMP産生を促進することが明らかとなっNAを正常マウス3T3細胞に発現させてTIMP-

た。またこの結果はガン転移における正常細胞由1の産生を抑制すると浸潤性と転移能を獲得した

来のMMPsの関与を強く示唆するものである。

細胞が得 られることを、逆にDeclerck ら I O lは

しかも今日までガン細胞の産生するMMP産生促

TIMP-2のcDNAを導入発現させることにより進活性が液性因子および接着の二通りで行われる転移能が低下することを報告している。これらの例はMCF-7細胞が最初であり、またこのMMP

事実はTIMPが転移抑制遺伝子産物のひとつで産生を促進させる因子は、複数存在することが示あることを示すと共に、MMPとTIMP産生の唆された。しかしこれらの因子については同定す

量的不均衡が転移性浸潤を誘起する要因になってるまでには至らず、さらに検討が必要であると考いる可能性を示唆している。

えられる。

今回線維芽細胞のゼラチナ ー ゼ活性におよぼす
MCF-7細胞培養上清の影響を検討したところ、

引用文献

線維芽細胞のゼラチナ ーl ) Biswas, C. and Nugent, M. A.

ゼ活性の有意な増加を認めた。従ってMCF-7細胞の培養上清を線維芽細胞に添加することにより線維芽細胞のMMPおよ(1987) J.

Cell. Biochem., 35, 2 47-258
2 ) Vater, C. A., Nagase, H. and Harris, E. D.

びTIMP 産 生 は共に増 加 す る が 、 全体 として

Jr. (1986) Biochem. J., 237, 853-858

MMP産生がTIMPに対し優位であることが明

3) Cawston, T. E. and Barrett, A. J. (1979 )らかとなりMCF-7細胞と正常細胞との相互作用によるMMPsの増加が転移浸潤に強く関与してAnal. Biochem. 99, 340-345
4) Laemmli, U. K. (1970) Nature (London) ,277, 680-685

いることが示唆された。
一方、MCF-7細胞培養上清添加により線維芽細胞の増殖は有意に促進されることが明らかとな
り、このことから線維芽細胞のMMP産生を促進

5) Nakajima, M., Chop, A. M. (1991) Semrn.
Cancer Biol., 2, 115-127
6) Pyke,C.,

Ralfkiaer,

E.,

Huhtala,P.,

するのはMCF-7細胞培養上i青中の増殖因子であHurskainer, T., Dano, K. and Tryggrason,

る可能性が示唆された。またMCF-7細胞培養上

K. (1992) Cancer Res., 52, 1336-1341

清をゲルろ過にて分離した場合、ゼラチナ ー ゼお7) Nabeshima, K., Lane, W. S. and Biswas, C.,

よびproMMP-3産生促進活性は異なることが示(1991) Arch. Biochem. Biophys., 285, 90-96

され、また先の線維芽細胞にMCF-7細胞培養上

8) Shultz, R. M., Silberman, S., Persky, B., Ba­

清あるいは細胞膜画分を添加したときのMMP産

jkowski, A.S. and Carmichael, D.F. (1988)

-64-

I

皮慈線維芽細胞とガン細胞の細胞間相互作用によるマトリックス分解酵素の産生

Cancer Res., 48, 5539-5545

M. (1992) Cancer Res., 52, 701-708

9) Kohka, R., Waterhouse, P., Yagel, S., Lala,
P. K., Overall, C. M., Norton, G. and Den­

（本研究の 一 部は第65回日本生化学大会

hardt, D. T. (1989) Sience, 243, 947-950
10) Declerck, Y. A., Perez, N., Shimada, H.,
Boone, T. C., Langley, K. E. and Taylor, S.

C 1992)において中島、 伊東、 森によって発表
された。）

-65-

パッチテスト結果のコンピュ ー タ ー 処理ンステム開発研究
名古屋大学医学部附属病院分院

早

川

律

子

The research members of Japanese Society for Contact Dermatitis (JSCD) havecooperated to study about the optimal concentrations and vehicles of patch test allergens
from 1975.
Since the every year data from collaborators has come to a vast volume, we intro­
duced a computer system into the patch test data processing. When we took the casecards of coresearch from JSCD members, we input the code number of the institute, pa­tient's number, sex, age, occupation, and the date of testing.
We are able to print out the table of patch test results, positive ratios of the allergens
patch tested , graphs of positive ratios and the patients'name who positively reacted to
one or more tested allergens.
In this paper, the patch test results in 1992 and 1993 are reported.
In 1992, we costudied about two kinds of preservatives (Kathon ® CG and formalde­hyde) and a tar dye (Lithol Rubine BCA) . 997 (141 males and 856 females) patientswith skin diseases were patch tested in 37 institutes. The optimal concentrations of
Kathon ® CG and formaldehyde were 100 ppm/aq and 1.0% aq respectively. The optimal
concentrationof Lithol Rubme BCA was 1.0% pet and its impurity was 0.1 % pet.
In 1993, we costudied about metal allergens such as gold and mercury. At present,
601 (142 males and 459 females) case cards have been collected and the data were input
into computer. Since we have had only a short time after finishing 1993.'s coresearch, all
the data have not been input into computer and we have not reached to the conclusion
about the optimal concentrations and the most suitable chemicals as patch test aller­gens.
Key words : Patch testing, computer system, Kathon ® CG, formaldehyde,R-202,
Lithol Rubine BCA, gold, mercury

緒なった。 このため ，

曰

日本接触皮膚炎学会の事務局が置かれている名古屋大学医学部附属病院分院皮膚科に従来からあったコンビュ ー ター

日本接触皮膚炎学会のパッチテスト研究班は，
1975年以来毎年共通テーマを設定して，

パ

ッチ

にハ

ー

IJ

に新た

ドディスクAV-6016HGをつけて，

テストアレルゲンの至適農度該当アレルゲンに接触皮膚炎学会の共通研究テ

最も適した基剤 パッチテスト材料などについて

果のコンピュ ー タ ー 処理を計画した。

ー日本

マパッチテスト結共同研究を行ってきた。 近年共同研究の参加施設

開発ソフトの増加に伴い， 毎年収集されるデー タは膨大となり， 集計には多大のエネルギーを要するように
The Study for Developing Computer System ofPatch Test Results

1)

製品名・アレルゲン名検索，

カチェック，

3)

4)

ゲンのテスト患者名リスト作成，

Nagoya University Branch
Hospital

般名別テスト患者リスト作成 ，
ゲン コ

ー

ド作成 ，

7)

全施設陽性率作成，

-66-

重複入

パッチテスト（製品・アレル

ゲン）セット別陽性率印刷，

Ritsuko Hayakawa

2)6)

製品とアレル
製品 ・一

5)

空きアレル

施設別陽性率印刷 ，
9)8)

患者別テストセットー

バッチテスト結果のコンピュ ー ター処理システム開発研究

まとめと がプリントアウトされる。

覧表作成， 10) 対象患者の性別・年齢別分布表
作成の10種のソフトを開発した。

実験

コンピュ ー タ ー システム
1. 1992年共同研究
1. 入力

1992 年はタ ー ル色素赤色202号(Lithol Ru­

図1に コンビュ ー タ ー のハ ー ドウエアを図示しbine BCA)とその不純物のパ ッチテスト至適濃

た。 各施設 より送付されて来たケ ー スカ ー ド の記

度と 陽 性頻度 の 検討， 殺菌 ・防腐剤で あ る

載項目に基づき ， 患者のコ ー ド番号（各施設にKathon®CGとformaldehydeのパッチテスト

コー

ド番号をつけ， 送付された順に numbering

し た：例えば001-0001 ,001 は 施 設 コ

ー

至適濃度の検討を行った。

ド，1 . 1 赤色202号(Lithol Rubine BCA)とそ

0001は001 の施設 からケ ー スカ ー ドが 最初に 送付の不純物
法定色素赤色202号(Lithol Ru bine BCA)

ロディスプレイはFDA名をD&C Red No.7, C.I.No.15850,
レ ー ザ ー ブリンタ ー

□□□□

ロ

MO(光磁気ディスク）

C.I名をPigmentRed57と称される赤色のタ ー
ル色素で ， 本邦では昭和31年より化粧品に使用されており． 最近最も繁用されている色素の1 つである。 図2に 赤色202号 の化学構造を示す。 現在多くの赤色タ ー ル色素がその感作性や催奇性 などの問題で使用が制限されているが赤202

キイボード

図1

コンピュ ー ターシステム

号は安全性に優れた色素と されて来た 2) 。 しかるに近年赤色202号に よ るアレルギ ー 性接触皮されて来たことを表 す）， イニシャル， 性別， 年

膚炎が報告され 3) • その原因が央雑する不純物

齢職業を入力する。 ついで 各例のバッチテスト

である可能性 が指摘された 4) 。 パ ッチテスト用

施行日 ， 貼付部位， セット名 ，

パ ッチテスト結果

試料を以下のように作成した。 約260 g'の市販のを入力する。 後 日パッチテスト結果が変更された

赤色202号を10 gずつ遠沈管に とり， メタノ ー ル

場合には， 変更コー ドで 入力しなお す。 最後に診50叫を加えて， 3000 rpmで遠心分離して上澄液断名を入力する。

を分取した。 市販品 メタノ ー ル不溶物（精製2. プリントアウト

so, ½ca1)対象患者の背景

HO

パ ッチテストを施行した患者の年齢性別表

がプリント アウトされる。
一2)パッチテスト結果の

R=R

CH3

覧表

パ ッチテスト結果が貼付年月日 の早い症例から順にプリントアウトされる。 ついで パッチテ
スト結果の集計表 ， 陽性率， 陽性率のグラフ ，アレルゲン別陽性 例がプリントアウトされる。
図2

パ ッチテスト 結果は各施設別と全施設 の結果の-67-

R-202号の化学構造

OOH

品）は1.0%白色ワセリンC pet). メタノ ー ル可の両者について検討した。 0.4%pet,

溶物（不純物）は0.1%petを作成した。

0.1% pet塩化金酸3 水塩と 4 水塩，

1 .2

0.5% pet,

Kathon®CGとFormaldehyde

Kathan®CGはロ ー ム・ アンド・ハ

ー

ウム ，

ス社で

0.2%pet,1.0%pet,0.25% pet金チオリンゴ酸ナトリュ

1.0% pet, 0.5%pet.

0.25 % pet金チオ

開発された水溶性防腐剤で， 本邦では1987年よ

硫酸ナトリュウム と 1.0%pet塩化第二水銀アミ

り化粧品に使用されている。 図3に Kathan®

ドを作成した。 また 1992年の共同研究の継続とCGの化学構造を示した。 Formaldehydeは殺してKathon®CG lOOppmのパッチテスト陽性

菌防腐剤として医薬品家庭用品工業分野で汎頻度を観察した。

用 さ れて い る他， formaldehyde resinや
0·

3. パッチテスト/. 0

48時間閉鎖パ ッチテストにより検討した。
3. 1

方

法

Finn Chamber ® ( EPITEST Ltd Oy
Helsinki, Finland)とScanpor®(NORGE­SPLASTER A/S, Oslo, Norway) tapeを用いて， 対象の背部に 48時間貼付した。 ワセリン基

図3

剤の試料はそのま ま 適量を Finn Chamber® のmethylisothiazolinone(Ml: 0.35%)

methylchloroisothiazolinone(MCI: 1.15%)

中心に付け， 水溶液の試料はFinn Chamber®
に慮紙をいれて ， 濾紙に適量を滴下した。

KathonCGの化学構造

3.2
formaldehyde releaserから遊離され， 広く生
活環境に存在 しているため， formaldehydeに

判

定

判定は除去後1時間と24時間にICDRG基準 6
に従って行った。

ー

士口系

よるアレルギ 性接触皮腐炎は難治性である。 我が国ではform aldehydeは現在化粧品に使用することが禁止さ れて い る が ，Formaldehyde releaserである殺菌・防腐剤が化粧品に使用されている。 Kathon®CGは100ppm,

50ppm ,

25ppm水溶液(aq)を作成し ，

formaldehydeは2%. 1%,

0.5%,

果

欧米で は

0.2%aq1.

1992年共同研究

1992年には男性141例 （平均年齢46.3土19.0歳）， 女性 856例（平均年齢38.9士16.3歳）の合計997例にパ ッチテストを施行した（表1)。 試験を作成した。

試料の 48時間 ，72時間判定時のパッチテスト陽2. 1993年共同研究の陽性率は市販赤色202号1%petは 17例， 精製性率を表2 , 表3に示した。 48時間判定の十以上
1993年は金の パ ッチテスト至適濃度の検討を行った。 これま で ，パ赤色202号1%petは10例， 不純物 0.1%petは 12
例 ， Kathon®CG lOOppm,

ッチテスト用の金として ，50ppm,

塩化金酸， 金チオリンゴ酸ナトリュウム， 金チオ

formaldehyde 2.0 % aq,

1.0 % aq,

硫酸ナトリュウムなどが用いられてきた 5) 。 また

0.2% aqはそれぞれ 15例，11例，

金と水銀の交叉反応の可能性が指摘さている

5)

14例，

10例

9例 ，

25ppm,
0.5 % aq,
35例

10例であった。 白色ワセリンは2ので同時に塩化第二水銀アミドを貼布し て交叉反例， 蒸留水は4例であった。 72時間判定の十以上応の有無を検討した。 塩化金酸は3水塩と4水塩の陽性率は市販赤色202号1%petは15例， 精製-68-

パッチテスト結果のコンピューター処理システム開発研究

表1＊＊

検査日： 04/01/01-04/12/31

セット名： 94 JSCD 92 tットー一�--}〈----―
各年齢別人数o- 9 10-19 20-29 30-39 40-49 50-60 60以上合 計

5

年齢·

11

16

16

19

36

女性

62

280

112

148

合計：

73

296

128

167

男性

作成日： 94年2月 ·s日頁＊＊

患者男女別年齢一覧

平均年齢

標準偏差
19.0

38

141

46.3

140

113

856

38.9

16.3

176

151

997

40. 0

16.9

-99999999

患者範囲·

表2
判定基準,JSCD基準判定＊＊,-,·,001-0001一患者,_ド: 037-0006
基!!I ,!CDRG
説明五
魯

セットバ'lチテスト結 果稟計表IJSC引

作成3 ,93年3月185頁

セット名： 94 JSCD 92 ,ット

検歪a , 04101101- 04112131

i 反応

表3

廷隕性

検査数

(- ---- 48時間結果ー ― -----)
JR
•··
••
•
•?
—

：屈強隔性

(----- 72時問結呆
•
·'
•

••

•··

IR .

赤色202号1%petは14例， 不純物0.1%petは10間 72時間判定時のパッチテスト陽性率を表 5,

formalde hyde2.0% aq, 1.0% aq, 0.5% aq,

化金酸3水塩0.4%pet, 0.2%pet. 0.1%pet,

例， Kathon®CG lOOppm, 50ppm, 25ppm,
0.2 % aqはそれぞれ10例， 9例， 7例， 58例，32例 13例， 8例であった。 白色ワセリンは1例，
蒸留水は4例であった。
2. 1993共同研究

現在までに入力したデ ー タ ーの集計結果では，

1993年の対象患者は男性142例（平均年齢43.2士

18.2歳）， 女性459例（平均年齢37.7土16.6歳）の合計601例であった（表4)。 試験試料の48時

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．0
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．0
．0
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．0
．0
0

43 2262388880
777666655556
999999999999

分― ------)

000000000000
•
0•
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0•
0•
0•
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0•
0•
0•
0•
0

名

剤剤剤剤剤剤剤
腐怠腐腐腐腐腐云ヌヌ剤剤
防 防防防防防 防色色色基基

aqua
aoua
aqua
ao
ao
ao
ao
pet
pet
pet
as 1s
as is

強渇性

頁

000000000000
000000000000
．0
．
．00
•00．
•0
•0
0
0
000•

剤

•••

000100000000
000000000000．． ．．．．．．．．
000000000000

甚

名

度

類

涅

12
JSCD 92 h卜
l00pp●
I !athon CG lOOpp●
2 lathon CG 50ppa
50pp●
3 lathon CG 25pp,
25pp●
21
4 For● aldehyde 2XlX
5 For● aldehyde lX
O. SX
6 For●aldehyde 0. SX
7 For●aldehyde 0. 2%
0. 2%
8 R-202 Co●●ercial Product lX
9 R-202 Purified lX
lX
lO R-202 Impurities 0. lX
0. U
ll l,l'll臼色1'リンll992. JSCD) l001
l2蒸召水lOOX
lOOX

作成8 c93年3月188 -15時 ,s
検査8 c04/0l/Ol-04/12/31

隕性

分

’’卜数
セット名
香号よ品名/7レルゲン名．．

セット陽性辛結果一 覧表IJSCDI

37

表6 に示した。 48時間判定の十以上の陽性率は塩

4水塩0.4%pet, 0.2%pet, 0.1%petはそれぞれ89例， 39例 6例， 21例， 10例， 6例であった。 金チオリンゴ酸ナトリュウム1.0%pet. 0.5%pet, 0.25%pet, 金チオ硫酸ナトリュウム1.0%pet, 0.5%pet, 0.25%petはそれぞれ40例，25例， 13例， 71例， 54例， 38例であった。 塩
化第二水銀アミド1.0%petは36例， 白色ワセリ

ンは6例 Kathan®CG lOOppmは10例， 蒸留

水は 5例であった。 72時間判定の十以上の陽性率
-69-

7

2

90

17. 1

3

七ット名： 135 JSCD 93 !ット

名
ン
ゲ
レ
1
数レ
ト
ゎァ
/
名
品
公

4 2 0 1 1 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 00 0 0．．．．．．． ．
．0． ． ．0．0．0．0
000 0 00 0
0 00 0•••••••

1 1 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 00 0 0．．．． ． ．．．
000000000
0 0 00000

4 2 0 1 0 0 2 2 1 5 3 22 0 0 00000 000000000000•• • • • • •• • • • • • • • •0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0261421643 8865121
1 0 0 00 0 0 00000000 0．． ．． ．． ．． ． ．．．． ．．．
0 0 0 0 0 0 0000000000
441521 222653 4112
000 0000000000000．． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ．
0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 06679580240488877
7898999998888999• •• •• •• ••• ••• •••000 0 0 0 0 0 0 0000000••••••••••
0000000000000000

53 0 2 l l o o o o o o o o o o00 0 0 0 0 0 00000 0000．． ．．
00 0 0 0 0 0 0 00000000

3 1 0 1 1 0 21 1 3 2 2 1 0 0 0

0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0••••••••••••••••
0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000••••• •••• ． ． ．
•
0 0 0 o o o ci0 0 0 0 0 0 0 0 0

考

-70-

251 3 11 53 19755121
1000000000000000．． ． ． ． ． ． ．
． ．． ． ．．．
0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

リュウム 1.0% pet. 0.5% pet, 0.25% pet はそ色 202 号の 1/10 の濃度でも十分反応する強い感作

れぞれ 45 例 32 例 ， 23 例 80 例 65 例 50 例

性を有することが判明した ” 。 赤色 202 号を製品であった。 塩化第二水銀アミド 1.0% pet は 43 例，に利用する場合には精製して用いることが望まれ

白色ワセリンは 5 例，

る。 Kathon®CG lOOppm で明らかな剌激反応

Kathon®CG lOOppm は753 722443 9658121
0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0• • • • • • • • • • • • •• • •0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 03 568560249596868
7898999997888999• •• • ••• • • • • • • •000 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 06468569778779010
7777777777777899
95 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 55-剤
瓜 a a 属 “ 辰 属 a ほ 凪 屈屈 払 剤 腐 剤
全金金金金金金金金金金金全基防基

．

s s
la i
ttttttttttttt ueeeeeeeeeeeeesq s
0ppppppppppppaaa

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.
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”

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”
巴
製

x
x
p
5xx5xxpx
4214210520520000•• .o o ooooooolooloollll
3334440酸 酸 装 坦 懐陰
hiDI
金金会金会金CSC
cJ
ttttttfff{ ｛ fi93
塩名ほほぼ 名
u9 9
bbb
c9 0
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6
リ リ リ ム ム ム e lo
ート トト ？ ？？9 ．
90
o oooootttリ リ リ リ ーX
Hi血 血 昭 皿 四 ほ ほ 唆 汁朴 外 ed 6 00
3 3 3 A A A T プ T 酸 陰 隕 at色 C I" 14" 1414
g i^
g ni
m白 On水UC
ueueueueue" "th留ト RAHAHARAHAMA金 金 金 金 金 金 h n Ka屈ッ
91 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 631111111，DC
s
Jは認められず（表 3), また陽性率は 50ppm, 25

9 例． 蒸留水は 5 例であった。

屈強陽性

...

強陽tt
渇性

案

pet, 4 水塩 0.4% pet. 0.2% pet, 0.1% pet は

t-

吋札罪

ロロ

[

名号
ト番
ッ
セ

は塩化金酸 3 水塩 0.4% pet. 0.2% pet, 0.1%

：
――――
―
表5

(----- 72時r.,結果―------)
•••
••
•
•'
IR
(- - -- - 48時r.,結果―------)
IR
•••
••
•
•?
—
検杢数
名
類
分
名
剤
甚
度

滋

＊＊
覧

ー
作成日： 94年2月16日 15 時54分頁
検査8 ,OS/01/01-05/12/31
ほ陽住

16.6
39. 0
85

表6
セット陪性半帖果一覧表IJSCDI＊＊
J-卜. ,OODOOODD-!f. 者Jード： 99999999
基準： !CDRG!l!IJI
'1R
魯凸反応

37.7
69
74

女性：

セットバッチテスト柘呆業It表IJSCDI
判定/);,t ,JSCD甚準判定

459
601

51

196

98

58

160

72

48

55
合計 ·

患者範囲：

-99999999
作成日： 93年11月16日頁：
セット名： 135 JSCD 93セット
検査日： 05/01/01-05/11/16(----—―----〉
各年齢別人数
年齢． o- 9 10-19 20-29 30-39 40-49 50-60 60以上合 計 平均年齢 標準偏差
36
23
16
男性·
26
43.2
32
142
18.2
患者男女別年齢

一＊＊

表4それぞれ 94 例， 46 例 9 例， 28 例， 14 例， 9 例であった。 金チオリンゴ酸ナトリュウム 1.0%

1992 年の共同研究の結果より， 赤色 202 号は頻pet, 0.5% pet. 0.25 % pet. 金チオ硫酸ナト

度は低いがそれ自体に感作性があり， 不純物は赤バッチテスト結果のコンピュ ー ター処理システム開発研究

ppm と濃度を低くしても差がなく ，Kathon®

CG のパッチテスト至適濃度は lOOppm と決定し8)れる。 塩化第二水銀アミド 1.0%pet の陽性率と，試験した試料中では勘案すると金チオリンゴ酸ナ。 Formaldehyde 2.0%aq は明らかに刺激反応(IR)と判定された例があり ， ＋？反応がトリュウム 0.25%pet が金のアレルギ ー を同定す

るのには最も適したアレルゲンと推定されるが，48 時間判定で 77 例 72 時間判定で 61 例と 1.0%

1994 年の全てのデ ー タ ー が入力されていないのた

aq に比較して 2 倍以上の例に認められた。 0.5%

で最終結論を保留する。

する患者で十？反応を呈した例があり， アレル

ギ ー 例を見 落とす可能性があった。 従って，

1) 早川律子 ：パッチテスト結果のコンピュ ー タ ー 処

formaldehyde は l.0%aq を指摘濃度と決定した理について ， 皮隣 34増14:183-184,1992

2) 日本化粧品工業連合会：法定色素ハンドプック ，

8) 0

1993 年の共同研究の結果より塩化金酸 3水塩0.4

薬事日報社， 東京， 1988,37-39,72,397-422% pet, 0.2 % pet では明らかな刺激反応が 48 時

3) 内海美穂子 ， 須貝哲郎 ， 庄司昭伸 ， 渡辺加代子：

間判定時にそれぞれ31 例， 19 例， 72 時間判定時

赤色 202 号 C Lithol Rubine BCA) による口紅に 25 例 13例と他の試料の O 乃至 9 例と比較して圧倒的に頻度が高く，パ ッチテストアレルゲンとしては不適当であることが判明した。 塩化金酸 3

皮洞炎 ， 皮岡 33増11:238-244,1991

4) 生野麻美子， 鹿庭正昭， 化粧品工業連合会色素専

門部会：赤色 202 号による接触皮岡炎 ， 皮膚 34増

水塩0.1% pet と塩化金酸 4 水塩0.1% pet は略同様の陽性率を示した。 金チオリンゴ酸ナトリュウ

12:203-208,1992

5) 鈴木真理 ， 早川律子：金属パッチテストの陽性頻ムに比較して金チオ硫酸ナトリュウムは陽性率が高く ， ＋？反応を呈する例も多かった。

パ ッチテ

度 ， 皮膚 34増14:35-43,1992
6) パ ー ティル・ マグヌッソン：貼布試験 ， 日皮会誌

スト結果から金チオリンゴ酸ナトリュウムの方がパッチテストアレルゲンとしては適当と考えられる。 塩化金酸 3 水塩 0.1% pet と金チオリンゴ酸

ナトリュウム 0.25%pet 十以上の陽性例は 48 時
間判定では 6 例， 38 例， 72 時間判定では 9 例 ，50 であった。 従って塩化金酸 3 水塩は 0.4%pet,

82:621-628,1972

7) 西原修美：赤色 202 号とその不純物のパッチテス
ト結果及び黒皮症患者の推移， 皮 �35増16:37-

44,19938) 片岡葉子：Formaldehyde および Kathon®CG のパッチテスト至適濃度の検討 ， 皮虞 35増 16:45-

0.2%pet では刺激反応を呈する例が多く， 0.1%
pet ではアレルギ

ー

献

歴を有

文

aq では反応が弱く ， 明らかなアレルギー54,1993

例を見落とす可能性が推測さ-71-

皮膚過敏症に対するマスト細胞の役割
ーマスト細胞欠損動物を用いた検定法の開発 —大阪大学医学部

北

村

幸

彦

Mast cell-deficient rats and mice were characterized in molecular and cellular lev­
els. The Ws locus of rats and the W locus of mice encode the c-kit receptor tyrosine ki­nase. The Ws locus is a 12 base deletion at the tyrosine kinase domain of c-kit. The.
cW" , W" and WI are three different point mutations of the tyrosine k.mase domam ofJi
the W (c-kit) locus. The molecular characteristics of the W c, W" and W r mutant
alleles were consistent with the numbers of skin mast cells in heterozygous and homozy­gous mutant animals. The coding region of the W sh mutant allele was normal, but the c-kit gene was not transcribed in cultured mast cells derived from the spleen of W'h /W'h
mice.

言

緒
．

1-9

に結合しているIgE分子が多価の抗原により架橋されることによりはじまる。IgEレセプタ ー
分子同士が架橋されたマスト細胞と好塩基球は好マスト細胞は皮腐など外界と接する器官の結合

塩基顆粒を放出し、好塩基顆粒に含まれる活性物

組織に多く存在する細胞で、表面には高親和性の質により炎症反応がひきおこされるのである。

ーが存在し、細胞質内には好塩基性

化粧品に対する過敏反応の中には、1)マスト

色素により染色される顆粒を持っている。この好細胞あるいは好塩基球が存在しなければ起こらな

塩基性顆粒にはヒスタミンや蛋白質酵素とともに、い即時型アレルギ ー 反応、2)マスト細胞の存在

プロテオグリカンが含まれており、好塩基性色素は必須でないが、マスト細胞が存在すれば、そのIgEレセプタと結合するのはこのプロテオグリカンである。表反応が増強される反応、3)マスト細胞が関与し面に 高親和性IgEレセプタ ー を発現することと、ない反応、の3種類が含まれていると考えられる。

ヒ又タミンを含む好塩基顆粒を細胞質内に含むこ

本研究の本来の目的は、マスト細胞を遺伝的に欠とは、マスト細胞と好塩基球か共通に持つ特徴で損するマウスとラットを用いて、この3種類の反あり、この2種類の細胞のみが即時型アレルギ

ー反応のエフェクタ ー 細胞として働く。
即時型アレルギ ー 反応は、マスト細胞あるいは好塩基球の表面に発現しているIgEレセプタ

応を区別する検定法を開発することであるが、マスト細胞欠損動物について、最近その原因遺伝子ーRoles of Mast Cells on Skin Hypersensitivity:
Development of Evaluating Sys­
tern by Using Mast Cell­
Deficient Animalsが明らかにされたことによって、マスト細胞欠損の原因を分子レベルで解析できるようになった。
そこで本研究では、使用するマスト細胞欠損動物の分子レベル、細胞レベルの解析が中心となった。

2. 材料と方法

Yukihiko Kitamura
材料と方法については、本研究助成金によってMedical School
Osaka University

出版することができた原著論文に詳しく書いてあ-72-皮膚過敏症に対するマスト細胞の役割るので省各する。なお上記論文は本報告宣に添付型アレルギ ー 反応のエフェクタ ー 細胞であり、とする。

もに多分化能血液幹細胞の子孫であるが、電子顕微鏡でみると、容易に区別し得る細胞である。マ

3. 主な結果

ウスけ好塩基球の数が極端に少なく、また血液蘊も 少ないために、好塩基球の研究には不向きで

3. 1

マスト細胞欠損ラット

あった。我々はc-kit遺伝子座の小欠失のためにー

我々は八木記念パ クの丹羽と近藤によって発マスト細胞を欠損しているWs/Wsラットを用い見されたWs/Wsラットがマスト細胞を欠損してて、マスト細胞と好塩基球の分化制御機構の相違いることを見つけ、さらにWs遺伝子座がマウスについて研究した。
Ws/Wsラットに消化管寄生虫Nippostrongy­

において、マスト細胞の分化に重要な役割をはたすW遺伝子座と同様にc-kitレセプタ

ー

・ タイ

lus brasiliensis (NB) を感染させると、好塩

ロシンカイネ ー スをコ ー ドしていることを示した。

基球数は50倍以上に上昇する。この上昇の程度

マスト細胞の存在は、通常組織片を好塩基性色は ＋／＋ラットと の有意差が な い が 、 ne gative

素で染色して調べている。好塩基性色素で染色さ

control として用いたヌ ー ドラットでは、好塩基れるのはプロテオグリカンである。マスト細胞の球の増加反応はまったく起こらない。NBを感染

分化過程において、プロテオグリカンを含む好塩

させたWs/Wsラットでは皮膚 のマスト細胞は甚顆粒の出現により、高親和性IgEレセプタ

ーまったく増加しない。 消化管ではNB感染前には(Fee RI) の発現の方が早く起こると考えられ存在しなかったマスト細胞が出現するが、＋／＋ー RNA

ラットの10%程度にとどまる。ヌ ー ドラットで(mRNA) の発現をWs/Wsラットと正常対照

はNB感染による消化管マスト細胞の増加がみら（＋／＋）ラットの皮膚組織から抽出したRNAをれないが、ヌ ー ドラットの皮膚には＋／＋ラットの逆転写酵素でcDNAにかえ、 PCR で増幅した後皮膚 よりもむしろ多数のマスト細胞が存在するに、 Southern blot を行って調べた。 またWsl（発表論文5)。

ているので、 Fee RIのメッセンジャ

Wsラットと＋／＋ラットの皮膚切片を用いてin皮膚のマスト細胞は結合組織型、消化管のマス

situハイプリダイゼ ションを行い、Fee RIを

卜細胞は粘膜型に分類されているが、結合組織型

発現している細胞を同定した（発表論文3)。

マスト細胞、粘膜型マスト細胞、好塩基球の分化ー+/+ラットの皮膚では、Fee RIのmRNAの制御を主に行っている細胞は上記の実験結果から、存在をcDNAのSouthern blot で検出でき、発結合組織型マスト細胞の分化制御は線維芽細胞、現している細胞をマスト細胞と同定できたが、粘膜型マスト細胞の分化制御は線維芽細胞とTリ

Ws/Wsラットの皮膚ではFee RIのmRNAを

ンパ球の両方、好塩基球の分化制御はTリンパ球

発現している 細胞は存在しなかった。Ws/Wsと考えられた（発表論文5と7)。

ラットの皮膚は好塩基性色素で染色される分化し線維芽細胞の生産するマスト細胞と好塩基球のたマスト細胞だけでなく、Fee RIのmRNAを

主な分化制御因子はstem cell factor (SCF)、

発現した段階のマスト細胞の前駆細胞も欠損してTリンパ球の生産する主な分化制御因子はインいることがわかった（発表論文3)。

タ ー ロイキン3 (IL-3) であることはわかっているので、結合組織型マスト細胞、粘膜型マスト

3.2

マスト細胞と好塩基球の分化統御機構の細胞、好塩基球の主な分化制御因子は表lのよう相違にまとめられた。

マスト細胞と好塩基球は前述したように、即時

-73-

表1

マスト細胞と好塩基球の主な分化制御因子
胞細主な分化制御因子

結合組織型マスト細胞

SCF

粘膜型マスト細胞

SCFとIL-3

好

IL-3

塩

基

結果として、細胞種特異的にc-kitの転写が障害球していると考えられた（発表論文1)。

4. 考 察SCFがc-kitレセプタ ー ・ タイ ロシンカイ

3. 3

ネ ー スに結合することによって始まるシグナルが、

マウスc-kit遺伝子異常とマスト細胞数

マウスではc-kit遺伝子座の突然変異が数多く

マスト細胞の分化・増殖•生存にきわめて重要な知られており、 その中には日本で発見されたもの

役割を演じていることが、 c-kit遺伝子に異常をもある。 我々は日本で発見されたWr

ユニ ー クな症状を示すw とw

sh

Jic

n

とw と、

について、 突持つマウスとラットを解析することにより明らかになった。

然変異遺伝子の分子レベルの異常と皮膚マスト細

すでに述べたように、 マウスとラットでは繊維胞数の間の関係を調べた。
rJ c
図1で示すようにW i 、 W尺w はいずれ芽細胞が生産するSCFに加えて、 Tリンパ球が生産するIL-3も、 粘膜型マスト細胞の分化制御

もc-kitレセプ ー ・タイロシンカイネ ー スのタイに関係しているが、 ヒトではIL-3のレセプタ ー

ロシンカイネ ー

ス部位の点突然変異であるが、を持ったマスト細胞は知られておらず、 SCFが各々の突然変異遺伝子のホモ、 あるいはヘテロ動

現在までにわかっている唯 一のマスト細胞の分化

物の皮膚マスト細胞数を説明しうるような分子的制御因子である。 一 方IL-3はマウス ・ ラットば異常を示した（発表論文6)。

かりでなくヒトにおいても好塩基球の主要な分化制御因子である。

c,.,,c,11"1●'"""'●lo

本研究の当初の目的はマスト細胞欠損動物を用

Kloa,eA'I P Dhull"gSi0< (622)

Aotopl""pl,o,yl,Oio,,
Sl0< (821)

いて、 皮窟過敏症に対するマスト細胞の役割を調SI'(1-2'1

べることであったが、 研究の進展上、 主としてマ
スト細胞欠損動物の性格付けを分子レベルで行うことになった。 現在では分子レベルでの性格付け"""'"''0『'""""記i,1 =ldoe"3-590 5R2

Rl6

83 I

R)5

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7

c
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n

，
，

w

595 623 660 790

r.;,,, """"'""'

固1

種々の突然変異マウスにおけるc-kit蛋白質。
アミノ酸はinitiation codonからの番号で示してある。 mis-sense突然変異はアミノ酸を1字の記号で示す。 略号： SP, シグナルペプタ
イド； TM、細胞膜貫通部位； aa, アミノ酸

ところがw

sh

については、 コ ー デイング領域に異常を認めないにもかかわらず、 W

sh

/W

sh

由来の培養マスト 細胞は、 c-kit のmRNAをなしには、正しい研究材料とみなされにくくなっているからである。 今後は改めてマスト細胞欠損
動物による皮膚過敏症の研究を行いたいと考えている。
特にWs/Wsラットについては、 我国で発見されたものであり、 Ws/Wsラットの性格付けについての我々の論文が出版されるにつれて、 外国からも分与の希望が多く寄せられている。 遺伝的な背景と微生物コントロー ルの両面でWs/Wsラッ
トは実験動物として完成されつつあり、 今後の利用が期待できる。

まったく発現していない。 小脳、 睾丸、 牌臓では
c-kitのmRNAを認めたので、 w

sh

突然変異遺

伝子は、 c-kitの調節領域に異常が起こり、 その

-74-

発表論文
1) Teno T, Tsujimura T, Koshimizu J, Kasuga1

皮膚過敏症に対するマスト細胞の役割

T, Adachi S, Isozaki K, Nishikawa SI, Mori­

T, Tei H, Nishimune Y, NomuraS and Kita­

moto M, Nishimune Y, Nomura S and Kita­

mura Y: Mast cell number in the skin of het­mura Y : c-kit gene was not transcribed incultured mast cells of mast cell-deficient W''

erozygotes reflects molecular nature of c-kit
mutation. Blood 81 : 2530-2538, 1993.

IW''mice that have normal number of ery­7) Arizono N, Kasugai T, Yamada M, Okada M,

throcytes and normal c-kit coding region.

Morimoto M, Tei H, Newlands GFJ, Miller

Blood 80 : 1448-1453, 1992.

HRP and Kitamura Y: Infection of Nip­

2) Jippo-Kanemoto T, AdachiS, Ebi Y, Matsu­

postrongylus brasiliensis induces develop­da H, Kasugai T, NishikawaSI and Kitamu­

ment of mucosal-type but not connective tis­ra Y : BALB/3T3 fibroblast conditioned

sue-type mast cells in genetically mast cell­

medium attracts cultured mast cells derived

deficient Ws/Ws rats. Blood 81 : 2572-2578,

from W IW but not from mi/mi mutant mice,

1993.

both of which are deficient in mast cells.

8) Kitamura Y, Kasugai T, Morimoto M, Tei H,
Tsujimura T, Niwa Y, Yamada M and Ari­

Blood 80 : 1933-1936, 1992.
3) Onoue H, Maeyama K, NomuraS, Kasugai T,

zono N : Development of mast cells and ba­

Tei H, Kirn HM, Watanabe T and Kitamura

sophils. Usefulness of mutant mice and rats.

Y : Absen,a of immature mast cells in the

Progress in Allergy and Clinical Immunology

skin of Ws/Ws rats with a small deletion at(eds, Miyamoto T, Okuda M) , Hogrete &tyrosine kinase domain of the c-kit gene. Am

Huber Publishers, Tronto, PP 477-484, 1992.

J Pathol 142 : 1001-1007, 1993.

9) Kitamura Y, Kasugai T, NomuraS and Mat­

4) Jippo-Kanemoto T, Kasugai T, Yamatodam

suda H : Development of mast cells and ba­

A, Ushio H, Mochizuki T, Tohya K, Kimurasophils. In Immunopharmacology of Mast

M, Nishimura M and Kitamura Y : Super­

Cells and Basophils ( ed, Foreman JC )normal histamine release and normal cyto­

Academic Press, London, PP 5-27, 1993.

toxic activity of beige ( Chediak-Higashi10) Kitamura Y, Kasugai T, Arizono N and Mat­syndrome) rat mast cells with giant gran­suda H : Development of mast cells and ba­

ules. Arch Int Allergy Immunol 100: 99-106,

sophils : Processes and regulation mecha nisms. Am J MedSci, 306 : 185-191, 1993.

1993.
5) Kasugai T, Okada M, Morimoto M, Arizono11) Hirata T, Morii E, Morimoto M, Kasugai T,

N, Maeyama K, Yamada M, Tei H, Dohmae

Tsujimura T, HirotaS, Kanakura Y, Nomu­

K, Onoue H, Newlands GFJ, Watanabe T,

ra S and Kitamura Y : Stem cell factor in­

Nishimune Y, Miller HRP and Kitamura Y :duces outgrowth of c-kit-positive neurites

Infection of Nippostrongylus brasiliensis in­and supports the survival of c-kit-positive

duced normal increase of basophils in mastneurons in dorsal root ganglia of mouse em­bryos. Development, 119 : 49-56, 1993.

cell-deficient Ws/Ws rats with a small dele­tion at the kinase domain of c-kit. Blood 81 :12) Kasugai T, Oguri K, Jippo-Kanemoto T,
Morimoto M, Yamatodani A, Yoshida K, Ebi

2521-2529, 1993.
6) Tsujimura T, Koshimizu U, Katoh H, Isozaki

Y, Isozaki K, Tei H, Tsujimura T, NomuraS,K, Kanakura Y, Tono T, Adachi S, Kasugai

Okayama M and Kitamura Y: Deficient dif-75-

ferentiation of mast cells in the skin of mi/mimice : Usefulness of in situ hybridization forevaluation of mast cell phenotype.

Am J

Pathol. 143 : 1337-1347, 1993.
13) Morimoto M, Kasugai T, Tei H, Jippo­
Kanemoto T, Kanakura Y and Kitamura Y
Age-dependent amelioration of hypoplastic
anemia in Ws!Ws rats with a small deletion at
the kinase domain of c-kit. Blood, 82 : 33153320, 1993.

-76-

チロジナ ー ゼ抑制因子の精製と応用
北里研究所メディカルセンター病院

亀

山

孝一郎

Using antibodies that recognize either tyrosinase, tyrosinase-related protein 1(TRPl) , or tyrosinase-related protein-2 (TRP2, DOPAchrome tautomerase) , thequantities of those melanpogenic enzymes were analyzed in five melanoma cell lines thatpossess various degrees of melanin production. There was a positive correlation between
quantities and synthetic rates of those melanogenic enzymes and thier melanin forma­tion. Surprisingly, pigmented cells showed higher levels of melanogenic inhibitors activ­
ity. These results clearly suggest that melanin production is regulated by a subtle bal­ance between the activities of these enzymes and other factors such as the melanogenic
inhibitor.

効率であった。 また各細胞が有している熱耐性型

概 要

チロジナ ー ゼの抑制因子の量を検討したところ、
驚くべきことに 、メラニン産生の高い細胞のほう

メラニン産生に関与する3つの酵素、すなわち、が低い細胞よりも、大量のチロジナ ー ゼ抑制因子

チロジナ ーゼ、チロジナ ーゼ関連蛋白l、チロジナ ーを有していた。 MSH処理をした際にはメラニン

ゼ関連蛋白2 (DOP Achrome tautomerase)

産生が上昇するが 、 この際にはチロジナ ー ゼ活性を認識する抗体を用いて 、これらメラニン産生にの上昇とメラニン産生の抑制因子の活性の低下が関与する酵素の量とメラニン産生の関係について観察された。 興味深いことには熱耐性型のチロジ検討した。 なお使用した細胞はメラニン産生能のナ ー ゼ抑制因子はチロジナ ー ゼの活性だけでなく 、異なる5つの細胞株である。 JB/MS-Wを除く

チロジナ ー ゼ関連蛋白2 (DOP Achrome tau­

すべての細胞は 4 日間のMSH処理にてメラニン

tomerase)の活性も抑制した。 これらの結果は産生能を 4 倍から30倍まで増加した。 JB/MS­

Wのメラニン産生能はMSHの処理の有無にかか

メラニン産生がチロジナ ー ゼ、チロジナ ー ゼ関連
蛋白 1 、 2 およびそれらの抑制因子により微妙にわらずバックグラウンド以下であった。 これら3制御されていることを強く示唆する。 さらに熱耐

つの酵素の量ないしは合成速度と細胞のメラニン性型の抑制因子のメラニン産生後期に及ぼす影響

産生能の間には正の相関関係が認められた。 JB/を人由来のメラノ ー マを用いて検討したところ、MS-Wを用いて熱耐性型のチロジナ ー ゼ抑制因

抑制因子は5,6-dihydroxyindole (DHI)の酸子の精製を行ったところ、20,000倍以上の精製化反応をチロジナ ー ゼの存在下、あるいは非存在

Purification of melanogenic inhibitor
Koichiro Kameyama下にて抑制した。 このことはこの抑制因子がメラニン産生の各種段階にてメラニン産生を制御していることを示唆している。

Kitazato Institute
Medical Center Hospital-77-

を添加し、 40,000G、 20分遠心、 上澄みを採取

材料および方法した。 そ し てクロロホルムを添加し40,000G 、20分遠心し、 脱塩の後に順相シリカゲルを通過させチロジナ ー ゼ抑制活性 を有する部分を採取し1. 培養細胞C57/BL6マ ウス由来のJB/MS メラノ ー マ細た。

胞およびそのサプクロ ー ン、 B16F10 メラノー マ
7.

細胞を用いた。 培養は10%の牛の血清を添加しGelfiltration Chromatography
細 胞成 分 を1 % NP 40に て抽出し た後にたDulbec cos'modifie d Eagle's medium を用しヽた。

SephadexG75を通過させた。

2. 抗

8. チロジナ ー ゼの精製

休

チロジナー ゼのC末端を認識するAnti-PEP 7

B16 メラノ ーマを用いて 、 カラム電気泳動法

抗体、 チロジナー ゼ関連蛋白1を認識するTMHl
モノクロ ー ナルにて精製を行った。

抗体 、 チロジナ ゼ関連蛋白2をー認識するAn ti-PEP 8 抗体を用いた。

9. 抑制因子のOHiに及ぼす影響
生成したDHIは東 ‘ノ ーの4mm X 25 cm RP-18

3. フロ

ー

サイトメトリー

カラムを用いて HPLCにてモニタ ー し た。 溶媒ールにて固定しは0.15 M Naふ01/methanol (75 % :25 %) ,

た後に50µ1の抗体を加え、 4℃にて1時間 反応さpH2.5を用い、毎分 0.5叫にて流した。 DHIの検せた後にFITCをラベルした2次 抗体を反応させ

出 は東ソ ーの紫外線検出器にて波長280nmにてた。 2回i先浄の後に解析を行った。

行った。

2Xlが個の細胞を7 0%エタノ

結 果

4. メラニン産生能の評価
1 4C- tyrosineを用いメラニン産生 を測定した。

1. メラニン産生能とMSHの効果
5. 免疫沈降法

チロジナ ー ゼが触媒する 反応であるty rosine

3 5S-methionineを用いて型どおり行った。

h yd roxylase 、 メラニン産生、 DOPAchrome
tautomeraseの活性の間には正の相関関係が認

6. チロジナ ー ゼ抑制因子の精製められた（表1)。

JB/MS-Wメラノー マ 細胞をヌ ー ドマウスに植え込み 採取した。 腫瘍500グラムあたり 2.5
リッタ

表1各種細胞のメラニン産生能(pMOL/10 5 cells/h)ーの純水を加えPol yt ron di sruptorにて細胞を粉砕した。 酢酸にて pH5.3として 65℃ 1
時間処理した。 40,000G 、 10分遠心し、 上澄みを採取した。 次に0.45µm のミリポアを通過させUlt ra - fi l trationにて分子量1,000以下を採取

メラニン

JB/KS
JB/MS P
JB/US ,
JB/MS B
Bl6fl0

した。 NH心HにてpH8.5としD EAE 25を通過した後に酢酸にてpH を3.5として Dowex50w-8を通過させた。 Evaporationの後にメタノ ー ル

-78-

＋＋
＋
＋＋
＋＋

in 杓

Tyrosinehydroxy lase
137
101
→6
980
725

19
14

DOPAchro
tautomerase
132
48

275
32

148
I 16

メラニンi/)i.ljこ能

2

血

—:"

チロジナ ー ゼ抑制因子の精製と応用

a1
aqw nuヒニコ： mos叫SE
Ea:m,

0
9
0
6

SN3!NI30N30S3•oni;
A←1

I円
―
3

(-)

: ,-MSH(-)(+): o-MSH(+)

0
4

。2

fluorescence intensity
』q
a
w nu1
0
=
::>

b

ー中-�-·.,

JB/MS

図2

_ ... _,,,_中JB-MS-P_ ... 日由← ...

JB/MS-W_,,,_出-田JB/MS-8_,,,_,,,_

816F10Flow cytometric analysis of tyros1nase,
TRP1 and TRP2

,ooo

0
0
0
9

"
i.eodeOONI〔S ) �dQ
S1130•O-X '1N01

c

0
0
0
2

fluorescence intensity

0
0
0
9

aqu nu =a3
1』,,-i...,•一→— -+-+

JB/MS

図3

Synthesis of tyrosinase, TRP1 and TRP2

3. チロジナ ー ゼ抑制因子の精製
fluorescence intensity
図1

Flow cytometric analysis of tyros1nase
a. JB/MS tyrosinase, b. JB/MS-W
tyrosinsse 、 c. Negative control

100グラムのJB/MS-W細胞を100叫の純粋を用いて 精製を行った際の代表的なデ ー タを示す
（表2)。 Dowex50WX - 8以降の段階は蛋白濃度が低く測定限度以下のため実際の精製効率は判定不能であった。 しかしその後順相クロマトグラ

2. メラニン産生に関与する酵素の量および合成
速度

フィ ー の精製法を加えることに より、 ほぼシング
ルピ ークの活性を得ることができた。

フロ ー サイトメトリ ー の結果を図1に 示す。 メ

異なるメラニン産生能を有する細胞よりチロジ

ラニン産生の異なる細胞間においてメラニン産生

ナ ー ゼ抑制因子を精製しその活性を比較したとこ

量とチロジナ ー ゼの量との間には正の相関関係がろ、 驚くべきことにメラニン産生能とチロジナ ー

認められた（図1、 2)。 またチロジナ ー ゼ、 チロ

ゼ抑制因子の活性との間には正の相関関係が認め

ジナ ー ゼ関連蛋白1、 2の合成速度とメラニン産られた。

生能の間にも正の相関関係が認められた（図3)。

-79-

nり1の伯ill紋

80. 0
24.5

pRS. S.65.C迅J'I.

UI trafi I trnllon

4.5
<0.1
<0.1

Do,e,501X·8

chlo,ofor● fj]flj<0.1

lllhlftPLC

65

675

8.H

20

55
15

l

20

430
HO

5

抑割·�
76

60

28

0.01

1000
538

2196

) 50.00) 10000)1000095.56) 50.00

3>50.00

3

I

I

25kD

I

匹

SH

21.96

430
5

70kD

1n,:i1� ホ

9556)10000

Gel filtration chromatography

血

心

，B

4.

450

(11)
500

A
g I UO!>!Q'4"1器 色 澄 ピ ←DF.AEScphadox

u介仰討汗ヤt(unit)↑年11"1lfll;1

(\)

鯰量

n(% )
呂o
3U一
nasaStayn,s1
Tc .. J
100.000

kD
I
6

iiJIIJI

Ill附A

表2チロジナ ー ゼ抑制因子の精製効率,.

JB/MS 細胞の1 %NP40抽出液をSephade xG

20

"'

30

,.

Fraction

"'

'5

00

図4A

75を通過させて分子量別に分けて、 精製したチ
ロジナ ー ゼに加えメラニ

1

り低分子の分画はメラニン産生を抑制した（図4

•

25kD

,cm

'""

A点線）。 しかしながら細胞を4日間MSHにて刺た場合には分子量7万前後の分画のメラニン産生A実線）。 また 分子量別に分けた ものを65℃1時

� ·--"Y'.· , . .
·.

-MSH

，8

められたメラニン産生抑制作用は消失した（図4

• MSH

8

'

I

能は 約2 0倍増加した。 さらに低分子の分画に認

1
rsrul
u
Ie
g) UOO,,Q!4Ues

激しながら培養した後に抽出液を作成し、 分画し

a n(% )utgm
nasaSti
i
yros
T

70kD

ラニン産生を促進するビ ー クが認められ、 またよkDI6

検討した。 その結果、 分子量約 7 万のところにメBン産生能に対する効果を,o

間熱処理した場合にはMSH処理をしていない場

30

35

Fraction

<O

45

”

図48

合にはチロジナ ー ゼのビ ー クもチロジナ ー ゼの抑制因子のビ ー クも残るが（図4B点線）、 MSH処の活性を も抑制した（図5中段）。 またメラニン

理をしている場合には驚くべきことに、 低分子分

産生は1280倍まで抑制因子を希釈しても 認めら

画に認められたチロジナ ー ゼに対する抑制因子はれた（図5下段）。

逆に促進因子となった（図4B実線）。

次に抑制因子のDHIの酸化に及ぼす影響を検討したところ37 ℃ 、 6 0分の処理にて10%のDHI

5. チロジナーゼ抑制因子のチロジナ

ー

ゼ、 チロ

が失われた（図6a,b)。 DHIをチロジナ ー ゼのジナ ー ゼ関連蛋白2、 メラニン産生に及ぼす存在下にて同処理をしたところ50%のDHIが失効果

われた（図6c)。 し か し な が ら DHIをチロジ

チロジナ ー ゼの抑制因子をチロジナ ー ゼが触媒

ナ ー ゼと抑制因子の存在下にて処理したところ

するtyrosine hydroxylase activity に対する効

DHIの低下率はわずか25%であった（図6d)。

果を検討したところ1280倍までチロジナ ー ゼ抑

興味深いことには DHIを抑制因子の存在下のみ

制因子を希釈しても酵素反応を抑制した（図5上

にて処理した場合に は DHIの量は全く不変で段）。 メラニン産生についても 1280倍まで希釈しあった（図6e)。

ても抑制効果が観察された。 また興味深いことには1 0倍希釈までの高濃度においてはチロジナ ー
ゼ関連蛋白2 (DOPAchrome tautome rase)-80-チロジナ ー ゼ抑制因子の精製と応用

岳

0'-Tyrosine

8000
6000

-MSH

Hydroxylase1

メラニン産生の盛んな細胞ほどチロジナ ー ゼの

、::i.
·4000
E

C.

C.

900

�

600

C.

300

゜E

C:
•�
一

e

い結果であった（表3)。 またこの抑制因子が

゜
1200

en
'l.

抑制因子をよりたくさん有していることは興味深

2000

C:

·ぎ-

MSH処理にて活性を失い、さらに熱処理をする
1:2

1:10

DOPAchrome

Tautomerase

1:50

1 :250

1:1250soo l DH I Production

4600

�
2
0:l[]. _0 1:2 1.10 1:50 1 匹
00 !

I°"_

ジナ ー ゼ抑制因子 ー 中性因子 ー チロジナ ー ゼ促進因子と変化することでメラニン産生を制御していることを明らかにした。 またよりたくさんのメラ
ニン産生を制御するためにはよりたくさんの制御因子（抑制因子）が必要とされることを明らかにしたところ抑制因子は DHI の特発的な酸化のみ

1:2

1:10

1:50

1:250

1:1250Melanin

ならず、チロジナ ー ゼ依存性の酸化を抑制した。
以上の結果はチロジナ ー ゼの抑制因子として我々が追っていたものが、チロジナ ー ゼが触媒するメ

Formation

ラニン産生初期の tyrosine hydroxylase だけでなく DOPAchrome tautomerase 、 そして DHI

sooo

oxidation をも制御していることを示唆する。

'l.

゜E

ことによりメラニン産生を逆に刺激した（図4)。
以上の結果はチロジナ ー ゼの抑制因子が実はチロした。 また抑制因子の DHI に及ぼす影響を検討゜ ゜

8000 1

考 察● +MSH

さて精製の結果であるが従来の方法に順相クロ｀｀ ｀マトグラフィ ー の手段を加えることにより、紫外゜線 235nm にてほぼシングルピ ー クの分画が採取
1:2

1:10

1:50

1:250

1:1250

Enzyme:lnhibitor Concentration

された。 このメラニン産生の制御因子の構造決定を行うことにより、生体内におけるメラニン産生の制御機構が明らかになることが期待される。 現

図5段階での精製効率は 20,000 倍であった。
表3メラニン産生能に対するチロジナーゼ抑制因子の効果
粗精製分画
コントロ ー ル

JB/NS

86%

JB/MS-W

60%

JB/MS-P

Control

37℃, lh''"●'"●M'"''tyroStnase
inhibitor

ihibitor only

JB/MS-B

Bl6FIO

図6

-81 一

8011>
88%

86%

16士2 pmol/16h

低分子分画
73%

70%
42%

76%

72%

接触光過敏症のマウスモデルを用いた化粧品による光アレルギ ー の
スクリ ー ニングおよびサンスクリ ー ンの効果の評価
浜松医科大学滝 川

雅 浩Contact photosensitivity (CPS) is successfully induced in mice by application ofphotosens1tizmg agents plus 1rrad1at10n with ultraviolet A (UVA) . By using thismouse model, we evaluated the photoallergenicity of cosmetic agents and the protective­
ness by sunscreens. Photoallergic cutaneous responses were induced by photosensitizing
agents, including tetrachlorosalicylanilide (TCSA), tribromosalicylanilide, bithonol,
musk ambrette, and methylcoumarin. In CPS to TCSA, two UVA-absorbing sun­screens, benzophenone-3 and Parsol 1789, dramatically inh如ted the CPS response,
whereas the two UVB-absorbers, p-aminobenzoic acid and 2-ethyl-hexyl-p­
methoxycinnamate, exhib辻ed much less suppressive effect. These findings indicatedthat the murine CPS model is useful for screening of photoallergenicity of cosmetics andevaluation of photoprotectiveness by sunscreens.

んだものが使われ、 それらが光接触皮膚炎の原因

． ． 緒

言

となった。 現在使われているあるいは将来使われる化粧品にも光アレルギ ー を惹起する新たな物質

我々はマウスを用いた接触光過敏症の実験モデが含まれている可能性があり、 個々の化粧品におル を 確 立 し 、 テトラ クロロサリチルアニリド

ける光アレルギ ー 能のスクリ ー ニングが必要とさ(TCSA)の光アレルギー反応を、 剃毛腹部にれる。 また 一 方では現在サンスクリーンの使用がTCSAを塗布し同部に長波長紫外線(UVA)を注目されており、 その遮断波長として中波長紫外照射することにより誘導しうることを示した

l

,

2) 0

この過敏症反応はT細胞による遅延型反応であl線(UVB)のみならずUVAの遮断が期待されている。 遮断効果の評価において生体系を用いて

り - 3 >、 主要組織適合抗原遺伝子複合体に支配さの検討が望まれるが有用な方法は確立していない。

れている , 4 >。 このマウスの実験系を化粧品の本研究ではこうした化粧品による光アレルギー能

ニングおよびサンスクのスクリ ー ニングとサンスクリ ー ンの効果の評価

リ ー ンのUVAに対する遮断効果の評価に利用す

とい う2点について、 接触光過敏症のマウスモデることは可能である。

ルを用いて検討した。

I

光アレルギ

ー

能のスクリ

ー

化粧品には古くは殺菌剤であるハロゲン化フェ

2. 実

ノ ー ルや人工香料であるマスクアムプレットを含
Screening for photoallergenicity of cosmetic
agents and evaluation of photo­protection by sunscreen agentsusing a mouse model of contact
photosensitivity
Masahiro Takigawa

2. 1

験

光アレルギ ー 能のスクリ ー ニング

基本となる接触光過敏症の感作と惹起のプロト
コ ー ルは、 マウス剃毛腹部に試験物質を塗布しUVA照射を行い光感作し(day 0、 1)、 day5に耳翼に試験物質塗布プラスUVA照射を行い光Hamamatsu University
School of Medicine

惹起する方法である

-82-

])

。 過敏症の程度は光惹起接触光過敏症のマウスモデルを用いた化粧品による光アレルギーのスクリーニングおよびサンスクリ ー ンの効果の評価の翌日耳蔑腫脹を測定し、耳翼厚の増加分をもっ3. 結て表した。 光アレルギーを通常の接触アレルギー

果と区別考應するために、惹起の際、 左耳翼に光惹起、右耳翼に単に試験物質を塗布するだけの惹起
を行った

I)

3. 1

光接触性皮洒炎を起こす種々の物質の光
アレルギ ー 能。 また過敏症反応を増強させるために光感作の2日前にシクロフォスファミドを腹腔
5

マウス剃毛腹部に試験物質であるTCSA、 ト

内投与する群をも併せて検討した , 6 J。 試験物

リプロモサリチルアニリド、 ビチオノ ー ル、 マス

質としては、TCSA、 トリプロモサリチルアニ

クアムプレットを塗布後UVAを照射し、耳翼にリド(TBS)、 ビチオノ ー ル、 マスクアムプレッ

当該物質プラスUVA照射にて惹起した。 この結トを検討した。

果、 全ての検討物質において有意な耳翼腫脹が認められ、光アレルギー 能が確認された 6) 。 特に

2.2

サンスクリ ー ン剤の効果の評価

TCSAは強い光接触性皮膚炎反応を示した。

TCSAを光ハプテンとする接触光過敏症におUVA照射無しに感作物質塗布のみを行った右耳

いて、光惹起の際、UVA照射前に耳翼にサンスの 腫脹は非常に弱く、得られた反応が光アレル

クリーン剤を塗布し、耳翼腫脹の抑制度を調べ

ギー反応であることが確認された 1) 。 光感作の2た 7) 。 サンスクリ ーン剤としてはbenzophenone

日前にシクロフォスファミドを腹腔内投与するこ-3, Parsol 1789,とにより、耳翼腫脹反応の比較的弱い物質でも実p-aminobenzoic

acid(PABA ) , 2-ethyl-hexyl-p-methoxycin­

質的な耳翼腫脹を得ることができた 6) 。

namate(EHMC)を用い、 1%および5% にエ
タノ ー ルにて溶解したものを検討した ” 。

3.2

TCSA接触光過敏症におけるサンスク
リ ー ン剤の抑制効果

TCSAと表皮細胞との結合物の定量は、TC ­SA塗布、UVA照射した耳翼より表皮細胞浮遊

TCSAを光ハプテンとする接触光過敏症にお液を作製、 これをfreezing/thawing, sonica­

いて、光惹起の際、UVA照射前に耳翼にサンス

tionして抽出物を得、TCSA結合物の吸収波長

ク リ ー ン 剤 で あ る benzophenone-3, Parsol

である260nm付近での吸光度を測定することに1789,PABA, EHMCを塗布し、耳翼腫脹の抑制

よって行った

8)。 結果は無処置表皮細胞抽出物

zophenone-3, Parsol 1789 はUVA サ ン ス クの吸光度でサプトラクションして表した。

PABA

Parsol 1789

2-EHMC5cd

aooog £ os
qy

llO

r-

Bemophonono-3度を検討した。 Figure 1に示すように 、 ben­

300

)00

JOO

Wnvelength (11111)

Fig.1

Absorption spectra of four sunscreen ingredients

-83-

,oo

リ ー ンであり、 PABA, EHMCはUVBサンス

PABA, EHMCより顕著なTCSA表皮細胞結合溶液においてはbenzophenone-3, Parsol 1789

クリ ー ンがTCSAと表皮細胞の結合を阻止する

クリー

物生成に対する抑制を示しC Figure 2)、 サンスンである。 Table 1に結果を掲げる。 5%

ことによって接触光過敏症の惹起反応を抑えるこは強い抑制効果を示し，PABA,EHMCの抑制はとが示された ” 。 各サンスクリ ー ンの抑制度を中等度であった(experiment 1)。 1%溶液ではbenzophenone-3, Parsol 1789は依然強く接触

Table 2に掲げる。

過敏症を抑制し、 PABA,EHMCは影響を与えなかった(experiment 2)。 よってUVAサンス
クリ ー ンはUVBサンスクリ ー ンより明らかに強いサンスクリ ー ン効果を示した。 またこのサンス

クリ ー ンの抑制効果は通常の接触過敏症である

TCSA/UVATCSA/UVA

Par sol 1 789

0. Sとo 2a a , b

゜

TCSA/UVATCSA/UVA

PA8A

2. 0 .! 0. 1 4 .a

TCSA/UVATCSA/UVA

2MEHMC

2. I ! 0. 17瀑

E

TCSA/UVATCSA/UVA

Vehicle4 5 .t 0. 59
0. 5�0. 18

TCSA/UVA(J,r; sunsc,-een solution)
TCSA/UVA

Benzoph亀none-3

I. 0 !. 0 • .46�TCSA/UYATCSA/UYA

P:arsol I789

a. sとa.25 a゜

TCSA/UVATCSA/UVA

PABA

3. 3 .t o. 46�

TCSA/UVATCSA/UVA

2-eHMC

3. s ! o. 1a c

E

TCSA/UVATCSA/UVA

Vehiclea,nzoohonon,-3
?u,oJ

ONFB

ONFB

8曇nz.00henone-3

8. I ! 0.51 c.

2-EHMCONFB

ONFB

Pano I

9. 0 !: o. 70 c

Venicl●

1789

.

ONFB

ONFS

p A.BA.

8. 5 !, 0.95 G

DNFB

ONFB

2-EHMC

8. 5こ0, 87 C

ONFB

DNFB

Vehicl●8.9こ0 88b Th● data,oo,e●● nt th● me●n of ●●亀k abao,b亀nee betw●● n

1. 8こ0 25

nm i'n ●xuact● ● qulv● l● nt to 2xl0 7 cells/ml.

ONFB--··---·· ·-------· -----· • • •••• • • •••••• •••• •• •· ··-·--·----· ·---····
p<O. 01,

1789

PA8A

d

.

4. 3�o. 25

1,10 2）.
a゜CAbso,bance at p●●• abso,otlon●●velonoth • sE0

0.8こ0 25

(SJC sunscreen so I ut I onl.

,' 4 3 4•- 9『 +- ＋0 1 6 7
1 2 2 2

TCSA/UVA

Sun, c c●●n ●●● nt

C,＇C

TCSA/UYAA

Amounts of TCSA-epidermal cell pho­
toadducts formed in earlobes

と
5

A
B

Exp● riment 3

Table 2

0.3 ! o.22 .a.·b

8C

Absorbance spectrum of TCSA-epider­mal cell photoadducts formed in ear­lobes. Five% solutions of sunscreen wereapplied to earlobes before irradiation.
The values represent the absorbance of
extracts equivalent to 2 X 10' cells/ mR.
The data were expressed by subtracting
the absorbance of extracts from thesame number of epidermal cells ob­
tained from mice untreated with TCSA
and sunscreens.

Eu ,we111 n;cospons� とSE
cm)(x 10-

CC

8
3

8onzophenone -3

2'0

iCSA/UVA38

TCSA/UVA

Exp● r-1● mnt 2

Wavelength (nm)Fig.2

15• ,un● c , ●●n ,oiution)A

2さSun,cceen ,oent

3
8

Exo● dm● nt I

Cha11enoe

83Sens i ti zatlon

0
1l

G,oup

Effects of sunscreens on the elicitationof contact photoallergy and ordinary
contact allergy

25

Table 1210

(experiment 3)。

x

DNF B接触過敏症には何ら影響を与えなかった

Fiv● • ,olutlons we,e appliod to ,adobes beto,e i"adl●tlon.

o<O. 05,254-262,omo●9● d with the vehlcl● o,ouo•

d st●ti● tlc a lly not sionifl
C●nt. ,omo● ,ed w,tn th● veh ic I● ● ,ouo.

como●9● d with G,ouo E.

b p<0.01.·comoa,edwith G,ouo● C and O.

' ,tat I● tlcally not slonlllc•nt, compa,ed with G,ouo E

4. 考
UVAサンスクリ ー ンであるbenzophenone-

3, Parsol 1789はUVBサンスクリ ー ンである
-84-

察

今回の実験結果はマウス接触光過敏症が化粧品

接触光過敏症のマウスモデルを用いた化粧品による光アレルギーのスクリーニングおよびサンスクリーンの効果の評価の光アレルギ ー 能のスクリ ー ニングおよびサンス

strictions of the major histocompatibility com

クリ ー ンの UVA に対する遮断効果の評価に利用

plex. J Invest Dermatol 79: 108-115, 1982.

できることを示した。 各光感作物質の耳翼腫脹度2) Tokura Y, Takigawa M : Immunologicalには差があり、 惹起反応の弱いものもあったがシMechanisms of contact photosensitivity. Eur

クロフォスファミドを前投与することにより反応

J Dermatol 3: 87-91, 1993.

をより顕現化することができた。 化粧品に含まれ3) Tokura Y, Takigawa M, Yamada M : lnduc­

る香料、植物由来の成分は、 現在においても光アtion of contact photosensitivity to TCSA usmgーレルギ 能を有するものが存在すると考えられ、

photohapten-modified syngeneic spleen cells

さらにはサンスクリ ー ン、 ボディロ ー ションはそArch Dermatol Res 280: 207-213, 1988.

れ自体日光暴露を前提として使用されるため、 本

4) Tokura Y, Satoh T, Takigawa M, Yamada M

ニング: Genetic control of contact photosensitivity toー

モデルを用いた光アレルギ 能のスクリーは利用価値が高いと考えられる。 またマウスを用

tetrachlorosalicyIaniiide. I. Preferential ach­

いるため個々の化粧品における接触光過敏症の免

vation of suppressor T cells in low responder

疫学的な機序解明を可能としうる。

H-2k mice. J Invest Dermatol 94 : 471-476,

TCSA 接触光過敏症モデルは UVA サンスク1990.

ー ンの光遮断能を評価するうえで、 有用である

5) Takigawa M, Miyachi Y, Toda K, Yoshikoka

ことも明らかとなった。 この遮断効果は光ハプテ

A : Mechanisms of contact photosensitivity in

ンが表皮細胞に光結合するステップを抑えること

mice. IV. Antigen-specific suppressor T cells

によって起こされる。 TCSA は蛋白と光結合す

induced by preirradiation of photosensitizmg

リることが明らかとなっており、 恐らく接触光過敏site to UVB. J Immunol 132: 1124-1129, 1984

症の initial step は TCSA が表皮ケラチノサイト

6) Miyachi Y, Takigawa M: Mechanisms of con­の膜あるいは細胞質の蛋白に光結合することにtact photosensitivity in mice. III . Predictive

よって生じると考えられる

8)。 サンスクリーン

testing of chemicals with photoalergemc po­

は UVA を吸収することにより、 この step を抑

tential in mice. Arch Dermatol 111 : 736-739,

制するといえる”。 サンスクリーンによる UVA

1983.

の遮断は、 臨床的に UVA を作用波長とする皮膚

7) Tokura Y, Yagi H, Ihda H, Takigawa M :疾患が多いこと、 UVA が色素沈着の原因波長とEvaluation of ultraviolet-A protection by

なることなどより注目を集めている。 この意味に

sunscreen agents using a mouse model of con­

おいて、 本系は従来の物理学的計測法に加えて、tact photoallergy. J Dermatol Sci 7:39-44,

in vivo の系でのサンスクリ ー ンの効果の評価を1994.

可能とする。

8) Tokura Y, Yagi H, Satoh T, Takigawa M: In­
hibitory effect of melanin pigment on sensiti­

文 献zation and elicitation of murine contact pho­1) Takigawa M, Miyachi Y: Mechanisms of con­tosensitivity : Mechanism of low responsive­

tact photosensitivity in mice. I. T cell regula­ness in C57BL/10 background mice. J Invest

tion

Dermatol 101: 673-678, 1993.

ofcontact

photosensitivity

totetrachlorosalicylanilide under the genetic re--85-

人工皮膚を用いた皮膚の形成機構に関する研究
広島大学理学部

吉

里

勝

利

The mechanism of formation of skin was studied using a reconstituted skin model.
The dermal model was made by culturing fibroblasts in three dimensional lattices ofcollagen (collagen gel culture) . It was found in this model that cells recognize andbind collagen fibrils utilizing their cell surface protein, cellular fibronectin (cFN)
Collagen fibrils induced the synthesis and phosphorylation of specific proteins in cells.
To develop a technique to grow hair follicles in the skin model, dermal papilla cells weresuccessfully immortalized by transfecting them with SV40 viruses. These cell lines
should be useful for identifying a hair-inducing factor.

言

緒

•I-

．

胞、 真皮線維芽細胞およびECM C主としてコラ ー ゲンとフィプロネクチン）を用いて人工的に動物の器官や組織は細胞と細胞外基質(Extra­

再構築する。 この再構築体を用いて表皮細胞と真cellular Matrix, 以下ECM)を構成要素として

皮線維芽細胞の相互作用に関する研究を行う。 ②

これらが複雑な様式で結合し、有機的複合体とし皮膚付属器官としての毛をも有する人工皮膚を構て特異的形態をとり種々の機能を果たしている。

築することを目指す。 ③

最近の細胞生物学や生化学の進歩により、これらの形成機構を、特に細胞とECMの結合様式を中の構成要素を純粋な形で分離することが可能と心に解析する。 ④なった。 本研究では、皮膚の構造と機能をより深用を生化学的に調べる。

人工皮膚を用いて皮膚皮膚細胞に対するECMの 作

く理解するために、皮膚から構成要素を分離した

2. 実験材料および方法

後、これらを用いて、皮膚を再構築して人工皮膚を作ることを試みた。 皮膚の主要構成要素の分離
およびそれらの性質に関しては、 これまでに多く細胞は正常ヒトまたはラット(Fisher系）の皮の研究がなされてきた。 しかしながら、これら構

膚から得られた真皮線維芽細胞または表皮細胞を成要素を用いて生体皮膚に類似の構造と機能を持用いた。 これらの細胞の分離と培養は既に公表しつ人工皮膚を再構築することに成功した研究例はた方法に従った I, 2) 。 人工真皮（線維芽細胞のない。

コラ ー ゲンゲル培養）は既報の方法に従って作製

本研究は次の目的をもって行われた。 ①

生体した 3) 0皮膚に近似の構造と機能をもつ人工皮膚を表皮細
The study on the mechanism of formation of theskin utilizing a reconstituted skinmodel

3. 結 果3. 1

人工真皮における線維芽細胞とコラ ー ゲンの結合様式

Katsutoshi Yoshizato

線維芽細胞をコラ ー ゲンゲルの中で三次元的にFaculty of Science
Hiroshima University

培養するとゲルが収縮し、 生体真皮に類似した形
態を示す

-86-

4)

。 ゲルの収縮は線維芽細胞とコラ ー人工皮膚を用いた皮膚の形成機構に関する研究

コ ラ ー ゲン上では 364個のスポット

ゲンが結合すること、 およびその後の細胞の運動なっていた。

などによって引きおこされる。 従ってゲルの収縮を確認できたが、 そのうち 26%はコラ ー ゲン上過程を調べることによって真皮形成過程におけるでのみ合成されており、前2者では合成されてい線維芽細胞と コ ラ ー ゲンの結合・認識機構を明らなかった。 残りのスポットはプラスチック上の細かに することが出来るものと思われる。

胞でも合成されているものであったが、 このうち私達は既にこのゲル収縮を特異的に阻害するモ

26%は コ ラ ー ゲンによってその合成がup-regu­

ノクロ ー ナル抗体A3A5を得ることに成功した 5) 0

lationされており、 23%は逆にdown-regula­

A3A5が認識する抗原は細胞性フィプロネクチン

tionされていた。 残りはプラスチック上のもの(cFN)である。 cFNが確かにゲル収縮過程でと同じ合成率であった。 以上の結果は細胞による重要な働きをしているかどうか検討した。 細胞をタンパク質の合成 パタ ー ンは基質依存的であり、充分量のcFNで処理した後コラ ー ゲンゲル培養

コ ラ ー ゲンは細胞のタンパク質合成の質と量のいを行ったところ収縮の促進がみられた。 逆に コ

ずれにおいても多大な影響を及ぼすことを示して

ラー

ゲンをcFNであらかじめ処理した後ゲル培いる ” 。

養を行うと収縮は抑制された。 これらの事実はゲ

コラ ー ゲンと細胞の接触が刺激となって細胞のル収縮過程でcFNが重要な働きをしていること

タンパク質合成の量的および質的変化を引き起こを示唆している。

しているものと考えられる。 この刺激の細胞内伝
プを決達の仕組みの 一端を知る目的で細胞内タンパク質定することは、 cFNと コ ラ ー ゲンの結合様式をのリン酸化の パター ンを調べた。 この時以下の理知る上で重要である。 FNをV8プロテア ー ゼや由でEGFの剌激伝達に対する コ ラ ー ゲンの影響

トリプシンでi肖化して断片化した。 得られた断片を見るという方法でこの問題にアプロ ー チするこのうちで A3A5と反応する最小分子量を持つものととした。

のアミノ 酸 シー クエンスを決定することでこの問で顕著な も の の 一 つは分裂抑制である 8) 。

題を解決しようとしている。 現在の段階ではまだ

ラ ー ゲンの農度依存的に細胞のDNA合成は顕著結論が得られていない。

に抑制される 3 , 9) 。 一方EGFは線維芽細胞のcFN分子上の A3A5に対するエビトー

コ ラ ー ゲンの細胞に対する効果のうち
コ

mitogen の 一 つで あ る 。 そ こ で EGFに よ る
線維芽細胞に対するコラ ー ゲンの作用

DNA合成の活性化の過程に コ ラ ー ゲンはどのよ

皮膚形成の過程でECMは細胞と結合し、種々うな影響を示 すか調べることによってコラ ー ゲンの影響を細胞に与えているものと考えられる。 ヒによって引き起こされる変化を追跡することにし3.2ー

卜真皮由来の線維芽細胞をコラ ゲンを基質とした。

てこの上で培養し、 細胞にどのような変化が表れ

低血清濃度(3%)培養液で線維芽細胞を培養るか検討した。 コント ロ ー ル基質としてプラス

してEGFを 3ng/叫の濃度で添加するとDNA合

チック上およびゼラチン上で細胞を培養して、 コ成が高まる。 この時、 タンパク質のリン酸化の パ細胞を sーメチ
ラ
オニンで標識し、 二次元電気泳動をO'Farrell

ター ンを調べた。 細胞を32 pの無機リン酸で標識の方法に従って行った。 360から 420個のタ ンパ

電気泳動を行った。 この時細胞はプラスチックあク質スポットを得ることができた。 ゼラチンとプ

るいはコラ ー ゲンの上で培養した。 リン酸化タン

ラスチック上の細胞の二次元パター ンはよく似てパク質の二次元電気泳動パター ンを両者で比較しー ゲン上のものと比較した。

s5ー

してタンパク質を可溶化して既述の方法で二次元いた。 ところがコラ ゲン上で培養された細胞のた。 パタ ー ンはほとんど同じであったが、 分子量

タンパク質 パタ ー ンはそれらと比べるとかなり異27,000のタンパ ク質の挙動に興味が持たれた l O)

-87-

0

このタンパク質には等電点の異なる2 つのスポッ

しかも興味あることにこの因子はプラスチック上トが存在していた。 一つは等電点(pl)が5.3でに培養された線維芽細胞に対しては効果を示さず

pp27a、 他はpI5.5でpp27bとそれぞれ名付けた。

に、 コラ ー ゲンゲル中の線維芽細胞に効果を持つ

後者はコラ ー ゲン上、 プラスチック上あるいはことである。

EGFの有無に関係なくリン酸化タンパク質とし

この分子量48,000を持つタンパク質の本体にて出現するがpp27a は特異的な挙動を示した。

興味がもたれたので、 本研究で次の実験を行った。

EGF添加後、 直線的にリン酸化され15分で最高表皮細胞によるconditioned mediumを調製し、値になり、 その後リン酸化の程度は減衰した。

これを抗原としてマウスを免疫した。牌細胞とミpp27aのリン酸化をプラスチック上とコラ ゲン

エロ ー マを常法に従って融合させハイプリド ー マ

上で比較するとコラ ー ゲン上では著しく抑制されを作製した。 このハイプリド ー マの中にコラ ー ゲ

ることがわかった。 最高値レベルで比較すると約

ンゲル溶解を阻害するクロ ー ンがあるかどうか検1/4に抑えられていた。 pp27aのリン酸化はH7

討したところ、 いくつかのクロ ー ンが得られた。

（プロテインキナ ゼC阻害剤）で抑制される。

この中でも最も阻害効果の高いクロ ー ンに注目し、またジェニステイン（チロシンキナー ゼの阻害剤）

このモノクロ ー ナル抗体に結合するタンパク質のでも70%のリン酸化抑制がみられた。 これらの分析を現在行っているところである。

ーー

結果はpp27aタンパク質のリン酸がコラ ー ゲン
線維土では抑制され、 そのことが細胞のEGF反3.4人工皮虐に毛を導入するための基礎的研究

応性を鈍くしている可能性を強く示唆している。

現在までに種々の細胞組み込み型の人工皮膚を

3. 3皮儒再構築体の中での表皮細胞と線維芽が分化したものである。 この分化過程で毛乳頭細開発する試みがなされてきた。 毛細胞は表皮細胞
胞（真皮毛乳頭細胞の一種）が重要な働きをして細胞の相互作用3.1 の項で述べた方法によってヒト真皮由来のおり、 この細胞の影響下で表皮細胞が毛母細胞ヘ

線維芽細胞をコラ ー ゲン線維の三次元的立体格子

分化する 13) 。 毛乳頭細胞が合成する特殊な成長の中に埋め込んで培養することによって真皮様構因子がこの作用をもっているのではないかと考え造を構築する。 この構築体の上面に別途調製したられているが、 その実体は不明である。 人工皮膚

表皮細胞を播取し、 皮膚様構造を構築する。 これに毛を導入する技術を開発するに当たって、 このはBell等によって開発された人工的に作られた因子の実体解明が必要と考えられるのでこのため皮膚等価物である

II)の基礎研究を行った。 因子解明の障害となってい。

この皮膚等価物をラット(Fisher)の皮膚細

るものの一つは毛乳頭細胞の増殖力である。 毛乳胞を用いて構築したところ次のような現象を見いだした I 2 l 。 表皮細胞や線維芽細胞をそれぞれ単増殖力が弱く、 因子を解明するのに必要な数の細独にコラ ー ゲン上（表皮細胞の場合）であるいは胞を得ることが困難であった。 そこで次の試みを

コラー ゲンゲル中（線維芽細胞の場合）で培養し頭細胞をin vitroで培養することは可能であるが行った。 ラットC Fisher)の頬髭を抜き取り、てもゲルの溶解現象はみられない。 ところが皮膚

毛乳頭を顕微鏡下にて分取した。 直ちに exp lant

等価物では、 ゲルの溶解が起こる。 この溶解現象

cultureを行い細胞を増殖させp rimary cultureを詳しく調べたところ、 次のようなことがわかっを得た。 この細胞にSV40ウイルス遺伝子を常法ている。 表皮細胞は分子量48,000のタンパク質に従って感染させたところ、 増殖クロ ー ンを7つを分泌しているが、 このタンパク質は線維芽細胞得た。 このクロ ー ンには確かにウイルス遺伝子がによるコラゲナー ゼ合成促進作用をもっている。

組み込まれていることをLarge T抗原に対する-88-

人工皮膚を用いた皮膚の形成機構に関する研究

コラ ー ゲン線維による細胞のタンパク質合成

特異抗体によって免疫染色することによって確認②

した。 このうちの1つのクロ ー ンについて次の実の量的および質的制御、③験を行った。 まず頬髭毛胞を別途調製し下半分を質のリン酸化の変化および、④ 人工皮膚への毛切除し上半分のみとした後、 さらに毛幹を抜きの導入に関する基礎研究。 これらの研究は皮膚の取った。 この毛胞の切断面に毛乳頭を挿入しこれ

正常な機能と構造を可能にしている仕組みを理解

をpositive controlとした。 この実験のnegative

する上で役に立つものと期待している。

コラ ー ゲンタンパク

controlは無挿入の毛胞である。 実験群はSV40

5. 総 括によって形質転換した細胞（およそlび個）を挿入したものである。 これら毛胞をラット腎臓の皮膜下に植え込んだ。 20日後に開腹し毛胞の変化

本研究は予定の課題に向かって比較的順調に展を調べたところ、 positive controlと実験群では開できたと思っている。 本研究は4つの項目に分

白い毛幹の伸長がみられたが、 negative control

けて実施された。 それぞれの項目について最終目

ではそのようなことはみられなかった。 この実験標に達するまでには今後の研究が必要である。 こは形質転換して無限増殖能をもった毛乳頭細胞がれからもこれら項目について研究を継続して理想毛の誘導能を保持していることを示している。 今

的皮膚モデルに 一歩でも近づきたいと考えている。

後、 毛誘導因子の実体解明にこの形質転換細胞は引用文献

大変有用であると考えている。

1) K. Yoshizato, S. Kikuyama and N. Sh10ya,

4. 考 察Biochim. Biophys. Acta,67,23 (1980) .
2) K. Yoshizato, A. Nishikawa and T.Taira, J.
Cell Sci.,91,491 (1988) .

本研究は人工皮膚をモデル実験の対象として扱

3 ) K. Yoshizato, T. Taira and N. Yamamoto,い、 皮膚の性質を明らかにしようとして行われた。

Biomed. Res., 6,61 (1985).

皮膚は体の表面を覆っており、 美容や外傷などの問題を考えるとき第一4) E. Bell,B. lvarsson and C. Merril,Proc. Natl.

に考慮に入れる必要のある

Acad. Sci. USA.,76,1274 (1979).

臓器である。 その意味で皮膚の人工モデルを作る

5) H. Asaga,S. Kikuchi and K. Yoshizato,Exp

ことは重要である。 これまでいくつかの試みが報

Cell. Res.,193,167 (1991).

告されている。 言うまでもなく本物に近いモデル

6) P. H. O'Farrell, J. Biol. Chem., 250, 4007

が理想であるが現状ではほど遠い。

(1975).

この中でもBellらによって開発された人工皮

7 ) N. Koseki and K. Yoshizato, Cell Adhesion

膚は注目に値する。 この人工皮屑は全て生体由来

and Communication,1,355 (1994).

の材料で作られているからである。 3項でも述べたごとく、 このモデルはコラー8) R. Sarber, B. Hull, C. Merrill, T. Soranno

ゲン、 表皮細胞、真皮線維芽細胞によって作られている。 非常に単and E. Bell,Mech. Age. Dev. 17, 107 (1981).

純なモデルではあるが、 現実の生体皮膚の性質を

9) K. Yoshizato, A. Makino and K. Nagayosh1,
Biomed. Res. 9,33 (1988).

in vitroで再現することができる。 勿論全ての性

10) N. Koseki and K. Yoshizato, in preparation

質の再現には至ってないが重要ないくつかの性質(1994).

の研究には優れたモデルであることは間違いない。

11) E. Bell, H. P. Ehrlich, D. J. Buttle and T.

本研究はこのモデルを利用して次の研究を行った。 ① 線維芽細胞とコラ ー ゲン線維の結合様式、-89-

Nakatsuji,Science 211, 1052 (1981).

12) K. 8. Nishikawa and K. Yoshizato, Biomed.

13) C. A. B. Jahoda, K. Horne and R. F. Oliver,
Nature311,560 (1984).

Res.11, 231 (1990).

-90-

サンスクリ ー ンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究
浜松医科大学古川福実

UVB is well known to induce anti-ENA antibody binding on the surface of humancultured keratinocytes. In SLE-prone MRL/lpr mice, UVB irradiation accelerates theonset of skin lesions and augments the cytotoxicity of cultured cells. Based on our previ­
ous reports, we examined the preventive effects of sun screen on DVB-induced changes
in uitro and in uiuo.
Normal human cultured keratinocytes were purchased from Clonetics (EPI­
PACK, San Diego). MRL/1 mice were maintained in our laboratory. As the sun screen,di- (p-methoxycinnamoyloxy) -mono- (2'-ethylhexanolyloxyl) propane was dis­solved in acetone for in uitro test and in the base cream for the in uiuo test.
In uitro MTT assay revealed the 1- 2 % sun screen solution in acetone blocked com­pletely the DVB-induced cytotoxicity of EP!-P ACK cells, mouse keratinocytes andmouse fibroblasts in culture. Anti-ENA antibody binding to cultured human ker­
atinocytes was markedly suppressed by sun screen. Long-term exposue to 500mJ le而
UVB light accelerated the development of skin lesions in MRL/1 mice painted with base
cream. In contrast, 2 or 4 % sun screen painting blocked the early onset of skin lesions.
These results suggested the usefulness of sun screen in the prevention of photocyto­
toxicity in human and murine lupus dermatoses.

1. 緒 言未だ充分に解明されているとは言い難い面があるのも事実である。
紫外線の細胞障害性や易感受性の研究において近年、 日光特に紫外線による皮膚障害が、 有棘は従来、 地表に到達しない短波長紫外線 (UVC、細胞癌や基底細胞癌などの悪性新生物、加齢およ部の自己免疫疾患の発症あるいは修飾因子と波長 280nm 以下）を用いた研究が主であった。

して注目されている。 主たる原因は皮膚を構成す

しかし、 実際の日常生活においては、 UVB やる表皮細胞や線維芽細胞の中波長紫外線 (UVB、UVA C 長波長紫外線、

波長 280-320nm) に対する細胞障害性や易感受

胞障害性や易感受性が問題となる。 この点につい性にある。 このような紫外線による皮膚障害を防ては、 国内外の研究成果は十分ではなく、 易感受止する目的で多種のサンスクリ

性の検索方法については確立した方法さえもない

一

び

一

ー

ン剤が用いられ

波長 320nm 以上）の細サンスクリ ーのが現状である。 そこで、 我々は今回下記の点を、ン剤の組織障害性に対する防御作用については、

主に免疫学ならびに生物学的手法により明らかに定の効果をあげている。 しかし、Immunological Effects of Sun Screen on Hu­
man and Murine Keratinocytes
Irradiated with UltraViolet B
Light
Fukumi Furukawa

するために研究を行った。
1) UVB 照射に対する培養細胞の易感受性の検討
2)サンスクリ ー ン剤の紫外線（特にUVB) による細胞毒性防御能は均 ーであるか否か。 すHamamatsu University
School of Medicine

なわち、 各個人別の培養表皮細胞を得ること
により、 その均 一 性の有無を検討する。

-91-3)サンスクリ ーン剤の自己免疫疾患とくにエリ

レ ー トを用いた発色法によるMTT法あるいは蛍テマト ー デスにおける光線過敏性（易感受光顕微鏡を用いたAO/EB法を用いた。詳細は、性）への 有効性が指摘されている。紫外線にコスメトロジ ー 研究振興財団研究業績中間報告集

対する易感受性に対するサンスクリ ーン剤の第2号p63-79, 1993に記載ずみである。
Pam、 HSCあるいはMRL/1マウスの線維芽

有 用性の解析を行う。

細胞に対するUVB 50mJ/c面の単照射において、

2. 実験と結果2%SB(プラスチック皿に SB溶解液を入れ、 皿越しに照射。 照射線量は、 溶解液を入れた皿越し

2. 1に培養細胞面での測定値。）は、 完全に細胞障害

細胞毒性への効果

培養細胞株として、 マウス由来のPam212、性を阻止した（表 1)。 HSCや線維芽細胞では、

HSC-1 C人由来皮膚squamous cell carcino­ma)を用いた（京都大学医学部皮膚科井階幸

線量依存性の傾向が伺えた。

一先生より分与）。 また、 成人あるいはマウスの表

表1

Percent inhibition of UVB-induced cyto­
toxicity by sunguard B

皮あるいは真皮線維芽細胞の培養を行った。
ヒト表皮培養細胞は、 新生児包皮より 得た皮店
組織を0.25%トリプシンで4℃ 20時間処理した
後、 表皮と真皮を剥離した。 表皮細胞浮遊液は、
MCDB153培地を基本とするKGM培地で無血清の条件下で型のごとく(37℃、 5% C02イン
キュベ ー タ ー 内） 行った。 真皮組織はコラゲナ ー
ゼ処理で線維芽細胞浮遊液を得た後、 10%F CS
を含んだM199培地で培養した。 また、 正常人や
光線過敏性を示す代表的疾患であるル ー プスエリ

Concen1ra1ion of Sunguard 8

Cell

0.5%

1.0%

2.0%

Pam 212

0%

0%

100%

100%

HSCー1

0

60士11

100

100

MRL/1 fibroblasts

0

43士7

49土21

100

Results are expressed as the mean (士1SD) of
three experiments.
l) Sunguard B was dissolved in acetone.
2) A single 50mJ/crr1 UVB light irradiation was
performed.

テマト ー デス(LE)の患者の表皮細胞培養は、

ヒト培挫表皮細胞へのUVB照射による細胞障

我々が開発した人工表皮水疱作製器 I . 2 >と培養害性は、 包皮由来あるいは成人由来においても線

方法 3) を用いて 行った。

量依存性に認められた。 図lは、 正常人(Con­trol)と光線過敏性を有するLEの培養表皮細胞

マウスの表皮細胞と真皮線維芽細胞の培養も、基本的には上記の方法によった4)を用いた結果を示している。 正常人はLE患者に。

サンスクリ ーン剤として、 di-(p-methoxycin -比して高い細胞障害性を示し、 新生児包皮のnamoy loxy)-mono-(2'-ethy lhexanoy loxy)

値 8) より高値を示した。 また、 培養細胞の条件

propane(サンガ ー ドB、 以下SB)を用いた。

が安定すれば、 個人差（細胞障害性）は新生児包実験によっては、 SBのコントロ ールとして base

皮の場合とほぼ同様であった。 そして、 2%SB

cream (oil 13 %, moisture 7 %, UV ab­によって、 UVBによる包皮あるいは成人培養表

sorbent 8 %, P-25 3 %, water 69 %)を用いた。

皮細胞の障害性は 阻止された。

線源として、 Toshiba FL-20SE30サンラン

自己免疫マウスのMRL/1では、 我々はすでに同ラン プは 305nmの波長にビ ー ク

コントロ ー ルのMRL/nマウスに比べてUVBにを有し、 UVR -305/365による測定で 15 cmの距

対する細胞障害性が高いことを報告した 4) 。 今

離で 2.4mW /c面の energy outputを示す。

回の実験においては、 例えば培養表皮細胞の場合、プを用いた。

細胞毒性の検定には既報 4) のごとく、 96穴プ
-92-

著明な抑制効果があることがMTT法を用いて明サンスクリ ー ンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究

30

らかとなったが、抑制の程度には、両マウス間に゜ー25

有意な差は見られなかった。図 2 は、第 2 代培養
表皮細胞にUVB200mJ/c面を照射したときの細（凌

2

匿璽100 mJ/cm2
仁50 mJ/cm2
仁コ 0 mJ/cm2

胞毒性の結果を示している。

50
1

A1 9 XO +O +f.Q

2. 2 自己免疫現象に対する効果
2.2.1
MRL/1マウスの場合
MRL/1マウスは代表的な自己免疫マウスで、4-5ヶ月齢にみられる皮疹はヒトLEの皮疹モデ
ルである 5) 。このマウスを用いて、図3の実験計

5

画に沿って照射を二日ごとに総計28回行った。
我々の従来の研究結果 6) よりUVB 500mJ/c而
LE(6 cases)

図1

Control(10 cases)

Cytotox1city of Cultured Keratinocytes to
UVB2) 2% SB、3) base cream、4)無処置の4つを設定した。肉眼的所見において、1)2)群

亡コ： non-treated

で著明な皮疹誘発抑制効果が見られるものの、他の免疫学的所見において差が見られないのは既報のごとくであった。そこで今回の実験では、表皮内の免疫担当細胞であるランゲルハンス細胞の動I n

25 I20（図3のC)照射群で有意な肉眼的所見が得られることが判明していたので、今回の照射量を500
mJ/c面と設定した。処置群として1) 4%SB、T

霊： sun screen

態を検索してみた。その結果、表 2 に示すように

SBはランゲルハンス細胞の減少を抑制すること

啄

、一

一J 15
•→一，»

MRL/Mp-lpr/lpr(MRL/1)
MAL/Mp—+/+(MRL/n)

1.5-mo-old
I
0 O O UV irradiation A:Control
B:100mJ/cm2

.80 1
ぢ、 0

uve(c:soo

D:10005

MRL/1(newborn)

MRL/n(newborn)

UVB; 200mJ/cm 2
図2

E:1 J/cm2
F:10
28 times every two day s
Examination : Light microscopy (skin & kidney)
Ultrastructural microscopy
Skin lupus band test
Anti-DNA antibodies(lg G)
Proteinuria
図3 In vivo UV light irradiation
UVA<

Effects of sun screen on UVB-induced cy­
totoxicity of cultured keratinocytes

-93-

表2

1a·-Langerhans cells in the epidermis of
MR L/1 mice irradiated with UVBて、 この現象は、 UVBに対する表皮細胞の易感
受性のマ ー カ ー として用いられ得る。 この減少に

Number/mm

対してSBがはたして、 抑制的に働くか否かを検4% Sunguard B

3 7. 5士7.1

討した。

2% Sunguard 8

34.7士3.9

Base cream

31.7土5 .2

Treatment

Non

23.9士5.2

Non-iradiated33.7土5.9

新生児包皮より得た第2継代目の培養表皮細胞を用いた。 抗体として用いたSS-A/Ro, SS-Bl
La, RNP, Sm 抗原に特異的な抗血清は、 SLE
患者の血清をスクリ ー ニングすることにより得た。
特異性 の 検 索 は、 double immunodiffusion,

controlc ounter immunoelectrophoresis お よびim­
Results were expressed as the mean (士1SD) of
5 examined mice.

munoblott ing 法で行った。 他に、自己免疫マウが判明した 。 しかし、 この ような傾向はbase

DNA抗体を用い、 コ ントロ ー ルとして正常人血cream群でも見られたことからSB特異的と言え

清(NHS)や無活性培養液を用いた。 測定方法

るか否か問題点として残っている。

は、 Lab-Tek chamber slideあるいは60mm 培

2. 2. 2ス由来のモノクロ ー ナル抗dsDNA抗体と抗ss­

抗ENA抗体結合誘導能

養 用ディシュに細胞を培養し、 70-80% コ ンフ

-UVB易感受性モデルとしてー

ルエンシ ー に達した時、 サンスクリ ー ン処置を

UVB照射によって、 正常人培養表皮細胞表面にENA (extractable nuclear antigens)が発行った後50mJ/c記のUVB照射し、 さ らに24時
間後に免疫組織学的に検索に供した。

7

現されることを従来 より認めてきた - 9 l。 光線
過敏性を示すL.E. 患者の表皮細胞では、 コ ント

一

ロ ー ルに比べて高い発現性を示す（図4)。 従っ
60”のごとく、 Lab-Tek chamber slide 用には、 acet one で、 flow cytometry 用には、 2%検討した。 二次抗体としては、 FIT C 抗ヒトIgGを用いた。 表3に示すとおり、 FACS解析にて明40 30 20

saqoJ
dJ
Ol'l
u1
pu1
q%

らかな抑制効果が認められた。 また、 通常の蛍光抗体法においても同様の結果を得た。
表3

Effects of sun screen on UVB induced bind­ing of antibody probes on the surface of
cultured keratinocytes by flow cytometry
Antibody specificilles

10

Control(10 cases)（--- ） cytotoxic,ty baseline
Antibodies binding to cultured ker­
atinocytes irradiated with UVB (100mJ/
cnl)

-94-

% positive cells
Control

Sun screen

SS-A/Ro

235士6953土1.2

SS-B/La

20.7土6.6

37土3.6

U,RNP

24.6土87

4 1士5114.2土97

54土4.9

<1%

<I%

Sm
NHS•

LE

(6 cases)

図4

報

パラホルムアルデヒドで後固定した細胞を用いて匿璽anti-SS-A
巨anti-RNP
anti-ssDNA
亡NHS

50

抗ENA抗体の培養表皮細胞への結合は、 既Resu Its represent the mean (士1SD) of at least
three experiments. Cells were irradiated with asingle UVB dose of 50mJ/cnl.
*N HS;normal human serumサンスクリーンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究

3. 考

察

文

献

l)古川福実他：京大式人工表皮水疱作製器の紹介
I . 基本設計とその試作。皮紀要84: 5-9, 1989

培養表皮細胞を用いて紫外線、特にUVB照射2)古） If福実他：京大式人工表皮水疱作製器の紹介

による細胞障害性や易感受性を検討した。 特に、II. 水疱表皮の組織学的検討。皮紀要84: 11-14,

UVB照射によって本来細胞内あるいは核内にあ

1989

るU,RNPやSS-A/Ro抗原が細胞表面に移動

3) Furukawa F et al : Serum-free serial culture

する現象は、UVBに対する細胞の易感受性を検of adult human keratinocytes from suct10n­出する方法として有用なものではないかと推察さ

blister roof epidermis. J Invest Dermatol 89 :れた。

460-463, 1989

そして、本研究は、このようなin vitro系にお4) Furukawa F et al : Susceptible cytotoxicity to

いてサンスクリ ー ン剤がUVB照射による表皮細ultraviolet B light in fibroblasts and ker­

胞障害性あるいは易感受性に対してもまた皮膚をatinocytes cultured from autoimmune-prone

場とする自己免疫的現象に対しても抑制的あるい

MRL/Mp-lpr/lpr mice. Clin lmmunol Im­
munopathol 52: 460-472, 1989

は予防的に働くことを示している。 また、 MRL
マウスを用いた実験より本剤の予防的あるいは治5) Furukawa F et al: Dermatopathological stud­

療的有用性が明らかとなった。 今後は、in vitro

ies on skin lesions of MRL mice. Arch Der­のUVBに対する易感受性の検索方法が、真に細matol Res 276: 186-194, 1984

胞表面であるか否か、あるいはin vitroのサンス

6) Horiguchi Y, Furukawa F et al : Effects of ul­

クリ ー ン剤の溶解性の問題等が解決されなければtraviolet light irradiation on the skin of MRL/

ならない。 前者においては、すでにconfocal蛍

1 mice. Arch Dermatol Res 279: 478-483, 1987

光顕微鏡によって、細胞表面の局在を確認したと

7) Furukawa F et al : Estradiol enhances bind­ころである。 このような問題点が、明らかになれ

mg to cultured human keratinocytes of anti­

ば、サンスクリ ー ン剤のさらに詳細な分子的作用

bodies specific for SS-A/Ro and SS-B/La. J

機序をも知ることができるようになろう。

Immunol 141: 1480-1488, 1988
8) Furukawa F et al : Binding of antibodies to

謝 辞

the extractable nuclear antigens SS-A/Ro

本研究に対するコスメトロジ ー 財団の援助に感and SS- B/La is induced on the surface of謝します。 また、本研究は、京都大学医学部皮膚human keratinocytes by ultraviolet light

科今村貞夫教授をはじめ、同大学の多くの先生方C UVL). J Invest Dermatol 94: 77-85, 1991のご協力により可能となったことを付記します。

9) Furukawa F et al : Relationship between heatshock protein induction and the binding of an­tibodies to the ENA on cultured human ker­
atinocytes. J Invest Dermatol 101 : 191-195,
1993

-95-

皮溝と加齢の関係- Direct Skin Sensorを用いた検討 ー
慶應義塾大学医学部

本

間

聡

起

The skin surface patterns of the three locations in 126 healthy Japanese men
aged 25-83 years old, were assesed by using the image of the video camera (DSS
and VMS-1210) . Correlations between age and furrow density of the three locations
were as follows, volar arm ; -0.34, arm ; -0.34, palm of a hand ; -0.19. The area of
furrows were also correlated with age in volar arm C -0.39) . The step-wise multiple
regression analysis revealed that results of % area of furrows, the degree ofanisotropy of thickness and the line density in volar arm were independently corrlat­
ed with age. Assessing the skin surface patterns using the image of the video macro­scope are convenient for the evaluations of progression in skin aging.

言

緒
．
1―

な加齢変化が認められるとされている 2) 。 しかし、 これまでの皮溝・皮丘の研究では、 かなり特殊な機器と技術を必要とするものが多かった 3) 。

老年者および老化の研究のなかで、 老化の指標

今回は、 接触式光源付き拡大スコ ー プを用いるこをどこに求めるのかは重要な課題である。 皮膚にとによって皮溝の状態を観察し、 加齢の及ぼす影

現れるシワは、 体表面から容易に、 しかも非侵襲響を定量的、 定性的評価法を交えて検討をした。

的に観察できる老化の指標として有望視されるも

2. 実 験

のである。 Kligrnanは、 シワをその発生部位、成因を基に4分類したが、 このうちcrinkle (縮緬ジワ）は、高齢者の非照射部位にみられる表面

2. 1

対

象

の細かいヒダを指しており、 内因的な加齢変化に

慶應健康相談センタ ー の人間ドックに受診した基づくものとしている ！） 。 皮膚表面には、 肉眼

25歳から83歳の健康成人男子126名を対象とし的に観察されるシワのほかに、 さらに細かい模様

た。 観察は、 9 月から 11 月の秋期に行った。

があり、 このうちル ー ペで観察されるレベルのものに皮溝・皮丘がある。 この皮溝・皮丘は身体部位によってその様相はかなり異なっているが、腹部や前腕屈側部など、 日光非照射部位では内因的

2. 2

方

2. 2. 1

法皮 溝 の 観察には、 DSS (Direct

Skin Sensor) (フジミック）と、 ビデオマクロ
スコ ー プCVMS-1210)C日本光電）を用いた。

Aging and Skin Furrows

ともに、 光源とつながれた接触端子を被検部位にSatoki Homma

直接あてて、 同部位を前者は約7倍に拡大するもSchool of Med1cme,
KEIO University.

ので、 後者は接触端子内の替えレンズを10倍用として観察を行った。 DSSは、 接続された熱写プリンタに、 VMS-1210はビデオ端子より接続したビデオレコ ー ダー（ビクタ ー HRVl)に記-96-

皮溝と加齢の関係

3. 断裂する肥厚が目立つ

録した。
2.2.2

観察部位は、 A. 前腕屈側肘関節高2. 2. 4

定量的項目として、 次の2項目の検より3-5cm末梢寄りの部位で、 この他にB. 手討を行った。 すなわち、①皮溝密度、 ②皮溝部が背部中央付近、C. 上腕屈側肘関節商より5- 10全体に占める面積率 。 ①皮溝密度については、観cm中枢寄りの2カ所についても観察した。 各々の察記録視野の中央に、 縦、 横2方向の垂線を引き、部位で5カ所以上を観察し、 体毛の ない部位、 シ

こ の 2本 の 線上 に 交 わ る 皮 溝数を 皮 溝 密 度ミ、母斑、 色素沈着の ない部位を被検部位として(Fd)とした（図 1 )。 なお、垂線が交差部を通選択した。 なお、A. C. の部位に明らかな日焼けが認められる 場合は対象外とした。 観察時、被検者は、 座位で自然肢位をとるようにし、観察部位
での筋肉の収縮による影響をできるだけ排除した。
2.2.3

各々得られた拡大像から先ず、以下の7つの項目について定性的評価を行った。 すな
わち、① 皮溝の太さ；
1. 繊

細2. やや太い3. 太 い

図1② 皮溝の直線性；
1. はぽ全ての皮溝が直線性
2.

一

部直線性

3. 全体に皮溝は屈曲性③ 皮溝辺縁のシャ ー プさ；
1. 明
2.

瞭

一

部また
は全体に不明瞭④ 放射度（各交差点で何本の皮溝が交わるか）

DSSによる皮溝· 皮丘の親察
左が27歳、 右が65歳の前腕屈側部で観察したもの過した場合、 その交差部を貫通する皮溝線のみをカウントした。 ②皮溝部の面積率は、 DSSで得られた像をVMS-1210の5倍拡大用の接触端子に代えて観察し、 これをパ ー ソナルコンビュ ー
タ ー C PC-9801DA )の画面上に投影したうえ
で、画 像計測ソフト（スカラ社SPC-120)にて、皮丘部位をトレ ー スすることにより、皮丘部分の面積(Ha)を計測した。 これより観察部位の全

1. 3本以上の交差点が多い

面積(Ta)から、 Ta-Ha/Taを計算し、 これ

2. おもに2本のみの交差点が多い

を皮溝部の面積率(%Fa)とした（図2)。

⑤ 皮溝の配列の規則性（皮溝の方向性がいくつかの方向で一 定しているか） ；
1 . 規則性あり
2. 規則性なし⑥ 観察視野全体での皮溝の太さの均一 性；
1. ほぼ全ての皮溝が同等
2. ほぱ2種類の皮溝に分けられる⑦

3. 様々な太さの皮溝が混在する

それぞれの皮溝の太さの均一性；
1 . ほぼ均一

図2

2. 細くなったり太くなったりする-97-

皮丘部分の面積率の測定

2. 2. 5

各症例から、観察当日に行った人間

ドックでの理学所見、 検査所見のデータを抽出し
た。
2.2.6

得られた結果は、 PC-9801パーソ

ナルコンピュ ー タ ー により、統計解析ソフト（マルチ統計 、 社会情報サービス）を用いて解析を行った。

3. 結 果

璽冒
璽〗
W,d<h

of

''"""''

3. 1

DSSとVMS-1210の画像（図3)の比較

2つの機種で観察した結果、 DSSの方が皮溝

図4

皮丘の判別が明確であり、 皮溝の形態学的特徴を観察するにも適していると考えられたことから、DSSから得られた映像を基に分析を行った。

ヽ ',,Reg u I a
(W,d>h of fu, .ow)

Fu,,owsofF, 『 『 ow,

93

2

29

'

0

J．

0

,0

20

30

<O

SO

'°Ag,

R, g" I• 『I, y (WI o, h ofoach '""owl

定性的評価項目、 各判定レベルの平均年齢、 その1
皮溝の太さ（右上）、 皮溝の直線性（右下）
観察視野での皮溝の太さの均 一 性（左上）それぞれの皮溝の太さの均 一性（左下）*: p<0.05

:::.〕
sh" p

•
A, d; ●' ',,

図3

Ago

図5

VMS-1210で観察した皮溝・皮丘3.2 定性的評価項目
7つの評価項目の各々について、 3回ずつ評価

0"''"'""'

"

"

"

'°

"

Ago

(A,,aogomoot)Ag•

定性的評価項目、 各判定レベルの平均年齢、 その2
皮溝辺縁のシャ ー プさ（右上）皮溝の放射度（右下）
皮溝の配列の規則性*:p<0.05

を行い、 2回以上同じ判定が下されたものを採用あったことから、 年齢の判別に有効なものとは考した。 一致率は、 80-90%であった。 肘関節近えられない。

傍で観察された7項目について、それぞれの判定
レベルの症例における平均年齢を図4、 5に示し

3.3

定量的評価項目た。 皮溝の太さ、皮溝辺縁の明瞭度、 皮溝の太さ

皮溝密度C Fd)および皮溝 部の面積率(%の均一性の3項目に年齢差が認められた。 各皮溝Fa)の測定値のDSS画像上の測定部位による誤1本1本における太さの均一 性については、断裂差を検討したところ、Fd、Faともに7%以内での認められるような症例は高齢者で多くなる傾向あった。 図6は、 肘関節近傍でのFd、 %Faにつであったが、均 一性と判定されたものは少数でいて、 10歳毎の年齢階層別に経年変化をみたも-98-

皮溝と加齢の関係

60

60

50

50

40

40

図8に上腕屈側と手背部で観察されたFd値と年齢との相関を示した。 上腕屈側では、0.34とJO30

肘関節近傍部 と同等であったが、手背部では0.192020であり、年齢以外の要因の関与が大きいことが考

IO

10

えられた。

20
a;

30
t7

7

40
Age

50

3 9

4 8

30

40

50

o:

1 3

Dens;ty7以上より、皮溝・皮丘の加齢変化は、皮溝密度

60

Age

L;ne(Fu«ow)

図6

20

60

1 7

39

4 8

%A r eaofFu r r ow

1 3

Fd (皮溝密度）および% Fa (皮溝の面積率）と年齢との関係、 10歳毎の年齢階層別の減少とその面積率の低下であり、年齢とともに、
皮溝の太さは拡大する傾向があるものの、その太さは多様化し、皮溝辺縁の非明瞭化も加齢に伴う変化と考えられる。

のである。 Fd、%Faについては、 中年期にかけて明確に減少する傾向にあり、 1度プラト ー 状

70.0

Fd

態となるが、 高齢になるにしたがって徐々に減少している。 図7 に、 同じく肘関節近傍での FdとFaの年齢との相関を散布図で示したが、それぞれ相関係数は、Fd 一 年齢が0.34、 %Fa 一 年齢
が0.39であった。
60

40

711.0

Fda63. 55-0. 235*Age

Fd

Age

60.0''
50.0

Fd

50.0,·····

俎.0•·

: .:

冥.0•·

30.0

..:..............,........................

20.0,, ... ,
躙

60

40

Fd=57. 26-0. 223*Age

Age

10.0,.

80.0

0.0

%Fa

,0

60

Fd=29. 15-0. 086!Age．．
図.0! ··... .:·::•.·:
�, . • .． ．

• ' • •• • • • • .: ． ..,.
40.0

.-

I

・・

Age

図8

年齢とFd (皮溝密度）との関係、 上が上腕屈側部、 下が手背部で観察したもの

3.4

年齢を目的変数とした多変量解析

次に、 これらの定量的、定性的評価項目の組合
20.0

40

図

蕊

%Fa;66. 47-0. 2861Age
図7

Age

年齢とFd (皮溝密度）および% Fa (皮溝の面積率）との関係、 前腕屈側部で観察したもの

せによって、この皮溝・皮丘の観察結果から、 どれだけ年齢を予測し得るのか検討した。 Fd、 %Faと定性評価7項目についてはダミ ー 変数を設定して、観察された計9項目を説明変数とする重回帰分析を行った（表1)。 解析は 変数増減法に

-99-

表1

年齢を目的変量とした重回帰分析
変数増減法(F=2.0)

4. 考 察

説明変黛

偏回帰係数

標準回帰係数F値

皮溝の面積率(%F'a)-0 386-0. 291

II.01

皮 溝の 太 さ の 均 一 性

3 565

0.227

7.11

皮 溝 密 度(F d)-0 307-0 200

5. 11-3. 302-0. 152

3. 26にその形態を変化させていくと言われている。 い

決定係数R'=0. 24

わゆる肉眼的に観察されるシワ(Wrinkle)と異個々の皮溝の太さの均 一性

誼相関係数R=0.49 、皮溝(Skin Furrow)は、胎生 4ヶ月には発生していると言われ 4) 、 その後加齢とともに徐々なり、生下時より既に存在し、徐々に変化していより、F値2.0以下の因子を棄却して行った。 その結果Fa値、 観察視野全体での皮溝の太さの均く特徴がある。 シワ同様、紫外線（日光）暴露や筋肉の収縮、機械的刺激によっても大きな影響を

一性、 Fd値、各皮溝1本1本における太さの均受けると考えられることから5, 6 l 、 加齢変化を観一性の4因子が選択され、この重回帰式の重回帰察するためには、できるだけ外的要因を排除でき係数は0.49、 決定係数は0. 2 4であった。

る部位が選択されている。 このことから前腕屈側や腹部で多く検討され てきたが、今回は、さらに

3. 5

身体所見・臨床検査値との対応（表2)

日光照射の影響を受けにくい上腕屈側でも観察し、Fd、%Faと、 臨床所見との関係を検討した。

ここでの年齢との相関係数は、前腕屈側でのもの

表2は、 Fd、 %Faをそれぞれ目的変数、 臨床と同等であった。 しかし、前腕部に比べると筋肉

デ ー タとして、年齢、 一日アルコ ー ル摂取量、 一の収縮の影響を受けやすく、 自然肢位をとるまで

日喫煙本数、肥満度、 収縮期血圧値、拡張期血圧にかなり時間を要するケ ー スもみられた。 手背部値、総コレステロ ー ル値、 中性脂肪値、 HDL­

は、外的要因の影響が顕著な部位だが、予測されコレステロ

ー ル値の 9項目を説明因子とした重回

表2 Fd、 % Faと臨床所見との関係(Fd、 % Fa値を目的変量とした重回帰式）
侶回帰
係数

説明変屈

Fd

標準回帰
係数

F値

響は少なからず存在すると予想され、 今後は、職業、または余暇の過ごし方など、外的要因につい

%Fa

偏回帰
係数

標準回帰
係数

F値

ての情報を詳細に聴取する必要があると思われた。

-0 3751118

観察のための機器としては、 今回はDSSを主に用いた。 VMS-1210のような多目的用の光源·O. 327

12 41-0 284-0 271-0. 0410.22-0. 707-0 106

I. 22

1日喫煙Ji! (本／日）

0 003

0. 0070. 01-0 015-0 032

o. 13

肥

0 038

0 078

0. 45

0 038

0 068

o. 37

0 029

o. 0600 12-0. 063

0. 1130.47

年

齢

1日アルコ ー ル摂取最
（合／日）
満

度(%)

収縮期血圧

·O 215

←

拡張期血圧

0 034

0. 049

o. oa

0 065

o oa1

0. 23

血清総コレステロ ー ル値

·O 030·O. 157

I 91-0 014-0 0640 35

血 消中性脂肪値

0 003

0.013

o. 12

0. 001

0. 019

0. 02

0 023

o. i'-18

0 14-0 148�o. 21s412

血消HDLコレステロ ー ル値

R- 0.38, R'-0.14

た通りに年齢との相関は小さい傾向がみられた。
しかし、 前腕部、 上腕部位でも外的要因による影R- 0.46 、 R'-0.22

帰分析を行った。 その結果、Fd、 %Faともに付き接触式拡大鏡を用いた場合、光線の向きや強さの関係で皮膚表皮のような透過性の高い検体では、 表面の細かい凹凸を描出するのが困難であり、皮溝の観察のためには適していなかった。 しかし、今回検討を加えなかったが、 VMS-1210ではカラ ー 画像が得られることから、 皮丘部の観察、 例
えば滑らかさ、 脂っぽさ、 湿り気といった項目を観察するには有利と考えられる。

年齢の関与が大きく、%Faに対してHDL ― コレ

加齢との関係では、検討したいずれの指標でもステロ ー ル値の関与が認められる他は、特に有意単独で年齢を十分に説明し得るものはなかった。

因子は検出されなかった。

今回検討した対象は、 人間ドックを受診した健常者であったため、年齢が40-50歳代に集中して-100-

皮溝と加齢の関係

おり、全体として年齢との相関が過小評価された有意な相関があるとする報告が成されているが 8) 、ことも考えられる。 しかし、定性評価項目も交え今回の検討からは、皮溝との関係は認められ なて検討すると、年齢を目的変数とした重回帰式のかった。 先の皮溝と真皮層の関連から考えると、相関係数は0.49であった。 従って、評価法の検

局所の物理的刺激を除けば、皮溝は、全身の組織

討次第では、これらの複数の説明要因の組合せがの中で比較的純粋に加齢による影響が見られる部

年齢の評価に有効であることが確認された。 定性

位であると考えられる。

評価では、皮溝の太さ、皮溝辺縁の明瞭度、皮溝

5. 総の太さの均一性の3項目に年齢差が認められたが、括年齢を目的変数とした重回帰式では、Fd、 %Faの他に皮溝の太さの均 一性が有意な説明因子

5. 1として検出された。 以上から今回観察された皮溝を、 25�83歳の健常男性で行った。

DSSを用いた前腕屈側部位の皮溝の観察

・皮丘の基本的な加齢変化は、皮溝の密度の減少とその面積率の低下であり、年齢とともに、皮溝5.2は太くなる傾向があるものの、その太さは多様化

は、皮溝の太さ、皮溝辺縁の明瞭度、皮溝の太さし、 また皮溝の辺縁の不明瞭化も加齢に伴う変化の均一性の3項目に、定量的評価項目では、皮溝と考えられる。 Corcuffらの研究でも

2)

、加齢

観察した項目の中で、定性的評価項目で密度(Fd)、皮溝面積率(%Fa)に年齢との相関が認められた。

に伴う基本的な変化として皮溝密度の減少、皮丘部分の増加を指摘しており、 ほぽ同様の結果となっているが、これらの変化が著明に出現する年

5. 3

代については、今回の結果と多少の違いが認めらによって、年齢との相関係数は上昇し、年齢を目れる。 また、この他に皮溝の深度の増加も加齢現的変数とした重回帰式では、0.49の相関係数で一

象の つとして挙げている。

上記の定性的・定量的評価項目の組合せあった。

皮溝の生理学的な意義としては、皮膚組織にかかる進展に対する予備としての役割が考えられて5.4いる。 高齢者の皮膚組織の変化として、真皮乳頭

皮溝の密度の減少とその面積率の低下であり、加の扁平化が挙げられる。 これにはコラ ー ゲン線維

齢により皮溝は太くなる傾向があるものの、そのの減少と弾性線維網の変性・減少も関与しI)

以上より、皮溝の基本的な加齢変化は、太さは多様化し、 また皮溝の辺縁の非明瞭化もみ

、

られた。

その結果、表皮と真皮の結合が脆弱となることか
ら、高齢者の様々な皮膚障害の発生の原因となる。
皮溝の変化は、 これらの真皮層の変化を反映した”

5. 5

前腕屈側以外に、上腕屈側、手背部でも。 従って、皮溝密度の観察した。 上腕屈側では、前腕部と同等の年齢と減少• その面積率の低下は、真皮との結合力の低の相関が得られたが、手背では相関は弱く、外的下、進展というストレスに 対する抵抗カ・復元カ

要因の影響が大きいと考えられた。

ものと考えられているの低下といった加齢変化を反映していると考えられる。

5.

臨床所見との関連では、%FaとHDL コレス
—

テロ

ー

ル値との間に負の相関が認められたが、この意義については不明である。 顔面のシワと喫煙

6

今後の課題としては、外的要因の影響をさらに詳しく被検者より聴取すること、観察する指標の客観性を上昇させるため、 自動画像解析装置の応用を考える、などが挙げられる。

量との間に、年齢、 日光照射歴を考慮にいれても

-101-

文 献
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tern Med. 114; 840-844, 1991

開放型セルを用いたレ ー ザ ー 光音響法による経皮吸収測定
東京大学工学部澤田嗣 郎

The feasibility of percutaneous absorptiometry technique utilizing an open-ended
Photoacoustic (PA) cell are reported. This PA system is capable of measuring percu­
taneous absorption in vivo with both high sensitivity and accuracy. In addition, it pro­vides the means for very simple measurement, compared with conventional methods
such as radioisotopes.
An in vitro percutaneous absorptiometry was attempted using 1 % indomethacin(IDM) ointment applied to an extracted hairless mouse skin. By this experiment, both
the decrease in the amount of IDM on the donor side by the PA signal and the increase in
the concentration of IDM in the receiver side by UV absorbance were observed alongwith penetration of IDM through the skin.
An in vivo percutaneous absorptiometry was attempted using the 1 % IDM ointment
applied to a hairless mouse. The diffusion coefficient of IDM through the skin in vivo ob­―tained by this PA method was calculated to be 6. 7 X 10 'crrf /min. This was in good
agreement with the results obtained by the conventional in vitro method using a longitu­
dinal diffusion cell.
Based upon the results shown above, it was concluded that the laser PA method us­
ing an open-ended cell was applicable to percutaneous absorption.

1 . はじめに重要な鍵である。 そのため、拡散セルやラジオア
イソト ー プ(RI)などの様々 な方法が開発され

近年、 経皮吸収促進剤や基剤の開発など、外用ているが、 簡便に かつ正しく物質の経皮吸収性剤の経皮吸収に関する基礎的な 研究から開発研究を評価可能な測定法は定まっていない。 特にin

ま で盛んに行われている。これは内服剤と比較しuiuo測定においてはin vitro法よりさらに定まって外用剤は、 効果の持続時間が長いことや副作用ていないのが現状である。in uiuo法においてはが小さいことなどの利点を有するからである。し一般的にRIが用いられているが、 対象薬剤に放かしながら最大の課題は、外的環境に対してバリ

射性物質をマ ー カ ー として施す必要性があり、 測

ア機能を有する皮膚（角層）にいかにして薬剤を定も極めて困難なため、スクリ ー ニング法と して吸収させるかである。医薬品や化粧品などの外用は不適当と思われる。さらに当然のことながらヒ剤を開発する際にも、 ドラッグデリバリーシステト(in uiuo)には適用できない。簡便にかつ正ム(DDS)という言葉が盛んに使われている。

し< in uiuo測定の可能 な評価法が望まれている。

このDDS研究において、薬剤の経皮吸収評価は

我々はこれまでに、 簡便かつ高感度に経皮吸収

Percutaneous Absorptiometry by Laser Pho­
toacoustic Method Using an
Open-ended Cell.
Tsuguo Sawada
Faculty of Engineering,
The University of Tokyo

評価の可能な開放型セルを用いた光音響(PA)法を開発し、 in vitro、 in uiuo経皮吸収測定ヘIの適用を行ってきた l , 2 l。 さらにより測定対象物資を拡大するため、 UVレー ザ ー 光源を用いた
高感度で高精度に適用可能な開放型セルを用いた
UVレ ー ザ ー PA法を新規に開発した叫そして、本法によるヘアレスマウスのin vitro、in uiuo

-103-

経皮吸収測定を行い、対象薬物の皮膚中拡散速度

ドメタシン(IDM; C19H1 uClN04, WakoPure

としての有効性を報告する。

を、ポリエチレングリコ ー ルと混合させた1.0%

Chemical, Reagent class; for biochemistry)を求めた。本論文において本法の経皮吸収測定法

IDM軟膏を作成した。尚、一般的にIDMは消炎剤として用いられている。

2. 実 験
図1 にライトガイドと 一体型の開放型PAセル

3. 結果と考察を用いたin vivo経皮吸収測定システムを示す。
Ar'LASER

PASー 吸光度同時測定によるIDMのm

3. 1

LIQIT
CHOPPERvitro経皮吸収測定

脂肪部を除去したヘアレスマウスの摘出皮閤に

1 .0%のIDM軟膏を10mg塗布し、拡散セルには

生理食塩水を用い 、PASー 吸 光 度同時測定を

図1.

UV-PAS法を用いた筋便かつ高精度な経皮吸収測定システム梃滋行った。このシステムは皮膚上のIDMの残存量をPA法で、皮膚透過したIDM量を吸光度で、連続かつ同時に測定可能なシステムである。図2

光源として2 57nmのUV光を用いた。UV光は、に示した結果のように、PA信号の減少に伴い吸Physics, Model-2020)に非線形光学結晶(/3して吸光度は8時間程のラグタイムが存在するが、なUV発振ユニット(Ascal Corp., UVA-4)

ことによるものと思われる。

5W( マルチ）のアルゴン レ ー ザ ー (Spectra-BaB心4 : BBO)を備えた光学微調整の可能を取り付けることで得られた。レ ー ザ ー ビ ー ムを

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リュ ー ムは小さくなり、測定もより簡便となった。

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作成した。このデザインによってセルのデッドボ

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がった音響パイプをその末端に取り付けることで

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いた。このPAセルは、ライトガイドの末端をセI

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a meter X lm) と 一 体型の開放型PAセルに導.:: so f
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イトガイド(Asahi Glass Corp., 5mm in di­

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チョッパ(NF Corp.)によって変調し、UVラ

これはIDMが皮膚の真皮層内に保持されやすい

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PAセル の共鳴周波数であ る2.2kHz にライト光度の増加が確認された。PA信号の変化と比較

図2.

UV-PAS・吸光度同時測定法によるIDMのin vitro経皮吸収測定た。この共鳴周波数は音響パイプの長さを変える

3. 2

UVレ ー ザ ー PAS法によるin vivo経 皮をこのPAセルを用いて高感度に検出し、ロック

1%のIDM軟膏を実使用量(6mg/10mm¢)、

また、 SINをさらに向上させるため、脈拍や環境ノイズの影響を受けにくい周波数(kHz)で共鳴を起こすようにPAセルの構造をデザインしことで調整可能であった。試料から発生する音波

インアンプで解析することでPA信号を得た。

モデル試料として 、257nm光を吸収するイン-104-

Time [Hour]

吸収測定と皮膚中拡散係数の算出

ヘアレスマウスの背部に塗布しin vivo経皮吸収測定を行った。この時、UVレ ー ザ ー 光の温熱に開放型セルを用いたレーザー光音響法による経皮吸収測定―6

よる経皮吸収促進の影響を防ぐため5分ごとに測10定を行い、ロックインアンプなどの微小信号器の厚(L)=O.lcm)この値は、従来のin vitro拡散機能を考慮して1回の測定にかける時間を15秒とセル法により得られた値(3.5 X 10 6 C面/min.)した。 優れたS/N (40以上）で得られたin vivoとオ ー ダ ー で一 致した。 この結果より、本法の経測定の結果を図3 に示す。 基剤のみ塗布し同条件

皮吸収評価法としての妥当性が得られた。

直/min.となった。

（ヘアレスマウスの皮膚
―

n=S

80
[
Aユ]

0.00

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1% IDM Ointment

50

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Vehicle20-0.08℃ 607 m,n

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図3.

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10

20

30

40

Time

[min.]

50

60

20
Time

UV-PAS法によるIDMのin vivo経皮吸収測
定（対象：ヘアレスマウス）

図4.

(min.]

経皮吸収理論に基づいた対数法による時定数の決定(IDMの皮膚中拡散係数の算出）

で測定を行った参照信号とIDM軟膏を塗布した

4. まとめと今後の課題

場合を比較すると、前者は時間に対してほぼ一 定であるが後者は60分後に初期PA信号に対して5％の信号の減少が認められた。 UVレ ー ザ ー 照射開放型セルを用いたレー ザ ー PA法は、高感度によるIDMの破壊や光変化は認められず、このかつ高精度にin vivo経皮吸収測定が可能であり、PA信号の減少はIDMの経皮吸収に伴うものとRIなどの従来法と比較して極めて測定が簡便で考えられた。 そこで、 IDMのヘアレスマウスのある。 さらに、本法を用いれば、経皮吸収に関す

in vivo皮膚における皮膚中拡散係数を、得られる新たな情報を得られる可能性があり、測定法とたPA信号から求めることを試みた。 これは、しての有効性も示された。 また、本報告においてPA信号の経時変化から時定数を定めることで求は光源としてレー ザ ー 光を用いているが、高出力めることができる 4) 。 皮膚上の物質の濃度の減のキセノンランプあるいは重水素ランプなどを用

少変化は基本的に指数関数で表されるので、時定

いれIfより多くの物質に本法を適用できる。

数はPA信号を対数でプロットすることで得られ現在、本法のヒトin vivo皮膚への適用を検討る。 また、膜中の物質の拡散理論より、時定数て中である。 この際の唯一の課題は、UV光の皮膚は次の式で記述される。
て =4L勺冗の安全性についてである。 可視光を光源とする場
z

D

合は、皮膚に対する波長と照射エネルギーの最大(L: 膜厚、D: 物質の膜中拡散係数）

許容値がわかっているので問題はほとんどない。

この原理を得られたPA信号(Fig.2)に適用す

しかしながら、波長が300nm以下のUV光の場

ると、図4に示したようにはて(607分）は相関

合には、実験例が少ないことやこれらの光が地表係数0.948で得られ、これより拡散係数は6.7 Xに到達していないこともあって、最大許容値は明-105-

確に定められていない。 従って、 光強度を可能な限り小さくし、 十分安全性を検討した上で適用す

Sawada, T. Anal. Chem. 1992, 64, 2661-2663.

3) Takamoto, R. ; Yamamoto, S. ; Namba, R. ;Takamatsu, T. ; Matsuoka, M. ; Sawada, T.

ることが必要である。

Anal. Chem. 1994, (in press) .

引用文献
I) Takamoto, R. ; Namba, R. ; Nakata, 0. ;Sawada, T. Anal. Chem. 1990, 62, 674-677.

4) Steven, D. C.; Sinclair, S. Y.; Martin, A. A.

IEEE Transactions on Biomedical Engineer­
mg 1976, BME-26 (4), 220-227.

2 ) Takamoto, R.; Namba, R.; Matsuoka, M. ;-106-

神経ペプチドによる皮膚炎症反応の成立機序とその特異的制御
千葉大学医学部

岩

本

逸

夫

Substance P(SP), a potent proinflammatory peptide which is present m sensory
neurons, causes granulocyte (neutrophil and eosinophil)infiltration in mouse skin by
inducing mast cell degranulation. Therefore, we determined which mediator from cuta­
neous mast cells mediates SP-induced granulocyte infiltration in the skin by the use of――
mediator antagonists. Subcutaneous injection of SP(10 7-10 'M)caused granulocyte in­filtration in the skin of BALB/c mice in a time-and concentration-dependent fashion.
Pretreatment with the LTB, antagonist decreased SP-induced neutrophil andeosinophil infiltration in mouse skin at 6h to the same extent that an inhibitor of mastcell degranulation disodium cromoglycate decrease those responses. However, pre­treatment with the PAF antagonist affected neither SP-induced neutrophil nor
eosinophil infiltration at 6h. A LTC, ID, antagonist and a histamine H, antagonist
chlorpheniramine had no effect on the granulocyte infiltration, either. The LTB, an tag­onist also decreased SP-induced neutrophil, but not eosinophil, infiltration in mouseskin at 24h. Second, we determined whether SP increases the expression of an adhesion
molecule ICAM-1 on human vascular endothelial cells. The amount of ICAM-1 on hu­
man umbilical vein-derived endothelial cells(HUVEC)was measured by a cell ELISA―
assay using an anti-ICAM-1 monoclonal antibody. SP(lO 'M)increased ICAM-1 ex­
pression on HUVEC in a time-dependent fashion, reaching a maximum at 16h. The―
amount of ICAM-1 on HUVEC was increased by 2.2寸old in the presence of SP(10 'M),
the potency of which was the same as that of IL-1 f3 (lOng/ml). The C-terminal peptide
SP,_ u also increased ICAM-1 expression on HUVEC, whereas the N-terminal peptide
SP,-, was inactive. Cycloheximide(0.5mM)inhibited the increase in SP-induced !CAM
-1 expression, indicating that SP induces the synthesis of ICAM-1 molecule. In addi­tion, HUVEC were found to have high affinity SP binding sites(Kd = 0.69nM, Bmax= l.6
X 10' sites/cell). We conclude that LTB, is a major mast cell-derived chemotactic me­
diator for initiating SP-induced neutrophil and eosinophil infiltration in mouse skin andthat SP increases the expression of ICAM-1 on human vascular endothelial cells.

1 . 緒 言スタンスPをはじめとする感覚神経ペプチドは強い炎症惹起作用を有し、種々の物理的あるいは化

各種炎症性皮膚疾患の成立には免疫学的機作の学的刺激により神経終末から遊離すると、皮膚の関与が示されている。 最近神経ペプチドが免疫反

血管透過性冗進および顆粒球浸潤を惹起する。 し応の増幅・調節および炎症反応の惹起に深く関与たがって、 神経性炎症の成立機序およびその特異していることが明らかにされてきた。 とくにサプ的制御機構を明らかにすることは、各種炎症性皮Role of neuropeptides in neurogenic inflamma­tion and its regulation
Itsuo Iwamoto

膚疾患の成因と治療の解明に重要と考えられる。
すなわち、 本研究の目的は、
1)神経ペプチドによるマウス皮膚炎症反応とくに顆粒球浸潤の機序を明らかにする。 とくに、
顆粒球遊走に関与する肥満細胞由来のケミカル

School of Medicine
Chiba University

メディエ ー タ ー の同定と血管内皮細胞活性化の関与の有無を明らかにする。

-107-2)神経ペプチドによる血管内皮細胞活性化の機的拮抗剤ON0-405和の効果を検討した。
―

序を明らかにする。とくに、神経ペプチドが血ON0-4057 (20µ,g/g)はSP(10 5M)皮下管内皮細胞上の接着分子の発現に関与している投与30分前に マウス腹腔内に前投与し、SP皮下か否かを明らかにする。また神経ペプチドの 血投与6時間後の顆粒球浸潤を調べた。また ONO-

管内皮細胞に対する増殖作用の有無を検討する。

405 7 C 20µg;g)をSP皮下投与30分前および12以上から皮膚における神経ペプチドによる炎症

時間後の2回腹腔内投与し、SP皮下投与24時間反応の機序およびその制御機構を明らかにする。

2. 実 験

後の顆粒球浸潤を調べた。
2.2皮膚神経性炎症における血管内皮細胞活性
化の役割

2. 1

マウス 皮 膚における神経性炎症モデルのSPによる血管内皮細胞活性化の機序をヒト培

解析
2. 1 . 1

養内皮細胞を用い検討した。
神経ペプチドによる顆粒球浸潤の機序

1)血管内皮細胞上のSP受容体の性状およびサ

皮膚における神経性 炎症の実験モデルとして、プタイプを3H-SPによる結合実験により検討

マウス皮膚のサプスタンスP(SP)による顆粒
ll

した。

。

2) SPがICAM-1 をはじめと する血管内皮細すなわち、まずB ALB/ Cマウス左側腹部 に0.9

胞上の接着分子の発現を誘導するか否かをモノ

叫 のair を皮下注してair blebを作製し、SP

クロ ー ナル抗体を用いた免疫細胞学的方法によ

球浸潤を Lawmanらの方法を用い解析した

(10

―5

M) 0.1 叫を皮下注した。対照としてはり木金言寸した。

PBS 0.1叫を皮下注した。6あるいは24時間後に3) SPが血管内皮細胞の増殖因子であるか否か

マウスを致死させ、air blebの部分を切り出し

を3H-TdRの取り込みにより検討した。

てスライドグラスの上に標本を作製し、 Wrigh­

3. 結 果Giemsa染色を行った。400倍にて鏡検し、任意の5視野の好中球および好酸球の総数を求めた。

3. 1 サブスタンスPによるマウス皮膚顆粒球浸SPによる顆粒球浸潤における皮膚肥満細胞および血管内皮細胞の役割を明らかにするため、SP

潤の機序

―

のN末端ペプチドとC末端ペプチドを用い顆粒

SP (lo-s-10 sM)皮下投与は10-1Mより用球浸潤、肥満細胞脱顆粒および血管透過性冗進を量依存性に好中球および好酸球浸潤を惹起した。

検討した。
2. 1 .2（好中球； 7.2士2.6vs 37.3土5.0/5視野、PBS―

ター 拮抗剤の効果
各種メディエ ーvs SPlO 7M、 平均土SD. 好酸球； 4.1士2.Q VS

SPによるマウス皮膚顆粒球浸潤か肥満細胞依10.4土2.4/5視野、PBS vs SP 10- 7 M、P<存性か否かを調べるため、肥満細胞脱顆粒抑制薬
disodium cromog lycate (DSCG )ziの効果を0.005 、 n=各5匹）。 その際SP 10-1Mより用量検討した。すなわち、DSCG ( lOOµg/叫）ある1 )。

いはPBS をSP(10―5

依存性の肥満細胞の脱顆粒が認められた(Fig.

M)とともにマウスに皮次にマウス皮膚における顆粒球浸潤がSPのN下投与し（総量0.1叫） 6時間後および24時間後

末端ペプチドまたはC末端ペプチドのどちらにの皮閤顆粒球浸潤を調べた。

よって惹起されているか調べるため、 N末端ぺ

SPによるマウス皮膚顆粒球浸潤の惹起にLTB4が関与しているか否かを調べるため、 LT比特異

プチド SPい4とSP1-sおよびC末端ペプチド

SP← IIとSPs-11各々を皮下投与して顆粒球浸潤-108-

神経ペプチドによる皮膚炎症反応の成立機序とその特異的制御

A

80

で有意な顆粒球浸潤を引き起こさなかった(n =5)。 肥満細胞脱顆粒惹起物質であるcompound60

48/80 (0.5-50µg/叫）の皮下投与は用量依存性に 好中球および好酸球浸潤を惹起した(n =5)。

40

SPフラグメント皮下投与によるマウス皮膚肥

20

゜

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」

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Spf
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nUBJ8 0!

――とSPG - 1 1 (10-6-10 4 M)はいずれも10 4Mま満細胞の脱顆粒を比較検討すると、 N末端ペプ
チドのSP1- 4 は有意の肥満細胞脱顆粒を引き起
―

-9

PBS

10

-8

10

-7

10

-6

10

-5

10

こさなかったが、 SP1 -9 (10-5-10 4 M)は用量依存性に肥満細胞脱顆粒を引き起こした。 しかB

意の肥満細胞脱顆粒を惹起しなかった。 Com­30pound 48/80 C 0.5-50µg/叫）は用量依存性に
肥満細胞脱顆粒を惹起した。
LTB4拮抗剤ON0-4057はSP皮下投与6時間,後のマウス皮膚好中球および好酸球浸潤を抑制した。 まず肥満細胞脱顆粒抑制薬DSCG (lOµg)

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l
E1
nueJ6ao

投与はSP (10 -5M)皮下投与6時間後の好中球
8 10

9
10

O%)
(
uo,
suapca J
re1
nuEJ
6ap a>,し、 C末端ペプチドSP4 -uとSPG -11いずれも有

PBS

-7

10

-6

10

-5

10

浸 潤 を 85.7 %抑 制 し たC 74.8 土 7.7 vs 16.1
土3.5 個 /5 視野、 SP vs SP + DSCG、 P<

0.001 、 n =6匹）C Tab.l)。 ON0-4057前投与(20µg/g)はSP (10-5M)皮下投与6時間後

Substance P (M)Fig.1. Concentrat1on-dependent substance Pinduced granulocyte infiltration (A) andmast cell degranulation (B) in mouseskin.
The granulocyte infiltration (neu­trophils;solid columns and eosinophils;
stippled columns) and mast cell degranu­
lation were examined at 6h after the subcu­
taneous injections of substance P (10-'-10-5M) .Data are means 土 SD for 5 to 8 miceat each concentration.

の好中球浸潤を74.1 %抑制した(75.4土7.3 vs24.6 士 3.6個/5視野、 SPvs SP+ ON0-4057 、P< 0.001、 n =6) (Fig.2)。

同様にDSCG C 10µg )投 与はSP C 10- sM)皮下投与による6時間後のマウス皮膚好酸球
Table 1の有無を検討した。 N末端ペプチドSP1-4 (10-•-10- 4 M)は10- 4 Mまでで有意な顆粒球浸潤を惹起しなかった(n =5)。 しかしSP1- s (10-•―
10-4 M)は10 s Mより有意な好中球浸潤を惹起

Effect of Disodium Cromoglycate on
Substance P-induced Granulocyte In­
filtration in Mouse Skin

Subcu<ancous
Injections

Number of Granulocytcs (per five ficl山）a
Ncutrophil,

Eosinophils

4.4 士 1.8
41.3 土 4.5
13.6 土 1.8拿

PBS

6.3 士 2.8

した(6.9 士 3.3 VS 26.Q 士 3.5と38.3 士 3.3/5視野、Substance P

74.8 士 7.7

PBS vs SP1 -s 10 5 Mと10 4 M 、 P< 0.001 、 n

Substance P + DSCG

16.l土3.'5'た(3.1土1.5 vs 9.0土1.9と14.0土2.3/5視野、

magnifica1ion of x400 at 6 h aOerthe subcutancnus injections of substance P (lo-5 M) in―=5)。 SP1 -sは10――sMより好酸球浸潤も惹起し――

PBS vs SP1 -s 10 sMと10 4 M 、 P< 0.005 、 n=5)。 C末端ペプチドSP―

4- 11 (10 •-10

―4

M)

• The number of granulocytcs infiltrating into the skin of BALB/c mice was counted at a

the absence or presence of disodium cromoglycate (DSCG; IOOµg/ml).
Data a,c mean 士 SC for six mice.
• significantly different from the corresponding mean value of substance Palone, p<0.00 I.

-109-

40 30 20

芸 e>モ翌）―

゜

ON0-4057sp(

゜

SO山 ko」aqw nN
dOU!
lj
!
Sl

80 60 40 20

!Jad)
!a>!
a!
sp1
(

O JaqE nN
4dOJぢ aN J!
S1CV-620950

10

Chlorphen.

Fig.2. Effect of mediator antagonists on sub­stance P-induced neutrophil infiltration inmouse skin.
Mice were preinjected intraperitoneal­
ly with a mediator antagonist ( solid
columns) or its vehicle (open columns),
and the neutrophil infiltration was exam­
ined at 6h after the subcutaneous injectionof substance P (1炉M) .CV-6209; a PAF
antagonist,ON0-4057; a L T84 antagonist,
and Chlorphen.; a histamine H, antago­
nist. Data are means土SD for 5 to 6 mice.•
significantly different from the mean valueof the corresponding vehicle、•p< 0.001.

ON0-4057

CV-6209

Chlorphen.

Fig.3. Effect of mediator antagonists on sub­stance P-induced eosinophil infiltation inmouse skin.
The eosinophil infiltration was exam­
ined at 6h after the subcutaneous injectionof substance P. Experimental protocols
and symbols are the same as in Fig.3.Da­ta are means土SD for 5 to 6 mice. • signifi­
cantly different from the mean value of thecorresponding vehicle, •P < 0.001.

には好中球と好酸球上の接着分子とそれに対応する血管内皮細胞上の接着分子間の特異的結合を介個/5視野、 SP vs SP + DSCG、 P<0.001、 n

しており、好中球浸潤ではICAM-1/LFA-1 ・=6)(Tab.1)。 ON0-4057前投与(20µg/g)

Mac-1 が 、は同好酸球浸潤を71. 3%抑制した(4.1土4.6 vs

VCAM /VLA-4が重要と考えられる。

15.1士2.1個/5視野、 SP VS SP + ON0-4057、

p

浸潤を75.1%抑制した(41.3土4.5 vs 13.6土1.8。

そこで SPによる ヒ ト 培 養 血 管 内 皮 細 胞(HUVEC)上のICAM-1の発現を新しく開発(Fig.3)n =6)

く0.001、分子の発現と増殖
次にSPが血管内皮細胞上の接着分子の発現を調節しているか否かをヒト培養血管内皮細胞を用いて検討した。 すなわち顆粒球が組織へ浸潤する

-llO-

10

サブスタンスPによる血管内皮細胞の接着

ON0-4057

゜

3.2

DSCG

50 40 30 20(Fig.4)。

」2 回）は有意に は抑 制 し なかった

q nN
o aE
k

µgig、

60
I8AljJad)•!
SPl(

したが、 (P<0.001、 n = 4)、 ON0-4057(20゜

DSCG (10µg) は同好酸球浸潤を34.4%抑制

4d0U1SO山!
Sl( Fig.4)。
n=4 )

8N j
4dOJ!J1
1
s1
O JaqE nN

後の好中球浸潤を各々40.1%と34.4%抑制した

00 80 60 40 20
ー
1a" I,ad)a1
sp1(

さらにDSCG (10µg)とON0-4057 (20µg/g、 2回）はSP(10-5M)皮下投与 24時間
(P < 0.001 と P< 0.002 、

好 酸 球 浸 潤 で は そ れ に加えて

DSCG

ON0-4057

Fig.4. Effect of disodium cromoglycate and of a
L TB, antagonist ON0-4057 on substanceP-induced granulocyte infiltration inmouse skin at 24h.
The granulocyte infiltration was examinedat 24h after the subcutaneous injection ofsubstance P (1いM) . Data are means 土SD for 4 mice. •.•• significantly different
from the mean value of the corresponding
vehicle, •p < 0.002
p < 0.001.
、●●

神経ペプチドによる皮膚炎症反応の成立機序とその特異的制御

した抗 ICAM-1 モノクロ ー ナル抗体 を用いた

Absorbance 250

VEC 上の ICAM-1 は無剌激でも中等度発現し200

cell ELISA 法にて行ったC Fig.5) 。 まず HU­(Xcontrol)

SP 添加後の HUVEC 上の ICAM-1 量ていた。

4 時間後より増加し 16時間となった (Fig.6) 5>。 また SP

150を経時的に調べると、以降ほぼプラト―ー100

10 s M の低濃度から ICAM-1 発現を増加させ、――
SPlO 8-10 7 M で最大となった (Fig.7) 5>。 さらに SP の C 末端ペプチドと N 末端ペプチドでICAM-1 発現への効果を検討すると、 C 末端ペプチドに活性があり N 末端ペプチドは効果がな
5)かった。 また こ の SP による HUVEC 上の

4

ICAM-1 発現増加が新たな蛋白合成によるもの
か否かを検討したところ、 この ICAM-1 の発現増加はシクロヘキシミドにより完全に抑制された

5)。 以上から SP は血管内皮細胞を直接刺激し、ICAM-1 合成を増加させることを示している。
しかし SP は HUVEC 上の VCAM-1 の発現は誘
次

①

8

12
16
Time(h)20

24

Fig.6. Time course of substance P-induced
ICAM-1 expression onHUVEC.
HUVEC were stimulated with SP (10 -•M) at 37℃ for 4 to 24h. The amount of
ICAM-1 on HUVEC was measured by acell ELISA and was expressed as% of theabsorbance in unstimulated HUVEC.

さらに 3H-SP を使った結合実験から HUVEC

上にはNK-1型の高親和性 SP 受容体が存在することが判明した(Kd=0.69nM、 Bmax = l.6 X
―

―

レ '‘

体体
抗抗
レ

T­
ナナ
ロロ
クク
知却

4い
AMeA
ICV

ニ
[

導しなかった。

6

10 り細胞）。 また SP C 10 9_10 s M)を添加して HUVEC を培養すると、 非添加群に比し2-2.5倍細胞数が増加した。

＞②

ピオチン化二次抗体(30二j③

分、 4 ℃ )芦杞Absorbance(%control)

盆

200

150

ストレプトアピジン—ピオチンベルオキシダーゼ複合体

j
④ 基質

ニ

よ枯芯

⑤ 吸光度の測定(450nm)

雷゜分、 4℃)

心正

Fig.5. Measurement of ICAM-1 on human umbilical vein-derived endothelial cells(HUVEC) by a cell ELISA assay using
an anti-lCAM-1 monoclonal antibody

100

-9

-8

-7

-6

Substance P (Io蝉）Fig.7. Dose-response curve of substance P-1n­
duced ICAM-1 expression onHUVEC.
HUVEC were stimulated with SP (10-• 10-sM) at 37℃ for 16h.

— -lll-端ペプチドおよびN末端ペプチド両者の活性を

4. 考 案有しているので、N末端ペプチドにより肥満細胞の脱顆粒が惹起されると同時にC末端ペプチド

今回の研究でSPによるマウス皮膚顆粒球浸潤

がその他の細胞に効果を発揮して顆粒球浸潤を増はそ のN末端ペプチド依存性に惹起されると強している可能性が考えられる。その可能性の1考えられた。すなわち、SPのN末端ペプチドつとして、SPがその C 末端ペプチドを介して直SP 1-9のBALB/Cマウスヘの皮下投与は用量依

接血管内皮細胞に作用し、血管透過性冗進などを存性に好中球および好酸球浸潤を惹起し、同時に惹起することが考えられる I Ol 。それによりSP

肥満細胞脱顆粒も惹起した。しかし、 C 末端ペプの場合は血管透過性冗進により肥満細胞からの走チドSP4-II とSPs-11の皮下投与は有意な顆粒球化性メディエ ー タ ー の作用増強や血管内皮細胞上浸潤を惹起せず、また肥満細胞脱顆粒も認められの接着分子の発現増強などを介して、顆粒球浸潤なかった。

が増強される可能性が ある。事実SPは培養ヒト

SP皮下投与によるマウス皮膚顆粒球浸潤は、血管内皮細胞上のIC AM-1の発現を増加させる。

肥満細胞欠損マウスでは有意の顆粒球浸潤が起ここれに対しSP I -9 とcompound 48/80は 血管内らないことから、肥満細胞依存性であることが示

皮細胞に対する作用はなく血管透過性冗進作用をされている 6 , 7 >。今回の結果であるN末端ペプ有さない。

チドSP 1-9がマウス皮膚の顆粒球浸潤と肥満細本研究により、LTB4がSPによるマウス皮膚

胞脱顆粒を引き起こすことは、in vitroの実験系

好中球および好酸球浸潤の主要な肥満細胞由来走でN末端ペプチドがラットなどの肥 満細胞の脱化性メディエ ー タ ー であると考えられる。すなわと一致する。また C 末

ち、LTB,, 拮抗剤ON0-40573) 前投与によりSP端ペプチドSP4-11とSPs-11が有意な顆粒球浸潤

皮下投与6時間後の好中球と好酸球浸潤は抑制さ顆粒を惹起すること8, 9)を惹起しなかったことは、これ ら がin vitroで肥れ、その抑制の程度はDSCGのそれと同程度で満細胞脱顆粒を引き起こさないこと 8 , 9 >と一致

あ った。さ らにON0-4057はSP皮下投与24時

す る 。な お 、 同じSPのN末端ペプチドでも間後の好中球浸潤をDSCGによるそれと同程度

SP I - 4 が 顆粒球浸潤を惹起しなかったことは抑制した。しかしON0-4057はSP皮下投与24

SP I�4 が in vitroで肥満細胞脱顆粒惹起作用を時間後の好酸球浸潤は有意には抑制しなかった。

ほとんど有さないこと 8) と矛盾しない。今回N

LT恥は好中球と好酸球に対する強力な走化性

末端ペプチドとしてSPぃ，を用いた主な理由は、

II I
メディエ ー ターである - 3 l 。しかしごく最近

C末端の2個のアミノ酸を欠くことによりSPのま でLTB"特異的拮抗剤 がなかったため、in作用を発揮するのに必要なNK-1受容体との結vivoの実際の炎症反応におけるLTB4 の役割は解合力がないことと肥満細胞との反応性を有してい析できなかった。今回我々は新し く開発された

ることによる。 C 末端ペプチドとしてSPs-11をLTB4 拮抗剤ON0-40573 )を用い、肥満細胞由来

用いたのは、NK-1受容体を剌激しうる最小ののLTB4がSPによるマウス皮膚顆粒球浸潤に関C末端ペプチドであることによる。

与していることを示した。本拮抗剤は〔 3 H〕

SPによる顆粒球浸潤を同じ程度の肥満細胞脱LTB4の各種動物好中球に対する結合を競合的に

顆 粒 を 惹 起 す る濃度で比較し た 場 合、SP は疎外し、その特異性もleukotriene C 4 とDぃ

SP I -9 あるい はcompound 48/80に比しより強

種々prostaglandins、血小板活性化因子などと＜顆粒球浸潤を惹起した。SPがより強く顆粒球の交叉性がないことが示されている 3) 。

浸潤を惹起する機序として、SPそのものは C 末-112-

最後に本研究により、皮腐における神経ペプチ

神経ペプチドによる皮膚炎症反応の成立機序とその特異的制御

ドによる炎症反応の成立機序の一端が解明された。

Leukotriene Res. 21:407-410, 1990.

この研究成果は皮膚炎症反応の抑制と修復の秩序

4) Iwamoto, I., Tomoe, S., Tomioka, H. andある促進に有用な知見と考えられ、 コスメトロ

Yoshida, S.: Leukotriene B, mediates sub­

ジ ー の分野に貢献すると考えられる。 すなわち、

stance P-induced granulocyte infiltration in

化粧品を含め種々外来異物は皮膚感覚神経を直接

mouse skin. Comparison with antigeninducedー

granulocyte infiltration. J. Immunol. 151:2116

的あるいはアレルギ 反応を介して間接的に刺激-2123,1993.

して、 神経ペプチドを遊離させる。 遊離した神経ペプチドは、 皮膚肥満細胞、顆粒球、 血管内皮細5) Nakagawa, N., Iwamoto, I., and Yoshida, S.:

胞など多くの細胞を活性化し炎症反応を惹起させ

Effect of substance P on the expression of an

ると考えられる。 まず第一に、

コスメトロジ ーadhesion molecule ICAM-1 in human vascu­の原因的治療の観点からすると、 化粧品の開発は感lar endothelial cells. Regul. Peptide 46:223-

覚神経のサプスタンス P などの神経ペプチドを遊

225, 1993.

離させないことが大切で、化粧品の安全性の指標

6) Matsuda, H., Kawakita, K., Kiso, Y.,として考慮されるべきであろう。 次に、 遊離した

Nakano, T. and Kitamura, Y.: Substance P

神経ペプチドによる炎症反応の特異的 抑制には

mduces granulocyte infiltration through de­

SP 拮抗剤をはじめとする 神経ペプチドの特異的

granulation of mast cells. J. lmmunol. 142:

拮抗剤の皮膚局所投与で有効性が期待できる。 さ927-931, 1989.
7) Yano, H., Wershil, B.K., Arizono, N. andらに LTB4 拮抗剤や ICAM-1 拮抗剤が有効であGalli, S.J.: Substance P-induced augmenta­

ることが示唆される。

tion of cutaneous vascular permeability and以上から、 本研究の成果は化粧品による直接的
あるいはアレルギー 反応を介した間接的な皮膚神

granulocyte infiltration in mice is mast celldependent. J. Clin. Invest. 84:1276-1286, 1989.

経性炎症に対する効果的な治療法の理論的根拠を

8) Fewtrell, C.M.S., Foreman, J.C., Jordan, C.

与えると考えられる。

C., Oehme, P., Renner, H. and Stewart, J.M.:

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other lipoxygenase products. Clin. Exp. Im--114-

皮膚の機能と脂質代謝に関する基礎的研究
新潟大学医学部

小

野

輝

夫

A novel skin-type fatty acid-binding protein, termed cutaneous(C)-FABP was pu­
rified to homogeneity from rat skin cytosol by DEAE-cellulose chromatography, fol­
lowed by chromatography on Mono S and Superdex 75 gel filtration. Although the par­tial amino acid sequence of C-FABP was homologous to those of known rat FABP fami­ly, especially heart FABP, C-F ABP was distinct from them with respect to the immunological properties and an apparent molecular mass.

ー

． 緒 言

最近Razaら 4) はネズミ皮膚のエビデルマ ー ルサ
イトゾ ー ル に 分子量14-15kDaのFABPが存

一般に各種動物組織のサイトゾ ー ルにはその細在することを示唆している他、 S churerら 5) は胞 種に 特異的な分子量約15kDaの低分子で、脂ヒト の培養ケラチ ノサ イ トで66 kDaおよび38

肪酸を特異的にリガンドにする脂肪酸結合蛋白kDaの 高分 子FABP の 存在 を 示 唆 し たほか(FABP)のス ー パ ー ファミリ ー 蛋白が発現されM adsen 6> も 乾癬と関連したFABP様蛋白が活ている。 これ らのFABPは細胞の機能発現、脂発に増殖している乾癬真皮で高度に発現されてい肪酸転送、代謝上重要な働きを演じていると考えることを報告しているが、FABPファミリ ー とられるが、これまで肝臓、心朦、骨格筋、脂肪細の関係は明確でない。 我々は皮膚組織を構成す

一胞、腸組織、ミエリン鞘などから 次構造の異なる各種細胞が活発なタ ー ンオ ー バ ー を行っている

る肝型、心筋型、脂肪細胞型、腸型、 シュワン細ことから、脂肪酸も活発に代謝されていると推定

I

胞型が 同定されている . 2) 。 この蛋白ファミリー

し、FABP分子種の検索をネズミ皮膚について

は脂肪酸の他細胞内に見出される低分子のレチ

行った。

ノ

ー

ル、レチノ

リン応蛋白スーー

ル酸結合蛋白をも包含するミエ

2. 実 験

パ ー ファミリ ー と呼ばれている。

この他に もリガンドを既知の脂肪酸やレチノー

ルなどと同定出来 ないが、明らかにこのファミリ ー

2. 1に属するI-15P蛋白も我々の研究室で見出され
3)

ネズミ皮膚サイトゾ ー ルの調製

体重300gスプラグ・ダウリ ー ネズミ(6匹）の背、皮膚組織でのFABPに関部皮膚5cm平方を電気カミソリで剃毛後切り出する報告はこれまで少なく 一次構造は不明である。

し、出来るだけ皮下脂肪組織を除いた後、 氷冷生

報告されているがBasic Studies on lipid metabolism of skin:lden­tification of Fatty Acid-Binding
ProteinTeruo Ono
School of Med1cme
Niigata University

理的食塩水に浸し 細片して30mMトリス塩酸緩衝液pH 7.3 (5mM EDTA、 2 mM PMSF、
lmM DTTを含む）内でポリトロンホモゲナイ
ザ ー を用いてホモゲナイズした。 得られたホモゲ
ネ ートは30分lOOOOXg で遠心後さらに125000X
gで90分超遠心してサイトゾ ー ルを調製した。

-115-

2.2

法 8) により測定した。 先ずエタノ ー ルに溶解し

C-FABPとH-FABPの純化

た放射性脂肪酸と C-FABPあるいはH-FABP

ネズミ皮膚 サイトゾ ー ルを 30mMトリス塩酸
緩衝液pH8.0(5mM EDTA、 2mM PMSF、 1をlOmM燐酸カ リウム緩衝液pH7.4で37℃1時

mM DTTを含む）で透析後、 上記緩衝液であら間培養した。 培養の最終容量は 500IL 1で 各構成

かじめ平衡化したDE-52(2.5cm X 15cm)の陰分の最終濃度はC-FABPあるいはH-FABPはー

イオン交換樹脂カラムに適応した。 50mM 2 モ

0.3µM、 エタノ ー ルは容量比で1%、 脂肪酸 0.2

ルフォリンエタ ン硫酸緩衝液pH5.5で溶出させ-20µM C比活性 12000dpm/nmol)を用いた。

た時の非吸着画分を集めて透析後、 同じ緩衝液で10分間氷冷後反応混液に氷冷 50%Lipidex懸i蜀

あらかじめ平衡化させたベットボリュウム 1ml

液 75叫を添加し 4℃10分間培養した。 LipidexのMono Sカラムにかけ、 同じ緩衝液で洗浄後、は15000 X g 5分遠らで除き上清の200叫を液体

各緩衝液 60mlを用い 0-0.5MNaClのリニアグ

シンチレ ー ションカウンタ ーで 放射能を 測定した。

ラジエントで溶出した。 180-190mM NaClに

3. 結果と考察

相当する画分をプ ー ルし 50mM燐酸カリウム緩衝液pH7.0であらかじめ平衡化したHiload 26/
60ス ーパ ー デックス 75カラム(2.6cm X 62cm)に

3 .1

分子的性状

適応した。 C-FABPはSDS PAGE上単ーな分

ネズミ皮膚より調製した各精製段階でのc­

子量 約 15kDaの蛋白として精製された。 心筋型

FABP標品のトリ シン SDS PAGEパタ ー ンをのH-FABPは既に報告した方法で ネズミ心筋よ図lに示した。 ネズミ皮膚のサイトゾ ー ル試料に

”

り精製した

。

混在した血清 アルプミンは陰イオン交換樹脂に吸着して除かれたが、 C-FABPは非吸着画分とし

2.3

アミノ酸配列の決定て回収され、 陽イオン交換樹脂に吸着することか精製したC-FABPをリジルエンドペプチダ ー

ら C-FABPの等電点は塩基性かそれに近い値をゼ(Achrobacter lyticus)で酵素／基質蛋白比1:持つと推定された。 純化したC-FABPのSDS

20(重量比）で 80mMトリス塩酸緩衝液pH8.5中PAGE上の移動度は純化したH-FABPよりもで 25℃8 時間i肖化を 行った。 得られたリジルエン

やや遅かった。 6匹のネズミ皮膚（各 5cm X 5

ドペプチダ ー ゼペプチドは高速液体クロマトのcm)より1.0�1.2mgのC-FABPを得 たがこれ

CH Capcellpackカラム(0.46 X 15cm)で分画し

は総サイトゾ ー ル蛋白の約1%に相当した。 従っ

た。 容量で 0.1% TFA中に アセトニト リルのリて C-FABPは他のFABP分子種と同様に正常

ニアグラジエントで溶出させた。 ペプチドの溶出な ネズミ皮膚サイトゾ ー ル中に豊富に存在する蛋は214nmの吸光度で追跡した。 アミノ酸配列の白の一つといえよう。

分析は120Aフェニルヒダントイン分析計を備えたアプライドバイオシステムの470Aガス相配列

3 .2

部分一次構造精製したC-FABPは既知の一 次構造を異にす分析装置で行った。

る FABP 分 子種で あ る 、
2. 4

H-FBAP 、 L­

FABP、 I-FABP、 aP2、 I-15Pに対するポ脂肪酸結合能の測定

Lipidex 1000および[1-14cJステ アリン酸

リクロナル抗体を用いたウエスタ ー ンブロット分

はシグマおよびアマ ー シャムから購入した。

析で全く検出されず、 免疫学的に明らかに識別さ

FABP蛋白からの脱脂およびC-FABPと H­れ、 新しいファミリ ー蛋白である可能性 が示唆さ

FABPに対する脂肪酸の結合は教室の人見の方れた。 他のネズミ FABP分子種と 一 次構造を 比-116-

皮膚の機能と脂質代謝に関する基礎的研究

5

4

3

2

ー
(kDa),

97.4-

66.245.031 . 0-

21. 514. 4-

L-FIIDP
1-F八DP
11-FIIBP
C-Fl\BP

19 21
29 31
18
1
MNFSGKYQVQSQENFEPFM
l\MG!.l'EDLl
KGKIJ I Kt'V
KMGlNVVKRMIIFUGTWKVYRNENYEKFMLGIIIIDN!.K
SLGVGFATR
ADIIFVGTWKLVIJSKNFODYM
VIISM'l'KP'I'
ELGVGL紅R
WRLVESIIGFEDYM
MGAM八KPD

t.-FIIDP
1-FIIBP
H-Fl\HP
C-FIIBP79 10967
127
l'l'N'l'MTLGUlVYKRVSKR lEECELE'l'M'l'GEKV
l.lOTY'l'YEGVP.I\KHlFKKE
VDFI\YSLIIDG'l'EI,
VEFDEVTI\DlJRKV
I. I 1.1'!.'l'IIGNVVSTR匹EKE!\lJVVEXVMNNI\J XTRVYETEXFXTFLDGI\LV

Fig.2

“一

Partial amino acid sequences of rat
FABPs. Numbering is based on the pri 一
mary structure of L-FABP. Identicalamino acid residues of C-FABP with other
FABPs are indicated by bold faced types.
Unidentified amino acid residue is ind1cat­
ed as X. L-FABP, liver FABP; 1-FABP,
intestine FABP; H-FABP, heart FABP; C-F ABP, cutaneous FABP.

端近傍で も部分的相同性を示したが、 N端近傍に比しややホモロジ ー は低かった。 これらの結果は既知のFABP分子種の構造的特徴を備えており 9) 、 C-FABPがFABP分子種のメンバーであることを強く示唆する。 また興味深いことに

Fig.1

Tricine/ SDS/ PAGE of rat cutaneous
FABP at various stages of purification.
The gel was stained with Coomassie bril. ―liant blue. Lane 1, rat skin high speed su­
pernatant (25µg of protein) ; lane 2, DE
52 flow through (10µg of protein) ; lane
3, Mono S fraction (18µg of protein) ;lane 4, purified cutaneous FABP (0.6µg
of protein) ; lane 5, purified heart FABP
(2µg of protein).

と同 ー ではないが進化的に極めて近縁の関係にあることが示された。 さらに極く最近報告されたヒ
卜乾癬と関連するFABPと高度の相同性を示し
た 6) 。 しか しヒトの乾癬と関連したFABPはノ ー ザンプロットでは正常のヒトケラチノサイト
では乾癬時のケラチノサイトに比べ極めて発現量は低く、 我々が今回正常ネズミ皮膚より得た c­

較するため にC-FABPの部分アミノ酸配列を決
ペプチダ ー

FABP分子種の中で も C-FABPは H-FABPゼ

FABPは豊富な蛋白であり、 ヒトの乾癬時に増消化とそのペプチドを高速液体クロマ トグラ

加するFABPとの同 一性が今後明らかに されね

フィ ー で分画して得られたペプチドマップの主要ばならないと思われる。 少なくとも乾癬化障害の

5つのビ ー クについてアミノ酸配列を決定した。

病理はFABPと密接に結び付いていると考えら

図2にはネズミC-FABPの決定した部分アミノ

れ、 ケラチノサイトの増殖分化に果た すFABP

酸配列の分析結果を示す。 リジルエンドペプ チの役割が今後の研究対象となろう。

定した。 C-FABPのリジルエンド

な

ダ

ー

ゼ処理C-FABPから遊離された5つのペプ

チドの配列分析は、 完全配列の約45%を含むと3.3

脂肪酸結合能推定された。 C-FABPのN端は他のFABP分

純化したC-FABPとH-FABPの放射性ステ

子種同様おそらくアセチル化によりプロックされアリン酸結合能を図3に示す。 双方の蛋白ともスc­

テアリン酸結合能を示すが、 H-FABPに比べ若FABPのN端近傍の配列は他のFABP分子種と干C-FABPは親和性は低かった。 ステアリン酸

極めて高い相同性を示した。 一方C-FABPのC

以外にパルミチン酸、 オレイン酸、 リノ ー ル酸、て い る と推定され決定出来な か ったが、

-117-

cDNAのクロ ー ニングを行っており、 今後cD­

0.2

NAの構造、 エクソン構成について合わせ報告すの相違点およびケラチノサイト増殖分化での役割ー゜OE u)31\llcl\13 1S O N n O CDる。 ヒトの乾癬と関連して報告されたFABPとが今後の課題である。

文

献1) Ockner,R.K., Manning,J.A.. Poppenhausen,
R.B. & Ho,W.K.L. (1972) Science, 177, 56-58.

2) Glatz,J.F.C. & Veerkamp,J.H. (1985) Int.J.
Biochem., 17, 13-22.

10

20

30

STEARIC ACID (µM)3) Kanda,T., Odani,S., Tomoi,M., Matsubara,
Y. & Ono,T. (1991) Eur.J.Biochem., 197, 759-

Fig.3 Binding assay of radiolabeled stearic acidwith the purified rat cutaneous FABP（●） and heart FABP (▲） • [1-14 CJ
Stear1c acid was incubated with 150 pmol
FABP at 37℃ for lh. Unbound fatty acidwas separated from bound fatty acid by
Lipidex 1000.
アラキドン酸でも同様な結果が得られた。

c­

FABPは脂肪酸をリガンドできるが、 未知のリ

768.

4) Raza,H.. Chung,W.L. & Mukhtar,H. (1991)
J.Invest.Dermatol.. 97. 323-326.

5) Schurer,N.Y., Bass,N.M., Jin.S.,Manning,J.

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Dermato!., 100, 82-86.

6) Madsen,P., Rasmussen,H.H..

Leffers,H..

ガンドの関与も否定できない。

Horne,B. & Celis,J.E. (1992) J.Invest. Der­

4. 総 括7) Kimura,H., Odani,S., Koide,T., Arakawa,matol., 99. 299-305.

M. & Ono,T. (1989) Biochem.J., 260, 303-306.

我々はネズミ皮膚より低分子のFABPを精製し、免疫学的性質、部分アミノ酸配列、 脂肪酸の結合能を基盤にFABPファミリーに属する完全に新しいメンバーの蛋白であることを明らかにした。 目下アミノ酸の部分配列を基にC-FABPの-118-

8) Hitomi,M.. Odani,S. & Ono,T. (1990) Eur.J.
Biochem.. 187, 713-719.

9) Veerkamp,J.H.. Peeters,R.A. & Maatman,
R.G.H.J. (1991) Biochim.Biophys.Acta, 1081,
1-24転移因子を用いたアントンアニン色素生合成遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析
東京理科大学基礎工学部

飯

田

滋

Although transposable controlling elements are believed to exist in virtually everyorganism, they have been isolated from only a few plants and have been characterized at
genetic and molecular level in only two plants, maize (Zea mays) and snapdragon(Antirrhinum majus). Their ability to transpose, affect gene expression and promote
DNA rearrangements causes genetic instability. We have identified and isolated a newtransposable controlling element, Tpnl (Transposon Pharbitis nil one), from a line ofJapanese morning glory (Pharbitis nil) bearing variegated flowers. The 6.4 kb trans­posable element was inserted in the gene for dehydroflavonol-4-reductase (DFR), oneof the genes involving anthocyanin pigment biosynthesis. Its terminal inverted repeats
and the number of target duplications indicate that it belongs to the family of the maizetransposable element Suppressor-mutator/Enhancer (SpmlEn). Cosegregation dataof the variegated flower phenotype and the DFR gene carrying Tpnl indicate that themutable phenotype is due to excision of Tpnl from the DFR gene. Sequences homolo­
gous to Tpnl are present in multiple copies in the genome of Japanese morning glory.

現するアントシアニン色素生合成系遺伝子などの1. 緒 言発現を調節して絞り模様（キメラ斑）を生じさせる因子として見い出され、その後、種々の生物種

キメラとは本来、頭が獅子、胴が山羊、尾が龍のゲノム上に散在されていることが明らかにされの ギリシャ神話の怪獣で、生物学上は複数の遺伝た。 トランスポゾンによる花の絞り模様形成に関的に異なる細胞群よりなる個体のことである。 植する分子遺伝学的研究はそのほとんどがキンギョ

物キメラは種々の原因により生ずるが、トランスソウで行われているだけである。 我々は平賀源内

ポゾンの転移に伴う体細胞変異によっても生じる。

が記述した絞りアサガオのアントシアニン色素生

一

トランスポゾンとは染色体上を転移し得る 定の合成系遺伝子中より 6.4kb のトランスポゾン Tpn

塩基配列をもつ遺伝的因子で、挿入・転移・脱離

I を単離し、この Tpnl が花弁の器官形成時に転• 欠失など種々の DNA 再編成を引き起こし、 ま

移することが絞り模様の形成に直接関与しているた遺伝子発現の調節に様々な影響を与え、遺伝的ことを明らかにしたので I . 2) 、その結果をここ

不安定性の一因となっている因子でもある。 トラ

で述べる。

ンスポゾンの存在は最初トウモロコシの穀粒で発Molecular analysis of a tran_sposable control­ling element affecting ex ·essionof a gene for anthocyanin biosy­
thesis.
Shigeru Iida
Department of Biological Scienceand Technology,
Science University of Tokyo2. 実 禁絞り花アサガオ a ー炉の系統として“

時雨絞

り" KK/SSB-3 と KK/SSB-、4 を、野生型

“

全

”

色花 アサガオとして KK/ZSh.-2 を用いた。
植物ゲノム Dl\JA は CTAB法
制限酵素による解笈

-119-

3)

により分離し、DNA 断片の入ファ ー ジベ

より古典遺伝学的解析が行われている 9 . 10) 。 す

クタ ー およびプラスミドベクタ ー ヘのクロ ー ン化、DNA塩基配列の決定などは既存の方法 4 , 5 lに準

なわち、アントシアニン色素生合成に関与する遺じて行った。 また、 DNAプロ

プとして用いた伝子のA-3に変異が起こったために、花弁細胞

アントシアニン色素生合成系の遺伝子は1.5kbの中で色素が生成されなくなり白色となるはずが、ー

6)

ペチュニアDFR-A遺伝子のcDNA 、 1.3kb

花弁形成時に体細胞復帰変異を起して、色素が生のキンギョソウのCandi遺伝子cDNA1) および合成されるようになり、花弁の一群の細胞が有色

2.2kbのトウモロコシBzl遺伝子のゲノミックとなったことが白色地に有色の絞り模様の形成機)

DNA断片 8 である。

構である。 白色の細胞群と有色の細胞群は体細胞変異により遺伝的に異なるので、このような絞り

3. 結

果

模様はキメラ斑とも呼ばれる。 花弁形成の早い時期に変異により白色から有色となった細胞はより

図1の白色地に有色の絞り模様のアサガオは、遺伝学的には“雀斑（そばかす/flecked)"、 園“”“

多く細胞分裂するので有色の細胞群の数も多くなり、 当然有色セクタ ー も大きくなる。 それ故、絞染り花の有色のセクタ ー の大きさは体細胞変異の時”

め分け と呼ばれる系統で、平賀源内の『物類品期を、 またセクタ ー の数は体細胞変異の頻度を表隙』(1762)の牽牛子・和名アサガホの項の黒す。

芸上は絞り模様により

時雨絞り

もしくは

“

時雨絞り

”

のように小さな有色スポットが白江南花•和名シボリアサガホに記載されている

たくさんある絞り花は花弁形成の後期に高頻度でアサガオと同じ系統と考えられている。 この雀斑

変異が起こり、系統のアサガオに関しては、1930年代に今井になセクタ ー のある花は低頻度の変異が早い時期に“”染め分け のような小数の大き起こったためと考えられる。
この体細胞変異の起こる茎頂や花茎頂の分裂組
織はアサガオなど双子葉植物の場合は、LI·L
II·Lillの3層に分けられる 11) 。 花の中にはL
I由来の表皮細胞でのみ色素発現が見られるものも多いが、アサガオの場合はLI·LII·L皿由
来のいずれの細胞においてもアントシアニン色素が生合成される。 そこで今井は雀斑アサガオを用いて表皮下のLII由来細胞が変異により有色となった花を自殖すると3対lの割合で有色花と絞り花の次世代アサガオが生ずることなどから生殖細胞はL II由来であることを明らかにした 10) 。
なお、アントシアニン色素の発現による絞り模様
F ig.1

Pigmentation Phenotypes of Pharbitis
Lines.
(A), FullypigmentedlineKK/ZSK-2.
(B) , (E) and (F)、Variegated line
KK/SSB-3.
(C) and (D) , Variegated line KK/
SSB-4.
(G) and (H) , Germinal revertantderived from KK/SSB-3.

-120-は雀斑系統のアサガオでは花ばかりでなく、葉や茎でも観察され（図1)、アサガオの場合、 茎の色素発現はLII由来の細胞でのみ起こることも知られている。 この雀斑の絞り模様を司るアントシ
アニン色素生合成系の易変性(mutable)遺伝子a — 炉は連鎖地図の第V染色体上にマップされている。 この易変性遺伝子a ー別は野生型（有色転移因子を用いたアントシアニン色素生合成遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析花）の遺伝子A-3に対し、劣性で、しかもa-3 1としてサザン法により検討した（図3)。 その結からA-3になった生殖細胞復帰変異体が2-5%果、絞り花アサガオDFR遺伝子領域中には6.4位の頻度で得られることも知られている

9

kbのDNA配列が挿入されていることが明らか, IO l 0

図lのような白色地に有色のキメラ斑は図2にとなった。 このDFR遺伝子傾域を、全色花と絞示したアントシアニン色素生合成経路のアントシ

り花アサガオの各ゲノムよりクロ ー ニングして、

アニジン ー3ー グルコシドまでの段階の生合成に関

そのDNA配列の挿入領域の構造解析を行ったと与する遺伝子か、もしくは、その転写調節因子遺伝子が易変性になっている場合が多い I 2 l。 そこ

ころ、絞り花アサガオDFRの第3エクソンの約でこの絞り花の白色地部分の色素分析をしたとこ挿入されていた。 その末端繰り返し配列やDFR

ろ、フラボノールが検出できたのでフラボノーlObp上流のイントロン内に6.4kbのDNA配列がル

遺伝子内の挿入部位で認められた3bpの標的重複の段階までは生合成されていると考えられた。 すなどの構造上の特徴から、トウモロコシ Spml

なわち、 図2のCHS、CHI、およびF3H遺伝子

A

37 8
73 8

ll
w
�

↓

(kb)

(kb)

—Flavone

�18.6
�12.2
�8.9

�Flavonolv>

Dihydroflavonol

[>

↓ FJH

v>

Flavanone[>N-

Chalcone

↓ CHI

Bglll

BamHI

tA

↓ CHS

DFR

｀

3 Malonyl-CoA + p-Coumaroyl-CoA

DFR

Leucoanthocyanidin(Candi)↓↓

Anthocyanidin↓ UFGT(Bzl)

Anthocyanin

B
Candi

やこれらの発現を制御する転写調節因子遺伝子は

EcoRY

UFGT
Oral

゜

A Simplified Pathway for Anthocyanin
Biosynthesis.

Fig.2

N

正常であって絞り模様の形成には関与していない

?;

>

'St

>

2
7

』

に、 図lの絞り花と野生型有色花アサガオより

�

t •
•

により易変性となっているか否かを検討するため

.
9,

心｀

UFGTの遺伝子が未知のトランスポゾンの挿入

(kb)

＇
・ぶ
，
”

ン｀

と思われ る。 そ こ でそ の先のDFR 、 AS 、

<">

N

?;

r--.

>

マ

>

(kb)

•15.0

各々ゲノムDNAを抽出し、各遺伝了つ構造を、既に単離されているペチュニアDFR-A遵伝子
cDNA、キンギョソウのAS遺伝子であるCandi

F ig.3遺伝子のcDNA、およびトウモロコシのUFGT遺伝子であるBzl遺伝子のコー ド領域をプロ ー プ-121-

DNA Gel Blot Analysis of the Pharbit1s
DFR Region inA-3anda-3'Lines.
V4 indicates the variegated line KK/SSB-4; V3, the variegated line KK/SSB-3;
W2, the wiId type KK/ZSK-2.

( +
＋
）

uoo

こl
+)
Hoo

u9

A
＞

ここ ）竺 DO）

Tpnl (Transposon Pharbitis nil One) と命
2l
名したI, 0
この新たに単離された転移因子Tpnlについて、

I+ )

＋

I J )

[

り最初に分離されたトランスポゾンということで(J

14> 類縁の新しいトランスポゾンであることが明らかとなったので、アサガオ(P. nil)よ

(J

1 a.

( ＋

En

(kb)

その構造と機能の解析を行うために全塩基配列のには28bpの逆繰り返し配列を、また、両末端近傍領域の各々0.8kbお よび1.0kbにわたり、
Spm/En類縁因子に見られる、転移酵素 の結合部位と考えられる構造を有していた。 これは今まFig.5で知られているSpm/Enファミリ ー のトランス
ポゾンの中で最も複雑な構造であった。
アサガオゲノム中にはペチュニアのDFR遺伝子 6) と相同性のあるDFR-A,B, Cの3種類の遺伝子が存在する（図 4)。 そこで、 Tpnlの挿入し

ニ
Tpn/

--.

•→
DFR・A

Fig.4

DFR B

... -·......
DFR・C

The Structures of the DFR Region in the
Pharbitis A-3 and a-3 1 Lines.

37 8
73 8
11

<< <

決定を行った。 この Tpnlは6412bpで、両末端

DNA Gel Blot Analysis of theDFR Genein the a-3 1 Lines and their Germinal
Reverta n ts.
Genomic DNAs were cleaved with Bgl II
and hybridized with the petunia DFR
cDNA probe. W (+/+) indicates thewild type line ( homozygous); V (f/f), the variegated I ine (homozygous) ;GR (+/f), a germina I revertant (het­erozygous) ; OGR (fl f), a variegatedoffspring (homozygous) of a germinal
revertant; OGR (+/f), a solidly colored
offspring (heterozygous) of a germina I
revertant ; OGR (+/+), a solidly col­ored offspring (homozygous) of a ger­minal revertant.

ていて発現され ないが、花弁形成中にTpnlがていたDFR-B遺伝子が絞り模様を形成させる

DFR遺伝子より転移・脱離する体細胞変異に易変性遺伝子のa-3 1 の本体であり、 その野生型

よって、 DFR遺伝子が再活性化されることが絞であるA-3遺伝子が花弁や葉、 茎な どの色素生り花（キメラ斑）形成の分子機構であることが明

合成に関与するDFR遺伝子であるか否かを検討らかとなった。 なお、 Tpnlの挿入によるDFR

するために、a —炉の生殖細胞復帰変異体を得て-B遺伝子不活性化の 分子機構と して は、Tpnl

さらにその自殖後代における有色花と絞り花アサ

内のタ ー ミネ ー タ ー により転写が終結することやガオのDFR-B遺伝子内にTpnlが挿入されていスプライシングが正常に起こらないことなどが考るか否かをサザン法により検討した。 その結果、えられる。 また、この花弁などで機能しているア

有色花アサガオは全て2対のDFR-B遺伝子のうサガオDFR-B遺伝子は6つ のエキソンと5つのち少なくとも一

方はTpnlが転移・脱離していたが、全ての絞り花アサガオの2対のDFR-B遺伝

イントロンから構成されていることも明らかとなった。

子はともにTpnlの挿入されたホモの状態であっ

なお、 アサガオゲノム上にはTpnlに相同性のた（図5)。 それ故、 Tpnlの挿入されたDFR­

配列が多コビ ー 存在する。 図6から明らかなよう

B遺伝子が易変性遺伝子a-3 1 の本体であり、に、 野生型の全色花アサガオに比べて雀斑系統のTpnlの挿入したDFR-B遺伝子は不活性化され絞り花アサガオゲノム中にはTpnl類縁の配列が-122-

転移因子を用いたアントシアニン色紫生合成遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析

N

3

<",

＞

ぐヽi

..,r

＞

(kb)

r'"',

3,

＞

cDNAとなって転移するレトロトランスポゾン

寸＞が存在する。 これらのうち、主に前者が転移に伴うDNA再編成などによって植物遺伝子の発現を調節し、キメラ斑を形成させることが知られてい23る。 高等植物のトランスポゾンによる遺伝子発現

9.4
6.6

の調節機構の分子遺伝学的解析は、そのはとんどかトウモロコシとキンギョソウで行われており、

4.4

DNA型トランスポゾンにより調節される遺伝子としてアントシアニン色素生合成系遺伝子群がよ2.3

く研究されている。 事実、図2のアントシアニン

2.0

色素生合成系遺伝子やその転写調節因子遺伝子の中にはトランスポゾンを用いた遺伝子タッギング法により同定・単離されたものも多い。 トランス
ポゾンの中で転移に必要な活性な転移酵素の遺伝子を持ち自ら転移できる因子を自律性因子、内部のみ転移できる因子を非自律性因子という。 我々は平賀源内が記述した絞りアサガオのアントシア

Probe B

Probe A
Fig.6

自律性因子より活性な転移酵素が供給されたとき

コ

ビnl

尼三］

欠失変異体などで転移酵素遺伝子に欠損があり、Probe B

Probe Aニ ン 色 素 生 合 成 系 の DFR-B 遺 伝 子 中 よ り 、Presence of Tpn!-related Elements 1n
thePharbitis Genome
The genomic DNAs were cleaved with
Bgl II and hybridized with the probes A
or Bas indicated. V4 indicates the var1e­
gated line KK/SSB-4; V3、the variegat­
ed line KK/SSB-3 ; W2, the wild type
KK/ZSK-2.

Spm/En類縁の6.4kbのトランスポゾンTpnlを単離し、このTpnlが花弁の器官形成時に転移す
ることか絞り模様の形成に直接関与していることを明らかにした。 このTpnlは6412bpであって、その構造上の特徴から考えて、自律性因子であるよりも自律性因子の内部欠損型の非自律性因子でより多く存在する。

ある可能性が高い。 もしもそうであるならば、ア

また、他の植物のトランスポゾンの場合と同様

サガオゲノム中に存在する自律性因子の作用によに、各々のアサガオゲノム中にはTpnlの末端領り、TpnlはDFR-B遺伝子より転移・脱離する域に相同性のある配列の方が内部領域の配列よりと考えられる。

もよりコビ ー 数が多いことも明らかとなった。

高等植物のトランスポゾンは転移因子としての側面から転移に伴う遺伝的組換え機構の解明や調4. 考 察節因子として植物遺伝子の発現調節機構の解明に貢献してきたのみならず、トランスポゾンタッギ

トランスポゾンは遺伝子 発現を制御する調節ングによる有用遺伝子の単離やトランスポゾンベ

因 子として最初にト ウモロコシで見い出されクタ ー による有用遺伝子の導入、さらには遺伝子

た I 3. I 4) 。 高等植物ゲノムには脱離と再挿入に発現制御のための生物学的スイッチなど植物バイより転移するDNA型トランスポゾンと、転移中

オテクノロジ ー にも利用され始めた。 ここに述べ

間体と し て 生じたRNAか逆転写 酵 素 に よ りたアサガオのトランスポゾンTpnlやその類縁因-123-

子の解析 も遺伝子発現機構の解析のみならず、 植

6) Beld, M., Martin, C., Huits, H., Stuitje, A.R.

物バイオテクノロジ ー にも貢献できる可能性もあand Gerats, A.G.M. C 1989) . Flavonoid syn­ろう 。 事実、 アサガオには 20 種以上の花色、 葉

thesis in Petunia hybrida : partial characteri­

色、 さらには花や葉の形態に関して、 トランスポ

zation of dihydroflavonol-4-reductase genes.

ゾ ンが関与すると考えられる易変性 (muta­

Plant Mo!. Biol., 13, 491-502.

ble) 変異体が知られている。

これらの中には

7) Martin, C., Prescott, A., Mackay, S. Bartlett,Tpnl 類縁因子の関与するものもあると思われ、J. and Vrijlandt, E. (1991) . Control of an­

トランスポゾンタッギングにより未知の有用遺伝

thocyanin biosynthesis in flowers of Antir­

子をアサガオから単離することもできそうである。

rhinum majus. Plant J., 1, 37-49.
8) Fedoroff, N.V., Frutek, D.B. and Nelson, 0.

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Mol. Gen. Genet., 239, 354-360.

-124-

皮膚の老化における染色体構造の変化と遺伝子修復機構に関する研究
理化学研究所花

岡文雄

Our previous experiments suggest that the length of the linker DNA which connects
nucleosomal core particles becomes to be heterogeneous by aging, both in vivo and invitro in human skin fibroblasts. In order to get some insight on the relation between
growth capacity and the regularity of nucleosome structure, we examined the structuralchange of lymphocyte chromatin upon growth stimulation with FHA. When chromatinof lymphocytes from peripheral blood was digested with the nuclease, unclear pattern ofelectrophoresis was observed. However, discrete ladders of nucleosomal DNA were de­tected in the case of lymphocytes stimulated with FHA for 48h and 96h. Their digestion
patterns were similar to those of lymphoma cell lines. These results indicate that theregularity of chromatin structure is closely related to the activity of cell proliferation.
As for the UV damage on the skin, we are investigating the mechanism of nucleotide
excision repair. We have purified to homogeneity a repair complex by in vitro comple­
mentation of the XP-C defect in a cell-free repair system containing UV-damaged SV
40 minichromosomes. The complex has a high affinity for ssDNA and consists of twotightly associated proteins of 125 and 58kd. Subsequent cDNA cloning revealed that the
125kd subunit is a N-terminally extended version of previously reported XPCC geneproduct which is thought to represent the human homolog of the S. cerevisiae repair gene
RAD4. The 58kd species turned out to be a human homolog of yeast RAD23. The 58kd
species and yeast RAD23 share a ubiquitin-like N-terminus. The nature of the XP心
defect implies that the complex exerts·a unique function in the genome overall repair
pathway which is important for prevention of skin cancer.

するバリヤ ー としても働いている。

1 . 緒

言

この皮膚は、 上皮組織としての表皮と、 結合組織としての真皮からなる。 表皮は、 その大部分をわれわれ人間の体全体を覆っている皮膚は体の占める表皮細胞と、 そこで作られて、 上述のバリ中で 番大きな器官であり、 個体の維持に重要な

ヤ ー としての機能を果す角質層（ケラチン層）、役割を果たしている。 すなわち、 外界からの情報

それに体表から日々剥離していく角質層を補うた

一

一に敏感に反応し、 体内の環境を 定に維持するために、 常に細胞分裂を繰り返している表皮最深部

めの 一種のセンサ ー の役割を果たすと同時に、 外の基底細胞とから成り立っている。 真皮は膠原繊界からの物理的・化学的刺激に対して体内を保護

維を中心とする繊維性結合組織で、 ほかに弾性繊

Studies on the Changes in Chromatin Structureduring P五g of Human Skin Fi­
broblasts and the Mechanism of
DNA Repair
Fumio Hanaoka
Riken Institute of Physical and,Chemical Research、

維、血管、 神経、 平滑筋繊維などを含んでいる。
既にわれわれはヒトの皮膚繊維芽細咆が老化に伴って、 その細胞機能の中枢である染色体構造に変化をきたすことを観察している I) 。 本研究では、 その原因が細胞の増殖能と関係しているかど
うかを、 ヒト末梢血リンパ球を用いて調べる。 同時に紫外線などによる遺伝子の損傷に対し、 皮膚-125-の細胞がどのような修復機構で対処しているかを

種類のポリペプチドを含む画分が得 られた。 p

分子レベルで明らかにするための一つのアプロ ー

125/p58複合体をグアニジンによる変性条件下、チとして、 われわれの確立した無細胞クロマチン

ゲル濾過HPLCによって分離し、 それぞれのポ

修復系

2, 3 lの応用を試みる。

リペプチドをCNBrで分解した後、 逆相HPLC
によって展開した。 p125については 一 ヶ所、 P

2. 実

験

58についてはニヶ所の部分アミノ酸配列を決定
した。

2. 1

ヌクレオソ

ー

ム構造の規則性の解析

細胞を界面活性剤を含む等張緩衝液中でホモジ

2. 4

クロコッカルヌクレア ー ゼを加え、 37℃で 一 定

XP-C群を相補する蛋白質のcDNAク
ロ ー ニング

ナイズすることにより核を調整した。 そこにマイ決定されたアミノ酸配列をもとに、 pl25につ時間保温した。 反応後、 DNAを抽出・精製しア

いては2組のオリゴヌクレオチド混合物を合成し、ガロ ー スゲル電気泳動法により分析した。

それらを用いた RT-PCRによってDNAプロ ープを作成した。 またp58については複数のオリゴ

2.2

ヌクレオチドを合成し、 プロー プとした。 以上の無細胞DNA修復系による修復能の検出

SV40のウイルス粒子を弱アルカリ処理するこプロ ー ブを用い、 HeLa細胞のcDNAライプラとによって得られるミニ染色体に紫外線を照射し、リー をスクリー ニングし、 ポジティブなクロ ー ン

ビリミジンニ量体を主とするDNA塩基損傷を導のなかでインサ ートの最も長いものについて塩基入した。 これを、 ATP およびCa- ⑫P〕 dCTP

配列を決定した。

を含むデオキシヌクレオチド基質等の存在下、

3. 結果と考察

種々の細胞粗抽出液と反応させた。 この時、 反応
液中には紫外線未照射のプラスミドpUC19を共存させ、 内部標準とした。 ヌクレオチド除去修復

3. 1

細胞増殖とヌクレオソ ー ム構造の規則性によって損傷が 修復されれば、 その部分に短い

正常ヒト末梢血リンパ球、 T 細胞由来CEM細DNA合成が起こり、 放射標識されたヌクレオチ胞、 B細胞由来WILL II細胞についてクロマチ

ドが取り込まれることになる。 この反応液からン構造を比較した。 CEM細胞、 WILL II細胞のDNAを抽出し、 制限酵素で直鎖状にした後、 ア

両がん細胞ではヌクレオソ ー ムの単量体から 6、

ガロ ー スゲル電気泳動でSV40DNAとpUC19を7量体までの明瞭な階段状の バ ンドが検出された。

分離し、 オー

トラジオグラフィーを行った。 ウイルスDNAへの放射活性の取り込みを、

イメ ー

ジ

一方、 正常リンパ球では3、 4量体までのヌクレ
オソ ー ムDNAは確認できるものの、 全体にバッ
クグラウンドが上がり、 不均ーな分解様式を示し

アナライザ ー によって定量化した。

た。 正常リンパ球をPHA存在下、 48時間、 96
XP-C群を相補する蛋白質の精製

時間と培養したところ、 バ ンドの位置は変わらず、

上記の無細胞系にXP-C群患者細胞の抽出液

それぞれのビ ー クの高さが増した（図1)。 このを適用し、 :t�eLa細胞の核抽出液を出発材料としことは、 増殖能の低い細胞ではヌクレオソ ー ム:})てXP-C群の修復欠損を相補する因子を精製し規則性が低下し、 リンカ ー DNAの長さにバ ラつ

2. 3

た。 ホスホセルロ ー ス、 変性DNAセルロ ー ス、きが多くなるが、 細胞分裂を繰り返すと、 その間

CMコスモゲルと Mono Qの4段階のカラムクロにヌクレオソ ー ム間の長さがそろってくることをマトグラフィ ー により、 分子量125Kと58Kの二示している。 したがって正常皮膚繊維芽細胞にお-126-

皮膚の老化における染色体構造の変化と遺伝子修復機構に関する研究

a性群の細胞抽出液いずれもが、修復正常なヒト
293細胞抽出液に比べて低い活性しか示さなかっ

au
uoqJ
os
qo

｀

た。 また、異なる群のXP 細胞抽出液を適当な割合で混合すると相互の欠損が相補され， 修復合成
活性の回復が見られた 3) 。 そこで遺伝子、蛋白質の両方とも解析の遅れていた XP-C 群について、相補因子の生化学的な同定を試みた。
阪

1蓼汲党枯ぼ'l-1i叫町抽硲坊り炭怜油液を色発材朽こして、 4段階のカラムクロマトグラフィ ー により得た精製標品は、SDS ポリアクリルアミドゲル
電気泳動上、分子量125Kと58Kの二種類のポリbペプチドを含んでいた。 この二つのポリペプチド
は、ゲル池過およびグリセロ ー ル密度勾配遠心において活性と挙動を共にしたことから、物理的な複合体を形成しているものと考えられる。 この因子は XP-C 群の細胞抽出液の修復欠f員を特異的に相補し、 C 群以外のXP 細胞抽出液による修復

c

I
I
I

’ ’

: ,

合成には全く影響を与えなかった。 このことから、本因子が XP-C 群の原因因子である可能性が非常に高いと思われた。

＇

3. 3

I

ング

60 basepoi rs我々の研究とは独立に、米国テキサス大学のグ

ヒト正常リンパ球の増殖とヌクレオソ ー ムの規

ル ー プがcDNA発現ライプラリ ー を XP-C 群細1220 1070 905
図1

15 525 3ム5

XP-C 群相補蛋白質のcDNAクロ ー ニ

則性
無処理のヒト正常リンパ球(a) 、 同じくPHA
処理、 48時間(b)および96時間(c)のサ
ンプルについて、 「実験」の項で述ぺた方法によりヌクレオソ ー ムの規則性を解析した。

胞に導入することにより、 C群の修復欠損を相補する遺伝子 XPCC を単離した叫その塩基配列から予想される遺伝子産物は 823個のアミノ酸からなる惟定分子員93Kの蛋白質で、我々が生化いて観察された、老化細胞クロマチンのヌクレオ学的に同定した125K、58Kのどちらとも合致し

ソ ー ム配列の不規則性は、細胞の増殖能の低下になかった。 そこでXPCC 遺伝子産物と我々のpよって結果的に引き起こされたものと考えられる。

125/p58との関係を明らかにするために、cDNA

クロ ー ニングを行った。
3.2

無細胞系を用いた XP-C 群相補因子の精製

紫外線照射したSV40ミニ染色体を鋳型としてスクリー ニングの結果、pl25について長さ3.6kbのcDNAクロ ー ンが得られた。 その塩基配列を決定したところ、 XPCC 遺伝子の配列とほぼ用いる無細胞DNA修復系において、ヌクレオチ一致した。 しかしながらpl25のcDNAは、既にド除去修復機構に欠陥を有するヒト遺伝病、色素発表されている XPCC のcDNAよりもN末端が性乾皮症 (XP) の A から G までの七つの相補

長く、我々が蛋白質レベルで決定したN末端の-127-

アミノ酸配列がXPCCには含まれていなかった。

Hydrnpathy

pl25のORF はXPCCよりも 117個多い940個の; 1111

アミノ酸からなり、推定分子量は106Kと計算さ

11l0一

れた。

・100ー
.,ooー

100

111

公

.JI

.JOO—

XPCC遺伝子は出芽酵母のRAD4遺伝子と部

図3分的な相同性を示すことが報告されているが、新たに同定されたN末端部分については既知の蛋

m

心a.a.

IJ

p58の疎水性プロットとリン酸化可能部位
アミノ酸残甚数の下のバーはリン酸化可能部位を示す。

白質との相同性は特に見い出されなかった。推定
アミノ酸配列より、pl25は極めて親水性に富み、ていることが示唆された。

またカゼインキナ ー ゼII、 Cキナ ー ゼを初めとす本研究の結果、無細胞 DNA修復系を用いて精るプロテインキナ ー ゼによってリン酸化を受ける製されたXP-C群の修復欠損を相補する蛋白質

可能性のある配列を非常に多く含むことが予想さが、遺伝学的に同定されたXPCC遺伝子産物とI一致することが分かった。このことは、我々の無れた（図2 )。

ぃ」r凰f:,t�;,flydrop,thy
l

100

:ro

却

割

500

600

700

aoo

細胞系が細胞内のヌクレオチド除去修復反応を忠実に反映していることを改めて示 したものと言え

900C,ai・る。さらに、XP-C群相補蛋白質のnativeな形髯�r���:り＼［叫図2を明らかにできたこと、 XPCCと新たな蛋白質との相互作用が見い出されたことは、無細胞系を利用することの有用性を証明した。今後、組み換

p125の疎水性プロットとリン酸化可能部位
アミノ酸残基数の下のバーはリン酸化可能部位を示す。

え蛋白質の大量発現、および抗体の作成によって、ヌクレオチド除去修復におけるpl25/p58の機能を明らかに していく予定である。特にXP-C群

一方、p58について2.9kbのcDNAクロ ンがの細胞は転写とカップルした修復に関しては正常得られた。その全塩基配列を決定したところ、アで、転写と無関係に起こる修復に欠陥があること

ミノ酸数409からな る推定分子量 43Kの未知の蛋が分かっている。その分子レベルでの解析に興味

ーー

検索の結果、が持たれる。また上述の脱リン酸化の効果がどち

この蛋白質は出芽酵母の第V染色体上のSYGP2らのコンポ ー ネントによるものなのかを明らかに白質をコドしていた。ホモロジー

遺伝子のORF29と比較的高い相同性を示したが、できるはずである。さらに、この無細胞系を用いこれが実は DNA修復に関係 した遺伝子、RADることによって、他のXP相補因子を初めとする。 p58 も酵母のDNA修復因子を同定することが可能であろう。

23、であることが判明した

5)

RAD23も、N末端部分がユビキチンと似た配列をしており、その部分の機能に特に興味が持たれ文 献る。pl25同様、p58についてもカゼインキナ ー1)

ゼ rr 、およびCキナ

ー

ゼでリン酸化されうるアミ

Ishimi, Y., Kojima, M., Takeuchi, F.,
Miyamoto, T., Yamada, M. and Hanaoka,

ノ酸配列が数ケ所見い出された（図3)。 そこで

F., Exp. Cell Res., 169, 458-467 ·1.987).

精製 したXP-C群相補蛋白質 を、アガロ ー ス

2) Sugasawa, K., Masutani, C. and Hanaoka,

ビ ー ズに固定したアルカリ性ホスファタ ー ゼで処

F., J. 因ol. Chem., 268, 9098-9104 (1993).

理したところ、相補活性が失われた。このことか

3) Masutani, C., Sugasawa, K., Asahina, H.,ら、本蛋白質の活性がリン酸化による制御を受けTar jrn, K. and Hanaoka, F., J. Biol, Chem.,-128-

皮廣の老化における染色体構造の変化と遺伝子修復機構に関する研究

268, 9105-9109 (1993).

4) Legerski, R. and Peterson, C., Nature, 359, 70

5) Melnick, L. and Sherman, F., J. Mol. Biol.,-73 (1992).

-129-

233, 372-388 (1993).

．

記念講演

廣部

．

平成5年度記念講演雅昭

コスメトロジー研究振興財団
第4回表彰・贈呈式記念講演

酸素分子の二重性格性について
廣 部 雅 昭東京大学薬学部薬品代謝化学

教授

場所
日時

薬学会館長井記念館
平成 5 年 11 月 19 日（金）ただいまご紹介にあずかりました廣部でござい

トロジ ー とも関係の深いという意味で「酸素分子ます。本日の栄えある表彰・贈呈式に先立ちましの二重性格性について」を本日のテ ー マに選んだて講演の機会を与えて頂きましたことを大変光栄

次第でございます。

に存じております。私は財団の評議員であります

皆様、酸素、空気でもよろしいのですが、このが、まず、本日助成金を授与されることになられ言葉を聞いた時にどのようなイメ ー ジをお持ちにた皆さんに心よりお祝いを申し上げます。

なられるでしょうか？

私事で恐縮でございます

記念講演という晴れがましい形で私どもの研究

が、私は酸素というものに非常な恩恵を感じておをご紹介させて頂くのはいかにも面映ゆい次第でります。いいイメ ー ジしか持っていません。私はございますが、依頼されるにつきましてはいろい

山の奥の生まれでございますが、小さいころ川でろ経緯がございました。まずは難しい話はするな、

泳いでいる時に深みにはまっておぼれ死にそうに難しい話は分かりやすくやれ、できたらおもしろなって、一命を取り止めたことがあります。そのくやれ、それからこの場にふさわしい内容にせよ

時の苦しみ、窒息の苦しみというのはもう本当にと、いろいろ難しいi主文がついております。研究耐え難いものであります。私にもし死に対する恐者というのは得てして難しい話をできるだけ難し

怖があるとしたら、その時に息苦しいのではない

くする傾向がございまして、私もその例に漏れなかという危惧でありまして、それは非常に恐ろしいわけでございますけれども、そういうことです

いと思っています。従いまして、私は泳ぎません。

ので、今日はできるだけ日頃とは趣を変えます。

「泳げない、泳がない」でなくて「泳がない、泳あるいは多少脱線をするかも知れませんがご容赦げない」です。私は水を見ますと非常な恐怖に陥をいただきたいと思います。注文が多い依頼です

ります。おぼれた時の苦しみが無意識に頭の中をので、テ ー マをどのように選ぽうかといろいろ考よぎるのだと思います。最近ゴルフを始めたのでえました。悩んだ末、結局のところ、日頃、私どすが池越えは絶対にだめです。水を見たとたんにもがやっておりますいろいろな研究の中でコスメ

めちゃくちゃにスコア ー が崩れます。スコア ー がTwo Faces of Molecular Oxygen

纏まらないのは池があるから、水があるからと思っています。

Masaaki Hirobe
Faculty of Pharmaceutical
Science
The University of Tokyo

よく「人はパンのみにて生きるにあらず」と言います。精神的な面を強調した言葉でありまして、「食べてただ生きているだけ」ではだめだということの例えだと思いますが、しかし物質的には食べ物が生きるための当然の前提となっております。

-131-また、人はパンが無くても水だけあれば十数日はわけです。それが20億か30億年前、藻類という生きていられるだろうと思います。食わず、飲ま植物が出まして光合成を行う様になりました。光

ずでもやっていけると粋がる向きもありますがそ合成というのは皆様ご承知のように光の働きで水の場合でも酸素という、空気という言葉は出てきと炭酸ガスから炭水化物を作り同時に酸素を作るません。人間は空気がなかったら絶幻に数分といという営みであり、 クロロフィルを持っている植

えども生きてはいられません。空気と云いました

物は皆そのような働さをします。そうしますと藻が当然ながらその中に含まれている酸素を意味し類の出す酸素というものは嫌気性生物にとってはています。このように生と死を分け隔てる最も基

いわば光合成工場からの排ガスで環境汚染物質に本的な物質、しかも分子量36という小さな酸素

相当します。そのため酸素を必要としない、あるという物質がなぜ生きるために必要なのかは良くいは酸素を嫌う生物はそういった環境汚染物質の判っているはずですけれども、通常、必ずしも中では棲息できなくなって来ました。太古の生物

人々の意識に上って来るわけではありません。
一は生きるために二つの中のひとつを選択しました。

般には酸素のもつイメ ー ジは常に良いかと思

ひとつの群は酸素の無い地下とか、海底に逃げています。しかし一度これが怒り出しますと生体にしまった。現在でも嫌気性生物は細々と生存してー

対して非常なダメ ジを与えます。最近は酸素のはいますが当然ながら世の中から見捨てられてい怖さが注目されてきまして、いろいろな研究がなるわけであります。一方は酸素毒性を克服して酸されております。このように酸素分子には良い面

素と共存できるように自らの体質を改善して環境と悪い面があり、 コスメトロジ にも極めて密接に順応してきました。これについては後ほど更に-関係があります。そのような訳で今日は「酸素説明します。そういうことで酸素を呼吸する生物ー

分子の二重性格性」ということに焦点を合わせまが出てきましたが、逆に酸素呼吸によって非常にして、私どもで行っております研究の一 端をご紹

効率的にエネルギ ー を利用できることになり、 生介させて頂きたいと思います。前置きはこれぐら

物はますます高度化、進化して参りました。これ

いに致しまして早速本論に入らせていただきます。

がいわゆる我々人間を含めた好気性生物でありまこれはある新聞が私どもの仕事を紹介した記事す。好気性生物は呼吸をしては排気ガスとして炭であります。「酸素分子はジキルとハイド」、す酸ガスを出していますが、植物は今度はその排気

なわちこちらが仏様、こちらが悪魔と二つの顔をガスを吸いまして、植物の排気ガスである酸素を有しております。このように酸素分子は生体に出します。このように酸素、炭酸ガスの循環が行とって諸刃の刃である。つまり二重人格的な性質

われるようになったわけです。酸素というものはがあるということを意味しております。「発ガン生きるために必須であると同時に酸素毒性がある関与究明」 「制ガン剤開発の一助に」の見出しはということ、そして生物はその毒性を克服できる

新聞社の方が勝手につけたものでありまして、私ような体質を備えているのだということを前提にどもはそんな高尚なことを常時やっているわけでこれからのお話をさせて頂きます。

はございません。酸素分子の二面性を漫画でお示

地球上の酸素が植物のお陰でどんどん増えて来しするために新聞記事を紹介させて頂いたわけでますとオゾン層ができ ， 太陽からの紫外線を吸収す。

し地上に届くのをかなり防ぐようになってきまし

酸素は地球上に無限にあるように見えます。とた。紫外線というのも生物にとって有害なものでころがこの地球に生物が住みだすようになった何す。酸素が出たことでオゾン層ができた。オゾン

10億年前にははとんどありませんでした。そ の層ができたことで紫外線が地上に到達する力が弱頃には嫌気性、つまり酸素のいらない生物がいた

くなってきた。そこで今まで海の底で紫外線から-132-

酸素分子の二重性格性について逃げてきた生物が陸上に上ってくることができるというものは光と色に弱い。剌激を受けますと輿ようになりました。これが両生類の出現でありそ奮して毒性を示す活性酸素ができます。これは励の後、人類へと進化してきたわけであります。現起一重項酸素と言います。いったん豹変した酸素ールができて地上に強い紫外線が当た

分子はそれ自身でさらにさまざまに変化をいたしるということで問題になっております。もしかすます。豹変した酸素は生体にさまざまな危害を加ると昔に戻っていく危険性があるということかもえます。これが酸素毒性と言われるものです。こ在オゾンホ

知れません。この紫外線障害はコスメトロジ ー とれに対し、生物がどういった対応をするかといい極めて密接な関係があります。

ますと、その 1 として豹変酸素を安全なものに分ところで生物は酸素の増大と共に酸素毒性に耐解します。そういった分解酵素があります。一方

えられる体質を徐々に備えてきたのですが、もしで生贄を出して自らを守ります。抗酸化剤、 ビタ

空気が突然全部酸素になってしまったとすると人ミンEなどの酸化され易いものを生贄にだしてこ

間を含めた哺乳類は50日から100日で死んでしまれを酸化させてわが身を守る対応の仕方です。まセントならこんた、豹変した酸素を旨く利用して使うこともありうと言われています。酸素 百パー

な良いことはないだろうと思うかもしれませんがます。酸素添加酵素とか私どものやっている薬物

そうはいきません。つまりある濃度以上では人類

代謝とか、あるいは抗ガン剤のデザインに使うやは死んでしまう。まさに酸素毒性によるものであり方です。酸素分子の二重性格性を逆に利用するります。生物は酸素からの攻撃に備えつつ平和的方法です。

なつき合いをしている訳です。どこかで聞いた国次に酸素分子の活性化と言うことについて分か

際平和と軍備の充実の問題に何となく対応していりやすくご説明したいと思います。通常空気中にるように思えます。

存在している酸素は三重項酸素といいます。ここ

地球の大気酸素濃度の変遷を見てみますと現在に反結合性の分子軌道を意味するシ ー ソ ー の様な

1気圧の大気のなかに約0.2気圧、5分の1の酸素板があり、それをバネが支えていると致します。

が含まれています。これを1と致しますと30億、通常の酸素分子では二つの酸素原子の間に1.5オ

40億年前ではちょうど現在の1万分の1の酸素しングストロ ー ム程の距離があり、電子が二個入っかありませんでした。この頃藻類が現れてきましています。 バ ランス良く同じ向きに2個の電子がて光合成が行われるようになり、酸素がどんどん入っていますがここには4個まで乗ることができ増えてくるようになりました。だいたい6億年前ます。ひとつ乗りますと還元的活性化、つまり餌になりますと現在の約百分の 1 になってきたのでを与えると言いましたが、電子を与えますと3個す。3億年前頃に現在より酸素が多かった時代がになります。ところがバランスが崩れて不安定にあったような記録がありますが本当かどうかは良なりますので、蹴り落として二つになるか、もうくわかりません。将来大気中の酸素濃度がどうひとつ貰って4 つになるかして安定化します。3

なっていくかはわかりませんが酸素濃度の増大に個の状態、つまり 1 電子還元をされたものはス ー

対応して紫外線の地表に到達する強さが弱くなってきていることが実際に示されております。
さてこのような良いイメ ジの酸素分子が突然ー

パ ー オキサイドと言いまして、酸素毒性の元凶と言われるものです。更に電子が入ってきますとO-0結合が伸びて来て、あるところでバネが切断

豹変します。 「君子も豹変する」は酸素分子の活されます。切れた時に最も活性なハイドロオキシ性化に対応いたします。豹変の仕方のその 1 、餌ラジカル、つまり生体に最も強い障害を与えるラを与えられた時に豹変する。餌とは電子のことでジカルが生じます。酸素分子は活性化する時電子

すが、還元的活性化に当たります。その 2 、酸素が1個入ってス ー パーオキサイド、2個入って-133-

パーオキサイドとなり、三電子還元されると切れ的分子への攻撃を開始するわけです。 攻撃されまてしまうんですね。 もうひとつの活性化方式があすと生体は抗酸化剤などで一生懸命防御しようとります。 色と光で興奮すると言ったのはこのことしますが、生体が負けますと活性酸素が細胞に対でありまして、電子が他から入るのでは無く、 隣して障害を与えることになります。 一方では酸素方に移りますと不安定

添加酵素や、ペルキシデ ー スと言われるものはこになり、 空いた場所には電子が欲しいと言う意味

ういった活性酸素を基質にして、有効に生体の中で求電子的な活性が生じます。 このように電子のの代謝などを行っていきます。 そういった意味で動きによって酸素分子は活性化される訳です。

活性酸素を上手に使う機構もあるわけです。

ーにいた電子がシ

ソ

ー

一

の

一

このように生体の中では常時活性酸素の生成と電子還元でス ーパ ー オキサイド、二電子還元で消去が酵素的あるいは化学的に行われております

今申し上げたことをまとめますと酸素分子はパーオキサイドとなります。 これは過酸化水素、が生体がどのような消去酵素を持っているかそのオキシド ールと呼ばれて消毒剤に使われているも典型的な例を示します。 最近最も注目されているのです。 更に還元されますと0-0結合が開裂しものにス ー パーオキサイ ド ディスムタ ー ゼ、てハイドロオキシラジカルになります。 ここにも(SOD)というものがあります。 SODはス ー

うひとつ電子が入りますと最も安定な水になりま

パー オキサイドを過酸化水素と酸素に分解する酵す。 つまり、安定な酸素分子と安定な水に間に四素です。 ところが過酸化水素もまだ活性酸素であ

電子還元が行われます。 そして酸素分子には還元りますから生体に対して障害を与える可能性があを受ければ受けるほど、更に電子を取り易くなるります。 生体はこれをカタラ ー ゼとかペルオキシと言うおもしろい性質があります。 一 方生体の中ター ゼといった酵素で安定な水に分解します。 こスといわれる酸化酵素があります。

ういった反応の組み合わせで活性酸素を安全なもーのに分解することが可能なのです。 ただ、ハイドにはオキシデー

例えばシトクロムオキシテ

ーゼと呼ばれる酵素

は酸素を途中で活性酸素種を生成させずに一気に

ロキシラジカルは非常に活性が高くて、これを抑

四電子還元して、水にまで持ってきてしまう非常

えきれないため生体が障害を受けるケ ー スがた＜に安全な酵素なんですね。 ところで途中でこのよさん見受けられます。 今日の最後の方のメイン

うな活性酸素種を出すような酵素もあります。 まテ ー マとなります一重項酸素はカロチノイドのよた先程申し上げました植物の光合成と言うのは四うな色素が消去すると言われております。 一方活

電子還元された最も高い還元状態にある水を四電性酸素種によって脂肪酸などがハイドロパーオキ

子酸化し、酸素に一気に持っていく反応に相当しサイドになる反応は脂質の過酸化と呼ばれますが、ます。

出来た過酸化脂質は更にまた活性酸素を誘導しま

通常世の中に存在している酸素分子と言うものす。 これをグルタチオンペロキシデ ースとかトコ
フェロールといった抗酸化剤が消去します。

は紫外線が当るとか、そのほかオキシデ ースなど
によって活性酸素種に変換する性質があり、 それ

活性酸素の関与が示唆されている病態、疾患にらは生体の中で常時出来る可能性があります。 出

ついては、 最近活性酸素の研究が盛んに行われて来てはいるが生体はそれを防御する機構を持って来たことで、非常に多くのものが関係しているといます。 つまり進化の過程でそういった体質に改いわれております。 個々について活性酸素がどこ善されて来たということで生体内にはそのようなに、どのように関与しているかは私自身良くわか

活性酸素を消去する酵素があり安全な通常の酸素りません。 放射線障害とか紫外線障害また炎症なや水に変化させてしまう機構があるわけです。 とどは理解出来ますね。 あと、 老化、 パーキンソン

ころが消去し切れなかった場合には活性酸素が標病、糖尿病……等々、 とにかく、 いろいろな病気-134-酸素分子の二重性格性についてが酸素が豹変してできた活性酸素によって引起こ

デヒドのびんを持ち出したことがあります。そのされるといわれております。

当時私はベンズアルデヒドは結晶だと思っていま

蛋白、 核酸あるいは、脂質のような生体を構成した。びんの栓の回りに綺麗な結晶がついていたしている物質が活性酸素によって酸化的障害を受んですね。だから結晶と思ったのですが実はベン

け秩序が乱されていくことで病変につながって行

ズアルデヒドは液体なんです。還元性があって酸くことが考えられますが、 この場合、 大体におい化され易いため空気に触れると酸化されて安息香てハイドロキシラジカルが元凶というか、 直接的酸になります。結晶はこの安息香酸だったんです。

な働きをしていると言われています。また、 これ

このように還元性の高い物質は空気に触れると自を生じさせるものがスーパー

オキサイドであると

動酸化します。考えてみればこの時ス ー パー オキ

いうことが分りその研究が盛んに行われるようにサイドが発生していたことになるだろうと思いまなったともいえます。

す。

ス ー パー オキサイドはどうして発生するのか？

前に御話したようにス ー パー オキサイド自身は

ス ー パー オキサイドがほかの活性酸素種に変身電子を取って安定化するか、 電子を蹴飛ばして元ーに戻って安定化します。つまり酸化と還元の両方

パー オキサイドそれ自体には大した活性はありまの性質を持っているので、 二つのスーパー オキサ

する仕方などが研究対象となっています。スー

分子の存在で格段に活イドが互いに反応して安定な酸素分子と過酸化水ー

素になります。これを不均化反応（ディスミュ ー

パー オキサイドに対抗するためにこれを分解する

テ ー ション）と言います。これを触媒するのが酵素、 SODがあることは先程申し上げましたがSODです。SODは過酸化水素を発生しますが、それ自身を医薬品として用いるにはいろいろな制

これとス ー パー オキサイドが反応しますとより毒せんが助人、 エフェクタ

性化する性質があります。生体の中には、 ス

約があります。治療に使う場合にはより広範な用性の強い三電子還元体ハイドロキシラジカルを生途に応じて使えるようなSOD機能をもった人工成することが知られております。したがって残っ物質をデザインしようという動きがあり、 こうている過酸化水素を徹底的にやっつけないと更にいった方面の研究も行われています。

活性なものになってしまうわけですね。これは世の中にはいろいろな活性酸素増産剤が知られ

ハー バ ー バイス反応といわれ鉄などの金属イオンていますが、 たとえば殺草効果のある農薬としてが触媒いたします。ここでできる酸素が一重項で知られるパラコ ー トは生体の中でNADPHなどはないかと言われた時代があります。最近では否から電子を1個もらいますと、 中間にまずアニオ

定的になっていますが、 そもそも一重項酸素をきンラジカルを生成します。そして次に酸素に電子ちんと証明する方法が無かったためにはっきりしを渡して、 ス ー パー オキサイドを作ります。ス ーません。私はこれが一重項ならおもしろいと思っ

パー オキサイドは それ自身あるいは他の活性酸ていますのでいずれ証明してみたいと思っていま素に変化して細胞に障害を与える訳ですが、 これす。

をSODがプロテクトいたします。一般に電子をス ー パー オキサイド自身は活性が弱いと言われ与え易い分子が存在しますと酸素分子からス ーていますが、 別の化合物、 さっき言いました助人

ー オキサイドができます。これを自動酸化とい

パ分子が関与致しますと一段と活性が高まってくるいます。

ことが私どもの実験で明らかになって来ました。

私は田舎の本当に文化の遅れたところで中学校

特にハロゲン化分子、 炭酸ガス、 リン酸などが時代を過ごしました。化学が好きだったので実験

ス ー パー オキサイドと反応しますとパー オキソ型をやろうと思い、 化学実験室から古いベンズアル中間体を経て極めて強い酸化能を持つようになる-135-

ことが明らかになりました。 大腸菌と人間を一緒易くするための階段に相当することをこのようににしてくれるなとおっしゃる方が居られるかも知

漫画化して説明しています。
いろいろな病巣、炎症部位ではス ー パ ー オキシ

れませんが、私どもは大腸菌の成育とその成育阻害を指標として酸素毒性を調べることをしておりドの農度が高いと言われております。 そうであれます。 大腸菌ではいろいろな効果が早く現れるのば消炎剤としてこのSOD自身を使えるのではな

で便利で良く使われる実験系です。 5時間から23いかということで今、薬としての試みがいろいろ

時間大腸菌を成育する過程に農薬に使われるパラと行われております。 SODは酵素そのものであーー

オキサイドを発生すりますので水には良く溶けますが、脂溶性が要求るのでこれが大腸菌の成育を阻害します。 クロロ

される細胞の奥にはなかなか入っていけません。

ホルムとか四塩化炭素、 ブロモトリクロルメタン

SODと同程度の活性を持った脂溶性の高いしかなどのトリハロゲン化物を加えますと活性が著しも合成ができるような簡単な構造の物質は無いだ

コー

トを加えますとス

パ

く増大し、成育が完全に阻害されるようになってろうかと私どもは長野助教授を中心に活発な研究来ます。 どういうわけかメチレンクロライドだけを行なっておりますが、すでに鉄を中心に持ちピはまったく影響を及ぼしません。 これらは有機化

リジン環を配位子とする簡単な錯体がSOD活性学をやっている人達がいつも使っている溶媒であを示すことを明らかにしております。

ーり、洗濯屋さんがドライクリ ニングに使うもの

すなわち通常の成育状態にある大腸菌の培養系にパラコ ー トを加えますとその成育が完全に阻害もこういった類であります。
次にこれも私どもがやった実験でありますが、されます。 これに私どもの合成した鉄TPP、

核酸は塩基、糖とリン酸基から構成されています。

TPAなどの人工のSODを加えますと成育の阻害

リン酸甚がス ー パ ー オキサイドを著しく活性化す

度が用量依存的に減ってきます。 つまりSODミ

ることを以前に明らかにしましたが、これをヌクミックとして働き得ることを証明したわけであり

レオチドに適用してみました所、塩基を選択的にます。

オ

次からは今日の後半のテ ー マになります。 一重

キシドのケミカルな ノ ー スとしてK02をよく使

項酸素は還元的に活性されたものとは異なる活性

いますが30℃で非常に高い効率でヌクレオチド

酸素種です。 さっき申し上げましたように光と色から塩基が切り出されます。 出てくることを喜ん

で活性化されたものです。 一重項酸素になります

でいるばかりには参りません。 これは核酸障害のと有機分子との反応性が著しく高まります。 化学

メカニズムとしての意味を持つからです。 つまり的にはスピン禁制といわれる言葉で説明されます。

オキサイドができた時、核酸を構成して通常の酸素分子は三重項であり、生体物質や通常いるリン酸基によりその活性が高まり、 核酸障害の有機物は一重項であります。 三重項と一重項はが引き起こされることを私どもは示唆したことに反応しにくいので我々は通常の酸素分子のなかでなります。

生きていられるわけです。 一重項酸素になるとス切り出すことが明らかになりました。 ス

ー

パ

ー

‘

ス

ー

パ

ー

ー

ス パ

ー

オキサイドは活性酸素の元凶であり、ピン禁制が無くなるので、反応し易くなります。

生体はSODによってこれを防御していることをしたがって生体に障害を与える可能性が出てきま

先程申し上げました。 SODは大変複雑な構造をす。 従来一重項酸素を消去する有効な酵素等は知持っておりまして、 中心に鉄やマンガンあるいはられておりませんので、ある種の現象が一重項酸

銅や亜鉛等の金属を含んでいます。

素による障害か否かを明らかにすることはなかな

SODの役割は不安定なス ー パ ー オキサイドかか難しい課題であります。 一重項酸素の検出方法

ら電子をもう一 つ別のス ー パーオキサイドに移りから考えていかなくてはなりません。 またどんな-136-

酸素分子の二重性格性について

色、 色素がこの反応を促進するかが問題となりまう生理的条件下より低い温度では阻害度が低下しす。

ますが、 これはエンドパ ー オキサイドからの 一重

皮膚はいつも光、紫外線に晒されています。も項酸素生成速度の低下に対応します。

しこのような色素が皮膚にあれば、 皮膚は常に空気に触れているわけですから一

ここに示したのは日刊工業新聞昨年2月の記事”

重項酸素ができるです。“女性の敵をチェック 、“肌の老化研究に可能性があります。そうしますと皮膚の障害が起ー役 、“一重項酸素を高感度検出 、‘‘コ ー セ ー 研

こり、 皮膚の老化につながります。紫外線障害と究所と東大 、 と出ています。私どもの教室出身は本質的にこのような現象ではないかということの研究員がコ ー セ ー 研究所の中で頑張っています

”

”

”

にもなります。そうしますと皮膚を酸素障害からが、 その縁で共同研究をやっております。この種守るにはどうしたら良いかということになり、 まの研究では先程申し上げましたように生体の中かさに活性酸素とコスメトロジ ー との接点になるわ

ら一重項酸素を特異的に感度良く検出する方法がけであります。

無いと何も議論ができません。 一重項酸素は光と一重項酸素研究の問題点のひとつは先程申し上色素でできるわけですが、 励起一重項状態から基げましたように生体の中での生成を確認する方法

底状態の酸素に戻る時に1268nmに相当する光をが今まで無かったことであります。またその生体出します。それを選択して増幅する装置がコ ーへの作用はどの程度かという点も明らかにする必

セ ー 研究所で開発されました。溶液中に増感剤を

要があります。

加え、 レ ー ザ ー 光を照射すると一重項酸素が発生

一重項酸素は光増感剤すなわち色素としますがこれに消去剤を加えると減少するのが一光で生成することが知られています。 有機化学反目で解ります。メラニン色素やコラ ー ゲンと 一重

応にもしばしば使われる方法です。光が無くとも

項酸素の相互作用はコ ー セ ー が 一生懸命やってい過酸化水素とNaOClあるいは燐オゾニドといっる研究でありますが、 その流れの中でこの装置がた系で一重項酸素を生成することが証明されてお開発されたわけです。現在のところこの装置は日ります。証明方法はもっばらある種の反応生成物

本に一 台しか無いはずで、 これを使用する研究はの構造からの推定によります。私どもは、 光が無

コ ー セ ー の研究所に行ってやらせてもらうしかあ

くても生体の中で一重項酸素を生成する新しい系

りません。私どもも始終行っては使わせてもらっとしてナフタレンエンドパ ー オキサイドというもています。コ ー セ ー は肌の衰えを隠すのでは無く、のを新たにデザイン致しました。これは生理的条

老化を抑える、 女性の夢をかなえる化粧品開発を

従来から

一

重項酸素を発生させるのでいろい

目ざして研究を行っているとのことです。そうい

ろな判定に使えます。このエンドパ ー オキシドはうことで女性の敵と言うのは一重項酸素でありま

ナフタレン誘導体に別途の方法で作った一重項酸

す。 つまり光が当たって色素があると皮膚の周り素を反応させて合成いたします。これが熱的に分で 一重項酸素ができ、 それが皮膚の老化に繋がる解致しますと一重項酸素を発生して自身はもとの可能性があるという訳です。従ってこの装置は有ナフタレンに戻るという系です。この化合物を生

効な化粧品の創製には欠かせない武器になると思件下で熱的に

一

体の中に入れ、 分解してできる 重項酸素によるわれます。
どんな色素が光の働きで一重項酸素を出すので障害を見ようというものです。
ーしょうか？いろいろ言われている中でコプロポリ

オキサイドを加えて行きますと用量依存的に成育

フィリン、 プロトボルフィリン、 ヘマトポルフィ

一重項酸素でも大腸菌成リンのようなポルフィリン骨格を持ったものがあ育が阻害されたことを示しています。 37℃といります。生体はこれらを産生します。 プロトポル

ここでもまた大腸菌を利用します。エンドパ阻害を受けます。つまり-137-

フィリンというのは実は血液の赤い色素ヘモグロ

うちで最も多くいるアクネ菌は代謝でボルフィリ

ビンの本体であり、中心に鉄が入っています。生ンを産生します。それが皮脂腺から分泌しまして、体は細胞の隅々にまで呼吸で取り入れた酸素をこ鼻とか顎に出てきます。それが分かるんですね。

れに乗せて供給しています。つまりこれは酸素の健常人ということですがいったい誰なんでしょキャリア です。また私どもが研究している薬物

う？

代謝酵素であるチトクロムP450といわれるものにあるということです。

ー

ともかくこれ位ポルフィリン類が顔の皮膚も全部このポルフィリンに鉄のはいった形です。

ある方法で肌から取ったこのポルフィンを集め

そのほか微生物が産生することも知られています。

て例の装置にかけてみますと1268nmに発光が認

これらは多くの冗電子が共役している色素のひとめられます。標品であるアクネ菌、肌から取ったつです。それからよく有機合成で一重項酸素を発アクネ菌のポルフィリン、 コプロポルフィリンの生させる時に使うロ ズベンガルもそのような色

デ ー タ ー などを解析してみますと吸光度との対応素です。エオシンもそうです。これは最近は使わなどから、皮脂と 一緒に分泌され皮膚に存在してー

なくりましたが赤インクの中の赤色素です。これいるのは結局コプロポルフィリンであり、これはは実際にやった人のいる実験の話ですが、蟻が集光に当たると一重項酸素をしっかり出しているこ

まってくるので困ってしまいこれを退治するためとがわかりました。つまり光に晒されている皮膚に甘い水の中に赤インクをたらして光の当たるとの上では一重項酸素が生成しているわけです。しころに置いておきました。すると案の定蟻の群れたがって今後は一重項酸素による障害がどの程度来てこれをなめ、すべて死んでしまいました。 こであるかということを研究していく必要があるし、一の系では 重項酸素ができてこれをなめた蟻が死んだと説明されています。このように

一

重項酸素

を与える色素はいろいろと知られているわけです。
コー

セ

ー

で開発した

一

重項酸素の高感度選択的検出系で、例えばヘマトポルフィリンにレ ー ザ ー

また、消去するものを与えるかあるいは紫外線が当たらないような工夫などかつ重要な問題となってくるわけです。
ここで一重項酸素と関連して最近話題になっている、夢の新物質、Cs。についてお話いたします。

光を照射しますと 重項酸素に基づく1268nmの

最近のサッカ ー プ ー ムは大変なものでありますが、選択的な発光を見ることが出来ます。色素量に対

この物質の形はサッカ ー ボ ー ルそのものでありま

応して発光が増えており、 一重項酸素の生成と対す。勘定してもらえばすぐ分かりますがサッカ ー

応しています。

ボ ー ル表面の頂点は60あります。この物質は炭一一重項酸素生成能を比較してみますと、有機合成に良く使われるロ ー ズベンガルに比べ、ポリフィリン系は圧倒的にたくさんの一

重項酸素を出素だけでできておりますのでCs。と呼ばれます。
同様にダイヤモンドも炭素の同素体でありますし、すす、黒煙みたいなああいう汚らしいものもそうです。Cs。の存在は理論的にずっと前から予想さすことが分かります。
これはコ ー セ ー

れていましたが実際に証明されたのは極最近であ研究所から借りたスライドです。先程からの数枚ります。すすの中に存在することが分かって以来

さあ、これは何でしょうか？

もそうです。健康の人を暗室の中に入れ、紫外線

世界的な規模で爆発的に研究されるようになりまを当てた時の写真です。このように光ります。顔した。例えばこの中に金属を入れたらどうなるだを洗えばきれいに取れて光らなくなるのでしょう

ろうか？

超電導物質としての可能性はどうであ

か？

ろうか？

いろいろ興味が尽きません。最近では

この辺は聞いてみないと良くわかりません。

皮膚には皮腐の恒常性を保つことに関係するいろ

エイズに効くのでは無いかなどの話も出て参りま

いろな微生物がいることが知られています。そのした。そういう訳でこの研究を文部省が重点研究

/-

-138-

酸素分子の二重性格性についてに指定しました。これはすすの中に有ると云うこなので喜んでいただきますが、お菓子の袋にはしとですから体の中に入る可能性があります。これ

ばしば腐敗防止のためにエ ー ジレスという脱酸素を使った化学反応を扱う研究者にとっては有害か剤が入っています。ある時大きなお菓子のパック

どうかは大問題であります。我々はCa。の生体へを頂いた際その中にかなり大きなエ ー ジレスがの影響、生物機能と云うものを調べようと云うこ入っていました。開けてしばらくしてこのエ ー ジとで

一つの研究班を組織致しました。私はその代レスが発熱しているのに気が付きました。これは表になっておりますのでこの物質を扱うことが多ホカロンつまり携帯用懐炉に使えるなと思いましくなっております。

た。発熱はパックの中の酸素を吸収したエ ー ジレ

Ca。をベンゼンに溶かしますと炭素だけの化合

スにまだ余力が残っているために新しい酸素に触物にも拘らずこのようにきれいな紫色を示します。

れて発熱反応を起こしたことを意味しています。

構造上から云いますと炭素だけでサッカ

ー

ボ

ー

ル

この時私はあることを思いつきました。つまり私になるためにはこのように二重結合が共役しないは最近五十肩ですので冷えないように携帯用壊炉、といけません。まさに共役冗電子系の固まりのよ

ホカロンをよく使っていますが、これは酸素をうなものです。したがって色素と云えます。それ吸って非常に多くの熱を出すものです。それならでは光を当てれば

一

重項酸素を出すのではないか

ばこれをエ ー ジレスの代わりに使ってみようと思いました。 ビニ ー ル袋の中にパンを入れ、一方はという疑問が生じます。
の開発した装置で測定します

そのまま、他方にはホカロンをもんでから一緒にとこのように 1268nm にピ ー クを持つきれいなス

入れ、封をしたわけです。この程度の酸素では発ルは光を熱しません。一週間経ちますとホカロンを入れな

またもやコ

ー

セ

ー

ペクトルが得られました。サッカ

ー

ボ

ー

受けて 一重項酸素を出しているわけです。
「転ばかった方のパンは徴びましたがホカロン入りはこぬ先のベ ー タ ー カロチン」とコマ ー シャのように全くカビが生えていません。徽は微生物ー タ ー カロチン、これは一 重項酸

ですので、生きるためには酸素、水、温度が必要

ルに出ているベ

一

素を消去するものです。光と色素でできる 重項です。我々は経験上このことを無意識に知ってお酸素を色素が消去する皮肉な仕組みになっている

ります。冷蔵庫に入れて冷やすのは微生物の成育わけです。

に必要な適当な温度を与えないと云うことであり

ベ ー タ ー カロチンの量が多くなれば明らかに一重項酸素の生成は減ってきます。

な水を与えないことであります。もうひとつの方

あ る病巣、例えばガン腫瘍にこのC a。を選択的に集まるように細工をしてからレます。また例えばお餅を乾燥すると云うのは十分

ー

ザ

ー

などを

法は酸素を絶つことです。好気性に進化した生物
は酸素が無いと生きられません。この実験ではカ使って局所的に光を当てることができればそこでビの生育に必要な酸素を吸収して与えないことに一なります。一 方密閉系でホカロンが空気中の 5 分

重項酸素が発生し、その毒性がガン細胞をやっつけることとなり、ガンが治る可能性が考えられの1のガスすなわち酸素を吸って止まると云う事ます。このような考え方をフォトダイナミックセ

も実験で確かめました。ホカロンは酸素を吸ってラピ ー と云います。活性酸素を出すような物質を熱を出す懐炉になりますが、こういった使い方である病巣に運び、酸素毒性を利用して治療する方

すと脱酸素剤となり、ものの保存に使えることに法であり、毒を逆に利用する人間の知恵が働いてなります。ただしこの保存方法が完璧であると信います。

じて使用されると私の信用にかかわります。何故

これは私が自分の家でやった実験です。私はよ

なら効果がどこまでもつかを私は確かめて見ましく人からお菓子をいただきます。甘いものが好きた。その結果何週間かの後、 一方が腐敗してべた-139-

べたになった時点で、 ホカロン入りの方も程度はに初めてそのありがたみか分かると云った意味で低いのですがわずかに徴びが生じました。 これはす。 夫婦の間柄などが良くそのように云われます

とうしてでしょうか？

酸素が完璧に取れなかっが、相手を怒らせたら大変怖いものです。 一方薬たのかあるいはもともとすでに徽があったのか？

学の立場で申し上げるとすれば、これは薬と毒のこの辺は良くわかりませんが今後検討して見たい

関係に良く似ています。 薬の価値が忘れられて副と思っています。 ス ー パー等で売っている真空作用が特に取りざたされている傾向がありますが、パックの食品はまさに酸素を抜いてある状態です

正しい使い方をしなければ薬だって怒りますよとが真空にできないようなものには安価なホカロン

私はいつも云っております。 最近のMRSA問題

を使いますとかなりの程度の防腐効果が有るといも薬の使い過ぎによります。 薬を安易に使ってそうことをこっそりお教えいたしたいと思います。

の恩恵に慣れ切っていたためにこのような面が出以上、酸素分子の功罪と申しますか、その二重てきたのだといつも思っています。 酸素の二重性

性格性について述べてまいりました。 人はよく

格性は実は薬の二重性格性に非常に良く似ている「空気のような存在」と云います。 これは身近な点を申し上げて本日の締めくくりとさせていただ

物事の恩恵がとかく忘れられがちである事のたときます。 ご静聴どうもありがとうございました。

えでありまして、そういったものが無くなった時

-140-

ー

コスメトロジ 研究雑感

研覧雑揺
カットに分けることができるものではなく、医学本研究とコスメトロジ
渡辺が古典的コスメトロジ ー の領域に踏み込むことが一できることを象徴的にあらわしている。今後本研
究が、医学とコスメトロジ ー が融合した新たなコ晋一

スメトロジ ー を創造するきっかけとなり、さらな（平成2年度）g

るコスメトロジ ー の発展につながることを期待し古くよ り 皮 膚科の 分野では 学問的興味から（帝京大学）

pigment biologyの研究が行われていた。しかし色素異常症は、生命的に問題となるようなこと

本研究とコスメトロジ 一がないため、医学的な強い関しがもたれず、治療との関わりの面では、いわば見捨てられてきた疾患であった。
しかし近年、医学の分野においてもquality of

新井lifeが叫ばれるようになり、生命的には問題とな

洋由（平成2年度）§る疾患でなくても、その疾患で悩んでいるヒトの皮膚は絶えず外気に曝されており、からだの中苦痛をいかに取り除くことができるかが重要な課でも、いわゆる酸素による傷害を最も受けやすい題となってきた。コスメトロジ

はまさにこのよ部分である。私はこれまで、生体成分、特に脂質

うな今まで有効な治療法のなかった色素異常症に

成分の酸化とそれに対する生体の防御機構につい

対し、患者さんのqualityof lifeを高めるためにて研究を行ってきた。特に、脂質酸化を防ぐ作用ー

多大な貢献をしてきた。しかし、近年のレーのあるビタミンEに注目している。ビタミンEは、

ザー

医学の進歩により、ある種の色素異常症をなんら

その生理作用や抗酸化作用の化学的メカニズムに癒痕を残すことなく治療することが可能になった。

関してこれまでにも膨大な研究があるが、この疎特に、太田母斑は我が国では1000人に6人の割合

水性の物質が生体内あるいは細胞内でいかに必要で存在すると報告されており、顔面という目立つな部位に必要な量だけ供給されているかという点部位に生じ、しかも女性に多いことから、太田母に関しては殆ど研究されてこなかった。私は、細斑は美容的にも、精神的にも深刻な問題であった。

胞内のビタミンE輸送に関わると考えられる特異今回の研究の目的は、このような患者さんの悩み

的結合蛋白質を同定しており、本蛋白質が、恐らを軽減することであり、まさにコスメトロジ ーのくは皮膚組織にも存在し、この蛋白質の増減が皮目指すものと同じである。元来医学、特に皮膚科

膚の酸素ストレスに対する抵抗性を規定する一つ

学は、コスメトロジ ー と表裏一 体の関係に在り、の因子であると想定し、この蛋白質を通して「コ

皮膚科学でカバ ー できない疾患に対し、患者のスメトロジ ー 」を考えてみようと思った。しかし、

quality of lifeを満足させる 一 つの手段として、研究を進めていくうちに、このビタミンE特異的

コスメトロジ ー が大きな役割をはたしてきた。 今

結合蛋白質は、実は生体内で肝臓にしか存在しな

回の研究は、医学とコスメトロジ ー がクリア ー

い蛋白質であることが分かってきて、生体内のビ-141-

タミンEの循環に非常に重要な役割を果たしてい証拠はないが、エストロジェンによってヒアルロると考えられるものの、皮膚との関係は余りない

ン酸合成酵素の誘導が起こるが、肝心のヒアルロ

ことが明らかになってきた。 そのようなわけで、ン酸の減少している老化した皮膚ではそのレセプ「コ」から研究費をいただいたけれ

タ ー も少なくなっている。 したがってエストロ

ど、多少の後ろめたさを感じていたわけである。

ジェンを投与してもヒアルロン酸の増加は期待でところがである。 我々がこの蛋白質に関する研究

きそうにない。 一方、 表皮はレチノイン酸の投与

成果を論文に発表したところ、 ドイツのある化粧によってヒアルロン酸が増加するがレチノイン酸

スメトロジ ー

ー

品メ カ

ー

（ニベアをつくっている会社らしい）

は皮膚に炎症反応を示すので化粧品に使用するこから、このビタミンE輸送蛋白質を化粧品中に入とはできない。 もし経皮的に吸収され得る低分子

れて、ビタミンEの皮膚への吸収をよくすること化合物によって内因性ヒアルロン酸合成が促進でを考えているので、サンプルを送ってくれないか、きれば有用な方法となる可能性がある。

という問い合わせがきたのである。 そのようなこ

最近は表皮細胞と皮膚線維芽細胞による細胞間とがうまくいくかどうかは分からないが、現在で相互作用によって種々のサイトカインの産生や今は、遺伝子工学の技術を使えばこのような蛋白質

回の私共の報告にも見られるようなマトリックスの大量生産も不可能ではないし、本来は肝臓にしメタロプロテア ー ゼの産生の増大が見いだされてか無い蛋白質を多少遺伝子的に改変して、皮膚でいる。 今後は単一細胞による実験よりもこのようも作用し、しかも長持ちするような蛋白質を人工なより生体に近い実験系を用いて検討する必要が的につくることも可能である。 だから、この蛋白あると考えられる。 化粧品の世界でも皮膚化学の質入りの化粧品が、 「ビタミンEの効果を有効に地道な研究によって生体反応から説明でき得るよ

利用する化粧品」として市場に出回ることもあな

うなよい製品の生まれることが期待される。

がち夢ではないかもしれない。

（東京大学）

本研究のコスメトロジ ー に

私のコスメトロジ 一 考森（東京薬科大学）

及ぼす影響

陽（平成3年度）§

早川律子（平成3年度）§

最近はコラ ー ゲンとかヒアルロン酸といった専

人間は紀元前にすでに目の回りを彩り、頬や口門用語がテレビコマ ー シャルを通じて茶の間でよ

唇に色 を つ け 、 黄土(yellow ocher)を 顔 にく聞かれるようになった。 コラ ー ゲンの誘導体や塗ったと報告されている。 古代エジプトにおけるヒアルロン酸が化粧品に添加使用されているのは

化粧は、太陽の光による皮膚の障害や結膜炎を防これらの生体高分子がもつ保水性という物理的性

止することが目的であった。 現代におけるメイク

質を利用しているものであるが、あたかも生体成

アップの意義は顔の欠点を隠し、肌色を整え目鼻分が補給されるような錯覚を視聴者に与えている。

立ちをハッキリさせて美しく見せることによる心皮膚ヒアルロン酸は加齢と共に減少し皮膚のみ

理的効果と紫外線から皮膚を防御することにある。

ずみずしさが失われる

一つの原因であるが真皮の一方、皮膚の洗浄と保護を目的とするスキンケア

ヒアルロン酸と表皮のヒアルロン酸は別々にコンに用いる化粧品は使用者の年齢、性などの個人的

トロ ルされているようである。 ヒトでは明確なな条件と気温や湿度、風の強さなどの環境条件を

ー

-142-

考えて選択する必要がある。 皮表脂質量は男性で粧品過敏症の発生には種々の機構が考えられるが、は同年齢の女性より多く、思春期では多く、高齢

このうちマスト細胞が関与するものをin vivoで者では低下している。 皮膚の洗浄に用いる石鹸やしらべるための実験システムを作製することが、洗顔料は、思春期の皮脂分泌の旺盛な人には脱脂本研究の当初の目的であった。 しかしこの分野のカの強い製品が適しており、中年以降の皮脂分泌研究の世界的な流れの中で、実験に使用すること低下を来した人では脱脂力の弱い製品が適していを予定していたマスト細胞欠損動物が、なぜマスる。 洗顔後の皮膚の保護に用いる製品も、皮膚表卜細胞を欠損するのか、その機構を分子レベルで面の状態によって異なる。 皮屑表面の状態をよく解明することが、当初予定していた実験を開始す

観察し座瘤や乾燥の有無、環境条件により、適切

るに先立って必要となったために、この報告書にな製品が異なる。 このようなメイキャップやスキ記載した研究は、マスト細胞欠損動物で異常がみ

ンケアに用いる化粧品は、その製造過程で皮膚安られるc-kit遺伝子の分子レベルの解析が中心と全性を確保する努力がなされているが、配合成分なった。

が経皮感作を起こす可能性をゼロにすることはで幸にして、我国で発見されたマスト細胞欠損動きない。 化粧品を使用して皮膚トラプルを生じた物である Ws/Ws ラットの分子レベル、細胞レベ患者に、 安全に使用できる化粧品を選択し適切なル、 個体レベルの特性がかなり明らかになったの

メイキャップやスキンケアを指導するためには、で、今後この Ws/Ws ラットを使用する皮膚過敏

その原因物質を同定し、安全な化粧品を選択する症の研究を改めて行える状況にある。 近い将来ことが必要となる。 この場合にパッチテスト検査

Ws/Ws ラットはマスト細胞の関与が疑われる皮が施行されるが、至適濃度と適切な方法でパッチ膚過敏症の検査や研究に必須の実験動物になるとテストが施行されないと判定を誤り、適切な指導考える。

が行えない。 本研究により、 日本接触皮固炎学会

最後に本研究の遂行を可能にしていただいたコの共同研究が推進され、より多くの化粧品配合成

スメトロジ ー 研究振典財団に深い感謝の意を表し分のパッチテスト至適濃度と基剤が決定されるこます。

（大阪大学）とは、コスメトロジ ー の分野に大きな貢献を果た
すものと期待される。

（名古屋大学）

本研究成果のコスメトロジ 一に及ぼす影響本研究成果のコスメトロジ 一

荒殿に及ぼす影響北村 幸彦

誠（平成3年度）§水ー油ー界面活性剤からなる多相系についての（平成3年度）§本研究は、エマルションの安定性、相分離後の各化粧品はその性格上、医薬品以上の安全性が要相の組成、相量などについての基礎情報を与える。

求される。 また化粧品を使用する人口が膨大であ

これらは、化粧品、香料の洗浄、起泡、吸湿作用るために、化粧品に対する過敏症の発生を根絶すなどの品質や安全性に直接関連した重要な要素でることは困難である。 皮膚はヒトの組織の中ではあり、材料の機能、物性等の基礎研究として本研

マスト細胞の存在密度の最も高い器官の一 つであ

究は大きな意味をもつ。 また本研究の成果は、油り、化粧品過敏症の中にはその発生にマスト細胞／水界面での非イオン性界面活性剤の吸着現象をが関与している場合がかなりあると思われる。 化

正しく理解し、界面での吸着膜の構造、物性など-143-

を知るうえで重要であることはすでに報告したと

ゲンなど種々の保湿剤の入った化粧品を用いてしうりである。 さらに本研究は油／水界面での界面

わとりにはげむなどがこの例であろう。 もう一 つ活性剤相の濡れの研究へと進展している。

は、 自己を美しく魅力あるものに表現すること。

界面での現象や溶液物性がコスメトロジ ー の科
一

学の重要な

部であることを考えると、 長期的に見て本研究成果のコスメトロジー

ただ、最初の目的もつまるところ皮膚を美しく保つことにある。

ヘの影響は大き男性、 女性という点から考えてみれば、 身体保（九州大学）

護のための化粧には性差がないといえる。 しかし、第2の目的については、 ごく一部の男性のためとは言え、 主に女性のものであろう。 しかし、 女性

コスメトロジ ー 雑感

についてみても、年齢、状況に応じて化粧する目滝川 雅治

的は微妙に変わるわけで、「何故化粧をするのか」という問には、 本人にも答えられないのでは（平成3年度）羽ないだろうか。

（浜松医科大学）「Forever young」（日本題は忘れた）という映画を飛行機内上演でみた。 米国映画で、 第二本研究成果のコスメトロジ 一次世界大戦前に、 フィアンセが交通事故で意識不に及ぼす影響明になり絶望した空軍パイロットが（実は彼女は命をとりとめたのだが）、 軍機密の冷凍装置で実吉里

験モデルとして冷凍人間となる。 戦後、 彼が冷凍保存されていることは忘れ去られるが、 基地に侵

勝利

（平成3年度）g

コスメトロジ ー の研究内容の一 つには

“

美しく

”

“

美

入した少年のいたずらで現代の世界に再生する。

あるための技術 の開発があると思う。何が彼はかつてのフィアンセが生きていることを知り、しいそこへ飛行機を駆って飛んで行き、 ハ ッピ ー エン

観的な答えはないに違いない。 ただ次の答えは誰ドとなる。 再生してから再会までの数週間の間に、にも受け入れてもらえると思う。

彼はどんどん老化して老人になっていくわけであー

るが、 これがメ キャップで上手に表現されている。
映画、 演劇などでは化粧• メー キャップをうまく利用して、 臨場感を出している。 これなどは化”か。 美の基準は何か。 などと質問すると客“自然なままで”健康な状態はそれだけで美しい 。
“

“

自然なま

ま

”

が美であるとすると

術”がコスメトロジ ー の目指すものの一 つとなっ自然なままにする技てしまい自己矛盾に陥りそうである。
この場合

“

自然のまま

”

“

に 健康な

”

というこ

粧の目的が極めてはっきりしているわけである。

とが加わって個人によっていろいろな技術が必要

しかし、 日常生活ではどうであろうか。

になってくるのかもしれない。 人によっては

「人は何

”

故化粧するのか」という問に答えることは容易で康なない。 古代世界や現代未開地では、 自然からの身

ろう。

が

“

“

健

”

若々しい青春 になる場合もあるであ体保護あるいはそれ以上に宗教的な意味が化粧に自然なままにする技術を開発するためにも自然賦与されていることはちがいない。 現代社会におの状態をモデル化して人為的操作を加えて分析・いては、 大きく2つの目的に分けられよう。

一

つ

解析しなくてはならない。 また、 皮膚は人間の自は、 実際的、 身体保護のため。 例えば、 サンスク

然美を議論する時、最も関心をよぶ器官でもある。

リ ー ンを用いて皮膚の光老化を防止する、 コラ ー

本研究が目指す理想的皮府モデルの開発とそのモ-144-

デルを利用した基礎研究はコスメトロジ ー の発展に大きな貢献をすると思う。

（広島大学）

長寿とコスメトロジ 一
本間

コスメトロジ ー 雑感古川聡起
（平成3年度）g

福実

私たちの研究室では、長寿の要因を多角的に検（平成3年度）g

討するために、東京都内の100歳老人の訪問調査

オロジ と名が付く分野を耳にするあるいは目を行っている。普段、病院では内科系の診療に当にする時、一般に我々は何かしら近寄り難いものたっているので、痴呆の程度の判定のほかは、診を感ずる。 自分の分野である皮膚科学即ちデルマ

察や超音波などの検査、血液の検査が中心だが、

ー

トロジ

ー

にしても、その門をたたこうとするとい

ささか緊張する。 しかし、コスメトロジー

その前後に交わされる何気ない会話や行動の中かに関しらも、いくつか長寿の秘訣をうかがい知ることがては、そのような緊張感は余りない。 何故だろうできる。 100歳老人は、約4倍女性の方が多いのと考えるに、その答は単純ではない。

だが、彼女らは、なかなかの“”おしゃれ である。

1つは、比較的新しい分野であって、オロジー に

新宿区のKおばあちゃんは、記念撮影と言った

ドルがない

ら、 「髪をとかしてから」と言って、正直言ってー

あまりとかす髪もないのでは？という髪を 一生懸

ドルがないあるいは意識されないことがコスメト

命なでてから写真に収まった。 今は既に亡くなっ

ロジ ー の最大の利点なのかもしれない。 研究は、た自分の亭主と区別がつかなくなっている息子さ自由闊達にしかも紳士的に全力で立ち向う所に醍んに隣の部屋から櫛を持ってきてもらって … 。 渋醐味がある。無意識に設定してしまうバリア ー の谷区のSおばあちゃんは、最後に記念撮影をしま無い分野に新の研究が生まれる可能性を感ずる。

しょうと言うと、 「私は昔は美人だったから」とつきもののあらかじめ設定されたハーことが原因かもしれない。 逆に言えば、そのハ

他の理由は、私自身のコスメトロジ

ー

に対する

言って、とうとう写真は撮らせてもらえなかった。

無知からくるものかもしれない。 多分、本学問に70歳と言われても信じてしまうぐらいなのに … 。

“”

知 は膨大なものであろう。 幸

彼女は信州の山荘にでかけて山を見るのが大好き

か不幸か、私自身はその膨大さを知らない。無知だったが、 99歳の誕生日を迎えるころから急になれば、無知なりに自由な発想が可能となり、既耳が遠くなり、それと同時に行動半径が狭くなっ

存の オロジた。 もちろん、ただ長寿であると言うだけならば、

今迄蓄積されたー

では自己規制していた方法が実現性あまり百寿者に学ぶことはないが、彼らは一様にを帯びてくる。
今回の研究テ ー マとしてサンスクリ ー ンの効用

90歳を越える超高齢になるまで、日常生活の活を細胞障害性という従来の思考様式と易感受性と動レベルが高く、またその頃の写真をみても20いういささか非科学的な思考様式から取り上げた。

歳は若く見える、健やかに長寿を達成している人

その成果には、いささか自信がないが、今後も、達である。 人間を見て年齢を想像する時には、

自由闊達に発想を拡げて行こうと思う。 研究を比

様々な要因を瞬時に総合的に見ているはずだが、較的自由に楽しむことができたのも、自らのイ

外見の中で皮腐の状態というのは、おそらく大き

メ ー ジとしてのコスメトロジ ー のおかげである。

なウェ ー トを占めているのだろう。 若返りは難し（浜松医科大学）

くても、皮膚の老化を少しでも防止し、若い外観-145-

を保つことは、単なる長寿ではなく、質の高い長ムは、 バ クテリアを退治する機能と抗炎症作用を寿を達成するのに重要な方策となる。その方策を併せもつ蛋白質である。しかも、一般に不安定と探るためにも、皮膚の老化に関する客観的で、そ言われる酵素蛋白質の中で、大変に安定な性質でして簡便な評価法が、臨床の場でも研究の場でもあるだけでなく、人間の体内で作られて涙の成分望まれる。長寿社会の到来とともに、コスメトロになっている安全な物質である。元々顔と馴染みジー

は、もはや若い人のものばかりでなく、 “老の物質であるから、このような蛋白質を多量に生”産すれば、他のコスメトロジ ー 素材の細菌による年学 にとっても重要な関心事となるからである。

劣化を防ぐとともに皮腐の炎症を抑えて安定化し、（慶應義塾大学）

皮膚に侵入する有害バクテリアを溶解して有用な素材となろうと発想したわけである。リゾチ ー ム

長寿社会でのコスメトロジ 一
鈴木の分子としての大きさは、酵素蛋白質としては最克周

も小さい部類にはいる。大きさが小さいので遺伝（平成4年度）g

日本人の平均寿命が80歳となっている。生活、経済、環境が著しく悪化しなければ、いずれ90

子工学・蛋白質工学という手法を用いる改良も行われている。小さい分子ではあるがますます高機
能化しつつある。これを効率良くたくさん作る原理を探るのが本研究課題である。

（広島大学）

歳近くまで伸びる可能性がある。長く生きるということは、経験を蓄積するだけでなく、傷害を蓄皮膚と私積することでもある。現在癌が主要な死因となっ澤田

た所以もここにある。

嗣郎

皮膚を清潔で美しく保つことは、これまでは比g較的若い世代の人の関心事であったが、熟年を楽（平成4年度）しく健康で生きるために広い世代でますます重要

私は化学計測を専門としているので、 目にするな課題となってきている。皮際は、微生物や温湿ものは何でもこれはどのように計測すれば良いか

度の変化、化学物質、光線と対峙する上に、視線などとすぐに考えてしまう。いわゆる職業病といにもさらされるわけであるから、もっとも多機能

うやつである。難しそうな対象程いつまでも気にな部位であるともいえる。長く生きるためにこのなって、いわゆる夜眠れそうにないってことにな

身近な器官とうまく接してゆきたい。

るのである。

個体の外環境への接点である皮膚を科学するこ

今般貴助成金を頂くことになった皮膚計測もそとは、私のような門外漢にも魅力的な分野である。

の中の一つであった。私が光熱変換分光法に興味

蛋白質の分泌を専門としてきたので、蛋白質の機をいだきはじめて、しばらくしてすぐに本法によ能を用いてコスメトロジーに積極的に寄与したい

り皮膚への薬物の浸透や外的刺激に対する皮膚のと考えていた。高齢者の皮膚はいろいろな成分に反応を計測してやろうと考えた。 10年前当時、不足がでてくるので、その機能を保つために補う

そのような分光計測は皆無といってよく、ちょっとすれば、細胞が作っているのと同じ物がよい。

と試しにやけどの薬の皮膚への浸透具合を調べて50年間以上も継続して皮閤に補うとすると、副興味深い結果を得ても適切なコメントや相談相手

作用の少ない安全な物でなければならない。筆者をして下さる皮膚科学の専門家は近くには居られらがこれまで研究対象として扱ったきたリゾチなかったと思う。当時私共の研究が新聞に紹介さ

ー

-146-

れたとき、真っ先に反応したのは、冷凍マグロの礎的研究を行うことが重要である。 具体的な例を

鮮度を解凍せずにわからないかというとある河岸

上げると、化粧品の中には白色顔料として酸化チの魚おろし問屋のおやじからの問い合わせであっタンが多量に含有している。 これは紫外線を散乱た。 半年間程そのおやじの相談にのってやったが、して、 UVカットの役割をしていると言われてい何となくそのままうやむやになってしまった。

るが、実際はミクロ的に電荷分離が起こり、光酸

私は皮膚計測に関心を持っていても、所詮皮膚化反応が進行している（その程度は、酸化チタン

科学がなんたるものか皆目わからないのがほんとの種類によって異なる）。 このように酸化チタンのところである。 皮膚は生体防御膜であり、生体存在下において、界面活性剤や高級脂肪酸などのを制御する調製膜位の知識しかないのであるから、化粧品素材はOHラジカルなどの活性酸素種の攻昨今では皮膚を通して薬物を投与したり、必要な撃により、光酸化を起こしている。 生体系におい善分を供給したりするとか様々な目的の研究があて、より短波長の紫外線は細胞核中の遺伝子を傷ることを知り、改めて私共の研究もまんざら捨て ，つけると言われているので、 DNA、 RNAなどたものではないと思ったりしている。 大して痛い

生体高分子（遺伝子）の酸化チタン中での光劣化思いもすることなく、体の悪いところを早期に発を調べることは必要である。 特に、タンパク質を見したり、古くなった体の部品を簡単に交換でき、構成しているアミノ酸が光分解され、アンモニア

体を痛めずに治療できればどんなに好いことかとイオンや硝酸イオン、炭酸ガスを生成するメカニ思いつつ、その夢に本研究が少しでも役立てばとズムを解明することは重要な課題であろう。 この考える次第である。

ような研究から皮膚保護作用力があり、人体に安（東京大学）

全性の高い化粧品が開発されるであろう。
コスメトロジ ー が、いろいろな学問体系を結び

コスメトロジ ー は．．．．
Interface Science
日高久夫

つける Interface の役割を果たし、これらの成果からさらに新しい境界分野が生まれることが期待される。

（明星大学）（平成4年度）§コスメトロジ ー は有機化学、生化学、医学、生

コスメトロジ ー と皮膚脂質

理学、 コロイドおよび界面化学、光化学、油化学

小野 輝夫など広範囲にまたがる学際領域の学問C Inter­face Science) である。 自然科学ばかりでなく、（平成4年度）g

社会科学（心理学なども含めて）とも深いつながは人間が皮膚を構成している細胞がかなりの速度でタ ー

健康で快適な生活を送るための科学と言えよう。

ンオ ー バ ー していることは、角化をはじめとする

環境化学とは一見関係なさそうだが、大気汚染の細胞の落屑、皮膚表面の油性の潤いの変化からもりがある。 広い意味で、 コスメトロジー悪化に伴う紫外線の増加は皮膚ガンの発生や免疫

容易に想像されるが、脂質の直接的な関与はこれ機能低下などを引き起こすことが指摘されている。

まで不明であった。 最近我々が長いこと関心を持

これらの問題を解決するためには、いろいろな専

ちながらその機能を明らかにできなかった細胞内門分野の研究者が違った立場（角度）から検討し、サイトゾ ー ルの脂肪酸結合蛋白(FABP)ファ

新しい独創的な方法を見つける必要があろう。 分

ミリ ー の新しい分子種の可能性が高い蛋白がヒト

子会合状態や相互作用に関する分子レベルでの基の皮膚から単離され、且つこの蛋白が既知の分子-147-

種と明らかに一次構造を異にするが、ファミリ ーろう。植物色素としてはカロチノイド、 ベ タレイ

であり、ヒトの乾癬発症と密接に共役

ン、フラボノイドなどがあげられるが、それら主して発現されているらしいことが報告され、ケラ要色素の中で最も多彩な色を構成している色素はチノサイトの増殖分化に FABP が関連している

フラボノイド系のアントシアニン色素であろう。

のではないかとの FABP 機能を解析する研究上

アントシアニン系の色素は人類が花より 色水の突破口が見出されそうである。細胞機能とセルを得たときから常に最も身近に合った色素であっサイクルを理解する上で皮膚の脂肪酸研究の比重たと考えられるにもかかわらず、その化学構造のは重いと考えられる。我々が関心を持つもう1つ

複雑さや安定性などからその利用度は合成色素に

のメンバ

ー

“

ー

”

の脂質にコレステロ ルがある。皮膚の皮脂腺は比べて今に到るまで極端に低い。しかしながら、不ケン化物を分泌して皮膚の潤いと光沢、湿度を植物のアントシアニン系色素は天然物由来の落ち保っているが、不ケン化物の中にはスクアレンと着いた色調や、消費者の嗜好品としての高級化粧呼ばれるコレステロ ー ル生合成の中間体でもある品の天然物嗜好、さらにはフラボノイド系のアン炭化水素が多量含まれている。このことは皮脂腺

トシアニン色素は植物においては紫外線によるでのコレステロ ー ル合成系が肝腸などの合成系とDNA障害に対する防御物質であって、紫外線に異なりスクアレン ・ エボキシダ ー ゼの発現が極め照射された植物体内で発現生成されることなどをて弱いか、あるいは酵素に対する阻害作用を持つ

考え合わせると、今後は化粧品用の色素としても蛋白の存在などを推定させ何らかの阻害機構があ最も注目される色素のように思われる。
“”

ると推定される。動物でもサメの肝朦は他と異な

数年前 バイオの口紅 ということで植物の組り例外的に大量のスクアレンを含んでいるので、織培養により産生した天然色素を含んだD紅が、ー

皮膚の皮脂腺との比較がコレステロ ル生合成の折からの天然嗜好とも相まって大いに話題となっ

面で大変興味深い。 コレステロ ル生合成の律速

たことかあった。このバイオの口紅に用いられた段階は、既知のHMG-CoA還元酵素以外にスク色素は数多くあるバイオテクノロジ ー の諸技術のー

アレン ・ エポキシダ ー ゼも有力で、細胞の増殖分

うち細胞（組織）培養技術を用いたものであって、

化 、 細 胞内情報伝達に役立つプレニ ル化蛋白

色素生合成系の遺伝子そのものを操作して天然色(rasやG結合蛋白）がスクアレン ・ エポキシ素の産生を高めるものではなかった。

ダー

ゼ段階以前の生成物を利用している点は細胞周期上極めて興味深い。

アントシアニン系色素など多くの植物天然色素
は二次代謝産物であって、その産生には数多くの（新厖大学）

遺伝子が関与している。これらアントシアニン色
素生合成系の遺伝子群に関する分子遺伝学的研究

高等植物の天然色索

は、そのほとんどがトウモロコシ、キンギョソウ

アントシアニン飯田

滋およびペチュニアで行われているだけだと言って（平成4年度）§

天然色素は人類が化粧を始めたときから化粧品も過言ではないであろう。我々は、誰でも一度は栽培したことのあるアサガオの一系統で、江戸時代に分離され平賀源内も記載している

“

漢名黒白
＂

として最も重要な物質であったことは疑い無いで

江南花、和名シボリアサガオ（絞り朝顔） のアあろう。我々が日常目にする天然色素の中で植物

ントシアニン色素の生合成系遺伝子の発現を調節

色素、特に花の色素の占める割合の大きさは、最して絞り模様を形成させる易変性遺伝子の本体を近の花舟に対する関心の高さをみれば明らかであ明らかにし、その発現調節機構を解明した。この-148-

ような色素生合成系遺伝子の発現調節機構の解明んになるわけではない。 ところが私の研究で扱っが、二次代謝産物系の多くの遺伝子を操作した天ている遺伝病、色素性乾皮症の患者さんの場合に然色素の生産に役立ち、いつか、最も身近な色素は、ほんの少し日光を浴びただけで、皮膚がんにであるアントシアニン類が、化粧品にも用いられなってしまう。 もちろん正常なヒトでも日光を浴る日がくることを夢見ている。

び過ぎると、シミやシワといった美容の大敵を通（東京理科大学）

り越して、やはり皮膚がんに罹る危険性が非常にコスメトロジ ー と私の研究
花岡 文雄

高くなる。
最近、オゾン層の減少で地表に到達する紫外線の量が増加し、世界的な問題になっている。 もと
もと皮膚がんの率が世界で最も高いオー ストラリ

（平成4年度）g

アでは、海岸に行くときだけでなく、外出には必DNA 修復研究の先駆者の 人でi:Jるディック

ず日焼け止めをするようにとの呼びかけが、皮膚一・ セトロウ博士によれば、通常の生活をしている

がん財団によりなされている。 また日光浴の盛ん

人間の細胞に引き起こされる遺伝子の傷の 90%

な英国では、今夏から、気象情報の中に「がん予以上は、太陽光線に含まれる紫外線によるビリミ

報」なるものを取り入れ、たとえば「明日は、

ジン ・ ダイマ ー であるという。 ビリミジン ・ ダイ

30分以内の日光浴でも日焼けし過ぎるので気をを含む DNA を鋳型として、 DNA 複製を行付けましょう」といった予報を出すという。 小麦マー

わせると、娘 DNA 分子に高頻度に突然変異を生色の肌というと健康美の象徴ではあるが、医学的ずる。 その結果は、ご存知のように細胞のがん化見地からすると、皮膚がんになる確率の高い人とへとつながっていくのである。 したがってピリミいうことになるかもしれない。 ビタミンDの合ジン ・ ダイマ ー の修復は非常に重要である。 幸い

成に必要な紫外線は、一日に数分間で充分と言わ大腸菌からヒトまで、ほとんどすべての生物はこれており、日光浴はほどほどに、そして紫外線防·の傷を修復するメカニズムを有しているため、止用の化粧品は頻繁に、をお奨めする。

少々の紫外線に当たったからといって、すぐにが（理化学研究所）

-149-

録

． ．

付

事業報告書（平成5年度）
役

員

研究助成課題 一 覧表

事業報告書（自 平成 5 年 4 月 1 日

至

平成 6 年 3 月 31日）

I. 4年度事業（平成 5 年度）

昨年に引き続き以下のような事業を計画し， 実行しました。

自然科学や社会科学の各分野にわたり， ひろくかかわりをもつ化粧品を総合的に体系化することを目的として①化粧品学の調査・研究に関して顕著な成績をあげた研究者や機関に対して功(1 件あたり100万円）

労金をもってこれを表彰する。

②皮膚の生理機能や老化機構の解明， 美容に役立つ素材の研究等化粧品学に関連した生命科学， その他の分野の調査・研究に対する助成を行う。

(1 件あたり 200 万円及び100 万円）③化粧品学の調査・研究にたずさわる研究者の海外派遣や招聘に対して資金援助を行う。

(1件あたり50 万円）

II. 募集及び選考の経過
本年度の各事業につきましては平成5年5月6日より募集を開始し同5年7月

20 日をもって締切りました。 研究助成事業は本年度も 一 般公募を原則とし全国140 ヶ所の大学・病院・研究機関等にダイレクトメ ー ルで推薦書を送付するほか 9 誌の関係学術雑誌にも広告し， その結果多数の応募をいただきました。 応募
者の研究分野が多岐にわたった為， 選考委員会の中に 3 分科会を設けそれぞれにおいて予備選考を行い平成5年9月 14日（火）ルビ ー ホ ー ルにおいて本選考委員会を開催し受賞候補者を決定し11月 19 日に理事長・理事・評議員の諒承を得て受賞者を最終決定しました。
皿第4回功労賞・研究助成等の結果
以下のとおり合計 18件が決定され研究助成金 2,400万円， 国際交流援助金130 万円が交付されました。

0件

功労表彰（小林孝三郎賞）
研

究

助

15件

成

※

国際交流援助3件※国際交流援助については11月以降 l 件の追加がなされて合計 3 件になった。
-151-

IV. 会議等
理事会
第 1 回通常理事会
開催 日 時平成5年6月10日（木）午後5時

開催場所

東京都千代田区丸の内 1-9-1 ルビ ー ホ ー ル会議室

理事総数

12 名

本人出席

11 名

監

2名

出席

2名

事

l 名（賛成）

委任状出席

審議事項
第一号議案

事業報告ならびに収支決算報告について
平成5年度の事業内容が事務局より詳細に説明された。 続
いて収支計算， 財産内容などが詳しく説明された。 次に小田倉監事より上記内容が適正適法である旨の監査結果が表明された。 質疑応答， 審議の後， 本議案は書面表決者を含•め全員 一 致で賛同を得， 可決承認された。

第二号議案

選考委員の選任について
事務局より， 西沢選考委員の退任及び後任選考委員として
岸田修 一 氏の推薦が提案され， 提案主旨について詳細な説明がなされた。 理事会は全員 一 致でこれを承認した。

報告事項
平成5年度の助成表彰の公募方法について研究助成事業の方式について， 昨年との相違点を主とした詳細な説明がなされた。 理事会及び評議員会は全員でその趣旨を認めた。
その他
研究業績中間報告集第2号が披露され， 近く研究報告集第1号が発刊される予定であることが報告された。
評議員会
第1回通常評議員会
開催日時・場所・議案ともに理事会に同じ。
評議員総数 14名

本人出席

9名

欠席

l名

委任状出席

4 名（賛成）

各議案とも全員 一 致で承認された。

-152-

第2回通常理事会
開催 日 時

平成5年11月19日（金）午後 2時30分

開催場 所

東京都渋谷区渋谷2-1 2-15

理事総数

12名

本人出席

11名

欠席

日本薬学会館会議室
l名

審議事項
第一号議案

第4回表彰・贈呈者の決定について
表彰・贈呈の候補者について， 選考枠， 選考経過などに及ぶ詳細な説明の後， 分野別の応募状況の確認などを含めた活発な意見が交換された。 なお今回は功労表彰対象者が推薦されなかったため， 該当者なしが提案された。 しかるの
ち本議案は書面表決者を含め全員一 致で原案通り可決され
た。

第二号議案

平成 6 年度事業計画案及び予算案について配布された資料に基づき， 事業計画， 予算案について新規事業金利動向などにもふれた詳細な説明があり， 前年の事業規模を維持， 継承した提案がなされた。 原案は書面表
決者を含め， 全員 一 致で賛同を得た。

報告事項
運用財産について（梱コ ー セ ー より， 運用財産として 2000 万円の寄付（前年度分は 1000万円）を受けた旨の報告があり， 理事， 評議員全員でその意義を確認し，二号議案採決の際の参考とした。
第2回通常評議員会
開催日時・場所・議案ともに理事会に同じ。
評議員総数

14名

本人出席

6名

欠席

l名

委任状出席

7名（賛成）

各議案とも全員 一 致で承認された。

-153-

選考委員会
分科会I
開催日時

平成5年9月 1日（水）午後4時

開催場所

東京都港区虎の門1-8-7富田屋会議室

審議事項

素材・物性にかかわる分野の選考

分科会II
開催日時

平成5年9月 7日（火）午後6時

開催場所

東京都千代田区丸の内1-9-1ルビ ー ホ ール会議室

審議事項

生体及び安全性にかかわる分野の選考分科会ITI
開催日時

平成5年9月10日（金）午後3時

開催場所

所沢市三ヶ島2-579-15早稲田大学人間科学部

審議事項

精神・文化にかかわる分野の選考

本選考委員会
開催日時

平成5年9月14日（火）午後5時

開催場所

東京都千代田区丸の内1-9 -1ルビ ー ホ ール会議室

審議事項

各分科会の結果を総合的に判断して助成候補者が決定さ
れた。

表彰贈呈式
開催日時

平成5年11
月19日（金）午後4時

開催場所

東京都渋谷区渋谷2 -12-15日本薬学会長井記念館
以

-154-

上

第4回

研究助成を受けられたかたがた(JA ー 一般研究助成A, JB ー一般研究助成B. 廿 一 国際交流援助）

研

管理番号

ワ九
ヒ

題

目

分 野

代表研 究者

還元型ネオプテリン(NPH-4)の紫外線照射皮膚障害に対する効果

放射化学
薬理学
生化学

東京理科大学生命科学研究所講師

JA-93-01

化粧品による光老化の抗酸化的制御に関する
細胞生物学的及び生化学的研究

皮膚科学

群馬大学医学部教授

JA-93-02

紫外線生物学太陽光紫外線で、 ヒトDNA中に誘発される 放射線生物学
JA-93-03 損傷と、 その修復に関する研究
細胞生物学
色彩の心理学的意味空間の研究

計量心理学
認知心理学
行動計量学

JA-93-04

JA-93-05

細胞膜の脂質の物性と機能の基礎的な研究
ーリン脂質物性のコスメトロジ ー ヘの応用 一

化粧品基本素材金属酸化物の酸性大気汚染物
JA-93-06 質との相互作用

色素化合物の光照射下での反応の解析

新規な構造を有するヒアルロン酸類似多糖
JA-93-08 の開発

物理化学

”

JA-93-09

宮 地 良 樹金沢大学薬学部教授

二階堂修

金沢大学文学部助教授

岡 本 安 晴夫

千葉大学理学部教授

金 子 克 美東京工業大学生命理工学部教授

糖鎖工学

東京工業大学生命理工学部助教授

”

-155-

周

生物物理化学
光化学治療
光増感化学

高分子化学
いわゆる しみ（肝斑など）の発症機構とその増悪因子に関する研究

島

東北大学理学部教授
生体物性学
細胞生物
大 木 和
物理学

固体界面化学

JA-93-07

小

大 倉

畑

中

一

研

郎

一

東北大学医学部講師
皮膚科学

富

田

靖

管理番号

JB-93-01

研

ワ
九

題

分

目

ペプチドシナ ー ジストによるビタミンEの抗酸化能の向上 ー ヒト血清アルプミン由来のペプチドシナ ー ジストの開発 一

野

脂質生化学
食品化学

代表研 究者
水産大学校講師

幡 手 英 雄層状鉱物を用いたホスト ー ゲスト反応による 無機材料化学 早稲田大学理工学部助教授
JB-93-02 有機色素のカプセル化
菅 原 義 之粘土科学
化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証福島大学教育学部助教授

JB-93-03 的研究

社会心理学

尋常性座癒の発症機序の解明のための皮膚のJB-93-04 保湿機能と脂質代謝に関する研究

皮膚科学

JB-93-05

哺乳類皮膚細胞のアポト ー シスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究

糖生物学
発生生物学
生化学

操

山

本 綾 子

九州大学理学部助教授

野 村

一

也

大阪薬科大学薬学部助教授
製剤学

化粧品に関わるコロイド次元分子集合体の高H-93-01 次構造の分光学的解明

田新潟大学医学部助教授

不飽和脂肪酸とその過酸化生成物の皮膚角質

JB-93-06 層への作用に関する研究

飛

界面科学

森

本

一

洋

チェンマイ大学薬学部助教授
Aranya Manos ro i
受入責任者東京理科大学理工学部

阿 部 正 彦H-93-02

化粧分野への仮想現実感(Virtual Reality)の応用研究

視覚工学
映像システム

H-93-03

日本の化粧品規制及び製造技術の現状把握

化粧品
行 政

神奈川工科大学助手

井 上 哲 理中国環境衛生部環境衛生処処長

高

国 強

受入責任者 日本化粧品工業連合会

有 本亨（敬称略 受付順）

-156-

員

平成6年4月1日現在
役

東京大学名誉教授（掬コ ー セ ー 代表取締役社長

高砂香料工業（樹代表取締役社長
安田信託銀行（梱代表取締役会長
慶応義塾大学医学部教授

慶応義塾大学医学部教授
環境衛生金融公庫理事

理

理

理

理

理

理

理

林 藤 邊 美 澤 林 原 山 村 川 輪 澤佐
小 佐 磯 宇 大 小 菅 高 中 西 花 宮郎 正 男 次 昭 郎 文 雄 郎 二 昭 香
三次士
孝 大 律 昭 利 證 正 冨 芳 武 隆

早稲田大学理工学部教授
理

正 節

典哉

公認会計士

弁護士
監 監

事 事

小 田倉
黒 田

（株博報堂代表取締役社長

長事 事 事 事 事 事 事 事 事 事 事
隼 理
務
理 専 理

東京化粧品工業会顧問
理（梱コ ー セ ー 代表取締役会長

名城大学理事

明冶薬科大学教授

東京理科大学工学部教授

東京理科大学薬学部教授

内科医師

帝京大学医学部教授

早稲田大学人間科学部教授

早稲田大学人間科学部教授

東京大学薬学部教授

東京工業大学理学部教授

千葉大学薬学部教授

神奈川大学理学部教授

隆

桂影 雅 榮 幹 晴々 橋村 呂 部 崎 崎 本 辺

評 評 評 評 評 評 評 評 評 評 評 評 評 評

議 議 議 議 議 議 議 議 議 議 議 議 議 議員 員 員 員 員 員 員 員 員 員 員 員 員 員

上大 緒 北 近 佐 高 中 野 廣 宮 山 山 渡

野 隈 方 原 藤

芳 孝 宏 文夫 一 泰 雄 保 之 久 子 勇 昭 三 夫 彦 徹

東京理科大学薬学部教授

日本薬剤師会専務理事-157-

研究助成課題一覧

素材、物性に関する分野
管理番号

研

如
九

課

題

代表研 究者

分 野

J 90-03

リン脂質膜の表面修飾と分子集合体としての筑波大学化学系助教授
界面物理化学
機能発現に関する研究

J 90-06

ヒアルロン酸で表面を修飾したリポ ‘ノ ー ムからの内容物の温度による放出制御
薬品物理化学

東京理科大学薬学部助手

J 90-07

皮膚DDSとしての高分子脂質リポソ ー ムの基礎研究早稲田大学理工学部教授

J 90-15

古 澤 邦 夫皮店への作用性を有する各種糖脂質の合成

高分子合成

有機合成化学牧 野 公 子出宏 之

千葉大学薬学部助教授

JII

昌

子

J 90-16

新製剤法及び新素材を用いた化粧品の品質確
保に関する研究J 91-02

生体適合性逆型ベシクルの生成、安定化と応用に関する研究J 91-05

新しいDDS剤型としての高分子ミセルの設計と機能開発J 91-06

化粧品素材としての利用が可能な乳酸菌の新早稲田大学理工学部専任講師
規育種技術の開発
応用生物化学J 91-08

化粧品素材としての竹節人参並びに甘草の組織培養による物質生産並びに大量増殖に関する研究生

J 91-10

界面活性剤を含む溶液混合系の相挙動と濡れの挙動に関する研究

界面化学

九州大学理学部助教授

物理化学

荒 殿

J 91-11

超微粒子分散系の構造と物性及び自己制御
コロイド系の開発

高分子物性

京都大学工学部助手

J 91-20

各種界面活性物質によるマクロ及びマイクロ
エマルションの調製並びに物性に関する
物理化学的研究J 92-01

衛生化学
溶液論

国立衛生試験所環境衛生化学部長

田明 治

横浜国立大学工学部助教授

界面化学
高分子合成

国

博信

東譴科大学生命科学研究所助教授

片

DDS

枝
岡

一

則

桐村光太郎

ヒトリゾチ ー ムタンパク質を高分泌する酵母
突然変異体を用いた素材生産の効率化研究

-158-

薬

薬用生物学

コロイド 物性
応用界面化学
分子生物学
遺伝学

広島大学医学部助教授

神

田

博史

誠

松 本 孝 芳東京理科大学理工学部講師

阿 部 正 彦広島大学理学部助手

鈴 木 克 周

研

管理番号

ワ九
b

課

題

分野

代表研 究者

物理化学

明星大学理工学部教授

J 92-03

化粧品の紫外線照射による光酸化メカニズムの研究

J 92-04

水素添加大豆リン脂質を用いた油性ゲル及び水性ゲルの保湿作用に関する研究

J 92-05

アスパラギン酸プロテアー ゼ類の蛋白工学的
機能改変によるケラチナ ー ゼの開発

蛋白工学

JA-93-05

細胞膜の脂質の物性と機能の基礎的な研究
ー
リン脂質物性のコスメトロジ ー ヘの応用 一

生体物性学
細胞生物
物理学

東北大学理学部教授

化粧品基本素材金属酸化物の酸性大気汚染物

物理化学

千葉大学理学部教授

固体界面化学金 子

JA-93-06 質との相互作用
JA-93-07

色素化合物の光照射下での反応の解析

新規な構造を有するヒアルロン酸類似多糖

JA-93-08 の開発
JB-93-01

ペプチドシナ ー ジストによるビタミンEの抗酸化能の向上 ー ヒト血清アル ビミン由来のペプチドシナ ー ジストの開発 ―界面科学
薬,u,. 子

生化学

日

高

久

夫

昭和薬科大学薬学部講師

藤井まき子
東京大学理学部助手

井 上 英 史大 木 和 夫克美

生物物理化学
光化学i台療
光増感化学

東京工業大学生命理工学部教授

糖鎖工学

東京工業大学生命理工学部助教授

大 倉

高分子化学

畑

脂質生化学

水産大学校講師

食品化学

中

一

研

郎

一

幡 手 英 雄層1犬鉱物を用いたホスト ー ゲスト反応による 無機材料化学 早稲田大学理工学部助教授
JB-93-02 有機色素のカプセル化
菅 原 義 之
粘土科学

-159-

研究助成課題一覧

2

生体、 安全性に関する分野
管理番号
J90-01

J 90-02

J90-05

J90-08

研

ウ九
'a

課

題

分

染毛剤成分の代謝に関する研究

薬物代謝

ドレイズ試験代替法の開発 ー ヒト細胞、 昆虫細胞を用いた高感度迅速試験法の開発研究一
胆it酸生合成のメカニズムに関する研究

皮膚の老化に伴うエラスチン遺伝子発現の動
,ム月�ヒ
ヒ
-

J90-09Werner症候群患者皮胸由来培養線維芽細胞のサイトカイン細胞成長因子に対する応答性

J 90-10

光化学反応によるフリ ー ラジカルの産生と表皮培養細胞に対する影響

J90-11野

色素性皮膚病変に対するレ ー ザ ー 療法の研究

組織培養学

生物有機化学

皮膚科学

皮膚科学
医科学
生化学
皮膚科学

J90-12

表皮糖脂質の生化学的、形態学的並びに臨床的研究（エピデルモシド）

J90-13生体の酸化的障害に対する防御機構の生化学的研究ー ビタミンEの活性発現機構の解析 一

生化学J 90-14

皮膚生理機能賦活物質の経皮吸収に対する評
価解析理論の確立

薬剤学J 91-01

培養表皮細胞及び線維芽細胞におけるグリコサミノグリカン及びコラ ー ゲンの代謝生化学

代表研 究者
食品薬品安全センタ ー 秦野研究所

中尾美津男
理化学研究所副主任研究員

大 野 忠 夫
東京工業大学理学部助教授

藤本

活性酸素、 フリ ー ラジカルによる生体膜障害の防止に関する研究

J91-04

パッチテスト結果のコンピュ ー タ ー 処理 シス
テムの開発

-160-

徳

慶應義塾大学医学部講師

島 新 吾
横浜市立大学医学部助手

佐々木哲雄
東京大学医科学研究所教授

金ケ崎士朗
帝京大学医学部助教授

渡 辺 晋

一

皮膚科学

山口労災病院皮膚科部長

生化学

浜中すみ子
東京大学薬学部助手

新 井 洋 由京都大学薬学部教授

瀬

崎

有機生化学
皮膚科学
接触皮膚炎

仁

東京薬科大学教授
木木木J 91-03善陽

東京大学先端科学技術研究センタ ー教授

二 木 鋭 雄名古屋大学医学部附属病院分院皮膚科長

早 川

律 子

管理番号

J91-07

J91-09J 91-12

J91-14

J 91-16

研

ワナ
ヒ

課

題

分 野

皮膚過敏症に対するマスト細胞の役割
ーマスト細胞欠損動物を用いた検定法の開発 —マウス悪性黒色腫を用いたチロシナ ー ゼ抑制因子の精製と応用
接触光過敏症のマウスモデルを用いた化粧品
による光アレルギ ー のスクリー ニング及びサンスクリー ンの効果の評価
メラニン生合成の調節

実験病理学
皮際科学
メラニン色素
光生物学
皮膚免疫
分子生物学

代表 研 究者
大阪大学医学部教授

北 村 幸彦
北里大学医学部講師

亀山孝 一 郎
浜松医科大学教授

滝 川 雅 浩
東北大学医学部教授

柴 原 茂 樹ビタミンCと上皮成長因子によるヒト皮膚線 分子細胞生物学 東京医科歯科大学助手
維芽細胞の増殖とコラ ー ゲン代謝調節機構の隆 一 郎
畑
分子細胞生物学的研究
医化学

J91-17

人工皮暦を用いた皮府の形成機構及び皮膚の反応性試験に関する研究

細胞生物学

J91-18

サンスクリ ー ンの紫外線性表皮障害に対する防御作用の免疫生物学的研究

皮膚科学

J91-19ダイレクトスキンセンサー を用いて測定した
皮溝と加齢の関係

老年病学

慶應義塾大学医学部助手

動脈硬化

本 間 聡 起J91-22

フリー ラジカルとポルフィリン代謝に関連する皮膚の老化機構解明に関する研究

環境科学

J92-02

光熱変換分光法による薬物の組織及び細胞ヘの非侵襲吸収計測法の開発

J 92-06

神経ペプチドによる皮膚炎症反応の成立機序とその特異的制御

J92-07

J 92-08

皮膚の機能と脂質代謝に関する基礎的研究

転移因子を用いたアントシアニン色素生合成
遺伝子とその発現調節因子遺伝子の解析

-161-

毒性学
分析科学
内科学
アレルギ ー 学
生化学
分子遺伝学
分子生物学

広島大学理学部教授

吉 里 勝 利京都大学医学部講師

古 川 福 実国立公衆衛生院労働衛生学部室長

勇

市 川
東京大学工学部教授

田嗣 郎

千葉大学医学部助手

岩 本 逸 夫
新潟大学医学部教授

小 野 輝 夫
東京理科大学基礎工学部教授

飯

田

滋

研

管理番号

J 92-09

J 92-10

J 92-11

ワ九
b

課

題

分 野

モノクロ ー ナル抗体を用いた紫外線誘発ON
A損傷の定量とメラニン色素のサンスクリ ーン効果の実験的証明
皮膚の老化における染色体構造の変化と遺伝
子修復機構に関する研究
アスコルビン酸2 ー グリコシドの生物学的有用性研究 ー 経皮吸収によるビタミンC
活性発現の評価 一

代表研 究者
奈良県立医科大学大学院生

皮膚科学

細胞生理学

免疫薬理学

小 林 信彦
理化学研究所主任研究員

花 岡 文 雄岡山大学薬学部教授

格

山 本

還元型ネオプテリン(NPH-4)の紫外線
JA-93-01 照射皮膚障害に対する効果

放射化学
薬理学
生化学

東京理科大学生命科学研究所講師

化粧品による光老化の抗酸化的制御に関する
JA-93-02 細胞生物学的及び生化学的研究

皮膚科学

群馬大学医学部教授

紫外線生物学1Jヽ

島 周 二宮 地 良 樹太陽光紫外線でヒトDNA中に誘発される損 放射線生物学 金沢大学薬学部教授
JA-93-03 傷とその修復に関する研究
二階堂
細胞生物学
＂

”

（肝斑など）の発症機構といわゆる しみJA-93-09 その増悪因子に関する研究

皮膚科学

JB-93-04

尋常性座癒の発症機序の解明のための皮膚の保湿機能と脂質代謝に関する研究

皮膚科学

JB-93-05

哺乳類皮膚細胞のアポト ー シスと細胞接着をつかさどるセラミドの研究

不飽和脂肪酸とその過酸化生成物の皮膚角質
JB-93-06 層への作用に関する研究

-162-

糖生物学
発生生物学
生化学
製剤学

修

東北大学医学部講師
-'-捐
主

田

＼

新潟大学医学部助教授

山 本 綾 子
九州大学理学部助教授

野 村

一

也

大阪薬科大学薬学部助教授

森 本

一

洋

研究助成課題一覧

3

精神、 文化に関する分野
研

管理番号J90-04

J91-13

J91-15

J91-21

Js-92-01

Js-92-02

JA-93-04

ワ九

課

題

分野

化粧が意識性に及ほす効果の研究

心理学

香料に関する定量的解析

感覚生理学

アルツハイマ ー 型老年痴呆症者と、 いわゆ”る" ほけ 症状を呈する人々への化粧による情動活性化の研究

感情心理学「色白」の嗜好構造に関する一考察

心理学
色彩心理学
造形C.、理学病院看護における化粧に関する研究

臨床心理学

基礎看護学

高齢者のおしゃれ行動とその評価に関する研ワ九ヒ

色彩の心理学的意味空間の研究

人間行動科学
計量心理学
認知心理学
行動計量学

化粧の個人的効果と対人的効果に関する実証
JB-93-03 的研究

-163-

社会心理学

代表研 究者
早稲田大学人間科学部教授

春 木豊

北海道大学薬学部教授

栗 原 堅 三同志社大学文学部教授

浜治世子

早稲田大学人間総合研究センター

斎 藤 美 穂埼玉県立衛生短期大学教授

大河原千鶴子北海道教育大学教育学部助教授

藤 森 立 男
金沢大学文学部助教授

岡 本 安 晴福島大学教育学部助教授

飛 田操

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非売品

コスメトロジー研究報告Vol. 2'94
1994年9月1 日発行
編者

佐藤大正，宮川安正

発行

財団法人

コスメトロジ ー 研究振興財団〒104東京都中央区銀座三丁目5番12号

電話東京03 (3564) 6731
製作

アサヒメディカル

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電話東京03 (3271) 1571(代表）
印刷

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©1994

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