リポソ ー ム封入薬物の皮膚吸収過程の解析と皮膚内ラジカ）レ消去への応用
九州大学

内海薬学部

英雄

Transdermal absorption of drugs entrapped in liposomes and radical scavenging effects ofantioxidants in skin were investigated with ESR spectroscopy. Spectral-spatial and spatial­
spatial 2-D imaging system were developed for this purpose.
Spin-labeled compound entrapped in liposomes was applied on stripped hair-less mouse skinand release of the compound from liposomes was imaged by using spectral-spatial 2-D analysis
system. Liposomes injected infravenously to mouse was measured non-invasively with a L-band
ESR, but it was impossible to measure liposomes applied on skin of live mouse because of lesssensitivity.
Anthralin radical was produced on hair-less mouse skin by treatment of anthralin and UV1rradiation. High resolution spectral-spatial imaging showed that anthralin radical wasgenerated near skin surface. Intravenous administration of antioxidants prevented thegeneration of the radical. Ascorbic acid and glutathione decreased the generation of anthralin
radical independent of inadiation period, but Trolox showed less effect during first 5 h irradiation.
Action mechanism of these antioxidants seems to be different.

1

緒

言

リポソ ー ムからの薬物の放出・吸収過程を解析するためには、 皮膚におけるリポソーム内薬物の近年、 化粧品分野においてリポソームは、 保湿挙動を遊離薬物のものと区別して解析する必要か効果並ぴに経皮吸収の向上効果を狙って積極的にある。 スピン標識化合物は、 溶液中に高濃度に存在するときには1本のプロードな電子スピン共嗚用いられるようになった。 しかし、 リボソームを薬剤の吸収担体として用いた場合、 皮膚における(ESR)スペクトルを与えるが、 希釈されるとンャープな3本線へと変化する。 従って、 リポソ ーム

薬物の吸収過程についての詳細はまだ分かっていないのか現状である。 それは、 リボソ ーム製剤の吸収評価を行うには、 薬物のリポソームからの放に高濃度に封入しておけばそのESRスペクトルの変化から薬物のモデルとしてリポソームからの放出 と組織での吸収という2つの過程を解析しなけ

出を解析することが可能である。 また、 ESRは試ればならず、 皮膚におけるリポソーム封入薬物の料を破壊せずにスペクトルを得ることが可能であ

これらの過程を同時に解析するための適切な手段

るため、 皮膚表面におけるリポソーム封入薬物のがまだ存在しないからに他ならない。

変化を経時的に調べることができる。 皮膚におけるリボソームからの放出・吸収過程を同時に解析するためには、 更に皮膚のどの部分のスピン標識

Imaging analysis,,oftransdermal

化合物が如何なるスペクトルを与えるかをµmのabsorption of liposome-entrappeddrugs and application toradical scavenging in skins

空間分解能で知ることが必要となる。 そのため、Hideo Utsumi法を開発する。 スペクトル ー 空間画像化解析は、

Farnlty of Pharmaceutical Sciences
Kyushu University

Mal tempoら l - 3 >、 Herrlingら 4. 5 >により既に行わ本研究では高分解能スペクトル ー 空間画像化解析れているが、 本研究ではこれを皮膚におけるリポ-94-

リボソ ー ム封入薬物の皮膚吸収過程の解析と皮膚内ラジカル消去への応用

ソ ー ムの解析に適応できるように改良を加えた。

理食塩水で懸恐した。

また、 近年生体計測用に開発されL — バンドESRにより、 リポソ ー ム製剤の挙動の無侵襲解析についヘアレスマウスに50mMアンスラリンのアセトンても検討した。
一方、 皮 膚では紫外線によりメラニン色素沈着、 アレルギー

皮膚におけるアンスラリンラジカルの生成

2. 3誘発、 皮膚癌生成などが起こるこ溶液500µlを塗布後、 紫外線ランプによりUV-Aあるいは uv-cを照射した。とが知られている。 これらの成因には紫外線が皮膚で生成する活性酸素やフリ ー ラジカルが係わっX バンドESRはJEOL JES RE-lXにより測定した。
—ていることが示唆されているが、 それをin vivoで証明した例やフリーラジカルの抗酸化剤による消去をin vivoで解析した例は未だない。 本研究では、 上記リポソーム製剤の放出・吸収過程の解ESR測定

2. 4L—｀

バンドESRはL ― ノ｀ ンドマイクロ波ユニットとループギャ ップ共振器（幅5mm, 内径33mm)を装備したJEOL JES PE-lXにより測定した。

析に加え、 紫外線照射により生成するラジカルの皮膚内存在位置を高分解能スペクトル ー 空間画像

2. 5

ESR画像化法を用いて調べた。 また更に、 皮商のラシカル

磁場勾配G =tan(e)・△ H/△ L(△ H, △L

生成におよぱす抗酪化剤のin vivoにおける効果はそれぞれ得ようとするスペクトル ー 空間画像のスペクトル軸， 空間軸の大きさ）で投影角度0のを調べた。

射影スペクトルを得、 filtered-backprojection

2実験

法により画像を再構成した。

ミッシングアングル（磁場勾配装置の限界から射影スペクトルを得る
2. 1

実験材料ヘアレスマウス (HR-1,5週齢，雌性）は、 星野試験動物飼育所より、 マウス(ddY,3週齢，雌性）ことのできない正負の限界投影角度から go· までの 角度）に由来する画像のア ー ティファクトは代数的再構成法により取り除いた。

は成和実験動物研究所よりそれぞれ購入した。 プ
レソ ー ムC-1は、 日本精化より恵与されたものを3

結果および考察用いた。4-trimethylammonium-2,2,6,6-tetra­
methylpiperidine-N-oxyl iodide (CAT-1)は

3. 1

Molecular Probes, Inc. より購入した。 アンスラリンはSigma Chemical. Co. より購入した。

スペクトル ー 空間2次元画像化システムの開発

3. 1. 1

高分解能スペクトル ー 空間2次元画像化システムの開発

2. 2

皮膚においてスペクトル ー 空問画像を得るため

リポソ ー ムの調製

プレソ ー ムC-1 (水素添加卵黄レシチン／コレには µmオ ー ダ ー でスペクトルを空間分離するこステロ ー ル(1:1))50mgに150mM CAT-1水溶 液とか必要である。 このために非常に強力な磁場勾500µ1を加え、 水 和させたのち、 凍結融解を5回配コイルと専用キャビティを制作メ ーカ ー に依頼繰り返し、 ポ リカ ー ボネ ー ト膜（ポアサイズし、 用いた結果、 数百µ mの解像度を持つ高分解400nm, 2枚重ね）を10回通過させた。 リポソ ーム能スペクト）レ ー 空間2次元画像化システムの構築に取 り込ま れ な かった C AT- 1 を遠心分 離に成功した。

(100, 000 X g, 60分， 20℃)により除き、 リポソームの沈澱を脂質濃度が70-80mMになるように生-95-

ーN-t:.._oo30 °60°

ヽ

□ 2 mM CAT-1.,,,.

-gogo〗1 r�,-�.�
.J\J;--,、,.／ー入·ー-.-一5。

1.0 mT→

図1O·�I

絵炉感". 150 mM CAT-1 in Liposome‘9
゜一120 °

クr＼I＼―-一\\.,_ _,,/'がJ

リポソーム封入CAT-Iと遊雄CAT-Iとからなるファントムーード
2mM CAT-I水溶、夜（シャ ー ブな3本線スベクトル） と150mM CAT-Iを封入したリポソ ム（プロな1本線スベクトル）をそれぞれ内径I. 6 cmのバイアルびんと内径0. 5 cmの試験管に入れ、 左図のファ—ントムを作成した。 図中に示す6方向はスペクトル 空間画像の空間釉の方向を示す。

3_ 1 _ 2

異種スペクトルを与えるラジカルの2次元の各位値でスベクトルの積分値を求め、 全 CAT-1

空間画像化システムの開発の空間分布を得た。 遊離CAT-1 の空間分布は 3 本線異種スペクトルを与えるラジカルの分布が1次のうちベ ー スライン補正した低磁場側ピー クの梢元空間に限定される場合に は スペクトル ー 空間分値より得、 全 CAT-1 の空間分布からこの寄与を2次元画像化法によりスペクトル分布が解析でき差し引いて、る。 しかし、 分布が2次元へと広がった場合にはした。6方向の スペクトル— 空間画像より得た2種スペクトル情報をのせた2次元空間画像を得る必スペクトルの 空間情報をそれぞれ別々に再構成要がある。 そこで、 スペクトル

し、ー空間2次元画像から異種スペクトルの空間情報を抽出して、 巽なリポソ ー ム封入CAT-1 の空間分布とリボソ ー ム封入CAT-1 、 遊離CAT-1 の 2次元空間画像を得ることができた（図3)。

る スペクトルを与えるラジカル種の2次元空間画像を得る方法を開発した。 図1に示すように スピ

3. 2

リポソ ー ム製剤の放出・ 吸収過程の解析

ン標識化合物 CAT-1 を封入したリポソ ー ムと遊離

3. 2. 1

リポソ ー ム製剤の111 p/po無侵製解析の CAT-1 とからなるファントムを作成し、 図中に皮I目に塗布したリポ ノ ー ムを/17 Pivo無侵襲測示す6方向を空間軸として6つのスペクトル ー 空間定する前段階として、 まず、 リポ ノ ー ムの体内動‘‘

2 次元画像を得た。 得られた画像は、 図 2に示すよ態をJR vivoで無侵襲解析できるか否かを検討しうに2種のスペクトルが分離されている部分と混た。

在している部分が存在する。 この画像から2種ス

スピン標識化合物 CAT-1 を封入したリボソ ー ム

ペクトルの位置情報を得るために、 まず空問軸上をマウスに尾静脈内投与し、 頭部から下腹部まで-96-

リボソ ー ム封入薬物の皮膚吸収過程の解析と皮膚内ラジカル消去への応用ヽ---·、,,,,、 /b ,'メ疇·······-a·········•············•······•·····......
ら‘，s

図2．

リボソ ー ム封入CAT-1と遊扉CAT-1とからなるファントムより得たスベクトル ー 空間画像と2つのスペクトル成分の空間分布の抽出
図1のが方向 を空間軸としたスベクトル — 空間画像（左上）の空間軸上の各ポイントでスベクトルの積分値を得 、 か方向の全CAT-1の分布とした（右上a)。 下に示すように、 スペクトルの低磁場側のシャ・ーブなピークのペースライン補正をし 、 その積分値の空間分布を0 方向の2mM CAT-1の分布とした・（右上b) 。 全CAT-Iの分布から2mM CAT-1の分布の寄与を差し引いて150mM CAT-1のO 方向の分布とした（右上a-3b) 。

Free Spin Probes

図3

Liposomal Spin Probes

リボソ ー ム封入CAT-1と遊難CAT-1の分離2次元分布画像
図2に示す方法で6方向のスペクトル ー 空間画像からリボソ ー ム封入と遊躇のCAT-1の6方向の空間分布を得、 それぞれ別々に2次元空間画像を再構成した。

-97-

の各部位におけるシグナル強度の分布を L — バンド

0.5 h

ESR を用いて経時的に調べた。 リポソ ー ムに封人された状態の CAT-1 のシグナルは胸部、 上腹部で高く、 頭部ても検出された。 上腹部以外のシグナ

善ルが経時的に減少したのに対し、 上腹部のシグナ
ル強度は24時間ではほとんど変わらず、48時間後でも70%が残っていた（図4)。投与6時間後に肝1.5

0ー2h5

゜゜

1eau>l!
Suaiu11eu6!
S a>l-o- Ohr
•6hr
●24hr
----o---- 48hr

I head I lchest11abdomen I�e"'+-3h,�e�

Eュ8 S

図4 L — バンドESRにより非侵哉的に測定したマウス
静脈内投与リポソ ー ムの体内分布の経時変化
CAT-1封入リポソ ー ムをマウスに尾静脈内投与し 、幅5mmの共振器を5mm間隔にずらしてリポ‘ノー ム
封入CAT-1のシグナル強度を経時的に求めた。
臓、 肺、 心臓、 胃を摘出し、 ESR 測定したところ、シグナルは肝臓のみに検出され、 このリボソ ー ム

1mTか肝臓に長期滞留することが示された。 以上のように、 L— バンド ESR を用いること によりリポソ ームの体内動態を無侵襲で解析することに成功した

図5皮店表面におけるリポソ ー ム崩壊の高分解能スペクトル ー 空間画像
ヘアレスマウスの剥離皮店に綿糸に染み込ませたCAT-I封入リポソ ー ム懸濁液を置き 、皮虚の深さ方向を空間軸として高分解能スベ
クトル ー 空間画像を経時的に得た。 リポ ‘ノ ーム添加0. 5時間後にプロ ー ドな1本線であったスペクトルが時間の経過と共にシャ ー プな3本線へと変化した。 中央下の小さなシグナルは
皮廂切片の皮下組織側に皮堵させた標準物質(DPPH)のものである。

‘

が、 皮膚に塗布したリポ ノ ー ムのill vivo検出は塗布量が限られているため現在のところ成功してしヽなし 'o
3. 2. 2

剥離皮膚表面におけるリポソ ー ム崩壊

皮陪塗布リポソ ー ムの/17 vivo検出ができな‘かったため、 剥離皮府を用いてリポ ノ ー ム崩壊を解析した。 図5は、ヘアレスマウス皮阻切片表面

-98-

‘

りホ ノ ー ム封人楽物の皮旧吸収過程U)序祈と皮膚内フシカル消去へのI心用に綿糸に染み込ませたCAT-1 封入リポ ノ ー ムを密‘着させ、 そのシグナルの変化を高分解能スペクト
ル — 空間2次元画像化システムにより経時的に調べた結果である。

CAT-I のシグナル下側の小さなシグナルは皮問の皮下組織側に付着させたDPPHのものである。 リポ ‘ノ ー ム添加直後にCAT-1 のングナ
ルはプロ ー ドな単ーピ ー クとして検出されたか、時間が経過するに従いシャ ー プな3本線ピ ー クへと変化していく様子が確認された。 これは、 CAT゜ー·(ne)�usuaiu―
1eu61s150

50-1を封入したリポ ‘ノ ー ムか皮附表面で崩壊していくことを意味する。 しかし、10CAT-I が皮膚へ浸透広がりは残念ながら確詔できなかった。

3. 3. 1304050irradiation time (hr)

していく様子を示す空問軸に沿った DPPH 方向への3. 320

図 6 皮南におけるアンスラリンラジカル生成に及ぼす紫外線照射の影響
アンスラリンのアセトン溶液を塗布したヘアレスマウスをUV-A照射下(0) 、 uv-c照射下（●）
あるいは暗所（▲)で飼育し 、 経時的に剥離皮窟をESR測定した。

皮膚生成ラジカルと抗酸化剤
皮膚におけるアンスラリンラジカルの生成

アンスラリンは抗尋常性幹せん治療薬として古くから用いられているが、 一方、 光増感作用があり炎症や発癌等を引き起こす ことも知られて いる。 皮府にアンスラリンを塗布したヘアレスマウによ全sua Uが検出された。 このシクナルは、 Packerら

6)·e)n·(で測定するとg値が2. 003の単ービ ー クのシクナル一致した。 アンスラリンラジカルのシグナル強度は紫外線照射時間の延長に伴い増加した（図6)。

uv :.. c照射，I、名゜

また、 ングナル強度はUV-A照射時に比ぺ時の方が大きかった（図6)。

図7は、 高分解能スペクトル ー 空間2次元画像化.��··-··、＇·,/f

一り報告されているアンスラリンラジカルのものとA

スを紫外線照射し、 その皮府切片を X — バンド ESR＼ヽ.

、ヽ.ヽ. �50100

150200ヽ

250300Distance from Teflon Surface (µm)

システムを用いて、 アンスラリンラジカルの皮旧における生成位龍解析を行った結果である。 ヘア

図7スベクトル —空間画像より得たアンスラリンラ
ジカルの皮店内分布
アンスラリンを塗布し紫外線照射したヘアレ
スマウスの剥甜皮虐を皮下組織側 (A) あるいは表皮側(B)をテフロン支持体に付堵させ 、皮店の深さ方向を空間軸としてスベクトル —空間画像を得、 アンスラリンラジカルのシグナルの積分値よりその空間分布を得た 。

レスマウスにアンスラリンを塗布したのち紫外線照射し、 剥離した皮沼切片をテフロン支持体に付看させて皮膚の深さ方向のスペクトル ー 空間画像を得た。 表皮を支持体側にして皮膚切片を付着させるとアンスラリンラジカルのピ ー クは支持体側に接近した。 このことより、 アンスラリンラジカルが皮屑の表面付近で発生していることが確認さ-99-

125607550

骨 曇骨

゜．゜．
．
|255101520。

゜50 40 30 20 10seu61
u11sua1�11e)n(1002510203040

irradiation time (hr)irradiation time (hr)UVA 照射時

uvc 照射時50

図8 アンスラリンラジカル生成に及ぽすアスコルピン酸静脈内投与の影饗ァンスラリン塗布マウスに紫外線照射5分前にOmmo I/kg (●）、0. 2mmo I/kg (0)あるいは2mmo I/kg（▲）のアスコルピン酸を尾静脈内投与し、 紫外線照射して、 経時的に剥雄皮膚を ESR 測定した。
拿p(O.05, 拿拿p(0.01. *拿拿p(0.005れた。 本システムでは数百µmの解像度を得ることができたが、シグナルの線幅の寄与を取り除く

あるTroloxを用い同様に実験を行った結果を図 9に示す。 アスコルヒン酸やグルタチオンが短時間(5 時間以内）において長時間 (24 時間）とことができないためこれ以上の詳細な解析は困難照射であった。

同様に有効にラジカル生 成を抑えていたのに対3. 3. 2し、 Troloxでは短時間照射ではあまり効果が現れアンスラリンラジカルに及ぽす抗酸化剤ず、長時間でアンスラリンラジカルの生成を抑制の効果した。

皮膚におけるアンスラリンラジカル生成に抗酸

ア ンスラリ ンは光醗化あるい は自動酸化で化剤がin vivoで如何に働くかを調べる目的で、

9-anthron-10-y 1 ラジカルやアンスラリンダイマ

マウスにアンスラリンを塗布する前に種々の抗酸ーとなりこれがアンスラリン ・ プラウンラジカル化剤を投与し、アンスラリンラジカル生成に及ぼへと変化すると言われているが 7, 8) 、皮膚でのアす効果を調べた。 アンスラリン塗布5分前にアスンスラリンラジカルの生成過程は不明の部分が多コルビン酸を静脈内投与しておくと、投与量依存い。 今回生体に投与した抗酸化剤でラジカル生成

的 に ア ンスラ リ ン ラ ジ カ ル 生 成が 抑 制され たが抑えられたことより、アンスラリンラジカル生（図8)。 この抑制効果は照射した紫外線の種類に成過程にこれら抗酸化剤により消去される活性種よらず見られた。 同様な抑制効果はグルタチオンが係わっていることが示唆される。 Troloxは、脂(0. 2mmol/kg体重）の静脈内投与でも見られた。

質のラウリル硫酸ナトリウムミセル中でベロキシ

皮膚におけるラジカル生成に及ぼす抗酸化剤の効ラジカルを効果的に消去することが報告されてい果をin vivoで評価できたのはこれが初めてである 9) 。 一 方、アスコルピン酸やグルタチオンは種る。

々の水溶性酸化物を還元するほか活性酸素種を直抗酸化剤としてビタミンEの水溶性 アナログで接消去 したり、グルタチオン — アスコルビン酸 ー-100-

リホソーム封人楽初U)反膚吸収近在U)序i/fと反｝膏内フソカル1月去へU)}心用

100

100

CO 75

75

一一全Cl)
C:

C》

•en一

�--------50-'
CU 25
C:

IT」

1550
25

5510/,,

25

20

152025

irradiation time (hr)irradiation time (hr)uvc 照射時

UVA照射時図910

アンスラリンラジカル生成に及ぽすT ro I ox静脈内投与の影響
アンスラリン塗布マウスに紫外線照射5分前にOmmol/kg (●）あるいは0.2mmol/kg (0)のTro I oxを尾静脈内投与し 、 紫外線照射して 、 経時的に剥扉皮膚をESR測定した 。
*D(0.05

ヒタミンEレドックス鎖を通して油相のペロキシ

みたところ、 静脈内投与したリポソ ー ムの挙動のラシカルの消去に係わっていることが知られてい解析には成功したが、 皮膚に塗布したリポソ ー ムる。Troloxの効果を発揮するまでの時間がアスコの検出は感度の制約からできなかった。 皮岡表面

ルピン酪やグルタチオンと異なった理由として、

におけるin vivo測定は、 今後のL — バンドESRのこれら抗酸化剤により消去される活性種の違い、感度の向上あるいは共振器の改良に委ねなければこれら抗酸化剤がアンスラリンラジカル生成部位ならない。

へ到達するまでの時間の違い、 といったことが考皮膚で紫外線照射により生成したアンスラリンえられる。 これらのどちらによるかは、 生体に投ラシカルの生成部位をスペクトル ー 空間画像化シ与した抗酸化剤のアンスラリンラジカル生成抑制ステムにより課べることができた。 このラジカル機構と共に今後の課題である。の生成における抗酸化剤の効果をin vivoで検討した結果、 抗酸化剤の種類により効果が現れるま4

総ての時間が異なることが分かった。 この抗酸化剤

括ESRをリポソ ー ム製剤の皮岡吸収過程並びに皮呵生成ラジカルの解析に応用するにあたり、 数百のラジカル生成抑制機構については今後の研究課題としたい。

µmの空間分解能を持つスペクトル ー 空間画像化

引用文献システムの開発に成功した。 また、 スペクトル情

1) Maltempo MM, :Differentiation of spectral

報に基づく2次元空間画像化法の開発にも成功し

and spatial components in EPR imaging

た。 高分解能スペクトル ー 空間画像化システムを

using 2-D image rec onstruction algo­

用いて皮膚切片表面におけるリポソ ー ムの崩壊を

rithms, J. J/agn. fleso几 69 156-161 1986

解析することができた。 リポソ ー ム製剤の挙動を

2) Ma 1tempo MM, Eaton SS, Eaton GR, : Spectra 1-—

L バンドESRによりin vivoで解析することを試-101-spatial two dimentional EPR imaging,/)ermato!, 92 677-682 1989

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3) Ma 1 tempo MM, Eaton SS,Eaton GR, : Reconst­7) Se E Malo T, Dubertret L, Prognon P,tional EPR images from incomplete setschemical properties and stability ofruction of spectralspatial two dimen­

Gond A, Mahuzier G, Santus R, : Physico­anthralin in model systems and humanof projections without prior knowledgeof the component spectra, J. Jlag11. l?eso11.

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