腸管ホルモン放出を制御するメカニズムの解明

坪井東京大学大学院総合文化研究科緒貴司准教授

されているホルモン分泌顆粒が絶えず細胞膜方向へ輸送

言

分泌反応は、ホルモン、神経伝達物質、酵素、粘液なされ、細胞膜とドッキングしていると考えられる。

どが細胞から放出される際の共通の機構であり、ヒトのこれまでの研究から、ホルモン分泌顆粒のリクルート高次生命現象を支える細胞の基本的活動である。その破過程から開口放出に至るまでの一連の過程は、低分子量

綻は、ホルモン分泌異常、脳機能障害、アレルギー反応

G タンパク質 Rab ファミリーが制御していることが明等の種々の疾患に直結する。小腸内分泌細胞から分泌さらかになったれるグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドて 60 種類以上の異なるアイソフォームが存在し、イン（GIP）や、グルカゴン様ペプチド –1（GLP–1）などの腸管クレチン分泌においても特異的な Rab アイソフォーム

ホルモン（インクレチン）は、糖や脂質依存的に門脈血が機能すると考えられている。最近の研究から、副腎髄中に分泌される。分泌されたインクレチンは、膵β細胞質クロマフィン細胞内に存在するカテコールアミン分泌膜上の G タンパク質共役型 GIP および GLP–1 受容体に顆粒の細胞膜とのドッキングおよびプライミング過程の結合し、血中グルコース濃度依存的に膵β細胞からのイ制御には、Rab27A とその結合タンパク質（エフェクター

ンスリン分泌を促進する。

タンパク質と呼ばれる）である Rabphilin およびシナプ4）。この Rab ファミリーは、ヒトにおい近年、小腸内分泌細胞に甘味受容体、脂質受容体、そトタグミン様タンパク質ファミリー 4a（synaptotagmin–

して ATP 感受性 K+ チャネルが発現していることが報告

like protein 4–a ; Slp4–a）が機能することが明らかになっ

された

1–3)

5)

。これらの受容体やチャネルが、腸管腔内のている 。しかしながら、小腸内分泌細胞からのインク糖や脂質を感受し、小腸内分泌細胞において機能するこ

レチン分泌において、どの Rab アイソフォームがどのとで、インクレチン分泌が起こると考えられる。しかし、ようなエフェクタータンパク質と共に機能し、インクレ小腸内分泌細胞内に存在するインクレチンを含んだホルチン分泌を制御しているのか、明らかにされていない。

モン顆粒が、どのような分子メカニズムで細胞外に分泌

そこで本研究では、小腸内分泌細胞がどのような分子機されるのか、その詳細な機構については明らかにされて構でインクレチンを分泌するのか、その実態を明らかにいない。

することを試みた。

ホルモン分泌顆粒は、細胞内のゴルジ体で産生され、細胞内で成熟する。その後、成熟したホルモン分泌顆粒

実験方法

は、細胞膜近傍まで運ばれ（リクルート過程）、細胞膜上1. 小腸内分泌細胞株 GLUTag 細胞に存在するに結合し（ドッキング過程）、細胞膜との融合可能な状態

インクレチン分泌制御関連 Rab ファミリーおよびへの準備段階（プライミング過程）を経る。その後ホルエフェクタータンパク質の同定

モン分泌顆粒は、細胞外からのカルシウムイオン流入にインクレチンの一つである GLP–1 を分泌する小腸内より、細胞膜と融合し、内容物であるホルモンを細胞外分泌 L 細胞株 GLUTag 細胞を用いて、RNeasy Mini Kit（キへと分泌する（開口放出）。我々の体内で、このインクレアゲン）により total RNA を抽出し、cDNA ライブラリー

チン分泌反応が起こるためには、細胞内に存在するインを作製した。SYBR Premix Ex Taq（タカラバイオ）を使

クレチンを含んだホルモン分泌顆粒の一部分が、あらか用し、リアルタイム PCR により、ホルモンや神経伝達じめ細胞膜とドッキングし、常に開口放出可能なプライ物質放出に関連性が報告させれている Rab ファミリーミング状態にあると考えられる。つまり、細胞内に貯蔵（Rab3A, 27A, 27B, 33A, 37）および Rab 結合タンパク質1坪井貴司（エフェクタータンパク質）の遺伝子発現量を解析した。

鏡を用いて、分泌刺激（グルコースや高カリウム刺激等）

Rab ファミリーおよびエフェクタータンパク質の発現量を GLUTag 細胞に与えた際の NPY–Venus 分泌顆粒動態、は、βアクチン発現量によるサンプル間の補正を行った細胞膜上に存在する NPY–Venus 分泌顆粒数、分泌反応値を利用した。

数を解析した。

次に発現の確認された Rab ファミリーおよびエフェクタータンパク質の GLUTag 細胞での内在性発現をウ

3. GLP-1 分泌制御関連タンパク質の機能解析エスタンブロットにより検討した。タンパク質レベルでGLUTag 細 胞 に 内 在 的 に 発 現 し て い る Rab お よ びの発現が確認できた Rab ファミリーおよびエフェクター

Rab エ フ ェ ク タ ー タ ン パ ク 質 を RNA 干 渉 法（small

タンパク質の GLUTag 細胞内における分布を蛍光免疫染interference RNA; siRNA）を用いて特異的にノックダウ

色法と全反射蛍光顕微鏡および共焦点蛍光顕微鏡を用いンし、その際の NPY–Venus 分泌反応への影響を全反射て解析した。

蛍光顕微鏡によって解析した。Rab および Rab エフェクタータンパク質の発現抑制の効果は、リアルタイム
PCR およびウエスタンブロットにより確認した。

2. 全反射蛍光顕微鏡による GLP-1 分泌機構の可視化解析
GLP–1 は、分泌顆粒に濃縮される過程で様々なプロセッシングを受ける。そのため、遺伝子組換え技術を用結果

いて GLP–1 に直接蛍光タンパク質を融合させることは、

小 腸 内 分 泌 L 細 胞 株 GLUTag 細 胞 に 発 現 し て い る

技術的に非常に困難と考えられる。そこで GLP–1 分泌Rab ファミリーおよびエフェクタータンパク質をリアル

顆粒の特異的な蛍光標識には、ニューロペプチド Y（NPY）

タイム PCR 法により解析した。解析の結果、Rab3A とに黄色蛍光タンパク質（Venus）を直接融合したプラスミ

Rab27B の 2 種類の Rab と Slp2–a、Slp5 の 2 種類のエド（NPY–Venus）を GLUTag 細胞に遺伝子導入することフェクタータンパク質の mRNA レベルでの発現が見らで行った。細胞膜から 100nm 以内に存在する蛍光標識れた。そこで、発現の見られた Rab ファミリーおよびした分子を特異的に検出できる全反射照明型蛍光顕微

エフェクタータンパク質のタンパク質レベルでの発現

図２

小腸内分泌細胞株 GLUTag 細胞における Rab27B とSlp2 - a の細胞内局在A, D：GLP-1 の細胞内局在
B：Rab27B の細胞内局在

図１

小腸内分泌細胞株 GLUTag 細胞における Rab ファミリーおよびエフェクタータンパク質の発現
A. Rab27 サブファミリーの GLUTag 細胞における発現
B. Slp ファミリーの GLUTag 細胞における発現

C：GLP-1 と Rab27B の共局在像
E：Slp2-a の細胞内局在
F：GLP-1 と Slp2-a の共局在像
2腸管ホルモン放出を制御するメカニズムの解明をウエスタンブロッティングにより検討した。その結トやマウスにおいて Rab27A と Rab27B という 2 種類

果、Rab27B（ 図 1A） と Slp2–a（ 図 1B） が GLUTag 細 胞のアイソフォームが存在する。Rab27A の変異は、色に内在的に発現していることが明らかになった。そこで素異常や免疫疾患などの症状を呈するヒトの遺伝病

Rab27B と Slp2–a の GLUTag 細胞内における分布を蛍Griscelli 症候群を引き起こす 。また、Rab27A が特異光免疫染色法により検討した。その結果、GLP–1 分泌的なエフェクター分子（Rabphilin や Slp4–a）と結合する

顆粒膜上に Rab27B と Slp2–a が局在することが分かっことで、副腎髄質クロマフィン細胞からのカテコールた（図 2）。

アミン分泌を制御することも明らかになっている 5)。本5)

Rab27B および Slp2–a の GLP–1 分泌における機能を研究の解析結果から、GLP–1 含有ホルモン分泌顆粒膜全反射蛍光顕微鏡により可視化解析した。Rab27B およ

上には、Rab27B が存在し、Rab27B 特異的なエフェク

び Slp2–a を GLUTag 細胞に過剰発現すると、細胞膜上タータンパク質である Slp2–a が Rab27B の結合していに結合している NPY-Venus で標識した GLP–1 分泌顆るホルモン分泌顆粒に結合、複合体を形成することで、粒（NPY–Venus 分泌顆粒）数が有意に増加し（図 3A）、さGLP–1 分泌を制御することが示唆された。そして、こらに NPY–Venus 分泌反応数自体も有意に増加した（図の Rab27B と Slp2–a の複合体が、何らかの細胞膜上の3B）。一方、siRNA を用いて GLUTag 細胞に内在的に発標的分子と結合することにより、GLP–1 含有ホルモン現している Rab27B または Slp2–a を特異的に単独ノッ分泌顆粒を細胞膜にドッキングさせ、分泌を促進させる

クダウンすると、細胞膜上に結合している NPY–Venusのではないかと考えられる。今後は、GLUTag 細胞にお分泌顆粒数が有意に減少するだけでなく（図 3A）、NPY–ける Slp2–a が、どのような細胞膜上の標的分子と結合Venus 分泌反応数自体も有意に減少した（図 3B）。しかし、して、インクレチン分泌を制御するのか、その詳細な分いずれの場合においても、分泌動態には何ら影響を与え子メカニズムの解明を試みる予定である。

なかった。

要考

約本研究により、Rab27B とそのエフェクタータンパク察

Rab27 は、Rab3 に近縁の Rab サブファミリーで、ヒ質である Slp2–a が小腸内分泌細胞株 GLUTag 細胞のイA

B
Number of fusion events（per 5 min）

2.51.51.00.540353025201510図３RNA 干渉を用いた Rab27B および Slp2-a 発現抑制によるホルモン分泌反応への影響

A：Rab27B および Slp2-a の発現促進および抑制による細胞膜上にドッキングしている顆粒数への影響
B：Rab27B および Slp2-a の発現促進および抑制によるホルモン分泌数への影響アスタリスクはコントロールとの有意差を示す（＊ p ＜ 0.05、 ＊＊ p ＜ 0.01）。
3Slp2-a-si RNA

Rab27B-si RNA

Slp2-aRab27B0

Slp2-a-si RNA

Rab27B-si RNA

Slp2-aRab27B

0.0

Control

5Control

Vesicle density（N/μm2）

2.0

45

坪井貴

司

ンクレチン含有ホルモン分泌顆粒膜上に存在することが文明らかになった。そして、この Rab27B と Slp2–a 複合1) H.J. Jang, et al,: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 104, 15069-

体が、インクレチン分泌をポジティブに制御する可能性

15074, 2007.

献2）F. Reimann, et al,: Cell Metab ., 8, 532-539, 2008.
3）S. Edfalk, et al,: Diabetes ., 57, 2280-2287, 2008.

が示唆される。

4）M. Zerial, et al,: Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2, 107-117,

謝辞

2001.
5）M. Fukuda: J. Biochem., 137, 9-16, 2005.

本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公益財団法人三島海雲記念財団ならびに関係者の皆様に厚く御礼を申し上げます。

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