発生再生の分子メカニズムを応用した人工皮膚作製
秋田大学

杉山俊

医学部生化学第一講座

博、亀田隆

Sonic hedgehog (Shh) regulates the principal processes in many developmental stages including the epithelial-mesenchymalinteraction. The extraordinary acceleration of signaling by Shh is responsible for the development of human basal cell
carcinomas and trichoepitheliomas; they might originate from the very immature keratinocytes including the stem cells. We
tried to utilize the mitogenic effect of Shh to accelerate the formation of cultured epithelium, which is already used in themedical field practically. To this end, we transfected shh cDNA into a Swiss-3T3 cell line, widely used as a feeder forkeratinocytes, and established a Shh expressing cell line. The lethally irradiated Shh expressing feeder cells remarkably
accelerated the growth of keratinocyte colonies obtained from the human neonatal foreskin, and the formation of wellstratified cultured epithelium, which is rich in immature small keratinocytes, expressing cytokeratin 14. This acceleration
was suppressed by the addition of cyclopamine, a specific inhibitor of Shh signaling. These data indicate that the Shh is apromising mitogen to improve the technology for cultured epithelium formation.

１．緒Hedgehog タンパク質がリガンドとして Patched という膜言レセプターに結合することで Smoothened という別の膜蛋

人体外表面はケラチノサイトが形成する表皮により覆われている。この薄い層は人体を乾燥・紫外線・物理的障害・白への抑制が解除され転写因子 Gli を介した標的遺伝子の発現制御が誘導されると考えられている４）。

免疫学的侵襲から保護する上で重要な役割を担っている。

近年、ヒトの表皮基底細胞がんや毛包腫等の極未熟なケ

このように重要な役割を担う表皮細胞層は非常に高い再生

ラチノサイトが癌化したと考えられる腫瘍では高頻度で能力を持っているが事故などによりその大半が失われるとpatched-1 に変異が生じていることが報告され、また遺伝生命活動の維持が危機に陥る。

子改変動物を用いた実験から Hedgehog シグナル系を人為

培養表皮は再生医工学技術による最も初期の産物であ的に活性化することにより、これらのがんを誘発できるこる。1970 年代に Green 博士らは Swiss-3T3 細胞をフィーとが報告されている４）。これらの報告は Hedgehog タンパ

ダー細胞として利用することでヒト表皮角質化細胞の増殖ク質を介したシグナル伝達が表皮幹細胞の増殖制御においをコントロールし、培養人工表皮を作製することに成功して重要な役割を担っていることを示唆する。本研究で我々

た１）。この技術は火傷や母斑の治療に広く応用され成功をはこのような未熟なケラチノサイトにおける Hedgehog シ

収めている 。現在ではベンチャービジネス企業群によりグナル系の生理作用を培養表皮作製系へ応用することを目

同種移植用の培養表皮が凍結品として供給されているが、指した。

２）

恒久的な生着を可能とする自家移植用培養表皮を迅速に供２．実給する為には培養表皮作製に要する期間をより短縮するこ2.1とが重要である。

細験胞

hedgehog 遺伝子産物はショウジョウバエに発生異常をSwiss-3T3 細胞（JCRB no. 9019 from HSRRB, Osaka,

引き起こす変異遺伝子として同定されたが、哺乳類ではJapan）並びに遺伝子導入 Swiss-3T3 細胞は全て 10％のウ

sonic hedgehog・indian hedgehog・desert hedgehog の３シ胎児血清を加えたダルベッコ改変 MEM 培地にて培養を種が相同遺伝子として報告されている 。このうち sonic

行った。継代培養には 0.05％トリプシンと 0.02％ EDTA

hedgehog 遺伝子産物（Shh）は哺乳類の発生において肢を加えた PBS を用いた。Swiss-3T3 細胞はクローン化さ芽の前後軸決定など形態形成のシグナル因子として重要れていない細胞株であるため遺伝的なバックグラウンドをな役割を担っていることが知られている。生化学的には揃えた実験のために我々はケラチノサイトに対して優れた

３）

A new technology for cultured skinformation using developmental molecularmechanism

フィーダー効果を示すクローン（クローン no.5；以下 no.5
cell と標記）を選択した。実験に用いたヒト新生児包皮由来ケラチノサイトは全て米国 Cell Applications, Inc. より

Toshiro Sugiyama, Takashi Kameda

購入した。凍結細胞を融解後、インビトロゲン社のケラチ

Department of Biochemistry Akita
University School of Medicine

ノサイト培養用培地で２日ほど快復培養を行った後に培養＊

表皮作製実験に用いた。

＊− 53 −

2.2

Shh 発現ベクターの作製と遺伝子導入

Swiss-3T3 細胞へ Shh 発現遺伝子を導入することを計画

ニワトリの sonic hedgehog 遺伝子 cDNA（ハーバード大した（図１A）。本法では Shh 発現フィーダー細胞とケラ学 Tabin 博士より分与）をクロンテック社の真核細胞用チノサイトを共培養することで充分な Shh タンパク質の発現ベクター pEGFP-N1 に組み込み Shh 発現用ベクター供給が可能になると期待される。またケラチノサイト自体

pSHH を作製した。本ベクターを組み込んだ細胞はジェネの遺伝子改変は行わないため細胞がん化などの危険性も低ティシンによる選択が可能である。我々は no.5 cell へのいと期待される。

pShh ベクターの導入（インビトロゲン社リポフェクタミ

Swiss-3T3 はクローン化された細胞株ではないため、フンプラスキットを使用）とジェネティシン（400 ㎍ / ㎖）ィーダー細胞のバックグラウンドを揃えるために我々はケによる選択を行い、Shh 蛋白を安定的に発現するフィーダラチノサイトへのフィーディング効果を指標に Swiss-3T3ー細胞株（no.5-Shh）を樹立した。Shh 蛋白の発現はサン由来クローン化細胞株（no.5 cell）を樹立した（詳細は省

タクルツ社の抗 Shh 抗体（H-160）を用いたウエスタンブ略）。Shh 発現誘導のため、我々は CMV プロモータによロット法にて確認した。

りニワトリ shh mRFNA を発現し、G418 による細胞株の選択を可能とする発現プラスミド p-Shh を作製した。リ2.3

培養表皮作製

ポフェクション法により no.5 cell に p-Shh プラスミドをフィーダー細胞の増殖停止のためにはガンマー線照射法

導入後、G418 による選択を行った。選択した細胞株におを用いた。培養皿でコンフレントにまで増殖した no.5 ま

ける Shh タンパク質の発現を抗 Shh タンパク質抗体を用たは no.5-Shh 細胞に対して約 70 Gy の照射を行ったのちいてウエスタンブロット法により検出した（図１B）。Shhトリプシナイズを行い 60mm 培養皿当たり 4×10 個の割タンパク質は合成後に自己触媒作用で N 末断片（Shh-N）

合で播種した。12-24 時間後に培養表皮作成用培地（10と C 末断片（Shh-C）に分離する。使用した抗体は生理活

5M アデニン・0.5 ㎍ / ㎖デキサ性を持つ N 末断片に特異的であり、p-Shh 導入細胞におメサゾン・1×10 − 10 M コレラ毒素・10ng/ml EGF・2×10 −けるニワトリの Shh-N（23kD）の発現が確認された。我々M トリヨードサイロニンを含むダルベッコ改変 MEM 培

はこの細胞株を no.5-Shh と名付けた。No.5-Shh は親株の% ウシ胎児血清・1.8×109−4地）に培地を交換し、快復培養を終えたヒト表皮ケラチノサイトは 60 ㎜培養皿あたり 5000-20000 細胞（lot により調節）を播種した。培地交換は週に２回のペースで行った。

2.4

ケラチノサイトコロニーの染色と培養表皮の組織化学的解析
ケラチノサイトコロニーの染色は培養皿をホルマリン固定した後、ローダナイル染色液（１％ Rhodamin B, １％Nile Blue）を用いて行った。培養表皮の組織化学的解析のためには、培養表皮をディスパーゼを用いて培養皿より剥離させた後にホルマリン固定を行いパラフィン切片を作製した。HE 染色並びにバイオメダ社の抗サイトケラチン
14 抗体を用いた免疫染色による解析を行った。

３．結3.1

果

Shh 発現フィーダー細胞株の樹立と Shh 遺伝子産物の発現確認
Shh 遺伝子産物のケラチノサイト増殖促進効果は再生医工学分野においても利用可能であると考えられるが、現在までのところ生理活性を持った Shh 精製タンパク質を入手することは一般的に困難である。またヒト表皮ケラチノサイトへの直接的な Shh 発現ベクターの導入は細胞のがん化を誘発する可能性が高く安全面での不安が大きい。これらの問題を解決するために我々は上皮系細胞の培養や培養表皮作製にフィーダー細胞として広く用いられている

図１：A 本研究開発の概念図 Swiss-3T3 細胞に Shh 発現遺伝子を導入し改良フィーダーを作製する。
B Shh 発現ベクターの導入による Swiss-3T3 細胞株における Shh タンパク質の発現。

− 54 −

発生再生の分子メカニズムを応用した人工皮膚作製

図２：放射線照射による no.5 ならびに no.5-Shh 細胞のフィーダー化。

no.5 に形態・増殖とも類似している（図２・データ省略）。
放射線照射後は両細胞株とも増殖停止・細胞肥大化が誘発され、良好なフィーダー細胞として利用可能であると考えられた（図２）。

3.2

図３：Shh 発現フィーダーによるケラチノサイトコロニーの増殖促進。

培養表皮の増殖における Shh 発現フィーダー細胞の有用性
我々は Shh 発現フィーダー細胞の有用性を確認するためにヒト包皮由来ケラチノサイトを用いた培養表皮作製実験を行った。放射線照射によりフィーダー化した no.5 細胞ならびに no.5-Shh 細胞とケラチノサイトを共培養し１週ごとに、各培養系でのコロニーの成長を比較した（図３）。ケラチノサイト播種後１週目では顕著な差を認めなかったが、２・３週目では Shh 発現フィーダー細胞との共培養において顕著なケラチノサイトコロニーの増殖促進が観察された。顕微鏡下において成長の良いケラチノサイトコロニーを観察したところ Shh 発現フィーダー細胞との共培養で、コントロールではほとんど観察されない極小サイズのケラチノサイトの活発な増殖像が観察された（図４）。以上の効果が実際に Shh の生理作用によるものかを確認するために Shh のシグナル伝達系を強力且つ高い特異性で抑制するサイクロパミンを用いた実験を行ったとこ

図４：Shh 発現フィーダー細胞との共培養で観察された極小サイズケラチノサイトの活発な増殖像。

ろ Shh 発現フィーダーによるケラチノサイト増殖亢進はサイクロパミンにより顕著に抑制された（図５）。Shh 発現フィーダー細胞を用いて作製した培養表皮を組織化学的に解析したところ基底細胞層に重層した細胞層の形成が認められた（図６）。これらの細胞層は免疫染色により、未熟なケラチノサイトのマーカーであるサイトケラチン 14陽性を示した。

４．考察

線維芽細胞との共培養が上皮系細胞の増殖に有用である
ことは古くから知られているが、その分子メカニズムについては未だ解明されていない点が多い。現在では完全合成培地によりケラチノサイトを培養して培養表皮を作製する図５：Shh 発現フィーダー細胞によるケラチノサイト増殖促進の Hedgehog シグナル伝達系阻害剤サイクロパミンによる抑制。

− 55 −

の開発ならびに幹細胞研究のためのツールとして有用であると期待される５）。
（引用文献）
１） Reinwald JG, Green H. Serial cultivation of strainsof human epidermal keratinocytes: the formation ofkerainizing colonies from single cells. Cell 6, 331-343,
図６：Shh 発現フィーダー細胞を用いて作製された培養表皮の組織切片像。
（上段：HE 染色 下段：抗サイトケラチン 14抗体による免疫染色）

1975
２） O’connor NE, Mulliken JB, Banks-Schlegel, et al.
Grafting of burns with cultured epithelium preparedfrom autologous epidermal cells. Lancet 1, 75-78, 1981

ことも可能であるが非常に高価な成長因子などを必要とす

３） Murone M, Rosenthal A, deSauvage FJ. Hedgehog

るため Green らによる Swiss-3T3 フィーダー細胞を用いsignal transduction: from flies to vertebrates. Exp. Cell.

る手法は依然として培養表皮作製のための簡便且つ確実なRes. 253, 25-33, 1999

プロトコールである。我々はこの Swiss-3T3 細胞に表皮

４） Bale AE, Yu K. The hedgehog pathway and basal cell

細胞の増殖・分化の調節に重要な役割をなしていると考え

carcinomas. Human Mol Gen. 10, 757-762, 2001.

られる Shh 遺伝子産物を発現させることで培養表皮作製

５） Kameda T, Hatakeyama S, Terada K, Sukiyama T.

法の改良を目指した。Shh 発現フィーダー細胞はヒト包皮

Acceleration of the formation of cultured epithelium

由来ケラチノサイトの増殖を有意に促進した。Hedgehog

using the hedgehog expressing feeder cells. Tissue Eng.

シグナルは体性幹細胞に対する増殖因子である可能性が示

7, 545-555, 2001

唆されており、我々の開発した手法は表皮再生医工学技術− 56 −