化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発
東京医科大学医学総合研究所免疫制御研究部門

善本隆之

Recently, several in vitro assays to predict the respiratory sensitizing potential of chemicals were developed, because
the use of animal models in safety testing of chemicals is significantly limited. However, these alternative methods cannot
distinguish chemical respiratory sensitizers and skin sensitizers, although the risk management systems for them are quite
different. Therefore, in the present study, we aim at developing a novel in vitro assay, which can discriminate chemical
respiratory sensitizers from skin sensitizers by taking advantage of the fundamental differences between their modes offunction; development of helper T (Th) 2 immune responses, which is critically important for respiratory sensitization.
We have established a novel 3 -dimensional ( 3 D) coculture system using scaffold, which consists of human airway
epithelial cell line, immature dendritic cells (DCs) derived from human peripheral blood CD 14 + monocytes, and humanfibroblast cell line. The present results indicate that this DC coculture system can discriminate the respiratory sensitizing
potential of chemicals from their skin sensitizing potential by means of more enhanced expression of key costimulatory
molecule OX 40 ligand, which is important for Th 2 differentiation, as a marker in DCs. Moreover, we have also developed
a novel DC/T coculture system, which consists of the sensitized DCs and allogenic naive CD 4 + T cells. In this system, we
have great advantage that IL- 4 up-regulation can be used as a marker for the prediction of respiratory sensitizing potential.
Indeed, our data suggest that selective up-regulation of IL- 4 was observed by the stimulation with respiratory sensitizer ascompared to that with skin sensitizer.
Taken together, the present results suggest that our 3 D coculture systems consisting of epithelial cells, DCs, fibroblast
cells, and T cells would be useful for in vitro evaluation of allergenic sensitizing potential of chemicals. We are currently
trying to further improve the versatility of these systems by using iPS technology.

1. 緒膚および呼吸器感作性の AOP の Key event（KE）1 〜 3

言に相当する初期の機序を反映した方法であるため、生体内近年、動物実験を用いない 3 Rs の世界的な潮流により、でのアレルギー発症により近い KE 4 の T 細胞の活性化や医薬品や化学物質などの安全性評価に関する in vitro 試験

分化誘導を反映した方法の方がより確度が高いと考えられ代替法の開発が産業界のみならず社会的にも急務とされてる。ところが、これまでにいくつか検討されているが、未いる。皮膚感作性試験代替法としては、蛋白質との結合性だその方法の確立には至っていない 6）。

を評価する DPRA 法、ケラチノサイトのストレス応答を最近、我々は、ヒト気道上皮細胞株とヒト末梢血 CD14 +評価する KeratinoSens 法、樹状細胞の活性化を評価する単球由来未成熟樹状細胞（DC）、ヒト線維芽細胞株の 3 種

h-CLAT 法などが、最近、OECD のテストガイドライン

類の細胞を、Scaffold（足場材）を用いてそれぞれ 3 次元培に採択された（図１）1 - 3）。ところが、これら既存の代替法は、養した後順に重ね、気道上皮組織をより忠実に模倣した生

例えば、危機管理体制が大きく異なる呼吸器感作性［ヘル体により近い 3 次元DC共培養系を開発した（図 2）。そこで、

パー T（Th）2 反応優位］と皮膚感作性（混合 Th 1 /Th 2 /本研究では、複数の代表的感作性化学物質を用いて、皮膚Th 17 反応）の違いを識別できず、現在、これらの感作性と呼吸器の感作性の違いを、これらの作用機序の違いを示の違いを識別可能な方法の開発が望まれている。さらに、す Th 2 分化および反応の誘導に係わる分子の発現増強のこれらの代替法は、それぞれ単独では、従来の動物を用い違いで識別できないか検討した。さらに、この 3 次元 DC

る GPMT 法や LLNA 法などの試験法を代替することは不共培養系に T 細胞も加えた 3 次元 DC/T 共培養系の構築の可能であるとされ 1-3）、そのため、有害性発現経路（AOP）4）に可能性についても検討を行った。

基づいた複数の方法の組み合わせ（IATA）によるより厳密

2. 方な評価が必要とされている 5）。これら既知の代替法は、皮法

2 . 1. 細胞株
Development of in vitro evaluation systemof allergenic sensitizing potential ofchemicals
Takayuki Yoshimoto
Depa rt ment of I mmu noreg ulat ion ,Institute of Medical Science, Tokyo
Medical University

ヒト気 道 上 皮 細 胞 株 BEAS-2 B（CRL- 9609） とヒト肺線維芽細胞株 MRC- 5（CCL-171）は、ATCCより購入し、10 %FCSを含むMEM 培地で培養した。ヒト健常人末梢血CD14 + 単球は、10 %FCSを含むRPMI 1640 培地で培養した。

− 167 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 1 感作性化学物質による呼吸器アレルギー発症までの有害性発現経路（AOP）と、既存の各試験法と本研究で開発中の 3 次元 DC 共培養系と 3 次元 DC/T 共培養系の位置づけ

図 2 気道上皮組織をより忠実に模倣するため、気道上皮細胞株、末梢血単球 CD14+ 単球由来未成熟 DC、肺線維芽細胞株を用いてより生体に近い３次元 DC 共培養系を構築

2 . 2 . 感作性化学物質（DNCB）｝ は、 全 て Sigma-Aldrich 社 よ り 購 入 し た。 始

3 種類ずつの代表的な呼吸器感作性化学物質｛ortho-め に DMSO に 溶 解 後、 共 培 養 用 培 地（MEM 培 地 とphthaldialdehyde（OPA），hexamethylene diisocyanate（HDI），

RPMI 1640 培地を 1：1 に混ぜた培地）で希釈し、至適濃度

trimellitic anhydride（TMA）｝と、皮膚感作性化学物質｛oxazoloneを検討後使用した。

（OXA），formaldehyde（FA），2 , 4 -dinitrochlorobenzene− 168 −

化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発

2 . 3 . Scaffold（図 3）

2 . 6 . 3 次元 DC 共培養系の作製（図 4）

市販のポリスチレン性の多孔質 Scaffold（Reinnervate

まず、ヒト気道上皮細胞株 BEAS- 2 B とヒト肺線維芽細社 の Alvetex® Scaffold 24 well plate、Alvetex® Scaffold

胞株 MRC- 5 を、1 . 5 × 106 個ずつ個別の 12 well insert の12 well insert）を用いた。

Scaffold 内で 3 日間培養した。一方、精製した未成熟 DC を、
0.7 〜 1 × 106 個 12 well insertのScaffold内で 1 日間培養後、+

2 . 4 . ヒト健常人末梢血 CD14 単球由来未成熟 DCの調製方法

無菌的にそれぞれの Scaffold を脱着し、次に、上から順に

東 京 医 科 大 学 医 学 研 究 倫 理 委 員 会 の 承 認（ 受 付 番 号の Scaffold を順番に重ねて 1 つの 12 well insert に装着した。

気道上皮細胞株、未成熟 DC、肺線維芽細胞株とそれぞれ3323、課題：アレルゲンの in vitro 感作性評価法の開発）

次に、始めに DMSO に溶解後、共培養用培地（MEM 培地の下、健常人ボランティアの同意の後、末梢血 50 ml をヘと RPMI 1640 培地を 1：1 に混ぜた培地）で希釈した感作

パ リ ン 存 在 下 で 採 血 し、Lympholyte-H（Cedarlane 社 ）性化学物質を 5 µl ずつ一番上の Scaffold に均等に 6 箇所添に重層後、比重勾配遠心法により単核球を分離した。そ加し、そのまま 30 分放置後、共培養培地 2 ml をプレートの後、抗 CD 14 抗体のマイクロビーズ（Miltenyi 社）を反応の方から一番上の Scaffold の所まで静かに加えた。9 時間

後、AutoMACS Pro で CD 14 + 細胞を精製（純度 > 99 %）後には、リアルタイム RT-PCR 解析用のサンプルを回収し、+した。次に、この CD 14 単球を GM-CSF（50 ng/ml）と24 時間後には、免疫組織学的解析用のサンプルを回収した。

IL- 4（10 ng/ml）で 6 日間培養後、抗 CD 11 c 抗体のマイクロビーズを反応後、AutoMACS Pro で未成熟 DC を精製（純度 > 99 %）した。

2 . 7. 3 次元 DC/T 共培養系の作製（図 5）
上述の（2 . 6 .）の 3 次元 DC 共培養系で 24 時間反応後、DC の Scaffold だ け を 無 菌 的 に 取 り 出 し、 新 し い 24 well+

2 . 5 . ヒト健常人末梢血ナイーブCD 4 T 細胞の精製

plate の底に置き、アロジェニックなナイーブ CD 4 +T 細胞

上述（2 . 4 .）のようにヒト健常人末梢血より分離した単核（1 . 5 × 106 個）を含む 10 %FCS 含有 RPMI 1640 培地 50 µl球から、ヒトナイーブ CD 4 +T 細胞アイソレーションキッ

を 加 え、2 日 後 に さ ら に 100 µl 同 じ 培 地 を 加 え、4 日 後+ト（Miltenyi 社）を用いて、ナイーブ CD 4 T 細胞を精製（純にはさらに 200 µl 同じ培地を加えて培養した。5 日後に、度 > 95 %）した。

Scaffold および培養液中の細胞から、リアルタイム RTPCR 解析用のサンプルを回収した。

図 3 ポリスチレン性の多孔質足場材である Alvetex® Scaffold は、生体内の３次元的な細胞間相互作用を反映し、Scaffold 膜の無菌的脱着が可能− 169 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 4 3 次元 DC 共培養系の構築方法：まず、個々の Scaffold で培養後、3 つを重ね合わせ、その一番上から、感作性化学物質を添加し 30 分放置後、培地を加えて培養、解析を行う

2 . 8 . リアルタイム RT-PCR 解析

刺激 24 時間後、各 Scaffold の組織切片を作製し、HE 染色

各Scaffoldおよび細胞よりtotal RNAをRNeasy Mini Kitや抗 CD 11 c 抗体、Hoechst などを用いた免疫組織学的解（QIAGEN 社）を用いて調製し、SuperScript III Reverse

析により、刺激 24 時間後も、上の上皮細胞の Scaffold やTranscriptase（Thermo Fisher Scientific 社）で cDNA を下の線維芽細胞の Scaffold へ、真ん中の DC の Scaffold 中®

II お よ び Perfectの DC が移動することは、殆ど見られなかった（data not

Real Time サポートシステムのプライマーセット（Takarashown）。そこで、刺激 9 時間後に、各 Scaffold より RNA社）を用いたリアルタイム -RT-PCR で標的分子の mRNAを回収し、DC の成熟化や Th 2 分化、Th 2 反応の誘導に発現を解析した。

関わる分子｛ 副刺激分子で DC の成熟化マーカーでもある®

TM

作 製 し、TB Green Premix Ex Taq

CD 80 や CD 86、MHC クラス II の HLA-DR、ナイーブ T

2 . 9. 免疫組織学的解析

細胞のリンパ節への遊走に重要なケモカインレセプターで各 Scaffold を OCT コンパウンドで包埋し液体窒素で凍DC 成熟化のマーカーでもある CCR 7、接着分子 ICAM- 1、結した後、10 µm の切片を作製し、ホルマリン固定後、ヘ上皮細胞から産生され DC 上に OX 40 L 発現を誘導するサ

マトキシリン・エオジン（HE）染色、抗 CD 11 c 抗体によるイトカイン TSLP、ナイーブ CD 4 +T 細胞の Th 2 分化誘導

DC の免疫組織学的染色、Hoechst を用いた核染色を行った。に重要な副刺激分子 OX 40 L、炎症性サイトカイン IL- 1 β

3. 結や IL- 8、抑制性サイトカイン IL- 10、Th 1 分化に重要な

果

ヘテロダイマーサイトカイン IL- 12 の 2 つのサブユニット

3 . 1. 3 次元 DC 共培養系を用いた呼吸器および皮膚の感作性化学物質の識別IL- 12 p 35 と IL- 12 p 40、上皮細胞から産生され Th 2 反応を増強する自然リンパ球（ILC 2）の分化増殖に重要なサイ

まず、代表的な呼吸器感作性化学物質として OPA、代トカインIL- 25 や IL- 33 など ｝の mRNA 発現をリアルタイ

表的な皮膚感作性化学物質として OXA を用いて、それぞム RT-PCR を用いて調べた。その結果、OPA と OXA 刺れの濃度を振って、刺激 9 時間後にRNAを回収し、リアルタ

激により、副刺激分子 CD 80 や CD 86 の発現増強は両者でイム RT-PCR により、内部標準であるハウスキーピング同レベルであったが、Th 2 分化の誘導に重要な OX 40 L の遺 伝 子 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase

発現増強が、OXA に比べ OPA 刺激で有意に高かった（data（HPRT）の mRNA 発現が、非刺激時の 10 分の 1 以下にな

not shown）。次に、HDI と FA、TMA と DNCB の組み合らない濃度を決めた（図 4）。そして、その濃度を用いて、わせで同様な検討を行ったところ、やはり、調べた上記の− 170 −化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発

図 5 3 次元 DC 共培養系にさらに T 細胞も加えた新しい 3 次元 DC/T 共培養系を用い、T 細胞を指標にした呼吸器と皮膚の感作性化学物質を識別する評価系の構築

分子の中で、CD 80 や CD 86 の発現増強は両者で同レベル以上の結果は、本研究の 3 次元 DC 共培養系において、であったが、FA や DNCB 刺激に比べ、HDI や TMA 刺激で、呼吸器と皮膚の感作性化学物質の識別に上皮細胞のバリヤ

OX 40 L の発現増強が有意に高かった（data not shown）。

ー機能や免疫調節機能の重要性を示唆している。

そこで、これら 6 種類の代表的な呼吸器と皮膚の感作性
CD 86 と OX 40 L 発現を調べたところ、非刺激に比べいず

3 . 3 . 3 次元 DC/T 共培養系を用いた呼吸器および皮膚の感作性化学物質の識別れの感作性化学物質刺激でも CD 86 発現増強は同レベルで生体内では、気道上皮で抗原に感作されると、その抗あったが、OX 40 L 発現増強のレベルが 6 種類の感作性化

原を DC が取り込み、成熟化して、所属リンパ節へ遊走し、学物質が 2 グループに分かれ、OXA や FA、DNCB の皮膚

そこで初めて抗原特異的なナイーブ CD 4 +T 細胞を刺激し、感作性化学物質の刺激に比べ、OPA や HDI、TMA の呼吸増殖とエフェクター細胞への分化が誘導され、獲得免疫系

器感作性化学物質の刺激で、有意に OX 40 L 発現増強が強が始動する。即ち、生体内では、抗原を捕らえた DC が所かった（図 6）。

属リンパ節へ移動することは極めて重要である。上述の検化学物質の至適濃度を用いて、この 3 次元 DC 共培養系で以上の結果は、本研究の 3 次元 DC 共培養系は、DC で討より、本研究の 3 次元 DC 共培養系では、感作性化学物の OX 40 L 発現増強を指標に、呼吸器と皮膚の感作性化学質で刺激 24 時間後には、DC が刺激により他の Scaffold へ物質の識別が可能である可能性を示している。の遊走が殆ど見られず留まっていたことより、生体内でのDC の移動を再現するため、24 時間後、DC の Scaffold だ

3 . 2 . 3 次元 DC 共培養系における上皮細胞の重要性

け取り出し、新しい 24 well plate の底に入れ、その上から次に、この 3 次元 DC 共培養系が有効である理由を調べ

ナイーブ CD 4 +T 細胞を加え、反応させることにした。まず、るため、同じ Scaffoldを用いた DC だけの 3 次元 DC 単独培

CD 4 +T 細胞としてシンジュニックな細胞を用いたところ、養系と、OPAとOXAを用いて比較検討した。その結果、3反応が弱かった。そこで、アロジェニックな細胞を用いた次元 DC 共培養系では上述と同様に、CD 86 発現増強は両ところ、いわゆる、アロの混合リンパ球反応（MLR）により、者で同じレベル発現増強が見られ、OXAに比べ OPA 刺激両者を混ぜただけで、T 細胞の活性化が見られ、T 細胞ので OX40 L 発現増強がより強く見られたが、3 次元 DC 単独活性化マーカーである CD 69 や Th 1 分化のマーカーであ培養系では、CD 86 発現増強は両者で同じレベル見られたが、る IFN-γ の発現増強が見られた。しかし、そこへ、呼吸器OX40 L 発現増強は、両者で有意な差が見られなかった（図 7）。

感作性化学物質 OPA と皮膚感作性化学物質 OXA を加える

− 171 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

図 6 6 種類の代表的感作性化学物質刺激で、CD86 発現増強は同程度、呼吸器感作性物質で OX40L 発現が有意に増加し、OX40L 発現増強の違いで 2 グループに識別可能

図 7 3 次元 DC 共培養系と 3 次元 DC 単独培養系を比較すると、選択的 OX40L 発現増強は DC 単独培養系では見られず、上皮細胞のバリヤー機能や免疫調節機能が重要と、OXA 刺激に比べ OPA 刺激により IFN-γ 発現のさらな以上の結果は、本研究の 3 次元 DC/T 共培養系は、T 細胞る増強と、OPA 刺激に比べ OXA 刺激により Th 2 分化マでの IL- 4 発現増強を指標に、呼吸器と皮膚の感作性化学ーカーである IL- 4 発現のさらなる増強が見られた（図 8）。

物質の識別が可能である可能性を示唆している。

− 172 −

化学物質のアレルギー感作性 in vitro 評価法の開発

図 8 ヒトプライマリー細胞を用いた新しい 3 次元 DC/T 共培養系を用い、T 細胞での IL-4 発現増強の違いにより呼吸器と皮膚の感作性化学物質の識別が可能

図 9 ヒト末梢血単球由来 DC を用いた 3 次元 DC 共培養系により、DC での OX40L 発現増強の違いにより皮膚と呼吸器の感作性化学物質の識別が可能

4. 考

DC 共培養系への応用を試みている。さらに、そこへ、T 細察胞ハイブリドーマや不死化した Th 細胞を加えて、同様な結

現在、さらに、複数の感作性化学物質を用いる検討や、果が得られれば、より有用な評価系になることが期待される。

これらの系の汎用性を向上させるため、iPS 由来のDCを複

これまでに、呼吸器と皮膚の感作性化学物質を識別可能数作製し、LPS や OK- 432 による刺激後の成熟マーカーのな方法として、皮膚感作性評価法のゴールドスタンダードで発現解析や抗原提示能力などについて比較検討し、3 次元あるマウスを用いた LLNAで刺激開始 6 日後に所属リンパ− 173 −コスメトロジー研究報告 Vol. 28, 2020

節でのリアルタイムRT-PCR 解析する方法が唯一報告され
7 , 8）

Pathway for Sensitization of the Respiratory Tract by。この系では、皮膚感作性化学物質に比べ呼吸Low-Molecular-Weight Chemicals: Building Evidence to

器感作性化学物質の刺激で、Th 2 分化や Th 2 反応の誘導

Support the Utility of In Vitro and In Silico Methods in aに重要な IL- 4 や IL- 4 R、IL-10、OX 40 L、TSLP などのRegulatory Context. Appl Vitro Toxicol, 3（2017）．ている分子の発現がより増強されることが示された

7 , 8）。ところが、

このような呼吸器と皮膚の感作性化学物質を識別可能な in9）vitro 動物実験代替法は、今のところ開発されていない 。

5. 総

5） OECD Guidance document on the reporting of defined
approaches and individual information sources to be usedwithin integrated approaches to testing and assessment（IATA）for skin sensitization. Paris, France: Organisation

括for Economic Cooperation and Development.（2016）．

本研究では、気道上皮組織を模倣した気道上皮細胞と6） van Vliet, E., Kuhnl, J., Goebel, C., Martinozzi-Teissier,

DC、肺線維芽細胞から構成される新しい 3 次元共培養系

S., Alepee, N., Ashikaga, T., Blomeke, B., Del Bufalo, A.,を構築し、この系を用いて、DC での Th 2 分化誘導に重要

Cluzel, M., Corsini, E., Delrue, N., Desprez, B., Gellatly,

な OX 40 L 発現増強を指標に、6 種類の代表的な感作性化

N., Giese, C., Gribaldo, L., Hoffmann, S., Klaric, M.,

学物質を呼吸器と皮膚の感作性化学物質の 2 グループに識Maillere, B., Naisbitt, D., Pallardy, M., Vocanson, M. &10）

別可能であることが示された（図９） 。さらに、この系

Petersohn, D. State-of-the-art and new options to assessにアロジェニックなナイーブ CD 4 T 細胞を加えた 3 次元T cell activation by skin sensitizers: Cosmetics Europe

DC/T 共培養系では、T 細胞での IL- 4 発現増強を指標に、Workshop. ALTEX 35, 179-192（2018）．

+

呼吸器と皮膚の感作性化学物質の識別が可能である可能性

7） Adenuga, D., Woolhiser, M. R., Gollapudi, B. B. &が示唆された。免疫反応は複雑なため、アレルギー感作性

Boverhof, D. R. Differential gene expression responsesの評価には、本研究のような生体内のキーになる反応をよdistinguish contact and respiratory sensitizers andり忠実に模倣した 3 次元共培養系が有効と考えられ、そのnonsensitizing irritants in the local lymph node assay.

汎用性を上げるべく現在も検討を続けている。

Toxicol Sci 126, 413-425（2012）．
8） Cumberbatch, M., Clelland, K., Dearman, R. J. & Kimber,（引用文献）

I. Impact of cutaneous IL-1 0 on resident epidermal

1） OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 442C:
In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity
Assay（DPRA）．Paris, France: Organisation for Economic

Langerhans' cells and the development of polarized
immune responses. J Immunol 175, 43-50（2005）．
9） North, C. M., Ezendam, J., Hotchkiss, J. A., Maier, C.,
Aoyama, K., Enoch, S., Goetz, A., Graham, C., Kimber, I.,Cooperation and Development.（2015）．
2） OECD Guideline for the Testing of Chemicals No.

Karjalainen, A., Pauluhn, J., Roggen, E. L., Selgrade, M.,

4 4 2D: In Vitro Skin Sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase

Tarlo, S. M. & Chen, C. L. Developing a framework

Test Method. Paris, France: Organisation for Economicfor assessing chemical respiratory sensitization: A

Cooperation and Development.（2015）．

workshop report. Regul Toxicol Pharmacol 80, 295-309

3） OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 442E:（2016）．

In Vitro Skin Sensitisation: human Cell Line Activation

10）Mizoguchi, I., Ohashi, M., Chiba, Y., Hasegawa,Test（h-CLAT）．Paris, France: Organisation for Economic

H., Xu, M., Owaki, T. & Yoshimoto, T. Prediction ofCooperation and Development.（2016）．

Chemical Respiratory and Contact Sensitizers by4） Sullivan, K. M., Enoch, S. J., Ezendam, J., Sewald, K.,

OX 4 0 L Expression in Dendritic Cells Using a Novel

Roggen, E. L. & Cochrane, S. An Adverse Outcome

3 D Coculture System. Front Immunol 8 , 929（2017）．

− 174 −