ショウガ成分誘導体の抗酸化作用と遺伝子発現誘導作用

同志社大学工学部（前・東京大学先端科学技術研究センター）

野口範子

Ginger is the rhizome of Zingiber officinale Roscoe, a plant cultivated in tropical and subtropical countries.
Ginger extract contains many kinds of constituents, such as gingerol, shogaol, and gingediol, responsible for thepungent taste of ginger and has been know to possess a variety of pharmaceutical effects. The present study wasconducted to evaluate antioxidant activities of some of ginger constituents and their synthetic derivatives (thirteencompounds) and to find out novel functions of these compounds in cell. All phenolic compounds inhibited lipid
peroxidation of methyl linoleate and low density lipoprotein (LDL). A hydrophilic group at the end of side chain
decreased antioxidant activity in LDL. The compounds with longer side chain showed stronger antioxidant activity.
A global study of gene expression using DNA microarray in endothelial cell exposed to ginger-related compounds
revealed that compounds having α-,β-unsaturated carbonyl, eg. shogaol, strongly induced expression of genes
which were regulated by Keap-1/Nrf2/ARE pathway. The side chain effects on gene expression was not as large asobserved in antioxidant activity. Nrf2-regulated genes encode cytoprotective proteins against oxidative stress, which
may explain a part of pharmaceutical effects of ginger extract.

１．緒Fig. １に示した。これらの化合物は東亜合成株式会社より言供与された。ヒト臍帯静脈内皮細胞 human umbilical vein

ショウガはインドや東南アジア原産の宿根草で、古来よendothelial cells（HUVEC）と培養液は Clonetics 社からり漢方の多くの処方に配合されている。ショウガには「生購入した。DNA マイクロアレイ用の GeneChip, Human姜」と「乾姜」があり、それぞれ薬効に違いがあるとされ、Genome Focus Array は Affymetrics 社から購入した。そ使い分けられている。日本では古くから、調味や薬味としの他の試薬は和光純薬から購入した。て親しまれているが、日本で用いられている「生姜」は厳
密には「乾生姜」に相当する。本稿ではこれらすべてを含めショウガと総称することとする。

2. 2

抗酸化作用の評価

ショウガ成分の誘導体の脂質酸化に対する抗酸化作用にショウガには解毒や解熱作用があり、頭痛や咳、痰、鼻ついて、リノール酸メチルのアセトニトリル均一溶液中、づまりなど風邪の諸症状を緩和したり、胃痛、腹痛、嘔気リン脂質のリポソーム膜、そしてリポタンパク質の酸化にを鎮めるなど多岐にわたる効能が知られ、薬理作用につい対して評価をおこなった。低比重リポタンパク質（LDL）

１）て詳細な研究がされている 。さらに、肌の美白作用もあの精製、分析および解析は研究室の常法に従った２）。

るとされコスメトロジーの分野においても非常に興味深い食材料である。ショウガの成分としては、精油や辛味成分

2. 3

内皮細胞における遺伝子発現の解析が知られている。精油は食品や化粧品の香料としてよく用HUVEC（１×105cells）に対して、エタノールに溶解いられている。辛味成分としては gingerol 類、shogaol 類

し た カ ル ボ ン 酸 型 シ ョ ウ ガ オ ー ル（[8]-Shogaol-COOH）、がある。本研究は後者の成分である gingerol 類、shogaol[6]-OCH3 -Gingediol そして [6]-OCH3 - Gingerol を終濃度 5µ類とその誘導体の抗酸化作用と血管内皮細胞に対する作用M になるように添加し、6 時間後に細胞から RNA を回収を明らかにすることを目的としておこなった。

して DNA マイクロアレイに供した３）。

２．実
2. 1

試

験

2. 4

薬

Real-time PCR

ショウガ誘導体によって大きく誘導された遺伝子につい本研究に用いたショウガ成分の誘導体の化学構造式をて、Real-Time PCR を用いて再現性の確認を行った。また、DNA マイクロアレイで検討した化合物以外のショウガ誘Act ivity of Shogaol Derivat ives asA nt iox ida nt a nd G ene E xpres sionRegulator
Noriko Noguchi
RCAST, University of Tokyo(Faculty of Engineering, DoshishaUniversity)

導体について、遺伝子誘導能を調べるために用いた４）。

2. 5

Western blot

ショウガ誘導体を添加 6 時間後の細胞を溶解し、電気泳動をおこなった後、転写因子 Nrf2 に対する抗体（SantCruz 社）を用いて Western blot を行った４）。

− 23 −

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

2. 6

LDL 受容体欠損マウスへのショウガ成分投与

酸化物質の代表のひとつである α -トコフェロールを対照と[8]-Shogaol-COOH、[6]-OCH3-Gingediol、 そ し て 天 然 のした。リノール酸メチルはラジカル開始剤から放出される[8]-Shogaol を２％コレステロール負荷した基本食餌に５％ラジカルにより酸化し、234nm に吸収をもつ酸化生成物重量で添加し、自発的摂取で４週間与えた。大動脈弁からを与える（Fig. ２, none）。α -トコフェロールはその高い腹部大動脈までを取り出し、ホルマリン固定後、オイルレラジカル捕捉能によって酸化を効率よく抑制し、α -トコフッド染色を行った。

ェロールが消費されると抗酸化物がないときと同じ酸化速

３．結
3. 1度にもどる。これに対して、３種類のショウガ成分誘導体

果は酸化を抑制するがその抑制能は小さかった。また、３種リノール酸メチルの酸化に対する抑制作用間に酸化抑制作用に大きな差は認められなかった。

生姜には [6]-gingerol や [8]-gingerol が多く含まれるが、3. 2

乾燥度の増加や精製の過程で脱水がおこるとそれぞれに対LDL の酸化に対する抑制作用応する [6]-shogaol や [8]-shogaol が 10：1 で回収されるよ酸化 LDL は動脈硬化の主要な危険因子である。LDL のうになる（Fig. １）。本研究ではこれらの天然ショウガ成脂溶性ラジカル開始剤による酸化に対する３種ショウガ

分 の 誘 導 体 ３ 種、[8]-Shogaol-COOH、[6]-OCH3-Gingediol

成分誘導体の抗酸化作用を調べた。均一溶液での脂質酸

そして [6]-OCH3-Gingerol を合成し、これらのリノール酸

化 と は 異 な り、[6]-OCH3 -Gingediol と [6]-OCH3 -Gingerol

メチルのアセトニトリル均一溶液中におけるラジカル酸化は 強 い 抗 酸 化 作 用 を 示 し た（Fig. 3）。 こ れ に 対 し て、に対する抗酸化作用の評価を行なった。ラジカル捕捉型抗[8]-Shogaol-COOH も酸化を抑制したが、その作用は他のCH3OOOH

HO-H2OHOO

CH3O[6]-Gingerol

CH3OO[6]-Shogaol

OCH3OCH3OHOHO[8]-Shogaol[6]-OCH3-Gingerol

CH3OOH OCH3O

CH3OCOOH

HOHO[6]-OCH3-Gingediol

Fig.1[8]-Shogaol-COOH

Chemical structure of constituents in ginger extract and their synthetic derivatives

31

Absorbance 234nm

Absorbance 234nm

2.5
2
1.5
1
0.5

0.8
0.6
0.4
0.2
0005

00

100-0.2Time,min

50

100

150

200Time,minFig.2 Antioxidant effect of [8]-Shogaol-COOH, [6]-OCH3Gingerol, and [6]-OCH3-Gingediol on oxidation of methyl
linoleate Increase in absorption at 234 nm in the oxidationof methyl linoleate (15mM) induced by 0.5mM AMVN inacetonitrile at 37 ℃ .
◆ : control; △ :1µM α-tocopherol; ◇ : 5µM [8]-Shogaol-COOH;● : 5µM [6]-OCH3-Gingerol; □ : 5µM [6]-OCH3-Gingediol

Fig.3 Antioxidant effect of [8]-Shogaol-COOH, [6]-OCH 3Gingerol, and [6]-OCH3-Gingediol on LDL oxidation
Increase in absorption at 234nm in the oxidation of LDL (0.1mg/ml) induced by 0.4mM AMVN in PBS (pH7.4) at 37 ℃ .
■ :control; ◇ : 5µM [8]-Shogaol-COOH; ● : 5µM [6]-OCH3Gingerol; □ : 5µM [6]-OCH3-Gingediol− 24 −

ショウガ成分誘導体の抗酸化作用と遺伝子発現誘導作用

２ 種 よ り も 劣 っ て い た。[8]-Shogaol-COOH と [6]-OCH3-

転写因子 Nrf2 によって制御されることが知られている

Gingediol および [6]-OCH3 - Gingerol との化学構造の違いは遺伝子によって占められていた。これらの遺伝子発現に側鎖にある。そこで、Fig. 4A に示すように Gingediol の[6]-OCH3-Gingediol や [6]-OCH3 -Gingerol は全く影響を及ぼ側鎖に修飾を加えた化合物を合成し、側鎖の化学構造のさなかった。

ちがいが LDL の酸化に対する抑制効果に及ぼす影響を検GeneChip で得られた結果についてその再現性を real

討した。その結果、[6]-OCH3-Gingerol の側鎖末端に -OHtime PCR に よ っ て 確 認 す る と と も に、Fig. 6A に 示 し基をつけると ([6]-OCH3-Gingerol-OH)、抗酸化効果が大きた他の誘導体を用いて比較することにより、遺伝子発現く低下することがわかった（Fig. 4B）。しかし、同じく末を決定する化学構造を求めた。もっとも強く誘導された

端に -OH 基をもつが炭素鎖の長さをのばすと ([8]-OCH3-

hemeoxygenase-1（HO-1）は、[8]-Shogaol-COOH によって誘Gingerol-OH), 抗酸化効果は [6]-OCH3 -Gingerol-OH よりも導されるが [6]-OCH3-Gingerol では誘導されないことが real優れ、[6]-OCH3 -Gingerol に近づいた。

time PCR に よ る 解 析 に お い て も 確 認 さ れ た（Fig. 6B）。

フェノール性の抗酸化物の抗酸化活性部位は、通常フ[8]-Shogaol-COOH と [6]-OCH3 -Gingediol ま た は [6]-OCH3 -ェノール基（ベンゼン冠の -OH 基）にあるが、ショウガ

Gingerol の化学構造上の違いは、[8]-Shogaol-COOH の側成分誘導体についてこの点を確認するために Phenyl-[8]-鎖にある α, β - 不飽和カルボニルであることに着目し、こShogaol-COOH を合成し、LDL の酸化に対する抑制作用の部分が Keto 型、そして Enol 型の化合物を用いて HO-1を調べた（Fig. 5A）。Phenyl-[8]-Shogaol-COOH は LDL のの 誘 導 能 を 調 べ た（Fig. 6B）。Keto 型 お よ び Enol 型

酸化をほとんどまったく抑制しなかった（Fig. 5B）。

shogaol はいずれも HO-1 の誘導をおこさなかった。抗酸化能に影響を与えた側鎖末端の修飾基やフェノール基の3. 3 血管内皮細胞の遺伝子発現誘導に及ぼす化学構造

HO-1 誘導能に及ぼす影響について検討をおこなったとこ

ショウガ成分の誘導体の血管内皮細胞の遺伝子発現ろ（Fig. 6C）、[8]-Shogaol-COOH の末端のカルボキシル基に及ぼす影響を網羅的に解析するために、ヒト遺伝子約に換わって、ヒドロキシル基（-OH）をもつ [8]-Shogaol-一万個に対するプローブを搭載した GeneChip を用いてOH の HO-1 誘導能は [8]-Shogaol-COOH と差はなかったが、[8]-Shogaol-COOH、[6]-OCH3-Gingediol そ し て [6]-OCH3-エステル基をもつ [8]-Shogaol-CooEt は HO-1 を誘導する

Gingerol に よ る 遺 伝 子 発 現 誘 導 を 調 べ た（Table １）。

もののその誘導能は [8]-Shogaol-COOH に比べて小さかっ

そ の 結 果、 非 常 に 興 味 深 い こ と に、[8]-Shogaol-COOHた。抗酸化能がまったくない Phenyl-[8]-Shogaol-COOH はの み が 遺 伝 子 発 現 を 大 き く 誘 導 す る こ と が わ か っ た。

HO-1 誘導能をもつがその作用は [8]-Shogaol-COOH に比較[8]-Shogaol-COOH に よ っ て 誘 導 さ れ る 遺 伝 子 の 上 位 は、して小さかった。また、比較のために天然のショウガ成分（A）（B）OH1

OCH 3

CH 3 O[6]-OCH 3-Gingediol
OH

OCH 3OH

CH 3 OHO[6]-OCH 3-Gingediol-OHOH0.80.70.60.50.4
0.3
0.20.1

OCH 3OHCH 3 OHOAbsorbance 234nm

HO0.900[8]-OCH 3-Gingediol-OH

50100150Time,min

Fig.4 Effects of side chain on LDL oxidation(A) Chemical structure of compounds studied.
(B) Increase in absorption at 234 nm in the oxidation of LDL (0.1 mg/ml) induced by 0.4 mM AMVN in PBS (pH7.4)
at 37 ℃ .
■ :control; ■ :5 µM [6]-OCH3-Gingediol; □ : 5µM: [6]-OCH3-Gingediol-OH; X: 5µM [8]-OCH3-Gingediol-OH− 25 −200

コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

である [6]-Shogaol や [8]-Shogaol の HO-1 誘導作用を分析とに注目し、これらのラジカル捕捉型抗酸化物質としてのしたところ、[8]-Shogaol は [8]-Shogaol-COOH とほぼ同等作用について研究を行なった。天然の化合物に加え、化学の誘導を示したが、[6]-Shogaol の誘導能は小さかった。

構造の一部がわずかに異なる種々の誘導体を合成し、その作用を比較検討することにより、抗酸化作用に影響を与え

3. 4 LDL 受容体欠損マウスの動脈硬化巣形成に対するショウガ成分の影響る分子内構造を特定することができた。
[8]-Shogaol-COOH、[6]-OCH3-Gingediol そ し て [6]-OCH3-

今回の投与期間（４週間）ではいずれの化合物も顕著なGingerol の３種のショウガ成分誘導体は均一溶液中にお動脈硬化抑制作用を示さなかった。投与期間を延長するなける脂質酸化に対してはほとんど同じ抗酸化作用を示した。

ど、実験方法を再検討する必要があると考えられた。

これは均一溶液中では側鎖のちがいによる化合物の動きに４．考差がないためと考えられる。

察

これに対し、LDL の酸化においては側鎖の影響が強くショウガには古くから様々な効能をもつ成分が含まれて現れた。側鎖の末端に親水性の高いカルボキシル基をもいることが知られていたが、その作用メカニズムに関して

つ [8]-Shogaol-COOH は [6]-OCH3-Gingediol や [6]-OCH3-は明らかでない部分も多かった。本研究では、ショウガのGingerol よりも抗酸化作用は劣ることが明らかとなった成分のなかで shogaol や gingerol がフェノール基をもつこが、これは脂質と蛋白質の球状複合体である LDL 内へ

（A）

（B）

10.9

O0.8COOH

HO[8]-Shogaol-COOHO
COOH

Absorbance 234nm

CH 3O0.70.60.50.4
0.30.2

Phenyl-[8]-Shogaol-COOH

0.10-0.1 050100150Time, min200

Fig.5 Effects of phenol group on LDL oxidation(A) Chemical structure of compounds studied.
(B) Increase in absorption at 234nm in the oxidation of LDL (0.1mg/ml) induced by 0.4 mM AMVN in PBS (pH7.4)
at 37℃．
◆ :control; □ : 5 µM [8]-Shogaol-COOH; ● : 5 µM Phenyl-[8]-Shogaol-COOH

Table1 Gene expression in endothelial cell induced by shogaol derivatives

Gene Namehemeoxygenase 1tripartite motif-containing 16
sequestosome 1glutamate-cysteineligase, modifier subunit
solute carrier family7, member 11
solute carrier family 3, member 2

HO-1
TRIM16SQSTM1GCLM
SLC7A11
SLC3A2− 26 −none

ShogaolCOOH

161
123
61223
608
229

1959
681
2197531635
466

OCH3OCH3Gingediol Gingerol
188
15273283
726
256

178
12075213642254

ショウガ成分誘導体の抗酸化作用と遺伝子発現誘導作用の侵入、分布が親水性の高いカルボキシルによって妨げ
５）長さも重要であることがわかった。炭素数を２つ増やしてられたためと考えられる 。この効果は側鎖中央部がま炭素鎖を長くした [8]-OCH3-Gingediol-OH は末端に -OH 基ったく同じで末端のヒドロキシル基の有無のみが異なるがあるにもかかわらず抗酸化効果は [6]-OCH3-Gingediol に[6]-OCH3 -Gingediol と [6]-OCH3 -Gingediol-OH の 比 較 に よ

かなり近づいたことから明らかである。

り明確に示されたといえる（Fig. 4）。LDL の抗酸化作用にフェノール系抗酸化物質の抗酸化活性はラジカルへの影響を与えるのは側鎖末端だけではなく、側鎖の炭素鎖のフェノール基からの電子、水素の供与であると考えられ

（A）
O

O
CH 3O

COOH

COOH

HO

[8]-Shogaol-COOH(Shogaol-COOH)

Phenyl-[8]-Shogaol-COOH(Phenyl-Shogaol)
OH

O

CH 3O

CH 3O

COOH

COOH

HOHO

Enol

KetoO

O
CH 3O

CH2OH

CH 3O

COOEt

HOHO

[8]-Shogaol-OH(Shogaol-OH)[8]-Shogaol-COOEt(Shogaol-COOEt)
OO

CH 3O

CH 3O

HOHO

[6]-Shogaol[8]-Shogaol
OHOCH3CH O
3HO[6]-OCH3-Gingediol

（B）

（C）
50

Relative mRNA levels

Relative mRNA levels

15*1050none
KetoShogaol-COOH*403020*none*

Shogaol Shogaol 6-Shogaol-COOH -OH
PhenylShogaol 8-Shogaol-Shogaol -COOEt

Fig.6 Induction of hemeoxygenase-1 (HO-1) by shogaol derivatives in endothelial cell.
(A) Chemical structure of compounds studied.
(B), (C)Relative mRNA levels of HO-1 were measured by real-time PCR. *p<0.01− 27 −**100Enol OCH3Gerol*コスメトロジー研究報告 Vol.15, 2007

るため ２）、[8]-Shogaol-COOH のベンゼン環の置換基がす5-hydroxy-2,2-dipentyl-4,6-di-tert-butylbenzofuran:

べてメチル基である Phenyl-[8]-Shogaol-COOH は予想どお

Design and evaluation as a novel radical-scavenging

り LDL の酸化を全く抑制しなかった。また、[8]-Shogaol-antioxidant against lipid peroxidation, Arch. Biochem.

COOH の置換基を２つの -OCH3 に変えた化合物も同様にBiophys., 342, 236-243, 1997.
３）Takabe W, Kanai Y, Chairoungdua A, et al.:

抗酸化作用をもたなかった（data not shown）。
ショウガ成分とその誘導体による内皮細胞の遺伝子発

Lysophosphatidylcholine enhances cytokine production

現誘導能の網羅的解析によって、転写因子の一つであるof endothelial cells via induction of L-type amino acidNrf2 が制御する遺伝子群が数多く誘導されることが示さ

transporter 1 and cell surface antigen 4F2. Arterioscler

れた

Thromb Vasc Biol. 24,1640-1645, 2004.

4，6，7）。さらにある特定の化学構造がこの遺伝子発現を厳密に規定していることが、種々の誘導体の遺伝子発現

４）Warabi E, Wada Y, Kajiwara H, et al.: Effect on

能を比較することにより明らかとなった。その構造はショ

endothelial cell gene expression of shear stress, oxygen

ウガ成分類の側鎖にある α−, β− 不飽和カルボニルであった。

concentration, and low-density lipoprotein as studied

Nrf2 は合成されると、細胞質に存在する蛋白質 Keap-1

by a novel flow cell culture system. Free Radic. Biol.
Med. 37,682-694, 2004.と結合し、Keap-1 のユビキチン化酵素作用によりユビキ
8, 9）５）Gotoh N, Noguchi N, Tsuchiya J, et al.: Inhibition of

ところが、親電子性の化合物やラジカル性の活性酸素が細oxidation of low density lipoprotein by vitamin E and胞内に増加すると Keap-1 分子内の２つの -SH が酸化され、related compounds. Free Rad. Res., 24, 123-134, 1996.

-S-S- 結合が生じたり、あるいは化合物（X）自体が結合

６）Hosoya T, Maruyama A, Kang M-I, et al.: Differential

して架橋構造をとり（-S-X-S-）、Keap-1 の構造変化がおこ

responses of the Nrf2-Keap1 System to laminar and

るため Nrf2 は Keap-1 から解離する 10）。解離した Nrf2 はoscillatory shear stress in endothelial cells. J. Biol.

核内に移行して遺伝子のプロモーター領域の antioxidant

Chem., 280, 27244-27250, 2005.

チン化されプロテアソームによって速やかに分解される。

response element（ARE）配列に結合し転写活性を促す。

７）Chen X L, Varner S E, Rao A S, et al.: Laminar flow

Table １に示したショウガ成分類によって発現誘導された

induction of antioxidant response element-mediated

遺伝子はすべてそのプロモーター領域に ARE 配列がある

genes in endothelial cells. A novel anti-inflammatory

ことが知られている。これらの遺伝子にコードされる蛋白mechanism. J. Biol. Chem. 278, 703-711, 2003.

質は細胞内を還元状態に保ち、酸化ストレスから細胞を防８）McMahon M, Itoh K, Yamamoto M, et al.: Keap1-御する機能をもつ。また、解毒機構の第二相の酵素も同じ

dependent proteasomal degradation of transcription

く Nrf2/ARE 制御下にあることがわかっている。ショウ

factor Nrf2 contributes to the negative regulation of

ガの効能のいくつかは α−, β− 不飽和カルボニル構造によantioxidant response element-driven gene expression.
J. Biol. Chem. 278, 21592-21600, 2003.

るこれらの遺伝子誘導にその作用機序を求めることができ

９）Itoh K, Tong K I, Yamamoto M,: Molecular

ると考えられる。
本研究により、ショウガ成分およびその誘導体の脂質

mechanism activating Nrf2-Keap1 pathway inや LDL の酸化に対する抗酸化作用に影響する化学構造と、

regulation of adaptive response to electrophiles. Free

遺伝子発現に影響する化学構造がそれぞれ明確になった。

Radic. Biol. Med. 36,1208-1213, 2004

また、ショウガ成分の細胞防御に関わる新規機能が明らか

10）Wakabayashi N, Dinkova-Kostova AT, Holtzclaw W
D, et al.: Protection against electrophile and oxidantになった。

stress by induction of the phase 2 response: fate of（引用文献）

cysteines of the Keap1 sensor modified by inducers.

１）油田正樹：現代東洋医学 , 8, 45-50, 1987.

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101,2040-2045, 2004.

２）Noguch N, Iwaki Y, Takahashi M, et al.: 2,3-Dihydro-− 28 −