炎症時における細胞動態と酵素活性を in vivo で可視化する
機能性 MRI プローブ
大阪大学大学院工学研究科

菊地和也

Highly sensitive imaging of enzymatic activities in deep region of living organisms have been a difficult challenge forbioimaging materials. Among them, 19 F magnetic resonance imaging (MRI) probes are suitable for noninvasively visualizing
enzymatic activities in vivo due to zero background signal. Although various enzyme-responsive 19 F MRI probes have beendeveloped, most of them have not been applicable to in vivo imaging because of their low sensitivity. Recently, we developedperfluorocarbons-encapsulated nanoparticles and demonstrated that they showed outstanding sensitivity in vivo. Here, wedeveloped enzyme-responsive 19 F MRI nanoprobes (FLAME-DEVD 2 ) for detecting caspase- 3 / 7 activity by employing
the paramagnetic relaxation enhancement effect as the OFF/ON switch of 19 F MRI signals. After intravenous injectionof FLAME-DEVD 2 and apoptosis-inducing reagents, caspase- 3 / 7 activity in a living mouse spleen was successfully
imaged by 19 F MRI. The results demonstrated that this imaging platform has great potential for highly sensitive detection of
enzymatic activities in vivo.

1. 緒

言

生命活動は、生体分子が複雑に相互作用することでその恒常性が保たれている。その中でも酵素は生命機能の維持と同時に癌やアルツハイマー病などの様々な疾患を引き起こすメディエーターとしての働きを持っている。生きた動物個体で酵素活性をイメージングすることは、その機能や動態の解析から、疾病の検出や薬効評価などの応用研究に

Fig. 1 (a) Structure and TEM image of FLAME., (b) In vivo
MR image of FLAME in tumor bearing mouse.

繋がる。Magnetic Resonance Imaging（MRI）は核磁気共鳴現象を利用した三次元断層画像法であり、核磁化の励起物をベースとする 19F MRI プローブは、in vivo においてにラジオ波を用いているので、放射線被爆の危険性がない。

低感度という問題点があった。
これまでに、上記の問題点を解決するために高感度なまた空間分解能や組織コントラストが優れているため、生体内における酵素活性を検出するのに非常に優れている手19法と言える。特に 19F MRI は内在性バックグラウンドシグ

nanoparticle for 19F MRI Enhancement） の 開 発 に 成 功

ナルがほとんど存在しないため、生体に投与した 19F MRIし て い る。FLAME は 一 分 子 内 に フ ッ 素 を 20 個 有 す る

造影剤のみを選択的にイメージングすることが可能であ

perfluoro 15-crown-5 ether（PFCE）を脂質により内包し、る。これまでにいくつかの小分子化合物をベースとした酵

その周りをシリカで被覆した構造をしている（Fig. 1a）。そF MRI 造 影 剤 FLAME（FLuorine Accumulated silica

素活性検出 F MRI プローブが報告されており、本研究室のため、生体内においても安定かつ非常に高感度な 19Fも常磁性緩和促進（PRE）効果に基づいた酵素活性検出 19F

MRI シグナルを示すことがわかっている（Fig. 1b）。

19

MRI プローブを開発してきた。PRE 効果とは、常磁性種

本研究では、PRE 効果による OFF/ON スイッチング機が持つ不対電子スピンの影響で、その近傍に存在する観構に基づき、生体内における酵素活性を検出する高感度な測核の横緩和時間 T2 が著しく減少する現象のことである。

19

F MRI 造影剤の開発を目的として取り組んだ。

T2 は、MRI シグナル強度と相関があるパラメーターであり、T2 を制御することで MRI シグナルの OFF/ON のスイッチング原理を確立可能である。しかしながら小分子化合2. 方法

2. 1. カスパーゼ-1 活性検出用

19

F MRI 造影剤

デザインした FLAME-WEHD X は、FLAME、Gd3+ 錯体、Functional in vivo Imaging of CellularDynamics and Enzyme Activity after
Inf lammation Using Chemica l M R I
ProbesKazuya Kikuchi
Graduate School of Engineering, OsakaUniversity

カスパーゼ -1 基質から構成される（Fig. 2）。カスパーゼ -1は基質配列 WEHD における D の C 末端を切断することが知られているので、この基質を介して FLAME と 19F MRIシグナルを抑制する Gd3+ 錯体を連結させた。FLAME の19

F MRI シグナルは、Gd3+ が持つ PRE 効果により FLAME内部のフッ素化合物の T2 が短縮されており、一時的に消− 68 −

炎症時における細胞動態と酵素活性を in vivo で可視化する機能性 MRI プローブ失している。カスパーゼ -1 が基質を切断して、Gd3+ 錯体

MRI シグナル増大を示したので、これをマウス実験に用が FLAME 表面から解離することで、PRE 効果が解消さいた。マウスは Black 6 を使用した。FLAME-WEHD 3

れ、19F MRI シグナルが回復する。また FLAME と Gd3+ 錯のみを生理食塩水中に分散させ、Black 6 マウスに皮下注体が立体障害となってカスパーゼ -1 が基質部位にアクセ射した。コントロールとして同じ PFCE 濃度の FLAME-スしにくいことが考えられる。そこで基質配列を 2, 3 個とCOOH を反対側に皮下注射した。コントロール側では非常繰り返すことで、FLAME と Gd3+ 錯体間の距離が離れてに強い 19F MRI シグナルが観測された。FLAME-WEHD

カスパーゼ -1 がアクセスし易くなるとともに、酵素が基3 を打ち込んだ側においては冠状断と水平断の両方で 3 時質を断する確率が増えると期待した。

間後から 19F MRI シグナルが観測され始めた。この原因と3. 結して皮膚への注射による果刺激に対する免疫応答、血清中の酵素による基質の切3. 1. FLAME-WEHD X（X = 1–3）の酵素反応断が考えられる。しかし、ポジティブコントロールの作製した FLAME-WEHD X とカスパーゼ -1 の酵素反応19を行い、 F MRI 測定を行った。FLAME-WEHD 1, 2 でalways ON の FLMAE-COOH と比べて 19F MRI シグナルが非常に抑制されていることが確認された（Fig. 4）。

19はカスパーゼ -1 存在下、非存在下において F MRI シグ
ナルの増大がほとんど見られなかったのに対し、FLAME19

WEHD 3 では酵素反応開始後 6 時間から F MRI シグナ

3. 3. FLAME-WEHD 3 を用いた生体における免疫応答の可視化ルの増大が確認された（Fig. 3）。

最 後 に 人 為 的 に 免 疫 応 答 を 起 こ す た め に、FLAMEWEHD 3（1.67 mM, 120 µL）を刺激物である IL-6 と同時

19

3. 2. FLAME-WEHD 3 のマウス体内における F
MRIシグナル評価に皮下注射した。コントロール側では投与後 7 時間後かFLAME-WEHD 3 がカスパーゼ -1 存在下において 19F

IL-6 を加えた側では投与後 30 分で非常に強い 19F MRI シ

ら 19F MRI シグナルが少ししか観測されなかったのに対し、Fig. 2 Design principle of FLAME-WEHD X (X = 1–3).

Fig. 3 (a) 19F MRI phantom images of FLAME-WEHD X with or without caspase-1.
(b) Time course of 19F MRI signal intensity.

− 69 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

グナルが観測された。これは IL-6 によって引き起こされ19より検出した初めての例であり、今後この造影剤を用いてた免疫応答に対して FLAME-WEHD 3 が応答し、 F MRI

痛風関節炎などの様々な炎症性疾患の検出、評価を行うこシグナルが増大したことを示唆する結果である（Fig. 5）。とで、19F MRI を用いた新たな検出法として免疫学への貢4. 考献が期待される。

察5. 総

PRE 効果を利用した OFF/ON スイッチング機構に基括

づ い た 分 子 設 計 を FLAME に 施 し、in vivo 応 用 可 能 な本研究で、カスパーゼ -1 活性検出用 19F MRI 造影剤と酵素活性検出 19F MRI 造影剤の開発を行った。作製したカスパーゼ -3 活性検出用 19F MRI 造影剤の開発をそれぞ19

FLAME-WEHD 3 はマウス体内の免疫応答を F MRI にれ行った。カスパーゼ -1 活性検出用 19F MRI 造影剤であFig. 4 In vivo 1H/19F MRI measurement of FLAME-COOH and FLAME-WEHD 3
in black 6 mouse at 15 min, 3 h, 6 h, 9 h after subcutaneously injection.

Fig. 5 In vivo 1H/19F MRI measurement of FLAME-WEHD 3 in black 6 mouse at 30 min, 7 h, 2days after subcutaneously injection with or without IL-6（1µg）．Total administered volume is 120µL（C PFCE = 1.67 mM）．19F MRI RAREVTR method: coronal plane; the matrix size was 128 × 64
and the slice thickness was 40 mm. T E, eff was 16 ms. T R was 1500 ms. The NEX was 128.

− 70 −

炎症時における細胞動態と酵素活性を in vivo で可視化する機能性 MRI プローブ

る FLAME-WEHD 3 は、カスパーゼ -1 の添加に伴いファ3） Okada S, Mizukami S, Sakata T, Matsumura Y,

19

ントム像で F MRI シグナルの増大が確認された。さらに

Yoshioka Y, Kikuchi K,: Ratiometric MRI Sensors

マウスへの応用において、IL -6 と皮下注射することによ

Based on Core-Shell Nanoparticles for Quantitative pH

りコントロールと比べて、非常に高感度にマウス体内の免Imaging, Adv. Mater., 19, 2989-2992, 2014.

19

疫応答を F MRI 検出していることを示唆する結果が得ら

4） Okada S, Mizukami S, Sakata T, Matsumura Y,

れた。これはマウス体内の免疫応答を 19F MRI により検出

Yoshioka Y, Kikuchi K,: Ratiometric MRI Contrast

した世界で初めての例である。今後、細胞実験などを行う

Agents Based on Core-Shell Nanoparticles for

ことに FLAME-WEHD 3 がどの程度カスパーゼ -1 に対しQuantitative pH Imaging, Dalton Trans., 4 2, 1 5 8 6 4-15867, 2013.て選択性を持っているか、そして FLAME-WEHD 3 のマ
ウス体内の動態を詳しく調べていくことで、特定の炎症性

5） Matsushita H, Mizukami S, Mori Y, Sugihara

疾患の 19F MRI 検出も期待される。

F, Shirakawa M, Yoshioka Y, Kikuchi K,:

1919F MRI

カ ス パ ー ゼ -3 活 性 検 出 用 F MRI 造 影 剤 で あ る

Monitoring of Gene Expression in Living Cells via Cell

FLAME-DEVD 1，2 は両者とも、ファントム像においてSurface beta-Lactamase Activity, ChemBioChem, 1 3,

非常に高コントラストにカスパーゼ -3 活性を検出できる

1579-1583, 2012.

ことが確認された。特に高コントラストにカスパーゼ -36） Mizukami S, Matsushita H, Takikawa R, Sugihara
19

活性を検出できた FLAME-DEVD 2 に関しては、マウス

F, Shirakawa M, Kikuchi K,:

体内のアポトーシスの 19F MRI 検出を行うことにより、本-Galactosidase Activity for Imaging of Gene Expression,

研究で行ったプローブデザインが様々なプロテアーゼに応Chem. Sci., 2, 1151-1155, 2011.

F MRI Detection of㌼7） Okada S, Mizukami S, Kikuchi K,: Application of

用可能であると考えられる。

Stimuli-Responsive Polymer for Development of Novel（引用文献）MRI Probes, ChemBioChem, 11, 785-787, 2010.

1） Nakamura T, Matsushita H, Sugihara F, YoshiokaY, Mizukami S, Kikuchi K.: Activatable198） Mizukami S, Takikawa R, Sugihara F, Shirakawa M,Kikuchi K,: Dual Functional Probe to Detect Protease

F MRI

Nanoparticle Probes for the Detection of Reducing

Activity for Fluorescence Measurement andEnvironments, Angew. Chem. Int. Ed., 5 4, 1 0 0 7-1 0 1 0,Angew. Chem. Int. Ed., 48, 3641-3643, 2009.

2015.

19F MRI,

9） Mizukami S, Takikawa R, Sugihara F, Hori Y, Tochio

2） Matsushita H, Mizukami S, Sugihara F, Nakanishi

H, Wälchli M, Shirakawa M, Kikuchi K,: Paramagnetic
19Y, Yoshioka Y, Kikuchi K,: Multifunctional Core-shell

Relaxation-based

Silica Nanoparticles for Highly Sensitive

Activity, J. Am. Chem. Soc., 130, 794-795, 2008.

19F MRI,

Angew. Chem. Int. Ed., 53, 1008-1011, 2014.

− 71 −F MRI Probe to Detect Protease