早老性疾患遺伝子による皮膚線維芽細胞の老化とテロメア制御
京都大学

小放射線生物研究センター

松賢

志Nijmegen Breakage Syndrome (NBS) is an autosomal recessive disorder characterized by chromosome
instability, defect in repair of double strand break and high incidence of lymphoid cancers . Here, we showthat NBS1 is recruited to telomere ends by alternative mechanism, in which NBS1 interacts with TRF2,
possibly through telomeric DNA, and forms discrete foci in ATM-independent manner. This is demonstrated
by the evidences that NBS1 foci are formed in ATM-defective cells, and that both NBS cells lacking FHA/BRCT domains and S278/343A clone, mutated in ATM-phosphorylated sites, can interact with TRF2.
Moreover, C-terminus of NBS1, MRE11 nuclease-binding region, was essential for the interaction with TRF2.
It is consistent that NBS1 lacking the C-terminus was failed to elongate the short telomere length in NBS
cells, although transfection both with full length of the NBS1 cDNA and of the S278/343A cDNA restored thetelomere length. Furthermore, the short G-tail length of NBS cell line has not changed significantly following
transfection with NBS1 cDNA lacking of the C-terminus region, while the full length of cDNA complements
the G-tail length. These findings suggest that NBS1 is recruited to telomere by MRE11/RAD50/NBS1
complex formation in ATR- and ATM-independent manner and is implicated in telomere length maintenance,
possibly through G-tail regulation.

１. 緒

言

２．実

験

老化に伴い細胞の染色体異常や突然変異の増加などゲノNBS1 蛋白によるテロメア延長機構：NBS 及び AT 初

ム不安定性が誘発される事は以前から知られていたが、最代培養細胞の分裂テロメア短縮を TTAGGG リピートを近、モデル動物の線虫の研究からゲノム不安定性が逆に老プローブとしたサザン法、AE プローブによる加水分解時化を促進する事が明らかになってきた。実際ゲノム不安定の発光を比較する HPA 法、テロメア FISH のシグナル強性を呈するヒト遺伝病では、がんや免疫不全と共に早期老度の高精度計測により分裂毎のテロメア長減少を正常細化を示す。本研究ではゲノム不安定性による老化機構を明胞の 150bp/ 分裂と定量比較する。また S1 ヌクレアーゼらかにするために、研究材料として染色体不安定症候群のによる 5’ 一本鎖 DNA 生成能や細胞内 ECR などによりナイミーヘン症候群（NBS）及び毛細血管拡張性運動失調

テロメア異常短縮の原因を解明する。続いて、NBS 細胞症（AT）のゲノム不安定性を呈するヒト遺伝病を用いる。

が NBS1cDNA 導入後にテロメアが延長することを確認しこれらの細胞では細胞老化の原因となる染色体テロメアがた後に、その延長機構を明らかにする。すなわち、ChIP異常に早く短縮する可能性が指摘されている。恐らくゲノ法でテロメア複製期の NBS1 と TRF2 の相互作用、NBS1ム安定化に関わるこれら遺伝病の蛋白が直接 DNA 末端のリン酸化と hTERT など関連蛋白との相互作用、免疫染テロメア延長制御に関わっていると思われる。このために色による共局在そして G—tail やテロメア長を指標とした染色体不安定症候群におけるテロメア長の測定を行う。さdeletion mutant 実験によりテロメア蛋白の作用機序を解らに、テロメア長の延長機構を解明するために、テロメア析する。NBS 患者の皮膚由来の線維芽細胞を SV40 で不Ｇテールの測定やテロメア蛋白 TRF2 相互作用について死化した GM07166VA7 細胞、及び正常細胞として子宮内解析する。また、ナイミーヘン症候群（NBS）のノックア腫由来の HeLa 細胞、ヒト肺由来細胞を不死化した MRC—ウトマウス細胞作製によるテロメア短縮機構を明らかにす

55V 細胞と GM07166VA7 に全身 NBS1 cDNA を発現ベクる事を目的とする。

ター pIRES-hyg で導入した放射線感受性が回復したクローンを用いる。

Celluar aging and abnormal regulationof telomeres in skin fibroblasts froma patient with an accelerated aging
disorder.
Kenshi Komatsu
Radiation Biology Center, Kyoto
University細胞同調は aphidicolin 2 µg/mL で 16 〜 20 時間培養後に、通常培地に戻して行う。除去後 0 〜 3 時間が G1/S 期、3 〜 5 時間後が S 期初期、5 〜 8 時間後が S 期後期、8 時間以降が G2/M 期に対応することをフローサイトメトリーで確認する。
NBS1 と TRF2 の 二 重 免 疫 染 色 は 細 胞 を Triton X—
100 で処理後に NBS1（rabbit）抗体と TRF2（goat）抗− 74 −

早老性疾患遺伝子による皮膚線維芽細胞の老化とテロメア制御体でインキュベートし、それぞれ anti-goat IgG—TRITC

NBS1 蛋白のリクルート機構は DNA 修復とテロメア維持と anti-rabbit IgG—Alexa 488 で染色する。また、細胞をでは異なることが確認された。

lysisbuffer で抽出した lysate を NBS1 抗体で沈殿した免NBS1 抗体及び TRF2 抗体を用いて MRC—5SV 細胞の免疫複合体を NBS1 抗体及び TRF2 抗体を用いたウエスタ

疫染色を行った結果、NBS1 及び TRF2 ともに細胞周期依ンブロット法で解析する。

存性にフォーカスを形成することが示された。特に NBS1

G-tail 長の測定は細胞から抽出した DNA を二本鎖のまフォーカスは S 期初期にドット状のフォーカスを形成しまゲル上でハイブリダイズする in gel hybridization を行て、NBS1 と TRF2 の二重染色は両フォーカスが一致するう。プローブには 5'（CCCTAA）43' オリゴヌクレオチことが確認された。また、テロメア FISH 法により細胞内ドを、そして 3'—エキソヌクレアーゼとして Mung Bean

局在を検討した結果、両フォーカスはテロメア上に存在すNuclease（MBN）を用いる。

ることが判明した。一方、NBS1 と TRF2 の生体内での結チキンＢ細胞由来の DT40 細胞は遺伝子ノックアウト合が免疫複合体での解析により明らかになった。つまり、の効率が通常の高等真核細胞の数百倍高頻度であるのでNBS1 抗体での複合体を TRF2 抗体を用いてウエスタンブノックアウト細胞の作製に良く使用される。我々は初めロット解析したところ、TRF2 の存在が確認された。このに NBS1 の N 末側保存領域 FHA/BRCT ドメインに設計

両者の結合は、NBS1 と TRF2 フォーカスの共局在の結果した変成プライマーを用いて、RT—PCR によりチキン胚と一致して、S 期初期においてのみ検出された。

由来の cDNA ライブラリーをスクリーニングする。続い続いて、テロメア端に存在する一本鎖 DNA（G—tail）て、ノックアウトコンストラクトを作製するためにエクを in gel hybridization により測定した結果、NBS 細胞のソン 2 からエクソン 6 に相当する約 5.5kb のゲノム DNA

G—tail は正常 HeLa 細胞及び NBS1 タンパクを強制再現さを用いて DT40 細胞の Nbs1 遺伝子をターゲッティングすせた NBS 細胞よりも約 80％短いことが明らかになった。

る。Nbs1 の個体レベルでの発現解析のためノックアウト

テロメアプローブが G—tail のみに Hybrize していることマウスを作製する。Nbs1 のエキソン 2 部位に PGK—neo—

は、MBN 処理によりサザン法のシグナルが消失したこと

poly A/HSD—tk ターゲティングベクター導入によりヌルにより確認できた。

突然変異 ES 細胞を得る。この変異 ES 細胞のターゲテン個体レベルでの発現を比較するためにマウス Nbs1 遺伝グベクターを Cre—Loxp で除去した細胞あるいは除去しな子のエキソン 4 以降をターゲテングしたマウス二種類のい ES 細胞を、C57BL/6 の 3.5 日胚から回収したブラスト性質を比較した。ターゲテングベクターがそのままのノシスト内に移入する。続いて偽妊娠 ICR マウスの子宮内ックアウトマウスでは胎生 8.5 日で致死になるが、細胞株に戻して得られるキメラマウス交配により F1 の尾 DNAは樹立可能であった。これに対して、Cre—Lox によりタの PCR 法により変異マウスを確認する。このマウス肺線ーゲティングベクターを除いたノックアウトマウスでは胎維芽細胞を樹立後、放射線致死感受性や染色体異常頻度な生 3.5 日で致死になり、細胞株化も不可能であった。両者

らびに遺伝子突然変異頻度を比較し、個体レベルの発現をのノックアウトマウスの違いは Nbs1 の C 末側蛋白の発現

リンパ球サブセット解析、Nbs1 蛋白発現の組織特異性をにあるので、ヒト NBS 細胞同様に生存にはＣ末側蛋白が測定する。

必要であることが示された。一方、正常細胞が極一部存在３．結果するキメラマウスが偶発的に発生した。このマウスは免疫NBS1 がテロメア維持に関わっていることは NBS 患者グロブリンの低下や性腺低形成などヒト NBS 患者の臨床の皮膚線維芽細胞の細胞分裂によるテロメア長をサザン法症状を呈すると共に、放射線照射後に体毛が早期に白色化により測定した結果、テロメア短縮が促進される事から明して正常マウスに比較して老化傾向を示した。また、このらかとなった。そこで二重免疫染色法によりテロメアに於マウスから樹立した Nbs マウス細胞は、ヒトマウス細胞

ける NBS1 フォーカス形成を観察した結果、フォーカスはと同程度の放射線感受性を示した。このため、テロメア結細胞周期のＳ期において見られた。また、この時期に一致合蛋白 TRF2 と NBS1 との相互作用を解析した。免疫共してテロメア蛋白 TRF2 と NBS1 が結合していることが沈法及び細胞のフォーカス形成による共局在は NBS1 とIP—ウエスタン法により確認できた。DNA 修復では NBS1

TRF2 は S 期初期に相互作用することを示した。NBS 細蛋白の損傷部位へのリクルートに ATM が関与している胞ではテロメア G-tail が短いことから、NBS1 と TRF2 がので、ATM が欠損している毛細血管拡張性運動失調症細

G-tail の延長とテロメア安定に機能していると思われる。

胞を用いて S 期でのテロメアへの NBS1 蛋白のリクルー

また、Nbs1 マウスと ATM 及び Ku マウスとの交配では、トを検討した。しかしながら、毛細血管拡張性運動失調症

これらの遺伝子のダブルノックアウトマウスは作製出来な細胞でも正常細胞と同様に NBS1 は TRF2 と結合が出来、かった。恐らく胚発生の極く初期に致死になると思われる。

またフォーカスが形成されることが判明した。この事から

しかしながら、同時に作成したチキン Nbs1 エクソン 2− 75 −からエクソン 6 に相当する約 5.5kb のゲノム DNA をターる不死化細胞では、S 期初期に G—tail をプライマーにテロゲティングした DT40 細胞は生存しており実験に使用可能メアが延長することが知られている。これと一致して、我々であった。Nbs1 ノックアウト細胞はヒト NBS 細胞と同じの結果は NBS1 が G—tail 形成に重要であること、そしてく生存可能であるが、野性型 DT40 細胞と比較して顕著にNBS1 が TRF2 と S 期初期に複合体を形成することを示し増殖速度が低下していた。また、ヒト NBS 細胞と同様にた。NBS1 のテロメア維持機構は S 期初期に G—tail を延長

自然及び放射線誘発染色体の高頻度の発生と放射線致死高することが示唆されるが、その詳細は不明である。我々感受性を示した。一方、ターゲットインテグレーションをは既に NBS1 が放射線誘発 DNA 二重鎖切断の再結合過指標に相同組換え能を野性型 DT40 細胞と比較した結果、程である相同組換えに必要であることを示しているので、Nbs1 ノックアウト細胞では顕著に相同組換え能が低下し相同組換えに必要な 5'—突出型単鎖 DNA 形成と同様の機ている事が判明した。また姉妹染色分体交換（SCE）は相構による可能性が指摘される。G—tail は染色体末端の T—同組換えによることが知られているが、MMC 誘発の SCE

loop の開環や G カルテットの解消にも関与しているので、頻度はチキン Nbs1 細胞で極端に低下していることが示さ

NBS 細胞におけるこれらの解析が哺乳動物細胞でのテロれた。これらの結果は SC—neo を導入した細胞で、I—Sce1メア維持機構の解明につながると期待される。

制限酵素を細胞内に一時的に発現させて DNA 二重鎖切断

我々が作製した二種類のノックアウトマウスのうち、を発生させて相同組換えをアッセイする実験系とも良く一

Cre—Loxp で Neo 遺伝子を除いたコンストラクトでは胚発致して、Nbs1 ノックアウト細胞では相同組換えが野性型生の極く初期（E3.5 日以前）に致死になった。これに対に比較して 1/100 以下に低下していた。もう一方の DNAして Neo 遺伝子が存在するマウスでは少しでも E7.0 〜 8二重鎖切断の再結合過程である非相同 DNA 末端再結合

日迄生存可能であった。後者では Nbs1 の C 末が発現してを pDVH14 レポーター遺伝子を用いてアッセイした結果、いることが確認されており、C 末側の存在が発生に大きなdirect joining と micro-homology associated joining のい

影響を及ぼすことが確認出来た。チキン Nbs1 ターゲティ

ずれも Nbs 細胞では正常であることが確認された。これ

ング細胞を用いた解析では Nbs1 はエンドジョイニングよは ATM 欠損の AT 細胞で異常な相同組換え能を呈するりも相同組換えの蛋白であることが示された。この点はが、非相同 DNA 末端再結合が正常であることと一致する。

高等真核生物と酵母での機能の大きな違いである。既に４．考

我々は Nbs1 C 末側がヌクレアーゼ活性を有する Mre11/

察

Rad50 との結合に必須であることを示したので、相同組NBS は歴史的に AT のバリアントに分類されてきた。

換えの初期に必要な突出型 1 本鎖 DNA が出来ないことが実際、本研究で示したように放射線損傷の修復に対してNbs1 の相同組換え能や胚発生初期での死に繋がると思わAT と同じ修復経路の欠損を示した。しかしながら、テロれる。従ってテロメア維持に重要な G—tail も同様の一本メア維持に関してはＡＴ細胞でも NBS1 フォーカス形成の鎖 DNA から構成されるので Nbs1 もテロメアの異常短縮、異常が見られない。また、NBS1 の TRF2 や hMre11 へのそして今回示された個体レベルでの老化の原因であると考結合も正常細胞と同様にＳ期前期で観察された。このことえられる。ATM や DNA—PK（Ku70/80）はヒストンのから上述の DNA 損傷と異なって、ATM が NBS1 と同一リン酸化に相補的に作用していることが知られているのでのテロメア維持経路で機能しているとは言い難い。テロメ

そのダブルノックアウトマウスはクロマチン・リモデリン

ア複製の場合には染色体上の定まった位置テロメアで起こグの失敗から致死になると予想される。Nbs1 とのダブルる現象であり、しかもそこには hMre11/Rad50 が細胞周ノックアウトマウスについても他の原因が予想されるので期を通じて結合していることからヒストン H2AX リン酸

今後さらに解析が必要である。

化による蛋白のリクルートが必要でないと思われる。テロ５．総メア維持に於ける魅力的な ATM の機能は、何らかの原因

括でテロメアが短縮した細胞をアポトーシスに誘導する事でNBS1 のテロメア維持における役割を解析した結果、ある。アポトーシス誘導は DNA 損傷応答における ATM

NBS1 蛋白はテロメア結合タンパク TRF2 とテロメア部の重要な機能であり、本研究のＡＴ細胞を使用した実験結位で共局在することが免疫染色法により示された。また、果とも矛盾しない。しかし、ATM の酵母ホモログ TEL1

NBS1 抗体を用いた免疫共沈物のウエスタンブロット解析がテロメア維持で重要な機能をしていると思われている酵は、TRF2 と NBS1 が物理的に結合していることが確認さ母ではアポトーシスが確認されていないことから、さらにれた。この結合は細胞周期依存性で S 期初期のテロメア重要なテロメア維持機能が ATM に存在すると思われる。

が延長する時期と一致した。NBS1 はヌクレアーゼ活性をテロメレース活性のないヒト組織の初代培養細胞は細胞有する Mre11/Rad50 と複合体を形成することから、テロ分裂毎にテロメアが短縮するが、テロメレース活性を有すメレースによるテロメア延長に必要な一本鎖 DNA の G—

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早老性疾患遺伝子による皮膚線維芽細胞の老化とテロメア制御

tail を測定したところ、NBS 細胞では正常細胞に比較して見られない。また、NBS1 の TRF2 や hMre11 への結合も短いことが判明した。一方、Nbs1 のノックアウトマウス

正常細胞と同様にＳ期前期で観察された。このことから上を 2 種類のターゲティングベクターを用いて作製した結述の DNA 損傷と異なって、NBS1 が ATM とは別経路の果、Nbs1 の C 末側が発現した ES 細胞では胎生 7.5 日まテロメア維持機能を有していることが示唆された。

で生存したが、ヌル変異体のマウスでは 3.0 日以前に胚が消失した。Nbs1 のＣ末側発現の変異体からは細胞株樹立（関連論文）が可能で、患者細胞と同様の放射線感受性を示した。また、

１） H. Tauchi, J. Kobayashi, K. Morishima, et al.: Nbs1 isNbs1 の野性型と変異体から構成されるキメラマウスではessential for DNA repair by homologous recombination

免疫不全や性腺低形成、そしてマウス由来細胞は放射線高in higher vertebrate cells. Nature, 420:93-98, 2002

感受性及び染色体不安定性など、ヒト疾患と同様の症状を

２） J. Kobayashi, H. Tauchi, S. Sakamoto, et al.,: NBS1

呈して病態解析に有用であることを示した。一方、チキン

localizes to g-H2AX foci through interaction with theB 細胞由来の DT40 細胞を用いて Nbs1 のターゲティング

FHA/BRCT domain. Curr. Biol., 12:1846-1851, 2002を行った結果、相同組換え能が野性型の 1/100 以下に低下

３） H. Tauchi, S. Matsuura, J. Kobayashi, et al.,:

していることから、ATM 同様に Nbs1 は相同組換え修復

Nijmegen breakage syndrome gene, NBS1, andの蛋白であることが判明した。しかしながら、テロメア維moleculer links to factors for genome stability.

持に関してはＡＴ細胞でも NBS1 フォーカス形成の異常がOncogene, 21: 8967-8980, 2002

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