新規紫外線障害防護剤の開発・評価

九州大学大学院薬学研究院

山 田

健 一

Lipid-derived radicals and peroxides are involved in the pathogenesis of oxidative stress diseases, although lipid
peroxide production is a required reaction between a lipid radical and molecular oxygen, a useful lipid radical detection
method has remained tentative. In this study, the focus was on nitroxide reactivity, which allows spin trapping with carboncentered radicals via radical-radical reactions and fluorophore quenching through interactions with nitroxide’s unpaired
electron. Thus, the aim here was to demonstrate a useful detection method for lipid-derived radicals as well as to clarify theeffects of ketoprrofen induced skin damage using nitroxide. This compound reacted with lipid-derived radicals, resulting influorescence due to alkoxyamine formation, and lipid peroxide concentrations decreased in the reaction system. Furthermore,
nitroxide inhibited lipid peroxide production and skin damage in mouse induced by ketoprofen adition and UV irradiation.
These results suggested that the novel application of profluorescent nitroxide could directly and sensitively detect lipidderived radicals and inhibited the skin damage.

１．緒

そこで本研究では、疾患の原因のひとつとされる脂質由言来ラジカルの検出手法を開発した。さらに、ケトプロフェ

紫外線は、フリーラジカルを産生し、皮膚のシミ・シワや、老化などを引き起こす原因のひとつである。オゾン層ン由来ラジカル中間体の検出とその抑制による疾患の軽減効果を、光過敏症障害モデルを用いて検討した。の破壊により、紫外線量の増大が進む現代、その防御は喫２．実緊の課題である。紫外線により皮膚内で産生したフリーラ験一方、ニトロキシド化合物（＞ N-O 化合物）は、フリーラ

２.１ 蛍光ニトロキシドプローブおよび X-band ESR・蛍光測定

ジカルと鋭敏に反応することから、抗酸化剤や、プラステ

Dansyl Chloride をリード化合物として、TEMPO 系蛍ィックの劣化防止剤として広く用いられている。この作用

光ニトロキシド化合物を合成した。ニトロキシドプロー

ジカルは、連鎖反応により、持続的な皮膚障害をもたらす。

メカニズムは、ラジカル－ラジカル反応を介した連鎖反応

ブ（100 mM）をリノール酸（800 mM）、リポキシゲナーゼの停止であり、このことは紫外線障害に対しても利用可能（0 . 1 mg/ml）と混合し、経時的に ESR 測定を行った。また、と考えられる。

蛍光光度計を用い、励起波長、蛍光波長及び蛍光強度を測一方、近年、蛍光法を用いた検出手法の開発が精力的に定した。

進められ、蛍光プローブは基礎研究に必要不可欠なツールとして高感度、かつリアルタイムな測定を可能としている。

２. ２

LC/MS による反応生成物の解析

蛍光団は不対電子が存在すると電子移動やスピン交換にニトロキシドプローブとリノール酸、リポキシゲナーゼより消光するために、蛍光をほとんど発しない（Fig. 1 A）。

を混合 10 分間後、2 倍量の冷アセトニトリルを加え、30 秒

例えば蛍光団を分子内に持つニトロキシド化合物は、蛍光間ボルテックスにて混和した。10 , 000 g、4℃にて 5 分間遠団を励起したときにニトロキシドと蛍光団との間で電子の心分離し、上清を測定した。また、加熱による変化を検討移動が生じ、蛍光が観察されなくなる。しかしニトロキシするために、反応後ヒートブロックを用いて 100℃で 5 分

ドは、フリーラジカルとラジカル－ラジカル反応にて共有間加熱し、サンプルを作製した。検出器は UV（240 nm）、結合する。その結果、蛍光原子団が消光状態から開放され、

イ オ ン 化 法 は Positive 及 び Negative モ ー ド、 移 動 相 は炭素中心ラジカルの検出が可能になる。

0 . 05 % ギ酸を含むアセトニトリル、流速は 0 . 2 ml/min とした。

２. ３

ケトプロフェン水溶液中で生成されるフリーラジカルの検出
Development and Evaluation of Protective
Agent for UV Irradiation
Ken-ichi Yamada
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Kyushu University

ケ ト プ ロ フ ェ ン は 0 . 1 N NaOH に 溶 解 し 0 . 1 M と し、
0 . 1 M phosphate buffer（PB）containing 100 mM DTPAを用いて希釈した。ケトプロフェンの光照射時に生成するラジカルの検出は、ケトプロフェン（3 mM）、スピント− 40 −

新規紫外線障害防護剤の開発・評価

Fig. 1 蛍光ニトロキシドを用いた脂質ラジカルの検出
A）ニトロキシドのラジカルの存在有無により蛍光の OFF-ON が制御可能 .
B）蛍光ニトロキシドと脂質ラジカルとの反応後の蛍光強度変化 .
C）リノール酸由来ラジカルとの反応後の推定構造 .

ラップ剤 POBN あるいはニトロキシドを混合後、X-bandacid 1 . 5 ml、蒸留水 0 . 6 ml を添加し 100℃の水浴中で 60 分ESR（JES-RE 1 X，JEOL）にて測定した。紫外線照射は間加熱した。加熱終了後、直ちに試験管を氷浴につけ反応

超高圧水銀灯（USHIO Optical Modulex，250 W）を用い溶液を冷却し、蒸留水 1 . 0 ml、n-butanol/pyridine（15 : 1）て、ESR キャビティー内を直接照射した。照射される光は、5 . 0 ml を加え撹拌後、2 , 000 rpm で 25 分間、遠心分離を行シャープカットフィルター（WG 305，駿河精機）を透過さった。遠心分離後、その上清を 532 nm にて吸光度を測定

せ、305 nm 以下の短波長の光はカットした。

した。

２. ４

２. ６

ケトプロフェン塗布および光照射

タンパク質含量の測定

イソフルラン麻酔下で BALB/c マウスの背部の毛をバタ ン パ ク 質 含 量 は Bio-Rad Protein Assay kit を 用リカンで刈り、4 % ケトプロフェン溶液を 200 ml 塗布した。

い Bradford 法 に よ り 測 定 し た。 反 応 で 生 じ た 青 色 溶 液

ケトプロフェンを皮膚に浸透させるためにマウスを暗所の 595 nm における吸光度を測定した。標準物質としてで 1 時間放置した後に、紫外線照射を行った。紫外線照射

Bovine Serum Albumin を用いた。にはブラックライト（TOSHIBA，FL 15 BLB，最大波長352 nm）を三連にして使用した。ライトからの照射光は、

２. ７

組織染色3 mm 厚のガラスを通過させることにより、320 nm 以下の

紫外線照射 24 時間後にマウス背中皮膚を切除し、10 %波長は除去した。紫外線照射量は約 40 J/ ㎠とした。紫外ホルマリンで固定後パラフィン包埋し、H.E. 染色を行った。

線照射 24 時間後、マウスは安楽死させた後、背中皮膚を３．結果、考察切除し液体窒素で急速凍結した後に以下の実験に使用した。

３.１
２. ５

脂質過酸化物測定（TBARs）

炭素中心ラジカルの検出

蛍光ニトロキシドプローブと炭素中心ラジカルとの反応

1）

過酸化脂質量の指標として、Ohkawa らの方法 に従いは、ラジカル消失および蛍光強度変化にて解析した。エ

TBARs 値を測定した。皮膚懸濁液 0 . 2 ml に 8 . 1 % SDS 0.2

マルジョン化させたリノール酸に Dansyl-TEMPO を加え、ml、2 0% acetic acid（pH3.5）1.5ml、0.8% 2 -Thiobarbituric

リポキシゲナーゼ添加 30 秒後から ESR ならびに蛍光強度− 41 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013を経時的に測定した。その結果 Dansyl-TEMPO は、未反

反面、光増感剤として知られるベンゾフェノン骨格を有し応の状態では蛍光をほとんど発しないのに対し、リポキシており、副作用として光線過敏症が報告されている 6）。こゲナーゼ添加後から ESR シグナル強度が減衰し、蛍光強れまでにケトプロフェン光分解経路には、中間体としてケ度は上昇した。未反応のプローブ、還元体では Ex 325 nm、トプロフェン由来のフリーラジカルが存在することが推Em 545 nm を示したのに対し、炭素中心ラジカルとの反応測されている。実際に、フェニル酢酸 7）や、ケトプロフェ後 Ex 335 nm、Em 487 nm へと波長がシフトした（Fig. 1 B）。

ンと類似した構造を持つフェニルプロピオン酸誘導体の

これは炭素中心ラジカルとの反応により蛍光原子団が疎NSAIDs であるナプロキセン 8）が光分解する過程でラジカ水環境に置かれることで短波長シフトしたものと考えられル中間体が生成する。一方、ケトプロフェンにおいてもメる。シフト後の波長にて測定を行うことで、還元体等の影

タノール中で methylviologen のような電子受容体が存在響を低減でき、より炭素中心ラジカルに特異的な解析が可すると電子移動が起こること 9）、ラジカルスカベンジャー能となる。さらに、LC/MS 測定により炭素中心ラジカル（BHA や GSH）の添加によりケトプロフェン分解産物の生と Dansyl-TEMPO の反応産物を検出できたことから（Fig.

成速度が減少すること 9）から、ラジカル中間体の存在が示1 C）、本手法が炭素中心ラジカルの測定に適していること

唆されている。

がわかった。

そこで、ケトプロフェン光分解経路で生成する炭素中リノール酸 / リポキシゲナーゼ系では、リノール酸の 11心ラジカルを検出することを目的とし、スピントラップ位のメチレンからプロトンが引き抜かれ、ペンタジエチル剤を用いて X-band ESR 測定を行った。ケトプロフェン溶ラジカルが生成する。その後、ラジカル連鎖反応により反液に POBN を加え 1 分間紫外線を照射したところ、スピ応は進行し、最終的には 13 - ヒドロペルオキシオクタデカンアダクトが検出され、シミュレーション解析の結果、2ジエン酸（13 -HPODE）を主とするヒドロペルオキシド体種類のラジカル由来の ESR スペクトルであることがわかを生成する。本測定では、リノール酸からプロトンが引きった。また、それぞれの超微細結合定数は、aN= 15 . 39 G、抜かれた炭素中心ラジカルあるいはエポキシ化されたラジabH= 1 . 957 G（POBN-R 1 , 72 %） お よ び、aN= 16 . 26 G、カルを Dansyl-TEMPO が捕捉し、付加生成物が形成されabH= 2 . 447 G（POBN-R 2，28 %） で あ っ た（data notたと考えられる。一方で、炭素中心ラジカルは酸素とも反shown）。

応し、13 -HPODE や二量体、エポキシド体などの脂質過さらに、質量分析装置を用いて、ケトプロフェンラジカ酸化生成物を生成する。炭素中心ラジカルが酸素と反応し、ル中間体とニトロキシドあるいはスピントラップ剤が結合ペルオキシルラジカルを生成する反応速度定数は非常に大した安定化合物の構造推定を行った。その結果、2 種類のきく、メチルラジカルでは 1 . 6 × 109 M- 1 s- 1 である 2）。また、ケトプロフェンラジカル中間体が生成していることがわか

ニトロキシドと炭素中心ラジカルの反応速度定数は 7 . 5 ×った。さらにこの系にリノール酸を添加するとリノール酸

8-1 -13）

10 M s であり 、フルオレスカミン誘導体蛍光ニトロキ
8-1 -12）由来脂質ラジカルが生成し、ニトロキシドと安定に結合すシドでは 7 . 8 × 10 M s との報告 がある。一方、ペルオることもわかった。一方ケトプロフェンを添加しない場合キシルラジカルとの反応における速度定数は 5 . 4 × 105 〜は、リノール酸由来ラジカルは検出できなかった。以上の6-1 -13）5 . 1 × 10 M s と上記と比較してその値は小さい 。加え結果より、光照射によりケトプロフェンラジカル中間体がて、ニトロキシドはペルオキシルラジカルや •NO 2 および生成し、脂質分子と反応し脂質ラジカルが生じることがわ

CO 3 • とは安定なアダクトを形成せず、転位と脱離によりかった。
そこで、実際にケトプロフェン塗布、紫外線照射によりアルコキシルアミン体を生成し、捕捉したラジカルの構造
2 , 4 , 5）

。そのため、Dansyl-TEMPO はペルマウス背中皮膚で過酸化脂質量が増加するか否かについオキシルラジカルとは反応しにくく、反応してもその安定て、紫外線照射 24 時間後における皮膚内 TBARs 値を測定性の問題から構造を特定、検出できなかったと考えられる。

した。その結果、ケトプロフェン塗布 ･ 紫外線照射処置群

以上の結果より、ニトロキシドは炭素中心ラジカルを鋭敏においてのみ、皮膚内 TBARs 値は有意に亢進した。脂質に捕らえ安定化し、質量分析装置を用いることでその構造過酸化反応は、活性酸素種やフリーラジカルが不飽和脂肪推定も可能であることが示された。

酸から水素を引き抜くことで開始され、その後連鎖的に反を維持できない応が進行する。紫外線照射のみを長時間行うと、マウス皮

３. ２ ケトプロフェンラジカル中間体の検出と光線過敏症に対するニトロキシドの抑制効果

膚内の過酸化脂質量が増加するとされているが、本条件でケトプロフェンは NSAIDs の一種であり、経皮製剤としルと反応するニトロキシドおよびスピントラップ剤の皮膚て関節炎や腰痛などの鎮痛、消炎に広く使用されている薬

内過酸化脂質量に与える影響について検討した。その結剤である。しかし、ケトプロフェン経皮製剤は効果が高い

果、紫外線照射 24 時間後における皮膚内 TBARs 値は有意は TBARs 値は上昇しなかった。そこで、炭素中心ラジカ− 42 −

新規紫外線障害防護剤の開発・評価に抑制された（Fig. 2）。一方、ヒドロキシルラジカルスカ

射されると、紅斑、浮腫、サンバーン細胞の生成などを起

ベンジャーは、亢進した TBARs 値を抑制しなかった（dataこすことが報告されている。しかしながら、前述したよう

not shown）。に本研究の実験条件では、vehicle 群に紫外線を照射して紫外線照射 24 時間後にマウスの背中皮膚を切除し組織も皮膚内の脂質過酸化反応亢進、浮腫形成はおこらなかっ染色を行った結果、ケトプロフェン塗布 ･ 紫外線照射群た。さらに、ニトロキシドあるいはスピントラップ剤をケで、角質層の不全角化、表皮の肥厚、細胞間浮腫、液状変

トプロフェンと同時に塗布し紫外線照射すると、照射 24性、さらに表皮内でアポトーシス細胞が認められた（Fig.

時間後の皮膚障害は有意に抑制された。

3）。また、紫外線照射を行っていない群では、これらの所以上の結果から、ケトプロフェン塗布マウスに紫外線を見は確認されなかった。紫外線照射 vehicle 塗布群におい照射するとケトプロフェンの光増感作用による皮膚障害がて一部、軽度の不全角化や表皮肥厚が生じており、紫外線誘発されること、この酸化障害発現は皮膚内で生成される照射単独でも障害を受けている可能性がある。実際に、高フリーラジカル、特にケトプロフェン由来のアルキルラジい障害性を有する UVB だけではなく、UVA でも大量に照カルや脂質ラジカルが関与することが明らかとなった。さらにニトロキシドやスピントラップ剤がケトプロフェン光増感作用による皮膚障害を抑制したことから、光線過敏症を抑制あるいは軽減するのに有用であることが示唆された。

４．総括

本研究では、蛍光ニトロキシドプローブが炭素中心ラジカルと反応することで、蛍光の OFF/ON を制御できることを示した。同時にプローブとの反応生成物の同定を行うことで、炭素中心ラジカルなどの反応中間体の検出が可能であることを示した。一方で、ケトプロフェン紫外線照射
時に、ケトプロフェンラジカル中間体が生成し、その後脂質ラジカルを産生することを見出し、またこれらラジカル
Fig. 2 ケトプロフェン塗布マウス背部での脂質過酸化測定
光照射により有意に脂質過酸化量が亢進し、POBN やニトロキシドの塗布により抑制された .

Fig. 3体の構造推定にも成功した。さらにケトプロフェンをマウスに塗布すると、脂質過酸化、ならびに組織障害が亢進するが、これをニトロキシドの添加により有意に抑制するこ

ケトプロフェン塗布マウス背部での組織染色画像− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol.21, 2013とを示した。以上の結果より、ニトロキシドを用いること

４）Goldstein S, et al., : Structure-activity relationship

で皮膚疾患に関わるラジカル中間体を安定に検出でき、まof cyclic nitroxides as SOD mimics and scavengers of

たラジカル中間体による連鎖反応を抑制し、その後の皮膚

nitrogen dioxide and carbonate radicals. J Phys Chem

障害を軽減できることを見出した。今後、プローブの最適

A, 110 ( 10 ), 3679 - 3685 , 2006 .

化を行うことで、皮膚疾患に関与する炭素中心ラジカルの５）Goldstein S, Samuni A, Russo A, : Reaction of cyclic

検出およびラジカル連鎖反応抑制剤として、新たな化合物

nitroxides with nitrogen dioxide: the intermediacy ofが見出せるものと期待している。

the oxoammonium cations. J Am Chem Soc, 125 ( 27 ),8364 - 8370 , 2003 .

謝辞６）Bosca F, Miranda MA, : Photosensitizing drugs
c o n t a i n i n g t h e b e n z o p h e n o n e c hr o m o p hore. J本研究の遂行にあたりコスメトロジー研究振興財団よりPhotochem Photobiol B, 43 ( 1 ), 1 - 26 , 1998 .

ご援助頂きましたことを深く感謝申し上げます。

７）Epling GA, Lopes A, : Fragmentation Pathways in（引用文献）

Photolysis of Phenylacetic Acid. J Am Chem Soc, 99(8),１）Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K, : Assay for lipid

2700 - 2704 , 1977 .

peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid８）Moore DE, Chappuis PP, : A Comparative-Studyof the Photochemistry of the Non-Steroidal Anti-reaction. Anal Biochem, 95 ( 2 ), 351 - 358 , 1979 .
２）Herbelin SE, Blough NV, : Intramolecular quenching

Inflammatory Drugs, Naproxen, Benoxaprofen andof excited singlet states in a series of fluorescamine-Indomethacin. Photochem Photobiol, 47 ( 2 ), 173 - 180 ,1988 .

derivatized nitroxides. J Phys Chem B, 102 ( 42 ), 8170 -９）Costanzo LL, De Guidi G, Condorelli G, Cambria

8176 , 1998 .
３）Goldstein S, Samuni A, : Kinetics and mechanism ofA, Fama M, : Molecular mechanism of drug

peroxyl radical reactions with nitroxides. J Phys Chem

photosensitization--II. Photohemolysis sensitized byA, 111 ( 6 ), 1066 - 1072 , 2007 .

ketoprofen. Photochem Photobiol, 50 ( 3 ), 359 - 65 , 1989 .

− 44 −