特集

特集

朴：ゲノム編集技術が切り開く精神疾患研究の新時代

813

臨床医にもわかる分子精神医学講座

ゲノム編集技術が切り開く精神疾患研究の新時代
朴秀賢

ゲノムワイド関連解析（GWAS）は精神疾患に関連する一塩基多型（SNP）を多数同定した．
それらの SNP の多くは non cording region や intron に存在しているため，その機能解析にはゲノム上の任意の部位に任意の変異を加えるゲノム編集技術が必要である．しかし，そのようなゲノム編集は非常に困難であったため大多数の SNP は単に疾患との相関が示されたにすぎず，疾患と SNP との因果関係は不明であった．1994 年の二本鎖 DNA 切断による相同組換え促進の発見を契機に，1996 年に zinc finger nuclease（ZFN）を用いた初めてのゲノム編集技術が開発された．しかし，DNA 認識様式の問題のために ZFN の発展・普及は進まなかった．ところが，2010年に ZFN の欠点を解消した TAL effector nuclease（TALEN）が開発され数年のうちに普及した．さらに，RNA 誘導型ヌクレアーゼを用いた CRISPR/Cas9 が 2012 年に開発されたことによりゲノム編集技術が短期間に爆発的に進歩・普及し，細胞のみならず個体においてもゲノム上の任意の部位に任意の変異を容易に導入することが可能になり，CRISPR/Cas9 を用いた研究は世界の一流誌に多数掲載されている．そのため，精神疾患の生物学的研究を行っていくうえで
CRISPR/Cas9 の知識は今後必須である．本稿では世界の一流誌の重要論文を理解するために必要なゲノム編集技術の基礎知識について CRISPR/Cas9 を中心に解説すると同時に，すでにGWAS により同定されている精神疾患と相関する SNP の機能解析への応用などゲノム編集技術が精神疾患研究に与える新たな可能性について論じる．
＜索引用語：GWAS，ゲノム DNA 変異，相同組換え，ゲノム編集，CRISPR/Cas9＞

は じ め に

CNV などが今後新たに次々と発見されることが近年の技術の進歩により，精神疾患の病態研究期待される．また，ゲノム DNA 変異に加えて，は大きく発展している．まずヒト血液由来のゲノ

精神疾患と関連するエピジェネティックな状態

ム DNA を用いたゲノムワイド関連解析（genome（DNA メチル化とヒストン修飾）の変化も次々とwide association study：GWAS）により，精神疾同定されてきている．しかし，これらの研究は，患に関連する一塩基多型（single nucleotide poly-

単にそれぞれのゲノム DNA 変異やエピジェネ

morphism：SNP）や大きなコピー数多型（copy

ティックな変化と精神疾患の相関関係を示したに

number variation：CNV）が多数同定された．続すぎず，それらのゲノム DNA 変異やエピジェネいて，次世代シークエンサー（next generation

ティックな状態の変化が実際に精神疾患の病態生

sequencing：NGS）を用いた全ゲノムシークエン

理においてどのような機能的役割を有しているのスや全エクソンシークエンスにより，精神疾患にかはまったく不明である．したがって，すでに得関 連 す る SNP や CNV 以 外 の タ イ プ の ゲ ノ ムられているゲノム DNA 変異やエピジェネティッ

DNA 変 異 や GWAS で は 検 出 で き な い 小 さ なクスに関する多くの知見を基に精神疾患の病態研

著者所属：神戸大学大学院医学研究科精神医学分野

精 神 経 誌（2018）120 巻 9 号

814

究をより発展させるためには，実際に動物モデルマウスと KO マウスの作製方法について述べる5,6）．

においてそれらのゲノム DNA 変異やエピジェネ

Tg マウスは，目的遺伝子を強制的に発現させティックな変化を再現させたときに生じる表現型ることにより，目的遺伝子の機能を解析するためを検討することが不可欠である．に使用されるものである．作製においては，目的ゲノム DNA 変異の生体での実際の機能を調べ遺伝子の cDNA を含む外来遺伝子を作製し，それるためには，遺伝子改変マウスの作製が不可欠でをマウスの受精卵にマイクロインジェクションすある．しかし，従来の遺伝子改変マウスの作製方る．マイクロインジェクションされた外来遺伝子法では，目的の変異を導入するためのベクター作は一定の確率で受精卵のゲノムに組み込まれる．

製に多大な労力と時間を要するうえに，受精卵やこの外来遺伝子のゲノム DNA への組み込みが生

ES 細胞への目的の変異導入効率は非常に低い．

じる確率は決して高くない．また，組み込まれる

そのため，遺伝子改変マウスの作製には多大な労外来遺伝子のコピー数は受精卵によって異なるう

力と時間，費用を要し，遺伝子改変マウスを用いえに，組み込みはランダムに色々な部位で生じた研究の大きな障壁となってきた．また，エピる．そのため，組み込まれても目的通りの適切なジェネティックな変化の遺伝子選択性の分子メカ発現を得られない確率が高く，1 つの外来遺伝子ニズムはいまだに不明であるため，特定のゲノム由来の Tg マウスにつき多数の系統マウス作製と上の領域に任意のエピジェネティックな状態の変スクリーニングが必要であり，作製においては多化を誘導することは従来の技術では不可能であっ大な費用と労力，時間を要する．外来遺伝子のゲた．したがって，ヒト血液由来ゲノム DNA を用ノム DNA への組み込みの確率の向上を目的としいた研究により同定された精神疾患に関連するゲたレトロウイルスベクターを用いる Tg マウス作

ノム DNA 変異やエピジェネティックな状態の変製方法もあるが，組み込まれる目的遺伝子のコ化の機能解析を行うためには，容易にゲノムを編ピー数や挿入部位の多様さは変わらないため，根集する技術の開発が不可欠である．

本的には外来遺伝子のマイクロインジェクション

本稿では，従来の遺伝子改変マウス作製方法のと同じ問題を有している．

概要と問題点について述べたうえで，その問題点

KO マウスは，目的遺伝子の発現を強制的に欠を克服すべく開発された新規ゲノム編集技術につ失させることにより，目的遺伝子の機能を解析すいて，今最も注目されている CRISPR/Cas9 を中るために使用されるものである．作製において心に紹介する．加えて，そのようなゲノム編集技は，目的遺伝子の配列全体もしくはエクソンの一術が可能にする精神疾患の病態研究の新展開につ部を薬剤耐性遺伝子に置き換えるために作製されいて解説を行いたい．

たターゲッティングベクターを ES 細胞に導入し，抗生物質で選択することにより，ゲノム DNA

Ⅰ．従来の遺伝子改変マウス作製方法の上の目的遺伝子を含む領域で相同組換え（Homol-概要と問題点

ogous Recombination Repair：HRR）が生じた ES

遺伝子改変マウスは，作製方法の違いにより，細胞を同定する．その HRR が生じた ES 細胞をマトランスジェニックマウス（Tg マウス）と遺伝ウスの胚盤胞胚に注入し，偽妊娠させた仮親の子子ターゲッティングマウスに大別される．遺伝子宮に移植することで，生殖系列キメラマウス（生ターゲッティングマウスには目的遺伝子を欠失さ殖細胞が ES 細胞由来）を得ることができる．こせるノックアウトマウス（KO マウス）とゲノムの生殖系列キメラマウスを野生型マウスと掛け合上の特定の領域に目的の配列を挿入するノックイわせることでヘテロマウス（相同染色体の一方のンマウスがあるが，作製方法の原理は KO マウス

みで HRR が生じている）が得られ，ヘテロマウとノックインマウスで同じである．以下では Tgス同士を掛け合わせることで，KO マウスが得ら特集朴：ゲノム編集技術が切り開く精神疾患研究の新時代

815

れる．このような KO マウスの作製過程においつとしてよく知られている．自然に HRR が生じて，ターゲッティングベクターの作製と HRR がる可能性は低いため，HRR の確率を上げるために生じた ES 細胞の選択・単離にはかなりの労力とは，ゲノム DNA に何らかの損傷を加える必要が時間を要するうえに，HRR が生じる確率はかなりある．1994 年に二本鎖 DNA 切断が HRR を促進低い．さらに，生殖系列キメラマウスの作製にはすることが見出された．また，固有の配列を認識まさに職人芸といえる特殊技術が必要であるうえ

して二本鎖 DNA を切断する酵素として，制限酵に，生殖細胞がうまく注入した ES 細胞由来にな素（ヌクレアーゼ）の存在は広く知られており，る確率は低い．したがって，KO マウスの作製技遺伝子工学の重要なツールとして汎用されてい術は確立しているものの，実際に作製するにはかる．これらのことから，ゲノム DNA 上の目的のなりの労力と時間，そして費用を要するのが現状領域をヌクレアーゼで切断することにより，目的である．の領域における HRR の確率を上げ，より容易にゲノム DNA を編集することができるのではない
Ⅱ．ゲノム編集技術への道かと考えられた．また，HRR よりも生じる確率が―CRISPR⊘Cas9 革命前夜―

高い DNA 修復機構として非相同末端結合（Non上述の通り，従来の遺伝子改変マウスの作製にHomologous End Joining：NHEJ）が存在していは多大な労力と時間，費用を要するため，より容る．NHEJ においては，修復の際に数塩基の欠易かつ短時間で安価に作製できる新たな遺伝子改損・挿入が高頻度に生じる．そのため，NHEJ を変マウスの作製方法の開発が求められるように利用すれば，HRR により薬剤耐性遺伝子などに置なった．そのような新規作製法による遺伝子改変換しなくても，目的遺伝子のエクソン内をヌクレマウスの効率的な作製は，技術の発達により次々アーゼにより切断することにより，NHEJ によりに同定されている数々の疾患関連ゲノム DNA 変フレームシフトが生じてストップコドンが高確率異の生体での機能の解明を促進することにより，に産生される結果，HRR を利用した従来の方法よ疾患の病態生理の解明に大きく寄与することが期

りも KO マウスを効率よく得られる可能性が期待待される．

される．

遺伝子改変マウスのなかでも，ゲノム DNA 上

そこで，転写因子由来で特定の DNA 配列を認でランダムに目的遺伝子が組み込まれる Tg マウ

識することができる zinc finger domain（ZF）と，スよりも，ゲノム DNA 上の特定の領域で目的遺認識配列が長く配列特異性が高いヌクレアーゼで伝子を欠損・挿入させることができる遺伝子ターある FokⅠを合体させて作製された人工ヌクレゲッティングマウス（KO マウスとノックインマ

アーゼ zinc finger nuclease（ZFN）が，初めてのウス）の使用が，疾患研究において主流になってゲノム編集技術として 1996 年に開発された4）．こいる．遺伝子ターゲッティングマウスの作製過程の ZFN は革命的な技術であったが，目的の DNAにおける複数の困難さのうち，最も作製効率に影配列を認識する ZF を理論的に設計することが困響を及ぼしているのは，HRR が生じる確率の低さ難であるため，目的の DNA 配列を認識する ZF をである．そこで，より効率のよい遺伝子ターゲッ選択するために ZF ライブラリーを用いたスクティングマウスを作製するためには，HRR の確率リーニングが必要であり，このスクリーニングにを上げるか，より生じる確率の高い別の DNA 修はかなりの労力と時間を要した．そのため，遺伝復機構を利用する必要がある．

子改変マウス作製への応用にはかなり時間を要

DNA の塩基配列が互いに類似した部位（相同し，結局普及せず，ゲノム編集技術は沈滞していた．

部位）で生じる組換えである HRR は，放射線やこのように ZFN の技術的限界のために沈滞し化学物質により損傷された DNA の修復機構の 1ていたゲノム編集技術の再発展のきっかけとなっ精 神 経 誌（2018）120 巻 9 号

816

たのが，2010 年に開発された TAL effector nucle-であったが，CRISPR 配列の近傍に細菌間で保存ase（TALEN）である ．TALEN は ZFN と同様された遺伝子クラスター（CRISPR associated：にヌクレアーゼとして FokⅠを用いているが，Cas）の存在が明らかとなり，Cas ファミリー遺伝1）

DNA 認識には ZF ではなく TAL effector を用い子として 45 個の遺伝子が同定された．これら 45ている．TAL effector というのは，植物病原細菌個の遺伝子のなかには，配列情報からヌクレアーのキサントモナス属由来の転写因子様蛋白であゼ活性を有しているのではないかと予測されるもる．その大きな特徴としては，TAL effector ののが多く含まれていた．さらに，CRISPR 配列同DNA の認識部位がモジュール構造を有しており，士の間には，バクテリオファージやプラスミドの認識させたい目的の DNA 配列に応じてモジュー配列が多数含まれていることが明らかとなり，

ルを組み合わせることにより，多少手間は要する

CRISPR は細菌の獲得免疫に関与しているのではものの，ZFN よりもはるかに容易かつ理論的にないかと推測されるようになった．これらの推測

DNA 認識部位を設計・作製することが可能にに基づいて多くの研究がなされた結果，最終的になった．このため，TALEN の技術開発やその応は，CRISPR/Cas は，細菌においてファージやプ用は短期間のうちに発展したが，DNA 認識を蛋ラスミドなどによる外来遺伝子の侵入を排除する白質が担っているため，モジュールの組み立てに獲得免疫機構であり，これらの外来遺伝子を分解労力と時間を要していた．

するために Cas ファミリー遺伝子の多くがヌクレアーゼをコードしており，ヌクレアーゼ活性を有Ⅲ．CRISPR⊘Cas9

する Cas ファミリー遺伝子のなかで最も重要な遺―ゲノム編集技術の革命児―

伝子が RNA 誘導型ヌクレアーゼ Cas9 であること

TALEN の技術開発や応用が発展しつつあったが示された．

2012 年，まったく異なる原理に基づくゲノム編集

こ れ ら の 知 見 を も と に，2012 年 に Doudna,技術である CRISPR/Cas9 が開発された．TALENJ. A.と Charpentier, E.らは，CRISPR と Cas9 をうと CRISPR/Cas9 の最大の違いは，前者は DNA 認

まく利用し，目的のゲノム DNA 上の部位に対応識を蛋白質が担っているのに対し，後者は DNA

した短い DNA 配列と CRISPR に由来する DNA認識を短い RNA が担っていることである．その配列から構成される guide RNA（gRNA）と Cas9

ため，CRISPR/Cas9 においては認識させたい目遺伝子を細胞に同時に導入することで，目的のゲ的の配列に対応したオリゴ DNA を合成するだけ

ノム DNA 上の部位に結合した gRNA に強制発現

で目的の部位にヌクレアーゼを誘導可能であり，された Cas9 を誘導し，目的の部位を切断するこTALEN で TAL effector のモジュールを組み立てとにより，目的遺伝子の発現を抑制することに成ることに比べるとはるかに簡便である．そのため功した3）．CRISPR/Cas9 においては細胞に核酸をCRISPR/Cas9 は驚異的な速さで普及し，関連す導入するだけでよく，gRNA の部位特異性は 20 塩る技術の開発も爆発的に発展し，ゲノム編集技術基程度の短い配列で決まるため設計も容易であに大きな革命をもたらした．

り，とくに KO マウスを作製する場合には HRR よ九州大学の石野良純らによって行われた大腸菌りも生じる頻度が高い NHEJ を利用できる．加えの遺伝子解読により，Clustered Regularly Inter-て，ES 細胞の培養や相同組換え体の単離，キメラspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）とマウスの作製など，KO マウスの作製において非いう，謎の繰り返し配列が大腸菌のゲノム DNA

常に労力と時間を要する過程がすべて不要となに存在していることが 1987 年に見出された ．続り，単に核酸を受精卵に導入して仮親に戻すだけいて，CRISPR はさまざまな細菌に広く存在してである．このため，CRISPR/Cas9 による KO マウいることが示された．CRISPR の機能は長年不明

ス作製が容易となり，1 ヵ月程度という短期間で2）

特集

朴：ゲノム編集技術が切り開く精神疾患研究の新時代

817

特殊技術を必要とせず誰でも気軽に KO マウスを

ム DNA 変異の生体での機能解析を自ら行うこと作製できるようになった．ノックインマウスの作が可能になったと考えられる．このような精神疾製には HRR を利用するため，CRISPR/Cas9 を用患に関連するゲノム DNA 変異の生体での機能解いても作製効率は KO マウスに比べると低くなっ析がより迅速に広範囲に行われることにより，精てしまう．それでも，KO マウスの場合と同様に，神疾患の病態解明が爆発的に発展することが大いES 細胞の培養や相同組換え体の単離，キメラマに期待される．

ウスの作製など，KO マウスの作製において労力遺伝子ターゲッティング動物の作製に際し，従と時間を要する過程がすべて不要となるため，従来の方法では ES 細胞が必要不可欠であるため，来よりもはるかに効率が向上している．

ES 細胞の培養系が樹立されているマウスでのみ

このように，CRISPR/Cas9 は簡便なゲノム編遺伝子ターゲッティング動物の作製が可能であっ集技術により遺伝子ターゲッティングマウスを容た．しかし，マウスで施行可能な行動テストが限易かつ迅速作製することを可能にしたため，爆発られているため，精神疾患研究のモデル動物とし的に普及し，関連技術がもの凄い勢いで発展してては，施行可能な行動テストが多く中枢神経系研いる．加えて，必要なベクター類の多くは Add-

究で汎用されているラットや，マーモセットなどgene にて安価で入手可能であるのも大きな魅力の よ り ヒ ト に 近 い 哺 乳 類 が よ り 適 し て い る．

である．CRISPR/Cas9 は今後ゲノム編集技術のCRISPR/Cas9 による遺伝子ターゲッティング動中核としてさらに発展していくことが期待される．

物作製には ES 細胞は不要であるため，ラットやマーモセットなどより精神疾患のモデル動物としⅣ．CRISPR⊘Cas9 が切り開くて適している動物で遺伝子ターゲッティング動物

精神疾患研究の新時代を作製することが可能になった．マウスで施行不CRISPR/Cas9 の部位特異性は 20 塩基程度の短能であった行動テストを遺伝子ターゲッティング

い配列により規定されているため DNA 認識に必ラット・マーモセットで施行することにより，遺要な gRNA の設計が非常に容易である．また，伝子変異が行動に及ぼす作用への理解が深まるこ

CRISPR/Cas9 を用いた遺伝子ターゲッティングとが大いに期待される．

マウス作製においては，非常に労力と時間を要す

近年，ゲノム DNA の変異に加えて，精神疾患る ES 細胞やキメラマウスの作製が不要で，受精に関連する DNA メチル化やヒストン修飾などの卵に gRNA と Cas9 の配列を組み込んだベクター

エピジェネティックな変化が数多く同定されつつを直接注入するだけで目的の変異体を高確率で得ある．エピジェネティックな変化の部位特異性のることが可能である．必要なプラスミドの入手も分子メカニズムはいまだに不明であるため，この容易で安価であり，プラスミドの作製は非常に簡ような精神疾患に関連するエピジェネティックな単である．そのため，専門家以外の研究者でも，変化を動物で再現することが従来は不可能であっ遺伝子ターゲッティングマウスの作製を 1 ヵ月程た．しかし，Cas9 と DNA メチルトランスフェ度という極めて短期間のうちに容易に行うことがラーゼ，ヒストンアセチラーゼ，ヒストンメチ可能になった．従来の作製方法による遺伝子ターラーゼを融合させた遺伝子を強制発現させること

ゲッティングマウスの作製は，遺伝子ターゲッに よ り，gRNA に よ り 誘 導 し た 目 的 の 部 位 でティングマウスの作製経験が乏しい精神科医およDNA メチル化，ヒストンアセチル化，ヒストン

び精神疾患の研究者にとってかなり敷居の高いもメチル化などのエピジェネティックな変化を誘導のであった．しかし，CRISPR/Cas9 によりその敷することが可能になった．今後，Cas9 エピジェ

居がかなり低くなり，以前に比べ気軽にヒトサンネティック関連蛋白複合体と gRNA を組み込ん

プルを用いて同定された精神疾患に関連するゲノだウイルスベクターを精神疾患への関与が指摘さ精 神 経 誌（2018）120 巻 9 号

818

れている脳内領域に局所注入することにより，精者すべてが CRISPR/Cas9 についての正しい知識

神疾患に関連するエピジェネティックな変化の生を学び，今後の研究に活かしていく必要がある．

体での機能解析が可能になることが大いに期待さ本稿が CRISPR/Cas9 について学ぶきっかけになれる．

れば幸いである．
お わ り に

なお，本論文に関連して開示すべき利益相反はない．

今までの精神疾患研究の主流は臨床サンプルを文用いたゲノム解析であり，精神疾患に関連するゲノム DNA 変異やエピジェネティックな変化が多数同定されてきた．しかし，臨床サンプルを用いた研究は所詮相関をみているにすぎない．そのよ

献1）Christian, M., Cermak, T., Doyle, E. L., et al.：Targeting DNA double strand breaks with TAL effector
nucleases. Genetics, 186；757 761, 2010
2）Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., et al.：

うな研究により同定されたゲノム DNA 変異やエ

Nucleotide sequences of the iap gene, responsible for

ピジェネティックな変化が精神疾患の病態においalkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichiaて実際に何らかの機能を担っているのか否かは，

coli, and identification of the gene product. J Bacteriol,

遺伝子改変マウス作製の敷居が精神科医や精神疾患の研究者にとってかなり高く，マウスよりも精神疾患研究のモデル動物として適しているラットやマーモセットで遺伝子改変動物を作製できないため，まったく不明であった．革命的なゲノム編集技術である CRISPR/Cas9 は，遺伝子改変動物の作製の敷居を大きく下げたうえにラットやマーモセットでの遺伝子改変動物作製を可能にすることにより，精神疾患に関連するゲノム DNA を変異やエピジェネティックな変化の機能的意義の解明を促進し，精神疾患研究を大きく発展させることが期待される．そのため，精神疾患研究を志す

169；5429 5433, 1987
3）Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., et al.：A programmable dual RNA guided DNA endonuclease inadaptive bacterial immunity. Science, 337；816 821, 2012
4）Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S.：Hybridrestriction enzymes：Zinc finger fusions to FokⅠcleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A, 93；1156 1160,1996
5）鈴木操：トランスジェニックマウス作製技術．

日薬理誌，129；325 329，2007
6）竹田直樹：相同組換え法による遺伝子破壊マウス作製技術．日薬理誌，129；330 336，2007

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

特集

朴：ゲノム編集技術が切り開く精神疾患研究の新時代

819

Genome Editing Technology Opens up a New Era of Researchon Psychiatric Disorders

Shuken BOKU

Genome wide association studies（GWAS）have identified many single nucleotide polymorphisms（SNPs）associated with psychiatric disorders. Such GWAS have revealed correlations
between SNPs and psychiatric disorders, but not causal association between SNPs and psychiatric disorders. In addition, it was previously impossible to intentionally edit the genome toreconstruct such SNPs in animal models because of technical limitations. Therefore, it remains
unclear whether the identified SNPs associated with psychiatric disorders function in thepathophysiology of psychiatric disorders.
In 1996, zinc finger nucleases（ZFNs）were developed as the first genome editing technology based on the stimulatory effects of DNA double stranded breaks on homologous recombination repair. However, ZFNs were not widely used because of the technical difficulty indesigning DNA recognition sites corresponding to targeted sequences. In 2010, TAL effector
nucleases（TALEN）were developed as an alternate genome editing technology which overcame the problem with ZFNs described above. Although TALEN became widely used for afew years, CRISPR/Cas9, a revolutionary genome editing technology entirely different fromZFNs and TALEN, was developed in 2012. It quickly replaced TALEN and has become themost common genome editing technology. CRISPR/Cas9 will greatly advance studies on psychiatric disorders because it facilitates the production of genetically engineered animals.
This review first provides a history of the development and basic knowledge of genome
editing technologies focusing on CRISPR/Cas9. Next, this review discusses the expected roles
for CRISPR/Cas9 in future studies on psychiatric disorders.
＜Authorʼs abstract＞＜Keywords：GWAS, genomic variation, homologous recombination repair, genome editing,
CRISPR/Cas9＞