高分子ナノゲル粒子の短距離秩序に基づく色彩の研究
九州大学大学院工学研究院化学工学部門

三浦佳子

Synthetic polymer nanogels were investigated in view of structural color component and molecular recognition units.
Synthetic nanogels with molecular recognition ability were prepared by addition of acrylamide derivative of sugar ligand.
The polymer nanogel showed the blue color based on the short distance order. The structural color was changed by raising
the temperature and molecular recognition of specific proteins.

1. 緒

れを利用したバイオセンサーの開発も含めて検討した。ま言た、癌関連タンパク質である、細胞成長因子に対して結合色彩は生活の上で欠かせないものであり、鮮やかな色彩する、ナノゲル粒子についても新たに調製を行った。

は古代以来人類の興味の一つであった。色彩をどのように発現させるかは化合物の探索も含めて長い間研究されてきた。色を出す素材、色素については有機化合物、無機化合物、2. 方法

2. 1. ヒドロゲルナノ粒子の合成

7）錯体など多くの化合物の研究が行われてきた。また、近年

N- イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）、ビスア

ではナノテクノロジーについても、光学技術の一つとしてクリルアミド（BIS）、開始剤（V-501）を加えて重合を行っ注目されている。有機化合物でも無機化合物でも、色素化た。界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）合物は特殊な電子バンドを有していることが多く、望んだを用いて重合系に加えた。多くの高分子の組成としては、色を発現させようとする研究には多くの困難が伴う。また、

NIPAAm 95%、BIS 5%、SDS を用いた。ナノゲル粒子の色素化合物は特殊な電子系を満足することが最重要である

粒径は SDS の濃度に大きく依存しており、SDS を減らしため、生体毒性が強い化合物であることがしばしばである。

た系についても検討した。ナノゲル粒子の直径は、動的光化合物の電子特性に依存せずに色彩を発現させる方法

散乱（DLS、マルバーン社、ゼータサイザーナノ）を用いてとして、物質の構造特性を利用した、“構造色” の利用が考えられる測定した。
また、生体分子認識製のモノマーとしては、生理活性糖1, 2）。構造色では、物質の周期構造に基づく光の干渉を利用しているため、特殊な電子構造を必要としない。

を持つアクリルアミドを用いた（Figure 1）。糖鎖を側鎖に周期構造を持つ分子には種々の有機、無機化合物があるが、持つアクリルアミドについては、過去の文献と同じ方法で均一な構造が必要とされている。私の研究グループでは、調製を行った。生体分子である糖の分子を円滑に行わせる

Poly（N-isopropylacrylamide）
を主体とする高分子ナノゲルために、適宜疎水性のモノマーである、N-tert- ブチルア粒子を各種合成してきている

3,4）。このナノゲル粒子は粒クリルアミドを適宜加えている。例えば、マンノースを含径が均一に調製することが可能であるため、構造色の研究

み、コンカナバリン A と結合する高分子モノマーの組成は、に適切であると予想された。高分子ナノゲル粒子の径を中NIPAAm 63 %、t-BAM 20%、BIS 10 %、アクリル酸（AAc）

心として、構造色を中心とした光学性質の検討を行った。

5%、マンノース 2 ％のモル比とした。タンパク質の分子

高分子ナノゲル粒子では、均一な微細粒子であるばかり認識については、下記に示す構造色センサーで調べるほか、ではなく、その内部が柔軟であることから、タンパク質な水晶発振子（QCM、Affinix Q4 イニシアム）によって測定どの物質を包摂することができる

5,6）。特に、ナノゲル組を行った。

成を選ぶことによって、特異的にタンパク質を認識する。

その外に癌関連のタンパク質を認識するナノゲル粒子に本研究では、タンパク質に対して結合する、ナノゲルとそついても合成を行った。ナノゲル粒子を認識するためのモノマーとして、硫酸基を有するアセチルグルコサミンを加えて、Figure 1 と同様に合成を行った。

Structural Color of Short Distance Orderof Polymer Nanogel
Yoshiko Miura
Department of Chemical Engineering,
Graduate School of Engineering, Kyushu
University

2. 2. ナノゲルを認識要素とした構造色の発現とバイ
3）
オセンサーの開発
Figure 1 に示す、糖鎖認識ナノゲルを用いて、特異的なタンパク質センサーとしての機能を調べた。糖鎖認識ナ− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

Figure 1 分子認識性を持つナノゲル粒子の合成。メインとなるモノマーとして NIPAAm を選び、架橋剤、疎水性部位、電荷、糖を持つ各種のモノマーを加えた。

ノゲルはナノゲルの径からの短距離秩序による構造色の変スに対する in vivo 試験は外注（静岡県立大学、カリフォル化を UV スペクトルによって調べた。また、構造色を補足ニア大学アーバイン校）によって行った。

する機材として、230 nm の微細構造を持つ基盤を用いた。

3. 結

ナノゲル粒子を微細構造基盤にスクシイミド基を介して固定化した。このナノゲルに対して、垂直方向にファイバー果

3. 1. 構造色によるバイオセンシング

式の UV 分光光度計（USB-4000-UV-Vis、オーシャンオプ

Figure 1 に示す組成の分子を用いて、ナノゲル粒子のティクス）によって、スペクトルを測定し、タンパク質の合成を行った。ナノゲル粒子は、PolyNIPAAm を主体と分子認識に伴う構造色の変化を調べた。UV スペクトルはしているため、高温で収縮し、偽沈殿重合によってナノ粒360-800nm まで測定した。また、タンパク質としては標子を形成した。タンパク質認識部位である、糖ユニット（マ的タンパク質としてコンカナバリン A、リファレンスタンンノース）を加えてナノゲル粒子を合成した。

パク質として牛血清アルブミンを用いた。

ナノゲル粒子については、マンノースを有するナノゲ
ルで約 200 nm の直径を持つ粒子を用いた。この粒子を2. 3. PolyNIPAAm ナノゲル粒子による構造色の発現を介して固定化した（Figure 2）。基材は微細孔に基づく色

230 nm の微細構造を持つ基材に対して、スクシイミド基

PolyNIPAAm ナノゲルを 2. 1. にしたがって調製した。

調を発して、500 nm 付近に UV ピークを示した。この基材

ナノゲル粒子で多様な色調を発現させるためには、種々のに対して、タンパク質を付与して、マンノースに特異的に短距離秩序（粒径の大きさ）を実現する必要がある。モノマ結合するコンカナバリンＡ（ConA）を添加したところ、スー濃度、架橋剤、界面活性剤の濃度、種類を変化させてナペクトル強度が減少した。一方で、マンノースと結合しなノゲルの合成を行った。ナノゲルの大きさは 100-2000 nm

い、牛血清アルブミン（BSA）を添加した場合には、UV ピ程度までとした。これに伴う、構造色の発現について検討ークの変化は見られなかった。ピーク強度の変化をタンパした。ナノ粒子の溶液の色は、希薄水溶液のスペクトルをク質の濃度に対してプロットして、Langmuir 式によってUV 分光光度計（cary8453、アジレント）または、ナノゲルフィッティングを行って、結合定数を算出した。タンパク溶液をガラス基板に析出させた上で、ナノファイバー分光質との解離定数（Kd）は 10-6 M オーダーで抗体に匹敵する光度計によっても測定を行った。また、ナノゲル溶液につような強さと特異性を示すことがわかった（Figure 3）。

いては温度を変化させて測定を行った。

このナノゲルを塗布した材料については、自然蒸発を用いて、ナノゲルを集積させたところ、青色のフィルムへと2. 4. ナノゲル粒子によるタンパク質の捕捉と生体材料としての展開8）変化した。ナノゲル自体の構造色と考えられた。一方で、このゲルフィルムに対して、タンパク質溶液を添加したとナノゲル粒子のいくつかは 2. 1. に示すようにタンパクころ、色調は消失した。水自体の添加でも色が消失したた質のリガンドを含んでおり、タンパク質に対して分子認め、ナノゲル構造体の自己組織化が弱いことが考えられた。

識性を示す。in vitro でのタンパク質の分子認識実験は、自己組織体の材料特性を強くするために、ナノゲル集積体

QCM にナノゲル粒子を固定化した上で、タンパク質を定に対して、PEG ジアクリレートを用いて架橋構造を作ら量的に添加して周波数変化を測定し、Langmuir 解析によせることとした。しかしながら、PEG ジアクリレートでって結合定数の解析を行った。また、一部のナノゲル粒子の架橋反応を行うときに色が消失することがわかった。

については、マウスに対する in vivo 試験を行った。マウ− 22 −

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Figure 2 スクシイミド基を介した、ナノゲル粒子の固定化。凹凸基材が構造色を発揮する基板。

Figure 3 ⒜ ナノゲル粒子と構造色を組み合わせた基板によるタンパク質のセンシング。⒝ 構
造色基板のスペクトルの代表例。

3. 2. ヒドロゲル粒子による構造色の発現
ナノゲルの溶液は短距離秩序と散乱光に基づく青色を呈している（Figure 4）。ナノゲルについては、PNIPAAm が温度応答性高分子であることから、33 度付近で疎水性に変化して、収縮する。ナノゲル溶液についても、温度を上昇させると相転移に基づいて、青色の光を呈さなくなった。また、マンノースを有するナノゲルについては濃厚溶液については青白い散乱光を呈しているが、ConA を添加することによって、色調が見られなくなることがわかった。

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Figure 4
ナノゲル粒子溶液

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また、ヒドロゲル粒子の分散液については、分散光が大3. 3. 癌関連タンパク質を認識するナノゲルの開発とセンシングきく影響しているため、輝度とコントラストの改善のため、

3. 1. では、ConA を認識するナノゲル粒子について報告

カーボンブラックを複合したナノ粒子の合成を行った。カした。ナノゲル粒子については、内部に分子認識空間を調ーボンブラック（和光純薬）分散液を調製し、通常のヒドロ製することで、抗体のような分子認識要素として用いるこゲル粒子と同様に PNIPAAm の合成を行った。ヒドロゲとができる。3. 1. では ConA を認識するナノゲルについて

ル粒子については、粒径の分散性（PDI）が大きくなり、明報告したが、ConA は豆由来のタンパク質で一種のモデル確な色を示さなくなった。

タンパク質である。そこで、疾病などに関係する重要なタBSA の添加によっては変化が見られなかった。

ナノゲル分散液の構造色については安定な分散が必要でンパク質を認識するナノゲルの開発を行った。

あることが示唆された。そこで、静電相互作用を導入し

N- アセチルグルコサミンに硫酸基を導入し、アクリルた。正電荷を持つモノマーとして、ジメチルアミノ基を持アミド化したモノマーを各種合成した。硫酸基について位つモノマー（ジメチルプロピルアミノメタクリルアミド置選択的に導入した。その上で、種々の硫酸化糖鎖高分（DMAPM）を加えて重合を行った。DMAPM を含むポリ子ナノゲルを合成した（Figure 5）。硫酸化糖のうち、3、4、マーについては、室温では安定的に青い発色を示した。ナ6 位に硫酸基を導入したナノゲルでは、細胞成長因子であノゲル粒子については、中性（DMAPM、アクリル酸非含る、血管内皮細胞成長因子（VEGF）と結合することがわか有）、イオン性に限らず、ゲル粒子の分散と発色には界面った。他の硫酸化糖（3 位硫酸化、４位硫酸化、６位硫酸活性剤の添加が必要であった。

化のモノ硫酸化の GlcNAc アクリルアミド）を含むナノゲ

ナノゲル粒子については、界面活性剤を 20 mM からルについては、VEGF との結合が弱かった。疎水性のモノ2 µM まで変化させることによって、ナノゲルの粒径を変マーである、TBAm を加えることによって、VEGF の結化させることができた。界面活性剤が多いと 50 nm 程度ま合を最大化することができた。硫酸化糖鎖高分子ナノゲルで小さくなり、µM オーダーまで減らすことによって、ゲについては、濃厚溶液は負電荷の導入によってよく分散し、ル粒子の粒径は 2 µｍ程度まで増大させることができた。

青い色調を呈した。また、温度の上昇や VEGF の添加に一方で、界面活性剤が多くなると径の均一性が失われる。

よって、青い色調は観察されなくなった。3. 1. の構造色基

粒度分布は粒径が 1 µm 以上では、1.5 以上（動的光散乱測板に固定化することで、VEGF のセンサーを開発する予定定による）であった。均一なナノゲル粒子（PDI 1.5 以下）でである。

は、濃厚溶液及び、ガラス基板上で乾燥して調製したナノ

また、VEGF の結合を利用して、癌の阻害効果についてゲル集積体が青色を発色した。バックグラウンドとして、検討した。VEGF は癌細胞による血管新生に深く関わって黒色ガラス（マツナミガラス）を使うと発色性が向上した。

いることが知られている。腫瘍を移植したマウスに対して、硫酸化糖鎖高分子ナノゲルを断続的に投与したところ、癌

Figure 5 VEGF に結合するナノゲル粒子の合成スキーム。左に示す硫酸化グルコサミンのアクリルアミドモノ
マーを含むナノゲル粒子は、VEGF と特異的に結合する。

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高分子ナノゲル粒子の短距離秩序に基づく色彩の研究には向上せず、透析後は構造色が失われた。硫酸化糖をモ腫瘍体積の減少が見られた。

4. 考ノマーとして加えた場合が最も分散性が保たれた。

察

界面活性剤を加えた状態では、構造色を安定的に発現し4. 1. 構造色によるバイオセンシングた。温度を上昇させると、PNIPAm は温度応答性高分子

ナノゲル粒子は分子認識素子としてターゲットに対するであることから収縮して、粒径が変化した。その場合には強い結合と大きな容量を有している。そのため、ナノゲル青色の構造色が鋭敏に失われた。ナノゲル粒子の構造色で粒子を用いて抗体を用いたときと同じようなバイオセンシは、均一な粒子の分散が重要であり、温度変化によって粒ングが可能である。構造色では、規則正しい基材の性質を径の均一性が失われると、構造色が発現されなくなった。

用いて、色を発現させることができた。ナノゲル粒子と構造色基板を用いることで、構造色を用いたバイオセンシングを行った。構造色基板では、規則的な孔間の光干渉によ4. 3. 癌関連タンパク質を認識するナノゲルの開発とセンシング

り構造色を生じる。ナノゲルを固定化しても、規則構造はVEGF や線維芽細胞増殖因子（FGF）などは細胞の成長に失われずに UV スペクトルが強く発現された。ナノゲルの関係するとともに、癌細胞での血管新生による癌細胞の異固定化、タンパク質の添加によって、反射率、規則構造が常増殖に関係することが知られている。そのため、これら低下するため、ピーク位置は 500nm 程度で変化しないもを免疫した抗体医薬が実際に治療に使われている。VEGF、のの、強度が変化した。ナノゲル粒子の分子認識能は抗体

FGF は細胞表面の硫酸化多糖（ヘパリン、ヘパラン硫酸107（M-1）オーダー）ことなど）に結合していることがわかっている。そこで、硫酸から、分子認識素子として適当であった。ナノゲル粒子を化多糖をベースにした、糖モノマーを合成することによ一層固定化することで、ターゲットタンパク質（ConA）をって、ナノゲル粒子の開発を行った。硫酸化度が高いグよく捕捉して高感度にタンパク質を検出することができた。

ルコサミンモノマーに疎水性を適宜加えることによって、ナノゲルをゆっくり乾燥させて積層させた構造を作製す

VEGF を効率的に捉える、ヒドロゲル粒子の合成に成功しることによって、青色の構造色を発する材料を調製するこた。QCM 解析によって、結合力が抗体と同様に高いこととができた。この青色素材はナノゲル粒子の複合体によるを確認した。ナノゲル粒子をマウスに対して投与すること長距離秩序の構造色と散乱光によるものと考えられる。こで、in vivo 試験を行った。ナノゲルが VEGF を捕捉するの積層構造はもろく崩れやすかった。PEG ジアクリレー

ことにより癌細胞の細胞増殖が抑えられることが実際に確

トを架橋剤として加えたが、逆に規則構造が失われたため、かめられた。と匹敵するほど強い（結合定数色調が発揮されなくなった。また、ナノゲルの構造色を発得られた硫酸化糖ナノゲル粒子については、濃厚溶液で揮する積層構造は、種々の刺激による構造体の変化に鋭敏は構造色に基づく青色色調を呈していた。硫酸基によってに反応して色調が変化するため、環境のセンシングには適一定の分散性が保たれ、アミノ基を導入した場合よりも安した性質であると考えられた。

定的に青色色調を呈した。この性質を利用することによって、癌関連の細胞成長因子の色調センシングが可能である

4. 2. ヒドロゲル粒子による構造色の発現ことを示唆した。また、3. 1. で示した構造色基板と組み合ナノゲル粒子の分散液では粒子の短距離秩序をベースとした干渉光と散乱光によって青色に発色した。この青色のわせた構造色センシングを行うことが近々の課題と考えられる。

構造色は分散状態が安定であれば恒常的に色を安定に発現

5. 総する。短距離秩序をベースにするために、より粒径の大き括な粒子も種々調製することができれば種々の色調のナノゲナノゲル粒子を構成要素として構造色を基礎とした検討

ル構造色を実現できると考えられた。しかしながら、各種を行った。ナノゲル粒子としては、NIPAAm を主モノマのナノゲルを調製したが、青色以外は発現させることがでーとして用いた。PNIPAAm は高温では収縮することかきなかった。これは、ナノゲルの大きさをセミミクロオー

ら偽沈殿重合によって各種のナノゲルを均一に合成するこダーから変化させると粒径の均一性（PDI）が低下して、効とができた。界面活性剤存在下で、均一なナノゲル粒子の果的に構造色を発現させることができないためであった。

場合には青色を効率よく発色した。ナノゲル粒子の粒径が、また、構造色の発現については、界面活性剤による安定分子認識（タンパク質の包摂）、温度の上昇などの各種刺激な分散が不可欠だった。重合時には界面活性剤を大量に加によって変化することによって色が消失した。また、ナノえるため、必ず青色色調の構造色を得ることができた。一ゲル自体の開発については順調に進めることができた。モ方で、透析によって界面活性剤を取り除くと青色の色調がノマーの開発によって、ConA, VEGF といったタンパク質失われた。ナノゲル自体にアミンを加えても分散性は完全に特異的に強く結合するナノゲルを開発することができた。

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コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

ナノゲルについては種々の粒径の高分子ゲルの開発を行Environment, Angewante Chemie 2014, 126, 2692-2695.

った。しかし一方で、粒径自体の構造色、短距離秩序に基

4）Hoshino, Y., Ohashi, R., Miura, Y., Rational Design of

づく構造色については色調を制御することは研究期間内でSynthetic Nanoparticles with a Large Reversible Shift

は達成することができなかった。特にナノゲル粒子の分散of Acid Dissociation Constants: Proton Imprinting in性を制御すること、濃厚溶液を調製することが鍵であるとStimuli Responsive Nanogel Particles., Adv. Mat. 2014,考えられた。

26, 3718-3723.

構造色を持つ基板を用いてタンパク質のセンシングを行

5） Hoshino, Y., Nakamoto, M., Miura, Y., Control

った。構造色を容易に発揮する基材を用いることで、ナノof Protein-Binding Kinetics on Synthetic Polymerゲルの持つ分子認識能と構造を生かすことができた。構造Nanoparticles by Tuning Flexibility and Inducing

色を生かすことで鋭敏なバイオセンシングを開発すること

Conformation Changes of Polymer Chains., J. Am.

ができた。

Chem. Soc., 2012, 134, 15209-15212.

今回の研究では、ナノゲルを新しい構造色の要素として

6） Nakamoto, M., Hoshino, Y., Miura, Y., Effect of種々の検討を行った。ナノゲルを構造色の発現には分散性

Physical Properties of Nanogel Particles on the Kineticが大きな鍵になることが示唆された。また、種々の粒径をConstants of Multiple Protein Recognition Process.,

つくることができたが多様な色を発現させることには未だ

Biomacromolecules, 2014, 15, 541-547.
7） Terada, Y., Hashimoto, W., Endo, T., Seto, H.,

検討が必要と考えられた。

Murakami, T., Hisamoto, H., Hoshino, Y., Miura, Y.,（引用文献）

Signal Amplified Two-Dimensional Photonic Crystal
Biosensor Immobilized with Glyco-Nanoparticles., J.

1） 吉岡伸也、木下修一、日本物理学会誌、64、619-623、Mater. Chem. B, 2014, 2, 3324-332.

20092） 木下修一、吉岡伸也、繊維学会誌、59、35-39、2003.

8） Koide, H., Yoshimatsu, K., Hoshino, Y., Lee, S.I.,

3） Yue, M., Hoshino, Y., Ohshiro, Y., Imamura, K.,

Okajima, A., Ariizumi, S., Narita, Y., Yonamine, Y.,

Miura, Y., Temperature-Responsive Microgel Films

Weisman, A. C., Nishimura, Y., Oku, N., Miura, Y., Shea,

as Reversible Carbon Dioxide Absorbents in Wet

K. J., Nature Chem. 2017. Doi:10.1038/nchem.2749.

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