刺激性試験のための元の性質を維持しながら無限分裂するヒト角膜上皮細胞の作成
岩手大学理工学部細胞工学・分子遺伝学研究室

福田智一

The Draize test has been used on rabbits since the 1960 s to evaluate the irritation caused by commercial chemicals
in products such as cosmetics or hairdressings. However, since 2003 , such tests, including the Draize test for cosmetics,
have been prohibited in European countries because they are considered problematic to animal welfare. For this reason,
replacement of in vivo methods with alternative in vitro methods has become an important goal. In this study, we establisheda corneal epithelial cell line co-expressing a mutant cyclin dependent kinase 4 (CDK 4 ), Cyclin D 1 , and telomerase reverse
transcriptase (TERT). The established cell line maintained its original morphology, and had an enhanced proliferation rate.
Furthermore, the cells showed a significant, dose-dependent, decrease in viability in an irritation test using glycolic acid.
These cells can now be shared with toxicology scientists, and should contribute to increasing the reproducibility of chemical
testing in vitro.

1. 緒

性試験の材料として利用できないかと考えた。しかし初代

言

培養細胞は数回の細胞継代の後に細胞分裂を培養ストレス

刺激性を含む化学物質の安全性を評価することは、化粧品および身の回りのシャンプーなどの生活用品を開発する上で重要な項目である。1960 年代より、様々な刺激性
1）のために停止してしまう。無限に細胞分裂できないことは
ヘイフリック限界と呼ばれている 3）。
細胞老化による分裂停止の限界を乗り越えるために様々を評価する方法が考案されてきた 。これらの方法のうち、な方法が従来用いられてきた。具体的には SV 40 ラージ T

ウサギを用いたドレイズ法は事実上の標準手法であった。

やヒトパピローマウィルス由来の E 6 /E 7 遺伝子産物であしかし 2003 年より欧州ではあらゆる化粧品の安全性試験

る。これらの癌遺伝子産物は腫瘍抑制遺伝子である p 53

においてドレイズ法を含む動物実験が禁止されている。こや RB を不活性化することが知られており、無限分裂させれらの動物実験の禁止は動物愛護の観点から実施されたもる方法として最も一般的である 4）。しかしこれらの SV 40のである。したがって眼を用いた動物の刺激性試験を代替

ラージ T や E 6 /E 7 遺伝子の発現は染色体の異常を誘発すする評価法を考案することは科学的および動物愛護の観点

ることが知られている 5 , 6）。

から重要な課題である。

2011 年に新たな無限分裂の方法が報告された。塩見ら

角膜上皮細胞は眼球組織の最も外側に存在する上皮細胞によると R 24 C 変異を持つサイクリン依存性キナーゼ 4であり、外界からの物質の侵入を防御している。刺激性に（CDK 4），サイクリン D 1，テロメア逆転写酵素（TERT）

よって最初に暴露されるのが組織の特性上、角膜上皮細胞の発現によってヒト筋肉由来細胞の無限分裂が可能になっであり、このことから角膜上皮細胞で試験管内刺激性試験た 7）。これらの細胞は分化能力および元の染色体パターンを実施することは必然性がある。この考えのもとに、ウサを維持していた。この方法は導入する遺伝子の末尾の文字

ギの初代角膜上皮細胞を用いて短期暴露法（STE 法）が開から、K 4 DT 法（変異型 CDK 4 , サイクリン D, TERT）と発された 2）。この方法はウサギの角膜上皮細胞へ被験物質

名付けられた。さらに我々の研究チームは新規に作られたを短時間暴露し、細胞死の割合で刺激性を判定する。しかK 4 DT 法がウシ、ブタ 8）、スイギュウ 9）、サル 10）、アメリ

しこれらの細胞であったとしても、ウサギはウサギであり、

カ平原ハタネズミ 11）を含む様々な動物種で適用可能であ人間とは本質的に異なる。このためにウサギの眼のデータることを示した 12）。この幅広い動物で使用可能である原はあくまでヒトの眼のモデルであり限界がある。このこと

理として、導入する CDK 4 およびサイクリン D 1 遺伝子のから我々はヒト由来角膜上皮細胞によって試験管内の刺激

アミノ酸配列が進化の上で高い保存性を持つことが予想された 12）。本研究ではヒト角膜上皮由来の無限分裂細胞がHuman-derived Corneal Epithelial Cells
Expressing Cell Cycle Regulators as a
New Resource for in vitro Ocular Toxicity
Testing

従来の動物を用いた刺激性試験の代換えになると予想される。本研究は毒性研究ならびに動物愛護の見地から見て重要な研究である。

Tomokazu Fukuda
G r a du a t e S c h o o l o f S c i e n c e a ndEngineering, Iwate University− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

2. 方

は LAS 4000 mini で取得した。

法

2 . 1. 細胞およびその培養法

2 . 4 . Population doubling assay

ヒト角膜 上皮細胞は米国 Lifeline Cell Technology 社か

初代および K 4 D, K 4 DT+T 細胞における細胞増殖活性らクラボウ株 式会社を通じて購入した。培養には Lifelineを測定するために、連続的な細胞継代を行った。詳細にはCell Technology 社が提供する基礎培地および増殖因子を各継代開始時に 5 ×104 細胞を 3 つの 35 mm dish へ播種し使用した。細胞の継代には 1 XPBS にて洗浄し、Stem Pro

た。その後、どれかのウェルがコンフルエントになった

Accutase によって細胞を剥離、分散を行った。剥離、分散

時点で全てのウェルの細胞を accutase 処理し、剥離した。

した細胞は 800 G, 5 分間遠心を行い、ペレット化した後に全てのウェルに存在した細胞数を計測した。測定した細胞新しい培地によって再度分散を行った。

数から PDL 値を算出した。PDL=log 2（A/B）の式に基づいた。B は各パッセージの最初に播種した細胞数、A は各

2 . 2 . レンチウィルスの作製および感染

パッセージの終わりに得られた細胞数である。それらの新規に無限分裂するヒト角膜由来上皮細胞を作製するため

PDL 値を累積として計算した。

に組み換えレンチウィルスの作製および濃縮を行った。組み
換えレンチウィルスの基本骨格として理化学研究所バイオリ

2 . 5 . PCR 解析

ソースセンターの三好博士より分与いただいた CSIIレンチウ

初代ヒト角膜上皮細胞、K 4 D および K 4 DT+T 細胞よィルスベクターを用いた。感染効率をモニタリングするために、りゲノム DNA を抽出した。導入した遺伝子内に設定した発現ベクターのオープンリーディングフレームの下流に IRES

プライマー配列もしくは、ヒト由来結節性硬化症原因遺（Internal Ribosomal Entry Sites）および Venus 蛍光タン

伝子（TSC 2）のエクソン内に設定したプライマー配列をコ

パク質を持つ CSII‒CMV‒MCS‒IRES‒Venus ベクターを使ントロールとして使用した。TSC 2 遺伝子はヒトゲノム上用した。CSII‒CMV‒MCS‒IRES‒Venus のマルチプルクロに 2 コピーしか存在せず、類縁した遺伝子が存在しないこーニングサイトへ変異型 CDK 4 およびサイクリン D のタンパと、偽遺伝子が存在しないことが知られていることから内ク質翻訳領域を 2 A自己消化ペプチドで連結したインサート

部コントロールとして使用した。増幅には東洋紡の KOD‒を挿入した。また、CSII‒CMV‒R 24 CCDK 4 および CSII‒

FX および特異的プライマーを用いて増幅を行った。PCRCMV‒CyclinD、そしてCSII‒CMV‒TERT の３種の遺伝子

産物は分子量マーカーとともに 1 % アガロースゲルにて電をモノシストロニックに発現するレンチウィルスを混合した混気泳動し、エチジウムブロマイドによって検出した。

合組み換えウィルス溶液を作製した。ウィルス作製は 293 T
細胞へのリポフェクション法で行い、詳細に関しては我々の

2 . 6 . F‒アクチンの染色13）

過去の研究報告に準拠した 。TERTを発現するレンチウィ

野 生 型、K 4 D お よ び K 4 DT+T 細 胞 を Lab‒Tek チ ャルスはその他の CDK 4 およびサイクリンD1 を発現するレンチ

ンバースライド中に細胞形態を確認するために播種した。

ウィルスと比較して、4 kbと長いインサートサイズを持つため

4 % パラフォルムアルデヒドで固定後、0 . 2 % Triton ×にレンチウイルスのタイターが低くなる。このためにK4 DT 細100 溶液にてパーミアビライズ処理した後に F アクチンを胞へ追加でハイグロマイシン耐性遺伝子を持つTERT発現レ染色するために 1 / 40 希釈したローダミン標識したファロ

トロウィルスを重感染させ、ハイグロマイシン耐性の K 4 DT

イジン染色によって染色した。核染色を 1 / 300 希釈した細胞をK 4 DT+Tと表記した 14）。

DAPI 溶液を用いて行った。観察はキーエンス社の蛍光顕微鏡 BZ 9000 にて実施した。

2 . 3 . ウェスタンブロッティング
野生型、K 4 D および K 4 DT+T 細胞よりタンパク質を

2 . 7. 細胞周期解析

可溶化させるために、我々は 50 mM Tris‒HCl（pH 7 . 4），

細胞周期解析を行うため、おおよそ 4×105 細胞の野生0 . 15 M NaCl, 1 % Triton X‒100 , 2 . 5 mg/mL の デ オ キ シ型、K 4 D および K 4 DT 細胞を 70 % エタノールにて固定しコール酸を含む溶液を使用した。CDK 4 およびサイクリ

た。野生型、K 4 D および K 4 DT について６回分の細胞かン D 1 のタンパク質レベルを検出するために、それぞれにらデータを得た。固定した細胞は Millipore 社の cell cycle

対する特異的抗体を使用した。またコントロールとして抗assay kit を 用 い て 染 色 を 行 っ た。 検 出 は Millipore 社 のtubulin 抗体を用いて検出した。全ての検出において二次Muse Cell Analyzer を用いた。検出結果はノンパラメト

抗体として anti‒mouse IgG もしくは anti‒rabbit IgG を使

リック法の多重比較である Steel 法を用いて有意差を検出用した。詳細な検出条件は過去に我々の研究室から発表し

した。

14）

た論文の内容に準拠した 。検出は化学発光で行い、画像− 146 −

刺激性試験のための元の性質を維持しながら無限分裂するヒト角膜上皮細胞の作成

2 . 8 . 刺激性試験

K 4 DT 細胞においてのみ、TERT 遺伝子の挿入が認めら

高橋らによって開発された短時間暴露法（STE 法）をれた。

用いて試験管内の暴露を行った 。我々はグリコール酸

Figure 2 A に遺伝子導入後の細胞の形態を示す。変異型を陽性対象物質として用いた。初代培養細胞もしくはCDK 4 およびサイクリン D 1、TERT の導入は細胞形態のK 4 DT+T 細胞に関して、0 . 5 % もしくは 5 % のグリコール変化を認めなかった。さらに詳細な細胞骨格の変化の可能

酸を５分間暴露した。PBS を陰性対象として用いた。PBS性を考慮し、細胞骨格の主要要素である F‒ アクチン染色にて２回洗浄後、アキュターゼにて剥離した。剥離した細を行った。結果を Figure 2 B に示す。その結果、野生型角胞をトリパンブルーによって染色、生存細胞数、総細胞数

膜上皮細胞と比較して有意な F アクチンの分布変化は認めを算出した。細胞生存率は総細胞数における生存細胞数にられなかった。

2）

Figure 3 A に 連 続 的 な 細 胞 継 代 を 行 っ た 結 果 を 示

よって算出した。

3. 結す。野生型細胞は継代１回にて細胞増殖を停止した一方、

果

K 4 DT+T 細胞は PD 20 を超える細胞増殖を示した。さら無限分裂するヒト由来角膜上皮細胞を作製するために、に K 4 D 細胞はおおよそ３回目の継代において細胞増殖をポリシストロニックに変異型 CDK 4 およびサイクリン停止した。Figure 3 B に継代１回目の細胞形態の様子を示

D 1 を発現するレンチウィルス（CSII‒CMV‒CDK 4 R 24 C‒

す。野生型はほとんど細胞増殖を停止しているが、K 4 D

Cyclin D‒IRES‒Venus）およびモノシストロニックに発現するおよび K 4 DT+T 細胞は継続的に細胞増殖していることがレンチウィルスの混合溶液（CSII‒CMV‒CDK4 R 24 C, CSII‒わかる。興味深いことに継代３回目において K 4 D 細胞の

CMV‒CyclinD, CSII‒CMV‒TERT）を用いた。Figure 1 A

一部において上皮から間葉系の細胞への形態変化が認めらに導入したレンチウィルスの遺伝子構造を示す。K 4 DT

れた（Figure 3 C and D）。

の混合レンチウィルスを感染させた後に、前述したように

次に継代１回目の細胞において細胞周期に対する

TERT のウィルスのタイターが比較的低いために、ハイ

CDK 4 , サイクリン D 1 および TERT の発現の影響を評価

グロマイシン耐性遺伝子を持つ TERT の発現レトロウィ

した。Figure 4 A, B, C に示すように細胞周期の解析結果

ルスベクターの追加感染を行った。Figure 1 B に PCR 法を示した。G 0 /G 1 , G 2 /M, S 期の細胞を異なる色で示した。

によるゲノム状の TERT の挿入遺伝子の検出結果を示す。

K 4 D および K 4 DT 細胞において G 2 /M 期の細胞割合の増加と G 0 /G 1 期の細胞の統計学的に有意な減少が野生型細Figure 1 Schematic representation of the different expression vectors used inthis study, and confirmation of genomic integration and protein expression.
（A）
Structure of the expression vectors used to establish the K4D and K4DT+T
cell lines. LTR; long terminal repeat, CMV; cytomegalovirus promoter, Hygro;
Hygromycin resistant gene.（B）Confirmation of the genomic integration of
the TERT expression cassette by PCR: 1; primary cells, 2; K4D cells, 3;
K4DT+T cells. The upper panel shows the specific 500 bp PCR productconfirming the presence of the TERT expression cassette, whereas thelower panel shows the 400 bp PCR product derived from the human
Tuberous Sclerosis Type II gene.（C）Detection of the introduced genes atthe protein level by western blot analysis: 1; primary cells, 2; K4D cells, 3;
K4DT+T cells. Western blots using anti‒CDK4（upper panel）, anti‒Cyclin D（middle panel）, and anti‒tubulin（lower panel）antibodies are shown.

− 147 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

Figure 2 Cell morphology of primary, K4D, and K4DT+T
c ells .（ A ） C ell m o r p h o lo g y u si n g p h a s e c o nt ra s t
microscopy at passage 0.（B）Morphological observationof the cytoskeleton（F–actin）and the nucleus, following
staining with rhodamine–labelled phalloidin and DAPI,
respectively. Left–hand panel, EGFP fluorescence, middle
panel, phalloidin staining, right–hand panel, merged imagesof the phalloidin, DAPI, and EGFP stains.

Figure 3 Cell growth status and morphological observationof primary, K4D, and K4DT+T cells.（A）Cell growth andsequential passaging of primary, K4D, and K4DT+T cell.
Cell growth is represented by the cumulative population
doubling value.（B）Morphological observation at passage
1 in the population doubling assay.（C）Cell morphology of
K4D and K4DT+T cells at passage 3. Upper panels, lower
magnification of K4D（left–hand panels）and K4DT+T cells（right–hand panels）． Lower panels, higher magnificationof K4D cells（left–hand panels）and K4DT+T cell（right–
hand panels）．

− 148 −

刺激性試験のための元の性質を維持しながら無限分裂するヒト角膜上皮細胞の作成

Figure 5 Cell morphology and EGFP expression of K4D
cells at passage 3.（ A）K4D cells at passage 3. Cellmorphology by differential interference contrast microscopy（DIC, left–hand panel）, EGFP fluorescence（EGFP,
middle panel）, and merged images（merge, right panel）．
（B）
High magnification view of K4D cells at passage 3 by DIC（left–hand panel）, EGFP fluorescence（EGFP, middle
panel）, and merged images（right–hand panel）．

る。このことから蛍光強度が低下した間葉系細胞においては細胞内の変異型 CDK 4 およびサイクリン D 1 遺伝子の発現量が上皮様形態の細胞と比較して低いと予想される。間葉系の形態を示す細胞の割合は継代数が増加するにつれ増加した。これらの状況からポリシストリロニックに変異型
CDK 4 およびサイクリン D 1 を発現するヒト角膜上皮細胞
は刺激性試験の代換えとして利用するためには安定性に欠けると判断した。
前述したように高橋らはウサギの角膜上皮細胞を利用して短時間暴露法（STE 法）を開発した。これに従って 0 . 5 %および 5 % グリコール酸を用いて野生型および K 4 DT+T
Figure 4 Cell cycle analysis of primary, K4D, and K4DT
cells.（ A）Cell cycle analysis of primary cells.（ B）Cell
cycle analysis of K4D cells.（ C）Cell cycle analysis of
K4DT+T cells.

細胞へ暴露を行い、STE 法によって評価した。Figure 6 Aに示したように野生型および K 4 DT+T 細胞は 0 . 5 % もし
くは 5 % のグリコール酸によって有意に細胞数が低下した。また暴露後の細胞形態では Figure 6 B に示したように細胞質内の空胞化や核の明瞭化を伴い、細胞の変性を示し胞と比較して認められた。これらの結果からヒト角膜上皮ていた。これらの結果から我々の作製したヒト角膜由来の細胞において変異型 CDK 4 およびサイクリン D 1 の発現に

K 4 DT+T 細胞は化学物質の刺激性を判断する上で有用な

よって細胞増殖および細胞回転が加速されていると結論し試験管内検出系になると考えられた。

た。

4. 考

我々は K 4 D 細胞において継代３回目周辺より間葉系細察胞への形態変化が認められた。我々はこの原因を探るた

本研究において我々は新規ヒト角膜由来の無限分裂上めにまず、細胞形態および下流に位置する蛍光タンパク

皮細胞の作製に成功した。作製には変異型 CDK 4、サイク質の発現量を蛍光顕微鏡にて検出を行った。Figure 5 A お

リン D 1 および TERT を用いた。野生型のヒト角膜上皮細よび B に示すように、上皮形態を維持する細胞においては胞は低密度で播種することで１回の細胞継代にも耐えら

EGFP を強く発現していたが、間葉系の細胞形態を示す細れず、細胞分裂を停止した。しかし K 4 DT+T 細胞は低密胞は比較的蛍光強度が弱かった。EGFP と変異型 CDK 4 お度においてもより強い細胞増殖活性を示した。これらのよびサイクリン D 1 の発現カセットは IRES 配列で繋がれK 4 DT+T 細胞の特性は細胞のハンドリングのしやすさをているため、両者の発現量は高い相関を持つと考えられ示しており、再現性の良い試験結果を得る上で有用な性質− 149 −

コスメトロジー研究報告 Vol.27, 2019

結合部位である 25 番目のアミノ酸に突然変異を保つために p 16 と結合しないために、p 16 による負の制御を受けることがない 12）。結果的に腫瘍抑制遺伝子蛋白 RB の恒常的リン酸化をもたらし、転写因子 E 2 F の遊離、そして下流の遺伝子の活性化をもたらす。変異型 CDK 4 およびサ
イクリン D 1 の発現は細胞周期の加速をもたらすが、染色体末端のテロメア配列の短縮からは逃れることはできない。
この制限を乗り越えるためにテロメア逆転写酵素（TERT）の発現が必要である。我々が作製した K 4 DT+T 細胞はテ
ロメア発現カセットの導入を確認しているので、無限分裂に至っている可能性が高い。
興味深いことにポリシストロニックに変異型 CDK 4 お
よびサイクリン D 1 を発現するレンチウィルスでは、ヒト
角膜上皮細胞の上皮細胞の形態を維持できず、途中から間葉系の細胞形態を示す変化が認められた。これらの細胞形態の変化は原因として 2 つの可能性がある。1 つめはテロ
メラーゼ活性がないためのテロメア長の短縮である。テロ
メア長の短縮のために細胞増殖が阻害された可能性がある。
もうひとつの可能性は TERT が存在しないため、CMV プ
ロモータの活性が低下したことである。詳細な分子メカニ
ズムは明らかではないが、我々は TERT を同時発現した
際に、CMV プロモータによって発現する変異型 CDK 4 お
よびサイクリン D 1 の蛋白質レベルが明らかに上昇する例を経験した。本研究において認められた間葉系細胞の蛍光
Figure 6 Assessment of glycolic acid（0.5% and 5%）as an
irritant in primary and K4DT+T cells using the short time
exposure（STE）method.（ A）Number of primary and
K4DT cells. The data are expressed as the mean, with theerror bars representing the standard error. Two stars
indicates a statistical significance more than 1%.（B）Cell
morphology of PBS treated（control）primary cells（left–
hand panel）, and 5% glycolic acid treated primary cells（right–hand panel）．
（C）Cell morphology of PBS treated
K4DT+T cells（left–hand panel）and 5% glycolic acidtreated K4DT+T cells（right–hand panel）．

蛋白質の量は上皮様形態を示す細胞のものより明らかに低かった。細胞の上皮様形態を維持するためにはより高いレベルの変異型 CDK 4 およびサイクリン D 1 蛋白質を必要とする可能性がある。
我々は新たなヒト角膜由来上皮細胞の作製の後に、刺激性試験を行った。結果を初代および K 4 DT+T 細胞の間で比較を行った。我々は陽性対象としてグリコール酸を選択した。グリコール酸への曝露は有意かつ容量依存的に生存細胞数の低下を引き起こした。我々の研究データは我々が樹立した K 4 DT+T 細胞が化学物質の刺激性試験に使用できる可能性を示している。無限分裂細胞の使用は刺激性試と考えられる。また初代培養細胞の場合は、比較的短期

験の再現性の向上に貢献すると考えられる。

間で細胞増殖活性を失うために繰り返しサンプリングと4. 考

培養を繰り返さなければならない。このことは試験の再察現性において影響する因子である。一方、我々の作製し我々は変異型 CDK 4、サイクリン D 1 およびテロメア逆た無限分裂細胞は世界中の研究者と研究資産として共有転写酵素の導入により、化粧品を含む様々な化学物質や日化できるため、将来的に標準化のための材料として利用

用品の刺激性を評価する試験管内実験系を構築した。本研できる可能性がある。

究は刺激性試験の再現性の向上へ貢献すると考えられる。

細胞が培養ストレスに晒された場合、p 16 を含む老化蛋
白質が蓄積することが知られている 15）。老化蛋白質 p 16

（引用文献）

は CDK 4 ‒ サイクリン D 1 蛋白質複合体に結合し、キナー

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ゼ活性を抑制する。その結果、細胞周期の G 1 /S 期への突

comparison of eye irritation in monkey and rabbits.

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