皮膚老化・がん化を誘発するストレス性刺激を蛍光タンパク質断片の相互作用により検出するシステムの開発
金沢大学医薬保健研究域薬学系遺伝情報制御学研究室

山下克美

Cdc25B is a cell cycle regulator that activates CDK/cyclin complex that leads to mitotic entry. Recently, we found thatCdc25B is degraded by cellular stresses that activate stress-activated MAP kinases p38 and JNK and that such stresses
cell cycle retardation. We also indicated that the Cdc25B degradation is mediated by phosphorylation of Cdc25B by suchbTrCP
kinases followed by ubiquitylation by SCF. We identified that the responsible sequence in Cdc25B for the interaction
bTrCPwith SCF
is in N-terminal 175 amino acids. Using such Cdc25B-derived peptide, we established a fluorescent proteinbased bio-imaging system that enables us to detect the stress-specific interaction between the Cdc25B-peptide and bTrCP1, abTrCP
substrate-recognition component in SCF. For this purpose, we applied the bimolecular fluorescence (BiFC) method. We
made two fusion constructs; N-terminal GFP fragment was fused to N-terminal Cdc25B fragment and N-terminal deletion
construct of bTrCP1 was fused to C-terminal GFP fragment. Such two constructs were further fused to make one artificial
gene. Although such GFP-derived fragments do not emit green fluorescence when they are separated each other, the green
fluorescence can be detected when two GFP-derived fragments were reconstituted through Cdc25B-bTrCP1 interaction thatis induced by cellular stress to phosphorylate Cdc25B. We were not able to detect green fluorescence not only co-transfectionof the Cdc25B-bTrCP1 Bi-FC probe with JNK1 but also after application of non-genotoxic stress, such as anisomycin andNaCl to probe-transfected cells. Furthermore, such stress-derived green fluorescence was detected by flow cytometry-based
methods, where we used a tetracycline-controlled expression cell lines.

１．緒有するようになる。発がん刺激はゲノム不安定性が引き起

言

こされる前に必ず細胞周期制御のかく乱を引き起こすこと

環境中の化学物質の中には細胞に対し毒性を有するものから、細胞周期進行停止にかかわる生体内の反応を検知すが数多く存在する。細胞に対する毒性の中には、細胞膜やることで、遺伝毒性・非遺伝毒性刺激にかかわらずより広微小管等の細胞骨格、さらには細胞内小器官を標的とし損範な発がん性刺激を検出することが可能になる（図１）。

傷を誘発する結果、細胞の機能低下が引き起こされる。こ私達は、細胞周期制御因子の Cdc25A と Cdc25B が非遺のような化学物質に対する一般的な細胞毒性を検出する方伝毒性細胞ストレスにより分解されることを発表した 1）。

法は数多く確立されており、実際の現場で広範に使用されこのうち Cdc25A は遺伝毒性ストレスによっても分解されている。化学物質の細胞毒性のうち重要なもののひとつにることがすでに知られていたため 2, 3）、Cdc25B について分発がん性がある。化学発がん物質のうち、ゲノム DNA を解機構を解析したところ、（１）Cdc25B の特異的なセリン標的とし、遺伝子損傷を誘発する遺伝毒性発がん性物質は、残基が、ストレス応答性 MAP キナーゼである p38 や JNK突然変異ひいては細胞がん化が誘発されることもある。一によりリン酸化されること、（２）そのリン酸化された部

般に、化学物質の有する遺伝毒性発がん性は、突然変異誘位に F-box タンパク質として分類される bTrCP を基質認発活性が有用な指標となるため、遺伝毒性化学物質の発がん性は、エイムステストをはじめとして数多く方法を用いて短期で推定可能である。一方で、これらの簡便な短期遺伝毒性試験で陰性を示すもののなかには長期動物実験で発がん性が検出されるものも多くある。
一般に、直接的、間接的かにかかわらずゲノムの恒常性を脅かす刺激は発がん刺激となりうるため、このような刺激を受けた細胞はがん細胞の特徴であるゲノム不安定性をApplication of BiFC system to detect
cellular stress that induces skin aging
and cancers
Katsumi Yamashita
Laboratory of Cell Biology, Institute ofMedical, Pharmaceutical, and Health
Sciences, Kanazawa University

図 1．化学物質による発がん機構
遺伝毒性化学発がん物質は突然変異を誘発し、非遺伝毒性化学
発がん物質は、細胞内のゲノム以外の成分を標的とすることで細胞機能をかく乱しゲノム不安定性を誘発することが、細胞の発がんにつながる。

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コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

識サブユニットするユビキチン化酵素である SCFbTrCP 4, 5）

スミドを安定的に発現する HeLa 細胞に、上記のプローブがリクルートされ、Cdc25B がユビキチン化されることが遺伝子をテトラサイクリン応答性配列の下流に配したプラ明らかとなった。さらに、このような細胞ストレスにより、スミド DNA を導入して得た。すなわち、プラスミド上に細胞周期停止が引き起こされることが明らかになったため、存在するブラストサイディン耐性遺伝子を利用し、テトラ細胞周期制御因子である Cdc25B の分解を誘発するようなサイクリン誘導性安定発現細胞株を分離した。

細胞ストレスは、発がん刺激となりうることが推測された。
そこで本研究においては、これらの生化学反応を利用して、ストレス刺激特異的な Cdc25B と bTrCP の相互作用を、蛍光タンパク質を利用したバイオイメージングにより検出す

２．３

顕微鏡観察

JNK 及び化学物質処理細胞の蛍光は、キーエンス社のBZ-9000 蛍光顕微鏡を用いて観察した。

るシステムの構築を行った。本研究では、バイオイメージ
ングとして、二分割し蛍光を発する能力を喪失した蛍光タ

２．４Flow Cytometry

ン パ ク 質 断 片 が、 再 構 成 に よ り 再 び 蛍 光 を 発 す る

テトラサイクリン誘導発現細胞を 1 mg/mL のドキシサイ

Bimolecular fluorescence complementation（BiFC）法 6, 7）

クリンで 24 時間処理しプローブタンパク質を発現させたを用いた。

のち、検定化学物質をさらに 24 時間処理した。その後、細２．実
２．
１胞を回収し、Flow cytometer（Becton-Dickinson, FACSCalibur）

験を用いて mKG に由来する緑色蛍光を計測した。

BiFC プローブプラスミドの作成

３．結

Cdc25B は、p38/JNK により安定性に関わるリン酸化を果

S101 および S103 と略記）が含まれる、N- 末端より 175 番

３．
１ プローブ遺伝子と JNK の細胞への一過的発現による BiFC の検出目までの断片を使用した。bTrCP は、bTrCP1 と bTrCP2

図２に、本研究の原理となる細胞ストレスにより活性化のうち bTrCP1 を実験に使用した（Cdc25B のユビキチンさ れ た p38 や JNK に よ り リ ン 酸 化 さ れ た Cdc25B の化能は同程度であった）。bTrCP は、N- 末端側約 200 アミ

SCFbTrCP によるユビキチン化の模式図を示した。即ち、細ノ酸までの領域に SCF 複合体構成に関わる F-box と呼ば胞ストレスによりストレス応答性の JNK や p38 が活性化れる領域を、約 300 アミノ酸より下流の C- 末端側に、基質され、Cdc25B の S101 と S103 がリン酸化される。そのリ認識と結合に関わる WD-domain と呼ばれる領域を有する。

ン酸化が引き金となり、ユビキチン化酵素である SCFbTrCP

本研究では、プローブタンパク質が SCF 複合体に取り込複合体の bTrCP タンパク質が Cdc25B の S101/103 付近にまれ、ユビキチン化されることがないように、N- 末端領結合し、Cdc25B がポリユビキチン化され、プロテアソー域の約 210 アミノ酸を決しつさせた、F-bTrCP1 を用いた。

ムで分解される。

受ける部位である 101 番目と 103 番目のセリン残基（以下、Bi-FC の GFP 蛍光タンパク質としては MBL 社より発売の monomeric Kusabira-Green（mKG）を ベ ー ス と し た、CoralHue® Fluoro-chase Kit を利用した。本キットでは、
mKG の N- 末端側 170 アミノ酸断片（mKGN）と C- 末端側52 アミノ酸断片（mKGC）を使用する。
まず、mKGNの下流にFLAGタグを付加したCdc25B-N175
断片を融合させた mKGN-FLAG-Cdc25B/N175 プラスミドと、F-bTrCP1 の 下 流 に mKGC 融 合 さ せ た F-bTrCP1mKGC プラスミドを作成した。さらに両者を、GGS 配列を 5 個タンデムに結合させた断片をはさんで、N- 末端側にmKGN-FLAG-Cdc25B/N175 を、C- 末 端 側 に F-bTrCP1mKGC を融合させ、mKGN-FLAG-Cdc25B/N175-（GGS）5 F-bTrCP1-mKGC がひとつのペプチドとして発現されるようなプローブプラスミドを作成した。

２．
２細胞への遺伝子導入

細胞への遺伝子導入は、Lipofectamine2000 を用いた 8）。
また、テトラサイクリン誘導発現細胞株は、Tet-on プラ

図 2．細胞周期制御因子 Cdc25B が細胞へのストレスにより分解される機構
細胞がストレスを受けると JNK や p38 のストレス応答性
MAP キナーゼが活性化される。これらのキナーゼにより、
Cdc25B の 101 番目と 103 番目のセリン残基がリン酸化されると、ユビキチン化酵素の SCFβTrCP との相互作用が生じCdc25B がポリユビキチン化され、プロレアソームで分解される。

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図 ３ に は こ れ ら 一 連 の 反 応 過 程 で 起 き る Cdc25B と150 mM とし、その最終濃度が 250 mM になるように添加

bTrCP のストレス誘発性相互作用を利用した BiFC の模式した。そして、薬物処理 24 時間後に蛍光顕微鏡にて BiFC

図 を 示 し た。 ２. 実 験 の 項 に 記 載 さ れ て い る よ う に、出現の有無を検討した。その結果、図５に示されるように、

mKGN-Cdc25B/N175 断片- bTrCP 断片-mKGC というプロアニソマイシン（図では Anisomycin と表記されている）、ーブペプチドを細胞で発現させる。この状態では、mKGNNaCl の場合とも BiFC が観察された。また、プローブ導入と mKGC は遠くの位置にあるため蛍光を発することはな細胞として HeLa 細胞を使用した場合でも同様の結果が得い。ストレスにより JNK が活性化され Cdc25B の S101/103られたため、本プローブの一過的発現により非遺伝毒性化がリン酸化されると、Cdc25B と bTrCP 間に相互作用が起学物質誘発性の、Cdc25B 分解を誘発する細胞ストレスがきるため、結果的に mKGN と mKGC が近接し、これらは検出できるものと判断した。

自発的に再構成される。再構成された mKG は再び蛍光を発するため、プローブ導入細胞が緑色蛍光を発することになる。
まずモデルシステムとして、プローブ遺伝子を Cos7 細

３．３ プローブ遺伝子をテトラサイクリンにより誘導的に発現できる細胞の NaCl 処理による BiFC の検出とFACS 利用した解析胞へ一過的に発現させる際に、同時に JNK（実験では赤これまでの研究で BiFC プローブの有効性が確認された

色蛍光を発する mCherry 遺伝子に JNK1 融合させたもの

ため、次に非遺伝毒性の強さの定量化を試みた。定量化にを 使 用 ）と そ の 活 性 化 遺 伝 子 で あ る MKK7 を 導 入 し、は、BiFC によって生じる緑色蛍光を Flow cytometry によBiFC が生じるか否かについて検討した。その結果、図４り検出することを計画した。細胞への一過的発現ではプロに示されるように、JNK1 発現細胞特異的に BiFC、即ち緑ーブ導入細胞数及び一細胞あたりに導入されるプローブ数

色蛍光が観察され、プローブの有効性が確認された。にばらつきが生じるため、実験ごとに一定の数値が得られない懸念がある。そこで、プローブを安定的に発現する細３．２ プローブ 遺 伝 子を一 過 的に発 現する細 胞のNaCl 処理による BiFC の検出胞の樹立を行った。
Cdc25B 断片及び bTrCP 断片の恒常的発現は、細胞に対JNK を用いたモデルシステムにより BiFC プローブの蛍し毒性を示すことが予想されたため、誘導的に発現できる光出現が確認されたため、次に薬剤処理による BiFC プロ方法を用いた。使用したのはテトラサイクリン誘導発現系ーブの応答を検討した。化学物質としては、JNK や p38 のであり 9, 10）、テトラサイクリン誘導体であり安定なドキシ活性化を誘導することが知られており、私たちの研究でもサイクリン添加によりプローブ発現が誘導される。

1）

Cdc25B 分解効果が確認されているアニソマイシン と、分離された細胞を用いて 250 mM NaCl による BiFC を蛍胃がんの発がんプロモーターとして知られる NaCl を用い光顕微鏡にて観察した。細胞に 5 mg/mL のドキシサイクた 9, 10）。Cos7 細胞へ BiFC プローブを一過的に導入 24 時間

リンを添加し 24 時間後に培地の最終 NaCl 濃度が 250 mM後に、アニソマイシンの場合は 50 ng/mL となるように培となるように NaCl を添加し、24 時間後に BiFC を観察し地へ添加した。NaCl の場合は、培地中の NaCl 濃度を約た。一過的発現ほど強いシグナルではないが蛍光が観察さ

図 3 Cdc25B-βTrCP の相互作用を利用した BiFC
Cdc25B の N- 末端断片と βTrCP の C- 末端断片を、図のように緑色蛍光タンパク質断片 mKGN170 と mKGC52 との融合タンパク質として細胞で発現させる。その細胞へストレスが加わると JNK がリン酸化され βTrCP との相互作用を介して、mKG断片の再構成が起きる結果、細胞から緑色蛍光が発せられる。

図 4 細胞への BiFC プローブの一過性発現による JNK1 誘導性の緑色蛍光の出現
Cos7 細 胞 へ プ ロ ー ブ と と も に Cdc25B を リ ン 酸 化 す る
JNK1 およびその活性化酵素遺伝子の MKK7 を同時に一過的に発現させ、BiFC 効果を観察した。ほとんどの JNK 発現細胞において緑色蛍光が検出され BiFC が生じていることがわかる。

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コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011れた。また、一過的発現の場合とは異なり、顕微鏡の視野価が行われている。一方、突然変異原性を示さないにもか中にあるすべての細胞で蛍光が観察された。次に、Flow

かわらず、動物実験において長期かつ高用量投与により発cytometry 解析を行った。その結果が図６に示されている。

がん性が検出される、非遺伝毒性化学発がん物質が数多く

こ の 実 験 で は、250 mM NaCl 存 在 下、12 時 間、24 時 間、存在する。非遺伝毒性化学発がん物質は、細胞内標的がひ48 時間後に細胞を回収し、Flow cytometry を行った。ド

とつではなく、決まった生物活性を示すわけではないため

キシサイクリン（図では Dox と表示されている）の添加前に、発がん性評価が困難であり、簡便な短期検定法は存在にはシグナルはほとんど検出されないが、ドキシサイクリしないのが現状である。

ン添加によりプローブを発現させただけで強いシグナルが発がんは必ずゲノム異常を伴う。ゲノムを直接の標的と出現することがわかる。これは、プローブ分子間の非特異しない非遺伝毒性発がん物質（刺激）においてもそれは例的な相互作用に由来すると考えられる（考察においてもう外ではないと考えられる。一方、ゲノム異常の初期過程に一度述べる）。一方、NaCl 処理により明らかなシグナルのおいては、細胞周期の亢進や停止が検出される。遺伝毒性増強が見られる。また NaCl 処理によるシグナルは、NaCl 処刺激による細胞周期チェックポイントでは、細胞周期の一理 時 間 と と も に 増 加 傾 向 に あ る こ と が わ か り、Flow

時的な進行停止が誘発される。非遺伝毒性ストレスにおいcytometry により BiFC の検出が可能であることが判明した。ては、ゲノム以外の細胞構成成分に損傷が誘発されると考４．考えられるが、このような非ゲノム性の損傷は細胞機能の低察下を誘発し、一時的な細胞周期進行遅延の原因となる可能

化学物質の遺伝毒性を短期間にかつ簡便に検出する方法は樹立されており、突然変異原性を指標にした発がん性評性がある。
私 達 は、 ま さ に 細 胞 周 期 制 御 因 子 で あ る Cdc25A と

図 5 BiFC プローブの一過性発現による非遺伝毒性化学物質誘発性の緑色蛍光の出現
図 4 と同様に、Cos7 細胞へ BiFC プローブを一過的に導入し、24 時間後にそれぞれの化学物質を加えた。さらに 24 時間後に細胞の蛍光観察を行った。

図 6 BiFC プローブ誘導発現細胞を用いた Flow cytometry による緑色蛍光の検出
BiFC 誘導発現 HeLa 細胞を 5μg/ml のドキソルビシン（Dox）で 24 時間処理し、BiFC プローブの発現を誘導した後、培地の NaCl 濃度が 250 mM になるように加え、さらに細胞を培養した。それぞれの NaCl 処理時間で細胞を回収し Flow cytometry（FACS）解析を行った。

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Cdc25B が非ゲノム損傷性のストレスにより分解され、そ方法は、そのような皮膚ストレスを誘発する非遺伝毒性化のようなストレスは細胞周期遅延を誘発することを明らか学物質を検出する方法となりうることが示された。今後は、にした。従って、このような Cdc25A や Cdc25B 分解を誘

本方法の改良及びこの科学的原理を応用した方法の開発に発するストレスは、非遺伝毒性発がん刺激である可能性がより、皮膚に対し危険な化学物質を排除し、安全性の高いある。

化粧品や添加物が開発されることが期待される。

本研究は、このようなコンセプトの基に、非遺伝毒性発がん刺激を検出する方法の構築を目指したものである。特（引用文献）に、これまでの研究成果として Cdc25B が非遺伝毒性刺激１）Uchida S, Yoshioka K, kizu R, et al,: Stress-bTrCP

によりユビキチン化を受けたのち分解さActivated Mitogen-Activated Protein Kinases c-Jun-れることがわかっていたために、Cdc25B 分解システムを

NH2-Terminal Kinase and p38 Targets Cdc25B for

利用した方法を確立した。

Degradation. Cancer Res. 69, 6438-6444, 2009.

特異的に SCF

非遺伝毒性ストレス検出のために、より簡便な方法とし２）Busino L, Donzelli M, Chiesa M, et al,: Degradation ofてタンパク質相互作用を利用した BiFC 法を応用した。本

Cdc25A by b -TrCP during S phase and in response to

方 法 で は、 ス ト レ ス 依 存 的 な JNK/p38 の 活 性 化 に よ りDNA damage. Nature 426, 87-91, 2003.

Cdc25B と SCF

bTrCP

複合体の bTrCP 分子間で相互作用が起３）Jin J, Shirogane T, Xu L, et al,: SCFb -TRCPlinks

きることを利用し、蛍光タンパク質断片を再会合させる。

Chk1 signaling to degradation of the Cdc25A protein

再会合した断片は自発的に再構成され、蛍光が出現する。

phosphatase. Genes Dev. 17, 3062-3074, 2003.

私たちの結果では、一過性発現系ではストレス刺激に伴４）Latres E, Chiaur D S, Pagano M.: The human F box

う再会合の結果、強い蛍光シグナルが検出されたことから、

protein b -Trcp associates with the Cul1/Skp1 complex

基本原理としては完成されたものと考える。一方、誘導発and regulates the stability of b -catenin. Oncogene 18,

現性安定細胞株を用いた実験では、プローブタンパク質の849-854, 1999.

発現に伴い、かなり強い蛍光の出現が認められた。この細５）Winston J T, Strack P, Beer-Romero P, et al,:b -TRCP

胞では、ストレス刺激に伴い蛍光の増強が認められたため、

The SCF

ストレス検出系としては利用可能であると考えられるが、specifically with phosphorylated destruction motifs

今後より実用的なシステムにしていくためにはプローブのin IkappaBalpha and beta-catenin and stimulates発現に伴う蛍光の抑制が課題である。BiFC ではタンパク

IkappaBalpha ubiquitination in vitro. Genes Dev. 13,

質分子間の非特異的な相互作用はあまり強くないと考えら-ubiquitin ligase complex associates270-283, 1999.

れてきたが、本研究では、プローブ発現自体で高い相互作

６）Hu CD, Chenenov Y, Kerppola TK.: Visualization

用が認められた。この蛍光は、bTrCP との相互作用が極of interactions among bZIP and Rel family proteins

めて低い突然変異型の Cdc25B 断片を使用した場合にも認in living cells using bimolecular fluorescence

められたため、BiFC 系が有する内在的な欠陥である可能

complementation. Mol. Cell 9, 789-798, 2002.

性がある。今後の検討が必要である。

７）Hu CD, Kerppola TK.: Simultaneous visualization

本研究で Flow cytometry を利用した蛍光検出が可能でof multiple protein interactions in living cells usingあることが判明した。Flow cytometry により蛍光強度のmulticolor fluorescence complementation analysis.

定量化が可能になることから、化学物質の非遺伝毒性スト

Nature Biotech. 21, 539-545, 2003.

レスの強度を定量化でき、ひいては発がん強度の定量化も８）Uchida S, Kuma A, Ohtsubo M, et al,: Binding of 14-3-可能となることも期待される。プローブ発現によりバック

3b but not 14-3-3σ controls the cytoplasmic localisation

グラウンド上昇を抑制することができれば、非遺伝毒性発of CDC25B: binding site preferences of 14-3-3 subtypes

がん物質の短期検索法として有用であることが期待できる。

and the subcellular localisation of CDC25B. J. Cell Sci,

５．総117, 3011-3020, 2004.

括９）Ohgaki H, Kato T, Morino K, et al,: Study of皮膚は、化粧品をはじめとする多くの化学物質に恒常的the promoting effect of sodium chloride on gastricに暴露されている。化学物質による皮膚ストレスは皮膚老carcinogenesis by N-methyl-N’-nitorosoguanidine in化や皮膚がんの原因となる。皮膚ストレスを誘発する化学物質は必ずしも突然変異を誘発するわけではない。皮膚細胞の細胞分裂を抑制するような化学物質を簡便かつ迅速に

inbred Wister rats. Gann 75, 1053-1057, 198410）Takahashi M, Nishikawa A, Furukawa F, et al,:Carcinogenesis 15, 1429-1432, 1994.

検出するシステムの確立が必要である。本研究で開発した− 121 −