Wnt シグナルによるメラニン産生の制御機構の解析
東北大学大学院

医学系研究科医学生物化学講座分子生物学分野

武田和久Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) consists of many isoforms that differ at their N-termini
but share a basic helix-loop-helix and leucine-zipper (bHLH-LZ) structure. Among the isoforms, melanocyte-specific
MITF (MITF-M) is of particular interest, because expression of MITF-M is under the regulation of the melanocytespecific promoter (M promoter) of the MITF gene, and transcription from the M promoter is induced by Wnt signals
through a nuclear mediator, lymphoid-enhancing factor 1 (LEF-1). Wnt, a group of secretory signaling molecule, evokes
a signal to regulate the melanocyte differentiation. The binding of Wnt to its receptor Frizzled leads to inactivationof glycogen synthase kinase-3β (GSK3β), followed by the accumulation of β-catenin and its translocation to nucleus.
LEF-1/TCF transcription factors can bind to the β-catenin, and the formed complexes transactivate the target genes.
Recently, we have shown that functional cooperation of MITF-M with LEF-1 could lead to transcriptional activationof the M promoter and the dopachrome tautomerase (DCT) gene, an early melanoblast marker. The bHLH-LZ regionof MITF-M is responsible for the physical interaction with LEF-1, and β-catenin is required for the collaboration
between LEF-1 and MITF-M. Importantly, MITF-M could function as a non-DNA-binding cofactor for LEF-1.
These results suggest that MITF-M may function as a self-regulator of its own expression to maintain a thresholdlevel of MITF-M at a certain sensitive stage of melanocyte development, which could account for dominant inheritanceof Waardenburg syndrome type 2 (WS2) that is characterized by deafness and hypopigmentation due to lack ofmelanocytes in the inner ear and skin. MITF-M therefore plays dual roles in the Wnt signaling pathway; MITF-M
represents a downstream target and a nuclear mediator of Wnt signals in melanocytes.

１. 緒（M プロモーター）により制御される。

言MITF 遺伝子の変異による難聴を伴う色素異常症として小眼球症関連転写因子（MITF）は塩基性ヘリックス・ル

ワーデンブルグ症候群２型（Waardenburg syndrome typeープ・ヘリックス - ロイシンジッパー（bH L H - L Z）構造を持2、WS2）が知られている 10）。WS2 患者は先天性感音難つ転写因子であり、神経堤由来のメラノサイトと脳由来の網聴の他に、皮膚白斑、早発性白髪、虹彩色素異常を呈する。

。Wnt

WS2 の発症は MITF-M の量不足（haploinsufficiency）に膜色素上皮細胞（R PE）の分化制御因子である

１, ２）は胚の形態形成や毛包の再生などに重要な細胞間シグナルよると推定されている 11）。

分子であり、MITF 及びメラノブラストの初期分化マーカーで

M I T F の機能異常は色素異常症（シミあるいは白斑）、毛３-ある DCT（dopachrome tautomerase）の発現を誘導する包の機能低下（白髪や脱毛）など、加齢に伴い遭遇する諸問。DCT はメラニン合成系酵素の一つであり、可溶性のメラ題と関連する。本研究では、M I T F の機能発現の多様な制ニン前駆物質の解毒にも関与すると考えられている 。

御機構を解明し、肝斑などの色素沈着や白斑の有効な予防

５）６）

MITF は少なくとも５種のアイソフォーム（A、B、C、H、法と治療法の開発を目ざす。誰しも美しく老いたいと願うものM）から成り、アイソフォームのアミノ末端はそれぞれ特であり、本研究は高齢者の良好な QOL の達成に貢献する。

異的なエキソン１によりコードされ、各エキソン１は固有２．実のプロモーターの制御下にある（図１）７- ９）。MITF-M の発現がメラノサイト特異的であるのに対し、MITF-A など

2・1

験

RT-PCR 法による新規アイソフォームの探索と発現解析

他のアイソフォームは RPE やメラノサイトを含めた種々の細胞で発現されている。すなわち、MITF-M の N 末を

マウス RPE で発現される新規 Mitf アイソフォームをコードするエキソン１M は最も下流に位置する第一エキ探索するため、マウス眼球組織由来の mRNA を用いたソンであり、その転写はメラノサイト特異的プロモーター

cDNA の 5' 端増幅法（5'-RACE 法）にて、Mitf cDNA をRole of Wnt signaling in the regulation ofmelanin biosynthesis
Kazuhisa Takeda
Department of Molecular Biology andApplied Physiology, Tohoku University
School of Medicine

解析した。その結果、Mitf-D を新たに同定した 12）。ついで、そのヒト cDNA である MITF-D をヒト RPE 細胞株からクローン化した。さらに、マウス及びヒト遺伝子断片を単離し、該当するエキソン（エキソン 1D）の位置を決定した（図１）。種々ヒト細胞やマウス組織における MITF-D
mRNA の発現をノーザンブロット法により解析した。

− 62 −

Wnt シグナルによるメラニン産生の制御機構の解析

2・2 M プロモーター機能解析によるエンハンサーの探索関与するシスエレメントを探索した。Tag 付きの各蛋白を調製

MITF-M を発現するメラノーマ細胞における M プロモ

し、pull-down 法と免疫沈降法により in vivo での結合を解ーター機能解析用の融合遺伝子の一時的発現法により、エンハンサーを探索し、MDE を同定した

析した。

。さらに、MDE13）

2・4の機能を詳細に解析し、結合タンパクを探索した。

cAMP シグナルと Wnt シグナルのクロストー

クの解析
2・3 MITF の機能制御因子の探索

上 記 実 験 に よ り、DCT 遺 伝 子 の CRE 類 似 配 列 が、DCT プロモーター機能解析用の融合遺伝子との一時的MITF-M と LEF-1 の相互作用による活性化に必須なこと

共発現法により、MITF-M と LEF-1 の相互作用を解析し、が判明した（図２A）５）。そこで、DCT 遺伝子の CRE 類似配

図１ MITF 遺伝子と MITF アイソフォームの模式図
黒い部分はタンパクをコードするエキソン領域を、白い部分は 5' あるいは 3' の非翻訳領域を示す。エキソン２〜９はすべてのアイソフォームに共通である。４種の MITF アイソフォームの N 末をエキソン１N と示した。エキソン１B の 3' 側の B1b 領域は、MITF-A mRNA などの生成の際に第２エキソンとして利用される。M プロモーター（エキソン１M の転写開始点の上流）はメラノサイト特異的に機能する。bw マウスの外来 DNA 挿入部と rw マウスで見られる DNA 欠失領域に相当する部分も示す。後者の欠失領域には、M プロモーターのエンハンサー（MDE）が存在する。

図２ MITF と LEF-1 の相互作用による転写調節
A. DCT 遺伝子の転写調節機構。DCT プロモーター領域には、MITF 結合部位、LEF-1 結合部位、及び CRE 類似配列が存在する。CRE 類似配列に結合するタンパクはまだ不明である。
B. M プロモーターの転写調節機構。MITF 遺伝子の M プロモーター領域を模式的に示す。M プロモーターにはLEF-1 結合部位と CRE は存在するが、MITF の結合部位は存在しない。

− 63 −

列をプローブにしたゲルシフトアッセイにより解析する。場合作用する５）。すなわち、MITF は Wnt シグナル伝達系のによっては、サウスウェスタン法にて結合蛋白を探索する。

構成因子としての役割も担うことが示唆される。この結果、Wnt シグナルは種々細胞において効率的に伝達されると考え

2・5

MITF-M による M プロモーターの自己制御機構の解析られる。一方、L E F-1 ファミリーに属する TCF-1 は M I T Fと相互作用しない 17）。よって、Wnt シグナル伝達経路におけ培養細胞での一時的発現解析では、MITF-M は LEF-1による M プロモーターの活性化を促進する

る LEF-1 と TCF １との機能的差異が明らかになった。

。しかし、

14）

同領域には MITF-M の結合部位は存在しない（図２B）。

3・4

Wnt シグナル伝達系と cAMP シグナル伝達系

よって、LEF-1 を介した MITF-M による未知の転写活性のクロスト−ク化機構の存在が示唆され、その分子基盤を明らかにする。

cAMP と Wnt シグナルによる DCT プロモーターの活性３．結3・1化には、共通の cAMP-response element（CRE）類似配列

果が関与するが、既知の CREB はこの配列には結合しない５）。

新規アイソフォーム MITF-D の同定

Wnt シグナル伝達系と cAMP シグナル伝達系のクロスト

RPE と破骨細胞で発現される MITF-D を新たに同定し−クの可能性が示唆される（図２A）。

た（図１） 。MITF-D の翻訳開始 Met は下流のエキソ
12）

ン１B に位置する。MITF-D mRNA の非翻訳領域はエキ

3・5

MITF による M プロモーターの自己活性化機構

WS2 の発症は MITF-M の量不足（haploinsufficiency）

ソン１D によりコードされる。によると考えられるが、その発症機構は不明であった。

3・2

M プロモーターの上流エンハンサー MDE の同定

MITF 自身が、LEF-1 を介して M プロモーター（自己遺M プロモーターの機能解析により、エキソン１M の上伝子）の転写を促進する事を明らかにした（図２B）14)。

流約 14kb にエンハンサー MDE を同定した（図１）13）。

この場合、MITF は M プロモーターに結合する必要は無MDE には２つの SOX10 結合部位が存在し、エンハンサい。すなわち、DNA との結合に関わらず MITF は LEF-1ー機能に必須である。事実、SOX10 は MDE に作用して、のコアクチベータ−として機能し得る。よって、発生過程

M プロモーターを活性化した。さらに、Mitf 変異マウス

で効率良く MITF-M の発現量を維持できると考えられる。

である red-eyed white（rw）のホモ接合体は赤眼、小眼球、広範な白毛を呈する 15）。その本態はエキソン１H、エキソ3・6

RPE における OTX2 の役割

ン１D、及びエキソン１B を含む DNA 断片の欠失である

RPE は脱落・生成を繰り返す杆体細胞外節片を絶えず（図１）16）。よって、rw マウスは MITF-A など B1b 領域貪食・処理するのみならず、ロドプシンの構成成分であを持つすべてのアイソフォームを欠損する。さらに、白毛る 11- シス - レチナールを再生し視細胞に供給する。このを呈することから、MITF-M の発現も欠損していること

ように、RPE は視細胞の機能維持に必須である。また、が示唆される。実際、rw マウスでは、MDE が欠失していRPE はメラニン合成という分化形質を持ち、メラニン合ることを明らかにした 13）。

成系の３つの酵素（チロシナーゼ、TRP1、DCT）を発現

これらの結果は Pigment Cell Research 誌に発表され、2002 年の最優秀論文賞を受賞した（文献 13）。

する。RPE に存在するメラニンは視覚機能に重要であるばかりでなく、視神経の適正な伸張にも関与する。転写因子 OTX2 が RPE 特異的に DCT プロモーターを活性化す

3・3

Wnt シグナル伝達系の構成因子としての MITFることを発見した 18,19）。

MITF-M が Wnt シグナル伝達系の転写因子 LEF-1 と協４．考

調的に作用してメラノブラストマーカーでもある DCT 遺伝子察プロモーターを活性化することを発見した 5）。この作用には、最近の美白ブームによりメラニンに対する一般の関心はL E F-1 と共に β- カテニンも関与する（図２A）。ヒト培養細高く、美白のためのさまざまな化粧品が登場している。さ胞における two-hybrid 法と抗体を用いた pull-down 解析法

らに、高齢化が進む我が国においては、単に健康で長生きにより、MITF の bHLH-LZ 領域が LEF-1 と相互作用するできればよいというわけではなく、その余生の質が重要視ことを明らかにした。よって、MITF-M は Wnt シグナル伝達されている。今や、美しく老いるという願望は必ずしも女系の構成因子でもある。MITF は DNA との結合の有無に関性だけのものではない。実際、皮膚の老化の指標の一つでわらず LEF-1 のコアクチベータ−として機能する。

ある色素沈着（シミ）を予防できるような化粧品・薬剤のbHLH-LZ 領域はすべての MITF アイソフォームに共通開発が待ち望まれている。

であり、MITF-A などのアイソフォームも LEF-1 と相互− 64 −

オゾン層の破壊により地上に到達する紫外線量が増加

Wnt シグナルによるメラニン産生の制御機構の解析し、世界的にメラノーマが増加している。メラニンの主なYamamoto H, Udono T, Durlu YK, Tamai M, Takahashi

機能は紫外線に対する防護作用であるが、様々な皮膚の炎

K, Shibahara S. Identification of a novel isoform of

症後にもメラニン色素の沈着がおこる。また、加齡に伴うmicrophthalmia-associated transcription factor that is

白髪の形成には、毛包メラノサイトの細胞死による脱落な

enriched in retinal pigment epithelium. Biochem Biophys

どの病態が考えられる。しかし、現時点でもメラノサイト

Res Commun 1998; 247: 710-715.の機能制御因子が続々と発見されており、メラノサイトの

８） Udono T, Yasumoto K, Takeda K, Amae S, Watanabe

分化・生存には従来考えられてきたよりも複雑な制御機構

K, Saito H, Fuse N, Tachibana M, Takahashi K, Tamaiが存在する。本研究は、メラノサイトの分化と機能維持に

M, Shibahara S. Structural organization of the human

重要な液性因子 Wnt に焦点を当てるものであり、コスメ

microphthalmia-associated transcription factor gene

トロジーにとって重要な知見を提供する。すなわち、我々

containing four alternative promoters: Biochim Biophysが明らかにする Wnt シグナル伝達に関連する新規因子のActa 2000; 1491: 205-219.

機能制御法を開発することにより、将来、皮膚を守る化粧９） Fuse N, Yasumoto K, Takeda K, Amae S, Yoshizawa M,品・薬剤の開発へと発展する可能性がある。

Udono T, Takahashi K, Tamai M, Tomita Y, Tachibana M,

MITF は色素細胞のみならずマスト細胞、破骨細胞など

Shibahara S. Molecular cloning of cDNA encoding a novelの分化制御因子であり、MITF 変異が及ぼす効果の多面性

microphthalmia-associated transcription factor isoformの分子基盤の解明も今後の重要な研究課題である。一方、with a distinct amino-terminus: J Biochem (Tokyo) 1999;

Wnt シグナルは、メラノサイトを含めた毛包細胞間の相126: 1043-1051.

互作用にも関与する。Wnt が毛包メラノサイトの生存維

10） Tassabehji M, Newton VE, Read AP. Waardenburg

持をどのように制御するのかも興味深い問題である。

syndrome type 2 caused by mutations in the humanmicrophthalmia (MITF) gene: Nature Genet 1994; 8: 251-（文献）255.

１） Hodgkinson CA, Moore KJ, Nakayama A, Steingrímsson

11） Nobukuni Y, Watanabe A, Takeda K, Skarka H,E, Copeland NG, Jenkins NA, Arnheiter H. Mutations atTachibana M. Analyses of loss-of-function mutations of thethe mouse microphthalmia locus are associated with defects

MITF gene suggest that haploinsufficiency is a cause ofin a gene encoding a novel basic-helix-loop-helix-zipper

Waardenburg syndrome type 2A: Am J Hum Genet 1996;

protein: Cell 1993; 74: 395-404.

59: 76-83.

２） Hughes MJ, Lingrel JB, Krakowsky JM, Anderson KP.

12） Takeda K, Yasumoto K, Kawag uchi N, Udono T,A helix-loop-helix transcription factor-like gene is locatedWatanabe K, Saito H, Takahashi K, Noda M, Shibahara S.

at the mi locus: J Biol Chem 1993; 268: 20687-20690.

Mitf-D, a newly identified isoform, expressed in the retinal

３） Dorsky RI, Raible DW, Moon RT. Direct regulation ofpigment epithelium and monocyte-lineage cells affected bynacre, a zebrafish MITF homolog required for pigment cell

Mitf mutations: Biochim Biophys Acta 2002; 1574: 15-23.

formation, by the Wnt pathway: Genes Dev 2000; 14: 158-13） Watanabe K, Takeda K, Yasumoto K, Udono T, Saito H,162.

Ikeda K, Takasaka T, Takahashi K, Kobayashi T, Tachibana４） Takeda K, Yasumoto K, Takada R, Takada S, Watanabe

M, Shibahara S. Identification of a distal enhancer for theK, Udono T, Saito H, Takahashi K, Shibahara S. Induction

melanocyte-specific promoter of the MITF gene: Pigmentof melanocyte-specific microphthalmia-associated

Cell Res 2002; 15: 201-212.（2002 年の最優秀論文賞を受transcription factor by Wnt-3a: J Biol Chem 2000; 275:賞）

14013-14016.

14） Saito H , Ya su moto K, Ta keda K, Ta ka ha shi K,

５） Yasumoto K, Takeda K, Saito H, Watanabe K, Takahashi

Fukuzaki A, Orikasa S, Shibahara S. Melanocyte-K, Shibahara S. Microphthalmia-associated transcription

specific microphthalmia-associated transcription factor

factor interacts with LEF-1, a mediator of Wnt signaling.

isoform activates its own gene promoter through physical

EMBO J 2002; 21: 2703-2714.

interaction with lymphoid-enhancing factor 1: J Biol Chem６） Steel KP, Davidson DR, Jackson IJ. TRP-2/DT, a new

2002; 277: 28787-28794.

early melanoblast marker, shows that steel growth factor

15） Steingrímsson E, Moore KJ, Lamoreux ML, Ferr_-(c-kit ligand) is a survival factor: Development 1992; 115:

D'Amaré AR, Burley SK, Sanders Zimring DC, Skow

1111-1119.

LC, Hodgkinson CA, Arnheiter H, Copeland NG, Jenkins

７） Amae S, Fuse N, Yasumoto K, Sato S, Yajima I,− 65 −NA. Molecular basis of mouse microphthalmia (mi)mutations helps explain their developmental and phenotypic18） Simeone A, Acampora D, Mallamaci A, Stornaiuolo A,

consequences: Nature Genet 1994; 8: 256-263.

D'Apice MR, Nigro V, Boncinelli E. A vertebrate gene16） Hallsson JH, Favor J, Hodgkinson C, Glaser T,

related to orthodenticle contains a homeodomain of theLamoreux ML, Magnusdottir R, Gunnarsson GJ, Sweet

bicoid class and demarcates anterior neuroectoderm in theHO, Copeland NG, Jenkins NA, Steingrímsson E. Genomic,gastrulating mouse embryo: EMBO J 1993; 12: 2735-2747.

transcriptional and mutational analysis of the mouse19） Takeda K, Yokoyama S, Yasumoto K, Saito H, Udono

microphthalmia locus: Genetics 2000; 155: 291-300.

T, Takahashi K, Shibahara S. OTX2 regulates expression17） Waterman ML, Fischer WH, Jones KA. A thymus-specificof DOPAchrome tautomerase in human retinal pigment

member of the HMG protein family regulates the human Tepithelium: Biochem Biophys Res Commun 2003; 300: 908-cell receptor Cα enhancer: Genes Dev 1991; 5: 656-669.

914.

− 66 −