紫外線誘発メラニン合成へのスフィンゴシン 1-ホスフェートの抑制効果の検討
神戸大学大学院医学系研究科応用分子医学講座皮膚科学

錦 織千佳子Melanin content in pigment cells is regulated by multiple mechanisms. We have previously shown thatmelanogenesis in mouse B16 melanoma cells is inhibited by activation of phospholipase D through ubiquitin
proteasome-mediated degradation of tyrosinase. Further, we have recently found that sphingosine 1-phosphate, alipid messenger that is implicated in the regulation of a wide variety of important cellular events acting throughintracellular as well as extracellular mechanisms, suppresses melanin content in B16 cells. In this study, theinvolvement of phospholipase D and sphingosine kinase, a key regulator of intracellular sphingosine 1-phosphatelevel, in ultraviolet B-induced skin pigmentation and sphingosine 1-phosphate-induced suppression of melanincontent in B16 cells was examined. Neither phospholipase D activity nor sphingosine kinase activity in B16cells was affected by ultraviolet B, suggesting that these enzymes are not involved in ultraviolet B-inducedpigmentation. We next investigated the involvement of phospholipase D and sphingosine kinase in the sphingosine
1-phosphate-induced suppression of melanin content. sphingosine 1-phosphate did not activate phospholipase
D in B16 cells, indicating that phospholipase D activation is not involved in the sphingosine 1-phosphateinduced suppression of melanin content. However, treatment of B16 cells with the sphingosine kinase inhibitor
dimethylsphingosine resulted in an increase in melanin content without affecting  tyrosinase activity. Melanosomes
were highly aggregated in the cells treated with dimethylsphingosine. Furthermore, sphingosine kinase colocalized with the aggregated melanosomes. These results suggest that sphingosine 1-phosphate, that is derived
from sphingosine in the melanosome membrane through the catalytic activation of sphingosine kinase, regulatesmelanin content through melanosome distribution.

１．緒は大部分スフィンゴシンキナーゼ（SPHK）によるスフィ言

ンゴシン代謝により制御されている。SPHK には SPHK1、哺乳動物のメラニンは、色素細胞に存在する特殊な細胞

SPHK2 の 2 つの分子種が存在する。一方、我々は細胞膜内小器官であるメラノソーム内で合成される。メラノソー

情報変換酵素であるホスホリパーゼ D（PLD）活性化がムにおいて、メラニン合成はチロシナーゼによるチロシン

同じく B16 細胞においてチロシナーゼのユビキチン−プの酸化反応を始めとする多段階のステップを経て遂行されロテアソーム系分解を促進した結果、メラニン生成抑制をる。メラニンはこのステップの中で生じた色素を有する起こすことを見い出し報告している２）。ある種の細胞では様々な生体高分子の混合物である。メラニンで満たされたS1P により細胞内 PLD が活性化されることが報告されてメラノソームは色素細胞の樹状突起内を突起端まで運ばれ、いる３, ４）。

色素細胞の周囲に存在する角化細胞に移送され、紫外線か本研究において我々は、皮膚の色素沈着を起こす紫外線らの皮膚の防御、種々の毒物・化学物質の吸収、肌色の違および色素細胞内メラニン量を減少させる S1P それぞれいの原因等に重要な役割を果たしている。の作用への SPHK、PLD 活性化の関与を検討した。

我々は色素細胞内メラニン量調節機構の研究過程で、マ２．実

ウス黒色腫由来 B16 細胞をスフィンゴシン 1- ホスフェート（S1P）処理した際、細胞内メラニン量が減少すること

験１）細胞を見い出した。S1P は生体膜スフィンゴ脂質由来の代謝産マウス黒色腫由来 B16 細胞を使用し、継代および実験物で、細胞内セカンドメッセンジャーとして、あるいは細には 10%FCS を含む Eagle’s minimal essential medium を胞膜表面レセプターを介するリガンドとして働く新規の情用いた。

報伝達脂質として注目されている 。細胞内 S1P レベル

２）SPHK アッセイ

１）

SPHK アッセイは、細胞溶解液とスフィンゴシンを 32 P
Role of sphingosine 1-phosphate inultraviolet-induced melanogenesis

で標識された ATP 存在下で反応させ、生成した S1P を

Chikako Nishigori

る 32P をバイオイメージング分析器（BAS2000, Fuji Photo

Kobe University Graduate Schoolof Medicine, Department of ClinicalMolecular Medicine, Division ofDermatology

薄層クロマトグラフィーにより分離し、S1P 中に含まれFilm）により測定することにより行った。
３）PLD アッセイ

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PLD 活性は、14C で標識されたリゾホスファチジルコリ

紫外線誘発メラニン合成へのスフィンゴシン 1-ホスフェートの抑制効果の検討

ンで標識した細胞をエタノール存在下で S1P で 30 分刺激

されている５）が、S1P による B16 細胞内メラニン量減少は、したあと、ホスファチジル基転移反応によって生成された細胞膜 S1P レセプターを刺激するのに用いられる S1P 濃

ホスファチジルエタノール中の 14C 放射能が脂質中に取り度に比べて高い濃度を要するため、S1P は細胞内に直接入込まれた全放射能に占める割合で表した。って効果を現わしている可能性を考え、細胞内の S1P レ

４）メラニン定量およびチロシナーゼアッセイ

ベルを制御する SPHK の関与について検討することにしこれまでに我々が用いた方法２）で行った。

た。B16 細胞を SPHK 阻害剤である dimethylsphingosine

５）免疫染色及び観察（DMS）（３µM）で処理したところ、72 時間後にはコン細胞の固定は３％パラホルムアルデヒド／ PBS で 20トロールに比べて細胞内メラニン量は増加していた（図分行った。0.2％ Triton X-100 処理および BSA によるブ2A）。しかし、チロシナーゼ活性は DMS 処理細胞とコロッキング後、抗メラノソーム抗体（HMB45）および抗ントロール細胞で差がなかった（図 2B）。DMS 処理した

SPHK1 抗体にて反応させ、２次抗体にて発色後、共焦点

B16 細胞内における SPHK1 の局在をメラノソームの局在顕微鏡にて観察した。と比較したところ、DMS 処理によりメラノソームは凝集３．結３. １し（図 3）、このときメラノソームと SPHK1 の局在はよく果一致していた（図 4）。

紫外線が SPHK、PLD 活性に及ぼす影響

４．考B16 細胞に紫外線 B を 5、10、30mJ/ ㎠照射したとき察の PLD、SPHK 活性を測定したが、どの照射量の場合も紫外線 B は PLD、SPHK 活性には影響を与えなかった

SPHK、PLD 活性には影響を与えなかった（データ省略）。

ため、紫外線による皮膚色素沈着機序への PLD、SPHK活性変化の関与は否定的と考えられた。次に我々は、S1P

３. ２ S1P が細胞内のメラニン量、PLD 活性に及ぼす影響

による B16 細胞内メラニン量減少機序への PLD、SPHK

B16 細胞を 10µM S1P で処理すると 72 時間後には細胞プターを介して PLD 活性化を起こし、その結果我々が以内のメラニン量はコントロールに比べて減少していた（図前報告した機序 、すなわちチロシナーゼのユビキチン−1A）。しかし、10µM S1P 処理により B16 細胞内の PLDプロテアソーム系分解促進により細胞内メラニン量が減少は活性化されなかった（図 1B）。

する可能性を考えたが、B16 細胞内のメラニン量を減少さ活性の関与を調べた。まず、S1P が B16 細胞表面のレセ
１）

せる濃度の S1P による PLD 活性化は起こらず、この S1Pが PLD 活性化を介してメラニン量を減少させる可能性をB16 細胞には S1P レセプターが発現していることは示能性を考え、細胞内の S1P 量を制御する SPHK の 阻害剤

AA6420.20.100
EtOH

S1PEtOH

S1P

図 1 AS1P 処理による B16 黒色腫細胞内メラニン量の変化
B16 細胞を 10µM S1P 処理し、72 時間後のメラニン量をコントロール（0.1％エタノール：EtOH）細胞とともに測定した。BS1P 処理による B16 黒色腫細胞内 PLD 活性変化：
14B16 細胞に C で標識されたリゾホスファチジルコリンを取り込ませ、エタノール存在下で 10μM S1P で 30 分刺激し、PLD 活性をコントロール（0.1％エタノール：EtOH）細胞とともに測定した。PLD 活性は、ホスファチジル基転移反応によって生成されたホスファチジルエタノール（PtdEtOH）
14中の C 放射能が、脂質中に取り込まれた全放射能に占める割合で表した。

B
1016Tyrosinase activity（X 10−3ｄｐｍ/µg protein）

0.38

否定した。次に、S1P が細胞内に入って効果を発揮する可Melanin content（µg/mg protein）

B
PtdEtoh（％ of total）

Melanin content（µg/mg protein）

３. ３ SPHK 阻害剤が細胞内のメラニン量、メラノソームの局在に及ぼす影響

1412108642086420EtOH

DMSEtOHDMS

図 2 A DMS 処理による B16 黒色腫細胞内メラニン量の変化
B16 細胞を 3µM DMS 処理し、72 時間後のメラニン量をコントロール（0.1％エタノール：EtOH）細胞とともに測定した。B DMS 処理による B16 黒色腫細胞内チロシナーゼ活性変化：B16 細胞を 3µM DMS 処理し、72 時間後のチロシナーゼ活性をコントロール（0.1％エタノール：EtOH）細胞とともに測定した。

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コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

anti-melanosome

DIC

anti-melanosome

anti-SPHK1DICDMS（-）
図 4 ADMS 処理した B16 黒色腫細胞内のメラノソームとSPHK1 の局在
B16 細胞を 3µM DMS 処理し、72 時間後、抗メラノソーム抗体（anti-melanosome）および抗 SPHK1 抗体（anti-SPHK1）で免疫染色を行い共焦点顕微鏡にて観察した。

DMS（+）

図 3 DMS 処理による B16 黒色腫細胞内のメラノソーム局在の変化
B16 細胞を 3µM DMS 処理し（DMS（+））、72 時間後、DMS 処理を行わなかった細胞（DMS（-））とともに抗メラノソーム抗体（anti-melanosome）を用いて免疫染色を行い共焦点顕微鏡にて観察した。

である DMS で細胞を処理したところ、B16 細胞のメラニ（文献）ン量は増加した。よって SPHK 活性化によって生じる細１）Taha TA, Hannun YA, and Obeid LM, : Sphingosine

胞内 S1P はメラニン量制御因子として働く可能性が示唆

kinase: Biochemical and cellular regulation and role in

された。DMS によるメラニン量増加はチロシナーゼ活性

disease. J. Biochem. Mol. Biol. 39, 113-131, 2006.

増加を伴わないことから、S1P はメラニン生成を促進する

２）Kageyama A, Oka M, Okada T, et al, : Down-という機序以外の機構により細胞内のメラニン量を制御す

regulation of melanogenesis by phospholipase D2ると推定した。そこで DMS 処理した細胞を顕微鏡で観察

through ubiquitin proteasome-mediated degradation of

したととろ、メラノソームの著明な凝集が起っていた。こtyrosinase. J. Biol. Chem. 279, 27774-27780, 2004.の結果より、SPHK により産生された S1P はメラノソー

３）Cummings RJ, Parinandi NL, Zaiman A, et al, :ムの凝集・拡散を制御していると考えられ、DMS による

Phospholiase D activation by sphingosine 1-phosphate

メラニン量増加はメラノソームの凝集過多の結果、拡散しregulates interleukin-8 secretion in human bronchialて細胞外に分泌されるメラノソームが減少した結果である

epithelial cells. J. Biol. Chem. 277, 30227-30235, 2002.と推定した。さらに、メラノソームと SPHK1 は局在がよ４）Banno Y, Takuwa Y, Akao Y, et al, : Involvement of

く一致したことから、SPHK1 はメラノソーム膜のスフィ

phospholipase D in sphingosine 1-phosphate-induced

ンゴシンからの S1P 産生を制御することによりメラノソ

activation of phosphatidylinositol 3-kinase and Akt inームの凝集・拡散を調節していると推定した。細胞内で生Chinese hamster ovary cells overexpressing EDG3. J.
Biol. Chem. 276, 35622-35628, 2001.

じた S1P がどのような機序でメラノソームの凝集・拡散を制御しているかは現時点では不明であるが、その機序の５）Arikawa K, Takuwa N, Yamaguchi H, et al, : Ligand-

解明は色素細胞のメラニン量制御機構およびメラニン分泌

dependent inhibition of B16 melanoma cell migration

機構の理解に大きく役立つと期待される。

and invasion via endogenous S1P2 G protein-coupledreceptor. J. Biol. Chem. 278, 32841-32851, 2003.

謝辞

本研究は、神戸大学大学院医学系研究科分子生物学講座
生化学

中村俊一教授との共同研究である。

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