天然由来石鹸に含まれる脂肪酸によるTSLP 産生とアレルギー誘発作用

東北大学大学院薬学研究科生活習慣病治療薬学分野

平 澤

典 保

Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) plays critical roles in the induction and exacerbation of allergic diseases. We
found that medium-chain fatty acid such as nonanoic acid induced the production of TSLP in vivo. Nonanoic acid promoted
sensitization to ovalbumin, resulting in an enhancement of the cutaneous anaphylactic response. In this report, we clarified
that the exposure to nonanoic acid after the sensitization augmented picryl chloride-induced thickening of the ear, which
was reversed in TSLP receptor-deficient mice. However, coconut oil, which includes medium-chain fatty acids, did not
induced TSLP production. To clarify the molecular mechanisms by which free fatty acid induced TSLP production, mouseepithelium cell line PAM212 was used. We found that valeric acid potently induced TSLP production. Isovaleric acid but
not the related compounds showed the activity. The agonists to GPR120, GPR84, GPR43 (FFA2R), GPR41 (FFA3R), andGPR40 were not induced TSLP production. PTX did not inhibit TPA-induced TSLP production but inhibited valeric acidinduced one. Valeric acid-induced TSLP production was inhibited by U0126 and TACP-1, suggesting that ERK and NF-κB
were involved in the production. These findings suggested that valeric acid induced TSLP production via G protein-coupled
receptor and mediated by ERK and NF-κB.
Conclusion: Low and medium-chain fatty acids have the activity to produce TSLP via unidentified receptors and TSLP
exacerbated allergic inflammation. Although coconut oil shows no activity, our findings suggested that the natural soap,
which includes medium-chain fatty acids, might be a risk to induce allergic dermatitis.

１．緒IL- 4、IL- 5、IL- 13などのTh2サイトカイン、tumor necrosis

言factor- a（TNF- a）などの炎症性サイトカインを産生する

近年、手湿疹など、アレルギー性の湿疹、皮膚炎が増加

炎症性 Th 2 細胞へと分化誘導し、さらに樹状細胞からのしている。この原因の一つに、石鹸や化粧品に含まれる化

thymus and activation-regulated chemokine（TARC）お学物質による影響が示唆されている。特に天然由来の石鹸

よび monocyte-derived chemokine（MDC）の産生を誘導には、界面活性作用による皮膚バリア機能の低下とともに、することで Th 2 型のアレルギー反応を増強し 4）、IgE の産同時に含まれる種々の化学物質が免疫機能に影響を与える生を高める。

可能性がある。本研究では、特に天然油脂に多く含まれるアトピー性皮膚炎患者の病変部位 5）や、重度の気管支喘息患者の気道上皮細胞 6）では、TSLP が高発現しておりア低・中鎖脂肪酸のアレルギー誘発活性に着目した。
石鹸や化粧品などの化学的因子の影響を直接的に受けるレルギー疾患における TSLP の関与が示唆された。遺伝子細胞としては皮膚上皮細胞があげられる。上皮細胞はこれ組み換えマウスを用いた実験によって、皮膚に特異的なまで、バリア機能を担う細胞として認識されてきたが、近TSLP の過剰発現により湿疹、紅斑といった アトピー性

年では外的刺激に対してサイトカイン等の炎症性メディエ皮膚炎様皮膚症状が自然発症する 7）こと、また OVA を抗ーターを産生し、免疫応答の制御にも寄与する 1）ことが明原としたアトピー性皮膚炎モデル 8）や喘息モデル 9）におけらかとなり、アトピー性皮膚炎の病態への寄与が示唆されるアレルギー炎症は TSLP 受容体欠損マウスにおいて顕著ている 2）。に抑制されることから、TSLP はアレルギー炎症においてThymic stromal lymphopoietin（TSLP）は、主に上皮細胞から産生される interleukin（IL）-7 様サイトカインで3）ある 。産生された TSLP は TSLP 受容体を介して、未成熟な樹状細胞を活性化させて成熟樹状細胞へと分化させる。
+

成熟樹状細胞はリンパ節に遊走し、naïve CD4 T細胞を必要かつ十分なマスタースイッチとして働くと考えられている 10）。
TSLP の誘導因子については、Toll like receptor（TLR）のリガンド、TNF-a や IL- 4 などのサイトカイン、タバコの煙（Cigarette smoke extract）等、さまざまな刺激因子が報告されているが、これらによる TSLP 産生誘導メカニズム

Effects of short- and medium-chain fatty
acids on TSLP production and inductionof allergy
Noriyasu Hirasawa
Laboratory of Pharmacotherapy of Lifestyle Related Diseases, Graduate Schoolof Pharmaceutcal Sciences, TohokuUniversityについてはいまだ不明な点が多い。また、これらの誘導因子に加えて、12 -O-tetradecanoylphorbol 13 -acetate（TPA）や dibutyl phthalate といった化学物質も TSLP 産生を誘導することが報告されている 11）。当研究室では、環境因子によるアレルギー増悪化の機序の一つとして、TSLP の関与を仮定し、身近に存在する化学物質による TSLP産生を解− 152 −天然由来石鹸に含まれる脂肪酸による TSLP 産生とアレルギー誘発作用析した結果、m-xylene や1 , 2 , 4 -trimethylbenzene といったより身近な化合物が TSLP 産生を誘導する12）ことを明らかにしている。特に、ヤシ油（ココナツオイル）など天然由した。PiCl で感作を行って 12 日後、感作した右耳介皮膚表裏に１%（w/v）PiCl 溶液 20 µl を塗布することにより惹起を行った。その後経時的に耳介の厚さを測定した。

来石鹸等に多く含まれる低・中鎖脂肪酸に TSLP 産生を誘ーを増強する活性（図２）がある事を見いだした 13）。そこ

2 . 3 マウスケラチノサイト株 PAM 212 細胞におけるTSLP 産生で本研究では、低・中鎖脂肪酸の TSLP 産生誘導機構と、PAM 212 細胞を 10 % FBS 含有 MEMa 中、１× 105 cells/

アレルギー誘発作用について、マウスのアレルギーモデル、ml になるように調製した。各濃度の阻害薬を添加して、導する活性（図１）、更には外来蛋白質に対するアレルギならびにマウスケラチノサイト細胞株の PAM 212 細胞を37℃、５% CO 2 存在下で任意の時間前処理した後、BSA用いて検討した。

存在下各種濃度の fatty acid で刺激した。24 時間培養後、

２．実
2 .1

培養液上清中の TSLP を ELISA で測定した。細胞毒性は験

MTT 法で評価した。

マウス耳介塗布モデル

３．結Balb/c 雄性マウスをジエチルエーテル麻酔し、耳介皮果

耳介皮膚組織を切り取った後、皮打ち抜きパンチ（直径3 .1 PiCl 誘発性接触皮膚炎モデルにおける耳介浮腫に対するnonanoic acid の影響

10 mm）で一定面積を打ち抜き、耳介皮膚組織を電子天秤

Picryl chloride（PiCl）を抗原とした接触皮膚炎モデルにて重量を測定した。耳介組織は、破砕用ビーズを用いてにおいて、感作と惹起の間に nonanoic acid を塗布するこ破砕した。遠心上清中の TSLP 量は Mouse TSLP DuoSetRとで、惹起時の反応に対する影響を解析した。PiCl で感作ELISA を用いて測定した。また mRNA 測定のためには耳を行い（day 0）、12 日後惹起を行った。その後、30 分、１介 組 織 20−30 mg を ５% Proteinase K 含 有 RNAiso Plus

時間、２時間、３時間、６時間、12 時間、24 時間後に耳500 µl 中で同様に破砕し、Real time PCR 法で解析した。

介の厚さを計測した。各々の耳介の厚さから惹起前の厚さ

膚の表裏に種々の化合物計 20 µl 塗布した。一定時間後、を引き、耳介皮膚の厚みの変化として表した。野生型

2 . 2 塩化ピクリルによるアレルギー性慢性皮膚炎様病態マウスの作製

C 57 BL/ 6 マ ウ ス で は、 惹 起 後 に 耳 介 肥 厚 が み ら れ、

C 57 BL/ 6 お よ び TSLP 受 容 体 欠 損 マ ウ ス（C 57 BL/ 6）

肥厚が増強された（図 3 A）。一方、TSLP 受容体欠損マウを用いた。Cyclophosphamide 溶液（30 mg/ml）を 150 mg/スにおいて、同様の実験を行った結果、惹起後の耳介肥厚kg となるように腹部皮下に投与した。２日後、マウスのはみられたが、nonanoic acid 塗布による耳介肥厚の増強作

右耳介皮膚に７%（w/v）PiCl 溶液 50 µl を表裏均等塗布す

用は著しく減弱した（図 3 B）13）。この結果から、nonanoicることにより感作を行った。感作５日後と 10 日後に、感acid は PiCl による接触皮膚炎を増強すること、そしてこの作を行った右耳介の表裏均等に nonanoic acid を 20 µl 塗布

作用は TSLP 産生を介していることが示唆された。

図１ マウス耳介モデルにおける脂肪酸の TSLP 産生誘導活性 13）
マウス耳介に各脂肪酸 20 µl を塗布し、24 時間後の耳介組織ホモジネート中の TSLP 量を測定した。*P< 0 . 05 , **P< 0 . 01

図２ Nonanoic acid による外来蛋白に対するアレルギー増強 13）
BALb/c マウスに nonanoic acid（B, D）あるいは vehicle（A, C）を塗布し 24 時間後に同部位に ovalbumin（OVA）を皮内注射して感作した。９日後、0 . 05 % Evans blue 溶液を静脈内注射した後、vehicle（矢頭）および OVA 溶液（矢印）を皮内注射した。30 分後、皮内に漏出した色素を抽出し定量した（E）。**P< 0 . 01

nonanoic acid を感作と惹起の間に 2 回塗布することで耳介− 153 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 20143.2

中鎖脂肪酸を含むココナツオイルの作用

生誘導活性には炭素数による違いがみられ、炭素数５の中鎖脂肪酸を多く含む天然成分として、ヤシ油（ココナvaleric acid が最も強い活性を示した（図４）。また valericツオイル）が注目されている。ココナツオイルは炭素数 12acid の 類 似 化 合 物 の 活 性 に つ い て 解 析 し た と こ ろ、のラウリン酸などの中鎖脂肪酸を多く含み、天然由来石鹸isovaleric acid には同程度の TSLP 産生誘導活性が認めら等に用いられている。そこでまず、ココナツオイルをマウれたが、pivalic acid、2 -methyl butanoic acid、1 - pentanol、ス耳介に塗布し、24 時間後の TSLP 産生を解析したが、

2 -pentanone、γ - aminbutanoic acid（図５）は２mM 濃度

TSLP の産生は認められなかった（data not shown）。

で活性は認められなかった。

3.3

3.4

PAM 212 細胞におけるTSLP 産生誘導

ATP の作用マウス耳介への脂肪酸刺激により TSLP 産生誘導がみら上皮細胞は物理的刺激により ATP を放出し。この ATPれたことから、マウスケラチノサイト細胞株である PAM 212がサイトカイン産生を誘導する可能性も報告されている。

細胞を用いて、in vitro における短鎖および中鎖脂肪酸のそこで、TSLP 産生に物理的刺激により放出される ATPTSLP 産生誘導活性を解析した。PAM 212 細胞を BSA 存が関与しているかどうか明らかにするために、ATPのTSLP在下各種脂肪酸で 24 時間刺激し、培養上清中 TSLP 濃度産生効果を検討した。その結果、ATPは１mMまでの濃度を ELISA により測定した。その結果、脂肪酸の TSLP 産範囲で TSLP 産生を誘導しなかった（data not shown）。

図３ Nonanoic acidによる塩化ピクリルによる接触アレルギーの増強 13）
野生型マウス（A）あるいは TSLPR 欠損マウスを 2 . 2 の方法で感作惹起した。感作と惹起の間（５日と 10 日）に nonanoic acid（黒丸）あるいは vehicle（白丸）を塗布した。惹起後経時的に耳介浮腫を計測した。
*P< 0 . 05 , **P< 0 . 01

図４ PAM212細胞における脂肪酸によるTSLP産生
PAM 212 細胞を各炭素数の飽和脂肪酸１mM で刺激し、24 時間後の培養液 上清中の TSLP を測定した。
*P< 0 . 05 , **P< 0 . 01

図５ Valeric acid 類似構造化学物質
Valeric acid および isovaleric acid（A）には TSLP 誘導活性が見られたが、その他の化合物（B）には２mMで活性は認められなかった。

− 154 −

天然由来石鹸に含まれる脂肪酸による TSLP 産生とアレルギー誘発作用

3.5

G 蛋白質連関受容体（GPCR）の関与

FFA 2 R（GPR 43）お よ び FFA 3 R（GPR 41）の 関 与 を 検Valeric acid による TSLP 産生誘導メカニズムの解析に討した。さらに上皮細胞の化学物質に対する核内受容体あたり、初めにこの反応が受容体を介する反応か否かにつAhR についても検討した。GPR 84 のアゴニストである

いて明らかにするため、Giタンパク質共役型 GPCRの関与の3 , 3’- diindolylmethane（DIM）、GPR 40 のアゴニストであ有無を検討した。百日咳毒素（PTX）は Gタンパク質の一つ

る troglitazone、GPR 40 および GPR 120 のアゴニストであの Giの a サブユニットをADPリボシル化することで受容体とる GW 9508 はアゴニスト作用を十分発現する濃度 10 µM まの相互作用を阻害する。PAM 212 細胞を50 , 100 nMのPTXで TSLP 産生を誘導しなかった（data not shown）。またで１時間前処理後、２mMの valeric acidあるいは 受容体をFFA 2 R アゴニストである tiglic acid、FFA 3 R アゴニスト

介さない刺激 薬として 30 nMの12 -O-tetradecanoylphorbolである 2 -methylbutylic acid は valeric acid とおなじ 2 mM

13 -acetate（TPA）で刺激し、24 時間後の培養上清中 TSLP

でも TSLP 産生を誘導しなかった。さらに PAM 212 細胞を

濃 度をELISAにより測 定した。 そ の 結 果、TPA に よ る

AhR のアゴニストである β- naphthoflavone（BNF）で刺激

TSLP 産生は PTX の影響をほとんど受けないのに対し、した場合にも TSLP産生は増加しなかった（data not shown）。

Valeric acid による TSLP 産生は PTX の前処理により半分程度に抑制された（図６）。この結果は、valeric acid の作用の少なくとも１部は GPCR を介したものであることを示唆している。

3.7

TSLP 産生誘導シグナル

TSLP 産生誘導に関与する細胞内シグナルの同定のために、各種阻害薬の効果を検討した。PAM 212 細胞を MEK阻害薬の U 0126（１µM）、p 38 阻害薬の SB 203580（10 µM）、

3.6

FFAR 関連の関与

JNK 阻 害 薬 の SP 600125（30 µM）、PI 3 K 阻 害 薬 のこれまで結果から、valeric acid の作用はカルボン酸がwortmannin（100 nM）で１時間前処理後、2 mM の valeric必要であること、受容体を介した作用であることが示唆さacid で刺激し、24 時間後の培養上清中 TSLP 濃度を ELISAれたため、次に中鎖−長鎖脂肪酸受容体 FFA 1 R（GPR 40）により測定した。その結果、U 0126 の前処理によってのみ、

お よ び GPR 120 , 中鎖脂肪酸受容体 GPR 84 , 短鎖 脂 肪 酸

valeric acid による TSLP 産生は抑制された（図７）。また、

図６ 百日咳毒素の作用
百日咳毒素 50 , 100 nM で 16 時間処理した後、valeric acid（C 5）あ る い は TPA で 刺 激 し、24 時 間 後 の 培 養 液 上 清 中 のTSLP 量を測定した。**P< 0 . 01

図７ Valeric acid による TSLP 産生に対する各種阻害薬の効果
PAM212細胞をU0126（U, 1µM）, SB203580（SB, 10µM）,
SP600125（SP, 30µM）, およびwortmannin（wort, 100nM）（A）あるいは各濃度のU0126（B）で １ 時 間 処 理 し た 後、valericacid 2 mM で刺激し、24 時間後の培養液上清中の TSLP 量を測定した。**P< 0 . 01

− 155 −

コスメトロジー研究報告 Vol.22, 2014

る事が示唆された。
一方、中鎖脂肪酸が多く含まれるとされるココナツオイ
ルをマウス耳介に塗布しても TSLP 産生活性は認められなかった。したがって、通常の状態では、ココナツオイルが添加されても、アレルギー誘発のリスクはさほど大きくないと考えられる。これは中鎖脂肪酸がグリセロールにエステル化されているためであること、あるいは濃度が活性を示すまでに達していない事が考えられるが、感染等、付加的な環境要因が加わると加水分解等により中鎖脂肪酸濃度が亢進して、アレルギーを増幅する可能性は否定できない。
図８ Valeric acid による TSLP 産生における NF-κB の関与
各 濃 度 の TPCA- 1 で １ 時 間 前 処 理 し た ち、valeric acid ２
mM で刺激し、24 時間後の培養液上清中の TSLP 量を測定した。
**P< 0 . 01

石鹸は、皮膚バリア機能を低下させるため、外来抗原の侵入を促進する可能性がある。
「茶のしずく」のように、蛋白成分が石鹸に含まれる場合には抗原の侵入が容易になるとともに、石鹸成分の脂肪酸が TSLP 産生を増大させて、アレルギーを増大させる可能性も考えられる。

I- kB kinase- 2 阻 害 薬 の TPCA- 1（0 . 3 , 1 , 3 , 10 µM）も、

５．総

valeric acid に よ る TSLP 産 生 を 濃 度 依 存 的 に 抑 制 し、NF-k B が関与している事が示唆された（図８）
。

４．考

括

本研究により、天然油脂に多く含まれる低・中鎖脂肪酸には、皮膚上皮細胞において、TSLP 産生をしめすことが察明らかになり、これらの成分を含む石鹸、化粧品にはアレ石鹸は脂肪酸のナトリウム塩あるいはカリウム塩が主成

ルギー誘発のリスクがある事が示唆された。そのリスクは分となり、天然油脂として牛脂、ヤシ油（ココナツオイル）大きいものではないと考えられるが、今後新しい製品を開などが加えられることがある。ヤシ油には炭素数 12 のラ発する上では、TSLP 産生について評価する事が望まれる。

ウリン酸などの中鎖脂肪酸が多く含まれている。炭素数が脂肪酸の受容機構は、GPCR が関与している事が示唆され少ない脂肪酸で作った石鹸は親水性が強いが親油性が弱い。

たが、その同定にはいたらなかった。今後更に、上皮細胞

今 回、 マ ウ ス 耳 介 塗 布 モ デ ル で は 炭 素 数 ９ の nonanoicの化学物質受容機構について解析を加える予定である。

acid が最も強い活性を、また PAM 212 細胞を用いた系では炭素数５の valeric acid が最も強い活性を示したが、こ（引用文献）

れは組織浸透性や培地への溶解性に基づくものであると考

１）Esche C, De Benedetto A, and Beck L: Keratinocytes

えられる。いずれの場合も、カルボン酸である事が必要で、

in atopic dermatitis: inflammatory signals. Cur. allergy

アルデヒドやアルコール、ケトンでは活性が認められなか

asthma reports 4 , 276 – 284 , 2004 .

った。これまでマウス耳介において、TSLP 産生を誘導す

２）Holgate ST: The epithelium takes centre stage inることが明らかになっている nonanoic acid は外来抗原に

asthma and atopic dermatitis. Trends Immunol 28 ,対する IgE 抗体産生を増大させるだけでなく、今回、接触

248 – 251 , 2007 .

抗原による皮膚アレルギーも増強する事が明らかになった。

３）R a y R . J , F u r l o n g e r C , W i l l i a m s D E , P a i g e

低・ 中 鎖 脂 肪 酸 の 作 用 機 構 を 明 ら か に す る た め に

CJ: Characterization of thymic stromal-derived

PAM 212 細胞を用いて解析した。最も活性が強かったもlymphopoietin (TSLP) in murine B cell development inのは炭素数５の valeric acid および isovaleric acid であっvitro. Eur. J. Immunol 26 , 10 – 16 , 1996 .

た。Isovaleric acid は足などの臭いの原因化合物である。

４）Liu Y-J: Thymic stromal lymphopoietin: master

類似化合物、ならびにこれまで明らかになっている脂肪酸

switch for allergic inflammation. J. Exp. Med. 203 , 269 –受容体アゴニストはいずれも TSLP 産生を誘導しないこと、

273 , 2006 .

GPCR を介する事、物理的刺激で放出される ATP にも活５）Soumelis V, et al. : Human epithelial cells trigger性が認められない事から、脂肪酸は未同定の受容体に作用

dendritic cell mediated allergic inflammation byしている可能性が示唆された。化学構造のわずかな相違により活性が大きく異なる事から、特異性の高い受容体を介producing TSLP. Nature Immunol. 3 , 673 – 680 , 2002 .
６）Ying S, et al.:Thymic stromal lymphopoietin

しているものと推測される。各種阻害剤の効果を検討した

expression is increased in asthmatic airways and

結果、PKC、ERK ならびに NF-kB の活性化が関与していcorrelates with expression of Th 2 -attracting− 156 −

天然由来石鹸に含まれる脂肪酸による TSLP 産生とアレルギー誘発作用

chemokines and disease severity. J. Immunol. 174 ,susceptibility to bronchial asthma. Am. J. Resp. Cell

8183 – 8190 , 2005 .

Mol. Biol. 44 , 787 – 793 , 2011 .

７）Yoo J, et al. : Spontaneous atopic dermatitis in mice11）Segawa R, Hirasawa N: Exacerbation of allergic

expressing an inducible thymic stromal lymphopoietin

diseases by chemical s: roles of thymic stromaltransgene specifically in the skin. J. Exp. Med. 202 ,lymphopoietin. J. Pharmacol. Sci. 2015 , in press
12）Satou N, et al. : Induction of thymic stromal

541 – 549 , 2005 .
８）He R, et al. : TSLP acts on infiltrating effector T cells

lymphopoietin production by xylene and exacerbation

to drive allergic skin inflammation. Pro. Natl. Acd. Sci.

of picryl chloride-induced allergic inflammation in mice.
Int. Archs Allergy Immunol. 157 , 194 – 201 , 2012 .

USA 105 , 11875 – 11880 , 2008 .
９）Al-Shami A, Spolski R, Kelly J, Keane-Myers A,13）Yamashita S, Segawa R, Satou N, Hiratsuka M,Leonard WJ: A role for TSLP in the development ofLeonard WJ, Hirasawa N: Induction of thymic stromal

inflammation in an asthma model. J. Exp. Med. 202 ,lymphopoietin production by nonanoic acid and829 – 839 , 2005 .

exacerbation of allergic inflammation in mice Allergol.

10）Harada M, et al. : Thymic stromal lymphopoietin

Int. 62 , 463 - 371 , 2013 .

gene promoter polymorphisms are associated with− 157 −