新規な構造を有するヒアルロン酸類似多糖の開発
東京工業大学生命理工学部

畑中

研

一

Syntheses of analogous polysaccharides to hyaluronic acid were attempted in order to better
understand the relationship between physical and biological properties and the chemicalstructure.
The polymerizable l,6-anhydro-2,4-di-0-benzyl-3-0-1- (methoxycarbonyl) ethy隅D-gluco ・pyranose (1) was synthesized by selective benzylation at C-2 and C-4 of l,6-anhydro-/3-D-gluco­
pyranose, followed by 1- (methoxycarbonyl) ethylation with methyl 2-chloropropionate.
Polymerization of 1 with phosphorus pentafluoride as initiator in methylene chloride at low
temperature under high vacuum gave a stereoregular (1→6)- a -D-glucopyranan derivative
Copolymerization of 1 and tri-0-benzylated monomer gave copolysaccharides having various
amounts of carboxylates. The calculated values of monomer reactivity ratios were 0.88 and 0.99
showing the distribution of each monomeric unit in the obtained copolymer was random.
恥drolysis of carboxylate groups was achieved by the reaction with potassium tert-butoxide,g1vmg the stereoregular polysaccharide containing the carboxylic acid. However, debenzylationof the polysaccharideヽ,;as unsuccessful.

1緒

言本研究では、ヒアルロン酸のどの様な化学構造が保水性や細胞との相互作用に関わっているのか

生理活性を有する機能性多糖の開発は最近の重（ヒアルロン酸様の生理活性を発現するためには要な課題であり、生体の応答性と密着した解析がどのような化学構造が最低限必要なのか）を詳細必要である。 しかしながら現在、機能性多糖の合に調べるため、アミノ基を有する糖とカルボキシ成法も未熟であり、生体との相互作用のメカニズル基を有する糖の共重合体を化学合成する。 化学

ムも未開発である。 本研究では、機能性多糖設計合成であるが故に、多糖ポリマ ー 鎖上における官による生体応答制御のモデル系として、 ヒアルロ能基の位置や分布を自由に変化させることができン酸類似多糖を化学合成し、皮膚との相互作用にるため、構造と機能の相関が（天然物と比べて）ついて調べる。

より明確にわかると思われる。

ヒアルロン酸は、Nーアセチルグルコサミンとグヒアルロン酸ナトリウムとして販売されているルクロン酸との交互共重合体構造を有するヘテロ粉末の市販品は、その水溶液の粘度や保湿性が分多糖であるが、細胞間隙に水を保持するのに役立子量によって異なることがわかっている。 また、ち、皮膚の澗滑性や柔軟性を保っていると考えら

ヒアルロン酸ナトリウムの保涅性は、周囲の環境れている。 皮下組織のヒアルロン酸が少なくなっ（相対湿度）の影響を受けにくいのが特徴であるてくると、皮屑にみずみずしさがなくなり、しわことが赤坂日出道氏らにより報告された . 2)がよってくる。

しかしながら、ヒアルロン酸の化学構造や高次構

l0造が保湿性に対してどのように影態するのかを調
Syntheses of New Analogous Polysaccharides

べた報告はない。 また、ヒアルロン酸類似の糖鎖

to Hyaluronic Acid

化合物を化学合成しようとする試みもなされていない。

Kenichi Hatanaka

糖質工学において、天然多糖の化学修飾は古く

Faculty of Bioscience andBiotechnologyから行われてきたが、精密構造を制御するまでにTokyo Institute of Technologyは至っていない。 一方、無水糖誘導体の開環璽合-46-新規な構造を有するヒアルロン醗類似多糖の開発やオルトエステルグリコシル化法といった優秀なで、位置特異的にカルボキシル基を持つ立体規則多糖合成法が開発されて以来、官能基を有する多性多糖を合成することであるため、ここではDー グ

糖合成は比較的容易に行われるようになった。 無ルコ ー スを出発原料として、モノマ ー の合成を行—

水糖誘導体のうちでは、l, 6 無水糖の重合が最もった。 1 , 6- /3 —無水環構造を持たせたのは、重合よく研究されていて、精密構造を有する機能性多反応における立体規則性の制御が容易であるとと糖合成の土台となっている。

もに、他の結合様式に較べて高い分子量のポリマ

本研究では、開環重合反応に及ぼす影響の小さーが得られることが予想されるからである。 すな

い C-3位に乳酸エステル基を導入し、多糖鎖を構

わちl, 6 — 無水糖の重合は完全にl, 6 — 開裂であり、築することによって、 ヒアルロン酸類似多糖を開反応を低温で行うとオキソニウムイオン機構で進発することを目的としている。

行し、立体 反転を伴ってa — 結合のポリマ ー を与える。 つまり、(l → 6)-a —結合の立体規則性多2実験

糖誘導体が得られるのである 4) 。 また、無水グル
コ ー スの3位に置換基を導入した背景には、重合・

2.

モノマ ー1

合成において3位の保護基の影態が最も小さいことが現在までに開環重合法によって合成された多糖知られているとともに、l. 6 — 無水グルコ ー スの2の種類はかなりの数に上る。 様々な糖残基の種類位と4位を簡単に選択的保護することができるとや結合様式のものはもちろん、水酸基を選択的にいう事実がある l は無水糖の重合における保護基保護することで種々の置換基を位置特異的に導入にはエ ー テル系保護基であるベンジル基が良好なすることも多く行われてきた

3)。 本研究の目的は、ものとして知られているため、ここでも同じ保護にあらかじめカルボキシル基を基を用いた。 ベンジル基は液体アンモニア中ナト保護した状態で導入し重合および共重合することリウムによる還元(Birch還元）で、短時間でモノマ ー ユニット

+ CH 3CHCOO
CH 3IClOBn'PF5')

NaH・・ ， >OMF t1nv -\'0Br
CH3CHCOOCH3t-BuOK...

-�Fig. 1. Synthesis and polymerization of 1,6-anhydro-2,4-di-O-benzyl-3-01-(methoxycarbonyl) ethyl-/3-D-glucopyranose and hydrolysis of
the obtained po I ymer.

-47-瓜合管定量的に脱保護することができる 5 . 6) 。
1,6—無水グルコ ー スの合成は、かつてはデンプ

真空ライン

ンや微結晶セルロ ー スの真空熱分解によって行わ4 にFraser-Reidが、6位トシれていた ” が、198年ル化後アルカリによって閉環させる方法 8) を開発
9)
し、1 989年に大量合成法が確立されたので、ここでもそれに従うこととした。 この方法の利点としては、遊離のDー クルコ ー スを原料として極めて安価な試薬で合成できること、また容易にスケ ールアップできることなどが挙げられる。 カルボキシル基（メチルエステルで保護）の導入は、オ ーソドックスなエ ー テル合成法により行った。 天然のムラミン酸にヒントを得た1- (メトキシカルボニル）エチル基 1 0 lを導入した(Fig. 1)。 水酸化ナトリウム6. Qgをn— ヘキサンで洗浄して、窒素気流下、ジメチルホルムアミド（乾燥、蒸留したもの）100mlに加え、しばらく懸濁させた後、2,4 ージ

Fig. 2. Polymerization apparatus.

ベンジル化1,6ー無水グルコ ー ス12. 0gを加え、 2
時間激しく撹拌した。 その後、 2 ークロロプロピオ

まれる水などの不純物を除去するために行った。）

ン酸メチル6. 0mlを滴下し、3時間反応させた。 反

次にEのブレ ー カブルシ ー ルを割って重合管をル添加によって行い、常法に従冷却し、重合溶媒となる塩化メチレンを導入してって後処理した後、シリカゲルカラム（酢酸エチEを切り離した。 溶液を均ーにしてから液体窒素

ル： n- ヘキサン=I: 4)により精製を行った。

で凍らせ、弱火で開始剤前駆体を熱分解させて、応停止はメタノー生じた五フッ化リンを重合管内に蒸着させた後、2. 2 重合および脱保護予め作製しておいた溶媒管を用いて、Fig.

触媒管を切り離して脱気しながら重合管を真空ラ2のインから切り離した。

ような重合装置を作製し、真空ラインに接続した。

所定重合温度に設定したエタノ ー ル恒温槽内でピンホ ー ルチェック、二回の加熱乾燥の後、窒素重合管を10分間激しく振とうし、重合反応を開始

気流下にてAを切断してモノマ ー化合物を導入、した。 一定 時間後、重合反応の停止は、重合管の同じく Bを切断して開始剤前駆体(p ークロロベン

一部を切断してメタノ ー ルを添加することで行っゼンジアゾニウムヘキサフルオロホスファ ー ト）た（この際ポリマ ー が生成していれば、白沈を生を導入し、それぞれ融封した。

じる）。 この溶液をクロロホルムに溶かし、10%一晩高真空下で乾燥してから真空ラインのコッ

炭酸水素ナトリウム水溶液で中和、脱イオン水でクを閉じ、 C のブレ ー カブルシ ー ルを割って重合三回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムによる乾燥、管を液体窒素で冷却、塩化メチレンを真空蒸留しろ過を行い、減圧濃縮した。 ポリマ ー をクロロホてモノマ ー を溶解させた。 溶液を均ーにしてからルム／メタノ ー ル系で再沈精製し、ベンゼン溶液1時間室温のまま放置、Cのアンプルを液体窒素でにして凍結乾燥を行った。

冷却して塩化メチレンをもとのアンプルに戻し、多糖ポリマ ー 鎖におけるカルボキシル基の脱保

凍 結させた状態で真空につ なぎ、Dのしぼり部

護は、水を含むTHF中のカリウムて 一 プトキシドにを融封した。 （この操作はモノマ ー 中に微量に含より行った。 また、液体アンモニア中のナトリウ-48-

新規な構造を有するヒアルロン俄類似多拙の開発

ム金属により脱ベンジル化を試みた。

ら二級ハロゲン化試薬に変えたことになるのであるが、結果として反応速度が著しく増大し、室温3結果と考察にて二時間後にはほとんど反応が終了した。 この反応に関して、以前、我々は光学活性な2-クロロ

3.

1

モノマ ー 合成

D クルコ

プロピオン酸を反応させた場合にラセミ化を伴っスを出発物質とする2,4 ジベンジルて反応が進行することを観察し、化合物 5 の生成体の合成は、酸化バリウムを作用させて得る既知反応がSN 1機構で進んでいることを証明した 1 O) 0ーの方法

11ーーに従って行った。 この化合物の3位に種一般の有機化学の教科書で述べられている通り、々の置換基を導入してカチオン開環重合性を検討

ハロゲン化アルキルのSN 1反応における反応性はした例は多く、様々な応用目的のもとに合成され第三級＞第二級＞第一級の順である。 これはカルている。 本研究ではまず、カルボキシル基を持たボカチオンの陽電荷を非局在化させる程度によっ)せることを目的に、メトキシカルポニルメチル基ている。 これを考慮すると、上記の反応はいずれの導入を、オ ー ソドックスなエ ー テル合成法によもSN 1機構をとる傾向にあり、カルボカチオンのり試みた。 反応溶媒にはジメチルホルムアミドお安定性の差が実際の反応速度および収率に反映しよびジオキサン、反応試薬にはクロロ酢酸メチルたと考えることかできる。 過去にメチル2— アセトおよびブロモ酢酸メチルを検討するとともに、反アミドー4,6- O —ベンジリデンー 2 — デオキシ ー a-D­

応条件として温度、濃度などを検討した。 しかしクルコピラノシドの 3 位にクロロ酢酸 1 2およびDL20回にも及ぶ予備試験を行ったもののなかなか収-2ークロロプロピオン酸 1 3) を反応させた例が報告

率の向上がみられず、むしろ全く反応しなかった

されているか、単純に比較はできないもののこのり精製困難な多くの生成物を与えたりということ場合も二級試薬のほうがはるかに収率か高くなっの方が多かった。 最終的にジメチルホルムアミドている。 今回ラセミ体の二級試薬を用いた合成で溶媒中でブロモ酢酸メチルを60℃で長時間反応さも収率は高く、1H-NMRスペクトルのアノメリックせるという手段をとり、なんとか収率を30%以上プロトンから判断すると、生成物はジアステレオにすることができたか、これも再現性は低かった。

マ ー 1 : 1 の混合物であった。

そこで、30%という低収率を改善すべく、次に反応試薬を2 ークロロプロピオン酸メチルに変え、3. 2重合、 共重合および脱保護

ジメチルホルムアミド溶媒中室温にて同様の反応

1, 6— アンヒドロ ー2,4ー ジー O ーベンジル —3-0 - 1を行った。 これはすなわちー級ハロゲン化試薬か（メトキシカルボニル）エチル — /3-Dー グルコピラノ

Table 1. Polymerization of 1,6-anhydro-2,4-di-0-benzyl-3-0-1(methoxycarbony I) ethyl- /3 -D-gl ucopyranose (1)"

No.

123M岱

Initiator

Temp.

TimeYield(mo!%)

（℃）

(h )

（％）

(x1Q4)

51510-60-60

゜1224244670

28.79.853a. Monomer concentration in d1ch1oromethane: 0.26-0.50 g/mL; imtiator: PF5.
b. Determined by GPC.

-49-

ース

ギュレ ー ションに相当（エクアトリアルCl-Hの変の単独重合性について は既に調べられているので、 まず既報 l 0) の結果を示す。 五フッ化リン角振動に由来）するピ ー クが認められることから、を開始剤として 重合を行うことにより、高収率得られた多糖誘導体は、a— グリコシド結合か( 61. 9-63. 7%)で高重合度（最高で平均重合度

ら成る立体規則性多糖誘導体、2,4 ー ジー O ーベンジ

4 00程度） の多糖誘導体が得られている。 得ら

ル ー3-0-1-(メトキシカルボニル）エチル ー (1→6)

れた多糖誘導体の立体規則性 は、 1 3C-NMRおよ-a-Dー グルコピラナンであると結論した。
次に、多糖鎖中のカルボキシル基含量が物性にび比旋光度からa —コンフィギュレ ー ションの及ぼす影響を調べることを目的として、カルボキ単一構造であると結論されている。 本研究でもこのカルボキシ ル モノマ

シル基含量の異なる種々のポリマ ー を共重合によー の単独重合を行い、Table 1に 示すような結果を得た。 前例よりもって合成した。 カルボキシル基を有するモノマ ー重合時間を短くすると、数平均分子量28. 7万といとトリベンジル化1, 6ー無水グルコ ー スとの共重合

う高分子量ポリマ ー を得ることができた。 これは、結果をTable 2に示す。 重合時間を短く、 収率重合時間が長くなると残存触媒によりボリマ ー 主を低く抑さえてあるのは、 モノマ ー の反応性を調鎖が切断されるということを示していると思われべるためである。 仕込みモノマ ー比を変化させるる。 大量にモノマーを仕込んだ重合の収率およびーことによって、カルボキシル基含量が14-100仕込％の共重合体を得た。Kelen-Tudos法により求み濃度が低かったこと、および開始剤の量が多かめたモノマ ー 反応性比は、0. 88と0. 99であり、共ったことが原因であると考えられる。 ここで、低重合体中の各モノマ ー ユニットは、 ほぼランダム得られたポリマーの分子量低下は、モノマ

1温における重合で得られたポリマ ー の 3C-NMRに分布していると言える。

スペク ト ルにおいてアノメリッ ク炭素 (C-1)がさらに、カルボキシル基を有する多糖誘導体の97. 4ppmのみに単一のピ ー クを与えていること、脱保護を試みた。 カリウムて 一 ブトキシドで処またIRスペクトルにおいて844cm-1にa—コンフィ理したポリマ ー の 1 H-NMRスペクトル中には、メチTable 2. Copolymerization of 1,6-anhydro-2,4-di-O-benzyl-3-0-1(methoxycarbonyl) eth-;.1-{3-D-glucopyranose (1) with 1,6anhydro-2, 3, 4-t ri-0-benzy I- /3 -D-glucopyranose (2)'

No.

1234
56
78
1011

Mole fri:).ct1on of 1 m feed（％）

゜

1020
30

40

50
60
70
80

90

100

Yield（％）

Mole fraction of 1 in copolymerb
（％）

68.0
3.2
3.8
7.0
18.5
13.9
12.0
6.6
9.0
8.2
11.4

0.0
14.5
23.2
33.3
37.8
48.8
59.0
70.4
75.3
89.7
100.0

a. Total monomers, 1.17 mmol; initiator: PF5, 5 mo!%; solvent:dichloromethane, 1 mL:temperature, -60 ° C; time: 1-9 min.
b. Determined by lH NMR spectroscopy.
-50-新規な構造を有するヒアルロン俄類似多糖の開発

ル エ ステルに帰属されるメチルプロトンの吸収がのかさ高さ（立体障害）によってf3 ーグリコシド結消失し、 エ ステルの加水分解が完全に起こってい合からなるオリゴ糖誘導体 （平均重合度5-7)をることを示した。 カリウム塩とした多糖は、モノ与えることがわかっている。 このフタルイミド基

マーはヒドラジン一水和物を用いて容易にアミノ基にユニット当たり2個のベンジル基を有してい変換することができる 14) 。

るにもかかわらす水溶性で、有機溶媒には不溶で予備的な実験では、アミノ基を有するユニットあった。
チ還元による脱ベンジル化は、現在までのとカルボキシル基を有するユニットがほぽl : lのところ成功していない。 前記のようにエステル加割合でランダムに存在するコポリマ ー を得ること水分解生成物が水にしか溶解しないため、適当なができた。 詳しい構造については現在検討中であ反応溶媒がなく、不均一 系となってしまうためでる。

バーある。 また、 エ ステル加水分解前のポリマ

ーは有4機溶媒可溶であるが、還元反応中に エ ステル基が括

総アルコ ルにまで還元されてしまったのである。
ーl, 6 —無水糖誘導体の開環重合および共重合によ

現在、接触水添による脱ベンジル化について検討って、カルボキシル基を種々の割合で持つ多糖を、中である。

かなり自在に設計して合成できるようになった。
3. 3

アミノ基前駆体を有するモノマ ー としかしながら、脱保護がうまくいってないため、の共重合

当初の予定であった保湿性と化学構造の相関を調

前述のように、ヒアルロン酸にはグルコサミンべるまでには至っていない。 今後、脱ベンジル化残基が含まれている。 ウロン酸ユニットとアミノの方法を確立しなければならない。 あるいは、ベ糖ユニットとの交互共重合体であることから、事ンジル基以外の保護基を検討する必要があるのか実上50%のアミノ糖含有率ということになる。 今もしれない。 一方で、アミノ糖前駆体モノマ ー とまでに行われたグリコサミノグリカンの構造活性の共重合が成功したことにより、ヒアルロン酸類相関に関する研究はすべて交互共重合体であるこ似多糖の合成は期待できると考えられる。とを前提として話を進めているので、アミノ基およびアセトアミド基の活性に対する存在的必然性

参考文献

は、これまでほとんと議論されたことがなかった。

l)

井武夫、日本化粧品技術者会誌、22 35(1988)

そこで各官能甚の存在量比が活性にどれだけ影響
2)するかを調べる場合、カルボキシル基のユニット

42(1986)3) 瓜生敏之、畑中研一、有機合成化学協会誌、サンプルが必要となる。 そのような多糖サンプル

42 557 (1984)

は、現在のところ開環重合法でしか得ることがで

4) N. K. Kochetkov,

きないと考えてよい。
ーTetrahedron., 43 2389(1987)

本研究では2位にアミノ基前駆体を導入した重と前述のカルポキシルモノマ

赤坂日出道、山口敏二郎、フレグナンスジャー ナル、14とアミノ基のユニットとの相対含量を変化させた

合性モノマ ー

赤坂日出道、瀬戸進、柳光男、福島正二、光5) T. Uryu,とのPrag. Polym. Sci., 18 717 (1993)

6) E. R. Ruckel and C. Schuerch, Biopolymers.,

共重合によって、合成多糖鎖中にアミノ基を有す

5 515 (1967)

るユニットとカルボキシル基を有するユニットを7)瓜生敏之、畑中研 一 、阪本吉弘、針間 一 成同時に持たせることに挑戦した。

萩野新、伊藤克博、船本明士、松崎啓、日本

2位にアミノ基前駆体であるフタルイミド基が化学会誌、10 1638 (1982)

導入されたモノマ ー は、単独重合において置換基-51-8) M. Georges and B. Fraser-Reid, Carbohydr.
Res., 127 162 (1984)
9) M.A.Zotto la, R.Alonso, G.D.Vite, andB. Fraser-Reid,]. Org. Chem.,

54 6123(1989)
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Soc. Jpn.,. , 41 2723 (1968)
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H. Kuzuhara, and K. Hatanaka, ]. Carbohydr.
Chem., in press.

Can. ]. Chem.,

J-52-