積層型ナノカプセルを用いたコスメティックデリバリーシステムの開発
慶應義塾大学理工学部

福井有香

In this research, we carried out internal and surface modifications of liposomes to prepare nanosized capsules withvarious functional properties including improved incorporation of active agents and controlled release of cargo in response
to external stimuli. For internal modification of liposomes, anionic polymers were generated within liposomes by living
radical polymerization. The obtained nanocapsules showed good absorption and retention of chemical substances dependingon the binding ability to the incorporated polymers, and the absorption capacity could be controlled by the length anddissolved state of the polymer chains. In addition, surface modification of liposomes was carried out by the layer-by-layer
deposition of enzymes and polysaccharides to prepare capsule walls with enzymatic degradability. First, lysozyme (Lyso)and phosphorylated chitosan (PCHI), which is cleavable by Lyso, were deposited over the liposome. Then, hyaluronic acid(HA) was deposited as an outermost layer. The degradation of the inner layer consisting of PCHI allowed the release of theoutermost layer consisting of HA. Also, degradation of the PCHI layer led to the exposure of the lipid membrane, whichfacilitated the release of cargo from the inner cavity of the liposome. We expect that polymer-deposited nanocapsules would
open up application potential as a carrier for delivery of active agents to the targeted skin region.

１．緒

よって、カプセルの表面状態を段階的に変化できることを言報告している 3）。この研究から、カプセル層の環境に応答

ナノサイズのカプセルは、組織への浸透性に加えて、カした再構築によって、物質放出の促進や目的部位に対するプセル層と内部のキャビティへの物質の保持能を有しておアフィニティの表面提示といった新しい機能発現の可能性り、細胞、組織、皮膚、頭皮、毛髪などをターゲットとしが示された。
本研究では、リポソームとポリマーの複合ナノカプセルたキャリア素材として注目されている。中でも、リン脂質分子からなる閉鎖小胞（リポソーム）は、生体安全性に優れ、 （リポナノカプセル）の化粧品用キャリア素材への応用展開
中空部（水相）には水溶性の物質と脂質膜部には脂溶性の物に向けて、リポナノカプセルの①表面と②内部の改質によ質を同時に封入可能で、医薬品、化粧品および食品用のカる機能開拓に挑戦した。図 1 に示すように、まず、①リポプセル素材として応用研究が行われている。これまでに申ソーム表面にバイオポリマーとその分解酵素を積層化する請者らは、リポソーム表面に天然物質（ポリマーおよびミことで、皮膚近傍の環境に応答して、積層膜の分解・剥離ネラル）を積層（layer-by-layer, LbL）することで、全てバを起こすことによって、リポソーム内部とカプセル層からイオ由来素材からなるカプセル素材（リポナノカプセル）のの有効成分の放出について検討を行った。さらに、②リポ開発を行ってきた 1 , 2）。この方法は、ポリマーの種類や吸ソームの内部にポリマーを複合化することで、ポリマーと着の量・形態・分布の調節から、吸着層の厚み、組成など、のアフィニティを利用した有効成分の保持能の付与を行っナノスケールにおける積層構造の精密なデザインが可能でた。

あり、膜安定性、分散安定性、物質保持能、標的指向性な

２．方

どの機能を組み込むこと（機能プログラミング）も可能である。また、この積層構造に着目した機能設計として、カプ法

2 . 1. リポソーム表面への積層膜の構築膜の構築

セル層の分解・剥離による担持物質の放出、表面性状の変アニオン性リン脂質であるDilauroyl phosphatidylacid（DLPA）化、および内包物の放出について検討を始めている。実際と 中 性 リ ン 脂 質 で あ る Dimyristoyl phosphatidylcholineに、カプセル層にバイオポリマーとその分解酵素を組み合（DMPC）を用いて、単純水和法とエクストルージョン法

わせることで、酵素によるバイオポリマーの分解と剥離に（pore size: 100nm）
により、アニオン性のリポソーム（Lipo）を作製した。カチオン性多糖であるキトサン（MW: 8 . 2 ×
104 Da, pKa= 6 . 5）にリン酸基を導入するために、メタン

P repa rat ion of Poly mer- depo sited
Nanocapsules for Cosmetic Delivery
SystemYuuka Fukui
Faculty of Science and Technology,Keio University

スルホン酸存在下で五酸化二リンを反応させてリン酸化キトサン（PCHI）を合成した。次に、PCHI がカチオン性を示す pH 3 . 0 において、アニオン性リポソーム（Lipo）の表面に PCHI の吸着を行った（Lipo-PCHI）。PCHI の吸着量は、アミノ基の定量法であるフルオレスカミン法を用いて測定した。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 1 リポソームの表面と内部へのポリマー複合化によるリポナノカプセルの作製とコスメティックデリバリーシステムへの応用

pH 7 . 4 において、
Lipo-PCHI の表面にLyso（pI: 11 . 10 ~ 11 . 35）

2 . 3 . リポソーム内部へのポリマー複合化と物質保持機能の付与の吸着を行った（Lipo-PCHI-Lyso）。Lyso の吸着量は蛍光2 . 1 . 項と同様の方法でアニオン性のリポソーム（Lipo）ラベル化した Lyso によって定量した。さらに、この表面を作製した。次に、リポソーム内部に光リビング開始が正電荷を示す条件において、アニオン性のヒアルロン酸剤であるイニファーターとアニオン性モノマーである（HA）の吸着を行った（Lipo-PCHI-Lyso-HA）。得られたカ2 -acrylamido- 2 -methyl-sulfonic acid（AMPS） を 封 入

プセルについて、動的光散乱法による水中粒径測定、電気し（AMPS-in-Lipo）、UV 照射（高圧水銀灯）による光リ

次に、PCHI の分解酵素としてリゾチーム（Lyso）を選択し、泳動光散乱法によるゼータ電位測定、さらに透過型電子顕ビングラジカル重合を行った。得られた AMPS ポリマー

微鏡（TEM）による形状観察を行った。

（PAMPS）内封リポソーム（PAMPS-in-Lipo）について、水中粒径測定、ゼータ電位測定、および TEM による形状

2 . 2 . 積層膜の分解・剥離に伴う物性の変化と内包物質の放出観察を行った。次に、内部の PAMPS を利用した物質のLyso による PCHI の酵素分解性を評価するため、Lipo-

討 す る た め に、PAMPS-in-Lipo 分 散 液 に カ チ オ ン 性 物

PCHI-LysoとLipo-PCHI-Lyso-HAを種々のpH条件下（pH5.0,質（Rhodamine 6 G（Rho 6 G）、Acridine Orange（AO）） と吸収と保持について検討を行った。まず、吸収挙動を検6 . 2 , 7 . 4）において、37 ℃で 24 時間インキュベートした。

ア ニ オ ン 性 物 質（Hydroxypyrene- 3 , 6 , 8 -trisulfonic acid

その後、分解によって生じた PCHI 断片を回収し、フェリシ（HPTS））を加え、種々の条件でインキュベーションを行

アン化カリウムを用いて PCHI の還元末端を検出した。また、った。遠心分離によって PAMPS-in-Lipo を回収した後、酵素分解後にLipo-PCHI-Lyso-HAの分散液を透析すること界面活性剤を加えて PAMPS-in-Lipo を崩壊させて、封入で、剥離した HA を回収し、ゲル浸透クロマトグラフィ法された各蛍光物質の定量を行った。

（GPC）によって分子量の測定を行った。次に、酵素分解前

３．結後の膜物性評価として、1 , 6 -diphenyl- 1 , 3 , 5 -hexatriene（DPH）を用いて、蛍光偏光解消測定により脂質膜の流動

果3 . 1. リポソーム表面への積層膜の構築性を評価した。次に、アニオン性の蛍光物質の HPTS を封作製した PCHI は両性（pI= 5 . 0）であり、低 pH で正電荷、入した Lipo を作製し、その表面に PCHI、Lyso および HA

高 pH で負電荷を帯びる。そこで、アニオン性の Lipo（粒径：を積層化した後、種々の条件下で酵素分解を行い、放出さ90 ± 31 nm）に対して、PCHI が正電荷を帯びる pH 条件におれた HPTS の蛍光強度測定より、放出量を算出した。

いて吸着を行ったところ、仕込みの PCHI 濃度に応じて、吸着量が増大した（Lipo-PCHI）。飽和吸着となるように作製した Lipo-PCHI の粒径は、90 ± 31 nm から 141 ± 30 nm と大− 74 −

積層型ナノカプセルを用いたコスメティックデリバリーシステムの開発で 24 時間静置したところ、Lyso の至適 pH（pH 5 . 0 - 6 . 0）付近においてともに PCHI の分解が促進された。Lipo-PCHILyso については、ゼータ電位（pH 6 . 2）が + 4 . 5 ± 4 mV から- 45 ± 2 mV と正から負に反転した。これは、表面から PCHI断片が剥離して、脂質膜が露出したことによると考えられた。次に、Lipo-PCHI-Lyso-HA については、酵素分解によって HA 断片が剥離し、低分子量化していることが確認された。HA は分子内に、Lyso の基質である N- アセチルグルコサミン残基を有しているため、Lyso によって分子が図 2 異なる pH 条件下における各種ナノカプセルのゼータ電位切断される。これらの結果から、酵素分解によってカプセル層に担持した物質の放出が可能であることを見出した。
次に、3 . 1 . 項で作製したナノカプセルの酵素分解に伴きくなった。また、ゼータ電位は pH とともに正から負へう膜物性評価を行った。脂質膜の流動性による影響につと変化し、両性を示すことがわかった（図 2、緑色）。そこで、いて、蛍光プローブである DPH を用いて、蛍光偏光解消

Lipo-PCHI が負電荷を帯びる条件（pH 7 . 4）において、Lyso測定により検討した。DPH は長い棒状の分子であるため、の吸着を行ったところ、Lyso の仕込み濃度に応じて吸着脂質分子の分子軸に沿って配向する。脂質の運動が束縛さ量が増加することがわかった（Lipo-PCHI-Lyso）。カプセれている場合は、DPH の蛍光偏光（蛍光異方性）は保たれ、2ル表面の 100 nm 当たりに 1 . 4 個の Lyso が吸着した Lipo-脂質の運動性が上がると蛍光偏光は素早く解消される。各

PCHI-Lyso において、粒径は 169 ± 32 nm となり、等電点

種ナノカプセルに DPH を加えて、蛍光偏光解消を測定しはLipo-PCHIよりも高pH側にシフトすることがわかった（図たところ、リポソームでは、昇温すると 35 - 45 ºC で蛍光２、黄色）。次に、Lipo-PCHI-Lyso が正電荷を示し、Lyso異方性の急激な減少が見られた（図 3）。これは、この温度の至適 pH より低い pH 2 . 0 において、アニオン性の HA の領域で脂質膜のゲルから液晶への転移が起こり、膜内の吸着を行ったところ、粒径は 124 ± 62 nm となり、ゼータDPH の運動性が上がったことによると考えられる。一方、電位は負に反転した（Lipo-PCHI-Lyso-HA）。また、得ら

Lipo-PCHI-Lyso（酵素分解前）と Lipo-PCHI-Lyso-HA（酵素れた Lipo-PCHI-Lyso-HA は、いずれの pH 環境においても分解前）については、広い温度領域において蛍光異方性はHA 由来の負電荷を呈するようになった（図２、赤色）。こ高い値となり、リポソームと比較して膜流動性が低い状態

れより、表面が HA で覆われたことが示された。TEM 観となっていることがわかった。これは、脂質膜表面へポリ察より、作製したナノカプセルはリポソーム由来の球形でマーが吸着することで、脂質膜の流動性が低下したことに中空構造を維持していた。

よると考えられる。さらに、Lipo-PCHI-Lyso と Lipo-PCHILyso-HA について、Lyso の至適条件（pH 6 . 2 , 37 ℃）近傍

3 . 2 . 積層膜の分解・剥離に伴う物性の変化と内包物において 24 時間インキュベートを行ったところ、脂質膜質の放出のゲル－液晶相転移が明確に観察されるようになり、蛍光

次に、酵素によるカプセル層の分解を確認するため、異方性が低下した。このことから、カプセル層の酵素分解

Lipo-PCHI-Lyso と Lipo-PCHI-Lyso-HA を種々の pH 条件下によって膜流動性が増大することが示された。

図 3 蛍光偏光解消測定による各種ナノカプセルの膜流動性の評価− 75 −コスメトロジー研究報告 Vol. 30, 2022

図 4 異なる pH 条件下における Lipo-PCHI からの HPTS 放出挙動

図 5 異なる pH 条件下における Lipo-PCHI-Lyso からの HPTS 放出挙動

次に、カプセル層の酵素分解に伴う物質の放出について検討を行った。Lipo に蛍光物質である HPTS の封入を行った後、カプセル層の構築を行った。Lipo の場合には素早い放出が見られ、24 時間後には放出率が 60 % に達した。
一方、Lipo-PCHI では pH によらず放出は 5 % 以下に抑制された（図 4）。上述したように、リポソーム表面にポリマーを被覆することで、脂質膜の流動性が低下するため（図 3）、内封物質の物質透過性が低下したことによると推察している。Lipo-PCHI-Lyso については、Lyso の至適条件（pH 5 . 0 6 . 0）近傍において放出の促進が見られ、pH 6 . 2 では、24時間後に 10 %、48 % 時間後に約 50 % の放出が観察された（図 5）。同様に、Lipo-PCHI-Lyso-HA についても、放出の促進が見られた。酵素分解による PCHI と HA の分解と剥離

図 6 各種ナノカプセルの Rho6G 封入量に伴って脂質膜の流動性が増大し（図 3）、カプセル層の物質透過性が増大したことによると考えられる。

3 . 3 . リポソーム内部へのポリマー複合化と物質保持
4）
機能の付与
次に、リポソーム内部においてリビングラジカル重合によってポリマーを生成し、このポリマーとのアフィニティを利用した物質のカプセル内への封入を行った。リビングラジカル重合は、開始点（開始剤）の数と重合時間により、

図 7 Rho6G 封入ナノカプセルを遠心濃縮した後の写真

ポリマーの数、鎖長および化学組成を精密に制御することが可能である。1 H NMR 測定より PAMPS の生成が確認でき、重合時間が 300 分の場合の分子量は 36 , 000 g/molと算出された。また、重合前後においてカプセルの粒径ポソームと重合する前のリポソーム（AMPS-in-Lipo）と比は 84 ± 26 nm から 84 ± 29 nm、ζ- 電位は ‒ 46 ± 6 mV から較して、PAMPS-in-Lipo への吸収量は高い値となった（図‒ 42 ± 4 mV となり、TEM 観察から球形で中空構造を維持6）。また、重合時間（ポリマー鎖長）を 150 分から 380 分したままであることが確認された。にすることで吸収量が増加することもわかった。AMPS-

作 製 し た PAMPS-in-Lipo へ の ア ニ オ ン 性 の HPTS のin-Lipo に比べて PAMPS-in-Lipo の方が濃く染まること吸収については、未処理のリポソームよりも PAMPS-in-が観察できた（図 7）。また、図 6 より、PAMPS-in-Lipo（重Lipo の方が低い値となった。これは、内部の PAMPS によ合時間：380 min）内部の Rho 6 G 濃度は、外水相の約 70 倍

る静電反発によって HPTS の吸収が抑制されたと考えていとなり、内部のポリマーによって物質を高濃度に封入できる。一方、カチオン性物質の吸収については、未処理のリることがわかった。

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積層型ナノカプセルを用いたコスメティックデリバリーシステムの開発

４．総ィックデリバリーシステムの開発が期待できる。

括

本研究では、リポソームの表層と内部にポリマーを複合謝

本研究にご支援をいただきました公益財団法人コーセー化することで、カプセル層の分解と剥離による表面性状の変化と物質の放出を可能とする機能性ナノカプセルの創製、

辞

コスメトロジー研究財団に深く御礼申し上げます。

さらに内部への有効成分の濃縮を行った。すなわち、リポソーム表面にバイオポリマーとその分解酵素を積層化することで、皮膚表面の弱酸性環境に応答して、封入物質の放（引用文献）
1） Fujimoto, K., Toyoda, T., Fukui, Y., Macromolecules,

出とカプセル層からの有効成分（HA）の放出を調節するこ40, 5122-5128（2007）．とが可能となった。また、粒径約 100 nm のリポソーム内

2） Fukui, Y., Fujimoto, K., Langmuir, 25, 10020-10025

部において、アニオン性ポリマーを複合化することで、外（2009）．

水相に添加したカチオン性の化合物を内部に濃縮可能であ

3） Fukui, Y., Otsuka, H., Fujimoto, K., Polymer Journal,

ることを見出した。以上のように、リポソームと複合化するポリマーの種類と組み合わせを選択することで、目的・

51, 1223-1230（2019）．
4） Fukui, Y., Fukui, A., Fujimoto, K., Polymer Journal,

用途に応じたカプセル素材の構築が可能であり、皮膚内の目的部位に有効成分を効果的にデリバリー可能なコスメテ− 77 −

published online.