【研究報告】（自然科学部門）

細胞間マグネシウム透過型チャネルの異常による腎不全発症機序の解明

五 十 里

岐阜薬科大学薬学部緒言彰教授がかりになると考えた。本研究では、腎不全の新規発症

腎臓の尿細管は、糸球体でろ過された電解質や栄養素機序の解明を目指し、ヒトクローディン-16 の細胞内局を再吸収することにより、体内濃度を一定に保つ働きを在調節機構と、クローディン-16 が尿細管細胞の機能に有する。高血圧や糖尿病などの生活習慣病の患者は、腎及ぼす影響について検討した。

不全を併発することが多いが、有効な治療法は見つかっていない。日本国内では、末期腎不全で透析を受ける患実験方法

者数が 30 万人を超え、超高齢化社会の到来とともに透1.

ベクターの調製析患者数のさらなる増加が懸念される。腎不全の発症機

ヒト腎臓の mRNA から調製した cDNA を用いて、PCR序の解析において、トランスフォーミング増殖因子-β や法により FXYD2 cDNA を増幅後、pMAL-c5x ベクター

血小板由来増殖因子などのサイトカインが糸球体硬化や（New Englad BioLabs）、pEGFP ベ ク タ ー（Clontech）、腎間質の繊維化を促進させ、腎不全を発症・進行させる

pCMV-Tag3 ベクター（Stratagene）にサブクローニンことが報告されている。しかし、サイトカインの分泌異グした。ヒトクローディン-16 を含む pFN21A ベクター

常機構や他因子の関与については不明なままである。

（Kazusa DNA Research Institute）を鋳型として、PCR高カルシウム尿症と腎石灰化を伴う家族性低マグネシ法により長鎖クローディン-16 と短鎖クローディン-16ウム血症（FHHNC）の患者は、腎尿細管におけるマグcDNA を増幅後、pCMV-Tag2 ベクターにサブクローニネシウム再吸収の異常を呈し、思春期までに約 3 分の 1ングした。

が末期腎不全に陥る。これまでに我々は FHHNC の原因
2.

遺伝子として同定されたクローディン-16 が、細胞間マ

酵母ツーハイブリッド法1）

グネシウムチャネルとして機能することを報告した 。

ヒトの腎臓から抽出した mRNA を鋳型として、PCR

さらに、FHHNC 患者で同定されたクローディン-16 の法でクローディン-16 のアミノ基側細胞質領域を増幅し変異体や、食塩感受性高血圧発症ラットで同定した脱リた。PCR 産物を酵母発現ベクターに組み込み、接合実ン酸化型クローディン-16 が、本来分布すべき細胞間接験に使用した。ヒトの腎臓 cDNA ライブラリーから作着装置から解離して細胞質内に分布することを解明し成したベクターとクローディン-16 アミノ基側細胞質領2–4）。このようにクローディン-16 のマグネシウムチャ域を組み込んだベクターを含む酵母を接合させ、寒天培ネルとしての働きと細胞内局在の調節機構が明らかに地で培養した。コロニーからプラスミド DNA を抽出なった。FHHNC 患者にはマグネシウムが経口または静注後、シークエンス解析を行って遺伝子配列を決定した。

で投与され、低マグネシウム血症が治療される。それにBLAST サーチを用いて、遺伝子配列に対応するタンパも関わらず腎不全を発症するため、低マグネシウム血症ク質を同定した。

ただけが腎不全の原因になるのではなく、クローディン-163.の発現や細胞内局在の異常も、腎不全の発症に関与するリコンビナントタンパク質の作成とプルダウンアッセイという仮説を立てた。また、クローディン-16 ノックア
ウトマウスは、低マグネシウム血症を呈するが腎不全をFXYD2/pMAL ベクターと NHE1/pMAL を大腸菌に起こさないことから、ヒトとマウスのクローディン-16形質転換後、Overnight Express（Novagen 社）を用いの構造および機能の違いが、腎不全の発症機序解明の手てマルトース結合タンパク質融合 FXYD2 タンパク質1

五 十 里彰（MBP-FXYD2）と MBP 融合 NHE1 タンパク質（MBP-た。バンドの検出には、ECL ウエスタンブロッティン

NHE1）を調製した。イヌ腎臓由来の MDCK 細胞に短グ 検 出 試 薬 お よ び C-DiGit Blot Scanner（LI-COR 社）

鎖クローディン-16 と長鎖クローディン-16 を発現させ、を使用した。

細胞ライセート、グルタチオンビーズ、MBP-FXYD2蛍光免疫染色8.

または MBP-NHE1 を混合して一晩インキュベートし細胞をカバーガラス上に培養し、メタノールで固定した。ビーズに結合したタンパク質を抽出し、ウエスタンた。0.2％ Triton X-100 で膜の透過処理を行い、4％ ブブロットに使用した。

ロックエースでブロッキングした。各種一次抗体を一晩腎尿細管上皮細胞の培養とトランスフェクションインキュベート後、Alexa Fluor 488 と 555 を室温で 1.5

MDCK 細胞を、DMEM（5％ fetal bovine serum 含）

時間インキュベートした。LSM700 共焦点レーザー顕微で培養し、3〜4 日ごとに 0.25％トリプシン溶液を用いて鏡（Zeiss 社）を用いて、タンパク質の細胞内局在を調継 代 し た。Lipofectamine 2000（Life Technologies 社）

べた。

4.

を用いて、プロトコールに従ってベクターをトランス細胞間透過性の評価

9.

フェクションした。24〜48 時間後にウエスタンブロッ細胞をトランスウェルに播種後、コンフルエントの状ト、蛍光免疫染色、細胞間透過性実験に使用した。

態 に な る ま で 培 養 し た。Millicell-ERS epithelial volt5.

細胞ライセートの調製と免疫沈降

ohmmeter（Millipore 社）を用いて、上皮膜間電気抵抗細胞を PBS で 2 回洗浄後、セルスクレーパーで掻き集値（TER）を測定した。トランスウェルの面積で補正めてマイクロチューブに移し、5,000 rpm、4℃で 2 分間後、空のトランスウェルにおける TER 値を差し引くこ

遠 心 し た。 上 清 を 除 去 後、lysis buﬀer（1％ Tritonとによりサンプルの TER 値（Ω · cm2）を算出した。まX - 100、150 mM NaCl、1 mM EDTA、20 mM Tris -た、xylidyl blue-1（XB-1）を用いて、管腔側から血管HCl、pH 7.4、0.1％ SDS）で懸濁し、20 秒間のソニケー側への上皮膜間マグネシウム透過性を測定した。

ションにより細胞膜を破壊した。その後、8,000 rpm で5 分間遠心して得られた上清画分を細胞ライセートとし結て使用した。免疫沈降では、細胞ライセート、プロテイ

1.

果
長鎖クローディン-16 のアミノ基側細胞質領域に結合するタンパク質の探索

ン G-セファロース、抗 FLAG 抗体を混合して一晩イン
キュベート後、遠心と RIPA バッファーによる洗浄を 3

ヒトのクローディン-16 には、ラットやマウスと比較回繰り返し、得られた沈降物をウエスタンブロットに使して同程度の大きさのもの（短鎖クローディン-16）と、用した。

アミノ基側領域が長いアイソフォーム（長鎖クローディン-16）が存在する（図 1）。長鎖クローディン-16 のアミ6.

ビオチン化ノ基側領域を組み込んだベクターを用いて、酵母ツーハ

細 胞 を PBS で 2 回 洗 浄 後、0.5 mg/mL sulfo-NHS-

イブリッド法により結合タンパク質を探索したところ、biotin 溶液でインキュベートし、細胞表面に分布するタFXYD2 と NHE1 が同定された。本研究では、FXYD2ンパク質をビオチン標識した。細胞を溶解後、ストレプが長鎖クローディン-16 の細胞内局在と NHE1 の機能にトアビジンビーズを用いてビオチン標識タンパク質を共及ぼす影響を検討した。

沈降し、ウエスタンブロットに使用した。
2.
7.

SDS-PAGE とウエスタンブロット

長鎖クローディン-16 と FXYD2 の結合
ラットとヒトの腎臓から抽出されたタンパク質を用い7.5％、10％または 15％ポリアクリルアミドゲルを用て、ウエスタンブロット法によりクローディン-16 の発いて電気泳動を行った。ゲルから PVDF 膜へタンパク

現 を 確 認 し た。 ヒ ト で は 23 kDa 付 近 と 30 kDa 付 近 に質を転写後、一次抗体で一晩インキュベートした。ブ

2 本のバンドが検出された（図 2A）。23 kDa 付近のバンロッキングには 2％スキムミルクを使用した。一次抗体

ドはラットと同じ位置であるため、ヒト短鎖クローディを洗浄後、二次抗体を室温で 1.5 時間インキュベートしン-16 であると考えられた。一方、30 kDa 付近のバンド2

細胞間マグネシウム透過型チャネルの異常による腎不全発症機序の解明

図1

ヒトのクローディン-16 のスプライスバリアント

ヒ ト の ク ロ ー デ ィ ン-16 に は、 長 鎖（L-CLDN16） と 短 鎖（S-CLDN16）の 2 種類のスプライスバリアントが存在する。

図3

クローディン-16 の細胞内局在に対する FXYD2 の影響（A）MDCK 細胞に L-CLDN16 と S-CLDN16 を発現させたところ、ウエスタンブロットにより目的サイズにバンドが検出された。
（B）MDCK 細胞に L-CLDN16 と S-CLDN16 を FXYD2-GFPと 共 発 現 さ せ、CLDN16 と FXYD2 の 結 合 を 調 べ た。（C）
MDCK 細 胞 に L-CLDN16 と S-CLDN16 を FXYD2-GFP と 共 発
現させ、蛍光免疫染色により細胞内局在を調べた。
図2

長鎖クローディン-16 と FXYD2 の結合（A）ラットとヒトの腎臓から抽出されたタンパク質を用いて、ウエスタンブロットを行った。ローディングコントロールとして β-アクチンを用いた。（B）MDCK 細胞に FLAG タグを融合
し た L-CLDN16 と S-CLDN16 を 過 剰 発 現 さ せ、MBP ま た は
MBP-FXYD2 とともにプルダウンアッセイを行った。MBP 抗体で MBP-FXYD2 のサイズを確認した。

結合することが明らかになった（図 2B）。
3.

長鎖クローディン-16 の細胞内局在に対する FXYD2の影響
MDCK 細胞に長鎖および短鎖クローディン-16 をトラ

は、ラットでは検出されなかったためヒト長鎖クローン ス フ ェ ク シ ョ ン し た と こ ろ、 そ れ ぞ れ 30 kDa とディン-16 であると考えられた。次に、クローディン-16

23 kDa 付 近 に 一 本 の バ ン ド が 検 出 さ れ た（図 3A）。と FXYD2 の結合を調べるため、プルダウンアッセイをFXYD2-GFP を共トランスフェクションし、クローディ実施した。長鎖および短鎖クローディン-16 を MDCK 細ン-16 との結合を調べたところ、長鎖クローディン-16 と胞に発現させ、大腸菌で調製した MBP-FXYD2 との結結合したが、短鎖クローディン-16 と結合しなかった合を調べたところ、長鎖クローディン-16 が FXYD2 と（図 3B）。蛍光免疫染色により短鎖クローディン-16 と長3五 十 里

彰

鎖クローディン-16 の細胞内局在を調べたところ、短鎖GFP 共発現細胞で、TER とマグネシウム透過性を有意クローディン-16 はタイトジャンクションの裏打ちタンに低下させた。

パク質である ZO-1 とともにタイトジャンクションに局
長鎖クローディン-16 と NHE1 の結合5.

在したが、長鎖クローディン-16 は主に細胞質に分布した（図 3C）。FXYD2-GFP を共トランスフェクションしクローディン-16 と NHE1 の結合を調べるため、プルたところ、FXYD2 とともに短鎖クローディン-16 は細胞ダウンアッセイを実施した。長鎖および短鎖クローディ膜に分布した。また、細胞膜に分布する長鎖クローディ

ン-16 を MDCK 細 胞 に 発 現 さ せ、 大 腸 菌 で 調 製 し た

ン-16 の量が増加した。

MBP-NHE1 との結合を調べたところ、長鎖クローディン-16 が NHE1 と 結 合 す る こ と が 明 ら か に な っ た（図4.

細胞間透過性に対するクローディン-16 と FXYD25A）。長鎖クローディン-16 発現細胞からタンパク質を発現の影響

抽 出 後、FALG 抗 体 を 用 い て 免 疫 沈 降 を 行 っ た が、これまでに我々は、ラットクローディン-16 の発現にNHE1 との結合は確認されなかった（図 5B）。FXYD2-より、TER とマグネシウム透過性が増加することを報告

myc を 共 発 現 し た と こ ろ、 長 鎖 ク ロ ー デ ィ ン-16 と1）した 。ヒト短鎖クローディン-16 発現細胞では、mockNHE1 が結合し、細胞膜表面におけるクローディン-16細胞よりも TER とマグネシウム透過性が増加したが、の分布量が増加した。蛍光免疫染色により長鎖クロー

長鎖クローディン-16 発現細胞ではほとんど変化しな

ディン-16 の細胞内局在を調べたところ、長鎖クローか っ た（図 4）。FXYD2-GFP の 共 発 現 に よ り、 長 鎖 ク

ディン-16 が主に細胞質に分布したのに対し、NHE1 とローディン-16 発現細胞における TER とマグネシウム透

ZO-1 は細胞膜に分布した（図 5C）。FXYD2-myc の共発過性が、短鎖クローディン-16 発現細胞と同程度まで増現により、細胞膜における長鎖クローディン-16 の分布

加 し た。 一 方、 短 鎖 ク ロ ー デ ィ ン-16 発 現 細 胞 で は量が増加したが、NHE1 や ZO-1 の細胞内局在はほとんFXYD2-GFP の共発現によってほとんど変化しなかっど変化しなかった。

た。FXYD2 siRNA は、長鎖クローディン-16 と FXYD2酸負荷による細胞障害に対するクローディン-16 発

6.

現の影響
MDCK 細胞に長鎖クローディン-16、短鎖クローディン-16、FXYD2-myc をトランスフェクションしたところ、mock と比較して細胞障害が有意に変化しなかった（図 6A）。HEPES で緩衝した DMEM を用いて、細胞をpH 7.4、7.0、6.5 の培地に暴露したところ、長鎖クローディン-16 または短鎖クローディン-16 の単独発現細胞では、pH 6.5 で生存率が大きく低下した（図 6B、C）。同様に、FXYD2-myc 発現細胞でも、pH 6.5 に暴露することにより生存率が低下した。長鎖クローディン-16 とFXYD2-myc の共発現により、pH 6.5 による生存率の低下 が 有 意 に 抑 制 さ れ た が、 短 鎖 ク ロ ー デ ィ ン-16 とFXYD2-myc の共発現では効果がなかった。
考察

FHHNC 患者で 40 カ所以上のクローディン-16 遺伝子の図4変異が報告されており、その大部分が細胞外ループと膜クローディン-16 の機能に対する FXYD2 の影響

貫 通 領 域 に 分 布 す る。 腎 尿 細 管 由 来 の MDCK 細 胞 やMDCK 細胞に S-CLDN16 と L-CLDN16 を発現させ、TER（A）とマグネシウム透過性（B）を測定した。また、FXYD2-GFPと FXYD2 siRNA の効果を調べた。** ＜0.01, NS ＞0.05。

LLC-PK1 細胞を用いた発現実験により、クローディン-16の遺伝子変異とマグネシウム輸送機能との関係が明らか
4

細胞間マグネシウム透過型チャネルの異常による腎不全発症機序の解明

図5

長鎖クローディン-16 と NHE1 の結合

図6

酸負荷による細胞障害に対するクローディン-16 と FXYD2発現の影響（A）MDCK 細 胞 に FLAG タ グ を 融 合 し た L-CLDN16 とS-CLDN16 を過剰発現させ、MBP または MBP-NHE1 とともにプルダウンアッセイを行った。MBP 抗体で MBP-NHE1 のサイ
ズ を 確 認 し た。（B）MDCK 細 胞 に L-CLDN16 と FXYD2-mycを発現させ、NHE1 の発現、L-CLDN16 と NHE1 の結合、細胞膜表面における LCDN16 の分布量を調べた。
（C）蛍光免疫染色により、NHE1 の細胞内局在に対する L-CLDN16 と FXYD2の影響を調べたが、NHE1 の細胞内局在は変化しなかった。

（A）MDCK 細胞に L-CLDN16、S-CLDN16、FXYD2-myc を発現させたが、細胞障害率はほとんど変化しなかった。NS ＞
0.05 . mock。
（B）MDCK 細 胞 に L-CLDN16 と FXYD2-mycを 発 現 後、 酸 負 荷 に よ る 細 胞 生 存 率 の 変 化 を 調 べ た。（C）
MDCK 細 胞 に S-CLDN16 と FXYD2-myc を 発 現 後、 酸 負 荷 による細胞生存率の変化を調べた。** ＜0.01, NS ＞0.05。にされてきた 5, 6）。マグネシウム輸送機能が低下またはの結合が阻害された。クローディン-16 がタイトジャン欠失した変異体は、本来分布すべきタイトジャンクショクションに分布するためには、セリン残基のリン酸化とンではなく、主にエンドソームやリソソームに分布すsyntaxin-8 との結合が必要であると考えられた。カルボる。近年我々は、クローディン-16 のタイトジャンクショキシル基側細胞質領域の役割が明らかになってきたが、ンへの移行に、SNARE ファミリーに属する syntaxin-8 がアミノ基側細胞質領域の役割は十分に解明されていな

4）関与することを発見した 。クローディン-16 のカルボキかった。本研究で我々は酵母ツーハイブリッド法によ

シル基側細胞質領域に存在する 217 番目のセリンをアラり、アミノ基側細胞質ドメインに結合する新たなタンパニンに置換すると、リン酸化量が低下して syntaxin-8 とク質として、FXYD2 と NHE1 を同定した。FXYD2 は長5五 十 里

彰

鎖クローディン-16 と結合したが、短鎖クローディン-16ける細胞生存率が、FXYD2 と長鎖クローディン-16 の共と結合しなかったことから、クローディン-16 のアミノ発現細胞で増大した。一方、FXYD2 と短鎖クローディ基側細胞質領域が FXYD2 との結合に必要であることがン-16 の共発現細胞では、生存率が変化しなかった。こ

明らかになった。

れらの結果から、長鎖クローディン-16 は NHE1 による細胞内 pH の調節機能を亢進させることが示唆された。

FXYD2 は Na /K -ATPase γ サブユニットをコード＋＋する遺伝子で、Na /K -ATPase の活性や発現の調節に＋尿細管上皮細胞では HCO−3 の再吸収や H の分泌が行わ関与すると報告されている7）。また、孤立性常染色体劣れており、尿細管内の pH が大きく変動する。長鎖ク性低マグネシウム血症の患者で FXYD2 の遺伝子変異がローディン-16 の発現低下によって NHE1 の機能が低下報告され8）、マグネシウム再吸収の調節においても重要するため、pH 変動に対する尿細管上皮細胞の調整機能な役割を果たすと考えられる。しかし、FXYD2 がどのが低下して腎不全に至る可能性がある。

＋＋ような機序でマグネシウム再吸収を調節するのかは不明
要で あ っ た。MDCK 細 胞 に 発 現 さ せ た ヒ ト 長 鎖 ク ロ ー

約ディン-16 は主に細胞質に分布したが、FXYD2 の共発現クローディン-16 の発現機能解析を行い、ヒトにのみにより長鎖クローディン-16 はタイトジャンクションに発現する長鎖クローディン-16 が FXYD2 や NHE1 と結も分布した（図 3）。さらに、管腔側から血管側へのマ合することを見出した。これまで長鎖クローディン-16

グネシウム透過性が FXYD2 の共発現によって増加し、は細胞質に分布し、マグネシウムチャネルとして機能しこの効果が FXYD2 siRNA の導入によって阻害されたないと報告されていたが、FXYD2 と共発現することに（図 4）ことから、長鎖クローディン-16 は FXYD2 の存

よってタイトジャンクションに分布し、マグネシウム透在下でマグネシウムチャネルとして機能することが明ら過性を亢進させることが明らかになった。さらに、長鎖かになった。これまで長鎖クローディン-16 を用いた発クローディン-16 は NHE1 と結合し、酸負荷による障害現実験では、長鎖クローディン-16 は主に細胞質に分布から細胞を保護したことから、長鎖クローディン-16 はし、マグネシウム透過性に影響を及ぼさないことが報告

マグネシウム再吸収だけでなく、細胞内 pH の調節にも5）されており 、我々の研究成果は長鎖クローディン-16関与することが示唆された。クローディン-16 は腎障害もマグネシウム輸送に関与することを初めて実証したこの新たな治療標的になる可能性があり、今後の創薬研究とになる。

が期待される。

NHE1 は広範な組織に発現し、細胞外から Na＋イオン謝を流入させ、その対向輸送として H＋を細胞外に排泄す

辞本研究を遂行するにあたり、助成を賜りました公益財ることにより、細胞内 pH や細胞内 Na 濃度の調節に関＋団法人三島海雲記念財団に心より感謝申し上げます。

与する。長鎖クローディン-16 と NHE1 の結合を調べた
ところ、FXYD2 非発現細胞で両者は結合しなかった

文が、FXYD2 の共発現によって両者が結合したことから、長鎖クローディン-16 がタイトジャンクションに分

献1） A. Ikari, et al.:
2） A. Ikari, et al.:
3） A. Ikari, et al.:
4） A. Ikari, et al.:
5） J. Hou, et al.:
6） P. J. Kausalya, et al.:
7） K. Geering:250, 2006.
8） I. C. Meij, et al.:

布後に NHE1 と結合することが示唆された。また、クローディン-16 や FXYD2 の発現により、NHE1 の発現量と細胞内局在は変化しなかったので、NHE1 の発現調節に長鎖クローディン-16 は関与しないことが明らかになった。細胞内 pH を変化させた際の生存率に対する長鎖クローディン-16 の影響を調べたところ、pH6.5 にお6, 279, 54826–54832, 2004.
, 56, 379–383, 2006.
, 214, 221–229, 2008.
, 289, 13112–13123, 2014.
, 118, 5109–5118, 2005.
, 116, 878–891, 2006.
, 290, F241–, 26, 265–266, 2000.