【研究報告】（自然科学部門）

腸内環境を模倣したマイクロデバイスの開発

横浜国立大学大学院工学研究院（現緒言掛川貴弘

工学研究員技術補佐員

大日本印刷株式会社研究開発センター）させるものである。これまでに、金電極上で密な分子層微生物間または、微生物と細胞間の相互作用を明らかを形成可能な自己組織化ペプチドの設計を行ってきた。にすることは、食の科学技術の発展において重要であ

これを介して接着した細胞が、5 分間の電位印加によりる。特に、腸内には無数の細菌が存在していることが知非侵襲的に脱離可能であることを報告している。一方られており、腸内マイクロバイオームの善玉菌と悪玉菌で、実はペプチド分子のみの脱離の場合、わずか数秒ののバランスが崩壊することで、炎症やうつ病などの疾電位印加で脱離することが電気化学的な解析によりすで患、肥満や免疫機能の低下が引き起こされる。そこで本にわかっている。すなわち、原理的には細胞シートも秒研究では、生体外で腸モデルを構築することを目的とし単位で脱離できる可能性が残されている。そこで、本研た。腸内細菌の 99％が嫌気性生物である一方、バリア究ではまず、素早い細胞脱離を実現するために、オリゴ機能をもつ腸上皮細胞には低酸素限界濃度で培養するこペプチドの配列について分子動力学計算を用いてシミュとが求められる。つまり、腸内を生体外で再現するためレートした。具体的には、80 種類のアミノ酸の組み合には、微生物群の培養環境中の酸素濃度の測定・制御がわせについて、バルク液中ではオリゴペプチドは凝集せ重要となる。また、その他の外的因子として、抗生物質ず、金表面に結合した後に、安定したコンフォメーショの長期投与により、腸炎が引き起こされることが知られンをとる配列を探索した。このオリゴペプチド設計で最ている。これは、抗生物質の投与により、その薬剤に感も重要な点は、リジン（K、＋電荷）およびグルタミン受性の細菌数は激減するものの、耐性をもつ微生物は腸酸（E、−電荷）の繰り返し配列（KEKE、KEKEKE 等）内で異常増殖するからである。つまり、抗生物質と微生を導入し、隣接する分子間で静電的な引力を生じさせ、物群との関係を生体外で評価することができれば、腸炎金表面上で密な分子層を形成するよう設計したことであなどの炎症反応を抑制・予防できる可能性がある。そこる。シミュレーションの結果、CGGGKEKEKEKGRGDSP

で本研究では、生体外で腸内のモデルを作製するための配列を用いると、オリゴペプチドが密に金表面を覆に、以下の 3 つの要素技術の確立に取り組んだ。つまい、細胞接着配列 GRGDSP が表面に提示されることがり、（1）腸膜を模擬した細胞シートの作製と回収、（2）示された（図 1）。実際にこのオリゴペプチドを修飾し微生物群中の酸素濃度の測定、（3）抗生物質の濃度によた基板で細胞脱離を評価したところ、従来法と比較してる微生物への影響をハイスループットに評価可能なマイより迅速な細胞脱離が実現された。次に、電極形状を工クロデバイスの開発である。

夫することにより、より効率的な細胞シートの脱離技術を確立した。細胞脱離が遅延する要因として、細胞自体結果および考察の電気的抵抗が考えられる。細胞のような巨大な物体が接着していると、電極全体への均一な電位印加が妨げら

筆者らは、電気化学的な反応に基づく細胞脱離技術を1）開発してきた 。この基盤技術は、金–チオール結合をれる可能性がある。この予測は、細胞脱離の際に、細胞介して金表面に形成した自己組織化単分子膜の還元脱離が周辺部から徐々に脱離するという顕微鏡観察結果に基反応を利用しており、素早い細胞脱離が可能な独創的なづくものである。そこで、ピラー構造を有する電極を作技術である。この原理は、金–チオール結合により金電製し、細胞直下の電極へのイオン流入を促進する工夫を極表面に単分子層を形成し、これを介して接着させた細施した。その結果、1 分の電位印加で 75％の細胞が脱離胞を、金–チオール結合を電気的に切断することで脱離し、3 分間の電位印加により、ほぼ全ての細胞を脱離さ
1

掛

川貴弘

図3
図1

細胞シートの回収

電気化学的細胞脱離で回収した細胞シートの蛍光顕微鏡像、
緑：生細胞、赤：死細胞。

オリゴペプチドの設計（a）設計したオリゴペプチド、（b）金表面に自己組織化したオリゴペプチド層、（c）規則的に配置したオリゴペプチド。

図4
図2

酸素濃度とアンモニア酸化量

シグナル物質の添加によるアンモニア酸化量。

ピラー電極を用いた電気化学細胞脱離初期接着細胞数を 100％とした時の電位印加時間による細胞脱離割合。

光ファイバーを用いた酸素濃度計を使用した。この手法の特徴は、蛍光クエンチング現象を利用しており、測定せることができた（図 2）。さらに、基板表面全体を細対象の酸素を消費せずに測定できる点である。そこで、胞が覆うまで培養し、細胞シートを形成させ、1 分間電微生物の培養液の体積を変化させた培養液中の酸素濃度位を印加することで、細胞シートを回収できることを示の測定について検討した。その結果、培養体積が大きくした（図 3）。回収した細胞シートは、良好な生存率をなるにつれ、酸素濃度が減少することを確認し、リアル示し、組織構築には必要不可欠である細胞間のタイトタイムで酸素濃度を計測できることを示した。さらに、ジャンクションも保っていることも確認した。以上の検微生物懸濁液中にシグナル物質を添加し、培地中のアン討により、腸膜を模倣した細胞シート作製、回収の可能モニア酸化量を測定した結果、酸素濃度が低い培養系の性が示された。

微生物群にシグナル物質を添加した系において、アンモ続いて、微生物の培養環境中の酸素濃度を測定する方ニア酸化量が向上することが示された（図 4）。つまり、法を確立した。現在までに酸素濃度を測定する様々なセ酸素濃度をモニタリング・制御した環境下で微生物を培ンサーが開発されているが、本研究においては微生物群養することで、より生体内に近い培養環境を実現できるを含む微小環境中の酸素濃度をリアルタイムに測定でき可能性が示された。
さらに、抗生物質の濃度とその効果をハイスループッる手法が求められる。そこで、数あるセンサーの中でも2

腸内環境を模倣したマイクロデバイスの開発

図5

マイクロデバイス（a）マイクロデバイスの概念図、（b）作製したマイクロデバイス。

図6

マイクロデバイス中での微生物培養（a）微生物の走査型電子顕微鏡像、（b）抗生物質の濃度の違いによる微生物の増殖評価。

トに評価可能なマイクロデバイスの開発に取り組んだ。

バ中で微生物に対する抗生物質の影響を評価できること

微小な培養体積中で評価することで、一度に大量の条件が可能であり、細菌に対する薬剤の効果などを診断でき下で評価できるだけではなく、評価に用いるサンプル量るツールになり得る可能性が示された。

や試薬にかかるコストなども抑えることができる。そこ

このことから、微小なマイクロチャンバ中で微生物にで、半導体作製にも用いる微細加工技術で、体積が 440対する抗生物質の影響を評価できることが可能であり、nL となるマイクロデバイスを作製した（図 5）。このマ細菌に対する薬剤の効果などを診断できるツールになりイクロデバイス作製のポイントは、表面張力を利用し得る可能性が示された。て、独立した培養チャンバへ微生物を均一に導入する機謝構を開発した点である。それぞれの培養チャンバは独立

辞
本研究は公益財団法人三島海雲記念財団によりサポーした状態で、少なくとも 24 時間以上培養できることをトされたものである。

確認している。さらに、種々の濃度の抗生物質を個々のマイクロデバイスに固定し、様々な抗生物質濃度下で微文生物を培養できる工夫を施した。その結果、抗生物質濃度に依存して、微生物の増殖速度に影響することがわ

献1） T. Kakegawa, et al.:
2013.
2） R. Inaba, et al.:かった（図 6）。このことから、微小なマイクロチャン

3., 19, 209–298,., 30, 3573–3579, 2009.