高齢健常者のエクソーム解析(疾患責任遺伝子同定のためのコントロールとして)

要旨
次世代シーケンサーから得られたゲノム配列は、ヒトリファレンス配列と比較を行い、塩基の違いを遺伝子変異として検出するのであるが、人種や多型の違いにより健常者であっても、多数の遺伝子変異が検出される。このことから、我々は、今後増えるであろう日本人の疾患患者の変異データと比較を行うために、独自の健常者データを取得する事にした。
まずは、70代の男性4名 (過去1年の入院歴なし、大病の既往歴なし) について、エクソーム解析を行った。タンパク質にインパクトを与える変異およびdbSNP JPTと1,000 Genomesの東アジア人アレル頻度1%以下で変異を絞り込んだところ、1名あたり約1,000の変異が残った。また、2名以上で見られる共通変異については600変異が検出され、このうちアミノ酸置換変異でのSIFT予測で”DAMAGING”な物は49変異見つかった。
高齢健常者2名以上で見られる変異は、疾患責任遺伝子の可能性は低い。このためこれらのデータを患者と比較することで、疾患責任遺伝子の同定に役立つことが期待される。
1

動機
健康な高齢者で見られる変異は、疾患責任遺伝子の可能性は低いと考えられるため、これらのデータを整備・蓄積し、遺伝病患者と比較することで、疾患責任遺伝子の同定・フィルタリングに役立たせたい。

2

被験者について• 日本人70代男性4名– 過去1年の入院歴なし、大病の既往歴なし– 問診票および臨床情報の取得を行っている※ プロジェクトについては、倫理審査委員会の了承済み

3

実験条件
• サンプル– ヒト 4検体 (D01, D02, D03, D04)

• エクソーム濃縮キット– Agilent社製 SureSelect all exon V5+UTRs kit• シーケンサー– illumina社製 HiSeq2000– 4検体マルチインデックス– Paired-end 100bpで1レーン使用
4

解析フロー
1. 生のリード情報からのアダプタ配列やクオリティの悪い塩基のトリミング (除去)
2. BWAによる、リード情報のリファレンスゲノ
ムへのアライメント (マッピング)
3. Picardによる、Duplicate リード (全く同じゲノム位置の同じ配列のリード) の除去

6. GATKによる、エクソームターゲット領域上のSNV (SNP), InDel変異の検出およびクオリ
ティの悪い変異のフィルタリング
7. snpEffによる、SNV (SNP), InDel変異の効果
予測 (Effect解析) とアノテーションの付与
8. dbSNPの日本人アレル頻度情報と1000
Genomesの東アジア人 (日本人+中国人) アレル頻度情報等の付与

4. GATKによる、1000 GenomesのInDel情報に基づいた既知InDel周辺の再アライメントおよび塩基スコアのキャリブレーション

9. タンパク質にインパクトを与える変異とアレル頻度情報による変異の絞り込み

5. GATKによる、リードカバレッジの計算

10. SIFTによるアミノ酸置換変異とフレームシ
フト変異のタンパク質への影響予測

5

リードカバレッジ集計結果■リード数集計結果
リードのトリミングおよびDuplicateリード (全く同じゲノム位置の同じ配列のリード) を除去した後のリード数 (ペア) の集計結果。

サンプル名

オリジナル トリミング後
ペアリード数 ペアリード数

Duplicateリード除去後
ペアリード数D01

100,353,174

79,407,838

73,413,290

D02

129,893,720

103,197,972

92,325,715

D03

86,790,051

68,830,832

63,725,707

D04

64,665,415

51,659,678

48,333,999■リードカバレッジ集計結果
GATKのDepthOfCoverageを用いて、エクソームターゲット領域 (SureSelect Human All Exon V5+UTRs: 117Mb) のリードカバレッ
ジの計算および集計結果。
サンプル
25 percentile
中央値 75 percentile
10x以上 25x以上 50x以上 75x以上 100x以上
総塩基数
平均値
名
(第１四分位数[Q1]) (Q2)
(第3四分位数[Q3]) (%)
(%)
(%)
(%)
(%)
D01
9,135,133,245
78.20
105623194.6
80.3
58.9
40.6
26.9
D02
11,536,882,163
98.76
132
794096.5
85.4
67.8
51.8
38.1
D03
7,997,351,837
68.46
92542793.1
76.9
53.2
34.2
21.3
D04
6,087,085,271
52.11
70
41
21
89.6
69.0
40.5
22.0
12.2
Total
34,756,452,516※ エクソームターゲット領域はSureDesignから取得した100bp Padded BEDファイルを使用。
※ SureSelect Human All Exon V5+UTRsのプローブ領域としては75Mb。

6変異解析集計結果
変異絞込み
SIFTで“Damaging”
フィルタリング後 タンパク質にインパクト アレル頻度1%以下
サンプル名 総変異数となった変異数
総変異数を与える変異数 ※1 の変異数 ※2
※3

D01
D02
D03
D04
全4検体

129,572
131,800
128,097
125,946
217,390

120,454
121,892
119,632
118,155
197,707

11,376
11,432
11,341
11,32518,934

1,005
1,034
961
1,014
2,658230
230
197
217713

1. タンパク質にインパクトを与える変異は、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、スタート
ロスト、スプライスサイト、InDel等
2. アレル頻度1%以下の変異は、dbSNPの日本人 (JPT-1411) アレル頻度 <= 0.01 かつ
1000 Genomesの東アジア人 (日本人+中国人) アレル頻度 <= 0.01
3. SIFTはアミノ酸置換変異とフレームシフト変異のタンパク質への影響予測を行うデータベース
7

高齢者2名以上で見られたレア変異タンパク質にインパクトを与え、なおかつアレル頻度1%以下の変異。
以下の488遺伝子中に600変異が検出された。
AC004076.9ASPN
CCDC83 DAP
FBXO2
ICMT
KRTAP9-8 MLL3OR7C2RALY
SH3BGR TMIEZNF384AC005220.3ATF5CCNJ
DCAF7FLGIGFBP2LAMC1MMP17
OR7E24
RBBP6SH3TC2
TNFAIP6 ZNF565
AC009113.1ATG3CCNYL2
DCHS1FLJ22184 IGFN1LARP6MPRIP
OR8B2
RBM19
SIGLEC8 TNXBZNF66P
AC010536.1ATN1CD34
DCP1B
FMNL1IL32
LCA10MRPS34
OVGP1RBMXL3SIRPATPRXLZNF714
AC073082.1ATP8A2
CDCP2DDHD1FMNL2INF2LCE4A
MST1L
PABPC1REC8SIRPB1TPSAB1ZNF720
AC073343.1ATXN1CDKL4DENND4B FOXC1
INO80E
LFNG
MUC12PALM2-AKAP2
REG3A
SIRT1TPSD1ZNF778
AC074212.3ATXN2
CDKN2AIP DENND4C FOXD1INS-IGF2 LIMD1MUC13PAPPA-AS1RFX1SKIDA1TPTEZNF804A
AC090616.2BAIAP2L2 CELA1
DHCR7
FOXE1
IRF2BPL LINC00636 MUC19PARP4RHBGSLAIN1
TRAK1ZNF816
AC134043.1BCAR1
CELA3A
DIAPH1FOXF2IST1LIPE
MUC2PCRNF19B
SLC19A1 TREH
ACIN1BCL6B
CENPV
DIXDC1FOXO6
ITIH5LOR
MUC20
PCDH12RNF208
SLC37A4 TRIM16
ACSM5BRD8CEP104
DKFZP686J19100
FRRS1LITIH6LRRC46MUC3A
PCLO
RP11-124D2.6
SLC38A10 TRIM49
ADAMTS8 BRI3BP
CES5A
DMKN
GAPVD1KAT6B
LRRC49
MUC5B
PCSK6RP11-131H24.4
SLC3A2TRIM49C
ADAMTSL1 BSPRY
CHD5DNAJC9GLIPR1L2 KCNC3LTBP4NACA
PCSK9RP11-1407O15.2
SMARCA2 TRIM5ADRA2B C11orf80 CHRNA3 DNHD1GOLGA6L2 KCNJ12LURAP1L NANOS1 PDE11A
RP11-17M16.1
SMPDL3B TSPYL1AFAP1L2 C14orf23 CHST15DOK3GOLGA8R KCNN3MADCAM1 NCL
PDE4DIP RP11-181C3.1
SNAPC4TTC40AGAP3C16orf11 CKAP4DPF3GPATCH4 KDM6B
MAFANCOR2PELP1RP11-210M15.1
SNRPCTTLL3AHNAK2C16orf3
CLCNKB DPP6GPR112
KIAA0040 MAGEC1 NIPA1PHF2RP1-130H16.18
SP9UBAP2L
AKD1C1orf222 CLEC11A DTNBP1 GPR137
KIAA0232 MAGEF1NLRC5
PI4KAP2 RP11-492D6.3
SPAG1UNC79
AL358813.2 C1orf86
CLEC18B DYRK1BGPRIN1KIAA0430 MAGI1NOP16PINX1RP1L1SPATA20 UNC93B1
AL391005.1 C20orf132 CLIC6EBLN2GPRIN2KIAA2018 MAML2NOTCH2 PITRM1RP3-368B9.1SPENURI1AL589765.1 C21orf49 CLTCL1EFCAB2GPSM1KIF1AMAML3NOTCH2NLPKD1L3RP5-874C20.3
SPI1USP20
AL691479.2 C21orf62 CLYBL
EIF3GGPX1KISS1MANEANOTCH4 PLA2G6RPL13A
SPRR3USP26
ALG10B
C2orf71
CNDP1EMG1GYLTL1B KLF14MAP2K3NOX4PLEKHG4B RPL14SRA1VEGFA
ALMS1C4A
CNPPD1 EOMESHADHB
KPNA4MAP3K1NPIPL2PODXLRRN3SRRD
VILL
ALPK2C4orf6
CNTN5EP400
HAVCR1KRI1MAP3K4NR1H2POLDIP2 RSPO1SRRM5VKORC1L1ANAPC1C8orf42
CNTNAP2 EPHA6HHIPL1KRT1MAPK15NUAK1POLR1B RTTN
SSC5DVPS13B
ANKLE1C8orf59
COL6A2ESPN
HLA-AKRT10MCC
NUDT11POU2F1RXFP1STAG2VPS9D1ANKMY1 C9orf174 COL7A1ESPNL
HLA-DQA1 KRT2MCM10NUP153
POU4F2RYKSTAU1VSIG10ANKRD33B CABP1COPZ2EVI5HLA-DQB1 KRT4MED15NUP210L PPYR1S100A16 STRA8VSIG10L
ANKRD36 CACNA1B CREB3L1 EVPL
HLA-DRB5 KRTAP10-7MEF2A
OBP2A
PREP
SAFB2SUSD2WDFY4ANKRD65 CACNA2D1 CREB3L2 FAM182B HNF1AKRTAP1-3 MEGF11OGFRPRKCSH SAMD1SYNGR1WDR66
ANKS1ACAMKK2 CRIPAK
FAM186A HOMER3 KRTAP17-1MEGF9OLFM1PRKDCSCAF1SYNJ1WRN
AP003026.1CAPN12CROCCP2 FAM187A HRCKRTAP29-1MEOX2OPN1LW PRR21SCARF2SYT7YEATS2AR
CARD10CSPG4FAM189A2 HRNRKRTAP4-3 MEX3A
OR13C2PRR23A
SCUBE2TBPZDHHC11ARID1B
CASTCTSA
FAM194B HSH2DKRTAP4-7 MEX3D
OR2L2PRSS3SEC16A
TCEAL4ZFHX3ARSD
CCBE1CYFIP2FAM205A HSPBAP1 KRTAP4-8 MGC20647 OR2T12PRSS48
SELPLGTCEAL6ZNF107ART5CCDC120 CYP11B1 FAM22F
HSPBP1KRTAP4-9 MIA2
OR2T2
PTK7SERINC2 TFAP2A
ZNF2ASAH1CCDC129 CYP21A2 FAM83GHSPG2KRTAP5-1 MICA
OR2T35RABL6SETBP1TMEM37
ZNF226ASB10CCDC40 CYP2B6FAM8A1HTRA1KRTAP5-8 MKL1
OR2T4
RAD21-AS1SFRP1TMEM43
ZNF227ASCC2CCDC66 DACH1FBF1ICA1KRTAP9-1 MKRN1
OR6C76
RAI1
SGK223
TMEM52ZNF2338高齢者2名以上でSIFT ”DAMAGING”な変異
アレル頻度1%以下、アミノ酸置換変異でSIFT “DAMAGING” な物として以下の49変異が検出された。
Chromo111111122223345566788991010101011111113
1313
14
15
151617171719
1919
191922
22
X
X

Position
6294548
22211078
145014103
145281408
145281543
145281633
153580072
97877478
220037608
239037384
241451294
14172424
96585671
159568305
10649678
10761137
15546294
17602839
134931359
100454797
143959188
139735349
140777306
47087609
49943983
75006782
75006785
217044366620033
124253170
25021263
25021323
26153950
9412011766223280
75982085
20442608
45911840
48628510
79254478
5017145587268558727036674347
42905979
24579157
38511670
54777555
140993859

Reference Change
C
G
T
G
GC
C
T
C
T
C
A
C
T
GA
A
C
GT
C
T
GA
GA
GT
C
GT
GC
T
C
T
GC
G
T
GT
C
A
C
GG
A
C
GT
GC
GC
T
T
C
GA
T
C
A
GGT
T
GC
T
C
T
C
A
A
T
C
A
A
C
C
A
TGA
GT
C
GC
GT
GC
T
C
T
A

Coverage
268
18315
999
1000
902
30877717119088451
85259
4120945745543
2317253982727728222373119983522441356654716634039367897067413904814141178773

Gene_name
ICMTHSPG2PDE4DIPNOTCH2NLNOTCH2NLNOTCH2NL
S100A16ANKRD36
CNPPD1ESPNLANKMY1
TMEM43
EPHA6RXFP1
ANKRD33BDAPDTNBP1FAM8A1
STRA8VPS13B
CYP11B1RABL6CACNA1B
PPYR1WDFY4DNAJC9DNAJC9INS-IGF2PC
OR8B2PARP4PARP4ATP8A2
UNC79MEGF11CSPG4ACSM5LRRC46
SPATA20SLC38A10
MADCAM1SAFB2SAFB2ZNF565LIPESUSD2PLA2G6ITIH6MAGEC1Prediction(SIFT) OMIM Disease
DAMAGING *Warning! Low confidence.
DAMAGING
SCHWARTZ-JAMPEL SYNDROME, TYPE 1DAMAGING *Warning! Low confidence.
DAMAGING
DAMAGINGDAMAGINGDAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGINGDAMAGINGDAMAGING
ARRHYTHMOGENIC RIGHT VENTRICULAR DYSPLASIA, FAMILIAL, 5DAMAGINGDAMAGING
DAMAGINGDAMAGINGDAMAGING
HERMANSKY-PUDLAK SYNDROMEDAMAGINGDAMAGING
DAMAGING
COHEN SYNDROMEDAMAGING *Warning!
ADRENALLow confidence.
HYPERPLASIA, CONGENITAL, DUE TO STEROID 11-BETA-HYDROXYLASEDAMAGING *Warning! Low confidence.
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING *Warning! Low confidence.
DAMAGINGPYRUVATE CARBOXYLASE DEFICIENCYDAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING
DAMAGING *Warning! Low confidence.
DAMAGING *Warning! Low confidence.
DAMAGING
DAMAGING *Warning! Low confidence.
DAMAGING
DAMAGING
PARKINSON DISEASE 14, AUTOSOMAL RECESSIVEDAMAGINGDAMAGING *Warning! Low confidence.

9結論と展望• 高齢健常者2名以上で見られる変異は、疾患
責任遺伝子の可能性は低い。このためこれらのデータを患者と比較することで、疾患責任遺伝子の同定に役立つことが期待される。
• 検体数を増やして、変異データをコンセンサスを得たうえで一般公開したい (+4検体を計画中)

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