0201-P-001※※ 2022 年 12 月改訂

研究用試薬※ 2006 年 04 月改訂

ヒトアディポネクチン ELISA キット
使用説明書
本キットは研究用試薬であり、疾病の診断若しくはその補助の目的で使用することはできない。

【開発の経緯及び特徴】※【キットの包装】
包装単位
96 テスト用
480 テスト用

アディポネクチンは、1996 年に大阪大学分子制御内科学、松澤らのグループにより脂肪組織中に特異的に発現する遺伝子
apM1（adipose most abundant gene transcript）として新たに同定されたサイトカイン（アディポサイトカイン）であり、数 量構成試薬(1～11) 1 組構成試薬(1～11) 5 組

付属品
プレートシール 6 枚
プレートシール 24 枚

【使用目的】

244 個のアミノ酸より成る分泌蛋白である。
血中では多量体をヒト血清又は血漿や脂肪細胞抽出液又は培養上清中のアディ形成し、Ⅷ・Ⅹ型コラーゲンや補体の C1q と相同性の高い球ポネクチンの測定状構造を有することが報告されている 1, 2)。近年、アディポネクチンは様々な生理活性を有することが報告され、特に平滑【測定原理】筋細胞の増殖を抑制することや単球の内皮細胞への接着を抑

本キットは、ELISA 法を用いたヒトアディポネクチン測定キッ制することから、動脈硬化の抑制効果が期待されている 3, 4, 5)。

トである。

さらに、マウスにおけるアディポネクチン投与実験では、ア測定原理を図１に示した。抗ヒトアディポネクチンモノクロ

ディポネクチンを投与することによって、糖尿病が改善するーナル抗体固相プレート（抗体プレート）に、あらかじめ前ことが見いだされた 6)。ヒトでのアディポネクチンの血中濃処理を行った検体又は標準液を加えて反応させると、アディ度は血清１mL あたり数μg 存在することが知られており、そポネクチンが抗体プレートに結合する（第１反応）。抗ヒトアの低下と肥満 7) や糖尿病 8, 9)及び動脈硬化 4, 8) との関連が報

ディポネクチン抗血清（ウサギ）（第１抗体液）を反応させ（第告されている。

２反応）、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ

本キットは、松澤らとの共同研究により開発されたヒトアデIgG ポリクローナル抗体（ヤギ）（酵素標識抗体液）を反応さィポネクチンに特異的な酵素免疫測定法（ELISA 法）によるもせる（第３反応）。基質液を加えて発色させ（発色反応）、そのであり、標準品にはリコンビナントヒトアディポネクチンの吸光度を 450nm で測定し、同時に測定した標準液の吸光度を用いている。本キットは、ヒト血清又は血漿や脂肪細胞抽から検体中のアディポネクチン濃度を算出する。

出液又は培養上清中のアディポネクチンを特異的に精度よく簡便に測定することが可能である。

抗体プレート96 ウェル／ 1 枚

5

標準品
12.0ng/mL

2mL／ チューブ

6

第１抗体液

12mL／ ボトル7

酵素標識抗体原液

0.1mL／ チューブ8

酵素標識抗体希釈液

15mL／ ボトル

9

基質液Ａ

7.5mL／ ボトル

1011

基質液Ｂ
反応停止液

7.5mL／ ボトル
15mL／ ボトル◆ ◆◆◆第１反応

EE

第２反応

基質液

○○○○○
発色反応

第３反応

吸光度測定

○○○ ●●●
EYYY◆◆◆Y YYEEE

EE

YY Y

4成分等
緩衝剤ほか
緩衝剤ほか
緩衝剤ほか
抗ヒトアディポネクチンモ
ノクローナル抗体ほか
リコンビナントヒトアディ
ポネクチンほか
抗ヒトアディポネクチン抗血清（ウサギ）ほか
西洋ワサビペルオキシダー
ゼ標識抗ウサギ IgG ポリク
ローナル抗体（ヤギ）ほか

E

YY Y

容 量
40mL／ ボトル
10mL／ ボトル
50mL／ ボトル

酵素標識抗体液

Y YY

12
3

構成試薬名
洗浄用原液
検体前処理液
検体希釈用原液

第１抗体液

YYY
YY

【キットの構成】

アディポネクチン

Y YY

Y YY

YY Y◆ ◆◆◆◆◆◆◆ ◆抗体プレート

図１. 測定原理

緩衝剤ほか
3,3',5,5'-テトラメチルベ
ンジジンほか
過酸化水素ほか
硫酸ほか-1TI25458308

【測定方法】④ ③の 100 倍希釈血清のうち 20μL を新たな容器に移し、検１．必要器具、機器等

体希釈液 1.0mL と混和する（5,100 倍希釈検体となる）。

(1)メスシリンダー(2)メスピペット

脂肪細胞抽出液又は培養上清の前処理(3)マイクロピペット及びチップ① 必要な構成試薬を 20～30℃に戻す。

(4)プレートウォッシャー

② 検体前処理液を精製水で 5 倍希釈する（5 倍希釈検体前処(5)ペーパータオル理液）。

(6)プレートリーダー（測定波長：450nm）③ 脂肪細胞抽出液又は培養上清 10μL を②の 5 倍希釈検体前(7)ヒートブロック等

処理液 90μL と混和後、ヒートブロック等を用いて 100℃

(8)マイクロチューブ等（容量 1.5mL 以上の密閉可能な容器）で 5 分間加熱する。このとき、容量 1.5mL 以上のマイクロチューブ等の容器を用い、密閉状態で加熱すること（10 倍２．試薬の調製法・保存法希釈検体となる）。

(1)洗浄液④ 検体希釈液を900μL 加え混和する（100 倍希釈検体となる）。

洗浄用原液全量(40mL)に精製水を 960mL の割合で混和し調製する。洗浄用原液に結晶が析出している場合は、加温して溶解後に調製し、調製後は 2～8℃で保存する。

抗体プレート(2)検体希釈液

検体の前処理洗浄1回 (約350L)

検体希釈用原液全量(50mL)に精製水を 200mL の割合で混和
標準液、前処理済み検体し調製する。調製後は 2～8℃で保存する。
(3)標準液100L

第1反応： 20～30℃、60分間静置

標準品 12.0ng/mL を検体希釈液で 2 倍段階希釈して、洗浄3回 (約350L x 3)6.0ng/mL、3.0ng/mL、1.5ng/mL、0.75ng/mL、0.375ng/mL
第1抗体液の濃度の標準液を調製する。なお、標準液 12.0ng/mL は標

100L
第2反応： 20～30℃、60分間静置

準品 12.0ng/mL を、0ng/mL は検体希釈液を使用する。
酵素標識抗体液の調製(4)酵素標識抗体液
酵素標識抗体希釈液 12mL に酵素標識抗体原液を 60μL の洗浄3回 (約350L x 3)

酵素標識抗体液100L割合で混和し、必要量調製する。
第２反応の直前に調製し、第3反応： 20～30℃、60分間静置速やかに使用する。

基質液の調製(5)基質液基質液Ｂ 6mL に基質液Ａを 6mL の割合で混和し、必要量調洗浄3回 (約350L x 3)

基質液製する。発色反応の直前に調製し、速やかに使用する。基100L
発色反応： 20～30℃、15分間静置

質液Ａは必要量採取後直ちにキャップをして 2～8℃で保反応停止液存する。
(6)検体前処理液

100L

吸光度測定

450nm

検体前処理液に結晶が析出している場合は、泡立てないように加温して溶解後に使用する。
(2) 測定方法

３．操作方法① 各構成試薬を 20～30℃に戻す。

操作方法の概略を図２に示した。

② 洗浄液、検体希釈液、各濃度の標準液を調製する。
③ 抗体プレートのアルミラミネート袋を開封し、検査に必要(１) 検体の前処理なストリップだけを取り出す。データシート、プレートマ

血清又は血漿（抗凝固剤：ＥＤＴＡ、へパリン）の前処理ップ等で標準液や検体の位置を確認する。

① 必要な構成試薬を 20～30℃に戻す。

④ 洗浄液を抗体プレートの各ウェルに約 350μL ずつ加えた② 血清又は血漿（抗凝固剤：EDTA、へパリン）10μL を検体後、プレートウォッシャーでウェルの液を完全に吸引除去

前処理液90μL と混和後、ヒートブロック等を用いて100℃する。続けて抗体プレートを逆さにしてペーパータオル等で 5 分間加熱する。このとき、容量 1.5mL 以上のマイクロに軽く叩きつけ、ウェル内に残った洗浄液を除去する。

チューブ等の容器を用い、密閉状態で加熱すること（10 倍⑤ 各濃度の標準液及び前処理済みの検体を各ウェルに 100μ希釈検体となる）。

L ずつ加える。標準液は各測定ごと、各抗体プレートごと③ 検体希釈液を900μL 加え混和する（100 倍希釈検体となる）。に必ず測定する。

-2TI25458308

【操作上の留意事項】⑥ プレートシールで抗体プレートをカバーし、20～30℃で 60分間静置反応させる。

1.検体は採取後測定に供するまで必ず凍結保存（-70℃以下⑦ 液ハネ等しないように注意して抗体プレートからプレートが望ましい）すること。

シールを取り除き、プレートウォッシャーでウェルの液を2.検体として用いることができる血漿は、EDTA 血漿、へパリ完全に吸引除去する。続いて、洗浄液を各ウェルに約 350ン血漿である。クエン酸血漿は、測定値が低くなる傾向がμL ずつ加え、再度速やかに吸引除去する。このとき、洗あるため、使用できない。

浄液があふれないように注意する。この洗浄と吸引の操作

3.前処理済みの検体を保存する場合は、必ず凍結保存（-70℃をさらに２回繰り返した後、④と同様にウェル内に残った以下が望ましい）すること。

洗浄液を除去する

4.リコンビナントマウスアディポネクチンとの交差反応は⑧ 第１抗体液を抗体プレートの各ウェルに 100μL ずつ加え320ng/mL においても認められなかった。また、本キットをる。

用いて、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウ⑨ プレートシールで抗体プレートをカバーし、20～30℃で 60

シ胎児の各血清を測定したとき、測定範囲下限分間静置反応させる。

（0.375ng/mL）未満であった。

⑩ ⑦と同様にウェルを洗浄する

5.各構成試薬は 20～30℃に戻し、よく混和してから使用する⑪ 酵素標識抗体液を抗体プレートの各ウェルに 100μL ずつこと。洗浄用原液、検体前処理液に結晶が析出している場加える。

合は、加温して溶解すること。

⑫ プレートシールで抗体プレートをカバーし、20～30℃で 60

6.各試薬の調製は前述に従って、適切なタイミングで行うこ分間静置反応させる。と。特に基質液は、調製後時間経過とともにブランク値が⑬ ⑦と同様にウェルを洗浄する。

上昇することや、浮遊物（結晶）が生じることがあるため⑭ 基質液を抗体プレートの各ウェルに 100μL ずつ加える。

注意が必要である。

⑮ 20～30℃で 15 分間静置反応させた後、反応停止液を抗体プ

7.キットは、4 回までの分割使用が可能である。
分割使用後、レートの各ウェルに 100μL ずつ加える。

残った構成試薬等は密閉して 2～8℃で保存すること。また、⑯ プレートリーダーにより各ウェルの 450nm（２波長測定の再使用する場合には、20～30℃に戻し、よく混和してから場合には対照波長 650nm）における吸光度を測定する。

使用すること。未使用の抗体プレートは、乾燥剤とともにアルミラミネート袋に戻し、密閉して 2～8℃で保存するこ４．アディポネクチン濃度の算出と。

(1)各濃度の標準液及び検体の吸光度から標準液 0ng/mL の吸8.同一製造番号のキットを同時に 2 キット（2 抗体プレート）

光度（ブランク値）の平均値を差し引いて、各実質吸光度以上操作する場合も、各抗体プレートごとに検量線を作成を算出する。

すること。

(2)X 軸に標準液の濃度を、Y 軸にその実質吸光度をプロット

9.製造番号の異なるキットを組み合わせて使用しないこと。

する。各プロットに適当な回帰曲線を当てはめ（例：両対10.標準液、検体とも二重以上の測定をすること。

数変換の二次回帰等、図３参照）、検量線を作成する。

11.検量線の範囲を超える高濃度検体は、検体希釈液で希釈し(3)検体の実質吸光度を検量線に当てはめ、アディポネクチンて測定すること。

濃度を読みとる。

12.洗浄後のウェルを乾燥させないように注意すること。また、(4)その値に検体の希釈倍率（血清又は血漿は 5,100 倍、細胞洗浄中はウェルを傷つけないように注意すること。

抽出液又は培養上清は 100 倍）を乗じ、検体中のアディポ

13.検体や試薬間のコンタミネーションを避けるため、検体やネクチン濃度を算出する。

試薬類の分注に際しては十分注意すること。
14.使用期限切れのキットは使用しないこと。

5.0

実質吸光度

【性能（感度・再現性）】
１．感度試験
1.0

標準液 12.0ng/mL の吸光度は 1.0 以上を示した。
２．再現性試験
自社施設において、2 種類の濃度の検体を同時に 4 回測定したとき、変動係数は 10%未満であった。

0.1
0.1

1.0

自社施設において、2 種類の濃度の検体を 6 回繰り返して10.0測定したとき、変動係数は 10%未満であった。

アディポネクチン濃度 (ng/mL)

３．測定範囲図 3. 両対数変換の二次回帰による検量線作成例

0.375ng/mL～12.0ng/mL のアディポネクチンを測定するこ-3TI25458308

とができる。また、自社施設において、最小検出限界は※※【問合せ先】

23.4pg/mL であった。

大塚製薬株式会社 診断事業部
TEL：03-6717-1400【使用上又は取扱い上の注意】【製造発売元】

1.本キットの構成試薬は、ヒトアディポネクチン測定以外の目的には使用できない。

大塚製薬株式会社

2.サンプリング等に使用するピペットには口をつけないこ

東京都千代田区神田司町 2-9と。

【包材等の材質】

3.標準液及び検体は常に感染の危険性が伴うものとして取扱いには十分注意すること。検体に接触したチップ等の器

袋（抗体プレート）：ＰＥ、ＰＥＴ、金属（アルミ）具やそれらの残液及びその容器等も同様に扱うこと。

ボトル（洗浄用原液、検体前処理液、検体希釈用原

4.反応停止液は硫酸を含むので、皮膚等に付着しないよう取液、第１抗体液、酵素標識抗体希釈液、基質液Ａ、扱いには十分注意すること。

基質液Ｂ、反応停止液）：ＰＥ

5.試薬が誤って目や口に入った場合や手等に触れた場合にチューブ（標準品 12.0ng/mL、酵素標識抗体原は水で十分に洗い流すなどの応急処置を行い、必要であれ液）：ＰＰば医師の手当等を受けるようにすること。

キャップ（洗浄用原液、検体前処理液、検体希釈

6.使用後の容器やピペット等は焼却処理するか、廃棄する場

用原液、標準品 12.0ng/mL、第１抗体液、酵素標

合には廃棄物に関する規定に従って医療廃棄物又は産業識抗体原液、酵素標識抗体希釈液、基質液Ａ、基廃棄物等区別して処理すること。

質液Ｂ、反応停止液）：ＰＰ

7.本キットにはアジ化ナトリウム(0.1%以下)を含有する構抗体プレート本体：ＰＳ

成試薬（検体希釈用原液、標準品 12.0ng/mL、第１抗体液）が含まれているので、廃棄する際には大量の水とともに廃個装箱（キットケース）、ケース内仕切り：ダン棄するなど注意すること。

ボール

8.標準液及び検体に接触したチップ等の器具やそれらの残液及びその容器等は、感染の危険性があるものとし、オートクレーブ（121℃、20 分）で滅菌処理するか、又は次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃度 1,000ppm 以上）に１時間以上浸してから処理すること。
9.本キットは研究用試薬であり、疾病の診断若しくはその補助の目的で使用することはできない。

【貯法・有効期間】
2～8℃、製造日より 12 ヵ月（使用期限は外箱に表示）※【包装単位】
96 テスト用及び 480 テスト用

【引用文献】
1) Maeda K, et al. : Biochem Biophys Res Commun, 221, 286～289, 1996
2) Maeda K, et al. : Gene, 190, 227～235, 1997
3) 木原進士：ホルモンと臨床, 49, 311-317, 2001
4) Ouchi N, et al. : Circulation, 100, 2473～2476, 1999
5) Ouchi N, et al. : Circulation, 102, 1296～1301, 2000
6) Yamauchi T, et al. : Nature Med, 7, 941-946, 2001
7) Arita Y, et al. : Biochem Biophys Res Commun, 257, 79～83, 19998) Hotta K, et al. : Arterioscler Thromb Vasc Biol, 20,1595～1599, 2000
9) Hotta K, et al. : Diabetes, 50, 1126～1133, 2001

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