TI25537503

研究用試薬※※2022 年 12 月改訂（部分、第 3 版）
※2016 年 3 月改訂（ ＿ 部分、第 2 版）

ヒトアクアポリン２ ELISA キット
使用説明書
本キットは研究用試薬であり、疾病の診断若しくはその補助の目的で使用することはできない。
【全般的な注意】

さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ（酵素）標識抗ウサギ IgG

1.本キットは、尿中のヒトアクアポリン 2 を測定するキットであを反応させます（第 3 反応）。次に基質液を加えて発色させ（発色反応）、450 nm における吸光度を測定します。標準液の吸光り、それ以外の目的に使用しないでください。
2.使用する際には、使用説明書をよく読んでください。

度より標準曲線を求め、尿検体中のヒトアクアポリン 2 濃度を3.使用する機器の添付文書及び取扱い説明書をよく読んでから算出します。

使用してください。
ヒトアクアポリン2

抗ヒトアクアポリン2
抗血清E

Y Y Y

【形状・構造等（キットの構成）】
洗浄用原液
1 次反応用緩衝液

40 mL×1 ボトル
15 mL×2 ボトル④抗体プレート

96 ウェル×1 枚⑤

抗ヒトアクアポリン 2 抗血清原液

100μL×1 チューブ

⑥2 次・3 次反応用緩衝液

40 mL×1 ボトル⑦

酵素標識抗ウサギ
IgG 原液100μL×1 チューブ

基質液 A

7.5 mL×1 ボトル⑨ 基質液 B
⑩ 反応停止液

7.5 mL×1 ボトル
15 mL×1 ボトル

⑧

第2反応

第3反応

発色反応

吸光度測定成分等
緩衝剤ほか
緩衝剤ほか
抗ヒトアクアポリン 2モノクローナル抗体
固相化プレート
抗ヒトアクアポリン 2
抗血清（ウサギ）ほ※かE

Y Y Y

Y Y Y

EE

E

EE

Y Y Y

①③

第1反応

基質液

EY Y Y

容量E

Y Y Y

構成試薬名

酵素標識
抗ウサギIgGY Y YY Y Y

Y Y Y

抗体プレート

図 1 測定原理概要【操作上の注意事項】

緩衝剤ほか

1．測定試料に関する事項

西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識抗ウサ
ギ IgG ポリクローナ
ル抗体（ヤギ）ほか
3、3’、5、5’-テトラメチルベンジジンほか過酸化水素ほか
硫酸ほか(1) 尿検体は前処理後、測定に使用してください。
(2) 尿検体は前処理直前に試験管ミキサーで十分混和してください。
(3)前処理済み尿検体は、5 回まで凍結融解しても測定への影響はありませんでした。
(4) 尿検体を輸送する場合は冷蔵で行ってください。尿検体は冷蔵又は－20℃以下で保存した場合、9 ヵ月まで測定への付属品：プレートシール 6 枚影響はありませんでした。
(5) 前処理済み尿検体は30℃で保存した場合は、24 時間まで、別包装（凍結：－20℃以下保存）②

構成試薬名標準液（600ng/mL）

容量200μL×1 チューブ成分等
リコンビナントヒト
アクアポリン 2 ほか

冷蔵又は－20℃以下で保存した場合は、80 日まで測定への影響はありませんでした。
2．尿検体の前処理法(1) 必要な試薬、容器【使用目的】

尿検体の前処理液調製には以下の試薬が必要です。本キッ

尿中のヒトアクアポリン 2 の測定

トには含まれていませんので測定開始にあたって準備してください。

※【測定原理】

・Triton X‐305（ｼｸﾞﾏ ｱﾙﾄﾞﾘｯﾁ社：X305-500ML：70%）

本キットは、ELISA 法を原理としてヒトアクアポリン 2 を測定・フェノールレッド（特級）します 1)。測定原理概要を図 1 に示します。抗ヒトアクアポリ・水酸化ナトリウム（特級）医薬用外劇物

ン 2 モノクローナル抗体を固相したプレート（抗体プレート）・塩酸（特級）医薬用外劇物に、標準液又は前処理済み尿検体を加えて反応させると、溶液

・HEPES：2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesul -中のヒトアクアポリン 2 が抗体プレートに結合します（第 1 反fonic acid応）。
次に抗ヒトアクアポリン 2 抗血清を反応させ（第 2 反応）、・容器：ポリエチレン、ポリプロピレン、ガラス製等の-1-

100 mL 程度の密閉可能な容器を用いてください。

また、洗浄中はウェルを傷つけないように注意してくださ

ただし、4N 水酸化ナトリウム溶液はガラス容器に保管い。
(3) 各構成試薬は 20～30℃に戻し、よく混和してから使用してしないでください。
(2) 前処理液の調製に関する注意事項

下さい。洗浄用原液に結晶が析出している場合は、加温し

1) 水酸化ナトリウムおよび塩酸は、事前に安全性データシ溶解後に使用してください。

ート（SDS）を確認の上、必ず保護具を着用する等適切に(4) 本キットは 4 回まで分割使用が可能です。

取り扱ってください。

(5) 使用後、残った構成試薬等は密閉して 2～8℃（標準液は－2) 調製した 4N 水酸化ナトリウム溶液および 4N 塩酸／1M20℃以下）で保存して下さい。未使用の抗体プレートは、HEPES 溶液も劇物に該当します。必ず保護具を着用する乾燥剤とともにアルミラミネート袋に戻し、密閉して 2～等適切に取り扱ってください。保管する場合は容器に「医8℃で保存して下さい。
(6) 標準液（600 ng/mL）は 7 回まで凍結融解しても測定に影響

薬用外劇物」と表示して適切な場所に保管してください。
3) 各前処理液は 2～8℃で保管して下さい。

はありませんでした。

4) Triton X‐305 は粘性が高いため、慎重に秤取し共洗いに※【測定方法】

より正確な量を添加してください。
(3) 前処理液の調製

1．必要器具、機器等(1) メスシリンダー

1) 5% Triton X‐305 溶液
4 mL の 70%Triton X‐305 と 1 mg のフェノールレッドを(2) メスピペット

52 mL の精製水で溶解します。

(3) マイクロピペット及びチップ2) 4N 水酸化ナトリウム溶液(4) プレートシェイカー

水酸化ナトリウム 8 g を 50 mL の精製水で溶解します。

(5) プレートウォッシャー

3) 4N 塩酸/1M HEPES 溶液(6) インキュベーター

14.3 g の HEPES を 30 mL 精製水で溶解します。HEPES 溶(7) ペーパータオル

液に 20 mL の濃塩酸を少量ずつ撹拌しながら加え、精製(8) プレートリーダー（測定波長：450 nm）

水で 60 mL に調製します。

(9) マイクロチューブ等（容量 1.5 mL 以上の密閉可能な容器）
2．試薬の調製法・保存法(4) 尿検体の前処理方法
1) 各前処理液を 20～30℃に戻します。

(1) 洗浄液

2) 検体前処理用のマイクロチューブ（容量 1.5 mL 以上の密洗浄用原液全量（40 mL）に精製水を 960 mL の割合で混和閉可能な容器）を用意します。

し調製する。洗浄用原液に結晶が析出している場合は、加3) 尿検体を試験管ミキサーで十分に撹拌後、速やかに 200温して溶解後に調製します。

μL をマイクロチューブに分注します。このとき尿沈さを(2) 標準液除去しないでください。
（沈さ中にもヒトアクアポリン 2標準液（600 ng/mL）20 μL を 1 次反応用緩衝液 380 μL でが存在するため均一に攪拌し、沈さも含めて素早く採取20 倍希釈し、30.0 ng/mL 標準液とします。30.0 ng/mL 標準して下さい。
）液を 2 倍段階希釈して、15.0 ng/mL、7.50 ng/mL、3.75 ng/mL、

4) 各マイクロチューブに 20 μL の 5%Triton X‐305 溶液を1.88 ng/mL、0.94 ng/mL、0.47 ng/mL の濃度の標準液を調製します。なお 0 ng/mL 標準液は 1 次反応用緩衝液を使用し加え、混合します。
5) 各マイクロチューブに 20 μL の 4N 水酸化ナトリウム溶ます。標準液の希釈方法を表 1 に示します。

液を加え、混合します。

表１ 標準液の希釈方法

6) 各マイクロチューブを 20 分間室温で静置します。

調製後濃度

7) 各マイクロチューブに 20 μL の 4N 塩酸/1M HEPES 溶液(ng/mL)
30.0
15.0
7.50
3.75
1.880.940.47を加え、混合します。この前処理した尿検体を測定に供します。
（前処理済み尿検体中の沈さはサンプリングしないでください。
）
3．妨害物質血液は 2.0%まで、ヒトγーグロブリンは 10.0 mg/dL まで、ヘモ採取標準液(ng/mL)600
30.0
15.07.50
3.75
1.880.94(μL)
20200200200200200200

1 次反応緩衝液(μL)
380200200200200200200

グロビンは 1.0 mg/dL まで、測定に影響はありませんでした。
(3) 抗ヒトアクアポリン 2 抗血清希釈液（201 倍希釈）

4．操作に関する事項(1) 測定時のコンタミネーションを避けるため、尿検体、前処2 次・3 次反応用緩衝液 12 mL に抗ヒトアクアポリン 2 抗

理済み尿検体や試薬類の分注に際しては十分注意してく

血清原液を 60 μL の割合で混和し、必要量調製します。第ださい。

2 反応の直前に調製します。

(2) 洗浄後のウェルを乾燥させないように注意してください。

-2-(4) 酵素標識抗ウサギ IgG 希釈液 （201 倍希釈）

2 次・3 次反応用緩衝液 12 mL に酵素標識抗ウサギ IgG 原ます。

液を 60 μL の割合で混和し、必要量調製します。第 3 反応(16) プレートリーダーにより各ウェルの 450 nm（2 波長測定の場合には対照波長 650 nm）における吸光度を測定しまの直前に調製します。
(5) 基質液す。

基質液 A 6 mL に基質液 B を 6 mL の割合で混和し、必要量調製します。発色反応の直前に調製し、速やかに使用し抗体プレートます。

洗浄1回 （約350μL×1）

標準液の希釈3．操作方法

1次反応用緩衝液

操作方法の概略を図 2 に示しました。

標準液、試料標準液及び前処理済み尿検体（試料）は、2 重測定をお薦めしま

100μL
50μL

抗ヒトアクアポリン2抗血清希釈液の調製す。

第1反応： 20～30℃、120分振とう

洗浄3回 （約350μL×3）

抗ヒトアクアポリン2抗血清希釈液(1) 各構成試薬を 20～30℃に戻します。
(2) 洗浄液、各濃度の標準液を調製します。

酵素標識抗ウサギIgG希釈液の調製(3) 抗体プレートのアルミラミネート袋を開封し、測定に必要なストリップだけを取り出します。データシート、プレー

洗浄3回 （約350μL×3）

酵素標識抗ウサギIgG希釈液

100μL
第3反応： 20～30 ℃、120分振とう（又は、 4℃、17時間静置）

トマップ等で標準液や試料の位置を確認します。
(4) 洗浄液を抗体プレートの各ウェルに約 350 μL ずつ加えた

基質液の調製後、プレートウォッシャーでウェルの液を完全に吸引除去

洗浄3回 （約350μL×3）

基質液

100μLします。続けて抗体プレートを逆さにしてペーパータオル

発色反応： 20～30 ℃、10分静置等に軽く叩きつけ、ウェル内に残った洗浄液を除去します。

反応停止液

100μL

(5) あらかじめ 1 次反応用緩衝液を各ウェルに 100 μL ずつ加吸光度測定 450nm

えた後、各濃度の標準液又は試料を各ウェルに 50 μL ずつ

図 2 操作方法概略

加えます。標準液は測定ごと、抗体プレートごとに必ず測定します。

4．ヒトアクアポリン 2 濃度の算出方法(6) プレートシールで抗体プレートをカバーし、20～30℃で各濃度の標準液及び検体の吸光度から標準液 0 ng/mL の吸光度120 分間振とう反応（400～800 rpm）させます。
（機種に（ブランク値）の平均値を差し引いて、各実質吸光度を算出しま＜第 1 反応＞より若干の違いがあります。）

100μL
第2反応： 20～30 ℃、120分振とうす。

(7) 液ハネ等しないように注意して抗体プレートからプレーX 軸に標準液の濃度を、Y 軸にその実質吸光度をプロットしま

トシールを取り除き、プレートウォッシャーで各ウェルのす。適切な回帰式を用い（例：4 パラメーターロジスティック曲液を完全に吸引除去します。続いて、洗浄液を各ウェルに線による検量線作成例、図 3 参照）、検量線を作成します。

約 350 μL ずつ加え、速やかに吸引除去します。このとき、検量線から試料の実質吸光度に対応する、ヒトアクアポリン2 濃洗浄液があふれないように注意してください。この洗浄と度を読みとります。

吸引の操作をさらに 2 回繰り返した後、(4)と同様にウェル尿検体中のヒトアクアポリン 2 濃度は、読み取った濃度に前処内に残った洗浄液を除去します。

理時の検体希釈倍率である 1.3 を乗じて容積補正し算出します。

(8) 調製した抗ヒトアクアポリン2 抗血清希釈液を抗体プレートの各ウェルに 100 μL ずつ加えます。
(9) プレートシールで抗体プレートをカバーし、20～30℃で120 分間振とう反応させます。

＜第 2 反応＞

実質吸光度(10) (7)と同様にウェルを洗浄します。
(11) 調製した酵素標識抗ウサギ IgG 希釈液を抗体プレートの各ウェルに 100 μL ずつ加えます。
(12) プレートシールで抗体プレートをカバーし、20～30℃で120 分間振とう反応、又は、4℃で 17 時間静置します。
＜第 3 反応＞

ヒトアクアポリン 2 濃度（ng/mL）(13) (7)と同様にウェルを洗浄します。
(14) 調製した基質液を抗体プレートの各ウェルに 100 μL ずつ加えます。20～30℃でストップウオッチ等を用いて、そ図 3 4 パラメーターロジスティック曲線による検量線作成例※【性能】
1．感度試験

れぞれのウェルの発色反応が正確に 10 分間となるように静置反応させます。

標準液 0 ng/mL の吸光度は 0.100 以下を示します。

＜発色反応＞

標準液 0.47 ng/mL の吸光度から 0 ng/mL の吸光度を引いた(15) 反応停止液を抗体プレートの各ウェルに 100 μL ずつ加え-3-

1 時間以上浸してから処理してください。

値は、0.030 以上を示します。
標準液 30.0 ng/mL の吸光度から 0 ng/mL の吸光度を引いた(3) 4N 水酸化ナトリウム溶液、4N 塩酸／1M HEPES 溶液を廃

値は、1.000 以上を示します。

棄する場合は、中和し大量の水で希釈することにより劇物2．正確性試験に該当しない物とした後、県や市等の廃棄物に関する条例

3 種類の管理検体の測定値は既知濃度の±30%以内の値を示や指針に従って処理してください。

します。

【包装】

3．同時再現性試験
3 種類の管理検体を 2 重測定で同時に 4 回測定するとき、測96 テスト用

定値の変動係数はいずれも 20%以下の値を示します。

（標準液別包装）4．測定範囲【貯法・有効期間】

自社施設にて、測定試料として前処理済み尿検体を用いた試
験の結果、ヒトアクアポリン 2 の測定範囲は 0.27～30.0

キット本体：2～8℃保存

ng/mL（前処理前の尿検体での測定範囲は、容積補正として標準液（別包装）：－20°C 以下保存

1.3 倍した 0.35～39.0 ng/mL）と設定しました。

製造日より 18 ヵ月（使用期限は外箱に表示）【使用上又は取扱い上の注意】【主要文献】

1．取り扱い上（危険防止）の注意

1) Sasaki S, Ohmoto Y, Mori T, Iwata F, Muraguchi M. Daily varianceof urinary excretion of AQP2 determined by sandwich ELISA
method .Clin Exp Nephrol. 2012; 16: 406-10.

(1) サンプリング等に使用するピペットには口をつけないでください。
(2) 標準液及び検体は常に感染の危険性が伴うものとして取扱いには十分注意してください。検体に接触したチップ等※※ 【問い合わせ先】
大塚製薬株式会社 診断事業部の器具やそれらの残液及びその容器等も同様に扱ってく

TEL：03-6717-1400

ださい。
(3) 測定操作にあたっては、感染の危険性を避けるために、マ【製造発売元】

スク及びディスポーザブルゴム手袋、実験着及び保護眼鏡

大塚製薬株式会社を着けて操作してください。また、取扱い後は手をよく洗東京都千代田区神田司町 2-9ってください。
(4) 反応停止液は硫酸を含んでいますので、皮膚等に付着しな【包材等の材質】

いよう取扱いには十分注意してください。

袋（抗体プレート）：ＰＥ、ＰＥＴ、金属（アルミ）(5) 試薬が誤って目や口に入った場合や手等に触れた場合にボトル（洗浄用原液、1 次反応用緩衝液、2 次・3 次は、水で十分に洗い流すなどの応急処置を行い、必要であ

反応用緩衝液、基質液Ａ、基質液Ｂ、反応停止液）：

れば医師の手当等を受けるようにしてください。

ＰＥ

2．使用上の注意

チューブ（抗ヒトアクアポリン 2 抗血清原液、酵素(1) 使用期限を過ぎたキットは使用しないで下さい。

標識抗ウサギ IgG 原液、標準液（600 ng/mL））：Ｐ(2) 製造番号の異なるキット中の構成試薬を組み合わせて使Ｐ用しないでください。

キャップ（洗浄用原液、1 次反応用緩衝液、2 次・3(3) 製造番号は同じキットであっても、異なるパッケージの構

次反応用緩衝液、基質液Ａ、基質液Ｂ、反応停止液、成試薬、抗体プレートを組み合わせて使用しないでくださ

抗ヒトアクアポリン 2 抗血清原液、酵素標識抗ウサい。

ギ IgG 原液、標準液（600 ng/mL））：ＰＰ(4) 本キットの標準液は－20℃以下、その他の構成試薬は 2～

抗体プレート本体：ＰＳ8°C で保存し、使用前に各構成試薬を 20～30℃に戻してください。

個装箱（キットケース）、ケース内仕切り：ダンボー

3．廃棄上の注意

ル(1) 使用後の容器やピペット等は焼却処理するか、廃棄する場
合には廃棄物に関する規定に従って医療廃棄物又は産業廃棄物等区別して処理してください。
(2) 標準液及び検体に接触したチップ等の器具やそれらの残液及びその容器等は、感染の危険性があるものとし、オートクレーブ（121°C、20 分）で滅菌処理するか、又は次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃度 1,000 ppm 以上）に

-4-

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