カテキンプローブの効率的合成と分子イメージングによる動態解析
Efficient Synthesis of Catechin Probe and its Molecular Imaging
静岡県立大学薬学部

医薬品製造化学教室

教授

菅敏幸、助教 浅川 倫宏

Toshiyuki Kan (Pofessor), Tomohiro Asakawa (Assistant Pofessor)
School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka
静岡県立大学

薬学部

医薬生命化学教室

教授

奥直人、助教 清水広介

Naoto Oku (Pofessor), Kosuke Shimizu (Assistant Pofessor)
School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka
浜松ホトニクス
（株）
中央研究所

塚田 秀夫

Hideo Tsukada
Central Research Laboratory, Hamamatsu Photonics K. K.の詳細な動態解明研究例は少なかった。我々は、カテキ

1. はじめにンに目印を付けたプローブ分子を合成することにより、生近所のスーパーのお茶売り場には、「インフルエンザ予理的条件下での動態解明が可能になると考え、研究に防：緑茶でうがいをしましょう」と書かれたポスターが、同僚着手した。さて、菅らの研究室では2005 年の赴任後より、の顔写真付きで貼られている。たしかに、緑茶のカテキンカテキン類の合成研究を開始していた。その過程で、図 1類はインフルエンザウイルスの感染を阻害することが証明に示す A 環部に水酸基の無いデオキシ EGCG（以下、されている。また、静岡特産の「緑茶」を多く飲む土地のDOEGCg）（2）が 1とほぼ同等のインフルエンザウイルス

人はガンや糖尿病になりにくいと言われ、その有効成分で増殖抑制活性を有することを明らかにした 1）。さらに、そあるエピガロカテキンガレート（以下、EGCg）（図 1 中、化の結果を基にして種々のプローブユニットの導入が可能と合物 1）は抗ガン作用や抗菌活性作用などの多彩な生理なる第一級アミン含有の側鎖を有する（−）-アミノペンチル活性を有していることも古くから知られている。そのため、デオキシ EGCG（以下、（−）-APDOEGCg）（ 3）を設計、EGCg の抗ウイルス作用、抗菌作用研究あるいは、がん合成した 2）。プローブ前駆体となる 3 はフェノール性水酸細胞の増殖抑制作用に代表される様々な生理作用研究

基を保護することなく、様々なプローブユニットの導入がは盛んに行われてきた。
しかし、EGCgの生体内や細胞で可能であった。特に、蛍光発色団（Tokyo Green）と連結

図 1 エピガロカテキンガレート（1）とその誘導体の構造

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カテキンプローブの効率的合成と分子イメージングによる動態解析することで蛍光プローブ（以下、APDOEGCg-TG）（4）をと3 位の立体化学を制御して 4 つの異性体を作り分ける合成し、ヒト臍帯静脈内皮細胞（以下、HUVEC）におけことが可能となった。図 2 で示したように、まず、A- 環部 7

るEGCg-TGの細胞内動態を解析した。
また、独自に開発とB- 環部 8をJulia-Kocienski 反応により連結しトランスオしたニトロベンゼンスルホニル（以下、Ns）基 をフェノールレフィン体 9を得た。引き続く、リンカー部分となる側鎖は 9性水酸基の保護基として用いることにより、EGCg の水酸への鈴木−宮浦反応により導入した。さらに、側鎖末端の基に位置選択的にメチル基を導入する方法を開発した4）。

窒素官能基は、筆者らが開発したNsアミド 7）との光延反

さらに、この方法により合成したメチル化 EGCg（5）を指標応により導入した。次に、AD-mix-βにより光学活性ジオーとすることで、1 から Cメチル化 EGCg（6）の迅速合成をルとした後、没食子酸を導入した。本反応では、位置選達成し、ラットへの経口と静脈内投与によるポジトロン断層択的なエステルは得られなかったが、2 位と3 位の混合物（PET）解析に成功した。のまま塩基処理すると転位反応が進行し、立体障害の小3）

11

さい 3 位の水酸基がエステル化された共通中間体 11 へ
2. カテキン蛍光プローブと収束した。続いて、鍵となる11からのピラン環の構築は、これまでの我々の合成の知見 6）を基にすることで、2 位選択的に構築可能となった。すなわち、11に酸を作用さ隣接基関与を利用することでシス・トランスの両異性体を

図 2 APDOEGCg（3）の合成とプローブ分子への変換

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せるとキノンメチド中間体 12を経由した環化が進行し、ト布が 4 の細胞内動態とかなり異なることから、4 の細胞内ランスのジヒドロベンゾピラン環 13 が得られた。一方、11分布は EGCg の分布を反映している可能性が大きいとを酸化してケトン15 にした後、三フッ化ホウ素−ジエチル考えられる。

エーテル錯 体（BF3・OEt2）存 在 下 でトリエチルシラン（Et3SiH）を作用させると中間体 16を経由して、ガロイル基の反対側からヒドリドの攻撃が進行しシス体のピラン17を構築した。同様の隣接基関与を利用したピラン環のシ「べにふうき」とよばれる茶は、含有するメチル化 EGCg

ス・トランス選択的構築は、糖の C-グリコシル化反応で報（5）に強力な抗アレルギー活性を有しているため、花粉症告されている 。さらに、窒素上の Ns 基をチオフェノールに有効な茶として大きな注目を集めている。当研究室で（PhSH）にて脱保護した後、ベンジル（Bn）とカルボベンジは、これまでのカテキン類合成の知見と、独自に開発したルオキシ（Cbz）基を水素添加反応により同時に除去し、プNs 基 3）をフェノール性水酸基の保護基として用いることローブ前駆体となる3を合成した。得られた3 は、天然物で、以下のメチル化 EGCgの合成を達成した 4）。図 4に示の 1 や合成品の 2より、さらに強いインフルエンザ感染阻したように、まず、没食子酸エステル20 の 3 位と4 位への害活性を有していることが明らかとなり2）、A 環部の修飾選択的なメチル基の導入を行った。20に炭酸リチウム存によって活性が失われていないことも確認した。また、この在下、ヨウ化メチルを作用させると最も反応性の高い 4 位3 は、フェノール性水酸基を保護することなく、様々なプ選択的にメチル基が導入される。一方、ホウ酸存在下にローブユニットの導入が可能な特徴を有している。まず、て反応を行うと、カテコールのホウ酸エステルの架橋中間グルタルアルデヒドをリンカーとしたキャリアータンパク質（ヒ体を経由して、3 位選択的にメチル化反応が進行した。こト血清アルブミン：HSA）と結合を行い、ハプテン18を合成

れらメチル基を導入した没食子酸の 2 つのフェノール性した。この 18を抗原としてマウスに免疫することで、モノク水酸基をNs 基にて保護した後、カルボン酸へと変換してローナル抗体の作製にも成功した。次に、蛍光プローブ

22と25を合成した。さらに、安価かつ容易に得られるカテの合成では、多くの既存の蛍光発色団の中から合成がキンの Ns 保護体 26と22と25 の縮合は円滑に進行し、9）容易なTokyo Green（TG） を選択した。3 のアミノ基の高27と28 が得られた。さらにチオフェノールと炭酸セシウム

い反応性を利用することで、フェノール性水酸基を保護を作用させると、エステルの分解や 2 位のエピメリ化が進することなくTG- 活性エステル19とのアミド化反応が進行行することなく、Ns 基の除去が進行し5と29 の合成を達しAPDOEGCg-TG（4）が得られた。また、本合成方法は成した。また、同様の手法にてB- 環の水酸基にも区別し高極性なプローブ合成に煩雑な精製操作を必要としないてメチル基の導入が可能となった。

8）

特徴も有している。

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3. カテキン PETプローブ

さて、PET 解析はガン診断にも使われる、リアルタイムか次にTokyo Green で標識した4を用いてHUVECにおつ三次元でイメージング可能な有効な方法である。しかける4 の細胞内動態を解析した 4）。図 3 に示したように、し、ポジトロン放出核種の 11C の半減期が 20 分と短時間4 はドット状に細胞に取り込まれ、時間と共に蛍光強度がであるため迅速なプローブ合成が強く求められている。そ増強した。また37℃、24 時間のインキュベーションで細胞こで、合成した 12Cメチル化 EGCg（5）を指標に、短時間質に広く分布していた。このことからカテキンはエンドソーでの 1 への 11Cメチル基の導入を試みた。種々条件を検ムに取り込まれ、細胞質に広がることが示唆されるが、細討した結果、図 5に示すように、n-Bu4NOHを塩基として胞質全体に広がってはいないので、その詳細については用いジメチルスルホキシド（DMSO）中、ヨウ化メチルを作さらなる検討が必要である。なお、4℃のインキュベーショ用させると、D 環ガレート部 4 位に選択的なメチル化が進ンでは、37℃のインキュベーションでみられる強い蛍光は行し、3 分で終了した。引き続く、高速クロマトグラフィー観察されなかったことから、エンドサイトーシスによる4 の（HPLC）による短時間での単離精製は、アスコルビン酸を取り込みが示唆された。さらに遊離の TGを用いた場合添加することで達成した。本メチル化と単離精製の条件には 4 のような強い蛍光は観察されず、またその分布はを浜松ホトニクスのホットラボにて実施することで、11Cメチ一部アクチンと共局在していた（図 3）。遊離の TG の分

ル化 EGCg（6）の高速合成に成功した。

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図 3 HUVECとTGやAPDOEGCｇ-TG（4）との複合体
HUVECを1µMのTG（上段）
またはAPDOEGCｇ-TG（4）（下段、緑色）と37℃でインキュベートし、細胞固定後にローダミン／パロイジン（赤色）およびDAPI（青色）
によりアクチン及び核の染色後、共焦点レーザー顕微鏡にて確認。

図 4 各種メチル化カテキンの実用的合成

図 5 カテキンPETプローブの合成

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図 6 11Cメチル化 EGCg
（6）をラット経口投与後の 5－15 分の集積画像

図 7 11Cメチル化 EGCg
（6）をラット尾静脈内投与後の 5－15 分の集積画像

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引き続き、合成した 6を普通飼育したラットに経口投与どのように変化するかを調べるなど応用範囲は広く、本研し、その動態を測定した。図 6 は、投与後 5−15 分の集

究は今後のカテキン研究や機能性食品成分の研究の発積画像を示している。6は胃に滞留し、徐々に小腸に移行展に大きく貢献するものと考えている。

する様子が観察された。別にラット（n=4）
を用意し、投与1 時間後に解剖して定量的解析を行ったところ、約 40％

謝辞の放射活性が胃から回収され、約 10％の放射活性が小本研究は、文部科学省「21 世紀 COEプログラム：先腸から回収された。体内に吸収された6 はごく少量と考え導的健康長寿学術研究推進拠点」と「グローバル COEられることから、その分布を画像から判断することは難し

プログラム：健康長寿科学教育研究の戦略的新展開」

い。そこで放射活性から定量的解析を行ったところ、放のプロジェクトとして開始された。日頃より叱咤激励いただ

射活性の約 0.1％が肝臓から回収され、血中からも全量いた元拠点リーダーの木苗直秀教授（静岡県立大学学の 10 分の 1 程度が回収された。このことは 6 の一部が吸長）に深謝します。さらに、本研究は「独立行政法人科学収され肝臓で代謝されることを示唆している。また腎臓か技術振興機構の地域結集型研究開発プログラム：静岡

らは約 0.05％の放射活性が回収された。

発

世界を結ぶ新世代茶飲料と素材の開発」の支援も経口投与後の動態解析結果をさらに裏付けるために、受けました。ご指導頂いた企業化統括の原征彦客員教次に6を静脈内に投与し、血中の 6 がどのように分布し代授と代表研究者の中山勉教授に感謝します。また、本研謝されるかを検討した。図 7 は、投与後 5−15 分の集積究が世界に誇れる「静岡のお茶」に貢献できれば、著者画像を示している。6 の放射活性は主に肝臓で観察されらにとっての大きな喜びです。

た。投与 5 分後及び 1 時間後に解剖して得られた定量的解析結果では、放射活性回収の絶対量は異なるものの経口投与後と類似の体内組織分布パターンを示したことから、経口投与で吸収された6 が、血中から肝臓に移行して代謝されることを示唆した。
さらに、6の静脈内投与後の PET 画像変化を追うと、肝臓から小腸に放射活性が移行する様子が観察され、投与 30 分後には小腸の放射活性が肝臓よりはるかに高くなるという像が観察された。
すなわちEGCg（正確にはガロイル基あるいはガロイル基に結合したメトキシ基）は、肝臓で代謝された後に、速やかに胆汁中に排泄されることが強く示唆された。

参考文献
1）Furuta, T.; Hirooka, Y.; Abe, A.; Sugata, Y.; Ueda, M.;
Murakami, K.; Suzuki, T.; Tanaka, K.; Kan, T. Bioorg. Med.
Chem. Lett. 2007, 17, 3095-3098.
2）Yoshida, A.; Hirooka, Y.; Sugata, Y.; Nitta, M.; Manabe, T.;
Ido, S.; Murakami, K.; Saha, R. K.; Suzuki, T.; Ohshima,M.; Yoshida, A.; Itoh, K.; Shimizu, K.; Oku, N.; Furuta, T.;
Asakawa, T.; Wakimoto, T.; Kan, T. Chem. Commun. 2011,47, 1794-1796.
3）Kan, T.; Fukuyama, T. Chem. Commun. 2004, 40, 353-359.

4. おわりに4）Aihara, Y.; Yoshida, A.; Furuta, T.; Wakimoto, T.; Akizawa,T.; Konishi, M.; Kan. T. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 45,4171-4174.

以上、述べてきたように蛍光標識カテキンの細胞内動

5）Piyaviriyakul, S.; Shimizu, K.; Asakawa, T.; Kan, T.; Siripong,P.; Oku, N. Biol. Pharm. Bull. 2011, 34, 396-400.

態の可視化、および PETを用いることでカテキンの吸収と体内分布を可視化することに成功した。我々は、機能性

6）Hirooka, Y.; Nitta, M.; Furuta, T.; Kan, T. Synlett. 2008, 32343238.

を有する他の食品成分の体内動態 PET 解析にも成功し

7）Fukuyama, T.; Cheung, M .; Kan, T. Synlett. 1999, 1301-1303.ており10）、PETを用いて食品成分の体内動態を可視化

8）Lewis, M.D.; Cha, J.K.; Kishi, Y. J. Am. Chem. Soc. 1982,104, 4976-4978.

する分子イメージング技術は、食品成分の機能性を解明する上で、非常に貴重なデータとなると確信している。本稿では 11Cメチル化 EGCg（6）を用いて経口投与時と、カテキン摂取後の動態を知るために静脈内投与の実験を行った。また、種々の食品等の摂取時にカテキン吸収が9）Urano, Y.; Kamiya, M.; Kanda, K.; Ueno, T.; Hirose K.;
Nagano, T. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4888-4894.
10）Asakawa, T.; Hiza, A.; Nakayama, M.; Inai, M.; Oyama, D.;
Koide, H.; Shimizu, K.; Wakimoto, T.; Harada, N.; Tsukada, H.;
Oku, N.; Kan, T. Chem. Commun. 2011, 47, 2868-2870.

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