ISSN

2188-2541

なごやの生物多様性

10：1-12（2023）

原著論文

環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析
黒川

景（1）

野呂

達哉（2）

熊澤

慶伯（3）

愛知県立大学看護学部病理学 〒463-8502 愛知県名古屋市守山区上志段味東谷
四日市大学環境情報学部環境情報学科 〒512–8512 三重県四日市市萱生町1200（3）
名古屋市立大学大学院理学研究科附属生物多様性研究センター 〒467-8501 名古屋市瑞穂区瑞穂町字山の畑1
（1）
（2）

Preliminary analysis of animal species around Saido-nagare Stream using
environmental DNA
Kei KUROKAWA（1）Tatsuya NORO（2）Yoshinori KUMAZAWA（3）Division of Pathology, Graduate School of Nursing and Health, Aichi Prefectural University, Tougoku
Kamishidami, Moriyama-ku, Nagoya, Aichi 463-8502, Japan（2）
Faculty of Environmental and Information Sciences, Yokkaichi University, 1200, Kayou-cho, Yokkaichi, Mie
512-8512, Japan（3）
Research Center for Biological Diversity, Graduate School of Science, Nagoya City University, 1 Yamanohata,
Mizuho-cho, Mizuho-ku, Nagoya 467-8501, Japan（1）

Correspondence:
Kei KUROKAWA  E-mail: keikuro@nrs.aichi-pu.ac.jp

要旨
名古屋市守山区中志段味地区にある才井戸流は，市内に残された貴重な湧水地の一つであり，大都市近郊にありながら多様な生物が観察されるスポットとして知られる．近年，次世代シーケンシングによる環境DNAメタバーコーディングの分析手法が開発され，環境中に生息する生物種の特定に有用であることが示されている．そこで，才井戸流の水から抽出した環境DNAを用いて，流域の動物種を分析することを試みた．魚類分析用のプライマーセットであるMiFish-Uを用いた分析では，ドジョウ属，
ミナミメダカ，タモロコが常時検出され，過去の才井戸流の生態調査の報告と概ね合致する結果が得られた．過去の生態調査では，希少種であるスナヤツメの生息が報告されているため，円口類分析用のプライマーセットMiFish-Lを用いた分析も試みたが，ポリメラーゼ連鎖反応による十分な増幅産物が得られなかった．哺乳類用のプライマーセットMiMammal-Uを用いた分析では，ドジョウ属，ミナミメダカ，
タモロコといった魚類とともに，ニホンイタチ，ハツカネズミ，キクガシラコウモリが検出された．ニ
ホンイタチとキクガシラコウモリは，名古屋市版レッドリスト2020で絶滅危惧ⅠA類に掲載されているが，それらの生息を強く支持するデータが得られた．環境DNAメタバーコーディングは，目視での生息調査を補完する継続的モニタリング手法として，今後より広く活用されることが期待される．
Saido-nagare Stream at Naka-Shidanmi district in Moriyama Ward, Nagoya City, is one of thevaluable springs in the city where rich biodiversity has been maintained despite its location in the
peripheral of the large city. In recent years, environmental DNA（eDNA）metabarcoding using the

受付日：2022年10月12日
受理日：2023年 1 月18日
―1―

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

next-generation sequencing has emerged and proved to be useful for identifying animal species livingin the environment. Here, we analyzed animal species around Saido-nagare using eDNA extracted
from the water of the stream. Misgurnus sp., Oryzias latipes, Gnathopogon elongatus were always
detected using the primer set for fish analyses, MiFish-U. These results are consistent with previous
reports on ecological surveys of Saido-nagare. Since past field surveys recognized Lethenteronreissneri as a rare aquatic species at Saido-nagare, we also attempted to detect this species by the
eDNA approach using the primer set specific for lampreys, MiFish-L. However, we did not detect any
amplification products by polymerase chain reaction using this primer set. The eDNA metabarcoding
using the primer set for mammals, MiMammal-U, detected Mustela itatsi, Mus musculus, andRhinolophus ferrumequinum, along with Misgurnus sp., Oryzias latipes, and Gnathopogon elongatus. M.
itatsi and R. ferrumequinum are listed as Critically Endangered IA species in the Red List Nagoya
2020. The eDNA metabarcoding that can complement visual surveillance in the field will be more
widely used for continuous monitoring of biodiversity.

であり，生物の分類群を超えて生命を維持するための細序文
才井戸流は，名古屋市北東部，守山区中志段味の庄内

胞の基本的な機能を担っている．rRNAの塩基配列は，川河畔に位置し，市内で最大級の湧水地の一つとして知生物の進化の過程で変異を生じつつも，幅広い生物で高られる．一部人の手の入った環境であるにもかかわら度に保たれていることから，
rRNA遺伝子の塩基配列（真ず，多様な生物の生息が知られ，調査や保全活動が行わ核生物では，核DNAにコードされる18S rRNA遺伝子まれている（土山ほか，2011；西ほか，2012）．

たはミトコンドリアDNAにコードされる12S rRNA遺伝

地域に生息する生物の調査は，現地でその生物を目視しつつ，可能ならば採取を行い，主に形態的特徴によっ子の塩基配列）に基づく生物の系統的分類は汎用性の高い方法と認められている．

て同定することが基本である．しかし，絶滅危惧種など

今 日， 米 国（National Center for Biotechnology

個体数が減少した生物，夜行性あるいは飛翔性の生物，

Information（NCBI））． ヨ ー ロ ッ パ（European

例えば才井戸流周辺の洞窟など立ち入り困難な場所に生

Bioinformatics Institute（EBI）），日本（DNA Data Bank

息する生物の調査などは，必ずしも容易ではない．また，

of Japan（DDBJ）） が 連 携 し て 運 営 す るInternational

形態的特徴のみからは，生物種の同定が困難な場合もあNucleotide Sequence Database（INSD）をはじめとするる．

公的な遺伝子データベースが公開され，遺伝子配列によ

従来からの形態による分類や，代謝などによる生化学

り生物種を同定する環境が整備されている．さらに近年，

分類とは全く異なる手法として，近年遺伝子による生物

次世代シーケンシング（next generation sequencing：の分類技術が進歩してきている．その先駆的な業績の 1

NGS）の技術により大量の塩基配列を高速に解読できるつとして，Carl Woeseら（Woese and Fox，1977）は，ようになったことから，海洋や河川から採水してDNA

リボソームRNA（ribosomal RNA：rRNA）の塩基配列を抽出し，12S rRNA遺伝子の部分塩基配列をNGSによに注目し，生物を真正細菌（Bacteria），古細菌（Archaea），

り網羅的に解読することによって，周辺環境に生息する真核生物（Eukaryota）の三つのドメインに大別したこ

生物種や生物相を推定する環境DNAメタバーコーディとが知られている．リボソームは，細胞内でDNAからングが開発されている（Miya et al., 2015; Ushio et al.,

転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の情報をア

2017）
．

ミノ酸配列に変換しタンパク質を合成する細胞内小器官―2―

本研究では，12S rRNA 遺伝子を用いた環境DNAメ

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

タバーコーディングが，才井戸流周辺に生息する魚類や音声モニタリングによる調査では，キクガシラコウモリ

哺乳類等を検出するのに適した方法であると考え，このの発するFM/CF/FM型の音声が検出されている．しか方法を導入した調査を実施した．

し，洞窟の入り口が土砂に埋まり人が入れるだけの十分なスペースはなく（図 1 ，B地点），今のところ洞窟か材料および方法

ら出巣するキクガシラコウモリを直接目視したり捕獲を1 ）調査地点および調査日行うには至っていない．そこで，この洞窟からしみ出し

才井戸流の下流には守山高等学校の敷地がある．流域

出口に貯留している水を調査の対象に加えた．洞窟からの生物に由来するDNAが集まることを想定し，高等学の水も，斜面を伝って才井戸流に流入するものと考えら校の手前で安全に採水できる地点を主要な調査地点に選れる．
A，Bそれぞれの地点で，採水を 3 度ずつ実施した．

んだ（図 1 ，A地点）．
才井戸流の南側は，庄内川の河岸段丘となっており，

A地点では，
2021年 7 月21日（サンプル 1 ），11月26日（サ段丘の上に神社がある．そこから才井戸流に向かって下

ンプル 2 ）
，2022年 3 月17日（サンプル 3 ）に，B地点

降する斜面は雑木林および竹林になっているが，その中では，2020年10月12日（サンプル 4 ），2021年 8 月11日（サ腹に，音声モニタリングによる調査でキクガシラコウモ

ンプル 5 ），2022年 3 月17日（サンプル 6 ：サンプル 3リ（Rhinolophus ferrumequinum）の音声を確認した洞と同日）に採水した．採水地点の写真を示す（図 2 ：A窟がある（野呂，2019，2020a，2020b）．洞窟は，由来

地 点， 図 3 ：B地 点， い ず れ も2022年 3 月17日 撮 影 ）．

がはっきりしないが人の手で掘られたものと考えられ，なお，野生での生息数が少ない希少種を確実に検出する

図 1 ．採水地点
A：才井戸流の守山高等学校手前の地点，B：キクガシラコウモリが生息すると考えられる洞窟の前
Fig. 1. Localities for collected water samples
A: Saido-nagare Stream in front of Moriyama High School, B: In front of a cave presumably inhabited by Rhinolophus
ferrumequinum.

―3―黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

目的には，一度の調査で反復採水を行い複数回のNGS解2 ）環境DNAの抽出

析を並行して行うことが推奨されているが（環境省自然採取した水から，環境DNA学会の「環境DNA調査・環境局生物多様性センター，2022），本研究においては，

実験マニュアルVer.2.2」（一般社団法人環境DNA学会，

労力や予算の制約もあり，予察的検討として反復採水は2020）に従ってDNAの抽出を行った．採水した水500 ml

行わなかった．

に対し，DNAの分解を防止するために現地で10%塩化
ベンザルコニウム500 ìlを添加し混和，クールボックス

図 2 ．A地点の風景
画 面 の 右 上 方 に 高 等 学 校 の 建 物 の 一 部 が 見 え る．
2022年 3 月17日撮影．
Fig. 2. View of locality A
Part of the high school building can be seen in theupper right of the image. Photographed on March
17, 2022.

で保冷し実験室に運搬した．水をフィルター（STERIVEX
HV 0.45 ìm FILTER UNIT，Millipore） に 通 し た 後，
環境DNAを含むフィルター付着物からDNAを抽出キット（DNeasy Blood and Tissue Kit，Qiagen）を用いて抽出した．まず，フィルターユニット内にproteinase K
20 ìl，AL溶液200 ìl，phosphate buffer saline（PBS）
240 ìlを添加し，ゆっくり攪拌しながら56℃ 20分加温し，タンパク質成分を分解した．フィルターユニット内のDNAを含む液を回収し，DNA抽出キットのカラムで精製，抽出した．得られたDNA溶液は，次項のポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）を実施するまで，-20℃で保管した．
3 ）環境DNAからの塩基配列データの取得
次世代シーケンシングのためのアダプター配列の付加を，イルミナ社のプロトコールに従い行った．A地点のサンプルに対しては，魚類を検出するために設計されたプライマーセットMiFish-U（Miya et al., 2015）と，哺図 3 ．B地点の風景
岩 盤に人の手で掘られたと思われる洞窟．入り口が土砂で埋もれつつあり，中の様子は見えない．2022
年 3 月17日撮影．
Fig. 3. View of locality B
The cave seems to have been dug by human handsin the bedrock. The entrance is being filled withearth and sand, and the inside is not visible.
Photographed on March 17, 2022.

乳類を検出するために設計されたプライマーセット
MiMammal-U（Ushio et al., 2017） を 用 い た． ま た，
1997～1998年 の 調 査 で， 才 井 戸 流 で は ス ナ ヤ ツ メ（Lethenteron reissneri）の生息が報告されているが（土山ほか，2010），円口類は一般的な魚類用のプライマー
セットであるMiFish-Uでは検出が困難と報告されているため，円口類用に設計されたプライマーセットMiFish-L（環境省自然環境局生物多様性センター，2020）を用いた．
B地点のサンプルに対しては，MiMammal-Uのみで分析を行った．
各地点の採取日毎のDNAサンプルを鋳型として，上記 プ ラ イ マ ー で 第 一 段 階 のPCRを，KOD-Plus-Neo（TOYOBO，Osaka，Japan）を用いた50 ìlの反応系で35サイクル行った（熱変性：98℃で10秒，アニーリング：
65℃で30秒，伸長反応：68℃で20秒）．得られた各サン
プルのPCR産物に，サンプル識別のためのインデックス
配列を付加するプライマーを用い，第二段階のPCRを，―4―

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

4 ）塩基配列データの解析

KOD-Plus-Neoを用いた50 ìlの反応系で12サイクル行った（熱変性：98℃で10秒，アニーリング：60℃で30秒，得られたNGSのDNA配列データは，MiFish pipeline

伸長反応：68℃で30秒）．PCR後の各DNAサンプルの濃（Sato et al., 2018）を参照し，バージョンアップした最度を，Qubit dsDNA HS Assay Kits（Thermo Fisher，

新のデータベースや，新たに報告された同等以上の機能

Waltham，MA，USA） を 用 い たQubit 4 Fluorometerを持つプログラムも導入して解析を行った．解析のパイ（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA） に よ る 蛍 光

プラインは以下の通りである．

測定で定量し，Illumina社（San Diego，CA，USA）の⑴

クオリティーチェック

プロトコールに従って，アンプリコン用DNAライブラ

SolexaQA++ dynamictrim （Cox，Peterson andリーを調製した．続いてIllumina MiSeq次世代シーケン

Biggs，2010）を用い，Phred quality score 10以上を配サーによるMiSeq Regent Micro Kit v2を用いた150塩基列データとして選別した．

のpaired-endシーケンスにより，DNA塩基配列データを

⑵

ペアリング

大量に取得した．取得したリード数は，各サンプルあた

MiSeqで 5 ’側から読み取った配列のファイルと， 3 ’

り552,708～1,568,264リードであった（表 1 ）．NGSによ側から読み取った配列のファイルのデータを，FLASH2り決定した塩基配列データは，表 1 に記したアクセッ（Magoč and Salzberg，2011）を用いて結合した．

ション番号で，DDBJ Sequence Read Archive（DRA）⑶

DNA配列長の選別
SolexaQA++ length sort（Cox, et al., 2010）を用い，に登録されている．

表 1 ．環境DNA解析に用いられた水の採集地点と検出された動物種の概要
Table 1. Localities for collected water samples and major animal species detected  by the eDNA metabarcoding

採集地点/
Locality

採集時期/
Collected date

DRAアクセッ
ション番号1/
DRA accession
numbers1

2021年 7 月21日

DRR413622
DRR413625

地点A
守山高等学校手前の才井戸流GPS：
2021年11月26日
北緯35.2510，
東経137.0243
2022年 3 月17日
地点B
2020年10月12日
才井戸流南側斜面の洞窟前の貯
2021年 8 月11日
留水GPS：
北緯35.2508，
2022年 3 月17日
東経137.0255
1
2

1
2

取得したリード数/ 高品質のリード数/
Number of highNumber of raw
quality reads
reads

2

794548/1568264

検出された動物種の概要/
Major animal species detected353196/357238

魚類：ドジョウ属，タモロコ，ミナ
ミメダカ，ブルーギル，ギンブナ
哺乳類：ヒト，ニホンイタチ，ハツ
カネズミ，キクガシラコウモリ

2

DRR413623
DRR413626

746022/5527082

303017/1257922

魚類：ミナミメダカ，ドジョウ属，
タモロコ
哺乳類：ヒト，ニホンイタチ，キク
ガシラコウモリ
鳥類：ウグイス属，ホオジロ属

DRR413624
DRR413627

588734/14277542

135627/1075922

魚類：ドジョウ属，タモロコ，ミナ
ミメダカ
哺乳類：キクガシラコウモリ

DRR413628

987244370118

哺乳類：キクガシラコウモリ，ヒト

DRR413629

699156240052

哺乳類：キクガシラコウモリ

DRR413630

681844218386

哺乳類：キクガシラコウモリ，アラ
イグマ，ハツカネズミ

NGSで得られた生塩基配列データのDDBJ Sequence Read Archive登録情報
斜線の左側にMiFish-Uを用いた解析の値，斜線の右側にMiMammal-Uを用いた解析の値を示す
地点Bの分析には，MiFish-Uを用いず，MiMammal-Uプライマーセットのみを用いていることに注意
DDBJ Sequence Read Archive accession numbers for raw sequence data obtainedValues to the left and right of a slash stand for read numbers obtained with MiFish-U and MiMammal-U primers, respectively
Note that only MiMammal-U primers（and not MiFish-U primers）were used for the analysis of locality B―5―黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

ペアリング後のDNA配列長のうち，200塩基以上を選別

遺伝子配列のデータセット mito（2022年 7 月13日版，した．

https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/） を 参 照 デ ー タ⑷

ベースとして，クラスター化を行った後のデータに対しアダプター配列の除去アダプター配列を Cutadapt（Martin，2011）を用い

12S rRNAの配列による生物種の検索を行った．DNAの除去した．この操作により得られた配列が，クラスター

配列長は，アダプター配列を除去した分を加味し，150

化前の高品質リードに相当する．

塩基以上を選別した．クラスター化されたデータより同⑸定した生物種について，クラスター化を行う前の高品質

データのクラスター化
VSEARCH cluster（Rognes et al. 2016）を用い，99%

リードの数をカウントした． 1 つのリードに対して検索

以上の塩基配列類似度のある配列をクラスター化した．

される生物種のうち，照合したデータベース配列とのア⑹ライメント長が長く，塩基配列の一致率の高い配列を優キメラ配列の除去
VSEARCH uchime（Rognes et al. 2016）を用い，キ

先して選択し，生物種の分析結果とした．少ないリード

メラ配列の除去操作を行った．

数の生物種でも，十分なアライメント長と塩基配列類似⑺

度があれば，検出された生物種として検討対象とした生物種の同定とリード数のカウント
Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）のインが， 5 リードに満たない生物種は対象外とした．

ストール版（BLAST+ 2.13.0）を用い，ミトコンドリア

表2．
A地点から2021年 7 月21日に得たサンプル 1 の環境DNA解析で検出された動物種とNCBI RefSeqデータベース上の登録配列とのマッ
チング
Table 2. A nimal species detected by the eDNA analysis of Sample 1 collected from Locality A on July 21, 2021 and matching to theregistered sequences at the NCBI RefSeq database

プライマー/
PrimerMiFish-U

MiMammal-U

1
1

NCBI RefSeq
アクセッション
番号/
NCBI RefSeq
accession No.

リード数/
Number of
reads

学名/Scientific name

リードの割合 アラインメント長
1
（％）
（bp）
/
/
Alignment
Percentage oflength（bp）
reads1

塩基配列類似度（%）/
Nucleotide
sequence
similarity（%）

NC_022854.1

Misgurnus bipartitus

100932

28.6

222

97.3

NC_008649.1

Gnathopogon elongatus

95055

26.9

226

99.1

NC_043847.1

Misgurnus anguillicaudatusとMisgurnus bipartitusの交雑種

38672

10.9

174

98.9

NC_004387.1

Oryzias latipes

38219

10.8

189

97.4

NC_015984.2

Lepomis macrochirus

11400

3.2

193

97.4

NC_002079.1

Carassius langsdorfii

7195

2.0

173

99.4

NC_012920.1

Homo sapiens

90463

25.3

222

99.6

NC_034330.1

Mustela itatsi

72630

20.3

214

100.0

NC_022854.1

Misgurnus bipartitus

48019

13.4

172

97.1

NC_008649.1

Gnathopogon elongatus

39339

11.0

222

99.1

NC_043847.1

Misgurnus anguillicaudatusとMisgurnus bipartitusの交雑種

38885

10.9

219

97.7

NC_004387.1

Oryzias latipes

7009

2.0

191

97.4

NC_006914.1

Mus musculus

60

0.0

170

100.0

NC_020326.1

Rhinolophus ferrumequinum

10

0.0

168

100.0

該当するリード数の高品質リード数（MiFish-Uの解析は353196リード，MiMammal-Uの解析は357238リード）に対する割合を示す
Percentage of the corresponding read numbers among high-quality reads obtained（353196 reads by MiFish-U analysis and 357238 reads by
MiMammal-U analysis）―6―

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

表 3 ．A地点から2021年11月26日に得たサンプル 2 の環境DNA解析で検出された動物種とNCBI RefSeqデータベース上の登録配列とのマッチング
Table 3. Animal species detected by the eDNA analysis of Sample 2 collected from Locality A on November 26, 2021 andmatching to the registered sequences at the NCBI RefSeq database
プライマー/
PrimerMiFish-U

MiMammal-U

1
1

NCBI RefSeq
アクセッション
番号/NCBI
RefSeqaccession No.

リード数/
Number of
reads

学名/Scientific name

リードの割合 アラインメント長
1
（％）
（bp）
/
/
Alignment
Percentage oflength（bp）
reads1

塩基配列類似度（%）/
Nucleotide
sequence
similarity（%）

NC_004387.1

Oryzias latipes

149233

49.2

215

98.6

NC_022854.1

Misgurnus bipartitus

62122

20.5

172

97.1

NC_008649.1

Gnathopogon elongatus

54758

18.1

226

99.6

NC_043847.1

Misgurnus anguillicaudatusとMisgurnus bipartitusの交雑種

7939

2.6

174

98.3

NC_053103.1

Horornis sp.

2095

0.7

181

97.2

NC_012920.1

Homo sapiens

1911

0.6

194

98.5

NC_034330.1

Mustela itatsi

10

0.0

193

99.0

NC_004387.1

Oryzias latipes

60255

47.9

208

98.1

NC_022854.1

Misgurnus bipartitus

22195

17.6

172

97.1

NC_008649.1

Gnathopogon elongatus

2032

1.6

177

100.0

NC_021445.1

Emberiza sp.

137

0.1

182

100.0

NC_043847.1

Misgurnus anguillicaudatusとMisgurnus bipartitusの交雑種

8

0.0

193

98.4

NC_020326.1

Rhinolophus ferrumequinum

5

0.0

168

100.0

該当するリード数の高品質リード数（MiFish-Uの解析は303017リード，MiMammal-Uの解析は125792リード）に対する割合を示す
Percentage of the corresponding read numbers among high-quality reads obtained（303017 reads by MiFish-U analysis and 125792 reads by
MiMammal-U analysis）

表 4 ．A地点から2022年 3 月17日に得たサンプル 3 の環境DNA解析で検出された動物種とNCBI RegSeqデータベース上の登録配列とのマッチング
Table 4. A nimal species detected by the eDNA analysis of Sample 3 collected from Locality A on March 17, 2022 and matching
to the registered sequences at the NCBI RegSeq database
プライマー/
PrimerMiFish-U

MiMammal-U

1
1

NCBI RefSeq
アクセッション
番号/NCBI
RefSeqaccession No.

リード数/
Number of
reads

学名/Scientific name

リードの割合 アラインメント長
1
（％）
（bp）
/
/
Alignment
Percentage oflength（bp）
reads1

塩基配列類似度（%）/
Nucleotide
sequence
similarity（%）

NC_022854.1

Misgurnus bipartitus

56348

41.5

218

97.7

NC_008649.1

Gnathopogon elongatus

41149

30.3

224

100.0

NC_004387.1

Oryzias latipes

25798

19.0

214

98.6

NC_022854.1

Misgurnus bipartitus

40582

37.7

172

97.7

NC_004387.1

Oryzias latipes

4549

4.2

168

98.8

NC_043847.1

Misgurnus anguillicaudatusとMisgurnus bipartitusの交雑種

1423

1.3

174

98.3

NC_016191.1

Rhinolophus ferrumequinum

0.0

168

100.0

43

該当するリード数の高品質リード数（MiFish-Uの解析は135627リード，MiMammal-Uの解析は107592リード）に対する割合を示す
Percentage of the corresponding read numbers among high-quality reads obtained（135627 reads by MiFish-U analysis and 107592 reads by
MiMammal-U analysis）―7―

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

これら 3 種（属）のみが検出されたが，夏にはさらにブ

結果
水の各採集地点，各採集日にて検出された動物種の概ルーギル（Lepomis macrochirus），ギンブナ（Carassius

要を表 1 に示す．また，各サンプルから得られた環境

langsdorfii）が検出された．MiMammal-Uのプライマー

DNAの解析結果を，表 2 ～ 5 に示す．Blast+による解は，MiFish-Uで検出される魚類とともに，概ね哺乳類

析で用いたミトコンドリア遺伝子配列のデータセットを効率よく検出している．サンプル 1 で，ヒト（Homomitoには，動物種に対応してNCBIのReference Sequencesapiens），ニホンイタチ（Mustela itatsi）が多数リード，（RefSeq）アクセッション番号が登録されているため，

ハツカネズミ（Mus musculus）が少数リード検出され

表 2 ～ 5 にはサンプルの解析結果として得られた動物種

た．一方，サンプル 2 ， 3 では，これらはいずれも少数の学名とRefSeq アクセッション番号を表示し，それぞのリードのみの検出にとどまるか，検出されなかった．

れのリード数およびサンプル毎の高品質リード数に対す

キクガシラコウモリ（Rhinolophus ferrumequinum）は，る割合，アライメント長の最大値および塩基配列類似度

3 回とも少数のリードが検出された．

を含む詳細な解析結果を記載した．円口類用のMiFish-L

今回の環境DNAの分析では，サンプル 2 から鳥類ものプライマーセットに関しては，いずれのサンプルにお検出された．MiFish-Uのプライマーによりウグイス属

いても十分量のPCR産物が得られず，データを取得でき（Horornis sp.）が，同じくサンプル 2 からMiMammal-U

なかった．

のプライマーによりホオジロ属（Emberiza sp.）が，そA地点で，夏にサンプル 1 ，秋にサンプル 2 ，初春にれぞれ少数リード検出された．

サンプル 3 を採取した．MiFish-Uプライマーによる魚

一方，B地点では一貫してキクガシラコウモリが多数類の検出については，リード数の順位の変動はあるもの

リード検出された．サンプル 4 ではヒト，サンプル 6 での，ドジョウ属（Misgumus），タモロコ（Gnathopogon

はアライグマ（Procyon lotor），ハツカネズミも検出さ

elongatus），ミナミメダカ（Oryzias latipes）がいずれれた．

のサンプルにも検出された．水温のまだ低い初春には，

表 5 ．B地点から得たサンプル 4 − 6 のMiMammal-Uプライマーを用いた環境DNA解析で検出された動物種とNCBI RefSeqデータ
ベース上の登録配列とのマッチング
Table 5. A nimal species detected by the eDNA analysis using the MiMammal-U primer of Samples 4-6 collected from Locality B
and matching to the registered sequences at the NCBI RefSeq database
サンプル
（採集日）
サンプル 4（2021年
7 月21日）サンプル 5（2021年11月26日）サンプル 6（2022年
3 月17日）11

塩基配列類似度（%）/
Nucleotide
sequence
similarity（%）

NCBI RefSeq
アクセッション
番号/NCBI
RefSeqaccession No.

学名/ Scientific name

リード数/
Number ofreads

NC_020326.1

Rhinolophus ferrumequinum290320

78.4

221

100.0

NC_012920.1

Homo sapiens

73164

19.8

221

99.1

NC_020326.1

Rhinolophus ferrumequinum

235254

98.0

218

100.0

NC_020326.1

Rhinolophus ferrumequinum138107

63.2

220

100.0

NC_009126.1

Procyon lotor

42702

19.6

167

98.2

NC_006914.1/
NC_010339.1

Mus musculus

28087

12.9

198

97.5

リードの割合 アラインメント長
（％）1/
（bp）
/
Alignment
Percentage oflength（bp）
reads 1

該当するリード数の高品質リード数（サンプル 4 − 6 について，それぞれ370118リード，240052リード，218386リード）に対する割合を示す
Percentage of the corresponding read numbers among high-quality reads obtained（370118 reads, 240052 reads, and 218386 reads for Samples
4-6, respectively）―8―

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

考察

い種，亜種については，近縁種についての示唆は得られ調査方法についてるものの，完全な同定には至らないという限界がある．

本研究では，名古屋市最大の湧水地であり，希少な動特に，地域固有の種，亜種については，登録が進んでい物種の生息が期待できる守山区才井戸流流域の 2 地点かないことが指摘されている（Alam et al., 2020）. 従って，

ら環境水を採取し，環境DNAによる生息動物種の検出

環境DNAの12S rRNAによる分析結果を，地域の生態系を試みた．当地域の動物調査は，これまで目視による個に生息する動物種に即して確認，検証することが必要で体確認やセンサーカメラ撮影，トラップによる捕獲，足ある．公的遺伝子データベースに登録されていない地域

跡・糞等による痕跡，コウモリ類が発する音声などの分

固有の種，亜種については，生息数の少ない種や捕獲が析によって行われてきた（野呂，2019，2020a，2020b）．

困難な種については不可能な場合もあるが，DNA 分析

しかし，コウモリ類やイタチ類などは夜行性のため目視が可能な個体や博物館標本などが得られれば12S rRNA

確認が難しく，また，同所的に近縁種が分布するために領域の配列の解読，データベースへの登録が望まれる．

区別が困難な動物の場合，これらの手法だけではなかなか確実な生息データを得づらいという問題点があった．

才井戸流に生息する魚類について

また，才井戸流の水圏内に生息する魚類については，魚3 回の調査を通して，ドジョウ属，タモロコ，ミナミ

類自体の数が少なく，採集だけでは詳細な魚類相を把握

メダカが検出されることが確認され，常時安定して生息できないという課題があった．

していることが示唆される．また，夏には検出される種

本研究では，筆者らが知る限りおそらく初めて，才井が増え，ブルーギル，ギンブナも検出された．これらは，戸流周辺の動物相調査を環境DNAの手法で行い，名古水温の低い 3 月には検出されなかったが，季節による個屋市版レッドリスト2020（名古屋市，2020）において絶体数の変化を反映している可能性もある．

滅危惧ⅠA類に掲載されているキクガシラコウモリやニ

才井戸流に生息するドジョウ属の詳細については，本ホンイタチなどの生息に関して確度の高い生息情報を提研究のように短い指標配列を用いたBlast+解析の精度に供することができた．このように，コウモリ類について

は限界があり，実際の才井戸流における捕獲調査によりは，今後，音声モニタリングと環境DNAの手法を併用

遺伝子を含めた種の検討が望まれる．コイやフナの仲間することによって，より信頼性の高い結果を得ることがについても，アライメント長が最も長く，かつ塩基配列できると考えられる．また，今回の洞窟のように，入口類似度が最も高いギンブナを結果として示したが，塩基が狭く，調査者が容易に進入できないような場合や調査

配列類似度がやや低くなるものの，同じ配列からコイ属者の侵入がコウモリ類に極度のストレスを与えてしまうやフナ属の交雑種を含めた種が検索されており，実際にといった状況においても，水から採取でき，非侵襲的な捕獲調査を行って結果を照合する必要があるものと考え

環境DNAの手法は非常に有効であると考えられる．たられる．

だし，本研究では，分析した地点の数が 2 地点と少なく，今回，1990年代後半に才井戸流で生息が確認されていまた反復採水などの手法も用いていないため，才井戸流

たスナヤツメの検出も試みた．円口類は一般的な魚類用

周辺の動物相を網羅的に調べたわけではない．現時点でのプライマーであるMiFish-Uでは検出が困難と報告さは，あくまで予察的な定性種分析を行った段階だと考えれており，円口類用に設計されたプライマーを用いたがている．今後は，今回の成果を踏まえて，より計画的に（環境省自然環境局生物多様性センター, 2020），NGSで定期的かつ定量的な環境DNAによる動物相のモニタリ

分析可能な量のアンプリコンDNAを得ることができな

ング調査を実施し，レッドリスト作成の基となる絶滅危

かった．スナヤツメは環境省レッドリスト2020絶滅危惧

惧種の生存情報に繋げていくことが期待される．

II 類（環境省，2020），名古屋市版レッドリスト2020 絶

ミトコンドリアDNAにコードされる12S rRNAの配列

滅危惧IA 類（名古屋市，2020）であり，才井戸流でのによる生物種の同定は，真核生物全般にわたって広く用現時点での絶滅が危惧され，追加的な調査が望まれる．

いられる方法であるが，データベースに登録されていな―9―

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析とは外来種のモニタリングに関して環境DNAの手法が才井戸流流域の哺乳類，鳥類について
才井戸流に生息する魚類に比し，周辺流域に生息，あ有効であることを示している．また，アライグマやニホるいは出現する哺乳類，鳥類については，サンプル毎にンイタチの検出は，頻繁に水辺で活動する動物が検出さ検出される種やリード数の変動がみられた．飲水や水浴

れやすいことを示唆している．一方，才井戸流において

び等，流域の水系との接触がより濃厚になった場合に，は， 過 去 に ア カ ギ ツ ネ（Vulpes vulpes），タヌキ

検出リード数が増加するものと考えられる．一方，才井（Nyctereutes procyonoides）， イ エ ネ コ（Felis catus），

戸流の流域の洞窟に生息するキクガシラコウモリについヌートリア（Myocastor coypus），アカネズミ（Apodemusては，洞窟出口の水から多数のリードが検出されるととspeciosus），カヤネズミ（Micromys minutus），ニホン

もに，才井戸流の下流地点からも， 3 回の調査で一貫し

ジ ネ ズ ミ（Crocidura dsinezumi），コウベモグラて少数のリードが確認された．以上より，哺乳類につい（Mogera wogura）といった多種の哺乳類が確認されてては，流域をねぐらとして生息するコウモリ類の場合にいるが（野呂，未発表），これらの哺乳類が環境DNAには，安定して検出されるものの，流域に近づいたり遠ざよる調査を重ねることによって検出されるかどうか，今

かったりして移動する動物種については，採水時期によ後この地域の生息調査を継続していく上で検討する価値

り検出リード数が大きく変動することが考えられる．今のある課題である．

回の環境DNAによる調査では，後述するように，才井MiFish-UおよびMiMammal-Uのプライマーは，もと戸流流域で過去に生息が確認されている哺乳類で情報のもと魚類および哺乳類を対象として設計されているが，得られなかった種がある．また，一部サンプルで鳥類が今回の調査では，少数のリードながら鳥類も検出され検出されたが，渡りなど季節による移動を含め網羅的なた．このうち，ウグイス属については，データベース上調査を実施するためには，調査地点を増やすとともに，はスンダウグイス（H. vulcanius）として検出された（ア

反復採水を行うことの必要性を示している．調査には，ライメント長181塩基，塩基配列類似度97.24%）．スンダ

労力や予算の制約が生じるが，生態学的に重要な意味をウグイスは，インドネシア，マレーシア，フィリピンに持つ生物種が生息する，あるいは観察される地点につい生息するウグイスの仲間で，日本には生息しない種であては，重点的に繰り返し調査に取り組むことによって，るが，才井戸流周辺域に生息するウグイスを検出したも貴重なデータが得られることが期待される．

のと判断するのが妥当と考えられた．GenBankにおける

才井戸流流域では，1990年代にニホンイタチの生息が日本のウグイス（H. diphone）のDNA配列の登録状況を確認されたという記録があるが（高田，2002），近年，検討したところ，ミトコンドリアDNAにコードされる

名古屋市内では外来種のシベリアイタチ（M. sibirica）

遺伝子のうち，cytochrome b遺伝子は登録されているが圧倒的に多く生息しているのが確認されている（野が，12S rRNA遺伝子の塩基配列は登録されていない．

呂，2015）．今回の環境DNAの12S rRNAによるメタバー

したがって，現状の遺伝子データベースで日本のウグイ

コーディングでは，アライメント長214塩基，塩基配列スを確認するためには，cytochrome b遺伝子による分類 似 度100%でM. itatsiと し て 検 出 さ れ て い る． 一 方，析を行う必要がある．ホオジロ属については，データ

NGSの同じリードからM. sibiricaも検索されているが，ベースによる分析ではアオジ（E. spodocephala），シマ

アライメント長214塩基で塩基配列類似度が97.20%とM.

アオジ（E. aureola），シマノジコ（E. rutila）の 3 種

itatsiよりも低値であった．DNA塩基配列の類似度に基がアライメント配列長182塩基，塩基配列類似度100%のづけば，才井戸流流域は名古屋市内で現在もニホンイタ

同配列として検出された．このうち，本州中部で見つかチが生息している貴重な環境であることが示唆された．

る可能性の高い種はアオジと考えられるが，才井戸流で今後，才井戸流周辺域にニホンイタチが生息しているか

実際に飛来が観察できるかどうかの情報が望まれる．

どうか確認するための捕獲調査が望まれる．その他の哺鳥類の12S rRNAメタバーコーディングのために設計

乳類については，今回の環境DNAの調査でアライグマ，

されたプライマーとしては，MiBird（Ushio et al., 2018）

ハツカネズミが検出された．アライグマが検出されたこが報告されている．今回は鳥類についての調査を計画し― 10 ―

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析ていなかったため，MiBirdによるメタバーコーディン

る知見や，博物館標本などから取得する新たなDNA情

グ は 実 施 し な か っ た．MiFish-U，MiMammal-U，

報と照合してデータを解釈する必要がある．一方，直接

MiBird-Uの 3 ’側のプライマー配列は共通であり， 5 ’側

確認が困難な生物種を，遺伝子配列に基づいてスクリーのプライマー配列が異なる．また，スンダウグイス（H.

ニングできる場合もある．従来からの生息調査に加え

vulcanius，アクセッション番号NC_053103.1）とアオジて，環境DNAによる生物種の分析手法を導入した継続（E. spodocephala， ア ク セ ッ シ ョ ン 番 号NC_021445.1）

的サーベイランスが，地域の生態系保全のために今後広の 5 ’側のプライマー配列に対応する配列の違いは 1 塩

く活用されることが期待される．

基のみである．今回，ウグイス属がスンダウグイスとしてMiFish-Uで， ホ オ ジ ロ 属 が ア オ ジ と し て

謝辞

MiMammal-Uで検出されたが，スンダウグイスについ本研究は，名古屋市立大学共用機器センターの次世代て は，MiFish-Uの プ ラ イ マ ー 配 列 と の 類 似 度 がシーケンサー（イルミナMiSeq）を用いて行われた．著

MiMammal-Uと の 類 似 度 を 上 回 り（85.7% 対 82.6%），

者の黒川は，2017年度から2020年度の愛知県立大学学長

ア オ ジ に つ い て は，MiFish-Uと の 類 似 度 が特別教員研究費および2022年度の愛知県立大学学長特別MiMammal-Uとの類似度を下回る（81.0% 対 87.0%）こ

研究費を受け，本研究を実施した．また，黒川が次世代とが影響しているものと考えられた．鳥類の検出用に設シーケンサーを用いた環境DNAの研究を開始するにあ計されていないMiFish-UおよびMiMammal-Uのプライたり，名古屋大学大学院医学系研究科神経疾患·腫瘍分マー配列との類似度は，いずれも90％未満であるが，今子医学研究センターシステム生物学分野

回のように鳥類が偶然検出される場合には，わずかな塩同研究科附属医学教育研究支援センター分析機器部門

基 配 列 の 違 い に よ りMiFishで 検 出 さ れ や す い 種 と伊藤康友様に懇切丁寧なご指導をいただいた．深田仁氏

MiMammalで検出されやすい種があることが示唆された．

をはじめとした中志段味の自然を次世代に伝える会の皆

紅朋浩先生，

様には現地調査に関して多大なご配慮をいただいた．
Xiakena Xiaokaitiさん（名古屋市立大学大学院生）にも結語
才井戸流に生息する生物種を，環境DNAの12S rRNA

技術的なサポートを頂いた．ここに謝意を申し上げる．

メタバーコーディングにより検討した．才井戸流に生息する魚類，流域の洞窟に生息するキクガシラコウモリの

引

用

文

献

他，ニホンイタチ，アライグマ，ハツカネズミといった

Alam, M. J., N-K. Kim, S. Andriyono, H-K. Choi, J-H. Lee

哺乳類が検出された．特に，ニホンイタチは，過去の調

and H-W. Kim. 2020. Assessment of fish biodiversity

査で才井戸流流域での生息が観察されていた．この地域

in four Korean rivers using environmental DNA

は，ニホンイタチの生息が現在も維持されている名古屋

metabarcoding. PeerJ, 8: e9508.

市内でも貴重な環境であることが示唆された．一方，かCox, M. P., D. A. Peterson and P. J. Biggs. 2010. SolexaQA:

つて生息が観察されたスナヤツメについては，円口類用

At-a-glance quality assessment of Illumina second-のプライマーを用いて検出を試みたが，今回の分析ではgeneration sequencing data. BMC Bioinformatics, 11:

検出できず，その生息が危ぶまれる．水中に生息する魚485.

類と比較し，周囲の水域をねぐらとせず移動する陸生生

一般社団法人環境DNA学会．2020．環境DNA調査・実験物については，検出リード数の変動が大きく，調査地点

マニュアル Ver. 2.2.

を増やし繰り返し調査を行う必要性が示された．環境

https://ednasociety.org/wp-content/

DNAの12S rRNAメタバーコーディングを用いた生物種

uploads/2022/06/eDNA_manual_ver2_2.pdf，2022 年の分析は，参照するデータベースに依存するため，地域

8 月30日確認の固有種の同定や，生息数の少ない絶滅危惧種の検出に

環境省．2020．環境省レッドリスト2020.

は限界がある．これまで蓄積された地域の生息調査によ― 11 ―

https://www.env.go.jp/content/900515981.pdf，2022

黒川ほか（2023） 環境DNAを用いた才井戸流周辺の動物種の予察的分析

年 8 月30日確認

様性保全活動協議会活動報告書，pp. 8-13．なごや生

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環境省自然環境局生物多様性センター．2022．環境DNA

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