３ 研究内容 （別紙）
研究課題名
抗生物質曝露後のマダイ（Pagrus major）における肝臓のハイスループットプロテオミクス
プロファイリングと影響評価(High-throughput proteomic profiling and hazard assessment in the liver of red seabreams (Pagrusmajor) following antibiotics exposure)

共同研究者名
代表者：飯田 緑（九州工業大学大学院）
分担者：前田和勲（九州工業大学）

研究目的
肝臓は、薬物代謝や免疫に関わる重要な組織である。マウスでは抗生物質の投与により肝臓の薬物代謝系が攪乱されることが報告されている。魚養殖場では飼料に抗生物質が添加されているが、魚類において抗生物質による肝機能への影響は明らかにされていない。そこで本研究計画では、マダイ幼魚にオキシテトラサイクリンを経口投与し、定量プロテオミクスを用いて抗生物質投与時の肝臓プロテームを明らかにし、肝機能に与える影響評価とその発現機序を予測することを目的とした。

研究内容
本研究では、①オキシテトラサイクリン（以下 OTC）を投与したマダイ幼魚（図１）を対象に、②肝臓タンパク質発現量を定量・同定し、③発現変化をしたタンパク質を特定する、④さらに、それらの機能を調べ、⑤引き起こされる影響を考察した。

1. OTC 投与条件
本研究では、３つの投与期間で OTC 投与を行なっている（図 1）。投与期間 A では育成馴化
期間（８６日間）の後、７日間の投与期間を設け、その後、検体を解剖した。投与期間 B では、投与期間 A の後３０日間の投与休止期間を設け、その後 7 日間の投与を行なった。さらに、投与期間 C では、投与期間 B の後、３０日間の投与休止期間を設け、検体を解剖した。
濃度試験区は３つの投与期間でそれぞれ対照区、低 OTC 区（50mg/魚体 kg/日）、高 OTC 区（500mg/魚体 kg/日）を設けた。

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図１OTC 投与期間

2. 肝臓タンパク質発現量の定量と同定
これまで我々は、OTC を投与したマダイ幼魚の肝臓から抽出したタンパク質を iTRAQ でラベルし MALDI TOF/TOF でタンパク質量の定量を行ってきた。さらに、この MS/MS のスペ
クトルデータから MASCOT データベース検索により、ペプチドの同定を行い、300 種類のタンパク質を同定することに成功している。しかし、シークエンスを得られた 1200 種のペプチドのうち、同定されたタンパク質が 200 種類あまりであったため、他のスズキ目の魚種（ヨーロッパヘダイ、ティラピア、スズキ）のペプチド配列を NCBI のデータベースから取得し、これらとの相同性検索から同定できるタンパク質の種類を増加させることを試みた。
この結果、投与期間 A では 375 種、投与期間 B では 405 種、合計で 510 種類のタンパク質を同定することに成功した。さらに、本研究では以下の解析を行うために、上記で同定されたタンパク質のアミノ酸配列から BLAST 検索を用いてゼブラフィッシュのオーソログを同定した。

3. 発現変化したタンパク質の特定
次に、上記で同定されたタンパク質を対象として、対照群と比べて OTC の投与量依存的に発現量が変化したタンパク質をヨンクヒール・タプストラ検定により特定した（p<0.05）。
この結果、投与期間 A では投与量依存的に増加したタンパク質 14 種、投与量依存的に減少したタンパク質 17 種の合計 30 種、投与期間 B では投与量依存的に増加したタンパク質 21種、投与量依存的に減少したタンパク質 26 種の合計 47 種のタンパク質が特定された（図２）。投与期間 A と B で共通して特定されたタンパク質は Annexin（anxa5b）、Ribosomalprotein S6（rps6）、ribosomal protein L5a（rpl5a）と si:ch73-71d17.1 の４つだった。
si:ch73-71d17.1 はヒトの amidohydrolase domain containing 1(AMDHD1)のオーソログであり、ヒスチジン代謝に関わる加水分解酵素の一つである。投与期間 A で最も発現上昇したタンパク質は Aldolase, Fructose-Bisphosphate B（aldob; 高 OTC 区での log2FC = 0.26）、

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発現減少したタンパク質は NADP-dependent malic enzyme（me1; 高 OTC 区での log2FC = 0.1）であった。投与期間 B で最も発現上昇したタンパク質は DNA polymerase epsilon
catalytic subunit (pole; 高 OTC 区での log2FC = 0.50)、発現減少したタンパク質は 60S
ribosomal protein L27a (rpl27a; 高 OTC 区での log2FC = -0.87)であった。
A）投与期間 A
aldob (log2FC = 0.26)

anxa11b (log2FC = 0.13)

anxa6 (log2FC = 0.19)

cyp4v8 (log2FC = 0.17)

aacs (log2FC = −0.55)

aclya (log2FC = −0.94)

anxa5b (log2FC = −0.13)

cptp (log2FC = −0.25)

ddb1 (log2FC = −0.28)

dpp3 (log2FC = −0.27)

fasn (log2FC = −0.81)

hspa5 (log2FC = −0.18)

hspa8 (log2FC = −0.34)

me1 (log2FC = −1)

ogdhl (log2FC = −0.28)

pgd (log2FC = −0.29)

rpl17 (log2FC = −0.08)

rpl31 (log2FC = −0.28)

rpl5a (log2FC = −0.09)

rpl6 (log2FC = −0.08)

rps6 (log2FC = −0.17)

ContContContContCont

2.0

1.6
1.4

1.5

1.2
1.0
1.0
0.50.8dhrs9 (log2FC = 0.12)

hpxa (log2FC = 0.26)

pklr (log2FC = 0.11)

ppa1b (log2FC = 0.22)
2.0

1.6
1.4

1.5

Normalized expression value

Normalized expression value

1.2
1.00.8si:ch73−71d17.1 (log2FC = 0.17)

si:dkey−243k1.3 (log2FC = 0.15)

slc27a6 (log2FC = 0.14)

stt3a (log2FC = 0.17)

1.6
1.4
1.2

1.0

0.5

2.0

1.5

1.0
1.0
0.5

0.8
Cont

upb1 (log2FC = 0.09)

Low

HighContLow

HighContLow

HighLow

HighLow

HighLow

High

2.0

1.6
1.4

1.51.21.0
1.00.50.8ContLow

HighLow

HighLowHighB）投与期間 B
ap2s1 (log2FC = 0.16)

cpne1 (log2FC = 0.13)

drg1 (log2FC = 0.18)

eif3s6ip (log2FC = 0.16)

adh5 (log2FC = −0.13) anxa1a (log2FC = −0.28) anxa5b (log2FC = −0.22) bcap31 (log2FC = −0.19) bcl2l10 (log2FC = −0.1) coro1ca (log2FC = −0.2)

eif4ba (log2FC = 0.15)
2.5

2.0

2.0
1.5
1.5
1.0

1.00.5fgg (log2FC = 0.19)

gdi2 (log2FC = 0.12)

gnmt (log2FC = 0.08)

nipsnap3a (log2FC = 0.15)

eif4a2 (log2FC = −0.05)

npepps (log2FC = 0.2)

fkbp2 (log2FC = −0.16)

habp2 (log2FC = −0.1)

krt94 (log2FC = −0.33) mdh1ab (log2FC = −0.31) mdh2 (log2FC = −0.18)

2.5

2.0

2.0
1.5
1.5
1.0

1.0

prdx2 (log2FC = 0.1)

psma6a (log2FC = 0.16)

psmd3 (log2FC = 0.29)

psmd6 (log2FC = 0.12)

1.5

1.0

rps7 (log2FC = 0.16)

si:ch73−71d17.1 (log2FC = 0.14)

snx5 (log2FC = 0.49)

tdo2b (log2FC = 0.4)

tsn (log2FC = 0.01)

Normalized expression value

Normalized expression value

0.5pole (log2FC = 0.49)
2.0

p4hb (log2FC = −0.24) pla2g12b (log2FC = −0.25) qars1 (log2FC = −0.1)

rpl27a (log2FC = −0.87)

rpl5a (log2FC = −0.23)

rps10 (log2FC = −0.01)

rps20 (log2FC = −0.14)

scp2a (log2FC = −0.15)
si:ch211−153b23.5 (log2FC = −0.19)
ssr3 (log2FC = −0.14)

2.52.01.51.00.5
rps25 (log2FC = −0.06)

rps6 (log2FC = −0.15)

2.5

2.0

2.0
1.5
1.51.01.00.5vcp (log2FC = 0.12)

Cont

Low

HighCont

Low

HighCont

Low

HighCont

Low

High

zgc:171772 (log2FC = −0.1)
zgc:172341 (log2FC = −0.15)

Cont

Low

High

Cont

Low

HighCont

Low

High

Cont

Low

High

2.5

2.0

2.0
1.5
1.5
1.0

1.00.5Cont

図２Low

HighCont

Low

HighCont

Low

High

対照群と比べて OTC の投与量依存的に発現量が変化したタンパク質。A）投与期間 Aで発現変動したタンパク質群（左：発現上昇した群、右：発現減少した群）。B）投与期間 Bで発現変動したタンパク質群（左：発現上昇した群、右：発現減少した群）。

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4. 発現変化タンパク質の機能解析
さらに、発現量が変化したタンパク質の機能的な特徴をとらえるために Gene ontology（GO）
解析と Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)パスウェイ解析をおこなった（Table 1）。この結果、投与期間 A・B 共に翻訳（GO:0006412）やリボソーム（dre03010）に関わるタンパク質の発現量が変化していることが明らかとなった。さらに、炭素代謝（dre01200:Carbin metabolism）に関わるタンパク質が期間 A で、リンゴ酸やカルボン酸代謝に関わるタンパク質が投与期間 B で変化していた。これらのことから、OTC 投与は真鯛幼魚の肝臓でタンパク質翻訳や代謝に影響を与えることが示唆された。
Table 1 発現変化タンパク質の機能解析

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5. アウトカムとその発現機序予測
最後に、これらのタンパク質の発現変動がどのような病気と関連するのか、ComparativeToxicogenomics Database (CTD)を用いて調査した（Table 2）。この結果、期間 A・B 共に消化器官における新生物（MESH:D004067;Digestive System Neoplasms、MESH:D005770;Gastrointestinal Neoplasms）に関わるタンパク質が発現変動していることが明らかとなった。さらに、期間 A では栄養と代謝系の病気（MESH:D009750;Nutritional andMetabolic Diseases）に関わるタンパク質が多く発現変動していた。投与期間 C では高OTC 区の検体で体重減少が引き起こされており、投与期間 A での栄養と代謝系の病気に関連しているタンパク質の発現変動の影響であることが示唆された。
Table 1 発現変化タンパク質の機能解析

今後の展望
本研究では、OTC 投与したマダイ幼魚を対象に、肝臓において発現変化タンパク質を同定し、それらの機能を調べ、引き起こされる影響を考察した。しかし、３つの投与期間のうち期間A と B の 2 つの投与期間を解析対象としていた。今後、期間 C も解析対象とし、同様の解析を行う。得られた成果を、Toxicological Sciences に投稿する。

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