SR21140

最終報告書

表

題：2-エチルヘキサン-1-イル=パルミタートの哺乳類培養細胞を用いる
染色体異常試験

試験番号：SR21140

株式会社化合物安全性研究所- 1 -SR21140

試験責任者の署名

表

題： 2‑エチルヘキサン＿ 1‑イル＝パルミタートの哺乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

試験番号： SR21140

株式会社化合物安全性研究所
試験責任者

7

20之 ／ 生 1
之月..2̲

‑2‑日

SR21140

陳述書
表題： 2‑エチルヘキサン ‑lーイル＝パルミタートの哺乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

試験番号： SR21140

本試験は， GLP基準「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準について」（平成23年 3月 3
1 日薬食発 033
1第 8号・平成 23・03・29製局第 6号・環保企発第 1
1
0
3
3
1
0
1
0号 厚 生
労働省医薬食品局長・経済産業省製造産業局長・環境省総合環境政策局長連名通知）を遵守して実施した（ただし，被験物質の安定性を除く）．
本試験に用いた試験方法は，試験法ガイドライン「新規化学物質等に係る試験の方法について」（平成23年 3月 3
1 日薬食発 033
1第 7号・平成 23・03・29製局第 5号・環保企発第 1
1
0
3
3
1
0
0
9号 厚 生
労働省医薬食品局長・経済産業省製造産業局長・環境省総合環境政策局長連名通知）および「新規化学物質等に係る試験の方法について」の一部改正について（令和 2年 1
1月 5日薬生発 1
10
5第 2号・ 20201015 製局第 1 号・環保企発第 2011055 号厚生労働省医薬•生活衛生局長・経済産業省

製造産業局長・環境省大臣官房環境保健部長連名通知）に準拠した．

株式会社化合物安全性研究所
試験責任者

‑3‑

1
之 月 之

日

20
之／年

SR21140

信頼性保証書表題：2‑エチルヘキサン＿ 1‑イル＝パルミタートの哺乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

試験番号：SR21140

本試験は，株式会社化合物安全性研究所Q
AUによって，下記のとおり査察された ．
査察段階

査察日

試験責任者

運営管理者

への報告日

への報告日

試験計画書

2021年 8月 30 日

2021年 8月 30 日

2021年 8月 30 日

被験物質の管理2021年 9月 1
3日

2021年 9月 1
3日

2021年 9月 1
3日

被験物質の調製

2021年 9月 1
3日

2021年 9月 1
3日

2021年 9月 1
3日

被験物質処理2021年 9月 1
3日

2021年 9月 1
3日

2021年 9月 1
3日

2021年 9月 1
6日

2021年 9月 1
6日

2021年 9月 1
4日

標本作製

2021年 9月 1
5日
2021年 9月 16日

観察2021年 9月 1
7日

2021年 9月 1
7日

2021年 9月 1
7日

生データ

2021年 12月 2 日

2021年 12月 2 日

2021年 1
2月 2 日

最終報告書（草案）：図表

2021年 1
2月 2 日2021年 12月 2 日

2021年 1
2月 2 日

最終報告書（草案）：本文

2021年 1
2月 2 日2021年 1
2月 2 日2021年 1
2月 2 日最終報告書

2021年 1
2月 27 日2021年 1
2月 27 日2021年 12月 27 日

本試験は，「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準について」（平成 23

年 3月 31日薬食発 0331第 8号・平成 23• 03• 29製局第 6号・環保企発第 110331010号 厚 生 労働省医薬食品局長・経済産業省製造産業局長・環境省総合環境政策局長連名通知）に従い実施された
本試験は，試験計画書に従って実施され，また，本報告書には当該試験に使用した方法および手順が正確に記載されており，試験成績には当該試験の実施過程において得られた生データが正確に反映していることを確認した

株式会社化合物安全性研究所
QAU責任者

」.l.

‑4 ‑

.
l
. 月 土／

日

SR21140

目次頁

表紙 ·························································································································· 1
試験責任者の署名 ········································································································ 2
陳述書 ······················································································································· 3
信頼性保証書 ·············································································································· 4
目次 ·························································································································· 5
表題 ·························································································································· 7
試験番号 ···················································································································· 7
試験目的 ···················································································································· 7
試験実施基準および試験法ガイドライン ·········································································· 7
試験委託者 ················································································································· 7
試験施設 ···················································································································· 7
試験責任者 ················································································································· 8
試験従事者およびその業務分担 ······················································································ 8
試験日程 ···················································································································· 8
1 要約 ······················································································································· 92 緒言 ····················································································································· 10
3 材料および方法 ······································································································ 10
4 成績 ····················································································································· 20
5 考察および結論 ······································································································ 20
6 試験成績の信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因 ················································ 21
7 資料の保存 ············································································································ 21
8 参考資料 ··············································································································· 21

Tables1

Effects of 2-Ethylhexyl Palmitate on growth rate of CHL/IU with or without S9 incell-growth inhibition test (preliminary test) ··························································· 222Effects of 2-Ethylhexyl Palmitate on growth rate of CHL/IU with or without S9 inchromosomal aberration test (main test) ································································ 23

3-1

Chromosome analysis of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 6 hours
without S9 ··································································································· 24

3-2

Chromosome analysis of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 6 hours
with S9······································································································· 25- 5 -SR21140

3-3

Chromosome analysis of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 24 hours
without S9 ··································································································· 26

Figures1

Growth rate of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 6 hours without S9 ············ 27

2Growth rate of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 6 hours with S9················ 28

3Growth rate of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 24 hours without S9 ·········· 29

4Incidence of chromosome aberrations in CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 6hours without S9 ··························································································· 30

5Incidence of chromosome aberrations in CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 6hours with S9 ······························································································· 31

6Incidence of chromosome aberrations in CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for24 hours without S9························································································ 32

Annex
1

Historical control data for chromosomal aberration test in CHL/IU (2021) ······················· 33
最終頁

- 6 -

33

SR21140

表題
2-エチルヘキサン-1-イル=パルミタートの哺乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

試験番号SR21140

試験目的
チャイニーズハムスター肺由来細胞 (CHL/IU) を用いて，2-エチルヘキサン-1-イル=パルミター
トの in vitro における染色体異常誘発性の有無を検討した．

試験実施基準および試験法ガイドライン
試験実施基準 (GLP) ：｢新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準について｣ (平成 23 年 3 月 31 日薬食発 0331 第 8 号・平成 23･03･29 製局第 6号・環保企発第 110331010 号 厚生労働省医薬食品局長・経済産業省
製造産業局長・環境省総合環境政策局長連名通知)
試験法ガイドライン ：｢新規化学物質等に係る試験の方法について｣ (平成 23 年 3 月 31 日
薬食発 0331 第 7 号・平成 23･03･29 製局第 5 号・環保企発第 110331009
号 厚生労働省医薬食品局長・経済産業省製造産業局長・環境省総
合環境政策局長連名通知)｢新規化学物質等に係る試験の方法について｣の一部改正について (令和2 年 11 月 5 日薬生発 1105 第 2 号・20201015 製局第 1 号・環保企発第2011055 号 厚生労働省医薬・生活衛生局長・経済産業省製造産業局長・環境省大臣官房環境保健部長連名通知)

試験委託者
名称

：厚生労働省 医薬・生活衛生局

所在地：東京都千代田区霞が関 1-2-2 (〒100-8916)

担当者

：

試験施設
名称

：株式会社化合物安全性研究所

所在地：札幌市清田区真栄 363 番 24 (〒004-0839)

運営管理者

：
- 7 -

SR21140

試験責任者
氏名

：

所属

：株式会社化合物安全性研究所 安全性研究部

試験従事者およびその業務分担
被験物質の調製：試験操作・観察

：

試験日程
試験開始日

：2021 年 8 月 30 日

実験開始日

：2021 年 9 月

6 日

細胞増殖抑制試験 (予備試験)
被験物質処理開始 ：2021 年 9 月

6 日

細胞増殖率の測定 ：2021 年 9 月

7 日

染色体異常試験 (本試験)
被験物質処理開始 ：2021 年 9 月 13 日
標本作製

：2021 年 9 月 14 日

標本観察終了日：2021 年 10 月

4 日

実験終了日

：2021 年 10 月

4 日

試験終了日

：2021 年 12 月 27 日

- 8 -

SR21140

1 要約
チャイニーズハムスター肺由来細胞 (CHL/IU) を用いて，2-エチルヘキサン-1-イル=パルミター
トの in vitro における染色体異常誘発性の有無を検討した．2-エチルヘキサン-1-イル=パルミター
トは短時間処理法 -S9 処理，短時間処理法 +S9 処理および連続処理法 24 時間処理の 3 処理条件
で試験を実施した．

細胞増殖抑制試験では被験物質 0.4000 g をアセトン 2 mL に定容し，最高濃度調製液 (200mg/mL) を調製した．200 mg/mL 調製液を公比 2 で希釈し，100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56
mg/mL 調製液を調製した．純度換算は実施せず，また反応性 (発熱，変色，発泡等) はみられな
かった．
細胞増殖抑制試験 (被験物質の用量；15.6，31.3，62.5，125，250，500，1000，2000 µg/mL) の結果，細胞増殖への影響はいずれの処理条件においても増殖抑制はみられなかった．被験物質の析出は，全処理条件の 250 µg/mL 以上の用量で認められた．培養液 pH への影響はいずれの処理
条件においてもみられなかった．

染色体異常試験では，被験物質 0.4000 g をアセトン 2 mL に定容し，最高濃度調製液 (200 mg/mL)を調製した．200 mg/mL 調製液を希釈し，100，50 mg/mL 調製液を調製した．純度換算は実施せず，また反応性 (発熱，変色，発泡等) はみられなかった．
染色体異常試験は，予備試験の結果に基づき各処理条件ともに 500，1000，2000 µg/mL の 3 用量を設定し評価した．その結果，染色体の構造異常および数的異常の出現率は，各処理条件のいずれの用量も 5%未満であり，結果は陰性であった．細胞増殖への影響では，いずれの処理条件においても被験物質処理による増殖抑制はみられなかった．被験物質の析出は全処理条件の全用量で認められた．培養液 pH への影響では，いずれの処理条件においてもみられなかった．これらの結果は予備試験の結果と一致するもので，その再現性が確認された．
陽性対照群における染色体の構造異常の出現率は各処理条件において明確な陽性値を示し，本試験系が適切な感度を有していたことが確認された．

以上のことから，2-エチルヘキサン-1-イル=パルミタートは当該試験条件下において哺乳類の培養細胞に対し染色体異常誘発性を有しないと判断した．

- 9 -SR21140

2 緒言
チャイニーズハムスター肺由来細胞 (CHL/IU) を用いて，2-エチルヘキサン-1-イル=パルミター
トの in vitro における染色体異常誘発性の有無を検討した．

3 材料および方法
3.1 被験物質
名称：2-エチルヘキサン-1-イル=パルミタート

別名 1)：パルミチン酸 2-エチルヘキシル
2-Ethylhexyl Palmitate

CAS 番号：29806-73-3

官報公示整理番号 1) ：(2)-798
構造式 2)：人＾［ヘCH3(CH2),4CH3

化学式 1)2)：C24H48O2

分子量 2)：368.65

物理化学的性質 1)2)3) ：外観；無色透明液体
比重；0.8597
引火点；204°C
純度 3)：98.8% (GC)

ロット番号 3)：

製造者・供給者：

試験施設受領日：2021 年 7 月 30 日

保存場所および保存期間 ：被験物質保存室 [2021 年 7 月 30 日 (試験施設受領) ~2021 年 9 月 13 日 (染色体異常試験の調製) ]
保存条件：冷蔵 (実測範囲 3.1 ~ 3.6°C)，気密，遮光，不活性ガス充填

安定性 1) (非 GLP)

：適切な条件下においては安定．

被験物質管理責任者からの移管量：5.0034 g
使用量：0.8000 g

取扱上の注意：ゴム手袋，マスク，保護メガネ着用

参考資料：1) 安全データシート：2-Ethylhexyl Palmitate，- 10 -

SR21140

試薬ウエブサイト，2-Ethylhexyl Palmitate2)3) 試験成績書：2-Ethylhexyl Palmitate，

3.2 被験物質の調製
調製方法：被験物質必要量をメスフラスコに精秤した．媒体を適量加え，被験物
質を溶解させた後メスアップした．よく混和した後，プラスチック製
試験管に移し入れ，最高濃度調製液を調製した．最高濃度調製液を希釈し，必要な調製液を調製した．
細胞増殖抑制試験では被験物質 0.4000 g を 2 mL に定容し，最高濃度
調製液 (200 mg/mL) を調製した．200 mg/mL 調製液を公比 2 で希釈し，100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56 mg/mL 調製液を調製した．
染色体異常試験では，被験物質 0.4000 g を 2 mL に定容し，最高濃度
調製液 (200 mg/mL) を調製した．200 mg/mL 調製液を希釈し，100，
50 mg/mL 調製液を調製した．

調製頻度：用時に調製し，調製後，細胞増殖抑制試験では 30 分以内，染色体異常試
験では 40 分以内に使用した．

調製液の添加容量 ：プレート内の液に対し 1 vol%の割合で添加した．
調製上の注意：ゴム手袋，マスク，保護メガネ着用．

残余調製液の処理 ：残余調製液は，産業廃棄物として回収した．

3.3 対照物質およびその調製
3.3.1 陰性対照物質 (媒体)
名称

：アセトン (Acetone)

ロット番号：APP0694

製造者：和光純薬工業株式会社

保存場所：被験物質保存室

保存条件：冷所，遮光使用量：100 mL (モレキュラーシーブを用いて脱水処理を行い，原液のまま使用した．)

添加容量：プレート内の液に対し 1 vol%の割合で添加した．

媒体の選択理由：試験施設において水，ジメチルスルホキシド，アセトンを用いて調製
確認 (SR21139 検討) を行った．その結果，被験物質は蒸留水 (20mg/mL) およびジメチルスルホキシド (200 mg/mL) に不溶，アセトン- 11 -

SR21140(200 mg/mL) には溶解することが確認され，反応性 (発熱，変色，発泡等) はみられなかった．このことから，当該試験の媒体としてアセトンを使用した．
3.3.2 陽性対照物質
3.3.2.1 短時間処理法 -S9 処理 (-S9 処理) および連続処理法 24 時間処理 (24h 処理)
名称：マイトマイシン C (MMC)

ロット番号：ESL7012

使用期限：2022 年 5 月

製造者：富士フイルム和光純薬株式会社

調製方法：MMC 1 mg/mL 溶液を日本薬局方生理食塩液 (ロット番号；K0I76，株
式会社大塚製薬工場) で 10 倍に希釈した後，更に希釈し 5 および 10µg/mL 濃度の溶液を調製した (調製日：2021 年 2 月 10 日)．

保存条件：-20°C 以下で凍結保存

調製液の使用期限 ：2022 年 2 月 9 日 (調製後 1 年)
調製液の添加容量 ：プレート内の液に対し 1 vol%の割合で添加した．
3.3.2.2 短時間処理法 +S9 処理 (+S9 処理)
名称：3,4-ベンゾピレン (BP)

ロット番号

：USJAI

純度：100.0%

使用期限：2024 年 1 月 21 日 (受入後 5 年)

製造者

：東京化成工業株式会社

調製方法：BP 21.8 mg をジメチルスルホキシド (ロット番号；KCR4386，富士フ
イルム和光純薬株式会社) 2.2 mL に溶解し，さらにジメチルスルホキ
シドを用いて 10 倍希釈し，1 mg/mL の濃度に調製した (調製日：2021
年 2 月 10 日)．調製にあたり含量の補正は行わなかった．

保存条件：-20°C 以下で凍結保存

調製液の使用期限 ：2022 年 2 月 9 日 (調製後 1 年)
調製液の添加容量 ：プレート内の液に対し 1 vol%の割合で添加した．

3.4 細胞
細胞名：CHL/IU

種 (由来組織)：チャイニーズハムスター (新生チャイニーズハムスター (雌) の肺)細胞の選択理由：増殖速度，継代における染色体の安定性，染色体標本の観察の容易- 12 -

SR21140

さおよび既知の変異原物質に対する感受性を考慮し選択した．
入手先

：

入手年月日

：2019 年 7 月 30 日

入手時継代数：13

凍結条件：10 vol% ジメチルスルホキシドを含む培地を用いて 1 × 106 cells/mL
細胞浮遊液を調製し，1 mL ずつバイアルに分注したものを凍結させた後，液体窒素内で保存した．

培養条件：75 cm2 培養フラスコを用いて，5.0%CO2，37.0 ºC に設定した CO2 イ
ンキュベーター (MCO-170AICUV-PJ；パナソニック ヘルスケア株式会社) 内で培養し，3 ~ 4 日毎に継代を行った．

マイコプラズマ：供試細胞と同時に凍結保存した細胞を用いて蛍光染色法によりマイコプラズマチェックが行われ，陰性であることが確認されている．

染色体数 (モード) ：25
倍加時間：13.4 時間 (供試細胞と同時に保存した細胞での測定結果)

供試細胞の継代数 ：30 以下 (細胞増殖抑制試験：21，染色体異常試験：23)

3.5 培地培地：イーグル MEM 培地 (Code 05900，ロット番号；77310231，日水製薬
株式会社)

血清

：牛胎児血清 (ロット番号；2194384P，GIBCO) を，56°Cで30分間非働化した後，使用した．

調製方法：イーグルMEM培地7.52 gを秤量し，日本薬局方注射用水 (ロット番号；
0H87，株式会社大塚製薬工場) 800 mLを加え溶解させた．オートクレー
ブ滅菌後，室温まで放冷し7.5%炭酸水素ナトリウム溶液 (ロット番号；
105K1643，関東化学株式会社) 26.9 mLを添加した．使用前に，29.2
mg/mL L-グルタミン溶液 (ロット番号；CAQ3717，富士フイルム和光
純薬株式会社) 9.3 mL および牛胎児血清を10%となるように添加した．

3.6 S9 mix
製造者：家田貿易株式会社

ロット番号：CAM202106A

製造年月日：2021 年 6 月 18 日

- 13 -

SR21140

製造方法：フェノバルビタール (1 日目 30 mg/kg を 1 回腹腔内投与，2 日目以降 60
mg/kg を 1 日 1 回 3 日間腹腔内投与) および 5,6-ベンゾフラボン (フェノバルビタール投与 3 日目に 80 mg/kg を 1 回腹腔内投与) で酵素誘導を行った Slc：SD ラット (雄，7 週齢，体重；184 ~ 240 g) の肝ホモジネー
トから調製した S9 (ロット番号；RAA202106A，S9 中蛋白含量 24.58
mg/mL) 1.05 mL に，コファクターミックス 2.45 mL を加え調製されている．S9 mix 1 mL 中のコファクターの成分濃度を次表に示す．
S9 mix 1 mL 中のコファクターの成分濃度
MgCl2(富士フイルム和光純薬株式会社 WDF6052)

5 μmolKCl(富士フイルム和光純薬株式会社 SKF5292)

33 μmol

G-6-P(オリエンタル酵母工業株式会社 118002)

5 μmolNADP(オリエンタル酵母工業株式会社 045908)

4 μmolHEPES 緩衝液

(pH7.2，株式会社同仁化学研究所 NN219)

4 μmol

保存条件：-80°C で凍結保存

使用期限：製造後 6 ヵ月 (製造より 3 ヵ月以内に使用した)

3.7 試験方法
3.7.1 細胞増殖抑制試験 (予備試験)
3.7.1.1 処理条件
-S9 処理，+S9 処理および 24h 処理の 3 処理条件について実施した．
3.7.1.2 試験群
最高用量を試験法ガイドラインの規定 (10 mM 又は 2 mg/mL の低い濃度) に従い 2000
µg/mL とし，以下公比 2 で低下させた計 8 用量 ( 2000，1000，500，250，125，62.5，31.3，
15.6 µg/mL ) の試験群を設定した．更に，処理条件毎に陰性対照群を設定した．
処理開始前プレート (Pretreatment Plate；PP) および各群に 2 枚のプレートを使用し，プ
レートには識別番号を明記した．
3.7.1.3 細胞の播種
直径 60 mm のプレートに，0.4 × 104 cells/mL の濃度の細胞浮遊液を 5 mL ずつ播種し，5.0%CO2，37.0°C に設定した CO2 インキュベーター (MCO-175；パナソニック ヘルスケア株式会社) 内で培養した．
3.7.1.4 試験液の処理
試験液の処理は下記方法で実施し，陰性対照物質についても同様に処理した．

- 14 -

SR21140a-S9 処理細胞播種後 3 日目にプレートの培養液を除去し，新鮮培地 3.0 mL，試験液 0.03 mL を加え 6 時間培養した．6 時間経過後にプレートの液を除去して PBS (-) で 3 回細胞を洗い，新鮮な培地 5 mL を加えて 18 時間培養した．

b+S9 処理細胞播種後 3 日目にプレートの培養液を除去し，新鮮培地 2.5 mL と S9 mix 0.5 mL (S9 の最終濃度約 5 vol%)，試験液 0.03 mL を加え 6 時間培養した．6 時間経過後にプレートの液を除去して PBS (-) で 3 回細胞を洗い，新鮮な培地 5 mL を加えて 18 時間培養した．

c24h 処理細胞播種後 3 日目にプレートの培養液を除去し，新鮮培地 5.0 mL，試験液 0.05 mL を加え，24 時間培養した．

3.7.1.5 試験液による析出の有無の確認
試験液による処理の開始時と終了時に，試験液による析出の有無を目視確認した．
3.7.1.6 試験液による培養液 pH への影響の有無の確認
試験液による処理の開始時と終了時に，pH の変化の有無を目視確認した．培養液色に変化が認められない場合には，試験液処理による培養液 pH への影響は無いものと判断した．
3.7.1.7 細胞増殖率 (RICC) の算出および 50%細胞増殖抑制濃度 (IC50) の算出
PP および処理終了後のプレート毎に以下の処理を行った．
プレートの液を除去して PBS(-) 3.0 mL で細胞を洗い，0.02%EDTA-0.25%トリプシン 0.5 mL を加えて細胞を剥離し，新たに培地 5.0 mL を加えてピペッティングし細胞浮遊液を調製した．この細胞浮遊液の一部を採取し，血球計算盤を用いて細胞数を計数した．
各プレートの細胞数より，次式により Relative increase in cell counts (RICC) を算出し，試験群毎にその平均値を算出した．
処理プレートの細胞増加数 (処理終了時の細胞数 － PP の細胞数*)
RICC =

× 100
対照プレートの細胞増加数 (処理終了時の細胞数 － PP の細胞数*)*；PP 2 枚の平均値を用いた．

RICC が 50%以下まで低下した処理条件については，50%細胞増殖抑制濃度 (IC50) を算出した．IC50 は，RICC が 50%となる点を挟む 2 用量の結果を用いて算出することとしたが，該当事例は発生しなかった．
3.7.2 染色体異常試験 (本試験)
3.7.2.1

処理条件-S9 処理，+S9 処理および 24h 処理の 3 処理条件について実施した．
- 15 -

SR21140

3.7.2.2
a

試験群
被験物質
細胞増殖抑制試験の結果，全処理条件で 50%以上の細胞増殖抑制は認められなかった．
この結果に基づき，染色体異常試験の用量は以下の用量を設定した．
-S9 処理：500，1000，2000 µg/mL+S9 処理：500，1000，2000 µg/mL
24h 処理：500，1000，2000 µg/mLb

対照物質
各処理条件について，陰性対照群ならびに次表の陽性対照群を設定した．

c

処理条件

陽性対照物質用量 (µg/mL)-S9 処理MMC

0.1+S9 処理BP1024h 処理

MMC

0.05

プレート数
PP および各群に 2 枚のプレートを使用した．プレートには識別番号を明記した．

3.7.2.3

細胞の播種
3.7.1.3 細胞の播種に準じた．

3.7.2.4
a

試験液の処理-S9 処理3.7.1.4 の a -S9 処理に準じ，陽性対照物質についても同様に処理した．

b+S9 処理3.7.1.4 の b +S9 処理に準じ，陽性対照物質についても同様に処理した．

c

24h 処理3.7.1.4 の c 24h 処理に準じ，陽性対照物質についても同様に処理した．

3.7.2.5

試験液による析出の有無の確認
3.7.1.5 試験液による析出の有無の確認に準じた．

3.7.2.6

試験液による培養液 pH への影響の有無の確認
3.7.1.6 試験液による培養液 pH への影響の有無の確認に準じた．

3.7.2.7

細胞増殖率 (RICC) の算出
3.7.2.8 で得られた細胞浮遊液を使用し，その測定方法は 3.7.1.7 細胞増殖率 (RICC) の算
出および 50%細胞増殖抑制濃度 (IC50) の算出に準じた．IC50 の算出は行わなかった．

- 16 -

SR21140

3.7.2.8

染色体標本の作製
培養終了の 2 時間前に，プレートに最終濃度 0.2 µg/mL のコルセミド (ロット番号；2229737，GIBCO) を加えた．培養終了時間に，プレートの液を遠沈管に回収した．なお，
24h 処理については被験物質の析出がみられたことから，プレート内の液は廃棄し，新鮮培地 5.0 mL を遠沈管に入れた．
プレートを PBS (-) (PBS タブレット：ロット番号；AJ9P003，
タカラバイオ株式会社) で細胞を洗い，0.02 % EDTA-0.25 %トリプシン (0.5M EDTA：ロ
ット番号；1852916，GIBCO，2.5%トリプシン：ロット番号；2216350，GIBCO) で処理して細胞を剥離させ，得られた細胞浮遊液を同上の遠沈管に回収し，細胞浮遊液の一部を細胞計数用に採取した．細胞浮遊液を 1000 rpm で 5 分間遠心した．上清を除去し，0.075 mol/L
塩化カリウム (ロット番号；811H1490，関東化学株式会社) を加え，穏やかにピペッティ
ングし 37°C で 15 分間細胞を膨満化 (低張処理) させた．氷冷したカルノア固定液 (メタノール：酢酸＝3：1，メタノール：ロット番号；304Y1097，関東化学株式会社，酢酸：ロ
ット番号；ESE2910，富士フイルム和光純薬株式会社) を加えて細胞を固定した後，1000rpm で 5 分間遠心して上清を除去し，新しいカルノア固定液を加えた．この固定操作を 3
回繰り返した後，細胞浮遊液をスライドグラス上に滴下し，乾燥させた．各プレートより
2 枚の染色体標本を作製した．スライドは，3%ギムザ液 [ギムザ液：ロット番号；EP681，
富士フイルム和光純薬株式会社，インスタント燐酸緩衝液 (pH6.8) ：ロット番号；D039，
株式会社 LSI メディエンス] で 20 分間染色し，水洗および風乾の後，封入剤 (マリノール，
ロット番号；210419，武藤化学薬品株式会社) で封入した．

3.7.2.9

観察用量の選択
観察用量として，3.7.2.7 の細胞増殖率 (RICC) の算出において，全ての処理条件で 50%を超える細胞増殖抑制がみられなかったことから全用量を選択した．

3.7.2.10 標本の確認
3.7.2.9 で選択した用量の標本ならびに対照群の標本について実施した．
作製した 1 枚の標本あたり約 75 個以上の分裂中期細胞が得られることを確認した．
3.7.2.11 染色体標本のコード化選択した観察用量の標本について 1 プレートにつき 1 枚の標本を選択しコード化した．
3.7.2.12 染色体標本の観察 1)
総合倍率 1000 倍の顕微鏡 (BX53F；オリンパス株式会社) で，1 枚あたり 150 個 (用量
あたり 300 個) の分裂中期細胞を観察した．
以下に示す分類に従って染色体異常の判定を行った．なお，構造異常については 25 ± 2の染色体をもつものを観察対象とした．
a

構造異常 (structural aberration)- 17 -

SR21140

・染色分体切断 (ctb：chromatid break)
染色分体のはっきりした不連続部分 (切断部分) で，不連続部分が染色分体の幅以上である場合，あるいは切断片が染色分体の長軸線上から外れている場合．
・染色分体交換 (cte：chromatid exchange)
染色分体の 2 ヵ所以上の切断部位が相互に交換 (結合反応) しているもの．
・染色体切断 (csb：chromosome break)
両方の染色分体の同じ位置に切断が生じている場合，切断の判定基準は，染色分体切断に準じた．
・染色体交換 (cse：chromosome exchange)
両方の染色分体の同じ位置で同じ方向に交換が生じている場合．
・その他 (others)
その他の構造異常として，断片化 (fragmentation) がある．一つの分裂中期細胞のほとんど全ての染色体に切断やギャップが現れ，交換型の異常が含まれていな
い場合．
bギャップ (gap)
染色分体あるいは染色体上に生じた非染色部分 (染色性が全くみられない部分)
で，非染色部分の幅が染色分体の幅より狭い場合．

c

数的異常 (numerical aberration)
・倍数体 (poly：polyploid)
染色体数 (25 ± 2) が倍加し，染色体数が 36 以上 (三倍体，四倍体等) となった
もの．
・その他 (others)
その他の数的異常として核内倍加がある．倍加した染色体が分離せずに平行に並んでいる場合に核内倍加 (end：endoreduplication) と判定し，倍数体とは区別した．

3.7.2.13 観察結果の集計方法
異常細胞数ならびに総異常細胞数 (total) を，プレートおよび用量毎，また構造異常および数的異常の分類毎に求めた．また，各用量の総異常細胞の出現率を求めた．出現率 (%) は観察した細胞数 (分裂中期細胞の数) に対する出現数の百分率で算出した．なお，構造異常は 1 個の細胞に複数の構造異常がある場合にも構造異常を有する細胞数は 1 として計数し，ギャップは構造異常には含めなかった．
a

構造異常について・ctb：染色分体切断をもつ細胞数・cte：染色分体交換をもつ細胞数- 18 -

SR21140・csb：染色体切断をもつ細胞数

・cse：染色体交換をもつ細胞数

・others ：その他の構造異常をもつ細胞数
・total：何らかの構造異常をもつ細胞数

ギャップについてb・gap：ギャップをもつ細胞数

数的異常についてc・poly：倍数体の細胞数・others：その他の数的異常をもつ細胞数

・total：何らかの数的異常をもつ細胞数3.7.2.14 観察結果の採用基準
観察可能な分裂中期細胞数がプレートあたり 150 個 (用量あたり 300 個) の標本のデータを採用データとした．
3.7.2.15 試験の成立条件
以下の基準を満たしている場合を，試験結果が正しく評価出来る条件とした．試験の結果，いずれの処理条件もその条件を満たしていた．
陰性対照群および陽性対照群ならびに 3 用量以上の被験物質群について，観察結果の採a

用基準を満たしている．
各処理条件の陰性対照群の染色体の構造異常および数的異常の出現率が背景データに基b

づく管理範囲 (平均値± 3 SD；平均値+ 3 SD < 1%の場合の上限：1%) 内である．
各処理条件の陽性対照群の染色体の構造異常の出現率が背景データに基づく管理範囲c(平均値± 3 SD) 内であり，陰性対照群と比較して有意な増加がみられる．かつ，RICC が40%以上である．
3.7.2.16 試験結果の評価
a

統計処理
染色体の構造異常または数的異常の出現率 (%) について，EXSUS (Version 10.1) およびSAS (Version 9.3) を用いて統計処理を行った．
陰性対照群と被験物質群および陽性対照群の比較には Fisher の正確検定を用いた (有意水準は両側 5%とし，1%と 5%を区別して示した)．Fisher の正確検定で陰性対照群と被験物質群に有意差が認められた場合は，Cochran-Armitage 検定により用量依存性を確認することとしたが，該当事例は生じなかった．

b

結果の判定
被験物質群における染色体異常の出現率が陰性対照群と比較して有意に増加し，かつ陰- 19 -

SR21140

性対照群の背景データに基づく管理範囲 (3.7.2.15 b) の上限を超えており，また，その増加に用量依存性がみられる場合，陽性と判定した．被験物質群において染色体異常の出現率に有意な増加がみられない場合，陰性と判定した．
3.7.2.17 再試験
以下のいずれかの場合，その処理条件について確認試験を実施することとしたが，該当事例は生じなかった．
a

陰性あるいは陽性の判定基準 (3.7.2.16) に合致せず，結果判定ができない場合．ただし，他の処理条件等において陽性判定される場合には実施しない．

b

試験結果より再確認が必要と判断された場合．

4 成績
4.1 細胞増殖抑制試験
細胞増殖率の結果を Table 1 および Figure 1 ~ 3 に示す．
試験の結果，全ての処理条件の 250 μg/mL 以上の用量で析出が観察された．培養液 pH への影響はいずれの処理条件においてもみられなかった．
細胞増殖への影響では，全ての処理条件で 50%以上の細胞増殖抑制は認められなかった．
4.2 染色体異常試験
染色体異常試験の結果を Table 2，Table 3-1 ~ 3-3 および Figure 1 ~ 6 に示す．
試験の結果，全用量で析出が観察された．培養液 pH への影響はいずれの処理条件においてもみられなかった．
標本観察の結果，被験物質の染色体の構造異常および数的異常の出現率は陰性対照群と比較し有意な増加はみられなかった．
各処理条件の陰性対照群の染色体の構造異常および数的異常の出現率は，背景データに基づく管理範囲 (Annex 1) 内であった．各処理条件の陽性対照群の染色体の構造異常の出現率は，背景データに基づく管理範囲 (Annex 1) 内であり，陰性対照群と比較し統計学的に有意な増加が認められた．また，いずれの処理条件においても陽性対照群の細胞増殖率(RICC) は 40%以上であった．

5 考察および結論
チャイニーズハムスター肺由来細胞 (CHL/IU) を用いて，2-エチルヘキサン-1-イル=パルミ
タートの in vitro における染色体異常誘発性の有無を検討した．

- 20 -

SR21140

試験の結果，被験物質の染色体の構造異常および数的異常の出現率に有意な増加はみられず，結果は陰性と判定した．
陰性対照群の染色体の構造異常および数的異常の出現率ならびに陽性対照群の染色体の構
造異常の出現率は各々の背景データの管理範囲内であった．また，陽性対照群では染色体の構
造異常の出現率に有意な増加が認められ，当該試験が適切な条件下で実施されたことが確認された．

以上のことから，2-エチルヘキサン-1-イル=パルミタートは当該試験条件において哺乳類の培養細胞に対し染色体異常誘発性を有しないと判断した．

6 試験成績の信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因
試験成績の信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因はなかった．

7 資料の保存7.1 資料の種類
次の資料を試験施設の資料保存室に保存する．
1．試験計画書
2．生データその他の記録文書
3．最終報告書
4．染色体標本7.2 保存期間
試験終了後 5 年間保存し，その後の保存については試験委託者との協議により決定する．

8 参考資料1) 化学物質による染色体異常アトラス；日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，1988 年，朝倉書店- 21 -

SR21140

Table 1

Effects of 2-Ethylhexyl Palmitateon growth rate of CHL/IU with or without S9 in cell-growth inhibition test
(preliminary test)
RICC (%)

Concentration(µg/mL)Group

Control a

S9-

S9+

S9-

b

6-18 hb

24-0 h b(Mean)(Mean)(Mean)―

96.6 , 103.4(100.0)90.6 , 109.4(100.0)102.5 , 97.5
(100.0)15.6

108.5 , 103.4(106.0)101.9 , 95.5
( 98.7)104.3 , 90.3
( 97.3)

31.3

95.1 , 96.0
( 95.6)96.2 , 103.8(100.0)95.4 , 77.1
( 86.3)

62.5

95.1 , 104.0( 99.6)118.1 , 95.5
(106.8)95.4 , 85.2
( 90.3)125

104.0 , 93.0
( 98.5)99.2 , 104.9(102.1)100.0 , 93.6
( 96.8)250

98.1 , 98.1 *( 98.1)90.6 , 87.9 *( 89.3)101.3 , 85.2 *( 93.3)500

98.1 , 84.7 *( 91.4)87.9 , 90.6 *( 89.3)96.7 , 89.8 *( 93.3)1000

93.0 , 84.7 *( 88.9)100.0 , 92.5 *( 96.3)98.0 , 78.9 *( 88.5)

2000

88.6 , 101.9 *( 95.3)95.5 , 84.2 *( 89.9)93.6 , 82.7 *( 88.2)2-Ethylhexyl
Palmitate

IC50 (µg/mL)

6-18 h--

RICC : Relative increase in cell counts
a : Acetoneb : Treatment time - recovery time
* : Precipitation was observed at the beginning and end of treatment
Change of pH in culture medium was not observed- 22 --

SR21140

Table 2

Effects of 2-Ethylhexyl Palmitateon growth rate of CHL/IU with or without S9 in chromosomal aberration test
(main test)
RICC (%)
S9+

S9GroupControl aConcentration

6-18 h(µg/mL)b

Concentration

6-18 h(Mean)(µg/mL)―119.9 , 80.1
(100.0)500

125.4 , 90.9
(108.2)1000

106.2 , 102.5 *(104.4)2000

111.6 , 84.4
( 98.0)0.1

84.4 , 79.0
( 81.7)S9bb

Concentration

24-0 h(Mean)(µg/mL)(Mean)―

97.2 , 102.8(100.0)―98.2 , 101.8(100.0)500

105.8 , 114.3 *(110.1)500

92.8 , 84.1
( 88.5)*1000

102.8 , 96.4
( 99.6)*1000

82.9 , 77.0
( 80.0)*2000

104.9 , 86.6
( 95.8)*

2000

91.6 , 86.9
( 89.3)*0.05

80.5 , 66.4
( 73.5)Control a2-Ethylhexyl
Palmitate

Mitomycin C

3,4-Benzopyrene

―

*

*

―

10

RICC : Relative increase in cell counts
a : Acetoneb : Treatment time - recovery time
* : Precipitation was observed at the beginning and end of treatment
Change of pH in culture medium was not observed- 23 -

62.3 , 58.8
( 60.6)―

- 24 --

6-18

Mitomycin C

2-Ethylhexyl
Palmitate

Control bControl b

Group

108.2

500*

98.0

81.7

2000*
0.1
0.1

104.4

100.0

―

1000*

RICC
(%)

Concentration(µg/mL)
Number of
metaphaseobserved
150
150
300
150
150
300
150
150
300
150
150
300
150
150
300
cte
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20
18
38

ctb
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
26
29
55

0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
1
20
19
39

csb
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1

0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
1
63
61
124
(41.3) **( 0.3) NS( 0.3) NS( 0.0) NS( 0.0)

poly, polyploid

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

cse others total (%)

Structural aberrations

ctb, chromatid breakcte, chromatid exchange
csb, chromosome breakcse, chromosome exchangea : Time schedule ; treatment time-recovery timeb : Acetone
RICC : Relative increase in cell counts* : Precipitation was observed at the beginning and end of treatment
NS : No significant difference (Fisher's exact test)** : Statistically significantly different from the control, p < 0.01 (Fisher's exact test)

S9

Time schedule a(hours)Time schedule

Table 3-1 Chromosome analysis of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 6 hours without S9

Gap Number of
metaphase poly others total (%)
observed
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0)
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS

Numerical aberrations

SR21140

- 25 -+

6-18

3,4-Benzopyrene

2-Ethylhexyl
Palmitate

Control bControl b

Group

110.1

500*

95.8

60.6

2000*
10
10

99.6

100.0

―

1000*

RICC
(%)

Concentration(µg/mL)
Number of
metaphaseobserved
150
150
300
150
150
300
150
150
300
150
150
300
150
150
300
cte
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
24
65
89

ctb
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
21
31
52

0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
15
14
29

csb
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
2
57
78
135
(45.0) **( 0.7) NS( 0.0) NS( 0.0) NS( 0.0)

poly, polyploid

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

cse others total (%)

Structural aberrations

ctb, chromatid breakcte, chromatid exchange
csb, chromosome breakcse, chromosome exchangea : Time schedule ; treatment time-recovery timeb : Acetone
RICC : Relative increase in cell counts* : Precipitation was observed at the beginning and end of treatment
NS : No significant difference (Fisher's exact test)** : Statistically significantly different from the control, p < 0.01 (Fisher's exact test)

S9

Time schedule a(hours)Time schedule

Table 3-2 Chromosome analysis of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 6 hours with S9Gap Number of
metaphase poly others total (%)
observed
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0)
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS

Numerical aberrations

SR21140

- 26 --

24-0

Mitomycin C

2-Ethylhexyl
Palmitate

Control bControl b

Group

88.5

500*

89.3

73.5

2000*
0.05
0.05

80.0

100.0

―

1000*

RICC
(%)

Concentration(µg/mL)
Number of
metaphaseobserved
150
150
300
150
150
300
150
150
300
150
150
300
150
150
300
cte
0
0
0
2
0
2
0
0
0
0
0
0
22
26
48

ctb
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
27
24
51

0
1
1
0
0
0
0
1
1
0
0
0
8
16
24

csb
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
2

0
1
1
2
1
3
0
1
1
0
0
0
54
62
116
(38.7) **( 0.0) NS( 0.3) NS( 1.0) NS( 0.3)

poly, polyploid

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

cse others total (%)

Structural aberrations

ctb, chromatid breakcte, chromatid exchange
csb, chromosome breakcse, chromosome exchangea : Time schedule ; treatment time-recovery timeb : Acetone
RICC : Relative increase in cell counts* : Precipitation was observed at the beginning and end of treatment
NS : No significant difference (Fisher's exact test)** : Statistically significantly different from the control, p < 0.01 (Fisher's exact test)

S9

Time schedule a(hours)Time schedule

Table 3-3 Chromosome analysis of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for 24 hours without S9

Gap Number of
metaphase poly others total (%)
observed
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0)
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS
0
150
0
0
0
0
150
0
0
0
0
300
0
0
0 ( 0.0) NS

Numerical aberrations

SR21140

SR21140

15.6
31.3
62.5
125
250
500
1000
2000
AU10
AU11
AU12
AU13
AU14
AU15
AU16
AU17

RICC (%)

100

↓↓

50

Cell-growth inhibition test (preliminary test)
Chromosomal aberration test (main test)

0
0

500

1000

1500

Concentration (µg/mL)

Figure 1

Growth rate of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for6 hours without S9

Each point represents mean value (n=2).
RICC: Relative increase in cell counts- 27 -

2000

SR21140

15.6
31.3
62.5
125
250
500
1000
2000
AW10
AW11
AW12
AW13
AW14
AW15
AW16
AW17

RICC (%)

100

50

↓f

Cell-growth inhibition test (preliminary test)
Chromosomal aberration test (main test)

0
0

500

1000

1500

Concentration (µg/mL)

Figure 2

Growth rate of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for6 hours with S9Each point represents mean value (n=2).
RICC: Relative increase in cell counts- 28 -

2000

SR21140

15.6
31.3
62.5
125
250
500
1000
2000
AY10
AY11
AY12
AY13
AY14
AY15
AY16
AY17

RICC (%)

100

50

↓f

Cell-growth inhibition test (preliminary test)
Chromosomal aberration test (main test)

0
0

500

1000

1500

Concentration (µg/mL)

Figure 3

Growth rate of CHL/IU treated with 2-Ethylhexyl Palmitate for24 hours without S9

Each point represents mean value (n=2).
RICC: Relative increase in cell counts- 29 -

2000

SR21140

20

1000
2000

↓︱

Structural aberration

-S9
+S9
24h

Incidence (%)

Numerical aberration

-S9

0
0

500

1000

1500

Concentration (µg/mL)

Figure 4

Incidence of chromosome aberrations in CHL/IU treated with
2-Ethylhexyl Palmitate for 6 hours without S9- 30 -

2000

SR21140

20

1000
2000

↓︱

Structural aberration

-S9
+S9
24h

Incidence (%)

Numerical aberration

+S9

0
0

500

1000

1500

Concentration (µg/mL)

Figure 5

Incidence of chromosome aberrations in CHL/IU treated with
2-Ethylhexyl Palmitate for 6 hours with S9- 31 -

2000

SR21140

20

1000
2000

↓︱

Structural aberration

-S9
+S9
24h

Incidence (%)

Numerical aberration

24h

0
0

500

1000

1500

Concentration (µg/mL)

Figure 6

Incidence of chromosome aberrations in CHL/IU treated with
2-Ethylhexyl Palmitate for 24 hours without S9- 32 -

2000

Annex 1

SR21140

Historical control data for chromosomal aberration test in CHL/IU (2021)

Negative control data (Period: January, 2019 - December, 2020)
Structural aberration
Treatment recovery time

6-18 hrNumerical aberration
24-0 hr

6-18 hr24-0 hr

Metabolicactivation

-

+

-

-

+

-

No. of data

45

45

45

45

45

45

Mean ± SD

0.3 ± 0.4

0.5 ± 0.4

0.3 ± 0.3

0.0 ± 0.1

0.0 ± 0.1

0.0 ± 0.1

Maximum

2.0

1.7

1.3

0.3

0.7

0.3

Minimum

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0 b - 1.0 c

0.0 b - 1.0 c

0.0 b - 1.0 c

Acceptancecriteria a

0.0

b

- 1.5

0.0

b

- 1.7

0.0

b

- 1.2

Positive control data (Period: January, 2019 - December, 2020)
Structural aberration
Treatment recovery time

Metabolicactivation

6-18 hr-Numerical aberration
24-0 hr+

Mitomycin C Benzopyrene

Mitomycin C

6-18 hr-24-0 hr+

Mitomycin C Benzopyrene

Mitomycin C( µg/mL)

0.1

10

0.05

0.1

10

0.05

No. of data

45

45

45

45

45

45

Mean ± SD

46.4 ± 3.8

44.7 ± 4.5

46.6 ± 3.5

0.0 ± 0.0

0.0 ± 0.2

0.0 ± 0.0

Maximum

56.0

55.3

54.0

0.3

1.0

0.3

Minimum

38.3

36.7

35.3

0.0

0.0

0.0

36.1 - 57.1

0.0 b - 1.0 c

0.0 b - 1.0 c

0.0 b - 1.0 c

Acceptanceacriteria

35.0 - 57.8 31.2 - 58.2

a: Mean ± 3SD
b: Lower limit is set at not less than 0.0%
c: Upper limit is set at not less than 1.0%
- 33 -