課題番号 ５Ａ－１２

研究題目 炎症応答を制御する新規複合型ユビキチン修飾機構の解明

研究組織
研究代表者：徳永文稔（大阪公立大学大学院医学研究科）
共同研究者：小迫英尊（徳島大学先端酵素学研究所）
研究分担者：及川大輔（大阪公立大学大学院医学研究科）：清水康平（大阪公立大学大学院医学研究科）【1】研究の概要[1-1]本研究の目的・概要
申請者は、ユビキチンの N 末端を介した直鎖状ユビキチン鎖(M1-Ub 鎖)を特異的に生成する複合体型 E3 酵素である LUBAC を世界に先駆けて発見し、LUBAC が NF-κB シグナルの活性化を介して炎症・免疫応答に極めて重要な役割を果たすことを明らかにしてきた。また近年、
LUBAC に結合する新規 E3 として LUBACassociated protein 1 (LAP1)を同定し、ネクロプトー シス制 御の新 たな機構 とし て LUBAC とLAP1 による RIPK1 の協調的な Ub 修飾を見出してきた。そこで本年度は、ネクロプトーシス過程における LUBAC・LAP1 による RIPK1 のUb 化の意義を精査するため、Lap1-KO 細胞由来サンプル及び LUBAC 阻害剤(HOIPIN-8)を用いて MS 解析を実施した。
[1-2]研究の方法・経過Lap1 野 生 型 MEF 及 び Lap1-KO MEF に
TNF/5z7（TAK1 阻害剤）/ZVAD（カスパーゼ阻害剤）±HOIPIN8 処理にてネクロプトーシスを誘導し、細胞抽出液を用いて変性条件下にてRIPK1 抗体による免疫沈降を行い、MS 解析を実施した。
【2】研究成果[2-1]本共同研究で明らかになった研究成果
PRM 法による精密定量の結果、野生型 MEFにおいてネクロプトーシス初期に刺激依存性の特に高い Ub 化部位を２箇所同定した。これ
らの Ub 化頻度は HOIPIN8 処理によって部分的に低下することが分かり、LUBAC によるプライミング Ub 化が RIPK1 の Ub 化過程に含まれることが示唆された。現在当該 Ub 化のネクロプトーシス制御における生理的意義について
RIPK1 点変異体を用いた解析を進めている。
[2-2]本共同研究による波及効果及び今後の発展性炎症誘導性細胞死であるネクロプトーシスは様々な炎症性疾患の発症や病態形成に関与することから、RIPK1 阻害剤をはじめ、臨床応用に向けた研究が世界中で精力的に進められている。
本成果により、LUBAC と LAP1 による複合型 Ub 修飾を介した新たなネクロプトーシス制御機構が明らかになりつつあり、炎症性腸疾患を含む複数の疾患との関連性を見出している。
本成果は、未だに制御が困難な炎症性疾患治療における重要な創薬標的の提示に繋がることが期待される。
【3】主な発表論文等[3-1]論文発表
1. Hoshino K, Nakazawa S, Yokobori T, Hagiwara K,Ishii N, Tsukagoshi M, Igarashi T, Araki K,Harimoto N, Tokunaga F, Shirabe K. RNF31
promotesproliferation
andinvasionof
hepatocellular carcinoma via nuclear factor kappaB
activation. Sci Rep. 14: 346, 2024.
2. Yanagawa H, Hara Y, Ando F, Suzuki S, Fujiki T,Oikawa D, Yui N, Mandai S, Mori Y, Susa K, MoriT, Sohara E, Tokunaga F, Uchida S. LRBA
signalosomes activate vasopressin-induced AQP2
trafficking at recycling endosomes. J Physiol.
601:5437-5451, 2023.
3. Fukushi M, Ohsawa R, Okinaka Y, Oikawa D,Kiyono T, Moriwaki M, Irie T, Oda K, Kamei Y,Tokunaga F, Sotomaru Y, Maruyama H, Kawakami
H, Sakaguchi T. PLoS One. 18:e0287545, 2023.
[3-2]学会発表
1. ○清水 康平、魏 民、及川 大輔、Tran Thi Thuy

Linh、小迫 英尊、高橋 宏隆、澤崎 達也、徳永文稔「新規 LUBAC 結合 E3 による TNF 誘導性細胞死の多面的制御」第 46 回日本分子生物学会年会 神戸ポートアイランド 2023/12/8
2. ○及川 大輔、翁 良徳、魏 民、塩田 正之、福士 雅也、入江 崇、堀居 拓郎、畑田 出穂、坂口 剛正、河田則文、徳永 文稔「BEACH ドメイ
ン含有タンパク質（BDCP）の新機能：RNA ウ
イルス誘導性細胞死の制御と非アルコール性脂肪性肝疾患への寄与」第 46 回日本分子生物学会年会 神戸ポートアイランド 2023/12/7
3. ○畑中 由香里、及川 大輔、翁 良徳、臼杵 克之助、徳永 文稔「直鎖状ユビキチン鎖生成酵素（LUBAC）阻害剤の ALS モデルマウスへの影響」第 17 回日本臨床ストレス応答学会大会 徳島大学 2023/11/17
4. ○及川 大輔、翁 良徳、魏 民、塩田 正之、福士 雅也、入江 崇、堀居 拓郎、畑田 出穂、坂口 剛正、河田 則文、徳永 文稔「LRBA によるRIG-I 様受容体シグナル制御と非アルコール性脂肪性肝疾患への寄与」第 17 回日本臨床ストレス応答学会大会 徳島大学 2023/11/17
5. ○Tran Thi Thuy Linh、Oikawa D, Shimizu K,
Okina Y, Tokunaga F「OTUD1 plays an importantrole in inflammatory response through regulation ofprogrammed cell death」第 17 回日本臨床ストレス応答学会大会 徳島大学 2023/11/17
6. ○徳永 文稔、及川 大輔、清水 康平、畑中 由
香里「LUBAC 阻害剤および LUBAC 協働性 E3による細胞機能制御」第 96 回日本生化学会大会 シンポジウム 福岡国際会議場 2023/11/1
7. ○坂口 詩穏、高橋 宏隆、及川 大輔、徳永 文稔、西野 耕平、小迫 英尊、澤崎 達也「ウイルス RNA 受容体 MDA5 を介した IFN 産生シグナ
ルを制御する脱ユビキチン化酵素の機能解析」
第 96 回日本生化学会大会 福岡国際会議場
2023/10/31
8. ○Shiota M, Min G, Oikawa D, Tokunaga F. “Heatshock protein 70-dependent regulation of celladhesion and migration” 第 82 回日本癌学会学術総会 パシフィコ横浜 2023/9/22
9. ○Kouhei Shimizu, Min Gi, Daisuke Oikawa, Tran
Thi Thuy Linh, Hidetaka Kosako, Hirotaka
Takahashi, Tatsuya Sawasaki, Fuminori Tokunaga.
LUBAC and its associated ubiquitin ligase generateheterotypic ubiquitin chains to inhibit necroptosis.
The 3rd Japan and Australia Meeting on Cell Death2023/8/17
10. ○清水 康平、魏 民、及川 大輔、Tran Thi Thuy
Linh、小迫 英尊、高橋 宏隆、澤崎 達也、徳永文稔「新規 LUBAC 結合 E3 による複合型ユビキチン鎖形成を介したネクロプトー シスの制御」 第 31 回日本 Cell Death 学会学術集会 順天堂大学 7 号館小川秀興講堂 2023/7/16
11. ○及川 大輔、魏 民、塩田 正之、福士 雅也、入江 崇、堀居 拓郎、畑田 出穂、坂口 剛正、
徳永 文稔「LRBA は RNA ウイルス誘導性細胞死（RIPA）を制御する」 第 31 回日本 Cell Death
学会学術集会 順天堂大学 7 号館小川秀興講堂
2023/7/15
12. ○柳川 英輝、安藤 史顕、及川 大輔、七松東、原 悠、鈴木 聡一郎、藤木 珠美、萬代 新太郎、森 雄太郎、森 崇寧、須佐 紘一郎、蘇原映誠、徳永 文稔、内田 信一「LRBA は尿細管における塩および水の再吸収を制御する」第 66回日本腎臓学会学術総会 パシフィコ横浜
2023/6/9
13. ○Saito R, Tada Y, Oikawa D, Sato Y, Iwanaga K,
Satoh A, Seto M, Kume K, Ueki N, Nakashima M,
Hayashi S, Toyoshima Y, Tokunaga F, Kawakami H,Kakita A. “Gordon Holmes syndrome and SCA17DI: pathologic features of 2 patients with
Huntington-like disorder” 第 64 回日本神経学会
学術大会 幕張メッセ 2023/6/1
14. ○清水康平、魏民、及川大輔、Tran Thi Thuy
Linh、小迫英尊、高橋宏隆、澤崎達也、徳永文
稔「新規 LUBAC 結合タンパク質によるネクロプトーシス制御機構」第 69 回生化学会近畿支部例会 京都大学百周年時計台記念館
2023/5/27[3-3]成果資料等【4】今後の課題等
これまでの本共同利用の支援をもとに、LAP1−LUBAC 依存的な RIPK1 の Ub 修飾がネクロプトーシスの進行を抑制していることを見出した。ネクロプトーシス過程に修飾される RIPK1の Ub 化部位は多数存在し、TMT 法により刺激依存的な修飾部位の全容は掴めた。そこで次に、ネクロプトーシスの抑制に特に寄与する RIPK1の主要な Ub 修飾部位を絶対定量によって明らかにし、当該部位の RIPK1 点変異体がネクロプトーシス制御に与える影響を評価する。さらに、修飾様式のバリエーションについても検討し、ネクロプトーシス抑制に寄与する新規ユビキチンコードを同定することで本制御系の詳細な動作原理を明らかにする。