20-06

THUNDERBIRD® Next
SYBR® qPCR Mix(Code No. QPX-201, QPX-201T)

使用说明书
科研用
TOYOBO CO., LTD. Biotech support Department
OSAKA JAPAN

A5940K- 目录 [1] 前言 ........................................................................................................................... - 1 [2] 产品组分.................................................................................................................... - 2 [3] 其他必需品 ................................................................................................................ - 2 [4] 使用方法.................................................................................................................... - 4 [5] 相关 Protocol: cDNA 合成 ......................................................................................... - 8 [6] 常见问题.................................................................................................................. - 10 [7] 相关产品.................................................................................................................. - 12 -- 注意事项 –本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全操作。

※ LightCycler®是 Idaho Technology Inc.及 Roche Diagnostic Systems 公司的商标。
※ SYBR®是 Thermo Fisher Scientific 公司的注册商标。

东洋纺（上海）生物科技有限公司[1] 前言THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix 是为使用 SYBR® Green I 检测体系的 Realtime PCR
而开发的 2×浓度的预混液。本试剂除引物以外的组分都已预先混合，包括通用规格的 passivereference dye，可将样品间荧光强度的误差控制在最小范围，提高了实验结果的重复性。此外，还含有蓝色视觉辅助染料，方便操作。
本产品通过改良原产品「THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code No. QPS-201)」的组分，
提高了反应特异性和检测灵敏度。通过提高 PCR 效率、抑制非特异性反应(引物二聚体等的产生)，可得到更广范围的可定量区域(动态范围)。另外，还可进行高速 PCR 循环。

◆本产品的特征◆1. 高特异性 通过优化组分以降低非特异性反应，从而提高了低拷贝样本检测时的准确度。
2. 可均一地检测各种目的片段 使用了新的反应增强剂。将因目的片段不同而导致的 PCR 效率的误差抑制到了最低、可定量长至 500bp 的片段。
3. 更广的可定量扩增区域

通过高效且特异的扩增，可在较广的测定范围进行分析。

4. 适用于各种仪器 除了一般的模块型仪器外，还可用于玻璃毛细管型高速循环仪。另外，本产品的组分中含有 passive reference dye，所以需要 passive reference 的仪器 (如：Applied Biosystems 公
司的仪器、Agilent Technologies 公司的仪器等) 无需再添加 ROX。
5. 可进行高速 PCR 循环

由于扩增效率高、快速循环条件下也可高效扩增。

6. 高速热启动 采用抗体法热启动的方式，通过加热使抗体迅速失活并释放 DNA 聚合酶活性，所以可设置较短的预变性时间。
7. 可使用 UNG 本产品组分中含有 dUTP。
通过添加 Uracil-N-Glycosylase(UNG)*，可防止 carryover污染导致的假阳性。
* 本产品中不含有 UNG。请使用另外销售的 Uracil-DNA Glycosylase(UNG), Heat-labile(Code No.
UNG-101)。
8. 含有蓝色染料 本产品组分中含有蓝色染料。分装之后的孔呈蓝色，可以减少分装差错。
* 蓝色染料对 qPCR 反应及荧光信号无影响。

＜SYBR® Green I 检测体系＞
SYBR®GreenⅠ检测体系通过SYBR®GreenⅠ染料与DNA的扩增产物结合，并以结合后染料的荧光强度的增强作为指标，进行检测。
虽然该方法和普通的 PCR 反应一样简便，但由于会出现引物二聚体、目的条带以外的扩增产物等，
因此有必要在扩增后对融解曲线进行分析确认。

-1-

[2] 产品组分
本产品包括以下试剂。
组成

保存

QPX-201(500 次份/20μL 反应)

QPX-201T(100 次份/20μL 反应)

THUNDERBIRD®
Next SYBR® qPCR Mix-20°C(或 2～8°C 下保存
3 个月以内)避光保存

5mL(1.67mL×3 支)

1mL(1mL×1 支)

THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix
是含有反应buffer、SYBR® Green I、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Mg2+、passive referencedye、DNA聚合酶及DNA聚合酶抗体等的2×预混溶液。 请添加模板DNA（cDNA、genomic DNA、
plasmid DNA等）及引物溶液，用灭菌水配制成1×浓度进行使用。
※ 产品到货后，请放于-20°C 冷冻保存。使用时，请融解后用 Vortex Mixer 充分混合，溶液完全均一后再使用。融解后，3 个月以内使用完时，可在 2～8°C 冷藏保存。长期不使用时，请放于-20°C
重新冷冻保存。已确认可反复冻融 10 次不影响品质。另外，为防止 SYBR® Green I 的荧光衰减，
使用及保存过程请尽量保持避光。

[3] 其他必需品
除本产品外，请准备以下试剂和仪器。

(1) Realtime PCR 仪
本产品适用于普通及高速的模块型（Block Type）、玻璃毛细管型（Glass Capillary Type）等各种
Realtime PCR 仪。请使用者根据各仪器说明书，结合实际情况进行适当调整。

(2) 引物
请根据目的基因的序列设计引物。为得到高灵敏度定量性的数据，引物的设计非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。
引物长度请设定为20～30mer、GC含量为40～60%。
扩增片段应小于500bp，如可能请尽量设定在80～200bp。过长的片段容易导致扩增效率低下。
检测cDNA时, 引物设计应尽量横跨内含子。这样可以防止基因组DNA扩增而引起假阳性。
请尽量选择融解温度（melting temperature: Tm）为60～65℃范围内的引物。融解温度值根据计算方法不同而有所差异，但请以60～65℃为基准进行考虑。
此外，引物的纯化纯度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物品质差别较大，
容易产生非特异性反应。请尽可能使用HPLC级别纯化，至少要用经Cartridge(OPC)级别以上纯化
的引物。

-2-

东洋纺（上海）生物科技有限公司(3) 模板 DNA
本产品可使用 cDNA、genomic DNA、plasmid DNA、virus DNA 等各种类型的模板。
a)cDNA
将普通逆转录反应试剂合成的cDNA，无需纯化，用灭菌水等稀释后可直接添加到Realtime
PCR反应液中。
添加量不应超过总反应体系的 10%。过量的添加会大大改变 PCR 反应缓冲液的组成，导致定量性低下。另外,如果使用的不是专门针对荧光定量 PCR 的逆转录试剂，那么添加的 cDNA 体积应小于总反应体系的 10%。

※ 本公司的Realtime PCR用cDNA试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit（Code No.FSQ-101）、
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No.FSQ-201）、ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA Remover（去基因组DNA）（Code No.FSQ-301），通过改良组分，使对
Realtime PCR反应的抑制降低了，可在PCR反应体系中添加最多至20%的液量。
b)

genomic DNA、virus DNA
genomic DNA、virus DNA 也可作为模板使用。由于 SYBR® Green I 拥有和双链 DNA 分子结合发光的特性，在以大量的双链 DNA 为模板的情况下，SYBR® Green I 与模板 DNA 自身相结合，
会造成基线上飘。因此，在以 genomic DNA 为模板时，为避免在高浓度区域出现线性差的情况，请注意添加量（每 50μl 反应体系以 200ng 为上限）。

c)plasmid DNA
plasmid DNA 也可作为模板使用。但如果直接使用环状 Plasmid DNA，容易导致扩增效率低下，
从而不能真实地反应拷贝数。因此请用限制性内切酶切为线性化后再使用。
此外，当用纯化过的plasmid DNA溶液作为模板使用时，相对全基因组DNA而言，目的片段的拷贝数会变得极高，因此添加到反应液中的量要适当减少。此时，溶液中的DNA浓度会变得很低，DNA容易被容器吸附，进行Realtime PCR时，会造成低浓度区域的线性和重现性低下。如果在稀释时，将与反应无关的核酸（yeast RNA等）作为掺入物与稀释液混合，可改善低浓度
区域的线性。
plasmid DNA 的拷贝数，可用以下简易的公式计算。
每 1μg plasmid DNA 的拷贝数 = 9.1×1011/ plasmid DNA 的大小（kb）(4) Uracil-N-Glycosylase (UNG)[可选]可使用另外销售的 Uracil-DNA Glycosylase(UNG),Heat-labile(Code No.UNG-101)。

-3-

[4] 使用方法(1) 反应液的配制
以下为 50μl 及 20μl 反应体系时的配制例。请根据实际使用的 PCR 仪的特征适当增减反应液量。
试剂50μL 反应体系

20μL 反应体系

灭菌水

X μL

X μL

THUNDERBIRD® Next
SYBR® qPCR Mix

25 μL

10 μL

Forward Primer
Reverse Primer

15 pmol
15 pmol

6 pmol6 pmol终浓度

0.3 μM*1
0.3 μM*1

DNA 溶液
Y μL
Y μL
总体积
50 μL
20 μL
*1. 扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度。由此可改善
反应结果。引物的浓度，请以终浓度 0.2～0.6μM 作为设定范围的参考。

(2) PCR 循环条件的设定以下为使用根据推荐条件(参考p.2 (2))设计的引物时的标准PCR循环条件（①高速循环、②普通循环）。该2步法PCR条件适用于绝大多数目的片段。
此外，本试剂在大多数情况下可直接使用其他公司试剂的反应条件。
在无法得到充分反应效率的情况下，或使用 Tm 值低于一般值（60℃以下）的引物时，用 3 步法可
得到更好的结果。详见 d)想改善反应效率时的 3 步法 PCR（第 7 页）。

① 快速循环
步骤
(UNG 反应)预变性
PCR变性
(40 cycles) 延伸

温度(20～25℃*1)
95°C
95°C
60°C*4② 普通条件步骤(UNG 反应)预变性
PCR变性
(40 cycles) 延伸

温度(20～25℃*1)
95°C
95°C
60°C*4时间升降速度
1(10 分* )
(最大)
2
30 秒*
最大
3
5 秒*
最大
10 秒*5最大(Data Collection 请设定在延伸步骤)
融解曲线分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)*6

时间
升降速度
1
(10 分* )
(最大)
2
30 秒*
最大
3
5 秒*
最大
5
30 秒*
最大
(Data Collection 请设定在延伸步骤)
融解曲线分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)*6-4-

东洋纺（上海）生物科技有限公司*1: 进行 UNG 处理时(可选；本产品中不含有 UNG，可使用另外销售的 Uracil-DNA Glycosylase(UNG),
Heat-labile(Code No. UNG-101))，请将 UNG 反应步骤设定在预变性之前。上表列出了一般的温度条
件及反应时间，请根据各公司的推荐条件进行调整。
*2: 本产品由于采用了高速热启动系统，可在极短的预变性时间内（20～60 秒）实现酶的再活化。但为了使模板 DNA 完全变性，须根据各仪器的特性设定足够的预变性时间。不知道最适时间时，请设定为
30 秒（预变性时间的延长对反应效率几乎没有任何影响）。
*3: PCR 循环中的变性时间根据各仪器的特性设定为 1~5 秒。请注意，变性时间不充分时可能导致 PCR效率下降。初次实验请设定为 5 秒（变性时间的延长对反应效率几乎没有任何影响）。
*4: 扩增效率较低时，可适当降低退火温度；发生非特异性反应时，可适当提高退火温度。可能会对反应结果有改善。请以 56℃～64℃的范围作为设定参考。
*5: 一般情况下，目的片段在 300bp 以下时，延伸时间 10 秒即可进行充分的反应。但一部分仪器为测定稳定的荧光，延伸时间需大于 10 秒。扩增曲线散乱，或各孔间的差异较大时，请设定较长的延伸时间
（30-60 秒）。另外，部分仪器由于硬件或配套软件的限制，无法设定为 25 秒以上，此时请根据仪器的使用说明书，设定最适的可设定时间（如 QuantStudio 5 的 96 孔板为 25 秒以下、Applied Biosystems
7000/7300 为 31 秒以上，7500 为 35 秒以上）。
*6: 融解曲线分析请根据各仪器的标准设定。详细请见各仪器的使用说明书。

a) Applied Biosystems StepOnePlusTM 的循环条件设定例
下例为本试剂在 Applied Biosystems（Applied Biosystems StepOnePlusTM 等）上使用时的循环条件。详细请见各仪器的使用说明书。(普通 Block Type、软件版本 2.3)
另外，Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System、QuantStudio™ Real-Time PCR
System 等也是类似的设定方法。
1.

启动软件，选择 Design Wizard、Advanced Setup、QuickStart 中的其中一个进行设定。

2.

选择下表中的标签键，reagents 选择 SYBR® Green Reagents。
Design Wizard 时
Advance Setup 时
QuickStart 时

3.

Methods＆Materials
Setup → Experiment Properties
Experiment Properties选择 Run Methods，按以下进行温度条件设定。

*1
*3

*2

-5-

*1. Sample Volume (μL)一栏中，请务必输入正确的反应液体积。
*2. 请将数据收集设置在延伸反应这一步。仪器或控制软件的规格上，有些不能设定为 25 秒以下，请先确认操作说明书，再设定适当的时间(例如: QuantStudio 5 的 96 孔板可设定为 25 秒以上，
Applied Biosystems 7000/7300 为 31 秒以上、7500 为 35 秒以上)。
*3. 请再加上融解曲线分析用循环。

4.

将反应板或管放入仪器，启动反应程序。

b) LightCycler®96 的循环条件设定例
下例为 Roche 公司的 LightCycler®96 的循环条件设定例。详细信息请参考操作说明书。(软件版本
1.1)
1. 启动软件，选择 Create New Experiment。
2. 在 Reaction Volume 内输入反应液体积。
3. 打开 Run Editor 键，在 Predefined Programs 中按依次选择 Preincubation、2 Step Amplification、Melting。
4. 选择 Preincubation，将 Target 更改为 95℃、Duration 30 秒。
5. 选择 2 Step Amplification，将 Target 更改为 95℃、Duration 5 秒、Target 60℃、Duration 10
秒。

*1

*2

*1. Reaction Volume(μl) 一栏中，请务必输入正确的反应液体积。
*2. 请将数据收集点设置在延伸反应这一步。

6. 将反应板或管放入仪器，启动反应程序。

c) CFX96 TouchTM Deep Well 的循环条件设定例
下面为使用 Bio-Rad 公司的 CFX96 TouchTM Deep Well 时的循环条件设定例。详细信息请参考操
作说明书。(软件版本 3.1)
1. 启动软件，选择 User-defined。
2. 选择 Create New，在 Sample Volume 内输入反应液体积。
3. 将各步骤分别更改为 95℃ 30 秒、95℃ 5 秒、60℃ 10 秒，共 40 个循环。

-6-东洋纺（上海）生物科技有限公司

*1

*2
*3
*1. Sample Volume (μL) 一栏中，请务必输入正确的反应液体积。
*2. 选择 Insert Melt Curve，请再加上融解曲线分析用循环。
*3. 在延伸反应循环中选择 Add Plate Read to Step，请设定数据收集点。

4. 将反应板或管放入仪器，启动反应程序。

d) 想提高反应效率时的 3 步法 PCR
用第 7 页中所述的 2 步法无法得到期望的结果时，用下述的 3 步法可得到改善。特别是想改善以下几种情况的结果时。

- 引物的Tm值低于一般值（60℃以下）时。
- 目的片段较长（500bp以上）时。
- 其他 PCR 效率低下的情况。
步骤
预变性
PCR
变性
(40 cycles) 退火
延伸

温度
95°C
95°C
55～65°C*2
72°C*4时间升降速度
120～60 秒*
最大1
1～5 秒*
最大
5～30 秒*3
最大4
10～60 秒*(Data Collection 请设定在延伸步骤)
融解曲线分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)*5*1: 预变性及 PCR 循环中的变性条件说明请参照第 7 页指导。
*2: 退火温度请设定在「引物 Tm～引物 Tm-5℃」的范围内。非特异性反应较多的情况下，稍微提高反应
温度可改善结果。
*3: 退火时间请按高速 PCR 仪 5 秒，普通 PCR 仪 15 秒的标准设定。非特异性反应较多，或反应效率较
差的情况，请以 30 秒为上限适当延长。
*4: 一般情况下，目的片段在 300bp 以下时，延伸时间 30 秒即可进行充分的反应。但一部分仪器为测定稳定的荧光，延伸时间需大于 30 秒。扩增曲线散乱，或各孔间的差异较大时，请设定较长的延伸时间
（30-60 秒）。另外，部分仪器由于硬件或控制用的软件的原因，无法设定为 25 秒以下，此时请根据仪器的使用说明书，设定最适的可设定时间（例如：QuantStudio 5 的 96 孔板可设定为 25 秒以上，
Applied Biosystems 7000/7300 为 31 秒以上，7500 为 35 秒以上）。
*5: 融解曲线分析请根据各仪器的标准设定。详细请见各仪器的使用说明书。

-7-

[5] 相关 Protocol: cDNA 合成
本试剂可以用各种逆转录反应合成的 cDNA 为模板，但如果用 Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂盒，则可进行更高灵敏度的反应。
本公司的 ReverTra Ace® qPCR RT Kit(Code No.FSQ-101)、ReverTra Ace® qPCR RT Master
Mix(Code No.FSQ-201)、ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ301)是专为 Realtime PCR 设计开发的高效率 cDNA 合成试剂盒。与本产品组合使用，可以得到可靠
性更高的结果。
这是使用 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix 或 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA
Remover 合成 Realtime PCR 用 cDNA 的方法。(详细请参照该试剂盒所附的说明书)。

● ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix (Code No. FSQ-201)(1) RNA 的变性（可选）取作为模板使用的 RNA（按使用量），65℃、5 分钟温育后在冰上急速冷却。
・ 如果进行了该步骤，则可提高容易形成高级结构的 RNA 的逆转录效率，所以在初次实验时建议
进行条件讨论。进行该步骤时，注意不要添加 5x RT Buffer。
(2) 反应液的配制
在冰上配制以下反应液。
Nuclease-free Water
5×RT Master Mix
RNA

X μL
2 μL
1 pg～1μg

Total volume

10 μL(3) 逆转录反应轻轻搅拌反应液，混合均匀后，进行以下温度的温育反应。
37°C,
15 分
（逆转录反应）50°C,
5 分 （可选）**98°C,
5分（酶失活反应）4°C,
hold** ReverTra Ace®经过改良，提高了耐高温反应性。通过本步骤，可能会提高逆转录效率。
反应结束后，4℃或-20℃保存。进行 Realtime PCR 反应时，作为模板直接或稀释后添加到反应液中。

-8-东洋纺（上海）生物科技有限公司● ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Code No. FSQ-301)(1) 4x DN Master Mix 与 gDNA Remover 的混合（初次使用时）
可在整管 4x DN Master Mix（440μl）中添加 8.8μl（1/50 量）的 gDNA Remover，颠倒混匀后再使用。添加 gDNA Remover 的 4x DN Master Mix 在-20°C 条件下可至少保持 3 个月的稳定。
・ 短时间内无法使用完毕时，请少量混合后使用（如：4x DN Master Mix 220μl + gDNA Remover
4.4μl)。
(2) RNA 的变性（可选）取作为模板使用的 RNA（按使用量），65℃、5 分钟温育后在冰上急速冷却。
・ 如果进行了该步骤，则可提高容易形成高级结构的 RNA 的逆转录效率，所以在初次实验时建议
进行条件讨论。
（进行该步骤时，请务必在添加 4x DN Master Mix 之前进行）。
(3) 基因组 DNA 去除反应（DNase 反应）
在冰上配制以下反应液。
4×DN Master Mix (已添加 gDNA Remover)
RNA template
Nuclease-free Water

2 μL
0.5pg～0.5μg
X μL

Total volume

8 μL轻轻搅拌反应液，混合均匀后，37°C 温育 5 分钟。
・ 必要时，可适当扩大反应体系。
(4) 逆转录反应继续在冰上进行以下反应液的配制。
(3)的反应液
5×RT Master Mix II

8 μL
2 μL

Total volume

10 μL轻轻搅拌反应液，混合均匀后，按以下温度进行温育。
37°C,

15 分

50°C,

5 分 （可选）**

98°C,
4°C,

5分
hold

（逆转录反应）（酶失活反应）** ReverTra Ace®经过改良，提高了耐高温反应性。通过本步骤，可能会提高逆转录效率。

反应结束后 4℃或-20℃保存。进行 Realtime PCR 反应时，作为模板稀释或直接添加到反应液中。

-9-[6] 常见问题问题用高浓度样品进行反应时线性混
乱

原因

对策
®

由于 SYBR Green I SYBR® Green I 与全部双链 DNA 相结合，由于具有发荧
与样品 DNA 的结合 光的特性，当样品中含高浓度的双链 DNA 时，会造成基
造成基线上飘
线上飘，从而无法计算出正确的 Ct 值。请适当降低样品浓度再进行反应。
样品溶液中的杂质抑 当样品纯度较低时，其所含的杂质会抑制 PCR 反应。此制了反应外，使用非 Realtime PCR 专用逆转录试剂盒合成的
cDNA 时，逆转录反应液中所含的物质也会抑制 PCR 反应。请降低样品浓度，或将样品纯化后再进行反应。建议
使用 Realtime PCR 用 cDNA 合成逆转录试剂盒。

用低浓度样品进行反应时线性混
乱

目的 DNA 的拷贝数过少反应液中的目的 DNA 只有几个到几十个拷贝时，拷贝数
散乱的概率变大，容易形成线性混乱。此时请适当提高样品浓度再进行反应。

DNA 被反应离心管所吸附使用样品的 DNA 量较少或样品稀释后被长时间存放的情况下，会使得 DNA 被反应离心管吸附，从而造成实际参
与反应的模板量减少。请提高样品浓度再进行反应。另
外，如果要对样品进行稀释，请稀释后立即进行反应。

同时产生引物二聚体 对目的 DNA 进行扩增时，同时发生引物二聚体的扩增，从而无法检测出目的片段的扩增曲线。进行融解曲线分析，出现几个峰顶时，请再次优化反应条件，防止引物二聚体的再次发生。
稀释系列样品的扩增曲线的间隔
不均一

与非特异性反应的竞 引物特异性不好时，会产生目的片段以外的扩增，从而无争法检测出目的片段的扩增曲线。进行融解曲线分析，出现几个峰顶时，请再次优化反应条件，防止引物二聚体的再次发生。仍无法得到改善时，请尝试重新设计引物。

PCR 效率低于
80%(slope < -3.95)

反应条件不合适根据目的片段的不同，有可能出现在标准的反应条件下PCR 效率不高的情况。 请根据[4]使用方法·(2) PCR 循环条件的设定，重新探讨 PCR 反应条件。

引物的 Tm 值低于一 使用 Tm 值较低的引物时，会出现在标准的循环条件下无般情况(60℃以下)
法充分退火的情况。此时可适当降低延伸温度 (参考p.5、*4)、或尝试使用三步法 PCR(参考 p.7)。
引物质量不好当引物质量不好时，会导致 PCR 效率大幅下降。可从引物原液重新稀释，或重新合成引物。

计算 PCR 效率时，包含了偏离直线的Ct 值如果计算 PCR 效率时，包含了偏离线性的 Ct 值，会增大计算值的误差。应将偏离直线的 Ct 值排除后再计算。

- 10 -

东洋纺（上海）生物科技有限公司

问题

原因

对策

PCR 效率高于
110% (slope >-3.1)

计算 PCR 效率时，包含了偏离线性的
Ct 值

如果计算 PCR 效率时，包含了偏离线性的 Ct 值，会增大计算值的误差。应将偏离直线的 Ct 值排除后再计算。

重现性差

样品纯度不好不纯的样品会抑制 PCR 反应，从而导致实验的重现性差。可降低样品的浓度或对样品进行纯化后再反应。

使用了稀释后长时间 浓度较低的 DNA 溶液长时间存放时，由于被反应容器吸放置的样品附，实际浓度会更低。请从原液重新稀释后再进行反应。
另外，通过梯度稀释的标准样品应避免稀释后再保存，最好每次使用时直接从原液稀释。

no-templatecontrol (NTC)可见扩增扩增曲线的荧光
信号很弱，或扩增曲线呈锯齿状

融解曲线分析时
可看到几个峰顶

使用了质粒 DNA 或
PCR 扩增产物作为
模板

使用质粒 DNA 或 PCR 扩增产物作为模板时，由于目的
片段相对全部 DNA 量的拷贝数非常高，应减少添加到反应液的液量。此时，溶液中 DNA 浓度非常低，DNA 很容
易被容器吸附而减少。这会造成低浓度区域的线性及重现性变差。在稀释时，可以在稀释液中混合一些与反应无关的核酸(Yeast RNA 等)，可改善低浓度区域的线性。

引物质量不好即便是同一序列的引物，在合成时也会发生质量上的差异。可在新合成时，与原来使用的引物做一下比较实验，以确认质量差异。

发生了引物二聚体融解曲线分析时，NTC 在目的片段的低温侧出现峰值，
疑似有引物二聚体产生。引物二聚体根据引物序列或引物
质量的不同发生的程度也有所差异。首先根据[4] 使用方
法·(2) PCR 循环条件的设定再次探讨 PCR 的反应条件，如果仍无法改善，则可进行引物的再设计或再合成。
合成时，纯化级别请选择 HPLC 以上。

发生交叉污染进行融解曲线分析时，NTC 的峰顶和目的片段大致在同
一位置时，可能是反应体系交叉污染所引起的。如果再次
尝试仍然如此，则可能是由试剂或灭菌水的交叉污染所引起的，此时请换新的试剂。

荧光测定时间太短

一部分仪器，PCR 的延伸时间过短时，荧光测定不能充
分完成。扩增曲线的锯齿状较明显时，将延伸时间设定得
稍长些(30～60 秒)可得到改善。

反应液量太少以少于仪器的标准条件的液量进行反应时，荧光测定值的误差会增大，此时应增加液量。

发生了非特异性反应 引物的特异性不好的情况下，会同时发生非特异性扩增，无法只检测出纯粹的目的片段的扩增曲线。此时应重新探讨反应条件，以避免非特异性反应的产生。仍无法得到改善时，请重新设计引物。
发生了引物二聚体

目的 DNA 的扩增与引物二聚体的扩增同时发生时。此时
应重新探讨反应条件以避免引物二聚体的发生。仍无法得到改善时，可重新设计引物或提高合成引物的纯度级别。

- 11 -

[7] 相关产品
Probe 检测体系用 Realtime PCR 试剂产品名称

容量1mL×1 支(100 次份/20 μL 反应)

Probe 检测体系用 Realtime PCR 试剂
THUNDERBIRD® Next Probe qPCR Mix

Code No.
QPX-101T

1.67mL x 3 支(500 次份/20 μL 反应)

QPX-101

cDNA 合成试剂盒产品名称Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂盒
ReverTra Ace® qPCR RT Kit
Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂 预混型
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix

容量Code No.

200 次份

FSQ-101

200 次份

FSQ-201

Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂 预混型（带基因组 DNA 去除试剂）ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover

200 次份

FSQ-301

容量0.5mL×5 支(250 次份/20 μL 反应)
0.5mL×5 支(250 次份/20 μL 反应)

Code No.

1-step Realtime PCR 相关试剂产品名称Probe 检测体系用 1-step Realtime PCR 试剂
RNA-directTM Realtime PCR Master Mix
SYBR® Green I 检测体系用 1-step Realtime PCR 试剂
RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
高效率 1-step qRT-PCR Kit
THUNDERBIRD® Probe One-step qRT-PCR Kit

QRT-101

QRT-201

250 次份
/20 μL 反应

QRZ-101

内容

Code No.

200 U

UNG-101

carryover 污染应对・防止假阳性试剂
产品名称
热敏性(Heat-labile) UNG
Uracil-DNA Glycosylase (UNG), Heat-labile- 12 -

<销售商>
东洋纺（上海）生物科技有限公司
邮编：200122
邮箱：tech@bio-toyobo.cn
网址：http://www.bio-toyobo.cn
联系电话：021-58794900
公司地址： 上海市浦东新区张杨路 500 号华润时代广场 28 楼 AL 单元<生产商>东洋纺株式会社敦贺生物工厂地址：日本国福井县敦贺市东洋町 10 番 24 号