企画特集

ナノテクノロジー Pick Up～新展開をもたらすナノテクノロジープラットフォーム～＜第 1 回 ＞

FIB-SEM 法を活用した腎糸球体足細胞の発生過程の解明
順天堂大学 市村 浩一郎，角田 宗一郎，川崎 優人，宮木 貴之，野波 隆寛，小池 正人，坂井 建雄，
生理学研究所 宮崎 直幸，村田 和義
名古屋大学 中尾 知代，榎本 早希子，荒井 重勇（左から） 順天堂大学

市村 浩一郎，名古屋大学

荒井 重勇，榎本 早希子，中尾 知代

SBF-SEM である［6][7］．これらの電顕法は樹脂包埋した

１．はじめにサンプルを SEM の鏡体内で切削し，切削面から断面像を得る手法であり，切削と撮影は全自動で繰り返し行うこ足細胞（podocytes）は糸球体の表面をなす上皮細胞でとができる．さらに，得られた連続像から任意の構造をあり（図 1），独特な突起構築を持つ［1][2］．糸球体と抽出・再構築し，立体構造を解析することが可能である．

は腎臓において血液を濾過し，尿を生成する組織であり，著者らは足細胞の立体構造解析における FIB-SEM や足細胞は血漿タンパク質が尿中へ漏れ出るのを防ぐ重要

SBF-SEM の有用性に早くから着目し，これらを活用してな役割を持つ．糸球体疾患患者では足細胞の突起構築に足細胞の正確な構造階層性［8］や発生期における突起構特異な形態変化を生じるため，病態の評価には足細胞の造の形成過程［9］，病態時における突起消失・再生過程電顕観察が重視されている．

（投稿中）を世界に先駆けて明らかにしてきた．これら一足細胞はボウマン腔（図 1，アスタリスク）と呼ばれる連の研究は，文部科学省ナノテクノロジープラットフォー

尿で満たされた空間に面しているため，走査電顕（SEM）

ム事業・微細構造解析プラットフォーム（名古屋大学），による形態観察に適し，現在に至るまで足細胞の形態解

生理学研究所，日本 FEI の支援を得て実施されたものであ析には SEM 観察が大きな役割を果たしてきた（図 1A，C）．

り，本稿では特にナノテクノロジープラットフォーム事

しかし，従来の SEM 観察だけでは足細胞の立体構造を詳業の支援が大きく関与している成果である「足細胞の突細に解析することは困難であった．その主な理由は二つ起形成過程の完全解明」について紹介したい．なお，こあり，一つは足細胞が糸球体基底膜という基質に張り付の研究成果は，英国科学雑誌 Journal of Cell Science のオいているために，裏面（接着面）の観察が困難であること，ンライン版に原著論文として公開されており（日本時間：

もう一つは糸球体の表面が起伏に富み，足細胞の一部が2016 年 7 月 12 日），同誌の特集号 ''Special Issue for 3D
Cell Biology'' （2017 年 1 月号）に掲載予定である．

深い谷間に入り込んでいるためである．
こうした問題を乗り越え，足細胞の全体像を詳細に把握するには，連続超薄切片の透過電顕（TEM）観察が有用であるが［3][4][5］，この手法は高度なグリット操作と多大な労力を要することから，一般の研究者がこれを活２．足細胞の立体構造～従来の認識～用することは現実的には難しい．そこで，第 3 の手法と正常な成熟足細胞は 3 つのコンパートメント（細胞体，して挙げられるのが，近年活用が進んでいる FIB-SEM や一次突起，足突起）からなり（図 1），これらが順に連な

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り構造階層をなすとこれまでは考えられてきた（図 2a）．

漿タンパク質の尿への漏出を防いでいる．

一次突起とは細胞体から直接伸びる太い突起で，一次突

先述のように，従来の SEM 観察では足細胞を腔側面か起から出る細い突起が足突起である．隣接する足細胞どらしか見ることができず，その立体構造は完全に把握されうしは足突起によって噛み合っており，足突起間の隙間ていなかった．特に，一次突起や細胞体と基底膜の関係に（スリット間隙）を通じて濾過が行われる．スリット間隙

ついては断片的にしか分かっておらず，また足細胞の高度には特殊化したタイト結合であるスリット膜が張られてな突起構造が発生期にどのように形成され，傷害時にどのいる．スリット膜は「バリア」としての機能を持ち，血ように消失・回復するかはほぼ分かっていなかった．

図 1 従来の電顕法で見た糸球体と足細胞（ラット）（A，B）糸球体の SEM 像（A）と TEM 像（B）．糸球体の最表面に見えている突起を無数に伸ばしている細胞が足細胞である．（C）
足細胞の SEM 像．隣接する 3 つの細胞を異なる色で示してある．細胞体（CB）から太い一次突起（P）が伸び出し，さらに一次突起から細かな足突起が無数に伸び出している．（D）足細胞の TEM 像．定圧灌流固定を施しているため，糸球体毛細血管（Cap）の壁がピンと張り詰めている．アスタリスクはボウマン腔（尿腔）を示す．

図 2 足細胞の新・旧構造階層性（a）従来の単純な構造階層．（b）FIB-SEM 法を活用した立体構造解析により，足突起は細胞体・一次突起の裏面にできる畝状隆起から伸び出ることが新たに判明した．

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３．FIB-SEM 法による足細胞の立体構造解析

３．１

正常な足細胞の立体構造

立体再構築像を表面（腔側面）から見ると，従来のSEM 像をよく再現していることが分かる（図 3A）．足細実験動物において足細胞の FIB-SEM 解析を行う場合に胞は糸球体基底膜に接着しているため，従来の SEM ではは，腎臓を定圧灌流固定することが望ましい．定圧灌流

足細胞を裏面（接着面）から観察することは困難であるが，固定とは，固定液を血圧と同等（もしくはそれ以上）の立体再構築像ならば裏面の観察も容易に行える（図 3B，F）．

静水圧で動脈内に注入し，目的の臓器を効率よく固定す

意外なことに，裏面は足突起によって占められているようる方法である．この方法は超微形態の死後変化を最小限に見え，一次突起や細胞体の位置が一見分からない．に抑えるだけでなく，糸球体の毛細血管壁をピンと張り単一の足細胞の再構築像を観察すると，足突起が一次詰めたまま固定し，毛細血管表面を覆う足細胞を生時と突起から伸び出る様式を明瞭にすることができる．表面同じ状態に引き伸ばしておく利点があり，再構築像も美から見ると，一次突起と足突起の関係は葉脈のように見しいものとなる．

えるが，裏面から見るとその関係はそう単純ではない（図サンプルは細胞膜のコントラスト増強のために多重ブ3）．一次突起の下面には畝状に隆起した部分（畝状隆起

ロック染色を施したのち，アルコール脱水したサンプル

ridge-like prominence）が形成され，足突起はこの畝からをエポキシ樹脂に包埋している．硬化した樹脂包埋サン左右に向って伸びている（図 3D）．つまり，畝状の隆起プルの表面をダイヤモンドナイフで露出し，糸球体の領は一次突起の接着装置であるとともに，足突起と一次突域から FIB-SEM により通常は 400 ～ 700 枚の連続断面像起の連結装置であるともいえる．細胞体の下面においてを撮影する．連続断面像からの足細胞の抽出（セグメンも同様な様式で足突起が伸び出しており（図 3E），足細テーション）と再構築には立体構築解析システム Amira胞の正確な構造階層は（図 2b）のようになっていると言6.0（FEI）を用いている．

える．また，先述したように，複数の足細胞が連結した

図 3 成熟足細胞の立体構造（ラット）（A，B）隣接する 3 つの成熟足細胞の再構築像．腔側面から見ると足細胞の 3 つのコンパートメント（細胞体，一次突起，足突起）のすべてが確認できるが（A），裏面は足突起に占められている（B）．（C，D）一次突起とそこか伸びる足突起の再構築像．腔側面からみると葉脈のように単純な形態に思えるが（C），裏面から見ると足突起は一次突起の裏面に形成された畝状の隆起を介してお互いにつながっている（D）．
（E）細胞体の裏面．細胞体でも一次突起と同様に畝状隆起が見られ，そこから足突起が伸び出ている．
（F，G）足細胞の 3 細胞間結合部（矢印）．スリット膜は形成されず，タイト結合に連結している．（H，I）3D プリンタで出力した成熟足細胞の一部分．硬質の半透明樹脂に出力したのち，腔側面を緑色，基底面（接着面）を黄色に着色した．

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状態だと裏面が足突起に占領されているように見えるが，のうち足細胞の突起形成が見られるのは S-shaped body

これは畝状隆起の幅が足突起とほぼ同じであるため，細stage，Capillary loop stage，Maturing glomerulus stage

胞体や一次突起から出る畝状隆起を足突起と区別し難いである（図 4）．好都合なことに，これらのステージは発ことによる．

生期のひとつの腎臓内で全て観察することができる．

隣接する二つの足細胞間にはスリット膜が形成される

S-shaped body stage では，足細胞は円柱状であり，タが，3 細胞間結合部の構造はこれまで分かっていなかっイト結合やアドヘレンス結合からなる結合装置複合体でた．FIB-SEM 解析では，しばしば足細胞の 3 細胞間結合連結され，円柱上皮を成している（図 4A1-A2，5C）．腔部を見付けることができ，この部位ではスリット膜が形

側面から見ると足細胞は敷石状に見えるが，反対に基底成されず形態的にはタイト結合をなすことが分かった（図側から見ると隣接する細胞間で不規則に入り組んで見え

3F，G）．3 細胞間結合部の同定は通常の TEM では不可能る（図 5A-D）．

であり，これも FIB-SEM 解析により初めて判明したことの一つである．

次いで，Capillary loop stage の初期には，足細胞は互いに細い突起（原始足突起 primitive foot processes）に

なお，再構築像は 3D プリンタで出力し，手に取り観察より噛み合うようになる（図 6A）．結合装置複合体（図することも可能であり（図 3H，I），教材としても活用できる．

6A，黄色）は原始足突起の直上まで下行しているが，原始足突起どうしの間にはスリット膜を含む細胞間結合装

発生期における足細胞の突起形成過程

置は存在しない．さらに発生が進み Capillary loop stage

糸球体の発生過程は 7 つのステージに区分され，そ6B，C）．これに伴い，結合装置複合体は一次突起を縁取っ

３．
２の後期に入ると，足細胞は複数の一次突起を形成する（図図 4 糸球体の発生ステージ（ラット）
発生初期では足細胞の細胞体は密集しており，糸球体はブドウの房のように見える（A1,A2）．
突起の形成は細胞体の直下で既に始まっているが，従来の走査電顕観察ではこの過程を観察することができない．SEM 像（A1，B1，C1），足細胞の形態変化を示す模式図（A2，B2，C2）．

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て位置するようになる．原始足突起は主に一次突起から伸び出し，長さが増すとともに，分岐したものも見られるようになる．
Maturing glomerulus stage になると，一次突起は太さ４．FIB-SEM 法による解析の課題とその解決策と長さを増す（図 6D，E）．結合装置複合体は原始足突起

FIB-SEM 法によりこれまで認識されていなかった足細どうしの間に位置するようになり，足突起は未熟足突起胞の立体構造が明らかになり，足細胞の構造解析におけ（immature foot processes）となる．一次突起の成熟過程

る本法の威力が証明されたわけだが，いくつかの問題点は均一ではなく，ひとつの足細胞内に様々な成熟段階がも浮き彫りになってきた．最も大きな問題となるのは，見られる（図 6E1-5）．始め一次突起は広い面積で基底膜連続断面像から目的の細胞を抽出する作業（セグメンテーと接着しているが，その接着面が徐々に狭まり，畝状隆ション）をマニュアルで行わなければならない点である．

起となる．

足細胞の複雑性から自動抽出は現時点ではほぼ不可能で未熟足突起間の細胞間結合装置はスリット膜に置き換ある．連続像を一枚一枚見ながら行う抽出作業は，数百わると，足突起間にスリット間隙ができ，未熟足突起は枚の TEM 像を観察することに匹敵し，その過程で重要な成熟足突起（mature foot processes）となる．さらに生後所見を見出せることも多々あり，意義のある作業ではあの発達過程で足突起内にアクチン線維の太い束が形成さるものの，解析の効率化には高度な自動抽出を可能としれ，高い糸球体内圧から糸球体壁を保護するうえで役立た画像解析ソフトの開発が切望される．

つ［10][11］．

図 5 足細胞の発生過程（ラット）（A-D）S-shaped body stage．足細胞は円柱状であり，他の上皮細胞と同様に細胞間結合装置（黄色）で連結している．
細胞間結合装置は基底方向に下行していくが，三細胞間結合部（tricellular junction，水色）が先行して下行する．

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図 6 足細胞の発生過程（ラット）（A）Capillary loop stage（初期）．原始足突起が形成されるが，突起間にスリット膜は見られない．（B，C）Capillary loop stage（後期）．一次突起が見られるようになる．細胞間結合装置は一次突起を縁取るように位置し，原始足突起間にはスリット膜は見られない．（D，E）Maturing glomerulus stage．一つの細胞内に様々な発達段階の一次突起（1-5）が見られる．CB 細胞体．

５．おわりに

参考文献

今後は FIB-SEM 解析を一層活用し，足細胞に残され[1] Ichimura, K., Sakai, T.: Evolutionary morphology ofた形態問題を解決してゆくとともに，ネフロン構成細胞

podocytes and primary urine-producing apparatus.の全種類を網羅した「Kidney Cell 3D Atlas」の作製を目

Anat. Sci. Int. (doi:10.1007/s12565-016-0368-4)

指している．さらに，FIB-SEM 解析はヒトの糸球体疾患[2] Kriz, W., Kaissling, B.: Structural organization of theにおいて足細胞傷害を形態的に評価するうえでも有用な

mammalian kidney. In: The Kidney, Physiology and

ツールとなることは間違いなく，病理学分野での活用がPathophysiology. 3rd ed. (Ed) Seldin, D.W., Giebisch,進んでゆくものと予想される．

G., Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, pp587-654 (2000)[3] Harris, K.M., Perry, E., Bourne, J., Feinberg, M.,

謝辞
FIB-SEM 解析は，文部科学省ナノテクノロジープラッ
トフォーム事業・微細構造解析プラットフォーム（名古Ostroff, L., Hurlburt, J.: Uniform serial sectioning fortransmission electron microscopy. J. Neurosci., 26:12101-12103 (2006)[4] Hoffpauir, B.K., Pope, B.A., Spirou, G.A.: Serial

屋大学）および日本 FEI の支援を受けて実施された．まsectioning and electron microscopy of large tissue

た SBF-SEM 解析は生理学研究所の支援を受け実施されvolumes for 3D analysis and reconstruction: a case

た．足細胞の立体構造に関する一連の研究は，JSPS 科研

study of the calyx of Held. Nat. Protoc., 2: 9-22 (2007)

費 15K18960，23590226 の助成を受けている．

NanotechJapan Bulletin Vol. 9, No. 5, 2016[5] Ichimura, K., Kurihara, H., Sakai, T.: Primary cilia

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disappear in rat podocytes during glomerularNonami, T., Miyazaki, N., Nakao, T., Enomoto, S., Arai,development. Cell Tissue Res., 341: 197-209 (2010)

S., Koike, M., Murata, K., Sakai, T.: Morphological[6] Kubota, Y.: New developments in electron microscopy

process of podocyte development revealed by block-for serial image acquisition of neuronal profiles.

face scanning electron microscopy. J. Cell. Sci. (doi:Microscopy, 64: 27-36, 2015.

10.1242/jcs.187815)[7] Ohno, N., Katoh, M., Saitoh, Y., Saitoh, S., Ohno, S.:[10] Ichimura, K., Kurihara, H., Sakai, T.: Actin filament

Three-dimensional volume imaging with electronorganization of foot processes in rat podocytes. J.

microscopy toward connectome. Microscopy, 64: 1726 (2015)

Histochem. Cytochem. 51: 1589-1600 (2003)[11] Ichimura, K., Kurihara, H., Sakai, T.: Actin filament[8] Ichimura, K., Miyazaki, N., Sadayama, S., Murata, K.,

organization of foot processes in vertebrate

Koike, M., Nakamura, K., Ohta, K., Sakai, T.: Three-glomerular podocytes. Cell Tissue Res., 329: 541-557

dimensional architecture of podocytes revealed by(2007)

block-face scanning electron microscopy. Sci. Rep., 5:8993 (2015)（順天堂大学

市村 浩一郎）[9] Ichimura, K., Kakuta, S., Kawasaki, Y., Miyaki, T.,【お問い合わせ】
微細構造解析プラットフォーム
名古屋大学☎ 052-789-3632
E-mail nanoplat@nagoya-microscopy.jp

ホームページ
http://nanoplat.nagoya-microscopy.jp/

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