Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 17, No. 1, 23–26, 2017

総説（特集）

デハロコッコイデス属細菌の大量培養と野外注入
The Dehalococcoides-containing Dechlorinating Mix Culture; Large-scale Production and Field
Demonstration
奥津徳也 *，上野俊洋

Noriya Okutsu*, Toshihiro Ueno
栗田工業株式会社 〒 329–0105 栃木県下都賀郡野木町川田 1–1* TEL: 0280–54–2609 FAX: 0280–57–2957* E-mail: noriya.okutsu@kurita.co.jp
Kurita Water Industries Ltd., 1–1, Kawada, Nogi-machi, Shimotsuga-gun, Tochigi 329–0105, Japan
キーワード：土壌・地下水汚染，トリクロロエチレン，バイオレメディエーション，Dehalococcoides 属細菌
Key words: contamination of soil and groundwater, trichloroethene, bioremediation, Dehalococcoides（原稿受付1.

2017 年 3 月 24 日／原稿受理

はじめにテトラクロロエチレン（PCE）やトリクロロエチレン（TCE）等の塩素化エチレンはドライクリーニングの溶剤や金属の洗浄剤として使用されてきたが，発ガン性や肝機能障害を誘発する可能性が指摘されており，土壌・地下水汚染が社会問題となっている。
土壌・地下水汚染対策としては，これまで，掘削除去や揚水処理が多く用いられてきたが，掘削除去への偏重は，ブラウンフィールド問題の深刻化や搬出汚染土壌の不適正処理につながりかねない。平成 22 年 4 月には，掘削除去偏重の是正をひとつの目的として，改正土壌汚染対策法が施行されている。
一方，微生物を用いた浄化技術（バイオレメディエーション）は，揚水処理に比べて浄化期間が短く，掘削除去よりも低コストであることなどの理由から近年適用されるケースが増えている。バイオレメディエーション
は，バイオスティミュレーションとバイオオーグメンテーションに大別される。前者は有機物や栄養塩等の増殖基質を供給して土着微生物を活性化するものであり，後者は外来微生物を導入するものである。現在適用されているのは主としてバイオスティミュレーションであるが，2005 年に経済産業省・環境省により「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」（以下利用指針と称する）が告示されたこともあり，バイオオーグメンテーションも徐々に普及しつつある。
当社は，環境庁「平成 10 年度土壌汚染浄化新技術確立・実証調査」においてバイオスティミュレーションの現場実証を行い 1)，その後数多くの現場で実用化を行っている 2)。また，2008 年 6 月には，複合微生物系として初めて，利用指針に対する適合確認を経済産業大臣・環境大臣から取得，これまでバイオオーグメンテーション

2017 年 4 月 19 日）の現場適用を進めてきた。ここでは，塩素化エチレン分解菌（Dehalococcoides 属細菌）の大量培養と現場適用事例について紹介する。
2.

Dehalococcoides 属細菌をによる塩素化エチレン分解

塩素化エチレン分解反応の概念図を図 1 に示す。嫌気条件下，テトラクロロエチレン（PCE）やトリクロロエチレン（TCE）は，シスジクロロエチレン（cis-DCE），
クロロエチレン（VC）を経て，エチレン 3) やエタン 4)に脱塩素化される。脱塩素化反応において塩素化エチレンは電子受容体となるが，電子供与体としては，有機酸 4) やアルコール 3)，糖類 5)，酵母エキス 5)，有機酸エステル 6)，植物油 7) 等の有機物や水素 8) が利用できる。
多くの細菌が塩素化エチレン分解菌として単離され，その分解能力が調べられている。例えば，Dehalospirillum
multivorans 9) ，Enterobacter agglomerans MS-1 10) ，Dehalobacter restrictus PER-K23 11) は PCE や TCE をDCE に脱塩素化して増殖できる。しかし，筆者の知る限り，エチレンまで完全に脱塩素化できる微生物として単離されているのは Dehalococcoides 属細菌（DHC 菌）のみである。報告されている DHC 菌の塩素化エチレン分 解 能 を 表 1 に 示 し た。CBDB1 株 を 除 き， い ず れ の
DHC 菌も塩素化エチレンの脱塩素化により増殖することができる。
3.

Dehalococcoides 属細菌を含む複合微生物系の大量培養

バイオオーグメンテーションに利用するための分解微生物（以下「利用微生物群」と称する）を取得するた

奥津，上野24

図 1．塩素化エチレン分解反応の概念図

表 1．報告されている Dehalococcoides 属細菌
菌株
195 株 14)
VS 株 15)
BAV1 株 16)
CBDB1 株 17)
GT 株 18)+

図 2．VC 集積体および cis-DCE 集積体による cis-DCE の脱塩素化

図 3．VC 集積培養体の T-RFLP 解析結果

PCE++TCE++++cis-DCE

VC+++++++は脱塩素化により増殖できることを示す。

め，集積培養を行った。実際の現場では，自然状態でPCE や TCE が cis-DCE に変換され，cis-DCE が比較的高濃度に残留している場合が多く見受けられる。バイオオーグメンテーションの実用化には cis-DCE 以降の分解がより重要となるため，ここでは cis-DCE を確実にエチレンにまで脱塩素化する微生物群の取得を試みた。
集積培養中，図 2 に示すように，cis-DCE で培養した場
合，しばしば VC の脱塩素化能が失われることがあった
ため，最終的には VC で集積培養を行った（電子供与体は有機酸）。
その結果，Trichococcus pasteurii を優占種とし，DHC菌を含む培養体が得られた。この培養体から DNA を抽出し，3 種の制限酵素（BstU1, HhaI, Sau96I）を用いてT-RFLP 解析を行ったところ，図 3（BstU1 を用いた結果）に示すようにエレクトロフェルグラムは単純な形態となった。また，利用微生物群にヒト病原体が存在しないことを確認するため，95 種類の代表的ヒト病原体について特異的な遺伝子配列を対照とした定量 PCR を実施した。その結果，これらの該当遺伝子の濃度は定量下限値（約 2.5×102 copies/mL）未満であった。
これらの結果より，本「利用微生物群」は有意な数の病原性細菌を含まないことが明らかとなり，バイオオーグメンテーション利用の安全性を十分に確保できると考えられた。「利用微生物群」をろ過して Trichococcus
pasteurii 等の細菌を除去し，DHC 菌の比率を高めた試料の電子顕微鏡写真を示す（図 4）。赤血球状の微生物が DHC 菌であろうと考えている。
広範囲の帯水層を対象に DHC 菌を利用したバイオオーグメンテーション技術を適用するには，より多くの培養液を生産する能力が必要である。実際に米国では，4000 L の発酵槽を用いた DHC 菌の培養実績が報告されている 12)。そこで，200 L 容量の発酵槽（図 5）を用いた大量培養方法を開発した。培養の一例を図 6 に示す。

バイオオーグメンテーション法の開発

Development of bioaugmentation

25

図 4．利用微生物群の電子顕微鏡写真
図 6．200 L 発酵槽における培養例
図中，▲：VC， ：エチレン，●：DHC 菌の 16S rRNA数を示す。
また，矢印は VC ガスを追添加した時期を示す。

図 5．200 L 容量の発酵槽

約 1％の植菌により，1 カ月程度で 150 L の培養液を生産することが可能である。
4.

図 7．PCE の汚染状況および井戸配置図

Dehalococcoides 属細菌を含む複合微生物系の野外注入「利用微生物群」を用いたバイオオーグメンテ―ションは，小規模パイロット試験において，栄養剤のみを注入するバイオスティミュレーションよりも浄化期間が短縮できることが確認されている 13)。ここでは，より広範囲でバイオオーグメンテ―ションを実施した事例を紹介する。
地下水中の PCE 濃度 0.01〜0.5 mg/L の範囲に培養液注入井戸（オーグメンテーション井戸）を 5 本設置した（図 7）。全ての井戸には，深度 GL-2〜GL-10 m 程度の帯水層に対してスクリーンを設置した。各オーグメンテーション井戸につき，各 10 L（DHC 菌 16S rDNA：約 1×108 copies/mL），計 50 L の培養液を栄養剤とともに注入した。
MW-1 におけるモニタリング結果を図 8 に示す。培養液および栄養剤の注入 60 日目までは，PCE 濃度の増減が確認された。栄養剤注入 2 回目を実施した後（注入90 日後）は，VC の分解生成物であるエチレン濃度が0.01 mg/L に増加した。以降は，TOC 濃度の低下に伴う一時的な PCE 濃度のリバウンドが観測されたものの，注入 210 日後において，PCE，TCE，および cis-DCE 濃度が全て分析下限値（0.001 mg/L）未満にまで低下した。また，注入 270 日目においては，VC 濃度も分析下限値（0.001 mg/L）未満にまで低下した。
DHC 菌 16S rDNA のコピー数は，施工前において10 copies/mL 程度であった。培養液および栄養剤の注入を行った後は，速やかに増殖し，注入 90 日後には 1.0×104 copies/mL 以上にまで増加した。
5.

おわりに

本稿では，当社における Dehalococcoides 属細菌を含むコンソーシアムを利用したバイオオーグメンテーション技術に関し，大量培養方法と現場適用事例を述べた。
大量培養方法の確立により，広範囲の汚染現場への適用が進められ，適用事例も 10 件を超えた。今後は，塩素化エチレンに限らず，様々な汚染物質に対して，バイオオーグメンテーション技術の活用が実現できるよう研究開発を進めて行きたい。

奥津，上野26

図 8．バイオオーグメンテ―ション適用サイトにおけるモニタリング結果a）VOC 濃度の推移。●：PCE，■：TCE，◆：cis-DCE，▲：VC，△：エチレン。b）DHC 菌の 16S rRNA 数および TOC 濃 度 の 推 移。 ●：DHC 菌 の 16S rRNA 数， □：TOC 濃度。
図中矢印は，培養液および栄養剤を注入した時期を示す。

謝

辞

本技術開発の一部は NEDO プロジェクト「生分解・処理メカニズムの解析と制御技術開発」の一環として実施したものです。開発にあたって多岐にわたるご指導をいただきました東北学院大学工学部の中村寛治教授に心より感謝申し上げます。
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