Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 20, No. 1, 63–69, 2020

総

説（特集）

水環境におけるバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の分布とVRE 耐性遺伝子の伝播ポテンシャルの評価
Investigation of Vancomycin Resistant Enterococci and Evaluation of Transferability
on Vancomycin Resistance Gene in Water Environment
西山正晃 1*，鈴木祥広 2Masateru Nishiyama * and Yoshihiro Suzuki2
1

1

山形大学農学部 食料生命環境学科 エコサイエンスコース 〒 997–8555 山形県鶴岡市若葉町 1–23
2
宮崎大学工学部 社会環境システム工学科 〒 889–2192 宮崎県宮崎市学園木花台西 1–1* TEL: 0235–28–2894* E-mail: m-nishiyama@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp
1
Department of Food, Life and Environmental Sciences, Faculty of Agriculture, Yamagata University,
1–23 Wakaba-machi, Tsuruoka, Yamagata 997–8555, Japan2

Department of Civil and Environmental Engineering, Faculty of Engineering, University of Miyazaki,
1-1 Gakuen Kibanadai-Nishi, Miyazaki 889-2192, Japan
キーワード：腸球菌，薬剤耐性，バンコマイシン，遺伝子伝播
Key words: Enterococcus, Antibiotic Resistance, Vancomycin, Gene transfer
（原稿受付

1.

2020 年 3 月 23 日／原稿受理

はじめに感染症の治療に使用される抗菌薬や家畜に対する成長促進剤の投与に伴い，薬剤耐性菌が出現し，その感染症は世界的な問題である。特に，薬剤耐性菌は医療機関において極めて深刻な問題となっており，耐性菌が原因となった死者数は世界中で少なくとも年間 70 万人である
試算されている 25)。また，現状のまま何も対策が講じられず，薬剤耐性菌が世界中で拡大すると想定した場合，2050 年には薬剤耐性菌が原因となる死者数が 1,000 万人に達し，経済的な損失は 1 兆 5000 億ドルに及ぶと見積もられている。したがって，薬剤耐性菌と薬剤耐性の発現に関連する遺伝子の存在は，21 世紀における人類の公衆衛生を脅かす世界共通の健康問題と認識されており，各国で耐性菌拡大防止の取り組みが策定されている 38)。これまでの一般認識として，薬剤耐性菌は，特定の医療施設，ならびに抗菌薬を過度に使用している畜産場や養殖場など，限定された場所に存在していると考えられてきた。ところが最近になって，薬剤耐性菌が土
壌，下水，都市河川・河口，あるいは沿岸域等の人々が通常の生活を営む周辺環境からも普遍的に検出され始めている 1,15)。
著者らは，水環境におけるバンコマイシン（VCM）
耐性腸球菌（vancomycin-resistant enterococci, VRE）にフォーカスして研究を進めている。VRE は，グラム陽性細菌の特効薬である VCM に対して耐性を獲得した腸球 菌 で あ り， 注 視 す べ き 耐 性 菌 グ ル ー プ で あ る2020 年 4 月 20 日）

ESKAPE の 1 つである 2,4,35)。VRE による院内感染症は世界中で発生しており，中でもアメリカ，ヨーロッパ，
および南アジアなどでは発症件数が増加している 6,10,37)。
我が国の VRE の臨床分離報告数は，欧米諸国と比較して少ないものの，VRE が原因菌となる院内感染の広がりが危惧されている 13,18,24)。その反面，大部分の腸球菌（Enterococcus）は，ヒトを含むほ乳類の腸管内に存在する常在菌であり，ふん便汚染指標細菌として公衆衛生の分野で古くから用いられている 34)。日本の都市河川や沿岸域からも腸球菌は 101 〜 102 CFU/100 mL レベルで検出されており 8,30)，我々の生活圏内に常に存在する細菌である。また，腸球菌は多様な環境因子（i.e. アルカ
リ，pH，温度増加，および塩化ナトリウム濃度）に耐性を有している 16,19)。したがって，水環境において VREを含む薬剤耐性腸球菌は，他の細菌と比較して生残性が高く，水系を経由した拡散・感染に関するリスクも高いと推察される。VRE に代表する薬剤耐性腸球菌の出現に伴い，環境から普遍的に検出される腸球菌の中に，薬剤耐性を獲得した腸球菌が存在している可能性があり，これらがその他の耐性株の出現や薬剤耐性菌の拡散・伝播に寄与するかもしれない。これまで日本の水環境を対象とした薬剤耐性菌の調査事例では，大腸菌 29) や緑膿
菌 31) で耐性菌の存在が確認されているものの，腸球菌の薬剤耐性に関する情報や知見は極めて少ない。
このような背景において，著者らの研究グループでは，日本の地方都市である宮崎の水環境において微生物
汚染の疫学調査を実施している。そこで本総説では，水西山，鈴木64

環境における VRE の拡散・分布に関する調査事例を紹介する。さらに，水環境において VRE 耐性遺伝子が腸球菌に伝播する可能性について，水環境を模擬した invitro 伝達実験による評価結果の一部についても報告する。
2.

VRE の種類とその特徴

VRE の出現は，1986 年にフランスで Leclercq ら 14) による臨床材料からの検出の報告が最初とされる。VCM
はグリコペプチド系抗生物質であり，細菌の細胞壁合成
酵素の基質であるペンタペプチド末端の D-alanyl-Dalanine に結合して細胞壁合成を阻害する働きがある。
末端である D-alanine を他のアミノ酸に置換，もしくは本来とは異なるアミノ酸で構成された腸球菌属に対して，VCM の 結 合 能 が 低 下 す る た め，VRE と な る 26)。
VRE には 6 種類のタイプがあり，ペンタペプチド末端のアミノ酸，耐性遺伝子の存在部位，耐性発現，グリコペプチド抗菌薬に対する感受性などの特徴によって分類される（表 1）。VCM 耐性は，ペンタペプチド最末端のD-alanine が lactate， ま た は serine に 変 化 し て お り，
VanA 型と VanB 型の耐性遺伝子の局在部位は，伝達性の ト ラ ン ス ポ ゾ ン で あ り， 他 の VanC 型，VanD 型，
VanE 型，ならびに VanG 型は染色体上にコードされていることから非伝達性である 7,9)。院内感染対策上問題となるのは，VanA 型と VanB 型であり，これらの遺伝子（vanA, vanB）は主にプラスミド上に存在する外来遺伝子である。そのため，同一菌種間だけではなく，どの腸球菌属へも伝播することが報告されている 9,36)。VanA
型は，VCM と別のグリコペプチド系抗菌薬であるテイコ プ ラ ニ ン（TEIC） に 高 度 耐 性，VanB 型，VanC 型，
お よ び VanE 型 は VCM に 中 度 か ら 高 度 耐 性 を 示 し，TEIC に 対 し て 感 受 性 で あ る。VanD 型 と VanG 型 は，
VCM に中度耐性を示し，TEIC に対して感受性か中度耐性を示す特徴がある 26)。
3.

下水と河川における薬剤耐性腸球菌のモニタリング

腸球菌の薬剤耐性化を調査するために，下水処理施設の流入下水と宮崎市内を流下する河川を対象として年間モニタリング調査を実施した 22)。年間モニタリングは，

宮崎県内の A 下水処理施設（日平均流量 6,300 m3/day）と 宮 崎 市 内 を 流 れ る 一 級 河 川 の 八 重 川（ 流 路 延 長
8.4 km，流域面積 17.6 km2）の定点から採取した。調査は，2011 年 6 月から 2012 年 7 月までの期間において，
月 1 回（計 10 回）実施した。
調査期間を通じて，流入下水と河川から腸球菌の選択培地を使用したメンブランフィルター法によってそれぞれ 239 株と 261 株の腸球菌を単離・同定し，薬剤感受性試験（MIC 試験）を行った。腸球菌全 500 株の中からVCM に対して耐性を示した株は検出されなかったものの，中度耐性を示す株がそれぞれ 10％（24 株）と 5.7％
（24 株）検出された（表 2）。ここで既往の VRE 検出率と比較すると，VRE が原因となる院内感染が深刻化しているアメリカでは，都市下水処理場から単離した腸球菌の最大 3％が VRE であると報告されている 28)。ヨー
ロッパ諸国の都市流入下水を対象とした疫学調査では，
0.6〜60％の範囲で VRE が検出されている 11)。河川や沿岸環境を対象とした調査事例では，北アメリカの沿岸域
か ら 単 離 し た 腸 球 菌 の う ち，8％（18 株 /227 株 ） がvanA あ る い は vanB の い ず れ か の 遺 伝 子 を 保 有 す る
VRE であったと報告されている 27)。韓国の 3 つの主要な 河 川 を 対 象 と し た 調 査 で は，VRE が 最 大 23 CFU/
100 mL で検出されている 20)。本研究で対象とした下水処理場の流入下水と河川から VCM に対して耐性を示す
VRE は検出されなかったが，中度耐性を示す VRE が検出され，日本の地方都市である宮崎の水環境おける
VRE の拡散の程度は諸外国の VRE 検出率と比較して極めて低かった。これには日本における VRE の院内感染の発生件数が，諸外国と比較して低いことと関連していると推察している。日本の臨床現場における VCM の投薬量は欧米と比較して少なく 12)，VRE が発生しにくい環境であると考えられる。また VRE の発生には，家畜の成長促進剤として家畜飼料に投薬されるアボパルシンの使用歴が関係していると考えられる 3,17)。アボパルシ
ンは VCM と類似した化学構造を有し，この成長促進剤の使用が VRE の発生に寄与していると言われている。
長期間アボパルシンを使用した国（現在では使用禁止）
では，今も農場やその周辺環境から VRE が検出されている 17)。日本ではアボパルシンの使用が短期間であった
ため，VRE の発生が抑えられたといわれている 39)。これらのことから日本の水環境中の VRE の検出率が諸外

表 1．VRE の分類と VCM 耐性の局在部位 26)
MIC（μg/mL）
耐性タイプ（関連する耐性遺伝子） VCM
TEIC

耐性遺伝子の局在部位

ペンタペプチド
末端構造

分離菌種

VanA（vanA）

64–1,000

16–512

プラスミド，染色体D-Ala-D-Lac

E. faecalis, E. faecium, etc

VanB（vanB）

4–1,000≤1

プラスミド，染色体D-Ala-D-Lac

E. faecalis, E. faecium, etc

VanC（vanC）

2–32

≤1

染色体

D-Ala-D-Ser

E. casseliflavus, E. gallinarum,
E. flavescens

VanD（vanD）

64–1284–64

染色体D-Ala-D-Lac

E. faecium E. faecium

VanE（vanE）

16

0.5

染色体

D-Ala-D-Ser

E. faecalis

VanG（vanG）

< 16

< 0.5

染色体

D-Ala-D-Ser

E. faecalis

VCM：バンコマイシン，TEIC：テイコプラニン

水環境における VRE の分布と耐性遺伝子の伝播ポテンシャル

65

表 2．流入下水と河川から単離した河川水から単離した腸球菌の薬剤感受性（ABPC：アンピシリン，PCG：ペンジルペニシリン，
TC：テトラサイクリン，IMP：イミペネム，EM：エリスロマイシン，VCM：バンコマイシン）
下水（239 株）
抗菌薬

感受性

下水（261 株）
中度耐性

耐性

単離菌株数（％，割合）

感受性

中度耐性

耐性

単離菌株数（％，割合）

ABPC

239（100％）

0（0％）

0（0％）

261（100％）

0（0％）

0（0％）

PGC

239（100％）

0（0％）

0（0％）

260（99.6％）

0（0％）

1（0.4％）

TC

131（54.8％）27（11％）

81（34％）

149（57.0％）29（11％）

83（32％）

IPM

239（100％）

0（0％）

0（0％）

261（100％）

0（0％）

0（0％）

EM

95（40％）

85（36％）

59（25％）

102（39.1％）

138（52.9％）21（8.0％）VCM

215（90.0％）24（10％）0（0％）

246（94.3％）15（5.7％）0（0％）

表 3．VRE の流域調査における各調査地点のバンコマイシン耐性遺伝子の分布
調査日地点

単離株数（株）

vanA

vanB

vanC1

vanC2/C3

Dec-13

St. 1

30

N.D.*

N.D.

3

17

St. 2

16

N.D.

N.D.

N.D.

11

St. 3

3

N.D.

N.D.

N.D.

3

St. 1

10

N.D.

N.D.

N.D.

1

St. 2

7

N.D.

N.D.

1

0

St. 3

7

N.D.

N.D.

N.D.

7

St. 1

60

N.D.

N.D.

N.D.

25

St. 2

60

N.D.

N.D.

N.D.

3

St. 3

34

N.D.

N.D.

N.D.

34

合計（割合，％）

227

N.D.

N.D.

4（1.8％）

101（44％）May-14

Sep-14*Not Detection

国と比較して低かったのではないかと考えている。
その他の抗菌薬への耐性化をみてみると，テトラサイ
クリン（TC）とエリスロマイシン（EM）のいずれかに対して，下水と河川水から中度耐性または耐性を示した菌株が多数検出された（表 2）。TC と EM は，古くからヒトのみならず畜産や養魚場で使用される汎用性の高い抗菌薬である。本研究と同一の対象河川である八重川
河川流域を対象とした薬剤耐性緑膿菌の調査では，単離株のすべてが TC に対して耐性を示し，TC の耐性株は広範囲で拡散していることを示唆する報告がある 31)。腸球菌においても，TC の耐性株が水環境中に存在していることが確認された。表 2 をみると，下水と河川に存在する腸球菌の大部分は，汎用性の高い抗菌薬に耐性を示
すことがわかる。
4.

河川流域を対象とした VRE の拡散実態と遺伝子型解析

河川流域を対象とした VRE の実態調査は上記の同一の河川において，上流から下流に至る 3 つの調査地点を選定し，河川流域における VRE の拡散実態を調査した 23)。流域調査の調査は計 3 回（2013 年 12 月，2014 年

5 月，および 9 月）実施した。VRE の拡散実態を調査するにあたり，著者らが提案した環境水中から VRE 株のスクリーニング法を用いて VRE 株を回収した 21)。回収
し た VRE 株 に つ い て バ ン コ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子（vanA，vanB，vanC1， お よ び vanC2/C3） の 保 有 を
PCR 法によって確認したところ，河川水において，全ての腸球菌株から vanA，および vanB は検出されなかった（表 3）。一方で，vanC1，および vanC2/C3 を保有す
る菌株がそれぞれ，3％（9 株）と 49％（165 株）検出され，中でも vanC2/C3 陽性株は全調査地点から確認された。本調査対象流域の河川環境中には vanC2/C3 のVRE が広範囲で分布した。これら vanC2/C3 の VRE は，
VCM に 対 し て 耐 性 を 有 し て お ら ず， 中 程 度 の 耐 性（MIC 値：4–8 μg/mL）を示した。アメリカでは沿岸域から VanA 型 VRE の分離報告があり，プラスミドを媒介とした耐性遺伝子の拡散を危惧する報告もある 27)。今回の対象流域で分離された VRE は全て VanC 型で染色体上に van を保有する菌株であり，VCM 耐性を伝播する菌株ではなかった。
vanC2/C3 型の VRE が全調査地点か広範囲で検出されたことから，パルスフィールドゲル電気泳動（pulsedﬁeld gel electrophoresis, PFGE）法によって菌株の遺伝子

西山，鈴木66

図 1．宮崎の八重川流域における VRE の実態調査から明らかとなった環境中での耐性遺伝子の伝播型を取得し，菌株間のゲノムパターンを比較した。さらに PFGE 法によって得られたバンドパターンに基づき
デンドログラムを作製し，薬剤耐性プロファイルとの関連 性 を 評 価 し た。 各 調 査 地 点 か ら 単 離 し た 101 株 のPFGE 型を取得した結果，88 タイプの遺伝子型が検出され，河川流域に分布する vanC2/C3 保有株の遺伝子型は著しく多様化していることがわかった。特に注視すべ
き点は，上流域で単離した菌株の中で，同一の PFGE型を有する菌株でも，薬剤耐性プロファイルが異なる菌株が存在した点である。これは，ヒト消化管内・水環境
中のいずれで生じたのかは明らかではないものの，水環境中で耐性遺伝子の伝播，あるいは欠落を示唆するものであった（図 1）。著者らは下水処理水の影響のある都
市河川において，同一の PFGE 型大腸菌の感受性株が下水処理水と混合し流下する過程において，薬剤耐性を発現しており 32)，環境水中で耐性遺伝子が伝播されることを示唆する発見をしている。河川流域における薬剤耐性プロファイルのモニタリングや遺伝子型解析の結果か
ら総じてみると，様々な排水のリザーバーである水環境
は，耐性遺伝子の伝播による薬剤耐性菌の発現のホットスポットとなっている可能性が高い。
5.

水環境を模擬した in vitro 伝達実験におけるvanA 遺伝子の伝播ポテンシャルの評価

薬剤耐性菌の拡大と発生と考えるうえで鍵となること
は，環境中で薬剤耐性遺伝子を獲得し，他の細菌へ伝播するかを明らかにすることである。様々な薬剤や耐性を含む排水が最終的に流入する水環境は，薬剤耐性菌が拡大する場となっている可能性が指摘されている 33)。しかしながら，環境中における薬剤耐性遺伝子の伝播に関する知見は少ないことが現状である。そこで，VRE において VCM に高度耐性を示し，かつ伝達性プラスミド（vanA をコード）である VanA 型 VRE をモデル細菌として，環境中で VRE の vanA が他の腸球菌種に伝播する可能性を評価した結果を報告する。
薬剤耐性遺伝子の伝播実験は，細菌学分野で採用されている Filter mating 法と Broth mating 法を採用し，寒天培地上と液体培地中で遺伝子の伝播を評価した。また，環境を模擬した条件として，都市河川水，河川底質，下水処理場の活性汚泥を想定した。河川水は菌体が想定水中で分散している状態を想定しており河川底質と活性汚泥は菌体が高濃度で集密する環境として想定した（図 2）。環境中における細菌間の耐性遺伝子の伝播は，薬剤耐性株（供与菌）から薬剤非耐性株（受容菌）への接合伝達による耐性遺伝子の伝播を計数することによって評価した。ここで使用した供与菌と受容菌はこれまで
著者らが水環境と食品から分離した腸球菌株を用いた。
供与菌には外国産食肉から分離した vanA 保有 E. faecalis を用いた。また，受容菌には環境分離した異なる 3種の腸球菌株とリファレンス株として E. faecalis OG1RFを用い，それぞれに耐性遺伝子マーカーを導入した。
薬剤耐性遺伝子の伝播実験は，供与菌と受容菌の菌体濃度を 108 CFU·mL–1 に調整し，混合比を 1 : 1 で実施した。伝播実験は，以下の 5 条件で実施した：（1）Filter
mating 法，（2）Broth mating 法，（3）河川水，（4）河川底質，（5）活性汚泥。（1）は，供与菌と受容菌の混合液をメンブランフィルターに濾過し寒天培地上で実施した。（2）は，液体培地中で反応させた。（3）〜（5）は，滅菌した河川水，河川底質，および活性汚泥に供与菌と受容菌の混合液を摂取した。各条件で培養した後，受容菌，供与菌，および耐性遺伝子が伝播した接合完了体のコロニー数を計数した。薬剤耐性遺伝子の伝播率は，受容菌に対する接合完了体の比によって評価した。
表 4 に，環境中を模擬した耐性遺伝子の伝播率を示す。Filter mating 法 に よ っ て 供 与 菌 か ら 受 容 菌 へ の水環境における VRE の分布と耐性遺伝子の伝播ポテンシャル

67

図 2．環境を模擬した in vitro 伝達実験の概略図

表 4．環境を模擬した in vitro 伝達実験によって得られた vanA の伝播率
受容菌

Filter mating

Broth mating

河川水

河川底質

活性汚泥

E. faecalis–7*

1.4×10N.D.**

N.D.

N.D.

N.D.

E. faecalis（OG1RF）

4.6×10

–10

N.D.

N.D.

2.1×10E. faecium

4.6×10–7

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

E. hirae

9.4×10

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

–9

–7

2.0×10–8* 各伝播率は受容菌あたりの接合完了体の数で表している**Not Detection

vanA の伝播率を推定した結果，供与菌から異なる 3 種の腸球菌属の受容菌への伝播率は 1.4×10–7〜4.6×10–10の範囲であった。同一の Filter mating 法による臨床分離株の vanA の伝播を検討した研究事例では，E. faecalis
から Enterococcus 属への vanA の伝播率は 10–7〜10–8 と報告されている 5,36)。今回の環境分離株を用いた伝播率
は，臨床分離株と同等の耐性遺伝子の伝播ポテンシャルを有していた。vanA が伝播した接合完了体株について
薬剤感受性試験をすると，VCM に加えて，EM と TC
に対しても耐性を獲得しており，VCM 耐性を含む複数の耐性遺伝子の伝播が示唆された。次に Broth mating法を用いた場合は，全ての腸球菌種において vanA の伝播は確認されなかった。同様に河川水で交配させた場合においても，遺伝子の伝播は確認されなかった。vanAをコードするプラスミドは接合伝達性プラスミドである
ことが知られている 36)。Broth mating 法や河川水による交配では供与菌と受容菌と間に距離があり，菌同士の接触の頻度が少なく，接合による伝播は生じにくいと考えられる。したがって，液相中で菌体が分散している状況
では vanA が伝播する可能性は極めて低いことが示唆された。これに対して，河川底質と活性汚泥においてvanA の伝播が確認された。河川底質と活性汚泥の伝播
率は，受容菌に E. faecalis OG1RF 株を用いた場合にそれぞれ 2.1×10–7 と 2.0×10–8 であった。菌体が集密する環境において，vanA に代表される接合伝達プラスミドが伝播したと考えられる。本研究で使用した河川底質と活性汚泥中の腸球菌数は，それぞれ 104 CFU/dry-100 gと 108 CFU/100 mL であった。したがって，伝播率 10–8から推定すると，実際の下水処理施設の活性汚泥中において vanA を保有する VRE から感受性腸球菌に vanAが伝播する可能性がある。今回の実験系では同属間における接合伝達プラスミドの伝播率について検討した。今後は，腸球菌以外の細菌属への伝播の可能性や環境要因の変化による伝播速度への影響なども評価する必要があると考えている。

西山，鈴木

68

6.

ま

と

め

宮崎県宮崎市の水環境をフィールドとして，VRE とその他の薬剤耐性腸球菌の存在実態を調査した。幸いなことに，VRE のモニタリング結果では，院内感染症において最重要である VanA 型と VanB 型の VRE は検出されなかった。しかしながら，VanC 型 VRE が河川流域に広く分布していること，薬剤耐性プロファイルの異なる同一の遺伝子型の株が存在することも確認された。
しかし，これらの結果はローカルな 1 ケーススタディでしかなく，海外と比較すると，日本の水環境における薬剤耐性菌に関する情報・知見は大幅に不足している。また，水環境を模擬した in vitro 伝達実験では，vanA の伝播は環境の菌体密度が重要なファクターであり，下水処理場の活性汚泥のように菌体が高密度の条件では，接合型の vanA のほか，EM と TC の耐性遺伝子も受容菌に伝播する可能性が示唆された。当面の重要課題として，下水処理水の放流域も含めた水環境における薬剤耐性菌の拡散・蓄積に関する調査データの蓄積，薬剤耐性菌の発現とその機構の解明，そしてこれらの情報・知見に基づくリスク管理があげられる。しかし，著者らのように水環境分野を専門とする研究者らのみでは，これらの難題に立ち向かうことは困難である。環境微生物学や医学・細菌学の薬剤耐性菌や細菌ゲノム解析のスペシャ
リストに加えて，疫学などの多様な分野の研究者・有識者との連携が必須である。
文

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