18-03

GenNext™
NGS Library
Quantification Kit(Code No. NLQ-101)

使用说明书
TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN－目 录－[1] 序言・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1[2] 产品内容・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 2[3] 产品以外需要准备的物品・・・・・・・・・・・・・・・・・ 4[4] 文库的稀释・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 4[5] 使用方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6[6] 数据分析・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 7[7] 常见问题・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 8[8] 相关产品・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9注意
本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。在使用本试剂盒时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全规范。
※illumina® 是 illumina Inc.注册的商标。
※SYBR®、
Qubit® 、Applied Biosystem®、
NanoDrop™ 、StepOne™、
StepOnePlus™是 Thermo Fisher Scientific
K.K.注册的商标或者商标。

东洋纺（上海）生物科技有限公司[1] 序言GenNext™ NGS Library Quantification Kit 是 illumina® 二代测序用的文库定量试剂盒。可定量
范围仅限含有 P5、P7 接头进而在 flow cell 上可以正常扩增的文库序列，定量结果特异且准确。
本试剂盒使用了能够扩增长链及高 GC 含量目的片段的 KOD SYBR® qPCR Mix 试剂。

◆特征◆
1. 降低了序列偏差性
采用了 KOD SYBR® qPCR Mix，不易受文库的 GC 含量及长度的影响。使用本产品定量，可以得到稳定的 cluster 密度。
2. 更广的可定量区域
备有从 20 pM 到 0.0002 pM 的 6 个浓度的 Standard DNA，可以在较广的范围内进行准确的定量。
3. 简便
本产品含有文库定量必需的全部试剂（qPCR 试剂、Primer Mix、Standard DNA、以及文库稀释 buffer），可以很方便地进行文库的定量。

关于 KOD SYBR® qPCR Mix
KOD SYBR® qPCR Mix 是去除了 3’→5’ Exonuclease 活性（校正活性）的 KOD exo(-) DNA
polymerase 与优化过的 buffer 组合而成的高性能 SYBR® Green I 分析用 MasterMix 试剂。通过将 KOD 卓越的合成能力最大限度地发挥出来，对 GC 含量超过 80%的目的片段及长链目的片段（～2kb）也能够稳定地进行 Realtime PCR 检测分析。

咨询电话：021-58794900

1[2] 产品内容本产品由以下试剂组成，20μl 反应体系可使用 500 次。
・KOD SYBR® qPCR Mix*
产品组成
KOD SYBR® qPCR Mix

包装

保存温度

5ml (1.67ml×3)-20°C(或者 2～8°C 3 个月以内)
避光保存

250 μl-20°C(或者 2～8°C)
避光保存

50×ROX reference dye*提供 KOD SYBR® qPCR Mix(code No. QKD-201)。

・Standard & Primer Set
产品组成

包装

保存温度

Standard DNA 1 (20 pM)

200 μl-20°C

Standard DNA 2 (2 pM)

200 μl-20°C

Standard DNA 3 (0.2 pM)

200 μl-20°C

Standard DNA 4 (0.02 pM)

200 μl-20°C

Standard DNA 5 (0.002 pM)

200 μl-20°C

Standard DNA 6 (0.0002 pM)

200 μl-20°C

2 ml (1 ml×2)-20°C

1.7 ml-20°C

5×Primer Mix
50×Dilution Buffer

KOD SYBR® qPCR Mix
・含有反应 buffer、SYBR® Green I、dNTPs、Mg2+、KOD exo(-) DNA polymerase 以及热启动
抗体等 2×浓度的预混液。
・不含有 ROX (passive reference dye)。
・产品送到后，请于-20°C 冷冻保存。
・初次使用前务必充分混匀。之后，可在 2～8°C 低温保存三个月。
・长期不使用应在-20°C 下保存。经过验证，本产品反复冻融 10 次对品质没有影响。
・为防止 SYBR® Green I 的荧光品质下降，请注意避光保存。

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http://www.bio-toyobo.cn东洋纺（上海）生物科技有限公司

50×ROX reference dye
・使用 Applied Biosystems®、Agilent Technologies 等相关型号的仪器时，为了校正孔间荧光强度及分装误差，反应体系中请添加 passive reference。最适添加量因仪器种类不同而异。主要仪器
的添加量，请参阅 p.7 [5] 使用方法 (1) 反应液的制备。
・不需要 passive reference 校正的仪器则无需添加。
・请在-20°C 或者 2～8°C 避光保存。
・长期不使用时，请在-20°C 冷冻保存。
※稳定使用同一浓度的 ROX reference dye 时，可事先将 50×ROX reference dye 与 KOD SYBR®
qPCR Mix 混合后保存。混合后缓慢颠倒混匀，请根据上述 KOD SYBR® qPCR Mix 保存条件进
行保存。混合比率如下所示。关于 ROX 的浓度，请参阅 p.7 [5] 使用方法 (１) 反应液的制备。
按 1×ROX 浓度使用时qPCR Mix : 50×ROX = 1.67ml : 66.8μl
按 0.1×ROX 浓度使用时qPCR Mix : 50×ROX = 1.67ml : 6.7μl
Standard DNA提供了作为 Standard DNA 的 6 个梯度的 10 倍稀释系列（20～0.0002pM）。Standard DNA 含有
illumina®二代测序文库中使用的 P5、P7 序列，扩增长度为 452 bp。
5×Primer Mix
引物可用于扩增包含 P5、P7 接头序列的文库 DNA。
Primer Forward ：5’- ATA CGG CGA CCA CCG AGA TC -3’
Primer Reverse ：5’- CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA G -3’※如果预先将 5×Primer Mix、50×ROX reference dye 以及灭菌水与 KOD SYBR® qPCR Mix 混合，请根据上述 KOD SYBR® qPCR Mix 的保存条件进行保存。混合比率如下。关于 ROX 的浓度，请参照 p.7 [5] 使用方法 (１) 反应液的制备。
使用 1×倍浓度的 ROX 时qPCR Mix : 50×ROX : 5×Primer Mix : 灭菌水 = 800μl : 32μl : 320μl : 128μl
使用 0.1×倍浓度的 ROX 时
qPCR Mix : 50×ROX : 5×Primer Mix : 灭菌水 = 800μl : 3.2μl : 320μl : 156.8μl
不使用 ROX 时qPCR Mix : 5×Primer Mix : 灭菌水 = 800μl : 320μl : 160μl咨询电话：021-58794900

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50×Dilution Buffer
50×Dilution Buffer 用灭菌水稀释 50 倍后的可用于文库稀释，稀释后请于 4°C 保存。
1×Dilution Buffer 的组成如下：10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、 0.1% Tween 20
Dilution Buffer 只能用于文库定量的稀释之用。

[3] 其他需要准备的物品
除了本产品之外，请准备以下试剂及仪器类。
(1) Realtime PCR 仪器本产品适用于普通的模块型，高速型及玻璃毛细管型等各种 Realtime PCR 仪器。请按照仪器的使用说明书进行操作。
(2) 文库样品
用于 illumina®二代测序的已制备文库样品。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[4] 文库的稀释(1) 1×Dilution Buffer 的制备用灭菌水将 50×Dilution Buffer 作 50 倍稀释，制成 1×的 Dilution Buffer。
1×Dilution Buffer 的组成如下所示：10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、 0.1% Tween20
1×Dilution Buffer 仅作文库稀释用。
(2) 文库的稀释
使用 1×Dilution Buffer，在 Standard DNA 1～6 的浓度范围内（20~0.0002 pM≒5.5~0.000055pg/μl），对文库样品进行稀释。首先将文库用 1×Dilution Buffer 稀释至 10 nM*1 以下（或者 2.7ng/μl 以下），再依次作 100 倍，1,000 倍、2,000 倍、4,000 倍、8,000 倍的梯度稀释。或者，
根据情况制备这些稀释倍数相近的稀释梯度，作定量使用。

*1: 文库稀释至 10 nM 以下时，参考 NanoDropTM、Qubit®、或者 Bioanalyzer 等测得的数值进行
稀释。根据测定值，求出浓度，文库的平均链长为 450bp 时，2.7ng/μl 大约相当于 10nM（文库的平均链长为一半的 225bp 时, 2.7ng/μl 大约相当于 20nM（10[nM] × 450[bp]/225[bp])。另
外，同样的实验，如果以前做过时，请参考当时的结果进行稀释。
*2: 1μl 左右的量用移液器分装时，请注意精确度。
如果没有对照品，文库浓度不能确定时，请参考表 1 进行稀释。

咨询电话：021-58794900

5表1文库类型

稀释方法的选择

通过PCR制备的文库（Whole Genome Seq、ChIP-Seq、RNA-seq及Amplicon Sequence用文库等）・初次请按10,000、20,000、40,000、80,000倍进行稀释。

Target capture法制备的文库・初次请按100,000、200,000、400,000、800,000倍进行
稀释。

不通过PCR制备的文库（Whole Gemome Seq用文库等）(1) 输入100ng～1μg DNA制备的文库(2) 输入10～100ng DNA制备的文库(3) 10ng 以下制备的文库(1) 初次请按5,000、10,000、20,000、40,000倍进行稀释。
(2) 初次请按100、200、400、800倍进行稀释。
(3) 初次请按2、4、8倍进行稀释。

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http://www.bio-toyobo.cn东洋纺（上海）生物科技有限公司[5] 使用方法(1) 反应液的制备
以下以 20 μl 反应体系的制备为例。请按照 Realtime PCR 仪器特性，适当增加或减少反应液的用量。
试剂20 μl 反应体系

KOD SYBR® qPCR Mix
50×ROX reference dye*1
5×Primer Mix
稀释的文库 / Standard DNA
灭菌水

10 μl
0.4 / 0.04 μl
4 μl
4 μl
1.6 / 1.96 μl
20 μl

合计

*1: 使用 Applied Biosystems®、Agilent Technologies 等相关型号的仪器时，为了校正孔间荧光强
度及分装误差，反应体系中请添加 passive reference。最适添加量因仪器种类不同而异。主要仪器的添加量如下所示。另外，不进行校正的仪器可以不用添加。
主要仪器的最适 ROX reference dye 浓度仪器终浓度 (添加量)

Applied Biosystems® 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、
StepOnePlus™ 等

1× (1/50 量)

Applied Biosystems® 7500、7500Fast、
Agilent Technologies 公司的仪器(option)等

0.1× (1/500 量)Roche 公司的仪器、Bio-Rad 公司的仪器、BioFlux LineGene 等

不需要经常按同一浓度使用 ROX reference dye 时，可以预先将 50×ROX reference dye 按以下比例与 KOD SYBR® qPCR Mix 混合后保存。
按 1×ROX 的浓度使用时qPCR Mix : 50×ROX = 1.67ml : 66.8μl
按 0.1×ROX 的浓度使用时qPCR Mix : 50×ROX = 1.67ml : 6.7μl

咨询电话：021-58794900

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(2) PCR 循环条件设定请按照各仪器的操作流程，按以下循环条件进行设定。融解曲线分析的设定，请按照各仪器的标准进行设定。详细信息，请参考各仪器的使用说明书。
预变性变性 :
退火 :延伸 :98℃, 2 min. *1
98℃, 10 sec.

35
cycles65℃, 10 sec.
68℃, 30 sec. *2

融解曲线分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)*1: 本产品因为使用了抗体，采用了热启动体系，所以请进行 98°C、2min.的预变性，失活抗体。
*2: 600bp 以上的文库时，请设定为 45 sec.。
(3) 产生非特异性扩增时的对策
当融解曲线上出现明显的非特异性扩增时，循环条件请参考 p.8 [5] 使用方法 (2) PCR 循环条
件设定，降低循环数，可以提高反应特异性。
预变性98℃, 2 min.
变性 :延伸 :98℃, 10 sec.

35
cycles68℃, 30 sec.

融解曲线分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)

另外，融解曲线在82℃附近出现峰时，可能是接头二聚体(adaptor dimer)导致的。接头二聚体（大约120bp）由文库制备的连接反应产生，如果混在文库中，就会产生定量值偏差，不能保证定量值的准确性。请用Bioanalyzer等电泳仪或通过凝胶电泳确认是否存在。发生这种情况时，推荐再进行一次文库的纯化，去除接头二聚体。

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http://www.bio-toyobo.cn东洋纺（上海）生物科技有限公司[6] 数据分析(1)文库浓度的计算方法
以测得的 Standard DNA 的 Ct 值作标准曲线。请去除明显异常的 Ct 值。
标准曲线由下图浓度（20 pM ~0.0002 pM）的对数值（X 轴：log10 Scale）与测定得到的 Ct
值（Y 轴）组成。使用文库稀释液得到的 Ct 值， 作成标准曲线，根据标准曲线计算文库的浓
度（pM）。
用上述方法计算得到的浓度是以 Standard DNA 片段长度 452 bp 为标准的值，片段长度不同时，有必要对文库进行校正。使用以下公式进行校正。

文库浓度（nM）=[计算出的文库样本的浓度（pM）] × 452 (Standard DNA 片段长度 bp) × 稀释倍率1000 × [文库样品平均片段长度 bp]

请使用定量值在标准曲线范围内的浓度最高的读数（稀释倍数最小的数值）。

咨询电话：021-58794900

9[7] 常见问题
现象

原因

对策

二代测序中簇的密度比 标准曲线的制作方法
较低，或比较高
有问题・请除去明显异常的 Ct 再进行计算。
・请设定适当的 Threshold。

反应液的制备方法有 反应液制备及添加 Standard DNA 时，请用移液问题
器充分混匀。
文库的稀释不合适稀释文库时，请尽量使其值在 Standard DNA1～6 的范围内（20～0.0002pM）。如果利用偏离了Standard DNA1～6 的范围的 Ct 值进行定量，则不能保证定量值的准确性。

产生非特异性扩增请参考 p.8 [6] 数据分析 (3) 产生非特异性扩增时的对策。

含有接头二聚体
(adaptor dimer)请参考 p.8 [6] 数据分析 (3) 产生非特异性扩增时的对策。有接头二聚体(adaptor dimer)时，定量值产生偏差，定量值的准确性不能保证。

只有 Standard DNA 被 本产品不适于该文库扩增，未见文库的扩增

本产品只能定量含有 illumina®P5、P7 接头序列的文库。

扩增曲线的荧光信号比 ROX reference dye较弱，或者扩增曲线的 的量过多
形状不平滑

使用 passive reference 的仪器， ROX
reference dye 的量使用过多时，荧光量校正时，有时 SYBR® Green I 的荧光值会看起来比较低。
请根据 p.6 [5] 使用方法 (1) 反应液的制备、来确定 50×ROX reference dye 的添加量。

荧光测定时间较短一些仪器，在 PCR 延伸时间比较短时，有时会出现荧光测定不充分。扩增曲线的间隙比较明显时，通过延长延伸时间(45～60 秒)，有时可以得到改善。

反应液的量比较少用仪器推荐的反应液的量以下的量进行反应时，有可能会增大荧光测定值的误差。请增加反应液的量以进行反应。

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http://www.bio-toyobo.cn东洋纺（上海）生物科技有限公司[8] 相关产品高效率 SYBR® Green I 检测体系用 Realtime PCR 试剂产品名
容量1ml×1(40 次用)
SYBR® Green I 检测体系用 Realtime PCR 试剂
KOD SYBR® qPCR Mix
1.67ml×3(200 次用)※KOD SYBR® qPCR Mix 中的 50×ROX reference dye 是独立包装的。
※容量是按 50μl 反应时的反应次数。

详细信息，请浏览本公司网页
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http://www.bio-toyobo.cn[生产商]东洋纺株式会社敦贺生物工厂地址：日本国福井县敦贺市东洋町 10 番 24 号