18-07

SuperPrep®
Cell Lysis & RT Kit for qPCR
(Code No. SCQ-101)

SuperPrep®
Cell Lysis Kit for qPCR
(Code No. SCQ-201)
中文说明书

科研用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目录
[1] 前言....................................................................................................................................................................... 1[2] 产品内容............................................................................................................................................................... 3[3] 产品以外需要准备的物品 ................................................................................................................................... 5[4] 使用方法............................................................................................................................................................... 5[6] 实验例................................................................................................................................................................. 15[7] Trouble Shooting ............................................................................................................................................. 19[8] 相关产品............................................................................................................................................................. 20―注意―
本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。
请勿作为诊断、临床试剂使用。
在使用本试剂盒时，请严格遵守实验室的一般注意事项，注意安全。

东洋纺（上海）生物科技有限公司[1] 前言SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)是为了能够用荧光定量 PCR 法进行
基因表达分析、由细胞裂解试剂(Lysis Reagents)和逆转录反应试剂(RT Reagents)组成的试剂盒。
通过使用本产品，可以从 96 孔板等培养的细胞开始简便地制备含有可作为逆转录反应模板用 RNA
的细胞裂解液。而且，本试剂盒中含有的逆转录反应（RT）试剂，针对该细胞裂解液的 RT 反应进行了优化。使用本试剂盒，可以简便、迅速地从培养细胞开始合成荧光定量 PCR 用的模板 cDNA。
SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-201)是单独销售的细胞裂解试剂。可制备用于一
步法荧光定量 RT-PCR 用的细胞裂解液。

图. 本产品的 Realtime PCR 分析流程◆本产品的特征◆1. 无需纯化 RNA从培养细胞开始，可简便地制备含有可用于逆转录反应模板用 RNA 的细胞裂解物。以制备的裂解液为模板，直接就可以进行逆转录反应，可大幅度地缩短分析时间。
2. 从裂解液开始合成高品质的 cDNA

1
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通过 buffer 组份的最优化，有效地抑制了因 RNase 等的细胞成分引起的 RNA 降解（制备好的RNA 在冰上可稳定放置 2 小时）。另外，由于用 DNase I 处理后再进行 cDNA 的合成，所以可以合成基因组 DNA 污染少的高品质 cDNA。逆转录试剂是用本公司的高效率逆转录酶「ReverTra Ace®」为基础进一步优化后的 Master Mix，可简便、高效率地合成 cDNA。合成
的 cDNA 可长期保存。
本试剂可用于各种类型细胞的分析。下表中这些代表性的细胞已确认可以使用。
表. 已确认本产品适用的细胞
细胞名称

贴壁／悬浮

种类

细胞

来源

1

A431

贴壁

H.sapiensepidermoid carcinoma cell line上皮样细胞癌

2

C2C12

贴壁

M. musculus

myoblast cell line肌细胞3

Caco-2

贴壁

H.sapienscolon adenocarcinoma cell line

大肠癌

4

CHO-K1

贴壁

C. griseus

ovary cell line

卵巢5

COLO205悬浮

H.sapienscolon adenocarcinoma cell line

大肠癌

6

DLD-1

贴壁

H.sapienscolon adenocarcinoma cell line大肠癌

7

HCT-15

贴壁

H.sapienscolon adenocarcinoma cell line

大肠癌

8

HDF

9

HEK293

贴壁

10

HeLa S311贴壁
H.sapiens

primary

foreskinfibroblasts 皮肤纤维芽细(primary cell)

胞

H.sapiens

embryonic kidney cell line

胎儿肾

贴壁

H.sapiens

cervix carcinoma cell line

子宫颈癌

HepG2

贴壁

H.sapiens

hepatocellular carcinoma cell line 肝癌

12

HUVEC

贴壁

H.sapiens

13

Jurkat

悬浮

14

K562

悬浮

15

KUSA-A1

16

L929

贴壁

17

MCF7

18
19

umbilical vein endothelial cells 脐带静脉内皮(primary cell)细胞

H.sapiens

T lymphocyte cell line

白血病 T 细胞H.sapiens

myelogenous leukemia cell line

成红细胞样白贴壁
M. musculus

血病细胞

bone marrow stromal stem cell 成骨细胞样细
line

胞系

M. musculus

aneuploid fibrosarcoma cell line

结缔组织

贴壁

H.sapiens

breast adenocarcinoma cell line

乳腺癌

Neuro2a贴壁

M. musculus

neuroblastoma cell line

神经细胞瘤

NIH-3T3

贴壁

M. musculus

embryo fibroblast cell line胎仔纤维芽细

2
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胞
贴壁
20

PC12

R. norvegicus

21

rMSC

22

THP-1

23

U937

贴壁
悬浮

悬浮

R. norvegicus

H.sapiens

H.sapiens

adrenal pheochromocytoma cell 肾上腺褐色细
胞瘤

linebone marrow stromal stem cells

骨髓间质细胞(primary cell)
acute monocytic leukemia cell

单核细胞

line
leukemic

monocyte

lymphoma

单核细胞

cell line

3. 降低了高通量分析时的误差操作步骤上因为减少了移液分管及稀释操作步骤，降低了高通量分析时的误差。另外，细胞裂解时无需用移液枪头上下吹打混匀，而且进行了 DNase I 处理，提高了操作性。只需添加 Stop
Solution 即可终止 DNase I 的反应，无需进行引起 RNA 不稳定的加热操作。
4. 可以与各种荧光定量 PCR 试剂组合使用
可以与各种荧光定量 PCR 试剂组合使用（SYBR® Green I, TaqMan® assay 两种都可以使用）。
另外，与本公司的 THUNDERBIRD® qPCR Mix (Code: QPS-101, QPS-201)等组合使用，可以确认从培养细胞开始便可以进行简便且高度准确的基因表达分析。此外，与本公司的RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101, QRT-201)等的 1-step 荧光定量
PCR 试剂组合使用，也可进行简易的分析。

[2] 产品内容
本产品中含有以下试剂，可供 100 次反应使用。试剂请于-20℃保存。
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)<Lysis Reagents>
试剂名称

保存条件

容量

-20℃
Lysis Solution

或者 2～8℃5 个月以内(注

5.5ml

1)
gDNA Remover

-20℃

33μl

Stop Solution

-20℃

1.1ml

RNase Inhibitor

-20℃

55μl

3
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东洋纺（上海）生物科技有限公司<RT Reagents>
试剂名称

保存条件（注 2）

容量5xRT Master Mix

-20℃

860μl

5xRT Master Mix no-RT Control

-20℃

86μl

Nuclease-free Water-20℃

1.7ml x2

SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-201)[上述 SCQ-101 的 Lysis Reagents 的单独销售品]
试剂名称

容量

-20℃

5.5ml

Lysis Solution

保存条件

或者 2～8℃
5 个月以内(注 1)
gDNA Remover

-20℃

33μl

Stop Solution

-20℃

1.1ml

RNase Inhibitor

-20℃

55μl

注1)

Lysis solution 在 2-8℃ 条件下可存放 5 个月。但是，添加过 gDNA Remover 的 Lysis
solution 不建议保存在 2-8℃。

注2)如果试剂需要长时间存贮，请放置在-30℃保存。

Lysis Solution
是经过优化过的并适用于 RT-qPCR 的细胞裂解试剂。该溶液含有降低 RNase 活性的成分，在细胞裂解的过程中防止 RNA 降解。添加附带的 gDNA Remover 后，在细胞裂解的同时进行基因组 DNA 的降解。
gDNA Remover
是本试剂盒中经过优化过的 DNase I 溶液。
按 49.7μl Lysis Solution 中加入 0.3μl gDNA Remover
的比例进行添加后，可将测定时会产生背景信号的基因组 DNA 降解。
Stop Solution
含有使 Lysis Solution 中的酶失活的成分。

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RNase Inhibitor
是本试剂盒中经过优化过的 RNase Inhibitor 溶液。将该溶液添加至 Stop Solution 后使用，可以降低样品中 RNase 活性。
5x RT Master Mix
是含有高效逆转录酶 ReverTra Ace®、RNase inhibitor、Oligo dT Primer、Random Primer、反应 buffer、MgCl2、dNTPs、glycerol(甘油)等的 5x 浓度的 Master Mix。使用该溶液之前，请先离心一下，使液体离心至管底。另外，因为该溶液具有粘性，请用移液器缓慢吸取。
5x RT Master Mix no-RT Control
是 5x RT Master Mix 中只去掉 ReverTra Ace®的 Master Mix。因为该溶液缺少逆转录酶，它可
作为逆转录反应的对照组使用。与 5x RT Master Mix 相同，使用该溶液之前，请先离心一下，使液体离心至管底。另外，因为该溶液具有粘性，请用移液器缓慢吸取。
Nuclease-free Water
Nuclease-free 级的灭菌蒸馏水。该蒸馏水未经对聚合酶活性可能有影响的焦碳酸二乙酯 (DEPC)处理。

[3] 产品以外需要准备的物品
除本产品之外，请准备以下的试剂及仪器。
・

Thermal cycler 或者是 Incubator请准备能保持本产品的 RT 反应推荐温度(37℃、50℃、以及 98℃)的仪器。

・

荧光定量 PCR 仪器及荧光定量 PCR 用的试剂
使用时请按各仪器，试剂使用说明书的指导进行。

[4] 使用方法
1. 细胞裂解液的制备(1)96 孔板培养的贴壁细胞① 向 96 孔板内放入适当数量的细胞（例如: 1～2x104 cells）。
如果细胞过多，有可能会使得裂解不充分或对 RT-PCR 产生抑制，及基因组 DNA 不能充分
被降解。本试剂一般可以处理 1x101～7x104 cells 的细胞样品，因细胞种类不同会有些差异。
以 104 cells 为标准，建议在预实验中确认细胞数的上限。
② 根据实验条件，孵育细胞。
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东洋纺（上海）生物科技有限公司③ 将培养基从孔中弃掉。
④ 向各孔中加入 PBS(-)（100μl 左右）。
⑤ 将 PBS 从孔中弃掉。
⑥ 参考下表，根据反应次数向所需量的 Lysis Solution 中添加 gDNA Remover。为了防止在加 样过程中溶液损失，制备比所需量多一些的反应液。使用多通道移液器时，请按比所
需量多出 10%的量制备反应液。
1 个反应

10 个反应

96 个反应

Lysis Solution

49.7μl497μl

4.77mlgDNA Remover

0.3μl

3μl

28.8μl请在实验前制备 gDNA Remover 与 Lysis Solution 的混合液。请避免保存已添加 gDNA
Remover 的 Lysis Solution。

⑦ 向各孔中加入 50μl Lysis Solution (含有 gDNA Remover)。
⑧ 室温孵育 5 分钟。其中最初的 30 秒，请用 plate Mixer（强度要适当，不要使培养基飞溅出来）振动。如果没有 plate mixer,请用手背敲打 plate 的侧面，使其轻轻地振动。
室温孵育 5 分钟后，裂解液可置于冰上保存 2 小时。
⑨ 参照下表，按照反应次数向 Stop Solution 中添加量的 RNase Inhibitor。为了防止在加样过程中溶液损失，请配制比需要量多一些的反应液。使用多通道移液器时，请配制多出 10%
左右的反应液。
1 次反应

10 次反应

96 次反应

Stop Solution

9.5μl

95μl

912μl

RNase Inhibitor

0.5μl

5μl

48μl

⑩ 向各孔中加入 10μl Stop Solution (含有 RNase Inhibitor)。
⑪ 室温孵育 2 分钟。其中最初的 30 秒，请用 Plate Mixer（强度要适当，不要使培养基飞溅出来）振动。如果没有 Plate Mixer,请用手背敲打 Plate 的侧面，使其轻轻地振动。
对于 RNase 活性很高的细胞，在冰上孵育，可以获得更好的再现性。
⑫ 将制备的裂解液置于冰上。
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有些细胞的 RNase 的活性很强，处理后也有可能残留有 RNase 活性，建议立即进行逆转
录反应得到 cDNA。如果实验一时中断, 请在 2 小时以内进行逆转录。细胞裂解液的稳定性,请参考 p.17 [6] 3。
以 cDNA 的状态在-80℃至少可以保存 2 周左右。
(2) 96 孔板培养的悬浮细胞
为了避免裂解不完全，当 1 个孔中的细胞数超过 7.5×104 时，请将细胞培养液的一部分移到新的 96 孔板后再进行以下处理。
① 在培养板离心机上 2,000 rpm、离心 5 分钟。
② 除去培养基。
请用吸引器或移液器除去培养板中的培养基及 PBS。倾滤法或在滤纸上敲打会造成细胞的损失。
③ 添加 PBS(-) 100μl，洗涤细胞（无需用移液器上下吹打）。
④ 2,000 rpm、离心 5 分钟。
⑤ 弃去 PBS，进行(1) ⑥以后的操作。
(3) 用 96 孔板以外的容器培养的细胞① 计算细胞数，离心去除培养基。
② 用 PBS(-)洗涤细胞。
③ 最好将细胞的浓度控制在 1x107 cells/ml 以下，用 PBS(-)悬浮细胞。
④ 向各多孔板或微量管中分别注入 5μl，按(1) ⑥以下的步骤操作。
2. 逆转录(RT)反应（使用 SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ -101)时）① 反应液的制备（40μl 反应体系时）
参考下表，根据反应次数配制，在冰上制备需要量多一些的反应液。在充分混合和瞬时离心后向各
PCR 管或板中分别注入 32μｌ该混合液。使用多通道移液器时，请按比所需量多出 10%的量制备
反应液。
1次

10 次

96 次

5x RT Master Mix

8μl

80μl

768μｌ

Nuclease-free Water

24μl

240μｌ

2,304μｌ7
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RT 反应中，推荐向 20～40μl 的反应体系中添加 20%体积的裂解液（例如 40μl 的体系中含
有 8μl 裂解液）。
制备 RT(-)样品时，请用 5xRT Master Mix no-RT Control 代替 5xRT Master Mix。试剂盒
中附有可用 10 次（40μl 反应体系）的 no-RT Control 的试剂。
②

向分装后的 RT Master Mix 中加入 8μl 细胞裂解液，轻轻地混合之后，瞬时离心使混合液置
于离心管的底部。

③ 按以下温度进行温育。
37℃、15min.
50℃、 5min.
98℃、 5min. （酶失活）4℃、Hold.
④ 反应结束后，产物可保存在 4℃或-20℃。4℃可保存一周左右、-20℃可长期保存。

[5] Realtime PCR
在进行 Realtime PCR 时，请参考所使用试剂及仪器的使用说明书。通常，按 10～15%体积的标
准添加 cDNA，就可以得到再现性很高的 Realtime PCR。由于使用的 Realtime PCR 试剂不同，有时模板的最适量也会不同，推荐先进行预实验。以下以本公司的试剂为例进行介绍。
1. 使用 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code: QPS-101)
详细信息请参考 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix 的使用说明书。
(1)

反应液的制备

下面是使用 TaqMan® Probe 法进行荧光定量 PCR， 50μl 及 20μl 反应体系的实验例。请根据所
使用的 Realtime PCR 仪器的特性，适当增减反应液的量。
20μl 反应体系50μl 反应体系

终浓度

灭菌水

Xμl

Xμl

THUNDERBIRD® Probe

10μl

25μl

1x

Forward Primer

6 pmol15 pmol

0.3μM

Reverse Primer

6 pmol15 pmol

0.3μM

TaqMan® Probe

4 pmol10 pmol

0.2μM

qPCR Mix8
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50x ROX reference dye

0.4 or 0.04μl

1 or 0.1μl

cDNA 溶液 （[4].2.④）～3μl～7.5μl1x / 0.1x*1*1: Applied Biosystems 公司的仪器、Agilent Technologies 公司的仪器等，为了校正孔间荧光强度及分装误差，使用 passive reference。使用这些仪器进行反应时，请添加试剂盒中附带的 ROX reference dye。最适添加量因仪器型号不同而异。主要仪器的添加量如下所示。另外，不需要校正的仪器则无需添加。

表 1.

主要仪器的最适 ROX reference dye 浓度仪器终浓度 (添加量)

Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、

1× (1/50 倍)

StepOnePlus™ 等
Applied Biosystems 7500、7500Fast、

0.1× (1/500 倍)

Agilent Technologies 公司的仪器(option)等
Roche 公司的仪器、Bio-Rad 公司的仪器、BioFlux LineGene 等

不添加(2) PCR 循环条件设定

步骤

温度

时间

升降速度

预变性

95℃

60 秒*1

最大

PCR

变性

95℃

15 秒*2

最大

40 cycles

延伸

60℃

60 秒

最大

（Data Collection 设定在延伸这一步）*1: 本产品采用了高速热启动体系，通过极短的预变性时间，即可将酶重新活化。但是，为了使
模板 DNA 充分变性，请根据各仪器的特性设定足够的预变性时间。当最适的预变性时间不确定时，请设定为 60 秒 (预变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)。

9垂询电话：021-58794900

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东洋纺（上海）生物科技有限公司*2: PCR 循环中的变性时间，请根据仪器的特性，按以下时间设定。请注意，变性不充分将会导
致 PCR 效率低下。当最适的变性时间不确定时，请设定为 15 秒 (变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)。

表 2.

主要仪器最适预变性时间的标准
仪器

预变性时间

Applied Biosystems 公司的高速循环仪

20 秒(Applied Biosystems 7500Fast 等)
毛细管型高速循环仪

30 秒(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的模块型循环仪(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(普通模块)、

60 秒

StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 公司的仪器、BioFlux Line Gene 等)

表 3.

主要仪器最适 PCR 循环中变性时间的标准仪器

PCR 循环中的变性时间Applied Biosystems 公司的高速循环仪

3秒(Applied Biosystems 7500Fast 等)
毛细管型高速循环仪

5秒(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的模块型循环仪(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(普通模块)、

15 秒

StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 公司的仪器、BioFlux Line Gene 等)

2. 使用 THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code: QPS-201)
详细信息请参考 THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix 的使用说明书。
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东洋纺（上海）生物科技有限公司(1) 反应液的制备
下面是使用 SYBR Green I 染料法进行荧光定量 PCR， 50μl 及 20μl 反应体系的实验例。请根
据所使用的 Realtime PCR 仪器的特性，适当增减反应液的量。

20μl 反应体系50μl 反应体系

终浓度

灭菌水

Xμl

Xμl

THUNDERBIRD® SYBR®

10μl

25μl

1x

Forward Primer

6 pmol15 pmol

0.3μM

Reverse Primer

6 pmol15 pmol

0.3μM

50x ROX reference dye

0.4 or 0.04μl

1 or 0.1μl

1x / 0.1x*1

cDNA 溶液（[4].2.④）～3μl～7.5μlqPCR Mix*1: Applied Biosystems 公司的仪器、Agilent Technologies 公司的仪器等，使用 passivereference 校正孔间荧光强度及分装误差。使用这些仪器进行反应时，请添加试剂盒中附
带的 ROX reference dye，最适添加量因仪器型号不同而异。主要仪器的添加量如下所示。
另外，不需要校正的仪器则无需添加。
*2: PCR 循环中的变性时间，请根据仪器的特性，按以下时间设定。请注意，变性不充分将
会导致 PCR 效率低下。当最适的变性时间不确定时，请设定为 15 秒 (变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)
表 1.

主要仪器的最适 ROX reference dye 浓度仪器终浓度 (添加量)

Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、
StepOnePlus™ 等
Applied Biosystems 7500、7500Fast、

1× (1/50 倍)

0.1× (1/500 倍)

Agilent Technologies 公司的仪器(option)等
Roche 公司的仪器、Bio-Rad 公司的仪器、BioFlux LineGene 等

不添加(2) PCR 循环条件的设定11
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步骤

温度

时间

升降速度

预变性

95℃

60 秒

最大

PCR

变性

95℃

15 秒

最大

40 cycles

延伸

60℃

60 秒

最大

（Data Collection 设定在延伸这一步）
融解曲线分析(Melting / Dissociation Curve Analysis)*3*1: 本产品采用了高速热启动体系，通过极短的预变性时间，即可将酶重新活化。但是，为了使模板 DNA
充分变性，请根据各仪器的特性设定足够的预变性时间。当最适的预变性时间不确定时，请设定为 60
秒 (预变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)。
*2: PCR 循环中的变性时间，请根据仪器的特性，按以下时间设定。请注意，变性不充分将会导致 PCR
效率低下。当最适的变性时间不确定时，请设定为 15 秒 (变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)*3: 融解曲线分析的设定，请根据各仪器的标准设定。详细信息请参考各仪器的使用说明书。

表 2.

主要仪器最适预变性时间的标准
仪器

预变性时间

Applied Biosystems 公司的高速循环仪

20 秒(Applied Biosystems 7500Fast 等)
毛细管型高速循环仪

30 秒(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的模块型循环仪(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(普通模块)、
StepOne™、StepOnePlus™、

60 秒

Agilent Technologies 公司的仪器、BioFlux Line Gene 等)

表 3.

主要仪器最适 PCR 循环中变性时间的标准仪器

PCR 循环中的变性时间Applied Biosystems 公司的高速循环仪

3秒(Applied Biosystems 7500Fast 等)
12
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毛细管型高速循环仪

5秒(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的模块型循环仪(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(普通模块)、

15 秒

StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 公司的仪器、BioFlux Line Gene 等)

3. 使用其他公司的 qPCR 试剂
使用 SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)制备的 cDNA，请以 qPCR 反应体系的 10～15%体积标准使用。使用本试剂盒的逆转录反应试剂以外的试剂合成时，请根据
所使用的试剂的说明书添加 cDNA 的量及 qPCR 反应体系。
使用化学修饰的热启动 qPCR 试剂时，本产品的 RT 反应液的最大添加量，请以 10%为标准。
根据所用 qPCR 试剂的性质不同，该值有可能会下降。请减少逆转录反应液的添加量。
4. 使用 1-step RT-qPCR 试剂
可以用本试剂制备的细胞裂解液作为 1-step RT-qPCR 的模板进行简易的测定。作为 1-step
RT-qPCR 的试剂，请使用本公司的 RNA-directTM Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101)、
RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-201)。详细信息请参考各产
品附带的说明书。
A. 使用 RNA-directTM Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101)(1) 反应液的制备
下面是使用 TaqMan® Probe 法进行荧光定量 PCR， 50μl 及 20μl 反应体系的实验例。请根据
所使用的 Realtime PCR 仪器的特性，适当增减反应液的量。
20μl 反应体系50μl 反应体系终浓度灭菌水(RNase-free grade)

Xμl

Xμl

RNA-directTM Realtime PCR

10μl

25μl

1x

50mM Mn(OAc)2

1μl

2.5μl

2.5 mM

Forward Primer

6 pmol15 pmol

0.3μM

Master Mix

13
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Reverse Primer

6 pmol15 pmol

0.3μM

TaqMan® Probe

4 pmol10 pmol

0.2μM

细胞裂解液([4].1.(1)⑫)

1～2μl

2.5～5μl(2) PCR 循环条件设定
步骤

温度

时间

升降速度

变性

90℃

30 秒

最大

逆转录反应

55℃

20 分

最大

变性

95℃

60 秒

最大

PCR

变性

95℃

15 秒

最大

40 cycles

延伸

60℃

60 秒

最大

（Data Collection 设定在延伸这一步）

B. 使用 RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(Code: QRT-201)(1) 反应液的制备
下面是使用 SYBR Green I 染料法进行荧光定量 PCR， 50μl 及 20μl 反应体系的实验例。请根
据所使用的 Realtime PCR 仪器的特性，适当增减反应液的量。
20μl 反应体系50μl 反应体系灭菌水 (RNase-free grade)

Xμl

Xμl

RNA-directTM SYBR® Green

10μl

25μl

1x

50mM Mn(OAc)2

1μl

2.5μl

2.5 mM

Forward Primer

4 pmol10 pmol

0.2μM

Reverse Primer

4 pmol10 pmol

0.2μM

细胞裂解液([4].1.(1)⑫)

1～2μl

2.5～5μl终浓度Realtime PCR Master Mix

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东洋纺（上海）生物科技有限公司(2) PCR 循环条件设定
步骤

温度

时间

升降速度

变性

90℃

30 秒

最大

逆转录反应

55℃

20 分

最大

变性

95℃

60 秒

最大

PCR

变性

95℃

15 秒

最大

40 Cycles

退火

55℃

15 秒

最大

延伸

74℃

60 秒

最大

（Data Collection 设定在延伸这一步）
融解曲线分析(Melting / Dissociation Curve Analysis)[6] 实验例
1 与纯化后的 RNA 检测结果比较＜方法＞
使用 SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)，对 2.5x104 个 HEK293 细胞进行处理得到细胞裂解液后，进行 cDNA 的合成（40μl 反应体系）。另外，同时使用 ReverTra
Ace® qPCR RT Master Mix (Code: FSQ-201)对从 HEK293 细胞提取的 66.6 ng 的 Total RNA
进 行 cDNA 合 成 （ 40μl 反 应 体 系 ）。 分 别 以 上 述 两 个 试 剂 得 到 的 cDNA 为 模 板 ， 用
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code: QPS-201)试剂，对 15 种管家基因进行 Realtime
PCR 分析比较。

＜结果＞

Purified RNA (Ct)30

R2 = 0.983

25

20

15

15

10

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10

15

20

SuperPrep

TM

25

Lysate (Ct)30

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结果表明：15 种目的基因中，试剂盒制备的 cDNA 与纯化的 RNA 制备的 cDNA 之间，存在很
高的相关性。由此可见，使用本试剂盒，无需进行复杂的 RNA 纯化，就可以简便地通过 Realtime
PCR 进行基因表达分析。
2. 分析准确性的评价＜方法＞
将 HeLa S3 细胞铺板于 96 孔板中，每孔 2x104 个细胞，添加 100nM phorbol 12-myristate
13-acetate (PMA)，培养 24 小时。然后，分别用 PBS(-)洗涤 PMA 处理过的 12 个孔及未处理过
的 12 个孔中的细胞，用 SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)处理后，进
行 cDNA 的合成。以得到的 cDNA 为模板，使用 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code:QPS-101)，对 IL-6、IL-1β、β-actin 基因的表达量进行 Realtime PCR 分析。同样使用 A 公司的细胞处理试剂进行 Realtime PCR 分析。IL-6、IL-1β 基因的 Ct 值用 β-actin 基因进行校正（ΔCt）、计算出有无 PMA 处理的差值（ΔΔCt）。接着计算 Z’-factor，进行比较。

Z’-factor : 是将数据的误差考虑在内的、 高通量分析体系中质量标准的数值。一般认为在
0.5 以上是良好的结果。这里使用以下公司计算得到。
Z’-factor = 1-3 x 【ΔCt(+) 标准偏差 + ΔCt(-) 标准偏差)】/ |ΔΔCt|＜结果＞
A 公司试剂

35

35

30

30

25

25

Ct

Ct

本公司试剂

20

20

15

15
0

5

10

15

0

20

5

10

IL1β

IL6

15

20

well no.

well no.
ACTB

IL-1β

IL-6

β-actin16
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Ct(IL-6)

ΔCt(IL-6-β-actin)

PMA

平均

平均

标准偏差

ΔΔCt

Z'

本公司试

(+)

26.96

6.27

0.14

-3.85

0.62

剂

(-)

30.24

10.12

0.35

A 公司试

(+)

26.50

4.30

0.34

-3.88

0.59

剂

(-)

29.44

8.18

0.19

IL-6

Ct(IL-1βIL-1β）ΔCt(IL-1β-β-actin)

PMA

平均

平均

标准偏差

ΔΔCt

Z'

本公司试

(+)

28.62

7.93

0.15

-5.94

0.74

剂

(-)

33.99

13.87

0.38

A 公司试

(+)

28.00

5.80

0.47

-6.19

0.61

剂

(-)

33.26

11.99

0.34

结果表明：虽然两种试剂得到的 Z’-factor 都超过了良好分析体系的标准 0.5，但是使用本公司的SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)和 THUNDERBIRD® Probe qPCR
Mix (Code: QPS-101)试剂时，比其他公司的试剂得到了更高的 Z’-factor，可见是相对质量更高的分析体系。
3. 细胞裂解液在冰上稳定性的确认
<方法>
使用 SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)，分别从 4x104 个 HeLa S3 及U937 细胞制备细胞裂解液，将样品移至冰上以后，放置 0、1、2、3、4、7、24 小时后，取细
胞裂解液样品进行 cDNA 的合成。同样使用 A 公司试剂制备细胞裂解液，同样方法取样，进行
cDNA 的合成。以得到的 cDNA 为模板，使用 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code:QPS-101)，对 β-actin 基因的表达量进行 Realtime PCR 分析。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司<结果><HeLa S3>

<U937>
U937

25

40

20

35

15

30

Ct

Ct

HeLa

10
5

25
20

0

15
0

10

20

0

on ice (hr)
A社試薬(β-actin)

1020

on ice (hr)
A社試薬(β-actin)

弊社試薬(β-actin)

弊社試薬(β-actin)

HeLa S3 细胞时，在冰上放置 2 小时，未见到 Ct 值有显著的差异。然而，RNase 活性较强的
U937 细胞，在冰上超过 2 小时，则可以见到 Ct 值的差异。

细胞的种类及处理细胞的数量较多时，定量 PCR 的结果有可能受到较强的 RNase 活性的影响。细胞裂解液制备后，建议迅速将样品置于冰上或 4℃进行 cDNA 的合成以避免 RNA 的降解。另外，根据需要，推荐对使用的细胞进行预实验。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[7] Trouble Shooting
现象

原因

对策
・过多的细胞来源的组分，有时会抑制 RT 反应或细胞数过多qPCR 反应。请减少铺板的细胞数，或将裂解液用 Lysis
Solution : Stop Solution = 5:1 的混合液稀释后，再添
加到 RT 反应中。
・因细胞的种类不同，有时 RNase 的活性会较强，裂
解液中的 RNase 不能完全失活。遇到这种细胞时，推荐细胞裂解后，将裂解液移至冰上，立刻进行 RT 反应，转化为 cDNA。一般细胞株的裂解液在冰上放置 2 小时左右是稳定的。
・样品数量较多、添加 Lysis Solution 5 分钟后，添加RNA 发生降解

Realtime PCR 中没

Stop Solution 比较困难时，请将样品移至冰上进行等

检测到信号，或检测待。

延迟・保存裂解液时，请冻存于-80℃并尽量减少冻融次
数。
・请使用新制备的细胞。要冻结保存分析用的细胞时，培养后，请用 PBS(-)进行洗涤，将 PBS(-)从细胞中弃去，于-80℃冻结。
・虽然用本产品得到的 RT 反应液，即使以最大 15%
的比例添加到 qPCR 反应液中，也可以确认对线性没逆转录反应液添加过

有影响，但根据所用 qPCR 试剂的性质不同，这个允

多许量有可能下降。请减少逆转录反应液的添加量。
・使用本产品以外的 RT 试剂时， 带入 qPCR 反应的
允许量有可能发生变化。请先进行预实验。

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定量性能低细胞裂解时没有混合 ・添加 Lysis Solution、Stop Solution 后，请充分混合，均匀

不要产生搅拌不均匀。

[8] 相关产品
产品名称各种荧光探针・荧光引物检测用 Realtime PCR 试剂

容量

Code No.

1.67mlx3

QPS-101(200 次用)

THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix
高效率 SYBR® Green I 检测体系用 Realtime PCR 试剂

1.67mlx3

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix(200 次用)

1-step qRT-PCR kit （TaqMan®分析・Probe 分析用）

0.5mlx5

RNA-directTM Realtime PCR Master Mix(100 次用)

1-step qRT-PCR kit （SYBR® Green I 分析用）

0.5mlx5

RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(100 次用)

QPS-201

QRT-101

QRT-201

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