Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 19, No. 1, 67–72, 2019

原著論文（通常論文）

Phellinus linteus 菌糸体の培養と免疫賦活能
Culture of Phellinus linteus Mycelium and Immunostimulatory Activity
長山純子 1，斎藤貴 2*

Junko Nagayama and Takashi Saito
12

神奈川工科大学大学院工学研究科 〒 243–0292 神奈川県厚木市下荻野 1030
神奈川工科大学工学部応用化学科 〒 243–0292 神奈川県厚木市下荻野 1030
* TEL: 046–291–3113 FAX: 046–291–3113* E-mail: saito@chem.kanagawa-it.ac.jp
1
Graduate School of Engineering, Kanagawa Institute of Technology,1030 Shimoogino, Atsugi, Kanagawa 243-0292, Japan2Kanagawa Institute of Technology Department of Applied Chemistry,1030 Shimoogino, Atsugi, Kanagawa 243-0292, Japan（原稿受付2018 年 9 月 3 日／ 2019 年 1 月 17 日）

Phellinus linteus of basidiomycetes has been found to have a high antitumor activity, but it is not practical because it requires a long time to form fruiting bodies. When 5.0×10–3 vol% of Ginkgo biloba leaf extract as a growth promoter wasadded into a culture medium, the amount of mycelia produced increased about 4 times as compared to that not added. It
was revealed that the Ginkgo biloba leaf extract is effective as a factor of promoting growth of Phellinus linteus mycelium.
When macromolecular polysaccharides was treated with macrophages, the cells are activated, and finally tumor necrosis
factor and NO are produced. Therefore, NO production ability was used as an indicator to evaluate immunostimulatory activity. As a result, it was found that the Phellinus linteus mycelium have a high NO production ability in those extracts at 60
to 70°C, which was 10.4 to 10.6 μM.
キーワード：メシマコブ，ギンコライド，菌糸体，免疫賦活活性
Key words: Phellinus linteus, Ginkgo biloba, mycelium, immunostimulatory activity

1.

緒

言

いくつかの薬用キノコの熱水抽出物がマウス腹水腫瘍細胞であるサルコーマ 180 に対しての抗腫瘍活性を持つ 1) ことが報告されて以来，キノコの持つ抗腫瘍活性に注目が集まっている。
メシマコブ（Phellinus linteus）はヒダナシタケ目タバコウロコタケ科キコブタケ属のキノコで，桑の木に選択的に寄生する木材腐朽菌の一つである。漢方薬物名では桑黄と呼ばれ，古くから薬用として用いられてきた。
近年では Phellinus linteus の持つ生理活性に対する研究が進み，Phellinus linteus が抗腫瘍活性を有し 2)，マウス皮膚二段階発がんを抑制することが報告されている 3)。また，血糖値上昇抑制効果を有することも明らかとなっており，糖尿病の予防に有効であることも示唆されている 4)。しかし近年，養蚕産業の減少と共に桑の樹木 が 減 少 し， 子 実 体 の 入 手 が 困 難 と な っ て い る。
Phellinus linteus 子実体は多年生のため人工栽培が困難であり，通常 10 cm 程度に成長するには約 10 年程度要すると言われている。しかし，担子菌類は固形培地を用いた子実体誘発に関する研究は行われているが 5)，液体培地での大量培養に関する実施例は報告されておらず，培養条件の検討も見られない。
一方，細胞に対してある種の植物抽出物が成長促進効果を示すという例が知られている。例えば，植物抽出物が蚕の成育に与える影響について調査した報告 6) があり，これによると一部の植物抽出物は蚕の成育を促進させる効果を持つことが認められている。しかし，植物抽出物を菌糸体培養に応用した例は見受けられない。イチョウ葉（Ginkgo biloba leaf）は一般にヒトに対して抗酸化作用，血液凝固抑制作用，脳機能障害の改善など高い生理活性を有していることが知られている 7,8)。そこ
で，イチョウ葉抽出物の様々な生理活性能によって，通常生育が遅い Phellinus linteus のような菌糸体の成長を促進させることができるものと考え，培養時の添加効果について検討した。また，得られた条件で生育した
Phellinus linteus 菌糸体の免疫賦活能を評価した。

長山，斎藤682.
2.1

菌糸体および実験方法

供試菌株

Phellinus linteus NBRC6989 株は，（独）製品評価技術
基 盤 機 構 よ り 分 譲 さ れ た も の を 使 用 し た。 こ のPhellinus linteus 菌糸体の外観を走査型電子顕微鏡を用いて観察したところ，その菌糸体の直径は 0.8〜3.0 μmで，菌糸体組織は糸状の組織構造を有し，多数分岐していることが認められた。
2.2

培地と培養方法

Phellinus linteus 菌糸体の液体培養に適した培地を決定するため，一般に担子菌培養に用いられているペプトン培地，麦芽培地，酵母培地，麦芽・酵母培地の 4 種類の培地を用いて菌糸体生育への影響を調査した。
ペプトン培地（D(+)-グルコース 20 g/L，Bacto TMPepton
5 g/L，粉末酵母エキス 2 g/L，硫酸マグネシウム七水和物 5 g/L， リ ン 酸 二 水 素 カ リ ウ ム 10 g/L）， 麦 芽 培 地（麦芽エキス乾燥粉末 20 g/L），酵母培地（D(+)- グル
コース 10 g/L，粉末酵母エキス 2.5 g/L）
，麦芽・酵母培地（麦芽エキス乾燥粉末 20 g/L，粉末酵母エキス 2 g/L）
を 121°C で 20 分間滅菌して実験に用いた。滅菌後，放冷した各培地に，あらかじめマツタケ培地 9) で平面培養した菌糸体を直径 5 mm の円状に打ち抜き，この菌糸体ディスクを上述の各培地に植菌した。30°C，暗所下，振とう数 100 rpm の条件で 10 日間培養を行い，培養終了した菌糸体を回収して純水で洗浄し，凍結乾燥を行い得られた菌糸体の乾燥質量を測定した。
2.3 培養条件
前述の 2.2 項の 4 種類の培地種の中で Phellinus linteus
菌糸体の生育量（乾燥質量）が最も高かった麦芽・酵母培地を用いて培養条件の検討を行った。
生育に対する pH の影響に関する実験では，1M-NaOHと 1M-HCl を用いて pH 4〜8 の範囲で培地の pH を調整した。菌糸体の生育に対する温度の影響に関する実験
では，培地を初発 pH 7 に調製し 25°C から 35°C までFig. 1.

5°C 毎に温度設定して，菌糸体の生育を観察した。また，天然植物抽出物添加による成長促進効果の検討に際しては，培養温度 30°C，初発 pH 7.0 の麦芽・酵母培地を用い，イチョウ葉総活性エキス（バイオ薬品株式会社）を 0.001〜0.05 vol％の範囲で添加した。
2.4

免疫賦活能の評価

麦芽・酵母培地を用いて Phellinus linteus の液体培養を行い，得られた菌糸体（3 g）を 10 倍量の純水（30 mL）に加え，25〜100°C の異なった抽出温度で抽出した。得られた抽出液を凍結乾燥したところ，褐色状の粉末を得た。この褐色状の粉末抽出物 0.1 g を純水に溶解して全量 10 mL に定容し，グリース法 10) にて NO 産生能の測定に用いた。
3.
3.1

結果および考察

培地種の比較

ペプトン培地，麦芽培地，酵母培地および麦芽・酵母培地の各培地ごとに生育した菌糸体の乾燥質量を比較した。その結果，麦芽・酵母培地において菌糸体の生育量が最も高く，麦芽培地，ペプトン培地および酵母培地に対して，それぞれ，1.5，1.9 および 2.0 倍の菌糸体が得られることが明らかとなった（Fig. 1）。
3.2

培養条件

（1）培地の初発 pH が菌糸体の生育に与える影響
担子菌の生育に伴う最適 pH，発育可能な pH 範囲などは菌種によって異なり，Phellinus linteus 菌糸体に関して至適 pH が 5.5 である報告 11) や，4.0 である報告 12)などが見られる。そこで本法では，初発 pH 4〜8 の範囲で菌糸体生育における至適初期 pH の検討を行った。
比較を行った培地種の中で最も生育が速かった麦芽・酵母培地を用いて，初期 pH が菌糸体の生育に与える影響を調べた。麦芽・酵母培地の初発 pH を 4〜8 の間で15 日間菌糸体を培養して生育量を比較したところ，いずれの pH 域でも生育が認められ，特に pH 7 においてEffect of culture medium on growth of Phellinus linteus mycelium for 10 days.

Phellinus linteus 菌糸体の培養と免疫賦活能

69Fig. 2. Effect of initial pH for medium on growth of Phellinus linteus mycelium.
Mycelium growth at pH 4 (black squares), pH 5 (black circles), pH 6 (black triangles), pH 7 (white squares) and pH 8 (white circles).

Fig. 3. Effect of culture temperature on growth of Phellinus linteus mycelium.
Mycelium growth at temperature 25°C (black squares), 30°C (black circles), and 35°C (black triangles).

生育が最も速いことが分かった（Fig. 2）。このことから，麦芽・酵母培地を用いた Phellinus linteus 菌糸体の液体培養においては，初期 pH 7 が最も培養に適していることが明らかとなった。
（2）培養温度の影響
担子菌の種類により生育に適した至適温度があり，近縁種であるカバノアナタケ（Fuscoporia obliqua）の至適温度は 25°C 13)，サナギタケ（Cordyceps militaris）は28°C 14)，マンネンタケ（Ganoderma lucidum）は 30°C 15)と報告されている。そこで，Phellinus linteus 菌糸体に関して，25〜35°C の範囲で最適な培養温度の検討を行った。
最も生育が速かった初期 pH 7 の麦芽・酵母培地を用いて培養至適温度の調査を行った。pH 7 に調製した麦芽・酵母培地を用いて異なった培養温度で培養を行った結果，25°C から 35°C までの範囲で生育が認められ，特に30°C において生育が最も速いことが分かった（Fig. 3）。
一方，35°C で成長の急激な低下が確認された。
3.3

イチョウ葉抽出物の添加効果と至適濃度菌糸体の培養時に生理活性の高い物質を加えることにより，菌糸体の生育に関わる代謝を高め，成長を促進させることができるものと考えた。そこで，生理活性の高い植物としてイチョウ（Ginkgo biloba）に着目した。イチョウ葉はヒトに対し，抗酸化作用，血液凝固抑制作用，脳機能障害の改善などの高い生理活性を持っていることが知られている 7,8)。
麦芽・酵母培地において，初期 pH 7，30°C で培養した際のイチョウ葉抽出物の Phellinus linteus 菌糸体への成長促進効果を検討したところ，培地に対する抽出物の含有率が 0.005 vol％において菌糸体の生育量が最大となったことから，0.005 vol％が至適濃度であることが明長山，斎藤70

Fig. 4.

Effect of addition of ginkgo biloba leaf extracts on culture for 10 days.

Fig. 5. Change of growth for Phellinus linteus mycelium culture addition Ginkgo biloba leaf extracts.
Mycelium growth at 0.005 vol% of ginkgo biloba leaf extracts (black circles) and without extracts (black squares).

らかとなった（Fig. 4）。生育量の経時変化を確認したところ，培養開始から 6 日間までは菌糸体の生育はほとんど認められなかったが，培養開始から 10 日後にはイチョウ葉抽出物を 0.005 vol％添加した菌糸体が無添加のものと比較して 2.5 倍，19 日後では 3.8 倍となることが分かった（Fig. 5）。このことから，イチョウ葉抽出物がPhellinus linteus 菌糸体に対して効果的な成長促進作用を持つことが明らかとなった。
3.4

Phellinus linteus 菌糸体が細胞に与える NO 産生能

菌糸体内にはヒトの恒常性を高める高分子多糖類が含まれている。この高分子多糖類はマクロファージの一酸化窒素合成酵素（NOS）の発現を誘導し，産生された一酸化窒素（NO）には細菌やがん細胞を除去する効果があることが知られている 16)。このことから，菌糸体抽出物とマウスの細網肉腫の腹水より樹立されたマクロファージ細胞株である J774.1 細胞（JCRB 細胞バンク）を用いて一酸化窒素産生を指標とした免疫賦活能の評価を行った。
マクロファージが活性化することにより，生体本来が持つ生体恒常性維持能力が高まる。そのなかでもマクロファージの NO 産生能は，細菌やウイルスなどの異物を排除する時に亢進する。そこで今回は，マクロファージ細胞株 J774.1 の NO 産生能を評価することで抽出物の有する自然免疫に対する機能を評価した。
初期 pH 7 の麦芽・酵母培地にイチョウ葉抽出物を0.005 vol％添加し 30°C で 20 日間培養した菌糸体を，25〜100°C で抽出した。得られた Phellinus linteus 菌糸体抽出物の NO 産生能をそれぞれ測定したところ，60〜70°C における抽出物において NO 産生能が高く，10.4〜10.6 μM と な っ た（Fig. 6）。 ま た，Phellinus linteus
抽出物は 25°C 抽出では 0.6 g，60°C では 0.7 g 得られ，高い抽出温度ほど抽出物量が増大することが認められた。
Phellinus linteus 菌糸体と同条件にて培養を行った

Phellinus linteus 菌糸体の培養と免疫賦活能

Fig. 6.

71

NO productivity for mycelium extracts which obtained under different extraction temperatures.

4.

結論

Phellinus linteus 菌糸体の培養に最適な培地は，麦芽・酵母培地であり，最適な初発 pH は 7.0 であることが明らかとなった。培養時の至適温度は 30°C であり，35°Cでは生育阻害を起こすことが分かった。成長促進剤としてイチョウ葉抽出物を培地に添加したところ，0.005 vol％濃度の際に高い成長促進効果があることが認められ，未添加のものと比較して 3.8 倍菌糸体量が増加することが分かった。
Phellinus linteus 菌糸体抽出物が示す抗腫瘍活性について NO 産生能を指標として評価したところ，本菌糸体では 10.4〜10.6 μM が得られ，他のキノコ類と比較すると高い NO 産生能を J774.1 細胞に与えることが明らかとなった。
文
Fig. 7. Comparison of NO productivity with other mycelium extracts.

スエヒロタケ（Schizophyllum commune），カワラタケ，コフキサルノコシカケ（Ganoderma（Trametes versicolor）
applanatum），カバノアナタケ（Inonotus obliquus）菌
糸体を 60°C にて抽出を行い NO 産生能を測定した。
その結果，Schizophyllum commune 菌糸体抽出物の8.3 μM と比較しても Phellinus linteus 菌糸体は約 1.3 倍高い NO 産生能を示した（Fig. 7）。一方，キノコ子実体の NO 産生能では，マイタケ（Grifola frondosa）では6.6 μM，シイタケ（Lentinula edodes）では 9.2 μM である 17) ことから，他のキノコ類と比較しても Phellinus
linteus 菌糸体抽出物はマクロファージの NO 産生能を増強させる効果を有するため，自然免疫向上に効果があることが示唆された。

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