Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 6, No. 2, 93–103, 2006ƷἕƷƷ◻⾷ᣀ⮥⾸Ʒ൮᧯ᢼᑿ⃆ȡ᧸ǓǮɲȸɓɻ΢ո੿‫⴫↽ك‬ᅒ‫ك‬۰ᢼǚȘǽᄽ╄ɥɲɦʀ‫ڤ‬ᄦǽ᧯᧳Ƿⶲᑿ⃆මɥɲɦʀ⫳᫘ȇǽ࿆༦
Production of Novel Polymer-Based Material from Lignin Derivatives by Microbial Function
大塚祐一郎1*，中村

雅哉1，大原

誠資1，片山義博2

YUICHIRO OTSUKA, MASAYA NAKAMURA, SEIJI OHARA, YOSHIHIRO KATAYAMA

重原淳孝2，政井英司3，福田雅夫3

KIYOTAKA SHIGEHARA, EIJI MASAI and MASAO FUKUDA
1

独立行政法人森林総合研究所 〒305–8687 茨城県つくば市松の里1
東京農工大学大学院生物システム応用科学研究科 〒184–8588 東京都小金井市中町2–24–16
3
長岡技術科学大学工学部 〒940–2188 新潟県長岡市上富岡町1603–1* TEL: 029–829–8282 FAX: 029–873–3797* E-mail: yotuka@ﬀpri.aﬀrc.go.jp
1
Department of Applied Microbiology, Forestry and Forest Products Research Institute, 1 Matsunosato, Tsukuba, Ibaraki
305–8687, Japan
2
Graduate School of Bio-Applications and Systems Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology,
2–24–16 Nakamachi, Fuchu, Tokyo 184–8588, Japan
3
Faculty of Engineering, Nagaoka University of Technology, 1603–1 Kamitomiokamachi, Nagaoka, Niigata 940–2188, Japan2

ȵʀɷʀɑ：リグニン，Sphingomonas paucimobilis SYK-6，2-ピロン-4,6-ジカルボン酸，代謝工学，バイオマテリアル
Key words: lignin, Sphingomonas paucimobilis SYK-6, 2-pyrone 4,6-dicarboxylic acid, metabolic engineering, bio-material（原稿受付2006年10月19日／原稿受理

1.ƷǾ ǧ Ȑ Ǻ
21世紀に入ってから地球規模で環境調和型社会・資源循環型社会の確立が盛んに叫ばれ，世界各地で様々な取り組みや研究が行われている。この中で化石資源からの脱却が特に重要な課題として議論されている。20世紀における化石資源の利用は産業を飛躍的に押し上げ，我々の生活を豊かなものにしてくれた。しかし，我々の生活圏とは隔離された地下深くに存在する化石資源を掘り出し，利用することは CO2 の増加や環境破壊など様々な問題を引き起こしている。この問題を解決する手段として注目を集めているのが，バイオマス資源の利用である。
バイオマスは我々の生活圏の中で生産・分解を繰り返し，
循環している。したがって，我々がその中で利用と廃棄を繰り返しても，その総量は変化しないため，環境にやさしい資源循環型の社会が構築できると考えられている。
バイオマス資源のうち地球上で最も多量に存在するものは植物バイオマスである。地球上における総陸地面積の30％は森林で覆われており，全バイオマスの90％に相当する 1 兆6500億トンのバイオマスが蓄積しているといわれている34)。毎年地球上では約1500億トンのバイオマ
スが生産されるが，その内の約1000億トンは陸上におい2006年11月25日）て生産されている。陸上で生産されるバイオマスの内，約650億トンは森林地帯にて，また150億トンは草地にて生産されており，このことから植物バイオマスとしては年間約800億トンものバイオマスが生産される。
植物バイオマスはこれまでに我々の生活において，木材，紙として昔から利用されてきた。この植物バイオマ
スを分子レベルで高度に利用することができれば，最終的には石油由来製品の95％までカバーし得るとの報告が近年なされている5)。さらに Goldstein の報告では，現在生産されている石油化学由来の製品（プラスチック，
合成繊維，合成ゴム等）を植物バイオマスから製造する
場合，変換効率，工程ロス等を換算し，目的物質の3.25倍の森林資源でまかなう事が可能であるとしており，年間30〜40億トンの原油採掘量に比較して，植物資源の年間生産量が約800億トンであるということから，その量的ポテンシャルは十分なものを秘めていると考えられる。
植物バイオマスの内訳を見てみると，その90％以上が細胞壁成分で占められている。その細胞壁成分のうち，約40％がセルロース，約20~30％がヘミセルロース，
15~30％がリグニンで構成されている（図 1 ）。このうち，セルロース，ヘミセルロース等の多糖類においては，紙やパルプの原料，キシリトール等の甘味料や医薬品等

94

大塚

他

図 1 ．植物バイオマス。
植物体乾燥重量の90％以上を細胞壁成分が占める。また，
細胞壁成分のうち，セルロースが40％，ヘミセルロースが20％，リグニンが15〜30％を占める。

様々な分野で高度な利用技術が確立されている。また，
近年ではこれら多糖類から燃料用アルコールを生産する
技術開発が盛んに行われている2,6,11,22)。このように，植物バイオマスの主要構成成分のうち，セルロース，ヘミ
セルロース等の多糖類は十分利用されてきているにもかかわらず，15~30％を占めるリグニンについては，製紙工場において燃料として利用されている以外はそのごく一部が香料として利用されているのみで，ほとんどは廃棄されている現状にある。
本総説においては，この未利用バイオマス資源であるリグニンに焦点を当て，我々の研究グループが提案する次世代型リグニン利用技術について述べていきたい。
2.Ʒɲȸɓɻ‫ڽ‬ȂǢțȍǶǽ֐᧸ཪ⒈
リグニンは地球上で最も多量に存在する芳香族高分子
バイオマスであり，自然界に供給される芳香族化合物の大半は植物リグニン由来であると考えられている。しかし，その膨大な存在量にもかかわらず，これまでリグニンの高度利用技術はほとんど確立されていない。その原因としては，リグニンの構造の複雑さにある。自然界に存在するリグニンは，コニフェリルアルコール，シナピ
ルアルコール，p-クマリルアルコールの 3 種類のモノリ
グノールがペルオキシダーゼの脱水素反応によって生じたフェノキシラジカル共鳴体が重合して生成し，3 次元網状構造を持つ。その構造は安定な C-C 結合や C-O-C結合からなるために非常に難分解性である。図 2 にリグ
ニンのモデル構造を示す。このように，リグニンは非常に複雑な高分子構造を形成しているために，利用技術が確立されてこなかったといえる。しかし，近年ではこのリグニンの高度利用を目的とした様々な研究開発が行われている。
製紙工場などにおいては，パルプを生産する際に多量のリグニンが分離される。クラフトパルプ法によって生成したクラフトリグニンはそのまま燃焼・廃棄することによりエネルギー回収されている。サルファイトパルプを生産することにより生成するリグニンスルホン酸は，
コンクリート減水剤や染料分散剤としての利用が多い
が，近年では鉛蓄電池の負極添加剤等高付加価値を狙った利用法の開発も進んでいる35)。しかし，これらの利用
法は製紙過程における副産物としてのリグニンスルホン酸に対して行われている利用研究であり，化学修飾によってある程度の付加価値をつけることには成功しているが，優れた特性を持つ物質の開発には至っていない。
近年では膨大な未利用バイオマスとして，リグニンをターゲットにした利用研究も盛んに行われてきている。

図 2 ．リグニンのモデル構造。
リグニンはモノリグノールのランダムな脱水素重合によって生成されるために，C-C 結合や C-O-C 結合を多く含む非常に複雑な三次元網状構造を形成している。

その中の代表的な研究としては，舩岡らの相分離系変換
システムからの溶媒抽出操作により得られるリグノフェ
ノールの応用がある。具体的には，任意のフェノール物
質を添加した植物細胞壁成分（リグニンと多糖類の複合体）に72％硫酸を添加し，攪拌することにより，セルロー
スを水相に，リグニンを添加したフェノール相に移行させ分離する。このとき添加したフェノール物質と酸水溶液の境界面での作用により 1,1-ビス（アリール）プロパ
ン型構造を基本ユニットとするリグノフェノールが生成する（相分離系変換システム）。これにより，フェノー
ル相を回収することによりリグノフェノール画分を容易に抽出・分離することが可能となるだけでなく，添加するフェノール物質の構造を変化させることにより，得られるリグノフェノールの機能性にバリエーションを持たせることが可能である。舩岡らはこの方法により，様々なリグノフェノールを作成し，コーティング剤，機能性塗料，バイオポリエステルとの複合プラスチックなどの開発に取り組んでいる36)。
また，この他にリグニンの利用を目的として Xiang
らの報告33) にあるようなリグニン低分子化処理技術の開発もいくつか行われている。彼らの報告では，アルカ
リ条件下での酸化分解により，高分子芳香族物質である
リグニンを高い割合で低分子化することができ，バニリ
ン，シリンガアルデヒド，バニリン酸，シリンガ酸に変換することができるが，得られた芳香族混合物を高度に利用するシステムの確立には至っていない。

リグニン低分子化芳香族物質からのポリマー原料生産95

図 3 ．植物バイオマスの高度利用戦略。
植物バイオマスから多糖類とリグニンを分離し，多糖類からは発酵によりアルコールや水素ガス・メタンガス等のバイオ燃料に，リグ
ニンからは低分子化処理した後，微生物発酵によりポリマー原料となる物質を生産できれば，化石資源の高度利用システムに匹敵するバイオマス高度利用技術が確立できると考えられる。

3.Ʒᓎˌͦࢪɲȸɓɻⶲಏ֐᧸༦ᨪ
以上のことから，これまでに行われてきたリグニン利
用研究は，製紙過程で発生するリグニンスルホン酸やリ
グノフェノール等があるが，これらはいずれも高分子芳香族物質であるリグニンを高分子物質のまま，その物性を保持しつつ利用する方法である。これらの利用技術は，リグニンをリグニンとしての優れた特性を生かしつつ，
さらに化学修飾により高付加価値をつけ利用する技術であるが，逆にリグニンとしての特性に縛られた限定的な利用技術になりかねないとも言える。それでは，膨大に存在する未利用バイオマスであるリグニンを，高度に利用する技術としてどの様な観点で開発していく必要が有るのだろうか？我々の生活において，現在工業的に非常に高度に利用されている化合物を考えてみると，圧倒的に石油由来の物質が多いことがわかる。図 3 に示すように，地中深くから採掘された原油は様々な有機物の混合物であるが，蒸留精製によりそれら一つ一つが精製され，それらを高度に利用するシステムが確立している。特に燃料として使用できない芳香族物質混合物を高度に利用できるようになったのは，この蒸留精製システムが大きく貢献している。すなわち，石油が高度に利用されている最大の要因は，混合物から物質の一つ一つを化成品の原料として利用可能なまでに精製し，そこから自由に設
計・合成が可能であるという点にある。従って，我々はこの石油の高度利用技術に倣って，例えば Xiang らが報告しているリグニン低分子化技術33) によって生成するリグニン低分子化芳香族混合物をファインケミカルス
製造の原料として利用可能な物質に変換・生成することができれば，リグニンの高度利用が可能になると考えた。
そこで，芳香族物質を分解する微生物に着目した。土壌中に存在する無数の微生物群の中には，低分子化リグ
ニン芳香族混合物を網羅的に資化し，二酸化炭素と水にまで完全に分解できるバクテリアが存在する3,4,10,16,20,21,27)。
これらのバクテリアは，リグニン由来の芳香族物質を対象にした代謝機能を永い進化の過程で獲得してきた。これらバクテリアは，リグニン関連の芳香族物質を複雑な代謝経路で分解してエネルギーを得るだけでなく，生命活動の維持に必要な DNA やタンパク，脂質などを合成している。すなわち，これらのバクテリアは，リグニン
低分子化芳香族物質を我々が考えもつかないような複雑且つ精密な代謝システムにより高度に利用しているといえる。もし，このような微生物機能を代謝工学技術により利用することができれば，リグニン低分子化芳香族混合物から有用な物質を生産・精製することができると期待される。そして，それにより，これまで成し遂げられなかったリグニンの高度利用技術が確立される可能性も考えられる。また，近年植物バイオマス由来のセルロー
ス・ヘミセルロース等の多糖類からの微生物発酵によるバイオ燃料生産技術の開発が盛んに行われている。さらにリグニン低分子化芳香族混合物からポリマー原料となる物質を生産することができれば，図 3 に示すように，膨大な存在量を誇る植物バイオマスから，石油の高度利用技術に代替できるバイオマス利用技術が確立できると考える。
4.Ʒɲȸɓɻ΢ո੿‫⴫↽ك‬ᅒᚆ۰ᢼո╫ẫ≗
Sphingomonas pucimobilis SYK-6
S. paucimobilis SYK-6 株 は， パ ル プ 廃 液 中 か ら
5,5'-dehydrodivanillic acid (DDVA) の分解菌として単離されたグラム陰性細菌である。DDVA はビフェニル型の

96

大塚

他

図 4 ．Sphingomonas paucimobilis SYK-6 の分解代謝経路。
既に獲得及び解析されている機能遺伝子は矢印に示している。SYK-6 は様々なリグニン由来の二量体・単量体芳香族化合物をことごとく PDC を経由して分解・資化することができる。

リグニンモデル化合物であり，縮合型構造のため難分解性とされている。その後，分解能の解析が行われた結果，
S. paucimobilis SYK-6 株は，リグニン由来の単量体でありシリンギル骨格の核であるシリンガ酸 (SA)，グアイ
アシル骨格の核であるバニリン酸 (VA) をはじめ，二量体化合物であるビフェニル，β-アリールエーテル，ジア
リールプロパンなど様々なリグニンモデル化合物を炭素源として生育できることが明らかとなった16,23,24)。さらに各リグニンモデル化合物の分解経路が解明され，β-ア
リールエーテル型二量体化合物グアイアシルグリセロー
ル β-グアイヤシルエーテルの分解機構においては，政井らの研究により Cα-dehydrogenase (ligD) によって Cα位がカルボニル型に変換された後，β-etherase (ligE, F)
により特異的に β-アリールエーテル結合が切断されることが明らかとなった12–15)。近年では SYK-6 のゲノム上には立体異性体特異的な複数の β-etherase が存在することが判明し，その機能についても詳細に解析されている18)。また，4,5-cleavage pathway の律速となる VA, SA
に対する demethylase（ligM, desA 遺伝子産物）がテト
ラヒドロ葉酸依存型の demethylase であることが明らかにされ1,19)，さらにこの demethylase により脱メチル化された後のメチルは C1 代謝経路により，アミノ酸合成や
DNA 合成に必須な要素として利用されていることが明らかにされた31,32)。脱メチル機能によって生じるプロト
カテキュ酸 (PCA) は，PCA 4,5-dioxygenase によって4-carboxy-2-hydroxymuconate-6-semialdehyde へと代謝され，このものは 4-carboxy-2-hydroxymuconate-6-semialdehyde dehydrogenase によってさらに下流の代謝物へと代謝される7,8)。PCA 4,5-dioxygenase をコードする遺伝子
ligA, B， 及 び 4-carboxy-2-hydroxymuconate-6-semialdehyde dehydrogenase をコードする遺伝子 ligC が発見され，これら 3 つの遺伝子はクラスターを形成していること が 明 ら か に さ れ た。 ま た 4-carboxy-2-hydroxymuconate-6-semialdehyde dehydrogenase に よ る 代 謝 産 物 は2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid (PDC) であることが明らかにされた17)。現在までに明らかとなっている SYK-6 のリグニン低分子化芳香族物質分解代謝経路を図 4 に示す。この代謝図を見ると，SYK-6 はリグニン低分子化
芳香族混合物に含まれる二量体・単量体の芳香族物質をことごとく分解・資化することが可能であり，さらにこれら様々な芳香族物質は PDC という一つの物質に収斂した後，完全分解されていることがわかる。すなわち，
これまでの研究によって明らかにされてきた SYK-6 株
は，長い進化の過程で様々なリグニン低分子化芳香族混合物を一旦 PDC に変換することにより生命活動に必須な炭素骨格を作り出す機能を獲得してきたといえる。
我々はこの中間代謝物である PDC に着目した。PDC
はピロン環に 2 つのカルボキシル基がついた化合物であるが，カルボキシル基という腕を 2 つ持つためにポリマ ー 化 が 可 能 で あ る。 さ ら に PDC は ① 分 極 性 の 強
い 3 つのカルボニル基，②弱アルカリ・生分解性を受けやすいラクトン部分，③共役二重結合，等の特徴的な極性剛直構造を有する。PDC 骨格を有するポリマーは，剛直環構造からなり親疎水性であると同時に，容易なラクトン環の加水分解開裂，共役二重結合の酸化・水和開裂などが予想できるため生分解性高分子材料として期待できる。図 5 に示すような PDC を単位に含むポリアミ
ドやポリエステル，ポリウレタン等は，生分解性を保持したまま幅広い物性を発現でき，例えば PET と同等品の合成も可能である。よってこの微生物機能と物理化学的リグニン低分子化技術を組み合わせることにより，リグニンから PDC へ変換する事が可能であり，まさにリグニン低分子化芳香族物質からのポリマー原料生産97

図 5 ．PDC を骨格とした様々なポリマー物質。
PDC をファインケミカルスとして利用可能なレベルで獲得できれば，このように自由な分子設計・合成が可能になる。

我々の目指す石油化学物質に代替可能なレベルでのリグ
ニン高度利用技術の確立が可能になると考えられる。
5.Ʒ൮᧯ᢼᑿ⃆ȡ᧸ǓǮ PDC ᧯᧳ȿɁɎɨǽᐦ᷂ 1
⾷PCA ǚȘǽ PDC ᧯᧳ȿɁɎɨ⾸SYK-6 の代謝経路を利用した PDC 生産システムを確立するためには，非常に生育が遅く扱いにくい SYK-6の代謝機能を生育が早く扱いやすい宿主に導入し，高発現させることが必要である。そこでまず，PDC を代謝工学により安定に生産することが出来るかどうかを検討するために，PCA から PDC へと変換する PCA 4,5-dioxygenase 及び 4-carboxy-2-hydroxymuconate-6-semialdehyde (CHMS) dehydrogenase をそれぞれコードする ligABと ligC を，PCA を細胞内に取り込むが代謝できない
mutant である Pseudomonas putida PpY1100 に導入し，PDC の蓄積が可能であるか，また PDC を高生産できるかどうかを検討した。
まず，SYK-6 株のゲノムライブラリーから ligABC を獲得し，広宿主域高発現ベクター pKT230MC に導入し，
pDVABC を得た。P. putida PpY1100 に pDVABC を導入した transformant を P. putida PpY1100/pDVABC と命名した。P. putida PpY1100/pDVABC は succinate を単一炭素源として生育できる。0.2％ succinate を含む W medium で P. putida PpY1100/pDVABC を前培養し，そこに15 mM の PCA を添加し更に培養したところ，310 nmに最大吸収を持つ物質が蓄積していることが明らかとなった。また，蓄積した物質を精製し，1H-NMR で分析した結果，確かに PDC が蓄積していることが明らかとなった。この結果から，pDVABC 上の PCA 4,5-dioxygenase と CHMS dehydrogenase は P. putida PpY1100/
pDVABC 内において活性型で発現し，PCA から PDCを生産・蓄積できることが明らかとなった。しかし，添加した PCA の全てが PDC に変換されることはなく，その変換は24時間以内で停止してしまった。
Succinate 単一炭素源培地において PCA から PDC への変換が完全に進行しない原因として，酵素の活性に問題があると考えられた。酵素活性の維持には，安定なタンパクの生産だけでなく，補因子の存在が必要である。
PCA 4,5-dioxygenase は外因の補因子を必要としないが，CHMS dehydrogenase は補酵素として NADP+ を必要とすることが明らかとなっている。P. putida PpY1100/
pDVABC 内で十分量の NADP+ を供給させるには，細胞内で解糖系を強く発現させ細胞内活性を高めることにより達成できると考えた。そこで，P. putida PpY1100/
pDVABC を glucose 単一炭素源培地にて培養し，そこに15 mM の PCA を添加して更に培養したところ，24時間で添加した PCA は完全に代謝され，PDC に変換された。
このことから，glucose を炭素源とすることにより，細胞内で解糖系が働き，NADP+ が十分供給されることにより，PCA が完全に PDC へと変換されることが強く示唆された。
P. putida PpY1100/pDVABC は glucose 炭素源培地にて 15 mM の PCA を完全に PDC へと変換し蓄積できる
ことが明らかとなった。そこで，さらに大規模なスケー
ルで大量に PDC を生産することが出来るかどうか検討した。前培養した P. putida PpY1100/pDVABC を 5L の
glucose 炭素源培地で OD660 が13.0になるまで培養した。
そこに 10％ (w/v) の PCA 溶液をぺリスタポンプを用
い，43.3 ml/h の 流 量 で 6 時 間 添 加 し た。 結 果 的 に，
50 g の PCA を添加したことになる。吸光度計を用いてPCA から PDC への変換をモニタリングしたところ，
PCA 添加開始36時間後には，添加した PCA はほぼ
PDC へと変換されることが明らかとなった。この結果
から，P. putida PpY1100/pDVABC を用いることで，PCA からの変換で 10 g/L 以上の濃度まで PDC を蓄積

98

大塚

できることが明らかとなった。上記の研究についての詳
細は文献26を参照していただきたい。
6.Ʒ൮᧯ᢼᑿ⃆ȡ᧸ǓǮ PDC ᧯᧳ȿɁɎɨǽᐦ᷂ 2
⾷VA SA ǚȘǽ PDC ᧯᧳ȿɁɎɨ⾸PCA からの PDC 生産システムの構築によって，PDC
は微生物の細胞内において生産・蓄積が可能であることが明らかとなった26)。そこで，次にさらに機能遺伝子を加えることによって，実際に天然のリグニンを Xiang
らの方法により低分子化した際に生成する VA, SA からの PDC 生産システムの構築を試みた。VA, SA からのPDC 生産システムの構築には，さらに demethylase 酵
素をコードする遺伝子を追加する必要がある。しかし，
SYK-6 の demethylase 酵素はテトラヒドロ葉酸に依存した酵素であるために，この酵素機能を高発現させるためには非常に複雑なテトラヒドロ葉酸生合成経路及び C1
代謝経路を同時に高発現する必要があるため，この demethylase 酵素をコードする遺伝子 ligM, desZ を導入した PDC 生産システムの開発は困難であることが考えられた1,19)。しかし一方で，Pseudomonas 属などいくつかの細菌で報告されている VA 脱メチル化機能は酸素添加型の反応はシンプルなシステムで機能している。すなわ
ち，demethylase 機能を持つ VanA, VanA のレダクターゼ機 能 を 持 つ VanB と い う 2 つ の タ ン パ ク 質 が 酸 素 とNADH を基質として VA 脱メチル化を行っているのである3)。このシステムを活用して脱メチル化活性を発言させるには，これらの酵素をコードする遺伝子 vanA,
vanB をクローニングしさえすればよい。しかし，これまでの Pseudomonas における vanA,B に関する3つの報
告は，いずれも VA 資化性欠損変異株へのゲノムライブ
ラリーの導入による変異復帰実験と，塩基配列解析に関するものである3,28)。Priefert らによってクローニングされた遺伝子を heterologous に発現させた VanA,B の活性の検定も行われているが，それにしても組換え大腸菌に
おいて VA から PCA へのわずかな変換をもってその活性が得られたと結論づけられているに過ぎず，より高い活性を得るための条件などについての詳細な研究はなされていない28)。
そこで，P. putida PpY101 株より回収したゲノムをテンプレートに PCR を行い vanA,B 遺伝子を獲得し，
pUC119 の Hinc II サイト上にクローニングした。さらにこのプラスミドを pvanAB と名づけ，E. coli XL1-blue
株に導入し，脱メチル活性を評価した。15 mM の VA を
含む LB 培地における PCA への変換量は，24時間で2.7 mM であった。これまで Van A,B の SA に対する挙動については報告されていなかったが，この pvanAB を持つ組換え XL1-Blue 株は SA の脱メチル化活性も持っており，15 mM の SA から 3-O-methylgallate (3MGA)への変換量は VA から PCA への変換の場合とほぼ同量
で24時間で 2.5 mM であった。
クローニングされた vanA,B から VA, SA の脱メチル化活性を持つタンパク質が発現されることが確認されたので，この遺伝子断片を P. putida PpY1100 株に導入し，発現させることを試みた。pvanAB を EcoR I, Hind III
で消化して得られる vanA,B 全長を広宿主域ベクター

他

pKT230MC の EcoR I サイト上にクローニングした(pDV01)。pDV01 を P. putida PpY1100 株に導入し，組換え株の VA 脱メチル化活性を検定したが，この組換え
株は VA 脱メチル化活性を全く示さなかった。
そこで，脱メチル活性の得られた pvanAB と活性の得られなかった pDV01 を詳細に比較したところ，pUC119のマルチクローニングサイト上に vanAB を挿入した
pvanAB においてはレポーター遺伝子としての lacZ と同一フレーム上に挿入されており，lacZ' とのフュージョ
ンタンパク質として vanA が発現していることが考えられた。そこで，vanAB を pUC119 上で lacZ' とは異なるフレームで挿入したところ活性は全く得られなかった。
さらに vanA 遺伝子の上流に 6 個のヒスチジンをコードする遺伝子断片を加え，6 ×ヒスチジンペプチドとのフュージョンタンパク質として vanA が発現するように設計したプラスミド pQvAB を作成し活性を評価したと
ころ，15 mM の VA から24時間で 2.9 mM の PCA が，
同じく SA から 2.5 mM の 3MGA が検出された。このことから組換え株を用いた heterologous な VanA, B の発現のためには VanA の N 末にペプチドが付加することが必要であることが明らかとなった。
しかし P. putida PpY101 株の中での VanA の翻訳ではもともとの SD 配列が使われているので，この様に N
末にペプチドが付加して存在するということは考えにくい。ひとつの可能性として，P. putida PpY101 株の中では VanA がシャペロン様タンパク質など他のタンパク質と複合体を形成している，ということが考えられる。すなわち，VanA は N 末がそのタンパク質複合体の中に組み込まれている状態で初めて活性を示す，ということが考えられる。従って VanA,B だけを発現させるようなプ
ラスミドを導入した組換え株は VanA の安定な活性を持
ちえず，VanA の N 末端に LacZ α フラグメントの一部
や 6 ×ヒスチジンといった小さなペプチドが付加されることで模擬的にタンパク質複合体中の VanA に近い形が再現され，それによって組換え株が脱メチル化活性を持
つようになると考えられる。Priefert らの報告28) において非常に弱い脱メチル活性しか得られなかったことは，
おそらく彼らの作成したプラスミド上にも VanA と複合体を形成すべきタンパク質をコードする遺伝子が存在していなかったことが原因かもしれない。
このようにして確立した脱メチル化酵素の安定な発現システムと先の研究によって確立している PCA から
PDC を生産するシステムを組み合わせ，VA, SA からのPDC 生産システムの構築を行った。pKT230MC 上に N
末端にオリゴペプチドを付加した vanA, vanB, ligA, ligB,
ligC をタンデムに並べて挿入した pDVZ21 を作成し，P.
putida PpY1100 株に導入した組換え微生物 P. putida
PpY1100/pDVZ21 を作成した（図 6 ）。この P. putida
PpY1100/pDVZ21 株において，VA, SA からの PDC 生
産能を評価したところ，VA, SA 両方から PDC の生産が 確 認 さ れ た。 そ こ で， こ の P. putida PpY1100/
pDVZ21 を用いてジャーファーメンターによる VA, SA
からの PDC 大量生産システムの構築を試みた。PCA から PDC を生産する際に LigC タンパクが補因子としてNADP+ を必要とすることから，組換え微生物の炭素源としてグルコースを過剰に加え細胞内活性を高めること

リグニン低分子化芳香族物質からのポリマー原料生産99

図 6 ．pDVZ21 の構造と導入した代謝遺伝子。
挿入された機能遺伝子は β-lactamase promoter により一つのオペロンとして非誘導的に高発現する。またこれらの機能遺伝子により，VA, SA は PDC へと変換される。

が必要であることは先に述べたとおりである26)。更に，
pDVZ21 によって発現させる VanAB 酵素及び LigABC
酵素においては，LigC タンパクが NADP+ を必要とす
るだけでなく，VanA 酵素の reductase として働く VanBが NADH を必要とすることが明らかとなっている。そこで，さらに細胞内活性を高めるためにグルコースの他に yeast extract 等をさらに加えた栄養豊富な PDC production medium を作成し，試験を行った。その結果，
5L スケールのジャーファーメンターシステムにおいて，
VA では24時間以内に SA でも36時間以内にそれぞれ
15 g/L の濃度の基質をほぼ完全に PDC へと変換することができた（図 7 ）。VA と比較して SA からの PDC 変
換にはより多くの反応時間を要する。VanAB が VA, SA
に対して同等の活性を示していることから，これはおそらく ligAB にコードされる PCA 4,5-dioxygenase 酵素がVA から変換される PCA と比較して SA から変換される 3MGA に対するアフィニティーが低いためと考えられる。
7.Ʒ᫘⥨ᙉǚȘǽ PDC Ṑ⓯ȿɁɎɨǽ᯺ᴗ
PDC をポリマーの原料として取り扱うためには，ファインケミカルスとして利用可能なレベルまで精製する必要がある。なぜならば，その後のポリマー化などの重縮合反応に不純物が存在するとポリマー化反応の妨げとなり，目的の分子量まで高分子化することが困難になってしまうからである。PDC を生産した発酵液内には，PDC だけでなく菌体由来の成分，培地成分など様々な物質を含む複雑な混合物であるといえる。そこで，これらの混合物から PDC を精製する技術の開発を試みた。
PDC は水に可溶であり，発酵終了時には培養液に溶けた状態で存在する。しかし，PDC の溶解度は通常の条
件では 182 mM (35 g/L) であるのに対し，NaCl との共存下では Na+ との複塩を形成し，その溶解度が 1/20 以

図 7 ．P. putida PpY1100/pDVZ21 株による VA, SA からの PDC
生産。
VA, SA どちらにおいても PDC の生産・蓄積が認められたが，SA においては，VA と比較して PDC への変換に
約 2 倍の時間を要する。

下になることが明らかとなった。そこで，発酵層から遠心分離により菌体及び不溶物を除去した発酵液に NaClを添加し pH 3.5 以下の条件にすると，PDC が Na+ との複塩として容易に回収でき，さらにイオン交換，脱塩，
再結晶操作により，高純度の PDC を得ることができた。
現在80％以上の回収率でファインケミカルスとして利用可能なレベルで発酵層から PDC を精製するシステムが確立している。
8.ƷPDC ȡ‫ڤ‬ᄦǷǦǮɥɲɦʀᢼ✤ǽ᧯᧳
我々はリグニンの高度利用技術の確立を目的として，組換え微生物を用いた発酵によりリグニンを低分子化した際に得られる芳香族物質のうち，VA, SA から PDCを生産・蓄積・精製する技術を確立した。PDC は有機
合成では作ることが困難であることから，本研究成果は
PDC を用いたポリマー物質の生産実験の道を初めて拓いたことになる。PDC は，3 つのカルボニル基，環内エー
テル酸素，共役二重結合を持ち，擬芳香族二塩基酸の構造をもつことから，種々の重縮合系ポリマーの原料にな

100

大塚

他

図 8 ．PDC-BHT コポリエステルの合成戦略。

り得るだけでなく，PDC 環が容易に二つのケトカルボ
ン酸へと分解されていくので，PDC ポリエステルでは，
主鎖エステル結合の切断だけでなく環構造自体の開裂も起こり，より使用後の処理が容易な生分解性高分子材料の開発も期待できる。
我々はこれまでに，PDC を基本骨格としたポリアミド，ポリウレタン，ポリエステルの合成法を確立してきた9,25,29,30)。ポリアミド，ポリウレタンポリマーについて
は現在，物性評価等を行っている段階であるために，本論文においては PDC ポリエステルを中心に述べる。
PDC のポリエステルポリマーとして現在合成系が確立しているのは，PDC と bis(beta-hydroxyethyl)terephthalate(BHT) との PDC-BHT コポリエステルである。PDC とBHT のみの共重合反応では，PDCx-BHT(1-x) コポリエス
テル体は x が0.5以下までのものしか合成することができなかった。そこで，PDC と過剰のエチレングリコー
ルを反応させることによって BHPDC を作成することに成功し，これを用いることによって x が1.0までの様々なコポリエステル体を作成することが可能となった。実際の構造と重縮合反応の手順を図8に示す。PDC, BHT,
BHPDC を混合し 170°C のオイルバスにて 50 min 加熱
し，50 mmHg の減圧下で50分，5 mmHg の減圧下で10分間重縮合反応を行うことにより，PDC-BHT コポリエ
ステルを得ることに成功した。このとき混合割合を変化させることにより，x が 0〜1.0の範囲の様々なコポリエ
ステルを作成することが可能である。図 9 には x=0.6のコポリエステルについて熱安定性を評価した TG-DTA
曲線を示している。この結果から，260°C 程度まで優れた熱安定性を示すことが明らかとなった。また，このコ
ポリエステルは融点を持たず，高温で軟化する性質をもつことが示された。
このように PDC をポリマー原料とした PDC-BHT コ
ポリエステルの合成に成功したのであるが，このコポリ

図 9 ．PDC 含有量60％の PDC-BHT コポリエステルにおける
TG-DTA 曲線。
この結果から，この PDC-BHT コポリエステルは 260°C程度までは安定であることと，融点を持たず軟化することが明らかとなった。

エステルポリマーは様々な金属に対して優れた接着性を示すことがわかってきた。そこで，図 8 のフローチャー
トに示す手順により分子量4,000程度の熱可塑性オリゴ
エステルを作成し，これを金属板の間に挟んで所定時間加熱してポリマー化させ，金属板同士の接着を行った。
その結果を表 1 に示す。PDC 含量が0.1〜1.0の範囲のコ
ポリエステルでアルミニウム，真鍮，銅，鉄，ステンレスに対する接着強度を測定した結果，約 30〜60 MPa と非常に強い接着強度を得ることができた。当初，PDC
含量が1.0に近づくに従って破断応力が大きくなることが予想されていたが，実験に用いた金属において破断応
力が最大値を示したのは PDC 含量が0.4〜0.6の範囲であった。また，アルミニウムにおいて PDC 含量が0.6のとき 57.0 MPa という非常に大きな接着強度が得られた。同時にガラスに対する接着強度の測定も試みたが，接着面が破断される前にガラス自身が破壊されるため接101

リグニン低分子化芳香族物質からのポリマー原料生産

図10．次世代型リグニン高度利用戦略。
表 1 ．各種 PDCx-BHT(1-x) コポリエステルにおける接着強度評価。
SampleAdhesion term

Maximum fracture stress/MPa

Content of PDC/x

Adhesion temperature/°C

Adhesion time/min

Al

Brass

Cu

Fe

SUS

0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6

250
250
250
250
250
250
220
210
200
180

60
60
60
60
60
50
40
30
10
5

3.9
6.0
9.5
40.9
34.2
57.0

16.7
20.6
23.5
35.5

5.5
11.1
0.8
21.9
26.3

x
14.3
29.7
33.5
31.7
40.6

11.1
15.0
30.4
31.4
49.9

0.7
0.8
0.9
1.0

23.2
24.3
13.8
4.2

30.2
18.5
21.5
27.9
12.8
4.6

12.3
12.5
17.0
8.1
4.3

36.7
29.0
15.8
6.0

15.0
31.5
23.9
19.7
4.4

X=0.4〜0.6 のコポリエステルにおいて非常に強い接着強度を示すことが明らかとなった。

着強度を測定することができないほどの接着強度を示した。
また，同様の方法でホットプレス法により PDC-BHT
コポリエステルポリマーからフィルムシートを作成することにも成功している。このシートに対する物性及び生分解性については現在調査中である。
9.ƷǙ Ȟ ș Ǻ
化石資源の高度利用技術の発展によって支えられて劇的な産業発展を見た20世紀から21世紀に突入し，我々の課題はクリーンで再生産可能なエネルギー・マテリアルの利用に移行してきている。クリーンで再生産可能な資源とはすなわちバイオマス資源である。化石資源の利用技術開発では，採掘された混合物から精製により得られる物質に対する，化学工学／合成化学分野の飛躍的な発展によって支えられてきたといえる。しかし，これまで
高度に利用されていなかったバイオマスに対して新たに利用技術を開発していくためには，太古からそれらを高度に利用してきた分解微生物が持つ「物質変換技術」を活用することが最も効率的であると考えられる。なぜならば，分解微生物は我々人類が想像もつかない数億年という非常に長い期間をかけて独自に利用技術を発展させてきたからである。このことから，21世紀におけるバイ
オマス利用技術開発には，これまで飛躍的に発展してきた化学工学/合成化学分野に加え，生化学・代謝工学な

102

大塚

ど生物工学分野の発展，さらにはこれらの分野を融合した生物・合成化学工学分野の発展が必要不可欠である。
リグニンは，地球上で最も多量に存在する芳香族バイ
オマスである。リグニンはその圧倒的な存在量にもかかわらず，これまで非常に限定的な分野でしか利用されてこなかった。リグニンの利用技術を飛躍的に向上させる
ためには，やはりこれまで発展してきた化学工学分野との融合が必要であるが，その構造の複雑さや扱いにくさ
がこれまで発展を阻んでいたといえる。しかし，前述のようにリグニンを分解する土壌微生物は我々の想像を超える複雑且つ緻密な代謝機能により見事なまでに高度に利用する手段を発展させており，これらの微生物代謝機能を応用することにより，全く新しいリグニン高度利用技術の確立が期待できると考えられた。
我々は，S. paucimobilis SYK-6 の芳香族分解代謝経路
を代謝工学的に応用することにより，リグニン低分子化
芳香族混合物として生成される VA, SA から新規生分解性ポリマーの原料となりうる PDC を生産・蓄積・精製することに成功した。今後さらに図 4 に示す SYK-6 株の代謝遺伝子を追加すれば，バニリン，シリンガアルデ
ヒド等アルデヒド型芳香族物質から PDC を生産することが可能になるだけでなく，C6C3 構造の物質や二量体化合物からの PDC が生産できるようになると期待される。本稿で述べたように，我々はこの PDC を用いて実際に PDC-BHT コポリエステルポリマーを作成し，それが非常に優れた金属接着性を示し，またホットプレス
法によりフィルムシートに加工できることを明らかにしてきた。これらの研究の最大の特徴は，リグニン低分子化芳香族混合物を単一の物質である PDC に収斂させる
ことにより，合成化学分野と直結して開発研究ができるということにある。現在はポリマー物質としては PDCBHT コポリエステルのみであるが，ファインケミカル
スとして利用可能な PDC を出発物質として扱えること
から，自由な分子設計が可能であり，今後様々なポリマーが作られていくだろう。特にポリ乳酸などのバイオプラ
スチック原料と組み合わせた PDC ポリマーを作成する
ことにより100％バイオマスからのバイオプラスチックスの生産も可能であると考えられる。最後に筆者らが提案する次世代型リグニン高度利用戦略の概要を図10に示す。近い将来我々の生活において，バイオマス由来の製品が石油化学由来の製品に取って代わる時代が来るのかもしれない。
ᄙᤙ1) Abe, T., E. Masai, K. Miyauchi, Y. Katayama, and M. Fukuda.
2005. A tetrahydrofolate-dependent O-demethylase, LigM, iscrucial for catabolism of vanillate and syringate in Sphingomonas paucimobilis SYK-6. J. Bacteriol. 187(6): 2030–
2037.
2) Ballesteros, I., M.J. Negro, J.M. Oliva, A. Cabanas, P.
Manzanares, and M. Ballesteros. 2006. Ethanol production
from steam-explosion pretreated wheat straw. Appl. Biochem.
Biotechnol. 129–132: 599–611.
3) Brunel, F., and J. Davison. 1988. Cloning and sequencing ofPseudomonas genes encoding vanillate demethylase. J.
Bacteriol. 170(10): 4924–4930.
4) Frank, C., U. Schwarz, C. Matthies, and H.L. Drake. 1998.
Metabolism of aromatic aldehydes and cosubstrates by the他
acetogen Clostridium formicoaceticum. Arch. Microbiol.
170(6): 427–434.
5) Goldstein, I.S. 1975. Potential for Converting Wood into
Plastics: Chemicals from wood may regain importance as thecost of petroleum continues to rise. Science 189: 847–852.
6) Gray, K.A. 2006. Bioethanol. Curr. Opin. Chem. Biol. 10(2):141–146.
7) Hara, H., E. Masai, Y. Katayama, and M. Fukuda. 2000. The
4-oxalomesaconate hydratase gene, involved in the protocatechuate 4,5-cleavage pathway, is essential to vanillate and syringate degradation in Sphingomonas paucimobilis SYK-6. J.
Bacteriol. 182(24): 6950–6957.
8) Hara, H., E. Masai, K. Miyauchi, Y. Katayama, and M.
Fukuda. 2003. Characterization of the 4-carboxy-4-hydroxy-2oxoadipate aldolase gene and operon structure of the protocatechuate 4,5-cleavage pathway genes in Sphingomonas
paucimobilis SYK-6. J. Bacteriol. 185(1): 41–50.
9) Kawai, H., M. Matsumoto, K. Shigehara, Y. Katayama, and S.
Nishikawa. 2001. Synthesis of aromatic polyamides with pyranone unit. Polymer Preprints, Japan (English Edition) 50: 356.
10) Kuhner, C.H., C. Frank, A. Griesshammer, M. Schmittroth, G.
Acker, A. Gossner, and H.L. Drake. 1997. Sporomusa
silvacetica sp, nov., an acetogenic bacterium isolated from aggregated forest soil. Int. J. Syst. Bacteriol. 47(2): 352–358.
11) Lin, Y., and S. Tanaka. 2006. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 69(6): 627–642.
12) Masai, E., Y. Katayama, S. Nishikawa, M. Yamasaki, N.
Morohoshi, and T. Haraguchi. 1989. Detetion and localizationof a new enzyme catalyzing the beta-aryl ether cleavage in thesoil bacterium (Pseudomonas paucimobilis SYK-6). FEBS
Lett. 249(2): 348–352.
13) Masai, E., Y. Katayama, S. Kawai, S. Nishikawa, M. Yamasaki,
and N. Morohoshi. 1991. Cloning and sequencing of the gene
for a Pseudomonas paucimobilis enzyme that cleaves betaaryl ether. J. Bacteriol. 173(24): 7950–7955.
14) Masai, E., Y. Katayama, S. Kubota, S. Kawai, M. Yamasaki,
and N. Morohoshi. 1993. A bacterial enzyme degrading themodel lignin compound beta-etherase is a member of the glutathione-S-transferase superfamily. FEBS Lett. 323(1-2): 135–
140.
15) Masai, E., S. Kubota, Y. Katayama, S. Kawai, M. Yamasaki,
and N. Morohoshi. 1993. Characterization of the C alpha-dehydrogenase gene involved in the cleavage of beta-aryl ether
by Pseudomonas paucimobilis. Biosci. Biotechnol. Biochem.
57(10): 1655–1659.
16) Masai, E., Y. Katayama, S. Nishikawa, and M. Fukuda. 1999.
Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes
involved in degradation of lignin-related compounds. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 23(4-5): 364–373.
17) Masai, E., K. Momose, H. Hara, S. Nishikawa, Y. Katayama,and M. Fukuda. 2000. Genetic and biochemical characterization of 4-carboxy-2-hydroxymuconate-6-semialdehyde dehydrogenase and its role in the protocatechuate 4,5-cleavage
pathway in Sphingomonas paucimobilis SYK-6. J. Bacteriol.
182(23): 6651–6658.
18) Masai, E., A. Ichimura, Y. Sato, K. Miyauchi, Y. Katayama,and M. Fukuda. 2003. Roles of the enantioselective glutathione S-transferases in cleavage of beta-aryl ether. J. Bacteriol.
185(6): 1768–1775.
19) Masai, E., M. Sasaki, Y. Minakawa, T. Abe, T. Sonoki, K.
Miyauchi, Y. Katayama, and M. Fukuda. 2004. A novel tetrahydrofolate-dependent O-demethylase gene is essential for
growth of Sphingomonas paucimobilis SYK-6. J. Bacteriol.
186(15): 4951–4959.
20) Merkens, H., G. Beckers, A. Wirtz, and A. Burkovski. 2005.
Vanillate metabolism in Corynebacterium glutamicum. Curr.
Micorobiol. 51(1): 59–65.
21) Milstein, O., J. Trojanowski, A. Huttermann, and J. Gressel.
1988. Catabolism of single ring aromatic acids by four

リグニン低分子化芳香族物質からのポリマー原料生産
Aspergillus species. Microbios. 55(222): 7–16.
22) Nakata, T., H. Miyafuji, and S. Saka. 2006. Bioethanol from
cellulose with supercritical water treatment followed by enzymatic hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129–132: 476–
485.
23) Nishikawa, S., T. Sonoki, T. Kasahara, T. Obi, S. Kubota, S.
Kawai, N. Morohoshi, and Y. Katayama. 1998. Cloning andsequencing of Sphingomonas (Pseudomonas) paucimobilis
gene essential for the O-demethylation of vanillate and syringate. Appl. Environ. Microbiol. 64: 836–842.
24) Noda, Y., S. Nishikawa, K. Shiozuka, H. Kadokura, H.
Nakajima, K. Yoda, Y. Katayama, N. Morohoshi, T.
Haraguchi, and M. Yamasaki. 1990. Molecular cloning of
the protocatechuate 4,5-dioxygenase gene of Pseudomonas
paucimobilis. J. Bacteriol. 172: 2704–2709.
25) Okamura, N., M. Matsumoto, K. Shigehara, C. Seki, and S.
Nishikawa. 1999. Synthesis of polymer with 2H-pyran-2-one4,6-dicarboxylic acid (PDC) nuclei. Polymer Preprints, Japan(English Edition) 48: 502.
26) Otsuka, Y., M. Nakamura, K. Shigehara, K. Sugimura, E.
Masai, S. Ohara, and Y. Katayama. 2006. Eﬃcient productionof 2-pyrone 4,6-dicarboxylic acid as a novel polymer-basedmaterial from protocatechuate by microbial function. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 71(5): 608–614.
27) Pelmont, J., M. Barrelle, M. Hauteville, D. Gamba, M.
Romdhane, A. Dardas, and C. Beguim. 1985. A new bacterial
dehydrogenase oxidizing the lignin model compound guaiacylglycerol beta-O-4-guaiacyl ether. Biochemie. 67(9): 973–986.
28) Priefert, H., J. Rabnehorst, and A. Steinbuchel. 1977.
Molecular characterization of genes of Pseudomonas sp.

103

strain HR199 involved in bioconversion of vanillin to protocatechuate. J. Bacteriol. 179(8): 2595–2607.
29) Sato, M,. H. Inoue, M. Matsumoto, K. Shigehara, Y.
Katayama, S. Nishikawa, and T. Kimura. 2003. Mechanicalproperties and degradability of polyesters carrying PDC nuclei. Polymer Preprints, Japan (English Edition) 52: 359.
30) Shigehara, K., N. Okamura, M. Matsumoto, C. Seki, Y.
Katayama, and S. Nishikawa. 1998. Synthesis of polyamide
with 2H-pyran-2-one-4,6-dicarboxylic acid (PDC) nuclei. Polymer Preprints, Japan (English Edition) 47: 415.
31) Sonoki, T., T. Obi, S. Kubota, M. Higashi, E. Masai, and Y.
Katayama. 2000. Coexistence of two diﬀerent O-demethylation
systems in lignin metabolism by Sphingomonas paucimobilis
SYK-6: Cloning and sequencing of the lignin biphenyl-specificO-demethylase (ligX) gene. Appl. Environ. Microbiol. 66:
2125–2132.
32) Sonoki, T., Y. Otsuka, S. Ikeda, E. Masai, S. Kajita, and Y.
Katayama. 2002. Tetrahydrofolate-dependent vanillate andsyringate O-demethylation links tightly to one-carbon metabolic pathway associated with amino acid synthesis and DNA
methylation in the lignin metabolism of Sphingomonas
paucimobilis SYK-6. J. Wood Sci. 48: 434–439.
33) Xiang, Q., and Y.Y. Lee. 2001. Production of oxychemicals
from precipitated hardwood lignin. Appl. Biochem. Biotech.
91–93: 71–80.
34) 安部 勲ほか．1998．木材科学講座 I．海青社．p. 12.
35) 飯塚尭介．2000．ウッドケミカルスの最新技術．シーエム
シー．
36) 舩岡正光．2005．木質系有機資源の新展開．シーエムシー．