Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 13, No. 2, 95–102, 2013

総

説（一般）

遺伝子クローニングの黎明期における Pseudomonas putida mt-2 の芳香族化合物分解の研究
Studies on Degradation of Aromatic Compounds by Pseudomonas putida mt-2
at the Dawning Age of Gene Cloning
中

澤

晶

子

Teruko Nakazawa
山口大学名誉教授 〒 755–0047 山口県宇部市島 1–4–12
E-mail: nakazawa@yamaguchi-u.ac.jp
Professor Emeritus, Yamaguchi University, 1–4–12 Shima, Ube, Yamaguchi 755–0047, Japan
キーワード：シュードモナス，カテコールジオキシゲナーゼ，TOL プラスミド，遺伝子クローニング，カスケード調節
Key words: Pseudomonas, catechol dioxygenase, TOL plasmid, gene cloning, cascade regulation
（原稿受付

1.

2013 年 11 月 26 日／原稿受理

はじめに

このたびは思いがけず環境バイオテクノロジー学会賞をいただき大変光栄に存じます。私は 1963 年から京都大学医学部医化学講座でシュードモナスのカテコール二原子酸素添加酵素の研究を行いました。1971 年から順天堂大学医学部細菌学講座へ移り，そこで Pseudomonas
putida mt-2 株の分子遺伝学的研究を始め，TOL プラス
ミドに出会いました。1978 年に山口大学医学部第 2 生
化学講座へ移ったのちは，TOL プラスミドによって支配される芳香族化合物分解系の遺伝子クローニングや遺伝子発現調節機構の解明など，環境バイオテクノロジーの基礎となる研究を行いました。また 1995 年につくばで開催された第 5 回国際シュードモナスシンポジウムの組織委員長をつとめました。本稿では，筆者らが日本で行った芳香族化合物分解の研究を，同じ時期に外国で行われた研究と合わせて発表順に記し，遺伝子クローニン
グの黎明期に行われた環境微生物研究の一例を紹介した
いと思います。
2.

2013 年 12 月 3 日）

ら 10％アセトン存在下にメタピロカテカーゼ（カテコール 2,3-ジオキシゲナーゼ，C23O）を精製し，結晶化に成功した 46)。筆者は，京都大学早石研究室へ移った
野崎グループに入り，酸素添加酵素の研究を始めた。最初の研究課題は，同じ基質に作用する 2 つの酵素が，オルト開裂とメタ開裂という異なる反応を行うのはなぜかを明らかにすることであった（図 1）。その謎を解く手
掛かりは，酵素タンパク質に含まれる非ヘム鉄にあった。鉄の荷電状態を直接測定するため，大阪大学医学部の山野俊雄教授の指導のもとに酵素の ESR を測定し，
C23O は予想通りシグナルを示さない 2 価鉄酵素であったが，C12O は g=4.3 に非ヘム 3 価鉄に固有のシグナルを示す 3 価鉄酵素であることが分かった。また，カテ芳香族化合物分解に関与する 2 原子酸素添加酵素

筆者は京都大学医学部卒業後，基礎研究を志し，1962
年に医化学講座 早石修教授の大学院生（博士課程）とな っ た。 早 石 教 授 は 1955 年 に 米 国 NIH に お い て，
シュードモナスのカテコール分解酵素ピロカテカーゼ（カテコール 1,2-ジオキシゲナーゼ，C12O）の反応につい て 18O2 を 用 い た 実 験 を 行 い， 反 応 生 成 物 で あ る
cis,cis-ムコン酸に 2 原子の 18O が取り込まれることを証
明し，世界で初めて 2 原子酸素添加酵素を報告した 16)。
1963 年，大阪大学教授を兼務していた早石教授の下，野崎光洋博士らは Pseudomonas putida (arvilla) mt-2 か

図 1．カテコールジオキシゲナーゼの 2 つの型。
ピロカテカーゼ（C12O）とメタピロカテカーゼ（C23O）
はいずれも 1 分子の酸素をカテコールに取り込む反応を触媒する酵素であり，生成物に 2 原子の酸素（太字）が取り込まれる。酵素の活性には C12O は 3 価鉄が，C23O には2 価鉄が必須である。

中

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コールを加えるとそのシグナルが完全に消失することから，反応中に鉄が 3 価鉄から 2 価鉄に変化すると推測された 40)。同時に，C12O 酵素溶液の紫赤色が灰青色に変化 す る こ と も わ か っ た。 そ こ で， ま ず カ テ コ ールがC12O の 3 価鉄に直接結合し，そこに酸素が作用して酸素添加の反応が起こることが推測された。さらに，3 価鉄のキレート剤を用いて 3 価鉄を除去すると酵素活性が失われ，そこに 2 価鉄を加えたのち空気酸化すると酵素活性が回復することから，C12O の 3 価鉄は酵素反応に必須であることを明らかにした 41)。一方 C23O は，過酸化水素処理で活性が無くなること，2 価鉄キレート剤によって活性が阻害されることなどから 2 価鉄酵素である
ことが証明された 47)。
3.

Pseudomonas putida mt-2 の TOL プラスミド

TOL プラスミドの研究について述べる前に，TOL プ
ラスミドが支配する芳香族化合物分解経路について述べる（図 2）。分解経路は上流経路と下流経路（メタ開裂経路）に分けられる。上流経路はトルエンとキシレンから，それぞれベンジルアルコールとメチルベンジルアル
コールを経て安息香酸とトルイル酸を生成する経路であり，下流経路は，安息香酸とトルイル酸からそれぞれ生
じるカテコールとメチルカテコールが C23O の働きで2-オキシムコン酸セミアルデヒドとそのメチル化合物になり，さらに分解されて TCA 回路に入る経路である。

澤

3.1

TOL プラスミドの発見

1969 年，糖輸送系の研究で有名な米国ジョンズホプ
キンス大学生物学科の Saul Rosemann 教授の下に留学
し，黄色ブドウ球菌の乳糖輸送系の研究を行った。1971
年 4 月に，順天堂大学医学部細菌学講座の横田 健教授の教室に講師として採用され，生化学から細菌学の世界へ入ることになった。まず，横田教授の研究テーマである大腸菌の糖代謝におけるサイクリック AMP の役割について，アラビノースイソメラーゼの転写にサイクリッ
ク AMP が関与することを明らかにした 42)。
この時期，大腸菌を用いた微生物遺伝学は，分子を対象とする分子遺伝学へと発展しつつあった。大腸菌以外の系で酵素の誘導合成機構を研究するため，Pseudomonas putida (arvilla) mt-2 株を京都大学より分与を受けた。
C23O 誘導合成変異菌の分離を目標に，安息香酸培地で黄色の 2-オキシムコン酸セミアルデヒドを生成できない菌の分離を試みたところ，非常に高頻度に現われ，いずれも，C23O の次に働く脱水素酵素も欠損していた。
意外なことに，変異菌は安息香酸を唯一の炭素源とする培地に親株よりもよく発育する。調べると C12O が働くオルト開裂系をもつことがわかった。すなわち，
Pseudomonas putida (arvilla) mt- 株は，オルト開裂系とメタ開裂系の 2 つの安息香酸分解系をもつこと，またメ
タ開裂系の遺伝子群は容易に脱落することが明らかになった 43)。
1972 年，米国の Chakrabarty 博士がサリチル酸分解
菌のメタ開裂経路はプラスミドによって支配されるとい

図 2．TOL プラスミドが支配するトルエン，キシレン分解経路 14,15)。
上流経路は，トルエンと m-, p-キシレンがそれぞれベンジルアルコールと m-, p-メチルベンジルアルコール，およびベンツアルデヒドと m-, p-メチルベンツアルデヒドを経て安息香酸と m-, p-トルイル酸へ分解する経路である。下流経路（メタ開裂経路）
は，安息香酸と m-, p-トルイル酸がそれぞれカテコールと 3-, 4-メチルカテコールを経て C23O の作用で 2-オキシムコン酸セミ
アルデヒドになったのち，m-トルイル酸は蟻酸を生じ，他方安息香酸と p-トルイル酸は 4-オキサロクロトン酸を経て，いずれも1-オキソペント 4-エノール酸となり TCA サイクルへ入る。一部の酵素（遺伝子）と化合物名は省略した。XO; Xylene dioxygenase,
BADH; Benzyl alcohol dehydrogenase, BZDH; Benzaldehyde dehydrogenase, TO; Toluate dioxygenase, C23O; Catechol 2,3-dioxygenase.

遺伝子クローニングの黎明期における Pseudomonas putida mt-2 の芳香族化合物分解の研究

う論文を発表した。分解プラスミドに関する最初の論文である。そこには，サリチル酸分解経路遺伝子群は高頻度に脱落すること，および他の Pseudomonas 菌株へ伝達できることが示された 2)。これに倣って，mt-2 のメタ
開裂経路遺伝子群の伝達実験を行い，1973 年に日本細菌学会で報告した。論文を準備中に英国ウエールズ大学の Williams と Murray が Metabolism of benzoate andthe methylbenzoates by Pseudomonas putida (arvilla) mt2: evidence for the existence of a TOL plasmid. という論文を発表した 52)。論文では mt-2 株のメタ開裂経路のすべての酵素活性が同時に消失すること，および接合伝達することが示されていた。はたして同じ菌株だろうかと半信半疑であったが，筆者らの，mt-2 には 2 つの開裂系があるという論文が繰返し引用されていることから，
彼らは同一の菌株だと知っていると思われた。
mt-2 はいかにして Williams 教授の手に渡ったのであろうか。後に，mt-2 を分離した細川桂一博士（元川崎医科大学教授）に直接尋ねる機会があった。1960 年，
彼が大阪大学医学部生化学の須田正巳教授の研究室の大学院生のとき， 適応酵素 （successive induction）研究のため，様々な環境の土壌から芳香族化合物分解菌を分離していた。その中に，箕面市の自宅菜園で採取した土壌から m-トルイル酸分解菌として分離された mt-2 があった。この菌株は強い C23O 産生菌で，m-トルイル
酸分解菌としては 2 番目の分離株であったため，mt-2と命名された。間もなく米国カルフォルニア大学の R.Y.
Stanier 教授のもとへ留学した時，mt-2 を他の数株ととも に 持 参 し た。Pseudomonas 分 類 学 の 大 家 で あ る
Stanier 教授は，mt-2 は P. putida の同定基準であるオルト開裂系を持たない興味ある菌株だと注目していた。後に彼の研究室で学んだ Hegeman が，mt-2 を用いてメタ
開裂系調節機構の研究を行い，それに注目した Williams

97

が Hegeman から分与を受けて TOL プラスミドの論文を書いたことがわかった。なお同じ 1974 年に，オーストラリアの Wong と Dunn も mt-2 の m-トルイル酸分解
プラスミドについて報告している 54)。Dunn はその直前にイリノイ大学の I.C. Gunsalus 教授の研究室にいたので，おそらくそこにあった mt-2 がオーストラリアへ渡ったと推測される。
3.2

RP4-TOL プラスミドの分離

こうして筆者は，mt-2 に導かれて最先端のプラスミ
ドの研究へ参入することになった。微生物遺伝学を初歩から学びながら，情報の少ない日本で研究を進めるのは大変難しかったが，幸い横田教授は，R プラスミドの発見者である東京大学医学部細菌学講座の秋葉朝一郎教授の門下生であり，当時の細菌学会には三橋進教授（群馬大），渡辺力助教授（慶応大）など多数の R プラスミド研究者がいた。これらの先輩から学び，広宿主域プラス
ミドと TOL プラスミドの組換え体を作り，大腸菌で遺伝子を解析する計画を立てた。
まず，TOL プラスミドの伝達を m-トルイル酸培地で調べると，元株に比べて C23O の誘導レベルが 10 倍以上，伝達頻度が約 1000 倍の TOL プラスミドが分離されたので 44)，以後の研究にはこれを用いた。次に，P.
aeruginosa PAO1 へ TOL プラスミドを伝達し，プラス
ミドの温度感受性を調べたところ，41°C 以上で速やかに脱落することから，プラスミドの複製は，その自然宿主である P. putida と同様に温度感受性であることを見出した 36)。一方，広宿主域の RP4 プラスミドは高温で脱落しない。そこで TOL と RP4 を PAO1 内に共存させ，高温で m-トルイル酸寒天培地に生える菌を選択すると，
RP4 と TOL の融合プラスミドが得られた（図 3）。最初に得られたプラスミド pTN1 は，C23O 活性はあるが，図 3．RP4-TOL ハイブリッドの分離 38)。
RP4 をもつ緑膿菌 PAO1 へ P. putida mt-2 から TOL プラスミドを伝達し，PAO1（TOL, RP4）を作成した。この菌を L-ブロス
で増殖後，m-トルイル酸寒天培地 42°C で培養し，生じたクローンを大腸菌へ伝達して RP4-TOL ハイブリド，pTN1 と pTN2 を
得た。

中

98

澤

m-トルイル酸による誘導合成が認められなかった。そこから m-トルイル酸培地によく発育し，C23O の誘導合成がみられるプラスミドを分離し pTN2 と命名した。
一方，Williams らは 1975 年に，TOL プラスミドはトルエンやキシレンなどの環状炭化水素を安息香酸やメチ
ル安息香酸（トルイル酸）へ分解する遺伝子群もコードしていることを見出した 56)。また 1976 年には，同様の代謝経路を持つプラスミドを他の土壌細菌からも分離
し，mt-2 由 来 の TOL プ ラ ス ミ ド を pWW0 と 命 名 した 53)。さらに 1977 年，エジンバラ大学の Broda 教授らと共同で，電子顕微鏡と制限酵素地図から pWW0 の分
子量が 78.1 MDa であることを報告した。論文の中で彼らは，TOL プラスミド DNA の分離は非常に困難であったが，大腸菌の F プラスミドの分離法に倣った新しい方法を考案してようやく得られたと記載している 5)。
筆 者 ら は，RP4-TOL 融 合 プ ラ ス ミ ド pTN2 の DNAを大腸菌から塩化セシウム―臭化エチジウム濃度勾配超遠心法により分離し，電子顕微鏡で解析した。pTN2 の分子量は 73.7 MDa であり，ヘテロデュプレックス解析
により 37.3 MDa の RP4 プラスミドの全長が取り込まれていることがわかり，TOL プラスミドの一部，おそらく C23O を含むメタ開裂系遺伝子群が転移したものであると推測した 38)。これはその後，東京大学の飯野徹
雄教授と津田雅孝博士によりトランスポゾンであることが証明された 51)。なお，TOL プラスミドが大腸菌へ伝
達できなかったことについては，米国シカゴ大学のBenson と Shapiro が P. putida で TOL::Tn401 を作成し，大腸菌と混合培養してカルベニシリン培地で選択すると伝達が見られることから，TOL は広宿主域プラスミド
であるが，大腸菌では分解系の遺伝子発現が悪いために
m-トルイル酸培地で伝達体が得られないことを報告した 1)。
1978 年，Williams らはさらに重要な論文を発表した。
すなわち，mt-2 の TOL プラスミド pWW0 のトルエン・
キシレン分解系は，上流の xylABC（キシレンからトルイル酸まで）と下流のメタ開裂系である xylEDFG（トルイル酸酸から TCA サイクルへ入る前まで）の 2 つのオペロンから成り，いずれも誘導物質存在下で xylR により正の制御をうけるというモデルである 55)。また英国の Downing と Broda は TOL プラスミドの制限酵素地図を発表した 4)。

考えられた 39)。
そ の 頃 mt-2 は ド イ ツ へ 渡 っ て い た。1981 年，
Williams 教授の研究室の Franklin が，マックスプランク
研究所の Timmis 博士の研究室に移り，Bagdasarian 夫
妻と共同で，大腸菌で Tn5 変異プラスミドを分離した。
これを P. putida へ入れて分解系の酵素活性を調べることにより，上流オペロンと下流オペロンの位置を明らかにした 7)。
筆者らは pBR322 をベクターとした TOL 遺伝子のク
ローニングを開始した。まず，上流オペロンの xylB 遺伝子および下流メタ開裂系の xylE 遺伝子をそれぞれクローニングし，転写の方向を決定した。また，大腸菌から C23O を精製し，精製酵素の比活性と免疫学的性状の比較から，mt-2 株が作る C23O と同一であることを示した 20)。さらに下流のメタ開裂系オペロンを pBR322に，xylS 領域を pACYC177 にクローニングし，XylS タ
ンパク質が下流オペロンを正に調節することを報告した 21)。次に xylR のクローニングを行い，これが上流オ
ペロンのみでなく下流オペロンの転写にも必須であることを示すとともに，2 つのオペロンのオペレーター・プ
ロモーター領域を決定した 22)。
その頃スイスのジュネーブ大学へ移った Timmis 教授の研究室から，トランスポゾン変異体の解析により
xylR と xylS の位置を決定したことが報告された 8)。また，東京大学から Timmis の研究室へ移った原山重明博
士らは，トランスポゾン変異体を用い，下流オペロンについて，m-トルイル酸ジオキシゲナーゼ遺伝子 xylXYZとそれに続くジヒドロジヒドロキシ安息香酸脱水素酵素
遺伝子 xylL を同定し，下流のメタ開裂系オペロンのプ
ロモーターの下流に xylXYZLE... と並んでいることを報
告した 11)。さらに，下流オペロンのプロモーターの解析 33)，クロロ安息香酸分解性シュードモナス菌への遺伝子導入による広域分解菌の構築 31)，安息香酸からカテコールを生成する大腸菌の構築 57)，トランスポゾン解析
による xylX と xylY の同定 13) が報告された。上流オペ
ロンについても，Tn5 変異体と遺伝子クローニングによる解析から，プロモーターの下流に，ベンツアルデヒド
脱水素酵素の遺伝子 xylC，ベンジルアルコール脱水素酵素の遺伝子 xylB，キシレンモノオキシゲナーゼの遺伝子 xylA がこの順に並んでいることが報告された（図2）12)。

3.3

3.4

遺伝子クローニング

筆者は 1978 年に山口大学医学部第 2 生化学講座の中澤 淳教授の研究室へ助教授として転任した。中澤（淳）
研究室では大腸菌のコリシン E1 について，遺伝子ク
ローニングや試験管内での遺伝子発現の解析やプラスミ
ド DNA の電顕解析が行われ，当時の分子生物学の最先端の研究を行う設備が整いつつあった。まず RP4-TOL
プラスミドの制限酵素地図を作製した。実験は，広島大学医学部薬学科出身の井上幸江大学院生と共に行った。
pTN2 の TOL 領 域 は，Broda ら が 1979 年 に 報 告 し た
TOL プラスミドの制限酵素地図の分解系をコードする領域とよく一致していた。また pTN1 は，C23O の遺伝
子 xylE のすぐ上流に 3.6 kbp の DNA 断片が挿入されており，このため C23O の誘導合成が妨げられているとプロモーター塩基配列の決定

1980 年当時，日本で DNA 塩基配列決定を行う研究
室はまだ限られていた。中澤（淳）研究室の蛯名洋介博
士は，ACTH の構造を決定した京都大学医学部中西重忠博士から Maxam-Gilbert 法による DNA 塩基配列法の手ほどきを受け，1981 年 11 月，最初の論文として，大腸菌プラスミドのコリシン E1 プロモーターの塩基配列を発表した 6)。次いで，滋賀医科大学の野崎研究室の中井智恵子助手が山口大学医学部で実験を行い，念願のC23O 遺 伝 子 xylE の DNA 塩 基 配 列 決 定 を 完 成 さ せた 35)。
酵素の誘導機構を解析するためには，転写開始点を正確に決定する必要があった。まず，上流オペロンのオペ
レーター・プロモーター領域 OP1/Pu の塩基配列を決

遺伝子クローニングの黎明期における Pseudomonas putida mt-2 の芳香族化合物分解の研究定した。次に，pTN2 をもつ P. putida を m-メチルベン
ジルアルコール存在下で培養して得られた mRNA を用い，S1 ヌクレアーゼ法および逆転写酵素法により正確な転写開始点を決定した。さらに誘導時の mRNA 量は，大腸菌では P. putida の約 10％であることを示した 18)。
この結果は PNAS に発表したが，投稿に際しては，米国イリノイ大学の Gunsalus 教授に推薦を依頼した。なお，Gunsalus 教授は 1984 年にイリノイ大学でプラスミ
ドシンポジウムを開催し，私も招待された。この会でChakrabarty，Williams，Timmis，Bagdasarian，Haas な
ど世界の Pseudomonas 研究者に会うことができた。またこの時，国際シュードモナスシンポジウムの開催に関する相談があり，第 1 回は 1986 年に Timmis 会長のもとスイスのジュネーブで開催されることが決まった。
筆者らは下流オペロンについても同様に，オペレー
ター・プロモーター領域 OP2/Pm と転写開始点を決定した 23)。同じ時期に Timmis 研究室からも Pm プロモー
ターの塩基配列と S1 マッピングによる転写開始点が報告された 33)。
筆者らは次に，xylR のオペレーター・プロモーター
について解析した。P. putida と大腸菌のいずれにおいても，約 30 kb 離れた 2 つの転写開始点があり，それぞれの上流に大腸菌のプロモーター共通配列を認めた。また，マキシセル法で XylR タンパク質の分子量 67,000 を決定した 24)。さらに xylS の塩基配列を決定し，それに基づく分子量が 36,502 であり，マキシセル法で決定された分子量 37,000 とよく一致すること，また XylS タン
パク質は塩基性で DNA 結合タンパク質の特徴を備えていることを報告した 25)。pTN1 についても、xylE の上流の挿入配列にある転写開始点を決定し，プロモーター構造について考察した 17)。
一方 Timmis 教授の研究室からは，下流オペロンの分解能を広げるため，誘導物質の特異性が変異した xylSの分離法が報告された 49)。また，TOL プラスミドの分
解系では分解できない 4-エチル安息香酸に着目し，これを分解できる xylS および xylE の変異株が報告された 50)。さらに，カテコールのメタ開裂系が詳細に解析され，カテコールから 2-オキシムコン酸セミアルデヒドになったのち，加水分解を受けて 1-オキソペント 4-エノール酸を経る経路と，オキサロクロトン酸を経て 3 段
階で分解される 2 つの経路があるが，m-トルイル酸は前者で，安息香酸や p-トルイル酸は後者で分解される
ことが示された 14)。
上流オペロンの酵素遺伝子とその産物についても詳細な解析が行われた。その結果，上流オペロンは xylCxylM-xylA-xylB-xylN と遺伝子が並び，プロモーターと
xylC の 間 に は 1.7 kp の ス ペ ー ス が あ る こ と，xylC は
57 kDa のベンズアルデヒド脱水素酵素を，xylM と xylAはそれぞれ 35 kDa と 40 kDa のキシレンジオキシゲナー
ゼのサブユニットの遺伝子であること，さらに xylB は
40 kDa のベンジルアルコール脱水素酵素の遺伝子であることが報告された 15)。
3.5

遺伝子発現調節機構

TOL プ ラ ス ミ ド に は 2 つ の 正 の 調 節 因 子 XylR とXylS がある。筆者らは先に，XylR が上流オペロンのみ

99

でなく下流オペロンの転写にも必須であることを報告したが 22)，さらに XylR は xylS の転写を活性化することか
ら，下流オペロンの転写活性化は XylS を介していることが考えられた 26)。また，上流オペロンおよび xylS の転写開始点とプロモーター配列の決定から，これらのプロモーター配列はいずれも，窒素代謝関連遺伝子の転写因子である NtrA/RpoN が認識するプロモーターに共通の -12，-24 配列を持つことを見出した。これらの結果に基づき，芳香族化合物完全分解系のカスケード調節機
構，すなわち m-キシレン存在下で XylR タンパク質が上流オペロンのみでなく xylS の転写をも活性化し，次いで XylS タンパク質が下流オペロンを活性化するというモデルを提唱した（図 4）26)。なお，窒素代謝遺伝子
群の転写との関連について，英国サセックス大学のDixon 博士が，筆者らが 1984 年に発表した上流オペロ
ンのプロモーター 18) に ntr/nif 共通配列があることを見つけ，大腸菌において上流オペロンのプロモーターの転写が，XylR のみでなく大腸菌の窒素代謝の正の調節因子である NtrC によっても活性化されることを報告した 3)。さらに筆者らは，カスケード調節機構を検証する
ため，xylS を tac プロモーターに連結して大腸菌で強制発現させると，誘導物質を加えなくても下流オペロンが活性化されることを報告した 27)。
同じ時期に Timmis 研究室からは，XylS タンパク質が大腸菌の正の調節因子として知られる AraC と相同性があり，NtrC とも相同性があることが報告された 34)。また，上流オペロンの OP1/Pu と xylS のプロモーターに共通配列があることなどから，筆者らと同様のカスケード調節機構が報告された 48)。
次に筆者らは xylR の DNA 塩基配列を決定し，XylR
が分子量 63,741 のタンパク質であり，Klebsiella Pneumoniae の窒素代謝に関係する遺伝子群の転写活性化因
子 NtrC/NifA と高い相同性があること，また，XylR タ
ンパク質の中央に NtrA/RpoN に結合する配列が，またC- 末端には DNA 結合配列があること，これらの結果
から XylR は NtrA/RpoN-RNA ポリメラーゼの転写活性化因子であること，活性化されるのは xylS および上流
プロモーター OP1/Pu であることを報告した 29)。
一方 Timmis らは P. putida の ntrA/rpoN をクローニ
ングし，in vitro で Kmr カセットを挿入した変異 ntrA/
rpoN を P. putida へ導入して変異菌の分離に成功した。
これを用いて TOL の上流オペロンおよび xylS の発現が

図 4．XylR による 2 つのオペロンのカスケード調節機構 26)。
XylR タンパク質は，m-キシレンや m-メチルベンジルアル
コール存在下に上流オペロンのプロモーター（OP1/Pu）と xylS のプロモーター Ps からの転写を活性化する。合成された XylS タンパク質は，上流オペロンの酵素の働きにより生じた m −トルイル酸の存在下で下流オペロン（メタ開裂系オペロン）（OP2/Pm）の転写を活性化する。

100

中

澤

図 5．上流オペロン（OP1/Pu）と xylS プロモーター上流の XylR 結合部位および NtrA-RNA ポリメラーゼ認識配列 19)。
各プロモーターの上流領域には，パリンドローム構造を持つ共通配列（URS1, URS2, URS3）があり，ここに XylR タンパク質が結合する。また，いずれのプロモーター領域にも NtrA/RpoN-RNA ポリメラーゼ認識配列がある。

図 6．XylR による NtrA 依存的 OP1/Pu プロモーター転写活性化機構のモデル 19)。
誘導物質により活性化された XylR タンパク質がプロモー
ター上流の調節配列（URS）に結合し，さらに NtrA に作用することで，URS とプロモーターの間の DNA がループ構造を作り，NtrA-RNA ポリメラーゼによる OP1 の転写が開始される。

みられないことを示したのに加え，RpoN が各種窒素化合物や有機酸の代謝および運動性に関与することを報告した 30)。
筆者らも P. putida の ntrA/rpoN のクローニングを
行 っ た。 大 腸 菌 の ntrA 遺 伝 子 を プ ロ ー ブ と し，P.
putida DNA とのクロスハイブリダイゼーションで得たDNA 断片を大腸菌へ導入し，上流オペロンの発現がXylR によって活性化されるクローンを得，Azotobacter
vinelandii や Klebsiella pneumoniae の ntrA と高い相同性を示す遺伝子を得た 28)。
さらに筆者らは，上流オペロンのプロモーター上流域
を詳細に解析するため，プロモーターに xylE を連結し，xylR と共に大腸菌に入れ，上流配列の欠失による C23O
活性の低下を調べた。その結果，転写開始点から 150 bp
上流にある長さ約 40 bp の DNA 配列（URS）が XylR
による活性化に必要であることを見出した。xylS プロ
モーターの上流配列も解析し，同様の配列を見出した（図 5）19)。さらに xylR 自身の転写に関しては，過剰のXylR により抑制されることが明らかになり，マスター
調節因子の調節機構が明らかになった 9)。なお，Timmis
研究室の de Lorenzo らは，上流オペロンのプロモー
ター上流にある XylR の結合部位の折れ曲がりに IHF（Integration host factor）が関与することを報告している 32)。
以上の結果から，XylR による NtrA 依存的 OP1/Pu
プロモーター転写活性化機構として，マスター調節因子
XylR の活性型と NtrA との相互作用により，固有のプロモーターに結合した NtrA-RNA ポリメラーゼが転写を開始するというモデルを提唱した（図 6）19)。
4.

おわりに

2002 年の終わりに，TOL プラスミド pWW0 とその脱落株である KT2440 の全ゲノム配列が発表され，P.
putida mt-2 の研究は新しい時代を迎えた。
pWW0（117 kbp）の配列は，TOL プラスミドの発見者である Williams 教授が，バーミンガム大学の Thomas
教授らと共同で行った 10)。見出された 148 の ORF のう
ち，77 が既知の遺伝子と相同性を示した。プラスミドの複製，維持，伝達に関する遺伝子は Inc-P9 プラスミ
ドの特徴を備え，Tn4651 と Tn4653 トランスポゾン上には，トランスポゾン関連遺伝子に加えて，このプラスミドの特性を決める分解系遺伝子と調節遺伝子，紫外線・ラジカル耐性遺伝子，重金属耐性，消毒剤耐性に関連する遺伝子などが存在したと報告している。
KT2440 の全ゲノム配列（6.18 Mbp）は，米国 TIGRの Fraser 博 士 ら の チ ー ム と ド イ ツ の Tümmler 教 授 やTimmis 教授らの研究グループによって決定された 45)。
緑膿菌ゲノムとの比較については，85％の ORF は共通であるが，緑膿菌の病原因子であるエキソトキシン Aや III 型分泌装置の遺伝子は存在しないことから，病原

遺伝子クローニングの黎明期における Pseudomonas putida mt-2 の芳香族化合物分解の研究性は低いと考えられた。また，多彩な物質分解能に関与
する透過性と分解系遺伝子が存在することから，環境バ
イオテクノロジーへの応用が期待される微生物であると述べられている。これに関連して筆者は， 日本から世界中を旅したシュードモナス と題するエッセイを
Env. Microbiol. に発表する機会を得た 37)。
その後 P. putida mt-2 の研究は飛躍的に進展している。
スペインの de Lorenzo 教授の研究グループや，東京大学の野尻秀昭準教授の研究ブループなどによる遺伝子発現調節機構の研究に加えて，mt-2 の研究から得られた成果を環境浄化に応用する研究が数多く進められている。今後も，環境バイオテクノロジーの基盤研究において，mt-2 が重要な役割を担うことが期待される。
謝辞

私が P. putida mt-2 に出会って半世紀経ちました。京都大学時代には早石修教授，野崎光洋博士から酵素学の真髄を学び，また Stanier 教授，Gunsalus 教授など当時の国際的な Pseudomonas 研究者に会う機会を得ました。
順天堂大学時代には横田 健教授から微生物遺伝学の基礎を学び，分解プラスミドの研究を始めました。そのきっかけとなった Chakrabarty の論文を紹介して下さったのが，東京大学の故矢野圭司教授でした。1978 年に移った山口大学第 2 生化学の中澤 淳教授の研究室では，新しい手法を用いて最先端の研究を行い，成果を世界に発信することができました。優れた共同研究者の井上幸江博士を得たことも幸運でした。TOL プラスミドの研究を通じて，欧米の沢山の研究者と交流することができました。
1987 年に医学部微生物学講座へ移って Helicobacter
pylori の研究を始め，次第に mt-2 の研究から遠のきま
したが，立ち上げの会に参加した国際シュ−ドモナスシ
ンポジウムには引き続き出席しました。1995 年，日本における第 5 国際シュードモナスシンポジウムの開催に当たっては，環境バイオテクノロジー学会の前身である
シュードモナス研究会の古川謙介教授，福田雅夫教授を始め多くの皆様に大変お世話になりました。
環境バイオテクノロジー学会賞の受賞にあたり，恩師，共同研究者を始め，お世話になった皆様に心から御礼を申し上げます。最後に，筆者を素晴らしい研究の世界へ導いてくれた P. putida mt-2 にも感謝の意を表した
いと思います。
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