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6204b00-160210-211223

国立研究開発法人 産業技術総合研究所

計量標準総合センター 標準物質認証書
認証標準物質NMIJ CRM 6204-b
No. +++
定量解析用リボ核酸（RNA）水溶液
Ribonucleic Acid (RNA) Solutions for Quantitative Analysis
本標準物質は、ISO 17034 及び ISO/IEC 17025 の要求事項に適合するマネジメントシステムに基づいて生産された 5 種類の異なる塩基配列のリボ核酸（RNA）水溶液のセットである。本標準物質は、DNA マイクロアレイ（DNA チップ）や定量的 RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、次世代シークエンサー等を用いた RNA 定量解析において、定量装置及び分析法の評価や精度管理に用いることができる。また DNA チップの評価のための RNA 標準物質の値付けに用いることができる。
【認証値】
本標準物質の認証値は 5 種類の RNA 水溶液（RNA500-A、-B、-C、RNA1000-A、-B）について、それぞれに含まれる 25 ℃における総 RNA（塩基の数や配列によらず、試料中に含まれる全ての RNA）の質量濃度である。認証値の不確かさは、合成標準不確かさと包含係数 k = 2 から決定された拡張不確かさであり、約 95 %の信頼の水準をもつと推定される区間の半分の幅を表す。
総RNAとしての濃度
試料名

認証値
質量濃度 (ng/μL)

拡張不確かさ質量濃度 (ng/μL)

RNA500-A

33.4

2.6

RNA500-B

32.3

2.6

RNA500-C

32.1

3.1

RNA1000-A

68.2

5.8

RNA1000-B

64.1

5.5

RNA500-A、-B、-C、RNA1000-A、-B は、それぞれ参考情報の図 1 の RNA として設計、調製された RNA の水溶液である。
【認証値の決定方法】
本標準物質の認証値は、各々の試料について、以下の 2 つの方法（リボヌクレオチド測定及びりん測定）において求められたリボヌクレオチドまたはりんの定量値を基に目的 RNA の質量分率を算出した。算出した RNA の質量分率に対して、振動式密度計により求めた試料の密度を用いて質量濃度に変換して決定したものである。
(1) 同位体希釈質量分析法（IDMS）によるリボヌクレオチド測定
試料中 RNA を酵素分解した後、液体クロマトグラフ質量分析装置（LC/MS）を用いたリボヌクレオチド測定によってリボヌクレオチドの質量分率を得た。その後、りん酸ジエステル結合部分の脱水を考慮した各リボヌクレオチド質量分率を算出し、それらの総和から RNA の質量分率を得た。
(2) 誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）によるりん測定
試料中 RNA を酸分解した後、ICP-MS を用いた測定によって得られたりんの質量分率と目的 RNA に含まれるりんの個数から RNA の質量分率を得た。

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6204b00-160210-211223【計量計測トレーサビリティ】
本標準物質の認証値は IDMS によるリボヌクレオチド測定と ICP-MS によるりん測定により決定した。IDMS によるリボヌクレオチド測定においては、NMIJ において定量 NMR により濃度評価したリボヌクレオチド標準液を用いた。定量 NMR ではフタル酸水素カリウム認証標準物質(NMIJ CRM 3001-b)で校正された内標準物質を用いた。ICP-MS によるりん測定では、JCSS りん酸イオン標準液を用いた。振動式密度計による密度測定では、JCSS密度標準液（純水）を用いた。従って、本標準物質の認証値は国際単位系(SI)にトレーサブルである。
【参考値】
本標準物質の参考値は、認証値をもとに、参考情報に示した RNA 分子の塩基組成を用いて算出した、25 ℃における RNA の物質量濃度である。参考値の不確かさは、合成標準不確かさと包含係数 k = 2 から決定された拡張不確かさであり、約 95 %の信頼の水準をもつと推定される区間の半分の幅を表す。
対象とするRNA分子としての濃度
試料名

参考値
物質量濃度 (pmol/μL)

拡張不確かさ
物質量濃度 (pmol/μL)

RNA500-A0.1950.014

RNA500-B0.1880.014

RNA500-C

0.187

0.017

RNA1000-A

0.2050.015

RNA1000-B

0.1930.014【有効期間】
本標準物質が未開封で下記の【保存に関する注意事項】の条件で保存された場合、本認証書は出荷日から6ヶ月間有効である。
【物質に関する情報】
本標準物質は 533 塩基または 1033 塩基からなるリボ核酸（RNA）を滅菌水に溶解することにより調製した水溶液であり、常温では無色透明の液体である。核酸低吸着プラスチック製バイアルに 300 μL ずつ分注された
試料 5 本がナイロン-直鎖状低密度ポリエチレン袋に脱気封入され、さらにアルミニウムラミネート袋に密封されている。
【保存に関する注意事項】－30 ℃から－20 ℃の冷凍庫に保存すること。
【使用に関する注意事項】
使用前に25 ℃±5 ℃に置き、自然解凍（加熱厳禁）し、十分に溶解する。キャップのねじが十分締まっていることを確認した上で十分に混和し、完全に均一化した後に使用すること。解凍後はすみやかに使い切ること。一度解凍した試料は、再利用してはならない。
試料を採取する際に試料低吸着型および RNA 分解酵素を含まないピペットチップや容器を使用すること。
試験・研究用以外には使用しないこと。
【取り扱いにおける注意事項】
安全データシート（SDS）を参考にして取り扱うこと。
【製造等】
本標準物質は、産業技術総合研究所生命工学領域バイオメディカル研究部門において設計された、特定の遺伝子をコードしない 533 塩基と 1033 塩基からなる 5 種類の人工 RNA であり、同部門で調製・小分けされた。上記の鋳型となる塩基配列 DNA をプラスミドへ挿入し、大腸菌内で複製した後にプラスミドを抽出、精製し、対象となる塩基配列を制限酵素で切断した後に酵素転写反応により鋳型 DNA に相補的な RNA を合成、精製したものである。各精製 RNA 水溶液は滅菌水で希釈した後、核酸低吸着プラスチック製バイアルに約 300 µL ずつ

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分注した。試料 5 本を 1 セットとしてナイロン-直鎖状低密度ポリエチレン袋に脱気封入され、さらにアルミニウムラミネート袋で密封した。
【参考情報】① 塩基配列・分子量情報
各試料に含まれる RNA は、図 1 の塩基配列として設計・調製した。各 RNA の分子量と酵素転写反応に用いた鋳型 DNA の塩基配列に関するデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL）のアクセッションナンバーを併せて示す。調製した RNA について、RNA の相補的 DNA （cDNA）を合成し、自動塩基配列決定装置を用いて塩基配列を解読した結果、図 1 に示す塩基配列を有することを確認した。
BASE COUNT165 A

127 C

121 G

120 U

ORIGIN
1 GGGCUCGACU AGUUAAUACG GUACAGGAUA ACCGAUCGGC UUGCAACAUA ACGGCGUUAA
61 GAAUGCGGGA GUGCAGUUUC CGAUUCUCAC AUCAAUCGCC AAUAAGGCCU UGUCGCAAUA121 UAGACUCAAC GGUUCUAGUA GCUGAUCGGU AUUACGUGAC GCAACCGAUU AGACAUGCAC181 AAUUCCUUGG UCGCUAUACU ACGGAAAUCG UCAGGUACUA UAACCCGUCG CAGGCCUAAU241 ACGUGUCGUC ACAUCGCCAA CCUAUCGUCA GUCGGAAAGA CGUUGCUGUC UACCAUCGAA301 ACUAUUUACC GCUCCGAGAU UCACGAGUAC GAACUCACGA GGAAGUUGCC CUAUGUAAGG361 UAUCACUCCA GGUACUGCGC CGAUAGUACC AGGUGAUCAA ACGGUUGCAA GAAGGCCACG421 ACGUAUCGGG CUCUUUAGAC GUACGCUCGA GAUUAAACGC GCACUGAUUC ACUUUAGCCC481 GGAAUGUCUC GGUGCGAUGU AGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA//分子量: 171 603.8
アクセッションナンバー：AB610939 （6204-a-500-1という名称で登録）
図 1-(a) 試料 RNA500-A 中に含まれる RNA の塩基配列BASE COUNT163 A

130 C130 G110 UORIGIN
1 GGGAGACUAA AUCUCGGCGU CGGUUCAUAC GCGCGAUCGU UUGCUGUCAG GGCAUACUCG61 AAUCCGGACU CCGACAAUUA UAGGCCAUCC UGAAUAGCCG AUCAUGCGAG UCACGAUAAG121 GCAGGCUCUG CGAUAUCCCG AUAUACUGGA GAAGCUGAAU CCCACCUAGA GCGAACUGUC181 AGAGGAUCGA CCUCAGGCUC GCUAUCAUCA UAACGGCGGA CGACCUGUGU CACAUUCCGA241 ACGCUACGUG ACGAUAUUAU CUGUCGAAAG GCAUAGAACG CCGGUCAAUA UCCUGCGGCA301 UUCUCUUUAU CACCGGCUAU AACUACUAGG UUCCGCAGAU AUAGACUGCG CACGGAACAU361 GUAGAUAGAU CGAGUAGGGU AGCGAUUUAA CGACUCGACU UACAGACAGA GACGUAGAAC421 GUCAGACGAG UGGUAUGCCC ACCAGAGGCG AUACAGGCUG UACCUGCGUA GCACUAGAGU481 CGUGCGUCAU GCGGACCCUA UCUAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA//分子量: 171 906.1アクセッションナンバー：AB610940 （CRM6204-a-500-2という名称で登録）
図 1-(b) 試料 RNA500-B 中に含まれる RNA の塩基配列

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BASE COUNT6204b00-160210-211223

171 A

126 C116 G120 UORIGIN
1 GGGACUAAAC GCACUGAAUA CCGUACUACA ACAGACGAAG UUGUAAAUAG CCGUGGUAAU
61 UAUGAACGAA UAUGGCCAUG UGUCCGCUAA UCCGCGGUAC UAGCCAGUUA GCAACUGCAC
121 CAAUCGCUCA CGUCAGUGGU UCUAUGCAAU AUGCUCCAGU ACCCUGUAAG UUCGCAAUCA
181 AUAGACGCGC CUUACUCCUC UCAAGAAGGG UAUCUGCAUG AGCCGACACA UCAAGACCCA
241 AUGGACGUUU GAGCGAGUGG CUUGGAGAGU AUUAACGCAC UAACUCUUCG AAGGCUUACU
301 UCGGCAAAUC CGCGAGCUCC ACUAUUAACA UGCCAAUACG ACAGGAUCAA UUCUGCGACU
361 GCACGACCGA AUUAUGCACC UACUUUGUGA GGCACGAGAU UCGUCUUGCA GCUAUUUAAA421 GGGUUCCAGC UUAUGGAUAG GCGACUCUUC AGUGCGUAAU AAAGCAACGC CCAAUCGGCA
481 UGUUACCGGA UAGUACGGGC GAUAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA//

分子量: 171 547.8
アクセッションナンバー：AB610942 （6204-a-500-4という名称で登録）
図 1-(c) 試料 RNA500-C 中に含まれる RNA の塩基配列BASE COUNT283 A258 C257 G235 UORIGIN1 GGGCGAUUCG AAGAGGUACG AGUGGACGCG UAAGCGAAUG ACCUAGACCU CGGCGUUAAU61 UAGGACCCUC UAAUCGCAAA CUCGACUCUC GUCCCAAUCC AAUGGAUGUC CAGUGCUCGG121 UAGCAUGAUC GUAUGAUGCG UAUCGCUGCG AGUAGAGGCC GACAAGUAGA CCGGUGCGAA181 UUUGGAGGUA CUUAGCCUCA UAUGAGAGCG CCUUGAAAUC ACCCAGUGCC GAUCGUAGCG241 GAAGAUUACU AGACUCCGCA GGGAAAUCCC ACCUGUAACG ACGGAAGAGC GUCACGAUAG301 CCUCUAACUA UCCGGUUCGC GACUAUCCGC UUAUGUGCCU CCACCUAAUG UGAGAGUUCA361 CCGAGGCAAA UGAUCUGUCA ACCGGUGUGA UCAGGACAUA CGCUUAAUGC CGUAGAAGCC421 CGUAAGCUCU CCGCCCUUUA AGAGGUUGUA GACGGCAGUU CUAAGGUCGU CGGGUCUAUG481 CCUUGCGACC UAAUAAUACG ACCGUGUGCU UAUGCGGACU GUCCUCUAAU GAAUAUCGCU541 UGUCCUAAGC UGGCGGUACU AGUGCUUAGG AUCGCACACC UCACCACAGU GCGCAUUUAA601 CCCUGUAGAU AACAUGGUAG ACACCGGUAA AUCGCGUUCG AAUUUCGCCC AAUCGAAGGC661 CCACAUCACU ACGUCGCCUG UAUUCUGAAC CUUGCGCUGC ACGUAGCAUA UAGAGCGUAC721 AUUCAAUCUA CCAGUUGCCU CCGACUGAAG UCGGCUAGCG UAUGACAUAG CGAGCUCUUA781 GUUCGGUGAC UACUUCUAGC ACUCCCAAUU CAAGCUCUGC GUUAUCAGGG UCGGAAGGUU841 AGGUUCGAAU UUCGACAGGC UAACAGAGCG AUAAGUGAUG AAUCCGCUCC GGGAGCAUCU901 AGACAAUAAC CGCGGUUAAG AGAAGGGCGA CAUAAGCGCG GGUGUCAACG UUCAAACCAG
961 UUGUAGCCAU CGCGAUUACC CGUUGGGAAU CUGAGGCGAC CUAAAAAAAA AAAAAAAAAA1021 AAAAAAAAAA AAA//分子量: 332 585.9アクセッションナンバー：AB610946 （6204-a-1000-3という名称で登録）
図 1-(d) 試料 RNA1000-A 中に含まれる RNA の塩基配列

BASE COUNT267 A

262 C245 G259 U4/6

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6204b00-160210-211223

ORIGIN
1 GGGAUUCCUA GGACUGUACU CUCGGUGCGU UGACCAUACG UAAGGCGAUC CUUUGAGUGG
61 AUCCCAUUAC UACGCGUCAC ACCUGCUUAC CCUCCCAAUA GUUGGUUCAG UAGCUCUCAG
121 CGGUUCUGGC AGAGUUCGGA UGAGUUUCUG CCUAUCAGUU CAUAGGUGCC CACGCAUUGG
181 GUCCACUCCU CGCCAGAAUU UGCGCAUUGC ACCAUUACUA CAGGCGGCUU UGGUUGUACG241 UCUAACGUUC GCACCAACAG GAGUCUCAGC UGAUCAUAGG CCCGGACCCU CAAUGUUCGA301 UGCGAUUCGU AAGAGGGUGU UCGUGUAAGG CCCAAUACGU UGUCAUGCCG GCUUAGAAAC361 CCAGUCGGAC GCGUCUCUAA CACUCGGAUG UGCAGGUAAU AGCCUUUACC AGCGCUUCUG421 UACGACCAUA CUUAGAGCUC GAGAUGCCGA CAUGAAAGGA UUCCGGAGUA CUGACCUGAA481 UACACGUUCA UAGCGUAAAU CGGCCGAGAU UCAACUUUAC GGCACGGAUA CAGCUCCUCU541 ACCUAUUUCC GUCGAAGUCU CUCACGAUAG UCGCGUACAU UUAGUGGGCG GUACACACAG601 CACGUCAACG CCAUCGCACU CUGAGUUCCC ACUCCACGGU ACGUUCACAG CACGUUGCCU661 UAAUAAGCUA CUUCGGUUCC GAGCAGUCAA CCUACUGUUU CCGGGUUAGC GCUCUGAUCA721 GCACCCGUUU ACUGACACGA ACCGCUAUCG AAUACUGAGU AGGUCGUGUG CCAAUAACUU781 UGGUUGCAGC UAAGCUAAUC GGACGGCGAC UUUAGCAAGU AACUCAGCCG UAUUGUUACG841 CUGACCGUAA ACGACGUGAG CGAUUGUCGU AGGUUAGCCA UAACAUAAAG GUUUCCCGAA901 CGGUAGCAUA GUUAGGCCUG UGUCCAGUCA GGUAAUACGA GAGAGUAAUU AACGCGAUCU
961 AAUGAGAAGC CGUGCAUGUC GAUCCUUGUU ACGGGUGUGA AAUAAAAAAA AAAAAAAAAA
1021 AAAAAAAAAA AAA//

分子量: 331 744.9
アクセッションナンバー：AB610947（6204-a-1000-4という名称で登録）
図 1-(e) 試料 RNA1000-B 中に含まれる RNA の塩基配列② ゲル電気泳動解析結果
本標準物質について、マイクロチップ型ゲル電気泳動により泳動解析を行ったところ、533塩基または1033塩基付
近に単一のバンドが確認された。
③ 密度測定結果
本標準物質について、振動式密度計を用いて25 ℃における密度測定を行ったところ、全ての試料の密度は0.9971 g/cm3であった。
【生産担当者】
本標準物質の生産に関する技術管理者は高津章子、生産責任者は藤井紳一郎、値付け担当者は藤井紳一郎、柴山祥枝、稲垣和三、山﨑太一、関口勇地、野田尚宏、松倉智子、佐々木章、吉岡真理子である。
【情報の入手】
本標準物質に関して認証値の変更等、重要な改訂があった場合、下記ホームページから「標準物質ユーザー登録」を行った購入者に通知する。なお、本標準物質に関する技術情報は、下記連絡先より入手できる。
【認証書の複製について】
本認証書を複製する場合は、複製であることが明瞭にわかるようにしなければならない。
【付記】
本標準物質は、新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）の委託事業「DNAチップの互換性向上のためのSIトレーサブルな核酸標準物質作成・評価技術の研究開発」（2008-2010年度）および経済産業省委託事業平成27
年度政府戦略分野に係る国際標準化活動「標準物質を用いた臨床検査機器の測定妥当性評価に関する国際標準化

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・普及基盤構築」（株式会社三菱総合研究所からの再委託）の研究成果に基づくものであり、産業技術総合研究所バイオメディカル研究部門との研究協力により開発された。

2020 年 4 月 1 日

国立研究開発法人 産業技術総合研究所
理事長 石村 和彦

本標準物質に関する質問等は以下にお問い合わせをお願いします。
国立研究開発法人 産業技術総合研究所 計量標準総合センター
計量標準普及センター 標準物質認証管理室〒305-8563 茨城県つくば市梅園 1-1-1
電話：029-861-4059、ファックス：029-861-4009、ホームページ：https://unit.aist.go.jp/qualmanmet/refmate/

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