受賞者講演要旨《農芸化学女性企業研究者賞》

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タンパク質工学を利用した産業用酵素の開発

ノボザイムズ
はじめに
自然界には，様々な機能を持つ酵素が存在し，比較的容易にジャパン株式会社

松井知子

し，MTP（microtiter plate）によるスクリーニングを行い，高温での活性・耐性がともに上昇した変異体を取得した．

目的とする反応を触媒する酵素を取得することができる．自然

これにより，高温でのブランチング処理が行われるフレンチ界に存在しない化合物を基質とした反応を触媒する酵素ですらフライ等へのアスパラギナーゼの効率的な応用の可能性が広発見されることがある．しかし，産業用酵素としては，目的とがっている．

する触媒機能だけではなく，実際のプロセスの条件（pH，温2.

飼料用フィターゼの開発

度等）に適した酵素であることが求められる．また，長い貯蔵

穀物中の有機リンはフィチン酸の形態で貯蔵されているが，安定性等も産業用酵素の重要な要件の一つである．これらすべ

これは難消化性であるため別に飼料として無機リンを添加するての要件を満たした酵素を自然界から得ることは難しく，最近必要がある．また，フィチン酸はカルシウム等の 2 価金属イオ

ではタンパク質工学を利用して酵素を改変することによって足ンと結合するため，これらの腸内での吸収を妨げる．フィターりない要件を満たすことが日常的に行われている．

ゼは，このフィチン態ことによりカルシウムの吸収を促進させ以下に，筆者らが中心となり，タンパク質工学の手法を利用した酵素開発の例をいくつか紹介する．
1.

アスパラギナーゼによるアクリルアミドの低減

2002 年にスウェーデン食糧庁とストックホルム大学によって，澱粉等の炭水化物が多く含まれる食材の高温加熱加工の際に，アクリルアミドが生成することが発見された 1）．アクリルアミる．排泄物の富リン化や狂牛病の問題のため無機リン，肉骨粉利用が減少・廃止される中，この 10 年ほどの間に，家畜飼料へのフィターゼ配合は飛躍的に増加した．弊社では，担子菌
Peniophora lycii 由来フィターゼを発見し，製品化に至っている．
このフィターゼの熱安定性ならびにさらなる貯蔵安定性の向ドは，グルコース等の還元糖とアスパラギンからアミノカルボ上をめざし，蛋白質工学による耐熱化を行った．酵素分子のニル反応（メイラード反応）によって生成されるのが主な経路

Molecular Dynamics Simulation 法などの手法を用い，ターゲッと考えられている．そこで，弊社では Aspergillus 由来のアスト部位を決定，ライブラリーを構築しスクリーニングを進めてパラギナーゼを用い，食品中のアスパラギンのアスパラギン酸いった結果，最終的に熱変性温度が酸性中性両 pH においてへの脱アミド化によって，原因物質のひとつであるアスパラギ20℃以上上昇した変異体が取得された（表 1）．実際にこれらのンを低減することを目的としたアスパラギナーゼ製剤「アクリ変異体は，貯蔵安定性等が増加したことが確認されている．

ルアウェイ」を開発した（図 1）．本製剤を生地に添加しアスパ

また，飼料製造には，ペレット化工程（殺菌と穀物澱粉の糊ラギンを減少させた後に焼成することにより高温で加工製造さ化のための短時間スチーム処理）を含む場合が多く，飼料用酵れる（ビスケットやトルティーヤ，成型ポテトチップスなど）

素はペレット化工程中に熱により失活する危険性がある．そこの食感・外観を損なうことなく，アクリルアミドの生成を抑制で，弊社では CT 顆粒（コーティングした耐熱性顆粒）を開発，することが可能になった．この製剤の用途を広げるために，タフィターゼに応用し，ペレット化工程で失活せず優れた熱安定

ンパク質工学によるアスパラギナーゼの耐熱化を行った．変異性を保持している酵素顆粒製剤を製造しているが，このペレッ導入箇所を，酵素分子のモデリングなどにより特定し，アスパト化工程でのさらなるフィターゼの安定性を得るため，筆者ら

ラギナーゼ遺伝子の変異体ライブラリーを酵母を利用して作製は Citrobacter braakii 由来のフィターゼのタンパク質工学による耐熱化も行った． Molecular Dynamics Simulation（MD）
法を用い，高温化での酵素分子の動きを予測し分子内 SS 結合を導入できる場所を探した．温度変化により大きく構造が変化する部位を同定し，変異を導入したところ（図 2），この分子内SS 結合変異体は，熱変性温度が上昇しているだけでなく，熱変性後のリフォールディング率の向上した変異体であることが確認された．また，ペレット化工程後の安定性向上も確認されている．

表 1.

図 1.

 クリルアミド生成過程の一経路（左）とアスパラギナーゼ
アによるアクリルアミド低減のメカニズム

DSC による熱変性温度（Td）

精製酵素

Td（℃）at pH2.5

Td（℃）at pH5.5

野生型
変異体 13660

5982

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《農芸化学女性企業研究者賞》

図 3.

図 2.

 itrobacter フィターゼの 500 K（濃）と 300 K（淡）におCける MD 予測構造の重ね合わせ
スティック表示は，フィチン酸，温度変化により大きく構造変化した部分を丸で表示

受賞者講演要旨

 ルファアミラーゼ変異体による生澱粉からのグルコー
アス生成効率の改善
同タンパク量のアルファアミラーゼ変異体と一定のグルコアミラーゼをトウモロコシ生澱粉に作用させ，生成グルコース量を測定収する手間が要らず，直接トラクターで鋤き込みができる生分解性マルチフィルムの需要がのびている．この酵素をさらに利3.

バイオエタノール用アミラーゼの開発

用すれば，フィルムの分解がコントロールできるため，作物の限りある化石エネルギーの代替として燃料用エタノール製造

取り入れ期の違いによってフィルムを変える必要もなくなる．

は，ブラジル・アメリカを筆頭に世界的に普及しつつある．原

また，土壌中のシートの切れ端がトラクターに絡まるなどの問料となるのは，サトウキビ，あるいは，とうもろこしを主とし題も減少する．実際に市販の PBS フィルムにこの酵素を噴霧た穀類である．とうもろこしの場合，ミルにて粉砕後，ジェッしたところ，翌日にはシート上に部分分解にて生じた裂け目がトクッカーあるいは 80℃以上の高温で糊化され，バクテリア観測でき，容易にトラクターにて鋤き込み可能となった．この由来アルファアミラーゼにて液化し，その液化澱粉にグルコアように，自然界より選び出した酵素のポリエステルに対する基ミラーゼなどの酵素製剤を添加しアルコール発酵を行う．これ

質特異性を向上させ，グリーンプラの分解促進へ応用することが現在の主流のプロセス（Conventional process）である．に成功した．また，酵素自身は土壌中で分解されるため，環境

ところが，米国 POET 社が開発した新プロセスでは，糊化・に影響を与える心配はないという点においても，非常に有用な液化工程を必要とせず，ミル粉砕したとうもろこしを直接一段応用であると考えている

階にてエタノール発酵を行う．これによりプロセス全体の 10–おわりに20％ほどかかっていた糊化・液化用エネルギーを削減すること

近年，ゲノム解析技術の発展とともに利用できる酵素遺伝子ができる．また，発酵残渣は飼料として用いられているが，情報は膨大に増加しており，DNA 合成技術の進歩とともに簡単

Conventional process のものに比べ，メイラード反応生成物がに遺伝子合成，そしてタンパク質合成が可能となってきている．

なくビタミン等豊富なため，付加価値が上がるというメリット

しかし，実際に産業用酵素として利用するには，製造時でのがある．しかし，このプロセスでは，生澱粉を分解する必要が生産量，安定性，酵素製剤としての安定性，実際の応用条件であり，従来の糊化を含む工程より酵素添加量が非常に多くなっの酵素のパフォーマンスを始めとして，数多くのハードルを乗てしまい，酵素コストがかかるのがデメリットになっていた．

り越えなくてはならない．

そこで，筆者らは生澱粉に対し非常に特異性の高いアルファア

その際にタンパク質工学は非常に有効な手段であり，各種のミラーゼをタンパク質工学により開発し，酵素の添加量を顕著変異導入部位選定法，ハイスループットな簡易スクリーニングに減らすことに成功した（図 3）．

法と実際の酵素の反応条件に基づいて構築した特異的なスク

4.

バイオプラスチック分解促進用酵素の開発

生分解性プラスチックは“グリーンプラ”として各種分野でリーニング方法とのバランスの良い組み合わせにより，必要とされる産業用酵素の開発を迅速かつ的確に遂行することが可能利用が広まっている．しかし，コンポスト中などの高温下ではとなるであろう．

分解を受けやすいが，実際の土壌中などでは速やかに分解され（引用文献）にくい．そこで，筆者らは酵素を添加することによりその分解を促進させることを試みた．筆者らは以前，ポリエステルの分解を試み，様々な加水分解酵素をスクリーニングし，またその特異性を上昇させるため蛋白質工学も行っている．その時に得1）Donald S. Mottram, Bronislaw L. Wedzicha and Andrew T.,
Dodson Acrylamide is formed in the Maillard reaction, Nature, Vol. 419, p. 448–449,（2002）2）松井知子 タンパク質工学・進化分子工学を利用した産業用酵素の開発．生物工学会誌，85（9）,p. 393–408,（2007）られた変異体を PBS（poly（butylene succinate））フィルムの分解に応用させたところ，他の加水分解酵素に比べ，PBS に謝辞

ここにおける研究は，ノボザイムズ

ジャパンなら対して特異性が高いことが判明した．実際に，PBS フィルム

びにノボザイムズ

断片をこの変異体を含む水溶液中に浸漬し 40℃にて反応させメリカにてると，4 時間後には完全に溶解した．この酵素の実際の応用分

恵都子，Lars K. Skov, Allan Nørgaard, Allan Svendsen 他多く

野の一つに，畑などに使われる農業用マルチフィルムの分解促の同僚とともに行った仕事，成果です．改めて，研究開発にか進がある．この分野において，作物取り入れ後のフィルムを回かわったすべての皆様に心から感謝申し上げます．

デンマーク本社

ノボザイムズノースア

福山志朗，綾部圭一，倉方悠馬，富木亜紀，平山