Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 13, No. 2, 85–88, 2013

総説（特集）

ダイズ根圏の N2O 発生機構と根粒菌による削減
Mitigation of N2O Emission from Soybean Rhizosphere by Bradyrhizobium japonicum Inoculation
板倉学，Sánchez Cristina，森内真人，南澤究

Manabu Itakura, Cristina Sánchez, Makoto Moriuchi and Kiwamu Minamisawa
東北大学大学院生命科学研究科 〒 980–8577 仙台市青葉区片平 2–1–1
Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2–1–1 Katahira, Aoba-Ku, Sendai 980–8577, Japan
キーワード：亜酸化窒素，脱窒，ダイズ根粒菌，根圏Key words: Nitrous oxide, Denitrification, Bradyrhizobium, Rhizosphere（原稿受付1.

2013 年 11 月 27 日／原稿受理

はじめに一酸化二窒素（N2O, 亜酸化窒素）は強力な温室効果ガスであるとともに，オゾン層破壊の主要な原因物質である。大気中の N2O 濃度は，産業革命以前の 270 ppbvから，近年にいたるまでほぼ直線的にその濃度が増加し続けており，地球環境問題の対策として大気中へのN2O 放出量の削減は必要不可欠となっている。
N2O は農業活動からの発生量が約 4 割と多く，マメ科植物の根粒根圏は N2O 発生のホットスポットであり 1,11,15,17)，マメ科植物の圃場や牧草地からの N2O 発生低減化技術の研究は，近年世界的にも注目を集めている。そこで，本稿では我々の実施してきたダイズ根粒菌の N2O 還元酵素遺伝子 nosZ，根圏微生物コミュニティーの N2O 代謝の分子微生物生態学的な N2O 発生メ
カニズムおよびダイズ根粒菌の N2O 還元能を利用した
N2O 削減の研究について紹介したい。
2.

ダイズ根粒菌における脱窒遺伝子と N2O 還元能

ダイズ根粒菌（Bradyrhizobium japonicum）は共生窒素固定だけでなく，その逆過程の脱窒も行い，硝酸イ オ ンから窒素ガス（N2）までの還元（NO3– → NO2–→ NO → N2O → N2）を行う（図 1）。2002 年に全ゲノム塩基配列が決定された USDA110 株では各ステップの反応を担う還元酵素遺伝子（napAB, nirK, norCB, nosZ）を保有していた 8)。しかし，ダイズ根粒菌には，USDA6株 9) のように nosZ 遺伝子を欠いているために N2O までの脱窒しか示さない株も存在している。日本の土着ダイズ根粒菌株の脱窒遺伝子を調べたところ，N2O 還元酵素遺伝子 nosZ を保有系統と非保有系統が存在していた 6,12,13)。これは，ダイズ根粒菌 B. japonicum は硝酸から N2O までの還元過程は共通して保有しているが，最終反応の N2O 還元酵素およびその構造遺伝子 nosZ は一部のダイズ根粒菌にしか存在しないことを意味する。

2013 年 12 月 4 日）

N2O 還元酵素は N2O から N2 への反応を触媒する酵素であり，N2O の削減において非常に重要な因子である。
そこで，ダイズ根粒菌の N2O 還元活性が nosZ 遺伝子に担われているか調べた。その結果，USDA110 株の nosZ遺伝子破壊株は N2O 還元酵素活性を失い，その nosZの遺伝的相補により N2O 還元酵素活性が回復した 14)。
さらに，USDA110 株により形成された根粒は 15N-N2Oを定量的に 15N-N2 に変換したことから，N2O 還元能を持つダイズ根粒菌は根粒状態においても N2O を N2 に吸収還元する能力を有していることが明らかとなった。また驚いたことに，大気中に微量に含まれている N2O ガス（約 340 ppb）をも吸収還元した（図 1）14)。土壌中のN2O 濃度は一般に大気中より高いので，nosZ 遺伝子を持ったダイズ根粒菌が形成した根粒は土壌中の N2O をクリーンアップできると考えられた。
3.

N2O パラドックス

上記の実験結果は，ダイズ根粒が少なくとも N2O の強力なシンクであることを示している。一方，農耕地の図 1．ダイズ根粒菌 Bradyrhizobium japonicum による脱窒。

板倉86

他

図 2．老化根粒からの N2O 発生と老化根粒の顕微鏡観察。
図 3．根粒根圏の N2O 発生メカニズム。

環境科学分野では，ダイズも含めたマメ科作物圃場からN2O が放出されていることが多数報告されている。この N2O パラドックスの原因を解明するために，東北大学の鹿島台圃場のダイズ根系の N2O フラックス測定をダイズ栽培期間中，根粒や根に分けて行ってみた。その結果，老化根粒から N2O フラックスが高いことが一つの原因であることが明らかとなった（図 2）3)。
N2O が発生している老化根粒，発生していない新鮮根粒，根から DNA を抽出し，培養に依存しない DNAに基づく生物群集構造解析と顕微鏡観察を行った。その結果，種々の脱窒細菌，脱窒糸状菌が検出された（図2）3)。また，原生動物や線虫も検出された（図 2）。
根粒の老化過程を注意深く観察すると，新鮮根粒の窒素固定機能が失われると，根粒内がピンクから茶褐色になり，土壌の細菌捕食性線虫が根粒内に侵入する。その後，原生動物やカビが侵入し，1 ヶ月室温で放置しておくと根粒の内部はきれいに無機化され，根粒の表皮のみが残るという状況になった。これらの観察結果より，特有な土壌生物相が老化根粒内外で一過的に形成されているものと考えられた。
4.

根粒菌硝酸還元の N2O 発生への寄与

圃場栽培ダイズではどの微生物が N2O 発生に関わっているのか詳細な反復解析が難しいので，実験室で根粒老化を再現するモデル実験系を作成した 4)。N2O 還元酵素遺伝子 nosZ を保有するダイズ根粒菌 B. japonicum
USDA110 株 と 硝 酸 還 元 酵 素 系 変 異 株 ΔnosZ，ΔnirK，ΔnirKΔnosZ を接種してダイズを無菌的に栽培し，30 日後に根粒老化を促進するため（i）地上部切除，（ii）地上部切除と土壌添加等の同時処理を行った。その結果，土壌添加と地上部切除の同時処理を行ったダイズの根粒からのみ，ΔnosZ，ΔnirKΔnosZ 株接種において顕著なN2O 発生が見られ，N2O の発生はダイズ根粒菌の nosZの機能に依存していることが明らかとなった 4)。また，
ダイズに 15N2 ガスを暴露し根粒内の固定窒素を 15N で標識し，根粒老化によって発生する 15N 濃度を測定した結果，15N 標識した根粒が老化した際に放出される N2O
ガスの 15N 濃度は根粒の 15N 濃度と等しかったので，根粒根圏から発生する N2O の起源は根粒窒素であることが明らかとなった 4)。

最終脱窒産物が N2 である USDA110 株を接種源とした根粒からは N2O は発生しなかったが，ΔnirKΔnosZ 株を接種源とした根粒からは ΔnosZ 株接種根粒の約半分の N2O 発生が観察された。ΔnirKΔnosZ 株では脱窒反応が亜硝酸で止まり，ダイズ根粒菌由来の N2O は発生しない。そのため ΔnirKΔnosZ 株接種根粒からの N2O 発生には，接種したダイズ根粒菌以外の土壌微生物が関与していることが強く示唆される。
以上の結果より，ダイズ根粒根圏からの N2O 発生には，N2O 発生源（ソース）としてダイズ根粒菌と土壌微生物の両方が関与していること，nosZ 遺伝子を保有しているダイズ根粒菌が N2O 吸収源（シンク）として働くことが明らかとなった（図 3）4)。
5.

ダイズ根粒根圏における糸状菌脱窒

上記のモデル実験系に脱窒カビをはじめとする真核生物の生育を阻害するシクロヘキシミドを添加したとこ
ろ，N2O 発生が顕著に減少した。このことからダイズ根粒根圏からの N2O 発生には脱窒性糸状菌の関与が示唆 さ れ た。 脱 窒 性 糸 状 菌 の 中 で も フ ザ リ ウ ム（Fusarium 属糸状菌）が高い脱窒能を保有しているということが分かっており 16)，顕微鏡や DNA 解析からも老化根粒においてフザリウムの存在が検出されていた。そこで，根粒根圏からの N2O 発生への脱窒糸状菌の関与を明らかにするため，N2O 発生が活発に起こっている根粒根圏から三日月型をしたフザリウム様の胞子の単胞子分離を行った。得られた 12 株の糸状菌の系統マー
カ ー 遺 伝 子 配 列 を 決 め た と こ ろ，11 株 が Fusarium
solani であった。
フザリウムは植物病原菌として知られているが，ダイズには特に病兆を示さないので，本分離株は非病原性のフザリウムと考えられる。得られたフザリウム分離株の脱窒活性試験を行ったところ，硝酸ではなく亜硝酸のみを脱窒基質として利用し，ほぼ化学量論的に N2O へと変換されることが分かった。さらに，15N 標識トレーサー実験によって発生した N2O の発生源を調べたとこ
ろ，発生した N2O はすべて亜硝酸由来であった。したがって，ダイズ根粒根圏からの N2O 発生を起こしている鍵土壌微生物として，フザリウムによる亜硝酸からのダイズ根圏の N2O 発生機構と根粒菌による削減

N2O 発生が強く疑われる（図 3）。
6.

根粒根圏からの N2O 発生の低減化

モデル実験系によるダイズ根粒根圏からの N2O 発生機構の検討の結果，ダイズ根粒菌及び脱窒糸状菌がN2O ソースとして働き，ダイズ根粒菌の保有する nosZが N2O のシンクとして機能していることが明らかとなった。そこで，筆者らはダイズ根粒菌の nosZ の活性を高める，すなわち N2O シンクの機能を増強することが出来れば，N2O 削減に利用できると考えた。そこで
N2O 還元活性の高いダイズ根粒菌（nosZ++）の作出を，B. japonicum USDA110 株を用いてプロモーター強化及び不均衡変異導入 5,7) の 2 つのアプローチで試みた（図 4）。その結果，プロモーター強化株，不均衡変異導入株のいずれも野生株と比較し N2O 還元活性の顕著な上昇が認められた 5,7)。
前述のモデル実験系を用いて，nosZ++ 株接種根粒からの N2O 発生を測定した結果，根粒老化過程における N2O 発生の有意な低減化が観察された 7)。特に，土壌 中 の 濃 度 を 想 定 し た 10 ppm N2O 雰 囲 気 中 で は，nosZ++ 株根粒のみで N2O の取込みが見られた。以上の結果より，nosZ++ 株により形成された根粒は N2O除去ポテンシャルが通常の nosZ+ 株よりも高いことが明らかとなった 7)。さらに，ポット栽培系を用い，nosZを保有していない根粒菌（nosZ- 株）が優占している土壌に，nosZ++ 株及び nosZ+ 株を接種しダイズを栽培87したところ，土着 nosZ- 株区と比較し，nosZ++ 株及び nosZ+ 株接種区において，根粒老化過程におけるN2O 発生が有意に減少していた。また老化根粒を回収し，老化根粒由来の N2O 発生を詳細に測定した結果，
nosZ++ 株接種によって nosZ+ 株接種に比べ N2O 発生量が有意に減少していた 7)。nosZ++ 株の接種効果を圃場レベルで検証するため，nosZ- ダイズ根粒菌が優占している実験圃場で nosZ++ 株の接種試験を行った。
その結果，根粒老化が起きる収穫期以降にダイズ根圏から発生する N2O をフィールドレベルでも半減させることが判明した 7)。
7.

根粒菌 N2O 還元酵素遺伝子の新規制御系

不均衡変異導入法により作出された nosZ++ 株のN2O 還元活性上昇の原因を明らかにするため，同手法により作出された 6 株の nosZ++ 株のゲノム解析を行い，染色体上の変異を同定した。その結果，解析した全ての nosZ++ 株において，硝酸同化系遺伝子の二成分制御因子 NasST 10) のセンサータンパク質をコードするnasS 遺伝子に変異が生じていた。そこで，B. japonicum
USDA110 株の nasS 変異株を作成したところ，nosZ++株と同様に N2O 還元活性の上昇が観察され，nasS の変異が N2O 還元活性上昇の原因であり，nosZ の発現制御に関与していることが示された（図 5）。NasS は NasTとともに，硝酸・亜硝酸の同化系遺伝子 nasABCDEF,nirA などの 2 成分制御系として機能していることが他

図 4．N2O 還元酵素活性強化根粒菌の二つの作出方法。

図 5．NasST による硝酸還元系遺伝子の転写制御。

板倉

88の脱窒細菌で知られている（図 5）。実際，nasT 変異により nasS 変異による nosZ の発現や N2OR 活性上昇はキャンセルされた。これらの結果より，nasS による脱窒過程の nos 遺伝子制御も同様なメカニズムなのか，その同化・異化および還元 • 酸化を超えた NasST による制御の可能性という面で興味深い。さらに，上記のダイズ根粒菌の nasS 変異に着目すれば，nosZ++ 株を取得できることを科学的に証明したことも，実用化という観点でも重要である。
8.

おわりに根圏微生物研究の創始者である Hiltner は 1904 年にマメ科植物根の周辺土壌では細菌数が増加することを明らかにし，それは根粒から放出される窒素化合物の影響であると考察した 2)。ある意味では，本研究は Hiltnerの根圏研究の現代版であるとも言える 18)。
根粒根圏から放出される N2O は，根粒タンパク質を物質的な起点として，土壌生物によるアンモニア化，硝化，脱窒と，根粒菌による N2O 還元のバランスにより生成すると考えられる。目に見えない微生物群がどのように物質循環過程を担っているかは微生物生態学の課題であるが，実は純粋分離された個別の微生物の性質に基づいて推定されている場合が多い。今後，アンモニア化，硝化，脱窒の各過程を担っているプレーヤーと窒素形態変化のダイナミズムの解明を，同位体化学とゲノム解析を駆使して解析することは，挑戦的で魅力的な課題である。
ダイズ根粒菌 nosZ++ 株の作出と N2O 削減効果の実証は，世界で初めての微生物を利用した N2O 削減技術の成功事例である 7)。今後，地球温暖化の防止という観点から本技術を広く世の中に広めていくためには，圃場
野生株のナチュラルバリエーションからの N2O 還元酵
素活性の高い根粒菌の選抜作出法の開発とそれらの利用が大変重要となる。さらに，ダイズ根粒菌において二成分制御系 NasST が N2O 還元活性の上昇に関与していることが明らかとなった。この NasST は硝酸同化系遺伝子の二成分制御系として環境細菌に広く分布していることが知られており 10)，nosZ++ 株よる N2O 削減戦略のNasST 及び nosZ 遺伝子を保有する環境細菌への応用も期待される。
謝

辞

本研究は生物系特定産業技術研究支援センター「基礎研究推進事業」及び「イノベーション創出基礎的研究推進事業」の助成により行われました。
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