Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 13, No. 1, 13–18, 2013

総説（特集）

Dehalococcoides 属細菌を含む複合微生物系を利用したバイオオーグメンテーション技術の開発と現場適用
Development and Practical Application of in situ Anaerobic Bioaugmentation Using
Dehalococcoides-containing Dechlorinating Mix Culture
奥津徳也 *，田村渉，上野俊洋，石田浩昭

Noriya Okutsu,Wataru Tamura, Toshihiro Ueno and Hiroaki Ishida
栗田工業株式会社 〒 329–0105 栃木県下都賀郡野木町川田 1–1* TEL: 0280–54–2609 FAX: 0280–57–2957* E-mail: noriya.okutsu@kurita.co.jp
Kurita Water Industries Ltd., 1-1, Kawada, Nogi-machi, Shimotsuga-gun, Tochigi 329-0105, Japan
キーワード：土壌・地下水汚染，トリクロロエチレン，バイオレメディエーション，Dehalococcoides 属細菌
Key words: Contamination of soil and groundwater, trichloroethene, bioremediation, Dehalococcoides
（原稿受付

1.

2013 年 6 月 27 日／原稿受理

はじめにテトラクロロエチレン（PCE）やトリクロロエチレン（TCE）等の塩素化エチレンはドライクリーニングの溶剤や金属の洗浄剤として使用されてきたが，発ガン性や肝機能障害を誘発する可能性が指摘されており，土壌・地下水汚染が社会問題となっている。
土壌・地下水汚染対策としては，これまで，掘削除去や揚水処理が多く用いられてきたが，掘削除去への偏重は，ブラウンフィールド問題の深刻化や搬出汚染土壌の不適正処理につながりかねない。平成 22 年 4 月には，掘削除去偏重の是正をひとつの目的として，改正土壌汚染対策法が施行されている。
一方，嫌気性バイオレメディエーションは，揚水処理に比べて浄化期間が短く，掘削除去よりも低コストであることなどの理由から近年適用されるケースが増えている。バイオレメディエーションは，バイオスティミュレーションとバイオオーグメンテーションに大別される。前者は有機物や栄養塩等の増殖基質を供給して土着微生物を活性化するものであり，後者は外来微生物を導入するものである。現在適用されているのは主としてバイオスティミュレーションであるが，2005 年に経済産業省・環境省により「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」（以下利用指針と称する）が告示されたこともあり，バイオオーグメンテーションも徐々に普及しつつある。
当社は，バイオスティミュレーションによる浄化を加速する技術という位置づけで，Dehalococcoides 属細菌を含む複合微生物系を利用したバイオオーグメンテーション技術の開発を行い，2008 年 6 月に，複合微生物系として初めて，利用指針に対する適合確認を経済産業

2013 年 6 月 27 日）大臣・環境大臣から取得した。
ここでは，当社における Dehalococcoides 属細菌を含む複合微生物系を利用したバイオオーグメンテーション技術の開発と現場適用事例について紹介する。
2. Dehalococcoides 属細菌を利用したバイオオーグメンテーションの概要
塩素化エチレン分解反応の概念図を図 1 に示す。嫌気条件下，PCE や TCE は，ジクロロエチレン（cis-DCE），塩化ビニル（VC）を経て，エチレンやエタンに脱塩素化される。嫌気性バイオレメディエーションは本反応を利用するものであり，使用される電子供与体の種類，地下への供給方法等に関しては，既報を参照されたい 8)。
Dehalococcoides 属細菌を利用したバイオオーグメン
テーション技術は，こうした電子供与体の供給技術に加えて，予め培養した微生物群を導入する技術であり，工法としてはバイオスティミュレーションとほぼ同等である。
そこで以下に，国外における普及状況について述べる。
Dehalococcoides 属細菌を利用したバイオオーグメン
テーション技術は，欧米において早く実用化されており，野外での利用実績も多数報告されている 1,3,4)。このように欧米で実用化が進んだ要因は，cis-DCE 以降の分解には Dehalococcoides 属細菌が必須であることを示すデータが集積されてきたことと 2)，VC 分解酵素の発見 5)によるところが大きい。これらの研究成果に基づき，① cis-DCE 以降の分解が進まない，② VC 分解酵素を有 す る Dehalococcoides 属 細 菌 が 検 出 さ れ な い， ③
Dehalococcoides 属細菌を増大して浄化期間を短縮した
い，といった現場において，バイオオーグメンテーションが適用されている。

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奥津他

図 1．塩素化エチレン分解反応の概念図．

表 1．バイオオーグメンテーションに利用されるコンソーシアムの概要

栗田工業

SiREM

浄化実績数

―

適用先

日本

150
米国，英国，スウェーデン，デンマーク

主な分解物質TCE, cis-DCE, VC

Dehalococcoides
Trichococcus pasteurii
コンソーシア Clostridium
ム中の主要微 pertidivorans
生物Methanobacteriumbryantii

病原菌評価

会社名
Shaw Environmental,Inc.
160

Regenesis
30

Bioremediation
Consulting Inc.
6

米国

米国

米国

TCE, cis-DCE,
PCE, TCE, cis-DCE, VC PCE,
VC, 1,1,1-TCA

Dehalococcoides
Geobacter
Methanomethylovorans

96 種類の病原菌につい 11 種類の病原菌についてコンソーシアム中に てコンソーシアム中に存存在しない事を確認。 在しない事を確認。

Dehalococcoides
メタン生成菌不明

PCE, TCE, cis-DCE,PCE, TCE, cis-DCE,
VC, 1,1,1-TCA など
VC, 1,1,1-TCA など
Dehalococcoides
Dehalobacter a)
Desulflomonas
michiganensis
Dehalococcoides
Desulforomonas
Dehalobacter a)chloroethenica硫酸還元菌
メタン生成菌
メタン生成菌※ Shaw
Environmental, Inc のコンソーシアムのうち 1種を利用
13 種類の病原菌につい 7 種類の病原菌についてコンソーシアム中に てコンソーシアム中に存在しない事を確認。 存在しない事を確認。

上表は各社の HP および ESTCP 資料（Environmental Security Technology Certification Program, E. Cox et al., October, 2005）を参考に作成した。a）は 1,1,1- トリクロロエタン分解細菌であり，オプションで混合される。

当社がバイオオーグメンテーションに利用している微生物とともに，欧米の汚染現場での適用実績がある代表的な微生物について，概要をまとめたものを表 1 に示す。ここで注目すべきは，これら事業に利用されている微生物は全て複合微生物系（＝コンソーシアムであり，単離された Dehalococcoides 属細菌ではないという点である。単離菌では培養が不安定になる，地中に添加しても増殖しない，といった問題があるのであろう。一方コンソーシアムを利用する場合には培養液中に病原菌が含まれていないかどうかが重要となるが，この点については，当社を含め各社独自の評価方法を用いている。
3.

Dehalococcoides 属細菌を含む複合微生物系の培養

当社がバイオオーグメンテーションに利用するコンソーシアムは，国内の塩素化エチレン汚染地下水由来であり，VC を基質として集積培養を行い，菌相解析等により病原菌を含まないことを確認している 9)。このような開発段階では，100 mL 程度の培養液を用いて評価する こ と が 可 能 で あ る が， 実 規 模 の 帯 水 層 を 対 象 にDehalococcoides 属細菌を利用したバイオオーグメン
テーション技術を適用するには，より多くの培養液を生産する能力が必要である。実際に米国では，4000 L の発酵槽を用いた Dehalococcoides 属細菌の培養実績が報告されている 7)。ここでは，当社における 200 L 容量の発酵槽を用いた DHC 菌の大量培養について述べる。
発酵槽の外観を図 2 に示す。2.6 mM の有機酸を含む無機培地 150 L を発酵槽に入れ，窒素・炭酸混合ガス（混合比 8 : 2）で内部の空気を置換した後，発酵槽を密閉した。その後，還元剤として塩化第一鉄と硫化ナトリウムをそれぞれ 1 mM, 2 mM となるよう添加して培養液を調製した。培養液調製直後に，Dehalococcoides 属
細菌を含む培養液 1 L と VC ガスを 500 mL 添加して培養を開始し，所定期間経過後に有機酸を 0.1 mmole/L培養液 /day で連続的に滴下した。なお培養期間中は，発酵槽のジャケットに温水を通液することにより，培養液の温度は 30°C に保持した。また発酵槽内部に取り付けた撹拌羽を用いて，40 rpm で培養液を常時撹拌した。
培養期間中の VC 濃度，VC の分解生成物であるエチレン濃度，および Dehalococcoides 属細菌 16SrDNA コ

バイオオーグメンテーション法の開発

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図 2．200 L 容量の発酵槽外観

図 4．地下水中の TCE 濃度分布および井戸の平面配置

図 3．培養期間中における VOCs 濃度および Dehalococcoides
属細菌数の経時変化
図中矢印は，VC ガスを追添加した時期を示す。

ピー数（以下，DHC 菌数）の経時変化を図 3 に示す。
培養初期の VC 濃度は，約 1 週間で 16 mg/L から 3 mg/L まで低下し，エチレン濃度の増加が確認された。VC
分 解 に 伴 い，DHC 菌 数 は 約 104 copies/mL か ら 約107 copies/mL にまで増加した。その後は培養 20 日目から有機酸の連続滴下を開始した。その結果，VC の分解速度は約 3 倍に増加し，培養 33 日目には 108 copies/mLに到達したため，培養を終了した。
本結果から，VC と有機酸を栄養源として供給して嫌気 条 件 下 で 培 養 を 行 う こ と に よ り， 約 1 か 月 間 で，DHC 菌数を 108 copies/mL 含む嫌気性微生物群を 150 L調製できることを確認した。これにより，実規模の帯水層に対して DHC 菌を利用したバイオオーグメンテーション技術を適用することが可能となった。
4. Dehalococcoides 属細菌を利用したバイオオーグメンテーションの現場適用
前述のように，当社は，経済産業省と環境省による利用指針に対する適合確認を，複合微生物系として初めて取得した。そこで，確認申請した事業計画に従って実証試験を行い，前述のコンソーシアムを利用したバイオオーグメンテーションの有効性を評価した。既報 8) では試験期間中であったため，試験開始後 4 ヶ月までの結果を示しており，本報ではその後の経過を含めて報告する。
実証サイトの土質は砂礫層であり，地下水位は深度GL-6 m 前後，帯水層厚みは約 13 m である。
本サイトにおける TCE の汚染状況と設置井戸の配置
は図 4 に示す通りである。TCE 濃度 0.1〜1.0 mg/L 以上の範囲にコンソーシアム注入井戸（オーグメンテーション井戸：AIW）を設置し，AIW より 1 m 離れた地点にそれぞれモニタリング井戸 MW-1 を設置した。また対照井戸として，AIW より約 20 m 離れた地点に増殖基質注入のみの井戸（スティミュレーション井戸：SIW）を，約 30 m 離れた地点に増殖基質も注入しないモニタリング井戸（MW-3）を設置した。さらに安全性評価の目 的 で，AIW の 約 150 m 上 流 側 に モ ニ タ リ ン グ 井 戸（MW-4），3 m 下流に MW-2，約 100 m 下流側には系外流出防止用揚水井戸とモニタリング井戸（MW-5）を設置した。全ての井戸には，深度 GL- 約 6〜19 m の帯水層に対してスクリーンを設置した。
なお，実証試験開始前に測定したところ，AIW 周辺の井戸，SIW，および MW-3 における地下水中の DHC
菌数はいずれも検出下限値（5 copies/mL）未満であった。
コンソーシアムは，10 L 規模の発酵槽を用いて VCで培養したものを，輸送用タンクを用いて嫌気条件を保持したまま実証サイトに輸送した。合計約 25 L のコンソーシアム（DHC 菌数：約 1×108 copies/mL）を増殖基質とともに AIW に注入した。なお，地下水中を嫌気条件にするため，コンソーシアム注入にあたっては事前に増殖基質を注入した。バイオオーグメンテーションで

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奥津

図 5．AIW におけるモニタリング結果
図中 day 0 において，コンソーシアムを注入した。

は増殖基質の注入を 2 回実施したことになる。一方，バイオスティミュレーションでは増殖基質の注入は 1 回であるが，増殖基質の注入量は両者とも同じである。
各井戸でのモニタリング結果をそれぞれ図 5〜図 8 に示す。なお，揮発性有機化合物（VOCs），DHC 菌数，
お よ び TOC の 分 析 下 限 値 は， そ れ ぞ れ 0.001 mg/L，
10 copies/mL，1 mg/L であり，分析の結果未検出であった場合，図では便宜上，分析下限値の値を表示した。
オーグメンテーション井戸（AIW）では，コンソー
シアム注入前において TCE および cis-DCE 濃度はほとんど変化しなかったが，注入 1 か月後には TCE の分解に伴い cis-DCE 濃度が増加した（図 5）。注入 2 か月後に は，DHC 菌 数 の 増 加（ 約 1.0×106 copies/mL） と 同時に，cis-DCE 濃度は 0.033 mg/L にまで減少し，分解生成物であるエチレン濃度の増加が確認された。その後は VC 濃度も減少し，注入 4 か月後には 0.002 mg/L にまで低下した。
AIW の 1 m 下流に位置する MW-1 では，コンソーシ
アム注入 1 か月後には TCE の分解に伴い cis-DCE 濃度が増加した（図 6）。注入 2 か月後には，DHC 菌数の増加（約 1.0×105 copies/mL）と同時に，cis-DCE 濃度は0.02 mg/L にまで減少し，分解生成物であるエチレン濃度の増加が確認された。その後は VC 濃度も減少し，注入 4 か月後には一時的なリバウンドが発生したものの，
注 入 6 か 月 後 に は 検 出 下 限 値 未 満 と な っ た。 さ ら に
AIW の 3 m 下流に位置する MW-2 においても，注入 1か月後には TCE の分解に伴い cis-DCE 濃度が増加した（図 7）。注入 2 か月後にはほとんど変化は見られなかったものの，注入 3 か月後には DHC 菌数が増加（約 1.0他

図 6．MW-1 におけるモニタリング結果
図中 day 0 において，AIW にコンソーシアムを注入した。

図 7．MW-2 におけるモニタリング結果
図中 day 0 において，AIW にコンソーシアムを注入した。

17バイオオーグメンテーション法の開発

×106 copies/mL）し，注入 6 か月後には cis-DCE，VCともに検出下限値未満となった。その後は注入 7 か月後に VC が一時的にリバウンドしたものの，注入 9 か月後には検出下限値未満となった。
以上の結果から，TCE はコンソーシアムを注入した井戸およびその下流井戸全てにおいて，注入 2 か月以内で地下水基準に適合し，cis-DCE はコンソーシアムを注入した井戸およびその下流 1 m の井戸で注入 4 か月以内，下流 3 m で注入 6 カ月以内に地下水基準に適合した。また VC はコンソーシアムを注入した井戸で注入 4か月以内，下流 1 m の井戸で 6 か月以内，下流 3 m の井戸で 9 か月以内に地下水環境基準に適合した。下流井戸において cis-DCE および VC の分解に時間を要したのは，注入井戸と一定の距離があるため，注入直後における DHC 菌数が少なく，Dehalococcoides 属細菌の増殖が律速したためと考えられる。
一方 SIW では，増殖基質注入 1 か月後には TCE の分解に伴い cis-DCE 濃度が増加し，注入 2 か月後にはTCE 濃度が 0.034 mg/L にまで低下したものの，DHC菌数の増加や cis-DCE および VC 濃度の減少は確認されず，分解生成物であるエチレン濃度の増加も確認されなかった（図 8）。その後 DHC 菌数は，注入 5 か月後に 約 1.0×103 copies/mL， 注 入 6 か 月 後 に 約 1.0×
106 copies/mL に ま で 増 加 し， エ チ レ ン に つ い て も0.02 mg/L にまで増加した。注入 7 か月以降は TOC が10 mg/L 以下にまで低下し，cis-DCE および VC 濃度の減少も確認されなかった。
なお，VC 分解に関わる遺伝子（vcrA）の周辺における塩基配列解読により，AIW，および MW-1 と MW-2で検出された Dehalococcoides 属細菌は，コンソーシアム中に含まれる Dehalococcoides 属細菌と同種であり，SIW で検出された Dehalococcoides 属細菌とは異なることを確認した 6)。従って，AIW で増殖した Dehalococcoides属細菌はコンソーシアム由来の微生物である可能性が示唆されている。また，AIW の下流に位置するモニタリング井戸（MW-2 および MW-5）において病原性細菌のモニタリングを継続しているが，コンソーシアム注入後約 1 年経過した時点においても，バイオオーグメンテーションによる病原性細菌の有意な増加は確認されていな
い。さらに，コンソーシアムも増殖基質も注入していな
い MW-3 では塩素化エチレン類に顕著な濃度変化は認められず，DHC 菌数も常時検出下限値未満であった（データ示さず）。
Dehalococcoides
今回増殖基質のみを注入した SIW では，属細菌の増殖に時間を要したことと，DHC 菌数が約 1.0
×106 copies/mL に到達した注入 6 か月後には TOC がほとんど残留していなかったことにより，cis-DCE 以降の分解が進まなかったものと考えられる。このため，SIWにおいて cis-DCE の浄化を促すには，今後さらに栄養剤を追加注入する必要がある。このように，バイオス
ティミュレーションでは土着の Dehalococcoides 属細菌の増殖に時間を要するために，浄化が長期化するだけでなく，栄養剤の注入量が増えることで浄化コストの増加にもつながるケースが想定される。これに対して，バイオオーグメンテーションは Dehalococcoides 属細菌の初濃度を高めることで浄化期間を短縮し，さらには浄化コストを削減することが期待できる。
5.

おわりに

本稿では，当社における Dehalococcoides 属細菌を含むコンソーシアムを利用したバイオオーグメンテーション技術の開発と現場適用事例を述べた。コンソーシアムの状態において培養規模の拡大には大きな課題は無く，また現場実証においても浄化期間・浄化コストの両面において良好な結果が得られている。しかしながら，生態系への影響等から，外来微生物を導入することに対する抵抗感は依然として散見される。今後は，現場適用を進める中で，バイオオーグメンテーションが地下の生態系に与える影響を詳細に解析していく必要があると考えている。
謝辞

本技術開発の一部は NEDO プロジェクト「生分解・処理メカニズムの解析と制御技術開発」の一環として実施したものです。開発にあたって多岐にわたるご指導をいただきました東北学院大学工学部の中村寛治教授に心より感謝申し上げます。
文

図 8．SIW におけるモニタリング結果
図中 day 0 において，増殖基質のみを注入した。

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