改訂第 3 版 序 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（野島 博）
初版 序 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（野島 博）
第1章 顕微鏡の歴史（野島博）

Ⅰ ガラスの発見 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 16
Ⅱ レンズの発明 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 17
Ⅲ 光学用レンズの作製と望遠鏡・顕微鏡の発明 –––––––––––––––––––––––––––––––––––– 17

Ⅳ 顕微鏡大量生産の時代 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 18
Ⅴ 分解能の限界 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 19
Ⅵ 分解能への挑戦 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 19
Ⅶ 電子顕微鏡の開発 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 20

Ⅷ 走査型プローブ顕微鏡 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 20①走査トンネル顕微鏡 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 21②原子間力顕微鏡 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 21

Ⅸ 新世代顕微鏡 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 21

Ⅹ バイオサイエンスにおける次世代型顕微鏡–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 22
Ⅺ 画像記録の進展 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 22

Ⅻ バイオイメージング技術の発達–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 23
第2章 各種の顕微鏡でできること
Ⅰ はじめに ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（坂口一紀） 24

Ⅱ 明視野観察（Bright Field）––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（坂口一紀） 24
1 特徴・メリット

2 目的・用途

Ⅲ 位相差観察（Phase Contrast）–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（坂口一紀） 25
1 特徴・メリット

2 目的・用途3 必要なアクセサリー

Ⅳ 微分干渉観察（Differential Interference Contrast）––––––（坂口一紀） 26
1 特徴・メリット

2 目的・用途3 必要なアクセサリー

contents
Ⅴ 暗視野観察（Dark Field）––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（坂口一紀） 27
1 特徴・メリット

2 目的・用途3 必要なアクセサリー

Ⅵ 偏光観察（Polarizing）––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（坂口一紀） 27
1 特徴・メリット

2 目的・用途3 必要なアクセサリー

Ⅶ 蛍光顕微鏡–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（阿部勝行） 28
1 目的・用途

2 特徴・メリット

3 蛍光観察における注意点

Ⅷ 共焦点レーザースキャン顕微鏡––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善） 30
1 目的・用途

第2 特徴・メリット

3章 光学顕微鏡Ⅰ 基礎知識 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（坂口一紀） 33①光学顕微鏡の構成 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 33
1 光学顕微鏡の構成

2 光学顕微鏡の種類②光学系の特徴と性能 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 34
1 倍率

2 実視野

3 開口数

4 分解能

5 焦点深度6 像の明るさ③光学系の機能 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 38
1 光学系の構成

2 照明光学系

3 観察光学系④いろいろな観察法 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 44
1 明視野観察2 位相差観察3 微分干渉観察

4 蛍光観察5 暗視野観察Ⅱ 基本的な取り扱い –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（横山茂樹） 53①はじめに ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 53②顕微鏡構成 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 54③使用前の初期調整 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 54
1 ケーラー照明の調整

2 コンデンサーの絞り調整法④顕微鏡操作 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 57
1 各顕微鏡共通の基本操作 2 明視野顕微鏡 3 位相差顕微鏡 4 微分干渉顕微鏡
5 暗視野顕微鏡 6 簡易偏光顕微鏡 7 蛍光顕微鏡 8 検鏡方法切り替え早見表⑤顕微鏡使用上のヒント–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 63
1 視度調整法

2 コンデンサー絞り

3 顕微鏡の能力⑥デジタルカメラ撮影 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 66
1 シングル画像撮影

2 画像の保存と処理

3 多重蛍光撮影⑦デジタル画像の処理ソフト –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 71⑧メンテナンス法 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 71
1 メンテナンス 2 レンズクリーニングに準備するもの 3 レンズのゴミ除去方法
4 対物レンズのオイル後始末方法 5 コーティング製品のクリーニング

第4章 蛍光顕微鏡（阿部勝行）

Ⅰ 蛍光顕微鏡の概要 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 75①目的・用途 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 75

②特徴 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 75

Ⅱ 蛍光の原理––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 75

Ⅲ 蛍光顕微鏡の基本構成 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 77①基本構成要素 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 77②蛍光顕微鏡用の光源 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 78③蛍光顕微鏡用のフィルター –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 79
1 励起フィルター

2 ダイクロイックミラー

3 蛍光フィルター

④蛍光顕微鏡用の対物レンズ –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 80

Ⅳ 基本的な使い方 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 81①各部の名称 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 81②標本の観察 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 82

Ⅴ よい蛍光像を得るためのポイント –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 89①よい蛍光像とは ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 89②適切なフィルターの選択 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 90
1 励起フィルターによる選択2 蛍光フィルターによる選択③蛍光観察に適した対物レンズの選択–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 94
1 蛍光観察に要求される対物レンズ性能

2 対物レンズの調整について④迷光を小さくする ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 97⑤自家蛍光についての注意（対物レンズを除く）–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 98
1 イマージョンオイルの自家蛍光2 標本組織そのものから出る自家蛍光⑥標本の褪色防止 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 100

Ⅵ 取り扱いと手入れのしかた –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 101①顕微鏡本体の取り扱いと手入れ ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 101②対物レンズの手入れ –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 101③蛍光キューブ，フィルターの取り扱いと手入れ –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 102

Ⅶ 全反射蛍光顕微鏡 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 103①はじめに ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 103②全反射蛍光顕微鏡の原理 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 103
1 全反射とエバネッセント光

2 全反射蛍光顕微鏡の種類③全反射蛍光顕微鏡の構成と使用法 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 104
1 全反射蛍光顕微鏡の基本構成
顕微鏡の観察手順

2 全反射蛍光顕微鏡に適した対物レンズ

3 全反射蛍光④全反射蛍光顕微鏡の応用例 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 109⑤全反射蛍光顕微鏡使用上の注意 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 110
1 試料の設置

第2 レーザーに対する安全性

3 干渉縞に対するトラブルシューティング

5章 CCD カメラを利用した画像処理法（曽我正宣）

Ⅰ ライフサイエンス分野における CCD カメラ ––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 113
Ⅱ CCD カメラの歴史とその原理 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 113

contents
Ⅲ CCD カメラを選択する際のポイント ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 116①各種 CCD カメラ –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 116
1 モノクロ CCD カメラ 2 カラー CCD カメラ
CCD カメラ 5 高速フレーム冷却 CCD カメラ

3 ビデオカメラ

4 感度増倍機能つき②製品の性能比較のポイント –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 120
1 素子サイズ 2 量子効率 3 ダイナミックレンジ
ノイズ 6 転送速度とフレームレート

4 冷却温度（暗電流） 5 読み出し

Ⅳ CCD カメラの使用方法 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 124①明視野撮影 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 124②蛍光撮影 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 126
1 カラー CCD カメラによる蛍光撮影

2 モノクロ CCD カメラによる蛍光撮影

Ⅴ CCD カメラを用いたいろいろなアプリケーション –––––––––––––––––––––––––––– 132①タイムラプスシステム–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 132②デコンボリューションシステム ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 132③ FRAP，FLIP，PA-GFP などのレーザーを使用したアプリケーション –––––––––––––– 133④ TIRF（全反射蛍光顕微鏡）システム –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 134⑤ FRET –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 135

第6章 共焦点レーザースキャン顕微鏡
Ⅰ はじめに ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）136

Ⅱ 共焦点レーザースキャン顕微鏡の特徴 ––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）137
Ⅲ 共焦点レーザースキャン顕微鏡の原理 ––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）141
Ⅳ 画像を作る–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）142①操作を始める前の注意–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 142②システムのセットアップ ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 142
1 対物レンズ2 主な操作パラメータの設定③操作の実際（単染色試料の観察）–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 143

Ⅴ 操作の詳細–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）145①試料の状況を双眼鏡筒で確認する –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 145②スキャン時のチェックポイント ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 145
1 シングルセクション（2D）の場合

23D，4D，タイムラプスなどの場合

Ⅵ 多重蛍光像および 3D，4D の画像 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）149①多重蛍光像 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 149
1 クロストークを減らすために② 3D（立体像再構築）–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 150③ 4D（3D の時系列）––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 152④ 2D 時系列 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 152⑤試料の褪色防止 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 153⑥画像劣化の諸要因 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 153

Ⅶ 非蛍光プローブ，反射干渉，透過光 / 蛍光検鏡 ––––––––––––––––––––––（石館文善）154①非蛍光プローブ ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 154②反射干渉検鏡法 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 155③透過光像の作り方 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 156④共焦点蛍光像と透過光像との合成 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 158⑤多彩なスキャニングテクノロジー –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 159

Ⅷ CLSM によるスペクトルイメージング –––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）160①スペクトルイメージングの特徴 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 160②スペクトルイメージングの原理 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 162③効果的な使い方 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 163
1 ピークが近接した緑または赤蛍光近傍の多重蛍光像を分離し画像化する 2 ターゲットの蛍光シグナルから自家蛍光の成分を除く 3 スペクトルが時々刻々と変化する現象をとらえる
4 多重蛍光シグナルの同時取得かつ分離④レファレンススペクトルをきっちり把握 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 166
1 レファレンスの準備

2 データ取得のポイント⑤時々刻々変化するスペクトルの解析–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 168⑥ FRET –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 169
1458 nm レーザーつきフィルター方式

2 スペクトルイメージング方式

Ⅸ FRAP –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）170
Ⅹ FCS/FCCS–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）171
1FCS/FCCS の原理

2２分子間相互作用の解析

Ⅺ RICS ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）174

Ⅻ FLIM ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）175
 高速イメージング –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）175
 2 光子励起顕微鏡による生体深部イメージング––––––––––––––––––––––（横井英司）176①はじめに ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 176②原理 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 176③顕微鏡・関連機器の構成 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 176
1 共焦点レーザースキャン顕微鏡との違い④特徴・メリット ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 178⑤脳内深部イメージングのための対物レンズのススメ ––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 179
1 可視〜近赤外域の透過率の高い対物レンズを使う 2 脳の深部を観察する場合はインデックスミスマッチ補正が重要 3 N.A. と検出視野の大きな対物レンズを使う

 光刺激 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）181
1 刺激からイメージングまで CLSM のみで完結

2 外部刺激デバイスによる刺激

ⅩⅥ 最新の技術動向 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）181
第7章 技術革新の著しい顕微鏡
Ⅰ ハイコンテンツスクリーニング––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（塩田 良）185
はじめに

1 目的・用途

2 原理

3 特徴・メリット

4 操作・手順の概略

contents
Ⅱ 質量顕微鏡法 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（小河 潔）189
はじめに 1 目的・用途
5 操作・手順の概略

2 原理

3 顕微鏡・関連機器の構成

4 特徴・メリット

Ⅲ 多光子レーザースキャン顕微鏡（MP-LSM）の応用例 –––––––––––––––––––––– 194
はじめに ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）①２光子励起顕微鏡による脳内深部イメージング ––––––––––––––––––––––––––––––（横井英司）194
1 操作・手順

2 画像の評価② MP-LSM による麻酔下のマウス脳神経細胞観察 -１ ––––––––––––––––––––––––（石館文善）196
1 麻酔下のマウス脳神経細胞観察における問題点

2 画像の評価③ MP-LSM による麻酔下のマウス脳神経細胞観察 -２ ––––––––––––––––––––––––（石館文善）197
1 画像の評価④ MP-LSM による固定マウス脳神経細胞観察 –––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）197
1 画像の評価

Ⅳ 細胞培養システム内蔵型顕微鏡–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 198
はじめに ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（小島清嗣）①インキュベータ一体型顕微鏡––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（小島清嗣）198
1 顕微鏡・関連機器の構成
5 注意点

2 目的・用途

3 特徴・メリット

4 操作・手順の概略②生細胞・組織観察時の注意点––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（石館文善）202
1 顕微鏡の選定

2 生細胞に元気でいてもらうために

Ⅴ 超解像顕微鏡 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 207
はじめに ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（根本隆治）① Photo activated localization microscopy（PALM）–––––––––––––––––（石館文善）207
1 原理

2 特徴・メリット② SIM 技法 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––（根本隆治）210
1 目的・用途

2 原理

3 操作・手順の概略

1 目的・用途

2 原理

3 構成

③ STED（Stimulated Emission Depletion）法––––––––––––––––––––––––––––（伊集院 敏）214
4 特徴・メリット

5 操作・手順の概略

6 注意点

Ⅵ 高解像度３D ライブセル光学顕微鏡 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––（根本隆治）219
はじめに

1 目的・用途

2 原理

3 操作・手順の概略

Ⅶ 非線形現象を利用した顕微鏡（SHG・CARS）–––––––––––––––––––––（林 真市）223
はじめに 1 目的・用途 2 原理
5 その他の非線形光学顕微鏡法

付

3 顕微鏡・関連機器の構成

4 特徴・メリット

録 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 227●各種レンズの用途 ●各種観察法の分類および観察対象 ●各社対物レンズ一覧表 ●代表的な蛍光試薬の励起吸収カーブ ●蛍光の褪色防止の例 ●共焦点レーザー顕微鏡に関するデータ一
覧 ●エミッションフィルターの機能と吸収スペクトル ●画像処理ソフトウェア一覧 ●顕微鏡活用に便利な Web サイト一覧

索

引 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 243