14《農芸化学技術賞》

受賞者講演要旨

高菌数，高生残性ビフィズス菌含有
ヨーグルト製造方法の技術開発①②③④

清 水（肖）金 忠①
宮 地 一 裕②
森永乳業株式会社 小田巻 俊 孝③
森永乳業株式会社 米 澤 寿美子④
森永乳業株式会社
森永乳業株式会社

はじめに

coccus thermophilus や Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgar-

近年の研究から腸内細菌は肥満や糖尿病，アレルギー疾患，icus 等が産生する乳酸や過酸化水素によりビフィズス菌の増殖

潰瘍性大腸炎，大腸ガン，さらには自閉症など様々な疾病との及び生残が妨げられること，等が挙げられる．そのため，これ関連が示唆されている．Bifidobacterium 属細菌（以下ビフィズ

までには酵母エキス等のビフィズス菌増殖促進物質の添加や，ス菌）は，ヒト腸管細菌叢の主要構成菌であり，酢酸や乳酸を酸及び酸素耐性を有するビフィズス菌株の選抜，酸素透過性の産生することで悪玉菌の増殖を抑制する他，様々な生理機能が低い容器の使用，ビフィズス菌の増殖及び生残に影響の少ない報告されている．

乳酸菌株の使用など様々な工夫がなされていた．しかし，これ森永乳業（株）では母乳栄養児の腸内にビフィズス菌が優勢にら工夫には追加コストが必要な上に，最終製品の風味に悪影響棲んでいることに着目し，1960 年代からビフィズス菌に関すを及ぼす可能性も考えられる．また，フルーツを含有するヨーる研究を開始した．1969 年に健康な乳児から Bifidobacterium

グルトやドリンクタイプヨーグルトは，酸や酸素の影響をよりlongum BB536 株（以下 BB536）を分離し，1971 年にはビフィ強く受けるため，利用をプレーンタイプヨーグルト等に限定せズス菌を含有するヨーグルトの開発に成功した．40 年以上にざるを得ない状況にあった．

渡る基礎・機能性・応用研究から，BB536 は腸内環境改善作

本演題では，これらの課題を解決するに至った，高菌数・高用を基本とする多くの生理機能を有していることが明らかに生残性ビフィズス菌 BB536 含有ヨーグルトの製造方法の開発なっている．現在，BB536 は国内のみならず，世界中の多くおよびその作用機序解析など，森永乳業（株）で取り組んだ内容の国においてもサプリメントや育児用粉乳などに利用されておを紹介する．

り，2007 年 に は 米 国 FDA か ら GRAS（Generally RecognizedAs Safe）認定を受けている．

1.

発酵乳中におけるビフィズス菌の増殖および生残性を改善する乳酸菌の探索

ビフィズス菌などのプロバイオティクスによる生理作用を期

筆者らは先述の課題解決に向けて，まず BB536 を対象に増待するには，ある程度の生きた菌数を摂取することが好ましい．

殖促進作用を示す乳酸菌について幅広く探索したところ，一部しかし，本来は腸管に棲む偏性嫌気性菌であるビフィズス菌，の Lactococcus（L.）lactis 菌株との混合発酵により，乳培地に特にヒトの腸管に多く棲息する B. longum などの菌種を牛乳おける BB536 の増殖が著しく促進されることを見いだした．

中で増殖させ，長く生存させるには困難を伴う．その理由としその効果は BB536 以外のビフィズス菌種に対しても見られ，て，①牛乳にはビフィズス菌の生育にとって必要な遊離アミノ幅広い有用性が示された（図 1A）．BB536 に対しては，非添加酸やビタミンなどの栄養素が不足していること，②製造工程に時と比較し 1000 倍以上もの増殖作用を示す L. lactis 菌株も存おいて酸素が混入してしまうこと，③発酵乳製造に一般的に用在した．さらに一部の L. lactis 菌株と混合発酵した際には，いられるいわゆるヨーグルトスターター乳酸菌である Strepto-

さらに冷蔵保存中におけるビフィズス菌の生残性についても大図1

Lactococcus lactis とビフィズス菌の共発酵によるビフィズス菌の増殖（A）および保存生残性（B）に対する改善作用□：L. lactis を含まない発酵方法；■：L. lactis との組み合わせによる発酵方法．（A）で株名の標記のないものはすべてタイプストレインを用いた．受賞者講演要旨

図2《農芸化学技術賞》

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冷蔵保存中における発酵乳の（A）ビフィズス菌数，（B）pH および（C）溶存酸素濃度□：B. longum BB536 の単独培養， △：B. longum BB536 と保存生残性改善作用の無い L. lactis 株との共培養，●：B. longumBB536 と保存生残性改善作用を有する L. lactis 株との共培養．

幅に改善されることを見出した（図 1B）．

フィズス菌増殖作用を示す L. lactis 菌株は，細胞壁結合性タンとの混合発酵による製品開発

パク質分解酵素（PrtP）を保有しており，この酵素により産生ところが，この作用は L. lactis 菌株と BB536 の 2 種混合系

されたペプチドやアミノ酸を混合発酵中にビフィズス菌が効率では問題なく再現できたものの，実際ヨーグルトを製造するた良く利用し，その増殖が促進されていることがわかった（図 3）．

めにヨーグルトスターター乳酸菌と共に複数菌種で混合発酵しこの活性物質の特定を試みたところ，ビフィズス菌を増殖させた場合には，発酵がうまく進まない問題が生じた．そこで，ヨーる物質は，L. lactis 菌株により異なることが示唆された．

2.

.

グルトスターターと相性のよい L. Lactis 菌株の選定や混合比

また，発酵中の溶存酸素濃度を測定したところ，L. lactis と率等の検討を繰返し，最終的に複数菌種での混合発酵ヨーグルの共培養では溶存酸素が著しく減少していたことから，酸化還トの製品化に成功した．その際，より良い L. lactis 菌株を取得

元電位の低下もビフィズス菌の増殖促進に寄与していると考えするために Lactococcus 属細菌 7 種を同時に検出できる新規られた．

Multiplex-PCR 法の考案と，L. lactis 菌種と菌株を同時に識別

4.

可能な L. lactis 特異的 rep-PCR 法を開発し，自然界から菌株のによるビフィズス菌の冷蔵保存時における生残性改善作用機序分離・収集を行い，豊富な菌株蓄積に至った．これらの研究に発酵乳に含まれるビフィズス菌は，冷蔵保存中に環境中のより開発された技術によって，様々な発酵乳製品における十分様々なストレスにさらされる．特に生残性に影響を与える因子なビフィズス菌数の維持が可能となり，酸度の高いフルーツタと考えられる保存中の pH と溶存酸素の挙動について計測をしイプや，溶存酸素濃度が高くなりやすいドリンクタイプのヨーたところ，pH 値は差が認められなかったが，保存期間中の溶グルト中でも，BB536 の保存生残性が安定した製品の開発に存酸素については，改善作用のある L. lactis 株では低い濃度で成功した．

維持されていた（図 2）．以上より，ビフィズス菌の生残性改善によるビフィズス菌の増殖促進機序

3.

作用は，酸よりも酸素によるストレスを緩和することが重要でこれまでにも一部のビフィズス菌種（B. breve，B. animalisあると考えられた．B. longum および L. lactis は共にカタラーなど）に限定して増殖および生残性を改善する作用のある L.

ゼを有していないため，NADH オキシダーゼをはじめとするlactis 菌株の使用に関する技術が開発されていたが，B. long-特徴的なフラボタンパク質により酸素消費を行うことが知られum など他のビフィズス菌に対して汎用的な技術ではなく，そている．そこで，L. lactis における遺伝子発現の比較解析をの作用機序も解明されていなかった．

行ったところ，その一つである 2 成分性 NADH ペルオキシダー

ビフィズス菌は，発酵乳ベース中で乳糖を利用し炭素源を確

ゼの構成成分であるアルキルハイドロペルオキシドレダクター保できるが，タンパク質分解酵素をもっていないことから自らゼ（ahpF, ahpC）が，保存 2 週間後において改善作用のある株充分な窒素源を確保することができない．本研究で得られたビでの遺伝子発現量が改善作用のない株よりも有意に高い値を示

図3

Lactococcus lactis によるビフィズス菌増殖促進作用，および冷蔵保存中のビフィズス菌生残性改善作用のメカニズム

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受賞者講演要旨したため，この活性がヨーグルト中の酸素消去に重要な役割をまでの工夫は，風味やコスト，製品タイプの制限と多くの課題担っていると推測された（図 3）．

が残されていた．これら課題を解決し開発された製品群「森永さらに，保存生残性に効果のある L. lactis 菌株では，保存期

ビヒダスシリーズ」は 2008 年より販売を開始し，現在は常時間中を通じて 2 価鉄イオン輸送システム（feoB）の発現が高く10 種類以上の製品ラインナップを展開している．本技術を活維持されており，ヨーグルト中の遊離鉄濃度も減少していたこ用し，よりおいしい製品の開発を続けていくことで，人々の健とから，フェントン反応が抑えられ，結果として BB536 はヒ康へ役立つ製品を今後も広く提供していきたい．

ドロキシラジカルによる酸化も受けにくくなっている可能性が考えられた．
おわりにヨーグルトに代表される発酵乳製品は私たちの身近な食品であり，特定保健用食品として効果効能を謳った製品も多く発売されている．ヨーグルト中のビフィズス菌数を維持させるこれ

謝辞

本研究開発は森永乳業（株）における基礎研究，製品開発およびマーケティングなどの関連部門との協働により達成された成果であります．携わっていただいた関係者の皆様に深謝申し上げます．