受賞者講演要旨《農芸化学女性企業研究者賞》

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きのこ由来レクチンのがん診断への応用

株式会社 J-オイルミルズ 小林（袴田）夕香
はじめに

2.

新規有用レクチンの発見

糖鎖研究は近年目をみはる進展を遂げてきました．基礎研究

フコース糖鎖の修飾は，癌や炎症に関与していると言われてでは多くの糖鎖の機能や役割が解明され，その知見や成果が医おり，α1-2，α1-3，α1-4，α1-6 など，その結合様式ごとに識別療分野に応用されるようになりつつあります 1, 2）．現在，市販できるレクチンの需要は高い 4）．現在，レンズマメレクチンをされているレクチンは約 20～30 種類であるが ，2003 年から使った肝臓がんのマーカータンパク質である α-フェトプロテの NEDO プロジェクトなどを経て，100 種以上の有用なレクインの糖鎖変化を検出する手法が，肝臓癌の早期診断や予後判チンからなる「レクチンライブラリー」の構築した．その中の定に使用されている（AFP-L3％）5, 6）．

3）

有用なレクチンは，癌診断への応用開発を進めた．
1.

α1-6 フコース特異的レクチンとして有用なスギタケレクチ

レクチンライブラリーの構築

2003–05 年度には，NEDO プロジェクトン（Pholiota squarrosa lectin）を上記に記載したレクチンライ
糖鎖エンジニアリ

ブラリー構築の中で発見し，PhoSL と命名した．電気泳動，

ング・糖鎖構造解析に参画し，糖鎖とレクチンの相互作用を網MALDI-TOF MS，N-末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 分 析 の 結 果 か ら，羅的に調べる「ヘクト・バイ・ヘクト（100 糖鎖×100 レクチ

PhoSL はサブユニット分子量約 4500，等電点 pI 4.0 の新規タン）プロジェクト」への非市販レクチンの供給という役割をンパク質であり，その N 末端アミノ酸配列は NH2-APVPVT-担った．その中で，必要とするレクチンをより選択的に探索す

KLVC DGDTYKCTAY LDFGDGRWVA QWDTNVFHTG-る手法として，従来の赤血球凝集だけでなく，酵素で加工したOH であった．フロンタルアフィニティークロマトグラフィー

赤血球を使う手法，水晶発振子マイクロバランス（QCM）など（FAC）による 126 種の糖鎖との糖結合性評価では，N 型糖鎖の機器を使う方法などを開発した．また実際に，それらの手法の α1-6 フコース糖にのみ結合し，α1-2，1-3，1-4 のような他のを組み合わせて，約 1,000 種の植物，動物，菌類の抽出液からフコース糖鎖には結合しなかった（図 1）．さらに，PhoSL は腫新規レクチンの探索を試み，結果として 3 年間の NEDO プロ

瘍マーカーである α-フェトプロテイン（AFP）のフコシル化さジェクトの間に，59 種類の新規レクチンを供給し，（独）産業れた AFP（AFP-L3）にのみ結合し，フコシル化されていない技術総合研究所と共同でそれらの詳細な糖結合特異性の解析を

AFP（AFP-L1）には結合しなかった．レクチンの pH 安定性は行った．NEDO プロジェクト終了後も，さらに探索手法を開発・改良し，新たにキャピラリー電気泳動装置を使用して，糖鎖と結合する新規で有用なレクチンの探索をおこない，レクチンを精製し，特異性を評価し，レクチンライブラリーとして構築した．

pH 2.0～11.0 の間，温度安定性は 0～100℃の間で安定であった
7）
（図 2）
．

3.

肝臓癌診断キットの開発と臨床応用

原発性肝癌（以下 HCC）における AFP-L3 分画の測定は AFPや PIVKA-II などと同様に，HCC の診断や治療効果の判定，再発の早期発見に役立っている．スギタケレクチン（PhoSL）

図1

PhoSL の糖鎖結合特異性

52《農芸化学女性企業研究者賞》

受賞者講演要旨

正常組織の中の実質細胞は，AAL，PhoSL でわずかに褐色に染まる．その染色レベルを「弱陽性（分類 1）」と定義した．この染色レベルを基準として，癌部が全体的に強く褐色に染まっているものを「強陽性」として「分類 3」に，強陽性よりも薄いが全体的に褐色に染まっているものを「陽性」として「分類 2」に，全く染まらなかったものを「陰性」として「分類 0」と評価した．染色結果を各組織の臨床背景に基づいて比較検討を行った．免疫組織学的検討の結果，正常に比べて原発癌では，全てのフコースが増加していたが，転移癌ではコアフコースのみが低下していた．このように，大腸癌の組織染色においては，原発巣と転移巣の組織表面上のフコシル化の違いを実証することができ，大腸癌診断の有用なツールであることが期待された．
おわりに
α1-6 フコースの糖鎖変化は癌化に共通した糖鎖変化であることから，多くの種類のがん診断に応用できることを立証した．スギタケレクチン（PhoSL）はがんの基礎研究やがん化のメカニズム解明等の研究において有用なツールとなることが期待できる．レクチンの医療応用例はまだ多くはないが，今後，基礎研究が進展し「疾病マーカーとなる糖タンパク質」や「疾病に伴う糖鎖変化」が発見されるようになれば，それらを選択
図 2 PhoSL の安定性
（A. 温度安定性 B. pH 安定性）

的に検出するレクチンを使った診断薬等が可能となるだろう．
謝辞

本研究は（株）J-オイルミルズにておこなわれたものは上記に記載した通り，特異性・選択性が高く，安定性に優れです．本研究室において実験を一緒におこなっていただきましていたことより，酵素免疫測定（ELISA）法に PhoSL を利用た研究員の方々，終始ご指導いただきました研究所のみなさし，新しいフコシル化 AFP（AFP-L3）キットとして系を構築

ま，知財戦略部のみなさまに感謝致します．これまで適切なごし，臨床的有用性を評価した．

指導を頂きました，静岡大学農学部河岸洋和教授，（独）産業技

対象は慢性肝疾患患者 50 例（慢性肝炎・肝硬変 22 例，HCC術総合研究所平林淳首席研究員，大阪大学医学部三善英知教28 例）並びに健常者 87 例を用いた．患者並びに健常者の血清授，石川町内科クリニック渡會伸治先生，並びに，ご指導いた中のフコシル化 AFP を新規に開発したフコシル化 AFP（AFP-だきました多くの共同研究先の諸先生方に厚く御礼申し上げまL3）キットを用いて測定した．また，HCC 患者の癌組織部位す．また，日々の研究を支えて頂きました（株）
J-オイルミルズを PhoSL 組織染色法を用いて癌細胞の発現を観察した．HCCの数多くの方々に深く感謝いたします．

患 者 28 例 中 担 癌 状 態 14 例 に お い て は，AFP 陽 性 率 7 例（50％），PIVKA-II 陽性は 8 例（57％），通常の AFP-L3 は 6 例（42％）であったのに比べ，フコシル化 AFP の陽性率は 9 例（64％）で最も優れていた．またフコシル化 AFP はいずれの腫瘍 マ ー カ ー と も 相 関 は 示 さ な か っ た． 免 疫 組 織 染 色 で は，HCC 患者由来の癌組織部位はレクチン染色されている症例があり，この患者の血清フコシル化 AFP 値は高かった．臨床試
験の結果，PhoSL を利用したフコシル化 AFP の測定は，既知の腫瘍マーカーと異なった性能を示し HCC 患者の診断，治療効果の判定に有用なものになると考えられた 8）．
4.

大腸癌診断への応用

大腸癌は多段階発癌の代表例であり，発癌から転移に至るそれぞれの過程において APC，K-ras，p53，DCC などの癌遺伝子／癌抑制遺伝子の異常が明らかとされており，様々な研究により悪性化を規定する分子の同定が進められている 9）．
大腸癌組織におけるヒイロチャワンタケレクチン（AAL）とPhoSL を用いた免疫染色を症例 139 例でおこなった．AAL はα1-3/1-4/1-6 結合のフコースを認識し，PhoSL は α1-6 結合のフコースをより特異的に認識する．この 2 種類のレクチンを使い，その染色レベルを比較することによりフコシル化の結合様式の違いを知ることができる．

（引用文献）
1）小林夕香，河岸洋和，糖鎖を認識する高分子：レクチン，BIO
INDUSTRY，Vol. 27（2）:p 6–11（2010）.
2）小林夕香，日本農芸化学会中部支部主催 第 163 回若手シンポジウム，糖鎖に着目した疾患に寄与できる「レクチンライブラリー」の開発（2011）.
3）Kobayashi Y, Tateno H, Ogawa H, Yamamoto K, Hirabayashi
J., Comprehensive list of lectins: origins, natures, and carbohydrate specificities. Methods Mol Biol. 1200: p 555–77.（2014）.
4）Miyoshi E, Moriwaki K, Nakagawa T, Biological function offucosylation in cancer biology. J Biochm. Vol. 143（6）: p 725–9（2008）.
5）Taketa K, Endo Y, et al.: Cancer Res., 53, 5419–5423（1993）.
6）横山和則，黒澤竜雄，渡辺光雄，マイクロフリュイディスク
技術を用いた全自動免疫蛍光測定装置ミュータスワコー i30．
生物試料分析 Vol. 33, No 3（2010）.
7）Kobayashi Y, Tateno H, Dohra H, Moriwaki K, Miyoshi E, Hirabayashi J, Kawagishi H, A novel core fucose-specific lectinfrom the mushroom Pholiota squarrosa. J Biol Chem. Vol. 287（41）:p 33973–82（2012）.
8）渡會伸治，松井弘斗，小林夕香，西藤桂子，上野 泰，癌治療
学会原発性肝癌患者における新しいフコシル化 AFP の測定意義と臨床病理学的検討．第 69回日本消化器外科学会総会（2013）.
9）Voutsadakis IA. Pathogenesis of colorectal carcinoma andtherapeutic implications: the roles of the ubiquitin-proteasome
system and Cox-2. J Cell Mol Med. Vol. 11（2）: p 252–85（2007）.