受賞者講演要旨《農芸化学技術賞》

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超好熱菌由来の新規 DNA ポリメラーゼの発見とその産業利用①②　　　　バイオケミカル事業部部員
ライフサイエンス事業部マネジャー
立命館大学　　 　　　　　生命科学部教授，学部長
東洋紡株式会社
東洋紡株式会社

はじめにわれわれの生活になじみのある微生物のほとんどは，常温，

③北 林
小松原
今 中雅秀忠夫①介②
行③

広く産業利用されている．この PCR 法の酵素として用いられるのが耐熱性 DNA ポリメラーゼである．

中性付近，豊富な栄養条件の下で活発に増殖できる．しかし，Taq DNA ポリメラーゼの利用により PCR 法の簡便化，自これらは地球に存在する微生物のごく一部であって，通常の培動化への道が開かれ，幅広く応用可能な手法として発展したの養設備で増殖可能な微生物は土壌中の全微生物の約 1～10％にであるが，この酵素は伸長反応の速度は高いが，3′-5′エキソヌ過ぎないことが分かってきた．そして，火山付近などの高温環クレアーゼ（プルーフリーディング）活性を持たないため，境，深海などの高圧環境，北極や南極域などの低温環境にも，DNA 合成時の正確性が低いという欠点があった．そこで，その環境に見事に適応した極限環境微生物が多数生息している

Thermus よりも更に高温（90℃以上）で生育する超好熱菌が探ことが明らかになった．これらの極限環境微生物は，従来の微索され，3′-5′エキソヌクレアーゼ活性を持つ Pyrococcus furio-生物に見られない特性を有し，基礎 ･ 応用両面で興味深い研究

sus の酵素（Pfu DNA ポリメラーゼ）が開発された．この酵素対象になっている．

は Taq DNA ポリメラーゼと比較して，耐熱性と正確性は高い

極限環境微生物の中でも，好熱菌は，一般に 55℃以上で生が伸長能力が低く，PCR 増幅効率が低いという欠点があった．

育可能な微生物をいう．好熱菌は高温環境下で生育できるた

超好熱菌の中で，耐熱性と合成速度と正確性の全てが優れる

め，その構成成分であるタンパク質も変性し難い性質を持ち，DNA ポリメラーゼの開発が待望されていた．

耐熱性酵素の宝庫といえる．好熱菌のうち，75℃以上で生育でわれわれは鹿児島県小宝島の硫気坑から超好熱始原菌を分離きるものが高度好熱菌であり，その例としては，Taq DNA ポ

し，Thermococcus kodakarensis KOD1 と名付けた．本菌は，リメラーゼの生産菌として有名な Thermus aquaticus などが65～100℃で生育し，有機物をエネルギー源および炭素源とし，挙げられる．

硫黄を電子受容体にした嫌気的従属栄養生育が確認されていこれらに対し，90℃以上で生育できるのが超好熱菌である｡

た．その菌体の生理特性は，既報の P. furiosus と極めて類似

超好熱菌は生物の進化系統樹の源流に位置しており，現存するしている．しかし，KOD1 株からクローニングされた KOD生物の中で原始生命体に最も近いと考えられている．その生育DNA ポリメラーゼは，Pfu DNA ポリメラーゼとアミノ酸レ

条件は，水素，硫化水素，硫黄，2 価鉄イオンなどをエネル

ベルにおいて高い相同性（約 80％）を有しているものの，そのギー源とし，二酸化炭素を唯一の炭素源として化学独立栄養増酵素特性は大きく異なっていた．そのプロセッシビティー殖を行なうものが多く，火山活動の盛んな原始地球環境（高（DNA ポリメラーゼが基質 DNA に結合してから離れるまでに温，嫌気的，無機的）に近いと考えられる．

合成できるヌクレオチドの数）は，既報の耐熱性 DNA ポリメ

東洋紡は 1882 年に繊維事業を創業し，1952 年に生化学関連ラーゼの中で最高水準であった（表 1）．この特長を明らかにす研究に着手して，1970 年に診断薬原料酵素事業，1972 年に臨るため，X 線結晶構造解析が行なわれ，立体構造が明らかにさ床検査薬事業を開始した．そして，この原料酵素の開発で培っれている．DNA ポリメラーゼには Palm 領域と Fingers 領域とた微生物培養，酵素精製の技術を用い，遺伝子工学研究用試薬呼ばれる領域があり，基質となる dNTP の取り込みに関与しの開発に着手して，1982 年に制限酵素の販売を開始している．ている．KOD DNA ポリメラーゼの Fingers 領域にはリジン，東洋紡の遺伝子工学研究用試薬事業は後発であり，特徴ある製アルギニンなどの塩基性アミノ酸が Palm 側に向かって数多く品の開発に取り組むことにより，存在感を発揮する必要があっ並んでおり，これが効率的な dNTP の取り込みに関与していた．一方，当時，大阪大学大学院工学研究科今中研究室ではることが示唆されている．

様々な極限環境から多種多様な微生物を採取して，これら微生

2.

KOD DNA ポリメラーゼの PCR への応用物を用いた基礎および応用研究を進めていた．超好熱始原菌

KOD DNA ポリメラーゼは，米国で開発された Taq DNA

Thermococcus kodakarensis KOD1 株由来の新規耐熱性 DNAポリメラーゼ，Pfu DNA ポリメラーゼとは異なる純然たるメポリメラーゼ（KOD DNA ポリメラーゼ）は，今中研究室で進イド ･ イン ･ ジャパンの酵素である．Taq DNA ポリメラーゼ

めていた応用研究の 1 つであり，産学の共同研究により製品開と比較して，耐熱性が約 7 倍，合成速度が約 2.5 倍，正確性が発されたものである．

約 50 倍と優れた酵素特性を有する，これまでに類の無い酵素

1.

KOD DNA ポリメラーゼの酵素特性であった（表 1）．しかし，その高い DNA 伸長能力や強すぎる特定の DNA 断片だけを増幅する PCR 法は，遺伝子の研究

3′-5′
エキソヌクレアーゼ活性のため，PCR に使用するには制分野のみならず，感染症や遺伝子検査といった診断分野など，御が難しく，使いづらいという欠点があった．われわれは，

14《農芸化学技術賞》
表1

受賞者講演要旨

耐熱性 DNA ポリメラーゼの特性比較

図1

最近の KOD DNA ポリメラーゼ関連製品（4） ホットスタート PCR 技術の採用
KOD DNA ポリメラーゼを使い易い PCR 酵素とするため，以PCR の成功率は，Primer ダイマーなどの非特異的な増幅に下に示すような様々な工夫を行った．

より低下する傾向がある．中でも PCR の最初の昇温の際に起（1） KOD DNA ポリメラーゼの機能改変

こる非特異的な酵素反応は PCR の成功率を著しく低下させる．

まず，PCR 成功率を向上するため，タンパク質工学技術を我々は，DNA ポリメラーゼドメインと 3′-5′エキソヌクレアー用いた KOD DNA ポリメラーゼの酵素特性の改変を試みた．

ゼドメインをそれぞれ認識する 2 種類のモノクローナル抗体を

PCR において 3′-5′エキソヌクレアーゼ活性は正確性を保つた

KOD DNA ポリメラーゼに結合させて，常温での酵素活性をめ重要となる．しかし，KOD DNA ポリメラーゼの強すぎる完全に封じ込むことに成功した．この抗体の添加によって，目3′-5′エキソヌクレアーゼ活性は伸長を阻害する原因になってい的とする DNA 断片のみを潤沢に得ることを可能にした．

た．そこで，ファミリー B DNA ポリメラーゼのエキソヌクレ

3.

最近の KOD DNA ポリメラーゼ関連製品の開発動向

アーゼ活性領域に共通して存在する Exo I ドメイン，および，1995 年に「KOD DNA ポリメラーゼ」を PCR 用酵素としてその近接するアミノ酸を改変することにより，3′-5′エキソヌク開発以来，上記の技術開発を重ね，最近，「KOD DNA ポリメ

レアーゼ活性の強弱を制御することを試みた．その結果，3′-5′ラーゼ」をベースに，用途別に 2 種類の PCR 用酵素を開発しエキソヌクレアーゼ活性が様々な強さを持った変異体を取得でた．1 つは KOD DNA ポリメラーゼの高い正確性を更に向上

き，幾つかの変異体では PCR の成功率を格段に向上すること

し て，PCR の 成 功 率 を 上 げ た「KOD-Plus-Neo」（正 確 性 はDNA ポ リ メ ラ ー ゼ の 約 80 倍）で あ る． も う 1 つ が，ができた．
（2） PCR 反応 Buﬀer 組成の最適化検討

KOD DNA ポリメラーゼの安定性，伸長能力を最大源に活か

KOD DNA ポリメラーゼは，その高い DNA 伸長能力から，して，マウステールや植物葉などから DNA を精製することなもともと GC リッチなど DNA 配列の影響を受けにくく，夾雑く，直接 PCR に持込むことを可能にした「KOD FX Neo」
（正する阻害物質の持込みにも耐性がある．しかし，その高い伸長確性は能力のため，誤って結合した Primer からも遺伝子を増幅してPlus-Neo」はヒトゲノムから 24 kb，「KOD FX Neo」はヒトしまい，非特異的な増幅が多かった．

ゲノムから 40 kb の目的産物を増幅することができる．

DNA ポ リ メ ラ ー ゼ の 約 20 倍）で あ る．
「KOD-

このような非特異的な増幅を防ぐには，PCR の反応組成が更に，2013 年には，これまでのリアルタイム PCR 用酵素の最も重要になる．一般的には，核酸と相互作用する陽イオンの常識を覆し，難配列，ロングターゲット，クルードサンプルで検討が行われ，Primer の結合状態を安定化するイオンと不安高効率リアルタイム PCR を可能にした「KOD SYBR Ⓡ qPCR定化するイオンのバランスや組み合わせにより，非特異的な増Mix」を開発した（図 1）．また，KOD DNA ポリメラーゼは研幅を防ぐことが行われている．KOD DNA ポリメラーゼの反究用途のみならず，遺伝子診断でも優れている（東洋紡（株）全応組成も様々な検討を行い，陽イオンだけでなく陰イオンが反自動遺伝子解析装置 GENECUBE Ⓡ の反応試薬として販売）．

応の特異性改善に関与することを見出し，特異性の高い PCR

その優れた伸長速度を活かし，素早く正確な判定が必要な診断を実現した．の用途でも大いに活躍することが期待されている．

（3） アクセサリータンパク質の利用

われわれは多くの研究者が望む製品の開発を心がけ，この生体内では DNA ポリメラーゼが連続的に効率よく DNA 合

18 年間に 13 個の KOD 関連製品群を開発している．これから成を行うため，様々なタンパク質と共同して働いている．このも「KOD DNA ポリメラーゼ」が PCR 酵素の 1 つの理想形とような DNA ポリメラーゼに協力して働くアクセサリータンパ

信じて，更なる応用研究を進めている．

ク質を PCR に利用した．
伸長能力を向上させたものの例としては増殖細胞核抗原謝辞本研究を行うにあたり，北陸先端科学技術大学院大（proliferating cell nclear antigen: PCNA）が挙げられる．真核学・高木昌宏先生，関西学院大学理工学部・藤原伸介先生に，生物では PCNA が DNA ポリメラーゼを DNA 鎖状にとどめてご指導をいただきました．ここに深く感謝の意を表します．まおくクランプ分子として働いており，DNA ポリメラーゼと結た，本研究開発に携わった，東洋紡関係者の皆様に深謝申し上合して，ポリメラーゼの DNA 鎖上のスムースな移動を助けるげます．さらに，本賞にご推薦いただきました広島大学大学院と考えられている．その他独自のアクセサリータンパク質を開生物圏科学研究科・江坂宗春先生，および選考委員の先生方に発し，KOD DNA ポリメラーゼに組み合わせることにより厚く御礼申し上げます．

PCR の増幅効率を向上することに成功した．