窒素酸化物の生体内における動態と作用の診断法開発
Development of a diagnostic method of behavior of nitrogen oxides in vivo
研究代表者

東京大学大学院薬学系研究科

助手

小島宏建

Hirotatsu KOJIMA, Ph.D., Assistant Professor
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

和文アブストラクト
大気汚染の元凶物質である窒素酸化物の一種でしかなかった一酸化窒素が、1987 年にわれわれの体内において、血管弛緩作用による血圧調節機能を有する生理活性物質であることが発表された。本発見は 1998 年度ノーベル医学生理学賞が贈られるほど重大な発見であり、これを契機に、一酸化窒素は血管弛緩だけでなく、免疫系や神経系での情報伝達や細胞死の制御など様々な生命活動や疾患とも関わりがあることが報告され、研究領域がますます拡がった。すなわち、生体内における一酸化窒素動態の異常は動脈硬化、高血圧症、虚血疾患、呼吸器疾患、感染・炎症疾患、脳梗塞、痴呆症、アルツハ
イマー病、発癌など、数多くの現代成人病と関わっているのである。そこで私は体内における一酸化窒素の挙動を体外から生体を傷付けずに調べる方法を開発すべく、その光診断薬開発をここに企画した。本研究は一酸化窒素関連疾患の診断・治療につながる基礎研究である。
Abstract

Nitrogen oxides (NOx) have been notorious air pollutants. In 1987, it wasrevealed that one of nitrogen oxides, nitric oxide (NO), is a relaxing factor of our bloodvessels. This finding is so important that a Nobel prize was awarded to the threeresearchers in 1998. The production of NO in neuron and immune cells was also
confirmed, and the functions of NO have been expanded. Namely, abnormal
production of NO is surely related to various diseases. Therefore, I have beendeveloping novel fluorescent indicators for detecting NO from outside of our bodies,
which will be useful for the diagnosis.

血管弛緩作用による血圧調節機能を有す

１．研究目的
大気汚染の元凶物質である窒素酸化物る生理活性物質であることが発表された。の一種でしかなかった一酸化窒素（NO）

本発見は 1998 年度ノーベル医学生理学

が、1987 年にわれわれの体内において、賞が贈られるほど重大な発見であり、こ-1-

れを契機に、NO は血管弛緩だけでなく、ことを選んだ。従来の画像診断法は形態免疫系や神経系での情報伝達や細胞死のを観察するためのものであるが、私が目制御など様々な生命活動や疾患とも関わ標とする蛍光画像化法は個々の生体物質りがあることが報告され、研究領域がまの動的挙動、すなわち、状態を観察できすます拡がった。すなわち、生体内におる画期的なものである。画像診断法は X

ける NO 動態の異常は動脈硬化、高血圧線撮影のみの時代から、近年の医療技術症、虚血疾患、呼吸器疾患、感染・炎症進歩は目覚ましく、PET や MRI が出現し、疾患、脳梗塞、痴呆症、アルツハイマーそれらの威力が発揮されている。電磁波病、発癌など、数多くの現代成人病と関計測法のうち、X 線などの短波長領域とわっているのである。

MRI に用いる長波長のラジオ波領域が実

そこで私は体内における NO の挙動を用化され、この間の化学や物理で最も広体外から生体を傷付けずに調べる方法をく用いられ、実生活でも非常に馴染みが開発したいと考えた。すなわち、近年、ある紫外〜可視〜近赤外〜赤外領域の光各種画像診断法が開発され、医療の現場は生体を構成する成分に吸収されやすく、でその威力が発揮されていることと併せ、生体組織を透過しにくいため、ほとんどNO を生体内で高感度検出し、画像化で利用されてこなかった。しかし、最近のきる診断法を確立すれば、これら病態のレーザー技術発達による光強度改善や、早期発見や治療に大きく貢献できるもの

コンピューターを利用する画像解析技と考え、NO 画像診断薬の開発を本研究術・装置の急速な発展により、光を用い目的とした。高齢化社会を迎えている今、る高感度測定が可能になってきた。特に、前述の現代成人病と関わる NO 臨床診断

650 nm〜800 nm 付近の近赤外領域はヘ法の確立は社会的な要請からも、緊急性ムや水による吸収が比較的小さくなっての高い重要な研究課題である。さらに、いることが知られるため、その波長域でNO が生成されたまさにその部位で検出励起・蛍光検出できるような NO 蛍光セ

できれば、神経伝達や記憶形成におけるンサー分子を創製すれば、上記生体内観NO の作用機序の解明など、21 世紀の科察の目的を達成できるものと考え、研究学といわれる脳研究への寄与も期待できをスタートした。
本研究開始までに私どもは新規 NO 検る。

出法として DAF 類（Kojima et al. Anal.
２．研究経過Chem. 1998, Kojima et al. Angew. Chem. Int.

既存の生体内画像化法には数種類ある

Ed. 1999）、DAR 類（Kojima et al. Anal.

が、放射線被曝のない人体と環境への安Chem. 2001）、DAMBO 類（Gabe et al. J.

全性と空間高分解能、NO 選択性を付与

Am. Chem. Soc. 2004）という蛍光センサするための化学的修飾が可能な点などのー分子の開発に成功している（図 1）。こ

将来性・発展性の観点から蛍光センサー

れらは生理的条件下 NO とその選択的な分子を用いた新しい画像化法を開発する捕捉部位である芳香族ジアミンと反応し-2-て、トリアゾール環を生成し、蛍光スイッチが入るように設計されたセンサー分子であるが、450〜600 nm の可視光域での励起蛍光のため、生体組織透過性が低く、生きたままの生物個体に適用することは困難であると判断した。

図3

DAC と NO の反応による蛍光強度変化
なお、この蛍光スイッチの設計法は、これまでに得られた知見をもとに私どもが見出した光誘起電子移動機構を利用す
図1

る分子設計理論に基づくものである。すこれまでに開発した NO 蛍光センサ

なわち、電子密度の高いジアミンの状態

ー分子では、励起されたシアニン蛍光団に電子
そこで私は近赤外域で励起可能で蛍光が移動して消光してしまうが、NO とのを発する蛍光団としてシアニン色素を採反応後に電子密度の下がったトリアゾー用し、NO を選択的に捕捉する芳香族ジル体へ変化するとその消光が解除され、アミンを結合し、図 2 のジアミノシアニ本来のシアニン蛍光が発せられる原理でン（DAC）を分子設計し、化学合成するある。
本センサー分子を実験動物であるラッことに成功した。

トの摘出腎臓に図 4 の灌流システムで流したところ、腎臓内部が DAC で染まり、簡単に色素を負荷できることが分かった。

図2

近赤外 NO 蛍光センサー分子 DAC の合成
DAC と NO を反応させると 790 nm のラット摘出腎臓を用いた ex vivo

近赤外蛍光が増大する当初の予測通りの

図 4性能を有していることが判明した（図 3）。

蛍光イメージングシステム-3-その後、NO 発生剤の溶液を同じよう織の内部の NO を外部から蛍光観察できに灌流し、腎内部において NO が生成することが上述のごとく実証できたため、る条件にすると、図 5 に示すように、生本研究の土台となるアイデアと方向性が成してくる NO を腎臓の外部から蛍光像正しいことがわかり、さらなる研究の推として時々刻々と可視化することに成功進による診断薬開発の可能性が現実的とした。蛍光画像は擬似色調で示しており、なった。

糸球体に相当する部分の蛍光強度が経時

本研究成果はこのセンサー分子の試作的に増大していった。経時観察後、確認開発までであるが、私の目指す研究の最のため、腎臓切片を作成し、蛍光顕微鏡

終目標はヒトのための全く新しい光診断観察したところ、図 5 右上の写真のよう法の開発である。すなわち、体内におけに確かに糸球体が存在する腎皮質が光っる生体分子の動的挙動を体外から、体をていた。スケールバーが示すように本検傷つけることなく、蛍光観察技術を用い出系はサブ mm レベルの高解像度を有すて診断できるようにしたいと考えている。

ることが分かる。

そのためには、生体分子を測定できる近赤外蛍光センサー分子を診断薬として発展させ、提供しなければならない。しかし、診断薬として完成させるには、センサー分子の感度等の性能や体内動態、安全性を検討する必要があり、現在、そのファーストステップを達成したところである。
今後、センサー分子の生体内における図5

詳細な性能評価を行い、その評価結果をラット摘出腎臓における NO 生成イ

分子設計にフィードバックして、さらなメージングる感度向上を行い、真に実用的な分子へと改良・発展させたいと考えている。

３．研究成果
光透過性が高く、生体イメージングに５．発表論文リスト

応用が期待される近赤外 NO 蛍光センサ

Sasaki, E., Kojima, H., Nishimatsu, H.,Urano, Y., Kikuchi, K., Hirata, Y., Nagano,
T.
Highly sensitive near-infrared
fluorescence probes for nitric oxide andtheir application to isolated organs. J.
Am. Chem. Soc., 127, 3684-3685, 2005.

ー分子を創製することに世界で初めて成功した。
４．今後の課題と発展
近赤外蛍光を利用することで、生体組-4-