シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

井本先生のリゾチームに関する蛋白質研究の足跡
井本 泰治 （いもと たいじ）
聞き手：九州大学薬学研究院 植田 正（うえだ ただし）植田：本日は井本先生に、ここ半世紀以上にわす。先生は卒業研究から 40 年以上一貫してリゾたり蛋白質研究のロゼッタストーンでありえたニ

チームの研究に邁進してこられました。報告数はワトリ卵白リゾチーム（以下リゾチームと記す）

250 報を超え、その内 180 報以上がリゾチームのに関する蛋白質研究の成果を振り返り、蛋白質科

報告ということです。また、先生は、Protein

学研究者の参考に供して頂くことにさせていただ

Engineering の創刊から Associate Editor を勤めきます。

られ、Cell. Mol. Life Sci.の Editorial Board

先生はリゾチームの研究で有名であったアリゾを長年勤められました。さらに、本蛋白質科学会

ナ大学の J.A. Rupley 教授のもとに共同研究員との前身の一つである蛋白工学会の創設･発展にもして留学(1967-1970)されました。Rupley 教授、御尽力なされました。

リゾチームの X 線解析で有名な Phillips 教授とでは先生のご研究の足跡をたどる第一歩とし共著で The Enzyme にあの有名な“Vertebrateて、どのようにしてリゾチームの研究を始められ

Lysozymes”(1)を執筆（1972 年）されておりま

たのかをお伺いしたいと思います。
井本：私の研究生活は 1960 年九大農学部農芸化学科生物化学研究室に所属を許され、船津勝先
生のもとでの卒業研究で始まりました。船津先生
が阪大蛋白研の共同研究員の時に浜口浩三先生と共同でリゾチームの可溶性基質として、グリコー
ルキチンを開発されたこともあって、当研究室でもリゾチームの研究を始めようということで、私と、同僚であった山崎信行君とがリゾチームとグ
リコールキチンの調製のために、卵の白身をお菓子屋さんに、海老のむき殻を東中洲の寿司屋さんにもらいに行くことからリゾチームの研究は始まりました(共同研究の重要性)。
植田：当時は研究材料を先生が自ら入手されていたのですね。
井本：そうです。翌年夏に、林勝哉助教授が米九大農学部大学院時代

国留学からお帰りになり、米国で UV 差スペクト

悪戦苦闘して組み立てたリゾチームの立体モデルを眺めています。

191

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

ルが蛋白質構造研究に利用できると言う最新情報をお持ち帰りになった(外国留学の重要性)。早速、林先生のご指導のもとに、リゾチームと可溶「ヤジローベー式フラクションコレクター」

性基質グリコールキチンとの ES-複合体の差スペ

この当時、本邦では目的試料を分取する最強のマシーン

クトルをキャッチして、差スペクトルの原因がトがこのヤジローベー式フラクションコレクターでした。こ

リプトファン残基（Trp）であることも証明しれは無電力完全自動フラクションコレクターでした。錘をた。これが私の最初の報告となりました(2)。こつけた釣り糸を巻きつけてこの重力でアームが回転しまの論文にこぎ付くまでにかなりの苦労をしましす。アームの先の水ためにカラムからの水滴がたまると、た。何しろ UV の測定装置としては旧式のシング

その重みで水ためが多少下方移動し、その際受けがねを押

ルビーム分光光度計 Beckmann DU が学科共同機器

していたアームの縦がねの小さな隙間を通して水ためが試として１台あるだけで、隣に置かれている冷凍遠験管一本分移動する。水ためにある程度液がたまるとサイ

心機の冷凍機の冷却スイッチが入るたびに針が振ホン原理で試験管に液が流出する。軽くなってアームが跳れるのを気にしながら小さな UV 吸収の差を追跡ね上がる。これで流出液が試験管一本分分取されます。実したのです(研究環境の重要性)。

に日本人の巧みの技の結集ではありませんか。
私がアリゾナに行って見ると、巧みの技が勝るとも思え

植田：リゾチーム（酵素）と基質類似体の世界

んのに、もう電動フラクションコレクターがごろごろして初の低分解能 X 線結晶解析（6Å）の結果がいました。

Nature に報告されたのが 1965 年ですから、先生

ちなみにこのフラクションコレクターは私が九大定年後の研究報告では、その前にリゾチームの活性部位

熊本の崇城大学にいたとき、前任教授であられた船津先生の Trp と基質類似体の相互作用を示唆しているこが倉庫に保管されていたのを、十数年前に見付け出し、手ととなりますね。蛋白質機能研究法が確立してな入れしたものです。現在は天野製薬の資料館に保管していい時代の研究成果としては注目すべきものです。

ただいております。

さて、近年、科学におけるセレンディピティーとか言って偶然性が重視されていますが、先生は講義でもこの点に付いて話されていましたが。
井本：はい。くしくも、リゾチームも、アレキサ
ンダーフレミングがシャーレに落とした鼻汁の回りの菌が溶けていたことから、偶然に発見したと言われています。偶然については以前に、｢化学と生物｣に「リゾチームの研究における偶然物語」(3)という小文を書きましたが、それをかいつまんで紹介しましょう。
かのパスツールが言っています「偶然は準備された心にのみ微笑む」と。
（１）リゾチーム中のトリプトファン残基に関して先にも述べたように、船津先生、林先生そしてリゾチームとの出会い、グリコールキチンと言うリゾチームの可溶性基質を調製する技術を持ち合わ192

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

せていたこと、お粗末ながら UV 差スペクトルを理解できるが、Trp108 はリゾチーム分子中深く埋何とか測定できる装置が存在したこと、折も折り、もれた残基である。この奇妙な現象を解明すべく、

Witkop が N-bromosuccinimide を用いての Trp の

私は、Rupley 教授のもとにポストドクターとして特異的酸化反応を報じていた(4)。これらどの一つ赴いた。

が欠けてもこの研究成果は実現しなかった。この偶然の結果、Trp がリゾチームの酵素反応で重要な役割を果たすことを見出すことが出来た(2)。引き続きこの残基が Trp62 であることも証明した(5)。
当時、非極性のアミノ酸残基が酵素反応に関与すると言う考えは全くなかったので、この発見の意
義は大きかった。リゾチームの酵素－基質複合体形成への Trp62 の関与については 1966 年のPhillips 等の X 線解析結果により、確実に証明された(6)。
一方、アリゾナ大学の Rupley 教授等は、ヨー

図１．リゾチームのヨード酸化により生産される Trp108－

ド酸化により、１個の Trp が特異的に酸化されリ

Glu35 架橋中間体。

ゾチーム活性が失われる事を報じた。しかも、そのTrp は 62 ではなく 108 であった(7)。Trp62 はリ

悪戦苦闘の結果、カルボン酸がインドールのヨ

ゾチーム表面に露出した残基でその選択的修飾はードによる酸化を特異的に触媒する事を見出した。なんと Trp108 の格好の位置に Glu35 のカルボキシル基が存在しているのです。さらに驚いた
事は、リゾチームのヨード酸化では Glu35 とTrp108 の間に共有結合した酸化中間体がかなり安定に存在する(8)(図１参照)。このことは X 線解
析によっても証明された(9)。
ここに調製された中間体リゾチームは活性を完全に失っており、外からなんら置換基を導入する
こと無く活性基（Glu35）を酵素内の別の基(Trp108)に結び付けて不活性化すると言う理想的な触媒基の化学修飾が偶然にも実現できた事になる(10)。
植田：この分子内架橋リゾチームは私も調製したことがありますが、乱暴に精製すると加水分解されてしまいます。悪戦苦闘されたようですが、調製方法が確立した際の感動はさぞ素晴らしかったでしょうね。

アリゾナ大学留学時代

井本：

大学の近くにあったチューソンのサボテン公園にて。

（２）プロテアーゼ消化機構に関して193

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

私は、卒論時代にリゾチームから要らない部分

植田：21 世紀になって、プロテアーゼ消化法ををプロテアーゼ消化により切り取って活性フラグ

用いて蛋白質の変性の遷移状態を評価する論文がメントを取り出す研究も行っていた。これは全く

Nature 姉妹紙に掲載されており、プロテアーゼ

旨く行かなかった。ばらばらのペプチドとインタ

を用いて蛋白質の物性を評価することが当たり前

クトのリゾチームしか生じなかった。このことになっていますが、プロテアーゼ消化の仕組みがは、リゾチームの消化は all or none で進行していわかってこその研究だと思います。

る事を示している。all or none でプロテアーゼ消化が進行するためには二つの理由があり、一つ

井本：

は、蛋白質にニックが入りその蛋白質が爆発的に（３）蛋白質の効率的な再生法に関して変性して優先的に消化される道筋と、いま一つ

蛋白質は容易に変性するし、また蛋白質工学的は、蛋白質はネイティブ（N）型と変性（D）型に大量生産させた蛋白質は往々にして変性蛋白質の平衡にあり、D 型のみが優先的に消化される道として生産される。これらを元の活性形に巻き戻筋である。この二つを区別する事は当時の私にはさせる（再生する）ことが蛋白質の有効利用には到底不可能に思えたので、ここで一応この研究は大切である。変性蛋白質は疎水面が表面に露出し打ち切りにしたが、いつかは解明したいとの信念ており、そのため会合して沈殿しやすい。そこを持ち続けた(準備された心と言えましょう)。

で、蛋白質の再生はアグリゲーションとの戦いで数年後、私は上に述べた Glu35-Trp108 エステルある。これを防ぐために、最もよく使われるのは

中間体リゾチームの証明の一環として、この部分

無限大希釈で会合を抑える方法である。しかしこのペプチドの分離を試みていた。この誘導体は頑れはあまり効率的方法ではない。１g の蛋白質を強にプロテアーゼ消化に抵抗した。この瞬間、私得るのに 100L の溶液となるほどの希釈が要求さは偶然の微笑を直感した。この誘導体では分子内れるからである。そこで高濃度で効率よく再生すへの一本の共有結合の導入で蛋白分子構造が非常る方法の開発が求められる。

に安定になっている、しかも X 線解析結果ではこ

我々のこの研究のきっかけとなったのも偶然のの架橋によってリゾチームの構造は全くと言って発見である。ある学生が 8M 尿素中で還元後再生

いいほど変化していないことも示されている(9)。

操作を行って、あまりにも少量の外液で透析を行ネイティブのリゾチームがかなり消化される条件

い、最終的に尿素が 2M 残ってしまった。するとにさらしてもこの誘導体は安定で、ニックの入っ意外なことに再生効率が抜群によかった。尿素は

たものは全く無い事をカラムクロマトグラフィー

ランダムな SS 結合を生成させる例として当時の解析により示すことが出来た(11)。かくして、リ

教科書にも載っていて、私としてはあまりにも強ゾチームのプロテアーゼ消化は変性型を通して進い先入観があって、尿素中での再生など思いもよ行する事を証明できた。さらにこの事はプロテアらなかった。しかしよく考えてみると尿素はよいーゼ消化の詳細な速度論的解析によっても確認で可溶化剤であり、うまくコントロールすればアグきた(12)。

リゲーションを抑えながら効率的に再生させるた

プロテアーゼ消化は一般にプロテアーゼにアクめのよい試薬である。かくして我々は 8M 尿素中セッシブルなランダム構造になったペプチド結合

で蛋白質を還元変性後、透析外液（8M 尿素）の尿に対して進行する事が分かった。プロテアーゼの素濃度を徐々に低下させながら透析することによ

消化機構に関するこの発見は T 細胞エピトープのり再生させるという画期的な高濃度での効率的再生成、アミロイド蛋白の発生等多くの生理機能の生法を開発することができた(13)。
透析外液の尿素濃度を低下させる希釈液に安定解明に寄与するところ大である。

化剤を高濃度に溶解させておき、透析外液の尿素

194シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

濃度の低下と共に安定化剤の濃度を上げる事でよがあることも見出されており、新規にデザインしり効率的な再生が可能なことも示した(14)。

て創製した蛋白質は当然抗原以外の何者でもない。このような状況のもとで、蛋白質に抗原性を植田：透析法を用いて蛋白質を再生することは失わせること、すなわち、免疫寛容を与えること以前から報告されていましたが、ここで示されはとてつもなく大切なことである。

た、一連の研究により導かれた蛋白質の効率的な古くからポリエチレングリコール(PEG)修飾に再生に関する考え方は、単鎖 Fv の効率的な再生より抗原性がやわらげられることが知られてい法にも利用されています。

た。確かにニワトリリゾチームを PEG 化してマウスに投与すると抗体生産が抑えられる。さらに、

井本;

PEG 化ニワトリリゾチームの投与処理後ネイティ（４）抗原性と免疫寛容に関して

ブニワトリリゾチームを投与しても抗体が生産さある時(1992)私の研究室名が薬品製造工学かられないという驚くべき結果が偶然にも得られた。

免疫薬品学に変更された。これを契機に、常々気

このことは PEG 化ニワトリリゾチームがニワトリがかりであった免疫の研究にもとりかかる事とな

リゾチームに対する免疫寛容を引き起こしたことった。

を意味する(16)。

医薬としての蛋白質の利用に当たって、大きな

次いでこの免疫寛容が起こる原因について検討障害となるのが抗原性の問題である。我々は、ニを行った。ネイティブニワトリリゾチームは投与

ワトリリゾチームの抗原ペプチドのアミノ酸配列

後 1 日で血中濃度が検出限界以下に低下するが、を持たせることのできるたった１残基の変異をマPEG 修飾ニワトリリゾチームは 28 日間も血中濃度

ウスリゾチームにあたえると、このマウスリゾチが検出可能なレベルに維持される。この間は免疫ームがマウスの抗原となって抗体が生産される事寛容が維持され、この後、徐々に寛容が低下すを見出した(15)。かくしてたったの 1 残基の変異る。再度の投与で寛容が再現する。血中にその蛋白質が存在すれば寛容が実現するらしいことが伺えたので、少し乱暴であったが、マウス１匹当たり毎日 10mg のネイティブニワトリリゾチームを投与し続けた。血中濃度は維持され、免疫寛容が成立した(17)。以上の結果から蛋白質を安定にして、血中濃度を長期間あるレベルに保たせると、
その蛋白質に対して免疫寛容が成立する可能性を示すことができた。このことは蛋白質の医薬としての利用に対して無限の可能性を示すものである。
植田：今年の日本蛋白質科学会で、抗体医薬品

九大在任中。学会中に植田助教授とわんこそばで英気の免疫原性に関するワークショップがありましをつけています。

た。中和抗体の産生により、治療にはより多量のでも自己蛋白質が抗原となり得ることが分かっ

蛋白質医薬品の投与が必要となりますから、医療た。より性能の向上した蛋白質の生産に向けて遺費削減の観点から、免疫寛容機構を医療現場に持伝子操作が加えられることは多々ある。ヒト型のちこむことができればよいのですが。

蛋白質でも医薬として投与すると抗原となる場合
井本：

195

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回（５）結論

白質の大量調製のための効率よい発現系に発展さ研究における新発見は、基盤となる幅広い基礎

せました(20)。

知識の上に着々と準備された計画の下で必然的に現れることもあり、偶然現れることもある。新発

植田：あと蛋白質の安定化の問題や、蛋白質の見の最も大きな出現確率は、必然と偶然の狭間に揺らぎの問題その酵素活性との関係等まだまだ先あるのではないだろうか。新発見のためには周到

生のお仕事に関連してお聞きしたい事も多々ありに準備された研究基盤と偶然のチャンスを増やす

ますが、最後に、21 世紀になり再燃しております

ための幅広く多大な実験量、さらにはこだわりの

リゾチームの反応機構に関して先生のお考えをごない柔軟な適応力が必要である。その上その目的披露願いたいのですが。

に向けた、あくなき求心力を保つことが大切であ
井本：ニワトリリゾチームの反応機構に関してる。
（偶然を生かすためには準備が重要）は Phillips 等が、1960 年中盤に主に X 線解析の結果を基に、次のように提案した(6)。

植田：最初に話されましたリゾチームの活性部
位の Trp の役割の仕事に加え、先生は実に多くの

基質 N-アセチルグルコサミンの６量体{(NAG)6}

蛋白質研究の手段に先鞭をつけておられますね。

がリゾチームの結合サイトであるクレフト(A-F)

X 線解析に関しましては九大薬学部にありましたにぴったりと結合する。触媒点は触媒基とみなせ有機化合物解析用の４軸 X 線解析装置を改良しる Asp52 と Glu35 が向かい合って存在する D と Eて、リゾチームの解析を始められました。NMR にの糖の間であり、両酸残基のカルボキシル酸素とつきましても、600MHz の装置は世界に数台しかな

D 糖の C1 原子の距離が離れすぎている事から、共い時期に九大薬学部に設置することに成功されて有結合中間体機構ではなく、オキソカルべニウム

います。特に現在蛋白質研究の主流をなしており

イオン中間体機構を提唱した。

ます遺伝子工学をその黎明期に蛋白質研究に取りGlu35 は一般酸触媒としてグリコシル結合酸素

込まれてこられたようですが、この辺の状況に付にプロトンを供与し、グリコシル結合の切断が起いてお聞かせください。

こり、カルボニウムイオンが生成し、D 糖の歪によってオキソカルベニウムイオンとして安定化さ

井本：私が遺伝子工学を蛋白質研究の手段に取れ、このプラスイオンを Glu35 とともに Asp52 のり入れたきっかけは実によき共同研究者にめぐり負イオンがさらに安定化する。ついで、Glu35 が合ったおかげです。九大薬学部の三木健良先生の水分子からプロトンを引き抜きながら、-OH を D

ご指導のもとに、まさに黎明期にあった遺伝子工糖の C1 に結合させる。かくして、リゾチーム反学の手法をリゾチームの研究に取り入れる事で蛋応がスムーズに進行する。
その後、約 10 年間の研究成果をも踏まえて、

白質工学をリードする事が出来ました。

我々は 1972 年に 798 報もの文献を網羅した The

当時(1985 年)高度発現ベクターとしては
pKK223-3 しか市販されておりませんでした。これ

Enzyme の総説(1)でこの説を支持した。当然、共ではリゾチームはほとんど発現しなかったので、有結合中間体説に対する対応も十分に行いながら温度感受的にコピー数が格段に増加する発現ベク

書き上げたつもりであった。ところが最近、

ターpKP1500 を開発し、大量のニワトリリゾチー

Asp52-糖共有結合中間体が取れたと言う報告がな

ムを大腸菌に発現させました(18)。次いで、酵母された(21)。これはアフィニティーラベリングにでの分泌系を構築し、ニワトリリゾチームを活性より Asp52 ラベルリゾチームが調製できた事の報

型で培地から得られるようにしました(19)。さら告に過ぎないと、軽く受け止めていたが、中間体に、Pichia 酵母による大量発現系のためのプロト機構が主流のような流れになりつつある事に驚い

コールを確立し、NMR 測定のための重原子置換蛋

ている。

196

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回「白いカラスがいたよ」と言う発言は、哲学的

多くのＤ結合部位への基質結合力の解析から、には、総てのカラスが白くない事を証明する必要

Ｄ結合部位への糖の結合には不都合な結合エネルがあると言う厄介な事態である。科学的には「そギーがかかる事が見出されている(1)。Ｄ結合部

れは突然変異だ」で済まされる問題かもしれない

位を含む複合体の結晶作成が困難を究めた事からが、「やはりある程度の対応を試みるべきかな」

もその実情がうかがい知れる。

と言う気もします。そこでまずは明らかにカルベ

Strynadka と James はニワトリリゾチームとニウムイオン中間体機構を強く支持すると思われ

NAM-NAG-NAM の複合体の 1.5Åでの詳細な解析かる結果をいくつかピックアップすることを試みた

ら、Ｄ糖が歪んで半椅子構造をとることを強調しい。

ている(27)。
種々の単糖-p-ニトロフェノールを(NAG)4 に結（１）カルベニウムイオン中間体で進んでいる証拠

合させた基質の分解パターンから、D サイトの糖

リゾチームの糖転移反応に於けるアクセプター

は(C2)NAc と(C5)CH2OH を有することが重要で、ことしての水分子に対する有効性を 14 種のラジオ

れらが糖に歪を与え、カルベニウムイオンの安定

アクティブ求核試薬について詳細に検討した結果な生産に寄与していることを示唆した(28)。
-Glycoside Hydrolase では結合エネルギーでは、全てがカルベニウムイオン中間体経由で反応

基質への歪を保障する事で活性半椅子構造を取らが進行している事を支持した(22)。

せ糖分解反応を加速することが示されている（２）Asp52 は必ずしもクリティカルな触媒基では

(29)。

ない。

（４）その他の証拠

クリティカルな触媒基であればその消失は活性の完全な消失に帰結するはずである。両機構でク250C、pH 7 で 290nm 光励起し 320nm の蛍光でリティカルな触媒基と見なされている Glu35 はそリゾチーム触媒反応を追跡した(30)。ES-複合体の修飾で完全に活性の消失が確認されている生成の早い蛍光変化(数ミリ秒)の後、約 100 秒に(10,23)。一方、Asp52 の方は Ala{0.24% (24)}、

わたって、ややゆっくりとした単調な加水分解反Ser{0.63% (24)}への変換でそれぞれ括弧内の活応が進行した。Asp52 による共有結合機構であれ性が残存した。ホモセリンへの注意深い化学修飾ばその負電荷の消失と再出現の影響を受けてによっても pH6.7 において 10%活性を示した{-CO- + -C+- → -CO-C- → -CO- + -C-(OH)}この(25)。Asp よりサイズが小さくなっており、pKa

反応段階全体にかけて単調な蛍光変化が展開されから考えても共有結合では説明がつかない。電気るはずは無い。

陰性度を大きくする残基への変換が活性を少し高めていそうな傾向は、Asp52 がマイナス電荷でカ

このようにカルベニウムイオン中間体機構を支ルべニウム正イオンを安定化すると言う説を支持持する論文は枚挙に暇が無いが、リゾチームの研する結果である。

究を引き継(ぐ事の重要性)いでくれた君のグルークリティカルな触媒基の一方が失われても何とプが大変な事を見出してしまいましたね。アサリ

か微々たる活性の発現の可能性があると言う言いガイのリゾチームでは酸性領域での通常反応で共逃れは、とりもなおさず共有結合以外でも反応が有結合中間体が質量分析で検出できたというもの

進んだ事のサポートを与える事になるのではないです(31)。既に我々はニワトリリゾチームのか。

Asp52 のカルボキシル基の枝を延長して Glu に換

Glu35 相当残基は必須だが Asp52 が存在しないえる事で共有結合中間体を捕捉出来る事を示して

リゾチーム類似酵素がかなり存在することも見出はいたが(32)、議論の矛先を多少変更する必要にされている(26)。

迫られた。

（３）歪の問題197

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

植田：アサリガイリゾチームは活性部位の一つ

Asn46 のアミド基との密接なコンタクトに注目しが、ニワトリリゾチームと異なり、リゾチームのてみよう。先にもこのコンタクトがＤ糖の歪の要

分子内に唯一存在するβシートのβ1 ストランド

因の一つであるとした文献(28)を紹介したが、うに存在しました。ニワトリリゾチームはβシート

なずけるところである。[C]ではこの NAc グルーのβ2 ストランドに存在するので、アサリリゾチ

プが O に置き換えられており、この込み合いが解ームの結果がニワトリリゾチームの触媒機構を否消されて、歪なしにＤ糖が安定に結合している

定するものではないと考えていました。この考え(34)。[B]の場合は NAc グループが F に置き換え

は最近受理された論文(35)でも実証されました

られており、このことがＤ糖の C1 と Asp52 のカが。

ルボキシル酸素との結合を何とか可能にしているものと考えられる。それでも[B_A]における(C2)-

井本:それでもこの結果は中間体機構を勢いづ

F と Asn46 の N2 が 1.9 Åと異常接近しており、けるものでしたよね。そこで、Ｄ結合部位に糖がAsn46 はこの込み合いが緩和される(3.9Å)別構造

結合したニワトリリゾチームの X 線構造解析の結体を取ったものが見られるようになる。しかしＤ

果を精査した(表１、図２)。[Ａ]は Trp62 の Tyr

糖に NAc グループが存在する場合にはたとえこのまたは Phe への変換体と(NAG)3 の複合体解析結果

形ででも安定な複合体の形成は望めそうに無い。
以上の考察から、Ｄ糖に NAc グループを持たなから演繹したもの(33)、[B_A]は2-Fluorochitobiose 複合体(21)、[B_B]は[B_A]のい糖を基質としたニワトリリゾチームの反応機構

別構造体、[C_A]は 4-O--tri-N-の解明は意味をなさないと考えられる。
一方、これらの考察から、Ｄ糖の NAc グループ

acetylchitotriosyl moranoline との複合体(34)、[C_B]は[C_A]の別構造体、[D]は NAM-NAG-と Asn46 の密接なコンタクトは C1 と Asp52 のカ

NAM との複合体(27)からのデータである。

ルボキシル酸素の距離を 3Å以内に近づけない事

まず[Ａ]での糖の C2 に付いた NAc グループと
表１ Ｄサイトに結合した糖とニワトリリゾチームの各原子間距離（4Å以内のもの）。

a

Asp52カルボキシル基のより近い酸素。

b

Asn46アミド基のより近い原子。

c

A; Try62 修飾体との基質複合体から推定した構造(1LZC, 分解能 1.80Å)。B_A; 2-Fluorochitobiose 複合体(1H6M, 1.64Å)。B_B; B_A の別構造体。C_A; 4-O--tri-N-acetylchitotriosyl moranoline との複合体(4HP0,
1.19Å)。C_B; C_A の別構造体。D; NAM-NAG-NAM との複合体（1.5Å,コオーディネートは未発表）(27)。

198シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

図２ 種々のＤサイト結合糖とリゾチームの Asn46 と Asp52 との原子配置。A, B, C は表１のリゾチームの座標。4Å以内の距離にある原子間は破線で示した。Ｄ糖の C1 は黄色で、別構造酸素は桃色、別構造窒素は空色で示した。

中間にある C1 と Asp52 の Oの距離がワイルドにも寄与している事が伺える。
実は共有結合機構で反応が進行するための要

リゾチームで 3.3Å（表１）であることから、表は、Asp52 のカルボキシル酸素がＤ糖の C1 炭素に２の値から C1 と Asp52 相当残基のカルボキシル

約 1.5Åの距離に近づくかどうかである。この点

酸素の大体の距離は推測できる。
先ずワイルドリゾチームでは天然基質を用いたに明確な回答を与える結果を我々はごく最近提出

場合に共有結合中間体は見出されていない。もちすることが出来た(35)。

ろん、Asp52 をつぶして代わりに Asn46 を Asp に

表２に種々に修飾したニワトリリゾチームの二つのカルボキシル触媒基間距離を示した。Ｄ糖のして Asp52 相当残基を 1Å程度遠ざけた

C1 との距離で示したいが、Ｄ糖複合体の解析が済Asn46Asp/Asp52Ser においても共有結合中間体はんでいないものもあるので、この値で示してある。

見つかっていない。しかも、この変換体は 2.5%の活性を示し、Asp46 が解離型で反応を触媒してい表２ 修飾ニワトリリゾチームの対をなす触媒基間距離と共有結合中間体生成の有無 aa

文献 35 より改変。

199シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

ることが、その活性の pH 依存性からはっきりとす。また、リゾチームの構造と機能の研究法は、示された(35)。この距離での共有結合の可能性は

多くの蛋白質の構造と機能研究の参考となってい全く考えられない。この事実は、ワイルドリゾチ

ますので、ここで紹介いただいた内容は本学会会

ームでは Asp52 が共有結合を生成することなく、員にとって興味深いものだと思います。本当にあ静電相互作用で反応をアシストしていることを明りがとうございました。

確に示している。
表２から明らかなように、Asp52 相当基を C1 に後記（聞き手から）：この原稿の依頼を井本先

かなり近づけると共有結合中間体が見られるよう生が受諾され１年以上になります。この間、井本になる。しかしながらこの共有結合中間体は酵素

先生は印刷中である二つの論文(35,37)の投稿と反応中間体とは言えないほどに安定で、カラムで並行して頑張っていただきました。特に、論文 37

分離でき、その分解速度はそのリゾチームの見かに付いては、卒論研究始めたときから気になられけの反応速度よりかなり遅い(35,36)。その意味ていた、酵素反応論の問題点に関しての論文でで表２ではこれらの場合にも Asp52 相当残基は負「いかに受け入れがたい理論であるかを物語る、

電荷供与基としても列記した。共有結合中間体機

ここ 10 年あまりの大奮闘の結果、77 歳にして、構では生成した中間体を速やかに分解する機構も正しい酵素反応論を上掲することが出来た」（井

同時に組み込まれていることが必要である。

本先生の言葉のまま）というもので、井本先生渾以上の考察を基に、糖鎖の加水分解は共有結合身の論文 (37)でありますのでこちらも是非ご一

中間体で進行する事を認めながらも、正常なニワ

読ください。

トリリゾチームの反応はカルベニウムイオン中間体機構で進行していると言う事ができるのではな
いでしょうか。
植田：詳細にリゾチームの触媒機構に関する考察をご教授いただきありがとうございます。昨
年、先生の喜寿のお祝いをしましたので、先生のリゾチーム研究は半世紀を越えることになりますね。
（リゾチームの反応機構に付いて簡単な説明を文末につけておりますのでご参考になさってく
ださい。
）

文 献
1)

2)

井本：九大農学部での同僚である山崎信行先
生、九大薬学部時代に私を支えてくれた山田秀徳
先生、さらに植田先生を始め多くの教え子の皆さ

3)
4)んの協力のもとにこれらの研究は生み出されてきたのです。
私の超半世紀にわたる研究生活で、よき師、よき共同研究者、よき研究環境、そしてよき偶然に恵まれた事を感謝しています。

5)

植田：リゾチームを研究対象とされたことのある先生は蛋白質科学会には沢山おられると思いま200

Imoto, T., Johnson, L. N., North, A. T. C., Phillips,
D. C., and Rupley, J. A., "Vertebrate Lysozymes"
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井本泰治、化学と生物 42, 694-700 (2004）
Witkop, B., Nonenzymatic methods for the
preferential and selective cleavage andmodification of proteins. Adv. Protein Chem., 16,
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Hayashi, K., Imoto, T., Funatsu, G., and Funatsu,
M., The Position of the Active Tryptophan
Residue in Lysozyme. J. Biochem. 58, 227-235(1965)

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

6)

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7) Hartdegen, F. J., and Rupley, J. A., The
Oxidation by Iodine of Tryptophan 108 in
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8) Imoto, T., Hartdegen, F. J., and Rupley, J. A.,
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Inactive Product and its Conversion to an
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9) Beddell, C. R., Blake, C. C .F., and Oatley, S. J.,
An X-ray study of the structure and binding
properties of iodine-inactivated lysozyme. J. Mol.
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10) Imoto, T., and Rupley, J. A., Oxidation of
Lysozyme by Iodine: Identification andProperties of an Oxindoyl Ester Intermediate;
Evidence for Participation of Glutamic Acid 35 in
Catalysis. J. Mol. Biol., 80, 657-668 (1973)11) Imoto, T., Fukuda, K., and Yagishita, K., A
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Lysozyme. I. Detection of the Transition by
Product Analyses of Protease Digests. Biochim.
Biophys. Acta, 336, 264-269 (1974)
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Refolding of an unstable lysozyme by gradientremoval of a solubilizer and gradient addition ofa stabilizer. J Biochem., 147, 427-431 (2010)15) Tsujihata Y, So T, Hashimoto Y, Ueda T, andImoto T., A single amino acid substitution in aself protein is sufficient to trigger autoantibody
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201

Reducedimmunogenicity
ofmonomethoxypolyethylene
glycol-modified
lysozyme for activation of T cells. Immunology
Lett., 49, 91-97 (1996)17) So, T., Ito, H.-O., Hirata, T., Ueda, T., and Imoto,T.,
Extendedblood
half-lifeofmonomethoxypolyethylene
glycol-conjugated
hen lysozyme is a key parameter controlling
immunological tolerogenicity. Cell. Mol. Life Sci.,
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Orita, T., Yamada, H., Imoto, T., and Horiuchi, T.,
Construction of a Plasmid Vector for the
Regulable High Level Expression of Eukaryotic
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Overproduction of Chicken Lysozyme. ProteinEng., 1, 327-332 (1987)19) Hashimoto, Y., Koyabu, N., and Imoto, T., Effectsof signal sequences on the secretion of hen
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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

32) Kuroki, R., Ito, Y., Kato, Y., and Imoto, T., A
Covalent Enzyme-Substrate Adduct in a Mutant
Hen EggWhite Lysozyme (D52E). 272, 19976–
19981 (1997)33) Maenaka K., et al., Dissection of Protein–
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Activity. J. Mol. Biol., 247, 281–293 (1995)
34) Ogata, M., et al., A Novel Transition-state
AnalogueforLysozyme,
4-O--Tri-Nacetylchitotriosyl
Moranoline,
Provided
Evidence Supporting the Covalent Glycosylenzyme Intermediate J. Biol. Cham., 288, 6072–
6082, (2013)35) Abe, Y., Kubota, M., Takazaki, S., Ito, Y.,
Yamamoto, H., Kang, D., Ueda, T., and Imoto,T., Effect on catalysis by replacement of catalytic
residue from hen egg white lysozyme to
Venerupis philippinarum lysozyme. Prot. Sci., 25,
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Sugimura, K., and Imoto, T., Analysis of acatalytic pathway via a covalent adduct of D52E
hen egg white mutant lysozyme by further
mutation. Prot. Eng. 12, 327–331, (1999)37) Imoto, T., Derivation of a valid momentary firstorder rate constant for kinetic and energetic
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25) Eshdat, Y., Dunn, A., and Sharon, N., Chemical
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revisited: crystallographic evidence for distortionof an N-acetylmuramic acid residue bound in site
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Enzymatic Reaction Coordinate: Analysis of a
Retaining -Glycoside Hydrolase. Biochemistry,
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Productive and Unproductive LysozymeChitosaccharide
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Kinetic
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31) Goto, T., Abe, Y., Kakuta, Y., Takeshita, K.,
Imoto, T., and Ueda, T., Crystal Structure of
Tapes japonica Lysozyme with Substrate
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202

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回（解説）リゾチームの触媒機構の変遷
聞き手 植田 正
ニワトリリゾチーム（以下リゾチーム）は酵素の中で最初に X 線結晶解析が成功した蛋白質である。リゾチームはグラム陽性菌の細胞壁に存在する N-アセチルグルコサミン(NAG)と N-アセチル
ムラミン酸のβ-1,4 結合を加水分解する生理機能を持っているが、触媒機構を議論する場合は、カニなどの甲羅の成分であるキチンを可溶化した、NAG のオリゴマーを基質として用いている。触媒
残基は Glu-35 と Asp-52 であることは、chemical mutation と部位特異的変異体解析により明らかとなっている。また、これらの酸・塩基触媒によって、NAG のオリゴマーが加水分解されることは共通した認識である。しかしながら、その触媒機構の詳細については、さまざまに議論されている。
その主なものを紹介する。

Fig.S1 キチンの構造

1953 年 Koshland は、NAG オリゴマーの加水分解において以下のような触媒機構を提唱した。
H+ドナーの役割をする Glu-35 から解離した H+が切断部位にある NAG の酸素原子に結合し、Asp52 のカルボキシレートイオンの求核攻撃により、NAG の 1 位の炭素と共有結合（Fig.S2）を形成する際に、NAG-NAG 間のβ1,4 結合が切断される。次に、解離している Glu-35 が水から H+を受け取り、生じた OH-が糖—酵素共有結合を加水分解して反応が終了する。
一方、1967 年に X 線結晶解析を基に Phillips は異なる機構を提唱した。H+ドナーの役割をする
Glu-35 から解離した H+が切断部位にある NAG の酸素原子に結合し、NAG-NAG 間のβ1,4 結合が切断される。この際に H+を受け取った NAG は、1 位の炭素原子カルボニウムイオンを生じ半椅子

Fig.S2 糖-酵素中間体

Fig.S3 カルベニウムイオン中間体

203

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

型構造をとる（Fig.S3）。半椅子型構造はカルベニウムイオンを安定化しやすい立体配座であるが、近傍に存在する Asp-52 のカルボキ
シレートイオンにより、さらに安定化される。次に、解離している
Glu-35 が水から H+を受け取るとともに、生じた OH- がカルベニウ
ムイオンに付加して反応が終了する。
リゾチームの NAG オリゴマーの加水分解機構として、
Phillips の機構が長い間受け入れられてきたが、2001 年 Vocadlo らは、リゾチ
ームと 2-アセトアミド-2-デオキシβ-d-グルコピラノシル-(1→4)2-デオキシ-2-フルオロ-β—d-グルコピラノシルフルオライド(NAG2FGlcF)を pH5.0 で共存させておくと、糖とリゾチームの間に共有結合が生じることを、質量分析、X 線結晶解析により示した（Fig.S4）。この論文が Nature 誌に発表された後、多くの生化学のテキストでは、次々とリゾチームの触媒機構が糖-酵素中間体を経て進むことに修正された。
しかし、筆者は Asp52 の酸素原子は切断点の糖の C1 に、共有結合の距離(約 1.5Å)に近づくことは無理であること、さらに Asp52 をSer とし、Asp52 よりさらに１Å程度 C1 から離れたところに挿入した Asp が解離形でカルベニウム陽イオンを安定化することで活性向上に関与したことなどから、ニワトリリゾチームの触媒反応はカル
べニウムイオン中間体機構で進行していると考えるほうが妥当であると主張している。

Fig.S4 Vacadlo らの主張
（報告を基に模式図を作成）

204

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第24回

井本泰治先生ご略歴：
昭和 14 年 福岡県に生まれる。
昭和 33 年 県立宗像高校卒業
昭和 37 年 九州大学農学部農芸化学科卒業
昭和39 年 九州大学農学研究科農芸化学専攻(修士課程)修了
昭和42 年 九州大学農学研究科農芸化学専攻(博士課程)修了
昭和 42 年 農学博士(九州大学)
同年

アリゾナ大学化学部共同研究員

昭和 45 年 九州大学農学部農芸化学科助手
同年

山口大学農学部農芸化学科助教授

昭和 53 年 九州大学薬学部製薬学科教授
平成 4 年 九州大学大学院薬学研究科教授
平成 12 年 九州大学大学院薬学研究院教授
平成 15 年 同上定年退職
平成 15 年 崇城大学教授
平成 22 年 同上定年退職
この間
昭和 62 年 1 月 Protein Engineering の編集委員
平成 9 年 Cellular and Molecular Life Science の Editorial
Board
平成 13 年 10 月 日本生化学会九州支部長＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
植田 正（聞き手）：
九州大学薬学部の４年次の卒業研究から井本教授の研究室に所属。
大学院生博士課程、助手、助教授を通じて井本先生とリゾチームを題材とした研究を実施。
2003 年九州大学大学院薬学研究院教授就任後も井本先生との共同研究を継続する。
井本先生とのリゾチームを題材とした論文は約 100 報。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

205