08-06

高保真性 PCR 反应酶的升级版

KOD –Plus- Ver.2(Code:KOD-211)

科研用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目 录【1】 简介.................................................................................................................................................1【2】 PCR实验步骤 ................................................................................................................................3【3】 进行实验的注意事项.....................................................................................................................4【4】 常见问题.........................................................................................................................................5【5】 相关产品.........................................................................................................................................6【6】 参考文献.........................................................................................................................................7【 注意 】
该系列产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事
项，适当使用保护用品，安全操作。

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LIMITED LICENSE

Use of this product is covered by one or more of the following US patents andcorresponding patent claims outside the US: 5,079,352, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155
and claims outside the US corresponding to US Patent No. 4,889,818. The purchase ofthis product includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoingpatent claims for using only this amount of product for the purchaser’s own internal
research. No right under any other patent claim (such as the patented 5’ Nuclease Process
claims in US Patents Nos. 5,210,015 and 5,487,972), no right to perform any patented
method, and no right to perform commercial services of any kind, including without limitation
reporting the results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, isconveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for research use only.
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Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.

东洋纺(上海)生物科技有限公司【1】 简介本产品是使用超嗜热原始菌 Thermococcus kodakararaensis KOD1 株开发的高保真性PCR 用酶。本酶除 Polymerase 活性外，还具有强力 3’→5’核酸外切酶活性（Proof-reading活性），因此保真性约为 Taq DNA Polymerase 的约 80 倍。本产品通过对原来的 KOD –Plus的 PCR Buffer 的改良，在保持出色的保真性的基础上，更提高了 PCR 反应的可靠性（成功率）。
本产品与 KOD –Plus-一样，将抑制多聚酶活性及校正活性的 2 种抗 KOD 单克隆抗体预混合在酶中，可简便地进行 Hot start PCR。本产品具有如下特征：
1）高可靠性 对难以扩增的序列目的片段及长目的片段的可靠性（PCR成功率）更高，因此可获得确实有效的扩增产物。
2）降低了带入的RT溶液的阻碍 与KOD –Plus-相比，降低了逆转录反应溶液带入对
PCR反应的阻碍。
3）高保真性 约为Taq DNA Polymerase的 80 倍，与KOD –Plus-具有同等的保真性，最适用于PCR产物的克隆。
※有另售的KOD/KOD –Plus-用TA克隆试剂盒「Target CloneTM –Plus-」。

◆KOD -Plus- Ver.2 是对 KOD –Plus-的反应缓冲液(10×Buffer for KOD –Plus-)进行改良后的升级版。如您手头已有 KOD –Plus-，则可购买单独销售的 KOD -Plus- Ver.2 用
Buffer(Code No.KOD-3B)
实例：※以各种 cDNA 为目的片段，使用 KOD -Plus- Ver.2、KOD -Plus-和其他公司 PCR 用酶的扩增性能比较例。
以经 HeLa total RNA 逆转录的各种 cDNA 为模板，用各产品的推荐条件对其进行 PCR。
结果可见，与其他酶相比，KOD –Plus- Ver.2 显示了良好的扩增效果。特别是对难扩增
的 human polymerase ε cDNA 6.8kb（第四栏）的目的片段，也能得到明亮的扩增条带。

垂询电话：021-58794900

1

其他公司高保真性

KOD -Plus- Ver.2
M 1234

KOD -Plus1234PCR用酶12341:human transferrin receptor cDNA 3.5kb
2:human tuberous scleosis cDNA 5.3kb
3:human adaptin cDNA 5.7kb
4:human polymerase εcDNA 6.8kb
M:1kb ladder◆ 产品内容KOD-211 (200 次用)
200μl × 1 支

KOD -Plus- (1.0 U/μl)
10× Buffer for KOD -Plus- Ver.2

1ml × 1 支

25mM MgSO4

1ml × 1 支

2mM dNTPs

1ml × 1 支

◆ 注意安全该系列产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全操作。
在进行相关实验时，有可能还会使用到其他对人体有害的试剂。请务必遵守各试剂的注
意事项及仪器、器具等的使用说明，适当使用保护用品。

◆ 性能•品质
各批号的 KOD -Plus- Ver.2 均对 HeLa total RNA 的逆转录产物 human polymerase εcDNA 6.8kb 进行扩增确认实验后再销售。

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http://www.bio-toyobo.cn东洋纺(上海)生物科技有限公司【2】 PCR 实验步骤(1)PCR反应液的配制配制反应液前请对各试剂进行充分混匀后再使用。冻结的试剂应使其完全融解。
Components

VolumeFinal Concentration

10× Buffer for KOD -Plus- Ver.2
2mM dNTPs
25mM MgSO4Primer(10μM each)

5 μl
5 μl
3 μl
1.5 μlTemplate DNA≧ 1 μl

KOD -Plus- (1U/μl)
Autoclaved,distilled water

1 μl
to 50 μl

1×0.2mM each
1.5mM
0.3μM each
Genomic DNA 10~200 ng/50μl
Plasmid DNA 1~50 ng/50μl
cDNA 请参照 3.-(7)
1 U/50μl•酶溶液请在最后添加，用vortex等对反应液进行充分混匀之后，将其放置到PCR仪上。

(2)PCR的循环条件
通常情况下请按以下的三步法进行反应。用高Tm值（65℃以上）的引物进行PCR，产
生杂带时，请尝试2步法。

3 Steps
Predenature:
Denature :Annealing :Extension :2 Steps
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
(Tm-5)℃, 30sec.
68℃, 1min. /kb

25～40
cyclesPredenature:
Denature :Extension :•延伸时间(Extension)请按目的片段链长1kb/min.的标准设定。

垂询电话：021-58794900

394℃,2min.
98℃,10sec.
68℃,1min. /kb

25～40cycles

【3】 进行实验的注意事项
(1) 请尽量选用 thin-wall 型反应用离心管。另外，PCR 反应液推荐量为 total 50μl。
(2)灭菌水、引物建议事先分成小包装，每次都使用完。
(3)dNTPs 请务必使用本产品添附的部分，也可以使用本公司另售的「dNTPs Mixture(2mM)」(Code No.NTP-201)。
(4)引物的 GC 含量不可太高，长度应保持在 22～34mer 的范围之内（Tm 值>60℃）。另外，设计引物时要注意不要使其形成分子内二级结构、引物二聚体等情况。
(5)对长链目的片段进行扩增时，请使用 Tm 值 65℃以上的引物。
(6)模板 DNA 的长度、纯度等对 PCR 的结果影响很大。如果模板 DNA 的量有余，建议事先做个电泳分析以确认其品质。本产品如果混入了过量的 RNA，则可能阻碍 PCR 的反应。
(7)以逆转录反应液为模板 DNA 时，RT 反应液中过剩的 RNA 会阻碍 PCR 反应。建议在 50μl
的 PCR 反应液中，RNA 的量控制在 150ng 以下。也就是说，用 1μg Total RNA，20μl 体
积进行 RT 反应，往 PCR 反应的添加量在 3μl 以下。另外，植物基因组根据抽出方法的不同，可能混入 RNA 的量更多。要防止 RNA 的混入，建议降低 DNA 样品的液量或对 DNA
样品进行 RNase 处理。
(8)对于高 GC 含量的目的片段，添加终浓度为 2～5%的 DMSO，有可能改善扩增效果。
(9)DNA 的变性条件为 94℃、15sec.时，能增加目的片段的扩增量。对于高 GC 含量的目的
片段，变性条件请设定为 98℃、10sec.。
(10)PCR 的循环数根据样品 DNA 的量而定。通常，使用人类基因组 DNA 50-200ng 时，30～40 循环可得到良好的结果。
(11)进行 Colony Direct PCR 时，注意不要向 PCR 反应液中带入过量的菌体。肉眼看不到
的菌体量即可充分进行 PCR。
(12)通过本产品扩增的PCR产物末端已被平滑化(blunt end)，因此可以通过平滑末端法进行克 隆 。 使 用 本 公 司 的 KOD/KOD –Plus- 用 TA 克 隆 试 剂 盒 TArget CloneTM –Plus-(CodeNo.TAK-201)即可简便地进行TA克隆。

4

http://www.bio-toyobo.cn东洋纺(上海)生物科技有限公司【4】 常见问题

原因

对策

具体数据

提高MgSO4的浓度从 标 准 的 1.5mM 提 高 到
2.0mM降低退火温度

下降到Tm-10℃增加循环数

增加2～5个循环

增加模板DNA的量无法看到扩增产物
或没有扩增产物

增加酶量从标准的1U提高到1.5～2.0U

确认使用的模板DNA、引 特别是 确认 模板DNA是 否被物的品质
RNA污染
对高GC 含 量的目的 片 段 从 标 准 的 1.5mM 降 低 到请降低MgSO4的浓度
1.0mM
样品中混有大量的RNA
提高退火温度将cDNA样品稀释后再使用
分解或除去RNA
勿高于68℃

进行Step Down PCR
可看到非特异性扩增产物

降低MgSO4的浓度从 标 准 的 1.5mM 降 低 到
1.0mM

设计新的引物组减少循环数

减少2～5个循环

降低模板DNA的量
背景中可看到smear或杂带
降低MgSO4的浓度不能进行TA克隆

垂询电话：021-58794900

从 标 准 的 1.5mM 降 低 到
1.0mM

减少使用的酶量

从标准的1U降低到0.5～0.8U请使用专用的试剂盒请使用TArget CloneTM –Plus-5

【5】 相关产品品 名包 装<M-MLV 改变型逆转录酶>

10,000 U×1 支®

ReverTra Ace (100 U/μl)

10,000 U×5 支<高保真性 PCR 酶>

250 U×1 支

KOD DNA Polymerase

250 U×5 支<热启动高保真性 PCR 酶>
KOD -Plus<KOD/KOD -Plus-用高效率TA 克隆试剂盒>TArget CloneTM -Plus-

保存温度-20℃-20℃-20℃

10 次份×5 本

TRT-101B
KOD-101
KOD-101B
KOD-201
KOD-201B

200 U×10 本
10 次份×1 本

TRT-101

KOD-201(2)100 U×1 本
200 U×1 本

Code.No.

-20℃

TAK-201
TAK-201B

dNTPs Mixture(2mM)

1 ml

-20℃

NTP-201

KOD -Plus-用 25mM MgSO4

1 ml-20℃

KOD-2S

KOD -Plus- Ver.2 用 Buffer

1 ml-20℃

KOD-3B6

http://www.bio-toyobo.cn东洋纺(上海)生物科技有限公司【6】 参考文献(1) Takagi, M., Nishioka, M., Kakihara, H., Kitabayashi, M., Inoue, H., Kawakami, B., Oka, M.,
and Imanaka, T., Appl. Environ. Microbiol., 63, 4504-4510 (1997)(2) Hashimoto, H., Matsumoto, T., Nishioka, M., Yuasa, T., Takeuchi, S., Inoue, T., Fujiwara,S., Takagi, M., Imanaka, T., and Kai, Y., J. Biochem. (Tokyo), 125, 983-986 (1999)(3) Mizuguchi, H., Nakatsuji, M., Fujiwara, S., Takagi, M., and Imanaka, T., J. Biochem.
(Tokyo), 126, 762-768 (1999)(4) Nishioka, M., Mizuguchi, H., Fujiwara S., Komatsubara, S., Kitabayashi, M., Uemura, H.,Takagi, M., and Imanaka, T., J. Biotechnol. 88, 141-149 (2001).
(5) Hashimoto, H., Nishioka, M., Fujiwara, S., Takagi, M., Imanaka, T., Inoue, T., and Kai. Y.,
J. Mol. Biol., 306, 469-77 (2001).
(6) Imanaka, T., and Takagi, M., J. Chin. Inst. Chem. Engrs., 32, 277-288 (2001)

垂询电话：021-58794900

7[制造 • 销售商]东洋纺（上海）生物科技有限公司
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