12-03

ReverTra Ace qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover
去基因组 DNA(Code No. FSQ-301)

科研用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目 录【1】 简介 ························································································ 1【2】 产品介绍 ·················································································· 2【3】 其他必需品 ··············································································· 3【4】 使用方法 ·················································································· 4【5】 APPENDIX ··············································································· 6【6】 常见问题 ·················································································· 8【7】 相关产品 ·················································································· 9【 注意 】
本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。

【 保存 】
所有组分请均保存于-20℃条件下。长期不用时，请在-30℃条件下保存。

【1】 简介
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 是增加了去除基因组 DNA (gDNA)功能的 Realtime PCR 用逆转录反应试剂盒，使用了本公司
高效率逆转录酶「ReverTra Ace」。
通过 Realtime PCR 进行基因表达分析时，cDNA 的检测非常重要。但是，用 过 柱 纯 化 式 的 RNA 抽 提 试 剂 盒 或 AGPC(Acid Guanidium - Phenol Chloroform)法纯化的 Total RNA 中经常会混入微量的 gDNA。当检测目的基因中存在假基因，或无法在横跨内含子的位置上设计引物时，混入的 gDNA 会被当作模板扩增，影响准确的定量。
本试剂盒中添附了具有强力 DNA 分解活性的 gDNA Remover，通过该组分将混入模板 RNA 的 gDNA 分解后，无需纯化即可对 RNA 进行逆转录，可简便
地配制出不含 gDNA 的 cDNA。此外，所有用于反应的试剂已预混，可非常容易
地配制反应液。
本产品不含 Realtime PCR 试剂，进行 Realtime PCR 实验时，推荐我司高
性能 Realtime PCR 试剂 THUNDERBIRD qPCR Mix 或 Realtime PCR MasterMix 系列（请参考[7]相关产品）。

◆本产品特征◆1. 可简便、迅速地去除基因组 DNA 和合成 cDNA
按顺序添加去除 DNA 反应试剂和逆转录反应试剂，只需约 20 分钟的操作，即可实现去除基因组 DNA (gDNA)和合成 cDNA。
2. 预混型试剂去除 DNA 反应的试剂和逆转录反应试剂均为在-20℃条件下也不会冻结的预混型试剂，同时，由于还添附了预混型 no-RT Control，可非常简便地配制逆转录反应（－）的对照反应液。
3. 可对 RNA 的整个区域进行均一的逆转录反应
采用了最适用于 Realtime PCR 用 cDNA 合成的反应 buffer，和按最佳比例
混合的 Primer mix（Oligo dT 及 Random Primer），可对 RNA 的整个区域进行
均一、高效率的逆转录反应。
4. 与 Realtime PCR 试剂的高适应性采用了对 Realtime PCR 的反应体系影响最小的组分，即便向 PCR 反应液
中带入最多 20%液量的逆转录反应液，也能显示出很好的线性。最适用于低表
达量 mRNA 的高灵敏度检测。

1

http://www.bio-toyobo.cn

东洋纺(上海)生物科技有限公司【2】 产品介绍本产品包含以下试剂，10μl 反应体系可用 200 次。同时还添附有 10μl 反应
体系可用 20 次的 5x RT Master Mix II no-RT Control。所有组分请均保存在-20°C
（注１）
条件下。
保存条件（注１）

容量gDNA Remover

-20°C

10μl

4x DN Master Mix

-20°C

440μl

5x RT Master Mix II （注２，３）

-20°C

400μl

5x RT Master Mix II no-RT Control

-20°C

40μl

Nuclease-free Water-20°C

1000μl x2

试剂名gDNA Remover该组分是最适合于本试剂盒的 DNase I。按 1/50 的比例添加到 4x DN MasterMix 中，由于液量很少，使用前请 spin down 混匀。
4x DN Master Mix
该组分是含 RNase inhibitor 及反应 buffer 的 4x 浓度的预混液。最开始使用
时，可在整管 4x DN Master Mix （440μl）中添加 8.8μl（1/50 量）的 gDNARemover，颠倒混匀后再使用。添加 gDNA Remover 的 4x DN Master Mix 在-20°C 条件下可至少保持 3 个月的稳定。短时间内无法使用完毕时，请少量混合后使用（如：4x DN Master Mix 220μl + gDNA Remover 4.4μl)。
5x RT Master Mix II该组分是高效率逆转录酶 ReverTra Ace、Random Primer、Oligo dT Primer、反应 buffer、dNTPs 等的 5x 浓度的预混液。
5x RT Master Mix II no-RT Control
该组分是从 5x RT Master Mix II 中去除了 ReverTra Ace 后的 Master mix，可用于配制逆转录（－）的对照溶液。
Nuclease-free Water
该组分是 Nuclease-free 级别的灭菌蒸馏水。为防止影响聚合酶的活性，未进行 DEPC 处理。
注 1）长期不用时，请在-30℃条件下保存。
注 2）逆转录反应时，需要来自 4x DN Master Mix 的成分，因此 5x RT Master Mix II垂询电话：021-58794900

2

不能单独使用。请务必使用 4x DN Master Mix 进行去除 gDNA 的反应。
注 3）本试剂盒中添附的 5x RT Master Mix II 与本公司不带基因组 DNA 去除功能的试剂盒 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Code No.FSQ-201)中所含的 5x RT MasterMix 组成不同，不能混用。请务必使用本试剂盒中添附的 5x RT Master Mix II。
注 4）无论哪个组分，打开盖子前，都请先 spin down，使液体都落到离心管底部后再使用。另外，除 Nuclease-free Water 以外的试剂，都有粘性，请小心使用移液器。
注 5）本产品是含有逆转录引物（Random Primer 及 Oligo dT Primer）的预混试剂，
不能使用基因特异性引物(Gene Specific Primer)。

【3】 其他必需品
除本产品之外，请再准备以下几种试剂和仪器。
・Thermal cycler和Incubator
本产品的建议使用温度为37°C、50°C、65°C以及98°C，请准备好符合条件
的相关仪器。
・Nuclease-free Water
本产品已添附可使用200次的Nuclease-free Water，此外请再准备一些
Nuclease-free Water，以便在稀释模板RNA时使用。推荐使用未经过DEPC处理
的Nuclease-free Water。也可以使用经DEPC处理过的水，但残留的DEPC会抑制反应的进行，因此请使用高压灭菌器彻底清除DEPC之后再使用。此外，为防
止核酸的混入，用于逆转录反应和PCR反应的Nuclease-free Water，建议和用于其它实验的Nuclease-free Water分开保存，避免共用。
・Total RNA
使用本产品，可以把Total RNA直接作为模板使用。从组织、培养细胞等得
到Total RNA中，作为表达分析对象的mRNA的含量通常为1-2%。除了进行检测表达量极低的目的基因之外，通常情况下都可以明显地检测到作为模板的TotalRNA。

3

http://www.bio-toyobo.cn东洋纺(上海)生物科技有限公司【4】 使用方法(1) 4x DN Master Mix与gDNA Remover的混合（仅在初次使用时）在整管4x DN Master Mix （440μl）中添加8.8μl（1/50量）的gDNA Remover，颠倒混匀。添加gDNA Remover后的4x DN Master Mix在-20°C条件下至少可保持3个月的稳定。
・短时间内无法使用完毕时，请少量混合后使用。
（如：4x DN Master Mix 220μl + gDNA Remover 4.4μl）(2) RNA的变性（option）*
把RNA在65°C条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。
*在经过以上步骤的处理后，对于容易形成高级结构的RNA可以提高逆转录的效率，初次实验时，建议探讨条件。（进行以上步骤处理时，请不要添加4x DN Master Mix。）(3) 去除基因组DNA反应（DNase反应）请在冰上配制如下反应液。
4x DN Master Mix (已添加gDNA Remover)
RNA template
Nuclease-free Water
Total

2 μl
0.5pg～0.5μg
8 μl

将反应液轻轻地搅拌均匀后，在37°C条件下温育5分钟。
・可根据需要，扩大反应体系。

(4) 逆转录反应接着，在冰上配制如下反应液。
8 μl
2 μl
10 μl

步骤(3)的反应液
5x RT Master Mix IITotal・进行逆转录（－）对照时，可用5x RT Master Mix II no-RT Control代替5x RT MasterMix II。通过逆转录（－）的对照，可确认信号是否来自cDNA。

垂询电话：021-58794900

4将反应液轻轻地搅拌均匀后，按以下温度进行反应。
37°C,50°C,98°C,4°C,15min.
5min. （option）**
5min. ・・・・・・・・・・・・
hold（逆转录反应）（酶失活反应）** ReverTra Ace经改良后提高了高温反应性，应用在本试剂盒中，提高了逆转录效率。

反应结束后，请在4°C或-20°C条件下保存。Realtime PCR时，作为模板直接或稀释后添加。
・添加到PCR反应液中的逆转录反应液，最多请不要超过20%。过量的添加会导致PCR
反应效率低下，无法准确地定量。

5

http://www.bio-toyobo.cn

东洋纺(上海)生物科技有限公司【5】 Appendix
实验例1：gDNA去除效果的确认＜方法＞
cDNA合成试剂：本试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No.FSQ-301)
模板：自制的HeLa total RNA 0.5μg /10μl反应体系
条件：用gDNA Remover添加（+）、或不添加（-）的4x DN Master Mix去除gDNA后，再分别用5x RT Master Mix II或5x RT Master Mix II no-RT Control进行逆转录反应。

4x DN Master Mix

5x RT Master Mix①- gDNA Remover- RTase②- gDNA Remover+ RTase③+ gDNA Remover- RTase④+ gDNA Remover+ RTase

Realtime PCR
试剂：THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix (Code No.QPS-201)
模板：上述cDNA2μl/20μl反应体系(带入量10%)
Target：ACTB(188bp)测定用仪器：Applied Biosystems 7900HT

＜结果＞

②④①③

条件③的情况下，没有确认到扩增，说明基因组DNA已被去除。

垂询电话：021-58794900

6实验例2：cDNA合成量（标准曲线）的比较
＜方法＞
cDNA合成试剂：本试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No.FSQ-301)
及不含去除基因组DNA功能的同类品ReverTra Ace qPCR RT kit(Code No.FSQ-101)
模板：HeLa total RNA 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng, 100ng, 1μg /20μl反应体系（只在FSQ-301的反应体系中添加了100ng人基因组DNA）
Realtime PCR
试剂：THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix (Code No.QPS-201)
模板：上述cDNA2μl/20μl反应体系(带入量10%)
Target：GAPDH(65bp)测定用仪器：Applied Biosystems 7900HT＜结果＞

结果可见，使用本产品（FSQ-301），未受基因组DNA混入的影响，和不含去除基因组DNA功能的FSQ-101一样，可获得很高的直线性。由此可见，使用FSQ-301
可在很广的RNA浓度范围内，进行同等效率的逆转录。

7

http://www.bio-toyobo.cn

东洋纺(上海)生物科技有限公司【6】 常见问题
现象

原因Realtime
RNA的纯度较低PCR时检测无信号，或者信 RNA被降解号出现延迟RNA的量过多或过少

RNA容易形成高级结构反应温度不当

对策
可能是由于配制RNA时残留的杂质抑制了逆转录反应。
请重新提纯模板RNA。
RNA可能是被混入的RNase降解。请重新配制RNA。此外，低浓度的RNA保存时，除更容易被RNase降解外，
由于被反应容器吸附，实际的RNA的量会有所减少。建议避免把使用过的低浓度RNA冻结保存后再使用，最好每次使用时直接从高浓度的保存液稀释。
经确认，使用本产品时，添加0.5pg～0.5μg范围的RNA
量（10μｌ反应体系）都能够进行稳定有效的逆转录反应。
但是由于RNA的种类和品质等的不同，可以进行反应的
RNA的量可能会有所改变。请适当增减模板RNA的添加量。
RNA容易形成高级结构的情况下，会抑制逆转录反应。
建议在逆转录反应前，将RNA在65℃条件下热变性5分
钟，然后急速在冰上冷却后再使用。然后（或者）在37℃・15分钟逆转录反应后，再追加50℃・5分钟的反应。
改变反应条件会对引物的退火效率、酶的活性、逆转录后的酶失活、模板RNA的清除效率等多方面产生影响。
在进行实验时，请务必要按照本使用说明书上记载的条件来设定反应温度。
逆转录反应液添加量过多会抑制PCR反应，因此添加到
PCR反应液中的逆转录反应液最好能控制在10%以下。
经确认，使用本产品可最多去除约50ng的基因组DNA（10μl反应体系）。但模板ＲＮＡ中混入过量DNA时，也有可能不能完全去除干净。请另外再进行DNase I处理，再次纯化模板RNA。

逆转录反应液的添加量过多
用no-RT
RNA中混入了过Control的反应 量的基因组DNA液进行
RealtimePCR时可确认产生了引物二聚 融解曲线分析时，no-template control在目的片段的低温
到扩增
体侧出现峰值，疑似有引物二聚体产生。除引物序列外，引物二聚体因引物质量不好而产生。此时应先再次摸索PCR反应条件，如果仍无法改善，则可进行引物再设计
或再合成。再次合成时，纯化级别应在HPLC以上。

垂询电话：021-58794900

8

【7】 相关产品
Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂
品名Realtime PCR用cDNA合成试剂盒
ReverTra Ace qPCR RT Kit
Realtime PCR用cDNA合成Master Mix
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix

容量Code No.

200次份

FSQ-101

200次份

FSQ-201

Realtime PCR 试剂
品名
容量
Code No.
Realtime PCR用Master Mix(Probe Assay用)
1ml x 5
QPK-101
Realtime PCR Master Mix
Realtime PCR用Master Mix(SYBR® Green Assay用)
1ml x 5
QPK-201SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
Realtime PCR用Master Mix(SYBR® Green Assay用)
1ml x 5
QPK-212®
SYBR Green Realtime PCR Master Mix -plus各种荧光Probe・荧光Primer检测体系用
1ml x 1
QPS-101T
Realtime PCR试剂
1.67ml x 3
QPS-101
THUNDERBIRD Probe qPCR Mix
SYBR® Green I检测体系用Realtime PCR試薬
1ml x 1
QPS-201T
1.67ml x 3
QPS-201
THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix※THUNDERBIRD qPCR Mix 中，50X ROX reference dye 另外单独添附。

One-step PCR 试剂
品名容量One-step Realtime PCR用Master Mix
0.5ml x 5
(Probe Assay用)
RNA-direct Realtime PCR Master Mix
One-step Realtime PCR用Master Mix(SYBR Green Assay用)
0.5ml x 5
RNA-direct SYBR® GreenRealtime PCR Master Mix※RNA-direct 系列中，50mM Mn(OAc)2 另外单独添附。

Code No.
QRT-101

QRT-201◆详情请浏览本公司中文网页
http://www.bio-toyobo.cn

9

http://www.bio-toyobo.cn

[销售商]

东洋纺（上海）生物科技有限公司
地址：上海市浦东新区张杨路 500 号华润时代广场 28 楼 AL
邮编：200122
订购 • 技术相关咨询
Tel:021-5879-4900

Fax:021-5879-4901

E-Mail:tech@bio-toyobo.cn
http://www.bio-toyobo.cn[生产商]东洋纺株式会社敦贺生物工厂地址：日本国福井县敦贺市东洋町 10 番 24 号

代理商资料：