08-07

Nucleic Acid Purification Kit

MagExtractor-Viral RNA（Code No.：NPK – 400）

使用说明书

研究用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目 录
1．前言............................................................................................................................ 1
2．使用前须知................................................................................................................ 1
3．试剂盒中所包含的物品............................................................................................ 2
4．开始抽提之前............................................................................................................ 2［1］试剂盒以外所需要的其他物品 ........................................................................ 2［2］试剂的准备 ........................................................................................................ 3［3］样品的准备 ........................................................................................................ 3［4］抽提流程 ............................................................................................................ 45．操作程序.................................................................................................................... 5［1］使用MFX-2000 抽提Viral RNA........................................................................ 5（1）操作程序的选择............................................................................................. 5（2）加温block，冷却（回收）block的温度设定............................................... 6（3）附带专用过滤器的tip的安装 ........................................................................ 6（4）安装专用试管................................................................................................. 6（5）安装试剂......................................................................................................... 6（6）安装样品......................................................................................................... 8（7）抽提开始......................................................................................................... 9（8）样品回收......................................................................................................... 9［2］使用手动法抽提Viral RNA............................................................................... 96．疑难解答.................................................................................................................. 12［1］磁珠不能很好的注入 ...................................................................................... 12［2］磁珠凝集，不易分开 ...................................................................................... 12［3］回收的RNA溶液有颜色.................................................................................. 13［4］RT-PCR不能很好地进行................................................................................. 13【 注意 】
本试剂盒中所包含的都是研究用试剂。请不要用于诊断，临床等场合。在使用
本试剂盒的时候，请严格遵守实验室的基本注意事项，并注意安全。

1．前言
MagExtractor－Viral RNA利用在Chaotrpic（盐）存在的情况下，核酸能吸附在硅胶表面的特性来抽提Viral RNA。本试剂盒通过使用MFX-2000，能够简便地
从血清以及血浆*1中自动抽提出Viral RNA。另外，本试剂盒也可用于手动抽提法。
在使用MFX-2000 进行抽提时，请阅读MFX-2000 的使用说明书。

性能以及特征·通过使用 MFX-2000，能够简便地从血清以及血浆中自动抽提出 Viral RNA。
·不使用苯酚，氯仿等危险溶液。
·由于无需进行乙醇沉淀或者离心分离，使得在短时间内（大约十五分钟）抽提成为可能。
·抽提出的 RNA 被回收至经过 DEPC 处理过的蒸馏水中，因此能够直接用于RT-PCR 等的实验。

2．使用前须知
MagExtractor - Viral RNA 对应以下样品：样品样品量

血清、血浆等～300μl·样品的状态，例如被反复冻结溶解等，可能会降低抽提效率。
·本试剂盒无法分离 RNA 和 DNA。而且，如果在样品中含有 DNA，则可能在所收集的 RNA 中会混有部分 DNA。

*1

在MFX-2000 中，需要安装用于MagExtractor- Viral RNA- （Option/Code No.：MFX-601）的软件。并且，由于需要加温功能，故请使用标准式样（加温，简易保冷功能/ Code No.：MFX-102）或者特别式样（加温，电子冷却功能/ Code No.：MFX-103）等机种。

1

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3．试剂盒中所包含的物品
本试剂盒内含有能对 100 份样品进行 RNA 抽提的试剂。请在以下所示的温度下保存。
39ml ......... 溶解·吸附液（含有蛋白质变性剂）............. 4℃
77ml ......... 洗净液Ⅰ（含有蛋白质变性剂）..................... 4℃
100ml ......... 洗净液Ⅱ（低浓度缓冲液）............................. 4℃
5ml ......... 溶出液（RNase free 蒸馏水）.......................... 4℃
4ml ......... 磁珠..................................................................... 4℃·在使用之前，使先使试剂回复到室温。特别是在 4℃时溶解·吸附液中可能会
析出盐分。此时应先使其回复到室温后，再进行搅拌以使盐分充分溶解。
·溶解·吸附液和洗净液Ⅰ中含有高浓度的蛋白质变性剂，使用时请格外小心，并请戴上手套做好防护措施。万一试剂沾在手或者皮肤上，请用清水充分清洗。
如若碰到眼睛，请立刻用清水清洗，然后去看医生。
·请将溶解·吸附液和 2 巯基乙醇溶液（2ME）以 100：1（v / v）的比例混合后使用。混合液请在 4℃下保存，并在 3 个月之内使用。

4．开始抽提之前［1］试剂盒以外所需要的其他物品
使用 MFX-2000 的场合：·专用试管（Code No：MFX-301）·附带专用过滤器的 tip（Code No：MFX-401）·安装试剂用试管（50ml用，15ml用，2ml用）*1
使用手动法的场合：·磁性台架（市场有售）·试管搅拌器·heat block（也可以是水浴槽）（65℃）·简易台式离心机（能进行大约 3,000~5,000r.p,m 程度的离心）
垂询电话：021-58794900

2［2］试剂的准备·溶解·吸附液先和 2ME 以 100：1（v / v）的比例混合后再使用。当仅制备必要量时，每次混合 700μl 的溶解·吸附液和 7μl 的 2ME。另外，全量制备时，在存放溶解·吸附液的容器里（77ml）加入 770μl 的 2ME 进行制备。请将此混合液（溶解·吸附液（含有 2ME））在 4℃下保存（可以存放 3 个月）。
·在使用之前，必须将所有试剂回复到室温。

［3］样品的准备·如果使用本试剂并通过 MFX-2000 来进行抽提，仪器提供将血清/血浆直接安装在仪器中的操作程序和安装事先用溶解·吸附液（含有 2ME）溶解的血清/血浆的操作程序。
（有关详细内容，请参照“5-［1］-（1）选择操作程序”。）·如果事先溶解了样品，则在溶解·吸附液（含有 2ME）中添加不超过 300μl 的血清/血浆，使得液体总量达到 800μl。然后进行彻底的搅拌并进行瞬时高速离心操作。此时，如果血清/血浆的使用量超过 300μl，则可能会
导致抽提效率的下降或者导致操作故障。

*1安装试剂用试管推荐以下产品。50ml试管：BLUE MAX 2170（BECTON DICKINSON公司生产），15ml试管：BLUE MAX Jr（BECTON DICKINSON公司生产），2ml微型试管：2220 ，2200（INOUPTIC公司生产），72.693，72.694（Assist公司生产）。

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http://www.bio-toyobo.cn东洋纺（上海）生物科技有限公司［4］抽提流程
以下列出了使用 MagExtractor－Viral RNA－的抽提流程：样品（血清/血浆 ~300μl）←溶解·吸附液（含有 2ME）......... ［样品的溶解］←磁珠：约 10 分钟 ...... ………［Viral RNA 的吸附］
B/F 分离
←洗净液Ⅰ：约 30 秒（两次）［除去非特异的吸附物］
B/F 分离
←洗净液Ⅱ：约 20 秒（两次）［除去蛋白质变性剂］
B/F 分离
←溶出液：约 2 分钟（65℃）［从 Viral RNA 的磁珠中溶离］
B/F 分离
回收上清液（约 50μl）

垂询电话：021-58794900

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5．操作程序
本试剂盒除了能够使用 MFX-2000 进行自动抽提以外，也可用于进行手动抽提。如果使用手动手提，则请参照第 11 页的“5-［2］使用手动法抽提 Viral RNA”。

［1］使用 MFX-2000 抽提 Viral RNA
在使用 MFX-2000 之前，请务必先阅读 MFX-2000 的使用说明书。如果在
MFX-2000 中使用本试剂盒，则必须在 MFX-2000 中安装用于 MagExtractor- Viral
RNA- （Option/Code No.：MFX-601）的软件。并且，对于所需要的加温功能，可以使用标准式样（加温，简易保冷功能/ Code No.：MFX-102）或者特别式样（加温，电子冷却功能/ Code No.：MFX-103）等机种。
（1）操作程序的选择
在 MFX-2000 中准备了以下 4 种用于抽提 Viral RNA 的操作程序。这些操作
程序是根据在 MFX-2000 中是否有溶解·吸附液的自动分装（有或无 2 种选择）以及处理的血清/血浆量（100μl 或 300μl）来设定的。如果选择了没有溶解·吸附液的自动分装的操作程序（41，42），则将事先用溶解吸附液溶解的血清/血浆装入仪器。请根据需要选择其中一个操作程序。
操作程序编
号显示屏上所显示的内样品容V-RNA：未分装试剂41
已溶解的剂血清/血浆（800μl）*
100
V-RNA：未分装试剂
42
已溶解的剂血清/血浆（800μl）*
300
V-RNA：已分装试剂43
血清/血浆（100μl）
100
V-RNA：已分装试剂44
血清/血浆（300μl）
300*事先在血清/血浆中添加溶解吸附液，总量不要超过 800μl。此时，如果血清/血浆容量少于 100μl，则选择 41 号操作程序。如果血清/血浆容量在 100μl
到 300μl 之间，则选择 42 号操作程序。
·一次操作只能够选择一个操作程序。
·除去试剂分装的时间，每个样品进行抽提所需的时间大约为十五分钟。

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http://www.bio-toyobo.cn东洋纺（上海）生物科技有限公司（2）加温 block，冷却（回收）block 的温度设定
将加温 block 以及冷却 block 设定为以下温度：
加温 block

冷却 block

65℃

10℃

温度设定

·使用简易保冷 block 的场合，请事先将保冷 block 置于冷藏库或者低温室冷却。简易保冷 block 用于回收液的短时间保冷。
·温度设定时，请仔细阅读 MFX-2000 的使用说明书。
（3）附带专用过滤器的 tip 的安装把附带专用过滤器的 tip（Code No：MFX-401）置于 tip 架内。使用的数量请参照下表。
样品数（N）

所需 tip 数

1~12N＋3

13~24

N＋5·请务必使用附带专用过滤器的 tip（Code No：MFX-401）。
·安装超过规定的 tip 数量不会对结果有所影响。
·tip 已用γ射线灭菌。使用时请带好手套。
·在 tip 架的左下方，纵向列出了 tip 的必要使用量。详细安装位置请阅读
MFX-2000 的使用说明书。
（4）安装专用试管
专用试管（Code No：MFX-301）依据样品数量安装于抽提架 A～E，加温block 及冷却 block。
·对于抽提架 A～E 及加温 block，请不要使用专用试管以外的其他试管。否则容易发生故障。
·对于冷却 block，也可以使用带螺旋帽的 1.5ml 试管（适合用于保存回收液）。
·详细安装方法，请参考 MFX-2000 的使用说明书。
（5）安装试剂试剂分别注入指定大小的试管中，安装于试剂架的指定位置。根据样品数的不同，需要的试剂量也会有所不同。请参照第 8 页的表来安装试剂。

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6试剂名称安装位置

试管

溶解·吸附液（含有 2ME）*1

1

洗净液 I

2洗净液 II

3磁珠

72ml 微型试管

溶出液1015ml 试管50ml 试管*1只需要操作程序 43 以及 44。

·注入试剂时，如果剂量较少，可以使用微量移液器，如果剂量较多，则以
试管的刻度为标准。
·请将磁珠事先搅拌充分后放入试剂架。
·抽提后剩下的试剂可以再次使用，不过需要注意的是，如果长时间放置，可能会由于干燥等原因使得液体的组成发生变化。特别是磁珠长时间放置后，混合液中可能会析出盐分。这种情况下请使用新的试管。
·使用的试剂剂量请不要多于规定量，否则会引起喷嘴污染以及液体溅出。
·除了试剂盒的溶出液（DEPC 处理后的蒸馏水），低盐分的中性溶液也可以作为溶出液使用。只是，对于该情况下的抽提效率等，请请事先进行实验，
以便确认。

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各试剂的分装量试剂名试管规格
安装位置

溶解·吸附液50ml
1洗净液 I50ml
2洗净液 II50ml
3磁珠
2.0ml
7

溶出液
15ml
10

各试管中分装的试剂量（ml）
15520.5.5
35
10
4
105
6
15
1
70.8
8
15
20
91010样 11
2025
12
1.5品
1.1
13数
1430
1525
16
15
1735
1.4
1830
19
40
20
2
21
22
20
35
1.7
45
23
24
以上是根据样品数而定的各试剂分装量标准。由于以上所标的试剂量已经非常充分，所以请根据这些数值将试剂分注到试剂管中并安装。
（6）安装样品
将血清/血浆（使用 43 号操作程序时为 100μl，使用 44 号操作程序时为 300μl）或者事先添加了溶解·吸附液（含有 2ME）而进行溶解过的血清/血浆（使用 41，42 号操作程序时，总容量均为 800μl）安装在抽提架的指定位置处。在抽提架的各个孔边有 1～24 的编号，指明了样品的安装位置。
·对于样品的制备，推荐使用带螺旋帽的 1.5ml 样品试管。请在打开试管盖的状态下放入指定位置。
·使用普通的 1.5ml 试管时，请用剪刀按图剪断后安放。剪断时请注意安全。
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（7）抽提开始根据以下要领，启动机器。
·确认样品，试管（试剂量），专用试管（抽提架，加温 block，冷却 block），
专用 tip 等是否按说明书进行安装。另外，也需确认试管是否已呈垂直状态。
·确认各试剂架的安装位置，确认 stage 是否完全收回到内部，并请关闭机器前门。
·在液晶画面输入操作程序号和样品数。
·确认了屏幕上显示的抽提所需的 tip 数后，输入满足要求的 tip 盒的第一个
tip 的位置。
·出现“请按下开始键”的画面后，在确认无误后按下“START”键。
·抽提开始后会在液晶画面上显示“操作中”。
（8）样品回收抽提操作结束后，打开机器前门取出样品。
·抽提结束后，抽提的 Viral DNA 被回收 block 上的试管回收。另外，液晶画面会再次显示“请按下开始键”字样的画面。
·确认仪器已完全停止后，从回收 block 上取出试管。请将其保存在冰上直至再次使用为止（如果要长期保存，请在－20℃下保存）。
·回收液量大约为 55μl。
·回收液中可能会混有少量的磁珠。这种情况下，在进行 RT-PCR 等解析之前，再次进行轻度离心，然后使用上清液。
·回收液中可能会残留低浓度的表面活性剂，或者产生气泡，但对于 RT-PCR
等的解析，仍可以直接使用。

［2］使用手动法抽提 Viral RNA
本试剂盒也能用于手动法抽提 Viral RNA。
·对于磁珠的分离，建议使用市场有售的 1.5ml 微型试管用磁性台架。但也可通过台式离心机以 3,000r.p.m 5 秒左右离心以达到分离效果。
·事先将 heat block 的温度设为 65℃。

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http://www.bio-toyobo.cn东洋纺（上海）生物科技有限公司［操作流程］
血清/血浆 ~300μl（1）←700μl 溶解·吸附液（2）搅拌 10sec（漩涡混合器搅拌强度：最大）←50μl 磁珠溶液（颠倒搅拌，使其均匀混合后再添加）（3）搅拌 10min（漩涡混合器搅拌强度：最大）
B/F 分离（4）←700μl 洗净液 I（5）搅拌 10sec（漩涡混合器搅拌强度：最大）
B/F 分离（6）←700μl 洗净液 I（7）搅拌 10sec（漩涡混合器搅拌强度：最大）
B/F 分离
←900μl 洗净液 II（8）搅拌 10sec（漩涡混合器搅拌强度：最大）
B/F 分离（9）←900μl 洗净液 II（10）搅拌 10sec（漩涡混合器搅拌强度：最大）
B/F 分离
瞬时高速离心后，再次去除上清部分。（11）←55μl 溶出液（12）搅拌 5sec（使粒子混合）
在 65℃下放置 2min（13）搅拌 5sec
瞬时高速离心（14）上清（约 50μl）（1） 在 1.5ml 微型试管中注入血清或者血浆（~300μl）。
（2） 添加 700μl 溶解·吸附液，充分搅拌后进行瞬时高速离心。
垂询电话：021-58794900

10（3） 添加 50μl 的磁珠后，使用试管混合器剧烈搅拌十分钟。
·请事先将磁珠混合后再使用。
·将搅拌强度设为最大，在室温下用试管混合器进行搅拌。此时，请确认磁珠是否已
充分混合，没有沉淀。

（4） 将试管置于磁性台架上，使磁珠靠近磁石，多次颠倒混合，使得盖子上的磁珠完全贴近磁石。然后，轻轻震动磁性台架，使得粘在盖子上的溶液摔
落下来。用微量移液器吸弃上清部分。
·置试管于磁性台架上，用微量移液器去除上清液。
·如果没有磁性台架，可使用简易台式离心机以 3,000r.p.m 左右的强度离心 5 秒钟。由于离心后粒子可能会变得不易分离，请在搅拌时确认粒子是否已充分混合。

（5）在试管中添加 700μl 洗净液Ⅰ后，使用漩涡混合器剧烈混合 10 秒钟。
·请混合至磁珠均匀分散为止。

（6） 执行步骤（4）。
（7） 重复步骤（5）（6）。
（8）在试管中添加 900μl 洗净液Ⅱ后，使用漩涡混合器剧烈混合 10 秒钟。
·请混合至磁珠均匀分散为止。

（9） 执行步骤（4）。
（10）重复步骤（8）（9）。
（11）将试管从磁性台架上取下，轻度离心（瞬时高速离心）后再次小心的去除上清液。
（12）添加 55μl 溶出液，搅拌五秒钟使磁珠完全混合。
（13）在 65℃下加热两分钟，再次搅动五秒钟，使得 Viral RNA 从磁珠中溶出。
（14）通过磁性台架或者瞬时高速离心后使得磁珠凝集，然后回收含有 Viral RNA的上清液。请将其在冰上保存直至再次使用为止。（如要要长期保存，请
在－20℃以下保存。）

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6．疑难解答发生错误时请参照以下对策。

［1］磁珠不能很好的注入
原因

对策由于磁珠的沉淀而引 请使用漩涡混合器搅拌直至均一混合。并且，请在起凝固化混合后迅速（10 分钟以内）开始抽提。

由于蒸发而引起的磁 为了避免今后再次发生这种问题，请不要再使用
珠混合液的成分浓缩， 2ml 试管中残留的磁珠。同样地，如果要保存试剂结晶化。

或者短时间内放置，则请盖紧瓶子或者试管的盖子。

·其他关于机器操作的疑难解答，在 MFX-2000 的使用说明书中有记载，可以加以参考［2］磁珠凝集，不易分开
原因样品过剩对策如果样品过剩，则可能会使得粒子凝集，从而无法
正确的进行抽提。另外，再经过反复的冻结溶解后，即使只有 100μl，有的样品也有可能会发生凝集。
请再次考虑减少样品量的条件。

使用的试剂量不足

在使用 MFX-2000 进行自动抽提时，如果试剂的使用量过少，抽提将可能无法正常进行。请确认抽提
试管内是否还存在试剂。

垂询电话：021-58794900

12［3］回收的 RNA 溶液有颜色
原因
混入了磁珠

对策
磁珠若是混入回收液中，会使得回收液呈现茶色。
请对回收液进行轻度的离心，使用上清液。

［4］RT-PCR 不能很好地进行
原因
混入了磁珠

对策
磁珠若是混入到 RT-PCR 反应液中则会阻碍反应的进行。请对回收液进行轻度的离心，使用上清液。

RNA 的分解

使用过多的样品而抽提得到的 RNA 溶液中会残留有 RNase。请再次考虑减少样品量的条件。

混入了 PCR 增幅产物

如果在水及正常血清等作为样品的 Nagative Control
中能够看到条带，则可认为是以前增幅的 PCR 产物的污染。请区分进行抽提的区域，制备 PCR 反应液
的区域以及进行检测（电泳等）的区域，并考虑在抽提以及制备反应液的区域中不带入 PCR 增幅产物的方法。

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