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リン酸化プロテオミクスの検出感度に関する基礎研究

Author(s)大坂, 一生Citation

科学研究費助成事業研究成果報告書: 1‑5

Issue Date

2015‑06‑02

TypeResearch Paper

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publisher

URL

http://hdl.handle.net/10119/12833

RightsDescription

研究種目：基盤研究(C), 研究期間：2012〜2014, 課題
番号：24619006, 研究者番号：90550244, 研究分野
：質量分析学Japan Advanced Institute of Science and Technology

２版

様式

Ｃ−１９、Ｆ−１９、Ｚ−１９ （共通）

科学研究費助成事業

研究成果報告書
平成 ２７ 年

６ 月

２ 日現在

機関番号： １３３０２
研究種目： 基盤研究(C)
研究期間： 2012 〜 2014
課題番号： ２４６１９００６
研究課題名（和文）リン酸化プロテオミクスの検出感度に関する基礎研究研究課題名（英文）Study on ion yield of phosphorylated peptides in ESI for proteomic analysis

研究代表者
大坂

一生（Osaka, Issey）

北陸先端科学技術大学院大学・ナノマテリアルテクノロジーセンター・講師
研究者番号：９０５５０２４４
交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）

4,100,000 円

研究成果の概要（和文）：翻訳後修飾タンパク質の検出や構造解析は，医学・薬学の分野において重要である．タンパ
ク質の同定は，そのタンパク質の消化物の質量分析によって行われる．しかし，消化生成物のペプチドはイオン化効率が一律でないため，検出感度が低いペプチドがある．これまでペプチドの検出感度の低下に関する詳細な議論は行われていない．本研究ではペプチドの物性とイオン収量の関係を系統的かつ定量的に評価した．多くの疎水性アミノ酸残基を含むペプチドは正負イオンともにより高い収量を示した．ESIにおいて試料分子のイオンの気化流束はイオン化効率よりもイオン収量に与える影響が大きいことが定量的に示された．

研究成果の概要（英文）：Methods for the proteomic analysis have been established using ESI‑MS interfacedwith liquid chromatography. If all the peptide ion peaks from a protein digest can be detected in a massspectrum, accurate identification of the protein can be achieved. However, it is difficult to detect the
all tryptic digests because of the different ion yields for each peptide fragment. The ion yields ofpeptides are strongly dependent upon their physicochemical properties. I have studied the effects of thehydrophobic amino acid Phe residue and the influence of its position in peptides on the positive‑ andnegative‑ion yields in ESI. Hydrophobic peptides containing Phe residue(s) were potentially advantageous
to the vaporization process from the charged droplet to the gas‑phase in ESI, resulting in increased
total ion yields in both positive‑ and negative‑ion ESI. The enhancement effect of hydrophobicity on theion yields was higher than that of basicity and acidity of the peptides in ESI.

研究分野： 質量分析学
キーワード： ESI

プロテオミクス

イオン収量

ペプチド

様 式 Ｃ−１９、Ｆ−１９、Ｚ−１９（共通）１．研究開始当初の背景
翻訳後修飾タンパク質の検出や構造解析
は，医学・薬学の分野において大変重要である．翻訳後修飾タンパク質の中でもリン酸化タンパク質は，アルツハイマーや癌などのマーカーとなるものが多いことが知られている．タンパク質は X 線回折によって構造を解されるが，リン酸化タンパク質の情報は極めて少ない．NMR 法は溶液中のタンパク質の立体構造を決定できるが多くの試料量を必要とする分析手法である．微量のタンパク質の同定は，二次元電気泳動や高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分離・精製後に酵素消化を行い，消化生成物の質量分析の結果とデータベースの照合によって行われる．この手法はペプチドマスフィンガープリント(PMF)法と言われている．しかし，消化生成物のペており応用例も多い LC-MS で用いられるイオン化法の ESI においては，ペプチドのイオン化の系統的な評価の研究が進んでいない．
LC-MS においてタンパク質の配列カバー率の低下を引き起こすペプチドの物性や，リン酸基導入によるイオン収量への影響を解明することは，プロテオーム解析とその定量の分野において大きな知見となる．
本研究課題ではリン酸化プロテオームのために，アミノ酸やペプチドの物性とイオン収量の関係を系統的かつ定量的に評価することを目的として，研究を遂行した．主に，アミノ酸残基やペプチドの物性とイオン収量の関係の定量的な評価や、リン酸化ペプチドのリン酸化によるイオン収量の定量的な評価、リン酸化タンパク質消化生成物のイオン収量の評価を行った．

プチドはイオン化効率が一律でないため，中には検出感度が低いために検出できないペプチドがあり，その場合はタンパク質の配列のカバー率が低下する．また，翻訳後修飾を受けたペプチド，特にリン酸化ペプチドはイオン収量が少ないために，量の少ないリン酸

３．研究の方法
質量分析におけるイオン化の反応は，以下の式を用いて検討した．

Ji = I × Jv

(J i:イオン収量，I:イオン化効率，J v:気化流束)化タンパク質の構造決定が困難である．リン
酸化タンパク質の配列カバー率上昇のためイオン化効率(I)は，プロトン親和力や酸・の解決策は，リン酸化されたペプチド断片の塩基性度などの物性と関連する．
気化流束(J v)

濃縮と，使用する消化酵素の変更のみである．

は凝縮相からの気化・脱離の傾向を示し，溶アミノ酸配列やペプチドのリン酸化による液では表面への移動のしやすさを表す表面検出感度の低下の原因に関する詳細な議論

活性や疎水性などと関連する．本研究課題では行われていない．

用いる ESI における気化流束(J v)は，電荷分離後に同電荷のイオンを高濃度に含む溶液が２．研究の目的

大気中で噴霧気化されて気体状イオンを生質量分析法の正イオン検出モードにおい成する傾向を示す．本研究課題では，様々なては，アルギニン(R)残基を含有するペプチド構造のペプチドのイオン収量と検出限界をの感度が高いことが経験的にわかっている．

求めることで，ペプチドの物性とイオン収量

その理由は，R は塩基性の高いグアニジノ基の関係性を評価した．

を含んでおり，アミノ酸の中で最もプロトン実験は LC-MS を用いてフローインジェク親和性が高いためであると説明される．しかション法で行った．試料の正負イオンのイオし，これらを系統的に評価して，イオン収量ン収量をそれぞれ求めた．と物性の関係性を検証した例は少ない．
プロテオームにおいて最もよく使用され(1) ペプチドを構成するアミノ酸の物性の影響の評価
スレオニン(T)ベースペプチド(T7)等を用いて行った．(表 1) T7 ペプチドの末端を塩基性のアルギニン(R)に変更したペプチド(RT6，T6R)や，疎水性のフェニルアラニン(F)に変更したペプチド(RT5F，FT5R)等を用いて，アミノ酸残基の物性とイオン化収量の関連性を定量的かつ系統的に評価した．
PeptideSequence

T7
TTTTTTT
RT6
RTTTTTT
T6R
TTTTTTR
RT5F
RTTTTTF
FT5R
FTTTTTRKT6
KTTTTTT
ACTH18-35 (A1)
RPVKVYPNGAEDESAEAF[pTry23]-ACTH18-35
RPVKVpYPNGAEDESAEAF(A1p1)[pTry23, pS31]-ACTH18-35
RPVKVpYPNGAEDEpSAEAF(A1p2)
36[Arg ]-ACTH18-36 (A2) RPVKVYPNGAEDESAEAFR[Arg36]-ACTH19-36 (A3) PVKVYPNGAEDESAEAFR
ACTH19-36 (A4)PVKVYPNGAEDESAEAFP
ACTH22-39 (A5)VYPNGAEDESAEAFPLEF[Arg22]-ACTH22-39 (A6) RYPNGAEDESAEAFPLEF(4) ペプチドの多価イオンの生成
ESI によるペプチドやタンパク質の多価イオン生成に対する添加物の影響を評価した．
添加剤には酢酸や酢酸アンモニウム，アンモニア水，炭酸水素アンモニウム等を用いた．
４．研究成果(1) スレオニンベースペプチドのイオン収量
ペプチドを構成するアミノ酸の物性の影
響の評価については，スレオニン(T)をベースとしたペプチドを用いて行った．塩基性のArg 残基や疎水性アミノ酸の Phe 残基のイオン収量に与える影響を評価した．Fig. 1 にス
レオニンベースペプチドの正・負イオンのイオン収量を示す．
1.4*107

Positive

Negative

Abundance

Abundance
T7

表 1. スレオニンベースや ACTH ベースのペプチド

RT6(2) ACTH ベースペプチドのイオン収量

T6R

質量分析において標準試薬として頻繁にRT5F使用されている ACTH ペプチドフラグメン

FT5R

トを用いてイオン収量を検証した． ACTH

KT6の C 末端や両末端を塩基性アミノ酸の R に変更したペプチドや，疎水性アミノ酸のプロリン(P)が末端にあるペプチド，C 末端が F であり N 末端が R で構成されるペプチドを用いた．
(表 1) これらを相対的に定量評価して，多価イオン生成や感度低下の要因を検証した．

8*104

2+1-1+

Fig. 1. スレオニンベースペプチドのイオン収量

Arg 残基を含むペプチドは正イオンのイオン収量が高かったが，負イオンのイオン収量においてはあまり変化が見られなかった．Arg残基の側鎖の官能基はプロトン親和力が高いため，正イオンモードにおいてペプチドの(3) リン酸化ペプチドのイオン収量ペプチドはリン酸化によりイオン収量が減少する．
しかしイオン化法の ESI において，リン酸基の数やその結合アミノ酸によるイオン収量への影響は知られていない．本研究
課題ではペプチドのリン酸化によるイオン収量低下を定量的に評価した．試料は ACTHの 18-35 フラグメントの配列を基準として，そのチロシン(Y)やセリン(S)の側鎖をリン酸化したリン酸化ペプチドを用いた．(表 1)

プロトン付加イオンの量が多くなったと考えられる．一方，Phe 残基を含むペプチドは正負両方のイオンモードにおいてイオン収量が向上した．正負両方のイオンモードにおいて，疎水性度が高いほどイオン収量が高くなることがわかった．この結果は，ESI の液滴中からのペプチドの気化流束(J v)が増加したことを示す．またペプチドの Arg や Phe 残基の位置によるイオン収量の違いも明らかとなった．

(2) ACTH ベースペプチドのイオン収量きいことを定量的に示すことができた．

ACTH ベースペプチドのイオン収量を Fig. 2に 示 す ． ACTH

フ ラ グ メ ン ト の

RPVKVYPNGAEDESAEAF(A1)とCorrelated total ion yield

物性がイオン収量に与える影響を評価した．

1.4E+8A6

1.6E+7A5A10.7E+80-20

A2 A3A4-15-10b) Negative
A5A60.8E+7-50A1A2 A3 A4-20-15-10-5Partition coefficient calculated for ACTH-based peptides

RPVKVYPNGAEDESAEAFR(A2)の比較におFig. 3. ACTH ベースペプチドの分配係数(PA)とイオン収量の関係

いて，A2 は塩基性アミノ酸の Arg を二つ含むにも関わらず，A1 よりもイオン収量が小a) Positive

Correlated total ion yield

ACTH フラグメントを用いて，アミノ酸の(3) リン酸化ペプチドのイオン収量さかった．Arg は高い親水性の性質を持つた

ESI によるリン酸化ペプチドのイオン収量

め，Arg を多く含むペプチドの脱離量が少なを評価するために設計されたリン酸化 ACTHくなったことが原因であると考えられる．A6の定量的な評価を行った．リン酸化ペプチドは疎水性アミノ酸残基が多く，また塩基性アのイオン収量を Fig. 4 に示す．リン酸基は負ミノ酸を含有しており，特に高いイオン収量イオンを生成しやすいが，正負イオンモードを示した．本研究によって，ESI において気の両方において，リン酸基の数が多いほどイ化流束(J v)はイオン化効率(I)よりもイオン収オン収量が減少した．リン酸基は親水性が高量に与える影響が大きいことが定量的に示いため，リン酸化ペプチドの脱離効率が低かされた．

ったと考えられる．このことは，上述の ESI

1.4*108

Positive

Negative

Abundance

Abundance

において気化流束(Jv)はイオン化効率(I)より1.6*107もイオン収量に与える影響が大きいという
結A1A29*107

A3

果に一致し

Positive

Negative

Abundance

Abundance

た．

4*106

A1A4A5

A1p1

A6

A1p2

5+3+3-4+2+2-1+1-Fig. 2. ACTH ベースペプチドのイオン収量

4+3+2+1+2+1+Fig. 4. リン酸化 ACTH のイオン収量

ペプチドの疎水性度を分配係数から計算(4) ペプチドやタンパク質の多価イオン生成

すると，疎水性の高いペプチドはイオン収量ペプチドやタンパク質の多価イオン生成が高いことが示された．(Fig. 3) ペプチドのに対する添加物の影響を評価した．試料溶液

分配係数はイオン収量を理解するために重への酢酸の添加量を増加させると，pH 変化要なファクターであることが示唆された．に伴いタンパク質は変成するために，タンパ

本研究の ESI におけるペプチドの疎水性度ク質表面の電荷状態が変化する．その結果，とイオン収量の関係を解析において， Arg や得られる多価イオン分布も変化する，酢酸のPhe の位置の違いによるイオン収量の違いが添加(pH3)では高い価数の正イオン，酢酸アン示され，ESI において気化流束(J v)はイオン化モニウムの添加(pH6.7)は低い価数の正イオ効率(I)よりもイオン収量に与える影響が大ンが生成された．タンパク質とペプチドの両方において，同様の結果が得られた．酢酸酢酸アンモニウムバッファー(pH3)を用いる

理化学研究所鈴木梅太郎記念ホール, 埼玉県
和光市, 2014 年 6 月 20 日と，酸性条件化であるにも関わらず低い価数の正イオンが得られた．この結果は，ESI で得られるタンパク質の多価イオンは，タンパ
ク質の変成だけでなく，ESI で生成された帯電液滴中におけるペプチドと添加物分子の反応も関係していることを示唆した．
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線〔雑誌論文〕（計３件）
1. Influence of hydrophobicity on positive- andnegative-ion yields of peptides in ESI-MS，I.
Osaka, M. Takayama，Rapid Communications in
Mass Spectrometry, 2014, 28, 2222-2226, DOI:
10.1002/rcm.7010 (査読有り)
2. Two-dimensional mapping using different
chromatographic separations coupled with mass
spectrometry for the analysis of ginsenosides in
Panax Ginseng root and callus，I. Osaka, H.
Hisatomi, Y. Ueno, S. Taira, Y. Sahashi, H.
Kawasaki, R. Arakawa，Anal. Sci., 2013; 29:429-434,
http://doi.org/10.2116/analsci.29.429(査読有り)
3.
5-Amino-1-naphthol,anavel
1,5-naphthalene derivative matrix suitable formatrix-assisted
laser
desorption/ionization
in-source decay of phosphorylated peptides，I.
Osaka, M. Sakai, M. Takayama，Rapid Commun.
MassSpectrom.,
2013;
27:
103-108,
DOI: 10.1002/rcm.6430 (査読有り)〔学会発表〕（計７件）
1. エレクトロスプレーイオン化法における化合物の物性とイオン収量の関係の評価，大坂一生, 日本分析化学会 高分子分析研究懇談会 第 375 回例会, ゆうぽうと, 東京都品川区, 2014 年 12 月 10 日

2. Two dimensional mapping integrating two
chromatogramsobtained with LC-MS for
proteomics analysis，I. Osaka, Y. Ueno, H.
Kawasaki, R. Arakawa, 30th International
Symposium on Chromatography (ISC2014)，
Salzburg，Austria, 2014/ 9/12-18
3. 高感度プロテオーム解析のための LC/MS
におけるペプチドのイオン収量の評価,物質構造解析, 大坂一生, 理研シンポジウム 物質構造解析 2014 MS と NMR の基礎と実践,

4. Influence of arginine, lysine, phenylalanine
residues and phosphorylation on the positive- andnegative-ion yields of peptides in ESI-MS, I.
Osaka, M. Takayama, HUPO 12th Annual worldcongress, Pacifico Yokohama, Yokohama City,Kanagawa, Japan, 2013/9/14-2013/9/18
5. ESI におけるペプチドの電荷状態分布に対する溶媒組成の影響, 大坂一生, 高山光男,
第 61 回質量分析総合討論会, つくば国際会
議場 つくばエポカル, 茨城県つくば市, 2013年 9 月 10 日-2013 年 9 月 12 日
6. Influence of basicity and hydrophobicity ofamino acid residues on the positive- andnegative-ion yields of peptides in ESI-MS, I.
Osaka, 日本質量分析学会 第三回若手春季シンポジウム 2013, Senri Life Science Center,
Toyonaka City, Osaka, Japan; 2013/6/20
7. Optimization of ESI method for the LC-MS
analysis of phosphorylated peptide, I. Osaka, M.
Takayama, 19th International Mass Spectrometry
Conference 2012; PWe-044, Kyoto International
Conference Center, Kyoto City, Kyoto, Japan,
2013/9/15-21
〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）
国内外の別：○取得状況（計０件）〔その他〕
ホームページ等
６．研究組織(1)研究代表者
大坂 一生（OSAKA ISSEY）
北陸先端科学技術大学院大学・ナノマテリ
アルテクノロジーセンター・講師
研究者番号：９０５５０２４４(2)研究分担者（）

研究者番号：(3)連携研究者（
研究者番号：）