08-06

Nucleic Acid Purification Kit®

MagExtractor－RNA－（Code No. : NPK – 200，201）

使用说明书

科研用
TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目 录[1] 前言 ........................................................................................................................... 1[2] 使用前须知 ............................................................................................................... 1[3] 试剂盒中所包含的物品 ........................................................................................... 2[4] 操作程序 ................................................................................................................... 3
1．试剂盒以外所需要的其他物品 ............................................................................ 3
2．试剂准备 ................................................................................................................ 3
3．样品的前处理方法 ................................................................................................ 4
4．抽提流程 ................................................................................................................ 55．用 MFX-2000 抽提 RNA....................................................................................... 5
6．手动法抽提 RNA................................................................................................. 12
7．DNaseⅠ处理 ....................................................................................................... 13[5] 疑难解答 ................................................................................................................. 15[6] 参考文献 ................................................................................................................. 18【 注意 】
本试剂盒中所包含的都是研究用试剂。请不要用于诊断，临床等场合。在使
用本试剂盒的时候，请严格遵守实验室的基本注意事项，并注意安全。

对于 PCR 法，Hoffmann-La Roche 公司保留专利。
MagExtractor 是东洋纺织株式会社的登录商标。
FALCON 是 BECTON DICKINSON 公司的登录商标。

[1] 前言
在含有 RNA 结合促进剂的蛋白质变性剂溶液中，RNA 能被磁珠吸附。本试
剂盒利用该特性来抽提培养细胞，组织等总 RNA，可用于 RT-PCR（逆转录 PCR）
实验。本试剂盒可作为全自动核酸抽提装置 MFX-2000 的试剂，也能用于手工抽提。使用 MFX-2000 的场合请先仔细阅读 MFX-2000 的使用说明书。
性能·特征· 能够从培养细胞等各种样品中抽提·纯化总 RNA。抽提出的 RNA 主要包含
rRNA，mRNA。
· 不含苯酚、氯仿等危险溶剂。
· 通过磁石进行固液分离，无需离心操作。
· 能够短时间内分离 RNA。使用 MFX-2000 自动抽提时，24 个样品大约只需 4小时就能够完成抽提。

[2] 使用前须知
MagExtractor® -RNA-对应以下样品。
对应
样品
培养

样品量

获取量

备注

～ 10 μ g /根据细胞的种类或培养条件等不同，RNA 的

106 cells

获取量也会有所变动。

～ 15 μ g /根据组织的种类或保存条件等不同，RNA 的

30mg

获取量也会有所变动。

～10O.D.（660nm）0.5ml～20μg / 5

需要通过 Zymolyase 等进行前处理。根据培培养液中的细胞

O.D.

养条件等不同，RNA 的获取量也会有所变

～5 x 10 cells
6

细胞

组织

酵母

～30mg

1

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动。
·从全血或血清样品中直接抽提时，收率会非常低。使用全血样品时，必须先进行离心等操
作富集白细胞。
·与使用酵母相同，通过 Lysozyme 处理后，也可以从大肠杆菌中抽提出 RNA，可能会混入
少量基因组 DNA。

[3] 试剂盒中所包含的物品
本试剂盒能抽提 50 样品进行 RNA 的试剂。请在适当的温度下保存。
50ml……………溶解·吸附液（含有蛋白质变性剂） ............ 4℃
33ml洗净液Ⅰ（含有蛋白质变性剂） ........................ 4℃或者室温
88ml洗净液Ⅱ（低浓度缓冲液） ................................ 4℃或者室温
5ml溶出液（RNase free 蒸馏水） ............................... 4℃或者室温
3ml磁珠 ............ 4℃或者室温
0.9ml2-巯基乙醇（2-ME） ........................................................... 4℃·如果试剂溅到衣服或者手上，请用清水充分清洗。如若碰到眼睛，请立刻用清
水清洗，然后去医院就诊。
·溶解·吸附液和洗净液Ⅰ中含有蛋白质变性剂，在操作的时候须特别注意。
·手工抽提时候，洗净液Ⅰ，洗净液Ⅱ必须恢复室温后方可使用。也可以直接在室温下保存。（如果要长期保存，建议在 4℃下保存。
）·请将溶解·吸附液和 2-巯基乙醇溶液（2-ME）以 100:1（v / v）的比例混合后使用。混合液请在 4℃下保存，在 3 个月之内使用。

垂询电话：021-58794900

2[4] 操作程序
1．试剂盒以外所需要的其他物品（1）试剂
从酵母中抽提 RNA 时，需要以下试剂：·Zymolyase（20,000U / g : 化学工业公司生产）·Zymolyase buffer（0.9M Sorbtol 0.1M EDTA，50mM DTT（pH7.5））（2）器具·器材
使用 MFX-2000 的场合·专用试管（Code No.: MFX-301）·带滤芯 tip（Code No.: MFX-401）·离心管（50ml 用，15ml 用，2ml 用）*1*1

离心管推荐以下产品。50ml 离心管：BLUE MAX 2170（BECTON DICKINSON 公司生产），15ml 离心管：BLUE MAX Jr（BECTON DICKINSON 公司生产），2ml 离心管：2220 ,2200（INOUPTIC 公司生产），72.693,72.694（Assist 公司生产）。

手工抽提的场合
·1.5ml 离心管用的磁性台架*1 或简易台式离心机（3,000~5,000rpm）·涡旋震荡器·水浴槽（65℃）

2．试剂准备
·先将溶解·吸附液和 2-ME 以 100:1（v / v）的比例混合后再使用。取 700
μl 溶解·吸附液和 7μl 的 2-ME 充分混匀。全量制备时，在存放溶解·吸附液的容器里（50ml）加入 500μl 的 2-ME 充分混匀。请将此混合液（溶解·吸附液（含有 2-ME））在 4℃下保存（可以存放 3 个月）。
·使用手工抽提时，请务必等洗净液Ⅰ，洗净液Ⅱ恢复到室温后再使用。

3

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3．样品的前处理方法由于样品中的 RNA 不稳定，所以请将样品在溶解·吸附液（含有 2-ME）
中溶解*2。另外，对于酵母等样品，在溶解之前必须先对细胞壁用溶菌酶进行消化处理。以下列出了几种代表性样品的前处理。
（1）培养细胞
·培养细胞通过离心等操作回收至 1.5ml 离心管内，再添加 700μl 的溶解·吸附液（含有 2-ME），用微量移液器仔细搅拌，直至完全没有粘性为止。
（此操作如果时间过短会影响 RNA 的收率。）·用漩涡混合器混合 30 秒左右后，在室温下放置 10～15 分钟。
（2）组织
·将溶解·吸附液（含有 2-ME）750～900μl 注入 1.5ml 离心管中，放置于冰上。
·切下组织，置液氮中冻结。然后，用锤子等敲碎组织，将冻结组织片（10～30mg左右）放入溶解·吸附液中（柔软的样品可以按照此法操作）。
·使用微型试管用的匀浆器，在冰上匀浆组织。
·用涡旋震荡器搅拌 30～60 秒左右，直至完全没有粘性。
·3,000~5,000rpm，离心 10 秒左右*1，将 620～750μl 左右的上清液放入另外一
个试管内*2。此时如果粘性还很高，可以通过微量移液器反复吹吸，直至至完全
没有粘性为止。（如果有粘性会影响收率。）·室温放置 10～15 分钟。

*1

高速离心时，RNA 可能沉淀而影响收率。

*2

上清液中残留少量不溶性物质不会影响抽提。

（3）酵母*1·在使用前，将 Zymolyase 20T（20,000U / g）用 Zymolyase buffer 配成 30mg / ml
溶液，冰浴放置。（试剂组成：参照第 2 页）·离心培养液，回收酵母。
·将沉淀悬浮于 50μl 的 Zymolyse 溶液中。（如果是菌落，可用接种环挑入 50
μl 的 Zymolyse 中。）
垂询电话：021-58794900

4

·用涡旋震荡器充分混匀，在 37℃下温育 5～20 分钟。
·在处理液中直接加入 700μl 的溶解·吸附液（含有 2-ME），通过微量移液器
仔细混合。
·用涡旋震荡器震荡 30 秒左右，然后在室温下放置 10～15 分钟。

4．抽提流程以下列出了使用 MagExtractor -RNA-抽提的流程样品|←溶解·吸附液（含有 2-ME）：放置 10～15 分钟[样品的溶解]
前处理溶液|←磁珠：约 1 分钟 ............................................ [RNA 吸附]| B/F 分离|←洗净液Ⅰ：约 10 秒 .................. [除去非特异的吸附物]| B/F 分离|←洗净液Ⅱ：约 5 秒（2 次） ......... [除去蛋白质变性剂]| B/F 分离|←溶出液（蒸馏水）：约 2 分钟（65℃）[从 RNA 的磁珠中洗脱]| B/F 分离回收上清液（40μl）*1

也可适用于抽提大肠杆菌 RNA，大肠杆菌通过 Lysozyme 处理后，再沉淀菌体进行抽提。
抽提大肠杆菌 RNA 时，在 RNA 溶液中可能会混入基因组 DNA，建议用 DNase I 进行处理，具体请参照第 11 页“DNaseⅠ处理”。

5．用 MFX-2000 抽提 RNA
在使用 MFX-2000 之前，请先阅读 MFX-2000 的使用说明书。在使用
MFX-2000 抽提 RNA 的时候，需要有加温功能。可以使用标准式样（加温，简
易 保 冷 功 能 / Code:MFX-102 ） 或 者 特 别 式 样 （ 加 温 ， 电 子 冷 却 功 能 /Code:MFX-103）等机种。
5

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东洋纺（上海）生物科技有限公司（1）操作程序的选择
以下显示了 MFX-2000 中提供的抽提 RNA 用的操作程序。请根据需要加以
选择。
①普通操作程序·用 40μl*1 的 RNA 溶出液对 RNA 进行溶出。
·回收液可以直接用于 DNaseⅠ处理及逆转录反应等。
·可测定回收液的吸光度。
·抽提所需时间约为每一个样品 10 分钟。
②乙醇溶液*2 沉淀操作程序·将 40μl 溶出液注入含 500μl 乙醇沉淀用试剂的试管中。
·可用于不立刻使用 RNA 或需将 RNA 长期保存的场合。
·需要通过离心来回收 RNA。
·抽提所需时间约为每一个样品 10 分钟。

操作程序

输入号码

液晶的显示内容

通常

21

RNA: Normal

乙醇溶液沉淀

22

RNA: Ethanol（2）加温 block，冷却 block 的温度设定
加温 block，冷却 block 的温度设定如下。

设定温度

加温 block

冷却 block

65℃

10℃·使用简易保冷 block 的场合下，请事先将保冷 block 置于冷藏库或者低温
室冷却。简易保冷 block 用于回收液的短时间保冷。
·温度设定时，请仔细阅读 MFX-2000 的使用说明书。

1*

溶出液量会有所增减。

2*

把自家制备的乙醇溶液沉淀用的试剂放置在试剂台架上。乙醇溶液沉淀用试剂将事先注
入回收用试管内，并能够从中析出 40μl 溶出液。

垂询电话：021-58794900

6

（3）附带专用过滤器的 tip 的使用
把附带专用过滤器的 tip（Code No.:MFX-401）置于 tip 架内。使用的数量请
参照下表。
·请务必使用附带专用过滤器的 tip（Code No.:MFX-401）。
·安装超过规定的 tip 数量不会有所影响。
·tip 已用γ射线灭菌。使用时请带好手套。
·在 tip 架的左下方，纵向列出了 tip 的必要使用量。详细安装位置请阅读
MFX-2000 的使用说明书。

7

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东洋纺（上海）生物科技有限公司·使用通常操作程序的情况：
样品数

tip 数

样品数

tip 数

1

5

13

31

2

7

14

33

3

9

15

35

4

11

16

37

5

13

17

39

6

15

18

41

7

17

19

43

8

19

20

45

9

21

21

47

10

23

22

49

11

25

23

51

12

27

24

53

·使用乙醇溶液沉淀操作程序的情况：
样品数

tip 数

样品数

tip 数

1

6

13

33

2

8

14

35

3

10

15

37

4

12

16

39

5

14

17

41

6

16

18

43

7

18

19

45

8

20

20

47

9

22

21

49

10

24

22

51

11

26

23

53

12

28

24

55

垂询电话：021-58794900

8

（4）安装专用试管
专用试管（Code No.:MFX-301）安装于抽提架 A～E，加温 block 及冷却 block等。
·对于抽提架 A～E 及加温 block，请不要使用专用试管以外的其他试管。否则
容易发生故障。
·对于抽提架 A～E，也可以使用专用的 6 连试管（Code No.:MFX-302）。
·对于冷却 block，也可以使用带螺旋帽的 1.5ml 试管（适合用于保存 RNA）。
·详细使用方法请阅读 MFX-2000 的使用说明书。
（5）试剂的使用试剂分别注入指定大小的试管中，安装于试剂架的指定位置。根据样品数的
不同需要的试剂量也会有所不同。请参照第 8 页的表来安装试剂。
·注入试剂时，如果剂量较少，可以使用微量移液器，如果剂量较多，则以试管的刻度为标准。
·请将磁珠事先搅拌充分后放入试剂架。
·使用乙醇溶液沉淀操作程序时，可以自由设定乙醇沉淀用试剂的组成。
（例 1：
蒸馏水:3M 醋酸钠（pH5.2）:乙醇＝7:1:25， 例 2： 蒸馏水:5M 醋酸铵:异丙醇
＝0.9:1:2）·抽提后剩下的试剂可以再次使用，不过需要注意的是，如果长时间放置，可能会由于干燥等原因使得液体的组成发生变化。
·使用的试剂剂量请不要多于规定量，否则会引起喷嘴污染以及液体溅出。

1*

安装位置

试剂名称

试管

1

洗净液Ⅱ

50ml 试管

2*1

乙醇溶液

7

磁珠

2ml 小型试管

9

洗净液Ⅰ

15ml 试管

10

溶出液

只在使用乙醇沉淀操作程序的情况下，使用自已制备的乙醇（异丙醇）沉淀用
试剂。

9

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东洋纺（上海）生物科技有限公司【各试剂的使用量】
试剂名称

洗净液Ⅱ

乙醇沉淀

磁珠

洗净液Ⅰ

溶出液

用试剂
试管大小

50ml

50ml

2ml

15ml

15ml

安装位置

1

2

7

9

10

各试管中注入的试剂量（ml）
1
2

5

1.5

3
4

0.5
7.5

4

6
7

1

15

8

0.8

9
10

20

样品数

12

7

25

10

1.1

14
15
16

19

30

1.4

15

2
13

40

1.7

23

垂询电话：021-58794900

11

12

21

24

1.5

10

35

20

22

8

9

17
18

5
6

11

13

0.5

3

5

5

2

14

42

10

（6）样品的前处理以及安装
根据 3～4 页的样品前处理方法来处理样品。请将待处理样品置于抽提架的样品置放孔。在抽提架的各个孔边有 1～24 的编号，指明了样品的安置位置。
·对于样品的制备推荐使用带螺旋帽的 1.5ml 样品试管。请在打开试管盖的状态下放入指定位置。
·使用普通的 1.5ml 试管时，请按图示剪断后安放。剪断时请注意安全。

←请沿此处剪断

·前处理溶液量请使用 620～750μl。培养细胞，酵母等的前处理溶液请使
用 700～750μl，组织破碎液由于沉淀物会导致的损耗，故请在使用时以 620μl以上为标准。（使用 600μl 以下的溶液量时，在搅拌过程中会起泡，使得获取量减少。）（7）抽提开始，样品回收
根据以下要领，启动机器。
·确认样品，试管（试剂量），试管种类，专用 tip 等是否按说明书进行安置。
·确认各试剂架的使用位置（将其锁定），确认 stage 是否完全收回到内部，并请关闭机器前门。
·在液晶画面输入操作程序号和样品数。
·出现“请按下开始键”的画面后，在确认无误后按下“START”键。
·在所有的抽提操作结束后会再次显示“请按下开始键”的画面。此时打开
机器的前门并取出样品。

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6．手动法抽提 RNA·准备 700μl 根据第 3～4 页的样品前处理方法制备的样品前处理溶液。
前处理结束后的样品（700μl）|←50μl 磁珠溶液（颠倒搅拌，使其均匀混合后再添加）| 搅拌 20sec*1（漩涡混合器搅拌强度：最大）| 在室温下放置 40～60sec。
| B/F 分离*2*3|←600μl 洗净液Ⅰ| 搅拌 10sec（漩涡混合器搅拌强度：最大）| B/F 分离|←800μl 洗净液Ⅱ| 搅拌 5sec（漩涡混合器搅拌强度：最大）| B/F 分离|←800μl 洗净液Ⅱ| 搅拌 5sec（漩涡混合器搅拌强度：最大）| B/F 分离| 瞬时高速离心后，再次去除上清部分*4|←40μl 溶出液| 搅拌 5sec（将粒子混合）| 在 65℃下放置 2min| 搅拌 5sec| 瞬时高速离心上清·将回收液的一部分稀释 10～20 倍后测定 A260，算出 RNA 浓度*5。

*1请用漩涡混合器的最大搅拌强度进行搅拌。

*2将试管置于磁性台架上并靠近磁珠，并且通过多次颠倒混合后使得盖上的磁珠完全贴近磁石。然后，轻轻震动磁性台架，使得盖上的溶液掉落下来。最后使用微量移液器去除上垂询电话：021-58794900

12

清部分。
*3

在没有磁性台架的场合下，可以使用简易台式离心机进行 5 秒钟 3,000r.p.m 左右的离心操
作。由于离心后粒子会变得较难分开，在搅拌时请确认粒子是否已混匀。

*4请尽可能小心的去除。

*5根据算式：RNA 浓度（ng / μl）＝A260×40×稀释率得出。

7．DNaseⅠ处理
在 RT-PCR 之时，由于 mRNA 的构造尚不知道，当制备夹含内含子区域的引物对产生困难时，或者是基因组上存在与 mRNA 有相似构造的假基因时，必须考虑混入的微量基因组 DNA 所带来的影响。特别是当表达量较少的 mRNA 通过 RT-PCR 进行扩增的场合时，
必须使用 RNase free 的 DNaseⅠ来对混入的 DNA
做酶分解处理。以下是其中一个实例。
（1）准备的物品·10×DNaseⅠ buffer*1·RNase free DNaseⅠ（10 U/μl）·DEPC 处理水·TE 饱和苯酚·氯仿：异戊醇（24:1）·5M 醋酸氨溶液（pH 未作调整）·糖原溶液（2mg/ml）（分子生物学用）·异丙醇·70％乙醇溶液（2）操作程序① DNaseⅠ处理

RNA 溶液 ............................ X（μl）
DEPC 处理水 ................................... 8.5-X
10 × DNaseⅠ buffer .......................................... 1

13

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RNase free DNaseⅠ（10 U/μl） .................................... 0.5
Total ........................... 10（μl）·置于冰上反应 10～30 分钟*2。
② 苯酚及氯仿处理/异丙醇沉淀
10μl DNaseⅠ处理液|← 100μl DEPC 处理水|← 100μl TE 饱和苯酚
| 用漩涡混合器仔细搅拌混合| 置于冰上，5min| 4℃，12,000r.p.m.×5min 离心| 将上清液注入其他微型试管内
*1

100mM Tris-HCI,20mM MgCl2（pH7.5）*2

DNaseⅠ在冰上能够充分发挥作用。如果在高温下反应，则会使得 RNA 产生分解。

|←等量的氯仿：异戊醇（24:1）| 充分搅拌后，4℃，12,000r.p.m.×5min 离心
100μl 上清|←5μl 糖原溶液（2mg/ml）|←100ml 5M 醋酸氨溶液|←200μl 异丙醇| 用漩涡混合器搅拌
| 在-20℃下，放置 30～60min| 4℃，12,000r.p.m.×10～15min 离心，去除上清液*1|←70％乙醇溶液 1ml|←缓慢旋转混合
|←4℃，12,000r.p.m.×2min 离心，去除上清液| 瞬时高速离心，彻底去除乙醇沉淀|←DEPT 处理水，或者是逆转录反应液垂询电话：021-58794900

14

| 逆转录反应液*2*1

能够确认到有糖原的沉淀。请注意不要吸入沉淀块。

*2

同时制备没有进行逆转录反应的阴性对照，以确认 PCR 的扩增是否来自 RNA。

[5] 疑难解答
发生错误时请参照以下对策。
（1）RNA 的获取量低*1
原因对策

在溶解·吸附液中溶 样品在溶解·吸附液中溶解时，通过 pipetting 搅拌，直至
解处理不充分液体完全丧失粘性。

在溶解·吸附液中放 样品在溶解· 吸附液中混合后，请在室温下培育 15 分钟
置时间过短

以上。
样品过剩时，粒子会凝集，获取量会减少。请再次考虑减样品过剩

少样品量的条件。特别是在使用 MFX-2000 进行自动抽提的情况下更需注意。

离心过度

在去除组织样品等中的不溶物时，以 5,000r.p.m.长时间离
心的话，RNA 有可能会和杂物一起沉淀。
在使用 MFX-2000 进行自动抽提时，如果试剂的使用量过

使用试剂不足少，抽提将可能无法正常进行。在 RNA 的量非常少的情况下，请确认抽提试管内是否还留有试剂。

（2）A260/280 很低
原因

对策

样品过剩

请减少样品量。

RNA 浓度RNA 稀释液

吸光度测试时的 RNA 浓度如果过低，会使得 A260/280 的值变低。
与用 buffer 稀释相比，用蒸馏水稀释 RNA 后测定，会使得A260/280 的值变低。

15

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东洋纺（上海）生物科技有限公司*1

RNA 获取量会由于细胞、组织的种类的不同而有很大的差别。

垂询电话：021-58794900

16

（3）RT-PCR 结果不良原因

对策

混入了基因组 DNA

根据样品的不同，有些会混入基因组 DNA*1，可以根据第11 页的 DNaseⅠ处理的操作程序来处理。另外，进行
RT-PCR 时，即使使用没有进行逆转录的样品，也推荐进行
对是否在 PCR 中同时扩增出了基因组 DNA 的确认。

RNA 的分解*1

参照（4）在使用大肠杆菌等的场合下，有时通过电泳可确认到存在来自基因组 DNA 的污染。

（4）RNA 被分解
原因对策

RNA 的加温处理RNA 如果在反应 buffer 中长时间加温会发生分解。若要长时间加温，则使用添加 RNase 抑制物的 buffer。另外，加温尽可能不要高于 70℃。

DNaseⅠ处理条件

根据 DNaseⅠ处理条件，RNA 有时会发生分解。推荐使用
本操作程序 11 页的 DNaseⅠ处理条件。有的操作程序会使
DNaseⅠ在加热后失去活性。但在 DNaseⅠ buffer 中进行
80℃以上的加热处理，会促进 RNA 的分解。

样品过剩使用过剩的样品会使得抽提后的 RNA 溶液中残留 RNase。
请再次考虑减少样品量的条件。

（5）磁珠凝集，不易分开
原因
样品过剩

对策
样品过剩时，粒子会凝集，获取量会减少。请再次考虑减
少样品量的条件。

在溶解·吸附液中溶 样品在溶解·吸附液中溶解时，通过 pipetting 来进行搅拌，解处理不充分

直至液体完全丧失粘性。

在溶解·吸附液中放 样品在溶解·吸附液中混合后，请在室温下培育 15 分钟以
置时间过短

上。

17

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东洋纺（上海）生物科技有限公司（6）回收 RNA 溶液染有颜色原因

对策

残留有血红素，叶绿 使用含有大量血红素，叶绿素等样品时，回收液有可能会
素等

被染色。请减少样品量。另外，在采取动物内脏时，请尽
量避免混入血液成分。
可以通过（DNaseⅠ处理（0℃））→苯酚及氯仿处理→异
丙醇沉淀的步骤来去除沉淀。

混入磁珠

磁珠若是混入回收液中，会使得回收液呈现茶色。磁珠不会对酶反应等产生阻碍作用，可以通过轻度离心加以去除。

[6] 参考文献
1) Vogelstein, B., and Gillespie. D. (1979) Preparative analytical purification of DNA
from agarose. Proc. Natl Acad. Sci. 76:615-619.
2) Boom, R., Sol C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L. Wertheim-van Dillen.
P.M.E. and van der Noordaa. J. (1990) Rapid and simple method for purificationof nucleic acids.J.Clin. Microbiol. 28:495-503.

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