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細胞認識機能を有する神経細胞活動記録に向けた次世代微小電極技術の開発

Author(s)羽賀, 渉

CitationIssue Date

2024-03

TypeThesis or Dissertation

Text version

ETDURLhttp://hdl.handle.net/10119/19074

RightsDescription

Supervisor: 筒井 秀和, 先端科学技術研究科, 博士

Japan Advanced Institute of Science and Technology

氏名羽

賀

渉

学

位の種類

博士（マテリアルサイエンス）

学

位記番号

博材第 579 号

学 位 授 与 年 月 日
論文題目論 文 審 査 委 員

令和 6 年 3 月 22 日
Development of next generation microelectrode technique toward
neuronal activity recordings with cell recognition capability
筒井秀和

北陸先端科学技術大学院大学

准教授

水谷五郎

同教授

平塚祐一

同准教授

山口拓実

同准教授

阿部秀樹

名古屋大学

准教授

論文の内容の要旨
Molecules called synapse organizers are involved in the formation of synapses. Among them, clustering ofneurexin-1β (b) by interacting with neuroligin-1 is known to cause synaptogenesis. The ability of Neurexin-1β toinduce synaptogenesis in synapse organizers has been studied from various viewpoints, and although theelucidation of this molecular function has been widely attempted, the use of this function as a molecular machine
has not been quite common. In this study, I developed an engineered synapse organizer based on Neurexin-1β andestablished a method to fabricate a glass microelectrode in which the main body was insulated by glass and only
the tip was metal (Gold). By combining these, I attempted to induce selective synaptogenesis in the glass
microelectrode. The engineered synapse organizer we developed formed synapse-like structures on the surfaces ofinorganic microbeads and glass microelectrodes by artificial binding, not intrinsic binding. The localization ofsynapsin, which acts as a synaptic marker molecule, and Rab3 in the introduced marker was consistent. The
engineered synapse organizer we developed can be said to be capable of inducing synaptogenesis in the glass
microelectrode. When the tips of microbeads and glass microelectrodes bearing Rab3 antibodies were contactedwith neurons expressing Rab3, I confirmed the accumulation of Rab3 despite the binding by antibodies. The

method for fabricating the glass microelectrode was developed by preferentially selecting a tool that is universallyused for the patch clamp method, which may be a compatible tool for fields that employ such electrophysiologicalmeasurement methods. I employed a focused ion beam (FIB) machine for the fabrication of the tip of themicroelectrode, and I was able to perform highly reproducible fabrication. This allowed us to efficiently fabricate
an electrode with an arbitrary tip shape using the FIB, if an electrode with gold conducting could be fabricated bya micropipette puller. Finally, in a proof-of-principle experiment using chick forebrain neurons, selective
synaptogenesis was induced in the glass microelectrode in a non-CO2-dependent culture medium. Chick neurons
are simple to culture, and unlike rats and other mammals, it is known that removing the forebrain neuron from anegg embryo is unlikely to cause biological problems. Experiments showed that synaptogenesis by the engineered
synapse organizer took at least 4 hours, but chick forebrain neurons transfected at room temperature and open air
survived for at least 8 hours and formed synapses with antibody-modified microbeads and glass microelectrodes.

Keywords: Electrophysiology, Neuron, Synapse Organizer, Glass Microelectrode, Protein Adsorption
論文審査の結果の要旨シナプスオーガナイザーとは、生体内でニューロンが精緻に配線される際に重要な役割を果たす分子群の総称である。シナプスオーガナイザーの生理機能を用いることにより、細胞種に対する選択性を備えた、ニューロン電気活動計測の新しい基本原理を確立できることが期待されている。本学位論文は、将来的にこうした新規計測原理の実証実験を成功させることを目標とした、三部の研究から構成される。
第Ⅰ部では、生体に備わる内在性のシナプスオーガナイザーとは交差反応を起こさない、小型の人工シナプスオーガナイザーの設計と評価を行った。具体的には、プレシナプスに存在するニューレキシン 1βと呼ばれるオーガナイザーにおいて、内在性リガンドと相互作用する LNS ドメインを除去し、12 アミノ酸からなるペプチドタグを挿入した。この人工改変ニューレキシンを発現するニューロンは、ペプチドタグに対するナノボディで修飾したマイクロビーズと接触するとプレシナプスの分化誘導を引き起こすことから、設計した分子が人工シナプスオーガナイザーとしての生理機能を持つことが示された。さらに、計測原理の実証を行う為の実験系として、Chick forebrain neuron に着目し、人工シナプスオーガナイザーの機能評価を行った。大気下・室温という環境下においても、マイクロビーズとの接触後、およそ 4 時間でプレシナプスへの分化誘導が引き起こされることを見出した。一般的に初代培養ニューロンを大気下・室温で維持することは困難であることから、今後、計測原理の実証を目指す上で、Chick forebrain neuronがユニークな利点を持つ優れた細胞モデルとなり得ることを示した。第Ⅱ部では、こうした計測原理を実証するために必要な、リガンド修飾微小電極の開発を行った。具体的には、硼珪酸ガラス管に金線を封入し、熱伸展と FIB を組み合わせ、金の先端露出部が 1 µm 程度とニューロンシナプスと同程度となるような先端加工方法を施し、さらに、先端露出部を第Ⅰ部で開発した人工シナプスオーガナイザーに対するリガンドで表面修飾する手法を確立した。第 III 部では、I 部で開発した人工シナプスオーガナイザー、及び、プレシナプスマーカーEGFP-Rab3 を予め導入した chick forebrain neuron に対し、II 部で開発したリガンド
修飾微小電極を光学顕微鏡観察下にて接触させ、それにより誘起されるシナプス分化誘導をリアルタイム観察する実験を行った。接触後数時間で Rab3 の集積が確認され、設計通りに金封入微小電極と標的ニューロンとの間にシナプス様の接合構造が形成されることを示唆する結果を得ている。
以上の成果は、将来的に、細胞種選択性を備える微小電極技術の開発に向けた重要な足掛かりとなるものであり、学術的な貢献は大きい。よって、博士（マテリアルサイエンス）の学位論文として十分価値あるものと認めた。