Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 11, No. 1 · 2, 69–75, 2011

総

説（一般）

プラスミドの接合伝達に関与する遺伝因子・環境因子
Genetic Elements and Environmental Factors Involved in the Plasmid Conjugation
松井

一泰 1，新谷政己 2，山根

久和 1，野尻秀昭 1*Kazuhiro Matsui , Masaki Shintani , Hisakazu Yamane and Hideaki Nojiri1*121

東京大学生物生産工学研究センター 〒 113–8657 文京区弥生 1–1–1
理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室 〒 351–0198 埼玉県和光市広沢 2–1* TEL: 03–5841–3064 FAX: 03–5841–8030* E-mail: anojiri@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
1
Biotechnology Research Center, The University of Tokyo, 1–1–1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113–8657, Japan
2
BioResource Center, Japan Collection of Microorganisms, RIKEN, 2–1 Wako, Hirosawa, Saitama 351–0198, Japan
1

2

キーワード：IncP-7 群プラスミド，接合伝達，pCAR1
Key words: IncP-7 plasmid, conjugation, pCAR1
（原稿受付

1.

2011 年 11 月 21 日／原稿受理

はじめに

プラスミドは様々な細菌間を接合伝達によって移動する可動性遺伝因子である．プラスミドは，薬剤耐性能や病原性など種々の遺伝子を伝播することで細菌の急速な進化・適応能の原動力となるため，古くから研究がなされてきた．それによれば，プラスミドの接合伝達は，宿主の置かれた環境の何らかの因子（温度・栄養条件など）に応答して開始される．自己伝達性プラスミドはoriT（origin of transfer），relaxase，type IV coupling protein（T4CP）からなる遺伝子領域で構成される MOB（Mobility）もしくは Dtr（DNA transfer and replication）と，タンパク質分泌機構である type IV secretion system（T4SS）を構成する MPF（mating pair formation）を持ち，MOB が プ ラ ス ミ ド DNA の 切 断 や 複 製 を 行 い，MPF が供与菌と受容菌の菌体間を接着し，双方をつなぐ管状の接合橋を形成する．可動性プラスミドは MPFを持たず，なかには T4CP も持たないものもあり，細胞内の他の因子が持つ MPF を利用して接合伝達される．なお，接合伝達システムは relaxase の系統分類をもとに 6 つのファミリー（MOBF, MOBH, MOBQ, MOBC,
MOBP, MOBV）に分類されている9)．
プラスミドの接合伝達では，まず，relaxase がプラス
ミド DNA の oriT 領域に結合し，二本鎖 DNA にニック
（切れ目）を入れ，二本鎖を開裂する．この relaxase‐
輸送 DNA 複合体は T4CP によって T4SS に連結され，T4CP が ATP を消費してタンパク質‐DNA 複合体を
T4SS を通して受容菌に輸送する（図 1）．受容菌内では，relaxase が供与菌から輸送される一本鎖 DNA のもう一方の末端を認識し，再環化する．プラスミドは受容菌内に侵入した後，受容菌からの制限・修飾系を回避し2011 年 12 月 6 日）ながら複製されることで初めて接合伝達が成立し，さらに安定に分配されることで，プラスミドを獲得した接合伝達体コロニーが得られる．
プラスミドの接合伝達の機構はほぼ共通であるにもかかわらず，その伝達頻度は，プラスミドの種類によって，また供与菌・受容菌の組合せ，接合の環境などによって著しく変化する39)．腸チフスの原因細菌である
Salmonella enterica serovar Typhi 由来の IncHI 多剤耐性
プラスミドでは，接合に必要な遺伝子の転写が低温下で誘導されること1)，また，IncF プラスミドは長く柔らかい性繊毛を持ち液体中で接合しやすく，IncP プラスミ
ドは短く硬い性繊毛を持ち固体表面上で接合しやすい，といった性繊毛の性質によって液体中・固体表面上での接合の生じやすさが異なること39) は解っているが，未だその理由の大半は不明である．つまり接合伝達の成否を決める環境因子とその作用機構について知見は不足していると言って良い．
2.

自己伝達性プラスミド pCAR1

筆者らの研究室では，原油中に含まれるヘテロ環式芳香族化合物 carbazole を唯一の炭素源・窒素源・エネル
ギ ー 源 と し て 生 育 可 能 な Pseudomonas resinovorans
CA10 株を活性汚泥中から単離し，その詳細な解析を行ってきた23)．難分解性物質の分解遺伝子群もプラスミ
ドによって細菌間を水平伝播することが多いが 7,25,26,40)，
CA10 株の carbazole 代謝に必要な酵素をコードする car
遺伝子群もプラスミド pCAR1 上に存在していた24,28,29)．
筆者らのグループでは pCAR1 の全長約 200 kb の全塩基配列を決定し21,37)，pCAR1 がプラスミドの不和合性群という分類上 IncP-7 群に属することを示した33)．また，塩

70

松井

基配列情報から推定された pCAR1 の複製・保持・接合伝達に関わる機能の基本性質を明らかにした36)．これはIncP-7 群プラスミドの基本機能を詳細に解析した最初の例であった．IncP-7 群プラスミドは土壌・水圏・動物体
内など環境に広く分布する Pseudomonas 属細菌間を接合伝達によって移動する12)．IncP-7 群のプラスミドとして は，toluene/xylene 分 解 プ ラ ス ミ ド pWW5338)，
pDK113,41) や naphthalene 分 解 プ ラ ス ミ ド pND6-117),
pAK5, pFME4, pFME5, pNK33, pNK43, pOS18, pOS1911)など近年急速に報告例が増加しており，環境中での分解関連遺伝子の重要な運び手の一つであることが示されつつある．
3. IncP-7 群プラスミドの接合伝達関連遺伝子と接合伝達
pCAR1 上 に は，Proteus vulgaris の Rts1（IncT）22)，

他

Salmonella typhi の R27（IncHI）14,31)，Providencia rettegeri の R3912)，S. enterica の SGI13) の接合伝達に関る
Trh タンパク質や Tra タンパク質とアミノ酸レベルで19 〜 50％の相同性を示す ORF が存在する（図 2）．また，同じ IncP-7 群に属する自己伝達性プラスミド pDK1
上には，それらと 83 〜 99％の高い相同性を示す遺伝子群が存在する（図 2）．
ORF121pCAR1 がコードするタンパク質（全長 900 アミ
ノ 酸 ） の N 末 端 側 373 ア ミ ノ 酸 は，R391 と R27 の
TraI タンパク質（それぞれ全長 717 アミノ酸と 1,012 アミノ酸）の N 末端側とそれぞれ 36％と 32％の相同性を有する．R27 の TraIR27 は relaxase に保存された 3 つのモチーフ（I 〜 III）を持ち，oriT の位置で DNA に nickを入れ接合伝達を開始する機能を持つ relaxase であると
考 え ら れ て い る18,31)．ORF121pCAR1 タ ン パ ク 質 上 に は，relaxase のモチーフ I と II は明確には見いだせないが，

図 1．接合伝達のモデル．
Relaxase が oriT からプラスミドの二本鎖 DNA を開裂し，ATPase 活性を持つ T4CP と相互作用することで，T4SS から受容菌へと一本鎖 DNA を輸送する．

図 2．pCAR121,42), pDK141), R2710,14,15), R3912,4), Rts122) の接合伝達関連遺伝子群の構造比較．
同じ模様の矢印は相同性のある遺伝子を表し，矢印の方向に転写される．矢印の下の英数字は遺伝子名または ORF を表し，
pCAR1, pDK1, R27 は trh を，R391 は tra を省略して表記している．例えば pCAR1 の N は trhN を表し，123 は ORF123を表す．波線は間の塩基配列を省略していることを表す．

71

プラスミドの接合関連因子

モチーフ III は保存されていた．一方，ORF122pCAR1 がコ ー ド す る タ ン パ ク 質 は R391 の TraDR391 と R27 の
TraGR27 とそれぞれ全長で 47％と 28％の相同性を示した．R27 の TraGR27 は 2 つ の 膜 貫 通 ド メ イ ン と ATP/GTP 結合モチーフ A を持ち，RP4 の TraGRP4 や F プラ
スミドの TraDF のように anchoring/coupling タンパク質であると考えられている43)．pCAR1 の ORF122pCAR1 にもATP/GTP 結合モチーフ A が存在する．上で述べた特徴 は，ORF121pCAR1 と ORF122pCAR1 は 接 合 時 に そ れ ぞれ relaxase と anchoring/coupling タ ン パ ク 質 と し て 機
能 す る こ と を 示 唆 し て い る． そ こ で ORF121pCAR1 とORF122pCAR1 を traIpCAR1 と traGpCAR1 と命名した21,42)．先に述べた Garcillan-Barcia らの分類に基づくと，pCAR1の TraIpCAR1 の相同性に基づいて pCAR1 の接合伝達シス
テムは MOBH に分類される9)．
Rts1 の oriT 領域（455 bp）は ORF251Rts1 と ORF252Rts1の遺伝子間領域に存在する．pCAR1 の ORF155pCAR1 は
Rts1 の ORF252Rts1 と 43 ％ の 相 同 性 を 示 す．pCAR1 のTraIpCAR1 と Rts1 の TraIRts1 が高い相同性を示すことから，
これら 2 つのプラスミドの oriT も互いに相同性があると 思 わ れ る． 実 際 に，pCAR1 の ORF155pCAR1 近 傍 に
465 bp か ら な る 推 定 oriT 領 域 が 存 在 し，Rts1 の oriT
領域と 42％の相同性を示した．Rts1 の oriT 領域にはTra タンパク質が認識すると思われる 3 つの逆方向反復配列が存在するが，pCAR1 上の推定 oriT 領域にも 2 つの逆方向反復配列が存在する21,42)．
ORF145pCAR1 と ORF146pCAR1 は Rts1 と R391 上 に コ ー
ドされる機能未知タンパク質と部分的な相同性を示し
た．ORF145pCAR1 と ORF146pCAR1 を 欠 失 し た pCAR1 を保持する P. putida KT2440 株から，pCAR1 を保持しな
い KT2440 株への接合伝達頻度は，野生型の pCAR1 と比較して約 1/100 以下まで減少することが示されている（Shintani et al., unpublished data）．IncP-7 群プラスミドのミニレプリコンを Pseudomonas 属細菌内にエレクト
ロポレーションによって導入した結果，接合伝達ではIncP-7 群プラスミドを受容できない細菌であっても，ミニレプリコンを有する形質転換体が得られた42)．このことは，複製能によって決められる IncP-7 群プラスミドの宿主域の方が，接合伝達能によって決められる宿主域よりも広く，接合伝達の成否によって IncP-7 群プラス
ミドの宿主域が決められることを示している33,42)．
IncHI プラスミドの性繊毛は「柔らかく」，接合伝達
頻度は土壌のような「固い」環境中に比べて水環境中の方が高いという性質がある16)．このことから，IncHI の性繊毛と相同性のある pCAR1 の性繊毛も「柔かく」，
水環境中において効率的に接合伝達すると考えられる．
IncHI プラスミドのもう一つの特徴として，温度依存的な接合伝達機構があり，接合伝達頻度が 25 〜 30°C で最大となり，温度が上昇するにつれて減少する27)．また，R27 には核様体タンパク質（nucleoid-associated proteins, NAPs）の一種である H-NS（Histone-like Nucleoid
Structuring）様タンパク質と，H-NS のホモログであり
DNA 結合領域を欠失した Hha 様タンパク質（大腸菌内での温度，浸透圧依存的な病原遺伝子の発現に関与する
タンパク質）がコードされているが 31)，R27 上の NAPs
や大腸菌染色体上の NAPs を破壊すると，野生型 R27
は接合伝達できない 33°C でも接合伝達が可能となる8)．
し か し，P. putida HS01 株 か ら P. fluorescens IAM112022RG 株への pCAR1 の接合伝達頻度は 25°C, 37°C,
42°C の条件下では差は認められず 32)，pCAR1 の接合伝達機構が IncHI プラスミドとは異なる可能性が示唆されている．また，実験室内環境で Pseudomonas 属に属す
る 5 株 の pCAR1 の 保 持 菌（ 供 与 菌 ） と Pseudomonas
属・非 Pseudomonas 属細菌 10 株との接合実験を行ったところ，供与菌の種類によって pCAR1 の接合伝達頻度が変化すること，P. putida HS01 株を供与菌とした際には，P. resinovorans CA10 株や P. putida KT2440 株を供与菌とした場合よりも接合伝達体が検出される受容菌の種類が多いことが示された32)（表 1）．この実験では，
Pseudomonas 属細菌以外への pCAR1 の接合伝達は認められなかった．また，P. putida KT2440 株を供与菌にした場合のように，受容菌の組み合わせによっては同じ種への接合伝達が検出できない例もあった．
4.

環境中における pCAR1 の接合伝達と宿主域

IncP-7 群プラスミドは一般に狭宿主域であり，主にPseudomonas 属細菌を宿主とすると考えられていた12)．

表 1．異なる供与菌における pCAR1 の接合伝達頻度 a

Burkholderia sp. PJ310GK
Comamonas testosteroni JCM 5832T
Escherichia coli CAG18620 (ME8878)
Pseudomonas. putida DS1RG
P. chlororaphis subsp. chlororaphis JCM 2778T
P. putida KT2440RG
P. resinovorans CA10dm4RG
P. fluorescens JCM 5963T
P. putida JCM 13063T
P. stutzeri JCM 5965T
a

HS01

DS1

–
–
–
+++
+
+
++
+
+
+

–
–
–
+++
+
+
++
+
+
+

JCM2778 KT2440K
–
–
–
+
+
+
++
+
+
+

–
–
–
–
–
+++
++
–
–
–

CA10
–
–
–
–
–
++
+++
–
–
–

接合伝達頻度は <10–7 per donor（検出限界以下）を –，10–7 〜 10–5 per donor を +，10–5 〜 10–3 perdonor を ++，10–3 〜 10–1 per donor を +++ と表記した．

72

松井

しかし，環境試料（雑多な環境細菌を含む混合物）を受容菌群として接合実験を行ったところ，carbazole 存在
下という選択圧下では Pseudomonas 属細菌が接合伝達
体 と し て 多 く 検 出 さ れ た も の の， 非 選 択 圧 下 で はStenotrophomonas 属細菌のみが接合伝達体として検出された34)．Pseudomonas 属以外の細菌が IncP-7 群プラ
スミドを保持することは，この実験において初めて見いだされた事象である．これまでの実験室内環境での接合実験では，P. putida KT2440（pCAR1）から Stenotrophomonas 属細菌への接合伝達は認められていないことから（Shintani et al., unpublished data），自然環境中の何らかの物質が接合伝達を促進した可能性や，他の細菌を経由して pCAR1 が水平伝播した可能性が考えられる．
また，carbazole 非存在下で Pseudomonas 属細菌以外が主要な宿主であった事実から考えると，特別な選択圧がかからない自然環境下では，必ずしも Pseudomonas 属
細菌が IncP-7 群プラスミドの主要な宿主ではない可能性が考えられる．すなわち，Pseudomonas 属細菌は人為的な培地での生育の早さなどのバイアスによって，より頻繁に IncP-7 群プラスミドの宿主として検出されたもので，実際の自然環境中では IncP-7 群プラスミドはより広範な細菌に保持されていると推測されている34)．
また，我々は pCAR1 のモデル環境中での振る舞いを調べるために，実際の土壌や環境水を模したモデル環境
試料に carbazole を添加後，pCAR1 を保持する P. putidaと 15 株の pCAR1 非保持菌株を接種し，carbazole 残存量変化，菌体数変化，接合伝達のモニタリングを行っ他た35)．その結果，接合伝達体はモデル水環境中から検出されたが，モデル土壌中からは検出されなかったことから，pCAR1 は水環境中で伝達し易いことが示唆された．
モデル水環境の成分分析の結果，接合伝達体が出現した
河川水や湖沼水と比較して，接合伝達体が出現しなかった対照区（リン酸系バッファー）では Cl–, SO42–, Ca2+,
Mg2+, Fe2+ が検出されなかった（表 2）．そこで，リン酸バッファーにこれらのイオンを添加し接合実験を行ったところ，Ca2+ もしくは Mg2+ を添加した際に接合伝達体が出現した（表 3）．添加するイオンの濃度を表 3 の1/10 に減少させても接合伝達体が検出されたことから，
少なくとも 39.9 μM の Ca2+ もしくは 37 μM の Mg2+ が存在すれば，pCAR1 が接合伝達することが示された35)．
対照的に，スラリー状のモデル土壌の上部に溜まった水層に存在するフミン酸が pCAR1 の接合伝達を阻害する現象も観察されている．フミン酸は二価の陽イオンをキレートすることが知られていることから，水層の Ca2+,
Mg2+ イオン濃度が pCAR1 の接合伝達には不十分であったことが上記の阻害効果の原因と思われる．また，接種する pCAR1 保持菌株を P. chlororaphis, P. fluorescens, P.
resinovorans に変えて同様の実験を行ったところ，P.
chlororaphis を pCAR1 保持菌株として接種したサンプ
ルのみ接合伝達体が出現した．興味深いことに，出現した接合伝達体は P. putida を pCAR1 保持菌株として接種したときと同様，すべて P. resinovorans であった35,36)．各モデル環境試料中に接種した pCAR1 の宿主とそれ以外の細菌 15 株には，供与菌・受容菌を一種類

表 2．モデル水環境に存在する各種イオン濃度 a（μM）
イオン

リン酸バッファー

河川水

湖沼水

Cl
SO42–
NH4+
NO3–
PO43–
Na+
K+
Ca2+
Mg2+
Fe2+

0
0
37,40037,60021,40031,000
5,860
0
0
0

2,310
501
394
85.5
6.32
2,460
194
402
391
<1.79

420
132
2.77
61.3
6.95
605
61.4
147
317
<1.79

–

a

リン酸バッファーは試薬への不純物の混入がないと仮定した場合の各イオンの濃度，
その他は実測値を示す．

表 3．モデル水環境に添加した各種イオン濃度 a（μM）と接合伝達の成否
イオン

リン酸バッファー

+CaCl2+MgSO4+Ca(NO3)2+Mg(NO3)2+KCl+Na2SO4

Cl
SO42–
Ca2+
Mg2+
Fe2+
接合 b

0
0
0
0
0
No

790
0
399
0
0
Yes

0
385
0
370
0
Yes

0
385
399
0
0
Yes

0
0
0
370
0
Yes

1020
0
0
0
0
No

0
708
0
0
0
No

–

a
b

リン酸バッファーは試薬への不純物の混入がないと仮定した場合の各イオンの濃度，その他は実測値を示す．
No は接合伝達体が検出限界以下（5.0 × 102 CFU/ml），Yes は接合伝達体が検出されたことを表す．

プラスミドの接合関連因子73

図 3．各イオン濃度における接合伝達頻度．
横軸は各イオンの濃度，縦軸は接合伝達頻度（接合伝達体数／供与菌数）を表す．イオンなし：Ca2+, Mg2+ 無添加，Ca2+：Ca2+
単独添加，Mg2+：Mg2+ 単独添加，Ca2+and Mg2+ each：Ca2+, Mg2+ 両方添加，イオンの上の数字は添加したイオンの終濃度（μM），
イオンなし上部の数字は検出限界を表す．接合伝達頻度は独立した 3 回の実験の平均値を，標準偏差と共に示す．

ずつ用いた接合実験では pCAR1 が接合伝達可能な組み合わせが複数存在するにもかかわらず32)，試料から接合伝達体を検出できたのは，そのうちの一部にとどまった．従って pCAR1 の宿主によっては陽イオンの存在がその接合伝達に寄与しない可能性も考えられる．これらのことは，二価の陽イオンが環境中での pCAR1 の宿主域にも影響を与えている可能性を示唆している．
5.

Ca2+ と Mg2+ が pCAR1 の接合伝達頻度に及ぼす影響の評価

Ca2+ と Mg2+ が pCAR1 の 接 合 伝 達 頻 度 に 及 ぼ す 影
響 を 評 価 す る た め に，Pseudomonas putida SM1443（pCAR1::rfp）株34) を供与菌，P. putida KT2440RG 株32)を受容菌として，Ca2+ と Mg2+ の濃度を調整したリン酸
バッファー中で液体接合（供与菌と受容菌の混合懸濁液を静置し，液体中で接合伝達を行う方法）を行った．その結果，Ca2+ と Mg2+ はどちらも接合伝達頻度を上昇させること，単独添加による効果は Ca2+ よりも Mg2+ の方が大きいこと，Ca2+ と Mg2+ を両方添加することで接合伝達頻度が相乗的に上昇することが明らかとなった（図 3）．また，各イオンは 40 μM 以上添加しても接合伝達頻度の上昇は見られなかったが，これはリン酸バッ
ファー中には多量の PO43– が存在することから，二価の陽イオンを一定以上加えると沈殿物を生じてしまうことが原因であると思われる．
6.

トランスポゾン破壊株ライブラリを用いた新規接合関連遺伝子の探索

これまでに接合伝達機構について詳細な研究がされている IncW プラスミド R3885) において，Ca2+ と Mg2+が IncW プラスミドの接合伝達に必要な ATPase である
TrwD と他の細菌の細胞膜との相互作用を促進し，その効果は Ca2+ の方が Mg2+ より高いことが報告されている20)．F プラスミドにおいても，接合伝達の際にプラスミドの切断を行う酵素 relaxase の in vitro における活性に二価の陽イオンが必須であることが示されている19)．
しかし，pCAR1 を用いた本研究以外に環境中において二価の陽イオンが重要であるとの報告例は無いことや，
R388 や IncP-1 プラスミドの pB1030) 等の他のプラスミ
ドでは環境中の二価陽イオンの有無で接合伝達頻度に差が検出できないこと（Matsui et al., unpublished data）から，IncP-7 プラスミドには IncW や F プラスミドとは異なる二価の陽イオンを必要とする理由があると考えられる．そこで現在は，トランスポゾン挿入変異を利用した
プラスミド供与菌，及び受容菌の破壊株ライブラリをプ
ラスポゾン6) を用いて作製し，Ca2+, Mg2+ 存在・非存在下で接合実験を行うことで，プラスミドの接合伝達に関与する遺伝子，特に二価の陽イオンに関係する遺伝子の探索を行っている．これまでに二価の陽イオン依存的ではないものの，受容菌の破壊株ライブラリから接合伝達頻度を検出限界以下まで減少させる遺伝子候補が，供与菌（プラスミド上）からは接合伝達頻度を上昇させる破壊株が得られている．
上でも述べたように，二価の陽イオンを添加しても接合伝達現象が起こらない（検出できるまでに頻度が上がらない？）宿主が存在することから，特定の宿主内で影響を受ける特別なタンパク質があるのかもしれない．つまり，本研究でターゲットとするタンパク質は，従来の接合伝達現象に必須なものではないかもしれないが，宿主によって挙動を変化させ，その宿主域を変えうる，新たな因子の発見が期待される．

74

松井

文

献

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