Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 11, No. 1 · 2, 61–67, 2011

総

説（一般）

ナフタレン誘導体による運動性抑制を介した緑膿菌バイオフィルムの制御
Control of Pseudomonas aeruginosa Biofilm through Inhibition of Swarming Motility by
Naphthalene Derivatives
大浦

啓，田代

陽介，豊福

雅典，中島

敏明，内山

裕夫，野村

暢彦*

Hiromu Oura, Yosuke Tashiro, Masanori Toyofuku, Toshiaki Nakajima-Kambe, Hiroo Uchiyama and Nobuhiko Nomura
筑波大学大学院生命環境科学研究科 〒 305–8572 つくば市天王台 1–1–1
TEL/FAX: 029–853–6627
E-mail: nomunobu@sakura.cc.tsukuba.ac.jp
Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba,
Tennodai 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki 305-8572, Japan
キーワード：ナフタレン誘導体，運動性，バイオフィルム
Key words: naphthalene derivatives, motility, biofilm
（原稿受付

1.

2011 年 10 月 17 日／原稿受理

はじめに

近年，環境中の微生物の多くは浮遊状態ではなく，物質表面に付着してバイオフィルムという集団形態をとって存在することが分かってきた7,9)。バイオフィルムとは，物質表面に付着した微生物と微生物が生産する多糖などの EPS（extracellular polymeric substances）から構成される三次元構造体のことである。バイオフィルムは我々を取り巻くあらゆる環境において形成されるが，そのなかには人間の社会活動と密接な関係性を持つものが多くみられる。例えば，水道管などの工業用配管中に形成されたバイオフィルムは，配管内部の詰まりや金属腐
食の誘発によって各設備の性能低下を引き起こすことが知られている42)。また，医療器具内やヒトの肺上皮に形成されたバイオフィルムは，高い抗生物質耐性や物理的剥離の困難性から感染症治療の難治化を引き起こす7,11)。
加えて近年では，う触や歯周病とバイオフィルムの深い関係性が報告されており41)，バイオフィルムの制御は口腔治療の分野においても重要なトピックとなっている。
このような負の側面が多く報告されているバイオフィ
ルムではあるが，その一方で工業的に有効利用されているケースも多い。例えば，排水処理に用いられる活性汚
泥や発酵工業で使われる麹などは，微生物が高密度で集合したバイオフィルム中でみられる高い物質変換能力を活用したものである40)。このように，バイオフィルムは正負両面において我々と深いつながりを持つ存在である
ことから，その理解と制御は近年の微生物学において一層重要なものとなってきている。そこで本稿では，バイオフィルムの形成および脱離と密接に関与する運動性に着目し，バイオフィルム制御へつながる新規知見について報告する。

2.

2011 年 12 月 2 日）

緑膿菌のバイオフィルム形成における運動性の役割

バイオフィルム研究のモデル微生物の一つである緑膿菌 Pseudomonas aeruginosa は，ヒトの肺気道上や傷口といった生物的表面のみならず，コンタクトレンズやカテーテルといった非生物表面に対してもバイオフィルムを形成する。興味深いことに，バイオフィルムを形成した緑膿菌は，浮遊状態と比較して抗生物質耐性が上昇することや，代謝活性が変化すること，変異株の出現率が上昇することなどが報告されており，明らかに浮遊状態とは全く異なる細胞状態であることが分かってきた7,17)。
そのため近年では，浮遊状態の研究に加えて，バイオ
フィルム形成時の挙動に関する研究が盛んに行われている。
緑膿菌のバイオフィルムは，浮遊状態の細胞が物質表面に付着し，多糖や DNA などの細胞外マトリクスを分泌しながらマイクロコロニーを形成するという過程を経て成熟化する（図 1）。そして，バイオフィルムの成熟にともなって生じる内部での栄養塩の枯渇や一酸化窒素などの代謝産物の蓄積によって緑膿菌細胞の脱離が誘導され1,2)，脱離した浮遊菌は別の場所に新たなバイオフィ
ルムを形成する。このような緑膿菌のバイオフィルム形
成には，細胞外多糖や細胞外 DNA などで構成される
EPS と，鞭毛や IV 型線毛を介した運動性が密接に関与することが報告されている20)。本稿では，この両者のうち運動性に着目し，バイオフィルム制御に関する新規の知見を述べる。
緑膿菌における運動性は，鞭毛を必須とする Swimming（液体中を泳ぐ運動性）と Swarming（半固体表面における集団での運動性），そして IV 型線毛を必須とする Twitching（固体表面を這う運動性）の 3 つが知ら

62

大浦

他

ing 能の上昇によってバイオフィルムからの脱離が促されることが報告されている2)。バイオフィルムからの脱離は，栄養塩の枯渇や代謝産物の蓄積によって条件の悪化したバイオフィルム内部から，より条件の良い場所へと移動する微生物の環境適応である一方，ヒト体内における全身への感染拡大や環境分野における微生物汚染の拡散といった負の側面も持つため，その制御は医療・環境分野を中心に広く求められている。
3.

図 1．緑膿菌バイオフィルムの生活環。
固体表面への付着，成熟，脱離の 3 段階で構成される。

図 2．寒天培地上において緑膿菌が示す 3 タイプの運動性。
左 か ら Swimming（0.3 ％ agar），Swarming（0.5 ％ agar），
Twitching（1.0％ agar）。

れている（図 2）。これらの運動性は，緑膿菌のバイオ
フィルム形成および脱離の各段階と密接に関与している。まず，バイオフィルム形成の初期段階において，緑膿菌は鞭毛や IV 型線毛を用いた運動性によって物質表面に近づく。鞭毛や IV 型線毛は物質表面に対しての反発的な力を相殺するため，菌体の基質表面への相互作用の段階で重要な働きをする。さらに，鞭毛は物質表面に対して物理化学的な力によって可逆的に付着（reversible
attachment）した後に生じる，強固な不可逆付着（irreversible attachment）に必要であることが報告されている20)。また，IV 型線毛による Twitching は緑膿菌バイオ
フィルムにみられるマッシュルーム型の立体構造の形成に関与することが報告されている20)。さらに，鞭毛を介する Swarming は，緑膿菌細胞が EPS で覆われた成熟
バイオフィルム内部から外部へと脱離する際に重要な働きをすることが示されており，Swarming 能の高い変異
株では野生株と比較してバイオフィルムの脱離が早期に誘導されることが報告されている5)。また，近年の研究において，バイオフィルム形成と Swarming は，細胞内セカンドメッセンジャーである 3',5'-cyclic diguanylic acid（c-di-GMP）濃度を介して逆の制御を受けることが報告されている6)。具体的には，細胞内の c-di-GMP 濃度の高い時には Swarming 活性が低下する一方で，バイオ
フィルム形成に重要な役割を果たす細胞外多糖の生産が誘導されることにより，バイオフィルム形成が促進される6)。その一方で，一酸化窒素などの脱離を促す環境シ
グナルに応答して c-di-GMP 濃度が低下すると，Swarm-

Swarming motility についてバイオフィルムからの脱離と密接に関与する Swarming motility は，半固体表面における微生物の急速な運動性（数 μm/s）と定義されている36)。これまで，緑膿菌の他に Escherichia coli, Proteus mirabilis, Serratia marcescens などのグラム陰性菌，そして Bacillus subtilis などのグラム陽性菌においてその存在が報告されている。
緑膿菌を始めとした Swarming 能を有する微生物において，Swarming には機能的な鞭毛とともに微生物が生産する界面活性剤であるバイオサーファクタントが必須であることが報告されている34)。Swarming 細胞はバイオ
サーファクタントの生産によって細胞と培地との間に生じる表面張力を低下させ，半固体表面における移動を可能にしている。緑膿菌ではラムノリピド，S. marcescens
ではセラウェッチン，B. subtilis においてはサーファク
チンといったバイオサーファクタントがその役割を果た
すことが知られている36)。緑膿菌のラムノリピド生産は細胞密度依存的遺伝子発現制御機構であるクオラムセン
シングによって正に制御されることが知られている25)。
クオラムセンシングとは，微生物が低分子のシグナル物
質（アシル化ホモセリンラクトン；AHL など）の濃度変化を介して周囲の菌体密度を感知し，それに応じて遺伝子発現を制御する機構のことである3)。緑膿菌では，
rhlI 遺伝子によって合成されるシグナル物質である Nbutanoyl-l-homoserine lactone（C4-HSL）と，その同族のレギュレーター遺伝子である rhlR の複合体によってラムノリピド生産が正に制御されることが報告されている25)。このようなクオラムセンシング依存的な Swarming の制御に加えて，炭素源の違いや炭素源量と窒素源量の比率によっても Swarming パターンが変化するという先行研究も存在する27,38)。また，Overhage らは緑膿菌
PAO1 株のトランスポゾンによるランダムな遺伝子破壊
により 36 株の Swarming 欠損株を取得しているが，その変異箇所は鞭毛や IV 型線毛合成に関わる遺伝子の他に転写因子やアミノ酸代謝に関わる遺伝子など非常に多様であったことを報告している23)。さらに，Tremblay らは Swarming プレート上の中央の細胞と外縁部の細胞では，遺伝子発現のプロファイルが顕著に異なるという報告を行っており，Swarming 細胞は均一な集団ではないことが示唆されている32)。他にも，Swarming 細胞は浮遊細胞と比較して抗生物質への耐性や毒素生産関連遺伝
子の転写が上昇することが報告されている16,22)。このよ
うに，Swarming は緑膿菌における一運動性という位置
付けのみならず，周囲の菌体密度や栄養塩に依存してそのパターンが変化し，さらに複数の遺伝子が関与する非
常に複雑な運動性と言える。

ナフタレン誘導体による緑膿菌の運動性抑制

緑膿菌において，Swarming はヒト体内での感染拡大や環境中での微生物汚染の拡大に繋がるバイオフィルムの脱離と密接に関与するため5)，その阻害活性を持つ化合物の探索は既に複数なされている。その例として分岐鎖脂肪酸やプロアントシアニジンなどが報告されているが15,19)，それらの Swarming 阻害剤がバイオフィルムに対しても脱離抑制効果を示すことを立証した報告は，我々の知る限り未だ存在しない。そのため，Swarming
阻害のみならずバイオフィルムに対しても脱離抑制効果を示す化合物の探索は，緑膿菌バイオフィルムの制御において非常に重要な課題であると考えられる。
4.
4.1.

ナフタレン誘導体による緑膿菌のSwarming motility の阻害

種 々 の ナ フ タ レ ン 誘 導 体 が 緑 膿 菌 の Swarming
motility に与える影響

前述のとおり，Swarming motility の阻害は緑膿菌のバ
イオフィルム形成および脱離を制御するうえで非常に重要な課題であると考えられた。このような背景から，
我々は緑膿菌の Swarming に対して阻害活性を示す化合物をターゲットとしたスクリーニングを行った結果，1ナフトールに代表されるナフタレン誘導体にその活性があることを見出した。そこで，緑膿菌の基準株として汎用される Pseudomonas aeruginosa PAO1 株14) を供試菌株としてナフタレン誘導体の Swarming に対する影響を詳細に解析することとした。まず，ナフタレンおよびその誘導体（図 3A）が緑膿菌の増殖に与える影響を評価するため，それらの濃度を振って培地に添加した際の増殖曲線を得た。その結果，本研究で使用した各種ナフタ
レン誘導体は 500 μM までの濃度範囲内において（ただ63

し，1,2-ジヒドロキシナフタレンは 250 μM まで），緑膿菌の増殖を阻害しないことが分かった（投稿準備中）。
この結果から，以下の実験では各種ナフタレン誘導体を
終 濃 度 500 μM（1,2-ジ ヒ ド ロ キ シ ナ フ タ レ ン の み
250 μM）で培地に添加して行った。次に，緑膿菌の増殖に影響を与えない濃度で各種ナフタレン誘導体を添加し た Swarming 用 の 0.5 ％ 寒 天 培 地 を Tremblay ら の 方
法33) に従って作製し，その中央に OD660=3.0 に調整した緑膿菌の前培養液を 5 μl 植菌後，30°C で 12 時間培養した。その結果，各種ナフタレン誘導体の溶媒として用いた dimethyl sulfoxide（DMSO）のみを加えたコント
ロール培地では寒天培地中央の植菌地点から同心円上に菌が移動したのに対し，1-ナフトール，1,2-ジヒドロキ
シナフタレン，2,3-ジヒドロキシナフタレン及び 1-アミノナフタレンを添加した培地では，中央の植菌地点から菌が全く移動しなかった。プレート上に広がった細胞の移動直径を 3 連で定量した結果を図 3B に示す。このナ
フタレン誘導体の添加による Swarming の阻害は 24 時
間以上培養を継続しても見られたため，運動性の遅れによる現象ではないことが確かめられた（投稿準備中）。
Swarming 阻害効果のあった複数のナフタレン誘導体の
うち 1-ナフトールを例に解析を進めたところ，1-ナフトール濃度依存的な Swarming 阻害が見られ，50 μM 以上の濃度において Swarming 能が完全に失われることが分かった（投稿準備中）。また，官能基を持たないナフ
タレンや，1-ナフトールと水酸基の位置のみが異なる 2ナフトールでは Swarming 阻害活性が見られなかったた
め，水酸基やアミノ基などの官能基の存在やその位置が重要であることが示唆された。さらに，Swarming 中の細胞が 1-ナフトールに近づいた際に Swarming 状態にある細胞の運動性が阻害されるかを確認するため，O’May
らの方法19) に従って 1-ナフトールを添加したペーパー
ディスクを Swarming 培地上に静置し，Swarming 細胞の挙動を確認した。その結果，1-ナフトールを含んだ
ペーパーディスクに近づいてきた Swarming 細胞はディ
スクを避けるような移動パターンを示した（投稿準備中）。このことから，1-ナフトールは既に Swarming 能を示している細胞に対しても Swarming 阻害活性を持つことが示唆された。またこの結果から，1-ナフトールによる Swarming の阻害（細胞が Swarming プレートの中央から全く移動しない現象）は，1-ナフトールに対する正の走化性が原因ではないことが示された。
4.2. 1-ナフトールが緑膿菌の 3 つの運動性に与える影響

図 3． 各 種 ナ フ タ レ ン 誘 導 体 と そ れ ら が 緑 膿 菌 の Swarming
motility に与える影響。
（A）本研究で使用したナフタレン誘導体。
（B）各種ナフタレン誘導体を添加した際の Swarming アッセイ。M9 最小培地（0.2％グルコース，0.5％カザミノ酸），30°C，12時間培養後に 3 連で測定した Swarming 細胞の移動直径（mm）。

前 述 し た 通 り， 緑 膿 菌 に は Swarming の 他 に Swimming と Twitching の 2 つの運動性があることが報告されている。Swarming 阻害活性を示したナフタレン誘導体
が他の 2 つの運動性に対しても同様に阻害活性を示すか否かは非常に興味深く，Swarming 阻害のメカニズムを解明するうえでも重要と考えられた。そこで，Swarming 阻害効果を示した 1-ナフトールを例に，Swimmingや Twitching に対しても同様に阻害効果を示すか否かを確認することとした。その結果，1-ナフトールは Swimming 及 び Twitching に は ほ と ん ど 影 響 を 及 ぼ さ ず，Swarming 特異的に阻害活性を示すことが分かった（投

64

大浦

他

稿 準 備 中 ）。 先 行 研 究 に お い て Swimming に は 鞭 毛，Twitching には IV 型線毛がそれぞれ必須とされているが，1-ナフトールがこれら 2 つの運動性に影響を与えなかったことから，鞭毛や IV 型線毛の機能は阻害されていないことが示唆された。また，1-ナフトールの添加により Swarming 阻害を受けている細胞を，液体培地や新
たな Swarming 培地に植え継いだ実験においても，活発な運動性が観察された。
5.

1-ナフトールはバイオフィルムの脱離を抑制する

緑膿菌のバイオフィルムが成熟すると，その内部で生じる栄養塩欠乏などの環境ストレスによって，緑膿菌細胞のバイオフィルムからの脱離が誘導される。バイオ
フィルムの脱離は，ヒト体内における感染拡大や環境分
野における病原菌の拡散を誘導するため，その制御は医療・環境分野を中心に広く求められている。Boles らの先行研究において，緑膿菌バイオフィルムの脱離はラム
ノリピドを介した Swarming によって正に誘導されることが報告されている5)。今回，1-ナフトールが顕著な
Swarming 阻害活性を示したため，それに伴い Swarming
によって誘導されるバイオフィルムの脱離も同様に抑制されることが推測された。そこで，バイオフィルム形成
途中にあたる培養 6 時間の時点で 1-ナフトール添加することによって，バイオフィルムの脱離が抑制されるかを確認することとした。バイオフィルム形成実験およびその定量は，O’Toole らの手法21) に従って行った。ポリ
塩化ビニル製の 96 穴マイクロタイタープレートに菌液を分注し，37°C で静置培養を行うことによりバイオフィ
ルムを形成させた。その後，経時的にサンプリングした
バイオフィルムをクリスタルバイオレット（CV）溶液
によって染色し，染色されたバイオフィルムを 99.5％エ
タノールで溶出した後の吸光度（OD595）を測定することによって定量化を行った。
その結果，6 時間の時点で 1-ナフトールの溶媒として用いた DMSO のみを添加したコントロールでは，培養
9 時間の時点でバイオフィルム形成量が最大となり，培養 12 時間において劇的な脱離を示した。それに対し，
培養 6 時間の時点で 1-ナフトールを添加した場合，培養 9 時間で最大形成量に達したのち，コントロールにおいて脱離がみられた培養 12 時間においても脱離がみられず，少なくとも 24 時間までバイオフィルム形成を続けた。培養 9 時間をバイオフィルム形成の最大値として，脱離がみられた培養 12 時間において残存している
バイオフィルムの割合を算出した結果，1-ナフトール添
加区で顕著にバイオフィルムが残存していた（図 4）。
上記で行ったクリスタルバイオレット染色によるバイオフィルムの定量は，細胞のみならず溶菌細胞由来の細胞残渣等を含んだ簡易的定量法であるため，より詳細に細胞を解析するため，共焦点顕微鏡を用いたバイオフィ
ルムの可視化および画像定量を行うこととした。コント
ロールにおいてバイオフィルムの脱離が観察された培養12 時間におけるバイオフィルムの三次元画像を共焦点
顕微鏡によって取得し24,39)，COMSTAT プログラム13) によってバイオフィルムのバイオマスを画像定量した。その結果，コントロールでは 0.02 ± 0.005（μm3/μm2）で

図 4．培養 12 時間において脱離せず，残存しているバイオフィ
ルムの割合。
コントロールにおいてバイオフィルムの脱離が観察された培養 12 時間の時点で，最大形成時（9 時間）と比較して残存しているバイオフィルムの割合（％）。

あったのに対し，1-ナフトールを添加すると 0.3±0.02（μm3/μm2）と 10 倍以上バイオフィルムが残存していた。また，Swarming 抑制効果を示さないネガティブコ
ントロールとして用いたナフタレンでは脱離抑制がみられず，COMSTAT によるバイオフィルムの定量結果でも 0.006 ± 0.002（μm3/μm2）とバイオフィルムの残存はコントロールと同様に少なかった。これらの結果から，
1-ナフトールは Swarming 阻害活性を持つだけではなく，
Swarming によって誘導されるバイオフィルムからの脱離に対しても，顕著な抑制効果を示すことが分かった。
6.

1-ナフトールを例にした Swarming 阻害メカニズムの解析

6.1. 1-ナ フ ト ー ル は Swarming 細 胞 へ の 分 化 を 抑 制する
ナフタレン誘導体による Swarming 阻害のメカニズムを解析するなかで，Swarming プレート上でみられる細胞形態の変化に着目した。先行研究において，Swarming 能を有する多くのバクテリアにおいて，Swarming 状
態にある細胞は浮遊細胞と比較して細胞が伸長し，鞭毛数が増加することが報告されている12,35)。緑膿菌においても，Swarming 状態にある細胞の長さは，通常の細胞長と比較して約 2 倍伸長しており，通常細胞では 1 本のみの鞭毛が，Swarming 細胞では 2 本（またはそれ以上）存在する事が報告されている26)。本稿では，このように
Swarming 状態で細胞が伸長し，鞭毛数が増加した細胞を Swarming 細胞と定義させていただく。これまでの先行 研 究 に お い て， 緑 膿 菌 で は ポ リ リ ン 酸 キ ナ ー ゼ（ppk）の欠損株において Swarming 能が失われるが，この欠損株では Swarming プレート上における細胞伸長がみられない26)。他にも，P. mirabilis の Swarming はポリフェノールの一種であるレスベラトロールによって阻害されるが，この際 Swarming 培地上において通常観察される細胞の伸長が顕著に抑制されることが報告されている37)。これらの先行研究から，1-ナフトールは緑膿菌のSwarming 細胞において通常観察される細胞伸長の抑制を介して Swarming を阻害している可能性が考えられた。そこで，コントロール培地で活発な Swarming を

65

ナフタレン誘導体による緑膿菌の運動性抑制

行っている細胞と，1-ナフトールを加えて Swarming が抑制されている状態の細胞形態を観察し，その長さを比較することとした。
1-ナフトールの有無において 12 時間培養した Swarming プレート上の細胞を回収し，共焦点顕微鏡によって細胞形態を観察した。その結果，DMSO のみを加えたコントロール培地においては振盪培養時の約 2 倍程度（3.8 ± 0.65 μm）に細胞が伸長していたのに対し，1-ナフ
ト ー ル 添 加 区 で は 振 盪 培 養 時 と 同 等 の 長 さ（1.6±
0.88 μm）であった。さらに，Swarming 抑制効果を示さないネガティブコントロールとして用いたナフタレンを
含 ん だ Swarming 培 地 に お け る 細 胞 長（3.5±0.42 μm）
は，コントロールの細胞長とほぼ同等であった。また，
1-ナフトールは液体振盪培養状態での細胞形態には影響を与えなかった。これらの結果から，1-ナフトールは通常の栄養細胞から Swarming 細胞への分化（細胞伸長）の抑制を介して，Swarming を阻害していることが示唆された。
6.2. 1-ナフトールによる Swarming 阻害にクオラムセ
ンシングやラムノリピドは関与しない
前述した通り，緑膿菌の Swarming には糖脂質型のバ
イオサーファクタントであるラムノリピドが必須であり，その生産はクオラムセンシングによる正の制御を受ける。緑膿菌においては，アシル化ホモセリンラクトン（AHL）をシグナル物質として用いる 2 つのクオラムセ
ンシングシステム（Rhl および Las システム）とキノロン骨格を有するシグナル物質である Pseudomonas quinolone signal（PQS）を介したクオラムセンシングシス
テムの存在が報告されており，ラムノリピドの生産は
C4-HSL をシグナル物質とする Rhl システムを介したク
オラムセンシングによって正に制御されている。また一方で，我々のグループでは 1-ナフトールが緑膿菌特異的シグナル物質である PQS を介したクオラムセンシン
グを抑制することを見出している29)。緑膿菌では PQSを介したクオラムセンシングシステムがラムノリピド生
産を正に制御する Rhl システムの上流に存在することが報告されているため10,18)，1-ナフトールによる Swarming 阻害は PQS 生産抑制に伴って生じる Rhl システム及びラムノリピドの生産抑制を介することが推測された。そこで，Swarming 阻害活性を示した 1-ナフトール
が，Rhl システム及びラムノリピド生産を抑制するか否かを確認することとした。
まず，1-ナフトールが Rhl システムに関与する遺伝子群の転写活性に与える影響の評価を，Rhl システムを構成する C4-HSL 合成酵素遺伝子（rhlI）とその同族のレギュレーター遺伝子（rhlR）のプロモーター活性測定によって行った。Swarming プレートから回収した細胞を用いた活性測定の結果，1-ナフトール添加時の rhlI および rhlR の転写活性はコントロールとほとんど変化しな
かった（投稿準備中）。このことから，1-ナフトールは
PQS 生産を阻害するが，その下流の Rhl システムの転写活性には影響を及ぼさないことが示された。
また，液体振盪培養において 1-ナフトールを添加した際のラムノリピド生産量を，オルシノールアッセイ4)によって定量したところ，コントロール（1-ナフトール

非添加区）と顕著な差は見られなかった（投稿準備中）。
また，Swarming プレートではラムノリピドのハローが細胞の外側で形成されることが報告されているが38)，1ナフトール添加区でもコントロール区と同程度ラムノリ
ピドのハローが形成されていた（投稿準備中）。さらに，
1-ナフトールを添加した Swarming 培地に対し，緑膿菌が定常期に生産する量に近いラムノリピド（0.5 g/L）を含んだ上清画分（ジエチルエーテルによってラムノリ
ピドを含む成分を抽出し，乾燥後に滅菌水で溶解させたも の ） を 外 部 添 加 す る こ と で 1-ナ フ ト ー ル に よ る
Swarming 阻 害 が 回 復 す る か を 確 か め た。 こ の 結 果
Swarming の 回 復 が み ら れ れ ば，1-ナ フ ト ー ル に よ る
Swarming 阻害はラムノリピドの不足によるものである
ことが推測されたが，この条件では Swarming の回復はみられなかった。これらの結果から，1-ナフトールによる Swarming 阻害はこれまで Swarming に必須とされてきた Rhl システムやその制御下にあるラムノリピドの生産抑制を介したものではないことが強く示唆された。
7.

総括と今後の展望

こ れ ま で の 解 析 結 果 か ら，1-ナ フ ト ー ル に よ る
Swarming 阻害は，これまで Swarming に必須であるとされてきた鞭毛の機能や，Rhl システムおよびラムノリ
ピドの生産抑制を介したものではないことが示唆された。その一方で，Swarming 細胞で通常観察される細胞
伸長が 1-ナフトールによって抑制されることを見出すことが出来たため（図 5），現在は細胞分裂に関わる因子などを中心に解析を進めている。また，Swarming 阻
害に関与する細胞伸長以外の因子として，細胞内セカン
ドメッセンジャーである c-di-GMP にも着目している。
先行研究では，細胞内の c-di-GMP 濃度が高いときにSwarming が抑制され，反対に低いときには Swarmingが促進されることが報告されている6)。Bernier らは，ア

図 5．ナフタレン誘導体を介した緑膿菌のナフタレン分解菌との相互作用のモデル図。
ナフタレン誘導体は，緑膿菌のクオラムセンシングの阻害を介して毒素生産を抑制する一方，Swarming に重要とされる細胞伸長の阻害を介して，Swarming およびバイオフィ
ルムからの細胞脱離を抑制する。また，本研究で用いたナ
フタレン誘導体の一つである 1,2-ジヒドロキシナフタレン
は，ナフタレン分解の中間代謝産物であるため，ナフタレ
ン分解菌による緑膿菌の毒性および運動性の抑制も推測さ
れる。

66

大浦

ルギニンなどのアミノ酸を細胞外から添加することによって Swarming が阻害されることを示しているが，その際に細胞内の c-di-GMP 濃度が上昇することを示して
い る4)。 ま た，Swarming 制 御 と 密 接 に 関 与 す る c-diGMP の合成酵素，または分解酵素をコードする遺伝子は，環境中のシグナル（O2 濃度など）を受容するセンサードメインを有することが報告されている。これらのセンサードメインの多くは細胞膜上に局在することが知られているため，微生物はこのセンサーによって細胞外の環境変化を感知し，それに応じて細胞内の c-di-GMP
濃度を変化させることにより，あらゆる環境に適応する機構が推測される。このような知見に基づいて，今回みられたナフタレン誘導体による Swarming 阻害について再考してみると，緑膿菌がナフタレン誘導体を環境シグ
ナルの一つとして認識し，細胞内の c-di-GMP 濃度をコ
ントロールしている可能性が推察される。つまり，緑膿
菌は細胞膜上のセンサータンパク質を介してナフタレン
誘導体を環境シグナルの一つとして認識し，続いて生じる細胞内の c-di-GMP 濃度の増加によって Swarming が阻害されていることが考えられる。そのため，ナフタレン誘導体添加時における細胞内の c-di-GMP 濃度の定量や，ナフタレン誘導体を認識するセンサータンパクの探索等にも興味がもたれる。
また，本研究で用いたナフタレン誘導体のうち 1,2-ジヒドロキシナフタレンは，多くのナフタレン分解菌においてみられる中間代謝産物の一つとして知られている。
環境中では複数種の微生物がバイオフィルム内部で共存することが推測されるため，環境常在菌である緑膿菌はナフタレン分解菌とともにバイオフィルムを形成していることも想定される。そのような複合バイオフィルムの内部において，ナフタレン分解菌は細胞外に 1,2-ジヒド
ロキシナフタレンを排出することによって緑膿菌の運動性やクオラムセンシングを抑制し，共存を可能する機構が有るのかも知れない（図 5）。このような視点も踏まえ，今後はナフタレン誘導体の作用機序解析とともに，
緑膿菌とナフタレン分解菌の環境中における相互作用という点にも着目し，更に解析を進めていきたい。これまで我々は，緑膿菌特異的シグナル物質である PQS が緑膿菌のみならず，その受容体をもたない異種の微生物に対して増殖抑制や細胞外小胞（メンブランベシクル）の生産促進という効果を持つことを報告してきた28,30,31)。
これらの知見は，異種微生物間におけるシグナル物質を介した相互作用の存在を強く示唆しているが，本研究がそのような緑膿菌と異種微生物における代謝産物を介した相互作用の新たな一例となれば非常に興味深い。そして，このような緑膿菌と異種微生物間における相互作用を解析していくなかで，実環境中における微生物どうしの関わり合いを紐解くヒントが見出されれば幸いである。
今回の解析において主として用いた 1-ナフトールは，Swarming 能が野生株と比較して顕著に高い尿路由来の臨床分離株に対しても高い Swarming 阻害活性を示した
ため，動物細胞に対する毒性の低い類似化合物の開発によって臨床現場への応用が期待出来る。このような応用を目指し，我々は現在 DNA マイクロアレイによる 1-ナフトール添加時の Swarming 細胞における遺伝子発現変

他化の網羅的解析を試みており，これによってナフタレン
誘 導 体 の 作 用 機 序 の 解 析 が 進 む と と も に， 新 規 のSwarming 制御系の発見が期待される。
緑膿菌バイオフィルムの制御という観点における本研
究の意義は，病原性微生物の体内や環境中での拡散を防止することが期待できる点が挙げられる。それに加え，
今後ナフタレン誘導体の作用機序が解明され，緑膿菌以外の微生物に対してもバイオフィルムの脱離抑制効果がみられた場合には，次のような応用も考えられる。例えば，バイオレメディエーションを効率的に行う上で分解菌の汚染サイトへの定着は重要な要素の一つであるが，その際にナフタレン誘導体を分解菌バイオフィルムの脱離抑制剤として用いることにより，分解菌の現場への定着促進効果が期待出来るだろう。このように，ナフタレン誘導体を病原性微生物の拡散防止という側面だけではなく，有用バイオフィルムの保持等に利用することができれば，本研究の意義は非常に高まると思われる。そのような応用も踏まえ，今後更にナフタレン誘導体の作用機序解析を解析していくことが重要と考えられる。
謝

辞

本研究は，文部科学省からの科学研究費補助，科学技術振興機構（JST）の戦略的創造研究推進事業（CREST）
および先端的低炭素化技術開発（ALCA）の補助を受けて行われました。この場を借りて感謝いたします。
文献1) Barraud, N., D.J. Hassett, S.H. Hwang, S.A. Rice, S.
Kjelleberg, and J.S. Webb. 2006. Involvement of nitric oxide in
biofilm dispersal of Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol.
188: 7344–7353.
2) Barraud, N., D. Schleheck, J. Klebensberger, J.S. Webb, D.J.
Hassett, S.A. Rice, and S. Kjelleberg. 2009. Nitric oxidesignaling in Pseudomonas aeruginosa biofilms mediates
phosphodiesterase activity, decreased cyclic di-GMP levels,and enhanced dispersal. J. Bacteriol. 191: 7333–7342.
3) Bassler, B.L. 2002. Small talk. Cell-to-cell communication inbacteria. Cell 109: 421–424.
4) Bernier, S.P., D.G. Ha, W. Khan, J.H. Merritt, and G.A.
O’Toole. 2011. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surfaceassociated group behaviors by individual amino acids throughc-di-GMP signaling. Res. Microbiol. 162: 680–688.
5) Boles, B.R., M. Thoendel, and P.K. Singh. 2005. Rhamnolipids
mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms. Mol. Microbiol. 57: 1210–1223.
6) Caiazza, N.C., J.H. Merritt, K.M. Brothers, and G.A. O’Toole.
2007. Inverse regulation of biofilm formation and swarming
motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189:
3603–3612.
7) Costerton, J.W., P.S. Stewart, and E.P. Greenberg. 1999. Bacterial
biofilms: a common cause of persistent infections. Science 284:
1318–1322.
8) Davey, M.E., N.C. Caiazza, and G.A. O’Toole. 2003. Rhamnolipid surfactant production aﬀects biofilm architecture in
Pseudomonas aeruginosa PAO1. J. Bacteriol. 185: 1027–1036.
9) Davey, M.E. and G.A. O’Toole. 2000. Microbial biofilms:
from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev.
64: 847–867.
10) Diggle, S.P., K. Winzer, S.R. Chhabra, K.E. Worrall, M.

ナフタレン誘導体による緑膿菌の運動性抑制
Cámara, and P. Williams. 2003. The Pseudomonas aeruginosaquinolone signal molecule overcomes the cell density-dependencyof the quorum sensing hierarchy, regulates rhl-dependent genes
at the onset of stationary phase and can be produced in theabsence of LasR. Mol. Microbiol. 50: 29–43.
11) Donlan, R.M. 2002. Biofilms: microbial life on surfaces.
Emerg. Infect. Dis. 8: 881–890.
12) Harshey, R.M. 2003. Bacterial motility on a surface: many
ways to a common goal. Annu. Rev. Microbiol. 57: 249–273.
13) Heydorn, A., A.T. Nielsen, M. Hentzer, C. Sternberg, M.
Givskov, B.K. Ersbøll, and S. Molin. 2000. Quantification of
biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.
Microbiology 146 (Pt 10): 2395–2407.
14) Holloway, B.W., V. Krishnapillai, and A.F. Morgan. 1979.
Chromosomal genetics of Pseudomonas. Microbiol. Rev. 43:
73–102.
15) Inoue, T., R. Shingaki, and K. Fukui. 2008. Inhibition ofswarming motility of Pseudomonas aeruginosa by branchedchain fatty acids. FEMS Microbiol. Lett. 281: 81–86.
16) Lai, S., J. Tremblay, and E. Déziel. 2009. Swarming motility: amulticellular behaviour conferring antimicrobial resistance.
Environ. Microbiol. 11: 126–136.
17) Mah, T.F., B. Pitts, B. Pellock, G.C. Walker, P.S. Stewart, andG.A. O’Toole. 2003. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature 426: 306–310.
18) McKnight, S.L., B.H. Iglewski, and E.C. Pesci. 2000. The
Pseudomonas quinolone signal regulates rhl quorum sensing
in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 182: 2702–2708.
19) O’May, C. and N. Tufenkji. 2011. The swarming motility of
Pseudomonas aeruginosa is blocked by cranberry proanthocyanidins and other tannin-containing materials. Appl. Environ.
Microbiol. 77: 3061–3067.
20) O’Toole, G. A. and R. Kolter. 1998. Flagellar and twitching
motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm
development. Mol. Microbiol. 30: 295–304.
21) O’Toole, G.A., L.A. Pratt, P.I. Watnick, D.K. Newman, V.B.
Weaver, and R. Kolter. 1999. Genetic approaches to study of
biofilms. Methods Enzymol. 310: 91–109.
22) Overhage, J., M. Bains, M.D. Brazas, and R.E. Hancock.
2008. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex
adaptation leading to increased production of virulence factors
and antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190: 2671–2679.
23) Overhage, J., S. Lewenza, A.K. Marr, and R.E. Hancock.
2007. Identification of genes involved in swarming motility
using a Pseudomonas aeruginosa PAO1 mini-Tn5-lux mutant
library. J. Bacteriol. 189: 2164–2169.
24) Paddock, S. 2002. Confocal reflection microscopy: the “other”
confocal mode. Biotechniques 32: 274, 276–278.
25) Pearson, J.P., E.C. Pesci, and B.H. Iglewski. 1997. Roles of
Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorum-sensing systems
in control of elastase and rhamnolipid biosynthesis genes. J.
Bacteriol. 179: 5756–5767.
26) Rashid, M.H. and A. Kornberg. 2000. Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities
of Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
4885–4890.
27) Shrout, J.D., D.L. Chopp, C.L. Just, M. Hentzer, M. Givskov,
and M.R. Parsek. 2006. The impact of quorum sensing and67

swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol. Microbiol. 62: 1264–
1277.
28) Tashiro, Y., S. Ichikawa, T. Nakajima-Kambe, H. Uchiyama,
and N. Nomura. 2010. Pseudomonas quinolone signal aﬀects
membrane vesicle production in not only gram-negative but
also gram-positive bacteria. Microbes Environ. 25: 120–125.
29) Tashiro, Y., M. Toyofuku, T. Nakajima-Kambe, H. Uchiyama,
and N. Nomura. 2010. Bicyclic compounds repress membrane
vesicle production and Pseudomonas quinolone signal synthesisin Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol. Lett. 304:
123–130.
30) Toyofuku, M., T. Nakajima-Kambe, H. Uchiyama, and N.
Nomura. 2010. The eﬀect of a cell-to-cell communication
molecule, Pseudomonas quinolone signal (PQS), produced by
P. aeruginosa on other bacterial species. Microbes Environ.
25: 1–7.
31) Toyofuku, M., N. Nomura, E. Kuno, Y. Tashiro, T. Nakajima,and H. Uchiyama. 2008. Influence of the Pseudomonas
quinolone signal on denitrification in Pseudomonas aeruginosa.
J. Bacteriol. 190: 7947–7956.
32) Tremblay, J. and E. Déziel. 2010. Gene expression in
Pseudomonas aeruginosa swarming motility. BMC Genomics
11: 587.
33) Tremblay, J. and E. Déziel. 2008. Improving the reproducibilityof Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. J. Basic
Microbiol. 48: 509–515.
34) Tremblay, J., A.P. Richardson, F. Lépine, and E. Déziel. 2007.
Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas
aeruginosa swarming motility behaviour. Environ. Microbiol.
9: 2622–2630.
35) Turner, L., R. Zhang, N.C. Darnton, and H.C. Berg. 2010.
Visualization of Flagella during bacterial swarming. J. Bacteriol.
192: 3259–3267.
36) Verstraeten, N., K. Braeken, B. Debkumari, M. Fauvart, J.
Fransaer, J. Vermant, and J. Michiels. 2008. Living on a surface:swarming and biofilm formation. Trends Microbiol. 16: 496–
506.
37) Wang, W.B., H.C. Lai, P.R. Hsueh, R.Y. Chiou, S.B. Lin, and
S.J. Liaw. 2006. Inhibition of swarming and virulence factor
expression in Proteus mirabilis by resveratrol. J. Med. Microbiol. 55: 1313–1321.
38) Xavier, J.B., W. Kim, and K.R. Foster. 2011. A molecularmechanism that stabilizes cooperative secretions in Pseudomonas
aeruginosa. Mol. Microbiol. 79: 166–179.
39) Yawata, Y., N. Nomura, and H. Uchiyama. 2008. Development of a novel biofilm continuous culture method for simultaneous assessment of architecture and gaseous metabolite
production. Appl. Environ. Microbiol. 74: 5429–5435.
40) Zhu, G., Y. Peng, B. Li, J. Guo, Q. Yang, and S. Wang. 2008.
Biological removal of nitrogen from wastewater. Reviews ofEnvironmental Contamination and Toxicology, 192: 159–195.
41) 太田寛行，鳥井康広．1998．歯と微生物．森崎久雄，大島広 行， 磯 辺 賢 治（ 編 ）， バ イ オ フ ィ ル ム． サ イ エ ン ス
フォーラム．
42) 仁加保務．1998．食品機器・配管系における防止技術．森
崎久雄，大島広行，磯辺賢治（編），バイオフィルム．サイエンスフォーラム．